(57)【要約】  本出願は、Ｌ−アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いてＬ−アミノ酸を生産する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が不活性化された、Ｌ−アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物。
【請求項２】
前記Ｌ−アミノ酸は、塩基性アミノ酸、脂肪族アミノ酸又は分枝鎖アミノ酸である、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項３】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−リシン（L-lysine）又はＬ−バリン（L-valine）である、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項４】
前記コリネバクテリウム属微生物は、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）である、請求項１に記載のコリネバクテリウム属微生物。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の微生物を培地で培養するステップと、
前記微生物又は培地からＬ−アミノ酸を回収するステップとを含む、Ｌ−アミノ酸の生産方法。
【請求項６】
前記Ｌ−アミノ酸は、塩基性アミノ酸、脂肪族アミノ酸又は分枝鎖アミノ酸である、請求項５に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
【請求項７】
前記Ｌ−アミノ酸は、Ｌ−リシン（L-lysine）又はＬ−バリン（L-valine）である、請求項５に記載のＬ−アミノ酸の生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｌ−アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物及びそれを用いてＬ−アミノ酸を生産する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｌ−アミノ酸は、タンパク質の基本構成単位であり、薬品原料や食品添加剤、動物飼料、栄養剤、殺虫剤、殺菌剤などの重要素材として用いられる。とりわけ、Ｌ−リシンは、生体内で全く生合成されない必須アミノ酸であり、成長促進、カルシウム代謝、胃液分泌促進、病気に対する抵抗力の増加に必要なことが知られている。前記Ｌ−リシンは、飼料、医薬品、食品などに様々に用いられている。また、Ｌ−バリンも、必須アミノ酸の一つであり、抗酸化効果及び筋肉細胞のタンパク質合成作用を直接促進する効果があることが知られている。前記Ｌ−バリンは、健康補助剤、医薬品、食品、飼料、香料、毛髪及び皮膚のコンディショニング剤などに用いられている。
【０００３】
一方、コリネバクテリウム属菌株（Corynebacterium）、特にコリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）は、Ｌ−アミノ酸及びその他の有用物質の生産に多く用いられているグラム陽性微生物である。前記アミノ酸を生産すべく、高効率生産微生物及び発酵工程技術の開発のために様々な研究が行われている。例えば、コリネバクテリウム属菌株において、アミノ酸の生合成に関与する酵素をコードする遺伝子の発現を増加させたり、アミノ酸の生合成に不要な遺伝子を除去するなどの標的物質特異的アプローチ方法が主に用いられている（特許文献１，２）。また、前記方法以外に、アミノ酸生産に関与しない遺伝子を除去する方法、アミノ酸生産における具体的な機能が知られていない遺伝子を除去する方法も活用されている。しかし、依然として効率的に高収率でＬ−アミノ酸を生産する方法に関する研究が求められている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００４】
【特許文献１】韓国登録特許第１０−０９２４０６５号公報
【特許文献２】韓国登録特許第１２０８４８０号公報
【特許文献３】韓国登録特許第１０−０１５９８１２号公報
【特許文献４】韓国登録特許第１０−００７３６１０号公報
【特許文献５】韓国登録特許第１０−１１１７０２２号公報
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】J. Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York, 1989
【非特許文献２】F.M. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc., New York
【非特許文献３】Karlin及びAltschul, Pro. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 5873(1993)
【非特許文献４】Methods Enzymol., 183, 63, 1990
【非特許文献５】http://www.ncbi.nlm.nih.gov
【非特許文献６】Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., USA, 1981
【非特許文献７】Appl. Microbiol. Biothcenol. 52:541-545, 1999
【非特許文献８】Moore, S., Stein, W.H., Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids. J. Biol. Chem.1948, 176, 367-388
【非特許文献９】van der Rest et al., Appl Microbiol Biotechnol 52:541-545, 1999
【非特許文献１０】Binder et al. Genome Biology 2012, 13:R40
【非特許文献１１】Biotechnology and Bioprocess Engineering, June 2014, Volume 19, Issue 3, pp 456-467
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明者らは、Ｌ−アミノ酸を高効率で生産する微生物を開発すべく鋭意研究した結果、特定遺伝子を不活性化するとＬ−アミノ酸の生産収率が増加するという事実を確認し、本発明を完成するに至った。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が不活性化された、Ｌ−アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を提供することを目的とする。
【０００８】
また、本発明は、前記微生物を用いた、Ｌ−アミノ酸の生産方法を提供することを目的とする。
【０００９】
さらに、本発明は、前記微生物のＬ−アミノ酸生産増加のための用途を提供することを目的とする。
【００１０】
さらに、本発明は、配列番号１を含むタンパク質をコリネバクテリウム属微生物において不活性化させるステップを含むＬ−アミノ酸生産増加方法を提供することを目的とする。
【発明の効果】
【００１１】
本発明のＬ−アミノ酸を生産する微生物は、Ｌ−アミノ酸を高効率で生産することができる。また、生産したＬ−アミノ酸は、動物飼料又は動物飼料添加剤だけでなく、人間の食品又は食品添加剤、医薬品など様々な製品に応用することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、これらを具体的に説明する。なお、本明細書で開示される各説明及び実施形態はそれぞれ他の説明及び実施形態にも適用される。すなわち、本明細書で開示される様々な要素のあらゆる組み合わせが本発明に含まれる。また、以下の具体的な記述に本発明が限定されるものではない。
【００１３】
前記目的を達成するために、本発明の一態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が不活性化された、Ｌ−アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物を提供する。
【００１４】
本発明における「Ｌ−アミノ酸」には、微生物が各種炭素源から代謝過程を経て生産するあらゆるＬ−アミノ酸が含まれ、具体的にはＬ−リシン、Ｌ−アルギニン、Ｌ−ヒスチジンなどの塩基性アミノ酸、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−グリシン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−アラニン、Ｌ−プロリン、Ｌ−メチオニンなどの非極性アミノ酸、Ｌ−セリン、Ｌ−トレオニン、Ｌ−システイン、Ｌ−アスパラギン、Ｌ−グルタミンなどの極性アミノ酸、Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−チロシン、Ｌ−トリプトファンなどの芳香族アミノ酸、Ｌ−グルタミン酸、Ｌ−アスパラギン酸などの酸性アミノ酸、Ｌ−アラニン、Ｌ−バリン、Ｌ−イソロイシン、Ｌ−セリンなどの脂肪族アミノ酸、Ｌ−バリン、Ｌ−ロイシン、Ｌ−イソロイシンなどの分枝鎖アミノ酸であってもよい。より具体的には、本発明におけるＬ−アミノ酸は、塩基性アミノ酸、脂肪族アミノ酸、分枝鎖アミノ酸であってもよい。さらに具体的には、Ｌ−リシン（L-lysine）又はＬ−バリン（L-valine）であってもよいが、これらに限定されるものではない。本発明の配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が不活性化されると生産能が向上するアミノ酸であればいかなるものでもよい。
【００１５】
本発明における「配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質」とは、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子によりコードされるコリネバクテリウム属微生物に内在的に存在するタンパク質を意味し、具体的にはコリネバクテリウム属微生物に内在的に存在する、配列番号１のアミノ酸配列からなる調節タンパク質（regulatory protein）を意味する。配列番号１のアミノ酸配列及び前記タンパク質をコードする遺伝子のポリヌクレオチド配列は、公知のデータベースから得られ、例えばＮＣＢＩのＧｅｎＢａｎｋなどから得られるが、これらに限定されるものではない。また、前記タンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を含むタンパク質、配列番号１のアミノ酸配列から必須に構成されるタンパク質、配列番号１のアミノ酸配列から構成されるタンパク質であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００１６】
また、本発明の前記タンパク質は、配列番号１で表されるアミノ酸配列だけでなく、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列からなるものであってもよい。配列番号１のアミノ酸配列と８０％以上の相同性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質には、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、具体的には８３％以上、８４％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上又は９７％以上の相同性又は同一性を有するアミノ酸配列からなるタンパク質が含まれる。前記配列と相同性又は同一性を有する配列であって、実質的に前記タンパク質と同一又は相当する生物学的活性を有するアミノ酸配列であれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するものも本発明に含まれることは言うまでもない。
【００１７】
本発明に「特定配列番号で表されるアミノ酸配列からなるタンパク質又はポリペプチド」と記載されていても、当該配列番号のアミノ酸配列からなるポリペプチドと同一又は相当する活性を有するものであれば、一部の配列が欠失、改変、置換、保存的置換又は付加されたアミノ酸配列を有するタンパク質であっても本発明に用いられることは言うまでもない。すなわち、当該配列番号のアミノ酸配列を含むポリペプチドも本発明に用いられることは言うまでもない。
【００１８】
それに加えて、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ポリペプチドをコードする塩基配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチドであって、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質と同じ活性を有するポリペプチドであればいかなるものでもよい。例えば、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質は、配列番号２のポリヌクレオチド配列を含む遺伝子によりコードされるものであってもよい。また、配列番号２のポリヌクレオチド配列を含むもの、配列番号２のポリヌクレオチド配列から必須に構成されるもの、配列番号２のポリヌクレオチド配列からなる遺伝子によりコードされるものであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００１９】
さらに、配列番号２のポリヌクレオチド配列は、配列番号２のポリヌクレオチド配列だけでなく、配列番号２と少なくとも８０％の相同性を有するポリヌクレオチド配列であってもよい。
【００２０】
具体的には、配列番号１と少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列であれば本出願に含まれ、配列番号２のポリヌクレオチド配列と少なくとも８０％、具体的には８３％以上、８４％以上、８８％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上又は９７％以上の相同性又は同一性を有するポリヌクレオチド配列も含まれてもよい。
【００２１】
また、配列番号２のポリヌクレオチド配列には、コドンの縮退（codon degeneracy）により、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質又はそれと相同性を有するタンパク質に翻訳されるポリヌクレオチドも含まれることは言うまでもない。さらに、公知の遺伝子配列から調製されるプローブ、例えば前記ポリヌクレオチド配列の全部又は一部に対する相補配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性を有するタンパク質をコードする配列であればいかなるものでもよい。
【００２２】
前記「ストリンジェントな条件」とは、ポリヌクレオチド間の特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。このような条件は、文献（例えば、非特許文献１、２）に具体的に記載されている。例えば、相同性の高い遺伝子同士、４０％以上、具体的には９０％以上、より具体的には９５％以上、さらに具体的には９７％以上、特に具体的には９９％以上の相同性を有する遺伝子同士をハイブリダイズし、それより相同性の低い遺伝子同士をハイブリダイズしない条件、又は通常のサザンハイブリダイゼーションの洗浄条件である６０℃、１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、具体的には６０℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ、より具体的には６８℃、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳに相当する塩濃度及び温度において、１回、具体的には２回〜３回洗浄する条件が挙げられる。ハイブリダイゼーションは、たとえハイブリダイゼーションの厳格さに応じて塩基間のミスマッチ（mismatch）が可能であっても、２つのポリヌクレオチドが相補的配列を有することが求められる。「相補的」とは、互いにハイブリダイゼーションが可能なヌクレオチド塩基間の関係を表すために用いられるものである。例えば、ＤＮＡにおいて、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。よって、本発明には、実質的に類似したポリヌクレオチド配列だけでなく、全配列に相補的な単離されたポリヌクレオチド断片が含まれてもよい。
【００２３】
具体的には、相同性を有するポリヌクレオチドは、５５℃のＴｍ値でハイブリダイゼーションステップが行われるハイブリダイゼーション条件と前述した条件を用いて検知することができる。また、前記Ｔｍ値は、６０℃、６３℃又は６５℃であってもよいが、これらに限定されるものではなく、その目的に応じて当業者により適宜調節されてもよい。
【００２４】
本発明における「相同性」又は「同一性」とは、与えられたアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列に一致する程度を意味し、百分率で表される。相同性及び同一性は、しばしば相互交換的に用いられてもよい。本発明において、与えられたアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列と同一又は類似の活性を有するその相同性配列は「％の相同性」と表される。
【００２５】
前記アミノ酸又はポリヌクレオチド配列の相同性又は同一性は、例えば文献によるアルゴリズムＢＬＡＳＴ［参照：非特許文献３］やＰｅａｒｓｏｎによるＦＡＳＴＡ（参照：非特許文献４）を用いて決定することができる。このようなアルゴリズムＢＬＡＳＴに基づいて、ＢＬＡＳＴＮやＢＬＡＳＴＸというプログラムが開発されている（参照：非特許文献５）。
【００２６】
また、任意のアミノ酸又はポリヌクレオチド配列が相同性、類似性又は同一性を有するか否かは、定義されたストリンジェントな条件下にてサザンハイブリダイゼーション実験で配列を比較することにより確認することができ、定義される好適なハイブリダイゼーション条件は当該技術の範囲内であり、当業者に周知の方法（例えば、非特許文献１、２）で決定される。
【００２７】
本発明における「配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が不活性化された」とは、前記タンパク質の発現が天然の野生型菌株、親株、又は配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質が改変されていない菌株に比べて全く発現しないことや、発現してもその活性がないか、減少したことを意味する。ここで、前記減少は、前記タンパク質をコードする遺伝子の変異、欠損などによりタンパク質の活性が本来微生物が有するタンパク質の活性より減少した場合や、それをコードする遺伝子の発現阻害又は翻訳（translation）阻害などにより細胞内で全体的なタンパク質の活性の程度が天然の菌株又は改変前の菌株より低下した場合や、それらの組み合わせを含む概念である。
【００２８】
本発明における前記不活性化は、当該分野で公知の様々な方法の適用により達成することができる。前記方法の例として、１）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法、２）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の発現が減少するように発現調節配列を改変する方法、３）前記タンパク質の活性が欠失又は低下するようにタンパク質をコードする前記遺伝子配列を改変する方法、４）前記タンパク質をコードする前記遺伝子の転写体に相補的に結合するアンチセンスオリゴヌクレオチド（例えば、アンチセンスＲＮＡ）を導入する方法、５）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のシャイン・ダルガノ（Shine-Dalgarno）配列の前にシャイン・ダルガノ配列と相補的な配列を付加することにより２次構造物を形成させてリボソーム（ribosome）の付着を不可能にする方法、６）前記タンパク質をコードする前記遺伝子のポリヌクレオチド配列のＯＲＦ（open reading frame）の３'末端に逆転写するようにプロモーターを付加する方法（Reverse transcription engineering, RTE）などが挙げられ、それらの組み合わせによっても達成することができるが、前記例に特に限定されるものではない。
【００２９】
具体的には、前記タンパク質をコードする前記遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法は、微生物中の染色体挿入用ベクターを用いて、染色体内の内在性標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを一部のヌクレオチド配列が欠失したポリヌクレオチド又はマーカー遺伝子に置換することにより行うことができる。このようなポリヌクレオチドの全部又は一部を欠失させる方法の一例として、相同組換えによりポリヌクレオチドを欠失させる方法が挙げられるが、これに限定されるものではない。他の例として、前記遺伝子の全部又は一部を欠失させる方法は、紫外線などの光又は化学物質を用いて突然変異を誘発し、得られた突然変異体から標的遺伝子が欠失した菌株を選択することにより行うことができる。
【００３０】
前記遺伝子欠失方法には、遺伝子組換え技術（Genetic recombination technique）による方法が含まれる。例えば、標的遺伝子に相同性を有するポリヌクレオチド配列が含まれるポリヌクレオチド配列又はベクターを前記微生物に導入して相同組換え（homologous recombination）を起こすことにより行うことができる。また、前記導入されるポリヌクレオチド配列又はベクターには、優性選択マーカーが含まれてもよいが、これに限定されるものではない。
【００３１】
また、前記発現調節配列を改変する方法は、当該分野で公知の様々な方法の適用により達成することができる。前記方法の例として、前記発現調節配列の活性がさらに低下するように、ポリヌクレオチド配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより発現調節配列上の変異を誘導して行うこともでき、より活性が低いポリヌクレオチド配列に置換することにより行うこともできる。前記発現調節配列には、プロモーター、オペレーター配列、リボソーム結合部位をコードする配列、及び転写と翻訳の終結を調節する配列が含まれるが、これらに限定されるものではない。
【００３２】
さらに、前記遺伝子配列を改変する方法は、前記酵素の活性がさらに低下するように、遺伝子配列の欠失、挿入、非保存的もしくは保存的置換、又はそれらの組み合わせにより配列上の変異を誘導して行うこともでき、活性がさらに低下するように改良された遺伝子配列又は活性がなくなるように改良された遺伝子配列に置換することにより行うこともできるが、これらに限定されるものではない。
【００３３】
本発明における「Ｌ−アミノ酸を生産する微生物」とは、自然にＬ−アミノ酸生産能を有する微生物、又はＬ−アミノ酸の生産能のない親株にＬ−アミノ酸の生産能が付与された微生物を意味する。例えば、前記Ｌ−アミノ酸を生産する微生物は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が不活性化された微生物であってもよい。あるいは、それに加えて、Ｌ−アミノ酸生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現を増加させるか、分解経路の酵素を不活性化させた微生物であってもよい。あるいは、Ｌ−アミノ酸生合成経路の酵素をコードする遺伝子の発現を増加させるか、分解経路の酵素を不活性化させた親株において、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が不活性化された微生物であってもよい。前記Ｌ−アミノ酸を生産する微生物は、公知の様々な方法で製造することができる。
【００３４】
本発明における「コリネバクテリウム属微生物」には、あらゆるコリネバクテリウム属微生物が含まれる。具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカム（Corynebacterium glutamicum）、コリネバクテリウム・クルジラクチス（Corynebacterium crudilactis）、コリネバクテリウム・デセルティ（Corynebacterium deserti）、コリネバクテリウム・エフィシエンス（Corynebacterium efficiens）、コリネバクテリウム・カルナエ（Corynebacterium callunae）、コリネバクテリウム・スタティオニス（Corynebacterium stationis）、コリネバクテリウム・シングラレ（Corynebacterium singulare）、コリネバクテリウム・ハロトレランス（Corynebacterium halotolerans）、コリネバクテリウム・ストリアツム（Corynebacterium striatum）、コリネバクテリウム・アンモニアゲネス（Corynebacterium ammoniagenes）、コリネバクテリウム・ポルティソリ（Corynebacterium pollutisoli）、コリネバクテリウム・イミタンス（Corynebacterium imitans）、コリネバクテリウムテス・テスツディノリス（Corynebacterium testudinoris）又はコリネバクテリウム・フラベッセンス（Corynebacterium flavescens）であり、より具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムである。
【００３５】
本発明の配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が不活性化された、Ｌ−アミノ酸を生産するコリネバクテリウム属微生物は、Ｌ−アミノ酸生産能が向上した微生物であってもよい。具体的には、前記微生物は、改変されていない菌株に比べてＬ−アミノ酸生産能が向上した微生物であってもよい。前記改変されていない菌株は、天然の野生型菌株、親株、又は配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質であってもよい。
【００３６】
本発明の他の態様は、本発明による前記微生物を培地で培養するステップと、前記微生物又は培地からＬ−アミノ酸を回収するステップとを含む、Ｌ−アミノ酸の生産方法を提供する。
【００３７】
本発明による前記微生物については前述した通りである。
【００３８】
本発明の方法において、コリネバクテリウム属微生物の培養は、当該技術分野で公知の任意の培養条件及び培養方法が用いられてもよい。
【００３９】
本発明における「培養」とは、微生物を人工的に適宜制御した環境条件で生育させることを意味する。本発明におけるＬ−アミノ酸を生産する微生物を用いてＬ−アミノ酸を培養する方法としては、当該技術分野で公知の方法を用いることができる。具体的には、前記培養は、バッチプロセス又は流加もしくは反復流加プロセス（fed batch or repeated fed batch process）で連続して培養することができるが、これらに限定されるものではない。培養に用いられる培地は、特に限定されるものではなく、いかなるものでも用いることができ、例えばコリネバクテリウム菌株の培養培地は公知である（例えば、非特許文献６）。
【００４０】
培地に用いることのできる糖源としては、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、デンプン、セルロースなどの糖及び炭水化物、大豆油、ヒマワリ油、ヒマシ油、ココナッツ油などの油脂、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸などの脂肪酸、グリセリン、エタノールなどのアルコール、酢酸などの有機酸が挙げられる。これらの物質は、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
用いることのできる窒素源としては、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、トウモロコシ浸漬液、黄粉及び尿素、又は無機化合物、例えば硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム及び硝酸アンモニウムが挙げられる。窒素源も、単独で用いることもでき、混合物として用いることもできるが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
用いることのできるリン源としては、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、又はそれらに相当するナトリウム含有塩が挙げられる。また、培養培地は、成長に必要な硫酸マグネシウム、硫酸鉄などの金属塩を含有してもよい。さらに、前記物質以外に、アミノ酸、ビタミンなどの必須成長物質が用いられてもよい。さらに、培養培地に好適な前駆体が用いられてもよい。しかし、これらに限定されるものではない。前述した原料は、培養過程において培養物に好適な方式でバッチ毎に又は連続して添加されてもよい。しかし、これらに限定されるものではない。
【００４３】
前記微生物の培養中に水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニアなどの基礎化合物、又はリン酸、硫酸などの酸性化合物を好適な方法で用いて培養物のｐＨを調整することができる。また、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を用いて気泡生成を抑制してもよい。好気状態を維持するために、培養物中に酸素又は酸素含有気体（例えば、空気）を注入してもよい。しかし、これらに限定されるものではない。
【００４４】
培養物の温度は、通常は２０℃〜４５℃、具体的には２５℃〜４０℃である。培養時間は、所望のＬ−アミノ酸の生成量が得られるまで続けてもよく、具体的には１０〜１６０時間であるが、これに限定されるものではない。
【００４５】
培養物からのＬ−アミノ酸の回収は、当該技術分野で公知の通常の方法により行うことができる。その回収方法としては、遠心分離、濾過、クロマトグラフィー、結晶化などの方法が用いられてもよい。例えば、培養物を低速で遠心分離することによりバイオマスを除去して得られた上清をイオン交換クロマトグラフィーにより分離することができるが、これに限定されるものではない。
【００４６】
前記回収ステップは、精製工程をさらに含んでもよい。
【００４７】
本発明のさらに他の態様は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の活性が不活性化された、コリネバクテリウム属微生物のＬ−アミノ酸生産増加のための用途を提供する。
【００４８】
本発明のさらに他の態様は、本発明の配列番号１を含むタンパク質をコリネバクテリウム属微生物において不活性化させるステップを含むＬ−アミノ酸生産増加方法を提供する。
【実施例】
【００４９】
以下、実施例を挙げて本発明をより詳細に説明する。しかし、これらの実施例は本発明を例示的に説明するためのものであり、本発明がこれらの実施例に限定されるものではない。
【００５０】
実施例１
トランスポゾンを用いたランダム突然変異ライブラリーの作製
リシン生産能が向上した菌株を得るために、次の方法でベクターライブラリーを作製した。
【００５１】
まず、コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ（特許文献３；前記微生物は、ＫＦＣＣ１０８８１として公開され、ブダペスト条約上の国際寄託機関に寄託番号ＫＣＣＭ１１０１６Ｐとして再寄託された）を親株とし、ＥＺ−Ｔｎ５TM＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐ ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅTMキット（Epicentre）を用いて得たプラスミドを電気パルス法（非特許文献７）で形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含む複合平板培地に塗抹して約２０，０００個のコロニーを得た。
＜複合平板培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１０ｇ，ペプトン１０ｇ，牛肉抽出物５ｇ，酵母抽出物５ｇ，ブレインハートインフュージョン（Brain Heart Infusion）１８．５ｇ，ＮａＣｌ ２．５ｇ，尿素２ｇ，ソルビトール９１ｇ，寒天２０ｇ（蒸留水１リットル中）
【００５２】
実施例２
トランスポゾンを用いたランダム突然変異ライブラリーのスクリーニング
実施例１で得た約２０，０００個のコロニーをそれぞれ３００μｌの次の選択培地に接種し、９６ディープウェルプレート（96-deep well plate）にて３２℃、１０００ｒｐｍで約２４時間培養した。
＜選択培地（ｐＨ８．０）＞
グルコース１０ｇ，硫酸アンモニウム（ammonium sulfate）５．５ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ １．２ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ０．８ｇ，Ｋ2ＨＰＯ4 １６．４ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド２ｍｇ（蒸留水１リットル中）
【００５３】
培養液中に生産されたＬ−リシンの生産量を分析するためにニンヒドリン法を用いた（非特許文献８）。
【００５４】
培養終了後に、培養上清１０μｌとニンヒドリン反応液１９０μｌを６５℃で３０分間反応させ、その後分光光度計（spectrophotometer）にて波長５７０ｎｍで吸光度を測定し、対照群であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株と比較して高い吸光度を示す約６０種のコロニーを選択した。その他のコロニーは、対照群として用いたコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株と同等又は低下した吸光度を示すことが確認された。
【００５５】
前述したように選択した約６０種の菌株を前記と同様に再び培養し、その後ニンヒドリン反応を繰り返し行い、最終的に親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株と比較してＬ−リシン生産能が向上した上位１０種の突然変異株を選択した。
【００５６】
実施例３
選択したランダム突然変異株におけるＬ−リシン生産能の分析
実施例２で選択した１０種の突然変異株を対象に、再現性のあるＬ−リシン生産能向上を示す菌株を最終選択するために、次の方法で培養を行った。種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３２℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。培養終了後に、ＨＰＬＣ（Waters社, 2478）を用いて培養液中のＬ−リシン濃度を分析した。各突然変異株のＬ−リシン生産濃度を表１に示す。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ，Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド２ｍｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 ４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【００５７】
【表１】
2021511009.tif 000002
【００５８】
前述したように選択した１０種の突然変異株のうち、Ｌ−リシン生産能が有意に向上した菌株としてＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ｍｔ−３を最終選択した。
【００５９】
実施例４
最終選択株におけるＬ−リシン生産能向上の原因解明
本実施例においては、実施例３で最終選択した突然変異株を対象に、トランスポゾンのランダムな挿入により欠損した遺伝子の同定を試みた。
【００６０】
Ｌ−リシンの生産能が最も優れるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ／ｍｔ−３のゲノムＤＮＡを抽出して切断し、その後連結して大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。形質転換した２０種のコロニーを選択し、その後未知の遺伝子の一部を含むプラスミドを得て、ＥＺ−Ｔｎ５TM＜Ｒ６Ｋγｏｒｉ／ＫＡＮ−２＞Ｔｎｐ ＴｒａｎｓｐｏｓｏｍｅTMキットのプライマー１（配列番号３）及びプライマー２（配列番号４）を用いて塩基配列を分析した。
【００６１】
その結果、配列番号２のポリヌクレオチド配列が欠損していることが確認された。配列番号２のポリヌクレオチド配列は、配列番号１のアミノ酸配列をコードするものであり、米国国立衛生研究所の遺伝子バンク（NIH Genbank）に報告されている塩基配列に基づいて機能が明確に解明されていない調節タンパク質（Regulatory protein）であることが確認された。
プライマー１（配列番号３）：ＡＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＡＧＣＴＣＴＣＡＴＣＡＡＣＣ
プライマー２（配列番号４）：ＣＴＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＡＣＡＣＣＴＡＣＡＴＣＴ
【００６２】
よって、前記タンパク質の活性の不活性化によりＬ−リシン生産能に影響があるか否かを確認するために、前記遺伝子を欠損候補遺伝子として選択した。
【００６３】
実施例５
遺伝子を欠損させる組換えベクターの作製
本実施例においては、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質の不活性化によりＬ−リシン生産に影響があるか否かを確認するために、コリネバクテリウム属のＬ−リシンを生産する微生物の染色体上で実施例４において選択した遺伝子を欠損させるための組換えプラスミドを作製した。そのために、表２のプライマー３〜６を合成した。
【００６４】
【表２】
2021511009.tif 000003
【００６５】
具体的には、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子のＯＲＦ部位（配列番号２）を欠損させるために、５'末端にＥｃｏＲＩ、３'末端にＳａｌＩ制限酵素部位を有するようにプライマー３（配列番号５）、プライマー４（配列番号６）、プライマー５（配列番号７）、プライマー６（配列番号８）（表２）を合成し、野生型コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３０３２のゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲ（非特許文献１）を行った。
【００６６】
その結果、前記遺伝子の上流及び下流に該当するＤＮＡ断片がそれぞれ５００ｂｐずつ増幅されることが確認された。ここで、ＰＣＲ条件は、９５℃で３０秒間の変性、５０℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の重合反応を３０サイクル行い、その後７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。コリネバクテリウム・グルタミカム中で複製が不可能なｐＤＺベクター（特許文献１）とＰＣＲで増幅された前記断片を染色体導入用制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＳａｌＩで処理し、次いでＤＮＡリガーゼを用いて連結し、その後大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシン（２５ｍｇ／ｌ）を含むＬＢ固体培地に塗抹した。
【００６７】
ＰＣＲにより前記標的遺伝子が挿入されたプラスミドで形質転換されたコロニーを選択し、その後プラスミド抽出法によりプラスミドを得た。そのプラスミドをｐＤＺ−△ＮＣｇｌ０２７５と命名した。
【００６８】
実施例６
コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６ＰにおいてＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株の作製及びそのＬ−リシン生産能の評価
代表的なＬ−リシン生産コリネバクテリウム属菌株であるＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株に基づいて、前述したように選択したＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株を作製し、そのＬ−リシン生産能を評価した。
【００６９】
具体的には、実施例５で作製した組換えプラスミドｐＤＺ−△ＮＣｇｌ０２７５を染色体上での相同組換えによりＬ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐに形質転換した（非特許文献９）。
【００７０】
その後、４％のスクロースを含む固体平板培地において２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー３とプライマー６を用いたＰＣＲにより、染色体上で配列番号２の遺伝子が欠損した菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ＮＣｇｌ０２７５と命名した。
【００７１】
前述したように作製したコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ＮＣｇｌ０２７５菌株のＬ−リシン生産能を分析するために、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ菌株と共に次の方法で培養した。
【００７２】
次の種培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに、親株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐと実施例６で作製した菌株コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ＮＣｇｌ０２７５を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間振盪培養した。次に、生産培地２４ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに１ｍｌの種培養液を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。前記種培地及び生産培地の組成は、それぞれ次の通りである。
＜種培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース２０ｇ，ペプトン１０ｇ，酵母抽出物５ｇ，尿素１．５ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 ４ｇ，Ｋ2ＨＰＯ4 ８ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド２ｍｇ（蒸留水１リットル中）
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，（ＮＨ4）2ＳＯ4 ４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，ＫＨ2ＰＯ4 １ｇ，ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミン塩酸塩１ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，ＣａＣＯ3 ３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【００７３】
培養終了後に、ＨＰＬＣを用いてＬ−リシンの生産量を測定した。分析したＬ−リシンの濃度を表３に示す。
【００７４】
【表３】
2021511009.tif 000004
【００７５】
これらの結果から、Ｌ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１０１６ＰからＮＣｇｌ０２７５を欠損させると、親株に比べてＬ−リシン生産能が平均１７．２％増加することが確認された。
【００７６】
よって、コリネバクテリウム属微生物において配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を不活性化することにより、Ｌ−リシン生産能が向上することが確認された。
【００７７】
また、菌株ＫＣＣＭ１１０１６Ｐ−ＮＣｇｌ０２７５をＣＡ０１−７５１２と命名し、ブダペスト条約上の寄託機関である韓国微生物保存センター（ＫＣＣＭ）に２０１７年１１月７日付けで寄託番号ＫＣＣＭ１２１５３Ｐとして国際寄託した。
【００７８】
実施例７
コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７ＰにおいてＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株の作製及びＬ−リシン生産能の評価
Ｌ−リシンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においても前記と同じ効果があるか否かを確認するために、実施例６と同様に、Ｌ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７Ｐ（特許文献４；前記微生物は、ＫＦＣＣ１０７５０として公開され、ブダペスト条約上の国際寄託機関に寄託番号ＫＣＣＭ１１３４７Ｐとして再寄託された）を対象に、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株を作製し、ＫＣＣＭ１１３４７Ｐ−ＮＣｇｌ０２７５と命名した。
【００７９】
その後、実施例６と同様に培養し、培養終了後に、ＨＰＬＣを用いてＬ−リシンの生産量を測定した。分析したＬ−リシンの濃度を表４に示す。
【００８０】
【表４】
2021511009.tif 000005
【００８１】
これらの結果から、Ｌ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１３４７Ｐに基づいて、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子を欠損させると、Ｌ−リシン生産能が平均１３．６％増加することが確認された。
【００８２】
よって、実施例６の結果と同様に、コリネバクテリウム属微生物において配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を不活性化することにより、非改変微生物に比べてＬ−リシン生産能が向上することが確認された。
【００８３】
実施例８
コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０ＰにおいてＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株の作製及びＬ−リシン生産能の評価
Ｌ−リシンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においても前記と同じ効果があるか否かを確認するために、実施例６と同様に、Ｌ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐ（特許文献１）を対象に、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株を作製し、ＫＣＣＭ１０７７０Ｐ−ＮＣｇｌ０２７５と命名した。
【００８４】
その後、実施例６と同様に培養し、培養終了後に、ＨＰＬＣを用いてＬ−リシンの生産量を測定した。分析したＬ−リシンの濃度を表５に示す。
【００８５】
【表５】
2021511009.tif 000006
【００８６】
これらの結果から、Ｌ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１０７７０Ｐに基づいて、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子を欠損させると、Ｌ−リシン生産能が平均１４．６％増加することが確認された。
【００８７】
よって、実施例７の結果と同様に、Ｌ−リシン生産能を有する様々なコリネバクテリウム属微生物において配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を不活性化することにより、その親株に比べてＬ−リシン生産能が向上することが確認された。
【００８８】
実施例９
コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３ＰにおいてＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株の作製及びＬ−リシン生産能の評価
Ｌ−リシンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においても前記と同じ効果があるか否かを確認するために、実施例６と同様に、コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐ（非特許文献１０）を対象に、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株を作製し、ＣＪ３Ｐ−ＮＣｇｌ０２７５と命名した。
【００８９】
その後、実施例６と同様に培養し、培養終了後に、ＨＰＬＣを用いてＬ−リシンの生産量を測定した。分析したＬ−リシンの濃度を表６に示す。
【００９０】
【表６】
2021511009.tif 000007
【００９１】
これらの結果から、Ｌ−リシン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ３Ｐを対象に、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子を欠損させると、Ｌ−リシン生産能が平均１５．８％増加することが確認された。
【００９２】
よって、実施例６〜８の結果と同様に、Ｌ−リシン生産能を有する様々なコリネバクテリウム属微生物において配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を不活性化することにより、Ｌ−リシン生産能が向上することが確認された。
【００９３】
実施例１０
コリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１ＰにおいてＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株の作製及びＬ−バリン生産能の評価
前記Ｌ−リシン以外に、Ｌ−バリン生産能を有するコリネバクテリウム・グルタミカムにおいてもＮＣｇｌ０２７５遺伝子の欠損によりバリン生産能が向上するか否かを評価した。
【００９４】
実施例５で作製した組換えプラスミドｐＤＺ−△ＮＣｇｌ０２７５を染色体上での相同組換えによりＬ−バリン生産菌株であるコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ（特許文献５）に形質転換した（非特許文献９）。その後、４％のスクロースを含む固体平板培地において２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー３とプライマー６を用いたＰＣＲにより、染色体上でＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株を作製した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＫＣＣＭ１１２０１Ｐ−ＮＣｇｌ０２７５と命名した。
【００９５】
前述したように作製した菌株のＬ−バリン生産能を比較するために、次の方法で培養して培養液成分を分析した。生産培地２５ｍｌを含有する２５０ｍｌのコーナーバッフルフラスコに各菌株を接種し、３０℃、２００ｒｐｍで７２時間振盪培養した。その後、ＨＰＬＣを用いてＬ−バリンの濃度を分析した。分析したＬ−バリンの濃度を表７に示す。
＜生産培地（ｐＨ７．０）＞
グルコース１００ｇ，硫酸アンモニウム４０ｇ，大豆タンパク質２．５ｇ，コーンスティープソリッド（Corn Steep Solids）５ｇ，尿素３ｇ，リン酸水素二カリウム１ｇ，硫酸マグネシウム７水塩０．５ｇ，ビオチン１００μｇ，チアミンＨＣｌ １ｍｇ，パントテン酸カルシウム２ｍｇ，ニコチンアミド３ｍｇ，炭酸カルシウム３０ｇ（蒸留水１リットル中）
【００９６】
【表７】
2021511009.tif 000008
【００９７】
これらの結果から、ＫＣＣＭ１１２０１Ｐ−ＮＣｇｌ０２７５菌株のＬ−バリン生産能は、対照群に比べて２５．０％増加することが確認された。すなわち、コリネバクテリウム属微生物においてＮＣｇｌ０２７５遺伝子を欠損させると、Ｌ−バリンの生産能が向上することが確認された。
【００９８】
また、コリネバクテリウム属微生物において配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を不活性化することにより、様々なＬ−アミノ酸生産能が向上することが確認された。
実施例１１
【００９９】
コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖを用いた、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株の作製及びＬ−バリン生産能の評価
Ｌ−バリンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においても前記と同じ効果があるか否かを確認するために、野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）；非特許文献１１］を導入してＬ−バリン生産能が向上した菌株を作製した。
【０１００】
具体的には、コリネバクテリウム・グルタミカムの野生型であるＡＴＣＣ１４０６７菌株のゲノムＤＮＡを、Ｇ−ｓｐｉｎ Ｔｏｔａｌ ＤＮＡ抽出ミニキット（Intron社, Cat. No 17045）により、キットに提供されたプロトコルに応じて抽出した。前記ゲノムＤＮＡを鋳型としてＰＣＲを行った。ｉｌｖＮ遺伝子にＡ４２Ｖ変異を導入するベクターを作製するために、プライマー７（配列番号９）とプライマー８（配列番号１０）のプライマー対及びプライマー９（配列番号１１）とプライマー１０（配列番号１２）のプライマー対を用いて、遺伝子断片Ａ、Ｂをそれぞれ得た。ＰＣＲ条件は、９４℃で５分間の変性後、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で６０秒間の重合を２５サイクル行い、７２℃で７分間の重合反応を行うものとした。
【０１０１】
その結果、断片Ａ、Ｂの両方において５３７ｂｐのポリヌクレオチドが得られた。前述した２つの断片を鋳型とし、プライマー７（配列番号９）とプライマー１０（配列番号１２）を用いてＯｖｅｒｌａｐｐｉｎｇ ＰＣＲを行うことにより、１０４４ｂｐのＰＣＲ産物（以下、「変異導入断片」という）が得られた。
【０１０２】
前述したように得られた変異導入断片を制限酵素ＸｂａＩ（New England Biolabs, Beverly, MA）で処理し、その後同じ制限酵素で処理したｐＤＺベクターとＴ４リガーゼ（New England Biolabs, Beverly, MA）を用いてライゲーションした。前述したように作製した遺伝子を大腸菌ＤＨ５αに形質転換し、その後それをカナマイシン含有ＬＢ培地から選択し、ＤＮＡ−ｓｐｉｎプラスミドＤＮＡ精製キット（iNtRON社）を用いてＤＮＡを得た。前記ｉｌｖＮ遺伝子のＡ４２Ｖ変異導入を目的とするベクターをｐＤＺ−ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）と命名した。
【０１０３】
【表８】
2021511009.tif 000009
【０１０４】
その後、前述したように作製した組換えプラスミドｐＤＺ−ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）を染色体上での相同組換えにより野生型であるコリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１４０６７に形質転換した（非特許文献９）。その後、４％のスクロースを含む固体平板培地において２次組換えを行った。２次組換えが終了した前記コリネバクテリウム・グルタミカム形質転換株を対象に、プライマー７とプライマー１０を用いたＰＣＲにより遺伝子断片を増幅し、その後遺伝子配列分析により変異導入菌株を確認した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖと命名した。
【０１０５】
最後に、Ｌ−バリン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ７Ｖを対象に、実施例９と同様に、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株を作製し、ＣＪ７Ｖ−ＮＣｇｌ０２７５と命名した。作製した菌株のＬ−バリン生産能を比較するために、実施例９と同様に培養し、Ｌ−バリンの濃度を分析した。分析したＬ−バリンの濃度を表９に示す。
【０１０６】
【表９】
2021511009.tif 000010
【０１０７】
これらの結果から、ＣＪ７Ｖ−ＮＣｇｌ０２７５菌株のＬ−バリン生成能は、対照群に比べて１７．６％増加することが確認された。すなわち、Ｌ−バリン生産能を有する様々なコリネバクテリウム属微生物においてＮＣｇｌ０２７５遺伝子を欠損させると、Ｌ−バリンの生産能が向上することが確認された。
【０１０８】
よって、実施例６〜１０と同様に、コリネバクテリウム属微生物において配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を不活性化することにより、様々なＬ−アミノ酸生産能が向上することが確認された。
【０１０９】
実施例１２
コリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ８Ｖを用いた、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株の作製及びＬ−バリン生産能の評価
Ｌ−バリンを生産する他のコリネバクテリウム・グルタミカムに属する菌株においても前記と同じ効果があるか否かを確認するために、実施例１０と同様に、野生株コリネバクテリウム・グルタミカムＡＴＣＣ１３８６９に１種の変異［ｉｌｖＮ（Ａ４２Ｖ）］を導入してＬ−バリン生産能を有するようになった変異株を作製した。前記組換え菌株をコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ８Ｖと命名した。
【０１１０】
Ｌ−バリン生産能を有するようになったコリネバクテリウム・グルタミカムＣＪ８Ｖを対象に、実施例９と同様に、ＮＣｇｌ０２７５遺伝子が欠損した菌株を作製し、ＣＪ８Ｖ−ＮＣｇｌ０２７５と命名した。
【０１１１】
作製した前記菌株のＬ−バリン生産能を比較するために、実施例９と同様に培養し、Ｌ−バリンの濃度を分析した。分析したＬ−バリンの濃度を表１０に示す。
【０１１２】
【表１０】
2021511009.tif 000011
【０１１３】
これらの結果から、ＣＪ８Ｖ−ＮＣｇｌ０２７５菌株のＬ−バリン生成能は、対照群に比べて２５．９％増加することが確認された。すなわち、実施例１０、１１の結果と同様に、Ｌ−バリン生産能を有する様々なコリネバクテリウム属微生物においてＮＣｇｌ０２７５遺伝子を欠損させると、Ｌ−バリンの生産能が向上することが確認された。
【０１１４】
よって、実施例６〜１１と同様に、コリネバクテリウム属微生物において配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質を不活性化することにより、様々なＬ−アミノ酸生産能が向上することが確認された。
【０１１５】
以上の説明から、本願の属する技術分野の当業者であれば、本発明がその技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で実施できることを理解するであろう。なお、前記実施例はあくまで例示的なものであり、限定的なものでないことを理解すべきである。本発明には、明細書ではなく請求の範囲の意味及び範囲とその等価概念から導かれるあらゆる変更や変形された形態が含まれるものと解釈すべきである。
【０１１６】
2021511009.tif 000012
【配列表】
2021511009000001.app
【国際調査報告】
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