(57)【要約】  本発明は、癌免疫療法、特にＳＬＡＭＦ６スプライスバリアントの発現および／または活性を特異的に調節することを含む改善された治療モダリティに関する。より具体的には、本発明の実施形態は、養子Ｔ細胞移入療法、細胞ワクチンおよび／またはポリペプチドベースの薬物を含む、癌治療のための組成物および方法を提供する。様々な実施形態において、Ｔ細胞および／または腫瘍細胞におけるＳＬＡＭＦ６バリアント３（ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３）の発現または活性の選択的な増強を提供する組成物および方法が提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された細胞集団を含む、治療用細胞組成物。
【請求項２】
養子移入Ｔ細胞組成物、腫瘍細胞ワクチンおよび樹状細胞（ＤＣ）ワクチンからなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記細胞集団はヒトＴ細胞集団であり、前記組成物は養子移入Ｔ細胞組成物である、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記細胞集団はヒト腫瘍細胞集団であり、前記細胞ワクチンは腫瘍細胞ワクチンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
前記細胞集団はヒトＤＣ集団であり、前記細胞ワクチンはＤＣワクチンである、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている、請求項２〜６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている、請求項２〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
前記細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を外因的に発現するように操作されている、請求項２〜７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための、請求項２〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記細胞集団はヒトＴ細胞集団であり、前記組成物は養子移入Ｔ細胞組成物であり、前記Ｔ細胞は、自家性であるか、または前記対象と組織適合性の同種Ｔ細胞である、請求項１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞は、前記対象のエクスビボＴ細胞、または前記対象と組織適合性のあるドナーのエクスビボＴ細胞を調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現させることと、得られたＴ細胞を癌治療のための養子移入組成物として配合することと、を含む方法によって生成されている、請求項１１に記載の使用のための組成物。
【請求項１３】
前記Ｔ細胞は、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとのインキュベーションによってさらに増殖および／または活性化されている、請求項１１または１２に記載の使用のための組成物。
【請求項１４】
前記細胞集団はヒト腫瘍細胞集団であり、前記細胞ワクチンは腫瘍細胞ワクチンである、請求項１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
前記腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である、請求項１４に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
前記細胞集団はＤＣ集団であり、前記細胞ワクチンはＤＣワクチンである、請求項１０に記載の使用のための組成物。
【請求項１７】
ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作されたＴ細胞を対象に投与することを含む、癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法。
【請求項１８】
前記Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞は自家性である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞は、前記対象と組織適合性の同種Ｔ細胞である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
方法であって、
ａ）前記対象から、または前記対象と組織適合性のあるドナーからＴ細胞を得ることと、
ｂ）前記細胞をエクスビボで調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現させることと、
ｃ）前記得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することと、を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
前記Ｔ細胞は、前記対象への投与前に、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとのインキュベーションによってさらに増殖および／または活性化される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された細胞集団を含む細胞ワクチンを前記対象に投与することを含む、癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法。
【請求項２５】
前記細胞集団は腫瘍細胞集団であり、前記細胞ワクチンは腫瘍細胞ワクチンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞集団はＤＣ集団であり、前記細胞ワクチンはＤＣワクチンである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている、請求項２４または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を外因的に発現するように操作されている、請求項２４記載の方法。
【請求項３１】
治療用細胞組成物を生成する方法であって、
ａ）Ｔ細胞、腫瘍細胞およびＤＣからなる群から選択される細胞集団を得ることと、
ｂ）前記細胞をエクスビボで調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現させることと、を含む、方法。
【請求項３２】
癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン。
【請求項３３】
前記使用は、前記対象の癌を治療するのに有効な量での前記対象への投与を含む、請求項３２に記載の使用のための、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン。
【請求項３４】
前記使用は、前記対象のＴ細胞を、前記Ｔ細胞を増殖および／または活性化するのに有効な量の前記単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとエクスビボで接触させることと、得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することと、を含む、請求項３２に記載の使用のための、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン。
【請求項３５】
癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法であって、有効量の単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを、前記対象に投与するか、または前記対象のＴ細胞と接触させ、それによって前記対象の癌を治療することを含む、方法。
【請求項３６】
前記対象に有効量の単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを投与することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記対象のＴ細胞を、前記Ｔ細胞を増殖および／または活性化するのに有効な量の前記単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとエクスビボで接触させることと、得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することと、を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
Ｎ’ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１シグナルペプチドに融合した、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを含む、キメラポリペプチド前駆体。
【請求項３９】
配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する、請求項３８に記載のポリペプチド前駆体。
【請求項４０】
配列番号１９に示されるポリヌクレオチドによってコードされる、請求項３８に記載のポリペプチド前駆体。
【請求項４１】
請求項３８に記載のポリペプチド前駆体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４２】
請求項３８に記載のポリペプチド前駆体を哺乳動物発現系で発現させることと、得られたエクトドメインポリペプチドを単離することと、を含むプロセスによって作製される、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン。
【請求項４３】
癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための、請求項４２に記載の単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌免疫療法、特に、ＳＬＡＭＦ６スプライスバリアントの発現および／または活性の差次的調節を含む改善された治療モダリティに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＳＬＡＭ（シグナル伝達リンパ球活性化分子）ファミリーの受容体は、造血起源の細胞で発現する免疫調節に関与する同型結合分子の典型である。ＳＬＡＭファミリータンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのＣＤ２サブグループのメンバーである。ＮＫ−ＴＢ抗原（ＮＴＢ−Ａ）、ＣＤ３５２、Ｌｙ−１０８、ＳＦ２０００およびＫＡＬＩとしても知られるＳＬＡＭファミリーメンバー６（ＳＬＡＭＦ６）は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞およびＢ細胞で発現するＩ型膜貫通タンパク質である。ＳＬＡＭＦ６は、受容体複合体にＳＬＡＭ関連タンパク質（ＳＡＰ）およびさらなるアダプタータンパク質を動員することによって媒介される同型相互作用を示す。
【０００３】
ヒトＳＬＡＭＦ６遺伝子は、ＳＬＡＭＦ６ポリペプチドをコードする８エクソンｍＲＮＡに転写される。しかしながら、特定のインフレーム配列の欠失を特徴とする追加のＳＬＡＭＦ６アイソフォーム（Ｏｔａ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ３６，４０−４５（２００４））の存在が示唆されている。別途指示されない限り、また特定のアイソフォームの同定を伴わない限り、本明細書で使用される「ＳＬＡＭＦ６」および「ＮＴＢ−Ａ」という用語は、古典的ＳＬＡＭＦ６（本明細書ではＳＬＡＭＦ６アイソフォーム１、バリアント１またはＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１とも称される）を指す。
【０００４】
ＳＬＡＭＦ６は、２つの細胞外Ｉｇ様ドメインおよび３つの細胞質チロシンベースのシグナル伝達モチーフを含み、これらのうちの１つは従来の免疫受容体チロシンベースの阻害モチーフに含まれる。ヒトＴ細胞上のＳＬＡＭＦ６の会合は、ＣＤ２８共刺激経路に取って代わり、Ｔｈ１表現型への分極を誘導することができる。しかしながら、Ｌｙ−１０８ノックアウトマウス（マウスＳＬＡＭＦ６オルソログ）からのＣＤ４陽性Ｔ細胞は、ＩＬ−４産生において障害を示し、Ｔｈ２分極におけるＳＬＡＭＦ６の役割が示唆される。この矛盾の理由は完全には解明されていない。ヒトＮＫ細胞上のＳＬＡＭＦ６の活性化は、細胞傷害性および増殖、ならびにＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−α産生も刺激する。
【０００５】
Ｖａｌｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４，２７９（１８），ｐｐ．１８６６２−１８６６９は、ＳＬＡＭＦ６が同型相互作用によりＴ細胞を活性化し、Ｔｈ１の特性を特異的に増強することを教示している。ＮＴＢ−Ａの最初の２２６アミノ酸をマウスＩｇＧ１のＦｃ部分に融合することにより作製されるＮＴＢ−Ａ−Ｆｃ融合タンパク質は、Ｔｈ１型サイトカインによって一般的に誘導されるＢ細胞アイソタイプスイッチングを阻害することが見いだされ、Ｔｈ１依存性自己免疫疾患（ＥＡＥモデル）を阻害した。したがって、報告されたＮＴＢ−Ａ融合タンパク質は、Ｖａｌｄｅｚらによって報告された実験系でＳＬＡＭＦ６アンタゴニストとして作用することが分かった。
【０００６】
ＶａｌｄｅｚらへのＵＳ２００９／０１７０１４は、ＰＲＯ２００８０ポリペプチド（古典的ＳＬＡＭＦ６のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有する）、その細胞外部分、そのホモログ、アゴニストおよびアンタゴニストを対象としており、それらは免疫疾患の推定上の調節因子として示唆されている。’０１４刊行物は、癌の治療のための免疫アジュバント療法においてそこに開示される特定の免疫刺激化合物の使用を示唆している。
【０００７】
Ｕｚａｎａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１２，１８８，ｐｐ．６３２−６４０）は、特異的抗体による抗原提示細胞（ＡＰＣ）上でのＳＬＡＭＦ６遮断が、ＣＤ８＋リンパ球からのサイトカイン分泌を阻害したことを開示している。この刊行物は、抗癌免疫療法を改善するための潜在的な標的として古典的ＳＬＡＭＦ６を示唆しているが、ＣＤ２８等の他の共刺激受容体をアゴニスト抗体で標的化する類似のアプローチが臨床試験において致死的転帰で終了したため、このアプローチに関連する実験的調査を正当化するべきであると考えられる。
【０００８】
ＳＬＡＭＦ６は特定の造血器腫瘍で発現するため、この抗原を異常に発現する腫瘍に対して抗腫瘍免疫応答を誘導するように、この分子に由来するペプチドエピトープを使用したワクチン接種が提案されている。例えば、ＷＯ２００６／０３７４２１は、ヒト腫瘍細胞株のＨＬＡクラスＩＩ分子に由来する３３８のペプチド配列を開示しており、それらは抗腫瘍免疫応答を誘発するためのワクチン組成物に使用することができる。これらの配列の中には、ＳＬＡＭＦ６の１０３〜１１８位に対応する１６アミノ酸ペプチドがある。さらに、これらのエピトープに抗体またはその免疫毒素複合体を標的化させることが示唆されている。例えば、ＵＳ２０１１／１７１２０４は、抗ＮＴＢ−Ａ抗体およびその抗原結合断片、ならびにＮＴＢ−Ａに結合して、ＮＴＢ−Ａの発現を特徴とする血液悪性腫瘍等の疾患を治療するためにそれらを使用する方法を開示している。ＮＴＢ−Ａに対するさらなる抗体は、例えばＫｒｏｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｙ  ２００７，１３７，ｐｐ．３０７−３１８）によって記載されている。これらの抗体は、ＮＴＢ−Ａを発現するリンパ球に細胞傷害効果を発揮し、Ｔ細胞の増殖またはサイトカインの分泌には影響を与えなかった。
【０００９】
ＥＰ２０８３０８８は、とりわけＳＬＡＭＦ６からなる群から選択される遺伝子の発現産物のレベルを調節することを含む、患者の癌を治療するための方法を開示しており、癌は、メラノーマ、乳癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、子宮癌、子宮頸癌、膀胱癌、胃癌または皮膚癌からなる群から選択される。この刊行物は、該方法が前記遺伝子の過剰発現を特徴とする患者を治療するのに有用であることを開示している。
【００１０】
ＷＯ０３／００８４４９は、ＮＴＢ−Ａポリペプチド、それをコードする核酸分子およびその使用に関する。この刊行物はまた、ＮＴＢ−Ａの活性をインビトロ、エクスビボまたはインビボで調節することによりＮＫ細胞活性を調節する方法、およびＮＴＢ−Ａもしくはその断片、またはそれをコードする核酸、または前記ポリペプチドを発現する組換え宿主細胞を使用して活性化合物をスクリーニングする方法にも関する。対象における免疫機能を調節するための薬物の調製における、ＮＴＢ−Ａポリペプチドの活性を調節する化合物の使用がさらに開示される。
【００１１】
Ｓｎｏｗら（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．２００９，１１９，ｐｐ．２９７６−２９８９；Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２０１０，２３６，ｐｐ．６８−８２）は、健康なドナーおよびＸ連鎖リンパ増殖性疾患（ＸＬＰ、稀な先天性免疫不全症）患者から得られたＴ細胞の再刺激誘発性細胞死（ＲＩＣＤ）の調節における、ＮＴＢ−Ａとその下流エフェクターＳＡＰの役割を検討した。この刊行物は、正常なドナーＴ細胞において、ＮＴＢ−ＡがＴＣＲ誘導アポトーシスに積極的に関与し、かつ必要であると報告している。対照的に、ＸＬＰ患者では、ＮＴＢ−ＡがＸＬＰ  Ｔ細胞においてＲＩＣＤ耐性に寄与することが分かっているため、この現象は逆行する。
【００１２】
本発明者らの一部に対するＷＯ２０１５／１０４７１１は、癌患者の治療のため、感受性患者の血球減少症を予防および治療するため、ならびに養子細胞療法のための改善されたＴ細胞組成物のエクスビボ調製のための、可溶性ＮＴＢ−Ａポリペプチドまたはそのアゴニストの使用を開示している。具体的には、ＷＯ’７１１は、特に、実質的なＮＴＢ−Ａ表面発現の欠如を特徴とする腫瘍、固形腫瘍、およびＣＤ１３７の表面発現を特徴とする腫瘍の塗料における、単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインもしくはそのアゴニストの対象への投与、またはＴ細胞と単離されたＮＴＢ−Ａエクトドメインもしくはそのアゴニストとのインキュベーションを開示している。ＷＯ’７１１の実施例に開示されているＮＴＢ−Ａの配列は、古典的ヒトＳＬＡＭＦ６の配列に対応している。
【００１３】
本発明者らの一部であるＥｉｓｅｎｂｅｒｇら（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ；６（２）２０１８）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞エフェクター機能および抗メラノーマ活性に関する古典的ヒトＳＬＡＭＦ６エクトドメインの２０３アミノ酸配列（Ｃ−末端、ノボプロテイン）を使用して行われた実験をさらに記載している。
【００１４】
異なる細胞および異なる臨床環境または実験環境で同定されているＳＬＡＭＦ６の様々な生物学的効果のために、それは免疫調節との関連において活性化または阻害効果のいずれかを発揮することができる二重受容体として特徴付けられている。完全には解明されていないものの、マウスモデルにおける実験に基づくと、応答の方向はＳＬＡＭＦ６の細胞内チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）に起因している（Ｋｅｓｚｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．２０１１，２０８（４）：８１１−８２２）。
【００１５】
癌の発生に対する不均衡な選択的スプライシングの寄与、および腫瘍形成性アイソフォームの形成に関して、多くの情報が蓄積されている（Ｋｏｚｌｏｖｓｋｉ，Ｉ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅｔ，２０１７，１３６（９）：ｐ．１１１３−１１２７）。選択的スプライシングは癌に特有のものではなく、遺伝子の９０％以上がこのプロセスを経験する。免疫受容体も例外ではなく、最もよく認識されている例は膜貫通タンパク質ＣＤ４５であり、そのスプライスされたアイソフォームは活性化されたＴ細胞からナイーブ細胞を区別する（Ｏｂｅｒｄｏｅｒｆｆｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００８，３２１（５８８９）：ｐ．６８６−９１）。他の免疫調節受容体に関しては、それらのＩｇ可変ドメインをコードするエクソン２の欠落は、全てのＩｇＳＦ受容体に共通である。驚くべきことに、機能的な結果はほとんど分かっていない。単一の研究は、古典的ＣＤ２８との非共有結合に起因して、２番目のエクソンを欠くＣＤ２８アイソフォームがＣＤ２８媒介シグナル伝達を増強し、シグナル増幅器として機能することを示した（Ｈａｎａｗａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ，２００２，９９（６）：ｐ．２１３８−４５）。抗ＣＤ２８治療の悲惨な記録のために、この観察はこれ以上行われなかった。
【００１６】
ＵＳ２０１４／０３０２０７０は、エクソン２ドメインに位置する４２ヌクレオチドのフレーム内欠失を含むヒトＰＤ１のアイソフォーム（Δ４２ＰＤ１）に関連している。ＵＳ’０７０は、このアイソフォームが、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２に関与せず、炎症誘発性サイトカインの産生を誘導できることを開示しており、また、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞免疫を増強するため、ならびに病原性感染症および／または癌の予防のための融合ＤＮＡワクチンを開発するための分子内アジュバントとしての使用を示唆している。ＵＳ’０７０はさらに、自己免疫疾患の治療標的としての可溶性Δ４２ＰＤ１タンパク質または中和抗体の使用を示唆している。
【００１７】
マウスＳＬＡＭＦ６（Ｌｙ−１０８）のアイソフォームが報告され、特徴付けされている（Ｋｅｓｚｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１（同所），Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６，Ａｐｒ；１７（４）：３８７−９６）。選択的スプライシングの結果として、識別された３つのＬｙ−１０８アイソフォームは、同一の細胞外ドメインを有するが、（とりわけＩＴＳＭモチーフをコードする）エクソン７〜９のうちの１つ以上の欠落のために細胞質の尾部が異なる。Ｌｙ−１０８アイソフォームは、マウスの狼瘡関連自己免疫に対する感受性またはそれからの保護のいずれかに関連していることが判明した。しかしながら、抗腫瘍免疫との関連においてＬｙ−１０８アイソフォームの活性における差は見られなかった。むしろ、Ｗｕらは、トランスフェクトされたアイソフォームに関係なく、ＮＫ細胞における異なるＬｙ−１０８アイソフォームの発現が非造血器腫瘍細胞株に対する応答性の向上をもたらしたと報告している。Ｗｕらはまた、ヒトＮＫ細胞のゲノム編集によるＳＬＡＭＦ６ノックアウトにより、抗癌活性が低下したことも報告している。
【００１８】
ヒトＳＬＡＭＦ６では、（マウスにおいて検出および特徴付けされた）細胞質尾部が変化した同等のアイソフォームは同定されなかった。むしろ、ＳＬＡＭＦ６バリアント２（ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２）は、２６６位の単一アラニン（細胞質尾部に対応する）の欠失によって古典的ＳＬＡＭＦ６（ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１）と異なり、ＳＬＡＭＦ６バリアント３（ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３）は、エクソン２のアミノ酸（ａａ）１７〜６５（細胞外ドメインに対応する）を欠き、ＳＬＡＭＦ６バリアント４（ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４）は、ａａ１７〜１２８をエンコードするエクソン２の大部分を欠いている。ヒトＳＬＡＭＦ６の任意の意図的な選択的にスプライスされたバリアントの生物学的および臨床的重要性は、これまで説明または決定されていない。
【００１９】
伝えられるところでは、癌免疫療法の進歩は患者の生存の増加に大きな影響を示したしかしながら、ＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１標的化に基づくものを含むこれらの治療の部分的な有効性は、効果的な抗癌免疫応答を妨げる障壁を克服するためのさらなる解決策を見つける必要性を示している。効力および／または安全性が強化された免疫療法のための組成物および方法の開発に関する満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、癌免疫療法、特に、ＳＬＡＭＦ６スプライスバリアントの発現および／または活性の調節を含む改善された治療様式モダリティに関する。より具体的には、本発明の実施形態は、養子Ｔ細胞移入療法、細胞ワクチンおよび／またはポリペプチドベースの薬物を含む、ヒト対象の癌治療のための組成物および方法を提供する。
【００２１】
本発明は、様々なＳＬＡＭＦ６アイソフォームが休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞で同時に発現し、抗腫瘍免疫の観点から異なるおよび反対の生物学的効果さえも示すという驚くべき発見に一部基づいている。具体的には、細胞外ドメインの配列をコードするエクソン２の一部を欠くヒトＳＬＡＭＦ６のスプライスバリアント、すなわちＳＬＡＭＦ６バリアント３（ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３）がＴ細胞活性および抗腫瘍免疫に強力なアゴニスト効果を及ぼすことを、ここで初めて開示する。対照的に、古典的ヒトＳＬＡＭＦ６（バリアント１、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１）を含む他のＳＬＡＭＦ６バリアント、およびエクソン２のより大きな部分を欠くスプライスバリアント（バリアント４、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４）は、著しく弱いアゴニスト効果を発揮するか、または下方制御効果を媒介して、結果的に抗腫瘍免疫を低下させる。本発明はさらに、本明細書に記載されるように、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを含む卓越した抗癌活性を示す治療用組成物の開発に一部基づいている。
【００２２】
様々な実施形態によれば、本発明の組成物および方法は、治療される対象にＳＬＡＭＦ６バリアント３（ＳＬＡＭＦ６ＶＡＲ３）を標的とするＴ細胞刺激を提供するのに有用である（ＳＬＡＭＦ６ＶＡＲ３またはそのエクトドメインの会合または投与によってまたはそれを通して媒介される活性を提供する）。いくつかの実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ＶＡＲ３を標的とする刺激は、後にさらに詳述するように、例えば、前記対象に、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を標的とするＴ細胞刺激を増強するようにエクスビボでマニピュレートされたＴ細胞組成物、および／または、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を選択的もしくは優先的に発現するように操作された細胞ワクチンを投与することによって提供されてもよい。いくつかの実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を標的とするＴ細胞刺激を提供することは、後にさらに詳述するように、古典的ＳＬＡＭＦ６（バリアント１、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１）の発現および／または活性を選択的もしくは優先的に阻害もしくは下方制御することを含む。
【００２３】
一態様では、本発明は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された細胞集団を含む治療用細胞組成物を提供する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、優先的（または差次的）発現は、マニピュレーション前のそれぞれの発現レベルと比較した相対的な発現レベルを指す。ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３に関して、この用語はさらに、他のＳＬＡＭＦ６バリアント、特にＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１と比較した、その相対的な発現レベルを指す。したがって、一実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現する細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作（または別様にマニピュレート）されている。例えば、限定されないが、細胞（例えば、Ｔ細胞）は、強力なまたは誘導可能なプロモーターにより調節される、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３をコードする核酸構築物でトランスフェクトまたは形質導入され得る。別の実施形態において、前記細胞（例えば、Ｔ細胞）は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。様々な実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を下方制御するのに適した方法は、アンチセンス、ＲＮＡ干渉分子（例えば、ｓｉＲＮＡ）、遺伝子編集構築物（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベースの構築物）等を含むがこれらに限定されない核酸物質の使用を含み得る。これらの方法に従って使用するのに適した薬剤は、その発現を選択的に低下させるように、すなわち、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を同時に低下させることなく、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１に特有の領域を標的とすることを理解されたい。
【００２５】
様々な実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された細胞集団を含む治療用細胞組成物は、養子移入Ｔ細胞組成物、腫瘍細胞ワクチンおよび樹状細胞（ＤＣ）ワクチンからなる群から選択される。一実施形態において、細胞集団はヒトＴ細胞集団であり、組成物は養子移入Ｔ細胞組成物である。別の実施形態において、細胞集団はヒト腫瘍細胞集団であり、細胞ワクチンは腫瘍細胞ワクチンである。特定の実施形態において、前記腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である。さらに別の実施形態において、細胞集団はヒトＤＣ集団であり、細胞ワクチンはＤＣワクチンである。別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている。別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。さらに別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御し、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を外因的に発現するように操作されている。
【００２６】
別の態様では、癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための、本明細書に記載のＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された細胞集団を含む治療用細胞組成物が提供される。一実施形態において、細胞集団はヒトＴ細胞集団であり、前記組成物は養子移入Ｔ細胞組成物であり、前記Ｔ細胞は、自家性であるか、または前記対象と組織適合性の同種Ｔ細胞である。別の実施形態において、前記Ｔ細胞は、対象の、または前記対象と組織適合性のあるドナーのエクスビボＴ細胞を調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現させることと、得られたＴ細胞を癌治療のための養子移入組成物として配合することと、を含む方法によって生成されている。別の実施形態において、前記Ｔ細胞は、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとのインキュベーションによってさらに増殖および／または活性化されている。別の実施形態において、細胞集団はヒト腫瘍細胞集団であり、細胞ワクチンは腫瘍細胞ワクチンである。別の実施形態において、腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である。別の実施形態において、細胞集団はＤＣ集団であり、細胞ワクチンはＤＣワクチンである。
【００２７】
別の態様では、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作されたＴ細胞を対象に投与することを含む、癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法が提供される。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている。別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。さらに別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御し、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように設計されている。別の実施形態において、前記Ｔ細胞は自家性である。別の実施形態において、前記Ｔ細胞は、前記対象と組織適合性の同種Ｔ細胞である。
【００２８】
別の実施形態において、方法は、
ａ）対象から、または対象と組織適合性のあるドナーからＴ細胞を得ることと、
ｂ）細胞をエクスビボで調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現させることと、
ｃ）得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することと、を含む。
【００２９】
別の実施形態において、Ｔ細胞は、前記対象への投与前に、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとのインキュベーションによってさらに増殖および／または活性化される。
【００３０】
別の態様では、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された細胞集団を含む細胞ワクチンを前記対象に投与することを含む、癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法が提供される。一実施形態において、細胞集団は腫瘍細胞集団であり、細胞ワクチンは腫瘍細胞ワクチンである。特定の実施形態において、腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である。別の実施形態において、細胞集団は樹状細胞（ＤＣ）であり、細胞ワクチンはＤＣワクチンである。別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている。別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。さらに別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御し、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。別の実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を外因的に発現するように操作されている。
【００３１】
別の態様では、治療用細胞組成物を生成する方法であって、
ａ）Ｔ細胞、腫瘍細胞およびＤＣからなる群から選択される細胞集団を得ることと、
ｂ）細胞をエクスビボで調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現させることと、を含む、方法が提供される。
【００３２】
別の態様では、癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインが提供される。一実施形態において、使用は、前記対象の癌を治療するのに有効な量での前記対象への投与を含む。別の実施形態において、使用は、前記対象のＴ細胞を、前記Ｔ細胞を増殖および／または活性化するのに有効な量の前記単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとエクスビボで接触させることと、得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することと、を含む。
【００３３】
別の態様では、本発明は、癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法であって、有効量の単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを、対象に投与するか、または前記対象のＴ細胞と接触させ、それによって前記対象の癌を治療することを含む、方法を含む。一実施形態において、方法は、前記対象に有効量の単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを投与することを含む。別の実施形態において、方法は、前記対象のＴ細胞を、前記Ｔ細胞を増殖および／または活性化するのに有効な量の単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとエクスビボで接触させることと、得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することと、を含む。
【００３４】
別の態様では、Ｎ’ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１シグナルペプチドに融合した、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを含む、キメラポリペプチド前駆体が提供される。一実施形態において、ポリペプチド前駆体は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、前記ポリペプチド前駆体は、配列番号１９に示されるポリヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態において、本明細書に開示されるポリペプチド前駆体をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１９に示されるとおりである。別の実施形態において、ポリペプチド前駆体を哺乳動物発現系で発現させることと、得られたエクトドメインポリペプチドを単離することと、を含むプロセスによって作製される、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインが提供される。別の実施形態において、本発明は、癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための、本明細書に開示されるポリペプチド前駆体に関する。
【００３５】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の説明および図面から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】メラノーマ細胞株におけるＳＬＡＭＦ６スプライスバリアントの異常発現。ｍＲＮＡは、ＳＬＡＭＦ６でトランスフェクトしたメラノーマ細胞株から抽出した。ＲＴ−ＰＣＲは、古典的なｖａｒ３およびｖａｒ４  ｍＲＮＡスプライスバリアントにまたがるように設計されたプライマーを用いて行った。
【図２Ａ−２Ｂ】標的メラノーマ細胞におけるＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現は、ＴＩＬによるＩＦＮ−γ分泌の増加を誘導する。図２Ａは、−２つの独立した実験の結果。図２Ｂは、２つの実験における３つのＴＩＬからの統合データの概要。両側ｔ検定＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００１
【図３Ａ−３Ｂ】標的メラノーマ細胞におけるＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現は、ＩＦＮγ＋ＴＮＦα＋ＴＩＬを増加させる。図３Ａは、−ドットプロット、図３Ｂは、陽性細胞の割合を示す３点測定の概要。両側ｔ検定＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０１
【図４Ａ−４Ｂ】ＳＬＡＭＦ６バリアントはＴ細胞で発現している。図４Ａでは、ｍＲＮＡは、ヒトＰＢＭＣ、Ｊｕｒｋａｔ細胞およびＣＤ８＋ＴＩＬから抽出した。Ｊｕｒｋａｔ細胞は、ＰＭＡおよびイオノマイシンで活性化した。ＲＴ−ＰＣＲは、異なるＳＬＡＭＦ６バリアント（ｖａｒ１：ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１＋ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２、ｖａｒ３：ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３、ｖａｒ４：ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４）に対して異なるサイズのＰＣＲ産物を生成するように設計されたプライマーを用いて行った。図４Ｂでは、−定量的ＲＴ−ＰＣＲの場合、ＲＮＡをＪｕｒｋａｔ細胞から単離し（ＰＭＡおよびイオノマイシンによる非活性化または活性化）、ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓキットを使用してｃＤＮＡに転写し、ＰｅｒｆｅＣＴ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＦａｓｔＭＩＸ  ＲＯＸを使用してリアルタイムＰＣＲを行った。
【図５】ＳＬＡＭＦ６  ＫＯ  Ｊｕｒｋａｔ細胞の生成。古典的ＳＬＡＭＦ６を欠くＪｕｒｋａｔ細胞は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集によって作製した。トランスフェクション後、古典的ヒトＳＬＡＭＦ６を欠く細胞を単一細胞選別によって選択し、コロニーの確立のために培養した。
【図６】古典的（ｖａｒ１）ＳＬＡＭＦ６−ノックアウト（ＫＯ）Ｊｕｒｋａｔ細胞の増強されたＴ細胞活性化。ＳＬＡＭＦ６を標的とするｓｇＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を使用して、５つの単一細胞Ｊｕｒｋａｔクローンを生成した。細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで４８時間活性化し、ＩＬ−２分泌を測定した。値は野生型と比較している。２つの実験の概要を示す。両側ｔ検定＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図７】ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１  ＫＯ  Ｊｕｒｋａｔ細胞の増強されたＴ細胞活性化は、残りのＳＬＡＭＦ６バリアントをサイレンシングすると逆転される。野生型Ｊｕｒｋａｔ細胞およびクローンＣ細胞に、エレクトロポレーションを使用してＳＬＡＭＦ６に対するｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ対照（ＱＩＡＧＥＮ）をトランスフェクトした。エレクトロポレーションの２４時間後、細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで４８時間活性化し、ＩＬ−２分泌を測定した。１元配置分散分析試験＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図８】ＳＬＡＭＦ６アイソフォームの略図。左のパネル：「ＳＬＡＭＦ６」古典的な全長アイソフォーム（ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１）。細胞外ドメイン、２２−２２６ａａ；Ｉｇ様Ｖ−型ドメイン、３５−１２０ａａ；Ｉｇ様Ｃ−型ドメイン、１３２−２０９ａａ；膜貫通ドメイン、２２７−２４７ａａ；細胞質ドメイン、２４８−３３１ａａ。中央パネル−「ＳＬＡＭＦ６Δ１７−６５」−３’でスプライスされたアイソフォーム（ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３）；右パネル−：「ＳＬＡＭ６ΔＥｘｏｎ２」総エクソン２スキップアイソフォーム（ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４）。
【図９Ａ−９Ｂ】図９Ａ〜図９Ｂ。ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３の可溶性エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６−Ｖ３）は、Ｔ細胞の活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を防止する。図９Ａでは、Ｐｍｅｌマウスの脾細胞を、それらの同族抗原とＩＬ２を用いてインビトロで増殖させ、ＩＬ−２、ｓｅＳＬＡＭＦ６−Ｖ３を添加した培地または培養液のみ（処理を行わない：「未処理」）でさらに４日間維持した。生存細胞％（アネキシンＶ−／ＰＩ−）は、フローサイトメトリーによって決定した。図９Ｂは、−生存細胞％を示す３点測定の平均値。両側ｔ検定＊＊ｐ＜０．０１。
【図１０】Ｔ細胞の共刺激。ヒトＰＢＭＣをｓｅＳＬＡＭＦ６−Ｖ３とともに３日間インキュベートした後、抗ＣＤ３抗体で一晩活性化した。培地へのＩＦＮ−γ分泌をＥＬＩＳＡで測定した。両側ｔ検定＊＊＊ｐ＜０．００１。
【図１１】ＥＬＩＳＡを用いたｓｅＳＬＡＭＦ６−Ｖ３の全長ｓｅＳＬＡＭＦ６−Ｆｃへの結合。ｓｅＳＬＡＭＦ６−ＦｃはＭａｘｉＳｏｒｂプレートにプレコートした。次いで、様々なＳＬＡＭファミリーメンバーからの可溶性エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６、ｓｅＳＬＡＭＦ６−Ｖ３、ｓｅＳＬＡＭＦ１、ｓｅＳＬＡＭＦ７、およびｓｅＳＬＡＭＦ８、全て６−ヒスチジンタグを含む）を添加した。検出には抗ヒスチジン抗体を使用した。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
本発明は、癌免疫療法、特に、ＳＬＡＭＦ６スプライスバリアントの発現および／または活性の調節を含む改善された治療様式モダリティに関する。より具体的には、本発明の実施形態は、養子Ｔ細胞移入療法、腫瘍細胞ワクチンおよび／またはポリペプチドベースの薬物を含む、ヒト対象の癌治療のための組成物および方法を提供する。
【００３８】
本発明は、部分的には、特定のヒトＳＬＡＭＦ６バリアントの発現および／または活性の差次的調節が改善された癌治療を提供するという驚くべき発見に一部基づいている。特に、様々なＳＬＡＭＦ６アイソフォームが、休止Ｔ細胞および活性化Ｔ細胞で同時に発現し、抗腫瘍免疫の観点から異なるおよび反対の生物学的効果さえも示すことが分かった。具体的には、細胞外ドメインの配列をコードするエクソン２の一部を欠くヒトＳＬＡＭＦ６のスプライスバリアント、すなわちＳＬＡＭＦ６バリアント３（ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３）がＴ細胞活性および抗腫瘍免疫に強力なアゴニスト効果を及ぼすことを、ここで初めて開示する。対照的に、古典的ヒトＳＬＡＭＦ６（バリアント１、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１）を含む他のＳＬＡＭＦ６バリアント、およびエクソン２のより大きな部分を欠くスプライスバリアント（バリアント４、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４）は、この後に詳述するように、著しく弱いアゴニスト効果を発揮するか、または下方制御効果を媒介して、結果的に抗腫瘍免疫を低下させる。
【００３９】
より具体的には、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を異常に発現するようにヒトメラノーマ細胞を操作すると、非トランスフェクション細胞に対するそれらの活性と比較して、抗メラノーマヒトＣＤ８＋Ｔ細胞活性が高まることが予期せず判明した。対照的に、他のＳＬＡＭＦ６バリアントの異常な発現はそのような増強をもたらさなかったか、またはさらには抗メラノーマ活性の低下をもたらした。さらに、驚くべきことに、遺伝子編集によるＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現の特異的下方制御は、正常なＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現レベルが維持されている間に、活性化刺激に対するＴ細胞応答の著しい増強をもたらすことが分かった。エクソン２における欠失を特徴とするものおよびそのような欠失を欠くものを含む、複数のＳＬＡＭＦ６バリアントの非特異的下方制御は、そのような増強をもたらさなかった。
【００４０】
本発明はさらに、ヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３）を含む単離されたポリペプチドを使用して行われた実験に一部基づいている。特に、ｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３は、マウスＴ細胞とヒトＴ細胞の両方において、Ｔ細胞の共刺激を提供するだけでなく、活性化誘導Ｔ細胞死を減少させるのにも有効であった。また、驚くべきことに、ｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１エクトドメインで同定された同型結合よりも高い親和性で単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１エクトドメインに結合することが見いだされた。
【００４１】
したがって、ＳＬＡＭＦ６は元々デュアル受容体として説明され、活性効果または阻害効果は、その細胞内チロシンスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）に起因していた。しかしながら、本開示は、受容体の細胞外部分がヒトＴ細胞における免疫応答の方向を決定することを予期せず実証している。特に、本発明は、ＳＬＡＭＦ６を発現する腫瘍のＴ細胞媒介性治療は、実質的なＳＬＡＭＦ６表面発現を欠く腫瘍の治療よりも効果的ではないかもしれないが、Ｔ細胞および／または腫瘍細胞におけるＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３の発現または活性の特異的増強により、治療効果の改善が提供されることを実証する。
【００４２】
したがって、本発明の実施形態は、癌の治療を必要とする対象の癌の治療のための方法に関する。これらの実施形態によれば、本発明の方法は、後にさらに詳述するように、例えば、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を標的とするＴ細胞刺激を増強するようにエクスビボでマニピュレートされたＴ細胞組成物、および／またはＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を選択的もしくは優先的に発現するように操作された細胞ワクチンを対象に投与することによって、前記対象にＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を標的とするＴ細胞刺激を提供することによって達成される。特定の理論または作用機序によって拘束されることを望むものではないが、細胞表面に発現したＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３分子（トランス）による、または単離された（可溶性、無細胞）ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインによるヒトＴ細胞の会合（結合）は、細胞内シグナル伝達を調節し、それによって前記Ｔ細胞を刺激する。様々な実施形態によれば、方法は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を標的とするＴ細胞刺激を提供するように、前記対象のＴ細胞上のＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３の選択的または優先的な会合を含む。好ましい実施形態によれば、前記方法は、実質的ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１を標的とするＴ細胞刺激を実質的に提供することなく、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を標的とするＴ細胞刺激を提供することを含む。他の実施形態において、方法は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３またはそのエクトドメインの投与（例えば、Ｔ細胞集団を細胞表面に発現したＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３または単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとインキュベートするかまたは別様に接触させることによる）を含み、それによってＴ細胞を刺激する。様々な実施形態によれば、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を標的とするＴ細胞刺激は、後にさらに詳述するように、例えば、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を標的とするＴ細胞刺激を増強するようにエクスビボでマニピュレートされたＴ細胞組成物、および／またはＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を選択的もしくは優先的に発現するように操作された細胞ワクチンを前記対象に投与することによって、提供される。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記刺激は、前記対象に単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン（またはその特定のアゴニスト）を投与し（または対象のＴ細胞と接触させる）、それによって前記対象の癌を治療することを含む。したがって、一態様では、対象に単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを投与し、それによって前記対象の癌を治療することを含む、癌の治療を必要とする対象の癌を治療するための方法が提供される。特定の実施形態において、前記方法は、前記対象に単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを投与することを含む。
【００４４】
別の態様では、癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインが提供される。一実施形態において、使用は、前記対象の癌を治療するのに有効な量の前記対象への投与を含む。別の実施形態において、使用は、前記対象のＴ細胞を、前記Ｔ細胞を増殖および／または活性化するのに有効な量の前記単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとエクスビボで接触させることと、得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することと、を含む。
【００４５】
他の実施形態によれば、本発明の治療法は、養子Ｔ細胞移入療法による癌治療を提供する。様々な実施形態において、治療は、前記対象にＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を標的とするＴ細胞刺激を増強するようにエクスビボでマニピュレートされたＴ細胞組成物を投与し、それによって前記対象の癌を治療することによって提供される。様々な実施形態において、マニピュレーションは、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を特異的に増強すること、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３活性を特異的に増強すること、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を特異的に低下させること、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００４６】
したがって、別の態様では、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に（本明細書では「差次的に」とも称される）発現するように操作されたＴ細胞を対象に投与することを含む、癌の治療を必要とする対象の癌を治療するための方法が提供される。
【００４７】
本発明の養子移入法の別の実施形態において、前記Ｔ細胞は自家性である。別の実施形態において、前記Ｔ細胞は同種であり、典型的には治療される対象と組織適合性である。他の実施形態において、前記Ｔ細胞は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、および操作されたＴ細胞株（例えば、キメラ抗原受容体を発現する）からなる群から選択される。別の実施形態において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態において、前記Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。さらに他の実施形態において、前記Ｔ細胞は、精製されたＣＤ８＋Ｔ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞である。
【００４８】
別の実施形態において、方法は、
ａ）対象から、または対象と組織適合性のあるドナーからＴ細胞を得ることと、
ｂ）細胞をエクスビボで調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現させることと、
ｃ）得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することと、を含む。
【００４９】
例えば、本明細書に開示および例示されているように、本発明の方法における使用に適したＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように調節されたＴ細胞集団を生成および選択する非限定的な手段が利用可能である。例えば、限定されないが、本明細書の実施例２は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３対ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１のｍＲＮＡ比が約１：１になるように増加されたＴ細胞集団の生成および選択を示しており、前記Ｔ細胞集団は、活性化に応答して平均４．５倍のＩＬ−２分泌の増加を示す（ＰＭＡおよびイオノマイシンによる、マニピュレートされていないＴ細胞と比較）。
【００５０】
さらに他の実施形態によれば、本発明の治療法は、腫瘍細胞ワクチン接種を使用する癌治療を提供する。したがって、他の実施形態において、前記活性化は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された（または別様にマニピュレートされた）腫瘍細胞ワクチンを前記対象に投与することを含む。例えば、ＳＬＡＭＦ６および／またはそのバリアントの実質的な発現を欠く腫瘍細胞（例えば固形腫瘍）は、外因性ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を発現するように操作され得るが、ＳＬＡＭＦ６および／またはそのバリアントを発現する腫瘍細胞（例えば造血器腫瘍）は、Ｔ細胞に関連して上述したようにマニピュレートされ得、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように、かつ／またはＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御する。そのような腫瘍細胞ワクチンは、前記対象への投与前の照射または別様の弱毒化を含む適切なプロトコルによって調製される。別の実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現する樹状細胞（ＤＣ）ワクチンの使用が企図される。そのようなＤＣワクチンには、対象への投与前に適切な腫瘍抗原が負荷され、典型的には、前記対象と組織適合性である。細胞ワクチンは、任意選択的にアジュバントまたは他の免疫調節因子と組み合わせて、適切な免疫プロトコルによって投与される。特定の実施形態において、腫瘍細胞ワクチンはメラノーマ細胞ワクチンである。
【００５１】
本発明の他の実施形態は、癌治療のための改善された細胞組成物に関する。様々な実施形態によれば、本発明は、養子移入および／またはワクチン接種に有用な細胞組成物を提供する。様々な実施形態において、本発明は、本明細書に詳述されるように、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された（または別様にマニピュレートされた）Ｔ細胞組成物および細胞ワクチンを提供する。他の実施形態において、本発明は、本明細書に詳述されるように、前記改善された細胞組成物およびワクチンを生成するための方法に関する。他の実施形態において、治療有効量のＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む、癌免疫療法用のための医薬組成物が提供される。
【００５２】
したがって、別の態様では、本発明は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された細胞集団を含む治療用細胞組成物を提供する。様々な実施形態において、組成物は、養子移入Ｔ細胞組成物、腫瘍細胞ワクチンおよびＤＣワクチンからなる群から選択される。一実施形態において、細胞集団はヒトＴ細胞集団であり、組成物は養子移入Ｔ細胞組成物である。別の実施形態において、細胞集団はヒト腫瘍細胞集団であり、細胞ワクチンは腫瘍細胞ワクチンである。特定の実施形態において、前記腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である。さらに別の実施形態において、細胞集団はヒトＤＣ集団であり、細胞ワクチンはＤＣワクチンである。別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている。別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。さらに別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御し、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を外因的に発現するように操作されている。
【００５３】
別の態様では、癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための、本明細書に記載のＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された細胞集団を含む治療用細胞組成物が提供される。一実施形態において、細胞集団はヒトＴ細胞集団であり、前記組成物は養子移入Ｔ細胞組成物であり、前記Ｔ細胞は、自家性であるか、または前記対象と組織適合性の同種Ｔ細胞である。別の実施形態において、前記Ｔ細胞は、対象の、または前記対象と組織適合性のあるドナーのエクスビボＴ細胞を調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現させることと、得られたＴ細胞を癌治療のための養子移入組成物として配合することと、を含む方法によって生成されている別の実施形態において、前記Ｔ細胞は、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとのインキュベーションによってさらに増殖および／または活性化されている。別の実施形態において、細胞集団はヒト腫瘍細胞集団であり、細胞ワクチンは腫瘍細胞ワクチンである。別の実施形態において、腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である。別の実施形態において、細胞集団はＤＣ集団であり、細胞ワクチンはＤＣワクチンである。
【００５４】
別の態様では、治療用細胞組成物を生成する方法であって、
ａ）Ｔ細胞、腫瘍細胞およびＤＣからなる群から選択される細胞集団を得ることと、
ｂ）細胞をエクスビボで調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現させることと、を含む、方法が提供される。
【００５５】
別の態様では、Ｎ’ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１シグナルペプチドに融合した、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを含む、キメラポリペプチド前駆体が提供される。一実施形態において、ポリペプチド前駆体は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する。別の実施形態において、前記ポリペプチド前駆体は、配列番号１９に示されるポリヌクレオチドによってコードされる。別の実施形態において、ポリペプチド前駆体をコードするポリヌクレオチドが提供される。特定の実施形態において、ポリヌクレオチド配列は、配列番号１９に示されるとおりである。別の実施形態において、ポリペプチド前駆体を哺乳動物発現系で発現させることと、得られたエクトドメインポリペプチドを単離することと、を含むプロセスによって作製される、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインが提供される。別の実施形態において、本発明は、癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための、本明細書に開示されるポリペプチド前駆体に関する。
【００５６】
ＳＬＡＭＦ６バリアント
一般に、ＳＬＡＭＦ６は、Ｎ’からＣ’の順序で次のドメインから構成される。
Ｉ．Ｎ末端シグナルペプチド、
ＩＩ．２つの保存された免疫グロブリン（Ｉｇ）様モチーフを含む細胞外部分（エクトドメイン）：Ｎ’Ｉｇ様Ｖ型ドメイン（ＩｇＶ、２層のβシート構造を有し、主に中性であるが極性の前面を有する）、およびＣ’Ｉｇ様Ｃ２型ドメイン（ＩｇＣ２、全体的なβ鎖トポロジーといくつかのジスルフィド結合を特徴とする）、
ＩＩＩ．らせん膜貫通ドメイン、ならびに
ＩＶ．ＳＬＡＭ関連タンパク質（ＳＡＰ）のＳＨ２ドメインと、関連するユーイング肉腫関連転写産物とのドッキング部位である免疫受容体チロシンベースのスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む、トポロジカル（細胞質）ドメイン。ＩＴＳＭモチーフは、活性化および阻害結合パートナーに対する重複した特異性を有するコンセンサス配列ＴｘＹｘｘＶ／Ｉ／Ｌを担持する。
【００５７】
古典的なヒトＳＬＡＭＦ６（例えば、アクセション番号Ｑ９６ＤＵ３、アイソフォーム１）では、シグナルペプチドは転写されたポリペプチドの１〜２１位に位置することが同定されており、エクトドメインは２２−２２６位に位置することが同定されており（ＩｇＶは３５〜１２０位に位置し、ＩｇＣ２は１３２〜２０９位に位置していた）、膜貫通ドメインは２２７〜２４７位に位置し、細胞質（細胞内）ドメインは２４８〜３３１位に位置していた。エクソン２は、１７〜１２７位のアミノ酸をコードする。
【００５８】
ヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１（前駆体、アクセション番号ＮＭ＿００１１８４７１４．１においても提供される）のアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＭＬＷＬＦＱＳＬＬＦＶＦＣＦＧＰＧＮＶＶＳＱＳＳＬＴＰＬＭＶＮＧＩＬＧＥＳＶＴＬＰＬＥＦＰＡＧＥＫＶＮＦＩＴＷＬＦＮＥＴＳＬＡＦＩＶＰＨＥＴＫＳＰＥＩＨＶＴＮＰＫＱＧＫＲＬＮＦＴＱＳＹＳＬＱＬＳＮＬＫＭＥＤＴＧＳＹＲＡＱＩＳＴＫＴＳＡＫＬＳＳＹＴＬＲＩＬＲＱＬＲＮＩＱＶＴＮＨＳＱＬＦＱＮＭＴＣＥＬＨＬＴＣＳＶＥＤＡＤＤＮＶＳＦＲＷＥＡＬＧＮＴＬＳＳＱＰＮＬＴＶＳＷＤＰＲＩＳＳＥＱＤＹＴＣＩＡＥＮＡＶＳＮＬＳＦＳＶＳＡＱＫＬＣＥＤＶＫＩＱＹＴＤＴＫＭＩＬＦＭＶＳＧＩＣＩＶＦＧＦＩＩＬＬＬＬＶＬＲＫＲＲＤＳＬＳＬＳＴＱＲＴＱＧＰＡＥＳＡＲＮＬＥＹＶＳＶＳＰＴＮＮＴＶＹＡＳＶＴＨＳＮＲＥＴＥＩＷＴＰＲＥＮＤＴＩＴＩＹＳＴＩＮＨＳＫＥＳＫＰＴＦＳＲＡＴＡＬＤＮＶＶ（配列番号１）。
【００５９】
ヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２は、配列番号１と比較して２６６位の単一アラニンの欠失によってＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１とは異なる。
【００６０】
ヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３（前駆体、ＮＭ＿００１１８４７１５．１）は、配列番号１と比較してアミノ酸（ａａ）１７〜６５の欠失によってＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１とは異なる。欠失は、シグナルペプチド（すなわち、ペンタペプチドＧＮＶＶＳ（配列番号２０））に存在するａａ１７〜２１と、エクトドメインに存在するａａ２２〜６５を含む。アクセション番号ＮＭ＿００１１８４７１５．１で示される前駆体配列は以下のとおりである：
ＭＬＷＬＦＱＳＬＬＦＶＦＣＦＧＰＶＰＨＥＴＫＳＰＥＩＨＶＴＮＰＫＱＧＫＲＬＮＦＴＱＳＹＳＬＱＬＳＮＬＫＭＥＤＴＧＳＹＲＡＱＩＳＴＫＴＳＡＫＬＳＳＹＴＬＲＩＬＲＱＬＲＮＩＱＶＴＮＨＳＱＬＦＱＮＭＴＣＥＬＨＬＴＣＳＶＥＤＡＤＤＮＶＳＦＲＷＥＡＬＧＮＴＬＳＳＱＰＮＬＴＶＳＷＤＰＲＩＳＳＥＱＤＹＴＣＩＡＥＮＡＶＳＮＬＳＦＳＶＳＡＱＫＬＣＥＤＶＫＩＱＹＴＤＴＫＭＩＬＦＭＶＳＧＩＣＩＶＦＧＦＩＩＬＬＬＬＶＬＲＫＲＲＤＳＬＳＬＳＴＱＲＴＱＧＰＥＳＡＲＮＬＥＹＶＳＶＳＰＴＮＮＴＶＹＡＳＶＴＨＳＮＲＥＴＥＩＷＴＰＲＥＮＤＴＩＴＩＹＳＴＩＮＨＳＫＥＳＫＰＴＦＳＲＡＴＡＬＤＮＶ（配列番号：１６）、
【００６１】
ヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４（前駆体、ＮＭ＿００１１８４７１６．１、配列番号１７）は、配列番号１と比較してａａ１７〜１２８の欠失によってＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１とは異なる。
【００６２】
したがって、本発明の実施形態において有用な、ヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３の単離されたエクトドメインのアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＫＳＰＥＩＨＶＴＮＰＫＱＧＫＲＬＮＦＴＱＳＹＳＬＱＬＳＮＬＫＭＥＤＴＧＳＹＲＡＱＩＳＴＫＴＳＡＫＬＳＳＹＴＬＲＩＬＲＱＬＲＮＩＱＶＴＮＨＳＱＬＦＱＮＭＴＣＥＬＨＬＴＣＳＶＥＤＡＤＤＮＶＳＦＲＷＥＡＬＧＮＴＬＳＳＱＰＮＬＴＶＳＷＤＰＲＩＳＳＥＱＤＹＴＣＩＡＥＮＡＶＳＮＬＳＦＳＶＳＡＱＫＬＣＥＤＶＫＩＱＹＴＤＴＫＭ（配列番号１８）。
【００６３】
本発明のさらなる実施形態において有用な、ヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３の単離されたエクトドメインのアミノ酸配列は以下のとおりである：
ＶＰＨＥＴＫＳＰＥＩＨＶＴＮＰＫＱＧＫＲＬＮＦＴＱＳＹＳＬＱＬＳＮＬＫＭＥＤＴＧＳＹＲＡＱＩＳＴＫＴＳＡＫＬＳＳＹＴＬＲＩＬＲＱＬＲＮＩＱＶＴＮＨＳＱＬＦＱＮＭＴＣＥＬＨＬＴＣＳＶＥＤＡＤＤＮＶＳＦＲＷＥＡＬＧＮＴＬＳＳＱＰＮＬＴＶＳＷＤＰＲＩＳＳＥＱＤＹＴＣＩＡＥＮＡＶＳＮＬＳＦＳＶＳＡＱＫＬＣＥＤＶＫＩＱＹＴＤＴＫＭ（配列番号１４）。
【００６４】
本明細書で使用される「エクトドメイン」という用語は、少なくともＩｇＶおよびＩｇＣ２ドメインを含む、ＳＬＡＭＦ６ポリペプチドの細胞外の表面露出部分を指す。典型的にかつ有利には、本発明の方法および組成物で使用されるＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインは、シグナルペプチド、膜貫通ドメインおよびトポロジードメイン等の、本明細書に記載される他のＳＬＡＭＦ６ドメインを実質的に除外する。そのような有利なポリペプチドは、本明細書において「単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン」と称される。単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインは、典型的にかつ好都合には、例えば、本明細書に記載されるような組換え法によって、合成的に作製される。換言すると、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインポリペプチドは、残留ＳＬＡＭＦ６配列（例えば、１−１０、好ましくは５以下のアミノ酸）を含み得るが、それらはインタクトなＳＬＡＭＦ６ポリペプチド（本明細書に記載の完全な機能的ドメイン等）にあった場合に機能する任意の追加のＳＬＡＭＦ６構造を欠く。単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインポリペプチドの他の例では、そのような残留ＳＬＡＭＦ６配列（例えば、最大約１０個のａａ）は、非連続的な方法で、つまり自然発生型ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３とは異なる順序または構成でポリペプチド内に配置される。そのような操作されたポリペプチドの非限定的な例は、以下にさらに詳細に記載されるキメラポリペプチド構築物によって表される。さらに、本発明の実施形態で言及される特に有利なＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインは、配列番号１と比較して、ａａ１７〜６５または１８〜６５を欠くが、ａａ６６〜１２８を保持する。
【００６５】
特定の実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインは、エピトープタグ（例えば、ポリヒスチジンタグ）および／または血漿半減期延長部分を含むがこれらに限定されない追加の外因性配列にコンジュゲートまたは融合され得る。哺乳動物発現系における組換え産生に適した単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインの例示的な配列は、本明細書において配列番号１５に示されている。コードされた配列は、本明細書の実施例３に記載されるように、発現されたポリペプチドの単離に有用なＮ’シグナルペプチド、ヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン、およびＣ’６−ヒスチジンタグを含む。
【００６６】
具体的には、本明細書に記載されるように、配列番号１５に示される（および配列番号１９に示されるポリヌクレオチドによってコードされる）ポリペプチドは、Ｎ’ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１シグナルペプチドに融合した単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを含むキメラポリペプチド前駆体である。本明細書の特定の実施形態においてさらに開示および例示されるように、哺乳動物発現系（ＨＥＫ２９３細胞）で発現させると、配列番号１５のポリペプチドをコードする構築物は、異種シグナルペプチドの一部を保持する単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを生じた。
【００６７】
本発明の実施形態において有用なポリペプチドおよびペプチド（例えば、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン）は、当該技術分野で既知の任意の組換えまたは合成方法を使用して単離または合成することができる。例えば、ペプチドまたはポリペプチド断片は、固相（例えば、Ｂｏｃまたはｆ−Ｍｏｃ化学）および液相合成法を含むがこれらに限定されない方法によって合成され得る。例えば、ペプチドは、Ｍｅｒｒｉｆｉｅｌｄの固相ペプチド合成法（１９６３，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８５，２１４９）によって合成することができる。代替として、ペプチドは、当該技術分野で周知の標準的な溶液方法を使用して、またはペプチド合成について当該技術分野で既知の任意の他の方法によって合成され得る。
【００６８】
ポリペプチドおよびペプチドは、組換え技術によって都合よく作製され得る。タンパク質およびペプチドを設計、発現および精製するための組換え法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇｓ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照）。核酸分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはＤＮＡもしくはＲＮＡのいずれかの誘導体を含み得る。ポリペプチドまたはペプチドをコードする単離された核酸配列は、その天然の供給源から、遺伝子全体（すなわち、完全）またはその一部として得ることができる。核酸分子は、組換えＤＮＡ技術（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅、クローニング）または化学合成を使用して作製することもできる。核酸配列は、天然の核酸配列およびそのホモログを含み、それには、限定されないが、ヌクレオチドが挿入、欠失、置換、および／または反転されているが、そのような修飾は、機能的産物をコードする核酸分子の能力に実質的に干渉しない、修飾された核酸配列が含まれる。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド配列は、タンパク質の遺伝暗号から推定できるが、いわゆる「ゆらぎの法則」によって与えられる、コドンの３番目の位置における古典的な塩基対合の例外の許容だけでなく、コードの縮重も考慮に入れなければならない。より多いまたはより少ないヌクレオチドを含むポリヌクレオチドは、同じまたは同等のタンパク質をもたらし得る。組換え産生法を使用して、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは酵母等の微生物の選択された宿主細胞は、ポリペプチドをコードする特定のＤＮＡ配列を含むハイブリッドウイルスまたはプラスミドＤＮＡベクターで形質転換され、ポリペプチドは、ＤＮＡ配列の転写および翻訳時に宿主において合成される。
【００６９】
別の態様では、本発明の方法は、対象から得られた細胞集団においてＳＬＡＭＦ６ｖａ３またはＳＬＡＭＦ６ｖａ３エクトドメインを含む単離されたポリペプチドを発現させることによって影響され得る（例えば、対象から細胞を単離し、該当するポリペプチドを発現することができるベクターを導入し、細胞を対象に再導入することによる）。ＳＬＡＭＦ６ｖａ３エクトドメインの発現に関して、ベクターは、ポリペプチドが対象で分泌され、対象のＴ細胞に接触できるように設計される。
【００７０】
所望の遺伝子産物を送達および発現するために使用される発現構築物またはベクターの調製は、当該技術分野で既知である。そのような構築物は、典型的には、当該技術分野で既知の調節配列または選択可能なマーカーを含む。核酸構築物（本明細書では「発現ベクター」とも称される）は、このベクターを原核生物、真核生物、または任意選択的にその両方（例えば、シャトルベクター）における複製および組み込みに適したものにする追加の配列を含み得る。さらに、典型的なクローニングベクターはまた、転写および翻訳開始配列、転写および翻訳ターミネーター、ならびにポリアデニル化シグナルを含み得る。
【００７１】
哺乳動物発現ベクターの例として、限定されないが、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／−）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／−）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、およびｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ−ＲＳＶおよびｐＢＫ−ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なｐＴＲＥＳ、ならびにそれらの誘導体が挙げられる。これらは、本明細書に記載される実施形態において有用な構築物のためのベクター骨格として役立ち得る。
【００７２】
組換えウイルスベクターは、水平感染および標的特異性等の利点を提供するため、本発明の遺伝子のインビボ発現に有用である。水平感染は、例えば、レトロウイルスの生活環に固有であり、単一の感染細胞が多くの子孫ビリオンを生成し、それが発芽して隣接する細胞に感染するプロセスである。その結果、初めはほとんどが元のウイルス粒子に感染していなかった大きな領域の細胞が急速に感染する。これは、感染病原体が娘子孫を通してのみ広がる垂直感染とは対照的である。水平方向に広がることができないウイルスベクターも作製され得る。この特徴は、局在化したいくつかの標的細胞のみに特異的遺伝子を導入することが所望の目的である場合に有用であり得る。
【００７３】
特定の例示的な実施形態において、本明細書に記載されるキメラポリペプチド前駆体を哺乳動物発現系で発現させ、得られたエクトドメインポリペプチドを単離することを含むプロセスによって作製される単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインは、本明細書に記載のその異種シグナルペプチド配列の最大１１個のＮ’ａａ酸残基を保持し得る（例えば、１〜１１個、１〜１０個、５〜１１個、または他の実施形態では５、６、７、または８個の残基）。いくつかの実施形態において、前記単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインは、少なくともペンタペプチドＧＮＶＶＳ（配列番号２０）を保持する。
【００７４】
細胞工学
特定の実施形態によれば、本発明は、細胞工学、ならびにＳＬＡＭＦ６アイソフォームの発現を差次的に変化させるように選択された細胞集団が修飾されるまたはマニピュレートされる組成物および方法に関する。特に、本発明の実施形態は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された細胞を用いる。ある特定の実施形態において、細胞集団は、Ｔ細胞、腫瘍細胞および樹状細胞（ＤＣ）からなる群から選択される。このような細胞は、いくつかの実施形態において、本明細書に詳述されるように、遺伝子工学または他の形態のエクスビボ調節を使用して作製される。
【００７５】
特定の実施形態において、細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。したがって、本発明の実施形態は、例えば、プラスミド、人工的に操作された制限酵素、メガヌクレアーゼを特異的にコードするプラスミド、または転写または転写後の遺伝子調節のためのツールを含むがこれらに限定されない工学ツールによる、遺伝子発現のゲノム編集、ゲノムサイレンシング、または翻訳後制御の使用を用いる。特定の実施形態において、アンチセンス分子、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）分子（例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）およびヘアピンＲＮＡ）および酵素的核酸分子（例えば、リボザイムおよびＤＮＡザイム）からなる群から選択されるツールの使用が企図される。他の特定の実施形態において、遺伝子編集剤（例えば、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）の使用が企図される。ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するためのそのような薬剤の使用に関する非限定的な例は、後述の実施例の項に提供される。
【００７６】
ＲＮＡ干渉は２段階のプロセスである。開始ステップと称される第１段階の間に、投入されたｄｓＲＮＡが２１〜２３ヌクレオチド（ｎｔ）の低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）に消化されるが、これはおそらく、ｄｓＲＮＡ（直接的に、または発現ベクター、カセット、もしくはウイルスを介して導入される）をＡＴＰ依存的に切断する、ｄｓＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼのＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーのメンバーであるＤｉｃｅｒの作用によると考えられる。連続的な切断事象により、ＲＮＡは、それぞれの鎖が２ヌクレオチドの３’オーバーハングを有する１９〜２１ｂｐの二本鎖（ｓｉＲＮＡ）に分解される。
【００７７】
エフェクター段階において、ｓｉＲＮＡ二重鎖がヌクレアーゼ複合体に結合して、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成する。ＲＩＳＣの活性化には、ｓｉＲＮＡ二重鎖のＡＴＰ依存的な巻き戻しが必要である。次いで、活性なＲＩＳＣは、塩基対形成相互作用によって相同な転写産物を標的化し、ｍＲＮＡを切断してｓｉＲＮＡの３’末端から１２ヌクレオチドの断片にする。切断の機序は依然として解明されていないが、研究により、各ＲＩＳＣが単一のｓｉＲＮＡおよびＲＮａｓｅを含むことが示されている。
【００７８】
先験的ｓｉＲＮＡを提供することにより、「開始ステップ」を排除することができる。ＲＮＡｉの顕著な効力のために、ＲＮＡｉ経路内での増幅ステップが示唆されている。増幅は、より多くのｓｉＲＮＡを生成したであろう投入されたｄｓＲＮＡのコピーによって、または形成されるｓｉＲＮＡの複製によって行うことができる。代替的または追加的に、ＲＩＳＣの複数の代謝回転事象によって増幅を達成することができる。
【００７９】
本発明での使用に適したＲＮＡｉ分子の合成は、以下のように達成することができる。初めに、核酸配列標的を、ＡＡジヌクレオチド配列について下流で任意選択的に走査する。各ＡＡの出現および３’に隣接する１９ヌクレオチドを、潜在的なｓｉＲＮＡ標的部位として記録する。次に、ＮＣＢＩサーバー（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／）から利用可能なＢＬＡＳＴソフトウェア等の任意の配列アライメントソフトウェアを使用して、潜在的な標的部位を適切なゲノムデータベース（例えば、ヒト、マウス、ラット等）と比較する。他のコード配列に有意な相同性を示す推定上の標的部位は除外する。
【００８０】
適格な標的配列をｓｉＲＮＡ合成のための鋳型として選択する。好ましい配列は低いＧ／Ｃ含量を含むものであり、これは、Ｇ／Ｃ含量が５５％より高いものと比較して、遺伝子サイレンシングの仲介により有効であることが証明されているためである。評価のために、標的遺伝子の長さに沿って、いくつかの標的部位が選択されることが好ましい。選択されたｓｉＲＮＡのより良好な評価のために、陰性対照を併せて使用することが好ましい。陰性対照ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡと同じヌクレオチド組成を含むが、ゲノムとの有意な相同性を欠くことが好ましい。したがって、任意の他の遺伝子に対して有意な相同性を全く示さない限り、ｓｉＲＮＡのスクランブルヌクレオチド配列が使用されることが好ましい。
【００８１】
アンチセンスオリゴヌクレオチドは、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡのコード鎖（センス鎖）に相補的（またはアンチセンス）な核酸である（マイナス鎖としても知られる）。アンチセンスオリゴ核酸は、典型的にはＲＮＡベースであるが、ＤＮＡベースでもあり得る。さらに、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、それらの安定性を高めるためにしばしば修飾される。これらの修飾は、当該技術分野で既知であり、限定されないが、オリゴヌクレオチド骨格の修飾、糖部分の修飾、または塩基の修飾を含む。また、これらの修飾には、一般に「ギャップのある」オリゴヌクレオチドと称される様々なＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドまたは構築物が含まれる。
【００８２】
理論に拘束されるものではないが、これらのアンチセンス分子のｍＲＮＡへの結合は、内因性ＲＮＡによるメッセージの分解を引き起こす二本鎖ＲＮＡのストレッチを誘導すると考えられている。代替的に、ＲＮＡからタンパク質を作る最中のリボソームは、形成される二本鎖ＲＮＡの領域に沿って移動できないため、進行が妨げられる。さらに、時折、オリゴヌクレオチドは、メッセージのプロモーター付近に結合するように特異的に設計され、これらの状況下で、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、メッセージの翻訳にさらに干渉し得る。
【００８３】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが機能する特定の機序に関係なく、細胞または組織へのそれらの投与により、特定のタンパク質をコードするｍＲＮＡの分解またはその翻訳の防止が可能になる。したがって、アンチセンス分子は、特定のタンパク質の発現および／または活性を低下させる。
【００８４】
特定のタンパク質に特異的に結合してその分解を媒介するアンチセンスオリゴ核酸を設計するためには、オリゴ核酸によって認識される配列がその特定のタンパク質に固有または実質的に固有であることが重要である。例えば、タンパク質全体にわたって頻繁に繰り返される配列は、特定のメッセージを特異的に認識して分解するオリゴ核酸の設計にとって理想的な選択ではない場合がある。当業者は、オリゴ核酸を設計し、そのオリゴ核酸の配列を、公的に利用可能なデータベースに寄託されている核酸配列と比較して、配列が特定のタンパク質に特異的または実質的に特異的であることを確認できる。
【００８５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドを生成する方法は、例えば、米国特許第７，０２２，８３２号、同第６，９７２，１７１号、同第６，２７７，９８１号、および米国特許出願公開第２００５／０２６１４８５号に見いだすことができる。
【００８６】
いくつかの実施形態において、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、当該技術分野で既知の方法により（例えば、エクソン２の）エクソンスキッピングを誘導し、それによりＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を下方制御するように設計され得る。
【００８７】
「酵素的核酸分子」または「酵素的オリゴ核酸」という用語は、基質結合領域において特定の遺伝子標的に対する相補性を有し、また、標的ＲＮＡを特異的に切断するように活性である酵素活性も有し、それによって標的遺伝子をサイレンシングする核酸分子を指す。相補的領域は、酵素的核酸分子の標的ＲＮＡへの十分なハイブリダイゼーションおよびその後の切断を可能にする。酵素的核酸という用語は、例えば、リボザイム、触媒ＲＮＡ、酵素ＲＮＡ、触媒ＤＮＡ、アプタザイムまたはアプタマー結合リボザイム、触媒オリゴヌクレオチド、ヌクレオザイム、ＤＮＡザイム、ＲＮＡ酵素と互換的に使用される。
【００８８】
いずれか特定の標的ＲＮＡを切断するリボザイムを設計する可能性により、リボザイムは基礎研究および治療用途の両方で貴重なツールとなった。治療において、リボザイムは、感染症疾患におけるウイルスＲＮＡ、癌における優性癌遺伝子、および遺伝的障害における特定の体細胞変異を標的とするために利用されてきた。リボザイムおよびリボザイム誘導体は、例えば、米国特許第５，４３６，３３０号、同第５，５４５，７２９号および同第５，６３１，１１５号に記載されている。
【００８９】
ゲノム編集は、１つ以上の細胞（対象内を含む）に存在する内因性染色体配列を編集することができる、例えば、標的エンドヌクレアーゼおよび一本鎖核酸を使用して修飾することができる方法である。ゲノム編集法は、ゲノム内の特定の領域での核酸配列の挿入、ゲノムからの特定の配列の切除、および／または特定のゲノム配列の新しい核酸配列との置換をもたらすことができる。例えば、また限定ではなく、ゲノム編集法は、ヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼを特定のゲノム配列に導くために、ゲノム内の特定の配列、例えば、融合遺伝子に関連する染色体切断点に相補的な、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を含むガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の使用を含むことができる。エンドヌクレアーゼの非限定的な例として、ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）が挙げられる。エンドヌクレアーゼは、標的ゲノム配列の切断をもたらすことができ、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）または相同組換えにより切断部位でのゲノムの修飾を可能にする。ゲノム編集方法の非限定的な例は、ＰＣＴ出願第ＷＯ２０１４／０９３７０１号に開示されており、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【００９０】
遺伝子発現を阻害するために使用されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の１つの非限定的な例であるＣＲＩＳＰＲｉは、米国特許出願公開ＵＳ２０１４／００６８７９７号に記載されている。ＣＲＩＳＰＲｉは、ＲＮＡ誘導型Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを利用して永続的な遺伝子破壊を誘導してＤＮＡの二本鎖切断を導入し、誤差が発生しやすい修復経路の引き金となってフレームシフト変異をもたらす。触媒作用のないＣａｓ９は、エンドヌクレアーゼ活性を欠いている。ガイドＲＮＡと共発現させると、転写伸長、ＲＮＡポリメラーゼ結合、または転写因子結合に特異的に干渉するＤＮＡ認識複合体が生成される。このＣＲＩＳＰＲｉ系は、標的遺伝子の発現を効率的に阻止する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子破壊は、標的遺伝子に特異的なガイドヌクレオチド配列、およびＣａｓエンドヌクレアーゼが細胞に導入され、Ｃａｓエンドヌクレアーゼが標的遺伝子に二本鎖切断を導入できるようにする複合体を形成したときに生じる。特定の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は発現ベクターを含む。他の実施形態において、Ｃａｓ発現ベクターはＣａｓ９エンドヌクレアーゼの発現を誘導する。Ｔ７、Ｃａｓ３、Ｃａｓ８ａ、Ｃａｓ８ｂ、ＣａｓｌＯｄ、Ｃｓｅｌ、Ｃｓｙｌ、Ｃｓｎ２、Ｃａｓ４、ＣａｓｌＯ、Ｃｓｍ２、Ｃｍｒ５、Ｆｏｋｌ、当該技術分野で既知の他のヌクレアーゼ、およびそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、他のエンドヌクレアーゼが使用されてもよい。
【００９１】
追加的または代替的に、細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている。特定の実施形態において、細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３（例えば、ヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３）を外因的に発現するように操作されている。したがって、本発明の実施形態は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を誘導または増強するために、プラスミドおよびウイルスベクターを含むがこれらに限定されない、本明細書に記載の発現構築物およびベクターの使用を用いる。
【００９２】
ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作された細胞では、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３の実質的な下方制御が発揮されていないことを理解されたい。同様に、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作された細胞では、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１の実質的な上方制御は発揮されない。したがって、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように操作された細胞は、典型的には、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３対ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１の発現比の増大によって特徴付けられる。そのため、いくつかの実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現の選択的な下方制御は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２の下方制御を伴い得る。
【００９３】
さらに他の実施形態において、本発明は、追加的または代替的に、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４発現を選択的に上方制御するために、本発明の組成物および方法で使用されるＴ細胞、腫瘍細胞および／またはＤＣを操作することを含む。さらに別の実施形態において、本発明は、追加的または代替的に、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４エクトドメインの投与を利用する。
【００９４】
別の態様では、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されたＴ細胞を対象に投与することを含む、癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法が提供される。
【００９５】
別の実施形態において、方法は、
ａ）対象から、または対象と組織適合性のあるドナーからＴ細胞を得ることと、
ｂ）細胞をエクスビボで調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御することと、
ｃ）得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することと、を含む。
【００９６】
別の態様では、本発明は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作された細胞集団を含む治療用細胞組成物を提供する。
【００９７】
他の実施形態において、調節はインビボで達成され得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を優先的に発現するように対象の細胞（例えば、Ｔ細胞、腫瘍細胞またはＤＣ）をインビボでマニピュレートすることを含む、癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法が提供される。様々な実施形態において、マニピュレーションは、遺伝子治療、ゲノム編集、エクソンスキッピング等を含むがこれらに限定されない、当該技術分野で既知の方法によって行われる。例えば、限定されないが、方法は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３の発現を誘導もしくは増強する発現ベクター、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１の発現を低下させる遺伝子編集剤（例えば、エクソン２を標的とするＣａｓ９／ｇＲＮＡ  ＲＮＰ）、および／またはＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１の発現を低下させるエクソンをスキップするオリゴヌクレオチド（エクソン２を標的とする）を対象に投与することによって行われ得る。
【００９８】
養子細胞療法
別の態様では、養子移入を必要とするレシピエント対象への養子移入に適した、本明細書に記載されるように調製されたＴ細胞組成物が提供される。本明細書で使用される場合、また別段の規定のない限り、用語「養子移入」は、以前に感作された免疫性物質（例えば、細胞または血清）がレシピエントに移入される受動免疫療法の形態を指す。「養子移入免疫療法」、「養子細胞療法」および「養子細胞免疫療法」という語句は、本明細書において互換的に使用され、癌または感染症疾患の発生または症状を緩和または改善するために、本発明のＴ細胞組成物等のエフェクター免疫担当細胞がそれを必要とする対象に投与（養子移入）される、治療または予防レジメンまたはモダリティを表す。
【００９９】
Ｔリンパ球（Ｔ細胞）は、免疫応答に関与する様々な異なる細胞型の１つである。Ｔ細胞の活性は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に関連してＴ細胞に提示される抗原によって調節される。次いで、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）がＭＨＣ−抗原複合体に結合する。一旦、抗原がＭＨＣと複合体を形成すると、ＭＨＣ−抗原複合体がＴ細胞上の特異的ＴＣＲによって結合され、それによってそのＴ細胞の活性を変化させる。抗原提示細胞によるＴリンパ球の適切な活性化には、ＴＣＲの刺激だけでなく、その共受容体の複合的かつ協調的な会合も必要である。
【０１００】
Ｔヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、形質細胞および記憶Ｂ細胞へのＢ細胞の成熟化、ならびに細胞障害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて他の白血球を助ける。これらの細胞は、その表面上にＣＤ４糖タンパク質を発現するため、ＣＤ４＋Ｔ細胞としても知られている。ヘルパーＴ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上に発現するＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されると活性化される。一旦、活性化されると、それらは急速に分裂し、活発な免疫応答を調節または補助するサイトカインと呼ばれるタンパク質を分泌する。
【０１０１】
細胞傷害性Ｔ細胞（ＴＣ細胞、またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与する。これらの細胞は、その表面上にＣＤ８糖タンパク質を発現するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞としても知られている。これらの細胞は、全ての有核細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩ分子に関連する抗原に結合することにより、その標的を認識する。
【０１０２】
以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に不可欠である。それらの主要な役割は、免疫反応の終盤にかけてＴ細胞媒介性の免疫を停止し、胸腺における負の選択のプロセスを回避した自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０１０３】
ＴＣＲは内在性膜タンパク質の複合体であり、特異的ＭＨＣ提示抗原認識による刺激およびクロノタイプ特異的α／βヘテロダイマーによる結合が、転写の活性化と、それに続く増殖およびエフェクター機能（ＣＤ８＋Ｔにおける細胞傷害活性およびＣＤ４＋Ｔ細胞におけるサイトカイン分泌等）とをもたらす。この活性化は、タンパク質のリン酸化、イノシトールリン酸の放出、および細胞内カルシウムレベルの上昇等の下流シグナル伝達経路に細胞外リガンド事象を関連付ける、以下に詳述する受容体複合体の他のサブユニットに関与する。
【０１０４】
ＣＤ３γ、δ、ε、およびζサブユニットの細胞内部分には、ＩＴＡＭ（免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ）と称される配列モチーフのコピーが含まれる。ＩＴＡＭは、タンパク質チロシンキナーゼ基質として、またリン酸化後、さらに他のキナーゼのＳＨ２ドメインの結合部位として機能する。活性化Ｔ細胞受容体へのプロテインキナーゼの動員の調節および機序には、キナーゼのＳｙｋファミリー（ＺＡＰ−７０）とＳｒｃファミリー（Ｌｃｋ）の両方のメンバーが関与している。
【０１０５】
上記で詳述したＴＣＲ刺激は、抗原特異的または抗原非特異的（ポリクローナル）であり得る。適切な抗原特異的ＴＣＲ活性化因子は、典型的には抗原提示細胞（ＡＰＣ）に関連して、ＭＨＣ分子に結合した抗原を含む。ポリクローナルＴＣＲ活性化因子は、特定の抗原の非存在下で、特異的ＴＣＲの会合に関連するシグナル伝達および転写活性化経路を開始することができる。適切なポリクローナルＴ細胞活性化因子は、Ｔ細胞受容体／ＣＤ３複合体、例えば本明細書に記載されるサブユニットを結合および架橋する抗体を含む。Ｔ細胞受容体を架橋する例示的な抗体として、ＨＩＴ３ａ、ＵＣＨＴ１およびＯＫＴ３モノクローナル抗体が挙げられる。刺激は、上記の機能的効果を誘発するように、当該技術分野で既知の量および条件下で提供される。ＴＣＲ刺激の様々な非限定的な例（抗原特異的およびポリクローナルの両方）は、後述の実施例に提供される。
【０１０６】
典型的には、養子細胞移入のための組成物は、ＴＣＲ刺激によりＴ細胞集団を活性化すること、および細胞を増殖させて投与のための治療有効量のエフェクターＴ細胞を得ることを含む方法によって調製される。このような方法は、限定されないが、急速増殖プロトコル（Ｒａｐｉｄ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ：ＲＥＰ）を含む。
【０１０７】
様々な実施形態において、ＴＣＲ刺激は、抗原非特異的（例えば、結合すると受容体を活性化するＣＤ３に特異的な抗体、例えばＯＫＴ３を使用して行われる）または抗原特異的（適切な抗原提示細胞および抗原を使用する）であり得る。癌治療に関連して、抗原特異的刺激は、典型的には、腫瘍関連抗原に対する刺激を用いる。「腫瘍関連抗原」（ＴＡＡ）という用語は、腫瘍または腫瘍細胞に関連する（それらによって運搬される、発現される、産生される、分泌される等）任意のタンパク質、ペプチド、または抗原を指す。腫瘍関連抗原は、腫瘍または腫瘍細胞（複数可）に（ほぼ）排他的に関連し得るが、健常な正常細胞には関連しないか、または健常な正常組織もしくは細胞と比較して腫瘍組織もしくは腫瘍細胞（複数可）において過剰発現し得る（例えば、２倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、１０００倍またはそれ以上）。より具体的には、ＴＡＡは、腫瘍細胞のＭＨＣ決定基によって（処理された形態で）提示されることが可能な抗原である。したがって、腫瘍関連抗原は、ＭＨＣ分子を発現する腫瘍または腫瘍細胞のみと関連している可能性が高い。周知のＴＡＡの非限定的な例は、ＭＡＲＴ−１、ｇｐ１００２０９−２１７、ｇｐ１００１５４−１６３、ＣＳＰＧ４、ＮＹ−ＥＳＯ、ＭＡＧＥ−Ａ１、チロシナーゼである。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、特にＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を刺激するために一般的に用いられる１つのアプローチは、Ｆｃ受容体保有アクセサリー細胞（フィーダー細胞）の存在下で、Ｔ細胞を可溶性抗ＣＤ３抗体とインキュベーションする、ＲＥＰと称されるアプローチである。この様式でＴ細胞に「提示」された抗体は、可溶性抗ＣＤ３単独または可塑性表面に固定化された抗ＣＤ３よりも効果的な増殖シグナルを生成する。癌の治療において、養子細胞療法は、典型的には、患者の腫瘍内に見られるＴ細胞（腫瘍浸潤リンパ球、ＴＩＬと称される）を回収することを含み、それを高濃度のＩＬ−２、抗ＣＤ３およびアロ反応性フィーダー細胞を用いてエクスビボで増殖することが推奨される。これらのＴ細胞は、次いで、ＩＬ−２の外因性投与とともに患者に戻され、抗癌活性をさらに高める。
【０１０９】
したがって、特定のさらなる有利な実施形態によれば、活性化および／または増殖は、フィーダー細胞の存在下で行われる。「フィーダー細胞」という用語は一般に、第２のタイプの細胞を維持および増殖させることができる環境を提供するために、第２のタイプの細胞と共培養される１つのタイプの細胞を指す。本発明の目的のために、この用語は、具体的には、増殖されるＴ細胞含有集団と典型的にはアロ反応性である、Ｆｃ受容体保有アクセサリー細胞を指す。換言すると、フィーダー細胞は、増殖されるＴ細胞含有集団と組織適合性である必要はなく、特定の有利な実施形態において、２つの集団は典型的にはＨＬＡ不適合である。本発明の実施形態で使用されるフィーダー細胞の典型的な例は、同種正常ドナーの末梢血単核細胞、ＰＢＭＣである。典型的かつ有利には、そのようなフィーダー細胞の使用は、例えば、本明細書に詳述されるように、抗原非特異的刺激抗体とのインキュベーションによって、抗原非特異的ＴＣＲ刺激と組み合わせて行われる。
【０１１０】
別の実施形態において、養子移入Ｔ細胞組成物は、照射されたＰＢＭＣ（増殖が不可能）を用いて調製される。例えば、ＰＢＭＣは、細胞を６０００ＲＡＤに曝露することにより、照射によって簡便に減弱され得る。別の実施形態において、養子移入Ｔ細胞組成物は、抗原提示細胞および抗原を担持する不活性粒子を含む人工抗原提示物を用いて調製され、抗原特異的刺激を提供する。
【０１１１】
様々な実施形態において、Ｔ細胞増殖は、少なくとも５日間、典型的には少なくとも６、７、または８日間行われ得る。典型的には、増殖は、最大約１６、１５、１４、１３、または１２日間、例えば５〜１５日間、例えば６〜１２日間、またはより典型的には８〜１５日間行われる。別の実施形態において、集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態において、Ｔ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。別の実施形態において、細胞はさらに遺伝子操作または修飾される（例えば、所望の抗原特異性を発揮するため）。例えば、別の実施形態において、細胞は、癌細胞または病原体（例えばウイルス）に対してそれらを再誘導するように予め設計されたＴＣＲを発現するように遺伝子操作されたリンパ球（例えばＣＴＬ等の精製Ｔ細胞）である。非限定的な例として、Ｔ細胞は、多くの固形腫瘍、例えば、滑膜肉腫に発現する抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１を標的とするＴＣＲを発現するように操作される。別の実施形態において、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現してそれらを癌細胞または病原体に再誘導するように遺伝子操作された末梢血単核細胞である。例えば、限定されないが、ＣＤ１９を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞は、急性リンパ芽球性白血病等のＢ細胞悪性腫瘍の治療に使用することができる。別の実施形態において、細胞は、それらの生物学的機能を増強する遺伝子を発現するように遺伝子操作された末梢血単核細胞である。例えば、限定されないが、そのような遺伝子は、膜結合サイトカインおよびサイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−２Ｒ）を含み得る。別の実施形態において、集団はＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。別の実施形態において、集団は、ＣＤ８＋Ｔ細胞とＣＤ４＋Ｔ細胞との組み合わせを含む。
【０１１２】
細胞組成物は、有効量のＴ細胞含有集団を含み得る。例えば、養子移入免疫療法に有効な量は、抗腫瘍応答等の有益な免疫応答を誘導または増強するのに十分な量であり、例えば、１０６〜１０１２個の細胞である。特にヒト対象のためのインビボ投与に適した細胞調製物は、薬学的に許容される賦形剤または希釈剤を含み得るが、そのような調製物は、病原体、毒素、発熱物質、ならびに薬学的に許容されると認識されていない任意の他の生物学的および非生物学的生物物質による混入が十分に回避されていることを理解されたい。例えば、限定されないが、養子移入免疫療法のためのＴ細胞は、２％ヒトアルブミンおよび任意選択的にＩＬ−２（例えば３００ＩＵ／ｍｌ）とともに滅菌生理食塩水を含む注射に適した緩衝液に都合よく懸濁され得る。
【０１１３】
特定の好ましい実施形態によれば、細胞組成物は、治療される対象と組織適合性である（例えば、自家細胞またはＭＨＣ  ＩＩ適合の同種細胞）。
【０１１４】
「組織適合性」という用語は、異なる個体間の組織の類似性を指す。組織適合性のレベルは、患者とドナーがどれだけ良好に適合しているかを示す。主要な組織適合性決定因子は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）である。潜在的なドナーと潜在的なレシピエントとの間でＨＬＡタイピングが行われ、２つのＨＬＡがいかに密接に適合しているかを決定する。本明細書で使用される「組織適合性」という用語は、ドナーとレシピエントとの間で６つ全てのＨＬＡ抗原（２つのＡ抗原、２つのＢ抗原、および２つのＤＲ抗原）が同じである実施形態を指す。
【０１１５】
しかしながら、ドナーとレシピエントが完全な適合を有しないにもかかわらず、他の実施形態において、２つ以上の抗原、例えば、６つのうちの５つの抗原で「不適合」である、または他の実施形態において、６つのうちの４つ、もしくは６つのうちの３つで不適合であるドナーおよびレシピエントが、本発明の特定の実施形態によって包含され得る。本明細書で使用される「実質的に組織適合性」という用語は、ＨＬＡ抗原６つのうち５つがドナーとレシピエントとの間で同じである実施形態を指す。
【０１１６】
細胞ワクチン
いくつかの実施形態によれば、本発明は、改善された腫瘍細胞ワクチンの生成および使用に関する。ワクチンおよび免疫原性組成物の調製において使用するための腫瘍細胞株は、周知の方法を使用して入手および調製され得る。確立された腫瘍細胞株、例えば、その全体が本明細書に組み入れられるＷＯ２０１２／１５６９６９に開示されているものが使用されてもよいか、または腫瘍生検から得られてもよい。例えば、細胞は、生検を化学的（酵素的）または物理的方法（破壊または濾過）によって破壊することによって得ることができる。細胞は、細胞懸濁液（新鮮細胞または凍結保存細胞）から得ることもできる。
【０１１７】
本発明の原理によれば、腫瘍細胞は、本明細書に記載されるように操作される。様々な実施形態において、操作またはマニピュレートされる腫瘍細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６および／またはそのバリアント（例えば、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１またはＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３）を最初に発現する。他の実施形態において、前記腫瘍細胞は、マニピュレーションの前にＳＬＡＭＦ６の実質的な発現を欠いている。例えば、ＳＬＡＭＦ６および／またはそのバリアントの実質的な発現を欠く腫瘍細胞（例えば固形腫瘍）は、外因性ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を発現するように操作され得るが、ＳＬＡＭＦ６および／またはそのバリアントを発現する腫瘍細胞（例えば造血器腫瘍）は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように、かつ／またはＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作され得る。別の特定の実施形態において、前記腫瘍細胞は、ＣＤ１３７を実質的に発現しない。
【０１１８】
細胞の成長を改善することが判明した場合、細胞を増殖するために使用される培地の成分のうち１つ以上が変更されてもよい。典型的には、精製された腫瘍細胞は、ワクチン接種の前に照射されるか、さもなければ減弱される。例えば、腫瘍細胞を洗浄して、５，０００〜３５，０００ラドで照射することができる。例えば、典型的なワクチンの調製のために、細胞は、（１１０Ｇｙまたは１７０Ｇｙまで）照射されてもよく、ＤＮＰとコンジュゲートされてもよく、また１０６〜１０９、典型的には約１−３＊１０７腫瘍細胞での皮下投与のために調製されてもよく、任意選択的に、ＢＣＧまたは当該技術分野で既知の他のアジュバントと混合される。限定されないが、完成品は、０．６ｍｌの体積のハンクス緩衝塩溶液（ＨＢＳＳ）に懸濁された、例えば１５００〜２０００万の照射されたＤＮＰ修飾メラノーマ細胞を含み得る。
【０１１９】
精製された腫瘍細胞は、短期または長期保存のために、適切な培地、賦形剤、溶液、または容器に入れることができる。前記保存は、細胞を冷蔵または冷凍環境に維持することを必要とする場合がある。腫瘍細胞は、凍結環境で保存する前に急速に凍結することができる。凍結サンプルは、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、エチレングリコール、スクロース、またはグルコースを含むがこれらに限定されない適切な凍結保存培地または化合物と接触させることができる。適切な培地、賦形剤、または溶液は、ハンクス塩溶液、生理食塩水、細胞増殖培地、または水を含み得るが、これらに限定されない。培地、賦形剤、または溶液は、滅菌されていてもいなくてもよい。
【０１２０】
培地、賦形剤、または溶液は、その後の診断もしくはマニピュレーションのためにサンプルを適切な状態に維持するため、または凝固を防止するために保存剤を含んでもよい。前記保存剤は、クエン酸塩、エチレンジアミン四酢酸、アジ化ナトリウム、またはチメルソル（ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）を含み得る。サンプルはグルタルアルデヒド、ホルムアルデヒド、またはメタノールを使用する等の当該技術分野で既知の任意の方法によって、保存前または保存中に固定することができる。容器は、カップ、蓋付きカップ、チューブ、滅菌チューブ、真空チューブ、シリンジ、ボトル、顕微鏡スライド、または任意の他の適切な容器を含むがこれらに限定されない、生体サンプルの保存および／または輸送に適した任意の容器であり得る。容器は、滅菌されていてもいなくてもよい。場合によっては、サンプルは、限定されないがＣｙｔｙｃ  ＴｈｉｎＰｒｅｐ、ＳｕｒｅＰａｔｈ、Ｍｏｎｏｐｒｅｐ等の、その後の細胞学的分析のための細胞の保存に適した市販の調製物に保存されてもよい。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、精製された照射腫瘍細胞は、免疫原性を高めるためにアジュバントで刺激される。アジュバントは、それ自体に特定の抗原効果を有することなく、免疫系を刺激してワクチンに対する反応を増加させることができる薬剤である。免疫学的アジュバントは、特定のワクチン抗原と組み合わせて使用すると、抗原特異的免疫応答を加速、延長、または増強するように作用し、特定の疾患に対する免疫増加を提供する任意の物質として定義される。アジュバントは、リポソーム、リポ多糖（ＬＰＳ）、抗原の分子ケージ、細菌細胞壁の成分、およびエンドサイトーシスされた核酸（二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、および非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド含有ＤＮＡ等）を含む、いわゆるＰＡＭＰと称される進化的に保存された分子の特定のセットを模倣することによってこのタスクを達成する。免疫系は、これらの特定の抗原性部分を認識するように進化してきたため、ワクチンと組み合わせたアジュバントの存在は、自然感染を模倣することによって樹状細胞（ＤＣ）、リンパ球、およびマクロファージの活性を増強することにより、抗原に対する自然免疫応答を高めることができる。さらに、アジュバントは病原性の任意の機能を超えて弱毒化されているため、宿主生物に対して独立した脅威をほとんどまたはまったくもたらさない。特定の実施形態において、細胞は、本明細書に記載されるように、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインでさらに刺激され、および／または組成物は、単離された可溶性ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインをさらに含む。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、ワクチンを生成するために使用される腫瘍細胞集団は、造血器腫瘍細胞集団（例えば、白血病、リンパ腫または骨髄腫の集団）であり得る。他の実施形態において、前記腫瘍細胞集団は、固形腫瘍細胞集団であり得る。他の実施形態において、前記腫瘍細胞集団は、癌腫細胞集団であり得る。例えば、限定されないが、前記腫瘍細胞集団は、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、子宮頸癌または結腸癌細胞を含むがこれらに限定されない固形腫瘍細胞集団であり得る。他の例示的な実施形態において、前記腫瘍細胞集団は、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、結腸癌または肺癌細胞を含むがこれらに限定されない癌細胞集団であり得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態において、前記腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である。
【０１２３】
本発明の組成物は、様々な方法で投与することができる。非限定的な例として、組成物は、静脈内に、もしくは腹腔内等の固形腫瘍の位置に隣接する体腔内に送達され得るか、または固形腫瘍内にもしくは隣接して直接注入され得る。特定の実施形態において、好ましい経路として、本発明の腫瘍ワクチン組成物は、リンパ内または静脈内注射によって、腫瘍に近接した皮下または皮内注射を介して投与され得る。
【０１２４】
注射用途に適した医薬形態は、滅菌された水溶液または分散液、および滅菌された注射溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末が含まれる。全ての場合において、形態は無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度まで流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌等の微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコール等）、それらの適切な混合物、および植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングの使用によって、分散液の場合には必要な粒子径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。
【０１２５】
樹状細胞ワクチン接種は、癌特異的Ｔ細胞依存性抗腫瘍免疫等のＴ細胞依存性免疫を誘導するように設計された免疫療法の形態であり、ＤＣを使用した耐久性のある完全な応答をもたらすことができる。ＤＣワクチン接種の重要なステップは、Ｔ細胞に対する疾患特異的抗原の効率的な提示である。ＤＣは、Ｔ細胞に抗原を捕捉、処理、および提示するそれらの能力によって、ワクチン接種の必要不可欠な成分である。活性化された（成熟した）抗原負荷ＤＣは、抗原特異的Ｔ細胞の、特有の機能およびサイトカインプロファイルを示すエフェクターＴ細胞への分化を開始する。「ＤＣ成熟」はさらに、ＤＣの未成熟な表現型から成熟した表現型への分化を指し、（１）抗原捕捉活性の低下、（２）表面ＭＨＣクラスＩＩ分子および共刺激分子の発現増加、（３）遊走を導くケモカイン受容体（例えば、ＣＣＲ７）の獲得、および（４）Ｔ細胞の分化を制御する異なるサイトカイン（例えば、インターロイキン１２［ＩＬ−１２］）を分泌する能力を含む、多様な細胞変化に関連している。いくつかの実施形態によれば、細胞は、治療される疾患の病因および／または病態に関連する抗原でパルスまたは負荷される。
【０１２６】
本発明のＤＣワクチンは、いくつかの実施形態において、少なくとも１つの癌関連抗原でパルスされた本発明のＤＣ細胞調製物を含み、前記ワクチンは、薬学的に許容される担体、賦形剤および／またはアジュバントをさらに含む。
【０１２７】
本明細書で使用される場合、単数または複数の抗原（例えば、腫瘍細胞溶解物等の腫瘍関連抗原）でＤＣに負荷を与えることに関連する「抗原負荷」または「抗原パルス」という用語は、ＤＣが抗原（複数可）を取り込み（例えば、貪食し）、かつ／または抗原（複数可）もしくはＤＣ細胞表面上のＭＨＣ分子に関連する抗原（複数可）由来のペプチドを発現するのを可能にするのに十分な条件下で、ＤＣと抗原（複数可）を接触させることを意味する。
【０１２８】
本明細書で使用される「抗原の食作用および／または発現を可能にするのに十分な条件」という表現は、適切な培地中で、免疫原の捕捉と、免疫系の他の細胞への前記免疫原のプロセシングおよび提示を可能にするのに十分な時間、樹状細胞をインキュベートすることを指す。
【０１２９】
細胞集団および組成物は、ヒトの治療において使用するための任意の便利な方法での投与のために配合され得る。ヒトへのインビボ投与のために、本明細書に開示される細胞および組成物は、薬学的に有用な組成物を調製するために使用される既知の方法に従って配合することができる。ＤＣは、単一の活性物質として、または薬学的に適切な希釈剤（例えば、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、保存剤（例えば、チメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、乳化剤、可溶化剤、アジュバントおよび／もしくは担体とともに、他の既知の活性物質（例えば、１つ以上の化学療法剤）と混合して組み合わせることができる。いくつかの実施形態において、細胞は、非経口経路による投与のために配合される。「非経口」という用語は、皮下注射、静脈内、筋肉内、大槽内注射、または注入技術を含む。腫瘍内注射、および直接臓器内注射（例えば、脾臓内または肝臓内注射）も含まれる。注射または注入技術のために、ＤＣは、限定されないが、ＰＢＳまたは抗凝固剤を含むＰＢＳ等の任意の適切な注射緩衝液に懸濁され得る。
【０１３０】
別の態様では、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作された細胞集団を含む細胞ワクチンを前記対象に投与することを含む、癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法が提供される。
【０１３１】
医薬組成物
他の実施形態において、本発明の方法で使用されるＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインおよびそのアゴニストは、任意選択的に薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤をさらに含む、医薬組成物の形態で提供される。
【０１３２】
前記組成物は、溶液、懸濁液、使用前に適切なビヒクルまたは希釈剤で再構成される凍結乾燥粉末、カプセル、錠剤、徐放性製剤等を含むがこれらに限定されない、患者への投与に適した任意の医薬形態であり得る。組成物は、好ましくは精製された形態の、本発明の治療有効量の薬剤と、医薬賦形剤と、を含み得る。本明細書で使用される場合、「医薬賦形剤」は、薬学的投与に適合する、溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤等、ならびにそれらの組み合わせを含む。これ以降、「治療的に許容される担体」および「薬学的に許容される担体」という語句は、互換的に使用されてもよく、生物に著しい刺激を引き起こさず、投与される化合物の生物学的活性および特性を抑制しない担体または希釈剤を指す。組成物はまた、補助的、追加的、または増強された治療的機能を提供する他の活性化合物を含んでもよい。別の実施形態において、組成物は、本質的にＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインまたはそのアゴニストと、１つ以上の医薬賦形剤とからなる。別の実施形態において、組成物は、精製されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン（またはそのアゴニスト）と、１つ以上の医薬賦形剤とからなる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１３３】
特定の実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインは、エピトープタグ（例えば、ポリヒスチジンタグ）および／または血漿半減期延長部分をさらに含む。例えば、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３ポリペプチドは、免疫グロブリンまたはその一部に融合またはコンジュゲートされ得る。他の半減期延長物質は、生物学的に適切なポリマーまたはコポリマー、例えば、ポリエチレングリコールまたはポリプロピレングリコール等のポリアルキレングリコール化合物を含む。他の適切なポリアルキレングリコール化合物は、限定されないが、以下の種類の家電または中性ポリマーを含む：デキストラン、ポリリジン、コロミン酸または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー、およびビオチン誘導体。
【０１３４】
本発明による半減期延長部分の他の例として、エチレングリコールのコポリマー、プロピレングリコールのコポリマー、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキサン、エチレン／無水マレイン酸コポリマー、ポリアミノ酸（例えば、ポリリジン）、デキストランｎ−ビニルピロリドン、ポリｎ−ビニルピロリドン、プロピレングリコールホモポリマー、プロピレンオキシドポリマー、エチレンオキシドポリマー、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、直鎖もしくは分岐グリコシル化鎖、ポリアセタール、長鎖脂肪酸、長鎖疎水性脂肪族基、免疫グロブリン軽鎖および重鎖、免疫グロブリンＦｃドメインもしくはその一部（参照、例えば、米国特許第６，６６０，８４３号）、ＦｃのＣＨ２ドメイン、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ））；例えば、米国特許第６，９２６，８９８号およびＵＳ２００５／００５４０５１；米国特許第６，８８７，４７０号）、トランスサイレチン（ＴＴＲ；例えば、ＵＳ２００３／０１９５１５４  Ａ１；２００３／０１９１０５６  Ａ１を参照）、またはチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が挙げられる。
【０１３５】
得られるポリペプチドまたはコンジュゲートは、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３が媒介する活性が、本明細書に記載されるように、実質的に維持されるように選択されることを理解されたい。
【０１３６】
様々な他の実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３特異的抗体等のＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３アゴニストの使用が企図される。本明細書で使用される「抗体（単数）」または「抗体（複数）」という用語は、抗体、好ましくはモノクローナル抗体またはその断片を指し、限定されないが、ヒト免疫グロブリン定常領域を有する全長抗体、モノクローナルＩｇＧ、一本鎖抗体、ヒト化モノクローナル抗体、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆ（ａｂ）断片、Ｆｖ断片、標識抗体、固定抗体および異種化合物とコンジュゲートした抗体を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。一実施形態において、抗体はモノクローナル抗体である。別の実施形態において、抗体はポリクローナル抗体である。別の実施形態において、抗体はヒト化抗体である。
【０１３７】
モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体を生成する方法は、当該技術分野で周知である。抗体は、いくつかの既知の方法のいずれか１つによって生成することができ、抗体分子のインビボ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング、または培養中の連続細胞株によるモノクローナル抗体分子の生成を利用することができる。これらは、限定されないが、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術、およびエプスタイン・バー・ウイルス（ＥＢＶ）ハイブリドーマ技術を含む。抗体をインビボで生成する従来の方法に加えて、当該技術分野で周知の方法によって、ファージディスプレイ技術を用いてインビトロで抗体を生成することができる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ  （Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．（１９９２−２０００），Ｃｈａｐｔｅｒ  １７，Ｓｅｃｔｉｏｎ  １７．１）。
【０１３８】
本発明の医薬組成物は、当該技術分野で周知のプロセスによって、例えば、従来の混合、溶解、造粒、粉砕、微粉砕、糖衣錠作製、研和、乳化、カプセル化、封入または凍結乾燥プロセスによって製造されてもよい。本発明の医薬組成物は、その意図される投与経路に適合するように配合される。投与を達成する方法は、当業者に既知である。組成物を配合するための適切な賦形剤および様式の例は、Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎによる「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」の最新版に記載されている。
【０１３９】
本発明による医薬組成物（例えば、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを含む）は、典型的には、注射または注入に適した液体製剤である。医薬組成物の投与の例として、経口摂取、吸入、静脈内および持続注入、腹腔内、筋肉内、腔内、皮下、皮膚、または経皮投与が挙げられる。ある特定の実施形態によれば、組成物は、病巣内（例えば、腫瘍内）投与に適している。他の実施形態において、組成物は静脈内投与に適している。
【０１４０】
例えば、生理食塩水、ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液を、特に注射液のための液体担体として用いることができる。適切な医薬賦形剤は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米、小麦、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール等を含む。
【０１４１】
静脈内投与に使用される溶液または懸濁液は、典型的には、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ，Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ，ＮＪ）、エタノール、またはポリオール等の担体を含む。全ての場合において、容易な注射針通過性のために、組成物は無菌かつ流動的でなければならない。適切な流動性は、多くの場合、レシチンまたは界面活性剤を使用して得ることができる。組成物はまた、製造および保存の条件下で安定でなければならない。微生物の予防は、抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサール等によって達成することができる。多くの場合、等張剤（糖）、多価アルコール（マンニトールおよびソルビトール）、または塩化ナトリウムが組成物中に含まれてもよい。組成物の長期吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを添加することにより達成することができる。必要な場合、組成物はまた、注射部位の痛みを和らげるためにリグノカイン等の局所麻酔薬を含んでもよい。一般に、成分は別々に、または単位投与剤型に一緒に混合されて、例えば、活性剤の量を示すアンプルまたはサシェ等の密閉容器中の凍結乾燥粉末または無水濃縮物として供給される。組成物が注入によって投与される場合、無菌の医薬品グレードの水または生理食塩水を含む輸液ボトルで分注することができる。組成物が注射によって投与される場合、投与前に成分が混合され得るように、注射用滅菌水または生理食塩水のアンプルが提供され得る。
【０１４２】
経口組成物は、不活性希釈剤または食用担体を含む。組成物は、ゼラチンに封入するか、または錠剤に圧縮することができる。経口投与の目的のために、活性剤を賦形剤とともに組み込み、錠剤、トローチ、またはカプセルに入れることができる。薬学的に適合する結合剤またはアジュバント材料を組成物に含めることができる。錠剤、トローチ、およびカプセルは、微結晶性セルロース、トラガカントガムもしくはゼラチン等の結合剤；デンプンもしくはラクトース等の賦形剤；アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、もしくはコーンスターチ等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムなどの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素等の流動促進剤；または甘味剤もしくは香剤を任意選択的に含んでもよい。
【０１４３】
組成物はまた、経粘膜または経皮経路によって投与されてもよい。例えば、Ｆｃ部分を含む抗体は、（Ｆｃ受容体を介して）腸、口、または肺の粘膜を通過することが可能であり得る。経粘膜投与は、ロゼンジ、鼻腔用スプレー、吸入器、または坐剤の使用を通して達成することができる。経皮投与も、当該技術分野で既知の軟膏、膏薬、ゲル、またはクリームを含む組成物の使用を通して達成され得る。経粘膜投与または経皮投与の場合、透過する障壁に適した浸透剤が使用される。吸入による投与の場合、抗体は、噴射剤（例えば、液体または気体）またはネブライザーを含む加圧容器またはディスペンサーからのエアロゾルスプレーの状態で送達される。組成物は、従来の結合剤およびトリグリセリド等の担体とともに、坐剤として配合することができる。
【０１４４】
皮内または皮下投与に使用される溶液または懸濁液は、典型的には、以下の成分の少なくとも１つを含む：水、生理食塩液、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒等の滅菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルパラベン等の抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩等の緩衝剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロース等の等張化剤。ｐＨは、酸または塩基で調整することができる。そのような調製物は、アンプル、使い捨て注射器、または複数回投与用バイアルに封入され得る。
【０１４５】
特定の実施形態において、ポリペプチド活性剤（例えば、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン）は、体からの急速な排出からポリペプチドを保護するための担体とともに調製される。生分解性ポリマー（例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸）がしばしば使用される。そのような製剤の調製方法は、当業者に知られている。リポソーム懸濁液も、薬学的に許容される担体として使用され得る。リポソームは、当該技術分野で既知の確立された方法に従って調製することができる（米国特許第４，５２２，８１１号）。他の特定の実施形態において、ＰＥＧ部分または糖脂質を含むリポソームは、血漿中滞留性を向上させるため、および／または肝臓取り込みを低減させるために有利に使用され得る。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、より大きなリポソーム（例えば、３００ｎｍ以上）が使用され、それらは脾臓による取り込みおよびクリアランスを優先的に媒介し、低減した肝臓クリアランスを有する。他の実施形態において、より小さなリポソーム（例えば、４０ｎｍ以下）が使用され、それらは肝臓の取り込みおよびクリアランスを優先的に媒介する。さらに他の実施形態において、４０〜３００ｎｍのリポソームが使用され、それらは血漿中滞留性を向上させ得る。他の実施形態において、リポソームはさらに、ＰＥＧ等のポリマーを含んでもよい。ＵＳ２０１１／１６０６４２は、肝臓および脾臓における蓄積が減少したペグ化リポソーム製剤を開示している。細網内皮系による取り込みを回避し、より長時間循環するように配合された様々なリポソームが、米国特許第６，２８４，２６７号に記載されている。
【０１４７】
さらに、本発明のＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインまたはアゴニストは、異種ポリペプチド、薬物、放射性ヌクレオチド、または毒素等の様々なエフェクター分子とともに投与され得る。したがって、いくつかの実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインまたはアゴニストは、癌治療、例えば、放射線照射または化学療法と組み合わせて（同時または連続的に）投与されてもよい。
【０１４８】
連続的および断続的な静脈内投与は、埋め込み型または外部ポンプ（例えば、ＩＮＦＵＳＡＩＤポンプ）を使用して達成することができる。そのようなポンプの使用および必要なパラメータに対する投与プロトコルの調整は、十分に当業者の能力の範囲内である。
【０１４９】
別の実施形態において、本発明のＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３ポリペプチドまたはアゴニストの投与または添加は、他の免疫調節因子、例えば、免疫細胞機能に対する修飾効果を示すシグナル伝達受容体標的化試薬の投与と組み合わせて（同時または連続的に）行われ得る。そのような試薬の例として、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、またはＰＤ−Ｌ１のアンタゴニストまたは阻害剤（抗体等）が挙げられる。市販のまたは臨床試験中の抗体の非限定的な例として、ＣＴＬＡ−４ブロッキング抗体（ＹＥＲＶＯＹ（商標）、ＢＭＳ、１〜３ｍｇ／ｋｇでのクリニックでの使用が承認されている）、ＰＤ−１ブロッキング抗体（ＫＥＹＴＲＵＤＡ（商標）、Ｍｅｒｃｋ、０．５〜２ｍｇ／ｋｇ；ＯＰＤＩＶＯ（商標）、ＢＭＳ、１〜３ｍｇ／ｋｇ）、およびＰＤ−Ｌ１標的化抗体（ＲＯＣＨＥ、臨床試験中）が挙げられる。
【０１５０】
他の態様によれば、本発明は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインまたはそのアゴニストを含むポリペプチドと、本発明の方法においてポリペプチドを使用するための指示書と、を含むキットに関する。
【０１５１】
別の実施形態において、組成物は、追加の抗原をさらに含むワクチンの形態で投与されない。別の実施形態において、組成物は、ワクチン接種に適合した治療レジメンによって投与されない。ワクチンおよびワクチン接種プロトコルは、当該技術分野で周知である。ワクチンは、典型的には、所望の免疫応答が誘発される１つ以上の抗原（例えば、弱毒化された癌細胞または腫瘍関連抗原）を含み、免疫応答を促進または増強するために使用される追加のアジュバント（例、ミョウバンまたは鉱油）を含むことが多い。
【０１５２】
「有効量」または「治療有効量」は、本発明の方法において有益な結果を発揮するのに十分な量を指す。より具体的には、治療有効量は、障害（例えば、癌）の症状を予防、緩和、もしくは改善する、または治療される対象の生存を延長するのに有効な活性成分（例えば、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインまたは細胞組成物）の量を意味する。したがって、本発明の単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインは、いくつかの実施形態において、抗腫瘍免疫の誘導または増強を必要とするヒト対象において抗腫瘍免疫を誘導または増強するのに有効な量で使用され得る。本明細書に示されるように、本発明の組成物および方法は、有利には増強された抗腫瘍活性を提供する。したがって、ある特定の実施形態において、本発明の組成物および方法に関連して使用される有効量は、従来の組成物および方法（例えば、ＳＬＡＭＦ６ｖａ１エクトドメインの投与）と比較して、最大５％、１０％、１５％、２０％、または最大５０％まで都合よく低減され得る。
【０１５３】
治療上の使用
別の態様では、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を差次的に発現するように操作されたＴ細胞を対象に投与することを含む、癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法が提供される。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている。別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。さらに別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御し、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように設計されている。別の実施形態において、前記Ｔ細胞は自家性である。別の実施形態において、前記Ｔ細胞は、前記対象と組織適合性の同種Ｔ細胞である。
【０１５４】
別の実施形態において、方法は、
ａ）対象から、または対象と組織適合性のあるドナーからＴ細胞を得ることと、
ｂ）細胞をエクスビボで調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を差次的に発現させることと、
ｃ）得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することと、を含む。
【０１５５】
別の実施形態において、Ｔ細胞は、前記対象への投与前に、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとのインキュベーションによってさらに増殖および／または活性化される。
【０１５６】
別の態様では、本発明は、癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を差次的に発現するように操作されたＴ細胞に関する。一実施形態において、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている。追加的または代替的に、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。様々な実施形態において、前記Ｔ細胞は、自家性であるか、または前記対象と組織適合性の同種Ｔ細胞である。別の実施形態において、前記Ｔ細胞は、対象の、または前記対象と組織適合性のあるドナーのエクスビボＴ細胞を調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を差次的に発現させることと、得られたＴ細胞を癌治療のための養子移入組成物として配合することと、を含む方法によって生成されている別の実施形態において、前記Ｔ細胞は、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとのインキュベーションによってさらに増殖および／または活性化されている（例えば、癌治療のための養子移入組成物としての配合前、または前記組成物を前記対象に養子移入する前）。
【０１５７】
別の態様では、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を差次的に発現するように操作された細胞集団を含む細胞ワクチンを前記対象に投与することを含む、癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法が提供される。一実施形態において、細胞集団は腫瘍細胞集団であり、細胞ワクチンは腫瘍細胞ワクチンである。特定の実施形態において、腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である。別の実施形態において、細胞集団は樹状細胞（ＤＣ）であり、細胞ワクチンはＤＣワクチンである。別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている。別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。さらに別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御し、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように設計されている。別の実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を外因的に発現するように操作されている。
【０１５８】
別の態様では、本発明は、癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を差次的に発現するように操作された細胞集団を含む治療用細胞組成物が提供される。一実施形態において、細胞集団は腫瘍細胞集団であり、細胞ワクチンは腫瘍細胞ワクチンである。特定の実施形態において、腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である。別の実施形態において、細胞集団は樹状細胞（ＤＣ）集団であり、細胞ワクチンはＤＣワクチンである。いくつかの実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている。追加的または代替的に、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。他の実施形態において、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を外因的に発現するように操作されている。
【０１５９】
別の態様では、本発明は、癌の治療を必要とするヒト対象の癌を治療するための方法であって、有効量の単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを、対象に投与するか、または前記対象のＴ細胞と接触させ、それによって前記対象の癌を治療することを含む、方法を含む。一実施形態において、方法は、前記対象に有効量の単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを投与することを含む。別の実施形態において、方法は、前記対象のＴ細胞を、前記Ｔ細胞を増殖および／または活性化するのに有効な量の単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとエクスビボで接触させることと、得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することと、を含む。
【０１６０】
別の態様では、本発明は、癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインに関する。一実施形態において、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインは、前記対象の癌を治療するのに有効な量での前記対象への投与によって使用するためのものである。別の実施形態において、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインは、前記対象のＴ細胞を、前記Ｔ細胞を増殖および／または活性化するのに有効な量の前記単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインとエクスビボで接触させることと、得られたＴ細胞を前記対象に養子移入し、それによって前記対象の癌を治療することとによって使用するためのものである。別の実施形態において、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインは、哺乳動物発現系で、Ｎ’ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１シグナルペプチドに融合した、単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを含むポリペプチド前駆体を発現させることと、得られたエクトドメインポリペプチドを単離することと、を含むプロセスによって作製されている。特定の実施形態において、ポリペプチド前駆体は、配列番号１５に示されるアミノ酸配列を有する。
【０１６１】
治療有効量（対象の癌を治療するのに有効な量等）の決定は、特に本明細書で提供される詳細な開示に照らして、十分に当業者の能力の範囲内である。本明細書に記載される活性成分の毒性および治療有効性は、細胞培養または実験動物におけるインビトロでの標準的な製薬手順によって決定することができる。これらのインビトロおよび細胞培養アッセイならびに動物試験から得られたデータは、ヒトに使用するための様々な投与量を処方する際に使用することができる。投与量は、用いられる剤形および利用される投与経路に応じて異なり得る。正確な処方、投与経路、および投与量は、患者の状態を考慮して個々の医師によって選択され得る（例えば、Ｆｉｎｇｌ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９７５），”Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｂａｓｉｓ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，”Ｃｈ．１，ｐ．１を参照）。
【０１６２】
例えば、限定されないが、（例えば、本明細書に開示されるキメラポリペプチド前駆体の発現により生成される）単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインの投与に適した用量範囲は、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ、典型的には０．０５ｍｇ／ｋｇ〜４０ｍｇ／ｋｇ、例えば、０．１〜２０、０．０５〜０．５、０．１〜１、１〜１０、２〜２０または１〜４０ｍｇ／ｋｇである。投与は、例えば、７〜９０日ごと、例えば、投与間は７、１０、１４、３０、６０または９０日であり得る。治療は、臨床的利益を維持し、治療プログラム全体の毒性を制限することを回避するために、担当医によって維持または調整されてもよいことを理解されたい。
【０１６３】
いくつかの例示的な実施形態において、Ｔ細胞（例えば養子移入療法のためのＴ細胞組成物）を増殖および／または活性化するのに有効な単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインの量は、例えば０．１〜４００μｇ／ｍｌ、典型的には１〜２００μｇ／ｍｌ、例えば、１０〜５０、２〜１００、または５０〜２００μｇ／ｍｌであり得る。例えば、限定されないが、癌の養子移入治療のためのＴ細胞組成物は、１ｎｇ／ｍｌ〜１μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜１００ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（例えば、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体）と、１〜２００μｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜５０μｇ／ｍｌの単離されたヒトＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインの存在下で、照射ＰＢＭＣ（フィーダー細胞として）で対象の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）２００：１〜１：３００、例えば、１：２００〜１：１００のＴＩＬ対ＰＢＭＣの比でインキュベートすることを含む、改変された急速増殖プロトコルによって生成され得る。インキュベーションは、５〜１５日、典型的には８〜１５日であり得る。
【０１６４】
様々な実施形態において、本発明の組成物および方法は、癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療において、例えば、限定されないが、非固形癌、例えば、全種類の白血病等の造血器腫瘍、例えば、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、マスト細胞白血病、有毛細胞白血病、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫および多発性骨髄腫の治療または阻害、ならびに頭頸部腫瘍、唇および口腔内の腫瘍、咽頭、喉頭、副鼻腔、大唾液腺、甲状腺、食道、胃、小腸、結腸、結腸直腸、肛門管、肝臓、胆嚢、肝外胆管、ファーター膨大部、膵外分泌部、肺、胸膜中皮腫、骨、軟部組織肉腫、皮膚の癌腫および悪性メラノーマ、乳房、外陰部、膣、子宮頸部、子宮体部、卵巣、卵管、妊娠性絨毛腫瘍、陰茎、前立腺、精巣、腎臓、腎盂、尿管、膀胱、尿道、眼瞼癌腫、結膜癌腫、結膜の悪性メラノーマ、ブドウ膜の悪性メラノーマ、網膜芽細胞腫、涙腺の癌腫、眼窩の肉腫、脳、脊髄、血管系、血管肉腫およびカポジ肉腫等の固形腫瘍の治療または阻害に使用され得る。ある特定の実施形態において、治療される癌は、メラノーマ、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、膀胱癌、肝臓癌、肺癌、前立腺癌、子宮頸癌または結腸癌からなる群から選択される。他の実施形態において、前記癌は、メラノーマ、卵巣癌、膵臓癌、乳癌、結腸癌または肺癌細胞からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態において、前記癌はメラノーマである。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、本発明の組成物および方法によって治療される前記癌は、ＳＬＡＭＦ６および／またはその１つ以上のバリアントの表面発現を特徴とする。例えば、癌は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４またはそれらの任意の組み合わせの表面発現を特徴としてもよく、各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態において、前記癌は、ＳＬＡＭＦ６および／またはその１つ以上のバリアントの実質的な（検出可能な）表面発現の欠如を特徴とする。例えば、癌は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４またはそれらの任意の組み合わせの実質的な表面発現の欠如を特徴としてもよく、各可能性は本発明の別個の実施形態を表す。例えば、限定されないが、癌がＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１の表面発現を特徴とする場合、前記癌の治療に有用な細胞ワクチン（例えば自家細胞ワクチン）は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１表面発現を低下させるように（および／またはＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を誘導するように）エクスビボで調節された対象の弱毒腫瘍細胞を含み得る。癌がＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１の実質的な表面発現を欠いている場合、前記腫瘍細胞ワクチンは、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を誘導または増強するようにエクスビボで調節された細胞集団を含み得る。
【０１６６】
別の態様では、本発明は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を差次的に発現するように操作された細胞集団を含む治療用細胞組成物を提供する。様々な実施形態において、組成物は、養子移入Ｔ細胞組成物、腫瘍細胞ワクチンおよびＤＣワクチンからなる群から選択される。一実施形態において、細胞集団はヒトＴ細胞集団であり、組成物は養子移入Ｔ細胞組成物である。別の実施形態において、細胞集団はヒト腫瘍細胞集団であり、細胞ワクチンは腫瘍細胞ワクチンである。特定の実施形態において、前記腫瘍細胞集団はメラノーマ細胞集団である。さらに別の実施形態において、細胞集団はヒトＤＣ集団であり、細胞ワクチンはＤＣワクチンである。別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御するように操作されている。別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。さらに別の実施形態において、Ｔ細胞は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３発現を選択的に上方制御し、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１発現を選択的に下方制御するように操作されている。別の実施形態において、細胞集団は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を外因的に発現するように操作されている。別の態様では、癌の治療を必要とするヒト対象の癌の治療に使用するための、本明細書に記載のＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を差次的に発現するように操作された細胞集団を含む治療用細胞組成物が提供される。
【０１６７】
別の態様では、治療用細胞組成物を生成する方法であって、
ａ）Ｔ細胞、腫瘍細胞およびＤＣからなる群から選択される細胞集団を得ることと、
ｂ）前記細胞をエクスビボで調節して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を差次的に発現させることと、を含む、方法が提供される。
【０１６８】
以下の実施例は、本発明のいくつかの実施形態をさらに詳しく示すために提示される。しかしながら、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１６９】
材料および方法
スプライスバリアントｍＲＮＡの検出
ｍＲＮＡは、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、ＪｕｒｋａｔＴ細胞、ＣＤ８＋腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）、およびＳＬＡＭＦ６トランスフェクトメラノーマ細胞から抽出した。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）は、以下のように、異なるＳＬＡＭＦ６バリアントに対して異なるサイズのＰＣＲ産物を生成するように設計されたプライマーを用いて行った。
フォワードプライマー−ＧＣＧＧＡＡＡＧＣＡＴＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧ（エクソン１、配列番号２）；
リバースプライマー−ＧＧＡＧＡＣＡＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＧＣＴＧ（エクソン３、配列番号３）。
【０１７０】
定量的ＲＴ−ＰＣＲでは、Ｊｕｒｋａｔ細胞（４ｘ１０６）を、ＰＭＡ（２００ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（３００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、２４ウェルプレートで４８時間３７°Ｃでインキュベートした。細胞を回収し、製造業者のプロトコルに従ってＧｅｎＥｌｕｔｅ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡキット（Ｓｉｇｍａ、ＲＴＮ７０）を使用してＲＮＡを単離した。次いで、ｑＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｑｕａｎｔａ、９５０４７−１００）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写した。
【０１７１】
リアルタイムＰＣＲは、ＰｅｒｆｅＣＴ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＦａｓｔＭＩＸ  ＲＯＸ（Ｑｕａｎｔａ、９５０７３−０１２）を使用して行った。使用したプライマーは以下のとおりである。
ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１＋ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２フォワード：ＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＴＴ（配列番号：４）；
ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１＋ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２リバース：ＧＧＧＧＴＴＡＡＧＣＴＧＣＴＴＴＧＴＧＡ（配列番号：５）；
ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４フォワード：ＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＴＴ（配列番号６）。
ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４リバース：ＣＡＧＡＴＧＧＡＧＣＴＣＡＣＡＧＧＴＣＡ（配列番号：７）；
ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３フォワード：ＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＴＴ（配列番号：８）；
ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３リバース：ＣＡＧＧＧＡＧＴＡＧＧＡＣＴＧＧＧＴＧＡ（配列番号９）。
【０１７２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミド
ＳＬＡＭＦ６特異的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ゲノム編集用の核酸構築物を生成するために、下の表１に指定される配列を、本質的には記載されているように（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１６、同所）、ベクターｐＳｐＣａｓ９（ＢＢ）−２Ａ−ＧＦＰ（Ａｄｄｇｅｎｅ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）にクローニングした。構築物１はエクソン２を標的としているため、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１のみに影響を与えるが、構築物２はシグナルペプチド領域を標的としているため、３つのバリアント全てに影響を与える。表１は、転写されたシングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）配列の配列を指定する。
【表１】
2021516668.tif 000002
【０１７３】
ＳＬＡＭＦ６ノックアウト（ＫＯ）Ｊｕｒｋａｔ細胞の生成
Ｊｕｒｋａｔ細胞をＲＰＭＩ−／−で２回洗浄し、１０ｘ１０６細胞／ｍｌのＲＰＭＩに再懸濁した。ＥＣＭ  ６３０  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｏｒ（ＢＴＸ  Ｈａｒｖａｒｄ）を２６０Ｖ、９７５μＦ、１５７５Ωで使用して、５×１０６Ｊｕｒｋａｔ細胞をＳＬＡＭＦ６−ＣＲＩＳＰＲプラスミド５μｇとともにＢｉｏｒａｄ  ０．４ｃｍキュベット中でエレクトロポレーションした。エレクトロポレーション後、完全ＲＰＭＩ培地に細胞を直ちに播種した。トランスフェクションの４８時間後、ＧＦＰを発現する細胞をソーティング（ＡＲＩＡ−ＩＩＩ  Ｓｏｒｔｅｒ）により選択した。ＮＴ−７抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、バリアント１および２を特異的に認識する）を使用した単一細胞選別によりヒトＳＬＡＭＦ６を欠く細胞を選択し、コロニーの確立のために培養した。
【０１７４】
メラノーマ細胞上での異常なＳＬＡＭＦ６発現
異なるＳＬＡＭＦ６バリアントをコードするＰＣＤＮＡ３．１＋／Ｃ−（Ｋ）ＤＹＫプラスミドをＧｅｎＳｃｒｉｐｔから購入した（クローンＩＤ：ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３、およびＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４のためのＯＨｕ０４７７２、ＯＨｕ０４７７４、ＯＨｕ０４７７６、それぞれ、アクセション番号ＮＭ＿００１１８４７１４．１、ＮＭ＿００１１８４７１５．１およびＮＭ＿００１１８４７１６．１）。リポフェクタミンを使用してヒトメラノーマ細胞をトランスフェクトした。Ｇ−４１８耐性メラノーマ細胞をサブクローニングし、安定にトランスフェクトされた細胞を実験に使用した。ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１の場合、細胞を抗ＮＴＢ−Ａ抗体（ＮＴ−７、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色し、ソートした（ＡＲＩＡ−ＩＩＩ）。陽性細胞を培養して実験に使用した。
【０１７５】
インターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）の分泌
腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ、１ｘ１０５）を、指示された標的メラノーマ細胞と１：１の比で一晩共培養した。別のタイプの実験では、健康なドナーから末梢血単核細胞を入手し、ｓｅＳＬＡＭＦ６−ｖａｒ３またはＩＬ−２の存在下で３日間インキュベートした。インキュベーション終了時に、細胞を洗浄し、抗ＣＤ３を結合させた１ｕｇ／ｍｌプレートで一晩活性化した。両方の実験で、馴化培地を回収し、製造業者のプロトコルに従ってＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）によりＩＦＮ−γ分泌を検出した。
【０１７６】
細胞内染色
ＴＩＬ（１ｘ１０５）を、指示された標的メラノーマ細胞と１：１の比で、３７℃で６時間共培養した。２時間後、ブレフェルジンＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１μｇ／ｍｌ）を４時間かけて加えた。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、抗ＣＤ８抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で染色した。固定および透過処理（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅプロトコル）に続いて、細胞内ＩＦＮ−γおよび腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）を室温で３０分間、抗ＩＦＮ−γおよび抗ＴＮＦ−α（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）で標識した。細胞を透過処理緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーに供した。
【０１７７】
インターロイキン２（ＩＬ−２）の分泌
野生型（ＷＴ）Ｊｕｒｋａｔ細胞または単一細胞ＫＯ  Ｊｕｒｋａｔ細胞（１ｘ１０５）を、ホルボール１２−ミリスタート１３−アセタート（ＰＭＡ、２００ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（３００ｎｇ／ｍｌを使用して、３７℃で４８時間活性化した。馴化培地を回収し、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ）を使用してＩＬ−２分泌を検出した。
【０１７８】
ＳＬＡＭＦ６結合ＥＬＩＳＡ
ＭａｘｉＳｏｒｂプレートを、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１のＦｃ融合エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６＿Ｆｃ、Ｃｒｅａｔｉｖｅ  Ｂｉｏｍａｒｔ、１μｇ／ｍｌおよび４℃）で一晩プレコートした。翌日、プレートを洗浄し、ＰＢＳＸ１中に１％ＢＳＡを含むブロッキング緩衝液を使用してブロックした。次に、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１（Ｐｒｏｓｐｅｃ、ｓｅＳＬＡＭＦ６）もしくはＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ／Ｂｏｎｏｐｕｓ、ｓｅＳＬＡＭＦ６−Ｖ３）から、またはＳＬＡＭＦ１、ＳＬＡＭＦ７もしくはＳＬＡＭＦ８（それぞれ、ｓｅＳＬＡＭＦ１、ｓｅＳＬＡＭＦ７およびｓｅＳＬＡＭＦ８）からの異なる濃度の単離されたエクトドメイン（６−ヒスチジンタグを含む）で、プレートを２時間インキュベートした。受容体結合エクトドメインポリペプチドの量は、ヒスチジンタグ（抗ＨＩＳ抗体）を標的とする、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体を使用して検出し、ＥＬＩＳＡリーダーを使用して定量化した。
【０１７９】
細胞生存率アッセイ
Ｐｍｅｌマウス  脾細胞を、１μｇ／ｍｌのｇｐ１００（２５−３３）ペプチドおよび３０Ｕ／ｍｌのＩＬ−２を使用して７日間活性化した。増殖後、脾細胞を洗浄し、カウントし、１ｘ１０５細胞をＩＬ−２もしくはｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３のいずれかを添加した培地で培養するか、または未処理のままにした（「未処理」）。さらに４日後、細胞を採取し、洗浄し、アネキシンＶアポトーシス検出キットで標識した。生存細胞（アネキシンＶおよびヨウ化プロピジウムの両方に陰性、アネキシンＶ−／ＰＩ−）をフローサイトメトリーにより分析した。
【０１８０】
実施例１ヒトメラノーマ細胞でのＳＬＡＭＦ６バリアント３の異常な発現は、抗メラノーマＴ細胞活性の増強をもたらす
ＳＬＡＭＦ６相互作用をトランスで（隣接する細胞間で）評価するために、またＳＬＡＭＦ６は、典型的には造血細胞でのみ発現されるため、ＳＬＡＭＦ６を異常に発現するメラノーマ標的細胞を生成した。このために、ＳＬＡＭＦ６バリアントを、上記のようにｐｃＤＮＡ３．１＋／Ｃ−（Ｋ）ＤＹＫプラスミド（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を使用して、メラノーマ株５２６ｍｅｌにおいて安定に発現させた。トランスフェクトされたメラノーマ細胞における異なるバリアントのｍＲＮＡ発現を図１に示す。
【０１８１】
古典的ＳＬＡＭＦ６（ｖａｒ１）は、同族（Ａ２＋）抗メラノーマＴＩＬを刺激する能力の低下を示した。対照的に、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３（５２６ｍｅｌ−ｖａｒ３）をトランスフェクトしたメラノーマ細胞は、ＩＦＮ−γ分泌（図２Ａ〜図２Ｂ）、ならびにＩＦＮ−γおよびＴＮＦαを発現するＣＤ８＋細胞の割合増加（図３Ａ〜図３Ｂ）によって決定されるように、抗メラノーマＴＩＬを刺激する能力の増加を予期せず実証した。図２Ａ〜図３Ｂにさらに見られるように、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４をトランスフェクトしたメラノーマ細胞は、これらの実験条件下で抗メラノーマＴＩＬを刺激する能力の増加を示さなかった。
【０１８２】
図２Ａ〜図２Ｂに記載される実験では、ｍｅｌ５２６株のＳＬＡＭＦ６をトランスフェクトしたメラノーマ細胞を、メラノーマ患者３人（６７６、４６３、２０９）のＨＬＡ適合腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）と一晩共培養した。培養中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡで測定した。値を親ｍｅｌ５２６と比較する。各ＴＩＬを２つの独立した実験で試験した（図２Ａに示す）。２つの実験における３つのＴＩＬからのデータを組み合わせた概要を図２Ｂに示す。
【０１８３】
図３Ａ〜図３Ｂに記載される実験では、ＴＩＬ２０９（１ｘ１０５）を、指示された標的メラノーマ細胞と１：１の比で、３７℃で６時間共培養した。２時間後、ブレフェルジンＡを加えた。インキュベーション終了時に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、抗ＣＤ８で染色した。固定および透過処理に続いて、細胞内ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを標識した。細胞を透過処理緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁し、フローサイトメトリーに供した。図３Ａ：ドットプロット、図３Ｂ：陽性細胞の割合を示す３点測定の概要。
【０１８４】
このように、本明細書に提示される結果は、ヒトメラノーマ細胞でのＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３の異常な発現は、非トランスフェクト細胞と比較して抗メラノーマヒトＣＤ８＋Ｔ細胞活性の増強をもたらす一方で、他のＳＬＡＭＦ６バリアントの異常な発現はそのような増強をもたらさなかったか、またはさらには抗メラノーマ活性の低下をもたらしたことを予期せず実証するものである。
【０１８５】
実施例２Ｔ細胞におけるＳＬＡＭＦ６バリアントの発現と、それがＴ細胞応答レベルに与える影響
リンパ球におけるＳＬＡＭＦ６バリアントの役割をさらに探求するために、異なるバリアントの発現を休止および活性化Ｔ細胞においてＲＴ−ＰＣＲによりアッセイした。図４Ａに見られるように、試験した全てのバリアントのｍＲＮＡは、Ｊｕｒｋａｔ（ＣＤ４＋）Ｔ細胞、抗メラノーマＴＩＬ（ＣＤ８＋）、およびＰＢＭＣを含む様々なＴ細胞集団において検出され、ｖａｒ１  ｍＲＮＡのレベルは全てのセルで最高であった。図４Ａ（中央パネル、Ｊｕｒｋａｔ細胞）および図４Ｂにさらに示されるように、全てのバリアントの発現レベルがＴ細胞の活性化後に増加した。
【０１８６】
１つのアミノ酸が異なるＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１とＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２の類似性に起因して、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２が鋳型として使用される場合、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１を同定するために使用されるプライマーも、同様のサイズを有するＰＣＲ産物を生成することに留意されたい。したがって、図４Ａ〜図４Ｂにおいて、ｖａｒ１はＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１およびＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２に対応するｍＲＮＡを示し、ｖａｒ３はＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３に対応するｍＲＮＡを示し、ｖａｒ４はＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４に対応するｍＲＮＡを示す。
【０１８７】
次に、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１を特異的に標的化するか（構築物１、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２も標的化する）、または全てのＳＬＡＭＦ６バリアント１〜４を非特異的に標的化するか（構築物２）のいずれかである２つのｓｇＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構築物を使用して、Ｊｕｒｋａｔ細胞の５つの単一細胞コロニーを生成した。トランスフェクション後、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１およびＳＬＡＭＦ６ｖａｒ２の表面発現を欠く細胞を単一細胞選別によって選択し、コロニーの確立のために培養した。図５に見られるように、両方の構築物がＳＬＡＭＦ６発現の低下によって特徴付けられるＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１−ノックアウトコロニーを生じた。
【０１８８】
次いで、得られたコロニーを、活性化刺激（ＰＭＡおよびイオノマイシン）に対する応答について機能的に試験した。図６に見られるように、コロニーの１つ（クローンＣ）からのリンパ球は、活性化に応答してＩＬ−２分泌において平均４．５倍の増加を示した。ＲＴ−ＰＣＲによってさらに確認されたように、構築物１によるトランスフェクションから得られたクローンＣは、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３ｍＲＮＡレベルの低下なしにＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１ｍＲＮＡレベルが低下することにより特徴付けられる（２つのバリアントのｍＲＮＡレベル比が約１：１になる）。
【０１８９】
構築物２によるトランスフェクションから生じたクローンＤおよびＥ、ならびにクローンＡおよびＢを含む残りのクローンでは、追加のＳＬＡＭＦ６スプライスバリアント（ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３および／またはＳＬＡＭＦ６ｖａｒ４）のｍＲＮＡ発現がさらに調節される。これらのクローンは、図６に示されるように、クローンＣによって示される活性化応答の強化を明らかにできなかったか、またはさらには活性化の大幅な低下を示した。
【０１９０】
これらの発見の特異性は、ＳＬＡＭＦ６特異的遺伝子サイレンシングを用いてさらに確認した。この目的のために、Ｊｕｒｋａｔ細胞（野生型およびクローンＣノックアウト細胞）に、エレクトロポレーション（２５０Ｖ、３００μＦ、１０００Ω、ＥＣＭ  ６３０  Ｅｌｅｃｔｒｏ  Ｃｅｌｌ  ＭａｎｉｐｕｌａｔｏｒＢＴＸ  ＨＡＲＶＡＲＤ  ＡＰＰＡＲＡＴＵＳ）を使用して、ＳＬＡＭＦ６に対するｓｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ対照（ＱＩＡＧＥＮ）をトランスフェクトした。ｓｉＲＮＡ配列は非コード領域３’から遺伝子までであるため、ＳＬＡＭＦ６の全てのバリアントをサイレンシングする。エレクトロポレーションの２４時間後、細胞をＰＭＡおよびイオノマイシンで４８時間活性化し、ＩＬ−２分泌を測定した。１元配置分散分析試験＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１。図７に見られるように、細胞を抗ＳＬＡＭＦ６  ｓｉＲＮＡで処理した場合、クローンＣで観察された活性化刺激に対する増強された応答は完全に逆転された。
【０１９１】
したがって、異なるＳＬＡＭＦ６バリアントの発現レベルは、Ｔ細胞の応答および活性化のレベルに影響を与える。ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３が下方制御されない場合のＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１の特異的下方制御は、Ｔ細胞活性化の増加をもたらすが、ＳＬＡＭＦ６バリアントの非特異的下方制御は、そのような増強はもたらさず、Ｔ細胞活性化の低下に関連している可能性がある。
【０１９２】
実施例３単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインの合成
以下の配列を発現プラスミド（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ／ＢｏｎＯｐｕｓ）にクローニングし、哺乳動物細胞株に組換え発現した。
核酸配列：ＡＴＧＴＴＧＴＧＧＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＴＴＴＧＴＣＴＴＣＴＧＣＴＴＴＧＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＴＧＴＡＧＴＴＴＣＡＧＴＡＣＣＣＣＡＴＧＡＡＡＣＣＡＡＡＡＧＴＣＣＡＧＡＡＡＴＣＣＡＣＧＴＧＡＣＴＡＡＴＣＣＧＡＡＡＣＡＧＧＧＡＡＡＧＣＧＡＣＴＧＡＡＣＴＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＣＴＡＣＴＣＣＣＴＧＣＡＡＣＴＣＡＧＣＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＴＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＧＧＣＴＣＴＴＡＣＡＧＡＧＣＣＣＡＧＡＴＡＴＣＣＡＣＡＡＡＧＡＣＣＴＣＴＧＣＡＡＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＴＴＡＣＡＣＴＣＴＧＡＧＧＡＴＡＴＴＡＡＧＡＣＡＡＣＴＧＡＧＧＡＡＣＡＴＡＣＡＡＧＴＴＡＣＣＡＡＴＣＡＣＡＧＴＣＡＧＣＴＡＴＴＴＣＡＧＡＡＴＡＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＧＣＴＣＣＡＴＣＴＧＡＣＴＴＧＣＴＣＴＧＴＧＧＡＧＧＡＴＧＣＡＧＡＴＧＡＣＡＡＴＧＴＣＴＣＡＴＴＣＡＧＡＴＧＧＧＡＧＧＣＣＴＴＧＧＧＡＡＡＣＡＣＡＣＴＴＴＣＡＡＧＴＣＡＧＣＣＡＡＡＣＣＴＣＡＣＴＧＴＣＴＣＣＴＧＧＧＡＣＣＣＣＡＧＧＡＴＴＴＣＣＡＧＴＧＡＡＣＡＧＧＡＣＴＡＣＡＣＣＴＧＣＡＴＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＣＴＧＴＣＡＧＴＡＡＴＴＴＡＴＣＣＴＴＣＴＣＴＧＴＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＡＡＧＣＴＴＴＧＣＧＡＡＧＡＴＧＴＴＡＡＡＡＴＴＣＡＡＴＡＴＡＣＡＧＡＴＡＣＣＡＡＡＡＴＧＧＧＡＴＣＴＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＣＡＣＴＧＡ（配列番号１９）。
アミノ酸配列：
ＭＬＷＬＦＱＳＬＬＦＶＦＣＦＧＰＧＮＶＶＳＶＰＨＥＴＫＳＰＥＩＨＶＴＮＰＫＱＧＫＲＬＮＦＴＱＳＹＳＬＱＬＳＮＬＫＭＥＤＴＧＳＹＲＡＱＩＳＴＫＴＳＡＫＬＳＳＹＴＬＲＩＬＲＱＬＲＮＩＱＶＴＮＨＳＱＬＦＱＮＭＴＣＥＬＨＬＴＣＳＶＥＤＡＤＤＮＶＳＦＲＷＥＡＬＧＮＴＬＳＳＱＰＮＬＴＶＳＷＤＰＲＩＳＳＥＱＤＹＴＣＩＡＥＮＡＶＳＮＬＳＦＳＶＳＡＱＫＬＣＥＤＶＫＩＱＹＴＤＴＫＭＧＳＨＨＨＨＨＨ（配列番号１５）。
【０１９３】
配列には、Ｎ’シグナルペプチド（太字）およびＣ’６−ヒスチジンタグが含まれる。ポリペプチドをＨＥＫ２９３細胞において発現させたところ、トランスフェクションの５日後に採取された細胞で分泌発現が観察された。得られたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインポリペプチドを、キレートＳＦＦ（Ｎｉ）カラムで精製した。
【０１９４】
配列番号１５で示されるＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン前駆体は、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメイン配列に融合した異種シグナルペプチド（すなわち、下線付きのペンタペプチド配列をさらに含むことによりＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３のシグナルペプチドとは異なるＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１のシグナルペプチド）を含むキメラポリペプチドであるため、作製および単離された、成熟した処理済みの組換えＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインポリペプチドを質量分析によってさらに特徴付けた。この系で単離された成熟ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３は、少なくともペンタペプチドＧＮＶＶＳ（配列番号２０）を含むシグナルペプチドの一部、および異種シグナルペプチド配列の最大１１個のアミノ酸を保持することが分かった。したがって、配列番号１５のアミノ酸１０〜２１に由来する配列は、単離されたエクトドメイン調製物中に少なくとも一部保持された。本明細書で「ｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３」と称される、この単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３エクトドメインを、この後に詳述するように、治療薬としてさらに特徴付けた。
【０１９５】
実施例４．ｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３は、Ｔ細胞の活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）を防止し、活性化されたＴ細胞を共刺激するように作用する
次いで、単離されたｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３ポリペプチドの機能特性を決定した。この目的のために、実施例３に記載されるエクトドメインポリペプチド（実施例および図全体を通してｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３またはｓｅＳＬＡＭＦ６−Ｖ３として示されている）を、長期Ｔ細胞活性化および二次アポトーシス（活性化誘導細胞死、ＡＩＣＤ）を測定するように設計された系においてマウス脾細胞とインビトロでインキュベートした。図９Ａおよび図９Ｂに見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３はＡＩＣＤを有意に減少させ、１週間の激しい活性化後のＴ細胞生存を改善した。ヒトＰＢＭＣを使用して行った実験で、ヒトＴ細胞について同様の結果が得られた。図９Ａ〜図９Ｂにさらに見られるように、マウス脾細胞におけるＡＩＣＤの防止にｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３が与える効果は、ＩＬ−２の効果と比較して著しく顕著であった。
【０１９６】
次に、ｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３がＴ細胞の共刺激を提供する能力を、３日間の活性化プロトコルにおいてアッセイした。この目的のために、ヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３とともに３日間インキュベートした後、抗ＣＤ３抗体を（ＰＢＳ中１μｇ／ｍｌで１時間）プレコートしたプレート上で一晩活性化させた。図１０に見られるように、ｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３によって共刺激されたＴ細胞は、活性化前の段階でｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３を投与されなかったＴ細胞「未処理」）と比較して、活性化後に増加したレベルのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）を分泌した。
【０１９７】
最後に、ＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１エクトドメインへのｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３の結合（Ｆｃコンジュゲート、ｓｅＳＬＡＭＦ６−Ｆｃ）を、ＥＬＩＳＡを用いて検証した（図１１）。図１１に見られるように、ＳＬＡＭファミリーの他のメンバーが結合したかどうかにかかわらず、ｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３は、ｓｅＳＬＡＭＦ６−Ｆｃに用量依存的に結合することができた。さらに、驚くべきことに、ｓｅＳＬＡＭＦ６ｖａｒ３が、単離されたＳＬＡＭＦ６ｖａｒ１エクトドメイン（ｓｅＳＬＡＭＦ６）で同定された同型結合よりも高い親和性でｓｅＳＬＡＭＦ６−Ｆｃに結合することが実証された。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年10月21日(2020.10.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
2021516668.tif 000018
2021516668.tif 000019
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