(57)【要約】本発明は、式(II)または(IIb)の化合物に関する。式中、X、Y、Rx、Ry、R5、およびNuは、本明細書および特許請求の範囲において定義されるとおりである。式(II)の化合物をオリゴヌクレオチドの製造において使用することができる。2021508327.tif 000114
2021508327.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式(II)
2021508327.tif 000103
の化合物：
式中、
Xは、酸素、硫黄、-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(=CRaRb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-；-O-NRa-、-NRa-O-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-、または-O-CRaRb-であり；
Yは、酸素、硫黄、-(CRaRb)n-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-、または-O-CRaRb-であり；
ただし、-X-Y-は、-O-O-、Si(Ra)2-Si(Ra)2-、-SO2-SO2-、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=N-C(Ra)=N-、-C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N-、および-Se-Se-のいずれでもないことを条件とし；
Jは、酸素、硫黄、=CH2、または=N(Ra)であり；
RaおよびRbは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、-OC(=Xa)Rc、-OC(=Xa)NRcRd、および-NReC(=Xa)NRcRdより独立に選択されるか、または
2個のジェミナルなRaおよびRbは一緒に、任意で置換されたメチレンを形成するか、または
2個のジェミナルなRaおよびRbは、それらが結合している炭素原子と一緒に、-X-Y-の炭素原子を1つだけ有するシクロアルキルもしくはハロシクロアルキルを形成し、
置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、および置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールより独立に選択される1〜3個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、およびメチレンであり；
Xaは、酸素、硫黄、または-NRcであり；
Rc、Rd、およびReは、水素およびアルキルより独立に選択され；かつ
nは、1、2、または3であり；
R5は、ヒドロキシル保護基であり；
Rxは、フェニル、ニトロフェニル、フェニルアルキル、ハロフェニルアルキル、シアノアルキル、フェニルカルボニルスルファニルアルキル、ハロフェニルカルボニルスルファニルアルキルアルキルカルボニルスルファニルアルキル、またはアルキルカルボニルカルボニルスルファニルアルキルであり；
Ryは、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり；かつ
Nuは、核酸塩基または保護された核酸塩基である。
【請求項２】
X-Y-が、-CH2-O-、-CH(CH3)-O-、または-CH2CH2-O-である、請求項1記載の化合物。
【請求項３】
式(III)または(IV)
2021508327.tif 000104
のものであり、式中、R5、Rx、Ry、およびNuは、請求項1で定義されるとおりである、請求項1または2記載の化合物。
【請求項４】
式(IIb)
2021508327.tif 000105
の化合物：
式中、
R5は、ヒドロキシル保護基であり；
Rxは、フェニル、ニトロフェニル、フェニルアルキル、ハロフェニルアルキル、シアノアルキル、フェニルカルボニルスルファニルアルキル、ハロフェニルカルボニルスルファニルアルキルアルキルカルボニルスルファニルアルキル、またはアルキルカルボニルカルボニルスルファニルアルキルであり；
Ryは、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり；かつ
Nuは、核酸塩基または保護された核酸塩基である。
【請求項５】
Rxが、フェニル、ニトロフェニル、フェニルメチル、ジクロロフェニルメチル、シアノエチル、メチルカルボニルスルファニルエチル、エチルカルボニルスルファニルエチル、イソプロピルカルボニルスルファニルエチル、tert-ブチルカルボニルスルファニルエチル、メチルカルボニルカルボニルスルファニルエチル、またはジフルオロフェニルカルボニルスルファニルエチルである、請求項1〜4のいずれか一項記載の化合物。
【請求項６】
Rxがフェニルカルボニルスルファニルアルキルである、請求項1〜5のいずれか一項記載の化合物。
【請求項７】
Rxがフェニルカルボニルスルファニルエチルである、請求項1〜6のいずれか一項記載の化合物。
【請求項８】
Ryがジイソプロピルアミノまたはピロリジニルである、請求項1〜7のいずれか一項記載の化合物。
【請求項９】
Ryがピロリジニルである、請求項1〜8のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１０】
式(V)
2021508327.tif 000106
のものであり、式中、R5およびNuは、請求項1で定義されたとおりである、請求項1〜9のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１１】
式(Vb)
2021508327.tif 000107
のものであり、式中、R5およびNuは、請求項4で定義されたとおりである、請求項4〜9のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１２】
Nuが、チミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、5-メチルシトシン、保護された5-メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシル、または保護されたウラシルである、請求項1〜11のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１３】
2021508327.tif 000108
2021508327.tif 000109
より選択される、請求項1〜12のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１４】
2021508327.tif 000110
2021508327.tif 000111
より選択される、請求項1〜12のいずれか一項記載の化合物。
【請求項１５】
酸性カップリング剤およびシリル化剤の存在下での5’保護LNAヌクレオシドまたは5’保護MOEヌクレオシドとホスフィンおよび片側保護ジチオールとの反応を含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の式(II)または(IIb)の化合物を製造するための方法。
【請求項１６】
酸性カップリング剤およびシリル化剤の存在下での式(C)または(Cb)
2021508327.tif 000112
の化合物と式P(Ry)3の化合物および式HSRxの化合物との反応を含み、式中、X、Y、R5、Nu、Rx、およびRyは、請求項1〜12のいずれか一項で定義されたとおりである、請求項15記載の方法。
【請求項１７】
酸性カップリング剤およびシリル化剤の存在下での式(C1)
2021508327.tif 000113
の化合物と式P(Ry)3の化合物および式HSRxの化合物との反応を含み、式中、R5、Nu、Rx、およびRyは、請求項1〜12のいずれか一項で定義されたとおりである、請求項15または16記載の方法。
【請求項１８】
式(II)または(IIb)の粗製化合物を分取HPLCによって精製する、請求項15〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
式(II)または(IIb)の粗製化合物を、アセトニトリル対水酸化アンモニウム水溶液の勾配を用いて溶出させる、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
オリゴヌクレオチドの製造における、請求項1〜14のいずれか一項記載の化合物の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
治療物質としての合成オリゴヌクレオチドの使用は、この数十年の間に著しい進歩を目の当たりにし、RNアーゼH活性化ギャップマー、スプライススイッチングオリゴヌクレオチド、マイクロRNA阻害剤、siRNA、またはアプタマーを含む、多様なメカニズムによって作用する分子が開発されてきた(S. T. Crooke, Antisense drug technology： principles, strategies, and applications, 2nd ed. ed., Boca Raton, FL： CRC Press, 2008（非特許文献1）)。しかし、オリゴヌクレオチドは、生物系において核酸分解に対して本質的に不安定である。さらに、オリゴヌクレオチドは、著しく不都合な薬物動態学的挙動を示す。これらの欠点を改善するために、多種多様の化学修飾がここ数十年間に調査されてきた。議論の余地はあるにしても、最も上首尾な修飾のうちの1つは、非架橋リン酸酸素原子のうちの1つが硫黄原子で置換されているホスホロチオアート結合の導入である(F. Eckstein, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009, 10, 117-121（非特許文献2）)。このようなホスホロチオアートオリゴデオキシヌクレオチドは、それらの未修飾のリン酸ジエステル類似体と比べて、増大されたタンパク質結合および核酸分解に対する明瞭に高い安定性、ならびにしたがって、実質的に長い、血漿、組織、および細胞における半減期を示す。これらの非常に重要な特徴により、第1世代のオリゴヌクレオチド治療的物質の開発が可能になり、ロックド核酸(LNA)のような後世代の修飾を通してのさらなる改良に向けてのドアが開かれた。しかし、ホスホロチオアートでリン酸ジエステル結合を置換すると、リン原子の位置にキラル中心が生じる。結果として、認可されているホスホロチオアートオリゴヌクレオチド治療物質はどれも、莫大な量のジアステレオ異性体化合物の混合物として使用され、これらのジアステレオ異性体化合物はすべて、異なる(おそらくは対立する)生理化学的特性および薬理学的特性を潜在的に有する。
【０００２】
単一の立体化学的に定義されたホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの立体特異的合成が現在は可能である(N. Oka, M. Yamamoto, T. Sato, T. Wada, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037（非特許文献3）)が、莫大な数の存在し得るジアステレオ異性体の中から最適な特性を有する立体異性体を同定することは依然として難題である。これに関連して、非キラルなチオリン酸結合を用いることによりジアステレオ異性体の複雑性を低めることに、大きな関心が持たれている。例えば、リン酸結合内の両方の非架橋酸素原子を硫黄で置換する、対称的な非架橋ジチオアート修飾(例えば、W. T. Wiesler, M. H. Caruthers, J. Org. Chem. 1996, 61, 4272-4281（非特許文献4）を参照されたい)が、免疫賦活性オリゴヌクレオチド(A. M. Krieg, S. Matson, E. Fisher, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996, 6, 133-139（非特許文献5）)、siRNA(例えば、X. Yang, M. Sierant, M. Janicka, L. Peczek, C. Martinez, T. Hassell, N. Li, X. Li, T. Wang, B. Nawrot, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 1214-1220（非特許文献6）)、およびアプタマー(例えば、X. Yang, S. Fennewald, B. A. Luxon, J. Aronson, N. K. Herzog, D. G. Gorenstein, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 3357-3362（非特許文献7）)に適用されている。興味深いことに、アンチセンスオリゴヌクレオチドに関連してこの非キラルな修飾を利用する試みは、これまで、限定的にしか成功していない(例えば、M. K. Ghosh, K. Ghosh, O. Dahl, J. S. Cohen, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 5761-5766（非特許文献8）およびJ. P. Vaughn, J. Stekler, S. Demirdji, J. K. Mills, M. H. Caruthers, J. D. Iglehart, J. R. Marks, Nucleic Acids Res. 1996, 24, 4558-4564（非特許文献9）を参照されたい)。
【０００３】
驚いたことには、本発明者らは、非架橋ホスホロジチオアートをオリゴヌクレオチド、特に、一般的なオリゴヌクレオチドギャップマーまたはミクスマー、特に、LNA-DNA-LNAギャップマーまたはLNA/DNAミクスマーに導入できることをこれまでに発見した。この修飾は、忍容性が良好であり、結果として生じる分子は、治療的適用に対して大きな可能性を示し、どの非架橋ホスホロジチオアート修飾も、存在し得るジアステレオ異性体の全体的ライブラリーのサイズを50％小さくする。この修飾をギャップマーのLNAフランク中に配置すると、結果として生じるオリゴヌクレオチドは、通常、対応するすべての親ホスホロチオアートよりも強力になる。通常、この修飾は、ギャップ領域内でさらに忍容性が良好であり、さらに驚くべきことに、適切に配置された場合、改良された効力もまた、もたらすことができる。
【０００４】
したがって、本発明者らは、例えば、改良された効力を含む、改良された生理化学的特性および薬理学的特性を有するオリゴヌクレオチドを本発明が提供することを、驚くべきことに発見した。いくつかの局面において、本発明のオリゴヌクレオチドは、活性または有効性を保持しており、かつ式(IAまたはIBIB)のホスホジチオアート結合が従来の立体的にランダムなホスホロチオアート結合で置換されている同一の化合物(ホスホロチオアート参照化合物)と同じくらい強力であり得るか、またはそれより強力である。非架橋ホスホロジチオアート修飾の導入はどれも、リンの位置のキラル中心のうちの1つを取り除き、それによって、化合物のジアステレオ異性体による複雑性を50％低める。さらに、ジチオアート修飾が導入される場合はいつも、そのオリゴヌクレオチドが、細胞、特に、肝細胞、筋細胞、心臓細胞などに、めざましく良好に取り込まれると思われる。
【０００５】
ギャップマーのLNAフランクへの非架橋ジチオアート修飾の導入は、特に有益であると思われ、より高度な標的減少ならびに実質的に優れた取込み挙動、より高度な安定性、および良好な安定性プロファイルを示す分子をもたらす。
【０００６】
オリゴヌクレオチドにおける非架橋ホスホロジチオアート結合の化学合成は、適切なチオホスホラミダイト構成単位を用いる固相オリゴヌクレオチド合成技術を用いると最もうまく実現する。このようなチオホスホラミダイトの上首尾な適用は、普通のDNA(X. Yang, Curr Protoc Nucleic Acid Chem 2016, 66, 4.71.71-74.71.14.（非特許文献10）)およびRNA(X. Yang, Curr Protoc Nucleic Acid Chem 2017, 70, 4.77.71-74.77.13.（非特許文献11）)について説明されており、必要とされる構成単位は、商業的供給業者から入手可能である。興味深いことに、難易度がより高い、対応するLNAチオホスホラミダイトの合成は、報告されていない。本出願において、本発明者らは、4種すべてのLNAチオホスホラミダイトの合成の成功およびオリゴヌクレオチドへのそれらの組込みについても報告する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】S. T. Crooke, Antisense drug technology： principles, strategies, and applications, 2nd ed. ed., Boca Raton, FL： CRC Press, 2008
【非特許文献２】F. Eckstein, Antisense and Nucleic Acid Drug Development 2009, 10, 117-121
【非特許文献３】N. Oka, M. Yamamoto, T. Sato, T. Wada, J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031-16037
【非特許文献４】W. T. Wiesler, M. H. Caruthers, J. Org. Chem. 1996, 61, 4272-4281
【非特許文献５】A. M. Krieg, S. Matson, E. Fisher, Antisense Nucleic Acid Drug Dev. 1996, 6, 133-139
【非特許文献６】X. Yang, M. Sierant, M. Janicka, L. Peczek, C. Martinez, T. Hassell, N. Li, X. Li, T. Wang, B. Nawrot, ACS Chem. Biol. 2012, 7, 1214-1220
【非特許文献７】X. Yang, S. Fennewald, B. A. Luxon, J. Aronson, N. K. Herzog, D. G. Gorenstein, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1999, 9, 3357-3362
【非特許文献８】M. K. Ghosh, K. Ghosh, O. Dahl, J. S. Cohen, Nucleic Acids Res. 1993, 21, 5761-5766
【非特許文献９】J. P. Vaughn, J. Stekler, S. Demirdji, J. K. Mills, M. H. Caruthers, J. D. Iglehart, J. R. Marks, Nucleic Acids Res. 1996, 24, 4558-4564
【非特許文献１０】X. Yang, Curr Protoc Nucleic Acid Chem 2016, 66, 4.71.71-74.71.14.
【非特許文献１１】X. Yang, Curr Protoc Nucleic Acid Chem 2017, 70, 4.77.71-74.77.13.
【発明の概要】
【０００８】
発明の記載
本発明は、式(I)
2021508327.tif 000003
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、LNAヌクレオシドであり、かつRは、水素またはリン酸保護基である)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドに関する。本発明はさらに、特に、式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むギャップマーオリゴヌクレオチドにも関する。本発明はまた、本発明によるオリゴヌクレオチドを製造するための方法、および本発明によるオリゴヌクレオチドの製造において特に有用であるLNAヌクレオシドモノマーにも関する。
【０００９】
本発明は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000004
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドに関する。
【００１０】
言い換えると、Mは、金属、例えばアルカリ金属、例えばNaもしくはKであるか、またはMは、NH4である。
【００１１】
本発明は、本明細書において説明する式IAまたはIBのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明のオリゴヌクレオチドは、好ましくは、1つまたは複数の2’糖修飾ヌクレオシド、例えば、1つもしくは複数のLNAヌクレオシドまたは1つもしくは複数の2’MOEヌクレオシドを含む、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドである。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的RNAを発現している細胞における標的核酸、例えば標的mRNA前駆体または標的マイクロRNAの発現を、インビボまたはインビトロで調節することができる。いくつかの態様において、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合をさらに含む。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチド、ミクスマーオリゴヌクレオチド、またはトータルマーオリゴヌクレオチドの形態であってよい。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドミクスマーは、標的mRNA前駆体におけるスプライシング事象を調節する際に使用するためのものであってよい。一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドミクスマーは、標的マイクロRNAの発現を阻害する際に使用するためのものであってよい。
【００１２】
本発明はさらに、治療的物質としての、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドのような本発明のオリゴヌクレオチドの使用にも関係する。
【００１３】
本発明はさらに、特に、式(IAまたはIB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むミクスマーオリゴヌクレオチドにも関する。本発明はさらに、特に、式(IAまたはIB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むトータルマーオリゴヌクレオチドにも関する。
【００１４】
本発明はまた、本発明によるオリゴヌクレオチドを製造するための方法、および本発明によるオリゴヌクレオチドの製造において特に有用であるLNAヌクレオシドモノマーにも関する。
【００１５】
本発明はまた、本発明によるオリゴヌクレオチドを製造するための方法、および本発明によるオリゴヌクレオチドの製造において特に有用であるMOEヌクレオシドモノマーにも関する。
【００１６】
本発明はさらに、本発明によるオリゴヌクレオチドの製造において使用され得る新規のMOEモノマーおよびLNAモノマーも提供する。
【００１７】
オリゴヌクレオチド合成の間、保護性R基の使用が、しばしば用いられる。オリゴヌクレオチド合成後、典型的には、保護基は、水素原子に交換されるか、または例えばオリゴヌクレオチドが塩の形態で存在する場合にはアルカリ金属陽イオンもしくはアンモニウム陽イオンのような陽イオンに交換される。典型的には、塩は、金属陽イオン、例えば、ナトリウム陽イオンもしくはカリウム陽イオン、またはアンモニウム陽イオンなどの陽イオンを含む。アンチセンスオリゴヌクレオチドに関して、好ましくは、Rは水素であるか、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドは、(IBに示すような)塩の形態で存在する。
【００１８】
式(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合は、例えば、
2021508327.tif 000005
(式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか；またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
からなる群より選択され得る。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの塩、アルカリ金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩の形態で存在してよい。
【００１９】
別の表し方をすると、本発明のオリゴヌクレオチドは、式IA’またはIB’
2021508327.tif 000006
のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含んでよい。
【００２０】
本発明はさらに、特に、式IAもしくはIBまたは式IA’もしくは式IB’に対して、式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むギャップマーオリゴヌクレオチドにも関する。
【００２１】
本発明はさらに、特に、式IAもしくはIBまたは式IA’もしくは式IB’に対して、式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むミクスマーオリゴヌクレオチドにも関する。
【００２２】
本発明はさらに、特に、式IAもしくはIBまたは式IA’もしくは式IB’に対して、式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むトータルマーオリゴヌクレオチドにも関する。
【００２３】
本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい態様において、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、LNAヌクレオシドである。
【００２４】
本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい態様において、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、2’-O-MOEヌクレオシドである。
【００２５】
本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、LNAヌクレオシドである。
【００２６】
本発明のオリゴヌクレオチドの好ましい態様において、オリゴヌクレオチドは、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであり、かつ2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、2’-O-MOEヌクレオシドである。
【００２７】
本発明は、細胞において標的RNAを阻害するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドは、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000007
(式中、(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド(本明細書においてギャップマーまたはギャップマーオリゴヌクレオチドと呼ばれる)であるか、またはそれを含む。
【００２８】
したがって、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを含むか、またはそれからなってよい。
【００２９】
本発明は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000008
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、LNAヌクレオシドであり、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンであり、A2は、該オリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシドである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３０】
本発明は、式(IA)または(IB)18
2021508327.tif 000009
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、LNAヌクレオシドであり、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンであり、A1は、該オリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレオシドである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３１】
本発明は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000010
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、2-O-MOEヌクレオシドであり、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンであり、A2は、該オリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシドである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３２】
本発明は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000011
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、2-O-MOEヌクレオシドであり、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンであり、A1は、該オリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレオシドである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３３】
本発明は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000012
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、2’糖修飾ヌクレオシドであり、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンであり、A2は、該オリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシドである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３４】
本発明は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000013
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、2’糖修飾ヌクレオシドであり、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンであり、A1は、該オリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレオシドである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。
【００３５】
2’糖修飾ヌクレオシドは、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシアルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-RNAヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、およびLNAヌクレオシドからなる群より選択される2’糖修飾ヌクレオシドからなる群より独立に選択されてよい。
【００３６】
本発明は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000014
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、
該一本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合(Sp、S)または(Rp、R)
2021508327.tif 000015
(N1およびN2はヌクレオシドである)
をさらに含む。
【００３７】
本発明はまた、細胞においてRNA標的を調節するための一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、10〜30ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、該連続ヌクレオチド配列は、1つまたは複数の2’糖修飾ヌクレオシドを含み、かつ該連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間に存在するヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000016
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつRは、水素またはリン酸保護基である)
のホスホロジチオアート結合である。
【００３８】
本発明はまた、細胞においてRNA標的を調節するための一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、10〜30ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、該連続ヌクレオチド配列は、1つまたは複数の2’糖修飾ヌクレオシドを含み、かつ該連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間に存在するヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000017
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
のホスホロジチオアート結合であり、
該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、mRNA前駆体である標的RNAのスプライシングを調節する際に使用するためのものである。
【００３９】
本発明はまた、細胞においてRNA標的を調節するための一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、10〜30ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、該連続ヌクレオチド配列は、1つまたは複数の2’糖修飾ヌクレオシドを含み、かつ該連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間に存在するヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000018
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
のホスホロジチオアート結合であり、
該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長い非コーディングRNAの発現を阻害する際に使用するためのものである。本発明の化合物によって標的とすることができるlncRNAの例については、WO 2012/065143を参照されたい。
【００４０】
本発明はまた、細胞においてRNA標的を調節するための一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、10〜30ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、該連続ヌクレオチド配列は、1つまたは複数の2’糖修飾ヌクレオシドを含み、かつ該連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間に存在するヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000019
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)のホスホロジチオアート結合であり、
該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトmRNAまたはmRNA前駆体である標的の発現を阻害する際に使用するためのものである。
【００４１】
本発明はまた、細胞においてRNA標的を調節するための一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、10〜30ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、該連続ヌクレオチド配列は、1つまたは複数の2’糖修飾ヌクレオシドを含み、かつ該連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間に存在するヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000020
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
のホスホロジチオアート結合であり、
該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ウイルスRNA標的の発現を阻害する際に使用するためのものである。適切なウイルスRNA標的は、例えば、HCVまたはHBVであり得る。
【００４２】
本発明はまた、細胞においてRNA標的を調節するための一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、7〜30ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、該連続ヌクレオチド配列は、1つまたは複数の2’糖修飾ヌクレオシドを含み、かつ該連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間に存在するヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000021
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
のホスホロジチオアート結合であり、
該一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドは、マイクロRNAの発現を阻害する際に使用するためのものである。
【００４３】
RNA標的、例えば、mRNA前駆体標的、mRNA標的、ウイルスRNA標的、マイクロRNA標的、または長い非コーディングRNA標的を標的とする場合、本発明のオリゴヌクレオチドは、適切に、標的RNAの発現を阻害することができる。これは、アンチセンスオリゴヌクレオチドと標的RNAの相補性によって実現する。RNA標的の阻害は、RNA標的のレベルを下げることによって、またはRNA標的の機能を妨害することによって、実現することができる。RNA標的のRNA阻害は、例えばギャップマーの使用を介した、RNアーゼHのような細胞RNアーゼの動員によって適切に実現することができるか、または(例えば、マイクロRNA阻害の場合、mRNA前駆体のスプライス調節の場合、もしくは長い非コーディングRNAと染色質との相互作用の妨害の場合の)立体的妨害メカニズムのような、ヌクレアーゼを媒介としないメカニズムによって、実現することができる。
【００４４】
本発明はまた、本発明によるオリゴヌクレオチドを製造するための方法、および本発明によるオリゴヌクレオチドの製造において特に有用であるLNAヌクレオシドモノマーまたはMOEヌクレオシドモノマーにも関する。
【００４５】
本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩またはそのコンジュゲート、特に、ナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩を提供する。
【００４６】
本発明は、オリゴヌクレオチドまたはその薬学的に許容される塩と、該オリゴヌクレオチドまたは該薬学的に許容される塩に任意でリンカー部分を介して共有結合的に結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲートを提供する。
【００４７】
本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート、および治療的に不活性な担体を含む、薬学的組成物を提供する。
【００４８】
本発明は、治療的に活性な物質として使用するための、本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲートを提供する。
【００４９】
本発明は、標的RNAを発現している細胞において該RNAを調節するための方法を提供し、該方法は、本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、コンジュゲート、または組成物の有効量を細胞に投与する段階を含み、該オリゴヌクレオチドは、該標的RNAに相補的である。
【００５０】
本発明は、標的mRNA前駆体を発現している細胞において該RNA前駆体のスプライシングを調節する方法を提供し、該方法は、本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、コンジュゲート、または組成物の有効量を細胞に投与する段階を含み、該オリゴヌクレオチドは、該標的RNAに相補的であり、該mRNA前駆体におけるスプライシング事象を調節することができる。
【００５１】
本発明は、ヒト細胞のような細胞においてmRNA前駆体、mRNA、または長い非コーディングRNAを阻害するための、本発明のオリゴヌクレオチド、薬学的な塩、コンジュゲート、または組成物の使用を提供する。
【００５２】
上記の方法または使用は、インビトロの方法またはインビボの方法であってよい。
【００５３】
本発明は、医薬の製造における、本発明のオリゴヌクレオチド、薬学的な塩、コンジュゲート、または組成物の使用を提供する。
【００５４】
本発明は、一本鎖ホスホロチオアートアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロまたはインビボでの安定性を増強するために使用するための、式IAまたはIBのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合の使用を提供する。
【００５５】
本発明は、一本鎖ホスホロチオアートアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロまたはインビボでの作用持続期間を延長するために使用するための、式IAまたはIBのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合の使用を提供する。
【００５６】
本発明は、一本鎖ホスホロチオアートアンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞取込みまたは組織分布を増大させるために使用するための、式IAまたはIBのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合の使用を提供する。
【００５７】
本発明は、骨格筋、心臓、(例えばHtra1ターゲティング化合物の場合の)網膜上皮細胞を含む上皮細胞、肝臓、腎臓、または脾臓からなる群より選択される組織中への一本鎖ホスホロチオアートアンチセンスオリゴヌクレオチドの取込みを増大させるために使用するための、式IAまたはIBのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合の使用を提供する。
【００５８】
インビボでの使用の場合、一本鎖ホスホロチオアートアンチセンスオリゴヌクレオチドは、治療的オリゴヌクレオチドであってよい。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】本発明によるオリゴヌクレオチドの投与から24時間後および74時間後の初代ラット肝細胞における標的mRNAのレベルを示す。図1は、1つの本発明によるホスホロジチオアートヌクレオシド間結合をギャップ中に有するオリゴヌクレオチドギャップマーの投与から24時間後および74時間後の初代ラット肝細胞における標的mRNAのレベルを示す。
【図２】本発明によるオリゴヌクレオチドの投与から24時間後および74時間後の初代ラット肝細胞における標的mRNAのレベルを示す。図2は、複数の本発明によるホスホロジチオアートヌクレオシド間結合をギャップ中に有するオリゴヌクレオチドギャップマーの投与から24時間後および74時間後の初代ラット肝細胞における標的mRNAのレベルを示す。
【図３】本発明によるオリゴヌクレオチドの投与から24時間後および74時間後の初代ラット肝細胞における標的mRNAのレベルを示す。図3は、複数の本発明によるホスホロジチオアートヌクレオシド間結合をギャップ中に有するオリゴヌクレオチドギャップマーの投与から24時間後および74時間後の初代ラット肝細胞における標的mRNAのレベルを示す。
【図４】本発明によるオリゴヌクレオチドの投与から24時間後および74時間後の初代ラット肝細胞における標的mRNAのレベルを示す。図4は、本発明によるホスホロジチオアートヌクレオシド間結合をフランク中に有するオリゴヌクレオチドギャップマーの投与から24時間後および74時間後の初代ラット肝細胞における標的mRNAのレベルを示す。
【図５】RNAおよびDNAにハイブリダイズされた、本発明によるホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの熱融解(Tm)を示す。
【図６】本発明によるホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドのラット血清中での安定性を示す。
【図７】ギャップマーのギャップ領域およびフランク領域中のアキラルなホスホジチオアートについての調査−初代ラット肝細胞の処理後の残存mRNAレベル。
【図８】ギャップマーのギャップ領域中のアキラルなホスホジチオアートの位置的依存性および最適化手法についての調査―初代ラット肝細胞の処理後の残存mRNAレベル。
【図９Ａ】ギャップマーのギャップ領域中のアキラルなホスホジチオアートについての調査−細胞取込みに対する効果。
【図９Ｂ】ギャップマーのギャップ領域中のアキラルなホスホジチオアートについての調査−細胞取込みに対する効果。
【図１０Ａ】ギャップマーのフランク領域にアキラルなホスホロジチオアートを導入すると、効力が増大し、ホスホロチオアートの量と効力の増大には相関関係がある(フランク中のホスホロジチオアート結合の数について4個の結合＞3個の結合＞2個の結合＞1個の結合＞結合なし)。
【図１０Ｂ】ギャップマーのフランク領域にアキラルなホスホロジチオアートを導入すると、効力が増大し、ホスホロチオアートの量と効力の増大には相関関係がある(フランク中のホスホロジチオアート結合の数について4個の結合＞3個の結合＞2個の結合＞1個の結合＞結合なし)。
【図１１】異なる細胞型におけるIC50値。
【図１２】3'末端を保護されたLNAオリゴヌクレオチドのインビトロでのラット血清中安定性。
【図１３】フランクおよびギャップ領域中にアキラルなホスホロジチオアート結合を含むギャップマーのインビボ評価―標的阻害。
【図１４Ａ】フランクおよびギャップ領域中にアキラルなホスホロジチオアート結合を含むギャップマーのインビボ評価−組織取込み。
【図１４Ｂ】フランクおよびギャップ領域中にアキラルなホスホロジチオアート結合を含むギャップマーのインビボ評価−肝臓/腎臓比。
【図１５Ａ】フランクおよびギャップ領域中にアキラルなホスホロジチオアート結合を含むギャップマーのインビボ評価−代謝産物解析。
【図１５Ｂ】フランクおよびギャップ領域中にアキラルなホスホロジチオアート結合を含むギャップマーのインビボ評価−代謝産物解析。
【図１６】アキラルなホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドに伴う長期の作用持続期間は、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合と組み合わせることによってさらに延ばすことができる。
【図１７Ａ】MALAT-1を標的とするアキラルなホスホロジチオアートギャップマーのインビトロでのEC50測定。
【図１７Ｂ】MALAT-1を標的とするアキラルなホスホロジチオアートギャップマーのインビボでの効力。
【図１７Ｃ】MALAT-1を標的とするアキラルなホスホロジチオアートギャップマーのインビボ研究−組織含有量。
【図１８Ａ】ApoBを標的とするアキラルなモノホスホロチオアート修飾ギャップマーオリゴヌクレオチドのインビトロ研究。活性データ。
【図１８Ｂ】ApoBを標的とするアキラルなモノホスホロチオアート修飾ギャップマーオリゴヌクレオチドのインビトロ研究。細胞含有量データ。
【図１９Ａ】ApoBを標的とするキラルなホスホロジチオアート修飾ギャップマーオリゴヌクレオチドのインビトロ研究。活性データ。
【図１９Ｂ】ApoBを標的とするキラルなホスホロジチオアート修飾ギャップマーオリゴヌクレオチドのインビトロ研究。細胞含有量データ。
【図２０】TNFRSF1Bの3'スプライス部位を標的とするスプライススイッチングオリゴヌクレオチド中に存在するアキラルなホスホロジチオアート(P2S)ヌクレオシド間結合の効果。ヒトColo 205細胞を96ウェルプレートに播種し、5μM(A)および25μM(B)のオリゴにそれぞれ曝露した。エクソン7スキッピングの比率(％)を、エクソン6〜8接合部を標的とするプローブを用いる液滴デジタルPCRによって解析し、エクソン2〜3を標的とするアッセイ法によってTNFRSF1Bの総量と比較した。SSO#26は親オリゴであり、SSO#27は、TNFRSF1Bを標的としない陰性対照である。
【図２１】S1ヌクレアーゼを用いる安定性アッセイ法。ジチオアートを含むオリゴをS1ヌクレアーゼと共に30分間および120分間、それぞれインキュベートした。これらのオリゴを15％TBE-尿素ゲル上で可視化した。インタクトなオリゴの移動のマーカーとして、(SSO#14)をS1ヌクレアーゼに曝露せずに含めた。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
定義
本明細書において、用語「アルキル」は、単独でまたは組合せで、1〜8個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキル基、具体的には1〜6個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキル基、より具体的には1〜4個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のアルキル基を意味する。直鎖および分枝鎖のC1〜C8アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、tert-ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチル、および異性体オクチル、特に、メチル、エチル、プロピル、ブチル、およびペンチルである。アルキルの具体例は、メチル、エチル、およびプロピルである。
【００６１】
用語「シクロアルキル」は、単独でまたは組合せで、3〜8個の炭素原子を有するシクロアルキル環、および具体的には3〜6個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル、およびシクロオクチル、より具体的にはシクロプロピルおよびシクロブチルである。「シクロアルキル」の具体例は、シクロプロピルである。
【００６２】
用語「アルコキシ」は、単独でまたは組合せで、式アルキル-O-(式中、用語「アルキル」は、先に示した意味を有する)を有する基、例えば、メトキシ、エトキシ、n-プロポキシ、イソプロポキシ、n-ブトキシ、イソブトキシ、sec-ブトキシ、およびtert-ブトキシを意味する。具体的な「アルコキシ」は、メトキシおよびエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の具体例である。
【００６３】
用語「オキシ」は、単独でまたは組合せで、-O-基を意味する。
【００６４】
用語「アルケニル」は、単独でまたは組合せで、オレフィン結合および最高8個、好ましくは最高6個、特に好ましくは最高4個の炭素原子を含む、直鎖または分枝の炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、1-プロペニル、2-プロペニル、isoプロペニル、1-ブテニル、2-ブテニル、3-ブテニル、およびイソブテニルである。
【００６５】
用語「アルキニル」は、単独でまたは組合せで、三重結合および最高8個、好ましくは2個の炭素原子を含む、直鎖または分枝の炭化水素残基を意味する。
【００６６】
用語「ハロゲン」または「ハロ」は、単独でまたは組合せで、フッ素、塩素、臭素、またはヨウ素、および具体的には、フッ素、塩素、または臭素、より具体的にはフッ素を意味する。用語「ハロ」は、別の基との組合せで、少なくとも1つのハロゲンによる該基の置換、具体的には1〜5個のハロゲン、特に1〜4個のハロゲン、すなわち、1個、2個、3個、または4個のハロゲンによる置換を意味する。
【００６７】
用語「ハロアルキル」は、単独でまたは組合せで、少なくとも1つのハロゲンによって置換された、具体的には1〜5個のハロゲン、特に1〜3個のハロゲンよって置換された、アルキル基を意味する。ハロアルキルの例には、モノフルオロ-、ジフルオロ-、またはトリフルオロ-メチル、-エチル、または-プロピル、例えば3,3,3-トリフルオロプロピル、2-フルオロエチル、2,2,2-トリフルオロエチル、フルオロメチル、またはトリフルオロメチルが含まれる。フルオロメチル、ジフルオロメチル、およびトリフルオロメチルは、具体的な「ハロアルキル」である。
【００６８】
用語「ハロシクロアルキル」は、単独でまたは組合せで、少なくとも1つのハロゲンによって置換された、具体的には1〜5個のハロゲン、特に1〜3個のハロゲンよって置換された、上記に定義されたシクロアルキル基を意味する。「ハロシクロアルキル」の具体例は、ハロシクロプロピル、特にフルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピル、およびトリフルオロシクロプロピルである。
【００６９】
用語「ヒドロキシル」および「ヒドロキシ」は、単独でまたは組合せで、-OH基を意味する。
【００７０】
用語「チオヒドロキシル」および「チオヒドロキシ」は、単独でまたは組合せで、-SH基を意味する。
【００７１】
用語「カルボニル」は、単独でまたは組合せで、-C(O)-基を意味する。
【００７２】
用語「カルボキシ」または「カルボキシル」は、単独でまたは組合せで、-COOH基を意味する。
【００７３】
用語「アミノ」は、単独でまたは組合せで、第一級アミノ基(-NH2)、第二級アミノ基(-NH-)、または第三級アミノ基(-N-)を意味する。
【００７４】
用語「アルキルアミノ」は、単独でまたは組合せで、上記に定義された1つまたは2個のアルキル基で置換された、上記に定義されたアミノ基を意味する。
【００７５】
用語「スルホニル」は、単独でまたは組合せで、-SO2基を意味する。
【００７６】
用語「スルフィニル」は、単独でまたは組合せで、-SO-基を意味する。
【００７７】
用語「スルファニル」は、単独でまたは組合せで、-S-基を意味する。
【００７８】
用語「シアノ」は、単独でまたは組合せで、-CN基を意味する。
【００７９】
用語「アジド」は、単独でまたは組合せで、-N3基を意味する。
【００８０】
用語「ニトロ」は、単独でまたは組合せで、NO2基を意味する。
【００８１】
用語「ホルミル」は、単独でまたは組合せで、-C(O)H基を意味する。
【００８２】
用語「カルバモイル」は、単独でまたは組合せで、-C(O)NH2基を意味する。
【００８３】
用語「カルバミド」は、単独でまたは組合せで、-NH-C(O)-NH2基を意味する。
【００８４】
用語「アリール」は、単独でまたは組合せで、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、およびホルミルより独立に選択される1〜3個の置換基によって任意で置換された、6〜10個の炭素環原子を含む、一価芳香族炭素環式の一環式または二環式の環系を意味する。アリールの例には、フェニルおよびナフチル、特にフェニルが含まれる。
【００８５】
用語「ヘテロアリール」は、単独でまたは組合せで、N、O、およびSより選択される1個、2個、3個、または4個のヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である、5〜12個の環原子を有する一価芳香族複素環式の一環式または二環式の環系を意味し、これは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、およびホルミルより独立に選択される1〜3個の置換基で置換されていてもよい。ヘテロアリールの例には、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリル、またはアクリジニルが含まれる。
【００８６】
用語「ヘテロシクリル」は、単独でまたは組合せで、N、O、およびSより選択される1個、2個、3個、または4個の環ヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である、4〜12個、特に4〜9個の環原子を有する一価の飽和または部分的に不飽和な一環式または二環式の環系を意味し、これは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、およびホルミルより独立に選択される1〜3個の置換基で置換されていてもよい。単環式の飽和ヘテロシクリルの例は、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロチエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、1,1-ジオキソ-チオモルホリン-4-イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル、またはオキサゼパニルである。二環式の飽和ヘテロシクロアルキルの例は、8-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクチル、キヌクリジニル、8-オキサ-3-アザ-ビシクロ[3.2.1]オクチル、9-アザ-ビシクロ[3.3.1]ノニル、3-オキサ-9-アザ-ビシクロ[3.3.1]ノニル、または3-チア-9-アザ-ビシクロ[3.3.1]ノニルである。部分的に不飽和なヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロオキサゾリル、テトラヒドロピリジニル、またはジヒドロピラニルである。
【００８７】
用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的にまたは他の点で望ましくない遊離塩基または遊離酸の生物学的な有効性および特性を保持している塩を意味する。これらの塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などの無機酸、特に塩酸、ならびに酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、ケイ皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸、N-アセチルシステインなどの有機酸と共に形成される。さらに、これらの塩は、遊離酸への無機塩基または有機塩基の添加によって調製されてもよい。無機塩基に由来する塩には、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩が含まれるが、それらに限定されるわけではない。有機塩基に由来する塩には、第一級アミン、第二級アミン、および第三級アミン、天然の置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、および塩基性イオン交換樹脂、例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニン、N-エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミンの樹脂の塩が含まれるが、それらに限定されるわけではない。本発明のオリゴヌクレオチドはまた、双性イオンの形態で存在することもできる。本発明の特に好ましい薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩、リチウム塩、カリウム塩、およびトリアルキルアンモニウム塩である。
【００８８】
用語「保護基」は、単独でまたは組合せで、別の未保護の反応部位で選択的に化学反応を行うことができるように、多官能性化合物中の反応部位を選択的に封じ込める基を意味する。保護基は、除去することができる。例示的な保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基、またはヒドロキシ保護基である。
【００８９】
「リン酸保護基」は、リン酸基の保護基である。リン酸保護基の例は、2-シアノエチルおよびメチルである。リン酸保護基の具体例は、2-シアノエチルである。
【００９０】
「ヒドロキシル保護基」は、ヒドロキシル基の保護基であり、チオール基を保護するのにも使用される。ヒドロキシル保護基の例は、アセチル(Ac)、ベンゾイル(Bz)、ベンジル(Bn)、β-メトキシエトキシメチルエーテル(MEM)、ジメトキシトリチル(またはビス-(4-メトキシフェニル)フェニルメチル)(DMT)、トリメトキシトリチル(またはトリス-(4-メトキシフェニル)フェニルメチル)(TMT)、メトキシメチルエーテル(MOM)、メトキシトリチル[(4-メトキシフェニル)ジフェニルメチル(MMT)、p-メトキシベンジルエーテル(PMB)、メチルチオメチルエーテル、ピバロイル(Piv)、テトラヒドロピラニル(THP)、テトラヒドロフラン(THF)、トリチルまたはトリフェニルメチル(Tr)、シリルエーテル(例えば、トリメチルシリル(TMS)、tert-ブチルジメチルシリル(TBDMS)、トリ-イソ-プロピルシリルオキシメチル(TOM)、およびトリイソプロピルシリル(TIPS)エーテル)、メチルエーテル、ならびにエトキシエチルエーテル(EE)である。ヒドロキシル保護基の具体例は、DMTおよびTMT、特にDMTである。
【００９１】
「チオヒドロキシル保護基」は、チオヒドロキシル基の保護基である。チオヒドロキシル保護基の例は、「ヒドロキシル保護基」のものである。
【００９２】
本発明の出発物質または出発化合物のうちの1つが、1つまたは複数の反応段階の反応条件下で安定ではないか、または反応性である、1つまたは複数の官能基を含む場合、当技術分野において周知の方法を適用して、適切な保護基(例えば、“Protective Groups in Organic Chemistry” by T. W. Greene and P. G. M. Wuts, 3rd Ed., 1999, Wiley, New Yorkにおいて説明されている)を、その重大な段階の前に導入することができる。このような保護基は、文献に記載されている標準的方法を用いて、合成のより後の段階で除去することができる。保護基の例は、tert-ブトキシカルボニル(Boc)、9-フルオレニルメチルカルバマート(Fmoc)、2-トリメチルシリルエチルカルバマート(Teoc)、カルボベンジルオキシ(Cbz)、およびp-メトキシベンジルオキシカルボニル(Moz)である。
【００９３】
本明細書において説明される化合物は、いくつかの不斉中心を含むことができ、光学的に純粋な鏡像異性体、鏡像異性体の混合物、例えばラセミ体、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性体ラセミ体、またはジアステレオ異性体ラセミ体の混合物の形態で存在することができる。
【００９４】
オリゴヌクレオチド
本明細書において使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、当業者によって通常理解されるように、2個またはそれより多い共有結合的に連結したヌクレオシドを含む分子と定義される。このような共有結合しているヌクレオシドは、核酸分子または核酸オリゴマーとも呼ばれ得る。一般に、オリゴヌクレオチドは、固相化学合成とそれに続く精製によって実験室で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合的に連結したヌクレオチドまたはヌクレオシドの核酸塩基部分の配列もしくは順序またはその修飾に言及する。本発明のオリゴヌクレオチドは人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、1つまたは複数の修飾されたヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでよい。
【００９５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書において使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に、標的核酸の連続配列にハイブリダイズすることにより、標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドと定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的には二本鎖ではなく、したがって、siRNAでもshRNAでもない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、該オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部または相互の自己相補性の程度が50％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造(同じオリゴヌクレオチドの2個の分子間の二重鎖)を形成できることが理解される。
【００９６】
発現の調節
本明細書において使用される用語「発現の調節」は、標的核酸の発現を変化させるか、または標的核酸のレベルを変化させるオリゴヌクレオチドの能力についての全般的用語として理解すべきである。発現の調節は、オリゴヌクレオチド投与前の標的核酸の発現もしくはレベルとの比較によって明らかにすることができ、または発現の調節は、本発明のオリゴヌクレオチドが投与されない対照実験を参照することにより明らかにすることもできる。対照は、生理食塩水組成物で処理される個体もしくは標的細胞、または非ターゲティングオリゴヌクレオチド(モック)で処理される個体もしくは標的細胞であることが、一般に理解される。
【００９７】
1つのタイプの調節は、例えば、(例えばRNアーゼH1を媒介とした分解による)標的核酸の分解または転写の妨害によって標的核酸の発現を阻害するか、下方制御するか、低減するか、抑制するか、なくすか、停止するか、妨害するか、妨げるか、減らすか、低下させるか、無効にするか、または終結する、オリゴヌクレオチドの能力である。別のタイプの調節は、例えば、標的mRNA前駆体に対するスプライシング事象を調節して、またはmRNAのマイクロRNA抑制のような阻害メカニズムの妨害を介して、標的RNAの発現を回復させるか、増加させるか、または増強する、オリゴヌクレオチドの能力である。
【００９８】
連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的である、例えば完全に相補的である、オリゴヌクレオチドの領域を意味する。この用語は、本明細書において、用語「連続核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と同義的に使用される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドが、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、F-G-F’ギャップマー領域のような連続ヌクレオチド配列を含み、かつ別のヌクレオチド、例えば、連続ヌクレオチド配列に官能基を結合させるのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域、例えば領域DまたはD’を任意で含んでよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であってもなくてもよい。本明細書において言及されるアンチセンスオリゴヌクレオチドミクスマーは、連続ヌクレオチド配列を含んでもよく、または連続ヌクレオチド配列からなってもよい。
【００９９】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成単位であり、本発明の目的においては、天然ヌクレオチドおよび非天然ヌクレオチドの両方が含まれる。天然には、DNAヌクレオチドおよびRNAヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および1つまたは複数のリン酸基(ヌクレオシド中には存在しない)を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、同義的に「ユニット」または「モノマー」と呼ばれる場合がある。
【０１００】
修飾ヌクレオシド
本明細書において使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、糖部分または(核酸)塩基部分に対する1つまたは複数の修飾の導入によって、等価なDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドと比べて修飾されたヌクレオシドを意味する。好ましい態様において、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。本明細書において、用語「修飾ヌクレオシド」はまた、用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「ユニット」もしくは修飾「モノマー」と同義的に使用されてよい。未修飾のDNAまたはRNAの糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書においてDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドと呼ばれる。通常、DNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドの塩基領域に修飾を有するヌクレオシドは、ワトソン・クリック塩基対が可能であれば、引き続きDNAまたはRNAと呼ばれる。
【０１０１】
修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、当業者によって通常理解されるように、2個のヌクレオシドを共有結合的に互いにカップリングする、リン酸ジエステル(PO)結合以外の結合と定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含んでよい。いくつかの態様において、修飾ヌクレオシド間結合は、リン酸ジエステル結合と比べて、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を高める。天然オリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接ヌクレオシド間のリン酸ジエステル結合を作り出すリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化する際に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチド中のDNAヌクレオシドまたはRNAヌクレオシドの領域、例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに修飾ヌクレオシドの領域、例えば領域FおよびF’において、ヌクレアーゼ切断から保護する働きをし得る。
【０１０２】
ある態様において、オリゴヌクレオチドは、例えばヌクレアーゼ攻撃に対する耐性がより高い1つまたは複数の修飾ヌクレオシド間結合のような、天然のリン酸ジエステルから改変された1つまたは複数のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることによって、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ法(例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ(SVPD))を用いることによって、明らかにすることができ、どちらも当技術分野において周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも50％は、修飾されており、例えば、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも60％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも80％、または例えば少なくとも90％は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合のすべてが、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの態様において、コンジュゲートのような、非ヌクレオチド官能基に本発明のオリゴヌクレオチドを連結するヌクレオシドはリン酸ジエステルであってよいことが、認識される。
【０１０３】
本発明のオリゴヌクレオチド中で使用するための好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートである。
【０１０４】
ホスホロチオアートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態、および製造の容易さという理由から特に有用である。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも50％は、ホスホロチオアートであり、例えば、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも60％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも80％、または例えば少なくとも90％は、ホスホロチオアートである。いくつかの態様において、ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合以外は、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合のすべてが、ホスホロチオアートである。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ホスホロジチオアート結合に加えて、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合と少なくとも1個のリン酸ジエステル結合、例えば、2個、3個、または4個のリン酸ジエステル結合の両方を含む。ギャップマーオリゴヌクレオチドにおいて、リン酸ジエステル結合は、存在する場合、ギャップ領域G中の連続DNAヌクレオシド間に配置されないことが適切である。
【０１０５】
ホスホロチオアート結合のようなヌクレアーゼ耐性結合は、標的核酸と二重鎖を形成した際にヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域、例えば、ギャップマーの場合の領域Gにおいて、特に有用である。しかし、ホスホロチオアート結合はまた、ヌクレアーゼを動員しない領域および/または親和性増強領域、例えばギャップマーの場合の領域FおよびF'においても有用であり得る。いくつかの態様において、ギャップマーオリゴヌクレオチドは、領域FもしくはF’または領域FおよびF’の両方に1つまたは複数のリン酸ジエステル結合を含んでよく、領域G中のヌクレオシド間結合は、完全なホスホロチオアートであってよい。
【０１０６】
有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列中のすべてのヌクレオシド間結合またはオリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアート結合である。
【０１０７】
EP 2742135で開示されているように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、(リン酸ジエステルおよびホスホロチオアート以外の)他のヌクレオシド間結合、例えばアルキルホスホナート/メチルホスホナートインターヌクレオシドを含んでよいことが認識されており、これらは、EP 2742135によれば、例えば、それ以外はDNAホスホロチオアートであるギャップ領域において許容され得る。
【０１０８】
立体的にランダムなホスホロチオアート結合
ホスホロチオアート結合は、非架橋酸素のうちの1つが硫黄で置換されているヌクレオシド間リン酸結合である。非架橋酸素のうちの1つを硫黄で置換すると、キラル中心が導入され、したがって、単一のホスホロチオアートオリゴヌクレオチド内で、各ホスホロチオアートヌクレオシド間結合は、S(Sp)型またはR(Rp)型の立体アイソフォームのいずれかで存在すると考えられる。このようなヌクレオシド間結合は、「キラルヌクレオシド間結合」と呼ばれる。比較すると、リン酸ジエステルヌクレオシド間結合は、2個の非末端酸素原子を有するため、キラルではない。
【０１０９】
立体中心のキラリティーについての記号表示は、Cahn, R.S.； Ingold, C.K.； Prelog, V. (1966) "Specification of Molecular Chirality" Angewandte Chemie International Edition 5 (4)： 385-415. doi：10.1002/anie.196603851において最初に公開された標準的なカーン-インゴルド-プレローグの法則(CIP順位則)に基づいて決定される。
【０１１０】
標準的なオリゴヌクレオチド合成の間、カップリングおよびその後の硫化の立体選択性は制御されない。このため、各ホスホロチオアートヌクレオシド間結合の立体化学は、ランダムにSpまたはRpであり、したがって、従来のオリゴヌクレオチド合成によって製造されたホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、実際には、2X種もの異なるホスホロチオアートジアステレオ異性体(Xは、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合の数である)として存在することができる。本明細書において、このようなオリゴヌクレオチドは、立体的にランダムなホスホロチオアートオリゴヌクレオチドと呼ばれ、立体定義されたヌクレオシド間結合をまったく含まない。したがって、立体的にランダムなホスホロチオアートオリゴヌクレオチドは、立体定義されない合成から生じる個々のジアステレオ異性体の混合物である。これに関連して、この混合物は、最大2X種の異なるホスホロチオアートジアステレオ異性体と定義される。
【０１１１】
立体定義されたヌクレオシド間結合
立体定義されたヌクレオシド間結合とは、2個のジアステレオ異性形態のうちの一方、すなわちRpまたはSpのジアステレオ異性体過剰を示す、キラルなヌクレオシド間結合である。
【０１１２】
当技術分野で使用される立体選択的なオリゴヌクレオチド合成方法は、典型的には、各キラルヌクレオシド間結合において少なくとも約90％または少なくとも約95％の立体選択性をもたらし、したがって、最高で約10％、例えば約5％のオリゴヌクレオチド分子が、別のジアステレオ異性形態を有し得ることを認識すべきである。
【０１１３】
いくつかの態様において、それぞれの立体定義されたキラルヌクレオシド間結合のジアステレオ異性体の比は、少なくとも約90：10である。いくつかの態様において、各キラルヌクレオシド間結合のジアステレオ異性体の比は、少なくとも約95：5である。
【０１１４】
立体定義されたホスホロチオアート結合は、立体定義されたヌクレオシド間結合の具体例である。
【０１１５】
立体定義されたホスホロチオアート結合
立体定義されたホスホロチオアート結合とは、2個のジアステレオ異性形態のうちの一方、すなわちRpまたはSpのジアステレオ異性体過剰を示す、ホスホロチオアート結合である。
【０１１６】
ホスホロチオアートヌクレオシド間結合のRp配置およびSp配置を下記に示す：
2021508327.tif 000022
上式で、3'のR基は、隣接ヌクレオシド(5'ヌクレオシド)の3'位置を表し、5'のR基は、隣接ヌクレオシド(3'ヌクレオシド)の5'位置を表す。
【０１１７】
本明細書において、Rpヌクレオシド間結合はsrPと表される場合もあり、Spヌクレオシド間結合はssPと表される場合がある。
【０１１８】
特定の態様において、それぞれの立体定義されたホスホロチオアート結合のジアステレオ異性体の比は、少なくとも約90：10または少なくとも95：5である。
【０１１９】
いくつかの態様において、それぞれの立体定義されたホスホロチオアート結合のジアステレオ異性体の比は、少なくとも約97：3である。いくつかの態様において、それぞれの立体定義されたホスホロチオアート結合のジアステレオ異性体の比は、少なくとも約98：2である。いくつかの態様において、それぞれの立体定義されたホスホロチオアート結合のジアステレオ異性体の比は、少なくとも約99：1である。
【０１２０】
いくつかの態様において、立体定義されたヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチド分子の集団中に存在するオリゴヌクレオチド分子の少なくとも97％、例えば少なくとも98％、例えば少なくとも99％、または(ほぼ)すべてにおいて、同じジアステレオ異性形態(RpまたはSp)で存在する。
【０１２１】
ジアステレオ異性体純度は、アキラルな骨格(すなわちリン酸ジエステル)のみを有するモデル系において測定することができる。例えば、立体定義されたヌクレオシド間結合を有するモノマーを以下のモデル系「5't-po-t-po-t-po3'」にカップリングすることにより、各モノマーのジアステレオ異性体純度を測定することが可能である。その場合、この結果は、5'DMTr-t-srp-t-po-t-po-t-po3'または5'DMTr-t-ssp-t-po-t-po-t-po3'を与えると考えられ、HPLCを用いてこれを分離することができる。ジアステレオ異性体純度は、これら2種の存在し得るジアステレオ異性体に由来するUVシグナルを積分し、これらの比、例えば、98：2、99：1、または99：1より大きい比を求めることによって、明らかにする。
【０１２２】
特定の単一のジアステレオ異性体(単一の立体定義されたオリゴヌクレオチド分子)のジアステレオ異性体純度は、各ヌクレオシド間位置の定義済みの立体中心におけるカップリング選択性および導入される立体定義されたヌクレオシド間結合の数の関数であると考えられることが理解される。例として、各位置におけるカップリング選択性が97％である場合、15個の立体定義されたヌクレオシド間結合を有する立体定義されたオリゴヌクレオチドについて得られる純度は、0.9715であると考えられ、すなわち、所望のジアステレオ異性体が63％であるのに対し、他方のジアステレオ異性体は37％である。定義されたジアステレオ異性体の純度は、合成後に、精製によって、例えば、イオン交換クロマトグラフィーまたは逆相クロマトグラフィーなどのHPLCによって高めることができる。
【０１２３】
いくつかの態様において、立体定義されたオリゴヌクレオチドとは、集団の少なくとも約40％、例えば少なくとも約50％が所望のジアステレオ異性体である、オリゴヌクレオチド集団を意味する。
【０１２４】
言い換えると、いくつかの態様において、立体定義されたオリゴヌクレオチドとは、集団の少なくとも約40％、例えば少なくとも約50％が、所望の(特定の)立体定義されたヌクレオシド間結合モチーフ(立体定義されたモチーフとも呼ばれる)からなる、オリゴヌクレオチド集団を意味する。
【０１２５】
立体的にランダムなヌクレオシド間キラル中心および立体定義されたヌクレオシド間キラル中心の両方を含む立体定義されたオリゴヌクレオチドの場合、立体定義されたオリゴヌクレオチドの純度は、所望の立体定義されたヌクレオシド間結合モチーフを保持しているオリゴヌクレオチド集団の比率(％)を基準として決定され、立体的にランダムな結合は、この計算では無視される。
【０１２６】
核酸塩基
用語「核酸塩基」は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する、ヌクレオシドおよびヌクレオチド中に存在するプリン(例えば、アデニンおよびグアニン)ならびにピリミジン(例えば、ウラシル、チミン、およびシトシン)部分を含む。本発明において、用語「核酸塩基」はまた、天然核酸塩基と異なる場合があるが核酸ハイブリダイゼーション時に機能的である修飾核酸塩基も含む。この文脈において、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン、およびヒポキサンチンなどの天然核酸塩基ならびに非天然変異体の両方を意味する。このような変異体は、例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1において説明されている。
【０１２７】
いくつかの態様において、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたは修飾ピリミジン、例えば、置換されたプリンまたは置換されたピリミジン、例えば、イソシトシン、シュードイソシトシン、5-メチルシトシン、5-チオゾロ-シトシン、5-プロピニル-シトシン、5-プロピニル-ウラシル、5-ブロモウラシル、5-チアゾロ-ウラシル、2-チオ-ウラシル、2'チオ-チミン、イノシン、ジアミノプリン、6-アミノプリン、2-アミノプリン、2,6-ジアミノプリン、および2-クロロ-6-アミノプリンより選択される核酸塩基に変えることによって、修飾される。
【０１２８】
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基に対する文字記号、例えば、A、T、G、C、またはUによって示すことができ、ここで、各文字は、等価な機能を有する修飾核酸塩基を任意で含んでよい。例えば、例示されるオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、A、T、G、C、および5-メチルシトシンより選択される。任意で、LNAギャップマーの場合、5-メチルシトシンLNAヌクレオシドが使用され得る。
【０１２９】
修飾オリゴヌクレオチド
用語「修飾オリゴヌクレオチド」とは、1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドおよび/または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを示す。用語「キメラ」オリゴヌクレオチドは、修飾されたヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを示すために文献で使用されてきた用語である。
【０１３０】
立体定義されたオリゴヌクレオチド
立体定義されたオリゴヌクレオチドとは、ヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個が、立体定義されたヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである。
【０１３１】
立体定義されたホスホロチオアートオリゴヌクレオチドとは、ヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、オリゴヌクレオチドである。
【０１３２】
相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド/ヌクレオチドがワトソン-クリック塩基対形成する能力を示す。ワトソン-クリック塩基対は、グアニン(G)-シトシン(C)およびアデニン(A)-チミン(T)/ウラシル(U)である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでよく、例えば、5-メチルシトシンがしばしばシトシンの代わりに使用され、したがって、用語「相補性」は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基の間のワトソン-クリック塩基対形成を包含することが理解される(例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055およびBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1を参照されたい)。
【０１３３】
本明細書において使用される用語「相補率(％)」は、核酸分子(例えばオリゴヌクレオチド)中の連続ヌクレオチド配列中のヌクレオチドであって、別の核酸分子(例えば標的核酸)の所与の位置の連続ヌクレオチド配列と、所与の位置において相補的である(すなわち、ワトソン-クリック塩基対を形成する)、ヌクレオチドの比率を意味する。この百分率は、(標的配列5'-3'およびオリゴヌクレオチド配列3'-5'とアラインした場合)2個の配列間で対を形成するアラインされた塩基の数を数え、そのオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、100を掛けることによって算出する。このような比較において、アライン(塩基対を形成)しない核酸塩基/ヌクレオチドは、ミスマッチと呼ばれる。好ましくは、連続ヌクレオチド配列の相補率(％)の計算において、挿入および欠失は許容されない。
【０１３４】
用語「完全に相補的」とは、100％の相補性を意味する。
【０１３５】
同一性
本明細書において使用される用語「同一性」は、核酸分子(例えばオリゴヌクレオチド)中の連続ヌクレオチド配列に対する百分率(％)で表される、別の核酸分子(例えば標的核酸)の所与の位置の連続ヌクレオチド配列と、所与の位置において同一である(すなわち、相補的ヌクレオシドとワトソン-クリック塩基対を形成する能力の点で)、ヌクレオチドの数を意味する。この百分率は、2個の配列間で同一であるアラインされた塩基の数を数え、そのオリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの総数で割り、100を掛けることによって算出する。同一性パーセント=(マッチ×100)/アラインされた領域の長さ。好ましくは、連続ヌクレオチド配列の相補率(％)の計算において、挿入および欠失は許容されない。
【０１３６】
ハイブリダイゼーション
本明細書において使用される用語「ハイブリダイズすること」または「ハイブリダイズする」は、2本の核酸鎖(例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸)が向い合わせの鎖上の塩基対間に水素結合を形成し、それによって二重鎖を形成することと理解される。2本の核酸鎖間の結合の親和性が、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、しばしば、オリゴヌクレオチの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度であると定義される融解温度(Tm)の観点から説明される。生理的条件では、Tmは親和性に厳密には比例しない(Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13：515-537)。標準状態のギブス自由エネルギーΔG°は、結合親和性をより正確に表し、反応の解離定数(Kd)とΔG°=-RTln(Kd)という関係にある(Rは気体定数であり、Tは絶対温度である)。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の反応のΔG°が非常に小さい場合、これは、オリゴヌクレオチドと標的核酸の間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔG°は、水溶液濃度が1Mであり、pHが7であり、かつ温度が37℃である反応に関連するエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合、ΔG°はゼロ未満である。ΔG°は、実験によって、例えば、Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38およびHoldgate et al., 2005, Drug Discov Todayにおいて説明されている等温滴定熱量測定(ITC)法を用いて、測定することができる。当業者は、ΔG°測定のために市販の機器が利用可能であることを知っていると考えられる。ΔG°はまた、Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34：11211-11216およびMcTigue et al., 2004, Biochemistry 43：5388-5405によって説明されている適切に導かれた熱力学的パラメーターを用いて、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95： 1460-1465によって説明されている最近接モデルを使用することによって、数値的に推定することもできる。意図される核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を有するためには、本発明のオリゴヌクレオチドは、10〜30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して、-10kcal未満の推定ΔG°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの態様において、ハイブリダイゼーションの程度または強さは、標準状態のギブス自由エネルギーΔG°に基づいて測定される。オリゴヌクレオチドは、8〜30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドに対して、-10kcalの範囲を下回る、例えば-15kcal未満、例えば-20kcal未満、および例えば-25kcal未満の推定ΔG°値で、標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、-10〜-60kcal、例えば-12〜-40、例えば-15〜-30kcal、または-16〜-27kcal、例えば-18〜-25kcalの推定ΔG°値で、標的核酸にハイブリダイズする。
【０１３７】
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわちDNAおよびRNA中に存在するリボース糖部分と比べた場合に糖部分の修飾を有する、1つまたは複数のヌクレオシドを含んでよい。
【０１３８】
オリゴヌクレオチドのいくつかの特性、例えば親和性および/またはヌクレアーゼ耐性を改良することを主に目指して、リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが作られてきた。
【０１３９】
このような修飾には、例えば、ヘキソース環(HNA)、またはリボース環上のC2炭素とC4炭素の間にビラジカル架橋を典型的には有する二環式の環(LNA)、またはC2炭素とC3炭素の間の結合を典型的には欠いている非連結リボース環(例えばUNA)による置換によってリボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸(WO 2011/017521)または三環式核酸(WO 2013/154798)が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えば、ペプチド核酸(PNA)またはモルホリノ核酸の場合に、糖部分が糖ではない部分で置換されているヌクレオシドも含まれる。
【０１４０】
また、糖修飾には、リボース環上の置換基を、DNAヌクレオシドおよびRNAヌクレオシド中に天然に存在する水素または2'-OH基以外の基に変更することによって作られる修飾も含まれる。置換基は、例えば、2’位、3’位、4’位、または5’位に導入されてよい。
【０１４１】
2’糖修飾ヌクレオシド
2'糖修飾ヌクレオシドは、2'位にHまたは-OH以外の置換基を有するか(2'置換ヌクレオシド)、またはLNA(2'-4'ビラジカル架橋)ヌクレオシドのように、リボース環中の2'炭素と第2の炭素の間に架橋を形成することができる2'連結ビラジカルを含む、ヌクレオシドである。
【０１４２】
実際、2'置換ヌクレオシドを開発することに多くの注目が集まり、多数の2'置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチド中に組み込まれた場合に有益な特性を有することが見出された。例えば、2'修飾糖は、オリゴヌクレオチドに、増強された結合親和性および/または増大されたヌクレアーゼ耐性を与え得る。
【０１４３】
2'置換修飾ヌクレオシドの例は、2'-O-アルキル-RNAヌクレオシド、2'-O-メチル-RNAヌクレオシド、2'-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2'-O-メトキシエチル-RNA(MOE)ヌクレオシド、2'-アミノ-DNAヌクレオシド、2'-フルオロ-RNAヌクレオシド、および2'-F-ANAヌクレオシドである。さらなる例は、例えば、Freier & Altmann； Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443およびUhlmann； Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、ならびにDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937において見出すことができる。下記は、いくつかの2’置換修飾ヌクレオシドの例である。
2021508327.tif 000023
【０１４４】
本発明に関して、2’置換は、LNAのような2’架橋分子を含まない。
【０１４５】
ロックド核酸ヌクレオシド(LNAヌクレオシド)
「LNAヌクレオシド」は、リボース環の立体構造を制限または固定する、ヌクレオシドのリボース糖環のC2'とC4'を連結するビラジカル(「2'-4'架橋」とも呼ばれる)を含む、2'修飾ヌクレオシドである。これらのヌクレオシドは、文献において、架橋核酸または二環式核酸(BNA)とも呼ばれている。リボースの立体構造の固定は、LNAがオリゴヌクレオチド中に組み込まれた場合に相補的なRNA分子またはDNA分子に対するハイブリダイゼーションの親和性が増強されること(二重鎖安定化)に関連付けられている。これは、オリゴヌクレオチド/相補物二重鎖の融解温度を測定することによって、ルーチン的に明らかにすることができる。
【０１４６】
非限定的な例示的LNAヌクレオシドは、WO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、WO 2004/046160、WO 00/047599、WO 2007/134181、WO 2010/077578、WO 2010/036698、WO 2007/090071、WO 2009/006478、WO 2011/156202、WO 2008/154401、WO 2009/067647、WO 2008/150729、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81、およびMitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238において開示されている。
【０１４７】
2’-4’架橋は、2位と4位を架橋する原子を含み、具体的には、式-X-Y-を有する(XはC4’に結合しており、YはC2’に結合している)：
式中
Xは、酸素、硫黄、-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(=CRaRb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-O-NRa-、-NRa-O-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-、または-O-CRaRb-であり；
Yは、酸素、硫黄、-(CRaRb)n-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-、または-O-CRaRb-であり；
ただし、-X-Y-は、-O-O-、Si(Ra)2-Si(Ra)2-、-SO2-SO2-、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=N-C(Ra)=N-、-C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N-、および-Se-Se-のいずれでもないことを条件とし；
Jは、酸素、硫黄、=CH2、または=N(Ra)であり；
RaおよびRbは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、-OC(=Xa)Rc、-OC(=Xa)NRcRd、および-NReC(=Xa)NRcRdより独立に選択されるか、または
2個のジェミナルなRaおよびRbは一緒に、任意で置換されたメチレンを形成するか、または
2個のジェミナルなRaおよびRbは、それらが結合している炭素原子と一緒に、-X-Y-の炭素原子を1つだけ有するシクロアルキルもしくはハロシクロアルキルを形成し；
置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、および置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシリル、アリール、およびヘテロアリールより独立に選択される1〜3個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、およびメチレンであり；
Xaは、酸素、硫黄、または-NRcであり；
Rc、Rd、およびReは、水素およびアルキルより独立に選択され；かつ
nは、1、2、または3である。
【０１４８】
本発明のさらに別の特定の態様において、Xは、酸素、硫黄、-NRa-、-CRaRb-、または-C(=CRaRb)-、具体的には酸素、硫黄、-NH-、-CH2-、または-C(=CH2)-、より具体的には酸素である。
【０１４９】
本発明の別の特定の態様において、Yは、-CRaRb-、-CRaRb-CRaRb-、または-CRaRb-CRaRb-CRaRb-、特に-CH2-CHCH3-、-CHCH3-CH2-、-CH2-CH2-、または-CH2-CH2-CH2-である。
【０１５０】
本発明の特定の態様において、-X-Y-は、-O-(CRaRb)n-、-S-CRaRb-、-N(Ra)CRaRb-、-CRaRb-CRaRb-、-O-CRaRb-O-CRaRb-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(=CRaRb)-CRaRb-、-N(Ra)CRaRb-、-O-N(Ra)-CRaRb-、または-N(Ra)-O-CRaRb-である。
【０１５１】
本発明の特定の態様において、RaおよびRbは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、およびアルコキシアルキル、特に、水素、ハロゲン、アルキル、およびアルコキシアルキルからなる群より独立に選択される。
【０１５２】
本発明の別の態様において、RaおよびRbは、水素、フルオロ、ヒドロキシル、メチル、および-CH2-O-CH3、特に、水素、フルオロ、メチル、および-CH2-O-CH3からなる群より独立に選択される。
【０１５３】
有利には、-X-Y-のRaおよびRbのうちの1つが上記に定義されたとおりであり、他ものがすべて、同時に水素である。
【０１５４】
本発明のさらに別の特定の態様において、Raは、水素またはアルキル、特に、水素またはメチルである。
【０１５５】
本発明の別の特定の態様において、Rbは、水素またはアルキル、特に、水素またはメチルである。
【０１５６】
本発明の特定の態様において、RaおよびRbの一方または両方は、水素である。
【０１５７】
本発明の特定の態様において、RaおよびRbの一方のみが、水素である。
【０１５８】
本発明の1つの特定の態様において、RaおよびRbの一方はメチルであり、他方は水素である。
【０１５９】
本発明の特定の態様において、RaおよびRbは、同時に両方ともメチルである。
【０１６０】
本発明の特定の態様において、-X-Y-は、-O-CH2-、-S-CH2-、-S-CH(CH3)-、-NH-CH2-、-O-CH2CH2-、-O-CH(CH2-O-CH3)-、-O-CH(CH2CH3)-、-O-CH(CH3)-、-O-CH2-O-CH2-、-O-CH2-O-CH2-、-CH2-O-CH2-、-C(=CH2)CH2-、-C(=CH2)CH(CH3)-、-N(OCH3)CH2-、または-N(CH3)CH2-である。
【０１６１】
本発明の特定の態様において、-X-Y-は、-O-CRaRb-(式中、RaおよびRbは、水素、アルキル、およびアルコキシアルキル、特に、水素、メチル、および-CH2-O-CH3からなる群より独立に選択される)である。
【０１６２】
特定の実施形態において、-X-Y-は、-O-CH2-または-O-CH(CH3)-、特に-O-CH2-である。
【０１６３】
2’-4’架橋は、式(A)および式(B)にそれぞれ示すように、リボース環の面より下(β-D-配置)または環の面より上(α-L-配置)のいずれかに位置してよい。
【０１６４】
本発明によるLNAヌクレオシドは、具体的には、式(B1)または(B2)を有する：
2021508327.tif 000024
式中、
Wは、酸素、硫黄、-N(Ra)-、または-CRaRb-、特に酸素であり；
Bは、核酸塩基または修飾核酸塩基であり；
Zは、隣接ヌクレオシドへのヌクレオシド間結合または5'末端基であり；
Z*は、隣接ヌクレオシドへのヌクレオシド間結合または3'末端基であり；
R1、R2、R3、R5、およびR5*は、水素、ハロゲン、アルキル、ハロアルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシ、アルコキシ、アルコキシアルキル、アジド、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、およびアリールより独立に選択され；かつ
X、Y、Ra、およびRbは、上記に定義されたとおりである。
【０１６５】
特定の態様では、-X-Y-の定義において、Raは、水素またはアルキル、特に、水素またはメチルである。別の特定の態様では、-X-Y-の定義において、Rbは、水素またはアルキル、特に、水素またはメチルである。さらに別の特定の態様では、-X-Y-の定義において、RaおよびRbの一方または両方は、水素である。特定の態様では、-X-Y-の定義において、RaおよびRbの一方のみが、水素である。1つの特定の態様では、-X-Y-の定義において、RaおよびRbの一方はメチルであり、他方は水素である。特定の態様では、-X-Y-の定義において、RaおよびRbは、同時に両方ともメチルである。
【０１６６】
さらに別の特定の態様では、Xの定義において、Raは、水素またはアルキル、特に、水素またはメチルである。別の特定の態様では、Xの定義において、Rbは、水素またはアルキル、特に、水素またはメチルである。特定の態様では、Xの定義において、RaおよびRbの一方または両方は、水素である。特定の態様では、Xの定義において、RaおよびRbの一方のみが、水素である。1つの特定の態様では、Xの定義において、RaおよびRbの一方はメチルであり、他方は水素である。特定の態様では、Xの定義において、RaおよびRbは、同時に両方ともメチルである。
【０１６７】
さらに別の特定の態様では、Yの定義において、Raは、水素またはアルキル、特に、水素またはメチルである。別の特定の態様では、Yの定義において、Rbは、水素またはアルキル、特に、水素またはメチルである。特定の態様では、Yの定義において、RaおよびRbの一方または両方は、水素である。特定の態様では、Yの定義において、RaおよびRbの一方のみが、水素である。1つの特定の態様では、Yの定義において、RaおよびRbの一方はメチルであり、他方は水素である。特定の態様では、Yの定義において、RaおよびRbは、同時に両方ともメチルである。
【０１６８】
本発明の特定の態様において、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、水素およびアルキル、特に、水素およびメチルより独立に選択される。
【０１６９】
本発明のさらに別の特定の有利な態様において、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。
【０１７０】
本発明の別の特定の態様において、R1、R2、R3は、同時にすべて水素であり、R5およびR5*の一方は水素であり、他方は上記に定義されたとおり、具体的にはアルキル、より具体的にはメチルである。
【０１７１】
本発明の特定の態様において、R5およびR5*は、水素、ハロゲン、アルキル、アルコキシアルキル、およびアジドより、特に、水素、フルオロ、メチル、メトキシエチル、およびアジドより独立に選択される。本発明の特定の有利な態様において、R5およびR5*の一方は水素であり、他方はアルキル、特にメチル、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルキル、特にメトキシエチル、もしくはアジドであるか；またはR5およびR5*は、両方とも同時に水素もしくはハロゲン、特に、両方とも同時に水素もしくはフルオロである。このような特定の態様において、Wは、有利には、酸素であることができ、-X-Y-は有利には-O-CH2-であることができる。
【０１７２】
本発明の特定の態様において、-X-Y-は-O-CH2-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。このようなLNAヌクレオシドは、すべて参照により本明細書に組み入れられるWO 99/014226、WO 00/66604、WO 98/039352、およびWO 2004/046160において開示されており、β-D-オキシLNAヌクレオシドおよびα-L-オキシLNAヌクレオシドとして当技術分野において一般に公知であるものが含まれる。
【０１７３】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は-S-CH2-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。このようなチオLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO 99/014226およびWO 2004/046160において開示されている。
【０１７４】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は-NH-CH2であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。このようなアミノLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO 99/014226およびWO 2004/046160において開示されている。
【０１７５】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は-O-CH2CH2-または-OCH2CH2CH2-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。このようなLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO 00/047599およびMorita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76において開示されており、2'-O-4'C-エチレンで架橋された核酸(ENA)として当技術分野において一般に公知であるものが含まれる。
【０１７６】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は-O-CH2-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3は、同時にすべて水素であり、R5およびR5*の一方は水素であり、他方は水素ではなく、例えばアルキル、例えばメチルである。このような5’置換LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO 2007/134181において開示されている。
【０１７７】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は-O-CRaRb-(式中、RaおよびRbの一方または両方は、水素ではなく、具体的にはアルキル、例えばメチルである)であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3は、同時にすべて水素であり、R5およびR5*の一方は水素であり、他方は水素ではなく、具体的にはアルキル、例えばメチルである。このような2箇所修飾されたLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO 2010/077578において開示されている。
【０１７８】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は-O-CHRa-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。このような6’置換LNAヌクレオシドは、どちらも参照により本明細書に組み入れられるWO 2010/036698およびWO 2007/090071において開示されている。このような6’置換LNAヌクレオシドにおいて、Raは、具体的にはC1〜C6アルキル、例えばメチルである。
【０１７９】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は、-O-CH(CH2-O-CH3)-(「2’O-メトキシエチル二環式核酸」、Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81)である。
【０１８０】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は、-O-CH(CH2CH3)-である。
【０１８１】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は-O-CH(CH2-O-CH3)-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。このようなLNAヌクレオシドはまた、当技術分野において環式MOE(cMOE)としても公知であり、WO 2007/090071において開示されている。
【０１８２】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は、-O-CH(CH3)-(「2’O-エチル二環式核酸」、Seth et al., J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81)である。
【０１８３】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は、-O-CH2-O-CH2-(Seth et al., J. Org. Chem 2010 前掲書中)である。
【０１８４】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は-O-CH(CH3)-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。このような6’-メチルLNAヌクレオシドはまた、当技術分野においてcETヌクレオシドとしても公知であり、どちらも参照により本明細書に組み入れられるWO 2007/090071(β-D)およびWO 2010/036698(α-L)において開示されているように、(S)-cETジアステレオ異性体または(R)-cETジアステレオ異性体のいずれかであってよい。
【０１８５】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は-O-CRaRb-(式中、RaもRbも水素ではない)であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。特定の態様において、RaおよびRbは、同時に両方ともアルキルであり、特に、同時に両方ともメチルである。このような6’二置換LNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO 2009/006478において開示されている。
【０１８６】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は-S-CHRa-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5およびR5*は、同時にすべて水素である。このような6’置換チオLNAヌクレオシドは、参照により本明細書に組み入れられるWO 2011/156202において開示されている。このような6’置換チオLNAヌクレオシドの特定の態様において、Raは、アルキル、特に、メチルである。
【０１８７】
本発明の特定の態様において、-X-Y-は、-C(=CH2)C(RaRb)-、-C(=CHF)C(RaRb)-、または-C(=CF2)C(RaRb)-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。有利には、RaおよびRbは、水素、ハロゲン、アルキル、およびアルコキシアルキル、特に、水素、メチル、フルオロ、およびメトキシメチルより独立に選択される。特に、RaおよびRbは、両方とも同時に水素もしくはメチルであるか、またはRaおよびRbの一方は水素であり、他方はメチルである。このようなビニルカルボLNAヌクレオシドは、どちらも参照により本明細書に組み入れられるWO 2008/154401およびWO 2009/067647において開示されている。
【０１８８】
本発明の特定の態様において、-X-Y-は-N(ORa)-CH2-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。特定の態様において、Raは、アルキル、例えばメチルである。このようなLNAヌクレオシドはまた、N置換LNAとしても公知であり、参照により本明細書に組み入れられるWO 2008/150729において開示されている。
【０１８９】
本発明の特定の態様において、-X-Y-は、-O-N(Ra)-、-N(Ra)-O-、-NRa-CRaRb-CRaRb-、または-NRa-CRaRb-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。有利には、RaおよびRbは、水素、ハロゲン、アルキル、およびアルコキシアルキル、特に、水素、メチル、フルオロ、およびメトキシメチルより独立に選択される。特定の態様において、Raは、アルキル、例えばメチルであり、Rbは、水素またはメチル、特に水素である(Seth et al., J. Org. Chem 2010前掲書中)。
【０１９０】
本発明の別の特定の態様において、-X-Y-は、-O-N(CH3)-である(Seth et al., J. Org. Chem 2010 前掲書中)。
【０１９１】
本発明の特定の態様において、R5およびR5*は、同時に両方とも水素である。本発明の別の特定の態様において、R5およびR5*の一方は水素であり、他方はアルキル、例えばメチルである。このような態様において、R1、R2、およびR3は、特に水素であることができ、-X-Y-は、特に-O-CH2-または-O-CHC(Ra)3-、例えば-O-CH(CH3)-であることができる。
【０１９２】
本発明の特定の態様において、-X-Y-は、-CRaRb-O-CRaRb-、例えば-CH2-O-CH2-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。このような特定の態様において、Raは、特にアルキル、例えばメチルであることができ、Rbは、水素またはメチル、特に水素であることができる。このようなLNAヌクレオシドは、立体構造が制限されたヌクレオチド(CRN)としても公知であり、参照により本明細書に組み入れられるWO 2013/036868において開示されている。
【０１９３】
本発明の特定の態様において、-X-Y-は、-O-CRaRb-O-CRaRb-、例えば-O-CH2-O-CH2-であり、Wは酸素であり、R1、R2、R3、R5、およびR5*は、同時にすべて水素である。有利には、RaおよびRbは、水素、ハロゲン、アルキル、およびアルコキシアルキル、特に、水素、メチル、フルオロ、およびメトキシメチルより独立に選択される。このような特定の態様において、Raは、特にアルキル、例えばメチルであることができ、Rbは、水素またはメチル、特に水素であることができる。このようなLNAヌクレオシドはまた、COCヌクレオチドとしても公知であり、参照により本明細書に組み入れられるMitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238において開示されている。
【０１９４】
指定がない限り、LNAヌクレオシドは、β-D型またはα-L型の立体アイソフォームで存在してよいことが認識される。
【０１９５】
本発明のLNAヌクレオシドの具体例は、スキーム1(式中、Bは上記に定義されたとおりである)に提示される。
スキーム1
2021508327.tif 000025
2021508327.tif 000026
2021508327.tif 000027
【０１９６】
具体的なLNAヌクレオシドは、β-D-オキシ-LNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、例えば、(S)-6’-メチル-β-D-オキシ-LNA((S)-cET)およびENAである。
【０１９７】
MOEヌクレオシド
用語「MOE」は、「メトキシエチル」を表し、下記に表すように、2’位においてメトキシ-エトキシ基で置換されたヌクレオシドを略語によって示す。
2021508327.tif 000028
【０１９８】
したがって、上記のヌクレオシドに、「MOE」または「2’-O-MOEヌクレオシド」のいずれかの名を付けることができる。
【０１９９】
RNアーゼH活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのRNアーゼH活性は、相補的RNA分子との二重鎖の状態にある場合にRNアーゼHを動員する能力を指す。WO 01/23613は、RNアーゼHを動員する能力を測定するのに使用することができる、RNアーゼH活性を測定するためのインビトロの方法を提供している。典型的には、オリゴヌクレオチドは、以下の条件を満たす場合、RNアーゼHを動員することができるとみなされる：すなわち、オリゴヌクレオチドが相補的標的核酸配列と共に提供された場合の初速度(pmol/l/分の単位で測定される)が、試験される該修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するがオリゴヌクレオチド中のすべてのモノマー間にホスホロチオアート結合を有するDNAモノマーのみを含むオリゴヌクレオチドを用い、かつ(参照により本明細書に組み入れられる)WO 01/23613の実施例91〜95によって提供される方法論を用いた場合に測定される初速度の少なくとも5％、例えば少なくとも10％、または20％超であること。RHアーゼH活性を測定する際に使用するために、組換えヒトRNアーゼH1が、Lubio Science GmbH, Lucerne, Switzerlandから入手可能である。
【０２００】
ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーであってよい。アンチセンスギャップマーは、RNアーゼHを媒介とした分解によって標的核酸を阻害するために一般に使用される。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、少なくとも3つの独特な構造領域である5'フランク、ギャップ、および3'フランク、すなわちF-G-F'を5'→3'の向きに含む。「ギャップ」領域(G)は、オリゴヌクレオチドがRNアーゼHを動員するのを可能にする一続きの連続DNAヌクレオチドを含む。ギャップ領域には、1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む5'隣接領域(F)、および1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む3'隣接領域(F')が隣接している。領域Fおよび領域F'中の1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強する(すなわち、親和性を増強する糖修飾ヌクレオシドである)。いくつかの態様において、領域Fおよび領域F'中の1つまたは複数の糖修飾ヌクレオシドは、2'糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性2'糖修飾であり、例えば、LNAおよび2'-MOEより独立に選択される。
【０２０１】
ギャップマー設計において、ギャップ領域の最も5'側および最も3'側のヌクレオシドはDNAヌクレオシドであり、それぞれ5'(F)領域または3'(F')領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して配置される。これらのフランクは、ギャップ領域から最も離れた末端、すなわち5'フランクの5'末端および3'フランクの3'末端に少なくとも1つの糖修飾ヌクレオシドを有することを、さらに特徴としてよい。
【０２０２】
領域F-G-F'は、連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、式F-G-F'のギャップマー領域を含んでよい。
【０２０３】
ギャップマー設計F-G-F'の全長は、例えば12〜32ヌクレオシド、例えば13〜24、例えば14〜22ヌクレオシド、例えば14〜17、例えば16〜18ヌクレオシドであってよい。
【０２０４】
例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
F1〜8-G5〜16-F’1〜8、例えばF1〜8-G7〜16-F’2〜8
ただし、ギャップマー領域F-G-F'の全長が少なくとも12、例えば少なくとも14ヌクレオチド長であることを条件とする。
【０２０５】
領域F、G、およびF'を下記にさらに定義し、F-G-F'式に組み入れることができる。
【０２０６】
ギャップマー―領域G
ギャップマーの領域G(ギャップ領域)は、オリゴヌクレオチドがRNアーゼH、例えばヒトRNアーゼH1を動員するのを可能にするヌクレオシド、典型的にはDNAヌクレオシドからなる領域である。RNアーゼHは、DNAとRNAとの二重鎖を認識しRNA分子を酵素的に切断する細胞酵素である。適切なギャップマーは、長さが少なくとも5個または6個の連続DNAヌクレオシド、例えば5〜16個の連続DNAヌクレオシド、例えば6〜15個の連続DNAヌクレオシド、例えば7〜14個の連続DNAヌクレオシド、例えば8〜12個の連続DNAヌクレオチド、例えば8〜12個の連続DNAヌクレオチドのギャップ領域(G)を有してよい。いくつかの態様において、ギャップ領域Gは、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個の連続DNAヌクレオシドからなってよい。ギャップ領域中のシトシン(C)DNAは、場合によってはメチル化されていてよく、このような残基は、5-メチル-シトシン(meC)として、またはcの代わりにeを用いて、アノテーションを付される。ギャップ中のシトシンDNAのメチル化は、潜在的毒性を低減するために、cgジヌクレオチドがギャップ中に存在している場合に有利であり、この修飾は、オリゴヌクレオチドの有効性に対して大きな影響を与えない。
【０２０７】
いくつかの態様において、ギャップ領域Gは、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個の連続のホスホロチオアート結合DNAヌクレオシドからなってもよい。いくつかの態様において、ギャップ中のヌクレオシド間結合のすべてが、ホスホロチオアート結合である。
【０２０８】
従来のギャップマーはDNAギャップ領域を有しているが、ギャップ領域内で使用された場合にRNアーゼH動員を可能にする修飾ヌクレオシドの例が多数ある。ギャップ領域内に含まれた場合にRNアーゼHを動員することができると報告されている修飾ヌクレオシドには、例えば、α-L-LNA、C4'アルキル化DNA(どちらも参照により本明細書に組み入れられるPCT/EP2009/050349およびVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300において説明されている)、ANAおよび2'F-ANAのようなアラビノース由来ヌクレオシド(Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. SOC. 125, 654-661)、UNA (unlocked nucleic acid)(参照により本明細書に組み入れられるFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039において説明されている)が含まれる。UNAは、アンロックド核酸であり、典型的にはリボースのC2とC3の間の結合が除去されてアンロックド「糖」残基を形成している。このようなギャップマー中で使用される修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域中に導入された場合に2'エンド(DNA様)構造をとるヌクレオシド、すなわちRNアーゼH動員を可能にする修飾物であってよい。いくつかの態様において、本明細書において説明されるDNAギャップ領域(G)は、ギャップ領域中に導入された場合に2'エンド(DNA様)構造をとる1〜3個の糖修飾ヌクレオシドを任意で含んでよい。
【０２０９】
領域G―「ギャップブレーカー」
あるいは、ギャップマーのギャップ領域に3'エンド立体構造を与え、同時にいくらかのRNアーゼH活性を保持する、修飾ヌクレオシドの挿入についても多数の報告がある。1つまたは複数の3'エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するこのようなギャップマーは、「ギャップブレーカー」または「ギャップが破壊された」ギャップマーとも呼ばれる。例えばWO 2013/022984を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、RNアーゼH動員を可能にするのに十分なDNAヌクレオシド領域をギャップ領域内に保持している。RNアーゼHを動員するギャップブレーカーオリゴヌクレオチド設計の能力は、典型的には、配列特異的またはさらに化合物特異的である―標的RNAのより特異的な切断を場合によっては提供するRNアーゼHを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示しているRukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487を参照されたい。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、3'エンド確認を与える修飾ヌクレオシド、例えば2'-O-メチル(OMe)ヌクレオシドもしくは2'-O-MOE(MOE)ヌクレオシド、またはβ-D LNAヌクレオシド(ヌクレオシドのリボース糖環のC2'とC4'の間の架橋がβ配座の状態にある)、例えば、β-D-オキシLNAヌクレオシドもしくはScETヌクレオシドであってよい。
【０２１０】
前述の領域Gを含むギャップマーと同様に、ギャップブレーカーまたはギャップが破壊されたギャップマーのギャップ領域は、(領域Fの3'ヌクレオシドに隣接している)ギャップの5'末端におけるDNAヌクレオシドおよび(領域F'の5'ヌクレオシドに隣接している)ギャップの3'末端におけるDNAヌクレオシドを有する。破壊されたギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の5'末端または3'末端のいずれかに、少なくとも3個または4個の連続DNAヌクレオシドからなる領域を保持している。
【０２１１】
ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの例示的な設計には、
F1〜8-[D3〜4-E1-D3〜4]-F’1〜8
F1〜8-[D1〜4-E1-D3〜4]-F’1〜8
F1〜8-[D3〜4-E1-D1〜4]-F’1〜8
が含まれ、
式中、領域Gは、角括弧[Dn-Er-Dm]の中にあり、Dは、DNAヌクレオシドの連続配列であり、Eは、修飾ヌクレオシド(ギャップブレーカーまたはギャップ破壊ヌクレオシド)であり、FおよびF'は、本明細書において定義される隣接領域であり、ただし、ギャップマー領域F-G-F'の全長が少なくとも12、例えば少なくとも14ヌクレオチド長であることを条件とする。
【０２１２】
いくつかの態様において、ギャップが破壊されたギャップマーの領域Gは、少なくとも6個のDNAヌクレオシド、例えば、6個、7個、8個、9個、10個、11個、12個、13個、14個、15個、または16個のDNAヌクレオシドを含む。前述したように、DNAヌクレオシドは、連続していてよく、または任意で、1つもしくは複数の修飾ヌクレオシドが割り込んでいてよく、ただし、ギャップ領域GがRNアーゼH動員を媒介できることを条件とする。
【０２１３】
ギャップマー―隣接領域FおよびF’
領域Fは、領域Gの5'DNAヌクレオシドのすぐ隣に位置している。領域Fの最も3'側のヌクレオシドは、高親和性糖修飾ヌクレオシドのような糖修飾ヌクレオシド、例えば、MOEヌクレオシドのような2'置換ヌクレオシド、またはLNAヌクレオシドである。
【０２１４】
領域F'は、領域Gの3'DNAヌクレオシドのすぐ隣に位置している。領域F'の最も5'側のヌクレオシドは、高親和性糖修飾ヌクレオシドのような糖修飾ヌクレオシド、例えば、MOEヌクレオシドのような2'置換ヌクレオシド、またはLNAヌクレオシドである。
【０２１５】
領域Fは、長さが1〜8個の連続ヌクレオチド、例えば長さが2〜6個、例えば3〜4個の連続ヌクレオチドである。有利には、領域Fの最も5'側のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域Fの最も5'側の2個のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域Fの最も5'側のヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域Fの最も5'側の2個のヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域Fの最も5'側の2個のヌクレオシドは、2'置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば2個の3'MOEヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域Fの最も5'側のヌクレオシドは、MOEヌクレオシドのような2'置換ヌクレオシドである。
【０２１６】
領域F'は、長さが2〜8個の連続ヌクレオチド、例えば長さが3〜6個、例えば4〜5個の連続ヌクレオチドである。有利には、いくつかの態様において、領域F'の最も3'側のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域F'の最も3'側の2個のヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域F'の最も3'側の2個のヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域F'の最も3'側のヌクレオシドは、LNAヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域F'の最も3'側の2個のヌクレオシドは、2'置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば2個の3'MOEヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域F'の最も3'側のヌクレオシドは、MOEヌクレオシドのような2'置換ヌクレオシドである。
【０２１７】
領域Fまたは領域F'の長さが1である場合、それは有利にはLNAヌクレオシドであることに注意すべきである。
【０２１８】
いくつかの態様において、領域Fおよび領域F’は、独立に、糖修飾ヌクレオシドの連続配列からなるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、領域Fの糖修飾ヌクレオシドは、2'-Oアルキル-RNAユニット、2'-O-メチル-RNA、2'-アミノ-DNAユニット、2'-フルオロ-DNAユニット、2'-アルコキシ-RNA、MOEユニット、LNAユニット、アラビノ核酸(ANA)ユニット、および2'-フルオロ-ANAユニットより独立に選択され得る。
【０２１９】
いくつかの態様において、領域Fおよび領域F'は、独立にLNAヌクレオシドおよび2'置換修飾ヌクレオシドの両方を含む(混合ウイング設計)。
【０２２０】
いくつかの態様において、領域FおよびF’は、1つのタイプの糖修飾ヌクレオシドのみから、例えば、MOEのみ、またはβ-D-オキシLNAのみ、またはScETのみからなる。このような設計は、均一フランク設計または均一ギャップマー設計とも呼ばれる。
【０２２１】
いくつかの態様において、領域FもしくはF'、またはFおよびF'のすべてのヌクレオシドはLNAヌクレオシドであり、例えば、β-D-オキシLNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、またはScETヌクレオシドより独立に選択される。いくつかの態様において、領域Fは、1〜5個、例えば2〜4個、例えば3〜4個、例えば、1個、2個、3個、4個、または5個の連続LNAヌクレオシドからなる。いくつかの態様において、領域FおよびF’のすべてのヌクレオシドは、β-D-オキシLNAヌクレオシドである。
【０２２２】
いくつかの態様において、領域FもしくはF'、またはFおよびF'のすべてのヌクレオシドは、2'置換ヌクレオシド、例えば、OMeヌクレオシドまたはMOEヌクレオシドである。いくつかの態様において、領域Fは、1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、または8個の連続OMeヌクレオシドまたは連続MOEヌクレオシドからなる。いくつかの態様において、隣接領域のうちの1つだけが、2'置換ヌクレオシド、例えば、OMeヌクレオシドまたはMOEヌクレオシドからなることができる。いくつかの態様において、2'置換ヌクレオシド、例えば、OMeヌクレオシドまたはMOEヌクレオシドからなるのは5'(F)隣接領域であり、一方、3'(F')隣接領域は、少なくとも1つのLNAヌクレオシド、例えば、β-D-オキシLNAヌクレオシドまたはcETヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、2'置換ヌクレオシド、例えば、OMeヌクレオシドまたはMOEヌクレオシドからなるのは3'(F')隣接領域であり、一方、5'(F)隣接領域は、少なくとも1つのLNAヌクレオシド、例えば、β-D-オキシLNAヌクレオシドまたはcETヌクレオシドを含む。
【０２２３】
いくつかの態様において、領域FおよびF'のすべての修飾ヌクレオシドはLNAヌクレオシドであり、例えば、β-D-オキシLNAヌクレオシド、ENAヌクレオシド、またはScETヌクレオシドより独立に選択され、その際、領域FもしくはF'、またはFおよびF'は、任意で、DNAヌクレオシドを含んでよい(交互フランク、より詳細についてはこれらの定義を参照されたい)。いくつかの態様において、領域FおよびF'のすべての修飾ヌクレオシドはβ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、その際、領域FもしくはF'、またはFおよびF'は、任意で、DNAヌクレオシドを含んでよい(交互フランク、より詳細についてはこれらの定義を参照されたい)。
【０２２４】
いくつかの態様において、領域FおよびF'の最も5'側および最も3'側のヌクレオシドは、LNAヌクレオシド、例えばβ-D-オキシLNAヌクレオシドまたはScETヌクレオシドである。
【０２２５】
いくつかの態様において、領域Fと領域Gの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である。いくつかの態様において、領域F'と領域Gの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である。いくつかの態様において、領域FまたはF'、FおよびF'のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である。
【０２２６】
さらなるギャップマー設計は、参照により本明細書に組み入れられるWO 2004/046160、WO 2007/146511、およびWO 2008/113832において開示されている。
【０２２７】
LNAギャップマー
LNAギャップマーは、領域FおよびF'のいずれか一方または両方がLNAヌクレオシドを含むか、またはそれからなる、ギャップマーである。β-D-オキシギャップマーは、領域FおよびF'のいずれか一方または両方がβ-D-オキシLNAヌクレオシドを含むか、またはそれからなる、ギャップマーである。
【０２２８】
いくつかの態様において、LNAギャップマーは、式：[LNA]1〜5-[領域G]-[LNA]1〜5(式中、領域Gはギャップマー領域Gの定義において定義されるとおりである)を有する。
【０２２９】
MOEギャップマー
MOEギャップマーは、領域Fおよび領域F'がMOEヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの態様において、MOEギャップマーは、設計[MOE]1〜8-[領域G]-[MOE]1〜8、例えば[MOE]2〜7-[領域G]5〜16-[MOE]2〜7、例えば[MOE]3〜6-[領域G]-[MOE]3〜6(式中、領域Gはギャップマーの定義において定義されるとおりである)を有する。5〜10-5設計(MOE-DNA-MOE)を有するMOEギャップマーが、当技術分野で広く使用されている。
【０２３０】
混合ウイングギャップマー
混合ウイングギャップマーは、領域Fおよび領域F'の一方または両方が、2'置換ヌクレオシド、例えば、2'-Oアルキル-RNAユニット、2'-O-メチル-RNA、2'-アミノ-DNAユニット、2'-フルオロ-DNAユニット、2'-アルコキシ-RNA、MOEユニット、アラビノ核酸(ANA)ユニット、および2'-フルオロ-ANAユニットからなる群より独立に選択される2'置換ヌクレオシド、例えばMOEヌクレオシドを含む、LNAギャップマーである。領域Fおよび領域F'のうちの少なくとも1つまたは領域Fおよび領域F'の両方が少なくとも1つのLNAヌクレオシドを含むいくつかの態様において、領域Fおよび領域F'の残りのヌクレオシドは、MOEおよびLNAからなる群より独立に選択される。領域Fおよび領域F'のうちの少なくとも1つまたは領域Fおよび領域F'の両方が少なくとも2個のLNAヌクレオシドを含むいくつかの態様において、領域Fおよび領域F'の残りのヌクレオシドは、MOEおよびLNAからなる群より独立に選択される。いくつかの混合ウイング態様において、領域Fおよび領域F'の一方または両方は、1つまたは複数のDNAヌクレオシドをさらに含んでよい。
【０２３１】
混合ウイングギャップマー設計は、どちらも参照により本明細書に組み入れられるWO 2008/049085およびWO 2012/109395において開示されている。
【０２３２】
交互フランクギャップマー
隣接領域は、LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドの両方を含む場合があり、これらはLNA-DNA-LNAヌクレオシドという交互モチーフを含むことから、「交互フランク」と呼ばれる。このような交互フランクを含むギャップマーは、「交互フランクギャップマー」と呼ばれる。したがって、「交互フランクギャップマー」は、フランク(FまたはF’)の少なくとも1つがLNAヌクレオシドに加えてDNAを含むLNAギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、領域Fもしくは領域F'の少なくとも1つ、または領域Fおよび領域F'の両方は、LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドの両方を含む。このような態様において、隣接領域FもしくはF'、またはFおよびF'の両方は、少なくとも3つのヌクレオシドを含み、F領域および/またはF'領域の最も5'側および最も3'側のヌクレオシドはLNAヌクレオシドである。
【０２３３】
交互フランクLNAギャップマーは、WO 2016/127002に開示されている。
【０２３４】
交互フランク領域は、最大3個の連続DNAヌクレオシド、例えば1〜2個または1個もしくは2個もしくは3個の連続DNAヌクレオシドを含んでよい。
【０２３５】
交互フランクには、例えば、
[L]1〜3-[D]1〜4-[L]1〜3
[L]1〜2-[D]1〜2-[L]1〜2-[D]1〜2-[L]1〜2
のように、LNAヌクレオシド(L)の数に続いてDNAヌクレオシド(D)の数を表す一連の整数としてコメントを付けることができる。
【０２３６】
オリゴヌクレオチド設計において、これらは数字としてしばしば表され、2〜2-1は5'[L]2-[D]2-[L]3'を表し、1-1-1-1-1は5'[L]-[D]-[L]-[D]-[L]3'を表すという具合である。交互フランクを有するオリゴヌクレオチド中のフランク(領域Fおよび領域F')の長さは、独立に、3〜10ヌクレオシド、例えば4〜8、例えば5〜6ヌクレオシド、例えば4個、5個、6個、または7個の修飾ヌクレオシドであってよい。いくつかの態様において、ギャップマーオリゴヌクレオチド中のフランクの一方だけが交互であり、他方はLNAヌクレオチドから構成される。付加的なエキソヌクレアーゼ耐性を与えるために、3'フランク(F')の3'末端に少なくとも2個のLNAヌクレオシドを有することが有利である場合がある。交互フランクを有するオリゴヌクレオチドのいくつかの例は以下のとおりである：
[L]1〜5-[D]1〜4-[L]1〜3-[G]5〜16-[L]2〜6
[L]1〜2-[D]1〜2-[L]1〜2-[D]1〜2-[L]1〜2-[G]5〜16-[L]1〜2-[D]1〜3-[L]2〜4
[L]1〜5-[G]5〜16-[L]-[D]-[L]-[D]-[L]2
ただし、ギャップマーの全長が少なくとも12、例えば少なくとも14ヌクレオチド長であることを条件とする。
【０２３７】
オリゴヌクレオチド中の領域D’または領域D’’
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的である、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーF-G-F'、およびさらなる5'ヌクレオシドおよび/もしくは3'ヌクレオシドを含むか、またはそれからなってよい。さらなる5'ヌクレオシドおよび/または3'ヌクレオシドは、標的核酸に完全に相補的であってもなくてもよい。このようなさらなる5'ヌクレオシドおよび/または3'ヌクレオシドは、本明細書において領域D'および領域D”と呼ばれ得る。
【０２３８】
領域D'または領域D”の付加は、ギャップマーのような連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分または別の官能基に結合するために使用され得る。連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分と結合するために使用される場合、これは生物切断可能なリンカーとしての機能を果たすことができる。あるいは、これは、エキソヌクレアーゼ保護を与えるために、または合成もしくは製造を容易にするためにも使用され得る。
【０２３９】
領域D'および領域D”を、それぞれ、領域Fの5'末端または領域F'の3'末端に結合して、次の式：D'-F-G-F'、F-G-F'-D”、またはD'-F-G-F'-D”の設計を作ることができる。この場合、F-G-F'は、オリゴヌクレオチドのギャップマー部分であり、領域D'または領域D”は、オリゴヌクレオチドの別個の部分を構成する。
【０２４０】
領域D'または領域D”は、独立に、標的核酸に相補的でも非相補的でもよい1個、2個、3個、4個、もしくは5個の付加的なヌクレオチドを含むか、またはそれからなってよい。F領域またはF'領域に隣接したヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチドではなく、例えば、DNAもしくはRNAまたはこれらの塩基修飾型である。D'領域またはD'領域は、ヌクレアーゼ感受性の生物切断可能なリンカーの役割を果たし得る(リンカーの定義を参照されたい)。いくつかの態様において、付加的な5'末端ヌクレオチドおよび/または3'末端ヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合で連結されており、DNAまたはRNAである。領域D'または領域D”として使用するために適しているヌクレオチドベースの生物切断可能なリンカーが、WO 2014/076195において開示されており、例として、リン酸ジエステル結合DNAジヌクレオチドが含まれる。ポリオリゴヌクレオチド構築物における生物切断可能なリンカーの使用が、WO 2015/113922において開示されており、その際、これらは、単一のオリゴヌクレオチド内で複数のアンチセンス構築物(例えばギャップマー領域)を連結するのに使用される。
【０２４１】
1つの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域D'および/または領域D”を含む。
【０２４２】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式によって表すことができる：
F-G-F'、特にF1〜8-G5〜16-F'2〜8
D'-F-G-F'、特にD'1〜3-F1〜8-G5〜16-F'2〜8
F-G-F'-D”、特にF1〜8-G5〜16-F'2〜8-D”1〜3
D'-F-G-F'-D”、特にD'1〜3-F1〜8-G5〜16-F'2〜8-D”1〜3。
【０２４３】
いくつかの態様において、領域D'と領域Fの間に位置するヌクレオシド間結合は、リン酸ジエステル結合である。いくつかの態様において、領域F'と領域D”の間に位置するヌクレオシド間結合は、リン酸ジエステル結合である。
【０２４４】
トータルマー
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシドのすべてが、糖修飾ヌクレオシドである。本明細書において、このようなオリゴヌクレオチドは、トータルマーと呼ばれる。
【０２４５】
いくつかの態様において、トータルマーの糖修飾ヌクレオシドのすべてが同じ糖修飾を含み、例えば、それらは、すべてLNAヌクレオシドであってよく、またはすべて2'O-MOEヌクレオシドであってよい。いくつかの態様において、トータルマーの糖修飾ヌクレオシドは、LNAヌクレオシドおよび2'置換ヌクレオシド、例えば、2'-Oアルキル-RNAヌクレオシド、2'-O-メチル-RNAヌクレオシド、2'-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2'-O-メトキシエチル-RNA(MOE)ヌクレオシド、2'-アミノ-DNAヌクレオシド、2'-フルオロ-RNAヌクレオシド、および2'-F-ANAヌクレオシドからなる群より選択される2'置換ヌクレオシドより、独立に選択され得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、LNAヌクレオシドおよび2'置換ヌクレオシドの両方を含み、例えば、2'置換ヌクレオシドは、2'-Oアルキル-RNAヌクレオシド、2'-O-メチル-RNAヌクレオシド、2'-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2'-O-メトキシエチル-RNA(MOE)ヌクレオシド、2'-アミノ-DNAヌクレオシド、2'-フルオロ-RNAヌクレオシド、および2'-F-ANAヌクレオシドからなる群より選択される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、LNAヌクレオシドおよび2'-O-MOEヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、(S)cET LNAヌクレオシドおよび2'-O-MOEヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドユニットは、2’置換ヌクレオシドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドの各ヌクレオシドユニットは、2’-O-MOEヌクレオシドである。
【０２４６】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシドのすべてが、LNAヌクレオシド、例えばβ-D-オキシ-LNAヌクレオシド、および/または(S)cETヌクレオシドである。いくつかの態様において、このようなLNAトータルマーオリゴヌクレオチドは、7ヌクレオシド長〜12ヌクレオシド長である(例えばWO 2009/043353を参照されたい)。このような短い完全なLNAオリゴヌクレオチドは、マイクロRNAを阻害するにあたって特に有効である。
【０２４７】
様々なトータルマー化合物が、特にマイクロRNAを標的とする場合(アンチmiR)またはスプライススイッチングオリゴマー(SSO)として、治療的オリゴマーとして著しく有効である。
【０２４８】
いくつかの態様において、トータルマーは、反復配列XYXもしくはYXYなどの少なくとも1つのXYXもしくはYXY配列モチーフを含むか、またはそれからなり、式中、XはLNAであり、Yは別の(すなわちLNAではない)ヌクレオチド類似体、例えば、2'-OMe RNAユニットおよび2'-フルオロDNAユニットである。いくつかの態様において、上記の配列モチーフは、例えば、XXY、XYX、YXY、またはYYXであってよい。
【０２４９】
いくつかの態様において、トータルマーは、7ヌクレオチド〜24ヌクレオチド、例えば、7、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、もしくは23ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってよい。
【０２５０】
いくつかの態様において、トータルマーの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも30％、例えば少なくとも40％、例えば少なくとも50％、例えば少なくとも60％、例えば少なくとも70％、例えば少なくとも80％、例えば少なくとも90％、例えば95％、例えば100％のLNAユニットを含む。完全なLNA化合物の場合、これらは12ヌクレオチド長未満、例えば7〜10ヌクレオチド長であることが有利である。
【０２５１】
残りのユニットは、本明細書において言及する非LNAヌクレオチド類似体、例えば2'-Oアルキル-RNAユニット、2'-OMe-RNAユニット、2'-アミノ-DNAユニット、2'-フルオロ-DNAユニット、LNAユニット、PNAユニット、HNAユニット、INAユニット、および2'MOE RNAユニットからなる群、または2'-OMe RNAユニットおよび2'-フルオロDNAユニットの群より選択されるものより選択されてよい。
【０２５２】
ミクスマー
用語「ミクスマー」は、DNAヌクレオシドおよび糖修飾ヌクレオシドの両方を含み、RNアーゼHを動員するには不十分な長さの連続DNAヌクレオシドが存在する、オリゴマーを意味する。適切なミクスマーは、最大3個または最大4個の連続DNAヌクレオシドを含んでよい。いくつかの態様において、ミクスマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、糖修飾ヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドからなる交互の領域を含む。オリゴヌクレオチド中に組み込まれた場合にRNA様(3'エンド)立体構造を形成する糖修飾ヌクレオシドの領域とDNAヌクレオシドの短い領域とを交互にすることによって、RNアーゼHを動員しないオリゴヌクレオチドを作ることができる。有利には、糖修飾ヌクレオシドは、親和性増強糖修飾ヌクレオシドである。
【０２５３】
オリゴヌクレオチドミクスマーは、しばしば、スプライス調節物質またはマイクロRNA阻害剤など、標的遺伝子を占拠することに基づく調節を提供するのに使用される。
【０２５４】
いくつかの態様において、ミクスマー中の糖修飾ヌクレオシドまたはその連続ヌクレオチド配列は、LNAヌクレオシド、例えば(S)cET LNAヌクレオシドもしくはβ-D-オキシLNAヌクレオシドを含むか、またはすべてLNAヌクレオシド、例えば(S)cET LNAヌクレオシドもしくはβ-D-オキシLNAヌクレオシドである。
【０２５５】
いくつかの態様において、ミクスマーの糖修飾ヌクレオシドのすべてが同じ糖修飾を含み、例えば、それらは、すべてLNAヌクレオシドであってよく、またはすべて2'O-MOEヌクレオシドであってよい。いくつかの態様において、ミクスマーの糖修飾ヌクレオシドは、LNAヌクレオシドおよび2'置換ヌクレオシド、例えば、2'-Oアルキル-RNAヌクレオシド、2'-O-メチル-RNAヌクレオシド、2'-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2'-O-メトキシエチル-RNA(MOE)ヌクレオシド、2'-アミノ-DNAヌクレオシド、2'-フルオロ-RNAヌクレオシド、および2'-F-ANAヌクレオシドからなる群より選択される2'置換ヌクレオシドより、独立に選択され得る。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、LNAヌクレオシドおよび2'置換ヌクレオシドの両方を含み、例えば、2'置換ヌクレオシドは、2'-Oアルキル-RNAヌクレオシド、2'-O-メチル-RNAヌクレオシド、2'-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2'-O-メトキシエチル-RNA(MOE)ヌクレオシド、2'-アミノ-DNAヌクレオシド、2'-フルオロ-RNAヌクレオシド、および2'-F-ANAヌクレオシドからなる群より選択される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、LNAヌクレオシドおよび2'-O-MOEヌクレオシドを含む。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは、(S)cET LNAヌクレオシドおよび2'-O-MOEヌクレオシドを含む。
【０２５６】
いくつかの態様において、ミクスマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドのみを含み、例えばLNAミクスマーオリゴヌクレオチドは、例えば8ヌクレオシド長〜24ヌクレオシド長であってよい(例えば、マイクロRNAのLNAアンチmiR阻害剤を開示しているWO 2007112754を参照されたい)。
【０２５７】
様々なミクスマー化合物が、特にマイクロRNAを標的とする場合(アンチmiR)またはスプライススイッチングオリゴマー(SSO)として、治療的オリゴマーとして著しく有効である。
【０２５８】
いくつかの態様において、ミクスマーは、以下のモチーフ
2021508327.tif 000029
(式中、Lは、LNAまたは2'置換ヌクレオシド(例えば2'-O-MOE)などの糖修飾ヌクレオシドを表し、DはDNAヌクレオシドを表し、各mは、1〜6より独立に選択され、各nは、1、2、3、および4、例えば1〜3より独立に選択される)を含む。いくつかの態様において、各Lは、LNAヌクレオシドである。いくつかの態様において、少なくとも1つのLはLNAヌクレオシドであり、少なくとも1つのLは2'-O-MOEヌクレオシドである。いくつかの態様において、各Lは、LNAヌクレオシドおよび2'-O-MOEヌクレオシドより独立に選択される。
【０２５９】
いくつかの態様において、ミクスマーは、10ヌクレオチド〜24ヌクレオチドの間、例えば、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、もしくは23ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってよい。
【０２６０】
いくつかの態様において、ミクスマーの連続ヌクレオチド配列は、少なくとも30％、例えば少なくとも40％、例えば少なくとも50％のLNAユニットを含む。
【０２６１】
いくつかの態様において、ミクスマーは、ヌクレオチド類似体と天然ヌクレオチドとの、もしくは1つのタイプのヌクレオチド類似体と別のタイプのヌクレオチド類似体との繰り返しパターンを有する連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。繰り返しパターンは、例えば、次のようであってよい：1つおきのヌクレオチドもしくは2つおきのヌクレオチドがLNAのようなヌクレオチド類似体であり、かつ残りのヌクレオチドが、DNAのような天然ヌクレオチドであるか、または本明細書において言及されるか、もしくはいくつかの態様において、本明細書において言及されるヌクレオチド類似体の群より選択される、2'MOE類似体または2'フルオロ類似体などの2'置換ヌクレオチド類似体である。LNAユニットのようなヌクレオチド類似体の繰り返しパターンは、決まった位置―例えば5'末端または3'末端において、ヌクレオチド類似体と組み合わされてよいことが認識される。
【０２６２】
いくつかの態様において、オリゴマーの3'末端から数えて最初のヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えばLNAヌクレオチドまたは2'-O-MOEヌクレオシドである。
【０２６３】
同じまたは異なり得るいくつかの態様において、オリゴマーの3'末端から数えて2番目のヌクレオチドは、ヌクレオチド類似体、例えばLNAヌクレオチドまたは2'-O-MOEヌクレオシドである。
【０２６４】
同じまたは異なり得るいくつかの態様において、オリゴマーの5'末端は、ヌクレオチド類似体、例えばLNAヌクレオチドまたは2'-O-MOEヌクレオシドである。
【０２６５】
いくつかの態様において、ミクスマーは、少なくとも2個の連続したヌクレオチド類似体ユニット、例えば少なくとも2個の連続したLNAユニットを含む少なくとも1つの領域を含む。
【０２６６】
いくつかの態様において、ミクスマーは、少なくとも3個の連続したヌクレオチド類似体ユニット、例えば少なくとも3個の連続したLNAユニットを含む少なくとも1つの領域を含む。
【０２６７】
エキソソーム
エキソソームは、典型的には30〜500nmの範囲の、天然の生物学的ナノベシクルであり、機能的に活性な積荷(miRNA、mRNA、DNA、およびタンパク質など)を介した細胞間情報交換に関与している。
【０２６８】
エキソソームは、あらゆるタイプの細胞によって分泌され、唾液、血液、尿、および乳などの体液中にも豊富に存在する。エキソソームの主要な役割は、特定の細胞間で様々なエフェクターまたはシグナル伝達分子を送達することによって情報を運ぶことである(Acta Pol Pharm. 2014 Jul-Aug；71(4)：537-43.)。このようなエフェクターまたはシグナル伝達分子は、例えば、タンパク質、miRNA、またはmRNAであることができる。現在、エキソソームは、治療的RNA分子を含む様々な薬物分子の治療的および診断的適用を拡大するために、このような分子の送達媒体として調査されている。siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および低分子などの合成分子を充填されたエキソソームの技術分野において、遊離の薬物分子と比べて、このような分子が送達および有効性の点で有利であることを示唆するかまたは示す開示がある(例えば、Andaloussi et al 2013 Advanced Drug Delivery Reviews 65： 391-397、WO 2014/168548、WO 2016/172598、WO 2017/173034、およびWO 2018/102397を参照されたい)。
【０２６９】
エキソソームは、乳のような生物学的供給源から単離することができ(乳エキソソーム)、特に、牛乳は、牛乳エキソソームを単離するための豊富な供給源である。例えば、Manca et al., Scientific Reports (2018) 8：11321を参照されたい。
【０２７０】
本発明のいくつかの態様において、一本鎖オリゴヌクレオチドはエキソソーム中に封入され(エキソソーム製剤)、エキソソームへの一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの充填についての例は、EP出願番号18192614.8で説明されている。本発明の方法において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、エキソソーム製剤の形態で細胞または対象に投与されてよく、特に、エキソソーム製剤の経口投与が構想される。
【０２７１】
いくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、例えば、生物切断可能なリンカー(例えば、リン酸ジエステル結合DNAヌクレオチドの領域)を介してアンチセンスオリゴヌクレオチドに共有結合的に結合され得るコレステロールのような親油性コンジュゲートと結合されてよい。このような親油性コンジュゲートは、エキソソーム中にアンチセンスオリゴヌクレオチドを配合するのを容易にすることができ、さらに、標的細胞への送達も促進し得る。
【０２７２】
コンジュゲート
本明細書において使用される用語「コンジュゲート」は、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分または領域Cもしくは第3の領域)に共有結合的に連結されているオリゴヌクレオチドを意味する。
【０２７３】
1つまたは複数の非ヌクレオチド部分への本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取込み、または安定性に影響を及ぼすことによって、オリゴヌクレオチドの薬理作用を改良し得る。いくつかの態様において、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、生物学的利用能、代謝、排出、透過性、および/または細胞取込みを改良することによって、オリゴヌクレオチドの薬物動態学的特性を改変または増強する。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織、または細胞型に導き、それによって、その器官、組織、または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を高め得る。同時に、コンジュゲートは、標的ではない細胞型、組織、もしくは器官におけるオリゴヌクレオチドの活性、例えばオフターゲット活性、または標的ではない細胞型、組織、もしくは器官における活性を低下させる役割を果たし得る。
【０２７４】
参照により本明細書に組み入れられるWO 93/07883およびWO 2013/033230は、適切なコンジュゲート部分を提供する。さらに他の適切なコンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体(ASGPR)に結合することができるものである。特に、三価のN-アセチルガラクトサミンコンジュゲート部分は、ASGPRに結合するために適しており、例えば、(参照により本明細書に組み入れられる)WO 2014/076196、WO 2014/207232、およびWO 2014/179620を参照されたい。このようなコンジュゲートは、肝臓へのオリゴヌクレオチドの取込みを増大させ、同時に腎臓におけるその存在量を減らす働きをし、それによって、コンジュゲートされたオリゴヌクレオチドの肝臓/腎臓比を、同じオリゴヌクレオチドのコンジュゲートされていないものと比べて大きくする。
【０２７５】
オリゴヌクレオチドコンジュゲートおよびそれらの合成はまた、それぞれがそっくりそのまま参照により本明細書に組み入れられるManoharan in Antisense Drug Technology, Principles, Strategies, and Applications, S.T. Crooke, ed., Ch. 16, Marcel Dekker, Inc., 2001およびManoharan, Antisense and Nucleic Acid Drug Development, 2002, 12, 103による包括的な総説において報告されている。
【０２７６】
ある態様において、非ヌクレオチド部分(コンジュゲート部分)は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素(例えば細菌毒素)、ビタミン、ウイルスタンパク質(例えばカプシド)、またはそれらの組合せからなる群より選択される。
【０２７７】
リンカー
結合またはリンカーは、1つまたは複数の共有結合を介して関心対象の1つの化学基またはセグメントを関心対象の別の化学基またはセグメントに連結する、2個の原子間の結合部である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分(例えばリンカーまたはテザー)を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第3の領域、例えばコンジュゲート部分(領域C)を第1の領域、例えば、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列(領域A)に共有結合的に連結する働きをする。
【０２７８】
本発明のいくつかの態様において、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列(領域Aまたは第1の領域)とコンジュゲート部分(領域Cまたは第3の領域)との間に配置されるリンカー領域(第2の領域または領域Bおよび/もしくは領域Y)を任意で含んでよい。
【０２７９】
領域Bは、正常時に生じる条件もしくは哺乳動物の体内で生じる条件に類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むか、またはそれからなる、生物切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換(例えば切断)を受ける条件には、pH、温度、酸化的もしくは還元的な条件、または作用物質、および哺乳動物細胞で見出される塩濃度もしくは哺乳動物細胞で生じるものに類似した塩濃度などの化学的条件が含まれる。哺乳動物細胞内条件には、例えばタンパク質分解酵素もしくは加水分解酵素またはヌクレアーゼに由来する、哺乳動物細胞において通常は存在する酵素活性の存在も含まれる。1つの態様において、生物切断可能なリンカーは、S1ヌクレアーゼ切断に感受性である。好ましい態様において、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、少なくとも2個の連続したリン酸ジエステル結合、例えば少なくとも3個または4個または5個の連続したリン酸ジエステル結合を含む、1〜10個のヌクレオシド、例えば1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、または10個のヌクレオシド、より好ましくは2〜6個のヌクレオシド、および最も好ましくは2〜4個の連結ヌクレオシドを含む。好ましくは、ヌクレオシドは、DNAまたはRNAである。リン酸ジエステルを含む生物切断可能なリンカーは、(参照により本明細書に組み入れられる)WO 2014/076195においてより詳細に説明されている。
【０２８０】
領域Yは、必ずしも生物切断可能ではないが、オリゴヌクレオチド(領域Aまたは第1の領域)にコンジュゲート部分(領域Cまたは第3の領域)を共有結合的に連結する働きを主としてするリンカーを指す。領域Yリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸ユニット、またはアミノアルキル基などの繰り返しユニットからなる、鎖構造またはオリゴマーを含んでよい。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素、すなわちA-C、A-B-C、A-B-Y-C、A-Y-B-C、またはA-Y-Cから構築することができる。いくつかの態様において、リンカー(領域Y)は、例えばC6〜C12アミノアルキル基を含む、C2〜C36アミノアルキル基のようなアミノアルキルである。好ましい態様において、リンカー(領域Y)は、C6アミノアルキル基である。
【０２８１】
投与
本発明のオリゴヌクレオチドまたは薬学的組成物は、局所的に(例えば、皮膚に、吸入によって、眼に、もしくは耳に)または腸内に(例えば、経口的もしくは消化管を介して)または非経口的に(例えば、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、もしくはくも膜下腔内)投与されてよい。
【０２８２】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドまたは薬学的組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内、または筋肉内への注射または注入、くも膜下腔内または頭蓋内、例えば脳内もしくは脳室内、硝子体内投与を含む非経口経路によって投与される。1つの態様において、活性なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の態様において、活性なオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与される。
【０２８３】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または薬学的組成物は、0.1〜15mg/kg、例えば0.2〜10mg/kg、例えば0.25〜5mg/kgの用量で投与される。投与は、週に1回、2週毎、3週毎、または月に1回、もしくは隔月であることができる。
【０２８４】
本発明はまた、硝子体内注射剤のような眼科用の剤形である医薬を製造するための、説明した本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用も提供する。いくつかの態様において、眼科的標的のためのオリゴヌクレオチドは、Htra-1である。
【０２８５】
本発明はまた、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、またはくも膜下腔内投与用の剤形(例えば注射剤)である医薬を製造するための、説明した本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用も提供する。
【０２８６】
例示的な利点
本明細書において示すように、本発明の化合物において使用されるアキラルなホスホロジチオアートヌクレオシド間結合は、立体定義されていないホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの活性、有効性、または効力を維持しつつ、該オリゴヌクレオチドの複雑性を低めることを可能にする。
【０２８７】
実際、本明細書において示すように、本発明の化合物において使用されるものは、立体定義されたホスホロチオアートとの組合せで独特な利益をもたらして、ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの活性、有効性、または効力を保持または改良しつつ、該オリゴヌクレオチドの複雑性をさらに低める機会を与える。
【０２８８】
本明細書において示すように、本発明の化合物において使用されるアキラルなホスホロジチオアートヌクレオシド間結合は、インビトロまたはインビボでの細胞取込みを改良することを可能にする。
【０２８９】
本明細書において示すように、本発明の化合物において使用されるアキラルなホスホロジチオアートヌクレオシド間結合は、(組織含有量もしくは細胞含有量または標的組織における活性/効力のいずれかとして測定される)インビトロでの体内分布を変更または改良することを可能にする。注目すべきことに、本発明者らは、骨格筋、心臓、脾臓、肝臓、腎臓、線維芽細胞、上皮細胞における組織取込み、含有量、および/または効力の改良を確認した。
【０２９０】
ミクスマーオリゴヌクレオチドとの関連で、本発明者らは、1つまたは複数のDNA ヌクレオシドの間またはそれらに隣接して(IAまたはIBに示すような)ホスホロジチオアート結合を組み入れることにより、増強された安定性および/または改良された効力などの改良が実現することを確認した。ギャップマーオリゴヌクレオチドとの関連で、本発明者らは、フランク領域のヌクレオシド間に(例えば、2’糖修飾ヌクレオシドの間に)(IAまたはIBに示すような)ホスホロジチオアート結合を組み入れることによっても、増強された安定性および/または改良された効力などの改良が実現することを見出した。
【０２９１】
本明細書において示すように、本発明の化合物において使用されるアキラルなホスホロジチオアートヌクレオシド間結合は、オリゴヌクレオチド安定性を改良することを可能にする。本発明の化合物にアキラルなホスホロジチオアートインターヌクレオシドを組み入れることにより、血清および細胞中のエキソヌクレアーゼに対する、特に3’エキソヌクレアーゼ、ただし5’エキソヌクレアーゼにも対する耐性が強化され、かつ本発明の化合物の優れた安定性から、アキラルなホスホロジチオアート結合を組み入れた化合物の、エンドヌクレアーゼに対する耐性もさらに示唆される。オリゴヌクレオチドの安定化は、毒性の分解産物の蓄積を減らすまたは防ぐにあたって、およびアンチセンスオリゴヌクレオチドの作用持続期間を延長するにあたって、特に重要である。実施例で示すように、ラット血清での安定性を用いて、改良された安定性について分析することができる。細胞での安定性を評価するために、組織(例えば肝臓)ホモジネート抽出物を使用してよい―例えば、このような方法を提供したWO 2014076195を参照されたい。オリゴヌクレオチドの安定性を測定するための他のアッセイ法には、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ安定性アッセイ法およびS1ヌクレアーゼ安定性が含まれる。
【０２９２】
特許請求の範囲のオリゴヌクレオチドの毒性リスクの低下は、(例えばWO 2017/067970で開示されている)インビトロ肝毒性アッセイ法または(例えばWO 2017/216340で開示されている) インビトロ腎毒性アッセイ法または(例えばWO 2016127000で開示されている)インビトロ神経毒性アッセイ法において試験される。あるいは、毒性は、インビボ、例えばマウスまたはラットにおいて分析してもよい。
【０２９３】
増強された安定性は、本発明のオリゴヌクレオチドの作用持続期間に利益をもたらすことができ、投与経路が侵襲性である、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、眼内、脳室内、またはくも膜下腔内投与などの非経口投与である場合に特に利益となる。
【０２９４】
一般的なオリゴヌクレオチドの態様
1  式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000030
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、LNAヌクレオシドであり、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチド。
2  (A1)および(A2)のうちの一方がLNAヌクレオシドであり、かつ他方がDNAヌクレオシド、RNAヌクレオシド、または糖修飾ヌクレオシドである、態様1記載のオリゴヌクレオチド。
3  (A1)および(A2)のうちの一方がLNAヌクレオシドであり、かつ他方がDNAヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドである、態様1または2記載のオリゴヌクレオチド。
4  (A1)および(A2)のうちの一方がLNAヌクレオシドであり、かつ他方がDNAヌクレオシドである、態様1〜3のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
6  (A1)および(A2)のうちの一方がLNAヌクレオシドであり、かつ他方が糖修飾ヌクレオシドである、態様1〜3のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
7  糖修飾ヌクレオシドが2’糖修飾ヌクレオシドである、態様2〜6のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
8  2’糖修飾ヌクレオシドが、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシアルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-RNAヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、またはLNAヌクレオシドである、態様7記載のオリゴヌクレオチド。
9  2’糖修飾ヌクレオシドがLNA ヌクレオシドである、態様7または8記載のオリゴヌクレオチド。
10  LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAより独立に選択される、態様1〜9のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
11  LNAヌクレオシドが、どちらもβ-D-オキシLNAである、態様9または10記載のオリゴヌクレオチド。
12  2’糖修飾ヌクレオシドが2’-アルコキシアルコキシ-RNAである、態様7または8記載のオリゴヌクレオチド。
13  2’-アルコキシ-RNAが2’-メトキシ-RNAである、態様10記載のオリゴヌクレオチド。
14  2’-アルコキシアルコキシ-RNAが2’-メトキシエトキシ-RNAである、態様1〜12のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
15  1〜15個、具体的には1〜5個、より具体的には1個、2個、3個、4個、または5個の態様1で定義される式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む、態様1〜14のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
16  リン酸ジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合、および態様1で定義される式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、態様1〜15のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
17  さらなるヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および態様1で定義される式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択される、態様16記載のオリゴヌクレオチド。
18  さらなるヌクレオシド間結合がすべて、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様16または17記載のオリゴヌクレオチド。
19  さらなるヌクレオシド間結合が、すべて、態様1で定義される式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、態様16または17記載のオリゴヌクレオチド。
20  オリゴヌクレオチドが7〜30ヌクレオチド長のものである、態様1〜19のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
21  1つまたは複数のヌクレオシドが、核酸塩基修飾ヌクレオシドである、態様1〜20のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
22  アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、マイクロRNA模倣体、またはリボザイムである、態様1〜21のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
23  態様1〜22のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩、特に、ナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩。
24  態様1〜23のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容される塩と、該オリゴヌクレオチドまたは該薬学的に許容される塩に任意でリンカー部分を介して共有結合的に結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
25  態様1〜24のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート、および治療的に不活性な担体を含む、薬学的組成物。
26  治療的に活性な物質として使用するための、態様1〜24のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート。
27  以下の段階を含む、態様1〜24のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドを製造するための方法：
(a)ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5'末端酸素原子にチオホスホラミダイトヌクレオシドをカップリングして、チオ亜リン酸トリエステル中間体を作製する段階；
(b)段階(a)で得られたチオ亜リン酸トリエステル中間体をチオ酸化する段階；および
(c)任意でオリゴヌクレオチドをさらに伸長させる段階。
28  態様27記載の方法によって製造されたオリゴヌクレオチド。
【０２９５】
ギャップマーの態様
1  細胞において標的RNAを阻害するためのアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチドであって、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000031
((IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む、アンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
2  少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合が式(IA)を有し、かつRが水素であるか；または少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合が式(IB)を有し、かつM+がNa+、K+、もしくはアンモニウムである、態様1記載のアンチセンスギャップマーオリゴヌクレオチド。
3  式(I)の少なくとも1個のヌクレオシド間結合の2個の酸素原子の一方が、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方が、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個が、2’糖修飾ヌクレオシドである、態様1または2記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
4  (A1)および(A2)のうちの一方が2’糖修飾ヌクレオシドであり、かつ他方がDNAヌクレオシドである、態様1〜3のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
5  (A1)および(A2)が、同時に両方とも2’修飾ヌクレオシドである、態様1〜3のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
6  (A1)および(A2)が、同時に両方ともDNAヌクレオシドである、態様1〜3のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
7  式5’-F-G-F’-3’(式中、Gは、RNアーゼHを動員することができる5〜18個のヌクレオシドの領域であり、領域Gの5'および3'にそれぞれ隣接領域FおよびF’が隣接し、領域FおよびF’は、1〜7個の2’糖修飾ヌクレオチドを独立に含むか、またはそれらからなり、領域Gに隣接している領域Fのヌクレオシドは2’糖修飾ヌクレオシドであり、領域Gに隣接している領域F'のヌクレオシドは2’糖修飾ヌクレオシドである)の連続ヌクレオチド配列を含む、態様1〜6のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
8  2’糖修飾ヌクレオシドが、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシアルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-RNAヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、およびLNAヌクレオシドより独立に選択される、態様1〜7のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
9  2’-アルコキシアルコキシ-RNAが2’-メトキシエトキシ-RNA(2’-O-MOE)である、態様8記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
10  領域Fおよび領域F’が、2’-メトキシエトキシ-RNAヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、態様7または8記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
11  領域Fもしくは領域F’中または領域Fおよび領域F’の両方の中の2’糖修飾ヌクレオシドの少なくとも1つまたはすべてがLNAヌクレオシドである、態様7〜10のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
12  領域Fもしくは領域F’または領域Fおよび領域F’の両方が、少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つのDNAヌクレオシドを含む、態様7〜11のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
13  領域Fもしくは領域F’または領域Fおよび領域F’の両方が、少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つの非LNA 2’糖修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも1つの2’-メトキシエトキシ-RNAヌクレオシドを含む、態様7〜12のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
14  ギャップ領域が、5〜16個、具体的には8〜16個、より具体的には8個、9個、10個、11個、12個、13個、または14個の連続DNAヌクレオシドを含む、態様1〜13のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
15  領域Fおよび領域F’が、独立に、1、2、3、4、5、6、7、または8ヌクレオシド長である、態様1〜14のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
16  領域Fおよび領域F’が、それぞれ独立に、1個、2個、3個、または4個のLNAヌクレオシドを含む、態様1〜15のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
17  LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAより独立に選択される、態様8〜16のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
18  LNAヌクレオシドがβ-D-オキシLNAである、態様8〜18に記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
19  オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列(F-G-F’)が、10〜30ヌクレオチド長、具体的には12〜22、より具体的には14〜20オリゴヌクレオチド長のものである、態様1〜18のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
20  領域Fおよび領域F’などのフランク領域のうちの少なくとも1つが、態様1〜19のいずれか1つで定義される式(IA)または(IB)のホスホロジチオアート結合を含む、態様1〜19のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
21  領域Fおよび領域F’などのフランク領域の両方が、態様1〜19のいずれか1つで定義される式(IA)または(IB)のホスホロジチオアート結合を含む、態様1〜19のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
22  FまたはF’などのフランク領域のうちの少なくとも1つが、少なくとも2個の態様1〜19のいずれか1つで定義される式(IA)または(IB)のホスホロジチオアート結合を含む、態様1〜21のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
23  両方のフランク領域、すなわちFおよびF’が、少なくとも2個の態様1〜19のいずれか1つで定義される式(IA)または(IB)のホスホロジチオアート結合を含む、態様1〜21のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
24  フランク領域の一方または両方が、LNAを3’ヌクレオシドに連結する式(IA)または(IB)のホスホロジチオアート結合を有するLNAヌクレオシドをそれぞれ含む、態様1〜23のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
25  一方または両方のフランク領域が、LNAを3’ヌクレオシドに連結する式(IA)または(IB)のホスホロジチオアート結合によって連結されている2個またはそれより多い隣接LNAヌクレオシドをそれぞれ含む、態様1〜24のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
26  フランク領域の一方または両方が、MOEを3’ヌクレオシドに連結する式(IA)または(IB)のホスホロジチオアート結合を有するMOEヌクレオシドをそれぞれ含む、態様1〜25のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
27  一方または両方のフランク領域が、MOEを3’ヌクレオシドに連結する式(IA)または(IB)のホスホロジチオアート結合によって連結されている2個またはそれより多い隣接MOEヌクレオシドをそれぞれ含む、態様1〜26のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
28  フランク領域FおよびF’が一緒に、1個、2個、3個、4個、または5個の式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ任意で、領域Fの最も3'側のヌクレオシドと領域Gの最も5'側のヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合もまた、式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜27のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
29  領域Fもしくは領域F’中の隣接ヌクレオシド間、領域Fと領域Gの間、または領域Gと領域F’の間に位置する1個の式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む、態様1〜28のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
30  ギャップ領域が、1個、2個、3個、または4個の式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、残りのヌクレオシド間結合がホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜29のいずれか1つに記載のギャップマー領域。
31  ギャップ領域が、少なくとも5個の連続DNAヌクレオチドの領域、例えば、6〜18個の連続DNAヌクレオチドまたは8〜14個の連続DNAヌクレオチドの領域を含む、態様1〜30のいずれか1つに記載のギャップマー。
32  1個または複数の立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合(Sp、S)または(Rp、R)
2021508327.tif 000032
(式中、N1およびN2は、ヌクレオシドである)をさらに含む、態様1〜31のいずれか1つに記載のギャップマー。
33  2個のDNAヌクレオシドの間、例えば、ギャップ領域中の2個のDNAヌクレオシドの間に、少なくとも1個の立体定義されたヌクレオシド間結合(Sp、S)または(Rp、R)を含む、態様32記載のギャップマー。
34  ギャップ領域が、Rpヌクレオシド間結合およびSpヌクレオシド間結合より独立に選択される2個、3個、4個、5個、6個、7個、または8個の立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む、態様32または33記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
35  領域Gが、少なくとも2個、3個、または4個の式IBのヌクレオシド間結合をさらに含む、態様32または33記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
34  (i)領域G内の(すなわち、領域G中のヌクレオシド間の)残りのヌクレオシド間結合すべてが、Rpヌクレオシド間結合およびSpヌクレオシド間結合より独立に選択される、いずれかの立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合であるか、または(ii)領域G内のすべてのヌクレオシド間結合が、Rpヌクレオシド間結合およびSpヌクレオシド間結合より独立に選択される、いずれかの立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様32〜35記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
35  フランク領域内のヌクレオシド間結合のすべてが、式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合であり、任意で、領域Fの最も3'側のヌクレオシドと領域Gの最も5'側のヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合もまた、式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合であり、かつ領域Gの最も3'側のヌクレオシドと領域F’の最も5'側のヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜34のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
36  領域Gのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および態様1で定義される式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択される、態様6〜35のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
37  領域Gのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、0個、1個、2個、または3個の態様1で定義される式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合、特に、0個の式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む、態様7〜36のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
38  残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合、リン酸ジエステルヌクレオシド間結合、および態様1で定義される式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合からなる群より独立に選択される、態様1〜37のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
39  領域Fのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合および領域F’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および態様1で定義される式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択される、態様7〜38のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
40  各隣接領域FおよびF’が、1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個の態様1で定義される式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を独立に含む、態様7〜39のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
41  隣接領域Fおよび/またはF’のヌクレオシド間結合のすべてが、態様1で定義される式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、態様7〜40のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
42  少なくとも1個の立体定義されたヌクレオシド間結合、例えば、少なくとも1個の立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む、態様1〜41のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
43  ギャップ領域が、1個、2個、3個、4個、または5個の立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む、態様1〜42のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
44  ギャップ領域のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合のすべてが、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜43のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
45  式(IA)または(IB)の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合が、領域Fのヌクレオシド間、領域F’のヌクレオシド間、領域Fと領域Gの間、または領域Gと領域F’の間に位置し、かつ領域FおよびF’の内部、領域Fと領域Gの間、および領域Gと領域F’の間の残りのヌクレオシド間結合が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合、立体的にランダムなヌクレオシド間結合、式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合、およびリン酸ジエステルヌクレオシド間結合より独立に選択される、態様7〜44のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
46  領域F内、領域F’内、または領域Fおよび領域F’の両方の内部の残りのヌクレオシド間結合が、すべて式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、態様45記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
47  領域Gのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、0個、1個、2個、または3個の態様1で定義される式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ領域G内の残りのヌクレオシド間結合が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合、立体的にランダムなヌクレオシド間結合、およびリン酸ジエステルヌクレオシド間結合より独立に選択される、態様6〜33のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
48  アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドまたは2’-O-MOEヌクレオシドである、態様1〜47のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
49  アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドまたは2’-O-MOEヌクレオシドである、態様1〜48のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
50  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も3'側の2個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドおよび2’-O-MOEヌクレオシドより独立に選択される、態様1〜49のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
51  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も5'側の2個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドおよび2’-O-MOEヌクレオシドより独立に選択される、態様1〜50のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
52  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も3'側の3個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドおよび2’-O-MOEヌクレオシドより独立に選択される、態様1〜51のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
53  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も5'側の3個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドおよび2’-O-MOEヌクレオシドより独立に選択される、態様1〜52のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
54  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も3'側の2個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドである、態様1〜53のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
55  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も5'側の2個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドである、態様1〜54のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
56  式(IA)または(IB)のヌクレオシド(A2)が、オリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシドである、態様1〜55のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
57  式(IA)または(IB)のヌクレオシド(A1)が、オリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレオシドである、態様1〜56のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
58  式5’-D’-F-G-F’-D’’-3’(式中、F、G、およびF’は、態様7〜45のいずれか1つで定義されるとおりであり、かつ領域D’およびD’’は、それぞれ独立に、0〜5個のヌクレオチド、特に2個、3個、または4個のヌクレオチド、特にDNAヌクレオチド、例えばリン酸ジエステル結合DNAヌクレオシドからなる)の連続ヌクレオチド配列を含む[ギャップマーオリゴヌクレオチドおよび隣接配列を含む、オリゴヌクレオチド]、態様7〜57のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド 。
59  ヒトRNアーゼH1を動員することができる、態様1〜58のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
60  哺乳動物、例えばヒトのmRNAもしくはmRNA前駆体標的、ウイルス標的、または長い非コーディングRNAのインビトロ阻害またはインビボ阻害のためのものである、態様1〜59のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド。
61  態様1〜60のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩、特に、ナトリウム塩またはカリウム塩。
62  態様1〜61のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容される塩と、該オリゴヌクレオチドまたは該薬学的に許容される塩に任意でリンカー部分を介して共有結合的に結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
63  態様1〜62のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート、および治療的に不活性な担体を含む、薬学的組成物。
64  治療的に活性な物質として使用するための、態様1〜63のいずれか1つに記載のギャップマーオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート。
【０２９６】
アンチセンスオリゴヌクレオチドの態様
本発明は、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000033
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドに関する。
【０２９７】
言い換えると、Mは、金属、例えばアルカリ金属、例えばNaもしくはKであるか、またはMは、NH4である。
【０２９８】
例えば、オリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば標的マイクロRNAの発現を調節することができるか、または標的mRNA前駆体のスプライシングを調節することができ、連続ヌクレオチド配列を含む、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであってよい。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、標的核酸に相補的であり、かつ標的核酸にハイブリダイズし、その発現を調節することができる連続ヌクレオチド配列を含む。好ましい態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列は、(A1)もしくは(A2)のいずれかがDNAヌクレオシドであるか、または(A1)および(A2)の両方がDNAヌクレオシドである、ミクスマーオリゴヌクレオチドである。
【０２９９】
本発明において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、核酸標的、例えば標的RNAに相補的であり、かつ該核酸標的(例えば、mRNA標的、mRNA前駆体標的、ウイルスRNA標的、もしくは長い非コーディングRNA標的)の発現を調節(例えば、mRNA前駆体標的のスプライス調節)または阻害することができる、一本鎖オリゴヌクレオチドである。標的に応じて、相補的である(すなわち、アンチセンス―好ましくは、相補的領域は、標的に対して完全に相補的である)オリゴヌクレオチドの長さまたはその領域の長さは、7〜30ヌクレオチドであってよい(連続ヌクレオチド配列と呼ばれる領域)。例えば、マイクロRNAのLNAヌクレオチド阻害剤は、7個の連続した相補的ヌクレオチドくらいの短さでもよく(30ヌクレオチドくらいの長さでもよく)、RNアーゼHを動員するオリゴヌクレオチドは、典型的には、少なくとも12個の連続した相補的ヌクレオチドの長さ、例えば12〜26ヌクレオチド長である。スプライス調節アンチセンスオリゴヌクレオチドは、典型的には、10〜30個の相補的ヌクレオチドからなる連続ヌクレオチド領域を有する。
【０３００】
スプライススイッチングオリゴヌクレオチド(SSO)としても公知のスプライス調節オリゴヌクレオチドは、mRNA前駆体と塩基対合し、RNA-RNA塩基対合またはスプライシング機構の構成要素とmRNA前駆体の間で起こるタンパク質-RNA結合相互作用を妨害することによって転写物の正常なスプライシングレパートリーを混乱させる、短い合成のアンチセンス修飾核酸である。mRNA前駆体のスプライシングは、圧倒的多数のタンパク質コード遺伝子の適切な発現に必要とされ、したがって、このプロセスを標的とすることにより、遺伝子からのタンパク質産生を操作する手段が与えられる。スプライシング調節は、正常なスプライシングの混乱を招く変異に起因する疾患の場合に、または遺伝子転写物の正常なスプライシングプロセスの邪魔をすることが治療に役立つ可能性がある場合に、特に有益である。SSOは、治療的にスプライシングを標的とし変更するための有効かつ特異的な方法を与える。Haven’s and Hasting NAR (2016) 44, 6549-6563を参照されたい。SSOは、標的mRNA前駆体のエクソン/イントロン境界に相補的であってもよく、またはmRNA前駆体のスプライシングを制御する、mRNA前駆体内部のスプライシングの促進エレメントまたはサイレンサーエレメント(まとめて、シス作用性スプライスエレメントと呼ばれる)を標的としてもよい。スプライス調節は、エクソンスキッピングまたはエクソンインクルージョンをもたらす場合があり、それによって、mRNA前駆体の選択的スプライシングが調節される。SSOは、ヌクレアーゼを媒介とせずに標的mRNA前駆体を調節することによって機能し、したがって、RNアーゼHを動員することができず、これらは多くの場合、完全な修飾オリゴヌクレオチド、すなわち、各ヌクレオシドが、2’糖を置換された糖部分のような修飾糖部分を含むもの(例えば、ホスホロチオアート骨格に基づいて、例えば15〜25ヌクレオチド長、しばしば18〜22もしくは20ヌクレオチド長の、完全な2’-O-MOEオリゴヌクレオチド)であるか、またはLNAミクスマーオリゴヌクレオチド(DNAヌクレオシドおよびLNAヌクレオシド、ならびに任意で2’-O-MOEのような他の2’糖修飾ヌクレオシドを含む、10〜30ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチド)のいずれかである。DNAヌクレオシドを含まないがLNAヌクレオシドおよび他の2’糖修飾ヌクレオシド、例えば2’-O-MOEヌクレオシドを含む、LNAオリゴヌクレオチドもまた、想定される。参照により本明細書に組み入れられるHaven’s and Hasting NAR (2016) 44, 6549-6563の表1は、一連のSSO標的、および報告されている活性をインビボで有する使用オリゴヌクレオチドの化学的性質を示しており、これを下記の表Aに再掲する。
【０３０１】
（表Ａ）
2021508327.tif 000034
2021508327.tif 000035
2021508327.tif 000036
2021508327.tif 000037
2021508327.tif 000038
【０３０２】
本発明のいくつかの態様において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、HBB、FKTN、LMNA、CEP290、CLCN1、USH1C、BTK、LRP8、CTLA4、BCL2L1、ERBB4、MDM4、STAT3、IL1RAP、TNFRSF1B、FLT1、KDR、SMN2、MYBPC3、TTN、DMD、NBN、IL10、HTT、APOB、MSTN、GYS2、およびATXN3からなる群より選択されるmRNA前駆体に相補的である、スプライス調節オリゴヌクレオチドである。本発明のSSOを用いて治療できる例示的な疾患を、個々の標的別に、表Aに示す。
【０３０３】
下記の態様は、全体として、本発明の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、および特に、スプライス調節アンチセンスオリゴヌクレオチド(SSO)に関する。
1  細胞においてRNA標的を調節するための一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、10〜30ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、該連続ヌクレオチド配列が、1つまたは複数の2’糖修飾ヌクレオシドを含み、かつ該連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間に存在するヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個が、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000039
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつRは、水素またはリン酸保護基である)のホスホロジチオアート結合である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
2  2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個が2’糖修飾ヌクレオシドである、態様1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
3  ヌクレオシド(A1)および(A2)の両方が2’糖修飾ヌクレオシドである、態様1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
4  2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個、またはヌクレオシド(A1)および(A2)の両方が、DNAヌクレオシドである、態様1〜3のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5  (A1)および(A2)のうちの少なくとも1つが2’糖修飾ヌクレオシドであるか、またはヌクレオシドが、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシアルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-RNAヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、もしくはLNAヌクレオシドより独立に選択される、態様1〜4のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6  (A1)および(A2)のうちの少なくとも1つがLNAヌクレオシドである、態様1〜5のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
7  (A1)および(A2)の両方がLNAヌクレオシドである、態様1〜5のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
8  (A1)および(A2)のうちの少なくとも1つが2’-O-メトキシエチルヌクレオシドである、態様1〜6のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
9  (A1)および(A2)の両方が2’-O-メトキシエチルヌクレオシドである、態様1〜5のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
10  LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAからなる群より選択される、態様1〜8のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
11  LNAヌクレオシドがβ-D-オキシLNAである、態様1〜8のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
12  連続ヌクレオチド配列が、1つまたは複数のさらなる2’糖修飾ヌクレオシド、例えば、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシアルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-RNAヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、またはLNAヌクレオシドからなる群より選択される1つまたは複数のさらなる2’糖修飾ヌクレオシドを含む、態様1〜11のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
13  連続ヌクレオチド配列が、LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドの両方を含む、態様1〜12のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
14  連続ヌクレオチド配列が、LNAヌクレオシドおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドの両方を含む、態様1〜12のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
15  連続ヌクレオチド配列が、LNAヌクレオシドおよび2’フルオロRNAヌクレオシドの両方を含む、態様1〜13のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
16  連続ヌクレオチド配列が、以下のいずれかを含む、態様1〜13のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド
(i)LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドのみ
(ii)LNAヌクレオシドおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドのみ
(iii)LNAヌクレオシド、DNAヌクレオシド、および2’-O-メトキシエチルヌクレオシドのみ
(iv)LNAヌクレオシド、2’フルオロRNAヌクレオシド、および2’-O-メトキシエチルヌクレオシドのみ
(v)LNAヌクレオシド、DNAヌクレオシド、2’フルオロRNAヌクレオシド、および2’-O-メトキシエチルヌクレオシドのみ、またはLNAヌクレオシド、2’フルオロRNAヌクレオシド、および2’-O-メトキシエチルヌクレオシドのみ
(vi)2’-O-メトキシエチルヌクレオシドのみ。
17  連続ヌクレオチド配列が、4個もしくはそれより多い連続DNAヌクレオシドの配列を含まないか、または3個もしくはそれより多い連続DNAヌクレオシドの配列を含まない、態様1〜16のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
18  アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、ミクスマーオリゴヌクレオチドまたはトータルマーオリゴヌクレオチドである、態様1〜17のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
19  ヒトRNアーゼH1を動員することができない、態様1〜18のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
20  ヌクレオシド(A2)が、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の3’末端ヌクレオシドである、態様1〜19のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
21  ヌクレオシド(A1)が、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の5’末端ヌクレオシドである、態様1〜20のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
22  少なくとも2個の式Iのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合、例えば、2個、3個、4個、5個、または6個の式Iのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む、態様1〜21のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
23  連続ヌクレオチド配列の最も3'側の2個のヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合が、式Iのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合であり、かつ連続ヌクレオチド配列の最も5'側の2個のヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合が、式Iのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜22のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
24  ホスホロチオアートヌクレオシド間結合をさらに含む、態様1〜23のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
25  立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合をさらに含む、態様1〜24のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
26  残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合、およびリン酸ジエステルヌクレオシド間結合からなる群より独立に選択される、態様1〜25のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
27  残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜26のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
28  連続ヌクレオチド配列が、哺乳動物のmRNA前駆体、哺乳動物の成熟mRNA標的、ウイルスRNA標的、または哺乳動物の長い非コーディングRNAに相補的、例えば100％相補的である、態様1〜27のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
29  RNA標的がヒトRNA標的である、態様28のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
30  哺乳動物、例えばヒトのmRNA前駆体標的のスプライシングを調節する、例えば、スプライススキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはスプライシング調節アンチセンスオリゴヌクレオチドである、態様1〜29のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
31  ヒトmRNA前駆体のイントロン/エクソンスプライス部位、またはヒトmRNA前駆体のスプライス調節領域に相補的、例えば100％相補的である、態様1〜30のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
32  アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、TNFR2、HBB、FKTN、LMNA、CEP290、CLCN1、USH1C、BTK、LRP8、CTLA4、BCL2L1、ERBB4、MDM4、STAT3、IL1RAP、TNFRSF1B、FLT1、KDR、SMN2、MYBPC3、TTN、DMD、NBN、IL10、HTT、APOB、MSTN、GYS2、およびATXN3からなる群より選択されるヒトmRNA前駆体配列に相補的、例えば完全に相補的である、態様1〜30のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
33  SSO#1〜SSO#25からなる群より選択される連続ヌクレオチド配列からなるか、またはそれを含む、態様1〜32のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
34  細胞がヒト細胞である、態様1〜33のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
35  アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さが10〜30ヌクレオチド長である、態様1〜34のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
36  アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さが12〜24ヌクレオチド長である、態様1〜34のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
37  アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは該アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の3’末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドまたは2-O-メトキシエチルヌクレオシドのいずれかである、態様1〜36のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
38  アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の5'末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドまたは2-O-メトキシエチルヌクレオシドのいずれかである、態様1〜27のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
39  アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の5'末端ヌクレオシドおよび3’末端ヌクレオシドが、どちらもLNAヌクレオシドである、態様1〜38のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
40  連続ヌクレオチド配列が、2個もしくは3個のLNA連続ヌクレオチドからなる少なくとも1つの領域および/または2個もしくは3個の連続した2’-O-メトキシエチル連続ヌクレオチドからなる少なくとも1つの領域を含む、態様1〜39のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
41  態様1〜40のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩、特に、ナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩。
42  態様1〜41のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容される塩と、該オリゴヌクレオチドまたは該薬学的に許容される塩に任意でリンカー部分を介して共有結合的に結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
43  態様1〜42のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート、および治療的に不活性な担体を含む、薬学的組成物。
44  治療的に活性な物質として使用するための、態様1〜43のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート。
45  標的RNAを発現している細胞において該標的RNAを調節するための方法であって、態様1〜44のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、コンジュゲート、または組成物の有効量を該細胞に投与する段階を含む、方法。
46  標的mRNA前駆体を発現している細胞において標的RNA前駆体のスプライシングを調節するための方法であって、態様1〜44のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、コンジュゲート、または組成物の有効量を該細胞に投与する段階を含む、方法。
47  インビトロの方法またはインビボの方法である、態様45または46記載の方法。
48  使用がインビトロまたはインビボである、細胞、例えばヒト細胞においてRNAを阻害するための、態様1〜44のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的塩、コンジュゲート、または組成物の使用。
【０３０４】
ミクスマーの特定の態様
1  細胞においてRNA標的を調節するための一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドが、10〜30ヌクレオチド長の連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなり、該連続ヌクレオチド配列が、2’糖修飾ヌクレオシドからなる交互の領域を含み、該連続ヌクレオチド配列を有する連続DNAヌクレオシドの最大長が3個または4個であり、かつ該連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間に存在するヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個が、式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000040
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつRは、水素またはリン酸保護基である)のホスホロジチオアート結合である、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
2  2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個が、2’糖修飾ヌクレオシドである、態様1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
3  ヌクレオシド(A1)および(A2)の両方が2’糖修飾ヌクレオシドである、態様1記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
4  2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個、またはヌクレオシド(A1)および(A2)の両方が、DNAヌクレオシドである、態様1〜3のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5  (A1)および(A2)のうちの少なくとも1つが2’糖修飾ヌクレオシドであるか、またはヌクレオシドが、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシアルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-RNAヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、もしくはLNAヌクレオシドより独立に選択される、態様1〜4のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6  (A1)および(A2)のうちの少なくとも1つがLNAヌクレオシドである、態様1〜5のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
7  (A1)および(A2)の両方がLNAヌクレオシドである、態様1〜5のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
8  (A1)および(A2)のうちの少なくとも1つが2’-O-メトキシエチルヌクレオシドである、態様1〜6のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
9  (A1)および(A2)の両方が2’-O-メトキシエチルヌクレオシドである、態様1〜5のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
10  LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAからなる群より選択される、態様1〜8のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
11  LNAヌクレオシドがβ-D-オキシLNAである、態様1〜8のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
12  連続ヌクレオチド配列が、1つまたは複数のさらなる2’糖修飾ヌクレオシド、例えば、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシアルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-RNAヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、またはLNAヌクレオシドからなる群より選択される1つまたは複数のさらなる2’糖修飾ヌクレオシドを含む、態様1〜11のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
13  連続ヌクレオチド配列が、LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドの両方を含む、態様1〜12のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
14  連続ヌクレオチド配列が、LNAヌクレオシドおよび2’-O-メトキシエチルヌクレオシドの両方を含む、態様1〜12のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
15  連続ヌクレオチド配列が、LNAヌクレオシドおよび2’フルオロRNAヌクレオシドの両方を含む、態様1〜13のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
16  連続ヌクレオチド配列が、以下のいずれかを含む、態様1〜13のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド
(i)LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシド
(ii)LNAヌクレオシド、DNAヌクレオシド、および2’-O-メトキシエチルヌクレオシド
(iii)LNAヌクレオシド、DNAヌクレオシド、2’フルオロRNAヌクレオシド、および2’-O-メトキシエチルヌクレオシド。
17  連続ヌクレオチド配列が、3個もしくはそれより多い連続DNAヌクレオシドの配列を含まないか、または2個もしくはそれより多い連続DNAヌクレオシドの配列を含まない、態様1〜16のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
18  アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、ミクスマーオリゴヌクレオチド、例えば、スプライス調節オリゴヌクレオチドまたはマイクロRNA阻害剤オリゴヌクレオチドである、態様1〜17のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
19  ミクスマーが、交互の領域モチーフ
2021508327.tif 000041
(式中、Lは2’糖修飾ヌクレオシドを表し、DはDNAヌクレオシドを表し、かつ各mは、1〜6より独立に選択され、各nは、1、2、3および4、例えば1〜3より独立に選択される)からなるかまたはそれを含む、態様18に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
20  各Lヌクレオシドが、LNAヌクレオシド、2’-O-MOEヌクレオシド、もしくは2’フルオロヌクレオシドからなる群より独立に選択されるか、または各Lが、独立にLNAもしくは2’-O-MOEである、態様19に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
21  各LがLNAである、態様20記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
22ヒトRNアーゼH1を動員することができない、態様1〜21のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
23  ヌクレオシド(A2)が、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の3’末端ヌクレオシドである、態様1〜22のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
24  ヌクレオシド(A1)が、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列の5’末端ヌクレオシドである、態様1〜23のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
25  少なくとも2個の式Iのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合、例えば、2個、3個、4個、5個、または6個の式Iのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む、態様1〜24のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
26  連続ヌクレオチド配列が、2個の連続DNAヌクレオチドの間のヌクレオシド結合が式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である2個の連続DNAヌクレオチド、すなわちP2S結合DNAヌクレオチド対を含む、態様1〜25のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
27  連続ヌクレオチド配列が、複数のP2S結合DNAヌクレオチド対を含む、態様1〜26のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド
28  連続ヌクレオチド配列中に存在する2個の連続DNAヌクレオチドの間のすべてのヌクレオシド結合が、式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜26のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
29  2’糖修飾ヌクレオシドとDNAヌクレオシドの間の少なくとも1個のヌクレオシド間結合が、式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜27のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
30  2’糖修飾ヌクレオシドとDNAヌクレオシドの間の複数のヌクレオシド間結合が、式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜27のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
31  2’糖修飾ヌクレオシドとDNAヌクレオシドの間のすべてのヌクレオシド間結合が、式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜27のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
32  2個の2’糖修飾ヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個が、式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合ではなく、例えばホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜27のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
33  2個の2’糖修飾ヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合のすべてが、式(IA)または(IB)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合ではなく、例えばホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜27のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
34  連続ヌクレオチド配列の最も3'側の2個のヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合が、式Iのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合であり、かつ連続ヌクレオチド配列の最も5'側の2個のヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合が、式Iのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜33のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
35  ホスホロチオアートヌクレオシド間結合をさらに含む、態様1〜34のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
36  立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合をさらに含む、態様1〜35のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
37  残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合、およびリン酸ジエステルヌクレオシド間結合からなる群より独立に選択される、態様1〜35のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
38  残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜36のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
39  連続ヌクレオチド配列が、哺乳動物、例えばヒトのmRNA前駆体に相補的、例えば100％相補的である、態様1〜37のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
40  哺乳動物、例えばヒトのmRNA前駆体標的のスプライシングを調節する、例えば、スプライススキッピングアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはスプライス調節アンチセンスオリゴヌクレオチドである、態様1〜38のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
41  ヒトmRNA前駆体のイントロン/エクソンスプライス部位、またはヒトmRNA前駆体のスプライス調節領域に相補的、例えば100％相補的である、態様1〜39のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
42  アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、TNFR2、HBB、FKTN、LMNA、CEP290、CLCN1、USH1C、BTK、LRP8、CTLA4、BCL2L1、ERBB4、MDM4、STAT3、IL1RAP、TNFRSF1B、FLT1、KDR、SMN2、MYBPC3、TTN、DMD、NBN、IL10、HTT、APOB、MSTN、GYS2、およびATXN3からなる群より選択されるヒトmRNA前駆体配列に相補的、例えば完全に相補的である、態様1〜41のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
43  SSO#1〜SSO#25からなる群より選択される連続ヌクレオチド配列からなるか、またはそれを含む、態様1〜42のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
44  細胞が哺乳動物細胞である、態様1〜43のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
45  アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さが10〜30ヌクレオチド長である、態様1〜44のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
46  アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さが12〜24ヌクレオチド長である、態様1〜44のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
47  アンチセンスオリゴヌクレオチドもしくは該アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の3’末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドまたは2-O-メトキシエチルヌクレオシドのいずれかである、態様1〜46のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
48  アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の5'末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドまたは2-O-メトキシエチルヌクレオシドのいずれかである、態様1〜47のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
49  アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列の5'末端ヌクレオシドおよび3’末端ヌクレオシドが、どちらもLNAヌクレオシドである、態様1〜48のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
50  連続ヌクレオチド配列が、2個もしくは3個のLNA連続ヌクレオチドからなる少なくとも1つの領域および/または2個もしくは3個の連続した2’-O-メトキシエチル連続ヌクレオチドからなる少なくとも1つの領域を含む、態様1〜49のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
51  態様1〜50のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩、特に、ナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩。
52  態様1〜51のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容される塩と、該オリゴヌクレオチドまたは該薬学的に許容される塩に任意でリンカー部分を介して共有結合的に結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
53  態様1〜52のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート、および治療的に不活性な担体を含む、薬学的組成物。
54  治療的に活性な物質として使用するための、態様1〜53のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート。
55  標的RNAを発現している細胞において該RNAを調節するための方法であって、態様1〜54のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、コンジュゲート、または組成物の有効量を該細胞に投与する段階を含む、方法。
56  標的mRNA前駆体を発現している細胞において標的RNA前駆体のスプライシングを調節するための方法であって、態様1〜54のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、コンジュゲート、または組成物の有効量を該細胞に投与する段階を含む、方法。
57  インビトロの方法またはインビボの方法である、態様55または56記載の方法。
58  使用がインビトロまたはインビボである、細胞、例えば哺乳動物細胞においてRNAを阻害するための、態様1〜54のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的塩、コンジュゲート、または組成物の使用。
【０３０５】
3'末端保護に関する特定の態様
1  式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000042
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンであり、かつ2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個は、2’糖修飾ヌクレオシド、例えば、LNAヌクレオシドまたは2’-O-MOEヌクレオシドであり、Rは水素またはリン酸保護基であり、A2はオリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシドである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
2  (A2)がLNAヌクレオシドであるか、または(A1)および(A2)の両方がLNAヌクレオシドである、態様1記載の一本鎖アンチセンス。
3  (A2)がLNAヌクレオシドであり、かつ(A1)が糖修飾ヌクレオチドである、態様1記載の一本鎖アンチセンス。
4  (A2)がLNAヌクレオシドであり、かつ(A1)がDNAヌクレオチドである、態様1記載の一本鎖アンチセンスド。
5  (A1)がLNAヌクレオシドであり、かつ(A2)が糖修飾ヌクレオチドである、態様1記載の一本鎖アンチセンス。
6  (A1)がLNAヌクレオシドであり、かつ(A2)がDNAヌクレオチドである、態様1記載の一本鎖アンチセンス。
7  糖修飾ヌクレオシドが2’糖修飾ヌクレオシドである、態様3または5記載の一本鎖アンチセンス。
8  2’糖修飾ヌクレオシドが、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシアルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-RNAヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、またはLNAヌクレオシドである、態様7記載の一本鎖アンチセンス。
9  2’糖修飾ヌクレオシドが2’-O-メトキシエチルヌクレオシドである、態様7または8記載の一本鎖アンチセンス。
10  LNAヌクレオシドまたはLNAヌクレオチドが、β-D-配置で存在する、態様1〜9のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンス。
11  LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAより独立に選択される、態様1〜10のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンス。
12  LNAがβ-D-オキシLNAである、態様1〜11のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンス。
13  標的核酸、例えば、mRNA前駆体、およびmRNA、マイクロRNA、ウイルスRNA、ならびに長い非コーディングRNAからなる群より選択される標的核酸に相補的である7〜30個の連続ヌクレオチド(アンチセンス一本鎖アンチセンスの連続ヌクレオチド配列と呼ばれる)からなるか、またはそれを含む、態様1〜12のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンス。
14  連続ヌクレオチド配列が、式5’-F-G-F’-3’(式中、Gは、RNアーゼHを動員することができる5〜18個のヌクレオシドの領域であり、領域Gの5'および3'にそれぞれ隣接領域FおよびF’が隣接し、領域FおよびF’は、1〜7個の2’糖修飾ヌクレオチドを独立に含むか、またはそれらからなり、領域Gに隣接している領域Fのヌクレオシドは2’糖修飾ヌクレオシドであり、領域Gに隣接している領域F'のヌクレオシドは2’糖修飾ヌクレオシドである)のギャップマー領域を含む、態様1〜13のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンス。
14  連続ヌクレオチド配列がミクスマーオリゴヌクレオチドであり、該ミクスマーオリゴヌクレオチドが、LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドの両方、ならびに任意で2’糖修飾ヌクレオシド(例えば、態様8または9に記載のもの)を含み、一本鎖アンチセンスが、4個またはそれより多い連続DNAヌクレオシドからなる領域を含まない、態様1〜13のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンス。
15  連続ヌクレオチド配列が糖修飾ヌクレオシドのみを含む、態様1〜13のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンス。
16  (mRNA前駆体スプライス事象のスプライシングを調節することができる)スプライス調節オリゴヌクレオチドである、態様14または15記載のオリゴヌクレオチド。
17  マイクロRNAに相補的である、例えばマイクロRNA阻害剤である、態様14または15記載のオリゴヌクレオチド。
18  リン酸ジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合、およびホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含むか、またはオリゴヌクレオチド内もしくはその連続ヌクレオチド配列内のさらなるヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合およびホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択される、態様1〜17のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
18  オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列のさらなるヌクレオシド間結合がすべて、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜18のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
19  オリゴヌクレオチドが、連続ヌクレオチド配列に対して5'の位置の5'領域を含み、5’ヌクレオシド領域が、少なくとも1個のリン酸ジエステル結合を含む、態様1〜18のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
20  5'領域が1〜5個のリン酸ジエステル結合DNAヌクレオシドを含み、任意で、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分に連結してよい、態様19記載のオリゴヌクレオチド。
21  1つまたは複数のヌクレオシドが、核酸塩基修飾ヌクレオシドである、態様1〜20のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
22  1つまたは複数のヌクレオシドが5-メチルシトシン、例えば、LNA 5-メチルシトシンまたはDNA 5-メチルシトシンである、態様1〜21のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド。
23  態様1〜22のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩、特に、ナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩。
24  態様1〜23のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容される塩と、該オリゴヌクレオチドまたは該薬学的に許容される塩に任意でリンカー部分を介して共有結合的に結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
25  態様1〜24のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート、および治療的に不活性な担体を含む、薬学的組成物。
26  治療的に活性な物質として使用するための、態様1〜25のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート。
27  静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、またはくも膜下腔内投与などの非経口投与によって対象に投与するために、治療法において使用するための、態様1〜24のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート。
【０３０６】
アキラルなホスホロジチオアート結合および立体定義されたホスホロチオアート結合を有するオリゴヌクレオチドに関する態様
1  式(IA)または(IB)
2021508327.tif 000043
(式中、2個の酸素原子のうちの一方は、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方は、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ(IA)の式中、Rは、水素またはリン酸保護基であり、かつ(IB)の式中、M+は、陽イオン、例えば金属陽イオン、例えばアルカリ金属陽イオン、例えばNa+陽イオンもしくはK+陽イオンであるか、またはM+は、アンモニウム陽イオンである)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ少なくとも1個の立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合(Sp、S)または(Rp、R)
2021508327.tif 000044
(N1およびN2はヌクレオシドである)(注意：いくつかの非限定的な態様において、N1および/またはN2はDNAヌクレオチドである)をさらに含む、
一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
2  A2が、オリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシドである、態様1記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
3  A1が、オリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレオシドである、態様1記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
4  1個、2個、3個、4個、5個、または6個の式IBのヌクレオシド間結合を含む、態様1〜3のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
5  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も5'側のヌクレオシド間結合と該アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も3'側のヌクレオシド間結合の両方が、式IBのヌクレオシド間結合である、態様1〜4のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
6  式IBのヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個において、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個が、2’糖修飾ヌクレオシド、例えば、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシアルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-RNAヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、およびLNAヌクレオシドからなる群より選択される2’糖修飾ヌクレオシドである、態様1〜5のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
7  式IBのヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個において、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個がLNAヌクレオシドである、態様1〜6のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
8  式IBのヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個において、2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個が2’-O-MOEヌクレオシドである、態様1〜6のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
9  アンチセンスオリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドまたは2’-O-MOEヌクレオシドである、態様1〜8のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
10  アンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドまたは2’-O-MOEヌクレオシドである、態様1〜9のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
11  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も3'側の2個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドおよび2’-O-MOEヌクレオシドより独立に選択される、態様1〜10のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
12  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も5'側の2個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドおよび2’-O-MOEヌクレオシドより独立に選択される、態様1〜11のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
13  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も3'側の3個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドおよび2’-O-MOEヌクレオシドより独立に選択される、態様1〜12のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
14  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も5'側の3個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドおよび2’-O-MOEヌクレオシドより独立に選択される、態様1〜13のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
15  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も3'側の2個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドである、態様1〜14のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
16  アンチセンスオリゴヌクレオチドの最も5'側の2個の末端ヌクレオシドが、LNAヌクレオシドである、態様1〜15のいずれか1つに記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
17  アンチセンスオリゴヌクレオチドが、2〜16個のDNAヌクレオチドからなる領域をさらに含み、該DNAヌクレオチド間のヌクレオシド間結合が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜16のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
18  LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAより独立に選択される、態様1〜17のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
19  LNAヌクレオシドがβ-D-オキシLNAである、態様1〜17のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
20  標的核酸、例えば、mRNA前駆体、およびmRNA、マイクロRNA、ウイルスRNA、ならびに長い非コーディングRNAからなる群より選択される標的核酸に相補的、例えば完全に相補的である7〜30個の連続ヌクレオチド(アンチセンスオリゴヌクレオチド)からなるか、またはそれを含む、態様1〜19のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
21  RNA標的を調節することができる、態様1〜20のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
22  例えばRNアーゼH1動員によってRNA標的を阻害することができる、態様1〜20のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
23  オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列が、式5’-F-G-F’-3’(式中、Gは、RNアーゼH1を動員することができる5〜18個のヌクレオシドの領域であり、領域Gの5'および3'にそれぞれ隣接領域FおよびF’が隣接し、領域FおよびF’は、1〜7個の2’糖修飾ヌクレオチドを独立に含むか、またはそれらからなり、領域Gに隣接している領域Fのヌクレオシドは2’糖修飾ヌクレオシドであり、領域Gに隣接している領域F'のヌクレオシドは2’糖修飾ヌクレオシドである)のギャップマー領域を含む、態様1〜22のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
24  領域Fまたは領域F’が、態様1〜19のいずれか1つに記載の式IBのヌクレオシド間結合を含む、態様23記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
25  領域FおよびF’の両方が、態様1〜19のいずれか1つに記載の式IBのヌクレオシド間結合を含む、態様24記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
26  領域Fおよび/またはF’内のすべてのヌクレオシド間結合が、態様1〜19のいずれか1つに記載の式IBのヌクレオシド間結合である、態様23〜25記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
27  領域FおよびF’が両方とも、LNAヌクレオシドを含むか、またはそれからなる、態様23〜26記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
28  領域FおよびF’が両方とも、MOEヌクレオシドを含むか、またはそれからなる、態様23〜27記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
29  領域FがLNAヌクレオシドを含み、かつ領域F’がMOEヌクレオシドを含むかまたはそれからなる、態様23〜28記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
30  領域Gが、領域Fの最も3'側のヌクレオシドと領域Gの最も5'側のヌクレオシドの間に位置する少なくとも1個の式IBのヌクレオシド間結合をさらに含む、態様23〜29記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
31  領域Gが、2個のDNAヌクレオシドの間に位置する少なくとも1個の立体定義されたホスホロチオアート結合を含む、態様23〜30記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
32  領域Gが、2個のDNAヌクレオシドの間に位置する少なくとも1個の式IBのヌクレオシド間結合を含む、態様23〜31記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
33  領域Gが、式IBのヌクレオシド間結合を少なくとも2個、3個、または4個、さらに含む、態様23〜32記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
34  領域G内の残りのすべてのヌクレオシド間結合が、Rpヌクレオシド間結合およびSpヌクレオシド間結合より独立に選択される立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様23〜31記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
35  任意で、領域Fの最も3'側のヌクレオシドと領域Gの最も5'側のヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合以外の、領域G内のすべてのヌクレオシド間結合が、Rpヌクレオシド間結合およびSpヌクレオシド間結合より独立に選択される立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様23〜31記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
36  4個未満の連続DNAヌクレオチドを含む、態様1〜22のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
37  ミクスマーオリゴヌクレオチドまたはトータルマーオリゴヌクレオチドである、態様1〜22または36のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
38  ミクスマーオリゴヌクレオチドが、LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドの両方、ならびに任意で2’糖修飾ヌクレオシド(例えば、態様6の一覧を参照されたい)、例えば2’-O-MOEヌクレオシドを含む、態様37記載の一本鎖オリゴヌクレオチド。
39  アンチセンスオリゴヌクレオチドが、3個またはそれより多い連続MOEヌクレオシドからなる領域を含み、任意で、該オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオシドが2’MOEヌクレオシドである、態様1〜38のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
40  標的がmRNA標的またはmRNA前駆体標的である、態様1〜39のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
41  mRNA前駆体スプライス部位、またはmRNA前駆体スプライス部位におけるスプライシング事象を制御する該mRNA前駆体の領域を標的とする、態様1〜40のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
42  mRNA前駆体標的のスプライシングを調節することができるスプライス調節オリゴヌクレオチドである、態様1〜41のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
43  標的がマイクロRNAである、態様1〜42のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
44  アンチセンスオリゴヌクレオチドが10〜20ヌクレオチド長、例えば12〜24ヌクレオチド長である、態様1〜42のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
45  アンチセンスオリゴヌクレオチドの長さが7〜30、例えば8〜12または12〜23ヌクレオチド長である、態様43記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
46  オリゴヌクレオチドが、連続ヌクレオチド配列に対して5'の位置の5'領域をさらに含み、5’ヌクレオシド領域が、少なくとも1個のリン酸ジエステル結合を含む、態様1〜45のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
47  5'領域が1〜5個のリン酸ジエステル結合DNAヌクレオシドを含み、任意で、オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分に連結してよい、態様46記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
48  1つまたは複数のヌクレオシドが、核酸塩基修飾ヌクレオシドである、態様1〜47のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
49  1つまたは複数のヌクレオシドが5-メチルシトシン、例えば、LNA 5-メチルシトシンまたはDNA 5-メチルシトシンである、態様1〜48のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド。
50  態様1〜49のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩、特に、ナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩。
51  態様1〜49のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容される塩と、該オリゴヌクレオチドまたは該薬学的に許容される塩に任意でリンカー部分を介して共有結合的に結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート。
52  態様1〜51のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート、および治療的に不活性な担体を含む、薬学的組成物。
53  治療的に活性な物質として使用するための、態様1〜52のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート。
54  静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、またはくも膜下腔内投与などの非経口投与によって対象に投与するために、治療法において使用するための、態様1〜53のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート。
55  一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドが、標的RNAに相補的、例えば完全に相補的である、細胞において標的RNAを阻害する際に使用するための、前記態様のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、塩、または組成物のインビトロの使用。
56  標的RNAを発現している細胞において該標的RNAを阻害するためのインビボまたはインビトロの方法であって、該標的RNAを阻害するために、前記態様のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、塩、コンジュゲート、または組成物の有効量を該細胞に投与する段階を含む、方法。
57  細胞において標的mRNA前駆体のスプライシングを調節する際に使用するための、前記態様のいずれか1つに記載の一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチド、塩、または組成物のインビトロまたはインビボの使用。
58  標的RNA前駆体を発現している細胞において該標的RNA前駆体のスプライシングを調節するためのインビボまたはインビトロの方法であって、標的RNAのスプライシングを調節するために、前記態様のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド、塩、コンジュゲート、または組成物の有効量を該細胞に投与する段階を含む、方法。
【０３０７】
本発明のHtra-1ターゲティングアンチセンスオリゴヌクレオチド
いくつかの態様において、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒト高温要求性セリンプロテアーゼA1(Htra1)をコードするmRNAまたはmRNA前駆体に相補的である―例えばWO 2018/002105を参照されたい。Htra1のmRNaまたはmRNA前駆体を標的とする本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いてHtra1発現を阻害することは、黄斑変性症、例えば加齢黄斑変性症(地図状萎縮)のような一連の医学的障害を治療するために有益である。ヒトHtra1のmRNA前駆体およびmRNAの標的配列は、以下で入手可能である：
2021508327.tif 000045
【０３０８】
Htra-1を標的とする本発明の化合物は、実施例にHtra1#1〜38として挙げている。
1  10〜30ヌクレオチド長である本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトHTRA1のmRNAまたはmRNA前駆体を標的とし、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、WO 2018/002105のSEQ ID NO 1または2に少なくとも90％、例えば100％相補的であり、SEQ ID NO 9および10として配列表に開示される、10〜22個のヌクレオチドからなる連続ヌクレオチド領域を含み、該アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の式IAまたは式IBのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
2  連続ヌクレオチド領域が、SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、および18：
2021508327.tif 000046
からなる群より選択される配列中に存在する配列と同一である、態様1または2記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
3  連続ヌクレオチド領域が、配列
2021508327.tif 000047
を含む、態様1〜3のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
4  オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、SEQ ID NO 11、12、13、14、15、16、17、および18のいずれか1つより選択される配列からなるか、またはそれを含む、態様1〜4のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
5  オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、1つまたは複数の2’糖修飾ヌクレオシド、例えば、2’-O-アルキル-RNAヌクレオシド、2’-O-メチル-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-O-メトキシエチル-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-DNAヌクレオシド、アラビノ核酸(ANA)ヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、およびLNAヌクレオシドからなる群より独立に選択される1つまたは複数の2’糖修飾ヌクレオシドを含む、態様1〜5のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
6  オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド領域が、少なくとも1個の修飾されたヌクレオシド間結合、例えば、1つもしくは複数のホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含むか、または例えば、該連続ヌクレオチド領域内のすべてのヌクレオシド間結合がホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、態様1〜5のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
7  オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列が、式5’-F-G-F’-3’(式中、領域FおよびF’は、1〜7個の糖修飾ヌクレオチドを独立に含み、かつGは、RNアーゼHを動員することができる6〜16個のヌクレオシドからなる領域であり、領域Gに隣接している領域FおよびF’のヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである)のギャップマーのようなギャップマーであるか、またはそれを含む、態様1〜6のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
8  領域FおよびF’のうちの少なくとも1つまたは両方が、少なくとも1つのLNAヌクレオシドをそれぞれ含む、態様7に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
9  Htra1#1〜38より選択される群より選択される、態様1〜8のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、大文字はβ-D-オキシLNAヌクレオシドユニットを表し、小文字はDNAヌクレオシドユニットを表し、下付き文字sはホスホロチオアートヌクレオシド間結合を表し、すべてのLNAシトシンは5-メチルシトシンであり、Pは式IBのホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を表し、Sは、Sp型の立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合を表し、Rは、Rp型の立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合を表し、かつXは、立体的にランダムなホスホロチオアート結合を表す、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
10  ナトリウム塩、カリウム塩、またはアンモニウム塩(例えば、薬学的に許容される塩)などの塩の形態の、前記態様のいずれか1つに記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
11  態様1〜10のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチドおよび該オリゴヌクレオチドまたはその塩に共有結合的に結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分を含む、コンジュゲート。
12  態様1〜10記載のオリゴヌクレオチドまたは態様11記載のコンジュゲート、ならびに薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩、および/またはアジュバントを含む、薬学的組成物。
13  HTRA1を発現している標的細胞においてHTRA1発現を調節するためのインビボまたはインビトロの方法であって、態様1〜10のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、または態様11に記載のコンジュゲート、または態様12に記載の薬学的組成物の有効量を該細胞に投与する段階を含む、方法。
14  態様1〜10のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、または態様11に記載のコンジュゲート、または態様12に記載の薬学的組成物の治療的有効量または予防的有効量を、疾患に罹患しているまたは疾患に易罹患性である対象に投与する段階を含む、疾患を治療または予防するための方法。
15  医薬品において使用するための、態様1〜10のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、または態様11に記載のコンジュゲート、または態様12に記載の薬学的組成物。
16  黄斑変性症(例えば、滲出型AMD、萎縮型AMD、地図状萎縮、中等度のdAMD、糖尿病性網膜症)、パーキンソン病、アルツハイマー病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節炎、例えば変形性関節症、および家族性虚血性脳小血管病からなる群より選択される疾患の治療または予防において使用するための、態様1〜10のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、または態様11に記載のコンジュゲート、または態様12に記載の薬学的組成物。
17  黄斑変性症(例えば、滲出型AMD、萎縮型AMD、地図状萎縮、中等度のdAMD、糖尿病性網膜症)、パーキンソン病、アルツハイマー病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、関節炎、例えば変形性関節症、および家族性虚血性脳小血管病からなる群より選択される疾患の治療または予防のための医薬を調製するための、態様1〜10に記載のオリゴヌクレオチド、または態様11に記載のコンジュゲート、または態様12に記載の薬学的組成物の使用。
18  地図状萎縮の治療において使用するための、前記態様のいずれか1つに記載のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート、塩、もしくは組成物、または使用。
【０３０９】
発明のさらに別の態様
したがって、本発明は、特に以下に関する：
標的RNAを発現している細胞において該標的RNAの発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
標的RNAを発現している細胞において該標的RNAの発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
(A1)および(A2)のうちの一方がLNAヌクレオシドであり、かつ他方がDNAヌクレオシド、RNAヌクレオシド、または糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
(A1)および(A2)のうちの一方がLNAヌクレオシドであり、かつ他方がDNAヌクレオシドまたは糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
(A1)および(A2)のうちの一方がLNAヌクレオシドであり、かつ他方がDNAヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
(A1)および(A2)のうちの一方がLNAヌクレオシドであり、かつ他方が糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
糖修飾ヌクレオシドが2’糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド。
2’糖修飾ヌクレオシドが、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシアルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-RNAヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、またはLNAヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
2’糖修飾ヌクレオシドがLNA ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAより独立に選択される、本発明によるオリゴヌクレオチド；
LNAヌクレオシドが、どちらもβ-D-オキシLNAである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
2’糖修飾ヌクレオシドが2’-アルコキシアルコキシ-RNAである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
2’-アルコキシ-RNAが2’-メトキシ-RNAである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
2’-アルコキシアルコキシ-RNAが2’-メトキシエトキシ-RNAである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
1〜15個、具体的には1〜5個、より具体的には1個、2個、3個、4個、または5個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む、本発明によるオリゴヌクレオチド；
リン酸ジエステルヌクレオシド間結合、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合、および上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択されるさらなるヌクレオシド間結合を含む、本発明によるオリゴヌクレオチド；
さらなるヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択される、本発明によるオリゴヌクレオチド；
さらなるヌクレオシド間結合がすべて、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるオリゴヌクレオチド；
さらなるヌクレオシド間結合がすべて、上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるオリゴヌクレオチド；
ギャップマー、特に、LNAギャップマー、混合ウイングギャップマー、交互フランクギャップマー、スプライススイッチングオリゴマー、ミクスマー、またはトータルマーである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
ギャップマーであり、かつ少なくとも1個の式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合が、ギャップ領域中および/または該ギャップマーの1つもしくは複数の隣接領域中に含まれる、本発明によるオリゴヌクレオチド；
連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマー領域F-G-F’に、リン酸ジエステルヌクレオシド間結合によってオリゴヌクレオチドの残部に連結されている1つまたは複数のDNAヌクレオシドを含む、隣接領域D’もしくはD’’またはD’およびD’’が隣接している、本発明によるオリゴヌクレオチド；
隣接領域FおよびF’の一方または両方、特に一方に、リン酸ジエステル結合DNAヌクレオシド、特に1〜5個のリン酸ジエステル結合DNAヌクレオシド(領域D’およびD’’)がさらに隣接しているギャップマーである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
7〜30ヌクレオチド長のものである、本発明によるオリゴヌクレオチド。
【０３１０】
本発明のオリゴヌクレオチドがギャップマーである場合、有利には、12〜26ヌクレオチド長のものである。16ヌクレオチドが、特に有利なギャップマーオリゴヌクレオチドの長さである。
【０３１１】
オリゴヌクレオチドが完全なLNAオリゴヌクレオチドである場合、有利には、7〜10ヌクレオチド長のものである。
【０３１２】
オリゴヌクレオチドがミクスマーオリゴヌクレオチドである場合、有利には、8〜30ヌクレオチド長のものである。
【０３１３】
本発明は、特に以下に関する：
1つまたは複数のヌクレオシドが、核酸塩基修飾ヌクレオシドである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
アンチセンスオリゴヌクレオチド、siRNA、マイクロRNA模倣体、またはリボザイムである、本発明によるオリゴヌクレオチド；
本発明によるオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩、特に、ナトリウム塩またはカリウム塩；
本発明によるオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容される塩と、該オリゴヌクレオチドまたは該薬学的に許容される塩に任意でリンカー部分を介して共有結合的に結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート；
本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート、および治療的に不活性な担体を含む、薬学的組成物；
治療的に活性な物質として使用するための、本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート；ならびに
医薬としての、本発明によるオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲートの使用。
【０３１４】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、完全にホスホロチオアートで連結された対応するオリゴヌクレオチドと比べて、標的核酸を調節する際の活性が高い。いくつかの態様において、本発明は、増強された活性、増強された効力、増強された特異的活性、または増大された細胞取込みを有するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、本発明は、変更されたインビトロまたはインビボでの作用持続期間、例えば、インビトロまたはインビボでの長期の作用持続期間を有するオリゴヌクレオチドを提供する。いくつかの態様において、標的核酸を調節する際の高い活性は、その標的核酸を発現している細胞においてインビトロまたはインビボで測定される。
【０３１５】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、変更された薬理学的特性、例えば、低減された毒性、例えば、低減された腎毒性、低減された肝毒性、または低減された免疫刺激を有する。肝毒性は、例えば、インビボで、または参照により本明細書に組み入れられるWO 2017/067970において開示されているインビトロアッセイ法を用いることにより、測定することができる。腎毒性は、例えば、インビトロで、または参照により本明細書に組み入れられるPCT/EP2017/064770において開示されているアッセイ法を用いることにより、測定することができる。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、5’CG3’ジヌクレオチド、例えばDNA 5’CG3’ジヌクレオチドを含み、その際、CとGの間のヌクレオシド間結合は、上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である。
【０３１６】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、改良されたヌクレアーゼ耐性、例えば、血清における改良された生体内安定性を有する。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドの3’末端ヌクレオシドは、A塩基またはG塩基を有し、例えば、3’末端LNA-Aヌクレオシドまたは3’末端LNA-Gヌクレオシドである。適宜に、オリゴヌクレオチドの最も3'側の2個のヌクレオシドの間のヌクレオシド間結合は、上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合であってよい。
【０３１７】
いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、増強された生物学的利用能を有する。いくつかの態様において、本発明のオリゴヌクレオチドは、血液へのより多くの曝露、例えば、より長い血液中滞留時間を有する。
【０３１８】
非架橋ホスホロジチオアート修飾は、ホスホラミダイト法を用いる固相合成によってオリゴヌクレオチド中に導入される。合成は、ユニバーサルリンカーを備えた制御された多孔性ガラス(CPG)を支持体として用いて実施される。このような固体支持体表面で、典型的には、オリゴヌクレオチドは、5’O-DMT保護ヌクレオシドホスホラミダイト構成単位のカップリングとそれに続く(チオ)酸化、キャッピング、およびDMT基の脱保護からなる逐次的サイクルを用いて、3'から5'の方向に作り上げられる。非架橋ホスホロジチオアートの導入は、適切なチオホスホラミダイト構成単位を用い、続いて一次中間体をチオ酸化することによって達成される。
【０３１９】
対応するDNAチオホスホラミダイトは市販されているが、各LNA構成単位はこれまでに説明されていない。これらは、例えば、モノベンゾイルで保護されたエタンジチオールおよびトリピロリジン-1-イルホスファンとの反応によって、5’-O-DMT保護ヌクレオシド3’-アルコールから調製することができる。
【０３２０】
したがって、本発明によるオリゴヌクレオチドは、例えば、スキーム2に従って製造することができ、スキーム中のR1、R2a、R2b、R4a、R4b、R5、Rx、Ry、およびVは、下記に定義するとおりである。
【０３２１】
スキーム2
2021508327.tif 000048
【０３２２】
したがって、本発明はまた、以下の段階を含む、本発明によるオリゴヌクレオチドを製造するための方法にも関する：
(a)ヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5'末端酸素原子にチオホスホラミダイトヌクレオシドをカップリングして、チオ亜リン酸トリエステル中間体を作製する段階；
(b)段階(a)で得られたチオ亜リン酸トリエステル中間体をチオ酸化する段階；および
(c)任意で、オリゴヌクレオチドをさらに伸長する段階。
【０３２３】
本発明は、以下の段階を含む、本発明によるオリゴヌクレオチドを製造するための方法に特に関する：
(a1)式(A)
2021508327.tif 000049
の化合物を、式(B)
2021508327.tif 000050
のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5’酸素原子にカップリングする段階；
(b1)段階(a1)で得られたチオ亜リン酸トリエステル中間体をチオ酸化する段階；および
(c)任意で、オリゴヌクレオチドをさらに伸長する段階；
上式で、
R2aおよびR4aは、一緒になって、上記に定義された-X-Y-を形成するか；または
R4aは水素であり、かつR2aは、アルコキシ、特にメトキシ、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルコキシ、特にメトキシエトキシ、アルケニルオキシ、特にアリルオキシ、およびアミノアルコキシ、特にアミノエチルオキシより選択され；
R2bおよびR4bは、一緒になって、上記に定義された-X-Y-を形成するか；または
R2bおよびR4bは、同時に両方とも水素であるか；または
R4bは水素であり、かつR2bは、アルコキシ、特にメトキシ、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルコキシ、特にメトキシエトキシ、アルケニルオキシ、特にアリルオキシ、およびアミノアルコキシ、特にアミノエチルオキシより選択され；
Vは、酸素または硫黄であり；かつ
R5、Rx、Ry、およびNuは、下記に定義するとおりである。
【０３２４】
本発明は、以下の段階を含む、本発明によるオリゴヌクレオチドを製造するための方法に特に関する：
(a2)式(II)
2021508327.tif 000051
の化合物を、式(IV)
2021508327.tif 000052
のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドの5’酸素原子にカップリングする段階；
(b2)段階(a2)で得られたチオ亜リン酸トリエステル中間体をチオ酸化する段階；および
(c)任意で、オリゴヌクレオチドをさらに伸長する段階；
上式で、
R2bおよびR4bは、一緒になって、上記に定義された-X-Y-を形成するか；または
R2bおよびR4bは、同時に両方とも水素であるか；または
R4bは水素であり、かつR2bは、アルコキシ、特にメトキシ、ハロゲン、特にフルオロ、アルコキシアルコキシ、特にメトキシエトキシ、アルケニルオキシ、特にアリルオキシ、およびアミノアルコキシ、特にアミノエチルオキシより選択され；かつ
R5、Rx、Ry、およびNuは、下記に定義するとおりである。
【０３２５】
本発明はまた、本発明の方法に従って製造されたオリゴヌクレオチドにも関する。
【０３２６】
本発明はさらに、以下に関する：
式(I)
2021508327.tif 000053
(式中、Rは、水素またはリン酸保護基である)
の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むギャップマーオリゴヌクレオチド；
標的RNAを発現している細胞において該標的RNAの発現を調節することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、上記に定義されたギャップマーオリゴヌクレオチド；
標的RNAを発現している細胞において該標的RNAの発現を阻害することができるアンチセンスオリゴヌクレオチドである、上記に定義されたギャップマーオリゴヌクレオチド；
RNアーゼH、例えばヒトRNアーゼH1を動員することができる、上記に定義されたギャップマーオリゴヌクレオチド；
式(I)の少なくとも1個のヌクレオシド間結合の2個の酸素原子の一方が、隣接ヌクレオシド(A1)の3’炭素原子に結合しており、他方が、別の隣接ヌクレオシド(A2)の5’炭素原子に結合しており、かつ2個のヌクレオシド(A1)および(A2)のうちの少なくとも1個が、2’糖修飾ヌクレオシドである、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
(A1)および(A2)のうちの一方が2’糖修飾ヌクレオシドであり、かつ他方がDNAヌクレオシドである、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
(A1)および(A2)が、同時に両方とも2’修飾ヌクレオシドである、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
(A1)および(A2)が、同時に両方ともDNAヌクレオシドである、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
式5’-F-G-F’-3’(式中、Gは、RNアーゼHを動員することができる5〜18個のヌクレオシドの領域であり、領域Gの5'および3'にそれぞれ隣接領域FおよびF’が隣接し、領域FおよびF’は、1〜7個の2’糖修飾ヌクレオチドを独立に含むか、またはそれらからなり、領域Gに隣接している領域Fのヌクレオシドは2’糖修飾ヌクレオシドであり、領域Gに隣接している領域F'のヌクレオシドは2’糖修飾ヌクレオシドである)の連続ヌクレオチド配列を含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
2’糖修飾ヌクレオシドが、2’-アルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アルコキシアルコキシ-RNAヌクレオシド、2’-アミノ-DNAヌクレオシド、2’-フルオロ-RNAヌクレオシド、2’-フルオロ-ANAヌクレオシド、およびLNAヌクレオシドより独立に選択される、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
2’-アルコキシアルコキシ-RNAが2’-メトキシエトキシ-RNA(2’-O-MOE)である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fおよび領域F’が、2’-メトキシエトキシ-RNAヌクレオチドを含むか、またはそれからなる、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
式[MOE]3〜8[DNA]8〜16[MOE]3〜8、例えば[MOE]5[DNA]10[MOE]5(すなわち領域Fおよび領域F’が、それぞれ5個の2’-メトキシエトキシ-RNAヌクレオチドからなり、領域Gが10個のDNAヌクレオチドからなる)を有するF-G-F’を含むギャップマーのような、領域Fおよび領域F’の両方が2’-メトキシエトキシ-RNAヌクレオチドからなる、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fもしくは領域F’中または領域Fおよび領域F’の両方の中の2’糖修飾ヌクレオシドの少なくとも1つまたはすべてがLNAヌクレオシドである、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fもしくは領域F’または領域Fおよび領域F’の両方が、少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つのDNAヌクレオシドを含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fもしくは領域F’または領域Fおよび領域F’の両方が、少なくとも1つのLNAヌクレオシドおよび少なくとも1つの非LNA 2’糖修飾ヌクレオシド、例えば少なくとも1つの2’-メトキシエトキシ-RNAヌクレオシドを含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
ギャップ領域が、5〜16個、具体的には8〜16個、より具体的には8個、9個、10個、11個、12個、13個、または14個の連続DNAヌクレオシドを含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fおよび領域F’が、独立に、1、2、3、4、5、6、7、または8ヌクレオシド長である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fおよび領域F’が、それぞれ独立に、1個、2個、3個、または4個のLNAヌクレオシドを含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
LNAヌクレオシドが、β-D-オキシLNA、6’-メチル-β-D-オキシLNA、およびENAより独立に選択される、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
LNAヌクレオシドがβ-D-オキシLNAである、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
オリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列(F-G-F’)が、10〜30ヌクレオチド長、具体的には12〜22、より具体的には14〜20オリゴヌクレオチド長のものである、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
式5’-D’-F-G-F’-D’’-3’(式中、F、G、およびF’は、請求項4〜17のいずれか一項で定義されるとおりであり、かつ領域D’およびD’’は、それぞれ独立に、0〜5個のヌクレオチド、特に2個、3個、または4個のヌクレオチド、特にDNAヌクレオチド、例えばリン酸ジエステル結合DNAヌクレオシドからなる)の連続ヌクレオチド配列を含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
ヒトRNアーゼH1を動員することができる、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
上記に定義された式(I)の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合が、領域Fもしくは領域F’中の隣接ヌクレオシド間、領域Fと領域Gの間、または領域Gと領域F’の間に位置する、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
ホスホロチオアートヌクレオシド間結合をさらに含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Gのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択される、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Gのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、0個、1個、2個、または3個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアート結合、リン酸ジエステル結合、および上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合からなる群より独立に選択される、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合および領域F’のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択される、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
各隣接領域FおよびF’が、1個、2個、3個、4個、5個、6個、または7個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を独立に含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
隣接領域FおよびF’が、1個、2個、3個、4個、5個、もしくは6個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を一緒にもしくは独立に含むか、または領域Fおよび/もしくは領域F'中のすべてのヌクレオシド間結合が、上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
隣接領域FおよびF’が一緒に、1個、2個、3個、または4個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
隣接領域FおよびF’が、2個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合をそれぞれ含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
隣接領域Fおよび/または隣接領域F’のヌクレオシド間結合のすべてが、上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
少なくとも1個の立体定義されたヌクレオシド間結合、例えば、少なくとも1個の立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
ギャップ領域が、1個、2個、3個、4個、または5個の立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合を含む、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
ギャップ領域のヌクレオシド間のヌクレオシド間結合のすべてが、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
上記に定義された式(I)の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合が、領域Fのヌクレオシド間、領域F’のヌクレオシド間、領域Fと領域Gの間、または領域Gと領域F’の間に位置し、かつ領域FおよびF’の内部、領域Fと領域Gの間、および領域Gと領域F’の間の残りのヌクレオシド間結合が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合、立体的にランダムなヌクレオシド間結合、式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合、およびリン酸ジエステルヌクレオシド間結合より独立に選択される、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
上記に定義された式(I)の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合が、領域Fの少なくとも2個の隣接ヌクレオシドの間、領域F’の2個の隣接ヌクレオシドの間、領域Fと領域Gの間、または領域Gと領域F’の間に位置し、かつ領域FおよびF’のヌクレオチド間の残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合、式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合、およびリン酸ジエステルヌクレオシド間結合より独立に選択される、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド。領域FおよびF’のホスホロチオアートヌクレオシド間結合は、立体的にランダムなものもしくは立体定義されたもののいずれかであってもよく、または立体的にランダムなものおよび立体定義されたものより独立に選択されてもよい；
上記に定義された式(I)の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合が、領域Fの少なくとも2個の隣接ヌクレオシドの間、領域F’の少なくとも2個の隣接ヌクレオシドの間、領域Fと領域Gの間、または領域Gと領域F’の間に位置し、かつ領域FおよびF’のヌクレオチド間の残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択される、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド。領域FおよびF’のホスホロチオアートヌクレオシド間結合は、立体的にランダムなものもしくは立体定義されたもののいずれかであってもよく、または立体的にランダムなものおよび立体定義されたものより独立に選択されてもよい；
上記に定義された式(I)の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合が、領域Fの少なくとも2個の隣接ヌクレオシドの間、領域F’の少なくとも2個の隣接ヌクレオシドの間、領域Fと領域Gの間、または領域Gと領域F’の間に位置し、かつ領域FとF’のヌクレオチドの間、領域Fと領域Gの間、および領域Gと領域F’の間の残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合および式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択される、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；領域FおよびF’のホスホロチオアートヌクレオシド間結合は、立体的にランダムなものもしくは立体定義されたもののいずれかであってもよく、または立体的にランダムなものおよび立体定義されたものより独立に選択されてもよい；
上記に定義された式(I)の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合が、領域Fの少なくとも2個の隣接ヌクレオシドの間、領域F’の少なくとも2個の隣接ヌクレオシドの間、領域Fと領域Gの間、または領域Gと領域F’の間に位置し、かつ領域FとF’のヌクレオチドの間、領域Fと領域Gの間、ならびに領域Gと領域F'の間の残りのヌクレオシド間結合が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合および式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択される、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
上記に定義された式(I)の少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合が、領域Fの少なくとも2個の隣接ヌクレオシドの間、領域F’の少なくとも2個の隣接ヌクレオシドの間、領域Fと領域Gの間、または領域Gと領域F’の間に位置し、かつ領域FおよびF’の内部、領域Fと領域Gの間、および領域Gと領域F’の間の残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合であり、該ホスホロチオアートヌクレオシド間結合が、すべて立体的にランダムなホスホロチオアートヌクレオシド間結合、すべて立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合であってよく、または立体的にランダムなホスホロチオアートヌクレオシド間結合および立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択されてよい、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域F内、領域F’内、または領域Fおよび領域F’の両方の内部の残りのヌクレオシド間結合がすべて、上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Gのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、0個、1個、2個、または3個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ領域G内の残りのヌクレオシド間結合が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合および立体的にランダムなホスホロチオアートヌクレオシド間結合より独立に選択される、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Gのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、0個、1個、2個、または3個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ領域G内の残りのヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個または領域G内の残りのヌクレオシド間結合のすべてが、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Gのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、0個、1個、2個、または3個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ領域G内の残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合、例えば、立体的にランダムなホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fまたは領域F’の少なくとも1つが、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ領域G内のすべてのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合、例えば、立体的にランダムなホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fまたは領域F’の少なくとも1つが、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ領域G内のすべてのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合であり、領域G内のホスホロチオアートヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fまたは領域F’の少なくとも1つが、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ領域G内のすべてのヌクレオシド間結合が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fと領域Gの間のヌクレオシド間結合、もしくは領域Gと領域F'の間のヌクレオシド間結合、または領域Fと領域Gの間および領域Gと領域F'の間の両方のヌクレオシド間結合が、上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合であり、かつ領域Fと領域Gの間および領域Gと領域F'の間のヌクレオシド間結合のうちの一方のみが上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である場合には、領域Fと領域Gの間または領域Gと領域F'の間の他方のヌクレオシド間結合がホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fまたは領域F'の少なくとも1つが、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、領域Fと領域Gの間のヌクレオシド間結合、もしくは領域Gと領域F'の間のヌクレオシド間結合、または領域Fと領域Gの間および領域Gと領域F'の間の両方のヌクレオシド間結合が、上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合であり、かつ領域Fと領域Gの間および領域Gと領域F'の間のヌクレオシド間結合のうちの一方のみが上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である場合には、領域Fと領域Gの間または領域Gと領域F'の間の他方のヌクレオシド間結合がホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Gのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、0個、1個、2個、または3個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ領域G内の残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合であり、領域Fと領域Gの間のヌクレオシド間結合、もしくは領域Gと領域F'の間のヌクレオシド間結合、または領域Fと領域Gの間および領域Gと領域F'の間の両方のヌクレオシド間結合が、上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合であり、かつ領域Fと領域Gの間および領域Gと領域F'の間のヌクレオシド間結合のうちの一方のみが上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である場合には、領域Fと領域Gの間または領域Gと領域F'の間の他方のヌクレオシド間結合がホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fまたは領域F’の少なくとも1つが、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、領域Gのヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、0個、1個、2個、または3個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ領域G内の残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合であり、領域Fと領域Gの間のヌクレオシド間結合、もしくは領域Gと領域F'の間のヌクレオシド間結合、または領域Fと領域Gの間および領域Gと領域F'の間の両方のヌクレオシド間結合が、上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合であり、かつ領域Fと領域Gの間および領域Gと領域F'の間のヌクレオシド間結合のうちの一方のみが上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合である場合には、領域Fと領域Gの間または領域Gと領域F'の間の他方のヌクレオシド間結合がホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fもしくは領域F’が、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むか、または領域Fと領域Gの間もしくは領域Gと領域F'の間のヌクレオシド間結合が、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、領域Gが、1個、2個、もしくは3個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ領域G内の残りのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fもしくは領域F’が、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むか、または領域Fと領域Gの間もしくは領域Gと領域F'の間のヌクレオシド間結合が、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、領域G内のヌクレオシド間結合のすべてが、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合であり、かつ領域G内のホスホロチオアートヌクレオシド間結合のうちの少なくとも1個が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fもしくは領域F’が、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むか、または領域Fと領域Gの間もしくは領域Gと領域F'の間のヌクレオシド間結合が、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、領域G内のヌクレオシド間結合のすべてが、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合であり、かつ領域G内のホスホロチオアートヌクレオシド間結合のすべてが、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合以外は、ギャップマー領域F-G-F’内の残りのすべてのヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
領域Fまたは領域F’のうちの少なくとも1つが、少なくとも1個の上記に定義された式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含み、かつ領域G内のすべてのヌクレオシド間結合が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
少なくとも1個の式(I)のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合以外は、ギャップマー領域F-G-F’内の残りのすべてのヌクレオシド間結合が、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合である、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
LNAギャップマー、混合ウイングギャップマー、交互フランクギャップマー、またはギャップブレーカーギャップマーである、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド；
本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチドの薬学的に許容される塩、特に、ナトリウム塩またはカリウム塩；
本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチドまたは薬学的に許容される塩と、該オリゴヌクレオチドまたは該薬学的に許容される塩に、任意でリンカー部分を介して、特に生物切断可能なリンカーを介して、具体的には2〜4個のリン酸ジエステル結合DNAヌクレオシド(例えば領域D’または領域D’’)を介して共有結合的に結合した少なくとも1つのコンジュゲート部分とを含む、コンジュゲート；
本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート、および治療的に不活性な担体を含む、薬学的組成物；
治療的に活性な物質として使用するための、本発明によるギャップマーオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲート；
医薬としての、ギャップマーオリゴヌクレオチド、薬学的に許容される塩、またはコンジュゲートの使用。
標的RNAの発現を調節するように、該標的RNAを発現している細胞に本発明によるオリゴヌクレオチドまたはギャップマーオリゴヌクレオチドを投与する段階を含む、細胞において標的RNAの発現を調節する方法；
標的RNAの発現を阻害するように、該標的RNAを発現している細胞に本発明によるオリゴヌクレオチドまたはギャップマーオリゴヌクレオチドを投与する段階を含む、細胞において標的RNAの発現を阻害する方法；ならびに
細胞において標的RNAを調節または阻害するように、該標的RNAを発現している細胞に本発明によるオリゴヌクレオチドまたはギャップマーオリゴヌクレオチドを投与する段階を含む、細胞において標的RNAを調節または阻害するインビトロの方法。
【０３２７】
標的RNAは、例えば、哺乳動物のmRNA、例えばmRNA前駆体もしくは成熟mRNA、ヒトmRNA、ウイルスRNA、または非コーディングRNA、例えばマイクロRNAもしくは長い非コーディングRNAであることができる。
【０３２８】
いくつかの態様において、調節は、標的mRNA前駆体のスプライシングパターンの変化をもたらす、mRNA前駆体のスプライス調節である。
【０３２９】
いくつかの態様において、調節は、(例えば、RNアーゼH1のようなRNアーゼHもしくはRISCの動員による)標的分解を介して起こり得る阻害であるか、または阻害は、標的RNAの正常な生物学的機能を阻害する、占有を介したメカニズムによって起こり得る(例えば、マイクロRNAもしくは長い非コーディングRNAのミクスマーまたはトータルマーによる阻害)。
【０３３０】
ヒトmRNAは、成熟RNAまたはmRNA前駆体であることができる。
【０３３１】
本発明はさらに、式(II)の化合物にも関する：
2021508327.tif 000054
式中、
Xは、酸素、硫黄、-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(=CRaRb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-O-NRa-、-NRa-O-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-、または-O-CRaRb-であり；
Yは、酸素、硫黄、-(CRaRb)n-、-CRaRb-O-CRaRb-、-C(Ra)=C(Rb)-、-C(Ra)=N-、-Si(Ra)2-、-SO2-、-NRa-、-C(=J)-、Se、-O-NRa-、-NRa-CRaRb-、-N(Ra)-O-、または-O-CRaRb-であり；
ただし、-X-Y-は、-O-O-、Si(Ra)2-Si(Ra)2-、-SO2-SO2-、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=N-C(Ra)=N-、-C(Ra)=N-C(Ra)=C(Rb)、-C(Ra)=C(Rb)-C(Ra)=N-、および-Se-Se-のいずれでもないことを条件とし；
Jは、酸素、硫黄、=CH2、または=N(Ra)であり；
RaおよびRbは、水素、ハロゲン、ヒドロキシル、シアノ、チオヒドロキシル、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、アリール、ヘテロシクリル、アミノ、アルキルアミノ、カルバモイル、アルキルアミノカルボニル、アミノアルキルアミノカルボニル、アルキルアミノアルキルアミノカルボニル、アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、アルカノイルオキシ、スルホニル、アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、チオヒドロキシルスルフィドアルキルスルファニル、アリールオキシカルボニル、アリールオキシ、アリールカルボニル、ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシカルボニル、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールカルボニル、-OC(=Xa)Rc、-OC(=Xa)NRcRd、および-NReC(=Xa)NRcRdより独立に選択されるか、または
2個のジェミナルなRaおよびRbは一緒に、任意で置換されたメチレンを形成するか、または
2個のジェミナルなRaおよびRbは、それらが結合している炭素原子と一緒に、-X-Y-の炭素原子を1つだけ有するシクロアルキルもしくはハロシクロアルキルを形成し；
置換アルキル、置換アルケニル、置換アルキニル、置換アルコキシ、および置換メチレンは、ハロゲン、ヒドロキシル、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル、ホルミル、ヘテロシクリル、アリール、およびヘテロアリールより独立に選択される1〜3個の置換基で置換されたアルキル、アルケニル、アルキニル、およびメチレンであり；
Xaは、酸素、硫黄、または-NRcであり；
Rc、Rd、およびReは、水素およびアルキルより独立に選択され；
nは、1、2、または3である。
R5は、ヒドロキシル保護基であり；
Rxは、フェニル、ニトロフェニル、フェニルアルキル、ハロフェニルアルキル、シアノアルキル、フェニルカルボニルスルファニルアルキル、ハロフェニルカルボニルスルファニルアルキルアルキルカルボニルスルファニルアルキル、またはアルキルカルボニルカルボニルスルファニルアルキルであり；
Ryは、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり；かつ
Nuは、核酸塩基または保護された核酸塩基である。
【０３３２】
本発明はさらに、以下に関する：
-X-Y-が、-CH2-O-、-CH(CH3)-O-、または-CH2CH2-O-である、式(II)の化合物；
本発明はさらに、式(IIb)の化合物も提供する：
2021508327.tif 000055
式中、
R5は、ヒドロキシル保護基であり；
Rxは、フェニル、ニトロフェニル、フェニルアルキル、ハロフェニルアルキル、シアノアルキル、フェニルカルボニルスルファニルアルキル、ハロフェニルカルボニルスルファニルアルキルアルキルカルボニルスルファニルアルキル、またはアルキルカルボニルカルボニルスルファニルアルキルであり；
Ryは、ジアルキルアミノまたはピロリジニルであり；かつ
Nuは、核酸塩基または保護された核酸塩基である；
R5、Rx、Ry、およびNuが上記のとおりである、式(III)または(IV)
2021508327.tif 000056
のものである、式(II)の化合物；
Rxが、フェニル、ニトロフェニル、フェニルメチル、ジクロロフェニルメチル、シアノエチル、メチルカルボニルスルファニルエチル、エチルカルボニルスルファニルエチル、イソプロピルカルボニルスルファニルエチル、tert-ブチルカルボニルスルファニルエチル、メチルカルボニルカルボニルスルファニルエチル、またはジフルオロフェニルカルボニルスルファニルエチルである、式(II)、(IIb)、(III)、または(IV)の化合物；
Rxが、フェニル、4-ニトロフェニル、2,4-ジクロロフェニルメチル、シアノエチル、メチルカルボニルスルファニルエチル、エチルカルボニルスルファニルエチル、イソプロピルカルボニルスルファニルエチル、tert-ブチルカルボニルスルファニルエチル、メチルカルボニルカルボニルスルファニルエチル、または2,4-ジフルオロフェニルカルボニルスルファニルエチルである、式(II)、(IIb)、(III)、または(IV)の化合物；
Rxがフェニルカルボニルスルファニルアルキルである、式(II)、(IIb)、(III)、または(IV)の化合物；
Rxがフェニルカルボニルスルファニルエチルである、式(II)、(IIb)、(III)、または(IV)の化合物；
Ryがジイソプロピルアミノまたはピロリジニルである、式(II)、(IIb)、(III)、または(IV)の化合物；
Ryがピロリジニルである、式(II)、(IIb)、(III)、または(IV)の化合物；
R5およびNuが上記に定義されたとおりである、式(V)
2021508327.tif 000057
のものである、式(II)の化合物；
R5およびNuが上記に定義されたとおりである、式(Vb)
2021508327.tif 000058
のものである、式(IIb)の化合物；
Nuが、チミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、5-メチルシトシン、保護された5-メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシル、または保護されたウラシルである、式(II)、(IIb)、(III)、(IV)、または(V)、もしくは(Vb)の化合物；
Nuが、チミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、5-メチルシトシン、保護された5-メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシル、または保護されたウラシルである、式(IIb)の化合物；
Nuが、チミン、保護されたチミン、アデノシン、保護されたアデノシン、シトシン、保護されたシトシン、5-メチルシトシン、保護された5-メチルシトシン、グアニン、保護されたグアニン、ウラシル、または保護されたウラシルである、 式(Vb)の化合物；
2021508327.tif 000059
2021508327.tif 000060
より選択される、式(II)の化合物。
2021508327.tif 000061
2021508327.tif 000062
より選択される、式(IIb)の化合物。
【０３３３】
式(II)および(IIb)の化合物中に不純物が存在すると、オリゴヌクレオチドの製造時に副生成物が生じ、合成の成功が妨げられる。さらに、不純物が存在する場合、式(II)または(IIb)の化合物は、保存時に不安定である。
【０３３４】
特に、式(X1)、(X2)、X(11)、および(X21)の化合物
2021508327.tif 000063
は、このような不純物の例である。
【０３３５】
したがって、保存目的およびオリゴヌクレオチド製造目的のために十分に純粋な形態の、式(II)または(IIb)の化合物が必要とされた。
【０３３６】
したがって、本発明はまた、少なくとも98％、具体的には99％、より具体的には100％の純度を有する式(II)(IIb)の化合物にも関する。
【０３３７】
したがって、本発明は特に、不純物としての式(X1)の化合物および/または(X2)の化合物を1％未満、特に0％含む、式(II)の化合物に関する。
【０３３８】
本発明はさらに、酸性カップリング剤およびシリル化剤の存在下での5’保護LNA ヌクレオシドとホスフィンおよび片側保護ジチオールとの反応を含む、上記に定義された式(II)の化合物を製造するための方法にも関する。
【０３３９】
本発明はさらに、酸性カップリング剤およびシリル化剤の存在下での5’保護MOEヌクレオシドとホスフィンおよび片側保護ジチオールとの反応を含む、上記に定義された式(IIb)の化合物を製造するための方法にも関する。
【０３４０】
本発明は、酸性カップリング剤およびシリル化剤の存在下での式(C)
2021508327.tif 000064
の化合物と式P(Ry)3の化合物および式HSRxの化合物との反応を含む(式中、X、Y、R5、Nu、Rx、およびRyは、上記に定義されたとおりである)、式(II)の化合物を製造するための方法に関する。
【０３４１】
本発明はさらに、酸性カップリング剤およびシリル化剤の存在下での式(C1)
2021508327.tif 000065
の化合物と式P(Ry)3の化合物および式HSRxの化合物との反応を含む(式中、R5、Nu、Rx、およびRyは、上記に定義されたとおりである)、式(II)の化合物を製造するための方法にも関する。
【０３４２】
本発明はまた、酸性カップリング剤およびシリル化剤の存在下での式(Cb)
2021508327.tif 000066
の化合物と式P(Ry)3の化合物および式HSRxの化合物との反応を含む(式中、R5、Nu、Rx、およびRyは、上記に定義されたとおりである)、式(IIb)の化合物を製造するための方法にも関する。
【０３４３】
酸性活性化剤としても公知である酸性カップリング剤の例は、テトラゾール、5-ニトロフェニル-1H-テトラゾール(NPT)、5-エチルチオ-1H-テトラゾール(ETT)、5-ベンジルチオ-1H-テトラゾール(BTT)、5-メチルチオ-1H-テトラゾール(MTT)、5-メルカプト-テトラゾール(MCT)、5-(3,5-ビス(トリフルオロメチル)フェニル)-1H-テトラゾール、および4,5-ジシアノイミダゾール(DCI)のようなアゾールベースの活性化剤、またはピリジニウムヒドロクロリド、イミダゾリウムトリフラート、ベンゾイミダゾリウムトリフラート、5-ニトロベンゾイミダゾリウムトリフラートのような酸性塩、もしくは2,4-ジニトロ安息香酸もしくは2,4-ジニトロフェノールなどの弱酸である。テトラゾールは、具体的な酸性カップリング剤である。
【０３４４】
ヒドロキシル基失活剤としても公知であるシリル化剤の例は、ビス(ジメチルアミノ)ジメチルシラン、N,O-ビス(トリメチルシリル)アセトアミド(BSA)、N,O-ビス(トリメチルシリル)カルバマート(BSC)、N,N-ビス(トリメチルシリル)メチルアミン、N,O-ビス(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(BSTFA)、N,N′-ビス(トリメチルシリル)尿素(BSU)、ブロモトリメチルシラン(TMBS)、N-tert-ブチルジメチルシリル-N-メチルリフルオロアセトアミド(MTBSTFA)、クロロジメチル(ペンタフルオロフェニル)シラン、クロロトリエチルシラン(TESCI)、クロロトリメチルシラン(TMCS)、1,3-ジメチル-1,1,3,3-テトラフェニルジシラザン(TPDMDS)、N,N-ジメチルトリメチルシリルアミン(TMSDMA)、ヘキサメチルジシラザン(HMDS)、ヘキサメチルジシロキサン(HMDSO)、N-メチル-N-トリメチルシリルアセトアミド(MSA)、N-メチル-N-トリメチルシリルヘプタフルオロブチルアミド(MSHFA)、N-メチル-N-(トリメチルシリル)トリフルオロアセトアミド(MSTFA)、1,1,3,3-テトラメチル-1,3-ジフェニルジシラザン(DPTMDS)、4-(トリメチルシロキシ)-3-ペンテン-2-オン(TMS acac)、1-(トリメチルシリル)イミダゾール(TMSI)、またはトリメチルシリルメタリルスルフィナート(SILMAS-TMS)である。1-(トリメチルシリル)イミダゾールは、具体的なシリル化剤である。
【０３４５】
本発明はさらに、式(II)または(IIb)の粗製化合物を分取HPLCによって精製する、式(II)、(IIb)、または(III)の化合物を製造するための方法にも関する。
【０３４６】
本発明はさらに、式(II)、(IIb)、または(III)の粗製化合物を分取HPLCによって精製し、アセトニトリル対水酸化アンモニウム水溶液の勾配を用いて溶出させる、式(II)、(IIb)、または(III)の化合物を製造するための方法にも関する。
【０３４７】
水中の水酸化アンモニウム含有量は、具体的には少なくとも約0.05％v/v、特に約0.05％〜1％v/v、より具体的には0.05％〜0.5％v/v、より具体的には約0.05％v/vである。
【０３４８】
アセトニトリルの勾配は、具体的には、特に20分から120分以内に0％〜25％から75％〜100％までのアセトニトリル、より具体的には、特に25分から60分以内に10％〜20％から75％〜90％までのアセトニトリル、より具体的には、特に30分以内に約25％〜75％のアセトニトリルである。
【０３４９】
本発明はまた、オリゴヌクレオチド、特に、本発明によるオリゴヌクレオチドまたはギャップマーオリゴヌクレオチドの製造における、式(II)、(IIb)、または(III)の化合物の使用にも関する。
【０３５０】
次に、限定的な特徴を持たない以下の実施例によって、本発明を例示する。
【実施例】
【０３５１】
実施例1：モノマー合成
1.1：  S-(2-スルファニルエチル)ベンゼンカルボチオアート
2021508327.tif 000067
クロロホルム(200mL)に溶かした1,2-エタンジチオール(133.57mL、1592mmol、1当量)およびピリジン(64.4mL、796mmol、0.5当量)の溶液に、クロロホルム(200mL)に溶かした塩化ベンゾイル(92.4mL、796mmol、0.5当量)を一滴ずつ1時間添加し、この反応物を0℃で1時間撹拌した。混合物を水(300mL)および塩水(300ml)で洗浄した。有機相をNa2SO4を用いて乾燥させ、濃縮して黄色い油にした。この油を蒸留(135〜145℃)して、無色の油としてS-(2-スルファニルエチル)ベンゼンカルボチオアート(40g、202mmol、収率13％)を得た。
2021508327.tif 000068
【０３５２】
1.2：  S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-1-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-3-(5-メチル-2,4-ジオキソ-ピリミジン-1-イル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-7-イル]オキシ-ピロリジン-1-イル-ホスファニル]スルファニルエチル]ベンゼンカルボチオアート
2021508327.tif 000069
1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-6-イル]-5-メチル-ピリミジン-2,4-ジオン(2.29g、4.00mmol、1.0当量)を60mLの無水ジクロロメタン中に溶解し、これにスパチュラ1杯分の3Åモレキュラーシーブを添加した。シリンジを用いてトリピロリジン-1-イルホスファン(960mg、3.98mmol、0.99当量)を添加し、続いて、テトラゾールの0.1mmolアリコート7つ(3Åモレキュラーシーブを加えて保存した無水アセトニトリル中0.5M溶液、0.4mLを7つ)を2分間隔で添加した。次いで、反応物にN-トリメチルシリルイミダゾール(56.0mg、0.400mmol、0.1当量)を添加した。5分後、テトラゾール(無水アセトニトリル中0.5M溶液、21.6mL)を添加し、すぐ後に、S-(2-スルファニルエチル)ベンゼンカルボチオアート(1.04g、5.24mmol、1.31当量)を添加した。120秒間、反応を進行させた。反応物の4個の同一バッチを合わせて一つにし、トリエチルアミン40mLを含むジクロロメタン600mL中にこの溶液を注ぐことによって、反応を停止した。この混合物を、飽和重炭酸ナトリウム(800mL)、続いて10％炭酸ナトリウム(2×800mL)および塩水(800mL)を用いて直ちに洗浄した。Na2SO4を用いて有機層を乾燥させた。10〜15分後、乾燥剤をろ過によって除去した。この溶液にトリエチルアミン(40mL)を添加し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮してシロップにした。シロップをトルエン(200mL)およびトリエチルアミン(40mL)中に溶解し、この溶液を、勢いよく撹拌されたヘプタン4500mL中にピペットで分注して、ふわふわした白色生成物を沈殿させた。ヘプタンの大部分をデカントした後、中程度の焼結ガラス漏斗を通すろ過によって白色沈殿を採取し、続いて減圧下で乾燥させて、白色固形物を得た。この固形物を分取HPLC(Phenomenex Gemini C18、250×50mm、10mmカラム、水/CH3CN中0.05％水酸化アンモニウム)によって精製し、凍結乾燥させて、白色固形物として4.58gの目標化合物を得た。
2021508327.tif 000070
【０３５３】
1.3：  S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-3-(6-ベンズアミドプリン-9-イル)-1-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-7-イル]オキシ-ピロリジン-1-イル-ホスファニル]スルファニルエチル]ベンゼンカルボチオアート
2021508327.tif 000071
N-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-6-イル]プリン-6-イル]ベンズアミド(2.74g、4.00mmol、1.0当量)を60mLの無水ジクロロメタン中に溶解し、これにスパチュラ1杯分の3Åモレキュラーシーブを添加した。シリンジを用いてトリピロリジン-1-イルホスファン(960mg、3.98mmol、0.99当量)を添加し、続いて、テトラゾールの0.1mmolアリコート7つ(3Åモレキュラーシーブを加えて保存した無水アセトニトリル中0.5M溶液、0.4mLを7つ)を2分間隔で添加した。次いで、反応物に1-(トリメチルシリル)-1H-イミダゾール(56.0mg、0.400mmol、0.1当量)を添加した。5分後、テトラゾール(無水アセトニトリル中0.5M溶液、21.6mL)を添加し、すぐ後に、S-(2-スルファニルエチル)ベンゼンカルボチオアート(1.04g、5.24mmol、1.31当量)を添加した。120秒間、反応を進行させた。
【０３５４】
反応物の4個の同一バッチを合わせて一つにし、トリエチルアミン40mLを含むジクロロメタン600mL中にこの溶液を注ぐことによって、反応を停止した。この混合物を、飽和重炭酸ナトリウム(800mL)、続いて10％炭酸ナトリウム(2×800mL)および塩水(800mL)を用いて直ちに洗浄した。Na2SO4を用いて有機層を乾燥させた。10〜15分後、乾燥剤をろ過によって除去した。この溶液にトリエチルアミン(10mL)を添加し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮してシロップにした。シロップをトルエン(100mL)およびトリエチルアミン(20mL)中に溶解し、この溶液を、勢いよく撹拌されたヘプタン4500mL中にピペットで分注して、ふわふわした白色生成物を沈殿させた。ヘプタンの大部分をデカントした後、中程度の焼結ガラス漏斗を通すろ過によって白色沈殿を採取し、続いて減圧下で乾燥させて、白色固形物を得た。この固形物を分取HPLC(Phenomenex Gemini C18、250×50mm、10mmカラム、水/CH3CN中0.05％水酸化アンモニウム)によって精製し、凍結乾燥させて、白色固形物として5.26gの目標化合物を得た。
2021508327.tif 000072
【０３５５】
1.4：  S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-3-(4-ベンズアミド-5-メチル-2-オキソ-ピリミジン-1-イル)-1-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-7-イル]オキシ-ピロリジン-1-イル-ホスファニル]スルファニルエチル]ベンゼンカルボチオアート
2021508327.tif 000073
N-[1-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-6-イル]-5-メチル-2-オキソ-ピリミジン-4-イル]ベンズアミド(2.70g、4.00mmol、1.0当量)を60mLの無水ジクロロメタン中に溶解し、これにスパチュラ1杯分の3Åモレキュラーシーブを添加した。シリンジを用いてトリピロリジン-1-イルホスファン(965mg、4.00mmol、1.0当量)を添加し、続いて、テトラゾールの0.1mmolアリコート7つ(3Åモレキュラーシーブを加えて保存した無水アセトニトリル中0.5M溶液、0.4mLを7つ)を2分間隔で添加した。次いで、反応物に1-(トリメチルシリル)-1H-イミダゾール(56.0mg、0.400mmol、0.1当量)を添加した。5分後、テトラゾール(無水アセトニトリル中0.5M溶液、21.6mL)を添加し、すぐ後に、S-(2-スルファニルエチル)ベンゼンカルボチオアート(1.04g、5.24mmol、1.31当量)を添加した。120秒間、反応を進行させた。反応物の4個の同一バッチを、トリエチルアミン40mLを含むジクロロメタン600mL中にこの溶液を注ぐことによって反応を停止し、合わせて一つにした。この混合物を、飽和重炭酸ナトリウム(800mL)、続いて10％炭酸ナトリウム(2×800mL)および塩水(800mL)を用いて直ちに洗浄した。Na2SO4を用いて有機層を乾燥させた。10〜15分後、乾燥剤をろ過によって除去した。この溶液にトリエチルアミン(40mL)を添加し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮してシロップにした。シロップをトルエン(100mL)およびトリエチルアミン(30mL)中に溶解し、この溶液を、勢いよく撹拌されたヘプタン4500mL中にピペットで分注して、ふわふわした白色生成物を沈殿させた。ヘプタンの大部分をデカントした後、中程度の焼結ガラス漏斗を通すろ過によって白色沈殿を採取し、続いて減圧下で乾燥させて、白色固形物を得た。この固形物を分取HPLC(Phenomenex Gemini C18、250×50mm、10mmカラム、水/CH3CN中0.05％水酸化アンモニウム)によって精製し、凍結乾燥させて、白色固形物として2.05gの目標化合物を得た。
2021508327.tif 000074
【０３５６】
1.5：  S-[2-[[(1R,3R,4R,7S)-1-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-3-[2-[(E)-ジメチルアミノメチレンアミノ]-6-オキソ-1H-プリン-9-イル]-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-7-イル]オキシ-ピロリジン-1-イル-ホスファニル]スルファニルエチル]ベンゼンカルボチオアート
2021508327.tif 000075
N'-[9-[(1R,4R,6R,7S)-4-[[ビス(4-メトキシフェニル)-フェニル-メトキシ]メチル]-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン-6-イル]-6-オキソ-1H-プリン-2-イル]-N,N-ジメチル-ホルムアミジン(2.62mg、4.00mmol、1.0当量)を200mLの無水ジクロロメタン中に溶解し、これにスパチュラ1杯分の3Åモレキュラーシーブを添加した。シリンジを用いてトリピロリジン-1-イルホスファン(965mg、4.00mmol、1.0当量)を添加し、続いて、テトラゾールの0.1mmolアリコート7つ(3Åモレキュラーシーブを加えて保存した無水アセトニトリル中0.5M溶液、0.4mLを7つ)を2分間隔で添加した。次いで、反応物に1-(トリメチルシリル)-1H-イミダゾール(56.0mg、0.400mmol、0.1当量)を添加した。5分後、テトラゾール(無水アセトニトリル中0.5M溶液、21.6mL)を添加し、すぐ後に、S-(2-スルファニルエチル)ベンゼンカルボチオアート(1.04g、5.24mmol、1.31当量)を添加した。180秒間、反応を進行させた。
【０３５７】
4個の同一バッチを合一し、トリエチルアミン40mLを含むジクロロメタン600mL中にこの溶液を注ぐことによって反応を停止した。この混合物を、飽和重炭酸ナトリウム(800mL)、続いて10％炭酸ナトリウム(2×800mL)および塩水(800mL)を用いて直ちに洗浄した。Na2SO4を用いて有機層を乾燥させた。10〜15分後、乾燥剤をろ過によって除去した。この溶液にトリエチルアミン(40mL)を添加し、ロータリーエバポレーターを用いて濃縮してシロップにした。シロップをトルエン(100mL)およびトリエチルアミン(30mL)中に溶解し、この溶液を、勢いよく撹拌されたヘプタン4500mL中にピペットで分注して、ふわふわした白色生成物を沈殿させた。ヘプタンの大部分をデカントした後、中程度の焼結ガラス漏斗を通すろ過によって白色沈殿を採取し、続いて減圧下で乾燥させて、白色固形物を得た。この固形物を分取HPLC(Phenomenex Gemini C18、250×50mm、10mmカラム、水/CH3CN中0.05％水酸化アンモニウム)によって精製し、凍結乾燥させて、黄色固形物として3.82gの目標化合物を得た。
2021508327.tif 000076
【０３５８】
実施例2：オリゴヌクレオチド合成
Bioautomation製のMerMade12自動DNA合成装置を用いて、オリゴヌクレオチドを合成した。ユニバーサルリンカーを有する制御された多孔性ガラス支持体(500Å)を用いて、1μmolスケールで合成を行った。
【０３５９】
DNAホスホラミダイトおよびLNAホスホラミダイトのカップリングのための標準的サイクル手順において、DMT脱保護は、CH2Cl2中3％(w/v)トリクロロ酢酸200μLを30秒間3回適用して、実施した。各ホスホラミダイトを、アセトニトリル(またはLNA-MeC構成単位の場合は1：1のアセトニトリル/CH2Cl2)中0.1M溶液100μLおよび活性化剤としてのアセトニトリル中5-(3,5-ビス(トリフルオロメチルフェニル))-1H-テトラゾールの0.1M溶液110μLを用い、180秒のカップリング時間を用いて、3回カップリングした。チオ酸化のためには、1：1のアセトニトリル/ピリジンに溶かした3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオンの0.1m溶液を用いた(3×190μL、55秒)。8：1：1のTHF/ルチジン/Ac2O(CapA、75μmol)および8：2のTHF/N-メチルイミダゾール(CapB、75μmol)を用いて、55秒間、キャッピングを実施した。
【０３６０】
チオホスホラミダイトの導入のための合成サイクルは、CH2Cl2中3％(w/v)トリクロロ酢酸200μLを30秒間3回適用することによるDMT脱保護を含んだ。市販のDNAチオホスホラミダイトまたは新しく調製したLNAチオホスホラミダイトを、アセトニトリル中10％(v/v)CH2Cl2に溶かした0.15M溶液100μLおよび活性化剤としてのアセトニトリル中5-(3,5-ビス(トリフルオロメチルフェニル))-1H-テトラゾールの0.1M溶液110μLを用い、それぞれ600秒のカップリング時間を用いて、3回カップリングした。チオ酸化は、アセトニトリル/ピリジンに溶かした3-アミノ-1,2,4-ジチアゾール-5-チオンの0.1M溶液を55秒間、3回適用することによって、実施した。8：1：1のTHF/ルチジン/Ac2O(CapA、75μmol)および8：2のTHF/N-メチルイミダゾール(CapB、75μmol)を用いて、55秒間、キャッピングを実施した。
【０３６１】
自動合成が完了次第、20mM DTTを含むアンモニア(32％)：エタノール混合物(3：1、v：v)を55℃で15〜16時間用いて、核酸塩基保護基の除去および固体支持体からの切断を実施する。
【０３６２】
粗製のDMT付きオリゴヌクレオチドを、固相抽出カートリッジおよびイオン交換クロマトグラフィーを用いる再精製によって、またはC18カラムを用いたRP-HPLC精製によってのいずれかで精製し、続いて、80％酢酸水溶液を用いたDMT除去およびエタノール沈殿を行った。
【０３６３】
以下の実施例において、本発明者らは、下記のチオ結合化学構造を使用した：
2021508327.tif 000077
【０３６４】
以下の実施例において、別段の定めが無い限り、アキラルなホスホロジチオアート結合(P2Sとも呼ばれる)は、(式(IA)または(IB)において示すように)非架橋ジチオアートであり、*の印を付けている。実施例で使用される化合物には、下記の核酸塩基配列を有する化合物が含まれる：
2021508327.tif 000078
【０３６５】
上記の手順に従って、以下の分子が調製された。
2021508327.tif 000079
2021508327.tif 000080
*隣接したヌクレオチド間のジチオアート修飾
A、G、mC、Tは、LNAヌクレオチドを表す。
a、g、c、tは、DNAヌクレオチドを表す。
他のすべての結合は、ホスホロチオアートとして調製した。
【０３６６】
実施例3：有効性および細胞取込みについてのインビトロ実験
初代ラット肝細胞を96ウェルプレートに播種し、抗生物質を含まない10％FCS含有ウィリアム培地E中で処理した。細胞は、完全細胞培養培地に溶かした指定濃度のLNA溶液で処理した。それぞれ24時間および72時間のインキュベーション時間後、Ca2+およびMg2+を含むPBSで細胞を3回洗浄し、165uLのPureLink Pro溶解緩衝液を用いて溶解した。製造業者の取扱い説明書に従ってThermo Fisher製のPureLink PRO 96 RNAキットを用いて、全RNAを単離し、RnApoB用のプライマープローブセット(Invitrogen)と共にLightCyclerマルチプレックスRNAウイルスマスター(Roche)を用いて、RT-qPCRを実施した。得られたデータをRibogreenに対して標準化した。
【０３６７】
様々な化合物に対してハイブリダイゼーションに基づくELISAアッセイ法を用いて、LNAオリゴヌクレオチドの細胞内濃度を測定した。データポイントはすべて、3つ1組で行った。データは、その平均として示している。
【０３６８】
これらの結果を図1〜4に示している。
【０３６９】
実施例4：RNAおよびDNAにハイブリダイズされた、ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの熱融解(Tm)
下記のオリゴヌクレオチドを調製した。ホスホロソイアート結合は、下付き文字のSで表し、本発明によるホスホロジチオアート結合は、下付き文字のPS2で表している。
2021508327.tif 000081
化合物1〜6は、配列モチーフSEQ ID NO 1を有する。
【０３７０】
以下の手順に従って、RNAおよびDNAにハイブリダイズされた化合物1〜6の熱融解(Tm)を測定した。
【０３７１】
緩衝液(100mM NaCl、0.1mM EDTA、10mM Na2HPO4、pH7)に溶かした等モル量のRNAまたはDNAおよびLNAオリゴヌクレオチド(1.5μM)の溶液を1分間、90℃まで加熱し、次いで、室温まで放冷した。CaryシリーズUV-Vis分光光度計(加熱速度  1℃/分、読み取り速度  1回/分)を用いて、260nmでのUV吸光度を記録した。吸光度を温度に対してプロットし、各曲線の一次導関数を求めることによって、Tm値を算出した。
【０３７２】
結果を以下の表および図5にまとめる。
2021508327.tif 000082
Td：解離(変性)温度；Ta：対合(再生)温度
【０３７３】
本発明による化合物は、対照のRNAおよびDNAに対する高い親和性を保持している。
【０３７４】
実施例5：ホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドの血清安定性
雄のSprague-Dawlingラットの血清中のオリゴヌクレオチド1〜6の安定性を以下の手順に従って測定した。
【０３７５】
3：1で混合したラット血清とヌクレアーゼ緩衝液(30mM酢酸ナトリウム、1mM硫酸亜鉛、300mM NaCl、pH4.6)に溶かしたオリゴヌクレオチド溶液25μMを37℃で0時間、5時間、25時間、52時間、または74時間インキュベートした。各試料2μLを、Water Acquity BEH C18、1.7μmカラムを装備したWater Acquity UPLCによるUPLC-MS解析のために注入した。260nmで測定された類似体ピーク面積を、異なる分解長に対する伸長定数を用いて補正して使用して、未切断オリゴヌクレオチドの比率(％)を明らかにした。
【０３７６】
UPLC溶離剤：A：2.5％MeOH、0.2M HEP、16.3mM TEA  B：60％MeOH、0.2M HEP、16.3mM TEA 
2021508327.tif 000083
【０３７７】
これらの結果を図6に要約する。
【０３７８】
本発明による少なくとも1個のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を有している化合物は、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合のみを有している化合物よりも優れたヌクレアーゼ耐性を有している。
【０３７９】
化合物1〜6において5時間後に認められた初期のオリゴヌクレオチド分解は、モノチオアート不純物の存在が原因で生じることが判明した。
【０３８０】
実施例7：ジチオアート修飾ギャップマー：LNAギャップマーのギャップ領域中のジチオアートの調査
試験した化合物
2021508327.tif 000084
化合物#1〜16および参照は、SEQ ID NO 1に示される配列モチーフを有する。
大文字：β-D-オキシLNAヌクレオシド；小文字：DNAヌクレオシド；
*=アキラルなホスホロジチオアート修飾結合；他のすべての結合はホスホロチオアート。
【０３８１】
実験：ApoB mRNAを標的とする上記の化合物を、初代ラット肝細胞において、化合物濃度2μMで72時間インキュベーションし、ジムノシス取込みを利用して試験した。次いで、RT-PCRを用いて標的mRNAレベルを測定した。結果を図7に示す。
【０３８２】
図7に示す結果は、単一のアキラルなホスホロジチオアートと複数のアキラルなホスホロジチオアートのどちらもギャップ領域およびフランク領域中で受け入れられることを示す。ギャップ中で3個または4個より多いアキラルなホスホロジチオアートを使用した場合、フランク領域中で複数のアキラルなホスホロジチオアートを使用した場合と比べて、抗力が低減する傾向があり得る。
【０３８３】
実施例8：活性についての位置依存性―設計の最適化
試験した化合物
2021508327.tif 000085
化合物#1〜16および参照は、SEQ ID NO 1に示される配列モチーフを有する。
大文字：β-D-オキシLNAヌクレオシド；小文字：DNAヌクレオシド；
*=アキラルなホスホロジチオアート修飾結合；他のすべての結合はホスホロチオアート。
【０３８４】
実験：ApoB mRNAを標的とする上記の化合物を、初代ラット肝細胞において、化合物濃度2μMで72時間インキュベーションし、ジムノシス取込みを利用して試験した。次いで、RT-PCRを用いて標的mRNAレベルを測定した。結果を図8に示す。
【０３８５】
実施例9：アキラルなホスホロジチオアートギャップマーの細胞取込み
試験した化合物
2021508327.tif 000086
化合物#1〜16および参照は、SEQ ID NO 1に示される配列モチーフを有する。
大文字：β-D-オキシLNAヌクレオシド；小文字：DNAヌクレオシド；
*=アキラルなホスホロジチオアート修飾結合；他のすべての結合はホスホロチオアート。
【０３８６】
実験：ApoB mRNAを標的とする上記の化合物を、初代ラット肝細胞において、化合物濃度2μMで72時間インキュベーションし、ジムノシス取込みを利用して試験した。ハイブリダイゼーションに基づくELISAアッセイ法を用いて、オリゴヌクレオチド含有量を測定した。これらの結果を図9Aおよび図9Bに示す。
【０３８７】
例外無く、アキラルなホスホロジチオアートを含めると、細胞取込みが増大した。しかし、アキラルなホスホロジチオアート結合の位置に応じて、取込みの改良は様々であった。
【０３８８】
実施例10：ギャップマーのフランク領域中のアキラルなホスホロジチオアートの量を増加させた場合
試験した化合物(配列モチーフ=SEQ ID NO 1)
2021508327.tif 000087
大文字：β-D-オキシLNAヌクレオシド；小文字：DNAヌクレオシド；
*=アキラルなホスホロジチオアート修飾結合；他のすべての結合はホスホロチオアート。
【０３８９】
実験：ApoB mRNAを標的とする上記の化合物を、初代ラット肝細胞において、化合物濃度2μMで72時間インキュベーションし、ジムノシス取込みを利用して試験した。次いで、RT-PCRを用いて標的mRNAレベルを測定した。これらの結果を図10Aおよび図10Bに示す。
【０３９０】
ギャップマーのフランク領域にアキラルなホスホロジチオアート修飾を導入すると、例外無く、効力が顕著に増大し、IC50が3分の1〜7分の1に低下した。興味深いことに、フランク中のキラルなホスホロジチオアート修飾の数が増えると、IC50が低下する。
【０３９１】
実施例11：インビトロでの、異なる細胞型におけるアキラルなホスホロジチオアート結合の効果
試験した化合物(配列モチーフ=SEQ ID NO 3)
2021508327.tif 000088
大文字：β-D-オキシLNAヌクレオシド；小文字：DNAヌクレオシド；
*=アキラルなホスホロジチオアート修飾結合；他のすべての結合はホスホロチオアート。
【０３９２】
Malat-1を標的とする上記の化合物を、3種のインビトロ細胞系、すなわちヒト初代骨格筋、ヒト初代気管支上皮細胞、およびマウス線維芽細胞(LTK細胞)において、化合物効力(IC50)を測定するための濃度範囲で、72時間のジムノシス取込みを利用して試験した。
【０３９３】
LTK細胞の濃度範囲：50μM、1/2 log希釈、8種類の濃度。
【０３９４】
qPCRを用いてMalat1のRNAレベルを定量し(GAPDHレベルに対して標準化)、IC50値を測定した。
【０３９５】
IC50の結果を図11に示す。アキラルなホスホロジチオアートの導入は、骨格筋細胞では、信頼性が高い効力増大を実現し、マウス線維芽細胞では、通常、効力の改良をもたらした。ヒト気管支上皮細胞における効果は、化合物に特有である傾向が高かったが、一部の化合物(#5)は、参照化合物よりも効力が著しく強かった。
【０３９６】
実施例12：5'末端および3'末端を保護されたLNAオリゴヌクレオチドのインビトロでのラット血清中安定性
試験した化合物(配列モチーフ=SEQ ID NO 1)
2021508327.tif 000089
大文字：β-D-オキシLNAヌクレオシド；小文字：DNAヌクレオシド；
*=アキラルなホスホロジチオアート修飾結合；他のすべての結合はホスホロチオアート。
【０３９７】
実験―実施例5を参照されたい。
【０３９８】
これらの結果を図12に示す。本発明者らは、50％という親オリゴヌクレオチド#1の急速な切断によって示されるように、LNAホスホロチオアートオリゴヌクレオチドの3'末端が、これまで考えられていたよりも血清ヌクレアーゼの影響を受けやすいこと、およびこのことが、オリゴヌクレオチドの3'末端のホスホロチオアート結合のキラリティーに関係しているらしいことを確認した。アキラルなホスホロジチオアートで5'末端を保護すると、保護が改良された。アキラルなホスホロジチオアートで3'末端を保護すると、ラット血清エキソヌクレアーゼからの完全な保護が実現した―化合物#4〜8について認められるわずかな低下は、モノチオアート不純物に相関があった。
【０３９９】
したがって、アキラルなホスホロチオアート結合によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの5’末端および/または3'末端の保護は、立体的にランダムなホスホロチオアートおよび立体定義されたホスホロチオアートに伴う不安定性という主な問題に対する解決法を与えるとみなされる。
【０４００】
実施例13：フランク中にアキラルなホスホロジチオアート結合を有するギャップマーのインビボでの評価
試験した化合物(配列モチーフ=SEQ ID NO 1)
2021508327.tif 000090
大文字：β-D-オキシLNAヌクレオシド；小文字：DNAヌクレオシド；
*=アキラルなホスホロジチオアート修飾結合；他のすべての結合はホスホロチオアート。
下線を引いた太字のヌクレオシドは、3'の位置で、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合によって連結されていることに留意されたい。化合物#7は、SSRSSRSR(S=Sp、R=Rp)のギャップ領域中に立体定義されたモチーフを有する。化合物#9の骨格モチーフ=RRSPRSSPSPSS(式中、S=Sp、R=Rp、およびP=アキラルなPS2結合(*))。
【０４０１】
実験：ApoBを標的とする上記の化合物を、1mg/kgの静脈内単一用量を用いて、雌C57BL/6JBomマウスに投与し、7日目に犠死させた(n=5)。肝臓におけるmRNA減少をRT-PCRを用いて測定し、これらの結果を図13に示す。
【０４０２】
これらの結果から、通常、アキラルなホスホロジチオアートヌクレオシド間結合の導入は、効力の改良を実現し、特に、フランク領域中にアキラルなホスホロジチオアート結合を有する化合物はどれも、効力の改良を示すことが示される。インビトロ実験で示したように、agap領域中での複数のホスホロジチオアート結合の使用(#8)は、効力を著しく失うことなく、受け入れられた。ギャップ領域中に立体定義されたホスホロチオアート結合を含みフランク中にアキラルなホスホロジチオアート結合を含むギャップマー設計の複合効果は、これらの結合技術をアンチセンスオリゴヌクレオチドと組み合わせた場合の相乗作用を例示しており、特に興味深い。
【０４０３】
実施例14：フランクおよびギャップ領域が修飾された、アキラルなホスホロジチオアートを有するギャップマーの、肝臓におけるインビボ組織含有量
【０４０４】
化合物および実験―実施例13を参照されたい。組織含有量についての結果(犠死させた動物から得た肝臓試料および腎臓試料中の含有量を測定するためのハイブリダイゼーションに基づくELISAによって測定)を図14Aおよび14Bに示す。化合物#1については実験誤差があったことに留意されたい―図14Bのデータを参照されたい。
【０４０５】
結果：図14A。アキラルなホスホロジチオアート結合を含むアンチセンスオリゴヌクレオチドはどれも、参照化合物と比べて組織取込み/含有量が多かった。図14Bは、アキラルなホスホロジチオアート結合の導入によって、試験したすべての化合物の(肝臓/腎臓比に基づいて決定される)体内分布が増大したことを示す。
【０４０６】
実施例15：インビボ実験の代謝産物の解析
化合物および実験―実施例13を参照されたい。代謝産物の解析は、C. Husser et al., Anal. Chem. 2017, 89, 6821で開示されている方法を用いて実施した。
【０４０７】
これらの結果を図15Aおよび図15Bに示す。ホスホロジチオアート修飾は、インビボでの3’エキソヌクレアーゼによる分解を効率的に防ぐ。いくらかのエンドヌクレアーゼ切断は残っている(注意：試験した化合物#1〜6はいずれもDNAホスホロチオアートギャップ領域を有しており、したがってこのことは予想された)。優れたエキソヌクレアーゼ保護を前提として、アンチセンスオリゴヌクレオチド内でのアキラルなホスホロジチオアート結合の使用は、エンドヌクレアーゼ切断を防止または制限するために使用され得るといえる。アキラルなホスホロジチオアートの増強されたヌクレアーゼ耐性は、注目すべき薬理学的利益、例えば、増強された活性および長期の作用持続期間、ならびにおそらくは、有毒な分解産物の回避をもたらすと予想される。
【０４０８】
実施例16：インビボ―長期の肝臓活性(ApoB)
試験した化合物(配列モチーフ=SEQ ID NO 1)：
2021508327.tif 000091
大文字：β-D-オキシLNAヌクレオシド；小文字：DNAヌクレオシド；
*=アキラルなホスホロジチオアート修飾結合；他のすべての結合はホスホロチオアート。
下線を引いた太字のヌクレオシドは、3'の位置で、立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合によって連結されていることに留意されたい。化合物#3は、SSRSSRSR(S=Sp、R=Rp)のギャップ領域中に立体定義されたモチーフを有する。化合物#2の骨格モチーフ=RRSSRSSRSRSS(式中、S=Sp、R=Rp、およびP=アキラルなPS2結合(*))。
【０４０９】
実験：実施例13の場合のように行う。ただし、7日目または21日目に犠死させた。これらの結果を図16に示す。ホスホロチオアート参照化合物と比べて、アキラルなホスホロジチオアートを導入することにより、肝臓中での作用持続期間が長くなり、これは、21日目時点の組織含有量が多いことと相関関係があった。注目すべきことには、ホスホロジチオアートで連結されたフランク領域とギャップ領域中の立体定義されたホスホロチオアート結合とを組み合わせることにより、長期の効力および作用持続時間に関するさらなる利益がもたらされた。このこともやはり、アンチセンスオリゴヌクレオチドにおいてアキラルなホスホロジチオアートヌクレオシド間結合と立体定義されたホスホロチオアート結合とを組み合わせることの顕著な相乗作用を強調するものである。
【０４１０】
実施例17：Malat-1を標的とするアキラルなホスホロジチオアート修飾ギャップマーを用いたインビボ研究
試験した化合物(配列モチーフ=SEQ ID NO 3)
2021508327.tif 000092
大文字：β-D-オキシLNAヌクレオシド；小文字：DNAヌクレオシド；
*=アキラルなホスホロジチオアート修飾結合；他のすべての結合はホスホロチオアート。
【０４１１】
実験：
インビトロ：マウスLTK細胞を用いて、インビトロの濃度用量反応曲線を明らかにした―MALAT-1 mRNA阻害の測定。
【０４１２】
インビボ：マウス(C57/BL6)に、用量15mg/kgのオリゴヌクレオチドを1日目、2日目、および3日目に3回、皮下投与した(n=5)。8日目にマウスを犠死させ、肝臓、心臓、腎臓、脾臓、および肺におけるMALAT-1 RNAの減少および組織含有量を測定した。親化合物は、2種の用量3×15mg/kgおよび3×30mg/kgで投与した。
【０４１３】
結果：インビトロの結果を図17に示す―フランク中に1個、2個、3個、および4個のアキラルなホスホロジチオアートを有する化合物は、インビトロで効力が著しく強いことが判明した。フランク中に5個のアキラルなホスホロジチオアートを有する化合物#7は、フランク中に1〜4個のアキラルなホスホロジチオアートを有するものよりも低い効力を有することが判明した。インビボ研究のために、効力が最も強い化合物#1、2、および6を選択した。インビボの結果を図17Bに示す(心臓)―これは、アキラルなホスホロジチオアート化合物が、心臓においてMALAT-1をノックダウンする効力が参照化合物の約2倍強かったことを示している。注目すべきことには、アンチセンスオリゴヌクレオチドの2つの3’末端ヌクレオシドの間にアキラルなホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を使用すると、5'末端が保護された同等のオリゴヌクレオチドよりも著しい改良がもたらされた。
【０４１４】
図17Cは、インビボ研究による組織含有量解析の結果を示す。アキラルなホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を含む3種のオリゴヌクレオチドはどれも、肝臓中での組織含有量が多かった。ジチオアートは、心臓および肝臓では含有量が同様であるか、または多く、腎臓では含有量が少ないという結果になり、やはり、PS修飾アンチセンスオリゴヌクレオチドより優れていることが示される。注目すべきことには、心臓での組織含有量については、化合物1のみが多かったことから、増強されたインビボ効力は、組織含有量の結果ではなく、より高い特異的活性の結果であり得ることが示唆された。
【０４１５】
実施例18：試験したアキラルなモノホスホチオアート修飾は、アキラルなホスホロジチオアート結合によって認められる移動可能な利益をもたらさない
試験した化合物(配列モチーフ=SEQ ID NO 1)
2021508327.tif 000093
大文字：β-D-オキシLNAヌクレオシド；小文字：DNAヌクレオシド；
■=3'-Sホスホロチオアート結合、他のすべての結合はホスホロチオアート。†=5'-Sホスホロチオアート結合、他のすべての結合はホスホロチオアート。
【０４１６】
この研究では、本発明者らは、ApoBを標的とする3'S修飾ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドギャップマーまたは5’S修飾ホスホロチオアートオリゴヌクレオチドギャップマーの系列を合成した―骨格結合中の硫黄の位置決めにより、アキラルなヌクレオシド間結合が生じる。合成方法については、WO2018/019799を参照されたい。
【０４１７】
これらの化合物を、以前に説明したようにインビトロで試験した―例えば、実施例8を参照されたい。
【０４１８】
これらの結果を図18Aに示す：これらの結果は、場合によっては化合物が効力を保持する場合もあるものの、通常、アキラルなモノホスホロチオアートは化合物の効力にとって不利益であったことを示す。これは、細胞含有量(図18B)と相関があると思われる。
【０４１９】
実施例19：キラルなホスホロジチオアート修飾は、アンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーに利益をもたらすことができる
試験した化合物(配列モチーフ=SEQ ID NO 1)
2021508327.tif 000094
大文字：β-D-オキシLNAヌクレオシド；小文字：DNAヌクレオシド；
◆=キラルなホスホロジチオアート結合；他のすべての結合はホスホロチオアートである。
【０４２０】
この研究では、本発明者らは、ApoBを標的とする立体的にランダムでキラルなホスホロジチオアートオリゴヌクレオチドギャップマーの系列を合成した―骨格結合中の硫黄の位置決めにより、キラルなヌクレオシド間結合が生じる。
【０４２１】
これらの化合物を、以前に説明したようにインビトロで試験した―例えば、実施例8を参照されたい。
【０４２２】
これらの結果を図19Aに示す。これらの結果は、一部の位置において、キラルなホスホロジチオアート化合物は参照化合物と同じくらい効力が強かったことを示し、このことから、キラルなホスホロジチオアートはアンチセンス機能性と両立しないわけではなかった―ただし、利益は化合物特異的であった(すなわち、移動可能ではないと思われる)ことが示唆された。同様の図が細胞取込みに関して認められるが(図19B)、アンチセンス活性と細胞取込みの間に相関関係はないようである。
【０４２３】
実施例20：Htra-1を標的とするアキラルなホスホロジチオアート修飾ギャップマーを用いたインビボ研究
試験した化合物
化合物はどれも、配列TATttacctggtTGTT(SEQ ID NO 4)を有する(式中、大文字はβ-D-オキシLNAヌクレオシドであり、小文字はDNAヌクレオシドである)。下記の表において、骨格モチーフは、各ヌクレオシド間結合についての骨格修飾のパターンを表し、5’ジヌクレオチドの間の結合から始まり3'ジヌクレオチド間のヌクレオシド間結合で終わる(左から右)。X=立体的にランダムなホスホロチオアートヌクレオシド間結合、P=アキラルなホスホロジチオアート(*)、S=Sp立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合、R=Rp立体定義されたホスホロチオアートヌクレオシド間結合。
2021508327.tif 000095
2021508327.tif 000096
2021508327.tif 000097
【０４２４】
実験：
ヒト膠芽腫U251細胞株をECACCから購入し、供給業者によって推奨されているように、37℃、5％CO2の加湿インキュベーター中で維持した。アッセイ法のために、ウェル当たり15000個のU251細胞を、飢餓培地(10％の代わりに1％のFBSであることを除いて、供給業者によって推奨される培地)を入れた96マルチウェルプレートに播種した。PBS中に溶解したオリゴヌクレオチドを添加する前に、細胞を24時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの濃度：5μM、1μM、および0.2μM。オリゴヌクレオチドの添加後4日目に、細胞を採取した。PureLink Pro 96 RNA精製キット(Ambion、製造業者の取扱い説明書に従う)を用いてRNAを抽出した。次いで、M-MLT逆転写酵素、ランダムデカマーRETROscript、RNアーゼ阻害剤(Ambion、製造業者の取扱い説明書に従う)を100mM dNTPセットPCRグレード(Invitrogen)およびDNアーゼ/RNアーゼフリー水(Gibco)と共に用いて、cDNAを合成した。遺伝子発現解析のために、TagMan Fast Advancedマスターミックス(2×)(Ambion)をダブレックス設定で用いてqPCRを実施した。次のTaqManプライマーアッセイ法をqPCRのために使用した： Life Technologies社製のHTRA1、Hs01016151_m1(FAM-MGB)、およびハウスキーピング遺伝子、TBP、Hs4326322E(VIC-MGB)。EC50測定はGraph Pad Prism6において行った。表中のHTRA1 mRNA相対的発現レベルは、対照(PBSで処置した細胞)に対する比率(％)として示している。
【０４２５】
結果：
2021508327.tif 000098
2021508327.tif 000099
2021508327.tif 000100
【０４２６】
実施例21：TNFRSF1Bエクソン7スキッピングを標的とするLNAミクスマーにおけるPS2ウォーク
本発明者らは、ミクスマー(13’mer)SSO#26を用いたTNFRSF1Bエクソン7のスキッピングが、TNFRSF1Bのイントロン6-エクソン7の3’スプライス部位を標的とする際に大いに効果的であることを以前に確認している(背景の情報についてはWO2008131807およびWO2007058894を参照されたい)。
【０４２７】
この実験は、式(IA)または(IB)のホスホロジチオアート結合(PS2)の存在が、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドのスプライス調節活性をさらに高めるにあたって有用であり得るかどうかを明らかにするために行った。この効果を明らかにするために、本発明者らは、親オリゴヌクレオチドSSO#26の様々な位置に式(IA)または(IB)のホスホロジチオアート結合を導入し、以下の化合物を合成した(下記の表)。
【０４２８】
試験した化合物：親オリゴヌクレオチド(SSO#26)のジチオアート修飾オリゴヌクレオチド。式((IA)または(IB))のホスホロジチオアートヌクレオシド間結合を*で印を付けた位置に導入した。他のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオアートヌクレオシド間結合であり(立体的にランダム)、大文字はβ-D-オキシLNAヌクレオシドを表し、LNA Cは5-メチル-シトシンであり、小文字はDNAヌクレオシドを表す。
2021508327.tif 000101
【０４２９】
実験：
Colo 205細胞(ヒト結腸直腸の腺癌)におけるオリゴヌクレオチド取込みおよびエクソンスキッピングを、2種の異なる濃度(5μMおよび25μM)におけるジムノシス取込みに基づいて解析した。細胞を96ウェルプレート(ウェル1つ当たり細胞25,000個)に播種し、オリゴヌクレオチドを添加した。オリゴヌクレオチド添加後3日目に、Qiagen装置を用いて96ウェルプレートから全RNAを単離した。スプライススイッチングの比率(％)を、エクソン6〜8接合部(エクソン7スキッピング)にまたがるFAM標識プローブを用いて液滴デジタルPCR(BioRad)によって解析し、TNFRSF1B(野生型およびエクソン7スキップ型)の総量を、HEX標識プローブおよびエクソン2〜3にまたがるIDT製プライマーを用いて解析した。ホスホロジチオアート結合の存在は、オリゴヌクレオチドがエクソンスキッピングを導入する能力に対して効果を有している(図20)。5μMでは、最も抗力の強いPS2オリゴヌクレオチドは、エクソンスキッピングを2倍よりも多く増やし、親(SSO#26)は約10％のエクソンスキッピングを示す場合、SSO#25は、20％よりも多いエクソン7スキッピングを示す。25μMでは、最も抗力の強いオリゴヌクレオチドは、60％よりも多いエクソンスキッピングに達し(SSO#7)、やはり、親と比べて2倍よりも多い。すべてのDNAヌクレオチドがホスホロチオアート修飾(PS)の代わりにジチオアート修飾(PS2)を有しているオリゴヌクレオチドSSO#22は、親と比べて活性の増大を示し、5μMでは3番目に抗力の強いオリゴヌクレオチドであり、25μMでは2番目に抗力の強いスプライススイッチングオリゴヌクレオチドである(図20)。しかし、LNAヌクレオシド間のすべての結合をPS2結合で交換すると(SSO#16)、親オリゴヌクレオチドと比べてスプライススイッチングの効力が低下した(図20)。さらに、ある種の位置にPS2を導入することは、エクソンスキッピング活性にとって有益ではない可能性があること、ならびにSSO#1、SSO#9、SSO#11、SSO#12、およびSSO#14は、5μMの低濃度では、顕著なスプライススイッチング活性を示さないが、いずれも高濃度では有効であったことが明らかである(図20)。本実施例は、PS2結合がスプライス調節オリゴヌクレオチドと共存できることを示し、さらに、LNAミクスマーのようなミクスマーオリゴヌクレオチド内で、DNAヌクレオシドに隣接してまたは隣接したDNAヌクレオシド間にPS2結合を導入する際の明らかな利益―これらの設計は、スプライシングを調節するにあたって著しく効果的であった―を強調するものである。
【０４３０】
材料および方法
液滴デジタルPCRによってTNFRSF1Bエクソン7スキッピングを検出するためのアッセイ法
2021508327.tif 000102
【０４３１】
TNFRSF1Bの総量を調べるためのアッセイ法
IDTアッセイ法  エクソン2〜3にまたがるHs.PT.58.40638488
【０４３２】
実施例22：ホスホロジチオアート修飾を含むミクスマーオリゴの安定性
親(SSO#26)の3種のジチオアート修飾オリゴヌクレオチドを、S1ヌクレアーゼ(表2)を用いる安定性アッセイ法のために選択した。選択したオリゴヌクレオチドを、1×S1ヌクレアーゼ緩衝液および製造業者の取扱い説明書に従う10UのS1ヌクレアーゼ(Invitrogen、カタログ番号18001-016)を含む反応緩衝液100μL中で、濃度25μM、37℃で30分または2時間、インキュベートした。この100μL反応混合物に500mM EDTA溶液2μLを添加することによって、S1ヌクレアーゼ反応を停止した。この反応混合物のうちの2.5μLをNovex(商標)TBE-尿素 2×試料緩衝液(LC6876 Invitrogen)中で希釈し、Novex(商標)15％TBE-尿素ゲル(EC6885BOX、Invitrogen)上に載せた。ゲルを180Vで約1時間泳動し、その後、SYBR金染色(S11494、Invitrogen)およびChemiDoc(商標)Touch Imaging System (BIO-RAD)を用いてゲル像を取得した。
【０４３３】
30分および120分のS1ヌクレアーゼインキュベーションを用いて、PS2を含むオリゴヌクレオチドの安定性を試験した。PS2結合の位置は、安定性に影響を与えており、DNAヌクレオチドに対して3'にPS2が存在する場合(SSO#14)、最も影響が大きい(図21)。30分間のS1ヌクレアーゼとのインキュベーションの後、親オリゴヌクレオチドはほとんど分解しているのに対し、PS2修飾オリゴは、13'merに相当する強いバンドを示している。さらに、SSO#14は、分解産物に相当するバンドをより強く示すことから、S1ヌクレアーゼによる初期の切断の後でさえ、残存するオリゴが安定していることが示唆される(図21、レーン5+9)。
【０４３４】
これらのデータから、ミクスマーオリゴヌクレオチドのようなオリゴヌクレオチド中に導入された場合のホスホロジチオアートの存在によって、エンドヌクレアーゼ活性からの保護がもたらされ―驚くべきことに、これは、本実験によって実際に示されるようにオリゴヌクレオチドの有効性を維持しつつ達成され、スプライシング調節活性が著しく向上し得ることが示される。LNAヌクレオシドおよびDNAヌクレオシドを含むミクスマーを用いて本明細書において例示されるように、ミクスマーオリゴヌクレオチド中の、DNAヌクレオシドに隣接したまたはDNAヌクレオシド間のPS2結合は、エンドヌクレアーゼ安定性を増強すると考えられる。したがって、ミクスマー(例えば、SSOまたはantimiR)のようなアンチセンスオリゴヌクレオチド中で使用するために、連続したDNAヌクレオシド間にPS2結合を使用することが有益であると考えられる。このような利益はまた、LNAまたはMOEなどの2’糖修飾ヌクレオシドが(それぞれ)5’または3’に隣接しているDNAヌクレオシドに隣接した5’または3’のPS2結合を用いることによってももたらされ得る。
【０４３５】
したがって、本発明は、スプライス調節またはマイクロRNA阻害など占拠することに基づくメカニズムにおいて使用するために改良されたアンチセンスオリゴヌクレオチドもさらに提供する。
【図１】
2021508327.tif 000115
【図２】
2021508327.tif 000116
【図３】
2021508327.tif 000117
【図４】
2021508327.tif 000118
【図５】
2021508327.tif 000119
【図６】
2021508327.tif 000120
【図７】
2021508327.tif 000121
【図８】
2021508327.tif 000122
【図９Ａ】
2021508327.tif 000123
【図９Ｂ】
2021508327.tif 000124
【図１０Ａ】
2021508327.tif 000125
【図１０Ｂ】
2021508327.tif 000126
【図１１】
2021508327.tif 000127
【図１２】
2021508327.tif 000128
【図１３】
2021508327.tif 000129
【図１４Ａ】
2021508327.tif 000130
【図１４Ｂ】
2021508327.tif 000131
【図１５Ａ】
2021508327.tif 000132
【図１５Ｂ】
2021508327.tif 000133
【図１６】
2021508327.tif 000134
【図１７Ａ】
2021508327.tif 000135
【図１７Ｂ】
2021508327.tif 000136
【図１７Ｃ】
2021508327.tif 000137
【図１８Ａ】
2021508327.tif 000138
【図１８Ｂ】
2021508327.tif 000139
【図１９Ａ】
2021508327.tif 000140
【図１９Ｂ】
2021508327.tif 000141
【図２０】
2021508327.tif 000142
【図２１】
2021508327.tif 000143
【配列表】
2021508327000001.app
【国際調査報告】
2021508327.tif 000144
2021508327.tif 000145
2021508327.tif 000146
2021508327.tif 000147