(57)【要約】  本発明は、少なくとも１種のアンチセンス分子を含む組成物を吸入によって投与するための、前記組成物のエアロゾルを発生させるエアロゾル発生機器の使用に関する。エアロゾル発生機器は穿孔を有する膜を備え、エアロゾルを発生させるための組成物が膜と接触して、エアロゾル発生機器の膜が振動する。穿孔は少なくとも１つの流路孔群で形成され、１つの流路孔群の各流路孔は最も狭い箇所で３μｍ以上、５μｍ以下の直径を有し、少なくとも１つの流路孔群は膜１ｍｍ２につき最大で５００個の流路孔を有する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
吸入により組成物を投与するための、前記組成物のエアロゾルを発生させるエアロゾライザーの使用であって、
・前記組成物が、少なくとも１種のアンチセンス分子を含み、
・前記エアロゾライザーが、穿孔のある膜を有し、
・前記エアロゾルを発生させるための前記組成物が、前記膜と接触し、前記エアロゾライザーの前記膜が振動し、
・前記穿孔が、少なくとも１つの流路群によって形成され、
・１つの流路群の各流路が、最も狭い箇所で３μｍ以上で５μｍ以下の直径を有し、少なくとも１つの流路群が、前記膜１ｍｍ２につき最大で５００個の流路を含む、
エアロゾライザーの使用。
【請求項２】
前記膜が、前記膜を振動させる圧電素子を有することを特徴とする、請求項１に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項３】
前記膜の流路が、円柱状であることを特徴とする、請求項１または２に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項４】
前記穿孔の流路が、円錐状であって、各円錐状流路の直径が、前記エアロゾルが前記穿孔から発出する部分の方向に縮小していくことを特徴とする、請求項１または２に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項５】
前記膜の前記穿孔が、少なくとも２つの群の流路を有することを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項６】
前記膜が、６ｍｍから８ｍｍの直径を有することを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一項に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項７】
前記膜が、少なくとも１種の金属を含む材料から製作され、前記金属が、特には、ステンレススチール、ニッケル、パラジウム、コバルト、ラストフリースチールからなる群のうちの１成分である金属および／または前記成分のうちの少なくとも２種の合金である金属であることを特徴とする、請求項１〜６のいずれか一項に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項８】
前記組成物が、７５ｍｇ／ｍｌ未満のアンチセンス分子濃度を有することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項９】
前記組成物が、２０ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのアンチセンス分子濃度を有することを特徴とする、請求項８に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項１０】
前記組成物が、３．５ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項１１】
前記流路群が、前記膜１ｍｍ２につき最大で３５０個の流路を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項１２】
前記流路群が、前記膜１ｍｍ２につき最大で２００個の流路を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項１３】
前記流路群が、前記膜１ｍｍ２につき最大で５０個の流路を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項１４】
前記組成物が、ＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡ、ａｓＤＮＡ、またはリボザイムを含む群から選択される少なくとも１種のアンチセンス分子を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項１５】
前記組成物が、ＧＡＴＡ−３の発現を特異的に減少させる少なくとも１種のアンチセンス分子、またはＴｂｅｔの発現を特異的に減少させる少なくとも１種のアンチセンス分子を含み、前記アンチセンス分子が、ＤＮＡザイムｈｄｇ１からｈｄｇ７０を含む群、またはＤＮＡザイムｔｄ１からｔｄ７８を含む群から選択されることを特徴とする、請求項１４に記載のエアロゾライザーの使用。
【請求項１６】
前記少なくとも１種のアンチセンス分子が、ｈｄｇ４０配列（ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧ）を有するＤＮＡザイムであることを特徴とする、請求項１５に記載のエアロゾライザーの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アンチセンス分子含有組成物を吸入によって投与するための、アンチセンス分子含有組成物のエアロゾルを発生させるエアロゾライザーの使用に関する。本発明は、より詳細には、請求項１に記載の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
他に明記しない限り、用語「発現」および「遺伝子発現」は、以後同義的に使用される。さらに用語「エアロゾル」は、以後、気体中または空気中の固体または液体の粒子の混合物を指し、一方、用語「ミスト」は、空気中にある微細に分散した液体のしずくを指す。
【０００３】
気道の炎症は最も頻繁に起こる呼吸器疾患である。これはしばしば慢性炎症につながる。そのような炎症の一例にはアレルギーがあり、花粉、獣毛、食品、ダニ類、防腐剤、染料、洗剤等、通常ヒトに対し無害である抗原に対する著しく不相応な免疫応答によって引き起こされる。慢性炎症につながる他の典型的な呼吸器疾患には、例えば喘息や慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）などの自己免疫性疾患がある。初期の炎症反応から慢性炎症への進行には、破壊と修正のプロセスが関係する。結果としては、耐性の喪失、つまり内在性細胞、共生性原因物質、さして重要でないアレルギー原を攻撃しない能力の喪失である。
【０００４】
免疫応答には自然免疫系と獲得免疫系との両方の要素が関係する。この観点において、特に、Ｔｈ１細胞の特異的発生を調節するＴｈ１細胞特異的転写因子Ｔｂｅｔ、およびＴｈ２細胞の特異的発生を調節するＴｈ２細胞特異的転写因子ＧＡＴＡ−３が重要な役割を果たす。
【０００５】
健康体ではＴｈ１細胞とＴｈ２細胞との間は平衡状態にある。この平衡状態はある特定の作用によって妨害されることがある。例えば慢性炎症の場合では、Ｔｈ１細胞とＴｈ２細胞との間の平衡状態は、ＧＡＴＡ−３の発現および／またはＴｂｅｔの阻害によってＴｈ２細胞寄りに移行する。Ｔｈ２細胞が支配的となり、これは多くの後期の慢性炎症疾患に特徴的である。
【０００６】
他の場合として、ＧＡＴＡ−３の阻害がある場合、またはＴｂｅｔの発現がＴｈ１細胞濃度の上昇を引き起こす場合、Ｔｈ１細胞が支配的になる。
【０００７】
そこで１つの治療方法として、Ｔｈ１細胞またはＴｈ２細胞が支配的になる場合に、転写因子ＧＡＴＡ−３および／またはＴｂｅｔをそれぞれ特異的に阻害する、または「スイッチオフする」方法がある。この方法でこれら２種類の細胞間の平衡状態を修復することが可能ある。ここで１つの可能性として、例えば適切なアンチセンス分子の使用を通じた、転写因子ＧＡＴＡ−３またはＴｂｅｔそれぞれの遺伝子発現に対する標的を定めた阻害がある。
【０００８】
特許文献１は、ＤＮＡザイムの形態での様々なＧＡＴＡ−３特異的またはＴｂｅｔ特異的アンチセンス分子の作用機序について記載している。したがって、特許文献１の開示内容は、本発明に対する技術的な背景としてみなされる。
【０００９】
特に呼吸器疾患の場合、各活性成分は吸入によって投与される。「吸入」とは、エアロゾルまたは気体状活性成分の吸入れを指す。吸入は、肺の様々な部位への直接的な接近を可能にする、確立された方法である。この方法により、活性成分の肺内薬物投与および経肺薬物投与が可能である。肺または肺内標的細胞による、吸入を介して薬物を服用するという選択肢は、薬物の効果において１つの重要な要素となっていることがある。この観点において諸要素の中で役割を果たすものは、吸入される粒子の径である。この径はＭＭＤ（「質量中央径」）またはＭＭＡＤ（「空気動力学的中央粒子径」）を用いて特徴付けられる。
【００１０】
多数の公知の吸入器があるが、３種類の機器が一般的に使用されており、各々がその働きによって異なる：定量吸入器、ドライパウダー吸入器、および特にエアロゾライザー。基本的に卓上機器が不都合なことは、使用する際に肺内への標的噴霧がないことから明白である。患者が吸い込む液滴の量は、代わりに、患者の呼吸動作に依存する。
【００１１】
エアロゾライザーは、ネブライザーとも呼ばれるが、液体貯蔵容器や溶剤から微細な液滴（以下しずくまたは粒子とも呼ばれる）を分散する。これによって患者が吸入することができるエアロゾルが形成される。ネブライザーは３つの機能的要素によって分類される。ジェット式ネブライザーでは、強い空気流がノズルで圧力を作り出し、キャピラリーシステムから液滴を引き出す。液滴の径が異なるため、大きすぎる液滴を留めるためにバッフルプレートを使用する。
【００１２】
超音波式ネブライザーでは、液滴は超音波によって発生する。超音波の振動数が大きければ大きいほど、液滴はより微細になる。
【００１３】
膜式ネブライザーは、多数の微小孔または流路を有する非常に薄い膜を備えており、１つの膜は優に１千を超えるような流路を有することができる。膜が振動し、それによって各流路はポンプとして作用して、規定のＭＭＡＤを有する液滴を産出する。
【００１４】
一般にアンチセンス分子は、通常は一本鎖のＲＮＡおよび／またはＤＮＡオリゴヌクレオチドで構成されるか、少なくとも１種のこのようなオリゴヌクレオチド成分を有するかの、いずれかの分子であると理解される。オリゴヌクレオチドとは、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）で使用されるプライマーなど、数個のヌクレオチドで構成される分子である。アンチセンス分子は、通常、その塩基配列が細胞性、ウイルス性、または合成のＲＮＡ分子またはＤＮＡ分子に対し相補的であるオリゴヌクレオチドを有し、ワトソン・クリック塩基対を通じてこれら分子に結合することができる。この特性は、例えば任意の標的ｍＲＮＡの機能を阻害する目的で、アンチセンス分子と例えば標的ｍＲＮＡとの特異的結合を通じて利用することができる。研究と治療との両方の用途において、アンチセンス分子は、遺伝子の発現に対する標的を定めた減衰または完全な抑制を達成するために使用される。核酸に基づかずに構成されるアンチセンス分子も長年知られている。そしてこのような分子類は一般に、その塩基対形成の能力の点において本物の核酸と競合する、核酸アナログを含む。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１５】
【特許文献１】国際公開第２００５／０３３３１４Ａ２号
【発明の概要】
【００１６】
現在のところ、アンチセンス分子を含有する組成物については、慢性炎症を伴う呼吸器疾患を患う患者の吸入治療のためのエアロゾライザーを介した、このような組成物の使用に関する適切な公知の統制条件やパラメーターはない。それどころか、アンチセンス分子含有組成物の使用において、アンチセンス分子含有組成物またはその溶液が高い粘度を有するため、使用するある特定エアロゾライザーの膜が短時間後に閉塞する現象を認めることとなる可能性がある。
【００１７】
したがって、慢性炎症を伴う呼吸器疾患を患う患者を治療する目的のために、アンチセンス分子含有組成物を吸入によって投与することができるエアロゾライザーの使用を可能にすることが、本発明の目的である。より詳細には、アンチセンス分子含有組成物をエアロゾライザーを用いて単純に、確実に、再現性良く投与することと、規定の方法で微粒化することとは可能なはずである、ということを意図するものである。
【００１８】
この目的は、本発明においては、エアロゾルを発生させるエアロゾライザーの使用、およびこれに対応して適合する、吸入による投与のための組成物の使用によって達成され、組成物は少なくとも１種のアンチセンス分子を含み、エアロゾルを発生させるための組成物は膜と接触してエアロゾライザーの膜が振動し、穿孔は少なくとも１つの流路群によって形成され、１つの流路群の各流路は最も狭い箇所で３μｍ以上で５μｍ以下の直径を有し、少なくとも１つの流路群は膜１ｍｍ２につき最大で５００個の流路を含む。アンチセンス分子含有組成物は、より詳細には、液体または溶液である。好ましくは、膜の各流路は最も狭い箇所で３μｍ以上、５μｍ以下の直径を有する。この場合、流路または微小孔は異なる幾何学的形状を有することができる。これらは例えばスリット入り、角ばった形状、または楕円形であってもよく、孔形状を有してもよい。膜に使用される微小孔とは、ここでは具体的には孔のことであり、各膜には少なくとも１００個の微小孔または流路が存在する。さらに、膜は圧電素子によって励起し、周期的変動をする。アンチセンス分子は、ＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡ、ａｓＤＮＡ、またはリボザイムを含む群から選択される。本明細書に関して、アンチセンス分子としてＤＮＡザイムを使用することが好ましい。しかし代替方法として、アンチセンス分子を、ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＰＴＯ）、２’−フルオロ−ＲＮＡ、ＦＡＮＡ、２’−Ｏ−メチルオリゴヌクレオチド、２’−Ｏ−メトキシエチルオリゴヌクレオチド、束縛エチルオリゴヌクレオチド（ｃＥｔ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ，４’−Ｃ−エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルフォリノ、Ｕｇｉｍｅｒ、三環系ＤＮＡ、ＤＮＡプライマー、またはアプタマーを含む分子の群から選択してもよい。
【００１９】
本発明のエアロゾライザーの使用による重要な利点は、アンチセンス分子含有組成物を約４μｍのＶＭＤ  ＭＶ（体積中位径）を有する粒子のエアロゾルに転換できることである。大きい粒子による衝撃力のため、５μｍより小さい粒子のエアロゾルのみが中気道および下気道内の慢性炎症に到達することができ、その結果、対応するアンチセンス分子、具体的にはＤＮＡザイムが作用部位に到達し、その部位で治療効果を発揮する。したがって、吸入を通じて粘着性アンチセンス分子含有組成物を投与する、有効、単純、および確実な方法が提供される。
【００２０】
本発明における各微小孔が３μｍから５μｍの直径を有する振動膜を備えるエアロゾライザーの使用により、一般に高い粘度を有するアンチセンス分子含有組成物を、治療学的に有効で吸入可能なエアロゾルに確実に転換することが可能である。さらに本発明に従った使用によって、患者が常に、規定の用量の活性成分をエアロゾライザーの起動事象ごと、または吸入局面ごとに受け取ることが可能になる。したがって、アンチセンス分子含有組成物を安全に、確実に、および再現性良く投与することができるのである。
【００２１】
流路群が、膜１ｍｍ２につき最大で５００個の流路を含むという特徴は、３μｍ以上、５μｍ以下の直径を有する流路による液滴形成に有利な効果をもたらす。すなわち、アンチセンス分子含有組成物を約４μｍのＶＭＤ  ＭＶを有する粒子のエアロゾルに転換することができるのである。一方、流路が１ｍｍ２あたり５００個より多い孔密度を有する膜は、液滴または粒子が膜の流路からの発出直後に融合、凝集、または結合してより大きな粒子を形成することとなるおそれがある。これは、粒子またはしずくが衝撃力のため、対象とする作用部位に到達しない、またはせいぜい低い程度までにしか到達しないという欠点を有することになるだろう。したがってアンチセンス分子、具体的にはＤＮＡザイムが、慢性炎症が存在する部位でその治療効果を発揮することは不可能であろう。逆に、本発明における１ｍｍ２につき最大で５００個の流路を有する膜を備えるエアロゾライザーの使用によって、粘着性アンチセンス分子含有組成物を吸入を通じて投与する、有効、単純、および安全な方法がもたらされる。さらに膜の振動によって、好ましい径の液滴のエアロゾルを形成するための、組成物の微粒化が促進される。
【００２２】
このエアロゾライザーは、緊急事態でも使用できる携帯型の簡便な機器であることが好ましい。ケーブル経由、１つまたは複数の電池経由、または電磁誘導によってエネルギーが器具に供給される。さらに本発明に従った使用の結果、発生するアンチセンス分子含有組成物のエアロゾルには、有害なガス状噴霧剤はない。
【００２３】
列挙した使用により、体の他の部位の副作用の危険性は低下し、さらにアンチセンス分子の局所的に標的を定めた活性により、必要な一投与ごとの活性成分の用量は、非特定的投与形態の場合よりも少ない。
【００２４】
さらに、例えば患者観察および法令遵守をモニターするために、エアロゾライザーが例えばブルートゥース（登録商標）などチップ技術を有することは可能である。
【００２５】
さらに有利な一展開によれば、膜を、この膜を振動させる圧電性結晶または振動子と結合させることは可能である。この実施形態によって、膜が１０ｋＨｚから１５０ｋＨｚの振動数で振動することが好ましいことが認められる。振動によって、膜は、上下に数マイクロメーター動いて、アンチセンス分子含有組成物をエアロゾルとしてエアロゾライザーの出射口の方向に圧力をかけることによって「マイクロポンプ」のように作用する。
【００２６】
本発明においては、流路は円錐状であることが可能であり、この場合、各円錐状流路の直径は、エアロゾルが流路から発出する部分の方向に縮小していく。この実施形態により、エアロゾルにおける最大かつ均一の径の液滴が確実となる。
【００２７】
また膜内の穿孔が、少なくとも２つの流路群を有することも有利である。
【００２８】
エアロゾライザーの使用に関して特に好ましい別形態では、膜は１ｍｍから８ｍｍの直径を有し、特に好ましくは６ｍｍから８ｍｍの直径を有する。さらなる有利な実施形態では、膜はシリコンおよび／または少なくとも１種の金属を含む材料から製作され、この金属は、特には、ステンレススチール、ニッケル、パラジウム、コバルト、ラストフリー（ｒｕｓｔ−ｆｒｅｅ）スチールからなる群のうちの１成分の金属、および／またはこれら少なくとも２種の成分の合金である。ラストフリースチールまたはニッケルから製作される膜が特に好ましい。さらに穿孔処理されたエアロゾライザーの膜は、円形、楕円形、または角形状であってもよい。このような材料から製作される膜の使用により、高い安定性が膜にもたらされる。同時に、このような膜は製作するのに好都合である。さらに、このような膜を備えるエアロゾライザーは頑丈であり、よって長寿命である。
【００２９】
さらに、アンチセンス分子含有組成物が７５ｍｇ／ｍｌ未満のアンチセンス分子濃度を有する場合が有利である。したがって慢性炎症を伴う呼吸器疾患を患う患者の治療において、これを吸入による投与に理想的に使用することができる。これは特に、７５ｍｇ／ｍｌを超えるアンチセンス分子濃度の組成物が非常に高い粘度を有し、膜内の穿孔の流路がこの高い粘度のために容易に詰まることから、エアロゾライザーを使用してエアロゾルとしてアンチセンス分子を投与することは困難であるか、不可能でさえあることによる。さらに７５ｍｇ／ｍｌを超えるアンチセンス分子濃度を有する組成物では、約６％の活性成分を喪失する。これは互いに容易に会合して重合体構造を形成する、アンチセンス分子の三次元構造による。この性質は、特にＤＮＡザイムに生じることが認められる。
【００３０】
したがって、アンチセンス分子含有組成物が２０ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのアンチセンス分子濃度を有する場合が特に有利である。２０ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのアンチセンス分子濃度を有する組成物は、本発明に従ったエアロゾライザーの使用に関しては最適な活性効果を示す。
【００３１】
３．５ｍＰａ・ｓ未満の粘度を有するアンチセンス分子含有組成物も可能である。３．５ｍＰａ・ｓを超える粘度を有する組成物の場合、エアロゾライザーがこの組成物の微粒化またはミスト化に必要な圧力を発出することは容易に可能なことではない。その結果、膜内の流路または孔は詰まるか塞がれる。この危険性は、７５ｍｇ／ｍｌ未満のアンチセンス分子濃度の組成物によって顕著に最小化される。このような粘度の組成物は、本発明に従った使用を通じた吸入によって問題なく、また活性成分の大きな喪失なく、投与することができる。
【００３２】
本発明のエアロゾライザーの使用に関する好ましい別形態では、流路群は膜１ｍｍ２につき最大で２００個の流路を含む。特に好ましい別形態では、流路群は膜１ｍｍ２につき最大で５０個の流路を含む。１ｍｍ２につき流路２００個までの、または５０個までの孔密度限度により、孔密度の有利な効果は強化され、これにより流路からの発出後の液滴の融合、凝集、または結合が防止される。したがって本発明の１ｍｍ２につき最大２００個または最大５０個の流路を有する膜を備えるエアロゾライザーの使用は、吸入により粘着性のアンチセンス分子含有組成物を投与する有効、単純、および安全な方法を可能にする。
【００３３】
有利な一使用形態によれば、組成物は、ＤＮＡザイム、ｓｉＲＮＡ、ａｓＤＮＡ、またはリボザイムを含む群から選択される、少なくとも１種のアンチセンス分子を含む。より詳細には、この少なくとも１種のアンチセンス分子は、ＧＡＴＡ−３の発現を特異的に減少させる、またはＴｂｅｔの発現を特異的に減少させることが可能である。このアンチセンス分子はＤＮＡザイムであることが好ましい。この場合の特異的アンチセンス分子は、転写因子ＧＡＴＡ−３および／またはＴｂｅｔのｍＲＮＡにインビボで結合し、切断する。これら転写因子のタンパク質は、それぞれＴｈ１依存性またはＴｈ２依存性慢性炎症疾患の進行の中心的鍵分子である。このｍＲＮＡの切断の結果、もはやｍＲＮＡを機能性タンパク質に翻訳することはできない。したがって、ＧＡＴＡ−３タンパク質またはＴｂｅｔタンパク質の量は顕著に最小化される。
【００３４】
好ましい一実施形態によれば、少なくとも１種のアンチセンス分子はＤＮＡザイムである。より好ましくは、このＤＮＡザイムは、ＤＮＡザイムｈｄｇ１からｈｄｇ７０を含む群、またはＤＮＡザイムｔｄ１からｔｄ７８を含む群から選択される。特に好ましくは、このＤＮＡザイムはｈｄｇ４０配列（ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧ）を有する。このような配列は、特に高い酵素活性を示し、高特異性、高効率でＧＡＴＡ−３  ｍＲＮＡを切断する。したがって、Ｔｈ２依存性呼吸器疾患であり、よってＧＡＴＡ−３値の上昇に呼応する呼吸器疾患に対する標的を定めた有効な治療に、ｈｇｄ４０配列（配列番号４０）を有するＤＮＡザイムは顕著に適している。有利な一展開によれば、アンチセンス分子含有組成物は少なくとも１種のヌクレアーゼ阻害剤を含むことができる。この場合、より詳細には、この少なくとも１種のヌクレアーゼ阻害剤は特異的にデオキシリボヌクレアーゼを不活性化することから、ＤＮアーゼ阻害剤である。このようなヌクレアーゼ阻害剤は、少なくとも１種のＤＮＡザイムをＤＮアーゼによる酵素的分解から保護する。
【００３５】
アンチセンス分子含有組成物の一例を下記表に示す。
2021532861.tif 000003
【００３６】
加えて、アンチセンス分子含有組成物は、少なくとも１種の塩および／または少なくとも１種のカチオンを含むことが可能である。このような組成物は、生理学的に好ましい溶媒を結果的に有し、そのため患者に容易に許容されることから、慢性炎症を伴う呼吸器疾患を患う患者の治療用途に有利に適している。この観点から、より詳細にはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）溶液が提供される。
【００３７】
しかし代わりに、例えばＴＥ緩衝剤など生理学的に好ましい溶媒に核酸を溶解して含有する、他の緩衝溶液も使用される。したがって、好ましくは、化合物である塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、塩化カリウム（ＫＣｌ）、リン酸水素二ナトリウム（Ｎａ２ＨＰＯ４）、リン酸水素二ナトリウム二水和物、リン酸二水素カリウム（ＫＨ２ＰＯ４）、ＴＲＩＳ、およびＥＤＴＡを含む群から選択される、有機および／または無機の添加剤が提供される。この場合、カチオンはＮａ、Ｍｇ、Ｋ、Ｌｉ、Ｃａ、Ｆｅ、Ｃｕ、およびＡｇを含む群から選択することができる。あるいは、例えばＭｇ（Ｎ（ＳＯ２ＣＦ３）２）２またはＭｇ（ＯＳＯ２ＣＦ３）２などの有機カチオンも同様に提供される。あるいは二価カチオンを使用する。有機および／または無機の添加剤がアンチセンス分子を安定させて酵素による分解からアンチセンス分子を保護することから、このような緩衝がある組成物は、アンチセンス分子の保護に特に適している。さらに、塩はこの組成物を標的細胞の内部へ吸収させる。二価カチオンは、アンチセンス分子が二価カチオン（好ましくはＭｇ２＋）に依存する触媒ドメインを有することから、アンチセンス分子活性を促進する補助因子として作用することができる。したがって二価カチオンは、「エンハンサー」またはブースターとして作用する。有利な一展開によれば、アンチセンス分子含有組成物は、少なくとも１種の有機および／または無機の添加剤、および／または溶解剤、および／または防腐剤を含んでもよい。この場合、溶解剤は特に錯体形成に対して使用される。さらに溶解剤は、組成物の溶媒特性を向上させる。提供される溶解剤は、好ましくはグリセロール誘導体、および／またはポリエチレングリコール、またはその他レシチンでもよい。防腐剤は、例えばパラベンでもよい。
【００３８】
アンチセンス分子含有組成物に添加可能な成分名は、以下の通りである。
2021532861.tif 000004
【００３９】
さらに、例えばアンチセンス分子含有組成物の表面張力を変化させる効果、または粘度を低減させる効果を有する、添加剤も提供することができる。
【００４０】
特に、慢性炎症を伴う呼吸器疾患を患う患者の治療における、アンチセンス分子含有組成物のエアロゾルを発生させる、吸入による投与のためのエアロゾライザーの使用に関して、上記の効果および利点が生じる。
【００４１】
本発明のさらなる特徴、詳細、および利点は、特許請求の範囲の文言ならびに以下例示的な実施形態および図からも明らかになるであろう。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
（実施例）
下記表１は、ＧＡＴＡ−３特異的ＤＮＡザイムｈｇｄ１〜７０をシークエンスプロトコルによるシークエンスＩＤで示すものである。
2021532861.tif 000005
2021532861.tif 000006
【００４３】
下記表２は、Ｔｂｅｔ特異的ＤＮＡザイムｔｄ１〜７８をシークエンスプロトコルによるシークエンスＩＤで示すものである。
2021532861.tif 000007
2021532861.tif 000008
【００４４】
ここで試験されたエアロゾライザーはそれぞれ、７５ｍｇ／ｍｌ未満のアンチセンス分子濃度を有する組成物を使用した。続いて、結果として生じたエアロゾルのしずくまたは液滴の径を確認した。
【００４５】
最初の試験で、圧電振動子なしで穿孔処理膜付きエアロゾライザーを試験した。これらのエアロゾライザーでは、慢性炎症を伴う呼吸器疾患を患う患者を治療するためのアンチセンス分子含有組成物を噴霧することは不可能であった。
【００４６】
この事例で、７５ｍｇ／ｍｌ未満のアンチセンス分子濃度を有する組成物を、膜内の流路の直径が３μｍ以上、５μｍ以下であり、かつこの膜の直径が６ｍｍから８ｍｍである振動膜を備えるエアロゾライザーと共に使用することを通じ、意外にも約４μｍのＶＭＤ  ＭＶを有する液滴のエアロゾルが形成されることが発見された。膜内の流路が詰まることはない。この現象は、特に２０ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌの間のアンチセンス分子濃度に観察することができる。
【００４７】
異なる材料（ラストフリースチール、ステンレススチール、ニッケル、パラジウム、コバルト、またはその合金）の穿孔処理膜を用いてエアロゾライザーを試験した。これらの材料は、例えばケイ素、二酸化ケイ素、窒化ケイ素の場合よりも、膜の製造において高い対費用効果があることが証明されている。
【００４８】
例えば漏斗状など、異なる膜流路形状／膜孔形状のエアロゾライザーを試験した。非常に良好な液滴形成が、特に円柱状および円錐状の流路に示された。これらの孔を膜内に作る技術（例えば平板印刷、レーザー切断など）は、当業者によく知られている。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本発明の実施形態による、アンチセンス分子含有組成物の粘度を、アンチセンス分子濃度の関数としたグラフである。
【図２】本発明の実施形態による、アンチセンス分子濃度に応じた、アンチセンス分子含有組成物の粘度測定結果である。
【図３】本発明の実施形態による、異なるアンチセンス分子濃度を有するアンチセンス分子含有組成物の、ＦＡＴ（工場受入試験（ｆａｃｔｏｒｙ  ａｃｃｅｐｔａｎｃｅ  ｔｅｓｔ））の測定結果である。
【図４】本発明の実施形態による、２０ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍｇ／ｍｌのアンチセンス分子濃度を有するアンチセンス分子含有組成物の、ＦＡＴの測定結果である。
【図５】本発明の実施形態による、異なる穿孔の膜を備える様々なエアロゾライザーを用いた、アンチセンス分子含有組成物の測定結果である。
【００５０】
図１は、アンチセンス分子含有組成物の粘度を、アンチセンス分子濃度の関数としたグラフである。提示された実施例においては、アンチセンス分子はＤＮＡザイムである。このＤＮＡザイムは、ＧＡＴＡ−３の発現および／またはＴｂｅｔの発現を特異的に減少させることができる。好ましい形態では、特にＤＮＡザイムｈｄｇ１からｈｄｇ７０を含む群またはＤＮＡザイムｔｄ１からｔｄ７８を含む群のアンチセンス分子が提供される。配列ＧＴＧＧＡＴＧＧＡｇｇｃｔａｇｃｔａｃａａｃｇａＧＴＣＴＴＧＧＡＧをもつＤＮＡザイムｈｇｄ４０を使用することが好ましい。ｈｄｇ４０はＧＡＴＡ−３の発現を特異的に阻害する。図１は、ｈｇｄ４０含有組成物の粘度の例示的なグラフである。図１のグラフのＹ軸に沿ってこの組成物の粘度がｍＰａ・ｓでプロットされており、Ｘ軸は組成物のＤＮＡザイム濃度をｍｇ／ｍｌで示す。このプロットから、ＤＮＡザイム含有組成物の粘度が実質的に指数関数的な増加をたどっていることは明白である。特に５０ｍｇ／ｍｌ以上の濃度で、粘度の急激な増加を観察することができる。粘度３．５ｍＰａ・ｓは、濃度が約７５ｍｇ／ｍｌであっても観察可能である。
【００５１】
図２は、調査するアンチセンス分子がＤＮＡザイムである場合の、アンチセンス分子濃度に応じたアンチセンス分子含有組成物の粘度測定結果である。表で提示された結果により、５０ｍｇ／ｍｌから１００ｍｇ／ｍｌの間のアンチセンス分子濃度を有するアンチセンス分子含有組成物の粘度が、指数関数的に増加することが実証される。ここで示された核酸濃度と粘度との間の相関関係は、別の二本鎖ＤＮＡ分子においては、これほど明白ではない。通常、二本鎖ＤＮＡ含有溶液の粘度は、ＤＮＡ濃度の増加と共に実質的に直線的な増加を示す。３．５ｍＰａ・ｓを超える粘度では、エアロゾライザーが到達しなければならないであろう圧力は高すぎる。この結果、膜内の流路または孔が詰まる、または塞がるおそれがある。この危険性は、組成物のアンチセンス分子濃度が７５ｍｇ／ｍｌ未満であると、このような組成物の粘度は３．５ｍＰａ・ｓ未満であることから、顕著に最小化される。
【００５２】
図３は、アンチセンス分子がＤＮＡザイムである場合の、具体的にはＤＮＡザイムｈｇｄ４０である場合の、異なるアンチセンス分子濃度を有する組成物のＦＡＴ（工場受入試験）測定結果の表である。ＦＡＴは製品の有用性を試験することを目的としている。表は、７５ｍｇ／ｍｌより高いアンチセンス分子濃度を有する組成物は、もはやこの試験のエアロゾライザーによって噴霧することができないことを示している（図３の表の３行目参照）。試験に先立ちアンチセンス分子濃度７５ｍｇ／ｍｌを有する組成物を除菌濾過した場合、このアンチセンス分子濃度は７５ｍｇ／ｍｌ未満に低下する。このようなＤＮＡザイム濃度を有する組成物は、試験で採用したエアロゾライザーを使用して噴霧することができる（図３の表の５および６行目参照）。ＦＡＴは粘度（ｄＰ／ｍｌ）をパーセントで報告している。ここで実施されたＦＡＴを通過するためには、粘度は５％未満でなければならなかったのである。図３の表の第２および第４行目の略称「ＷＦＩ」は、「注射用水（Ｗａｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）を指し、試験対照を意味する。したがって対照「ＷＦＩ」は、粘度１ｄＰ／ｍｌに相当する。
【００５３】
図４は、２０ｍｇ／ｍｌおよび５０ｍｇ／ｍｌのアンチセンス分子濃度を有する組成物それぞれに対する、ＦＡＴの測定結果である。ここで調査したアンチセンス分子は、具体的にはＤＮＡザイムを有する。結果は、このような組成物は、ＦＡＴに合格し、本発明に従った使用によって噴霧することができることを示す（図４の表の３、４、６、および７行目の「合格」参照）。
【００５４】
したがって図３および図４の測定結果は、アンチセンス分子含有組成物、より詳細には７５ｍｇ／ｍｌ未満のＤＮＡザイム濃度を有するＤＮＡザイム含有組成物は、ここで記載された特徴に従ったエアロゾライザーによるエアロゾルとして使用することができることを示している。よって本発明に従った使用は、慢性炎症を伴う呼吸器疾患を患う患者の治療に理想的に適する。この場合、２０ｍｇ／ｍｌから５０ｍｇ／ｍｌのアンチセンス分子濃度、つまりＤＮＡザイム濃度を使用することが好ましい。
【００５５】
図５は、試験したいくつかのエアロゾライザーの測定結果である。この測定結果は、本発明の特徴を有するエアロゾライザーが、アンチセンス分子含有組成物のエアロゾルを発生させるのに理想的に適していることを示す（図５、Ｂ〜Ｄ列）。図５に示した事例において、アンチセンス分子はＤＮＡザイムである。Ｂ〜Ｄ列の機器の場合、振動させたエアロゾライザー膜にこの組成物を接触させることによって、エアロゾルが形成される。本発明では、この膜は少なくとも１つの流路群により形成される穿孔を有し、この流路は最も狭い箇所で３μｍから５μｍの間の直径を有し（図５、セルＢ５、Ｃ５、およびＤ５）、この流路群は膜１ｍｍ２につき最大で５００個の流路を有する（図５、セルＢ６、Ｃ６、およびＤ６）。この場合、約４μｍの径を有する液滴または粒子が生成され（図５、セルＢ１１〜Ｂ１３、Ｃ１４、Ｄ１２、およびＤ１４）、その径は、慢性炎症を伴う呼吸器疾患を患う患者の治療のための、アンチセンス分子含有組成物のエアロゾルの発生に理想的であるとみなされる。膜の振動によって、好ましい径を有する液滴の形成が促進される。
【００５６】
流路が最も狭い箇所で３μｍ未満の直径を有する機器（図５、セル５Ａ）、または膜が１ｍｍ２につき５００個より多い流路を有する機器（図５、セル６Ａ）によって、５μｍＶＭＤ  ＭＶより大きい径の液滴のエアロゾルがもたらされる（図１２Ａ、１３Ａ、および１４Ａ）。この径の液滴は、衝撃力のために、対象とする作用部位に到達しない、または非常に低い程度までにしか到達しないという欠点を有する。したがってアンチセンス分子、具体的にはＤＮＡザイムが、慢性炎症が存在する部位でその治療効果を発揮することは不可能であろう。この理由の１つに孔密度がある。膜１ｍｍ２につき流路が５００個を超える孔密度により、結果として生じる液滴または粒子が流路からの発出直後に融合、凝集、または結合を起こし、より大きい粒子を形成する可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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