(57)【要約】  本発明は、ノッチ受容体の細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインと、異種の細胞外リガンド結合ドメインを含むキメラ受容体、並びに具体的にはＴ細胞の機能及び／又はＴ細胞の生存の改善、さらに具体的にはがん治療におけるその使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ノッチ受容体の細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、ヘテロ二量体ドメイン及びＬｉｎ−１２−ノッチ（ＬＮＲ）繰り返しドメインと、異種の細胞外リガンド結合ドメインと、を含むキメラ受容体。
【請求項２】
前記受容体はノッチシグナル伝達が可能である、請求項１に記載のキメラ受容体。
【請求項３】
前記異種の細胞外リガンド結合ドメインは、
可溶性リガンドに対して特異的なリガンド結合ドメイン、
ＳｃＦｖ抗体ドメイン、好ましくは、腫瘍細胞表面抗原に対して特異的なＳｃＦｖ抗体ドメインのような細胞表面抗原に対して特異的なリガンド結合ドメイン、
Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン又はそのリガンド結合フラグメント、
表面分子の関与なくキメラ受容体に交差結合可能な抗体に対するエピトープを含む細胞外ドメイン、
ビオチンのような部分を含み、作用因子によってストレプトアビジンのような前記部分に対して複数の結合部位と交差結合し得る細胞外ドメイン、
からなる群から選択される、請求項１又は２に記載のキメラ受容体。
【請求項４】
前記ＬＮＲドメインと前記異種の細胞外リガンド結合ドメインとの間に位置する連結配列をさらに含む、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラ受容体。
【請求項５】
請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ受容体をコードする配列を含む核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項７】
請求項５に記載の核酸分子又は請求項６に記載のベクターを有する単離された細胞。
【請求項８】
前記細胞は、腫瘍由来Ｔ細胞又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のようなＴ細胞である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記Ｔ細胞は、がんを患う患者から単離された自己Ｔ細胞である、請求項７又は８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現する、請求項８又は９に記載の細胞。
【請求項１１】
請求項５又は６に記載の核酸分子又はベクターによって形質導入される、遺伝子操作されたＴ細胞。
【請求項１２】
請求項５に記載の核酸分子、請求項６に記載のベクター又は請求項７から１１のいずれか一項に記載の細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と、を含む医薬組成物。
【請求項１３】
治療上有効量の請求項１から１１のいずれか一項に記載のキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞を対象に投与することを含む、Ｔ細胞の機能及び／又はＴ細胞生存の改善を必要とする前記対象でのＴ細胞の機能及び／又はＴ細胞生存を改善する方法。
【請求項１４】
対象でのＴ細胞の機能及び／又はＴ細胞生存を改善する方法での使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞。
【請求項１５】
前記方法は、Ｔ細胞の疲弊を防ぐ又は阻害することを含む、請求項１３又は１４に記載の方法又はキメラ受容体、核酸分子、ベクター若しくは細胞。
【請求項１６】
治療上有効量の請求項１から１１のいずれか一項に記載のキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞を、免疫療法を必要とする対象に投与することを含む、前記対象での免疫療法。
【請求項１７】
治療、好ましくは免疫療法での使用のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載のキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞。
【請求項１８】
前記治療又は免疫療法が抗体ベースの免疫療法をさらに含む、請求項１６又は１７に記載の使用のための方法又はキメラ受容体、核酸分子、ベクター若しくは細胞。
【請求項１９】
前記対象は、がんを患っている、請求項１３から１８のいずれか一項に記載の使用のための方法又はキメラ受容体、核酸分子、ベクター若しくは細胞。
【請求項２０】
抗体ベースの免疫療法の有効性を、がんを患い前記抗体で治療されている対象において高める方法であって、請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ受容体を発現する治療上有効量のＴ細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
抗体ベースの免疫療法の有効性を、がんを患い前記抗体で治療されている対象において高める方法での使用のための、請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ受容体を発現するＴ細胞。
【請求項２２】
請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ受容体をコードする核酸配列を含む有効量のＴ細胞を、がんの治療を必要とする対象に投与することを含む、前記対象におけるがんの治療方法。
【請求項２３】
対象におけるがんの治療方法での使用のための、請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むＴ細胞。
【請求項２４】
前記対象からＴ細胞を単離すること、
前記Ｔ細胞に請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ受容体をコードする核酸配列を与えることで前記Ｔ細胞を改変すること、
前記改変されたＴ細胞を前記対象に戻すこと、
を含む、
請求項２２に記載の方法又は請求項２３に記載の使用のためのＴ細胞。
【請求項２５】
細胞、好ましくはヒトＴ細胞を供給すること、
前記細胞に請求項５又は６に記載の核酸分子又はベクターを与えること、及び
請求項１から４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を発現させること、
を含む、請求項７から１１のいずれか一項に記載の細胞の集団を製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は治療、特にがん治療の分野、より具体的には養子Ｔ細胞免疫療法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで増幅させた、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）又はＴ細胞の養子導入による腫瘍治療で顕著な成功が達成された。腫瘍で発見され、ＣＤ３ζ及びＣＤ２８又は４−１ＢＢ等の共刺激受容体に結合している、抗原特異的な細胞外ドメイン（抗体の一部）をＣＡＲは含む（図１）。Ｔ細胞におけるＣＡＲの発現は、腫瘍抗原によるそれらの活性化を引き起こす。特定の血液悪性腫瘍において、９０％までの完全寛解がＣＡＲ  Ｔ細胞で得られた。固形がんの治療ではほとんど成功していない。このため、いまだに多くの患者がこのような治療法で治療されていない。大きな障害は、導入されたＴ細胞の準最適な持続性及び、最大の治療効果のためにすべてを標的にしなければならない複数の抑制性受容体によるＴ細胞機能の阻害（疲弊として知られる現象）である。理想的には、抗腫瘍Ｔ細胞が広い範囲で抑制機序の影響を受けず、十分に長期生存することで、完全な腫瘍根絶を達成できる。
【０００３】
ノッチは膜結合リガンドに応答する細胞表面受容体である。それは、ひときわ直接経路を介してシグナル伝達し、細胞内ドメインがγ−セクレターゼによって細胞膜から切断され、核に移行し、転写因子として機能する（図２）。ノッチはＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞エフェクターの分化の両方の主な調節因子である。また、固形がんに対して最も有効なＴ細胞のタイプとして出現するＣＤ４メモリーＴ細胞に加え、組織レジデントメモリーＴ細胞の長期間の生存をそれは促進する。さらに、ノッチは、ＣＤ８エフェクターＴ細胞の遺伝子発現プログラムの主な調節因子である。その中で直接の標的遺伝子はＩＦＮγ、グランザイムＢ及びパーフォリンに加え、転写因子Ｔ−ｂｅｔ及びエオメソデルミンをコードするものである。ノッチ経路をＴ細胞特異的に欠くマウスはモデル腫瘍に拒絶反応を示さない。逆に、腫瘍関連骨髄系由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）はＴ細胞におけるノッチ発現を下方制御し、おそらく有効なＴ細胞が介在する拒絶を腫瘍が回避することを促進する。活性のあるノッチアレルの発現は、ＣＤ８  Ｔ細胞をＭＤＳＣが介在する抑制に対して非感受性にする。
【０００４】
最近の研究では（非特許文献１及び２）、ノッチの膜貫通ドメインと細胞外ドメインの小部分とを含むキメラ受容体が形成された。それらは別の表面受容体由来のリガンド結合ドメインに結合する一方で、ノッチの細胞内部分が別のトランス活性化因子（Ｇａｌ４）に置換されている。これら受容体へのリガンドの結合はγ−セクレターゼが介在するＧａｌ４の放出をもたらし、その結果、人為的な応答遺伝子の転写を活性化する。このため、これらの受容体には、ノッチの細胞内エフェクタードメイン及びノッチの細胞外リガンド結合ドメインの両方、及びその結果としてノッチシグナル伝達がもはや存在しない。
【０００５】
腫瘍の免疫療法に係る新たな組成物及び方法が本技術分野で必要とされており、それは既存の免疫療法と組み合わせて用いられるか、又は組み合わせずに用いられる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Morsut, L., Roybal, K. T., Xiong, X., Gordley, R. M., Coyle, S. M., Thomson, M., and Lim, W. A. (2016) Engineering Customized Cell Sensing and Response Behaviors Using Synthetic Notch Receptors. Cell 164, 780-791
【非特許文献２】Roybal, K. T., Rupp, L. J., Morsut, L., Walker, W. J., McNally, K. A., Park, J. S., and Lim, W. A. (2016) Precision Tumor Recognition by T Cells With Combinatorial Antigen-Sensing Circuits. Cell 164, 770-779
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、全般的には、Ｔ細胞の機能を、特には腫瘍免疫療法において改善する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
したがって、本発明は、ノッチ受容体の細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインと、異種の細胞外リガンド結合ドメインと、を含むキメラ受容体を提供する。さらに好ましくは、キメラ受容体は、ノッチ受容体のヘテロ二量体ドメイン及びＬｉｎ−１２−ノッチ（ＬＮＲ）繰り返しドメインを含む。
【０００９】
本発明に係るキメラ受容体は、異種の細胞外リガンド結合ドメインがリガンドと結合した場合、ノッチシグナル伝達、好ましくはノッチ１、ノッチ２、ノッチ３及び／又はノッチ４シグナル伝達が可能である。
【００１０】
さらなる態様では、本発明は、本発明に係るキメラ受容体をコードする配列を含む核酸分子を提供する。
【００１１】
さらなる態様では、本発明は、本発明に係る核酸分子を含むベクターを提供する。
【００１２】
さらなる態様では、本発明は、本発明に係る核酸分子を有する単離された細胞を提供する。さらなる態様では、本発明は当該細胞の集団を提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、本発明に係るキメラ受容体を発現する単離された細胞を提供する。さらなる態様では、本発明は当該細胞の集団を提供する。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、遺伝子操作されたＴリンパ球を提供し、該Ｔリンパ球は、本発明に係る核酸分子又はベクターによって形質導入される。
【００１５】
さらなる態様では、本発明は、本発明に係る核酸分子、ベクター又は細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と、を含む医薬組成物を提供する。
【００１６】
さらなる態様では、本発明は、Ｔ細胞の機能及び／又はＴ細胞生存の改善を必要とする対象でのＴ細胞の機能及び／又はＴ細胞生存を改善する方法を提供し、該方法は、治療上有効量の本発明に係るキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞を対象に投与することを含む。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、対象におけるＴ細胞の機能及び／又はＴ細胞生存を改善する方法での使用のための、本発明に係るキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞を提供する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、免疫療法を必要とする対象での免疫療法を提供し、該方法は、治療上有効量の本発明に係るキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞を対象に投与することを含む。
【００１９】
さらなる態様では、本発明は、治療、好ましくは免疫療法での使用のための、本発明に係るキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞を提供する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、がんを患い、抗体で治療される対象における抗体ベースの免疫療法の有効性を高める方法を提供し、該方法は、本発明に係るキメラ受容体を発現する治療上有効量のＴ細胞を対象に投与することを含む。
【００２１】
さらなる態様では、本発明は、抗体ベースの免疫療法の有効性を、がんを患い抗体で治療されている対象において高める方法での使用のための、本発明に係るキメラ受容体を発現するＴ細胞を提供する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、がんの治療を必要とする対象におけるがんの治療方法を提供し、該方法は、本発明に係るキメラ受容体をコードする核酸配列を含む有効量のＴ細胞を対象に投与することを含む。
【００２３】
さらなる態様では、本発明は、対象におけるがんの治療方法での使用のための、本発明に係るキメラ受容体をコードする核酸配列を含むＴ細胞を提供する。
【００２４】
さらなる態様では、本発明は、本発明に係る細胞の集団を製造する方法を提供し、該方法は、
細胞、好ましくはヒトＴ細胞を供給すること、
当該細胞に本発明に係る核酸分子又はベクターを与えること、
本発明に係るキメラ抗原受容体を発現させること、
を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の概要。４−１ＢＢ又はＣＤ２８共抑制受容体のいずれかの細胞内シグナル伝達ドメイン及びＣＤ３ゼータ鎖に結合した抗体のｓｃＦｖ（単鎖）リガンド結合部分が示されている。
【図２】ノッチシグナル伝達経路。薄い青色及び赤色でノッチの２つの膜結合リガンドであるＪａｇｇｅｄとＤｅｌｔａが示されている。ノッチ受容体はオレンジ色で描かれている。リガンド結合後、ノッチの細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）が膜から切り出され、核に移行し、そこでＣＳＬ及びＭＡＭＬタンパク質と複合体となって転写活性化因子を形成する。
【図３】ノッチ欠損は、抗ウイルスＣＤ８  Ｔ細胞におけるエフェクター機能の減少を導く。（Ａ）実験のフローチャート。野生型（Ｎｏｔｃｈ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＮｏｔｃｈ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ）又はＴ細胞特異的ノッチ１／２ノックアウトマウス（Ｎｏｔｃｈ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＮｏｔｃｈ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＣＤ４−Ｃｒｅ）をＨｋＸ３１インフルエンザウイルスに鼻腔内から感染させ、１０日後にＴ細胞（脾臓から示された結果）が単離され、ＣＤ８及びＤｂＮＰ３６６−３７４  ＭＨＣテトラマーへの結合に関して染色された（Ｂ）。（Ｃ）野生型（黒い棒）又はノッチ１／２ＫＯマウス（無色の棒）におけるＤｂＮＰ３６６−３７４−特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の個数。ＤｂＮＰ３６６−３７４−特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるＩＦＮγ（Ｄ）又はグランザイムＢ産生細胞の割合（Ｅ  青色のヒストグラムが野生型；赤色のヒストグラムがＮ１／２ｋｏ）。（Ｆ）ＦＡＣＳで分けられたＤｂＮＰ３６６−３７４−特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞におけるグランザイムＢ及びパーフォリンの相対的なｍＲＮＡ発現量。（Ｇ）ＨｋＸ３１ウイルスの担持量（Ｈ）マウスの体重曲線及び（Ｉ）感染マウスの血液におけるインフルエンザ中和抗体の力価。すべてはＢａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４の結果である。
【図４】有効なメモリー産生におけるノッチに関するＣＤ８  Ｔ細胞内因性の要件。まず、野生型又はノッチ１／２ノックアウトマウスをＨｋＸ３１インフルエンザウイルスに鼻腔内で感染させ、続いて４３日後にＰＲ８インフルエンザに再感染させた。（Ａ）再感染後８日の血液におけるＤｂＮＰ３６６−３７４ＭＨＣテトラマー結合ＣＤ８＋  Ｔ細胞の割合。（Ｂ）脾臓及び肺におけるＤｂＮＰ３６６−３７４ＭＨＣテトラマー結合ＣＤ８＋  Ｔ細胞の個数。（Ｃ）Ｒａｇ１欠損マウスがＣＤ４５．２＋  ＷＴ  ＢＭ（黒い棒）と混合した、又はＣＤ４５．２＋  ノッチ１／２ＫＯ  ＢＭ（無色の棒）と混合したＣＤ４５．１＋  ＷＴ骨髄（ＢＭ）で再構成された。続いて、マウスをＡのように感染及び再感染させた。左にＣＤ４５．１＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の応答、右にＣＤ４５．２＋  ＣＤ８＋  Ｔ細胞の応答が示される。また、ＣＤ４５．２＋  ＫＯ  ＢＭのみ（灰色の棒）で再構成された応答も示される。結果は、対応するＷＴ対照に対して正規化された。（Ｄ）肺から単離され、ＮＰ３６６−３７４ペプチドを用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏ再刺激されたＩＦＮγ、ＴＮＦα及びグランザイムＢ産生ＣＤ８  Ｔ細胞、及び野生型の脾臓の抗原提示細胞の割合（ここで留意すべきはインフルエンザ特異的Ｔ細胞の個数が肺と類似したことである−図４Ｂ参照）。
【図５】ノッチ欠損は抗ウイルスＣＤ８  Ｔ細胞におけるエフェクター機能の低下につながる。（Ａ）野生型又はＴ細胞特異的ノッチ１／２ノックアウトマウス由来のインフルエンザ特異的エフェクターＣＤ８  Ｔ細胞間で異なる発現の（ＲＮＡｓｅｑで得られた）遺伝子の遺伝子セット濃縮解析。（Ｂ）野生型又はノッチ１／２ｋｏエフェクターＴ細胞におけるＰＤ１及びＬａｇ３のｍＲＮＡ発現量。（Ｃ）１０４  ＣＤ４５．２野生型又はノッチ１／２ｋｏ  ＯＴ１  Ｔ細胞がＣＤ４５．１野生型共通遺伝子マウスに移され、続いて該マウスを、インフルエンザを発現するオボアルブミンＮＰ３６６−３７４ペプチドに感染させた。感染後３０日の肺におけるインフルエンザ特異的メモリーＣＤ８  Ｔ細胞でのＰＤ１に関する代表的なＦＡＣＳヒストグラム（左）及びＭＦＩ（右）。（Ｄ）実験のフローチャート：ＣＤ４５．２  ＯＴ１  Ｔ細胞が空ベクター又はレトロウイルスベクターをコードするＮＩＣＤ（ノッチ細胞内ドメイン）で形質導入され、（Ｃ）のように感染させたＣＤ４５．１野生型マウスに移された。７日後、Ｔ細胞が単離され、ＰＤ１発現量に関してＦＡＣＳで解析された（Ｅ）。
【図６】生理学的なノッチ応答はＮＩＣＤにかなり敏感である。（Ａ）ノッチ応答性ＨＥＳ１−ルシフェラーゼレポーターの活性化が異なる量のｍＥＲ−ＮＩＣＤ１又は構造的ＮＩＣＤ１発現の核放出によって誘導された。Ｕ２ＯＳ細胞がホタルルシフェラーゼを発現するレポータープラスミド、構造的にウミシイタケルシフェラーゼを発現するプラスミド及び空ベクター対照、ｍＥＲ−ＮＩＣＤ又はＮＩＣＤ１でそれぞれ形質導入された。タモキシフェン（４−ＨＴ）が示された濃度で添加された。ホタルルシフェラーゼ活性が同じ試料のウミシイタケルシフェラーゼ活性に対して正規化され、空ベクター対照試料の何倍かで示された（平均＋ＳＤ）。留意されるべきは、ＭＥＲ−ＮＩＣＤが４−ＨＴなしで１５．２倍の漏れ誘導（ｌｅａｋｙ  ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を生じさせることである。（Ｂ、Ｃ）対照のＯＰ９細胞との共培養の２週間後の胸腺細胞のフローサイトメトリー分析。ＣＤ３４＋ＣＤ１ａ−前駆細胞が共培養の前にＮＩＣＤ１、ｍＥＲＮＩＣＤ１又は空ベクター対照で形質導入された。タモキシフェンが示された濃度で、ｍＥＲ−ＮＩＣＤ１及び空ベクター導入培養物に添加された。（Ｂ）形質導入された細胞がＣＤ４及びＣＤ８の表面発現に関して解析されＴ細胞の分化が評価された。（Ｃ）形質導入系統の細胞におけるＣＲＴＨ２の発現によって決定されたＩＬＣ２分化。
【図７】抗ＴＡ−ｃｈノッチ受容体。ノッチのＬＮＲ、ヘテロ二量体、膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが隣接した細胞の表面分子、例えば腫瘍抗原（ＴＡ）に対する抗体新細胞外ドメインに融合される。腫瘍細胞等の相対する細胞におけるリガンドへの抗体ネオ細胞外ドメインの結合は、ＴＡＣＥ及びγ−セクレターゼによる切断を誘導する結果、ＮＩＣＤが核へ移行し、内因性ノッチ標的遺伝子の転写が促進される。抗ＴＡ−ｃｈノッチ受容体は、表面抗原の活性化なしでは不活性である。
【図８】ノッチ１受容体のアミノ酸配列。ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ４６５３１．４の配列。
【図９】ノッチは疲弊の顕著な特徴の進行からＣＤ８  Ｔ細胞を保護する。（Ａ）ＯＴ−１  ＣＤ８＋  Ｔ細胞が活性化され、ＩＲＥＳ−Ｔｈｙ１．１と結合したＥＶ又はＮＩＣＤを発現するウイルスで形質導入され、５日間置かれた。続いて、細胞がＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞（オボアルブミンを発現しない）と、一晩共培養され、次に（形質導入された細胞を同定するため）Ｔｈｙ１．１及びグランザイムＢについて染色され、フローサイトメトリーで解析された。留意すべきは、Ｔｈｙ１．１−細胞は、解析の対象外であることである。さらに留意すべきは、Ｔｈｙ１．１の発現量が、ＮＩＣＤ挿入物の大きさのために、ＥＶとＮＩＣＤコンストラクトとの間で異なることである。（Ｂ）ＯＴ−１  Ｔ細胞が活性化され、（Ａ）のように形質導入された。形質導入後５日で、細胞がさらに６日間培養され、疲弊を誘導する繰り返しのＴＣＲ刺激のために、オボアルブミンを発現する新しいＢ１６−Ｆ１０黒色腫細胞（Ｂ１６−Ｏｖａ）が毎日加えられた。次に、細胞がＴｈｙ１．１及びＰＤ１について染色され、フローサイトメトリーで解析された。（Ｃ）ＯＴ−１  ＣＤ８＋  Ｔ細胞が（Ｂ）のように処理され、図に示されたたように、回数の異なるＢ１６−Ｏｖａとの共培養の後に、Ｔｈｙ１．１＋細胞の割合がフローサイトメトリーで解析された。（Ｄ）ＯＴ−１  ＣＤ８＋  Ｔ細胞が活性化され、ＥＶ又はｍＥＲ−ＮＩＣＤ（ＮＩＣＤのタモキシフェン誘導可能型）を発現するウイルスで形質導入され、タモキシフェンなし、又は０．０５ｍＭ（＋）若しくは０．５ｍＭ（＋＋）タモキシフェンありで、（Ｃ）に示されたようにＢ１６−Ｏｖａとともに培養された。続いて、Ｔｈｙ１．１＋細胞がＩＦＮｇ、ＩＬ１０、グランザイムＢ及びＰＤ１の発現に関してフローサイトメトリーで解析された。
【図１０】ＣＤ１９に対するキメラノッチ受容体（ＣＮＲ）の生成と発現。（Ａ）実験の概要。ＣＮＲはヒトＣＤ１９に特異的な細胞外ＳｃＦｖドメインを含む。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃタンパク質に融合されたヒトＣＤ１９タンパク質がＣＮＲの表面発現の検出に使用された。そして、蛍光標識された抗ヒト抗体がｈＣＤ１９−Ｉｇ融合タンパク質の検出に用いられた。ＰＥＳＴ＝ノッチＰＥＳＴドメイン；ＡＦ６４７＝Alexa Fluor 647。（Ｂ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＣＮＲ発現コンストラクト又は対照が形質導入され、次に、ｈＣＤ１９−Ｉｇなし、又は異なる濃度のｈＣＤ１９−Ｉｇありに続いて蛍光標識された抗ヒト抗体で染色された。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、リガンド結合に続くノッチシグナル伝達を機能させるキメラ受容体に関し、受容体はノッチの細胞内エフェクター及び膜貫通ドメインと、異種の細胞外リガンド結合ドメインとの組み合わせから作製される。ノッチシグナル伝達がＴ細胞におけるＰＤ１（プログラム死タンパク質１）及びＬＡＧ３（リンパ球活性遺伝子３）等のＴ細胞特異的抑制性受容体の発現を抑制することを本発明者は見出した。腫瘍はこのような抑制性分子の上方制御を介して抗腫瘍Ｔ細胞応答を抑制することで免疫破壊を回避することが多い。このため、ノッチの治療的活性化は、ヒト患者における腫瘍に対するＴ細胞応答を増強するための魅力的な標的である。いまのところ、ノッチの治療的使用は２つの問題のために妨げられている。まず、多くの種類の細胞でのノッチの機能及びその全身での活性化は多くの副作用を生じさせるおそれがある。次に、過度のノッチシグナル伝達はがんの原因となり得る。ノッチの細胞内エフェクタードメインを異種の細胞外結合ドメインと組み合わせた場合にノッチシグナル伝達が維持されることを発明者は見出したことで、時間的にも体内での位置的にもノッチシグナル伝達の活性化の制御が可能となるため、それらの欠点が回避できる。これは、本発明のキメラ受容体が最適な異種リガンドに応答するためである。実施例では、ヒトノッチ１タンパク質の５’末端と融合したヒトＣＤ１９に対するＳｃＦｖ抗体ドメインからなるキメラノッチ受容体の調製が説明される。
【００２７】
よって、本発明は、ノッチ受容体の細胞内ドメイン及び膜貫通ドメインと、異種の細胞外リガンド結合ドメインとを含むキメラ受容体を提供する。さらに好ましくはキメラ受容体は、ノッチ受容体のヘテロ二量体ドメインとＬｉｎ−１２−ノッチ（ＬＮＲ）繰り返しドメインを含む。
【００２８】
ノッチ受容体ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３及びノッチ４、並びにそれらの配列に加え、ノッチ細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、ヘテロ二量体ドメイン、Ｌｉｎ−１２−ノッチ（ＬＮＲ）繰り返しドメイン及びネガティブ調節領域（ＮＲＲ）等のそれら受容体における異なるドメイン及びそれらの配列は本技術分野で既知である。よって、当業者は本発明に係るキメラ受容体を製造又は使用する場合に、適切なドメインを良好に選択することができる。
【００２９】
本明細書で使用された場合、“ノッチ受容体の細胞内ドメイン”は、ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３又はノッチ４シグナル伝達、好ましくはノッチ１又はノッチ２シグナル伝達を開始することができる細胞内ドメインを意味する。したがって、本発明に係るキメラ受容体は、ノッチシグナル伝達、好ましくはノッチ１、ノッチ２、ノッチ３及び／又はノッチ４シグナル伝達、より好ましくはノッチ１及び／又はノッチ２シグナル伝達が可能である。異種の細胞外リガンド結合ドメインがリガンドに結合した場合に、ノッチシグナル伝達、好ましくはノッチ１、ノッチ２、ノッチ３及び／又はノッチ４シグナル伝達、より好ましくはノッチ１及び／又はノッチ２シグナル伝達が誘導される。このため、“ノッチシグナル伝達が可能”とは、キメラ受容体の異種の細胞外リガンド結合ドメインがリガンドに結合した場合、ノッチシグナル伝達が誘導されることを意味する。ノッチ細胞内ドメインは当業者によく知られている。好ましくは、それはノッチ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）を含み、これは、完全なままのノッチ受容体、好ましくはノッチ１又はノッチ２の、より好ましくはヒトのノッチ１のＮＩＣＤ、又はＮＩＣＤのノッチシグナル伝達経路開始部分の、ノッチ細胞外ドメインへのリガンドの結合後にγ−セクレターゼによって切断されるドメインである。当該部分は、ノッチシグナル伝達を開始させることができる。さらに、好ましい実施の形態におけるキメラ受容体は、ノッチ１のＣ末端トランス活性化ドメイン、ＲＡＭドメイン及びアンキリンリピートを含む細胞内ドメイン全体を有する。
【００３０】
Ｃ末端ＰＥＳＴ領域を含むか欠くＮＩＣＤを使用することができる。この領域の欠失によって、ＮＩＣＤタンパク質がより安定になり、シグナル伝達がより強く、より持続する。よって、特定の好ましい実施の形態では、ノッチ受容体の細胞内ドメインは、図８に示された配列の１７４４番目から２４２４番目のアミノ酸、ノッチ１以外のノッチ受容体の対応する配列、又は当該配列に少なくとも同一性９０％の配列を有する。当該配列は好ましくはノッチシグナル伝達を開始することができる。当該配列は図８に示された上記配列の１７４４番目から２４２４番目のアミノ酸に好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。特に好ましい実施の形態では、ノッチ受容体の細胞内ドメインは、図８に示された配列の１７４４番目から２４２４番目のアミノ酸を含み、より好ましくは、それは図８に示された配列の１７４４番目から２４２４番目のアミノ酸からなる。細胞内ドメインは、ノッチ１の示された配列、したがって図８に示された配列の１７４４番目から２４２４番目のアミノ酸を有することが好ましい。
【００３１】
他の好ましい実施の形態では、ＮＩＣＤ全体が使用され、ノッチ受容体の細胞内ドメインは、図８に示された配列の１７４４番目から２５５５番目のアミノ酸、ノッチ１以外のノッチ受容体の対応する配列、又は当該配列に少なくとも同一性９０％の配列を有する。当該配列は好ましくはノッチシグナル伝達を開始することができる。当該配列は図８に示された上記配列の１７４４番目から２５５５番目のアミノ酸に好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。特に好ましい実施の形態では、ノッチ受容体の細胞内ドメインは、図８に示された配列の１７４４番目から２５５５番目のアミノ酸を含み、より好ましくは、それは図８に示された配列の１７４４番目から２５５５番目のアミノ酸からなる。細胞内ドメインは、ノッチ１の示された配列、したがって図８に示された配列の１７４４番目から２５５５番目のアミノ酸を有することが好ましい。
【００３２】
本明細書で用いられた場合、“ノッチ受容体の膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）”はノッチ１、ノッチ２、ノッチ３又はノッチ４、好ましくはノッチ１又はノッチ２の膜貫通ドメインを意味する。ノッチ膜貫通ドメインは当業者によく知られている。特に好ましい実施の形態では、ノッチ受容体の膜貫通ドメインは、図８に示された配列の１７３６番目から１７４３番目のアミノ酸若しくはノッチ１以外のノッチ受容体の対応する配列、又は当該配列に少なくとも同一性９０％の配列を有する。当該配列は好ましくはγ−セクレターゼによるＮＩＣＤの切断を開始することができる。当該配列は図８に示された上記配列の１７３６番目から１７４３番目のアミノ酸に好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。特に好ましい実施の形態では、ノッチ受容体の膜貫通ドメインは、図８に示された配列の１７３６番目から１７４３番目のアミノ酸を含み、より好ましくは、それは図８に示された配列の１７３６番目から１７４３番目のアミノ酸からなる。ＴＭＤは、ノッチ１の示された配列、したがって図８に示された配列の１７３６番目から１７４３番目のアミノ酸を有することが好ましい。
【００３３】
ノッチ受容体のヘテロ二量体ドメインとＬｉｎ−１２−ノッチ（ＬＮＲ）繰り返しドメインとが受容体のネガティブ調節領域（ＮＲＲ）を形成する。ノッチＬＮＲドメイン、ヘテロ二量体ドメイン及びＮＲＲは、当業者によく知られている。ヘテロ二量体ドメイン及びＬＮＲリピートは、本発明のキメラ受容体における異種の細胞外リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置する。ドメインの順番は、好ましくは異種の細胞外リガンド結合ドメイン−ＬＮＲドメイン−ヘテロ二量体ドメイン−膜貫通ドメインである。標準的なノッチシグナル伝達は、ノッチ受容体へのリガンドの結合で開始される。これによって、ＡＤＡＭメタロプロテアーゼが介在するヘテロ二量体の細胞外フラグメントの切断が起こる。そして、膜に連結されたフラグメントがγ−セクレターゼによって切断され、ノッチの細胞内フラグメント（ＮＩＣＤ）が放出される。ヘテロ二量体ドメイン及びＬＮＲドメインは、ノッチ受容体のＮＲＲに位置し、それは、リガンド結合ドメインと膜貫通ドメインとの間にある。ＬＮＲは、リガンド結合がない場合に、受容体の休止した構造での維持に関与し、すなわち、ＡＤＡＭメタロプロテアーゼによる切断を妨げるか阻害する。好ましい実施の形態では、キメラ受容体は、ノッチ受容体のネガティブ調節領域（ＮＲＲ）全体を含む。好ましくは、このＮＲＲは、図８に示された配列の１４４７番目から１７３５番目のアミノ酸、ノッチ１以外のノッチ受容体の対応する配列、又は当該配列に少なくとも同一性９０％の配列を有する。当該配列は図８に示された上記配列の１４４７番目から１７３５番目のアミノ酸に好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。特に好ましい実施の形態では、このＮＲＲは、図８に示された配列の１３９６番目から１７３５番目のアミノ酸、ノッチ１以外のノッチ受容体の対応する配列、又は当該配列に少なくとも同一性９０％の配列を有する。当該配列は図８に示された上記配列の１４４７番目から１７３５番目のアミノ酸に好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％、より好ましくは少なくとも９９％の同一性を示す。この配列では、ノッチ配列の細胞外部分がプロリン１３９６まで拡張されると（図８参照）、リガンド結合がない状態において、より短いコンストラクトよりも確実に休止した受容体となる。本発明のキメラ受容体は、受容体を細胞膜に向かわせるシグナルペプチドをさらに任意に含む。ＮＲＲは、ノッチ１の示された配列、したがって図８に示された配列の１４４７番目から１７３５番目又は１３９６番目から１７３５番目のアミノ酸を有することが好ましい。
【００３４】
特に好ましい実施の形態では、本発明のキメラ受容体は、ノッチ受容体の細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、ヘテロ二量体ドメイン及びＬｉｎ−１２−ノッチ（ＬＮＲ）リピートドメインと、異種のリガンド結合ドメインとを、好ましくは示された順番で含む。よって、本発明の好ましいキメラ受容体は、図８に示された配列の１４４７番目から２４２４番目のアミノ酸、又はノッチ１以外のノッチ受容体の対応する配列を含む。さらに特に好ましい実施の形態では、本発明のキメラ受容体は、図８に示された配列の１４４７番目から２５５５番目のアミノ酸、又はノッチ１以外のノッチ受容体の対応する配列を含む。さらに特に好ましい実施の形態では、本発明のキメラ受容体は、図８に示された配列の１３９６番目から２４２４番目のアミノ酸、又はノッチ１以外のノッチ受容体の対応する配列を含む。さらに特に好ましい実施の形態では、本発明のキメラ受容体は、図８に示された配列の１３９６番目から２５５５番目のアミノ酸、又はノッチ１以外のノッチ受容体の対応する配列を含む。キメラ受容体は、ノッチ１の上記配列、したがって図８に示された配列を含むのが好ましい。
【００３５】
本明細書で用いられた場合、用語“異種のリガンド結合ドメイン”は、ノッチ受容体のリガンド結合ドメイン以外のドメイン、すなわち、ノッチ１、ノッチ２、ノッチ３又はノッチ４の細胞外リガンド結合ドメイン以外のドメインを意味する。異種のリガンド結合ドメインは、選択されるリガンドが結合し得る任意のドメインでもよい。特に、リガンド結合ドメインは、任意の細胞表面抗原又は任意の可溶性リガンドの結合パートナーでもよい。異種のリガンド結合ドメインの汎用性によって任意の特定の用途に関して適切なリガンドが選択できる。このように、本発明のキメラ受容体によるノッチシグナル伝達の活性化は、選択した時間、選択した位置／細胞種、又はその両方に誘導され得る。適した細胞外リガンド結合ドメインの好ましい例は、可溶性リガンドに特異的なリガンド結合ドメイン、細胞表面抗原に特異的なリガンド結合ドメイン、及びそれらの組み合わせである。より好ましい例は以下である。
・抗体又は細胞表面抗原に特異的な単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）等の抗体の抗原結合部位
・抗体又は細胞表面抗原に対する抗体のエピトープ、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメントに特異的な単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のよう抗体の抗原結合部位
・Ｆｃ受容体の細胞外Ｆｃ結合ドメイン又はそのリガンド結合フラグメント
・表面分子の関与なくキメラ受容体に交差結合可能な抗体に対するエピトープを含む細胞外ドメイン
・ビオチンのような部分を含み、作用因子によってストレプトアビジンのような前記部分に対して複数の結合部位と交差結合し得る細胞外ドメイン（当該作用因子の添加で複数のキメラ受容体のクラスターがもたらされる）
【００３６】
原則として、表面抗原の次のタイプが本発明に応じて用いられる。
１．腫瘍特異性抗原
２．非腫瘍細胞での発現量と比較して腫瘍細胞での発現量が高い抗原
３．腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の両方で発現しているものの、本発明のキメラ受容体を発現するＴ細胞の活性化が非腫瘍細胞によって誘導されることで許容できる副作用を生じるＣＤ１９及びＣＤ２０等の抗原
４．腫瘍細胞及び非腫瘍細胞の両方で発現しているものの、１種以上の抗原との組み合わせにおいて腫瘍細胞に特異的なＴ細胞エピトープ等の抗原、及び
５．腫瘍の周囲の細胞で発現するＰＤＬ１及びＰＤＬ２等の抗原
【００３７】
好ましい実施の形態では、細胞表面抗原が腫瘍抗原で、異種の細胞外リガンド結合ドメインが当該腫瘍抗原に特異的な抗体又は抗体の抗原結合部位である。腫瘍抗原の好ましい例は、ＴＡＧ−７２、カルシウム活性化塩素チャンネル２、９Ｄ７、Ｅｐ−ＣＡＭ、ＥｐｈＡ３、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、メソセリン、ＳＡＰ−１、ＢＡＧＥファミリー、ＭＣ１Ｒ、前立腺特異抗原、ＣＭＬ６６、ＴＧＦ−βＲＩＩ、ＭＵＣ１、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ４７、ＣＤ５２、ＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）、ＣＤ２７４（ＰＤ−Ｌ１）、ＣＤ２７３（ＰＤ−Ｌ２）、ＣＤ３４０（ＥｒｂＢ−２）、ＧＤ２、ＴＰＢＧ、ＣＡ−１２５、ＭＵＣｌ、未熟ラミニン受容体及びＥｒｂＢ−１である。
【００３８】
当業者は、本発明に係るキメラ抗原受容体に使用され得る可溶性リガンドとそれらの結合パートナーとを同定することができる。適した可溶性リガンドの例は、キメラノッチ受容体の細胞外ドメインにおけるエピトープに対する抗体又はキメラノッチ受容体のビオチン化された細胞外ドメインとの組み合わせにおけるストレプトアビジン等の分子である。可溶性リガンドに特異的なリガンド結合ドメインと細胞表面抗原に特異的なリガンド結合ドメインとの組み合わせでもよい。この場合、ノッチシグナル伝達は、可溶性リガンドと細胞表面抗原とが両方存在するという条件のみで誘導されるだろう。例えば、細胞外ドメインは、腫瘍の表面抗原に対する別の抗体（“スイッチ”抗体）にそれ自体が組み込まれた、ペプチドネオエピトープに対する、又はビオチンもしくはＦＩＴＣ部分に対する抗体からなってもよい。結果として、スイッチ抗体の標的となる細胞表面抗原に加え、スイッチ抗体自体も存在することを条件として、キメラノッチ受容体の活性化が起こるだけである。この提唱は、参照することで本明細書に組み入れられるＭａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１６に記載されており、受容体の一時的なコントロール（望む場合のみに有効又は無効にする）とともに量的なコントロール（スイッチ抗体の濃度を増加又は減少させることによる）を可能にする。
【００３９】
本発明のキメラ受容体は、膜貫通ドメインと異種の細胞外リガンド結合ドメインとの間に位置する連結配列をさらに任意に含む。当該連結配列は、好ましくは３０個までのアミノ酸、例えば２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個のアミノ酸である。
【００４０】
アミノ酸配列又は核酸配列の同一性の割合、又は用語“％配列同一性”は、本明細書では、２つの配列を、必要に応じて最大の％同一性を与えるようにギャップを導入して位置合わせしたときの、参照のアミノ酸配列の残基又は核酸配列の残余と同一であるアミノ酸配列の残基又は核酸配列の残余の全長に対する割合として定義される。位置合わせの方法及びコンピュータプログラムは、本技術分野でよく知られており、例えば“Ａｌｉｇｎ  ２”である。
【００４１】
本明細書で説明されるアミノ酸配列において、アミノ酸は一文字の記号で示される。これらの一文字の記号及び三文字の記号は当業者によく知られており、次の意味がある。Ａ（Ａｌａ）はアラニン、Ｃ（Ｃｙｓ）はシステイン、Ｄ（Ａｓｐ）はアスパラギン酸、Ｅ（Ｇｌｕ）はグルタミン酸、Ｆ（Ｐｈｅ）はフェニルアラニン、Ｇ（Ｇｌｙ）はグリシン、Ｈ（Ｈｉｓ）はヒスチジン、Ｉ（Ｉｌｅ）はイソロイシン、Ｋ（Ｌｙｓ）はリシン、Ｌ（Ｌｅｕ）はロイシン、Ｍ（Ｍｅｔ）はメチオニン、Ｎ（Ａｓｎ）はアスパラギン、Ｐ（Ｐｒｏ）はプロリン、Ｑ（Ｇｌｎ）はグルタミン、Ｒ（Ａｒｇ）はアルギニン、Ｓ（Ｓｅｒ）はセリン、Ｔ（Ｔｈｒ）はスレオニン、Ｖ（Ｖａｌ）はバリン、Ｗ（Ｔｒｐ）はトリプトファン、Ｙ（Ｔｙｒ）はチロシン。
【００４２】
本明細書で用いられる場合、用語“特異的な”及び“特異的に結合する”又は“特異的に結合可能な”は、リガンドとリガンド結合ドメインとの間、例えば、抗体又はその抗原結合部位とその抗原又は可溶性リガンド及びその結合パートナーとの間の非共有結合性の相互作用を意味する。それは、リガンドが選択的に他のドメインよりも上記のリガンド結合ドメインに結合することを示す。
【００４３】
本明細書において、“抗体の抗原結合部位”は、抗体として同じ抗原に特異的に結合することができる抗体の部位を意味するが、必ずしも同じ程度でなくてもよい。その部位は、必ずしも抗体それ自身に含まれる必要はなく、単鎖可変フラグメント（ＳｃＦｖ）、抗体の重鎖及び軽鎖の可変領域の融合タンパク質のように、ともに抗原に結合可能な抗体の異なるフラグメントを含んでもよい。
【００４４】
本明細書で用いられる場合、“細胞表面抗原”は、細胞の細胞外表面に発現する抗原又は分子を意味する。
【００４５】
本明細書で用いられる場合、“腫瘍抗原”は腫瘍の細胞に発現する抗原を意味する。また、腫瘍抗原は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）と言われる。
【００４６】
本明細書で用いられる場合、“可溶性リガンド”は、水溶性リガンドを意味し、これに対する結合パートナーが本発明のキメラ受容体の細胞外ドメインとして使用されてもよい。可溶性リガンドは、例えば静脈注射等の注射又は経口で対象に投与されるのが好ましい。
【００４７】
また、本発明に係るキメラ受容体をコードする配列を含む核酸分子が提供される。本発明に係る上記核酸分子を含むベクターが提供される。好ましい実施の形態では、ベクターはウイルスベクターであって、例えば、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである。他の好ましい実施の形態では、ベクターはトランスポゾンを含むかトランスポゾンである。上記核酸分子又はベクターは、ベクターが導入された特定の細胞で発現させる、例えばウイルス起源の強いプロモーター等の高い発現量のための手段及びシグナル配列のような他の成分を追加で含んでもよい。好ましい実施の形態では、核酸分子またはベクターは、１種以上の次の成分：ＥＦ１ａプロモーターまたはＭＳＣＶの５’ＬＴＲ等のＴ細胞での発現を促進するプロモーター、ＧＭＣＳＦタンパク質由来または細胞膜に向かわせるためのＣＤ８タンパク質由来のＣ末端シグナルペプチド及びポリアデニル化シグナルを含む。
【００４８】
また、本発明に係る核酸分子またはベクターを有する、単離された細胞が提供される。単離された細胞は、好ましくはナチュラルキラー細胞、マクロファージ、好中球、好酸球、又はＴ細胞のような免疫細胞である。核酸分子又はベクターは、レンチウイルス形質導入、レトロウイルス形質導入、ＤＮＡエレクトロポレーション又はＲＮＡエレクトロポレーションのような本技術分野で知られた任意の方法で、細胞、好ましくは免疫細胞内に導入されてもよい。核酸分子又はベクターは、一時的に、好ましくは安定的に、のいずれかで細胞に供される。細胞に対する核酸の形質導入又はエレクトロポレーションの方法は、当業者に知られている。
【００４９】
一般に、本発明のキメラ受容体は、有利には、Ｔ細胞の機能及び／又はＴ細胞の生存、好ましくは腫瘍に対するＴ細胞の反応を改善するために使用される。よって、Ｔ細胞の機能及び／又はＴ細胞の生存を、それらを必要とする対象において改善するための方法が提供され、当該方法は、本発明に係る治療上有効量のキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞、好ましくはＴ細胞を対象に投与することを含む。Ｔ細胞の機能及び／又はＴ細胞の生存を改善することは、Ｔ細胞疲弊を防ぐ又は阻害することを好ましくは含む。好ましい観点では、対象はがんを患っている。上記の細胞は、好ましくはＴ細胞、好ましくはがんを患う対象の自己Ｔ細胞であって、例えば腫瘍由来Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）又は対象の血液から単離されたＴ細胞である。
【００５０】
また、本発明に係るキメラ受容体、核酸分子若しくはベクター、又は本発明に係る核酸分子若しくはベクターを有する、治療に使用するための細胞が提供される。好ましくは、当該治療は、免疫療法、より好ましくは腫瘍免疫療法である。好ましい実施の形態では、当該腫瘍免疫療法は、養子細胞導入、より好ましくは養子Ｔ細胞導入を含む。
【００５１】
このため、免疫療法を必要とする対象への免疫療法の方法も提供され、該方法は、本発明に係る治療上有効量のキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞を対象に投与することを含む。好ましい実施の形態では、当該方法は、本発明に係る細胞又は細胞集団の投与を含む。
【００５２】
“養子細胞導入”は患者に細胞を導入することを意味する。特に、“養子Ｔ細胞導入”は、患者にＴ細胞を導入することを意味する。細胞は、患者自身から生じたものでもよいし、他の個人由来のものでもよい。養子Ｔ細胞導入は、血液から単離された、好ましくは治療される対象又は患者由来の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）又はＴ細胞の導入を含むのが好ましい。血液から単離されたＴ細胞が使用される場合、望ましくは、Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は腫瘍特異的Ｔ細胞受容体をさらに発現する。
【００５３】
“ＴＩＬ”は、治療される患者の腫瘍に又は腫瘍の周囲にある自己Ｔ細胞を意味する。Ｔ細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）等のサイトカイン及び抗ＣＤ３抗体とともに培養され、患者に導入されて戻される。ｉｎ  ｖｉｖｏ投与で、ＴＩＬは腫瘍及び標的の腫瘍細胞に再浸潤する。ＴＩＬ治療の前に、患者は腫瘍致死を抑制し得る体内のリンパ球を枯渇させるために骨髄非破壊的化学療法を受けても良い。リンパ球の枯渇が完了してから、任意にＩＬ−２と組み合わせたＴＩＬが患者に注入される。ＴＩＬを含む養子Ｔ細胞導入を用いた免疫療法の方法は、本技術分野でよく知られている。好ましい実施の形態では、本発明に応じて使用されるＴＩＬには、患者から単離された後に本発明に係る核酸分子又はベクターが与えられる。さらに好ましくは、ＴＩＬが本発明に係るキメラ受容体を発現する。
【００５４】
本明細書で用いられる場合、“免疫療法”は疾患又は障害を患う個体を、当該個体における免疫応答を誘導又は増強することで治療することを意味する。腫瘍免疫療法は、腫瘍及び／又は当該腫瘍の細胞に対する個体の免疫応答を誘導又は増強することに関する。本発明に係る免疫療法は、治療又は予防のいずれのためであってもよい。“治療”は、免疫療法の成分が存在する腫瘍を改善又は阻害することで免疫応答を誘導又は阻害することを意味する。“予防”は、免疫療法の成分が防御免疫応答を誘導し、がんの進行から個体を保護することを意味する。
【００５５】
また、がんの治療を必要とする対象におけるがんを治療する方法が提供され、該方法は、本発明に係るキメラ受容体をコードする核酸配列を有する有効量のＴ細胞を対象に投与することを含む。当該Ｔ細胞は、好ましくは自己Ｔ細胞、例えば対象の血液から単離されるＴＩＬ又はＴ細胞である。
【００５６】
本発明に係るキメラ受容体ベース、及び／又は本発明に係るキメラ抗原受容体をコードする又は本発明に係るキメラ抗原受容体を発現する核酸分子が与えられた細胞、好ましくはＴ細胞、より好ましくはＴＩＬ等の自己Ｔ細胞又は血液から単離されたＴ細胞ベースの治療を用いて治療又は予防される腫瘍は、いかなる型の腫瘍であってもよく、例えば原発腫瘍、二次腫瘍、進行性腫瘍及び転移性である。本発明によって治療又は予防される腫瘍の限定しない例は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄単球性白血病（ＣＭＭＬ）、リンパ腫、多発性骨髄腫、好酸球性白血病、有毛細胞白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、大細胞型免疫芽球性リンパ腫、形質細胞腫、肺腫瘍、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、膵臓腫瘍、乳房腫瘍、肝腫瘍、脳腫瘍、皮膚腫瘍、骨腫瘍、結腸腫瘍、直腸腫瘍、肛門腫瘍、小腸腫瘍、胃腫瘍、神経膠腫、内分泌系腫瘍、甲状腺腫瘍、食道腫瘍、胃部腫瘍、子宮腫瘍、尿路腫瘍及び膀胱腫瘍、腎腫瘍、腎細胞がん、前立腺腫瘍、胆嚢腫瘍、頭頸部腫瘍、卵巣腫瘍、頸部腫瘍、膠芽細胞腫、黒色腫、軟骨肉腫、線維肉腫、子宮内膜腫瘍、食道腫瘍、眼腫瘍、消化管間質腫瘍、脂肪肉腫、鼻咽頭腫瘍、甲状腺腫瘍、膣腫瘍及び外陰部腫瘍である。
【００５７】
本明細書で用いられる場合、“対象”は好ましくは哺乳類、より好ましくはヒトである。
【００５８】
本明細書における“Ｔ細胞”又は“ＴＩＬ”は、ＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋  Ｔ細胞又はＴＩＬのいずれか、あるいはＣＤ４＋若しくはＣＤ８＋  Ｔ細胞又はＴＩＬの組み合わせのいずれかであってよい。好ましい実施の形態では、Ｔ細胞又はＴＩＬは、ＣＤ８＋  Ｔ細胞又はＴＩＬである。
【００５９】
また、本発明は、遺伝子操作されたＴ細胞を提供し、該Ｔ細胞は、本発明の核酸分子又はベクターを形質導入される。当該操作されたＴ細胞は、好ましくは、腫瘍由来Ｔ細胞又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）である。さらに、本発明に係る単離された細胞は、好ましくはＴ細胞、より好ましくは腫瘍由来Ｔ細胞又はＴＩＬである。特に好ましい実施の形態では、Ｔ細胞はがんを患った患者から単離された自己Ｔ細胞、すなわち自己ＴＩＬ又は血液から単離された自己Ｔ細胞である。さらに好ましくは、Ｔ細胞は、本発明に係るキメラ抗原受容体を発現する。
【００６０】
一態様において、本発明に係るキメラ受容体ベースの治療は、少なくとも１つのさらなる免疫療法の構成要素と組み合わされる。さらなる免疫療法の構成要素は、本技術分野で知られた任意の免疫療法の構成要素でもよい。好ましくは、上記のさらなる免疫療法の構成要素は、細胞免疫療法、抗体療法、サイトカイン療法、ワクチン及び／又は小分子免疫療法、又はそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００６１】
好ましい実施の形態では、キメラ受容体を用いた治療は、抗体ベースの免疫療法と組み合わされ、好ましくは、共抑制Ｔ細胞分子に対する抗体を用いる治療を含む。共抑制Ｔ細胞分子は、免疫チェックポイントともいう。共抑制Ｔ細胞分子の好ましい例は、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）、プログラム死１（ＰＤ−１）、ＰＤ−リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、ＰＤ−Ｌ２、シグナル調節タンパク質アルファ（ＳＩＲＰα）Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンドメイン３含有分子３（ＴＩＭ３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）、ＣＤ２７６、ＣＤ２７２、Ａ２ＡＲ、ＶＩＳＴＡ及びインドールアミン２，３ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）である。よって本発明に係るキメラ受容体又はキメラ受容体を有する細胞と組み合わされる共抑制Ｔ細胞分子に対する抗体は、好ましくは、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＳＩＲＰα抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ２７６抗体、抗ＣＤ２７２抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ａ２ＡＲ抗体、抗ＶＩＳＴＡ抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体及び抗ＩＤＯ抗体からなる群から選択される。さらなる免疫療法成分として使用される、適した抗体は、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ランブロリズマブ、イピリムマブ及びリリルマブである。
【００６２】
実施例に示されるように、ノッチシグナル伝達は共抑制Ｔ細胞分子の発現を減少させる。よって、がんを患い、かつ上記抗体で治療されている対象における本明細書で規定された抗体ベースの免疫療法の有効性を向上させる方法も提供され、該方法は、本発明に係るキメラ受容体を発現する治療上有効量のＴ細胞を対象に投与することを含む。上記Ｔ細胞は、好ましくは自己Ｔ細胞、例えば、対象の血液から単離された自己ＴＩＬ又はＴ細胞である。
【００６３】
さらに好ましい実施の形態では、キメラ受容体を用いた治療は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は腫瘍特異的Ｔ細胞受容体に関する治療と組み合わされる。好ましくは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をさらに含む、本発明に係るキメラ受容体を含む、及び／又は発現する細胞が用いられる。これは、ＴＩＬ以外のＴ細胞、例えば血液から単離された自己Ｔ細胞が使用された場合に特に好ましい。ＣＡＲは、細胞外腫瘍結合部分、普通はモノクローナル抗体由来の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖｓ）と融合した細胞内Ｔ細胞シグナル伝達ドメインからなる抗原を標的とする受容体である。ＣＡＲは、ＭＨＣを介した抗原提示から独立して、特異的に（腫瘍）細胞表面抗原を認識する。ＣＡＲは、好ましくはＣＤ３ζのシグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８又は４−１ＢＢのような共抑制受容体と結合した、腫瘍関連抗原に特異的な細胞外ドメイン（抗体の抗原結合部分のような）を含むのが好ましい。当該細胞は、好ましくはＴ細胞、より好ましくは、治療される対象由来、例えば血液又は腫瘍等由来の自己Ｔ細胞である。
【００６４】
明確かつ簡単な説明のために、本発明の同じ又は別の態様又は実施の形態の一部として、特徴が本明細書で説明される。本発明の同じ又は別の実施の形態の一部として本明細書で説明される特徴のすべての又は一部の組み合わせを含む実施の形態を本発明の範囲が包含することが業者によって理解される。
【００６５】
本発明が以下の、限定しない実施例においてさらに詳細に説明される。
【実施例】
【００６６】
（実施例１）
結果
ＣＤ８  Ｔ細胞応答におけるノッチの役割を調べるために、Ｂａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４におけるノッチ１遺伝子及びノッチ２遺伝子をＴ細胞特異的に欠損させたマウス（Ｎｏｔｃｈ１／２ｋｏ）を、インフルエンザウイルスに感染させた。応答のピークで、インフルエンザ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞が、インフルエンザの免疫優性ペプチドを担持するＤｂテトラマーを用いて検出された（図３ａ、ｂ）。インフルエンザ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の応答の大きさは野生型（ＷＴ）及びＮｏｔｃｈ１／２ｋｏマウスにおいて類似したが（図３Ｃ及び図示せず）、ノッチ１／２欠損Ｔ細胞は、ＷＴ  ＣＤ８  Ｔ細胞よりも産生したＩＦＮγ及びグランザイムＢが少なかった（図３ｄ、ｅ、ｆ）。また、Ｎｏｔｃｈ１／２ｋｏマウスは、インフルエンザウイルスを除去することができず、回復の遅延を示した（図３ｇ、ｈ）。中和抗体の力価がどちらかといえばノッチ１／２ｋｏマウスで上昇した（図３ｉ）ことは、それらのウイルスを除去できないことがそれらの無効なＣＤ８  Ｔ細胞応答に起因することを示唆している。
【００６７】
インフルエンザに対するメモリー応答は、評価したすべての解剖学的部位において、ノッチ１／２欠損によってさらにいっそう大きく影響を受けた（図４ａ、ｂ）。ノッチ１／２ｋｏ  ＣＤ８  Ｔ細胞が混合した骨髄キメラにおいて均一に増幅することができないことによって示されるように（図４ｃ）、欠陥のあるメモリー活性はノッチのＣＤ８  Ｔ細胞に備わっている機能によるものであった。驚くべきことに、肺に見られるノッチ１／２ｋｏメモリーＣＤ８  Ｔ細胞の個数は正常であるが（図４ｂ）、それらはほとんどエフェクター分子を産生できなかった（図４ｄ）。
【００６８】
ノッチ１／２ｋｏ  ＣＤ８  Ｔ細胞が徹底的に反応しないことは、ＰＤ１及びＬａｇ３のような抑制性受容体の発現による“疲弊”：完全な応答不能を思い起こさせる（Ｗｈｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｃｈｉ、２０１５）。ノッチ１／２ｋｏ  ＣＤ８  エフェクターＴ細胞の全トランスクリプトーム解析によってこの考えが補強される。ノッチ１／２ｋｏとＷＴエフェクターＴ細胞との間で異なる発現を示した遺伝子の中で、最も有意に増加した遺伝子セットが、Ｔ細胞の疲弊を検討するために用いられる原型的なモデルであるＬＣＮＶへの急性感染と慢性感染との比較で得られた（Ｗｈｅｒｒｙ  ａｎｄ  Ｋｕｒａｃｈｉ、２０１５）。実際、ＰＤ１及びＬａｇ３両方のｍＲＮＡ発現量がノッチ１／２ｋｏ  ＣＤ８  エフェクターＴ細胞で増加した（図５ｂ）。
【００６９】
重要なことに、ＰＤ１の発現が（ＯＴ１  Ｔ細胞受容体が反応する）インフルエンザ−Ｏｖａに感染したＷＴ共通遺伝子レシピエントマウスに導入されたノッチ１／２欠損ＯＴ１  Ｔ細胞の表面で増加した（図５ｃ）。Ｔ細胞及びＢ細胞の内因性レパートリーがこれらマウスにおけるインフルエンザウイルスを効率的に除去し、ノッチ１／２ｋｏ  Ｔ細胞での選択的なＰＤ１発現の増加に対する説明としてウイルスの存続を除外した。さらに、ノッチ１／２ｋｏ  ＯＴ１  Ｔ細胞に特異的な活性化されたノッチアレル（ＮＩＣＤ）の発現がＰＤ１の発現を強く抑制した（図５ｅ）。これは、ＣＤ８  Ｔ細胞が本来備えている様式において、ノッチがＰＤ１の発現を抑制することを示している。
【００７０】
ノッチの細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）の発現は、ＣＤ４  Ｔ細胞及びＣＤ８  Ｔ細胞の両方において、ノッチの活性化を模倣している（Ｈｅｌｂｉｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｂａｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１４；Ａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００７）。ノッチシグナル伝達は極めて敏感で、ＮＩＣＤコンストラクトの過剰発現によって得られる核のＮＩＣＤ分子の個数が、リガンドを介した活性化後に得られる分子の個数を大いに超えることがあり得る。これは胸腺前駆細胞におけるタモキシフェン誘導ＭＥＲ−ＮＩＣＤアレルを用いた実験によって示される。ＯＰ９間質細胞上でのＣＤ３４＋ＣＤ１ａ−ヒト胸腺前駆細胞の培養では、ＮＩＣＤが発現した場合に分化をもたらすのみであった（図６ｂ）。際だって、ＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性細胞の分化が、タモキシフェンなしというルシフェラーゼレポーターコンストラクトのかなり弱い転写活性をもたらす条件（図６ａ）において、ＭＥＲ−ＮＩＣＤの漏れ活性によって最大となった（図６ｂ）。さらに、タモキシフェンの添加によるＭＥＲ−ＮＩＣＤの活性増加は、二重陽性胸腺細胞からＣＲＴＨ２＋  ＩＬＣ２細胞への分化の段階的な転換をもたらした（図６ｃ）。これらの結果は、ＮＩＣＤに対する内因性応答プログラムの優れた感受性を強調する。さらにそれらは、ノッチシグナル伝達の強さが、場合によっては、この受容体に対する生物学的応答に質的に影響を及ぼすことを示す（これらの結果はＧｅｎｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．２０１３で発表済みである）。
【００７１】
材料と方法
マウス。すべてのマウスのバックグラウンドはＣ５７ＢＬ／６である。Ｎｏｔｃｈ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＮｏｔｃｈ２ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘＣｄ４−Ｃｒｅマウスが用いられた（Ａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４、Ａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。Ｃｒｅ−陰性の同腹の子がすべての実験で使用された。ＯＴ−Ｉ  ＴＣＲ（００３８３１）を発現する遺伝子組み換えマウスをジャクソン・ラボラトリーズから入手できる。マウスは、大学病院の動物センター（ＡＭＣ、アムステルダム、オランダ）で特定の病原体がない条件で飼育され、収容された。マウス（雄及び雌の両方）は、実験開始時に８〜１６週齢であった。感染実験の間、野生型及びノッチ１−２−ＫＯマウスは、ケージのバイアスを避けるために一緒に収容された。無作為化のために意図的ではない方法が用いられた。ウイルス負荷及び血球凝集アッセイの決定を除いて、盲検化に関して形式的な方法は用いず、操作者はマウスの遺伝子型を知らなかった。野生型及びノッチ１−２−ＫＯ  ＢＭを１：１の比で含む、混合した骨髄（ＢＭ）キメラが５〜１０×１０６個のドナーＢＭ細胞を、致死的な放射線を浴びたＲＡＧ１−欠損マウスに静脈内に注射することで作製された。ドナー起源の野生型及びノッチ１−２−ＫＯ細胞は、遺伝子背景が同一のＣＤ４５．１／２マーカーで同定された。ＢＭキメラは実験の１２週間後に使用された。すべてのマウスが組織及び国の動物実験ガイドラインに従って用いられた。すべての手順が現地の動物倫理委員会によって承認された。
【００７２】
マウス試験での培地、試薬及びｍＡｂ。培養培地は１０％熱不活化ＦＣＳ（Ｌｏｎｚａ）、２００Ｕ／ｍｌペニシリン、２００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）、ＧｌｕｔａＭＡＸ（Ｇｉｂｃｏ）及び５０μＭβ−メルカプトエタノール（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えたイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ、Ｌｏｎｚａ）とした（ＩＭＤＭ）。フローサイトメトリーに使用されたすべての直接結合したモノクローナル抗体は、特に明記しない限り、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（サンディエゴ、カリフォルニア州）から購入した：抗ＣＤ３ε（クローン１４５−２Ｃ１１）、抗ＣＤ４（クローン  ＧＫ１．５）、抗ＣＤ８α（Ｌｙ−２、クローン  ５３−６．７）、抗ＣＤ２８（クローン  ３７．５１）、抗ＣＤ４４（クローン  ＩＭ７）、抗ＣＤ４５．１（クローン  Ａ２０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ４５．２（クローン  １０４）、抗ＣＤ１２７（抗ＩＬ７Ｒα、クローン  Ａ７Ｒ３４）、抗グランザイムＢ（クローン  ＧＢ−１１、Ｓａｎｑｕｉｎ  ＰｅｌｉＣｌｕｓｔｅｒ）、抗ＩＬ−２（クローン  ＪＥＳ６−５Ｈ４）、抗ＩＦＮ−γ（クローン  ＸＭＧ１．２）、抗ＫＬＲＧ−１（クローン  ２Ｆ１）、抗ＴＮＦα（クローン  ＭＰ６−ＸＴ２２）、及びアイソタイプ対照（ｃａｔ．＃３９００Ｓ）（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）。
【００７３】
インフルエンザ感染。１００〜２００×５０％組織培養有効感染量（ＴＣＩＤ５０）のＨ３Ｎ２インフルエンザＡウイルスＨＫｘ３１（Ｂｅｌｚ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、インフルエンザＡ／ＷＳＮ／３３、Ａ／ＷＳＮ／３３−ＯＶＡ（Ｉ）（Ｔｏｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、Ａ／ＰＲ／８／３４（Ｈ１Ｎ１）又はＬＣＭＶ  ｇｐ３３−４１エピトープを発現する組み換えＡ／ＰＲ／８／３４（Ｍｕｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）にマウスを鼻腔内感染させた。以前説明されたようにＭＤＣＫ又はＬＬＣ−ＭＫ２細胞を感染させることでストック及びウイルス力価が得られた（Ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｌｕｉｊｓ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。示された時間間隔で、血液試料が尾静脈から取得されるか、マウスが犠牲にされ器官が採取され、インフルエンザ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞の個数が決定された。インフルエンザ特異的ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、抗ＣＤ８（５３−６．７）及びインフルエンザ−Ａ−由来ヌクレオカプシドタンパク質（ＮＰ）ペプチドＮＰ３６６−３７４  ＡＳＮＥＮＭＥＴＭ（血液研究のためにＳａｎｑｕｉｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで製造された）を含むＨ−２ＤｂのＰＥ−又はＡＰＣ−結合テトラマーを用いて列挙された。感染マウスの肺におけるＡ／ＰＲ／８／３４ウイルス量が、肺ｍＲＮＡの単離及びＡ／ＰＲ／８／３４  Ｍ遺伝子に特異的な次のプライマー及びプローブを用いた定量ＰＣＲによるウイルスｍＲＮＡの検出によって決定された。センスプライマー：５’−ＣＡＡＡＧＣＧＴＣＴＡＣＧＣＴＧＣＡＧＴＣＣ−３’；アンチセンスプライマー：５’−ＴＴＴＧＴＧＴＴＣＡＣＧＣＴＣＡＣＣＧＴＧＣＣ−３’；プローブ：５’−ＡＡＧＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＣＴＧＡ−３’。
【００７４】
ウイルスに対する中和抗体の存在に関して、以前説明されたようにウイルスの４つの赤血球凝集ユニットと七面鳥赤血球を用いた血球凝集阻害（ＨＩ）アッセイによって血清が試験された（Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９７５）。値は、凝集が完全に阻害された血清希釈の最大値を示す。
【００７５】
フローサイトメトリー及び細胞分類。細胞内サイトカイン及びグランザイムＢ染色のために、１０μｇ／ｍｌブレフェルジンＡ（シグマ）の存在下で４時間、脾臓細胞及び全肺試料が１μｇ／ｍｌのＭＨＣクラスＩ限定的インフルエンザ由来ペプチドＮＰ３６６−３７４  ＡＳＮＥＮＭＥＴＭで刺激され、サイトカイン放出が防がれた。０．５％ＢＳＡ及び０．０２％ＮａＮ３を含むＰＢＳ中で、関連のある蛍光色素結合ｍＡｂで細胞が３０分間、４℃で染色された。細胞内染色のために、細胞が固定され、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて透過処理された。データの取得及び解析がＦＡＣＳＣａｎｔｏ（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）及びＦｌｏｗＪｏソフトウェアで行われた。
【００７６】
Ｈ−２  Ｄｂ−ＮＰテトラマー−陽性ＣＤ８＋  Ｔ細胞をインフルエンザ感染マウスから単離するために、脾臓の単細胞懸濁液がインフルエンザ特異的テトラマー及び様々なマーカーで染色された。細胞がＦＡＣＳＡｒｉａ  ｃｅｌｌ  ｓｏｒｔｅｒｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて分類された。
【００７７】
ヒト胸腺細胞の分析に関して、生細胞及び死細胞は、７−アミノアクチノマイシンＤ（７−ＡＡＤ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）又はフィクサブル  ライブ／デッド  ダイ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）での染色に基づいて区別された。データがＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で得られ、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（ＴｒｅｅＳｔａｒ）を用いて解析された。単細胞懸濁液が、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ）、フィコエリトリン−  シアニン  ５（ＰＥ−Ｃｙ５）、ＰＥ−Ｃｙ５．５、ＰＥ−Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５、アロフィコシアニン（ＡＰＣ）／Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７、ＡＰＣ−Ｃｙ７、ＡＦ７００（すべてＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ又はＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、Ｈｏｒｉｚｏｎ  Ｖ５００（ＨＶ５００、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｖｉｏｌｅｔ  ４２１（ＢＶ４２１）、ＢＶ７１１及びＢＶ７８５（すべてＢｉｏｌｅｇｅｎｄ）で直接標識された抗体で染色された。次のヒト抗原に特異的な抗体が使用された：ＣＤ１ａ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ５６、ＣＤ９４、ＣＤ１１７、（ｃＫｉｔ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒα）、ＣＤ１６１、ＣＤ２９４（ＣＲＴＨ２）、ＣＤ３０３（ＢＤＣＡ２）、ＣＤ３３６（Ｎｋｐ４４）、ＣＤ２７８  （ＩＣＯＳ）、ＴＣＲαβ、ＴＣＲγδ及びＦｃＥＲ１。抗マウスＣＤ９０．１（Ｔｈｙ１．１）−ＦＩＴＣ、−ＰＥ又は−ＡＰＣ−ｅＦｌｕｏｒ  ７８０（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）がＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−Ｔｈｙ１．１レトロウイルスを形質導入された細胞の検出に用いられた。
【００７８】
レトロウイルス形質導入及びマウスＣＤ８＋  Ｔ細胞の養子導入。記載されたように（Ａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２００４）、ウイルスがＰｌａｔＥ細胞で産生された。ＣＤ４５．２＋  ＯＴ−Ｉ野生型又はＯＴ−Ｉ  ノッチ１−２−ＫＯマウス由来の全脾臓細胞が１ｎＭ  ＯＶＡ２５７−２６４ペプチドとインキュベートされ、翌日、細胞がウイルス上清（８μｇ／ｍｌ  ポリブレンを含む）で回転感染され（３７℃で９０分間、７００×ｇ）、３７℃で５時間維持された。培地が交換され、翌日、生細胞が密度遠心法（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ、Ａｘｉｓ−ｓｈｉｅｌｄ  ＰｏＣ）で単離され、７．５×１０２から５×１０４個の間の細胞が時限インフルエンザ−ＯＶＡ感染ＣＤ４５．１＋マウスに導入された。ドナーＯＴ−１  Ｔ細胞が、ＣＤ４５．２＋ＣＤ８＋及びＴｈｙ１．１又はＧＦＰ三重陽性細胞として導入後５〜１０日で検出された。
【００７９】
ウイルス産生及びヒト胸腺細胞の形質導入。ウイルス産生では、Ｐｈｏｅｎｉｘ  ＧＡＬＶパッケージング細胞がＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ  （Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて一時的に導入された。ウイルスを含む上清が導入後４８時間で収集され、ドライアイス上で即座に凍結され、使用まで−８０℃で保管された。形質導入に関しては、翌日、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ）で被覆されたプレート内で細胞が３７℃で６〜８時間、ウイルス上清とインキュベートされた。
【００８０】
ヒト胸腺細胞実験に使用されたレトロウイルスコンストラクト。ヒトＮＩＣＤ１−ＩＲＥＳ−Ｔｈｙ１．１−ＭＳＣＶコンストラクトは以前記載された（Ａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２００４）。ｍＮＲ−ＮＩＣＤ融合を得るため、Ｎ末端ｍＥＲドメインが次のプライマー：ＧＡＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＧＡＴＣＣＡＣＧＡＡＡＴＧＡＡ及びＧＡＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＣＡＣＣＴＴＣＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＧを用いてＰＣＲ増幅され、ｍＥＲ−ｐＢＳを作製するために、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ（ｐＢＳ）のＥｃＯＲ１及びＥｃＯＲＶサイトにクローン化された。転写開始シグナルを欠くヒトＮＩＣＤ１がこれらのプライマー：ＡＴＣＧＧＡＧＧＴＴＣＴＣＧＣＡＡＧＣＧＣＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＡＴ及びＧＡＴＣＡＧＡＡＧＣＴＴＧＡＡＴＴＣＴＴＡＣＴＴＧＡＡＧＧＣＣＴＣＣＧＧＡＡＴＧを用いてＰＣＲ増幅され、続いて、ｍＥＲ−ｐＢＳのＥｃＯＲＶ及びＨｉｎｄＩＩＩサイトにクローン化された。次に、ＢａｍＨ１及びＣｌａ１を用いて、ＩＲＥＳ−Ｔｈｙ１．１−ＭＳＣＶにｍＥＲ−ＮＩＣＤ１フュージョンインサートがクローン化された。
【００８１】
遺伝子発現プロファイリングマウス試験。Ｈ−２  Ｄｂ−ＮＰ３６６−３７４＋ＣＤ８＋  Ｔ細胞がフローサイトメトリーによってインフルエンザ感染マウスの脾臓から単離された。全ＲＮＡが製造者の手順に従ってＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で抽出された。ディープ配列解析のために、全ＲＮＡがさらにｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ  ＲＮＡＩＩカラム（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）によって精製され、ＲＮＡがＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＲＮＡ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて増幅され、Ｃｙ３又はＣｙ５色素（Ａｍｅｒｓｈａｍ）のいずれかを用いて、ＵＬＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｋｒｅａｔｅｃｈ）で標識された。配列がＨｉＳｅｑ２０００  ｍａｃｈｉｎｅの１つのレーンで１０サンプルのプーリングによって得られた。サンプルごとに１７００〜２７００万リードが得られた。
【００８２】
リードマッピング（ＴｏｐＨａｔ）及び発現の異なる遺伝子の決定（ＤＥＳｅｑ）はＡｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３に記載されたように行われた。エキソン−エキソン連結を測ることができるＴｏｐＨａｔ（バージョン１．４．０）を用いて、リードがマウスの参照ゲノム（ビルドｍｍ９）にマッピングされた。ＴｏｐＨａｔは、遺伝子モデルの既知セットが与えられた（ＮＣＢＩ  ビルド３７、バージョン６４）。試料ごとのｇｅｎｅｃｏｕｎｔを得るために、ＨＴＳｅｑ−ｃｏｕｎｔが用いられた。このツールは、与えられたＧｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｆｏｒｍａｔ（ＧＴＦ）ファイルに存在する各遺伝子に関するｇｅｎｅｃｏｕｎｔを作製する。すべての試料においてゼロカウントの遺伝子が、データセットから除外された。統計解析がＲパッケージＤＥＳｅｑを用いて行われた。発現の異なる遺伝子は、ＳＬＥＣ及びＭＰＥＣの試料の間、並びに野生型及びノックアウトの試料の間で決定された。ＤＥＳｅｑは遺伝子のカウントが負の２項分布によってモデル化され得ると仮定する。試料の正規化のために、“サイズ因子”がカウントデータから決定された。１つのプールされた分散値を見積もるために、重複を伴うすべての条件の試料を用いた“プールされた”方法で経験的分散が決定された。続いて、発現値に関する分散−平均関係を決定することでパラメトリック適合が各遺伝子について２つの分散推定値が得られた（経験的推定値及び適合された値）。‘ｍａｘｉｍｕｍ  ｓｈａｒｉｎｇＭｏｄｅ’を用いることでより控えめとなるように、我々はそれら２つの値の最大値を選択した。最後に、ｐ値及びＦＤＲ補正されたｐ値が算出された。
【００８３】
発現に違いがある遺伝子のセットで顕著に示される生物学的プロセスを強調するため、我々はＲＮＡ−ｓｅｑデータの解析のために開発されたＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ＧＯｓｅｑ（Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）を使用した。まず、我々はＳＬＥＣ−ＭＰＥＣとＷＴ−ＫＯとの比較からＦＤＲ＜０．５のすべての遺伝子を選択した。続いて、顕著に示されるプロセスを決定するためにＧＯ“生物学的プロセス””である遺伝子セットが用いられた。さらに、我々は、注釈付きの遺伝子セットを集めたＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｒｏａｄｉｎｓｔｉｔｕｔｅ．ｏｒｇ／ｇｓｅａ）からの‘Ｃ７’遺伝子セットを用いた。遺伝子セットＣ７は免疫系における細胞型、状態及び摂動を示す遺伝子セットからなる免疫学の特徴を含む。当該特徴はヒト及びマウス免疫学での公開されたマイクロアレイ試験の手作業での整理によって得られたものである。遺伝子セットがヒト免疫プロジェクトコンソーシアム（ＨＩＰＣ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｍｕｎｅｐｒｏｆｉｌｉｎｇ．ｏｒｇ）の一部として作成された。Ｃ７遺伝子セットをＧＯｓｅｑによって使用可能なフォーマットに変換するために自前のＲスクリプトが開発された。
【００８４】
統計解析。図は平均と、平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を意味する誤差バーとを示す。標準スチューデントｔ−検定（対ではない、両側）がＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアで適用された。３以上の群が比較される場合、ボンフェローニ補正を伴う一元配置分散分析が用いられた。Ｐ＜０．０５が統計的に有意であるとみなされた。
【００８５】
ヒト胸腺造血前駆細胞の単離。生後胸腺（ＰＮＴ）組織標本が心臓切開手術を受けた子から得られた（ＬＵＭＣ、Ｌｅｉｄｅｎ、オランダ）。ヘルシンキ宣言に従うＡＭＣ倫理委員会での承認を得てそれらが使用された。細胞懸濁液がＳｔｏｍａｃｈｅｒ  ８０  Ｂｉｏｍａｓｔｅｒ（Ｓｅｗａｒｄ）を使用した機械的破砕によって調製された。４℃での一晩のインキュベーション後、胸腺細胞がＦｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ（Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ；Ｎｙｃｏｍｅｄ  Ｐｈａｒｍａ）密度勾配から単離された。単細胞懸濁液がＭＡＣＳ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によってＣＤ３４＋細胞について濃縮され、蛍光標識された抗体で染色され、続いて、それぞれＣＤ３４＋ＣＤ１ａ−ＣＤ３−ＣＤ５６−ＢＤＣＡ２−又はＣＤ３４＋ＣＤ１ａ＋ＣＤ３−ＣＤ５６−ＢＤＣＡ２−として、ＦＡＣＳ  Ａｒｉａ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）でＦＡＣＳ分類された（本試験ではＣＤ３４＋ＣＤ１ａ−及びＣＤ３４＋ＣＤ１ａ＋と呼ばれる）。分類された集団の純度は＞９９％であった。
【００８６】
胸腺前駆細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化。分類された胸腺前駆細胞が５％正常ヒト血清、ＳＣＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ、両方ともＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を含むＹｓｓｅｌ’ｓ培地で一晩培養された。ＯＰ９細胞が３０Ｇｒｅｙの照射によって有糸分裂で不活化され、共培養の開始の１日前に５×１０３／ｃｍ２の密度で播種された。形質導入後、胸腺前駆細胞が事前に播種されていたＯＰ９細胞に添加された。共培養はＦＣＳ（２０％  Ｆｅｔａｌ  Ｃｌｏｎｅ  Ｉ、Ｈｙｃｌｏｎｅ）及びＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）を含むＭＥＭα（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で行われた。場合によって、Ｆｌｔ３ｌ（５ｎｇ／ｍｌ、ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）が培地に添加された。培養物は３〜４日ごとに新たにされた。生来のリンパ系細胞のための分化アッセイは、特に明記されない限り通常は１週間後に解析された。細胞が強制的なピペッティングによって収集され、７０ｍｍナイロン製メッシュフィルター（Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｓ）に通された。
【００８７】
レポーター遺伝子アッセイ。Ｕ２ＯＳ細胞がＦｕＧｅｎｅ  ＨＤ形質導入試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて一時的に形質導入された。細胞にＮＯＴＣＨ応答性プロモーターと、ＮＩＣＤ１−ＭＳＣＶ  Ｔｈ１．１、ｍＥＲ−ＮＩＣＤ１−ＭＳＣＶ  Ｔｈ１．１又は空ベクター対照のいずれかとが同時導入された。形質導入効率の違いを補正するために、ウミシイタケルシフェラーゼを構造的に発現するｐＲＬ−ＣＭＶ対照ベクターが同時導入された。形質導入は三重に行われた。適用できる場合には、ｍＥＲ−ＮＩＣＤ１の核転座を誘導するために、４−ヒドロキシ−タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ）が一晩のインキュベーション後に添加された。形質導入の４８時間後に細胞が溶解され、Ｓｙｎｅｒｇｙ  ＨＴ  ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  ｒｅａｄｅｒ（Ｓｙｎｔｅｋ）においてＤｕａｌ  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒ  Ａｓｓａｙ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いてルシフェラーゼ活性が測定された。以前記載された（Ｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．２００７）、２つの異なるノッチ応答性レポーターコンストラクトが使用された。
【００８８】
キメラノッチ受容体（ＣｈＮＲ）システム。キメラノッチ受容体を作製するために、ヘテロ二量体ドメインを除くノッチの細胞外ドメインがノッチのヘテロ二量体ドメインに結合したｓｃＦｖ抗体からなる異種リガンド結合ドメインに置換された。この受容体は、隣接した細胞の表面上のｓｃＦｖ抗体の関連するリガンドに結合することで活性化されるが、この表面抗原が存在しない場合は休止したままである（図７）。ＣｈＮＲはレトロウイルスの形質導入又は他の方法を介したＣＤ４  Ｔ細胞において発現される。このような改変されたＴ細胞が患者に養子導入された場合、ノッチはそれらＴ細胞のみに対して特異的にオンになる。
【００８９】
典型的には、ＣｈＮＲはそれ自身によってＴ細胞を完全に活性化するのに十分ではない。そのため、追加のＴ細胞受容体シグナル（又はその模倣）が必要である。例えば、Ｔ細胞は、腫瘍反応性に関する選択後の初期の腫瘍（腫瘍浸潤リンパ球−ＴＩＬ）由来であってもよい。また、ＣｈＮＲは、腫瘍抗原に対する組み換えＴ細胞受容体又は従来のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように改変されたＴ細胞とともに使用されてもよい。
【００９０】
この基本的概念の多くの変形が可能である。細胞外ドメインとして、表面抗原を認識する任意の抗体が原理上は使用され、腫瘍細胞の表面に発現する任意の表面抗原が原理上は標的とされる。最後に、可溶性リガンドによって活性化される細胞外ドメインでさえ、選択肢である。例えば、細胞外ドメインは腫瘍上の表面抗原に対する他の抗体（スイッチ抗体）にそれ自身が組み込まれた（Rodgers et al. 2016で記載されたような）ペプチドネオエピトープ、（Ma et al. 2016で記載されたような）ビオチン又はＦＩＴＣ部分に対する抗体からなってもよい。結果として、スイッチ抗体に標的とされる細胞表面抗原に加えて、スイッチ抗体自身も存在する場合に限ってのみ、キメラノッチ受容体が活性化される。この仕組みが受容体の一時的な調節と（望む場合にのみオンとオフとを切り替える）、量的な調節（スイッチ抗体の濃度の増加又は減少）とを可能にする。しかし、すべてのこれら状況において、キメラノッチ受容体からのノッチの細胞内ドメインの開放が中心とする目標に維持される。
【００９１】
例示的なキメラノッチ受容体の調製が実施例２で説明される。
（実施例２）
結果
Ｔ細胞が慢性的にそのＴ細胞受容体を介して刺激される場合にＴ細胞の疲弊が起こる。実施例１の結果は、インフルエンザウイルスへの感染に応答するＣＤ８  Ｔ細胞が、ノッチによるこの疲弊プログラムの活性化から保護されることを示す。しかし、インフルエンザ感染は、通常、Ｔ細胞の慢性的な刺激を引き起こす。したがって、ノッチの意図的な活性化も、通常は疲弊が誘導される条件下での疲弊を防ぐこともできるのかどうかが我々の疑問であった。この目的のために、我々は、活性化したノッチアレル（ＮＩＣＤ）がＴ細胞に導入されてからＴ細胞がＴＣＲ刺激を繰り返し受けるｉｎ  ｖｉｔｒｏシステムを用いた。ＮＩＣＤはレトロウイルス発現システムを用いてＯＴ−１  ＣＤ８  Ｔ細胞（これはＨ２−Ｋｂにおけるオボアルブミンタンパク質由来のＳＩＩＮＦＥＫＬペプチドを認識する）において発現された。レトロウイルスコンストラクトのＩＲＥＳ−Ｔｈｙ１．１配列によって、形質導入されたＴ細胞（Ｔｈｙ１．１＋）及び形質導入されていないＴ細胞（Ｔｈｙ１．１−）の識別が可能になる。例えば、細胞溶解エフェクタータンパク質グランザイムＢの自発的な産生によって示されたように、ＣＤ８＋  ＯＴ−１  Ｔ細胞におけるＮＩＣＤの発現がエフェクター機能をかなり強化した（図９Ａ）。続いて、形質導入されたＯＴ−１細胞がアボアルブミン（Ｂ１６−Ｏｖａ）を発現するＢ１６Ｆ１０黒色腫細胞の毎日の添加によって繰り返し刺激された。これらの条件によって、対照のウイルス（空のベクター−ＥＶ）で形質導入されたＯＴ−１  Ｔ細胞の表面のチェックポイント分子（及び疲弊の顕著な特徴）であるＰＤ１の顕著な発現がもたらされる（図９Ｂ、左）。しかし、ＮＩＣＤの発現は、ほとんど完全に、ＰＤ１の発現を抑制した（図９Ｂ、右）。また、ＮＩＣＤの発現は、ＯＴ−１  Ｔ細胞に対する競争上の優位性を与えた：ＮＩＣＤで形質導入された集団におけるＴＨ１．１＋細胞の割合が経時的に次第に増加した一方で、細胞が空ベクターで形質導入されていた場合、ＴＨ１．１＋集団は安定なままであった（図９Ｃ）。
【００９２】
ＮＩＣＤアレルの発現後に得られる活性のあるノッチ分子の濃度は、おそらく非生理学的に高い。さらに、ＣｈＮＲを用いて当該活性のあるノッチ分子の同様に高い量を達成することは可能ではない。また、ＣＤ８  Ｔ細胞に対する保護的な効果がさらに弱いノッチ刺激で得られるかどうかを調べるために、我々は、ＮＩＣＤのタモキシフェン誘導可能型を利用した（実施例１でも使用、図６）。このコンストラクトは、エストロゲンにはもはや反応せず、タモキシフェンのみに応答するように変異したエストロゲン受容体（ＥＲ）のリガンド結合ドメインにＮ末端で結合したＮＩＣＤからなる。この変異ＥＲドメイン（ｍＥＲ）は、熱ショックタンパク質に結合することで、細胞質においてＮＩＣＤ分子を隔離し、これによってそれを不活性な状態に維持する。しかし、タモキシフェンを添加すると、ｍＥＲ−ＮＩＣＤ融合タンパク質がそれらの熱ショックタンパク質から分離することで、ＮＩＣＤを活性化する。ルシフェラーゼレポーターアッセイによって示されたように（図６Ａ）、この融合タンパク質は、ＮＩＣＤそれ自身よりもかなり低いノッチ活性の最大値に到達し、その活性はタモキシフェンの滴定によって量的に調節され得る。最後に、このｍＥＲ−ＮＩＣＤは、タモキシフェンを欠いてもある程度の“漏れ”ノッチ活性を有し、それはルシフェラーゼレポーターアッセイでほとんど検出できず、さらに胸腺前駆細胞からＣＤ４＋ＣＤ８＋胸腺細胞への分化の誘導のようなノッチの生理的機能を生じさせる（図６Ｂ）。このため、ＣＤ８  Ｔ細胞の疲弊に対する保護のためのシグナル強度の必要条件を調べるために、我々はこのｍＥＲ−ＮＩＣＤコンストラクトを用いて、さらに、Ｂ１６−Ｏｖａ黒色腫細胞での反復的刺激モデルを用いた（Ａ〜Ｃのように）。０．５ｍＭ又は０．０５ｍＭでさえ、タモキシフェンでのｍＥＲ−ＮＩＣＤの刺激は、実際にＰＤ１の発現と寛容誘導のサイトカインＩＬ１０の産生とを抑制した（図９Ｄ）。また、それはＩＦＮｇ及びグランザイムＢのようなエフェクター分子を産生させた。意外なことに、それらの効果のいくつかはタモキシフェンなしでｍＥＲ−ＮＩＣＤによって誘導されるかなり低い漏れＮＩＣＤ活性によってでも得られた。したがって、ノッチは、相対的に控えめな程度のノッチの活性であっても、疲弊の顕著な特徴（ＰＤ１の発現、エフェクター分子の産生の喪失）の進行からＣＤ８  Ｔ細胞を保護できると、我々は結論づけた。
【００９３】
キメラノッチ受容体の作製
ヒトＣＤ１９に対するＳｃＦｖ抗体ドメインからなるキメラノッチ受容体が作製された（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １９９７；３４：１１５７−１１６５に記載され、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．２００９  Ｓｅｐ；３２（７）：６８９−７０２におけるＣＡＲコンストラクトで使用されたＳｃＦｖ）。このＳｃＦｖが細胞外ヘテロ二量体ドメインの上流を切り取られたヒトＮＯＴＣＨ１タンパク質の５’末端にフレームで結合された（図１０Ａ）。
【００９４】
具体的には、ＧＭＣＳＦリーダー配列（ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬ  ＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬ）が、ＦＭＣ６３−２８Ｚ抗ＣＤ１９  ＳｃＦｖのＩｇ重鎖可変領域（ＩＰＤＩＱＭＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＲＡＳＱＤＩＳＫＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＫＬＬＩＹＨＴＳＲＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＳＮＬＥＱＥＤＩＡＴＹＦＣＱＱＧＮＴＬＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＴＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧＥＶＫＬＱＥＳＧＰＧＬＶＡＰＳＱＳＬＳＶＴＣＴＶＳＧＶＳＬＰＤＹＧＶＳＷＩＲＱＰＰＲＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＧＳＥＴＴＹＹＮＳＡＬＫＳＲＬＴＩＩＫＤＮＳＫＳＱＶＦＬＫＭＮＳＬＱＴＤＤＴＡＩＹＹＣＡＫＨＹＹＹＧＧＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＡＡＡ）が後に続くＩｇκ軽鎖可変領域にフレームで結合され、それは（図８に示された配列の）イソロイシン１４２７から始まってリシン２５５５までのヒト全長ＮＯＴＣＨ１タンパク質のＣ末端にフレームで結合されている。
【００９５】
別のコンストラクトにおいて、使用されたヒトＮＯＴＣＨ１配列のＣ末端はプロリン１３９０で始まる。また、両方のバリアント（Ｉｌｅ１４２７又はプロリン１３９０で始まる、図８の配列参照）は、ヒトＮＯＴＣＨ１のＣ末端ＰＥＳＴドメインの欠失した状態で作製される（ヒトＮＯＴＣＨ１タンパク質のアラニン２４２４で終わる、図８の配列参照）。
【００９６】
次に、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞への形質導入後に、融合タンパク質がｐＨＥＦＴＩＧレンチウイルス発現ベクターから発現され（“ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｐＣＤＨ１”としてＪ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００９；１８３：７６４５−７６５５に、“ｐＨＥＦ”としてＰＮＡＳ  Ａｕｇｕｓｔ  ９，２０１１  １０８（３２）  １３２２４−１３２２９に記載されている）、細胞表面におけるその存在が組み換えヒトＣＤ１９−Ｉｇタンパク質で染色されることで立証された（図１０Ｂ）。
【００９７】
材料と方法
マウス。Ｈ２−Ｋｂによって提示されるオボおアルブミンの残基２５７〜２６４を標的とするように特に設計されたＴＣＲα−Ｖ２及びＴＣＲβ−Ｖ５遺伝子を挿入して遺伝子組み換えされた雄又は雌のＯＴ−１  ＴＣＲ遺伝子組み換えマウス（Ｃ５７ＢＬ／６株）が飼育され、オランダがん研究所（ＮＫＩ、アムステルダム、オランダ）の動物施設で維持された。すべての動物実験は機関のガイドラインを順守し、ＮＫＩの動物倫理委員会で承認された手順にしたがって行われた。
【００９８】
細胞株及び試薬。Ｂ１６−Ｆ１０及びＢ１６−ＯＶＡ腫瘍細胞株が１０％熱不活化ウシ胎仔血清（Ｂｏｄｉｎｇｏ  ＢＶ）、５％Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ、ベルギー）及び５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、１０．０００Ｕペニシリン及び１０ｍｇストレプトマイシン）を添加したＨＥＰＥＳを含むイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）で培養された。Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅｃｏ細胞及びＨＥＫ２９３Ｔ細胞が１０％熱不活化ウシ胎仔血清（Ｂｏｄｉｎｇｏ  ＢＶ）及び５％Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ、ベルギー）を加えたＨＥＰＥＳを含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＤＭ）で培養された。すべての細胞が３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートされた。
【００９９】
細胞精製。単細胞懸濁液がＯＴ−１マウスの脾臓及びリンパ節から採取された。ＣＤ８＋  Ｔ細胞がＭａｇｎｅｔｉｃ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｉｎｇ（ＭＡＣＳ）によって濃縮され、精製された。ＣＤ８α＋  Ｔ  ｃｅｌｌ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、マウス（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）がＤ８α＋  Ｔ細胞の陰性選択のために使用された。続いて、細胞が１０％熱不活化ウシ胎仔血清（Ｂｏｄｉｎｇｏ  ＢＶ）、５％Ｌ−グルタミン（Ｌｏｎｚａ、ベルギー）、５％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｓｉｇｍａ、１０．０００Ｕペニシリン及び１０ｍｇストレプトマイシン）及び５０μＭβ−メルカプトエタノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加したＩＭＤＭで最長２週間培養された。
【０１００】
マウスＣＤ８＋  Ｔ細胞のレトロウイルス形質導入。製造者の指示に従ってＦｕＧＥＮＥ（登録商標）  ＨＤ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いたコンストラクトで、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ｅｃｏ細胞に形質導入することでレトロウイルスのストックが作製された。形質導入の１日前に３×１０６個の細胞が１００ｍｍディッシュに播かれた。８７９μｌのプラスミド溶液（ＯｐｔｉＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  ｂｙ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中の０．０２０μｇ／μｌ）に５６μｌのＦｕＧＥＮＥ（登録商標）  ＨＤ  ｒｅａｇｅｎｔが加えられ、続いてＲＴで１０分間インキュベートされた。次に、複合体溶液が細胞に加えられ、一晩、３７℃でインキュベートされた。ウイルス上清が収集され、細胞残屑を除去するために０．４５μＭシリンジフィルタでフィルタ処理された。ウイルス上清がｐＭＳＣＶ−ＥＶ及びｐＭＳＣＶ−ＮＩＣＤから調製された。レトロウイルスベクターは、キャップ非依存転写を可能にするＩＲＥＳ配列、及び陽性形質導入選択のために使用されたＴｈｙ１．１（ＣＤ９０．１）選択マーカーを含んでいた。ＯＴ−１マウスから精製された活性化ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、２４ウェルプレート（１×１０６細胞／ウェル）で１０μｇ／ｍｌ  ポリブレン（Ｍｅｒｃｋ）の添加でウイルスに感染させられた。ＲＴにおいて、細胞が９０分間、２０００ＲＰＭで回転され、３７℃、５％ＣＯ２で４時間、インキュベートされた。
【０１０１】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の形質導入。６ウェルプレートにおいて製造者の指示に従ってＦｕｇｅｎｅ  ＨＤ  ｒｅａｇｅｎｔを用いて、細胞がＣＮＲ−ｐＨＥＦＴＩＧ又はｐＨＥＦＴＩＧ空ベクターで形質導入された。４８時間後、発現がフローサイトメトリーで解析された。
【０１０２】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞活性化及び再刺激。Ｔ細胞の十分なｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性化のために、ＯＶＡ２５７−２６４（ＳＩＩＮＦＥＫＬ）ペプチドをコードする、改変されたＡＰＣ細胞株ＭＥＣ．Ｂ７．ＳｉｇＯＶＡ（ＳＡＭＢｃｄ８＋ＯＫ）が使用された。ＣＤ８＋  Ｔ細胞の精製に続き、１０６個のＣＤ８＋  Ｔ細胞が２４ウェルプレートで１０５  ＳＡＭＢＯＫ細胞と、２４時間共培養された。次に、細胞が集められ、形質導入された。細胞が再刺激まで±１．５×１０６細胞／ｍｌの細胞密度で維持された。形質導入の５日後、３００．００  ＣＤ８＋  Ｔ細胞が、平底９６ウェルプレート５０．０００  Ｂ１６−Ｆ１０／Ｂ１６−ＯＶＡと共培養された（図５）。２４時間毎にＴ細胞が付着性のＢ１６細胞から除去され、新たなＢ１６細胞に播種された。所望の再刺激の各時点の４時間前に、ブレフェルジンＡ（１０００×、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）が添加された。サイトカイン産生及び抑制性受容体の発現がフローサイトメトリーを介して評価された。
【０１０３】
フローサイトメトリー及び抗体。すべての試料がＢＤ  ＦＡＣＳｙｍｐｈｏｎｙ  Ａ５（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）で測定された。フローサイトメトリー測定の前に、細胞が細胞外で染色され（４℃、１．５％ＦＣＳ含有ＰＢＳで）、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を用いて固定され、透過処理された。次に、細胞が細胞内で染色された（４℃、１×ＰｅｒｍＷａｓｈで）。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）に融合したヒトＣＤ１９タンパク質がＣＮＲの表面発現の検出に使用された。次に、蛍光標識された抗ヒト抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）がｈＣＤ１９−Ｉｇ融合タンパク質を検出するために使用された。
【０１０４】
参照
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【０１０５】
（付記）
（付記１）
ノッチ受容体の細胞内ドメイン、膜貫通ドメイン、ヘテロ二量体ドメイン及びＬｉｎ−１２−ノッチ（ＬＮＲ）繰り返しドメインと、異種の細胞外リガンド結合ドメインと、を含むキメラ受容体。
【０１０６】
（付記２）
前記受容体はノッチシグナル伝達が可能である、付記１に記載のキメラ受容体。
【０１０７】
（付記３）
前記異種の細胞外リガンド結合ドメインは、
可溶性リガンドに対して特異的なリガンド結合ドメイン、
ＳｃＦｖ抗体ドメイン、好ましくは、腫瘍細胞表面抗原に対して特異的なＳｃＦｖ抗体ドメインのような細胞表面抗原に対して特異的なリガンド結合ドメイン、
Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメイン又はそのリガンド結合フラグメント、
表面分子の関与なくキメラ受容体に交差結合可能な抗体に対するエピトープを含む細胞外ドメイン、
ビオチンのような部分を含み、作用因子によってストレプトアビジンのような前記部分に対して複数の結合部位と交差結合し得る細胞外ドメイン、
からなる群から選択される、付記１又は２に記載のキメラ受容体。
【０１０８】
（付記４）
前記ＬＮＲドメインと前記異種の細胞外リガンド結合ドメインとの間に位置する連結配列をさらに含む、付記１から３のいずれか一つに記載のキメラ受容体。
【０１０９】
（付記５）
付記１から４のいずれか一つに記載のキメラ受容体をコードする配列を含む核酸分子。
【０１１０】
（付記６）
付記５に記載の核酸分子を含むベクター。
【０１１１】
（付記７）
付記５に記載の核酸分子又は付記６に記載のベクターを有する単離された細胞。
【０１１２】
（付記８）
前記細胞は、腫瘍由来Ｔ細胞又は腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）のようなＴ細胞である、付記７に記載の細胞。
【０１１３】
（付記９）
前記Ｔ細胞は、がんを患う患者から単離された自己Ｔ細胞である、付記７又は８に記載の細胞。
【０１１４】
（付記１０）
前記Ｔ細胞は、キメラ抗原受容体を発現する、付記８又は９に記載の細胞。
【０１１５】
（付記１１）
付記５又は６に記載の核酸分子又はベクターによって形質導入される、遺伝子操作されたＴ細胞。
【０１１６】
（付記１２）
付記５に記載の核酸分子、付記６に記載のベクター又は付記７から１１のいずれか一つに記載の細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤と、を含む医薬組成物。
【０１１７】
（付記１３）
治療上有効量の付記１から１１のいずれか一つに記載のキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞を対象に投与することを含む、Ｔ細胞の機能及び／又はＴ細胞生存の改善を必要とする前記対象でのＴ細胞の機能及び／又はＴ細胞生存を改善する方法。
【０１１８】
（付記１４）
対象でのＴ細胞の機能及び／又はＴ細胞生存を改善する方法での使用のための、付記１から１１のいずれか一つに記載のキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞。
【０１１９】
（付記１５）
前記方法は、Ｔ細胞の疲弊を防ぐ又は阻害することを含む、付記１３又は１４に記載の方法又はキメラ受容体、核酸分子、ベクター若しくは細胞。
【０１２０】
（付記１６）
治療上有効量の付記１から１１のいずれか一つに記載のキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞を、免疫療法を必要とする対象に投与することを含む、前記対象での免疫療法。
【０１２１】
（付記１７）
治療、好ましくは免疫療法での使用のための、付記１から１１のいずれか一つに記載のキメラ受容体、核酸分子、ベクター又は細胞。
【０１２２】
（付記１８）
前記治療又は免疫療法が抗体ベースの免疫療法をさらに含む、付記１６又は１７に記載の使用のための方法又はキメラ受容体、核酸分子、ベクター若しくは細胞。
【０１２３】
（付記１９）
前記対象は、がんを患っている、付記１３から１８のいずれか一つに記載の使用のための方法又はキメラ受容体、核酸分子、ベクター若しくは細胞。
【０１２４】
（付記２０）
抗体ベースの免疫療法の有効性を、がんを患い前記抗体で治療されている対象において高める方法であって、付記１から４のいずれか一つに記載のキメラ受容体を発現する治療上有効量のＴ細胞を前記対象に投与することを含む、方法。
【０１２５】
（付記２１）
抗体ベースの免疫療法の有効性を、がんを患い前記抗体で治療されている対象において高める方法での使用のための、付記１から４のいずれか一つに記載のキメラ受容体を発現するＴ細胞。
【０１２６】
（付記２２）
付記１から４のいずれか一つに記載のキメラ受容体をコードする核酸配列を含む有効量のＴ細胞を、がんの治療を必要とする対象に投与することを含む、前記対象におけるがんの治療方法。
【０１２７】
（付記２３）
対象におけるがんの治療方法での使用のための、付記１から４のいずれか一つに記載のキメラ受容体をコードする核酸配列を含むＴ細胞。
【０１２８】
（付記２４）
前記対象からＴ細胞を単離すること、
前記Ｔ細胞に付記１から４のいずれか一つに記載のキメラ受容体をコードする核酸配列を与えることで前記Ｔ細胞を改変すること、
前記改変されたＴ細胞を前記対象に戻すこと、
を含む、
付記２２に記載の方法又は付記２３に記載の使用のためのＴ細胞。
【０１２９】
（付記２５）
細胞、好ましくはヒトＴ細胞を供給すること、
前記細胞に付記５又は６に記載の核酸分子又はベクターを与えること、及び
付記１から４のいずれか一つに記載のキメラ抗原受容体を発現させること、
を含む、付記７から１１のいずれか一つに記載の細胞の集団を製造する方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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