(57)【要約】アニオン性薬物送達用組成物を凍結乾燥及び再構成するときに、優れた安定性、安全性及び有効性を発揮することを可能にする凍結乾燥のための組成物及び方法を開示する。
2021503461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として、アニオン性薬物；カチオン性化合物；両親媒性ブロック共重合体；及び下記式（１）〜（６）
【化１】
2021503461.tif 000022
式（１）
（式中、Ａは、−ＣＯＯ−ＣＨＺ−であり；Ｂは、−ＣＯＯ−ＣＨＹ−、−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２−であり；Ｒは、水素原子、又はアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル若しくはエチル基であり；ＺとＹは、それぞれ、水素原子、又はメチル若しくはフェニル基であり；Ｍは、Ｎａ、Ｋ又はＬｉであり；ｎは、１〜３０の整数であり；ｍは、０〜２０の整数である）
【化２】
2021503461.tif 000023
式（２）
（式中、Ｘは、メチル基であり；Ｙ’は、水素原子又はフェニル基であり；ｐは、０〜２５の整数であり、ｑは、０〜２５の整数であり、但し、ｐ＋ｑは、５〜２５の整数であり；Ｒは、水素原子、又はアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル若しくはエチル基であり；Ｍは、Ｎａ、Ｋ又はＬｉであり；Ｚは、水素原子、又はメチル若しくはフェニル基である）
【化３】
2021503461.tif 000024
式（３）
（式中、Ｗ−Ｍ’は、
【化４】
2021503461.tif 000025
であり；ＰＡＤは、Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体及びＤ，Ｌ−乳酸と１,４−ジオキサン−２−オンの共重合体からなる群から選択され；Ｒは、水素原子、又はアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル若しくはエチル基であり；Ｍは、独立して、Ｎａ、Ｋ又はＬｉである）
【化５】
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式（４）
［式中、Ｓは、
【化６】
2021503461.tif 000027
｛ここで、Ｌは、−ＮＲ１−又は−０−（ここで、Ｒ１は、水素原子又はＣ１−１０アルキルである）であり、ａは、０〜４の整数であり、ｂは、１〜１０の整数であり、Ｍは、Ｎａ、Ｋ又はＬｉである）｝であり；Ｑは、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３又はＣＨ２Ｃ６Ｈ５であり；ＰＡＤは、Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体及びＤ，Ｌ−乳酸と１,４−ジオキサン−２−オンの共重合体からなる群から選択される一つ以上である］
【化７】
2021503461.tif 000028
式（５）
［式中、Ｒ’は、−ＰＡＤ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＭ（ここで、ＰＡＤは、Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸と１,４−ジオキサン−２−オンの共重合体からなる群から選択され、Ｍは、Ｎａ、Ｋ又はＬｉである）であり；ａは、１〜４の整数である］
【化８】
2021503461.tif 000029
式（６）
［式中、Ｘ及びＸ’は、独立して、水素、炭素数１〜１０のアルキル又は炭素数６〜２０のアリールであり；Ｙ及びＺは、独立して、Ｎａ、Ｋ又はＬｉであり；ｍ及びｎは、独立して、０〜９５の整数であり、但し、５＜ｍ＋ｎ＜１００であり；ａ及びｂは、独立して、１〜６の整数であり；Ｒは、−（ＣＨ２）ｋ−（ここで、ｋは、０〜１０の整数である）、炭素数２〜１０の２価アルケニル、炭素数６〜２０の２価アリール又はこれらの組み合わせである］
で示される化合物からなる群から選択される一つ以上のポリ乳酸塩；
を含むアニオン性薬物送達用組成物であって、該アニオン性薬物は、カチオン性化合物と静電相互作用により複合体を形成し、該複合体は、両親媒性ブロック共重合体及びポリ乳酸塩が形成するナノ粒子構造内部に封入されている、アニオン性薬物送達用組成物、及び
抗凍結剤として、ソルビトール
を含む、アニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物。
【請求項２】
アニオン性薬物１重量部に対して、ソルビトールを１〜５，０００重量部含む、請求項１に記載のアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物。
【請求項３】
アニオン性薬物が、核酸である、請求項１に記載のアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物。
【請求項４】
カチオン性化合物が、カチオン性脂質及びカチオン性高分子からなる群から選択される一つ以上である、請求項１に記載のアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物。
【請求項５】
カチオン性脂質が、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（Ｎ’−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ−コレステロール）、コレステリルオキシプロパン−１−アミン（ＣＯＰＡ）、Ｎ−（Ｎ’−アミノエタン）カルバモイルプロパン酸トコフェロール（ＡＣ−トコフェロール）及びＮ−（Ｎ’−メチルアミノエタン）カルバモイルプロパン酸トコフェロール（ＭＣ−トコフェロール）からなる群から選択される一つ以上である、請求項４に記載のアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物。
【請求項６】
カチオン性脂質が、下記式（７）
【化９】
2021503461.tif 000030
式（７）
（式中、ｎとｍは、それぞれ、０〜１２であり、但し、２≦ｎ＋ｍ≦１２であり、ａとｂは、それぞれ、１〜６であり、Ｒ１とＲ２は、それぞれ独立して、炭素数１１〜２５の飽和又は不飽和炭化水素からなる群から選択される）
で示されるカチオン性脂質である、請求項４に記載のアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物。
【請求項７】
Ｒ１とＲ２が、それぞれ独立して、ラウリル（lauryl）、ミリスチル（myristyl）、パルミチル（palmityl）、ステアリル（stearyl）、アラキジル（arachidyl）、ベヘニル（behenyl）、リグノセリル（lignoceryl）、セロチル（cerotyl）、ミリストレイル（myristoleyl）、パルミトレイル（palmitoleyl）、サピエニル（sapienyl）、オレイル（oleyl）、リノレイル（linoleyl）、アラキドニル（arachidonyl）、エイコサペンタエニル（eicosapentaenyl）、エルシル（erucyl）、ドコサヘキサエニル（docosahexaenyl）及びセロチル（cerotyl）からなる群から選択される、請求項６に記載のアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物。
【請求項８】
両親媒性ブロック共重合体が、親水性Ａブロックと疎水性Ｂブロックで構成されるＡ−Ｂ型ジブロック共重合体であり、
親水性Ａブロックが、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド及びその誘導体からなる群から選択される一つ以上であり、
疎水性Ｂブロックが、ポリエステル、ポリ無水物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル及びポリホスファゼンからなる群から選択される一つ以上である、請求項１に記載のアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物。
【請求項９】
疎水性Ｂブロックの末端ヒドロキシ基が、コレステロール、トコフェロール、及び炭素数１０〜２４の脂肪酸からなる群から選択される一つ以上によって修飾されている、請求項８に記載のアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物。
【請求項１０】
融合性脂質（fusogenic lipid）をさらに含む、請求項１に記載のアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物。
【請求項１１】
融合性脂質が、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジン酸、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジン酸、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジン酸、コレステロール及びトコフェロールからなる群から選択される一つ以上である、請求項１０に記載のアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物を用いて凍結乾燥を行う工程を含むアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥方法。
【請求項１３】
請求項１２に記載の方法によって凍結乾燥されたアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アニオン性薬物含有医薬組成物の凍結乾燥のための組成物及び方法に関するものであり、より詳細には、核酸などのアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物及び方法、並びにその凍結乾燥物に関する。
【背景技術】
【０００２】
医薬品は通常、乾燥製剤の最終製品として商品化されている。そのために減圧乾燥、噴霧乾燥、凍結乾燥などの通常の乾燥方法を用いることができる。中でも、凍結乾燥方法は、物質を凍結させ、水蒸気分圧を下げることで、氷を直接蒸気にする昇華によって乾燥する方法である。このような凍結乾燥工程では、抗凍結剤を使用する場合が多い。
【０００３】
「医薬品添加剤に関する韓国のガイドライン（２０１５年１２月）」によれば、医薬品製剤は、製剤の安定性、安全性、均質性を維持しながら品質と経済性を高めるために、一般的に添加剤を加えている。つまり、添加剤は、医薬品を製剤化するとき、安定性、安全性、品質などの有用性を高めるために追加使用する物質をいう。このような添加剤は、製剤化において医薬品の品質を管理するために使用され、一般に添加剤を大量に使用する場合が多いため、特に安全性の確認が必要である。
【０００４】
遺伝子治療におけるアニオン性薬物、特に核酸の有効性は検証されている。このように安全で効率的な薬物送達技術は古くから研究されており、様々な送達システム及び送達技術が開発されてきた。最近、非ウイルス性送達システムが活発に開発されている。このような非ウイルス性送達システムは、ウイルス性送達システムと比較して効率ではないが、生体内安全性の側面で副作用が少なく、経済性の側面で生産コストが低いという利点がある。特に、特許文献１は、有効成分として、アニオン性薬物；カチオン性化合物；両親媒性ブロック共重合体；及びポリ乳酸塩を含み、アニオン性薬物は、カチオン性化合物と静電相互作用によって複合体を形成し、複合体は、両親媒性ブロック共重合体及びポリ乳酸塩が形成するナノ粒子構造内部に封入されていることを特徴とする、アニオン性薬物送達用組成物を開示している。
【０００５】
このように、アニオン性薬物の生体内、生体外での送達効率、治療効果検証などに関して、多くの研究が行われてきた。しかし、抗凍結剤はまだ研究されていない。特に、核酸種のアニオン性薬物は、凍結又は凍結乾燥中に構造変化を示す可能性があり、非ウイルス性送達システムの構造変化を引き起こす可能性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国  公開特許公報  第２０１７−００３２８５８号
【発明の概要】
【０００７】
以上のような技術的背景の下、本発明は、アニオン性薬物送達用組成物を凍結乾燥及び再構成するときに、優れた安定性及び安全性、並びに優れた有効性を発揮可能にする凍結乾燥のための組成物を提供することを目的とする。
【０００８】
本発明の別の目的は、アニオン性薬物送達用組成物を凍結乾燥及び再構成するときに、優れた安定性及び安全性、並びに優れた有効性を発揮可能にする凍結乾燥方法を提供することである。
【０００９】
本発明のさらに別の目的は、アニオン性薬物送達用組成物を凍結乾燥及び再構成するときに、優れた安定性及び安全性、並びに優れた有効性を発揮することができるアニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥物を提供することである。
【００１０】
本発明の一態様は、有効成分として、アニオン性薬物；カチオン性化合物；両親媒性ブロック共重合体；及びポリ乳酸塩を含み、アニオン性薬物は、カチオン性化合物と静電相互作用によって複合体を形成し、複合体は、両親媒性ブロック共重合体及びポリ乳酸塩が形成するナノ粒子構造内部に封入されているアニオン性薬物送達用組成物、及び抗凍結剤としてソルビトール（sorbitol）を含む、アニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥のための組成物に関する。
【００１１】
本発明の別の態様は、上記組成物を用いて凍結乾燥を行う工程を含む、アニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥方法に関する。
【００１２】
本発明のさらに別の態様は、上記方法によって凍結乾燥された、アニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥物に関する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
以下、本発明について詳細に説明する。
【００１４】
本発明者らは、本出願人により出願された特許文献１によるアニオン性薬物送達用組成物に多様な抗凍結剤を添加し、得られた組成物の凍結乾燥及び再構成を行い、ソルビトールの使用により予想外に優れた安定性及び安全性、並びに優れた有効性が得られることを初めて確認した。即ち、本発明者らは、ソルビトールを添加することにより、他の抗凍結剤、例えば、トレハロース、マンニトール、スクロース又はグルコースを添加する場合と比べて、凍結乾燥及び再構成時に、未封入薬物（例えばｓｉＲＮＡ）量の減少、薬物（例えばｓｉＲＮＡ）分解性の低下、毒性の低下及び有効性の増大を同時に発揮可能であることを初めて確認した。
【００１５】
従って、本発明は、アニオン性薬物送達用組成物の凍結乾燥において抗凍結剤としてソルビトールを用いることを特徴とする。
【００１６】
本発明の一実施態様において、ソルビトールは、アニオン性薬物１重量部に対して、１〜５，０００重量部使用することが好ましい。より好ましくは１〜４，０００重量部、さらに好ましくは５〜３，０００重量部、最も好ましくは５〜２，０００重量部使用することができる。上記量範囲において、未封入薬物量の低下、薬物分解性の低下、毒性の低下及び有効性の増大を得ることができる。
【００１７】
アニオン性薬物送達用組成物の構成成分の中で、アニオン性薬物とカチオン性化合物は、両親媒性ブロック共重合体とポリ乳酸塩によって形成されるナノ粒子構造内部に封入されている。このようなアニオン性薬物及びカチオン性化合物が封入された高分子ナノ粒子送達システムの概略構造を図１に示す。図１を参照すれば、アニオン性薬物とカチオン性化合物は、それらの間の静電相互作用により結合し、アニオン性薬物とカチオン性化合物の複合体を形成する。形成されたアニオン性薬物とカチオン性化合物の複合体は、両親媒性ブロック共重合体及びポリ乳酸塩によって形成されるナノ粒子構造内に封入される。
【００１８】
図１に示すように、両親媒性ブロック共重合体及びポリ乳酸塩によって形成されるナノ粒子構造は、水性環境下で、両親媒性ブロック共重合体の親水性部分がナノ粒子の外壁を形成し、両親媒性ブロック共重合体の疎水性部分と両親媒性ブロック共重合体と別の成分として含まれるポリ乳酸塩がナノ粒子の内壁を形成し、その形成されたナノ粒子の内部にアニオン性薬物とカチオン性化合物の複合体が封入された構造である。
【００１９】
アニオン性薬物とカチオン性化合物の複合体は、両親媒性ブロック共重合体及びポリ乳酸塩によって形成されるナノ粒子構造内に封入された状態を維持しているため、血液又は体液中における安定性が向上される。一実施態様によれば、ナノ粒子の粒子径は、１０〜２００ｎｍであってもよく、より具体的には１０〜１５０ｎｍである。また、ナノ粒子の標準電荷は、−２０〜２０ｍＶであってもよく、より具体的には−１０〜１０ｍＶである。粒子径及び標準電荷は、ナノ粒子構造の安定性、構成成分の含量、体内でのアニオン性薬物の吸収及び医薬組成物としての滅菌の利便性の観点から好ましい。
【００２０】
本発明による組成物に有効成分として含まれるアニオン性薬物は、水溶液中の分子において負電荷を示す薬理学的活性を有する全ての物質を含む概念である。具体的な一実施態様として、アニオン性は、カルボン酸基、リン酸基及び硫酸基からなる群から選択される一つ以上の官能基から提供され得る。また、本発明の一実施態様として、アニオン性薬物は、ペプチド、タンパク質又はヘパリンなどのポリアニオン性薬物又は核酸であってもよい。
【００２１】
核酸は、デオキシリボ核酸、リボ核酸、又は主鎖（backbone）、糖又は塩基が化学的に修飾されているか、又は末端が修飾されているポリヌクレオチド誘導体などの核酸薬物であってもよい。より具体的には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｓｉＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）、アプタマー、アンチセンスＯＤＮ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム及びＤＮＡザイム等からなる群から選択される一つ以上の核酸であってもよい。さらに、核酸の主鎖、糖又は塩基は、血液中での安定性を高めたり、免疫反応を弱めたりする目的で、化学的に修飾されてもよく、又は末端が修飾されてもよい。具体的には、核酸のホスホジエステル結合の一部をホスホロチオエート又はボラノホスフェート結合で置き換えるか、一部のリボース塩基の２’−ＯＨ位にメチル基、メトキシエチル基、フッ素などの様々な官能基が導入された修飾されたヌクレオチドを一つ以上含むことができる。
【００２２】
また、核酸の一つ以上の末端は、コレステロール、トコフェロール及び炭素数１０〜２４の脂肪酸からなる群から選択される一つ以上で修飾されてもよい。例えば、ｓｉＲＮＡの場合、センス及び／又はアンチセンス鎖の５’又は３’末端、又は両端が修飾されてもよく、好ましくは、センス鎖の末端が修飾されてもよい。
【００２３】
コレステロール、トコフェロール及び炭素数１０〜２４の脂肪酸には、コレステロール、トコフェロール及び炭素数１０〜２４の脂肪酸の各々の類似体、誘導体及び代謝体が含まれる。
【００２４】
ｓｉＲＮＡは、標的遺伝子と同じ細胞に存在する場合に、ｓｉＲＮＡの配列に相補的であるｍＲＮＡの分解を媒介することで、標的遺伝子の発現を減少又は抑制し得る、二本鎖ＲＮＡ、又は一本鎖ＲＮＡ内部で二本鎖の形態をとる一本鎖ＲＮＡを指す。二本鎖は、ヌクレオチド間の水素結合によって互いに結合される。二本鎖内部の全てのヌクレオチドと相補的に結合している必要はなく、両方の鎖が分離されていても分離されていなくてもよい。一実施態様として、ｓｉＲＮＡの長さは、約１５〜６０ヌクレオチド（これは、二本鎖ＲＮＡの片側のヌクレオチドの数、即ち、塩基対の数を意味する；そして一本鎖ＲＮＡの場合、一本鎖ＲＮＡ内部に存在する二本鎖の長さを意味する）、具体的には、約１５〜３０ヌクレオチド、より具体的には、約１９〜２５のヌクレオチドであり得る。
【００２５】
一実施態様として、二本鎖ｓｉＲＮＡは、３’又は５'末端の一端又は両端に１〜５ヌクレオチドのオーバーハング（overhang）を有してもよい。別の実施態様では、両端にオーバーハングを有しないブラント（blunt）形態であってもよい。具体的には、米国特許公開第２００２−００８６３５６号、米国特許第７，０５６，７０４号に開示されたｓｉＲＮＡであってもよい（文献は、本明細書に参照により援用される）。
【００２６】
また、ｓｉＲＮＡは、二本の鎖が同じ長さの対称構造を有する場合と、一方の鎖が他方の鎖より短い非対称構造を有する場合がある。具体的には、１９〜２１ヌクレオチド（ｎｔ）のアンチセンス；及びアンチセンスに相補的な配列を有する１５〜１９ｎｔのセンスで構成される二本鎖のｓｉＲＮＡ分子であって、アンチセンスの５'末端がブラント末端であり、アンチセンスの３'末端に１−５ヌクレオチドオーバーハングを有する非対称ｓｉＲＮＡであってもよい。具体的には、国際特許公開第０９／０７８６８５号に開示されたｓｉＲＮＡであってもよい。
【００２７】
本発明において、アニオン性薬物は、組成物の総重量に対して、好ましくは０．００１〜１０重量％、より具体的には０．０１〜８重量％の量で含まれる。アニオン性薬物の量が０．００１重量％未満のとき、薬物に比べて使用される送達システムの量が過剰になり、従って、送達システムによる副作用が引き起こされる可能性がある。アニオン性薬物の量が１０重量％を超えると、ナノ粒子径が大きくなり過ぎて、ナノ粒子の安定性が低下し、ろ過滅菌時の損失率が大きくなる場合がある。
【００２８】
具体的な一実施態様では、カチオン性化合物は、アニオン性薬物と静電相互作用によって結合されて複合体を形成し、複合体は、両親媒性ブロック共重合体のナノ粒子構造内部に封入される。したがって、カチオン性化合物は、アニオン性薬物と静電相互作用によって複合体を形成できるあらゆるタイプの化合物を含むことができ、例えば、脂質と高分子を含むことができる。カチオン性脂質は、Ｎ，Ｎ−ジオレイル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＤＡＣ）、Ｎ，Ｎ−ジステアリル−Ｎ，Ｎ−ジメチルアンモニウムブロミド（ＤＤＡＢ）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）、Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＴＭＡ）、１，２−ジアシル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＴＡＰ）、１，２−ジアシル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＡＰ）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ−コレステロール）、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、３β−［Ｎ−（Ｎ'−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ−コレステロール）、３β−［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ−コレステロール）、コレステリルオキシプロパン−１−アミン（ＣＯＰＡ）、Ｎ−（Ｎ'−アミノエタン）カルバモイルプロパン酸トコフェロール（ＡＣ−トコフェロール）及びＮ−（Ｎ'−メチルアミノエタン）カルバモイルプロパン酸トコフェロール（ＭＣ−トコフェロール）からなる群から選択される一つ又は二以上の組み合わせであってもよい。このようなカチオン性脂質を使用する場合、カチオン性脂質から誘発される毒性を低減させるために分子内のカチオン密度が高いポリカチオン性脂質をなるべく使用しないことが好ましい。より具体的には、分子当たり水溶液中でカチオンを示せる官能基は一つであり得る。従って、より好ましい一実施態様において、カチオン性脂質は、３β−［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−トリメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＴＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（Ｎ’，Ｎ’−ジメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＤＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（Ｎ’−モノメチルアミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＭＣ−コレステロール）、３β［Ｎ−（アミノエタン）カルバモイル］コレステロール（ＡＣ−コレステロール）、Ｎ−（１−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピル−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＡＰ）、Ｎ，Ｎ−ジメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＤＭＡ）及びＮ，Ｎ，Ｎ−トリメチル−（２，３−ジオレオイルオキシ）プロピルアミン（ＤＯＴＭＡ）からなる群から選択される一つ以上であってもよい。一方、カチオン性高分子は、キトサン、グリコールキトサン、プロタミン、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアミドアミン、ポリエチレンイミン、デキ��トラン、ヒアルロン酸、アルブミン、高分子ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミン及びポリビニルアミン（ＰＶＡｍ）からなる群から選択される一つ以上であってもよい。好ましくは、高分子ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、ポリアミン及びポリビニルアミン（ＰＶＡ）からなる群から選択される一つ以上であってもよい。
【００２９】
具体的な一実施態様では、カチオン性脂質は、下記式（７）
【化１】
2021503461.tif 000003
式（７）
（式中、ｎとｍが、それぞれ、０〜１２であり、但し、２≦ｎ＋ｍ≦１２であり、ａとｂが、それぞれ、１〜６であり、Ｒ１とＲ２が、それぞれ独立して、炭素数１１〜２５の飽和又は不飽和炭化水素からなる群から選択される）で示されるカチオン性脂質であってもよい。
【００３０】
好ましくは、ｎとｍは、独立して、１〜９、２≦ｎ＋ｍ≦１０であってもよい。
【００３１】
好ましくは、ａとｂは、２〜４であってもよい。
【００３２】
好ましくは、Ｒ１とＲ２が、それぞれ独立して、ラウリル、ミリスチル、パルミチル、ステアリル）、アラキジル、ベヘニル、リグノセリル、セロチル、ミリストレイル（、パルミトレイル、サピエニル、オレイル、リノレイル、アラキドニル、エイコサペンタエニル、エルシル、ドコサヘキサエニル及びセロチルからなる群から選択されてもよい。
【００３３】
カチオン性脂質の具体例は、１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド、１，８−ジリノレオイルテトラエチレンペンタミド、１，４−ジミリストレオイルジエチレントリアミド、１，１０−ジステアロイルペンタエチレンヘキサミド及び１，１０−ジオレオイルペンタエチレンヘキサミドからなる群から選択される一つ以上であってもよい。
【００３４】
本発明で用いられるカチオン性化合物は、組成物の総重量に対して、０．０１〜５０重量％、具体的には０．１〜１０重量％の量で含まれてもよい。カチオン性脂質の含量が０．０１重量％未満のとき、アニオン性薬物と複合体を形成するのに十分ではない場合があり、５０重量％を超えると、ナノ粒子径が多くなり過ぎて、ナノ粒子の安定性が低下し、ろ過滅菌時の損失率が高くなる場合がある。
【００３５】
カチオン性化合物とアニオン性薬物は、静電相互作用により結合され、複合体を形成する。具体的な一実施態様として、カチオン性化合物（Ｎ）とアニオン性薬物（Ｐ）の電荷量の比（Ｎ／Ｐ；カチオン性化合物対アニオン性薬物の負電荷の正電荷の比）は、０．１〜１２８であり、具体的には０．５〜６４、より具体的には１〜３２、さらに具体的には１〜２４、最も具体的には６〜２４である。比（Ｎ／Ｐ）が０．１未満のとき、十分な量のアニオン性薬物を含む複合体を形成することが困難になる可能性がある。従って、十分な量のアニオン性薬物を含む複合体を形成することができるように、比（Ｎ／Ｐ）が０．１以上であることが有利である。一方、この比（Ｎ／Ｐ）が１２８を超えると、毒性を誘発する可能性があるので、１２８以下であることが有利である。
【００３６】
具体的な一実施態様では、両親媒性ブロック共重合体は、親水性Ａブロック及び疎水性Ｂブロックを含むＡ−Ｂ型ブロック共重合体であってもよい。Ａ−Ｂ型ブロック共重合体は、水溶液中で疎水性Ｂブロックがコア（内壁）を形成し、親水性Ａブロックがシェル（外壁）を形成するコア−シェルタイプの高分子ナノ粒子を形成する。
【００３７】
これに関して、親水性Ａブロックは、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリルアミド及びその誘導体からなる群から選択される一つ以上であってもよい。より具体的には、親水性Ａブロックは、モノメトキシポリエチレングリコール、モノアセトキシポリエチレングリコール、ポリエチレングリコール、ポリエチレンとプロピレングリコールの共重合体及びポリビニルピロリドンからなる群から選択される一つ以上であってもよい。親水性Ａブロックは、数平均分子量が、２００〜５０，０００ダルトン、より具体的には１，０００〜２０，０００ダルトン、さらに具体的には１，０００〜５，０００ダルトンである。
【００３８】
また、必要に応じて、特定の組織又は細胞に到達できる官能基若しくはリガンド、又は細胞内送達を促進できる官能基を、親水性Ａブロックの末端に化学的に結合させて、両親媒性ブロック共重合体とポリ乳酸塩で形成された高分子ナノ粒子送達システムの体内分布を調節するか、ナノ粒子送達システムの細胞内への送達効率を高めることができる。官能基又はリガンドは、単糖類、多糖類、ビタミン、ペプチド、タンパク質及び細胞表面受容体に対する抗体からなる群から選択される一つ以上であってもよい。より具体的には、官能基又はリガンドは、アニスアミド（anisamide）、ビタミンＢ９（葉酸）、ビタミンＢ１２、ビタミンＡ、ガラクトース、ラクトース、マンノース、ヒアルロン酸、ＲＧＤペプチド、ＮＧＲペプチド、トランスフェリン、トランスフェリン受容体に対する抗体などからなる群から選択される一つ以上であってもよい。
【００３９】
疎水性Ｂブロックは、生体適合性及び生分解性高分子であり、それは、ポリエステル、ポリ無水物、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル及びポリホスファゼンからなる群から選択される一つ以上であってもよい。より具体的には、疎水性Ｂブロックは、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリカプロラクトン、ポリジオキサン−２−オン、ポリラクチドとグリコリドの共重合体、ポリラクチドとポリジオキサン−２−オンの共重合体、ポリラクチドとポリカプロラクトンの共重合体及びポリグリコリドとポリカプロラクトンの共重合体からなる群から選択される一つ以上であってもよい。別の一実施例では、疎水性Ｂブロックは、数平均分子量が、５０〜５０，０００ダルトン、より具体的には２００〜２０，０００ダルトン、さらに具体的には５,００〜５，０００ダルトンである。また、疎水性ブロックの疎水性を高めることにより、ナノ粒子の安定性を向上させるために、トコフェロール、コレステロール、又は炭素数１０〜２４の脂肪酸を疎水性ブロック末端のヒドロキシ基に化学的に結合させることができる。
【００４０】
親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）を含む両親媒性ブロック共重合体の含量は、組成物の乾燥総重量に対して、４０〜９９．９８重量％、好ましくは５０〜９９．８重量％、より好ましくは６０〜９０重量％である。両親媒性ブロック共重合体の含量が４０重量％未満のとき、ナノ粒子径が大きくなり過ぎ、ナノ粒子の安定性が低下し、ろ過滅菌時の損失率が高くなる場合があり、含量が９９．９８重量％を超えると、取り込むことができるアニオン性薬物の含量が少なくなり過ぎる場合がある。
【００４１】
別の一実施例では、両親媒性ブロック共重合体において、親水性ブロック（Ａ）と疎水性ブロック（Ｂ）の組成比は、共重合体の重量に対して、親水性ブロック（Ａ）が４０〜７０重量％、具体的には５０〜６０重量％範囲であってもよい。親水性ブロック（Ａ）の量が４０重量％未満のとき、高分子の水への溶解度が低く、ナノ粒子を形成することが困難になる場合がある。従って、共重合体がナノ粒子を形成するのに十分な水への溶解度を有することができるように親水性ブロック（Ａ）の量が４０重量％以上であることが有利である。親水性ブロック（Ａ）の量が、７０重量％を超えると、親水性が高くなり過ぎて高分子ナノ粒子の安定性が低下し、アニオン性薬物／カチオン性脂質複合体を可溶化するための組成物としての使用が困難になる場合がある。従って、ナノ粒子安定性を考慮すると、親水性ブロック（Ａ）の量が７０重量％以下であることが有利である。
【００４２】
具体的な一実施態様では、両親媒性ブロック共重合体は、水溶液中でアニオン性薬物とカチオン性脂質の複合体をナノ粒子構造内部に封入可能であるが、このとき、アニオン性薬物とカチオン性脂質の複合体の重量（ａ）対両親媒性ブロック共重合体の重量（ｂ）の比［ａ／ｂ×１００；（アニオン性薬物重量＋カチオン性脂質重量）／両親媒性ブロック共重合体重量×１００］は、０．００１〜１００重量％、具体的には０．０１〜５０重量％、より具体的には０．１〜２０重量％であってもよい。重量比が、０．００１重量％未満のときには、アニオン性薬物とカチオン性脂質の複合体の含量が少なくなり過ぎて、アニオン性薬物の作用有効量を満たすことが困難になる場合があり、１００重量％を超えると、両親媒性ブロック共重合体の分子量及びアニオン性薬物と脂質の複合体の量を考慮して、適切なサイズのナノ粒子構造が形成されない場合がある。
【００４３】
本発明による組成物中のナノ粒子構造は、ポリ乳酸塩（ＰＬＡＮａ）を含むことを特徴とする。ポリ乳酸塩は、ナノ粒子のコア（内壁）に分布し、コアの疎水性を高め、ナノ粒子を安定化すると同時に、体内で細網内皮系（ＲＥＳ）を効果的に回避する。即ち、ポリ乳酸塩中のカルボン酸アニオンは、ポリ乳酸よりも効果的にカチオン性複合体と結合し、高分子ナノ粒子の表面電荷を減少させる。従って、高分子ナノ粒子の表面電荷の正電荷は、ポリ乳酸塩を含まない高分子ナノ粒子の正電荷よりも小さくなるため、細網内皮系による補足が少なくなり、標的部位（例えば、癌細胞、炎症細胞など）への送達効率に優れるという長所がある。
【００４４】
両親媒性ブロック共重合体と別の成分として含まれているポリ乳酸塩は、ナノ粒子内壁の成分であり、数平均分子量が５００〜５０，０００ダルトン、具体的には１，０００〜１０，０００ダルトンであってもよい。ポリ乳酸塩の数平均分子量が５００ダルトン未満のとき、疎水性が低くなり過ぎ、ナノ粒子のコア（内壁）に存在しにくくなる場合があり、数平均分子量が５０，０００ダルトンを超えると、高分子ナノ粒子の粒子サイズが大きくなり過ぎる場合がある。
【００４５】
ポリ乳酸塩は、両親媒性ブロック共重合体１００重量部に対して、１〜２００重量部、具体的には１〜１００重量部、より具体的には１０〜６０重量部使用されてもよい。ポリ乳酸塩の量が両親媒性ブロック共重合体１００重量部に対して、２００重量部を超えると、ナノ粒子径が大きくなり、滅菌膜ろ過が困難になる場合がある。ポリ乳酸塩の量が両親媒性ブロック共重合体１００重量部に対して１重量部未満のとき、所望の効果が得られにくくなる。
【００４６】
一実施態様において、本発明の組成物は、アニオン性薬物１重量部に対して、両親媒性ブロック共重合体を１０〜１，０００重量部、ポリ乳酸塩を５〜５００重量部含んでもよい。好ましくは、両親媒性ブロック共重合体は、５０〜８００重量部、より好ましくは１００〜５００重量部であってもよい。好ましくは、ポリ乳酸塩は５〜３００重量部、より好ましくは１０〜１００重量部であってもよい。
【００４７】
一実施態様において、塩が形成される末端とは反対のポリ乳酸塩の末端（例えば、カルボン酸ナトリウム）、ヒドロキシ、アセトキシ、ベンゾイルオキシ、デカノイルオキシ、パルミトイルオキシ及び炭素数１〜２のアルコキシからなる群から選択される一つで置換されていてもよい。
【００４８】
好ましい一つの実施様態として、本発明のポリ乳酸塩は、下記式（１）〜（６）の化合物からなる群から選択される一つ以上であってもよい：
【化２】
2021503461.tif 000004
式（１）
（式中、Ａは、−ＣＯＯ−ＣＨＺ−であり；Ｂは、−ＣＯＯ−ＣＨＹ−、−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＣＯＯ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２−であり；Ｒは、水素原子、又はアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル若しくはエチル基であり；ＺとＹは、それぞれ、水素原子、又はメチル若しくはフェニル基であり；Ｍは、Ｎａ、Ｋ又はＬｉであり；ｎは１〜３０の整数であり；ｍは０〜２０の整数である）
【化３】
2021503461.tif 000005
式（２）
（式中、Ｘは、メチル基であり；Ｙ’は、水素原子又はフェニル基であり；ｐは、０〜２５の整数であり、ｑは、０〜２５の整数であり、但し、ｐ＋ｑは、５〜２５の整数であり；Ｒは、水素原子、又はアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル若しくはエチル基であり；Ｍは、Ｎａ、Ｋ又はＬｉであり；Ｚは、水素原子、又はメチル若しくはフェニル基である）
【化４】
2021503461.tif 000006
式（３）
（式中、Ｗ−Ｍ’は、
【化５】
2021503461.tif 000007
であり；ＰＡＤは、Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体及びＤ，Ｌ−乳酸と１,４−ジオキサン−２−オンの共重合体からなる群から選択され；Ｒは、水素原子、又はアセチル、ベンゾイル、デカノイル、パルミトイル、メチル若しくはエチル基であり；Ｍは、独立して、Ｎａ、Ｋ又はＬｉである）
【化６】
2021503461.tif 000008
式（４）
［式中、Ｓは、
【化７】
2021503461.tif 000009
｛ここで、Ｌは、−ＮＲ１−又は−０−（ここで、Ｒ１は、水素原子又はＣ１−１０アルキルである）であり、ａは、０〜４の整数であり、ｂは、１〜１０の整数であり、Ｍは、Ｎａ、Ｋ又はＬｉである）｝であり；Ｑは、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３又はＣＨ２Ｃ６Ｈ５であり；ＰＡＤは、Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体及びＤ，Ｌ−乳酸と１,４−ジオキサン−２−オンの共重合体からなる群から選択される一つ以上である］
【化８】
2021503461.tif 000010
式（５）
［式中、Ｒ’は、−ＰＡＤ−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−ＣＨ２ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＯＭ（ここで、ＰＡＤは、Ｄ，Ｌ−ポリ乳酸、Ｄ−ポリ乳酸、ポリマンデル酸、Ｄ，Ｌ−乳酸とグリコール酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とマンデル酸の共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸とカプロラクトンの共重合体、Ｄ，Ｌ−乳酸と１,４−ジオキサン−２−オンの共重合体からなる群から選択され、Ｍは、Ｎａ、Ｋ又はＬｉである）であり；ａは、１〜４の整数である］
【化９】
2021503461.tif 000011
式（６）
［式中、Ｘ及びＸ’は、独立して、水素、炭素数１〜１０のアルキル又は炭素数６〜２０のアリールであり；Ｙ及びＺは、独立して、Ｎａ、Ｋ又はＬｉであり；ｍ及びｎは、独立して、０〜９５の整数であり、但し、５＜ｍ＋ｎ＜１００であり；ａ及びｂは、独立して、１〜６の整数であり；Ｒは、−（ＣＨ２）ｋ−（ここで、ｋは、０〜１０の整数である）、炭素数２〜１０の２価アルケニル、炭素数６〜２０の２価アリール又はこれらの組み合わせである］。
【００４９】
ポリ乳酸塩は、好ましくは、式（１）又は（２）で示される化合物である。
【００５０】
一実施態様において、本発明の組成物は、アニオン性薬物の細胞への送達効率を高めるために、組成物の総重量に対して、０．０１〜５０重量％、具体的には０．１〜１０重量％の融合性脂質（fusogenic lipid）をさらに含んでもよい。
【００５１】
融合性脂質は、アニオン性薬物とカチオン性脂質の複合体と混合されると、疎水性相互作用によって複合体と結合して、アニオン性薬物とカチオン性脂質と融合性脂質の複合体を形成し、融合性脂質を含む複合体は、両親媒性ブロック共重合体のナノ粒子構造内部に封入される。一実施態様では、融合性脂質は、リン脂質、コレステロール及びトコフェロールからなる群から選択される一つ又は二以上の組み合わせであってもよい。
【００５２】
具体的には、リン脂質は、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジン酸からなる群から選択される一つ以上であってもよい。ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ）及びホスファチジン酸は、１又は２つのＣ１０−２４脂肪酸と結合された形態であってもよい。コレステロール及びトコフェロールには、コレステロール及びトコフェロールの各々の類似体、誘導体及び代謝体が含まれる。
【００５３】
具体的には、融合性脂質は、ジラウロイルホスファチジルエタノールアミン、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン、ジリノレオイルホスファチジルエタノールアミン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルエタノールアミン、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルエタノールアミン、ジラウロイルホスファチジルコリン、ジミリストイルホスファチジルコリン、ジパルミトイルホスファチジルコリン、ジステアロイルホスファチジルコリン、ジオレオイルホスファチジルコリン、ジリノレオイルホスファチジルコリン、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジルコリン、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジルコリン、ジラウロイルホスファチジン酸、ジミリストイルホスファチジン酸、ジパルミトイルホスファチジン酸、ジステアロイルホスファチジン酸、ジオレオイルホスファチジン酸、ジリノレオイルホスファチジン酸、１−パルミトイル−２−オレオイルホスファチジン酸、１，２−ジフィタノイル−３−ｓｎ−ホスファチジン酸、コレステロール及びトコフェロールからなる群から選択される一つ又は二以上の組み合わせであってもよい。
【００５４】
好ましい実施態様では、融合性脂質は、ジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、ジパルミトレオイルホスホコリン（ＤＰＰＣ）、ジオレオイルホスホコリン（ＤＯＰＣ）、ジパルミトレオイルホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）等からなる群から選択される一つ以上であってもよい。
【００５５】
具体的な一実施態様として、本発明による両親媒性ブロック共重合体及びポリ乳酸塩ナノ粒子構造に封入されたアニオン性薬物とカチオン性化合物の複合体を含む組成物は、血管、筋肉、皮下、経口、骨、経皮又は局所組織などの投与経路で投与されることができ、それは経口又は非経口投与のための様々な製剤に製剤化されてもよい。経口投与製剤としては、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤などが挙げられ、非経口投与製剤としては、点眼剤、注射剤などが挙げられる。好ましい一実施態様として、組成物は、注射用製剤であってもよい。例えば、本発明による組成物の凍結乾燥物は、注射用蒸溜水、０．９％生理食塩水及び５％デキストロース水溶液などで再構成し、注射用製剤形態で製造することができる。
【００５６】
本発明によれば、アニオン性薬物送達用組成物が、優れた安定性、安全性及び有効性を維持することができる、凍結乾燥組成物及び方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】本発明によるアニオン性薬物とカチオン性化合物の複合体が封入された高分子ナノ粒子送達システムの概略的な構造を示した図である。
【実施例】
【００５８】
以下の実施例を参照して、本発明を以下により詳細に説明する。しかしながら、下記実施例は、本発明を下記の実施例を説明するためだけのものであり、本発明の範囲はそれによっていかなる方法でも限定されない。
【００５９】
［製造例］ＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（ｄｉｏ−ＴＥＴＡ）／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ含有高分子ナノ粒子の製造
ＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡ５μｇを蒸溜水９４．５２μＬに溶解させ、ｄｉｏ−ＴＥＴＡ９４．５２μｇを９４．５２μｌの２０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．６）に溶解させ、超音波処理した状態で溶液を滴下混合した。得られた混合物を凍結乾燥して、粉末状にし、その粉末を酢酸エチル１０μＬに溶解させた。そこに、ＰＬＡＮａ３００μｇを酢酸エチル１５μＬに溶解させた溶液、ＤＯＰＥ１０４．２μｇを酢酸エチル５．２μＬに溶解させた溶液、ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール１０００μｇを酢酸エチル２０μＬに溶解した溶液を順に添加し、混合した。得られた混合物を蒸溜水１００μＬに滴下しながら、超音波粉砕機を用いて複合エマルジョンを製造した。製造した複合エマルジョンを１口丸底フラスコに入れ、ロータリーエバポレーターで減圧蒸留して酢酸エチルを選択的に除去し、ｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラアミド（ｄｉｏ−ＴＥＴＡ）／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮＡ／ＤＯＰＥ含有高分子ナノ粒子を製造した。
【表１】
2021503461.tif 000012
【００６０】
［実施例１〜４］ＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（ｄｉｏ−ＴＥＴＡ）／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／ソルビトール含有高分子ナノ粒子の凍結乾燥製剤の製造
製造例で製造した高分子ナノ粒子の濃度をｓｉＲＮＡ１００ｎｇ／μＬに固定し、ソルビトールを添加し、超低温フリーザーで凍結させた後、凍結乾燥を行った。凍結乾燥条件は、下記表２に示す通りである。
【表２】
2021503461.tif 000013
【００６１】
凍結乾燥粉末に、室温の滅菌蒸溜水を添加し、振とうして粉末を溶解させ、ｓｉＲＮＡ／ｄｉｏ−ＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＤＯＰＥ／ソルビトール含有組成物を製造した。
【表３】
2021503461.tif 000014
【００６２】
［比較例１〜３］ＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（ｄｉｏ−ＴＥＴＡ）／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／トレハロース含有高分子ナノ粒子の凍結乾燥製剤の製造
抗凍結剤としてトレハロースを用いることにより、ｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／トレハロース含有高分子ナノ粒子を実施例１と同様の方法で製造した。
【表４】
2021503461.tif 000015
【００６３】
［比較例４］ＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（ｄｉｏ−ＴＥＴＡ）／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／マンニトール含有高分子ナノ粒子の凍結乾燥製剤の製造
抗凍結剤としてマンニトールを用いることにより、ｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／マンニトール含有高分子ナノ粒子を実施例１と同様の方法で製造した。
【表５】
2021503461.tif 000016
【００６４】
［比較例５］ＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（ｄｉｏ−ＴＥＴＡ）／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／スクロース含有高分子ナノ粒子の凍結乾燥製剤の製造
抗凍結剤としてスクロースを用いることにより、ｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／スクロース含有高分子ナノ粒子を実施例１と同様の方法で製造した。
【表６】
2021503461.tif 000017
【００６５】
［比較例６］ＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡ／１，６−ジオレオイルトリエチレンテトラミド（ｄｉｏ−ＴＥＴＡ）／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／グルコース含有高分子ナノ粒子の凍結乾燥製剤の製造
抗凍結剤としてグルコースを用いることにより、ｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／グルコース含有高分子ナノ粒子を実施例１と同様の方法で製造した。
【表７】
2021503461.tif 000018
【００６６】
［実験例１］ｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／抗凍結剤含有高分子ナノ粒子のサイズ測定と安定性の比較（ヘパリン競争分析法）
サイズ測定を、種々の抗凍結剤を用いて製造した高分子ナノ粒子について行った。粒子のサイズは、動的光散乱（ＤＬＳ）法を使用して測定した。具体的には、光源としてＨｅ−Ｎｅレーザーを使用し、ＭＡＬＶＥＲＮ社のＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ９０装置をマニュアルに従って操作した。
【００６７】
また、抗凍結剤の種類に応じた高分子ナノ粒子のｉｎ  ｖｉｔｒｏ安定性を評価するために、ヘパリン競争分析を行った。製剤１０μＬ（ｓｉＲＮＡ３００ｎｇ）にヘパリン４０μｇを処理し、室温で１０分間反応させた後、電気泳動で分解したｓｉＲＮＡを測定した。ｓｉＲＮＡの分解度が低いほど、製剤の安定性が高いことを示す。さらに、製剤自体を電気泳動に供して、製剤中にの未封入のｓｉＲＮＡを測定した。
【００６８】
種々の抗凍結剤を用いて製造した実施例２と比較例１、４〜６についての未封入ｓｉＲＮＡ、粒子径、ｓｉＲＮＡの分解度の測定結果を下記表８に示す。
【表８】
2021503461.tif 000019
【００６９】
表８から分かるように、トレハロース又はマンニトールを用いた場合、未封入ｓｉＲＮＡの量が多くなり、スクロースを用いた場合、ｓｉＲＮＡの分解度が高かった。従って、トレハロース、マンニトール及びスクロースは、適切な抗凍結剤ではないことが確認できた。
【００７０】
抗凍結剤の中で、種々の量のソルビトール又はトレハロースを用いて製造した実施例１〜４及び比較例１〜３の分析結果を下記表９に示す。
【表９】
2021503461.tif 000020
【００７１】
表９から分かるように、トレハロースを用いたい場合、未封入ｓｉＲＮＡの量が多くなり、トレハロースの量が多いほどｓｉＲＮＡの分解度が高くなった。従って、トレハロースは適切な抗凍結剤ではないことが確認できた。
【００７２】
［実験例２］ｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／抗凍結剤含有高分子ナノ粒子の細胞有効性及び毒性の比較
製造例、実施例２〜４及び比較例１及び６で製造したｓｉＲＮＡ／ｄｉｏＴＥＴＡ／ｍＰＥＧ−ＰＬＡ−トコフェロール／ＰＬＡＮａ／ＤＯＰＥ／抗凍結剤含有高分子ナノ粒子に対して、肺癌細胞株であるＡ５４９へのｓｉＲＮＡの送達効率をｍＲＮＡレベルで確認した。細胞を５０００細胞ウェル／ウェルの濃度で９６ウェル細胞培養プレートに播種した。２４時間後、各ウェルで約５０〜６０％の細胞が均一に増殖していることを確認した。次に、ウェル内の培地を除去し、最終容量の１０％の血清を含む９０μＬの新鮮な培地を添加した。細胞培養液に、製造例、実施例２〜４及び比較例１及び６の組成物を、ｓｉＲＮＡが４００ｎＭ、２００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、５ｎＭ、０．５ｎＭ、０．０５ｎＭの濃度になるように加えた。細胞を３７℃、５％ＣＯ２の培養器で４８時間培養し、培地を除去した後、細胞溶解混合物１００μＬを添加し、５０℃で１８時間反応した。その後、ｍＲＮＡ発現評価のために、Ｂｒａｎｃｈｅｄ  ＤＮＡ  ａｓｓａｙ（ｂＤＮＡ、Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ２．０アッセイキット、Ｐａｎｏｍｉｃｓ、ＱＳ０００９）を使用した。プロトコルに従い、２．０基質を添加し、室温で５分間反応させた後、マイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ）を用いて蛍光発現量を測定した。また、細胞内毒性分析のために、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ−Ｇｌｏ発光細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ、Ｇ７５７１）を用いた。プロトコルに従い、室温で細胞プレートに分析サンプル（１００μｌＬ）と細胞力価測定試薬（１００μＬ）を添加し、３０分間反応させた後、マイクロプレート蛍光リーダー（Ｂｉｏ−Ｔｅｋ、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ）を用いて値を測定した。細胞株に対する有効性と毒性を評価した結果は下記表１０に示す。
【表１０】
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【００７３】
表１０から明らかように、凍結乾燥後は、凍結乾燥前と比較してＬＣ５０が増加し、ＩＣ５０が減少するため、凍結乾燥により毒性が低下し、有効性が向上する傾向がみられた。ＬＣ５０／ＩＣ５０を計算した結果、ソルビトール２．５ｍｇ＞ソルビトール５ｍｇ＞ソルビトール１０ｍｇ＞グルコース２．５ｍｇ＞トレハロース２．５ｍｇ順に有効性を示した。
【図１】
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【国際調査報告】
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