(57)【要約】タンパク質を安定化するための組成物、リン酸塩、ヒスチジン、又はそれらの組合せを含む緩衝液、及び塩化ナトリウムを含まない、かつ／又はトレハロース、  スクロース及びマンニトールからなる群から選択される１以上を含む安定剤；  安定化用組成物とタンパク質を含むタンパク質の安定化液体組成物；並びに、安定化用組成物を用いて安定化された液体組成物を調製する方法が、提供される。
2021508687.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む液体組成物：
（１）５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌのタンパク質；
（２）ｐＨ４〜８の緩衝液；及び
（３）安定剤、
であって、前記緩衝液は、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、前記酸の薬学的に許容される塩、及びヒスチジンからなる群から選択される少なくとも１つを含み、
かつ前記安定剤は、塩化ナトリウムを含まない、液体組成物。
【請求項２】
前記安定剤が、トレハロース、スクロース、及びマンニトールからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項３】
前記タンパク質の量が、２０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項４】
前記緩衝液のｐＨが、５．２〜７．２である、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項５】
前記組成物中の緩衝液の濃度が、１〜５０ｍＭである、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項６】
前記組成物中の緩衝液の濃度が、１〜２０ｍＭである、請求項５に記載の液体組成物。
【請求項７】
前記安定剤が、１〜２０％（ｗ／ｖ）トレハロース、１〜２０％（ｗ／ｖ）スクロース、及び０．５〜１０％（ｗ／ｖ）マンニトールからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２に記載の液体組成物。
【請求項８】
前記安定剤が、５〜１２％（ｗ／ｖ）トレハロース、５〜１２％（ｗ／ｖ）スクロース、及び２〜７％（ｗ／ｖ）マンニトールからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項７に記載の液体組成物。
【請求項９】
前記安定剤が、５〜１２％（ｗ／ｖ）スクロースを含む、請求項８に記載の液体組成物。
【請求項１０】
前記緩衝液が、１〜２０ｍＭリン酸ナトリウムを含む、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項１１】
前記安定剤が、５〜１２％（ｗ／ｖ）トレハロース、５〜１２％（ｗ／ｖ）スクロース、及び２〜７％（ｗ／ｖ）マンニトールからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１０に記載の液体組成物。
【請求項１２】
前記安定剤が、５〜１２％（ｗ／ｖ）スクロースを含む、請求項１１に記載の液体組成物。
【請求項１３】
前記緩衝液が、１〜２０ｍＭのヒスチジンを含む、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項１４】
前記安定剤が、５〜１２％（ｗ／ｖ）トレハロース、５〜１２％（ｗ／ｖ）スクロース、及び２〜７％（ｗ／ｖ）マンニトールからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項１３に記載の液体組成物。
【請求項１５】
前記安定剤が、５〜１２％（ｗ／ｖ）スクロースを含む、請求項１４に記載の液体組成物。
【請求項１６】
界面活性剤をさらに含む、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項１７】
前記界面活性剤が、全組成物に基づいて、０．００１〜３％（ｗ／ｖ）の量で含まれる、請求項１６に記載の液体組成物。
【請求項１８】
水性かつ等張性である、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項１９】
前記組成物が、水性であり、かつ２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項２０】
前記タンパク質が、１０〜５００ｋＤａの分子量を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項２１】
前記タンパク質が、ＶＥＧＦアンタゴニストである、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項２２】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが、アフリベルセプトである、請求項２１に記載の液体組成物。
【請求項２３】
硝子体内投与用である、請求項２２に記載の液体組成物。
【請求項２４】
請求項２３に記載の液体組成物を含む、硝子体内投与用注射剤。
【請求項２５】
以下を含む、液体組成物
（１）３０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト；
（２）ｐＨ５．２〜７．２の緩衝液；
（３）安定剤；及び
（４）０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）の界面活性剤、
であって、前記緩衝液は、１〜２０ｍＭリン酸ナトリウム、１〜２０ｍＭヒスチジン、又はそれらの組合せであり、
かつ前記安定剤は、塩化ナトリウムを含まない、液体組成物。
【請求項２６】
安定剤が、５〜１２％（ｗ／ｖ）トレハロース、５〜１２％（ｗ／ｖ）スクロース、及び２〜７％（ｗ／ｖ）マンニトールからなる群から選択される少なくとも１つを含む、請求項２５に記載の液体組成物。。
【請求項２７】
安定剤が、５〜１２％（ｗ／ｖ）スクロースを含む、請求項２６に記載の液体組成物。
【請求項２８】
硝子体内投与用である、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の液体組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
タンパク質の安定化された液体製剤が提供され、それは、リン酸、ヒスチジン、若しくはそれらの組合せ、及び安定剤を含む緩衝液を含む、タンパク質の安定化用組成物であって、当該安定剤は、トレハロース、スクロース及びマンニトールからなり群から選択される少なくとも１つを含み、かつ／又は塩化ナトリウムを含まない、組成物；当該安定化用組成物及びタンパク質を含む安定化された液体組成物；及び当該安定化用組成物を用いた安定化された液体組成物の調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
融合タンパク質薬物は、一般的なタンパク質薬物よりも分子量が大きく、構造が複雑なため、物理化学的不安定性をより引き起こしやすく、それゆえ、適切な製剤の開発が要求される。タンパク質薬物の化学的及び物理的安定性は、ｐＨ条件、緩衝液の選択、タンパク質の濃度、賦形剤及び温度等の種々の条件によって最適化することができる。融合タンパク質の安定性を確実にし、融合タンパク質の薬理活性を維持することができる製剤の開発のために、緩衝液の改変、ｐＨ最適化及び安定剤添加等といった種々の手段が使用されてきていた。
【０００３】
黄斑変性治療薬であるＥＹＬＥＡ（登録商標）（アフリベルセプト）は、４０ｍｇ／ｍＬアフリベルセプト、ｐＨ６．２、１０ｍＭリン酸ナトリウム、４０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％（ｗ／ｖ）スクロース、及び０．０３％（ｗ／ｖ）ポリソルベート２０の組成を有する液体製剤薬物である。眼内薬物の場合、可視以下粒子（ｓｕｂ−ｖｉｓｉｂｌｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ）の規制基準は、他の一般的なバイオ医薬品のそれらよりも厳格であり（表１を参照）、したがって、粒子的側面を考慮した製剤を開発する必要がある。。
【０００４】
【表１】
2021508687.tif 000003
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
したがって、本開示は、タンパク質薬物の安定性を増強する安定化用組成物、及びそれを含むタンパク質薬物の安定な液体組成物を提供する。
【０００６】
実施形態は、以下を含む、タンパク質薬物の安定化用組成物を、提供する：
リン酸ナトリウム、ヒスチジン、又はそれらの組合せを含む緩衝液、及び
塩化ナトリウムを含まない、かつ／又はトレハロース、スクロース、マンニトール及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つを含む、安定剤。
【０００７】
別の実施形態は、タンパク質；リン酸ナトリウム、ヒスチジン、又はそれらの組合せを含む緩衝液；塩化ナトリウムを含まない、かつ／又はトレハロース、スクロース、マンニトール、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つを含む安定剤、を含む液体組成物を提供する。
【０００８】
例えば、液体組成物は、以下を含んでいてもよく
（１）５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌのタンパク質；
（２）ｐＨ４〜８の緩衝液；及び
（３）安定剤、
ここで、緩衝液はリン酸ナトリウム、ヒスチジン、又はそれらの組合せを含み、
かつ、安定剤は塩化ナトリウムを含まない、かつ／又はトレハロース、スクロース及びマンニトールからなる群から選択される少なくとも１つを含む。
液体組成物は、界面活性剤を、例えば、全組成物に基づいて０．０１〜３％（ｗ／ｖ）の量でさらに含んでもよい。
【０００９】
別の実施形態は、液体組成物を含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
例えば、液体組成物又は医薬組成物について、タンパク質は、１０〜５００ｋＤａ、１０〜４００ｋＤａ、１０〜３００ｋＤａ、１０〜２００ｋＤａ、又は１０〜１５０ｋＤａの分子量を有するものであってもよい。一実施形態では、タンパク質は、ＶＥＧＦアンタゴニストであってもよく、例えば、アフリベルセプト（約９７〜１１５ｋＤａの分子量を有する）、ベバシズマブ（約１４９ｋＤａの分子量を有する）、ラニビズマブ（約４８ｋＤａの分子量を有する）等からなる群から選択される少なくとも１つであってもよい。
【００１１】
タンパク質がＶＥＧＦアンタゴニスト、例えば、アフリベルセプト、ベバシズマブ、ラニビズマブ等からなる群から選択される１以上である場合、医薬組成物は、眼科用組成物であってもよく、特に、硝子体内投与用非経口製剤であってもよい。
【００１２】
液体組成物又は医薬組成物は、硝子体内投与用であってもよい。
【００１３】
なお別の実施形態は、タンパク質を安定化する方法又は安定化水性液体組成物を調製する方法であって、方法がタンパク質を安定化用組成物と混合する工程を含む方法を、提供する。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本明細書では、タンパク質の安定性を増強するための安定化用組成物、それを含むタンパク質の安定な液体組成物、タンパク質を含む安定な水性液体組成物の調製方法、及びタンパク質の安定化方法が、提供される。
【００１５】
一実施形態は、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、又はそれらの組合せを含む緩衝液、及び塩化ナトリウムを含まない、かつ／又はトレハロース、スクロース、及びマンニトールからなる群から選択される少なくとも１つを含む安定剤を含む、タンパク質の安定化用組成物を、提供する。
【００１６】
別の実施形態は、以下を含む液体組成物を、提供する
（１）タンパク質；
（２）リン酸ナトリウム、ヒスチジン又はそれらの組合せを含む緩衝液；及び
（３）塩化ナトリウムを含まない、かつ／又はトレハロース、スクロース、及びマンニトールからなる群から選択される１以上を含む、安定剤。
【００１７】
液体組成物中のタンパク質含有量は、５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ〜８０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌから６０ｍｇ／ｍｌ、又は３０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌであってもよく、例えば、５ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、２０ｍｇ／ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ、４０ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ、６０ｍｇ／ｍｌ、７０ｍｇ／ｍｌ、８０ｍｇ／ｍｌ、９０ｍｇ／ｍｌ、又は１００ｍｇ／ｍｌであってもよい。
【００１８】
緩衝液は、ｐＨ４〜８、例えば、ｐＨ５．２〜７．５、ｐＨ５．２〜７．２、ｐＨ５．２〜７、ｐＨ５．２〜６．８、ｐＨ５．２〜６．６、ｐＨ５．２〜６．４、ｐＨ５．２〜６．２、ｐＨ５．５〜７．５、ｐＨ５．５〜７．２、ｐＨ５．５〜７、ｐＨ５．５〜６．８、ｐＨ５．５〜６．６、ｐＨ５．５〜６．４、ｐＨ５．５〜６．２、ｐＨ５．８〜７．５、ｐＨ５．８〜７．２、ｐＨ５．８〜７、ｐＨ５．８〜６．８、ｐＨ５．８〜６．６、ｐＨ５．８〜６．４、ｐＨ５．８〜６．２、又はｐＨ６．２の１つであってもよい。
【００１９】
緩衝液は、リン酸、酢酸、クエン酸、コハク酸、当該酸の薬学的に許容される塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩等）、及びヒスチジンからなる群から選択される１以上を含んでもよい。一実施形態において、緩衝液は、リン酸ナトリウム、ヒスチジン、又はそれらの組合せを含んでもよい。緩衝液は、全液体組成物に基づいて、約１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約１ｍＭ〜約４０ｍＭ、約１ｍＭ〜約３０ｍＭ、約１ｍＭ〜約２０ｍＭ、約１ｍＭ〜約１５ｍＭ、１ｍＭ〜約１２ｍＭ、約５ｍＭ〜約５０ｍＭ、約５ｍＭ〜約４０ｍＭ、約５ｍＭ〜約３０ｍＭ、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、約５ｍＭ〜約１５ｍＭ、約５ｍＭ〜約１２ｍＭ、約８ｍＭ〜約５０ｍＭ、約８ｍＭ〜約４０ｍＭ、約８ｍＭ〜約３０ｍＭ、約８ｍＭ〜約２０ｍＭ、約８ｍＭ〜約１５ｍＭ、約８ｍＭ〜約１２ｍＭ、又は１０ｍＭの濃度で含まれてもよい。
【００２０】
一実施形態では、安定剤は塩化ナトリウムを含まなくてもよい。
【００２１】
他の実施形態において、安定剤は、トレハロース、スクロース、マンニトール、及びそれらの組合せからなる群から選択される１以上であってもよい。例えば、安定剤は、１〜２０％（ｗ／ｖ）、１〜１５％（ｗ／ｖ）、１〜１０％（ｗ／ｖ）、５〜２０％（ｗ／ｖ）、５〜１５％（ｗ／ｖ）、５〜１０％（ｗ／ｖ）、７．８〜２０％（ｗ／ｖ）、７．８〜１５％（ｗ／ｖ）、７．８〜１０％（ｗ／ｖ）、７．８〜８．２％（ｗ／ｖ）、又は８％（ｗ／ｖ）のトレハロース；１〜２０％（ｗ／ｖ）、１〜１５％（ｗ／ｖ）、１〜１０％（ｗ／ｖ）、５〜２０％（ｗ／ｖ）、５〜１５％（ｗ／ｖ）、５〜１０％（ｗ／ｖ）、７．８〜２０％（ｗ／ｖ）、７．８〜１５％（ｗ／ｖ）、７．８〜１０％（ｗ／ｖ）、７．８〜８．２％（ｗ／ｖ）、又は８％（ｗ／ｖ）のスクロース；及び０．５〜１０％（ｗ／ｖ）、０．５〜７．５％（ｗ／ｖ）、０．５〜５％（ｗ／ｖ）、１〜１０％（ｗ／ｖ）、１〜７．５％（ｗ／ｖ）、１〜５％（ｗ／ｖ）、３〜１０％（ｗ／ｖ）、３〜７．５％（ｗ／ｖ）、３〜５％（ｗ／ｖ）、４〜５％（ｗ／ｖ）、又は４．５％（ｗ／ｖ）のマンニトールからなる群から選択される１以上を含んでもよい。
【００２２】
特定の実施形態では、液体組成物が緩衝剤としてリン酸ナトリウムを含む、又は緩衝剤としてリン酸塩（例えば、リン酸ナトリウム）及び安定剤としてスクロースを含む場合、液体組成物は、塩化ナトリウムを含まなくてもよい。
【００２３】
液体組成物は、タンパク質、緩衝剤及び安定剤の上記の内容物、及び残留水性媒体（例えば、水（精製水）、生理食塩水、注射水等）を含んでもよい。
【００２４】
一実施形態では、液体組成物は、界面活性剤を、全液体組成物に基づいて、例えば、０．００１〜３％（ｗ／ｖ）、０．００１〜２％（ｗ／ｖ）、０．００１〜１％（ｗ／ｖ）、０．００１〜０．５％（ｗ／ｖ）、０．００１〜０．１％（ｗ／ｖ）、０．００１〜０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０１〜３％（ｗ／ｖ）、０．０１〜２％（ｗ／ｖ）、０．０１〜１％（ｗ／ｖ）、０．０１〜０．５％（ｗ／ｖ）、０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）、０．０１〜０．０５％（ｗ／ｖ）、又は０．０３％（ｗ／ｖ）の量で、さらに含んでもよい。界面活性剤は、液体組成物媒体中にタンパク質を均一に分散させることができる任意の薬学的に許容される界面活性剤であってもよい。界面活性剤は、非イオン性界面活性剤；例えば、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノラウレート））、ポリソルベート４０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノパルミテート）、ポリソルベート６０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノステアレート）、ポリソルベート８０（ポリオキシエチレン（２０）ソルビタンモノオレエート）からなる群から選択される少なくとも１つであってもよく、ここで、ポリオキシエチレンの後ろの数値、つまり（２０）は、オキシエチレン基（−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）−）；ポロキサマー（ＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯコポリマー；ＰＥＯ：ポリ（エチレンオキシド）、ＰＰＯ：ポリ（プロピレンオキシド））、ポリエチレン−ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチレン化合物（例えば、ポリオキシエチレン−ステアレート、ポリオキシエチレンアルキルエーテル（アルキル：Ｃ１〜Ｃ３０）、ポリオキシエチレンモノラウリルエーテル、アルキルフェニルポリオキシエチレンコポリマー（アルキル：Ｃ１〜Ｃ３０）等）、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）等の総数を意味する。例えば、界面活性剤は、ポリソルベート（例えば、ポリソルベート２０）であってもよい。
【００２５】
本明細書で提供される液体組成物は、生存組織と等張であってもよい。例えば、液体組成物の浸透圧は、約２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約４００ｍＯｓｍ／ｋｇ、例えば、約２５０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３００ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。そのような浸透圧は、安定剤によって調整されてもよい。
【００２６】
本明細書で提供される液体組成物の導電率は、約０．１ｍＳ／ｃｍ以上、例えば、約０．１ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍ、約０．１ｍＳ／ｃｍ〜約７ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍ、約１ｍＳ／ｃｍ〜約７ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍ、約２．５ｍＳ／ｃｍ〜約７ｍＳ／ｃｍ、約５ｍＳ／ｃｍ〜約１０ｍＳ／ｃｍ、又は約５ｍＳ／ｃｍ〜約７ｍＳ／ｃｍであってもよい。
【００２７】
本明細書で提供される液体組成物において、タンパク質は、タンパク質薬物、例えば、１０〜５００ｋＤａ、１０〜４００ｋＤａ、１０〜３００ｋＤａ、１０〜２００ｋＤａ、又は１０〜１５０ｋＤａの分子量を有するタンパク質（例えば、融合タンパク質）であってもよい。一実施形態では、タンパク質は、ＶＥＧＦ（血管内皮増殖因子）アンタゴニスト、例えば、ヒトＶＥＧＦ受容体１及びＶＥＧＦ受容体２の細胞外ドメインに由来するＶＥＧＦ結合部位とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が融合したＶＥＧＦ特異的融合タンパク質であってもよい。特定の実施形態では、ＶＥＧＦ特異的融合タンパク質は、ヒトＶＥＧＦ受容体１（Ｆｌｔ１）の免疫グロブリン様（Ｉｇ）ドメイン２とヒトＶＥＧＦ受容体２（Ｆｌｔ１又はＦｌｔ４）のＩｇドメイン３とを含む領域と、ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域が融合した、タンパク質であってもよい；例えば、ＶＥＧＦ特異的融合タンパク質は、配列番号１の以下のアミノ酸配列を有するアフリベルセプトであってもよい。
【００２８】
アフリベルセプトアミノ酸配列（配列番号１）
ＳＤＴＧＲＰＦＶＥＭ  ＹＳＥＩＰＥＩＩＨＭ  ＴＥＧＲＥＬＶＩＰＣ  ＲＶＴＳＰＮＩＴＶＴ  ＬＫＫＦＰＬＤＴＬＩ  ＰＤＧＫＲＩＩＷＤＳ  ＲＫＧＦＩＩＳＮＡＴ  ＹＫＥＩＧＬＬＴＣＥ  ＡＴＶＮＧＨＬＹＫＴ  ＮＹＬＴＨＲＱＴＮＴ  ＩＩＤＶＶＬＳＰＳＨ  ＧＩＥＬＳＶＧＥＫＬ  ＶＬＮＣＴＡＲＴＥＬ  ＮＶＧＩＤＦＮＷＥＹ  ＰＳＳＫＨＱＨＫＫＬ  ＶＮＲＤＬＫＴＱＳＧ  ＳＥＭＫＫＦＬＳＴＬ  ＴＩＤＧＶＴＲＳＤＱ  ＧＬＹＴＣＡＡＳＳＧ  ＬＭＴＫＫＮＳＴＦＶ  ＲＶＨＥＫＤＫＴＨＴ  ＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ  ＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰ  ＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲ  ＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤ  ＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦ  ＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨ  ＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱ  ＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶ  ＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮ  ＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮ  ＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴ  ＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥ  ＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲ  ＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬ  ＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳ  ＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧ  ＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰ  ＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦ  ＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳ  ＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣ  ＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨ  ＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰ  Ｇ
（ジスルフィド架橋：３０−７９；１２４−１８５；２４６−３０６；３５２−４１０、二量体：２１１；２１４）
【００２９】
融合タンパク質は、組換え又は合成により生成されてもよい。
【００３０】
本明細書で提供される液体組成物は、約４０℃の高温で４週間以上安定に維持されてもよい。
【００３１】
用語「安定性が優れている」又は「安定して維持される」とは、物理的、化学的及び／又は生物学的特性及び／又は組成物中のタンパク質の構造が貯蔵の最中に維持できること（例えば、貯蔵の最中、低タンパク質ポリマー形成率、低タンパク質凝集率、低タンパク質分解率、及び／又は低変性率等）を意味してもよい。タンパク質の安定性を測定するための種々の分析技術は、関連する技術分野で周知である。
【００３２】
例えば、本明細書で提供される液体組成物は、タンパク質（抗体）含有量が４０ｍｇ／ｍｌの場合、４０℃で４週間貯蔵の最中に従来のＳＥＣ（サイズ排除クロマトグラフィー）で測定された、タンパク質ポリマー形成率又は凝集率（高分子量％（ｗ／ｖ）；％ＨＭＷ）の変化（貯蔵４週目での％ＨＭＷ−０週目（貯蔵開始）での％ＨＭＷ）は、約９未満、例えば、約８．８以下又は約８．３以下であるが、これらに限定されない。
【００３３】
別の実施形態は、液体組成物を含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、医薬的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容される担体は、従来使用されているものであり、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、デンプン、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸塩、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水（例えば、精製水）、食塩水、シロップ、メチルセルロース、ヒドロキシ安息香酸メチル、ヒドロキシ安息香酸プロピル、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油等からなる群から選択される１以上を含んでもよいが、これらに限定されない。
【００３４】
液体組成物又は医薬組成物は、経口又は非経口経路で投与してもよい。非経口投与（例えば注射）の場合、それは、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与、内皮投与、局所投与、鼻腔内投与、肺内投与、直腸内投与、腫瘍内投与、硝子体内投与等により投与してもよい。
【００３５】
特定の実施形態では、液体組成物又は医薬組成物は、上記のＶＥＧＦアンタゴニストを含む点眼溶液であってもよく、この場合、眼の硝子体液に投与される非経口製剤であってもよい。
【００３６】
別の実施形態は、タンパク質を前述の安定化用組成物と混合する工程を含む、タンパク質を安定化する方法又は安定化された液体組成物を調製する方法を提供する。
【００３７】
特定の実施形態において、以下を混合する工程を含む、タンパク質を安定化する方法又は安定化された水性液体組成物を調製する方法が提供される
（１）タンパク質；
（２）リン酸ナトリウム、ヒスチジン、又はそれらの組合せを含む緩衝液；
（３）塩化ナトリウムを含まない、かつ／又はトレハロース、スクロース及びマンニトールからなる群から選択される１以上を含む、安定剤；そして
（４）任意で、界面活性剤。
【００３８】
タンパク質の安定化方法又は安定化された水性液体組成物の調製方法に使用される各成分の種類及び含有量の具体的な説明は、上述と同じである。
【発明の効果】
【００３９】
本発明は、融合タンパク質といったタンパク質が物理的、化学的及び／又は生物学的有効性を長期間安定して維持できるようにする安定化用の組成物及び液体製剤を提供することにより、タンパク質の貯蔵中に起こり得る、ポリマー及び／又は凝集体の生成ならびにフラグメントの生成及び／又は荷電変異体への変性を阻害し、それによりタンパク質の薬理効果を長期間維持することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、実施例２で測定された試験組成物の４０℃での４週間の貯蔵中の４週間の４週間の％ＨＭＷ（高分子量％）変化率（Δ％ＨＭＷ）を示すグラフである。
【図２】図２は、実施例２で測定された試験組成物を４０℃での４週間の貯蔵中の４週間の△％ＨＭＷ結果に基づいて、Ｍｉｎｉｔａｂ（Ｍｉｎｉｔａｂ、バージョン１７）を用いて統計的に有意な因子を分析した結果を示すグラフである。
【図３】図３は、実施例３で測定された試験組成物の４０℃での４週間の貯蔵中の４週間のΔ％酸性結果に基づいて、Ｍｉｎｉｔａｂを用いて統計的に有意な因子を分析した結果を示すグラフである。
【図４】図４は、実施例４で測定された試験組成物の４０℃での４週間の貯蔵中の４週間の％ＲＰＡ（相対効力活性）変化率（Δ％ＲＰＡ）結果に基づいて、Ｍｉｎｉｔａｂを用いて統計的に有意な因子を分析した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
以下、実施例及び試験例を通じて本発明をより詳細に説明する。しかしながら、これらの実施例及び試験例は、本発明を例示することを意図しており、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４２】
（実施例１．液体組成物の調製）
ＶＥＦＧアンタゴニストとして機能する融合タンパク質である、タンパク質薬物としてのアフリベルセプト（ヒトＶＥＧＦ受容体１及び２の細胞外ドメインに由来するＶＥＧＦ結合部位とヒトＩｇＧ１のＦｃ領域の融合タンパク質；ＣＡＳ番号：８６２１１１−３２−８；配列番号１）を用いて、タンパク質薬物の液体組成物１〜１４を、以下の表２の組成物として調製した：
【００４３】
【表２】
2021508687.tif 000004
【００４４】
（実施例２．ＨＭＷ含有量（％）の測定）
実施例１で調製した組成物１〜１４の安定性を試験するために、組成物中のタンパク質薬物の凝集度を示す％ＨＭＷ（％高分子量；重量に基づく）を、タンパク質薬剤濃度４０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．２、４０℃の条件で４週間の貯蔵の最中にＳＥ−ＨＰＬＣで測定した。
【００４５】
より具体的には、モノマー検出時よりも早く検出された物質をＨＭＷと定義し、％ＨＭＷを流量１．０ｍＬ／ｍｉｎ、注入時間１７分の条件でＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  ２６９５  ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌｅ  ａｌｌｉａｎｃｅ）及びカラム（東ソー、ＴＳＫ−ｇｅｌ  Ｇ３０００  ＳＷＸＬ）を用いて測定した（％ＨＭＷ＝ＡｒｅａＨ／ＡｒｅａＴＯＴＡＬ×１００）。
【００４６】
測定された％ＨＭＷ（初期％ＨＭＷ、第４週％ＨＭＷ、Δ％ＨＭＷ（第４週％ＨＭＷ−初期％ＨＭＷ））を表３に示し、第４週％ＨＭＷを図１に示す（Ｐ：Ｎａ−リン酸、Ｈ：ヒスチジン、Ｔ：トレハロース、Ｓ：スクロース、Ｍ：マンニトール）：
【００４７】
【表３】
2021508687.tif 000005
【００４８】
表３及び図１に示すように、安定剤としてスクロース、トレハロース又はマンニトールを含むすべての試験組成物において、第４週での％ＨＭＷ及び第４週での％ＨＭＷの増加率（初期の％ＨＭＷと比較して（０週））の両方は、対照（ＥＹＬＥＡ（登録商標）及びＥＹＬＥＡ（登録商標）組成物適用製剤）のそれらよりも低かった。
【００４９】
表３に示されるΔ％ＨＭＷの結果に基づく統計的に有意な要因を分析した結果が図２に示される。図２において、△％ＨＭＷに有意に影響を与えた因子が安定剤としてのマンニトール、スクロース、及びトレハロースであることが確認された。図２に示すように、緩衝液の種類による大きな違いはなく、安定剤の場合、デキストロースを用いた組成物と比較して、マンニトール、スクロース又はトレハロースを用いたほうが、％ＨＭＷが低いことが示された。
【００５０】
上記のようにΔ％ＨＭＷを低下させることが確認された安定剤としてのマンニトール、スクロース、又はトレハロースを含む製剤について、上記と同様の試験を繰り返し行った（ｎ＝３）、そして得られた結果を表４に示す：
【００５１】
【表４】
2021508687.tif 000006
【００５２】
表４に示すように、安定剤としてマンニトール、スクロース、又はトレハロースを含む製剤は、対照と比較して低いΔ％ＨＭＷを示し、優れた安定性を有し、そのような優れた安定性が繰り返し達成されたことを示した。
【００５３】
（実施例３．酸性成分（％）と主要成分（％）の測定）
表５に示すように、組成物１−１０（タンパク質薬物濃度：４０ｍｇ／ｍＬ；ｐＨ６．２；界面活性剤：０．０３％（ｗ／ｖ）ＰＳ２０）を、優れた安定化効果が実施例１及び表３で確認された安定剤としてのマンニトール、スクロース、又はトレハロースを用いて、及び対照の安定剤としてのデキストロースを用いて、調製した。これらの組成物の安定性をテストするために、組成物中のタンパク質薬物の変性度を示す％酸性（％酸性バリアント含有量；重量に基づく）及び％メイン（電荷バリアントアスペクトの初期状態の表面電荷を維持するタンパク質の含有量（重量に基づく））を、４０℃で４週間貯蔵中に、画像化キャピラリー等電点電気泳動（ｉｃＩＥＦ）を用いて測定した。
【００５４】
より具体的には、％酸性、％塩基性、及び％メインは、酵素（シアリダーゼＡ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を処理した後、ｉｃＩＥＦ装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｍｐｌｅ、ｉＣＥ３）を用いてサンプル注入時間１１０秒、２０００ｐｓｉのサンプル注入圧力の条件下で、インキュベートされたサンプルの酸性、メイン、及び塩基性アイソフォームを分析することにより測定した。
【００５５】
測定された％酸性及び％メイン（初期、第４週、第４週の結果−初期結果（Δ％酸性及びΔ％メイン））を表５に示す：
【００５６】
【表５】
2021508687.tif 000007
【００５７】
表５に示すように、試験組成物のすべては、安定剤としてデキストロースを含む比較組成物と比較して、％酸性及び％メインの両方でより低い変化度を示した、このことは、試験組成物が増加した安定性を有したことを示す。
【００５８】
表５の結果に基づいて決定された統計的に有意な因子が分析された、結果を図３に示す。図３に示すように、緩衝液の種類による△％酸性の有意差がないことが確認されたが、デキストロースを除いてすべての安定剤が△％酸性に有意に影響を与えた。
【００５９】
（実施例４．アフリベルセプトのＶＥＧＦ結合効力の測定）
実施例１で調製した表２の組成物１〜１４中の薬理活性成分であるアフリベルセプトの活性の維持を試験するために、ＶＥＦＧに対する組成物中のアフリベルセプトの％ＲＢＡ（相対結合活性）及び％ＲＰＡ（相対効力活性）を、タンパク質薬物濃度４０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ６．２、４０℃の条件で４週間貯蔵の最中に測定した。
【００６０】
より具体的には、％ＲＢＡは、以下の方法で測定した：ＭａｘｉＳｏｒｐ９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）上へのＶＥＧＦ１６５コーティング（洗浄及びブロッキングを含む；Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍ）を行った後、アフリベルセプト及び二次抗体（Ｓｉｇｍａ）をその上に順番にロードし、次いで、ＴＭＢ  ＥＬＩＳＡ物質溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を処理し；  その後、ＥＬＩＳＡリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ）を用いて％ＲＢＡ（相対効力分）を測定した。
【００６１】
４０℃で０週及び４週で測定した％ＲＢＡ並びに４週間の％ＲＢＡ変化率（Δ％ＲＢＡ）を、表６に示す。
【００６２】
【表６】
2021508687.tif 000008
【００６３】
表６に示すように、％ＲＢＡ減少率が、安定剤としてデキストロースを含む組成物を除いて、すべてのテストした組成物において対照のそれより低いか又は同等のレベルであったことが示され、そのような結果は、試験したすべての組成物において、アフリベルセプトがＶＥＧＦへの結合活性を十分に維持したことを示した。
【００６４】
また、％ＲＰＡは、以下の方法で測定した：アフリベルセプトとＶＥＧＦが順番にロードされた９６ウェルプレート中にＫＤＲ２９３細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）をロードしてインキュベートした後、％ＲＰＡ（相対効力分析）をＥｎｖｉｓｉｏｎマイクロプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、Ｅｎｖｉｓｉｏｎ  ２０１４）を用いて分析した。
【００６５】
４０℃で０週及び４週で測定した％ＲＰＡ並びに４週間の％ＲＰＡ変化率（Δ％ＲＰＡ）を、表７に示す。
【００６６】
【表７】
2021508687.tif 000009
【００６７】
表７に示すように、安定剤としてデキストロースを含む組成物を除いて、すべての試験した組成物の％ＲＰＡの低下率は、対照のそれより低いか又は同等であった、このことは、ＶＥＧＦ中和キャパシティに対するアフリベルセプトの相対的力価が  すべての試験した組成物で十分に維持することができることを提示する。
【００６８】
統計的に有意な因子を表７における％ＲＰＡ結果に基づいて分析した、得られた結果を図４に示す。図４に示すように、試験したすべての緩衝液は、対照と比較して同様又は改善された％ＲＰＡ減少を示し、安定剤の場合、デキストロースを除くすべての試験した安定剤は、対照と比較して同様又はより少ない％ＲＰＡ減少を示した。
【００６９】
（実施例５．６種類の組成物の安定性の測定）
実施例１で調製した組成物のうち、実施例２〜４で優れた安定性が確認された６種類の組成物（表２における組成物４、５、６、８、９及び１０）の％メインを、ＣＥ−ＳＤＳ（キャピラリー電気泳動ドデシル硫酸ナトリウム）を用いて測定した（４０℃、４週間）。
【００７０】
より具体的には、％メインは、以下の方法で測定した：ＳＤＳサンプルバッファー（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）とＢＭＥ（２−メルカプトエタノール、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を混合したサンプル（混合比：約１：５０（ｖ：ｖ）を７０℃で熱処理した後、ＣＥ分析機器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、ＰＡ８００  ｐｌｕｓ）及び３２  ｋａｒａｔ  ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、２２０ｎｍ未満で検出された％全タンパク質面積を分析した。
【００７１】
４０℃で０週及び４週で測定した％メイン並びに４週間の％メイン変化率（Δ％メイン）を、表８に示す：
【００７２】
【表８】
2021508687.tif 000010
【００７３】
表８に示されるように、テストされた６つの組成物の％メイン減少は、対照のそれと同等又はそれより低かった。そのような結果は、すべてのテストされた６つの組成物が、対照と同等又はそれより高い安定性を有していたことを示した。
【図１】
2021508687.tif 000011
【図２】
2021508687.tif 000012
【図３】
2021508687.tif 000013
【図４】
2021508687.tif 000014
【配列表】
2021508687000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月17日(2020.7.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下を含む液体組成物：
（１）５ｍｇ／ｍｌ〜１００ｍｇ／ｍｌのＶＥＧＦアンタゴニスト；
（２）リン酸または前記酸の薬学的に許容される塩を含み、かつ４〜８の範囲のｐＨを有する、１〜５０ｍＭの緩衝液；及び
（３）７．８〜１０％（ｗ／ｖ）の安定剤、
であって、前記液体組成物は、塩化ナトリウムを含まない、液体組成物。
【請求項２】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストの量が、２０ｍｇ／ｍｌ〜６０ｍｇ／ｍｌである、請求項１に記載の液体組成物。
【請求項３】
前記液体組成物のｐＨが、５．８〜６．２である、請求項１又は２に記載の液体組成物。
【請求項４】
前記組成物中の緩衝液の濃度が、１〜２０ｍＭである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項５】
前記緩衝剤が、リン酸ナトリウムである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項６】
前記安定剤の量が、７．８〜８．２％（ｗ／ｖ）である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項７】
前記安定剤が、トレハロース、スクロース、及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項８】
界面活性剤を０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）の量でさらに含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項９】
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、およびそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項８に記載の液体組成物。
【請求項１０】
水性かつ等張性である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項１１】
前記組成物が、水性であり、かつ２００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの浸透圧を有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項１２】
前記ＶＥＧＦアンタゴニストが、アフリベルセプトである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の液体組成物。
【請求項１３】
以下を含む、液体組成物
（１）３０ｍｇ／ｍｌ〜５０ｍｇ／ｍｌのアフリベルセプト；
（２）リン酸ナトリウムを含む、１〜２０ｍＭの緩衝液；
（３）７．８〜１０％（ｗ／ｖ）のスクロース；及び
（４）０．０１〜０．１％（ｗ／ｖ）のポリソルベート２０；
であって、前記液体組成物は、６．２のｐＨを有し、かつ塩化ナトリウムを含まない、液体組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の液体組成物を含む、硝子体内投与用非経口製剤。
【国際調査報告】
2021508687.tif 000015
2021508687.tif 000016
2021508687.tif 000017
2021508687.tif 000018
2021508687.tif 000019
2021508687.tif 000020
2021508687.tif 000021
2021508687.tif 000022
2021508687.tif 000023
2021508687.tif 000024