(57)【要約】【課題】  インキュベータ内の細胞サンプルを自動的に画像化及び分析するためのシステム及び方法が提供する。【解決手段】  作動顕微鏡は、数日、数週間、又は数か月にわたってサンプル容器のウェル内のサンプルの画像を生成するように動作する。特定のウェルの各スキャンについて複数の画像が生成され、そのようなスキャン内の画像は、ウェル内の代謝的に活性な細胞を画像化及び分析するために使用される。この分析は、最大強度値から各画素について、スキャンにわたって、最小強度値を減算することによって「範囲画像」を生成することを含む。したがって、この範囲画像は、スキャン期間にわたって活性の変化を示す細胞又は細胞の一部（例えば、ニューロン、筋細胞、心筋細胞）を強調し、一方、画像化の際に一貫して高い強度を示す領域（例えば、細胞活性とは無関係な大量の自己蛍光を示す領域）を脱強調する。【選択図】無し【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養容器の動画をキャプチャすることと、
前記動画から静的な範囲画像を生成することと、を含み、前記範囲画像は、完全なスキャン期間にわたって、各ピクセル位置において、最大蛍光強度から減算された最小蛍光強度を表すピクセルで構成される、方法。
【請求項２】
前記範囲画像をセグメント化することによって、オブジェクトを定義することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オブジェクトから、前記完全なスキャン期間からの平均オブジェクト平均強度を導出することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記オブジェクトから、前記完全なスキャン期間にわたるすべてのオブジェクトトレースのペアワイズ相関分析を導出することをさらに含む、請求項２又は３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
前記オブジェクトから、前記完全なスキャン期間からすべてのオブジェクトの平均バースト持続時間の平均を導出することをさらに含む、請求項２〜４のいずれかに記載の方法。
【請求項６】
前記オブジェクトから、前記完全なスキャン期間からすべてのオブジェクトの各バーストの強度を導出することをさらに含む、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記完全なスキャン期間からのすべてのオブジェクトの平均バースト強度の平均として、全体的なバースト強度メトリックを導出することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
１つ以上の期間中に生物学的活性細胞を同定する方法であって、前記方法は、前記１つ以上の期間の各々について、
ａ．サンプル容器内に含有されるサンプルの複数の蛍光活性画像を生成することであって、前記サンプルは、生物学的活性細胞を含み、前記複数の蛍光活性画像の各画像は、それぞれの複数のピクセル値を含み、各ピクセル値は、画像フレーム内のそれぞれのピクセル位置に対応する、生成することと、
ｂ．前記複数の蛍光活性画像から蛍光範囲画像を生成することであって、複数の蛍光活性画像から蛍光範囲画像を生成することは、前記蛍光範囲画像について複数のピクセル値を決定することを含み、前記蛍光範囲画像について所与のピクセル値を決定することは、前記複数の蛍光活性画像の各々から、前記画像フレーム内の前記所与のピクセル値のピクセル位置に対応するピクセル位置を有するピクセル値のセットの範囲を決定することを含む、生成することと、
ｃ．前記蛍光範囲画像に基づいて、対応する期間中の前記サンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトの、前記画像フレームに対する位置を決定することであって、前記１つ以上の活性オブジェクトの各々は、前記対応する期間中に前記サンプル内に存在する少なくとも１つのそれぞれの生物学的活性細胞の一部分である、決定することと、
ｄ．前記対応する期間中の前記サンプル容器内の前記１つ以上の活性オブジェクトの各活性オブジェクトについて、前記対応する期間にわたる前記１つ以上の活性オブジェクトの各々のそれぞれの時間変化活性レベルを決定することと、を含む、方法。
【請求項９】
１つ以上の期間中に生物学的活性細胞を同定する方法であって、前記方法は、前記１つ以上の期間の各々について、
ａ．サンプル容器内に含有されるサンプルの複数の蛍光活性画像を生成することであって、前記サンプルは、生物学的活性細胞を含み、前記複数の蛍光活性画像の各画像は、それぞれの複数のピクセル値を含み、各ピクセル値は、画像フレーム内のそれぞれのピクセル位置に対応する、生成することと、
ｂ．前記複数の蛍光活性画像から蛍光範囲画像を生成することであって、複数の蛍光活性画像から蛍光範囲画像を生成することは、前記蛍光範囲画像について複数のピクセル値を決定することを含み、前記蛍光範囲画像について所与のピクセル値を決定することは、前記複数の蛍光活性画像の各々から、前記画像フレーム内の前記所与のピクセル値のピクセル位置に対応するピクセル位置を有するピクセル値のセットの範囲を決定することを含む、生成することと、
ｃ．前記蛍光範囲画像に基づいて、対応する期間中の前記サンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトの、前記画像フレームに対する位置を決定することであって、前記１つ以上の活性オブジェクトの各々は、前記対応する期間中に前記サンプル内に存在する少なくとも１つのそれぞれの生物学的活性細胞の一部分である、決定することと、
ｄ．前記対応する期間中の前記サンプル容器内の前記１つ以上の活性オブジェクトの各活性オブジェクトについて、前記対応する期間にわたる前記１つ以上の活性オブジェクトの各々のそれぞれの時間変化活性レベルを決定することを含み、各時間変化活性レベルは、前記複数の蛍光活性画像の各々から、対応する活性オブジェクトの前記決定された位置に近接したピクセル位置を有するピクセル値のセットに基づいて決定される、決定することと、を含む、方法。
【請求項１０】
前記サンプル容器は、インキュベータ内に位置する、請求項８〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
特定の期間中の特定の活性オブジェクトの時間変化活性レベルを決定することは、
前記特定の期間中に生成された前記複数の蛍光活性画像の各々から、前記特定の活性オブジェクトの前記決定された位置に近接したピクセル位置を有する、ピクセル値のセットに基づいて、未修正の時間変化活性レベルを決定することと、
前記未修正の時間変化活性レベルに基づいて、前記特定の期間にわたる前記特定の活性オブジェクトの光退色の時間変化活性レベルを決定することと、
前記未修正の時間変化活性レベルから前記光退色の時間変化レベルを除去することによって、前記特定の期間中の前記特定の活性オブジェクトの前記時間変化活性レベルを決定することと、を含む、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の期間の第１の期間及び前記１つ以上の期間の最終期間は、２４時間を超えて時間的に離隔されている、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の期間の第１の期間及び前記１つ以上の期間の最終期間は、３日を超えて時間的に離隔されている、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の期間の第１の期間及び前記１つ以上の期間の最終期間は、３０日を超えて時間的に離隔されている、請求項８〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の期間は、指定された割合で経時的に規則的に離間している、請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記指定された割合は、１日よりも大きい、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記指定された割合は、１日２回よりも大きい、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の期間のうちの少なくとも２つの期間は、２４時間以内に生じる、請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記１つ以上の期間のうちの少なくとも３つの期間は、２４時間以内に生じる、請求項８〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の期間の第１の期間中に位置する活性オブジェクトと、前記１つ以上の期間の異なる期間中に位置する活性オブジェクトとは、前記サンプル内の同じ生物学的活性細胞の部分である、請求項８〜１９のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の期間の特定の期間中に前記サンプル容器内の前記１つ以上の活性オブジェクトに対して決定された前記時間変化活性レベルに基づいて、前記特定の期間中の前記サンプル容器内の活性オブジェクトの各ペア間のパターン又は協調度のうちの少なくとも１つを決定することと、
前記特定の期間中に、前記サンプル容器内の活性オブジェクトの各ペア間のパターン又は協調度の度合いのうちの前記決定された少なくとも１つを表示することと、をさらに含む、請求項８〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記生物学的活性細胞は、ニューロン、平滑筋細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、又は分泌細胞のうちの少なくとも１つを含む、請求項８〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記１つ以上の期間の特定の期間中に前記サンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトについて決定された前記時間変化活性レベルに基づいて、活性オブジェクトのサブセットを選択することをさらに含み、前記特定の期間中の前記サンプル容器内の前記１つ以上の活性オブジェクトから特定の活性オブジェクトを選択することは、前記特定の活性オブジェクトについて決定された前記時間変化活性レベルが少なくとも１つのバーストを示すことを決定することを含む、請求項８〜２２のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記活性オブジェクトの選択されたサブセットについて決定された前記時間変化活性レベルに基づいて、前記活性オブジェクトの選択されたサブセット内の活性オブジェクトの各ペア間のパターン又は協調度の少なくとも１つを決定することと、
前記活性オブジェクトの選択されたサブセット内の活性オブジェクトの各ペア間の前記決定されたパターン又は協調度の少なくとも１つを表示することと、をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプル容器内の前記１つ以上の活性オブジェクトの前記画像フレームに対する位置を決定することは、前記ピクセル位置の１つ以上のセットを決定することを含み、各セットは、前記１つ以上の活性オブジェクトのそれぞれの活性オブジェクトの前記画像フレーム内の範囲に対応する、請求項８〜２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
前記１つ以上の期間の特定の期間中に前記特定の活性オブジェクトについての時間変化活性レベルを決定することは、前記特定の活性オブジェクトに対応する前記決定されたピクセル位置のセットに対応する、前記特定の期間にわたるピクセル値の総活性レベルを決定することを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記１つ以上の期間の特定の期間についての複数の蛍光画像を生成することは、前記複数の蛍光活性画像を生成するために顕微鏡を操作することを含み、前記方法は、
前記特定の期間について前記の複数の蛍光画像を生成する前に、前記顕微鏡が前記特定の期間についての前記サンプルの前記複数の蛍光活性画像を生成できるように、作動したガントリを操作して前記サンプル容器に対して前記顕微鏡を配置することをさらに含む、請求項８〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上の期間の特定の期間に対応する特定の複数の蛍光活性画像の各前記蛍光活性画像に表される前記サンプルのそれぞれの光退色の程度を決定することと、
前記特定の期間についての前記蛍光範囲画像を生成する前に、前記特定の複数の蛍光活性画像の各々の前記蛍光活性画像を、前記それぞれの決定された光退色度に従って修正することと、をさらに含む、請求項８〜２７のいずれかに記載の方法。
【請求項２９】
前記生物活性細胞は、前記生物活性細胞の活性レベルに関連する蛍光特性を有するフルオロフォアを含み、前記サンプルの所定の蛍光活性画像を生成することは、前記フルオロフォアの励起波長において前記サンプルを照明することと、前記フルオロフォアの放射波長において前記サンプルから応答的に発出される光を画像化することと、をさらに含む、請求項８〜２８のいずれかに記載の方法。
【請求項３０】
前記フルオロフォアは、カルシウム感受性フルオロフォアを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
それぞれの決定された時間変化活性レベルに基づいて、前記１つ以上の期間の少なくとも１つの期間中の前記オブジェクトの１つ以上についてのそれぞれの平均強度レベルを決定することをさらに含む、請求項８〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３２】
それぞれの決定された時間変化活性レベルに基づいて、前記１つ以上の期間の少なくとも１つの期間中の前記オブジェクトの１つ以上のそれぞれのバースト割合を決定することをさらに含む、請求項８〜３０のいずれかに記載の方法。
【請求項３３】
１つ以上の期間中に生物学的活性細胞を同定する方法であって、前記方法は、前記１つ以上の期間のそれぞれについて：
ａ．サンプル容器内に含まれるサンプルの複数の蛍光活性画像を生成することであって、前記サンプルは生物学的活性細胞を含み、前記複数の蛍光活性画像の各画像はそれぞれの複数のピクセル値を含み、各ピクセル値はそれぞれ、画像フレーム内のピクセル位置に対応する、生成することと、
ｂ．対応する期間中の前記サンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトの前記画像フレームに対する位置を決定することであって、前記１つ以上の活性オブジェクトのそれぞれは、前記対応する期間中の前記サンプル内に存在する少なくとも１つのそれぞれの生物学的活性細胞の部分である、決定することと、
ｃ．前記対応する期間中の前記サンプル容器内の前記１つ以上の活性オブジェクトのそれぞれについて、前記対応する期間にわたるそれぞれの時間変化活性レベルを決定することと、
ｄ．前記１つ以上の活性オブジェクトについて決定された前記時間変化活性レベルに基づいて、前記１つ以上の活性オブジェクトから活性オブジェクトのサブセットを選択することであって、前記１つ以上の活性オブジェクトから特定の活性オブジェクトを選択することは、特定の活性オブジェクトについて決定された前記時間変化活性レベルが、少なくとも１つのバーストを示すことを決定する、選択することと、を含む、方法。
【請求項３４】
１つ以上の期間中に生物学的活性細胞を同定する方法であって、前記方法は、１つ以上の期間のそれぞれについて、
ａ。サンプル容器内に含まれるサンプルの複数の蛍光活性画像を生成することであって、前記サンプルは生物学的活性細胞を含み、前記複数の蛍光活性画像の各画像はそれぞれの複数のピクセル値を含み、各ピクセル値は画像フレーム内のそれぞれのピクセル位置に対応する、生成すること、
ｂ．対応する期間中の前記サンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトの前記画像フレームに対する位置を決定することであって、前記１つ以上の活性オブジェクトのそれぞれは、前記対応する期間中の前記サンプル内に存在する、少なくとも１つのそれぞれの生物学的活性細胞の部分である、決定すること。
ｃ．前記対応する期間中の前記サンプル容器内の前記１つ以上の活性オブジェクトの各々について、前記１つ以上の活性オブジェクトの前記それぞれの決定された位置に近接したピクセル位置を有する、前記複数の蛍光活性画像の各々からのピクセル値のそれぞれのセットに基づいて、前記対応する期間にわたるそれぞれの時間変化活性レベルを決定することと、
ｄ．前記１つ以上の活性オブジェクトについて決定された前記時間変化活性レベルに基づいて、前記１つ以上の活性オブジェクトから活性オブジェクトのサブセットを選択することであって、前記１つ以上の活性オブジェクトから特定の活性オブジェクトを選択することは、前記特定の活性オブジェクトについて決定された前記時間変化活性レベルが、少なくとも１つのバーストを示す、選択することと、を含む、方法。
【請求項３５】
前記サンプル容器がインキュベータ内に配置されている、請求項３３〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
特定の期間中の特定の活性オブジェクトの時間変化活性レベルを決定することは、
前記特定の期間中に生成された前記複数の蛍光活性画像の各々から、前記特定の活性オブジェクトの前記決定された位置に近接したピクセル位置を有するピクセル値のセットに基づいて未修正の時間変化活性レベルを決定すること、
前記未修正の時間変化活性レベルに基づいて、前記特定の期間にわたる前記特定の活性オブジェクトの光退色の時間変化レベルを決定することと、
前記特定の期間中の前記特定の活性オブジェクトの前記時間変化活性レベルを、前記未修正の時間変化活性レベルから前記時間変化レベルの光退色を除去することによって決定することと、を含む、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３７】
前記１つ以上の期間の第１の期間及び前記１つ以上の期間の最終期間は、２４時間よりも長い時間で離隔される、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記１つ以上の期間の第１の期間及び前記１つ以上の期間の最終期間が３日よりも長い時間で離隔される、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ以上の期間の第１の期間及び前記１つ以上の期間の最終期間は、３０日よりも長い時間で離隔される、請求項３３〜３５のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記１つ以上の期間は、指定された割合で経時的に規則的に離間している、請求項３３〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記指定された割合は、１日よりも大きい、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記指定された割合は、１日２回よりも大きい、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記１つ以上の期間のうちの少なくとも２つが２４時間以内に生じる、請求項３３〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記１つ以上の期間のうちの少なくとも３つが２４時間以内に生じる、請求項３３〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記１つ以上の期間の第１の期間中に位置する前記活性オブジェクト及び前記１つ以上の期間の異なる期間中に位置する活性オブジェクトは、前記サンプル内の前記同じ生物学的活性細胞の部分である、請求項３３〜４４のいずれかに記載の方法。
【請求項４６】
前記１つ以上の期間の特定の期間中に前記サンプル容器内の前記１つ以上の活性オブジェクトについて決定された前記時間変化活性レベルに基づいて、前記特定の期間中の前記サンプル容器内の活性オブジェクトの各ペア間のパターン又は協調度の少なくとも１つを決定することと、
前記特定の期間中に、前記サンプル容器内の活性オブジェクトの各ペア間のパターン又は協調度のうちの前記決定された少なくとも１つを表示することと、をさらに含む、請求項３３〜４５のいずれかに記載の方法。
【請求項４７】
前記生物学的活性細胞は、ニューロン、平滑筋細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、又は分泌細胞の少なくとも１つを含む、請求項３３〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記サンプル容器内の前記１つ以上の活性オブジェクトの前記画像フレームに対する位置を決定することは、前記ピクセル位置の１つ以上のセットを決定することを含み、各セットは、前記１つ以上の活性オブジェクトのそれぞれの活性オブジェクトの前記画像フレーム内の範囲に対応する、請求項３３〜４７のいずれかに記載の方法。
【請求項４９】
前記１つ以上の期間の特定の期間中に特定の活性オブジェクトの時間変化活性レベルを決定することは、前記特定の活性オブジェクトに対応する前記決定されたピクセル位置のセットに対応する、前記特定の期間にわたるピクセル値の総活性レベルを決定することを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記１つ以上の期間の特定の期間についての複数の蛍光画像を生成することは、顕微鏡を操作して前記複数の蛍光活性画像を生成することを含み、前記方法は、
前記特定の期間についての前記複数の蛍光画像を生成する前に、前記顕微鏡が前記特定の期間についての前記サンプルの前記複数の蛍光活性画像を生成できるように、作動したガントリを操作して前記サンプル容器に対して前記顕微鏡を配置することをさらに含む、請求項３３〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記１つ以上の期間の特定の期間に対応する特定の複数の蛍光活性画像の各蛍光活性画像において表されるサンプルのそれぞれの光退色度を決定することと、
前記特定の期間の前記蛍光範囲画像を生成する前に、前記特定の複数の蛍光活性画像のそれぞれの前記蛍光活性画像を、前記それぞれの決定された光退色度に従って補正することと、をさらに含む、請求項３３〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記生物学的活性細胞は、前記生物学的活性細胞の活性レベルに関連する蛍光特性を有するフルオロフォアを含み、前記サンプルの所定の蛍光活性画像を生成することは、前記フルオロフォアの励起波長で前記サンプルを照明することと、前記フルオロフォアの発光波長で前記サンプルから応答的に発出される光を画像化することと、をさらに含む、請求項３３〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記フルオロフォアは、カルシウム感受性フルオロフォアを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
それぞれの決定された時間変化活性レベルに基づいて、前記１つ以上の期間の少なくとも１つの間の前記オブジェクトの１つ以上のそれぞれの平均強度レベルを決定することをさらに含む、請求項３３〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
それぞれの決定された時間変化活性レベルに基づいて、前記１つ以上の期間の少なくとも１つの間の前記オブジェクトの１つ以上のそれぞれのバースト割合を決定することをさらに含む、請求項３３〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５６】
非一時的コンピュータ可読媒体であって、コンピューティングデバイスの１つ以上のプロセッサによって実行される場合、前記コンピューティングデバイスに、請求項１〜５５のいずれかに記載の方法を実行するコンピュータ操作を実行させる、少なくともコンピュータ可読命令を格納するように構成されている、非一時的コンピュータ可読媒体。
【請求項５７】
システムであって、
１つ以上のプロセッサと、
非一時的コンピュータ可読媒体であって、前記１つ以上のプロセッサによって実行される場合、前記システムに、請求項１〜５５のいずれかに記載の方法を実行させる、少なくともコンピュータ可読命令を格納するように構成されている非一時的コンピュータ可読媒体と、を備える、システム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／５８４，３８８号の優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
細胞（例えば、培養細胞、外植組織サンプル）は、適用された条件に対する細胞の反応を評価するために、様々な培地中でインキュベートし、様々な条件（温度、溶存ガスレベル、放射線、湿度、添加物質、電界又は磁場、ウイルス、微生物など）にさらすことができる。適用された条件に対する細胞の反応は、薬物又は治療の有効性を評価するために、物質の毒性（例えば、実験薬物又は治療の毒性）を評価するために、細胞の遺伝子修飾の効果を研究するために、細胞及び／若しくはそこから形成された組織のメタボロミクス、構造、又は他の特性を研究するために、又は何らかの他の情報を決定するために、測定することができる。この評価には、インキュベータからサンプルを取り出すことと、それを画像化すること（例えば、蛍光顕微鏡又は他の画像化装置を使用して）と、が含まれる。この画像化は、サンプルの破壊をもたらす可能性がある造影剤又は化学試薬の添加を含むことができる。しかしながら、この方法は、画像化中のサンプルを摂動させ、したがって、サンプルの母集団の反応を経時的に評価するためには、それぞれの異なる持続時間の間、複数セットのサンプルがインキュベートされることを要求する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示の一態様は、（ｉ）細胞培養容器の動画をキャプチャすることと、（ｉｉ）この動画から静的範囲画像を生成することであって、この範囲画像は、完全なスキャン期間にわたって各ピクセル位置で最大蛍光強度から減算された最小蛍光強度を表すピクセルで構成される、生成することと、を含む、方法に関する。
【０００４】
本開示の別の態様は、１つ以上の期間中に生物学的活性細胞を同定する方法に関する。この方法は、１つ以上の期間のそれぞれについて、（ｉ）サンプル容器内に含まれるサンプルの複数の蛍光活性画像を生成することであって、サンプルは生物学的活性細胞を含み、複数の蛍光活性画像の各画像はそれぞれ複数のピクセル値を含み、各ピクセル値は画像フレーム内のそれぞれのピクセル位置に対応する、蛍光活性画像を生成することと、（ｉｉ）蛍光範囲画像の複数のピクセル値を決定することにより、複数の蛍光活性画像から蛍光範囲画像を生成することであって、上記蛍光範囲画像の所定のピクセル値を決定することは、画像フレーム内の所与のピクセル値のピクセル位置に対応するピクセル位置を有する複数の蛍光活性画像のそれぞれから、ピクセル値のセットの範囲を決定することを含む、蛍光範囲画像を生成することと、（ｉｉｉ）蛍光範囲画像に基づいて、対応する期間中のサンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトの画像フレームに対する位置を決定することであって、１つ以上の活性オブジェクトの各々は、対応する期間中にサンプル内に存在する少なくとも１つのそれぞれの生物学的活性細胞である、位置を決定することと、（ｉｖ）対応する期間中のサンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトの各活性オブジェクトについて、対応する期間にわたる１つ以上の活性オブジェクトのそれぞれの時間変化活性レベルを決定することと、を含む。対応する期間にわたる１つ以上の各々の活性オブジェクトのそれぞれの時間変化活性レベルを決定することは、対応する活性オブジェクトの決定された位置に近いピクセル位置を有する、複数の蛍光活性画像の各々からのピクセル値のセットに基づいて各時間変化活性レベルを決定することを含むことができる。
【０００５】
本開示のさらに別の態様は、１つ以上の期間中に生物学的活性細胞を同定する方法に関する。この方法は、１つ以上の期間のそれぞれについて、（ｉ）サンプル容器内に含まれるサンプルの複数の蛍光活性画像を生成することであって、サンプルは生物学的活性細胞を含み、複数の蛍光活性画像の各画像はそれぞれ複数のピクセル値を含み、各ピクセル値は画像フレーム内のそれぞれのピクセル位置に対応する、蛍光活性画像を生成することと、（ｉｉ）対応する期間中のサンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトの画像フレームに対する位置を決定することであって、１つ以上の活性オブジェクトの各々は、対応する期間中にサンプル内に存在する少なくとも１つのそれぞれの生物学的活性細胞の一部である、位置を決定することと、（ｉｉｉ）対応する期間中のサンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトのそれぞれについて、対応する期間にわたるそれぞれの時間変化活性レベルを決定することと、（ｉｖ）１つ以上の活性オブジェクトについて決定された時間変化活性レベルに基づいて、特定の活性オブジェクトに対して決定された時間変化活性レベルが少なくとも１つのバーストを示すことを決定することにより、１つ以上の活性オブジェクトから活性オブジェクトのサブセットを選択することと、を含む。対応する期間にわたるそれぞれの時間変化活性レベルを決定することは、１つ以上の活性オブジェクトのそれぞれの決定された位置に近いピクセル位置を有する、複数の蛍光活性画像の各々からのピクセル値のセットに基づいてそれぞれの時間変化活性レベルを決定することを含むことができる。
【０００６】
本開示のさらに別の態様は、コンピューティングデバイスの１つ以上のプロセッサによって実行されるとき、本明細書に記載の方法の１つ以上を実行するコンピュータ操作をコンピューティングデバイスに実行させる、少なくともコンピュータ可読命令を格納するように構成された非一時的コンピュータ可読媒体に関する。
【０００７】
本開示のさらに別の態様は、（ｉ）１つ以上のプロセッサと、（ｉｉ）１つ以上のプロセッサによって実行されるとき、本明細書に記載の方法の１つ以上をシステムに実行させる少なくともコンピュータ可読命令を格納するように構成された非一時的コンピュータ可読媒体と、を含む、システムに関する。
【０００８】
これらの態様、利点、及び代替、ならびに他の態様、利点、及び代替は、必要に応じて添付の図面を参照しながら以下の詳細な説明を読むことによって当業者には明らかになる。さらに、この概要の項及び本文書の他の場所で提供される説明は、限定ではなく例として特許請求の主題を例示することを意図していることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１】細胞を含むサンプルの例を示す。
【図２Ａ】図１のサンプルの第１の時点で撮影された画像を示す。
【図２Ｂ】図１のサンプルの第２の時点で撮影された画像を示す。
【図２Ｃ】図１のサンプルの第３の時点で撮影された画像を示す。
【図２Ｄ】図１のサンプルの第４の時点で撮影された画像を示す。
【図３】図２Ａ〜Ｄの画像から生成された「範囲画像」を示す。
【図４】図３の「範囲画像」のセグメント化を示す。
【図５Ａ】細胞又は細胞の一部について決定された時間変化活性トレースの例を示す。
【図５Ｂ】細胞又は細胞の一部について決定された時間変化活性トレースの例を示す。
【図５Ｃ】サンプルの一連の画像について決定された時間変化光退色曲線の例を示す。
【図６】自動サンプル画像化装置の一例の要素を示している。
【図７】方法の一例のフローチャートである。
【図８】方法の一例のフローチャートである。
【図９】画像解析システムの一例の画像である。
【図１０】方法の一例のフローチャートである。
【図１１】方法の一例のフローチャートである。
【図１２】経時的なサンプル展開の進行例を示している。
【図１３Ａ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１３Ｂ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１３Ｃ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１３Ｄ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１３Ｅ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１３Ｆ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１３Ｇ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１３Ｈ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１３Ｉ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１３Ｊ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１４】細胞の分化を示す。
【図１５】本明細書に示すシステムの機能を示す。
【図１６Ａ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１６Ｂ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１６Ｃ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１６Ｄ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１７Ａ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１７Ｂ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１８Ａ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１８Ｂ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１８Ｃ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１８Ｄ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１８Ｅ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１８Ｆ】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図１９】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図２０】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図２１】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【図２２】本明細書に示すシステム及び方法を使用して得られた実験結果の例を示す。
【００１０】
特許又は出願ファイルには、カラーで作成された少なくとも１つの図面が含まれている。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開のコピーは、請求及び必要な料金の支払いに応じて、所定官庁によって提供される。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
方法及びシステムの例が、本明細書に記載されている。「例示的」、「例」、及び「例証」という語は、本明細書では「例、事例、又は例証として役立つ」ことを意味するために使用されることが理解されるべきである。本明細書で「例示」、「例」、又は「例示」として説明されるいかなる実施形態又は特徴も、必ずしも他の実施形態又は特徴よりも好ましいか又は有利であると解釈されるべきではない。さらに、本明細書で説明される例示的な実施形態は、限定することを意図するものではない。開示されたシステム及び方法の特定の態様は、多種多様な異なる構成に配置及び組み合わせることができることが容易に理解される。
【００１２】
Ｉ．概要
様々な用途において、組織及び／又は細胞サンプルの挙動を経時的に（例えば、時間、日、週、又は月又は他の適切な期間）測定及び分析することが望ましい。そのような検出及び分析は、治療の有効性を評価するため、物質の毒性を決定するため、又は関心対象の他の情報を決定するために、様々な治療的処置、環境条件、遺伝子改変、伝染性疾患、又は他の指定された経時的な条件の評価を容易にすることができる。この検出及び分析は、細胞及び／又は組織サンプルの画像化を含むことができる。そのような画像化には、複数の異なる期間（例えば、１時間ごと、１日ごと、１週間ごと、１日２回、又は他の適切な期間のセット）の動画又は各期間にわたるサンプルの構造及び／若しくは活性を描写する他の一連の画像を生成することが含まれ得る。「動画」は、特定の期間の間にサンプルから撮影されたすべての画像を含むことができ、又は、そのような画像のサブセットを含むこともできる。
【００１３】
そのような画像シーケンスは、サンプル内の細胞の活性のパターン又は構造に関する情報を提供できる。サンプル内の細胞のペア、細胞の一部、又は他の「活性オブジェクト」間の接続性の程度は、活性オブジェクトのペア、ピークの存在、大きさ、幅、若しくは何らかの他の測定値、又は細胞のペアの活性間の関係を説明する測定された確率関数の他の特徴、又はサンプル内の活性オブジェクトのペアの経時的に測定された活性レベル間の類似性及び／又は因果性の他の測定基準について決定された時間変化活性レベル間の相関又は一貫性として決定することができる。サンプル内の活性オブジェクトの母集団の接続性の程度は、このようなペアワイズ測定の平均又は他の要約測定基準として決定することができる。サンプル中の活性オブジェクト間の接続性のパターンは、サンプル中の活性オブジェクトについて決定されたペアワイズ測定基準に基づいて、グラフ、又はサンプル中の活性オブジェクト間の接続性の強さ、方向、又は他の指標の他の表示として決定することができる。
【００１４】
このような接続性の尺度は、ニューロン、筋細胞、又は電気的に相互に信号を送ることができるか、又は、そうでなければ機能的に接続されている細胞間で決定することができ、その結果、第１の細胞の活性の変化が、数秒から数分の時間スケールで、第１の細胞に接続されている第２の細胞の活性の測定可能な変化を生じることができる。
【００１５】
そのような画像化を容易にするために、一定期間にわたって、自動化された画像化システム内又はその近くにサンプルを配置することができる。そのような自動画像化システムには、画像化装置（例えば、顕微鏡、蛍光画像化装置、１つ以上の光源、及び／又はサンプルの画像化を容易にするように構成された他の要素）及びガントリ又は画像化装置を、サンプルを含むサンプル容器に対して移動するように構成された他のアクチュエータが含まれる可能性がある（例えば、各ウェルが培養細胞、外植組織、又は関心対象の他の生物学的材料のそれぞれのサンプルを含む複数のウェルを有するサンプル容器に対して）。アクチュエータは、自動化された様式で、指定された時点で（例えば、スキャンスケジュールに従って）画像化デバイスを動かして、各サンプルを画像化することができる。したがって、複数のスキャン期間のそれぞれの間に、サンプルのそれぞれについて１つ以上の画像を自動的に生成することができる。サンプル容器内にあるサンプル、及び自動画像化システムは、サンプルを画像化するためにサンプルをインキュベータから取り出す必要性を回避するために、両方をインキュベータ内に配置することができる。そのような実施形態では、サンプルをより「自然に」展開させることができ、サンプルをインキュベータから画像化システムに移す摂動を回避することができる。
【００１６】
そのような様式でそのようなシステムを操作することは、経時的に特定のサンプルについて複数の画像を生成すること可能性がある。分析の特定の側面を自動化することは有益であり得る。例えば、自動化システム（例えば、本明細書に記載の方法の１つ以上を実施するサーバ又は他のコントローラ）は、サンプルの画像に基づいて、サンプル内の「活性オブジェクト」を同定及び位置付けするように動作し得る。そのような活性オブジェクトには、活性に関して経時的に変化する細胞又は細胞の一部（例えば、核、ミトコンドリア、又は他の細胞小器官、細胞質及び／又はその区画、樹状突起セグメント又はニューロンの他の区画）が含まれ得る（例えば、カルシウム濃度、膜電圧、リン酸化及び／又はユビキチン化状態、転写又は翻訳活性、又は関心対象の活性に対する他のいくつかの画像化可能なプロキシに関して）。そのような細胞には、ニューロン、平滑筋細胞、横紋筋細胞、心筋細胞、分泌上皮細胞、又は関心対象の活性レベルの画像化可能な増加及び減少を示し得る他のいくつかの種類の細胞が含まれ得る。
【００１７】
特に、経時的な変化を同定するために、画像内のそのようなオブジェクトを同定し、位置付け（又は「セグメント化」）することは困難であり得る。そのようなオブジェクトを同定及び位置付けするために、サンプルのスキャンからの一連の画像を使用して、スキャン期間中にサンプリングされたものについて「範囲画像」を生成することができる。そのような範囲画像は、一連の画像の画像フレーム内の各位置について、一連の画像のすべてにわたる最大強度値と最小強度値との間の差を決定することにより決定される。したがって、範囲画像の「明るい」ピクセルは、一連の画像にわたって、画像化された活性レベルに関して（例えば、蛍光検出された細胞内カルシウム濃度に関して）変化した位置に相当する。サンプル内の「活性オブジェクト」（例えば、細胞、細胞の一部）に関する位置、範囲、又は他の情報は、範囲画像から決定できる（例えば、閾値処理、テンプレートマッチングなどを介する）。このような方法は、活性に関して変化するが活性がほとんどなく、及び／又は活性が弱い領域（例えば、スキャンの間に活性が１回だけバーストするニューロン）を強調しながら、「常に活性」である領域（例えば、常に高いが変化しないアーティファクトレベルの自己蛍光を示す領域）を破棄するという利点を有する。
【００１８】
同定された活性オブジェクトに関する場所、程度、又は他の情報を使用して、活性オブジェクトに関する情報を決定することができる。例えば、スキャン全体の時間変化活性トレースは、活性オブジェクトごとに決定することができる。この時間変化活性トレースを使用して、活性オブジェクトに関する情報（例えば、バースト割合、平均バースト持続時間若しくは強度、全体的な平均強度、バースト／上昇活性の表示に費やされた時間）、活性オブジェクトの母集団に関する情報（例えば、全体の平均バースト持続時間、平均バースト割合）、及び／又は活性オブジェクト間の関係（例えば、時間変化活性トレース間の相関、活性オブジェクトのセットの時間変化活性トレース間の相関の程度若しくはパターン）を決定することができる。追加的又は代替的に、このような時間変化活性トレースを使用して、活性オブジェクトとして誤って同定されたオブジェクト（例えば、上記の範囲画像法を使用して同定されたオブジェクト）をフィルタリングして除外することができる（少なくとも１つのバーストを示さない同定されたオブジェクトを、さらなる分析から拒否することによって）。
【００１９】
ＩＩ．画像処理の例
本明細書に記載のシステム及び方法を使用して、及び／又はサンプル容器内に含まれるサンプルのいくつかの他の装置又は方法を使用して、複数の画像を生成することができる。画像は、生成された時間に応じて、個別の「スキャン」に組織化することができる。各スキャンは、指定された時間量（例えば、時間、日、週、月）だけ他のスキャンから時間的に離隔され、各スキャンは、１つ以上の画像を含み得る。例えば、各スキャンは、１秒あたり３画像の割合（又は他の適切な割合）で撮影されたサンプルの３分間（又は他の適切な持続時間）の価値の画像を含み得る。特定のスキャンに対応する画像は、スキャン期間の間のサンプルに関する何らかの情報を決定するために、分析することができる。これは、サンプル内の細胞及び／若しくはその一部がスキャンの間に何らかの活性を示したこと（それらが「活性オブジェクト」であること）を決定すること、そのような細胞及び／若しくはその活性部分の空間的な範囲を位置付け及び／若しくは決定すること、又はサンプルに関する何らかの他の情報を決定することを含むことができる。例えば、そのような同定及び／又は位置付けされたオブジェクトごとに、スキャン全体のオブジェクトの活性レベルを記述する時間変化活性トレースを決定することができる。そのような活性レベル（又は「トレース」）を使用して、細胞に関する情報、細胞の母集団に関する情報、細胞間の相互関係に関する情報、又はサンプルに関する他の情報を決定することができる。そのような情報は、経時的に取られたいくつかの異なるスキャンの各スキャンに対して決定され、経時的なサンプルの挙動に関する情報を決定するために使用することができる（例えば、時間、日、週、又は月）。
【００２０】
様々な画像処理技術を、サンプル内の関心対象の細胞又は他のオブジェクトの画像内の範囲を同定、位置決め、及び／又は決定するために、単一スキャンの間に、サンプルの可視画像及び／又は不可視光画像に適用して、撮影することができる。１回のスキャンの間に取得した画像を使用して、スキャンの間に活性レベルの変動に対応する強度の変動を示すオブジェクト（例えば、細胞、細胞の一部）を強調する「範囲画像」を生成する。例えば、画像は、関心対象の活性に対応するサンプル中の蛍光物質を検出するために取得された蛍光画像であり得る。そのような蛍光物質には、カルシウム感受性フルオロフォア（例えば、細胞内カルシウムの濃度が活性の代理として選択される）、電圧感受性フルオロフォア（例えば、膜電圧の変動が活性の代理として選択される）、又は関心対象の何らかの活性指標（例えば、リン酸化／ユビキチン化状態、転写／翻訳活性、細胞内カルシウム濃度、膜貫通電圧）と相関する蛍光特性（例えば、蛍光強度、励起波長、発光波長）を有する他の物質を含むことができる。追加的又は代替的に、染料、発色団、化学発光物質、又は関心対象の何らかの活性測定基準と相関する光学特性（例えば、色、不透明度、強度）を有する他の物質を使用して、スキャンの間の画像化活性を促進してもよい。
【００２１】
このような範囲画像は、範囲画像の所定のピクセルについて、スキャンの画像の画像フレーム内の範囲画像の所定のピクセルの位置に対応する、スキャン中の画像全体のピクセル値のセットの範囲を決定することによって、スキャン用に生成することができる。これは、範囲画像ピクセルの位置に正確に対応するスキャンの画像全体のピクセルのみを比較することを含むことができる。代替的に、各画像の近くのピクセルのセットを使用して、範囲を生成してもよい（例えば、範囲画像を決定するときに平滑化又はフィルタリング機能を提供する）。そのようなピクセル値のセットの範囲を決定することは、ピクセル値の最大値とピクセル値の最小値との差を決定することを含むことができ、又は他の方法を含むことができる（例えば、外れ値のピクセル値を破棄するために、ピクセル値の５パーセンタイルとピクセル値の９５パーセンタイルとの間の差を決定すること）。本明細書で説明する方法を使用して生成された範囲画像は、スキャン画像のセット内で表されるオブジェクトを強調することができ、それらのオブジェクトが活性であったことがまれである場合でさえ、及び／又はスキャン期間内の非常に短い期間の間、これらのオブジェクトは、スキャン期間全体にわたって強度に関して変化する。さらに、そのような範囲画像は、スキャン期間全体にわたって一貫した高強度を示したが、変化せず、活性な細胞、細胞の一部、又は関心対象の他の活性オブジェクトを表す可能性が低い、オブジェクト及び／又は領域（例えば、交絡自己蛍光物質、又は誤った活性であるサンプル中のフルオロフォア若しくは他の活性感受性造影剤である物質に起因する）を拒否及び／又は脱強調することができる。
【００２２】
図１は、例示的なサンプル容器の内容物１００（例えば、そのようなウェルの配列を含むサンプル容器のウェルの内容物）を例解する。内容物１００は、第１の細胞１１０ａ及び第２の細胞１１０ｂ（例えば、第１及び第２のニューロン）を含む。細胞１１０ａ、１１０ｂは、スキャン期間にわたって複数回画像化される場合、細胞から受ける光（例えば、細胞により発現されるか、又はさもなければ細胞内に存在するカルシウム感受性フルオロフォアから受ける蛍光）が、スキャン期間中に画像から画像へ変化するような活性細胞である。細胞１１０ａ、１１０ｂは、本明細書で説明される方法を使用して、それぞれの活性オブジェクトとして検出され得る活性領域を含む。示されるように、第１の細胞１１０ａは、第１の活性オブジェクト１２０ａ（例えば、核）を含み、一方、第２の細胞１１０ａは、第２の活性オブジェクト１２０ｂ（例えば、核）及び第３の活性オブジェクト１２０ｃ（例えば、カルシウム濃度又は他の活性関連の画像化可能な特性の変動を経時的に示す樹状突起ネットワークの一部）を含む。
【００２３】
サンプル容器の内容物１００は、本明細書に記載のシステム及び方法に従って、及び／又は他の何らかの装置若しくはプロセスを介して、スキャン期間にわたって複数回画像化することができる。細胞及び／又はその活性部分の強度は、スキャン期間全体にわたって、それらの細胞及び／又は部分の活性の変化に伴って変化し得る。したがって、これらの細胞及び／又は細胞の一部から受ける光の強度は、スキャン期間にわたって変化する可能性があり、この変化は、スキャン期間にわたって撮影された画像によってキャプチャされ得る。次に、これらのバリエーションを使用して範囲画像を生成し、これは、次には、サンプル容器の内容物に関連する他のいくつかの分析を同定、位置付け、又は実行するために使用することができる。
【００２４】
図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、及び２Ｄは、スキャン期間内のそれぞれ異なる第１、第２、第３、及び第４の時点で内容物１００をそれぞれ撮影した第１の２００ａ、第２の２００ｂ、第３の２００ｃ、及び第４の２００ｄの例示的な画像をそれぞれ例解する。第１の活性オブジェクト１２０ａは、第１及び第２の時点の間に活性であり、したがって、第１の２００ａ及び第２の２００ｂ画像は対応する高強度領域を示し、一方、第３の２００ｃ及び第４の２００ｄ画像の対応する位置は比較的暗い。第２の活性オブジェクト１２０ｂは、第４の時点の間でのみ活性であり、第３の活性オブジェクト１２０ｃは、第１、第３、及び第４の時点の間で活性であった。さらに、アーティファクト１３０は、４つの時点すべてにわたって一貫した強度で光を発出した。したがって、４つの画像２００ａ〜ｄはすべて、対応する高強度領域を示す。そのようなアーティファクトは、干渉する自家蛍光を示す領域（例えば、励起スペクトル及び／又は発光スペクトルに関して、サンプル内の活性を画像化するために使用されるフルオロフォアと重複するフルオロフォアを含む）、高濃度の造影剤を含有し、及び／又は造影剤の蛍光を増加させる物質（例えば、カルシウム感受性発蛍光団に結合して活性化する物質）を含む領域、又は何らかの他のメカニズムを通じて交絡光を発出する領域である。
【００２５】
次いで、例示的な画像２００ａ〜ｄから、及び／又はスキャン期間の間にサンプル内容物１００から撮影された追加の画像から範囲画像３００を生成することができる。この範囲画像３００は、活性オブジェクト１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃが範囲画像３００（明るい領域）において強調されるように、本明細書に記載のシステム及び／又は方法に従って生成することができる。逆に、スキャン期間にわたって強度の変化を示さなかった領域は、範囲画像において強調されない（例えば、アーティファクト１３０に対応する領域）。次いで、範囲画像３００を使用して、サンプル内の活性オブジェクトの範囲を同定、位置付け、及び／又は決定することができる。
【００２６】
そのような同定、位置、又は他のセグメント化タスクは、本明細書で説明されるように生成された範囲画像に基づいて、様々な方法を介して達成され得る。例えば、範囲画像内の活性オブジェクト（細胞、細胞の一部など）の位置を同定する前に、背景画像の減算、ノイズフィルタリング、又は他の前処理方法を範囲画像に適用できる。次いで、範囲画像の画像フレーム内の活性オブジェクトを位置付けするために、閾値化、テンプレートマッチング、又は他の方法を範囲画像及び／若しくはその前処理バージョンに適用することができる。
【００２７】
活性オブジェクトの位置（例えば、スキャン中にわたって、細胞内カルシウム濃度又は関心対象の何らかの他の生物学的活性の画像化可能な測定値の変化を示す、細胞又は細胞の一部の位置）を決定することは、単一の位置（例えば、重心、活性オブジェクトの境界内の任意の点）、有効半径、領域（例えば、活性オブジェクトの決定された外周によって定義される領域）、画像フレーム内のピクセル若しくは他の個別のサブ領域のセット、又は各活性オブジェクトについてのいくつかの他の位置情報を決定することを含むことができる。図４は、図１に示す活性オブジェクト１２０ａ、１２０ｂ、１２０ｃについて決定された、図２Ａ〜Ｄに示す画像２００ａ〜ｄの画像フレーム４００内の様々な位置を例解する。位置を決定することは、各活性オブジェクト（例えば、対応する範囲画像中の離散又はさもなければ他の区別可能な高強度領域の重心）についての単一点（例えば４１０ａ、４１０ｂ、４１０ｃ）の位置を決定することを含むことができる。追加的又は代替的に、位置を決定することは、各活性オブジェクトが占める画像フレーム内の程度（例えば、４２０ａ、４２０ｂ、４２０ｃ）を決定することを含むことができる。これは、各活性オブジェクトが広がる範囲画像のピクセルのセット及び／又はピクセル位置を決定することを含むことができる。
【００２８】
次いで、活性オブジェクトの決定された位置は、活性オブジェクトのそれぞれについての情報を決定するために使用することができる。例えば、活性オブジェクトのそれぞれについて、決定された位置に基づいて、時間変化活性レベルを決定することができる。特定の活性オブジェクトの時間変化活性レベルは、活性オブジェクトを含むサンプル（例えば、細胞内カルシウム濃度）の撮影画像の強度で表されるように、スキャン全体の活性オブジェクトの活性レベルを表す。したがって、時間変化活性レベルを使用して、活性オブジェクトの活性（例えば、ニューロン又はその一部の活動電位のファイアリング）の全体的なレベル、パターン、及びタイミング（例えば、他の活性オブジェクトに対する）を評価することができる。例えば、バースト割合又はバースト頻度、バースト持続時間、バースト強度、平均活性レベル、活性レベルの変動性、又は活性オブジェクトの活性に関する他の何らかの情報及び／又はその分布は、活性オブジェクトについて決定された、時間変化活性レベルから決定されてもよい。このような情報はまた、サンプルについての全体的な測定基準、を決定するためにも使用されてもよく、例えば、サンプル中の活性オブジェクトの平均的な全体の活性は、サンプル中の活性オブジェクトについての時間変化活性レベルから決定することができる。
【００２９】
決定された時間変化活性レベルはまた、サンプル内の活性オブジェクト（例えば、ニューロン）間の機能的な接続性に関する情報を決定するためにも使用することができる。例えば、ペアワイズ相関は、サンプル中の活性オブジェクトの各ペアに対して決定される。次に、そのような相関を報告及び／又は使用して、サンプル内の活性オブジェクトの活性間のパターン又は全体的な調整の程度を決定することができる。
【００３０】
特定の活性オブジェクトに対して、様々な方法で時間変化活性レベルを生成することができる。活性オブジェクトの位置を決定することが、活性オブジェクトのピクセル、又は画像フレーム内の範囲に関する何らかの他の情報を決定することを含む例において、活性オブジェクトの時間変化活性レベルを決定することは、活性オブジェクトの程度に対応する、スキャン全体の各蛍光強度画像のピクセルの全体的な強度の合計、平均、又は何らかの他の測定値（例えば、活性オブジェクトに対応するピクセルの決定されたセット）を決定することを含むことができる。別の例において、活性オブジェクトの決定されたポイント位置の指定された距離内のピクセルの加重平均を使用して、スキャン全体で活性オブジェクトの時間変化活性レベルを決定することができる。
【００３１】
サンプルの蛍光画像化は、サンプルの光退色を生じ得る。そのような光退色は、サンプルから撮影された蛍光画像において、サンプル及び／又はその中の活性オブジェクトの検出された蛍光強度の経時的な漸減として現れる可能性がある。この光退色は、検出及び／又は定量化することができ、その影響（例えば、そのような蛍光画像から生成された時間変化活性トレースに対する影響）は様々な方法で低減又は除去することができる。図５Ａは、光退色を示した活性オブジェクトについて決定された時間変化活性トレース５００の例を例解する。光退色によって引き起こされる時間変化活性トレース５００の下降傾向は、点線５１０によって示されている。この光退色効果のレベルは、例えば、ローパスフィルタの適用、移動ウィンドウの最小値の適用、離散バーストの同定及び除去、又は何らかの他の方法を使用することにより、時間変化活性トレース５００から決定することができる。次に、決定された光退色のレベルを適用して、光退色の効果を補正し、活性オブジェクトのより正確な時間変化活性レベルを生成することができる（図５Ｂの例では、修正された時間変化活性レベル５２０として示されている）。追加的又は代替的に、経時的な光退色のレベルを、何らかの他の方法で決定（例えば、スキャンの各蛍光活性画像について、それぞれの光退色のレベルを決定することにより）及び適用して、１つ以上の経時間変化活性レベルを修正することができる（図５Ｃの例では、光退色レベル５３０として示されている）。
【００３２】
上記の範囲画像法は、サンプル内の活性オブジェクトを同定及び／又は位置付けするために使用することができる。追加的又は代替的に、そのようなオブジェクトは、スキャン全体で１つ以上の異なるバーストを示すことに基づいて同定されてもよい。例えば、推定活性オブジェクトの位置を決定し（例えば、上記の範囲方法を使用してもよく、及び／又は何らかの他のセグメント化方法を使用して）、この決定した位置を使用して、推定活性オブジェクトの時間変化活性レベルを決定してもよい。次に、この時間変化活性レベルを分析して、時間変化活性レベルに少なくとも１つのバーストが含まれているかどうかを決定することができる。その場合、推定活性オブジェクトを確認し、追加の分析に使用することができる（例えば、平均バースト割合、全体的な母集団バースト割合、サンプル内の確認された活性オブジェクト間の接続性の程度及び／又はパターンの決定）。バーストが検出されない場合、推定活性オブジェクトは拒否され、その時間変化活性トレースは追加の分析から破棄される。したがって、バーストを呈し、それゆえに実際の活性細胞及び／又はその一部を表す可能性が高い推定活性オブジェクトの母集団から、活性オブジェクトのサブセットを選択することができる。このような選択プロセスは、例えば、１つ以上の推定活性オブジェクトが範囲画像中で検出される利点を有することができ、これはバーストを示さず、代わりにスキャン全体で人工的な高レベルの光退色を示し、したがって範囲画像内で高強度領域として現れ得る。
【００３３】
バーストには、スキャン期間の間の細胞、細胞の一部、又は他の活性オブジェクトの検出された活性の任意の急速な変化が含まれる。例えば、バーストは、記録されたビデオシーケンスにおいて活性オブジェクトの検出された蛍光強度の急速な変化を生じる可能性がある。そのようなバーストは、活性オブジェクトに対して決定された時間変化強度レベルトレースにおけるピークを生じる。バーストは、様々な方法を使用して、所定の時間変化活性レベル内で同定できる。いくつかの例において、時間変化活性レベルが閾値を超えるときはいつでも、及び／又は時間変化活性レベルが、閾値レベルを超えているか、及び／又は閾値レベルを超えて増加しているかによって、ベースラインレベル（例えば、移動ウィンドウの最小値を使用した時間変化活性レベルトレースから決定される）から増加するときはいつでも、時間変化活性レベル内でバーストを同定することができる。追加的又は代替的に、テンプレート割合マッチング、ハイパスフィルタリング、又は他の方法を使用して、本明細書で説明するように決定された時間変化活性レベル内のバーストを同定することができる。このようなバーストピークの強度及び持続時間特性は、活性オブジェクトの時間変化活性レベルトレースから計算することができる。平均バースト特性は、活性オブジェクトごとに計算され、次いで、スキャンの間にサンプル中のすべての活性オブジェクトに対して集計される。
【００３４】
ＩＩＩ．サンプルシステム
自動画像化システムを利用して、複数の異なるスキャン期間の間に、サンプル容器のそれぞれのウェルにおいて、複数の生物学的サンプルの画像（例えば、蛍光活性画像）を自動化様式で経時的に生成することができる。自動画像化システムにより、各スキャン期間の間に各サンプルの画像のセット、例えば、３分間のスキャン期間にわたって毎秒３画像の割合で撮影された画像のセットを撮影することができる。次いで、例えば、本明細書に記載の方法に従って、サンプルに関する何らかの情報を決定するために、画像を分析することができる。
【００３５】
このような自動画像化システムの使用は、生物学的サンプルを画像化する人件費を大幅に削減でき、ならびに、手動画像化と比較した場合に生成される画像のタイミング、ポジショニング、及び画像パラメータに関する一貫性を増加させることができる。さらに、そのような自動画像システムは、インキュベータ内で動作するように構成でき、画像化のためにインキュベータからサンプルを除去する必要性を除外する。したがって、サンプルの増殖環境をより一貫して維持できる。さらに、自動化された画像化システムが顕微鏡又は他の画像装置をサンプル容器に対して動かすように作用する場合（例えば、静的画像装置によって画像化されるサンプル容器を動かす代わりに）、動きに関連したサンプルの摂動は減少できる。これにより、サンプルの増殖と展開を改善し、運動関連の交絡を減らすことができる。
【００３６】
このような自動画像システムは、２４時間より多く、３日より多く、３０日より多く、又はそれより多くの期間で離隔されたスキャンの間に１つ以上の画像を生成するように動作できる。スキャンは、指定された速度で、例えば、１日に１回、１日に１回より多く、１日に２回より多く、又は１日に３回より多く発生するように指定することができる。スキャンは、２４時間以内に少なくとも２回、少なくとも３回、又はそれ以上の数のスキャンが発生するように指定することができる。いくつかの例では、１つ以上のスキャンからのデータを分析し（例えば、本明細書で説明する方法に従って）、追加のスキャンのタイミングを決定するために使用することができる（例えば、サンプル内で発生すると予測される離散イベントの発生を検出するために、スキャンの割合、持続時間、画像キャプチャ割合、又は何らかの他の特性を増加させるため）。
【００３７】
そのような自動画像システムの使用は、長期間にわたって複数の時点で同じ生物学的サンプルの画像化を容易にすることができる。したがって、個々の細胞及び／又は細胞のネットワークの発達及び／又は挙動を経時的に分析することができる。例えば、細胞のセット、細胞の一部、又は他の活性オブジェクトは、単一のサンプル内で、異なる、広く離間された期間中に行われたスキャン内で同定することができる。次に、スキャン全体で同じ活性オブジェクトを同定するために、同定されたオブジェクトのこれらのセットをスキャン間で比較することができる。したがって、個々の細胞又は細胞の一部の挙動を、数時間、数日、数週間、又は数か月にわたって追跡及び分析することができる。
【００３８】
図６は、そのような自動画像化システム６００の要素を例解する。自動画像化システム６００は、自動画像化システム６００の他の要素が取り付けられるフレーム６１０を含む。フレーム６１０は、インキュベータ内に適合するように構成（例えば、サイズ設定）されてもよい。自動画像化システム６００は、フレーム６１０に結合されたサンプル容器トレイ６３０内に取り外し可能に配置されるサンプル容器６２０を含む。サンプル容器トレイ６３０は、様々な異なるサンプル容器（例えば、様々な業界標準のサンプル容器）の保持を容易にするために、取り外し可能であり得、及び／又は取り外し可能なインサートを含むことができる。システム６００は、画像化装置６４０がサンプル容器６２０の個々のウェル（例えば、実施例のウェル６２５）の内容物の画像を生成するように動作できるように、画像化装置６４０をサンプル容器６２０に対して位置決めするように構成される作動ガントリ６５０をさらに含む。
【００３９】
画像化装置６４０は、顕微鏡、蛍光画像化装置、２光子画像化システム、位相コントラスト画像化システム、１つ以上の照明源、１つ以上の光学フィルタ、及び／又はサンプル容器６２０内に含まれるサンプルの画像化を容易にするように構成される他の要素を含むことができる。いくつかの例では、画像化装置６４０は、サンプル容器６２０の両側に配置された要素（例えば、生物学的サンプルの位相コントラスト画像化を容易にするために、例えば、コヒーレント、偏光、単色、又は別途指定された照明光）を含む。そのような例では、サンプル容器６２０の両側の要素は、それぞれ異なるガントリ、同じガントリ、に結合されてもよく、及び／又はサンプル容器６２０の片側の要素は、サンプル容器６２０に対して移動可能でなくてもよい。
【００４０】
作動ガントリ６５０は、フレーム６１０及び画像化装置６４０に結合され、サンプル容器６２０内の複数の異なるサンプルの画像化を容易にするために、サンプル容器６２０に対して少なくとも２つの方向で装置６４０の位置を制御するように構成される。作動ガントリ６５０はまた、画像化装置６４０を使用して生成される画像の焦点の制御を容易にするために、及び／又は、サンプル容器６２０内で、画像化装置６４０を使用して画像化できる材料の深さを制御するために、サンプル容器６２０に向かい、及びそこから離れる第３の方向において画像化装置６４０の位置を制御するように構成されてもよい。追加的又は代替的に、画像化装置６４０は、画像化装置６４０の焦点距離を制御するための１つ以上のアクチュエータを含むことができる。
【００４１】
作動ガントリ６５０は、サンプル容器６２０に対する（例えば、サンプル容器６２０の特定のウェルに対する）画像化装置６４０の絶対位置及び／又は相対位置の検出を容易にするように構成された要素を含むことができる。例えば、作動ガントリ６５０は、エンコーダ、リミットスイッチ、及び／又は他の位置検知要素を含み得る。追加的又は代替的に、画像化装置６４０又はシステムの他の要素は、サンプル容器６２０に対する画像化装置６４０の絶対位置及び／又は相対位置を決定するために、サンプル容器６２０及び／又はサンプル容器トレイ６３０の基準マーク又は他の特徴を検出するように構成できる。
【００４２】
計算機能（例えば、作動ガントリ６５０及び／又は画像化装置６４０を操作して、指定された期間の間にサンプル容器６２０内のサンプルを画像化し、範囲画像を生成し、及び／又は本明細書に記載の他の方法を実行するための機能）は、１つ以上のコンピューティングシステムによって実施されてもよい。そのようなコンピューティングシステムは、自動画像化システム（例えば、６００）に統合されてもよく、そのような自動画像化システムに関連付けられてもよく（例えば、直接有線又は無線接続を介して、ローカルネットワークを介して、及び／又はインターネット上の安全な接続を介して）、及び／又は何らかの他の形をとってもよい（例えば、自動画像化システムと通信する、及び／又は生物学的サンプルの画像のストアにアクセスするクラウドコンピューティングシステム）。そのようなコンピューティングシステムは、通信インターフェース、ユーザインターフェース、プロセッサ、及びデータストレージを含み得、これらのすべては、システムバス、ネットワーク、又は他の接続メカニズムによって互いに通信連結することができる。
【００４３】
通信インターフェースは、他のデバイス、アクセスネットワーク、及び／又はトランスポートネットワークと、電気、磁気、電磁気、光学、又は他の信号のアナログ又はデジタル変調を使用して、通信するコンピューティングシステムを可能にするように機能することができる。したがって、通信インターフェースは、従来の電話サービス（ＰＯＴＳ）通信及び／又はインターネットプロトコル（ＩＰ）又は他のパケット化通信などの回線交換及び／又はパケット交換通信を容易にし得る。例えば、通信インターフェースは、無線アクセスネットワーク又はアクセスポイントとの無線通信用に配置されたチップセット及びアンテナを含み得る。また、通信インターフェースは、イーサネット、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、又は高品位マルチメディアインタフェース（ＨＤＭＩ）ポートなどの有線インターフェースの形を取るか、又はこれらを含み得る。通信インターフェース４０２はまた、無線ＬＡＮ、ＷｉＦｉ、ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ（登録商標）、全地球測位システム（ＧＰＳ）のような無線インターフェース、又は広域無線インターフェース（例えば、ＷｉＭＡＸ、若しくは３ＧＰＰロングタームエボリューション（ＬＴＥ））の形態を採るか、又はこれらを含むことができる。しかしながら、物理層インターフェースの他の形態、及び標準又は専用の通信プロトコルの他のタイプの他の形態が、通信インターフェースにわたって使用されてもよい。さらに、通信インターフェースは、複数の物理的な通信インターフェース（例えば、ＷｉＦｉインターフェース、ＢＬＵＥＴＯＯＴＨ（登録商標）インターフェース、及び広域無線インターフェース）を備えてもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態では、通信インターフェースは、他のデバイス、リモートサーバ、アクセスネットワーク、及び／又はトランスポートネットワークと通信することをコンピューティングシステムに可能にするように機能することができる。例えば、通信インターフェースは、生物学的サンプルの画像（例えば、蛍光活性画像）の表示を送信及び／又は受信し、範囲画像の表示、そのような画像内の活性オブジェクトの位置のセット、及び／又は、本明細書に記載の方法又はいくつかの他の情報を使用して、そのような画像から生成されたそのような活性オブジェクトから決定された時間変化活性トレースを送信するように機能し得る。
【００４５】
そのようなコンピューティングシステムのユーザインターフェースは、コンピューティングシステムが、ユーザと相互作用して、例えば、ユーザからの入力を受け取ること、及び／又はユーザに出力を提供することを可能にするように機能することができる。したがって、ユーザインターフェースは、キーパッド、キーボード、タッチセンシティブ又はプレゼンスセンシティブパネル、コンピュータマウス、トラックボール、ジョイスティック、マイクなどの入力コンポーネントが含まれ得る。ユーザインターフェースはまた、例えば、プレゼンスセンシティブパネルと組み合わせることができる、表示画面などの１つ以上の出力構成要素を含むことができる。ディスプレイ画面は、ＣＲＴ、ＬＣＤ、及び／若しくはＬＥＤ技術、又は現在知られているか又は今後開発される他の技術に基づいてもよい。ユーザインターフェースは、スピーカ、スピーカジャック、オーディオ出力ポート、オーディオ出力デバイス、イヤホン、及び／又は他の類似デバイスを介して、可聴出力を生成するように構成することもできる。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ユーザインターフェースは、ビデオ（例えば、特定の生物学的サンプルの特定のスキャンの間に生成される画像のビデオ）又は他の画像をユーザに提示する役割を果たすディスプレイを含むことができる。加えて、ユーザインターフェースは、  コンピューティングデバイスの構成及び動作を容易にする１つ以上のボタン、スイッチ、ノブ、及び／又はダイヤルを含むことができる。これらのボタン、スイッチ、ノブ、及び／又はダイヤルのいくつか又はすべてが、タッチセンシティブ又はプレゼンスセンシティブパネルの機能として実装されることが可能である。ユーザインターフェースは、ユーザが、自動画像化システム内に含まれるサンプルのタイプを指定すること、サンプルの画像化のスケジュールを指定すること、システムによって実行される画像のセグメント化及び／若しくは分析のパラメータを指定すること、又は自動画像システムの操作のために、他のいくつかのコマンド又はパラメータを入力することを可能にすることができる。
【００４７】
いくつかの例では、用途に応じて、本明細書に記載されている方法の一部を異なるデバイスによって実行できる。例えば、システムの異なるデバイスは、計算リソース（例えば、メモリ、プロセッササイクル）及びデバイス間の通信のために異なる情報帯域幅の異なる量を有することができる。例えば、第１のデバイスは、作動ガントリ、画像化装置、又は他の要素を操作して、複数の異なるスキャン期間の間に生物学的サンプルの画像を生成することができる組み込みプロセッサであり得る。次に、第２のデバイスは、第１のデバイスから、第１のデバイスからの画像情報を受信し（例えば、インターネットを介して、専用の有線リンクを介して）、受信した画像データに対して本明細書に記載の画像処理及び分析方法を実行できる。本明細書に記載されている方法の異なる部分は、そのような考慮事項に応じて配分することができる。
【００４８】
ＩＶ．方法の例
図７は、時間の１つ以上の期間の間に、生物学的活性細胞を同定するための方法７００のフローチャートである。方法７００は、１つ以上の時間の期間のそれぞれについて、サンプル容器（７１０）内に含まれるサンプルの複数の蛍光活性画像を生成することを含む。サンプルは生物学的活性細胞を含み、複数の蛍光活性画像の各画像はそれぞれ複数のピクセル値を含み、各ピクセル値は画像フレーム内のそれぞれのピクセル位置に対応する。この方法７００はさらに、１つ以上の時間の期間のそれぞれについて、複数の蛍光活性画像（７２０）からの蛍光範囲画像を生成することを含む。複数の蛍光活性画像から蛍光範囲画像を生成することは、蛍光範囲画像の複数のピクセル値を決定することを含み、蛍光範囲画像の所定のピクセル値を決定することは、画像フレーム内の所与のピクセル値のピクセル位置に対応するピクセル位置を有する複数の蛍光活性画像から、ピクセル値のセットの範囲を決定することを含む。
【００４９】
方法７００は、蛍光範囲画像に基づいて、１つ以上の期間の各々について、対応する期間の間のサンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトの画像フレームに対する位置を決定することをさらに含む（７３０）。１つ以上の活性オブジェクトの各々は、対応する期間の間にサンプル内に存在する少なくとも１つのそれぞれの生物学的活性細胞の一部である。方法７００は、さらに、１つ以上の期間の各々について、及び対応する各期間の間のサンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトの各活性オブジェクトについて、対応する期間にわたる各々の１つ以上の活性オブジェクトのそれぞれの時間変化活性レベルを決定することを含む（７４０）。これは、複数の蛍光活性画像の各々から、対応する活性オブジェクトの決定された位置に近接したピクセル位置を有するピクセル値のセットに基づいて、各時間変化化活性レベルを決定することを含み得る。
【００５０】
図８は、１つ以上の期間の間に生物学的活性細胞を同定するための方法８００のフローチャートである。方法８００は、１つ以上の期間の各々について、サンプル容器内に含まれるサンプルの複数の蛍光活性画像を生成することを含む（８１０）。サンプルは生物学的活性細胞を含み、複数の蛍光活性画像の各画像はそれぞれ複数のピクセル値を含み、各ピクセル値は画像フレーム内のそれぞれのピクセル位置に対応する。方法８００は、１つ以上の期間の各々について、対応する期間中のサンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトの画像フレームに対する位置を決定することをさらに含む（８２０）。１つ以上の活性オブジェクトの各々は、対応する期間の間にサンプル内に存在する少なくとも１つのそれぞれの生物学的活性細胞の一部である。
【００５１】
方法８００は、さらに、１つ以上の期間の各々について、及び対応する各期間の間のサンプル容器内の１つ以上の活性オブジェクトのそれぞれについて、対応する期間にわたるそれぞれの時間変化活性レベルを決定することを含む（８３０）。これは、複数の蛍光活性画像の各々から、１つ以上の活性オブジェクトのそれぞれの決定された位置に近接したピクセル位置を有するピクセル値のそれぞれのセットに基づいてそれぞれの時間変化活性レベルを決定することを含むことができる。方法８００は、１つ以上の期間のそれぞれについて、及び１つ以上の活性オブジェクトに対して決定された時間変化活性レベルに基づいて、１つ以上の活性オブジェクトから活性オブジェクトのサブセットを選択することを含む（８４０）。１つ以上の活性オブジェクトから特定の活性オブジェクトを選択することは、特定の活性オブジェクトに対して決定された時間変化活性レベルが少なくとも１つのバーストを示すことを決定することを含む。
【００５２】
いずれかの方法７００、８００は、追加の要素又は特徴を含むことができる。
【００５３】
Ｖ．実施形態の例
神経系に影響を及ぼすヒトの疾患を研究する上での主要な障害は、ヒトの表現型を正確に表す神経細胞の活性を監視、分析、及び定量化する能力である。
【００５４】
現在、様々なタイプの培養ニューロンは、疾患の状態と疾患にかかっていない状態の両方で哺乳動物のニューロン機能のモデルとして有望であると考えられている。しかしながら、哺乳動物のニューロンシステムは複雑であり、培養ニューロンの特性評価、それらの機能の分析、培養中のニューロンによって形成されたニューロンネットワークの分析、培養ニューロンの品質管理の提供、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）由来の神経細胞モデルの改善を行うための、試薬、ハードウェア、ソフトウェア、及びガイド付きプロトコルを含むツールの継続的な必要性が存在している。
【００５５】
例えば、本開示によって提供されるニューロン分析用の改善されたツールは、培養ニューロンが機能的に活性であるかどうか、培養においてニューロンが機能的に活性になった時期、ならびに機能活性が培養中及び様々な実験条件下でどのように経時的に変化するか、ニューロンの物理的特性は何か、ならびに物理的特性が培養中及び様々な実験条件下でどのように経時的に変化するか、などを決定するためのより良好な機能細胞モデルを生成するがこれらに限定されない。本開示に従って提供される方法及びシステムは、数千個の細胞からの測定が可能であることと実用的であることの両方であるため、統計的に堅牢である神経培養の複数の関連する測定をユーザが行うことを可能にする。本開示に従って提供される方法及びシステムは、以前のシステムよりも高いスループットで長期培養の変化をユーザが分析することを可能にする。
【００５６】
本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有することを意図している。このような用語は、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  ＤＷ  Ｒｕｓｓｅｌｌ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；第３版、２００１年。  ＦＭ  Ａｕｓｕｂｅｌ、編、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ；  第５版、２００２；  Ｂ．  Ａｌｂｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，第４版、Ｇａｒｌａｎｄ、２００２；  Ｄ．Ｌ．  Ｎｅｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｍ．Ｍ．  Ｃｏｘ，  Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、第４版、Ｗ．Ｈ．  Ｆｒｅｅｍａｎ  ＆  Ｃｏｍｐａｎｙ，  ２００４年。及びＫｕｒｓａｄ  Ｔｕｒｋｓｅｎ（編）、Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ：  ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２００２；１８５，  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  ＩＳＢＮ：  ９７８０４７０１５１８０８を例示的に含む様々な標準的な参考文献における文脈において定義されていることが見出される。
【００５７】
ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３生細胞分析システム
ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３ハードウェアは、１）ガントリ、及び２）コントローラの２つのコンポーネントで構成されている。ガントリは、生細胞培養の自動画像取得を可能にする顕微鏡、カメラ、及び消耗品トレイを収容し、標準的な組織培養インキュベータ内に設置される。自発的な神経活性用途では、顕微鏡システムは、オレンジスペクトルの蛍光画像を収集するように調整されたフィルタモジュールを含む（例えば、５４０ｎｍ；通過帯域：［５１３、５６８ｎｍ；ｅｍ：６０９ｎｍ；通過帯域：［５７７、６８４］ｎｍ  ）及び近赤外スペクトル（例えば、６６１ｎｍ；通過帯域：［６４８、６７４］；  ｅｍ：７２７ｎｍ；通過帯域：［６４１、７７１］ｎｍ。コントローラには、画像ストレージ、データハンドリング、データベースストレージ、ファイルシステム、自動画像処理、グラフ作成、及びグラフィカルユーザインターフェイス（ＧＵＩ）を介したクライアントコンピュータからのネットワーク経由の相互作用を可能にするプロセッサ、メモリ、及びデータストレージドライブが含まれる。コントローラ上のソフトウェアは、１）サーバとの対話、及び２）機器の制御という２つの目的に役立つ。
【００５８】
ガントリは、インキュベータに設置され、顕微鏡及びカメラを収容する。
【００５９】
コントローラは、顕微鏡システムを制御し、サーバとして機能する。
【００６０】
コントローラは、イーサネットポートなどの通信ポートに接続されるが、これに限定されない。
【００６１】
グラフィカルユーザインターフェイス（ＧＵＩ）がコンピュータにロードされ、顕微鏡システムを制御し、データと対話するためにコントローラ（すなわち、サーバ）と対話する。本開示の態様によれば、すべての自動画像処理は、コントローラ上で完了する。
【００６２】
自動化された動画のキャプチャ
Ｉｎｃｕｃｙｔｅ  Ｓ３顕微鏡は、９６ウェルプレートなどであるがこれに限定されない、細胞培養容器のユーザ定義の場所に移動し、適切なＬＥＤをオンにして、４ｘ対物レンズを使用して、毎秒３フレーム（ｆｐｓ）などの所望の顕微鏡対物レンズを使用して所望の速度で動画をキャプチャする。
【００６３】
本開示の特定の態様によれば、取得されたデータは圧縮形式で保存され、その動画から静的な「範囲」画像が生成される。範囲画像は、完全なスキャン期間にわたって各ピクセル位置で最大蛍光強度から減算された最小蛍光強度を表すピクセルで構成される。バックグラウンド減算（トップハット）、最小細胞幅の定義、蛍光閾値処理を含む、複数のパラメータを最適化することにより、範囲画像上で画像のセグメント化が完了する。一旦オブジェクトが定義されると、追加のユーザ定義の最小バースト強度フィルタを使用して、バーストをさらに定義する。通常、各オブジェクトはニューロンであるが、ニューロン部分はまた、例えば、樹状突起、軸索、シナプスなどのオブジェクトとして定義することもできる。
【００６４】
これらのセグメント化されたオブジェクトから、３分間のスキャンから次のデータが得られ、１）相関−スキャン期間にわたるすべてのオブジェクトトレースのペアワイズ相関分析、２）平均オブジェクト平均強度−スキャン期間にわたる全オブジェクトの平均強度の平均、３）バースト持続時間−スキャン期間にわたるすべてのオブジェクトの平均バースト持続時間の平均、５）バースト割合−スキャン期間にわたるすべてのオブジェクトバースト割合の平均、６）バースト強度−各バーストの強度は、強度曲線の下の領域をバーストの持続時間で除算することによって計算される。全体のバースト強度測定基準は、スキャン期間にわたるすべてのオブジェクトの平均バースト強度の平均である。最後に、活性オブジェクトの数は、活性オブジェクトの合計数、すなわち、スキャン期間内のセグメント化されたオブジェクトによって定義される。オプションで、これらの測定基準の７つすべて、又はそのサブセット、又は１つ以上の追加の測定基準を単独又は組み合わせて、各オブジェクト、各ウェル、又はウェルの各セットについて計算し、データベースに格納し、グラフィカルユーザインターフェイスを介して、クライアントコンピュータでデータを取得した後、ユーザにすぐに表示する。
【００６５】
通常、ウェルは２４時間ごとにスキャンされるが、より多いか又はより少ない頻度のスキャンはオプションである。各スキャンに続いて、それらの時点で測定基準が計算され、例えばデータベースに格納される。例えば、３０日間の実験の過程にわたって、各測定基準に３０の点が収集され、時系列に連結され、実験の全時間枠、すなわち時間、日、週、月にわたってグラフ化することができる。
【００６６】
本明細書に記載するように、本開示のシステム及び方法は、自動化された適度なスループットの方法で長期間にわたる神経ネットワーク活性の変化をユーザが監視することを可能にする。対照的に、以前の方法は、１）エンドポイント方法（様々な測定パラメータの読み取りが１回のみ可能）、２）極度に破壊的な方法（カルシウム色素、対、遺伝子コード化カルシウムインジケーターの使用、３）分析／視覚化用のインキュベータから、ユーザが細胞を移動させる必要がある、４）統計的に関連性がない（ごく少数の細胞から測定を行うため）、５）非常に手動（自動化されていない）、又は６）低スループット（一度に１つ、手動）である。
【００６７】
本開示の態様によれば、ニューロン又はニューロン様細胞は、特に限定されないが、カルシウムインジケータタンパク質ＧｃａＭＰ、又はその変異体、例えば、赤のスペクトルバンドのＣａ（２＋）依存性蛍光を発出するＣａ２＋インジケータｊＲＣａＭＰ１ｂ及びその変異体などを発現するように遺伝子操作される。
【００６８】
本発明の組成物及び方法の実施形態は、以下の実施例で例解される。これらの実施例は例示の目的で提供されており、本発明の組成物及び方法の範囲に対する制限とはみなされない。
【００６９】
自発的な神経活性のためのＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３画像化
実験方法：細胞と試薬
神経活性を測定するための機器／システムの有用性は、ラット星状細胞と初代及びｉＰＳＣ由来ニューロンの共培養を用いた長期画像化実験で例示されている。細胞内Ｃａ２＋の時間的変化は、神経活性の尺度として使用される。細胞内Ｃａ２＋のこれらの長期測定を行うために、ニューロンは、レンチウイルス送達システムを介して、遺伝的にコードされたＣａ２＋インジケータ（ＧＥＣＩ）、ｊＲＣａＭＰ１ｂに感染した。  ｊＲＣａＭＰ１ｂは、Ｈｏｗａｒｄ  Ｈｕｇｈｅｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ−米国特許：ＵＳ２０１６／０１７６９３１  Ａ１からライセンスされ、Ｄａｎａ  ｅｔ  ａｌ、ｅＬｉｆｅ  ２０１６；  ５：ｅ１２７２７に記載されている。サンプルデータには、初代ラット前脳ニューロンとｉＰＳＣ由来ニューロンの３つの調製物、ｉＣｅｌｌ  ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、Ｐｅｒｉ．４Ｕ神経細胞（Ｎｃａｒｄｉａ）及びｉＮｅｕｒｏｎｓ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）からの実験が含まれる。
【００７０】
すべての実験は、ニューロンと星状細胞の付着を強化するために、ポリ−Ｄ−リジン（ラット前脳ニューロン）、ポリエテンイミン／ラミニン（ｉＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓ及びＰｅｒｉ．４Ｕ）又はマトリゲル（ｉＮｅｕｒｏｎｓ）でコーティングされた９６ウェルマイクロプレートで行った。すべての調製物は、１５，０００細胞／ウェルの密度で、初代ラット星状細胞（ＭＴＩ−Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｅｍ）と共培養した。有糸分裂阻害剤（５−フルオロ−２´−デオキシウリジン／ウリジンの組み合わせ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加して、播種の２〜３日後に分裂細胞の増殖を減少させた。培養物は、３０日間までの期間維持され、培地は週に２回５０％交換した。
【００７１】
初代ニューロン実験では、ラット前脳ニューロン（Ｅ−１８胚（ＭＴＩ−Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｔｅｍ）から採取）を、Ｎｅｕｒｏｃｕｌｔ（商標）ＳＭ１  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）及び２  ｍＭグルタミンを有するＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）Ｍｅｄｉｕｍ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中で５，０００〜４０，０００ニューロン／ウェルの密度範囲でプレーティングした。プレーティング１日後のニューロンにＧＥＣＩ  ｊＲＣａＭＰ１ｂを感染させた。プレーティング３日後に画像化を開始した。実験条件として、メンテナンス培地は、プレートの一部においてＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（商標）ＳＭ１  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有するＢｒａｉｎＰｈｙｓ（商標）Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に交換した。
【００７２】
ｉＣｅｌｌ  ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓの実験において、ｉＣｅｌｌ  ＧｌｕｔａＮｅｕｒｏｎｓを、３０，０００ニューロン／ウェルの密度で、ｉＣｅｌｌ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  Ｂ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、ｉＣｅｌｌ  Ｎｅｒｖｏｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）、及びＮ２  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を有する、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（商標）Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）中にプレーティングした。プレーティング１日後のニューロンにＧＥＣＩ  ｊＲＣａＭＰ１ｂを感染させた。プレーティング３日後に画像化を開始し、２７日間継続した。
【００７３】
Ｐｅｒｉ．４Ｕ神経細胞実験において、Ｐｅｒｉ．４Ｕ神経細胞を、Ｎｅｕｒｏ．４Ｕ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｕｉｍ（Ｎｃａｒｄｉａ）及びＮｅｕｒｏ−Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １（Ｎｃａｒｄｉａ）に２５，０００ニューロン／ウェルの密度でプレーティングした。プレーティング１日後のニューロンにＧＥＣＩ  ｊＲＣａＭＰ１ｂを感染させた。プレーティング３日後に画像化を開始した。実験条件として、メンテナンス培地は、プレートの一部において、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（商標）ＳＭ１  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（商標）Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に変更した。
【００７４】
ｉＮｅｕｒｏｎ実験において、ｉＮｅｕｒｏｎを１０，０００ニューロン／ウェルの密度で３Ｎ培地（ＤＭＥＭ  ／  Ｆ１２培地とＮｅｕｒｏｂａｓａｌ（商標）培地、インスリン、非必須アミノ酸、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒの組み合わせ）にプレーティングした。プレーティング２１日後のニューロンにＧＥＣＩ  ｊＲＣａＭＰ１ｂを感染させた。実験条件として、メンテナンス培地は、プレートの一部において、ＮｅｕｒｏＣｕｌｔ（商標）ＳＭ１  Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を有する、ＢｒａｉｎＰｈｙｓ（商標）Ｎｅｕｒｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に交換した。ＧＥＣＩ感染後に画像化を開始し、１０日間継続した。
【００７５】
明確さのために別個の実施形態の文脈において説明されている本発明の特定の特徴は、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることが理解される。逆に、簡潔さのために単一の実施形態の文脈で説明されている本発明の様々な特徴は、別個に又は任意の適切なサブコンビネーションで提供することもできる。
【００７６】
本明細書において言及されるあらゆる特許又は刊行物は、あたかも各々の個々の刊行物が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示される場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７７】
本明細書に記載される組成物及び方法は、現在、例示的な好ましい実施形態の代表例であり、本発明の範囲に対する制限として意図されていない。それらの変更及び他の用途は、当業者に思い浮かぶであろう。そのような変更及び他の使用は、特許請求の範囲に記載されている本発明の範囲から逸脱することなく行うことができる。
【００７８】
ＶＩ．結論
上記の詳細な説明は、添付の図面を参照して、開示されたシステム、デバイス、及び方法の様々な特徴及び機能を説明している。図面において、文脈がそうでないことを示さない限り、類似の記号は通常、類似のコンポーネントを同定する。詳細な説明、図面、及び特許請求の範囲に記載されている例示的な実施形態は、限定することを意味していない。本明細書に提示される主題の範囲から逸脱することなく、他の実施形態を利用することができ、他の変更を行うことができる。本明細書に一般的に記載され、図面に例解されるような本開示の態様は、多種多様な異なる構成で配置、置換、組み合わせ、分離、及び設計することができ、これらのすべてが本明細書に明示的に企図されていることは容易に理解される。
【００７９】
図面におけるメッセージフロー図、シナリオ、及びフローチャートのいずれか又はすべてに関して、本明細書で説明するように、各ステップ、ブロック、及び／又は通信は、例示的実施形態に従う情報の処理及び／又は情報の送信を表し得る。代替的な実施形態は、これらの例示的な実施形態の範囲内に含まれる。これらの代替的な実施形態において、例えば、ステップ、ブロック、送信、通信、要求、応答、及び／又はメッセージとして記載される機能は、関連する機能に依存して、示されるか又は議論される順序とは異なる順序で実行されることができ、実質的に同時又は逆の順序を含む。さらに、より多いか又は少ないステップ、ブロック、及び／又は機能が、本明細書に記載されるメッセージフロー図、シナリオ、及びフローチャートのいずれかとともに使用することができ、これらのメッセージフロー図、シナリオ、及びフローチャートは、一部又は全体で、互いと組み合わせることができる。
【００８０】
情報の処理を表すステップ又はブロックは、本明細書で説明する方法又は技術の特定の論理機能を実行するように構成することができる回路に対応し得る。代替的又は追加的に、情報の処理を表すステップ又はブロックは、モジュール、セグメント、又はプログラムコードの一部（関連データを含む）に対応し得る。プログラムコードは、方法又は技術において特定の論理機能又は動作を実装するためにプロセッサによって実行可能な１つ以上の命令を含むことができる。プログラムコード及び／又は関連データは、ディスクドライブ、ハードドライブ、又は他の記憶媒体を含む記憶装置など、任意のタイプのコンピュータ可読媒体に格納することができる。
【００８１】
コンピュータ可読媒体はまた、レジスタメモリ、プロセッサキャッシュ、及び／又はランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）のような短期間データを格納するコンピュータ可読媒体などの非一時的コンピュータ可読媒体も含むことができる。コンピュータ可読媒体は、例えば、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、光学ディスク若しくは磁気ディスク、及び／又はコンパクトディスク読み取り専用メモリ（ＣＤ−ＲＯＭ）などの二次又は永続的な長期ストレージなど、プログラムコード及び／又はデータを長期間格納する非一時的なコンピュータ可読媒体も含むことができる。コンピュータ可読媒体はまた、任意の他の揮発性又は不揮発性ストレージシステムでもあり得る。コンピュータ可読媒体は、例えば、コンピュータ可読記憶媒体、又は有形の記憶装置と見なされ得る。
【００８２】
さらに、１つ以上の情報送信を表すステップ又はブロックは、同じ物理デバイス中のソフトウェア及び／又はハードウェアモジュール間の情報送信に対応し得る。しかしながら、異なる物理デバイスにおけるソフトウェアモジュール及び／又はハードウェアモジュール間で、他の情報送信が行われ得る。
【００８３】
本明細書において様々な態様及び実施形態が開示されているが、他の態様及び実施形態は当業者には明らかである。本明細書に開示されている様々な態様及び実施形態は例示を目的としており、限定を意図するものではなく、その真の範囲は以下の特許請求の範囲によって示される。
【図１】
2021502055.tif 000002
【図２Ａ】
2021502055.tif 000003
【図２Ｂ】
2021502055.tif 000004
【図２Ｃ】
2021502055.tif 000005
【図２Ｄ】
2021502055.tif 000006
【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【図１３Ｉ】
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【図１３Ｊ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１８Ｃ】
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【図１８Ｄ】
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【図１８Ｅ】
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【図１８Ｆ】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【国際調査報告】
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