(57)【要約】  癌を発現する癌および感染を標的として処置するための組成物および方法が開示される。特に、形質転換されたおよび感染した細胞を標的とし殺すための養子細胞移植で使用することのできるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドが開示される。該ＣＡＲを発現するよう組換えられた、Ｔ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞といった免疫エフェクター細胞も開示される。したがって、本開示のＣＡＲを発現するように組換えられた本開示の免疫エフェクター細胞の養子移植を伴う、感染または癌を有する対象において免疫治療を提供する方法も開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＮＫＧ２Ｄエクトドメインおよび膜貫通ドメインを含み、細胞内シグナル伝達ドメインを含むが共刺激シグナル伝達領域は含まないか、または共刺激シグナル伝達領域を含むが細胞内シグナル伝達ドメインは含まない、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチド。
【請求項２】
ＮＫＧ２Ｄエクトドメインが、配列番号１との配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であるアミノ酸配列、または誘導された自己タンパク質を結合することのできる、その少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２もしくは１４３アミノ酸のフラグメントを含む、請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
共刺激シグナル伝達領域が、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３に特異的に結合するリガンド、およびその任意の組み合わせからなる群から選択される共刺激分子の細胞質ドメインを含む、請求項１または２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
ＣＡＲポリペプチドが、式：
ＳＰ−ＮＫＧ２Ｄ−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ；または
ＳＰ−ＮＫＧ２Ｄ−ＨＧ−ＴＭ−ＩＳＤ
［式中、
「ＳＰ」は、シグナルペプチドを表し、
「ＮＫＧ２Ｄ」は、ＮＫＧ２Ｄエクトドメインを表し、
「ＨＧ」は、任意に存在してもよいヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、２価リンカーを表す。］
で規定される、請求項１〜３のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項５】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜４のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれかに記載される組換えポリペプチドをコードする、単離された核酸配列。
【請求項７】
請求項６に記載される単離された核酸配列を含む、ベクター。
【請求項８】
第１のＣＡＲポリペプチドおよび第２のＣＡＲポリペプチドを発現する免疫エフェクター細胞であって、
第１のＣＡＲポリペプチドが、請求項１〜５のいずれかに記載されるＣＡＲポリペプチドであり、第２のＣＡＲポリペプチドが、第１のＣＡＲポリペプチドとは異なるリガンド結合標的を結合するものであり、
第１のＣＡＲポリペプチドが細胞内シグナル伝達ドメインを含み共刺激シグナル伝達領域を含まない場合、第２のＣＡＲポリペプチドが共刺激シグナル伝達領域を含み、
第１のＣＡＲポリペプチドが共刺激シグナル伝達領域を含み細胞内シグナル伝達ドメインを含まない場合、第２のＣＡＲポリペプチドが細胞内シグナル伝達ドメインを含み共刺激シグナル伝達領域を含まない、
細胞。
【請求項９】
第２のＣＡＲポリペプチドが、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３およびＣＬＥＣ１２Ａを含む群から選択される標的を結合する、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
免疫エフェクター細胞が、αβＴ細胞、γδＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、制御性Ｔ細胞、またはその任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項８または９に記載の細胞。
【請求項１１】
免疫エフェクター細胞が、第１のＣＡＲポリペプチドが標的細胞上の誘導された自己タンパク質を結合し、および第２のＣＡＲポリペプチドが標的細胞上のそのリガンド結合標的を結合したときに、抗腫瘍または抗ウイルス免疫を示す、請求項１０に記載の細胞。
【請求項１２】
対象において抗腫瘍または抗ウイルス免疫を提供する方法であって、請求項８〜１１のいずれかに記載される免疫エフェクター細胞を有効量で対象に投与することを含み、それによって該哺乳動物において抗腫瘍または抗ウイルス免疫を提供する、方法。
【請求項１３】
対象にチェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
チェックポイント阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはその組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年４月６日出願の米国仮出願第６２／６５３７２２号、および２０１８年６月１日出願の米国仮出願第６２／６７９４２９号の利益を主張し、その全体を引用により本書の一部とする。
【０００２】
配列表
本願は、２０１９年４月３日作成のファイル名「320103-2070_ST25」のASCII.txtファイルとして電子フォームで提出される配列表を含む。該配列表の内容は、その全体が本願に含まれる。
【背景技術】
【０００３】
手術、放射線療法および化学療法は、白血病、固形腫瘍および転移を包含する癌の治療のために受け入れられた標準的なアプローチである。従来の癌治療法の補助として、癌を直接的または間接的に縮小または消滅させるための、生体の免疫系を利用する免疫療法（しばしば、生物学的療法、バイオセラピー、または生物応答調節物質療法と称される）が、多年にわたり研究されている。ヒト免疫系は癌治療のための未開発の資源であり、免疫系の成分を活用して効果的な治療法を開発することができると考えられる。
【発明の概要】
【０００４】
癌およびウイルス感染細胞の標的化された処置のための組成物および方法を開示する。例えば、形質転換された、および感染した細胞を標的とし殺すために、養子細胞移植で用いることのできるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）ポリペプチドを開示する。本開示のＣＡＲポリペプチドは、エクトドメイン中に、ストレスを受けた、悪性形質転換された、および感染した細胞の表面上に現れるＭＩＣおよびＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰファミリーの誘導された自己タンパク質を結合することのできる標的化剤を含む。本開示のＣＡＲポリペプチドを発現するように組換えられた免疫エフェクター細胞も開示する。
【０００５】
いくつかの態様において、標的化剤は、ＭＩＣおよびＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰファミリーの誘導された自己タンパク質を結合することのできる、ＮＫＧ２Ｄタンパク質、またはＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメインの少なくとも一部を含むポリペプチド、を含む、ＮＫＧ２Ｄデコイである。
【０００６】
他のいくつかの態様において、標的化剤は、ＭＩＣおよびＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰファミリーの誘導された自己タンパク質を結合することのできる抗体である。例えば、標的化剤は、ＭＩＣおよびＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰファミリーの誘導された自己タンパク質を特異的に結合する抗体のＦａｂまたは一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）でありうる。
【０００７】
他のＣＡＲと同様に、本開示のポリペプチドは、免疫エフェクター細胞を活性化することのできる、膜貫通ドメインおよびエンドドメイン（endodomain）をも含みうる。例えば、エンドドメインは、シグナル伝達ドメインおよび／または１つもしくはそれ以上の共刺激シグナル伝達領域を含みうる。
【０００８】
さらに、本開示のＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲ、およびリガンド結合標的の異なる少なくとも１つの他のＣＡＲを含む、デュアル（dual）ＣＡＲ Ｔ細胞も開示する。この態様において、１つのＣＡＲはＣＤ３ζドメインのみを含むことができ、他のＣＡＲは共刺激ドメインのみを含むことができる。この態様において、デュアルＣＡＲ Ｔ細胞の活性化のためには、標的細胞において両方の標的が同時発現される必要がありうる。
【０００９】
したがって、いくつかの態様において、本開示のＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲポリペプチドは、不完全なエンドドメインを含む。例えば、ＣＡＲポリペプチドは、細胞内シグナル伝達ドメインと共刺激ドメインの両方ではなく一方のみを含むことができる。この態様において、それと、足りていないドメインを含む第２のＣＡＲポリペプチド（または内在性Ｔ細胞受容体）との両方がそれぞれの標的を結合しない限り、免疫エフェクター細胞は活性化されない。したがって、いくつかの態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインを含むが、共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）は含まない。他のいくつかの態様において、ＣＡＲポリペプチドは、ＣＤ２８、４−１ＢＢの細胞質ドメイン、またはその組み合わせを含むが、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメイン（ＳＤ）は含まない。
【００１０】
本開示のデュアルＣＡＲ Ｔ細胞は、本開示のＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲと、例えばＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３またはＣＬＥＣ１２Ａのようなリガンド結合標的の異なる少なくとも１つの他のＣＡＲを含むことができる。ＣＡＲは一般に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）に由来する抗原認識ドメインを、リンパ球活性化に関与する膜貫通シグナル伝達モチーフと共に含む（Sadelain M, et al. Nat Rev Cancer 2003 3:35-45）。したがって、追加のＣＡＲは、第２の標的、例えばＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３またはＣＬＥＣ１２Ａを結合する抗体を含むことができる。
【００１１】
いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）シグナル伝達ドメインである。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８、４−１ＢＢの細胞質ドメイン、またはその組み合わせを含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達領域は、１つまたはそれ以上の細胞内シグナル伝達および／または共刺激分子の細胞質ドメインを１、２、３または４個含む。いくつかの態様において、共刺激シグナル伝達領域は、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢの細胞質ドメインにおいて、シグナル伝達を向上する１つまたはそれ以上の変異を含む。
【００１２】
いくつかの態様において、本開示のＣＡＲは、Ｙ２０６および／またはＹ２１８におけるリン酸化が改変されたＣＤ２８細胞質ドメインの変異形態を含む共刺激シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様において、本開示のＣＡＲは、Ｙ２０６に、該ＣＡＲの活性を低下しうる減弱化変異を含む。いくつかの態様において、本開示のＣＡＲは、Ｙ２１８に、該ＣＡＲの発現を低下しうる減弱化変異を含む。減弱化を達成するために、該チロシンを任意のアミノ酸残基、例えばアラニンまたはフェニルアラニンで置換することができる。いくつかの態様において、Ｙ２０６および／またはＹ２１８のチロシンは、ホスホミメティック（phosphomimetic）残基で置換される。いくつかの態様において、本開示のＣＡＲは、該ＣＡＲの活性を高めうる、Ｙ２０６のホスホミメティック残基による置換を含む。いくつかの態様において、本開示のＣＡＲは、該ＣＡＲの発現を高めうる、Ｙ２１８のホスホミメティック残基による置換を含む。例えば、ホスホミメティック残基は、ホスホチロシンでありうる。いくつかの態様において、ＣＡＲは、同じＣＡＲの異なる残基における、ホスホミメティックアミノ酸とリン酸化可能でないアミノ酸による置換の組み合わせを含みうる。例えば、ＣＡＲは、Ｙ２０９および／またはＹ１９１におけるアラニンまたはフェニルアラニン置換と、Ｙ２０６および／またはＹ２１８におけるホスホミメティック置換とを含みうる。
【００１３】
いくつかの態様において、本開示のＣＡＲは、特定のＴＲＡＦタンパク質、例えば、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６、またはその任意の組み合わせに対する結合を高める変異を有する１つまたはそれ以上の４１ＢＢドメインを含む。いくつかの態様において、４１ＢＢ変異は、例えばＮＦ−κＢを介する、ＴＲＡＦ１および／またはＴＲＡＦ２に依存するＴ細胞の増殖および生存を高める。いくつかの態様において、４１ＢＢ変異は、例えばＩＲＦ７／ＩＮＦβを介する、ＴＲＡＦ３に依存する抗腫瘍効果を高める。いくつかの態様において、４１ＢＢ細胞質ドメインは、アミノ酸配列：
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号９）
を含み、ここで、ＴＲＡＦ結合に関与するこのドメインの領域を下線で示している。したがって、本開示のＣＡＲは、ＴＲＡＦ結合を高める、および／またはＮＦκＢシグナル伝達を高める、該下線部の配列における少なくとも１つの変異を有する４１ＢＢ細胞質ドメインを含むことができる。
【００１４】
また、本書に開示されるように、ＴＲＡＦタンパク質は、いくつかの態様において、ＣＡＲ Ｔ細胞機能を、ＮＦκＢおよび４１ＢＢに関係なく高めることができる。例えば、ＴＲＡＦタンパク質は、いくつかの態様において、Ｔ細胞におけるＣＤ２８共刺激を高めることができる。したがって、ＣＡＲを、１つまたはそれ以上のＴＲＡＦタンパク質、例えばＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、ＴＲＡＦ４、ＴＲＡＦ５、ＴＲＡＦ６またはその任意の組み合わせと同時発現する免疫エフェクター細胞も本書に開示する。いくつかの態様において、ＣＡＲは、腫瘍抗原を標的とする任意のＣＡＲである。例えば、第１世代のＣＡＲは典型的には、ＣＤ３ζ鎖に由来する細胞内ドメインを有したが、第２世代のＣＡＲでは、Ｔ細胞にさらなるシグナルを提供するために、ＣＡＲエンドドメインに、さまざまな共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインが付け加えられた。いくつかの態様において、ＣＡＲは４１ＢＢ活性化が向上された本開示のＣＡＲである。
【００１５】
本開示のＣＡＲポリペプチドをコードする単離された核酸配列、該単離された核酸を含むベクター、および該ベクターを含む細胞も開示する。例えば、細胞は、α−βＴ細胞、γ−δＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、Ｂ細胞、自然リンパ球（ＩＬＣ）、サイトカイン誘導性キラー（ＣＩＫ）細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、リンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞、および制御性Ｔ細胞からなる群から選択される免疫エフェクター細胞でありうる。免疫エフェクター細胞は、例えば、対象から得られた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）または骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）から得ることができる。
【００１６】
いくつかの態様において、細胞は、ＣＡＲのＮＫＧ２Ｄエクトドメインが腫瘍またはウイルス感染細胞に結合したときに免疫治療活性を示す。
【００１７】
感染または癌を有する対象に、本開示のＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲで組換えられた免疫エフェクター細胞を有効量で投与することを含む、該対象において抗腫瘍免疫を提供する方法も開示する。
【００１８】
本発明の１つまたはそれ以上の態様の詳細を、添付の図面および以下の記載において説明する。本発明の他の特徴、目的および利点は、以下の記載および図面ならびに特許請求の範囲から明らかになる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
正常細胞の表面においては全く存在しないかまたは低レベルでしか存在しないが、感染した、形質転換された、老化した、およびストレスを受けた細胞によって過剰に発現される誘導された自己タンパク質を特異的に認識することのできるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を開示する。ＣＡＲを発現するよう改変された免疫エフェクター細胞、例えばＴ細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞も開示する。したがって、本開示の免疫エフェクター細胞を用いる、対象に免疫治療を提供する方法も開示する。
【００２０】
ＣＡＲは通常、エクトドメイン、膜貫通ドメイン、およびエンドドメインの３つのドメインからなる。エクトドメインは、標的化剤を含み、誘導された自己タンパク質の結合に与る。それは場合により、ＣＡＲがグリコシル化され免疫エフェクター細胞の細胞膜に係留されうるように、シグナルペプチド（ＳＰ）をも含む。膜貫通ドメイン（ＴＤ）は、その名称が示すように、エクトドメインとエンドドメインを連結し、細胞によって発現されるとき細胞膜の内側に位置する。エンドドメインは、抗原認識の後に活性化シグナルを免疫エフェクター細胞に伝達する、ＣＡＲの作用末端である。例えば、エンドドメインはシグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）および共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）を含みうる。本開示のＣＡＲは、第２のＣＡＲを組み合わせることが意図されるので、活性化のために第２のＣＡＲを必要とする、不完全なエンドドメインを有することができる。
【００２１】
ＮＫＧ２Ｄは、形質転換された、および感染した細胞の検出および排除のための主要な認識受容体であり、これは、そのリガンドが、感染、または例えば癌におけるようなゲノムストレスの結果としての、細胞ストレスによって誘導されるからである。すべてのＮＫＧ２ＤリガンドはＭＨＣクラスＩ分子との相同性を有し、ＭＩＣとＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰの２つのファミリーに分類される。ヒトＭＩＣ遺伝子はＭＨＣローカスに位置し、７つのメンバー（ＭＩＣ Ａ〜Ｇ）からなり、そのうちＭＩＣＡおよびＭＩＣＢのみが機能的転写をもたらす。マウスにはＭＩＣ遺伝子はない。知られている１０のヒトＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ遺伝子のうち、ＲＡＥＴ１Ｅ／ＵＬＢＰ４、ＲＡＥＴ１Ｇ／ＵＬＢＰ５、ＲＡＥＴ１Ｈ／ＵＬＢＰ２、ＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰ１、ＲＡＥＴ１Ｌ／ＵＬＢＰ６、ＲＡＥＴ１Ｎ／ＵＬＢＰ３、の６つが、機能的タンパク質をコードする。マウスにおいては、オルソロガスＲＡＥＴ１／ＵＬＢＰファミリーのタンパク質は、Ｒａｅ−１、Ｈ６０およびＭＵＬＴ−１、の３つのサブファミリーに分類される。
【００２２】
ＮＫＧ２Ｄデコイは、任意の哺乳動物ＮＫＧ２Ｄタンパク質でありうるが、好ましくはヒトＮＫＧ２Ｄタンパク質である。ＮＫＧ２Ｄのタンパク質の配列は当分野において知られている。例えば、いくつかの態様において、ＮＫＧ２Ｄのエクトドメインは、
ＩＷＳＡＶＦＬＮＳＬＦＮＱＥＶＱＩＰＬＴＥＳＹＣＧＰＣＰＫＮＷＩＣＹＫＮＮＣＹＱＦＦＤＥＳＫＮＷＹＥＳＱＡＳＣＭＳＱＮＡＳＬＬＫＶＹＳＫＥＤＱＤＬＬＫＬＶＫＳＹＨＷＭＧＬＶＨＩＰＴＮＧＳＷＱＷＥＤＧＳＩＬＳＰＮＬＬＴＩＩＥＭＱＫＧＤＣＡＬＹＡＳＳＦＫＧＹＩＥＮＣＳＴＰＮＴＹＩＣＭＱＲＴＶ（配列番号１）
との配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であるアミノ酸配列、または誘導された自己タンパク質を結合することのできる、その少なくとも１００、１１０、１２０、１３０、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２もしくは１４３アミノ酸のフラグメントを含む。
【００２３】
例えばヒトＮＫＧ２Ｄエクトドメインに基づくＮＫＧ２Ｄデコイは、当分野で知られており、引用によりその全体が本書に組み込まれるＷＯ２０１７０８３５４５、ＷＯ２０１７０８３６１２に記載されるものを包含する。
【００２４】
いくつかの態様において、ＮＫＧ２Ｄのエクトドメインは、
ＦＬＮＳＬＦＮＱＥＶＱＩＰＬＴＥＳＹＣＧＰＣＰＫＮＷＩＣＹＫＮＮＣＹＱＦＦＤＥＳＫＮＷＹＥＳＱＡＳＣＭＳＱＮＡＳＬＬＫＶＹＳＫＥＤＱＤＬＬＫＬＶＫＳＹＨＷＭＧＬＶＨＩＰＴＮＧＳＷＱＷＥＤＧＳＩＬＳＰＮＬＬＴＩＩＥＭＱＫＧＤＣＡＬＹＡＳＳＦＫＧＹＩＥＮＣＳＴＰＮＴＹＩＣＭＱＲＴＶ（配列番号２）
との配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００２５】
いくつかの態様において、ＮＫＧ２Ｄのエクトドメインは、
ＮＱＥＶＱＩＰＬＴＥＳＹＣＧＰＣＰＫＮＷＩＣＹＫＮＮＣＹＱＦＦＤＥＳＫＮＷＹＥＳＱＡＳＣＭＳＱＮＡＳＬＬＫＶＹＳＫＥＤＱＤＬＬＫＬＶＫＳＹＨＷＭＧＬＶＨＩＰＴＮＧＳＷＱＷＥＤＧＳＩＬＳＰＮＬＬＴＩＩＥＭＱＫＧＤＣＡＬＹＡＳＳＦＫＧＹＩＥＮＣＳＴＰＮＴＹＩＣＭＱＲＴＶ（配列番号３）
との配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００２６】
いくつかの態様において、ＮＫＧ２Ｄのエクトドメインは、
ＱＩＰＬＴＥＳＹＣＧＰＣＰＫＮＷＩＣＹＫＮＮＣＹＱＦＦＤＥＳＫＮＷＹＥＳＱＡＳＣＭＳＱＮＡＳＬＬＫＶＹＳＫＥＤＱＤＬＬＫＬＶＫＳＹＨＷＭＧＬＶＨＩＰＴＮＧＳＷＱＷＥＤＧＳＩＬＳＰＮＬＬＴＩＩＥＭＱＫＧＤＣＡＬＹＡＳＳＦＫＧＹＩＥＮＣＳＴＰＮＴＹＩＣＭＱＲＴＶ（配列番号４）
との配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００２７】
いくつかの態様において、ＮＫＧ２Ｄのエクトドメインは、
ＳＹＣＧＰＣＰＫＮＷＩＣＹＫＮＮＣＹＱＦＦＤＥＳＫＮＷＹＥＳＱＡＳＣＭＳＱＮＡＳＬＬＫＶＹＳＫＥＤＱＤＬＬＫＬＶＫＳＹＨＷＭＧＬＶＨＩＰＴＮＧＳＷＱＷＥＤＧＳＩＬＳＰＮＬＬＴＩＩＥＭＱＫＧＤＣＡＬＹＡＳＳＦＫＧＹＩＥＮＣＳＴＰＮＴＹＩＣＭＱＲＴＶ（配列番号５）
との配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００２８】
いくつかの態様において、マウスＮＫＧ２Ｄのエクトドメインは、
ＭＳＫＣＨＮＹＤＬＫＰＡＫＷＤＴＳＱＥＱＱＫＱＲＬＡＬＴＴＳＱＰＧＥＮＧＩＩＲＧＲＹＰＩＥＫＬＫＩＳＰＭＦＶＶＲＶＬＡＩＡＬＡＩＲＦＴＬＮＴＬＭＷＬＡＩＦＫＥＴＦＱＰＶＬＣＮＫＥＶＰＶＳＳＲＥＧＹＣＧＰＣＰＮＮＷＩＣＨＲＮＮＣＹＱＦＦＮＥＥＫＴＷＮＱＳＱＡＳＣＬＳＱＮＳＳＬＬＫＩＹＳＫＥＥＱＤＦＬＫＬＶＫＳＹＨＷＭＧＬＶＱＩＰＡＮＧＳＷＱＷＥＤＧＳＳＬＳＹＮＱＬＴＬＶＥＩＰＫＧＳＣＡＶＹＧＳＳＦＫＡＹＴＥＤＣＡＮＬＮＴＹＩＣＭＫＲＡＶ（配列番号６）
との配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００２９】
いくつかの態様において、マウスＮＫＧ２Ｄのエクトドメインは、
ＮＫＥＶＰＶＳＳＲＥＧＹＣＧＰＣＰＮＮＷＩＣＨＲＮＮＣＹＱＦＦＮＥＥＫＴＷＮＱＳＱＡＳＣＬＳＱＮＳＳＬＬＫＩＹＳＫＥＥＱＤＦＬＫＬＶＫＳＹＨＷＭＧＬＶＱＩＰＡＮＧＳＷＱＷＥＤＧＳＳＬＳＹＮＱＬＴＬＶＥＩＰＫＧＳＣＡＶＹＧＳＳＦＫＡＹＴＥＤＣＡＮＬＮＴＹＩＣＭＫＲＡＶ（配列番号７）
との配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００３０】
いくつかの態様において、マウスＮＫＧ２Ｄのエクトドメインは、
ＰＶＳＳＲＥＧＹＣＧＰＣＰＮＮＷＩＣＨＲＮＮＣＹＱＦＦＮＥＥＫＴＷＮＱＳＱＡＳＣＬＳＱＮＳＳＬＬＫＩＹＳＫＥＥＱＤＦＬＫＬＶＫＳＹＨＷＭＧＬＶＱＩＰＡＮＧＳＷＱＷＥＤＧＳＳＬＳＹＮＱＬＴＬＶＥＩＰＫＧＳＣＡＶＹＧＳＳＦＫＡＹＴＥＤＣＡＮＬＮＴＹＩＣＭＫＲＡＶ（配列番号８）
との配列同一性が少なくとも６５％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％もしくは１００％であるアミノ酸配列を含む。
【００３１】
いくつかの態様において、ＮＫＧ２Ｄデコイは、少なくとも２つのＮＫＧ２Ｄモノマーを含む。いくつかの態様において、ＮＫＧ２Ｄデコイはマルチマーの形態である。ＮＫＧ２Ｄデコイは、直線状連結、フェリチンベースのマルチマー化、コイルドコイルマルチマー化等によってマルチマー化されたＮＫＧ２Ｄモノマーを含みうる。
【００３２】
「シグナル伝達ドメイン（ＳＤ）」は、リン酸化されたときにシグナル伝達カスケードを活性化する免疫受容体チロシン活性化モチーフ（immunoreceptor tyrosine-based activation motif；ＩＴＡＭ）を含む。用語「共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）」は、共刺激タンパク質受容体、例えばＣＤ２８、４１ＢＢおよびＩＣＯＳに由来する、Ｔ細胞受容体によるＴ細胞活性化を高めることのできる細胞内シグナル伝達ドメインをさす。
【００３３】
いくつかの態様において、エンドドメインは、ＳＤまたはＣＳＲのいずれかを含み、両方は含まない。該態様において、本開示のＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞は、足りていないドメインを含むもう１つのＣＡＲ（またはＴ細胞受容体）もが、対応する抗原に結合した場合にのみ活性化される。
【００３４】
いくつかの態様において、本開示のＣＡＲは、式：
ＳＰ−ＮＫＧ２Ｄ−ＨＧ−ＴＭ−ＣＳＲ；または
ＳＰ−ＮＫＧ２Ｄ−ＨＧ−ＴＭ−ＩＳＤ
で規定され、式中、
「ＳＰ」は、任意に存在してもよいシグナルペプチドを表し、
「ＮＫＧ２Ｄ」は、ＮＫＧ２Ｄエクトドメインを表し、
「ＨＧ」は、任意に存在してもよいヒンジドメインを表し、
「ＴＭ」は、膜貫通ドメインを表し、
「ＣＳＲ」は、１つまたはそれ以上の共刺激シグナル伝達領域を表し、
「ＩＳＤ」は、細胞内シグナル伝達ドメインを表し、
「−」は、ペプチド結合またはリンカーを表す。
【００３５】
さらなるＣＡＲのコンストラクトが、例えば、Fresnak AD, et al. Engineered T cells: the promise and challenges of cancer immunotherapy. Nat Rev Cancer. 2016 Aug 23;16(9):566-81に記載されており、ＣＡＲモデルについての教示のために、この文献の全体を引用により本書の一部とする。
【００３６】
例えば、ＣＡＲは、ＴＲＵＣＫ、Universal ＣＡＲ、Self-driving ＣＡＲ、Armored ＣＡＲ、Self-destruct ＣＡＲ、Conditional ＣＡＲ、Marked ＣＡＲ、TenＣＡＲ、Dual ＣＡＲ、またはｓＣＡＲでありうる。
【００３７】
ＴＲＵＣＫ（T-cells redirected for universal cytokine killing）は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および抗腫瘍サイトカインを同時発現する。サイトカイン発現は、構成的でありうるか、またはＴ細胞活性化によって誘導されうる。ＣＡＲの特異性により標的化されて局在化された炎症性サイトカインの産生が、内在性の免疫細胞を腫瘍部位へと招集し、抗腫瘍反応を増強しうる。
【００３８】
universal他家ＣＡＲ Ｔ細胞は、内在性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子をもはや発現しないように組換えられており、それによって、それぞれ、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）または拒絶を防止する。
【００３９】
self-driving ＣＡＲは、ＣＡＲ、および腫瘍リガンドに結合するケモカイン受容体を共発現するものであり、それによって腫瘍ホーミングを促進する。
【００４０】
免疫抑制に抵抗性であるように操作されるＣＡＲ Ｔ細胞（Armored ＣＡＲ）は、さまざまな免疫チェックポイント分子（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４）またはプログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ１））を、免疫チェックポイントスイッチ受容体共に、もはや発現しないように遺伝子組換えされたものでありうるか、または免疫チェックポイントシグナル伝達をブロックするモノクローナル抗体と共に投与されうる。
【００４１】
self-destruct ＣＡＲは、ＣＡＲをコードするためにエレクトロポレーションによって導入されるＲＮＡを用いて設計されうる。あるいは、Ｔ細胞の誘導アポトーシスが、遺伝子組換えリンパ球におけるチミジンキナーゼへのガンシクロビルの結合、またはより新しく報告された、低分子二量化剤によるヒトカスパーゼ９活性化の系に基づいて達成されうる。
【００４２】
conditional ＣＡＲ Ｔ細胞は、デフォルトで不応答性であるかまたはスイッチが「オフ」の状態にあり、回路を完成する低分子が加わって、シグナル１およびシグナル２の両方の完全な伝達が可能となることによって活性化される。あるいは、Ｔ細胞は、続いて投与される標的抗原に標的化された二次抗体に対して親和性を有するアダプター特異的受容体を発現するように設計されうる。
【００４３】
marked ＣＡＲ Ｔ細胞は、ＣＡＲと、存在するモノクローナル抗体薬が結合する腫瘍エピトープとを発現する。忍容できない有害作用がある状況において、該モノクローナル抗体の投与は、ＣＡＲ Ｔ細胞を排除し、さらなるoff-tumor作用を示すことなく症状を軽減する。
【００４４】
tandem ＣＡＲ（ＴａｎＣＡＲ）Ｔ細胞は、親和性の異なる２つの一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）が連結されたものに細胞内共刺激ドメインおよびＣＤ３ζドメインが融合されたものからなる単一のＣＡＲを発現する。ＴａｎＣＡＲ Ｔ細胞の活性化は、標的細胞が両方の標的を同時発現したときにのみ起こる。
【００４５】
dual ＣＡＲ Ｔ細胞は、リガンド結合標的の異なる２つの別個のＣＡＲを発現し、一方のＣＡＲはＣＤ３ζドメインのみを含み、他方のＣＡＲは共刺激ドメインのみを含む。dual ＣＡＲ Ｔ細胞の活性化のためには、腫瘍において両方の標的が同時発現される必要がある。
【００４６】
safety ＣＡＲ（ｓＣＡＲ）は、細胞外ｓｃＦｖが細胞内抑制性ドメインに融合されたものからなる。標準的なＣＡＲを同時発現するｓＣＡＲ Ｔ細胞は、標準的なＣＡＲ標的を持つがｓＣＡＲ標的は持たない標的細胞に遭遇したときにのみ活性化される。
【００４７】
エンドドメインは、抗原認識の後にシグナルを免疫エフェクター細胞に伝達し、免疫エフェクター細胞の正常エフェクター機能の少なくとも１つを活性化する、ＣＡＲの作用末端である。Ｔ細胞のエフェクター機能は、例えば、細胞溶解活性、またはサイトカイン分泌を包含するヘルパー活性でありうる。したがって、エンドドメインは、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の「細胞内シグナル伝達ドメイン」および任意に共受容体を含みうる。通常、細胞内シグナル伝達ドメインの全体を用いることができるが、多くの場合、鎖全体を用いる必要はない。細胞内シグナル伝達ドメインのトランケートされた部分が用いられる範囲において、そのようなトランケートされた部分は、エフェクター機能シグナルを伝達する限り、インタクト鎖の代わりに用いられうる。
【００４８】
刺激様式で作用するＴＣＲ複合体の初期活性化を調節する細胞質内シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）として知られるシグナル伝達モチーフを含みうる。ＩＴＡＭを含む細胞質内シグナル伝達配列の例には、ＣＤ８、ＣＤ３ζ、ＣＤ３δ、ＣＤ３γ、ＣＤ３ε、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩａ）、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＦｃγＲＩγ、ＦｃγＲＩＩＩγ、ＦｃεＲＩβ（ＦＣＥＲＩＢ）、およびＦｃεＲＩγ（ＦＣＥＲＩＧ）に由来するものがある。
【００４９】
いくつかの態様において、細胞質内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）（TCR zeta, GenBank accno. BAG36664.1）に由来する。Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ（ＣＤ３ζ）鎖は、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖またはＣＤ２４７（Cluster of Differentiation 247）としても知られる、ヒトにおいてＣＤ２４７遺伝子によりコードされるタンパク質である。
【００５０】
第一世代ＣＡＲは典型的には、内在性ＴＣＲからのシグナルの主要なトランスミッターであるＣＤ３ζ鎖由来の細胞内ドメインを有した。第二世代ＣＡＲは、Ｔ細胞にさらなるシグナルを提供するために、ＣＡＲのエンドドメインに、さまざまな共刺激タンパク質受容体（例えば、ＣＤ２８、４１ＢＢ、ＩＣＯＳ）に由来する細胞内シグナル伝達ドメインを追加したものである。前臨床試験により、第二世代ＣＡＲデザインは、Ｔ細胞の抗腫瘍活性を改善することが示されている。より新しい第三世代ＣＡＲでは、さらに効果を高めるために複数のシグナル伝達ドメインが組み合わせられている。そのようなＣＡＲがグラフトされたＴ細胞は、共刺激受容体／リガンド相互作用から独立した、増殖、活性化、持続、および腫瘍抑制作用の改善を示している（Imai C, et al. Leukemia 2004 18:676-84; Maher J, et al. Nat Biotechnol 2002 20:70-5）。
【００５１】
例えば、ＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン自体を含むようにデザインされうるか、または本発明のＣＡＲに関して望ましい任意の他の細胞質ドメインと組み合わせられうる。例えば、ＣＡＲの細胞質ドメインは、ＣＤ３ζ鎖の一部および共刺激シグナル伝達領域を含みうる。共刺激シグナル伝達領域とは、共刺激分子の細胞内ドメインを含むＣＡＲの部分をいう。共刺激分子は、抗原に対するリンパ球の効果的反応のために必要な、抗原受容体またはそのリガンド以外の細胞表面分子である。そのような分子の例は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ならびにＣＤ８３、ＣＤ８、ＣＤ４、ｂ２ｃ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＭｙＤ８８、ＢＴＮＬ３およびＮＫＧ２Ｄに特異的に結合するリガンドを包含する。したがって、ＣＡＲは、共刺激シグナル伝達エレメントとしてＣＤ２８を有するものが主に例として挙げられるが、他の共刺激エレメントも、単独で、または他の共刺激シグナル伝達エレメントとの組み合わせとして使用することができる。
【００５２】
いくつかの態様において、ＣＡＲはヒンジ配列を含む。ヒンジ配列は、抗体のフレキシビリティを高める短いアミノ酸配列である（Woof et al., Nat. Rev. Immunol., 4(2): 89-99 (2004)参照）。ヒンジ配列は、抗原認識部分（例えば、抗ＮＫＧ２Ｄ ｓｃＦｖ）と膜貫通ドメインとの間に配置されうる。ヒンジ配列は、任意の適当な分子から誘導または取得される任意の適当な配列でありうる。いくつかの態様において、例えば、ヒンジ配列は、ＣＤ８ａ分子またはＣＤ２８分子に由来する。
【００５３】
膜貫通ドメインは、天然または合成ソースのいずれかに由来しうる。ソースが天然物である場合、該ドメインは、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来しうる。例えば、膜貫通領域は、以下のものに由来しうる（すなわち、その膜貫通領域を少なくとも含みうる）：Ｔ細胞受容体のα、βまたはζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８（例えば、ＣＤ８α、ＣＤ８β）、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、およびＰＡＧ／Ｃｂｐ。あるいは、膜貫通ドメインは合成物であり得、その場合、疎水性の高い残基、例えばロイシンおよびバリンを含みうる。いくつかの態様において、合成膜貫通ドメインの各末端にフェニルアラニン、トリプトファンおよびバリンのトリプレットが存在しうる。短いオリゴペプチドまたはポリペプチドリンカー、例えば２〜１０アミノ酸の長さのものが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞質ドメインの間の架橋を形成しうる。
【００５４】
いくつかの態様において、ＣＡＲは１つよりも多い膜貫通ドメインを有し、これは、同じ膜貫通ドメインの反復でありうるか、または異なる膜貫通ドメインでありうる。
【００５５】
いくつかの態様において、ＣＡＲは、ＷＯ２０１５／０３９５２３に記載されるようなマルチ鎖ＣＡＲであり、該教示のために該文献を引用により本書の一部とする。マルチ鎖ＣＡＲは、個別の細胞外リガンド結合ドメインおよびシグナル伝達ドメインを異なる膜貫通ポリペプチド中に含みうる。シグナル伝達ドメインは、最適なシグナル伝達を提供する、天然の受容体により近いフレキシブルな構造を形成するように、膜近傍位置に集合するようデザインされうる。例えば、マルチ鎖ＣＡＲは、ＦＣＥＲＩα鎖の一部およびＦＣＥＲＩβ鎖の一部を、該ＦＣＥＲＩ鎖が自然に二量体化してＣＡＲを形成するように、含みうる。
【００５６】
本開示のＣＡＲを構成し得る、ＮＫＧ２Ｄ領域、共刺激シグナル伝達領域、および細胞内シグナル伝達ドメインの組み合わせの例を、下記の表１、２および３に挙げる。
【００５７】
【表１】
2021520780.tif 000002
【００５８】
【表２−１】
2021520780.tif 000003
【００５９】
【表２−２】
2021520780.tif 000004
【００６０】
【表２−３】
2021520780.tif 000005
【００６１】
【表３−１】
2021520780.tif 000006
【００６２】
【表３−２】
2021520780.tif 000007
【００６３】
【表３−３】
2021520780.tif 000008
【００６４】
【表３−４】
2021520780.tif 000009
【００６５】
【表３−５】
2021520780.tif 000010
【００６６】
【表３−６】
2021520780.tif 000011
【００６７】
【表３−７】
2021520780.tif 000012
【００６８】
【表３−８】
2021520780.tif 000013
【００６９】
【表３−９】
2021520780.tif 000014
【００７０】
【表３−１０】
2021520780.tif 000015
【００７１】
【表３−１１】
2021520780.tif 000016
【００７２】
【表３−１２】
2021520780.tif 000017
【００７３】
【表３−１３】
2021520780.tif 000018
【００７４】
【表３−１４】
2021520780.tif 000019
【００７５】
【表３−１５】
2021520780.tif 000020
【００７６】
【表３−１６】
2021520780.tif 000021
【００７７】
【表３−１７】
2021520780.tif 000022
【００７８】
【表３−１８】
2021520780.tif 000023
【００７９】
【表３−１９】
2021520780.tif 000024
【００８０】
【表３−２０】
2021520780.tif 000025
【００８１】
【表３−２１】
2021520780.tif 000026
【００８２】
【表３−２２】
2021520780.tif 000027
【００８３】
【表３−２３】
2021520780.tif 000028
【００８４】
【表３−２４】
2021520780.tif 000029
【００８５】
【表３−２５】
2021520780.tif 000030
【００８６】
【表３−２６】
2021520780.tif 000031
【００８７】
【表３−２７】
2021520780.tif 000032
【００８８】
【表３−２８】
2021520780.tif 000033
【００８９】
【表３−２９】
2021520780.tif 000034
【００９０】
【表３−３０】
2021520780.tif 000035
【００９１】
【表３−３１】
2021520780.tif 000036
【００９２】
【表３−３２】
2021520780.tif 000037
【００９３】
【表３−３３】
2021520780.tif 000038
【００９４】
【表３−３４】
2021520780.tif 000039
【００９５】
【表３−３５】
2021520780.tif 000040
【００９６】
【表３−３６】
2021520780.tif 000041
【００９７】
【表３−３７】
2021520780.tif 000042
【００９８】
【表３−３８】
2021520780.tif 000043
【００９９】
【表３−３９】
2021520780.tif 000044
【０１００】
【表３−４０】
2021520780.tif 000045
【０１０１】
【表３−４１】
2021520780.tif 000046
【０１０２】
【表３−４２】
2021520780.tif 000047
【０１０３】
【表３−４３】
2021520780.tif 000048
【０１０４】
【表３−４４】
2021520780.tif 000049
【０１０５】
【表３−４５】
2021520780.tif 000050
【０１０６】
【表３−４６】
2021520780.tif 000051
【０１０７】
【表３−４７】
2021520780.tif 000052
【０１０８】
【表３−４８】
2021520780.tif 000053
【０１０９】
【表３−４９】
2021520780.tif 000054
【０１１０】
【表３−５０】
2021520780.tif 000055
【０１１１】
【表３−５１】
2021520780.tif 000056
【０１１２】
【表３−５２】
2021520780.tif 000057
【０１１３】
【表３−５３】
2021520780.tif 000058
【０１１４】
【表３−５４】
2021520780.tif 000059
【０１１５】
【表３−５５】
2021520780.tif 000060
【０１１６】
【表３−５６】
2021520780.tif 000061
【０１１７】
【表３−５７】
2021520780.tif 000062
【０１１８】
【表３−５８】
2021520780.tif 000063
【０１１９】
【表３−５９】
2021520780.tif 000064
【０１２０】
【表３−６０】
2021520780.tif 000065
【０１２１】
【表３−６１】
2021520780.tif 000066
【０１２２】
【表３−６２】
2021520780.tif 000067
【０１２３】
【表３−６３】
2021520780.tif 000068
【０１２４】
【表３−６４】
2021520780.tif 000069
【０１２５】
【表３−６５】
2021520780.tif 000070
【０１２６】
【表３−６６】
2021520780.tif 000071
【０１２７】
【表３−６７】
2021520780.tif 000072
【０１２８】
【表３−６８】
2021520780.tif 000073
【０１２９】
【表３−６９】
2021520780.tif 000074
【０１３０】
【表３−７０】
2021520780.tif 000075
【０１３１】
【表３−７１】
2021520780.tif 000076
【０１３２】
【表３−７２】
2021520780.tif 000077
【０１３３】
【表３−７３】
2021520780.tif 000078
【０１３４】
【表３−７４】
2021520780.tif 000079
【０１３５】
【表３−７５】
2021520780.tif 000080
【０１３６】
【表４】
2021520780.tif 000081
【０１３７】
【表５】
2021520780.tif 000082
【０１３８】
【表６−１】
2021520780.tif 000083
【０１３９】
【表６−２】
2021520780.tif 000084
【０１４０】
【表６−３】
2021520780.tif 000085
【０１４１】
【表６−４】
2021520780.tif 000086
【０１４２】
【表６−５】
2021520780.tif 000087
【０１４３】
【表６−６】
2021520780.tif 000088
【０１４４】
【表６−７】
2021520780.tif 000089
【０１４５】
ＮＫＧ２Ｄエクトドメイン、および少なくとも他の標的抗原、例えばＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３またはＣＬＥＣ１２Ａを結合するｓｃＦｖを含む、二重特異的ＣＡＲも開示される。異なる抗原、例えばＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３またはＣＬＥＣ１２Ａを結合する他のＣＡＲとの連携においてのみ作動するようにデザインされたＣＡＲも開示される。例えば、このような態様において、本開示のＣＡＲのエクトドメインは、シグナル伝達ドメイン（ＳＤ）または共刺激シグナル伝達領域（ＣＳＲ）の両方ではなく一方のみを含み得る。第２のＣＡＲ（または内在性Ｔ細胞）は、それが活性化されたとき、足りていないシグナルを提供する。例えば、本開示のＣＡＲがＩＳＤを含みＣＳＲを含まない場合、該ＣＳＲを含む免疫エフェクター細胞は、ＣＳＲを含む別のＣＡＲ（またはＴ細胞）が対応する抗原を結合した場合にのみ活性化される。同様に、本開示のＣＡＲがＣＳＲを含みＩＳＤを含まない場合、該ＣＡＲを含む免疫エフェクター細胞は、ＩＳＤを含む別のＣＡＲ（またはＴ細胞）が対応する抗原を結合した場合にのみ活性化される。
【０１４６】
腫瘍抗原は、免疫反応、特にＴ細胞仲介免疫反応を誘発する、腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。追加の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原の抗体または天然リガンドでありうる。追加の抗原結合ドメインは、処置する特定の癌の種類に応じて選択されうる。いくつかの態様において、腫瘍抗原は、ＣＤ１９、ＴＡＧ−７２、ＣＤ９９、ＣＬＥＣ１２Ａ、ＴＩＭ３、ＣＤ８３、ＣＤ１２３、ＴＩＭ３、ＣＤ３３、および任意のその組み合わせの群から選択される。
【０１４７】
腫瘍抗原の例は以下のものを包含するが、それに限定されない：分化抗原、例えばチロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２および腫瘍特異的多系統（multilineage）抗原、例えばＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐｉ５；過剰発現した胎児性抗原、例えばＣＥＡ；過剰発現した癌遺伝子および変異した腫瘍抑制遺伝子、例えばｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ；染色体転座によるユニークな腫瘍抗原；例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ；ならびにウイルス抗原、例えばエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７。他のタンパク質ベースの大きな抗原は、以下のものを包含する：ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳｌ、ＳＤＣＣＡＧ１ ６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンC（cyclophilm C）関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＴＰＳ、ＧＰＣ３、ＭＵＣ１６、ＬＭＰ１、ＥＢＭＡ−１、ＢＡＲＦ−１、ＣＳ１、ＣＤ３１９、ＨＥＲ１、Ｂ７Ｈ６、Ｌ１ＣＡＭ、ＩＬ６、およびＭＥＴ。腫瘍抗原は、例えば以下のものを包含する：グリオーマ関連抗原、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＩＬ−ｌｌＲａ、ＩＬ−１３Ｒａ、ＥＧＦＲ、ＦＡＰ、Ｂ７Ｈ３、Ｋｉｔ、ＣＡ ＬＸ、ＣＳ−１、ＭＵＣ１、ＢＣＭＡ、ｂｃｒ−ａｂｌ、ＨＥＲ２、β−ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＡＬＫ、ＣＤ１９、サイクリンＢｌ、レクチン反応性ＡＦＰ、Ｆｏｓ関連抗原１、ＡＤＲＢ３、サイログロブリン、ＥｐｈＡ２、ＲＡＧＥ−１、ＲＵｌ、ＲＵ２、ＳＳＸ２、ＡＫＡＰ−４、ＬＣＫ、ＯＹ−ＴＥＳｌ、ＰＡＸ５、ＳＡＲＴ３、ＣＬＬ−１、フコシルＧＭ１、ＧｌｏｂｏＨ、ＭＮ−ＣＡ ＩＸ、ＥＰＣＡＭ、ＥＶＴ６−ＡＭＬ、ＴＧＳ５、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ポリシアル酸、ＰＬＡＣ１、ＲＵｌ、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｌｅｗｉｓＹ、ｓＬｅ、ＬＹ６Ｋ、ｍｕｔ ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＹＣＮ、ＲｈｏＣ、ＴＲＰ−２、ＣＹＰＩＢＩ、ＢＯＲＩＳ、プロスターゼ、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＸ３、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ＬＭＰ２、ＮＣＡＭ、ｐ５３、ｐ５３変異体、Ｒａｓ変異体、ｇｐｌＯＯ、プロステイン（prostein）、ＯＲ５１Ｅ２、ＰＡＮＸ３、ＰＳＭＡ、ＰＳＣＡ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ｈＴＥＲＴ、ＨＭＷＭＡＡ、ＨＡＶＣＲ１、ＶＥＧＦＲ���、ＰＤＧＦＲ−β、サービビン（survivin）およびテロメラーゼ、レグマイン、ＨＰＶ Ｅ６,Ｅ７、精子タンパク質１７、ＳＳＥＡ−４、チロシナーゼ、ＴＡＲＰ、ＷＴ１、前立腺癌腫瘍抗原１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＬ−ＩＡＰ、ＭＡＧＥ、ＭＡＧＥ−Ａ１，ＭＡＤ−ＣＴ−１、ＭＡＤ−ＣＴ−２、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、ＸＡＧＥ１、ＥＬＦ２Ｍ、ＥＲＧ（ＴＭＰＲＳＳ２  ＥＴＳ融合遺伝子）、ＮＡ１７、好中球エラスターゼ、肉腫転座ブレークポイント、ＮＹ−ＢＲ−１、ｅｐｈｎｎＢ２、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２４、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ９７、ＣＤ１７１、ＣＤ１７９ａ、アンドロゲン受容体、ＦＡＰ、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、ＧＤ２、ｏ−アセチル−ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ３、ＧＰＲＣ５Ｄ、ＧＰＲ２０、ＣＸＯＲＦ６１、葉酸受容体（ＦＲａ）、葉酸受容体β、ＲＯＲ１、Ｆｌｔ３、ＴＡＧ７２、ＴＮ Ａｇ、Ｔｉｅ２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ７Ｒ、ＣＬＤＮ６、ＴＳＨＲ、ＵＰＫ２、メソテリン、ならびにその任意の組み合わせ。
【０１４８】
核酸およびベクター
本開示の免疫エフェクター細胞におけるＣＡＲの発現を可能にする、本開示のＣＡＲをコードするポリヌクレオチドおよびポリヌクレオチドベクターも開示される。
【０１４９】
本開示のＣＡＲおよびその領域をコードする核酸配列は、当分野で知られる組換え法を用いて、例えば、標準的な技術を用いて、該遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによって、該遺伝子をそれを含むことがわかっているベクターから誘導することによって、またはそれを含む細胞および組織から直接に単離することによって、得ることができる。あるいは、関心の遺伝子は、クローン化ではなく合成的に生産することができる。
【０１５０】
ＣＡＲをコードする核酸の発現は、典型的には、ＣＡＲポリペプチドをコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、該コンストラクトを発現ベクターに組み込むことによって達成される。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の調節のために有用な、転写および翻訳ターミネーター、開始配列、およびプロモーターを含む。
【０１５１】
本開示の核酸は、多くの種類のベクターにクローン化しうる。例えば、核酸を、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス、およびコスミドを包含するがそれに限定されないベクターにクローン化しうる。特に関心が持たれるベクターとしては、発現ベクター、複製ベクター、プローブ合成ベクター、およびシーケンシングベクターが挙げられる。
【０１５２】
さらに、発現ベクターは細胞に、ウイルスベクターの形態で提供されうる。ウイルスベクター技術は当分野においてよく知られており、例えばSambrookらの文献（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）および他のウイルス学および分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして有用なウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスを包含するが、それに限定されない。適当なベクターは通常、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたはそれ以上の選択マーカーを含む。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドベクターは、レンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである。
【０１５３】
哺乳動物細胞への遺伝子導入のためのウイルスベースの系が数多く開発されている。例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系の好適なプラットフォームを提供する。当分野において知られた技術を用いて、選ばれた遺伝子がベクターに挿入されレトロウイルス粒子にパッケージされうる。その後、該組換えウイルスが単離され対象の細胞にin vivoまたはex vivoで送達されうる。
【０１５４】
適当なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それに作動可能に連結された任意のポリヌクレオチド配列の高レベルの発現を駆動することのできる強力な構成型プロモーター配列である。適当なプロモーターの他の一例は、伸長成長因子−1α（ＥＦ−１α）である。しかしながら、他の構成型プロモーター配列を使用してもよく、それにはシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、ＭＮＤ（骨髄増殖性肉腫ウイルス）プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長い末端配列（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バーウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ならびにヒト遺伝子プロモーター、例えば、限定されないが、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターが包含されるが、それに限定されない。あるいは、プロモーターは誘導型プロモーターでありうる。誘導型プロモーターの例には、メタロチオニンプロモーター、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターが包含されるが、それに限定されない。
【０１５５】
さらなるプロモーターエレメント、例えばエンハンサーは、転写開始の頻度を調節する。これは典型的には、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域に位置するが、最近は、多くのプロモーターが、開始部位の下流にも機能的エレメントを含むことが示されている。プロモーターエレメント間の間隔は、エレメントが相対的に逆向きとなるかまたは移動したときにプロモーター機能が保たれるように、しばしばフレキシブルである。
【０１５６】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するために、細胞に導入される発現ベクターは、ウイルスベクターでトランスフェクトまたは感染されたことが調べられる細胞の集団における発現細胞の決定および選択を促進する、選択可能なマーカー遺伝子もしくはレポーター遺伝子またはその両方をも含むことができる。他のいくつかの態様において、選択可能なマーカーは、別のＤＮＡ片に含まれ、同時トランスフェクション法で使用されうる。選択可能マーカーおよびレポーター遺伝子はいずれも、宿主細胞における発現を可能にする適当な調節配列に連結されうる。有用な選択可能マーカーとしては、例えば抗生物質耐性遺伝子が挙げられる。
【０１５７】
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性のある細胞を特定するため、および調節配列の機能性を評価するために用いられる。レポーター遺伝子は通常、レシピエントである生物または組織に存在しないかまたはそこで発現されない遺伝子であり、その発現が容易に検出可能な何らかの性質（例えば酵素活性）によって顕在化されるポリペプチドをコードする遺伝子である。レポーター遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入されてから適当な時間が経過した時点でアッセイされる。適当なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼ、または緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を包含しうる。適当な発現系はよく知られており、知られている技術を用いて調製されうるか、または市販のものを入手しうる。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子発現を示す最小の５’フランキング領域のコンストラクトが、プロモーターとして同定される。そのようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子に連結され得、プロモーターにより駆動される転写を調節する物質の能力を評価するために使用され得る。
【０１５８】
細胞に遺伝子を導入する、および発現させる方法は、当分野で知られている。発現ベクターに関して、ベクターは当分野で知られる任意の方法によって、宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母または昆虫細胞に容易に導入されうる。例えば、発現ベクターは宿主細胞に、物理的、化学的または生物学的手段によって導入されうる。
【０１５９】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、パーティクルガン、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等がある。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を作製する方法は、当分野でよく知られている。例えば、Sambrookらの文献（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）を参照されたい。
【０１６０】
関心のポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を包含する。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒトの細胞への遺伝子導入手段として最も広く用いられている。
【０１６１】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段は、コロイド分散系、例えば高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフィア、ビーズ、ならびに脂質ベースの系、例えば水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセルおよびリポソームを包含する。in vitroおよびin vivoでデリバリーベヒクルとして使用するためのコロイド系の例は、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。
【０１６２】
非ウイルスのデリバリー系が用いられる場合、デリバリーベヒクルの一例はリポソームである。他の一態様において、核酸は脂質と会合されうる。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内相に封入され、リポソームの脂質二重層内に分散され、リポソームとオリゴヌクレオチドの両方に会合する連結分子を介してリポソームに結合され、リポソームに取り込まれ、リポソームと複合体形成され、脂質含有溶液中に分散され、脂質と混合され、脂質と組み合わせられ、脂質中に分散物として含められ、ミセルに含まれ、もしくはミセルと複合体形成され、または他の様式で脂質と会合されうる。脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターに関連する組成物は、溶液中の特定の構造に限定されない。例えば、それは、二重層構造中に、ミセルとして、または「崩壊した」構造を有して、存在しうる。それはまた、溶液中に単に分散され得、場合によっては大きさまたは形が均一でない凝集物を形成し得る。脂質は、天然に生じる脂質または合成脂質でありうる、脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質中に天然に生じる脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、例えば脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコールおよびアルデヒドを含む化合物群を包含する。使用に適する脂質は、市販品から入手しうる。例えば、ジミリスチルホスファチジルコリン（「ＤＭＰＣ」）をSigma（St. Louis, Mo.）から、ジセチルホスフェート（「ＤＣＰ」）をK & K Laboratories（Plainview, N.Y.）から、コレステロール（「Ｃｈｏｉ」）をCalbiochem-Behringから、ジミリスチルホスファチジルグリセロール（「ＤＭＰＧ」）および他の脂質をAvanti Polar Lipids, Inc,（Birmingham, Ala.）から入手しうる。
【０１６３】
免疫エフェクター細胞
本開示のＣＡＲを発現するように改変された免疫エフェクター細胞（本書において「ＣＡＲ−Ｔ細胞」とも称される）も開示される。該細胞は好ましくは、処置される対象から取得される（すなわち自家である）。しかしながら、いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞株またはドナーエフェクター細胞（同種）が用いられる。免疫エフェクター細胞は、末梢血単核球細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位由来の組織、腹水、胸水、脾臓組織、および腫瘍を包含する数多くの供給源から入手されうる。免疫エフェクター細胞は、対象から採取された血液から、当業者に知られる任意の数の技術、例えばFicoll（商標）分離を用いて取得されうる。例えば、細胞を個体の循環血液からアフェレーシスによって取得しうる。いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、赤血球細胞を溶解し単球を除去して、末梢血リンパ球から、例えば、PERCOLL（商標）勾配による遠心分離、または対向流遠心エルトリエーションによって取得される。免疫エフェクター細胞の特定の亜集団が、ポジティブまたはネガティブ選択技術によってさらに単離されうる。例えば、免疫エフェクター細胞は、ポジティブ選択される細胞に独特の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いて、例えば、所望の免疫エフェクター細胞のポジティブ選択に十分な時間にわたる抗体結合ビーズとのインキュベーションによって、単離されうる。あるいは、免疫エフェクター細胞集団の富化は、ネガティブ選択される細胞に独特の表面マーカーに対する抗体の組み合わせを用いるネガティブ選択によって達成されうる。
【０１６４】
いくつかの態様において、免疫エフェクター細胞は、感染性疾患および異物に対する生体防御に関与する任意の白血球を含む。例えば、免疫エフェクター細胞は、リンパ球、単球、マクロファージ、樹状細胞、マスト細胞、好中球、好塩基球、好酸球、またはその任意の組み合わせを含みうる。例えば、免疫エフェクター細胞は、Ｔリンパ球を含みうる。
【０１６５】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、他のリンパ球、例えばＢ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）と区別されうる。それは、胸腺において成熟する（扁桃においても成熟するものもある）ことから、Ｔ細胞と呼ばれる。Ｔ細胞にはいくつかのサブセットがあり、それぞれ機能が異なる。
【０１６６】
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、他の白血球細胞を免疫学的プロセスにおいて助け、これには、Ｂ細胞の形質細胞およびメモリーＢ細胞への成熟、および細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化が包含される。該細胞は、表面にＣＤ４糖タンパク質を発現するので、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られる。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子によりペプチド抗原が提示されたときに活性化される。ヘルパーＴ細胞は、活性化されると、速やかに分裂し、活性免疫反応を調節または支援する、サイトカインを呼ばれる小タンパク質を分泌する。該細胞は、異なるサイトカインを分泌して異なる種類の免疫反応を促進する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、ＴＨ９、またはＴＦＨを包含する複数のサブタイプの１つに分化する。
【０１６７】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染した細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植片拒絶にも関わる。該細胞は、表面にＣＤ８糖タンパク質を発現するので、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られる。該細胞は、すべての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩ分子に付随する抗原への結合によって標的を認識する。制御性Ｔ細胞により分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよび他の分子によって、ＣＤ８＋細胞はアネルギー状態に不活性化され得、これにより自己免疫疾患を防止する。
【０１６８】
メモリーＴ細胞は、感染の解消後も長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。該細胞は、その同様の（cognate）抗原に再び暴露されたとき多数のエフェクターＴ細胞へと短時間で増殖して、過去の感染に対する「記憶」を免疫系に提供する。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋でありうる。メモリーＴ細胞は典型的には、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。
【０１６９】
かつてはサプレッサーＴ細胞として知られた制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に重要である。その主要な役割は、免疫反応の終了に向けてＴ細胞仲介免疫を低減させること、および胸腺におけるネガティブ選択プロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞には、内在性Ｔｒｅｇ細胞およびadaptive Ｔｒｅｇ細胞の、２つの主要なクラスが知られている。
【０１７０】
ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞（ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞と混同しないよう注意）は、適応免疫系にも自然免疫系にも関わる。主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子により提示されるペプチド抗原を認識する通常のＴ細胞とは異なり、ＮＫＴ細胞は、ＣＤ１ｄと呼ばれる分子により提示される糖脂質抗原を認識する。
【０１７１】
いくつかの態様において、Ｔ細胞はＣＤ４＋細胞の混合物を含む。他のいくつかの態様において、Ｔ細胞は、細胞表面発現に基づくサブセット１つまたはそれ以上が富化される。例えば、いくつかの態様において、Ｔ細胞は、細胞傷害性ＣＤ８＋リンパ球を含む。いくつかの態様において、Ｔ細胞は、αおよびβ鎖の代わりに１つのγ鎖および１つのδ鎖を有する独特のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を有するγδＴ細胞を含む。
【０１７２】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞は、ウイルス感染および形質転換された細胞を殺すことのできるＣＤ５６＋ＣＤ３−大顆粒リンパ球で、自然免疫系の重要な細胞サブセットを構成する（Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676）。細胞傷害性ＣＤ８＋Ｔリンパ球とは異なり、ＮＫ細胞は、事前の感作を必要とせずに腫瘍細胞に対する細胞傷害性を発揮し、また、ＭＨＣ−Ｉネガティブ細胞を殺すことができる（Narni-Mancinelli E, et al. Int Immunol 2011 23:427-431）。ＮＫ細胞は、サイトカインストーム（Morgan RA, et al. Mol Ther 2010 18:843-851)、腫瘍崩壊症候群（Porter DL, et al. N Engl J Med 2011 365:725-733）、およびon-target, off-tumor作用という、致死的でありうる合併症を回避しうるので、より安全なエフェクター細胞である。ＮＫ細胞は癌細胞キラーとしての役割を有することがよく知られ、ＮＫ細胞の傷害がＭＭの進行に重要であることが広く示されているが（Godfrey J, et al. Leuk Lymphoma 2012 53:1666-1676; Fauriat C, et al. Leukemia 2006 20:732-733）、ＮＫ細胞仲介抗ＭＭ作用を向上しうる手段は、本開示のＣＡＲ以前には、ほとんど探索されていない。
【０１７３】
処置方法
本開示のＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、腫瘍細胞を包含する、感染した、形質転換された、およびストレスを受けている細胞に対する抗腫瘍免疫反応を引き起こすことができる。本開示のＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞により引き起こされる抗腫瘍免疫反応は、能動または受動免疫反応でありうる。さらに、ＣＡＲ仲介免疫反応は、ＣＡＲ修飾免疫エフェクター細胞が免疫反応を誘導する養子免疫療法の一部をなしうる。
【０１７４】
キメラ抗原受容体を発現する免疫エフェクター細胞の養子移植は、有望な抗癌処置である。患者の免疫エフェクター細胞を採取した後、該細胞を本開示のＮＫＧ２Ｄ ＣＡＲを発現するように遺伝子操作してから、輸注により患者に戻す。
【０１７５】
本開示のＣＡＲ修飾免役エフェクター細胞は、単独で、または希釈剤および／または他の成分、例えばＩＬ−２、ＩＬ−５または他のサイトカインもしくは細胞集団と組み合わせた医薬組成物として投与されうる。すなわち、医薬組成物は、本書に記載される標的細胞集団を、１つまたはそれ以上の薬学的または生理学的に許容しうる担体、希釈剤または賦形剤との組み合わせとして含みうる。そのような組成物は、緩衝剤、例えば中性緩衝食塩液、リン酸緩衝食塩液等；炭水化物、例えばグルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えばＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。本開示の方法に使用する組成物は、いくつかの態様において、静脈内投与用に調製される。医薬組成物は、ＭＭの処置に適当な任意の方法で投与されうる。投与の量および頻度は、患者の状態および患者の疾患の重篤度といった因子によって決定されうるが、適当な用量は臨床試験によって決定されうる。
【０１７６】
「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」または「処置有効量」が示されるとき、投与される本発明の組成物の正確な量は、医師によって、患者（対象）により個々に異なる年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態を考慮して決定されうる。本書に記載されるＴ細胞を含む医薬組成物は一般に、１０４〜１０９細胞／ｋｇ体重、例えば１０５〜１０６細胞／ｋｇ体重（これら範囲内のすべての整数値を包含する）の用量で投与しうるということができる。Ｔ細胞組成物をそのような投与量で複数回投与してもよい。免役療法において知られる輸注技術を用いて、細胞を投与しうる（例えば、Rosenberg et al., New Eng. J. of Med. 319:1676, 1988参照）。特定の患者に対して最適な用量および処置レジメンは、医学の専門家によって、患者の疾患徴候をモニターして処置を調節することで容易に決定されうる。
【０１７７】
いくつかの態様において、活性化されたＴ細胞を対象に投与し、その後再び採血し（またはアフェレーシスを実施し）、そこからのＴ細胞を本開示の方法にしたがって活性化し、該活性化および増殖されたＴ細胞を患者に再輸注することが望ましいことがありうる。このプロセスを、数週間毎に複数回実施しうる。いくつかの態様において、１０ｃｃ〜４００ｃｃの採血からのＴ細胞を活性化しうる。いくつかの態様において、２０ｃｃ、３０ｃｃ、４０ｃｃ、５０ｃｃ、６０ｃｃ、７０ｃｃ、８０ｃｃ、９０ｃｃまたは１００ｃｃの採血からのＴ細胞を活性化しうる。この複数回の採血／複数回の再輸注のプロトコルの使用は、あるＴ細胞集団の選抜に役立ちうる。
【０１７８】
本開示の組成物の投与は、注射、輸注または移植を包含する任意の好都合な方法で行われうる。本書に記載される組成物は、皮下、皮内、腫瘍内、リンパ節内、髄腔内、筋肉内、静脈内（ｉ.ｖ.）注射または腹腔内投与によって患者に投与されうる。いくつかの態様において、本開示の組成物は、皮内または皮下注射によって患者に投与される。いくつかの態様において、本開示の組成物は、ｉ.ｖ.注射によって投与される。組成物は、腫瘍、リンパ節または感染部位の中に直接注射されてもよい。
【０１７９】
いくつかの態様において、本開示のＣＡＲ修飾免役エフェクター細胞は、サリドマイド、デキサメタゾン、ボルテゾミブおよびレナリドミドを包含するがそれに限定されない、任意の数の関連する処置法との組み合わせで（例えば、その前、それと当時、またはその後に）患者に投与される。他のいくつかの態様において、ＣＡＲ修飾免役エフェクター細胞は、化学療法、照射、免役抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノレートおよびＦＫ５０６、抗体または他の免疫除去（immunoablative）剤、例えばＣＡＭ ＰＡＴＨ、抗ＣＤ３抗体もしくは他の抗体療法、サイトキシン（cytoxin）、フルダリビン（fludaribine）、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド、ＦＲ９０１２２８、サイトカイン、ならびに照射との組み合わせで使用されうる。いくつかの態様において、ＣＡＲ修飾免役エフェクター細胞は、骨髄移植との組み合わせ、または化学療法剤、例えばフルダラビン、外部放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドもしくは抗体（例えばＯＫＴ３またはＣＡＭＰＡＴＨ）を使用するＴ細胞除去（ablative）療法との組み合わせで（例えば、その前、それと同時、または他のその後に）患者に投与される。他の一態様において、本発明の細胞組成物は、Ｂ細胞除去療法、例えばＣＤ２０と反応する薬剤、例えばリツキサンの後に投与される。例えば、いくつかの態様において、対象は、高用量化学療法の後に末梢血幹細胞移植が行われるという、標準的な処置を受けうる。いくつかの態様において、対象は、該移植の後、本発明の増殖された免疫細胞の輸注を受ける。他の一態様において、増殖された細胞は、手術の前または後に投与される。
【０１８０】
本開示の方法の癌は、制御されない増殖、浸潤または転移が生じている対象における任意の細胞であってよい。癌は、前立腺癌、卵巣癌、肺腺癌、乳癌、子宮内膜癌、胃癌、結腸癌および膵臓癌を包含する。いくつかの態様において、癌は、骨髄異形成症候群、急性骨髄性白血病、または二重表現型白血病を含む。
【０１８１】
いくつかの態様において、癌は、現在放射線療法が適用されている任意の新生物または腫瘍でありうる。あるいは、癌は、標準的な方法による放射線療法に対する感受性が十分ではない新生物または腫瘍でありうる。したがって、癌は、肉腫、リンパ腫、白血病、癌腫、芽腫、または胚細胞腫瘍でありうる。本開示の組成物を処置のために使用しうる癌の例には、次のものがあるが、それに限定されない：リンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、菌状息肉症、ホジキン病、骨髄性白血病、膀胱癌、脳腫瘍、神経系癌、頭頸部癌、頭頸部の扁平上皮癌、腎臓癌、肺癌、例えば小細胞肺癌および非小細胞肺癌、神経芽腫／膠芽腫、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、皮膚癌、肝臓癌、メラノーマ、口腔、咽喉、咽頭および肺の扁平上皮癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、子宮頸部癌、乳癌、上皮癌、腎臓癌、泌尿生殖器癌、肺癌、食道癌、頭頸部癌、大腸癌、造血器腫瘍；精巣癌；結腸直腸癌、前立腺癌、および膵臓癌。
【０１８２】
本開示のＣＡＲは、細胞傷害作用または細胞増殖抑制作用を有する任意の化合物、成分またはグループと組み合わせて使用しうる。薬剤成分は、微小管阻害剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤、またはＤＮＡインターカレーターとして機能しうる化学療法剤であって特に癌治療に用いられるものを包含する。
【０１８３】
本開示のＣＡＲは、チェックポイント阻害剤と組み合わせて使用しうる。２つの知られている抑制性チェックポイント経路は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）およびプログラム細胞死１（ＰＤ−１）受容体を介するシグナル伝達を伴う。これらタンパク質は、Ｔ細胞機能の全段階を通して重要な役割を果たす補助シグナル伝達分子のＣＤ２８−Ｂ７ファミリーのメンバーである。ＰＤ−１受容体（ＣＤ２７９としても知られる）は、活性化したＴ細胞の表面上に発現する。そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１；ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ；ＣＤ２７３）は、樹状細胞またはマクロファージといったＡＰＣの表面上に発現する。ＰＤ−Ｌ１が主要なリガンドであり、ＰＤ−Ｌ２は発現パターンがより大きく制限されている。リガンドがＰＤ−１に結合したとき、抑制性シグナルがＴ細胞に伝達され、それによってサイトカイン産生が低下し、Ｔ細胞増殖が抑制される。チェックポイント阻害剤は以下のものをブロックする抗体を包含するが、それに限定されない：ＰＤ−１（ニボルマブ（ＢＭＳ−９３６５５８またはＭＤＸ１１０６）、ＣＴ−０１１、ＭＫ−３４７５）、ＰＤ−Ｌ１（ＭＤＸ−１１０５（ＢＭＳ−９３６５５９）、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、ＰＤ−Ｌ２（ｒＨＩｇＭ１２Ｂ７）、ＣＴＬＡ−４（イピリムマブ（ＭＤＸ−０１０）、トレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６））、ＩＤＯ、Ｂ７−Ｈ３（ＭＧＡ２７１）、Ｂ７−Ｈ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ−３（ＢＭＳ−９８６０１６）。
【０１８４】
プログラム細胞死１（ＰＤ−１）に対するヒトモノクローナル抗体、および抗ＰＤ−１抗体を単独で、または他の免疫療法と組み合わせて使用する癌処置方法が、米国特許第８００８４４９号に記載されており、これを該抗体に係る記載のために引用して本書の一部とする。抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその使用が、米国特許第８５５２１５４号に記載されており、これを該抗体に係る記載のために引用して本書の一部とする。抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗癌剤が、米国特許第８６１７５４６号に記載されており、これを該抗体に係る記載のために引用して本書の一部とする。
【０１８５】
いくつかの態様において、ＰＤＬ１阻害剤は、ＰＤＬ１を特異的に結合する抗体、例えばＢＭＳ−９３６５５９（Bristol-Myers Squibb）またはＭＰＤＬ３２８０Ａ（Roche）を含む。いくつかの態様において、ＰＤ１阻害剤は、ＰＤ１を特異的に結合する抗体、例えばラムブロリズマブ（Merck）、ニボルマブ（Bristol-Myers Squibb）、またはＭＥＤＩ４７３６（AstraZeneca）を含む。ＰＤ−１に対するヒトモノクローナル抗体、および抗ＰＤ−１抗体を単独で、または他の免疫療法と組み合わせて使用する癌処置方法が、米国特許第８００８４４９号に記載されており、これを該抗体に係る記載のために引用して本書の一部とする。抗ＰＤ−Ｌ１抗体およびその使用が、米国特許第８５５２１５４号に記載されており、これを該抗体に係る記載のために引用して本書の一部とする。抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体を含む抗癌剤が、米国特許第８６１７５４６号に記載されており、これを該抗体に係る記載のために引用して本書の一部とする。
【０１８６】
本開示のＣＡＲは、他の癌免疫療法と組み合わせて使用しうる。免疫療法には２つの異なる種類がある：受動免疫療法は、患者において免疫反応を開始させる必要なく、標的の癌細胞に対する細胞傷害活性に対応する免役系の成分を用いるものであり、能動免役療法は、内因の免疫反応を能動的に誘発するものである。受動免役療法は、特定の抗原に反応してＢ細胞により産生されたモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の使用を包含する。１９７０年代のハイブリドーマ技術の開発と、腫瘍特異的抗原の同定とによって、免疫系による破壊のために腫瘍細胞を特異的に標的としうる医薬ｍＡｂ開発が可能となった。これまでｍＡｂは最大の成功を収めている免役療法であり、２０１２年の売上上位３位までの抗癌剤はｍＡｂであった。その１つは、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）のようなＢ細胞悪性腫瘍の表面上に高発現するＣＤ２０タンパク質を結合するリツキシマブ（リツキサン、Genentech）である。リツキシマブは、化学療法と組み合わせたＮＨＬおよび慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）治療用にＦＤＡに承認されている。もう１つの重要なｍＡｂはトラスツズマブ（ハーセプチン；Genentech）であり、ＨＥＲ２（ヒト上皮増殖因子受容体２）の発現を標的とすることにより、ＨＥＲ２陽性乳癌の治療に改革をもたらした。
【０１８７】
最適な「キラー」ＣＤ８ Ｔ細胞反応を引き起こすのにも、Ｔ細胞受容体活性化に加えて共刺激が必要であり、これはＯＸ４０（ＣＤ１３４）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）を包含する腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーの結合を介して提供されうる。活性化（アゴニスト）抗ＯＸ４０ｍＡｂによる処置はＴ細胞分化および細胞溶解機能を高め、それによりさまざまな腫瘍に対する抗腫瘍免疫の増強をもたらすので、ＯＸ４０は特に関心が持たれる。
【０１８８】
いくつかの態様において、そのようなさらなる処置剤は、代謝拮抗剤、例えばメトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、デカルバジン（decarbazine）、ヒドロキシ尿素、アスパラギナーゼ、ゲムシタビンまたはクラドリビンから選択し得る。
【０１８９】
いくつかの態様において、そのようなさらなる処置剤は、アルキル化剤、例えばメクロレタミン、チオテパ、クロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロホスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、プロカルバジン、マイトマイシンＣ、シスプラチンおよび他の白金誘導体、例えばカルボプラチンから選択しうる。
【０１９０】
いくつかの態様において、そのようなさらなる処置剤は、有糸分裂阻害剤、例えばタキサン、例えばドセタキセルおよびパクリタキセル、およびビンカアルカロイド、例えばビンデシン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびビノレルビンから選択しうる。
【０１９１】
いくつかの態様において、そのようなさらなる処置剤は、トポイソメラーゼ阻害剤、例えばトポテカンもしくはイリノテカン、または細胞増殖抑制剤、例えばエトポシドおよびテニポシドから選択しうる。
【０１９２】
いくつかの態様において、そのようなさらなる処置剤は、成長因子阻害剤、例えばＥｒｂＢ１（ＥＧＦＲ）の阻害剤（例えばＥＧＦＲ抗体、例えばザルツムマブ、セツキシマブ、パニツムマブもしくはニモツズマブ、または他のＥＧＦＲ阻害剤、例えばゲフィチニブもしくはエルロチニブ）、他のＥｒｂＢ２（ＨＥＲ２／ｎｅｕ）の阻害剤（例えば、ＨＥＲ２抗体、例えばトラスツズマブ、トラスツズマブ−ＤＭ１またはペルツズマブ）、またはＥＧＦＲおよびＨＥＲ２の両方の阻害剤、例えばラパチニブから選択しうる。
【０１９３】
いくつかの態様において、そのようなさらなる処置剤は、チロシンキナーゼ阻害剤、例えばイマチニブ（Glivec、Gleevec STI571）またはラパチニブから選択しうる。
【０１９４】
したがって、いくつかの態様において、開示される抗体は、オファツムマブ、ザノリムマブ、ダラツムマブ、ラニビズマブ、ニモツズマブ、パニツムマブ、ｈｕ８０６、ダクリズマブ（Zenapax）、バシリキシマブ（Simulect）、インフリキシマブ（Remicade）、アダリムマブ（Humira）、ナタリズマブ（Tysabri）、オマリズマブ（Xolair）、エファリズマブ（Raptiva）、および／またはリツキシマブと組み合わせて用いられる。
【０１９５】
いくつかの態様において、前記疾患の処置のためにＣＡＲと組み合わせて使用する処置剤は、抗癌サイトカイン、ケモカイン、またはその組み合わせでありうる。適当なサイトカインおよび成長因子の例は、ＩＦＮｙ、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８ａ、ＩＬ−２８ｂ、ＩＬ−２９、ＫＧＦ、ＩＦＮａ（例えばＩＮＦａ２ｂ）、ＩＦＮ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４０Ｌ、Ｆｌｔ３リガンド、幹細胞因子、アンセスチム、およびＴＮＦａを包含する。適当なケモカインは、Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ａｒｇ（ＥＬＲ）を持たないケモカイン、例えば、ヒトＣＸＣおよびＣ−Ｃケモカインファミリーに属するＩＰ−１０、ＭＣＰ−３、ＭＩＧおよびＳＤＦ−ｌａを包含しうる。適当なサイトカインは、サイトカイン誘導体、サイトカインバリアント、サイトカインフラグメント、およびサイトカイン融合タンパク質を包含する。
【０１９６】
いくつかの態様において、前記疾患の処置のためにＣＡＲと組み合わせて使用する処置剤は、細胞周期コントロール／アポトーシス調節剤（「調節物質」とも称する）でありうる。細胞サイクルコントロール／アポトーシス調節剤は、次のような細胞サイクル調節／アポトーシス調節物質を標的化および調節する分子を包含しうる：（ｉ）ｃｄｃ−２５（例えばＮＳＣ６６３２８４）、（ii）細胞サイクルを過剰刺激するサイクリン依存性キナーゼ（例えばフラボピリドール（Ｌ８６８２７５、ＨＭＲ１２７５）、７−ヒドロキシスタウロスポリン（ＵＣＮ−０１、ＫＷ−２４０１）、およびロスコビチン（Ｒ−ロスコビチン、ＣＹＣ２０２、および（iii）テロメラーゼ調節剤（例えばＢＩＢＲ１５３２、ＳＯＴ−０９５、ＧＲＮ１６３、ならびに例えば米国特許第６４４０７３５号および米国特許第６７１３０５５号に記載される組成物）。アポトーシス経路を阻害する分子の例は、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）／アポトーシス２リガンド（Ａｐｏ−２Ｌ）、ＴＲＡＩＬ受容体を活性化する抗体、ＩＦＮ、および抗センスＢｃｌ−２を包含するが、それに限定されない。
【０１９７】
いくつかの態様において、前記疾患の処置のためにＣＡＲと組み合わせて使用する処置剤は、ホルモン調節剤、例えば抗アンドロゲンおよび抗エストロゲン治療に有用な薬剤でありうる。そのようなホルモン調節剤の例は、タモキシフェン、イドキシフェン、フルベストラント、ドロロキシフェン、トレミフェン、ラロキシフェン、ジエチルスチルベステロール、エチニルエストラジオール／estinyl、抗アンドロゲン（例えばフルタミド／eulexin）、プロゲスチン（例えばカプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシ-プロゲステロン／provera、酢酸メゲステロール／megace）、アドレノコルチコステロイド（例えばヒドロコルチゾン、プレドニゾン）、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ならびにそのアナログおよび他のＬＨＲＨアゴニスト、例えばブセレリンおよびゴセレリン）、アロマターゼ阻害剤（例えばアナストロゾール／arimidex、アミノグルテチミド／cytraden、エキセメスタン）、またはホルモン阻害剤（例えばオクトレオチド／sandostatin）である。
【０１９８】
いくつかの態様において、前記疾患の処置のためにＣＡＲと組み合わせて使用する処置剤は、抗癌核酸または抗癌抑制性ＲＮＡ分子でありうる。
【０１９９】
前記の併用投与は、同時に、個別に、または前後して行いうる。同時投与のためには、処置剤を適当に１つの組成物または別個の組成物として投与しうる。
【０２００】
いくつかの態様において、本開示のＣＡＲは、放射線治療と組み合わせて投与される。放射線治療は照射を含みうるか、または関連する放射性医薬の患者への投与が提供される。放射線源は、処置される患者の外部または内部に存在しうる（放射線治療は、例えば外部照射治療（ＥＢＲＴ）または小線源治療（ＢＴ）の形態でありうる）。そのような方法の実施において使用しうる放射性元素は、例えばラジウム、セシウム１３７、イリジウム１９２、アメリシウム２４１、金１９８、コバルト５７、銅６７、テクネチウム９９、ヨーダイド１２３、ヨーダイド１３１、およびインジウム１１１を包含する。
【０２０１】
いくつかの態様において、本開示のＣＡＲは、手術と組み合わせて投与される。
【０２０２】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍細胞傷害性および特異性を向上する、腫瘍免役抑制を回避する、宿主拒絶を回避する、および処置効果半減期を遅らせる、いくつかの様式でデザインされうる。例えばＴＲＵＣＫ（T-cells Redirected for Universal Cytokine Killing）Ｔ細胞は、ＣＡＲを持つうえに、腫瘍細胞傷害を促進するＩＬ−１２のようなサイトカインを放出するように設計されてもいる。このような細胞は、腫瘍環境に局在させられ該ＣＡＲが活性化されたときに分子ペイロードを放出するように設計されているので、該ＣＡＲ−Ｔ細胞はしばしば、「armored ＣＡＲ」とも称される。いくつかのサイトカインが、前臨床および臨床の両方で癌治療剤として研究されており、ＴＲＵＣＫ形態のＣＡＲ−Ｔ療法に同様に組み込まれたときにも有用性を示しうる。それには、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、Ｍ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＴＲＡＩＬ、ＦＬＴ３リガンド、リンホタクチン、およびＴＧＦ−βが包含される（Dranoff 2004）。「self-driving」または「homing」ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲに加えてケモカイン受容体を発現するように設計されている。ある種のケモカインは腫瘍においてアップレギュレートされうるので、ケモカイン受容体を含むことで、腫瘍の養子Ｔ細胞へのトラフィキングおよび養子Ｔ細胞による浸潤を促進し、それによってＣＡＲ−Ｔの特異性および機能性の両方を向上する（Moon 2011）。universal ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲを有するうえに、内在性ＴＣＲ（Ｔ細胞受容体）またはＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）タンパク質を発現しないように設計されてもいる。これら２つのタンパク質が養子Ｔ細胞治療のシグナル伝達レパートリーから除外されることで、移植片対宿主病および拒絶がそれぞれ防止される。armored ＣＡＲ−Ｔ細胞の名称は、腫瘍免疫抑制および腫瘍誘導ＣＡＲ−Ｔ機能低下を回避するその能力にもよっている。そのような特定のＣＡＲ−Ｔは、ＣＡＲを有し、チェックポイント阻害分子を発現しないように設計されうる。あるいは、そのようなＣＡＲ−Ｔは、チェックポイントシグナル伝達を遮断するモノクローナル抗体（ｍＡｂ）と同時投与されうる。抗ＰＤＬ１抗体の投与により、ＣＡＲ−ＴＩＬ（腫瘍浸潤リンパ球）の傷害能力が顕著に回復された。ＰＤ１−ＰＤＬ１およびＣＴＬＡ−４−ＣＤ８０／ＣＤ８６シグナル伝達経路が研究されているが、armored ＣＡＲ−Ｔのデザインにおいて、ＬＡＧ−３、Ｔｉｍ−３、ＩＤＯ−１、２Ｂ４およびＫＩＲを包含する他の免疫チェックポイントシグナル伝達分子を標的とすることが可能である。ＴＩＬの他の細胞内阻害剤は、ホスファターゼ（ＳＨＰ１）、ユビキチン−リガーゼ（すなわち、ｃｂｌ−ｂ）、およびキナーゼ（すなわち、ジアシルグリセロールキナーゼ）を包含する。armored ＣＡＲ−Ｔは、それを腫瘍分泌サイトカインの作用から保護する、またはそれを腫瘍分泌サイトカインの作用に対し抵抗性とするタンパク質または受容体を発現するようにも設計されうる。例えば、該ダブルネガティブ形態のＴＧＦ−β受容体で形質導入されたＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）は、リンパ腫分泌ＴＧＦ−βによる免疫��制に対し抵抗性である。そのような形質導入細胞は、対照カウンターパートと比較して、in vivoで顕著に向上した抗腫瘍活性を示した。
【０２０３】
tandemおよびdual ＣＡＲ−Ｔ細胞は、２つの異なる抗原結合ドメインを有するという特徴を有する。tandem ＣＡＲは、細胞内共刺激および刺激ドメインに連結された、細胞外環境に面する２つの連続する抗原結合ドメインを含む。dual ＣＡＲは、１つの細胞外抗原結合ドメインが細胞内共刺激ドメインに連結され、第２の異なる細胞外抗原結合ドメインが細胞内刺激ドメインに連結されるように設計される。dual ＣＡＲは、刺激および共刺激ドメインが２つの抗原結合ドメインの間で分離されるので、「split ＣＡＲ」とも称される。tandemおよびdual ＣＡＲデザインのいずれにおいても、Ｔ細胞におけるＣＡＲ回路のシグナル伝達を起こすためには、両抗原結合ドメインの結合が必要である。これら２種のＣＡＲデザインは、別個の異なる抗原に対する結合親和性を有するので、「二重特異的」ＣＡＲとも称される。
【０２０４】
「生きた医薬」形態としてのＣＡＲ−Ｔ細胞に関する１つの重要な課題は、in vivoでのその操作可能性、およびその免疫刺激副作用の可能性である。より良くＣＡＲ−Ｔ治療を制御し望ましくない副作用を抑制するために、オフスイッチ、安全メカニズム、および条件付きの制御メカニズムを包含するさまざまな特徴が設計されている。例えば、self-destructおよびmarked/tagged ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲ発現Ｔ細胞のクリアランスを促進する「オフスイッチ」を持つように設計されている。self-destruct ＣＡＲ−Ｔは、ＣＡＲを含むうえに、外来分子の投与の際に誘導可能なプロアポトーシス自殺遺伝子または「排除（elimination）遺伝子」を発現するように設計されてもいる。この目的のために、ＨＳＶ−ＴＫ（単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ）、Ｆａｓ、ｉＣａｓｐ９（誘導性カスパーゼ９）、ＣＤ２０、ＭＹＣ ＴＡＧ、およびトランケートされたＥＧＦＲ（内皮増殖因子受容体）を包含するさまざまな自殺遺伝子を使用しうる。例えばＨＳＫは、プロドラッグガンシクロビル（ＧＣＶ）をＧＣＶトリホスフェートに変換し得、これは自身を複製ＤＮＡに組み込ませ、最終的に細胞死を導く。ｉＣａｓｐ９は、低分子ＡＰ１９０３を結合するＦＫ５０６結合タンパク質の成分を含むキメラタンパク質で、カスパーゼ９二量体化およびアポトーシスを誘導する。一方、marked/tagged ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＡＲを有するうえに、選択マーカーを発現するように設計されてもいる。該選択マーカーに対するｍＡｂの投与により、該ＣＡＲ−Ｔ細胞のクリアランスが促進されうる。トランケートされたＥＧＦＲは、そのような、抗ＥＧＦＲｍＡｂにより標的とされうる抗原の１つであり、セツキシマブの投与は該ＣＡＲ−Ｔ細胞の除去を促進するよう作用する。そのような特徴を持つように作製されるＣＡＲは、「switchable ＣＡＲ」を意味するｓＣＡＲ、および「regulatable ＣＡＲ」を意味するＲＣＡＲとも称される。「safety ＣＡＲ」は、「inhibitory ＣＡＲ」（ｉＣＡＲ）とも称され、２つの抗原結合ドメインを発現するように設計される。該細胞外ドメインの１つは、腫瘍関連抗原に対するものであり、細胞内共刺激および刺激ドメインに連結される。一方、第２の細胞外抗原結合ドメインは、正常組織に対いて特異的であり、細胞内チェックポイントドメイン、例えばＣＴＬＡ４、ＰＤ１またはＣＤ４５に連結される。ｉＣＡＲに複数の細胞内抑制性ドメインを組み込むことも可能である。抑制性ドメインを提供しうる抑制性分子としては、Ｂ７−Ｈ１、Ｂ７−１、ＣＤ１６０、ＰＩＨ、２Ｂ４、ＣＥＡＣＡＭ（ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−３、および／またはＣＥＡＣＡＭ−５）、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、およびＴＧＦβ−Ｒが挙げられる。正常組織の存在下において、該第２の抗原結合ドメインの刺激は、ＣＡＲを抑制するように作用しうる。このような二重の抗原特異性のために、ｉＣＡＲは二重特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の一形態でもあることに注意すべきである。safety ＣＡＲ−Ｔ設計は、腫瘍組織に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の特異性を高めるものであり、かつ、通常のＣＡＲではオフターゲット効果が生じうる、ある種の正常組織が非常に低いレベルで腫瘍関連抗原を発現しうる状況において有利なもの��ある（Morgan 2010）。conditional ＣＡＲ−Ｔ細胞は、細胞外抗原結合ドメインが細胞内共刺激ドメインに連結されたものと、別個の細胞内共刺激分子を発現する。該共刺激および刺激ドメイン配列は、外来分子の投与の際に、結果としてのタンパク質が細胞内で集合してＣＡＲ回路を完成しうるように設計される。このようにして、ＣＡＲ−Ｔ活性化を調節することができ、特定の患者のための微調整またはオーダーメードも可能でありうる。dual ＣＡＲデザインと同様、conditional ＣＡＲにおいても、不活性時には刺激および共刺激ドメインは物理的に分離しており、そのため、これもまた「split ＣＡＲ」とも称される。
【０２０５】
いくつかの態様において、前記のような操作された特徴を２つまたはそれ以上組み合わせて、改善された多機能ＣＡＲ−Ｔを作製しうる。例えば、dualまたはconditional ＣＡＲデザインを有し、ＴＲＵＣＫのようにサイトカイン放出をも行うＣＡＲ−Ｔ細胞を作製することが可能である。いくつかの態様において、２つの異なる癌抗原に対する２つの別個の抗原結合ドメインを有し、そのそれぞれが対応する共刺激ドメインに連結された、２つのＣＡＲを発現するように、dual-conditional ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製することができる。共刺激ドメインは、活性化分子の投与後にのみ、刺激ドメインと機能するようになりうる。このＣＡＲ−Ｔ細胞が有効となるためには、癌が両方の癌抗原を発現し、かつ、活性化分子が患者に投与される必要があり、したがって該デザインはdualおよびconditional ＣＡＲ−Ｔ細胞の両方の特徴を併せ持つ。
【０２０６】
典型的には、ＣＡＲ−Ｔ細胞はα−βＴ細胞を用いて作製されるが、γ−δＴ細胞を用いてもよい。いくつかの態様において、ＣＡＲ−Ｔ細胞作製のために用いられる、記載されるＣＡＲのコンストラクト、ドメインおよび操作された特徴は、ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞、Ｂ細胞、マスト細胞、ミエロイド系貪食細胞およびＮＫＴ細胞を包含する他の種類のＣＡＲ発現免疫細胞の作製においても同様に用いることができる。あるいは、ＣＡＲ発現細胞は、Ｔ細胞とＮＫ細胞の両方の性質を持つように作製されうる。さらなる態様において、ＣＡＲで形質導入される細胞は、自己由来または他家由来でありうる。
【０２０７】
ＣＡＲ発現のために、レトロウイルス形質導入（γ−レトロウイルスを包含する）、レンチウイルス形質導入、トランスポゾン／トランスポザーゼ（Sleeping BeautyおよびPiggyBacシステム）、およびメッセンジャーＲＮＡ導入を介する遺伝子発現を包含するいくつかの異なる方法を使用しうる。遺伝子編集（遺伝子挿入または遺伝子削除／破壊）は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を操作する可能性に関しても、重要性が高まっている。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＺＦＮ（ジンクフィンガーヌクレアーゼ）およびＴＡＬＥＮ（転写活性化様エフェクターヌクレアーゼ）システムは、ＣＡＲ−Ｔ細胞作製に用いられる可能性のある３つの方法である。
【０２０８】
定義
用語「アミノ酸配列」とは、アミノ酸残基を表す略号、文字、記号または語の並びをいう。本書に用いるアミノ酸の略号は、従来のアミノ酸１文字コードで、次のように表される：Ａ，アラニン；Ｂ，アスパラギンまたはアスパラギン酸；Ｃ，システイン；Ｄ，アスパラギン酸；Ｅ，グルタメート、グルタミン酸；Ｆ，フェニルアラニン；Ｇ，グリシン；Ｈ，ヒスチジン；Ｉ，イソロイシン；Ｋ，リジン；Ｌ，ロイシン；Ｍ，メチオニン；Ｎ，アスパラギン；Ｐ，プロリン；Ｑ，グルタミン；Ｒ，アルギニン；Ｓ，セリン；Ｔ，スレオニン；Ｖ，バリン；Ｗ，トリプトファン；Ｙ，チロシン；Ｚ，グルタミンまたはグルタミン酸。
【０２０９】
用語「抗体」は、免疫グロブリン、特異的結合能を維持するその誘導体、および免疫グロブリン結合ドメインと同様またはほぼ同様の結合ドメインを有するタンパク質をさす。そのようなタンパク質は、天然物から誘導されうるか、または部分的もしくは完全に合成的に製造されうる。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルでありうる。抗体は、ヒトのクラスであるＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、およびＩｇＥの任意のものを包含する、任意の種に由来する任意のクラスの免疫グロブリンのメンバーでありうる。例示的な態様において、本書に記載される方法および組成物に使用される抗体は、ＩｇＧクラスの誘導体である。用語「抗体」には、インタクトな免疫グロブリン分子に加え、標的抗原を選択的に結合する、そのような免疫グロブリン分子のフラグメントまたはポリマー、ならびにヒトまたはヒト化バージョンの免疫グロブリン分子も包含される。
【０２１０】
用語「抗体フラグメント」とは、抗体の完全長未満の任意の誘導体をさす。例示的な態様において、抗体フラグメントは、完全長抗体の特異的結合能のかなりの部分を少なくとも維持する。抗体フラグメントの例は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ディアボディ、Ｆｃ、およびＦｄフラグメントを包含するが、それに限定されない。抗体フラグメントは任意の方法で製造されうる。例えば、抗体フラグメントは、酵素的または化学的に、インタクト抗体の断片化によって製造されうるか、組換えによって、抗体の部分配列をコードする遺伝子から製造されうるか、または完全もしくは部分的に合成的に製造されうる。抗体フラグメントは、場合により、一本鎖抗体フラグメントでありうる。あるいは、抗体フラグメントは、連結された、例えばジスルフィド架橋により連結された複数の鎖を含みうる。抗体フラグメントはまた、場合により、複数の分子の複合体でありうる。機能的な抗体フラグメントは、典型的には少なくとも約５０のアミノ酸、より典型的には少なくとも約２００のアミノ酸を含みうる。
【０２１１】
用語「抗原結合部位」とは、抗原上のエピトープを特異的に結合する抗体の領域をいう。
【０２１２】
用語「アプタマー」とは、特定の標的分子に結合するオリゴ核酸またはペプチド分子をいう。該分子は一般的には、ランダム配列のプールから選択される。選択されるアプタマーは、独特の三次構造に適応し、標的分子を高親和性および特異性で認識することができるものである。「核酸アプタマー」は、そのコンフォメーションによって標的分子に結合し、それによって該分子の機能を阻害または抑制する、ＤＮＡまたはＲＮＡオリゴ核酸である。核酸アプタマーは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはその組み合わせによって構成されうる。「ペプチドアプタマー」は、可変ペプチド配列が定常足場タンパク質中に挿入されたコンビナトリアルタンパク質分子である。ペプチドアプタマーの選択は典型的には、ストリンジェントな酵母ジハイブリッド条件下に行われ、それによって、選択されたペプチドアプタマーが細胞内の状況において安定に発現され正しく折り畳まれる確率が高められる。
【０２１３】
用語「担体」とは、化合物または組成物と組み合わされたとき、その意図される使用または目的のために該化合物または組成物の調製、貯蔵、投与、送達、有効性、選択性または任意の他の特徴を補助または促進する、化合物、組成物、物質または構造を意味する。例えば、担体は、活性物質の分解を最小限にするよう、および対象における有害な副作用を最小限にするよう選択されうる。
【０２１４】
用語「キメラ分子」とは、自然の状態では別個に存在する２つまたはそれ以上の分子を連結することによって作製される単一の分子をいう。単一のキメラ分子は、その構成成分である分子全部の望ましい機能性を有する。キメラ分子の種類の１つに、融合タンパク質がある。
【０２１５】
用語「組換え抗体」とは、任意のＩｇクラス（例えばＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭおよびＩｇＹ）に由来する抗体の重鎖および／または軽鎖の可変ドメインに由来する抗原結合部位を含む抗体フラグメントを少なくとも含み、場合により、抗体の可変および／または定常ドメインの全体または一部を含みうる組換え分子をいう。
【０２１６】
用語「エピトープ」とは、抗体が優先的および特異的に結合する抗原の領域をいう。モノクローナル抗体は、分子的に規定されうる分子の１つの特異的エピトープに優先的に結合する。本発明において、多重特異性抗体によって複数のエピトープが認識されうる。
【０２１７】
用語「融合タンパク質」とは、２つまたはそれ以上のポリペプチドが、１つのポリペプチドのアミノ末端と別のポリペプチドのカルボキシル末端との間に形成されるペプチド結合によって連結されることにより形成されるポリペプチドをいう。融合タンパク質は、その構成成分であるポリペプチドの化学的カップリングによって形成されうるか、または連続する単一の融合タンパク質をコードする核酸配列から単一のポリペプチドとして発現されうる。単一鎖の融合タンパク質とは、連続する単一のポリペプチド骨格を有する融合タンパク質である。融合タンパク質は、２つの遺伝子をインフレームで連結して単一の核酸とし、次いで該核酸を適当な宿主細胞中で、該融合タンパク質が産生される条件下に発現させるための、分子生物学における従来の技術を用いて調製されうる。
【０２１８】
用語「Ｆａｂフラグメント」とは、抗体のパパイン酵素による切断によって生成される、抗原結合部位を含む抗体のフラグメントをいい、該酵素は、ヒンジ領域で、Ｈ鎖間ジスルフィド結合よりＮ末端側において切断することによって、１つの抗体分子から２つのＦａｂフラグメントを生じさせる。
【０２１９】
用語「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」とは、抗体分子のペプシン酵素による切断によって生成される、２つの抗原結合部位を含む抗体のフラグメントをいい、該酵素は、ヒンジ領域で、Ｈ鎖間ジスルフィド結合よりＣ末端側において切断する。
【０２２０】
用語「Ｆｃフラグメント」とは、抗体重鎖の定常ドメインを含む抗体のフラグメントをいう。
【０２２１】
用語「Ｆｖフラグメント」とは、抗体重鎖および軽鎖の可変ドメインを含む抗体のフラグメントをいう。
【０２２２】
「遺伝子コンストラクト」は、ポリペプチドの「コーディング配列」を含むか、または別の様式で生物学的に活性なＲＮＡ（例えば、アンチセンス、デコイ、リボザイム等）に転写されることのできる、核酸、例えばベクター、プラスミド、ウイルスゲノム等をさし、細胞（例えば、いくつかの態様において、哺乳動物細胞）にトランスフェクトされ得、該コンストラクトが導入された細胞においてコーディング配列の発現を引き起こし得る。遺伝子コンストラクトは、コーディング配列に作動可能に連結された１つまたはそれ以上の調節エレメント、また、イントロン配列、ポリアデニル化部位、複製起点、マーカー遺伝子等を含みうる。
【０２２３】
用語「同一性」とは、２つの核酸分子またはポリペプチド間の配列同一性をさす。同一性は、比較の目的でアラインされうる各配列のある位置を比較することによって決定されうる。比較される配列のある位置が同じ塩基で占められているとき、それら分子は該位置において同一である。核酸またはアミノ酸配列間の相同性または同一性の程度は、核酸配列間で共通する位置部分における同一であるかマッチするヌクレオチドの数の関数である。２つの配列間の同一性を計算するために、さまざまなアラインメントアルゴリズムおよび／またはプログラムを用いることができ、その例には、ＧＣＧ配列解析パッケージ（University of Wisconsin, Madison, Wis.）の一部として利用可能なＦＡＳＴＡまたはＢＬＡＳＴがあり、例えばデフォルト設定で使用することができる。例えば、本書に記載される特定のポリペプチドとの同一性が少なくとも７０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％であり、好ましくは実質的に同じ機能を示すポリペプチド、およびそのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドが意図される。同様のスコアは、特に指定しない限りＢＬＯＳＵＭ６２の使用に基づきうる。ＢＬＡＳＴＰを使用する場合、相同性パーセントはＢＬＡＳＴＰポジティブスコアに基づき、配列同一性パーセントはＢＬＡＳＴＰ同一性スコアに基づく。ＢＬＡＳＴＰ「同一性」は、高スコアの配列対における同一である総残基の数および割合を示し、ＢＬＡＳＴＰ「ポジティブ」は、アラインメントスコアが正の値を有し互いに類似する残基の数および割合を示す。本書に開示されるアミノ酸配列に対してそのような程度の同一性もしくは相同性または任意の中間の程度の同一性もしくは相同性を有するアミノ酸配列が、本開示に意図され包含される。類似するポリペプチドのポリヌクレオチド配列は、遺伝コードを用いて推定されるか、または従来の方法で、特にそのアミノ酸配列を遺伝コードで逆に翻訳することによって得られうる。
【０２２４】
用語「リンカー」は、当分野で認知されており、２つの化合物、例えば２つのポリペプチドを連結する分子または分子群をいう。リンカーは、単一の架橋分子からなりうるか、または架橋分子と化合物との間に一定の距離を置くように架橋分子とスペーサー分子を含みうる。
【０２２５】
用語「多価抗体」とは、１つより多い抗原認識部位を含む抗体または組換え抗体をいう。例えば、「二価」抗体は２つの抗原認識部位を持ち、「四価」抗体は４つの抗原認識部位を持つ。「単一特異性」、「二重特異性」、「三重特異性」、「四重特異性」等の用語は、多価抗体中に存在する（抗原認識部位の数ではなく）異なる抗原認識部位特異性の数を表す。例えば、「単一特異性」抗体の抗原認識部位はすべて同じエピトープを結合する。「二重特異性」抗体は、第１のエピトープを結合する少なくとも１つの抗原認識部位、および第１のエピトープとは異なる第２のエピトープを結合する少なくとも１つの抗原認識部位を有する。「多価単一特異性」抗体は、複数の抗原認識部位を有し、そのすべてが同じエピトープを結合するものである。「多価二重特異性」抗体は、複数の抗原認識部位を有し、そのうちのいくつかが第１のエピトープを結合し、いくつかが第１のエピトープとは異なる第２のエピトープを結合するものである。
【０２２６】
用語「核酸」とは、単一のヌクレオチド、または２つもしくはそれ以上のヌクレオチドが、１つのヌクレオチドの３’位において別のヌクレオチドの５’末端へとリン酸基によって連結されたものを含む、天然または合成の分子をいう。核酸は長さによって限定されず、したがって、核酸はデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を包含しうる。
【０２２７】
用語「作動可能に連結される」とは、ある核酸と別の核酸配列との機能的関係性をいう。プロモーター、エンハンサー、転写および翻訳終止部位、並びに他のシグナル配列は、他の配列に作動可能に連結される核酸配列の例である。例えば、転写調節エレメントへのＤＮＡの作動可能な連結とは、該ＤＮＡを特異的に認識し、それに結合し、転写するＲＮＡポリメラーゼによって、該ＤＮＡの転写が該プロモーターから開始されるという、該ＤＮＡとプロモーターの間の物理的および機能的関係性をいう。
【０２２８】
用語「ペプチド」、「タンパク質」および「ポリペプチド」は互換的に用いられ、２つまたはそれ以上のアミノ酸が、１つのアミノ酸のカルボキシル基により別のアミノ酸のαアミノ基へと連結されたものを含む、天然または合成の分子をいう。
【０２２９】
用語「薬学的に許容しうる」とは、化合物、材料、組成物および／または投与形態が、妥当な医学的判断の範囲内において、ヒトおよび動物の組織と接触する使用のために、妥当なベネフィット／リスク比に見合って過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴うことなく適当であることをいう。
【０２３０】
用語「ポリペプチドフラグメント」または「フラグメント」は、特定のポリペプチドに関して用いられるとき、該参照のポリペプチドと比較してアミノ基残基が欠失されているが、残るアミノ酸配列は通常、参照ポリペプチドの配列と同一であるポリペプチドをさす。そのような欠失は、参照ポリペプチドのアミノ末端もしくはカルボキシ末端またはその両方におけるものでありうる。フラグメントは典型的には、少なくとも約５、６、８もしくは１０アミノ酸の長さ、少なくとも約１４アミノ酸の長さ、少なくとも約２０、３０、４０もしくは５０アミノ酸の長さ、少なくとも約７５アミノ酸の長さ、または少なくとも約１００、１５０、２００、３００、５００もしくはそれ以上のアミノ酸の長さである。フラグメントは、参照ポリペプチドの生物学的活性の１つまたはそれ以上を維持しうる。さまざまな態様において、フラグメントは、参照ポリペプチドの酵素活性および／または相互作用部位を含みうる。他の一態様において、フラグメントは免疫学的性質を有しうる。
【０２３１】
用語「タンパク質ドメイン」とは、構造的完全性を示すタンパク質の一部分、タンパク質の複数の部分、またはタンパク質全体をいい、その決定は、タンパク質の一部分、タンパク質の複数の部分、またはタンパク質全体のアミノ酸組成に基づきうる。
【０２３２】
用語「一本鎖可変フラグメントまたはｓｃＦｖ」は、重鎖ドメインと軽鎖ドメインが連結されたＦｖフラグメントをいう。１つまたはそれ以上のｓｃＦｖフラグメントが他の抗体フラグメント（例えば重鎖または軽鎖の定常ドメイン）に連結されて、１つまたはそれ以上の抗原認識部位を有する抗体コンストラクトを形成しうる。
【０２３３】
本書において「スペーサー」とは、融合タンパク質を構成するタンパク質を連結するペプチドをさす。スペーサーは一般に、前記タンパク質を連結するか、またはそれらの間にいくらかの短い距離もしくは他の空間的関係を確保する以外に、特別な生物学的活性を持たない。しかしながら、スペーサーを構成するアミノ酸は、分子の何らかの性質、例えば分子のフォールディング、正味荷電、または疎水性に影響を及ぼすように選択されうる。
【０２３４】
本書において、用語「特異的に結合する」とは、ポリペプチド（抗体を包含する）または受容体に関して用いられるとき、タンパク質および他のバイオ医薬の不均一集団における該タンパク質もしくはポリペプチドまたは受容体の存在を決定する結合反応をいう。したがって、特定される条件（例えば、抗体の場合に免疫アッセイ条件）において、特定のリガンドまたは抗体は、その特定の「標的」に、サンプル中に存在する他のタンパク質、または生体内において該リガンドもしくは抗体が接触しうる他のタンパク質に有意な量で結合しない場合に、「特異的に結合する」（例えば、抗体がある内皮抗原に特異的に結合する）。通常、第２の分子に「特異的に結合する」第１の分子は、該第２の分子に対して約１０５Ｍ−１よりも大きい（例えば１０６Ｍ−１、１０７Ｍ−１、１０８Ｍ−１、１０９Ｍ−１、１０１０Ｍ−１、１０１１Ｍ−１、および１０１２Ｍ−１、またはそれ以上の）親和定数（Ｋａ）を有する。
【０２３５】
本書において、用語「特異的に送達する」とは、ある分子が、ある特定の標的分子またはマーカーを有する細胞または組織と優先的に結び付き、該標的分子を欠く細胞または組織とはそうでないことをいう。分子と非標的の細胞または組織との間にある程度の非特異的相互作用が起こりうることは、当然認識される。しかしながら、特異的送達は、標的分子の特異的認識に仲介されるものとして、区別されうる。特異的送達は典型的には、送達される分子と標的分子を有する細胞との間に、送達される分子と標的分子を欠く細胞との間よりもはるかに強い結び付きをもたらす。
【０２３６】
用語「対象」とは、投与または処置の標的である任意の個体をいう。対象は、脊椎動物、例えば哺乳動物でありうる。したがって、対象はヒトまたは動物の患者でありうる。用語「患者」は、医療家、例えば医師の処置を受ける対象をいう。
【０２３７】
用語「処置に有効」とは、疾患または障害の１つまたはそれ以上の原因または症状を改善するのに十分な、用いられる組成物の量をいう。そのような改善は、軽減または改変であればよく、解消である必要はない。
【０２３８】
用語「形質導入」および「トランスフェクション」とは、核酸、例えば発現ベクターの、レシピエント細胞への導入を意味し、該細胞の染色体ＤＮＡへの核酸導入を包含する。
【０２３９】
用語「処置」とは、疾患、病的状態または障害の治癒、軽減、安定化または防止が意図される、患者の医学的処置をさす。該用語は、アクティブな処置、すなわち疾患、病的状態または障害の改善に特に向けられる処置を包含し、また、原因処置、すなわち疾患、病的状態または障害の原因を取り除くことに向けられる処置を包含する。該用語はさらに、緩和処置、すなわち疾患、病的状態または障害の治癒よりもむしろ症状の緩和のためにデザインされる処置；予防処置、すなわち疾患、病的状態または障害の発症を最小限にする、または部分的もしくは完全に阻止することに向けられる処置；および補助的処置、すなわち疾患、病的状態または障害の改善に向けられる別の特定の処置を補助するために用いられる処置を包含する。
【０２４０】
用語「バリアント」とは、保存的アミノ酸置換、非保存的アミノ酸置換（すなわち縮重バリアント）、アミノ酸をコードする各コドン（すなわちＤＮＡおよびＲＮＡ）のゆらぎ位置内での置換、ペプチドＣ末端に付加されたアミノ酸を有するアミノ酸またはペプチド配列、または参照される配列との配列同一性が６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるペプチドをいう。
【０２４１】
用語「ベクター」とは、細胞内に、該ベクター配列に連結された別の核酸を運ぶことのできる核酸配列をさす。用語「発現ベクター」は、細胞による発現に適当な形態で（例えば、転写調節エレメントに連結された形態で）遺伝子コンストラクトを含む任意のベクター（例えば、プラスミド、コスミドまたはファージ染色体）を包含する。
【０２４２】
本発明の多くの態様を説明した。しかしながら、本発明の精神および範囲から外れることなくさまざまな変更がなされうることが理解される。したがって、他の態様が特許請求の範囲に含まれる。
【０２４３】
本書に用いられる技術用語および科学用語はいずれも、別に定義しない限り、本発明が属する技術分野における専門家により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本書に引用される刊行物およびそこから引用される内容は、特に参照により本書の一部とされる。
【０２４４】
当業者は、本書に記載される発明の特定の態様の多くの等価物を、認識しうるか、またはルーチンなものを超えない実験によって確認することができる。そのような等価物は特許請求の範囲に包含されることが意図される。
【配列表】
2021520780000001.app
【国際調査報告】
2021520780.tif 000090
2021520780.tif 000091
2021520780.tif 000092