(57)【要約】  本発明は、組換えタンパク質の発現を高めるためのリーダー配列に関する。また、本発明は、リーダー配列を用いてインスリンおよびインスリン類似体を調製するための方法に関する。このリーダーペプチドは、プレ−プロインスリンの発現を有意に増す。また、本発明は、本発明のリーダー配列と断片との融合によって調製されたタンパク質配列に関する。本発明は、前記リーダー配列を用いてインスリンおよびその類似体を調製することによって実証される。
2021532730.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
式１
で表されるプレ−プロインスリンを中間体として含むインスリンおよびインスリン類似体を製造するための方法であって、
Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖であり、Ｒ１はリーダーペプチド配列である、方法。
【請求項２】
前記リーダーペプチドは、
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｃ）アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｄ）アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチドまたは
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プレ−プロインスリンから式２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３で表されるプロインスリンを調製することを含み、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
機能し得るように前記リーダーペプチドに結合しているプロインスリンをコードする核酸を含む原核生物宿主細胞を生産用培地で培養することにより、プロインスリンを発現させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記原核宿主細胞は、Pseudomonas細胞またはEscherichia coli細胞から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記生産用培地は、１００ｍｌあたり、１％酵母エキス、１％デキストロース、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、１．２５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．５％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび０．１％の微量金属溶液（塩酸中のＦｅＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＮａＭｏＯ４、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｕＳＯ４またはＨ３ＢＯ３）、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
インスリンまたはインスリン類似体の前記前駆体に機能し得るように結合しているリーダーペプチドを含むポリペプチドであって、前記リーダーペプチドは、
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｃ）アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｄ）アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチドまたは
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択される、ポリペプチド。
【請求項８】
インスリンまたはインスリン類似体の前記前駆体は、式２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３で表されるプロインスリンであり、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖である、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項９】
前記リーダーペプチドは、原核生物宿主細胞における前記インスリンおよびインスリン類似体の発現を調節する、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
前記原核宿主細胞は、Pseudomonas細胞またはEscherichia coli細胞から選択される、請求項７に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｃ）アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｄ）アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチドまたは
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択される、リーダーペプチド配列。
【請求項１２】
式１：Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３で表されるプレ−プロインスリンを用いて調製される式２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３で表されるプロインスリン配列であって、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖であり、Ｒ１は、
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｃ）アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｄ）アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチドまたは
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択される、プロインスリン配列。
【請求項１３】
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｃ）アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｄ）アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチドまたは
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択されるリーダーペプチドをコードする塩基配列。
【請求項１４】
前記配列は、配列番号９または配列番号１０に示されている、請求項１３に記載の塩基配列。
【請求項１５】
式１すなわちＲ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖であり、Ｒ１は、
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｃ）アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｄ）アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチドまたは
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択される、塩基配列。
【請求項１６】
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６から選択される、請求項１５に記載の塩基配列。
【請求項１７】
請求項１５または１６に記載の塩基配列を含む組換え遺伝子コンストラクト。
【請求項１８】
pET28aULL1INS、pET28aULL2INS、pET28aULL1LSP、pET28aULL2LSP、pET28aULL1GRまたはpET28aULL2GRから選択される、請求項１７に記載の組換え遺伝子コンストラクト。
【請求項１９】
請求項１５に記載の塩基配列を有する遺伝子コンストラクトを含む発現ベクター。
【請求項２０】
前記ベクターは、インスリン製造用の前記プラスミドpET28aULL1INS、pET28aULL2INSまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２１】
前記ベクターは、インスリンリスプロ製造用のプラスミドpET28aULL1LSP、pET28aULL2LSPまたはそれらの組み合わせを含む、請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
前記ベクターは、インスリングラルギン製造用のプラスミドpET28aULL1GR、pET28aULL2GRまたはそれらの組に合わせを含む、請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２３】
前記発現が原核生物宿主細胞で行われる、請求項１９に記載の発現ベクター。
【請求項２４】
前記原核宿主細胞は、Pseudomonas細胞またはEscherichia coli細胞から選択される、請求項２３に記載の発現ベクター。
【請求項２５】
式１：Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３の発現用の組換え遺伝子発現ベクターを含む組換え遺伝子コンストラクトを調製するための方法であって、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖であり、Ｒ１は、
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｃ）アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｄ）アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチドまたは
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択される、方法。
【請求項２６】
式１
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
式１
で表されるプレ−プロインスリンを中間体として含み、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖であり、Ｒ１はリーダーペプチドである、請求項１に記載の方法によって得られるインスリンまたはインスリン類似体。
【請求項２７】
前記リーダーペプチドは、
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｃ）アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｄ）アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチドまたは
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択される、請求項２６に記載のインスリンまたはインスリン類似体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質の発現用の新規なリーダー配列に関する。また、本発明は、リーダー配列を用いて組換えタンパク質の発現を改善する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景の説明には、本発明を理解する上で有用であろう情報が含まれる。これは，本明細書で提供される情報のいずれかが、現時点で権利請求された発明に対する先行技術であるか、そのような先行技術に関連していると認めるものではなく、具体的または暗黙的に参照される刊行物が先行技術であると認めるものでもない。
【０００３】
組換えＤＮＡ技術の応用によって、いくつかの治療用組換えタンパク質が、バイオ医薬品の用途で利用できるようになった。組換えタンパク質の生産には、一般に、原核生物と真核生物の両方の発現系が用いられている。
【０００４】
すべての発現系のうち、Escherichia coli（E. coli）が、依然として組換えタンパク質を生産するための最も都合のよい宿主である。その理由は、タンパク質を迅速かつ安価に高収量で生産できることにある。また、遺伝子工学的特徴がよく知られており、様々な分子ツールを入手できることも、バイオ医薬品産業におけるE. coliの利用を大きく後押ししている。さらに、様々なプロモーター、リーダーパートナー、変異株を入手できることが大いに有利に作用し、E. coliは、実験室レベルと工業レベルの両方で組換えタンパク質の生産に最も広く利用される方法のひとつになっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
E. coliには多くの利点があるが、活性を発現させるためにグリコシル化やリフォールディングなどの翻訳後修飾を行う高度な仕組みがないため、より複雑なタンパク質を発現させるには限界がある。
【０００６】
一方、E. coliでは、哺乳類などのタンパク質の多くのタンパク質をうまく発現させることができず、これらのタンパク質には、バキュロウイルス発現系、グラム陽性生物、Pseudomonas発現系など、広範な他の生物での発現が模索されている。E. coliにおけるタンパク質の生産量を増すことが、組換えタンパク質の生産プロセスの重要な課題のひとつになっており、この問題を克服して解決するために多くの試みがなされてきた。いくつかの例では、研究者らが、強力なプロモーターの使用、成長培地へのスクロースおよびベタインの添加、リン酸緩衝液を用いた富栄養培地の使用、発現を増加させるためのリーダー配列の使用を模索してきた。発現の低さとは別に、組換えタンパク質のタンパク質分解が、発現宿主の大きな問題となっている。
【０００７】
高収量でタンパク質を得るための別の要因として、目的の遺伝子、発現ベクター、遺伝子量、転写制御、コドン出現頻度、翻訳制御、宿主設計、発現条件を操作するのに利用できる生長培地および培養条件または発酵条件、目的のタンパク質の比活性または生物活性、タンパク質のターゲティング、融合タンパク質、分子シャペロン、タンパク質分解などがあげられる。
【０００８】
発現されるタンパク質の発現を増やして安定性を高めるための最良の方法のうちの１つに、Ｎ末端またはＣ末端をリーダー配列と融合することがある。転写されたｍＲＮＡに強い二次構造が形成されると、異種遺伝子の発現が減少する。この強い二次構造は、リボソームとｍＲＮＡとの結合を阻害することで、効率的な翻訳開始を妨げる。タンパク質のＮ末端とＣ末端の両方にあるリーダー配列決定因子は、組換えタンパク質の発現やプロテアーゼ分解に対する安定性に影響を与える可能性がある。
【０００９】
リーダー配列は、タンパク質の発現用の非常に効率的なツールである。発現以外にも、リーダー配列は、融合パートナーの溶解性、さらにはフォールディングにすら影響する。リーダー配列を用いると、実質的にどのようなタンパク質であっても、その生化学的特性に関する予備知識を必要とすることなく精製できるようになる。
【００１０】
米国特許第１００００５４４号には、宿主細胞で発現コンストラクトを用いてインスリンまたはインスリン類似体を発現させることでインスリンまたはインスリン類似体を製造するための方法が記載されている。発現コンストラクトは、宿主細胞、特に細菌細胞において、インスリンに対するリーダーペプチドを有する。
【００１１】
米国特許第６８４１３６１号には、トロンビンとカルボキシペプチダーゼＢの作用によるＤＮＡの発現によって得られる融合タンパク質からインスリンを調製するのにＤＮＡを用いることが記載されている。
【００１２】
特公平７−１２１２２６号および日本特許第２５５３３２６号には、２つの塩基性アミノ酸残基を介して結合しているＢ鎖とＡ鎖を含むミニプロインスリンを酵母で発現させ、そのミニプロインスリンをin vitroにてトリプシン処理することで、インスリンを製造する方法が記載されている。
【００１３】
しかしながら、これらのパラメータのすべてに関して単一のリーダー配列が最適だというわけではなく、それぞれに長所と短所がある。発現、溶解性および精製の点でより良い結果を得るために、特定のタンパク質について、複数のリーダー配列を異なる組み合わせで一緒に追加することができる。このため、容易かつ効率的のよい組換えインスリンの効率的な発現に役立つリーダー配列を提供することが、当技術分野において必要とされている。
【００１４】
本発明の主な目的は、インスリン、具体的には組換えヒトインスリンおよびインスリン類似体を容易かつ効率的に発現させるための効率的かつ新規なリーダー配列を提供することにある。
【００１５】
本発明の別の目的は、新規なリーダー配列とプロインスリンまたはプロインスリン類似体とを含む融合タンパク質を提供することにある。
【００１６】
本発明のさらに別の目的は、新規なリーダー配列とプロインスリンまたはプロインスリン類似体とを含む融合タンパク質を調製するための方法を提供することにある。
【００１７】
本発明のさらに別の目的は、リーダー配列を用いてインスリンを調製するための、容易かつ極めて効率的で、工業的に拡張可能な方法を提供することにある。
【００１８】
本発明のさらに別の目的は、リーダー配列を含むプレ−プロインスリンからインスリンまたはインスリン類似体を調製するための効率の高い方法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
このサマリーは、以下の詳細な説明の部分でさらに説明される概念の選択肢を簡略化した形で紹介するために提供される。このサマリーは、特許請求の範囲に記載された主題の重要な特徴または本質的な特徴を特定することを意図したものではなく、また、特許請求の範囲に記載された主題の範囲を決定する際の補助として用いられることを意図したものでもない。
【００２０】
一態様において、本発明は、
ａ）配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｃ）アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｄ）アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチドまたは
ｅ）ａ）、ｂ）、ｃ）またはｄ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択されるリーダーペプチド配列に関する。
【００２１】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示されたリーダーペプチド配列をコードする塩基配列を提供する。
【００２２】
別の態様において、本開示は、配列番号９または配列番号１０から選択される塩基配列を提供する。
【００２３】
さらに別の態様において、本開示は、インスリンまたはインスリン類似体の前駆体に機能し得るように結合している、本明細書に開示されたリーダーペプチド配列を含むプレ−プロインスリンポリペプチドを提供する。
【００２４】
別の態様において、本開示は、式１：Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３で表されるプレ−プロインスリンポリペプチドを提供し、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖であり、Ｒ１はリーダーペプチドである。
【００２５】
別の態様において、本開示は、式２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３で表されるプロインスリンであるインスリンまたはインスリン類似体の前駆体を提供し、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖である。
【００２６】
本開示のさらに別の態様において、リーダーペプチドは、原核生物宿主細胞におけるインスリンおよびインスリン類似体の発現を調節する。
【００２７】
本開示の別の態様において、原核宿主細胞は、Pseudomonas細胞またはEscherichia coli細胞から選択される。
【００２８】
一態様において、本開示は、式１:Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３のプレ−プロインスリンを用いて調製されたプロインスリンを提供し、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖であり、Ｒ１はリーダーペプチドである。
【００２９】
別の態様において、本開示は、プレ−プロインスリンからプロインスリンを調製する方法を提供し、プレ−プロインスリンは、リーダーペプチドを含む。
【００３０】
さらに別の態様において、本開示は、プレ−プロインスリンからプロインスリンを調製する方法を提供し、プレ−プロインスリンは式１：Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３で表され、プロインスリンは、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３で表され、Ｒ１はリーダーペプチドであり、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖である。
【００３１】
一態様において、本開示は、インスリンまたはインスリン類似体の前駆体に機能し得るように結合している、本明細書に開示されたリーダーペプチド配列を含むプレ−プロインスリンポリペプチドをコードする塩基配列を提供する。
【００３２】
別の態様において、本開示は、リーダーペプチド配列を含むプレ−プロインスリンポリペプチドをコードする塩基配列を提供し、塩基配列は、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５または配列番号１６に記載の配列である。
【００３３】
一態様において、本開示は、本明細書に開示されたリーダーペプチド配列または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６に記載の塩基配列を含む、プレ−プロインスリンポリペプチドをコードする塩基配列を含む組換え遺伝子コンストラクトを提供する。
【００３４】
別の態様において、本開示は、pET28aULL1INS、pET28aULL2INS、pET28aULL1LSP、pET28aULL2LSP、pET28aULL1GRまたはpET28aULL2GRから選択される組換え遺伝子コンストラクトを提供する。
【００３５】
一態様において、本開示は、本明細書に開示されたリーダーペプチド配列または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６に記載の塩基配列またはpET28aULL1INS、pET28aULL2INS、pET28aULL1LSP、pET28aULL2LSP、pET28aULL1GRまたはpET28aULL2GRから選択される遺伝子コンストラクトを含む、プレ−プロインスリンポリペプチドをコードする塩基配列を含む組換え遺伝子コンストラクトを調製するための方法を提供する。
【００３６】
さらに別の態様において、本開示は、本明細書に開示されたリーダーペプチド配列または配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５もしくは配列番号１６に記載の塩基配列またはpET28aULL1INS、pET28aULL2INS、pET28aULL1LSP、pET28aULL2LSP、pET28aULL1GRまたはpET28aULL2GRから選択される遺伝子コンストラクトを含む、プレ−プロインスリンポリペプチドをコードする塩基配列を含む遺伝子コンストラクトを含む発現ベクターを提供する。
【００３７】
別の態様において、本開示は、インスリン製造用の組換え遺伝子コンストラクトpET28aULL1INSまたはpET28aULL2INS、インスリンリスプロ製造用の組換え遺伝子コンストラクトpET28aULL1LSPまたはpET28aULL2LSPおよびインスリングラルギン製造用の組換え遺伝子コンストラクトpET28aULL1GRまたはpET28aULL2GRを含む、発現ベクターを提供する。
【００３８】
さらに別の態様において、本開示は、本明細書に開示された発現ベクターを含む原核生物宿主細胞を提供する。
【００３９】
別の態様において、本開示は、Pseudomonas細胞またはEscherichia coli細胞から選択される、発現ベクターを含む原核生物宿主細胞を提供する。
【００４０】
一態様において、本開示は、本明細書に開示されるようなプロインスリンの発現を介して、インスリンおよびインスリン類似体を発現させる方法を提供する。
【００４１】
別の態様では、本発明は、好適な生産用培地で原核宿主細胞を発酵させることを含む、プロインスリンの発現を介してインスリンおよびインスリン類似体を発現させる方法を提供する。
【００４２】
さらに別の態様において、本発明は、プロインスリンの発現を介してインスリンおよびインスリン類似体を発現させる方法を提供し、生産用培地は、１００ｍｌあたり、１％酵母エキス、１％デキストロース、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、１．２５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．５％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび０．１％の微量金属溶液（塩酸中のＦｅＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＮａＭｏＯ４、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｕＳＯ４またはＨ３ＢＯ３）、カナマイシン（２０μｇ／ｍｌ）を含む。
【００４３】
さらに別の態様において、本開示は、本明細書に開示されたリーダーペプチドを使用することを含む、インスリンおよびインスリン類似体を製造する方法を提供する。
【００４４】
別の態様において、本開示は、インスリンもしくはインスリン類似体の前駆体またはポリペプチドに機能し得るように結合している、本明細書に開示されたリーダーペプチド配列を含む、プレ−プロインスリンポリペプチドを使用することを含む、インスリンおよびインスリン類似体を製造する方法を提供する。
【００４５】
さらに別の態様において、本開示は、本明細書に開示されたプロインスリンを使用することを含む、インスリンおよびインスリン類似体を製造する方法を提供する。
【００４６】
一態様において、本開示は、本明細書に開示されたリーダーペプチドを含む方法によって調製されたインスリンまたはインスリン類似体を提供する。
【００４７】
別の態様において、本開示は、インスリンまたはインスリン類似体の前駆体に機能し得るように結合している、本明細書に開示されたリーダーペプチド配列を含むプレ−プロインスリンポリペプチドを含む方法によって調製されたインスリンまたはインスリン類似体を提供する。
【００４８】
別の態様において、本開示は、本明細書に開示されているようなプロインスリンを含む方法によって調製されたインスリンまたはインスリン類似体を提供する。
【００４９】
本発明のこれらおよび他の特徴、態様および利点は、以下の説明および添付の特許請求の範囲を参照してよりよく理解されるであろう。本発明の他の態様は、以下の説明に記載され、一部は本明細書から明らかになるか、本発明を実施することにより学習されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５０】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の複数の態様をさらに例示するために含まれる。本明細書に提示された特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することにより、本開示をより一層理解できるであろう。
【図１】図１は、E. coli BL21 DE3におけるコンストラクトpET28aULL1INSおよびpET28aULL2INSを有するプレ−プロインスリンの発現解析である。
【図２】図２は、E. coli BL21 DE3におけるコンストラクトpET28aULL1LSPおよびpET28aULL2LSPを有するプレ−プロインスリンリスプロの発現解析である。
【図３】図３は、E. coli BL21 DE3におけるコンストラクトpET28aULL1GLRおよびpET28aULL2GLRを有するプレ−プロインスリングラルギンの発現解析である。
【図４】図４は、pET28aベクターマップをULL1INSとともに示したアノテーション図である。
【図５】図５は、pET28aベクターマップをULL2INSと共に示したアノテーション図である。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
添付の配列の簡単な説明
配列番号１は、リーダー配列（Ｒ１）である、ULL1のアミノ酸配列である。
配列番号２は、リーダー配列（Ｒ１）である、ULL2のアミノ酸配列である。
配列番号３は、インスリンのプロインスリン配列に融合した、配列番号１のアミノ酸配列である。
配列番号４は、インスリンのプロインスリン配列に融合した、配列番号２のアミノ酸配列である。
配列番号５は、インスリンリスプロのプロインスリン配列に融合した、配列番号１のアミノ酸配列である。
配列番号６は、インスリンリスプロのプロインスリン配列に融合した、配列番号２のアミノ酸配列である。
配列番号７は、インスリングラルギンのプロインスリン配列に融合した、配列番号１のアミノ酸配列である。
配列番号８は、インスリングラルギンのプロインスリン配列に融合した、配列番号２のアミノ酸配列である。
配列番号９は、配列番号１をコードする塩基配列である。
配列番号１０は、配列番号２をコードする塩基配列である。
配列番号１１は、配列番号３をコードする塩基配列である。
配列番号１２は、配列番号４をコードする塩基配列である。
配列番号１３は、配列番号５をコードする塩基配列である。
配列番号１４は、配列番号６をコードする塩基配列である。
配列番号１５は、配列番号７をコードする塩基配列である。
配列番号１６は、配列番号８をコードする塩基配列である。
【００５２】
以下、本開示の実施形態を詳細に説明する。当業者であれば、本開示が、具体的に記載されたもの以外の変形および改変の対象となることを認識するであろう。本開示は、そのようなすべての変形例および改変例を含むことが理解されるであろう。提供される詳細な開示は、実施形態に対する予想される変形例を限定することを意図したものではなく、むしろ、その意図は、添付の特許請求の範囲によって定義される、本開示の意図および範囲に包含されるあらゆる改変例、等価物および代替物をカバーすることである。以下の説明ならびにそこに記載された実施形態は、本開示の態様および原理の特定の実施形態の１つまたは複数の例の例示によって提供される。これらの例は、それらの原理および開示を説明する目的で提供され、限定的なものではない。
【００５３】
本明細書全体を通して、「一実施形態」または「ある実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記載された特定の機能、構造または特徴が、少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。したがって、本明細書中の様々な箇所での「一実施形態において」または「ある実施形態において」という表現の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を参照しているわけではない。さらに、特定の機能、構造または特徴が、１つ以上の実施形態において任意の適切な方法で組み合わせてもよい。
【００５４】
本明細書における何らかの実施形態に関して提供されるありとあらゆる例または例示的な言い回し（例えば、「などの」）の使用は、本発明をより良く浮かび上がらせることを意図したものにすぎず、別の方法で権利が請求される本発明の範囲に制限を与えるものではない。本明細書のいかなる言い回しも、本発明の実施に不可欠な請求項に記載のない要素を示すものと解釈されるべきではない。
【００５５】
本明細書の説明およびそれに続く特許請求の範囲全体で使用する場合、「a」、「an」および「the」の意味は、文脈から明らかにそうでないことが示されるのでない限り、複数についての言及を含む。また、本明細書の説明で使用する場合、「in」の意味は、文脈から明らかにそうでないことが示されるのでない限り、「in」および「on」を含む。
【００５６】
文脈が別段のことを要求しない限り、以下の明細書全体を通して、「含む（comprise）」という語およびその変化形、例えば「comprises」および「comprising」は、「含むが、これに限定されるものではない」のようなオープンで包括的な意味で解釈されるべきである。
【００５７】
援用された文献における用語の定義または使用が、本明細書に記載されているその用語の定義と整合性がとれないまたは矛盾する場合、本明細書に記載されているその用語の定義が用いられ、援用文献におけるその用語の定義は用いられない。
【００５８】
本明細書で用いられる様々な用語を以下に示す。請求項で用いられる用語が以下に定義されていない場合、その用語は、出願時の印刷された刊行物や発行された特許に反映されているように当業者がその用語に与えた最も広い定義が与えられるべきである。
【００５９】
本明細書で使用する場合、「ペプチド」という用語は、長さ、翻訳後修飾または機能にかかわらず、ペプチド結合で結合しているアミノ酸配列を含む分子をいう。
【００６０】
本明細書で使用する場合、「ジペプチド」という用語は、ペプチド結合で結合している２個のアミノ酸のアミノ酸配列を含む分子をいう。
【００６１】
本明細書で使用する場合、「ポリペプチド」という用語は、天然に存在するか、組換えで、化学的にまたは他の手段によって生産または改変されたものをいい、本質的にネイティブのタンパク質と同じようにして翻訳後に処理され得るタンパク質の三次元構造を想定することできる。
【００６２】
「ペプチド」、「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、本明細書では同義に用いられる。
【００６３】
本明細書で使用する場合、「インスリン」という用語は、多くの重要な細胞プロセスにおいて重要な役割を果たす、５１アミノ酸残基のポリペプチド（５８０８ダルトン）であるホルモンをいう。それは、細胞の成長および分化の刺激に関与している。また、単量体形態のホルモンが二量体のチロシンキナーゼ型の膜受容体に結合することで開始されるシグナル伝達経路を介して、自らの調節機能（例えば、細胞内へのグルコースの取り込み）を発揮する。ヒトインスリンの成熟型は、Ａ鎖（GlyA1-AsnA21）とＢ鎖（PheB1-ThrB30）をなす５１個のアミノ酸で構成され、総分子量は５８０８Ｄａである。この分子は、２つの鎖間ジスルフィド結合（A20-B19、A7-B7）と１つの鎖内ジスルフィド結合（A6-A11）によって安定している。本発明のインスリンは、天然のもの、合成によって提供されるものまたは遺伝子操作（例えば、組換え）によって提供されるものを含み、本発明の様々な実施形態では、インスリンはヒトインスリンであってもよい。
【００６４】
本明細書で使用する場合、「インスリン類似体」という用語は、より迅速に作用する形態またはより均一に作用する形態のいずれかのインスリンである、改変された形態のインスリンをいう。そのような類似体の非限定的な例として、インスリンリスプロ、インスリンデグルデク、インスリンアスパルトおよびインスリングラルギンがあげられる。インスリン類似体「リスプロ」は、ヒトインスリンと一次構造が同一であり、Ｂ２８位のリジンとＢ２９位のプロリンとが入れ替わっている点がヒトインスリンとは異なる。これは、短時間作用型のインスリン単量体類似体である。インスリン類似体「グラルギン」は、Ａ２１位でアスパラギンがグリシンに置換され、Ｂ鎖のＣ末端にアルギニン残基が２個追加されている点でヒトインスリンとは異なる。インスリングルギン溶液を製剤化し、ｐＨ４．０で注射する。これらの改変によって、等電点が大きくなって中性のｐＨに近づき、生理学的条件下での溶解度が低下し、グラルギンが注射部位で沈殿するため、吸収が遅くなる。グラルギンは２０〜２４時間持続する長時間作用型の類似体である。
【００６５】
本明細書で使用する場合、「プレ−プロインスリン」という用語は、式「Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３」で表される順序で結合している、リーダーペプチド（Ｒ１）、インスリンのＢ鎖（Ｘ１）、Ｃペプチドすなわちジペプチド（Ｘ２）およびインスリンのＡ鎖（Ｘ３）を含む一本鎖ポリペプチド分子をいう。
【００６６】
「プレ−プロインスリン」または「プレプロインスリン」という用語は、本明細書では同義に用いられる。
【００６７】
本明細書で使用する場合、「プロインスリン」という用語は、プレ−プロインスリンからリーダー配列が切断された後にできる一本鎖ポリペプチド分子をいい、式「Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３」で表され、インスリンのＡ鎖（Ｘ３）とＢ鎖（Ｘ１）を結合させるジペプチドすなわち「Ｃ−ペプチド」（Ｘ２）を含む。
【００６８】
本明細書で使用する場合、「核酸配列」またはポリヌクレオチド配列という用語は、天然に存在する塩基、糖および糖間（バックボーン）結合からなるヌクレオシドまたはヌクレオチド単量体の配列をいう。この用語には、天然に存在しないモノマーまたはその一部を含む修飾された配列または置換された配列も含まれる。本発明の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であってもよく、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含む天然に存在する塩基を含んでいてもよい。本明細書にて提供される方法に従って使用できるインスリンをコードする核酸配列は、プロインスリンおよびプレ−プロインスリンを含むインスリンポリペプチドまたはその前駆体をコードするどのような核酸配列であってもよい。
【００６９】
本明細書で使用する場合、「機能し得るように結合して」という表現は、本明細書ではリーダー配列Ｒ１である制御配列が、コード配列を発現させてポリペプチドにするように、制御配列がポリヌクレオチド配列のコード配列に対して適切な位置に配置された構成をいう。
【００７０】
本明細書で使用する場合、「コード配列」という用語は、適切な制御配列の制御下におかれたときにポリペプチドに翻訳されるｍＲＮＡに転写されるポリヌクレオチド配列をいい、制御配列は、本明細書ではリーダー配列Ｒ１である。コード配列の境界は、一般に、ｍＲＮＡの５’末端のオープンリーディングフレームの先頭に位置する開始コドンと、そのｍＲＮＡのオープンリーディングフレームの３’末端に位置する終止コドンとによって決定される。コード配列としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、半合成ヌクレオチド、合成ヌクレオチド、組換えヌクレオチドがあげられるが、これらに限定されるものではない。コード配列は、例えば、式Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３のプロインスリンをコードする塩基配列である。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「pET28aULL1INS」という用語は、ベクターpET28aと、配列番号９の塩基配列と、本明細書にて先に定義したような、組換えヒトインスリンに対応するＸ１−Ｘ２−Ｘ３をコードする塩基配列とを使用して、プレ−プロインスリンをコードするのに使用されるプラスミドをいう。
【００７２】
本明細書で使用する場合、「pET28aULL1LSP」という用語は、ベクターpET28aと、配列番号９の塩基配列と、本明細書にて先に定義したような、インスリンリスプロに対応するＸ１−Ｘ２−Ｘ３をコードする塩基配列とを使用して、プレ−プロインスリンをコードするのに使用されるプラスミドをいう。
【００７３】
本明細書で使用する場合、「pET28aULL1GR」という用語は、ベクターpET28aと、配列番号９の塩基配列と、本明細書にて先に定義したようなインスリングラルギンに対応するＸ１−Ｘ２−Ｘ３をコードする塩基配列とを使用して、プレ−プロインスリンをコードするのに使用されるプラスミドをいう。
【００７４】
本明細書で使用する場合、「pET28aULL2INS」という用語は、ベクターpET28aと、配列番号１０の塩基配列と、本明細書にて先に定義したような、組み換えヒトインスリンに対応するＸ１−Ｘ２−Ｘ３をコードする塩基配列とを使用して、プレ−プロインスリンをコードするのに使用されるプラスミドをいう。
【００７５】
本明細書で使用する場合、「pET28aULL2LSP」という用語は、ベクターpET28aと、配列番号１０の塩基配列と、本明細書にて先に定義したような、インスリンリスプロに対応するＸ１−Ｘ２−Ｘ３をコードする塩基配列とを使用して、プレ−プロインスリンをコードするのに使用されるプラスミドをいう。本明細書で使用する場合、「pET28aULL2GR」という用語は、ベクターpET28aと、配列番号１０の塩基配列と、本明細書にて先に定義したような、インスリングラルギンに対応するＸ１−Ｘ２−Ｘ３をコードする塩基配列とを使用して、プレ−プロインスリンをコードするのに使用されるプラスミドをいう。
【００７６】
本明細書で使用する場合、「リーダー配列」または「タグ」という用語は、タンパク質の産生を最大化する、タンパク質の前駆体形態のアミノ末端に位置するペプチド配列をいう。
【００７７】
本発明は、配列番号１および配列番号２に記載のアミノ酸配列と少なくとも８０％の相同性を有する配列を提供する。配列番号１および配列番号２に記載のアミノ酸配列は、それぞれULL1およびULL2とも呼ばれる。
【００７８】
本発明は、インスリン、より具体的にはヒトインスリンおよびインスリン類似体を製造するための方法を提供する。また、本発明は、発現を高めるために本方法で使用されるペプチドに関する。
【００７９】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリン配列ならびに、プロインスリンを介してプレ−プロインスリン配列からインスリンおよびインスリン類似体を調製するための方法が提供され、ここで、式１の前記プレ−プロインスリンおよび式２の前記プロインスリンは、以下の通りである。
式１：Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３および式２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３、
式中、Ｒ１は、配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチドであるか、配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドである。
Ｘ１は、インスリンおよびインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、
Ｘ２は、ＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫを含むジペプチドであり、
Ｘ３は、インスリンおよびインスリン類似体の「Ａ」鎖である。
【００８０】
本発明の一実施形態において、ペプチドは、配列番号１に記載のアミノ酸配列と配列番号２に記載のアミノ酸配列とを有する。配列番号１および配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチドは、リーダー配列またはタグとも呼ばれる。本発明に開示された配列番号１および配列番号２の新規な配列は、細菌宿主細胞における低分子量タンパク質などのタンパク質の発現を増強するため、目的とするタンパク質の高収量化につながる。周知のように、細菌宿主細胞では、低分子量タンパク質を発現させるのは、メッセンジャーＲＮＡの不安定さと、タンパク質の急速な分解のために困難である。また、基礎となるコード配列の翻訳が非効率であることも、低分子量タンパク質の発現が減ることにつながる。本発明に開示された新規な配列は、当技術分野で当たり前になっているこれらの欠点を克服しようとする試みである。
【００８１】
本発明の別の実施形態では、配列番号１または配列番号２に記載の１から１５までのアミノ酸の配列に対して少なくとも８０％の相同性を有するペプチドが提供される。
【００８２】
本発明の一実施形態において、配列番号１または配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するリーダー配列は、組換えタンパク質の発現を高めるのに重要な要因を考慮して設計された。細菌宿主細胞における組換えタンパク質の発現に影響を与える要因としては、細菌宿主細胞のタンパク質の大きさ、コードＤＮＡ配列のＧＣ含有量、ｍＲＮＡの二次構造、翻訳開始率、コドン出現頻度などがあげられる。考慮の対象とした要因は、細菌宿主細胞のコードＤＮＡ配列のＧＣ含有量、ｍＲＮＡの二次構造、翻訳開始率およびコドン出現頻度であった。
【００８３】
本発明の一実施形態において、宿主細胞は、好ましくはE. coli、より好ましくはE. coli Gold BL 21 DE3であった。
【００８４】
本発明の一実施形態では、配列番号１のペプチドをコードする配列番号９に記載の塩基配列を有する、プロインスリンをコードする遺伝子を設計し、コドンを最適化し、化学合成し、Genscript（登録商標）によってpUC57にクローニングして、pUC57ULL1INSを調製した。制限酵素NdeIおよびBamH1を使用して、pUC57ULL1INSプラスミドとpET28aベクターを切断した。遺伝子断片であるULL1INSをゲル溶出キット（Qiagen（登録商標））で精製し、pET28aベクターにライゲーションして、pET28aULL1INSを調製した。さらに、増殖宿主であるE. coli TOP10細胞に形質転換し、ライゲーション後のpET28aULL1INSプラスミドを増やした。このようなプラスミドを単離し、E. coli Gold BL 21 DE3細胞に形質転換し、タンパク質の発現を確認した。
【００８５】
本発明の別の実施形態では、配列番号２のペプチドをコードする配列番号１０に記載の塩基配列を含む、プロインスリンをコードする遺伝子を設計し、コドンを最適化し、化学合成し、Genscript（登録商標）によってpUC57にクローニングして、pUC57ULL2INSを調製した。制限酵素NcoIおよびBamH1を使用して、pUC57ULL2INSプラスミドとpET28aベクターを切断した。遺伝子断片であるULL2INSをゲル溶出キット（Qiagen（登録商標））で精製し、pET28aベクターにライゲーションして、pET28aULL2INSを調製した。さらに、増殖宿主であるE. coli TOP10細胞に形質転換し、ライゲーション後のpET28aULL2INSプラスミドを増やした。このようなプラスミドを単離し、E. coli Gold BL 21 DE3細胞に形質転換し、タンパク質の発現を確認した。
【００８６】
本発明のさらに別の実施形態では、インスリングラルギンおよびインスリンリスプロなどのインスリン類似体を調製するための遺伝子コンストラクトが提供される。
【００８７】
本発明で使用されるインスリン断片は、長さが１５９ｂｐであり、小さなＣ鎖（２アミノ酸）を持つインスリンタンパク質の塩基配列に対応する。
【００８８】
本発明の一態様では、プレ−プロインスリン配列からインスリンを調製するための方法が提供される。この方法は、発酵、細胞溶解、封入体の調製、封入体の可溶化、リーダーペプチドを切断してプロインスリンを得ること、陰イオン交換クロマトグラフィー、リフォールディング、疎水性相互作用クロマトグラフィー、トリプシンによる酵素的切断、陰イオン／陽イオン交換クロマトグラフィー、カルボキシペプチダーゼによる酵素的切断、逆相クロマトグラフィーの工程を含む。
【００８９】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は発酵工程を含み、この発酵工程は、pET28aULL1INSまたはpET28aULL2INSで形質転換したE. coli細胞を生産用培地で増殖させ、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）で誘導し、発酵工程の最後に、得られた細胞塊を回収することを含む。
【００９０】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は、細胞溶解工程を含む。プレ−プロインスリンの封入体を含有する細胞を、トリス−ＮａＣｌ緩衝液に再懸濁し、Ｍｉｎｉ−ＤｅＢＥＥホモジナイザーを用いて高圧で溶解した。
【００９１】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は、封入体を調製する工程を含む。プレ−プロインスリンが豊富な封入体を、β−メルカプトエタノールなどの還元剤を含有するトリス−ＮａＣｌ緩衝液で洗浄した。
【００９２】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は、封入体を可溶化する工程を含む。６Ｍの塩酸グアニジンを塩基性緩衝液に入れた溶液に封入体を溶解した。溶解された封入体の懸濁液に、亜硫酸ナトリウムおよびテトラチオン酸ナトリウムを添加することによって、亜硫酸分解処理をほどこした。
【００９３】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は、リーダーペプチドを切断してプロインスリンを得る工程を含む。可溶化された封入体の懸濁液のｐＨを１〜２に調節した。この溶液に臭化シアノゲンを添加し、８℃で一晩インキュベートした。その後、過剰量の精製水を加えてタンパク質を沈殿させた。その上で、遠心分離後に得られたペレットをグリシン緩衝液で洗浄し、８Ｍの尿素に溶解させる。
【００９４】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程を含む。８Ｍの尿素に溶解したタンパク質に対して陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。陰イオン交換樹脂にタンパク質をロードし、塩化ナトリウムを含有する８Ｍの尿素緩衝液で溶出した。プロインスリンが濃縮された形態で得られた。
【００９５】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は、リフォールディングの工程を含む。濃縮された形態で得られたプロインスリンを、グリシン緩衝液で希釈することによってリフォールディングさせた。溶液のｐＨを９．５に維持し、タンパク質濃度については０．５〜１ｍｇ／ｍｌの範囲であった。リフォールディング反応を２５℃で２〜３時間進行させた。ｐＨが約４．０になるように酢酸を添加して、反応を停止させた。
【００９６】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）の工程を含む。リフォールディングした溶液に対して疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。塩化ナトリウムを添加することで溶液の導電性を高めた上で、疎水性相互作用樹脂にタンパク質をロードした。グリシン緩衝液中の塩化ナトリウムの勾配を増加させながら、プロインスリンを溶出した。
【００９７】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は、トリプシンによる酵素的切断の工程を含む。ＨＩＣから溶出したタンパク質を、タンパク質とトリプシンとの比１：５０００で消化した。好ましくは、トリプシンは、粉末状または固定化された形態である。固定化トリプシンを用いる場合には、トリプシンを含むビーズを濾過により分離して反応を停止させる。粉末状のトリプシンを使用する場合は、酢酸を添加して反応を停止させる。
【００９８】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は、陰イオン／陽イオン交換クロマトグラフィーの工程を含む。切断のために使用されるトリプシンの形態（粉末または固定化）に応じて、タンパク質に対して、陽イオン交換クロマトグラフィーまたは陰イオン交換クロマトグラフィーのいずれかを実施することができる。好ましくは、塩化ナトリウムの勾配を増加させることによって、タンパク質を溶出する。
【００９９】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は、カルボキシペプチダーゼによる酵素的切断の工程を含む。交換クロマトグラフィーで溶出したタンパク質をカルボキシペプチダーゼで消化し、Ｂ鎖からＣ末端アルギニンを除去する。
【０１００】
本発明の一実施形態では、プレ−プロインスリンからインスリンを調製するための方法は、逆相クロマトグラフィーの工程を含む。消化されたサンプルから、逆相クロマトグラフィーによって活性インスリンを精製する。このタンパク質を、最終的な結合が樹脂１０〜１５ｍｇ／ｍｌの範囲になるようにロードする。好ましくは、アセトニトリルの勾配を大きくしながらインスリンを溶出する。
【０１０１】
以上、本開示の様々な実施形態を説明したが、本開示のさらに別の実施形態を、その基本的な範囲から逸脱することなく編み出すことができる。本発明の範囲は、後述する特許請求の範囲によって決定される。本発明は、当業者が利用可能な情報および知識と組み合わせたときに当業者が本発明を製造および使用できるようにするために含まれる、本明細書に記載の実施形態、バージョンまたは例に限定されるものではない。
【実施例】
【０１０２】
以下に示す実施例は、厳密には例示だけを目的とするものであり、いかなる方法でも本発明を限定するものではない。開示された実施形態の様々な改変ならびに、前記発明の別の実施形態は、当業者に明らかになるであろう。したがって、そのような改変は、ここで例示した本発明の真の意図または範囲から逸脱することなく行うことができると考えられる。
実施例１：プラスミドpET28aULL1INSの構築
【０１０３】
ペプチドULL1INSをコードする配列番号９の塩基配列と一緒にプロインスリンをコードする遺伝子を設計し、コドンを最適化して化学合成し、Genescript（登録商標）によってpUC57にクローニングして、pUC57ULL1INSを調製した。遺伝子断片をpET28aベクターにクローニングした。プラスミド１０μｌ、NdeI  １μｌ、BamHI  １μｌ、１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液２μｌおよび滅菌水６μｌからなる反応混合物をセットアップすることによって、pUC57ULL1INSプラスミドを制限酵素で切断した。制限酵素NdeIおよびBamHIでpET28aベクターを切断し、粘着末端を形成した。反応混合物には、１０μｌのpET28aベクター、１μｌのNdeI、１μｌのBamHI、２μｌの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液および６μｌの滅菌水が含まれていた。両方の反応液を３７℃で２時間インキュベートした。遺伝子断片をゲル溶出キット（Qiagen（登録商標））で精製し、pET28aベクターにライゲーションした。さらに、増殖宿主であるE. coli TOP10細胞に形質転換し、ライゲーション後のプラスミドを増殖させた。このようなプラスミドを単離し、E. coli Gold BL 21 DE3細胞に形質転換し、タンパク質の発現を確認した。
実施例２：プラスミドpET28aULL2INSの構築
【０１０４】
ペプチドULL2INSをコードする配列番号１０の塩基配列と一緒にプロインスリンをコードする遺伝子を設計し、コドンを最適化して化学合成し、Genscript（登録商標）によってpUC57にクローニングして、pUC57ULL2INSを調製した。遺伝子断片をpET28aベクターにクローニングした。１０μｌのプラスミド、１μｌのNcoI、１μｌのBamHI、２μｌの１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液および６μｌの滅菌水を含む反応混合物をセットアップすることによって、pUC57ULL2INSプラスミドを制限酵素で切断した。制限酵素NcoIおよびBamHIでpET28aベクターを切断し、粘着末端を形成した。反応混合物には、pET28aベクター１０μｌ、NcoI  １μｌ、BamHI  １μｌ、１０Ｘ  ＮＥＢ緩衝液２μｌおよび滅菌水６μｌが含まれていた。両方の反応液を３７℃で２時間インキュベートした。遺伝子断片をゲル溶出キット（Qiagen（登録商標））で精製し、pET28aベクターにライゲーションした。さらに、増殖宿主であるE. coli TOP10細胞に形質転換し、ライゲーション後のプラスミドを増殖させた。このようなプラスミドを単離し、E. coli Gold BL 21 DE3細胞に形質転換し、タンパク質の発現を確認した。
実施例３：プラスミドpET28aULL1LSPの構築
【０１０５】
コンストラクトpET28aULL1LSPを得るために、ＰＣＲを用いてプラスミドpET28aULL1INSに部位特異的変異導入を行った。部位特異的変異導入は、Ｂ鎖のＢ２８位とＢ２９位にＰＫからＫＰへの変化を引き起こすであろう。以下のペアの変異導入プライマーを使用した。
フォワード：5’GTG GTT TCT TTT ATA CCA AAC CGA CCA AAC GTG GCA TTG T 3'
リバース：5’ACA ATG CCA CGT TTG GTC GGT TTG GTA TAA AAG AAA CCA C 3'
【０１０６】
ＰＣＲ反応混合物は、３００μＭのｄＮＴＰミックス、１Ｘ  ＰＦｕバッファー、１０ｐｍの各プライマー、１μｌのテンプレートプラスミドおよび４１μｌの滅菌水で構成されていた。使用したＰＣＲ条件は、９４℃で８分、９４℃で４０秒、５５℃で４０秒、６８℃で３分（２０サイクル）、６８℃で１０分であった。部位特異的変異導入産物をDpnIで消化した後、増殖宿主であるE. coli TOP10細胞に形質転換して増殖させた。Fermentas（登録商標）ミニプレップキットを用いてプラスミドを単離した後、E. coli Gold BL 21 DE3細胞に形質転換してタンパク質を発現させた。
実施例４：プラスミドpET28aULL2LSPの構築
【０１０７】
コンストラクトpET28aULL2LSPを得るために、ＰＣＲを用いてプラスミドpET28aULL2INSに部位特異的変異導入を行った。部位特異的変異導入は、Ｂ鎖のＢ２８位とＢ２９位にＰＫからＫＰへの変化を引き起こすであろう。以下のペアの変異導入プライマーを使用した。
フォワード：5’GTG GTT TCT TTT ATA CCA AAC CGA CCA AAC GTG GCA TTG T 3'
リバース：5’ACA ATG CCA CGT TTG GTC GGT TTG GTA TAA AAG AAA CCA C 3'
【０１０８】
ＰＣＲ反応混合物は、３００μＭのｄＮＴＰミックス、１Ｘ  ＰＦｕバッファー、１０ｐｍの各プライマー、１μｌのテンプレートプラスミドおよび４１μｌの滅菌水で構成されていた。ＰＣＲプログラムを、９４℃で８分、９４℃で４０秒、５５℃で４０秒、６８℃で３分（２０サイクル）、最終伸張では６８℃で１０分に維持した。部位特異的変異導入産物をDpnIで消化した後、増殖宿主であるE. coli TOP10細胞に形質転換して増殖させた。Fermentas（登録商標）ミニプレップキットを用いてプラスミドを単離した後、E. coli Gold BL 21 DE3細胞に形質転換してタンパク質を発現させた。
実施例５：プラスミドpET28aULL1GRの構築
【０１０９】
コンストラクトpET28aULL1GRを得るために、プラスミドpET28aULL1INSに部位特異的変異導入を行った。部位特異的変異導入プライマーは、Ｂ鎖の末端に追加のＡｒｇ（Ｒ）を導入し、Ａ鎖のアスパラギン（Ｎ）をグリシン（Ｇ）に置換するであろう。これによって、インスリン配列がグラルギン配列に変換されるであろう。これを、２段階の部位特異的変異導入ＰＣＲで実施した。最初のＳＤＭ  ＰＣＲでは、以下のプライマーを使用した。
フォワード：5’AAACCGACCAAACGTCGTGGCATTGTGGAACA 3’
リバース：5’ TGTTCCACAATGCCACGACGTTTGGTCGGTTT 3’
【０１１０】
ＰＣＲ反応混合物は、３００μＭのｄＮＴＰミックス、１Ｘ  ＰＦｕバッファー、１０ｐｍの各プライマー、１μｌのテンプレートプラスミドおよび４１μｌの滅菌水で構成されていた。増幅に用いたサーマルサイクラーの条件は、９４℃で８分、９４℃で４０秒、５５℃で４０秒、６８℃で３分（２０サイクル）、６８℃で１０分であった。部位特異的変異導入産物をDpnIで消化した後、増殖宿主であるE. coli TOP10細胞に形質転換して増殖させた。Fermentas（登録商標）ミニプレップキットを用いて、これらのコロニーからプラスミドを単離した。このプラスミドをテンプレートとして２回目のＳＤＭ  ＰＣＲに使用した。
さらに、以下の変異導入プライマーのペアを用いて、２番目のＳＤＭ  ＰＣＲを実施した。
フォワード：5’ CTGGAAAACTATTGCGGCTAATAAGGATCCGAA 3’
リバース：5’ TTCGGATCCTTATTAGCCGCAATAGTTTTCCAG 3’
【０１１１】
ＰＣＲ反応混合物は、３００μＭのｄＮＴＰミックス、１Ｘ  ＰＦｕバッファー、１０ｐｍの各プライマー、１μｌのテンプレートプラスミドおよび４１μｌの滅菌水で構成されていた。ＰＣＲプログラムを、９４℃で８分、９４℃で４０秒、５５℃で４０秒、６８℃で３分（２０サイクル）、６８℃で１０分に維持した。部位特異的変異導入産物をDpnIで消化した後、増殖宿主であるE. coli TOP10細胞に形質転換して増殖させた。Fermentas（登録商標）ミニプレップキットを用いてプラスミドを単離した後、E. coli Gold BL 21 DE3細胞に形質転換してタンパク質を発現させた。
実施例６：プラスミドpET28aULL2GRの構築
【０１１２】
コンストラクトpET28aULL2GRを得るために、プラスミドpET28aULL2INSに部位特異的変異導入を行った。部位特異的変異導入プライマーは、Ｂ鎖の末端に追加のＡｒｇ（Ｒ）を導入し、Ａ鎖のアスパラギン（Ｎ）をグリシン（Ｇ）に置換するであろう。これによって、インスリン配列がグラルギン配列に変換されるであろう。これを、２段階の部位特異的変異導入ＰＣＲで実施した。最初のＳＤＭ  ＰＣＲでは、以下のプライマーを使用した。
フォワード：5’AAACCGACCAAACGTCGTGGCATTGTGGAACA 3’
リバース：5’ TGTTCCACAATGCCACGACGTTTGGTCGGTTT 3’
【０１１３】
ＰＣＲ反応混合物は、３００μＭのｄＮＴＰミックス、１Ｘ  ＰＦｕバッファー、１０ｐｍの各プライマー、１μｌのテンプレートプラスミドおよび４１μｌの滅菌水で構成されていた。ＰＣＲプログラムは、９４℃で８分、９４℃で４０秒、５５℃で４０秒、６８℃で３分（２０サイクル）、最終伸張では６８℃で１０分であった。部位特異的変異導入産物をDpnIで消化した後、増殖宿主であるE. coli TOP10細胞に形質転換して増殖させた。Fermentas（登録商標）ミニプレップキットを用いて、これらのコロニーからプラスミドを単離した。このプラスミドをテンプレートとして２回目のＳＤＭ  ＰＣＲに使用した。
さらに、以下の変異導入プライマーのペアを用いて、２工程目のＳＤＭ  ＰＣＲを実施した。
フォワード：5’ CTGGAAAACTATTGCGGCTAATAAGGATCCGAA 3’
リバース：5’ TTCGGATCCTTATTAGCCGCAATAGTTTTCCAG 3’
【０１１４】
ＰＣＲ反応混合物は、３００μＭのｄＮＴＰミックス、１Ｘ  ＰＦｕバッファー、１０ｐｍの各プライマー、１μｌのテンプレートプラスミドおよび４１μｌの滅菌水で構成されていた。増幅に用いたＰＣＲプログラムは、９４℃で８分、９４℃で４０秒、５５℃で４０秒、６８℃で３分（２０サイクル）、６８℃で１０分であった。部位特異的変異導入産物をDpnIで消化した後、増殖宿主であるE. coli TOP10細胞に形質転換して増殖させた。Fermentasミニプレップキットを用いてプラスミドを単離した後、E. coli Gold BL 21 DE3細胞に形質転換してタンパク質を発現させた。
コンストラクトの配列決定：この作業で調製したすべてのコンストラクトを配列決定によって確認した。
実施例７：コンストラクトpET28aULL1INSを用いたインスリンの発現解析
【０１１５】
ベクターpET28aULL1INSを含有するE. coli細胞を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する５０ｍｌのHiveg Luriaブロスにて、３７℃、１６０ｒｐｍで一晩培養した。次に、この２％培養物を、１％酵母エキス、１％デキストロース、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、１．２５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．５％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび０．１％の微量金属溶液（塩酸中のＦｅＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＮａＭｏＯ４、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｕＳＯ４またはＨ３ＢＯ３）を含有する１５０ｍｌの生産用培地に移した。カナマイシンを最終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加した。培養物を３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。細胞密度が１〜１．２（ＯＤ６００ｎｍ）に達した時点で、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて培養物を誘導した。この培養物をさらに４時間インキュベートした。プレ−プロインスリンの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により解析した。プレ−プロインスリンの発現は、全細胞タンパク質の約２５％であった。
実施例８：コンストラクトpET28aULL2INSを用いたインスリンの発現解析
【０１１６】
ベクターpET28aULL2INSを含有するE. coli細胞を、２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する５０ｍｌのHiveg Luriaブロスにて、３７℃、１６０ｒｐｍで一晩培養した。次に、この２％培養物を、１％酵母エキス、１％デキストロース、０．３％ＫＨ２ＰＯ４、１．２５％Ｋ２ＨＰＯ４、０．５％（ＮＨ４）２ＳＯ４、０．０５％ＮａＣｌ、０．１％ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏおよび０．１％の微量金属溶液（塩酸中のＦｅＳＯ４、ＺｎＳＯ４、ＣｏＣｌ２、ＮａＭｏＯ４、ＣａＣｌ２、ＭｎＣｌ２、ＣｕＳＯ４またはＨ３ＢＯ３）を含有する１５０ｍｌの生産用培地に移した。カナマイシンを最終濃度２０μｇ／ｍｌになるように添加した。培養物を３７℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。細胞密度が１〜１．２（ＯＤ６００ｎｍ）に達した時点で、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて培養物を誘導した。この培養物をさらに４時間インキュベートした。プレ−プロインスリンの発現をＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により解析した。プレ−プロインスリンの発現は、全細胞タンパク質の約４０％であった。
実施例９：コンストラクトpET28aULL1INSを用いたヒトインスリンの調製
【０１１７】
発酵工程−pET28aULL1INSで形質転換したE. coli細胞を生産用培地で増殖させ、ＩＰＴＧで誘導した。発酵工程の最後に、細胞量を求める。
【０１１８】
細胞溶解−プレ−プロインスリンの封入体を含有する細胞をトリス−ＮａＣｌ緩衝液に再懸濁し、Ｍｉｎｉ−ＤｅＢＥＥホモジナイザーを用いて高圧で溶解した。
【０１１９】
封入体の調製−プレ−プロインスリンが豊富な封入体を、β−メルカプトエタノールなどの還元剤を含有するトリス−ＮａＣｌ緩衝液で洗浄した。
【０１２０】
封入体の可溶化−６Ｍグアニジン塩酸塩を塩基性緩衝液に入れた溶液に封入体を溶解した。溶解された封入体の懸濁液に、亜硫酸ナトリウムおよびテトラチオン酸ナトリウムを添加することによって、亜硫酸分解処理をほどこした。
【０１２１】
リーダーペプチドを切断してプロインスリンを得る−可溶化された封入体の懸濁液のｐＨを１〜２に調節した。この溶液に臭化シアノゲンを添加し、８℃で一晩インキュベートした。その後、過剰の精製水を加えてタンパク質を沈殿させた。その上で、遠心分離後に得られたペレットをグリシン緩衝液で洗浄し、８Ｍの尿素に溶解させる。
【０１２２】
陰イオン交換クロマトグラフィー−８Ｍの尿素に溶解させたタンパク質に対して、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。陰イオン交換樹脂にタンパク質をロードし、塩化ナトリウムを含有する８Ｍの尿素緩衝液で溶出した。プロインスリンが濃縮された形態で得られた。
【０１２３】
リフォールディング−次いで、プロインスリンをグリシン緩衝液で希釈することにより、プロインスリンのリフォールディングを行った。溶液のｐＨを９．５に維持し、タンパク質濃度については０．５〜１ｍｇ／ｍｌの範囲であった。リフォールディング反応を２５℃で２〜３時間行った。ｐＨが約４．０になるように酢酸を添加して、反応を停止させた。
【０１２４】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）−リフォールディングした溶液に対して疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。塩化ナトリウムを添加することで溶液の導電性を高めた上で、疎水性相互作用樹脂にタンパク質をロードした。グリシン緩衝液中の塩化ナトリウムの勾配を増加させながら、プロインスリンを溶出した。
【０１２５】
トリプシンによる酵素的切断−ＨＩＣから溶出したタンパク質を、タンパク質とトリプシンとの比１：８０００で４℃にて消化した。反応をＨＰＬＣでモニターし、完了反応時に、固定化トリプシンを濾過により分離して反応を停止させた。
【０１２６】
陰イオン交換クロマトグラフィー−消化されたタンパク質を、陰イオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した。陰イオン交換クロマトグラフィーにタンパク質をロードし、塩化ナトリウムを含有する緩衝液で溶出した。塩化ナトリウムの勾配を増加させることによって、インスリンを溶出した。
【０１２７】
カルボキシペプチダーゼによる酵素的切断−上記の工程で得られたタンパク質をカルボキシペプチダーゼで消化し、Ｂ鎖からＣ末端のアルギニンを除去する。
【０１２８】
逆相クロマトグラフィー−消化されたサンプルから、逆相クロマトグラフィーによって活性インスリンを精製する。このタンパク質を、最終的な結合が樹脂１０〜１５ｍｇ／ｍｌの範囲になるようにロードする。アセトニトリルの勾配を大きくしながらインスリンを溶出する。
実施例１０：コンストラクトpET28aULL2GLRを用いたヒトインスリンの調製
【０１２９】
本実施例では、遺伝子コンストラクトpET28aULL2GLRからより多くのヒトインスリンを製造するための本発明の有用性を示す。コンストラクトpET28aULL2INSを用いてヒトインスリングラルギンを調製するために従った工程は、以下に記載した通りである。
【０１３０】
発酵工程−pET28aULL1INSで形質転換したE. coli細胞を生産用培地で増殖させ、ＩＰＴＧで誘導した。発酵工程の最後に、細胞量を求める。
【０１３１】
細胞溶解−プレ−プロインスリンの封入体を含有する細胞をトリス−ＮａＣｌ緩衝液に再懸濁し、Ｍｉｎｉ−ＤｅＢＥＥホモジナイザーを用いて高圧で溶解した。
【０１３２】
封入体の調製−プレ−プロインスリンが豊富な封入体を、β−メルカプトエタノールなどの還元剤を含有するトリス−ＮａＣｌ緩衝液で洗浄した。
【０１３３】
封入体の可溶化−６Ｍグアニジン塩酸塩を塩基性緩衝液に入れた溶液に封入体を溶解した。溶解された封入体の懸濁液に、亜硫酸ナトリウムおよびテトラチオン酸ナトリウムを添加することによって、亜硫酸分解処理をほどこした。
【０１３４】
リーダーペプチドを切断してプロインスリンを得る−可溶化された封入体の懸濁液のｐＨを１〜２に調節した。この溶液に臭化シアノゲンを添加し、８℃で一晩インキュベートした。その後、過剰の精製水を加えてタンパク質を沈殿させた。その上で、遠心分離後に得られたペレットをグリシン緩衝液で洗浄し、８Ｍの尿素に溶解させる。
【０１３５】
陰イオン交換クロマトグラフィー−８Ｍの尿素に溶解させたタンパク質に対して、陰イオン交換クロマトグラフィーを実施した。陰イオン交換樹脂にタンパク質をロードし、塩化ナトリウムを含有する８Ｍの尿素緩衝液で溶出した。プロインスリンが濃縮された形態で得られた。
【０１３６】
リフォールディング−次いで、プロインスリンをグリシン緩衝液で希釈することにより、プロインスリンのリフォールディングを行った。溶液のｐＨを９．５に維持し、タンパク質濃度については０．５〜１ｍｇ／ｍｌの範囲であった。リフォールディング反応を２５℃で２〜３時間行った。ｐＨが約４．０になるように酢酸を添加して、反応を停止させた。
【０１３７】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）−リフォールドディングした溶液に対して疎水性相互作用クロマトグラフィーを実施した。塩化ナトリウムを添加することで溶液の導電性を高めた上で、疎水性相互作用樹脂にタンパク質をロードした。グリシン緩衝液中の塩化ナトリウムの勾配を増加させながら、プロインスリンを溶出した。
【０１３８】
トリプシンによる酵素的切断−ＨＩＣから溶出したタンパク質を、タンパク質とトリプシンとの比１：５０００で消化した。この反応については、４℃、ｐＨ１１．２で実施した。反応をＨＰＬＣ分析でモニターした。消化完了後、酢酸を添加して反応を停止させた。
【０１３９】
陽イオン交換クロマトグラフィー−消化されたタンパク質を、陽イオン交換クロマトグラフィーでさらに精製した。陽イオン交換クロマトグラフィーにタンパク質をロードし、塩化ナトリウムを含有する緩衝液で溶出した。塩化ナトリウムの勾配を増加させることによって、インスリングラルギンを溶出した。
【０１４０】
逆相クロマトグラフィー−消化されたサンプルから、逆相クロマトグラフィーによって活性インスリンを精製する。このタンパク質を、最終的な結合が樹脂１０〜１５ｍｇ／ｍｌの範囲になるようにロードする。アセトニトリルの勾配を大きくしながらインスリンを溶出する。
実施例１１：異なるリーダーペプチドを用いた、インスリンおよびインスリン類似体の発現レベルと収量の比較
【０１４１】
【表１】
2021532730.tif 000003
インスリンまたはその類似体の発現は、リーダーペプチドの存在下での発現と比較して、リーダーペプチドなしでの発現のほうが大幅に少なかった。
【０１４２】
【表２】
2021532730.tif 000004
【０１４３】
観察されるように、本発明のリーダーペプチド配列の存在は、インスリンおよびインスリン類似体の発現を増強し、目的のタンパク質の最終収量を増した。
【０１４４】
以上、本発明の特定の実施形態を単に例示の目的で本明細書にて説明したが、本発明の意図および範囲から逸脱することなく様々な改変をほどこし得ることが理解され、本発明または添付の特許請求の範囲をいかなる方法でも制限するように解釈されるべきではないことが理解されるであろう。
【図１】
2021532730.tif 000005
【図２】
2021532730.tif 000006
【図３】
2021532730.tif 000007
【図４】
2021532730.tif 000008
【図５】
2021532730.tif 000009
【配列表】
2021532730000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年9月22日(2021.9.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式１
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
式１
で表されるプレ−プロインスリンを中間体として含むインスリンおよびインスリン類似体を製造するための方法であって、
Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖であり、Ｒ１はリーダーペプチド配列であり、
前記リーダーペプチド配列は、
ａ）    配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、または
ｂ）    ａ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド、
から選択される、方法。
【請求項２】
前記ｂ）のリーダーペプチドは、
ａ）    配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）    アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｃ）    アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチド
から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
プレ−プロインスリンから式２：Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３で表されるプロインスリンを調製することを含み、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
機能し得るように前記リーダーペプチドに結合しているプロインスリンをコードする核酸を含む原核生物宿主細胞を生産用培地で培養することにより、プロインスリンを発現させることを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記原核宿主細胞は、Pseudomonas細胞またはEscherichia coli細胞から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
インスリンまたはインスリン類似体の前記前駆体に機能し得るように結合しているリーダーペプチドを含むポリペプチドであって、前記リーダーペプチドは、
ａ）    配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）    ａ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択される、ポリペプチド。
【請求項７】
ａ）    配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）    ａ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択される、リーダーペプチド配列。
【請求項８】
式１すなわちＲ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３で表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列であって、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖であり、Ｒ１は、
ａ）    配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）    ａ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド
から選択される、塩基配列。
【請求項９】
配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５および配列番号１６から選択される、請求項８に記載の塩基配列。
【請求項１０】
請求項８または９に記載の塩基配列を含む組換え遺伝子コンストラクト。
【請求項１１】
インスリンの発現のためには、pET28aULL1INSまたはpET28aULL2INS、インスリンリスプロの発現のためには、pET28aULL1LSPまたはpET28aULL2LSP、インスリングラルギンの発現のためには、pET28aULL1GRまたはpET28aULL2GRから選択される、請求項１７に記載の組換え遺伝子コンストラクト。
【請求項１２】
式１
Ｒ１−Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３
式１
で表されるプレ−プロインスリンを中間体として含み、Ｘ１はインスリンまたはインスリン類似体の「Ｂ」鎖であり、Ｘ２はＲＲまたはＫＲまたはＲＫまたはＫＫから選択されるジペプチドであり、Ｘ３はインスリンまたはインスリン類似体の「Ａ」鎖であり、Ｒ１はリーダーペプチドであり、
前記リーダーペプチドは、
ａ）    配列番号２に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、または
ｂ）    ａ）と少なくとも８０％の相同性を有するペプチド、
から選択される、請求項１に記載の方法によって得られるインスリンまたはインスリン類似体。
【請求項１３】
前記ｂ）のリーダーペプチドは、
ａ）    配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）    アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｃ）    アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチ
から選択される、請求項２６に記載のインスリンまたはインスリン類似体。
【請求項１４】
前記ｂ）のリーダーペプチドは、
ａ）    配列番号１に記載のアミノ酸配列を有するペプチド、
ｂ）    アミノ酸配列MSRIVINAYAKATQPを含むペプチド、
ｃ）    アミノ酸配列MEKHTKDQIIEAPHMを含むペプチ
から選択される、請求項７に記載のリーダーペプチド。
【国際調査報告】
2021532730.tif 000010
2021532730.tif 000011
2021532730.tif 000012
2021532730.tif 000013