(57)【要約】無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定のためのデバイス、方法、およびシステムが本明細書に提供される。候補薬剤をスクリーニングして、候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節するかどうかを判定する方法も、本明細書に提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定のための方法であって、
（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることであって、
前記プライマー対が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記標的核酸の第１の部分に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、前記標的核酸の第２の部分に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域に隣接する、接触させることと、
（ｂ）リガーゼを添加して、前記第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することと、
（ｃ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、前記第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして前記第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、
（ｄ）前記１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下で埋め込んで、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、
（ｅ）ライゲーションを可能にする条件下で、前記バーコード配列を有する前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、前記一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、前記ライゲーションが、前記第３のオリゴヌクレオチドおよび前記第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、
（ｆ）ステップ（ｅ）を何度も繰り返すことと、
（ｇ）前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、前記無傷組織内の前記細胞における前記標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記一対のプライマーが、試料と接触する前に加熱することによって変性する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記細胞が、細胞の集団内に存在する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞の集団が、複数の細胞型を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記固定され、透過処理された無傷組織を前記接触させることが、前記一対のプライマーを同じ標的核酸にハイブリダイズさせることを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的核酸が、ＲＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記標的核酸が、ＤＮＡである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、パドロックプローブを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの３’末端を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域に隣接する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が、前記標的核酸の特定のためのバーコード情報を提供する、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記固定され、透過処理された無傷組織を前記接触させることが、異なる標的核酸に対する特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせることを含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、閉じた核酸環として提供され、リガーゼを添加する前記ステップが、省略される、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が、溶液中のライゲーションを最小限に抑えるように選択される、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記リガーゼを添加することが、ＤＮＡリガーゼを添加することを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記核酸分子が、アミン修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記アミン修飾されたヌクレオチドが、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分修飾を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記埋め込むことが、前記１つ以上のアンプリコンをアクリルアミドと共重合させることを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記埋め込むことが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを清澄化することを含み、前記標的核酸が、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンに実質的に保持される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記清澄化することが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから複数の細胞成分を実質的に除去することを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記清澄化することが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから脂質を実質的に除去することを含む、請求項２７または２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、塩基を解読するように構成されている、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第４のオリゴヌクレオチドが、解読された塩基をシグナルに変換するように構成されている、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記シグナルが、蛍光シグナルである、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、配列決定が進むにつれて、エラーの蓄積を排除することを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記撮像することが、共焦点顕微鏡法、２光子顕微鏡法、明視野顕微鏡法、無傷組織拡張顕微鏡法、および／またはＣＬＡＲＬＩＴＹ（商標）最適化光シート顕微鏡法（ＣＯＬＭ）を使用して前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像することを含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記無傷組織が、薄い切片である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記無傷組織が、５〜２０μｍの厚さを有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、４回以上生じる、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、５回以上生じる、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記無傷組織が、厚い切片である、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記無傷組織が、５０〜２００μｍの厚さを有する、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、６回以上生じる、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、７回以上生じる、請求項３９または４０に記載の方法。
【請求項４３】
候補薬剤をスクリーニングして、前記候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節するかどうかを判定する方法であって、
（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることであって、
前記プライマー対が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドおよび前記第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、前記第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補領域が、前記標的核酸の第１の部分に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補領域に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補領域に相補的であり、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補領域が、前記標的核酸の第２の部分に相補的であり、前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補領域に隣接する、接触させることと、
（ｂ）リガーゼを添加して、前記第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することと、
（ｃ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、前記第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして前記第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、
（ｄ）前記１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下で埋め込んで、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、
（ｅ）ライゲーションを可能にする条件下で、前記バーコード配列を有する前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、前記一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、前記ライゲーションが、前記第３のオリゴヌクレオチドおよび前記第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、
（ｆ）ステップ（ｅ）を何度も繰り返すことと、
（ｇ）前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、前記無傷組織内の前記細胞における前記標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、
（ｈ）前記標的核酸の遺伝子の発現のレベルを検出することであって、前記少なくとも１つの候補薬剤の不在下における前記標的核酸の発現のレベルに対する、前記少なくとも１つの候補薬剤の存在下における前記標的核酸の発現のレベルの変化が、前記少なくとも１つの候補薬剤が前記無傷組織内の前記細胞における前記核酸の遺伝子発現を調節することを示す、検出することと、を含む、方法。
【請求項４４】
前記一対のプライマーが、前記試料と接触する前に加熱することによって変性する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞が、細胞の集団内に存在する、請求項４３または４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞の集団が、複数の細胞型を含む、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記固定され、透過処理された無傷組織を前記接触させることが、前記一対のプライマーを同じ標的核酸にハイブリダイズさせることを含む、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的核酸が、ＲＮＡである、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記標的核酸が、ＤＮＡである、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、パドロックプローブを含む、請求項４３〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、請求項４３〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、請求項４３〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、請求項４３〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、請求項４３〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第２の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、請求項４３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、請求項４３〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの５’末端を含む、請求項４３〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの３’末端を含む、請求項４３〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第１の相補性領域が、前記第２のオリゴヌクレオチドの前記第３の相補性領域に隣接する、請求項４３〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記第２のオリゴヌクレオチドの前記バーコード配列が、前記標的核酸の特定のためのバーコード情報を提供する、請求項４３〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記固定され、透過処理された無傷組織を前記接触させることが、異なる標的核酸に対する特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせることを含む、請求項４３〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記第２のオリゴヌクレオチドが、閉じた核酸環として提供され、リガーゼを添加する前記ステップが、省略される、請求項４３に記載の方法。
【請求項６４】
オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が、溶液中のライゲーションを最小限に抑えるように選択される、請求項４３〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記リガーゼを添加することが、ＤＮＡリガーゼを添加することを含む、請求項４３〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記核酸分子が、アミン修飾されたヌクレオチドを含む、請求項４３〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記アミン修飾されたヌクレオチドが、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分修飾を含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記埋め込むことが、前記１つ以上のアンプリコンをアクリルアミドと共重合させることを含む、請求項４３〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記埋め込むことが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを清澄化することを含み、前記標的核酸が、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンに実質的に保持される、請求項４３〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記清澄化することが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから複数の細胞成分を実質的に除去することを含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記清澄化することが、前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから脂質を実質的に除去することを含む、請求項６９または７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記第３のオリゴヌクレオチドが、塩基を解読するように構成されている、請求項４３〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記第４のオリゴヌクレオチドが、解読された塩基をシグナルに変換するように構成されている、請求項４３〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記シグナルが、蛍光シグナルである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、配列決定が進むにつれて、エラーの蓄積を排除することを含む、請求項４３〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記撮像することが、共焦点顕微鏡法、２光子顕微鏡法、明視野顕微鏡法、無傷組織拡張顕微鏡法、および／またはＣＬＡＲＩＴＹ（商標）最適化光シート顕微鏡法（ＣＯＬＭ）を使用して前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像することを含む、請求項４３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記無傷組織が、薄い切片である、請求項４３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記無傷組織が、５〜２０μｍの厚さを有する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、４回以上生じる、請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、５回以上生じる、請求項７７または７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記無傷組織が、厚い切片である、請求項４３〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記無傷組織が、５０〜２００μｍの厚さを有する、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、６回以上生じる、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを前記接触させることが、７回以上生じる、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８５】
前記検出することが、フローサイトメトリー、配列決定、プローブ結合および電気化学的検出、ｐＨ変化、ＤＮＡタグに結合した酵素によって誘発される触媒作用、量子絡み、ラマン分光法、テラヘルツ波技術、および／または走査電子顕微鏡法を実行することを含む、請求項４３〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記フローサイトメトリーが、質量サイトメトリーまたは蛍光活性化フローサイトメトリーである、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記検出することが、顕微鏡法、走査質量分析、または他の撮像技術を実行することを含む、請求項４３〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記検出することが、シグナルを判定することを含む、請求項４３〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記シグナルが、蛍光シグナルである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
システムであって、
撮像チャンバおよびポンプを含むデバイスと、
請求項１〜４２のうちのいずれか１つを実行するように構成されたプロセッサユニットと、を備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１８年４月９日に出願された米国仮特許出願第６２／６５５，０５２号、２０１８年６月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／６８７，４９０号、および２０１９年２月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／８０８，１５９号の利益を主張し、それらの出願は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
生物学的組織において、機能の多様性は、部分的には、細胞特異的遺伝子発現の複雑さを介して形態の多様性から生じ、これは、各組織の独自の三次元の分子生体構造および細胞特性を定義する。サブ細胞分解能での遺伝子発現の空間マッピングのためのインサイチュ転写学的ツールが出現し、それは、多重化されたインサイチュＲＮＡハイブリダイゼーションおよびインサイチュＲＮＡ配列決定の両方を含む、これらの組織構造−機能関係を探ることに適用可能であり得る。現在のインサイチュ配列決定アプローチは、高密度で複雑な組織環境において酵素反応を実施する課題に直面し、現在、効率の低さに苦しんでいるが、そのような組織内配列決定の潜在的価値は、巨大であり得、遺伝子同一性をエンコードするために多数のポリヌクレオチドプローブを利用するハイブリダイゼーションに基づく多重化／読み出しと比較して、配列決定は、単一ヌクレオチド分解能で動作し、したがって、本質的に、はるかに大きな情報を提供する。しかしながら、現在の配列決定方法は、哺乳類の脳などの組織におけるスループットに必要な感度、忠実度、およびスケーラビリティの根本的な制限により、まだ無傷組織の３Ｄ体積には適用可能ではない。例えば、哺乳類の脳は、差次的遺伝子発現および回路特異的生体構造の両方から生じる機能に不可欠な多様性とともに、細胞型の複雑なタペストリーで構成される。細胞分解能で３Ｄ位置的生体構造を保持しながら、高含量の遺伝子発現情報を取得することは、困難であり、脳構造と機能の統合的理解を制限してきた。本開示は、上記の問題に対処し、関連する利点を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定のためのデバイス、方法、およびシステムが本明細書に提供される。候補薬剤をスクリーニングして、候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節するかどうかを判定する方法も、本明細書に提供される。
【０００４】
本開示は、無傷組織における細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定のための方法を提供し、この方法は、（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることであってプライマー対が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、標的核酸の第１の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、標的核酸の第２の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域に隣接する、接触させることと、（ｂ）リガーゼを添加して、第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することと、（ｃ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、（ｄ）１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下で埋め込んで、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、（ｅ）ライゲーションを可能にする条件下で、バーコード配列を有する１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、ライゲーションが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、（ｆ）ステップ（ｅ）を何度も繰り返すことと、（ｇ）１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、を含む。ある場合には、一対のプライマーは、試料と接触させる前に加熱することによって変性する。ある場合には、細胞は、集団に存在する。ある場合には、細胞の集団は、複数の細胞型を含む。
【０００５】
本開示はまた、候補薬剤をスクリーニングして、候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節するかどうかを判定する方法を提供し、この方法は、（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることであってプライマー対が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、標的核酸の第１の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、標的核酸の第２の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域に隣接する、接触させることと、（ｂ）リガーゼを添加して、第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することと、（ｃ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、（ｄ）１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下で埋め込んで、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、（ｅ）ライゲーションを可能にする条件下で、バーコード配列を有する１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、ライゲーションが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、（ｆ）ステップ（ｅ）を何度も繰り返すことと、（ｇ）１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、（ｈ）標的核酸の遺伝子の発現のレベルを検出することであって、少なくとも１つの候補薬剤の不在下における標的核酸の発現のレベルに対する、少なくとも１つの候補薬剤の存在下における標的核酸の発現のレベルの変化が、少なくとも１つの候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節することを示す、検出することと、を含む。ある場合には、一対のプライマーは、試料と接触させる前に加熱することによって変性する。ある場合には、細胞は、細胞の集団に存在する。ある場合には、細胞の集団は、複数の細胞型を含む。
【０００６】
本明細書に記載される方法に従って使用されるデバイスも提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法の自動化のための流体システムが提供され、連続動作を可能にする。いくつかの実施形態では、システムは、流体デバイスと、本明細書に記載される方法を実行するように構成されたプロセッサとを備える。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１Ａ】３Ｄ組織環境内の空間トランスクリプトミクスのためのインサイチュＲＮＡ配列決定を含む、本明細書に記載されるような、空間分解された転写アンプリコン読み出しマッピング（ＳＴＡＲｍａｐ）方法の概略図を描写する。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図１Ｄ】同上。
【図１Ｅ】同上。
【図２Ａ】高品質のＲＮＡ撮像およびマウス脳インスタンス化のための、分子内ライゲーションを介した核酸の特異的増幅（ＳＮＡＩＬ）プローブを描写する。
【図２Ｂ】同上。
【図２Ｃ】同上。
【図２Ｄ】同上。
【図２Ｅ】同上。
【図２Ｆ】同上。
【図２Ｇ】同上。
【図２Ｈ】同上。
【図２Ｉ】同上。
【図３Ａ】ＳＴＡＲｍａｐにおけるバックグラウンド低減およびアンプリコン固定化のためのヒドロゲル組織化学（ＨＴＣ）を描写する。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【図３Ｅ】同上。
【図３Ｆ】同上。
【図３Ｇ】同上。
【図３Ｈ】同上。
【図４Ａ】ＳＴＡＲｍａｐの低バックグラウンドエラー補正インサイチュ配列決定構成要素である、動的アニーリングおよびライゲーションによる配列決定（ＳＥＤＡＬ）の態様を描写する。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】同上。
【図４Ｄ】同上。
【図４Ｅ】同上。
【図４Ｆ】同上。
【図４Ｇ】同上。
【図４Ｈ】同上。
【図４Ｉ】同上。
【図４Ｊ】同上。
【図４Ｋ】同上。
【図４Ｌ】同上。
【図５Ａ】本明細書に記載される方法を使用して一次視覚皮質内の細胞型を分類することを描写する。
【図５Ｂ】同上。
【図５Ｃ】同上。
【図５Ｄ】同上。
【図５Ｅ】同上。
【図５Ｆ】同上。
【図５Ｇ】同上。
【図５Ｈ】同上。
【図５Ｉ】同上。
【図５Ｊ】同上。
【図５Ｋ】同上。
【図５Ｌ】同上。
【図５Ｍ】同上。
【図５Ｎ】同上。
【図６Ａ】ＳＴＡＲｍａｐのためのデータ処理パイプラインを描写する。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図７Ａ】抑制性および興奮性サブクラスタのＳＴＡＲマッピングのための遺伝子発現情報を描写する。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図７Ｄ】同上。
【図８Ａ】非神経性細胞型のサブクラスタ化を描写する。
【図８Ｂ】同上。
【図８Ｃ】同上。
【図９Ａ】本明細書に記載される方法を使用した、細胞クラスタ化の再現性を伴うバッチ効果の欠如を描写する。
【図９Ｂ】同上。
【図９Ｃ】同上。
【図９Ｄ】同上。
【図９Ｅ】同上。
【図９Ｆ】同上。
【図９Ｇ】同上。
【図１０Ａ】本明細書に記載される方法を使用した、活性調節された遺伝子（ＡＲＧ）の細胞型特異的調節を検出し、定量化する行動経験を描写する。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１１Ａ】本明細書に記載される方法を使用した、暗い試料およびＡＲＧならびに光試料およびＡＲＧの発現情報を描写する。
【図１１Ｂ】同上。
【図１１Ｃ】同上。
【図１２】薄い組織切片および厚い組織切片についてのＳＴＡＲｍａｐの実験フローチャートを描写する。
【図１３Ａ】視覚皮質体積における細胞型の３次元構築物を描写する。
【図１３Ｂ】同上。
【図１３Ｃ】同上。
【図１３Ｄ】同上。
【図１３Ｅ】同上。
【図１３Ｆ】同上。
【図１３Ｇ】同上。
【図１３Ｈ】同上。
【図１３Ｉ】同上。
【図１４Ａ】多数のマーカー遺伝子の発現である、連続ＳＥＤＡＬ読み出しを描写する。
【図１４Ｂ】同上。
【図１５Ａ】マウス一次視覚皮質における短距離抑制性クラスタの２Ｄ最近傍分析およびクロスメソッド検証を描写する。
【図１５Ｂ】同上。
【図１５Ｃ】同上。
【図１６Ａ】ＳＴＡＲｍａｐのスケーラビリティを描写する。
【図１６Ｂ】同上。
【図１６Ｃ】同上。
【図１６Ｄ】同上。
【図１６Ｅ】同上。
【図１７】ＳＴＡＲｍａｐで特定されたニューロン型と、公開された単一細胞ＲＮＡ配列決定結果との相関関係を描写する。
【図１８Ａ】本明細書に記載される方法を使用した、内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）の細胞型サブクラスタの遺伝子発現分析を描写する。
【図１８Ｂ】同上。
【図１８Ｃ】同上。
【図１８Ｄ】同上。
【図１８Ｅ】同上。
【図１８Ｆ】同上。
【図１９Ａ】本明細書に記載される方法を使用した、ｍＰＦＣの細胞クラスタの再現性および空間的組織を描写する。
【図１９Ｂ】同上。
【図１９Ｃ】同上。
【図２０Ａ】本明細書に記載される方法を使用した、６ラウンドの配列決定におけるマウス海馬細胞培養物中の１０２０個の遺伝子の分析を描写する。
【図２０Ｂ】同上。
【図２０Ｃ】同上。
【図２１Ａ−１】本明細書に記載される方法を使用した、マウス原発視覚皮質内の１０２０個の遺伝子の遺伝子発現分析を描写する。
【図２１Ａ−２】同上。
【図２１Ｂ−１】同上。
【図２１Ｂ−２】同上。
【図２１Ｃ−１】同上。
【図２１Ｃ−２】同上。
【図２１Ｃ−３】同上。
【図２２Ａ】本明細書に記載される方法を使用した、マウス原発視覚皮質内の１０２０個の遺伝子の再現性および測定値のクロスメソッド比較を描写する。
【図２２Ｂ】同上。
【図２２Ｃ】同上。
【図２２Ｄ】同上。
【図２３Ａ】薄い組織切片および厚い組織切片についてのＳＴＡＲｍａｐの実験フローチャートおよび損失積算を描写する。
【図２３Ｂ】同上。
【図２３Ｃ】同上。
【図２３Ｄ】同上。
【図２４Ａ】本明細書に記載される方法を実行するために使用される例示的な流体システムのグラフィックレイアウトを描写する。
【図２４Ｂ】同上。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定のためのデバイス、方法、およびシステムが本明細書に提供される。候補薬剤をスクリーニングして、候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節するかどうかを判定する方法も、本明細書に提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、空間分解転写アンプリコン読み出しマッピング（ＳＴＡＲｍａｐ）と称される、脳および他の臓器における３Ｄ無傷組織ＲＮＡ配列決定のための開示された方法は、改良されたライゲーションによる配列決定プロセス、特異的シグナル増幅、およびヒドロゲル組織化学を統合することを含む（図１Ａ）。ある特定の態様では、ＳＴＡＲｍａｐは、マウス視覚皮質切片内のすべての細胞における１６０個の異なる遺伝子の配列決定を介して細胞分解能発現マッピングを可能にする。ある特定の態様では、ＳＴＡＲｍａｐは、神経間およびグリアサブタイプを含む皮質層内の多様な解剖学的および分子的に分解された細胞型の特定、ならびに視覚刺激、空間位置、および分子的に定義された細胞類型の関数としての活性調節された遺伝子の発現の定量化を可能にする。特定の態様では、ＳＴＡＲｍａｐは、立方ミリメートル規模の体積で３０，０００個を超える細胞を定量化することを可能にし、抑制性ニューロンの３Ｄクラスタ化パターンと対照的な興奮性ニューロンサブタイプの勾配分布を明らかにする。
【００１０】
いくつかの実施形態では、インサイチュ合成されたヒドロゲルは、天然の生体分子に結合する細胞内に送達された界面と統合され、これは、組織を、その構成細胞内から、タンパク質、核酸、および他の標的のための多くの種類の分子表現型検査に適合する高分解能体積撮像および分析に好適な新しい状態に形質転換する。例えば、合成ヒドロゲルは、ＤＮＡ配列決定を含む酵素反応に対応するために使用されており、これらに限定されないが、その参照が参照により本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１４／０２５３９２に開示されている技術を含む、当該技術分野で知られている。いくつかの実施形態では、生物学的組織は、ＲＮＡ由来の相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）の作成、保持、および機能的提示と適合するヒドロゲルに埋め込まれた形態に変換され得る。そのような態様では、３Ｄインサイチュ配列決定は、そのような組織−ヒドロゲル配合物内で実行することができ、したがって、光学透明性、バックグラウンドの低減、拡散速度の上昇、およびより大きな機械的安定性の重要な付随特性を利用する。
【００１１】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書において互換的に使用され、コードされた、およびコードされていないアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。「ポリペプチド」という用語は、これらに限定されないが、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基の有無に関わらない異種および相同リーダー配列を伴う融合体、免疫学的にタグ付けされたタンパク質などを含む、融合タンパク質を含む。「ポリペプチド」という用語は、脂肪酸部分、脂質部分、糖部分、および炭水化物部分のうちの１つ以上を含むポリペプチドを含む。用語「ポリペプチド」は、翻訳後修飾されたポリペプチドを含む。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「標的核酸」という用語は、単一細胞に存在する任意のポリヌクレオチド核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子、ＲＮＡ分子、修飾された核酸など）である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、コーディングＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、非コーディングＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、成熟ｍｉＲＮＡ、未熟ｍｉＲＮＡなど）である。いくつかの実施形態では、標的核酸は、細胞の文脈におけるＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡなど）のスプライス変異である。したがって、好適な標的核酸は、スプライスされていないＲＮＡ（例えば、プレｍＲＮＡ、ｍＲＮＡ）、部分的にスプライスされたＲＮＡ、または完全にスプライスされたＲＮＡなどであり得る。目的の標的核酸は、細胞集団内で可変的に発現することができ、すなわち、異なる存在量を有し得、ここで、本発明の方法は、個々の細胞における、ＲＮＡ転写産物を含むがこれに限定されない、核酸の発現レベルのプロファイリングおよび比較を可能にする。標的核酸はまた、ＤＮＡ分子、例えば、変性ゲノム、ウイルス、プラスミドなどであり得る。例えば、これらの方法を使用して、例えば、標的核酸が集団内の細胞のゲノムに異なる存在量で存在する癌細胞集団におけるコピー数多型、ウイルス負荷および動態を判定するためのウイルス感染した細胞などを検出することができる。
【００１３】
本明細書において互換的に使用される、「オリゴヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド」、および「核酸分子」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、これらに限定されないが、一本鎖、二本鎖、または多鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、またはプリンおよびピリミジン塩基、または他の天然、化学的、もしくは生化学的に修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。ポリヌクレオチドの骨格は、糖およびリン酸基（典型的にはＲＮＡもしくはＤＮＡに見られる場合がある）、または修飾もしくは置換された糖もしくはリン酸基を含むことができる。あるいは、ポリヌクレオチドの骨格は、ホスホラミダイト、および／またはホスホロチオエートなどの合成サブユニットのポリマーを含むことができ、したがって、オリゴデオキシヌクレオシドホスホロアミダートまたは混合ホスホロアミダートホスホジエステルオリゴマーであり得る。Ｐｅｙｒｏｔｔｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：１８４１−１８４８，Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２４：２３１８−２３２３．ポリヌクレオチドは、１つ以上のＬ−ヌクレオシドを含み得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾ヌクレオチド、ウラシル、他の糖、ならびにフルオロリボースおよびチオエートなどの連結基、ならびにヌクレオチド分岐を含み得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分により中断され得る。ポリヌクレオチドは、Ｎ３’−Ｐ５’（ＮＰ）ホスホロアミダート、モルホリノホスホロシダート（ＭＦ）、ロック核酸（ＬＮＡ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（ＭＯＥ）、または２’−フルオロ，アラビノ核酸（ＦＡＮＡ）を含むように修飾されてもよく、これは、ポリヌクレオチドのヌクレアーゼ分解に対する耐性を増強することができる（例えば、Ｆａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：４０−４４，Ｔｏｕｌｍｅ（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１９：１７−１８を参照されたい）。ポリヌクレオチドは、標識構成成分との接合などにより、重合後にさらに修飾され得る。この定義に含まれる他のタイプの修飾は、キャップ、類似体との天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上の置換、およびポリヌクレオチドをタンパク質、金属イオン、標識成分、他のポリヌクレオチド、または固体支持体に結合するための手段の導入である。免疫調節核酸分子は、本明細書により詳細に記載されるように、例えば、リポソームと関連して、マイクロカプセル化されて、などの様々な配合物で提供することができる。増幅に使用されるポリヌクレオチドは、一般に、増幅における最大効率のために一本鎖であるが、代替的には、二本鎖であってもよい。二本鎖である場合、ポリヌクレオチドは、伸長生成物を調製するために使用される前に、最初にそのストランドを分離するように処理され得る。この変性ステップは、典型的には、熱の影響���受けるが、代替的に、アルカリを使用し、その後、中和によって実施され得る。
【００１４】
「対象」または「個体」または「患者」は、治療が所望される任意の対象を意味する。特に関心があるのは、人間の被験者である。他の対象には、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、鳥（例えば、ニワトリまたは他の家禽）、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが含まれ得る。特に関心があるのは、脳障害を有するか、または脳障害を受けやすい対象である。
【００１５】
本発明がさらに説明される前に、本発明は、記載された特定の実施形態に限定されるものではなく、したがって、当然ながら変わり得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを説明するためのものであり、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００１６】
値の範囲が提供される場合、文脈が別段明確に指示しない限り、その範囲の上限および下限と、その記述された範囲にある任意の他の記述された値または介在値との間の、下限の単位の１０分の１までの各介在値が、本発明の中に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、記述された範囲にある任意の具体的に除外された限界次第で、より小さい範囲に独立して含まれてもよく、本発明にも包含される。記述された範囲が限界のうちの一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除く範囲も本発明に含まれる。
【００１７】
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の任意の方法および材料も、本発明の履行または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料がここで説明される。本明細書で言及されるすべての刊行物は、引用された刊行物に関連して方法および／または材料を開示し、説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００１８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別途明示されない限り、複数の指示物を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「細胞」への言及は、複数のそのような細胞を含み、「そのオリゴヌクレオチド」への言及は、１つ以上のオリゴヌクレオチドおよび当業者に既知のその同等物への言及を含む。特許請求の範囲は、あらゆる任意選択的な要素を排除するように立案され得ることにさらに留意されたい。そのため、この記述は、特許請求要素の列挙に関連する「単に」、「のみ」などのそのような排他的な用語の使用、または「否定的」な限定の使用の先行詞としての役割を果たすことが意図される。
【００１９】
明確にするために別個の実施形態の観点から記載されている本発明のある特定の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供されてもよいことが理解される。逆に、簡潔にするために単一の実施形態の観点から記載されている本発明の様々な特徴は、別々にまたは任意の好適な部分的組み合わせで提供されてもよい。本発明に関する実施形態のすべての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、まさにありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されているかのように、本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態およびそれらの要素のすべての部分的組み合わせも、本発明によって具体的に包含され、まさにありとあらゆるそのような部分的組み合わせが本明細書に個々にかつ明示的に開示さているかのように、本明細書に開示される。
【００２０】
本明細書において考察された刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示についてのみ提供される。本明細書におけるいかなるものも、本発明が、先行発明のためにそのような刊行物に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の公開日とは異なる場合があり、これらは、独立して確認される必要があり得る。
【００２１】
方法
本明細書に開示される方法には、改良されたライゲーションによる配列決定プロセス、特異的シグナル増幅、生物学的組織を透明な配列決定チップに変えるためのヒドロゲル組織化学、ならびに空間分解転写アンプリコン読み出しマッピング（ＳＴＡＲｍａｐ）」と称される、高度に多重化された遺伝子検出をサブ細胞レベルおよび細胞レベルで空間分解するための関連データ分析パイプラインによる、画像に基づくインサイチュ核酸（ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）配列決定技術が含まれる。いくつかの実施形態では、ＳＴＡＲｍａｐは、改良されたｃＤＮＡライブラリ調製、配列決定、およびヒドロゲル組織化学によって可能になる、３Ｄインサイチュトランスクリプトミクスのためのプラットフォームを定義する。
【００２２】
上記で要約したように、本明細書に開示される方法は、無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定のための方法を含み、この方法は、（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることであってプライマー対が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、標的核酸の第１の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、標的核酸の第２の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域に隣接する、接触させることと、（ｂ）リガーゼを添加して、第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することと、（ｃ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、（ｄ）１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下で埋め込んで、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、（ｅ）ライゲーションを可能にする条件下で、バーコード配列を有する１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、ライゲーションが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、（ｆ）ステップ（ｅ）を何度も繰り返すことと、（ｇ）１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、を含む。
【００２３】
本明細書に開示される方法はまた、候補薬剤をスクリーニングして、候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節するかどうかを判定する方法を提供し、この方法は、（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることであってプライマー対が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、標的核酸の第１の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、標的核酸の第２の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域に隣接する、接触させることと、（ｂ）リガーゼを添加して、第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することと、（ｃ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、（ｄ）１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下で埋め込んで、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、（ｅ）ライゲーションを可能にする条件下で、バーコード配列を有する１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、ライゲーションが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、（ｆ）ステップ（ｅ）を何度も繰り返すことと、（ｇ）１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、（ｈ）標的核酸の遺伝子の発現のレベルを検出することであって、少なくとも１つの候補薬剤の不在下における標的核酸の発現のレベルに対する、少なくとも１つの候補薬剤の存在下における標的核酸の発現のレベルの変化が、少なくとも１つの候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節することを示す、検出することと、を含む。
【００２４】
ある特定の態様では、本明細書に開示される方法は、既存の遺伝子発現分析ツールと比較して、より速い処理時間、より高い多重性（最大１０００個の遺伝子）、より高い効率、より高い感度、より低いエラー率、およびより多くの空間分解された細胞型を提供する。そのような態様では、改良されたヒドロゲル組織化学法は、エラー低減を伴うインサイチュ配列決定のための改良されたライゲーションによる配列決定プロセス（ＳＥＤＡＬ）である、インサイチュ配列決定に適合するヒドロゲルで刷り込まれた核酸に生体組織を形質転換する。いくつかの他の態様では、本明細書に開示される方法は、単一細胞および／または単一分子感度で生物医学的研究および臨床診断（例えば、癌、細菌感染、ウイルス感染など）のための空間的に配列決定すること（例えば、試薬、チップ、またはサービス）を含む。
【００２５】
分子内ライゲーションを介した核酸の特異的増幅（ＳＮＡＩＬ）
いくつかの実施形態では、ＳＴＡＲｍａｐの１つの構成要素は、分子内ライゲーションを介した核酸の特異的増幅の略であるＳＮＡＩＬと称することができる、細胞ＲＮＡからインサイチュでｃＤＮＡライブラリを生成するための効率的なアプローチを含む。ある特定の実施形態では、本発明の方法は、特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることを含み、一対のプライマーは、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含む。
【００２６】
より一般的には、組織内の目的の細胞内に存在する核酸は、本明細書において第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドと称される、一対のプライマーを含む複合体のアセンブリのための足場として機能する。いくつかの実施形態では、固定され、透過処理された無傷組織を接触させることは、一対のプライマーを同じ標的核酸にハイブリダイズさせることを含む。いくつかの実施形態では、標的核酸は、ＲＮＡである。そのような実施形態では、標的核酸は、ｍＲＮＡであってもよい。他の実施形態では、標的核酸は、ＤＮＡである。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイズする」および「ハイブリダイゼーション」という用語は、ワトソン−クリック塩基対合を介して複合体を形成するのに十分に相補的であるヌクレオチド配列間の複合体の形成を指す。プライマーが標的（鋳型）と「ハイブリダイズする」場合、そのような複合体（またはハイブリッド）は、例えば、ＤＮＡ合成を開始するためのＤＮＡポリメラーゼによって必要とされるプライミング機能を果たすのに十分に安定している。ハイブリダイゼーション配列は、安定したハイブリッドを提供するために完全な相補性を有する必要はないことが理解されるであろう。多くの状況において、安定したハイブリッドは、塩基の約１０％未満が不一致である場合に形成され、４個以上のヌクレオチドのループを無視するであろう。したがって、本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、アッセイ条件下で「相補体」で安定した二本鎖を形成するオリゴヌクレオチドを指し、一般的に、約９０％以上の相同性が存在する場合である。
【００２８】
ＳＮＡＩＬオリゴヌクレオチドプライマー
本発明の方法では、ＳＮＡＩＬオリゴヌクレオチドプライマーは、少なくとも第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、標的核酸の第１の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、標的核酸の第２の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域に隣接する。代替的な実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、閉じた環状分子であり、ライゲーションステップは、省略される。
【００２９】
本開示は、固定され、透過処理された組織を接触させることが、異なる標的核酸に対する特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせることを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、これらに限定されないが、５個以上の第１のオリゴヌクレオチド、例えば、８個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１８個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上を含む、複数の第１のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、１５個以上、例えば、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、および最大８０個の異なる標的核酸配列にハイブリダイズする、これらに限定されないが、１５個以上の第１のオリゴヌクレオチド、例えば、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、および最大８０個の異なる第１のオリゴヌクレオチドを含む、複数の第１のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、これらに限定されないが、５個以上の第２のオリゴヌクレオチド、例えば、８個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１８個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上を含む、複数の第２のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、１５個以上、例えば、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、および最大８０個の異なる標的核酸配列にハイブリダイズする、これらに限定されないが、１５個以上の第２のオリゴヌクレオチド、例えば、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、および最大８０個の異なる第１のオリゴヌクレオチドを含む、複数の第２のオリゴヌクレオチドを含む。１つ以上の対が各標的核酸に特異的に結合する場合、複数のオリゴヌクレオチド対を反応に使用することができる。例えば、感度を向上させ、可変性を低減するために、２つのプライマー対を１つの標的核酸に使用することができる。細胞内の複数の異なる標的核酸を検出すること、例えば、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大８個、最大９個、最大１０個、最大１２個、最大１５個、最大１８個、最大２０個、最大２５個、最大３０個、最大４０個以上の異なる標的核酸を検出することも目的である。プライマーは、典型的には、使用前に、典型的には、少なくとも約５０℃、少なくとも約６０℃、少なくとも約７０℃、少なくとも約８０℃、および最大約９９℃、最大約９５℃、最大約９０℃の温度まで加熱することによって変性する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、プライマーは、試料と接触させる前に加熱することによって変性する。ある特定の態様では、オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）は、溶液中のライゲーションを最小限に抑えるように選択される。核酸の「融解温度」または「Ｔｍ」は、加熱、または例えば酸もしくはアルカリ処理などによる塩基対間の水素結合の他の解離により、核酸の螺旋構造の半分が失われる温度として定義される。核酸分子のＴｍは、その長さおよびその塩基組成に依存する。ＧＣ塩基対を豊富に含む核酸分子は、豊富なＡＴ塩基対を有するものよりも高いＴｍを有する。温度がＴｍを下回ると、核酸の分離された相補鎖が自発的に再会合またはアニールして、二本鎖核酸を形成する。核酸ハイブリダイゼーションの最も高い速度は、Ｔｍより約２５℃低い温度で生じる。Ｔｍは、次の関係を使用して推定され得る。Ｔｍ＝６９．３＋０．４１（ＧＣ）％（Ｍａｒｍｕｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９６２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．５：１０９−１１８）。
【００３１】
ある特定の実施形態では、複数の第２のオリゴヌクレオチドは、パドロックプローブを含む。いくつかの実施形態では、プローブは、測定および定量化することができる検出可能な標識を含む。「標識」および「検出可能な標識」という用語は、これらに限定されないが、放射性同位体、蛍光剤、化学発光剤、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素阻害剤、発色団、色素、金属イオン、金属溶剤、リガンド（例えば、ビオチンまたはハプテン）などを含む検出可能な分子を指す。「蛍光剤」という用語は、検出可能な範囲内で蛍光を示すことが可能な物質またはその一部分を指す。本発明と共に使用することができる標識の具体的な例としては、フィコエリトリン、アレクサ色素、フルオレセイン、ＹＰｅｔ、ＣｙＰｅｔ、カスケードブルー、アロフィコシアニン、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｃｙ７、ローダミン、ダンシル、ウンベリフェロン、テキサスレッド、ルミノール、アクラジムエステル、ビオチン、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、強化緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、強化黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）、ホタルシフェラーゼ、レニラルシフェラーゼ、ＮＡＤＰＨ、ベータ−ガラクトシダーゼ、ホラジッシュペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、クロラムフェンアセチルトランスフェラーゼ、およびウレラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３２】
いくつかの実施形態では、１つ以上の第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドは、標的核酸の異なる領域、または標的部位に結合する。対では、各標的部位は、異なり、標的部位は、例えば、他方の部位から通常は１５個のヌクレオチド以下離れている、例えば、１０、８、６、４、または２個のヌクレオチド以下離れている、標的核酸上の隣接部位である。標的部位は、典型的には、同じ方向で標的核酸の同じストランド上に存在する。標的部位はまた、細胞内に存在する他の核酸と比べて、独自の結合部位を提供するように選択される。各標的部位は、概して、長さ約１９〜約２５個のヌクレオチド、例えば、約１９〜２３個のヌクレオチド、約１９〜２１個のヌクレオチド、または約１９〜２０個のヌクレオチドである。第１および第２のオリゴヌクレオチドの対は、対の各オリゴヌクレオチドが、その同族標的部位に結合するための同様の融解温度を有するように選択され、例えば、Ｔｍは、約５０℃、約５２℃、約５８℃、約６２℃、約６５℃、約７０℃、または約７２℃からであってもよい。標的部位のＧＣ含有量は、一般に、約２０％以下、約３０％以下、約４０％以下、約５０％以下、約６０％以下、約７０％以下であるように選択される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドは、第１、第２、および第３の相補性領域を含む。第１のオリゴヌクレオチドの標的部位は、第１の相補性領域を指すことができる。上で要約したように、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域は、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有し得る。ある特定の態様では、第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域は、例えば、４〜８個のヌクレオチドまたは４〜７個のヌクレオチドを含む、３〜１０個のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様では、第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域は、６個のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域は、同様に６個のヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域は、例えば、４〜８個のヌクレオチドまたは４〜７個のヌクレオチドを含む、３〜１０個のヌクレオチドの長さを有する。
【００３４】
いくつかの実施形態では、第２の第１のオリゴヌクレオチドは、第１、第２、および第３の相補性領域を含む。第２のオリゴヌクレオチドの標的部位は、第２の相補性領域を指すことができる。上で要約したように、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域は、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有し得る。ある特定の態様では、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域は、例えば、４〜８個のヌクレオチドまたは４〜７個のヌクレオチドを含む、３〜１０個のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様では、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域は、６個のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様では、第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域は、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端を含む。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域は、同様に６個のヌクレオチドの長さを有する。そのような実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域は、例えば、４〜８個のヌクレオチドまたは４〜７個のヌクレオチドを含む、３〜１０個のヌクレオチドの長さを有する。さらなる実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域は、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端を含む。いくつかの実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域は、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域に隣接する。
【００３５】
いくつかの態様では、第２のオリゴヌクレオチドは、バーコード配列を含み、第２のオリゴヌクレオチドのバーコード配列は、標的核酸の特定のためのバーコード化情報を提供する。「バーコード」という語は、単一細胞または細胞のサブ集団を特定するために使用される核酸配列を指す。バーコード配列は、増幅中に目的の標的核酸に連結され、標的核酸が由来する細胞にアンプリコンをトレースするために使用することができる。バーコード配列が最終の増幅された標的核酸生成物（すなわち、アンプリコン）に組み込まれるように、バーコード配列を含む領域および標的核酸に相補的な領域を含有するオリゴヌクレオチドで増幅を行うことによって、増幅中に目的の標的核酸にバーコード配列を添加することができる。
【００３６】
組織
本明細書に記載されるように、開示される方法は、特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと少なくとも接触させることによる無傷組織のインサイチュ配列決定技術を含む。本明細書に記載される方法で使用するために好適な組織検体には、一般に、これらに限定されないが、上皮、筋肉、結合組織、および神経組織を含む、例えば、生検検体および解剖検体などの生体または死体から収集された任意のタイプの組織検体が含まれる。組織検体は、本明細書に記載される方法を使用して収集および処理され、処理直後に顕微鏡分析に供されてもよく、または、保存され、将来の時点で、例えば、長期間保管された後に顕微鏡分析に供されてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して、将来の分析のために、組織検体を安定した、アクセス可能な、完全に無傷の形態で保存することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法を使用して、以前に保存または保管された組織検体を分析してもよい。いくつかの実施形態では、無傷組織は、視覚皮質切片などの脳組織を含む。いくつかの実施形態では、無傷組織は、これらに限定されないが、例えば、５〜１８μｍ、５〜１５μｍ、または５〜１０μｍを含む、５〜２０μｍの厚さの薄い切片である。他の実施形態では、無傷組織は、これらに限定されないが、例えば、５０〜１５０μｍ、５０〜１００μｍ、または５０〜８０μｍを含む、５０〜２００μｍの厚い切片である。
【００３７】
本発明の態様は、無傷組織を固定することを含む。本明細書で使用される「固定すること」または「固定」という用語は、生物学的材料（例えば、組織、細胞、器官、分子など）を腐敗および／または分解から守るプロセスである。固定は、任意の便利なプロトコルを使用して達成され得る。固定は、試料を固定試薬（すなわち、少なくとも１つの固定剤を含有する試薬）と接触させることを含むことができる。試料は、固定試薬によって広範囲の時間、接触することができ、これは、温度、試料の性質、および固定剤（複数可）に依存し得る。例えば、試料は、固定試薬によって、２４時間以下、１８時間以下、１２時間以下、８時間以下、６時間以下、４時間以下、２時間以下、６０時間以下、４５時間以下、３０時間以下、２５時間以下、２０時間以下、１５時間以下、１０時間以下、５時間以下、または２時間以下、接触することができる。
【００３８】
試料は、固定試薬によって、５分〜２４時間、例えば、１０分〜２０時間、１０分〜１８時間、１０分〜１２時間、１０分〜８時間、１０分〜６時間、１０分〜４時間、１０分〜２時間、１５分〜２０時間、１５分〜１８時間、１５分〜１２時間、１５分〜８時間、１５分〜６時間、１５分〜４時間、１５分〜２時間、１５分〜１時間、１５分〜１．５時間、１５分〜１時間、１０分〜３０分、１５分〜３０分、３０分〜２時間、４５分〜１．５時間、または５５分〜７０分の範囲の時間、接触することができる。
【００３９】
試料は、使用されるプロトコルおよび試薬に応じて、様々な温度で固定試薬によって接触することができる。例えば、場合によっては、試料は、−２２℃〜５５℃の範囲の温度で固定試薬によって接触することができ、目的となる特定の範囲には、これらに限定されないが、５０〜５４℃、４０〜４４℃、３５〜３９℃、２８〜３２℃、２０〜２６℃、０〜６℃、および−１８〜２２℃が含まれる。場合によっては、試料は、−２０℃、４℃、室温（２２〜２５℃）、３０℃、３７℃、４２℃、または５２℃の温度で固定試薬によって接触することができる。
【００４０】
任意の便利な固定試薬を使用することができる。一般的な固定試薬には、架橋固定剤、沈殿固定剤、酸化固定剤、水銀などが含まれる。架橋固定剤は、共有結合によって２つ以上の分子を化学的に結合し、幅広い架橋試薬を使用することができる。好適な架橋固定剤の例としては、これらに限定されないが、アルデヒド（例えば、一般的に「パラホルムアルデヒド」および「ホルマリン」とも称されるホルムアルデヒド、グルタルアルデヒドなど）、イミドエステル、ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド）エステルなどが挙げられる。好適な沈殿固定剤の例としては、これらに限定されないが、アルコール（例えば、メタノール、エタノールなど）、アセトン、酢酸などが挙げられる。いくつかの実施形態では、固定剤は、ホルムアルデヒド（すなわち、パラホルムアルデヒドまたはホルマリン）である。固定試薬中のホルムアルデヒドの好適な最終濃度は、１０分間で、約１．６％を含む、０．１〜１０％、１〜８％、１〜４％、１〜２％、３〜５％、または３．５〜４．５％である。いくつかの実施形態では、試料は、４％のホルムアルデヒドの最終濃度で固定される（例えば、３８％、３７％、３６％、２０％、１８％、１６％、１４％、１０％、８％、６％など、より濃縮された原液から希釈されるとき）。いくつかの実施形態では、試料は、１０％のホルムアルデヒドの最終濃度で固定される。いくつかの実施形態では、試料は、１％のホルムアルデヒドの最終濃度で固定される。いくつかの実施形態では、固定剤は、グルタルアルデヒドである。固定試薬中のグルタルアルデヒドの好適な濃度は、０．１〜１％である。固定試薬は、任意の組み合わせで２つ以上の固定剤を含有することができる。例えば、いくつかの実施形態では、試料は、ホルムアルデヒドおよびグルタルアルデヒドの両方を含有する固定試薬と接触させる。
【００４１】
本明細書で使用される「透過化」または「透過処理する」という用語は、核酸プローブ、抗体、化学基質などの実験試薬に透過可能な試料の細胞（細胞膜など）をレンダリングするプロセスを指す。透過化のための任意の便利な方法および／または試薬を使用することができる。好適な透過化試薬としては、洗剤（例えば、サポニン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ−２０など）、有機固定剤（例えば、アセトン、メタノール、エタノールなど）、酵素などが挙げられる。洗剤は、ある範囲の濃度で使用することができる。例えば、０．００１％〜１％の洗剤、０．０５％〜０．５％の洗剤、または０．１％〜０．３％の洗剤を透過化に使用することができる（例えば、０．１％のサポニン、０．２％のトゥイーン−２０、０．１〜０．３％のトリトンＸ−１００など）。いくつかの実施形態では、少なくとも１０分間氷上でメタノールを使用して、透過処理する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、同じ溶液を固定試薬および透過化試薬として使用することができる。例えば、いくつかの実施形態では、固定試薬は、０．１％〜１０％のホルムアルデヒドおよび０．００１％〜１％のサポニンを含有する。いくつかの実施形態では、固定試薬は、１％のホルムアルデヒドおよび０．３％のサポニンを含む。
【００４３】
試料は、透過化試薬によって広範囲の時間、接触することができ、これは、温度、試料の性質、および透過化試薬（複数可）に依存し得る。例えば、試料は、透過化試薬によって、２４時間以上、２４時間以下、１８時間以下、１２時間以下、８時間以下、６時間以下、４時間以下、２時間以下、６０分以下、４５分以下、３０分以下、２５分以下、２０分以下、１５分以下、１０分以下、５分以下、または２分以下、接触することができる。試料は、使用されるプロトコルおよび試薬に応じて、様々な温度で透過化試薬によって接触することができる。例えば、場合によっては、試料は、−８２℃〜５５℃の範囲の温度で透過化試薬によって接触することができ、目的となる特定の範囲には、これらに限定されないが、５０〜５４℃、４０〜４４℃、３５〜３９℃、２８〜３２℃、２０〜２６℃、０〜６℃、−１８〜−２２℃、および−７８〜−８２℃が含まれる。場合によっては、試料は、−８０℃、−２０℃、４℃、室温（２２〜２５℃）、３０℃、３７℃、４２℃、または５２℃の温度で透過化試薬によって接触することができる。
【００４４】
いくつかの実施形態では、試料は、酵素透過化試薬と接触する。アッセイ試薬による試料の透過を妨げる細胞外マトリックスまたは表面タンパク質を部分的に分解することによって試料を透過化する酵素透過化試薬。酵素透過化試薬との接触は、固定後および標的検出前の任意の時点で行われ得る。場合によっては、酵素透過化試薬は、市販の酵素であるプロテイナーゼＫである。そのような場合、試料は、固定後試薬と接触する前にプロテイナーゼＫと接触する。プロテイナーゼＫ処理（すなわち、プロテイナーゼＫによる接触であり、一般に「プロテイナーゼＫ消化」とも称される）は、ある範囲の時間にわたって、ある範囲の温度で、調査中の各細胞型または組織型について経験的に決定される酵素濃度の範囲に及んで実行することができる。例えば、試料は、プロテイナーゼＫによって３０分間以下、２５分間以下、２０分間以下、１５分間以下、１０分間以下、５分間以下、または２分間以下、接触させることができる。試料は、１μｇ／ｍｌ以下、２μｇ／ｍｌ以下、４μｇ／ｍｌ以下、８μｇ／ｍｌ以下、１０μｇ／ｍｌ以下、２０μｇ／ｍｌ以下、３０μｇ／ｍｌ以下、５０μｇ／ｍｌ以下、または１００μｇ／ｍｌ以下のプロテイナーゼＫに接触することができる。試料は、２℃〜５５℃の範囲の温度でプロテイナーゼＫによって接触することができ、目的となる特定の範囲には、これらに限定されないが、５０〜５４℃、４０〜４４℃、３５〜３９℃、２８〜３２℃、２０〜２６℃、および０〜６℃が挙げられる。場合によっては、試料は、４℃、室温（２２〜２５℃）、３０℃、３７℃、４２℃、または５２℃の温度でプロテイナーゼＫによって接触することができる。いくつかの実施形態では、試料は、酵素透過化試薬と接触しない。いくつかの実施形態では、試料は、プロテイナーゼＫと接触しない。無傷組織と少なくとも固定試薬および透過化試薬との接触により、固定され、透過処理された組織の生成が生じる。
【００４５】
リガーゼ
いくつかの実施形態では、開示される方法は、リガーゼを添加して、第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することを含む。いくつかの実施形態では、リガーゼを添加することは、ＤＮＡリガーゼを添加することを含む。代替の実施形態では、第２のオリゴヌクレオチドは、閉じた核酸環として提供され、リガーゼを添加するステップは、省略される。ある特定の実施形態では、リガーゼは、標的核酸分子の配列決定を促進する酵素である。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「リガーゼ」という用語は、ポリヌクレオチドを一緒に結合するか、または単一のポリヌクレオチドの末端を結合するために一般的に使用される酵素を指す。リガーゼとしては、ＡＴＰ依存性二本鎖ポリヌクレオチドリガーゼ、ＮＡＤ−ｉ−依存性二本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡリガーゼ、ならびに一本鎖ポリヌクレオチドリガーゼ、例えば、ＥＣ６．５．１．１（ＡＴＰ依存性リガーゼ）、ＥＣ６．５．１．２（ＮＡＤ＋依存性リガーゼ）、ＥＣ６．５．１．３（ＲＮＡリガーゼ）に記載されるリガーゼのうちのいずれかが挙げられる。リガーゼの具体的な例としては、細菌リガーゼ、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＮＡリガーゼおよびＴａｑＤＮＡリガーゼ、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）熱安定性ＤＮＡリガーゼ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（登録商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃｏｒｐ．、ｌｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）の一部、ウィスコンシン州マジソン）、ならびにファージリガーゼ、例えば、Ｔ３ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、およびＴ７ＤＮＡリガーゼ、ならびにそれらの変異体が挙げられる。
【００４７】
ローリングサークル増幅
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行するステップを含み、実行することは、ポリメラーゼが１つ以上のアンプリコンを形成するように、第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、第１のオリゴヌクレオチドをプライマーとして使用することを含む。そのような実施形態では、一本鎖環状ポリヌクレオチド鋳型は、第２のヌクレオチドのライゲーションによって形成され、この環状ポリヌクレオチドは、第１のオリゴヌクレオチドに相補的な領域を含む。適切なｄＮＴＰ前駆体および他の補因子の存在下でＤＮＡポリメラーゼを添加すると、第１のオリゴヌクレオチドは、鋳型の多数のコピーの複製によって細長くなる。この増幅生成物は、検出プローブに結合することによって容易に検出することができる。
【００４８】
いくつかの実施形態では、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドが同じ標的核酸分子にハイブリダイズする場合にのみ、第２のオリゴヌクレオチドを環化し、ローリングサークル増幅して、ｃＤＮＡの多数のコピーを含有するｃＤＮＡナノボール（すなわち、アンプリコン）を生成することができる。「アンプリコン」という用語は、ＰＣＲ反応または他の核酸増幅プロセスの増幅された核酸生成物を指す。いくつかの実施形態では、アミン修飾されたヌクレオチドが、ローリングサークル増幅反応にスパイクされる。
【００４９】
ローリングサークル増幅のための技術は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｂａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２６：５０７３−５０７８，１９９８；Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ１９：２２６，１９９８；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１０１１３−１１９，２０００；Ｆａｒｕｑｉ  ｅｔ  ａｌ，ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２：４，２０００；Ｎａｌｌｕｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２９：ｅｌ１８，２００１；Ｄｅａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．１１：１０９５−１０９９，２００１；Ｓｃｈｗｅｉｔｚｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ．２０：３５９−３６５，２００２；米国特許第６，０５４，２７４号、同第６，２９１，１８７号、同第６，３２３，００９号、同第６，３４４，３２９号、および同第６，３６８，８０１号を参照されたい）。いくつかの実施形態では、ポリメラーゼは、ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼである。
【００５０】
特定の態様では、核酸分子は、アミン修飾されたヌクレオチドを含む。そのような実施形態では、アミン修飾されたヌクレオチドは、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分修飾を含む。他のアミン修飾されたヌクレオチドの例には、これらに限定されないが、５−アミノアリル−ｄＵＴＰ部分修飾、５−プロパルギルアミノ−ｄＣＴＰ部分修飾、Ｎ６−６−アミノヘキシル−ｄＡＴＰ部分修飾、または７−Ｄｅａｚａ−７−プロパルギルアミノ−ｄＡＴＰ部分修飾が含まれる。
【００５１】
組織−ヒドロゲル設定へのアンプリコン埋め込み
いくつかの実施形態では、開示される方法は、ヒドロゲルサブユニットの存在下で１つ以上のアンプリコンを埋め込んで、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することを含む。記載されるヒドロゲル組織化学は、組織清澄化、酵素拡散、および多重サイクル配列決定のために核酸をインサイチュ合成されたヒドロゲルに共有結合することを含むが、既存のヒドロゲル組織化学方法は、それができない。いくつかの実施形態では、組織−ヒドロゲル設定へのアンプリコン埋め込みを可能にするために、アミン修飾されたヌクレオチドが、ローリングサークル増幅反応にスパイクされ、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用してアクリルアミド部分で官能化され、アクリルアミドモノマーと共重合されて、ヒドロゲルを形成する。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「ヒドロゲル」または「ヒドロゲルネットワーク」という用語は、水が分散媒体であるコロイドゲルとして時々見られる、水溶性であるポリマー鎖のネットワークを意味する。言い換えれば、ヒドロゲルは、溶解することなく大量の水を吸収することができるポリマー材料のクラスである。ヒドロゲルは、９９％超の水を含有することができ、天然もしくは合成ポリマー、またはそれらの組み合わせを含み得る。ハイドロゲルはまた、それらの著しい水含有量により、天然組織に非常に類似した程度の柔軟性を有する。好適なヒドロゲルの詳細な説明は、参照により具体的に本明細書に組み込まれる、公開された米国特許出願第２０１０／００５５７３３号で見ることができる。本明細書で使用される場合、「ヒドロゲルサブユニット」または「ヒドロゲル前駆体」という用語は、三次元（３Ｄ）ヒドロゲルネットワークを形成するために、架橋または「重合」され得る親水性モノマー、プレポリマー、またはポリマーを意味する。いかなる科学的理論にも拘束されるものではないが、ヒドロゲルサブユニットの存在下での生物学的検体のこの固定は、検体の成分をヒドロゲルサブユニットに架橋し、それによって所定の位置に分子成分を固定し、組織構造および細胞形態を保存すると考えられる。
【００５３】
いくつかの実施形態では、埋め込むことは、１つ以上のアンプリコンをアクリルアミドと共重合させることを含む。本明細書で使用される場合、「コポリマー」という用語は、２つ以上のタイプのサブユニットを含有するポリマーを記載する。この用語は、２、３、４、５、または６タイプのサブユニットを含むポリマーを包含する。
【００５４】
ある特定の態様では、埋め込むことは、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを清澄化することを含み、標的核酸は、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコン中に実質的に保持される。そのような実施形態では、清澄化することは、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから複数の細胞成分を実質的に除去することを含む。いくつかの他の実施形態では、清澄化することは、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから脂質を実質的に除去することを含む。本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、清澄化する前に試料中に存在する元の量が、約７０％以上、例えば７５％以上、例えば８０％以上、例えば８５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上、例えば１００％減少したことを意味する。
【００５５】
いくつかの実施形態では、ヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを清澄化することは、検体を電気泳動させることを含む。いくつかの実施形態では、アンプリコンを、イオン性界面活性剤を含む緩衝液を使用して電気泳動させる。いくつかの実施形態では、イオン性界面活性剤は、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。いくつかの実施形態では、検体を、約１０〜約６０ボルトの範囲の電圧を使用して電気泳動させる。いくつかの実施形態では、検体を、約１５分〜約１０日間の範囲の期間、電気泳動させる。いくつかの実施形態では、この方法は、清澄化された検体を、清澄化された組織の屈折率と一致する屈折率を有する封入剤中でインキュベートすることをさらに含む。いくつかの実施形態では、封入剤は、検体の光学的透明度を増加させる。いくつかの実施形態では、封入剤は、グリセロールを含む。
【００５６】
動的アニーリングおよびライゲーションによるエラー補正を伴う配列決定（ＳＥＤＡＬ）
本明細書に開示される方法は、ライゲーションを可能にする条件下で、バーコード配列を有する１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させるステップを含み、一対のプライマーは、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、ライゲーションは、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる。いくつかの実施形態では、ＳＥＤＡＬは、ＳＴＡＲｍａｐに対して特異的に考案された。そのような実施形態では、本明細書における改良されたライゲーションによる配列決定方法は、低バックグラウンドノイズおよびエラー低減を伴う組織形態の最良の保存のために室温で動作することを含む。そのような他の実施形態では、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることは、配列決定が進むにつれてエラーの蓄積を排除することを含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることは、これらに限定されないが、例えば、３回以上、４回以上、５回以上、６回以上、または７回以上を含む、２回以上生じる。ある特定の実施形態では、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることは、薄い組織検体について４回以上生じる。他の実施形態では、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることは、厚い組織検体について６回以上生じる。いくつかの実施形態では、１つ以上のアンプリコンは、一対のプライマーによって、２４時間以上、２４時間以下、１８時間以下、１２時間以下、８時間以下、６時間以下、４時間以下、２時間以下、６０時間以下、４５時間以下、３０時間以下、２５時間以下、２０時間以下、１５時間以下、１０時間以下、５時間以下、または２時間以下、接触することができる。
【００５８】
本方法を使用して調製された試料は、いくつかの異なるタイプの顕微鏡法、例えば、光学顕微鏡法（例えば、明視野、傾斜照明、暗視野、位相コントラスト、微分干渉コントラスト、干渉反射、エピ蛍光、共焦点などの顕微鏡法）、レーザー顕微鏡法、電子顕微鏡法、および走査プローブ顕微鏡法のいずれかによって分析することができる。いくつかの態様では、非一過性コンピュータ可読媒体は、インサイチュ配列決定の多数ラウンドの顕微鏡法を通じて取得された生の画像を、まず解読された遺伝子同一性および空間的位置に転換し、次いで、遺伝子発現の１細胞あたりの組成を分析する。
【００５９】
ＳＥＤＡＬオリゴヌクレオチドプライマー
いくつかの実施形態では、開示される方法は、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含む。特定の態様では、第３のオリゴヌクレオチドは、塩基を解読するように構成され、第４のオリゴヌクレオチドは、解読された塩基をシグナルに変換するように構成される。いくつかの態様では、シグナルは、蛍光シグナルである。例示的な態様において、ライゲーションを可能にする条件下で、バーコード配列を有する１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることは、完全な一致が生じた場合にのみ、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドの各々がライゲーションして、撮像のための安定した生成物を形成することを伴う。ある特定の態様では、リガーゼ酵素の不一致感度は、標的核酸分子の基礎配列を決定するために使用される。
【００６０】
「完全に一致した」という用語は、二本鎖に関して使用される場合、二本鎖を構成するポリヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドストランドが、各ストランドのすべてのヌクレオチドが他方のストランド内のヌクレオチドとワトソン−クリック塩基対合を受けるように、互いに二本鎖構造を形成することを意味する。「二本鎖」という用語には、これらに限定されないが、用いることができる、デオキシイノシン、２−アミノプリン塩基を有するヌクレオシド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）などのヌクレオシド類似体の対合が含まれる。２つのオリゴヌクレオチド間の二本鎖における「不一致」は、二本鎖における一対のヌクレオチドがワトソン−クリック結合を受けることができないことを意味する。
【００６１】
いくつかの実施形態では、この方法は、標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、これらに限定されないが、５個以上の第３のオリゴヌクレオチド、例えば、８個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１８個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上を含む、複数の第３のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、１５個以上、例えば、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、および最大８０個の異なる標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、これらに限定されないが、１５個以上の第３のオリゴヌクレオチド、例えば、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、および最大８０個の異なる第１のオリゴヌクレオチドを含む、複数の第３のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、これらに限定されないが、５個以上の第４のオリゴヌクレオチド、例えば、８個以上、１０個以上、１２個以上、１５個以上、１８個以上、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上を含む、複数の第４のオリゴヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、本開示の方法は、１５個以上、例えば、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、および最大８０個の異なる標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズする、これらに限定されないが、１５個以上の第４のオリゴヌクレオチド、例えば、２０個以上、３０個以上、４０個以上、５０個以上、６０個以上、７０個以上、および最大８０個の異なる第１のオリゴヌクレオチドを含む、複数の第４のオリゴヌクレオチドを含む。１つ以上の対が各標的核酸に特異的に結合する場合、複数のオリゴヌクレオチド対を反応に使用することができる。例えば、感度を向上させ、可変性を低減するために、２つのプライマー対を１つの標的核酸に使用することができる。細胞内の複数の異なる標的核酸を検出すること、例えば、最大２個、最大３個、最大４個、最大５個、最大６個、最大７個、最大８個、最大９個、最大１０個、最大１２個、最大１５個、最大１８個、最大２０個、最大２５個、最大３０個、最大４０個以上の異なる標的核酸を検出することも目的である。
【００６２】
ある特定の実施形態では、ＳＥＤＡＬは、塩基不一致によって阻害される活性を有するリガーゼ、第３のオリゴヌクレオチド、および第４のオリゴヌクレオチドを伴う。この文脈における「阻害された」という用語は、約２０％以上、例えば２５％以上、例えば５０％以上、例えば７５％以上、例えば９０％以上、例えば９５％以上、例えば９９％以上、例えば１００％低減されるリガーゼの活性を指す。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、５〜１３個のヌクレオチド、５〜１０個のヌクレオチド、または５〜８個のヌクレオチドを含む、５〜１５ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドのＴｍは、室温（２２〜２５℃）である。いくつかの実施形態では、第３のオリゴヌクレオチドは、縮退しているか、または部分的に縮退している。いくつかの実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、５〜１３個のヌクレオチド、５〜１０個のヌクレオチド、または５〜８個のヌクレオチドを含む、５〜１５個のヌクレオチドの長さを有する。いくつかの実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドのＴｍは、室温（２２〜２５℃）である。塩基読み出しに対応するＳＥＤＡＬの各サイクルの後、第４のオリゴヌクレオチドは、剥離され得、これは、配列決定が進むにつれてエラーの蓄積を排除する。そのような実施形態では、第４のオリゴヌクレオチドは、ホルムアミドによって剥離される。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＳＥＤＡＬは、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを洗浄して、非結合オリゴヌクレオチドを除去し、その後、撮像のための蛍光生成物を明らかにすることを伴う。ある特定の例示的な実施形態では、検出可能な標識を使用して、本明細書に記載される１つ以上のヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドを検出することができる。ある特定の実施形態では、検出可能な標識を使用して、１つ以上のアンプリコンを検出することができる。検出可能なマーカーの例としては、様々な放射性部分、酵素、補綴基、蛍光マーカー、発光マーカー、生物発光マーカー、金属粒子、タンパク質−タンパク質結合対、タンパク質−抗体結合対などが挙げられる。蛍光タンパク質の例としては、これらに限定されないが、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、ウンベリフェロン、フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン、ジクロロトリアジニルアミンフルオレセイン、塩化ダンシル、フィコエリトリンなどが挙げられる。生物発光マーカーの例としては、これら限定されないが、ルシフェラーゼ（例えば、細菌、ホタル、コメツキムシなど）、ルシフェリン、エクオリンなどが挙げられる。視覚的に検出可能なシグナルを有する酵素系の例としては、これら限定されないが、ガラクトシダーゼ、グルコリミダーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、コリンエステラーゼなどが挙げられる。識別可能なマーカーには、１２５Ｉ、３５Ｓ、１４Ｃ、または３Ｈなどの放射性化合物も含まれる。識別可能なマーカーは、様々な供給源から市販されている。
【００６４】
蛍光標識、およびヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドへのそれらの付着は、Ｈａｕｇｌａｎｄ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、第９版（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、ユージーン、２００２）、ＫｅｌｌｅｒおよびＭａｎａｋ、ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅｓ、第２版（Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、ニューヨーク、１９９３）、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ、編集者、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ａｎａｌｏｇｕｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、オックスフォード、１９９１）、ならびにＷｅｔｍｕｒ、Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６：２２７−２５９（１９９１）を含む多くのを報告に記載される。本発明に適用可能な特定の方法論は、米国特許第４，７５７，１４１号、同第５，１５１，５０７号、および同第５，０９１，５１９号の参考文献の例に開示されている。一態様では、１つ以上の蛍光色素は、標識された標的配列のための標識として使用され、例えば、米国特許第５，１８８，９３４号（４，７−ジクロロフルオレセイン色素）、米国特許第５，３６６，８６０号（スペクトル分解性ローダミン色素）、米国特許第５，８４７，１６２号（４，７−ジクロロローダミン色素）、米国特許第４，３１８，８４６号（エーテル置換されたフルオレセイン色素）、米国特許第５，８００，９９６号（エネルギー伝達色素）、Ｌｅｅら、米国特許第５，０６６，５８０号（キサンチン染料）、米国特許第５，６８８，６４８号（エネルギー伝達染料）などによって開示されている。標識付けは、米国特許第６，３２２，９０１号、同第６，５７６，２９１号、同第６，４２３，５５１号、同第６，２５１，３０３号、同第６，３１９，４２６号、同第６，４２６，５１３号、同第６，４４４，１４３号、同第５，９９０，４７９号、同第６，２０７，３９２号、同第２００２／００４５０４５号、および同第２００３／００１７２６４号の特許および特許刊行物に開示されるように、量子ドットで行うことができる。本明細書で使用される場合、「蛍光標識」という用語は、１つ以上の分子の蛍光吸収および／または発光特性を通して情報を伝達するシグナル伝達部分を含む。そのような蛍光特性には、蛍光強度、蛍光寿命、発光スペクトル特性、エネルギー伝達などが含まれる。
【００６５】
ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列に容易に組み込まれる市販の蛍光ヌクレオチド類似体としては、これらに限定されないが、Ｃｙ３−ｄＣＴＰ、Ｃｙ３−ｄＵＴＰ、Ｃｙ５−ｄＣＴＰ、Ｃｙ５−ｄＵＴＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）、フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ、テトラメチルローダミン−６−ｄＵＴＰ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（商標）−５−ｄＵＴＰ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（商標）−７−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＦＬ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＴＲ−１４−ｄＵＴＰ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）−５−ｄＵＴＰ、ＯＲＥＧＯＮ  ＧＲＥＥＮＲ（商標）４８８−５−ｄＵＴＰ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（商標）−１２−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）６３０／６５０−１４−ｄＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）６５０／６６５−１４−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５３２−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５６８−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５９４−５−ｄＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ−ＦＬＵＯＲ（商標）５４６−１４−ｄＵＴＰ、フルオレセイン−１２−ＵＴＰ、テトラメチルロダーミン−６−ＵＴＰ、ＴＥＸＡＳ  ＲＥＤ（商標）−５−ＵＴＰ、ｍＣＨＥＲＲＹ、ＣＡＳＣＡＤＥ  ＢＬＵＥ（商標）−７−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＦＬ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ−１４−ＵＴＰ、ＢＯＤＩＰＹ（商標）ＴＲ−１４−ＵＴＰ、ＲＨＯＤＡＭＩＮＥ  ＧＲＥＥＮ（商標）−５−ＵＴＰ、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）４８８−５−ＵＴＰ、ＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５４６−１４−ＵＴＰ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーン）などが挙げられる。他のフルオロフォアを有するヌクレオチドのカスタム合成（Ｈｅｎｅｇａｒｉｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１８：３４５を参照されたい）についてのプロトコルは、当該技術分野で既知である。
【００６６】
合成後の付着に利用可能な他のフルオロフォアには、これらに限定されないが、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）３５０、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５３２、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５４６、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５６８、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）５９４、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）６４７、ＢＯＤＩＰＹ４９３／５０３、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ  Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ  ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ５６４／５７０、ＢＯＤＩＰＹ５７６／５８９、ＢＯＤＩＰＹ５８１／５９１、ＢＯＤＩＰＹ６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ６５０／６６５、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ、ダンシル、ＬｉｓｓａｍｉｎｅローダミンＢ、Ｍａｒｉｎａ  Ｂｌｕｅ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ４８８、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ５１４、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、ローダミン６Ｇ、ローダミングリーン、ローダミンレッド、テトラメチルローダミン、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ，Ｉｎｃ．、オレゴン州ユージーンから入手可能）、Ｃｙ２、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）などが挙げられる。ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ５、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＰＥ−Ａｌｅｘａ染料（６１０、６４７、６８０）、ＡＰＣ−Ａｌｅｘａ染料などを含むがこれらに限定されない、ＦＲＥＴタンデムフルオロフォアも使用することができる。
【００６７】
金属銀または金粒子を使用して、蛍光標識されたヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列からのシグナルを高めることができる（Ｌａｋｏｗｉｃｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ３４：６２）。
【００６８】
ビオチン、またはその誘導体も、ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列上の標識として使用され、その後、検出可能に標識されたアビジン／ストレプトアビジン誘導体（例えば、ヒコエリトリン接合されたストレプトアビジン）、または検出可能に標識された抗ビオチン抗体によって結合され得る。ジゴキシゲニンは、標識として組み込まれ、その後、検出可能に標識された抗ジゴキシゲニン抗体（例えば、フルオレセン化された抗ジゴキシゲニン）によって結合され得る。アミノアリール−ｄＵＴＰ残基は、オリゴヌクレオチド配列に組み込まれ、その後、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）誘導体化された蛍光色素に結合され得る。一般に、接合対の任意のメンバーは、検出可能に標識された接合パートナーが結合して、検出を可能にすることができることを条件として、検出オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る。本明細書で使用される場合、抗体という用語は、Ｆａｂなどの任意のクラスの抗体分子、またはその任意のサブ断片を指す。
【００６９】
オリゴヌクレオチド配列のための他の好適な標識には、フルオレセイン（ＦＡＭ）、ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）、ダンシル、ビオチン、ブロモデオキシウリジン（ＢｒｄＵ）、ヘキサヒスチジン（６×Ｈｉｓ）、リン−アミノ酸（例えば、Ｐ−ｔｙｒ、Ｐ−ｓｅｒ、Ｐ−ｔｈｒ）などが含まれる。一実施形態では、ビオチン／α−ビオチン、ジゴキシゲニン／α−ジゴキシゲニン、ジニトロフェノール（ＤＮＰ）／α−ＤＮＰ、５−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）／α−ＦＡＭの下のハプテン／抗体対が検出に使用され、各抗体は、検出可能な標識で誘導体化される。
【００７０】
ある特定の例示的な実施形態では、ヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチド配列は、例えば、米国特許第５，３４４，７５７号、同第５，７０２，８８８号、同第５，３５４，６５７号、同第５，１９８，５３７号、および同第４，８４９，３３６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９１／１７１６０号などに開示されるような、特に、捕捉剤によってその後結合されるハプテンで間接的に標識され得る。多くの異なるハプテン捕捉剤対が使用可能である。例示的なハプテンには、これらに限定されないが、ビオチン、デスビオチン、および他の誘導体、ジニトロフェノール、ダンシル、フルオレセイン、ＣＹ５、ジゴキシゲニンなどが含まれる。ビオチンについては、捕捉剤は、アビジン、ストレプトアビジン、または抗体であってもよい。抗体は、他のハプテンの捕捉剤として使用することができる（市販されている多くの染料−抗体対、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、オレゴン州ユージーン）。
【００７１】
細胞
本明細書に開示される方法は、無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定のための方法を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、細胞の集団に存在する。ある特定の他の実施形態では、細胞の集団は、これらに限定されないが、興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、および非神経性細胞を含む、複数の細胞型を含む。本発明のアッセイで使用するための細胞は、生物、生物由来の単一細胞型であり得るか、または細胞型の混合物であり得る。天然に存在する細胞および細胞集団、遺伝子操作された細胞株、トランスジェニック動物由来の細胞などが含まれる。事実上、いかなる細胞型およびサイズにも対応することができる。好適な細胞には、細菌、真菌、植物、および動物細胞が含まれる。本発明の一実施形態では、細胞は、哺乳類細胞、例えば、天然に存在する組織、例えば、血液、肝臓、膵臓、神経組織、骨髄、皮膚などの複雑な細胞集団である。いくつかの組織は、単分散懸濁液に分裂され得る。あるいは、細胞は、培養集団、例えば、複雑な集団に由来する培養物、細胞が多数の系統に分化した、または細胞が刺激に差別的に応答している、単一細胞型に由来する培養物であってもよい。
【００７２】
本発明で使用することができる細胞型としては、幹細胞および前駆細胞、例えば、胚幹細胞、造血幹細胞、間葉幹細胞、神経頂部細胞など、内皮細胞、筋肉細胞、心筋細胞、平滑筋および骨格筋細胞、間葉細胞、上皮細胞；Ｔｈ１Ｔ細胞、Ｔｈ２Ｔ細胞、ＴｈＯ  Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞などのＴ細胞を含むリンパ球などの造血細胞；Ｂ細胞、前Ｂ細胞など；単球；樹状細胞；好中球；およびマクロファージ；ナチュラルキラー細胞、肥満細胞など；脂肪細胞、甲状腺、内分泌腺、膵臓、脳、例えばニューロン、グリア、星状細胞、樹状細胞などの特定の臓器に関与する細胞、ならびにそれらの遺伝子組み換えされた細胞が挙げられる。造血細胞は、炎症過程、自己免疫疾患などに関連する場合があり、内皮細胞、平滑筋細胞、心筋細胞などは、心血管疾患と関連する場合があり、ほとんどのいかなる型の細胞も、肉腫、癌、およびリンパ腫などの腫瘍、肝細胞を有する肝疾患、腎細胞を有する腎臓疾患などと関連する場合がある。
【００７３】
細胞はまた、異なる型の形質転換された細胞または腫瘍性細胞、例えば、異なる細胞起源の肉腫、異なる細胞型のリンパ腫などであり得る。Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（バージニア州マナサス）は、１５０個以上の異なる種からの４，０００個を超える細胞株、７００個のヒト癌細胞株を含む９５０個を超える癌細胞株を収集し、利用可能にしている。Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅは、ヒト腫瘍細胞株の大パネルから臨床的、生化学的、および分子的データを蓄積しており、これらは、ＡＴＣＣまたはＮＣＩから入手可能である（Ｐｈｅｌｐｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  ２４：３２−９１）。自発的に派生したか、または個々の細胞株から所望の成長または応答特性に対して選択された異なる細胞株が含まれ、類似の腫瘍型に由来するが、異なる患者または部位に由来する多数の細胞株を含み得る。
【００７４】
細胞は、非付着細胞、例えば、単球、Ｔ細胞、Ｂ細胞を含む血球、腫瘍細胞など、または付着細胞、例えば、上皮細胞、内皮細胞、神経細胞などであり得る。付着細胞をプロファイルするために、それらは、プローブ分子を特定し、結合するそれらの能力を維持する様式で、それらが付着している基質から、および他の細胞から解離することができる。
【００７５】
そのような細胞は、当該技術分野で既知の様々な技術によって、様々な組織、例えば、血液、骨髄、固形組織（例えば、固形腫瘍）、腹水から、例えば、抽出、洗浄、洗い流す、外科的解離などを使用して個体から取得することができる。細胞は、固定または非固定、新鮮または冷凍、全部または分散された試料から得ることができる。組織の分散は、既知の技術を使用して機械的にまたは酵素的に生じ得る。
【００７６】
撮像
開示される方法は、いくつかの異なるタイプの顕微鏡法、例えば、共焦点顕微鏡法、２光子顕微鏡法、明視野顕微鏡法、無傷組織拡張顕微鏡法、および／またはＣＬＡＲＩＴＹ（商標）最適化光シート顕微鏡法（ＣＯＬＭ）のうちのいずれかを使用して、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像することを含む。
【００７７】
明視野顕微鏡法は、すべての光学顕微鏡技術のうち最も単純である。試料照明は、透過された白色光を介し、すなわち、下から照射され、上から観察される。限界には、焦点外の材料のぼやけによる、ほとんどの生体試料の低いコントラスト、および低い見かけ分解能が含まれる。技術の単純性および必要とされる最小限の試料調製は、大きな利点である。
【００７８】
傾斜照射顕微鏡法では、検体は、側面から照射される。これにより、画像に３次元の外観を与え、さもなければ見えない特徴を強調することができる。この方法に基づくより最近の技術は、細胞培養に使用するための倒立顕微鏡上で見られるシステムである、ホフマンの変調コントラストである。傾斜照明は、明視野顕微鏡法と同じ限界（焦点外の材料のぼやけによる、多くの生体試料の低いコントラスト、および低い見かけ分解能）を受けるが、それは、さもなければ見えない構造を強調し得る。
【００７９】
暗視野顕微鏡法は、染色されていない透明な検体のコントラストを改善するための技術である。暗視野照射は、慎重に整列された光源を使用して、画像平面に入る直接透過された（散乱していない）光の量を最小限に抑え、試料によって散乱された光のみを収集する。暗視野は、画像のコントラスト（特に透明なオブジェクトのコントラスト）を劇的に向上させるが、機器のセットアップや試料の調製をほとんど必要としない。しかしながら、この技術は、多くの生体試料の最終画像における低光量に苦しみ、低い見かけ分解能の影響を受け続けている。
【００８０】
位相コントラストは、光学顕微鏡照明技術であり、透明な試料を通過する光の位相シフトを画像中の輝度変化に変換するる。言い換えれば、位相コントラストは、屈折率の差をコントラストの差として示す。位相シフト自体は、人間の目には見えないが、輝度変化として示されると見えるようになる。
【００８１】
微分干渉コントラスト（ＤＩＣ）顕微鏡法では、光学密度の差が、レリーフの差として表示されるであろう。このシステムは、常光線および異常光線の光を分割するコンデンサ内の特別なプリズム（ノーマルスキープリズム、ウォラストンプリズム）から成る。２つの光線の間の空間差は、最小である（対物レンズの最大分解能未満）。検体を通過した後、光線は、対物レンズ内の同様のプリズムによって再結合される。均質な検体では、２つの光線の間に差はなく、コントラストは、生成されていない。しかしながら、屈折境界付近（例えば、細胞質内の核）では、常光線と異常光線との差により、画像中でレリーフが生成されるであろう。微分干渉コントラストは、偏光光源を機能させる必要があり、２つの偏光フィルタは、一方は、コンデンサ（偏光器）の下で、他方は、対物レンズ（分析器）の上で光路に適合しなければならない。
【００８２】
干渉を使用する別の顕微鏡技術は、干渉反射顕微鏡法（反射干渉コントラスト、またはＲＩＣとしても知られている）である。これは、異なる屈折率を有する２つの物質の間に界面があるときはいつでも、反射される狭範囲の波長の偏光を使用して、細胞のガラス表面への付着を調べるために使用される。細胞がガラス表面に接着しているときはいつでも、ガラスからの反射光および接着細胞からの反射光は、干渉するであろう。ガラスに細胞が接着していない場合、干渉は、存在しないであろう。
【００８３】
蛍光顕微鏡は、有機物質または無機物質の特性を研究するために、反射および吸収の代わりに、またはそれに加えて蛍光およびリン光を使用する光学顕微鏡である。蛍光顕微鏡法では、試料は、試料中の蛍光を励起する波長の光で照射される。通常、照明よりも長い波長である蛍光光は、次いで顕微鏡対物レンズを通して撮像される。この技術では、照明が単色に近く、正しい波長であることを保証する照明（または励起）フィルタ、および励起光源のいずれも検出器に到達しないことを保証する第２の発光（またはバリア）フィルタの２つのフィルタを使用することができる。あるいは、これらの機能は両方とも、単一の二色フィルタによって達成され得る。「蛍光顕微鏡」とは、それが、落射蛍光顕微鏡のようなより単純な設定であっても、光学切断を使用して、蛍光画像のより良い解像度を得る共焦点顕微鏡などのより複雑な設計であっても、蛍光を使用して、画像を生成する任意の顕微鏡を指す。
【００８４】
共焦点顕微鏡は、点照明、および検出器の前にある光学的に接合された平面中のピンホールを使用して、焦点外の信号を排除する。焦点面に非常に近い蛍光によって生成される光のみが検出可能であるため、画像の光学分解能は、特に試料の深度方向において、広視野顕微鏡のそれよりもはるかに優れている。しかしながら、試料の蛍光からの光の多くがピンホールで遮断されるため、この解像度の増加は、信号強度の低下を犠牲にしたものであり、長時間の曝露が必要となることが多い。試料中の１つの点のみが一度に照射されるため、２Ｄまたは３Ｄ撮像は、検体中の規則的なラスター（すなわち、平行走査ラインの矩形パターン）にわたって走査することを必要とする。焦点面の達成可能な厚さは、ほとんどの場合、使用された光の波長を対物レンズの数値開口率で割ったものによって定義されるが、検体の光学特性によっても定義される。可能な薄い光学的切断により、これらのタイプの顕微鏡は、特に試料の３Ｄ撮像および表面プロファイリングに優れたものになる。ＣＯＬＭは、大きい明確化された試料の高速３Ｄ撮像に代替の顕微鏡法を提供する。ＣＯＬＭは、大きな免疫染色された組織を調査し、取得の速度を向上させ、生成されたデータのより高い品質をもたらす。
【００８５】
光シート顕微鏡法としても知られている、単面照明顕微鏡法（ＳＰＩＭ）では、検出対物レンズの焦点面内のフルオロフォアのみが照射される。光シートは、一方向に視準が合い、他方向に焦点が合っている光線である。検出器の焦点面の外側でフルオロフォアが励起されないため、この方法は、固有の光学切断も提供する。さらに、従来の顕微鏡法と比較した場合、光シート法は、低減した光漂白および低い光毒性を示し、多くの場合、はるかに多くの１検体あたりの走査を可能にする。検体を回転させることによって、この技術は、実質的に、異なる角度から取得される多数のビューを有するいかなる平面をも撮像することができる。しかしながら、あらゆる角度に関して、検体の比較的浅いセクションのみが高解像度で撮像され、より深い領域は、ますますぼやけて見える。
【００８６】
超解像顕微鏡法は、光顕微鏡法の形態である。光の回折により、従来の光顕微鏡法の分解能は、１８７３年にＥｒｎｓｔ  Ａｂｂｅによって述べられたように制限される。達成可能な分解能の良好な近似値は、点拡散関数のＦＷＨＭ（半径最大時の全幅）であり、高数値のアパーチャおよび可視光を有する正確な広視野顕微鏡は、通常、約２５０ｎｍの分解能に達する。超解像技術は、回折限界よりも高い解像度の画像を取り込むことを可能にする。それらは、エバネッセント波に含有される情報を取り込む、「真の」超解像技術、ならびに超解像画像を再構築するために撮像される物質に対して実験技術および既知の限界を使用する、「機能的」超解像技術の２つの広範なカテゴリに分類される。
【００８７】
レーザー顕微鏡法は、様々な形態の顕微鏡法でレーザー照明源を使用する。例えば、生物学的用途に焦点を当てたレーザー顕微鏡法は、非線形顕微鏡法、飽和顕微鏡法、および２光子励起顕微鏡法（例えば、１ミリメートルの非常に高深度まで生体組織の撮像を可能にする蛍光撮像技術）などの多光子蛍光顕微鏡法を含むいくつかの技術において、超短波パルスレーザー、またはフェムト秒レーザーを使用する。
【００８８】
電子顕微鏡法（ＥＭ）では、電子光線を使用して、検体を照射し、拡大画像を生成する。電子顕微鏡は、電子が可視光（光子）より約１００，０００倍の短い波長を有するため、光動力光学顕微鏡よりも大きな解像力を有する。それらは、５０ｐｍ超の分解能および最大約１０，０００，０００倍の倍率を達成することができるが、通常の非焦点光顕微鏡は、回折によって、約２００ｎｍの分解能および２０００倍を下回る有用な倍率に制限される。電子顕微鏡は、静電気および電磁「レンズ」を使用して、電子光線を制御し、それに焦点を合わせて、画像を形成する。これらのレンズは、検体上または検体を通して光を集束することによって拡大画像を形成する光学顕微鏡のガラスレンズに類似するが、それとは異なる。電子顕微鏡を使用して、微生物、細胞、大分子、生検試料、金属、および結晶を含む幅広い生物学的検体および無機検体を観察する。産業的には、電子顕微鏡は、品質管理および故障分析にしばしば使用される。電子顕微鏡法の例としては、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）、走査電子顕微鏡法（ＳＥＭ）、反射電子顕微鏡法（ＲＥＭ）、走査透過型電子顕微鏡法（ＳＴＥＭ）、および低電圧電子顕微鏡法（ＬＶＥＭ）が挙げられる。
【００８９】
走査プローブ顕微鏡法（ＳＰＭ）は、検体を走査する物理プローブを使用して表面の画像を形成する顕微鏡の分科である。表面の画像は、検体のラスター走査でプローブを機械的に移動させ、ラインごとに、プローブ表面相互作用を位置の関数として記録することによって取得される。ＳＰＭの例としては、原子力顕微鏡法（ＡＴＭ）、弾道電子放射顕微鏡法（ＢＥＥＭ）、化学力顕微鏡法（ＣＦＭ）、導電性原子力顕微鏡法（Ｃ−ＡＦＭ）、電気化学走査トンネリング顕微鏡（ＥＣＳＴＭ）、静電力顕微鏡法（ＥＦＭ）、流体力顕微鏡法（ＦｌｕｉｄＦＭ）、力変調顕微鏡法（ＦＭＭ）、機能指向走査プローブ顕微鏡法（ＦＯＳＰＭ）、ケルビンプローブ力顕微鏡法（ＫＰＦＭ）、磁力顕微鏡法（ＭＦＭ）、磁気共鳴力顕微鏡法（ＭＲＦＭ）、近視野走査光学顕微鏡法（ＮＳＯＭ）（またはＳＮＯＭ、走査近視野光学顕微鏡法、ＳＮＯＭ、圧電応答力顕微鏡法（ＰＦＭ）、ＰＳＴＭ、光子走査トンネリング顕微鏡法（ＰＳＴＭ）、ＰＴＭＳ、光熱顕微分光法／顕微鏡法（ＰＴＭＳ）、ＳＣＭ、走査容量顕微鏡法（ＳＣＭ）、ＳＥＣＭ、走査電気化学顕微鏡法（ＳＥＣＭ）、ＳＧＭ、走査ゲート顕微鏡法（ＳＧＭ）、ＳＨＰＭ、走査ホールプローブ顕微鏡法（ＳＨＰＭ）、ＳＩＣＭ、走査イオン伝導顕微鏡法（ＳＩＣＭ）、ＳＰＳＭスピン偏光走査トンネリング顕微鏡法（ＳＰＳＭ）、ＳＳＲＭ、走査拡散抵抗顕微鏡法（ＳＳＲＭ）、ＳＴｈＭ、走査熱顕微鏡法（ＳＴｈＭ）、ＳＴＭ、走査トンネリング顕微鏡法（ＳＴＭ）、ＳＴＰ、走査トンネリング電位差測定法（ＳＴＰ）、ＳＶＭ、走査電圧顕微鏡法（ＳＶＭ）、およびシンクロトロンＸ線走査トンネリング顕微鏡法（ＳＸＳＴＭ）が挙げられる。
【００９０】
無傷組織拡張顕微鏡法（ｅｘＭ）により、約７０ｎｍの方位分解能を有する厚い保存検体の撮像が可能になる。ＥｘＭを使用すると、撮像前に生体検体を物理的に拡張することによって、光学回折限界が回避され、したがってサブ回折限界された構造を、従来の回折限界された顕微鏡によって視認可能なサイズ範囲に持ち込む。ＥｘＭは、回折限界された顕微鏡のボクセル速度で、ただし超分解能顕微鏡のボクセルサイズで、生体検体を撮像することができる。膨張した試料は、透明であり、膨張した材料が＞９９％水であるため、屈折率が水に整合している。拡張顕微鏡法の技術は、例えば、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｑ＆Ａ：Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ，ＢＭＣ  Ｂｉｏｌ．２０１７；１５：５０に開示されるように、当該技術分野で知られている。
【００９１】
スクリーニング方法
本明細書に開示される方法はまた、候補薬剤をスクリーニングして、候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節するかどうかを判定する方法を提供し、この方法は、（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることであってプライマー対が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、標的核酸の第１の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、標的核酸の第２の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域に隣接する、接触させることと、（ｂ）リガーゼを添加して、第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することと、（ｃ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、（ｄ）１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下で埋め込んで、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、（ｅ）ライゲーションを可能にする条件下で、バーコード配列を有する１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、ライゲーションが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、（ｆ）ステップ（ｅ）を何度も繰り返すことと、（ｇ）１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、（ｈ）標的核酸の遺伝子の発現のレベルを検出することであって、少なくとも１つの候補薬剤の不在下における標的核酸の発現のレベルに対する、少なくとも１つの候補薬剤の存在下における標的核酸の発現のレベルの変化が、少なくとも１つの候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節することを示す、検出することと、を含む。そのようなスクリーニング方法は、本明細書に提供されるＳＴＡＲｍａｐのステップを含む。
【００９２】
いくつかの態様では、検出することは、フローサイトメトリー、配列決定、プローブ結合および電気化学的検出、ｐＨ変化、ＤＮＡタグに結合した酵素によって誘発される触媒作用、量子絡み、ラマン分光法、テラヘルツ波技術、および／または走査電子顕微鏡法を実行することを含む。ある特定の態様では、フローサイトメトリーは、質量サイトメトリーまたは蛍光活性化フローサイトメトリーである。いくつかの他の態様では、検出することは、顕微鏡法、走査質量分析、または本明細書に記載される他の撮像技術を実行することを含む。そのような態様では、検出することは、シグナル、例えば、蛍光シグナルを決定することを含む。
【００９３】
本明細書において互換的に使用される「試験剤」、「候補薬剤」、および文法上の同等物とは、対象アッセイにおいて活性について試験される任意の分子（例えば、タンパク質（本明細書においてタンパク質、ポリペプチド、およびペプチドを含む）、小分子（すなわち、５〜１０００Ｄａ、１００〜７５０Ｄａ、２００〜５００Ｄａ、または５００Ｄａ未満のサイズ）、または有機もしくは無機分子、多糖、ポリヌクレオチドなど）を意味する。
【００９４】
様々な異なる候補薬剤を、上記の方法によってスクリーニングすることができる。候補薬剤は、多数の化学クラス、例えば、５０ダルトン超（例えば、少なくとも約５０Ｄａ、少なくとも約１００Ｄａ、少なくとも約１５０Ｄａ、少なくとも約２００Ｄａ、少なくとも約２５０Ｄａ、または少なくとも約５００Ｄａ）および約２０，０００ダルトン未満、約１０，００ダルトン未満、約５，０００ダルトン未満、または約２，５００ダルトン未満の分子量を有する小有機化合物を包含する。例えば、いくつかの実施形態では、好適な候補薬剤は、約５００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａ、例えば、約５００Ｄａ〜約１０００Ｄａ、約１０００Ｄａ〜約２０００Ｄａ、約２０００Ｄａ〜約２５００Ｄａ、約２５００Ｄａ〜約５０００Ｄａ、約５０００Ｄａ〜約１０，０００Ｄａ、または約１０，０００Ｄａ〜約２０，０００Ｄａの範囲の分子量を有する有機化合物である。
【００９５】
候補薬剤は、タンパク質との構造的相互作用、例えば、水素結合に必要な官能基を含むことができ、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、もしくはカルボキシル基、または官能性化学基のうちの少なくとも２つを含むことができる。候補薬剤は、上記の官能基のうちの１つ以上で置換された環状炭素もしくは複素環式構造、および／または芳香族もしくはポリ芳香族構造を含むことができる。候補薬剤は、ペプチド、糖類、脂肪酸、ステロイド、プリン、ピリミジン、それらの誘導体、構造類似体、またはそれらの組み合わせを含む生体分子の中にも見られる。
【００９６】
候補薬剤は、合成化合物または天然化合物のライブラリを含む多種多様な供給源から得られる。例えば、無作為化オリゴヌクレオチドおよびオリゴペプチドの発現を含む、多種多様な有機化合物および生体分子のランダムおよび指向性合成のための多数の手段が利用可能である。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリが入手可能であるか、または容易に生成される。加えて、天然または合成により生成されたライブラリおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を通じて容易に修飾され、組み合わせライブラリを生成するために使用することができる。既知の薬理剤を、アシル化、アルキル化、エステル化、アミド化などの指向性またはランダムな化学修飾に供して、構造類似体を生成してもよい。さらに、スクリーニングは、既知の薬理活性化合物およびそれらの化学類似体に、または合理的な薬物設計によって作成されるものなどの未知の特性を有する新しい薬剤に向けられ得る。
【００９７】
一実施形態では、候補モジュレータは、合成化合物である。ランダム化されたオリゴヌクレオチドの発現を含む多種多様な有機化合物および生体分子のランダムおよび指向性合成には、任意の数の技術が利用可能である。例えば、ランダム化学法ならびに酵素法を含む、新しい化合物を生成するための方法を考察する、参照により本明細書に明示的に組み込まれる、ＷＯ９４／２４３１４を参照されたい。
【００９８】
別の実施形態では、候補薬剤は、入手可能であるか、または容易に生成される細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリとして提供される。加えて、天然または合成により生成されたライブラリおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的手段を通じて容易に修飾される。既知の薬理学的薬剤を、酵素修飾を含む指向性またはランダムな化学修飾に供して、構造的類似体を生成してもよい。
【００９９】
一実施形態では、候補薬剤は、タンパク質（抗体、抗体断片（すなわち、抗原結合領域、一本鎖抗体などを含有する断片）、核酸、および化学部分を含む。一実施形態では、候補薬剤は、天然に存在するタンパク質または天然に存在するタンパク質の断片である。したがって、例えば、タンパク質を含有する細胞抽出物、またはタンパク質性細胞抽出物のランダムまたは指向性消化物を試験してもよい。このようにして、スクリーニングのために原核タンパク質および真核タンパク質のライブラリを作製することができる。他の実施形態は、細菌、真菌、ウイルス、および哺乳動物タンパク質（例えば、ヒトタンパク質）のライブラリを含む。
【０１００】
一実施形態では、候補薬剤は、有機部分である。この実施形態では、ＷＯ９４／２４３１４に概して記載されるように、候補薬剤は、化学修飾され得る一連の基質から合成される。本明細書における「化学修飾される」には、従来の化学反応、ならびに酵素反応が含まれる。これらの基質としては、一般に、これらに限定されないが、アルキル基（アルカン、アルケン、アルキン、およびヘテロアルキルを含む）、アリール基（アレンおよびヘテロアリールを含む）、アルコール、エーテル、アミン、アルデヒド、ケトン、酸、エステル、アミド、環状化合物、複素環式化合物（プリン、ピリミジン、ベンゾジアゼピン、ベータ−ラクタム、テトラシリン、セファロスポリン、および炭水化物を含む）、ステロイド（エストロゲン、アンドロゲン、コルチゾン、エコジソンなどを含む）、アルカロイド（エルゴット、ビンカ、キュレール、ピロリジン、およびマイトマイシンを含む）、有機金属化合物、ヘテロ原子担持化合物、アミノ酸、およびヌクレオシドが挙げられる。化学反応（酵素反応を含む）を部分上で行って、次いで本発明を使用して試験することができる新しい基質または候補薬剤を形成してもよい。
【０１０１】
デバイスおよびシステム
本方法の態様を実行するためのデバイスも含まれる。本デバイスは、例えば、撮像チャンバ、電気泳動装置、フローチャンバ、顕微鏡、針、チューブ、ポンプを含み得る。
【０１０２】
本開示はまた、本方法を実行するためのシステムを提供する。システムは、本明細書に記載されるモジュール、例えば、電源、冷蔵ユニット、廃棄物、加熱ユニット、ポンプなどのうちの１つ以上を備え得る。システムはまた、本明細書に記載される試薬、例えば、撮像バッファー、洗浄バッファー、ストリップバッファー、ＮｉｓｓｌおよびＤＡＰＩ溶液のうちのいずれかを含み得る。特定の実施形態によるシステムはまた、顕微鏡および／または関連する撮像機器、例えば、カメラの構成要素、デジタル撮像構成要素、および／または画像取り込み機器、１つ以上のユーザ入力に従って画像を収集するように構成されたコンピュータプロセッサなどを備え得る。
【０１０３】
上で考察されたように、本明細書に記載されるシステムは、撮像チャンバおよびポンプを有する流体デバイスと、本明細書に記載される無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定のための方法を実行するように構成されたプロセッサユニットとを備える。いくつかの実施形態では、このシステムは、ＳＴＡＲｍａｐの自動化を可能にし、それは、これらに限定されないが、ゲルに埋め込まれたＤＮＡでのプローブのハイブリダイゼーションの反復ラウンド、これらのプローブ上での蛍光標識されたオリゴヌクレオチドのライゲーション、過剰なプローブを洗い流すこと、撮像すること、および次のラウンドの配列決定のためにプローブを剥離することを含むように本明細書に記載されるプロセスである。いくつかの実施形態では、システムは、連続動作を可能にし得る。いくつかの実施形態では、システムは、試料上のインサイチュＤＮＡ配列決定に関与する配列決定化学物質を流すための撮像チャンバを備える。いくつかの実施形態では、流体およびポンプのシステムは、試料への配列決定化学物質の送達を制御する。
【０１０４】
緩衝液は、１つ以上のポート、および任意選択で、チューブ、ポンプ、バルブ、または任意の他の好適な流体取り扱いおよび／または流体操作機器、例えば、デバイスの１つ以上の構成要素に取り外し可能に取り付けられるか、または永久的に取り付けられるチューブの使用によって追加／除去／再循環／交換され得る。例えば、第１および第２の端部を有する第１のチューブは、第１のポートに取り付けることができ、第１および第２の端部を有する第２のチューブは、第２のポートに取り付けることができ、第１のチューブの第１の端部は、第１のポートに取り付けられ、第１のチューブの第２の端部は、レセプタクル、例えば、冷却ユニット、加熱ユニット、濾過ユニット、廃棄物レセプタクルなどに作動可能に連結され、第２のチューブの第１の端部は、第２のポートに取り付けられ、第２のチューブの第２の端部は、レセプタクル、例えば、冷却ユニット、氷上ビーカー、濾過ユニット、廃棄物レセプタクルなどに作動可能に連結される。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、システムは、命令を有する非一過性コンピュータ可読記憶媒体を備え、命令は、プロセッサユニットによって実行されると、プロセッサユニットに、化学物質の送達を制御させ、このプロセスを顕微鏡と同期させる。いくつかの実施形態では、非一時的コンピュータ可読記憶媒体は、プロセッサユニットによって実行されると、プロセッサユニットに、光学シグナルを測定させる命令を含む。
【０１０６】
ユーティリティ
本明細書のデバイス、方法、および、システムは、当該技術分野において、例えば、生物医学的研究および／または臨床診断におけるいくつかの使用法を見出す。例えば、生物医学的研究では、適用には、これらに限定されないが、基礎生物学または薬物スクリーニングのための空間分解された遺伝子発現分析が含まれる。臨床診断では、適用には、これらに限定されないが、患者試料についての疾患、免疫応答、細菌またはウイルスＤＮＡ／ＲＮＡなどの遺伝子マーカーを検出することが含まれる。本明細書に記載される方法の利点の例としては、生の試料から最終データを取得するのにわずか３日または４日しかかからず、既存のマイクロアレイまたは配列決定技術よりもはるかに速い速度を提供する効率、高度に多重化されている（最大１０００個の遺伝子）、単一細胞および単一分子感度、保存された組織形態、ならびに／または低いエラー率を伴う高いシグナル対ノイズ比が挙げられる。
【０１０７】
特定の態様では、ＳＴＡＲｍａｐは、マウス視覚皮質における分子定義された細胞型および活性調節された遺伝子発現の研究に適用することができ、皮質ニューロンの短距離および長距離空間的構成を、以前にアクセス可能ではなかった体積スケールで可視化するために、より大きな３Ｄ組織ブロックに拡張可能であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、高度に多重化されたタンパク質検出のためのＤＮＡ接合された抗体に適合され得る。
【０１０８】
本発明のデバイス、方法、およびシステムは、多様な組織におけるいくつかの不均質な細胞集団を研究するために一般化することもできる。いかなる科学的理論にも拘束されることなく、脳は、ＳＴＡＲｍａｐ分析に適した特別な課題をもたらす。例えば、異なる細胞型にわたって観察される多型の活性調節された遺伝子（ＡＲＧ）発現は、内在性細胞生物学的特性（シグナル伝達経路成分発現など）、および外部感覚情報を異なる細胞（ここでは視覚皮質）に送る神経回路生体構造などの外在性特性の両方に依存する可能性が高い。そのような場合、ＳＴＡＲｍａｐによって例示されるインサイチュトランスクリプトトミクスは、撮像に基づく分子情報を、解剖学的情報および活動情報と効果的にリンクさせることができ、したがって、脳機能および機能障害を解明する。
【０１０９】
本明細書に開示されるデバイス、方法、およびシステムは、細胞成分、例えば、通常は、構造的支持を提供するが、サブ細胞タンパク質および分子の視覚化を妨げる脂質が除去されることを可能にし、同時に、試料が組織の超構造を物理的に支持するヒドロゲルに架橋されているため、細胞および組織の３次元構築物を維持する。この除去は、実質的に、生体検体の内部を光および／または巨大分子に対して透過性にし、検体、例えば、細胞および細胞下構造の内部を、組織の時間のかかる破壊的切断を伴わずに顕微鏡的に可視化することを可能にする。典型的には別個のステップで実施される一掃および透過化が、細胞成分を除去する単一のステップで組み合わせることができるため、この手順は、当該技術分野で一般的に使用される手順よりも速い。加えて、包括的な分析のために、検体は、反復的に染色される、染色されない、および他の試薬で再染色され得る。重合性アクリルアミド部分によるさらなる官能化により、アンプリコンが多数の部位でポリアクリルアミドネットワーク内に共有結合的に固定されることが可能になる。
【０１１０】
一例では、本デバイス、方法、およびシステムは、疾患を評価、診断、または監視するために用いることができる。本明細書で使用される場合、「診断」には、概して、対象の疾患または障害に対する感受性の予測、対象が現在疾患または障害に罹患しているかどうかの判定、疾患または障害に罹患している対象の予後（例えば、癌状態の特定、癌の段階、患者が癌により死ぬ可能性）、疾患または障害の治療に対する対象の応答性の予測（例えば、同種造血幹細胞移植、化学療法、放射線療法、抗体療法、小分子化合物療法などに対する陽性応答、陰性応答、全く応答なし）、および治療測定の使用（例えば、治療の効果または有効性に関する情報を提供するために対象の状態を監視する）が含まれる。例えば、生検は、癌組織から調製され、癌のタイプ、癌が発症した範囲、癌が治療的介入に応答するかどうかなどを決定するために顕微鏡的に分析され得る。
【０１１１】
本デバイス、方法、およびシステムは、候補の治療薬を、組織または疾患に対するそれらの効果についてスクリーニングするための有用な技術も提供する。例えば、対象、例えば、マウス、ラット、イヌ、霊長類、ヒトなどを、候補薬剤と接触させてもよく、その臓器または生検を、本方法によって調製してもよく、１つ以上の細胞または組織パラメータについて顕微鏡的に分析された調製された検体。パラメータは、細胞または組織の定量化可能な構成要素、特に、望ましくは高スループットシステムで正確に測定することができる構成要素である。パラメータは、細胞表面決定基、受容体、タンパク質、またはその立体構造もしくは翻訳後修飾、脂質、炭水化物、有機もしくは無機分子、核酸、例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡなど、またはそのような細胞成分に由来する部分、またはこれらの組み合わせを含む、任意の細胞成分もしくは細胞生成物であり得る。ほとんどのパラメータは、定量的読み出しを提供するが、場合によっては、半定量的または定性的な結果が許容されるであろう。読み出しは、単一の決定された値を含んでもよく、または平均、中央値、もしくは分散などを含んでもよい。特徴的に、パラメータ読み出し値の範囲は、複数の同じアッセイから各パラメータについて取得されるであろう。可変性が予期され、試験パラメータのセットの各々についての値の範囲は、単一の値を提供するために使用される共通の統計的方法と共に標準的な統計的方法を使用して取得されるであろう。したがって、例えば、１つのそのような方法は、細胞生存率、組織血管形成、免疫細胞浸潤の存在、疾患の進行を変化させる際の有効性などを検出することを含み得る。いくつかの実施形態では、スクリーンは、分析されたパラメータ（複数可）を、対照または参照試料、例えば、候補薬剤と接触していない対象から同様に調製された検体からのものと比較することを含む。スクリーニングのための目的の候補薬剤としては、多くの化学クラス、主に、有機金属分子を含み得る有機分子、無機分子、遺伝子配列などを包含する既知および未知の化合物が挙げられる。スクリーニングのための目的の候補薬剤には、核酸、例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、アンチセンス分子、もしくはｍｉＲＮＡをコードする核酸、またはポリペプチドをコードする核酸も含まれる。本発明の重要な態様は、毒性試験などを含む候補薬物を評価することである。本方法を使用する組織試料の評価には、例えば、遺伝子解析、転写解析、ゲノム解析、プロテオミック解析、および／または代謝解析が含まれ得る。
【０１１２】
本デバイス、方法、およびシステムはまた、サブ細胞分解能で
、例えば、染色体異常（反転、複製、転座など）、遺伝子ヘテロ接合性の喪失、疾患または良好な健康に対する素因を示す遺伝子の対立遺伝子の存在、療法に対する応答性の可能性、祖先などの、組織全体における遺伝的にエンコードされたマーカーの分布を可視化するために使用され得る。そのような検出は、例えば、上述のような疾患の診断およびモニタリング、個別化された医薬、ならびに父子関係の研究において使用され得る。
【０１１３】
分析情報のデータベースを蓄積することができる。これらのデータベースは、既知の細胞型からの結果、特定の条件下で処理された細胞の分析からの参照などを含み得る。データマトリックスを生成することができ、データマトリックスの各点は、細胞からの読み出しに対応し、各細胞についてのデータは、多数の標識からの読み出しを含み得る。読み出しは、平均、中央値、もしくは分散、または測定値に関連する他の統計的または数学的に導出された値であり得る。出力読み出し情報は、対応する参照読み出しと直接比較することによってさらに精密化され得る。同一の条件下で各出力について得られた絶対値は、生体系に内在する変動性を表示し、個々の細胞変動性ならびに個体間に内在する変動性も反映する。
【０１１４】
本開示の非限定的態様の例
上記の本主題の態様（実施形態を含む）は、単独で、または１つ以上の他の態様または実施形態と組み合わせて有益であり得る。前述の説明を限定することなく、１〜８９の番号が付いた本開示の特定の非限定的態様が以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかになるように、個別に番号付けされた態様の各々は、先行する、または以下の個別に番号付けされた態様のいずれかと共に使用または組み合わされてもよい。これは、態様のすべてのそのような組み合わせを支持することを意図しており、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに限定されない。
１．無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定のための方法であって、
（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることであって、
プライマー対は第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、
第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、
第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域は、標的核酸の第１の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域は、第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域は、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域は、標的核酸の第２の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域は、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域に隣接しており、
（ｂ）リガーゼを添加して、第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することと、
（ｃ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、
（ｄ）１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下に埋め込み、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、
（ｅ）ライゲーションを可能にする条件下で、バーコード配列を有する１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、ライゲーションは、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、
（ｆ）ステップ（ｅ）を何度も繰り返すことと、
（ｇ）１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、を含む、方法。
２．一対のプライマーが、試料と接触させる前に加熱することによって変性する、態様１に記載の方法。
３．細胞が、細胞の集団内に存在する、態様１または２に記載の方法。
４．細胞の集団が、複数の細胞型を含む、態様３に記載の方法。
５．固定され、透過処理された無傷組織を接触させることが、一対のプライマーを同じ標的核酸にハイブリダイズさせることを含む、態様１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．標的核酸が、ＲＮＡである、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
７．ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、態様６に記載の方法。
８．標的核酸が、ＤＮＡである、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
９．第２のオリゴヌクレオチドが、パドロックプローブを含む、態様１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、態様１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、態様１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、態様１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
１３．第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、態様１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、態様１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、態様１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端を含む、態様１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端を含む、態様１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域に隣接する、態様１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．第２のオリゴヌクレオチドのバーコード配列が、標的核酸の特定のためのバーコード情報を提供する、態様１〜１８のいずれか１つに記載の方法。
２０．固定され、透過処理された無傷組織を接触させることが、異なる標的核酸に対する特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせることを含む、態様１〜１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．第２のオリゴヌクレオチドが、閉じた核酸環として提供され、リガーゼを添加するステップが、省略される、態様１に記載の方法。
２２．オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が、溶液中のライゲーションを最小限に抑えるように選択される、態様１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．リガーゼを添加することが、ＤＮＡリガーゼを添加することを含む、態様１〜２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．核酸分子が、アミン修飾されたヌクレオチドを含む、態様１〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．アミン修飾されたヌクレオチドが、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分修飾を含む、態様２４に記載の方法。
２６．埋め込むことが、１つ以上のアンプリコンをアクリルアミドと共重合させることを含む、態様１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．埋め込むことが、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを清澄化することを含み、標的核酸が、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコン中に実質的に保持される、態様１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．清澄化することが、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから複数の細胞成分を実質的に除去することを含む、態様２７に記載の方法。
２９．清澄化することが、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから脂質を実質的に除去することを含む、態様２７または２８に記載の方法。
３０．第３のオリゴヌクレオチドが、塩基を解読するように構成されている、態様１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．第４のオリゴヌクレオチドが、解読された塩基をシグナルに変換するように構成されている、態様１〜３０のいずれか１つに記載の方法。
３２．シグナルが、蛍光シグナルである、態様３１に記載の方法。
３３．１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることが、配列決定が進むにつれて、エラーの蓄積を排除することを含む、態様１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．撮像することが、共焦点顕微鏡法、２光子顕微鏡法、明視野顕微鏡法、無傷組織拡張顕微鏡法、および／またはＣＬＡＲＬＩＴＹ（商標）最適化光シート顕微鏡法（ＣＯＬＭ）を使用して１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像することを含む、態様１〜３３のいずれか１つに記載の方法。
３５．無傷組織が、薄い切片である、態様１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
３６．無傷組織が、５〜２０μｍの厚さを有する、態様３５に記載の方法。
３７．１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることが、４回以上生じる、態様３５または３６に記載の方法。
３８．１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることが、５回以上生じる、態様３５または３６に記載の方法。
３９．無傷組織が、厚い切片である、態様１〜３４のいずれか１つに記載の方法。
４０．無傷組織が、５０〜２００μｍの厚さを有する、態様３９に記載の方法。
４１．１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることが、６回以上生じる、態様３９または４０に記載の方法。
４２．１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることが、７回以上生じる、態様３９または４０に記載の方法。
４３．候補薬剤をスクリーニングして、候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節するかどうかを判定する方法であって、
（ａ）特異的ハイブリダイゼーションを可能にする条件下で、固定され、透過処理された無傷組織を少なくとも一対のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させることであって、
プライマー対が、第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドを含み、
第１のオリゴヌクレオチドおよび第２のオリゴヌクレオチドの各々が、第１の相補性領域、第２の相補性領域、および第３の相補性領域を含み、第２のオリゴヌクレオチドが、バーコード配列をさらに含み、
第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補領域が、標的核酸の第１の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補領域に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補領域に相補的であり、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補領域が、標的核酸の第２の部分に相補的であり、第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補領域に隣接する、接触させることと、
（ｂ）リガーゼを添加して、第２のオリゴヌクレオチドをライゲーションし、閉じた核酸環を生成することと、
（ｃ）核酸分子の存在下でローリングサークル増幅を実行することであって、第２のオリゴヌクレオチドを鋳型として、そして第１のオリゴヌクレオチドをポリメラーゼのためのプライマーとして使用して、１つ以上のアンプリコンを形成することを含む、実行することと、
（ｄ）１つ以上のアンプリコンをヒドロゲルサブユニットの存在下に埋め込み、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを形成することと、
（ｅ）ライゲーションを可能にする条件下で、バーコード配列を有する１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを一対のプライマーと接触させることであって、一対のプライマーが、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドを含み、ライゲーションは、第３のオリゴヌクレオチドおよび第４のオリゴヌクレオチドの両方が同じアンプリコンにライゲーションするときにのみ生じる、接触させることと、
（ｆ）ステップ（ｅ）を何度も繰り返すことと、
（ｇ）１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像して、無傷組織内の細胞における標的核酸のインサイチュ遺伝子配列決定を判定することと、
（ｈ）標的核酸の遺伝子の発現のレベルを検出することであって、少なくとも１つの候補薬剤の不在下における標的核酸の発現のレベルに対する、少なくとも１つの候補薬剤の存在下における標的核酸の発現のレベルの変化が、少なくとも１つの候補薬剤が無傷組織内の細胞における核酸の遺伝子発現を調節することを示す、検出することと、を含む、方法。
４４．一対のプライマーが、試料と接触させる前に加熱することによって変性する、態様４３に記載の方法。
４５．細胞が、細胞の集団内に存在する、態様４３または４４に記載の方法。
４６．細胞の集団が、複数の細胞型を含む、態様４５に記載の方法。
４７．固定され、透過処理された無傷組織を接触させることが、一対のプライマーを同じ標的核酸にハイブリダイズさせることを含む、態様４３〜４６のいずれか１つに記載の方法。
４８．標的核酸が、ＲＮＡである、態様４３〜４７のいずれか１つに記載の方法。
４９．ＲＮＡが、ｍＲＮＡである、態様４８に記載の方法。
５０．標的核酸が、ＤＮＡである、態様４３〜４７のいずれか１つに記載の方法。
５１．第２のオリゴヌクレオチドが、パドロックプローブを含む、態様４３〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．第１のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、態様４３〜５１のいずれか１つに記載の方法。
５３．第１のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、態様４３〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．第１のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、態様４３〜５３のいずれか１つに記載の方法。
５５．第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、態様４３〜５４のいずれか１つに記載の方法。
５６．第２のオリゴヌクレオチドの第２の相補性領域が、１９〜２５個のヌクレオチドの長さを有する、態様４３〜５５のいずれか１つに記載の方法。
５７．第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、６個のヌクレオチドの長さを有する、態様４３〜５６のいずれか１つに記載の方法。
５８．第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの５’末端を含む、態様４３〜５７のいずれか１つに記載の方法。
５９．第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの３’末端を含む、態様４３〜５８のいずれか１つに記載の方法。
６０．第２のオリゴヌクレオチドの第１の相補性領域が、第２のオリゴヌクレオチドの第３の相補性領域に隣接する、態様４３〜５９のいずれか１つに記載の方法。
６１．第２のオリゴヌクレオチドのバーコード配列が、標的核酸の特定のためのバーコード情報を提供する、態様４３〜６０のいずれか１つに記載の方法。
６２．固定され、透過処理された無傷組織を接触させることが、異なる標的核酸に対する特異性を有する複数のオリゴヌクレオチドプライマーをハイブリダイズさせることを含む、態様４３〜６１のいずれか１つに記載の方法。
６３．第２のオリゴヌクレオチドが、閉じた核酸環として提供され、リガーゼを添加するステップが、省略される、態様４３に記載の方法。
６４．オリゴヌクレオチドの融解温度（Ｔｍ）が、溶液中のライゲーションを最小限に抑えるように選択される、態様４３〜６３のいずれかに記載の方法。
６５．リガーゼを添加することが、ＤＮＡリガーゼを添加することを含む、態様４３〜６４のいずれか１つに記載の方法。
６６．核酸分子が、アミン修飾されたヌクレオチドを含む、態様４３〜６５のいずれか１つに記載の方法。
６７．アミン修飾されたヌクレオチドが、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分修飾を含む、態様６６に記載の方法。
６８．埋め込むことが、１つ以上のアンプリコンをアクリルアミドと共重合させることを含む、態様４３〜６７のいずれか１つに記載の方法。
６９．埋め込むことが、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを清澄化することを含み、標的核酸が、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコン中に実質的に保持される、態様４３〜６８のいずれか１つに記載の方法。
７０．清澄化することが、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから複数の細胞成分を実質的に除去することを含む、態様６９に記載の方法。
７１．清澄化することが、１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンから脂質を実質的に除去することを含む、態様６９または７０に記載の方法。
７２．第３のオリゴヌクレオチドが、塩基を解読するように構成されている、態様４３〜７１のいずれか１つに記載の方法。
７３．第４のオリゴヌクレオチドが、解読された塩基をシグナルに変換するように構成されている、態様４３〜７２のいずれか１つに記載の方法。
７４．シグナルが、蛍光シグナルである、態様７３に記載の方法。
７５．１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることが、配列決定が進むにつれて、エラーの蓄積を排除することを含む、態様４３〜７４のいずれか１つに記載の方法。
７６．撮像することが、共焦点顕微鏡法、２光子顕微鏡法、明視野顕微鏡法、無傷組織拡張顕微鏡法、および／またはＣＬＡＲＩＴＹ（商標）最適化光シート顕微鏡法（ＣＯＬＭ）を使用して１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを撮像することを含む、態様４３〜７５のいずれか１つに記載の方法。
７７．無傷組織が、薄い切片である、態様４３〜７６のいずれか１つに記載の方法。
７８．無傷組織が、５〜２０μｍの厚さを有する、態様７７に記載の方法。
７９．１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることが、４回以上生じる、態様７７または７８に記載の方法。
８０．１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることが、５回以上生じる、態様７７または７８に記載の方法。
８１．無傷組織が、厚い切片である、態様４３〜７６のいずれか１つに記載の方法。
８２．無傷組織が、５０〜２００μｍの厚さを有する、態様８１に記載の方法。
８３．１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることが、６回以上生じる、態様８１または８２に記載の方法。
８４．１つ以上のヒドロゲルに埋め込まれたアンプリコンを接触させることが、７回以上生じる、態様８１または８２に記載の方法。
８５．検出することが、フローサイトメトリー、配列決定、プローブ結合および電気化学的検出、ｐＨ変化、ＤＮＡタグに結合した酵素によって誘発される触媒作用、量子絡み、ラマン分光法、テラヘルツ波技術、および／または走査電子顕微鏡法を実行することを含む、態様４３〜８４のいずれか１つに記載の方法。
８６．フローサイトメトリーが、質量サイトメトリーまたは蛍光活性化フローサイトメトリーである、態様８５に記載の方法。
８７．検出することが、顕微鏡法、走査質量分析、または他の撮像技術を実行することを含む、態様４３〜８６のいずれか１つに記載の方法。
８８．検出することが、シグナルを判定することを含む、態様４３〜８７のいずれか１つに記載の方法。
８９．シグナルが、蛍光シグナルである、態様８８に記載の方法。
９０．システムであって、
撮像チャンバおよびポンプを含む流体デバイスと、
態様１〜４２のうちのいずれか１つを実行するように構成されたプロセッサユニットと、を備える、システム。
【実施例】
【０１１５】
以下の実施例は、当業者に本発明の作製方法および使用方法の完全な開示および説明を提供するように示されるのであって、本発明者らが彼らの発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、以下の実験が、実行されるすべてまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関して精度を保証するように努力がなされてはいるが、いくらかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別段の指定がない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子量であり、温度は、摂氏であり、圧力は、大気圧またはその付近である。標準的な略語、例えば、ｂｐ、塩基対（複数可）；ｋｂ、キロ塩基（複数可）；ｐｌ、ピコリッター（複数可）；ｓまたはｓｅｃ、秒（複数可）；ｍｉｎ、分（複数可）；ｈまたはｈｒ、時間（複数可）；ａａ、アミノ酸（複数可）；ｋｂ、キロ塩基（複数可）；ｂｐ、塩基対（複数可）；ｎｔ、ヌクレオチド（複数可）；ｉ．ｍ．、筋肉内の（筋肉内で）；ｉ．ｐ．、腹腔内の（腹腔内で）；ｓ．ｃ．、皮下の（皮下で）などが使用され得る。
【０１１６】
材料および方法
以下の材料および方法は、特に断りのない限り、一般的に、本明細書に記載される実施例に提示される結果に適用する。
【０１１７】
マウス
すべての動物の手順は、スタンフォード大学のＡｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｖｅ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ（ＡＰＬＡＣ）によって承認された動物ケアガイドライン、および国立衛生研究所のガイドラインに従った。雄のＣ５７／ＢＬ６マウス（６〜１０週間）を実験に使用した。暗／光実験のために、マウスを標準光サイクルで収容し、続いて一定の暗さに５日間配置した。暗い収容の後、マウスを犠牲にするか、または犠牲の前に１時間、光に曝露するかのいずれかをした。コカイン実験のために、マウスに生理食塩水または１５ｍｇ／ｋｇのコカインのいずれかを、犠牲の１時間前に注射した。薄い切片については、動物をイソフルランで麻酔し、急速に首を切り落とした。脳組織を除去し、Ｏ．Ｃ．Ｔ中に配置し、液体窒素中で凍結させ、クライオスタット（Ｌｅｉｃａ  ＣＭ１９００、以下の薄い組織切片のセクションに詳細情報）を使用してスライスした。大量の試料について、動物をブプレネックス（１００ｍｇ／ｍｌ、ｉ．ｐ．）で麻酔し、冷たいＰＢＳで心経灌流し、次いで４％のＰＦＡで灌流した（以下の大量の試料のセクションに詳細情報）。Ｔｈｙ１−ＹＦＰマウスは、Ｂ６．Ｃｇ−Ｔｇ（Ｔｈｙ１−ＹＦＰ）ＨＪｒｓ／Ｊであった。トランスジェニックパーバルブミンマウスは、Ｐａｒｖ−ＩＲＥＳ−Ｃｒｅ（ＪＡＸ＃８０６９）およびＡｉ１４（ＪＡＸ  ＃７９０８）マウスを交配させることにより生成した。
【０１１８】
化学物質および酵素
名前（供給元、カタログ番号）による化学物質および酵素を以下に列挙する。Ｇｅｌ  Ｓｌｉｃｋ溶液（Ｌｏｎｚａ、５０６４０）。ＰｌｕｓＯｎｅバインドシラン．（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、１７−１３３０−０１）。ポリ−Ｌ−リジン溶液、０．１重量／体積％（Ｓｉｇｍａ、Ｐ８９２０）。超純蒸留水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１０９７７−０１５）。ガラス底の１２ウェルおよび２４ウェルプレート（ＭａｔＴｅｋ、Ｐ１２Ｇ−１．５−１４−ＦおよびＰ２４Ｇ−１．５−１３−Ｆ）。＃２マイクロカバーグラス、直径１２ｍｍ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、７２２２６−０１）。Ｏ．Ｃ．Ｔ．化合物（Ｆｉｓｈｅｒ、２３−７３０−５７１）１６％のＰＦＡ、ＥＭグレード（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、１５７１０−Ｓ）。ＨＰＬＣ用メタノール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、３４８６０−１Ｌ−Ｒ）。ＰＢＳ、７．４（Ｇｉｂｃｏ、１倍は、１００１０−０２３、１０倍は、７００１１−０４４）。Ｔｗｅｅｎ−２０、１０％の溶液（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、６５５２０６）。Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、１０％の溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、９３４４３）。ＯｍｉｎｉＰｕｒホルムアミド（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ，７５−１２−７）。２０×ＳＳＣ緩衝液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓ６６３９）。リボヌクレオシドバナジル錯体（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｓ１４０２Ｓ）。剪断鮭精子ＤＮＡ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＡＭ９６８０）。ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＡＭ２６９６）。Ｔ４ＤＮＡリガーゼ、５Ｗｅｉｓｓ  Ｕ／μＬ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＬ００１１）。Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、ＥＰ００９４）。１０ｍＭのｄＮＴＰ混合物（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１００００４８９３）。ＢＳＡ、分子生物学グレード（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｂ９０００Ｓ）。５−（３−アミノアリール）−ｄＵＴＰ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＡＭ８４３９）。ＢＳＰＥＧ９（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、２１５８２）。アクリル酸ＮＨＳエステル、９０％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ８０６０）。メタクリル酸ＮＨＳエステル、９８％（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、７３０３００）。ＤＭＳＯ、無水（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｄ１２３４５）。アクリルアミド溶液、４０％（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１６１−０１４０）。ビス溶液、２％（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、１６１−０１４２）。過硫酸アンモニウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａ３６７８）。Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルエチレンジアミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｔ９２８１）。ＯｍｉｎｉＰｕｒ  ＳＤＳ、２０％（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、７９９１）。プロテアーゼＫ、ＲＮＡグレード（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２５５３００４９）。エビアルカリホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、Ｍ０３７１Ｌ）ＤＡＰＩ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｄ１３０６）。ＮｅｕｒｏＴｒａｃｅ蛍光Ｎｉｓｓｌ染色剤、黄色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｎ−２１４８０）。ＰＭＳＦ（Ｓｉｇｍ���、９３４８２）。パパイン（Ｗｏｒｔｈｉｎｇｔｏｎ、ＬＳ００３１２７）。マトリゲル（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、３５６２３４）。Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、２１１０３−０４９）。ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ、ＳＨ３００７１０３）。Ｂ−２７サプリメント（Ｇｉｂｃｏ、１７５０４０４４）。２ｍＭのｇｌｕｔａｍａｘ（Ｇｉｂｃｏ、３５０５０−０６１）。フルオロデオキシウリジン（Ｓｉｇｍａ、Ｆ−０５０３）。抗ＮｅｕＮ抗体（Ａｂｃａｍ、１９０５６５）。
【０１１９】
原発性マウス皮質ニューロン培養
マウスの子からのネオオーティスまたは海馬を産後０日目（Ｐ０）に除去し、０．４ｍｇ／ｍＬのパパインで消化し、１ウェルあたり６５，０００個の細胞の密度で１：３０のマトリゲルで事前にコーティングされた２４ウェルのガラス底プレート上にプレートした。培養されたニューロンを、１．２５％のＦＢＳ、４％のＢ−２７サプリメント、２ｍＭのＧｌｕｔａｍａｘ、および２ｍｇ／ｍｌのフルオロデオキシウリジンを含有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ培地中で維持し、３７℃で５％のＣＯ２と共に湿潤培養インキュベーター中に保持した。
【０１２０】
ｓｍＦＩＳＨ
Ｑｕａｓａｒ５７０を有するマウスＧａｐｄｈのＳｔｅｌｌａｒｉｓ  ＳｈｉｐＲｅａｄｙ  ｓｍＦＩＳＨプローブを、ＬＧＣ  Ｂｉｏｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＳＭＦ−３００２−１）から購入した。ｓｍＦＩＳＨ実験を、付着細胞および凍結マウス脳組織のための製造業者のプロトコルに従って行った。
【０１２１】
ＳＴＡＲｍａｐプローブの設計
ＳＮＡＩＬプローブは、以下のように設計した。（１）すべてのマウスタンパク質のコンセンサスｃＤＮＡ配列（ＣＣＤＳ）をｆｔｐ：／／ｆｔｐ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｐｕｂ／ＣＣＤＳ／ｃｕｒｒｅｎｔ＿ｍｏｕｓｅからダウンロードし、参照トランスクリプトームをダウンロードした（ｈｇｄｏｗｎｌｏａｄ．ｃｓｅ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｇｏｌｄｅｎＰａｔｈ／ｍｍ１０／ｂｉｇＺｉｐｓ／）。多数の転写アイソフォームを有する遺伝子については、最短のアイソフォームのみを考慮し、（２）Ｐｉｃｋｙ２．２（３２ビット）を使用して、４０〜４６個のヌクレオチドの長さ制限を有する各プローブ対のハイブリダイゼーション配列を設計し、各遺伝子に対して４つの配列を設計し、（３）得られた相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）配列（４０〜４６ｎｔ）を２０〜２５ｎｔの半分に分割し、それらは、その間に０〜２ｎｔのギャップを有し、かつ２つの半分の間の融解温度（Ｔｍ）の最良の一致を有する。すべてのプローブは、６０ｎｔ未満であり、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ）によって９６ウェルプレートとして製造された。１６０個の転写産物の実験について、自家製配列決定試薬は、Ａｌｅｘａ４８８、５４６、５９４、および６４７で標識された６つの読み取りプローブ（Ｒ１〜Ｒ６）、ならびに１６個の２塩基エンコーティング蛍光プローブ（２塩基＿Ｆ１〜２塩基＿Ｆ１６）を含んだ。２８個の転写産物の大量実験について、すべてのＳＮＡＩＬプライマープローブをアクリダイト修飾で順序付けし、１１ｎｔの直交読み取りプローブ（ＯＲ１〜ＯＲ７）および４つの１塩基蛍光プローブ（１塩基＿Ｆ１〜１塩基＿Ｆ４）を使用して配列決定を実施した。すべての配列は、出版社サイトでＥｘｃｅｌデータファイルとして提供される。
【０１２２】
細胞培養物および薄い組織切片についてのＳＴＡＲｍａｐ手順
試料調製
ガラス底の１２ウェルまたは２４ウェルプレートをメタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（バインドシラン）によって処理した。脳組織切片については、１２ウェルプレートをさらにポリ−Ｌ−リジン溶液で処理した。＃２マイクロカバーグラス（１２ｍｍ）を、メーカーの指示に従って、後の重合のためにＧｅｌ  Ｓｌｉｃｋで前処理した。初代ニューロン細胞培養物をＰＢＳ中の１．６％のＰＦＡで１０分間固定し、次いで、予め冷却した（−２０℃）メタノールに移し、−８０℃で少なくとも１５分間（および最大１週間）維持した。脳組織については、採取したばかりのマウス脳を直ちにＯ．Ｃ．Ｔ．に埋め込み、スナップ冷凍した。組織は、−８０℃で貯蔵するか、またはクライオスタットに移すかのいずれかをし、１６μｍの切片として切断した。一次視覚皮質を含有する切片を、前処理されたガラス底プレートに搭載した。脳切片をＰＢＳ中の４％のＰＦＡで、室温で１０分間固定し、−２０℃のメタノールで透過化させ、その後−８０℃で１５分間置いてからハイブリダイズした。
【０１２３】
ライブラリ構築
ＳＮＡＩＬプローブを１００または２００μＭで超高純度ＲＮａｓｅを含まない水に溶解させ、プールした。プローブ混合物を９０℃で２〜５分間加熱し、その後、室温で冷却した。試料を−８０℃から採取し、室温で５分間平衡化し、ＰＢＳＴＲ（０．１％のＴｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳ中の０．１Ｕ／μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎ）で２〜５分間洗浄し、４０℃の加湿されたオーブン内で、１×ハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、１０％のホルムアミド、１％のＴｗｅｅｎ−２０、２０ｍＭのＲＶＣ、０．１ｍｇ／ｍｌのサーモン精子ＤＮＡ、および１オリゴあたり１００ｎＭでのプールされたＳＮＡＩＬプローブ）中で穏やかに振盪しながら一晩インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳＴＲで２０分間、２回洗浄し、続いて、３７℃でＰＢＳＴＲに溶解した４×ＳＳＣ中で１回２０分間洗浄した。最後に、試料をＰＢＳＴＲで１回室温で短時間すすいだ。次いで、試料を、穏やかに撹拌しながら室温でＴ４ＤＮＡライゲーション混合物（１×ＢＳＡおよび０．２Ｕ／μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎで補充したＴ４ＤＮＡリガーゼの１：５０希釈）と共に、２時間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳＴＲで２回洗浄し、ＲＣＡ混合物（Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの１：５０希釈、２５０μＭのｄＮＴＰ、１×ＢＳＡおよび０．２Ｕ／μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ、ならびに２０μＭの５−（３−アミノアリール）−ｄＵＴＰ）と共に、３０℃で２時間撹拌下でインキュベートした。次に、試料をＰＢＳＴ中で２回洗浄し（ＳＵＰＥＲａｓｅ・Ｉｎを省略したＰＢＳＴＲ）、ＰＢＳＴ中の２０ｍＭのアクリル酸ＮＨＳエステルで室温で２時間処理した。試料をＰＢＳＴで１回短時間洗浄した後、モノマー緩衝液（４％のアクリルアミド、０．２％のビスアクリルアミド、２×ＳＳＣ）と共に、室温で３０分間インキュベートした。緩衝液を吸引し、１０μＬの重合混合物（０．２％の過硫酸アンモニウム、０．２％のテトラメチレンジアミンをモノマー緩衝液に溶解させた）を試料の中央に加え、これらをＧｅｌ  Ｓｌｉｃｋでコーティングされたカバースリップによって直ちに覆い、室温で１時間インキュベートし、次いでＰＢＳＴによって２回、各５分間洗浄した。組織ゲルハイブリッドをプロテイナーゼＫ（０．２ｍｇ／ｍｌ）で、３７℃で１時間消化させ、次いでＰＢＳＴで３回（各５分間）洗浄した。
【０１２４】
撮像および配列決定
単一遺伝子検出のために、ＤＮＡアンプリコンに相補的な１９ｎｔの蛍光オリゴをＰＢＳＴに溶解させた１×ＳＳＣ中に５００ｎＭで希釈し、試料を室温で３０分間インキュベートした後、ＰＢＳＴによって３回、各５分間洗浄してから撮像した。配列決定のために、各配列決定サイクルは、試料をストリッピング緩衝液（６０％のホルムアミド、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）で１０分間室温で２回処理することから始め、各５分間の３回のＰＢＳＴ洗浄が続いた。試料を配列決定混合物（１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの１：２５希釈、１×ＢＳＡ、１０μＭの読み取りプローブ、および５μＭの蛍光オリゴ）と共に、室温で３時間インキュベートした。次いで、試料を洗浄および撮像緩衝液（２×ＳＳＣおよび１０％のホルムアミド）で各３回（１０分間）すすいでから、撮像に進んだ。ＤＡＰＩ染色は、Ｎｉｓｓｌ染色で配列決定画像を位置合わせすることを目的として、サイクル１の前およびサイクル６の後、メーカーの指示に従って行った。細胞セグメント化を目的として、メーカーの指示に従って、サイクル６の後にＮｉｓｓｌ染色を行った。４０５のダイオード、白色光レーザー、４０倍油浸対物レンズ（ＮＡ１．３）を備えるＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８共焦点顕微鏡法を使用して、７８ｎｍ×７８ｎｍ×３１５ｎｍのボクセルサイズの画像を取得した。
【０１２５】
薄片ＳＴＡＲｍａｐデータ処理
すべての画像処理ステップは、ＭＡＴＬＡＢ（登録商標）  Ｒ２０１７Ａを使用して実施した。
【０１２６】
画像位置合わせ
画像位置合わせは、すべての並進オフセットにおける２つの画像体積間の相互相関を計算するための３次元高速フーリエ変換（ＦＦＴ）を使用して達成した。最大相関係数の位置を特定し、画像体積を並進させて、オフセットを補償するために使用した。すべての画像を、最初に視野全体にわたるグローバル変換を通じて、次いで、各タイルについて別々に（画像取得中に顕微鏡によって使用される個々のタイル状の視野に対応する）、配列決定の第１ラウンドに位置合わせした。
【０１２７】
スポット呼び出し
位置合わせした後、配列決定の第１ラウンドでの各カラーチャネルにおいて、個々のドットを別々に識別した。１６０個の遺伝子実験について、まず、３次元のＬａｐｌａｃｉａｎ  ｏｆ  Ｇａｕｓｓｉａｎで体積をフィルタリングし、次いで３Ｄで局所最大値を見つけることによって、直径約７ピクセルのドットを識別した。１０２０個の遺伝子実験については、同様の手法を使用してドットを見つけたが、Ｌａｐｌａｃｉａｎ  ｏｆ  Ｇａｕｓｓｉａｎを多数のスケールで計算し、これらのスケールにわたって最大値を見つけた。各ドットを識別した後、４つのチャンネルすべてにわたるドットの主色を、ドット位置を取り囲む３×３×１のボクセル体積で、各ラウンドで決定した。
【０１２８】
バーコードフィルタリング
ドットをまず品質スコアに基づいてフィルタにかけた。品質スコアは、各配列決定ラウンドでの各ドットが、色の混合物ではなく、１つの色から得られた範囲を定量化した。バーコードＤＮＡ配列の２塩基エンコーディング後の予想されたカラー配列に基づいて、バーコードコードブックを色空間に変換した。コードブック内の品質閾値および一致した配列を通過したドットカラー配列を保持し、そのバーコードが表した特異的遺伝子で識別し、他のすべてのドットを拒否した。次いで、コードブック内の高品質のドットおよび関連する遺伝子同一性を、下流分析のために保存した。
【０１２９】
２Ｄ細胞セグメント化
核は、配列決定の最終ラウンド後のＤＡＰＩチャネルの最大強度投影から手動で特定した。Ｎｉｓｓｌ染色に基づいて、Ｉｌａｓｔｉｋで実行されるランダムフォレスト分類子を使用して、細胞体を最初に特定した。分類子を、すべての試料からトリミングされた領域のランダムに選択されたサブセット上で訓練し、次いで、全画像に適用した。次いで、閾値確率マップをピクセル拡大して、残りの穴を埋めた。最後に、次いで、マーカーに基づく分水嶺変換を適用して、組み合わされ、閾値処理された細胞体マップおよび核の特定された位置に基づいて閾値処理された細胞体をセグメント化した。各細胞体の周囲に凸包を計算した。次いで、２Ｄで各凸包と重複する点をその細胞に割り当てて、１細胞あたりの遺伝子発現マトリックスを計算した。
【０１３０】
単一細胞のデータ前処理
すべての単一細胞分析は、ＳＴＡＲｍａｐ実験の分析のためにＰｙｔｈｏｎのカスタムソフトウェアパッケージを使用して実施された。１細胞あたりの発現マトリックスを、最初に、以下の式を用いて、各細胞ｉに関してすべての遺伝子ｊにわたる発現値Ｅｉｊについて正規化した。
【０１３１】
Ｎｉｊ＝ｌｎ（１＋中央値（Ｅｉ：）＊（Ｅｉｊ／ΣＥｉ：））
【０１３２】
クラスタ化のために、１細胞あたりの転写産物の数、試料の同一性、および実験条件（光対暗）に関連する効果を線形モデルを使用して回帰させた。
【０１３３】
Ｅｉｊ＝ｎＳｐｏｔｓｉ＋ｅｘｐｔＩＤｉ＋ｅｘｐｔＣｏｎｄｉであり、Ｅｉｊがポアソン分布されていると仮定している。
トップレベルの単一細胞のクラスタ化
【０１３４】
正規化およびスケーリングの後、主成分分析を適用して、細胞発現マトリックスの次元性を低減した。次いで、説明された分散比に基づいて、トップのＰＣを、ＰＣあたりの説明された分散比の手動分析に基づいて、トップレベルのクラスタ化に使用した。次に、ルーヴァン距離を有する共有最近傍（ＳＮＮ）アルゴリズムを使用して、トップＰＣをクラスタ化した。興奮性神経マーカーＳｌｃ１７ａ７（小胞グルタミン酸輸送体）、抑制性神経マーカーＧａｄ１、および非神経性マーカーＭｑｐのために強化されたクラスタを手動で統合させて、これらの細胞型を表す３つの主要クラスタを形成した。Ｕｎｉｆｏｒｍ  Ｍａｎｉｆｏｌｄ  Ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｒｏｊｅｃｔｉｏｎ（ＵＭＡＰ）（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｍｃｉｎｎｅｓ／ｕｍａｐ）を使用して、細胞を表示した。次いで、各クラスタの細胞を、ＰＣＡ分解を使用してサブクラスタ化し、続いてルーヴェンＳＮＮクラスタ化によって、特定の細胞型を決定した。
【０１３５】
単一細胞のサブクラスタ化
次いで、抑制性、興奮性、および非神経性クラスタを、主要クラスタに適用されるのと同じアプローチを使用してサブクラスタ化した。
【０１３６】
発現差異解析
このサブクラスタにおいて特異的に可変である遺伝子を、バイモド試験（尤度比試験）を使用して、各クラスタと他のすべてのクラスタとの間の各遺伝子の差次的発現のＰ値を計算することによって選択した。クラスタの数に基づいて、Ｐ値をＦＤＲ補正した。
【０１３７】
厚い組織切片についてのＳＴＡＲｍａｐ手順
試料調製
ガラス底の１２ウェルプレートおよびマイクロカバーグラス（１２ｍｍ）を、薄い組織切片の場合と同じように前処理した。マウスをＰＦＡで灌流し、氷上で２〜３時間固定し、氷上のＰＢＳに３０分間移し、１５０μｍの切片として切断した。一次視覚皮質を含有する切片を前処理されたガラス底のプレートに移し、氷冷ＰＢＳで１回洗浄した。
【０１３８】
ライブラリ構築
試料を−２０℃に冷却したメタノールで、４℃で１時間事前に清澄化し、次いで、１×透過化およびハイブリダイゼーション緩衝液（２×ＳＳＣ、１０％ホルムアミド、１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００、２０ｍＭのＲＶＣ、、１オリゴあたり１００ｎＭでの０．１ｍｇ／ｍｌのサーモン精子ＤＮＡおよびプールされたＳＮＡＩＬプローブ、ならびに０．２％のＳＤＳ）中で、４０℃の加湿オーブン中で２日間穏やかに振盪しながらインキュベートした。メタノール処理は、試料を膨張および変形から保護し、タンパク質およびＲＮＡ（Ｔｈｙ１−ＹＦＰ）の共検出のために、メタノール事前の一掃を飛ばして進んだ。次いで、試料をＰＢＳＴＶ（０．１％のＴｒｉｔｏｎおよび２ｍＭのＲＶＣ）で、３７℃で２回、各々１時間洗浄し、次いでＰＢＳでさらに１時間洗浄した。次に、試料を重合混合物Ｉ（４％のアクリルアミド、０．２％のビス−アクリルアミド、２×ＳＳＣ、０．５％のＶＡ−０４４）と４℃で１時間インキュベートした。緩衝液を吸引し、４０μＬの重合混合物ＩＩ（０．１％の過硫酸アンモニウム、重合混合物Ｉに溶解した０．１％のテトラメチルエチレンジアミン）を試料の中央に加え、これらを直ちにＧｅｌ  Ｓｌｉｃｋでコーティングされたカバースリップで覆い、４０℃で１時間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳＴＶによって２回、各２０分間洗浄した。組織−ゲルハイブリッドをプロテイナーゼＫ（２×ＳＳＣ中０．２ｍｇ／ｍｌ、１％のＳＤＳ）で３７℃で一晩消化させ、次にＰＢＳＦ（ＰＢＳ中の２ｍＭのＰＭＳＦ）およびＰＢＳＴＲで２回（各３０分間）洗浄した。次に、試料を、Ｔ４ＤＮＡライゲーション混合物（１×ＢＳＡおよび０．２Ｕ／μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎで補充したＴ４ＤＮＡリガーゼの１：５０希釈）と、穏やかに撹拌しながら室温で１２時間インキュベートした。次いで、試料をＰＢＳＴＲで２回洗浄し（各１時間）、次いで、ＲＣＡ混合物（Ｐｈｉ２９ＤＮＡポリメラーゼの１：５０希釈、２５０μＭのｄＮＴＰ、１×ＢＳＡおよび０．２Ｕ／μＬのＳＵＰＥＲａｓｅ−Ｉｎ、ならびに２０μＭの５−（３−アミノアリール）−ｄＵＴＰ）と共に、３０℃で１２〜２４時間インキュベートした。最後に、試料をＢＳＰＥＧ９によって架橋した。
【０１３９】
撮像および配列決定
最初に試料をＤＡＰＩで一晩染色し、次にＰＢＳによって１時間すすいだ。各サイクルは、試料をストリッピング緩衝液（６０％のホルムアミド、０．１％のＴｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）で２０分間室温で２回処理することから始め、各２０分間の３回のＰＢＳＴ洗浄が続いた。試料を、室温で４時間、大量の配列決定混合物（１×Ｔ４ＤＮＡリガーゼ緩衝液、Ｔ４ＤＮＡリガーゼの１：５０希釈、１×ＢＳＡ、５μＭの直交読み取りプローブ、および４００ｎＭの１塩基蛍光オリゴ）と共にインキュベートした。次いで、試料をＰＢＳで２回（各２０分間）すすいでから、撮像に進んだ。４０５ｎｍのダイオード、白色光レーザー、および２５倍水浸対物レンズ（ＮＡ０．９５）を備えるＬｅｉｃａ  ＴＣＳ  ＳＰ８共焦点顕微鏡を使用して、０．９μｍ×０．９μｍ×１μｍのボクセルサイズの画像を取得した。
【０１４０】
大量のＳＴＡＲｍａｐデータ処理
画像レジストレーション３Ｄ  ＦＦＴの位置合わせを、位置合わせのためのＤＡＰＩチャンネルを使用することを除き、再び適用した。具体的には、各ラウンドでのＤＡＰＩチャネルを、第１ラウンドにグローバルに位置合わせし、次いで、画像を取得するために使用される視野タイルに対応する４×５グリッド内で区分的に位置合わせした。
【０１４１】
細胞所見および定量化
位置合わせした後、ＤＡＰＩチャネルに適用されるるＬａｐｌａｃｉａｎ−ｏｆ−Ｇａｕｓｓｉａｎフィルタの最小値を使用して細胞を特定した。各遺伝子の発現を定量化するために、各カラーチャネルにおける平均強度を、各核の周囲の１０×１０×３のボクセル体積で平均化した。
【０１４２】
３Ｄ細胞分析
最初に、細胞を、ｋ平均法を使用して、Ｇａｄ１、Ｓｌｃ１７ａ７、およびいくつかの非神経性遺伝子を用いて抑制性、興奮性、および非神経性にクラスタ化した。次いで、ｋ平均法を使用して、各クラスタをサブクラスタ化した。ｋ平均法の初期値を、各マーカー遺伝子の平均発現に設定した。細胞型間の距離を計算するために、すべての興奮性ニューロンと各抑制性ニューロンサブタイプとの細胞間の最近傍距離を、ユークリッド距離を有する高速最近傍計算のためのｋＤツリーを使用して計算した。
【０１４３】
ＳＴＡＲｍａｐの物理的限界を評価するためのＡｃｔｂスパイクイン
１００および１０００個の遺伝子はすべて、最終ナノボールにおいて増幅されるであろうパドロック中の共通の１８ｎｔ配列（配列Ａ）を共有した。異なる１８ｎｔ配列（配列Ｂ）を有するＡｃｔｂのために、別のセットのＳＮＡＩＬプローブを設計した。ＡｃｔｂのＳＮＡＩＬプローブと０、１００、または１０００個の遺伝子のＳＮＡＩＬプローブとを一緒に混合し、ハイブリダイゼーションに使用した。Ａｃｔｂスパイクインならびに１００および１，０００個の遺伝子の両方は、等しい効率を保証するために同じライゲーションおよび増幅ステップを経た。読み出しのために、２つの蛍光検出オリゴ（配列Ｂに相補的なＡｌｅｘａ４８８−プローブおよび配列Ａを標的とするＡｌｅｘａ６４７−プローブ）を試料に添加し、Ａｃｔｂのアンプリコンおよび残りの遺伝子のアンプリコンを２つの別個のチャネルで撮像した。次いで、Ａｃｔｂ  ＲＮＡのアンプリコンを試験して、アンプリコンの数が、増大した数の他の遺伝子によって希薄化されるかどうかを、分子クラウディングの指標として決定した（図１６Ａ〜１６Ｅ）。
【０１４４】
ＣＬＡＲＩＴＹ組織の免疫染色
ＰＦＡ固定された組織を、Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ（２００５）で前述されたように処理した。簡潔に述べると、厚さ２００μｍのＰＦＡ固定された脳切片を１％のアクリルアミド埋め込み溶液中に４℃で２３時間置き、３７℃で４時間埋め込み、次いで５日間受動的に清澄化した。清澄化した切片をＰＢＳＴ中で２日間洗浄し、抗ＮｅｕＮ（１：１００）で、室温で２４時間染色し、次いでＰＢＳＴ中で２４時間洗浄した。共焦点顕微鏡を使用して切片を撮像した。
【０１４５】
自動インサイチュ配列決定のためのデバイス（仮説）
実験手順の自動ステップには、より大きな体積で、室温で維持される３つの緩衝液が含まれ、それらは、１）洗浄緩衝液、２）撮像緩衝液、および３）ストリップ緩衝液である。リガーゼ酵素混合物のチューブを４℃に維持する。蛍光標識された撮像材料を含有する８本のチューブがあり、４℃で維持する。チューブのうちの６本は、ハイブリダイゼーションのための蛍光標識されたオリゴヌクレオチドおよびプローブを含有する。チューブのうちの１本は、小分子Ｎｉｓｓｌ染色を含有し、１本は、小分子ＤＡＰＩ染色を含有する。撮像時にリガーゼとオリゴとを混合することが不可能である場合、それらは、潜在的に予め混合され、４℃で維持することができる。
【０１４６】
配列決定プロセスは、カスタム撮像チャンバに搭載され、流体に接続された試料を含む。６つのラウンドの各々で、リガーゼ混合物、リガーゼ混合物、および６つのオリゴヌクレオチド混合物のうちの１つを混合し（総体積２００〜４００μｌ）、次いで、試料に３時間適用する必要がある。次に、洗浄緩衝液を１０分間試料上に流す。次いで、洗浄緩衝液を撮像緩衝液と交換する。次いで、システムが、顕微鏡にトリガーを送信し、顕微鏡は、蛍光撮像を実行する。撮像が完了すると、顕微鏡は、システムにトリガーを送信して、次のラウンドを開始させる。システムは、試料上で１０分間ストリッピング緩衝液を流す。洗浄緩衝液を５分間流して、残留ストリッピング緩衝液を除去する。次のラウンドのリガーゼおよび蛍光標識されたオリゴを適用する。このプロセスを６回繰り返した後、レーザーラウンドを剥離し、洗浄し、その後、ＮｉｓｓｌおよびＤＡＰＩ溶液を同時に１時間適用する。これは次いで、洗浄され、撮像緩衝液で撮像される。最後に、実験が完了した後、システム全体を漂白剤で洗い流して、次の実行のために一掃する。
【０１４７】
コンピュータ制御された流体は、様々な溶液をポンプし、リガーゼ溶液とオリゴ溶液とを混合し、各ラウンドで使用されるオリゴ溶液を選択する。このシーケンスにおけるすべてのパラメータ（流速、時間など）は、プログラム可能であるはずである。
【０１４８】
このすべてのために、カスタム撮像チャンバは、流入ポートおよび流出ポートを備える少ない体積で密封された組織の切片を保持し、２４プレートホルダーを備えた顕微鏡に適合する。図２４Ａは、ＳＴＡＲｍａｐ配列決定のための全体的なハードウェア設定を描写し、図２４Ｂは、本明細書に記載される例示的な流体系の設計を描写する。
【０１４９】
結果
実施例１：ＳＴＡＲｍａｐ
インサイチュ配列決定技術を含む本明細書に開示される方法は、無傷の生物学的組織における高度に多重化された遺伝子検出（最大１０００個の遺伝子）を可能にした。この方法は、生の生物学的組織（新鮮または保存された、わずか１つの細胞または大きくても１ミリメートル（複数可）のサイズ）から始まり、サブ細胞および細胞分解能で、かつ高効率、低エラー率、および高速な処理時間を伴う、出力画像に基づく遺伝子定量化をもたらした。
【０１５０】
本明細書に記載されるようなＳＴＡＲｍａｐの概略図を、図１Ａに描写する。脳組織を調製した後（マウス脳プロトコルのための方法を参照されたい）、無傷組織内で細胞内ｍＲＮＡ（破線）と遭遇し、それにハイブリダイズしたカスタムＳＮＡＩＬプローブ（図２Ａ）を、ｃＤＮＡアンプリコンとして酵素的に複製した。アンプリコンを、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド部分修飾を用いてインサイチュで構築し、次いで、ヒドロゲルネットワーク（波線）内に埋めむためにアクリルアミドと共重合させ、その後、
非結合脂質およびタンパク質の一掃が続いた（図３Ａ〜３Ｆ）。各ＳＮＡＩＬプローブは、遺伝子固有の識別子セグメントを含有し、これは、エラー訂正のための２塩基エンコーディングを用いてインサイチュ配列決定を通じて読み出される（ＳＥＤＡＬ、図４Ａ〜４Ｌ）。最後に、３Ｄにおける高度に多重化されたＲＮＡ定量化は、空間における遺伝子発現および細胞型を明らかにした。
【０１５１】
図１Ａは、ＳＮＡＩＬに関する以下の方法を描写し、プライマーおよびパドロックプローブの対は、標的特異的シグナルを増幅し、単一プローブの非特異的ハイブリダイゼーションから一般的に生じることが知られているノイズを排除した。図１Ｃおよび１Ｄは、プライマーおよびパドロックプローブの隣接結合のみがシグナル増幅をもたらすことを示した。ｍＲＮＡ  Ａは、Ｇａｐｄｈを表し、ｍＲＮＡ  Ｂは、Ａｃｔｂを表した。両方の蛍光画像は、マウス脳切片におけるＧａｐｄｈ  ｍＲＮＡ（灰色）および細胞核（青色）標識を示し、不一致のプライマーおよびパドロックによる標識の不在を指摘した（図１Ｄ、右）。スケールバーは、１０μｍを示した。図１Ｅは、ＳＴＡＲｍａｐのために考案された改良されたライゲーションによる配列決定法である、ＳＥＤＡＬを介した組織−ヒドロゲル複合体中のＤＮＡアンプリコンのインサイチュ配列決定を描写した。各サイクルについて、読み取りプローブ（星記号標識を有しない線）は、読み取り位置を設定するための、５’末端にリン酸塩（５’Ｐ）を有する縮退塩基（Ｎは、Ａ、Ｔ、ＣおよびＧの等しい混合物を表す）の漸増的に増加する長さのランを含有し、解読プローブ（星記号標識を有する線）は、３’末端にジヌクレオチドのための色コーディングを有するフルオロフォアによって標識付けした。２種類のプローブは、両方のプローブがＤＮＡ鋳型（より低い配列）に完全に相補的である場合にのみ、ライゲーションして、高い融解温度を有する安定した生成物を形成し、ライゲーションされていないプローブを洗い流した後のその後の撮影を可能にした。各撮像サイクルの後、プローブを、次のサイクルを開始することができるように、６０％のホルムアミドを使用して堅牢な組織−ヒドロゲルから剥ぎ取った。Ｘは、読み取られる未知の塩基を示し、「下線」は、解読された配列を示し、Ｃｈ１〜４は、蛍光チャネルを示した。スケールバーは、２μｍを示した。
【０１５２】
実施例２：ＳＮＡＩＬ
逆転写は、インサイチュ配列決定のための主要な効率制限ステップであり得、ＳＮＡＩＬは、両方のプローブが同じＲＮＡ分子にハイブリダイズするときにのみ設計されるプライマーおよびパドロックプローブの対（図２Ａ）でこのステップを迂回した。ＳＮＡＩＬプローブ（ＳＴＡＲｍａｐの１つの構成要素）の設計には、次のものが含まれ、各プライマーまたはパドロックプローブ（１９〜２５個のヌクレオチド；ｎｔ、青色）は、標的ＲＮＡとハイブリダイズするために６０℃以上の設計されたＴｍ（核酸の融解温度）を有したが、プライマーとパドロックとの間の相補配列は、Ｔｍが、室温未満で各アーム上でわずか６ｎｔであったため、プライマー−パドロックのＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションは、４０℃でのＤＮＡ−ＲＮＡハイブリダイゼーション中はごくわずかであったが、次のステップでＴ４ＤＮＡリガーゼによるＤＮＡライゲーションを可能にした。
【０１５３】
パドロックプローブを環化し、ローリングサークルを増幅して、ｃＤＮＡの多数のコピーを含有するｃＤＮＡナノボール（アンプリコン）を生成した（図１Ａ〜１Ｄ）。この機構は、標的特異的シグナル増幅を保証し、単一プローブの非特異的ハイブリダイゼーションからさもなければ必ず生じたノイズを除外した。実際、転帰は、市販の単一分子蛍光インサイチュハイブリダイゼーション（ｓｍＦＩＳＨ）プローブと比較して、はるかに高い絶対強度およびシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ）であった（図２Ｂ〜２Ｆ）。図２Ｂは、マウス皮質細胞培養物およびマウス視覚皮質切片における、Ｇａｐｄｈ  ｍＲＮＡを標的とする市販のｓｍＦＩＳＨプローブおよびＳＮＡＩＬプローブのシグナル対ノイズ比（ＳＮＲ；シグナルスポットの平均強度／バックグラウンドの平均強度）の比較を描写した。エラーバーは、スポット強度の標準偏差（ｓ．ｄ．）を示した。エラーバーは、取得された画像の６４０，０００ピクセル中のＲＮＡ信号に対応する、３９，３９８ピクセル、３０，２９７ピクセル、９７，５５５ピクセル、および１９，３９２ピクセルのｓ．ｄ．を表し、＊＊＊は、スチューデントｔ−検定でＰ＜０．０００１である。図２Ｃ〜２Ｆは、皮質細胞培養物（図２Ｃおよび２Ｄ）および視覚皮質切片（図２Ｅおよび２Ｆ）におけるＧａｐｄｈ  ｓｍＦＩＳＨ（図２Ｃおよび２Ｅ）およびＳＮＡＩＬプローブ（図２Ｄおよび２Ｆ）の蛍光画像を描写し、スケールバーは、１０μｍを示す。図２Ｇは、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）を使用した多重化ＲＮＡ撮像方法の比較を示した。ＦＩＳＳＥＱおよびパドロックプローブと比較して、ＳＮＡＩＬプローブは、逆転写の効率制限ステップを克服し、実験手順を大幅に簡素化し、ＰＬＡＹＲは、４つのプローブ、１つの追加のステップ、および２つのライゲーション部位を必要とするが、ＳＮＡＩＬは、一対のプローブおよび１つのライゲーション部位のみを必要とする。１５１個の細胞型遺伝子マーカーの１細胞あたりのＲＮＡのボックスプロットを、単一細胞ＲＮＡ配列決定（ｓｃＲＮＡ−ｓｅｑ，．ｒｅｆ）およびＳＴＡＲｍａｐ（視覚皮質の１６０個の遺伝子マッピングから抽出する）によって測定した（図２Ｇ）。ボックスプロットは、第１および第３の四分位数、中央線を中央値として、ヒゲを５％および９５％のデータポイントとして、Ｐ値を順位和検定として描写した。単一細胞ＲＮＡ配列決定およびＲＣＡベースの多重化ＲＮＡ検出方法の要約、数を参照文献から抽出した（図２Ｉ）。
【０１５４】
実施例３：組織−ヒドロゲル設定へのｃＤＮＡアンプリコン埋め込み
組織−ヒドロゲル設定へのｃＤＮＡアンプリコン埋め込みを可能にするために、アミン修飾されたヌクレオチドをローリングサークル増幅反応にスパイクし、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルを使用してアクリルアミド部分で官能化し、アクリルアミドモノマーと共重合させて、ヒドロゲルを形成した（図１Ａ、図３Ａ）。薄い組織切片におけるＳＴＡＲｍａｐのためのヒドロゲル組織化学の概略図を、図３Ａに描写した。ＤＮＡアンプリコンがポリアクリルアミドネットワーク内で多数の部位で共有結合的に固定されるように、ＤＮＡアンプリコンを５−（３−アミノアリール）−ｄＵＴＰの微小レベルの存在下で合成し、それは、低速度でＴを置き換え、アクリル酸Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ＡＡ−ＮＨＳ）を使用して、重合可能なアクリルアミド部分でのさらなる官能化を可能にした（図３Ａ、右）。次いで、得られた組織−ヒドロゲルをタンパク質消化および脂質除去に供して、透明性を高めた（図３Ｂ〜３Ｅ）。蛍光画像（４つのすべての蛍光チャネルからの合計強度）は、マウス視覚皮質における１６０個の遺伝子検出（図３Ｂおよび３Ｃ）ならびにマウス内側ハベヌラにおける１６個の遺伝子検出（図３Ｄおよび３Ｅ）を表した。未処理の試料（図３Ｂおよび３Ｄ）と比較して、５−（３−アミノアリール）−ｄＵＴＰ  Ｈ  ＴＣで処理され、脂質およびタンパク質の清澄化を行った試料（図３Ｃおよび３Ｅ）は、不透明度および自己蛍光の低減を示した。スケールバーは、５０μｍを示した。ＤＮＡ−ゲル架橋は、ゲル中にＤＮＡアンプリコンを維持した。１６０個の遺伝子試料をＡＡ−ＮＨＳを用いて、または用いないで調製し、内側前頭前皮質内で撮像した（図３Ｆ〜３Ｇ）。ＡＡ−ＮＨＳなしで調製された新鮮な試料は、ＡＡ−ＮＨＳ処置された試料と比較して３６％のシグナル損失を有し、室温で２４時間保存した後にさらなる４０％のシグナル損失を受けたが、ＡＡ−ＮＨＳ処置された試料は、９％のシグナル変化のみを有した（図３Ｆ）。蛍光強度は、１２０μｍ×１２０μｍ×３μｍの撮像寸法を有する４つの技術的複製の平均であった。エラーバーは、平均±ｓ．ｄ．を示し、＊＊＊は、両側ｔ検定でｐ＜０．００１である。蛍光画像を図３Ｇに、３．５μｍのスケールバーで描写した。
【０１５５】
この設計化学により、アンプリコンがヒドロゲルネットワークと共有結合していることが決定付けられるため、標的の位置および形状は、多くの検出サイクルを通して維持された。図３Ｈは、サイクル１、剥離、サイクル２についてのＳＴＡＲｍａｐによってＧａｐｄｈ  ＲＮＡを検出する視覚皮質内の１つのニューロンのズームイン蛍光画像、ならびにサイクル１およびサイクル２の統合された画像を描写し、配列決定サイクルにわたるＤＮＡアンプリコンの安定した空間位置を実証する。スケールバーは、２μｍを示す。
【０１５６】
実施例４：ＳＥＤＡＬ
配列決定される遺伝子固有の識別子として、５塩基バーコード（１，０２４個のライブラリサイズ）を設計し、各パドロックプローブに組み込み、したがって、多重化された遺伝子検出を可能にした（図１Ａ）。合成による配列決定パラダイムは、室温で実施されたライゲーションによる配列決定方法と比較して、反応温度の上昇を必要とし、それは、次に撮像および試料安定性にとって問題であるため回避した。しかしながら、報告された、または市販のライゲーションによる配列決定方法のいずれも、この困難な無傷組織適用のための必要なＳＮＲまたは精度に達しない（図４Ａ〜４Ｌ）。この理由から、ＳＥＤＡＬと呼ばれる新しい手法が、特にＳＴＡＲｍａｐのために考案された（図４Ａ〜４Ｌ）。
【０１５７】
ＳＥＤＡＬの概略図を、図４Ａに描写する。ＳＥＤＡＬは、塩基不一致によって強く阻害される活性を有するＴ４ＤＮＡリガーゼ、ならびに調査される塩基位置を設定する読み取りプローブ、および塩基情報を撮像用の色に変換した蛍光解読プローブの２つの種類の配列決定プローブを含んだ。事前にアニールされた読み取りプローブ（または同等物）を使用した他のライゲーションによる配列決定方法とは異なり、ＳＥＤＡＬにおける読み取りプローブは、短く（１１ｎｔ、室温に近いＴｍ）、部分的に縮退し（例えば、図４Ａ、サイクル４に示されるように、５’末端の最初の２つの塩基は、Ｎであり、Ａ、Ｔ、Ｃ、およびＧの等量の混合物である）、１段階反応のために解読プローブおよびＴ４ＤＮＡリガーゼと混合した。室温では、読み取りプローブは、ＤＮＡ鋳型でアニールし、ＤＮＡ鋳型から切り離す動的状態のままであった。Ｔ４ＤＮＡリガーゼは、読み取りプローブがＤＮＡ鋳型と完全に一致した場合にのみ、それを蛍光の８ｎｔの解読プローブにライゲーションした。すなわち、２つのプローブは、完全な一致が生じたときにのみ、撮像のための安定した生成物を形成するようにライゲーションした。次いで、短い読み取りおよび解読プローブを洗い流し、蛍光の１９ｎｔの生成物を撮像のためにＤＮＡアンプリコンに安定的にハイブリダイズさせたままにした。次のサイクルのために、以前の蛍光生成物を剥離し、読み取りプローブは、読み取りフレームを１つの塩基分シフトさせるための１つ以上の縮退塩基を含んだ（図１Ｅ）。５’Ｐは、５’リン酸塩を示した。３’ＩｎｖＴは、読み取りプローブの自己ライゲーションを防止する３’反転ｄＴ塩基を示し、３’ＯＨは、３’ヒドロキシル基を示した。
【０１５８】
塩基読み出しに対応する各サイクルの後、蛍光生成物をホルムアミドによって剥離し、それにより、配列決定が進むにつれて、エラーの蓄積が排除された（図１Ｅおよび図４Ｂ）。すべてのライゲーションによる配列決定方法の主要特性の比較を図４Ｃ〜４Ｆに示した。マウス脳組織に適用した場合の市販のＳＯＬｉＤ配列決定キットに関連するバックグラウンド問題を、図４Ｃおよび４Ｄに描写するが、カスタムＳＥＤＡＬ試薬は、図４Ｅおよび４Ｆにおいて最小限のバックグラウンドを示した。シグナル画像（図４Ｃおよび４Ｅ）は、Ｍａｌａｔ１、Ａｃｔｂ、Ｃａｌｍ１、およびＳｎａｐ２５遺伝子の配列決定の第１のサイクルを表した。バックグラウンド画像（図４Ｄおよび４Ｆ）を、第１のサイクルの開裂／剥離の後に取得した。スケールバーは、５０μｍを示した。
【０１５９】
１塩基および２塩基エンコーディングパラダイムの概略図を、サイクル３中に単一の配列決定エラー（間違った色）を有するか、または有しない例示的な結果と共に、図４Ｇおよび４Ｈに描写した。１塩基エンコーディングについて、単一の配列決定エラーは、１つの塩基変異、したがって間違った５塩基コードをもたらした（図４Ｇ）。２塩基エンコーディングについては、６サイクルのパラダイムがエラー低減の役割を果たした。任意の配列決定サイクル中に単一のエラーが伝播し、隣接する既知の塩基Ｇを他の塩基に変異させたため、誤った読み取りは、拒否された（図４Ｈ）。２塩基エンコーディングスキームは、スポットの高密度を撮像することに関連するいかなる残留誤差をも軽減するように設計し、実施した（図４Ｇ〜４Ｈ）。
【０１６０】
４個の高度に発現した試験遺伝子のパネルに基づいて、ＳＴＡＲｍａｐのエラー率は、以前の方法よりも１桁超低かった（約１．８％対２９．４％、図４Ｉ〜４Ｌ）。ｃＰＡＬ（１塩基エンコーディングスキームを表す）およびＳＥＤＡＬ（２塩基エンコーディングスキームを表す）からの実際のデータを、マウス視覚皮質における４個の遺伝子検出に適用した。Ｍａｌａｔ１、Ａｃｔｂ、Ｃａｌｍ１、およびＳｎａｐ２５のＳＮＡＩＬプローブは、２つの条件に関して同一であり、４つの５塩基コードの各対のハミング距離は、５であり（すなわち、完全な非相同性）、そのようなスパースコーディングを用いて、配列決定エラー率を、すべての検出されたスポットのうちの間違ったスポット（使用される４つの５塩基コードではない）のパーセンテージによって推定した。（図４Ｉ〜４Ｊ）。ｃＰＡＬによって検出された４個の遺伝子の空間マップを図４Ｉに示し、ＳＥＤＡＬを図４Ｊに示す。４個の遺伝子実験におけるｃＰＡＬのエラー率（図４Ｉ）は、２９．４％であった（図４Ｋ）が、内蔵されたエラー低減後のＳＥＤＡＬのエラー率（図４Ｊ）は、１．８％であった（図４Ｌ）。
【０１６１】
実施例５：ＳＴＡＲｍａｐを使用した原発性視覚皮質における細胞型の細胞分類
ＳＴＡＲｍａｐが、必要な感度および精度で単一細胞転写状態の高含量３Ｄ無傷組織配列決定の最初の目標をもたらすことができるかどうかを試験するために、ＳＴＡＲｍａｐを、神経科学における差し迫った現在の課題である、成体マウス脳の新皮質における細胞型の検出および分類、ならびに対応する組織構成の原理に適用した。マウス原発性視覚新皮質の生体構造および機能は、広範に研究されており、多数の論文、方法論、およびデータソースにまたがる以前の知見と比較することにより結果の検証を可能にしているが、視覚皮質内の深く分子定義された細胞型の完全な多様性は、単一の実験ではまだ空間的に解決されておらず、潜在的に基本的な共同統計および３Ｄ体積にわたる組織原理の特定を除外している。そのような情報が提供することができるであろう実験の影響力の多くの例の中で、共同３Ｄ細胞類型マッピングは、細胞型および空間的位置の関数として、神経活性で誘発された遺伝子発現の時空論理を解読することを補助するために使用した。
【０１６２】
一次視覚皮質（Ｖ１）を冠状に切片化し、５塩基のバーコード化されたＳＮＡＩＬプローブを、冠状マウス脳切片におけるインサイチュＳＥＤＡＬ配列決定の６ラウンドにわたって使用して（図１Ａ、図５Ａ〜５Ｂ）、マウス皮質単一細胞ＲＮＡ配列決定から照合された１１２個の推定細胞型マーカー、および４８個の活性制御された遺伝子（ＡＲＧ）含む、１６０個の遺伝子の大規模な硬化された遺伝子セットを調査した。マウスコホートのうちの１つのアームにおいて、視覚的に誘発された神経活性が、暗所での４日間の収容後に１時間の光曝露を介して提供され、他のマウスは、犠牲になる前に暗所で継続的に保持した。すべての皮質層を覆う６００〜８００個の細胞を含有する８μｍ厚の体積を撮像した。図５Ｂは、サイクル１の全図（図５Ｂ、上）およびすべての６つのサイクルにわたるズームビュー（図５Ｂ、下）と共に、プロセス中のＳＴＡＲｍａｐの生の蛍光画像を描写した。全視野は、１．４ｍｍ×０．３ｍｍを示し、スケールバーは、１００μｍを示し、ズーム領域は、１１．７８μｍ×１１．７８μｍを示し、スケールバーは、２μｍを示し、チャネルは、４つの蛍光チャネルのカラーコードを示し、Ｌ１〜６は、６つの新皮質層を示し、ｃｃは、脳梁を示し、ＨＰＣは、海馬を示した。
【０１６３】
６ラウンドの配列決定後、蛍光Ｎｉｓｓｌ染色を使用して、細胞体をセグメント化し、アンプリコンの個々の細胞への帰属を可能にした（図６Ａ〜６Ｂ）。図６Ａは、生撮像データから解読された読み込みを抽出する処理パイプラインを示す図を描写し（各ステップに対応する詳細については、方法も参照されたい）、（１）試料を多数のラウンドにわたって撮像し、（２）試料をラウンドにわたって位置合わせし、位置合わせによって補正されなければならない不整合を有する２つのラウンド（緑色および紫色）を示し、（３）スポットを、各ラウンドの点における色値に基づいて解読されるであろう推定アンプリコンとして、各カラーチャネルにおいて自動的に特定し（第１ラウンドにおいては独立して）、（４）読み込みを、各ラウンドにわたる各スポットの最大強度と、各バーコード化されたＤＮＡ配列（色空間エンコードされたバーコード）についての予測されたカラー配列との比較に基づいて呼び出し、（５）細胞を、様々な強度およびテクスチャ特徴を考慮した機械学習に基づくセグメント化を使用して検出して、バックグラウンドからＮｉｓｓｌ含有細胞をセグメント化し（図６Ｂ）に記載））、（６）読み込みを、各有効な読み込みの位置と、各細胞のセグメント化された領域の凸包との重複を計算することによって細胞に割り当てた。
【０１６４】
細胞の凸包と重複した読み込みによってエンコードされた遺伝子を、その細胞に割り当てた。図６Ｂは、セルの範囲を決定するための方法を描写し、（１）ランダムフォレスト分類子（標識予測のための非パラメトリック機械学習アルゴリズム）をサブサンプルされたセットのＮｉｓｓｌ染色データ上で訓練して、細胞含有領域対バックグラウンドを区別し、（２）ＤＡＰＩ（細胞核）チャネルを使用して、細胞位置を手動で選択し、（３）分類子を画像全体に適用して、細胞の位置を予測し、（４）細胞を、マーカーベースの分水嶺を使用して、この予測からセグメント化し、これは、画像の細胞標識された領域を、核の既知の位置に基づいて別個の細胞体にセグメント化した。
【０１６５】
図５Ｃのヒストグラムは、１細胞あたりの読み込み（ＤＮＡアンプリコン）（図５Ｃ、左）、および１細胞あたりの遺伝子（図５Ｃ、右）を検出した。１細胞あたりのアンプリコンおよび１細胞あたりの遺伝子に対応する値は、大幅に変化した（図５Ｃ）が、１６０個の遺伝子発現パターンは、生物学的複製間で一貫し（Ｒ＝０．９４〜０．９５、図５Ｄ）、単一細胞レベルでの転写産物の多様性の信頼できる検出が明らかになった。生物学的複製の定量的再現性を、光条件または暗条件に関わらず図５Ｄに示し、ｌｏｇ２（アンプリコン量）は、プロットされた全撮像領域にわたる１６０個の遺伝子に関する。ｒｅｐ１は、第１の複製における式値を示し、ｒｅｐ２は、第２の複製における式値を示した。
【０１６６】
この１６０個の遺伝子パイロットは、既知の皮質層マーカーおよびインターニューロンの空間分布を忠実に再現し、ここでは、対になった公開地図計画からのインサイチュ画像とＳＴＡＲｍａｐ結果との比較を介して図示した（図５Ｅ）。図５Ｅに示されるＳＴＡＲｍａｐの検証は、Ａｌｌｅｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｂｒａｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＡＩＢＳ）（図５Ｅ、左列）からのインサイチュ画像、およびＡＩＢＳから空間遺伝子発現パターンを確実に再現した１６０個の遺伝子ＳＴＡＲｍａｐから抽出された個々の遺伝子のＲＮＡパターン（図５Ｅ、右列）を描写した。
【０１６７】
細胞分類は、１１２個の細胞型マーカーの発現データを使用して行った。まず、４つの生物学的複製からプールされた３，０００個以上の細胞を、主成分分解後にグラフベースのクラスタ化を使用して３つの主要な細胞型（興奮性ニューロン、抑制性ニューロン、および非神経性細胞）にクラスタ化し、次いで各カテゴリの下でさらにサブクラスタ化した（図５Ｆ〜５Ｈおよび図６Ｃ）。２つの次元における細胞トランスクリプトームの類似性を可視化するために使用される非線形次元低減技術である均一マニホールド近似（ＵＭＡＰ）プロットは、４つの生物学的複製からプールされた３，１４２個の細胞、２，１９９個の興奮性ニューロン、３２４個の抑制性ニューロン、および６１９個の非神経性細胞（図５Ｆ）にわたって、主要な細胞型の一貫したクラスタ化を示した。図５Ｇに示される１１２個の細胞型マーカーの遺伝子発現ヒートマップは、各細胞クラスタと整合し、抑制性、興奮性、または非神経性細胞型によるクラスタ化を示す。各遺伝子の発現を、各細胞内のすべての遺伝子にわたってｚスコア化した。新皮質およびそれ以降における代表的な細胞分解された空間マップを図５Ｈに示し、細胞型を図５Ｆのようにコード化した。興奮性および抑制性サブタイプのクラスタ化（図５Ｉ〜５Ｎ）は、ＵＭＡＰプロット（図５Ｉおよび５Ｌ）、代表的遺伝子の棒グラフ（図５Ｊおよび５Ｍ）（そのクラスタ内のすべての細胞にわたる平均±Ｓ．Ｅ．Ｍ．の発現であり、各棒グラフは、すべてのクラスタにわたる最大平均の発現までスケールされる）、および興奮性（図５Ｉ〜５Ｋ）および抑制性（図５Ｌ〜５Ｎ）ニューロンのインサイチュ空間分布（図５Ｋおよび５Ｎ）を描写した。各クラスタのセル数は、以下の通りであった。Ｌ２／３：５８９；Ｌ４：６４９；Ｌ５：３９３；Ｌ６：３６８；ＰＶニューロン：１１１；ＶＩＰニューロン：４６；Ｓｓｔニューロン：４６；Ｎｐｙニューロン：５６．クラスタ中の細胞の包含を、空間情報を使用せずに各細胞内のアンプリコン表現によって完全に誘導し、次いで、興奮性細胞クラスタを、そのクラスタについて観察された空間層に従って命名し、一方で、阻害細胞クラスタを、アンプリコンマーカーの強力な分離に基づいて、優性細胞型アンプリコンに従って命名した。
【０１６８】
図６Ｃは、１細胞あたりの発現データをクラスタ化およびサブクラスタ化するための方法を描写し、（１）データを、ｚスコア化された対数変換カウントとして、細胞×遺伝子のマトリックスで表し、（２）主成分分析（ＰＣＡ）を、マトリックスに適用して、細胞×係数のマトリックスに低減し、（３）細胞の位置を、可視化のための均一マニホールド近似（ＵＭＡＰ）（高次元データの２Ｄ可視化のための非線形次元低減技術）を使用してプロットし、（４）細胞を、共有最近傍ベースのグラフクラスタ化を使用してＰＣＡ値によってクラスタ化し、（５）次いで、個々のクラスタに対応する細胞の発現値を取得し、サブクラスタ化のために再び使用する。
【０１６９】
豊富に定義された興奮性ニューロンは、解剖学的皮質層および既知の層特異的遺伝子マーカーの発現プロファイルとの空間的対応によって示される（ｅＬ２／３、ｅＬ４、ｅＬ５、およびｅＬ６；図５Ｉ〜５Ｋおよび図７Ａ〜７Ｂ）４つの主要な型に分離した。図７Ａにおける興奮性細胞型のＺスコア化された発現マトリックスは、１細胞型あたりの多数の発現変動遺伝子のクラスタ化を示した。示される遺伝子は、各クラスタ内の細胞対任意の他の細胞において発現した遺伝子について、尤度比検定を使用して、１０−１０の偽発見率（ＦＤＲ）で調整されたＰ値閾値および０．１の最小ｌｏｇ１０の倍率変化に基づいて選択した。図７Ｂは、細胞にわたる各クラスタにおいて豊富になった多数の既知の層特異的遺伝子の相対発現（すべての興奮性細胞にわたって最小および最大に正規化）のＵＭＡＰ視覚化を描写し、ほとんどが特定の興奮性サブタイプで豊富になっていることを示す。図７Ｃは、図７Ａのように選択される抑制性細胞型の発現マトリックスを描写した。図７Ｄは、既知のニューロン間マーカー遺伝子の相対発現を示すＵＭＡＰ視覚化を描写し、各々が抑制性神経性サブタイプで特異的に豊富になっていることを示す。
【０１７０】
４つの興奮型の空間的構成は、層状パターンを示したが、各層内の異なる細胞型の中で広範な混合が存在した。抑制性ニューロンはまた、各サブタイプの優性インター神経マーカーによって示される４つの主要な型（Ｖｉｐ、Ｓｓｔ、Ｎｐｙ、およびＰｖａｌｂ、図５Ｌ〜５Ｎおよび図７Ｃ〜７Ｄ）にクラスタ化され、ＶｉｐおよびＮｐｙ型は、より多くの上位層に分布することが観察されたが（Ｌ１〜３）、ＳｓｔおよびＰｖａｌｂ型は、より一般的に下位層に見られた（Ｌ４〜６）。
【０１７１】
アストロサイト、オリゴデンドロサイト、内皮細胞、および平滑筋細胞を含む非神経性細胞型も検出された（図８Ａ〜８Ｃ）。ここに例示される主要な細胞型の数（合計１２個）は、さらに分解され得る（単一細胞ＲＮＡ配列決定は、各型内の遺伝子発現の見てすぐにわかる異種性と一致する、４０個以上のサブタイプ化をもたらし得る；図７Ａ〜７Ｄ；図８Ａ〜８Ｃ）。４つの非神経性細胞型のＵＭＡＰ視覚化を図８Ａに描写したた。非神経性細胞型のＺスコア化された発現マトリックスを図８Ｂに描写した。示される遺伝子は、各クラスタ内の細胞対任意の他のクラスタ内の細胞で発現する遺伝子について、尤度比検定を使用して、１０−１０の偽発見率（ＦＤＲ）で調整されたＰ値閾値および０．１の最小ｌｏｇ１０倍変化に基づいて選択した。図８Ｃは、非神経性細胞型についてのマーカー遺伝子（１クラスタあたりのトップ発現変動遺伝子）の１細胞あたりの発現のＵＭＡＰ可視化を描写し、そのクラスタに対する特異性を示す。色は、すべての非神経性細胞にわたる各遺伝子の相対発現（最小および最大に正規化）を示した。
【０１７２】
標的とされた１１２個の遺伝子セットを用いて、１試料あたり６００〜８００個の細胞のサイズで、４つの生物学的複製の中で、１２個すべての主要細胞型が、バッチ効果を伴わず、非常に類似した空間パターンで確実に検出された（図９Ａ〜９Ｇ）。図９Ａ〜９Ｃは、試料複製によってコードされ、次いで、主要クラスタ（図９Ａ）、興奮性サブクラスタ（図９Ｂ）、および抑制性サブクラスタ（図９Ｃ）によってグループ化された細胞のＵＭＡＰ可視化を描写した。すべての細胞型（図９Ｄ）、興奮性細胞型（図９Ｅ）、抑制性細胞型（図９Ｆ）、および非神経性細胞型（図９Ｇ）の光複製および暗複製の対（図９Ｄ〜９Ｇ、上および下）の空間マップ。
【０１７３】
実施例６：単一細胞ＲＮＡ配列決定
単一細胞レベルでのＳＴＡＲｍａｐの定量的能力を評価して、分子定義された細胞型において、実験条件にわたって示差的遺伝子発現分析を試験した。視覚刺激依存性遺伝子発現パターン（単一細胞分解能をインサイチュで有する４８個の定義されたＡＲＧを介して）を評価した。単一細胞ＲＮＡ配列決定手順をさらに発展させて、マウス脳を、天然転写シグネチャの最大保存のために、犠牲後最小の取り扱い時間（５分未満）および薬物治療なしでフラッシュ凍結した。既知の最初期遺伝子（Ｆｏｓ、Ｅｇｒ１、およびＥｇｒ２、図１０Ａ〜図１０Ｄ）のグローバル誘導は、１時間の光曝露後に一次視覚皮質で観察された。単一細胞分解能では、ＡＲＧ変化の定量的範囲（発現の倍率変化）は、神経性細胞型にわたって顕著な多様性を示した（図１０Ｂ〜１０Ｃおよび図１１Ａ〜１１Ｃ）。図１０Ａは、最初期遺伝子（ＩＥＧ）として知られる原型的なＡＲＧの視覚皮質における空間発現パターンを検証した。犠牲は、暗闇中または１時間の光曝露後であった。図１０Ｂおよび１０Ｃは、抑制性細胞型および興奮性細胞型における光条件と暗条件との間の遺伝子発現の対数倍率変化の火山プロットを描写した。発現が著しく増加または減少した遺伝子（ウィルコクソンの順位和検定での、偽発見率で調整されたＰ値＜０．０５、）を緑色で標識し、最も著しく変化した遺伝子（Ｐ値＜０．０５および倍率変化＞２）を赤色で標識した。多くのＡＲＧは、興奮−転写カップリングの予期されていなかった細胞型特異的論理の発見を指す細胞型特異性を示した。図１０Ｄは、細胞型によるＥｇｒ２発現のバイオリンプロットを描写した。＊＊＊＊は、Ｐ＜０．０００１であり、ｎ．ｓ．は、ウィルコクソンの順位和検定で有意ではないことを示し、赤色標識細胞型の倍率変化は、２超を示した。一般に、異なる層にわたる興奮性ニューロンにおけるＡＲＧ発現プログラムは、非常に類似していたが、抑制性細胞におけるＡＲＧ発現プログラムは、はるかに異なる細胞型特異的特徴を示し（図１１Ｂ）、例えば、Ｅｇｒ２は、抑制性ニューロンにおいてではなく、興奮性ニューロンにわたって光誘導を示した（図１０Ｄ）が、対照的に、Ｐｒｏｋ２は、Ｖｉｐ抑制性ニューロンにおいて上方制御された（図１０Ｃ）。
【０１７４】
最後に、神経活性がＡＲＧのエンハンサー内からの非コーディングＲＮＡの共転写を誘発することができるため、これらのエンハンサーＲＮＡの例が研究され（Ｆｏｓ遺伝子のｅＲＮＡ１〜５）、ポリアデニル化されていないこれらの転写産物は、現在の単一細胞ＲＮＡ配列決定で測定することが非常に困難であった。しかしながら、ｅＲＮＡ３は、最も有意かつ一貫したＡＲＧマーカーとして特定された（図１１Ｂ）。図１１Ａは、暗／光生物学的複製の１６０個の遺伝子の相関関係を描写し、同じ条件の試料が、スケール、スピアマンＲ値が異なる条件下での試料よりも高度に相関したことを示した。図１１Ｂは、抑制性および興奮性ニューロンサブタイプにおけるＡＲＧの対数スケール発現データ（１細胞あたりの数）を描写した。任意の細胞型において発現が著しく増加した遺伝子を赤色で強調した。図１１Ｃは、光に応答するそのクラスタにおけるのすべてのＡＲＧの平均発現の相関に基づく神経性サブタイプの相関のヒートマップを描写し、抑制性細胞型からの細胞が、興奮性細胞型よりも他の抑制性細胞型と相関しており、逆も同様であることを示した。スケールは、Ｒ＝０．８〜Ｒ＝１の範囲であったことに留意されたい。
【０１７５】
実施例７：大きい組織体積に適用されるＳＴＡＲｍａｐ法
１６０個の遺伝子実験は、１細胞体の厚さ以下の脳切片で実行したため、組織体積中の細胞の３Ｄ構成を捕捉するためのＳＴＡＲｍａｐ法の能力はまだ試験しなかった。ＳＴＡＲｍａｐは、細胞分解能で遺伝子発現を線形的に読み出して、組織体積における高スループット分子分析を可能にするための戦略を用いて、無傷組織体積に対する拡散アクセスおよび撮像スループットにおける制限を克服するようにさらに開発された（図１２および図１３）。図１２は、試料寸法、ライブラリ調製、撮像および配列決定、ならびにデータ出力のステップを含む、本明細書に開示される方法を描写した。薄い組織（ｚ＜１６μｍ、細胞単層）については、新鮮凍結されたマウス脳を使用してライブラリを調製し、クライオスタットスライシング、ＰＦＡ固定、透過化、ハイブリダイゼーション、ライゲーションおよび増幅、ならびにヒドロゲル埋め込みおよび組織清澄化が後続した。撮像および配列決定には、単一アンプリコン分解能、高ＮＡ油浸対物レンズ、１時間あたり２００細胞の撮像、縮退プローブとのＳＥＤＡＬ反応、およびサイクルから遺伝子への指数的読み出しが含まれた。データ出力には、３Ｄアンプリコンおよび２Ｄ細胞型決定が含まれた（図１Ａ〜１Ｅ、図５Ａ〜５Ｎ、および図１０Ａ〜１０Ｄ）。より厚い組織（ｚ＞１００μｍ、多数の細胞層）については、ＰＦＡ固定されたマウス脳を使用してライブラリを調製し、ビブラトームスライシング、透明化およびハイブリダイゼーション、ヒドロゲル埋め込みおよび組織清澄化、ならびにライゲーションおよび増幅が後続した。撮像および配列決定には、単一細胞分解能、低ＮＡ水浸対物レンズ、１時間あたり１０，０００個の細胞の撮像、直交プローブとのＳＥＤＡＬ反応、およびサイクルから遺伝子への線形読み出しが含まれた。データ出力には、３Ｄ細胞型決定が含まれた（図１３Ａ〜１３Ｉ）。
【０１７６】
図１３Ａは、連続ＳＥＤＡＬ遺伝子読み出しを介した体積ＳＴＡＲマッピングを描写した。改変されたＳＴＡＲｍａｐ手順（図１２、右）および環状遺伝子読み出し（各サイクルにおいて４個の遺伝子）を使用して、各アンプリコンを過剰サンプリングすることなく、単一細胞分解能で大きな組織体積を迅速にマッピングした。Ｔｈｙ１：：ＹＦＰマウス脳を使用して、大体積のＳＴＡＲｍａｐの特異性および浸透深さを最初に試験し、ＳＴＡＲｍａｐは、１５０μｍの組織厚にわたるＹＦＰ  ｍＲＮＡを成功裏に検出し、特に、数万個の散在した隣接細胞を標識せずに、単一細胞分解能でのＹＦＰタンパク質およびｍＲＮＡを共局在化した（図１３Ｂ）。検証は、３Ｄ皮質体積におけるＹＦＰ発現ニューロン（トランスジェニックＴｈｙ１：：ＹＦＰマウス株から）の特異的なＳＴＡＲＭＡＰ標識を示した。スケールバーは、０．５ｍｍを示す。
【０１７７】
マウス一次視覚皮質の空間細胞型決定は、すべての６層および脳梁にまたがる体積にわたって３０，０００個超の細胞に拡張した。２３個の細胞型マーカーおよび線形ＳＥＤＡＬ配列決定の７サイクルにわたって読み出された５個のＡＲＧを含む２８個の遺伝子を使用して（図１３Ｃ〜１３Ｄおよび図１４Ａ〜１４Ｂ）、マーカー遺伝子のＫ平均クラスタ化（方法）を各細胞型に適用した（１６０個の遺伝子実験によって抽出されたものの大部分に対応する１１個の細胞型を回収したが、ここでは２８個の遺伝子のみである）。図１３Ｃは、視覚皮質ＳＴＡＲｍａｐ体積において多数ラウンドにわたって取得された、主要な細胞型（図１３Ｃ、左）、層特異的マーカー（図１３Ｃ、左中央）、抑制性マーカー（図１３Ｃ、右中央）、および活性調節された遺伝子（図１３Ｃ、右）の代表的な標識を描写した。
【０１７８】
１１個の細胞型の３Ｄパターン化（図１３Ｅ〜１３Ｆ）は、１６０個の遺伝子薄片組織所見と一致したが、はるかに大きな細胞数を有する、空間にわたる細胞分布の正確かつ定量的なプロファイリングを提供した。興奮性、抑制性、および非神経性細胞型の空間ヒストグラムは、図１３Ｄと同じ標識を使用した（図１３Ｅ）。細胞を２Ｄ最大投影における５μｍのビンでカウントし、脳梁（ｃｃ）から軟膜までの距離の関数として細胞数／μｍ単位でプロットし、皮質層に垂直なビンにわたって平均化した。最大投影された細胞位置のプロットを、図１３Ｄ（図１３Ｅ、底部）のようにクラスタによってコード化した。空間ヒストグラム（図１３Ｅ）および相関分析（図１４Ｂ）の両方によって反映されるように、興奮性サブタイプは、層分布を示し、各サブタイプの空間密度は、隣接する層へ空間をわたって減衰していた。対照的に、抑制性サブタイプは、Ｖｉｐサブタイプ（主に層２／３に位置する）、ならびにＳｓｔサブタイプおよびＰｖａｌｂサブタイプ（層４および５に位置する）によって示される層の優先傾向にも関わらず、より分散していた。図１４Ａは、ＸＹ平面に投影された３Ｄ最大における各遺伝子の発現を描写し、後のクラスタ化に使用される１細胞あたりで抽出された遺伝子発現値の空間分布を示す。各遺伝子は、すべての遺伝子にわたって細胞ごとにｚスコア化した。図１４Ｂは、各細胞型の分布間のボクセル単位の相関係数を描写し、２５μｍグリッド上にビニングされている。
【０１７９】
非神経性細胞は、層１および白色物質において主に見られた。図１３Ｄは、細胞間の全シグナルの平均差に関して正規化するために、各細胞について遺伝子にわたってｚスコア化された、多数の興奮性、抑制性、および非神経性細胞型にクラスタ化された１つの体積からの３２，８４５個の単一細胞からの２８個の遺伝子の１細胞あたりの発現マトリックスを描写した。列を、４つの群において、実施したように配列決定ラウンドの順序でソートした。図１３Ｆは、３次元における各細胞型（興奮性、抑制性、非神経性）およびサブタイプの空間分布を描写した。各ドットは、単一細胞を表し、空間寸法は、μｍであった。
【０１８０】
より細かい体積パターンを発見するために、各配列決定で定義されたサブタイプの個々の細胞からその最近傍までの距離の分布を分析し、いかなる抑制性ニューロンの最近傍も、興奮性ニューロンまたは他の抑制性サブタイプではなく、それ自体のサブタイプである傾向があったことを予期せず発見した（図１３Ｇ）。すべての興奮性細胞（興奮性）と各阻害性細胞型との間で３Ｄで計算された最近傍距離を図１３Ｇに描写した。自己比較のために、最近傍は、最も近い同一でない細胞として定義され、持続的な自己相関は、抑制性サブタイプの自己クラスタ化を明らかにした。抑制性ニューロンが純粋なごま塩の分布でより豊富な興奮性ニューロンの中でランダムに分散していた場合、抑制性ニューロン間の距離は、抑制性ニューロンから興奮性ニューロンまでの距離よりも大きくなるであろう（図１３Ｈ）。図１３Ｈのように、同じ距離を分析したが、シャッフル（ランダム化）された細胞型標識を使用した。抑制性ニューロンの実際のサブタイプ内距離は、はるかに短かった（約１５μｍ、単一のニューロンのサイズに等しく、直接的な体細胞並置を示す；図１３Ｉ）。図１３Ｉは、ある特定の型の各阻害性細胞と、同じ型の任意のメンバー（抑制性・抑制性、例えば、ＶＩＰ・ＶＩＰ）または任意の興奮性ニューロン（抑制性・興奮性）との間の３Ｄで計算された最近傍距離を描写し、＊＊＊＊は、ウィルコクソンの順位和検定でＰ＜０．０００１である。図１３Ｉは、２Ｄではなく、３Ｄでのみ正確に測定することができた、体積にわたる抑制性サブタイプの自己クラスタ化構成を明らかにした（図１５Ａ〜１５Ｃ）。Ｚ方向に沿った８μｍ（１つの細胞よりも薄い）の切片の２Ｄ投影で計算された興奮性細胞型と、異なる抑制性細胞型との間の平均最近傍距離を、図１３Ａ〜１３Ｉ（図１５Ａ）に示される同じ３Ｄ体積内で取得した。２Ｄ最近傍距離は、図１３Ｄに示される同じ細胞型について、３Ｄ距離を正確に推定することができなかった（過剰推定）。そのようなパターン化は、機能的に関連する可能性があり、例えば、インビボ撮像は、視覚皮質における抑制性ニューロン群が視覚応答を鋭敏にさせることができることを示唆している。図１５Ｂは、図１３Ｃからのズームビューである、抑制性ニューロンの３Ｄ短距離クラスタの例を描写した。図１５Ｃは、トランスジェニックマウスの一次視覚皮質において観察された短距離抑制性ニューロンクラスタ（Ｐａｒｖ−ＩＲＥＳ−ＣｒｅとＡｉ１４とを交配することによって生成された）を描写した。Ｐｖａｌｂ細胞をｔｄｔｏｍａｔｏによって標識し、すべてのニューロン核をＡｌｅｘａ６４７接合された抗ＮｅｕＮで免疫染色した。
【０１８１】
実施例８：ＳＴＡＲｍａｐのスケーラビリティ
ＳＴＡＲｍａｐは、より長い配列決定長またはより高い遺伝子数に適合し、ＳＴＡＲｍａｐによって同時に、定量的にアクセスすることができる遺伝子またはＲＮＡ種の数に固有の制限はなかった（図１６Ａ〜１６Ｅ）。図１６Ａは、プローブ混合の潜在的な希釈効果を、ＳＮＡＩＬ  ＤＮＡアンプリコンのための細胞の物理的容量とともに試験するための、増加する量の他のＲＮＡを共検出したときのＡｃｔｂ  ｍＲＮＡの検出を描写した。ＡｃｔｂのＳＮＡＩＬプローブを、検出のための直交ＤＮＡ配列で設計し、０（図１６Ａ）、１００（図１６Ｂ）、または１，０００個（図１６Ｃ）の他の遺伝子のプローブと混合物中にスパイクした。ＳＮＡＩＬプローブが、単一プローブとして作用するよりも混合物中で作用するとき、効率が低かった場合、またはローリングサークル増幅のためスペースが十分になかった場合、Ａｃｔｂスパイクインは、より少ないアンプリコンをもたらし、および／または各アンプリコンの強度が低下した。蛍光画像をマウス視覚皮質において取得し、緑色は、ＡｃｔｂアンプリコンのＡｌｅｘａ５４６チャネルであり、赤色は、他のすべての遺伝子のＡｌｅｘａ６４７チャネルであり、青色は、細胞核のＤＡＰＩ染色である。図１６Ａ〜１６Ｃの定量化を図１６Ｄに描写した。ボックスプロットは、希釈および細胞空間制限のいずれの効果も、少なくとも１，０００個の遺伝子のスケールまでは有意ではないことを示した。ボックスは、第１および第３の四分位数を示し、中央線は、中央値を示し、ヒゲは、５％および９５％のデータポイントを示し、ｎは、２２８×２２８×２μｍの撮像体積にわたるＡｃｔｂアンプリコンの数を示し、ｙ軸は、絶対蛍光強度を示した。図１６Ｅは、ＳＴＡＲｍａｐのスケーラビリティの実験的および理論的推定を描写した。コーディングは、５ｎｔのコードが１，０２４個の遺伝子をエンコードすることができることを示し、ＳＮＡＩＬプローブは、ＲＮＡ相補配列に加えて３５ｎｔのコーディング空間を有し、ＳＥＤＡＬは、配列決定単位として１７ｎｔを必要（読み取りプローブのための１１ｎｔのドッキング領域＋５ｎｔのコードおよび１ｎｔのフランキング塩基）とするため、ＳＮＡＩＬプローブは、２つのそのような単位を保持し、４１０（１０６）個のコードを可能にし、より長い読み込みのための他の配列決定方法（例えば、ＳＯＬｉＤ、プライマー結合のための１８ｎｔおよびコーディングのための１７ｎｔ）では、上限が、１０１１個に近づいた。哺乳動物ニューロンにおいて最大１，０００個の遺伝子について物理的容量を検証し、ＤＮＡアンプリコンの物理的サイズがＡＦＭおよびＴＥＭによって決定されるように約１００〜２００ｎｍであったため、細胞の直径が約１５μｍであり、密閉型モデル（空間効率７４％）を使用していることを考慮すると、推定最大容量は、１細胞あたり１０６個のアンプリコンであった。マウス海馬細胞培養物における１，０２０個の遺伝子実験および視覚皮質実験で光学体積を検証し、アンプリコン／細胞とは、すべての６回の配列決定ラウンドを通じて成功裏に位置合わせされたものを指す。共焦点顕微鏡法によって撮像されるように、ＤＮＡアンプリコンの平均直径は、４００〜６００ｎｍであり、物理的限界で使用されるのと同じモデルを適用すると、最大容量は、１細胞あたり２×１０４個のアンプリコンであった。１，０２０個の遺伝子の実験データは、この限界に近づいた。いかなる科学的理論にも拘束されるものではないが、細胞培養物と組織切片との間の数値的差異は、次の考慮事項に起因し得る。（１）全細胞を細胞培養物中で撮像すると同時に、細胞画分を組織切片中で撮像した（８μｍ、＜１つの細胞の厚さ）、（２）海馬細胞培養物は、成体マウス脳と比較して分化が少なく、したがって、１細胞あたりのＲＮＡの多様性（より多くの遺伝子）を示す、（３）脳組織中の細胞の高密度３Ｄパッキングとは対照的に、インビボで培養された細胞は、ｘｙ平面内でかなり広がり、ｚ方向で薄くなったが、ｘｙ平面内の画像は、ｚ方向と比較してより高い光学分解能を示した（ボクセルサイズ７８×７８×２５０μｍ）。
【０１８２】
実施例９：ＳＴＡＲｍａｐの１６０個の遺伝子実験において特定されたニューロン型と、公開されている単一細胞ＲＮＡ配列決定結果との相関
図１７は、特定されたＳＴＡＲｍａｐの興奮性および抑制性クラスタ内のすべての遺伝子にわたる平均遺伝子発現と、Ａｌｌｅｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑによって特定された対応するクラスタとのピアソン相関を描写した。例えば、Ｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）を参照されたい。単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑデータについて、発現を、主要な型（例えば、Ｌ２／３）内のすべてのサブタイプにわたって平均化し、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑと１６０個の遺伝子Ｖ１実験との間で共通であった遺伝子のみを使用して、相関を計算し、スケールは、ピアソン相関係数で０〜０．６であった。
【０１８３】
実施例１０：ＳＴＡＲｍａｐを使用した内側前頭前皮質（ｍＰＦＣ）の細胞型サブクラスタの遺伝子発現分析
図１８Ａは、興奮性サブクラスタのＵＭＡＰ可視化を描写した。図１８Ｂは、１つの興奮性サブクラスタあたりの発現変動遺伝子を描写した。図１８Ｃは、抑制性サブクラスタのＵＭＡＰ可視化を描写した。図１８Ｄは、１つの抑制性サブクラスタあたりの発現変動遺伝子を描写した。図１８Ｅは、非神経性サブクラスタのＵＭＡＰ可視化を描写した。図１８Ｆは、１つの非神経性サブクラスタあたりの発現変動遺伝子を描写した。
【０１８４】
図１９Ａ〜１９Ｃは、興奮性サブクラスタ（図１９Ａ）、抑制性サブクラスタ（図１９Ｂ）、および非神経性サブクラスタ（図１９Ｃ）の４つの生物学的複製にわたる空間マップを描写した。
【０１８５】
実施例１１：マウス海馬細胞培養物中の１０２０個の遺伝子の細胞型サブクラスタの遺伝子発現分析
図２０Ａ〜２０Ｃは、本明細書に記載される方法を使用した６ラウンドの配列決定におけるマウス海馬細胞培養物中の１０２０個の遺伝子の分析を描写した。図２０Ａは、第１ラウンドの４つの蛍光チャネルを統合するｆａｗの蛍光画像を描写した。図２０Ｂは、細胞型マーカーの例を描写した。神経性遺伝子マーカー（Ｓｃｎａ）を非神経性遺伝子マーカー（Ｍｔ１）から十分に分離し、神経性サブタイプマーカー（Ｒｅｌｎ、Ｓｓｔ）の分布は異なる。図２０Ｃは、２７０×２７０μｍの撮像面積での、１細胞あたりのアンプリコンおよび遺伝子の統計解析を描写した。
【０１８６】
図２１Ａ〜２１Ｃは、本明細書に記載される方法を使用してマウス原発視覚皮質内の１０２０個の遺伝子の追加の遺伝子発現情報を描写した。図２１Ａは、興奮性サブクラスタ（図２１Ａ、左）および１つの興奮性サブクラスタあたりの発現変動遺伝子（図２１Ａ、右）のＵＭＡＰ可視化を描写した。図２１Ｂは、抑制性サブクラスタ（図２１Ｂ、左）および１つの抑制性サブクラスタあたりの発現変動遺伝子（図２１Ｂ、右）のＵＭＡＰ可視化を描写した。図２１Ｃは、非神経性サブクラスタ（図２１Ｃ、左）および１つの非神経性サブクラスタあたりの発現変動遺伝子（図２１Ｃ、右）のＵＭＡＰ可視化を描写した。
【０１８７】
図２２Ａ〜２２Ｄは、ＳＴＡＲｍａｐによるマウス一次視覚皮質中の１０２０個の遺伝子の再現性、および測定値のクロスメソッド比較を描写した。図２２Ａは、視覚皮質における２つの１，０２０個の遺伝子複製間の１遺伝子あたりの読み込みの相関関係を描写した。図２２Ｂは、１細胞あたりの検出された読み込み（図２２Ｂ、左）および１細胞あたりの検出された遺伝子（図２２Ｂ、右）のヒストグラムを描写した。図２２Ｃは、１，０２０個の遺伝子の視覚皮質実験の他の複製における細胞型の空間マップを描写した。図２２Ｄは、特定されたＳＴＡＲｍａｐの１，０２０個の遺伝子クラスタ内のすべての遺伝子にわたる平均遺伝子発現と、Ａｌｌｅｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅからの単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑによって特定された対応するクラスタとのピアソン相関を描写した。
【０１８８】
実施例１２：薄い組織切片および厚い組織切片についてのＳＴＡＲｍａｐ
図２３Ａは、薄い組織および厚い組織についてのＳＴＡＲｍａｐの実験フローチャートを描写した。図２３Ｂは、大量実験のための修飾されたプライマープローブの調製を示した。ＤＮＡプローブを５’アミン修飾で順序付けし、プールし、ＡＡ−ＮＨＳによって重合性部分に変換した。図２３Ｃは、様々な数の遺伝子を用いた異なる実験設計の実験期間を示した。図２３Ｄは、他の単一細胞アプローチとの、ＳＴＡＲｍａｐのＲＮＡ種、空間分解能、およびスループットの比較を示した。単一細胞ＲＮＡ配列決定は、最近開発された空間トランスクリプトーム法と組み合わせて、領域空間分解能（１００μｍ）を得ることができる。
【０１８９】
本発明は、その特定の実施形態を参照して記載されているが、本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な変更が行われ得、同等物が置換され得ることを当業者に理解されるべきである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスステップ、またはステップを、本発明の目的、主旨、および範囲に適合させるために、多くの変更が行われ得る。すべてのそのような修正は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であることが意図される。
参考文献
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【図１Ａ】
2021520795.tif 000003
【図１Ｂ】
2021520795.tif 000004
【図１Ｃ】
2021520795.tif 000005
【図１Ｄ】
2021520795.tif 000006
【図１Ｅ】
2021520795.tif 000007
【図２Ａ】
2021520795.tif 000008
【図２Ｂ】
2021520795.tif 000009
【図２Ｃ】
2021520795.tif 000010
【図２Ｄ】
2021520795.tif 000011
【図２Ｅ】
2021520795.tif 000012
【図２Ｆ】
2021520795.tif 000013
【図２Ｇ】
2021520795.tif 000014
【図２Ｈ】
2021520795.tif 000015
【図２Ｉ】
2021520795.tif 000016
【図３Ａ】
2021520795.tif 000017
【図３Ｂ】
2021520795.tif 000018
【図３Ｃ】
2021520795.tif 000019
【図３Ｄ】
2021520795.tif 000020
【図３Ｅ】
2021520795.tif 000021
【図３Ｆ】
2021520795.tif 000022
【図３Ｇ】
2021520795.tif 000023
【図３Ｈ】
2021520795.tif 000024
【図４Ａ】
2021520795.tif 000025
【図４Ｂ】
2021520795.tif 000026
【図４Ｃ】
2021520795.tif 000027
【図４Ｄ】
2021520795.tif 000028
【図４Ｅ】
2021520795.tif 000029
【図４Ｆ】
2021520795.tif 000030
【図４Ｇ】
2021520795.tif 000031
【図４Ｈ】
2021520795.tif 000032
【図４Ｉ】
2021520795.tif 000033
【図４Ｊ】
2021520795.tif 000034
【図４Ｋ】
2021520795.tif 000035
【図４Ｌ】
2021520795.tif 000036
【図５Ａ】
2021520795.tif 000037
【図５Ｂ】
2021520795.tif 000038
【図５Ｃ】
2021520795.tif 000039
【図５Ｄ】
2021520795.tif 000040
【図５Ｅ】
2021520795.tif 000041
【図５Ｆ】
2021520795.tif 000042
【図５Ｇ】
2021520795.tif 000043
【図５Ｈ】
2021520795.tif 000044
【図５Ｉ】
2021520795.tif 000045
【図５Ｊ】
2021520795.tif 000046
【図５Ｋ】
2021520795.tif 000047
【図５Ｌ】
2021520795.tif 000048
【図５Ｍ】
2021520795.tif 000049
【図５Ｎ】
2021520795.tif 000050
【図６Ａ】
2021520795.tif 000051
【図６Ｂ】
2021520795.tif 000052
【図６Ｃ】
2021520795.tif 000053
【図７Ａ】
2021520795.tif 000054
【図７Ｂ】
2021520795.tif 000055
【図７Ｃ】
2021520795.tif 000056
【図７Ｄ】
2021520795.tif 000057
【図８Ａ】
2021520795.tif 000058
【図８Ｂ】
2021520795.tif 000059
【図８Ｃ】
2021520795.tif 000060
【図９Ａ】
2021520795.tif 000061
【図９Ｂ】
2021520795.tif 000062
【図９Ｃ】
2021520795.tif 000063
【図９Ｄ】
2021520795.tif 000064
【図９Ｅ】
2021520795.tif 000065
【図９Ｆ】
2021520795.tif 000066
【図９Ｇ】
2021520795.tif 000067
【図１０Ａ】
2021520795.tif 000068
【図１０Ｂ】
2021520795.tif 000069
【図１０Ｃ】
2021520795.tif 000070
【図１０Ｄ】
2021520795.tif 000071
【図１１Ａ】
2021520795.tif 000072
【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１６Ｅ】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２１Ａ−１】
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【図２１Ａ−２】
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【図２１Ｂ−１】
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【図２１Ｂ−２】
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【図２１Ｃ−１】
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【図２１Ｃ−２】
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【図２１Ｃ−３】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【国際調査報告】
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