(57)【要約】  本発明は、調節性Ｔ細胞及びその使用に関する。それらの免疫抑制活性及び抗炎症活性により、調節性Ｔ細胞は末梢寛容において中心的な役割を果たし、このように、自己免疫障害及び炎症性障害の発生を決定的に防止する。本発明者らは、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇが高レベルのＬＴαを発現し、それによって、それらの免疫抑制的な特徴を負に調節することを示した。本発明者らは、マウスにおけるＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入によって、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性大腸炎から保護され、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、多臓器自己免疫、及びＣＡＣの発生を減弱させることを実証した。本発明者らはまた、混合骨髄キメラにより、造血細胞における特異的なＬＴα発現によって、Ｔｒｅｇの免疫抑制的な特徴が負に制御されることを示した。特に、本発明は、リンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
リンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞。
【請求項２】
リンホトキシンアルファをコードする遺伝子が欠失している、請求項１記載の調節性Ｔ細胞。
【請求項３】
リンホトキシンアルファをコードする遺伝子が変異し、生存不能なＲＮＡをもたらす、請求項１記載の調節性Ｔ細胞。
【請求項４】
請求項１記載の調節性Ｔ細胞の集団。
【請求項５】
調節性Ｔ細胞の免疫抑制活性を刺激するためのエクスビボ方法であって、該方法が以下を含む：
ｉ）被験体から生物学的サンプルを得ること；
ｉｉ）該サンプルから調節性Ｔ細胞を単離すること；
ｉｉｉ）調節性Ｔ細胞のインビトロ増殖；
ｖｉ）リンホトキシンアルファ遺伝子をサイレンシング又は不活性化するために、前記の単離された制御性Ｔ細胞を遺伝的に改変すること。
【請求項６】
生物学的サンプルが血液サンプルである、請求項５記載の方法。
【請求項７】
自己抗原を認識／結合するキメラ抗原受容体を発現することにおいて特徴付けられる、請求項１記載の調節性Ｔ細胞。
【請求項８】
請求項７記載の調節性Ｔ細胞の集団。
【請求項９】
キメラ抗原受容体をコードするベクターを用いてインビトロ又はエキソビボで調節性Ｔ細胞をトランスフェクト又は形質導入する工程を含む、請求項７記載の調節性Ｔ細胞を製造する方法。
【請求項１０】
それを必要とする被験体における養子細胞治療での使用のための、請求項４又は／及び請求項８記載の調節性Ｔ細胞の集団。
【請求項１１】
請求項４又は／及び請求項８記載の調節性Ｔ細胞の集団を含む医薬組成物。
【請求項１２】
それを必要とする被験体において自己免疫疾患を処置する方法であって、該方法が、請求項４又は／及び請求項８記載の調節性Ｔ細胞の集団の治療的有効量を被験体に投与することを含む方法。
【請求項１３】
自己免疫疾患が炎症性腸疾患である、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
自己免疫疾患が多発性硬化症又は１型糖尿病である、請求項１２記載の方法。
【請求項１５】
それを必要とする被験体において炎症関連癌を処置する方法であって、該方法が、請求項４記載の調節性Ｔ細胞の集団の治療的有効量を被験体に投与することを含む方法。
【請求項１６】
炎症関連癌が大腸炎関連癌である、請求項１５記載の方法。
【請求項１７】
それを必要とする被験体においてアレルギーを処置する方法であって、該方法が、請求項４記載の調節性Ｔ細胞の集団の治療的有効量を被験体に投与することを含む方法。
【請求項１８】
外因的に投与される分子に対する免疫反応又は移植組織もしくは移植細胞に対する免疫反応を、それを必要とする被験体において処置する方法であって、該方法が、請求項４記載の調節性Ｔ細胞の集団の治療的有効量を被験体に投与することを含む方法。
【請求項１９】
それを必要とする被験体において移植組織又は移植細胞に対する免疫反応を処置する方法であって、該方法が、請求項４記載の調節性Ｔ細胞の集団の治療有効量を被験体に投与することを含む方法。
【請求項２０】
被験体がヒトである、請求項５、６、１２〜１９のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、調節性Ｔ細胞及びその使用に関する。特に、本発明は、リンホトキシンアルファを発現しない、又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞、ならびに自己免疫障害及び炎症関連癌の処置及び防止のためのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、末梢自己寛容の維持において決定的な役割を果たすＣＤ４＋Ｔ細胞のサブセットを構成する（Sakaguchi, S., et al. (2008). Regulatory T cells and immune tolerance. Cell 133, 775-787）。この細胞型は、胸腺の負の選択を免れた危険な自己反応性Ｔ細胞を免疫抑制する独特の能力を持ち、それにより炎症性障害及び自己免疫障害の発生を防止する。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞は、胸腺及び、末梢中のナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の変換の両方から由来し、それぞれ天然Ｔｒｅｇ及び誘導性Ｔｒｅｇと呼ばれる（Dhamne, C. et al. (2013). Peripheral and thymic foxp3(+) regulatory T cells in search of origin, distinction, and function. Front Immunol 4, 253）。個体発生の間に、天然Ｔｒｅｇの発生は、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞の発生と比較して大幅に遅延する、なぜなら、Ｔｒｅｇの最初の波は周産期の間に生成されるのに対し、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞は胎生段階の初期に出現するからである（Fontenot, J.D. et al.(2005). Developmental regulation of Foxp3 expression during ontogeny. The Journal of experimental medicine 202, 901-906）。
【０００３】
我々の免疫系の制御及び維持におけるＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞の重要性は、切断された非機能的なＦｏｘｐ３タンパク質をもたらすＦｏｘｐ３遺伝子中の変異を示すＳｃｕｒｆｙマウスを用いて例証された（Brunkow, M.E. et al. (2001). Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse. Nature genetics 27, 68-73）。これらのマウスは若齢で死亡する。なぜなら、それらは、胸腺由来Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇを産生することができず、このように、多臓器炎症を伴う致死的なリンパ増殖性症候群を発生するからである。Ｆｏｘｐ３は、その後、Ｔｒｅｇの発生、機能、及び恒常性の主要調節因子として同定された。Ｆｏｘｐ３遺伝子中の遺伝子変異もヒトにおいて同定されており、免疫調節異常、多腺性内分泌障害、腸疾患Ｘ連鎖（ＩＰＥＸ）症候群と呼ばれる重度の自己免疫障害に関与する（Bennett, C.L. et al. (2001). The immune dysregulation, polyendocrinopathy, enteropathy, X-linked syndrome (IPEX) is caused by mutations of FOXP3. Nature genetics 27, 20-21）。
【０００４】
Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇはいくつかの機構を使用して免疫応答を抑制する（Workman et al., 2009）。４つの主な作用機序が記載されている：免疫抑制サイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、及びＩＬ−３５）、エフェクターＴ細胞及び樹状細胞の細胞溶解（マウス及びヒトにおいてそれぞれグランザイムＢ及びＡ）、代謝破壊（ＣＤ３９  、ＣＤ７３、及びＣＤ２５）、及び樹状細胞における抗原提示の調節（ＣＴＬＡ−４及びＬＡＧ−３）。
【０００５】
マウスでは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）におけるＷＴ  Ｔｒｅｇの養子移入によって、確立された腸の炎症（Maloy, K.J. et al. (2003). CD4+CD25+ T(R) cells suppress innate immune pathology through cytokine-dependent mechanisms. The Journal of experimental medicine 197, 111-119）、Ｉ型糖尿病（Szanya, V. et al. (2002). The subpopulation of CD4+CD25+ splenocytes that delays adoptive transfer of diabetes expresses L-selectin and high levels of CCR7. Journal of immunology 169, 2461-2465）、実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）（McGeachy, M.J. et al. (2005). Natural recovery and protection from autoimmune encephalomyelitis: contribution of CD4+CD25+ regulatory cells within the central nervous system. Journal of immunology 175, 3025-3032）、及び喘息（Presser, K. et al.(2008). Coexpression of TGF-beta1 and IL-10 enables regulatory T cells to completely suppress airway hyperreactivity. Journal of immunology 181, 7751-7758）が防止及び治癒することが示されている。さらに、Ｔｒｅｇ細胞はしばしば、腫瘍の免疫監視を減弱することにより腫瘍促進性になるが、それらは、対照的に、炎症を弱めることによる慢性炎症媒介性癌、例えば大腸炎関連癌（ＣＡＣ）などにおいて抗腫瘍性の役割を果たす（Waldner, M.J., and Neurath, M.F. (2009). Colitis-associated cancer: the role of T cells in tumor development. Semin Immunopathol 31, 249-256）。ヒトでは、Ｔｒｅｇベースの細胞治療が現実になりつつある（Riley, J.L. at al. (2009). Human T regulatory cell therapy: take a billion or so and call me in the morning. Immunity 30, 656-665）。例えば、ヒトＴｒｅｇを使用した第１相臨床治験が、Ｉ型糖尿病（Bluestone, J.A., et al. (2015). Type 1 diabetes immunotherapy using polyclonal regulatory T cells. Sci Transl Med 7）、難治性クローン病（Desreumaux, P. et al. (2012). Safety and efficacy of antigen-specific regulatory T-cell therapy for patients with refractory Crohn's disease. Gastroenterology 143）、又は幹細胞移植時の急性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（Di Ianni, M. et al. (2011). Tregs prevent GVHD and promote immune reconstitution in HLA-haploidentical transplantation. Blood 117, 3921-3928）を患う患者において報告されている。しかし、依然として、自己免疫疾患及び炎症性疾患の新たな治療を開発することが必要である。
【０００６】
加えて、Ｔｒｅｇ養子移入技術においては、主要な限定工程が存在する：大量の細胞が、ヒトにおける有効な治療のために要求される。このように、Ｔｒｅｇ細胞治療の分野では、炎症性障害及び自己免疫障害を効率的に処置するために、依然として、要求される細胞数を低下させる必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、調節性Ｔ細胞及びその使用に関する。特に、本発明は、リンホトキシンアルファを発現しない、又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞、ならびに自己免疫障害及び炎症関連癌の処置及び防止のためのそれらの使用に関する。特に、本発明を特許請求の範囲により定義する。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
発明の詳細な説明：
それらの免疫抑制活性及び抗炎症活性により、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）は、末梢寛容において中心的な役割を果たし、このように、自己免疫障害及び炎症性障害の発生を決定的に防止する。本発明者らは、胸膜及び脾臓のＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇが、膜アンカー型ＬＴα１β２ヘテロ複合体として、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞よりも高いレベルのリンホトキシンα（ＬＴα）を発現することを示した。重要なことに、Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇにおけるこの発現は、ヒトにおいて保存されている。ＬＴα−／−マウスからの胸腺及び脾臓のＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ（ＬＴα−／−Ｔｒｅｇ）は高度に抑制的な細胞の特徴を提示し、ＬＴαがこの細胞型の免疫抑制機能を負に調節することを示す。
【０００９】
興味深いことに、腸の炎症を限定することにより、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入（ＡＴ）によって、デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性大腸炎から保護され、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）が治癒し、及び大腸炎関連癌（ＣＡＣ）の発生が減弱する。ＬＴα−／−ＴｒｅｇのＡＴはまた、多臓器自己免疫の重症度を減弱させる。さらに、４倍少ないＬＴα−／−Ｔｒｅｇ細胞の投与は、ＤＳＳ誘発性大腸炎に対してＷＴ  Ｔｒｅｇと同じ保護を示す。ハイスループットＲＮＡ−ｓｅｑによって、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが特殊な分化プログラムを採用し、このように、活性化／エフェクター表現型を提示することが明らかになった。重要なことに、混合骨髄キメラによって、特異的に造血細胞におけるＬＴα発現が、Ｔｒｅｇの抑制的な特徴を負に制御することが明らかになった。
【００１０】
最後に、それらはまた、Ｔｒｅｇと抗原提示細胞（即ち、樹状細胞及び胸腺上皮細胞）の間のそれぞれのＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用によって、Ｔｒｅｇの免疫抑制的な特徴が制御されることを実証した。
【００１１】
まとめると、それらの知見によって、このように、ＬＴαがＴｒｅｇの免疫抑制特性を負に調節し、このように、Ｔｒｅｇ抑制活性を増加させるための処置において貴重な新たな標的を構成しうることが明らかになった。さらに、Ｔｒｅｇの免疫抑制活性を増加させることにより、養子移入において注射される細胞の数を低下させることができ、それは技術的な促進を表す。
【００１２】
本発明の調節性Ｔ細胞
したがって、本発明の第１の態様は、リンホトキシンアルファを発現しない、又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞に関する。これによって、調節性Ｔ細胞の抑制活性を増加させることが可能になる。
【００１３】
一実施形態では、リンホトキシンアルファをコードする遺伝子が欠失している。
【００１４】
一実施形態では、リンホトキシンアルファをコードする遺伝子が変異し、生存不能なＲＮＡをもたらす。
【００１５】
本明細書中で使用するように、用語「調節性Ｔ細胞」又は「Ｔｒｅｇ」は、免疫系を調節し、自己抗原への寛容を維持し、ならびに自己免疫疾患及び炎症性疾患を抑止するＴ細胞の亜集団を指す。これらの細胞は一般的に、エフェクターＴ細胞の誘導及び増殖を抑制又は下方調節し、抗原提示細胞の機能を調節する。Ｔｒｅｇは、細胞間接触により、又は免疫抑制サイトカインの放出を通じて、抑制活性（即ち、従来のＴ細胞の増殖を阻害する）が可能な細胞である。
【００１６】
本明細書中で使用するように、用語「リンホトキシンアルファ」又は「ＬＴ−α」（また、腫瘍壊死因子−ベータ（ＴＮＦ−β）として公知である）は、腫瘍壊死因子ファミリーのメンバーを指す。リンホトキシンアルファは、リンパ球により分泌されるサイトカインである。リンホトキシンアルファ（Ｕｎｉｐｒｏｔ参照：ホモサピエンスについてのＰ０１３７４、ハツカネズミについてのＰ０９２２５）は、リンホトキシンアルファ（ＬＴＡ）遺伝子（ＮＣＩＢＩ参照：ホモサピエンスについての遺伝子ＩＤ：４０４９、ハツカネズミについての遺伝子ＩＤ：１６９９２）によりコードされる。
【００１７】
本明細書中で使用するように、表現「減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現する」は、調節性Ｔ細胞が、その野生型の操作されていない対応物と比較し、より少ないリンホトキシンアルファを発現することを意味する。
【００１８】
用語「遺伝子」は、転写又は翻訳された後に特定のポリペプチド又はタンパク質をコードすることが可能な少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含む天然又は合成ポリヌクレオチドを指す。
【００１９】
本明細書中で使用するように、用語「欠失した」は、遺伝子の全体的又は部分的な欠失を意味する。部分的欠失は、１塩基対（bp）から遺伝子のほぼ完全なポリペプチドコード領域までの、標的遺伝子からの任意の量のＤＮＡの除去を含みうる。全体的な欠失は、隣接配列を伴う又は伴わない、遺伝子の完全なコード領域の除去を含み、これは、遺伝子機能のために要求される調節エレメント（例えば、転写プロモーター）を含んでもよい、又は含まなくてもよい。さらに、欠失によって、調節領域（例えばプロモーターなど）のみの除去がもたらされ、コード領域はインタクトなまま残りうる。その結果は、ｍＲＮＡを産生することができず、そのため、遺伝子が欠損することである。
【００２０】
一実施形態では、ネオカセットを伴うマウスＬＴアルファをコードする遺伝子の第２エキソンの小部分、完全な第３エキソン、及び第４エキソンの小部分が、ＬＴアルファ遺伝子をサイレンシングするために欠失されている（De Togni et al. Science. 1994 Apr 29;264(5159):703-7において記載されている通り）。
【００２１】
本明細書中で使用するように、本明細書中で使用する用語「変異遺伝子」は、変異が生じた遺伝子を意味する。本明細書中で使用する用語「変異」は、核酸の配列中での変化を意味し、遺伝学などにおいて使用される塩基の置換、挿入、欠失、逆位、重複、転座などを含む。変異遺伝子中での変異の領域は、転写領域に限定しないが、しかし、遺伝子発現のために要求される調節領域（例えばプロモーターなど）を含む。
【００２２】
本明細書中で使用するように、用語「生存不能なＲＮＡ」は、タンパク質中に翻訳されないＲＮＡに関する。
【００２３】
本発明の別の目的は、本発明の調節性Ｔ細胞の集団に関する。
【００２４】
本明細書中で使用するように、用語「集団」は細胞の集団を指し、そこで、細胞の総数の過半数（例、少なくとも約５０%、好ましくは少なくとも約６０%、より好ましくは少なくとも約７０%、及びさらにより好ましくは少なくとも約８０%）が、目的の細胞の特定の特徴を有し、目的のマーカーを発現する。
【００２５】
本発明の別の目的は、調節性Ｔ細胞の免疫抑制活性を刺激するためのエクスビボ方法に関し、前記方法は以下を含む：
ｉ）被験体から生物学的サンプルを得ること；
ｉｉ）前記サンプルから調節性Ｔ細胞を単離すること；
ｉｉｉ）調節性Ｔ細胞のインビトロ増殖；
ｉｖ）リンホトキシンアルファ遺伝子をサイレンシング又は不活性化するために、前記の単離された調節性Ｔ細胞を遺伝的に改変すること。
【００２６】
本明細書中で使用するように、用語「被験体」は、哺乳動物（例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類など）を表示する。好ましくは、本発明に従った被験体はヒトである。
【００２７】
本明細書中で使用するように、用語「生物学的サンプル」は、任意の体液又は組織を指す。一実施形態では、生物学的サンプルは血液サンプルである。
【００２８】
本明細書中で使用するように、用語「調節性Ｔ細胞免疫抑制活性」は、当技術分野において周知であり、エフェクターＴ細胞の誘導及び増殖を抑制又は下方調節するＴｒｅｇの能力を指す。本明細書中で使用するように、用語「調節性Ｔ細胞免疫抑制活性を刺激する」は、調節性Ｔ細胞免疫抑制活性の増加を指す。
【００２９】
本明細書中で使用するように、「単離する」は、その自然環境からの細胞又は細胞集団の除去を指す。本明細書中で使用するように、「単離された」は、その自然環境（例えば血液サンプルなど）から除去され、単離、精製、又は分離され、それが自然でともに存在する他の細胞を少なくとも約７５%含まない、８０%含まない、８５%含まない、及び好ましくは約９０%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%含まない細胞又は細胞集団を指す。
【００３０】
本明細書中で使用するように、用語「遺伝的に改変する」は、細胞の遺伝物質における少なくとも１つの核酸の付加、抑制、又は置換を指す。
【００３１】
本明細書中で使用するように、用語「リンホトキシンアルファ遺伝子をサイレンシングする」は、リンホトキシンアルファ遺伝子機能の全体的又は部分的な抑制を指す。この用語は、リンホトキシンアルファをコードする遺伝子がゲノムから欠失されるか、又は変異して生存不能なＲＮＡがもたらされることを意味する。
【００３２】
本発明の方法に従い、本発明の調節性Ｔ細胞をサンプルから単離する。当業者により公知の全ての技術を使用してもよい。
【００３３】
一実施形態では、調節性Ｔ細胞は、ＣＤ８＋細胞及びＣＤ１９＋細胞の枯渇によるＣＤ４＋Ｔ細胞の事前濃縮後に細胞選別機により単離する。選別された調節性Ｔ細胞の純度は＞９７%であった。
【００３４】
本発明に従い、本発明の調節性Ｔ細胞は、リンホトキシンアルファ遺伝子をサイレンシングするために、遺伝的に改変させる。特に、リンホトキシンアルファをコードする遺伝子を欠失又は変異させ、生存不能なＲＮＡをもたらす。
【００３５】
当業者により公知の全ての技術を、リンホトキシンアルファ遺伝子をサイレンシングするために使用してもよい。
【００３６】
一実施形態では、リボザイム、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡを、リンホトキシンアルファ遺伝子をサイレンシングするために使用する。
【００３７】
リボザイムは、本発明における使用のためのリンホトキシンアルファ遺伝子発現の阻害剤として機能することができる。リボザイムは、ＲＮＡの特異的切断を触媒することが可能な酵素ＲＮＡ分子である。リボザイム作用の機構は、相補的標的ＲＮＡへのリボザイム分子の配列特異的ハイブリダイゼーション、それに続くエンドヌクレアーゼ切断を含む。リンホトキシンアルファｍＲＮＡ配列のエンドヌクレアーゼ切断を特異的かつ効率的に触媒する操作されたヘアピン又はハンマーヘッドモチーフリボザイム分子は、それにより本発明の範囲内において有用である。任意の潜在的なＲＮＡ標的内の特異的リボザイム切断部位は、リボザイム切断部位（それは、典型的には、以下の配列ＧＵＡ、ＧＵＵ、及びＧＵＣを含む）について標的分子をスキャンすることにより最初に同定される。一度同定されると、切断部位を含む標的遺伝子の領域に対応する約１５と２０の間のリボヌクレオチドの短いＲＮＡ配列を、オリゴヌクレオチド配列を不適切にしうる、予測される構造的特色（例えば二次構造など）について評価することができる。候補標的についての適合性はまた、例えば、リボヌクレアーゼ保護アッセイを使用し、相補的オリゴヌクレオチドとのハイブリダイゼーションへのそれらの接近可能性をテストすることにより評価することができる。
【００３８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスＲＮＡ分子及びアンチセンスＤＮＡ分子を含み、それらは、ｍＲＮＡに結合し、このように、タンパク質翻訳を防止し、又はｍＲＮＡ分解を増加させ、このように、細胞中での標的タンパク質のレベル、及び、このように、活性を減少させることにより標的ｍＲＮＡの翻訳を直接的に遮断するように作用する。例えば、少なくとも約１５塩基の、ｍＲＮＡ転写物配列の固有の領域に相補的であるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、従来のホスホジエステル技術により合成することができる。配列が公知である遺伝子の遺伝子発現を特異的に阻害するためのアンチセンス技術を使用するための方法は、当技術分野において周知である（例、米国特許第６，５６６，１３５号；第６，５６６，１３１号；第６，３６５，３５４号；第６，４１０，３２３号；第６，１０７，０９１号；第６，０４６，３２１号；及び第５，９８１，７３２号を参照のこと）。
【００３９】
小さな阻害性ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、本発明における使用のための遺伝子発現の阻害剤として機能することができる。リンホトキシンアルファ遺伝子発現は、被験体又は細胞を、小さな二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、又は小さな二本鎖ＲＮＡの産生を起こすベクターもしくはコンストラクトと接触させることにより低下させることができ、リンホトキシンアルファ遺伝子発現が特異的に阻害される（即ち、ＲＮＡ  干渉又はＲＮＡｉ）。適したｄｓＲＮＡ又はｄｓＲＮＡをコードするベクターを選択するための方法は、その配列が公知である遺伝子について当技術分野において周知である（例えば、Tuschl, T. et al. (1999)；Elbashir, S. M. et al. (2001)；Hannon, GJ. (2002)；McManus, MT. et al. (2002)；Brummelkamp, TR. et al. (2002)；米国特許第  ６，５７３，０９９号及び第６，５０６，５５９号；ならびに国際特許公開ＷＯ  ０１／３６６４６、ＷＯ  ９９／３２６１９、及びＷＯ  ０１／６８８３６を参照のこと）。
【００４０】
ショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉を介して遺伝子発現をサイレンシングするために使用することができるタイトなヘアピンターンを作るＲＮＡの配列である。ｓｈＲＮＡは一般的に、細胞中に導入されたベクターを使用して発現され、そこで、ベクターはＵ６プロモーターを利用し、ｓｈＲＮＡが常に発現されることを確実にする。ｓｈＲＮＡヘアピン構造は、細胞機構によりｓｉＲＮＡ中に切断され、それは次に、ＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に結合する。この複合体は、それが結合しているｓｉＲＮＡと一致するｍＲＮＡに結合し、切断する。小さな干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、時折、ショート干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとして公知であり、生物学において多様な役割を果たす２０〜２５ヌクレオチド長の二本鎖ＲＮＡ分子のクラスである。最も注目すべきことに、ｓｉＲＮＡがＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）経路中に含まれ、それにより、ｓｉＲＮＡは特定の遺伝子の発現に干渉する。
【００４１】
リンホトキシンアルファ遺伝子発現の阻害剤として有用なアンチセンスオリゴヌクレオチド及びリボザイムの両方を、公知の方法により調製することができる。これらは、化学合成（例えば、例、固相ホスホラマダイト化学合成による、など）のための技術を含む。あるいは、アンチセンスＲＮＡ分子は、ＲＮＡ分子をコードするＤＮＡ配列のインビトロ又はインビボ転写により生成することができる。そのようなＤＮＡ配列は、適切なＲＮＡポリメラーゼプロモーター（例えばＴ７又はＳＰ６ポリメラーゼプロモーターなど）を組み入れた広く多様なベクター中に組み入れることができる。本発明のオリゴヌクレオチドへの種々の修飾を、細胞内安定性及び半減期を増加させる手段として導入することができる。可能な修飾は、分子の５’及び／又は３’末端へのリボヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドの隣接配列の付加、あるいはオリゴヌクレオチド骨格内でのホスホジエステラーゼ連結よりはむしろホスホロチオエート又は２’−Ｏ−メチルの使用を含むが、これらに限定しない。
【００４２】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡは、インビボで単独で、又はベクターとの会合において送達されうる。その最も広い意味において、「ベクター」は、細胞及び典型的にはマスト細胞へのアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はリボザイム核酸の移行を促すことが可能な任意の媒体である。古典的には、ベクターは核酸を細胞に輸送し、ベクターの非存在をもたらしうる分解の程度に比べて、低下した分解を伴う。一般的に、本発明において有用なベクターは、プラスミド、ファージミド、ウイルス、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はリボザイムの核酸配列の挿入又は組み入れにより操作されたウイルス又は細菌供給源から由来する他の媒体を含むが、これらに限定しない。ウイルスベクターは好ましい型のベクターであり、以下のウイルスからの核酸配列を含むが、これらに限定しない：レトロウイルス、例えばモロニーマウス白血病ウイルス、ハーベイマウス肉腫ウイルス、マウス乳腺腫瘍ウイルス、及びラウス肉腫ウイルスなど；アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス；ＳＶ４０型ウイルス；ポリオーマウイルス；エプスタインバーウイルス；パピローマウイルス；ヘルペスウイルス；ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；ならびにＲＮＡウイルス、例えばレトロウイルスなど。命名されていないが、しかし、当技術分野において公知の他のベクターを容易に用いることができる。
【００４３】
好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が目的の遺伝子を用いて置換されている非細胞傷害性の真核生物ウイルスに基づく。非細胞傷害性ウイルスは、レトロウイルス（例、レンチウイルス）を含み、そのライフサイクルは、ＤＮＡ中へのゲノムウイルスＲＮＡの逆転写を含み、その後の宿主細胞ＤＮＡ中へのプロウイルス組込みを伴う。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療治験のために承認されている。最も有用なのは、複製欠損（即ち、所望のタンパク質の合成を指示することが可能であるが、しかし、感染性粒子を製造することが不可能である）であるレトロウイルスである。そのような遺伝的に改変されたレトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率形質導入のための一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを産生するための標準的プロトコール（プラスミド中への外因性遺伝物質の組み入れ、プラスミドを用いたパッケージング細胞株のトランスフェクション、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの産生、組織培養培地からのウイルス粒子の収集、及びウイルス粒子を用いた標的細胞の感染を含む）がKriegler, 1990において、及びMurry, 1991において提供されている。特定の適用のための好ましいウイルスは、アデノウイルス及びアデノ随伴ウイルスであり、それらは二本鎖ＤＮＡウイルスである。アデノ随伴ウイルスは、複製欠損になるように操作することができ、広い範囲の細胞型及び種に感染することが可能である。それは、利点、例えば熱及び脂質溶媒安定性；多様な系統の細胞（造血細胞を含む）における高い形質導入頻度；及び重複感染阻害の欠如（このように、複数の一連の形質導入を可能にする）などをさらに有する。報告によると、アデノ随伴ウイルスは、部位特異的な様式においてヒト細胞ＤＮＡ中に組込み、それにより、挿入変異誘発の可能性及びレトロウイルス感染に特徴的な挿入遺伝子発現の変動を最小限にすることができる。また、野生型アデノ随伴ウイルス感染は、選択圧の非存在において、１００継代を超えて組織培養中で追跡されており、アデノ随伴ウイルスのゲノム組込みが比較的安定な事象であることを意味する。アデノ随伴ウイルスはまた、染色体外の様式において機能することができる。他のベクターはプラスミドベクターを含む。プラスミドベクターは、当技術分野において広範に記載されており、当業者に周知である。例えば、Sambrook et al., 1989を参照のこと。過去数年間において、プラスミドベクターは、抗原をコードする遺伝子をインビボで細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されてきた。それらは、このために特に有利である。なぜなら、それらは、ウイルスベクターの多くと同じ安全性の懸念を有さないためである。これらのプラスミドは、しかし、宿主細胞と適合性のあるプロモーターを有し、プラスミド内で操作的にコードされた遺伝子からペプチドを発現することができる。一部の一般に使用されるプラスミドは、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐＲＣ／ＣＭＶ、ＳＶ４０、及びｐＢｌｕｅＳｃｒｉｐｔを含む。他のプラスミドが当業者に周知である。加えて、プラスミドは、制限酵素及びライゲーション反応を使用して注文設計され、ＤＮＡの特定の断片を除去及び付加してもよい。プラ��ミドは、多様な非経口経路、粘膜経路、及び局所経路により送達してもよい。例えば、ＤＮＡプラスミドは、筋肉内、目、皮内、皮下、又は他の経路により注射することができる。それはまた、鼻腔内スプレー又は液滴、直腸坐剤及び経口的に投与してもよい。それはまた、遺伝子銃を使用して表皮又は粘膜表面中に投与してもよい。プラスミドは水溶液中で与え、金粒子上で、又は別のＤＮＡ送達系（リポソーム、デンドリマー、渦巻状物、及びマイクロカプセル化を含むが、これらに限定しない）との会合において乾燥させてもよい。
【００４４】
好ましい実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、又はリボザイム核酸配列は、異種調節領域（例、異種プロモーター）の制御下にある。
【００４５】
一実施形態では、エンドヌクレアーゼを、リンホトキシンアルファ遺伝子をサイレンシングするために使用する。一実施形態では、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９」技術を、リンホトキシンアルファ遺伝子をサイレンシングするために使用する。
【００４６】
本明細書中で使用するように、用語「ＣＲＩＳＰＲ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、塩基配列の短い反復を含む原核生物ＤＮＡのセグメントである、関連付けられるクラスター化した規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復を指す。細菌では、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座は、可動遺伝エレメント（ウイルス、転移エレメント、及び接合型プラスミド）に対するＲＮＡ誘導性適応免疫系をコードする。３つの型（Ｉ−ＩＩＩ）のＣＲＩＳＰＲ系が同定されている。ＣＲＩＳＰＲクラスターはスペーサー（先行する可動エレメントに相補的な配列）を含む。ＣＲＩＳＰＲクラスターは転写され、成熟ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化した規則的に間隔を空けた短いパリンドローム反復）ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）中に処理される。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼＣａｓ９はＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系に属し、標的ＤＮＡを切断する強力なエンドヌクレアーゼ活性を有する。Ｃａｓ９は、約２０塩基対（bp）の固有の標的配列（スペーサーと呼ぶ）を含む成熟ｃｒＲＮＡ及びプレｃｒＲＮＡのリボヌクレアーゼＩＩＩ援用処理のためのガイドとしての役割を果たすトランス活性化低分子ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）により誘導される。ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二本鎖によって、ｃｒＲＮＡ上のスペーサーと標的ＤＮＡ上の相補配列（プロトスペーサーと呼ぶ）の間の相補的な塩基対を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに向ける。Ｃａｓ９は、トリヌクレオチド（ＮＧＧ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、切断部位（ＰＡＭからの３番目のヌクレオチド）を特定する。ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡは、別々に発現させる、又は合成ステムループを介して人工融合小ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）中に操作し、天然のｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖を模倣することができる。そのようなｓｇＲＮＡは、ｓｈＲＮＡと同様に、直接的なＲＮＡトランスフェクションのために合成又はインビトロで転写する、あるいはＵ６又はＨＩ促進性ＲＮＡ発現ベクターから発現させることができるが、人工ｓｇＲＮＡの切断効率は、別々に発現されたｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを用いた系についての切断効率よりも低くなる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼはＣａｓ９ヌクレアーゼでありうる。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、野生型の化膿性連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｒｏｇｅｎｅｓ）配列と同一のヌクレオチド配列を有することができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼは、他の種、例えば、他の連鎖球菌種（例えばサーモフィルスなど）；緑膿菌、大腸菌、あるいは他の配列決定された細菌ゲノム及び古細菌、又は他の原核微生物からの配列でありうる。あるいは、野生型の化膿性連鎖球菌Ｃａｓ９配列を改変することができる。核酸配列は、哺乳動物細胞における効率的な発現のために最適化された、即ち、「ヒト化」されたコドンでありうる。ヒト化Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＬ６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１  ＧＬ６６９１９３７６１；又はＫＭ０９９２３３．１  ＧＬ６６９１９３７６５において列挙されている発��ベクターのいずれかによりコードされるＣａｓ９ヌクレアーゼ配列でありうる。あるいは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は、例えば、Ａｄｄｇｅｎｅ（マサチューセッツ州ケンブリッジ）からの市販のベクター（例えばＰＸ３３０又はＰＸ２６０など）内に含まれる配列でありうる。一部の実施形態では、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＫＭ０９９２３１．１  ＧＬ６６９１９３７５７；ＫＭ０９９２３２．１；ＧＬ６６９１９３７６１；又はＫＭ０９９２３３．１  ＧＬ６６９１９３７６５のＣａｓ９エンドヌクレアーゼ配列あるいはＰＸ３３０又はＰＸ２６０（Ａｄｄｇｅｎｅ、マサチューセッツ州ケンブリッジ）のＣａｓ９アミノ酸配列のいずれかの変異体又は断片であるアミノ酸配列を有することができる。Ｃａｓ９ヌクレオチド配列は、Ｃａｓ９の生物学的に活性な変異体をコードするように改変することができ、これらの変異体は、例えば、１つ以上の変異（例、付加、欠失、もしくは置換変異又はそのような変異の組み合わせ）を含むため、野生型Ｃａｓ９とは異なるアミノ酸配列を有することができる、又は含むことができる。置換変異の１つ以上は、置換（例、保存的アミノ酸置換）でありうる。例えば、Ｃａｓ９ポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、野生型Ｃａｓ９ポリペプチドに対して、少なくとも又は約５０%の配列同一性（例、少なくとも又は約５０%、５５%、６０%、６５%、７０%、７５%、８０%、８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の配列同一性）を伴うアミノ酸配列を有することができる。保存的アミノ酸置換は、典型的には、以下の群内の置換を含む：グリシン及びアラニン；バリン、イソロイシン、及びロイシン；アスパラギン酸及びグルタミン酸；アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニン；リジン、ヒスチジン、及びアルギニン；ならびにフェニルアラニン及びチロシン。Ｃａｓ９ヌクレアーゼ配列は変異配列でありうる。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、保存されたＦｉＮＨ及びＲｕｖＣドメイン中で変異させることができ、それらは、鎖特異的切断において含まれる。例えば、ＲｕｖＣ触媒ドメイン中のアスパラギン酸からアラニン（Ｄ１０Ａ）への変異によって、Ｃａｓ９ニッカーゼ変異体（Ｃａｓ９ｎ）がＤＮＡを切断するよりもむしろニックを入れて、一本鎖の切断をもたらすことが可能になり、ＨＤＲを通じたその後の優先的な修復によって、標的外の二本鎖切断からの不要なインデル変異の頻度を潜在的に減少させることができる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物学的に活性な変異体であるポリペプチドは、それらの配列が、対応する野生型ポリペプチドと類似している又は同一である程度に関して特徴付けることができる。例えば、生物学的に活性な変異体の配列は、野生型ポリペプチド中の対応する残基と少なくとも又は約８０%同一でありうる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼの生物学的に活性な変異体は、ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼに対して、又はそのホモログもしくはオルソログに対して、少なくとも又は約８０%の配列同一性（例、少なくとも又は約８５%、９０%、９５%、９７%、９８%、又は９９%の配列同一性）を伴うアミノ酸配列を有しうる。ＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼポリペプチドの生物学的に活性な変異体は、本方法において有用であるための十分な生物学的活性を保持しうる。生物学的に活性な変異体は、標的化ＤＮＡ切断において機能するための十分な活性を保持しうる。生物学的活性は、当業者に公知の方法において評価することができ、インビトロ切断アッセイ又は機能アッセイを含むが、これらに限定しない。
【００４７】
それは、ヒト（Mali et al., 2013, Science, Vol. 339 : 823-826）、細菌（Fabre et al., 2014, PLoS Negl. Trop. Dis., Vol. 8:e2671.）、ゼブラフィッシュ（Hwang et al., 2013, PLoS One, Vol. 8:e68708.）、線虫（Hai et al., 2014 Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11.）、細菌（Fabre et al., 2014, PLoS Negl. Trop. Dis., Vol. 8:e2671.）、植物（Mali et al., 2013, Science, Vol. 339 : 823-826）、アフリカツメガエル（Guo et al., 2014, Development, Vol. 141 : 707-714.）、酵母（DiCarlo et al., 2013, Nucleic Acids Res., Vol. 41 : 4336-4343.）、ショウジョウバエ（Gratz et al., 2014 Genetics, doi:10.1534/genetics.113.160713）、サル（Niu et al., 2014, Cell, Vol. 156 : 836-843.）、ウサギ（Yang et al., 2014, J. Mol. Cell Biol., Vol. 6 : 97-99.）、ブタ（Hai et al., 2014, Cell Res. doi: 10.1038/cr.2014.11.）、ラット（Ma et al., 2014, Cell Res., Vol. 24 : 122-125.）、及びマウス（Mashiko et al., 2014, Dev. Growth Differ. Vol. 56 : 122-129.）を含む多くの細胞株及び生物において重要な遺伝子を標的化するために既に成功裏に使用されてきた。
【００４８】
一部の実施形態では、エンドヌクレアーゼは、Ｚｅｔｓｃｈｅら（“Cpf1 is a Single RNA-guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System (2015); Cell; 163, 1-13）におけるプロボテラ及びフランシセラ１（Ｃｐｆ１）からのより最近に特徴付けられたＣＲＩＳＰＲであるＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１である。
【００４９】
キメラ抗原受容体を発現する、本発明の調節性Ｔ細胞
本発明のさらなる目的は、自己抗原を認識／結合するキメラ抗原受容体を発現することにおいて特徴付けられる本発明の調節性Ｔ細胞に関する。
【００５０】
用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」は、当技術分野におけるその一般的な意味を有し、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインに連結された抗体（例、ｓｃＦｖ）の抗原結合ドメインを含む人工的に構築されたハイブリッドタンパク質又はポリペプチドを指す。本発明の文脈において、抗体の抗原結合ドメインは、自己抗原を認識／結合する。
【００５１】
本明細書中で使用するように、用語「認識する」又は「結合する」は、本発明の文脈において、キメラ抗原受容体が抗原について親和性を有することを意味する。
【００５２】
本明細書中で使用するように、用語「自己抗原」は、内因性抗原、又はその活性断片を指し、それは免疫系により認識される。
【００５３】
自己抗原は、細胞タンパク質、リン酸化タンパク質、細胞表面タンパク質、細胞脂質、核酸、糖タンパク質（細胞表面受容体を含む）を含むが、これらに限定しない。自己抗原の例は、プレプロインスリン（ＰＰＩ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）、インスリノーマ関連タンパク質２（ＩＡ−２）、膵島特異的グルコース−６−ホスファターゼ触媒サブユニット関連タンパク質（ＩＧＲＰ）、亜鉛トランスポーター８（ＺｎＴ８）及びクロモグラニンＡ（Ｔ１Ｄについて）；ミエロペルオキシダーゼ及びプロテイナーゼ３（多発性血管炎を伴う肉芽腫症について）；ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）及びミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（多発性硬化症における）；ならびにグリアジン（セリアック病における）を含むが、これらに限定しない。
【００５４】
別の目的は、自己抗原を認識／結合するキメラ抗原受容体を発現することにおいて特徴付けられる、本発明の調節性Ｔ細胞の集団に関する。
【００５５】
本発明の別の目的は、自己抗原を認識／結合するキメラ抗原受容体を発現する、本発明の調節性Ｔ細胞を製造する方法に関し、それは、キメラ抗原受容体をコードするベクターを用いたインビトロ又はエクスビボでの、本発明の調節性Ｔ細胞をトランスフェクト又は形質導入する工程を含む。
【００５６】
用語「形質導入」又は「形質導入する」は、遺伝物質のウイルス移入及びレシピエント細胞におけるその発現を指す。
【００５７】
本明細書中で使用する用語「トランスフェクション」又は「トランスフェクトする」は、ＤＮＡ（例、製剤化されたＤＮＡ発現ベクター）を細胞中に導入し、それにより細胞の形質転換を可能にする過程を指す。
【００５８】
本明細書中で使用するように、用語「ベクター」は、宿主細胞中で複製する及び／又は組込むためのベクターの能力を破壊することを伴わず、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子を指す。
【００５９】
処置の方法
本発明の調節性Ｔ細胞集団（リンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団ならびにリンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて、及び自己抗原を認識／結合するキメラ抗原受容体を発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団）が、治療的な使用のために特に適切である。
【００６０】
したがって、本発明のさらなる目的は、リンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団、ならびに／あるいはリンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて、及び、それを必要とする被験体における養子細胞治療での使用のための、自己抗原を認識／結合するキメラ抗原受容体を発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団に関する。
【００６１】
本明細書中で使用する用語「養子細胞治療」は、遺伝的に改変されている又はされていない自己又は同種リンパ球の輸血に関連する細胞ベースの免疫治療を指す。本発明の目的のために、調節性Ｔ細胞を遺伝的に改変する。
【００６２】
本発明のＴｒｅｇの集団は、公知の技術、又は本開示に基づいて当業者に明らかであろうそれらのバリエーションに従った養子細胞治療のための方法及び組成物において利用することができる。例えば、Gruenbergらに対する米国特許出願公開第２００３／０１７０２３８号を参照のこと；また、Rosenbergに対する米国特許第４，６９０，９１５号を参照のこと。一部の実施形態では、細胞は、最初にそれらを、それらの培養培地から回収し、次に細胞を、投与のための適切な培地及び容器系（「医薬的に許容可能な」担体）中で、処置有効量で洗浄及び濃縮することにより製剤化する。適切な注入培地は、任意の等張培地製剤、典型的には生理食塩水、Normosol R（Abbott）、又はPlasma-Lyte A（Baxter）でありうるが、しかし、また、５%デキストロース（水中）又は乳酸リンゲル液を利用することができる。注入培地は、ヒト血清アルブミンを用いて補充することができる。組成物中の細胞の処置有効量は、レシピエントの年齢及び体重に、標的とする状態の重症度に依存している。古典的には、注射されるＴｒｅｇの数は約１〜３×１０６/kgである（Adair et al. HumanＴｒｅｇ Made Antigen Specific by Gene Modification: The Power to Treat Autoimmunity and Antidrug Antibodies with Precision. Front Immunol 2017）。しかし、投与量は、本発明のＴｒｅｇを使用する場合には低下させてもよい。なぜなら、それらの免疫抑制活性が増加するためである。一実施形態では、投与量は少なくとも５０%だけ低下させてもよい。一実施形態では、投与量は７５%だけ低下させてもよい。一実施形態では、標準的な細胞治療の投与量を使用してもよい：これらの細胞の量は、約１０３/kg、好ましくは５×１０３/kgと低くてもよく；及び、１０７/kg、好ましくは１０８/kgと高くてもよい。細胞の数は、その中に含まれる細胞の型と同様に、組成物が意図される究極的な使用に依存するであろう。臨床的に関連する数の免疫細胞を、細胞の所望の総量に累積的に等しい、又はそれを超える複数回の注入中に配分することができる。
【００６３】
本発明の目的のために、養子細胞治療において使用される調節性Ｔ細胞は、被験体（「自己細胞」）から又は別の個体（「同種細胞」）から単離されうる。
【００６４】
本明細書中で使用するように、「同種細胞」は、１つの被験体（ドナー）から単離され、別の被験体（レシピエント又は宿主）において注入された細胞を指す。
【００６５】
本明細書中で使用するように、「自己細胞」は、単離され、同じ被験体（レシピエント又は宿主）中に戻して注入された細胞を指す。
【００６６】
一実施形態では、養子細胞治療において使用される調節性Ｔ細胞は、幹細胞から由来しうる。
【００６７】
本明細書中で使用する用語「幹細胞」は、自己複製の特性を有し、複数の細胞型中に分化する発生能を有する未分化状態又は部分的な分化状態にある細胞を指し、発生能に関する特定の暗黙の意味（  即ち、全能性、多能性、多分化能など）を伴わない。
【００６８】
特定の実施形態では、養子細胞治療において使用される調節性Ｔ細胞は、誘導多能性幹細胞から由来しうる。
【００６９】
本明細書中で使用するように、用語「ｉＰＳＣ」及び「誘導多能性幹細胞」は互換的に使用され、例えば、１つ以上の遺伝子の強制発現を誘導することにより、非多能性細胞、典型的には成体の体細胞から人工的に誘導された（例、誘導された又は完全な逆転による）多能性幹細胞を指す。
【００７０】
特定の実施形態では、養子細胞治療において使用される調節性Ｔ細胞は、胚性幹細胞から由来しうる。
【００７１】
本明細書中で使用する用語「胚性幹細胞」は、胚の胚盤胞の内部細胞塊の天然多能性幹細胞を指す（例、米国特許第５，８４３，７８０号；第６，２００，８０６号；第７，０２９，９１３号；第７，５８４，４７９号を参照のこと。それらを、参照により本明細書中に組み入れる）。そのような細胞は、体細胞核移入から由来する胚盤胞の内部細胞塊から同様に得ることができる（例えば、米国特許第５，９４５，５７７号、第５，９９４，６１９号、第６，２３５，９７０号を参照のこと。それらを、参照により本明細書中に組み入れる）。胚性幹細胞は多能性であり、発生の間に、３つの一次胚葉：外胚葉、内胚葉、及び中胚葉の全ての派生体を生じる。言い換えれば、それらは、特定の細胞型について十分かつ必要な刺激が与えられた場合、成体の身体の２００を上回る細胞型の各々に発生することができる。それらは、胚体外膜又は胎盤に寄与せず、即ち、全能性ではない。
【００７２】
一実施形態では、養子細胞治療において使用される調節性Ｔ細胞は、従来のＣＤ４＋Ｔ細胞の変換から由来しうる。
【００７３】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体において自己免疫疾患を処置する方法に関し、前記方法は、リンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団、ならびに／あるいはリンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて、及び、自己抗原を認識／結合するキメラ抗原受容体を発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００７４】
本明細書中で使用するように、用語「自己免疫疾患」は、被験体における自己免疫応答（自己（ａｕｔｏ）抗原又は自己（ｓｅｌｆ）抗原に対して向けられる免疫応答）の存在を指す。自己免疫疾患は、自己寛容の崩壊により起こる疾患を含み、適応免疫系が、自然免疫系の細胞との協調において、自己抗原に応答し、細胞及び組織の損傷を媒介する。一部の実施形態では、自己免疫疾患を、少なくとも部分的に、体液性及び／又は細胞性免疫応答の結果として特徴付ける。自己免疫疾患の例は、限定しないが、急性散在性脳脊髄炎（ＡＤＥＭ）、急性壊死性出血性白質脳炎、アジソン病、無ガンマグロブリン血症、円形脱毛症、アミロイドーシス、強直性脊椎炎、抗ＧＢＭ／抗ＴＢＭ腎炎、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）、自己免疫性血管浮腫、自己免疫性再生不良性貧血、自己免疫性自律神経障害、自己免疫性肝炎、自己免疫性高脂血症、自己免疫性免疫不全症、自己免疫性内耳疾患（ＡＩＥＤ）、自己免疫性心筋炎、自己免疫性膵炎、自己免疫性網膜症、自己免疫性血小板減少性紫斑病（ＡＴＰ）、自己免疫性甲状腺疾患、自己免疫性蕁麻疹、軸索及び神経性ニューロパシー、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、自己免疫性心筋症、キャッスルマン病、セリアック病、シャーガス病、慢性疲労症候群、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、慢性再発性多発性骨髄炎（ＣＲＭＯ）、チャーグ・ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡／良性粘膜類天疱瘡、クローン病、コーガン症候群、寒冷凝集素症、先天性心ブロック、コクサッキー心筋炎、ＣＲＥＳＴ疾患、本態性混合型クリオグロブリン血症、脱髄性ニューロパチー、疱疹状皮膚炎、皮膚筋炎、デビック病（視神経脊髄炎）、円板状ループス、ドレスラー症候群、子宮内膜症、好酸球性筋膜炎、結節性紅斑、実験的アレルギー性脳脊髄炎、エバンス症候群、線維筋痛症、線維化性肺胞炎、巨細胞性動脈炎（側頭動脈炎）、糸球体腎炎、グッドパスチャー症候群、多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）、グレーブス病、ギランバレー症候群、橋本脳炎、橋本甲状腺炎、溶血性貧血、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、妊娠性疱疹、低ガンマグロブリン血症、高ガンマグロブリン血症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、ＩｇＧ４関連硬化性疾患、免疫調節性リポタンパク質、封入体筋炎、炎症性腸疾患、インスリン依存性糖尿病（１型）、間質性膀胱炎、若年性関節炎、川崎症候群、ランバートイートン症候群、  白血球破砕性血管炎、扁平苔癬、硬化性苔癬、木質結膜炎、線形ＩｇＡ疾患（ＬＡＤ）、ループス（ＳＬＥ）、ライム病、メニエール病、顕微鏡的多発血管炎、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、モーレン潰瘍、ムッハ・ハーバーマン病、多発性硬化症、重症筋無力症、筋炎、ナルコレプシー、視神経脊髄炎（デビック）、自己免疫性好中球減少症、眼瘢痕性類天疱瘡、視神経炎、回帰性リウマチ、ＰＡＮＤＡＳ（レンサ球菌感染性小児自己免疫神経精神障害）、傍腫瘍性小脳変性症、発作性夜間ヘモグロビン尿症（ＰＮＨ）、Ｐａｒｒｙ−Ｒｏｍｂｅｒｇ症候群、パーソネージ・ターナー症候群、毛様体扁平部炎（周辺部ぶどう膜炎）、天疱瘡、末梢性ニューロパチー、静脈周囲脳脊髄炎、���性貧血、ＰＯＥＭＳ症候群、結節性多発性動脈炎、Ｉ型、ＩＩ型、ＩＩＩ型の自己免疫性多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性筋炎、心筋梗塞後症候群、心膜切開後症候群、プロゲステロン皮膚炎、原発性胆汁性肝硬変、原発性硬化性胆管炎、乾癬、乾癬性関節炎、特発性肺線維症、壊疽性膿皮症、赤芽球癆、レイノー現象、反射性交感神経性ジストロフィー、ライター症候群、再発性多発性軟骨炎、下肢静止不能症候群、後腹膜線維症、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、シュミット症候群、強膜炎、強皮症、シェーグレン症候群、精子＆精巣の自己免疫、全身硬直症候群、亜急性細菌性心内膜炎（ＳＢＥ）、スザック症候群、交感性眼炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞性動脈炎、血小板減少性紫斑病（ＴＴＰ）、トロサ・ハント症候群、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、未分化型結合組織病（ＵＣＴＤ）、ブドウ膜炎、血管炎、小水疱性皮膚炎、白斑、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、及びウェゲナー肉芽腫症［多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）］。一部の実施形態では、自己免疫疾患は、関節リウマチ、１型糖尿病、全身性エリテマトーデス（ループス又はＳＬＥ）、重症筋無力症、多発性硬化症、強皮症、アジソン病、水疱性類天疱瘡、尋常性天疱瘡、ギランバレー症候群、シェーグレン症候群、皮膚筋炎、血栓性血小板減少性紫斑病、高ガンマグロブリン血症、意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症（ＭＧＵＳ）、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症（ＷＭ）、慢性炎症性脱髄性多発神経炎（ＣＩＤＰ）、橋本脳症（ＨＥ）、橋本甲状腺炎、グレーブス病、及びウェゲナー肉芽腫症［多発血管炎性肉芽腫症（ＧＰＡ）］からなる群より選択する。
【００７５】
一実施形態では、自己免疫疾患は炎症性腸疾患である。
【００７６】
一実施形態では、自己免疫疾患は多発性硬化症又は１型糖尿病である。
【００７７】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体において炎症関連癌を処置する方法に関し、前記方法は、リンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００７８】
本明細書中で使用するように、用語「炎症関連癌」は、炎症が、癌の開始及び発生において含まれる発症機構の少なくとも１つであると考えられる任意の癌を指す。炎症関連癌の例は、大腸炎関連癌、胃腺癌、膀胱癌、肝臓癌、直腸癌、胆管癌、結腸癌、結腸直腸癌、胆嚢癌、肝細胞癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、食道癌、膀胱癌、中皮腫、肺癌、口腔扁平上皮癌、膵臓癌、外陰部扁平上皮癌、唾液腺癌、肺癌、ＭＡＬＴリンパ腫を含むが、しかし、これらに限定しない。
【００７９】
一実施形態では、炎症関連癌は大腸炎関連癌である。大腸炎関連癌は、結腸直腸癌のサブタイプである。
【００８０】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体においてアレルギーを処置する方法に関し、前記方法は、リンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００８１】
本明細書中で使用するように、用語「アレルギー」は、一般的に、炎症により特徴付けられる不適当な免疫応答を指し、限定しないが、食物アレルギー、呼吸器アレルギー、及び全身応答（例として、例えばクインケ浮腫及びアナフィラキシーなど）を起こす、又は起こす可能性を伴う他のアレルギーを含む。この用語は、アレルギー、アレルギー性疾患、過敏性関連疾患、又は気道炎症に関連付けられる呼吸器疾患（例えば喘息又はアレルギー性鼻炎など）を包含する。一部の実施形態では、本発明の方法は、アナフィラキシー、薬物過敏症、皮膚アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、ドライアイ疾患、アレルギー性接触アレルギー、食物過敏症、アレルギー性結膜炎、昆虫毒アレルギー、気管支喘息、アレルギー性喘息、内因性喘息、職業性喘息、アトピー性喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）に関連する１つ以上の症状を防止、処置、又は軽減する際に有効である。本発明の方法により処置されうる過敏症関連疾患又は障害は、アナフィラキシー、薬物反応、皮膚アレルギー、湿疹、アレルギー性鼻炎、蕁麻疹、アトピー性皮膚炎、ドライアイ疾患［又は他に乾性角結膜炎（ＫＣＳ）として言及し、また、乾性角膜炎、眼球乾燥症と呼ぶ］、アレルギー性接触アレルギー、食物アレルギー、アレルギー性結膜炎、昆虫毒アレルギー、及び気道炎症に関連付けられる呼吸器疾患（例えば、ＩｇＥ介在性喘息及び非ＩｇＥ介在性喘息）を含むが、しかし、これらに限定しない。気道炎症に関連付けられる呼吸器疾患は、鼻炎、アレルギー性鼻炎、気管支喘息、アレルギー性（外因性）喘息、非アレルギー性（内因性）喘息、職業性喘息、アトピー性喘息、運動誘発性喘息、咳誘発性喘息、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、及び慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）を含みうるが、しかし、これらに限定しない。
【００８２】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体において外因的に投与される分子に対する免疫反応を処置する方法に関し、前記方法は、リンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００８３】
この種類の非限定的な例は、遺伝的欠損症の状況における補充治療に対する免疫反応を含み、それらは、血友病Ａ、血友病Ｂ、他の凝固因子（例えば第ＩＩ因子、プロトロンビン、及びフィブリノーゲンなど）の先天性欠損症、原発性免疫不全症（例、重度の複合免疫不全症、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症、ＩｇＡ欠損症）、原発性ホルモン欠損症（例えば成長ホルモン欠損症及びレプチン欠損症など）、先天性酵素異常症及び代謝障害、例えば炭水化物代謝の障害（例、ショ糖−イソマルターゼ欠損症、糖原病など）、アミノ酸代謝の障害（例、フェニルケトン尿症、メープルシロップ尿症、グルタル酸血症１型）、尿素回路障害（例、カルバモイルリン酸シンテターゼＩ欠損症）、有機酸代謝の障害（例、アルカプトン尿症、２−ヒドロキシグルタル酸尿症）、脂肪酸酸化及びミトコンドリア代謝の障害（例、中鎖アシル−補酵素Ａデヒドロゲナーゼ欠損症）、  ポルフィリン代謝の障害（例、ポルフィリン症）、プリン又はピリミジン代謝の障害（例、レッシュ・ナイハン症候群）、ステロイド代謝の障害（例、リポイド先天性副腎過形成症、先天性副腎過形成症）、ミトコンドリア機能の障害（例、カーンズ・セイヤー症候群）、ペルオキシソーム機能の障害（例、ツェルウェーガー症候群）、リソソーム蓄積症（例、ゴーシェ病、ニーマンピック病）を含むが、しかし、これらに限定しない。
【００８４】
本発明のさらなる目的は、それを必要とする被験体における移植組織又は移植細胞に対する免疫反応を処置する方法に関し、前記方法は、リンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団の治療有効量を被験体に投与することを含む。
【００８５】
本明細書中で使用するように、用語「移植」は、第１の生物（又はドナー）から得られ、第２の生物（又はレシピエント）中に移植することができる臓器及び／又は組織及び／又は細胞を指す。
【００８６】
典型的には、被験体は、心臓、腎臓、肺、肝臓、膵臓、膵島、脳組織、胃、大腸、小腸、角膜、皮膚、気管、骨、骨髄、筋肉、又は膀胱からなる群より選択される移植片を用いて移植されたであろう。本発明の方法はまた、レシピエント被験体によるドナー組織、細胞、移植片、又は臓器移植の拒絶に関連付けられる免疫応答を防止又は抑制するために特に適切である。移植片関連の疾患又は障害は、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（例えば骨髄移植に関連付けられる）、及び臓器、組織、又は細胞移植片の移植（例、組織又は細胞の同種移植片又は異種移植片）（例、皮膚、筋肉、神経、膵島、臓器、肝臓の実質細胞などの移植片などを含む）の拒絶からもたらされる又はそれに関連付けられる免疫障害を含む。このように、本発明の方法は、宿主対移植片病（ＨＶＧＤ）及び移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）を防止するために有用である。キメラ構築物を、移植の前、間、及び／又は後（例、移植の少なくとも１日前、移植の少なくとも１日後、及び／又は移植手順自体の間）に被験体に投与してもよい。一部の実施形態では、キメラ構築物を、移植の前及び／又は後に定期的に被験体に投与してもよい。
【００８７】
本明細書中で使用するように、用語「被験体」は、哺乳動物（例えばげっ歯類、ネコ、イヌ、及び霊長類など）を表示する。好ましくは、本発明に従った被験体はヒトである。
【００８８】
本明細書中で使用するように、「処置」又は「処置する」は、有益な又は所望の結果（臨床結果を含む）を得るためのアプローチである。本発明の目的のために、有益な又は所望の臨床結果は、以下の１つ以上を含むが、これらに限定しない：疾患に起因する１つ以上の症状を軽減させること、疾患の程度を減少させること、疾患を安定化させること（例、疾患の悪化を防止又は遅延させること）、疾患の拡大を防止又は遅延させること、疾患の再発を防止又は遅延させること、疾患の進行の遅延させる又は遅らせること、疾患状態を改善させること、疾患の寛解（部分的又は全体的）を提供すること、疾患を処置するために要求される１つ以上の他の医薬の用量を減少させること、疾患の進行を遅延させること、生活の質を増加させること、及び／又は生存期間を延長させること。用語「処置」は、予防的処置を包含する。本明細書中で使用するように、用語「防止する」は、所与の状態を獲得又は発生するリスクにおける低下を指す。
【００８９】
本明細書中で使用するように、用語「投与する」又は「投与」は、例えば、粘膜、皮内、静脈内、皮下、筋肉内送達及び／又は本明細書中に記載する、又は当技術分野において公知である物理的送達の任意の他の方法などにより、身体外に存在する物質を被験体中に注射する又は他に物理的に送達する行為を指す。疾患、又はその症状が処置されている場合、物質の投与は典型的には、疾患又はその症状の発症後に起こる。疾患又はその症状が防止されている場合、物質の投与は典型的には、疾患又はその症状の発症前に起こる。
【００９０】
「治療有効量」は、「改善された治療転帰」が結果としてもたらされるように、当業者により日常的に用いられている手順を使用して決定する。しかし、本発明の組成物の１日総使用量は、健全な医学的判断の範囲内で、主治医により決められうることが理解されるであろう。任意の特定の被験体についての具体的な治療有効用量レベルは、多様な因子（処置される障害及び障害の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物、被験体の年齢、体重、全体的な健康、性別、及び食事；用いられる具体的な化合物の投与の時間、投与の経路、及び排泄の速度；処置の期間；組み合わせにおいて使用される薬物；ならびに医療分野において周知である同様の因子を含む）に依存する。
【００９１】
本発明に従い、調節性Ｔ細胞の集団は、医薬組成物の形態において被験体に投与する。
【００９２】
したがって、本発明のさらなる目的は、リンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団、ならびに／あるいはリンホトキシンアルファを発現しない又は減少したレベルのリンホトキシンアルファを発現することにおいて、及び、自己抗原を認識／結合するキメラ抗原受容体を発現することにおいて特徴付けられる調節性Ｔ細胞の集団を含む医薬組成物に関する。
【００９３】
典型的には、Ｔｒｅｇの集団を、医薬的に許容可能な賦形剤、及び、場合により、徐放性マトリックス（例えば生分解性ポリマーなど）と組み合わせて、治療用組成物を形成してもよい。「医薬的に」又は「医薬的に許容可能な」は、哺乳動物、特にヒトに適宜投与された場合、有害反応、アレルギー反応、又は他の悪い反応を産生しない分子実体及び組成物を指す。医薬的に許容可能な担体又は賦形剤は、非毒性固体、半固体又は液体の充填剤、希釈剤、封入材料、又は任意の型の製剤補助剤を指す。経口、舌下、皮下、筋肉内、静脈内、経皮、局所、又は直腸投与用の本発明の医薬組成物において、有効成分は、単独又は別の有効成分との組み合わせで、単位投与形態において、  動物及びヒトへの従来の医薬担体との混合物として投与することができる。適切な単位投与形態は、経口経路形態、例えば錠剤、ゲルカプセル、粉末、顆粒及び経口懸濁液又は溶液、舌下及び頬側投与形態など、エアロゾル、インプラント、皮下、経皮、局所、腹腔内、筋肉内、静脈内、皮下、経皮、くも膜下腔内及び鼻腔内投与形態ならびに直腸投与形態などを含む。一実施形態では、本発明のＴｒｅｇ集団は、非経口経路により投与する。好ましい実施形態では、本発明のＴｒｅｇ集団は、静脈内経路により投与する。典型的には、医薬組成物は、注射することが可能な製剤用に医薬的に許容可能である溶剤を含む。これらは、特に等張、滅菌生理食塩水（リン酸一ナトリウム又はリン酸二ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、又は塩化マグネシウムなど、又はそのような塩の混合物）、又は、乾燥、特に凍結乾燥組成物（それによって、滅菌水又は生理食塩水の添加時に、場合に依存して、注射可能な溶液の構成が可能になる）でありうる。注射可能な使用のための適切な医薬形態は、滅菌水溶液又は分散液；ゴマ油、落花生油、又は水性プロピレングリコールを含む製剤；及び滅菌注射溶液又は分散液の即時調製用の滅菌粉末を含む。全ての場合において、形態は滅菌でなければならず、簡単な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造及び保存の条件下で安定でなければならず、微生物（例えば細菌及び真菌など）の混入作用に対して保護されなければならない。遊離塩基又は薬理学的に許容可能な塩としての本発明の溶液は、界面活性剤（例えばヒドロキシプロピルセルロースなど）と適切に混合された水中で調製することができる。分散液はまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、及びそれらの混合物中、ならびに油中で調製することができる。通常の保存及び使用の条件下では、これらの調製物は、微生物の成長を防止するための保存剤を含む。Ｔｒｅｇの集団は、中性又は塩の形態で組成物中に製剤化することができる。医薬的に許容可能な塩は、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含み、それらは、無機酸、例えば塩酸又はリン酸など、あるいは酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸などの有機酸と形成される。遊離カルボキシル基と形成される塩はまた、無機塩基、例えば、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、又は水酸化第二鉄など、及びイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒス���ジン、プロカインなどの有機塩基から由来しうる。担体はまた、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、及び植物油を含む溶媒又は分散媒でありうる。適した流動性は、例えば、コーティング（例えばレシチンなど）の使用により、分散液の場合においては要求される粒子サイズの維持により、及び界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合では、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含めることが好ましいであろう。注射用組成物の長時間吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンなど）の組成物中での使用によりもたらすことができる。滅菌注射溶液は、要求される量の活性化合物を、適当な溶媒中に、必要に応じて、上に列挙する他の成分のいくつかとともに組み入れること、それに続く濾過滅菌により調製する。一般的に、分散液は、種々の滅菌された活性成分を、基礎分散媒、及び上に列挙したものからの、要求される他の成分を含む滅菌溶剤中に組み入れることにより調製する。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合では、典型的な調製方法は、活性成分と任意の追加の所望の成分の粉末を、以前に滅菌濾過されたその溶液からもたらす真空乾燥技術及び凍結乾燥技術である。直接注射用のより又は高度に濃縮された溶液の調製も熟慮されており、そこでは、溶媒としてのＤＭＳＯの使用によって、極度に迅速な浸透がもたらされ、高濃度の活性薬剤が小さな腫瘍領域に送達されると想定される。製剤化時、溶液を、投与製剤と適合する様式において、及び治療的に有効であるような量で投与する。製剤は、多様な剤形（例えば上に記載する注射可能な溶液の型など）で簡単に投与されるが、しかし、薬物放出カプセルなども用いることができる。水溶液中での非経口投与のために、例えば、溶液を、必要な場合、適切に緩衝化し、液体希釈剤を最初に、十分な生理食塩水又はグルコースを用いて等張にする。これらの特定の水溶液は、静脈内、筋肉内、皮下、及び腹腔内投与のために特に適切である。これに関連して、用いることができる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に公知であろう。投与量における一部の変動が、処置されている被験体の状態に依存して必然的に生じるであろう。投与について責任のある人が、任意の事象において、個々の被験体について適当な用量を決定するであろう。
【００９４】
本発明を、以下の図面及び実施例によりさらに例証する。しかし、これらの実施例及び図面は、本発明の範囲を限定するとして、任意の方法で解釈すべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００９５】
【図１】ＬＴα−／−マウスからの胸腺Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇは高度に抑制的な特徴を示す。（Ａ）Ｌｔα及びＬｔβの発現を、成体Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰレポーターマウスからの精製されたＦｏｘｐ３−ＧＦＰ−従来型ＣＤ４＋ＳＰ胸腺細胞及びＦｏｘｐ３−ＧＦＰ＋ＣＤ４＋ＣＤ８−ＴｒｅｇにおけるｑＰＣＲにより測定した（ｎ＝３実験）。（Ｂ）ＷＴ胸腺からの従来型Ｆｏｘｐ３−ＣＤ４＋ＳＰ細胞及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞における細胞表面ＬＴα１β２ヘテロ三量体（可溶性ＬＴβＲ−Ｆｃタンパク質を用いた染色により検出）の発現を示す代表的なヒストグラム（ｎ＝６）。データは、２つの独立した実験からプールする（ｎ＝３〜４匹のマウス／群）。（Ｃ）ＷＴマウスの脾臓から由来するＦｏｘｐ３＋  ｎＴｒｅｇ（ｎ＝２０）、Ｆｏｘｐ３＋  ｎＴｒｅｇ（抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体を用いたＯ／Ｎ刺激）（ｎ＝５）、Ｆｏｘｐ３＋  ｉＴｒｅｇ（ｎ＝６）、及びＣＤ８＋ＣＤ２８ｌｏＴｒｅｇ（ｎ＝６）における細胞表面ＬＴα１β２ヘテロ三量体（可溶性ＬＴβＲ−Ｆｃタンパク質を用いた染色により検出）の発現を示す代表的なヒストグラム。（Ｄ）ＩＬ１０、Ｅｂｉ３、Ｔｇｆｂ１、Ｉｆｎｇ、Ｇｚｍｂ、及びＦａｓｌ  ｍＲＮＡの発現レベルを、ＷＴ（ｎ＝３〜６）及びＬＴα−／−（ｎ＝３〜６）の成体及び生後１０日目マウスから精製したＣＤ４＋ＣＤ２５＋胸腺ＴｒｅｇにおけるｑＰＣＲにより測定した。データは、２つの独立した実験から由来する（ｎ＝３〜４匹のマウス／群）。
【図２】末梢ＬＴα−／−Ｔｒｅｇはエフェクター表現型を提示する。Ｔｒｅｇの極性化及びエフェクター機能に関連付けられることが公知であるいくつかの遺伝子の発現レベルを、精製ＷＴ及びＬＴα−／−脾臓ＴｒｅｇにおけるｑＰＣＲにより測定した（ｎ＝３匹のマウス／群）。
【図３】ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入は、ＤＳＳ誘発性大腸炎の重症度から保護する。（Ａ）ＷＴマウス及びＬＴα−／−マウスからの精製された脾臓ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋細胞におけるＦｏｘｐ３発現の代表的なフローサイトメトリープロファイル。（Ｂ）実験設定：大腸炎を、７日間にわたる飲料水中の２%ＤＳＳ、それに続く１１日目までの水だけの投与により、２日前に２×１０５個のＷＴ又はＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて注射したＷＴマウスにおいて誘発した。結腸炎症及び腸間膜リンパ節におけるＣＤ４＋Ｔ細胞プライミングを、プロトコールの１１日目及び４日目にそれぞれ分析した。（Ｃ）２×１０５個のＷＴ又はＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて注射したＷＴマウスの０日目での初期体重と比べた体重減少。データは、４匹のマウス／群を用いた３つの独立した実験から由来する。（Ｄ）疾患活動性指数（ＤＡＩ）を、ＤＳＳ誘発性大腸炎の経過の間にモニターした。（Ｅ）ヒストグラムは、両方の群のマウスにおける結腸の組織学的スコアを示す。（Ｆ）炎症誘発性サイトカイン（Ｉｌ６、Ｉｆｎｇ、Ｔｎｆａ、Ｉｌ１７ａ、Ｉｌ１ａ、及びＩｌ３３）及びケモカイン（Ｃｃｌ２及びＣｘｃｌ１２）の発現レベルを、プロトコールの終了時にＷＴ（ｎ＝４）又はＬＴα−／−（ｎ＝４）Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスの結腸組織においてｑＰＣＲにより測定した。（Ｇ）両群の結腸において観察されたＬｙ６Ｇ＋好中球、Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋マクロファージ、ＣＤ１１ｂ＋  ＣＤ１１ｃ＋及びＣＤ８α＋ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞（ＤＣ）、ＣＤ１９＋Ｂ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞の数。データは、４匹のマウス／群を用いた２つの独立した実験から由来する。（Ｈ）フローサイトメトリープロファイルならびにＴｈ１（ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋）及びＴｈ１７（ＣＤ４＋ＩＬ−１７Ａ＋）結腸浸潤Ｔ細胞の数。データは、４匹のマウス／群を用いた３つの独立した実験から由来する。（Ｉ）Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１及びＴｒｅｇ／Ｔｈ１７の比率。（Ｊ）２．１０５個のＷＴ又は１．１０５もしくは０．５．１０５個のＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて注射したＷＴマウスの０日目の初期体重と比べた体重減少。データは、４匹のマウス／群を用いた２〜３回の独立した実験から由来する。
【図４】ＩＢＤからのＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入。（Ａ）実験設定：Ｒａｇ２−／−レシピエントマウスを、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを枯渇させたＣＤ４５．１  ＷＴ脾細胞を用いて養子移入した。３週間後、マウスがＩＢＤの徴候を発生した場合、マウスに、２×１０５個のＷＴ又はＬＴα−／−ＣＤ４５．２のいずれかのＴｒｅｇを用いて注射した。体重を３週間の間にモニターした。（Ｂ）ＷＴ又はＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて注射した、又は未処置のマウスの０日目での初期体重と比べた体重減少。（Ｃ）ヒストグラムは、プロトコールの終了時に観察された結腸の長さ及び結腸の重量／長さの比率を示す。（Ｄ）全結腸浸潤Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇのフローサイトメトリープロファイル及び数。（Ｅ）ＣＤ４５．２起源の結腸浸潤Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇのフローサイトメトリープロファイル及び数。（Ｆ）ＣＤ４５．１起源のＴｈ１（ＣＤ４＋ＩＦＮ−γ＋）及びＴｈ１７（ＣＤ４＋ＩＬ−１７Ａ＋）結腸浸潤細胞の代表的なフローサイトメトリープロファイル及び数。（Ｇ）結腸におけるＴｒｅｇ／Ｔｈ１及びＴｒｅｇ／Ｔｈ１７の比率。
【図５】結腸慢性炎症の間のＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入は、ＡＯＭ−ＤＳＳモデルにおけるＣＡＣの発生を抑制する。（Ａ）実験設定：ＣＤ４５．１  ＷＴマウスにＡＯＭ（腫瘍形成を開始する）を用いて注射し、それに続く飲料水中での３サイクルのＤＳＳによって、慢性大腸炎（結腸直腸腫瘍の発生を促進する）を誘発した。ＣＤ４５．２  ＷＴ又はＬＴα−／−のいずれかのマウスから精製された２×１０５個の脾臓ＣＤ４＋  ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを、最初の２サイクルのＤＳＳの前に、これらのマウスにおいて養子移入した。結腸を、ＡＯＭ注射後３、６、及び１２週目に収集した。（Ｂ−Ｃ）ヒストグラムは、プロトコールの６及び１２週間目での結腸当たりの腫瘍の総数（Ｂ）及びそれらの容積（Ｃ）を示す。（Ｄ）ヒストグラムは、３、６、及び１２週目での結腸の重量／長さの比率を示す。（Ｅ）炎症誘発性サイトカインの発現レベルを、３及び６週間目にＷＴ（ｎ＝４）又はＬＴα−／−（ｎ＝４）Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスからの非腫瘍性結腸組織におけるｑＰＣＲにより測定した。（Ｆ）ヒストグラムは、３週間目での全結腸浸潤細胞の数を示す。（Ｇ、Ｈ）両方の群のマウスの結腸におけるＬｙ６Ｇ＋好中球、Ｆ４／８０＋ＣＤ１１ｂ＋及びＦ４／８０＋ＣＤ１１ｂ−マクロファージ、ＣＤ１１ｂ＋ＣＤ１１ｃ＋及びＣＤ１１ｂ−ＣＤ１１ｃ＋ＤＣ、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ１、Ｔｈ１７、及びＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの頻度及び数。データは、３〜４匹のマウス／群を用いた２つの独立した実験から由来する。
【図６】Ｌｔａ−／−Ｔｒｅｇの養子移入によって、多臓器自己免疫の重症度が減弱する。（Ａ）実験設定：Ｒａｇ２−／−レシピエントマウスには、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ枯渇ＣＤ４５．１  ＷＴ脾細胞を用いて養子移入した。４週間後、マウスの体重が減り始めた際、マウスには、２×１０５個のＷＴ又はＬｔａ−／−ＣＤ４５．２のいずれかのＴｒｅｇを用いて注射した。Ｔｒｅｇ養子移入の３週間後、マウスを屠殺し、末梢組織を免疫浸潤について調べた。プロトコールの開始時にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ枯渇ＣＤ４５．１  ＷＴ脾細胞及びＣＤ４５．２  ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて同時注射したＲａｇ２−／−レシピエントを対照として使用した。（Ｂ）対照、又はＷＴもしくはＬｔａ−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスの０日目での初期体重と比べた体重減少。（Ｃ）対照において観察された浸潤に対して標準化された、ＣＤ４５．１ドナー細胞による臓器浸潤レベルを表す図表。各々の図表は、１匹の個々のマウスを表す。
【図７】Ｔｒｅｇ細胞の抑制的な特徴は、ＬＴα１β２／ＬＴβＲ軸により制御される。（Ａ）実験設定：致死的に照射されたＷＴ  ＣＤ４５．１ｘＣＤ４５．２レシピエントマウスは、ＷＴ  ＣＤ４５．１＋ＷＴ  ＣＤ４５．２又はＷＴ  ＣＤ４５．１  ＋ＬＴα−／−ＣＤ４５．２からの混合ＢＭ細胞（比率５０：５０）を用いて再構成された。６週間後、それぞれＷＴ群及びＬＴα−／−ドナー群からのＣＤ４５．２  ＷＴ及びＣＤ４５．２ＬＴα−／−を細胞選別し、Ｔｒｅｇ抑制機能に関連付けられるいくつかの遺伝子について分析した。（Ｂ）ＣＤ４５．２起源の脾臓ＣＤ４＋Ｔ細胞を、フローサイトメトリーにより、両方の群におけるＦｏｘｐ３の発現について分析した。ヒストグラムは、ＣＤ４５．２  ＷＴ及びＬＴα−／−ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの頻度及び数を示す。（Ｃ）Ｉｌ１０、Ｅｂｉ３、Ｔｇｆ−β１、Ｉｆｎ−γ、Ｇｚｍｂ、Ｆａｓｌ、及びＩｌ１７ａ  ｍＲＮＡの発現レベルを、ドナー群からの精製ＣＤ４５．２  ＷＴ及びＬＴα−／−ＴｒｅｇにおいてｑＰＣＲにより測定した。（Ｄ）可溶性ＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質と共に、又は可溶性ＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質無しでプレインキュベートした、及び２４時間の間に精製ＣＤ１１ｃ＋ＤＣと共培養した精製ＷＴ  Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇを、Ｋｌｒｇ１、Ｉｌ１０、Ｅｂｉ３、Ｔｇｆｂ１、Ｇｚｍｂ、Ｆａｓｌ、及びＩｌ１７ａの発現レベルについてｑＰＣＲにより分析した。
【図８】ＬＴα発現は、末梢血液から由来するヒトＴｒｅｇにおいて保存されている。可溶性ＬＴβＲ−Ｆｃ受容体を用いた染色により検出された（Ａ）細胞内ＬＴαタンパク質及び（Ｂ）細胞表面ＬＴα１β２ヘテロ三量体の発現を、男性及び女性患者の末梢血液から由来するＣＤ４＋ＣＤ２５−ＣＤ１２７ｌｏＴｒｅｇにおけるフローサイトメトリーにより分析した。
【実施例】
【００９６】
材料及び方法
マウス
全てのマウス−ＣＤ４５．１  ＷＴ、ＣＤ４５．１ｘＣＤ４５．２  ＷＴ、ＣＤ４５．２  ＷＴ、ＣＤ４５．２ＬＴα−／−、Ｒａｇ２−／−、及びＦｏｘｐ３−ＧＦＰレポーターマウス−を、純粋なＣ５７ＢＬ／６バックグラウンドで、  ＣＩＭＬ（フランス）での特定の無病原体条件下で維持した。標準的な食物及び水を自由に与えた。雄及び雌を生後１０日目又は６〜１２週齢で使用した。キメラを６〜８週齢で生成した。動物を含む全ての手順を、施設の及び倫理的なガイドラインに従って実施してきた。
【００９７】
健常ボランティアの採血及びＰＢＭＣ分離
血液を、Etablissement Francaisdu Sang（フランス、ナンテス）で健常な個人から収集した。書面によるインフォームドコンセントを、施設のガイドラインに従って提供した。ＰＢＭＣを、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（Eurobio、フランス、コートアボフ）により単離した。残りの赤血球及び血小板を、低張溶液及び遠心分離を用いて除いた。
【００９８】
ＢＭキメラ
ＢＭ移植の前に、マウスに、Ｃｓ−１３７γ放射線源（５００ラドの２線量）を用いて致死的に照射し、２４時間後にＣＤ４５．１  ＷＴドナーからの１０７個のＢＭ細胞をＣＤ４５．２ドナー（ＷＴ又はＬＴα−／−のいずれかのマウス）と比率５０：５０で移植した。Ｔ細胞再構成を、フローサイトメトリーにより血球を分析することにより評価した。マウスを、再構成の６週間後に分析した。
【００９９】
Ｔｒｅｇ細胞単離
胸腺及び脾臓のＴｒｅｇ細胞を、７０μmのメッシュを通して胸腺及び脾臓を引っ掻くことにより分離した。脾臓赤血球を、溶解緩衝液（eBioscience）を用いて溶解させた。細胞選別の前に、ＣＤ４＋Ｔ細胞を、抗ビオチンマイクロビーズを伴う抗ＣＤ８α（クローン５３．６．７）及び抗ＣＤ１９（クローン１Ｄ３）ビオチン化抗体を使用し、ＡｕｔｏＭＡＣＳ（Miltenyi Biotech）により、枯渇プログラムを介して、ＣＤ８＋及びＣＤ１９＋細胞の枯渇により事前に濃縮した。ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを、FACSAriaIII細胞選別機（ＢＤ）を使用して選別した。
【０１００】
インビボでのＬＴα−／−Ｔｒｅｇの安定性
ＣＤ４５．１  ＷＴ及びＣＤ４５．２ＬＴα−／−マウスから精製された２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇを、致死量以下に照射されたＣＤ４５．１ｘＣＤ４５．２  ＷＴレシピエントマウス中に静脈内に養子移入した（比率５０：５０）。移入の７日後、ＣＤ４５．１  ＷＴ及びＣＤ４５．２ＬＴα−／−ＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇを、FACSAriaIII細胞選別機（ＢＤ）を用いて精製した。
【０１０１】
ＲＮＡ−ｓｅｑ実験
ＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇを、ＷＴ及びＬＴα−／−マウスから細胞選別した。２つの生物学的複製物を各々の条件について調製した。全ＲＮＡ  を、RNeasy Micro Kit（Qiagen）を使用して抽出し、ＤＮａｓｅ  Ｉを用いて処理した。ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーを、TruSeq Stranded mRNAキット（Illumina）を使用して調製し、Illumina HiSeq 2000装置を用いて配列決定し、シングルエンド５０bp読み取りデータのデータセットを生成した  。読み取りデータを、ＴｏｐＨａｔ２（バージョン２．０．１２）を使用してマウス参照ゲノム（ｍｍ１０）にマッピングし、次にＣｕｆｆｌｉｎｋｓ又はＣｕｆｆｄｉｆｆ（バージョン２．２．１）及びｍｍ１０ゲノムＧＴＦ遺伝子注釈ファイル（ｈｔｔｐｓ：／／ｓｕｐｐｏｒｔ．ｉｌｌｕｍｉｎａ．ｃｏｍ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ／ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ＿ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｉｇｅｎｏｍｅ．ｈｔｍｌ）を使用してカウントした。読み取りデータのカウントに加えて、Ｃｕｆｆｄｉｆｆによってサンプル間の標準化を実施し、ＬＴα−／−対ＷＴ  Ｔｒｅｇにおける差次的遺伝子発現及びその統計的有意性を算出するために使用した。Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓにより生成された発現レベルは、１００万のマッピングされた読み取りデータ（ＦＰＫＭ）当たりの転写物のキロベース当たりの断片として、Matrix2pngプログラムにより処理し、サンプルにわたり平均値０及び分散１に標準化された遺伝子発現レベルのヒートマップを生成した。ＬＴα−／−及びＷＴ  Ｔｒｅｇの間のトランスクリプトームの差を説明する生物学的過程の同定は、ＧＳＥＡを用いて、Gene Ontology（ＧＯ）生物学的過程（ｃ５．ｂｐ．ｖ５．１）を定義するすべての遺伝子組の発現における濃縮を算出する際、及び最も濃縮された過程を選択する際に実施した。多数の並べ替え（１０，０００）及び「古典的」スコアリングスキームを使用し、遺伝子組の濃縮のレベル又は標準化濃縮スコア（ＮＥＳ）を計算した。ゼロ発現値を分析から除去した。有意性（Ｐ値＜０．０５及びＦＤＲ＜０．２５）に達するＮＥＳを伴うＧＯ生物学的過程を選択した。異なるＧＯ過程を、ある程度の遺伝子重複を共有する遺伝子組により定義することができうるため、それらの遺伝子組の類似性に依存したＧＳＥＡの選択過程及びそれらの関連性を表すネットワークを、Cytoscapeを用いて行った。関連するＧＯ過程の群を、０．７を超える「重複係数」を選ぶEnrichmentMapを使用して決定した。クラスター分析を、ClusterMaker及び実行された「ＭＣＬクラスター」方法を使用して実施した。濃縮及び関連ＧＯ生物学的過程の各々のクラスターについて、最も有意な濃縮を伴う過程を選択し、そのＮＥＳを考慮した。
【０１０２】
ＤＳＳ誘発性大腸炎実験
大腸炎の誘発の２日前に、ＷＴレシピエントマウスに、ＷＴ又はＬＴα−／−マウスから選別した２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇ、あるいは代わりに１．１０５個の脾臓ＬＴα−／−Ｔｒｅｇ（言及している場合）を用いて静脈内注射した。大腸炎の誘発を、７日間にわたる飲料水中の２%ＤＳＳ（Alfa Aesar）、それに続き、１１日目に屠殺するまでは水だけを与えることにより評価した。体重、直腸出血、及び便の粘稠度をＤＳＳ投与後に毎日モニターし、ＤＡＩを決定するために使用した。
【０１０３】
ＩＢＤ実験
Ｒａｇ２−／−レシピエントマウスに、ＣＤ５５．１  ＷＴマウスから精製された５．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ枯渇ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を用いて静脈内注射した。３〜４週間後、ＣＤ４５．２  ＷＴ又はＬＴα−／−マウスから選別した２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇを静脈内注射した。体重を、ＩＢＤの経過の間に週１回モニターした。
【０１０４】
大腸炎関連癌（ＣＡＣ）実験
ＷＴ  ＣＤ４５．１レシピエントマウスに、アゾキシメタン（ＡＯＭ、１２．５mg/kg、Sigma）を腹腔内注射した。５日後、２．５%ＤＳＳ（Alfa Aesar）を５日間にわたって飲料水中で、それに続いて１６日間の水道水を与えた。このサイクルを２回繰り返した（５日間の２．５%ＤＳＳ及び４日間の２%ＤＳＳ）。２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓ＷＴ  Ｔｒｅｇ又はＬＴα−／−を、最初の２サイクルのＤＳＳの前にこれらのマウスにおいて静脈内注射した。結腸を、ＡＯＭ投与後の３、６、１２週目に収集した。
【０１０５】
多臓器自己免疫実験
Ｒａｇ２−／−レシピエントマウスに、ＣＤ４５．１  ＷＴマウスから精製された３．１０６個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ枯渇脾細胞を用いて静脈内注射した。４週間後、ＣＤ４５．２  ＷＴ又はＬｔａ−／−マウスからの２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇを静脈内に養子移入した。対照は、プロトコールの開始時に、ＣＤ４５．２  ＷＴマウスからの２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋脾臓Ｔｒｅｇ及びＣＤ４５．１  ＷＴマウスからの３．１０６個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ枯渇脾細胞を同時に受けた。体重を、プロトコールの経過の間に週１回モニターした。
【０１０６】
結腸組織からの固有層単核細胞の単離
結腸を０．５cmの小片に切断し、２%ＦＣＳを伴うＨＢＳＳ中で洗浄し、次にＨＢＳＳ  ２mM  ＥＤＴＡ中で、３７℃で回転下において２回インキュベートした（１５分間、次に３０分間）。小片を７０μm細胞濾過器で濾過し、１mg/mlコラゲナーゼＶＩＩＩ（Sigma）を伴う培養培地（ＲＰＭＩ培地中の１０%ＦＣＳ、１%ペニシリン−ストレプトマイシン、及び１．５%ＨＥＰＥＳ）中で、３７℃で回転下において４５分間の間インキュベートした。細胞を濾過し、４０／１００%Percoll（Sigma）勾配を用いた２０分間にわたる２１００rpmで室温での遠心分離により単離した。
【０１０７】
インビトロ共培養アッセイ、Ｔｒｅｇ活性化、及びｉＴｒｅｇ生成
共培養アッセイについては、２．１０３個の細胞選別された全ＣＤ１１ｃｈｉ  ＤＣ、ＣＤ１１ｃｈｉＰＤＣＡ−１ｌｏ、Ｓｉｒｐα＋  ＣＤ１１ｃｈｉ  ＰＤＣＡ−１ｌｏ、又はＣＤ１１ｃｉｎｔ  ＰＤＣＡ−１ｈｉを、３７℃で２４時間の間、可溶性ＬＴβＲ−Ｆｃ組換えタンパク質（２μg/ml；Ｒ＆Ｄシステム）を用いて１時間の間プレインキュベートした又はしていない１０４個の精製ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇと共培養した。Ｔｒｅｇ活性化については、５．１０４個の細胞選別されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを、ＩＬ−２（２００U/ml、Immunotools）及びＴＧＦ−β（０．２ng/ml、eBioscience）の存在における可溶性抗ＣＤ２８（１μg/ml；クローン３７．５１）を含む培養培地中で、抗ＣＤ３ε抗体（５μg/ml；クローン２Ｃ１１）を用いて以前にコーティングされたプラスチックバウンド（plastic bound）上で培養した。ｉＴｒｅｇは、精製ＣＤ４＋ＣＤ２５−細胞を、ＩＬ−２（２００U/ml、Immunotools）及びＴＧＦ−β（２０ng/ml、eBioscience）の存在における可溶性抗ＣＤ２８（１μg/ml；クローン３７．５１）を含む培地中で４日間にわたり、抗ＣＤ３ε抗体（５μg/ml；クローン２Ｃ１１）を用いて以前にコーティングされたプラスチックバウンド上で培養することによりインビトロで生成した。
【０１０８】
フローサイトメトリー
抗ＣＤ４（ＲＭ４．５）抗体、抗ＣＤ８α（５３．６．７）抗体、抗ＣＤ４５．１（Ａ２０）抗体、抗ＣＤ４５．２（１０４）抗体、抗ＣＤ４４（ＩＭ７）抗体、抗ＣＤ２５（ＰＣ６１）抗体、抗ＣＤ１１ｂ（Ｍ１／７０）抗体、抗ＣＤ１９（１Ｄ３）抗体、抗ＣＤ６２Ｌ（ＭＥＬ−１４）抗体、及びＩＦＮ−γ（ＸＭＧ１．２）抗体はＢＤからであった。抗ＣＤ６９（Ｈ１．２Ｆ３）抗体、抗ＣＣＲ７（４Ｂ１２）抗体、抗Ｑａ−２（６９５Ｈ１−９−９）抗体、抗ＩＬ−１０（ＪＥＳ５−１６Ｅ３）抗体、抗Ｆ４／８０（６Ｆ１２）抗体、抗ＣＤ１１ｃ（Ｎ４１８）抗体、抗ＩＬ−１７Ａ（ＴＣ１１−１８Ｈ１０．１）抗体、及び抗ＣＣＲ６（２９−２Ｌ１７）抗体はBioLegendからであった、抗Ｌｙ６Ｇ（ＲＢ６−８Ｃ５）、抗ＫＬＲＧ１（２Ｆ１）、抗Ｋｉ−６７（ＳｏｌＡ１５）、及び抗Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ−１６ｓ）はeBioscienceからであった。抗Ｓ１ｐ１（７１３４１２）はRnD Systemsからであった。Ｆｏｘｐ３、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１７Ａ、及びＫｉ−６７の細胞内染色については、細胞を固定し、透過処理し、製造者の指示（eBioscience）に従ってＦｏｘｐ３染色キットを用いて染色した。サイトカインの検出については、細胞を、ブレフェルジンＡ（５μg/ml；ＢＤ）の存在において、ホルボール１２−ミリスチン酸１３−アセテート（ＰＭＡ；１０ng/mL；Sigma）及びイオノマイシン（１μg/ml；  Sigma）を用いて、３７℃で３時間にわたり刺激した。ＬＴβＲ−Ｆｃを用いた染色については、細胞を、１μg/１０６個細胞でＬＴβＲ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄシステム）を用いて、氷上で４５分間にわたりインキュベートした。ＬＴβＲ−Ｆｃ染色を、Alexa Fluor 488結合ロバ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２フラグメント（Jackson ImmunoResearch）を使用して視覚化した。ヒトの抗ＣＤ４（ＯＫＴ４）抗体、抗ＣＤ２５（ＢＣ９６）抗体、抗ＣＤ１２７（Ａ０１９Ｄ５）抗体をBioLegendから購入した。染色細胞を、FACSCanto II（ＢＤ）を用いて分析し、データを、FlowJoソフトウェアを使用して分析した。
【０１０９】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ
全ＲＮＡを、TRIzol（Invitrogen）を用いて単離し、ｃＤＮＡを、ランダムオリゴｄＴプライマー及びSuperscript II逆転写酵素（Invitrogen）を用いて合成した。ｑＰＣＲを、SYBR Premix Ex Taqマスターミックス（Takara）を用いて、ABI 7500高速リアルタイムＰＣＲシステム（Applied Biosystem）で実施した。結果をアクチンｍＲＮＡに対して標準化した。
【０１１０】
免疫蛍光染色
胸腺切片上での免疫蛍光染色は、Alexa Fluor 488結合抗Ｆｏｘｐ３（ＦＪＫ−１６ｓ；eBioscience）及び抗Ｋ１４（ＡＦ６４、Covance Research）を使用することにより以前に記載されたように実施し、Ｃｙ３結合抗ウサギ（Invitrogen）を用いて明らかにした。切片を、１μg/ml  ＤＡＰＩを用いて対比染色し、Mowiol（Calbiochem）を用いて乗せた。画像を、LSM 780 Leica SP5X共焦点顕微鏡を用いて取得し、ImageJソフトウェアを用いて定量化した。
【０１１１】
統計分析
統計的有意性を、対応のないスチューデントのｔ検定又はマンホイットニー検定を使用し、GraphPad Prism 6ソフトウェアを用いて評価した。ボンフェローニ補正による二元配置Ａｎｏｖａ検定を、腫瘍成長、体重の減少、及びＤＡＩの分析のために使用された（＊、Ｐ＜０．０５；＊＊、Ｐ＜０．０１；＊＊＊、Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊、Ｐ＜０．０００１）。データの正規分布を、ダゴスティーノ・パーソンオムニバス正規性検定を使用して評価した。エラーバーは平均±ＳＥＭを表す。
【０１１２】
結果
発生中のＬＴα−／−Ｔｒｅｇは、胸腺におけるそれらの出現から高度に抑制的な細胞の特徴を提示する。
【０１１３】
本発明者らは、ＬＴαが、胸腺において、単一陽性の胸腺細胞、特にＣＤ４＋胸腺細胞における正の選択時に、髄質胸腺上皮細胞との高親和性相互作用により上方調節されることを以前に報告している。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞は、胸腺間質細胞との高親和性ＴＣＲ相互作用により選択されるため、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３−ＧＦＰレポーターマウスの胸腺からの精製ＴｒｅｇにおけるＬＴαｍＲＮＡの発現レベルを分析した。際だったことに、本発明者らは、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが従来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞よりも〜５倍より多くのＬＴαｍＲＮＡを発現することを見出した（図１Ａ）。ＬＴαと同様に、ＬＴβｍＲＮＡも、従来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞と比較し、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇにおいて過剰発現していた。可溶性ＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質を用いた染色によって、ＬＴαタンパク質が、ＬＴαＲ受容体だけに結合する膜アンカー型ＬＴα１β２ヘテロ複合体（図１Ｂ）として、従来のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３−Ｔ細胞中よりもＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ中で大幅に発現されることが明らかになった。天然Ｔｒｅｇ細胞の発生は、Ｆｏｘｐ３−ＣＤ２５＋及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５−細胞前駆体からのＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇの発生に導く多段階過程である。興味深いことに、ＬＴβＲ−Ｆｃ染色は、Ｆｏｘｐ３−ＣＤ２５＋前駆体中よりもＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５−前駆体及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋成熟Ｔｒｅｇ細胞中で大幅に高く、ＬＴα１β２発現がＦｏｘｐ３の発現と相関していることを示す（データは示さず）。ＬＴα１β２発現は、脾臓から由来する天然Ｔｒｅｇにおいて保存されていた（図１Ｃ）。この発現は、抗ＣＤ３ε／ＣＤ２８抗体を用いた活性化Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇにおいて増加した。本発明者らは、ＬＴα１β２が、調節特性が付与された他のＴ細胞サブセット、例えば誘導性Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（ｉＴｒｅｇ）及びＣＤ８＋ＣＤ２８ｌｏＴｒｅｇなどにおいて発現されたか否かをさらに調べた。ＣＤ８＋ＣＤ２８ｌｏＴｒｅｇとは対照的に、本発明者らは、ＬＴα１β２ヘテロ複合体がＦｏｘｐ３＋ｉＴｒｅｇにおいて高度に発現されていることを見出した（図１Ｂ）。これらのデータは、高レベルのＬＴα１β２が転写因子Ｆｏｘｐ３を発現するＴｒｅｇ細胞系統に制限されていること、及びこの発現がＴＣＲ活性化時に大幅に増加することを示す。従来のＣＤ４＋Ｔ細胞と比較したＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇにおけるこの優先的な発現は、ＬＴαがＴｒｅｇ抑制活性に含まれていたであろうことを示唆する。本発明者らは、このように、ＬＴα−／−マウスから由来するＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの発生及び機能特性を分析した。
【０１１４】
本発明者らは、ＬＴα−／−マウスが、それらの胸腺において通常の頻度及び数のＦｏｘｐ３−ＣＤ２５＋及びＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５−前駆体ならびにＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋成熟Ｔｒｅｇを示すことを観察した（データは示さず）。さらに、それらのＷＴ対応物と同様に、ＬＴα−／−マウスからのＦｏｘｐ３＋ＣＤ２５＋胸腺Ｔｒｅｇは、単一陽性の胸腺細胞の皮質−髄質遊走に含まれる同等レベルのケモカイン受容体ＣＣＲ７を提示し、このように、正常密度で髄質中に優先的に位置した（データは示さず）。Ｑａ−２−Ｆｏｘｐ３＋の新たに生成されたＴｒｅｇと比較し、ＬＴα−／−マウスからのＱａ−２＋Ｆｏｘｐ３＋成熟Ｔｒｅｇもスフィンゴ脂質受容体Ｓ１Ｐ１の発現を上方調節し（データは示さず）、胸腺からのＴ細胞放出に関与し、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが通常、末梢に輸送されることを示唆する。この観察に従って、正常な頻度及び数の胸腺から移行したばかりのＴｒｅｇ細胞が、ＬＴα−／−マウスの血液及び脾臓中で観察された（データは示さず）。
【０１１５】
本発明者らは次に、ｑＰＣＲによりＴｒｅｇ細胞機能に関連付けられるいくつかの遺伝子の発現レベルを検討した。成体マウスでは、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ３９、ＣＤ７３、及びＬＡＧ−３  ｍＲＮＡが正常な発現レベルを示したが（データは示さず）、対照的に、胸腺のＬＴα−／−Ｔｒｅｇは、それらのＷＴ対応物と比較し、より高いレベルのＩＬ−１０、Ｅｂｉ３、ＴＧＦ−β１、ＩＦＮ−γ、グランザイムｂ（Ｇｚｍｂ）、及びＦａｓＬ  ｍＲＮＡを発現した（図１Ｄ）。本発明者らは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの高度に抑制的な特徴が、Ｔｒｅｇ細胞の出現から獲得されうると仮定した。このことを検証し、成体胸腺中へのＴｒｅｇ再循環に起因する潜在的な末梢効果を除外するために、本発明者らは、胸腺におけるＴｒｅｇの初期出現に対応する周産期の間にＬＴα−／−Ｔｒｅｇを分析した。成体Ｔｒｅｇと同様に、本発明者らは、Ｔｒｅｇ抑制機能に関連付けられるいくつかの遺伝子（例えばＩＬ−１０、Ｅｂｉ３、ＩＦＮ−γ、及びＦａｓＬなど）のレベルがＬＴα−／−周産期Ｔｒｅｇにおいて増加することを見出した（図１Ｄ）。この高度に免疫抑制的な特徴が再循環Ｔｒｅｇに関連付けられうることを決定的に除外するために、発生中Ｔｒｅｇを再循環中Ｔｒｅｇから区別するケモカイン受容体ＣＣＲ６の発現を分析した。正常な頻度及び数のＣＣＲ６−発生中及びＣＣＲ６＋再循環中ＴｒｅｇがＬＴα−／−マウスにおいて観察され（データは示さず）、これらのマウスがＴｒｅｇ再循環における欠損を示さないことを示す。さらに、Ｔｒｅｇ細胞機能に関連付けられるいくつかの遺伝子の発現が、精製ＣＣＲ６−発生中及びＣＣＲ６＋再循環中ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの両方において、それらのそれぞれのＷＴ対応物と比較して大幅に増加し（データは示さず）、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが、胸腺において、それらの発生からの高度に免疫抑制的な特徴を示すことを示す。
【０１１６】
従来のＣＤ４＋Ｔ細胞と同様に、正の選択時のＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの成熟は、ＣＤ６９の喪失及びＱａ２の獲得により特徴付けられる。本発明者らは、ＷＴ胸腺と比較し、ＬＴα−／−胸腺における発生中ＣＣＲ６−Ｔｒｅｇにおいてより高い頻度及び数のＣＤ６９−Ｑａ２＋成熟細胞を見出した（データは示さず）。際だったことに、ＣＣＲ６発生中Ｔｒｅｇ集団では、本発明者らは、Ｔｒｅｇ細胞機能に関連付けられるいくつかの遺伝子の発現が、ＷＴマウスと比較し、ＬＴα−／−マウスからのＣＤ６９−Ｑａ２＋成熟Ｔｒｅｇにおいて特異的に増加していることを見出した（データは示さず）。まとめると、これらのデータは、ＬＴαの発現によって、Ｑａ−２＋段階からの発生中Ｔｒｅｇの抑制的な特徴が負に制御されることを示す。
【０１１７】
ＬＴα−／−Ｔｒｅｇは特殊な分化プログラムを採用する。
【０１１８】
ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの抑制活性に関する洞察を得るために、本発明者らは、ＬＴα−／−脾臓Ｔｒｅｇの分子特徴をハイスループットＲＮＡ−ｓｅｑにより分析した（データは示さず）。ＷＴとＬＴα−／−Ｔｒｅｇの間の遺伝子発現において有意な変動を示す遺伝子（Ｐ値≦０．０５）及び倍変化の差≧２及び≦０．５は、それぞれ上方調節及び下方調節されたと考えた。本発明者らは、ＷＴ  Ｔｒｅｇと比較し、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇにおいて合計３０６の上方調節された遺伝子及び１１３の下方調節された遺伝子を同定した（データは示さず）。ＬＴα−／−Ｔｒｅｇにおいて調節された遺伝子の組をより良く特徴付けるために、本発明者らは、遺伝子オントロジー（ＧＯ）分析を実施した。ＬＴα−／−Ｔｒｅｇにおいて過剰発現した遺伝子を、８つの主な生物学的過程に関連付けた（データは示さず）。入力遺伝子の組についてヒットした上位のＧＯ用語を、細胞周期過程及び細胞増殖に関連付けた。これらのカテゴリーにおいて関係付けられる遺伝子のヒートマップによって、細胞増殖の多くの主要な調節因子が、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇにおいて上方調節されることが明らかになった（例えばＵｈｒｆ１など、結腸Ｔｒｅｇの増殖及び成熟において関係付けられる）。これらのＲＮＡ−ｓｅｑデータと一致して、本発明者らは、ＷＴマウス中よりも、ＬＴα−／−マウスの脾臓からのＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇにおける増殖中Ｋｉ−６７＋細胞のより高い頻度を観察した（データは示さず）。転写に関連付けられる遺伝子のヒートマップによって、この過程の主要な調節因子も同定された（例えばＡｈｒなど、その活性化はＴ細胞誘発性大腸炎を防止する抑制性Ｔｒｅｇを誘発することが見出されている）。
【０１１９】
Ｔｒｅｇは、ヘルパーＴ細胞の分化に関連付けられてきたいくつかの転写因子により制御される特殊な分化プログラムを採用することができる。本発明者らは、Ｔｈ１、Ｔｈ２、Ｔｈ１７、ＣＤ４濾胞ヘルパーエフェクターＴ細胞及び脂肪常在性Ｔ細胞の制御にそれぞれ特化したエフェクターＴｒｅｇにより発現されるＴｂｘ２１、Ｉｒｆ４、Ｒｏｒｃ、Ｂｃｌ６、及びＰｐａｒγ転写因子が、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇにおいて強く上方調節されることを見出した（データは示さず）。この上方調節はまた、ＣＣＲ６発生中及びＣＣＲ６＋再循環中胸腺ＬＴα−／−Ｔｒｅｇにおいて観察された（データは示さず）。これらの観察と一致して、ヘルパーＴ細胞の極性化に関連付けられると報告されている多くの遺伝子も、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇにおいて上方調節されていた。さらに、全てのエフェクターＴｒｅｇについての共通の特徴を表す転写因子Ｂｌｉｍｐ−１（Ｐｒｄｍ１遺伝子）ならびに終末的に活性化及び／又は分化したエフェクターＴｒｅｇを特徴付けるＫｌｒｇ１及びＴｉｇｉｔが、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇにおいて上方調節されていた。これらのデータに従い、ＫＬＲＧ１＋細胞及びＣＤ６９＋ＣＤ４４＋エフェクター細胞の頻度の増加が、ＬＴα−／−マウスの脾臓からのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇにおいて観察された（データは示さず）。さらに、本発明者らは、フローサイトメトリーにより、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇがより高いレベルのＣＤ４４、Ｈｅｌｉｏｓ、及びＮｕｒ７７活性化マーカーを発現することを見出した（データは示さず）。
【０１２０】
ＲＮＡ−ｓｅｑデータによって、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが、Ｔｒｅｇの免疫抑制機能に関連付けられるいくつかの遺伝子（例えばＥｂｉ３、Ｉｌ１０、Ｔｇｆ−β、及びＧｚｍｂなど）をコードする多量のｍＲＮＡを発現していることも明らかになった。これらの観察と一致して、ＣＤ６９−ＣＤ４４＋Ｔｒｅｇ細胞とは対照的に、Ｔｒｅｇエフェクター機能に関連付けられるいくつかの遺伝子（例えばＩｌ１０、Ｅｂｉ３、Ｔｇｆｂ、Ｉｆｎｇ、Ｇｚｍｂ、及びＦａｓｌなど）が、ＬＴα−／マウスにおいてＣＤ６９＋ＣＤ４４＋エフェクターＴｒｅｇ細胞中で、高レベルで特異的に上方調節されていた（データは示さず）。胸腺Ｔｒｅｇと同様に（データは示さず）、Ｔｒｅｇエフェクター機能に関連付けられる他の遺伝子（例えばＣｔｌａ４、ＣＤ３９、ＣＤ７３、及びＬａｇ３など）の発現は、脾臓ＬＴα−／−Ｔｒｅｇにおいて不変であった（データは示さず）。重要なことに、ＲＮＡ−ｓｅｑ分析により同定された異なるカテゴリー中のいくつかの候補遺伝子の発現が、精製ＷＴ及びＬＴα−／−Ｔｒｅｇ上でのｑＰＣＲにより確認された（図２）。まとめると、これらのデータは、このように、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが極性化され、このように、活性化／エフェクター表現型を提示することを示す。
【０１２１】
ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入によって潰瘍性大腸炎から保護される。
【０１２２】
ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが、Ｔｒｅｇ抑制機能において関係付けられるいくつかの遺伝子を高度に発現すると仮定し（図１Ｄ及び２）、本発明者は次に、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入がデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）誘発性大腸炎から保護する治療的利益を示すか否かを評価した。ＷＴ又はＬＴα−／−マウスから精製されたＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ（図３Ａ）を主に含む２．１０５個のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞を、２%ＤＳＳを用いた大腸炎の誘発の２日前に、ＷＴレシピエントマウス中に注射した（図３Ｂ）。本発明者らは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスが、ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスよりも有意に少ない体重を喪失したことを観察した（図３Ｃ）。さらに、疾患活動性指数（ＤＡＩ）（便の粘稠度、直腸出血、及び体重減少を組み合わせる）は、これらのマウスにおいてほとんど重要ではなかった（図３Ｄ）。体重減少及びＤＡＩに従って、これらのマウスは、結腸上皮のより少ない損傷（データは示さず）及び実験の終了時での低下した大腸炎の組織学的スコアを呈した（図３Ｅ）。本発明者らはまた、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスの結腸における炎症誘発性サイトカイン（例えばＩｌ６、Ｉｆｎγ、Ｔｎｆ−α、Ｉｌ１７Ａ、Ｉｌ１α、及びＩｌ３３など）ならびに免疫細胞の動員において関係付けられるケモカイン（例えばＣｃｌ２及びＣｘｃｌ１２など）の発現低下を観察した（図３Ｆ）。本発明者らはさらに、結腸浸潤免疫細胞の性質をフローサイトメトリーにより分析した。好中球、マクロファージ、樹状細胞、Ｂ細胞、及びＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスと比較し、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスにおいて劇的に低下した（図３Ｇ）。ＣＤ３＋及びＢ２２０＋細胞の浸潤低下を組織学的な結腸切片上で確認した（データは示さず）。Ｔｈ１及びＴｈ１７エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の数も低下した（図３Ｈ）。結果的に、Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１及びＴｒｅｇ／Ｔｈ１７の比率が、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスの結腸において増加した（図３Ｉ）。本発明者らは次に、養子移入細胞の数を２．１０５個から１．１０５個に、及び次に０．５．１０５個細胞に低下させることにより、大腸炎に対して保護するためのＬｔａ−／−Ｔｒｅｇの潜在力を評価した。本発明者らは、１．１０５個のＬｔａ−／−Ｔｒｅｇが、体重減少の低下により特徴付けられる２．１０５個のＷＴ  Ｔｒｅｇよりも良好な保護を示すことを観察した（図３Ｊ）。興味深いことに、０．５．１０５個のＬｔａ−／−Ｔｒｅｇは、２．１０５個のＷＴ  Ｔｒｅｇと同じ保護効果を示し、Ｌｔａ−／−ＴｒｅｇがインビボでそれらのＷＴ対応物よりも約４倍より抑制性であることを示す。
【０１２３】
本発明者らは次に、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入によって、ＤＳＳの投与の５日後に腸間膜リンパ節においてＣＤ４＋Ｔ細胞プライミングが阻害されるか否かをさらに決定した。注目すべきことに、本発明者らは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスが、この時間点でより長い結腸の長さ及び低下した結腸の重量／長さの比率を既に示すことを見出したが、減弱した結腸炎症を示す（データは示さず）。際だったことに、Ｔｈ１及びＴｈ１７エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の数が、これらのマウスの腸間膜リンパ節において大幅に低下し（データは示さず）、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇによって、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞のエフェクター中への変換が阻害されることを示す。まとめると、これらのデータは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入によって、結腸炎症を弱めること及び腸間膜リンパ節における病原性ＣＤ４＋Ｔ細胞のプライミングにより潰瘍性大腸炎の発症から保護されることを示す。
【０１２４】
ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入は炎症性腸疾患からの回復を促進する。
【０１２５】
本発明者らは次に、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入が炎症性腸疾患（ＩＢＤ）を治癒するための利益を示すか否かを検討した。この問題に対処するために、ＩＢＤを、ＣＤ４５．１  ＷＴコンジェニックマウスからＲａｇ２−／−レシピエントマウス中へのＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ枯渇ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞の移入により誘導し、ＩＢＤの発生を、体重減少を評価することによりモニターした。Ｔ細胞養子移入の約３〜４週間後、マウスが下痢及び体重減少により特徴付けられるＩＢＤの臨床症状を発生した場合、それらは、精製ＷＴ又はＬＴα−／−Ｔｒｅｇを受け、体重を週１回モニターされた（図４Ａ）。Ｔｒｅｇを受けなかったマウスを対照として使用した。ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスは、Ｔｒｅｇを受けなかったマウスよりも多くの体重を得たが、ＷＴ  Ｔｒｅｇの移入によってＩＢＤが寛解されることを示す（図４Ｂ）。興味深いことに、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスは、ＷＴ  Ｔｒｅｇを受けたマウスよりも多くの体重を得た。際だったことに、これらのマウスは、低下した結腸の重量／長さの比率を伴うより高い結腸の長さを示したが、減弱した結腸炎症を示す（図４Ｃ）。これらの観察に従って、これらのマウスは、低下した組織学的スコアを提示した（データ示さず）。重要なことに、ＣＤ４５．２起源の全Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ及びＦｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの数は、ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスよりも、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスの結腸においてより上昇していた（図４Ｄ−Ｅ）。さらに、Ｔｈ１及びＴｈ１７エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、これらのマウスの結腸において低下していた（図４Ｆ）。結果的に、Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１及びＴｒｅｇ／Ｔｈ１７の比率が、これらのマウスにおいて増加した（図４Ｇ）。注目すべきことに、この実験設定では、ＣＤ４＋Ｔ細胞の頻度及び数が、いくつかの末梢組織（例えば唾液腺、膵臓、及び肺など）において低下したが、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇがまた、自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞の組織浸潤を制御することを示す（データは示さず）。さらに、ＣＤ４４ｈｉＣＤ６２Ｌｈｉ中央及びＣＤ４４ｈｉＣＤ６２ＬｌｏエフェクターメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、これらの末梢組織において特異的に低下した（データは示さず）。まとめると、これらのデータは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入によってＩＢＤを処置することができ、自己反応性ＣＤ４＋Ｔ細胞の組織浸潤が制御されることを実証する。
【０１２６】
ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入はＣＡＣの発生を減弱する。
【０１２７】
ＬＴα−／−ＴｒｅｇによってＤＳＳ誘発性大腸炎から保護されること（図３）、及び結腸の慢性炎症がＣＡＣの開始をもたらしうることを仮定し、本発明者らは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入によってＣＡＣの出現から保護されるか否かを評価した  。このために、本発明者らは、アゾキシメタン（ＡＯＭ）の投与で構成される古典的なＣＡＣプロトコールを使用し、腫瘍形成、それに続く３サイクルのＤＳＳを開始し、慢性大腸炎（複数の結腸直腸腫瘍の発生を促進する）を誘発させた（図５Ａ）。これらの反復サイクルのＤＳＳは、患者において観察された結腸炎症の活動期及び寛解期を模倣している。ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを、最初の２つのサイクルのＤＳＳ（結腸直腸腫瘍の発生に先行するＣＡＣ炎症期に対応する期間）の前に養子移入した。興味深いことに、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを受けたマウスは、より少ない結腸直腸腫瘍（主に遠位結腸中に位置する）を示し、ＣＡＣプロトコールの６週間及び１２週間の両方でＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスよりも全体的に低下した容積を伴った（図５Ｂ−Ｃ、及びデータは示さず）。本発明者らは、このように、結腸直腸腫瘍の発生が、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスにおける低下した結腸炎症により防止されると仮定した。一致して、これらのマウスは、３週間からプロトコール終了までの結腸の重量／長さの比率の低下を示し、減弱した結腸炎症を示す（図５Ｄ）。ＣＡＣプロトコールの３週目に、本発明者らは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスの結腸において、炎症誘発性サイトカイン（例えばＩｌ１α、Ｉｌ１β、Ｔｎｆ−α、及びＩｌ１７Ａなど）の発現低下を観察した（図５Ｅ）。炎症誘発性サイトカインの発現低下も、ＣＡＣプロトコールの６週目に持続した。さらに、免疫細胞の動員において関係付けられるケモカイン（例えばＣｃｌ２、Ｃｃｌ４、Ｃｘｃｌ１０、及びＣｘｃｌ１２など）の発現も、これらのマウスの結腸において低下した（図５Ｅ）。本発明者らは次に、ＣＡＣプロトコールの３週目に、フローサイトメトリーにより結腸浸潤性の炎症性免疫細胞の性質を調べた（図５Ｆ−Ｈ）。全結腸浸潤性免疫細胞の数は、ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスと比較し、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスにおいて大幅に低下した（図５Ｆ）。好中球、マクロファージ、樹状細胞の数は、これらのマウスの結腸において特異的に低下した（図５Ｇ）。さらに、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の数は、両方の群の結腸において類似していたが、Ｔｈ１７エフェクターＣＤ４＋Ｔ細胞の数は、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを受けたマウスにおいて特異的に低下した（図５Ｈ）。対照的に、結腸浸潤Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの頻度はこれらのマウスにおいて増加したが、それらの数は、ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスにおいて観察された数と類似していた。まとめると、これらのデータは、結腸の慢性炎症の間でのＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入によって、結腸炎症を弱めることにより結腸直腸腫瘍の発生が減弱されることを示す。
【０１２８】
Ｌｔａ−／−Ｔｒｅｇの養子移入は多臓器自己免疫を抑制する。
【０１２９】
本発明者らは次に、Ｌｔａ−／−Ｔｒｅｇが消耗性疾患のモデルにおいて多臓器自己免疫を抑制する能力を評価した。ＣＤ４５．１  ＷＴコンジェニックマウスから単離されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ枯渇全脾細胞を、Ｒａｇ２−／−レシピエント中に移入した。４週間後、マウスの体重を喪失した場合、マウスは精製ＷＴ又はＬｔａ−／−Ｔｒｅｇを受け、体重を週１回モニターした（図６Ａ）。実験プロトコールの開始時にＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ枯渇全脾細胞及びＷＴ  Ｔｒｅｇを同時に受けたマウスを対照として使用した。興味深いことに、Ｌｔａ−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスは、ＷＴ  Ｔｒｅｇを受けたマウスよりも多くの体重を得た（図６Ｂ）。重要なことに、これらのマウスはそれらの最初の体重の約１５%を回復し、プロトコールの最後で対照の体重にほぼ達した。Ｔｒｅｇ養子移入から３週間後、ＷＴ  Ｔｒｅｇを受けたマウス（ＣＤ４５．１起源の脾臓ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の上昇した数を示す）とは対照的に、Ｌｔａ−／−Ｔｒｅｇを用いて移入されたマウスは、対照において観察されたのと同様の数のこれらの細胞を有していた（データは示さず）。さらに、脾臓ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ドナーＴ細胞は、ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスと比較し、Ｌｔａ−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスにおいてより少ないＣＤ４４＋ＣＤ６２Ｌ−活性化細胞を含んでいたが、Ｌｔａ−／−ＴｒｅｇによってＴ細胞活性化が減弱されることを示す（データは示さず）。対照と同様に、炎症性細胞の浸潤低下が、ＷＴ  Ｔｒｅｇを受けたマウスと比較し、Ｌｔａ−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスにおける末梢組織（唾液腺及び膵臓を含む）の組織学的検査により観察された（データは示さず）。したがって、個々のマウスにおけるフローサイトメトリーによるＣＤ４５．１ドナー細胞浸潤の検査によって、Ｌｔａ−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスの唾液腺、膵臓、及び腎臓におけるより低い浸潤が明らかになった（図６Ｃ）。本発明者らは、Ｔｒｅｇ枯渇全脾細胞の養子移入に基づくこの設定を利用し、いくつかの末梢臓器に対する自己抗体の生成を評価した（図６Ａ）。３つの群のマウスからの血清を用いたＲａｇ２−／−組織切片の免疫染色によって、Ｌｔａ−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスからの血清が、ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスの血清よりも唾液腺、膵臓、腎臓、肝臓、及び肺に対するより少ない自己抗体を含むことが明らかになった（データは示さず）。このように、Ｌｔａ−／−Ｔｒｅｇの養子移入によって、免疫細胞の浸潤及びいくつかの末梢組織に対する自己抗体の生成が限定される。
【０１３０】
養子移入されたＬＴα−／−Ｔｒｅｇは、それらの高度に免疫抑制的な特徴をインビボで維持する。
【０１３１】
Ｔｒｅｇ細胞は特定の可塑性を示しうるため、本発明者らは、養子移入時のインビボでのＬＴα−／−Ｔｒｅｇの安定性を分析した。このために、亜致死的に照射されたＣＤ４５．１  ｘ  ＣＤ４５．２  ＷＴレシピエントマウスを、それぞれ同じ比率の細胞選別されたＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＷＴならびにＣＤ４５．１及びＣＤ４５．２起源のＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて移入した（データは示さず）。養子移入から１週間後、本発明者らは、レシピエントマウスの脾臓からの両方の起源のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを精製し（データは示さず）、Ｔｒｅｇ機能に関連付けられるいくつかの遺伝子の発現を分析した。ＣＤ４５．１又はＣＤ４５．２起源のＣＤ４＋ＣＤ２５＋細胞の同様の頻度及び数が回復した（データは示さず）。しかし、ＣＤ４５．２起源のＬＴα−／−Ｔｒｅｇは、高レベルのＫｌｒｇ１、Ｉｌ１０、Ｔｇｆｂ、Ｉｆｎｇ、ｇｚｍｂ、及びＩＬ１７ａを発現し（データは示さず）、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが、それらの高度に免疫抑制的な特徴を養子移入時に保持したことを示す。
【０１３２】
造血細胞中でのＬＴα発現及びＬＴα１β２／ＬＴβＲ軸（axis）は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制的な特徴を負に制御する。
【０１３３】
ＬＴα−／−マウスは、無秩序な胸腺及び脾臓の微小環境を示すため、本発明者らは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの高度に免疫抑制的な表現型における非造血間質細胞の寄与を最初に分析した。このために、本発明者らは、致死的に放射線を照射したＣＤ４５．２  ＷＴ又はＬＴα−／−レシピエントマウスを、ＣＤ４５．１コンジェニックマウスからのＷＴ  ＢＭ細胞を用いて再構成した骨髄（ＢＭ）キメラを生成した（それぞれＷＴ  ＣＤ４５．１：ＷＴ及びＷＴ  ＣＤ４５．１：ＬＴα−／−マウス）。ＢＭ移植の６週間後、ＣＤ４５．１ドナー起源のＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ細胞を脾臓から細胞選別し、Ｔｒｅｇエフェクター機能に関連付けられるいくつかの遺伝子の発現について分析した（データは示さず）。Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの同様の頻度及び数を、両方の群のマウスにおいて観察した（データは示さず）。さらに、Ｋｌｒｇ１、Ｔｇｆｂ、Ｇｚｍｂ、Ｆａｓｌ、及びＩＬ１７ａの発現は、両方の群のマウスにおいて同様であったが、非造血細胞が、ＬＴα−／−マウスにおいて観察されたＴｒｅｇの高度に抑制的な特徴において関係付けられないことを示す（データは示さず）。
【０１３４】
本発明者らは次に、致死的に照射されたＣＤ４５．１  ｘ  ＣＤ４５．２  ＷＴレシピエントマウスを、ＷＴ  ＣＤ４５．１及びＷＴ  ＣＤ４５．２（ＷＴドナー群）、又はＷＴ  ＣＤ４５．１及びＬＴα−／−ＣＤ４５．２（ＬＴα−／−ドナー群）からのＢＭ細胞を用いて再構成された混合骨髄キメラ（５０：５０）を生成することにより、造血区画のそれぞれの寄与を決定した（図７Ａ）。６週間後、本発明者らは、脾臓におけるＷＴ  ＣＤ４５．２  ＢＭ細胞から由来するものと比較した、ＬＴα−／−ＣＤ４５．２  ＢＭ細胞から由来するＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇの頻度及び数の増加を見出した（図７Ｂ）。際だったことに、精製ＬＴα−／−ＣＤ４５．２Ｔｒｅｇは、ＷＴ  ＣＤ４５．２Ｔｒｅｇと比較し、Ｉｌ１０、Ｅｂｉ３、Ｔｇｆｂ１、Ｉｆｎｇ、Ｇｚｍｂ、Ｆａｓｌ、及びＩＬ１７ａ遺伝子の発現増加を示した（図７Ｃ）。これらのデータは、造血細胞におけるＬＴαの発現によって、Ｔｒｅｇ細胞の免疫抑制的な特徴が負に制御されることを示す。
【０１３５】
本発明者らは、Ｔｒｅｇが、膜アンカー型ＬＴα１β２ヘテロ複合体としてＬＴαを発現することを観察したため（図１）、本発明者らは、Ｔｒｅｇの抑制的な特徴を制御する際でのＬＴα１β２／ＬＴβＲ軸の寄与を評価した。特に、本発明者らは、Ｔｒｅｇ及び樹状細胞の間でのＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用を遮断することによって、Ｔｒｅｇ細胞の抑制的な特徴に影響が及ぼされるか否かを分析した。このために、可溶性ＬＴβＲ−Ｆｃ融合タンパク質とプレインキュベートした、又はしていない精製ＷＴ  ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇを、精製ＣＤ１１ｃ＋樹状細胞を用いて共培養した。興味深いことに、ＬＴβＲ−Ｆｃを用いてプレインキュベートしたＴｒｅｇによって、前処理されていないＴｒｅｇと比較し、Ｔｒｅｇ抑制機能に関連付けられるいくつかの遺伝子（例えばＫｌｒｇ１、Ｉｌ１０、Ｅｂｉ３、Ｔｇｆｂ１、Ｇｚｍｂ、Ｆａｓｌ、及びＩｌ１７ａなど）の発現が上方制御された（図７Ｄ）。これらのデータは、このように、Ｔｒｅｇ及び樹状細胞の間でのＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用によって、Ｔｒｅｇの抑制的な特徴が負に制御されていることを示す。
【０１３６】
ＬＴα発現は、末梢血から由来するヒトＴｒｅｇにおいて保存されている。
【０１３７】
本発明者らは次に、ＬＴα発現が、女性及び男性の健常ドナーの末梢血から由来するヒトＴｒｅｇにおいて保存されているか否かを評価した。Ｆｏｘｐ３＋ＣＤ４＋ＴｒｅｇをＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＣＤ１２７ｌｏ細胞として古典的に同定した。細胞内ＬＴαタンパク質（図８Ａ）及び細胞表面ＬＴα１β２ヘテロ複合体（図８Ｂ）は、分析した全てのドナーのＴｒｅｇにおいて、フローサイトメトリーにより実質的に検出され、この発現がマウスからヒトにおいて保存されていることを示す。
【０１３８】
考察
いくつかの試験によって、Ｔｒｅｇ細胞の発生及び機能の正の調節において関係付けられる多数の分子が同定されている。対照的に、少数の報告によって、Ｔｒｅｇ機能を負に調節するシグナルが記載されている。本明細書では、調節特性を付与された異なるＴ細胞集団を分析することにより、本発明者らは、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇが、膜アンカー型ＬＴα１β２ヘテロ複合体としてＬｔａを実質的に発現することを見出した。ＬＴαは、ＣＤ２５−Ｆｏｘｐ３＋前駆段階での胸腺におけるそれらの発生から、Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞において発現される。この発現は、末梢ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇにおいて保存されている。ＬＴβＲ−／−マウスと同様に、ＬＴα−／−マウスは、胸腺中でのＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｔｒｅｇ細胞発生において明らかな欠損を示さない。しかし、抑制機能に関連付けられる遺伝子の特徴は、胸腺及び末梢のＬＴα−／−Ｔｒｅｇの両方において大きく増強され、ＬＴαによって、それらの免疫抑制的な特徴が負に調節されていることを示す。本発明者らのデータは、この表現型が胸腺におけるＴｒｅｇの発生から検出可能であることを示す。なぜなら、この高度に抑制的な特徴が、周産期のこの細胞型でのそれらの出現から、及び成体における発生中のＣＣＲ６−Ｔｒｅｇ細胞において観察されたからである。この表現型は、このように、再循環中の末梢Ｔｒｅｇに起因しない可能性が高いが、しかし、むしろ発生的である。さらに、胸腺におけるＬＴαの発現は、Ｆｏｘｐ３の発現（Ｔｒｅｇ細胞の同一性を決定づける）と相関するため、これは、Ｔｒｅｇが、細胞が過剰反応し、このように、免疫反応を過剰に抑制することを防止するためにそれらの活性を厳密に制御する主要な分子を発現することを示唆する。
【０１３９】
胸腺及び脾臓の両方のＬＴα−／−Ｔｒｅｇが、代謝破壊において関係付けられるＣＤ３９、ＣＤ７３、及びＣＤ２５の発現、ならびに抗原提示の調節において関係付けられるＣＴＬＡ−４及びＬＡＧ−３の発現において明らかな欠損を示さない。対照的に、それらは、ＩＬ−１０、ＴＧＦ−β、及びＩＬ−３５免疫抑制サイトカインならびにグランザイムＢ、ＩＦＮ−γ、及びＦａｓＬ（細胞毒性媒介性の抑制機構において含まれる）の発現増加を示す。さらなる研究が、それらの抑制的な作用様式を正確に定義するために要求されるが、本発明者らは、それにもかかわらず、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが、阻害的サイトカインの分泌及び標的細胞の細胞溶解において含まれる分子の発現を通じて、それらの強力な抑制活性を媒介する可能性が高いことを示す。ＲＮＡ−ｓｅｑデータによって、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが活性化／エフェクター表現型（Ｂｌｉｍｐ−１、Ｋｌｒｇ１、及びＴｉｇｉｔマーカーの発現増大により特徴付けられ、終末的に活性化及び／又は分化エフェクターＴｒｅｇを区別すると記載される）を示すことが確認された。これらの観察と一致して、ＣＤ４４ｈｉＣＤ６９＋及びＫＬＲＧ１＋エフェクターＴｒｅｇ細胞のより高い頻度がまた、フローサイトメトリーによりＬＴα−／−マウスの脾臓において観察された。ＬＴα−／−Ｔｒｅｇはまた、高レベルのＩｋａｒｏｓファミリー転写因子であるＨｅｌｉｏｓを発現する。興味深いことに、ＣＤ４＋Ｆｏｘｐ３＋Ｈｅｌｉｏｓ＋Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔｒｅｇ集団の大部分内に高度に抑制的な機能を持つことが示されている。さらに、Ｈｅｌｉｏｓの強制発現によって、Ｔｒｅｇの抑制機能が増強されるのに対し、Ｈｅｌｉｏｓのノックダウンは、インビトロ及びインビボの両方で抑制機能の減少をもたらす。Ｈｅｌｉｏｓのこの高い発現によって、このように、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが高度に免疫抑制的であるという概念が支持される。脾臓のＬＴα−／−Ｔｒｅｇはまた、より高いレベルのＮｕｒ７７（ＴＣＲ刺激により上方調節される即時初期遺伝子である）を発現し、それらが最近抗原により活性化されたことを示唆する。さらに、ＲＮＡ−ｓｅｑデータによって、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが高度に増殖性の細胞の特徴を示すことが明らかになったが、これは、フローサイトメトリーによる高頻度のＫｉ−６７＋増殖性Ｔｒｅｇ細胞により確認された。まとめると、これらのデータは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが活性化／エフェクター表現型を持つことを示す。
【０１４０】
Ｔｒｅｇ表現型の安定性は議論されている問題であるが、本発明者らは、養子移入されたＬＴα−／−Ｔｒｅｇが、移入後少なくとも７日間、それらの高度に免疫抑制的な特徴をインビボで保持することを観察した。ＬＴα−／−Ｔｒｅｇ表現型の安定性は、これらの抑制細胞の移入が病理学的状態において利益を示しうることを示唆する。ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが高度に免疫抑制的な特徴を示すと仮定し、本発明者らは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入が、炎症性腸障害を保護及び処置する際に、ＷＴ  Ｔｒｅｇよりも優れた治療的利益を呈するか否かを評価した。興味深いことに、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの移入によって、ＤＳＳ誘発性大腸炎から保護され、ＷＴ  Ｔｒｅｇよりも効率的にＩＢＤから処置される。これは、ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスと比較した、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスにおける低下した体重減少、より高い結腸の長さ、及び低下した組織学的スコアにより反映された。さらに、本発明者らは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇによって、結腸炎症及び炎症性免疫細胞の浸潤が大幅に低下することを観察した。ＤＳＳ誘発性大腸炎モデルでは、本発明者らは、大腸炎の誘発前のＬＴα−／−Ｔｒｅｇの移入によって、腸間膜リンパ節におけるＴｈ１及びＴｈ１７病原性細胞のプライミング及び／又は増殖が低下することを見出した。重要なことに、Ｔｒｅｇ／Ｔｈ１及びＴｒｅｇ／Ｔｈ１７の比率が、ＤＳＳ誘発性大腸炎モデル及びＩＢＤモデルの両方において結腸中で増加し、Ｔｒｅｇによって、また、この組織において局所的にそれらの抑制効果を発揮することができることを示唆する。
【０１４１】
結腸炎症を抑制するためのそれらの能力により、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入によって、また、ＣＡＣ（慢性炎症により促進されることが公知である）の発生が減弱する。これは、ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて注射したマウスの腫瘍よりも小さな容積を示す結腸直腸腫瘍の数における約３倍低下により、約６週目での結腸発癌から例証した。重要なことに、この保護効果は、ＣＡＣプロトコールの終了まで、即ち、それがそれほど顕著ではなかった場合でさえ約１２週目まで持続した。ＷＴ  Ｔｒｅｇを用いて移入したマウスと比較し、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇを受けたマウスでのＣＡＣ発生におけるこの減弱は、ＣＡＣプロトコールの３週間から観察可能な結腸炎症の低下により説明される。これを、低下した（ｉ）結腸の重量／長さの比率、（ｉｉ）炎症誘発性サイトカインの発現、及び（ｉｉｉ）結腸中への炎症性免疫細胞の動員において関係付けられるケモカインにより特徴付けた。まとめると、これらのデータは、それらのＷＴ対応物と比較し、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇが、大腸炎を処置し、大腸炎及びＣＡＣの両方の発生から保護するより高い能力を示すことを示す。ＬＴα−／−Ｔｒｅｇは、このように、ＷＴ  Ｔｒｅｇよりも増大した抗炎症／免疫抑制機能を示す。養子移入細胞の数を減少させることにより、本発明者らは、Ｌｔａ−／−Ｔｒｅｇが、それらのＷＴ対応物よりもインビボで約４倍より抑制的であることを決定することができた。
【０１４２】
重要なことに、混合骨髄キメラは、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの活性化／エフェクター表現型が、造血細胞におけるＬＴα発現の特異的な喪失に起因しており、非造血間質細胞においてではない可能性が高いことを示した。さらに、本発明者らのデータによって、Ｔｒｅｇ及び樹状細胞、特にＳｉｒｐα＋  ｃＤＣ及びｐＤＣの間でのＬＴα１β２／ＬＴβＲ相互作用によってＴｒｅｇ細胞の抑制的な特徴が負に制御されることが明らかになり、抗原提示細胞との直接的な細胞接触によってＴｒｅｇ抑制活性が調節されることを示唆する。
【０１４３】
膜アンカー型ＬＴα１β２ヘテロ複合体として発現されるＬＴαは、ヒトＴｒｅｇにおいて保存されているため、ＬＴα−／−Ｔｒｅｇの養子移入によって、他の炎症性障害及び自己免疫障害を防止及び／又は処置するための治療的な適用を見出すことが期待される。さらに、これらの細胞の移入はまた、それぞれ慢性膵炎、気管支炎、及び膀胱炎により誘発される他の炎症誘発性癌、例えば膵臓癌、肺癌、又は膀胱癌などの発生から保護するために有益でありうる。
【０１４４】
結論として、本発明者らの試験では、ＴｒｅｇにおけるＬＴα発現によって、この細胞型の抑制能力が微調整されることを確認した。ＬＴαは、このように、Ｔｒｅｇ活性を増加させる興味深い新たな治療標的を表しうるが、それによって、要求される細胞数を低下させることにより、ならびに炎症性障害及び自己免疫障害を効率的に処置し、及び炎症誘発性癌の発生を防止することにより、Ｔｒｅｇ細胞治療の分野において臨床応用を見出すことが期待される。
【０１４５】
参考文献：
本願全体を通して、種々の参考文献によって、本発明が関係する最新技術が記載されている。これらの参考文献の開示を、本明細書により、参照により本開示中に組み入れる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図３Ｆ】
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【図３Ｇ】
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【図３Ｈ】
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【図３Ｉ】
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【図３Ｊ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図４Ｆ】
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【図４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図５Ｄ】
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【図５Ｅ】
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【図５Ｆ】
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【図５Ｇ】
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【図５Ｈ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【国際調査報告】
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