(57)【要約】  アスパラギナーゼと併用してアルギナーゼを用いて癌細胞を阻害するための方法である、高純度アルギナーゼの調製及びアルギナーゼの単一置換ポリエチレングリコール共役体の高効率性調製のための組成物及び方法が提供される。高純度アルギナーゼは、初期高温沈殿工程を適用した後、イオン交換を行って、９０％以上の純度でアルギナーゼを提供することによって提供される。直鎖状又は分枝鎖状のポリエチレングリコールとの共役は、アルギナーゼと比較して低いモル過剰、及び低温で、マレイミド誘導体化ポリエチレングリコールを用いて行われる。そのようなポリエチレングリコール誘導体化アルギナーゼは、癌細胞、特に低内因性アスパラギナーゼ発現を有する細胞の増殖の阻害におけるアスパラギナーゼとの併用に有用である。
2021502108.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アルギナーゼを発現する細胞を得る工程、
前記細胞を破砕してアルギナーゼを含む溶解物を生成する工程、
前記溶解物から第一混入物を沈殿させ、第一部分的精製アルギナーゼを含む上清を生成するために適切な時間、ＣｏＣｌ２の存在下で、前記溶解物の温度を沈殿温度に上昇させる工程と、
前記上清を陰イオン交換体に接触させて、第一の結合フラクション及び第一のフロースルーフラクションを生成する工程、を含む、アルギナーゼを精製する方法であって、
前記フロースルーフラクションが、Ｍｎ２＋がＣｏ２＋で置換された部分的精製Ｃｏ２＋アルギナーゼを含む、方法。
【請求項２】
前記第一のフロースルーフラクションを陽イオン交換体に接触させて、第二の結合フラクション及び第二フロースルーフラクションを生成する工程、
溶出緩衝液を前記陽イオン交換体に適用して、溶出フラクションを生成する工程、をさらに含む、請求項１に記載の方法であって、
前記溶出フラクションが、Ｍｎ２＋がＣｏ２＋で置換された精製Ｃｏ２＋アルギナーゼを含む、方法。
【請求項３】
前記細胞がヒトアルギナーゼ１を発現する、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記細胞が細菌細胞である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記沈殿温度が５０℃よりも高い、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記沈殿温度が約６５℃である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣｏＣｌ２が、少なくとも２０ｍＭの濃度で提供される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記時間が、５分間〜３０分間の間である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記時間が約１５分間である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記陰イオン交換体が強陰イオン交換体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記陽イオン交換体が強陽イオン交換体である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記部分的精製Ｃｏ２＋アルギナーゼが、少なくとも８０％の純度を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１３】
前記精製ヒトＣｏ２＋アルギナーゼが、少なくとも９０％の純度を有する、請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも１つのシステインを含む対象タンパク質を得る工程、
２℃〜１５℃の温度の６．５〜７．０の間のｐＨを有する緩衝液中において前記対象タンパク質をＰＥＧ−マレイミドに接触させる工程、
２℃〜１５℃で２４時間〜７２時間、前記ＰＥＧ−マレイミドと共に前記対象タンパク質をインキュベートして、ＰＥＧ誘導体化タンパク質を生成する工程、を含む、タンパク質を選択的に誘導体化する方法であって、
前記ＰＥＧ−マレイミドが、前記対象タンパク質と比較して６倍未満のモル過剰で存在する、方法。
【請求項１５】
前記ＰＥＧ−マレイミドが分枝ＰＥＧを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＰＥＧ−マレイミドが直鎖ＰＥＧを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象タンパク質が、ヒトアルギナーゼ１又はその変異体である、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記変異体が、一つのシステインを除く全ての除去を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象タンパク質又は前記その変異体がポリヒスチジン配列を含まない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
未反応の又は加水分解されたＰＥＧ−マレイミドから前記ＰＥＧ誘導体化タンパク質を分離する追加的な工程をさらに含む、請求項１４〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
分離の前記追加的な工程が、透析、サイズ排除クロマトグラフィ及びイオン交換クロマトグラフィから成る群の内の一つによって行われる、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＰＥＧ−マレイミドが、前記対象タンパク質と比較して４倍未満のモル過剰で存在する、請求項１４〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
ＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１の調製物であって、
少なくとも２０ｋＤａの分子量を有する単一のポリエチレングリコール部分に共有結合する配列番号１に相当するペプチド配列であって、前記ＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１が、前記調製物中においてヒトアルギナーゼの少なくとも９０％を表し、前記ＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１がポリヒスチジン配列を含まない、ペプチド配列、
を含む調製物。
【請求項２４】
前記ポリエチレングリコール部分が直鎖状である、請求項２３に記載の調製物。
【請求項２５】
前記ポリエチレングリコール部分が分枝鎖状である、請求項２３に記載の調製物。
【請求項２６】
前記ポリエチレングリコール部分が、「Ｙ」分岐構造を含む、請求項２５に記載の調製物。
【請求項２７】
前記ポリエチレングリコール部分が、「Ｖ」分岐構造を含む、請求項２５に記載の調製物。
【請求項２８】
前記ＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１が、マンガン、ニッケル及びコバルトから成る群から選択される金属補因子を含む、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の調製物。
【請求項２９】
癌細胞を阻害する方法であって、
前記癌細胞に接触する培地中のアルギニン濃度を低下させる工程、
前記培地中のアスパラギン濃度を低下させる工程、を含む方法。
【請求項３０】
アルギナーゼを用いてアルギニン濃度を低下させる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アルギナーゼが組換えヒトアルギナーゼである、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
アスパラギナーゼを用いてアスパラギン濃度を低下させる、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌細胞が低アスパラギナーゼ発現を有する、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
グルタミン濃度を低下させる工程をさらに含む、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
アミノトランスフェラーゼ阻害剤を用いてグルタミン濃度を低下させる、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アミノトランスフェラーゼ阻害剤がアミノオキシ酢酸である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
アルギニン還元酵素、及び、
アスパラギン還元酵素、を含む、癌細胞を阻害するための組成物。
【請求項３８】
前記アルギニン還元酵素がアルギナーゼである、請求項３７に記載の組成物。
【請求項３９】
前記アルギナーゼが組換えヒトアルギナーゼである、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
前記アスパラギン還元酵素がアスパラギナーゼである、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記癌細胞が低アスパラギナーゼ発現を有する、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
グルタミン濃度を低下させる化合物をさらに含む、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
グルタミン濃度を低下させる前記化合物がアミノトランスフェラーゼ阻害剤である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記アミノトランスフェラーゼ阻害剤がアミノオキシ酢酸である、請求項４３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年８月１６日に出願された米国仮出願第６２／５４６４８９号及び２０１７年１１月２７日に出願された米国仮出願第６２／５９１１０２号の利益を主張するものである。これらの及び全ての参照された外因性材料は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれている参考文献の用語の定義又は使用が、本明細書において提供されるその用語の定義と矛盾しているか、又は、相いれない場合、本明細書において提供されるその用語の定義が優先するとみなす。
【０００２】
本発明の分野は、アルギナーゼ精製、アルギナーゼ修飾、並びにアルギナーゼ及びアスパラギナーゼの医学的使用である。
【背景技術】
【０００３】
以下の記載は、本発明を理解する際に有用であり得る情報を含む。本明細書において提供される情報のいずれも従来技術であるか、若しくは主張される本発明に関連したものであること、又は具体的若しくは暗黙的に参照されるいずれの刊行物も従来技術であることは、承認されるものではない。
【０００４】
アミノ酸欠乏が癌を処置するための有効な候補であり得ることを示唆するエビデンスが増えている。特定のアミノ酸（例えばアルギニン、アスパラギン又はグルタミン）の欠乏は、異なる型の癌を処置するために有用であることが分かっている（Ｆｅｕｎ，Ｙｏｕら、２００８（非特許文献１）；Ｈｅｎｓｌｅｙ，Ｗａｓｔｉら、２０１３（非特許文献２）；Ｋｒａｌｌ，Ｘｕら、２０１６（非特許文献３））。本明細書における全ての刊行物は、あたかも個々の各刊行物又は特許が参照により具体的且つ個別に組み込まれていることが示されているかのように同程度に参照により組み込まれている。組み込まれた参考文献における用語の定義又は使用が、本明細書において提供されるその用語の定義と矛盾しているか、又は相いれない場合、本明細書において提供されるその用語の定義が適用され、参考文献のその用語の定義は適用されない。アミノ酸欠乏の有効性は、ｍＴＯＲＣｌの非活性化やタンパク質合成の破壊などの下流効果によるものと考えられる。
【０００５】
アルギニンを枯渇させるための組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡｒｇ）の適用は、インビトロにおける癌細胞増殖の阻害に有効であることが示されている（Ｌａｍ，Ｗｏｎｇら、２００９（非特許文献４）Ｔｓｕｉ，Ｌａｍら、２００９（非特許文献５））。アルギニンは、タンパク質合成におけるその準必須役割のためだけでなく、ｍＴＯＲＣｌを活性化する際のアルギニンの役割のためにも、標的アミノ酸として選択された（Ｃａｒｒｏｌｌ，Ｍａｅｔｚｅｌら、２０１６（非特許文献６）；Ｃｈａｎｔｒａｎｕｐｏｎｇ，Ｓｃａｒｉａら、２０１６（非特許文献７）；Ｋｒａｌｌ，Ｘｕら、２０１６（非特許文献３）；Ｓａｘｔｏｎ，Ｃｈａｎｔｒａｎｕｐｏｎｇら、２０１６（非特許文献８）；Ｚｈｅｎｇ，Ｚｈａｎｇら、２０１６（非特許文献９））。アルギニン欠乏が乳癌、結腸癌、肺癌及び子宮頸癌から誘導された細胞系を含む各種癌細胞系を効果的に阻害することが可能であったことが分かった。
【０００６】
酵素アルギナーゼは、アルギニンに作用してオルニチン及び尿素を生成するものであって、尿素回路の一部である。アルギナーゼは、化学療法剤としての使用が増えており、血清中のアルギニンの濃度を低下させるために利用される。これらの枯渇血清中アルギニンレベルは、癌細胞（それらの内の多くの種類がアルギニンに関して栄養要求性である）を効果的に「飢餓」させることができる。
【０００７】
治療剤としてのアルギナーゼの使用は、大量及び高純度の両方のヒトアルギナーゼの利用可能性を必要とする。高精製組換えヒトアルギナーゼを提供する試みが行われてきた。例えば、（Ｌｅｕｎｇ及びＬｏに対する）米国特許第８，５０７，２４５号（特許文献１）には、ＰＥＧ化のための単一部位を提供するために修飾された組換えヒトアルギナーゼ１を精製する擬似親和性クロマトグラフィ法が記載されている。しかし、記載された前記方法は、金属擬似親和性媒質との錯体形成を可能にするポリヒスチジン配列を含む形態に制限される。この擬似親和性媒質は、共役反応における大過剰の反応性ＰＥＧ類似体の使用によって必要とされる親和性精製工程において用いられる。したがって、そのような方法によって精製されたアルギナーゼ１は、前記ポリヒスチジン配列を除去する追加的処理を行うことなしに、完全にヒトと考えることはできない。
【０００８】
未修飾アルギナーゼは血漿中で不安定であり、それによってその治療上の適用が厳しく限定される。タンパク質のポリマーポリエチレングリコールとの共役（ＰＥＧ化）を含む血漿中半減期を延長する多くの試みが探究されてきた。広く使用される共役ストラテジーは、（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ及びＳｔｏｎｅに対する）米国特許第９，０５０，３４０号（特許文献２）に記載されている通りのアルギナーゼのアミノ基（例えば、リジンのε−アミン）の非選択的ＰＥＧ化である。そのような処理は、著しいモル過剰の費用のかかるアミン反応性ＰＥＧ試薬の使用を、そのような試薬の比較的急速な加水分解に一部起因して必要とする。そのようなランダム共役によって、前記修飾アルギナーゼの定性的及び定量的特性決定も複雑になり、それによってその医薬的使用が限定される。カップリング反応が、しばしばスケールアップに適していない非常に厳しく管理された条件下で行われない限り、そのようなアプローチを用いて、一貫した生成物特性が達成される可能性はない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】米国特許第８，５０７，２４５号
【特許文献２】米国特許第９，０５０，３４０号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Feun, L., M.  You, et al. (2008).  "Arginine deprivation as a targeted therapy for cancer." Curr Pharm Des 14(11): 1049-1057.
【非特許文献２】Hensley, C.  T., A.  T.  Wasti, et al. (2013).  "Glutamine and cancer: cell biology, physiology, and clinical opportunities." J Clin Invest 123(9): 3678-3684.
【非特許文献３】Krall, A.  S., S.  Xu, et al. (2016).  "Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor." Nat Commun 7: 11457.
【非特許文献４】Lam, T.  L., G.  K.  Wong, et al. (2009).  "Recombinant human arginase inhibits proliferation of human hepatocellular carcinoma by inducing cell cycle arrest." Cancer Lett 277(1): 91-100.
【非特許文献５】Tsui, S.  M., W.  M.  Lam, et al. (2009).  "Pegylated derivatives of recombinant human arginase (rhArg1) for sustained in vivo activity in cancer therapy: preparation, characterization and analysis of their pharmacodynamics in vivo and in vitro and action upon hepatocellular carcinoma cell (HCC)." Cancer Cell Int 9: 9.
【非特許文献６】Carroll, B., D.  Maetzel, et al. (2016).  "Control of TSC2-Rheb signaling axis by arginine regulates mTORC1 activity." Elife 5.
【非特許文献７】Chantranupong, L., S.  M.  Scaria, et al. (2016).  "The CASTOR Proteins Are Arginine Sensors for the mTORC1 Pathway." Cell 165(1): 153-164.
【非特許文献８】Saxton, R.  A., L.  Chantranupong, et al. (2016).  "Mechanism of arginine sensing by CASTOR1 upstream of mTORC1." Nature 536(7615): 229-233.
【非特許文献９】Zheng, L., W.  Zhang, et al. (2016).  "Recent Advances in Understanding Amino Acid Sensing Mechanisms that Regulate mTORC1." Int J Mol Sci 17(10).
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
したがって、活性で、効果的に且つ一貫してＰＥＧ化されたアルギナーゼを高純度で提供することができる方法の必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
（発明の概要）
本発明の主題は、高純度アルギナーゼを調製し、誘導体化し、癌の処置においてアスパラギナーゼと併用してそのように調製されたアルギナーゼを利用するための組成物及び方法を提供することである。
【００１３】
本発明の概念の一実施形態は、アルギナーゼを発現する細胞（細菌細胞など）を得る工程、前記細胞を破砕してアルギナーゼを含む溶解物を生成する工程、前記溶解物から混入物を沈殿させ、第一部分的精製アルギナーゼを含む上清を生成するために充分な時間（例えば、約５〜３０分間）、（例えば、少なくとも２０ｍＭの濃度の）ＣｏＣｌ２の存在下で、前記溶解物の温度を沈殿温度（例えば、少なくとも５０℃又は約６５℃）に上昇させる工程、とによってアルギナーゼを精製する方法である。この上清を陰イオン交換体に接触させて、それによってさらなる混入物を結合させて、部分的精製Ｃｏ２＋アルギナーゼ（すなわち、Ｍｎ２＋をＣｏ２＋に置換したアルギナーゼ）を含むフロースルーフラクションを提供する。そのような部分的精製Ｃｏ２＋アルギナーゼは、約８０％以上の純度を有することができる。
【００１４】
幾つかの実施形態において、前記方法は、前記フロースルーフラクションを陽イオン交換体に接触させて、前記アルギナーゼを含む結合フラクションと、第二のフロースルーフラクションとを生成するさらなる工程を含む。溶出緩衝液を前記陽イオン交換体に適用して、精製Ｃｏ２＋アルギナーゼを溶出させる。そのような精製Ｃｏ２＋アルギナーゼは、約９０％以上の純度を有することができる。前記アルギナーゼは、ヒトアルギナーゼ１であることができる。そして、用いられる陰イオン交換体及び陽イオン交換体は、強イオン交換体であることができる。
【００１５】
本発明の概念の別の実施形態は、少なくとも一つのシステインを含むタンパク質を得る工程、２℃〜１５℃の温度で６．５〜７．０の間のｐＨを有する緩衝液中でＰＥＧ−マレイミドに前記タンパク質を接触させる工程、２℃〜１５℃で２４時間〜７２時間、前記ＰＥＧ−マレイミドと共に前記タンパク質をインキュベートしてＰＥＧ誘導体化タンパク質を生成する工程、とによってタンパク質（ヒトアルギナーゼ１又はその変異体など）を選択的に誘導体化する方法である。そのような方法において、前記ＰＥＧ−マレイミドは、前記タンパク質よりも４倍モル過剰未満で存在する。前記ＰＥＧ−マレイミドは、分枝鎖状又は直鎖状のＰＥＧから誘導され得る。幾つかの実施形態において、一つのシステインを除いて全てを除去する変異を有するアルギナーゼ中の前記タンパク質。幾つかの実施形態において、前記タンパク質は、ポリヒスチジン配列を含まない。幾つかの実施形態において、前記方法は、例えば、透析、サイズ排除クロマトグラフィ及び／又はイオン交換クロマトグラフィによって、未反応の又は加水分解されたＰＥＧ−マレイミドから前記ＰＥＧ誘導体化タンパク質を分離する追加的工程を含む。
【００１６】
本発明の概念の別の実施形態は、少なくとも２０ｋＤａの分子量を有する単一ＰＥＧ部分に共有結合する配列番号１に相当するペプチド配列を含むＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１の調製物である。前記ＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１は、そのような調製物中における少なくとも９０％のヒトアルギナーゼを示し、前記ＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１は、ポリヒスチジン配列を含まない。前記ＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼの前記ＰＥＧ部分は、直鎖状又は分枝鎖状であることができる（例えば、「Ｙ」構成又は「Ｖ」構成を有する）。そのような実施形態の内の幾つかにおいて、前記ＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１は、マンガン、ニッケル及び／又はコバルトなどの金属補因子を含むことができる。
【００１７】
本発明の概念の別の実施形態は、癌細胞を阻害する方法であって、前記癌細胞を培養する際に利用される培地中のアルギニン濃度を低下させる工程、前記培地中のアスパラギン濃度を低下させる工程、とによって前記癌細胞を阻害する方法である。前記アルギニン濃度は、アルギナーゼ（例えば、組換えヒトアルギナーゼ）を用いて低下させ得る。同様に、前記アスパラギン濃度は、アスパラギナーゼ（ＡＳＮａｓｅ）を用いて低下させ得る。そのような実施形態の内の幾つかにおいて、前記癌細胞は、アスパラギンシンテターゼ（ＡＳＮＳ）発現が低い。そのような実施形態の内の幾つかにおいて、前記方法は、例えばアミノトランスフェラーゼ阻害剤（アミノオキシ酢酸など）を用いてグルタミン濃度を低下させるさらなる工程を含む。
【００１８】
本発明の概念の別の実施形態は、アルギニン還元酵素及びアスパラギン還元酵素を含む、癌細胞を阻害するための組成物である。アルギニン還元酵素は、組換えヒトアルギナーゼなどのアルギナーゼであることができる。同様に、前記アスパラギン還元酵素は、アスパラギナーゼ（ＡＳＮａｓｅ）であることができる。そのような実施形態の内の幾つかにおいて、前記癌細胞は、アスパラギンシンテターゼ（ＡＳＮＳ）発現が低い。前記組成物は、アミノトランスフェラーゼ阻害剤（例えば、アミノオキシ酢酸）など、グルタミン濃度を低下させる化合物を含むこともできる。
【００１９】
本発明の主題の各種の目的、特徴、態様及び長所は、同様の符号が同様の構成要素を表す添付図面と共に、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から、より明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の概念の例示的な処理のフローチャートである。
【図２】熱的沈殿のホモジェネート及び生成物についての８〜１６％勾配ゲル上の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥから得られた結果を示す電気泳動ゲルの写真。
【図３】Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）上のクロマトグラフィの間のＵＶ吸光度のグラフ。
【図４】典型的なＣａｐｔｏ  Ｑ（商標）クロマトグラフィ工程についての８〜１６％勾配ゲル上の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥから得られた結果を示す電気泳動ゲルの写真。
【図５】Ｃａｐｔｏ  Ｓ（商標）の上のクロマトグラフィの間のＵＶ吸光度のグラフ。
【図６】典型的なＣａｐｔｏ  Ｑ（商標）クロマトグラフィ工程についての８〜１６％勾配ゲル上の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥから得られた結果を示す電気泳動ゲルの写真。
【図７】ＰＥＧ−マレイミドの異なるモル過剰における２〜８℃におけるヒトキナーゼ１についてのＰＥＧ化キネティクスのグラフ。
【図８】Ｄａｙ０におけるＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１の単回静脈内投与後の健康なラットにおける血漿中アルギニン濃度のグラフ。
【図９】Ｄａｙ０におけるＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１の単回静脈内投与で処置した健康なラットにおける血漿中アルギニン濃度のグラフ。
【図１０】Ｄａｙ０におけるＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１の単回静脈内投与で処置した健康なラットの体重のグラフ。
【図１１】Ｄａｙ０における直鎖状及び分枝鎖状のＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１の単回静脈内投与で処置した健康なラットにおける血漿中アルギニン濃度のグラフ。
【図１２】Ｄａｙ０における直鎖状又は分枝鎖状のＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１の単回静脈内投与で処置した健康なラットの体重のグラフ。
【図１３】ＬＣ／Ｑ−ＴＯＦ  ＭＳによる分子質量決定。ＰＥＧ化アルギナーゼの解析質量は、３４，５７２．３Ｄａである。
【図１４】変異体ヒトアルギナーゼ１のペプチドマップ。
【図１５】２ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後の経時的なラット血漿中のアルギナーゼの酵素活性のグラフ。
【図１６】２ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後の経時的なラット血漿中の免疫活性ＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１の血漿中濃度のグラフ。
【図１７】（ｉ）低ＡＳＮＳ発現細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＺＲ−７５−１、ＭＣＦ７）及び（ｉｉ）高ＡＳＮＳ発現細胞系（ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２及びＭＩＡ−Ｐａｃａ２）におけるＡＳＮａｓｅ単独の有効性のグラフ。３組の独立した試験を実験ごとに行った。誤差の棒は、１標準偏差（ＳＤ）を表す。
【図１８】（ｉ）低ＡＳＮＳ発現細胞系（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＺＲ−７５−１、ＭＣＦ７）及び（ｉｉ）高ＡＳＮＳ発現細胞系（ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２及びＭＩＡ−Ｐａｃａ２）におけるｒｈＡｒｇ単独及びｒｈＡｒｇ−ＡＳＮａｓｅ併用の有効性のグラフ。３組の独立した試験を実験ごとに行った。誤差の棒は、１標準偏差（ＳＤ）を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下の記載は、本発明を理解する際に有用であり得る情報を含む。本明細書において提供される情報のいずれも従来技術であるか、若しくは主張される本発明に関連したものであること、又は具体的若しくは暗黙的に参照されるいずれの刊行物も従来技術であることは、承認されるものではない。
【００２２】
本発明の主題は、ヒトアルギナーゼの拡張可能な精製を提供する装置、組成物及び方法を提供することである。本発明の概念の組成物及び方法において、組換えヒトアルギナーゼを含有する調製物が高温でインキュベートされ、それによって沈殿物が形成される。この沈殿物を除去し、上清を回収し、陰イオン交換体上においてイオン交換に供する。この陰イオン交換処理から得られたフロースルーフラクションを回収し、陽イオン交換体上におけるさらなるポリッシング工程に供するが、ここで塩勾配を用いてヒトアルギナーゼを溶出させる。得られたヒトアルギナーゼを、例えばＰＥＧ化によって修飾することができる。そのようなＰＥＧ化は、高純度でＰＥＧ化ヒトアルギナーゼを生成するために、低温で比較的小さいモル過剰の反応性ＰＥＧ類似体を用いて実施され得る。本発明の主題は、癌細胞の増殖を阻害するためにアルギニン及びアスパラギンを低下させる化合物を用いる装置、システム及び方法を提供することである。そのような化合物は、アルギニン及びアスパラギンの濃度を触媒的に低下させるアルギナーゼ及び／又はアスパラギナーゼなどの酵素であり得る。好ましい実施形態において、そのような酵素は、そのような組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡｒｇ）などのヒト酵素である。
【００２３】
そのようなアミノ酸枯渇酵素は、自然原料から精製される酵素として、又は組換え細菌、組換え真菌、組換え植物細胞若しくは組換え動物細胞の生成物として提供され得る。そのような治療において利用される酵素は、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又はそれ以上を超える純度を有することが可能であり、変換後に修飾されてもよい。そのような修飾としては、吸収及び／又は半減期を向上させる修飾（ＰＥＧ化など）を挙げることができる。酵素含有医薬製剤は、例えば注射又は注入によって静脈内投与され得る。そのような調製物は、癌処置のために利用される化学療法剤、免疫療法剤及び／又は放射線治療を含むことができるか、又は同時投与され得る。
【００２４】
本発明の主題の各種の目的、特徴、態様及び長所は、同様の符号が同様の構成要素を表す添付図面と共に、以下の好ましい実施形態の詳細な説明から、より明らかになるであろう。
【００２５】
開示された前記手法が、組換え原料から天然配列を有する高精製ヒトアルギナーゼの拡張性のある作製を含む多くの有利な技術的効果を提供することを認めるべきである。
【００２６】
幾つかの実施形態において、本発明のある種の実施形態を記載し、主張するために用いられる成分の量、濃度などの特性、反応条件などを表す数は、幾つかの例において「約」という用語で修飾されるものと理解される。したがって、幾つかの実施形態において、本明細書及び添付の特許請求の範囲に記載される数値的パラメータは、特定の実施形態によって得られることが求められる所望の特性によって変化し得る近似値である。幾つかの実施形態において、数値的パラメータは、報告される著しい桁の数字を考慮し、通常の端数処理技術を適用することによって解釈されるべきである。それにも関わらず、本発明の幾つかの実施形態の幅広い範囲を記載する数値範囲及びパラメータは近似値であり、具体例に記載される数値は、実行可能であるのと同程度に正確に報告される。本発明の幾つかの実施形態に示される数値は、それらのそれぞれの試験測定値で見出される標準偏差から必然的に生じるある種の誤差を含んでもよい。
【００２７】
本明細書における、及び、続く特許請求の範囲にわたる記載において用いられるように、「一つの（ａ）」、「一つの（ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」の意味は、文脈が明確に規定しない限り、複数形の参照を含む。また、本明細書における記載において用いられるように、「中の（ｉｎ）」の意味は、文脈が明確に規定しない限り、「中の（ｉｎ）」及び「上の（ｏｎ）」を含む。
【００２８】
本明細書における値の範囲の説明は、単に範囲内の別々の各値を個別に参照する短縮方法の役割を果たすことが意図されるだけである。本明細書において示されない限り、各個別の値は、あたかもそれが本明細書において個別に列挙されるかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に特に明記しない限り、又は文脈に明確に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実施され得る。本明細書におけるある種の実施形態に関して提供されるあらゆる例又は例示的な文言（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をより良好に明らかにすることを意図するものであって、それ以外の場合に主張される本発明の範囲を限定するものではない。本明細書における文言は、本発明の実施に必須な、主張されないいかなる要素も示すものとして解釈されるべきでない。
【００２９】
本明細書に開示される本発明の代替的な要素又は実施形態の組分けは、限定するものとして解釈されるものではない。各群の部分は、個別に又は前記群の他の部分若しくは本明細書において見出される他の要素と組み合わせて参照され、主張され得る。群の一つ以上の部分は、利便性及び／又は特許性の理由で群の中に含まれ得るか、又は削除され得る。そのような包含又は削除が行われる場合、本明細書は、このように添付の特許請求の範囲に用いられる全てのマーカッシュ群の明細書を実現して修飾される群を含むと本明細書において考えられる。
【００３０】
以下の考察は、本発明の主題の多くの例示的な実施形態を提供するものである。各実施形態が本発明の要素の単一の組み合わせを表すにもかかわらず、本発明の主題は、開示された要素の全ての可能な組み合わせを含むと考えられる。したがって、一実施形態が要素Ａ、Ｂ及びＣを含む場合、第二実施形態は要素Ｂ及びＤを含み、そして本発明の主題は、明示的に開示されない場合であっても、Ａ、Ｂ、Ｃ又はＤの他の残りの組み合わせを含むことも考えられる。
【００３１】
本発明の概念の実施形態において、前記アミノ酸枯渇酵素の内の一つは、哺乳類、鳥類、爬虫類、植物、真菌及び／又は細菌のアルギナーゼなどのアルギナーゼである。幾つかのそのような実施形態において、前記アルギナーゼは、培養における例えば、細菌、酵母、真菌、昆虫、植物又は哺乳類の細胞の遺伝子操作の生成物として提供されるヒトアルギナーゼであることができる。そのようなアルギナーゼは、続く共役反応、例えば潜在的に修飾可能な側鎖を含む一つ以上のアミノ酸の除去又は置換の特異性を向上させる役割を果たす一つ以上の配列修飾を含むことができる。好ましい実施形態において、組換えヒトアルギナーゼは、大腸菌クローン、例えば、ヒトアルギナーゼ１をコードするｃＤＮＡが挿入されたカナマイシン耐性発現ベクターｐＥＴ−３０ａを含む株ＢＬ２１（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏｌａｂｓのＴ７  Ｅｘｐｒｅｓｓ）において生成され得る。そのような形質転換された大腸菌の培養は、適切な培地中で、任意の適切なスケール、例えば、０．１Ｌ、１Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ以上で実施され得る。そのような細菌培養物の光学密度は、それが組換えヒトアルギナーゼ１の回収のための最適密度にいつ達したのかを決定するためにモニタされ得る。別の場合、前記細菌の回収及びさらなる処理の前に、あらかじめ決められた時間、培養を継続することができる。
【００３２】
図１は、本発明の概念の処理の例を概説するフローチャートを提供する。示されるように、前記ヒトアルギナーゼ１を発現する細菌又は他の細胞が、前記所望の酵素を遊離するために、回収され、破砕され、抽出される。細菌は、濾過、沈降及び／又は遠心分離を含む任意の適切な手段によって回収され得る。所望により、このようにして回収される細菌は、後続の処理の前に濯がれ得るか、又は洗浄され得る。
【００３３】
前記細菌又は他の細胞の破砕は、任意の適切な処理によって実施され得る。これらとしては、酵素消化、浸透圧ショック、急激な圧力変化（例えば、圧縮による圧搾及び／又は音波処理による）が挙げられるが、それらに限定されるものではない。幾つかの実施形態において、これらの処理は、温度制御状態下で実施され得る。例えば、音波処理を受ける細菌又は他の細胞の温度は、それがヒトアルギナーゼの後続の活性と適合する温度を超えないことを確保するように制御され得る。他の実施形態において、前記細菌又は他の細胞の破砕の前、間又は後に、一つ以上のプロテアーゼ阻害剤を添加することができる。さらに他の実施形態において、前記細菌又は他の細胞の破砕の前、間又は後に、一つ以上の安定剤（例えば、抗酸化剤）を添加することができる。
【００３４】
前記細菌又は他の細胞の破砕の後、（例えば、沈降、濾過及び／又は遠心分離によって）残余の破片を除去して、前記ヒトアルギナーゼを含む溶液を放置することができる。本発明者らは、アルギナーゼが、望ましくない混在タンパク質の変性及び後続の沈殿をもたらす可能性がある高温（すなわち、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、６０℃及び／又は７０℃超）で驚くほど安定していることを見出した。例えば、本発明者らは、ヒトアルギナーゼＩが、多くの混在タンパク質の沈殿をもたらす温度である７４℃で安定していることを見出した。理論に限定されることなく、この安定性は、二価のイオンによる錯体形成によって提供されると考えられる。これによって、（混在タンパク質を含む）沈殿物と（ヒトアルギナーゼを含む）上清とを生成するために、Ｍｎ２＋又はＣｏ２＋などの二価のイオンの存在下で、高温（すなわち、３７℃を上回る温度）でアルギナーゼを抽出することが可能になる。さらに、コバルトキレート化アルギナーゼは、非常に増強された触媒活性（ｋｃａｔ／ＫＭ）を示すので、高い触媒ポテンシャルを提供するためだけでなく、前記アルギナーゼのＭｎ２＋をＣｏ２＋に置換するためにも、抽出の間にＣｏＣｌ２を利用することができる。前記ヒトアルギナーゼの適切〜最適な回収率、純度及び活性を提供するために、前記温度及びインキュベーション時間を選択することができる。
【００３５】
インキュベーション温度は、約４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃、９０℃又は約９０℃超からの範囲であることができる。インキュベーション時間は、１分間、２分間、３分間、５分間、１０分間、１５分間、３０分間、４５分間、１時間、２時間、３時間、４時間、８時間、１２時間又は１２時間超からの範囲であることができる。幾つかの実施形態において、前記インキュベーション期間の間に前記温度を変化させることができる。好ましい実施形態において、前記インキュベーション温度は６５℃であり、前記インキュベーション期間は１５分間である。本発明者らは、そのような方法が、同時に前記アルギナーゼにおいてＭｎ２＋をＣｏ２＋に置換しつつ、有利には、望ましくない感熱性タンパク質の大部分を除去することができることを見出した。
【００３６】
この沈殿工程の後、さらなる処理のために、前記アルギナーゼを含む前記上清を回収する。前記上清は、沈降、濾過及び／又は遠心分離を含む任意の適切な方法によって前記沈殿物から分離され得る。次いで、回収された前記上清を、陰イオン交換に適合性のある水性緩衝液に、（例えば、透析、ゲル濾過及び／又は透析濾過によって）移送する。そのような緩衝液の組成は、用いられる陰イオン交換媒体の性質に少なくとも部分的に依存しているが、概して、比較的低い（例えば、１００ｍＭ未満の）モル濃度及び高いｐＨ（例えば、７超）を有することができる。そのような陰イオン交換体は、アンモニウム基を含む陰イオン交換体など、陰イオンに対する比較的低い親和性を有する弱陰イオン交換体であることができる。別の場合、そのような陰イオン交換体は、陰イオンに対する比較的高い親和性を有する強陰イオン交換体（第四級アミン基を含む陰イオン交換体など）であることができる。好ましい実施形態において、強陰イオン交換体が用いられる。例えば、Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）などの強陰イオン交換体を利用する場合、適切な緩衝液は、ｐＨ８．０５の２０ｍＭのＴｒｉｓであることができる。前記上清の最終タンパク質濃度は、存在する混入材料の少なくとも一部からのアルギナーゼの最適な分離のために適切なものを提供するために調整され得る。
【００３７】
適切な陰イオン交換緩衝液に移送した後、前記上清を陰イオン交換媒体で処置する。上記したように、そのような陰イオン交換媒体は、強陰イオン交換媒体、例えば固定第四級アミンを含む陰イオン交換媒体であることができる。前記陰イオン交換媒体は、任意の適切な形態で、例えば、濾過器、不混和液、多孔質粒子及び／又は非多孔質粒子として提供され得る。そのような強陰イオン交換媒体の例としては、ペンダント第四級アミン基を含む多孔質粒子として提供されるＣａｐｔｏ  Ｑ（商標）媒体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）がある。そのような陰イオン交換媒体を、前記上清中で混合及び／又は懸濁されるバルク固体相として適用し、次いで、（例えば、沈降、遠心分離及び／又は濾過によって）除去することができる。好ましい実施形態において、前記陰イオン交換媒体は、クロマトグラフィカラムにおけるクロマトグラフィベッドとして提供される。
【００３８】
前記上清を陰イオン交換媒体のベッドに適用することが可能であり、それによって、部分的に精製されたアルギナーゼを含むフロースルーフラクションの通過が可能になると共に、少なくとも幾つかの混入物が前記媒体に結合する。適用の間の流速と共に、そのようなカラムの体積及び構成は、前記上清からの混入物の最適な捕捉のために適切なものを提供するために最適化され得る。部分的に精製された前記ヒトアルギナーゼの通過及び回収の後、前記陰イオン交換媒体は、再利用のために、（例えば、高塩濃度を含む緩衝液によって）濯がれ、再生され得る。そのような実施形態において、前記陰イオン交換媒体は、殺菌処置及び／又は発熱性物質低減処置に耐えるように選択され得る。
【００３９】
回収された、部分的に精製された前記アルギナーゼを、（前記適用に依存して）そのまま利用することができるか、又はさらなるポリッシング工程に供することができる。おそらく、医薬的使用法がそのようなさらなる処理を必要とすることになる。ポリッシング工程が所望される場合、部分的に精製された前記アルギナーゼを陽イオン交換クロマトグラフィのために適切な水性緩衝液に移送することができる。この移送は、透析、ゲル濾過及び／又は透析濾過を含む任意の適切な手段によって達成され得る。幾つかの実施形態において、この移送は、適切な陽イオン交換緩衝液組成物を提供する希釈緩衝液における部分的に精製された前記ヒトアルギナーゼの希釈によって効果的に達成され得る。さらに他の実施形態において、前の前記陰イオン交換工程で利用された前記緩衝液は、陽イオン交換のために適切となるように、（例えば、ｐＨ及び／又はイオン強度の操作によって）調整され得る。
【００４０】
部分的に精製された前記アルギナーゼは、適切な陽イオン交換緩衝液である場合、陽イオン交換媒体に適用され得る。適切な緩衝液は、典型的には、低〜中程度のイオン強度（例えば、２００ｍＭ未満）及び中性のｐＨ（例えば、ｐＨ７）を有する。適切な陽イオン交換緩衝液の例としては、５０ｍＭのＴｒｉｓ（ｐＨ７）がある。そのような陽イオン交換体は、カルボキシル基を含む陽イオン交換体など、陽イオンに対する比較的低い親和性を有する弱陽イオン交換体であることができる。別の場合、そのような陽イオン交換体は、陽イオンに対して比較的高い親和性を有する強陽イオン交換体（スルホン酸基を含む陽イオン交換体など）であることができる。好ましい実施形態において、前記陽イオン交換媒体は、ペンダントスルホン酸基を含む、Ｃａｐｔｏ  Ｓ（商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）などの強陽イオン交換媒体であることができる。部分的に精製された前記アルギナーゼ調製物に由来するアルギナーゼは、前記陽イオン交換媒体に結合され、選択的に溶出するので、前記陽イオン交換媒体は、好ましくは、勾配溶出を支持するように所定位置に固定される固体（例えば、粒子）として提供される。好ましい実施形態において、前記陽イオン交換媒体は、クロマトグラフィカラムにおけるクロマトグラフィベッドとして提供される。適用の間の流速と共に、そのようなカラムの体積及び構成は、前記陽イオン交換媒体からのヒトアルギナーゼの最適な捕捉及び後続の遊離に適切なものを提供するように最適化され得る。
【００４１】
そのような陽イオン交換カラムを用いる場合、陽イオン交換緩衝液に移送された部分的に精製されたアルギナーゼは、前記陽イオン交換媒体上における前記アルギナーゼの捕捉を可能にする流速で前記カラムに適用される。部分的に精製された前記アルギナーゼの適用の後、前記陽イオン交換カラムは、非結合材料を除去するために追加的な体積の陽イオン交換緩衝液（例えば、１〜１０カラム体積）で濯がれ得る。所望により、洗浄がいつ完了するのかを決定するために、この処理の間にＵＶ吸光度をモニタすることができる。幾つかの実施形態において、緩やかに結合した材料を変位するために、よりストリンジェントな陽イオン交換緩衝液（例えば、前記陽イオン交換緩衝液よりも高いｐＨ及び／又はイオン強度を有する洗浄緩衝液）が前記陽イオン交換カラムに適用される追加的な洗浄工程を用いることができる。そのような洗浄緩衝液の例としては、０．５Ｍ未満（ｐＨ７）における、５０ｍＭのＴｒｉｓ＋塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）がある。幾つかの実施形態において、様々なストリンジェンシーの一連のそのような洗浄緩衝液を用いることができる。
【００４２】
部分的に精製された前記アルギナーゼの適用及び任意の後続の洗浄工程の後、溶出緩衝液の適用によって、精製されたアルギナーゼを前記陽イオン交換媒体から溶出させる。ステップ溶出を提供するために、単一のボーラスとして固定組成物の溶出緩衝液を適用することによって、この溶出を提供することもできる。他の実施形態において、前記溶出緩衝液は、陽イオン交換緩衝液に対する溶出緩衝液の比が経時的に増加する前記陽イオン交換緩衝液との混合物として適用され得る。そのような勾配溶出アプローチにおいて、この比が変化する速度は、経時的に線形であり得るか、又は非線形であり得る。好ましい実施形態において、前記カラム緩衝液の組成物を経時的に一定の速度で陽イオン交換緩衝液から溶出緩衝液へ移行させる直線勾配を用いて、溶出が達成される。前記溶出緩衝液は、前記陽イオン交換緩衝液とは、ｐＨ、イオン強度又はそれらの両方が異なる可能性がある。好ましい実施形態において、前記溶出緩衝液は、前記陽イオン交換緩衝液の組成及びｐＨを実質的に再現するが、さらに高濃度（例えば０．２Ｍ超）のＮａＣｌを含む。そのような溶出緩衝液の例としては、５０ｍＭのＴｒｉｓ＋０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ７）がある。
【００４３】
そのような勾配溶出の間、どのフラクションが回収されるのかを決定するために、前記カラムを出る材料のＵＶ吸光度をモニタすることができる。所望の収率及び純度を提供するために、アルギナーゼ含有率及び／又は混入物の存在に基づいてフラクションを選択することができる。そのようなフラクションを、回収し、プールし、安定性のために適切な緩衝液に移送することができる。幾つかの実施形態において、そのような精製アルギナーゼを、続いて凍結及び／又は凍結乾燥することができる。さらに他の実施形態において、そのようにして得られた精製アルギナーゼは、医薬的使用のために、例えばＰＥＧ化によって誘導体化され得る。本発明の概念の方法及び組成物の典型的な結果は、約３０％の収率で高純度（＞９０％）のヒトアルギナーゼを提供することができる。前記精製ヒトアルギナーゼの通過及び回収の後、前記陽イオン交換媒体は、再利用のために、（例えば、高塩濃度を含む緩衝液によって）濯がれ、再生され得る。そのような実施形態において、前記陽イオン交換媒体は、殺菌処置及び／又は発熱性物質低減処置に耐えるように選択され得る。
【００４４】
幾つかの実施形態において、続いて、上記の通りに精製されるアルギナーゼに化学修飾をほどこすことができる。適切な化学修飾としては、ビオチン化、電荷修飾、架橋及び共役（例えば、親水性ポリマー（例えば、デキストラン）のグラフト、ＰＥＧなど）が挙げられる。例えば、精製されたアルギナーゼをアミン反応性基及び／又はチオール反応性基を担持するポリマーに接触させることによって、前記ポリマーの反応性形態を用いて、そのようなポリマーを前記精製アルギナーゼにグラフトさせることができる。適切な反応性基としては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、スルホＮＨＳエステル、エポキサイド、ハロゲン化トリアジン、アルデヒド、ヒドラジン、ヨードアセトアミド、マレイミド、及び本技術分野で知られている他の架橋基が挙げられる。幾つかの実施形態において、そのような処理で用いられるヒトアルギナーゼは、例えば、前記ヒトアルギナーゼ上に存在する修飾可能なアミノ酸側鎖の数及び／又は位置を制限するか、又は減少させるために、遺伝子修飾され得る。例えば、ヒトアルギナーゼの配列内の一つ以上のリジンを別のアミノ酸と置換することによって、反応性アミンの数を減らすことができる。同様に、ヒトアルギナーゼの配列内の一つ以上のシステインを別のアミノ酸と置換することによって、反応性チオールの数を減らすことができる。
【００４５】
一般にニッケルに対する親和性を有する融合タンパク質を生成するために用いられる（例えば、アミノ末端及び／又はカルボキシル末端における）ポリヒスチジン配列の付加は、本発明の概念の組成物又は方法において必要ではないことが理解されるべきである。適切な組換えアルギナーゼの例は、配列番号１で提供される。そのようなポリヒスチジン配列を含むことは、前記ヒトアルギナーゼを抗原性にする可能性があり、ゆえに、治療剤としての反復使用に不適切である。さらに、ポリヒスチジン配列を含む場合、初期精製の間の、及び上記の修飾反応に続く陽イオン交換を用いた前記アルギナーゼの単離に干渉することになる。
【００４６】
ＰＥＧ化は、治療価値を有するタンパク質の血清半減期に延長するためにしばしば用いられる。そのような処理は、確実に前記対象タンパク質のかなりの割合をＰＥＧ化するために、概して、大きなモル過剰（例えば、１０倍以上のモル過剰）のＰＥＧの反応性形態を用いて行われる。このことは、ヒトアルギナーゼ１など、結合効率性を低下させる立体化学的問題を提示するタンパク質において特に当てはまる。ＰＥＧの典型的な反応性形態としては、ＰＥＧ−ＮＨＳ又はＰＥＧ−スルホＮＨＳ（アミンによる結合が所望される場合に用いられる）又はＰＥＧ−マレイミド（チオールによる結合が所望される場合に用いられる）が挙げられる。大きなモル過剰のそのような活性化ＰＥＧの使用は、大きなモル過剰における低選択度での結合の可能性、後続の前記反応タンパク質からの大過剰の未反応ＰＥＧの分離の困難、及び費用を含む多くの理由により、望ましくない。
【００４７】
驚くべきことに、本発明者らは、非常に低い（例えば、タンパク質含有率に対して３倍〜４倍の）モル過剰のＰＥＧマレイミドを用いて、ヒトアルギナーゼ（上記のように精製されるヒトアルギナーゼ１など）を効率的にＰＥＧ化することができることを見出した。さらに驚くべきことに、このＰＥＧ化を、選択条件下で（例えば、プロトン化によって潜在的に反応性のアミンを阻止する緩酸性ｐＨ）、低温で（それらの両方は、反応性を低下させる）、延長された（すなわち、１時間を超える、及び／又は、最高で７２時間の）反応時間、高効率で行うことができる。本発明者らは、そのような方法によって、提供された前記ヒトアルギナーゼ１の実質的に全て（すなわち、９０％超）のＰＥＧ化を提供することが可能になり、ゲル濾過及び／又はイオン交換によって、残留する未反応の、又は加水分解された比較的少量のＰＥＧからの分離を容易に達成することができることを見出した。幾つかの実施形態において、このようにして修飾された前記ヒトアルギナーゼを遺伝子修飾して、天然配列と比較して少量の潜在的に反応性のシステインを提供することができる。好ましい実施形態において、前記ヒトアルギナーゼは、単一のシステインを提供し、且つポリヒスチジン配列を含まない修飾ヒトアルギナーゼ１であることができる。幾つかの実施形態において、前記ヒトアルギナーゼは、コバルトやニッケルなどの非天然（すなわち、マンガンではない）金属補因子を含むことができる。
【実施例】
【００４８】
細胞破砕、抽出及び清澄化
アンピシリン耐性、一過性及び構成的発現ベクターｐＥＴ−３ａを含む大腸菌クローン（株：ＢＬ２１  Ｓｔａｒ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、ヒトアルギナーゼ−１をコードするｃＤＮＡで形質転換し、培養において確立した。湿重量が４２．２ｇのそのような培養物から生成された細胞ペーストを２３０ｍＬの溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ７．９、１ｍＭのＭｇＳＯ４）で洗浄した後、細胞ペーストの回収のために遠心分離を行った。２１０ｍＬの溶解緩衝液による前記細胞ペーストの再懸濁の後、さらなる処理のために３５ｍＬを吸引した。
【００４９】
Ｑ７００  Ｓｏｎｉｃａｔｏｒ（Ｑｓｏｎｉｃａ）及び以下のデューティサイクル：（１０秒間ＯＮ、３０秒間ＯＦＦ、３．５分間のＯＮ）を用いて音波処理によって３５ｍＬの前記細胞再懸濁液からヒトアルギナーゼを放出して、ホモジェネートを産生した。遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、１５分間）の後、得られた上清を回収し、水浴中でＣｏＣｌ２の存在下で熱的沈殿に供した（６５℃で１５分間）。遠心分離によって沈殿物を除去し、上清をさらなる精製工程に供した。図２は、ホモジェネートについてのＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果と、少なくとも２０ｍＭのＣｏＣｌ２が存在する場合は、約１５分間、６５℃の温度でアルギナーゼの最適回収が観察されたことを示す各種量のＣｏＣｌ２が存在する場合の熱的沈殿の結果とを示す。処理のこの工程は、感熱性不純物を除去しただけでなく、キレート化イオンをコバルトで置換した。
【００５０】
陰イオン交換クロマトグラフィによる部分精製
熱的沈殿（２６．５ｍＬ）によって生成された前記上清を０．４５μｍ濾過器（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｃａｐｔｉｖａ（商標）Ｅｃｏｎｏｆｉｌｔｅｒ  ＰＥＳ膜、２５ｍｍ、０．４５μｍ）で濾過し、１００ｍＬのＭｉｌｌｉＱ（商標）水及び１１０ｍＬの２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．１）で希釈して、ローディング試料（ｐＨ７．９５、伝導率：１．２１３ｍＳ／ｃｍ）を産生した。
【００５１】
前もって２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ８．１）で平衡させたＣａｐｔｏ  Ｑ（商標）（１×６．８ｃｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を詰めたクロマトグラフィカラムを取り付けたＡＫＴＡ（商標）ｐｒｉｍｅ  ｐｌｕｓ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）におけるＦＰＬＣによって前記精製を行った。さらなる精製のために、その流れを３．５ｍＬ／分の流速で回収した。この処理の間、ＵＶ吸光をモニタした。結果を図３に示す。Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）クロマトグラフィの間に回収されたフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図４に示す。ヒトアルギナーゼ１が、一部の少量の混入物と共に、フロースルーフラクションに残留することは明らかである。
【００５２】
陽イオン交換クロマトグラフィによるさらなる精製
１５ｍＬの５０ｍＭのＭＥＳ（ＭＥＳ一水和物）緩衝液（ｐＨ６．７）を、前記Ｃａｐｔｏ  Ｑ（商標）カラムから得られた前記フロースルーフラクションに加え、３．９ｍＬ／分の流速でＣａｐｔｏ  Ｓ（商標）カラム（１×１０ｃｍ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上にロードする前に６Ｎの塩酸を加えることによって、前記ｐＨを６．２に調整した。前もって前記Ｃａｐｔｏ  Ｓ（商標）カラムを５０ｍＭのＭＥＳ緩衝液（ｐＨ６．７）で平衡させた。平衡化緩衝液中において０〜０．５ＭのＮａＣｌの直線勾配でヒトアルギナーゼ１を溶出した。ＵＶ吸光度をモニタした。典型的な結果を図５に示す。Ｃａｐｔｏ  Ｓ（商標）クロマトグラフィの間に回収されたフラクションのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果を図６に示す。前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルがオーバーロードされることが明らかであることが示される非常に少量の混入物のみで、簡便なＮａＣｌ勾配を用いて、ヒトアルギナーゼ１が高純度で溶出することが明らかである。
【００５３】
前記ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルをオーバーロードするタンパク質濃度でも明らかに汚染物が存在しないことは、このヒトアルギナーゼ１調製物についての少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％以上の純度を示す。この純度が、ポリヒスチジン又は他の親和性「タグ」配列を必要とすることなく達成されたものであり、天然タンパク質配列の精製を表すことを理解すべきである。本発明者らは、配列修飾及び／又は誘導体化（例えば、ＰＥＧ化）ヒトアルギナーゼを精製するために、並びに前記誘導体化反応の反応生成物における未反応ヒトアルギナーゼから誘導体化されたものの分離のために、本発明の概念の方法及び組成物を利用することができることを検討する。
【００５４】
処理収率及び発現レベルの推定
表１は、前記精製処理の各種ポイントにおける処理収率の推定を提供するものである。ＵＶ分光光度計（Ｍｕｌｔｉｓｋａｎ（商標）ＧＯ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標））を用いて２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって測定されるＣａｐｔｏ  Ｓのプールのものを除いて、Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅ（商標）Ｖｅｒｓｉｏｎ５．２（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いてデンシトメトリーによってタンパク質濃度を測定した。２８０ｎｍにおける吸光係数は、１ｍｇ／ｍＬについて０．７０３である。
【００５５】
【表１】
2021502108.tif 000003
【００５６】
この例における全収率を２８．５％で推定した。
【００５７】
各種のＰＥＧ部分を有する共役ヒトアルギナーゼ１の調製
３００〜４５０Ｕ／ｍｇの触媒活性を有し、上記のように精製された配列修飾コバルトキレート化ヒトアルギナーゼ−１（配列番号１）を、異なるマレイミド誘導体化ＰＥＧによる後続のＰＥＧ化のために得た。選択的共役のために、４つのＰＥＧ−マレイミド、すなわち、２０Ｌ（２０−ＫＤ直鎖状ＰＥＧ−マレイミド（Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国）から購入、Ｃａｔ＃Ｍ−ＭＡＬ−２０Ｋ））、２０Ｖ  Ｓｉｎｏｐｅｇ＃０６０２０１０１９１２（２０―ＫＤ「Ｖ」構成ＰＥＧ−マレイミド（ＮＯＦ  Ｃｏｒｐ．から購入、Ｃａｔ＃ＧＬ２−２００ＭＡ））、２０Ｙ（２０−ＫＤ「Ｙ」構成ＰＥＧ−マレイミド（Ｓｉｎｏｐｅｇから購入、＃０６０２０５０１９５４））、４０Ｙ（４０−ＫＤ「Ｙ」構成ＰＥＧ−マレイミド（Ｊｅｎｋｅｍ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（米国）から購入、Ｃａｔ＃Ｙ−ＭＡＬ−４０Ｋ））を用いた。共役のために、５ｍｇ／ｍＬの上記ヒトアルギナーゼ１を、ｐＨ６．７で、４〜１０℃で、異なるモル比のそれぞれの前記ＰＥＧ試薬と反応させた。この低温で、少なくとも４８時間、前記反応混合物をインキュベートした。次いで、サイズ排除クロマトグラフィ又は陽イオン交換クロマトグラフィ（大規模調製のためにより適切であり得る）で前記モノペグ化生成物を分離した。陽イオン交換クロマトグラフィのために、ＭａｃｒｏＣａｐ（商標）ＳＰカラムを用いて、０．１ＭのＮａＣｌを含む２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．３緩衝液を前記溶出緩衝液として用いてＰＥＧ化生成物を精製した。
【００５８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって決定されるように、モノペグ化生成物を含むフラクションをプールし、濃縮し、ＰＢＳ  ｐＨ７．４緩衝液に対して透析した。０．１％（１ｍｇ／ｍＬ）の溶液について、０．７０３の吸光係数を用いて、２８０ｎｍにおける紫外線分光法によって、最終タンパク質濃度を直接決定した。
【００５９】
マレイミド誘導体化ＰＥＧは、効率的にはｐＨ６．５〜７．５で、安定なチオエーテル結合を形成するためのスルフヒドリル基のタンパク質共役のために有効である。ｐＨが７．５を超える場合に一級アミンの方への反応性が生じる可能性があり、前記ｐＨが増加するにつれて、前記マレイミド基の安定性は低下する。ヒトアルギナーゼは、そのような誘導体化親水性ポリマーを用いた共役に対して、比較的、耐性を示すことが知られている。ヒトアルギナーゼは、ホモトリマーである。本発明者らは、（理論に束縛されるものではないが）前記スルフヒドリル共役反応が（例えば、立体障害によって）選択的な場合であっても、前記第一ＰＥＧ分子の共役が前記ホモトリマー上の第二共役を妨げる可能性があると考える。その結果、完全反応を確保するために、通常、大きな過剰モル比のＰＥＧ試薬が利用される。例えば、従来の反応条件下で、６倍のモルのＰＥＧの添加によって、室温における３５時間のインキュベーションの後で７１．１％のモノペグ化生成物が生じ、８倍のモル過剰の添加によって、室温における４６時間のインキュベーションの後で８６．３％のモノペグ化生成物が生じた。
【００６０】
驚くべきことに、本発明者らは、ストリンジェントな共役条件（弱酸性ｐＨなど）を用いる場合であっても、前記共役反応が低温（例えば、１０℃未満）で生じる場合、最小限のＰＥＧ試薬を用いて高共役収率を達成することができることを見出した。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、低温によって、マレイミド結合基の半減期が延長され、その結果、二回目及び三回目の共役の確率が増加すると考える。反応のための前記ｐＨは、スルフヒドリル基の選択的共役に好都合となるために、約ｐＨ６．７であることができる。
【００６１】
異なるモル比（例えば、２倍、４倍、６倍）の前記ＰＥＧ−マレイミド試薬でＰＥＧ化キネティクスを検討した。ＰＥＧ−マレイミドの添加及び約４℃のインキュベーションの後、陽イオン交換体（ＭａｃｒｏＣａｐ（商標）ＳＰ）による精製の前に４倍の体積の２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．３緩衝液で前記粗反応混合物を希釈した。前記希釈反応混合物を前記カラム上にロードした後、２０ｍＭ  ＭＥＳ  ｐＨ６．３緩衝液で洗浄することによって、余剰のＰＥＧを除去した。次いで、０．１ＭのＮａＣｌを含む同じ緩衝液でモノペグ化アルギナーゼを溶出させた。ＰＢＳ緩衝液に対する大規模な透析及び濃縮の後、前記最終生成物は、比活性が４２５Ｕ／ｍｇであった。
【００６２】
経時的な低温におけるＰＥＧ化収率（モノＰＥＧ化生成物）を、逆相超高速液体クロマトグラフィ（ＲＰ−ＵＰＬＣ）によって決定した。結果は、図７に示されるが、ヒトキナーゼ１よりも４倍のモル過剰のＰＥＧ−マレイミドが４８時間で９５％の収率に達するために充分であることを示す。本発明者らは、３倍のモル過剰が、低温で、延長されたインキュベーション（例えば、４８時間以上）の場合に同様の収率に達するために充分であると考える。
【００６３】
健康なラットにおけるＰＥＧ化ヒトアルギナーゼ１の薬力学的試験
動物：各試験群について３匹の健康な幼若雄性ＳＤラットを選択した。各群のラットに、ヒトアルギナーゼ共役体を、示された用量で、ＩＶ送達を介して投与した。各動物について、１ｍＬのシリンジを用いて、抗凝固薬（ヘパリンＮａ）を含む試料チューブを用いて、適切な時点で、約０．８ｍＬの全血の試料を頸静脈から採取した。１０分間、３，０００ｒｐｍにおける前記血液試料の即時の遠心分離によって血漿試料を調製した。上清（０．３〜０．４ｍＬ）を得て、二つの試料に分割し、−８０℃で各々を貯蔵した。
【００６４】
アルギニンの定量：以下に、及び表２に示される条件を用いて、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６４６０  Ｌｉｑｕｉｄクロマトグラフィ及びＥｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ  Ｔｒｉｐｌｅ  Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ  ＭＳシステムを用いて、アルギニンの公知の濃度と比較して、アルギニンの血漿中濃度を決定した。
【００６５】
カラム：Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｚｏｒｂａｘ  ＲＲＨＤ  ＨＩＬＩＣ  Ｐｌｕｓ  ９５Å、２．１×１００ｍｍ、１．８μｍ
移動相Ａ：５ｍＭ  ＮＨ４ＣＯＯ−／０．１％ギ酸；Ｂ：アセトニトリル中における０．１％ギ酸
流速：０．２ｍＬ／分；注入体積ｌμＬ
実行時間（平衡化を含む）：１５分間
検出：極性＋
【００６６】
【表２】
2021502108.tif 000004
【００６７】
参照調製物：３０ｍＭでアルギニン貯蔵溶液を調製する。１％のＢＳＡ／ＰＢＳ緩衝液中において４、１０、２５、７５、１００、１５０、２００及び２５０μΜでアルギニンの作業標準を調製する。約６０μｇ／ｍＬで、シネフリンの貯蔵溶液を調製する。以下で記載されるように試料前処理手法の回収率を標準化するために、シネフリンを内部標準として用いる。
【００６８】
試料前処理：５０μＬの血漿試料を１０μＬのシネフリン原料と共に添加した後、５４０μＬのＭｅＯＨを添加して、前記試料中のタンパク質を沈殿させる。完全な混合を確実にするためにボルテックスする。最大速度で遠心分離して沈殿物を遠心沈殿させた後、前記上清のＵＰＬＣ／ＭＳ分析を行う。アルギニンの標準物質（４〜２００μＭ）も上記と同じ試料処理手法に供した（シネフリン及びＭｅＯＨ沈殿を添加する）。
【００６９】
分析及び算出：試料中の選択生成物イオンの算出領域を用いて、参照標準物質に対するアルギニンの濃度を決定した。定量限界は、約５μΜである。
【００７０】
単回静脈（ＩＶ）送達を介して、健康なラットにおいて、アルギニン枯渇の潜在性を決定した。三つの共役体、すなわち、Ａ２０ＣＬ（２０ｋＤ直鎖状ＰＥＧと共役したアルギニン）、Ａ２０ＣＶ（２０ｋＤ「Ｖ」分枝鎖状ＰＥＧと共役したアルギニン）及びＡ４０ＣＹ（４０ｋＤ「Ｙ」分枝鎖状ＰＥＧと共役したアルギニン）を、誤算のために、それぞれ２．４ｍｇ／Ｋｇ、３．３ｍｇ／Ｋｇ及び２．８ｍｇ／Ｋｇで投与した。処置後の血漿中アルギニンを図８に示したが、これは、健康な雄性ラットにおいて、約５日間、（投与前レベルと比較して）血漿中アルギニンが９５％のアルギニン枯渇に成功したことを示す。
【００７１】
静脈送達によって１．２ｍｇ／ｋｇ及び０．４ｍｇ／ｋｇでＡ２０ＣＬの投与を受けたラットを用いて用量設定試験を行った後、血漿中アルギニン濃度のモニタリングを行った。結果を図９に示す。１．２ｍｇ／ｍＬのＡ２０ＣＬによる処置によって、血漿中アルギニンの低レベル（＜１０μΜ）が約５日間生じた。図１０に示されるように、処置の間、有意な体重減少は示されなかった。このことは、ＰＥＧ修飾アルギナーゼの耐容性が良好であることを示唆する。
【００７２】
直鎖状ＰＥＧ及び分枝鎖状ＰＥＧを、アルギニン枯渇のためのヒトアルギナーゼ１の修飾におけるそれらの潜在性に関して、一対一で比較した。Ｄａｙ０において、３匹の健康な雄性ラットに、２ｍｇ／ｋｇで、それぞれＡ２０ＣＬ及びＡ２０ＣＹを投与した。相対的な血漿中アルギニン濃度の結果を図１１に示す。示されるように、直鎖状形態の共役体及びＹ形態の共役体の両方は、連続的に少なくとも５日間、血漿中アルギニンの９０％を枯渇させることに成功する。
【００７３】
図１２に示されるように、直鎖状ＰＥＧ修飾アルギナーゼ又は分枝鎖状ＰＥＧ修飾アルギナーゼによる処置の間、有意な体重減少は示されなかった。このことは、直鎖状ＰＥＧ修飾アルギナーゼ及び分枝鎖状ＰＥＧ修飾アルギナーゼの両方の耐容性が良好であることを示唆する。
【００７４】
ヒトアルギナーゼ１の分子質量
Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５４０  ＵＨＤ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳシステムが連結されたＵＰＬＣシステムを用いて逆相（ＲＰ）クロマトグラフィによって、前記変異体ヒトアルギナーゼ１の分子質量を分析した。
【００７５】
前記精製アルギナーゼの質量スペクトルｍ／ｚを図１３に示すが、これは、３４，５７２．３Ｄａのデコンヴォルーション質量を示す。このことは、前記変異体ヒトキナーゼのアミノ酸配列（すなわち、Ｎ末端Ｍｅｔを有さない）から誘導された３４，５７１．６Ｄａの平均質量と良好に一致する。
【００７６】
ペプチドマッピング及び共役部位の決定
４Ｍの尿素の存在下で、２ｍｇ／ｍＬのタンパク質及び配列決定グレードの２％（ｗ／ｗ）Ｌｙｓ−Ｃを含む５０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８  緩衝液において、タンパク分解性溶液を調製した。室温で６時間のインキュベーションの後、前記反応物を急冷するためにＴＦＡ又はギ酸を添加し終濃度０．１％で得た。注入の前に、遠心分離によって、又は０．２μｍ又は０．４μｍの膜による濾過によって、沈殿物を除去した。
【００７７】
ＬＣ／ＭＳシステム、具体的には、Ａｇｉｌｅｎｔ  ６５４０  ＵＨＤ  Ａｃｃｕｒａｔｅ  Ｍａｓｓ  Ｑ−ＴＯＦ  ＬＣ／ＭＳシステムが連結されたＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムを用いて、ペプチド同定を行った。
【００７８】
下記の通りの、及び表３の条件を用いて、クロマトグラフィ手法を行った。
カラム：分子質量決定（上記参照）のために利用されたものと同じ
移動相及び勾配：
移動相Ａ：水中における０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
移動相Ｂ：１００％（ｖ／ｖ）アセトニトリル中における０．１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ
流速：０．４ｍＬ／分
注入：１０μｇ
【００７９】
【表３】
2021502108.tif 000005
【００８０】
ＬＣ−ＭＳが連結されたペプチドマッピングによって、ＰＥＧ化ヒトキナーゼ１のＰＥＧ化部位を同定した。４Ｍの尿素の存在下でリジン残基のＣ末端側上のペプチド結合を選択的に加水分解するエンドプロテイナーゼＬｙｓ−Ｃによってタンパク質を消化した。全てのタンパク分解性ペプチドを図１４に示されるように割り当てることに成功したが、リシルペプチドについては、表４にまとめた。前記ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼ１のペプチドマップは、Ｋ６ペプチドにおける共役を示すが、ここでＣｙｓ−４４がスルフヒドリル修飾を受けやすい唯一の部位である。
【００８１】
【表４】
2021502108.tif 000006
【００８２】
酵素活性及びキネティクス
５４０ｎｍの最大吸光度で発色団を生成するための加熱によって、強酸、チオセミカルバジド及びＦｅ３＋の存在下で、尿素のジアセチルモノキシム（ｄｉａｃｅｔｙｌｍｏｎｏｘｉｎｅ）（ＤＡＭＯ）誘導体化を検出することによって、触媒活性を決定した。アッセイは、１．２５ｍＭの検出下限で、０〜１５ｍＭの尿素の間、リニアーであることが示された。典型的には、３分間、あらかじめ３７℃に設定されたヒートブロック上で、３０μＬの血漿試料及び陽性対照を暖めることによって、反応を開始した。３０μＬのアルギニン基質を添加した後、前記混合物を、正確に５分間、３７℃でインキュベートした後、３０μＬの２５％トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）の添加によって急冷を行った。遠心分離の後、１０μＬの作業尿素標準、試料／陽性対照又はブランク対照を３００μＬの発色試薬（ＤＡＭＯ及びチオセミカルバジドを含む）と混合し、前記混合物を、正確に１０分間、あらかじめ１００℃に設定された熱ブロック上でインキュベートした。得られた試料の５４０ｎｍにおける吸光度を測定して、尿素濃度を決定した。アルギナーゼ活性の単位は、毎分１μモルの尿素生成と定義される。
【００８３】
経時的な血漿中のアルギナーゼ活性を図１５に示す。算出されたＡ２０ＣＬ及びＡ２０ＣＹの半減期（ｔｌ／２）は、それぞれ１７．０時間及び１７．６時間であった。Ｄａｙ５の後で採取した血漿試料中において、活性は検出されなかった。
【００８４】
酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）
サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて、ＰＥＧ化ヒトアルギナーゼ１の血漿中濃度を決定した。前記アッセイでは、捕捉抗体としてヒトアルギナーゼ１に特異的なウサギポリクローナル抗体（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  ＃１１５５８−ＲＰ０１）、検出抗体としてＨＲＰ結合抗ヤギＩｇＧ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＨＡＦ０１７）と共にヒツジポリクローナル抗アルギナーゼ抗体（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ＃ＡＦ５８６８）を利用した。
【００８５】
２ｍｇ／ｋｇにおけるＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１の単回ＩＶ投与の後の免疫活性ＰＥＧ修飾ヒトアルギナーゼ１の血漿中濃度のＥＬＩＳＡ試験の結果を図１６に示す。（２０ＬのＰＥＧと共役した）Ａ２０ＣＬ及び（２０Ｙ  ＰＥＧと共役した）Ａ２０ＣＹの血漿中濃度は、投与の２４時間後において、それぞれ１０１３±１１９ｎｇ／ｍＬ及び２２３９±２５７ｎｇ／ｍＬであった。投与前及び投与の１２０時間後に採取した全試料の濃度は、検出限界（１６０ｎｇ／ｍＬ）未満であった。しかるに、それぞれＡ２０ＣＬ及びＡ２０ＣＹについて２２．６時間及び２０．３時間において半減期を算出したが、それは示される酵素活性についての半減期と一致する。
【００８６】
配列修飾組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡｒｇ）の阻害効果を増強するため、本発明者らは、同時にｒｈＡｒｇ及びアスパラギナーゼ（ＡＳＮａｓｅ）を用いて癌細胞からアルギニン及びアスパラギンを欠乏させた。本発明者らは、アミノ酸交換因子としてのアスパラギンの役割のため、アスパラギン欠乏が少なくともアルギニン欠乏の効果と相補的な効果を有する可能性があると考える。アスパラギンは、細胞内へのアルギニン移入を調節することが可能であり、したがって、アルギニン媒介ｍＴＯＲＣ１活性化に影響を及ぼす可能性があると考えられる。本発明者らは、アスパラギンの欠乏が、細胞内においてｍＴＯＲＣ１の方へのアルギニン輸送を減退させる可能性があるという理論を立てる。
【００８７】
癌細胞内のアスパラギンの欠乏の影響は、前記細胞内に存在するアスパラギン生成酵素アスパラギンシンテターゼ（ＡＳＮＳ）の量に依存する可能性がある（Ｒｉｃｈａｒｄｓ及びＫｉｌｂｅｒｇ  ２００６；Ｂａｌａｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈら、２０１３；Ｌｉｕ，Ｄｏｎｇら、２０１３）。前記影響を評価するため、これによって、本発明者らは、（ｉ）比較的低いＡＳＮＳを発現する乳房細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＣＦ７、ＺＲ−７５−１（Ｙａｎｇ，Ｈｅら、２０１４）、（ｉｉ）高ＡＳＮＳ発現細胞系ＨｅＬａ（Ｇｕｅｒｒｉｎｉ，Ｇｏｎｇら、１９９３）、ＭＩＡ−Ｐａｃａ−２（Ｌｉｕ，Ｄｏｎｇら、２０１３）及びＨｅｐＧ２（Ｇｊｙｍｉｓｈｋａ，Ｓｕら、２００９）を処置するために、ｒｈＡｒｇ及びＡＳＮａｓｅを利用することができた。個別の各薬物（ｒｈＡｒｇ、ＡＳＮａｓｅ）及び組み合わせの有効性を比較した。
【００８８】
例
組換えヒトアルギナーゼ（ｒｈＡｒｇ）の発現、精製及びＰＥＧ化のための例示的な手法は、上記で詳細に記載される。アルギナーゼの一つの単位は、３０℃、ｐＨ８．５で１分間当たり１μｍｏｌ尿素を生成する酵素の量として定義される。アスパラギナーゼ（ＡＳＮａｓｅ）をＳｉｇｍａ（Ａ３８０９）から購入した。
【００８９】
ＭＴＴアッセイ：低ＡＳＮＳ発現乳癌細胞系（ＭＣＦ−７、ＺＲ−７５−１及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１）及び高ＡＳＮＳ発現癌細胞系（ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２及びＭＩＡ−Ｐａｃａ−２）をＡＴＣＣから購入した。細胞を５×１０３個／ウェルの密度で９６ウェル平板内に播種した。インキュベーションの１日後に、前記培養培地を各種濃度のｒｈＡｒｇを含む培地で置換した。結合アッセイ（すなわち、アルギナーゼ及びアスパラギナーゼを利用する）のために、前記培養培地を一定のモル比（例えば、５（ｒｈＡｒｇ）：１（ＡＳＮａｓｅ））で異なる濃度のｒｈＡｒｇ及びＡＳＮａｓｅを含む培地で置換した（Ｃｈｏｕ  ２０１０）。前記ＭＴＴアッセイをＤａｙ３（薬物処置の３日後）において行った。前記培養培地をＭＴＴ溶液（１ｍｇ／ｍＬ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で置換し、３７℃で４時間インキュベートした。インキュベーションの４時間後、ＭＴＴ溶液をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）で置換し、５７０ｎｍにおける吸光度を６５０ｎｍの基準で測定した。処置細胞の吸光度を未処置細胞の平均吸光度で割ることによって細胞生存度を決定した。各細胞系について三つの独立した組の実験（ｎ＝３）を行った。Ｐｒｉｓｍ（商標）バージョン６．０１を用いてデータを分析した。
【００９０】
併用指数（ＣＩ）の算出：ＣａｌｃｕＳｙｎ（商標）バージョン２．１を用いてｒｈＡｒｇ及びＡＳＮａｓｅ処置の併用指数を算出した。ＣＩは、添加（ＣＩ＜１、相乗的）効果を超える、添加（ＣＩ＞１（拮抗的））効果より低い、又は添加（ＣＩ＝１）効果と同等など、前記薬物の併用効果についての値を提供する。
【００９１】
本発明者らは、ＡＳＮａｓｅ単独が、低ＡＳＮＳ発現細胞系及び高ＡＳＮＳ発現細胞系の大部分に対する良好な阻害効果を提供しないことを見出した。（ｉ）低ＡＳＮＳ発現癌細胞及び（ｉｉ）高ＡＳＮＳ発現癌細胞におけるＡＳＮａｓｅの用量反応曲線を図１７に示す。ＡＳＮａｓｅは、０．０１６〜０．４Ｕ／ｍＬの範囲の低阻害効果（２０％未満の細胞阻害）を示した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＺＲ−７５−１、ＭＣＦ７、ＨｅＬａ及びＨｅｐＧ２において、６０〜７０％の細胞生存度を検出することが可能である。ＭＩＡ−Ｐａｃａ−２において、約４０％の細胞生存度が検出された。
【００９２】
驚くべきことに、ｒｈＡｒｇ及びＡＳＮａｓｅの併用は、低ＡＳＮＳ発現細胞系において、ｒｈＡｒｇ単独と比較して、実質的に向上した阻害効果を提供する。図１８に示される通りの、（ｉ）低ＡＳＮＳ発現癌細胞及び（ｉｉ）高ＡＳＮＳ発現癌細胞における、ｒｈＡｒｇ単独の用量反応曲線（実線）並びにｒｈＡｒｇ及びＡＳＮａｓｅの併用の用量反応曲線（破線）。低ＡＳＮＳ発現細胞系において、ｒｈＡｒｇ及びＡＳＮａｓｅの併用処置は、各種濃度において、急激に向上した細胞阻害効果を提供した。ｒｈＡｒｇ−ＡＳＮａｓｅの併用処置は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１における阻害効果の良好な向上を示した。高ＡＳＮＳ発現細胞系において、併用処置は、平均的に、阻害効果をわずかに向上させた（＜５％）。本発明者らは、ｒｈＡｒｇ−ＡＳＮａｓｅ併用治療が、高ＡＳＮＳ発現細胞系ではなく、低ＡＳＮＳ発現細胞系において、予想外の強い相乗効果を提供することを見出した。
【００９３】
濃度が異なるｒｈＡｒｇ及びＡＳＮａｓｅの併用の併用指数（ＣＩ）を表５に示す。驚くべきことに、低ＡＳＮＳ発現細胞系ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＺＲ−７５−１及びＭＣＦ７について、前記併用の全てが、癌細胞増殖の阻害に対する相乗効果（ＣＩ＜１）を示した。高ＡＳＮＳ発現細胞系ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２及びＭＩＡ−Ｐａｃａ２について、ｒｈＡｒｇ及びＡＳＮａｓｅの前記併用のほとんどが、細胞増殖の阻害に対する拮抗効果（ＣＩ＞１）を示した。
【００９４】
【表５】
2021502108.tif 000007
【００９５】
本発明者らは、アスパラギン単独の欠乏が、癌細胞に対する阻害効果をほとんど提供しないことを見出した。そのようなアスパラギン欠乏単独は、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）を除いて、癌を処置するための有効な方法であるとは思われない。本発明者らは、これらの白血病細胞におけるアスパラギンシンテターゼ（ＡＳＮＳ）の低発現によるＡＬＬに対するＡＳＮａｓｅの有効性の理論を立てる（Ｓｕ，Ｐａｎら、２００８）。
【００９６】
本発明者らは、上記で記載される通りの併用治療において、アルギニン欠乏が、ｍＴＯＲＣ１の非活性化を提供する可能性があり、一方でアスパラギン欠乏が、細胞内におけるｍＴＯＲＣ１タンパク質へのアルギニンの移入を減退させる可能性があるという理論を立てる。高ＡＳＮＳ発現レベルによってグルタミンからアスパラギンが生成される可能性があるので、前記併用治療の有効性は、前記癌細胞のＡＳＮＳ発現レベルに影響を受ける可能性がある（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ及びＭｅｉｓｔｅｒ  １９７２）。ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２及びＭＩＡ−Ｐａｃａ２は、高ＡＳＮＳ発現レベルを示すが、低ＡＳＮＳレベルを示す癌細胞と比較して、併用治療において示される向上は小さかった。ＣＩ算出によって、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＺＲ−７５−１及びＭＣＦ７などの低ＡＳＮＳ発現細胞系が、ほとんどの併用濃度において、言及されたｒｈＡｒｇ−ＡＳＮａｓｅ相乗効果を示すことが示される。しかし、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２及びＭＩＡ−Ｐａｃａ２などの高ＡＳＮＳ発現細胞系において、低い相乗効果が認められる。その結果は、細胞生存度アッセイと一致していた。本発明者らは、高ＡＳＮＳ発現細胞系が、充分なアスパラギンを生成して、前記併用治療の有効性を弱める可能性があるという理論を立てる。本発明者らは、ＡＳＮＳの発現レベルが、ｒｈＡｒｇ−ＡＳＮａｓｅ併用治療の有効性を予測するために使用され得るものであり、テーラーメイド薬物治療を開発するために有用であり得ると考える。
【００９７】
各種癌細胞系におけるアルギナーゼ及びアスパラギナーゼによる併用治療の結果に基づいて、本発明者らは、癌処置のために、インビトロでアルギニン及びアスパラギンと同時に、グルタミンも欠乏させる可能性があると考える。グルタミン欠乏治療の有効性は、ｃ−ＭＹＣ発現の発現レベルに大きく依存する（Ｗｉｓｅ及びＴｈｏｍｐｓｏｎ  ２０１０）。本発明者らは、アルギニン（アルギナーゼなど）、アスパラギン（アスパラギナーゼなど）及びグルタミン（アミノトランスフェラーゼ阻害剤アミノオキシ酢酸若しくはＡＯＡ、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アザセリン及び／又はアシビシンなど）を減少させるための化合物による併用治療が、癌細胞の増殖の阻害に非常に有効である可能性があると考える。理論に束縛されるものではないが、本発明者らは、アルギニン、アスパラギン及びグルタミンの欠乏は、（例えば、ｒｈＡｒｇによる）アルギニン除去によってｍＴＯＲＣ１を非活性化させる可能性があり、（例えば、ＡＳＮａｓｅ及びＡＯＡによる）アスパラギン及びグルタミンの低減によって細胞内のアルギニン濃度を低レベルに維持することができるという仮説を立てる。
【００９８】
上記方法を用いて、アルギナーゼを高効率性でＰＥＧ化し、高い純度、比活性及び収率で単離することが可能である。そのようなＰＥＧ化アルギナーゼは、インビトロで延長された半減期を示し、アルギニン濃度の低下に有効であり、耐容性が良好である。したがって、本発明者らは、上記のように単離され、共役させたアルギナーゼが、癌の処置における治療用途に、特にそのような癌が低アスパラギナーゼ活性を示す場合、特に良好に適していると考える。アスパラギナーゼと併用して用いられる場合における異なる癌細胞系に対する予想外で且つ著しい相乗効果のエビデンスに基づいて、本発明者らは、上記のように調製され、アスパラギナーゼと併用して用いられるＰＥＧ化アルギナーゼが、癌の処置において同様の相乗効果を提供することができると考える。血清半減期を延長するために、そのような処置方法で利用されるアスパラギナーゼをＰＥＧ化することも可能であるか、又は同様の親水性ポリマーと共役させることも可能である。
【００９９】
好ましい実施形態において、同様の薬物動態を示すアルギナーゼ及びアスパラギナーゼを提供することによって、同時投与が可能になる。そのような酵素は、注射、注入及び／又は（例えば、吸入による）粘膜全体にわたる吸着を含む任意の適切な方法によって提供され得る。適切な処置スケジュールを、利用される前記酵素の薬物動態によって決定することが可能であり、異なる腫瘍の型及び／又は表現型を順応するために適合させることが可能である。例えば、比較的高いレベルのアスパラギナーゼを発現する腫瘍を有する個体を、より低いレベルのアスパラギナーゼを発現する腫瘍を有する個体と比較して、より頻回に、且つ／又は、より高い用量のアルギナーゼ及び／若しくはアスパラギナーゼで処置することが可能である。適切な処置プロトコルは、１２時間毎、２４時間毎、３６時間毎、４８時間毎、３日毎、４日毎、５日毎、７日毎、１０日毎、１４日毎、２１日毎、２８日毎又は２８日超毎のアルギナーゼ、アスパラギナーゼ並びに／又はアルギナーゼ及びアスパラギナーゼの混合物の投与を含むことができる。いくつかの実施形態において、投与の頻度は、処置の過程にわたって変動することが可能であり、初期の処置の期間を超えて延長する維持投与を含むことが可能である。好ましい実施形態において、アルギナーゼを上記のように調製されるＰＥＧ化アルギナーゼとして提供し、アスパラギナーゼをＰＥＧ化形態で提供することもできる。上記したように、アミノトランスフェラーゼ阻害剤の使用によるグルタミンの低減は癌細胞の増殖の低減に有用であると、本発明者らも考える。したがって、上記で記載される通りのアルギナーゼ／アスパラギナーゼ処置プロトコルは、グルタミン（アミノオキシ酢酸若しくはＡＯＡ、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、アザセリン及び／又はアシビシンなど）の血中濃度を低下させるために有効なアミノトランスフェラーゼ阻害剤の使用を含むことができる。
【０１００】
参考文献
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【０１０１】
本明細書における本発明の概念を逸脱することなく、すでに記載されているものに加えて、さらに多くの変更が可能であることは、当業者にとって明らかであるべきである。ゆえに、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲の精神を除いて制限されるものではない。その上、本明細書及び特許請求の範囲の両方の解釈において、全ての用語は、文脈に合わせた最も幅広い可能な方法で解釈されるべきである。特に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、非排他的方法で要素、構成要素又は工程を参照するものと解釈されるべきであり、このことは、前記参照された要素、構成要素又は工程が存在する可能性があるか、利用され得るか、又は明示的に参照されない他の要素、構成要素若しくは工程と組み合わされ得ることを示す。本明細書が、Ａ、Ｂ、Ｃ・・・及びＮから成る群から選択されるものの内の少なくとも一つを主張し、参照する場合、前記文は、Ａ＋Ｎや、Ｂ＋Ｎなどではなく、前記群からの一つの要素だけを必要とするものと解釈されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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