(57)【要約】  本明細書は、哺乳動物が疾患（例えば、がん）を有すると特定するために使用することができるバイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）を同定するための方法及び材料を提供する。本明細書はまた、がんを同定及び／または治療するための方法及び材料も提供する。例えば、本明細書は、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）ポリペプチドに由来する１つ以上のペプチドフラグメントを使用して、哺乳類が、がん（例えば、卵巣癌）を有すると同定する方法及び材料を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
卵巣癌の治療方法であって、
哺乳動物から得られた血液試料中のペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）ポリペプチドに由来するペプチドフラグメントを含む１つ以上のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルを検出すること；および
前記哺乳動物に１つ以上のがん治療を施すこと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記１つ以上のがん治療が、手術、化学療法、ホルモン療法、標的療法、放射線療法、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
哺乳動物が卵巣癌を有すると同定する方法であって、
前記哺乳動物から得られた血液試料中のペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）ポリペプチドに由来するペプチドフラグメントを含む１つ以上の血液ペプチドバイオマーカーのレベルを検出すること；および
前記１つ以上の血液ペプチドバイオマーカーの上昇したレベルが前記血液試料で検出された場合に、前記哺乳動物を卵巣癌と診断すること
を含む、前記方法。
【請求項４】
前記哺乳動物がヒトである、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記血液試料が血漿試料である、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＰＰＩＡペプチドフラグメントがアミノ酸配列ＶＳＦＥＬＦＡＤＫ（配列番号１）を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＰＩＡペプチドフラグメントがアミノ酸配列ＦＥＤＥＮＦＩＬＫ（配列番号２）を含む、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
ペプチドバイオマーカーを同定する方法であって、
疾患血液試料中に存在するポリペプチドを消化して、疾患ペプチドフラグメントを得ること；
前記疾患ペプチドフラグメントを第１の重同位元素で標識して、標識された疾患ペプチドフラグメントを得ること；
参照血液試料中に存在するポリペプチドを消化して、参照ペプチドフラグメントを得ること；
前記参照ペプチドフラグメントを第２の重同位元素で標識して、標識された参照ペプチドフラグメントを得ること；および
前記標識された疾患ペプチドフラグメント及び前記標識された参照ペプチドフラグメントを質量分析に供してペプチドバイオマーカーを前記同定すること
を含み、ここで、前記ペプチドバイオマーカーのレベルは、前記標識された参照ペプチドフラグメントと比較して、前記標識された疾患ペプチドフラグメントにおいて上昇している、前記方法。
【請求項９】
前記疾患血液試料が、前記疾患を有する１以上の哺乳動物由来の血液を含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記疾患血液試料が、前記疾患を有する複数の哺乳動物由来の血液を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記参照血液試料が、１以上の健康な哺乳動物由来の血液を含む、請求項８から１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記参照血液試料が、複数の健康な哺乳動物由来の血液を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記方法が、各試料から１つ以上の非常に豊富な血液タンパク質を枯渇させることをさらに含む、請求項８から１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
前記非常に豊富な血液タンパク質が、アルブミン、ＩｇＧ、α１−アンチトリプシン、ＩｇＡ、ＩｇＭ、トランスフェリン、ハプトグロビン、α２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、補体Ｃ３、α１−酸性糖タンパク質、アポリポタンパク質Ａ−Ｉ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｂ、及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記方法が、各消化工程の前に、各試料中の糖タンパク質を濃縮することをさらに含む、請求項８から１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
前記質量分析が、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を使用して行われる、請求項８から１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
ペプチドバイオマーカーのバリデーション方法であって、
前記ペプチドバイオマーカーを含む複数のペプチドを塩基性ｐＨ逆相液体クロマトグラフィー（ｂＲＰＬＣ）に供して、複数の画分を得ること；
前記複数の画分を複数の画分群に編成することであって、前記画分の数が前記画分群の数よりも多い、編成すること；
酸性ｐＨで直交高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により各画分群のペプチドバイオマーカーを分離し、連続的なＨＰＬＣ溶出液を得ること；および
前記ペプチドバイオマーカーの強度を決定するために、前記ペプチドバイオマーカーの事前最適化された遷移及び事前最適化された滞留時間を含む選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）法を使用して前記連続的なＨＰＬＣ溶出液を分析すること
を含み、ここで、前記ペプチドバイオマーカーは、前記ペプチドバイオマーカーが、前記ＳＲＭ法を使用して参照試料と比較した疾患試料における上昇したレベルで検出及び定量化される場合に確認される、前記方法。
【請求項１８】
ペプチドバイオマーカーの同定及びバリデーション方法であって、
Ａ．  候補ペプチドバイオマーカーを同定することであって、前記同定することが：
ｉ．  疾患血液試料中に存在するポリペプチドを消化して、疾患ペプチドフラグメントを得ること；
ｉｉ．  前記疾患ペプチドフラグメントを第１の重同位元素で標識して、標識された疾患ペプチドフラグメントを得ること；
ｉｉｉ．  参照血液試料中に存在するポリペプチドを消化して、参照ペプチドフラグメントを得ること；
ｉｖ．  前記参照ペプチドフラグメントを第２の重同位元素で標識して、標識された参照ペプチドフラグメントを得ること；および
ｖ．  前記標識された疾患ペプチドフラグメント及び前記標識された参照ペプチドフラグメントを質量分析に供して候補ペプチドバイオマーカーを同定すること、を含み、
ここで、前記候補ペプチドバイオマーカーのレベルは、前記標識された参照ペプチドフラグメントと比較して、前記標識された疾患ペプチドフラグメントにおいて上昇している、
前記同定すること、
Ｂ．  ＳＡＦＥ−ＳＲＭ法を構築することであって、前記構築することが：
ｉ．  前記候補ペプチドバイオマーカーを合成すること；
ｉｉ．  前記合成候補ペプチドバイオマーカーを質量分析に供して、候補ペプチドバイオマーカーの遷移を決定することであって、前記遷移が、最も強い強度を有する前駆体プロダクトイオンのペアを同定し、前記前駆体プロダクトイオンのペアを生成する衝突エネルギー（ＣＥ）を同定することによって決定される、前記決定すること；
ｉｉｉ．  前記候補ペプチドバイオマーカーを含む複数のペプチドを塩基性ｐＨ逆相液体クロマトグラフィー（ｂＲＰＬＣ）に供して、複数の画分を得ることであって、前記複数が本質的に等量の各ペプチドからなる、前記得ること；
ｉｖ．  前記複数の画分を複数の画分群に編成することであって、前記画分の数が前記画分群の数よりも多い前記編成すること；
ｖ．  前記候補ペプチドバイオマーカーの遷移及び固定滞留時間を使用して、前記画分群のそれぞれにおける前記候補ペプチドバイオマーカーの強度を決定すること：および
ｖｉ．  高ｐＨでのそれらの疎水性に従って前記遷移を再構築することにより、前記滞留時間を最適化すること、
を含む、前記構築すること、
Ｃ．  前記候補ペプチドバイオマーカーを確認することであって、前記確認することが：
ｉ．  前記疾患血液試料中の前記候補ペプチドバイオマーカーを定量化することであって、前記定量化することが：
ａ．  前記候補ペプチドバイオマーカーを含む前記疾患ペプチドフラグメントをｂＲＰＬＣに供して、複数の画分を得ること；
ｂ．  前記複数の画分を複数の画分群に編成することであって、前記画分の数が前記画分群の数よりも多い、前記編成すること；
ｃ．  酸性ｐＨで直交ＨＰＬＣにより各画分群のペプチドを分離し、連続的なＨＰＬＣ溶出液を得ること；および
ｄ．  前記候補ペプチドバイオマーカーの遷移及び前記最適化された滞留時間を含むＳＲＭ法を使用して前記連続的なＨＰＬＣ溶出液を分析すること；を含む、前記定量化することと、
ｉｉ．  前記参照血液試料中の前記候補ペプチドマーカーを定量化することであって、前記定量化することが：
ａ．  前記参照ペプチドフラグメントをｂＲＰＬＣに供して、複数の画分を得ること；
ｂ．  前記複数の画分を複数の画分群に編成することであって、前記画分の数が前記画分群の数よりも多い、前記編成すること；
ｃ．  酸性ｐＨで直交ＨＰＬＣにより各画分群のペプチドを分離し、連続的なＨＰＬＣ溶出液を得ること；および
ｄ．  前記候補ペプチドバイオマーカーの遷移及び前記最適化された滞留時間を含む前記ＳＲＭ法を使用して前記連続的なＨＰＬＣ溶出液を分析すること；を含む、前記定量化することと、
ｉｉｉ  前記候補ペプチドバイオマーカーが、前記参照試料と比較して、前記疾患試料において上昇したレベルで定量化された場合に、前記候補ペプチドバイオマーカーを確認すること、
を含む、前記確認すること、
を含む、前記方法。
【請求項１９】
前記合成候補ペプチドバイオマーカーが重同位元素で標識されていない、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ペプチドバイオマーカーの前記最適化された滞留時間が、対象から得られた試料にスパイクされて存在する合成バイオマーカーペプチドを使用して決定される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記最適化されたペプチドバイオマーカーの滞留時間が、前記ペプチドバイオマーカーの強度に反比例する、請求項１７から２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＨＰＬＣが、質量分析計に結合された装置で行われる、請求項１７から２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記質量分析計がトリプル四重極質量分析計である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記衝突エネルギーが、データセットＳ５に記載されている衝突エネルギーのうちのいずれか１つである、請求項１７から２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記滞留時間が、データセットＳ５に記載されている滞留時間のうちのいずれか１つである、請求項１７から２３のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月２０日に出願された米国特許出願連続番号第６２／５８８，６５４号の権益を主張する。先行出願の開示は、本出願の開示の一部とみなされる（参照により組み込まれる）。
【０００２】
１．技術分野
本明細書は、哺乳動物が疾患（例えば、がん）を有すると特定するために使用することができるバイオマーカー（例えば、ペプチドバイオマーカー）を同定するための方法及び材料を提供する。本明細書はまた、がんを同定及び／または治療するための方法及び材料も提供する。例えば、本明細書は、ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）ポリペプチドに由来する１つ以上のペプチドフラグメントを使用して、哺乳類が、がん（例えば、卵巣癌）を有すると同定する方法及び材料を提供する。
【背景技術】
【０００３】
２．背景情報
本年、２５万人近くの女性が卵巣癌と診断され、１４万人以上の女性がその疾患で死亡する（Ｈｏｗｌａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４  ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，  １９７５−２０１１  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ））。卵巣癌が診断され、早期に、すなわち癌が卵巣外に広がる前に治療される場合、５年間の相対生存率は９０％を超える（Ｈｏｗｌａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４  ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，  １９７５−２０１１  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ））。しかしながら、そのような早期で発見されるのは全卵巣癌の１５％にすぎず、がんが後期で発見された患者の予後は悲惨である（Ｈｏｗｌａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４  ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，  １９７５−２０１１  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ））。したがって、卵巣癌を早期に発見できる可能性のあるバイオマーカーの開発の必要性が広く認識されている。このような検出のために、ＣＡ−１２５またはＨＥ−４などの従来のバイオマーカーを使用すること、または超音波を使用することの試みが数多く存在してきた（Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９２：１２１４−１２２１；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ９：５５５−５６６；Ｓｃｈｏｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  Ｂｉｏｍａｒｋｅｒｓ  Ｍｅｄ  １：５１３−５２３；及びＶａｎ  Ｇｏｒｐ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １０４：８６３−８７０）。いくつかは可能性を示すが、そのいずれも、「がんを患っていない女性への主要な外科的介入を含む重大な危害」を頻繁にもたらすため、ＵＳ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｔａｓｋ  Ｆｏｒｃｅによるスクリーニングには推奨されない（Ｍｏｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１２  Ａｎｎ  Ｉｎｔｅｒｎ  Ｍｅｄ  １５７：９００−９０４）。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本明細書は、がんを同定及び／または治療するための方法と材料を提供する。場合によっては、本明細書は、１つ以上のＰＰＩＡペプチドフラグメントを使用して、哺乳類ががん（卵巣癌など）を有すると同定するための材料及び方法を提供する。例えば、試料（例えば、血液試料などの非侵襲性試料）中の１つ以上のＰＰＩＡペプチドフラグメントの上昇したレベルを使用して、哺乳動物が卵巣癌を有すると同定することができる。例えば、１つ以上の循環ペプチドバイオマーカー（例えば、１つ以上のＰＰＩＡペプチドフラグメント）の上昇レベルに少なくとも部分的に基づいて、がん（例えば、卵巣癌）を有すると同定された哺乳動物は、１つ以上のがん治療で治療することができる。
【０００５】
本明細書はまた、哺乳動物ががんを有すると同定するためのバイオマーカーとして使用され得るペプチドバイオマーカー（例えば、循環ペプチドバイオマーカー）を同定及び／またはバリデーション（確認）する方法及び材料を提供する。場合によっては、定性的及び定量的質量分析（ＭＳ）技術の組み合わせを使用して、複数の循環ペプチドバイオマーカーを同定することができる。例えば、がん患者と健康な個人由来の試料のグローバルプラズマプロテオミクスプロファイリングを使用して、候補ペプチドバイオマーカーを同定することができ、各候補ペプチドバイオマーカーは、選択された反応モニタリング（ＳＡＦＥ−ＳＲＭ）による分画溶出液の逐次分析によって評価でき、候補ペプチドマーカー（複数可）を確認することができる。場合によっては、本明細書で同定される１つ以上のペプチド（例えば、１つ以上の循環ペプチドバイオマーカー）を使用して、本明細書に記載されるような疾患（例えば、がん）を有する哺乳動物を同定することができる。
【０００６】
本明細書で実証されるように、ＳＡＦＥ−ＳＲＭは、がんの循環（例えば、血液中の）ペプチドバイオマーカーの発見及び確認に使用することができる。がん患者の血漿に由来するタンパク質分解ペプチドと健康な個人に由来するタンパク質分解ペプチドを比較することで数百の候補ペプチドバイオマーカーが同定され、診断での有効性を実証する可能性がある少数の候補ペプチドバイオマーカーの確認にＳＲＭと組み合わせた２Ｄクロマトグラフィーが使用された。本明細書に示されるように、このアプローチはがん患者由来の血漿に適用され、ＰＰＩＡ遺伝子によってコードされる２つのペプチドが発見され、その存在量は卵巣癌患者の血漿で増加したが、健康な対照では増加しなかった。このアプローチは、一般に、任意の疾患及び／またはさまざまな疾患状態に特徴的なタンパク質及びペプチドバイオマーカーの発見に適用できる。
【０００７】
候補ペプチドバイオマーカーの確認を含む、ハイスループットで、ロバスト性で、再現性のあるシステムでペプチドバイオマーカーを同定する能力を有することで、定量的かつ大規模な並列方式で多数の候補ペプチドバイオマーカーを同定及び確認する独自かつ未実現の機会が提供される。さらに、血液試料中の循環ペプチドバイオマーカーを検出する能力を有することで、従来の方法及び／または非侵襲的な試料方式を使用して達成できるものよりも早期で、哺乳動物ががんを有すると同定する独自かつ未実現の機会が提供される。
【０００８】
一般に、本明細書の１つの態様は、卵巣癌を治療する方法を特徴とする。方法は、哺乳動物から得られた血液試料中のＰＰＩＡポリペプチドに由来するペプチドフラグメントを含む１つ以上のペプチドバイオマーカーの上昇したレベルを検出することと、１つ以上のがん治療を該哺乳動物に施すことと、を含むか、または本質的にそれからなる。１つ以上のがん治療は、外科手術、化学療法、ホルモン療法、標的療法、放射線療法、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。哺乳動物はヒトであり得る。血液試料は血漿試料であり得る。ＰＰＩＡペプチドフラグメントは、アミノ酸配列ＶＳＦＥＬＦＡＤＫ（配列番号１）を含み得る。ＰＰＩＡペプチドフラグメントは、アミノ酸配列ＦＥＤＥＮＦＩＬＫ（配列番号２）を含み得る。
【０００９】
別の態様では、本明細書は、哺乳動物が卵巣癌を有すると同定する方法を特徴とする。方法は、該哺乳動物から得られた血液試料中のＰＰＩＡポリペプチドに由来するペプチドフラグメントを含む１つ以上の血液ペプチドバイオマーカーのレベルを検出することと、該試料中に１つ以上の血液ペプチドバイオマーカーの高レベルが検出される場合に前記哺乳動物が卵巣癌を有すると診断することとを含むか、または本質的にそれからなる。哺乳動物はヒトであり得る。血液試料は血漿試料であり得る。ＰＰＩＡペプチドフラグメントは、アミノ酸配列ＶＳＦＥＬＦＡＤＫ（配列番号１）を含み得る。ＰＰＩＡペプチドフラグメントは、アミノ酸配列ＦＥＤＥＮＦＩＬＫ（配列番号２）を含み得る。
【００１０】
別の態様では、本明細書は、ペプチドバイオマーカーを同定する方法を特徴とする。方法は、疾患血液試料中に存在するポリペプチドを消化して疾患ペプチドフラグメントを得ることと、疾患ペプチドフラグメントを第一の重同位体で標識して標識疾患ペプチドフラグメントを得ることと；参照血液試料中に存在するポリペプチドを消化して参照ペプチドフラグメントを得ることと、参照ペプチドフラグメントを第２の重同位体で標識して標識参照ペプチドフラグメントを得ることと；標識疾患ペプチドフラグメント及び標識参照ペプチドフラグメントを質量分析に供して、標識参照ペプチドフラグメントに対して標識疾患ペプチドフラグメントにおいて上昇するペプチドバイオマーカーを同定することと、を含むか、または本質的にそれからなる。疾患血液試料は、疾患を有する１つ以上の哺乳動物由来の血液を含むことができる。疾患血液試料は、疾患を有する複数の哺乳動物由来の血液を含むことができる。参照血液試料は、１つ以上の健康な哺乳動物由来の血液を含むことができる。参照血液試料は、複数の健康な哺乳動物由来の血液を含むことができる。方法はまた、各試料から１つ以上の非常に豊富な血液タンパク質を枯渇させることを含み得る。豊富な血液タンパク質は、アルブミン、ＩｇＧ、α１−アンチトリプシン、ＩｇＡ、ＩｇＭ、トランスフェリン、ハプトグロビン、α２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、補体Ｃ３、α１−酸性糖タンパク質、アポリポタンパク質ＡＩ、アポリポタンパク質Ａ−ＩＩ、アポリポタンパク質Ｂ、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。方法はまた、各消化ステップの前に、各試料中の糖タンパク質を濃縮することを含み得る。質量分析は、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計を使用して実行できる。
【００１１】
別の態様では、本明細書は、ペプチドバイオマーカーを確認する方法を特徴とする。方法は、ペプチドバイオマーカーを含む複数のペプチドを塩基性ｐＨ逆相液体クロマトグラフィー（ｂＲＰＬＣ）に供して、複数の画分を得ることと；複数の画分を複数の画分群に編成することであって、画分の数が画分群の数よりも多い、編成することと；酸性ｐＨで直交高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により各画分群のペプチドバイオマーカーを分離し、連続的なＨＰＬＣ溶出液を得ることと；プチドバイオマーカーの強度を決定するための、ペプチドバイオマーカーの事前最適化遷移及び事前最適化滞留時間を含む選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）法を使用して、該連続的なＨＰＬＣ溶出液を分析することであって、ＳＲＭメソッドを使用して、参照試料と比較して疾患試料において高いレベルでペプチドバイオマーカーが検出及び定量される場合にペプチドバイオマーカーが確認される、分析することと、を含むか、または本質的にそれからなる。方法に最適化されたペプチドバイオマーカーの滞留時間は、ペプチドバイオマーカーの強度に反比例し得る。ＨＰＬＣは、質量分析計に接続されたデバイスで実行できる。質量分析計は、トリプル四重極質量分析計であり得る。衝突エネルギーは、データセットＳ５に示されている衝突エネルギーのうちのいずれかであり得る。滞留時間は、データセットＳ５に示されている滞留時間のうちのいずれかであり得る。
【００１２】
別の態様では、本明細書は、ペプチドバイオマーカーを同定及び確認する方法を特徴とする。この方法は、候補ペプチドバイオマーカーを同定することと、候補ペプチドバイオマーカーのためのＳＡＦＥ−ＳＲＭ法を構築することと、ＳＡＦＥ−ＳＲＭ法を使用して候補ペプチドバイオマーカーを確認することと、を含むか、または本質的にそれからなる。
【００１３】
候補ペプチドバイオマーカーを同定することは、疾患血液試料中に存在するポリペプチドを消化して疾患ペプチドフラグメントを得ることと、疾患ペプチドフラグメントを第一の重同位体で標識して標識疾患ペプチドフラグメントを得ることと；参照血液試料中に存在するポリペプチドを消化して参照ペプチドフラグメントを得ることと、参照ペプチドフラグメントを第２の重同位体で標識して標識参照ペプチドフラグメントを得ることと；標識疾患ペプチドフラグメント及び標識参照ペプチドフラグメントを質量分析に供して、標識参照ペプチドフラグメントに対して標識疾患ペプチドフラグメントにおいて上昇する候補ペプチドバイオマーカーを同定することと、を含み得るか、または本質的にそれからなり得る。ＳＡＦＥ−ＳＲＭ法を構築することには、
【００１４】
候補ペプチドバイオマーカーを合成することと、合成候補ペプチドバイオマーカーを質量分析に供して、候補ペプチドバイオマーカーの遷移を決定することであって、遷移が、最も強い強度を有する前駆体−プロダクトイオンのペアを同定し、前駆体−プロダクトイオンのペアを生成する衝突エネルギー（ＣＥ）を同定することによって決定される、決定することと、候補ペプチドバイオマーカーを含む複数のペプチドをｂＲＰＬＣに供し、複数の画分を得ることであって、複数は本質的に等量の各ペプチドからなる、得ることと、複数の画分を複数の画分群に編成することであって、画分の数が画分群の数よりも多い、編成することと、候補ペプチドバイオマーカーの遷移と固定の滞留時間を使用して各画分群の該候補ペプチドバイオマーカーの強度を決定することと、高ｐＨでの疎水性に応じて遷移を再構築することによって滞留時間を最適化することと、を含み得るか、または本質的にそれからなり得る。該候補ペプチドバイオマーカーを確認することは、該候補ペプチドバイオマーカーを含む該疾患ペプチドフラグメントをｂＲＰＬＣに供して複数の画分を得ることにより、疾患血液試料中の候補ペプチドバイオマーカーを定量化することと、該複数の画分を複数の画分群に編成することであって、画分の数が画分群の数よりも多い、編成することと、酸性ｐＨでの直交ＨＰＬＣによる各画分群中のペプチドを分離して連続的なＨＰＬＣ溶出液を得ることと、候補ペプチドバイオマーカーの遷移と最適化された滞留時間を含むＳＲＭ法を使用した連続的なＨＰＬＣ溶出液を分析することと、参照ペプチドフラグメントをｂＲＰＬＣに供し、複数の画分を得ることによって参照血液試料中の候補ペプチドマーカーを定量することと、複数の画分を複数の画分群に編成することであって、画分の数が、画分群の数よりも多い、編成することと、酸性ｐＨでの直交ＨＰＬＣによって各分画群中のペプチドを分離して連続的なＨＰＬＣ溶出液を得ることと、候補ペプチドバイオマーカーの遷移と最適化された滞留時間を含むＳＲＭ法を使用して前記連続的なＨＰＬＣ溶出液を分析することと、候補ペプチドバイオマーカーが、参照試料と比較して、疾患試料において上昇したレベルで定量される場合に候補ペプチドバイオマーカーを確認することと、を含み得るか、または本質的にそれからなり得る。合成候補ペプチドバイオマーカーは、重同位体で標識しないものとし得る。ペプチドバイオマーカーの最適化された滞留時間は、対象から得られた試料にスパイクされて存在する合成バイオマーカーペプチドを使用して決定される。方法に最適化されたペプチドバイオマーカーの滞留時間は、ペプチドバイオマーカーの強度に反比例し得る。ＨＰＬＣは、質量分析計に接続されたデバイスで実行できる。質量分析計は、トリプル四重極質量分析計であり得る。衝突エネルギーは、データセットＳ５に示されている衝突エネルギーのうちのいずれかであり得る。滞留時間は、データセットＳ５に示されている滞留時間のうちのいずれかであり得る。
【００１５】
別途定義されない限り、本明細書において使用される技術用語及び科学用語は、本発明に関連する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において記載されているものと類似または同等の方法及び材料を本発明を実施するのに使用することができるが、適切な方法及び材料を以下に記載する。本明細書において言及される全ての刊行物、特許出願、特許、及び他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優位となるであろう。更に、材料、方法及び例は、例示にすぎず、限定を意図しない。
【００１６】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細は、添付の図面及び以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴、目的及び利点は、明細書及び図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】血漿バイオマーカーの同定と確認のワークフローの概略図が含まれる。血漿バイオマーカーの発見と同定は、ｉＴＲＡＱまたはＴＭＴアッセイなどの標識依存の定量的プロテオミクスを通じて行われた（Ａ）；血漿バイオマーカーの確認はＳＡＦＥ−ＳＲＭを介して行われた（Ｂ）。
【図２】複雑な試料におけるＳＡＦＥ−ＳＲＭによるペプチド検出能を示す。６つの重同位体標識ペプチド（ペプチド１：ＩＱＬＶＥＥＥＬＤＲ＊（配列番号３）；ペプチド２：ＶＩＬＨＬＫ＊（配列番号４）；ペプチド３：ＩＩＬＬＦＤＡＨＫ＊（配列番号５）；ペプチド４：ＴＬＡＥＳＡＬＱＬＬＹＴＡＫ＊（配列番号６）；ペプチド５：ＬＬＧＨＬＶＫ＊（配列番号７）；ペプチド６：ＧＬＶＧＥＩＩＫ＊（配列番号８）、＊はＣ１３及びＮ１５の重同位体標識アミノ酸を示す）を合成し、複雑な試料中の少量のペプチドの検出におけるＳＡＦＥＳＲＭの感度を評価するために使用した。各ペプチドの１フェムトモルが従来のＳＲＭで検出された（Ａ）。しかし、１ｆｍｏｌのこれらのペプチドをトリプシンで消化した血漿試料に添加すると、それらの検出ははるかに困難になる（Ｂ）。ｂＲＰＬＣ分取は、標準ＳＲＭの感度を向上させることができたが、実行間で大きな分散があった（Ｃ）。最適化された滞留時間と循環時間を備えたＳＡＦＥ−ＳＲＭにより、６つのペプチド全ての、遊離ペプチドの強度の平均７０％の強度による検出を可能にした（Ｄ）。
【図３】ペプチドバイオマーカーによる卵巣癌の予測を示す。（Ａ）全ての３１８ペプチドの卵巣癌予測の平均二乗誤差（ＭＳＥ）は、ＭＳＥによって最良の予測因子から最悪の予測因子までランク付けされたペプチドでプロットされる。（Ｂ）１０の最良のペプチドバイオマーカーが表示され；ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡからのペプチドＶＳＦＥＬＦＡＤＫが最良の予測因子であった。（Ｃ）ＰＰＩＡペプチドＶＳＦＥＬＦＡＤＫの卵巣癌予測性能は、同一のタンパク質由来の別のペプチドＦＥＤＥＮＦＩＬＫ（配列番号２）と組み合わせることでさらに改善された。
【図４】総血漿プロテオーム（Ａ）及び血漿グリコプロテオーム（Ｂ）によるｉＴＲＡＱ標識ベースの定量的プロテオミクス試験の詳細な技術ワークフローが含まれる。
【図５】ＳＡＦＥ−ＳＲＭスキームが含まれる。（Ａ）複雑な生体試料からペプチドを高ｐＨにおける疎水性に応じて９６の画分に分離するためにｂＲＰＬＣ分取を行った。ＳＡＦＥ−ＳＲＭ画分群はウェルにオーバーレイされる。（Ｂ）最終的なＳＡＦＥ−ＳＲＭ法で使用された２０のＳＡＦＥ−ＳＲＭ画分群のそれぞれにおける全てのペプチドのシグナル強度の合計を示すクロマトグラム。（Ｃ）ＳＡＦＥ−ＳＲＭ法遷移カバレッジ。各画分群ｉについて、特定のＳＡＦＥ−ＳＲＭ法ｉは、その画分群中のペプチドを検出する遷移と、２つの隣接群、群ｉ−１及び群ｉ＋１で構成される（式中、ｉ∈）。
【図６】８つの血漿試料中の３つの卵巣癌バイオマーカーペプチドのＳＡＦＥ−ＳＲＭプロファイルが含まれる。４つの卵巣癌血漿試料（２５３、２５６、２６０、及び２７１）と４つの健常血漿試料（２０２、２０５、２０７、及び２０９）をＳＡＦＥ−ＳＲＭで分析した。各試料について、ピーク下の領域が表示される。
【図７】ＳＡＦＥ−ＳＲＭベースのＰＰＩＡアッセイとＥＬＩＳＡベースのＣＡ１２５アッセイを使用した卵巣癌の診断性能の比較を示す。ベン図は、卵巣癌患者６３人のコホートで同定された症例数を示す。
【図８】ＰＰＩＡ由来のＳＡＦＥ−ＳＲＭ標的ペプチドのＭＳスペクトルが含まれる。
【図９】全血漿のｉＴＲＡＱデータセットのＭＡプロットが含まれる。３つの実験のそれぞれからの非正規化ペプチド強度を各々の特定の標識（１１４、１１５、１１６、及び１１７）で比較し、対応するＭＡプロットを、Ａ範囲を６〜１４に固定し、Ｍ範囲は−４〜４に固定して、対数変換された生の強度を使用して生成した。データセットいずれかに関連付けられているバイアスの明確な証拠はなかった。技術的分散（Ｉ〜Ｌ）は生物学的分散（Ａ〜ＤまたはＥ〜Ｈ）よりも大幅に小さい。
【図１０】３つのデータセットにおけるがんと正常の非正規化及び中央値正規化のヒストグラムを示す。がん／正常のタンパク質比は、データセット１（Ａ〜Ｃ、上）、データセット２（Ａ〜Ｃ、中）、及びデータセット３（Ａ〜Ｃ、下）について、ｌｏｇ２スケールを使用してプロットされた。中央値正規化後、がん／正常の同一のタンパク質比は、データセット１（Ｄ〜Ｆ、上）、データセット２（Ｄ〜Ｆ、中）、及びデータセット３（Ｄ〜Ｆ、下）について、ｌｏｇ２スケールを使用してプロットされた。ｌｏｇ２（相対比）＝０の線が各プロットに示される（赤色の線）。バイアスされたデータは、結腸直腸癌（Ｂ）及び卵巣癌（Ｃ）について観察された。膵臓癌（Ａ）についてのバイアスは明確でなかった。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本明細書は、疾患を同定及び／または治療するための方法と材料を提供する。場合によっては、疾患はがんである。例えば、１つ以上の循環ペプチドバイオマーカー（例えば、ＰＰＩＡペプチドフラグメント）の上昇したレベルを有する哺乳動物は、がん（例えば、卵巣癌）を有すると同定することができ、必要に応じて、１つ以上のがん治療を投与され得る。本明細書で使用されるとき、「循環ペプチド」は、哺乳動物の体内の任意の閉鎖系（例えば、循環系）で検出することができるペプチドである。場合によっては、哺乳動物（例えば、がんを有すると疑われる哺乳動物）由来の血液試料（例えば、血漿試料）は、１つ以上のＰＰＩＡペプチドフラグメントの上昇したレベルについて評価することができ、１つ以上のＰＰＩＡペプチドフラグメントの上昇したレベルが検出される場合に哺乳動物はがんを有すると同定でき、必要に応じて、哺乳動物に１つ以上のがん治療を施して、がんの重症度を低下させ、及び／または癌の症状を軽減できる。
【００１９】
循環ペプチドバイオマーカー（例えば、ＰＰＩＡペプチドフラグメント）のレベルに関して本明細書で使用されるとき、「上昇したレベル」という用語は、１以上の健康な哺乳動物（例えば、がんを有さない哺乳動物）からの試料（例えば、参照試料）で典型的に観察される、循環ペプチド（例えば、ＰＰＩＡペプチドフラグメント）の参照レベルよりも高い任意のレベルを指す。場合によっては、参照試料は、循環ペプチドの上昇したレベルに関連する疾患を示さない哺乳動物から得られた試料であり得る。例えば、卵巣癌に関連するペプチドバイオマーカーの場合、参照試料は、卵巣癌を有さない対象から得られた試料であり得る。場合によっては、参照試料は、上昇したレベルのペプチドバイオマーカーが観察されるのと同一の哺乳動物から得られた試料であり得、参照試料は、上昇したレベルの循環に関連する疾患の発症前に得られたペプチドであった。場合によっては、同一の哺乳動物から得られたそのような参照試料は、参照試料として将来使用するために凍結されるか、さもなくば保存される。場合によっては、１つ以上のＰＰＩＡフラグメントの上昇したレベルは、本明細書に記載の存在量スコア閾値に基づいて評価され得る（例えば、実施例１及びデータセットＳ７を参照されたい）。場合によっては、参照試料が検出不可能なレベルの循環ペプチドバイオマーカーを有する場合、上昇したレベルは、循環ペプチドバイオマーカーの検出可能なレベルであってもよい。特定のレベルが上昇したレベルであるかどうかを決定するとき、比較可能な試料からのレベルが使用されることが理解されよう。
【００２０】
本明細書に記載されるように、任意の適切な哺乳動物を評価及び／または治療することができる。例えば、ヒトまたはサルなどの他の霊長類は、１つ以上のＰＰＩＡペプチドフラグメントの上昇したレベルについて評価することができ、必要に応じて１つ以上のがん治療で治療して、ヒトまたはその他の霊長類の体内に存在するがん細胞の数を減らすことができる。場合によっては、がんを有する、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、マウス、及びラットを、１つ以上のＰＰＩＡペプチドフラグメントの上昇したレベルについて評価することができ、必要に応じて、本明細書に記載されるように、１つ以上のがん治療で治療して、ヒトまたはその他の霊長類の体内に存在するがん細胞の数を減らすことができる。
【００２１】
哺乳動物由来の任意の適切な試料は、本明細書に記載されるように評価され得る（例えば、１つ以上の循環ペプチドバイオマーカーの上昇したレベルについて評価される）。循環ペプチドバイオマーカーを含む可能性のある試料の例には、非限定的に、血液試料（例えば、全血、血清、または血漿試料）、血液、血漿、尿、脳脊髄液、唾液、痰、気管支肺胞洗浄液、胆汁、リンパ液、嚢胞液、便、及び腹水が含まれる。場合によっては、試料は血漿試料であり得る。
【００２２】
１つ以上の循環ペプチドバイオマーカーは、任意の適切な循環ペプチドバイオマーカーであり得る。場合によっては、循環ペプチドバイオマーカーは、本明細書に記載の方法のいずれかを使用して（例えば、ＳＡＦＥ−ＡＲＭ法を使用して）同定及び確認される。１つ以上のＰＰＩＡペプチドフラグメントは、任意の適切なＰＰＩＡペプチドフラグメントを含み得る。ＰＰＩＡペプチドフラグメントの例には、非限定的に、アミノ酸配列ＶＳＦＥＬＦＡＤＫ（配列番号１）を含むペプチドフラグメントと、アミノ酸配列ＦＥＤＥＮＦＩＬＫ（配列番号２）を含むペプチドフラグメントが含まれる。
【００２３】
任意の適切な方法を使用して、１つまたは複数の循環ペプチドバイオマーカーの上昇したレベルを検出することができる。ペプチドレベルを検出する方法の例としては、非限定的に、分光法（例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）及び液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ／ＭＳ））、抗体依存法（例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、タンパク質免疫沈降、免疫電気泳動、ウエスタンブロッティング、及びタンパク質免疫染色）、ならびにアプタマー依存法が含まれる。場合によっては、１つ以上の循環ペプチドバイオマーカー（例えば、１つ以上のＰＰＩＡペプチドフラグメント）は、質量分析技術を使用して検出できる。
【００２４】
場合によっては、本明細書に記載されるようにがんを有すると（例えば、少なくとも部分的に１つ以上の循環ペプチドバイオマーカーの上昇したレベルに基づいて）同定された哺乳動物は、任意の適切な方法を使用してがん診断を確認することができる。がんを診断するのに使用できる方法の例には、身体検査（例えば、内診）、画像検査（例えば、超音波またはＣＴスキャン）、血液検査（例えば、ＣＡ１２５などのマーカー）、組織検査（例えば、生検）が含まれるが、これらに限定されない。
【００２５】
本明細書に記載されるようにがんを有すると（例えば、ＰＰＩＡペプチドフラグメントなどの１つ以上の循環ペプチドバイオマーカーの上昇したレベルに少なくとも部分的に基づいて）同定されたら、哺乳動物を１つ以上のがん治療で治療することができる。１つ以上のがん治療は、任意の適切ながん治療を含み得る。がんの治療は手術を含み得る。がんが卵巣癌である場合、手術には、片方または両方の卵巣、卵管、子宮、近傍のリンパ節、及び／または近傍の脂肪性腹部組織（網）の除去が含まれる。がん治療は放射線療法を含み得る。がん治療は、化学療法、ホルモン療法、標的療法、及び／または細胞毒性療法などの薬物療法の実施を含み得る。がん治療の例には、非限定的に、プラチナ化合物（シスプラチンまたはカルボプラチンなど）、タキサン（パクリタキセルまたはドセタキセルなど）、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ−パクリタキセル）、アルトレタミン、カペシタビン、シクロホスファミド、エトポシド（ｖｐ−１６）、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン（ｃｐｔ−１１）、リポソームドキソルビシン、メルファラン、ペメトレキセド、トポテカン、ビノレルビン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）アゴニスト（ゴセレリン及びロイプロリドなど）、抗エストロゲン療法（タモキシフェンなど）、アロマターゼ阻害剤（レトロゾール、アナストロゾール、及びエキセメスタンなど）、血管新生阻害剤（ベバシズマブなど）、ポリ（ＡＤＰ）−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）阻害剤（オラパリブ、ルカパリブ、及びニラパリブなど）、体外照射療法、近接照射療法、放射性リン、及びそれらの任意の組み合わせが含まれる。
【００２６】
本明細書に記載されるように、任意の適切ながんを同定及び／または治療することができる。本明細書に記載されるように治療され得る癌の例には、非限定的に、肺癌（例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌）、甲状腺乳頭癌、甲状腺髄様癌、分化型甲状腺癌、甲状腺再発癌、難治性分化型甲状腺癌、肺腺癌、細気管支肺細胞癌、多発性内分泌腫瘍２Ａまたは２Ｂ型（それぞれＭＥＮ２ＡまたはＭＥＮ２Ｂ）、褐色細胞腫、副甲状腺過形成、乳癌、結腸直腸癌（例えば、転移性結腸直腸癌）、乳頭状腎細胞癌、胃腸粘膜の神経膠腫症、炎症性筋線維芽細胞性腫瘍、または子宮頸癌、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、青年期のがん、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、虫垂癌、星状細胞腫、異型奇形腫瘍／ラブドイド腫瘍、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脳幹神経膠腫、脳腫瘍、乳癌、気管支腫瘍、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍、原発不明癌、心臓腫瘍、子宮頸癌、小児癌、脊索腫、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性骨髄増殖性腫瘍、結腸癌、結腸直腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、胆管癌、腺管上皮内癌、胚性腫瘍、子宮内膜癌、上衣腫、食道癌、表皮神経芽腫、ユーイング肉腫、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌、卵管癌、骨の線維性組織球腫、胆嚢癌、胃癌、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、神経膠腫、有毛細胞腫瘍、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞癌、組織球腫、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼内黒色腫、膵島細胞腫瘍、膵神経内分泌腫瘍、カポジ肉腫、腎臓癌、ランゲルハンス細胞組織球症、喉頭癌、白血病、唇、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫、骨癌、黒色腫、メルケル細胞癌、中皮腫、転移性扁平上皮癌、中線管癌、口内癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性腫瘍、骨髄性白血病、骨髄性白血病、多発性骨髄腫、骨髄増殖性腫瘍、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽細胞腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、口腔癌、口腔癌、唇癌、中咽頭癌、骨肉腫、卵巣癌、膵臓癌、乳頭腫症、傍神経節腫、副鼻腔癌及び鼻腔癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、下垂体癌、形質細胞腫瘍、胸膜肺芽腫、妊娠期及び乳癌、原発性中枢神経系リンパ腫、原発性腹膜癌、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、セザリー症候群、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部肉腫、扁平上皮癌、扁平上皮癌、胃癌、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽頭癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂と尿管の移行上皮癌、原発不明癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、及びウィルムス腫瘍が含まれる。場合によっては、本明細書に記載の材料及び方法を使用して、卵巣癌を同定及び／または治療することができる。
【００２７】
別の態様では、本明細書はまた、哺乳動物が疾患及び／または疾患段階を有すると同定するためのバイオマーカーとして使用され得るペプチドバイオマーカー（例えば、循環ペプチドバイオマーカー）を同定及び／または確認する方法及び材料を提供する。場合によっては、本明細書で提供される方法及び材料は、哺乳動物ががんを有すると同定するために使用され得るペプチドバイオマーカー（例えば、循環ペプチドバイオマーカー）を同定及び／または確認するために使用できる。
【００２８】
本明細書に記載の方法及び材料は、ペプチドバイオマーカー（例えば、循環ペプチドバイオマーカー）を同定するために使用され得る。場合によっては、循環ペプチドバイオマーカーを同定する方法には、対照試料（例えば、参照試料）と比較するとき、疾患試料において上昇している循環ペプチドバイオマーカーを同定することが含まれ得る。場合によっては、疾患試料には、１以上（例えば、２、３、５、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上）の疾患を有する哺乳動物由来の血液が含まれ得る。場合によっては、疾患試料には単一の哺乳動物由来の血液が含まれ得る。場合によっては、対照試料には、１以上（例えば、２、３、５、８、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、またはそれ以上）の健康な哺乳動物（例えば、疾患を有さない哺乳動物）由来の血液が含まれ得る。場合によっては、対照試料は、単一の哺乳動物由来の血液を含み得る。場合によっては、１つ以上の循環ペプチドバイオマーカーを同定する方法には、疾患血液試料に存在するポリペプチドをペプチドフラグメントに消化して、疾患ペプチドフラグメントの試料を得ることと、参照血液試料中に存在するポリペプチドをペプチドフラグメントに消化して、参照ペプチドフラグメントの試料を得ることと、が含まれる。場合によっては、消化された試料由来のペプチドフラグメント（例えば、疾患ペプチドフラグメントまたは参照ペプチドフラグメント）は、区別して標識できる。例えば、疾患の血液試料由来のペプチドフラグメントが標識なしのままであってもよく、かつ参照試料由来のペプチドフラグメントが重同位元素で標識されていてもよく、または逆もまた同様である。例えば、疾患の血液試料由来のペプチドフラグメントと参照試料由来のペプチドフラグメントが異なる重同位元素で標識されていてもよい。場合によっては、異なる疾患（例えば、異なるがんの種類）または異なる病期（例えば、第１の疾患試料が初期の疾患試料であり、第２の疾患試料が進行性疾患試料である）由来の１つ以上（例えば、２、３、４、５、またはそれ以上）の試料を使用することができ、各試料（例えば、各疾患試料及び対照試料）はそれぞれ異なる重同位元素で標識することができる。重同位元素の例には、非限定的に、重水素、Ｃ１３、Ｎ１５、及びＯ１８が含まれる。疾患血液試料由来のペプチドフラグメントと参照試料由来のペプチドフラグメントが標識されていないとき、疾患ペプチドフラグメントと参照ペプチドフラグメントを質量分析に供することができ（例えば、個別の実行として独立して質量分析に供する）、結果を比較して、１つ以上のペプチドバイオマーカー（例えば、参照試料と比較して疾患試料で上昇しているペプチド）を同定することができる。疾患血液試料由来のペプチドフラグメントと参照試料由来のペプチドフラグメントが区別して標識されるとき、標識疾患ペプチドフラグメントと標識参照ペプチドフラグメントを質量分析に供することができ（例えば、単一の質量分析の実行として）、結果を比較して、１つ以上のペプチドバイオマーカー（例えば、参照試料と比較して疾患試料で上昇しているペプチド）を同定することができる。
【００２９】
任意の適切な質量分析計を使用することができる。質量分析計の例には、非限定的に、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計及びトリプル四重極質量分析計、飛行時間（ＴＯＦ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）−ＴＯＦ、ならびに表面増強レーザー脱離／イオン化（ＳＥＬＤＩ）−ＴＯＦが含まれる。例えば、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計は、本明細書に記載の１つ以上のペプチドバイオマーカーを同定するときに使用することができる。
【００３０】
ポリペプチドを消化するための任意の適切な方法を使用することができる。場合によっては、ポリペプチドは酵素的に消化し得る。場合によっては、ポリペプチドは化学的に消化し得る。例えば、ポリペプチドは、非限定的に、Ａｒｇ−Ｃ、Ａｓｐ−Ｎ、Ａｓｐ−Ｎ（Ｎ−末端Ｇｌｕ）、ＢＮＰＳもしくはＮＣＳ／尿素、カスパーゼ１、カスパーゼ１０、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、キモトリプシン、キモトリプシン（低特異性）、クロストリパイン、ＣＮＢｒ、ＣＮＢｒ（メチルＣｙｓ）、ＣＮＢｒ（酸を含む）、エンテロキナーゼ、第Ｘａ因子、ギ酸、Ｇｌｕ−Ｃ（ＡｍＡｃ緩衝液）、Ｇｌｕ−Ｃ（Ｐｈｏｓ緩衝液）、グランザイムＢ、ＨＲＶ３Ｃプロテアーゼ、ヒドロキシルアミン、ヨードソ安息香酸、Ｌｙｓ−Ｃ、Ｌｙｓ−Ｎ、Ｌｙｓ−Ｎ（Ｃｙｓ修飾）、弱酸加水分解、ＮＢＳ（長時間曝露）、ＮＢＳ（短時間曝露）、ＮＴＣＢ、膵エラスターゼ、ペプシンＡ、ペプシンＡ（低特異性）、プロリルエンドペプチダーゼ、プロテイナーゼＫ、ＴＥＶプロテアーゼ、サーモリシン、トロンビン、トリプシン及び／または加水分解を使用して消化できる。
【００３１】
場合によっては、１つ以上の循環ペプチドバイオマーカーを同定する方法には、疾患試料及び／または対照試料から、大量に存在する循環タンパク質を低減または排除することが含まれる。大量に存在する循環タンパク質の例には、非限定的に、アルブミン、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、及びＩｇＭ）、α１−アンチトリプシン、トランスフェリン、ハプトグロビン、α２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、補体Ｃ３、α１−酸性糖タンパク質（オロソムコイド）、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ；アポリポタンパク質Ａ−Ｉ及びＡ−ＩＩなど）、及び低密度リポタンパク質（ＬＤＬ；アポリポタンパク質Ｂなど）が含まれる。大量に存在する循環タンパク質は、適切な技術を使用して低減または排除できる。循環タンパク質は、適切な技術を使用して低減または排除できる。循環タンパク質を低減または排除するための手段の例としては、非限定的に、シバクロンブルー色素及び抗体ベースの血漿枯渇が挙げられる。例えば、大量に存在する循環タンパク質は、抗体ベースの血漿枯渇によって低減または排除できる。
【００３２】
場合によっては、１つ以上の循環ペプチドバイオマーカーを同定する方法には、疾患試料及び／または対照試料から、少量で存在する循環タンパク質を濃縮することが含まれる。例えば、ペプチドリガンドライブラリーを使用して（例えば、ＰｒｏｔｅｏＭｉｎｅｒタンパク質濃縮キットの戦略を参照されたい）、またはアプタマーを使用して、少量のタンパク質を濃縮することができる。
【００３３】
場合によっては、１つ以上の循環ペプチドバイオマーカーを同定する方法には、疾患血液試料及び／または対照試料由来のペプチドフラグメントを変性すること、還元すること、及び／またはアルキル化することが含まれる。例えば、尿素、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、メタノール、グリセロール、及び／または熱を使用してペプチドを変性させることができる。例えば、ペプチドは、トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、及び／または２−メルカプトエタノールを使用して還元することができる。例えば、ペプチドは、メタンチオスルホン酸メチル（ＭＭＴＳ）、ヨードアセトアミド、及び／またはヨード酢酸を使用してアルキル化することができる。
【００３４】
場合によっては、１つ以上の循環ペプチドバイオマーカーを同定する方法には、糖タンパク質、リン酸化タンパク質、及び／または各試料の他の翻訳後修飾を持つタンパク質を濃縮することが含まれる。
【００３５】
本明細書に記載の方法及び材料は、ペプチドバイオマーカー（例えば、循環ペプチドバイオマーカー）を確認するために使用され得る。場合によっては、１つ以上の循環ペプチドバイオマーカーを確認する方法には、本明細書に記載の種々の方法のうちのいずれかに従って同定された循環ペプチドバイオマーカーを確認することを含めることができる。ペプチドバイオマーカー（例えば、循環ペプチドバイオマーカー）を確認する方法には、選択した反応モニタリングＳＲＭ（ＳＡＦＥ−ＳＲＭ）による分画された溶出液の逐次分析が含まれる。場合によっては、ペプチドバイオマーカーは、予め最適化された遷移及び／または予め最適化された滞留時間を含むＳＲＭ法を使用して確認できる（例えば、ペプチドバイオマーカーの強度を決定するため）。場合によっては、ペプチドバイオマーカーの強度を決定するために最適化された遷移及び／または最適化された滞留時間を有するＳＲＭ法を構築することにより、ペプチドバイオマーカーを確認できる。例えば、候補ペプチドバイオマーカーの各セットについて、ＳＡＦＥ−ＳＲＭ法のセットをコンパイルできる。実施例１で実証されるように、各候補バイオマーカーの合成ペプチドを塩基性ｐＨ逆相液体クロマトグラフィー（ｂＲＰＬＣ）に供し、画分群を生成することができる。合成ペプチドの画分群を質量分析に供して、どの群にどの合成ペプチドが位置するかを確認し、同時にその群内でペプチドの標準強度を決定することができる（最初に使用された特定の量から導出）（例えば、図５を参照されたい）。ペプチドバイオマーカーは、例えば、ペプチドバイオマーカーが、本明細書に記載のＳＡＦＥ−ＳＲＭ法を使用して参照試料と比較した疾患試料における上昇したレベルで検出及び定量化される場合に確認され得る。
【００３６】
場合によっては、（例えば、ＳＡＦＥ−ＳＲＭを使用して）ペプチドバイオマーカーを確認する方法には、１つ以上のペプチドバイオマーカーをｂＲＰＬＣ（例えば、高ｐＨでのｂＲＰＬＣ）に供し、複数の画分（例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、またはそれ以上の画分）を得ることと；複数の画分を複数の画分群（例えば、２、３、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０またはそれ以上の画分群）に編成することと；酸性ｐＨ（低ｐＨ）での直交ＨＰＬＣによって各画分群のペプチドバイオマーカーを分離して連続的なＨＰＬＣ溶出液を得ることと；ＳＲＭ法を使用して連続的なＨＰＬＣ溶出液を分析することと、を含み、ペプチドバイオマーカーは、ペプチドバイオマーカー用に最適化された衝突エネルギー、滞留時間が観察された場合に確認される。場合によっては、ＳＲＭ法は、その画分群で溶出される合成ペプチドで事前に確立できる。場合によっては、複数の画分には、４８、９６、または３８４の画分が含まれる。場合によっては、複数の画分群には、１６、３２、または１２４の画分群が含まれる。
【００３７】
場合によっては、（例えば、ＳＡＦＥ−ＳＲＭを使用して）ペプチドバイオマーカーを確認する方法には、ＨＰＬＣを質量分析計に結合することが含まれる。任意の適切な質量分析計を使用することができる。質量分析計の例には、非限定的に、Ｏｒｂｉｔｒａｐ質量分析計、トリプル四重極質量分析計、ＴＯＦ、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ、及びＳＥＬＤＩ−ＴＯＦが含まれる。例えば、ＨＰＬＣは、本明細書に記載の１つ以上のペプチドバイオマーカーを確認するときに使用され得るトリプル四重極質量分析計に結合され得る。
【００３８】
場合によっては、（例えば、ＳＡＦＥ−ＳＲＭを使用して）には、各ペプチドバイオマーカーの遷移パラメーターを構築することが含まれ得る。例えば、遷移には、非限定的に、前駆体イオンｍ／Ｚ、プロダクトイオンｍ／Ｚ、衝突エネルギー、及び／または滞留時間のパラメーターが含まれ得る。遷移は、特定の前駆体−プロダクトイオンペアに対して最適化できる。例えば、前駆体である各ペプチドは、断片化された後に複数のプロダクトイオンを持つことができ、各プロダクトイオンは、独自の最適化された衝突エネルギーと滞留時間を持つことができる。場合によっては、滞留時間を最適化することには、高ｐＨでの疎水性に応じて遷移を再構築することが含まれる（例えば、実施例１及び図５を参照されたい）。場合によっては、滞留時間を最適化するときに、異なる標的ペプチドをほぼ同じ量でスパイクして、どのペプチドがより長い滞留時間で検出する必要があるのかを判定できる。各ペプチドは複数の遷移を持ち、各遷移は前駆体とプロダクトイオンのペアに対応する。場合によっては、遷移は合成ペプチドを使用して各標的ペプチドに対して最適化できる。場合によっては、遷移パラメーターは、データセットＳ５に記載されているとおりにすることができる。
【００３９】
場合によっては、特定の画分の前後の画分を分析して、多数の試料を分析する際のｂＲＰＬＣの保持時間の潜在的な変動のバランスをとることができる。
【００４０】
場合によっては、ペプチドバイオマーカーを確認する方法（例えば、ＳＡＦＥ−ＳＲＭを使用する）は、合成ペプチドによって確立できる。
【００４１】
場合によっては、ペプチドバイオマーカーを確認する方法（例えば、ＳＡＦＥ−ＳＲＭを使用する）は、軽いペプチド（例えば、重同位元素で標識されていないペプチド）によって確立できる。軽いペプチドの使用は、さまざまな理由のいずれかのために有利であり得る。例えば、軽いペプチドは一般に製造コストが低く、そのため、特に数百または数千のバイオマーカーを確認する必要があるバイオマーカー開発の初期段階で、重いペプチドを使用する高コストが削減される。重同位元素で標識されたペプチドもイオン抑制につながり、感度が低下することがある。
【００４２】
本明細書に記載の方法及び材料は、ペプチドバイオマーカー（例えば、循環ペプチドバイオマーカー）を同定すること、及び（例えば、ＳＡＦＥ−ＳＲＭを使用して）ペプチドバイオマーカーを確認することの両方に使用され得る。
【００４３】
本発明は、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定しない、以下の実施例においてさらに説明される。
【実施例】
【００４４】
実施例１：候補バイオマーカーを確認するための選択された反応モニタリングアプローチ
この実施例は、候補ペプチドの大きなリストを、定量化、感度、または特異性を損なうことのないより管理しやすいリストに絞り込むことができる固有のバイオマーカーを開発するためのペプチド中心のプラットフォームについて記載する。この実施例はさらに、がん組織からではなく血漿から直接単離されたペプチドが、固有のがんバイオマーカーの発見に使用できることを示す。
【００４５】
材料及び方法
血漿試料  ９６人の健常人、８１人の卵巣癌患者、５１人の膵臓癌患者、及び３８人の結腸直腸癌患者を含む、合計２６６人由来の血漿試料が得られた。血漿試料と臨床データは、適切な制度的審査委員会の承認を受けた後に、Ｔｈｅ  Ｏｎｔａｒｉｏ  Ｔｕｍｏｒ  Ｂａｎｋ，  Ｉｎｄｉｖｕｍｅｄ，  Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  ａｎｄ  Ｔｈｅ  Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌから入手された。２６６人の患者の選択された臨床的特徴及びそれらの腫瘍の組織病理学的特徴は、データセットＳ１に列挙されている。
【００４６】
材料及び試薬  ヒト血漿枯渇Ｓｅｐｐｒｏ  ＩｇＹ１４  ＬＣ１０カラムシステムはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。トリス−（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）及びメタンチオスルホン酸メチル（ＭＭＴＳ）は、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。ＬｙｓＣ及びトリプシンプロテアーゼは、Ｐｒｏｍｅｇａから購入した。ＰＮＧａｓｅ  Ｆは、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓから購入した。ＴｉＯ２濃縮のためのＴｉｔａｎｓｐｈｅｒｅ、１０または５μｍはＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。ＣＡ１９−９及びＣＡ１２５抗体はＦｕｊｉｒｅｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓから購入した。強陽イオン交換（ＳＣＸ）クロマトグラフィーのためのＰｏｌｙＳＵＬＦＯＥＴＨＹＬ  Ａカラム（１００×２．１ｍｍ、５μｍ、２００Å）は、ＰｏｌｙＬＣから購入した。試料調製のためのＣ１８カートリッジ、及びｂＲＰＬＣとトリプル四重極質量分析計のオンラインＨＰＬＣのためのクロマトグラフィーカラムは、Ｗａｔｅｒｓから購入した。全てのｉＴＲＡＱ試薬と緩衝液はＡＢ  Ｓｃｉｅｘから購入した。合成ペプチドはＧｅｎｓｃｒｉｐｔから購入した。他の全ての試薬は、特に明記しない限り、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００４７】
溶液の調製  ＳＣＸ溶媒Ａは、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリルを含み；ＳＣＸ溶媒Ｂは、１０ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、３５０ｍＭのＫＣＬ、２５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリルを含み；両方のＳＣＸ溶媒について、５０％Ｈ３ＰＯ４を添加することでｐＨ２．７５が達成された。ｂＲＰＬＣ溶媒Ａは１０ｍＭのＴＥＡＢＣを含み；ｂＲＰＬＣ溶媒Ｂは、１０ｍＭのＴＥＡＢＣ、９０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）アセトニトリルを含んだ。ＳＡＦＥ−ＳＲＭ  ＭＳ溶媒Ａは、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ギ酸を含む水であり；ＳＡＦＥＳＲＭ溶媒Ｂは、０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）ギ酸を含むアセトニトリルであった。
【００４８】
ｉＴＲＡＱベースの発見試験のためのプールされた血漿試料  正常な個人５０人、膵臓癌の患者１３人、結腸直腸癌の患者１８人、及び卵巣癌の患者１８人が、初期分析のために選択された。これらの４つの患者群のうちの１つの中の各個人の血漿１００マイクロリットルを、試験の第１フェーズにわたって、処理する前にプールした。この試験のフェーズ１では、個々の患者のペプチドではなくこれらのプールを使用し、「プールされたペプチド」と呼ばれる。
【００４９】
血漿枯渇  血漿中の豊富なタンパク質［アルブミン、ＩｇＧ、α１−アンチトリプシン、ＩｇＡ、ＩｇＭ、トランスフェリン、ハプトグロビン、α２−マクログロブリン、フィブリノーゲン、補体Ｃ３、α１−酸性糖タンパク質（オロソムコイド）、ＨＤＬ（アポリポタンパク質ＡＩ及びＡ−ＩＩ）、ならびにＬＤＬ（主にアポリポタンパク質Ｂ）］は、Ｓｅｐｐｒｏ  ＩｇＹ１４  ＬＣ１０カラムシステムを使用して枯渇された。血漿試料をＩｇＹ希釈緩衝液で５倍に希釈し、ろ過（０．２２μｍ）し、次いで、バイナリポンプ、外部試料インジェクター、ＵＶ検出器、フラクションコレクターからなるＡｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステムに接続されたＩｇＹ  ＬＣ１０カラムに注入した。非保持画分を収集した。
【００５０】
血漿プロテオーム試料調製  枯渇した血漿タンパク質を９Ｍの尿素中で変性させ、５ｍＭのＴＣＥＰを使用して６０℃で１５分間還元し、システイン残基を５ｍＭのＭＭＴＳにより室温、暗所で１５分間アルキル化した。アルキル化したタンパク質の溶液を、Ｕｌｔｒａｃｅｌ−１０メンブレン（ミリポア）を備えたＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５遠心フィルターユニットを使用して脱塩し、９Ｍの尿素で２回洗浄し、脱塩した血漿タンパク質を４ｍＬの４０ｍＭのＴＥＡＢＣで再構成した。次いで、試料をＬｙｓＣプロテアーゼで３時間消化した、次いでシークエンシンググレードのトリプシンを使用して３７℃で一晩消化した。追加のシークエンシンググレードのトリプシンを消化が終了する３時間前に添加し、消化系を５０℃で最後の３０分間インキュベートした後、１％ＴＦＡを添加して反応を停止した。消化物のＣ１８を介した洗浄は、他の場所（例えば、Ｈｏｗｌａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１４  ＳＥＥＲ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ  Ｒｅｖｉｅｗ，  １９７５−２０１１  （Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ）を参照されたい）で説明されているように実行された。ｉＴＲＡＱ実験で使用されていない試料、すなわちプールされた血漿試料ではなく個々のドナー由来の試料では、ＭＭＴＳではなく５０ｍＭのヨードアセトアミド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）をアルキル化に使用した。
【００５１】
ヒト血漿試料からのＮ−グリコシル化タンパク質の濃縮及び単離１００マイクロリットルのプールされたヒト血漿試料は、９Ｍの尿素で変性され、還元、アルキル化、及びろ過によって処理されて塩が除去され、次いで凍結乾燥された。凍結乾燥したタンパク質は、０．１％ＴＦＡを含む５％アセトニトリルで再構成された。１０ｍＭの過ヨウ素酸ナトリウムをタンパク質溶液に適用し、その後暗所にて４℃で１時間インキュベートした。酸化されたタンパク質を精製するために、別のＣ８カートリッジクリーニングが実行された。凍結乾燥したタンパク質を１ｍＬのヒドラジド樹脂カップリング緩衝液（０．１Ｍのリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０）で再構成し、Ｂｉｏ−Ｒａｄから購入した２５０μＬのヒドラジド樹脂を溶液に添加して、室温での５時間のインキュベーションによって糖プロテオームをコンジュゲートした。次いで、樹脂を４ｍＬの１．５ＭのＮａＣｌで２回、続いて４ｍＬの水、４ｍＬの１００ｍＭのＴＥＡＢＣ緩衝液で２回、最後に４ｍＬの５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．５）で洗浄した。２５マイクロリットルのＰＮＧａｓｅ  Ｆを樹脂に添加し、続いて攪拌しながら３７℃で４時間インキュベートした。次いで、樹脂を８，０００×ｇで５分間遠心分離し、上清を回収した。樹脂ペレットを５００μＬの４０μＭの重炭酸アンモニウムで２回洗浄し、上記のように遠心分離にかけた。これらの遠心分離からの上清を合わせ、凍結乾燥し、４０ｍＭの重炭酸アンモニウムで再構成し、トリプシン消化とＣ１８洗浄を行った後、これらをｉＴＲＡＱ標識に使用した。合計で６５７個のグリコシル化タンパク質が同定及び定量化された（データセットＳ３）。この試験の確認フェーズに持ち越されたＮ−グリコシル化タンパク質濃縮実験から２９のタンパク質が同定された。
【００５２】
ｉＴＲＡＱ標識、ＳＣＸクリーニング、及びｂＲＰＬＣ分取  ４つのプールからのペプチドを１５μＬのＨ２Ｏ及び２０μＬの溶解緩衝液（ｉＴＲＡＱラベリングキットに付属）で再構成し、７０μＬのエタノールで希釈した４つのｉＴＲＡＱ試薬のうちの１つと共に室温でインキュベートした。４つのプールのそれぞれからのペプチドは、それぞれ１１４、１１５、１１６、または１１７のレポーターイオンを含むｉＴＲＡＱ試薬で標識された。室温で２時間インキュベートした後、５０μＬの水を添加した。室温で１０分間さらにインキュベートした後、１００μＬの水を添加した。室温でさらに１０分間インキュベートした後、４０μＬの４０ｍＭの重炭酸アンモニウムを添加し、反応液を４℃で一晩インキュベートした。試料を真空乾燥して５０μＬにし、合わせて、２５％アセトニトリルを含む１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ２．７）（ＳＣＸ溶媒Ａ）で４ｍＬに希釈した。１００ｍＭのリン酸を使用して、試料のｐＨを２．７に調整した。次いで、ｉＴＲＡＱ標識ペプチドを、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２００  ＨＰＬＣシステムにおいて、ポリスルホエチルＡカラム（ＰｏｌｙＬＣ）（３００Å、５μｍ、１００×２．１ｍｍ）を備えたＳＣＸクロマトグラフィーを使用して精製した（例えば、Ｆｉｓｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００５  Ａｍ  Ｊ  Ｏｂｓｔｅｔ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  １９２：１２１４−１２２１を参照されたい）。分取は、塩濃度が０から３５０ｍＭのＫＣｌに増加する、ＳＣＸ溶媒Ｂ中の線形勾配を使用して４５分間実行した。次いで、ペプチド分画を真空乾燥し、４ｍＬのｂＲＰＬＣ溶媒Ａで再構成して、ＸＢｒｉｄｇｅ  Ｃ１８カラム（Ｗａｔｅｒｓ）によってｂＲＰＬＣ分取を行った。ｂＲＰＬＣからの合計９６の分画を９６ウェルプレートに入れた。
【００５３】
血漿ペプチドの調製  各個人由来の２００μＬの血漿試料は、上述の手順を使用して処理された。凍結乾燥した血漿ペプチド試料を、３％アセトニトリルを含む２ｍＬの１０ｍＭの重炭酸トリエチルアンモニウム（ｐＨ８．２）で再構成した。ペプチド分取は、高ｐＨにてＣ１８カラムを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２６０  ＨＰＬＣシステムで行った。２つのＨＰＬＣ移動相溶媒は、１０ｍＭの重炭酸トリエチルアンモニウム（溶媒Ａ）、及び９０％アセトニトリルを含む１０  ｍＭの重炭酸トリエチルアンモニウム（溶媒Ｂ）であった。最初の２０分間のフラッシングステップで塩を除去し、その後、溶媒Ｂを０から１００％に増加する９６分の勾配が後に続く、１２０分のＨＰＬＣ勾配法を適用した。血漿ペプチド試料からの９６画分をＰｒｏｔｅｉｎ  ＬｏＢｉｎｄプレート（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）に収集し、各１分のウィンドウの間に溶出したペプチドを各ウェルに収集した。図５Ａに示されるスキームに従ってペプチド画分を合わせ、真空乾燥した。次いで、４０μＬのＳＲＭ溶媒Ａを使用して乾燥ペプチドを再構成し、３ｆｍｏｌの重同位元素標識されたＫ−Ｒａｓ野生型（ＷＴ）ペプチド（ＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫ＊；配列番号２３）でスパイクしてから、Ａｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ＵＨＰＬＣシステムで別のオンライン分取を行った。オンラインＵＨＰＬＣは各試料を低ｐＨ（ｐＨ３）で分取し、高ｐＨ（ｐＨ８．２）で実行された最初のＨＰＬＣ画分とは劇的に異なる分取プロファイルを作成した。分取された試料は、ＳＲＭポジティブイオンモードで動作するＡｇｉｌｅｎｔ  ６４９０トリプル四重極質量分析計のＪｅｔ  Ｓｔｒｅａｍ  ＥＳＩソースに連続的に注入された。
【００５４】
正常及びがんの血漿試料の定量的プロテオミクスアッセイ  ｉＴＲＡＱ標識依存定量的プロテオミクスアッセイを実施して、正常血漿とがん血漿の試料間のプロテオミクス的な相違を評価した。パイプラインには、血漿タンパク質枯渇、変性、還元、アルキル化、糖タンパク質の濃縮、トリプシン消化、脱塩、ｉＴＲＡＱ標識、強陽イオン交換（ＳＣＸ）クリーニング、及びｂＲＰＬＣ分取、続いてＯｒｂｉｔｒａｐ  ＭＳ分析、社内開発のＲスクリプトを使用する定量的プロテオミクスデータ分析が含まれていた。
【００５５】
液体クロマトグラフィー−ＭＳ／ＭＳ及び血漿定量プロテオミクスデータ分析  ｉＴＲＡＱ標識ｂＲＰＬＣ分離試料のナノフローエレクトロスプレーイオン化液体クロマトグラフィー（ＬＣ）−ＭＳ／ＭＳ分析は、ＥｋｓｉｇｅｎｔナノＬＣとＡｇｉｌｅｎｔ１１００マイクロウェルプレートオートサンプラーによって制御される逆相システムと接続されたＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｖｅｌｏｓ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計によって実行された。ｂＲＰＬＣ画分を７５μｍ×２ｃｍのＭａｇｉｃ  Ｃ１８ＡＱカラム（５μｍ、１００Å；Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）で順次処理し、次いで、ナノフロー溶媒デリバリーを備える分析用カラム（７５μｍ×１０ｃｍ、Ｍａｇｉｃ  Ｃ１８ＡＱ、５μｍ、１００Å；Ｍｉｃｈｒｏｍ  Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ）で分離した。３％アセトニトリル／０．１％ギ酸（溶媒Ａ）と９０％アセトニトリル／０．１％ギ酸（溶媒Ｂ）からなる移動相の流速は２００ｎＬ／分であり、１０分間のカラム平衡化手順、１０分間の試料ローディング手順、及び次のグラジエントプロファイル：（分：Ｂ％）０：０；２：６；７２：４０％；７８：９０％；８４：９０％；８７：５０％；９０：５０％（最後の３つのステップは５００ｎＬ／分の流速である）からなる１１０分のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ法で構成されていた。ＭＳ及びＭＳ／ＭＳデータは、２．５ｋＶのスプレー電圧及びｍ／ｚ４００で６０，０００の分解能で正イオンモードで取得された。全てのデューティサイクルについて、ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＶｅｌｏｓでのＭＳ／ＭＳ分析のために、最も豊富な１０のペプチド前駆体が選択された（正規化された衝突エネルギー、４０％）。ｉＴＲＡＱベースの定量的プロテオミクスの詳細なフローチャートを示す（図４Ａ）。
【００５６】
定量的プロテオミクス分析  ｉＴＲＡＱ実験からのＭＳデータは、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒ（バージョン２．１；Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ）で分析された。ＭＳ／ＭＳスペクトルデータは、プログラムのＭＡＳＣＯＴ及びＳｅｑｕｅｓｔ  ＨＴ検索コンポーネントの抽出機能を使用して処理された。両方のコンポーネントについて、同じ検索パラメーターが選択され、これらには変更可能な修飾としてチロシンでのｉＴＲＡＱ標識、メチオニンの酸化、及びＮ／Ｑでの脱アミド化が含まれていた。Ｎ末端のｉＴＲＡＱ標識、及びシステインでのリジン、メチルチオ修飾は、固定された修飾として使用された。ＭＳデータは、５５，６９２配列を含むＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ７２ヒトタンパク質データベースに対して検索された。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒは、タンパク質エントリーの反転された配列を含む別個のデコイデータベース（逆データベース）を使用して、偽同定の割合を計算する。Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒは、両方の検索からの一致数を計数し、１つのペプチドのみが正しい一致であると仮定して、スペクトルごとのトップの一致のみを計数することにより、偽発見率（ＦＤＲ）を計算する。スコアの閾値は、フォワードのヒットと比較して１％及び５％のリバースのヒットを取得するように調整され、全体のＦＤＲは５％となった。前駆体及びレポーターイオンウィンドウの許容誤差は、それぞれ２０ｐｐｍ及び０．０５Ｄａに固定された。ピークリストの生成に指定された基準には、１．５の信号対雑音比と６００〜８，０００Ｄａの前駆体質量範囲の包含が含まれた。図８に示すように、ＰＰＩＡタンパク質からの２つの確認されたＳＡＦＥ−ＳＲＭ標的ペプチドは、最初は１％ＦＤＲカットオフを使用して明確に同定された。
【００５７】
さらなる確認のための潜在的ながんバイオマーカーとしての６４１ペプチドの選択合計２０４個のタンパク質が、３つの全血漿ｉＴＲＡＱプロテオミクスデータセットのうちの少なくとも２つで共有されていた。これらのタンパク質のうちの８７は、経験的修正ｅＢａｙｅｓ  ｔ検定での存在度検定スコアに基づいて、ＳＲＭベースの確認をさらに進めるための潜在的ながんバイオマーカーとして選択された。これらのタンパク質からの合計４６１のｐｒｏｔｅｏｔｙｐｉｃなペプチドがＳＲＭ定量化標的として選択された（タンパク質あたり約５つの標的ペプチド）。これらの４６１ペプチドのうち、２０８が実験で直接観察され、さらに２５３ペプチドがＰｅｐｔｉｄｅＡｔｌａｓ、ＰＲＩＤＥなどのいくつかのデータベースのクエリから追加された（例えば、Ｄｅｓｉｅｒｅ  ｅｔ  ａｌ．  ２００６  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ３４：Ｄ６５５−Ｄ６５８；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０８：２４４４−２４４９；及びＶｉｚｃａｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１６  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４：Ｄ４４７−Ｄ４５６を参照されたい）。また、ｉＴＲＡＱデータセット内に、これらのペプチドは、初期選択の厳密な基準を満たしていないが、生物学的特性に基づいて妥当な候補バイオマーカーとみなした１８０のペプチドを同定した。全体として、試験のフェーズ１から６４１のＳＲＭ標的ペプチドを選択し、確認フェーズ（データセットＳ４）に進めた。
【００５８】
Ｒ／Ｂｉｏｄｕｃｔｏｒでｌｉｍｍａパッケージを使用したペプチド定量化の統計分析プールされた試料のペプチド発現比は、１１４（正常個人プール）のものと比較して、１１７（膵臓癌プール）、１１６（結腸直腸癌プール）、または１１５（卵巣癌プール）のｉＴＲＡＱ標的のペプチドイオン強度の中央値に基づいて計算された。試料調製は二重で実施した（２回の生物学的反復）。ＭＳ分析は、最初の反復（データセット１を生成）で１回、２回目の反復で２回実行され、データセット２及び３を生成し、したがって技術的な反復であった。マトリックスは、未加工のペプチド存在量データを格納するために生成され、行名はペプチドの全ての固有の配列を含んだ。列１〜４には、データセット１からの１１４、１１５、１１６、及び１１７の標識強度の強度が格納された。列５〜８及び列９〜１２には、それぞれデータセット２及び３からの類似の標識強度が格納された。「ＮＡ」は、特定の標識を有する特定のデータセット（データセットＳ２）でペプチドが検出されなかったことを示すために使用された。
【００５９】
ＭＡプロットは、異なるデータセット間の潜在的なバイアスを比較するために生成された。これらのＭＡプロットでは顕著なバイアスが観察されなかったため（図９）、後続の分析のために正規化中央値を選択した（図１０）。この分析では、マイクロアレイデータの分析のために開発された概念を借用し、ＢｉｏｄｕｃｔｏｒプロジェクトのＲパッケージを使用してペプチドの倍数変化を分析した（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ９：５５５−５６６を参照されたい）。特に、観察された変化の統計的有意性を判断するために、ｌｉｍｍａ（マイクロアレイデータの線形モデル）からの修正ｔ検定を使用した（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｄｉａｇｎ  ９：５５５−５６６を参照されたい）。
ｙｉとｘｉがそれぞれがん血漿プロテオームと正常血漿プロテオームにおけるｉ番目のタンパク質の存在量を表すとすると、
【数１】
2021503607.tif 000002
及び、
【数２】
2021503607.tif 000003
であり、
式中、μ及びσは、３つのデータセットにおけるペプチド存在量の平均と分散を示す。反復間で有意な分散があるペプチドバイオマーカー（正常と比較してがん血漿プロテオームで高度に上方制御される）を同定することを回避するために、以下の式のｔ検定を採用した。
【数３】
2021503607.tif 000004
【００６０】
ｔ検定は、経験的ベイズ法によって修正された。他の全てから分離して各ペプチドを検定する代わりに、経験的ベイズ修正ｔ検定は、他の全てのペプチドから強度を借用し、それにより、個々の各ペプチドの誤差推定を改善する。ｌｉｍｍａ  ＲパッケージのｅＢａｙｅｓ修正ｔ検定を使用して、試料間のペプチド存在量の差を統計分析した。合計で、８７の異なるタンパク質からの２０８のペプチドが候補がんバイオマーカーとして同定され、この試験の確認フェーズに持ち越された。
【００６１】
定量的血漿プロテオミクスにより同定された候補バイオマーカー  プロテオミクスデータベース検索（ＰＲＩＤＥ、ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｐｒｉｄｅ／ａｒｃｈｉｖｅ／、及びＰｅｐｔｉｄｅ  Ａｔｌａｓ、ｗｗｗ．ｐｅｐｔｉｄｅａｔｌａｓ．ｏｒｇ／を使用）は、８７個のタンパク質に対して行われ、それらの２５３個の最も容易に検出可能なペプチド（上述の２０８個以外）候補ペプチドリストに追加された。３つの発見データセットから繰り返し観察されたが、ｅＢａｙｅｓ修正ｔ検定に合格しなかった別の１８０ペプチドも追加された。合計で、６４１個の候補ペプチドがさらなる確認に供された（データセットＳ４）。
【００６２】
ＳＡＦＥ−ＳＲＭアッセイの開発  我々の試験では、６４１の標的ペプチドを標的とする合計４，３８４の遷移が、合成ペプチドを使用して最適化された。各合成ペプチドについて、最適化された衝突エネルギーと滞留時間のセットが取得された（データセットＳ５）。
【００６３】
簡潔に述べると、弱塩基性環境（ｐＨ８．２）での各ペプチドの疎水性に基づいて、６４１の合成ペプチドを９６の画分に分離するためにＨＰＬＣ分取が行われた。次いで、図５に示すスキームに従って、合計９６のペプチド画分をそれぞれ３つの連続画分を含む３２群に編成した。これらの各群は、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４９０トリプル四重極  質量分析計に接続されたＣ１８ベースのＨＰＬＣを通じて分取された。各ペプチドを検出するための最適なパラメーターを決定するために、各々の群で４，３８４の遷移の全てをカバーするＳＲＭアッセイを実行した。各ペプチドのＳＡＦＥ−ＳＲＭ画分群ＩＤを同定した後、各画分群に固有のＳＡＦＥ−ＳＲＭ法を構築し、標的群の直前または直後に溶出した連続群のＳＲＭ遷移も方法に組み込んだ（図５）。各ペプチドのＳＡＦＥ−ＳＲＭ群ＩＤは、データセットＳ５に列挙され、ここで各ＩＤは、図５に示すｂＲＰＬＣ分取プレートを指す。
【００６４】
６４１の候補ペプチドが合成され、以下の３段階の最適化アプローチを使用してＳＡＦＥ−ＳＲＭ法を確立するための標準として使用された：
ｉ）前駆体イオン（通常は正に帯電したｐｒｏｔｅｏｔｙｐｉｃなペプチド）とプロダクトイオン（衝突誘起解離から生成されたペプチドフラグメント）の各ペアに対して、衝突エネルギーの最適化を行った。各前駆体イオンについて、上の２ステップ及び下の２ステップ（ステップサイズ、４ｅＶ）の衝突エネルギーの理論的最適値を適用して、各前駆体イオンを断片化した。各ペプチドについて、最も強い強度を示す５〜８個の断片化イオンを検出標的として選択した。ペプチドの質量電荷比（ｍ／ｚ）、最適化された衝突エネルギー値、及びペプチド断片化イオンのｍ／ｚは、このようにして各ペプチドに対して確立された。このような値のセットは、典型的にはＳＲＭ遷移と呼ばれる。合計で、４，３８４のＳＲＭ遷移がこのように最適化され、６４１のペプチドを標的にした（平均して、ペプチドあたり約７の遷移）。
ｉｉ）ｂＲＰＬＣ分取の最適化。６４１の合成ペプチドは、上述のように調製された試験のフェーズ１で使用されたプールされた正常血漿試料に由来するペプチドにスパイクされ、３つの独立したＨＰＬＣ分取が行われた。上述のように、ｂＲＰＬＣ分取からの９６の画分を「画分群」にまとめ、各群が３つの連続した画分を含んだ。各ｂＲＰＬＣ画分群で４，３８４の遷移を評価し、各遷移について固定された滞留時間を有した（５ｍｓ）。各ペプチドの最高量を含むｂＲＰＬＣ画分群が決定され、それによって各ペプチドの画分群ＩＤが定義された。各ペプチドの標準強度（ＳＩ）（１０ｆｍｏｌのペプチドについて質量分析計で測定された強度）も記録した。
ｉｉｉ）  ＳＲＭ法の構築。同一の画分群ＩＤを持つペプチドからの全ての遷移をコンパイルすることにより、各画分群ごとに固有のＳＲＭ法が作成された。同一のＳＲＭ遷移が、主要な画分群の前後に溶出する画分群で評価された。したがって、各画分群は、ＳＲＭ遷移の３つの異なるセットで評価された。各遷移についての滞留時間は、ペプチドのＳＩに反比例するように修正され、３〜２０ｍｓの範囲であった。
【００６５】
各合成ペプチドについて、最適化された衝突エネルギーと滞留時間のセットが取得された。全てのペプチドのＳＲＭ遷移と画分群ＩＤのリストをデータセットＳ５に示す。全ての遷移パラメーターは手動で検査及びキュレーションされ、ヒト血漿試料中の非特異的分析物との共溶出による過度のノイズを伴うイオンを除外した。フェーズ１で使用された全ての進行がん血漿試料のプールで、１，９９０の遷移のセットが３１８ペプチドに対応して再現性よく検出された（データセットＳ５）。
【００６６】
標準ペプチドを使用した最初の方法構築ステップの後、最後のＨＰＬＣ−ＭＳステップで分析する必要がある群の数を３２から２０に削減することができた。６４１のペプチドのうち合計３１８がこれらの２０の群の少なくとも１つで再現性よく観察され、１，９９０の検出可能な遷移（ペプチドあたり平均６．３遷移）が得られた。
【００６７】
ＳＡＦＥ−ＳＲＭの性能評価６つの重同位元素標識ペプチド（ペプチド１：ＩＱＬＶＥＥＥＬＤＲ＊（配列番号３）；ペプチド２：ＶＩＬＨＬＫ＊（配列番号４）；ペプチド３：ＩＩＬＬＦＤＡＨＫ＊（配列番号５）；ペプチド４：ＴＬＡＥＳＡＬＱＬＬＹＴＡＫ＊（配列番号６）；ペプチド５：ＬＬＧＨＬＶＫ＊（配列番号７）；ペプチド６：ＧＬＶＧＥＩＩＫ＊（配列番号８）、ここで＊はＣ１３及びＮ１５重同位元素標識アミノ酸を示す）を、それぞれ１ｆｍｏｌで混合し、混合物を標準のＳＲＭ法で分析した。等量（各１ｆｍｏｌ）の６つの重同位元素標識ペプチドをタンパク質分解消化された血漿ペプチド試料に添加し、標準のＳＲＭアプローチ（ｂＲＰＬＣ分取を伴わない）、ｂＲＰＬＣ−ＳＲＭアプローチ、またはＳＡＦＥ−ＳＲＭアプローチで検出した。ペプチド存在量は、各アプローチで検出されたペプチドのＳＲＭシグナルのＡＵＣによって計算された。
【００６８】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４９０質量分析計の調整  各血漿試料のＳＡＦＥ−ＳＲＭアッセイは、製造元の調整混合物（Ａｕｔｏｔｕｎｅ及びＣｈｅｃｋｔｕｎｅ）並びに我々が調製した調整混合物を使用して機器の性能を確認した後でのみ実施した。我々の調整混合物は、広範囲の質量（Ｍ／ｚ範囲、２００〜１，４００）と疎水性を表す２０のペプチドからなった（表Ｓ２）。
【表１】
2021503607.tif 000005
【００６９】
データ分析  全ての群に対して２０の異なるＳＲＭ法で構成される一連のアッセイを実行して、３１８のペプチドのそれぞれの存在量を定量化した。２０のデータセットは、各血漿試料に対して２０のＳＡＦＥ−ＳＲＭ法を使用して質量分析計によって生成され、データ分析のためにＳｋｙｌｉｎｅ  ３．６にインポートされた（例えば、ＭａｃＬｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２６：９６６−９６８を参照されたい）。デュアルコントロールアプローチにより、標識参照ペプチド（ＬＲＰ）法（例えば、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  １０：Ｍ１１０．００６５９３）を参照されたい）を改善し、試料調製効率の分散と質量分析計の感度の変動を調整した。第１の対照は、試料調製の前に血漿試料にスパイクした重同位元素標識変異ＫＲＡＳタンパク質であった。第２の対照は、最終的なＨＰＬＣ−ＭＳで実行する前に、各群にスパイクされた重同位元素標識ＷＴ  ＫＲＡＳペプチドであった。標的ペプチドの存在量は、３ｆｍｏｌの重同位元素（重リジン残基）で標識されたＫ−Ｒａｓ  ＷＴペプチド（ＬＶＶＶＧＡＧＧＶＧＫ；配列番号２３）からの全ての遷移の合計曲線下総面積（ＡＵＣ）に正規化された、全ての遷移のＡＵＣで表された。所定の試料からの各ペプチドの存在量を、Ｏｒｉｇｅｎｅから購入した重同位元素標識Ｋ−Ｒａｓ変異体（Ｇ１２Ｄ）タンパク質に由来するペプチドの存在量に正規化することにより、試料調製の変動を調整した。この調整のために、この重同位元素アミノ酸（重リジン及び重アルギニン）標識タンパク質に由来する６つのペプチドを選択した。ペプチド配列と最適化された遷移パラメーターは、データセットＳ５に列挙される。
【００７０】
ＳＡＦＥ−ＳＲＭ存在量スコア（Ｓ）は、全ての試料の３１８のペプチドのそれぞれについて計算された。Ｐｉ、ｊ、ｋが試料ｊの画分ｋのペプチドｉの積分強度、Ｎｊ、ｋが試料ｊの画分ｋのＫ−Ｒａｓ  ＷＴ重対照ペプチドの積分強度、Ｍｊが試料ｊにおけるＫ−ＲＡＳタンパク質ペプチドの中央値存在量の積分強度であると仮定する。Ｓｉ、ｊを試料ｊのペプチドｉの存在量スコアとする。したがって、Ｓｉ、ｊは次のように計算できる。
【数４】
2021503607.tif 000006
式中、Ｍｊについて
【数５】
2021503607.tif 000007
【００７１】
この試験では、３１８のペプチドのうち７１が、隣接する２つのＳＡＦＥ−ＳＲＭ群全体で繰り返し検出された。各試料中のこのようなペプチドの存在量は、ペプチドが検出された隣接するＳＡＦＥ−ＳＲＭ実行の正規化された存在量スコアを合計することによって計算された。
【００７２】
ＳＡＦＥ−ＳＲＭパイプラインの再現性は、試料ｊの再現率（ＲＲ）を次のように計算することによって測定された。
【数６】
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【００７３】
ＳＡＦＥ−ＳＲＭパイプラインを通じて処理された各試料のＲＲ値は、データセットＳ７に列挙された。
【００７４】
がんプロテオミクスバイオマーカーの同定  最良のペプチド分類子を同定するために、ＭＡＴＬＡＢにおいて段階的な前方選択ロジスティック回帰が採用された。最初に、ロジスティック回帰モデルを、３１８のペプチド存在量スコアを使用して、２７の既知の健康な試料と７、７、及び９の既知の結腸直腸癌、卵巣癌、及び膵臓癌の血漿試料を含む５０試料のトレーニングセットに適合した。各モデルの予測モデルの性能を推定するために、１個抜きのクロス確認が使用された。トレーニングセットでクロス確認された誤分類率が最も低いペプチドをモデルに含めるために選択した。１を超えるペプチドが最も低い誤分類率を達成した場合、モデルの可能性が最も高いペプチドを選択することにより、つながりが壊れた。モデルに追加するペプチドバイオマーカーを選択するこのプロセスは、ペプチドの追加によってクロス確認の誤分類率のさらなる低下が達成できなくなるまで繰り返された。完全な分類を達成できる同一のタンパク質由来のペプチドのサブセットを見つけるために、同一の段階的前向き選択手順が各々の潜在的なバイオマーカータンパク質に適用された。最良の分類子を同定した後、ペプチドバイオマーカーのさまざまな組み合わせに適合するモデルの予測性能を、追加の４８試料について盲検的に比較した。最良のペプチド分類子の組み合わせと個々の最良のペプチド分類子の組み合わせによって構築された予測モデルを、７３試料の追加コホートで盲検的に評価した。
【００７５】
結果
試験デザイン  この試験は、定性的及び定量的ＭＳ技術の組み合わせを使用して、がん固有のプロテオミクスバイオマーカーを同定及び確認するために設計された。この技術分野におけるこれまでのほとんどの試験は、がん組織の分析から始まり、次いで、がん特異的なタンパク質またはペプチドが血漿中で同定できるかどうかを判定しようとしていた。本試験では、血漿から直接候補ペプチドを同定することを試みた。試験は３つの別々のフェーズで実行された：フェーズ１、がん患者と健康な個人からの試料の全血漿プロテオミクスプロファイリング、１８８の遺伝子由来の６４１の候補ペプチドマーカーを得た；フェーズ２、、ＳＲＭによる分取溶出液の逐次分析（ＳＡＦＥ−ＳＲＭ）と呼ばれる、選択された反応モニタリング（ＳＲＭ）ベースのアッセイの実装、追加の血漿試料中の６４１の候補ペプチドマーカーのそれぞれを評価して、有望なバイオマーカーとしてのペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼＡ（ＰＰＩＡ）由来の２つのペプチドを得た；フェーズ３、ＳＡＦＥ−ＳＲＭを使用したがん患者と対照の独立したセットにおけるこれら２つのペプチドの性能の評価。フェーズ１は、多数のタンパク質の定性分析に最適なＯｒｂｉｔｒａｐ質量分析計で行われ、一方で、フェーズ２及び３は、選択された分析物の定量分析に最適なトリプル四重極質量分析計で行われた。この試験の３つのフェーズで、さまざまなドナー供給源由来の合計２６６の血漿試料が評価された（表Ｓ１）。
【００７６】
【表２】
2021503607.tif 000009
【００７７】
フェーズ１：がん患者からのバイオマーカー候補の同定がんの潜在的なタンパク質バイオマーカーを同定するために、まず、５０人の正常な健康な個人、１８人の卵巣癌の患者、１３人の膵臓癌の患者、及び１８人の結腸直腸癌の患者から、等量の血漿からなる４つのプールされたヒト血漿試料を作成した（データセットＳ１）。高濃度の推定バイオマーカーが血漿中に見つかる可能性を最大にするために、全てのがん患者は進行した疾患を有していた。抗体ベースの血漿枯渇を実施して、４つのプールのそれぞれからアルブミン及び免疫グロブリンなどの１４の豊富なタンパク質を除去した。次いで、各プールをトリプシンで消化し、得られたペプチドをｉＴＲＡＱで特異的に標識した。ｉＴＲＡＱ標識により、４つのプールを混合して１つのＭＳ実験で分析できる。次いで、プールを分析して全プロテオームを評価した（図１Ａ及び図４Ａ）。個別の実験において、グリコシル化タンパク質由来のペプチドの潜在的な相違を明らかにするために、トリプシン消化とｉＴＲＡＱ標識の前に、プールされた血漿試料は、糖タンパク質を濃縮した（図４Ｂ）。
【００７８】
図４に概説するワークフロー全体の反復を実行した。これらの分析により、合計で２２３，６０２のペプチドが同定され、これは１，２４９の独自のタンパク質から１０，７８９の固有のペプチドを表す（データセットＳ２及びＳ３）。次いで、がん患者及び正常な個人からの血漿試料中のこれらの各ペプチドの相対的存在量を、経験的ベイズ修正ｔ検定（材料及び方法）を使用して計算した。合計８，０６９の固有のペプチドが少なくとも２つの反復で定量化され、反復間のこれらのペプチドの存在量の相関は０．７４（９５％ＣＩ、０．７３〜０．７５）であった。材料及び方法で詳細に説明されているように、我々の分析は最終的に、プールされた正常対照と比較してプールされたがん血漿試料中の存在量が大幅に増加した１８８のタンパク質に由来する６４１のペプチドを得た（データセットＳ４）。
【００７９】
フェーズ２ａ：ＳＡＦＥ−ＳＲＭの開発  何百もの固有の潜在的なペプチドバイオマーカーの確認は、困難な作業である。この困難さは、血漿タンパク質からのそのようなペプチドの存在量が一般に低く、異なるペプチドの存在量がこの低い範囲内でかなり変動するという事実によって悪化する。これらの課題に取り組むためのアプローチを、５つの主要なコンポーネントで開発した。第１に、目的の６４１のペプチドは個別に合成されたが、高度に精製されていないため、コストを管理可能に維持できる。第２に、これらの各ペプチドに対してＳＲＭ法が作成された。６４１の各方法は、主要な目的の衝突後のペプチド固有の遷移の強度が最も高くなる前駆イオンの衝突エネルギーと滞留時間について最適化された。各ペプチドに与えられた滞留時間は、等量の合成ペプチドをスパイクしたヒト血漿ペプチド試料から測定されたペプチドの強度に反比例した。この特徴により、装置はシグナル強度が低いペプチドの検出により多くの時間を費やすことができ、それにより、少量のペプチドを検出するための全体的なイオン統計が改善された。このプロトコールにより、４，３８４の遷移（ペプチドあたり約７つの遷移、データセットＳ５）が同定された。
【００８０】
第３に、基本的なｐＨ逆相液体クロマトグラフィー（ｂＲＰＬＣ）を使用してペプチドを分取し、それぞれ３つの連続した画分を含む３２の「画分群」にまとめられた９６の画分を得、さらに分析するために、２０の画分群を選択した。第４に、各画分群のペプチドは、疎水性相互作用に基づく直交高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法（Ｃ１８−ＲＰＬＣ）で分離された。最後に、第２のＨＰＬＣカラムからの連続溶出液を、上述の合成ペプチドを使用して事前最適化された衝突エネルギー、滞留時間、遷移からなるＳＲＭ法を使用して分析した。このアプローチをＳＡＦＥ−ＳＲＭと呼んだ（図５）。ＳＡＦＥ−ＳＲＭの利点の１つは、２次元クロマトグラフィー分取を採用していることである。個別の画分には、全体よりもはるかに少ないペプチドが含まれているため、不要なペプチドによるイオン抑制が減少し、シグナル対ノイズ比が向上する。ＳＡＦＥ−ＳＲＭの第２の利点は、確認フェーズでペプチドの発見に使用される定性的アプローチが定量的アプローチに変換されることである。最後に、この方法は、ｂＲＰＬＣクロマトグラフィーで一般的に観察される溶出時間の変動に非常に耐性があり、これは、連続する画分がペプチドの存在量について冗長に試験されるためである（材料及び方法）。
【００８１】
ＳＡＦＥ−ＳＲＭの性能を評価するために、ＨＰＬＣで異なる疎水性特性を持つ６つのペプチドを選択し、それらを重同位元素標識形態（材料及び方法）として合成した。次いで、これらのペプチドを混合し、上述の最適化された衝突エネルギーと滞留時間を使用して標準のＳＲＭ分析を実行した。予想通り、６つのペプチド全てが高い信頼度で検出された。しかしながら、上述のようにこれらのペプチドを正常な血漿から生成されたトリプシン消化試料にスパイクすると、それらの平均強度は純粋なペプチドで得られたものの約５％にすぎず、６つのペプチドのうち３つのみが完全に検出可能であった。このスパイクされた試料をＳＡＦＥ−ＳＲＭで分析すると、６つのペプチド全てを検出でき、その強度は純粋なペプチドで得られたものの平均７０％であった（図２）。
【００８２】
フェーズ２ｂ：ＳＡＦＥ−ＳＲＭによる候補ペプチドの試験  最初に、ＳＡＦＥ−ＳＲＭを使用して、試験の最初のｉＴＲＡＱベースの発見フェーズで使用された４つの血漿プールを評価した。これらのプールされた試料で検出可能なペプチドは、イオン抑制、同一のクロマトグラフィー画分での不要なペプチドの共溶出、またはその他の技術的な問題による影響が最も少ないと予想された。注意深く調査した結果、６４１の試験されたペプチドのうち３１８が、プールされた試料で１，９９０の遷移（ペプチドあたり６．３遷移、データセットＳ５）を通じて再現性よく検出可能であることが判明した。これらの３１８のペプチドは１２１のタンパク質にマッピングされた。
【００８３】
次いで、ＳＡＦＥ−ＳＲＭを使用していずれも発見フェーズでは使用されなかった９４の個人の血漿試料を評価した。これらの試料のうちの４８は正常な個人からのものであり、１４、１４、及び１８はそれぞれ結腸直腸癌、卵巣癌、及び膵臓癌の患者からのものであった（データセットＳ１）。ＳＡＦＥ−ＳＲＭの存在量スコアは、９４の個人及び４つのプールされた血漿試料のそれぞれの３１８ペプチドのそれぞれについて計算された（データセットＳ６）。統計的手法を使用して、ペプチドまたはペプチドの組み合わせが試料の起源をペプチドのシグネチャから正確に分類できたかどうかを判断した。この目的のために、トレーニング用の試料の約半分をランダムに選択した（健常ドナーから２７、大腸癌、卵巣癌、または膵臓癌の患者からそれぞれ７、７、９試料）。試料の残りの半分は、トレーニング試料から派生した分類子の性能を試験するために使用された。
【００８４】
分類モデルが進化するにつれ、予測モデルの性能を推定するために、再帰的で、１個抜きのクロス確認戦略が使用された。最初に、トレーニングセットで最高のクロス確認済み分類スコアを生成するペプチドが選択された。次いで、ペプチドに関するデータを検索して、いずれかの第２のペプチドが分類スコアを増加できるかどうかを判断した。追加するペプチドバイオマーカーを選択するこのプロセスは、他のペプチドの追加によって分類スコアのさらなる増加が達成できなくなるまで繰り返された。このアプローチを使用して、優れた分類の可能性を持つペプチドのいくつかの組み合わせが特定された（図３Ａ及びＢ）。
【００８５】
いくつかのマーカーの組み合わせによる卵巣癌の分類で最高のパフォーマンスが観察された。卵巣癌の頂点の単一ペプチドマーカーは、ＰＰＩＡ（シクロフィリンＡとも呼ばれる）由来のＶＳＦＥＬＦＡＤＫ（配列番号１）であった。次いで、３１８ペプチドセット内のＰＰＩＡからの他のペプチドのいずれかを、特異性を低下させることなく分類子に追加できるかどうかを判断し、ＰＰ１Ａからの第２のペプチド（ＦＥＤＥＮＦＩＬＫ；配列番号２）をこの方法で追加できることを発見した（図３Ｃ）。３６の正常試料間で１００％の特異性をもたらすペプチド存在量レベルを使用して、ＶＳＦＥＬＦＡＤＫ（配列番号１）及びＦＥＤＥＮＦＩＬＫ（配列番号２）がそれぞれ７５．０％及び７８．６％の感度をもたらすことを発見した。２つのＰＰＩＡペプチドのピアソン相関係数は０．８３（９５％ＣＩ、０．７８〜０．８７）であった。２つのペプチドのうち少なくとも１つは、２８の試料のうちの２３（８２．１％）で上昇した。
【００８６】
フェーズ３：確認  分類子を作成するために使用されたデータセットは大きく、９８の試料のそれぞれで試験された３１８のペプチドからの１，９９０の遷移であった。そのような実験では過剰適合が可能であり、全ての分類子の独立した確認が必須であることはよく知られている。したがって、３５の卵巣癌症例由来の血漿と健康な個人または他のがんタイプの患者からの３８の試料からなる７３症例の個別のコホートを評価した（データセットＳ７）。これらの７３の症例では、ＳＡＦＥ−ＳＲＭが実行されたが、分析された遷移は、ＰＰＩＡからの２つのペプチドとフィブロネクチンからのペプチドに対応するものだけであった。これは、全ての試料で同様のレベルで発現することが判明し、したがって正規化に使用された。陽性スコアに必要な相対存在量は、上述のフェーズ２ｂの結果から事前に決定された。卵巣癌患者及び正常な個人におけるこれらのペプチドのＳＡＦＥ−ＳＲＭプロファイルの例を図６に示す。卵巣癌症例からの３５の血漿試料のうちの２０（５７．１％；９５％ＣＩ、４０〜７３％）が、ＰＰＩＡからのＶＳＦＥＬＦＡＤＫ（配列番号１）について陽性であったが、一方、正常な個人からの１４の試料はいずれも陽性ではなかった（特異度１００％、９５％ＣＩ、８９〜１００％）。ＰＰＩＡからの第２のペプチドＦＥＤＥＮＦＩＬＫ（配列番号２）については、卵巣癌症例からの３５の血漿試料のうちの１４（４０．０％；９５％ＣＩ、２４〜５８％）が陽性であり、第１のＰＰＩＡペプチドについては、健康な個人からの１４の試料はいずれも陽性ではなかった。ＦＥＤＥＮＦＩＬＫ（配列番号２）ペプチドが陽性の血漿試料は全て、同一のタンパク質由来のＶＳＦＥＬＦＡＤＫ（配列番号１）も陽性であった。膵臓癌の２４人の患者がこのアッセイで試験され、そのうちの１人だけ（４．２％；９５％ＣＩ、０．２〜２３．１％）がペプチドＶＳＦＥＬＦＡＤＫ（配列番号１）で陽性であり、ペプチドＦＥＤＥＮＦＩＬＫ（配列番号２）で陽性でなかった（データセットＳ７）。
【００８７】
早期卵巣癌患者由来の血漿の１７のうちの１１（６４．７％）がＰＰＩＡペプチドについて陽性であったのに対し、より進行したがん患者の血漿の４６のうちの３２（６９．６％）が陽性（結合期）とであったことは注目に値する（フェーズ２ｂ及びフェーズ３を組み合わせる、データセットＳ７）。比較のために、ＣＡ１２５レベルは同一のコホートのサブセットで測定された。ＣＡ１２５は、６３人の卵巣癌患者のうちの２０人で上昇し、５０人の健康な対照では上昇しなかった。ＣＡ１２５とＰＰＩＡにおける上昇は完全に重なり合うことがなかったため、ＣＡ１２５またはＰＰＩＡのいずれかのレベルの検出感度は７４．６％（９５％ＣＩ、６２．１〜８４．７％）であり、いずれか単独よりも高かった（図７のベン図を参照されたい）。
【００８８】
これらの結果は、ＳＡＦＥ−ＳＲＭが循環中の疾患特異的ペプチドを発見するための一般化可能な方法として使用できることを示している。具体的には、ＳＡＦＥ−ＳＲＭ法を使用して、哺乳動物が卵巣癌を有すると同定するための循環ペプチドマーカーとして使用できる、ＰＰＩＡからのペプチドを同定及び確認する。
【００８９】
他の実施形態
本発明は、それらの詳細な説明と共に記載されてきたが、前述の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の範囲を例示することを意図し、それを限定することを意図しないことを理解されたい。他の態様、利点、及び改変は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【００９０】
【表３】
2021503607.tif 000010
【表４】
2021503607.tif 000011
【表５】
2021503607.tif 000012
【表６】
2021503607.tif 000013
【表７】
2021503607.tif 000014
【００９１】
【表８】
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【表９】
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【表１０】
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【００９２】
【表１１】
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【表１２】
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【表１３】
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【表１４】
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【００９３】
【表１５】
2021503607.tif 000022
【表１６】
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【表１７】
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【表１８】
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【表１９】
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【表２０】
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【表２１】
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【表２２】
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【００９４】
【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【００９５】
【表２８】
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【表２９】
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【表３０】
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【表３１】
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【表３２】
2021503607.tif 000039
【００９６】
【表３３】
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【表３４】
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【表３５】
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【表３６】
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【表３７】
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【００９７】
【表３８】
2021503607.tif 000045
【表３９】
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【表４０】
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【表４１】
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【表４２】
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【００９８】
【表４３】
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【表４４】
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【表４５】
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【表４６】
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【表４７】
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【００９９】
【表４８】
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【表４９】
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【表５０】
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【表５１】
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【表５２】
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【表１４８３】
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【表１４８４】
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【表１４９０】
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【表１４９１】
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【表１４９２】
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【表１４９３】
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【表１４９５】
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【表１４９６】
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【表１４９７】
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【０３９０】
【表１４９８】
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【表１４９９】
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【表１５００】
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【表１５０１】
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【表１５０２】
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【表１５０３】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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