(57)【要約】  本開示は、一般に、免疫応答、例えば、予防ワクチン接種または治療的投与の後の免疫応答を増強するための異なる自己増幅ＲＮＡ分子の使用に関する。いくつかの実施形態は、プライム・ブースト免疫レジメンを使用して、対象における免疫応答を誘導するための組成物および方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における免疫応答を誘導する方法であって、
第１の抗原をコードする第１のＲＮＡレプリコンを含むプライミング組成物の少なくとも一用量を前記対象に投与することと；
その後、第２の抗原をコードする第２のＲＮＡレプリコンを含む少なくとも一用量のブースティング組成物を前記対象に投与することと
を含み、前記第１のＲＮＡレプリコンと第２のＲＮＡレプリコンが互いに異なる、前記方法。
【請求項２】
前記第１および第２の抗原が少なくとも１つの交差反応性抗原決定基を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１のＲＮＡレプリコンが、前記第２のＲＮＡレプリコンが免疫系を活性化する免疫学的機序とは異なる少なくとも１つの免疫学的機序を介して前記対象の免疫系を活性化する、請求項１〜２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４】
前記第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つがプラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つがトガウイルス（Togaviridae）科、フラビウイルス（Flaviviridae）科、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科、ラブドウイルス（Rhabdoviridae）科、アルテロウイルス（Arteroviridae）科、ピコルナウイルス（Picornaviridae）科、アストロウイルス（Astroviridae）科、コロナウイルス（Coronaviridae）科、およびパラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科からなる群から選択される科に属するウイルス種に由来する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１のＲＮＡレプリコンが非アルファウイルス（non-alphavirus）に由来し、前記第２のＲＮＡレプリコンがアルファウイルス（alphavirus）種に由来する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記第１のＲＮＡレプリコンがアルテリウイルス（Arterivirus）に由来する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記第２のＲＮＡレプリコンが、東部ウマ脳炎ウイルス（Eastern equine encephalitis virus、ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Venezuelan equine encephalitis virus、ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（Everglades virus、ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（Mucambo virus、ＭＵＣＶ）、セムリキフォレストウイルス（Semliki forest virus、ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（Pixuna virus、ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（Middleburg virus、ＭＩＤＶ）、チクングニヤウイルス（Chikungunya virus、ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（O'Nyong-Nyong virus、ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（Ross River virus、ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（Barmah Forest virus、ＢＦ）、ゲタウイルス（Getah virus、ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（Sagiyama virus、ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（Bebaru virus、ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（Mayaro virus、ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（Una virus、ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（Sindbis virus、ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（Aura virus、ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（Whataroa virus、ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（Babanki virus、ＢＡＢＶ）、キジラガチウイルス（Kyzylagach virus、ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Western equine encephalitis virus、ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（Highland J virus、ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（Fort Morgan virus、ＦＭＶ）、ヌドゥムウイルス（Ndumu virus、ＮＤＵＶ）、サケ科アルファウイルス（Salmonid alphavirus、ＳＡＶ）、およびバギークリークウイルス（Buggy Creek virus、ＢＣＲＶ）からなる群から選択されるアルファウイルス（alphavirus）種に由来する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のＲＮＡレプリコンが、ウマ動脈炎ウイルス（equine arteritis virus、ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（porcine reproductive and respiratory syndrome virus、ＰＲＲＳＶ）、マウスの乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（lactate dehydrogenase elevating virus 、ＬＤＶ）、サル出血熱ウイルス（simian hemorrhagic fever virus、ＳＨＦＶ）、およびウォブリィポッサム病ウイルス（wobbly possum disease virus、ＷＰＤＶ）からなる群から選択されるアルテリウイルス（Arterivirus）種に由来する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つが、１、２、４位、またはそれらの組合せに１つまたは複数のヌクレオチド置換を有する改変５’−ＵＴＲを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つまたは複数のヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つが前記改変５’−ＵＴＲの２位でのヌクレオチド置換である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記改変５’−ＵＴＲの２位の前記ヌクレオチド置換がＵ→Ｇ置換である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つが改変５’−ＵＴＲを含む改変ＲＮＡレプリコンであり、１つまたは複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つが、ウイルスキャプシドエンハンサーまたはそのバリアントの構造エレメント中に１つまたは複数のＲＮＡステムループを含む改変アルファウイルス（alphavirus）レプリコンである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つが異種非構造タンパク質ｎｓＰ３のコード配列を含む改変アルファウイルス（alphavirus）レプリコンである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記異種非構造タンパク質ｎｓＰ３がチクングニヤウイルス（Chikungunya virus、ＣＨＩＫＶ）ｎｓＰ３、シンドビスウイルス（Sindbis virus、ＳＩＮＶ）ｎｓＰ３、またはそれらのバリアントである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第１および第２の抗原のうちの少なくとも１つが２６Ｓサブゲノムプロモーターまたはそのバリアントのコントロール下で発現される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記２６ＳサブゲノムプロモーターがＳＩＮＶ  ２６Ｓサブゲノムプロモーター、ＲＲＶ  ２６Ｓサブゲノムプロモーター、またはそれらのバリアントである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第１のＲＮＡレプリコンがアルテリウイルス（arterivirus）種に由来し、前記第２のＲＮＡレプリコンが非アルテリウイルス（non-arterivirus）種に由来する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記アルテリウイルス（arterivirus）種が、ウマ動脈炎ウイルス（equine arteritis virus、ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（porcine respiratory and reproductive syndrome virus、ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（lactate dehydrogenase elevating virus 、ＬＤＶ）、およびサル出血熱ウイルス（simian hemorrhagic fever virus、ＳＨＦＶ）からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２のＲＮＡレプリコンがアルファウイルス（alphavirus）に由来する、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記第１のＲＮＡレプリコンがＥＡＶに由来し、前記第２のＲＮＡレプリコンがアルファウイルス（alphavirus）に由来する、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記アルファウイルス（alphavirus）がＶＥＥＶに由来する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のＲＮＡレプリコンおよび前記第２のＲＮＡレプリコンが、それぞれ、目的の遺伝子をコードする配列を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記目的の遺伝子が前記対象に対する抗原決定基であるポリペプチドをコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記ブースティング組成物の２回以上の用量を前記対象に投与することを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
１つまたは複数の前記プライミング組成物およびブースティング組成物が薬学的に許容される担体を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記対象が鳥類種、甲殻類種、または魚類種である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記対象が哺乳動物である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記対象が水生動物または鳥類種である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
２つのＲＮＡレプリコンを対象に送達する方法であって、
第１の抗原をコードする第１のＲＮＡレプリコンをコードする第１の核酸配列を前記対象に投与することと；
その後、第２の抗原をコードする第２のＲＮＡレプリコンをコードする第２の核酸配列を前記対象に投与することと
を含み、前記第１および第２のＲＮＡレプリコンが互いに異なる、前記方法。
【請求項３２】
第１の抗原をコードする第１のＲＮＡレプリコンを含むプライミング組成物と；
第２の抗原をコードする第２のＲＮＡレプリコンを含むブースティング組成物と
を含む組成物であって、前記第１および第２のＲＮＡレプリコンが互いに異なる、前記組成物。
【請求項３３】
第１の抗原をコードする第１のＲＮＡレプリコンをコードする第１の核酸配列と；
第２の抗原をコードする第２のＲＮＡレプリコンをコードする第２の核酸配列と
を含む組成物であって、前記第１および第２のＲＮＡレプリコンが互いに異なり、
前記第１のレプリコンおよび／または前記第２のレプリコンが、目的の分子のコード配列に作動可能に連結されているプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットを含む、前記組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下に、２０１８年１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／６１９，５４０号の優先権を主張し、その全内容は、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
添付の配列表の物質は、これにより参照によって本出願に組み込まれる。添付の配列表テキストファイル、名称ＳＧＩ２２３０１ＷＯ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔは、２０１９年１月１６日に作成され、３ｋｂである。このファイルは、Ｗｉｎｄｏｗｓ ＯＳを使用するコンピューター上でＭｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｗｏｒｄを使用してアクセスすることができる。
【０００３】
本開示の態様は、ウイルス学、感染症および免疫学の分野に関する。さらに詳しくは、本開示は、異なるＲＮＡレプリコンを含む少なくとも２つの免疫原性組成物を連続投与することによって、対象における免疫応答を誘導および／または増強するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
抗原特異的メモリーＣＤ８  Ｔ細胞の大きな集団を生成することは、様々な動物およびヒトの疾患に対するワクチン設計での望ましい目標である。実験モデルで実施された多数の研究からは、感染時に存在する抗原特異的メモリーＣＤ８  Ｔ細胞の総数が、様々な異なる病原体に対する宿主保護を付与する能力と密接に相関していることが証明されている。現在、メモリーＣＤ８  Ｔ細胞の大きな集団を迅速に生成することに関して最も考えられ得るアプローチの１つは、プライム・ブーストワクチン接種を使用することによるものである。実際、治療のため、または疾患予防のための多回投与免疫接種は、単回投与免疫接種よりも、多くの場合、効果的であることが報告されている。この違いは、弱毒生ワクチン、不活化ワクチン、組換えタンパク質サブユニットワクチン、および多糖体ワクチンを含む異なるタイプのワクチンで観察されている。しかし依然として、さらに有効な異種プライム・ブーストレジメンが必要とされている。
【発明の概要】
【０００５】
このセクションは、本出願の一般的な概要を提供するものであり、その全範囲またはその特徴のすべてを包括するものではない。
【０００６】
本開示は、様々な適用に対して２つのＲＮＡレプリコンを対象に送達するための組成物および方法を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示した組成物および方法は、対象における免疫応答の誘導および／または増強を可能にする。いくつかの実施形態では、本明細書に開示した組成物および方法は、目的の分子、例えば治療用ポリペプチドなどの対象における産生に使用することができる。
【０００７】
一態様では、本明細書で開示したいくつかの実施形態は、対象における免疫応答を誘導する方法であって、第１の抗原をコードする第１のＲＮＡレプリコンを含むプライミング組成物の少なくとも一用量を対象に投与することと；その後、第２の抗原をコードする第２のＲＮＡレプリコンを含むブースティング組成物の少なくとも一用量を対象に投与することとを含み、第１のＲＮＡレプリコンと第２のＲＮＡレプリコンが互いに異なる、方法に関する。第１のＲＮＡレプリコンおよび第２のＲＮＡレプリコンは、本明細書に記載されている任意のものであり得る。
【０００８】
別の態様では、本明細書に開示したいくつかの実施形態は、２つのＲＮＡレプリコンを対象に送達する方法であって、第１の抗原をコードする第１のＲＮＡレプリコンをコードする第１の核酸配列を対象に投与することと；その後、第２の抗原をコードする第２のＲＮＡレプリコンをコードする第２の核酸配列を対象に投与することとを含み、第１のＲＮＡレプリコンと第２のＲＮＡレプリコンが互いに異なる、方法に関する。第１のＲＮＡレプリコンおよび第２のＲＮＡレプリコンは、本明細書に記載されている任意のものであり得る。
【０００９】
本開示による方法の実施形態の実施は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含むことができる。いくつかの実施形態では、第１の抗原と第２の抗原は、互いに同一である。いくつかの実施形態では、第１の抗原および第２の抗原のアミノ酸配列は、互いに相同である。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、少なくとも１つの交差反応性抗原決定基を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、対象において実質的に同一の免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、免疫系が第２のＲＮＡレプリコンによって活性化され得る免疫学的機序とは異なる少なくとも１つの免疫学的機序を介して、対象の免疫系を活性化することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫学的機序は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、オートファジー経路、トール様受容体（ＴＬＲ）、ストレス顆粒、ＲＮａｓｅ  Ｒ、およびオリゴアデニル酸合成酵素（ＯＡＳ）の差次的活性化からなる群から選択される。
【００１０】
本明細書に開示したいくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、改変ＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、プラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、トガウイルス（Togaviridae）科、フラビウイルス（Flaviviridae）科、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科、ラブドウイルス（Rhabdoviridae）科、アルテロウイルス（Arteroviridae）科、ピコルナウイルス（Picornaviridae）科、アストロウイルス（Astroviridae）科、コロナウイルス（Coronaviridae）科、およびパラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科からなる群から選択される科に属するウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、アルファウイルス（Alphavirus）またはアルテリウイルス（Arterivirus）に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、東部ウマ脳炎ウイルス（Eastern equine encephalitis virus、ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Venezuelan equine encephalitis virus、ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（Everglades virus、ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（Mucambo virus、ＭＵＣＶ）、セムリキフォレストウイルス（Semliki forest virus、ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（Pixuna virus、ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（Middleburg virus、ＭＩＤＶ）、チクングニヤウイルス（Chikungunya virus、ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（O'Nyong-Nyong virus、ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（Ross River virus、ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（Barmah Forest virus、ＢＦ）、ゲタウイルス（Getah virus、ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（Sagiyama virus、ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（Bebaru virus、ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（Mayaro virus、ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（Una virus、ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（Sindbis virus、ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（Aura virus、ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（Whataroa virus、ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（Babanki virus、ＢＡＢＶ）、キジラガチウイルス（Kyzylagach virus、ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Western equine encephalitis virus、ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（Highland J virus、ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（Fort Morgan virus、ＦＭＶ）、ヌドゥムウイルス（Ndumu virus、ＮＤＵＶ）、サケ科アルファウイルス（Salmonid alphavirus、ＳＡＶ）、およびバギークリークウイルス（Buggy Creek virus、ＢＣＲＶ）からなる群から選択されるアルファウイルス（alphavirus）種に由来する。
【００１１】
本明細書で開示されたいくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは両方ともアルファウイルス（alphavirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは、同一のアルファウイルス（alphavirus）種または２つの異なるアルファウイルス（alphavirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルファウイルス（alphavirus）に由来し、第２のＲＮＡレプリコンは非アルファウイルス（alphavirus）種に由来する。他の実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは非アルファウイルス（alphavirus）に由来し、第２のＲＮＡレプリコンはアルファウイルス（alphavirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルテリウイルス（Arterivirus）（例えばＥＡＶ）に由来し、第２のＲＮＡレプリコンはアルファウイルス（alphavirus）（例えばＶＥＥＶ）に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、１、２、４位、またはそれらの組合せに１つまたは複数のヌクレオチド置換を有する改変５’−ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つは、改変５’−ＵＴＲの２位でのヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態では、改変５’−ＵＴＲの２位のヌクレオチド置換は、Ｕ→Ｇ置換である。
【００１２】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、改変５’−ＵＴＲを含む改変ＲＮＡレプリコンであり、１つまたは複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡレプリコンは、１つまたは複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分を欠いている。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡレプリコンは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、ウイルスキャプシドエンハンサーの構造エレメント中に１つまたは複数のＲＮＡステムループを含む改変アルファウイルスレプリコンである。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、異種非構造タンパク質ｎｓＰ３のコード配列を含む改変アルファウイルスレプリコンである。いくつかの実施形態では、異種非構造タンパク質ｎｓＰ３は、チクングニヤウイルス（Chikungunya virus、ＣＨＩＫＶ）ｎｓＰ３またはシンドビスウイルス（Sindbis virus、ＳＩＮＶ）ｎｓＰ３である。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原のうちの少なくとも１つは、２６Ｓサブゲノムプロモーターまたはそのバリアントのコントロール下で発現される。いくつかの実施形態では、２６Ｓサブゲノムプロモーターは、ＳＩＮＶ  ２６Ｓサブゲノムプロモーター、ＲＲＶ  ２６Ｓサブゲノムプロモーター、またはそれらのバリアントである。
【００１３】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、ウマ動脈炎ウイルス（equine arteritis virus、ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（porcine respiratory and reproductive syndrome virus、ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（lactate dehydrogenase elevating virus 、ＬＤＶ）、およびサル出血熱ウイルス（simian hemorrhagic fever virus、ＳＨＦＶ）からなる群から選択されるアルテリウイルス（arterivirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンの両方ともアルテリウイルス（arterivirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは、同一のアルテリウイルス（arterivirus）種、または２つの異なるアルテリウイルス（arterivirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルテリウイルス（arterivirus）に由来し、第２のＲＮＡレプリコンは非アルテリウイルス（non-arterivirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルテリウイルス（arterivirus）に由来し、第２のＲＮＡレプリコンはアルファウイルス（alphavirus）に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルテリウイルス（arterivirus）種に由来する未改変ＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルテリウイルス（arterivirus）種に由来する改変ＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルファウイルス（alphavirus）種に由来するＲＮＡレプリコンであり、第２のＲＮＡレプリコンはアルテリウイルス（arterivirus）種に由来するＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルス（alphavirus）種に由来する未改変ＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルス（alphavirus）種に由来する改変ＲＮＡレプリコンである。
【００１４】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、本開示のこの態様および他の態様による方法は、１つまたは複数のその後のブースティングステップ、例えば、ブースティング組成物の１回または複数回のその後の投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のプライミング組成物およびブースティング組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、対象は水生動物である。いくつかの実施形態では、対象は、鳥類種、甲殻類種、または魚類種である。いくつかの実施形態では、鳥類種は、食料消費のための鳥類種である。いくつかの実施形態では、甲殻類はエビである。いくつかの実施形態では、魚類種は、水産養殖において使用される魚類種である。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ロバ、ハムスター、またはバッファローである。
【００１５】
一態様では、本明細書で開示したいくつかの実施形態は、第１の抗原をコードする第１のＲＮＡレプリコンを含むプライミング組成物と；第２の抗原をコードする第２のＲＮＡレプリコンを含むブースティング組成物とを含む組成物であって、第１のＲＮＡレプリコンと第２のＲＮＡレプリコンは互いに異なる、組成物に関する。
【００１６】
別の態様では、本明細書で開示したいくつかの実施形態は、第１の抗原をコードする第１のＲＮＡレプリコンをコードする第１の核酸配列と；第２の抗原をコードする第２のＲＮＡレプリコンをコードする第２の核酸配列とを含む組成物であって、第１のＲＮＡレプリコンと第２のＲＮＡレプリコンは互いに異なり、第１のレプリコンおよび第２のレプリコンが、目的の分子のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットを含む、組成物に関する。第１のＲＮＡレプリコンおよび第２のＲＮＡレプリコンは、本明細書に記載されている任意のものであり得る。
【００１７】
本開示の上記の態様による組成物の実施形態の実施は、以下の特徴のうちの１つまたは複数を含み得る。いくつかの実施形態では、第１の抗原と第２の抗原は互いに同一である。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列と第２の抗原のアミノ酸配列は、互いに相同である。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、第１の抗原と第２の抗原は、少なくとも１つの交差反応性抗原決定基を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原と第２の抗原は、対象において実質的に同一の免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、免疫系が第２のＲＮＡレプリコンによって活性化され得る免疫学的機序とは異なる少なくとも１つの免疫学的機序を介して、対象の免疫系を活性化することができる。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの免疫学的機序は、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、オートファジー経路、トール様受容体（ＴＬＲ）、ストレス顆粒、ＲＮａｓｅ  Ｒ、およびオリゴアデニル酸合成酵素（ＯＡＳ）の差次的活性化からなる群から選択される。
【００１８】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、改変レプリコンである。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、プラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する。いくつかの実施形態において、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、トガウイルス（Togaviridae）科、フラビウイルス（Flaviviridae）科、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科、ラブドウイルス（Rhabdoviridae）科、アルテロウイルス（Arteroviridae）科、ピコルナウイルス（Picornaviridae）科、アストロウイルス（Astroviridae）科、コロナウイルス（Coronaviridae）科、およびパラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科からなる群から選択される科に属するウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、アルファウイルス（Alphavirus）またはアルテリウイルス（Arterivirus）に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、東部ウマ脳炎ウイルス（Eastern equine encephalitis virus、ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Venezuelan equine encephalitis virus、ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（Everglades virus、ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（Mucambo virus、ＭＵＣＶ）、セムリキフォレストウイルス（Semliki forest virus、ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（Pixuna virus、ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（Middleburg virus、ＭＩＤＶ）、チクングニヤウイルス（Chikungunya virus、ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（O'Nyong-Nyong virus、ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（Ross River virus、ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（Barmah Forest virus、ＢＦ）、ゲタウイルス（Getah virus、ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（Sagiyama virus、ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（Bebaru virus、ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（Mayaro virus、ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（Una virus、ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（Sindbis virus、ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（Aura virus、ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（Whataroa virus、ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（Babanki virus、ＢＡＢＶ）、キジラガチウイルス（Kyzylagach virus、ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Western equine encephalitis virus、ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（Highland J virus、ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（Fort Morgan virus、ＦＭＶ）、ヌドゥムウイルス（Ndumu virus、ＮＤＵＶ）、サケ科アルファウイルス（Salmonid alphavirus、ＳＡＶ）、およびバギークリークウイルス（Buggy Creek virus、ＢＣＲＶ）のうちの任意の１つもしくは複数からなる群、またはこれらのウイルスのすべての可能な組合せもしくは部分的組合せからなる群から選択されるアルファウイルス（alphavirus）種に由来する。例えば、いくつかの実施形態では、アルファウイルス（alphavirus）種は、東部ウマ脳炎ウイルス（Eastern equine encephalitis virus、ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Venezuelan equine encephalitis virus、ＶＥＥＶ）、およびエバーグレーズウイルス（Everglades virus、ＥＶＥＶ）からなる群から選択することができる。
【００１９】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは両方ともアルファウイルス（alphavirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは、同一のアルファウイルス（alphavirus）種または２つの異なるアルファウイルス（alphavirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルファウイルス（alphavirus）に由来し、第２のＲＮＡレプリコンは非アルファウイルス（non-alphavirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、１、２、４位、またはそれらの組合せに１つまたは複数のヌクレオチド置換を有する改変５’−ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つは、改変５’−ＵＴＲの２位でのヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態では、改変５’−ＵＴＲの２位でのヌクレオチド置換は、Ｕ→Ｇ置換である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、改変５’−ＵＴＲを含む改変ＲＮＡレプリコンであり、１つまたは複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部を欠いている。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡレプリコンは、１つまたは複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の実質的な部分を欠いている。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡレプリコンは、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含まない。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、ウイルスキャプシドエンハンサーの構造エレメントまたはそのバリアント中に１つまたは複数のＲＮＡステムループを含む改変アルファウイルス（alphavirus）レプリコンである。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、異種非構造タンパク質ｎｓＰ３のコード配列を含む改変アルファウイルス（alphavirus）レプリコンである。いくつかの実施形態では、異種非構造タンパク質ｎｓＰ３は、チクングニヤウイルス（Chikungunya virus、ＣＨＩＫＶ）ｎｓＰ３、シンドビスウイルス（Sindbis virus、ＳＩＮＶ）ｎｓＰ３、またはそのバリアントである。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原のうちの少なくとも１つは、２６Ｓサブゲノムプロモーターまたはそのバリアントのコントロール下で発現される。いくつかの実施形態では、２６Ｓサブゲノムプロモーターは、ＳＩＮＶ  ２６Ｓサブゲノムプロモーター、ＲＲＶ  ２６Ｓサブゲノムプロモーター、またはそれらのバリアントである。
【００２１】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、ウマ動脈炎ウイルス（equine arteritis virus、ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（porcine respiratory and reproductive syndrome virus、ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（lactate dehydrogenase elevating virus 、ＬＤＶ）、およびサル出血熱ウイルス（simian hemorrhagic fever virus、ＳＨＦＶ）からなる群から選択されるアルテリウイルス（arterivirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンの両方ともアルテリウイルス（arterivirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは、同一のアルテリウイルス（arterivirus）種、または２つの異なるアルテリウイルス（arterivirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルテリウイルス（arterivirus）に由来し、第２のＲＮＡレプリコンは非アルテリウイルス（non-arterivirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルテリウイルス（arterivirus）に由来し、第２のＲＮＡレプリコンはアルファウイルス（alphavirus）に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルテリウイルス（arterivirus）種に由来する未改変ＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルテリウイルス（arterivirus）種に由来する改変ＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルファウイルス（alphavirus）種に由来するＲＮＡレプリコンであり、第２のＲＮＡレプリコンはアルテリウイルス（arterivirus）種に由来するＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルス（alphavirus）種に由来する未改変ＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルス（alphavirus）種に由来する改変ＲＮＡレプリコンである。
【００２２】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、本開示による組成物は、１つまたは複数のその後のブースティングステップ、例えば、ブースティング組成物の１回または複数回のその後の投与のための組成物をさらに含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のプライミング組成物およびブースティング組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態では、対象は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物は、ヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ロバ、ハムスター、またはバッファローである。
【００２３】
前述の概要は単なる例示であり、決して限定することを意図するものではない。本明細書で説明した例示的な実施形態および特徴に加えて、本出願のさらなる態様、実施形態、目的および特徴は、図面、詳細な説明、および特許請求の範囲から十分に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】本開示のいくつかの実施形態による対象における免疫応答を誘導する方法の非限定的な例の概略図である。この例では、従来のプライム・ブーストレジメン（破線）または異種プライム・ブーストレジメン（実線）に対する、抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の総数によって決定した場合の免疫応答の規模が経時的にプロットされている。
【図２Ａ】本開示のいくつかの実施形態による様々なプライム・ブースティングスケジュール後のマウスにおける免疫応答の分析を実施した実験の結果をまとめている。図２Ａでは、エフェクターＩＦＮ−γ−分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の平均頻度は、ブーストの１４日後に免疫化されたＢＡＬＢ／ｃマウス由来の脾細胞の酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって決定した（αはアルファウイルスレプリコンを表す）。図２Ｂでは、ブーストの１４日後の総ＩｇＧ力価の幾何平均（ＥＤ２０％の逆数）を酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）で測定した。すべての免疫応答は９５％の信頼区間で示されており、提示した統計はノンパラメトリックな独立マン・ホイットニー検定を使用している。
【図２Ｂ】上記と同様。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本開示の前述の特徴および他の特徴は、添付の図面と共に、以下の説明および添付の特許請求の範囲からより完全に明らかになるであろう。これらの図面は本開示によるいくつかの実施形態のみを表しており、その範囲を限定すると考えるものではなく、本開示が添付の図面を使用することにより、さらに具体的におよび詳細に説明されると理解されたい。
【００２６】
本開示の詳細な説明
本開示は、一般に、免疫応答、例えば予防的ワクチン接種および／または治療的投与後の免疫応答を増強するための異なる自己増幅ｍＲＮＡ分子の使用に関する。本開示のいくつかの実施形態は、予防的および／または治療的に使用することができる異種プライム・ブースト免疫レジメンを使用して、対象における免疫応答を誘導するための組成物および方法に関する。いくつかの実施形態では、本明細書で開示した組成物および方法は、対象における目的の分子、例えば治療用ポリペプチドを産生するために展開することができる。
【００２７】
抗原特異的メモリーＣＤ８  Ｔ細胞の大きな集団の生成は、様々な動物およびヒトの疾患に対するワクチン設計の望ましいゴールである。メモリーＣＤ８  Ｔ細胞の大きな集団を効率的に生成する１つのアプローチは、「異種」プライム・ブースト形式におけるプライム・ブーストワクチン接種の使用を介するものであり、それは、１つのベクターで送達される抗原によりメモリーＣＤ８  Ｔ細胞の生成をプライムすることと、次いで、同一の抗原、または本質的に同一の抗原を、その後の時点で異なるベクターの文脈で投与することを含む。
【００２８】
本明細書で開示したいくつかの実施形態は、対象における優れた免疫応答を誘発するための方策として２つの異なる物理療法を使用する同一の免疫原の連続投与を含む異種プライム・ブーストレジメンに関する。この方策は、限定するものではないが、マラリア、ＨＩＶ、結核、エボラ出血熱を含む様々なやっかいな病原体に使用することができる。異種プライム・ブーストは、優れたメモリー応答、規模の大きなＣＤ８＋  Ｔ細胞の応答、免疫系により認識されるＴ細胞エピトープの拡大、およびＴ細胞の多機能性の増加をもたらすことができる。アルファウイルス（Alphavirus）由来のレプリコン（例えば、シンドビスウイルス（Sindbis virus）、ＶＥＥウイルス、およびセムリキフォレストウイルス（Semliki forest virus））は、タンパク質、ＤＮＡ、およびビロソームと組み合わせて、異種プライム・ブースト設定において使用されてきた。これらは、ヒトパピローマウイルス（human papillomavirus、ＨＰＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus、ＨＩＶ）についてはマウスの小動物モデルにおいて、ならびに、デング熱についてはレプリコンが粒子形態で送達される非ヒト霊長類（ＮＨＰ）において効果的であることがわかった。さらに、完全に合成されたアルファウイルス（Alphavirus）由来のレプリコンは、同種プライム・ブーストレジメンにおいて広く使用されてきた。本発明は、異種プライム・ブーストレジメンにおいて使用するための２つの免疫学的に異なるレプリコンを有するレジメンを提供する。また本発明は、同種または異種の投与レジメンを使用することができる治療用タンパク質を発現するアルファウイルス（Alphavirus）由来のレプリコンの反復投与を有するレジメンを提供する。
【００２９】
本明細書で開示されているように、２つの免疫学的に異なるＲＮＡレプリコンでメモリーＣＤ８  Ｔ細胞の生成をプライムすることおよびブーストすることにより、免疫応答を戦略的に改善し、より複雑な病原体に取り組むことができる。例えば、ワクチンに関して、リコール応答は、既存の抗体または抗原を送達するプラットフォームへのＴ細胞応答によって悪影響を被り得る（抗ベクター免疫）。同様に、同一のプラットフォームを使用する抗原の多回投与は、全く同じ方法で免疫系を刺激するが、免疫検出の代替の機序と相乗作用することができないため、より本質的に自己限定的な可能性がある。いかなる特定の理論に縛られるものではないが、異種プライム・ブースト免疫は、応答の低下の原因となる機序に応じて既存の抗体またはＴ細胞の応答を避けるように設計することができるので、最初の問題を回避するように機能すると考えられる。さらに、２つの免疫学的に異なるレプリコンを使用する異種プライム・ブーストは、最初の投与と相乗作用する様々な方法で後続の投与が免疫系を活性化するように設計することができる。
【００３０】
別の例では、治療法に関して、ベクターに対する免疫応答が治療用タンパク質を発現する細胞のクリアランスをもたらすことができるので、リコール応答は異種タンパク質発現の期間および規模を縮小することができる。いかなる特定の理論に縛られるものではないが、異種プライム・ブースト免疫は、反復投与の際に免疫系がタンパク質を発現しているレプリコンを認識する能力を低下させ、それによりクリアランスを遅延させることにより、この問題を回避すると考えられる。
【００３１】
以下の詳細な説明において、本明細書の一部を形成する添付の図面を参照する。図面において、文脈が別段の指示をしない限り、類似の記号は、典型的には、類似の構成要素を特定する。詳細な説明、図面、および特許請求の範囲に記載されている代替の例示は、限定することを意味するものではない。本明細書で提示された主題の趣旨または範囲から逸脱することなく、他の代替案を使用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書に一般的に記載され、図に示した態様は、種々様々の異なる構成で配置、置換、組合せ、および設計を行うことができ、それらのすべては明示的に企図され本出願の一部となることは容易に理解されよう。
【００３２】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術分野の用語、表記法、および他の科学用語または専門用語は、本出願が関係する当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。ある場合には、一般に理解されている意味を有する用語は、明確性および／または即時参照するために本明細書において定義されており、本明細書にそのような定義を包含することは、当技術分野で一般に理解されているものに対する本質的な相違を表すものと解釈されるべきではない。本明細書で説明または言及した技術および手順の多くは、当業者によって十分に理解されており、従来の方法を使用して一般に使用される。
【００３３】
いくつかの定義
単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明確に他のことを示さない限り、複数の言及を含む。例えば、用語の「細胞」とは、１つまたは複数の細胞を含み、それらの混合物を含む。「Ａおよび／またはＢ」は、本明細書では、以下の選択肢：「Ａ」、「Ｂ」、「ＡまたはＢ」、ならびに「ＡおよびＢ」のすべてを含むように使用される。
【００３４】
用語の「約」とは、本明細書で使用される場合、およそのその通常の意味を有する。近似の程度が文脈から明らかでない場合、「約」とは、提供した値を含むすべての場合において、提供した値のプラスもしくはマイナス１０％以内、または最も近い有効数字に四捨五入されることを意味する。範囲が提供されている場合、それらには境界値が含まれる。
【００３５】
用語の「抗原決定基」または「エピトープ」とは、本明細書で使用される場合、免疫系、例えば、抗体、Ｂ細胞（例えばＢリンパ球）および／またはＴ細胞により認識される、抗原（例えばポリペプチド）の一部、例えば、抗原の一次、二次、三次、または四次構造の一部を意味する。いくつかの実施形態では、抗原決定基は、抗原の表面上の部位である。いくつかの実施形態では、抗原決定基は、抗体分子が抗原に結合する部位である。用語の「交差反応性抗原決定基」とは、同一抗体によって結合される２つ以上の異なる抗原分子（例えばポリペプチド）上に存在する抗原決定基の能力を意味する。さらに、同一抗体によって結合され得る抗原決定基を含む２つ以上の抗原分子は、例えば、同一分子もしくはその断片、互いのバリアント、または異なる分子であり得ることは理解されよう。同一抗体によって結合され得る交差反応性抗原決定基を含むポリペプチドに関する例として、ポリペプチドは、同一のまたは異なる一次アミノ酸配列を有することができるが、ポリペプチドはそれぞれ同一抗体によって結合され得る抗原決定基（例えば「交差反応性」）を含む。
【００３６】
用語の「由来する」とは、本明細書で使用される場合、起源または供給源を意味し、天然、組換え、未精製または精製の分子を含み得る。本開示の分子は、ウイルスまたは非ウイルス分子に由来し得る。元のタンパク質またはポリペプチドに由来するタンパク質またはポリペプチドは、元のタンパク質またはポリペプチドを部分的または全体的に含むことができ、元のタンパク質またはポリペプチドの断片またはバリアントであってもよい。いくつかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンは実質的にウイルスゲノムであり、これは、配列が宿主細胞内または処理した生物内で自律的に複製するのに十分なレプリコンの遺伝情報は含むが、完全な野生型ウイルスゲノムではないことを意味する。
【００３７】
用語の「遺伝子」とは、タンパク質をコードする、または機能性ＲＮＡに転写することができる核酸分子の任意のセグメントを意味するために幅広く使用される。遺伝子は、転写されるが、最終の成熟および／または機能性ＲＮＡ転写物の一部でない配列を含んでいてもよく、またタンパク質をコードする遺伝子は、転写されるが翻訳されない配列、例えば、５’非翻訳領域、３’非翻訳領域、イントロンなどをさらに含んでいてもよい。さらに、遺伝子は、それらの発現に必要な制御配列を任意選択でさらに含んでいてもよく、そのような配列は、例えば、転写または翻訳されない配列であってもよい。遺伝子は、目的の供給源からクローニングすること、または既知のもしくは予測した配列情報から合成することを含む、様々な供給源から取得することができ、所望のパラメーターを有するように設計された配列を含んでいてもよい。
【００３８】
用語「免疫応答」または「免疫」とは、本明細書で同義的に使用される場合、体液性応答（例えばＢ細胞）および／または細胞性応答（例えばＴ細胞）の誘導を意味する。適切には、体液性免疫応答は、宿主への１つまたは複数の抗原の導入に応答して免疫化した動物の血清中に存在する抗原特異的抗体を測定することにより評価することができる。以下のいくつかの例示的な実施形態では、免疫応答は、下記の実施例１で論じているように、免疫化動物由来の脾細胞に対する酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳｐｏｔ）アッセイによって、または免疫化した動物の血清の酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価される。用語の「免疫原」または「免疫原性」とは、特異的免疫応答を誘導する分子を意味する。
【００３９】
核酸分子、ポリペプチド、およびＲＮＡレプリコンに関して本明細書で使用される場合の用語「改変された」および「配列改変」とは、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列が天然のもの（例えば、野生型または未改変）とは異なる核酸分子、ポリペプチド、およびＲＮＡレプリコンを定義するものとする。用語「天然の」および「野生型」とは、本明細書で使用される場合、天然で確認される形態を意味する。例えば、天然の、未改変の、または野生型の核酸分子、ヌクレオチド配列、ＲＮＡレプリコン、またはタンパク質は、天然の供給源に存在し、そこから単離され、人間の操作によって故意に改変されていない物であり得る。以下に詳細に記載されているように、本開示のいくつかの実施形態による核酸分子、ポリペプチド、およびＲＮＡレプリコンは、改変された核酸分子、ポリペプチド、およびＲＮＡレプリコンであり、したがって、それらは非天然のＲＮＡレプリコンである。
【００４０】
用語の「プライム」および「ブースト」とは、当技術分野におけるそれらの通常の意味を有するものとする。「プライミング」とは、対象を第１の抗原組成物で免疫化し、同一抗原または類似抗原へのその後の曝露（複数可）の際にリコールされ得る抗原に対する対象の免疫を誘導することを意味する。いくつかの実施形態では、プライミングは、単一の抗原組成物、例えば、プライミング組成物単独またはブースティング組成物単独による免疫化によって得られる免疫応答レベルよりも、同一抗原組成物または関連の抗原組成物（例えば、少なくとも１つの交差反応性抗原決定基を有する抗原を含む組成物）による後続の免疫化（「ブースティング」）の際に抗原への免疫応答のより高いレベルを誘導する。「ブースター投与」とは、より早期の（プライム）投与後の抗原組成物（例えばワクチン）の投与を意味する。対象への最初の免疫化（例えば、プライミング組成物の投与）の後、いくつかの実施形態では、ブースター投与は、同一免疫原性抗原、または少なくとも１つの交差反応性抗原決定基を有する抗原への再曝露のために、プライミング組成物で使用した抗原とともに同じ対象に１回または複数回投与することができる。
【００４１】
本明細書で同義的に使用される用語の「ＲＮＡレプリコン」および「レプリコンＲＮＡ」とは、許容細胞内でそれ自体の増幅または自己複製を指示するために必要とされるすべての遺伝情報を含有するＲＮＡを意味する。それ自体の複製を指示するために、ＲＮＡ分子は、１）ポリメラーゼ、レプリカーゼ、またはウイルスもしくは宿主細胞由来のタンパク質、核酸もしくはリボ核タンパク質と相互作用しＲＮＡ増幅プロセスを触媒することができる他のタンパク質をコードし；２）サブゲノムレプリコンにコードされたＲＮＡの複製および転写に必要とされるｃｉｓ作用性ＲＮＡ配列を含有する。これらの配列は、複製のプロセス中にその自己コード化タンパク質、または非自己コード化細胞由来のタンパク質、核酸もしくはリボ核タンパク質、または任意のこれらのコンポーネント間の複合体に結合され得る。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡレプリコン分子は、典型的には、以下の順序のエレメントを含有する：複製のためにｃｉｓで必要とされる５’ウイルスＲＮＡ配列（複数可）、生物学的に活性な非構造タンパク質をコードする配列、サブゲノムＲＮＡのプロモーター、複製のためにｃｉｓで必要とされる３’ウイルス配列、および連続するポリアデニル酸（polyadenylate tract）。さらに、ＲＮＡレプリコンは、正極性または「メッセージ」センスの分子である可能性があり、ＲＮＡレプリコンは、任意の既知の天然ＲＮＡウイルスの長さとは異なる長さであってもよい。本開示のいくつかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、野生型ウイルスゲノムに存在する構造ウイルスタンパク質の配列のうちの少なくとも１つを欠損しているか、または機能的に欠損している可能性がある。機能的に欠損するとは、構造ウイルスタンパク質が、それらが通常の自然な機能を実行することを可能にする量または形態で存在しないことを意味する。多くの実施形態では、構造遺伝子をコードする配列は、１つまたは複数の異種配列、例えば、目的の遺伝子（ＧＯＩ）をコードする配列で置換することができる。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、例えば、対象患者に対する抗原もしくは抗原決定基（例えば、本明細書で記載した抗原）であるポリペプチドをコードする配列、抗体、または抗体の断片であり得る。ＲＮＡレプリコンが組換えアルファウイルス（alphavirus）粒子にパッケージングされるこれらの場合において、それは、粒子形成につながるアルファウイルス（alphavirus）構造タンパク質との相互作用を開始するように機能する１つまたは複数の配列、いわゆるパッケージングシグナルを含有していなければならない。本発明のＲＮＡレプリコンは、自己増幅する能力を有することができ、宿主細胞または動物細胞内で自己増幅することができる。様々な態様では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも１ｋｂまたは少なくとも２ｋｂまたは少なくとも３ｋｂまたは少なくとも４ｋｂまたは少なくとも５ｋｂまたは少なくとも６ｋｂまたは少なくとも７ｋｂまたは少なくとも８ｋｂまたは少なくとも１０ｋｂまたは少なくとも１２ｋｂまたは少なくとも１５ｋｂまたは少なくとも１７ｋｂまたは少なくとも１９ｋｂまたは少なくとも２０ｋｂのサイズであることが可能であり、あるいは１００ｂｐ〜８ｋｂまたは５００ｂｐ〜８ｋｂまたは５００ｂｐ〜７ｋｂまたは１〜７ｋｂまたは１〜８ｋｂまたは２〜１５ｋｂまたは２〜２０ｋｂまたは５〜１５ｋｂまたは５〜２０ｋｂまたは７〜１５ｋｂまたは７〜１８ｋｂまたは７〜２０ｋｂのサイズであることが可能である。分子（例えば、核酸、ポリペプチド、または抗体分子）の「断片」は、核酸については、少なくとも１０または少なくとも２０または少なくとも３０または少なくとも５０または少なくとも７５または少なくとも１００または少なくとも２００または少なくとも３００または少なくとも５００、または少なくとも１ｋｂまたは少なくとも２ｋｂまたは少なくとも３ｋｂまたは少なくとも５ｋｂのヌクレオチド、またはポリペプチド分子についてはアミノ酸を含有する。また断片は、特異的結合分子の結合ドメインでもあり得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡレプリコンはウイルスベクターではなく、ウイルスタンパク質（例えば、ウイルスベクター上にコードされているキャプシドタンパク質）を利用して、その核酸を宿主細胞に送達する。本発明のＲＮＡレプリコンは、キャプシドまたはウイルス粒子を欠損している、機能的に欠損している、もしくは有していない可能性があるか、またはキャプシドにキャプシド化されない、もしくはウイルス粒子に含まれ得ない。
【００４２】
本発明のＲＮＡレプリコンは、天然または野生型ウイルス（例えば、本明細書で記載したＲＮＡウイルスまたはレトロウイルス）に由来することがあり、このことは、レプリコンが野生型ウイルスゲノムから改変されたことを意味する。本発明のＲＮＡレプリコンは、野生型ウイルスゲノム中に存在しない配列、例えば、１つもしくは複数の異種配列（例えば１つもしくは複数の目的の遺伝子）および／または本明細書で記載した他の配列もしくは改変を含むことができる。またＲＮＡレプリコンは、野生型ゲノム（例えばウイルス構造タンパク質）から欠失された、または機能的に欠失された１つまたは複数の配列を有することもできる。配列は、通常で自然な機能の実行を可能にする量または形態で存在しない場合、機能的に欠失される。例えば、配列は完全にもしくは実質的に欠失され得るか、または通常で自然な機能を実行しないように短縮することができる。異なる実施形態では、本発明のＲＮＡレプリコンは、野生型ゲノムの配列と少なくとも少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％または少なくとも９５％または８０〜９９％または９０〜９５％または９０〜９９％または９５〜９９％または９７〜９９％または９８〜９９％の配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、配列同一性のパーセントは、レプリコン（例えば目的の遺伝子）上に存在し得る１つまたは複数の異種配列をカウントせずに、および／または野生型ゲノム（例えば１つもしくは複数の構造遺伝子）中に当然存在し得る１つもしくは複数の配列の欠失をカウントせずに計算され得る。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示したＲＮＡレプリコンは、操作された合成の、または組換えのＲＮＡレプリコンである。本明細書で使用される場合、用語の組換えとは、ポリヌクレオチドの人間の操作による、または間接的ではあるがその操作から結果的に生じる、任意の分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡなど）を意味する。非限定的な例として、ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのポリメラーゼ反応によって生成された、もしくはリンカーに結合された、またはベクター、例えばクローニングベクターもしくは発現ベクターなどに組み込まれた、任意の核酸分子などの組換えＤＮＡ分子である。非限定的な例として、組換えＲＮＡレプリコンは、以下のうちの１つまたは複数であり得る：１）例えば、化学的または酵素的技術（例えば、化学的核酸合成の使用による、または複製、重合、エキソヌクレアーゼによる消化、エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、逆転写、転写、塩基改変（例えばメチル化を含む）のための酵素の使用による、または核酸分子の組換え（相同および部位特異的組換えを含む）を使用し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成または改変される；２）自然界で連結されていないヌクレオチド配列と連結される；３）天然のヌクレオチド配列に関して１つまたは複数のヌクレオチドを欠損する分子クローニング技術を使用して操作される；４）天然のヌクレオチド配列に関して１つもしくは複数の配列変化または再配列を有するように分子クローニング技術を使用して操作される。
【００４４】
本明細書で使用したタンパク質の「バリアント」という用語は、少なくとも１つのアミノ酸が改変された、例えば、それぞれ欠失され、挿入され、または置き換えられていることを除き、基準タンパク質と同一のまたは本質的に同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを意味する。アミノ酸の置き換えは、好ましくはタンパク質中の非必須アミノ酸残基での保存的アミノ酸置換であってもよい。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置き換えられるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野において公知である。これらのファミリーは、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン、およびヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、およびグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、およびシステイン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、およびトリプトファン）、ベータ分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、スレオニン、バリン、およびイソロイシン）、ならびに芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびヒスチジン）を含む。タンパク質のバリアントは、タンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約８０％、９０％、９５％、９８％、または９９％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％の同一であるアミノ酸配列を有し得る。好ましくは、バリアントは、タンパク質と同じ機能を保持するタンパク質の機能的バリアントである。
【００４５】
また本開示の目的は、本明細書に記載したポリヌクレオチドのバリアントである。そのようなバリアントは、同一のもしくは異なる種に由来する相同ポリヌクレオチドを含む、天然のものであり得るか、または非天然のバリアント、例えば、化学合成方法を使用して合成されたポリヌクレオチド、もしくは組換えＤＮＡ技術を使用して生成されたポリヌクレオチドであり得る。ヌクレオチド配列に関して、遺伝コードの縮重は、遺伝子から産生されるポリペプチドのアミノ酸配列を変化させることなく、遺伝子のタンパク質コード配列の少なくとも１つの塩基を異なる塩基で置換する可能性を提供する。したがって、本開示のポリヌクレオチドはまた、遺伝コードの縮重に従って置換により本明細書で開示した任意のポリヌクレオチド配列から変化した任意の塩基配列を有していてもよい。コドンの使用を説明する参考文献は、容易に広く利用することができる。さらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列バリアントは、例えば、特定の宿主のコドン発現を最適化する（例えば、ウイルスｍＲＮＡ中のコドンを他の生物、例えば哺乳動物または魚類種により好まれるものに変化させる）ために、様々な理由で産生され得る。
【００４６】
当業者には理解されるように、書面による説明を提供する観点などのいずれかの目的およびあらゆる目的のために、本明細書で開示したすべての範囲は、いずれかのおよびあらゆる可能性のある下位範囲およびそれらの下位範囲の組合せも包含する。いずれかのリストした範囲は、少なくとも二等分、三等分、四等分、五等分、十等分などまで分割された同じ範囲を十分に説明し、有効にするものと容易に認識することができる。非限定的な例として、本明細書で論じたそれぞれの範囲は、下位３分の１、中位３分の１および上位３分の１などまで容易に分割することができる。また当業者には理解されるように、「最大で」、「少なくとも」、「〜を超える」、「〜未満」などのすべての用語は、列挙した数値を含み、また上記で論じたように、続いて下位範囲に分割することができる範囲を意味する。最後に当業者には理解されるように、範囲は、それぞれの個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１〜３個の項目を有する群は、１、２、または３個の項目を有する群を意味する。同様に、１〜５個の項目を有する群は、１、２、３、４、または５個の項目を有する群を意味する等である。
【００４７】
本明細書で説明した方法またはプロセスのいくつかの実施形態では、一時的または操作的順序が明確に列挙されている場合を除き、ステップは、任意の順序で実施することができる。さらに、いくつかの実施形態では、特定したステップは、明確な特許請求の範囲の用語が、それらは別々に実施されることを述べていない限り、同時に実施することができる。例えば、いくつかの実施形態では、Ｘを行うことを特許請求されたステップと、Ｙを行うことを特許請求されたステップは、単一の操作内で同時に実施することができ、結果として生じたプロセスは、特許請求されたプロセスの文字どおりの範囲内に含まれる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「含む（comprising）」とは、「含む（including）」、「含有する（containing）」、または「〜を特徴づける」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で使用される場合、「〜からなる」とは、特許請求した組成物または方法において特定されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。本明細書で使用される場合、「〜から本質的になる」とは、特許請求された組成物または方法の基本的および新規の特徴に実質的に影響しない材料またはステップを除外しない。例えば、組成物の成分の説明における、または方法のステップの説明における用語「含む」の本明細書での任意の列挙は、列挙された成分またはステップから本質的になる組成物および方法、ならびにそれらからなる組成物および方法を包含するものと理解する。
【００４９】
見出し、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｃ）などは、単に本明細書および特許請求の範囲を読みやすくするために示しており、開示の範囲またはその代替案を何ら限定するものではない。本明細書または特許請求の範囲における見出しの使用は、ステップまたは要素がアルファベット順もしくは番号順、またはそれらが示されている順序で実施されることを必要としない。
【００５０】
異種プライム・ブースト免疫の方法
治療または疾患予防のための多回投与免疫接種は、単回投与免疫接種よりもより効果的であることが多いことが報告されている。ワクチン接種後の多数の抗原特異的メモリーＣＤ８  Ｔ細胞の生成は、その数が宿主の免疫化および保護と強く相関しているので、様々な動物およびヒトの疾患に対するワクチン設計に対する望ましいゴールであると一般に考えられている。これらの多数の細胞を生成するアプローチの１つは、プライム・ブースト免疫のプロセスを使用することであり、これは一次メモリー形成後の抗原特異的免疫細胞の再刺激に依存する。そのようなプロセスにおいては、最初に対象に投与される「プライミング」組成物と、その後に１回または複数回投与される「ブースティング」組成物がある。いかなる特定の理論によって縛られるものではないが、ワクチンによる免疫応答のブースティングによって、感染時の病原体に対する保護の媒介に必要なエフェクター細胞がより多く生成されると広く考えられている。
【００５１】
同じ免疫化剤の再投与を利用する同種プライム・ブースト免疫は、ワクチンの初期の開発以来使用されてきた。古典的なワクチン接種のアプローチは同種プライム・ブースト治療法に依存しており、伝統的に、よりやっかいな疾患に取り組むのに十分なほどには強力な免疫応答を誘発することはできなかった。例えば、この方法は、通常、抗原への体液性応答をブーストするのに効果的であるが、プライムされた免疫系による同種ブースティング剤の急速なクリアランスにより、ＣＤ８  Ｔ細胞の数を増加させるにはさほど効果的ではないと一般に考えられており、さらには細胞性免疫（ＣＭＩ）をブーストし損なう。
【００５２】
一方、異種プライム・ブースト免疫、または２つの異なる療法を使用する同一免疫原の投与は、最近、対象における優れた免疫応答を誘発するための方策として開発された。特に、新しいワクチン療法、例えば異種プライム・ブーストなどは、難しい病原体、例えば、マラリア、結核（ＴＢ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、およびエボラなどに対して順調に採用されてきた。異種プライム・ブースト免疫により得られる優れたメモリー応答としては、限定するものではないが、より大規模なＣＤ８＋  Ｔ細胞応答、免疫系によって認識されるＴ細胞エピトープの拡大、およびＴ細胞の多機能性の増加が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明のプライム・ブースト法は、処置した対象におけるＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞の有意な増加をもたらす。様々な実施形態では、有意な増加は、単回用量投与に対して、または同種プライム・ブーストレジメンに対して、少なくとも２５％、または少なくとも５０％、または少なくとも１００％、または少なくとも１５０％、または少なくとも２００％、または少なくとも２５０％、または少なくとも３００％の増加であり得る。さらに、特に、ベクター系ワクチン候補が使用される場合、プライミング後に生成される抗ベクター免疫による干渉を最小限にするので、異種プライム・ブーストのアプローチは、ＣＭＩを効果的にブーストすると報告されている。エフェクター細胞を定量的に増強することとは別に、二次メモリー細胞の質的な違いもブースティングの後に見られる。二次メモリーＣＤ８  Ｔ細胞は、一次メモリー細胞とは対照的に、末梢組織に非常に効率的に移動し、細胞溶解を増強し、侵入部位での病原体への効果的な対抗を促進することを示す。さらに、異種プライム・ブーストの方策は、免疫応答の相乗的増強をもたらし、それにより抗原特異的Ｔ細胞の数の増加、高アビディティーＴ細胞の選択的濃縮、ならびに免疫応答の幅および深さの増加をもたらすことができる。例として、図１は、免疫メモリー応答の規模、長さ、および質のすべてを改善することができるという異種プライム・ブーストレジメンの利点を概略的に示している（Nolz JC and Harty JT, Adv. Exp. Med. Biol., 2011より改変引用した図）。この例では、ブースターワクチン接種を使用して、メモリーＣＤ８  Ｔ細胞の数を増加させている。抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の総数によって決定される、従来のプライム・ブーストレジメンまたは異種プライム・ブーストレジメンに対する免疫応答の規模が経時的にプロットされている。一次ワクチンのチャレンジの後、ＣＤ８  Ｔ細胞は拡大、縮小し、一次メモリー集団を形成する。ＣＤ８  Ｔ細胞のこの一次メモリー集団が同一ワクチン接種（同種ブースト、破線）の二次チャレンジに暴露された場合、拡大、縮小、およびより大きな二次メモリー集団の形成の別のラウンドが生じる。同種ブースターワクチン接種とは対照的に、異なるベクター（異種ブースト、実線）の文脈で送達されるＣＤ８  Ｔ細胞抗原の投与は、一次メモリーＣＤ８  Ｔ細胞のさらなる拡大を促進し、同種ブースターワクチン接種で見られたものよりも大きな二次メモリー集団がもたらされる。
【００５３】
異種プライム・ブーストは、ある特定の設定で応答を高めることが報告されているが、すべての組合せが免疫力の改善を示しているわけでなく、どの組合せが効果的であるかを決定する重要性を示している。広く、耐久性、および持続性のある免疫を誘発するワクチンの組合せの発見は、確実な保護を付与するために重要である。より詳しくは、アルファウイルス（Alphavirus）由来のレプリコン、例えば、シンドビスウイルス（Sindbis virus）、ＶＥＥウイルス、およびセムリキフォレストウイルス（Semliki forest virus））などは、すべて、タンパク質、ＤＮＡ、およびビロソームと組み合わせて異種プライム・ブースト設定で使用されてきた。これらは、ヒトパピローマウイルス（human papillomavirus、ＨＰＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（human immunodeficiency virus、ＨＩＶ）に対する小動物モデル、例えばマウスにおいて、ならびにデング熱については粒子形態で送達されるレプリコンによるＮＨＰにおいて、免疫化に効果的であることが証明されている。さらに、完全合成されたアルファウイルス由来のレプリコンは、同種プライム・ブースト療法において広く使用されてきた。それまで、広く使用されてきた唯一の完全合成レプリコン系は、非構造的タンパク質が保持され、構造タンパク質が目的の遺伝子と置き換えられている、ウイルスのアルファウイルス（Alphavirus）ファミリーに由来していた。しかし、新しいレプリコンの操作における最近の進歩により、新しいタイプのレプリコンが産生され、合成レプリコンだけを使用して新しいワクチン療法を発見することが可能になった。
【００５４】
同様に、タンパク質の治療的投与に対する古典的なアプローチは、慣例的に、所望の臨床効果を有するのに十分な高用量のタンパク質の外因性注射に依存してきた。より最近では、核酸系またはウイルス系のベクターを使用して配列を宿主細胞に送達し、それにより目的の所望するタンパク質が発現されている。しかし、ｍＲＮＡなどの厳密に核酸に基づいた送達方法は、比較的非免疫原性であるが、耐久性がなくタンパク質の持続的な発現を有していない。反対に、ウイルス由来の方法は、より耐久性があり持続的なタンパク質の発現が可能であるが、また本質的に免疫原性でもある。これは、タンパク質を産生する細胞に対する免疫応答をもたらすことがあり、時には抗薬物抗体の形態でタンパク質自体をもたらすことがある。またタンパク質送達のウイルス系の方法は、コストがより高く、より製造が複雑となる傾向があり、この技術がどの程度広く使用され得るかを制限している。この理由のため、免疫系を活性化する免疫学的に異なる機序を有するレプリコンを使用すると、治療用タンパク質のより持続的な発現を可能にする反復注射の増加またはより多様な回数が可能となり得る。またこのアプローチは、産生される治療用タンパク質のレベルを低下させる抗薬物抗体の形成を制限するのに有用であることも予想される。
【００５５】
一態様では、本開示の様々な実施形態は、一般に、治療および／または予防用途、例えばワクチン接種および／または免疫化の用途のために、２つのＲＮＡレプリコンを対象に送達する方法に関する。一態様では、本明細書に開示したいくつかの実施形態は、対象における免疫応答を誘導する方法であって、第１の抗原をコードする第１のＲＮＡレプリコンを含むプライミング組成物の少なくとも一用量を対象に投与することと；続いて、第２の抗原をコードする第２のＲＮＡレプリコンを含むブースティング組成物の少なくとも一用量を対象に投与することとを含み、第１および第２のＲＮＡレプリコンが互いに異なる、方法に関する。いくつかの実施形態では、第１の抗原と第２の抗原は、互いに同一である。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列と第２の抗原のアミノ酸配列は、互いに相同である。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンと第２のＲＮＡレプリコンは、異なる属のＲＮＡウイルスのゲノムに由来する。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、少なくとも１つの交差反応性抗原決定基を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、対象において実質的に同じ免疫応答を誘導する。
【００５６】
いくつかの実施形態では、プライミング組成物は、対象に単回投与で投与される。いくつかの実施形態では、プライミング組成物は、対象に多回投与で投与される。いくつかの実施形態では、ブースティング組成物は、対象に単回投与で投与される。いくつかの実施形態では、ブースティング組成物は、対象に多回投与で投与される。いくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、対象に少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、もしくは少なくとも１０回の連続投与またはそれらの間の任意の回数の投与で投与される。いくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、対象に少なくとも１０、少なくとも１２、少なくとも１４、少なくとも１６、または少なくとも２０回の連続投与またはそれらの間の任意の回数の投与で投与される。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、プライミングでの高抗原用量は一般にはエフェクター細胞の誘導に好ましいとされるが、より低用量は免疫メモリーの誘導を優先的に駆動すると一般的に考えられている。したがって、より高用量のプライミング組成物は即時応答には望ましいが、メモリー細胞の発達に影響し、高用量の効果を逆に妨げる可能性がある。プライム用量とは反対に、抗原の利用可能性が高くなると数多くのメモリーＢ細胞が分化され、それにより応答が増幅されるので、より高用量のプースト組成物はより大きな免疫応答を誘導することが明らかになっている。いくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、対象に約０．００１ｍｇ／ｋｇ体重〜約５０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲の多回投与で投与することができる。この用量範囲は、２５ｇのマウスに対して製剤化した状態のＲＮＡレプリコン約０．０２５μｇ〜５０μｇに相当する。いくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物の好ましい用量は、製剤化された状態で１μｇ未満のＲＮＡレプリコンを含む。いくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物の好ましい用量は、約１００μｇ、約２００μｇ、約３００μｇ、約４００μｇ、約５００μｇ、約６００μｇ、約７００μｇの非製剤化の状態のＲＮＡレプリコン（例えば、生理食塩水中のネイキッドＲＮＡ）を含む。様々な実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのいずれかまたは両方は、ネイキッドＲＮＡとして（例えば生理食塩水中で）投与することができるか、またはいずれかもしくは両方をナノ粒子に含めて投与することができるか；またはいずれか一方をネイキッドＲＮＡとして投与し、他方をナノ粒子として投与することもできる。小動物モデルが関与するいくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、約０．０１μｇ〜約３０μｇの範囲の一用量または多用量で対象に投与することができる。大型動物モデルおよびヒトが関与するいくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、約０．１μｇ〜約１００μｇの範囲の一用量または多用量で対象に投与することができる。いくつかの実施形態では、小動物モデルに適した用量は、約５×１０−５μｇ／１００ｍｇ〜約０．１５μｇ／１００ｍｇの範囲である。この用量範囲は、２０ｇのマウスに対する約０．０１μｇ〜約３０μｇに相当する。いくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、２０ｇのマウスに対して用量当たり約１５μｇの多用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、例えば大型動物モデル、例えばヒトの場合、適切な用量は、約１．２５×１０−７μｇ／１００ｍｇ〜１．２５×１０−４μｇ／１００ｍｇの範囲である。この用量範囲は、８０ｋｇの宿主に対して約０．１μｇ〜約１００μｇ用量に相当する。いくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、製剤化した状態で全身用量当たり約０．００１μｇ、約０．０１μｇ、約０．１μｇ、約１μｇ、約１０μｇ、約１００μｇ、約２００μｇ、約３００μｇのＲＮＡの多用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、全身用量当たりの約５０μｇのＲＮＡの多用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、経時的に徐々に増加する用量で投与される。いくつかの実施形態では、プライミング組成物および／またはブースティング組成物は、経時的に徐々に減少する用量で投与される。
【００５７】
本明細書で開示した方法のいくつかの実施形態では、免疫スケジュールが重要であり得る。例えば、遅延ブースティングは、プライムによって誘導される一次応答の干渉を回避するのに有用である。近い間隔（例えば１〜２週間）のワクチン用量は、免疫応答の急速な誘導を引き起こし得るが、いくつかの実施形態では、同数のワクチン用量がより長い間隔（例えば１〜２カ月）で投与された場合よりも応答は持続されない可能性がある。１〜２週間の最小限の間隔でも、メモリーＢ細胞の最適な親和性成熟が保証され得る。本明細書で開示した方法のいくつかの実施形態では、プライミング組成物およびブースティング組成物の少なくとも一用量は、約１週間、または２、３、４、５、６、７、もしくは８週間、または１〜２もしくは２〜４もしくは３〜４週間の間隔で対象に投与される。本明細書で開示した方法のいくつかの実施形態では、プライミング組成物およびブースティング組成物の少なくとも一用量は約４週間の間隔で対象に投与される。任意の特定の対象については、特定の投与レジメンが、個人の必要性と、組成物の投与を管理または監督する人の専門的な判断に従って経時的に調整することができることは当業者にはさらに理解されよう。例えば、用量は、投与された組成物の臨床効果、例えば、毒性作用および／または実験値に基づいて調整することができる。投与レジメンは、最適な所望効果を提供するように調整することができる。例えば、上で論じたように、単回用量を投与することができ、いくつかの分割用量を経時的に投与することができ、または治療の状況の緊急状態により示したように用量は比例的に減少または増加させることができる。本明細書で開示した組成物を投与するための適切な用量およびレジメンの決定は、関連する技術分野で周知であり、本明細書で開示した教示を提供した場合、当業者によって包含されることが理解されよう。
【００５８】
したがって、本明細書で提供された開示に基づいて、用量および投与レジメンが治療分野において周知の方法に従って調整されることは当業者には理解されよう。すなわち、最大許容用量を容易に確立することができ、検出可能な治療上の利益を対象に提供するための有効量も、検出可能な治療上の利益を患者に提供するために各薬剤を投与する時間的要件と同様に決定することができる。したがって、特定の用量および投与レジメンが本明細書では例示されているが、これらの例は、本開示を実施する際に患者に提供することができる用量および投与レジメンを決して限定するものではない。
【００５９】
本明細書で開示したプライミングおよびブースティング組成物の投与は、作用部位への組成物の送達を可能にするあらゆる方法によって影響を受け得る。これらの方法は、経口経路、十二指腸内経路、非経口注射（静脈内、皮下、筋肉内、血管内、または注入を含む）、局所投与、および直腸投与を含む。注入は、点滴、持続注入、注入ポンプ、定量ポンプ、デポ製剤、または他の適切な手段により投与することができる。いくつかの実施形態では、プライミング組成物の少なくとも一用量は、対象に筋肉内投与される。いくつかの実施形態では、少なくとも一用量のブースティング組成物は、対象に筋肉内投与される。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ブースティング組成物の少なくとも一用量は、少なくとも１つの交差反応性エピトープを含む異なるタイプの抗原を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示した異種プライム・ブースト免疫化の方法は、複数のブースティング組成物の１つがプライミング組成物で使用されたものと同一のＲＮＡレプリコンを含む免疫レジメンを包含するものであり、したがって、同一のまたは異なる用量いずれかの「同種ブースト」は、ブースティング組成物の複数回の投与のうちの少なくとも１つである限り、プライミング組成物で使用されるものとは異なるＲＮＡレプリコンを含む。
【００６１】
いくつかの実施形態では、プライミング組成物中の第１の抗原は、ブースティング組成物中の第２の抗原と同一の抗原であり得る。いくつかの実施形態では、第１の抗原および第２の抗原は、同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列の一部（例えば、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）である。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、互いに相同（例えば、実質的に同一）であるアミノ酸配列を含む。２つ以上のポリマー分子、例えばポリペプチドのアミノ酸配列の文脈において本明細書で使用される場合の「同一の」または「同一性パーセント」という用語は、ポリマー分子間の配列類似性を意味する。２つのアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的なまたは完全な同一性がある場合、相同（例えば実質的に同一）である。例えば、８０％同一とは、２つの配列が最大マッチングのために配列比較されている場合、アミノ酸の８０％が同一であることを意味する。そのような場合、用語の「実質的に同一」とは第２のアミノ酸配列に対して十分なまたは最小数の同一のまたは同等の（例えば類似の側鎖を有する）アミノ酸を含有する第１のアミノ酸を意味し、その結果、第１および第２のアミノ酸配列は、共通のドメイン、例えば、免疫学的抗原決定基（例えばエピトープ）を有する。例えば、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらの値のいずれか２つの間の範囲の配列同一性を示し得る。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と少なくとも９５％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と少なくとも９８％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と少なくとも９９％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と少なくとも１００％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と同一である。
【００６２】
本明細書で使用される場合、用語の「同一」または「同一性」パーセントとは、２つ以上の核酸配列またはポリペプチド配列の文脈において、比較ウィンドウ上で最大の一致が得られるように比較およびアラインされた場合、同一であるか、または特定のパーセンテージの同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドを有する２つ以上の配列または部分配列を意味する。特に指示のない限り、選択された配列、例えば「配列番号Ｘ」の比較ウィンドウは、配列番号Ｘの全長であり、例えば「配列番号Ｘの１００ｂｐ」の比較ウィンドウは明示した１００ｂｐである。アミノ酸配列または核酸配列の同一性の程度は、指定したプログラムパラメーターに基づいて比較される配列をアラインするための様々なコンピュータープログラムによって決定することができる。例えば、配列は、Smith & Waterman Adv. Appl. Math. 2:482-89, 1981の局所相同性アルゴリズム、Needleman & Wunsch J. Mol. Biol. 48:443-53, 1970の相同性アラインメントアルゴリズム、またはPearson & Lipman Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444-48, 1988の類似性探索方法を使用してアラインし比較することができ、また目視検査に基づいてアラインし比較することができるか、または分析にコンピュータープログラム（例えば、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）を使用することができる。
【００６３】
配列同一性パーセントの計算に加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も実行する（例えば、Karlin & Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90:5873-87, 1993を参照されたい）。最小合計確率（Ｐ（Ｎ））は、２つのヌクレオチド配列またはアミノ酸配列間の一致が偶然生じる確率の指標を提供する。例えば、試験核酸と参照核酸との比較における最小合計確率が約０．１未満、好ましくは約０．０１未満、より好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は参照配列に類似していると考えられる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、少なくとも１つの交差反応性抗原決定基を含む。用語の「エピトープ」または「抗原決定基」とは、本明細書で同義的に使用される場合、Ｂ細胞（例えばＢリンパ球）によって認識される抗原分子（例えばポリペプチド）、およびＢ細胞によって分泌される抗体の一次、二次、三次または四次構造を意味する。エピトープは、線状または立体構造であり得る。一般に、エピトープは、特有の空間構造に少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の連続アミノ酸または非連続アミノ酸を含む。用語の「エピトープ」および「抗原決定基」に包含されるのは、少数の連続アミノ酸残基のみを含む単純エピトープ、ならびに不連続アミノ酸残基を含む複雑エピトープである。いくつかの場合において、複雑エピトープは一次配列において単離されたアミノ酸残基を含むが、抗原の三次元折り畳み構造においては近接して単離されたアミノ酸残基を含む。用語の「交差反応性抗原決定基」または「交差反応性エピトープ」とは、同一抗体によって結合される２つ以上の抗原分子（例えばポリペプチド）上に存在する抗原決定基の能力を意味する。さらに、同一抗体によって結合され得る抗原決定基を含む２つ以上の分子は、例えば、同一分子もしくはその断片、互いのバリアント、または異なる分子であり得ることは理解されよう。例として、同一抗体によって結合され得る抗原決定基を含むポリペプチドに関して、ポリペプチドは、同一のまたは異なる一次アミノ酸配列を有することができるが、ポリペプチドは、同一抗体によって結合することが可能な抗原決定基（例えば「交差反応性」）をそれぞれ含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、対象において実質的に同じ免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、用語の「実質的に同じ免疫応答」とは、例えば、第１の抗原に対して誘導される抗体の濃度が、同一条件下で試験した第２の抗原に対して誘導される抗体の濃度とほぼ同じであるか、またはその濃度の少なくとも約７５％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％である場合を意味し得る。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、対象において同じ免疫応答を誘導し、例えば、第１の抗原に対して誘導される抗体の濃度は、同一条件下で試験した第２の抗原に対して誘導される抗体の濃度と同一である。
【００６５】
いくつかの実施形態では、「実質的に同じ免疫応答」という用語は、例えば、第１の抗原に対して誘導される抗体プロファイルのタイプがほぼ同じであるか、または同一条件下で試験した第２の抗原に対して誘導されるタイプの抗体プロファイルと少なくとも約７５％、もしくは少なくとも約８０％、もしくは少なくとも約９０％、もしくは少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９９％同一である場合を意味し得る。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、対象において同じ免疫応答を誘導し、例えば、第１の抗原に対して誘導される抗体プロファイルのタイプは、同一条件下で試験した第２の抗原に対して誘導される抗体プロファイルのタイプと同一である。
【００６６】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは、異なる免疫学的機序を介して対象の免疫系を活性化することができ、例えば、対象患者の免疫系を差次的に関与させ、または活性化することができる。例えば、いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、第２のＲＮＡレプリコンが対象における免疫系を活性化することができる免疫機序の１つもしくは複数と、またはいずれかとは異なる免疫学的機序を介して、対象の免疫系を活性化することができる。いくつかの実施形態では、第１および第２のそれぞれのＲＮＡレプリコンは、独立して、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の免疫学的機序を介して、対象の免疫系を活性化することが可能である。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは、１つ、２つ、３つ、またはそれ以上の一般的な免疫学的機序を介して、免疫系を活性化することができる；しかし、第１のＲＮＡレプリコンによって利用される免疫学的機序のうちの少なくとも１つは、第２のＲＮＡレプリコンによって利用される免疫学的機序のそれぞれとは異なる。第１および／または第２のレプリコンが免疫系を活性化することができる免疫学的機序の非限定的な例としては、（１）別個のまたは関連するレプリコンの非構造タンパク質によってコードされている宿主細胞免疫回避の異なる活性機序；（２）宿主細胞の免疫がレプリコン自体を認識するための異なる受動的機序；および（３）１回目と２回目の注射中に免疫系を差次的に関与させ、または活性化するように機能する免疫調節タンパク質の共コード化が挙げられる。本開示のいくつかの実施形態では、２つ以上の免疫学的機序のうちの少なくとも１つは、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子Ｉ（ＲＩＧ−Ｉ）、オートファジー経路、トール様受容体（ＴＬＲ）、ストレス顆粒、ＲＮａｓｅ  Ｒ、およびオリゴアデニル酸合成酵素（ＯＡＳ）の差次的活性化からなる群から選択される。
【００６７】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、改変レプリコンである。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは、プラス鎖ＲＮＡウイルスに由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、トガウイルス（Togaviridae）科、フラビウイルス（Flaviviridae）科、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科、ラブドウイルス（Rhabdoviridae）科、アルテロウイルス（Arteroviridae）科、ピコルナウイルス（Picornaviridae）科、アストロウイルス（Astroviridae）科、コロナウイルス（Coronaviridae）科、およびパラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科からなる群から選択される科に属するウイルス種に由来する。したがって、いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスに由来する。適切なマイナス鎖ＲＮＡウイルス種としては、限定するものではないが、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科、ラブドウイルス（Rhabdoviridae）科、およびパラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科が挙げられる。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科に属するウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、インフルエンザウイルスＡ（Influenza virus A）、インフルエンザウイルスＢ（Influenza virus B）、インフルエンザウイルスＣ（Influenza virus C）、インフルエンザウイルスＤ（Influenza virus D）、イサウイルス（Isavirus）、ソゴトウイルス（Thogotovirus）、およびクアランジャウイルス（Quaranjavirus）からなる群から選択されるオルソミクソウイルス（Orthomyxovirus）属に属するウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、インフルエンザウイルス（Influenza virus）に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、インフルエンザウイルスＡ（Influenza virus A）に由来する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、ラブドウイルス（Rhabdoviridae）科に属するウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、キュリオウイルス（Curiovirus）、サイトラブドウイルス（Cytorhabdovirus）、ジコルハウイルス（Dichorhavirus）、エフェメロウイルス（Ephemerovirus）、ハパウイルス（Hapavirus）、レダンテウイルス（Ledantevirus）、リッサウイルス（Lyssavirus）、ノビラブドウイルス（Novirhabdovirus）、ヌクレオラブドウイルス（Nucleorhabdovirus）、ペルハブドウイルス（Perhabdovirus）、シグマウイルス（Sigmavirus）、スプリビウイルス（Sprivivirus）、スリプウイルス（Sripuvirus）、チブロウイルス（Tibrovirus）、ツパウイルス（Tupavirus）、バリコサウイルス（Varicosavirus）、ベシクロウイルス（Vesiculovirus）からなる群から選択されるラブドウイルス（Rhabdovirus）属に属するウイルス種に由来する。好ましいラブドウイルス（Rhabdovirus）種の非限定的な例としては、限定するものではないが、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（viral hemorrhagic septicemia virus、ＶＨＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus、ＶＳＶ）、および狂犬病ウイルス（rabies virus、ＲＡＢＶ）が挙げられる。
【００６９】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科に属するウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、ニューモウイルス（Pneumovirinae）亜科またはパラミクソウイルス（Paramyxovirinae）亜科に属するパラミクソウイルス（Paramyxovirus）ウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、アクアパラミクソウイルス（Aquaparamyxovirus）、アブラウイルス（Avulavirus）、フェルラウイルス（Ferlavirus）、ヘニパウイルス（Henipavirus）、メタニューモウイルス（Metapneumovirus）、モルビリウイルス（Morbillivirus）、ニューモウイルス（Pneumovirus）、レスピロウイルス（Respirovirus）、およびルブラウイルス（Rubulavirus）からなる群から選択されるパラミクソウイルス（Paramyxovirus）属に属するウイルス種に由来する。好ましいパラミクソウイルス（Paramyxovirus）種の非限定的な例としては、限定するものではないが、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（human respiratory syncytial virus、ｈＲＳＶ、亜群Ａ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（bovine respiratory syncytial virus、ｂＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス（human metapneumovirus、ｈＭＰＶ）、ウシ−ヒトパラインフルエンザウイルス３（bovine-human parainfluenza virus 3、ｂ／ｈＰＩＶ３）、ヒトパラインフルエンザウイルス１（human parainfluenza virus 1、ｈＰＩＶ１）、組換えウシ−ヒトパラインフルエンザウイルス３（recombinant bovine-human parainfluenza virus 3、ｒＢ／ＨＰＩＶ３）、センダイウイルス（Sendai virus、ＳｅＶ）、アンデスウイルス（Andes virus、ＡＮＤＶ）、ムンプスウイルス（Mumps virus、ＭｕＶ）、シミアンウイルス５（Simian virus 5、ＳＶ５）、および麻疹ウイルス（Measles virus、ＭｅＶ）が挙げられる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、トガウイルス（Togaviridae）科またはフラビウイルス（Flaviviridae）科に属するプラス鎖ウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、フラビウイルス（Flaviviridae）科に属するウイルス種、例えば、フラビウイルス（Flavivirus）属およびペスチウイルス（Pestivirus）属に属するウイルスに由来する。フラビウイルス（Flavivirus）属に属するウイルスの非限定的な例としては、黄熱病ウイルス（yellow fever virus、ＹＦＶ）、デング熱ウイルス（Dengue fever virus）、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus、ＪＥＶ）、西ナイルウイルス（West Nile virus、ＷＮＶ）およびジカウイルス（Zika virus）が挙げられる。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、黄熱病ウイルス（yellow fever virus）またはデング熱ウイルス（Dengue fever virus）に由来する。毒性および非毒性のフラビウイルス（flavivirus）株が両方とも適している。好ましいフラビウイルス（flavivirus）株の非限定的な例としては、限定するものではないが、ＹＦＶ（１７Ｄ）、ＤＥＮ４（８１４６６９および誘導体）、ＤＥＮ２（ＰＤＫ−５３）、クンジンウイルス（Kunjin virus、ＫＵＮ）、ＪＥＶ（ＳＡ１４−１４−２）、マレーバレー脳炎ウイルス（Murray Valley encephalitis virus、ＭＶＥＶ、ＩＲＥＳの減弱化）、ＷＮＶ（ＳＣＦＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（Bovine viral diarrhea virus、ＢＶＤＶ）ＣＰ７、ＢＶＤＶ−ＳＤ１、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ、ならびに古典的豚コレラウイルス（classical swine fever virus、ＣＳＦＶ）が挙げられる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、プラス鎖ウイルス種、例えば、トガウイルス（Togaviridae）科のアルファウイルス（Alphavirus）属に属するウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、アルテリウイルス（Arteriviridae）科のアルテリウイルス（Arterivirus）属に属するプラス鎖ウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、アルテリウイルス（Arteriviridae）科のアルテリウイルス（Arterivirus）属に属するプラス鎖ウイルス種に由来し、他のＲＮＡレプリコンは、トガウイルス（Togaviridae）科のアルファウイルス（Alphavirus）属に属する種に由来する。
【００７２】
アルファウイルス（ALPHAVIRUSES）
アルファウイルス（Alphavirus）は、少なくとも３０のメンバーを含み、それぞれがウイルスのスパイクタンパク質を含有するエンベロープによって囲まれたヌクレオキャプシド中に封入された正極性の一本鎖ＲＮＡゲノムを有する、ＩＶ群トガウイルス（Togaviridae）科の遺伝的、構造的、および血清学的に関連するウイルスの属である。現在、アルファウイルス（alphavirus）属は、特に、シンドビスウイルス（Sindbis virus、ＳＩＮ）、セムリキフォレストウイルス（Semliki Forest virus、ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（Ross River virus、ＲＲＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Venezuelan equine encephalitis virus、ＶＥＥＶ）、および東部ウマ脳炎ウイルス（Eastern equine encephalitis virus、ＥＥＥＶ）を含み、これらはすべて密接に関連しており、様々な脊椎動物、例えば、哺乳動物、げっ歯動物、魚類、鳥類の種、大型哺乳動物、例えば、ヒトおよびウマ、ならびに無脊椎動物、例えば、甲殻類および昆虫などに感染することができる。種と個体の間の伝播は主として蚊を媒介して生じ、アルファウイルス（alphaviruse）をアルボウイルス（Arboviruses）−または節足動物媒介ウイルス（Arthropod-Borne Viruse）の集団への寄与体にする。例えば、シンドビスウイルス（Sindbis viruse）とセムリキフォレストウイルス（Semliki Forest viruse）は広く研究されており、これらのウイルスの生活環、複製の様式などは十分に特徴づけられている。例えば、アルファウイルス（alphaviruse）は動物細胞において非常に効率的に複製することが示されており、このことにより、そのような細胞のタンパク質および核酸を産生するためのベクターとしてそれらは貴重とされている。
【００７３】
アルファウイルス（alphavirus）粒子はエンベロープ化されており、７０ｎｍの直径を有し、球状の傾向があり（わずかに多形性ではある）、約４０ｎｍのアイソメトリックヌクレオキャプシドを有する。アルファウイルス（alphavirus）ゲノムは、約１１〜１２ｋｂの長さの正極性の一本鎖ＲＮＡであり、５’キャップ、３’ポリ−Ａテール、２つのオープンリーディングフレームを含み、第１のフレームは酵素機能を有する非構造タンパク質をコードしており、第２のフレームはウイルス構造タンパク質（例えば、キャプシドタンパク質Ｃ、Ｅ１糖タンパク質、Ｅ２糖タンパク質、Ｅ３タンパク質および６Ｋタンパク質）をコードしている。
【００７４】
アルファウイルス（alphavirus）ゲノムの５’の３分の２は、ウイルスＲＮＡの転写および複製に必要ないくつかの非構造タンパク質をコードしている。これらのタンパク質はＲＮＡから直接翻訳され、細胞タンパク質と一緒にウイルスゲノムの複製およびサブゲノムＲＮＡの転写にとって不可欠なＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを形成する。４つの非構造タンパク質（ｎｓＰ１〜４）は単一ポリタンパク質として産生され、ウイルスの複製機構を構成する。ポリタンパク質のプロセシングは高度に制御された方法で生じ、Ｐ２／３ジャンクションでの切断がゲノム複製中のＲＮＡテンプレート使用に影響を及ぼす。この部位は狭い間隙の基部に位置し、容易にアクセスはできない。切断されると、ｎｓＰ３はｎｓＰ２を包囲する環状構造を形成する。これら２つのタンパク質には、広範囲の界面を有する。非細胞変性ウイルスまたは温度感受性表現型を産生するｎｓＰ２における変異は、Ｐ２／Ｐ３インターフェイス領域でクラスター化する。ｎｓＰ２非細胞変性変異の位置の反対のＰ３変異は、Ｐ２／３の効果的な切断を阻止する。これは、次に、ウイルスＲＮＡ産生レベルを変化させるＲＮＡ感染性に影響を及ぼし得る。
【００７５】
ゲノムの３’の３分の１は、ウイルス粒子の形成に必要とされるすべての構造タンパク質：コアヌクレオキャプシドプロテインＣ、ヘテロダイマーとして会合するエンベロープタンパク質のＰ６２およびＥ１の翻訳テンプレートとして機能するサブゲノムＲＮＡを含む。ウイルスの膜に固定された表面糖タンパク質は、受容体の認識、および膜融合を介した標的細胞への侵入に関与している。サブゲノムＲＮＡは、ｎｓｐ４タンパク質をコードするＲＮＡ配列の３’末端に存在するｐ２６Ｓサブゲノムプロモーターから転写される。Ｐ６２のＥ２およびＥ３へのタンパク質分解的成熟により、ウイルス表面に変化が生じる。Ｅ１、Ｅ２、時にはＥ３、糖タンパク質「スパイク」は一緒にＥ１／Ｅ２二量体またはＥ１／Ｅ２／Ｅ３三量体を形成し、Ｅ２は中心から頂点まで伸展しており、Ｅ１は頂点間のスペースを満たし、Ｅ３は、存在する場合、スパイクの遠位端にある。ウイルスがエンドソームの酸性度に暴露された際、Ｅ１はＥ２から解離してＥ１ホモ三量体を形成するが、これは、細胞膜およびウイルス膜を一緒に駆動する融合ステップに必要である。アルファウイルス（alphavirus）糖タンパク質Ｅ１はクラスＩＩのウイルス融合タンパク質であり、インフルエンザウイルスおよびＨＩＶで確認されるクラスＩの融合タンパク質とは構造的に異なる。Ｅ２糖タンパク質は、その細胞質ドメインを介してヌクレオキャプシドと相互作用するように機能するが、その外部ドメインは細胞受容体の結合に関与する。ほとんどのアルファウイルス（alphavirus）は周辺タンパク質Ｅ３を喪失しているが、セムリキウイルスではそれはウイルス表面に会合したままである。いくつかの実施形態では、第１および／または第２のＲＮＡレプリコンは、いずれのウイルス構造タンパク質もコードしていないか、またはＥ１もしくはＥ２もしくはＥ３、もしくはそれらのいずれか１つ、もしくはそれらの任意の組合せをコードしていない。例えば、ＲＮＡレプリコンがアルファウイルス（alphavirus）に由来する場合、それはＥ１またはＥ２またはＥ３、またはそれらの任意の組合せもしくは一部の組合せをコードすることができない。
【００７６】
アルファウイルス（alphavirus）複製は、宿主細胞内の膜に関連するプロセスである。感染サイクルの第１のステップでは、ゲノムＲＮＡの５’末端は、ゲノムＲＮＡに相補的なマイナス鎖を産生するＲＮＡポリメラーゼ活性を持つポリタンパク質（ｎｓＰ１−４）に翻訳される。第２のステップでは、マイナス鎖は、２つのＲＮＡ：（１）翻訳によって他のｎｓｐタンパク質を産生し、ウイルスのゲノムとして作用する二次ウイルスのゲノムに対応するプラスゲノムＲＮＡ；および（２）感染性粒子を形成するウイルスの構造タンパク質をコードするサブゲノムＲＮＡ、をそれぞれ産生するためのテンプレートとして使用される。プラスゲノムＲＮＡ／サブゲノムＲＮＡの比は、ｎｓｐ  １、ｎｓｐ  ２、ｎｓｐ  ３、ｎｓｐ  ４へのポリタンパク質のタンパク質分解性自己切断によって制御される。実際に、ウイルス遺伝子の発現は、２つのフェーズにおいて起こる。第１のフェーズでは、プラスゲノム鎖およびマイナス鎖の主要な合成がある。第２のフェーズ中、サブゲノムＲＮＡの合成は事実上排他的であり、それにより、多量の構造タンパク質が産生される。
【００７７】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、アルファウイルス（alphavirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、アルファウイルス（alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群、またはＳＦ群、またはＳＩＮ群に属するアルファウイルス（alphavirus）に由来する（概説に関しては、例えば、Strauss and Strauss. Microbiol. Rev., 58:3 p 492-562, 1994を参照されたい）。ＳＦ群のアルファウイルス（alphavirus）の非限定的な例としては、セムリキフォレストウイルス（Semliki Forest virus）、オニョンニョンウイルス（O'Nyong-Nyong virus）、ロスリバーウイルス（Ross River virus）、ミドレブルクウイルス（Middelburg virus）、チクングニアウイルス（Chikungunya virus）、バーマフォレストウイルス（Barmah Forest virus）、ゲタウイルス（Getah virus）、マヤロウイルス（Mayaro virus）、サギヤマウイルス（Sagiyama virus）、ベバルウイルス（Bebaru virus）、およびウナウイルス（Una virus）が挙げられる。ＳＩＮ群のアルファウイルス（alphavirus）の非限定的な例としては、シンドビスウイルス（Sindbis virus）、ガードウッドＳ．Ａ．ウイルス（Girdwood S.A. virus）、南アフリカアルボウイルス（South African Arbovirus）Ｎｏ．８６、オッケルボウイルス（Ockelbo virus）、アウラウイルス（Aura virus）、ババンキウイルス（Babanki virus）、ワタロアウイルス（Whataroa virus）、およびキジラガチウイルス（Kyzylagach virus）が挙げられる。ＶＥＥＶ／ＥＥＥＶ群のアルファウイルス（alphavirus）の非限定的な例として、東部ウマ脳炎ウイルス（Eastern equine encephalitis virus、ＥＥＥＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Western equine encephalitis virus、ＷＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Venezuelan equine encephalitis virus、ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（Everglades virus、ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（Mucambo virus、ＭＵＣＶ）、セムリキフォレストウイルス（Semliki forest virus、ＳＦＶ）、ピクスナウイルス（Pixuna virus、ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（Middleburg virus、ＭＩＤＶ）、チクングニヤウイルス（Chikungunya virus、ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（O'Nyong-Nyong virus、ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（Ross River virus、ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（Barmah Forest virus、ＢＦ）、ゲタウイルス（Getah virus、ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（Sagiyama virus、ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（Bebaru virus、ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（Mayaro virus、ＭＡＹＶ）、およびウナウイルス（Una virus、ＵＮＡＶ）が挙げられる。毒性および非毒性アルファウイルス（alphavirus）株は、両方とも本明細書で開示した方法および組成物に適している。いくつかの特定の実施形態では、アルファウイルス（alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、シンドビスウイルス（Sindbis virus、ＳＩＮ）、セムリキフォレストウイルス（Semliki Forest virus、ＳＦＶ）、ロスリバーウイルス（Ross River virus、ＲＲＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Venezuelan equine encephalitis virus、ＶＥＥＶ）、または東部ウマ脳炎ウイルス（Eastern equine encephalitis virus、ＥＥＥＶ）に由来する。いくつかの実施形態では、アルファウイルス（alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Venezuelan equine encephalitis virus、ＶＥＥＶ）に由来する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンの両方ともアルファウイルス（alphavirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは、同一のアルファウイルス（alphavirus）種または２つの異なるアルファウイルス（alphavirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルファウイルス（alphavirus）に由来し、第２のＲＮＡレプリコンは非アルファウイルス（non-alphavirus）種に由来する。非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンの非限定的な例としては、トガウイルス（Togaviridae）科、フラビウイルス（Flaviviridae）科、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科、ラブドウイルス（Rhabdoviridae）科、アルテロウイルス（Arteroviridae）科、ピコルナウイルス（Picornaviridae）科、アストロウイルス（Astroviridae）科、コロナウイルス（Coronaviridae）科、およびパラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科からなる群から選択される科に属するウイルス種に由来するＲＮＡレプリコンが挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、マイナス鎖ＲＮＡウイルスに由来する。適切なマイナス鎖ＲＮＡウイルス種としては、限定するものではないが、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科、ラブドウイルス（Rhabdoviridae）科、およびパラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科のウイルス種が挙げられる。いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、オルトミクソウイルス（Orthomyxoviridae）科に属するマイナス鎖ＲＮＡウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、インフルエンザウイルスＡ（Influenza virus A）、インフルエンザウイルスＢ（Influenza virus B）、インフルエンザウイルスＣ（Influenza virus C）、インフルエンザウイルスＤ（Influenza virus D）、イサウイルス（Isavirus）、ソゴトウイルス（Thogotovirus）、およびクアランジャウイルス（Quaranjavirus）からなる群から選択されるオルソミクソウイルス（Orthomyxovirus）属に属するウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、インフルエンザウイルス（Influenza virus）に由来する。いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、インフルエンザウイルスＡ（Influenza virus A）に由来する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、ラブドウイルス（Rhabdoviridae）科に属するマイナス鎖ＲＮＡウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、キュリオウイルス（Curiovirus）、サイトラブドウイルス（Cytorhabdovirus）、ジコルハウイルス（Dichorhavirus）、エフェメロウイルス（Ephemerovirus）、ハパウイルス（Hapavirus）、レダンテウイルス（Ledantevirus）、リッサウイルス（Lyssavirus）、ノビラブドウイルス（Novirhabdovirus）、ヌクレオラブドウイルス（Nucleorhabdovirus）、ペラブドウイルス（Perhabdovirus）、シグマウイルス（Sigmavirus）、スプリビウイルス（Sprivivirus）、スリプウイルス（Sripuvirus）、チブロウイルス（Tibrovirus）、ツパウイルス（Tupavirus）、バリコサウイルス（Varicosavirus）、ベシクロウイルス（Vesiculovirus）からなる群から選択されるラブドウイルス（Rhabdovirus）属に属するウイルス種に由来する。好ましいラブドウイルス（Rhabdovirus）種の非限定的な例としては、限定するものではないが、ウイルス性出血性敗血症ウイルス（viral hemorrhagic septicemia virus、ＶＨＳＶ）、水疱性口内炎ウイルス（vesicular stomatitis virus、ＶＳＶ）、および狂犬病ウイルス（rabies virus、ＲＡＢＶ）が挙げられる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、パラミクソウイルス（Paramyxoviridae）科に属するマイナス鎖ＲＮＡウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、ニューモウイルス（Pneumovirinae）亜科またはパラミクソウイルス（Paramyxovirinae）亜科に属するパラミクソウイルス（Paramyxovirus）ウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、アクアパラミクソウイルス（Aquaparamyxovirus）、アブラウイルス（Avulavirus）、フェルラウイルス（Ferlavirus）、ヘニパウイルス（Henipavirus）、メタニューモウイルス（Metapneumovirus）、モルビリウイルス（Morbillivirus）、ニューモウイルス（Pneumovirus）、レスピロウイルス（Respirovirus）、およびルブラウイルス（Rubulavirus）からなる群から選択されるパラミクソウイルス（Paramyxovirus）属に属するウイルス種に由来する。好ましいパラミクソウイルス（Paramyxovirus）種の非限定的な例としては、限定するものではないが、ヒト呼吸器合胞体ウイルス（human respiratory syncytial virus、ｈＲＳＶ、亜群Ａ）、ウシ呼吸器合胞体ウイルス（bovine respiratory syncytial virus、ｂＲＳＶ）、ヒトメタニューモウイルス（human metapneumovirus、ｈＭＰＶ）、ウシ−ヒトパラインフルエンザウイルス３（bovine-human parainfluenza virus 3、ｂ／ｈＰＩＶ３）、ヒトパラインフルエンザウイルス１（human parainfluenza virus 1、ｈＰＩＶ１）、組換えウシ−ヒトパラインフルエンザウイルス３（recombinant bovine-human parainfluenza virus 3、ｒＢ／ＨＰＩＶ３）、センダイウイルス（Sendai virus、ＳｅＶ）、アンデスウイルス（Andes virus、ＡＮＤＶ）、ムンプスウイルス（Mumps virus、ＭｕＶ）、シミアンウイルス５（Simian virus 5、ＳＶ５）、および麻疹ウイルス（Measles virus、ＭｅＶ）が挙げられる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、トガウイルス（Togaviridae）科またはフラビウイルス（Flaviviridae）科に属するプラス鎖ウイルス種に由来する。いくつかの実施形態では、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、フラビウイルス（Flaviviridae）科に属するウイルス種、例えば、フラビウイルス（Flavivirus）属およびペスチウイルス（Pestivirus）属に属するウイルスに由来する。フラビウイルス属に属するウイルスの非限定的な例としては、黄熱病ウイルス（yellow fever virus、ＹＦＶ）、デング熱ウイルス（Dengue fever virus）、日本脳炎ウイルス（Japanese encephalitis virus、ＪＥＶ）、西ナイルウイルス（West Nile virus、ＷＮＶ）およびジカウイルス（Zika virus）が挙げられる。いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、黄熱病ウイルス（yellow fever virus）またはデング熱ウイルス（Dengue fever virus）に由来する。毒性および非毒性のフラビウイルス（flavivirus）株は両方とも適している。好ましいフラビウイルス（flavivirus）株の非限定的な例としては、限定するものではないが、ＹＦＶ（１７Ｄ）、ＤＥＮ４（８１４６６９および誘導体）、ＤＥＮ２（ＰＤＫ−５３）、クンジンウイルス（Kunjin virus、ＫＵＮ）、ＪＥＶ（ＳＡ１４−１４−２）、マレーバレー脳炎ウイルス（Murray Valley encephalitis virus、ＭＶＥＶ、ＩＲＥＳの減弱化）、ＷＮＶ（ＳＣＦＶ）、ウシウイルス性下痢ウイルス（Bovine viral diarrhea virus、ＢＶＤＶ）ＣＰ７、ＢＶＤＶ−ＳＤ１、ＢＶＤＶ−ＮＡＤＬ、ならびに古典的豚コレラウイルス（classical swine fever virus、ＣＳＦＶ）が挙げられる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、非アルファウイルス（non-alphavirus）ＲＮＡレプリコンは、アルテリウイルス（Arteriviridae）科に属するプラス鎖ウイルス種に由来し、これはアルテリウイルス（Arterivirus）属のウイルスであり得る。適切なアルテリウイルス（arterivirus）種としては、限定するものではないが、ウマ動脈炎ウイルス（equine arteritis virus、ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（porcine respiratory and reproductive syndrome virus、ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（lactate dehydrogenase elevating virus 、ＬＤＶ）、サル出血熱ウイルス（simian hemorrhagic fever virus、ＳＨＦＶ）、およびウォブリィポッサム病ウイルス（wobbly possum disease virus）（ＷＰＤＶ）が挙げられる。
【００８３】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、１、２、４位、またはそれらの組合せに１つまたは複数のヌクレオチド置換を有する改変５’−ＵＴＲを含む。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つは、改変５’−ＵＴＲの１位でのヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つは、改変５’−ＵＴＲの２位でのヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド置換のうちの少なくとも１つは、改変５’−ＵＴＲの４位でのヌクレオチド置換である。いくつかの実施形態では、改変５’−ＵＴＲの２位でのヌクレオチド置換は、Ｕ→Ｇ置換である。いくつかの実施形態では、改変５’−ＵＴＲの２位でのヌクレオチド置換は、Ｕ→Ａ置換である。いくつかの実施形態では、改変５’−ＵＴＲの２位でのヌクレオチド置換は、Ｕ→Ｃ置換である。
【００８４】
本開示のいくつかの実施形態では、１つまたは複数のウイルス構造タンパク質のコード配列の一部または全体は、本明細書で開示したＲＮＡレプリコンに存在しない、および／または改変されている。したがって、いくつかの特定の実施形態では、本明細書で開示したＲＮＡレプリコンは、改変５'ＵＴＲを含み、１つまたは複数のウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の少なくとも一部が欠けており、例えば、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の最初の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のヌクレオチドを欠いている。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡレプリコンは、構造ポリペプチドＥ１、Ｅ２、Ｅ３、６Ｋ、およびキャプシドプロテインＣの１つもしくは複数をコードする配列、または構造ポリペプチドをコードする１つもしくは複数の他の配列の約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上が欠けている可能性がある。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡレプリコンは、構造ポリペプチドＥ１、Ｅ２、Ｅ３、６Ｋ、およびキャプシドプロテインＣの１つもしくは複数をコードする配列、または構造ポリペプチドをコードする１つもしくは複数の他の配列の実質的な部分または全体が欠けている。本明細書で使用される場合、ウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列の「実質的な部分」は、当業者による配列の手動の評価によって、またはＢＬＡＳＴなどのアルゴリズムを使用するコンピューター自動化配列比較および同定によって、そのタンパク質の推定上の同定を提供するのに十分なウイルス構造タンパク質をコードする核酸配列を含む（例えば、Karlin & Altschul, 1993、前掲を参照されたい）。いくつかの実施形態では、改変ＲＮＡレプリコンは、構造ポリペプチドＥ１、Ｅ２、Ｅ３の１つもしくは複数をコードする配列、またはそれらの任意の組合せもしくは部分的組合せの少なくとも一部または全体が欠けている。また改変ＲＮＡレプリコンは、タンパク質６Ｋおよび／またはキャプシドプロテインＣの配列の少なくとも一部または全体が欠けている可能性がある。
【００８５】
ウイルスキャプシドエンハンサー配列
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、ウイルスキャプシドエンハンサーの構造エレメント中に１つまたは複数のＲＮＡステムループを含む改変アルファウイルス（alphavirus）レプリコンである。
【００８６】
いくつかのウイルスは、例えば、その下流に位置したコード配列の翻訳を増強するために異種ウイルスゲノムで使用することができる１つまたは複数のステムループエレメント／構造を形成することが可能な配列を有する。例えば、シンドビスウイルス（Sindbis virus）のサブゲノムｍＲＮＡは、ウイルスキャプシドタンパク質（例えばキャプシドエンハンサー）の野生型ＡＵＧイニシエーターコドンの下流に安定性のあるＲＮＡヘアピンループを有する。このステムループＲＮＡ構造は、多くの場合、下流ＬｏｏＰ（またはＤＬＰモチーフ）と呼ばれている。ＤＬＰ構造は、シンドビスウイルス（Sindbis virus、ＳＩＮＶ）２６Ｓ  ｍＲＮＡにおいて最初に特徴づけられ、セムリキフォレストウイルス（Semliki forest virus、ＳＦＶ）においても検出された。最近、同様のＤＬＰ構造が、新世界（ＭＡＹＶ、ＵＮＡＶ、ＥＥＥＶ（ＮＡ）、ＥＥＥＶ（ＳＡ）、ＡＵＲＡＶ）および旧世界（ＳＶ、ＳＦＶ、ＢＥＢＶ、ＲＲＶ、ＳＡＧ、ＧＥＴＶ、ＭＩＤＶ、ＣＨＩＫＶ、ＯＮＮＶ）メンバーを含むアルファウイルス（alphavirus）属の少なくとも１４の他のメンバーに存在することが報告されている。これらのアルファウイルス（alphavirus）２６Ｓ  ｍＲＮＡの予測構造は、ＳＨＡＰＥ（選択的２’−ヒドロキシルアシル化およびプライマー伸長）データ（Toribio et al., Nucleic Acids Res. May 19;44(9):4368-80, 2016）、その内容は参照により本明細書に組み込まれる）に基づいて構築された。シンドビスウイルス（Sindbis virus）の場合には、ＤＬＰモチーフは、シンドビスサブゲノムＲＮＡの最初の〜１５０ヌクレオチドで確認されている。ヘアピンは、シンドビスキャプシドＡＵＧ開始コドン（シンドビスサブゲノムＲＮＡのヌクレオチド５０のＡＵＧ）の下流に位置し、正確なキャプシド遺伝子ＡＵＧが翻訳の開始に使用されるようにリボソームを仕切る。ヘアピンがリボソームを休止させるので、ｅＩＦ２αは翻訳開始のサポートを要求されない。いかなる特定の理論にも縛られるものではないが、任意の目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列の上流にＤＬＰモチーフを置くと、典型的には、ヘアピンにコードされているＮ末端キャプシドアミノ酸のＧＯＩコードされたタンパク質への融合タンパク質が生じると考えられており、その理由は、開始がＧＯＩ  ＡＵＧではなくキャプシドＡＵＧで起こるためである。さらに、未改変ＲＮＡレプリコンは、多くの場合、それらが導入される細胞の初期の自然免疫系状態に感受性である。細胞／個体が非常に活性のある自然免疫系状態である場合、ＲＮＡレプリコン性能（例えば、ＧＯＩの複製および発現）は、悪影響を受け得る。ＤＬＰを操作してタンパク質翻訳、特に非構造タンパク質の翻訳の開始をコントロールすることによって、効果的なＲＮＡレプリコン複製に影響を及ぼす自然免疫系の既存の活性化状態の影響が除かれるか、または軽減される。その結果、ＧＯＩの発現がより一定となり、ワクチン有効性または処置の治療効果に影響を与え得る。アルファウイルス（alphavirus）ＤＬＰに関するさらなる情報は、例えば、米国特許出願第１５／８３１，２３０号で確認することができる。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、ウイルス種の下流ループ（ＤＬＰ）モチーフを含み、���ＬＰモチーフは、１つまたは複数のＲＮＡステムループのうちの少なくとも１つを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、配列番号２〜９のいずれか１つまたは複数と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を示す核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、配列番号２〜９のいずれか１つまたは複数と約８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％、またはこれらのいずれか２つの値の間の範囲の配列同一性を示す核酸配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸配列は、配列番号２〜９のいずれか１つまたは複数と少なくとも９５％の配列同一性を示す。
【００８７】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのいずれか１つまたは両方は、ウイルスキャプシドタンパク質の５’コード配列から少なくとも約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約３００、またはそれ以上のヌクレオチドを含む改変アルファウイルス（alphavirus）レプリコンである。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、東部ウマ脳炎ウイルス（Eastern equine encephalitis virus、ＥＥＥＶ）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（Venezuelan equine encephalitis virus、ＶＥＥＶ）、エバーグレーズウイルス（Everglades virus、ＥＶＥＶ）、ムカンボウイルス（Mucambo virus、ＭＵＣＶ）、ピクスナウイルス（Pixuna virus、ＰＩＸＶ）、ミドレブルクウイルス（Middleburg virus、ＭＩＤＶ）、チクングニヤウイルス（Chikungunya virus、ＣＨＩＫＶ）、オニョンニョンウイルス（O'Nyong-Nyong virus、ＯＮＮＶ）、ロスリバーウイルス（Ross River virus、ＲＲＶ）、バーマフォレストウイルス（Barmah Forest virus、ＢＦ）、ゲタウイルス（Getah virus、ＧＥＴ）、サギヤマウイルス（Sagiyama virus、ＳＡＧＶ）、ベバルウイルス（Bebaru virus、ＢＥＢＶ）、マヤロウイルス（Mayaro virus、ＭＡＹＶ）、ウナウイルス（Una virus、ＵＮＡＶ）、シンドビスウイルス（Sindbis virus、ＳＩＮＶ）、アウラウイルス（Aura virus、ＡＵＲＡＶ）、ワタロアウイルス（Whataroa virus、ＷＨＡＶ）、ババンキウイルス（Babanki virus、ＢＡＢＶ）、キジラガチウイルス（Kyzylagach virus、ＫＹＺＶ）、西部ウマ脳炎ウイルス（Western equine encephalitis virus、ＷＥＥＶ）、ハイランドＪウイルス（Highland J virus、ＨＪＶ）、フォートモーガンウイルス（Fort Morgan virus、ＦＭＶ）、ヌドゥムウイルス（Ndumu virus、ＮＤＵＶ）、およびバギークリークウイルス（Buggy Creek virus、ＢＣＲＶ）からなる群から選択されるアルファウイルス（alphavirus）種のキャプシド遺伝子に由来する。いくつかの特定の実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、シンドビスウイルス（Sindbis virus）種またはセムリキフォレストウイルス（Semliki Forest virus）種のキャプシド遺伝子に由来する。さらにいくつかの特定の実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサーは、シンドビスウイルス（Sindbis virus）種のキャプシド遺伝子に由来する。さらに、その増強活性を実質的に低下させることなく、ウイルスキャプシドタンパク質からの５’コード配列において改変がなされ得ることは、当業者には理解されよう（例えば、Frolov et al., J. Virology 70:1182, 1994; Frolov et al., J. Virology 68:8111, 1994を参照されたい）。好ましくは、そのような変異は、５’キャプシドコード配列によって形成されるＲＮＡヘアピン構造を実質的に保存する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサー配列は、ヘアピン構造の上流にあるウイルスキャプシドタンパク質の５’コード配列の全部を含有してはいない。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサー配列は、キャプシドタンパク質の全部または一部をコードし得る。したがって、本明細書で開示したいくつかの実施形態では、キャプシドエンハンサー領域は、ウイルスキャプシドタンパク質全体をコードしない。いくつかの実施形態では、ウイルスキャプシドエンハンサー配列は、ウイルスキャプシドタンパク質からのアミノ末端断片をコードする。そうでなければ機能的キャプシドがキャプシドエンハンサー配列によってコードされている実施形態では、キャプシド自己プロテアーゼ活性を除去することが望ましい可能性がある。
【００８９】
いくつかの実施形態では、本開示のＲＮＡレプリコンに含まれるウイルスキャプシドエンハンサー配列は、任意の他のバリアント配列、例えば、ウイルスキャプシドエンハンサーについて予測されるＲＮＡステムループの１つまたは複数に機能的または構造的に等しいＲＮＡヘアピンを形成することができ、下流でそれに作動可能に連結されたＲＮＡ配列（例えば、目的の遺伝子のコード配列）の翻訳を増強するように作用することができる合成配列または異種配列であってもよい。
【００９０】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つの異種非構造タンパク質のコード配列を含む改変アルファウイルス（alphavirus）レプリコンである。いくつかの実施形態では、改変アルファウイルス（alphavirus）レプリコンは、異種非構造タンパク質ｎｓＰ３のコード配列を含む。いくつかの実施形態では、異種非構造タンパク質ｎｓＰ３は、チクングニヤウイルス（Chikungunya virus、ＣＨＩＫＶ）ｎｓＰ３またはシンドビスウイルス（Sindbis virus、ＳＩＮＶ）ｎｓＰ３である。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原のうちの少なくとも１つは、２６Ｓサブゲノムプロモーターまたはそのバリアントのコントロール下で発現される。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原のうちの少なくとも１つは、アルファウイルス（alphavirus）２６Ｓサブゲノムプロモーターまたはそのバリアントのコントロール下で発現される。いくつかの実施形態では、２６Ｓサブゲノムプロモーターは、ＳＩＮＶ  ２６Ｓサブゲノムプロモーター、ＲＲＶ  ２６Ｓサブゲノムプロモーター、またはそれらのバリアントである。
【００９１】
アルテリウイルス（ARTERIVIRUSES）
アルテリウイルス（アルテリウイルス科（Family Arteriviridae）、アルテリウイルス属（Genus Arterivirus））は、家畜および野生動物を感染させる、エンベロープのある一本鎖のプラスセンスＲＮＡウイルスの重要な群を包含する。アルテリウイルスは、コロナウイルス（Coronaviridae）科（コロナウイルス（Coronavirus）およびトロウイルス（Torovirus）属）のメンバーと同様のゲノム構成および複製方略を共有するが、ウイルス粒子（例えばビリオン）の遺伝的複雑性、ゲノム長、生物物理学的特性、サイズ、構築物、および構造タンパク質組成は顕著に異なる。現在、アルテリウイルス（Arterivirus）属は、ウマ動脈炎ウイルス（equine arteritis virus、ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（porcine reproductive and respiratory syndrome virus、ＰＲＲＳＶ）、マウスの乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（lactate dehydrogenase elevating virus 、ＬＤＶ）、サル出血熱ウイルス（simian hemorrhagic fever virus、ＳＨＦＶ）、およびウォブリィポッサム病ウイルス（wobbly possum disease virus、ＷＰＤＶ）を含むと考えられる。最近の研究では、新たに同定されたウォブリィポッサム病ウイルス（wobbly possum disease virus、ＷＰＤＶ）もまたアルテリウイルス（Arterivirus）属に属することが報告されている。
【００９２】
典型的なアルテリウイルス（arterivirus）のゲノムは、１２．７〜１５．７ｋｂの長さで変わるが、そのゲノム構成はいくつかの小さな変動と比較的一致している。アルテリウイルス（arterivirus）ゲノムは、１０〜１５個の公知のＯＲＦのアレイに隣接する５’および３’非翻訳領域（ＮＴＲ）を有する、多シストロン性プラス鎖ＲＮＡである。ラージレプリカーゼＯＲＦ  １ａおよび１ｂは、ゲノムの５’近位の４分の３を占めており、ＯＲＦ１ａのサイズはＯＲＦ１ｂのサイズよりもより大きく変動する。ＯＲＦ１ａの翻訳はレプリカーゼポリタンパク質（ｐｐ）１ａを産生するが、ＯＲＦ１ｂは−１のプログラムされたリボソームフレームシフト（ＰＲＦ）によって発現され、Ｃ末端でｐｐ１ａをｐｐ１ａｂに伸長する。さらに、ショートトランスフレームＯＲＦは、＋１フレームにおいてＯＲＦ１ａのｎｓｐ２コード領域とオーバーラップしており、また−２  ＰＲＦにより発現されることが報告されている。３’近位のゲノム部分はコンパクトな構成を有し、８〜１２個の比較的小さな遺伝子を含有しており、それらの大部分は隣接する遺伝子とオーバーラップする。これらのＯＲＦは構造タンパク質をコードしており、サブゲノムｍＲＮＡの３’−ｃｏ−末端のネスティッドセットから発現される。これらのＯＲＦの構成は保存されているが、ＯＲＦ１ｂの下流に、ＳＨＦＶ、および最近同定されたすべてのＳＨＦＶウイルスは、ＯＲＦ  ２〜４の遠い過去に起きた重複に由来し得る３つまたは４つの追加のＯＲＦ（〜１．６ｋｂ）を含んでいる。ＯＲＦ１ａのサイズの変動とともに、この推定された重複は、アルテリウイルス（arterivirus）間のゲノムサイズの違いを説明している。
【００９３】
ウマ動脈炎ウイルス（equine arteritis virus、ＥＡＶ）に関して、野生型ＥＡＶゲノムは、約１２．７ｋｂのサイズである。ゲノムの５’の４分の３は、２つのラージレプリカーゼタンパク質１ａおよび１ａｂをコードしている；２つのタンパク質のアミノ酸配列はＮ末端で同一であるが、リボソームフレームシフトにより、１ａｂのＣ末端領域のアミノ酸配列は特有である。ＥＡＶゲノムの３’の４分の１はウイルスの構造タンパク質遺伝子をコードしており、そのすべてはサブゲノムＲＮＡから発現される。サブゲノムＲＮＡは、不連続の転写メカニズムによって生成される３’ｃｏ−末端ＲＮＡのネストされたセットを形成する。サブゲノムＲＮＡは、ゲノムＲＮＡと隣接していない配列から構成されている。すべてのＥＡＶサブゲノムＲＮＡは、ゲノムの５’配列と同一である共通の５’リーダー配列（長さは１５６〜２２１ヌクレオチド）を共有する。サブゲノムＲＮＡのリーダー部分およびボディ部分は、転写制御配列（ＴＲＳ）と呼ばれる保存配列によって連結される。ＴＲＳは、リーダー（ＴＲＳリーダー）の３’末端、ならびに各構造タンパク質遺伝子（ボディＴＲＳ）の上流に位置しているサブゲノムプロモーター領域で確認される。サブゲノムＲＮＡは、マイナス鎖複製中間体ＲＮＡが転写される場合に生成される。転写が起こる場合、複製複合体は、各ボディＴＲＳに来て、次いで、発生期のマイナス鎖ＲＮＡが、マイナス鎖ＲＮＡ転写が継続する相補的プラス鎖リーダーＴＲＳと会合するようになるので休止する。この不連続な転写メカニズムは、５’および３’の両方のＥＡＶ保存配列を有するサブゲノムＲＮＡをもたらす。次いで、マイナス鎖サブゲノムＲＮＡは、サブゲノムプラスセンスｍＲＮＡを産生するためのテンプレートになる。
【００９４】
ＥＡＶの全ゲノムを表す感染性ｃＤＮＡクローンは報告されており（van Dinten 1997; de Vries et al., 2000, 2001; Glaser et al., 1999）、それらはほぼ２０年間ＥＡＶ  ＲＮＡの複製および転写の研究に使用されてきた（ｖａｎ  Ｍａｒｌｅ  １９９９，  ｖａｎ  Ｍａｒｌｅ  １９９９ａ，  Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００，  Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００ａ，  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２０００，  Ｔｉｊｍｓ  ２００１，  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００１，  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００３，  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００４，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｒｎ  ２００５，  Ｂｅｅｒｅｎｓ  ＆  Ｓｎｉｊｄｅｒ  ２００７，  Ｔｉｊｍｓ  ２００７，  Ｋａｓｔｅｒｅｎ  ２０１３）。さらに、ＯＲＦ２およびＯＲＦ７の代わりに挿入されたクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）遺伝子を含有する感染性クローンが生成され、ＣＡＴタンパク質がそれらのＲＮＡでエレクトロポレーションされた細胞において発現されることが示された（ｖａｎ  Ｄｉｎｔｅｎ  １９９７，  ｖａｎ  Ｍａｒｌｅ  １９９９）。構造タンパク質遺伝子領域の部位特異的変異誘発および欠失を介した感染性クローンの改変は、ＲＮＡ複製をサポートする各構造遺伝子の要件を決定するために使用されてきている（Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００）。Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００によって報告された研究は、構造遺伝子はＲＮＡ複製をサポートするのに必要はないと結論を下した。サブゲノムＲＮＡ産生におけるＴＲＳ活性にとっての配列相同性要件の分析が行われ、不連続の転写がどのように機械的に生じるかをよりよく定義するために使用され（ｖａｎ  Ｍａｒｌｅ  １９９９，  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２０００，  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００１，  Ｐａｓｔｅｒｎａｋ  ２００３，  ｖａｎ  ｄｅｎ  Ｂｏｒｎ  ２００５）、不完全な干渉ＲＮＡが、ＲＮＡのウイルス粒子への複製およびパッケージングに必要な最小限のゲノム配列を理解するために使用されてきた（Ｍｏｌｅｎｋａｍｐ  ２０００ａ）。この点に関するさらなる情報は、例えば、米国特許出願第１５／４８６１３１号で確認することができ、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００９５】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、アルテリウイルス（arterivirus）種に由来する。適切なアルテリウイルス（arterivirus）種としては、ウマ動脈炎ウイルス（equine arteritis virus、ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（porcine respiratory and reproductive syndrome virus、ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（lactate dehydrogenase elevating virus 、ＬＤＶ）、サル出血熱ウイルス（simian hemorrhagic fever virus、ＳＨＦＶ）、およびウォブリィポッサム病ウイルス（wobbly possum disease virus、ＷＰＤＶ）が挙げられる。本明細書で開示したいくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンのうちの少なくとも１つは、ウマ動脈炎ウイルス（equine arteritis virus、ＥＡＶ）、ブタ繁殖・呼吸障害症候群ウイルス（porcine respiratory and reproductive syndrome virus、ＰＲＲＳＶ）、乳酸デヒドロゲナーゼ上昇ウイルス（lactate dehydrogenase elevating virus 、ＬＤＶ）、およびサル出血熱ウイルス（simian hemorrhagic fever virus、ＳＨＦＶ）からなる群から選択されるアルテリウイルス（arterivirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、アルテリウイルス（arterivirus）ＲＮＡレプリコンは、ウマ動脈炎ウイルス（equine arteritis virus、ＥＡＶ）に由来する。毒性および非毒性のアルテリウイルス（arterivirus）株は両方とも適する。好ましいアルテリウイルス（arterivirus）株の非限定的な例としては、限定するものではないが、ＥＡＶ−毒性Ｂｕｃｙｒｕｓ株（ＶＢＳ）、ＬＤＶ−Ｐｌａｇｅｍａｎｎ、ＬＤＶ−Ｃ、ＰＲＲＳＶ−１型、およびＰＲＲＳＶ−２型が挙げられる。例示的な好ましいＥＡＶ株としては、限定するものではないが、ＥＡＶ  ＶＢ５３、ＥＡＶ  ＡＴＣＣ  ＶＲ−７９６、ＥＡＶ  ＨＫ２５、ＥＡＶ  ＨＫ１１６、ＥＡＶ  ＡＲＶＡＣ  ＭＬＶ、ＥＡＶ  Ｂｕｃｙｒｕｓ株（Ｏｈｉｏ）、改変ＥＡＶ  Ｂｕｃｙｒｕｓ、無毒性株ＣＡ９５、Ｒｅｄ  Ｍｉｌｅ（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）、８４ＫＹ−Ａ１（Ｋｅｎｔｕｃｋｙ）、Ｗｒｏｃｌａｗ−２（Ｐｏｌａｎｄ）、Ｂｉｂｕｎａ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、およびＶｉｅｎｎａ（Ａｕｓｔｒａｌｉａ）が挙げられる。ＰＲＲＳＶ株の非限定的な好ましい例としては、ＰＲＲＳＶ  ＬＶ４．２．１、ＰＲＲＳＶ  １６２４４Ｂ、ＰＲＲＳＶ  ＨＢ−１（ｓｈ）／２００２、ＰＲＲＳＶ  ＨＢ−２（ｓｈ）／２００２、ＰＲＲＳＶ  ＨＮ１、ＰＲＲＳＶ  ＳＤ  ０１−０８、ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０８０２、ＰＲＲＳＶ  ＳＤ０８０３、ＰＲＲＳＶ  ＶＲ２３３２が挙げられる。ＳＨＦＶ株およびバリアントの非限定的な好ましい例としては、ＳＨＦＶバリアントＳＨＦＶ−ｋｒｔｇ１ａおよび−ｋｒｔｇ１ｂ（ＳＨＦＶ−ｋｒｔｇ１ａ／ｂ）、ＳＨＦＶｋｒｔｇ２ａ／ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＸ４７３８４７〜ＪＸ４７３８５０）、ＳＨＦＶ−ＬＶＲ、ＳＨＦＶプロトタイプバリアントＬＶＲ  ４２−０／Ｍ６９４１（ＮＣ＿００３０９２）、Ｋｉｂａｌｅ  ｒｅｄ  ｃｏｌｏｂｕｓからのＳＨＦＶ−ｋｒｃｌおよびＳＨＦＶｋｒｃ２（それぞれ、ＨＱ８４５７３７およびＨＱ８４５７３８）が挙げられる。他の好ましいアルテリウイルス（arterivirus）の非限定的な例としては、ＰＲＲＳＶ−Ｌｅｌｙｓｔａｄ、ヨーロッパ型（１��）株（Ｍ９６２６２）；ＰＲＲＳＶＶＲ２３３２、北アメリカ型（２型）株（Ｕ８７３９２）；ＥＡＶ−Ｂｕｃｙｒｕｓ  （ＮＣ＿００２５３２）；ＥＡＶ−ｓ３６８５  （ＧＱ９０３７９４）；ＬＤＶ−Ｐ、Ｐｌａｇｅｍａｎｎ株（Ｕ１５１４６）；およびＬＤＶ−Ｃ、神経毒性Ｃ型株（Ｌ１３２９８）が挙げられる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは、同一のアルテリウイルス（arterivirus）種または２つの異なるアルテリウイルス（arterivirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルテリウイルス（arterivirus）に由来し、第２のＲＮＡレプリコンは非アルテリウイルス（non-arterivirus）種に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルテリウイルス（arterivirus）に由来し、第２のＲＮＡレプリコンはアルファウイルス（alphavirus）に由来する。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルテリウイルス（arterivirus）種に由来する未改変ＲＮＡレプリコンである。いくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルテリウイルス（arterivirus）種に由来する改変ＲＮＡレプリコンである。
【００９７】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンはアルファウイルス（alphavirus）種に由来するＲＮＡレプリコンであり、第２のＲＮＡレプリコンはアルテリウイルス（arterivirus）種に由来するＲＮＡレプリコンである。ある特定の実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルス（alphavirus）種に由来する未改変ＲＮＡレプリコンである。他の実施形態では、第１のＲＮＡレプリコンは、アルファウイルス（alphavirus）種に由来する改変ＲＮＡレプリコンである。
【００９８】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、本開示の方法は、１つまたは複数のその後のブースティング投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、または少なくとも１０回の連続ブースティング投与またはそれらの間の任意の回数の投与をさらに含む。いくつかの実施形態では、その後のブースティング投与は、経時的に徐々に用量を増加させて実施される。いくつかの実施形態では、その後のブースティング投与は、経時的に徐々に用量を減少させて実施される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のプライミング組成物およびブースティング組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。本明細書で使用される場合、用語の「薬学的に許容される担体」とは、一般的に安全で、非毒性であり、生物学的にも他の点でも望ましくなくはない医薬組成物または製剤の調製に有用である担体を意味し、獣医学での使用ならびにヒトの医薬品での使用に許容される担体を含む。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は水と同じようにシンプルであるが、例えば、生理的塩濃度の溶液または生理食塩水を含むこともできる。またそれは脂質ナノ粒子であり得る。適切な材料としては、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）Ｃ１２デンドリマー、および／または１，２−ジミリスチル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］が挙げられる。またポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ならびに／あるいはＧ５およびＧ９  ＮＨ２  ＰＡＭＡＭデンドリマーも使用することができる。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、安定剤、希釈剤および緩衝液であり得るか、またはそれらを含んでいてもよい。適切な安定剤は、例えば、ＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、ドライミルク、血清アルブミンもしくはカゼイン）またはそれらの分解産物である。適切な緩衝液は、例えばアルカリ金属リン酸塩である。希釈剤としては、水、水性緩衝液（例えば緩衝生理食塩水）、アルコールおよびポリオール（例えばグリセロール）が挙げられる。動物またはヒトへの投与については、本出願による組成物は、とりわけ、非経口的に、鼻腔内に、噴霧により、皮内に、皮下に、経口的に、エアロゾルにより、または筋肉内に投与することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、第１および第２のＲＮＡレプリコンは、それぞれ、目的の遺伝子（ＧＯＩ）のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットを含む。本明細書で使用する場合、用語の「発現カセット」とは、ｉｎ  ｖｉｖｏおよび／またはｅｘ  ｖｉｖｏでのレシピエント細胞におけるコード配列の適切な転写および／または翻訳を指示するのに十分な制御情報を有する、プロモーターなどの発現コントロールエレメントに作動可能に連結されたタンパク質または機能的ＲＮＡのコード配列を含有する遺伝物質の構築物を意味する。
【０１０１】
用語の「作動可能に連結された」とは、本明細書で使用される場合、２つ以上の配列間の機能的な連結を意味する。例えば、目的のポリヌクレオチドと制御配列（例えばプロモーター）との間の作動可能な連結は、目的のポリヌクレオチドの発現を可能にする機能的な連結である。この意味において、用語の「作動可能に連結された」とは、制御領域が目的のコード配列の転写または翻訳を制御するのに効果的であるように制御領域および転写されるコード配列のポジショニングを意味する。本明細書で開示したいくつかの実施形態では、用語の「作動可能に連結された」とは、コントロール配列がポリペプチドをコードするｍＲＮＡ、ポリペプチド、および／または機能的ＲＮＡの発現または細胞の局在を指示または制御するように、ポリペプチドまたは機能的ＲＮＡをコードする配列に対して制御配列が適切な位置に配置される構成を示す。したがって、プロモーターが核酸配列の転写を媒介することができる場合、プロモーターは核酸配列と作動可能に連結している。作動可能に連結されたエレメントは、隣接していてもよいし、隣接していなくてもよい。
【０１０２】
ＤＮＡの２つ以上の配列を一緒に作動可能に連結する技術は当業者にはよく知られており、そのような技術は、標準の分子生物学的操作についての多数のテキストに記載されている（例えば、Maniatis et al., "Molecular Cloning: A Laboratory Manual" 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.; and Gibson et al., Nature Methods 6:343-45, 2009を参照されたい）。
【０１０３】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、本明細書で開示したＲＮＡレプリコンは、２つ以上の発現カセットを含むことができる。原則として、本明細書で開示したＲＮＡレプリコンは、一般に、任意の数の発現カセットを含むことができる。いくつかの特定の実施形態では、ＲＮＡレプリコンは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、または６つの発現カセットを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の発現カセットのうちの少なくとも１つは、アルテリウイルス（arterivirus）ＲＮＡレプリコンの転写制御配列（ＴＲＳ）の下流に作動可能に配置されており、ＴＲＳは、ＴＲＳ１、ＴＲＳ２、ＴＲＳ３、ＴＲＳ４、ＴＲＳ５、ＴＲＳ６、およびＴＲＳ７からなる群から選択される。いくつかの特定の実施形態では、１つまたは複数の発現カセットのうちの少なくとも１つは、アルテリウイルス（arterivirus）ＲＮＡレプリコンのＴＲＳ７の下流に作動可能に配置されている。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＧＯＩのコード配列は、参照コード配列の発現レベルよりも高いレベルで発現するように最適化される。いくつかの実施形態では、参照コード配列は、最適化されていない配列である。いくつかの実施形態では、ＧＯＩコード配列の最適化は、コドン最適化を含み得る。ヌクレオチド配列のコドン最適化に関して、遺伝コードの縮重は、遺伝子から産生されるポリペプチドのアミノ酸配列に変化を起こすことなく、遺伝子のタンパク質コード配列の少なくとも１つの塩基を異なる塩基で置換する可能性を提供する。したがって、本出願のポリヌクレオチドはまた、遺伝コードの縮重に従って置換によって本明細書に記載の任意のポリヌクレオチド配列から変更された任意の塩基配列を有していてもよい。コドン利用を説明する参考文献は、公的に容易に利用することができる。本開示のいくつかのさらなる実施形態では、ポリヌクレオチド配列バリアントは、様々な理由で、例えば、特定の宿主に対してコドン発現を最適化するために（例えば、アルテリウイルス（arterivirus）ｍＲＮＡ中のコドンを他の生物、例えばヒト、ハムスター、マウス、またはサルが好むものに変化させる）、産生され得る。
【０１０５】
本明細書で開示したいくつかの実施形態では、ＧＯＩは、ポリペプチドのアミノ酸配列をコードし得る。ポリペプチドは、一般に任意のポリペプチドであることができ、例えば、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助用ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、抗体、抗原、免疫モジュレーター、およびサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、ＧＯＩは、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助用ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドをコードする。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示したＲＮＡレプリコンは、第３のヌクレオチド配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結されたタンパク質分解切断部位のコード配列をさらに含む。一般に、当技術分野で公知の任意のタンパク質分解切断部位は、本開示のポリヌクレオチドおよびＲＮＡレプリコンに組み込むことができ、例えば、プロテアーゼにより産生後に切断されるタンパク質分解切断配列であり得る。またさらに適切なタンパク質分解性切断部位は、外部プロテアーゼの添加後に切断され得るタンパク質分解性切断配列も含む。いくつかの実施形態では、本明細書で開示したＲＮＡレプリコンは、第３のヌクレオチド配列の下流およびＧＯＩのコード配列の上流に作動可能に連結された自己プロテアーゼペプチドのコード配列をさらに含む。本明細書で使用する場合、用語の「自己プロテアーゼ」とは、自己タンパク質分解活性を有し、より大きなポリペプチド部分からそれ自体を切断することが可能な「自己切断」ペプチドを意味する。ピコルナウイルス群のメンバーである口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）で最初に同定された、いくつかの自己プロテアーゼは、その後、例えば、ウマ鼻炎Ａウイルス（equine rhinitis A virus、Ｅ２Ａ）、ブタテッショウウイルス−１（porcine teschovirus-1、Ｐ２Ａ）およびゾセア・アシグナウイルス（Thosea asigna virus、Ｔ２Ａ）から「２Ａ様」ペプチドが同定され、それらのタンパク質分解切断における活性は、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ真核生物系で明らかになっている。そのように、自己プロテアーゼの概念は当業者に利用可能であり、多くの天然の自己プロテアーゼ系が同定されている。十分に研究された自己プロテアーゼ系としては、限定するものではないが、ウイルスプロテアーゼ、発生タンパク質（例えば、ＨｅｔＲ、Ｈｅｄｇｅｈｏｇタンパク質）、ＲｕｍＡ自己プロテアーゼドメイン、ＵｍｕＤなど）が挙げられる。本開示の組成物および方法に適した自己プロテアーゼペプチドの非限定的な例としては、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（porcine teschovirus-1 2A、Ｐ２Ａ）、口蹄疫ウイルス（foot-and-mouth disease virus、ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（Equine Rhinitis A Virus、ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）、ゾセア・アシグナウイルス（Thosea asigna virus）２Ａ（Ｔ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス（cytoplasmic polyhedrosis virus）２ａ（ＢｍＣＰＶ２Ａ）、軟化病ウイルス（Flacherie Virus）２Ａ（ＢｍＩＦＶ２Ａ）、またはこれらの組合せからのペプチド配列が挙げられる。
【０１０７】
本開示の組成物
本明細書で開示したいくつかの実施形態は、第１の抗原をコードする第１のＲＮＡレプリコンを含むプライミング組成物；および第２の抗原をコードする第２のＲＮＡレプリコンを含むブースティング組成物を含む組成物であって、第１および第２のＲＮＡレプリコンが互いに異なる、組成物に関する。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原のアミノ酸配列は、互いに相同である。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、互いに同一である。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、少なくとも１つの交差反応性抗原決定基を含む。いくつかの実施形態では、組成物は、対象において免疫応答を誘導するためのものである。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、対象において実質的に同じ免疫応答を誘導する。組成物は、例えば、薬学的に許容される担体またはそれらの混合物を含む予防的組成物または医薬組成物であり得る。いくつかの実施形態において、本出願の組成物は、ワクチンとして使用することができる。
【０１０８】
本明細書で開示したいくつかの実施形態は、第１の抗原をコードする第１のＲＮＡレプリコンをコードする第１の核酸配列と；第２の抗原をコードする第２のＲＮＡレプリコンをコードする第２の核酸配列であって、第１および第２のＲＮＡレプリコンが互いに異なり、第１のレプリコンおよび第２のレプリコンが目的の分子のコード配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む少なくとも１つの発現カセットを含む、組成物に関する。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原のアミノ酸配列は、互いに相同である。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、互いに同一である。いくつかの実施形態では、第１および第２の抗原は、少なくとも１つの交差反応性抗原決定基を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原のアミノ酸配列は、第２の抗原のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を示す。いくつかの実施形態では、組成物は、目的の分子を産生するためのものである。いくつかの実施形態では、目的の分子はポリペプチドである。ポリペプチドは、一般に任意のポリペプチドであることができ、例えば、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助用ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、目的の分子は、抗体、抗原、免疫モジュレーター、およびサイトカインからなる群から選択されるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、目的の分子は、治療用ポリペプチド、予防用ポリペプチド、診断用ポリペプチド、栄養補助用ポリペプチド、工業用酵素、およびレポーターポリペプチドからなる群から選択されるポリペプチドである。
【０１０９】
目的の分子を産生する方法
本開示の組成物および方法を使用して目的の分子、例えば、本明細書に記載の目的の遺伝子（ＧＯＩ）のオープンリーディングフレームにコードされているポリペプチドを産生（例えば発現）することができる。したがって、本出願は、目的の分子、例えばポリペプチドを産生するための組成物および方法をさらに提供する。これに関するさらなる情報は、例えば、米国特許出願第１５／４８６１３１号；同第１５／７２３６５８号、同第１５／８３１，２３０号で確認することができる。
【０１１０】
したがって、いくつかの実施形態は、態様および実施形態のいずれか１つによる第１および第２のＲＮＡレプリコンを対象に連続して投与することを含む、対象において目的のポリペプチドを産生する方法に関する。
【０１１１】
本明細書で開示した方法および組成物は、例えば、水産養殖、農業、畜産にとって、および／またはワクチン、医薬品、工業製品、化学薬品などの製造において使用されるポリペプチドの産生を含む治療および医薬用途にとって重要であるかまたは関心が持たれる対象とともに使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で開示した組成物および方法は、アルファウイルス（alphavirus）の天然宿主である対象、例えば、げっ歯動物、マウス、魚類、鳥類、ならびにヒト、ウマ、ブタ、サル、および類人猿などのより大きな哺乳動物、ならびに無脊椎動物とともに使用することができる。特に好ましい種は、本出願のいくつかの実施形態では、脊椎動物種および無脊椎動物種である。原則として、任意の動物種を一般的に使用することができ、例えば哺乳動物種、例えばヒト、ウマ、ブタ、霊長類、マウス、フェレット、ラット、コットンラット、ウシ、ブタ、ヒツジ、ウサギ、ネコ、イヌ、ヤギ、ロバ、ハムスター、またはバッファローであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、鳥類種、甲殻類種、または魚類種である。いくつかの実施形態では、鳥類種は、食物消費用の鳥類種である。適切な鳥類種の非限定的な例としては、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、シチメンチョウ、ダチョウ、エミュー、ウズラ、ハト、白鳥、クジャク、キジ、コジュケイ、およびホロホロチョウが挙げられる。用語の「甲殻類」は、本明細書で使用される場合、すべての甲殻類種、例えば「エビ」、「ロブスター」、「ザリガニ」、および「カニ」と一般に呼ばれるもの、例えば、ペナエウス（Penaeus）、リトペナエウス（Litopenaeus）、マルスペネエウス（Marsupenaeus）、フェナーオーペエウス（Fenneropenaeus）、およびファルファンテペナエウス（Farfantepenaeus）を含む。いくつかの実施形態では、甲殻類種はエビ種、特に水産養殖において育てられる種、例えば、リトペナオイス・バナメイ（Litopenaeus vannamei）、ペナオイス・バナメイ（Penaeus vannamei）、ペナオイス・スチルリロストリス（Penaeus styllirostris）、ペナオイス・モノドン（Penaeus monodon）、パンダルス・ボレアリス（Pandalus borealis）、アセテス・ジャポニカス（Acetes japonicas）、トラキサランブリア・クルビロストリス（Trachysalambria curvirostris）、およびフェンネロペナオイス・キネンシス（Fenneropenaeus chinensis）である。いくつかの実施形態では、魚は、消費のために水産養殖において使用される観賞魚または魚種、例えばウナギ、サケ、マス、コイ、ナマズ、バス、およびティラピアなどである。いくつかの実施形態では、魚種は、サケ科である。
【０１１２】
上述の様々な対象を形質転換またはトランスフェクトする技術は当技術分野において公知であり、技術文献および科学文献に記載されている。
【０１１３】
本開示で言及したすべての刊行物および特許出願は、あたかもそれぞれ個別の刊行物または特許出願が参照により組み込まれることが具体的および個別に示されたのと同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１４】
科学雑誌記事、特許文書、および教科書を含む多くの情報源が本明細書で言及されているが、この参考文献がこれらの文書のいずれかが当技術分野における通常の一般知識の一部を形成することを承認するものではないことは、明らかに理解されよう。
【０１１５】
本明細書に記載した一般的な方法の議論は、単なる例示を目的としている。他の代替方法および代替案は、本開示を検討した際に当業者には明らかであり、本出願の趣旨および範囲内に含まれるものとする。
【実施例】
【０１１６】
追加の代替案を以下の実施例においてさらに詳細に開示するが、これは決して特許請求の範囲を限定するものではない。
【０１１７】
[実施例１]
異なるＲＮＡレプリコンを使用した異種プライム・ブースト後の免疫応答の増加
この実施例は、免疫学的に別個の機序を介して対象の免疫系を活性化するＲＮＡレプリコンで実施された異種プライム・ブースト免疫後の免疫応答の誘導を説明する実験を要約する。上記のように、異種プライム・ブースト免疫は、（１）抗ベクター免疫の回避、および（２）免疫応答の差次的および相乗的活性化を介して、増強された免疫応答を生成すると考えられる。異種プライム・ブーストスケジュールは、送達用の個別のプラットフォームを使用して有効性を実証しているが、このアプローチはレプリコンの合理的な操作を介して利用することができなかった。現在まで、免疫系を差次的に関与させるレプリコンは、Ｔ細胞応答またはＢ細胞応答のいずれの改善のためにも、使用されていない。さらに、治療用タンパク質をコードするレプリコンに対する抗ベクター応答を回避するための２つの別個のシステムの使用は、タンパク質発現の規模または持続性を増強する方法として以前は不可能であった。
【０１１８】
異種プライム・ブースト形式において免疫応答を増強する手段として２つの異なる完全合成レプリコン系の使用が本明細書に記載されている。異種プライム・ブーストに２つの異なる系を使用することは抗ベクター免疫の回避および免疫系の差次的活性化により他のワクチンに有効であったが、これは、以前は可能でなかったか、またはレプリコンを使用して実証されてはいない。その理由は２つある。第１に、アルファウイルス（alphavirus）レプリコンは、現在使用可能な唯一のレプリコン系であり、ＥＡＶを新たに操作することによりこの免疫化方法またはタンパク質投与が可能になった。第２に、異種プライム・ブースト形式において差次的免疫応答を駆動する２つの異なるレプリコン間の免疫活性化の機序を顕著に変化させる同じウイルスファミリー内の合理的な操作の欠如は実証されていない。
【０１１９】
この実施例で説明した実験では、２つの異なるウイルス由来のＲＮＡレプリコン：動脈炎ウイルス（ウマ動脈炎ウイルス−ＥＡＶ）およびアルファウイルス（alphavirus）（ベネズエラウマ脳炎ウイルス−ＶＥＥＶ）を異種ＲＮＡレプリコンプライム・ブーストアプローチの代表例として使用した。組換えＥＡＶベースおよびＶＥＥＶベースのＲＮＡレプリコンを設計し、続いて、異種プライム・ブーストワクチン接種治療計画においてマウスにワクチン接種するために使用した。以下でより詳細に記載するように、これらの組換えＲＮＡレプリコンはマウスモデルにおいてｉｎ  ｖｉｖｏでテストされ、同種プライム・ブースト治療計画を受けた対照動物と比較して、分化および増強された免疫応答が実証された。例えば、出願人は、生理食塩水製剤において、インフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００３（Ｈ５Ｎ１）株に由来するヘマグルチニン（ＨＡ）抗原を使用したＥＡＶ−ＥＡＶ免疫化またはＶＥＥＶ−ＶＥＥＶ免疫化と比較した場合、異種プライム・ブースト治療計画がブースティングステップ後に優れたＴ細胞応答を生じることを実証した。
【０１２０】
レプリコンの免疫原性に対する異種プライム・ブーストの影響を分析するため、下流ループ配列（またはＤＬＰモチーフ）を含有するＥＡＶレプリコンまたはＶＥＥレプリコンの組合せでマウスを免疫した。それぞれのレプリコンは、インフルエンザＡ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）からの血球凝集素（ＨＡ）のコード配列を含んでいる。これらの実験において、ＢＡＬＢ／ｃマウスを生理食塩水で製剤化した１５μｇの用量で免疫し、４週間の間隔で筋肉内注射した。最終注射の１４日後に、脾臓および血清を採取し、ＨＡに対する免疫応答を分析した。これらの実験結果の概要を図２Ａ〜図２Ｂに示す。
【０１２１】
図２Ａに示したように、脾細胞を、保存されたＴ細胞エピトープ（Ｈ−２  Ｋｄ：ＩＹＳＴＶＡＳＳＬ；配列番号１）で刺激し、プライミング組成物がＥＡＶレプリコンを含み、ブースティング組成物がＶＥＥＶレプリコンを含む異種プライム・ブーストレジメンを受けた群が、同種プライム群または単回投与群のいずれかと比較した場合、ＩＦＮ−γ分泌ＣＤ８＋  Ｔ細胞に有意な増加があることを明らかにした。
【０１２２】
上記の観察は、プライミング組成物がＶＥＥＶレプリコンを含み、ブースティング組成物がＥＡＶレプリコンを含む異種プライム・ブーストレジメンを受けた動物とは異なっており、同種プライム・ブーストレジメンと比較して、異種プライム・ブーストレジメンが差次的効果を示している。いかなる特定の理論に縛られるものではないが、同種ＶＥＥＶ−ＶＥＥＶ群に対する異種ＥＡＶ−ＶＥＥＶ投与群でのＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の増加について可能な説明の１つは、レプリコンによってコードされているウイルスの非構造的なタンパク質への抗ベクター免疫の減少である。上記で論じたように、抗ベクター免疫は、レプリコンを発現する細胞のより迅速なクリアランスをもたらし、したがって、ブーストで発現された抗原を制限する。
【０１２３】
また上記のデータは、それぞれのレプリコンの投与の順序が、生成されるＴ細胞応答に影響があることを示唆している。詳細には、最初にＶＥＥＶベースのレプリコン、続いてＥＡＶベースのレプリコンを用いる異種プライム・ブーストスケジュールでは、最初にＥＡＶプライミング、続いてＶＥＥＶブーストを用いる異種プライム・ブーストレジメンと同頻度のＩＦＮγ＋抗原特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞は生成されなかった。上記の観察に一致して、投与の順序は、他の異種プライム・ブーストワクチンモデル系において差次的Ｔ細胞応答をもたらすことも示した。例えば、ウイルス系ベクターを使用したマラリアに対する保護については、マラリア抗原ＭＥ．ＴＲＡＰをコードするアデノウイルス系ベクターによるプライミング、続いて同じ抗原をコードする改変されたワクシニア・アンカラ系ベクターによるブーストによって、投与の順序が逆の場合よりもＴ細胞メモリー応答が改善され、保護が強化された。
【０１２４】
図２Ｂに示したように、様々な異種プライム・ブーストレジメンにおけるＢ細胞応答も試験した。動物からの血清を最終注射の１４日後に採取し、ＨＡ特異的総ＩｇＧ応答を評価した。ＣＤ８＋  Ｔ細胞応答の上昇とは対照的に、異種ＥＡＶ−ＶＥＥＶプライム・ブーストレジメンを受けた動物からのＢ細胞応答は、ＶＥＥＶ−ＶＥＥＶ同種レジメン群と比較した場合、抗原特異的総ＩｇＧの最低限のわずかなレベル低下を示した。しかし、両方の異種プライム・ブースト群（すなわち、ＥＡＶ−ＶＥＥＶおよびＶＥＥＶ−ＥＡＶ）において観察されたＢ細胞応答は、単回投与を受けた動物よりも有意に高かった。この方法では、異種プライム・ブーストを使用して、有意に改善されたエフェクターＣＤ８＋  Ｔ細胞応答でＢ細胞応答を誘発することができる。
【０１２５】
ブーストの１４日後のＴ細胞応答が、同種プライム・ブースト療法とは対照的に、２つの異なるレプリコンを使用して改善されたことは予想外であった。とはいえ、これは以前に試みられたことがないので、免疫応答におけるいかなる違いも、概念的には予想外であった。詳細には、ＶＥＥＶレプリコンプライム、続いてＥＡＶレプリコンブーストにより、ＥＡＶレプリコンプライムおよびＶＥＥＶレプリコンブーストに比べたＴ細胞応答の低下が生じることは予想外であった。さらに、ＥＡＶ−ＥＡＶレプリコン同種プライム・ブーストと比較した場合、異種プライム・ブーストはＴ細胞応答およびＢ細胞応答の両方を増強したが、ＶＥＥＶ−ＶＥＥＶレプリコン同種プライム・ブーストと比較した場合、Ｔ細胞応答のみ優れていたことも予想外であった。最後に、異種プライム・ブーストの他の実証とは対照的に、化学的に類似している自己増幅可能なｍＲＮＡが投与後の下流免疫応答に差次的に影響を及ぼし得るという観察も、予想外である。
【０１２６】
特に、ＥＡＶ系レプリコンによるプライム免疫化とその後のアルファウイルス（alphavirus）系レプリコンによるブースト免疫化が最良のＴ細胞応答を実証したので、以下の表１にリストしたアルファウイルス（alphavirus）系レプリコンをそれぞれ使用して、ＥＡＶ系レプリコンによる免疫系のプライムとその後のブースト免疫化を実施するために追加の実験も行う。
【０１２７】
【表１】
2021511318.tif 000002
【０１２８】
またさらなる実験を、以下を実証するために行う：（１）生理食塩水またはＬＮＰ（カチオン性脂質ナノ粒子）製剤中のＥＡＶ−ＶＥＥＶまたはＶＥＥＶ−ＥＡＶの免疫応答の優位性、（２）免疫活性化の免疫学的機序を有する２つのＶＥＥＶレプリコンの優位性、および（３）治療環境における異種プライム・ブーストの優位性。
【０１２９】
本開示の特定の代替案が開示されているが、様々な改変および組合せが可能であり、添付の特許請求の範囲の真の趣旨および範囲内と考えられることを理解されたい。したがって、本明細書で提示した正確な要約および開示に対して限定するものではない。
【０１３０】
本発明は上記の実施例を参照して説明されてきたが、改変および変更が本発明の趣旨および範囲内に包含されることは理解されよう。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
2021511318.tif 000003
【図２Ａ】
2021511318.tif 000004
【図２Ｂ】
2021511318.tif 000005
【配列表】
2021511318000001.app
【国際調査報告】
2021511318.tif 000006
2021511318.tif 000007