(57)【要約】  本発明は、アミノ酸配列ＬＬ−［Ｘ］ｎ−ＬＬ（ここで、ＸはＲ、ＬおよびＷから選択され、ｎ＝１０〜１２であり、［Ｘ］ｎは、４個のＲ、４個のＬ、および２〜４個のＷを含む）を含む、細胞膜透過性ペプチドとして使用しうる新規なペプチドに関する。本発明は、本発明のペプチドおよびカーゴ分子を含むナノ粒子、ならびにその使用にも関する。
2021531274.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アミノ酸配列ＬＬ−［Ｘ］ｎ−ＬＬを含み、ここで、ＸはＲ、ＬおよびＷから選択され、ｎ＝１０〜１２であり、［Ｘ］ｎは、４個のＲ、４個のＬ、および２〜４個のＷを含む、１４〜１６アミノ酸残基の長さを有する天然に生じない細胞膜透過性ペプチド。
【請求項２】
アミノ酸配列ＬＬ−［Ｘ］ｍ−ＲＬＬを含み、ここでｍ＝９〜１１である、請求項１に記載のペプチド。
【請求項３】
［Ｘ］ｎまたは［Ｘ］ｍは、クラスターとして存在するかまたは分散して存在するＷモチーフを含む、請求項１または２に記載のペプチド。
【請求項４】
［Ｘ］ｎまたは［Ｘ］ｍが、ＬＬからなるクラスターを少なくとも１つ、好ましくは２つ含む、請求項１〜３のいずれかに記載のペプチド。
【請求項５】
ペプチドが、ＬＬＷＲＬＷＲＬＬＷＲＬＷＲＬＬ（配列番号１）、ＬＬＲＬＬＲＷＷＷＲＬＬＲＬＬ（配列番号２）、ＬＬＲＬＬＲＷＷＲＬＬＲＬＬ（配列番号３）、およびＬＬＲＬＬＲＷＷＷＷＲＬＬＲＬＬ（配列番号４）から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜４のいずれかに記載のペプチド。
【請求項６】
ペプチドがＬ−アミノ酸および／またはＤ−アミノ酸を含む、請求項１〜５のいずれかに記載のペプチド。
【請求項７】
ペプチドが正味の正電荷５を有する、請求項１〜６のいずれかに記載のペプチド。
【請求項８】
ペプチドが、前記アミノ酸配列のＣ末端に共有結合された、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、システアミド、チオール、アミド、カルボキシル、置換されていてもよい直鎖もしくは分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル、第１級もしくは第２級アミン、オシジック（osidic）誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナルおよび／または標的化分子のなかから選択される、１つまたはそれ以上の成分さらに含む、および／またはペプチドが、前記アミノ酸配列のＮ末端に共有結合された、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、アミン、アセチル、置換されていてもよい直鎖もしくは分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル、第１級もしくは第２級アミン、オシジック誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナルおよび／または標的化分子のなかから選択される、１つまたはそれ以上の化学成分をさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載のペプチド。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれかに記載されるペプチドの、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）としての使用。
【請求項１０】
細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）が哺乳動物細胞の形質膜の透過に適当である、請求項９に記載のペプチドの使用。
【請求項１１】
請求項１〜８のいずれかに記載されるペプチドの、トランスフェクション試薬としての使用。
【請求項１２】
請求項１〜８のいずれかに記載されるペプチド、およびカーゴ分子を含む、ナノ粒子。
【請求項１３】
カーゴ分子が、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、低分子、医薬活性物質、およびその任意の混合物からなる群から選択され、好ましくは、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ＰＭＯ分子、アンチセンス分子、ＬＮＡ分子、ｍｃＤＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９分子、プラスミド、リボザイム、アプタマー、シュピーゲルマー（spiegelmer）およびデコイ分子からなる群から選択される核酸である、請求項１２に記載のナノ粒子。
【請求項１４】
ナノ粒子の大きさが、５０〜３００ｎｍ、好ましくは１００〜２００ｎｍであり、および／またはカーゴ分子がペプチドと、共有結合もしくは非共有結合により結合している、請求項１２または１３に記載のナノ粒子。
【請求項１５】
請求項１２〜１４のいずれかに記載されるナノ粒子、および薬学的に許容しうる担体を含む、医薬組成物。
【請求項１６】
カーゴ分子をインビトロで細胞に送達する方法であって、前記細胞を、前記カーゴ分子を含む請求項１２〜１４のいずれかに記載されるナノ粒子と接触させるステップを含む方法。
【請求項１７】
カーゴ分子をエクスビボで組織および／または器官に送達する方法であって、前記組織および／または器官を、前記カーゴ分子を含む請求項１２〜１４のいずれかに記載されるナノ粒子と接触させるステップを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞膜透過性ペプチドとして使用しうる天然に生じないペプチドに関する。より具体的には、本発明のペプチドは、カーゴ分子、例えばｓｉＲＮＡと自己集合して、カーゴ分子を細胞にトランスフェクトするためのペプチドベースのナノ粒子を形成することができる。本発明は、前記ナノ粒子を含む医薬組成物、およびカーゴ分子を細胞中に送達する方法にも関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳動物細胞におけるＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、このメカニズムをさまざまな疾患の治療に利用するための新たな研究機会を切り開いた。短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、各３’末端に２ヌクレオチドオーバーハングを含む２０〜２５塩基対の長さを有する二本鎖ＲＮＡ分子である。標的ｍＲＮＡに相補的な配列を有するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列特異的な遺伝子発現抑制（サイレンシング）を誘導することができる。ｓｉＲＮＡは、ウイルス感染および癌のような多くの治療困難な疾患のための潜在的候補薬剤であることが示されている。
【０００３】
このようなオリゴヌクレオチドは、そのデザインの融通性および高度の特異性のゆえに、未来の薬剤としての可能性は際立っている。しかしながら、低い細胞膜透過性や、細胞内に入ってからの速いエンド／リソソーム分解といった制限は、特定の担体の使用によって克服されるかもしれない。カチオン性脂質、ポリマー、デンドリマーおよびペプチドをベースとする数多くの送達技術が開発されている。そのような非ウイルス担体材料のなかで、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）が、その配列および機能の多様性のゆえに関心が高まっている。ＣＰＰは通常、後半なソース（例えば、ヒト、マウス、ウイルスまたは純合成物）に由来する短い（３０アミノ酸までの）ペプチドである。ＣＰＰは、その構造的特性に基づいて、アルギニンリッチＣＰＰと両親媒性ＣＰＰの２つのクラスに分類されうる。
【０００４】
両親媒性ＣＰＰは、細胞インターナリゼーションおよびカーゴとの相互作用のために必要な、親水性および疎水性の両ドメインを含む。初期の両親媒性ＣＰＰにおいては、それらドメインは、ｐＶＥＣ（A. Elmquist et al. VE-Cadherin-Derived Cell-Penetrating Peptide, pVEC, with Carrier Functions, Exp. Cell Res. 269 (2001) 237-244）、ＭＰＧおよびＰｅｐ−１（S. Deshayes et al., (2005) Cell-penetrating peptides: tools for intracellular delivery of therapeutics, Cell. Mol. Life Sci. CMLS. 62, 1839-1849）に見られるように、ペプチド鎖に沿ったその位置にしたがって配される。第２期の両親媒性ＣＰＰは、親水性および疎水性ドメインの分離がαヘリックスまたはβシートといった二次構造の形成によって生じている、もう１つの大きなペプチドクラスである。最も一般的に用いられるＣＰＰの多くは、このクラスのメンバーで、その例は、ペネトラチン（penetratin）（D. Derossi et al., (1994) The third helix of the Antennapedia homeodomain translocates through biological membranes., J. Biol. Chem. 269(14) 10444-50）、トランスポータン（tansportan）（M. Pooga et al., (1998) Cell penetration by transportan, FASEB J. 12, 67-77）、ｈＣＴバリアント（ヒトカルシトニン）（J. Hoyer et al., (2012) Knock-down of a G protein-coupled receptor through efficient peptide-mediated siRNA delivery, J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 161(3), 826-834）、ＲＩＣＫ（A. Vaissiere et al., (2017) A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery, J Nanobiotechnology. 15(1), 34）、またはＣ６Ｍ１（M. Jafari et al., (2014) Serum stability and physicochemical characterization of a novel amphipathic peptide C6M1 for siRNA delivery, PLoS ONE. 9(5):e97797）である。
【０００５】
ＣＰＰを用いてオリゴヌクレオチドをベクター化する方法は主に２つある。ＣＰＰにオリゴヌクレオチドを直接コンジュゲートすることによる方法（共有コンジュゲーション法）と、ＣＰＰとオリゴヌクレオチドの間に非共有結合体を形成することによる方法（ナノ粒子をベースとする方法）である。非共有結合ナノ粒子（ＮＰ）の形成は、複数の負電荷を有し、それゆえカチオン性ペプチドと静電複合体を形成することのできるオリゴヌクレオチドのＣＰＰ仲介送達において特に効果的である。さらに、ペプチドベースのナノ粒子は、ＮＰの集合を可能にするために化学的修飾を必要としないので、実施が非常に容易なワンステッププロセスである。したがって、静電複合体の形成は、ＣＰＰ仲介ｓｉＲＮＡ送達のための最も一般的な方法となっている。
【０００６】
しかしながら、これまでに、開発されたＮＰは、低い安定性、低い膜透過性、低い標的遺伝子の効果的サイレンシング能力、細胞傷害性等を包含する、いくつかの欠点を示している。
【０００７】
したがって、前記制限を克服する、改善された細胞膜透過性ペプチドが依然必要とされる。特に、治療剤のような化合物を標的細胞に、顕著な細胞傷害性および／または免疫原性を示すことなく効率的に送達することを可能にする細胞膜透過性ペプチドが必要である。
【発明の概要】
【０００８】
既に開発されたＣＰＰおよびその欠点の研究によって、本発明者は、ペプチドの溶解性、二次構造、低い細胞傷害性、および高い取り込み効率に正の影響を及ぼすために配列の特定の位置に存在しなければならない３つの必須のアミノ酸を特定した。より具体的には、本発明者は、従来のＣＰＰの欠点を少なくとも部分的に克服する、専らロイシン（Ｌ）、アルギニン（Ｒ）およびトリプトファン（Ｗ）残基からなる新規なＣＰＰを開発した。Ｗ−およびＲ−リッチ両親媒性ペプチド（W- and R-rich Amphipathic Peptide）を略してＷＲＡＰとも称される該新規な短鎖両親媒性ペプチドにおいて、トリプトファン残基は配列全体に分散して存在するか、または配列の１つのドメイン中にクラスターとして存在しうる。本発明のペプチドは全般に、より高い全体的なトランスフェクション効率を示し、かつ、より低い程度の細胞傷害性を示す。
【０００９】
したがって、本発明の目的は、アミノ酸配列ＬＬ−［Ｘ］ｎ−ＬＬ（ここで、ＸはＲ、ＬおよびＷから選択され、ｎ＝１０〜１２であり、［Ｘ］ｎは、４個のＲ、４個のＬ、および２〜４個のＷを含む）を含む天然に生じないペプチドを提供することである。
【００１０】
一態様において、ペプチドはアミノ酸配列ＬＬ−［Ｘ］ｍ−ＲＬＬを含み、ここでｍ＝９〜１１である。
【００１１】
一態様において、［Ｘ］ｎまたは［Ｘ］ｍは、アミノ酸配列中にクラスターとして、または分散して存在する２〜４個のＷを含む。
【００１２】
その代わりに、またはそれに加えて、［Ｘ］ｎまたは［Ｘ］ｍは、ＬＬからなるクラスターを少なくとも１つ、好ましくはＬＬからなるクラスターを２つ含みうる。
【００１３】
一態様において、ペプチドは、
ＬＬＷＲＬＷＲＬＬＷＲＬＷＲＬＬ（配列番号１  −  ＣＰＰ１）、
ＬＬＲＬＬＲＷＷＷＲＬＬＲＬＬ（配列番号２  -  ＣＰＰ２）、
ＬＬＲＬＬＲＷＷＲＬＬＲＬＬ（配列番号３  -  ＣＰＰ３）、および
ＬＬＲＬＬＲＷＷＷＷＲＬＬＲＬＬ（配列番号４  -  ＣＰＰ４）
から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００１４】
本発明のペプチドは、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）として特に有用である。本発明のペプチドは、哺乳動物細胞の形質膜の透過のため、およびトランスフェクション試薬としての使用のために適当である。
【００１５】
本発明のさらなる目的は、本発明のペプチドおよびカーゴ分子を含むナノ粒子を提供することである。カーゴ分子は、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、低分子、医薬活性物質、およびその任意の混合物からなる群から選択しうる。好ましくは、カーゴ分子は、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ＰＭＯ分子、アンチセンス分子、ＬＮＡ分子、ｍｃＤＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９分子、プラスミド、リボザイム、アプタマー、シュピーゲルマー（spiegelmer）およびデコイ分子からなる群から選択される核酸である。
【００１６】
本発明のナノ粒子は、医薬組成物の製造のために使用しうる。本発明は、それと薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物をも提供する。
【００１７】
本発明の他の目的は、カーゴ分子を、インビトロで細胞に、および／またはエクスビボで組織および／または器官に送達する方法であって、前記細胞を、前記カーゴ分子を含む本発明のナノ粒子と接触させるステップを含む方法を提供することである。
【００１８】
本発明のナノ粒子はまた、カーゴ分子を含む本発明のナノ粒子を動物に投与するステップを含む、動物においてカーゴ分子を送達する方法において使用しうる。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】PEPstrMODによる、使用した両親媒性ペプチドの親水性条件での３Ｄ構造の予測。ペプチドの、サーフィスおよびリボンによる表示。サーフィス表示では、両親媒性を確認するために、Ｎ末端からＣ末端への軸に沿った図、および９０度回転させた図の２つを示す。トリプトファン残基を赤で、アルギニンを青で、それ以外を黄色で示す。
【図２】ｓｉＲＮＡの存在下に複合体を形成する両親媒性ペプチドの能力の評価。（Ａ）予め形成したＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ複合体をアガロースゲル（１％ wt/vol）上の電気泳動によって、GelRedで染色して分析した。データは、ｎ＝３での平均±ＳＤを表す。（Ｂ）ＣＰＰ１およびＣＰＰ２ベースのナノ粒子の透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）画像。超純粋中のＣＰＰ：ｓｉＲＮＡナノ粒子の画像（Ｒ＝２０、４０μＭ ＣＰＰ）。スケールバーは、拡大画像における５００ｎｍおよび１００ｎｍに対応する。
【図３】プラスミドの存在下に複合体を形成する両親媒性ペプチドの能力の評価。Ａ）アガロースゲル中のプラスミドｐＧＬ３の移動を示すグラフ。予め形成したＣＰＰ：ｐＧＬ３複合体を、さまざまなチャージ比（ＣＲ）で調製し、GelRedで染色するアガロースゲル（０．５％ wt/vol）上の電気泳動によって分析した。データは、ｎ＝２での平均±ＳＤを表す。ＭＥＦ細胞（Ｂ）またはＭＣＦ−７細胞（Ｃ）におけるＣＰＰ２：ｐＧＬ３トランスフェクション後の用量依存的なルシフェラーゼ発現。ＣＰＰ２：ｐＧＬ３のゲル移動性に基づき、ナノ粒子をＣＲ１で、３つの異なるプラスミド濃度（６２．５ｎｇ、１２５ｎｇおよび２５０ｎｇ）で調製した。ＮＴ＝未処置細胞。データは、ｎ＝２での平均±ＳＤを表す。
【図４】ＣＰＰ：ｓｉＲＮＡナノ粒子のノックダウン効果の、細胞における評価。（Ａ）Ｕ８７細胞における、一定のｓｉＦＬｕｃ濃度２０ｎＭでさまざまなモル比ＲのＣＰＰ：ｓｉＦＬｕｃ複合体によりトランスフェクトした後の、相対Ｌｕｃ活性（％ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃ）および相対傷害性（ＬＤＨ量）。（Ｂ）Ｕ８７細胞における全トランスフェクション時間（２４時間と３６時間）による相対Ｌｕｃ活性（％ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃ）。（Ｃ）Ｕ８７細胞において、ＣＰＰ：ｓｉＦＬｕｃナノ粒子（一定のモル比Ｒ＝２０）により、さまざまなｓｉＦＬｕｃ濃度でトランスフェクトした後の、相対Ｌｕｃ活性（％ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃ）および相対傷害性（ＬＤＨ量）。ｓｉＦＬｕｃを２０ｎＭで導入するためにLipofectamine（登録商標）RNAiMAXを供給元により指示されるように使用する（「対照」パネルのＲＮＡｉのレーン）。略号：Ｒ＝モル比、ｓｉＦＬｕｃ＝ｓｉＲＮＡ ＦＬｕｃ、ｓｉＳＣＲ＝スクランブルｓｉＲＮＡ、Ｎ.Ｔ.＝未処置細胞、Ｃｔｒｌ＝対照、ｎ.ｄ.＝測定せず。
【図５】Ｕ８７細胞における、アイソフォームＬ（ＣＰＰ２［Ｌ］）またはアイソフォームＤ（ＣＰＰ２［Ｄ］）のＣＰＰ２によりベクター化されたｓｉＲＮＡの濃度に依存するホタルルシフェラーゼ発現の低下を示すグラフ。ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃ値は、未処置細胞（Ｎ.Ｔ.）の条件に対して正規化。
【図６】ＣＰＰ１またはＣＰＰ２によりベクター化されたｓｉＲＮＡの濃度によるホタルルシフェラーゼサイレンシングを示すグラフ。すべてのｓｉＲＮＡの濃度で、送達方法は１０％血清存在下にも有効である（Ｕ８７細胞）。ＦＬｕｃ／Ｌｕｃ値は、未処置細胞（Ｎ.Ｔ.）の条件に対して正規化。
【図７】異なる実験室で異なる評価方法で行われたホタルルシフェラーゼ発現低下を示すグラフ（Ｕ８７細胞）。ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃ値は、未処置細胞（Ｎ.Ｔ.）の条件に対して正規化。
【図８】ＣＰＰ：ｓｉＲＮＡと、Ｃ６Ｍ１：ｓｉＲＮＡまたは他の誘導したＣＰＰとの比較。（Ａ）Ｕ８７細胞における、Ｃ６Ｍ１：ｓｉＦＬｕｃと比較した、ＣＰＰ：ｓｉＦｌｕｃトランスフェクション後のホタルルシフェラーゼ発現のノックダウン効果を示すグラフ。インキュベーション条件：５０００細胞／ウェル、２００ｎＭペプチドおよび１０ｎＭ ｓｉＲＮＡ（vol:vol構成）のナノ粒子、インキュベーション時間 １時間３０。ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃ値は、未処置細胞（Ｎ.Ｔ.）の条件に対して正規化。ｎ＝２の独立した実験を３回。（Ｂ）Ｕ８７細胞における、ロイシン「ダブレット」に変異を有する誘導したＣＰＰナノ粒子（表１参照）と比較した、ＣＰＰ：ｓｉＦｌｕｃトランスフェクション（vol:vol構成）後のホタルルシフェラーゼ発現のノックダウン効果を示すグラフ。インキュベーション条件：５０００細胞／ウェル、示されたｓｉＲＮＡ濃度でＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ比＝２０：１、インキュベーション時間 １時間３０。ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃ値は、未処置細胞（Ｎ.Ｔ.）の条件に対して正規化。ｎ＝２の独立した実験を３回。（Ｃ）Ｕ８７細胞における、変異を有する誘導したＣＰＰ２ナノ粒子（表１参照）と比較した、ｓｉＦｌｕｃ担持ＣＰＰ：ｓｉＦｌｕｃトランスフェクション（希釈調製）後のホタルルシフェラーゼ発現のノックダウン効果を示すグラフ。インキュベーション条件：５０００細胞／ウェル、示されたｓｉＲＮＡ濃度でＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ比＝２０：１、インキュベーション時間 １時間３０。ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃ値は、未処置細胞（Ｎ.Ｔ.）の条件に対して正規化。ｎ＝３の独立した実験を３回。
【図９】ＣＰＰ１：ｓｉＲＮＡおよびＣＰＰ２：ｓｉＲＮＡ ＰＢＮ活性の評価。（Ａ）さまざまな細胞株における、示されたｓｉＲＮＡ−ＦＬｕｃ濃度でのＣＰＰ：ｓｉＦＬｕｃ ＰＢＮトランスフェクション後の相対ＦＬｕｃ活性（％）。Ｕ８７：ヒトグリオブラストーマ細胞株、ＫＢ：Ｈｅｌａ由来ケラチン形成細胞株、ＨｕＨ７：ヒト肝癌細胞株）、ＲＭ１：マウス前立腺癌細胞株、Ｎｅｕｒｏ２ａ：マウス神経芽細胞腫細胞株、ＭＣＦ７：ヒト乳癌細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：ヒト乳腺癌細胞株、ＭＥＦ−ＲＡＳ：Ｒａｓ改変マウス胎児線維芽細胞、Ａ５４９：ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞、ＨＴ２９：ヒト結腸癌細胞株、ＣＭＴ９３：直腸癌細胞株、ＧＬ２６１：マウスグリオブラストーマ細胞株。（Ｂ）Ｕ８７細胞における、示されたｓｉＲＮＡ−ＣＤＫ４濃度でのＣＰＰ：ｓｉＲＮＡナノ粒子トランスフェクション後ＣＤＫ４サイレンシング。略号：ｓｉＳＣＲ＝スクランブルｓｉＲＮＡ、Ｎ.Ｔ.＝未処置細胞。（Ｃ）Ｕ８７細胞における内因性ＣＤＫ４タンパク質発現に対する、ｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬としてのLipofectamine（登録商標）RNAiMAXの活性とのＣＰＰ１：ｓｉＣＤＫ４ナノ粒子活性の比較。黒色の破線＝傷害性なし、赤色の破線＝用量依存的な傷害性。（Ｄ）ＣＰＰ２ナノ粒子の細胞傷害性をLipofectamine（登録商標）RNAiMAXと比較して評価するためのコロニー形成アッセイ。さまざまなＣＰＰ２：ｓｉＲＮＡナノ粒子（比２０、ｓｉＲＮＡ濃度５０ｎＭ）をＭＥＦ−Ｒａｓ細胞と共にインキュベートし（１４日間）、ＣＰＰ２ペプチド単独（１００ｎＭ）またはＲＮＡｉ：ｓｉＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ濃度２０ｎＭ）条件と比較した。（Ｅ）Ｕ８７細胞における、培養後３日間の、ｓｉＣＤＫ４の単回投与（２０ｎＭ）、ｓｉＣＤＫ４の２回投与（２０ｎＭ＋２０ｎＭ）、またはｓｉＣＤＫ４の３回投与（２０ｎＭ＋２０ｎＭ＋２０ｎＭ）後の、ＣＰＰ：ｓｉＲＮＡナノ粒子トランスフェクション後ＣＤＫ４サイレンシング。略号：ｓｉＳＣＲ＝スクランブルｓｉＲＮＡ、Ｎ.Ｔ.＝未処置細胞。
【図１０】ＣＰＰＰ：ｓｉＲＮＡナノ粒子のインターナリゼーション・カイネティック。（Ａ）Ｕ８７細胞における、さまざまなインキュベーション時間（分）での、２０ｎＭ ｓｉＲＮＡ−ＦＬｕｃ濃度でＣＰＰ：ｓｉＦＬｕｃナノ粒子トランスフェクション後の相対ＦＬｕｃ活性（％）。（Ｂ）Ｕ８７細胞における、さまざまなインキュベーション時間（分）での、２０ｎＭ ｓｉＲＮＡ−ＣＤＫ４濃度でＣＰＰ：ｓｉＲＮＡナノ粒子トランスフェクション後のＣＤＫ４サイレンシング。（Ｃ）Ｕ８７細胞株の生細胞における、ＣＰＰ１またはＣＰＰ２ナノ粒子（ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ５＝２０ｎＭ、Ｒ＝２０）でベクター化したＣｙ５標識ｓｉＲＮＡの細胞内分布の画像。核を、Hoechst 33342色素を用いて標識した。白色バーは２０μｍを表す。（Ｄ）スピニングディスクによる、ＣＰＰ１：ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３ｂおよびＣＰＰ２：ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３ｂインターナリゼーション・カイネティックの比較（ｓｉＲＮＡ−Ｃｙ３ｂ＝２０ｎＭ、Ｒ＝２０）。１２００秒にわたり５秒毎に画像を記録した。その後、平均グレー値のパーセンテージを時間に対してプロットした（平均±ＳＤ；２〜３の独立した実験からの２〜５の個別のカウントされた細胞）。
【図１１】ナノ粒子はインビボで異種移植マウスの腫瘍モデルにおいてホタルルシフェラーゼ発現の低下を誘導した。（Ａ）ＣＰＰ２ナノ粒子：ｓｉＦｌｕｃの注入後の示される時点における、二重の生物発光（ＦｌｕｃおよびＮｌｕｃ）および腫瘍蛍光を表す画像（Ｕ８７−ＣＭＶ−Ｆｌｕｃ−ＣＭＶ−ｉＲＦＰ−ＩＲＥＳ）。（Ｂ）ＣＰＰ２ナノ粒子：ｓｉＦｌｕｃ（１５μｇ ｓｉＲＮＡ）の腫瘍内注入後直接のＦｌｕｃおよびＮｌｕｃルシフェラーゼの定量分析。統計学的分析（平均±ＳＥＭ、ｎ＝１１）：０時間（＝対照）に対する一元ＡＮＯＶＡとDunnetのポスト検定、＊ｐ＜０．０５。（Ｃ）ＣＰＰ２ナノ粒子：ｓｉＦｌｕｃ（２０μｇのｓｉＲＮＡ）の腫瘍内注入後直接のＦｌｕｃ ｍＲＮＡの定量分析。統計学的分析（平均±ＳＤ、ｎ＝４）：０時間（＝対照）に対するｔ検定、＊＊＊ｐ＝０．０００９。Ｆｌｕｃ ｍＲＮＡレベルをＧＡＰＤＨタンパク質のｍＲＮＡに対する比として表す（Ｆｌｕｃ／ＧＡＰＤＨ）。
【図１２】ＣＰＰナノ粒子によるｓｉＲＮＡカクテルのベクター化。（Ａ）ＰＢＮによる２つのｓｉＲＮＡの同時トランスフェクション：Ｕ８７細胞において［ＣＰＰ２：ｓｉＣＤＫ４／ｓｉＣｙｃＢ１］混合物は、内因性ＣＤＫ４およびサイクリンＢ１タンパク質の発現の用量依存的低下を示す。（Ｂ）ＰＢＮによる、さまざまな量の２つのｓｉＲＮＡのトランスフェクション。［ＣＰＰ１：ｓｉＣＤＫ４／ｓｉＣｙｃＢ１］混合物は、内因性ＣＤＫ４およびサイクリンＢ１（Ｕ８７細胞）タンパク質発現の、各ｓｉＲＮＡの量に対して逆比例的な低下を示す。
【図１３】多重にグラフトされたナノ粒子の開発。（Ａ）ＲＧＤ−Ａｈｘ−ＣＰＰ２ペプチド（Ｒ−ＣＰＰ２、Ｒ＝２０）によるｓｉＦｌｕｃトランスフェクション後の、用量依存的な相対ＦＬｕｃ活性（％）。（Ｂ）ＣＰＰ２：ＲＧＤ−Ａｈｘ−ＣＰＰ混合物（１００％：０％ないし０％：１００％のＣＰＰ２：Ｒ−ＣＰＰ２比）は、Ｆｌｕｃルシフェラーゼ活性のサイレンシングに影響しなかった（２０ｎＭ ｓｉＦｌｕｃでＲ＝２０）。（Ｃ）Ｆｌｕｃルシフェラーゼ活性に対するＣＰＰ１ナノ粒子のペグ化率の影響（２０ｎＭ ｓｉＦｌｕｃでＲ＝２０）。（Ｄ）Ｆｌｕｃルシフェラーゼ活性に対する多重グラフトＣＰＰ２ナノ粒子の影響（２０ｎＭ ｓｉＦｌｕｃでＲ＝２０）。（Ｅ）異なる成分の単純な混合によって作製されるペプチドナノ粒子を表す図。
【図１４】適用した調製条件による、Ｕ８７細胞におけるホタルルシフェラーゼサイレンシングを表す図。Ｕ８７細胞をＰ９６ウェルプレートに播種した（５０００細胞／ウェル）。ナノ粒子を「vol:vol」条件で調製するか（終濃度ＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ １００ｎＭ：５ｎＭ；２００ｎＭ：１０ｎＭおよび４００ｎＭ：２０ｎＭ）、または高濃度で調製し（ＣＰＰ［１０μＭ］：ｓｉＲＮＡ［０．５μＭ］）、その後希釈した（＝「希釈」条件）。ナノ粒子のインキュベーション時間は、無血清培地において１時間３０であった。血清の添加後、細胞を３６時間インキュベートした後、ルシフェラーゼアッセイを行った。ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃ値は、未処置細胞（Ｎ.Ｔ.）の条件に対して正規化。ｎ＝２の独立した実験を３回。
【図１５】細胞懸濁液に対するＣＰＰ１：ｓｉＲＮＡおよびＣＰＰ２：ｓｉＲＮＡ ＰＢＮ活性の評価。（Ａ）Ｕ８７細胞懸濁液におけるＣＰＰ：ｓｉＦＬｕｃナノ粒子トランスフェクション後の、用量依存的な相対ＦＬｕｃ活性（％）（ｓｉＲＮＡ＝１０ｎＭ、２０ｎＭおよび５０ｎＭ）。インキュベーション条件：１００００細胞／ウェル、示されるｓｉＲＮＡ濃度でＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ比２０：１、無血清培地中でインキュベーション時間１．５時間。ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃ値は、未処置細胞（Ｎ.Ｔ.）の条件に対して正規化。略号：ｓｉＳＣＲ＝スクランブルｓｉＲＮＡ、ｓｉＦＬｕｃ＝ホタルルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ。ｎ＝２の独立した実験を３回。（Ｂ）Ｕ８７細胞懸濁液におけるＣＰＰ：ｓｉＦＬｕｃナノ粒子トランスフェクション後の、用量依存的な相対ＦＬｕｃ活性（％）（ｓｉＲＮＡ＝１０ｎＭ、２０ｎＭおよび５０ｎＭ）。インキュベーション条件：１００００細胞／ウェル、示されるｓｉＲＮＡ濃度でＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ比２０：１、１０％血清含有培地中でインキュベーション時間１．５時間。ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃ値は、未処置細胞（Ｎ.Ｔ.）の条件に対して正規化。略号：ｓｉＳＣＲ＝スクランブルｓｉＲＮＡ、ｓｉＦＬｕｃ＝ホタルルシフェラーゼ特異的ｓｉＲＮＡ。ｎ＝２の独立した実験を３回。（Ｃ）ホタルルシフェラーゼで安定にトランスフェクトされたＵ９３７ヒトマクロファージ懸濁液におけるＣＰＰ：ｓｉＦＬｕｃナノ粒子トランスフェクション後の、用量依存的な相対ＦＬｕｃ活性（％）（ｓｉＲＮＡ＝１０ｎＭ、２０ｎＭおよび５０ｎＭ）。インキュベーション条件：１００００細胞／ウェル、示されるｓｉＲＮＡ濃度でＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ比２０：１（またはｓｉＲＮＡ単独）、無血清培地中でインキュベーション時間１．５時間。ＦＬｕｃは、未処置細胞（Ｎ.Ｔ.）の条件に対して正規化。ｎ＝２の独立した実験を３回。
【図１６】嚢胞性線維症の状況におけるＭＢＢＯおよびプラスミド同時トランスフェクションの評価。（Ａ）予め形成したＣＰＰ１：ＭＢＢＯ複合体を、GelRedで染色するアガロースゲル（１％ wt/vol）上の電気泳動によって分析した。データは、ｎ＝２での平均±ＳＤを表す。（Ｂ）動的光散乱（ＤＬＳ）によるＣＰＰ１：ＭＢＢＯ複合体（Ｒ＝５、１０μＭ ＣＰＰ１）の平均サイズの測定。（Ｃ）気管支Ｂｅａｓ−２ｂ細胞を、Lipofectamin（商標）RNAiMAX、JetPEI（登録商標）（PJ）またはＣＰＰ２を用いて１μｇのＣＦＴＲをコードするプラスミドで、およびRNAiMAXまたはＣＰＰ１を用いて１００ｎＭのＭＢＢＯでトランスフェクトした。ＣＦＴＲ転写物およびハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの量をｑＰＣＲによって測定した。ＣＦＴＲ値をまずＧＡＰＤＨに対して正規化し、次いで３’−ＵＴＲ結合性を持たないＭＢＢＯ（ＭＢＢＯ−Ｃｔｒｌ＝１）を用いる対照条件に対して正規化した。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
定義
本書において使用する用語「ペプチド」または「ペプチド分子」とは、ペプチド結合で連結された複数の天然または修飾アミノ酸残基を含む、天然に生じるかまたは天然に生じない（例えば化学合成または組換えＤＮＡ技術によって生成される）任意の線状高分子をさす。
【００２１】
本書において使用する用語「アミノ酸残基」とは、天然にペプチドを構成する２０の「標準」アミノ酸の任意のものを意味する。本書においてアミノ酸は、以下の命名法にしたがって１文字または３文字コードで表される：Ａ：アラニン（Ａｌａ）；Ｃ：システイン（Ｃｙｓ）；Ｄ：アスパラギン酸（Ａｓｐ）；Ｅ：グルタミン酸（Ｇｌｕ）；Ｆ：フェニルアラニン（Ｐｈｅ）；Ｇ：グリシン（Ｇｌｙ）；Ｈ：ヒスチジン（Ｈｉｓ）；Ｉ：イソロイシン（Ｉｌｅ）；Ｋ：リジン（Ｌｙｓ）；Ｌ：ロイシン（Ｌｅｕ）；Ｍ：メチオニン（Ｍｅｔ）；Ｎ：アスパラギン（Ａｓｎ）；Ｐ：プロリン（Ｐｒｏ）；Ｑ：グルタミン（Ｇｌｎ）；Ｒ：アルギニン（Ａｒｇ）；Ｓ：セリン（Ｓｅｒ）；Ｔ：スレオニン（Ｔｈｒ）；Ｖ：バリン（Ｖａｌ）；Ｗ：トリプトファン（Ｔｒｐ）、およびＹ：チロシン（Ｔｙｒ）。本発明のペプチドのアミノ酸残基は典型的には、Ｌ体またはＤ体として存在する。本書において使用する用語「非天然アミノ酸残基」とは、天然にコードされないか、または生物の遺伝コード中に見られない、非コード化または非タンパク質構成アミノ酸を意味する。本書において使用する用語「修飾アミノ酸残基」とは、翻訳後修飾されたアミノ酸のような、非標準アミノ酸を意味する。翻訳後修飾の例は、リン酸化、グリコシル化、アシル化（例えばアセチル化、ミリストイル化、パルミトイル化）、アルキル化、カルボキシル化、ヒドロキシル化、糖化、ビオチン化、ユビキチン化、化学的性質の変更（例えばβ脱離  脱イミド化、脱アミド化）、および構造変更（例えばジスルフィド架橋の形成）を包含する。
【００２２】
細胞膜透過性ペプチド
本発明は、アミノ酸配列ＬＬ−［Ｘ］ｎ−ＬＬ（ここで、ＸはＲ、ＬおよびＷから選択され、ｎ＝１０〜１２であり、［Ｘ］ｎは、４個のＲ、４個のＬ、および２〜４個のＷ、好ましくは３〜４個のＷを含む）を含む、新規な天然に生じないペプチドに関する。
【００２３】
本発明者は驚くべきことに、本書において本発明のペプチドと称される該ペプチドは、細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）として働くのに適当であり、したがって、カーゴ分子を細胞の細胞質に、好ましくは哺乳動物細胞の形質膜を通して送達しうることを見出した。
【００２４】
本発明のペプチドは、すべてＲ、ＬおよびＷから選択される１４〜１６アミノ酸残基の長さを有する。本発明者は、ペプチドのアミノ酸配列中のそのような３種のアミノ酸残基の一定の分布が、ＣＰＰとして特に興味深いペプチドをもたらすことを発見した。実際、前記ペプチドは、細胞に取り込まれる能力が高く、インターナリゼーションの後、標的細胞に対する顕著な細胞傷害性および／または免疫原作用を示さない（すなわち、前記ペプチドは、少なくとも細胞のトランスフェクションおよび／または透過を仲介するのに十分な濃度において、細胞の生存性を損なわない）。本書において用いられる「顕著でない」という表現は、本発明のペプチドのインタナリゼーション後、標的細胞の３０％未満、特に２０％または１０％未満が死ぬことと理解される。化合物の細胞傷害性、および／またはそのような化合物が適用された標的細胞の生存性を測定する方法は、当業者に知られている（例えば、Ausubel, F.M. et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, Hoboken, NJ, USAも参照されたい）。
【００２５】
本書において使用される用語「細胞に取り込まれる能力」とは、細胞の膜（すなわち、形質膜）、エンドソーム膜、および小胞体の膜）を通過する、および／またはそのような細胞の膜を通したカーゴ分子の通過（すなわち、そのトランスフェクション可能性）をもたらす、ペプチドの能力をいう。前記の細胞の膜を通過する能力を有するペプチドは、本書において「細胞膜透過性ペプチド」または「ＣＰＰ」と称される。ペプチドのインターナリゼーション挙動および／またはトランスフェクション能力を決定する数多くの方法が当分野において確立されており、例えば、検出可能な標識（例えば蛍光色素）をペプチド（および／またはトランスフェクトされるカーゴ分子）に結合するか、またはペプチドをレポーター分子と融合させることによって、ペプチドの細胞取り込みが起こった際に例えばＦＡＣＳ分析または特異的抗体による検出を可能にすることによる方法がある（例えば、Ausubel, F.M. et al. (2001) Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, Hoboken, NJ, USA参照）。当業者はまた、そのような方法において用いるペプチド、および適用可能な場合にカーゴの濃度範囲をどのように選択すべきかを認識し、これはペプチドの性質、カーゴの大きさ、使用する細胞の種類等に依存しうる。
【００２６】
一態様において、本発明のペプチドはアミノ酸配列ＬＬ−［Ｘ］ｍ−ＲＬＬを含み、ここでｍ＝９〜１１である。
【００２７】
好ましくは、［Ｘ］ｎまたは［Ｘ］ｍは、ＷＷ、ＷＷＷまたはＷＷＷＷからなるクラスターを含む。好ましくは、そのようなクラスターは中央に存在し、すなわち、該トリプトファンクラスターの両端に続いて同数のアミノ酸残基が存在する。
【００２８】
一態様において、［Ｘ］ｎまたは［Ｘ］ｍは、ＬＬからなるクラスターを少なくとも１つ、好ましくはＬＬからなるクラスターを２つ含む。
【００２９】
好ましくは、本発明のペプチドは、正味の正電荷５を有する。
【００３０】
一態様において、ペプチドは、
ＬＬＷＲＬＷＲＬＬＷＲＬＷＲＬＬ  （配列番号１）、
ＬＬＲＬＬＲＷＷＷＲＬＬＲＬＬ  （配列番号２）、
ＬＬＲＬＬＲＷＷＲＬＬＲＬＬ  （配列番号３）、および
ＬＬＲＬＬＲＷＷＷＷＲＬＬＲＬＬ  （配列番号４）
から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【００３１】
一態様において、ペプチドは、前記アミノ酸配列のＣ末端に共有結合された、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸、システアミド、チオール、アミド、カルボキシル、置換されていてもよい直鎖もしくは分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル、第１級もしくは第２級アミン、オシジック（osidic）誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナルおよび／または標的化分子のなかから選択される、１つまたはそれ以上の成分さらに含む、および／またはペプチドは、前記アミノ酸配列のＮ末端に共有結合された、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、修飾アミノ酸、アミン、アセチル、置換されていてもよい直鎖もしくは分枝Ｃ１−Ｃ６アルキル、第１級もしくは第２級アミン、オシジック誘導体、脂質、リン脂質、脂肪酸、コレステロール、ポリエチレングリコール、核局在化シグナルおよび／または標的化分子のなかから選択される、１つまたはそれ以上の化学成分をさらに含む。
【００３２】
ナノ粒子
本発明はさらに、少なくとも１つのカーゴ分子と複合体化された少なくとも１つの本発明のペプチドを含むナノ粒子を提供する。そのようなカーゴ分子は、本書において定義される任意のカーゴ分子でありうる。一態様において、ナノ粒子は、１つより多い本発明のペプチドを含みうる。特に、ナノ粒子は、同じかまたは異なる複数のペプチドを含みうる。また、ナノ粒子は、１つより多いカーゴ分子を含みうる。特に、ナノ粒子は、同じかまたは異なる複数のカーゴ分子を含みうる。
【００３３】
好ましくは、ナノ粒子の大きさは、５０〜３００ｎｍ、好ましくは１００〜２００ｎｍである。
【００３４】
一態様において、ペプチドとカーゴ分子との複合体は、非共有結合に基づいて形成されうる。そのような非共有結合は、イオン結合、水素結合もしくは疎水性相互作用、またはその組み合わせでありうる。
【００３５】
あるいは、ペプチドとカーゴ分子との複合体は、共有結合によって形成されうる。そのような共有結合は、好ましくはペプチドの適当な反応性基とカーゴの間、より好ましくは本発明のペプチドの末端とカーゴ分子の間に形成される。化学的性質またはカーゴ分子によって、そのような共有結合を形成する成分または基は異なり、当業者はその技術の範囲内でそのような結合を達成することができる。
【００３６】
好ましくは、カーゴ分子は、核酸、ペプチド、タンパク質、脂質、低分子、医薬活性物質、および任意のその混合物からなる群から選択される。
【００３７】
本発明のペプチドは、核酸分子との複合体形成に特に適当である。したがって、本発明の一つの目的は、本発明のペプチド、ならびにＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、ＰＮＡ分子、ｓｉＲＮＡ分子、ＰＭＯ分子、アンチセンス分子、ＬＮＡ分子、ｍｃＤＮＡ分子、ｍｉＲＮＡ分子、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９分子、プラスミド、リボザイム、アプタマー、シュピーゲルマーおよびデコイ分子からなる群から選択される核酸分子または任意のその混合物を含むナノ粒子を提供することである。
【００３８】
本書において使用される用語「ｍｉＲＮＡ分子」（または「ｍｉＲＮＡ」）とは、局所ＲＮＡ前駆体ｍｉＲＮＡ構造を形成することのできる転写物からプロセシングされる遺伝子座に由来する内因性ＲＮＡ分子をさす。成熟ｍｉＲＮＡは通常、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドの長さであるが、他のヌクレオチド数、例えば１８、１９、２６または２７のヌクレオチドでも存在しうる。
【００３９】
本書において使用される用語「ｓｈＲＮＡ分子」（すなわち、短鎖ヘアピンＲＮＡ分子）とは、「ｓｉＲＮＡ二本鎖」のセンスおよびアンチセンス鎖両方をステムループまたはヘアピン構造中に含む人工の単鎖干渉ＲＮＡ分子をさす。このヘアピン構造のステムは典型的には１９〜２９ヌクレオチドの長さで、ループは典型的には４〜１５ヌクレオチドの長さである。
【００４０】
用語「ｓｉＲＮＡ分子」とは、標的分子をコードする標的核酸、好ましくはｍＲＮＡに対する短い干渉ＲＮＡをさす。ｓｉＲＮＡは、典型的には約２１〜２３ヌクレオチドの長さを有する、二本鎖ＲＮＡである。２本のＲＮＡ鎖の一方の配列が、分解すべき標的核酸の配列に対応する。したがって、標的分子の核酸配列、好ましくはｍＲＮＡ配列がわかったうえで、２本の鎖の一方が該標的分子のｍＲＮＡと相補的である二本鎖ＲＮＡをデザインし得、該遺伝子を含む系に前記ｓｉＲＮＡを適用すると、対応する標的核酸が分解され、したがって対応するタンパク質のレベルが低下されうる。
【００４１】
用語「リボザイム」とは、触媒として活性な核酸を言い、これは好ましくは、基本的に２つの部分を含むＲＮＡからなる。第１の部分は触媒活性を示し、第２の部分は標的核酸との特異的相互作用に与る。
【００４２】
用語「アプタマー」とは、標的分子と特異的に相互作用する、一本鎖または二本鎖のＤ−核酸をさす。アプタマーは現在、治療剤として使用されている。
【００４３】
用語「シュピーゲルマー」とは、Ｌ−核酸、すなわちＬ−ヌクレオチドからなるものをさす。シュピーゲルマーは、生物学的系において非常に高い安定性を有し、アプタマーに匹敵して、対象とする標的分子との特異的相互作用を示すという事実によって特徴付けられる。
【００４４】
他の一態様において、カーゴ分子は、少なくとも２つのアミノ酸が共有結合、好ましくはペプチド結合により共有結合したものからなるペプチドである。一態様において、ペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸、非天然アミノ酸、またはその混合物からなる。あるいはカーゴ分子はタンパク質である。
【００４５】
他の一態様において、カーゴ分子は、低分子、好ましくは分子量が１０００Ｄａ以下の低分子である。特に、低分子は薬剤または候補薬剤である。
【００４６】
他の一態様において、カーゴ分子は医薬活性物質である。
【００４７】
他の一態様において、カーゴ分子は脂質である。
【００４８】
他の一態様において、カーゴ分子は抗体またはタンパク質である。
【００４９】
医薬組成物
本発明のさらなる目的は、本発明のナノ粒子（すなわち少なくとも１つのカーゴ分子と結合した少なくとも１つのペプチド）および１つ以上の薬学的に許容しうる担体を含む医薬組成物を提供することである。実際、本発明のナノ粒子は、医薬組成物の製造に有利に使用されうる。
【００５０】
本書において使用される用語「医薬組成物」とは、対象、好ましくはヒト患者に投与するための組成物をいう。本発明の医薬組成物は、当分野において確立された任意の医薬投与形態、例えばカプセル、マイクロカプセル、カシェ、丸薬、錠剤、粉末、ペレット、多粒子製剤（例えばビーズ、顆粒または結晶）、エアロゾル、スプレー、泡、溶液、分散液、チンキ、シロップ、エリキシル、懸濁液、油中水型乳剤、例えば軟膏、および水中油型乳剤、例えばクリーム、ローション、バーム、皮膚パッチ、滴剤、ペースト、ならびに坐剤を包含する。
【００５１】
本発明の医薬組成物は、経口、直腸、経鼻、局所（口腔内および舌下を包含する）、腹腔および非経口（筋肉内、皮下および静脈内を包含する）投与、または吸入もしくはインサフレーションによる投与に適当な製剤を包含する。投与は局所的または全身的でありうる。
【００５２】
本発明の他の一側面は、前記ナノ粒子の、医薬として、およびマーカーまたはイメージング剤としての使用である。
【００５３】
本発明は、インビトロで分子を細胞に送達する方法であって、該細胞を前記ナノ粒子または医薬組成物と接触させるステップを含む方法にも関する。本発明は、エクスビボで分子を組織および／または器官に送達する方法であって、該組織および／または器官を前記ナノ粒子または医薬組成物と接触させるステップを含む方法にも関する。
【００５４】
インビボでカーゴ分子を送達する、前記カーゴ分子を含む請求項１３〜１７のいずれかに記載されるナノ粒子に前記動物を接触させる投与ステップを含む、本発明の方法。
【００５５】
本発明のいくつかの側面を、さらに以下の実施例において明らかにし、図面（実施例において述べられる）によって説明する。
【実施例】
【００５６】
材料および方法
材料
ジオレイルホスファチジルグリセロール（ＤＯＰＧ）およびジオレイルホスファチジルコリン（ＤＯＰＣ）リン脂質、コレステロール（Ｃｈｏｌ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）をAvanti Polar Lipidsから購入した。大型単層小胞（ＬＵＶ）を、過去に報告されているようにＤＯＰＣ／ＳＭ／Ｃｈｏｌ（２：２：１）の脂質混合物から押出法によって調製した（A. Vaissiere et al., (2017) A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery, J Nanobiotechnology. 15(1), 34）。
【００５７】
さまざまなｓｉＲＮＡ配列（未標識およびＣｙ５標識）をEurogentecから購入した。Ｃｙ３ｂ標識ｓｉＲＮＡをBioSynthesisから購入した。以下のｓｉＲＮＡを使用した：抗ホタルルシフェラーゼ（ｓｉＦＬｕｃ)：5'-CUU-ACG-CUG-AGU-ACU-UCG-AdTdT-3'（配列番号５）（センス鎖）および抗ルシフェラーゼの対応するスクランブルバージョン（ｓｉＳＣＲ）：5'-CAU-CAU-CCC-UGC-CUC-UAC-UdTdT-3'（配列番号６）（センス鎖）、ならびに5'-CAG-AUC-UCG-GUG-AAC-GAU-GdTdT-3'（配列番号７）（アンチセンス鎖）に基づく抗サイクリン依存性キナーゼ４（ｓｉＣＤＫ４）ｓｉＲＮＡおよびスクランブルバージョン：5'-AAC-CAC-UCA-ACU-UUU-UCC-CAA-dTdT-3'（配列番号８）（アンチセンス鎖）。
【００５８】
ｓｉＲＮＡストック溶液をＲＮアーゼ不含水中に調製し、ペプチドストック溶液およびＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ複合体を過去の文献に記載されるように調製した（Konate K, et al. (2016) Optimisation of vectorisation property: a comparative study for a secondary amphipathic peptide. Int J Pharm. 509, 71-84）
【００５９】
ペプチドの合成および修飾
ペプチドを、LifeTeinから購入するか、または発明者の実験室で標準的なＦｍｏｃ化学を用いて合成し、ＨＰＬＣ／ＭＳにより精製した（純度＞９５％）（配列を表１に示す）。Ｎ末端にシステイン残基を有する精製したＣＰＰに、室温で２３時間の間に４モル過剰のＰＥＧマレイミド２０００（Nanocs）を用いてＰＥＧ部分をグラフトした。Ｎ末端にリンカーとしてアミノヘキサン酸を有するＣＰＰに、合成中にＲＧＤ標的化配列をグラフトした。
【００６０】
ペプチド構造予測
ＷＲＡＰの三次構造を予測するために、PEPstrMODサーバーを使用した（http://osddlinux.osdd.net/raghava/pepstrmod/）（H. Kaur, et al., (2007) Protein Pept. Lett. 14, 626-630; S. Singh, et al., (2015) Biol. Direct. 10, 73）。
【００６１】
円二色性（ＣＤ）測定
溶液中またはリポソーム小球存在下のペプチドについて、Jasco 810（Japan）円二色計において、石英スプラシル（suprasil）セル（Hellma）中、光路長１ｍｍでＣＤスペクトルを記録した。ペプチドを各条件で同じ濃度（４０μＭ）で使用した。データピッチ０．５ｎｍ、バンド幅１ｎｍおよび標準的感度で、１９０ｎｍ〜２６０ｎｍの間の３積算からスペクトルを得た。
【００６２】
アガロースゲルシフトアッセイ
ＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ複合体をさまざまな比で５％グルコース中に形成し、室温で３０分間プレインキュベートした。各サンプルを、文献に記載されるようにＵＶ検出のためにGelRed（Interchim）で染色するアガロースゲル（１％ ｗ／ｖ）電気泳動により分析した。
【００６３】
動的光散乱（ＤＬＳ）およびゼータ電位（ＺＰ）
ＣＰＰ：ｓｉＲＮＡナノ粒子を、Zetasizer NanoZS（Malvern）を用いて粒子分布および均一性（ＰｄＩ）の平均サイズ（Ｚ平均）について評価した。ゼータ電位を、５％グルコース＋５ｍＭ ＮａＣｌ中で測定した。すべての結果は３つの独立した測定から得た（各測定を２５℃で３回行った）。
【００６４】
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）
透過電子顕微鏡法（ＴＥＭ）のために、懸濁液の５μｌ滴を、カーボンコーティングした３００メッシュグリッドに１分間適用し、濾紙を当てることにより液体を除去し、その後２％酢酸ウラン溶液滴を載せた。１分後、濾紙を端に当てることによって余分の染色剤を除去し、グリッドを室温で数分間乾燥させ、Jeol 1200EX2透過電子顕微鏡を１００ｋＶの加速電圧で用いて調べた。SIS Olympus Quemesa ＣＣＤカメラを用いてデータを取得した。
【００６５】
培養条件
ホタルおよびNanolucルシフェラーゼ（FLuc-NLuc）をコードするプラスミドで安定にトランスフェクトされたＵ８７ＭＧヒトグリオブラストーマ（Aldrian G et al., J. Control. Release 2017）を、以下の完全培地中で培養した：GlutaMAX（商標）（Life Technologies）、ペニシリン／ストレプトマイシン（Life Technologies）、１０％熱非働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、PAA）、非必須アミノ酸NEAA 1X（LifeTechnologies）を補充したＤＭＥＭ。さらに、ヒグロマイシンＢ（Invitrogen、５０μｇ／ｍｌ）を、選択のための抗生物質として加えた。
【００６６】
Ｈｅｌａ由来ケラチン形成細胞株（ＫＢ）、マウス神経芽細胞腫細胞株（Ｎｅｕｒｏ２ａ）、ヒト肝癌細胞株（ＨｕＨ７）、ヒト乳癌細胞株（ＭＣＦ７）、およびヒト肺胞基底上皮腺癌細胞株（Ａ５４９）を、選択用抗生物質を添加していない同じ完全培地中で培養した。
【００６７】
同じ完全培地中でマウス前立腺癌細胞株（ＲＭ１）をブラスチシジンＳ（Invitrogen、１０μｇ／ｍＬ）を添加して培養し、ヒト結腸癌細胞株（ＨＴ２９）、直腸癌細胞株（ＣＭＴ９３）およびマウスグリオブラストーマ細胞株（ＧＬ２６１）をヒグロマイシンＢ（Invitrogen、それぞれ１４００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１５０μｇ／ｍｌ）を選択用抗生物質として添加して培養した。
【００６８】
同じ完全培地中でＧ４１８（Invitrogen、１００μｇ／ｍｌ)選択用抗生物質を添加してヒト乳腺癌（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１）を培養した。
【００６９】
ＡＴＣＣから入手した不死化ヒト気管支上皮細胞株ＢＥＡＳ−２Ｂを、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）（Eurobio）、１％Ultroser G（Pall BioSepra）、１％抗生物質−抗真菌剤（Life Technologies SAS）および１％Ｌ−グルタミン（Life Technologies SAS）を補充したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Fisher Scientific）中で培養した。Ｔ−ラージ不死化マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）を、ペニシリン／ストレプトマイシン（Life Technologies）および１０％熱不働化ウシ胎児血清（ＦＢＳ、PAA）を補充したDMEM/F12培地（Life Technologies）中で培養した。
【００７０】
すべての細胞を５％ＣＯ２および３７℃の加湿インキュベーター内で維持した。
【００７１】
細胞培養および一過性トランスフェクション
文献に記載されるように２０００００個のＢｅａｓ−２ｂ細胞を６ウェルプレートに播種した（Viart V et al. Eur Respir J. 2015）。細胞を、JetPEI（登録商標）またはＣＰＰ２を用いて１μｇのｐｍ−ｃＤＮＡ−ＣＦＴＲ−３’ＵＴＲで、およびRNAiMAXまたはＣＰＰ１を用いて１００ｎＭのＭＢＢＯでトランスフェクトした。
【００７２】
ＲＮＡ抽出およびＲＴ−ｑＰＣＲ
文献に記載されるように、トータルＲＮＡを抽出し、逆転写し、増幅した（Viart V et al. Eur J Hum Genet 2012）。逆転写は１μｇのトータルＲＮＡおよびＭＭＬＶ逆転写酵素を用いて行い、ｑＰＣＲを第１鎖ＤＮＡの１：１０希釈物を用いて行った。相対発現レベルを、ＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡを内在性コントロールとして比較ＤＤＣｔ法によって計算した。
【００７３】
コロニー形成アッセイ
ＭＥＦ細胞を６ウェルプレートに播種した（２５０細胞／ウェル）。播種から２４時間の後、細胞をナノ粒子（Ｒ＝２０、５０ｎＭ ｓｉＲＮＡ）と共に１４日間インキュベートした。コロニー可視化のために、細胞をメタノール：酢酸（３：１）の溶液で４℃で２０分間固定し、ギムザ（Sigma Aldrich）／Ｈ２Ｏ（３．５：１０）の溶液で室温で２０分間標識した。残った染色溶液を水で除去し、プレートを数時間乾燥させた。各ウェルの写真を撮影し、全コロニーを計数した。
【００７４】
トランスフェクション実験
ルシフェラーゼアッセイのために、実験の２４時間前に、さまざまな細胞（５０００細胞／ウェル）を、前記の対応する培地を用いて９６ウェルプレートに播種した。翌日、５％グルコース水中でｓｉＲＮＡおよびＣＰＰ（等体積）を混合し、次いで３７℃で３０分間インキュベートすることによって、ナノ粒子を形成した（「ｓｉＲＮＡ  ｏｎ  ＣＰＰ」）。一方、細胞を覆う増殖培地を、予め加温した７０μｌの新鮮な無血清ＤＭＥＭに交換した。３０μｌのナノ粒子溶液を細胞に直接加え、３７℃で１．５時間インキュベートした。２０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭ（ＦＢＳ終濃度＝１０％）の添加後、細胞をさらに３６時間インキュベートし、最後にルシフェラーゼ検出のために溶解した。血清存在下のトランスフェクションのためには、細胞をナノ粒子と、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ中で、３７℃で１．５時間インキュベートし、次いで１０％ＦＢＳを補充したＤＭＥＭを細胞に加えてさらに３６時間インキュベートし、最後にルシフェラーゼ検出のために細胞を溶解した。
【００７５】
ウエスタンブロットアッセイのために、実験の２４時間前に、前記のような対応する培地を用いて、２４ウェルプレートの各ウェルにＵ８７細胞を７５０００細胞／ｍｌで播種した。標準的なインキュベーションのために、細胞を、１７５μｌの予め加温した新鮮な無血清ＤＭＥＭ＋７５μｌのナノ粒子溶液と共にインキュベートした。１．５時間のインキュベーション後、トランスフェクション試薬を除去することなく２５０μｌのＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳを各ウェルに加え、細胞をさらに２４時間インキュベートした。５００μｌの終体積中５、１０および２０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度を含み、Ｒ＝２０のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比でペプチド：ｓｉＲＮＡナノ粒子を試験するために実験手順をデザインした。ＤＭＥＭ＋２０％ＦＢＳ（ＦＢＳ終濃度１０％）の添加後、細胞をさらに２４時間インキュベートし、最後にＣＤＫ４ウエスタンブロット検出のために溶解した。
【００７６】
顕微鏡実験のために、イメージングの２４時間前に、３０００００個のＵ８７細胞をガラス底デッシュ（FluoroDish, World Precision Instruments）に播種した。実験前に細胞をＤ−ＰＢＳで２回洗い、１６００μｌの完全培地で覆った。その後、５％グルコース水溶液中に調製した４００μｌのＮＰ（ペプチド：ｓｉＲＮＡ；Ｒ＝２０、ｓｉＲＮＡ＝２０ｎＭ）を前記細胞に直接加えた。
【００７７】
細胞傷害性の測定
ナノ粒子により誘導される細胞傷害性を、５０μｌの上清においてCytotoxicity Detection KitPlus（LDH, Roche Diagnostics）を製造者の指示にしたがって使用して評価した。
【００７８】
ルシフェラーゼレポーター遺伝子サイレンシングアッセイ
さまざまなベクターを用いるｓｉＲＮＡ送達を、細胞溶解物中の残存ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）活性を測定することによって評価した。簡潔に述べると、３６時間後に細胞を覆う培地を注意深く取り除き、５０μｌの0,5X Passive Lysis Buffer（PLB; Promega）と交換した。４℃で３０分間震盪後、細胞の入ったプレートを遠心処理し（１０分間、１８００ｒｐｍ、４℃）、５μｌの各細胞溶解物上清を最後に白色９６ウェルプレートに移した。Ｕ８７−ＦＬｕｃ−ＮＬｕｃ細胞について、両ルシフェラーゼ活性を、文献に記載されるように半分に希釈したデュアルルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）を使用してプレートリーディング・ルミノメーター（POLARstar Omega, BMG Labtech）で定量した（G. Aldrian, et al., (2017) J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 256, 79-91）。結果を、最初に未処置細胞に対して正規化され（％ＦＬｕｃおよび％ＮＬｕｃ）、次に％ＮＬｕｃの値に対して正規化された各ルシフェラーゼについての相対発光量（relative light unit；ＲＬＵ）のパーセンテージで表して、相対Ｌｕｃ活性（％ＦＬｕｃ／％ＮＬｕｃ）を得た。
【００７９】
Ｆｌｕｃ発現のみを有する他の細胞株については、半分に希釈したルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）を使用してプレートリーディング・ルミノメーターでルシフェラーゼ活性を定量した。結果を、未処置細胞に対して正規化された相対発光量（ＲＬＵ）のパーセンテージとして表した（％Ｆｌｕｃ）。
【００８０】
ウエスタンブロッティング
トランスフェクトされた細胞を、ＰＢＳで洗い、ＲＩＰＡバッファー［５０ｍＭ Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．０。１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１％Triton X-100、０．１％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム, Sigma-Aldrich）、プロテアーゼ阻害剤（SigmaFAST, Sigma-Aldrich）含有］中で溶解した。１３０μｌ／２４ウェルの溶解バッファーと共に、細胞を氷上で５分間インキュベートした。その後、細胞を掻き取り、１．５ｍｌチューブに移した。氷上で５分後、細胞溶解物を遠心分離し（１０分間、１３４００ｒｐｍ、４℃）、上清を集め、Pierce BCAタンパク質アッセイ（ThermoFisher）によりタンパク質濃度を測定した。細胞抽出物（０．２５〜０．３８μｇ／μｌ）を、４〜２０％のMini-PROTEAN（登録商標）TGXTMプレキャストゲル（Bio-Rad）によって分離した。電気泳動後、サンプルをTrans-Blot（登録商標）Turbo（商標）Mini PVDF転写膜（Bio-Rad）に転写した。抗体として、抗サイクリンＢ１マウスｍＡｂ V152、抗ＣＤＫ４ウサギｍＡｂ D9G3E、抗ビンキュリン ウサギｍＡｂ E1E9V、抗マウスＩｇＧ ＨＲＰ、および抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰを使用した（いずれもCell Signaling）。Amershamイメージャー600（GE Healthcare Life Science）において、ブロットを、Pierce ECL plusウエスタンブロッティング基質（ThermoFisher）を用いて示した。ブロットのシグナル強度をImage Jによって定量化した。
【００８１】
共焦点顕微鏡法
共焦点顕微鏡法による細胞イメージングのために、倒立型LSM780多光子顕微鏡（Zeiss）を使用した。ＮＰ添加後に細胞を、５％ＣＯ２および３７℃で加湿インキュベーター内で１時間インキュベートした。インキュベーション終了の１０分前に、核標識のためにHoechst 33342色素を細胞に加えた。その後、細胞をＤ−ＰＢＳで２回洗い、FluoroBrite ＤＭＥＭ培地（Life Technologies）で覆った。共焦点画像を映し出し、ImageJソフトウェアで処理した。
【００８２】
スピニングディスク実験のために、スピニングディスク（ANDOR）系と組み合わせた倒立型顕微鏡（Nikon Ti Eclipse）を使用して、生細胞内部のＮＰのインターナリゼーションのカイネティクスを調べた。ＮＰを添加後に細胞をケージインキュベーター（Okolab）で３７℃に保ち、ＥＭ−ＣＣＤカメラ（iXon Ultra）で画像を１２００ｓにわたり５ｓ毎に直接記録し、Andor IQ3ソフトウェアを用いて映し出した。異なるチャネル間で発光ブリードスルーが観察されないことを確実にするためにコントロール実験を行った。すべての画像をImageJソフトウェアで処理した。
【００８３】
インビボマウス実験
ボルドー大学動物施設において６〜１０週齢の免疫不全ＮＯＧ（NOD/SCID/IL-2Rγnull）マウスを飼育した。特定の病原体のない条件下に維持されたマウスを、水および食餌を自由に摂取させる１２時間明暗サイクル下の標準条件で維持した。空気中２％イソフルラン（Belamont, Nicholas Piramal Limited, London, UK）による麻酔を行った。マウスのイメージングする領域を、クリッパーおよび除毛クリームを用いて予め剃毛した。
【００８４】
マウス右後肢へのＵ８７−ＦＲＴ−ＣＭＶ−Ｆｌｕｃ−ＣＭＶ−Ｎｌｕｃ細胞（２×１０６細胞／１００μＬ ＰＢＳ）の注入によって皮下腫瘍を生じさせた。移植の４週後に皮下腫瘍をイメージングした。
【００８５】
ｍＲＮＡ抽出および定量ＲＴ−ＰＣＲ
Trizol（Thermo Fisher Scientific）を用いてＵ８７細胞からトータルｍＲＮＡを単離した。NucleoSpin RNA（Macherey-Nagel）を使用して、１ｍｇのトータルＲＮＡを用いてｃＤＮＡの合成を行った。MyIq Quantitative（Bio-Rad）を使用して、Fast SYBR Green Master Mix（Invitrogen）を用いて定量ＰＣＲを行った。Ｆｌｕｃ増幅用のプライマーは、Ｆｌｕｃ−Ｆｗ：ＴＣＣＡＴＴＣＣＡＴＣＡＣＧＧＴＴＴＴＧＧ（配列番号９）、Ｆｌｕｃ−Ｒｖ：ＧＣＴＡＴＧＴＣＴＣＣＡＧＡＡＴＧＴＡＧＣ（配列番号１０）、ＧＡＰＤＨ−Ｆｗ：ＧＣＣＡＡＧＧＴＣＡＴＣＣＡＴＧＡＣＡＡＣ（配列番号１１）、ＧＡＰＤＨ−Ｒｖ：ＧＡＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣＧＣＴＧＴＴＧ（配列番号１２）であった。
【００８６】
反応は、３つの独立した実験において３回行った。発現データは、発現レベルのばらつきをコントロールするためにハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨの幾何平均に対して正規化し、２ＤＤＣｔ法を用いて分析した。
【００８７】
結果
１．ペプチドの特徴付け
本実験では、複数の両親媒性ペプチドを、処置剤分子を送達するためのペプチドベースのナノ粒子（ＰＢＮ）を形成する能力について試験し比較した（表１）。ペプチドＣＰＰ１〜ＣＰＰ４は本発明のペプチドに属し、３種のアミノ酸ロイシン、アルギニンおよびトリプトファンの残基からなる。ペプチドは１５〜１６アミノ酸の長さで、アミド基（−ＣＯＮＨ２）を有するＣ末端部分およびＮ末端部分のアミン（−ＮＨ２）を有する。本発明のすべてのペプチドは単独で＋５（またはＮ末端部にカップリングする成分がある場合は＋４）の正味の正電荷を有する。
【００８８】
【表１】
2021531274.tif 000003
脚注： ＣＰＰ ＡＡ＝ＣＰＰ配列のアミノ酸の数
【００８９】
ＣＰＰの構造的性質を調べるために、最初に各ペプチドの３Ｄ構造のin silico予測を行った。ＣＰＰ１〜ＣＰＰ４の配列を親水性環境においてPepStrMODサーバに提示した。計算後にPepstrMODにより作製されたペプチドモデルは、すべてのペプチドがαヘリックス構造をとることを示した（図１）。ＣＰＰ１およびＣＰＰ２はそれ以外のモデルよりも顕著なヘリックス構造をとると予測された。
【００９０】
次いで、予測された構造を実験によって調べたものと対比させた。円二色性スペクトルを、溶液中の遊離ペプチドについて、次いでｓｉＲＮＡ存在下のペプチドについて、次いでリポソーム添加後に記録した。表２に示すように、すべてのペプチド（ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＣＰＰ３およびＣＰＰ４）が、ｓｉＲＮＡ分子存在下に、また、中性のまたは負に荷電した脂質（「大型単ラメラ小胞」（ＬＵＶ））の存在下にも、αヘリックス構造をとる。
【００９１】
【表２】
2021531274.tif 000004
脚注：ランダムコイル（ｒｃ）コンフォメーションは、２１２ｎｍに正のバンド、および１９５ｎｍ付近に負のバンドを有する。ヘリックスコンフォメーションは、２０７ｎｍおよび２２２ｎｍにおける２つの極大、ならびに１９１ｎｍ付近の１つの極大によって特徴付けられる。ターン様構造には、２００ｎｍおよび２２８ｎｍにおいて２つの極大が見られる。Ｒ２０のＣＰＰ：ｓｉＲＮＡモル比、およびｒ１０のＣＰＰ：脂質で、ＣＰＰ濃度４０μＭ。
【００９２】
２．両親媒性ペプチドのコロイド特性
ＣＤによって示されたコンフォメーション変化は、ほとんどすべてのＣＰＰがｓｉＲＮＡと相互作用することを示唆した。ｓｉＲＮＡの複合体形成を評価するために、ＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ複合体の形成をアガロースシフトアッセイにより調べた（図２）。ｓｉＲＮＡは単独でアガロースゲル中を移動することができたが（＝１００％シグナル）、ＣＰＰと複合体形成すると、ペプチドがオリゴヌクレオチド移動をモル比依存的に抑制した。明らかにＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＣＰＰ３およびＣＰＰ４は同様の様式でｓｉＲＮＡと複合体化することができ、複合体化はＲ＝２０およびＲ＝４０のペプチド：ｓｉＲＮＡモル比で最適であった。
【００９３】
ＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ複合体（５％グルコース、Ｒ＝２０）のコロイド特性を、動的光散乱（ＤＬＳ）によりナノ粒子サイズおよび均一性に関して特徴付けた。強度測定（％）により、ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＣＰＰ３およびＣＰＰ４が直径８０ｎｍ〜２００ｎｍのＰＢＮを形成したことが示され、多分散指数（ＰｄＩ）は約０．３であった（表３）。数に基づくナノ粒子サイズ分布（％）は、強度に基づくサイズ分布によって示されたものに加えて、より小さいナノ粒子が存在することを示唆した。そのようなより小さい粒子の直径は、４種のＣＰＰ：ｓｉＲＮＡについて２０ｎｍ〜５０ｎｍであった（表３）。より重要なことには、両方の測定されたサイズ値は、４℃で７２時間貯蔵後にも顕著に変化しなかった（データを示さず）。
【００９４】
ＣＰＰ１：ｓｉＲＮＡまたはＣＰＰ２：ｓｉＲＮＡからなるＰＢＮは、正に荷電した表面（ゼータ電位測定、表３）、および透過電子顕微鏡により示される球形状（図２Ｂ）の両方を有する。
【００９５】
【表３】
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脚注：すべてのＣＰＰ：ｓｉＲＮＡ複合体を、Ｒ＝２０、ｓｉＲＮＡ濃度５００ｎＭで、平均サイズ取得のためには５％グルコース水溶液中に形成し、ＺＰ評価のためには５ｍＭのＮａＣｌを含む５％グルコース水溶液中に形成した。独立した製剤のｎ≧２（ラン毎に３測定）。ｎ.ｄ.：測定せず。＊１ｍＭのＮａＣｌを含む５％グルコース中でＺＰ測定。
【００９６】
３．調製に依存するｓｉＲＮＡ担持ＣＰＰナノ粒子の効果
調製時の適用濃度に依存するｓｉＲＮＡ担持ＣＰＰナノ粒子の効果を評価した。
２つの異なる調製を比較した：
１）希釈条件：  複合体を高濃度（例えばＣＰＰ［１０μＭ］：ｓｉＲＮＡ［０．５μＭ］）で調製し、その後希釈して、細胞培養アッセイのために５ｎＭ、１０ｎＭおよび２０ｎＭのｓｉＲＮＡ終濃度とした。
２）体積:体積条件：  ＣＰＰおよびｓｉＲＮＡの溶液を個別に調製し、その後混合して、細胞培養アッセイのために５ｎＭ、１０ｎＭおよび２０ｎＭのｓｉＲＮＡ終濃度とした。
【００９７】
ＣＰＰ２を用いて行った調製によって例示されるように、適用した調製手順に応じてナノ粒子のノックダウン効果が増加され得た（図１４）。希釈条件は、より高いノックダウン効果を誘導するようである（２倍の増加）。このことは、トランスフェクトすることが「困難」であることが知られる細胞のトランスフェクションのために特に興味深い。
【００９８】
４．両親媒性ペプチドはプラスミドの調製に使用されうる：
ＣＰＰ１およびＣＰＰ２ペプチドは、プラスミドのようなオリゴヌクレオチドと会合されたとき、複合体を形成した（図３）。複合体形成を、ＣＰＰとｓｉＲＮＡの複合体形成について前記したようにアガロースゲル（０．５％）を用いて可視化した。ＣＰＰ（正荷電）およびプラスミド（負荷電）間の中性荷電（ＣＲ＝１）に相当するチャージ比（ＣＲ）において、プラスミドをＣＰＰと複合体化した。すると、嵩高いＣＰＰ：プラスミド複合体はもはやアガロースゲル中を移動することができなかった。
【００９９】
プラスミドバンド単独の強度を１００％と正規化した。ＣＰＰ：プラスミドチャージ比を連続的に高めることによって、アガロースゲル（０．５％）中の移動が比例的に低下されたｐＧＬ３プラスミド（６．５６ｋｂｐ）の複合体化が得られた。
【０１００】
プラスミド担持ＣＰＰナノ粒子のトランスフェクション能力を分析するために、ＭＣＦ７（ヒト乳癌）およびＭＥＦ（マウス胚線維芽）細胞を、ホタルルシフェラーゼをコードするプラスミド（ｐＧＬ３）でトランスフェクトした。ＣＰＰ２：ｐＧＬ３（ＣＲ＝１）と２４時間インキュベート後、細胞を溶解し、ホタルルシフェラーゼの、その基質の添加による発現を定量した（Promegaのキット）。図３Ｂおよび３Ｃに示すように、未処置細胞と比較して、タンパク質発現の増加に相関するホタルルシフェラーゼ活性増加が用量依存的に見られた。
【０１０１】
結論として、ＢＰＮは、先にｓｉＲＮＡで示したように、プラスミドをトランスフェクトするためにも使用することができた。
【０１０２】
５．ルシフェラーゼスクリーニングアッセイによるＣＰＰ：ｓｉＲＮＡナノ粒子の細胞活性の特徴付け
ＣＰＰベースのナノ粒子の細胞活性を、文献に記載されるようにルシフェラーゼスクリーニングアッセイにおいて評価した（L.N. Patel, et al., (2007) Pharm. Res. 24, 1977-1992; A. Elmquist, et al., (2001) Exp. Cell Res. 269, 237-244）。さまざまなＣＰＰ：ｓｉＲＮＡナノ粒子のノックダウン効果を、ＦＬｕｃ／ＮＬｕｃレポーター遺伝子の構成的発現のために安定にトランスフェクトされたＵ８７細胞株において行った（Ｕ８７−ＦＲＴ−ＣＭＶ／Ｆｌｕｃ−ＣＭＶ／ｉＲＦＰ−ＩＲＥＳ−ＮＬｕｃ）。
【０１０３】
本発明者は初めに、効果的なルシフェラーゼノックダウンのために必要な、ペプチドとｓｉＲＮＡ（２０ｎＭの一定濃度）の最適なモル比を調べた（図４Ａ）。ＣＰＰ１、ＣＰＰ２、ＣＰＰ３およびＣＰＰ４について、本発明者は、Ｒ＝４０で少し増加する、Ｒ＝２０で７０％を超える顕著なルシフェラーゼノックダウンを観察した。並行して、すべてのナノ粒子処理において、相対的な細胞傷害性は観察されなかった（ＬＤＨ測定）。
【０１０４】
非常に有望なホタルルシフェラーゼノックダウン結果が、全トランスフェクションの３６時間後、また、２４時間後にも、観察可能であったが、これは実験者にとって得るところが大きかった。ＣＰＰ２：ｓｉＲＮＡおよびＣＰＰ４：ｓｉＲＮＡについてモル比Ｒ２０およびＲ４０において、適用したトランスフェクション時間に関わらず、すべての条件でルシフェラーゼシグナルの相対的低下が同じであった（約６０〜８０％）（図４Ｂ）。
【０１０５】
次いで、最適なペプチド：ｓｉＲＮＡモル比Ｒ＝２０を用いて、最適なｓｉＲＮＡ濃度を調べた（図４Ｃ）。３種のＰＢＮ（ＣＰＰ１、ＣＰＰ２およびＣＰＰ４）が、約７．５ｎＭのＩＣ５０値で、非常に良好な用量依存的相関を示して顕著なノックダウン効果を示した。ここでも、用いたすべての条件で細胞傷害性は観察されなかった。
【０１０６】
最後に、本発明者は、本発明のナノ粒子は、Lipofectamine（登録商標）RNAiMAX（ｓｉＲＮＡトランスフェクション用にThermoFisherから現在市販されている製品）と、同じｓｉＲＮＡ使用濃度において等価なルシフェラーゼノックダウン低下を誘導したことを認識することができた。しかしながら、このような条件下に、本発明者は、Lipofectamine（登録商標）RNAiMAXベクター化で２１％に相当する顕著な細胞傷害性を観察した（図４Ｃ）。
【０１０７】
ナノ粒子の反復または長期適用のために、ＣＰＰは、細胞外または細胞内プロテアーゼによるその分解を低減するためにアイソフォームＤのものを使用することが好ましい。これに関連して、ＣＰＰ２：ｓｉＲＮＡナノ粒子の効果を、ＬまたはＤ立体配置のペプチドを用いて評価した。
【０１０８】
コロイド特性の試験によって、アイソフォームＤのペプチドＣＰＰ２（ＣＰＰ２［Ｄ］）は、ＣＰＰ２［Ｌ］と同じ大きさのナノ粒子を形成することが、ＤＬＳによる確認で示された（Ｉ％＝７０±１１ｎｍ、Ｎｂ％＝３１±１ｎｍ、ＰｄＩ＝０．３０２±０．０２４、ＣＰＰ２［Ｌ］について表３を参照されたい）。
【０１０９】
並行して、ホタルルシフェラーゼ発現の低下は、Ｒ２０の一定の比で用量依存的に（１ｎＭ〜２０ｎＭのｓｉＲＮＡ）、したがってペプチドの異性化（ＣＰＰ２［Ｄ］およびＣＰＰ２［Ｌ］）に関わらず、観察された（図５）。
【０１１０】
インビボ適用を促進するために、静脈内注射による投与の際に起こり得る血清タンパク質との相互作用を模すために、ナノ粒子を血清の存在下にインキュベートした。血清（１０％）の存在は、ＣＰＰ１の場合１５ｎＭおよび２０ｎＭのｓｉＲＮＡ、ＣＰＰ２の場合１０ｎＭ〜２０ｎＭのｓｉＲＮＡでのホタルルシフェラーゼサイレンシングに関して、ナノ粒子の活性に有意な悪影響を及ぼさなかった（図６）。１０％血清存在下に、血清なしの条件に相当する約７０％のルシフェラーゼ活性低下が観察された。
【０１１１】
最後に発明者は、ＣＰＰによるｓｉＲＮＡトランスフェクションは、実験室が変わっても、また、用いる検出方法に関わらず、再現可能であることを示した。この比較において、Ｕ８７細胞をＣＰＰ２：ｓｉＲＮＡナノ粒子と、３つのｓｉＲＮＡ濃度（５ｎＭ、１０ｎＭおよび２０ｎＭ）でインキュベートした。インキュベーション後、細胞を溶解し、９６ウェルプレートに移した（Dual Luciferaseキット, Promega with PolarStar measurement, BMG）、またはチューブ内の（Luciferase Assay Reagent and Nano-Glo Luciferase Assay, Promega with Lumat LB 9507 measurement, Berthold Technologies）細胞溶解物において、ホタルルシフェラーゼおよびNanoLucの活性を定量した。いずれの場合も、ホタルルシフェラーゼ発現の用量依存的低下を示す値は同じであった（図７）。
【０１１２】
６．ＣＰＰ：ｓｉＲＮＡの活性の、同様の配列を有する他のＣＰＰとの比較
２つのペプチドＣＰＰ１およびＣＰＰ２と類似するが異なる配列を、アミノ酸位置の重要性（ＣＰＰ１とＣ６Ｍ１との対比）、およびロイシン残基の役割（ＣＰＰ２とＣＰＰ２−１〜ＣＰＰ２−３との対比、表１）を示すために合成した。
【０１１３】
本発明のＣＰＰが、ｓｉＲＮＡトランスフェクションに関して、Jafari et al. (2013)に記載されるＣ６Ｍ１ペプチドよりも良好な効果を有することを示すために、直接比較を行った。Ｃ６Ｍ１アナログで、ペプチド配列のＮ末端部のロイシンダブレットにおいてロイシンを欠失するＣ６Ｍ１−Ｌ配列を含めた（表１および図８Ａ）。
【０１１４】
ホタルルシフェラーゼを過剰発現するヒトグリオブラストーマ細胞（Ｕ８７）を、ＣＰＰ１、Ｃ６Ｍ１、Ｃ６Ｍ１−ＬおよびＣＰＰ２の４つのベクターペプチドを用いて調製したｓｉＲＮＡ封入ナノ粒子（ｓｉＦｌｕｃまたは陰性対照としてのｓｉＳＣＲ）と共にインキュベートした。これらの調製は、すべてのペプチドについて同じ濃度（ＣＰＰ＝２００ｎＭ、ｓｉＲＮＡ＝１０ｎＭ）、同じ方法で並行して実施した。その後、インキュベーション間のバイアスを回避するために、すべての溶液を、各ウェルに５０００個の細胞を含むＰ９６プレート中で１．５時間インキュベートした。
【０１１５】
ルシフェラーゼ活性の測定によって、発明者は、ＣＰＰ１：ｓｉＲＮＡおよびＣＰＰ２：ｓｉＲＮＡはルシフェラーゼ発現の９０％低下を誘導できたことを明らかに示した。対照的に、発明者は、Ｃ６Ｍ１：ｓｉＲＮＡによるわずか６０％、Ｃ６Ｍ１−Ｌ：ｓｉＲＮＡによるわずか４０％のルシフェラーゼノックダウンを観察した（図８Ａ）。
【０１１６】
結論として、ＣＰＰ１ペプチドはルシフェラーゼ発現低下に関して、Ｃ６Ｍ１よりも３倍活性であり、Ｃ６Ｍ１−Ｌよりも６倍活性であった（両比較においてｐ＝****、一元ＡＮＯＶＡとTukeyのポスト検定）。さらに、発明者は、ＣＰＰ２ペプチドがＣ６Ｍ１（２倍）およびＣ６Ｍ１−Ｌ（３．５倍）よりも効果的であることも示すことができた。
【０１１７】
ペプチド配列中のロイシン「ダブレット」の重要性を理解するために、さまざまな位置でロイシン残基を欠失させたアナログを作製した（表１参照）。ＣＰＰ２配列の中央のみ（ＣＰＰ２−１）またはすべての「ダブレット」（ＣＰＰ２−２）を単一のロイシン残基で置き替えた場合、発明者は、ルシフェラーゼアッセイにおいてナノ粒子が完全に不活性であることを観察した（図８Ｂ）。
【０１１８】
第２のステップにおいて、発明者は、ＣＰＰ１およびＣＰＰ２配列のＮおよびＣ末端部の「ダブレット」の重要性を分析しようと考えた（それぞれ、ＣＰＰ１−１およびＣＰＰ２−３）。この欠失も、in celluloでナノ粒子（ｓｉＲＮＡ−ＦＬｕｃ）の活性に影響を及ぼした（図８Ｂ）：
・ナノ粒子ＣＰＰ２−３：ｓｉＦＬｕｃは、ルシフェラーゼサイレンシングに関して、ＣＰＰ２：ｓｉＦｌｕｃ ＰＢＮによって観察されるものと比較して活性を示さなかった。
・ナノ粒子ＣＰＰ１−１：ｓｉＦＬｕｃは、特に１０ｎＭおよび２０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度において、同じ濃度のＣＰＰ１：ｓｉＦＬｕｃナノ粒子と比較して３分の１および５分の１のＰＢＮ活性に相当する、低い抑制活性を示した。
【０１１９】
第３のステップにおいて、発明者は、発明者が開発したＣＰＰのコンセンサス配列、およびＣ６Ｍ１およびＣ６Ｍ１−Ｌと比較したその挙動を確認しようと考えた。したがって、ペプチド配列末端（Ｎ末端およびＣ末端）に追加のアルギニン残基を有するペプチド配列を合成した（表１のＣＰＰ１−６ＲおよびＣＰＰ２−６Ｒ配列参照）。
【０１２０】
しかしながら、配列内の２つのアルギニンの付加は、ペプチドの正味総電荷も高めうる。親ペプチドと同じ正味電荷をもたらすために、ＮおよびＣ末端アルギニン残基を有するが非末端の２つのアルギニン残基を欠失する２つのさらなるペプチドを設計した（ＣＰＰ１−４ＲおよびＣＰＰ２−４Ｒ、表１）。すべての場合に、ペプチド両端におけるアルギニン付加は、in celluloでナノ粒子（ｓｉＲＮＡ−ＦＬｕｃ）の活性を低下させた（図８Ｂ）：
・ナノ粒子ＣＰＰ１−４Ｒ：ｓｉＦＬｕｃは、ルシフェラーゼサイレンシングに関して、ＣＰＰ１：ｓｉＦｌｕｃ ＰＢＮの場合に観察されるものと比較して活性を示さなかった。ナノ粒子ＣＰＰ１−６Ｒ：ｓｉＦＬｕｃは、同じ濃度のＣＰＰ１：ｓｉＦＬｕｃナノ粒子と比較してＰＢＮとして４分の１（５ｎＭのｓｉＲＮＡ）および３分の１（１０ｎＭおよび２０ｎＭのｓｉＲＮＡ）に相当する低い抑制活性を示した。
・ナノ粒子ＣＰＰ２−４Ｒ：ｓｉＦＬｕｃおよびＣＰＰ２−６Ｒは、すべてのｓｉＲＮＡ濃度において、ＣＰＰ２：ｓｉＦＬｕｃナノ粒子と比較してＰＢＮとして３分の１ないし４分の１に相当する低い抑制活性を示した。さらに、ＣＰＰ２−４Ｒは、ルシフェラーゼ活性測定において幾分かのばらつきを示したが、これはナノ粒子インキュベーションのいくらかの細胞傷害効果によるものと考えられる。
・得られた結果はＤＬＳ測定によって説明された（表３）：ＣＰＰ１−４Ｒ：ｓｉＲＮＡは親ナノ粒子よりもよく凝集しており、ＣＰＰ１−６Ｒ：ｓｉＲＮＡ粒子はＣＰＰ１：ｓｉＲＮＡよりも大きく、多分散度がより高く、ＣＰＰ２−４Ｒ：ｓｉＲＮＡおよびＣＰＰ２−６Ｒ：ｓｉＲＮＡは、ＣＰＰ２：ｓｉＲＮＡよりも小さいナノ粒子を形成するようであったが多分散度がより高いように見えた。
【０１２１】
結論として、ＣＰＰ１およびＣＰＰ２は両方とも、最高のノックダウン効果を持つ安定なナノ粒子形成を可能にする最良のアミノ酸組み合わせを有する。
【０１２２】
７．ＣＰＰ：ｓｉＲＮＡナノ粒子のトランスフェクション効果の実施例
最高のトランスフェクション効果を示したので、ＣＰＰ１およびＣＰＰ２をさらなる細胞試験および開発のために選択した。汎用のトランスフェクション剤としての可能性を評価するために、両ペプチドをさまざまな細胞株に対して試験した。２０ｎＭのｓｉＲＮＡを使用して、Ｕ８７（ヒトグリオブラストーマ）、ＫＢ（Ｈｅｌａ由来ケラチン形成細胞）、ＨｕＨ７（ヒト肝癌）およびＮｅｕｒｏ２ａ（マウス神経芽細胞腫）、ＭＣＦ７（ヒト乳癌）、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳腺癌）細胞において、５０ｎＭのｓｉＲＮＡを使用して、ＣＭＴ９３（直腸癌）、ＭＥＦ−ＲＡＳ：Ｒａｓ改変マウス胎児線維芽細胞、Ａ５４９：ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞、ＨＴ２９（ヒト結腸癌）およびＲＭ１（マウス前立腺癌）細胞において、また、１００ｎＭのｓｉＲＮＡを使用して、ＧＬ２６１（マウスグリオブラストーマ）細胞において、５０％〜８０％のＦＬｕｃ遺伝子サイレンシングが検出され、同等のノックダウン効果を達成するために、細胞株によっては高いｓｉＲＮＡ用量を必要とすることが示された（図９Ａ）。
【０１２３】
また、ＣＰＰ１およびＣＰＰ２ベースのＮＰを、グリオブラストーマにおいて過剰発現することが知られる内因性タンパク質であるサイクリン依存性キナーゼ４（ＣＤＫ４）を標的化するよう適用した（D.W. Parsonset al., (2008) An integrated genomic analysis of human glioblastoma multiforme, Science. 321, 1807-1812）。５ｎＭ、１０ｎＭおよび２０ｎＭにおいてそれぞれ３０％、６０％および８０％に相当するＣＤＫ４発現抑制という、両ペプチドでの顕著なＣＤＫ４ノックダウンが観察された。ＣＰＰ１：ｓｉＣＤＫ４は、ＣＰＰ２：ｓｉＣＤＫ４よりも少し高いＣＤＫノックダウン効果を示すようであった（図９Ｂ）。
【０１２４】
Lipofectamine（登録商標）RNAiMAX（ThermoFisherから市販されている脂質トランスフェクション分子）との直接の比較により、本ＰＢＮトランスフェクション系が優れていることが明らかに示された（図９Ｃ）。両方のトランスフェクション系が顕著なＣＤＫ４ノックダウンを示して有効であったが、Lipofectamine（登録商標）RNAiMAX条件は低い濃度ですでに顕著な細胞傷害作用を示した。細胞傷害性は、内部標準を用いるウエスタンブロット（ビンキュリン発現：濃灰色のバー）、または総タンパク質濃度（ＢＣＡキットで測定、赤色の値）で観察することができた。
【０１２５】
５０ｎｍのｓｉＣＤＫ４濃度において、ＣＰＰ１は細胞傷害性を示さずに８０％を超えるＣＤＫ４ノックダウンを誘導した。一方、ｓｉＲＮＡをLipofectamine（登録商標）RNAiMAX試薬を用いて導入した場合は、ノックダウンは同じであったが、総細胞タンパク質およびビンキュリンの量の顕著な低下を伴い、このトランスフェクション試薬が顕著に細胞傷害性であることが示された（赤色の破線）。
【０１２６】
ＣＰＰ２の細胞傷害性も、コロニー形成アッセイによって、細胞の生存および増殖に対する高い傷害性プロファイルを示した両RNAiMAX条件と比較して観察された（図９Ｄ）。他のＣＰＰ２条件はいずれも、未処置細胞との比較で、細胞の生存および増殖に影響しなかった。予想されたように、細胞サイクルに関わるサイクリンＤ１タンパク質に対するｓｉＲＮＡを用いる対照条件は、細胞生存の５０％の低下を示した。
【０１２７】
内因性タンパク質ＣＤＫ４に対するＣＰＰ２ベースのＮＰの効果を、培養後３日間の間のＮＰの３連続投与後にも評価した（図９Ｅ）。顕著なＣＤＫ４ノックダウンがすべての条件で検出されたが、単回投与（投与１）と比較して２０ｎＭのｓｉＲＮＡの３連続投与（投与３）によって明らかに蓄積効果が観察され、ＣＰＰ２ベースＮＰの経時的な蓄積効果の可能性が示唆された。
【０１２８】
８．細胞懸濁液に対するＣＰＰ：ｓｉＲＮＡナノ粒子のトランスフェクション効果の実施例：
非接着細胞（懸濁液）に対するｓｉＲＮＡ担持ＣＰＰナノ粒子のトランスフェクション効果を評価するために、Ｕ８７細胞に対していわゆる逆トランスフェクションを行った。「標準」トランスフェクション条件においては、細胞をマイクロタイタープレートに所望の濃度で播種し、ウェル底に接着した後（６時間〜２４時間）、細胞をナノ粒子でトランスフェクトした。「逆」トランスフェクションにおいては、ナノ粒子をマイクロタイタープレートに移し、その後、血清を含むかまたは含まない培地に再懸濁させたトリプシン処理細胞をナノ粒子に加えた（図１５ＡおよびＢ参照）。
【０１２９】
いずれの場合も、ＣＰＰ１：ｓｉＦＬｕｃおよびＣＰＰ２：ｓｉＦＬｕｃは、用量依存的なルシフェラーゼ遺伝子サイレンシングを示し、これは、ＣＰＰ：ｓｉＳＣＲナノ粒子はノックダウン効果を示さなかったことから、特異的であった。このサイレンシング特異性は、血清を含む培地でも含まない培地でも同様に観察された。しかしながら、逆トランスフェクションのサイレンシング効果は、「標準」トランスフェクションと同等の８０〜９０％のノックダウンを達成するために、少し高い用量のｓｉＲＮＡ（２０ｎＭの代わりに５０ｎＭ）を必要とした。
【０１３０】
次に、ホタルルシフェラーゼで安定にトランスフェクトされたＵ９３７ヒトマクロファージといった非接着細胞におけるＣＰＰ２：ｓｉＦＬｕｃのトランスフェクション効果を評価した（図１５Ｃ）。ＣＰＰ２：ｓｉＦＬｕｃナノ粒子は、用量依存的なルシフェラーゼ遺伝子サイレンシングを示し、これは、ｓｉＦＬｕｃ単独ではノックダウン効果が示されなかったことから、該トランスフェクションに特異的であった。サイレンシング効果は、１０ｎＭ、２０ｎＭおよび５０ｎＭのｓｉＲＮＡ濃度でそれぞれ４０％、８０％および１００％と決定された。
【０１３１】
９．嚢胞性線維症の状況におけるＣＰＰ１：ＭＢＢＯおよびＣＰＰ２：プラスミドの同時トランスフェクション
嚢胞性線維症（ＣＦ）は、主として肺を冒し、膵臓、肝臓、腎臓および腸をも冒す遺伝子疾患である。これは、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質の遺伝子の両コピーにおける変異の存在によって引き起こされる。ＣＦＴＲは、ｍｉｃｏｒＲＮＡ、例えばｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−４９４によって転写後制御されたことが最近わかった（Gillen AE et al. Biochem J. 2011; Megiorni F et al. Plos One, 2011; Ramachandran S et al. PNAS, 2012, Viart V et al. Eur Respir J. 2015）。ｍｉＲ−１４５を包含するいくつかのｍｉＲＮＡが、ＣＦＴＲが抑制されている初代ヒト気道上皮細胞において発現され（Gillen AE et al. Biochem J , 2011）、またはＣＦ患者において脱制御される（Oglesby IK et al. J immunol, 2013; Ramachandran S et al. AJRCMB . 2013）。
【０１３２】
M. Taulan-Cardars博士のグループは、ＣＦＴＲ遺伝子３’−ＵＴＲへのｍｉＲ−１０１、ｍｉＲ−６００、ｍｉＲ−１４５およびｍｉＲ−３８４を包含するいくつかのｍｉＲＮＡの結合を抑制するターゲットサイトブロッカー（ＴＳＢ、ｍｉＲＮＡ結合ブロッカーオリゴヌクレオチド（ＭＢＢＯ）とも称される）を設計した（ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０６９５２２）。このＭＢＢＯは、モル比依存的にＣＰＰ１で封入することができ、Ｒ＝５で完全に複合体化した（図１６Ａ）。発明者はこのモル比を用いて、動的光散乱（ＤＬＳ）により測定された平均サイズ１８０ｎｍのナノ粒子を得た（図１６Ｂ）。 
【０１３３】
その後、発明者は、気管支Ｂｅａｓ−２ｂ細胞におけるＣＦＴＲ転写物量に対するＭＢＢＯトランスフェクションの効果を、異なるトランスフェクション試薬と比較して評価した（図１６Ｃ）。同時トランスフェクション実験において、ＣＦＴＲをコードするプラスミド（ｐｍ−ｃＤＮＡ−ＣＦＴＲ−３’ＵＴＲ、１１．８ｋｂｐ）をさまざまなＭＢＢＯ（１９〜２８ｐｂ）と共に導入した。ＣＦＴＲ転写レベルを最初にハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）に対して正規化し、次いで対照ＭＢＢＯ（３’−ＵＴＲ結合性を持たないＭＢＰ−Ｃｔｒｌ）に対して正規化した。３つの異なるトランスフェクション試薬組み合わせを分析した：
- ＣＦＴＲプラスミドおよびＭＢＢＯでのトランスフェクションの両方においてLipofectamin（商標）RNAiMAX
- ＣＦＴＲプラスミドでのトランスフェクションにおいてJetPEI（登録商標）、およびＭＢＢＯでのトランスフェクションにおいてＣＰＰ１
- ＣＦＴＲプラスミドでのトランスフェクションにおいてＣＰＰ２、およびＭＢＢＯでのトランスフェクションにおいてＣＰＰ１
【０１３４】
図１６Ｃに示されるように、気管支Ｂｅａｓ−２ｂ細胞におけるＣＰＰ２：プラスミド／ＣＰＰ１：ＭＢＢＯでのトランスフェクション後のＣＦＴＲ転写物の量は、JetPEI（登録商標）：プラスミド／ＣＰＰ１：ＭＢＢＯを用いたトランスフェクションと比較して２〜３倍多く、JetPEI（登録商標）：プラスミド／RNAiMAX：ＭＢＢＯ条件と比較して１０〜１２倍多かった。このＣＦＴＲ転写増加は、ＣＰＰ１およびＣＰＰ２ペプチドベースのトランスフェクションに基づくプラスミドおよびＭＢＢＯによるトランスフェクション効果がより高いことに関係付けられる。
【０１３５】
１０．ｓｉＲＮＡ担持ＰＢＮのインターナリゼーション・カイネティクスの評価
ＣＰＰ１およびＣＰＰ２ベースのナノ粒子は、遺伝子サイレンシングにおいて顕著な効果を示し、最適なｓｉＲＮＡ送達が示唆された。したがって本発明者は、時間に依存するその細胞インターナリゼーションを評価することを試みた。ｓｉＲＮＡ担持ＰＢＮ（２０ｎＭ  ｓｉＦＬｕｃ）をヒトＵ８７細胞に、５分間〜９０分間の範囲のさまざまなインキュベーション時間の間、適用し、次いで、ＰＢＮ溶液を１０％ＦＢＳ含有培地に３６時間の間交換した。結果は、ＣＰＰ１およびＣＰＰ２ナノ粒子は、５分間のインキュベーション後にすでにＦＬｕｃ活性の４０％低下を誘導することができたことを示し、速やか、かつ顕著なタンパク質ノックダウンが示唆された（図１０Ａ）。さらに、両ペプチドにより、細胞傷害性を伴わない最大および飽和ＦＬｕｃサイレンシングが６０分のインキュベーション後に観察された。図４Ｃと比べて、６０分での最大のノックダウン効果は少し低かったが、これは、ｉ）３０分間のさらなるインキュベーション時間がなかったこと、およびii）ＰＢＮ溶液を交換したが、補足培地で満たさなかったことによると考えられる。
【０１３６】
ｓｉＣＤＫ４担持ＰＢＮを用いて行った同様の時間依存実験により、ウエスタンブロット評価で同様の結果が示され、短時間でのトランスフェクション効果が確認された（図１０Ｂ）。この場合も、最初のノックダウン効果は５分間のインキュベーション後に観察することができ、サイレンシング効果は６０分で最大となった。
【０１３７】
ＣＰＰベースのナノ粒子のインターナリゼーションについてさらに情報を得るために、共焦点顕微鏡実験を行った。ｓｉＲＮＡ細胞分布を表す画像は、１時間のインキュベーション後において、他のＰＢＮで観察されたのと同様の区切られたパターンを示した（図１０Ｃ）（A. Vaissiere, et al., (2017) A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery, J. Nanobiotechnology. 15, 34.; G. Aldrian, et al., (2017) PEGylation rate influences peptide-based nanoparticles mediated siRNA delivery in vitro and in vivo, J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 256, 79-91.; A. Rydstroem, et al., (2011) Direct translocation as major cellular uptake for CADY self-assembling peptide-based nanoparticles, PloS One. 6, e25924.）。その後、発明者は、両ＣＰＰベースのナノ粒子のインターナリゼーション・カイネティックをＣｙ３標識ｓｉＲＮＡの細胞内蓄積に基づいて評価するためにスピニングディスク実験を行った（図１０Ｄ）。グラフに示すように、両ＰＢＮによって送達されたｓｉＲＮＡにより、約１５分間（９００秒〜９４５秒）のインキュベーション後に蛍光が最大に達したことが観察された（９０％±５％）。インターナリゼーション（５０％）のＩＣ５０値は、ＣＰＰ１およびＣＰＰ２ナノ粒子によって、それぞれ２４０秒および１８５秒のインキュベーション後に得られた。このインターナリゼーションは、１２０分間のインキュベーション後にインターナリゼーションが最大に達したＲＩＣＫ：ｓｉＲＮＡまたは２０％ＰＥＧ−ＲＩＣＫ：ｓｉＲＮＡといった、過去に分析されたＰＢＮと比較して、非常に速かった（A. Vaissiere, et al., (2017) A retro-inverso cell-penetrating peptide for siRNA delivery, J. Nanobiotechnology. 15, 34.; G. Aldrian, et al., (2017) PEGylation rate influences peptide-based nanoparticles mediated siRNA delivery in vitro and in vivo, J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 256, 79-91.）。まとめると、両ＣＰＰベースのナノ粒子で観察された速いｓｉＲＮＡインターナリゼーション・カイネティックは、５分間のインキュベーション後でも観察されるノックダウン効果の説明となりうる（図１０Ａおよび１０Ｂ）。
【０１３８】
１１．ナノ粒子のインビボ評価（マウス異種移植モデル）
ナノ粒子のインビボにおける効果を評価するために、皮下腫瘍中に注入した（マウスＵ８７−ＣＭＶ−ＦＬｕｃ−ＣＭＶ−ｉＲＦＰ−ＩＲＥＳ−ＮＬｕｃ細胞）。腫瘍形成のために、Ｕ８７細胞（２．１０６細胞／１００μｌ）をＢ６アルビノマウスの右脚に皮下注入した。腫瘍成長後、ＣＰＰ２：ｓｉＦｌｕｃナノ粒子（２０μｌ）を腫瘍の中心部に注入した。Lumina LTソフトウェア（Perkin Elmer Inc.）を使用してVivoptic（UMS 3767 - ボルドー大学）で生物発光イメージング（ＢＬＩ）を行った。麻酔溶液（２％イソフルラン）の投与後、マウスにＤ−ルシフェリンを腹腔内注射し、注射の８分後の時点の画像を得た。
【０１３９】
「二重の」生物発光（ＦｌｕｃおよびＮｌｕｃ）および蛍光（ｉＲＦＰ）を示す画像は、２４時間の時点における可視ホタルルシフェラーゼの低下を示す（図１１Ａ）。この現象は、より多数の動物の平均において、より顕著であり（ｎ＝１１）、２４時間でルシフェラーゼシグナルの７０％の低下を示した（＊ｐ＜０．０５）（１５μｇのｓｉＦｌｕｃでのＣＰＰ２：ｓｉＦｌｕｃ、Ｒ＝２０）（図１１Ｂ）。より重要なことに、ＣＰＰ２：ｓｉＦｌｕｃナノ粒子注入後４８時間でｍＲＮＡ−Ｆｌｕｃの割合は８０％低下した（＊＊＊ｐ＝０．０００９）（図１１Ｃ）。
【０１４０】
１２．ＣＰＰナノ粒子によるｓｉＲＮＡ「カクテル」のベクター化
ＣＰＰベースのナノ粒子は、サイクリンＢ１およびＣＤＫ４タンパク質を標的とする（同じ割合の）２つのｓｉＲＮＡのカクテル（図１２Ａ）および（異なる割合の）２つのｓｉＲＮＡのカクテル（図１２Ｂ）について以下例示するように、異なるタンパク質を標的とする複数の異なるｓｉＲＮＡの「カクテル」の送達も可能にしうる：
【０１４１】
１３．高度にモジュール型のナノ粒子の評価（グラフトＰＢＮ）：
ナノ粒子の標的化は、治療用分子の健常組織におけるインターナリゼーションを減少させ、望ましくない副作用を防止するための必須条件となっている。数年来、ある種の組織または細胞種における過剰発現受容体を認識するナノ粒子に、ペプチドまたは糖といった標的化分子がグラフトされている（F. Danhier et al., (2012) Mol Pharm. 9(11):2961-73.; 22.; D.M. Copolovici et al., (2014) ACS Nano. 8(3):1972-94.; D. Arosio et al., (2017) Recent Pat Anticancer Drug Discov. 12(2):148-168.）。
【０１４２】
癌に関しては、３種のアミノ酸からなる標的化配列（ＲＧＤ）が、単一の治療用分子またはベクターの特異性を高めるために最もよく研究されている（U.K. Marelli UK, et al., (2013) Front Oncol. 3:222.）。このペプチドは、癌細胞表面で過剰発現するαｖβ３インテグリン受容体と特異的に相互作用することが知られている。
【０１４３】
ナノ粒子のモジュレーションに関してプルーフ・オブ・コンセプトを行うために、ＲＧＤの線状配列（アミノヘキサン酸リンカーＡｈｘを有する）を、ペプチドＣＰＰ２のＮ末端部にグラフトした。
【０１４４】
４残基のＣＰＰ２ペプチドの伸長は、ルシフェラーゼアッセイによって観察されたように、ナノ粒子の形成に影響しないようであった（図１３Ａ）。ネイキッドＰＢＮの場合と同等に、ルシフェラーゼ発現が約７０％低下した（図４）。使用したグラフトペプチドのパーセンテージ（ＣＰＰ２単独とＲＧＤ−Ａｈｘ−ＣＰＰ２との比）にかかわらず、ルシフェラーゼサイレンシングのレベルは一定に保たれた（図１３Ｂ）。
【０１４５】
ペプチドベースのナノ粒子の使用における主な制約は、血流中におけるその短い寿命である。しかしながら、多くのペプチド化学のおかげで、ＰＢＮを、その薬理学的性質を改善するために機能的成分によって修飾することができる（T. Lehto, et al., (2016) Drug Deliv. Rev. 106(Pt A), 172-182）。この方向で、ＰＥＧ化が、インビボにおける安定性を改善するため、肝臓および脾臓における単核貪食細胞系（ＭＰＳ）による認識ならびに血液成分との相互作用を防止するために、広く用いられている。例えば、Genexol-PM［メトキシ−ＰＥＧ−ｐｏｌｙ（Ｄ,Ｌ−ラクチド）タキソール］は、米国で第II相臨床試験において実際の成功を収めた最初のポリマーベースのミセルナノ粒子である。
【０１４６】
このような状況で、プルーフ・オブ・コンセプトによって、本発明のペプチドナノ粒子が、ＰＥＧ成分をグラフトすることができ、多重にグラフトすることもできることが示された（図１３Ｃ）。２０％のＰＥＧ−ＣＰＰの添加は、ナノ粒子の活性に有意な影響を及ぼさなかった。１００％ＰＥＧ−ＣＰＰの条件のみが、それを完全に抑制した。このような結果は、ＰＥＧ−ＲＩＣＫで得られたデータと相関した（G. Aldrian, et al., (2017) J. Control. Release Off. J. Control. Release Soc. 256, 79-91）。
【０１４７】
さらに、ＰＥＧ−ＣＰＰの添加が２０％を超えないとき、標的化ＲＧＤペプチド配列の挿入による３成分混合物の形成は（ＣＰＰ２：２０％ ＲＧＤ−Ａｈｘ−ＣＰＰ２：２０％ ＰＥＧ−ＣＰＰ２）、ネイキッドナノ粒子（ＣＰＰ２）と同じルシフェラーゼ活性低下効果を示した（図１３Ｄ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図９−３】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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