(57)【要約】  本発明は、アフリカ豚熱ウイルスのＰ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む組み換えベクター、前記組み換えベクターにより形質転換された形質転換体及び前記形質転換体から分離したアフリカ豚熱ウイルスのＰ３２抗原タンパク質を含むアフリカ豚熱の診断用組成物及びキットなどに関する。【選択図】なし
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなるアフリカ豚熱（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）ウイルスＰ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、
植物体で発現することを特徴とする、アフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項２】
前記組み換えベクターは、配列番号３のＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項３】
前記ＢｉＰをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５′末端方向に位置することを特徴とする、請求項２に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項４】
前記組み換えベクターは、配列番号４のポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項５】
前記ポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３′末端方向に位置することを特徴とする、請求項４に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項６】
前記組み換えベクターは、配列番号６のＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項７】
前記ＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３′末端方向に位置することを特徴とする、請求項６に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項８】
前記組み換えベクターは、配列番号３のＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４のポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチド；及び
配列番号６のＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項９】
前記組み換えベクターは、ＢｉＰをコードするポリヌクレオチド、Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチド及びＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されたことを特徴とする、請求項８に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項１０】
前記組み換えベクターは、配列番号８の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターで形質転換された、形質転換体。
【請求項１２】
前記形質転換体は、植物体であることを特徴とする、請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質は、水溶性であることを特徴とする、請求項１３に記載のアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質。
【請求項１５】
請求項１３に記載のアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を有効成分として含む、アフリカ豚熱の診断用組成物。
【請求項１６】
請求項１３に記載のアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を有効成分として含む、アフリカ豚熱の診断用キット。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を抗原として用いてヒトを除いた動物に由来する生物学的試料内で抗原−抗体反応を通じてアフリカ豚熱ウイルスに対する抗体を検出する段階を含む、アフリカ豚熱の診断方法。
【請求項１８】
下記の段階を含むアフリカ豚熱の診断のための組み換え抗原の製造方法：
（ａ）請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターを植物体に形質転換させる段階；及び
（ｂ）前記植物体から組み換え抗原を分離及び精製する段階。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質の、アフリカ豚熱の診断のための使用。
【請求項２０】
アフリカ豚熱の診断に用いられる製剤を生産するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アフリカ豚熱（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ，ＡＳＦ）診断用抗原Ｐ３２タンパク質生産用組み換えベクター、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体、及び前記形質転換体から分離したＡＳＦウイルスのＰ３２タンパク質を含むアフリカ豚熱の診断用組成物及びキットなどに関する。
【０００２】
本出願は、２０１９年６月１７日に出願された韓国特許出願第１０−２０１９−００７１８６１号及び２０２０年６月１５日に出願された韓国特許出願第１０−２０２０−００７２２０４号に基づく優先権を主張し、当該出願の明細書及び図面に開示されたすべての内容は本出願に援用される。
【背景技術】
【０００３】
アフリカ豚熱（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ，ＡＳＦ）は、アスファウイルス科（Ａｓｆａｒｖｉｒｉｄａｅ）に属するアフリカ豚熱ウイルス（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ，ＡＳＦＶ）感染による豚伝染病であって、１９２１年にケニアで最初報告があった後、主にサハラ以南の地域で発生報告があり、２００７年以後に黒海沿岸であるジョージア、アルメニア、アゼルバイジャンなどアフリカ以外の地域でその発生範囲が増え始めた。特に最近には、韓国と交流が多いロシア内で東西にその発生が広がっている。アフリカ豚熱は、豚に感染時に斃死率が１００％に達し、この疾病に対するワクチンが開発されていないため、発生直ちに処分しなければならない危険度の高い伝染病であって、診断が大変重要である。
【０００４】
アフリカ豚熱ウイルス特異タンパク質のうち、Ｐ１５、Ｐ３５、Ｐ７２、Ｐ５４、及びＰ３０などが、抗原性が高いと知られていて、診断候補群として考慮されている。現在アフリカ豚熱ウイルス抗体を用いた診断用キットは生産されたことがなく、外国の場合、Ｐ３０組み換えタンパク質を用いた抗体診断キット（ＳＶＡＮＯＶＩＲ社）などが商業化されて使用されている。
【０００５】
一方、分子生物学と遺伝工学技術の目覚ましい発達は、植物分野にも及び、植物体から有用生理活性物質を生産しようとする努力が着実に続いている。植物から有用物質を生産することは、生産コストを顕著に減少させることができ、従来、一般的方法（動物細胞又は微生物でタンパク質を合成して分離精製する方法）で発生しうる様々な汚染源（ウイルス、癌遺伝子、腸毒素など）を根本的に排除することができると共に、商品化段階でも動物細胞や微生物とは異なって、種子での管理が可能であるという点から有利な利点を有している。
【０００６】
これより、本発明者らは、アフリカ豚熱清浄国を維持し、疾病の流入に備えるための迅速なアフリカ豚熱抗原診断法を開発するために鋭意努力した結果、アフリカ豚熱ウイルス特異タンパク質のうち、Ｐ３２組み換えタンパク質を植物体にて高効率で発現させることができるシステムを開発して、本発明を完成することになった。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
アフリカ豚熱ウイルスは、感染細胞の細胞質を複製する巨大二重らせんＤＮＡウイルスである。このウイルスは、豚に斃死率の高い出血熱を引き起こしながらも、疾病の兆候なしに媒介体の役割をするような自然的宿主豚、イボイノシシ、アカカワイノシシ、カズキダニ科に属するヒメダニ（Ｏｒｎｉｔｈｏｄｏｒｏｓ）属に持続的に感染する。このウイルスは、豚に致命的な出血熱を発生させるので、早期に診断することが大変重要である。
【０００８】
本発明は、上記のようなアフリカ豚熱の感染が疑われる個体を迅速に診断する必要性及び従来技術上の問題点を解決するために導き出されたものであって、植物体を用いて効率的な生産が可能であると共に、診断敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）及び特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）の高い組み換えアフリカ豚熱ウイルス抗原、及びこれを含むアフリカ豚熱の診断用組成物又はキットを提供することを目的とする。
【０００９】
また、本発明は、前記アフリカ豚熱ウイルス抗原をコードする遺伝子を含む組み換えベクター、及び前記組み換えベクターにより形質転換された形質転換体などを提供することをその目的とする。
【００１０】
また、本発明は、アフリカ豚熱の診断方法、アフリカ豚熱の診断のための組み換え抗原の製造方法及び前記組み換えタンパク質を含むアフリカ豚熱の診断用組成物の製造方法などを提供することを目的とする。
【００１１】
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
上記のような本発明の目的を達成するために、本発明は、配列番号２のアミノ酸配列からなるアフリカ豚熱（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）ウイルスＰ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、植物体で発現することを特徴とする、アフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクターを提供する。
【００１３】
本発明の一具現例において、前記組み換えベクターは、配列番号３のＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができる。
【００１４】
本発明の他の具現例において、前記ＢｉＰをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５′末端方向に位置することができるが、これに制限されるものではない。
【００１５】
本発明のさらに他の具現例において、前記組み換えベクターは、配列番号４のポリヒスチジン（ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができる。
【００１６】
本発明のさらに他の具現例において、前記ポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３′末端方向に位置することができるが、これに制限されるものではない。
【００１７】
本発明のさらに他の具現例において、前記組み換えベクターは、配列番号６のＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができる。
【００１８】
本発明のさらに他の具現例において、前記ＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３′末端方向に位置することができるが、これに制限されるものではない。
【００１９】
本発明のさらに他の具現例において、前記組み換えベクターは、配列番号３のＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；配列番号４のポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチド；及び配列番号６のＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００２０】
本発明のさらに他の具現例において、前記組み換えベクターは、ＢｉＰをコードするポリヌクレオチド、Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチド及びＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドが順次に連結され得るが、これに制限されるものではない。
【００２１】
本発明のさらに他の具現例において、前記組み換えベクターは、配列番号８の塩基配列を含むことができるが、これに制限されるものではない。
【００２２】
また、本発明は、前記組み換えベクターで形質転換された形質転換体を提供する。
【００２３】
本発明の一具現例において、前記形質転換体は、植物体でありうる。
【００２４】
また、本発明は、前記組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を提供する。
【００２５】
また、本発明は、前記組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質のアフリカ豚熱の診断用途を提供する。
【００２６】
しかも、本発明は、アフリカ豚熱の診断に用いられる製剤を生産するための用途として前記組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を提供する。
【００２７】
本発明の一具現例において、前記タンパク質は、水溶性でありうる。
【００２８】
また、本発明は、前記アフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を有効成分として含む、アフリカ豚熱の診断用組成物を提供する。
【００２９】
また、本発明は、前記アフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を有効成分として含む、アフリカ豚熱の診断用キットを提供する。
【００３０】
また、本発明は、前記組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を抗原として用いてヒトを除いた動物に由来する生物学的試料内で抗原−抗体反応を通じてアフリカ豚熱ウイルスに対する抗体を検出する段階を含む、アフリカ豚熱の診断方法又はアフリカ豚熱の決定方法を提供する。
【００３１】
また、本発明は、（ａ）本発明による組み換えベクターを植物体に形質転換させる段階；及び（ｂ）前記植物体から組み換え抗原を分離及び精製する段階を含むアフリカ豚熱の診断のための組み換え抗原の製造方法を提供する。
【００３２】
また、本発明は、（ａ）本発明による組み換えベクターを植物体に形質転換させる段階；（ｂ）前記植物体から組み換え抗原を分離及び精製する段階；及び（ｃ）前記分離・精製された組み換え抗原を用いて診断用組成物又は診断用キットを製造する段階を含む、アフリカ豚熱の診断用組成物又はキットの製造方法を提供する。
【発明の効果】
【００３３】
アフリカ豚熱を含むウイルス性疾病の診断及び予防に用いるためのタンパク質、特に抗原は、タンパク質のフォールディング、グリコシル化などの問題によってバクテリアを用いずに、主に動物細胞を用いて生産されている。しかしながら、動物細胞を用いたワクチン生産方法は、大量生産のための設備拡充に大きい費用がかかるので、製造が容易でなく、抗原のコストが高価である場合が多い。また、動物細胞を用いて製造された抗原は、保存が容易でないと共に、動物に感染可能なウイルスに汚染される可能性が高いという短所を有している。しかしながら、本発明は、植物を用いてこのような短所を補完した。すなわち植物細胞は、動物細胞とは異なって、動物に感染可能なウイルスに汚染される可能性が非常に低く、ただ耕作面積が確保されれば、いつでも大量生産が可能であると共に、植物体を通じて長期保管が可能であるので、安定的に安価な抗原の生産が可能である。
【００３４】
本発明の組み換えアフリカ豚熱ウイルス抗原は、植物体でも効果的に発現すると共に、高い水溶性を有していて、分離及び精製が容易であり、また、アフリカ豚熱ウイルスに対する高い敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）及び特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）を示すので、多様な分野に幅広く使用可能なものと期待される。
【００３５】
また、本発明による組み換えアフリカ豚熱ウイルス抗原タンパク質を用いてアフリカ豚熱を診断できる組成物又はキットを製作することができ、したがって、アフリカ豚熱に感染した個体を早期に診断することができるので、疾病の拡散防止に有用に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】図１は、本発明の一実施例による植物体でアフリカ豚熱ウイルスＰ３２抗原の発現のための遺伝子の配列を示す切断地図である（ＮＢ，ｎｅｗ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；６ｘＨｉｓ、ポリヒスチジンタグ；ＨＤＥＬ、小胞体保留シグナル）。
【図２】図２は、植物体でＰ３２抗原を発現させた後、分離精製してウェスタンブロッティングで確認した結果を示す図である（Ｔ、全抽出物；Ｓ、上清画分；Ｐ、沈殿画分）。
【図３】図３は、本発明の一実施例による植物体でアフリカ豚熱ウイルスＰ３２抗原を発現させた後、その純度を確認した結果を示す図である。
【図４】図４は、本発明の組成物を含むアフリカ豚熱に対する抗体血清診断キットを作製し、スペインのアフリカ豚熱標準実験室で提供する血清を用いて前記抗体血清診断キットの反応性及び敏感度をテストした結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
別途定義されない限り、本明細書で使用されたすべての技術的及び科学的用語は、本発明の属する技術分野における熟練した専門家により通常的に理解されるものと同じ意味を有する。一般的に、本明細書において使用された命名法は、本技術分野においてよく知られており、通常使用されるものである。
【００３８】
本発明は、アフリカ豚熱（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）ウイルスＰ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、植物体で発現することを特徴とする、アフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクターを提供することができる。
【００３９】
前記アフリカ豚熱ウイルスＰ３２タンパク質は、感染性サイクルの初期段階でウイルスの内在化に関与すると知られている。
【００４０】
また、前記Ｐ３２タンパク質は、配列番号１の塩基配列によりコードされる、又は配列番号２のアミノ酸配列からなるものでありうるが、これに制限されるものではない。より具体的に、本発明のアフリカ豚熱ウイルスＰ３２タンパク質をコードする塩基配列は、配列番号１で表される塩基配列からなりうるが、これに制限されず、前記塩基配列の変異体が本発明の範囲内に含まれる。本発明の配列番号１で表される塩基配列の核酸分子は、これを構成する核酸分子の作用性等価物、例えば、核酸分子の一部の塩基配列が欠失、置換又は挿入により変更されたが、核酸分子と機能的に同じ作用をすることができるバリアントを含む概念である。具体的に、前記遺伝子は、配列番号１で表される塩基配列の塩基配列とそれぞれ７０％以上、より好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上、最も好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。例えば、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、１００％の配列相同性を有するポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドに対する「配列相同性の％」は、二つの最適に配列された配列と比較領域を比較することによって確認され、比較領域でのポリヌクレオチド配列の一部は、二つの配列の最適配列に対する参考配列（追加又は削除を含まない）に比べて追加又は削除（すなわちギャップ）を含むことができる。
【００４１】
本明細書において使用された用語「ポリヌクレオチド」は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、一般的にリン酸ジエステル結合により互いに結合された２以上の連結されたヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体を含むオリゴマー又はポリマーを示す。ポリヌクレオチドは、また、例えばヌクレオチド類似体、又はリン酸ジエステル結合以外の「骨格」結合、例えばリン酸トリエステル結合、ホスホロアミダイト結合、ホスホロチオエート結合、チオエステル結合又はペプチド結合（ペプチド核酸）を含むＤＮＡ及びＲＮＡ誘導体を含む。ポリヌクレオチドは、一本鎖及び／又は二本鎖ポリヌクレオチド、例えばデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）だけでなく、ＲＮＡ又はＤＮＡのうちいずれか一つの類似体を含む。
【００４２】
本発明の一具体例において、前記組み換えベクターは、ＢｉＰ（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチド、６個の連続したヒスチジン（ポリヒスチジン、ｐｏｌｙｈｉｓｔｉｄｉｎｅ）をコードするポリヌクレオチド又はＨＤＥＬ（Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）ペプチドをコードするポリヌクレオチドなどをさらに含むことができる。
【００４３】
本発明の他の具体例において、前記ＢｉＰをコードするポリヌクレオチドは、Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５′末端方向に位置することができ、前記ポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチド及びＨＤＥＬペプチドをコードするポリヌクレオチドは、Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３′末端方向に位置することができる。
【００４４】
本明細書において、「組み換えベクター」とは、ベクター内に挿入された異種の核酸によりコード化されるペプチド又はタンパク質を発現できるベクターを称するものであって、好ましくは目的抗原（本発明では、アフリカ豚熱抗原Ｐ３２）を発現することができるように作製されたベクターを意味する。前記「ベクター」は、試験管内、生体外又は生体内で宿主細胞に塩基の導入及び／又は転移のための任意の媒介物を言い、他のＤＮＡ断片が結合して結合された断片の複製をもたらすことができる複製単位（レプリコン）であり得、「複製単位」とは、生体内でＤＮＡ複製の自己ユニットとして機能する、すなわち自らの調節により複製可能な、任意の遺伝的単位（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルスなど）を言う。
【００４５】
本発明の組み換えベクターは、好ましくはＲＮＡ重合酵素が結合する転写開始因子であるプロモーター、転写を調節するための任意のオペレーター配列、適合したｍＲＮＡリボソーム結合部位をコードする配列と転写及び解読の終結を調節する配列、ターミネータなどを含むことができ、より好ましくは、ＢｉＰ遺伝子、Ｈｉｓタグ（最小６個以上のヒスチジン残基で構成されたアミノ酸モチーフ）、小胞体シグナルペプチド（小胞体標的化配列と同じ意味）遺伝子、クローニングサイトなどをさらに含むことができ、より好ましくは、形質転換体を選別するための抗生剤耐性遺伝子などの選別用マーカー遺伝子などをさらに含むことができる。
【００４６】
前記「遺伝子（図１では、ＮＢで表示）」は、好ましくは配列番号３の塩基配列を含む遺伝子であり、最も好ましくは配列番号３で表される遺伝子であるが、配列番号３の塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。前記ＢｉＰ遺伝子は、組み換えタンパク質が発現するとき、配列の一部が切られて、一部のアミノ酸だけが残ることがある。
【００４７】
前記「クローニングサイト」とは、ベクター内で各遺伝子を連結／区分することを目的で挿入されたものを総称する。
【００４８】
前記「小胞体シグナルペプチド（ＥＲ信号配列）」は、当業者に知られた植物小胞体シグナルペプチドであれば、その種類及びアミノ酸配列が制限されず、例えばＵＳ２０１３／０２９５０６５、ＷＯ２００９／１５８７１６などの文献を参考にすることができる。本発明において前記「小胞体シグナルペプチド」は、好ましくはＨＤＥＬ（Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ、配列番号７で表されるポリペプチド）であり得、配列番号６で表される塩基配列で暗号化されるものでありうる。また、本発明の小胞体シグナルペプチドは、配列番号６の変異体が本発明の範囲に含まれる。具体的に、前記遺伝子は、配列番号６の塩基配列と９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９８％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。前記小胞体シグナルペプチドの結合位置は、植物細胞内で発現又は合成を目的とするタンパク質のＣ末端に追加（又は連結）されることを特徴とする。
【００４９】
本発明において前記ポリヒスチジンタグの他に利用可能なタグ用遺伝子は、一例としてＡｖｉタグ、カルモジュリンタグ、ポリグルタミン酸タグ、Ｅタグ、ＦＬＡＧタグ、ＨＡタグ、Ｈｉｓタグ、Ｍｙｃタグ、Ｓタグ、ＳＢＰタグ、ＩｇＧ−Ｆｃタグ、ＣＴＢタグ、Ｓｏｆｔａｇ１タグ、Ｓｏｆｔａｇ３タグ、Ｓｔｒｅｐタグ、ＴＣタグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶタグ、Ｘｐｒｅｓｓタグなどが含まれ得、前記ＩｇＧ−Ｆｃタグは、ヒト、マウス、ウサギ又は豚に由来するものでありうる。
【００５０】
前記選別用マーカー遺伝子には、一例としてグリホサート（ｇｌｙｐｈｏｓａｔｅ）又はホスフィノスリシン（ｐｈｏｓｐｈｉｎｏｔｈｒｉｃｉｎ）のような除草剤抵抗性遺伝子、カナマイシン、Ｇ４１８、ブレオマイシン、ハイグロマイシン、クロラムフェニコールのような抗生剤耐性遺伝子、ａａｄＡ遺伝子などが含まれ得、前記プロモーターには、一例としてｐＥＭＵプロモーター、ＭＡＳプロモーター、ヒストンプロモーター、Ｃｌｐプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来３５Ｓプロモーター、カリフラワーモザイクウイルス由来１９Ｓ  ＲＮＡプロモーター、植物のアクチンタンパク質プロモーター、ユビキチンタンパク質プロモーター、ＣＭＶ（サイトメガロウイルス）プロモーター、ＳＶ４０（Ｓｉｍｉａｎ  ｖｉｒｕｓ  ４０）プロモーター、ＲＳＶ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  ｓｙｎｃｙｔｉａｌ  ｖｉｒｕｓ）プロモーター、ＥＦ−１α（Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ−１  ａｌｐｈａ）プロモーターなどが含まれ得、前記ターミネータは、一例としてノパリンシンターゼ（ＮＯＳ）、イネアミラーゼＲＡｍｙ１  Ａターミネータ、パセオリンターミネータ、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのオクトパイン（Ｏｃｔｏｐｉｎｅ）遺伝子のターミネータ、大腸菌のｒｒｎＢ１／Ｂ２ターミネータなどが含まれ得るが、前記列挙したものは、例示に過ぎず、これに制限されない。
【００５１】
本発明の他の具体例において、前記組み換えベクターは、プロモーター遺伝子、ＢｉＰ（ｎｅｗ  ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ；ＮＢ）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド、Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチド及びＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドの順に連結され得る。
【００５２】
上記のような順序によって連結された場合、すなわち図１の切断地図に示された発現カセットを含む場合、本発明による組み換えベクターは、配列番号８の塩基配列を含み、最も好ましくは配列番号８で表される塩基配列からなるが、配列番号８の塩基配列と８０％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の配列相同性を有する塩基配列を含むことができる。
【００５３】
本発明の他の様態として、本発明は、前記の組み換えベクターで形質転換された、形質転換体を提供する。
【００５４】
本発明の一具体例において、前記形質転換体は、好ましくは大腸菌、バチルス、サルモネラ、酵母などのような微生物、昆虫細胞、ヒトを含む動物細胞、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ウマ、ウシなどのような動物、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、植物などであり得、より好ましくはイネ、コムギ、オオムギ、とうもろこし、豆、ジャガイモ、アズキ、エンバク、及びモロコシを含む食糧作物類；シロイヌナズナ、ハクサイ、ダイコン、トウガラシ、イチゴ、トマト、スイカ、キュウリ、キャベツ、マクワウリ、カボチャ、ネギ、タマネギ、及びニンジンを含む野菜作物類；高麗人参、タバコ、ワタ、ゴマ、サトウキビ、テンサイ、エゴマ、ピーナッツ、及びアブラナを含む特用作物類；及びリンゴ、ナシ、ナツメ、モモ、ブドウ、ミカン、カキ、スモモ、アンズ、及びバナナを含む果樹類；及びバラ、カーネーション、キク、ユリ、及びチューリップを含む草花類などでありうるが、本発明のベクターで形質転換され得る生命体であれば、これに制限されない。
【００５５】
本明細書において、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」とは、注入されたＤＮＡにより生物の遺伝的な性質が変わることを総称し、「形質転換体（ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）」とは、分子遺伝学的方法で外部の遺伝子を注入して製造された生命体であって、好ましくは本発明の組み換えベクターにより形質転換された生命体であり、前記生命体は、微生物、真核細胞、昆虫、動物、植物など生命がある生物であれば、制限がなく、好ましくは大腸菌、サルモネラ、バチルス、酵母、動物細胞、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ウマ、ウシ、アグロバクテリウム・ツメファシエンス、植物などであるが、これに制限されない。
【００５６】
本明細書において、「植物」は、本発明の抗原を含むタンパク質を大量生産できる植物であれば、制限なしに使用され得るが、より具体的には、タバコ、シロイヌナズナ、トウモロコシ、イネ、ダイズ、カノーラ、アルファルファ、ヒマワリ、モロコシ、コムギ、ワタ、ピーナッツ、トマト、ジャガイモ、レタス及びトウガラシよりなる群から選ばれ、好ましくはタバコでありうる。本発明でのタバコは、タバコ属（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｇｅｎｕｓ）植物であって、タンパク質を過発現できるものであれば、特に種類が制限されず、形質転換方法とタンパク質大量生産の目的に合うように適切な品種を選択して本発明を実施することができる。例えばＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ  Ｌ．又はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．ｘａｎｔｈｉなどの品種を用いることができる。
【００５７】
前記形質転換体は、形質転換、トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）、アグロバクテリウム媒介形質転換方法、パーティクルガン衝撃法、超音波処理法、電気穿孔法（エレクトロポレーション）及びＰＥＧ（ポリエチレングリコール）媒介形質転換方法などの方法で製造され得るが、本発明のベクターを注入できる方法であれば、制限がない。
【００５８】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、本発明による組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスのＰ３２組み換えタンパク質（抗原）を提供する。
【００５９】
本発明の一具体例において、前記Ｐ３２組み換えタンパク質（抗原）は、水溶性でありうる。より具体的に、植物体で発現した組み換えＰ３２タンパク質は、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％が水溶性画分に溶解しているものでありうる。
【００６０】
また、本発明の他の具体例において、前記Ｐ３２組み換えタンパク質（抗原）は、９０％以上の純度で分離・精製され得る。より具体的に、植物体で発現した組み換えＰ３２タンパク質は、通常の分離・精製方法を用いた場合、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％純度の組み換えＰ３２タンパク質を得ることができる。
【００６１】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、本発明による組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスのＰ３２組み換えタンパク質（抗原）を有効成分として含む、アフリカ豚熱の診断用組成物又は診断キットを提供する。
【００６２】
本明細書において使用された用語「診断」は、病理状態の存在又は発病可能性を確認することを意味する。その中でも、本発明は、特にアフリカ豚熱の診断に有用である。本発明の組み換えベクターにより生産されたＰ３２抗原を用いる場合、アフリカ豚熱に感染した個体の体内で生産される特定の抗体を検出することができる。すなわち、Ｐ３２抗原は、アフリカ豚熱を診断するのに有用な指標（診断マーカー）として使用され得る。
【００６３】
本明細書において、「抗原」とは、体内で免疫反応を起こすすべての物質を総称し、好ましくはウイルス、化合物質、細菌、花粉、癌細胞など又はこれらの一部ペプチド又はタンパク質であるが、体内で免疫反応を起こすことができる物質であれば、これに制限されない。
【００６４】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、本発明による組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を抗原として用いてヒトを除いた動物に由来する生物学的試料内で抗原−抗体反応を通じてアフリカ豚熱ウイルスに対する抗体を検出する段階を含む、アフリカ豚熱の診断方法を提供する。
【００６５】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、（ａ）本発明による組み換えベクターを植物体に形質転換させる段階；及び（ｂ）前記植物体から組み換え抗原を分離及び精製する段階を含むアフリカ豚熱の診断のための組み換え抗原の製造方法を提供する。
【００６６】
本発明のさらに他の様態として、本発明は、（ａ）本発明による組み換えベクターを植物体に形質転換させる段階；（ｂ）前記植物体から組み換え抗原を分離及び精製する段階；及び（ｃ）前記分離・精製された組み換え抗原を用いて診断用組成物又は診断用キットを製造する段階を含む、アフリカ豚熱の診断用組成物又はキットの製造方法を提供する。
【００６７】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例によって本発明の内容が限定されるものではない。
【実施例】
【００６８】
［実施例１：アフリカ豚熱ウイルスのＰ３２抗原を発現する組み換えベクターの製造］
図１の切断地図のように、植物体でアフリカ豚熱ウイルス抗原Ｐ３２タンパク質（感染性サイクルの初期段階でウイルスの内在化に関与すると知られた）を発現させることができるように組換えした植物発現ベクターを作製した。より詳細には、アフリカ豚熱ウイルスのＰ３２タンパク質に対する遺伝子情報を確保し、植物体での発現に最適化した配列でＰ３２タンパク質をコードする遺伝子（配列番号１）を合成した。
【００６９】
具体的に、ｐＣＡＭＢＩＡ１３００ベクターのＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター遺伝子とＮＯＳターミネータの間にＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）シグナルペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号３）、アフリカ豚熱ウイルスのＰ３２抗原組み換えタンパク質をコードするポリヌクレオチド（配列番号１）、６個の連続したヒスチジンで構成されたＨｉｓタグをコードするポリヌクレオチド（配列番号４）及びＨＤＥＬ（Ｈｉｓ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ）ペプチドをコードするポリヌクレオチド（配列番号６）を順に連結して、アフリカ豚熱ウイルスのＰ３２タンパク質の植物発現ベクターを作製した。
【００７０】
［実施例２：Ｐ３２抗原の発現及び確認］
（２．１．植物発現アフリカ豚熱ウイルスＰ３２抗原ベクターの一過性発現）
前記実施例１で準備した植物発現ベクターをアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＬＢＡ４４０４菌株に電気穿孔法を用いて形質転換させた。形質転換されたアグロバクテリウムを５ｍＬのＹＥＰ液体培地（酵母抽出物１０ｇ、ペプトン１０ｇ、ＮａＣｌ  ５ｇ、カナマイシン５０ｍｇ／Ｌ、リファンピシン２５ｍｇ／Ｌ）で２８℃の条件で１６時間振とう培養した後、１次培養液１ｍＬを５０ｍＬの新しいＹＥＰ培地に接種して、２８℃の条件で６時間振とう培養した。このように培養されたアグロバクテリウムは、遠心分離（７，０００ｒｐｍ、４℃、５分）して収集した後、６００ｎｍの波長で吸光度（Ｏ．Ｄ）値が１．０になるようにインフィルトレーション（Ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）バッファー［１０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ５．７）、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、２００μＭのアセトシリンゴン］に懸濁させた。アグロバクテリウム懸濁液は、注射針を除去した注射器を用いてＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａの葉の裏面に注入する方法でアグロインフィルトレーションを行った。
【００７１】
（２．２．アフリカ豚熱ウイルスＰ３２抗原の発現確認）
前記実施例２．１で準備した植物の葉からタンパク質を抽出して遠心分離した後に、上清画分（Ｓ）にあるタンパク質と沈殿（Ｐ）分画分にあるタンパク質、上清画分と沈殿を全部含む画分（Ｔｏｔａｌ；Ｔ）をそれぞれ分離して、ウェスタンブロッティングで組み換えＰ３２抗原タンパク質の発現を確認した。より詳細には、各画分３０μＬをＳＤＳ試料バッファーと混合した後に加熱した。そして、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに電気泳動してサイズ別に分離したタンパク質バンドを確認し、これをＰＶＤＦ膜に移動させた後に、５％スキムミルクを用いてブロッキング段階を経た後、ポリヒスチジンと反応する抗体を結合させ、ＥＣＬ溶液を製造社で提供する方法によって処理して、組み換えＰ３２抗原タンパク質の発現を確認した。
【００７２】
その結果、図２に示されたように、組み換えＰ３２抗原タンパク質が高効率で発現したことを確認し、発現した組み換えＰ３２抗原タンパク質の９５％以上が上清画分で確認された。
【００７３】
また、図３のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果で、Ｐ３２と記載したレーンから確認できるように、Ｐ３２以外のさらなるタンパク質バンドは全く現れておらず、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）を用いた標準曲線を用いて組み換えタンパク質を定量した結果、高純度のＰ３２抗原タンパク質が分離されることを確認した。
【００７４】
上記のように、本発明のアフリカ豚熱ウイルスのＰ３２組み換えタンパク質は、本来のタンパク質と比較して大きい変異や変化なしに良好に精製された。このような結果は、タンパク質を植物で発現させる場合、糖の構造が変更されて生産効率が落ちる問題点が見られないことを確認したものであって、本発明によるアフリカ豚熱ウイルスのＰ３２組み換えタンパク質が植物で良好に生産されることを確認した結果である。
【００７５】
［実施例３：Ｐ３２抗原のＡＳＦ標準血清に対する反応性の確認］
前記実施例２．２で準備したＰ３２抗原タンパク質を用いて抗体血清診断キットの試作品を作製し、スペインＡＳＦ標準実験室で提供する血清にて反応性及び敏感度テストを進めた。
【００７６】
その結果、図４及び下記表１に示されたように、組み換えＰ３２抗原タンパク質で作製された本発明のＡＳＦ診断用キットは、提供されたサンプル結果と同様に、陰性と陽性結果で１００％同一に現れ、また、陽性最小限界に設定された血清（図４、ｌｉｍｉ；表１、陽性最小限界Ｒｅｆ．Ｓｅｒｕｍ）で陽性判定が確認されて、特異性及び敏感性に優れていることが確認された。
【００７７】
【表１】
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【００７８】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態に容易に変形可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解すべきである。
【産業上の利用可能性】
【００７９】
本発明の組み換えアフリカ豚熱ウイルス抗原は、植物体を用いて効率的な生産が可能であると共に、高い水溶性を有していて、分離及び精製が容易であり、また、診断敏感度（ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ）及び特異度（ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ）が高いため、これを用いて製造したアフリカ豚熱の診断用組成物及びキットなどは、アフリカ豚熱に感染した個体を早期に診断することができるので、産業的利用価値が大きいものと予想される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月22日(2020.7.22)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列からなるアフリカ豚熱（Ａｆｒｉｃａｎ  ｓｗｉｎｅ  ｆｅｖｅｒ）ウイルスＰ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、
植物体で発現することを特徴とする、アフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項２】
前記組み換えベクターは、配列番号３のＢｉＰ（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項３】
前記ＢｉＰをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの５′末端方向に位置することを特徴とする、請求項２に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項４】
前記組み換えベクターは、配列番号４のポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項５】
前記ポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３′末端方向に位置することを特徴とする、請求項４に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項６】
前記組み換えベクターは、配列番号６のＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項７】
前記ＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドは、前記Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチドの３′末端方向に位置することを特徴とする、請求項６に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項８】
前記組み換えベクターは、配列番号３のＢｉＰをコードするポリヌクレオチド；
配列番号４のポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチド；及び
配列番号６のＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項９】
前記組み換えベクターは、ＢｉＰをコードするポリヌクレオチド、Ｐ３２タンパク質をコードするポリヌクレオチド、ポリヒスチジンをコードするポリヌクレオチド及びＨＤＥＬをコードするポリヌクレオチドが順次に連結されたことを特徴とする、請求項８に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項１０】
前記組み換えベクターは、配列番号８の塩基配列を含むことを特徴とする、請求項８に記載のアフリカ豚熱の診断のための抗原生産用組み換えベクター。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターで形質転換された、形質転換体。
【請求項１２】
前記形質転換体は、植物体であることを特徴とする、請求項１１に記載の形質転換体。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質。
【請求項１４】
前記タンパク質は、水溶性であることを特徴とする、請求項１３に記載のアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質。
【請求項１５】
請求項１３に記載のアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を有効成分として含む、アフリカ豚熱の診断用組成物。
【請求項１６】
請求項１３に記載のアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を有効成分として含む、アフリカ豚熱の診断用キット。
【請求項１７】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質を抗原として用いてヒトを除いた動物に由来する生物学的試料内で抗原−抗体反応を通じてアフリカ豚熱ウイルスに対する抗体を検出する段階を含む、アフリカ豚熱の診断方法。
【請求項１８】
下記の段階を含むアフリカ豚熱の診断のための組み換え抗原の製造方法：
（ａ）請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターを植物体に形質転換させる段階；及び
（ｂ）前記植物体から組み換え抗原を分離及び精製する段階。
【請求項１９】
請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質の、アフリカ豚熱の診断のための使用（但し、診断対象はヒトを除く）。
【請求項２０】
アフリカ豚熱の診断に用いられる製剤を生産するための、請求項１〜１０のいずれかに記載の組み換えベクターを用いて生産されたアフリカ豚熱ウイルスＰ３２組み換えタンパク質の使用。
【国際調査報告】
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