(57)【要約】本明細書に記載されているのは、疾患モデルのための生体模倣システムである。具体的には、疾患患者から得られたものを含む、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）及びｉＰＳＣ由来細胞をマイクロ流体「チップ」デバイスに播種して、細胞の発達及び疾患の病因を研究する。本明細書では、パーキンソン病（ＰＤ）を含む神経変性疾患のモデリングが、ＰＤ病理に関連するニューロンを含む血管新生ヒトモデルにおいて主要なＰＤ病理を再現することが示されている。かかる組成物及び方法は、ＰＤバイオマーカーの研究、ＰＤリスク評価のための患者のスクリーニング、ならびに治療法の発見及び試験に使用される。バイオマーカーのパネルは、神経活動による生きたＰＤチップの分析、全トランスクリプトーム、プロテオーム、及びメタボローム分析、ならびに培地及び組織の機能酵素試験を通じて生成される。血液脳関門浸透研究と組み合わせた血管系チャネルを介した治療法の導入は、ＰＤチップに存在するヒト神経細胞における有効性について評価することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞を培養する方法であって、
（ｉ）アストロサイト、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）、またはその両方、
（ｉｉ）ニューロン、
（ｉｉｉ）ミクログリア、
（ｉｖ）上面及び底面を含む膜を含む、マイクロ流体デバイス
を提供する工程と、
前記底面に前記ＢＭＥＣを播種して播種された内皮細胞を作製する、または前記上面に前記アストロサイトを播種して播種されたアストロサイトを作製する、または前記底面に前記ＢＭＥＣを播種して播種された内皮細胞を作製しかつ前記上面に前記アストロサイトを播種して播種されたアストロサイトを作製する工程と、
前記上面にニューロンを播種して播種されたニューロンを作製する工程と、
前記上面にミクログリアを播種して播種されたミクログリアを作製する工程と、
播種された内皮細胞、播種されたアストロサイト、播種されたニューロン、及び播種されたミクログリアのうちの１つまたは複数を、一定の流量で一定期間培養する工程と
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記アストロサイト、ＢＭＥＣ、ニューロン、及びミクログリアが、幹細胞または初代細胞からそれぞれ分化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ニューロンの播種が、ＢＭＥＣの播種後１日以上である、請求項３に記載の方法。
【請求項４】
ニューロンの播種が、ＢＭＥＣの播種後６日である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＢＭＥＣの播種と前記アストロサイトの播種が同時に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記播種した内皮細胞が、静置培養において培養した同じ細胞と比較して、一定の流量で一定期間培養した後、より成熟した表現型を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
一定の流量での培養培地の流れが、前記播種された内皮細胞とＢＭＥＣとの間のタイトな細胞間接合の形成を促進する、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記タイトな細胞間接合部を検出する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記タイトな細胞間接合部がＴＥＥＲ測定によって検出される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
パッチクランプ測定、細胞外電気生理学測定、カルシウム感受性色素もしくはタンパク質を使用したイメージング、または電圧感受性色素もしくはタンパク質を使用したイメージングのうちの少なくとも１つによって、ニューロンまたはアストロサイト活性を測定する工程をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記タイトな細胞間接合部が、細胞透過性アッセイによって検出される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記膜の前記上面が上部マイクロ流体チャネルの一部を含み、前記膜の前記底面が下部マイクロ流体チャネルの一部を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記上部マイクロ流体チャネル及び前記下部マイクロ流体チャネルが、少なくとも１つの入口ポート及び少なくとも１つの出口ポートをそれぞれ含み、前記培養培地が前記入口ポートに入り、前記出口ポートから出る、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ニューロンが、神経変性疾患と診断されたヒト患者由来の人工多能性幹細胞に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、またはアルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ニューロンが、脊髄運動ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記脊髄運動ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンが、少なくとも３週間、一定の流量での前記培養培地の流れを含む条件下で培養される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）、アストロサイト、及びニューロンを含む共培養物を含む、マイクロ流体デバイス。
【請求項１９】
前記ニューロンが、脊髄運動ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンである、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２０】
前記共培養物が、ミクログリア細胞をさらに含む、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２１】
前記ミクログリアが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のミクログリアである、請求項２０に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２２】
前記ニューロンが、ｉＰＳＣ由来のニューロンである、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２３】
前記ＢＭＥＣが、ｉＰＳＣ由来のＢＭＥＣである、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２４】
前記アストロサイトが、ｉＰＳＣ由来のアストロサイトである、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２５】
前記ＢＭＥＣ、アストロサイト、及びニューロンが、マイクロ流体チップのマイクロチャネル内または膜上にある、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２６】
前記マイクロ流体チップが、第１及び第２の表面を有する多孔質膜によって分離された２つのマイクロチャネルを含み、前記ニューロンが前記第１の表面で培養され、前記ＢＭＥＣが前記第２の表面で培養される、請求項２５に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２７】
前記脳内皮細胞及び前記ニューロンが、流動培養培地と接触している、請求項１８に記載のマイクロ流体デバイス。
【請求項２８】
多量の血液細胞を、リプログラミング因子をコードする１つまたは複数のベクターと接触させる工程と、
多量のリプログラミング因子を前記血液細胞に送達する工程と、
リプログラミング培地において前記血液細胞を培養する工程と
を含む方法であって、
前記多量の血液細胞が、神経変性疾患に罹患したヒト対象から得られ、さらに前記リプログラミング因子の送達及びリプログラミング培地における培養により、血液細胞由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が生成される、
前記方法。
【請求項２９】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病（ＰＤ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３１】
前記ｉＰＳＣが、アストロサイト、ミクログリア、及び血管細胞のうちの１つまたは複数と流動的に連通してさらに培養される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３２】
前記１つまたは複数のベクターが、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｉＰＳＣをニューロンに分化させる工程を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｉＰＳＣを血管細胞に分化させる工程を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｉＰＳＣをアストロサイトに分化させる工程を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３６】
前記ｉＰＳＣをミクログリアに分化させる工程を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３７】
多量の血液細胞をリプログラミング因子をコードする1つまたは複数のベクターと接触させる工程と、
多量のリプログラミング因子を前記血液細胞に送達する工程と、
リプログラミング培地において前記血液細胞を培養する工程と
を含む方法により作られた、多量の神経変性疾患に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であって、
前記多量の血液細胞が、神経変性疾患に罹患したヒト対象から得られ、さらに前記リプログラミング因子の送達及びリプログラミング培地における培養により、血液細胞由来のｉＰＳＣが生成される、
前記ｉＰＳＣ。
【請求項３８】
前記神経変性疾患が、パーキンソン病（ＰＤ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記神経変性疾患が、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である、請求項３７に記載の方法。
【請求項４０】
多量の細胞を１つまたは複数の試験化合物と接触させる工程と、
１つまたは複数のパラメータを測定する工程と、
前記測定された１つまたは複数のパラメータに基づいて１つまたは複数の試験化合物を選択する工程と
を含む、化合物スクリーニングの方法であって、
細胞が神経変性疾患由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化する、
前記方法。
【請求項４１】
前記分化細胞がニューロンである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記分化細胞が血管細胞である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記分化細胞がアストロサイトである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記分化細胞がミクログリアである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記１つまたは複数のパラメータが、多量の血管細胞を通る前記試験化合物の透過性を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４６】
前記ｉＰＳＣが、
多量の血液細胞を、リプログラミング因子をコードする１つまたは複数のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターと接触させる工程と、
多量のリプログラミング因子を前記血液細胞に送達する工程と、
リプログラミング培地において前記血液細胞を培養する工程と
を含む方法によって作られ、
前記多量の血液細胞が、神経変性疾患に罹患したヒト対象から得られ、さらに前記リプログラミング因子の送達及びリプログラミング培地における培養により、血液細胞由来のｉＰＳＣが生成される、
請求項４０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府による資金提供を受けた研究の記載
本発明は、国立衛生研究所により付与されたＮＳ１０５７０３に基づく政府の支援によりなされた。当該政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、細胞、特にマイクロ流体デバイスまたはチップを含むがこれらに限定されない、流体デバイスにおける疾患モデリングのための細胞を培養する分野に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及びパーキンソン病（ＰＤ）の根底にある生理学的、分子的、及び細胞的変化は複雑である。死後の脳組織では、疾患の根底にある運動ニューロン及びドーパミンニューロンが明らかに失われているが、神経細胞死への経路は、いくつかの既存の理論があるものの憶測のままである。しかしながら、これらの突然変異体固有の表現型は、現在の培養システムでは明白な細胞死を示さない孤発性の起源の成人発症疾患をまだ説明していない。特定の分子標的のためにＡＬＳ及びＰＤの遺伝的形態に関する研究は興味深いが、ＡＬＳ及びＰＤの症例の約９０％には既知の遺伝子変異がなく、孤発性と呼ばれている。孤発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）または孤発性パーキンソン病（ｓＰＤ）について発表されているものは比較的少数であり、運動ニューロンまたはドーパミンニューロンに分化した少数の患者由来のｉＰＳＣを使用した論文はほとんどない。これらの研究は、ミトコンドリア機能を含む遺伝子発現パターンのいくつかの変化と、ｓＡＬＳ症例のサブセットにおけるカスパーゼ活性またはＴＤＰ凝集の増加を示している。孤発性ＰＤの場合、一部のレポートでは表現型が示されないが、ＤＡニューロンプロセスの減少と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで後の時点において細胞死の表現型を示すレポートもある。疾患の遺伝的形態よりも挑戦的ではあるが、本発明者らは、ｓＡＬＳ及びｓＰＤに関する研究は孤発性形態が優勢であるためにはるかに重要であり、これらのモデルを開発するには早急な作業が必要であると考えている。さらに、孤発性疾患の複雑な性質により、疾患の病因全般をよりよく示す一般的な疾患の表現型を誘発するためのニューロン生理学のより完全なモデルが必要となる可能性がある。孤発性系統に明白な遺伝的「確証」がないという事実は、複雑な遺伝学が疾患に寄与する可能性があることを排除するものではない。したがって、基礎疾患の複雑さを説明することができる細胞の発達及び疾患病理学のモデルが当技術分野で非常に必要とされている。孤発性症例の交絡問題は、機能的に関連する生きているヒト組織を用いた生体模倣（ＭＰＳ）モデルを使用することによって簡潔に調べることができる。
【０００４】
ＡＬＳ及びパーキンソン病などの神経変性疾患を含む、疾患の生体模倣（ＭＰＳ）モデル（ＭＯＤ）の構成及び方法について本明細書で記載する。孤発性ＡＬＳ及びＰＤの症例は、ｉＰＳＣモデルにおいてまだ十分に活用されていない。ＭＰＳベースのＭＯＤは、アウトカム評価として電気生理機能及びメタボロミクスの研究を可能にする。細胞に薬剤を流し、リアルタイムで疾患関連のバイオマーカーに関する情報を収集するＭＰＳの能力を活用することで、他の方法では不可能な方法でこれらの疾患の研究が可能になる。
【発明の概要】
【０００５】
記載されているように、本発明者らが脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）について以前に示したように、ｉＰＳＣ由来ニューロンは早期発症神経疾患のモデル化に非常に成功している。本明細書では、本発明者らによる予備研究が、ｉＰＳＣ由来の運動ニューロンが分化の８週間以内に細胞培養皿で神経変性を受け、疾患の生体模倣（ＭＰＳ）モデル（ＭＯＤ）におけるヒトの病理を模倣することを示している。
【０００６】
これらの研究を拡張すると、電気生理機能及びメタボロミクスプロファイリングに基づくバイオマーカーに焦点を当てることができる。ＡＬＳの遺伝的形態に特有の電気生理学的変化は、ＡＬＳのｉＰＳＣモデルにおいて本発明者ら及び他の人によって示されている。本発明者らは、これらが孤発性モデルでも見られると予測している。ＰＤモデルについてはあまり知られていないが、ＭＰＳ  ＭＯＤを使用することにより、孤発性パーキンソン病（ｓＰＤ）ドーパミン作動性（ＤＡＮ）がカルシウムイメージングを使用してニューロンシグナル伝達に違いがあるかどうかを初めて調べることができる。メタボロミクスプロファイリングは、チップからの溶出液中の最大３００の代謝物のモニタリングを可能にし、ＭＰＳに非常に適している。一例として、神経伝達物質スクリーンを配置して、同じ溶出液中のニューロンの健康状態を監視することができる。
【０００７】
チップ上の記載されているＭＰＳ  ＭＯＤ疾患モデリングは、細胞の発達及び疾患の病因を含む神経変性疾患の研究を可能にする。一例として、パーキンソン病（ＰＤ）ＰＤチップを使用して、生きているヒト脳組織での一通り揃った細胞アッセイを可能にする灌流可能システムにおいてＰＤをモデル化する。これは、罹患していない患者から作製されたＰＤチップと比較したときに診断に使用することができ、ＰＤ自体のメカニズム及び治療標的の研究に使用することができる。最後に、それは血液脳関門の透過性を決定するという追加の利点を備えた新規薬物のスクリーニングに使用することができる。
【０００８】
ＰＤチップは、ｉＰＳＣ由来の組織を利用して、パーキンソン病において変性する脳の部分を特定的に表す「脳オンチップ」モデルを作成する培養システムである。予備的な結果として、このチップは主要なＰＤ病理を再現し、新しい血管新生コンパートメントを含む。これは、ＰＤバイオマーカーの研究、ＰＤリスク評価のための患者スクリーニング、ならびに治療法の発見及び試験に使用される。バイオマーカーのパネルは、神経活動による生きたＰＤチップの分析、全トランスクリプトーム、プロテオーム、及びメタボローム分析、ならびに培地及び組織の機能酵素試験を通じて生成される。血管系チャネルを通じて実験的治療薬を流すことにより、主要な血液脳関門浸透研究を行うことができる。さらに、バイオマーカーの発見について述べたのと同じリードアウトを使用して、浸透する薬物の、ＰＤチップに存在するヒト神経細胞における有効性が評価され得る。ｉＰＳＣを使用したＰＤモデルが試みられたが、若年発症の孤発性患者のものはなかった。これらのチップは、孤発性患者のＰＤ病態生理を再現する。さらに、治療薬送達の重要な特徴であるヒト血管成分を含むモデル、または疾患の進行に役割を果たすと考えられている支持細胞（例えば、ミクログリア、アストロサイト）のキャストを組み込んだモデルはない。
【０００９】
記載のＭＰＳ  ＭＯＤを使用すると、さらにいくつかの革新的な側面がある。１つ目は、完全にヒト患者固有のシステムによるハイコンテント生物学的研究を実施するための培養システムを含む、高度にスケーラブルなＭＰＳの使用である。２つ目は、ｉＰＳＣモデルにおいて十分に活用されていない孤発性ＡＬＳ及びＰＤの症例に焦点を当てている。３つ目は、細胞上または血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して薬物を流すＭＰＳの能力、及びＣａｒｔａｇｅシステム（図１）を介したリアルタイムの生物学的スクリーニングにおいて疾患関連バイオマーカーに関する情報を収集するＭＰＳの能力を活用するアウトカム評価として、電気生理機能及びメタボロミクス（神経伝達物質レベルを含む）に焦点を当てている。４つ目は、活性な血液脳関門と神経組織の組み合わせで、脳側または血液側のいずれかに薬物を投与できるようにし、これにより、血液脳関門を通過する化合物の能力がシミュレートされる。第５の態様は、非ＰＤＭＳチップ（薬物吸収を低減するための）、及び神経活動のリアルタイム記録のためにチップに組み込まれたＭＥＡデバイスを含む。
【００１０】
本明細書に記載されているのは、（ｉ）アストロサイト、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）、もしくはその両方、（ｉｉ）ニューロン、（ｉｉｉ）上面及び底面を含む膜を含むマイクロ流体デバイスを提供する工程、底面にＢＭＥＣを播種して播種した内皮細胞を作製する工程、または上面にアストロサイトを播種して播種したアストロサイトを作製する工程、または底面にＢＭＥＣを播種して播種した内皮細胞を作製しかつ上部にアストロサイトを播種して播種したアストロサイトを作製する工程、上面にニューロンを播種して播種したニューロンを作製する工程、しばらくの間一定の流量で、１つもしくは複数の播種した内皮細胞、播種したアストロサイト、及び播種したニューロンを培養する工程、を含む細胞を培養する方法である。他の実施形態では、細胞を培養する方法は、（ｉ）アストロサイト、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）、もしくはその両方、（ｉｉ）ニューロン、（ｉｉｉ）ミクログリア、（ｉｖ）上面及び底面を含む膜を含むマイクロ流体デバイスを提供する工程、底面にＢＭＥＣを播種して播種した内皮細胞を作製する工程、または上面にアストロサイトを播種して播種したアストロサイトを作製する工程、または底面にＢＭＥＣを播種して播種した内皮細胞を作製しかつ上面にアストロサイトを播種して播種したアストロサイトを作製する工程、上面にニューロンを播種して播種したニューロンを作製する工程、上面にミクログリアを播種して播種したミクログリアを作製する工程、しばらくの間一定の流量で、１つもしくは複数の播種した内皮細胞、播種したアストロサイト、播種したニューロン、及び播種したミクログリアを培養する工程工程、を含む。他の実施形態では、アストロサイト、脳微小血管内皮細胞、ニューロン、及びミクログリアは、それぞれ幹細胞または初代細胞から分化している。他の実施形態では、ニューロンの播種は、脳微小血管内皮細胞を播種した１日以上後である。他の実施形態では、ニューロンの播種は、ＢＭＥＣを播種した６日後である。他の実施形態では、ＢＭＥＣの播種及びアストロサイトの播種は同時に行われる。他の実施形態では、播種した内皮細胞は、静置培養で培養された同じ細胞と比較して、しばらくの間一定流量で培養した後、より成熟した表現型を示す。他の実施形態では、一定流量での培養培地の流れは、播種された内皮細胞と脳微小血管内皮細胞との間のタイトな細胞間接合部の形成を促進する。他の実施形態では、該方法は、タイトな細胞間接合部を検出する工程を含む。他の実施形態では、タイトな細胞間接合部は、ＴＥＥＲ測定によって検出される。他の実施形態では、パッチクランプ測定、細胞外電気生理学測定、カルシウム感受性色素もしくはタンパク質を使用するイメージング、または電圧感受性色素もしくはタンパク質を使用するイメージングのうちの少なくとも１つによるニューロンまたはアストロサイト活性の測定である。他の実施形態では、タイトな細胞間接合部が細胞透過性アッセイによって検出される。
【００１１】
他の実施形態では、膜の上面は上部マイクロ流体チャネルの一部を含み、膜の底面は下部マイクロ流体チャネルの一部を含む。他の実施形態では、上部マイクロ流体チャネル及び下部マイクロ流体チャネルは、少なくとも１つの入口ポート及び少なくとも１つの出口ポートをそれぞれ含み、培養培地は入口ポートから入り、出口ポートから出る。他の実施形態では、ニューロンは、神経変性疾患と診断されたヒト患者由来の人工多能性幹細胞に由来する。他の実施形態では、神経変性疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、パーキンソン病（ＰＤ）、ハンチントン病（ＨＤ）、またはアルツハイマー病（ＡＤ）である。他の実施形態では、ニューロンは、脊髄運動ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンである。他の実施形態では、脊髄運動ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンは、少なくとも３週間、一定の流量での培養培地の流れを含む条件下で培養される。
【００１２】
さらに、本明細書では、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）、アストロサイト、及びニューロンを含む共培養物を含むマイクロ流体デバイスについても記載される。他の実施形態では、ニューロンは、脊髄運動ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンである。他の実施形態では、共培養物は、ミクログリア細胞をさらに含む。他の実施形態では、ミクログリアは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のミクログリアである。他の実施形態では、ニューロンはｉＰＳＣ由来のニューロンである。他の実施形態では、ＢＭＥＣはｉＰＳＣ由来のＢＭＥＣである。他の実施形態では、アストロサイトはｉＰＳＣ由来のアストロサイトである。他の実施形態では、ＢＭＥＣ、アストロサイト、及びニューロンは、マイクロチャネル内またはマイクロ流体チップの膜上にある。他の実施形態では、マイクロ流体チップは、第１及び第２の表面を有する多孔質膜によって分離された２つのマイクロチャネルを含み、ニューロンは第１の表面で培養され、脳微小血管内皮細胞は第２の表面で培養される。他の実施形態では、脳内皮細胞及びニューロンは、流動培養培地と接触している。
【００１３】
本明細書に記載されているのは、多量の血液細胞をリプログラミング因子をコードする１つまたは複数のベクターと接触させる工程と、多量のリプログラミング因子を血液細胞に送達する工程と、リプログラミング培地において血液細胞を培養する工程と、を含む方法であり、該多量の血液細胞は、神経変性疾患に罹患したヒト対象から得られ、さらに、該リプログラミング因子の送達及びリプログラミング培地における培養により、血液細胞由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が生成される。他の実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病（ＰＤ）である。他の実施形態では、神経変性疾患は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。他の実施形態では、ｉＰＳＣは、アストロサイト、ミクログリア、及び血管細胞のうちの１つまたは複数と流動的に連通してさらに培養される。他の実施形態では、１つまたは複数のベクターは、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターである。他の実施形態では、方法は、ｉＰＳＣをニューロンに分化させる工程を含む。他の実施形態では、方法は、ｉＰＳＣを血管細胞に分化させる工程を含む。他の実施形態では、方法は、ｉＰＳＣをアストロサイトに分化させる工程を含む。他の実施形態では、方法は、ｉＰＳＣをミクログリアに分化させる工程を含む。
【００１４】
本明細書に記載されているのは、多量の血液細胞をリプログラミング因子をコードする１つまたは複数のベクターと接触させる工程と、多量のリプログラミング因子を血液細胞に送達する工程と、リプログラミング培地において血液細胞を培養する工程と、を含む方法により作られた多量の神経変性疾患に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であって、該多量の血液細胞が、神経変性疾患に罹患したヒト対象から得られ、さらに該リプログラミング因子の送達及びリプログラミング培地における培養により、血液細胞由来のｉＰＳＣが生成される。他の実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病（ＰＤ）である。他の実施形態では、神経変性疾患は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
【００１５】
また、本明細書に記載されているのは、多量の細胞を、１つまたは複数のパラメータを測定する１つまたは複数の試験化合物と接触させる工程と、測定された１つまたは複数のパラメータに基づいて１つまたは複数の試験化合物を選択する工程と、を含む化合物スクリーニングの方法であり、細胞は、神経変性疾患に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化する。他の実施形態では、分化した細胞はニューロンである。他の実施形態では、分化した細胞は血管細胞である。他の実施形態では、分化した細胞はアストロサイトである。他の実施形態では、分化した細胞はミクログリアである。他の実施形態では、１つまたは複数のパラメータは、多量の血管細胞を越えた試験化合物の透過性を含む。他の実施形態では、ｉＰＳＣは、多量の血液細胞をリプログラミング因子をコードする１つまたは複数のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターと接触させる工程と、多量のリプログラミング因子を該血液細胞に送達する工程と、リプログラミング培地において該血液細胞を培養する工程と、を含む方法によって作られ、該多量の血液細胞は、神経変性疾患に罹患したヒト対象から得られ、さらに、リプログラミング因子の送達及びリプログラミング培地における培養により、血液細胞由来のｉＰＳＣが生成される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】（ａ）臓器チップＰＤＭＳマイクロ流体システムは大規模に製造される。（ｂ）臓器チップには、多孔質膜によって分離された２つの異なるチャネルが含まれており、微小体積で培養された細胞型の直接相互作用が可能である。（ｃ）マイクロ流体培地送達システムでは、最大１２個の同一チップを連続的に流すことができる。各チップは、溶出液を簡単にサンプリングできる液体リザーバを含む個別のカートリッジに入れられている。
【図２】（Ａ）本発明者らは、ＡＬＳ及びＰＤをそれぞれ研究するために、ヒトｉＰＳＣを脊髄運動ニューロン（ｓｐＭＮ）及びドーパミン作動性ニューロン（ＤＡＮ）に誘導するためのロバストで再現性の高い方法を確立した。ｓｐＭＮはマーカー膵島１（ｉｓｌ１）を発現し、ＤＡＮはチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）を発現する。（Ｂ）ｓｐＭＮ及びＤＡＮ（上部）は、ＢＭＥＣを発現するゾナオクルーデンス１（ＺＯ−１）（下部）とともにチップ内で成熟する。（Ｃ）ＢＭＥＣは下部チャネル全体をコーティングし、血液脳関門の特性をシミュレートする血管様内腔を作製する。
【図３】ニューロンはＭＰＳ培養においてより活発である。（Ａ）カルシウム活性化蛍光色素で処理したＭＰＳのｓｐＭＮの代表的な画像である。（Ｂ）チップ内の神経機能を決定するために、各解析で同時に３００ニューロン以上のトランジエントを追跡できる。ｓｐＭＮをＭＰＳで培養すると、一過性の活性の有意な増加が観察され、ＢＭＥＣが下部チャネルに含まれるとさらに増加した。（Ｃ）２つの非罹患ｉＰＳＣ系統を別々に分析し、ＭＰＳ単独（ＭＮチップ）及びＢＭＥＣとの共培養（ＢＭＥＣ−チップ）で培養した場合、トランジエント周波数が有意に増加した。エラーバーは平均の標準誤差として報告される。＊＊＊はＡＮＯＶＡＰ＜＝０．００１を示し、＊＊＊＊はＰ＜＝０．０００１を示す。
【図４】ＢＭＥＣ共培養は、成熟に関連する特定の転写物の変化を誘発する。Ｒｎａシークエンシングは、チップ内で培養されたｓｐＭＮ（ＭＰＳ）、またはＢＭＥＣとの共培養（ＥＣ−ＭＰＳ）で実施した。さらに、同一のｓｐＭＮを従来の９６ウェルプレート（９６Ｗ）で、ＢＭＥＣ馴化培地（９６ＣＭ）の存在下で培養した。（ａ）主成分分析を、全ての条件の中で最も高い分散に関連する遺伝子セットを決定するために、遺伝子転写物のリードアウトに対して実施した。ｓｐＭＮが運動ニューロン前駆細胞（ＭＮＰ）から離れて成熟するにつれて、ＭＰＳ培養は転写物の独自のセットを活性化した（ＰＣ２，青矢印）。ＰＣ３遺伝子は、ＢＭＥＣ共培養（ＥＣ−ＭＰＳ）において特異的に発現した。（ｂ）上位の遺伝子セットは、ＤＡＶＩＤを使用して経路に分類した。上位のＰＣ２遺伝子は、タンパク質刺激及び神経分化に関与する経路が豊富である。ＰＣ３遺伝子経路には、血管相互作用、独特の細胞外マトリックス相互作用、及び分泌タンパク質発現の増加を制御することが知られている遺伝子が含まれていた。（ｃ）神経成熟に関与する既知のシグナル伝達経路もＥＣ−ＭＰＳ条件において再現された。Ｎｏｔｃｈ阻害は、運動ニューロンの成熟を促進することが知られている。アストロサイトによるトロンボスポンジン−１（ＴＨＢＳ１）の分泌は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで神経の成熟を増加させることが以前に示されている。ＥＣ−ＭＰＳ  ｓｐＭＮは、ＴＨＢＳ１ならびにセマフォリン３Ａ及び５Ａを上方制御した。
【図５】（Ａ）Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉは、ＣＤ１１５陽性ミクログリアをヒトｉＰＳＣ由来マクロファージから効率的に区別するためのロバストなプロトコルを開発した。（Ｂ）ＦＡＣＳは、細胞がＣＤ１１ｂ及びＣＤ１１ｃを含む神経変性疾患に関係するミクログリアマーカーを発現することを示している。
【図６】凍結ペレットは、標準的な培養プレートから調製し、ＲＮＡＳｅｑ用に処理した。主成分分析（ＰＣＡ）によって分析された、疾患系統及び対照系統の間の明確な分離を引き出す教師なしクラスタリングを実行した。
【図７】（Ａ）代謝濃縮分析は、対応するｐ値と濃縮倍率（ｆｏｌｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）とともに濃縮経路を示す。ｓＡＬＳ対対照では、影響を受ける上位５つの経路は、クエン酸回路、糖新生、アラニン代謝、ミトコンドリアの電子伝達鎖、及びグルタミン酸代謝である。この予備データは、孤発性及び対照の間にメタボロミクスの違いがあることを示しており、これはチップ試料からの流出物を使用すると拡大される。（Ｂ）代謝物試料の主成分分析（ＰＣＡ）は、対照試料と疾患試料の明確な分離を示している。Ｃ９とｓＡＬＳの間にはわずかな分離があり、２つの病状の間の代謝の違いを示している。この予備研究は、対照と疾患の間でｉＰＳＣ由来の運動ニューロンに代謝の違いがあることを示している。Ｎ＝１、３回繰り返し。
【図８】チップ内で２週間を超えて成熟させたｓｐＭＮは、ニューラルネットワーク形成を示す協調的な活動のバーストを示す。これは、母集団レベルで定量化され、チップ上の３００個のアッセイされたニューロンの総ニューロン活動を示すラスタープロット（左）に変換できる。個々のニューロン（ｙ軸）は、秒単位で時間の経過とともに記録され（ｘ軸）、同時に発火する（線）。これらのバーストの接続性は、バーストの類似性によって定量化でき、ピアソン相関によって表示できる（右）。より多くのネットワークバーストは、健康な発達中のヒト神経組織を示す。
【図９】（ａ）本発明者らは、生きたニューロン機能研究を支援するための新規のＭＮ特異的プロモーター構築物を開発した。（ｂ）レンチウイルス（ＬＶ）に包まれている場合、膵島１（ｉｓｌ１）プロモーターを使用して細胞質ＧＦＰを介して細胞を標識することができる。（ｃ）ＭＰＳで培養されたニューロンは、分析のために上部チャネルを露出することにより、全細胞パッチクランプ法で電気生理学的特性を分析できる。非常に複雑で同期した自発的な活動のバーストが、培養２週間でＭＰＳに記録された。
【図１０】薬物スクリーニングのフローチャートは、ＮＣＡＴＳ化合物ライブラリのろ過ステップと一次スクリーニングの概要を示している。化合物は、従来の方法で細胞毒性について試験される。次に、ＭＰＳシステムを使用して化合物のＢＢＢ透過性について試験される。透過性化合物は、ＳＡ３ｃに列挙されているスクリーニングアッセイのパネルを使用して、疾患の表現型の調節について試験される。
【図１１】ＭＰＳモデルの血液脳関門は、医薬品開発にとって重要な資産である。様々なサイズの分子の傍細胞透過性評価は、様々な効率で下部から上部チャネルまでＢＭＥＣバリアを通過する。十分なバリア機能がチップで３週間で記録されている。Ｙ軸は、１８時間後に検出された底部濃度のパーセントでプロットされる。
【図１２】ｉＰＳＣ由来組織は、定義されたプロトコルによって特定の神経、グリア、及び内皮への運命に誘導することができる。本発明者らは、チップへの播種の準備において、これらのプロトコルが並行して実行される能力を以前に決定した。簡単に言えば、アストロサイト及びＢＭＥＣを同時にチップに入れ、調製段階（Ｐｒｅｐ）中に確立することができる。その後、ｓｐＭＮ及びＤＡＮを６日後にチップに播種する。最後に、ミクログリアを１週間で播種し、全ての細胞型を流動下で成熟させる。ｓｐＭＮ、アストロサイト、及びＢＭＥＣは、チップ（スノーフレーク）に播種する前の段階で生成し、大量に凍結することもできる。これにより、チップの「オンデマンド」播種が可能になり、スケーリングが容易になる。
【図１３】共培養における細胞の様々な組み合わせを示す研究デザインである。
【図１４】電気生理機能、細胞生存率、メタボロミクス、細胞含有物、プロテオーム、及びトランスクリプトームを含む表現型のリードアウトを示す研究デザインである。
【図１５】疾患の表現型をスクリーニングするための研究デザインである。
【図１６−１】疾患モデリング研究のためのＡＬＳ及びＰＤ関連チッププラットフォームである。（ａ）ＡＬＳチップの二重分化及び播種パラダイムの概略図である。ｓｐＮＰＣ及びＢＭＥＣはどちらも、ヒトｉＰＳＣから生成され、それぞれ上部チャネル及び下部チャネルに播種される。ＥＣ／脊髄チップの横断面（右）は、多孔質膜によって分離された２つのコンパートメントを示す。（ｂ）上部チャネルでＳＭＩ３２を発現し、下部チャネルでＢＭＥＣによって発現されるＩＳＬ１を発現する６日間のインキュベーションでの脊髄チップ全体の免疫染色である。（ｃ）膜Ｚ平面でトリミングされた最大投影画像は、ｓｐＭＮマーカーＳＭＩ３２及び膵島１（ＩＳＬ１）、ならびにタイト接合部マーカーのゾナオクルーデンス１（ＺＯ−１）で免疫染色されたＥＣ／脊髄チップの播種端の上部及び下部コンパートメントを示す。スケールバー＝４００ミクロン（左）４０ミクロン（右）。（ｄ）脊髄チップのＺ軸に沿ったコンピューターで生成された透視図（上）での共焦点光学再構成は、下部チャネル全体を囲むＢＭＥＣのコンフルエントな層を示す。直交図（下）は、多孔質ＰＤＭＳ膜によって分離された６日での培養物の明確な分離を示す。スケールバー＝１００ミクロン。（ｅ）ＰＤチップの二重分化及び播種の概略図である。ｉＰＳＣはドーパミン作動性ニューロン（ＤＡＮ）及びＢＭＥＣに分化し、分化の１５日目にチップに播種される。（ｆ）チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）の３０日目の免疫細胞化学は、ＤＡＮが生存し、チップ内で確立されたことを示す（上）。グルコーストランスポーター１（ＧＬＵＴ−１）は、ＣＮＳの微小血管系で特異的に発現し、ＢＭＥＣ（下）において発現する。
【図１６−２】図１６−１の続きの図である。
【図１７】脊髄運動ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、アストロサイト、ミクログリア、及び内皮細胞は、非罹患ｉＰＳＣ系統から生成される。（ａ）脊髄運動ニューロン（ｓｐＭＮ）は、脊髄神経前駆体に分化し、分化の１２日目に凍結する。（ｂ）ドーパミン作動性ニューロン（ＤＡＮ）は、チロシンゼヒドロキシラーゼ（ＴＨ）発現ニューロンに分化するフロアプレート前駆体に分化する。（ｃ）アストロサイトはｉＰＳＣに由来し、アストロサイトマーカーＧＦＡＰ及びＳ１００ｂを発現する。（ｄ）骨髄系前駆体は、マクロファージを生じさせる可能性のある造血前駆体のｉＰＳＣに由来する。チップ内のニューロンと共培養すると、骨髄系前駆体は、ＴＲＥＭ２及びＩＢＡ１を発現するミクログリア様細胞に分化する。（ｆ）細胞型毎に少なくとも２つの独立した分化からの細胞型の解凍後の生存率である。（ｇ）チップ実験で使用するための細胞バンクの表である。ドーパミン作動性ニューロン（ＤＡＮ）は、解凍後にＴＨ陽性細胞を含まず、さらなる凍結保存の最適化が必要であることを示す。
【図１８】全てのＮＶＵ細胞型は、チップ上で２８日間生存する。（ａ）ＡＬＳチップ（ｂ）ＰＤチップ。チップの様々な寸法図（ｃ）ＳＭＩ３２、ＩＳＬ１、ＧＬＵＴ１で染色、（ｄ）ＳＭＩ３２、ＩＳＬ１、ＧＬＴ１で染色、（ｅ）ＧＦＡＰ、Ｓ１００ｂ、Ｔｕｊ１、（ｆ）ＩＢＡ１、ＤＡＰＩ。
【図１９−１】疾患バイオマーカーを特定するための、検証済みのｓｐＭＮ及びＤＡＮ  ＭＰＳモデルにおける４つのｓＡＬＳ、４つのｓＰＤ、４つの対照、及び４つのＳＭＡ系統の比較である。目的１において最適な条件及び潜在的なバイオマーカーの安定したセットを決定後、本発明者らはｓＡＬＳ及びｓＰＤ系統の分析に移る。脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）ｉＰＳＣ系統は、本発明者らがＳＭＮの欠如などの特定のバイオマーカーを確認することを本発明者らが認識しているため、陽性対照として使用される。タンパク質及び細胞死の表現型。各チップ系統（ＡＬＳ及びＰＤ）は、診断及び治療法の開発を支援するために、疾患特異的バイオマーカーを検出するために、生きている組織及びエンドポイント後の組織の両方で一連（アッセイのパネル）の疾患関連分析を受ける。ニューロンはＭＰＳ培養においてより活発である。（ａ）カルシウム活性化蛍光色素で処理されたＭＰＳにおけるｓｐＭＮの代表的な画像である。（ｂ）チップ内の神経機能を決定するために、各解析において同時に３００ニューロンのトランジェントを追跡できる。（ｃ）ｓｐＭＮをＭＰＳで培養するとトランジエント活性の有意な増加が観察され、ＢＭＥＣが下部チャネルに含まれるとさらに増加した。エラーバーは平均の標準誤差として報告される。＊＊＊はＡＮＯＶＡＰ＜＝０．００１を示し、＊＊＊＊はＰ＜＝０．０００１を示す。（ｄ）細胞培地のＬＤＨアッセイは、チップ間で安定性を示す。フローサイトメトリー及び３Ｄイメージングにより、疾患関連タンパク質の母集団及び形態計測による定量が可能になる。（ｅ）ＡＬＳチップのＧＦＰ発現ニューロン（ＧＦＰ＋）は、非ＧＦＰニューロン（ＧＦＰ−）から分離され、ＦＡＣＳによって定量化した。（ｆ）トリオシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）及びα−シヌクレイン（α−ＳＹＮ）で染色されたＤＡＮ培養物の共焦点イメージングである。形態計測による再構成（緑色）及びα−ＳＹＮ突起部の自動定量化（白色）を実行して、疾患特異的バイオマーカーを決定できる。
【図１９−２】図１９−１の続きの図である。
【図２０】バルク及び単一細胞のトランスクリプトーム分析は、チップの細胞生理機能を明らかにすることができる。（ａ）ＲＮＡシークエンシングは、チップ内で培養されたｓｐＭＮ（ＭＰＳ）、またはＢＭＥＣとの共培養（ＥＣ−ＭＰＳ）で実施した。さらに、同一のｓｐＭＮを従来の９６ウェルプレート（９６Ｗ）で、ＢＭＥＣ馴化培地（９６ＣＭ）の存在下で培養した。上位の遺伝子セットは、ＤＡＶＩＤを使用して経路に分類した。上位のＰＣ２遺伝子は、タンパク質刺激及び神経分化に関与する経路が豊富である。ＰＣ３遺伝子経路には、血管相互作用、独特の細胞外マトリックス相互作用、及び分泌タンパク質発現の増加を制御することが知られている遺伝子が含まれていた。（ｂ）ＡＬＳ及び対照ｉＰＳＣ由来のＭＮ培養で実行された単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑは、単層培養内の異なる亜集団を明らかにする。左の図は、グローバルトランスクリプトームに基づく単一細胞のｋ最近傍クラスタリングを示し、緑色の影付きノードは、細胞の亜集団におけるＩＳＬ１発現のレベルを示す。真ん中の図は、これらの培養物内のＡＬＳ対対照ＩＳＬ１陽性細胞において変化した経路を明らかにする遺伝子セット濃縮分析を示す。右のベン図は、これらの経路のサブセットが、孤発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）対、対照のレーザー捕捉ＭＮ（ｌｃ−ＭＮ）で破壊されていることが確認されたものと重複していることを示す。
【図２１】チャネルの写真である。
【図２２】ｉＰＳＣ組織及び臓器チップ：マイクロエンジニアリングにより強化されたモデリングである。Ｅｍｕｌａｔｅ  Ｉｎｃ．の生体模倣システム（ＭＰＳ）。マイクロボリューム培養は、オートクリン及びパラクリンシグナル伝達を強化し得る。複数のコンパートメントにより、複数の細胞型が可能である。培地の層流は、ニューロンの培養に独特の影響を及ぼす。
【図２３】ｉＰＳＣ組織及び臓器チップ：マイクロエンジニアリングにより強化されたモデリングである。チップ及びＢＭＥＣはニューロン活動を増加させる。ＢＭＥＣを有するチップにおけるｉＰＳＣ由来ニューロンは、９６ウェルにわたって独自の遺伝子発現を示した。
【図２４】ＤＡチップ：ドーパミン作動性ニューロン｜ヒトｉＰＳＣの内皮共培養物である。パーキンソン病モデリング用の中脳ＤＡニューロンを含むように適合されたチップシステムである。再現性のあるＴＨ発現である。薬物検査用の血液脳関門コンポーネントである。
【図２５】ＤＡチップ：創薬のための独自の培養物のリードアウトである。ＤＡチップは、チップ溶出液からサンプリングできるヒトドーパミンを生成する。
【図２６】ＤＡチップ：ライブの薬の有効性に関する自動ＤＡニューロン活動分析である。部位ごとに１０００〜２０００個のニューロンが自動的に識別される。培地の継続的な灌流下のチップである。薬は、有効性及び血液脳関門透過性を決定するために投与され得る。
【図２７】ＰＤチップ用のｉＰＳＣ由来のＮＶＵ細胞型の共培養物である。丸で囲んだ細胞型は、同じ患者から別々に分化し、チップ上で一緒に共培養した。（ａ）上面図（ｂ）底面図。
【図２８】ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑは、チップ内のｉＰＳＣ由来の共培養物の機能強化を決定する。チップ内のｉＰＳＣ由来の細胞型は、転写物シグネチャーによって分離することができる。ニューロンは、ＢＭＥＣとの共培養においてより成熟する。
【図２９】ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑは、チップ内のｉＰＳＣ由来の共培養物の機能強化を決定する。
【図３０】孤発性パーキンソン病の患者特異的なチップにより、シヌクレインタンパク質が増加している。Ｌｏｔｈｉａｎ対照コホート（８０Ｙ併存症なし）。孤発性の早期発症パーキンソン病患者コホートである。バイオマーカーは、追加の患者チップにおいて確認される。
【図３１】フルＮＶＵチップのメタボロミクスプロファイルである。
【図３２】ＡＬＳ及びＰＤチップの開発である。研究目標である。
【図３３】ＡＬＳのバックグラウンドを持つＳＣチップを使用したバイオマーカー発見試験である。ＡＬＳ及びＰＤチップは、段階的に安定性が検証される。（ａ）チップでの孤発性ＡＬＳ及び孤発性ＰＤモデリングの両方のために選択されたドナー系統の表である。Ｌｏｔｈａｉｎ対照は臨床的に評価されており、神経疾患または併存疾患はない。（ｂ）将来のバイオマーカー開発研究のベースラインとしても機能する、包括的な一連の生理学的アッセイが実施される。培地溶出液は、乳酸デヒドロゲナーゼアッセイを介して細胞死についてアッセイされ、質量分析（Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃ．）を介してメタボロミクスについてアッセイされる。ニューロン活動はカルシウムイメージング（Ｃａ．Ｉｍａｇｉｎｇ）を介して観察される。細胞集団及び疾患関連発現は、高度なイメージング技術を使用して評価される。細胞は、トランスクリプトーム解析を介して分子シグネチャーについても分析される。各細胞型の独自の起源を維持するために、単一細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ−Ｓｅｑ）がＰＤチップ開発において実施される。
【図３４】ＰＤ５．１  ＰＤバイオマーカーパイロット研究ＤＡである。早期発症の孤発性患者のチップ及びＣＴＲを、アストロサイト及びＢＭＥＣとともに３０日間培養した。ＳＮＣＡの蓄積は、現在のオフチップモデリング研究と一致するウエスタンブロットを介して観察した。より大規模な患者試験の主要なバイオマーカーになると期待されている。
【図３５】ＰＤ５．１バイオマーカー発見研究パラダイムである。ＰＤバイオマーカー研究の概略図である。各条件（ＣＴＲ対ＰＤ）の５つの独立したドナー系統を、系統あたり３つの複製で培養した。培養パラダイムには、チップ内で１４日間培養された中脳神経細胞が含まれ、その後ＢＭＥＣが追加され、エンドポイントまで培養した。エンドポイントデータは右側にリストされている。
【図３６】ＰＤ５．１  ＤＡ−ニューロンベースラインチップ（合計３０チップ）である。各患者チップの１０倍での代表的な培養画像（播種及びメインチャネル）である。エンドポイントでの神経溶出液の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性である。ＢＭＥＣはチップ間で非常に安定している。ＰＤ特異的な細胞死は観察されなかった。
【図３７】ＤＡチップはＰＤ研究に関連するマーカーを発現する。０１７２対照チップは、ドーパミン作動性ニューロン及びＢＭＥＣマーカーを発現した。染色の劣化（２週間未満）のため、全てのチップは画像化されなかった。０１７２ｉＣＴＲの中脳チップの共焦点蛍光画像である。上のチャネルの画像は、チロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）、α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、及びＤＡＰＩ染色を示している。下のチャネルは、シナプトフィジン陽性のニューロン染色を欠くＧｌｕｔ−１発現を示している。Ｚスタックの再構成（右）は、上部及び下部のコンパートメントにおいてそれぞれ血管系及び神経組織の分離を示している。
【図３８】カルシウムイメージングは、ＰＤチップにおいて異なる活性を示す。カルシウムイメージングは、エンドポイントの各系統で取得した。分析したビデオあたり平均３１３ニューロンである。発火頻度の全体的な減少は、ニューロンごとに非常に多様である。Ｆｌｕｏ−４ＡＭ色素を使用したライブカルシウムイメージングの代表的な静止画像である。活性の程度によってビニングされた１０分間の取得による、カルシウム一過性現象を伴うニューロンの割合である。ヘルツ（Ｈｚ）単位の条件ごとの全ニューロンの平均周波数である。
【図３９】ＰＤ対ＣＴＲ  ＤＡチップ溶出液のメタボロミクスシグネチャーである。ＤＡチップは、群あたり５系統、系統あたり３チップ（合計３０チップ）から２８日目に生成した。チップにおいて２４時間コンディショニングされ、分析のために収集された２５μｌの神経培地である。６３／２１９代謝物は、反復実験全体でＱＣ（３０％ＣＶ）に合格した。２つの代謝物はＰＤ試料において著しく調節不全であった（ｔ検定）。
【図４０】メタボロミクスＭ５．１（ＤＡチップ）である。（ａ）全ての代謝物のＰＣＡ：ＰＣ３の傾向として、対照チップから疾患チップを分離する方向にある（点線）。ブランクチップ培地の減算は、ＰＤチップの代謝物の生成及び消費の変化を示す。（ｂ）２４時間のコンディショニング（静的）後のエンドポイントでのニューロン溶出液のメタボロミクスプロファイリングである。４１の固有の代謝物を含むメタボロミクスデータセットのＰＣＡプロットである。円は個々のチップを示す。ＰＤチップ対ＣＴＲＬチップで差次的に検出された上位の代謝物である。存在量は、ブランク培地から減算後に報告された。＊Ｐ＜０．０５ｔ検定。
【図４１】チップコホートに特異的なキヌレニンバイオマーカーである。キニレニンは平均ＣＴＲチップの２．７倍の増加であるが、孤発性ＰＤ系統の変動が観察された。９６ウェルプレートは同じ効果がなく、チップの培養の強化、またはＢＭＥＣの共培養が原因である可能性がある。
【図４２】ＡＬＳ５．１バイオマーカー発見研究パラダイムである。
【図４３】孤発性ＡＬＳ対Ｌｏｔｈｉａｎ対照ＭＮ−チップコホートである。１０人の患者の運動ニューロンが播種された４０個のチップである。少しのばらつきがチップ間で観察された（５日目）。ＬＤＨ、及びメタボロミクスプロファイリングは、１４日及び２８日目に実施される。
【図４４】ＰＤバイオマーカー研究の概略図である。（ａ）各条件（ＣＴＲ対ＰＤ）の５つの独立したドナー系統を、系統あたり３つの複製で培養した。（ｂ）培養パラダイムには、チップ内で１４日間培養された中脳ニューロンが含まれ、その後ＢＭＥＣが追加され、エンドポイントまで培養した。エンドポイントデータは右側にリストされている。（ｃ）各患者チップの１０倍での代表的な培養画像（播種及びメインチャネル）である。（ｄ）エンドポイントでの神経溶出液の乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）活性である。
【図４５−１】パーソナライズされたｉＰＳＣベースのＢＢＢチップは、個人間のばらつきを検出する。Ａ）播種戦略の概略図である。ｉＰＳＣは、懸濁液中でＥＺ球体（初期の神経前駆細胞）に分化する。次に、ＥＺ球体は分離され、「脳側」に播種され、そこでさらに混合神経培養物に分化する。同質遺伝子ｉＰＳＣはｉＢＭＥＣに分化し、上記のように「血液側」に播種される。Ｂ）播種後７日目のＣＳ８３ｉＣＴＲ  ｉＰＳＣベースのＢＢＢチップでの免疫細胞化学は、脳コンパートメントに存在するＥＺ球体由来の神経培養物がネスチン＋神経前駆細胞を発現することを示す（赤）。ＧＦＡＰ＋（赤）及びＳ１００１３＋（緑）アストロサイト、ならびにニューロンマーカーの重鎖ニューロフィラメント（ｈＮＦ、赤）、ＭＡＰ２ａｂ（緑）、及び１３ＩＩＩ−チューブリン（赤）、ならびにシナプスマーカーのシナプトフィジン（ＳＹＰ、緑）。スケールバー２００μｍ。Ｃ）播種後８日で、カルシウムイメージングにより、神経培養物がテトロドトキシン（ＴＴＸ）によって阻害される臓器チップ上で自発的な神経活動を示すことが明らかになった。Ｄ）デキストラン−ＦＩＴＣ（３ｋＤａ）の血液から脳への透過性は、ｉＢＭＥＣのみを播種した臓器チップ（黒いバー）、初代ヒトアストロサイト及び周皮細胞を有するｉＢＭＥＣ（赤いバー）、またはｉＰＳＣ由来神経細胞を有するｉＢＭＥＣで測定した（ｉＮｅｕｒａｌ、青いバー）。ダネットの多重比較検定を使用した一元配置分散分析（＊ｐ＜０．０５）。Ｅ）ＴＥＥＲ測定値は播種後２日で１５００Ωｘｃｍ２に達し、５日間、１０００Ωｘｃｍ２を超えたままである。Ｆ）健康な対照ｉＰＳＣ（ＣＳ６１７ｉＣＴＲ、ＣＳ０１７２ｉＣＴＲ、ＣＳ１８８ｉＣＴＲ）またはハンチントン病患者のｉＰＳＣ（ＣＳ８１ｉＨＤ）に由来するＢＢＢチップと比較した４、２０、または７０ｋＤａのデキストラン分子の透過性である。テューキーの多重比較検定を使用した二元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５。Ｇ）健康な対照のｉＰＳＣ由来のＢＢＢチップ間のデキストラン分子の透過性は、以前に報告されたｉｎ  ｖｉｖｏげっ歯類の脳への取り込み（Ｐｅ，ｃｍ  ｓ−１）と相関している（Ｒ２＝０．９６）。Ｈ）血液から脳へのＴ３透過性は、健康なドナー（ＣＳ６１７ｉＣＴＲ、ＣＳ１７２ｉＣＴＲ、ＣＳ１８８ｉＣＴＲ、ＣＳ０３ｉＣＴＲ）、ＭＣＴ８欠損患者（ＣＳ０１ｉＭＣＴ８）、ナンセンス変異がＣＳ０３ｉＣＴＲ系統に導入された同質遺伝子系統（ＣＳ０３ｉＣＴＲｍｕｔ）、及びＣＳ０１ｉＭＣＴ８系統（ＣＳ０１ｉＭＣＴ８ｃｏｒ）において点突然変異が修正された同質遺伝子系統に由来する、ＢＢＢチップにおいて比較される。ＭＣＴ８変異体と対照系統の間のネストｔ検定、＊ｐ＜０．０５。Ｉ）デキストラン−ＦＩＴＣと蛍光グルコース類似体２−ＮＢＤＧまたはレチガビン、レベチラセタム、及びコルヒチンを「血液チャネル」（各１０μｇ／ｍｌ）に同時にスパイクし、それらの透過性及び濃度を、蛍光または液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）によって「脳側」で評価した。テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、ｎ＝３〜４チップ／薬剤／���胞系統。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳで実施した試験のデータは、試料ごとに３回の別々の注入から平均化した。
【図４５−２】図４５−１の続きの図である。
【図４６】ｉＰＳＣベースのＢＢＢチップを使用したヒト全血ろ過は、神経細胞毒性を評価し、疾患モデリングを強化することができる。Ａ）ｉＰＳＣベースのＢＢＢチップを介したヒト全血の灌流の概略図。Ｂ）ヒト全血が「血液側」から３６００μｌ／時（５ｄｙｎ／ｃｍ２に相当）で灌流された。ｉＢＭＥＣは、全血を「血液チャネル」に制限する。神経細胞を単独で培養する場合、またはｉＢＭＥＣをＴＮＦα（１０ｎｇ／ｍｌ）で処理する場合、ヒト全血が「脳側」に拡散する可能性がある（緑色の矢印で強調表示）。Ｃ）ヒト全血を一晩灌流後、蛍光デキストラン−ＦＩＴＣ（３ｋＤａ）の血液から脳への透過性の測定は、神経細胞をｉＢＭＥＣ（白いバー）で培養した場合に低い拡散レベルを示し、ｉＰＳＣ由来の神経細胞を単独で培養した場合（灰色のバー）、またはＴＮＦα処理後に培養した場合（１０ｎｇ／ｍｌ、黒いバー）、透過性が大幅に増加した。一元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．０００１。Ｄ）βＩＩＩ−チューブリン＋ニューロン（赤）及びＧＦＡＰ＋アストロサイト（緑）の免疫細胞化学は、神経細胞がｉＢＭＥＣによって保護されているが、単独で培養すると減少することを示した。スケールバー２００μｍ。Ｅ）ＬＤＨを定量化することによって神経毒性を評価することにより、ｉＢＭＥＣが血液誘発細胞毒性から「脳側」を保護できる機能的障壁を提供することを確認した（白いバー）。対照的に、ｉＢＭＥＣなし（灰色のバー）またはＴＮＦα処理あり（黒いバー）の臓器チップは、血管漏出、及びＬＤＨ放出の有意な増加をもたらした。ダネットの多重比較検定による一元配置分散分析、＊＊ｐ＜０．０１。Ｆ）ＭＣＴ８欠損症モデルの実験計画である。Ｇ）対照系統（黒いバー）及びＭＣＴ８欠損系統（無色のバー）を含むｉＰＳＣベースのＢＢＢチップ全体の血液から脳へのＴ３（１００ｎＭ）透過性を測定すると、ＭＣＴ８変異を有するｉＰＳＣベースのＢＢＢチップが、変異のないＢＢＢチップと比較して、輸送が大幅に減少した。テューキーの多重比較検定による一元配置分散分析、＊ｐ＜０．０５。色分けは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で編集された同質遺伝子ｉＰＳＣ株を表す。
【図４７】前脳ＭＰＳのｉＰＳＣ由来細胞型である。（ａ）対照及びＣ９ｏｒｆ７２  ＣＮは、どちらも６０日でＢＣＬ１１Ｂを発現し、９０日でアストロサイトタンパク質を発現する。（ｂ）ドーパミン作動性ニューロン（ＴＨ；緑）と共培養されたミクログリア（赤）である。（ｃ）脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）である。（ｄ）下部コンパートメントのＢＭＥＣ及び上部の神経細胞（緑）との３週間の共培養後のＭＰＳの断面画像である。
【図４８】５０日目に、ＣＮは前脳及びＶＥＮ関連のトランスクリプトームを発現する。（ａ）ＣＴＲ及びＣ９ｏｒ１７２  ＣＮの偏りのないクラスターである。（ｂ）フォン・エコノモニューロン（ＶＥＮ）に関連する１つまたは２つ〜５つの遺伝子を発現する細胞である。（ｃ）ＣＮは、典型的な前脳特異的転写物を発現する。（ｄ）ＣＮ培養は、成熟ニューロン（上部）、神経前駆細胞（中央部）、及びいくつかの未成熟グリア（下部パネル）で構成されている。
【図４９】ｉＰＳＣ由来ＭＧは再現性が高い。２Ｄでは、５つの対照（ＣＴＲ）及び５つのＡＬＳ（Ｃ９ｏｒ１７２）系統がＭＧ関連の転写物を発現する。対照系統及び疾患系統の両方が一貫してミクログリアを生成する。
【図５０】ＭＰＳにおける機能的なＢＢＢである。全血の存在下では、毒性（ａ）及びデキストラン透過性（ｂ）はＢＭＥＣの共培養で減少する。
【図５１】ＭＰＳから分離された共培養細胞型はｓｃＲＮＡによって識別される。上部（中脳ニューロンとＭＧ）及び下部（ＢＭＥＣ）のチャンバーは、ｓｃＲＮＡによる分析のためにプールされる。細胞の偏りのないクラスタリングにより、６つの推定集団が識別される（左）。ニューロン、ミクログリア、神経前駆細胞、増殖細胞、及び内皮細胞を代表する特定の遺伝子である（右）。
【図５２】Ｃ９ｏｒｆ７２修正系統にはＲＮＡ病巣がなく、Ｃ９ｏｒｆ７２の発現が回復されている。（ａ）親系統及び修正系統のプライムＰＣＲを繰り返す。（ｂ）ＲＮＡ病巣は修正に存在しない。（ｃ）Ｃ９ｏｒｆ７２の合計及び転写物バリアント（ＴＶ２＆３）は正常に戻る。
【図５３】ＰＤ対ＣＴＲの中脳ＭＰＳから検出された代謝物の違いである。（ａ）５つの対照と５つのＰＤ中脳ＭＰＳ間で示差的に検出された代謝物のヒートマップである。（ｂ）Ｌ−キヌレニンは、ＣＴＲ  ＭＰＳと比較してＰＤからの溶出物が豊富である。
【図５４】ＡＡＶ−ＧＦＰによる治療の６日後のＭＰＳニューロンである。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
詳細な説明
本明細書において引用される全ての参照文献は、その全体が記述されるように、参照により本明細書に組み込まれる。別途記載のない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ３ｒｄ  ｅｄ．，Ｒｅｖｉｓｅｄ，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  ２００６）、及びＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ  ２０１２）は、本出願において使用される用語の多くについて一般的なガイドを当業者に提供する。
【００１８】
本発明の実施において使用することができる本明細書に記載されるものと類似または同等の多くの方法及び材料を、当業者は認識するであろう。実際、本発明は、記載される方法及び材料に決して限定されない。
【００１９】
本明細書では、いくつかの略語が使用されている。
【００２０】
本明細書で使用される「マイクロ流体」という用語は、移動する流体が１つまたは複数のチャネル内に拘束されるか、またはそれを通過する構成要素に関し、１つまたは複数の寸法が１０ｍｍ以下（マイクロスケール）である。マイクロ流体チャネルは、１つまたは複数の方向でマイクロスケールより大きくなる場合があるが、チャネル（複数可）は、少なくとも１つの方向でマイクロスケール上にあり得る。場合によっては、マイクロ流体チャネルの形状は、チャネルを通る流体の流量を制御するように構成され得る。マイクロ流体チャネルは、チャネルを通過する幅広い流量を可能にするために、様々な形状で作製することができる。しかしながら、本開示は「マイクロ流体」デバイスについて頻繁に言及するが、教示されることの多くは、より大きな流体デバイスに同様にまたは等しく当てはまることに留意することが重要である。臓器チップが治療用途を目的としている場合、より大きなデバイスが特に関連する可能性がある。より大きな流体デバイスを利用できるアプリケーションの例には、高度に分化した細胞を生成するためのデバイスの使用（例えば、デバイスは細胞の分化及び／または成熟を促進するために使用でき、その後、細胞は、移植、体外デバイスでの使用、または研究用途を含み得る、下流での使用のために溶出される）、または移植もしくは体外使用のためのデバイス、例えば、膵島オンチップ、内皮血管細胞オンチップ、骨格筋チップ、または前述の細胞の組み合わせ（例えば、チップ上のチャネル内の膵島−血管細胞、チップ上のチャネル内の膵島−筋細胞）の使用が挙げられる。従来の静置培養とは異なり、本発明は、栄養素を提供し、廃液を除去する培地の一定の流れに細胞が曝されるマイクロ流体デバイスを企図する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「接続される」、「結合される」、及び「〜と連通している」という語句は、機械的、電気的、磁気的、電磁気的、流体的、及び熱的相互作用を含む、２つ以上の要素間の任意の形態の相互作用を指す。例えば、一実施形態では、マイクロ流体デバイスの第１及び第２のチャネルは、流体リザーバと流体連通している。２つの構成要素は、互いに直接接触していなくても、互いに結合されている場合がある。例えば、２つの構成要素は、中間構成要素（例えば、管または他の導管）を介して互いに結合され得る。
【００２２】
記載されているように、本発明者らが脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）について以前に示したように、ｉＰＳＣ由来ニューロンは早期発症神経疾患のモデル化に非常に成功している。本明細書では、本発明者らによる予備研究が、ｉＰＳＣ由来の運動ニューロンが分化の８週間以内に細胞培養皿で神経変性を受け、疾患の生体模倣（ＭＰＳ）モデル（ＭＯＤ）におけるヒトの病理を模倣することを示している。
【００２３】
これらの研究を拡張すると、電気生理機能及びメタボロミクスプロファイリングに基づくバイオマーカーに焦点を当てることができる。ＡＬＳの遺伝的形態に特有の電気生理学的変化は、ＡＬＳのｉＰＳＣモデルにおいて本発明者ら及び他の人によって示されている。本発明者らは、これらが孤発性モデルでも見られると予測している。ＰＤモデルについてはあまり知られていないが、ＭＰＳ  ＭＯＤを使用することにより、孤発性パーキンソン病（ｓＰＤ）ＤＡＮがカルシウムイメージングを使用してニューロンシグナル伝達に違いがあるかどうかを初めて調べることができる。メタボロミクスプロファイリングは、チップからの溶出液中の最大３００の代謝物のモニタリングを可能にし、ＭＰＳに非常に適している。一例として、神経伝達物質スクリーンを配置して、同じ溶出液中のニューロンの健康状態を監視することができる。
【００２４】
チップ上の記載されているＭＰＳ  ＭＯＤ疾患モデリングは、細胞の発達及び疾患の病因を含む神経変性疾患の研究を可能にする。一例として、パーキンソン病（ＰＤ）ＰＤチップを使用して、生きているヒト脳組織での一通り揃った細胞アッセイを可能にする灌流可能システムにおいて、ＰＤをモデル化する。これは、罹患していない患者から作製されたＰＤチップと比較したときに診断に使用することができ、ＰＤ自体のメカニズム及び治療標的の研究に使用することができる。最後に、それは血液脳関門の透過性を決定するという追加の利点を備えた新規薬物のスクリーニングに使用することができる。
【００２５】
ＰＤチップは、ｉＰＳＣ由来の組織を利用して、パーキンソン病において変性する脳の部分を特定的に表す「脳オンチップ」モデルを作成する培養システムである。予備的な結果として、このチップは主要なＰＤ病理を再現し、新しい血管新生コンパートメントを含む。これは、ＰＤバイオマーカーの研究、ＰＤリスク評価のための患者スクリーニング、ならびに治療法の発見及び試験に使用される。バイオマーカーのパネルは、神経活動による生きたＰＤチップの分析、全トランスクリプトーム、プロテオーム、及びメタボローム分析、ならびに培地及び組織の機能酵素試験を通じて生成される。血管系チャネルを通じて実験的治療薬を流すことにより、主要な血液脳関門浸透研究を行うことができる。さらに、バイオマーカーの発見について述べたのと同じリードアウトを使用して、浸透する薬物の、ＰＤチップに存在するヒト神経細胞における有効性が評価され得る。ｉＰＳＣを使用したＰＤモデルが試みられたが、若年発症の孤発性患者のものはなかった。これらのチップは、孤発性患者のＰＤ病態生理を再現する。さらに、治療薬送達の重要な特徴であるヒト血管成分を含むモデル、または疾患の進行に役割を果たすと考えられている支持細胞（例えば、ミクログリア、アストロサイト）のキャストを組み込んだモデルはない。
【００２６】
記載のＭＰＳ  ＭＯＤを使用すると、さらにいくつかの革新的な側面がある。１つ目は、完全にヒト患者固有のシステムによるハイコンテント生物学的研究を実施するための培養システムを含む、高度にスケーラブルなＭＰＳの使用である。２つ目は、ｉＰＳＣモデルにおいて十分に活用されていない孤発性ＡＬＳ及びＰＤの症例に焦点を当てている。３つ目は、細胞上または血液脳関門（ＢＢＢ）を通過して薬物を流すＭＰＳの能力、及びＣａｒｔａｇｅシステム（図１）を介したリアルタイムの生物学的スクリーニングにおいて疾患関連バイオマーカーに関する情報を収集するＭＰＳの能力を活用するアウトカム評価として、電気生理機能及びメタボロミクス（神経伝達物質レベルを含む）に焦点を当てている。４つ目は、活性な血液脳関門と神経組織の組み合わせで、脳側または血液側のいずれかに薬物を投与できるようにし、これにより、血液脳関門を通過する化合物の能力がシミュレートされる。第５の態様は、非ＰＤＭＳチップ（薬物吸収を低減するための）、及び神経活動のリアルタイム記録のためにチップに組み込まれたＭＥＡデバイスを含む。臓器チップに関する詳細は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｓａｎｃｅｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍａｎ  ｉＰＳＣ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｏｒｇａｎ−Ｃｈｉｐ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  Ｉｎ  ｐｒｅｓｓ（２０１８）に記載されている。
【００２７】
本明細書に記載されているのは、（ｉ）アストロサイト、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）、もしくはその両方、（ｉｉ）ニューロン、（ｉｉｉ）上面及び底面を含む膜を含むマイクロ流体デバイスを提供する工程、底面にＢＭＥＣを播種して播種した内皮細胞を作製する工程、または上面にアストロサイトを播種して播種したアストロサイトを作製する工程、または底面にＢＭＥＣを播種して播種した内皮細胞を作製しかつ上部にアストロサイトを播種して播種したアストロサイトを作製する工程、上面にニューロンを播種して播種したニューロンを作製する工程、しばらくの間一定の流量で、１つもしくは複数の播種した内皮細胞、播種したアストロサイト、及び播種したニューロンを培養する工程、を含む細胞を培養する方法である。他の実施形態では、細胞を培養する方法は、（ｉ）アストロサイト、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）、もしくはその両方、（ｉｉ）ニューロン、（ｉｉｉ）ミクログリア、（ｉｖ）上面及び底面を含む膜を含むマイクロ流体デバイスを提供する工程、底面にＢＭＥＣを播種して播種した内皮細胞を作製する工程、または上面にアストロサイトを播種して播種したアストロサイトを作製する工程、または底面にＢＭＥＣを播種して播種した内皮細胞を作製しかつ上面にアストロサイトを播種して播種したアストロサイトを作製する工程、上面にニューロンを播種して播種したニューロンを作製する工程、上面にミクログリアを播種して播種したミクログリアを作製する工程、しばらくの間一定の流量で、１つもしくは複数の播種した内皮細胞、播種したアストロサイト、播種したニューロン、及び播種したミクログリアを培養する工程、を含む。他の実施形態では、アストロサイト、ＢＭＥＣ、ニューロン、及びミクログリアは、それぞれ幹細胞から分化しているか、または初代細胞である。様々な実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、神経変性疾患に罹患している対象に由来する。様々な実施形態では、アストロサイト、ＢＭＥＣ、ニューロン、及びミクログリアのうちの１つまたは複数は、ｉＰＳＣから分化している。様々な実施形態では、アストロサイト、ＢＭＥＣ、ニューロン、及びミクログリアのうちの１つまたは複数は、神経変性疾患に罹患している対象のｉＰＳＣから分化している。アストロサイト、ＢＭＥＣ、ニューロン、及びミクログリアの様々な組み合わせは、健康で正常な非疾患対象、及び／または神経変性疾患に罹患している対象の両方の細胞を含むことができることを理解されたい。神経変性疾患には、ＡＬＳ、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、プリオン病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、運動失調及び麻痺、例えば脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、及び当技術分野で認識されている他の全ての神経変性疾患が含まれる。様々な実施形態では、前述の疾患には、優性突然変異体及び孤発性形態、例えば孤発性ＡＬＳ、アルツハイマー病、及びパーキンソン病が含まれる。他の実施形態では、ニューロンは、前脳、中脳、及び／または後脳のニューロンである。他の実施形態では、ニューロンは、脊髄運動ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、またはコリン作動性ニューロンである。
【００２８】
他の実施形態では、ニューロンの播種は、ＢＭＥＣを播種した１日以上後である。他の実施形態では、ニューロンの播種は、ＢＭＥＣを播種した６日後である。他の実施形態では、ＢＭＥＣの播種及びアストロサイトの播種は同時に行われる。他の実施形態では、播種した内皮細胞は、静置培養で培養された同じ細胞と比較して、しばらくの間一定流量で培養した後、より成熟した表現型を示す。他の実施形態では、一定流量での培養培地の流れは、播種された内皮細胞とＢＭＥＣとの間のタイトな細胞間接合部の形成を促進する。他の実施形態では、該方法は、タイトな細胞間接合部を検出する工程を含む。他の実施形態では、タイトな細胞間接合部は、ＴＥＥＲ測定によって検出される。他の実施形態では、パッチクランプ測定、細胞外電気生理学測定、カルシウム感受性色素もしくはタンパク質を使用するイメージング、または電圧感受性色素もしくはタンパク質を使用するイメージングのうちの少なくとも１つによるニューロンまたはアストロサイト活性の測定である。他の実施形態では、タイトな細胞間接合部が細胞透過性アッセイによって検出される。
【００２９】
例えば、輸送及び透過性アッセイは、上部チャネルと下部チャネルの両方を、３０μｌ／時で培地で灌流することによって実施することができる。下部チャネルを、神経培地で、またはクエン酸ナトリウムで処理した全ヒト血液で灌流し、下部チャネルを、神経培地で灌流した。上部及び下部チャネルの両方からの入力及び溶出液の両方から収集された培地／血液を、蛍光、発光、またはＭＳによって読み取った。蛍光（４８５ｎｍの励起及び５３０ｎｍの蛍光）または発光をプレートリーダーで検出した。測定した値は、次のようにＰａｐｐ値を計算するために使用した。
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【００３０】
他の実施形態では、膜の上面は上部マイクロ流体チャネルの一部を含み、膜の底面は下部マイクロ流体チャネルの一部を含む。他の実施形態では、上部マイクロ流体チャネル及び下部マイクロ流体チャネルは、少なくとも１つの入口ポート及び少なくとも１つの出口ポートをそれぞれ含み、培養培地は入口ポートから入り、出口ポートから出る。他の実施形態では、ニューロンは、神経変性疾患と診断されたヒト患者由来の人工多能性幹細胞に由来する。他の実施形態では、脊髄運動ニューロンまたはドーパミン作動性ニューロンは、少なくとも３週間、一定の流量での培養培地の流れを含む条件下で培養される。
【００３１】
さらに、本明細書では、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）、アストロサイト、及びニューロンを含む共培養物を含むマイクロ流体デバイスについても記載される。他の実施形態では、ニューロンは、脊髄運動ニューロン及びドーパミン作動性ニューロンである。他の実施形態では、共培養物は、ミクログリア細胞をさらに含む。他の実施形態では、アストロサイト、脳微小血管内皮細胞、ニューロン及びミクログリアは、それぞれ幹細胞から分化しているか、または初代細胞である。様々な実施形態では、幹細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。他の実施形態では、ミクログリアは、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来のミクログリアである。他の実施形態では、ニューロンはｉＰＳＣ由来のニューロンである。他の実施形態では、ＢＭＥＣはｉＰＳＣ由来のＢＭＥＣである。他の実施形態では、アストロサイトはｉＰＳＣ由来のアストロサイトである。様々な実施形態では、ｉＰＳＣは、神経変性疾患に罹患している対象に由来する。様々な実施形態では、アストロサイト、ＢＭＥＣ、ニューロン、及びミクログリアのうちの１つまたは複数は、ｉＰＳＣから分化している。様々な実施形態では、アストロサイト、ＢＭＥＣ、ニューロン、及びミクログリアのうちの１つまたは複数は、神経変性疾患に罹患している対象のｉＰＳＣから分化している。アストロサイト、ＢＭＥＣ、ニューロン、及びミクログリアの様々な組み合わせは、健康で正常な非疾患対象、及び／または神経変性疾患に罹患している対象の両方の細胞を含むことができることを理解されたい。神経変性疾患には、ＡＬＳ、パーキンソン病、アルツハイマー病、ハンチントン病、プリオン病、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、運動失調及び麻痺、例えば脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、及び当技術分野で認識されている他の全ての神経変性疾患が含まれる。様々な実施形態では、前述の疾患には、優性突然変異体及び孤発性形態、例えば孤発性ＡＬＳ、アルツハイマー病、及びパーキンソン病が含まれる。他の実施形態では、該方法は、ｉＰＳＣを前脳、中脳、及び／または後脳のニューロンを含むニューロンに分化させる工程を含む。他の実施形態では、ニューロンは、脊髄運動ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、またはコリン作動性ニューロンである。
【００３２】
他の実施形態では、ＢＭＥＣ、アストロサイト、及びニューロンは、マイクロチャネル内またはマイクロ流体チップの膜上にある。他の実施形態では、マイクロ流体チップは第１及び第２の表面を有する多孔質膜によって分離された２つのマイクロチャネルを含み、ニューロンは第１の表面で培養され、ＢＭＥＣは第２の表面で培養される。他の実施形態では、細胞は流動培養培地と接触している。様々な実施形態では、膜は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個の微細孔を含む半多孔質である。これには、例えば、３ミクロンの細孔が含まれる。
【００３３】
本明細書に記載されているのは、多量の血液細胞をリプログラミング因子をコードする１つまたは複数のベクターと接触させる工程と、多量のリプログラミング因子を血液細胞に送達する工程と、リプログラミング培地において血液細胞を培養する工程と、を含む方法であり、該多量の血液細胞は、神経変性疾患に罹患したヒト対象から得られ、さらに、該リプログラミング因子の送達及びリプログラミング培地における培養により、血液細胞由来の人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が生成される。他の実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病（ＰＤ）である。他の実施形態では、神経変性疾患は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。他の実施形態では、ｉＰＳＣは、アストロサイト、ミクログリア、及び血管細胞のうちの１つまたは複数と流動的に連通してさらに培養される。他の実施形態では、１つまたは複数のベクターは、ｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターである。他の実施形態では、方法は、ｉＰＳＣをニューロンに分化させる工程を含む。他の実施形態では、方法は、ｉＰＳＣを血管細胞に分化させる工程を含む。様々な実施形態では、血管細胞は、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）である。他の実施形態では、方法は、ｉＰＳＣをアストロサイトに分化させる工程を含む。他の実施形態では、方法は、ｉＰＳＣをミクログリアに分化させる工程を含む。他の実施形態では、方法は、ｉＰＳ細胞を前脳、中脳、及び／または後脳のニューロンを含むニューロンに分化させる工程を含む。様々な実施形態では、ニューロンは、脊髄運動ニューロン、ドーパミン作動性ニューロン、またはコリン作動性ニューロンである。ｉＰＳＣリプログラミングに関する詳細は、参照により本明細書に完全に組み込まれる、Ｂａｒｒｅｔｔ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．Ｒｅｌｉａｂｌｅ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ．２０１４  Ｄｅｃ；３（１２）：１４２９−３４に記載されている。
【００３４】
本明細書に記載されているのは、多量の血液細胞をリプログラミング因子をコードする１つまたは複数のベクターと接触させる工程と、多量のリプログラミング因子を血液細胞に送達する工程と、リプログラミング培地において血液細胞を培養する工程と、を含む方法により作られた多量の神経変性疾患に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）であって、該多量の血液細胞が、神経変性疾患に罹患したヒト対象から得られ、さらに該リプログラミング因子の送達及びリプログラミング培地における培養により、血液細胞由来のｉＰＳＣが生成される。他の実施形態では、神経変性疾患はパーキンソン病（ＰＤ）である。他の実施形態では、神経変性疾患は筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。様々な実施形態では、前述の疾患には、優性突然変異体及び孤発性形態、例えば孤発性ＡＬＳ及びパーキンソン病が含まれる。
【００３５】
また、本明細書に記載されているのは、多量の細胞を、１つまたは複数のパラメータを測定する１つまたは複数の試験化合物と接触させる工程と、測定された１つまたは複数のパラメータに基づいて１つまたは複数の試験化合物を選択する工程と、を含む化合物スクリーニングの方法であり、細胞は、神経変性疾患に由来する人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から分化する。他の実施形態では、分化した細胞はニューロンである。他の実施形態では、分化した細胞は血管細胞である。他の実施形態では、分化した細胞はアストロサイトである。他の実施形態では、分化した細胞はミクログリアである。他の実施形態では、１つまたは複数のパラメータは、多量の血管細胞を越えた試験化合物の透過性、細胞の電気生理学的特性の変化、例えば神経伝達物質の産生及び放出を含む細胞の代謝プロファイルの変化を含む。他の実施形態では、ｉＰＳＣは、多量の血液細胞をリプログラミング因子をコードする１つまたは複数のｏｒｉＰ／ＥＢＮＡ１ベクターと接触させる工程と、多量のリプログラミング因子を該血液細胞に送達する工程と、リプログラミング培地において該血液細胞を培養する工程と、を含む方法によって作られ、該多量の血液細胞は、神経変性疾患に罹患したヒト対象から得られ、さらに、リプログラミング因子の送達及びリプログラミング培地における培養により、血液細胞由来のｉＰＳＣが生成される。
【００３６】
本明細書にさらに記載されるのは、予後、診断、または治療選択を支援するためのバイオマーカーパネルであり、神経変性障害に罹患している疑いのある対象の１つまたは複数のバイオマーカーをアッセイし、アッセイされた１つまたは複数のバイオマーカーに基づいて治療レジメンを予測、診断、または選択することを含む。様々な実施形態では、対象は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）またはパーキンソン病に罹患していると疑われる。様々な実施形態では、バイオマーカーは、神経伝達物質を含む代謝酵素である。様々な実施形態では、バイオマーカーは、ネスチン、Ｔｕｊ１、ＭＡＰ２、ＧＦＡＰ、Ｓ１００Ｂ、ＣＤ１１Ｂ、ＰＵ．１、ＧＬＵＴＡ−１、ＺＯ−１、ＳＭＩ３１／Ｉｓｌ１、ＴＨ／ＰＩＴＸ３、Ｐｈｏｓｏｐｈｏ−ＴＤＰ、ＦＡＳリガンド、ＳＯＤ１などを含む。様々な実施形態では、バイオマーカーは、オピオイド受容体を含む。様々な実施形態では、オピオイド受容体は、Ｍｕ１、Ｋａｐｐａ１、Ｄｅｌｔａ１、及びオピオイド関連ノシセプチン受容体１を含む。
【００３７】
詳細は、米国出願第１５／４５８，１８５、１５／３５２，２８９、ＰＣＴ出願第、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／４９１１５、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／４９１９３、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１６０７９、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１６０９８、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１６０７９、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１６０９８、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０１６０９８、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／１６０７９、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８−０２２５１１、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／５７７２４、及びＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／４９１１５、及び米国仮特許出願第６２／６５３，６９７、米国仮特許出願第６２／７５５，２８２、米国仮特許出願第６２／８１６，７８５、米国仮特許出願第６２／６６４，８８８、米国仮特許出願第６２／６６４，８２７、米国仮特許出願第６２／８１６，７９５、米国仮特許出願第６２／６６４，９４２、米国仮特許出願第６２／７５５，３６５に記載されており、これらのそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【００３８】
以下は非限定的な例である。
【００３９】
実施例１
予備データ
臓器チップは、肺胞と小気道、腸、肝臓、腎臓、及び血液脳関門、及び他の臓器を含む、いくつかの臓器及び組織システムのＭＰＳモデルを可能にする。臓器チップは、並列動作中にスケールアップでき、特別に開発された機器とペアにして、ユーザーがチューブを接続及び切断する必要をなくし、流体のデッドボリュームを減らしてサンプリングを改善し、不要な気泡を取り除くことができる。これらの利点により、実験スループットが向上し、ばらつきが減少する（図1）。
【００４０】
臓器チップ上の生物学的材料には、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、ｉＰＳＣ由来の細胞及び組織が含まれる。臨床で採取された単純な血液試料を使用して、ドナーの遺伝子構造を保持するｉＰＳＣ系統を導出することができる。患者の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、リプログラミング因子の一過性異所性発現を可能にする非統合技術を使用して、増殖工程を必要とせずに直接リプログラムされる。短期間で、ｉＰＳＣコロニーは、その起源組織のエピジェネティックマークが取り除かれ、ドナー患者の遺伝子構造を保持する多能性細胞の安定した供給源であり続ける。この方法は、ＡＬＳ患者の２００を超えるＰＢＭＣ試料で問題なく実施されており、他の線維芽細胞ベースの方法よりも核型異常が少ないことが示されている。これらのｉＰＳＣは、対象となる様々な組織タイプの後続の疾患モデリング研究のために増殖及び冷凍保存できる。本発明者らは、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）、アストロサイト、ミクログリア、脊髄運動ニューロン（ｓｐＭＮ）、及びドーパミン作動性ニューロン（ＤＡＮ）を含む、複数のｉＰＳＣ由来細胞系統を生成するためのロバストな分化技術を開発した。
【００４１】
本発明者らは、神経変性疾患をより適切にモデル化するために、ｉＰＳＣ、ｉＰＳＣ由来の細胞及び組織をＭＰＳシステムにうまく展開した。本発明者らの予備研究は、ｓｐＭＮ及びＤＡＮがＭＰＳにおけるＢＭＥＣ（及びアストロサイト）との共培養において３週間以上生存し、適切なニューロン表現型を生成できることを示した（図２）。さらに、本発明者らは、チップ環境及びＢＭＥＣの存在によって強化されるカルシウムイメージングを使用してニューロンの活性化を検出することができる（図３＆８）。最後に、本発明者らは、チップの組み合わせ及び内皮の相互作用がＲＮＡ−ｓｅｑプロファイルの特定の変化につながることを観察し、相互作用する細胞型が既知の血管相互作用経路を刺激し、より機能的な状態に向かって成熟し始めていることを示唆している（図４）。
【００４２】
ＰＤ及びＡＬＳのＭＰＳモデルの開発における本発明者らの以前の研究において、本発明者らは、ＢＭＥＣのみ、またはアストロサイト及びＢＭＥＣのいずれかを用いたニューロンの播種及び共培養法を確立した。一定の流れの条件下でｓｐＭＮについて行われた本発明者らの研究は、ＢＭＥＣが連続的な流れの下でのニューロンの樹立に必要であることを示した。ＢＭＥＣ及びアストロサイトは、ＤＡＮとの共培養において生存し、拍動流下で３週間安定し続けていることも示した。重要なことに、これらのＢＭＥＣ及びアストロサイト細胞型は、ロットで極低温保存できる（図１２）。次に、以前に検証されたアストロサイト及びＢＭＥＣを解凍し、臓器チップに直接播種し、ＰＤまたはＡＬＳ関連の神経組織との共培養に備えて成熟させることができる。
【００４３】
本発明者らは、これらの支持細胞型のこのオンデマンドの利用可能性が、後の実験において本発明者らのシステムのスケーリングに役立つことを期待している。ＢＭＥＣ及びアストロサイトを超えて、ミクログリアは正常なニューロンの発達に必要であり、ＡＬＳ及びＰＤ疾患の病因における重要な細胞型として影響を与えている。最近のプロトコルは、ＭＰＳにおいて異なる神経生理機能及び疾患表現型を誘発する可能性のある機能的ミクログリアの分化のために開発された（図５）。これを踏まえて、本発明者らは、各疾患モデルシステム内でＢＭＥＣ、アストロサイト、及びミクログリアを組み合わせて、後の目的で使用される機能的なプラットフォームを実現する。
【００４４】
実施例２
対照ｉＰＳＣ由来のＭＮ及びＤＡＮの信頼できるＭＰＳモデルの開発
上述のＭＰＳデバイスで神経細胞及び内皮細胞を播種する本発明者らによる以前の研究では、ｓｐＭＮとＤＡＮの両方が、反対側のチャネルに播種されたＢＭＥＣとの共培養において分化できることが示されている。特定の理論に縛られるものではないが、アストロサイト及びミクログリアの追加はモデルをさらに強化すると考えられている。例えば、ミクログリアは神経変性疾患に関与している細胞型でもあり、従来の培養形態では機能を失うことが知られている。したがって、ＭＰＳは、この細胞型がｉｎ  ｖｉｔｒｏで初めて新たな生物学的及び疾患関連生理機能を示すことを可能にし得る。
【００４５】
最初の研究では、ニューロンに播種する１週間前に、神経側にｉＰＳＣ由来のアストロサイトを、血液側にＢＭＥＣを播種した臓器チップが含まれている。予備的な結果は、アストロサイト層が神経及び血液コンパートメントの両方の安定性を高めることを示している。ｓｐＭＮ及びＤＡＮの両方のプラットフォームでのアストロサイト及びミクログリアの有用性を評価するために、本発明者らは、３ミクロンの孔を有する細胞を付着するためのＰＥＴ膜を備えた標準のＰＤＭＳチップを利用する。この半多孔質のバリアは、アストロサイトエンドフィートの突出を可能にするのには十分な大きさであるが、重要な神経またはＢＭＥＣの移動を阻害するのには十分小さい。
【００４６】
最初の研究では、ＳｃｏｔｌａｎｄのＬｏｔｈｉａｎコホートから生成された２５の対照ｉＰＳＣ系統に焦点を当てる。この場合、６０〜８０歳の患者が長年追跡されており、神経学的に正常であることが示されている。これらの系統の１つは、ｓｐＭＮ、ＤＡＮ、ＢＭＥＣ、及びアストロサイトの産生のための標準的な対照系統として使用される。本発明者らは、アウトカム指標としてバイオマーカーの限られたパネルを使用する。
【００４７】
実施例３
アストロサイト及びミクログリアを使用して、ｓｐＭＮ及びＤＡＮの成熟を通じて潜在的なバイオマーカーを強化する
ｓｐＭＮまたはＤＡＮのいずれかは、次の４つの異なる条件下でチップ内で培養される：（ｉ）上部チャネルのニューロンのみ、（ｉｉ）上部チャネルのニューロンと下部チャネルのＢＭＥＣ（図２のように）、（ｉｉｉ）上部チャネルにアストロサイト、下部チャネルにＢＭＥＣでプレコーティングしたチップに播種したニューロン、及び（ｉｖ）上部チャネルにアストロサイト、下部チャネルにＢＭＥＣでプレコーティングしたチップに播種したニューロン及びミクログリア（図５）。構成的プロモーターの下で細胞質蛍光レポーター系統を使用してミクログリアを生成することができる結果、培養物におけるそれらの持続性を決定することができる。このことは、特定のマーカーによってこれらの細胞を特性決定する問題を克服する。両チャネルは１０μｌの流量を有することができ、神経細胞及び内皮細胞の生存に最適であると思われる。
【００４８】
播種後２週間または４週間で培養物を分析し、共培養物がデバイス内で経時的に成熟する方法を確立する。４種類の細胞の組み合わせは、将来の研究の実現可能性を判断するために、３つの重要なパラメータに応じてスコアリングされる：（ｉ）ニューロン機能のためのカルシウム一過性活性、（ｉｉ）共培養安定性を決定するための支持細胞の免疫染色、（ｉｉｉ）ニューロン確立を決定するためのニューロン形態、及び（ｉｖ）神経伝達物質産生を含む代謝（表１）。成功したスコアは、高い一過性活性、支持細胞型の適切な分布、適切な画像分析を可能にするニューロンの形態、及びニューロンの健康を示す体細胞サイズによって決定される。実行間のばらつきを評価するために、これらの実験は３回繰り返される。
【００４９】
実施例４
ＭＰＳ培養物が複数の実験にわたって信頼できるバイオマーカー発現を示すかどうかを判断
最高スコアの播種の組み合わせに基づいて、より広範な表現型のアウトカム指標が適用される。これには、ＭＰＳの主要な利点と多領域の細胞生理学的リードアウトを組み合わせた細胞アッセイの包括的なマトリックスが含まれる（表２）。
【００５０】
以下は、４週間、培養において評価される：（ｉ）質量分析によるメタボロミクスプロファイリング代謝バイオマーカーの発現を、ＭＰＳデバイスからの流出液において測定する、（ｉｉ）ニューロンの電気生理機能を、ＭＰＳデバイスにおいて成熟したカルシウムのライブイメージングを使用して分析する、（ｉｉｉ）ＭＰＳデバイスを実験後に分析し、ハイコンテンツイメージングを使用してＭＮ及びＤＡＮの形態及び生存を評価する、ならびに（ｉｖ）全体のプロテオミクス及びトランスクリプトームプロファイリングを実行して、これらのデバイスにおいて一貫して発現される潜在的なバイオマーカーを探索する。
【００５１】
本発明者らは、全体的なチップ要件を低減するために、同じチップのセットで実施される相補的アッセイを慎重に検討した。これらの技術の完全な説明は、本明細書に記載されるさらなる例とともに表２に提供される。これらの実験は、類似した継代数で同じ対照ｉＰＳＣ系統を使用して３回繰り返される（表３）。将来のスクリーニングのために選択されたバイオマーカーは、各データセットのＡＮＯＶＡ評価に基づいて実行間で有意差（Ｐ＜０．０５）を示さない。
【００５２】
ライブカルシウムイメージング−ＭＰＳの神経チャネルにカルシウム活性化蛍光色素Ｆｌｕｒｏ−４ＡＭ（ｔｈｅｒｍｏ）を適用すると、神経活動を光学的に検出できる。本発明者らは、毎秒最大２００フレームの高速ＣＭＯＳカメラを使用して取り込みを実行できる。ＭＰＳ内のライブフラッシュニューロンのビデオは、カスタムＭＡＴＬＡＢソフトウェアを使用して定量化され、一過性のイベントの数であるカルシウムを決定し、さらにニューロンの活動を決定する。このハイスループットアッセイは、ニューロンの大きなコホートを同時に正確に測定できる。培養物が成熟するにつれて、カルシウム活性の波が観察される。同期率及び波の数は、このアッセイにより容易に識別される追加の指標である。本発明者らは、成熟を、対照に対する培養物中の自発的に活性なニューロンの数の増加（図３を参照）、及び成熟を示す活性の同期した「波」の数（図８）として定義する。
【００５３】
メタボロミクス−本発明者らは、臓器チップからの溶出液を定期的に収集し、メタボロミクスアッセイを使用してＭＳによって分析することを計画している。４週間後に、本発明者らは出口リザーバから手動で培地溶出液を収集し、試料を３回処理して、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムに注入する。これにより、チップ内の細胞の健康状態を動的に読み取ることができ、この助成金のＵＧ３部分の期間において使用するための低スループットの薬物アッセイシステムの基礎として機能する。代謝産物の抽出は、加熱条件なしで乾燥させた試料でのメタノール抽出を使用して行い、さらなる使用まで−８０℃で保存した。分析は、液体クロマトグラフィーと６５００トリプル四重極（ＳＣＩＥＸ）を組み合わせて行い、抽出物から標的代謝物を検出するための高感度で選択性の高いシステムを提供する。さらに、神経伝達物質の放出を、定常状態と化合物の添加の両方で監視する。神経伝達物質は、ドーパミン、セロトニン、ＧＡＢＡ、グルタミン酸、アセチルコリン、及びそれらの前駆体を含む、検出及び分析された代謝産物のリストに含まれている。
【００５４】
細胞死のＬＤＨアッセイ−乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）は、全てのヒト細胞のサイトゾルに存在する酵素である。細胞溶解すると、この酵素は培地に放出され、細胞死の指標として定量化できる。細胞毒性検出キット（Ｒｏｃｈｅ）は、細胞培地用に最適化された比色ＬＤＨキットである。ＭＰＳに存在する細胞毒性の割合は、吸光度の値を罹患していない対照と比較することによって計算される。
【００５５】
免疫細胞化学−神経マーカーには、アストロサイト用のグリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、ミクログリア用のＣＤ１１ｂまたはＰＵ．１が含まれる。疾患特異的ニューロンは、ＤＡＮの場合はチロシンヒドロキシラーゼ（ＴＨ）及びＰＩＴＸ３、ＭＮの場合はＳＭＩ３２及びＩｓｌｅｔ１（ＩＳＬ１）の任意の組み合わせによって識別される。本発明者らはまた、（Ａ）早期発生マーカーであるネスチン及びＴｕｊ１、ならびに（Ｂ）後期マーカーＭＡＰ２ａｂ（神経細胞）、Ｓ１００ｂ（神経膠）、及びＣｈＡＴ（ＭＮ）、またはＤＡ輸送体ＤＡＴ（ＤＡＮ）も含む。本発明者らはまた、（Ｃ）タイト接合部マーカーのゾナオクルーデンス１（ＺＯ−１）及びＢＭＥＣ特異的マーカーのグルコース輸送体１（ＧＬＵＴ−１）を通じてＢＭＥＣの同一性を確認する。本発明者らの先行研究では、本発明者らは、広視野顕微鏡及び共焦点顕微鏡の両方に最適な画像化技術を決定した。本発明者らは最近、チップ全体を非常に迅速に走査し、高倍率でニューロンを解像できる高速走査ライトシート顕微鏡を購入した。包括的な分析用に全てのチップ染色のデジタルレコードを生成するために、本発明者らが次の各実験を進める間、この新しい画像診断法の実施が継続される。
【００５６】
ＲＮＡｓｅｑ−神経培養物を上部チャネルから取り出し、処理してｍＲＮＡ転写物を分析する。読み取り深度を高めるために、チップは試料あたり３チップでプールされる。ＲＮＡｓｅｑライブラリを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＴｒｕＳｅｑキットを使用して生成し、Ｎｅｘｔｓｅｑ５００で７５ｂｐのシングルリードによりシークエンシングし、ｈｇ１９ヒトゲノムにア系統し、１００万あたりのキロベースあたりのリード数に定量化した。
【００５７】
プロテオミクス−ＳＷＡＴＨとも呼ばれる、データ非依存性解析（ＤＩＡ）と呼ばれる新しいプロテオミクスアプローチは、（ｉ）ＣＨＩＰ内の細胞集団の組成を表す事前に選択された高品質ペプチドで構成される質量分析（ＭＳ）ペプチドライブラリを構築すること、及び（ｉｉ）ＭＳ機器（６６００  Ｔｒｉｐｌｅ  ＴＯＦ，Ｓｃｉｅｘ）で分析された各消化された個々のＣＨＩＰ試料から得られたＤＩＡ  ＭＳデータをペプチドライブラリと比較すること、を伴う２工程プロセスである。ＤＩＡの利点は、（ｉ）各試料に必要な分析工程数が両方とも少ないために、わずかなプロテオームカバレッジを最大化しながら、試料量を最小化し、精度を高め、実験のばらつきを減らす（ＣＶ率を約２０％まで低減）ことと、（ｉｉ）質量分析試料処理の自動化である。標的タンパク質の量が少ないために必要な場合、本発明者らは溶出液を濃縮するか、または複数のＭＰＳデバイスから回収した試料を組み合わせることができる。本発明者らはまた、特定の標的化ペプチドの検出及び定量化のみを可能にする高感度質量分析法である、多重反応モニタリングを使用する。
【００５８】
実施例５
１０のｉＰＳＣ系統全体で再現可能なバイオマーカーを検証
前述の研究は、ＭＰＳデバイスにおける表現型のリードアウトを確立する。単一の対照ｉＰＳＣ系統は、プロトコルを介して少なくとも３回実行される。目的は、このシステムを使用して疾患特異的な変化を検出する前に、様々な患者間にどのようなばらつきが存在するかを確立することである。その後、１０の個別の対照系統により、患者間の違いを比較できる（表３）。後の実験において生物学的変動の可能性のあるソースを減らし、本発明者らは、単一の対照系統由来の支持組織（ＢＭＥＣ、アストロサイト、ミクログリア）の標準セットを利用する。４週間後、本発明者らはニューロン集団と形態分析を行う。チップ内の合計ｓｐＭＮまたはＤＡＮの最小しきい値に到達した対照系統が含まれ、その後、表現型マーカーの完全なセットが適用される。ヒト系統間のバイオマーカー発現にどの程度のばらつきがあるかについてデータが分析される。ＡＮＯＶＡ試験を使用して系統間で有意差を示さない表現型アッセイの結果（Ｐ＜０．０５）がさらに評価される。
【００５９】
実施例６
さらなる調整
本発明者らは、細胞産物を組み合わせたＭＰＳデバイスにより、ニューロン活動が強化され、ニューロンがより成熟することを期待している。さらなる調整には、各細胞型の比率、接続時間、またはＭＰＳデバイス内で細胞が一緒に生存できる条件を確立する他のパラメータのいずれかを調整することが含まれる。この最適なプロトコルを１つの対照系統で３回繰り返すが、全範囲のバイオマーカーの読み取りを取り込むことで、技術の信頼性を判断できる。現在、ＭＰＳチップとそれらを収容する培養装置は、許容レベルが極めて低く、デバイスから一貫した性能を提供する高品質の制御で、生物学的ソースに起因すると思われるばらつきを伴い、製造されている。
【００６０】
潜在的なバイオマーカーの条件と安定したセットを決定した後、ＡＬＳ及びｓＰＤ系統のより詳細な分析が行われる。ＳＭＡ  ｉＰＳＣ系統は、本発明者らが、ＳＭＮタンパク質の欠如、及び細胞死の表現型などの特定のバイオマーカーが陽性対照として機能することを知っているため、陽性対照として使用される。
【００６１】
実施例７
疾患のバイオマーカーを特定するための検証済みのｓｐＭＮ及びＤＡＮ  ＭＰＳモデルにおける４つのｓＡＬＳ、４つのｓＰＤ、４つの対照、及び４つのＳＭＡ系統の比較
本発明者らによる以前の研究は、ｉＰＳＣに由来する２次元ｓｐＭＮ培養において、本発明者らがＲＮＡｓｅｑ分析及びプロテオミクスに基づいて、対照、ＳＭＡ、及びＡＬＳの遺伝的形態を分離できることを示した（図６）。興味深いことに、本発明者らは、ＴＧＦ−βが、ＲＮＡｓｅｑ及びプロテオミクスデータの両方に基づいてＡＬＳ試料において増加する信頼できるバイオマーカーであることを発見した。本明細書では、チップの改善された生理学的環境、ならびに電気生理機能及びメタボロミクスの包含により、疾患関連バイオマーカーの数がさらに増える。
【００６２】
実験計画の概要を表４に示し、様々なアッセイの説明を表２にまとめている。これらのアッセイに加えて、本発明者らは、カスパーゼ−３染色及びＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ染料を使用した酸化ストレス及びミトコンドリアストレスの追加の測定を含む。これらは両方ともＰＤ及びＡＬＳに関係しており、本発明者らはすでに本発明者らのメタボロミクスアッセイにおいて予備的な表現型を確認した（図７）。さらに、本発明者らは、ＡＬＳ及びＰＤの臨床的特徴を表し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された疾患特異的プロテイノパチーを調査する。具体的には、本発明者らは、共焦点及びライトシート顕微鏡によって、凝集したＴＤＰ−４３及びシヌクレインタンパク質の発現及び局在化を分析する。全てのチップは、４週間の生存時間でバイオマーカーの発現について評価する。本発明者らは、対照／ｓＡＬＳと対照／ｓＰＤ間のバイオマーカー発現の違いをランク付けし、増加または減少したもののリスト、それに加えて疾患系統に特異的な（そしてＳＡ１ｂのどの対照でも観察されなかった）新しいバイオマーカーを生成する。
【００６３】
実施例８
２０のｓＡＬＳ、ｓＰＤ、及び対照系統を試験して、複数の孤発性系統全体にまたがるシグネチャーの存在を確認
４つの系統の初期の特性決定により、疾患特異的な表現型のアイデアがもたらされるが、本発明者らの対象疾患としてのｓＡＬＳ及びｓＰＤのより大きな群全体にわたる信頼性を理解することはが関心対照である。これらの系統は、本発明者らが現在作製しているＬｏｔｈｉａｎ対照コホート（２５系統）及びＡｎｓｗｅｒ  ＡＬＳを介して利用可能であり、ＡＬＳコホート系統（現在１，０００のｉＰＳＣ系統を作製中）を生成する。本発明者らは、観察される表現型の重症度の可能性を高めるために急速に進行する患者に焦点を当てる。同様に、本発明者らは早期発症患者に焦点を当てた２０のｓＰＤ  ｉＰＳＣ系統も作製する。本発明者らは、少なくとも３つの主要なバイオマーカーに直接焦点を当てて、複数の疾患系統にわたるシグネチャーを比較する。
【００６４】
実施例９
代謝バイオマーカー
本発明者らは、カスパーゼ３の増加、ＴＤＰ４３の誤局在化／凝集、またはＤＡニューロン線維の長さの減少などの家族性疾患モデルの文献において予測されるｓＡＬＳ及びｓＰＤに特異的ないくつかのバイオマーカーを見る可能性がある。最も重要なのは、バイオマーカーが患者及び系統全体で信頼できることであり、孤発性疾患患者の系統と関連していることがわかっている。Ｌｏｔｈｉａｎ対照コホートを使用すると、これにより、この群（すなわち、ＡＬＳまたはＰＤを発症したであろう対照患者）のバイオマーカー信号が交絡することがなくなる。本発明者らは、最も重要なバイオマーカーは、後述するスクリーニングのためのスケールアップに役立つ性質のメタボロミクスであると考えている。
【００６５】
実施例１０
対照支持細胞の役割、環境ストレス
本発明者らは、支持細胞型を標準化して潜在的ばらつきを制限し、生理学的環境を反映するシステムを提供することを選択したため、本発明者らは、対照支持細胞を使用して疾患の表現型が保護されることを発見し得る。表現型が見られない場合、本発明者らは、ＡＬＳまたはＰＤ患者系統に由来する支持細胞（ＢＭＥＣ、アストロサイト、ミクログリア）を使用して実験を繰り返し、潜在的な疾患の表現型を再評価する。
【００６６】
このような結果は、ＡＬＳ及びＰＤの病変において、支持細胞が罹患細胞に及ぼす非自律的影響の概念を支持するであろう。非常にまれだが、異なる分析モダリティのいずれにおいても、ＡＬＳ及び／またはＰＤ系統と対照系統の間に有意差がない場合、本発明者らはシステムに環境ストレッサーを導入する。ＡＬＳ系統の場合、これには運動ニューロンに選択的効果があることが示されているアルシナイトまたはホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）阻害剤による興奮毒性が含まれ、ＰＤ系統の場合はパラコートになる。この追加の複雑さは、完全にｉＰＳＣによって駆動されるＭＰＳモデルのユニークな利点を示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで複雑な疾患の相互作用を分析する。
【００６７】
実施例１１
運動ニューロンまたはドーパミンニューロンにおける機能的表現型の検出
カルシウム蛍光色素の使用は、本発明者らのＭＰＳモデルにおいてニューロン機能を決定するための貴重なツールであることが証明されている。全体的な一時的な活性のリードアウト（図３）に加えて、混合ニューラルチャネル内のニューロンの相互接続性の増加は、経時的に成熟する動的な集団レベルの活性シグネチャーを有するニューラルネットワークを形成する（図８）。カルシウム染料の投与はエンドポイントで行われるアッセイであるため、培養における経時的な神経生理機能の変化は、実験ごとにさらに多くのチップを必要とする。ネットワーク形成と薬物治療への反応における疾患関連のダイナミクスは、病因への新たな洞察をもたらし得る。
【００６８】
経時的に同じチップのアッセイを可能にするために、神経培養物は疾患研究に関連する細胞型特異的プロモーターを含む構築物に感染させることができ、それにより目的の細胞型に特異的なライブリードアウトを作成する（図９）。本発明者らは以前に、Ｉｓｌ１陽性細胞におけるＧＦＰの高発現を可能にする、強化された運動ニューロン（ＭＮ）特異的Ｉｓｌｅｔ  １プロモーターによって駆動される新規ＧＦＰレポーターを含むレンチウイルス構築物を開発した。本発明者らは、この新規プロモーターを利用して、経時的にｓｐＭＮの機能的リードアウトのためにＧＣＡＭＰ６を駆動し、それをバイオマーカーリードアウトに組み込むことを意図している。このシステムの成功により、本発明者らは、他のグループによってドーパミン作動性細胞マーカーとして成功していることが示されている、ＤＡＮ特異的チロシンヒドロキシラーゼプロモーター駆動のＧＣＡＭＰ６システムも開発する。
【００６９】
本発明者らはまた、パッチ電気生理機能によって、個々の細胞レベルで電気生理学的表現型を評価することができる（図９）。これにより、ＭＰＳにおいて成熟したニューロンの高解像度分析が可能になった。これは、ＭＰＳデバイスに組み込まれた電極を使用してさらに拡張できる。本発明者らは、３年目までのこれらの特殊なＭＥＡ  ＭＰＳ開発を予期しており、カルシウムイメージングの代わりにそれらを使用する可能性がある。
【００７０】
実施例１２
ＮＣＡＴＳライブラリを使用したＭＰＳベースの薬物スクリーニング
記載されているように、バイオマーカーは、ライブ電気生理機能（ニューロンの発火パターンの変化、すなわち図９）、細胞死アッセイ、溶出液での神経伝達物質及びメタボロミクススクリーニング、トランスクリプトーム及びプロテオミクス分析から見つかった非常に不一致な個々の遺伝子のｑ−ＰＣＲの組み合わせで検出される。バイオマーカーには、全ての試料でバイオマーカーパネルを簡単に実行できるメタボロームで見つかったものが含まれる。
【００７１】
または、非常にロバストな電気生理学的表現型の同定は、デバイス電極を組み込んだ新しいライブＭＥＡ  ＭＰＳシステムによって、または説明されている細胞特異的レポーターの１つを適応させることによって研究できる。
【００７２】
これらのアプローチは、高スループットの創薬スケールでのヒトｉＰＳＣ由来のＭＰＳシステムの使用を可能にする。一例として、本発明者らは、２８１６化合物のＮＣＡＴＳ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎをスクリーニングするために一次フィルターとして血液脳関門特性（ＢＢＢ）透過性を組み込むことにより、試験デザインにおけるＭＰＳ培養の主な利点を活用した（図１０）。次に、本発明者らは、神経チャネル溶出液の完全なメタボロームリードアウトを含む、特定された疾患表現型を利用する。最後に、本発明者らは、ＢＢＢ透過性プロパティ、電気生理機能及び代謝産物応答のライブアッセイ、及び上記の細胞のアッセイ終了時のリードアウトを含む、ＭＰＳでのみ達成可能な高解像度アッセイを通じてこれらの候補を検証することを目指している。
【００７３】
実施例１３
臨床的に価値のあるバイオマーカーのアノテーションリスト
本発明者らの最も検証されたマーカーは、既存の文献の広範なマイニングに基づいて、血液、脳脊髄液（ＣＳＦ）、及び脳／脊髄組織の患者（孤発性及び遺伝的形態のＡＬＳ及びＰＤの両方）試料の既知のレベル／活性と比較される。これらの検索から、本発明者らは３つの可能性のある結果を予期している：（ｉ）バイオマーカーは、ＡＬＳまたはＰＤにおいて変化することがすでに知られているが、これは、チップ内の生きているニューロンが患者の既知の疾患病変を再現していることを示す。（ｉｉ）バイオマーカーは、アッセイされたが、ＡＬＳまたはＰＤに関連することは示していない。これは、疾患の病因の初期にのみ見られ（本発明者らの細胞モデルが「若い」ｉＰＳＣを使用しているため）、患者の臨床症状または後期段階で見落とされたかもしれないことを示している可能性がある。（ｉｉｉ）ＭＰＳモデルから決定されたバイオマーカーに関する既知のデータはない：この可能性は、患者において試験できる真に新しい疾患特有の特性である可能性がある。この場合、本発明者らは、ｓＡＬＳ及びｓＰＤ患者の生体液中の選択されたバイオマーカーのアッセイを開発しようと試みるであろう。本発明者らの臨床共同ＰＩのＤｒｓ．Ｂａｌｏｈ及びＴａｇｌｉａｔｉは、ＭＰＳの新規バイオマーカー検証を中心とした臨床研究を実施するのに適した立場にある。本発明者らは、最も翻訳可能なバイオマーカーが末梢血及びＣＳＦにあることを予期している。３つの可能性全てに明確な臨床的意義があるため、バイオマーカーは、有望なトランスレーショナルデータと、チップ上及び患者の生体液の両方での大規模なバイオマーカー検出の実現可能性の両方に基づいてランク付けされる。次に、本発明者らは、この短いリストを使用して、以下に説明する実験におけるこれらの新しいバイオマーカーを使用する新しい創薬プラットフォームを設計する。
【００７４】
実施例１４
ＢＢＢを通過してＭＰＳの神経側に入る小分子
本発明者らは、最初の混合物中の活性分子のバリア特性または機能性疾患の表現型効果を交絡することがないように、最初にＢＭＥＣ、ＭＮ、及びＤＡＮ毒性の全ての薬物候補を試験する。リソースを節約するために、本発明者らは、標準的な３８４ウェル形式の薬物スクリーニングプラットフォームで対照ＭＮ及びＤＡＮ培養物を試験する。非細胞毒性化合物は、ＭＰＳでのその後の組み合わせスクリーニングのために識別される。経験に基づいて、本発明者らは２〜５％の細胞毒性の割合を予期している。次に、本発明者らは、候補分子が血液チャネルを通過し、ＢＭＥＣ層を通って神経コンパートメントに入る能力によって候補ライブラリをフィルタリングしようとする。未発表の大規模な研究では、本発明者らは、このシステムがバリアを通過する及び通過しない既知の薬物に関してＢＢＢを模倣することを示した（図１１）。さらに、ＭＰＳチップを収納する独自の培養デバイスには、薬物を血液側にロードし、脳側から薬物を収集するために使用できる入力リザーバがある。本発明者らは、これらの化合物がそれらのＢＢＢ透過性のために臨床に迅速に翻訳される可能性が最も高いと期待している。本発明者らは、最初に一連の１００の化合物混合物を下部チャネルに流し、質量分析によって神経コンパートメントからの溶出液上の同じ分子を調べることにより、この透過性を決定する。これは、２，８１６の薬物全ての透過性が試験されるまで２９回繰り返される。ｉｎ  ｖｉｖｏで観察された不十分なＢＢＢ浸透に基づいて、本発明者らはＮＣＡＴのコレクションのサブセット（約２０％）のみが、陰性対照として含まれているデキストランよりも高い閾値内で検出されることを予期する。これらのろ過された化合物は、本発明者らの一次スクリーニングで使用される。
【００７５】
実施例１５
一次スクリーニングを実施して、新規バイオマーカー調節化合物を特定する
次に、陽性の候補混合物が個々の化合物に分離され、新しいチップセットで再実行されて、この助成金の最終年に特性決定される個々の候補を決定する。最終候補は、バイオマーカーの全範囲を使用して検証され、メタボロミクスの変化に加えて、表現型の変化が各薬剤によってどれだけうまく逆転するかを決定する。本発明者らは、用量反応実験を実施して、改変された表現型に基づいて最適濃度も決定する。本発明者らはまた、新しい治療標的経路を解明し得る特定の疾患の表現型を悪化させる薬物を発見し得る。これらの薬物はＦＤＡ承認済みであるため、ｓＡＬＳ及びｓＰＤの臨床試験に迅速に移行できる独自の新薬セットが生まれる。
【００７６】
実施例１６
共培養ｉＢＭＥＣ及びヒト神経細胞は、細胞相互作用及びＢＢＢ機能を示す。
アストロサイト及びｉＢＭＥＣはそれぞれのチャネルにとどまることができるが、アストロサイトプロセスは細孔から突出して、ｉＢＭＥＣと直接細胞間接触を形成し、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて観察されるアストロサイトエンドフィートを模倣する。さらに、ヒト周皮細胞及びアストロサイトとの共培養は、臓器チップ上で単独で培養されたｉＢＭＥＣと比較して、蛍光デキストラン−ＦＩＴＣ（３ｋＤａ）の血液から脳への漏出を有意に減少させ、層流に加えて、初代ヒトアストロサイト及び周皮細胞が、臓器チップ上で機能的なＢＢＢの成熟をさらに促進することができることを示す。まとめると、これらの結果は、ＢＢＢを形成するＮＶＵのインターフェースに似た臓器レベルの構造を示している。血液コンパートメントを１０または１００ｎｇ／ｍｌのＴＮＦαで一晩灌流すると、対照条件と比較して、アストロサイトの形態が変化し、血管表面を覆うエンドフィートのような構造が減少した。興味深いことに、血管のエンドフィートカバレッジの減少に続いて、デキストランの血液から脳への漏出が増加し、これは血管刺激がバリア機能に大きな影響を及ぼし、脳と血液コンパートメントの間の機能的連結が再現されたことを示している。
【００７７】
実施例１７
アストロサイトのエンドフィートカバレッジ分析
アストロサイトの突出部（エンドフィートのような構造）で覆われた血管表面の割合を定量化するために、その血管表面をＤＭＥＭ（ＦＢＳなし）で洗浄し、血管グリコカリックスに結合できるレプチンである蛍光標識コムギ胚芽凝集素（ＷＧＡ−６４７  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色する（ＤＯＩ：１０．１００２／ｊｅｍｔ．２２６０２）。室温で１５分後、チップを新鮮なＤＭＥＭで２回すすぎ、２％  ＰＦＡを室温で２０分間行い、アストロサイトマーカーＧＦＡＰ（Ａｂｃａｍ）で染色した。抗マウス二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８）及びＨＯＥＣＨＳ（Ａｂｃａｍ）とのインキュベーション後、ＰＢＳで洗浄し、共焦点顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ８５０）で画像化した。
【００７８】
多孔性膜の下の領域は、ＷＧＡ−６４７シグナル（内皮表面全体を染色した）及び内皮細胞の核蛍光シグナル（ＨＯＥＣＨＳＴ）を使用して局所化した。次に、各チップの５つのランダムな領域を、１０Ｘ対物レンズ（Ｚｅｉｓｓ）を使用したＧＦＡＰ蛍光（４８８）信号を使用して画像化した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して、バックグラウンドを差し引き、次いでＧＦＡＰチャネルで検出されたデジタル信号をバイナリイメージに変換した。最後に、シグナルカバレッジの割合を、画像内のピクセルの総数に対する明るいピクセルの比率としてバイナリイメージから計算した。画像処理及び定量化は、バイアスのないシグナル測定を保証するために、ＩｍａｇｅＪでコンパイルされた自動マクロを使用して実行した。数値が収集され、Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｖ７を使用して統計的に分析した。
【００７９】
実施例１８
調査結果
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）及びパーキンソン病（ＰＤ）の根底にある生理学的、分子的、及び細胞的変化は複雑である。本発明者らは、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉの人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）コアを活用して、ＡＬＳ及びＰＤ系統の大規模なコホートを生成した。ＡＬＳ（ＡＬＳチップ）及びパーキンソン病（ＰＤチップ）を研究するために、疾患関連組織の共培養物を組み合わせた高度に生理学的なモデルを開発した。さらに、この微小生理学的プラットフォームには、脳特異的な血管チャネルが含まれており、ヒトの疾患システムにおける血液脳関門（ＢＢＢ）の特性の研究を可能にする。疾患特異的な病態生理学を理解するために、包括的なゲノム、メタボロミクス、及び電気生理学的アッセイが開発されており、両方のシステムにおいて新たなバイオマーカーを生成するために使用される。このプロジェクトの主な結果は、孤発性ＡＬＳ及びＰＤの両方の再現性のある疾患特異的表現型の確立であり、脳側または血液側のいずれかで新規表現型低下薬をスクリーニングするためのバイオマーカーとして使用され、血液脳関門を通過する化合物の能力をシミュレートした。本発明の２年目に、本発明者らは早期発症孤発性（ＥＯＳ）ＰＤ及びＡＬＳ患者系統のコホートを確立し、中脳及び脊髄チップモデルを使用してロバストなバイオマーカーを決定するための継続的な研究を行っている。本発明者らの最初の完全なＰＤトライアルでは、本発明者らは、５つのＥＯＳＰＤ系統を利用し、それらを本発明者らの「スーパー対照」Ｌｏｔｈｉａｎコホートの５つの対照と比較した。本発明者らは、生細胞イメージング及びメタボロミクスシグネチャーの両方において、ＰＤ患者系統における初期の疾患特異的シグネチャーを決定した。ＰＤチップパラダイムは、ヒトドーパミン作動性ニューロンに対するオピエートの効果を研究するためのプラットフォームとして使用するようにも適合されており、モルヒネ及び他のオピエートアゴニストへの応答に関する予備研究の結果も提示される。
【００８０】
実施例１９
ＢＢＢチップ間の個人間のばらつきは、罹患患者のＢＢＢ変化を検出できる
個別化医療に関連するシステムとしてｉＰＳＣベースのＢＢＢチップを検証するには、臓器特異的疾患のモデリングを実証することが重要である。本発明者らは最近、ハンチントン病（ＨＤ）のｉＰＳＣベースのモデルを報告し、そこではＨＤ−ｉＢＭＥＣが改変されたバリア機能を示した。候補分子の患者特異的脳透過性の予測因子としてパーソナライズされたＢＢＢチップを使用する可能性を評価するために、本発明者らは、３人の健康なドナー（ＣＳ６１７ｉＣＴＲ、ＣＳ１７２ｉＣＴＲ、及びＣＳ１８８ｉＣＴＲ）及びＨＵＮＴＩＮＧＴＩＮ遺伝子（ＣＳ８１ｉＨＤ）内に７１個のＣＡＧリピートを有するＨＤ患者に由来するｉＰＳＣベースのＢＢＢチップ全体の様々な分子量の蛍光標識デキストランの透過性を調べた。特に、健康な個人間で有意なばらつきは観察されなかったが、ＨＤ−ＢＢＢチップではデキストラン−ＦＩＴＣ分子の透過性が有意に増加した（図４５Ｆ）。さらに、健康な対照由来のＢＢＢチップを横切るデキストラン分子の透過性は、以前に報告されたｉｎ  ｖｉｖｏでのげっ歯類の脳への取り込みと相関し（Ｙｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）（Ｒ２＝０．９６）、ｉＰＳＣベースのＢＢＢチップが、サイズに基づいて分子を選択的に分離できるバリアを形成し、維持することを示す（図４５Ｇ）。本発明者らはまた、最近、精神運動遅滞の重篤な形態であるモノカルボン酸トランスポーター８（ＭＣＴ８）欠損症のｉＰＳＣベースのモデルを報告し、ｉＢＭＥＣを横断する甲状腺ホルモン（トリヨードサイロニン、Ｔ３）の輸送には機能的なＭＣＴ８が必要であることを示した。臓器特異的疾患モデリングをさらに評価するために、本発明者らは、ＭＣＴ８欠損症用のｉＰＳＣベースのＢＢＢチップを生成し、これは上記の健康な対照系統及び以下の公開されたｉＰＳＣ系統を使用した：（ｉ）対照系統ＣＳ０３ｉＣＴＲ；（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介したＭＣＴ８変異ＣＳ０３ｉＣＴＲｍｕｔ；（ｉｉｉ）患者系統ＣＳ０１ｉＭＣＴ８；（ｉｖ）ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した相同組換えＣＳ０１ｉＭＣＴ８ｃｏｒを使用して変異が修正されたＭＣＴ８変異系統。液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）は、Ｔ３輸送が健康な対照ＢＢＢチップ全体で安定している一方で、ＭＣＴ８欠損ＢＢＢチップは有意に低い透過性を示し（図４５Ｈ）、ＢＢＢを横断するＴ３の血液から脳への輸送へのＭＣＴ８の必要性を確認した。概して、これらの結果は、患者特異的なｉＰＳＣベースのＢＢＢチップを使用して、ＢＢＢ機能の患者間のばらつきを予期できることを示唆し得る。
【００８１】
次に、本発明者らは、ｉＰＳＣベースのＢＢＢチップを使用して、蛍光グルコース類似体２ＮＤＢＧ、市販薬のコルヒチン（痛風治療、中程度の透過性）、及び抗てんかん薬のレベチラセタム及びレチガビン（ＢＢＢに効率的に浸透することができる）を含む、追加の分子の相対透過性を予測できるかどうかを試験する。これらの分子は同時に「血液側」にスパイクされ、「脳側」でのそれらの濃度は、蛍光またはＬＣ−ＭＳ／ＭＳを使用して評価した（図４５Ｉ及び図４７Ａ）。ｉＰＳＣベースのＢＢＢチップ全体でのこれらの分子の拡散は、透過性の予想される違いを示し、このモデルがヒトＣＮＳ薬物の浸透性を予測できることを示唆している。
【００８２】
実施例２０
ＢＢＢチップを介して灌流されるヒト全血は「血液側」に限定され、これは血液に起因する毒性から保護し、疾患モデリングを強化する
ほとんどの培養システムでは、神経細胞は栄養及び成長因子を含む培地で維持されており、血管の血流は考慮されていない。しかしながら、神経細胞をろ過されていない血液に曝すと、脳出血で観察されるように、細胞毒性を引き起こす可能性がある。したがって、神経細胞に支持栄養素及び成長因子を安全に提供するために、血液をろ過する機能的なＢＢＢが必要である。抗凝固剤のクエン酸ナトリウムで処理されたヒト全血は、「血液側」を介して生理学的に適切なせん断速度（３，６００μｌ／ｈｒ，５ｄｙｎ／ｃｍ２に相当）で灌流し、ｉＰＳＣ由来の神経細胞を含む脳コンパートメントは神経媒体で灌流した（図４６Ａ）。血液灌流中のデキストラン−ＦＩＴＣ（３ｋＤａ）透過性の測定は、ｉＢＭＥＣが血液を「血液側」に閉じ込める機能的障壁を維持できることを示した（図４６Ｂ，Ｃ）。対照的に、ｉＢＭＥＣを含まない、またはＴＮＦαで処理されたｉＢＭＥＣを含むＢＢＢチップには機能的な障壁がなかったため、血液が「脳側」に漏れた（図４６Ｂ，Ｃ）。免疫細胞化学分析及び乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）生存率アッセイは、ｉＰＳＣベースのＢＢＢチップを含む神経細胞が血液に起因する毒性を示さなかったが、ｉＢＭＥＣを含まない、またはＴＮＦ−αで処理された神経培養物は有意な毒性を示した（図４６Ｄ，Ｅ）。これらの結果は、ｉＰＳＣベースのＢＢＢチップのｉＢＭＥＣが「脳側」の神経細胞を血液に起因する細胞毒性から保護し、それによりＢＢＢの重要なｉｎ  ｖｉｖｏ機能の１つを再現することを示している。ヒト全血をｉＰＳＣベースのＢＢＢチップに組み込むと、このプラットフォームに別の重要なｉｎ  ｖｉｖｏＢＢＢインターフェースが導入される。
【００８３】
血液中では、Ｔ３の９０％以上が担体として機能するタンパク質に結合しており、結合しておらず活性を維持しているのはごく一部である。したがって、これらの生理学的条件下でＭＣＴ８欠損モデルを試験するために、Ｔ３をスパイクしたヒト全血を「血液側」から灌流し、Ｔ３を含まない神経培地を「脳側」から灌流した（図４６Ｆ）。ＭＣＴ８欠損ｉＰＳＣベースのＢＢＢチップ全体のＴ３透過性は、健康な対照系統のｉＰＳＣベースのＢＢＢチップと比較して有意に低かった（図４６Ｇ）。これらの結果は、ＢＢＢを通過する血液輸送Ｔ３輸送体がＭＣＴ８依存性であることを示している。特に、健康な対照ｉＰＳＣベースのＢＢＢチップ全体でのＴ３の全体的な透過性は、培地と比較して全血灌流液で約５分の１であり（図４５Ｈ）、全血の状況で輸送を測定することは、生理学的ＢＢＢのいくつかの側面を再現したことを示唆している。これらの実験は、全血をＢＢＢチッププラットフォームと組み合わせて使用して、遺伝子ベ−スの神経疾患におけるＢＢＢの役割をさらに確立できることを示している。
【００８４】
実施例２１
チップ上のアルツハイマー病
チップ上のアルツハイマー病前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）は、６５歳未満の認知症患者に特によく見られる臨床症候群である。これは、アルツハイマー病及びレビー小体型認知症に次いで、全ての年齢層で３番目に一般的である。患者は、行動、実行機能、及び言語において進行性の欠陥を示し、ＦＴＤは顕著な行動要素のために様々な精神障害を模倣することができる。ＦＴＤの病変は、前頭側頭葉変性症（ＦＴＬＤ）と呼ばれ、前頭葉、前側頭葉、前帯状皮質、及び島皮質のニューロン喪失、神経膠症、及び微小空胞の変化を特徴とする。これらの領域は、皮質のレイヤー５に特殊なニューロン（フォン・エコノモ及びフォークニューロン）を持っており、皮質と皮質下のネットワークの統合に役割を果たし、行動障害型前頭側頭型認知症の非常に早い段階で退化すると仮定されている。ＲＮＡ結合タンパク質ＴＤＰ−４３の凝集体は、ＦＴＬＤ（ＦＴＬＤ−ＴＤＰと呼ばれる）の約５０％に見られ、残りの症例は凝集したＭＡＰＴ（ＦＴＬＤ−ｔａｕ）またはＦＵＳ（ＦＴＬＤ−ＦＵＳ）のいずれかである。認知症の家族歴は対象の最大４０％で報告されており、強力な遺伝的要素を裏付けている。ＦＴＬＤ−ＴＤＰの根底にある一般的な遺伝子変異には、Ｃ９ｏｒｆ７２のヘキサヌクレオチドリピート伸長、ＧＲＮ及びＴＢＫ１遺伝子の機能喪失変異、ＴＡＲＤＢＰ（ＴＤＰ−４３自体をコードする）、ＶＣＰ、及びＣＨＭＰ２Ｂのミスセンス変異が含まれる。ＦＴＤの最も一般的な病理学的及び遺伝的変異であることに加えて、関連する神経変性症候群筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）との有意な重複を示し、共通の遺伝的要因及び病変を有する。さらに、ＦＴＬＤ−ＴＤＰの非細胞自律性及びさらに非ＣＮＳ自律性の病因についての強力な証拠があり、本明細書で提案する多細胞３Ｄ前脳オンチップモデリングに理想的に適している。
【００８５】
目的は、Ｃ９ｏｒｆ７２及びＧＲＮ変異からのＦＴＬＤ−ＴＤＰの最も一般的な遺伝的形態のモデリングである。これらの遺伝子はそれぞれ、ミクログリアを含む骨髄細胞において高度に発現している。興味深いことに、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ及び全身性炎症の間には関連性があり、この疾患の患者は自己免疫疾患の発生率が高くなっている。したがって、ＦＴＤ関連の突然変異は、脳及び末梢免疫系の骨髄細胞機能に重大な影響を与える可能性があると仮定されている。ただし、これまでのｉＰＳＣモデリングは、神経細胞の自律的な表現型に完全に焦点を合わせてきた。ＢＢＢを作製するための皮質細胞及び内皮細胞を用いた独自の臓器オンチップモデリングにより、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者の血清が、このヒト前脳モデルのニューロン表現型にどのように影響するかを革新的に調べることができる。さらに、ＦＴＬＤ−ＴＤＰの一般的な遺伝子型のいくつかには、転写物を含むＣ９ｏｒｆ７２リピート伸長をノックダウンするアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）、ＧＲＮの発現を増強する遺伝子治療及び／または薬剤を含む、臨床使用が検討されている治療戦略がある。ただし、ＦＴＬＤ−ＴＤＰに利用できるバイオマーカーがなく、臨床進行を測定することは困難であるため、臨床試験に入る前に治療的介入を検証するためのツールの開発が依然として重要なニーズである。したがって、ＦＴＬＤ−ＴＤＰの３Ｄモデルシステムにおいて特定されたバイオマーカーを検証するためのツールとして、ＡＳＯ及び遺伝子治療などの概念実証治療介入が使用される。最後に、本発明者らの臨床測定値、生体試料、及び剖検材料へのアクセスは、前脳生体模倣システム（ｆＭＰＳ）における本発明者らの発見をヒトの臨床測定値と相互検証する独自の機会を提供する。
【００８６】
成功した場合、本発明者らは、診断及び介入の発展を前進させる形式で、プログラニュリン及びＴＤＰ−４３プロテイノパチーに関連する病態生理機能へのさらなる洞察を推進するための重要な影響を与えるという独自の立場になる。ｉＰＳＣ由来のニューロンは、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、ハンチントン病、Ｃ９ｏｒｆ７２関連ＡＬＳ、及びＭＣＴ８欠損症について本発明者らが以前に示したように、特定の神経疾患のモデル化に非常に成功している。本発明者らは最近、ｉＰＳＣ由来の脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の組み込みが、３Ｄ臓器オンチップモデルにおけるニューロンの成熟を促進することを報告し、本発明者らは、２Ｄ培養におけるｉＰＳＣからの皮質ニューロン及びミクログリアの分化に関する広範な予備データを有するが、これは、本発明者らが現在のＮＣＡＴＳチップコンソーシアムの一部であるため、現在進行中の作業である。本発明者らにはまた、以下に示す予備データと、ＭＰＳチップ上の非特異的ニューロンと共培養したときにＢＢＢを形成する本発明者らのＢＭＥＣプロトコルの機能的能力を検証するレビュー中の出版物がある。最後に、ＵＣＳＦ記憶・加齢センター（ＵＣＳＦ  Ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）を通じて、本発明者らは、相関する剖検材料、生体液、及び臨床測定値を有する、世界有数の最もよく特性決定されたＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者のコレクションを持っている。
【００８７】
本態様では、特許請求された本発明は、（ｉ）Ｅｍｕｌａｔｅ  Ｉｎｃの高度にスケーラブルで市販のＭＰＳデバイスにおける皮質ニューロン、アストロサイト、ミクログリア、及び脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）の組み合わせによる前脳組織の完全にヒトの患者特異的モデル、（ｉｉ）試薬を細胞上またはＢＢＢに流し、カートリッジシステムを介してリアルタイムの生物学的スクリーニングで情報を収集するＭＰＳ機能を活用するための、電気生理学、メタボロミクス（神経伝達物質レベルを含む）、及び単一細胞トランスクリプトミクスを適用するバイオマーカー発見への包括的で偏りのないアプローチ、（ｉｉｉ）ＦＴＬＤ−ＴＤＰの最も一般的なバリアントから遺伝子操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるペアの同質遺伝子対照を有するｉＰＳＣ系統の開発、（ｉｖ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの神経及びグリア機能に関する末梢血清因子の検査が可能になる、活性な血液脳関門（ＢＢＢ）と、ミクログリア細胞を含む前脳組織との組み合わせ、を含む。最後に、（ｖ）本発明者らには、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ  ｆＭＰＳの所見を、包括的な臨床、画像、バイオマーカーのデータ、ならびに同じ個人の検死の病変及び皮質の単一核ＲＮＡ−ｓｅｑで相互検証する前例のない機会がある。このアプローチは、「患者オンチップ」精密医療につながり、ＡＤＲＤの現在の治療方法を覆す可能性がある。
【００８８】
実施例２２
ｉＰＳＣ由来組織を備えたＥｍｕｌａｔｅプラットフォーム
ＥｍｕｌａｔｅのＭＰＳテクノロジーには、肺胞及び小気道、腸、肝臓、腎臓、血液脳関門（ＢＢＢ）及び他の臓器の主要なモデルが含まれている。本発明者らは、ロバストな脳オンチップモデルの確立に加えて、ｉＰＳＣ由来の脳微小血管内皮細胞及び非特異的混合ニューロン培養を使用したＢＢＢのモデリングにＭＰＳプラットフォームを適用することに成功した（図５０）。本発明者らは、患者の末梢血または線維芽細胞を使用し、リプログラミング因子の一過性の異所性発現を可能にする非統合技術を使用して直接リプログラミングされる。数回の継代にわたって、ｉＰＳＣコロニーはエピジェネティックなマークを取り除き、ドナー患者の遺伝子構成を保持する多能性細胞の安定した供給源であり続ける。これらのｉＰＳＣは、以下に概説するように、関心のある様々な組織タイプのその後の疾患モデリング研究のために拡張して極低温で保存することができる。
【００８９】
前脳特異的ニューロンの生成：ＮｅｕｒｏＬＩＮＣＳイニシアチブの一環として、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉは、ロボットイメージング、単一細胞ＲＮＡシークエンシング（ｓｃＲＮＡ）、プロテオミクス、ｍＲＮＡトランスクリプトーム、及びエピゲノム分析用に凍結保存及び分散される大規模な皮質ニューロン（ＣＮ）培養物の生成に、皮質前脳プロトコルを採用した。これらの研究は２Ｄ培養で行われているが、ＣＮはロバストであり、いくつかの重要な前脳マーカーを発現している（図４７及び４８）。分化によって生成された細胞型の不均一性を特定するために、５０日間の分化後に１つの対照及び１つのＣ９ｏｒｆ７２系統でｓｃＲＮＡを実行した（図４８）。バッチ正規化に続いて、ｔ分布型確率的近傍埋め込み（ｔＳＮＥ）分析は、バイアスのないクラスタリングを示し、これは、対照及びＣ９ｏｒｆ７２  ＣＮの両方がそれぞれ様々な細胞型を生成することを示している（図４８）。フォン・エコノモ紡錘ニューロン（ＶＥＮ）は、ＦＴＤ（２７−２９）で特に脆弱であり、関連する深層皮質遺伝子（ＢＣＬ１１Ｂ、Ｆｅｚｆ２、ＬＭＯ４、ＮＭＢ、及びＳＬＣ１７Ａ７）の組み合わせを発現する。ＶＥＮ関連遺伝子の２〜３、４及び５の組み合わせを共発現する細胞が同定されている。本発明者らは、ＣＮ培養物中の細胞の約１５％が、少なくとも３つのＶＥＮ関連遺伝子を共発現し、疾患の偏りがないことを発見した。前脳マーカーはＣＮにおいて高度に発現しており、培養物はニューロン、神経前駆細胞、及びグリア細胞型の不均一な混合物である（図４９）。海馬及び視床下部の遺伝子の発現は低かった。さらに、この分化は、長期培養後に自発的にアストロサイトを生成する。本明細書では、本発明者らは、分化の６０日後にＣＮをＭＰＳに播種し、他の細胞型と共培養する前にさらに２週間成熟させて、９０日目に示すようなアストロサイトの発現を可能にすることを計画している（図４７）。
【００９０】
ＭＰＳでの共培養用の他の細胞型の生成：Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉは、脳微小血管内皮細胞（ＢＭＥＣ）及びミクログリアを含む、複数のｉＰＳＣ由来細胞系統を生成するためのロバストな分化技術も備えている（図４７）。関連する研究で、本発明者らはＢＭＥＣをｉＰＳＣ由来ニューロンと共培養し、神経細胞がＭＰＳで８週間以上生存し、適切なニューロン表現型を生成できることを発見した（図４７）。ＢＭＥＣの生存期間は２週間であるが、必要に応じてＢＭＥＣをチップに再播種することが可能であり、本発明者らはこのプロセスを引き続き最適化する。パーキンソン病及びＡＬＳのＭＰＳモデルの開発における本発明者らの進行中のＮＩＨ資金による作業において、本発明者らは、ＢＭＥＣのみ、またはアストロサイト及びミクログリアのいずれかを用いたニューロンの播種及び共培養法を確立した。重要なのは、ＣＮ、ＢＭＥＣ、アストロサイト、及びミクログリアのように、その後の実験のために極低温でバッチで保存できることである。ＱＣ検証後、凍結ロットのＢＭＥＣ及びミクログリアを解凍し、ＭＰＳに直接播種し、事前に播種したＣＮとの共培養で成熟させることができる。ＢＭＥＣ及びアストロサイトに加えて、ミクログリア（ＭＧ）は正常なニューロンの発達に必要であり、ＦＴＬＤにおいて神経炎症の役割を果たす可能性がある。機能的ＭＧを導出するためのプロトコルは、Ｃｅｄａｒｓ−ＳｉｎａｉのｉＰＳＣ系統の大規模コホート全体で確立されている（図４７）。ｆＭＰＳを最適に構築するために、本発明者らはＭＧを主要な要素として含め、潜在的な神経炎症経路を本発明者らのＦＴＬＤ−ＴＤＰの表現型評価に組み込むことを計画している。本発明者らは、本発明者らの最初の目的の間に、細胞型の理想的な組み合わせ及びタイミングを決定する。
【００９１】
患者の血清試料の適用：重要なことに、本発明者らが提案したｆＭＰＳモデルは、皮質細胞機能に関する末梢血清の評価を可能にし、本発明者らはこれが表現型及びバイオマーカーの発見を強化すると予測している。本発明者らは、混合ニューロン培養を使用してＢＢＢ  ＭＰＳモデルをすでに確立しており、その中で本発明者らは、ＢＭＥＣチャネルを通してヒト全血をうまく通過させた（図５０）。本発明者らが提案したＭＰＳ環境でのＣＮ及びＭＧとＢＭＥＣの共培養では、本発明者らは神経血管ユニットの完全なｉｎ  ｖｉｔｒｏヒト表現を有する。さらに、血清試料は、ｆＭＰＳの由来と同じＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者から収集されており、本発明者らはこれらの試料をシステムに流すことができる。初めて、これにより、血中の循環代謝及び免疫因子と、対照及び罹患した皮質ニューロンの機能との関係を調査することができる。
【００９２】
実施例２３
多細胞３Ｄヒト前脳ＭＰＳ及び患者ｉＰＳＣ系統の開発
興味深いのは、ＦＴＬＤ−ＴＤＰを研究するための多細胞前脳ＭＰＳモデル（ｆＭＰＳ）の開発である。これには、スコットランドのＬｏｔｈｉａｎコホートの対照ｉＰＳＣ系統が含まれ、ここでは、６０〜８０歳の患者が長年追跡され、神経学的に正常であることが示されている。これらの系統の１つは、ＣＮ、ＢＭＥＣ、ＭＧの産生、及びｆＭＰＳの確立のための標準的な対照として使用される。本発明者らは、アウトカム指標のパネルを使用して、通常の対照系統でシステムを検証し、次いで追加の４つの対照ｉＰＳＣ系統でロバスト性を調べる。並行して、本発明者らは、Ｃ９ｏｒｆ７２及びＧＲＮ患者のｉＰＳＣ系統と同質遺伝子対照のセットを開発し、その後、ＳＡ２及びこの提案のＵＨ３部分におけるＦＴＬＤ−ＴＤＰの疾患バイオマーカーを特定するために使用される。
【００９３】
上記の追求には、皮質ニューロン、グリア、及びＢＭＥＣからなる３Ｄ  ｆＭＰＳの開発が含まれ、その安定性を検証する。対照ｉＰＳＣ由来のＣＮは、単一の系統から生成され、２Ｄ培養で６０日間分化した後、チップのトップチャネルに播種される。このタイムラインは、分化の神経膠形成能（図４７）を利用して、ニューロン及びアストロサイトで構成される皮質集団をもたらす。１４日後、ＢＭＥＣが下部チャネルに追加され、チップのサブセットにおいてＭＧが神経チャンバーに追加される。両方のチャネルの流量は５〜７ｐｌ／時であり、本発明者らはこれが神経細胞及び内皮細胞の生存及び成熟に最適であると考えている。培養物はライブイメージングされ、ＬＤＨの溶出液及びデキストラン透過性がニューロンの播種後に毎週収集され、全生存、バリア機能、及び細胞型相互作用が確立される。ＭＰＳの設計を前提として、本発明者らは、デバイスの神経チャンバー及び血管チャンバーの両方の溶出液を収集して分析する。ＢＭＥＣ／ＭＧ、ｆＭＰＳとの共培養の２週間及び４週間で、モデルは固定され、細胞集団及び形態について評価される。皮質ニューロンの生理機能を評価するために、本発明者らは各時点でＣａ２＋イメージングを使用する。共培養パラダイムは、将来の研究の実現可能性を判断するための４つの重要なパラメータに応じてスコアリングされる：（ｉ）ニューロン機能のためのカルシウム一過性活性、（ｉｉ）共培養安定性を決定するための免疫染色、（ｉｉｉ）ニューロン及びグリアの確立を決定するための細胞形態、ならびに（ｉｖ）神経血管ユニットの評価のためのＢＢＢ機能及び細胞毒性。成功するスコアは、高カルシウム一過性活性、全ての細胞型の適切な分布、適切な画像分析を可能にする神経形態、及び神経コンパートメントの低ＬＤＨ及びデキストランレベルによって決定される。これらの実験は３回繰り返され、同じバッチを使用した実行間のばらつきを評価する。これらの研究から、本発明者らは共培養ｆＭＰＳモデルの最適なタイミング及び播種条件を選択する。本発明者らの第１の合格／不合格基準として、本発明者らは次のサブ目標に進む前に、安定した多細胞ｆＭＰＳモデルを達成する必要がある。エンドポイントで３つ全ての細胞型の存在を示すＩＣＣデータと相まって、一貫したバリア及び毒性の性能をもたらす、対照由来細胞の最適な播種密度及びタイミングの確立は、本発明者らのマイルストーン基準である。本発明者らのマイルストーン及び基準の完全な説明を表示するには、この研究戦略セクションの最後を参照のこと。
【００９４】
実施例２４
ｆＭＰＳの測定におけるバイオマーカー／アッセイのロバスト性の決定。
最高スコアの共培養パラダイムに基づいて、本発明者らは、Ｃｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉで確立された多領域の細胞生理学的リードアウトを利用する細胞アッセイの包括的なマトリックスを含むように、本発明者らの表現型のアウトカム指標を拡張する。以下は、ＣＮ後、または最終分析のために、共培養の４週間後に、週間隔で評価される：溶出液は、（ｉ）質量分析を使用した神経伝達物質及び代謝物のメタボロミクスバイオマーカー発現について、及び（ｉｉ）ＥＬＩＳＡを使用したサイトカイン産生について、プロファイルされる、（ｉｉｉ）神経生理機能はライブカルシウムイメージングを使用して分析される、（ｉｖ）ＭＰＳデバイスは実験後に分析され、ハイコンテントイメージングを使用して細胞型の形態及び生存が評価される。細胞毒性及びＢＢＢ透過性は、神経コンパートメントにおいてＬＤＨ及びデキストランのクロスオーバーを使用して測定される。本発明者らは、全体的なチップ要件を低減するために、同じセットのチップに対する補完的なアッセイを注意深く検討した。このシステムの信頼性を確立するために、これらの実験は、ＳＡ１．１で一緒に生成された同じ対照ｉＰＳＣ系統由来の細胞ロットを使用して３回繰り返され、合計１８ｆＭＰＳが比較される。各アッセイにおいて、本発明者らは結果を比較し、測定あたり２５％未満の変動係数（ＣＶ）に基づいてモデルの有効性を判断する。例えば、ＬＤＨ値が１回の実行あたり５チップ間で２５％の分散内にある場合、対照ｆＭＰＳは細胞毒性のモデル化に信頼性があり（または有意な毒性が観察されないことを示すことにも信頼性がある）、３つの実験のそれぞれの平均は有意差がない。本発明者らは、繰り返し測定を説明するために適切な統計的検定を適用し、検証のために全てのデータをＣｅｄａｒｓ−Ｓｉｎａｉの生物統計コアに提出する。本発明者らは、これらのアッセイが３回の実行間で有意差のない結果を生成すると判断した場合（実行ごとに５回の繰り返し）、本発明者らは５人の別々の対照個体から得られたｆＭＰＳモデルの評価に進む。
【００９５】
実施例２５
５人の対照個体からｆＭＰＳ全体で再現可能なバイオマーカーを特定する。
このシステムを使用してＦＴＬＤ−ＴＤＰの疾患特異的変化を検出する前に、本発明者らは、異なるヒト対象間にどのような差異が存在するかを確立する必要がある。ここで、本発明者らはＳＡ１．２ａの最もロバストなアッセイに焦点を当て、５つの対照ｆＭＰＳ間の変動性を調べる（表５）。さらに、これらのデバイスにおいて一貫して発現している細胞型を探索するために、系統ごとに１つのｆＭＰＳが単一細胞ＲＮＡトランスクリプトームプロファイリング（ｓｃＲＮＡ）に割り当てられる。ＭＰＳでＭＧ及びＢＭＥＣと共培養された中脳ニューロンに関する本発明者らの研究の予備データは、ｓｃＲＮＡの適用、及び共培養された細胞型の回復を示している（図５１）。本発明者らは、モデル内の細胞型の変動の評価を支援するために、本発明者らのｆＭＰＳに同じアプローチを適用することを計画している。４週間後に細胞生存の最小閾値を満たすｆＭＰＳチップは、系統間変動の分析に含まれる。５つの対照全体でＣＶが２５％以下である、再現性のあるバイオマーカー及びリードアウトをもたらすアッセイが、対照手段としてのアプリケーションとして選択される。後の目的で生物学的変動の潜在的な原因を減らすために、本発明者らは、５つの対照ＭＰＳの中で最高のバリアスコアを生成する対照−ＢＭＥＣ系統を選択する。この系統は疾患チップのＢＢＢチャンバーに使用され、ＣＮ及びＭＧは両方とも各ＦＴＬＤ−ＴＤＰ系統由来である。本発明者らが将来の疾患分析のために前進するために選択したバイオマーカーは、実行間で２５％ＣＶを超える変動を示す必要がある。対照ｆＭＰＳモデル対象間で、特に系統内で２５％以下、系統全体で３０％以下の低い変動係数を確立することは、本発明者らの進展のための第２の合格／不合格基準になる。これは、アプリケーションをスクリーニングするための本発明者らの多細胞ｆＭＰＳ設計の有用性を表している。
【００９６】
実施例２６
Ｃ９ｏｒｆ７２（８）及びＧＲＮ変異を有するＦＴＬＤ−ＴＤＰ対象からのｉＰＳＣ系統の生成。
ＵＣＳＦ記憶・加齢センター（ＵＣＳＦ  Ｍｅｍｏｒｙ  ａｎｄ  Ａｇｉｎｇ  Ｃｅｎｔｅｒ）は、ｉＰＳＣリプログラミング用の細胞に加えて、高度に特性決定されたＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者試料を収集した。これらには、臨床スケール、シリアルニューロイメージング、脳の病理学、及び生体試料などの疾患の表現型の測定が含まれる。Ｃｅｄａｒｓ−ＳｉｎａｉのｉＰＳＣコアを利用して、本発明者らはＦＴＬＤ−ＴＤＰ対象からｉＰＳＣ系統を生成し、そこから臨床、生体試料、及び剖検材料の完全なコレクションを入手できる。したがって、本発明者らは、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ  ｆＭＰＳの結果を個々の臨床及び病理学的データで検証する独自の機会を得る。これには、血液／脳ｆＭＰＳ相互作用のためにこれらの患者から収集された血清、及びＳｅｅｌｅｙ研究所による単一核ＲＮＡシークエンシングにすでに使用されている死後の前脳組織が含まれる。さらに、これらのＦＴＬＤ−ＴＤＰ  ｉＰＳＣ系統はｉＰＳＣコアによって産生されるため、ＣＮ及びＭＧの分化にすぐに入ることができ、凍結保存して直接使用するために保存することができる。性別を生物学的変数として説明するために、男性及び女性の両方から系統が生成されるが、本発明者らはｆＭＰＳ表現型に関しては有意差を予測していない。
【００９７】
実施例２７
ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集を使用してＣ９ｏｒｆ７２及びＧＲＮ同質遺伝子修正ｉＰＳＣ系統を生成する。
本発明者らは、３つのＡＬＳ患者由来ｉＰＳＣにおけるＣ９ｏｒｆ７２遺伝子の反復増殖をすでに除去し、正常なＣ９ｏｒｆ７２遺伝子発現を回復し、ｉＰＳＣ由来ニューロンにおけるＲＮＡ病巣及びＲＡＮジペプチドの産生を停止している（図５２）。同様に、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９技術を使用して、本発明者らは通常のコード配列を、ＧＲＮで見られるような遺伝子のミスセンス及びナンセンス対立遺伝子に復元した。本発明者らは、これらのすでに確立されたアプローチを使用して、生成された３つのＣ９ｏｒｆ７２及び３つのＧＲＮｉＰＳＣ系統の同質遺伝子対照を開発する。系統は、増殖するときに核型が決定され、継代され、親系統と一致する。前脳ニューロンへの予備的な分化は、チップにおいて使用する前に確立される。
【００９８】
実施例２８
ＦＴＬＤ−ＴＤＰの２つの一般的な遺伝的形態における疾患関連バイオマーカーのｆＭＰＳモデルの特徴
ＦＴＬＤ−ＴＤＰ系統に起因する違い。本明細書では、本発明者らは、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ由来組織に関連する潜在的なバイオマーカー及び／または表現型の検出を含むように、本発明者らのアッセイを拡張する。本発明者らは、最初に、本発明者らのアッセイにおけるバイオマーカー及び表現型の個体間変動を最小限に抑えるために、疾患及び同質遺伝子修正された系統を使用することを提案する。次に、本発明者らは、ｆＭＰＳ及びアッセイをＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者系統のより大きなコホートに適用して、バイオマーカーが再現性があり、疾患の不均一性を表すかどうかを判断する。バイオマーカーの同定及びバイオマーカーの確認により、本発明者らはシステムをヒトデータと相互検証し、同定されたバイオマーカーを使用して候補治療薬の前臨床有効性試験を実施し、潜在的な診断用途のためにｆＭＰＳに対する患者血清の流れの影響を調べる。
【００９９】
上記に基づいて、Ｃ９ｏｒｆ７２及びＧＲＮ対象のｉＰＳＣ系統のセットと同質遺伝子対照を使用して、ｆＭＰＳの疾患関連表現型及びバイオマーカーを特定できる。ＳＡ１での本発明者らの研究に基づいて、本発明者らは同質遺伝子対照と並行して罹患したｆＭＰＳモデルを生成し、バイオマーカー及び表現型のリードアウトを評価する。３つのＣ９ｏｒｆ７２及び３つのＧＲＮ疾患、ならびに対応する同質遺伝子系統が、ＣＮ及びＭＧの導出に使用され、結果として６セットのＣＮ及びＭＧが患者特異的神経コンパートメントを生成する。各ｆＭＰＳのＢＭＥＣは、決定された最高スコアの対照系統に由来する。同質遺伝子対照と組み合わせたＣ９ｏｒｆ７２増殖系統が使用されるため、本発明者らは、ＲＮＡ病巣及びＲＡＮジペプチド産生などの疾患特異的バイオマーカーを評価する。ＧＲＮ  ＭＰＳモデルでは、本発明者らはＧＲＮタンパク質及びリソソーム機能のレベルを監視し、両方において発明者らはリン酸化ＴＤＰ−４３封入体をスクリーニングする。重要なことに、ＧＲＮタンパク質及びＤＰＲ産生の測定は、溶出液から行うことができ、時間の経過とともに新規バイオマーカーの変化と相関し得る。単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑ実験により、対照と疾患ｆＭＰＳ間で、ＶＥＮニューロンなどの同じ個々の細胞型のトランスクリプトームプロファイルを直接比較し、皮質細胞の発達が影響を受けるかどうかを判断できるようになる。ＦＴＬＤ−ＴＤＰの免疫学的要素を評価するために、ＭＧの形態は、共焦点顕微鏡と疾患関連ミクログリア（ＤＡＭ）を示す特定の転写物の発現を使用して評価される。２Ｄにおいて、共培養なしで、本発明者らは、家族性ＡＤ患者ｉＰＳＣ由来のＭＧが、ＤＡＭ表現型に関連する転写物を差次的に発現することを発見した（図示せず）。本発明者らは、本発明者らが提案した多細胞ｆＭＰＳモデルが罹患ＭＧの変化を促進し、サイトカイン分泌の変化がＥＬＩＳＡまたは質量分析によって溶出液中に検出されることを期待している。推定される疾患特異的バイオマーカーは、有意性及び再現性によってランク付けされ、統計的に有意なバイオマーカーが追求される。
【０１００】
上記は、Ｃ９ｏｒｆ７２及びＧＲＮと正常対照に変異があるＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者ｉＰＳＣ系統のより大きなグループにわたる疾患バイオマーカーのロバスト性の研究につながる。異なる疾患関連バイオマーカー及び表現型のリードアウトを確立した後、本発明者らは、ｆＭＰＳ疾患モデルを本発明者らのＦＴＬＤ−ＴＤＰ対象の完全なコホートに適用する。いくつかの表現型／バイオマーカー試料として、本発明者らは、診断機能におけるｆＭＰＳの概念実証アプリケーション中に適用できる。疾患関連ｆＭＰＳのプールが増えると、本発明者らはバイオマーカーの有用性を確認し、表現型またはバイオマーカーが、正常な対照と比較して、Ｃ９ｏｒｆ７２及びＧＲＮ患者由来のｆＭＰＳモデル全体で保存されているかどうかを判断する。ＳＡ２．２の完了により、提案の最終的な合格／不合格基準が定義される：本発明者らが、疾患対同質遺伝子修正ｆＭＰＳから、及びより広範な患者群にわたってバイオマーカーの差次的発現を検出した場合にのみ、本発明者らは提案のＵＨ３フェーズに進む。
【０１０１】
本発明者らは、以前の２Ｄ培養研究から予測された、ＦＴＬＤ−ＴＤＰに特異的なバイオマーカーが確認されることを予期しているが、大部分は新規のバイオマーカーになる。Ｌｏｔｈｉａｎ対照コホートでは、本発明者らは、この群（すなわち、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ病変を発症したであろう対照患者）において交絡バイオマーカーシグナルが確認されることを予期していない。本発明者らは最近、早期発症パーキンソン病（ＰＤ）の患者のｉＰＳＣ由来ドーパミンニューロンが、本発明者らの中脳ＭＰＳモデルの代謝物シグネチャーの違いを示すことを実証した（図５３）。実際、５つの対照と５つのＰＤ系統ごとに１つのＭＰＳの試料サイズを使用して、本発明者らは、いくつかの代謝物の有意な倍数変化を特定し、２つをここに示す（図５３）。したがって、本発明者らは、制御された培養システムにおける罹患した溶出液へのメタボロミクスの適用が、特に、比較のためのより大きな疾患及び対照系統のコホートで、ＦＴＬＤ−ＴＤＰの違いも明らかにするであろうと予想する。
【０１０２】
バイオマーカーの発見後、ＦＴＬＤ−ＴＤＰの対象及び組織からの臨床測定値及び単一核ＲＮＡデータを評価できる。疾患モデルの所見をヒトの臨床的及び病理学的測定値と比較することにより、ＦＴＬＤ−ＴＤＰＭＰＳモデルを検証することができる。この目的のために、本発明者らは、臨床データ及び死後皮質組織が収集された、完全に特性決定されたＦＴＬＤ−ＴＤＰ対象のセットを使用することを選択した。このようにして、本発明者らは、微小流体前脳モデルの病状特性（ＴＤＰ−４３プロテイノパチー、グリア活性化状態、細胞死）を調査できるだけでなく、本発明者らは、これらの所見を個々の患者データと比較することもできる。
【０１０３】
さらなる目的は、ＦＴＬＤ−ＴＤＰの皮質及び細胞の脆弱性を定義することであり、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ皮質の単一細胞レベルでの病理学的変化を決定するための進行中のプロジェクトがある。凍結した死後組織の前頭島及び一次運動皮質の核は、すでに公開されているプロトコルを適応する、そのすでに資金提供された提案の一部として、ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）の単一核シークエンシングのために処理される。このデータセットが、本発明者らのｆＭＰＳで生成されたｓｃＲＮＡデータセットと組み合わされると、ｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルと、同じ個体の患者組織との間で単一細胞転写プロファイリングデータを比較する独自の機会が得られる。本発明者らは、患者のｓｎＲＮＡのプロファイルをｆＭＰＳ  ｓｃＲＮＡと比較し、異なる細胞集団の同定を支援するために、各データセットの正規化された発現マトリックスを開発する。データセット全体で同定された細胞集団において、本発明者らは、保存された遺伝子経路と発散した遺伝子経路の両方、及びトランスクリプトームシグネチャーについて説明する。遺伝子セット濃縮分析は、皮質ニューロン、アストロサイト、ミクログリア、及びＢＭＥＣからのデータを直接調べるためにも使用され、これらは本発明者らが両方のデータセットにおいて表されることを予期している。
【０１０４】
実施例２９
Ｃ９ｏｒｆ７２に対するアンチセンスオリゴヌクレオチドを含む遺伝子型特異的修飾因子に対するバイオマーカーの治療反応、及びＡＡＶ−ＧＲＮによる遺伝子置換を評価する
バイオマーカーの発見は、特定の遺伝的バリアントを標的とするＦＴＤ／ＡＬＳスペクトラム障害の治療法が臨床試験に入っていることを示唆し得、現在、ＦＴＤではなくＡＬＳに焦点が当てられている。これは主に、ＡＬＳの進行速度が速いため、機能的評価尺度を使用した臨床試験がバイオマーカーなしで実行可能であるのに対し、ＦＴＤでは不可能であるためである。このことは、この提案の重要性、特にＦＴＬＤ−ＴＤＰの新規バイオマーカーの特定及び検証を強調している。ｆＭＰＳモデルを使用して特定されたバイオマーカーは、ＦＴＤ患者の遺伝子治療の試験を設計及び監視するために使用でき、孤発性ＦＴＤの治療試験にも役立つことが期待されるため、本発明者らの発見は即座に翻訳に影響を与える。したがって、本目的において、本発明者らは、現在開発中のＦＴＬＤ−ＴＤＰに対する２つの治療アプローチの効果を調査し、Ｃ９ｏｒｆ７２及びＧＲＮ関連ＦＴＤのｆＭＰＳモデルにおけるバイオマーカーを変更する能力を決定する。
【０１０５】
ＦＴＬＤ−ＴＤＰのＣ９ｏｒｆ７２及びＡＡＶ−ＧＲＮに対するアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ）：Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の反復増殖によって引き起こされる有毒なＲＮＡ及びタンパク質種の産生をブロックすることは、ｉＰＳＣ及びＦＴＤ／ＡＬＳの動物モデルにおいて治療効果があることが示されている。ＦＴＬＤ−ＴＤＰを引き起こすＧＲＮにおける変異は、機能の喪失及びハプロ不全を均一に引き起こし、遺伝子置換が実行可能な治療アプローチであることを示している。本明細書において、本発明者らは、モデルの安定性に基づいてより大きなコホートから選択された、以前と同様に４つのＣ９ｏｒｆ７２及び４つのＧＲＮＭＰＳチップを生成する。次に、本発明者らは、ＡＳＯをＣ９ｏｒｆ７２  ｆＭＰＳに、またはＡＡＶ−ＧＲＮをＧＲＮ  ｆＭＰＳに、神経コンパートメントを介して流して、ＣＳＦを介した髄腔内投与を模倣し、バイオマーカーが改善を示すかどうかを判断する。ＡＳＯ実験の場合、本発明者らは、陽性対照として溶出液からのＤＰＲ生成についてＥＬＩＳＡを比較し、ＡＡＶ−ＧＲＮの場合、本発明者らはＧＲＮレベルについて同じことを行う。このようにして、本発明者らは、バイオマーカーの修正に関連して、標的に関与するための内部対照を有する。ＡＳＯ及びＡＡＶは、Ｉｏｎｉｓ（Ｆｒａｎｋ  Ｂｅｎｎｅｔｔからの手紙）及びＡｖｅｘｉｓ（Ｂｒｉａｎ  Ｋａｓｐａｒからの手紙）における本発明者らの協力者によって提供され、本発明者らは、彼らとの協力及び出版の確かな実績がある。重要なことに、ｆＭＰＳを使用すると、本発明者らは１２時間間隔の時間経過にわたって溶出液を調べて、治療効果までの時間と効果の持続時間の両方を特性決定することができる。本発明者らは、神経チャンバーを介した投与による効果を確認すると、次に、本発明者らは、末梢投与及びＢＢＢ透過性による送達を試験するために、血液チャンバーを介してＡＳＯまたはＡＡＶ−ＧＲＮを投与する。この場合も、以前に特定された変更されたバイオマーカーのアッセイは、表９に概説されているように実施される。ＡＳＯ及びＡＡＶの潜在的なオフターゲットまたは細胞毒性効果を制御するために、本発明者らは、罹患したｆＭＰＳモデルのニューロン側を通過したスクランブルＡＳＯ及びＡＡＶ−ＧＦＰを使用してミラーリング実験を実施する。本発明者らはまた、３つの対照由来のＭＰＳチップに対するＣ９ｏｒｆ７２及びＡＡＶ−ＧＲＮに対するＡＳＯの効果を評価する。重要なことに、治療後にバイオマーカーまたは表現型の逆転が観察された場合、本発明者らは、ｆＭＰＳのどの細胞型が「修正」されているかを正確に評価し、回復につなげる。
【０１０６】
実施例３０
ｆＭＰＳモデルにおいて流れるＦＴＬＤ−ＴＤＰ血清の効果の特性決定
全ての遺伝子型にわたるＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者は、自己免疫疾患の発生率が高いことを示しており、ＧＲＮレベルは、肥満及びインスリン抵抗性に関連しており、ＧＲＮ変異を有するＦＴＬＤ−ＴＤＰ対象は、循環ＩＬ−６のレベルが上昇している。Ｃ９ｏｒｆ７２及びＧＲＮタンパク質は、自然免疫系の末梢骨髄細胞においても高度に発現しており、本発明者らのグループなどの研究は、これらのタンパク質の機能の喪失が免疫細胞機能の変化につながることを強く支持している。これにより、ＦＴＬＤ−ＴＤＰにおける神経変性が、末梢血及び前脳組織の代謝因子及び／または免疫因子間の相互作用を伴う可能性が高まる。毒性試験または治療効率の事前スクリーニングに加えて、本発明者らのｆＭＰＳは、患者試料中のこれらの循環因子を評価するための生物学的リードアウトとして、独自に使用することができる。これはデバイスの野心的なアプリケーションであるため、本明細書において、本発明者らは、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ血清に曝露されたときにｆＭＰＳのアプリケーションをまず確立することを提案する。適切な対照実験を並行して使用して、本発明者らは、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者の血清が対照ｆＭＰＳモデルにおいて疾患表現型を誘発するかどうかを試験する。本発明者らは、血清由来の因子が、ＢＭＥＣ、ミクログリア、アストロサイトの機能、及びｉＰＳＣが生成され、ｆＭＰＳが播種されたのと同じ患者の血清を検査する前例のない能力に影響を与えると仮定している。これにより、ｆＭＰＳモデルを使用して、皮質機能に対する末梢因子の影響について多数の患者の血清をスクリーニングし、ＢＢＢ全体での薬物送達を調べるための段階が設定される。
【０１０７】
上記に基づいて、対照対ＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者から流れる血清が、ｆＭＰＳの疾患バイオマーカーに及ぼす影響を調べて、循環因子が疾患の表現型に及ぼす影響を判断できる。本発明者らは、ＳＡ２におけるバイオマーカーの最も安定性かつロバストな測定を示した３つの対照、３つのＣ９ｏｒｆ７２、及び３つのＧＲＮ患者由来のｆＭＰＳセットを使用し、本発明者らは、ＩＬ−６を使用して、流れる（ｉ）神経コンパートメントの炎症誘発性サイトカインに対する陽性対照応答を確立するためのＩＬ−６を含む培地、（ｉｉ）血清タンパク質によって引き起こされる違いを説明するための健康な対照血清、及び（ｉｉｉ）様々な潜在的な違いを生み出すそれぞれのＦＴＬＤ−ＴＤＰ対象の血清、の影響を確立する。本発明者らが、ｆＭＰＳを介して流れるヒト血清の影響を、対照または患者適合疾患のいずれかで評価すると、本発明者らは、３つの対照由来のｆＭＰＳに対するＦＴＬＤ−ＴＤＰ血清の影響を試験する。選択された血清は、本発明者らが疾患表現型の最大の増強または発現を観察するＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者（Ｃ９ｏｒｆ７２またはＧＲＮのいずれか）からのものである。本発明者らは、上記のように脳及び血清溶出物を検査する。ＩＬ−６または血清の投与後、神経チャンバーからの溶出液は、サイトカイン産生、及びＦＴＬＤ−ＴＤＰ組織ｆＭＰＳに対するＤＰＲまたはＧＲＮ放出のいずれかについて１２時間ごとに試験される。実験（５日間の血清の流れ）の終わりに、ＭＰＳが収集され、ミクログリア及びアストロサイトの活性化のためのものを含むマーカーが評価される。
【０１０８】
これらの実験は、ｆＭＰＳモデルにおける血清の流れの影響、及びＦＴＬＤ−ＴＤＰ血清からの要素が疾患関連バイオマーカーを生成するかどうかを決定する。陽性対照としてＩＬ−６を使用して、本発明者らは、循環する炎症誘発性因子に応答して、ミクログリア、アストロサイト及びニューロンにおいてシグナル伝達変化のカスケードが発生するかどうか、及び炎症がＦＴＬＤ−ＴＤＰ関連ｆＭＰＳバイオマーカーを悪化させるかどうかを決定する。さらに、本発明者らは、ＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者の血清因子が、対照またはＦＴＬＤ−ＴＤＰに由来するｆＭＰＳにおける疾患バイオマーカーに影響を与えるかどうかを決定する。ＦＴＬＤ−ＴＤＰ患者血清の主要な影響が観察された場合、血清成分を特定するフォローアップ研究が行われる。
【０１０９】
上記の種々の方法及び手法は、本発明を実施する多数の手段を提供する。当然、記載の目的または利点の必ずしも全てが、本明細書に記載の任意の特定の実施形態にしたがって達成されるわけではないことを理解すべきである。したがって、例えば、本方法が、本明細書で教示または示唆され得るように、他の目的または利点を必ずしも達成することなく、本明細書に教示の１つの利点または利点群を達成または最適化する仕方で実施することができることを、当業者らは認識するであろう。様々な有利及び不利な代替物が、本明細書で述べられる。好ましい実施形態の一部が、１つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を具体的に含む一方、他のものは、１つの、別の、またはいくつかの不利な特徴を具体的に除外するが、さらに他のものは、１つの、別の、またはいくつかの有利な特徴を含むことにより、本不利な特徴を具体的に軽減することが理解されるべきである。
【０１１０】
さらに、当業者は、異なる実施形態の種々の特徴の適用性を認識するであろう。同様に、上述した種々の要素、特徴、及びステップ、ならびにそのような要素、特徴、またはステップそれぞれのための他の既知の等価物は、本明細書に記載の原理にしたがって方法を実施するために、当該技術分野の当業者が組み合わせることができる。多様な実施形態では、種々の要素、特徴、及びステップ中に、一部が具体的に含まれ、残りのものが具体的に除外されるであろう。
【０１１１】
本発明は、特定の実施形態及び実施例の文脈で開示されるが、本発明の実施形態が、具体的に開示された実施形態を超えて、他の代替実施形態及び／または使用ならびにその修正及び等価物にまで及ぶことは、当業者らに理解されるであろう。
【０１１２】
本発明の実施形態では、多くの変形及び代替要素が開示されている。さらに別の変形及び代替要素は、当業者には明らかであろう。これらの変形には、限定されないが、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）に関連する組成物及び方法、ニューロン、血管細胞、ミクログリア及びアストロサイトなどの支持細胞を含む分化したｉＰＳＣ、上述の細胞の操作に使用されるベクター、上述の組成物の使用に関する方法及び組成物、手法及び組成物ならびにそれに使用される溶液の使用、ならびに本発明の教示により作製される生成物の特定の使用がある。本発明の種々の実施形態は、これらの変形または要素のいずれかを具体的に含むか、または除外し得る。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明及び特許請求するために使用される成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数字は、一部の場合、「約」という用語で修飾されるものとして理解されるべきである。したがって、いくつかの実施形態では、書面による説明及び添付の特許請求の範囲に記載の数値パラメータは、特定の実施形態により得られることが求められる所望の特性に応じて変動し得る近似値である。いくつかの実施形態では、数値パラメータは、報告された有効桁数の数を考慮して、かつ通常の四捨五入手法を適用することにより解釈されるべきである。本発明のいくつかの実施形態の広い範囲について記載する数値範囲及びパラメータは、近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に記載される数値は、実行可能な限り正確に報告される。本発明のいくつかの実施形態において提示される数値は、それぞれの試験測定値に見出される標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含有し得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本発明の特定の実施形態を説明する文脈で（特に、以下の特許請求の範囲の特定の文脈で）使用される「ａ」及び「ａｎ」及び「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の指示対象は、単数形及び複数形の両方を網羅すると解釈することができる。本明細書の値の範囲の列挙は単に、範囲内に入るそれぞれの別々の値を個々に指す簡単な方法として役立つことが意図される。本明細書で別途指示のない限り、各個別値は、本明細書で個別に列挙されているかのように、本明細書に組み込まれる。本明細書中に記載される全ての方法は、本明細書中で特に指示のない限り、または文脈によって明らかに矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書で特定の実施形態に関して提供される任意の及び全ての例の使用、または例示的な言語（例えば、「など」）は、本発明をより適切に表すことが意図され、別途特許請求される本発明の範囲に制限を課さない。本明細書の言語は、本発明の実施に必須の、特許請求されていない任意の要素を示すと解釈されるべきではない。
【０１１５】
本明細書に開示されている本発明の代替要素または実施形態のグループ化は、制限として解釈されるべきではない。各グループメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーもしくは本明細書に見られる他の要素と任意の組み合わせで、参照して、特許請求することができる。グループの１つ以上のメンバーは、便宜及び／または特許性の理由により、グループに含まれるか、またはグループから削除され得る。そのような任意の包含または削除が生じた場合、本明細書は、本明細書にこのように修正されたグループを含有するとみなされ、添付の特許請求の範囲で使用される全てのＭａｒｋｕｓｈグループの書面による説明を満たす。
【０１１６】
本発明を実施するための本発明者に既知の最良の形態を含む、本発明の好ましい実施形態が本明細書に記載される。それらの好ましい実施形態の変形は、上述の説明を読むと当業者らに明らかになるであろう。当業者らが、必要に応じて、そのような変形を用い得ることが企図され、本発明は、本明細書に具体的に記載される以外で実施することができる。したがって、本発明の多くの実施形態は、適用法により許可されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題の全ての修正及び同等物を含む。さらに、その全ての可能な変形における上記の要素の任意の組み合わせは、本明細書に別途指示のない限り、または文脈により明らかに矛盾しない限り、本発明に包含される。
【０１１７】
さらに、本明細書を通して、特許及び印刷された出版物に対して、多数の参照がなされている。上記で引用された参考文献及び印刷された刊行物のそれぞれは、全体が参照により本明細書に個々に組み込まれる。
【０１１８】
最後に、本明細書に開示の本発明の実施形態は、本発明の原理の例示であることを理解すべきである。用いることができる他の修正は、本発明の範囲内であり得る。したがって、限定ではなく例として、本発明の代替構成を、本明細書の教示にしたがって利用することができる。したがって、本発明の実施形態は、示され、記載されるように正確に限定されない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５−１】
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【図４５−２】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【国際調査報告】
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