(57)【要約】間葉系幹細胞（ＭＳＣ）に由来する臨床グレードのエキソソームを製造する方法が本明細書に提供される。さらに、ｓｉＲＮＡのような治療剤をエキソソームに搭載する方法が提供される。臨床グレードのエキソソームを投与することによって疾患を治療する方法もまた、本明細書中に提供される。【選択図】図１Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からエキソソームを製造する方法であって：
（ａ）ＭＳＣを機能的に閉鎖されたバイオリアクター中で、ヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含む培地中で７５〜９５％コンフルエンシーまで培養すること；
（ｂ）細胞を、さらにＰＬＴを本質的に含まない培地中で培養すること；
（ｃ）前記バイオリアクターからの馴化培地画分を採集すること；及び
（ｄ）前記馴化培地画分からエキソソームを単離すること
を含む、方法。
【請求項２】
各馴化培地画分が、採集後に−８０℃で保存される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記馴化培地画分を解凍し、工程（ｄ）の前にプールする、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＳＣが、骨髄由来ＭＳＣとしてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ＭＳＣが脂肪由来ＭＳＣとしてさらに定義される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ａ）の前に、前記バイオリアクターに少なくとも１×１０７個のＭＳＣを播種することをさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＳＣが、約４００〜５００細胞／ｃｍ２の密度で播種される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記閉鎖されたバイオリアクターが中空繊維バイオリアクターである、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
中空繊維バイオリアクターが、テルモ細胞増殖システムである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（ａ）の培地において、ＰＬＴが５％の濃度である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
新鮮な培地が、前記バイオリアクター中のＭＳＣに連続的に添加される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
細胞が、５％酸素で培養される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
工程（ａ）の培養が５〜１０日間である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
工程（ａ）の培養が、８日間である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＭＳＣが８０〜９０％コンフルエンシーまで培養される、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ＭＳＣが８５〜９０％コンフルエンシーまで培養される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｂ）の培養が２４〜７２時間である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
工程（ｂ）の培養が４８時間である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ｂ）の培地がＰＬＴを含まない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
ＭＳＣが工程（ａ）と（ｂ）との間で洗浄される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
ＭＳＣが無血清の規定培地中で培養される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
工程（ａ）〜（ｄ）が無血清条件下で行われる、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記馴化培地画分が、密封バッグに採集される、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記馴化培地画分が２４〜７２時間毎に採集される、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記馴化培地画分が４０〜５０時間毎に採集される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
馴化培地画分が４８時間毎に採集される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記馴化培地画分が、それぞれ２００〜３００ｍＬの体積である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記馴化培地画分を１０〜１４日間採集する、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記馴化培地画分を１２日間採集する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
少なくとも５つの馴化培地画分が採集される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
工程（ａ）〜（ｄ）が３週間未満で行われる、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
各馴化培地画分が、９×１０１１〜５０×１０１１個のエキソソームを含む、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
工程（ｃ）で、少なくとも１０×１０１２個のエキソソームが単離される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
工程（ｃ）で、少なくとも１５×１０１２個のエキソソームが単離される、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
単離が、エキソソーム含有ペレットを得るためのプールされた画分の濾過及び限外遠心と前記エキソソーム含有ペレットを緩衝液中に再懸濁することを含む、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
隔離が、ポンプ及びヒートシールされた管を使用して、機能的に閉鎖された様式で行われる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
濾過が、プールされた画分を０．２μｍフィルターに通すこととしてさらに定義される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
単離がさらに、大きな細胞残屑を除去するための、濾過の前の遠心分離工程をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
単離が４℃で行われる、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記緩衝液が、０．０９Ｍ塩化ナトリウム、０．２３Ｍグルコン酸ナトリウム、０．２７Ｍ酢酸ナトリウム三水和物、５ｍＭ塩化カリウム、及び３ｍＭ塩化マグネシウムを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
前記緩衝液のｐＨが７．４である、請求項３５又は４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記緩衝液がＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標）である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記エキソソームに治療剤を搭載することをさらに含む、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記治療剤が、１つ以上のサイトカイン、化学療法剤、核酸、小分子、又はタンパク質を含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記核酸がＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＲＮＡがｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
ＲＮＡがｓｉＲＮＡである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４８】
搭載が、前記エキソソームをエレクトロポレーションすることを含む、請求項４３〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
エレクトロポレーションが、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標）で実行される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記方法が工程（ｄ）とエレクトロポレーションとの間で、エキソソームを洗浄すること又は緩衝液を交換することを含まない、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
工程（ｄ）から搭載されたエキソソームの数までのエキソソームの数が２０％を超えて減少しない、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法によって産生されたエキソソームを含む、医薬組成物。
【請求項５３】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法によって産生されたエキソソームの有効量を対象に投与することを含む、癌を治療するための方法。
【請求項５４】
対象がヒトである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記エレクトロポレーションされたエキソソームが、前記対象に直接注入される、請求項５３又は５４に記載の方法。
【請求項５６】
少なくとも第２の抗癌治療を施すことをさらに含む、請求項５３〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記少なくとも第２の抗癌療法が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法又は免疫療法を含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項４３〜５１のいずれか一項に記載の方法によって産生された有効量のＲＮＡ搭載エキソソームを細胞に投与することを含む、ＲＮＡを細胞に送達する方法。
【請求項５９】
前記細胞がヒト細胞である、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記細胞が癌細胞又はＴ細胞である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法によって産生された有効量のエキソソームを対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法。
【請求項６２】
前記エキソソームにｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを搭載する、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記疾患又は障害が、癌、炎症性障害、又は免疫関連障害である、請求項６１又は６２に記載の方法。
【請求項６４】
癌が肺癌である、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記エキソソームにＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡが搭載される、請求項６１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記対象がヒトである、請求項６１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記エキソソームが、経口、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、内視鏡的、経皮的、皮下、局所的、又は直接注射によって投与される、請求項６１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記エキソソームが静脈内に投与される、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
少なくとも第２の治療剤を投与することをさらに含む、請求項６１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記少なくとも第２の治療剤が抗癌剤である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
抗癌剤が、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法又は免疫療法である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
免疫介在性炎症性疾患に罹患している対象における、該疾患を治療する方法であって、該対象に治療有効量の請求項１に記載のＭＳＣ由来エキソソームを投与することを含む、方法。
【請求項７３】
免疫介在性炎症性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、及びクローン病からなる群より選択される、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
ＭＳＣが同種異系である、請求項７２又は７３に記載の方法。
【請求項７５】
エキソソームが全身的又は局所的に投与される、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
エキソソームが、直腸、鼻、頬、膣、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病変内、又は頭蓋内経路を介して、又は埋め込み型のリザーバーを介して投与される、請求項７２〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記エキソソームが、少なくとも１つのさらなる治療剤と組み合わせて投与される、請求項７２〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１７年１１月１６日に出願された米国仮特許出願第６２／５８７，４０８号の利益を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
［技術分野］
本発明は一般に、分子生物学及び医学の分野に関する。より詳細には、本発明がＧＭＰ（ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）準拠エキソソームの大規模生産のための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
エキソソームやマイクロベシクルを含む細胞外小胞（ＥＶ）は、いくつかの生理学的過程に関与するナノサイズの細胞間コミュニケーション媒体である。具体的にはエキソソームは細胞によって放出されるナノサイズの小胞であり、細胞成分及び産物の細胞間交換の様式を構成し、これは治療的送達剤としてのそれらの有用性への新たな関心を促した。それらの人工的な対応物とは異なり、これらの自然に製造された、細胞間の特殊化されたシャトルサービスの特徴は、治療ペイロードの効率的な送達のための独特の利点を提供し得る。エキソソーム産生と細胞取り込みに関連するエキソソームと調節機構のこのような特徴は、さらに研究されるべき状態にとどまる。にもかかわらず、癌を含む疾患の治療的管理のためのエキソソームの使用は、既に有望な結果を示している。
【０００４】
それらの生物学的特性のために、エキソソームは免疫障害の治療、並びに治療化合物（例えば、サイトカイン、化学療法剤、核酸及びウイルスベクター）の全身送達のための有望な候補である。しかしながら、それらの低い産生収率により、臨床での潜在的な使用可能性が限定される。従って、治療に使用され得るエキソソームを産生するための効率的な方法については、未だ満たされないニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００５】
第１の実施形態では、ヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含む培地中で間葉系幹細胞（ＭＳＣ）をコンフルエンシー（例えば、７５〜９５％又は８０〜９０％コンフルエンス、約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％コンフルエンス）まで機能的に閉鎖されたバイオリアクター中で培養すること；さらにＰＬＴを本質的に含まない（例えば、ＰＬＴを含まない）培地中で細胞を培養すること；バイオリアクターから馴化培地画分を採集すること；及び馴化培地画分からエキソソームを単離することを含む、ＭＳＣからエキソソームを製造する方法が提供される。
【０００６】
いくつかの態様では、各馴化培地画分が、採集後に−８０℃で保存される。特定の態様において、馴化培地画分は、単離の前に解凍され、そしてプールされる。
【０００７】
特定の態様では、ＭＳＣは、骨髄由来ＭＳＣとしてさらに定義される。特定の態様では、ＭＳＣは、脂肪由来ＭＳＣとしてさらに定義される。
【０００８】
さらなる態様では、本方法は、バイオリアクター中でＭＳＣを培養する前に、バイオリアクターに少なくとも１×１０７のＭＳＣを播種することをさらに含む。一部の態様では、ＭＳＣは、約４００〜５００細胞／ｃｍ２の濃度で播種される。
【０００９】
特定の態様では、密閉バイオリアクターが中空繊維バイオリアクターである。いくつかの態様では、中空繊維バイオリアクターがテルモ細胞増殖システムである。
【００１０】
いくつかの態様では、ＰＬＴは、ＭＳＣ培養物の培地中で５％の濃度である。ＰＬＴの濃度は、約２〜１０％、例えば３、４、５、又は６％であってもよい。特定の態様では、新鮮な培地が、バイオリアクター中のＭＳＣに連続的に添加される。特定の態様において、細胞は、５％酸素で培養される。いくつかの態様において、工程（ａ）の培養は５〜１０日間（例えば、６、７、８、又は９日間）である。特定の態様において、工程（ａ）の培養は８日間である。
【００１１】
特定の態様では、ＭＳＣは、８５％〜９０％コンフルエンシー、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％コンフルエンシーまで培養される。コンフルエンシーは、グルコース及びラクトースレベルをモニターすることによって測定され得る。例えば、ラクトースのレベルは約２〜６ｍｍｏｌ／Ｌ、例えば、約２、３、４、５、又は６ｍｍｏｌ／Ｌであり得、グルコースのレベルは約８０〜１４０ｍｇ／ｄＬ、例えば、約８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、又は１４０ｍｇ／ｄＬであり得る。
【００１２】
いくつかの態様では、本質的にＰＬＴを含まない培地での培養が、２４〜７２時間、例えば、２４〜４８、３６〜５０、４８〜６０、又は５０〜７２時間、約３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１又は５２時間である。特定の態様において、培養はＰＬＴを本質的に含まない培地であり、約４８時間である。特定の態様において、さらなる培養工程の培地は、ＰＬＴを含まない。
【００１３】
特定の態様において、ＭＳＣは、ＰＬＴでの培養と、本質的にＰＬＴを含まないか又は含まない培地中での培養との間で、洗浄される。いくつかの態様において、ＭＳＣは、無血清の規定培地中で培養される。特定の態様において、完全な方法は、無血清条件下で実施される。
【００１４】
特定の態様において、馴化培地画分は、密封バッグに採集される。特定の態様において、馴化培地画分は、２４〜７２時間ごとに採集される。いくつかの態様において、馴化培地画分は、４０〜５０時間ごとに採集される。特定の一態様では、馴化培地画分は、４８時間毎に採集される。
【００１５】
いくつかの態様では、馴化培地画分は、２００〜２５０又は２５０〜３００ｍＬなど、２００〜３００ｍＬの容量である。特定の態様において、馴化培地画分は、１０〜１４日間（例えば、１０、１１、１２、１３、又は１４日間）採集される。特定の態様では、馴化培地画分は１２日間採集される。特定の態様では、少なくとも５つの馴化培地画分が採集される。特定の態様において、この方法は、３週間未満で行われる。
【００１６】
いくつかの態様において、各々の馴化培地画分は、９×１０１１から５０×１０１１のエキソソームを含む。特定の態様において、少なくとも１０×１０１２のエキソソームが、採集された培地画分において単離される。特定の態様において、少なくとも１５×１０１２のエキソソームが、採集された培地画分において単離される。少なくとも１０×１０１１、１５×１０１１、２０×１０１１、２５×１０１１、３０×１０１１、３５×１０１１、４０×１０１１、４５×１０１１、５０×１０１１、６０×１０１１、７０×１０１１、８０×１０１１、９０×１０１１、１０×１０１２、１５×１０１２、２０×１０１２、又は２５×１０１２のエキソソームを単離することができる。
【００１７】
特定の態様において、単離は、プールされた画分の濾過及び超遠心分離を含み、エキソソーム含有ペレットを得、そしてエキソソーム含有ペレットを緩衝液中に再懸濁する。いくつかの態様において、単離は、ポンプ及びヒートシールされたチューブを用いて、機能的に閉鎖された様式で行われる。いくつかの態様において、濾過はさらに、プールされた画分を、０．２μｍフィルターのようなフィルターに通すこととして定義される。さらなる態様において、単離は、大きな細胞残屑を除去するための濾過の前の遠心分離工程をさらに包含する。特定の態様において、単離は４℃で行われる。
【００１８】
特定の態様では、緩衝液が約０．０１〜０．１Ｍ、例えば約０．０８、０．０９、又は０．１Ｍ、特に約０．１〜０．５Ｍ、例えば約０．１、０．２、又は０．３Ｍの塩化ナトリウム、約０．１〜０．５Ｍ、例えば約０．１、０．２、又は０．３Ｍ、特に約０．２３Ｍのグルコン酸ナトリウム、約０．１〜０．５、例えば０．１、０．２又は０．３Ｍ、特に約０．２７Ｍの酢酸ナトリウム三水和物、１〜１０ｍＭ、例えば約６〜７ｍＭ、特に約５ｍＭの塩化カリウム、及び約１〜５ｍＭ、例えば約２〜４ｍＭ、特に約３ｍＭの塩化マグネシウムを含む。いくつかの態様では、緩衝液が約６〜８、例えば、約６．８、６．９、７．０、７．１、７．２、７．３、７．４、７．５、又は７．６、特に約７．４などのｐＨを有する。特定の態様では、緩衝液はＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標）である。
【００１９】
さらなる態様において、この方法は、エキソソームに治療剤を搭載する工程をさらに包含する。いくつかの態様において、治療剤は、１つ以上のサイトカイン、化学療法剤、核酸、小分子、又はタンパク質を含む。特定の態様において、核酸は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡを含む。いくつかの態様において、ＲＮＡはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｓｈＲＮＡである。特定の態様では、ＲＮＡはｓｉＲＮＡである。いくつかの態様において、搭載は、エキソソームをエレクトロポレーションすることを包含する。特定の態様において、エレクトロポレーションは、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標）中で行われる。特定の態様において、この方法は、エキソソームを単離する工程とエレクトロポレーションする工程との間で、エキソソームを洗浄する工程、又は緩衝液を交換する工程を包含しない。特に、エキソソームを単離する段階から搭載されたエキソソームの数までのエキソソームの数は２０％以上減少しない。
【００２０】
別の実施形態では、実施形態の方法（例えば、ヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含む培地中で、８０〜９０％コンフルエンシーまで機能的に閉鎖されたバイオリアクター中でＭＳＣを培養すること；ＰＬＴを本質的に含まない（例えば、ＰＬＴを含まない）培地中で細胞をさらに培養すること；バイオリアクターから馴化培地画分を採集すること；及び馴化培地画分からエキソソームを単離すること）によって産生されるエキソソームを含む医薬組成物が提供される。
【００２１】
さらに別の実施形態において、癌を治療するための方法が提供され、これは、実施形態の方法に従って産生された有効量のエキソソームを投与すること（例えば、ヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含む培地中で、８０〜９０％コンフルエンシーまで、機能的に閉鎖されたバイオリアクター中でＭＳＣを培養すること；ＰＬＴを本質的に含まない（例えば、ＰＬＴを含まない）培地中で細胞をさらに培養すること；バイオリアクターから馴化培地画分を採集すること；及び馴化培地画分からエキソソームを単離すること）を包含する。いくつかの態様では、対象はヒトである。
【００２２】
特定の態様において、エレクトロポレーションされたエキソソームは、対象に直接注入される。追加の態様では、方法が少なくとも第２の抗癌療法を投与することをさらに含む。いくつかの態様において、少なくとも第２の抗癌治療は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法又は免疫療法を含む。
【００２３】
別の実施形態において、本実施形態の方法（例えば、ヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含む培地中で、８０〜９０％コンフルエンシーまで、機能的に閉鎖されたバイオリアクター中でＭＳＣを培養する工程；さらに、細胞を、本質的にＰＬＴを含まない（例えば、ＰＬＴを含まない）培地中で培養する工程；バイオリアクターから馴化培地画分を採集する工程；馴化培地画分からエキソソームを単離する工程；及び単離されたエキソソームにＲＮＡを搭載し、それによってＲＮＡ搭載エキソソームを産生する工程）によって産生される、有効量のＲＮＡが搭載されたエキソソームを細胞に送達する工程を含む、ＲＮＡを細胞に送達する方法が提供される。いくつかの態様において、細胞はヒト細胞である。特に、細胞は癌細胞又はＴ細胞である。
【００２４】
さらなる実施形態において、それを必要とする対象における疾患又は障害を治療する方法が提供され、これは、本実施形態の方法（例えば、ヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含む培地中で８０〜９０％コンフルエンシーまで機能的に閉鎖されたバイオリアクター中でＭＳＣを培養すること；ＰＬＴを本質的に含まない（例えば、ＰＬＴを含まない）培地中で細胞をさらに培養すること；バイオリアクターから馴化培地画分を採集すること；及び馴化培地画分からエキソソームを単離すること）によって産生された有効量のエキソソームを投与することを含む。いくつかの態様において、エキソソームは、ｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡを搭載している。特定の態様において、エキソソームは、ＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡが搭載される。いくつかの態様では、対象はヒトである。
【００２５】
いくつかの態様において、疾患又は障害は、癌、炎症性障害、又は免疫関連障害である。特定の態様では、癌は肺癌である。
【００２６】
特定の態様において、エキソソームは、経口的に、局所的に、静脈内に、腹腔内に、筋肉内に、内視鏡的に、経皮的に、皮下的に、局所的に、又は直接注射によって投与される。いくつかの態様において、エキソソームは静脈内に投与される。
【００２７】
追加の態様では、方法は、少なくとも第２の治療薬を投与することをさらに含む。いくつかの態様では、少なくとも第２の治療剤が抗癌剤である。特定の態様において、抗癌剤は、化学療法、放射線療法、遺伝子療法、手術、ホルモン療法、抗血管新生療法又は免疫療法である。
【００２８】
別の実施形態では、前記疾患に罹患している対象における免疫介在性炎症性疾患を治療する方法であって、前記対象に、本方法（例えば、ヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含む培地中で８０〜９０％コンフルエンスになるように機能的に閉じたバイオリアクター中でＭＳＣを培養すること；ＰＬＴを本質的に含まない（例えば、ＰＬＴを含まない）培地中で細胞をさらに培養すること；バイオリアクターから馴化培地画分を採集すること；及び馴化培地画分からエキソソームを単離すること）に従って産生された治療有効量のＭＳＣ由来エキソソームを投与することを含む方法が提供される。いくつかの態様において、免疫介在性炎症性疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、及びクローン病からなる群から選択される。特定の態様において、ＭＳＣは同種異系である。いくつかの態様において、エキソソームは、全身的又は局所的に投与される。特定の態様において、エキソソームは、直腸、鼻腔内、口腔内、膣内、皮下、皮内、静脈内、腹腔内、筋肉内、関節内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、病変内、又は頭蓋内経路を介して、又は埋め込み型のリザーバーを介して投与される。いくつかの態様において、エキソソームは、少なくとも１つのさらなる治療剤と一緒に投与される。
【００２９】
本発明の他の目的、特徴及び利点は、下記の詳細な説明によって明かとなる。しかしながら、本発明の詳細な説明、特異的な実施例及び好適な実施例は例示として行われるものであって、この詳細な説明によって当業者に明らかになる各種の変更や修正は、本発明の精神及び範囲内にあることを理解しなくてはならない。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
以下の図面は本明細書の一部を掲載し、本発明のある態様をさらに示すために含まれる。本発明は、ここに提示される特定の実施形態の詳細な記載と組み合わせてこれらの図面の１以上を参照することによって良好に理解されるのであろう。
【００３１】
【図１】図１Ａ〜１Ｄ：（図１Ａ）Ｔｕｒｕｍｏ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）を用いて間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からＥＶを産生するように設計された概略手順。（図１Ｂ）エキソソームの採集のためのＭＳＣバイオリアクター培養の手順を詳述する模式図。（図１Ｃ）ＭＳＣ馴化培地からのエキソソームの単離及びエレクトロポレーション手順の概略図。（図１Ｄ）ＭＳＣ由来エキソソームの生成を示す概略図。
【００３２】
【図２】図２は、バイオリアクター上で培養されたＭＳＣからのＥＶを含有する馴化培地の生産のための戦略の概略図である。
【００３３】
【図３】図３：バイオリアクター上で培養されたＭＳＣ馴化培地からのＥＶの単離のための戦略の概略図。
【００３４】
【図４】図４Ａ〜４Ｂ：バイオリアクター中で産生されたＭＳＣ由来エキソソームの同定。（図４Ａ）エキソソームマーカーの発現を示す、各採取時にバイオリアクター中で産生されたＭＳＣ由来エキソソームのフローサイトメトリー。（図４Ｂ）エキソソームの典型的な形態を示す、各採取物からの代表的なＴＥＭ。
【００３５】
【図５】図５Ａ〜５Ｅ：各採取時にのバイオリアクター中で産生されたエキソソームの定量。（図５Ａ）ｍｉｃｒｏＢＣＡ及びＮａｎｏＳｉｇｈｔによって決定された量子において産生されたＭＳＣ由来エキソソームの数。（図５Ｂ）ＮａｎｏＳｉｇｈｔを用いた各収穫測度の粒度分布。（図５Ｃ）エキソソーム産生の間のバイオリアクター中のグルコース及びラクトースのレベル。（図５Ｄ）異なる時点でＭＳＣ馴化培地から単離され、ＮａｎｏＳｉｇｈｔによって定量化された細胞当たりに産生されたエキソソームの数。（図５Ｅ）２４時間及び４８時間で単離されたＭＳＣ由来エキソソーム上のエキソソームマーカーの代表的なフローサイトメトリー。
【００３６】
【図６】図６Ａ〜６Ｂ：ヒト血小板溶解物（ｈＰＬＴ）又は無血清条件を補充した培地中で産生されたＭＳＣ由来エキソソームの定量。（図６Ａ）ＮａｎｏＳｉｇｈｔによって分析されたｈＰＬＴを伴って又は伴わずに培養されたＭＳＣの馴化培地から単離された、細胞当たりのエキソソームの数。（図６Ｂ）培地単独対ヒト血小板溶解物（ｈＰＬＴ）を補充した培地を使用して産生されたＭＳＣ由来エキソソームのフローサイトメトリーであり、無血清培地上で産生されたエキソソームの純度を示す。
【００３７】
【図７】図７：１６の異なるｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒプログラム及び３つの異なるｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ溶液を用いたＭＳＣ由来エキソソームエレクトロポレーションの評価。エレクトロポレーションの効率を、４８時間後にレシピエント細胞上でＭＳＣ由来エキソソームによるｓｉＲＮＡ送達によって誘導されるアポトーシスによって評価した。
【００３８】
【図８】図８Ａ〜８Ｃ：５つの異なる溶液を用いたＭＳＣ由来エキソソームエレクトロポレーションの評価。（図８Ａ）エレクトロポレーションの効率を、４８時間後にレシピエント細胞上のＭＳＣ由来エキソソームによるｓｉＲＮＡ送達によって誘導されるアポトーシスによって評価した。（図８Ｂ）研究用緩衝液（ＲＢ）又は臨床用緩衝液（ＣＢ；すなわち、血小板溶解物（ＰＬＴ））のいずれかを使用する、エレクトロポレーション後のＭＳＣエキソソームの代表的な透過型電子顕微鏡写真であり、エレクトロポレーション後のエキソソーム完全性の維持を示す。（図８Ｃ）Ｌｏｎｚａ装置及びＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標）溶液を用いてエレクトロポレーションしたＭＳＣ由来エキソソームを用いたｓｉＲＮＡの送達によって誘導された、レシピエント細胞における遺伝子転写のサイレンシング。
【００３９】
【図９】図９：超遠心分離前及び超遠心分離後のエキソソームの数。研究用緩衝液を使用したエキソソームのエレクトロポレーションには、第２の洗浄工程を含み、これは、サンプルの少なくとも５０％の損失をもたらし得る。
【００４０】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄ：バイオリアクターにおいて産生されてマウスに注射された、予め標識されたＭＳＣ由来のエキソソームの生体内分布）。ＷＴヌードマウスにおける８×１０９の標識エキソソームの腹腔内（図１０Ａ、１０Ｂ）又は静脈内（図１０Ｃ、１０Ｄ）投与の６時間後におけるＤＩＲ標識ＭＳＣエキソソームの蛍光。（Ａ、Ｃ）解剖された臓器。（Ｂ、Ｄ）脾臓及び肝臓を伴わない解剖された臓器。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
ヒト治療のためのエキソソームを処方するためには、その製造のいくつかの態様がＧＭＰ（ｇｏｏｄ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  ｐｒａｃｔｉｃｅ）基準に準拠したエキソソームの大規模生産を含む、慎重な検討を必要とする。そこで、本研究は、ＧＭＰ準拠エキソソームを生成するための、革新的な手順及び関連する系統的分析に関するものである。
【００４２】
したがって、特定の実施形態では、本開示がテルモ細胞増殖システムなどの機能的に閉鎖されたバイオリアクターを使用して、間葉系間質細胞（ＭＳＣ）からエキソソームなどのＥＶを産生するための効率的かつ臨床的に関連する戦略を提供する。本明細書で提供される方法は、約３週間などの短時間で少なくとも１０×１０１２のＥＶを産生することができる。本発明の方法は、機能的に閉鎖された無血清系における臨床グレードのＥＶの大規模な産生及び単離を含む。ＥＶは骨髄由来ＭＳＣなどから、臨床的に適切な用量で製造される。
【００４３】
好ましい実施形態では、全方法は無血清であり、したがって、血清中のエキソソームからのＭＳＣ由来ＥＶの汚染は本質的にない。具体的には、この方法は、バイオリアクターにおけるＭＳＣの初期培養におけるヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）の使用を含み得る。本発明者らは、ＭＳＣを約８０〜９０％、例えば約８５％コンフルエンスまで培養すると、ＥＶの効率的な産生が得られることを見出した。従って、ＭＳＣは次いで、ＥＶを含む馴化培地の採集の前に、約２４〜７２時間（例えば、約２４時間又は４８時間）、ＰＬＴを含まない培地に切り替えられ得る。馴化培地画分は、約４８時間毎に採集され、ＥＶの単離まで、約−８０℃などで凍結されてもよい。馴化培地画分は、約４〜１０回、例えば約５、６、７、又は８回、特に約６回採集することができる。従って、バイオリアクターへのＭＳＣの播種から最終採集までの期間は、約１５〜３０日、例えば約２０日であり得る。各馴化培地画分は、少なくとも１×１０１１のエキソソーム、例えば、少なくとも９×１０１１、特に約３×１０１２のエキソソームを含むことができる。
【００４４】
好ましくは、ＥＶの単離の前に、採集した培地画分を解凍しプールする。エキソソームの単離は最初の遠心分離工程（例えば、１，０００ｇ）、続いて超遠心分離（例えば、約１００，０００ｇ）を含み得る。エキソソームペレットを生成するために、３ラウンドなどの複数ラウンドの超遠心分離があってもよい。いくつかの態様では、エキソソームペレットがＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標）などのＧＭＰ準拠の緩衝液に再懸濁される。エキソソームは超遠心分離の前に、０．２μｍフィルターなどの濾過にさらに供してもよい。この手法は、９〜１０×１０１２かそれ以上のエキソソーム、例えば１５×１０１２の総エキソソームの生成をもたらし得る。
【００４５】
さらに、エキソソームは治療剤（例えば、サイトカイン、化学療法剤、又は核酸）を搭載され得る。従って、本方法によって産生されるようなエキソソームを、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標）のようなＦＤＡ認可緩衝液中でのエレクトロポレーションによって搭載するための方法が提供される。エレクトロポレーションは、フロースルーエレクトロポレーションシステム（例えば、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ  ＬＶ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｏｎｚａ）で実施され得る。各々のエレクトロポレーションランは、少なくとも２×１０１２のエキソソームを含むことができる。エキソソームには、ｓｉＲＮＡなどの核酸を搭載することができる。緩衝液は、患者における使用のためにＦＤＡ承認され、滅菌され、そして非発熱性であり、患者に直接注入できるため、患者への投与の前に緩衝液を交換するための洗浄工程は必要ない。従って、従来の方法においてエキソソームの約５０％の損失をもたらし得るような、追加の洗浄工程からのエキソソームの損失はない。この緩衝液は、エレクトロポレーション後のエキソソームの完全性を維持し得る。
【００４６】
さらに、患者における免疫関連疾患及び癌などの疾患の治療のための、ｓｉＲＮＡを搭載したエキソソームなどのエキソソームの使用方法が本明細書に提供される。
【００４７】
［Ｉ．定義］
本明細書で使用される場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、本明細書では特定の成分のいずれも組成物に意図的に配合されておらず、かつ／又は汚染物質としてのみ又は微量で存在することを意味するために使用される。したがって、組成物の意図しない汚染から生じる特定の成分の総量は０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％を下回る。最も好ましいのは、標準的な分析方法で特定の成分の量を検出することができない組成物である。
【００４８】
ここでいう「ａ」又は「ａｎ」とは一つ又は複数を意味する場合があるが、ここでいう請求権において、「含む」と併用する場合には「ａ」又は「ａｎ」とは一又は複数を意味する場合がある。
【００４９】
特許請求の範囲における「又は」という用語の使用は代替物のみを指すことが明示的に示されない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は代替物及び「及び／又は」のみを指す定義を支持するが、本明細書で使用される「別の」は少なくとも後者又はそれ以上を意味してもよく、「約」、「実質的に」及び「ほぼ」という用語は一般に、記載された値のプラス又はマイナス５％を意味する。
【００５０】
「細胞外小胞」及び「ＥＶ」は、クラスとして、エキソソーム、エキソソーム様小胞、エクトソーム（細胞膜から直接小胞の出芽に起因する）、微粒子、微小小胞、分泌マイクロベシクル（ｓｈｅｄｄｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ；ＳＭＶ）、ナノ粒子及びさらには（大型の）アポトーシス性小胞又は小体（細胞死に起因する）又は膜粒子を含む、細胞由来及び細胞分泌性マイクロベシクルである。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「マイクロベシクル」及び「ＭＶ」は、典型的には直径が約１００ｎｍ〜約１，０００ｎｍ、又は血漿中で約１００ｎｍ〜約４００ｎｍであるリン脂質二重層によって囲まれた、より大きな細胞外小胞又は構造を意味する。マイクロベシクル／ＭＶは、細胞膜の出芽やブレブ形成（ｂｌｅｂｂｉｎｇ）によって調節された放出によって形成される。
【００５２】
細胞外小胞のクラス内で、重要な成分は「エキソソーム」それ自体であり、これは、直径が、好ましくは約４０〜１２０ｎｍ（例えば、５０〜１００ｎｍ）であり、そして膜性小胞（すなわち、エキソサイトーシス的融合、又は多小胞体（ＭＶＢ）の「エキソサイトーシス」から生じる、エンドサイトーシス起源のリン脂質二重層によって取り囲まれた小胞）である。エキソソームは哺乳動物由来の任意の適当な生物学的試料から単離されてもよく、これには全血、血清、血漿、尿、唾液、母乳、脳脊髄液、羊水、腹水、骨髄及び培養哺乳動物細胞（例えば、未成熟樹状細胞（野生型又は不死化）、誘導及び非誘導多能性幹細胞、線維芽細胞、血小板、免疫細胞、網状赤血球、腫瘍細胞、間葉系幹細胞、衛星細胞、造血幹細胞、膵臓幹細胞、白色及び褐色脂肪前駆細胞など）が含まれるが、これらに限定されない。当業者が理解するように、培養細胞サンプルは、（エキソソームを含まない血清を使用して）細胞に適切な培養培地中にある。
エキソソームは、テトラスパニンなどの表面マーカー、例えばＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ４４、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ８２及びＣＤ１５１；
インテグリン、ＩＣＡＭ−１、ＥｐＣＡＭや、アネキシン、ＴＳＧ１０１、ＡＬＩＸなどの標的化マーカー又は膜融合マーカー；及びＲａｂ５ｂ、ＨＳＰ７０、ＬＡＭＰ２（ｌｙｓｏｓｏｍｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）及びＬＩＭＰ（ｌｙｓｏｓｏｍａｌ  ｉｎｔｅｇｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）などの他のエキソソーム膜貫通蛋白質
などの、他の小胞に存在しない特定の表面マーカーを含む。
【００５３】
用語「間葉系幹細胞」又は「ＭＳＣ」は、本明細書で使用される場合、自己再生能力、及び特に結合組織、骨髄の間質、脂肪細胞、真皮及び筋肉を含む大きな表現型の多様性を有する子孫細胞を産生する分化能力を有する、中胚葉に由来する多能性体性幹細胞を指す。ＭＳＣは一般に、マーカーＣＤ１９、ＣＤ４５、ＣＤ１４及びＨＬＡ−ＤＲに対して陰性であり、マーカーＣＤ１０５、ＣＤ１０６、ＣＤ９０及びＣＤ７３に対して陽性であることを特徴とする細胞マーカー発現プロファイルを有する。ＭＳＣは、任意のタイプの組織から単離され得る。一般に、ＭＳＣは、骨髄、脂肪組織、臍帯、又は末梢血から単離され得る。特定の実施形態では、ＭＳＣは骨髄由来幹細胞である。
【００５４】
エキソソームが由来するＭＳＣは、自家、同種又は異種であり得る。本明細書中で使用される場合、用語「自己」は、ＭＳＣのドナー及び前記ＭＳＣに由来するエキソソーム（又は単離されたエキソソーム集団）のレシピエントが同じ対象であることを意味する。用語「同種」がＭＳＣのドナー及び前記ＭＳＣに由来するエキソソーム（又は単離されたエキソソーム集団）のレシピエントが異なる対象であることを意味する。用語「異種」がＭＳＣのドナー及び前記ＭＳＣに由来するエキソソーム（又は単離されたエキソソーム集団）のレシピエントが異なる種の対象であることを意味する。特定の実施形態において、エキソソームが由来するＭＳＣは同種異系である。
【００５５】
用語「脂肪組織由来幹細胞」又は「ＡＳＣ」は、本明細書中で使用される場合、脂肪組織に由来するＭＳＣを指す。ＡＳＣは当該分野で公知の方法（例えば、「ヒト脂肪間葉系幹細胞単離及び増殖」の下で以下に記載される方法）によって、脂肪組織から単離され得る。「脂肪組織」は、任意の脂肪組織を意味する。脂肪組織は例えば、皮下、大網／内臓、乳房、性腺、臓器周囲又は他の脂肪組織部位に由来する、褐色又は白色脂肪組織であってもよい。好ましくは、脂肪組織は皮下白色脂肪組織である。脂肪組織は、初代細胞培養物又は不死化細胞株を含み得る。脂肪組織は、脂肪組織を有する任意の生物に由来し得る。いくつかの実施形態では脂肪組織は哺乳動物であり、さらなる実施形態では脂肪組織はヒトである。脂肪組織の便利な供給源は脂肪吸引手術である。しかしながら、脂肪組織の供給源も、脂肪組織の単離方法も、本発明にとって重要ではないことが理解されるのであろう。特定の実施形態において、ＡＳＣは、対象の脂肪吸引物から単離される。
【００５６】
ＭＳＣは任意の動物、好ましくは非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット又はマウス）及び霊長類（例えば、サル又はヒト）を含む哺乳動物に由来し得る。特定の実施形態では、ＭＳＣはヒトである。
【００５７】
用語「機能的に閉鎖された」は、システム全体を気密封止することによって、又は採集システムへのすべての接続部に無菌バリアフィルタを提供することによって、流体の無菌性を保証するように封止されたシステムを指す。
【００５８】
用語「バイオリアクター」は、細胞に栄養素を提供し、代謝産物を除去し、閉鎖滅菌系において細胞増殖を導く生理化学的環境を提供する大規模細胞培養系を指す。特定の態様において、生物学的プロセス及び／又は生化学的プロセスは、監視及び制御された環境条件及び操作条件（例えば、ｐＨ、温度、圧力、栄養供給及び老廃物除去）下で発生する。本開示によれば、本方法と共に使用するのに適した基本的なクラスのバイオリアクターは、中空繊維バイオリアクターを含む。
【００５９】
用語「中空繊維」は、バイオリアクター内に含まれる細胞に栄養素（溶液中）を送達する際に使用するため、及びバイオリアクター内に含まれる細胞から廃棄物質（溶液中）を除去するために、規定されたサイズ、形状及び密度の孔を含む（任意の形状の）中空構造を含むことが意図される。本開示の目的のために、中空繊維は、再吸収性又は非再吸収性材料から構築されてもよい。繊維は管状構造を含むが、これに限定されない。
【００６０】
本明細書中で使用される場合、用語「患者」又は「対象」は、生きている哺乳動物生物、例えば、ヒト、サル、ウシ、ヒツジ、ヤギ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、モルモット、又はそれらのトランスジェニック種を指す。特定の実施形態では、患者又は対象は霊長類である。ヒト患者の非限定的な例は、成人、若者、乳児及び胎児である。
【００６１】
「治療」又は「治療すること」は、（１）疾患の病理又は症状を経験又は表示する対象又は患者における疾患の阻害（例えば、病理及び／又は症状のさらなる発達を停止すること）、（２）疾患の病理又は症状を経験又は表示する対象又は患者における改善（例えば、病理及び／又は症状を逆転する）、及び／又は（３）疾患の病理又は症状を経験又は表示する対象又は患者における疾患のあらゆる測定可能な減少をもたらすこと、を含む。
【００６２】
用語「有効である」はその用語が本明細書及び／又は請求項において使用される場合、所望の、予想される、又は意図される結果を達成するのに十分であることを意味する。「有効量」、「治療有効量」又は「薬学的有効量」は、患者又は対象を化合物で処置する文脈において使われる場合、疾患を処置又は予防するために対象又は患者に投与した場合に、そのような疾患の処置又は予防に影響を及ぼすのに十分な量である化合物の量を意味する。
【００６３】
本明細書で使用される用語「癌」は、固形腫瘍、転移性癌、又は非転移性癌を記述するために使用され得る。特定の実施形態では、癌は、膀胱、血液、骨、骨髄、脳、乳房、結腸、食道、十二指腸、小腸、大腸、結腸、直腸（ｃｏｌｏｎ）、直腸（ｒｅｃｔｕｍ）、肛門、歯肉、頭部、腎臓、肝臓、肺、鼻咽頭、頸部、卵巣、膵臓、前立腺、皮膚、胃、精巣、舌、又は子宮に由来し得る。
【００６４】
用語「接触された」及び「曝露された」は、細胞に適用される場合、治療剤が標的細胞に送達されるか、又は標的細胞と直接並置されるプロセスを記載するために本明細書中で使用される。細胞殺傷を達成するために、例えば、１つ以上の薬剤が、細胞を殺傷するか、又は細胞が分裂するのを妨げるのに有効な量で細胞に送達される。
【００６５】
患者の有効な応答又は患者の「応答性」とは、疾患又は障害のリスクがあるか、又はそれに罹患している患者に与えられる臨床的又は治療的利益をいう。このような便益には、細胞又は生物学的反応、完全応答、部分応答、安定した疾患（進行又は再燃を伴わない）、又は後に再燃を伴うが応答が含まれる。例えば、有効な応答は、癌と診断された患者における腫瘍サイズの減少又は無増悪生存であり得る。
【００６６】
本明細書で使用される「治療剤」は、疾患又は健康関連状態の治療上の利益を得る目的で、対象に投与することができる任意の薬剤を指す。例えば、治療剤を含むナノ粒子は、腫瘍のサイズを減少させる、腫瘍の局所侵襲性を減少させるか又は阻害する、又は転移の発生のリスクを減少させる目的で、対象に投与され得る。
【００６７】
本明細書中で使用される「診断剤」は、対象における疾患又は健康関連状態を診断する目的のために対象に投与され得る任意の薬剤を指す。診断には、病気があるかどうか、病気が進行しているかどうか、病状に何らかの変化があるかどうかを判断することが含まれる。
【００６８】
治療剤又は診断剤は、小分子、ペプチド、タンパク質、ポリペプチド、抗体、抗体フラグメント、ＤＮＡ、又はＲＮＡであり得る。特定の実施形態では、治療剤又は診断剤はｓｉＲＮＡである。
【００６９】
本明細書で使用される「核酸」とは一般に、核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はその誘導体又は類似体の分子（すなわちストランド）を指す。核酸塩基は、例えば、ＤＮＡに見られる天然に存在するプリン又はピリミジン塩基（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「ｇ」、チミン「Ｔ」又はシトシン「Ｃ」）又はＲＮＡに見られる天然に存在するプリン又はピリミジン塩基（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」又はＣ）を含む。用語「核酸」は、それぞれが「核酸」という用語の亜種である「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」を包含する。用語「オリゴヌクレオチド」は、長さが３〜約１００核酸塩基の分子を指す。用語「ポリヌクレオチド」は、長さが約１００核酸塩基よりも大きい少なくとも１つの分子を指す。
【００７０】
これらの定義は、一本鎖又は二本鎖の核酸分子を指す。二本鎖核酸は完全に相補的な結合によって形成されるが、いくつかの実施形態において、二本鎖核酸は部分的又は実質的な相補的な結合によって形成され得る。したがって、核酸は、典型的には分子を含む、特定の配列の１つ以上の相補鎖又は「相補物」を含む二本鎖分子を包含し得る。本明細書で使用するように、一本鎖核酸は接頭辞「ｓｓ」で、二本鎖核酸は接頭辞「ｄｓ」で表すことができる。
【００７１】
本明細書で使用する「ヌクレオチド」とは「骨格部分」をさらに含むヌクレオシドを指す。骨格部分は、一般に、ヌクレオチドを、ヌクレオチドを含む別の分子に、又は核酸を形成する別のヌクレオチドに、共有結合的に接続させる。天然に存在するヌクレオチドにおける「骨格部分」は、典型的には五炭糖に共有結合的に付着したリン部分を含む。骨格部分の結合は、典型的には五炭糖の３′−又は５′−位置のいずれかで起こる。しかしながら、特にヌクレオチドが天然に存在する五炭糖又はリン部分の誘導体又は類似体を含む場合、他のタイプの接続が当技術分野で知られている。
【００７２】
核酸は、天然に存在する核酸中に存在し得る、核酸塩基、核酸塩基リンカー部分及び／又は骨格部分の誘導体又は類似体を含み得るか、又はそれらから完全に構成され得る。本明細書で使用される「誘導体」（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）は、天然に存在する分子の化学的に修飾された形態又は改変された形態を指し、用語「模倣」（ｍｉｍｉｃ）又は「類似体」（ａｎａｌｏｇ）は天然に存在する分子又は部分に構造的に類似していてもよく、又は類似していなくてもよいが、類似の機能を有する分子を指す。本明細書で使用される「部分」（ｍｏｉｅｔｙ）は一般に、より大きな化学的又は分子構造のより小さな化学的又は分子成分を指す。核酸塩基、ヌクレオシド及びヌクレオチド類似体又は誘導体は、当技術分野で周知である。
【００７３】
用語「ｓｉＲＮＡ」（短い干渉ＲＮＡ）は、短い二本鎖ＲＮＡ複合体（典型的には１９〜２８塩基対長）をいう。換言すれば、ｓｉＲＮＡは２つのヌクレオチド鎖を含む二本鎖核酸分子であり、各鎖は約１９〜約２８ヌクレオチド（すなわち、約１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８ヌクレオチド）を有する。この複合体はしばしば、３′−オーバーハングを含む。ｓｉＲＮＡは当業者に公知の技術を使用して作製され得、そして多種多様なｓｉＲＮＡはＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，  Ｉｏｗａ）のような供給者から商業的に入手可能である。一実施形態では、本明細書に記載のＴＮＦ−αに対する２′−Ｏ−メチル修飾ｓｉＲＮＡ二重鎖をナノ粒子に組み込むことができ、アンチセンス鎖上の２′−Ｏ−メチル修飾はオフターゲット効果を排除し、非特異的免疫応答を最小限にし、ｓｉＲＮＡ安定性を改善する。
【００７４】
「マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）」は３′−ＵＴＲエレメントを介してタンパク質コード遺伝子を標的化し、実質的にサイレンシングすることができる、短い非コードＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは長さが約２１〜２２ヌクレオチドであり、非タンパク質コード遺伝子から転写されるより長い前駆体から生じる。
【００７５】
「免疫障害」、「免疫関連障害」又は「免疫介在性障害」とは、免疫応答が疾患の発症又は進行において役割を果たす障害を指す。免疫介在性疾患には、自己免疫疾患、同種移植片拒絶反応、移植片対宿主病及び炎症性及びアレルギー性状態が含まれる。
【００７６】
「自己免疫疾患」とは、免疫系が正常宿主の一部である抗原（すなわち自己抗原）に対して免疫応答（例えば、Ｂ細胞又はＴ細胞応答）を生じ、その結果として組織が傷害される疾患を指す。自己抗原は、宿主細胞に由来し得るか、又は粘膜表面に通常コロニー形成する微生物（共生生物として知られる）のような共生生物に由来し得る。
【００７７】
本明細書で使用される「コンフルエンシー」という用語は、バイオリアクターの中空繊維などの表面を覆う細胞のパーセンテージを指す。コンフルエンシーは、細胞が培養される培地中のグルコース及び／又はラクトースのレベルによって測定され得る。
【００７８】
［ＩＩ．エキソソームの産生］
本開示の特定の実施形態は、バイオリアクター、特に中空繊維バイオリアクターなどの機能的に閉鎖された系の使用による、臨床グレードＥＶ、特にエキソソームの大規模生産のための方法に関する。重要なことに、エキソソーム産生の全プロセスは、その後の治療剤の搭載を含めて、無血清であり得る。
【００７９】
（Ａ．間葉系幹細胞）
ＥＶの産生のための細胞は、脂肪由来又は骨髄由来ＭＳＣなどのＭＳＣであってもよい。特定の態様において、ＭＳＣは、自己又は同種異系であり得るヒトＭＳＣである。
【００８０】
ＭＳＣは、約１００〜１，０００細胞／ｃｍ２、例えば約１５０細胞／ｃｍ２、約２００細胞／ｃｍ２、約２５０細胞／ｃｍ２、約３００細胞／ｃｍ２、例えば約３５０細胞／ｃｍ２、例えば約４００細胞／ｃｍ２、例えば約４５０細胞／ｃｍ２、例えば約５００細胞／ｃｍ２、例えば約５５０細胞／ｃｍ２、例えば約６００細胞／ｃｍ２、例えば約６５０細胞／ｃｍ２、例えば約７００細胞／ｃｍ２、例えば約７５０細胞／ｃｍ２、例えば約８００細胞／ｃｍ２、例えば約８５０細胞／ｃｍ２、例えば約９００細胞／ｃｍ２、例えば約９５０細胞／ｃｍ２、又は約１，０００細胞／ｃｍ２の密度でバイオリアクターに播種することができる。特に、細胞は、約４００〜５００細胞／ｃｍ２、例えば約４５０細胞／ｃｍ２の細胞密度で播種することができる。
【００８１】
バイオリアクター中に播種される細胞の総数は、約１．０×１０６〜約１．０×１０８細胞、例えば、約１．０×１０６〜５．０．０×１０６、５．０×１０６〜１．０×１０７、１．０×１０７〜５．０×１０７、５．０×１０７〜１．０×１０８細胞であり得る。特定の態様では、バイオリアクターに播種される細胞の総数は、約１．０×１０７〜約３．０×１０７、例えば約２．０×１０７細胞である。
【００８２】
細胞は、任意の適切な細胞培養培地に播種され得、その多くは商業的に入手可能である。例示的な培地には、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ、ＭＥＭ、Ｍｅｄｉａ  １９９、ＨＡＭＳなどが含まれる。一実施形態では、培地がαＭＥＭ培地、特にＬ−グルタミンを補充したαＭＥＭである。培地には、増殖因子、サイトカイン、ホルモン、又はＢ２７、抗生物質、ビタミン及び／又は低分子薬物のうちの１つ以上を添加することができる。特に、培地は無血清であってもよい。
【００８３】
いくつかの実施形態では、細胞を室温でインキュベートすることができる。インキュベータは加温され、約５％ＣＯ２及び約１％Ｏ２の大気を有することができる。いくつかの実施形態では、ＣＯ２濃度が約１〜２０％、２〜１０％、又は３〜５％であってもよい。いくつかの実施形態では、Ｏ２濃度が約１〜２０％、２〜１０％、又は３〜５％であってもよい。
【００８４】
特定の実施形態では、細胞を無血清培地に播種し、培養する。培地には、血小板溶解物、特にヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を補充することができる。ＰＬＴは、約１〜１０％、例えば約１〜４％、２〜５％、３〜６％、４〜７％、５〜８％、又は６〜１０％、例えば約４％、５％、又は６％、特に約５％の濃度で培地中に存在してもよい。
【００８５】
ＭＳＣは、播種後約５〜１０日間、例えば約５、６、７、８、９、又は１０日間、特に約７、８、又は９日間、バイオリアクター中で初期培養することができる。具体的には、ＭＳＣは、約７５〜９５％コンフルエンシー、例えば約７５〜８０％、８０〜８５％、８５〜９０％、又は９０〜９５％コンフルエンシーまで、特に約８５〜９０％、例えば８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、又は９０％コンフルエンシーまで、ＰＬＴを含む培地中で初期培養することができる。細胞が意図したコンフルエンシーに到達したら、細胞を、ＰＬＴを含まない培地に移すことができる。細胞は、ＰＬＴを含まない培地に移す前に、ＰＢＳなどの緩衝液で少なくとも１回洗浄することができる。
【００８６】
ＰＬＴを含まない培地中での細胞の培養は、ＰＬＴ中に存在し得るエキソソームによるＭＳＣ由来エキソソームの汚染又は希釈を防止するために使用される。いくつかの態様では、ＰＬＴを遠心分離にかけてエキソソームを除去し、エキソソームを含まないＰＬＴを得ることができる。
【００８７】
細胞は、ＰＬＴを含まない培地中で、約８〜１００時間、例えば１２〜７２時間、例えば約１２〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６５〜７０、又は７０〜７２時間、培養することができる。特に、細胞は、ＰＬＴを含まない培地中で、約２４〜４８時間、例えば、約４８時間、エキソソームの採集の前に培養され得る。
【００８８】
（Ｂ．バイオリアクター）
バイオリアクターは、静的バイオリアクター、撹拌フラスコバイオリアクター、回転壁容器バイオリアクター、中空繊維バイオリアクター及び直接潅流バイオリアクターを含む一般的なカテゴリーに従って分類することができる。バイオリアクター内で、細胞は、遊離であるか、又は固定化され、多孔性３次元足場（ヒドロゲル）上に播種され得る。
【００８９】
培養中の物質移動を促進するために、中空繊維バイオリアクターを使用することができる。中空繊維バイオリアクターは、１０〜３０ｋＤａの典型的な分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）範囲で平行に配列された小さい半透過性毛細管膜である中空繊維をベースとした３Ｄ細胞培養システムである。これらの中空繊維膜はしばしば、管状ポリカーボネートシェル内に束ねられ、収容されて、中空繊維バイオリアクターカートリッジを形成する。カートリッジ内には２つの区画、すなわち、中空繊維内の毛細管内（ＩＣ）空間と、中空繊維を取り囲む毛細管外（ＥＣ）空間とがあり、これらの区画にはインレットポート及びアウトレットポートも取り付けられている。
【００９０】
このように、本開示では、バイオリアクターは中空繊維バイオリアクターであってもよい。中空繊維バイオリアクターは、細胞が繊維の管腔内に埋め込まれ、培地が管腔外空間を潅流することができ、又は代わりに、中空繊維を通して気体及び培地潅流を提供し、細胞は管腔外空間内で増殖することができる。本開示に適した中空繊維バイオリアクターは、当技術分野で公知であり、Ｃａｒｉｄｉａｎ（Ｔｅｒｕｍｏ）ＢＣＴ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍを含むことができるが、これに限定されない。
【００９１】
中空繊維は、バイオリアクターにおける栄養素の送達及び老廃物の除去に適しているべきである。中空繊維は任意の形状であってもよく、例えば、円形及び管状であってもよく、又は同心リングの形態であってもよい。中空繊維は、吸収性又は非吸収性の膜から構成されてもよい。例えば、中空繊維の適切な成分としては、ポリジオキサノン、ポリラクチド、ポリグラクチン、ポリグリコール酸、ポリ乳酸、ポリグリコール酸／トリメチレンカーボネート、セルロース、メチルセルロース、セルロースポリマー、セルロースエステル、再生セルロース、プルロニック（登録商標）、コラーゲン、エラスチン、及びこれらの混合物が挙げられる。
【００９２】
バイオリアクターは、細胞の播種の前にプライミングされ得る。プライミングは、ＰＢＳなどの緩衝液でフラッシングすることを含んでもよい。プライミングはまた、フィブロネクチンなどの細胞外マトリックスタンパク質でバイオリアクターをコーティングすることを含んでもよい。次いで、バイオリアクターはＰＬＴ培地（例えば、αＭＥＭ）で洗浄され得る。
【００９３】
（Ｃ．馴化培地の採集）
ＰＬＴフリーの培地中で培養された細胞からの馴化培地は、８〜１００時間ごと、例えば１２〜７２時間ごと、例えば約１２〜１５、１５〜２０、２０〜２５、２５〜３０、３５〜４０、４０〜４５、４５〜５０、５０〜５５、５５〜６０、６５〜７０、又は７０〜７２時間ごとに採集することができる。特に、馴化培地画分は、約２４〜４８時間ごとに採集することができる。
【００９４】
馴化培地画分は、約１００〜５００ｍＬ、例えば、約１００〜１５０、１５０〜２００、２５０〜３００、３５０〜４００、４００〜４５０、又は４５０〜５００ｍＬ、特に約２５０ｍＬの容量を含むことができる。画分を密封バッグに集め、エキソソームが単離されるまで約−７０℃〜約−９０℃、例えば約−８０℃で凍結保存することができる。
【００９５】
特定の態様において、馴化培地は、各ランについて、少なくとも４回、例えば４〜１０回、特に５、６、７、８、又は９回、特に６回採集される。個々の画分を、例えば４℃で一晩、例えば２〜６℃で約１０〜２０時間解凍することができる。
【００９６】
（Ｄ．エキソソームの単離）
次いで、プールした馴化培地画分を、特に４℃でエキソソーム単離に供することができる。馴化培地は約２℃、４℃、６℃、８℃、１０℃、１２℃、１４℃、１６℃、１８℃、２０℃、２２℃、２４℃、又は２６℃の温度で遠心分離することができ、一実施形態では、馴化培地が約４℃の温度で遠心分離される。エキソソーム単離は、エキソソーム単離のための当該分野で公知の方法によって実施され得る。好ましくは、エキソソームの単離はまた、上記のエキソソームの産生と同様に、閉鎖系において行われる。これは、ポンプ及び密閉されたチューブの使用によって達成され得る。
【００９７】
単離は、大きな破片を除去するための遠心分離工程と、それに続く濾過と、１つ以上の超遠心分離工程とを含んでもよい。単離方法はプールされた培地画分の全てを処理するために、複数回（例えば、３回）実施され得る。
【００９８】
遠心分離工程は約５００〜２，０００ｇ（例えば、約１，０００ｇ）で約５〜２５分間（例えば、約１５分間）の遠心分離を含み得る。馴化培地は、約１，０００ｇ、２，０００ｇ、４，０００ｇ、６，０００ｇ、８，０００ｇ；  １０，００００ｇ；  １２，０００ｇ、１４，０００ｇ、１６，０００ｇ、又は１８，０００ｇで遠心分離され得る。遠心分離は、１０〜３０分、１２〜２８分、１４〜２４分、又は１５〜２０分などの期間であってもよい。当業者が理解するように、適切な市販の実験室用遠心分離機、例えば、ＴＨＥＲＭＯ−ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ（商標）又はＣＯＬＥ−ＰＡＲＭＥＲ（商標）が、この遠心分離工程を行うために使用される。特に、遠心分離は、Ｃｏｂｅ  ２９９１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｔｅｒｕｍｏ）のような閉鎖系で行うことができる。低速遠心分離は生きた細胞、死んだ細胞、及びより大きな細胞残屑を除去するために、２回以上実施され得る。
【００９９】
濾過工程はより大きなマイクロベシクルのような破片を除去するために、０．１〜０．３ミクロンフィルター、例えば０．２ミクロンフィルターなどの、サブミクロンフィルターを有する濾過バッグの使用を含んでもよい。次いで、上清を、チューブに直接接続されたラインを用いて、チューブ（例えば、ポリカーボネートチューブ）に移すことができる。濾過は、２回以上繰り返すことができる。濾過は同じサイズのフィルター、例えば、０．２ミクロンフィルターを１回以上通過させることによって行うことができる。あるいは、同じ又は減少するサイズのフィルター（例えば、４０〜５０ミクロンフィルターを通る１つ以上のパス、２０〜３０ミクロンフィルターを通る１つ以上のパス、１０〜２０ミクロンフィルターを通る１つ以上のパス、０．２〜１０ミクロンフィルターを通る１つ以上のパスなど）を使用した、２つ以上のフィルターを使用する濾過が行われ得る。この工程で使用するのに適したフィルターには、０．４５及び０．２２ミクロンのフィルターの使用が含まれる。
【０１００】
超遠心分離は７５，０００〜１５０，０００ｇ、例えば、１００，０００〜１７０，０００ｇ、例えば、約１００，０００ｇで、約２〜６時間、例えば、１〜３時間、例えば、約４又は５時間行うことができる。このステップを実行するために、ＴＨＥＲＭＯ−ＳＣＩＥＮＴＩＦＩＣ又はＢｅｃｋｍａｎなどの市販の超遠心分離機を使用することができる。具体的には、超遠心分離は、限定されないが、タイプ４５  Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）などの、任意の閉鎖系遠心法を用いて実施することができる。この超遠心分離工程は結果を向上させるために、任意で、例えば、２回以上繰り返されてもよい。エキソソーム含有ペレットを、確立された技術を使用して上清から除去し、そして適切な生理学的溶液中に再懸濁する。
【０１０１】
当業者が理解するように、遠心分離又は超遠心分離工程のいずれかからのエキソソームペレットは、適切な生理学的溶液（例えば、滅菌ＰＢＳ、滅菌０．９％生理食塩水又は滅菌炭水化物含有０．９％生理食塩水緩衝液）を使用して、遠心分離工程の間に洗浄され得る。
【０１０２】
遠心分離後、溶液を除去し、エキソソームをＰＢＳなどの適切な緩衝液に再懸濁する。緩衝液のｐＨは試料に適合する任意のｐＨであってよいが、典型的な範囲は６〜８である。緩衝液は、４〜１０、４〜６、４〜８、６〜１０、６〜８、又は８〜１０のｐＨを有し得る。特に、エキソソームペレットは、例えば、約７．４の生理学的ｐＨで、臨床グレードの緩衝液（例えば、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標））中に再懸濁され得る。緩衝液の容量は、約０．０１体積〜約０．０９体積、約０．０２体積〜約０．０８体積、約０．０３体積〜約０．０７体積の沈殿溶液であり得る。採集されたエキソソームはエレクトロポレーション又は治療のためなどに直ちに使用され得るか、又は凍結され、そして後の使用のために、例えば、−２０℃で保存され得る。
【０１０３】
本明細書中で使用される場合、分析はエキソソームの直接的又は間接的な可視化を可能にし、そしてインビボ又はエクスビボであってもよい、任意の方法を含む。例えば、分析は、限定されないが、固体基質に結合したエキソソームのエクスビボ顕微鏡又はサイトメトリー検出及び可視化、フローサイトメトリー、蛍光イメージングなどを含み得る。例示的な態様において、癌細胞由来エキソソームは、グリピカン１に対する抗体を使用して検出され、続いて固体基質に結合され、そして顕微鏡又はサイトメトリー検出を使用して可視化される。エキソソームは、エキソソーム表面マーカー：ＣＤ６３、ＣＤ４７、ＣＤ９及びＣＤ８１のフローサイトメトリー発現、及び／又は透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によって分析され得る。さらに、ナノ粒子追跡分析及びマイクロＢＣＡアッセイを使用して、エキソソームを定量し得る。
【０１０４】
従って、バイオリアクターへのＭＳＣの播種から最終採集までの期間は、約１５〜３０日、例えば１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、又は２４日、例えば約１９又は２０日であり得る。各馴化培地画分は、少なくとも１×１０１２のエキソソーム、例えば少なくとも２×１０１２のエキソソーム、特に約３×１０１２のエキソソームを含み得る。本方法は、少なくとも１０×１０１２のエキソソーム、例えば少なくとも１１×１０１２のエキソソーム、例えば少なくとも１２×１０１３のエキソソーム、例えば少なくとも１３×１０１２のエキソソーム、例えば少なくとも１４×１０１２のエキソソーム、例えば少なくとも１５×１０１２のエキソソーム、例えば少なくとも１６×１０１２のエキソソーム、例えば少なくとも１７×１０１２のエキソソーム、例えば少なくとも１８×１０１２のエキソソーム、例えば少なくとも１９×１０１２のエキソソーム、又は例えば、少なくとも１７×１０１２のエキソソームの、全エキソソームの産生を生じ得る。
【０１０５】
（Ｅ．エキソソームの搭載）
本発明の方法によって産生されるエキソソームは、治療剤又は診断剤のようなカーゴを搭載され得る。本発明のエキソソームを使用して送達され得るカーゴの例は、ＤＮＡ（核ＤＮＡ及びミトコンドリアＤＮＡの両方）のような核酸分子、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡのようなＲＮＡ、アプタマー及び他の核酸含有分子、ペプチド、タンパク質、リボザイム、炭水化物、ポリマー、治療薬、小分子などのような、エキソソーム中に天然に存在しない（外部ソースに由来する）外因性物質を含むが、これらに限定されない。
【０１０６】
一実施形態では、本発明の単離されたエキソソームは、二次構造を有する化合物（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質／ペプチド）、並びに大きな化合物（例えば２０塩基対を超える、例えば５０塩基対を超える、又は１００塩基対を超える塩基対、ペプチド、タンパク質などを含む核酸分子）の送達に特に有用である。
【０１０７】
カーゴは、細胞へのカーゴの導入のために当該分野で確立された方法を使用して、本エキソソームに導入され得る。従って、例えば、約２０〜１０００Ｖ／ｃｍの範囲の電圧を印加するエレクトロポレーションを使用して、カーゴをエキソソームに導入し得る。
カチオン性脂質ベースのトランスフェクション試薬を使用するトランスフェクションもまた、カーゴをエキソソームに導入するために使用され得る。適切なトランスフェクション試薬の例としてはＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸＴｍ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＲＮＡｉＭＡＸ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ３０００  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔ又はＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｗｉｔｈ  ＰＬＵＳＴＭ  Ｒｅａｇｅｎｔが挙げられるが、これらに限定されない。カーゴ搭載のために、適切な量のトランスフェクション試薬が使用されるが、当該量は試薬、サンプル及びカーゴによって変化し得る。例えば、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸＴｍ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用する場合、約０．１５ｕＬ〜１０ｕＬの範囲の量を使用して、１００ｎｇ〜２５００ｎｇのｍＲＮＡ又はタンパク質をエキソソームに搭載し得る。他の方法、例えば、タンパク質導入のための細胞浸透性ペプチドの使用もまた、カーゴをエキソソームに導入するために利用され得る。
【０１０８】
特定の実施形態では、ｓｉＲＮＡ等の核酸等のカーゴは、エキソソームにエレクトロポレーション（例えば、ＦＤＡ承認の緩衝液（例えば、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ）中のエレクトロポレーション）を用いて搭載される。エレクトロポレーションは、フロースルーエレクトロポレーションシステム（例えば、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒ  ＬＶ  Ｌａｒｇｅ  Ｓｃａｌｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ、Ｌｏｎｚａ）で実行される。各々のエレクトロポレーションのランは、少なくとも２×１０１２のエキソソームを含むことができる。緩衝液は、患者における使用のためにＦＤＡ承認され、滅菌され、そして非発熱性であり、患者に直接注入され得るので、患者への投与の前に緩衝液を交換するために必要とされる洗浄工程は必要ない。従って、エキソソームの約５０％の損失をもたらし得る、従来の方法におけるような追加の洗浄工程によるエキソソームの損失はない。
【０１０９】
特定の実施形態では、治療薬がｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、又はｎｃＲＮＡなどのＲＮＡ、特にｓｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡ治療薬であってもよい。ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ模倣体又はｍｉＲＮＡ前駆体であり得る。エキソソームに搭載されるＲＮＡのサイズは、１００ヌクレオチド長未満、例えば７５ヌクレオチド長未満、特に５０ヌクレオチド長未満であり得る。例えば、ＲＮＡは約１０〜１００ヌクレオチド（例えば、２０〜５０ヌクレオチド、特に１０〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２５〜３５、３０〜４０、又は４５〜５０ヌクレオチド）の長さを有し得る。
【０１１０】
ＲＮＡは、修飾されていても、修飾されていなくてもよい。ＲＮＡは、１つ以上のヌクレオチドの改変を含み得る。このような改変は非ヌクレオチド物質の付加（例えば、ＲＮＡの末端又は内部（ＲＮＡの１つ以上のヌクレオチドにおける））を含み得る。特定の態様において、ＲＮＡ分子は、３′−ヒドロキシル基を含む。本開示のＲＮＡ分子中のヌクレオチドはまた、非天然ヌクレオチド又はデオキシリボヌクレオチドを含む、非標準ヌクレオチドを含み得る。二本鎖オリゴヌクレオチドは、修飾された骨格、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、又は当技術分野で公知の他の修飾された骨格を含有してもよく、又は非天然ヌクレオシド間結合を含み得る。ｓｉＲＮＡのさらなる修飾（例えば、２′−Ｏ−メチルリボヌクレオチド、２′−デオキシ−２′−フルオロリボヌクレオチド、「ユニバーサル塩基」ヌクレオチド、５−Ｃ−メチルヌクレオチド、１以上のホスホロチオエートヌクレオチド間結合、及び逆位デオキシ脱塩基の残基取り込み（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｄｅｏｘｙａｂａｓｉｃ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ））は、米国公開第２００４００１９００１号及び米国特許第６，６７３，６１１号に見出すことができる（これらの各々がその全体が参考として組み込まれている）。総称して、上記のこのような改変された核酸又はＲＮＡは、全て、修飾ｓｉＲＮＡと呼ばれる。
【０１１１】
好ましくは、ＲＮＡｉは、タンパク質の発現を、少なくとも１０％、２０％、３０％、又は４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、又は７０％、さらにより好ましくは少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、又はそれ以上減少させることができる。
【０１１２】
本明細書中に記載される方法又は組成物において使用されるｓｉＲＮＡは、記載された遺伝子／タンパク質のＮＣＢＩ参照配列によってコードされるｍＲＮＡ配列に相補的な部分を含み得る。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは二本鎖部分（二重鎖）を含む。一実施形態では、ｓｉＲＮＡは、２０〜２５ヌクレオチド長である。一実施形態では、ｓｉＲＮＡが一方又は両方の鎖上に独立して１つ又は２つのヌクレオチド３′オーバーハングを有する１９〜２１コアＲＮＡ二重鎖を含む。一実施形態では、オーバーハングはＵＵである。ｓｉＲＮＡは５′リン酸化されていてもされていなくてもよく、ヌクレアーゼ分解に対する効力及び／又は耐性を改善するために、当該分野で公知の修飾のいずれかで修飾され得る。非限定的な実施形態において、ｓｉＲＮＡは、１つ以上の細胞にトランスフェクトされるように投与され得る。一実施形態ではｓｉＲＮＡが第１及び第２鎖を含む二本鎖ＲＮＡを含むことができ、ここで、ＲＮＡの一方の鎖は遺伝子のＲＮＡ転写物の一部に８０、８５、９０、９５又は１００％相補的である。
【０１１３】
一実施形態では、本開示のｓｉＲＮＡの一本鎖成分は、１４〜５０ヌクレオチド長である。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡの一本鎖成分は、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、又は２８ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡの一本鎖成分は、２１ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡの一本鎖成分は、２２ヌクレオチド長である。さらに別の実施形態では、本開示のｓｉＲＮＡの一本鎖成分が２３ヌクレオチド長である。一実施形態では、本開示のｓｉＲＮＡが２８〜５６ヌクレオチド長である。
【０１１４】
標的遺伝子は一般に、ポリペプチドをコードする領域を含むポリヌクレオチド、又はポリペプチドの発現に重大な複製、転写若しくは翻訳若しくは他のプロセスを調節するポリヌクレオチド領域、又はポリペプチドをコードする領域と発現を調節するポリペプチドに作動可能に連結された領域との両方を含むポリヌクレオチドを意味する。標的遺伝子は、染色体（ゲノム）又は染色体外であり得る。それは、細胞に対して内因性である場合もあれば、外来遺伝子（導入遺伝子）である場合もある。外来遺伝子は宿主ゲノムに組み込まれ得るか、又はプラスミド又はコスミドのような染色体外遺伝的構築物上に存在し得る。また、標的遺伝子は病原体、例えば、ウイルス、細菌、真菌又は原虫に由来することができ、それらは、生物又は細胞に感染することができる。標的遺伝子は、レトロウイルス遺伝子のようなインターフェロン応答を誘発しないウイルス性及びプロウイルス性遺伝子であり得る。標的遺伝子は、タンパク質をコードする遺伝子、又はリボソームＲＮＡ、スプライソソームＲＮＡ、ｔＲＮＡなどをコードする遺伝子のような非タンパク質をコードする遺伝子であってもよい。
【０１１５】
細胞内で発現されている任意の遺伝子を標的とすることができる。好適には、標的遺伝子が疾患に重要な、又は研究対象として特に興味深い細胞活性の進行に関与するか、又は関連するものである。従って、例として、以下は標的遺伝子発現を調節又は弱めるために本開示の方法において使用され得る可能な標的遺伝子のクラスである：発生遺伝子（例えば、接着分子、サイクリンキナーゼインヒビター、Ｗｎｔファミリーメンバー、Ｗｉｎｇｅｄ  ｈｅｌｉｘファミリーメンバー、Ｈｏｘファミリーメンバー、サイトカイン／リンホカイン及びそれらの受容体、成長因子又は分化因子及びそれらの受容体、神経伝達因子とその受容体）、腫瘍抑制遺伝子（例えば、ＡＰＣ、ＣＹＬＤ、ＨＩＮ−１、ＫＲＡＳ２ｂ、ｐ１６、ｐ１９、ｐ２１、ｐ２７、ｐ２７ｍｔ、ｐ５３、ｐ５７、ｐ７３、ＰＴＥＮ、Ｒｂ、ウテログロビン、Ｓｋｐ２、ＢＲＣＡ−１、ＢＲＣＡ−２、ＣＨＫ２、ＣＨＫＮ２Ａ、ＤＣＣ、ＤＰＣ４、ＭＡＤＲ２／ＪＶ１８、ＭＥＮ１、ＭＥＮ２、ＭＴＳ１、ＮＦ１、ＮＦ２、ＶＨＬ、ＷＲＮ、ＷＴ１、ＣＦＴＲ、Ｃ−ＣＡＭ、ＣＴＳ−１、ｚａｃ１、ｒａｓ、ＭＭＡＣ１、ＦＣＣ、ＭＣＣ、ＦＵＳ１、Ｇｅｎｅ  ２６（ＣＡＣＮＡ２Ｄ２）、ＰＬ６、Ｂｅｔａ＊（ＢＬＵ）、Ｌｕｃａ−１（ＨＹＡＬ１）、Ｌｕｃａ−２（ＨＹＡＬ２）、１２３Ｆ２（ＲＡＳＳＦ１）、１０１Ｆ６、Ｇｅｎｅ  ２１（ＮＰＲＬ２）又はＳＥＭ  Ａ３ポリペプチドをコードする遺伝子）、プロアポトーシス遺伝子（例えば、ＣＤ９５、カスパーゼ−３、Ｂａｘ、Ｂａｇ−１、ＣＲＡＤＤ、ＴＳＳＣ３、ｂａｘ、ｈｉｄ、Ｂａｋ、ＭＫＰ−７、ＰＡＲＰ、ｂａｄ、ｂｃｌ−２、ＭＳＴ１、ｂｂｃ３、Ｓａｘ、ＢＩＫ、及びＢＩＤ）、サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−γ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＰＤＧＦ、及びｍｄａ７）、癌遺伝子（例えば、ＡＢＬＩ、ＢＬＣ１、ＢＣＬ６、ＣＢＦＡ１、ＣＢＬ、ＣＳＦＩＲ、ＥＲＢＡ、ＥＲＢＢ、ＥＢＲＢＢ２、ＥＴＳ１、ＥＴＳ１、ＥＴＶ６、ＦＧＲ、ＦＯＸ、ＦＹＮ、ＨＣＲ、ＨＲＡＳ、ＪＵＮ、ＫＲＡＳ、ＬＣＫ、ＬＹＮ、ＭＤＭ２、ＭＬＬ、ＭＹＢ、ＭＹＣ、ＭＹＣＬ１、ＭＹＣＮ、ＮＲＡＳ、ＰＩＭ１、ＰＭＬ、ＲＥＴ、ＳＲＣ、ＴＡＬ１、ＴＣＬ３及びＹＥＳ）、並びに酵素（ＡＣＰ−デサチュラーゼ及びヒドロキシラーゼ、ＡＤＰ−グルコースピロホリラーゼ、ＡＴＰアーゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、シクロオキシゲナーゼ、デカルボキシラーゼ、デキストリナーゼ、エステラーゼ、ＤＮＡ及びＲＮＡポリメラーゼ、ガラクトシダーゼ、グルカナーゼ、グルコースオキシダーゼ、ＧＴＰａｓｅ、ヘリカ��ゼ、ヘミセルラーゼ、インテグラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、キナーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、リポキシゲナーゼ、リゾチーム、ペクチンエステラーゼ、ペルオキシダーゼ、ホスファターゼ、ホスホリパーゼ、ホスホリラーゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテイナーゼ及びペプチダーゼ、プラナーゼ（ｐｕｌｌａｎａｓｅｓ）、リコンビナーゼ、逆転写酵素、トポイソメラーゼ、キシラナーゼ）が挙げられる。
【０１１６】
当業者には理解されるように、本発明のエキソソームは、カーゴを搭載する前又は後に、カーゴの送達のためのビヒクルとしてのその有用性を増強するために、標的化部分を含めることによってさらに改変され得る。この点に関して、エキソソームは、特定の細胞を組織型に特異的に標的化する実体を組み込むように操作され得る。この標的特異的実体（例えば、標的細胞又は組織上の受容体又はリガンドに対して親和性を有するペプチド）は例えば、当該分野で十分に確立された方法を使用して、エキソソーム膜マーカーへの融合によって、エキソソーム膜内に組み込まれ得る。
【０１１７】
［ＩＩＩ．使用方法］
いくつかの実施形態では、本開示が細胞へのＲＮＡｉなどの治療薬の送達のために本明細書で提供されるエキソソームの使用方法を提供する。送達のためにエキソソームによって標的化され得る追加の免疫細胞は、樹状細胞、ＮＫ細胞、及び／又はＢ細胞を含む。さらなる実施形態において、本開示のエキソソームによって送達される治療剤は、小分子、ペプチド、ワクチン、又は抗原であり得る。細胞は、インビボ又はエクスビボであり得る。一実施形態では、ＲＮＡｉを含む有効量のエキソソームを細胞に投与することを含む、ＲＮＡを細胞に送達する方法が提供される。細胞は、Ｔ細胞のような免疫細胞、又はＫＲＡＳ陽性癌細胞のような癌細胞であってもよい。
【０１１８】
さらなる実施形態において、ＲＮＡを封入するエキソソームの有効量を対象に投与することを含む、生物を免疫刺激する方法が提供される。ＲＮＡは免疫調節性ＲＮＡであってもよい。別の実施形態において、本開示のエキソソームの有効量を投与すること含む、疾患又は障害を有する対象を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態において、疾患又は障害の治療のための、又は対象を免疫刺激するための、本開示のエキソソームの使用が提供される。
【０１１９】
インビボ細胞は、哺乳動物などの任意の対象に存在し得る。例えば、対象は、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、霊長類、又は鳥類であり得る。特定の実施態様において、対象はヒトを指す。例えば、ヒトは、疾患を有する対象であり得る。疾患は、炎症性疾患、過剰増殖性疾患、感染症、又は変性疾患など、対象を苦しめるあらゆる疾患であってもよい。特定の実施形態では、疾患が癌などの過剰増殖性疾患である。例えば、癌は、乳癌、肺癌、前立腺癌、卵巣癌、脳癌細胞、肝臓癌、子宮頸癌、結腸癌、腎臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、骨癌、食道癌、膀胱癌、子宮癌、悪性リンパ腫、胃癌、膵臓癌、精巣癌、腸癌、リンパ腫、又は白血病であり得る。特定の実施形態では、癌は卵巣癌である。
【０１２０】
別の実施形態では、本開示のエキソソームの治療有効量を前記対象に投与することを含む、前記疾患に罹患している対象における免疫介在性炎症性疾患を治療する方法が提供される。
【０１２１】
癌は、これらに限定されないが、具体的には以下の組織学的タイプのものであり得る：新生物、悪性；癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）；癌腫（ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、未分化；巨大及び紡錘細胞癌；小細胞癌；乳頭癌；扁平上皮癌；リンパ上皮癌；基底細胞癌；毛母癌；移行上皮癌；乳頭状移行上皮癌；腺癌；ガストリノーマ、悪性；胆管癌；肝細胞癌；肝細胞癌と胆管癌の合併；索状癌；腺様嚢胞癌；腺腫様ポリープにおける腺癌；腺癌、家族性ポリポーシス；固形癌腫；カルチノイド腫瘍、悪性；腺房細胞腺癌；乳頭腺癌；色素嫌性癌腫；好酸性癌；好酸性腺癌；好塩基性癌；明細胞腺癌；顆粒細胞癌；濾胞腺癌；乳頭状及び濾胞状腺癌；非被包性硬化性癌；副腎皮質癌；子宮内膜癌；皮膚付属器癌；アポクリン腺癌；皮脂腺癌；精巣腺癌；粘表皮癌；嚢胞腺癌；乳頭状嚢胞腺癌；乳頭状漿液性嚢胞腺癌；粘液性嚢胞腺癌；粘液性腺癌；印環細胞癌；浸潤性導管癌；髄様癌；小葉癌；炎症性癌；パジェット病、乳房；腺扁平上皮癌；扁平上皮化を伴う腺癌；胸腺腫、悪性；卵巣間質腫瘍、悪性；莢膜細胞腫（ｔｈｅｃｏｍａ）；顆粒膜細胞腫、悪性；男性胚細胞腫（ａｎｄｒｏｂｌａｓｔｏｍａ）、悪性；セルトリ細胞癌；ライディッヒ細胞腫瘍、悪性；脂質細胞腫瘍、悪性；傍神経節腫、悪性；乳房外傍神経節腫、褐色細胞腫；悪性黒色腫；メラニン欠乏性黒色腫；表層拡大型黒色腫；巨大色素性母斑における悪性黒色腫；類上皮細胞黒色腫；青色母斑、悪性；肉腫；線維肉腫；線維性組織球腫、悪性；粘液肉腫；脂肪肉腫；平滑筋肉腫；横紋筋肉腫；胎児性横紋筋肉腫；胞巣状横紋筋肉腫；間質肉腫；混合腫瘍、悪性；ミュラー管混合腫瘍；腎芽腫；肝芽腫；癌肉腫；間葉腫、悪性；ブレナー腫瘍、悪性；葉状腫瘍、悪性；滑膜肉腫；中皮腫、悪性；胎児性癌；奇形腫、悪性；卵巣甲状腺腫、悪性；絨毛癌；中腎腫、悪性；血管肉腫；血管内皮腫、悪性；カポジ肉腫；血管外皮腫、悪性；リンパ管肉腫；骨肉腫；傍骨性骨肉腫；軟骨肉腫、悪性；間葉性軟骨肉腫；骨の巨細胞腫；ユーイング肉腫；歯原性腫瘍、悪性；エナメル上皮肉腫；エナメル上皮腫、悪性；エナメル上皮線維肉腫；松果体腫、悪性；脊索腫；神経膠腫、悪性；上衣腫；星細胞腫；原形質星細胞腫；原線維性星細胞腫；星芽細胞腫；膠芽腫；乏突起神経膠腫；乏突起膠芽腫；原始神経外胚葉；小脳肉腫；神経節芽細胞腫；神経芽細胞腫；嗅神経原性腫瘍；髄膜腫、悪性；神経線維肉腫；神経鞘腫、悪性；顆粒細胞腫、悪性；悪性リンパ腫；ホジキン病；ホジキン側肉芽腫；小リンパ球性悪性リンパ腫；びまん性大細胞型悪性リンパ腫；濾胞型悪性リンパ腫；菌状息肉腫；その他の特定の非ホジキンリンパ腫；悪性組織球症；多発性骨髄腫；マスト細胞肉腫；免疫増殖性小腸疾患；白血病；リンパ性白血病；形質細胞白血病；赤白血病；リンパ肉腫細胞白血病；骨髄性白血病；好塩基球性白血病；好酸球性白血病；単球性白血病；マスト細胞白血病；巨核芽球性白血病；骨髄肉腫；及び有毛細胞白血病。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、治療剤を搭載した有効量のエキソソームを、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における疾患又は障害を治療する方法が提供される。この疾患は、自己免疫疾患のような免疫関連疾患であり得る。自己免疫疾患の非限定的な例としては、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫アディソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎及び睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアック・スパート皮膚炎、慢性疲労免疫不全症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー、チャーグ−ストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状ループス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症−線維筋炎、グレーヴス病、ギラン−バレー病、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡニューロパチー、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合性結合組織病、多発性硬化症、１型又は免疫介在性糖尿病、重症筋無力症、ネフローゼ症候群（微小変化型疾患、巣状糸球体硬化症、又は膜性腎症など）、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛、多発性筋炎及び皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、潰瘍性大腸炎、ブドウ膜炎、血管炎（結節性多発動脈炎、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎又は疱疹状皮膚血管炎など）、白斑及びウェゲナー肉芽腫症が挙げられる。したがって、本明細書に開示される方法を用いて治療することができる自己免疫疾患のいくつかの例には、多発性硬化症、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、Ｉ型糖尿病、クローン病；潰瘍性大腸炎、重症筋無力症、糸球体腎炎、強直性脊椎炎、血管炎、又は乾癬を含むが、これらに限定されない。また、対象は喘息のようなアレルギー性疾患を有することができる。
【０１２３】
治療結果は予測及びモニターすることができ、かつ／又は、そのような治療から利益を得る患者は、本明細書に記載の方法を介して特定又は選択することができる。
【０１２４】
腫瘍性状態の治療に関しては、腫瘍性病態の段階に応じて、腫瘍性状態の治療は、腫瘍性組織を除去するための手術、放射線療法及び化学療法などの治療法を１つ又は複数組み合わせて行う。他の治療レジメンは抗癌剤、例えば、治療組成物及び化学療法剤の投与と組み合わせることができる。例えば、このような抗癌剤で治療される患者は、放射線療法を受けてもよく、及び／又は外科手術を受けてもよい。
【０１２５】
疾患の治療のために、治療組成物の適切な投与量は上記に定義されるように、治療される疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、患者の病歴及び薬剤に対する応答、そして主治医の判断に依存するのであろう。薬剤は一度に、又は一連の治療にわたって、患者に適切に投与される。
【０１２６】
治療的及び予防的方法及び組成物は、所望の効果を達成するのに有効な組み合わせ量で提供され得る。組織、腫瘍、又は細胞は、１つ以上の薬剤を含む１つ以上の組成物又は薬理学的製剤と接触させることができ、又は組織、腫瘍、及び／又は細胞を２つ以上の別個の組成物又は製剤と接触させることによって接触させることができる。また、このような併用療法は、化学療法、放射線療法、外科的療法、又は免疫療法と併用することができると考えられる。
【０１２７】
併用投与は、同じ投薬形態での２つ以上の薬剤の同時投与、別々の投薬形態での同時投与、及び別々の投与を含み得る。すなわち、本発明の治療組成物及び別の治療剤は、同じ投薬形態で一緒に処方され得、そして同時に投与され得る。あるいは、対象の治療組成物及び別の治療剤を同時に投与することができ、ここで、両方の薬剤は別々の製剤中に存在する。別の代替において、治療剤は、他の治療剤の直後に投与され得るか、又はその逆であり得る。別個の投与プロトコルにおいて、対象の治療組成物及び別の治療剤は、数分間隔で、又は数時間間隔で、又は数日間隔で投与され得る。
【０１２８】
本明細書中に記載されるエキソソームは、治療、研究及び診断適用において使用され得る。例えば、以下に記載されるエキソソームは細胞の１つ以上の表現型特性を増強するために、細胞培養物に添加され得る。本発明のエキソソームは細胞の１つ以上の表現型特性を阻害するために、細胞培養物に添加され得る。本発明のエキソソームは、細胞培養物に添加されて、細胞の新しい表現型特性を提供し得る。
【０１２９】
（Ａ．医薬組成物）
本明細書中に記載される特定の方法は、本開示のエキソソームを含む組成物の薬学的に有効な量の投与を含む方法に関する。
【０１３０】
本明細書中で使用される場合、「薬学的に受容可能な担体」は、当業者に公知であるように、任意及び全ての溶媒、分散媒体、コーティング、界面活性剤、抗酸化剤、防腐剤（例えば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張剤、吸収遅延剤、塩、防腐剤、薬物、薬物安定剤、ゲル、結合剤、賦形剤、崩壊剤、潤滑剤、甘味剤、香味剤、染料などの材料及びそれらの組み合わせを含む（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ，１９９０）。任意の従来の担体が活性成分と不適合である限りを除いて、治療又は医薬組成物におけるその使用が意図される。本開示において使用される組成物は、固体、液体又はエアロゾル形態で投与されるべきかどうか、及び注射のような投与経路のために滅菌される必要があるかどうかに依存して、異なる型の担体を含み得る。
【０１３１】
医薬活性物質のためのそのような媒体及び剤の使用は当該分野でよく知られている。任意の従来的な媒体又は薬剤が活性成分と不適合な場合を除いて、治療組成物におけるその使用が意図される。補助活性成分も組成物に組み込むことができ、これらは以下でより詳細に論じる。ヒトへの投与のために、調製物はＦＤＡ生物学局の標準によって要求されるように、無菌性、発熱性、一般的な安全性及び純度の標準を満たすことが好ましい。
【０１３２】
エキソソームを含む組成物は、必要に応じて、所望されない低分子量分子を除去するために広範囲に透析され得、及び／又は所望のビヒクルへのより容易な処方のために凍結乾燥され得る。特に、本開示のエキソソームを構成する組成物（例えば、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ）は、一切の加工を必要とせず、対象に直接注入することができる。次いで、活性化合物は一般に、任意の公知の経路（例えば、非経口投与）による投与のために処方される。投与方法は、以下により詳細に議論される。
【０１３３】
本開示は、血管内注射のための、又は以下により詳細に議論されるような任意の他の経路による適用のための、無菌溶液である組成物を使用する方法を意図する。当業者は、任意の他の経路による注射又は適用のための無菌溶液を生成するための技術に精通している。滅菌注射用溶液は必要量の活性化合物を適切な溶媒中に、当業者によく知られている種々の他の成分と共に組み込むことによって調製される。
【０１３４】
組成物の処方は、投与経路に依存して変化し得る。水溶液中での非経口投与のためには、例えば、溶液は適切に緩衝化されるべきであり、そして液体希釈剤は最初に十分な生理食塩水又はグルコースで等張にされるべきである。これに関連して、使用できる滅菌水性媒体は、本開示に照らして当業者に知られているであろう。
【０１３５】
他の薬学的に許容される形態には、静脈内又は筋肉内注射などの非経口投与のために製剤化された化合物に加えて、埋め込み型の薬物送達デバイスを介した投与のための製剤、及び任意の他の形態が含まれる。本開示では、点鼻液又はスプレー、エアロゾル又は吸入剤を使用することもできる。
【０１３６】
経口処方は例えば、医薬グレードのマンニトール、ラクトース、澱粉、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される賦形剤を含む。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤又は粉末の形態をとる。当業者は、経口製剤の調製のための周知の技術に精通しているであろう。
【０１３７】
特定の実施形態では、医薬組成物が少なくとも約０．１重量％の活性薬剤を含む。組成物は例えば、約０．０１％を含むことができる。他の実施形態では、医薬組成物が例えば、組成物の約２重量％〜約７５重量％、又は組成物の約２５重量％〜約６０重量％、及びその中で導出可能な任意の範囲を含む。
【０１３８】
医薬組成物は、１つ以上の成分の酸化を遅らせるために種々の抗酸化剤を含んでもよい。さらに、微生物の作用の防止はパラベン（例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン）、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール、又はこれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない、種々の抗菌剤及び抗真菌剤などの防腐剤によってもたらされ得る。この組成物は製造及び貯蔵の条件下で安定であり得、そして微生物（例えば、細菌及び真菌）の汚染作用に対して保存され得る。外毒素汚染は安全なレベル、例えば、０．５ｎｇ／ｍｇタンパク質未満に最小限に保たれるべきであることが理解される。
【０１３９】
組成物が液体形態である実施形態において、担体は水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、脂質（例えば、トリグリセリド、植物油、リポソーム）、及びそれらの組み合わせを含むが、これらに限定されない溶媒又は分散媒体であり得る。多くの場合、例えば、糖、塩化ナトリウム又はそれらの組み合わせ、などの等張剤を含むことが好ましい。
【０１４０】
他の実施形態では、本開示において、点鼻液又はスプレー、エアロゾル又は吸入剤を使用してもよい。点鼻液は、点滴又はスプレーで経鼻通路に投与されるように設計された水溶液であってもよい。
【０１４１】
滅菌注射用溶液は、必要に応じて、必要な量のナノ粒子を、上記に列挙した種々の他の成分と共に適切な溶媒中に組み込み、続いて滅菌することによって調製される。
【０１４２】
処方時に、エキソソームは、投薬処方と適合性のある様式で、そして治療的に有効であるような量で投与される。
【０１４３】
ナノ粒子は、当業者に公知の任意の方法を用いて対象に投与することができる。例えば、エキソソームを含む医薬有効量の組成物を、静脈内、脳内、頭蓋内、髄腔内、黒質又は黒質の領域に、皮内、動脈内、腹腔内、病巣内、気管内、鼻腔内、局所的に、筋肉内、腹腔内、皮下、経口、局所的に、部分的に、吸入（例えば、エアロゾル吸入）、注射、注入、連続注入、標的細胞を直接局所潅流浴、カテーテルを介して、洗浄を介して、クリームで、脂質組成物（例えば、リポソーム）中で、又は当業者に公知であるような他の方法若しくは上記の任意の組み合わせによって投与することができる（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ、１９９０）。特定の実施形態では、組成物が薬物送達デバイスを使用して対象に投与される。
【０１４４】
他の実施形態において、エキソソームは経口、鼻腔内、経腸、局所、舌下、動脈内、髄内、髄腔内、吸入、眼、経皮、膣又は直腸経路を含むが、これらに限定されない経路による投与のために処方され、各場合に適切な担体を含む。例えば、局所適用のためのエキソソーム組成物は、適切な担体を含んで調製され得る。クリーム、ローション及び軟膏は、トリグリセリド基剤などの適切な基剤を使用して局所適用のために調製することができる。このようなクリーム、ローション及び軟膏はまた、界面活性剤を含み得る。エアゾール製剤はまた、適切な噴射剤アジュバントが使用されるように調製されてもよい。他のアジュバントもまた、それがどのように投与されるかにかかわらず、組成物に添加され得、例えば、抗菌剤、抗酸化剤、及び他の防腐剤が、長期の貯蔵期間にわたる微生物の増殖及び／又は分解を防ぐために組成物に添加され得る。
【０１４５】
ナノ粒子の薬学的に有効な量は、意図される目標、例えば細胞死の阻害に基づいて決定される。投与される量は、治療の回数及び用量の両方に従って、治療される対象、対象の状態、所望の保護、及び投与経路に依存する。治療薬の正確な量はまた、開業医の判断に依存し、そして各個体に特有である。
【０１４６】
例えば、治療薬の用量は、１用量当たり約０．０００１ミリグラム〜約１．０ミリグラム、又は約０．００１ミリグラム〜約０．１ミリグラム、又は約０．１ミリグラム〜約１．０ミリグラム、さらには約１０ミリグラム程度であってもよい。反復投与も可能である。いくつかの実施形態において、用量は、少なくとも約０．０００１ミリグラムである。さらなる実施形態において、用量は、少なくとも約０．００１ミリグラムである。なおさらなる実施形態において、用量は、少なくとも０．０１ミリグラムである。なおさらなる実施形態において、用量は、少なくとも約０．１ミリグラムである。より具体的な実施形態では、用量が少なくとも１．０ミリグラムであり得る。さらにより具体的な実施形態では、用量が少なくとも１０ミリグラムであってもよい。さらなる実施形態において、用量は、少なくとも１００ミリグラム以上である。
【０１４７】
他の非限定的な例において、用量はまた、約１マイクログラム／ｋｇ体重、約５マイクログラム／ｋｇ体重、約１０マイクログラム／ｋｇ体重、約５０マイクログラム／ｋｇ体重、約１００マイクログラム／ｋｇ体重、約２００マイクログラム／ｋｇ体重、約３５０マイクログラム／ｋｇ体重、約５００マイクログラム／ｋｇ体重、約１ミリグラム／ｋｇ体重、約５ミリグラム／ｋｇ体重、約１０ミリグラム／ｋｇ体重、約５０ミリグラム／ｋｇ体重、約１００ミリグラム／ｋｇ体重、約２００ミリグラム／ｋｇ体重、約３５０ミリグラム／ｋｇ体重、約５００ミリグラム／ｋｇ体重、約１０００ｍｇ／ｋｇ体重、又はそれ以上／投与、及びそこで誘導可能な任意の範囲を含んでもよい。本明細書中に列挙される数から誘導可能な範囲の非限定的な例では、約５ｍｇ／ｋｇ／体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ／体重、約５マイクログラム／ｋｇ／体重〜約５００ミリグラム／ｋｇ／体重などの範囲が、上記の数に基づいて投与され得る。
【０１４８】
用量は、当業者によって決定されるように反復することができる。従って、本明細書中に記載される方法のいくつかの実施形態において、単回用量が意図される。他の実施形態において、２つ以上の用量が意図される。２回以上の用量が対象に投与される場合、用量間の時間間隔は、当業者によって決定される任意の時間間隔であり得る。例えば、用量間の時間間隔は、約１時間〜約２時間、約２時間〜約６時間、約６時間〜約１０時間、約１０時間〜約２４時間、約１日〜約２日、約１週間〜約２週間、又はそれ以上、又はこれらの列挙された範囲のいずれかの中で導出可能な任意の時間間隔であり得る。
【０１４９】
特定の実施形態では、本方法が医薬組成物の患者への連続供給を提供することができる。これは、カテーテル法、続いて治療剤の連続投与によって達成され得る。投与は術中又は術後であり得る。
【０１５０】
（Ｂ．併用療法）
本開示の特定の実施形態は、疾患の治療又は予防のための治療の１つ以上の二次形態の投与又は適用を提供する。例えば、疾患は、癌などの過剰増殖性疾患であってもよい。
【０１５１】
二次的治療形態は、癌の治療又は予防に適用できる１つ以上の二次的薬理学的製剤の投与であってもよい。
【０１５２】
二次治療が薬理学的製剤である場合、それは、ナノ粒子の投与の前、同時、又は後に投与され得る。
【０１５３】
エキソソームの投与と二次治療との間の間隔は、当業者によって決定される任意の間隔であり得る。例えば、間隔は数分から数週間であってもよい。薬剤が別々に投与される実施形態では、一般に、各治療剤が対象に対して有利に組み合わされた効果をなお発揮することができるように、各送達の時間の間に長期間が経過しないことを保証する。例えば、治療薬間の間隔は互いに約１２時間〜約２４時間であってもよく、より好ましくは互いに約６時間〜約１２時間以内であってもよい。しかし、いくつかの状況では、治療期間を延長することができ、その場合、それぞれの投与の間に数日（２、３、４、５、６又は７）から数週間（１、２、３、４、５、６、７又は８）が経過する。いくつかの実施形態において、二次治療剤の投与のタイミングは、ナノ粒子に対する対象の応答に基づいて決定される。
【０１５４】
様々な組み合わせを用いることができる。以下の例では、エキソソーム組成物は「Ａ」であり、抗癌療法は「Ｂ」である：
Ａ／Ｂ／Ａ        Ｂ／Ａ／Ｂ        Ｂ／Ｂ／Ａ        Ａ／Ａ／Ｂ        Ａ／Ｂ／Ｂ        Ｂ／Ａ／Ａ        Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ        Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ              Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ              Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ              Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ            Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ            Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ              Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ              Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ            Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ            Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ            Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
【０１５５】
本開示の任意の化合物又は治療の患者への投与は、薬剤の毒性（存在する場合）を考慮して、このような化合物の投与のための一般的なプロトコルに従う。したがって、いくつかの実施形態では、併用療法に起因する毒性をモニタリングするステップがある。治療サイクルを繰り返すことができることが期待される。また、種々の標準的療法、並びに外科的介入は、記載された療法と組み合わせて適用することができると考えられる。
【０１５６】
特定の態様において、標準的な療法は化学療法、放射線療法、免疫療法、外科的療法又は遺伝子療法を含み、そして本明細書中に記載されるように、遺伝子発現療法の阻害剤、抗癌療法、又は遺伝子発現療法の阻害剤及び抗癌療法の両方と組み合わせて使用され得ることが意図される。
【０１５７】
（１．化学療法）
本実施形態によれば、多種多様な化学療法剤を使用することができる。「化学療法」という用語は癌を治療するための薬物の使用を指し、「化学療法剤」は、癌の治療において投与される化合物又は組成物を意味するために使用される。これらの薬剤又は薬物は例えば、それらが細胞周期に影響を及ぼすかどうか、及びどの段階で影響を及ぼすかといった、細胞内でのそれらの活性の様式によって分類される。あるいは、薬剤がＤＮＡを直接架橋する能力、ＤＮＡに挿入する能力、又は核酸合成に影響を及ぼすことによって染色体及び有糸分裂異常を誘導する能力に基づいて特徴付けられ得る。
【０１５８】
化学療法剤の例としては、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボコン、メトレドパ、及びウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド、及びトリメチルオロメラミンを含むエチレンイミン及びメチルアメラミン；アセトゲニン（特に、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシド塩酸塩、メルファラン、ノベムビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンなどのニトロソウレア；エネジイン抗生物質（カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩ及びカリケアマイシンオメガＩ１）などの抗生物質；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラマイシン；同様にネオカルジノスタチン発色団及び関連する発色団、ネオカルジノスタチン発色団、アクチノマイシン、アクチノマイシン、オートラルニシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣ、ミコフェノール酸、ノガラルマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポチロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ビューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン及びゾルビシンなどのマイトマイシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、プテロプテリン、及びトリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、及びチオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン及びフロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロナノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトンなどのアンドロゲン；ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸、エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デホファミン；デメコルシン；エルホルミシン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウムアセテート；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサマイトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン（ｎｉｔｒａｅｒｉｎｅ）；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；  ２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫポリサッカライド複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバイジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチンなどの白金配位錯体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルヒロルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイド（レチノイン酸など）；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビエン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質トランスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナム、及び上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸、又は誘導体が挙げられる。
【０１５９】
（２．放射線療法）
ＤＮＡ損傷を引き起こし、広範に使用されている他の因子には、γ線、Ｘ線、及び／又は放射性同位元素の腫瘍細胞への指向性送達として知られているものが含まれる。マイクロ波、陽子ビーム照射（米国特許第５，７６０，３９５号及び第４，８７０，２８７号）、及びＵＶ照射のような他の形態のＤＮＡ損傷因子もまた意図される。これらの因子はすべて、ＤＮＡ上、ＤＮＡの前駆体上、ＤＮＡの複製と修復、及び染色体の集合と維持、広範囲の損傷に影響を及ぼす可能性が高い。Ｘ線の線量範囲は長時間の（３ないし４週間の）５０〜２００レントゲンの１日線量から、２０００〜６０００レントゲンの単回線量に及ぶ。放射性同位体の線量範囲は広く変化し、同位体の半減期、発せられる放射線の強度及びタイプ、及び腫瘍細胞による取込に依存する。
【０１６０】
（３．免疫療法）
当業者は、さらなる免疫療法が実施形態の方法と組み合わせて、又は組み合わせて使用され得ることを理解する。癌治療との関連では、免疫治療薬が癌細胞を標的とし、破壊するための免疫エフェクター細胞及び分子の使用に依存し得る。リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標））がそのような例である。免疫エフェクターは、例えば、腫瘍細胞の表面上のいくつかのマーカーに特異的な抗体であり得る。抗体単独では、治療のエフェクターとして役立つか、又は他の細胞を動員して、実際に細胞殺傷に影響を及ぼすかもしれない。抗体はまた、薬物又は毒素（化学療法剤、放射性核種、リシンＡ鎖、コレラ毒素、百日咳毒素など）に結合され得、そして標的化剤として役立ち得る。別法として、エフェクターは、腫瘍細胞標的と直接的に又は間接的に相互作用する表面分子を運ぶリンパ球であってもよい。様々なエフェクター細胞には、細胞傷害性Ｔ細胞及びＮＫ細胞が含まれる。
【０１６１】
抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）は、細胞殺傷薬物に共有結合したモノクローナル抗体（ＭＡｂ）を含む。このアプローチは、それらの抗原標的に対するＭＡｂの高い特異性を、非常に強力な細胞毒性薬物と組み合わせ、その結果、ペイロード（薬物）を、豊富なレベルの抗原で腫瘍細胞に送達する「武装」ＭＡｂをもたらす。薬物の標的送達はまた、正常組織におけるその曝露を最小限にし、毒性の減少及び治療指数の改善をもたらす。ＡＤＣ治療薬２剤、ＡＤＣＥＴＲＩＳ（登録商標）（ブレンツキシマブ  ベドチン）を２０１１年に、ＫＡＤＣＹＬＡ（登録商標）（トラスツズマブ  エムタンシン又はＴ−ＤＭ１）を２０１３年にＦＤＡが承認したことにより、このアプローチの妥当性が検証された。このアプローチでは、抗原に対して、ＭＡｂの高い特異性を組み合わせている。現在、がん治療のための様々な段階の臨床試験において、３０を超えるＡＤＣ薬候補が存在する。抗体工学及びリンカー−ペイロード最適化がますます成熟することにつれて、新しいＡＤＣの発見及び開発は、このアプローチに適切な新しい標的の同定及び確認、並びに標的ＭＡｂの生成にますます依存している。ＡＤＣ標的の２つの基準は、腫瘍細胞における発現のアップレギュレート／高レベル及びロバストな内在化である。
【０１６２】
免疫療法の１つの態様において、腫瘍細胞は標的化しやすい、すなわち、他の細胞の大部分に存在しない、いくつかのマーカーを担持することができる。多くの腫瘍マーカーが存在し、これらのいずれも、本実施形態の文脈において標的化に適する可能性がある。一般的な腫瘍マーカーには、ＣＤ２０、癌胎児性抗原、チロシナーゼ（ｐ９７）、ｇｐ６８、ＴＡＧ−７２、ＨＭＦＧ、シアリルルイス抗原、ＭｕｃＡ、ＭｕｃＢ、ＰＬＡＰ、ラミニン受容体、ｅｒｂ  Ｂ及びｐ１５５が含まれる。免疫療法の代替態様は、抗癌効果を免疫刺激効果と組み合わせることである。免疫刺激分子には、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、γ−ＩＦＮなどのサイトカイン、ＭＩＰ−１、ＭＣＰ−１、ＩＬ−８などのケモカイン、及びＦＬＴ３リガンドなどの成長因子も含まれる。
【０１６３】
現在研究中又は使用中の免疫療法の例は免疫アジュバント、例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｏｖｉｓ、熱帯熱マラリア原虫（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、ジニトロクロロベンゼン、及び芳香族化合物；サイトカイン療法、例えば、インターフェロンα、β、及びγ、ＩＬ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、及びＴＮＦ；遺伝子療法、例えば、ＴＮＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、及びｐ５３；並びにモノクローナル抗体、例えば、抗ＣＤ２０、抗ガングリオシドＧＭ２、及び抗ｐ１８５である。１つ以上の抗癌療法が、本明細書中に記載される抗体療法と共に使用され得ることが意図される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、免疫療法が免疫チェックポイント阻害剤であってもよい。免疫チェックポイントはシグナル（例えば、共刺激分子）を上昇させるか、又はシグナルを低下させる免疫系における分子である。免疫チェックポイント遮断の標的となりうる抑制性チェックポイント分子には、アデノシンＡ２Ａ受容体（Ａ２ＡＲ）、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６としても知られる）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４、ＣＤ１５２としても知られる）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、キラー細胞免疫グロブリン（ＫＩＲ）、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）、プログラムドデス１（ＰＤ−１）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）及びＴ細胞活性化ＶドメインＩｇ抑制因子（ＶＩＳＴＡ）がある。特に、免疫チェックポイント阻害剤はＰＤ−１軸及び／又はＣＴＬＡ−４を標的とする。
【０１６５】
免疫チェックポイント阻害剤は小分子、リガンド又はレセプターの組換え形態などの薬物であってもよく、又は特に、ヒト抗体などの抗体であってもよい（例えば、国際特許公開第ＷＯ２０１５０１６７１８号；両方とも参照により本明細書に組み込まれる）。免疫チェックポイントタンパク質又はそのアナログの公知のインヒビターが使用され得、特に、抗体のキメラ化形態、ヒト化形態又はヒト形態が使用され得る。当業者が知るように、代替及び／又は同等の名称が、本開示において言及される特定の抗体のために使用され得る。そのような代替及び／又は同等の名前は、本開示の文脈において交換可能である。例えば、ランブロリズマブはまた、ＭＫ−３４７５及びペンブロリズマブの代替及び同等の名称で知られていることが知られている。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストがＰＤ−１のそのリガンド結合パートナーへの結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤ−１リガンド結合パートナーは、ＰＤＬ１及び／又はＰＤＬ２である。別の実施形態において、ＰＤＬ１結合アンタゴニストは、その結合パートナーへのＰＤＬ１の結合を阻害する分子である。特定の態様において、ＰＤＬ１結合パートナーは、ＰＤ−１及び／又はＢ７−１である。別の実施形態において、ＰＤＬ２結合アンタゴニストは、その結合パートナーへのＰＤＬ２の結合を阻害する分子である。特定の態様では、ＰＤＬ２結合パートナーはＰＤ−１である。アンタゴニストは、抗体、その抗原結合フラグメント、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドであり得る。例示的な抗体は、米国特許番号に記載されている。８，７３５，５５３、８，３５４，５０９及び８，００８，４４９（すべて参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本明細書中に提供される方法において使用するための他のＰＤ−１軸アンタゴニストは米国特許出願第２０１４０２９４８９８号、同第２０１４０２２０２１号、及び同第２０１１０００８３６９号（全て、本明細書中に参考として援用される）に記載されるように、当該分野で公知である。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、抗ＰＤ−１抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ニボルマブ、ペンブロリズマブ及びＣＴ−０１１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストは、イムノアドヘシン（例えば、定常領域（例えば、免疫グロブリン配列のＦｃ領域）に融合されたＰＤＬ１又はＰＤＬ２の細胞外又はＰＤ−１結合部分を含むイムノアドヘシン）である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１結合アンタゴニストはＡＭＰ２２４である。ニボルマブはＭＤＸ−１１０６−０４、ＭＤＸ−１１０６、ＯＮＯ−４５３８、ＢＭＳ−９３６５５８、及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）としても知られており、ＷＯ２００６／１２１１６８に記載されている抗ＰＤ−１抗体である。ペンブロリズマブは、ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ  ３４７５、ランブロリズマブ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）及びＳＣＨ−９００４７５とも呼ばれ、ＷＯ２００９／１１４３３５に記載されている抗ＰＤ−１抗体である。ＣＴ−０１１、ｈＢＡＴ又はｈＢＡＴ−１としても知られ、ＷＯ２００９／１０１６１１に記載されている抗ＰＤ−１抗体である。ＡＭＰ−２２４は、Ｂ７−ＤＣＩｇとしても知られており、ＷＯ２０１０／０２７８２７及びＷＯ２０１１／０６６３４２に記載されているＰＤＬ２−Ｆｃ融合可溶性受容体である。
【０１６８】
本明細書中に提供される方法において標的化され得る別の免疫チェックポイントは、ＣＤ１５２としても知られる細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）である。ヒトＣＴＬＡ−４の完全なｃＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｌ１５００６を有する。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞の表面上に見出され、抗原提示細胞の表面上のＣＤ８０又はＣＤ８６に結合すると「オフ」スイッチとして機能する。ＣＴＬＡ４は免疫グロブリンスーパーファミリーの一員で、ヘルパーＴ細胞の表面に発現し、Ｔ細胞に抑制性シグナルを伝達する。ＣＴＬＡ４はＴ細胞共刺激タンパク質であるＣＤ２８と類似しており、両分子は抗原提示細胞上で、ＣＤ８０及びＣＤ８６（それぞれＢ７−１及びＢ７−２とも呼ばれる）に結合する。ＣＤ２８は刺激性シグナルを伝達するのに対し、ＣＴＬＡ４はＴ細胞に抑制性シグナルを伝達する。細胞内ＣＴＬＡ４は制御性Ｔ細胞にも認められ、その機能に重要であると考えられる。Ｔ細胞レセプターとＣＤ２８を介するＴ細胞の活性化は、Ｂ７分子の阻害レセプターであるＣＴＬＡ−４の発現を増加させる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、ヒト抗体、ヒト化抗体、又はキメラ抗体）、その抗原結合断片、イムノアドヘシン、融合タンパク質、又はオリゴペプチドである。
【０１７０】
本方法での使用に適した抗ヒトＣＴＬＡ−４抗体（又はそれに由来するＶＨ及び／又はＶＬドメイン）は、当技術分野で周知の方法を使用して生成することができる。あるいは、当技術分野で認識されている抗ＣＴＬＡ−４抗体を使用することができる。例えば、米国特許第８，１１９，１２９号、国際公開第０１／１４４２４号、国際公開第９８／４２７５２号；国際公開第００／３７５０４号（ＣＰ６７５，２０６、トレメリムマブとしても知られている；以前はチシリムマブ）、米国特許第６，２０７，１５６号に開示されている抗ＣＴＬＡ−４抗体を、本明細書に開示されている方法において使用することができる。上記の各出版物の教訓は、ここでは参考までに取り込んでいる。ＣＴＬＡ−４への結合のためにこれらの技術的に認識された抗体のいずれと競合する抗体も使用することができる。例えば、ヒト化ＣＴＬＡ−４抗体は国際特許出願第ＷＯ２００１０１４４２４号、ＷＯ２００００３７５０４号、及び米国特許第８，０１７，１１４号に記載されており、すべて参照により本明細書に組み込まれる。
【０１７１】
例示的な抗ＣＴＬＡ−４抗体は、イピリムマブ（１０Ｄ１、ＭＤＸ０１０、ＭＤＸ１０１、及びＹｅｒｖｏｙ（登録商標）としても知られる）又はその抗原結合フラグメント及び変異体である。他の実施形態では、抗体は、イピリムマブの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又はＶＲを含む。したがって、一実施形態では、抗体は、イピリムマブのＶＨ地域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメイン、並びにイピリムマブのＶＬ地域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３ドメインを含む。別の実施形態では、抗体が上述の抗体と同じＣＴＬＡ−４上のエピトープとの結合及び／又は結合について競合する。別の実施形態において、抗体は、上記の抗体と少なくとも約９０％の可変領域アミノ酸配列同一性（例えば、イピリムマブと少なくとも約９０％、９５％、又は９９％の可変領域同一性）を有する。
【０１７２】
ＣＴＬＡ−４を調節するための他の分子には、米国特許番号ＵＳ５８４４９０５号、ＵＳ５８８５７９６号、国際特許出願番号ＷＯ１９９５００１９９４及びＷＯ１９９８０４２７５２に記載されているようなＣＴＬＡ−４リガンド及びレセプターが含まれる。；すべて参照により本明細書に組み込まれる；及び米国特許第ＵＳ８３２９８６７号に記載されるような免疫接着（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１７３】
（４．手術）
癌を有する人の約６０％が、予防的、診断的又は病期分類、治癒的及び緩和的手術を含む何らかの種類の手術を受ける。治癒的手術は、癌性組織の全て又は一部が物理的に除去され、切除され、及び／又は破壊され、本実施形態の治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法、及び／又は代替療法などの他の療法と併用され得る。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部の物理的除去をいう。腫瘍切除に加えて、手術による治療には、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡的に制御された手術（モース手術）が含まれる。
【０１７４】
癌性細胞、組織、又は腫瘍の一部又は全部を切除すると、体内に空洞が形成され得る。治療は、潅流、直接注射、又は追加の抗癌治療を伴う領域の局所適用によって達成され得る。そのような治療は例えば、１、２、３、４、５、６、７日毎に、又は１、２、３、４及び５週間毎に、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヶ月毎に反復することができる。これらの治療は、同様に様々な投与量であり得る。
【０１７５】
（５．その他の薬剤）
治療の治療効果を改善するために、他の薬剤を本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用してもよいことが企図される。したがって、さらなる例を考えることができる。これらの追加の薬剤には、細胞表面受容体及びギャップ結合のアップレギュレーションに影響する薬剤、細胞増殖抑制剤及び分化剤、細胞接着の阻害剤、アポトーシス誘導剤に対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる薬剤、又は他の生物学的薬剤が含まれる。ギャップ結合の数を増加させることによる細胞間シグナル伝達の増加は、隣接する過剰増殖性細胞集団に対する抗過剰増殖作用を増加させるのであろう。他の実施形態において、細胞増殖抑制剤又は分化剤は治療の抗過剰増殖効力を改善するために、本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用され得る。細胞接着の阻害剤は、本実施形態の効力を改善することが意図される。細胞接着阻害剤の例は、局所接着キナーゼ（ＦＡＫ）阻害剤及びロバスタチンである。さらに、抗体ｃ２２５のような、アポトーシスに対する過剰増殖性細胞の感受性を増加させる他の薬剤が治療効力を改善するために、本実施形態の特定の態様と組み合わせて使用され得ることがさらに意図される。
【０１７６】
［キット］
実施形態の様々な態様において、治療剤及び／又は他の治療剤及び送達剤を含有するキットが想定される。いくつかの実施形態において、本実施形態は、実施形態のエキソソーム組成物を調製及び／又は投与するためのキットを意図する。キットは、本実施形態の医薬組成物のいずれかを含有する１つ以上の密封バイアルを含み得る。このキットは例えば、エキソソーム、並びに実施形態の成分を調製、処方及び／又は投与するための試薬、又は本発明の方法の１つ以上の工程を実行するための試薬を含み得る。いくつかの実施形態では、キットはまた、エッペンドルフチューブ、アッセイプレート、シリンジ、ボトル、又はチューブなどのキットの構成要素と反応しない容器である適切な容器を含んでもよい。容器は、プラスチック又はガラスなどの滅菌可能な材料から作製されてもよい。
【０１７７】
キットは、本明細書に記載される方法の手順のステップを概説し、本明細書に記載される手順と実質的に同じ手順に従うか、又は当業者に公知である、説明書をさらに含んでもよい。取扱説明は、コンピュータを使用して実行されると、薬学的に有効な量の治療薬を送達する実際の又は仮想の手順の表示を引き起こす、機械可読命令を含むコンピュータ可読媒体中にあってもよい。
【実施例】
【０１７８】
［Ｖ．実施例］
以下の実施例は本発明の好ましい実施形態を実証するために含める。以下の実施例において開示される手法が本発明の実施において十分に機能することが発明者らによって見いだされた技術を表し、従って、本発明の実践において十分に機能することが当業者には理解されるはずである。しかしながら、当業者であれば、本発明の開示を考慮して、開示されかつ同様の結果を得られる特定の実施例において、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、多くの変更が可能であることは理解できるのであろう。
【０１７９】
［例１−エキソソームの生産と特性化］
ＭＳＣから大量のエキソソームを生成するために、骨髄由来ＭＳＣのバイオリアクター培養物を、馴化培地の２５０ｍＬ採集物の採集を可能にするように適合させた。Ｔｅｒｕｍｏ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍは、細胞のＧＭＰ準拠性産生のために設計された自動中空繊維細胞培養プラットフォームである。
【０１８０】
ＭＳＣを、約４５０細胞／ｃｍ２の濃度で、約２．０×１０７ＭＳＣと共にバイオリアクターに播種した。細胞を、ＭＳＣ増殖及び接着のために、Ｌ−グルタミン＋ヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を補充したαＭＥＭ培地を使用して、５％酸素中で８日間培養した。
【０１８１】
他者によって報告されていない本発明の方法における独特の工程はバイオリアクターにおける最適なＭＳＣコンフルエンスのための血小板溶解物の最初の使用、続いて、バイオリアクターにおけるＭＳＣが８５％以上のコンフルエンスに達したら、増殖培地を無血清馴化培地と交換する次の工程を含む。この工程は、血小板溶解物中に大量に見出され、そうでなければＭＳＣ由来エキソソームを希釈するエキソソームで最終産物を汚染することを回避する。馴化培地をバイオリアクター中に４８時間放置し、次いでＥＶ精製のために採集した（図１）。バイオリアクターは、６つの採集（４８時間毎に１つ）を含むＥＶを１２日間連続的に産生した（図２）。
【０１８２】
このアプローチを用いて、約６億ＭＳＣからＥＶを逐次採集することによりシステムを最適化した。２１日後、４８時間毎に採集され、−８０ｏＣで保存された馴化培地画分を解凍し、プールし、機能的に閉鎖された系で濾過した（図３）。
【０１８３】
ポンプ（Ｂａｘｔｅｒ）を、このプロセスのためのバッグチューブのヒートシール後の濾過のために使用し、これは、臨床細胞治療手順に必要とされるＧＭＰコンプライアンスと一致した。ＸＥ−９０  Ｕｌｔｒａｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いて、１００，０００ｇで４時間、４℃で超遠心分離することにより、ＥＶを馴化培地からエキソソームとして単離した。Ｂａｘｔｅｒポンプ及びヒートシールされたチューブを使用して、最高品質の臨床製品のために機能的に閉鎖された様式で超遠心分離機からエキソソームを除去した。
【０１８４】
エキソソームはろ過及び限外遠心により濃縮され、エキソソーム数は１回の採集当たり９０００億〜４兆５０００億の範囲であった。生成されたエキソソームの総数は、バイオリアクター実行当たり９．８〜１５．１兆の範囲である。バイオリアクター実験の６つの収穫物全てからのエキソソームのモードサイズは、約１７０ｎｍに特徴的なピークを示した。エキソソーム蛋白質含量の測定値は、ＮａｎｏＳｉｇｈｔ分析により決定したエキソソーム数に近似した。特に、馴化培地の代謝収穫（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｈａｒｖｅｓｔｓ）は一定のままであり、ＭＳＣが生存したままであることを支持した。
【０１８５】
精製されたエキソソームを、エキソソーム表面マーカー：ＣＤ６３、ＣＤ４７、ＣＤ９及びＣＤ８１のフローサイトメトリー発現；並びに透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）によって同定した（図４）。さらに、ナノ粒子追跡分析及びマイクロＢＣＡアッセイを使用して、エキソソームを定量した（図５）。１回のバイオリアクター実行からの収率は１００  Ｔ−２２５フラスコからのおおよそのエキソソーム収率に等しい、最低１０×１０１２エキソソームであった。従って、本発明の方法は、エキソソームの効率的な臨床グレードの産生を可能にする。
【０１８６】
［実施例２−エキソソームのエレクトロポレーション］
４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒシステムは実施例１に由来するエキソソームのような、２．５×１０１０〜２．５×１０１２の範囲の大規模エキソソーム数の閉鎖された、効率的かつスケーラブルなインビトロトランスフェクションを可能にするために、ＬＶユニットと適合された。４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆａｃｔｏｒデバイスは３つの異なる核内因子溶液であるＳＥ、ＳＦ、及びＳＧを含み、これらの各々は、ＭＳＣ由来エキソソーム及び特異的ｓｉＲＮＡを使用して、１６の異なる核内因子プログラムと組み合わせて試験された。ｓｉＲＮＡをＭＳＣ由来エキソソームに効率的に組み込むための各条件の効率を、ｓｉＲＮＡを有するＭＳＣエキソソームによって誘導されたレシピエント細胞のアポトーシスアッセイによって評価した（図７）。
【０１８７】
以前は規定されたエレクトロポレーション緩衝液（研究用緩衝液、「ＲＢ」）を使用して、ｓｉＲＮＡをエキソソームに導入したが、これは、その緩衝液がヒトの使用に対して承認されていないため。細胞又はマウスを治療する前に、エキソソームの洗浄工程を必要とした。洗浄工程はエキソソームの損失に関連し、これは、ｓｉＲＮＡのエキソソームへの首尾よいエレクトロポレーションを可能にし、そして細胞又はマウスに直接投与され得る希釈剤の使用によって軽減され得る。臨床緩衝液（ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標）、「ＣＢ」）、ヒト使用のためのＦＤＡ承認希釈剤（これは、ＭＳＣ及び患者への多くの他の細胞産物注入のために使用される）を、エレクトロポレーションについて試験した。ＭＳＣ由来エキソソームのエレクトロポレーションに続いて、電子顕微鏡分析は、最初に処方された研究用緩衝液（ＲＢ）又はＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標）（図８Ｂ）のいずれかを使用して、完全なエキソソームの存在を確認した。
【０１８８】
［実施例３−エキソソーム製造における条件の最適化］
ＭＳＣ培養物からエキソソームを産生するための最良の時間を決定するために、馴化培地の採集を異なる時間で行った（図５Ｄ）。ナノサイトから得られたデータ（すなわち、粒子の数）を、フローサイトメトリーについて得られたデータ（すなわち、エキソソームマーカーのパーセンテージ）と合わせた。結果は、ＭＳＣからの粒子の数が２４時間で最高レベルに達し、４８時間まで維持されることを示した。その後、粒子の数は有意に減少した。フローデータは、エキソソームマーカーのパーセンテージが２４時間でのパーセンテージと比較して、４８時間で濃縮されたことを示した（図５Ｅ）。２４時間と４８時間との間の粒子の数は有意に異ならなかったので、４８時間の時点を採集のための時点として選択した。
【０１８９】
次に、培養中のＭＳＣからエキソソームを産生するための理想的な条件を決定するために、ＰＬＴを含有する培地の有無にかかわらず、２４時間の培養後に、馴化培地からＭＳＣ由来エキソソームを単離した。結果は、ＰＬＴを有する培地から単離された粒子の数が無血清培地よりも多いことを示した（図６Ａ）。しかしながら、エキソソームマーカーのフローサイトメトリーはおそらくＰＬＴ中のタンパク質及び脂質の数が多いために、エキソソームのパーセンテージが低いことを示した（図６Ｂ）。
【０１９０】
従って、核酸又はタンパク質の小配列のエキソソームへのエレクトロポレーションのプロセスは無菌溶液（すなわち、ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標））（図８Ａ）を使用して最適化され、これは、ヒトにおいて直接注入され得、操作、材料の損失、及び治療のコストを減少させた（図９）。ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標）が最適なエレクトロポレーション結果を生じることを実証する前に、５つの異なる研究用緩衝液を試験した（図８Ａ）。さらに、このストラテジーによって産生されたＭＳＣ由来エキソソームの、いくつかの組織を標的とする能力が、インビボで実証された（図１０）。
【０１９１】
従って、本研究は、レシピエント細胞における標的ＲＮＡのインビトロ発現をサイレンスし得るＫＲＡＳ  ｓｉＲＮＡを保有するＭＳＣ−エキソソームの効率的な大規模生産を実証した（図８Ｃ）。このアプローチは、以前の方法と比較して、より多くの数のＥＶを１対数より多く生成する。さらに、本発明の方法は洗浄又は他の操作なしに、操作されたエキソソームの直接注入を可能にする。
【０１９２】
［実施例４−材料及び方法］
細胞：ＭＤアンダーソン癌センターのＣｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た骨髄由来ＭＳＣ（継代３）を、１％Ｌ−グルタミン、５％ヒト血小板溶解物、１％ペニシリン−ストレプトマイシンを添加したαＭＥＭ（完全培地）で培養した。３つの異なるドナー由来のＭＳＣを評価し、次いで、その高いエキソソーム産生収率に基づいて単一のドナーを選択した。インビトロトランスフェクションのために、６ウェルプレートのウェルあたり２５０，０００個のＰａｎｃ−１細胞を一晩播種した。エキソソーム処理の前に、単層を１ｍｌのＰＢＳで２回洗浄し、次いで、１ｍｌの無血清培地（１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ）中のエキソソームで、各アッセイについて記載したような指示された時点で処理した。
【０１９３】
臨床緩衝液（ＰＬＡＳＭＡＬＹＴＥ−Ａ（登録商標）ｐＨ  ７．４又は「ＣＢ」）は、０．０９Ｍ塩化ナトリウム、０．２３Ｍグルコン酸ナトリウム；０．２７Ｍ酢酸ナトリウム三水和物、５ｍＭ塩化カリウム、３ｍＭ塩化マグネシウムから構成される。抗菌剤を含まない。水酸化ナトリウムでｐＨを７．４に調整する。
【０１９４】
臨床グレードのエキソソームは、ＭＤアンダーソン癌センターのＣｅｌｌ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ＬａｂｏｒａｔｏｒｙのＧＭＰ施設で培養したＭＳＣから厳密に調製した。Ｑｕａｎｔｕｍバイオリアクター培養系（Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴ）を１Ｌの１×ＰＢＳでプライミングし（自動化プロセス）、２５０ｍｌの１×ＰＢＳ中に希釈した５ｍｇのヒトフィブロネクチン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ドイツ）で２４時間コーティングした。次いで、バイオリアクターを、１％Ｌ−グルタミン、５％ヒト血小板溶解物、及び１％ペニシリン−ストレプトマイシン（完全培地）を添加した培養済みαＭＥＭ５００ｍｌで洗浄し、２５ｍｌの完全培地中で希釈した２０×１０６ＭＳＣ（継代３）をロードし、完全培地を使用して９日間増殖させた。新鮮な完全培地を連続的に細胞に添加し、毎日のグルコース及び乳酸塩の測定によって規定されるように、注入速度を調節した。９日後、細胞が約８０％コンフルエンスに達したとき（グルコース及びラクトース測定によって確認される）、細胞を２Ｌの１×ＰＢＳで洗浄して、完全培地をＰＬＴを含まない培地（１％Ｌ−グルタミン及び１％ペニシリン−ストレプトマイシンを補充したαＭＥＭ）に交換した。次いで、バイオリアクター馴化培地（２５０ｍｌ）を、密封バッグ（閉鎖系）中に４８時間ごとに採集し、全部で６回の採集（回収）を行った。これらの１２日間、培養物は、毎日測定される一定のグルコースレベルに基づいて拡大しなかった。従って、エキソソームを、１２日間にわたって４８時間毎に連続的に採集した。収穫物を、さらなる処理のために−８０℃で保存した。各収穫物を、無菌性（嫌気性及び好気性細菌について陰性であることが確認された）、エンドトキシン（＜１ＥＵ／ｍｌ）及びマイコプラズマ（ＰＣＲ、陰性）の試験を行った。次いで、採集物を４℃で一晩解凍し、プールし、Ｃｏｂｅ  ２９９１  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴ）を使用した閉鎖系において、１，０００ｇで１５分間遠心分離した。遠心分離（４℃で１５分間、１，０００ｇ）によって大きな細胞残屑を除去した後、馴化培地を、０．２μｍフィルター（Ｔｅｒｕｍｏ  ＢＣＴ）の濾過バッグを使用して閉鎖系で濾過した。次いで、６００ｍｌの上清を、シリンジ及びポリカーボネートチューブ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）に直接接続されたラインを使用して、半閉鎖系で６つの透明なポリカーボネートチューブ（各チューブは１００ｍｌの容量を有する）に移し、密封し、４５型Ｔｉローター（Ｂｅｃｋｍａｎ−Ｃｏｕｌｔｅｒ）中で、１００，０００ｇで３時間遠心分離した。全ての採集物が遠心されるまで、このプロセスを３回繰り返した（合計１５００ｍｌ）。次に、ポンプに接続した１６Ｇシリンジ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１４−８２６−１８Ｂ）を用いて上清を吸引した。エキソソームペレットを、１８Ｇシリンジ（ＢＤ、カタログ番号４０８３６０）を使用して、４ｍｌ（チューブ当たり）の臨床緩衝液中に手動で再懸濁し、そして滅菌ガラス容器（ＡＰＰ  Ｐｈａｒｍａ、容量３０ｍｌ）に移した。これを、全ての遠心分離が完了するまで、４℃で７２時間まで維持した。全ての遠心分離が完了したとき、再懸濁された���キソソームの最終プール容量は７２ｍｌであった。プールされたＭＳＣエキソソームを、ＮａｎｏＳｉｇｈｔＴＭ（０．５ｍｌ）、フローサイトメトリー（１ｍｌ）によって分析し、そしてエンドトキシン（プールされたサンプル０．５ｍｌを使用して）及び無菌性（上記に詳述されるように、プールされたサンプル１ｍｌを使用して）を試験した。最後に、エキソソーム（最終容量６９ｍｌ）を、各々（２ｍｌ）を含むクライオガラスバイアルに分け、−８０℃で保存した。将来の臨床製品の製造のために、エキソソームは、大規模エレクトロポレーションのために直接処理され（詳細については以下を参照のこと）、次いで、分注され、−８０℃で保存される。
【０１９５】
ＮＴＡによる粒子サイズ及び濃度分布の測定：単離されたエキソソーム懸濁液を、ＮａｎｏＳｉｇｈｔＴＭ  ＬＭ  １０機器（ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  Ｌｔｄ）を使用して分析した。分析設定を最適化し、サンプル間で一定に保ち、各ビデオを分析して、各粒子サイズの平均、モード、中央値及び推定濃度を得た。
【０１９６】
ｍｉｃｒｏＢＣＡアッセイによるエキソソームの定量：ＣＢに再懸濁したＭＳＣエキソソームを１×ＰＢＳで洗浄し、ＳＷ  ４１型Ｔｉトーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）中で１００，０００ｇで３時間超遠心分離した。次いで、洗浄したＭＳＣエキソソームを、ＮａｎｏＳｉｇｈｔＴＭによって再び測定し、そしてｍｉｃｒｏＢＣＡタンパク質アッセイ試薬キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造元の仕様に従って、総タンパク質含量を分析した。
【０１９７】
エキソソームのエレクトロポレーション：総数で０．５×１０１２個のＭＳＣ由来エキソソーム及び０．５ｍｇのｓｉＲＮＡソース２（Ａｖｅｃｉａ）を、２０ｍｌの臨床緩衝液中で混合した。これらのエキソソームを、４Ｄ  Ｎｕｃｌｅｏｆａｔｏｒ  ＬＶユニット（Ｌｏｎｚａ）を使用して、閉鎖系においてエレクトロポレーションした。ＬＶ  ＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅＴＭカートリッジは、２０ｍｌまでのエレクトロポレーションを可能にする新しいキュベットシステムである。カートリッジは、２つのリザーババッグ（入口及び出口）と、１時間当たり１ｍｌでカートリッジを満たす蠕動ポンプとに接続される。全ての手順の間、アウトレットバッグは氷上に維持され、手順を完了するのに約１０分かかる。エレクトロポレーション後、エキソソームをＮａｎｏＳｉｇｈｔＴＭによって分析し、エンドトキシン及び無菌性について試験し（上記に詳述したように）、凍結バイアルに分注し、−８０℃で保存した。次に、これらのエキソソームを氷上で解凍し、その後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ実験に使用した。インビトロ実験のために、エキソソームを、以下に詳述する下流の適用のために希釈した。インビボ実験のために、１０９のエレクトロポレーションされたエキソソームを、１００μＬの研究用緩衝液又は臨床緩衝液中で希釈した。
【０１９８】
電子顕微鏡：最適濃度で固定した標本を３００メッシュのカーボン／ホルムバール被覆グリッド上に置き、最低１分間ホルムバールに吸収させた。グリッドをＰＢＳですすぎ、０．１Ｍリン酸緩衝液中の２．５％グルタルアルデヒド中に１５分間置いた。ＰＢＳ及び蒸留水でリンスした後、グリッドを乾燥させ、酢酸ウラニルを用いてコントラストを染色した。サンプルをＴｅｃｎａｉ  Ｂｉｏ  Ｔｗｉｎ透過型電子顕微鏡（ＦＥＩ、Ｈｉｌｌｓｂｏｒｏ、ＯＲ）で観察し、画像をＡＭＴ  ＣＣＤカメラ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）で撮影した。
【０１９９】
エキソソームのフローサイトメトリー分析：ＭＳＣからのエキソソームを上記のように単離し、２００μｌのＰＢＳに再懸濁した。アルデヒド／硫酸塩ビーズ（１０μｌ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を溶液に添加し、ビーズ及びエキソソーム混合物を、卓上ローテーターを用いて室温で１５分間混合した。次いで、ＰＢＳ（６００μｌ）を溶液に添加し、４℃で混合を一晩続け、１Ｍグリシン（４００μｌ）を添加し、室温で混合を１時間続けた。次に、混合物を８，０００ｇで１分間スピンダウンした。次いで、沈殿物をＰＢＳ中１０％  ＢＳＡ１００μＬに再懸濁し、室温で４５分間混合した。混合物を８，０００ｇで１分間スピンダウンし、上清を吸引した。次いで、エキソソームが付着したビーズ（ペレット）を、ＰＢＳ中の２０μｌの２％  ＢＳＡに再懸濁し、そしてＣＤ４７、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、ＣＤ２９、ＣＤ９０又はアイソタイプ・コントロールについて免疫標識した。ビーズに結合したエキソソームを、１μｌの抗ＣＤ４７抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号１４−０４７９）又は１μｌの抗ＣＤ６３（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５６０１９）、又は１μｌの抗ＣＤ−８１抗体（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５６７５）、又は１μｌの抗ＣＤ９抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号ＳＡＢ４７０００９２）又は１μｌの抗ＣＤ２９免疫（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３０３００１）、又は１μｌの抗ＣＤ９０免疫ａ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、カタログ番号３２８１０１）、又は１μｌのマウスＩｇＧ１、κアイソタイプ・コントロール免疫（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、カタログ番号５５５７４６）と２０μｌ容量でインキュベートし、室温で３０分間混合した。次に、混合物を８，０００ｇで１分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットをＰＢＳ中の２％  ＢＳＡ２０μｌに再懸濁した。次いで、１μｌの二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ａ２１２０２）を試料及びアイソタイプ・コントロールに添加した。次いで、全てのサンプルを室温で１時間混合した。次いで、サンプルを８，０００ｇで１分間遠心分離し、上清を吸引し、ペレットをＰＢＳ中の２％ＢＳＡ  ２００μｌに再懸濁した。ビーズに結合したエキソソームを、ＰＢＳ中の２％  ＢＳＡで３回洗浄した。エキソソームマーカー（ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１、ＣＤ４７、及び間葉系マーカー（ＣＤ２９及びＣＤ９０）の発現を、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０セルアナライザーを用いて分析した。データは、ＦｌｏｗＪｏＲソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ  Ｉｎｃ．）を用いて分析した。フローサイトメトリーデータは、アイソタイプ対照及び各実験のサンプルの両方について並べて取得した。同じエキソソーム調製物を用いて、フローサイトメトリー実験を独立して２回繰り返した。
【０２００】
本明細書に開示され、特許請求される方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験を行うことなく、作製し、実行することができる。本発明の組成物及び方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、本発明の概念、精神及び範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法及び方法のステップ又はステップのシーケンスに変形を適用できることは当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤で本明細書中に記載の薬剤を代用し、同じ又は類似の結果が達成され得ることが理解されるのであろう。当業者に明らかなすべてのそのような同様な置換及び修飾は、添付の請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲及び概念内にあるとみなされる。
【０２０１】
［参考文献］
以下の参考文献は、それらが本明細書に示されるものを補足する例示的な手順又は他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
国際公開ＷＯ  ００／３７５０４号
国際公開ＷＯ  ０１／１４４２４号
国際公開ＷＯ  ９８／４２７５２号
国際公開ＷＯ１９９５００１９９４号
国際公開ＷＯ１９９８０４２７５２号
国際公開ＷＯ２００００３７５０４号
国際公開ＷＯ２００１０１４４２４号
国際公開ＷＯ２００６／１２１１６８号
国際公開ＷＯ２００９／１０１６１１号
国際公開ＷＯ２００９／１１４３３５号
国際公開ＷＯ２０１０／０２７８２７号
国際公開ＷＯ２０１１／０６６３４２号
国際公開ＷＯ２０１５０１６７１８号
米国特許４，８７０，２８７号
米国特許５，７６０，３９５号
米国特許５，８４４，９０５号
米国特許５，８８５，７９６号
米国特許８，００８，４４９号
米国特許８，０１７，１１４号
米国特許８，１１９，１２９号
米国特許８，３２９，８６７号
米国特許８，３５４，５０９号
米国特許８，７３５，５５３号
米国公開特許番号２０１１０００８３６９号
米国公開特許番号２０１４０２２０２１号
米国公開特許番号２０１４０２９４８９８号
【図１Ａ−１】
2021503286.tif 000003
【図１Ａ−２】
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【図１Ａ−３】
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【図１Ａ−４】
2021503286.tif 000006
【図１Ａ−５】
2021503286.tif 000007
【図１Ａ−６】
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【図１Ｂ】
2021503286.tif 000009
【図１Ｃ】
2021503286.tif 000010
【図１Ｄ】
2021503286.tif 000011
【図２】
2021503286.tif 000012
【図３】
2021503286.tif 000013
【図４Ａ−１】
2021503286.tif 000014
【図４Ａ−２】
2021503286.tif 000015
【図４Ａ−３】
2021503286.tif 000016
【図４Ａ−４】
2021503286.tif 000017
【図４Ａ−５】
2021503286.tif 000018
【図４Ａ−６】
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【図４Ｂ】
2021503286.tif 000020
【図５Ａ】
2021503286.tif 000021
【図５Ｂ】
2021503286.tif 000022
【図５Ｃ】
2021503286.tif 000023
【図５Ｄ】
2021503286.tif 000024
【図５Ｅ−１】
2021503286.tif 000025
【図５Ｅ−２】
2021503286.tif 000026
【図６Ａ】
2021503286.tif 000027
【図６Ｂ−１】
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2021503286.tif 000029
【図６Ｂ−２】
2021503286.tif 000030
【図７Ａ】
2021503286.tif 000031
【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
2021503286.tif 000033
【図８Ｂ】
2021503286.tif 000034
【図８Ｃ】
2021503286.tif 000035
【図９】
2021503286.tif 000036
【図１０Ａ】
2021503286.tif 000037
【図１０Ｂ】
2021503286.tif 000038
【図１０Ｃ】
2021503286.tif 000039
【図１０Ｄ】
2021503286.tif 000040
【国際調査報告】
2021503286.tif 000041
2021503286.tif 000042