(57)【要約】  本発明は、食道癌を検出するための組成物及びその使用を提供し、該組成物は、ＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のうちの１種又は２種である標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸を含む。本発明は、食道癌を検出するための組成物をさらに提供し、前記組成物は、ＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のうちの１種又は２種である標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸と、ＳＮＣＧである標的タンパク質の濃度を検出するための抗体と、を含む。本発明は、上記組成物を含むキット、及び食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製における上記組成物の使用をさらに提供する。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
食道癌をインビトロで検出するための組成物であって、
ＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のうちの１種又は２種である標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸を含む、組成物。
【請求項２】
ＳＮＣＧ、即ちγシヌクレイン（γ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）である標的タンパク質の濃度を検出するための抗体をさらに含む、請求項１に記載の食道癌をインビトロで検出するための組成物。
【請求項３】
前記ＭＴ１Ａ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記ＥＰＯ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示される、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
前記標的遺伝子のターゲット配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片を含み、
前記断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記標的遺伝子のターゲット配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片を含み、
前記断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
標的遺伝子のターゲット配列の５位非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する試薬をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーをさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
前記少なくとも９個のヌクレオチドの断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の配列、若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列であり、
前記少なくとも１５個のヌクレオチドの断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の配列であり、
ブロッカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の配列である、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
標的タンパク質の濃度を検出するための試薬をさらに含み、前記試薬は、酵素結合免疫吸着アッセイ試薬であり、たとえば、前記試薬は、標的タンパク質の濃度を検出するための抗体でコーティングされた反応プレート、ＳＮＣＧプロテアーゼコンジュゲート、基質液、洗浄液及び停止液を含む、請求項２〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片をさらに含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーをさらに含む、請求項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の配列をさらに含む、請求項１４に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列をさらに含む、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項１８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の配列をさらに含む、請求項１７に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１９】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の配列をさらに含む、請求項１８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項２０】
食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製におけるＭＴ１Ａ遺伝子の使用。
【請求項２１】
食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製におけるＥＰＯ遺伝子の使用。
【請求項２２】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物又は請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項２３】
別の成分として、ヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及び前記ＤＮＡポリメラーゼの機能に必要なバッファから選ばれる少なくとも１種をさらに含む、請求項２２に記載のキット。
【請求項２４】
別の成分として、標的タンパク質の濃度を検出するための抗体でコーティングされた反応プレート、ＳＮＣＧプロテアーゼコンジュゲート、基質液、洗浄液及び停止液から選ばれる少なくとも１種をさらに含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
プロトコルをさらに含む、請求項２２〜２４のいずれか１項に記載のキット。
【請求項２６】
食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製における、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物又は請求項１１〜１９のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２７】
前記食道癌をインビトロで検出するためのキットは、
標的遺伝子のターゲット配列又はその断片を含むＤＮＡサンプルを検出対象生体サンプルから分離するステップ１）と、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップ２）と、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態及び／又は標的タンパク質の濃度の検出結果に基づいて、生体サンプルの状態を判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップ３）と、を含む方法により食道癌を検出する、請求項２０、２１及び２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
前記方法は、
検出対象生体サンプルのゲノムＤＮＡを抽出するステップと、
抽出したゲノムＤＮＡを試薬で処理して、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したＤＮＡサンプルをＤＮＡポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、ＤＮＡ重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項２９】
前記方法は、
被験者の末梢血を採取して、血漿又は血清を分離するステップと、
血漿又は血清中の遊離ＤＮＡを抽出するステップと、
抽出した遊離ＤＮＡを試薬で処理して、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したＤＮＡサンプルをＤＮＡポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、ＤＮＡ重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、
ＳＮＣＧ抗体を用いて、免疫反応により血漿又は血清中のＳＮＣＧの濃度を決定するステップと、を含む、請求項２７に記載の使用。
【請求項３０】
前記試薬は亜硫酸水素塩試薬である、請求項２８又は２９に記載の使用。
【請求項３１】
標的遺伝子のターゲット配列又はその断片を含むＤＮＡサンプルを検出対象生体サンプルから分離するステップと、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップと、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の検出結果に基づいて生体サンプルの状態を判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップと、を含む、食道癌の検出方法。
【請求項３２】
検出対象生体サンプルのゲノムＤＮＡを抽出するステップと、
抽出したゲノムＤＮＡを試薬で処理して、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したＤＮＡサンプルをＤＮＡポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、ＤＮＡ重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、を含む食道癌の検出方法。
【請求項３３】
被験者から生体サンプルを採取するステップと、
被験者の生体サンプル中の前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップと、
被験者の生体サンプル中の前記標的タンパク質の濃度を決定するステップと、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と標的タンパク質の濃度の両方の検出結果に基づいて被験者が食道癌に罹ったか否かを判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップと、を含む食道癌の検出方法。
【請求項３４】
被験者の末梢血を採取して、血漿又は血清を分離するステップと、
血漿又は血清中の遊離ＤＮＡを抽出するステップと、
５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したＤＮＡサンプルをＤＮＡポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、ＤＮＡ重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、
ＳＮＣＧ抗体を用いて、免疫反応により血漿又は血清中のＳＮＣＧの濃度を決定するステップと、を含む食道癌の検出方法。
【請求項３５】
前記標的遺伝子はＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のうちの１種又は２種である、請求項３１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＭＴ１Ａ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＥＰＯ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
前記試薬は亜硫酸水素塩試薬である、請求項３２又は３４に記載の方法。
【請求項３９】
前記プライマーは、
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列の断片、及び／又は
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列の断片である、請求項３２又は３４に記載の方法。
【請求項４０】
前記ブロッカーは非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーである、請求項３２又は３４に記載の方法。
【請求項４１】
前記プローブは、
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片である、請求項３２又は３４に記載の方法。
【請求項４２】
前記プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の配列、若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４３】
前記ブロッカーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の配列である、請求項４０に記載の方法
【請求項４４】
前記プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の配列である、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物技術分野に属し、食道癌を検出するための組成物及び疾患検出におけるその使用に関し、具体的には、食道癌を検出するための組成物、及びその対応するキットと使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
食道癌は一般的な消化管腫瘍である。全国腫瘍予防治療弁公室のデータによると、２０１５年、中国の食道癌の発症率は１０万人あたり４７８例であり、死亡率は１万人あたり３７５例であり、一般的な癌の中でそれぞれ４番目と３番目にランクされている。食道癌の死亡率は８０％に近く、悪性度の高い癌である。毎年世界中で約３０万人が食道癌で亡くなっており、その半数が中国で亡くなっている。
【０００３】
食道癌の高い死亡率につながる重要な要因は、早期食道癌の診断率が低いことである。早期食道癌の治癒率は中期及び後期の治癒率よりもはるかに高いが、早期食道癌には明らかで特異的な症状がないため、ほとんどの被験者は診断時に中期及び後期に進展している。臨床研究では、癌の病巣形成の始まりから被験者に臨床症状が現れるまでには平均で数年かかることがわかり、これにより、早期食道癌の検出と早期食道癌の診断率の向上に有効なウィンドウズ期間が提供される。このウィンドウ期間を最大限に活用することで、食道癌の治療効果を向上させ、食道癌の死亡率を低下させることが期待できる。
【０００４】
食道癌診断技術の現在の臨床応用は、主に次の理由により、早期食道癌の検出とスクリーニングでは限定されている。１）組織生検は侵襲性が高く、早期癌スクリーニングには適していないこと、２）画像検出技術（たとえば、食道造影検査及び内視鏡検査）機器のコスト、操作技術、及び侵襲性の制限のため、癌スクリーニング技術として広く普及させることが難しい。３）従来の血清腫瘍マーカー（たとえば、ＡＦＰ、ＣＥＡ、ＣＡ１２５やＣＡ１９９など）は、食道癌の検出に対する感度が低く、早期癌スクリーニングの要件を完全に満たすことができない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
以上に鑑み、検出しにくく、感度が低く、コストが高いという従来の食道癌検出技術の問題に対して、本発明は、食道癌を検出するための組成物を提供する。本発明による組成物は、食道癌を高感度且つ特異的に検出することができ、本発明は、前記組成物を含むキット及び食道癌検出におけるその使用をさらに提供する。本発明によるキットは、食道癌検出感度が良好であり、食道癌を簡便、迅速かつ効果的に検出できる。
【０００６】
本発明は、食道癌をインビトロで検出するための組成物、キット及びその使用、並びにこのキットによる検出方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
具体的には、本発明は以下の内容に関する。
１．  食道癌をインビトロで検出するための組成物であって、
ＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のうちの１種又は２種である標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸を含む組成物。
２．  前記ＭＴ１Ａ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示される、項１に記載の組成物。
３．  前記ＥＰＯ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示される、項１に記載の組成物。
４．  前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
前記標的遺伝子的ターゲット配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片を含み、
前記断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
５．  前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記標的遺伝子のターゲット配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片を含み、
前記断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
６．  標的遺伝子のターゲット配列の５位非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する試薬をさらに含む、項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
７．  前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーをさらに含む、項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
８．  前記少なくとも９個のヌクレオチドの断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の配列、若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列であり、
前記少なくとも１５個のヌクレオチドの断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の配列であり、
ブロッカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の配列である、項７に記載の組成物。
９．  食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片を含むオリゴヌクレオチド。
１０．  中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片をさらに含む、項９に記載のオリゴヌクレオチド。
１１．  非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーをさらに含む、項１０に記載のオリゴヌクレオチド。
１２．  食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の配列を含むオリゴヌクレオチド。
１３．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の配列をさらに含む、項１２に記載のオリゴヌクレオチド。
１４．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列をさらに含む、項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
１５．  食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列を含むオリゴヌクレオチド。
１６．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の配列をさらに含む、項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
１７．  ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の配列をさらに含む、項１６に記載のオリゴヌクレオチド。
１８．  食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製におけるＭＴ１Ａ遺伝子の使用。
１９．  食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製におけるＥＰＯ遺伝子の使用。
２０．  項１〜８のいずれか１項に記載の組成物又は項９〜１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
２１．  別の成分としてヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及び前記ＤＮＡポリメラーゼの機能に必要なバッファから選ばれる少なくとも１種をさらに含む、項２０に記載のキット。
２２．  プロトコルをさらに含む、項２０又は２１に記載のキット。
２３．  食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製における、項１〜８のいずれか１項に記載の組成物又は項９〜項１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
２４．  前記食道癌をインビトロで検出するためのキットは、
１）標的遺伝子のターゲット配列又はその断片を含むＤＮＡサンプルを検出対象生体サンプルから分離するステップと、
２）前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップと、
３）前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の検出結果に基づいて生体サンプルの状態を判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップと、を含む方法により食道癌を検出する、項１８、１９及び２３のいずれか１項に記載の使用。
２５．  前記方法は、
検出対象生体サンプルのゲノムＤＮＡを抽出するステップと、
抽出したゲノムＤＮＡを試薬で処理して、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したＤＮＡサンプルをＤＮＡポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、ＤＮＡ重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、を含む、項２４に記載の使用。
２６．  前記試薬は亜硫酸水素塩試薬である、項２５に記載の使用。
２７．  食道癌の検出方法であって、
標的遺伝子のターゲット配列又はその断片を含むＤＮＡサンプルを検出対象生体サンプルから分離するステップと、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップと、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の検出結果に基づいて生体サンプルの状態を判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップと、を含む食道癌の検出方法。
２８．  食道癌の検出方法であって、
検出対象生体サンプルのゲノムＤＮＡを抽出するステップと、
抽出したゲノムＤＮＡを試薬で処理して、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したＤＮＡサンプルをＤＮＡポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、ＤＮＡ重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、を含む食道癌の検出方法。
２９．  前記標的遺伝子はＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のうちの１種又は２種である、項２７又は２８に記載の方法。
３０．  前記ＭＴ１Ａ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示される、項２９に記載の方法。
３１．  前記ＥＰＯ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示される、項２９に記載の方法。
３２．  前記試薬は亜硫酸水素塩試薬である、項２８に記載の方法。
３３．  前記プライマーは、
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片である、項２８に記載の方法。
３３．  前記ブロッカーは非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーである、項２８に記載の方法。
３４．  前記プローブは、
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片である、項２８に記載の方法。
３５．  前記プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の配列、若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列である、項３３に記載の方法。
３６．  前記ブロッカーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の配列である、項３３に記載の方法。
３７．  前記プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の配列である、項３４に記載の方法。
３８．  食道癌をインビトロで検出するための組成物であって、
ＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のうちの１種又は２種である標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出するための核酸と、
ＳＮＣＧ、即ちγシヌクレイン（γ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）である標的タンパク質の濃度を検出するための抗体と、を含む組成物。
３９．  前記ＭＴ１Ａ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示される、項３８に記載の組成物。
４０．  前記ＥＰＯ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示される、項３８に記載の組成物。
４１．  前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出するための核酸は、
前記標的遺伝子のターゲット配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片を含み、
前記断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、項３８〜４０のいずれか１項に記載の組成物。
４２．  前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記標的遺伝子のターゲット配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片をさらに含み、
前記断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、項３８〜４１のいずれか１項に記載の組成物。
４３．  標的遺伝子のターゲット配列の５位非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する試薬をさらに含む、項３８〜４２のいずれか１項に記載の組成物。
４４．  前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーをさらに含む、項３８〜４３のいずれか１項に記載の組成物。
４５．  前記少なくとも９個のヌクレオチドの断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の配列、若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列であり、
前記少なくとも１５個のヌクレオチドの断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の配列であり、
ブロッカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の配列である、項４４に記載の組成物。
４６．  標的タンパク質の濃度を検出するための試薬をさらに含み、前記試薬は酵素結合免疫吸着アッセイ試薬であり、たとえば、前記試薬は、標的タンパク質の濃度を検出するための抗体でコーティングされた反応プレート、ＳＮＣＧプロテアーゼコンジュゲート、基質液、洗浄液及び停止液を含む、項３８〜４５のいずれか１項に記載の組成物。
４７．  項３８〜４６のいずれか１項に記載の組成物又は項９〜１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
４８．  別の成分としてヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及び前記ＤＮＡポリメラーゼの機能に必要なバッファから選ばれる少なくとも１種、及び
標的タンパク質の濃度を検出するための抗体でコーティングされた反応プレート、ＳＮＣＧプロテアーゼコンジュゲート、基質液、洗浄液及び停止液を含む、項４７に記載のキット。
４９．  プロトコルをさらに含む、項４７又は４８前記的キット。
５０．  食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製における、項３８〜４６のいずれか１項に記載の組成物又は項９〜項１７のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドの使用。
５１．  前記食道癌をインビトロで検出するためのキットは、
被験者の生体サンプル中の前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップ１）と、
被験者の生体サンプル中の前記標的タンパク質の濃度を決定するステップ２）と、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と標的タンパク質の濃度の両方の検出結果に基づいて被験者が食道癌に罹ったか否かを判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップ３）と、を含む方法により食道癌を検出する、項１８、１９及び５０のいずれか１項に記載の使用。
５２．  前記方法は、
被験者の末梢血を採取して、血漿又は血清を分離するステップと、
血漿又は血清中の遊離ＤＮＡを抽出するステップと、
抽出した遊離ＤＮＡを試薬で処理して、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したＤＮＡサンプルをＤＮＡポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、ＤＮＡ重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、
ＳＮＣＧ抗体を用いて、免疫反応により血漿又は血清中のＳＮＣＧの濃度を決定するステップと、を含む、項５１に記載の使用。
５３．  前記試薬は亜硫酸水素塩試薬である、項５２に記載の使用。
５４．  食道癌の検出方法であって、
被験者から生体サンプルを採取するステップと、
被験者の生体サンプル中の前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップと、
被験者の生体サンプル中の前記標的タンパク質の濃度を決定するステップと、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と標的タンパク質の濃度の両方の検出結果に基づいて被験者が食道癌に罹ったか否かを判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップと、を含む食道癌の検出方法。
５５．  食道癌の検出方法であって、
被験者の末梢血を採取して、血漿又は血清を分離するステップと、
血漿又は血清中の遊離ＤＮＡを抽出するステップと、
５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換するステップと、
試薬で処理したＤＮＡサンプルをＤＮＡポリメラーゼ及び標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーの存在下で、ＤＮＡ重合反応を行うステップと、
プローブを用いて増幅産物を検出するステップと、
前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定するステップと、
ＳＮＣＧ抗体を用いて、免疫反応により血漿又は血清中のＳＮＣＧの濃度を決定するステップと、を含む食道癌の検出方法。
５６．  前記標的遺伝子はＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のうちの１種又は２種であり、
前記標的タンパク質はＳＮＣＧである、項５４又は５５に記載の方法。
５７．  前記ＭＴ１Ａ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示される、項５６に記載の方法。
５８．  前記ＥＰＯ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示される、項５６に記載の方法。
５９．  前記試薬は亜硫酸水素塩試薬である、項５５に記載の方法。
６０．前記プライマーは、
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片である、項５５に記載の方法。
６１．  前記ブロッカーは非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーである、項５５に記載の方法。
６２．  前記プローブは、
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片である、項５５に記載の方法。
６３．  前記プライマーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の配列、若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列である、項６０に記載の方法。
６４．  前記ブロッカーはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の配列である、項６１に記載の方法。
６５．  前記プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の配列である、項６２に記載の方法。
【発明の効果】
【０００８】
本発明者らは、エピゲノミクス及びバイオインフォマティクス技術を使用して、食道癌組織及び傍癌性対照組織の全ゲノムのメチル化データを分析した結果、食道癌に関連する２つのメチル化遺伝子を見つけ、これら２つの食道癌メチル化遺伝子のメチル化異常が生じたターゲット配列を決定し、さらに、本発明者らは、これら２つの食道癌メチル化遺伝子のターゲット配列によりこれら２つの遺伝子のメチル化状態を高感度かつ特異的に検出できるため、それにより末梢血中の遊離ＤＮＡの検出に使用できることを見出した。食道癌患者及び正常対照個体の末梢血サンプルを検出した結果、本発明に記載の組成物及び検出方法が、２つの異なる細胞型の一般的な食道癌である扁平上皮癌及び腺癌を含む食道癌を高感度かつ特異的に検出できることを示している。したがって、本発明は、食道癌をインビトロで検出するための組成物及び検出方法を提供し、重要な臨床応用価値を有する。
【０００９】
さらに、本発明者らは、多くの腫瘍タンパク質マーカーのうち、ＳＮＣＧタンパク質と前記標的遺伝子のメチル化の両方を検出することにより食道癌の検出を著しく改善できることを見出した。したがって、本発明は、食道癌をインビトロで検出するための組成物及び検出方法を提供し、重要な臨床応用価値を有する。
【００１０】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の特定の説明及び特許請求の範囲によって詳細に説明される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
本発明の上記及び他の特徴は、図面及び詳細な説明を参照して以下でさらに説明される。なお、これらの図面は、本発明のいくつかの例示的な実施形態を示すだけであり、したがって、本発明の保護の範囲を限定するものと見なされるべきではない。特に明記しない限り、図面は必ずしも縮尺通りではなく、同様の符号は同様の構成要素を示す。
【図１】本発明の標的遺伝子のスクリーニング結果を示すグラフである。
【図２】本発明による組成物及び検出方法を使用して、白血球ゲノムＤＮＡ（標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の陰性コントロール）及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼで処理した白血球ゲノムＤＮＡ（標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の陽性コントロール）の検出である。その結果、本発明による組成物及び検出方法では、白血球ゲノムＤＮＡの検出結果が陰性であり、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼで処理した白血球ゲノムＤＮＡの検出結果が陽性である。
【図３】前記組成物及び検出方法を使用して、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出することにより、食道癌を非侵襲的にインビトロで検出した結果を示すグラフである。
【図４】前記組成物及び検出方法を用いて、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態及び標的タンパク質の濃度を検出することにより、食道癌を非侵襲的にインビトロで検出した結果を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
一態様では、本発明は、食道癌をインビトロで検出するための組成物を提供し、前記組成物は、ＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のうちの１種又は２種である標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出するための核酸と、ＳＮＣＧである標的タンパク質の濃度を検出するための抗体と、を含む。
【００１３】
本発明は、食道癌において異常なメチル化が生じた、ＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のターゲット配列を含む標的遺伝子のターゲット配列を提供し、ＭＴ１Ａ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−２に示され、ＥＰＯ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３−４に示される。
【００１４】
ＭＴ１Ａ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示される。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １
ＣＡＣＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＴＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＴＣＡＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＴＣＣＴＴＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣ
【００１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の相補的配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２
ＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＧＣＣＧＧＡＣＧＣＡＡＡＧＧＡＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＴＧＡＧＴＣＣＧＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＧＧＴＧ
【００１６】
好ましくは、ＥＰＯ遺伝子的ターゲット配列の配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示される。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３
ＣＧＣＧＣＡＣＧＣＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＧＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣＧＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＧＧＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＧ
【００１７】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の相補的配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される。
ＣＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＴＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＣＧＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＴＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＣＧＣＧ
【００１８】
好ましくは、標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、標的遺伝子のターゲット配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片を含み、前記断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む。いくつかの好ましい実施形態では、亜硫酸水素塩(バイサルファイト)を使用して検出対象サンプルのＤＮＡを変換する場合、標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、標的遺伝子のターゲット配列を亜硫酸水素塩で変換した配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片を含み、前記ヌクレオチドの断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む。
【００１９】
より好ましくは、標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記標的遺伝子のターゲット配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片を含み、前記ヌクレオチドの断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む。いくつかの好ましい実施形態では、たとえば、亜硫酸水素塩を使用して検出対象サンプルのＤＮＡを変換する場合、標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で、標的遺伝子のターゲット配列を亜硫酸水素塩で変換した配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片を含み、前記ヌクレオチドの断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
好ましくは、前記組成物は、標的遺伝子のターゲット配列の５位非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する試薬をさらに含む。より好ましくは、前記試薬は亜硫酸水素塩である。
【００２１】
好ましくは、標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、非メチル化状態のＤＮＡと優先的に結合するブロッカーをさらに含む。
【００２２】
好ましくは、前記組成物は、以下のプライマー、プローブ及び／又はブロッカーのうちの１種又は複数種を含む。
ＭＴ１Ａプライマー  Ｆ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５
ＣＧＧＡＣＧＴＡＡＡＧＧＡＴＴＣ
ＭＴ１Ａプライマー  Ｒ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６
ＧＡＡＡＣＧＡＡＣＴＣＧＡＣＴＡＡＡＣＧ
ＭＴ１Ａプローブ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７
ＴＧＣＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＧＴＴＴＣＧ
ＭＴ１Ａブロッカー
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８
ＣＡＡＡＣＴＣＡＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣ
ＥＰＯプライマー  Ｆ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９
ＡＧＴＣＧＴＡＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴ
ＥＰＯプライマー  Ｒ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０
ＣＡＡＣＧＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧ
ＥＰＯプローブ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１
ＣＧＣＡＡＣＧＡＡＣＧＡＣＣＧＡ
ＥＰＯブロッカー
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２
ＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧ
【００２３】
別の態様では、本発明は、食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドを提供し、このオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片を含む。
【００２４】
好ましくは、食道癌をインビトロで検出するためのこのオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列を亜硫酸水素塩で変換した配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片、及び／又は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列を亜硫酸水素塩で変換した配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片を含む。
【００２５】
本発明の食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドは、中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は、中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片をさらに含む。
【００２６】
好ましくは、食道癌をインビトロで検出するためのこのオリゴヌクレオチドは、中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列を亜硫酸水素塩で変換した配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は、中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列を亜硫酸水素塩で変換した配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片を含む。
【００２７】
本発明の食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドは、非メチル化状態のＤＮＡと優先的に結合するブロッカーをさらに含む。
【００２８】
一つの具体的な実施形態では、食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の配列を含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の配列をさらに含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列をさらに含む。
【００２９】
別の具体的な実施形態では、食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０の配列を含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１の配列をさらに含む。ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の配列をさらに含む。
【００３０】
別の態様では、本発明は、前記組成物を含むキットを提供する。このキットは、別の成分として、ヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及び前記ＤＮＡポリメラーゼの機能に必要なバッファから選ばれた少なくとも１種をさらに含む。
【００３１】
本発明の食道癌をインビトロで検出するための組成物は、標的タンパク質の濃度を検出するための抗体をさらに含み、前記標的タンパク質はγシヌクレイン（ＳＮＣＧ）である。
【００３２】
本発明は、さらに、食道癌をインビトロで検出するためのキットの調製における、ＭＴ１Ａ遺伝子、ＥＰＯ遺伝子、ＳＮＣＧタンパク質の使用に関する。
【００３３】
なお、前記ＭＴ１Ａは、メタロチオネイン１Ａであり、英語名がｍｅｔａｌｌｏｔｈｉｏｎｅｉｎ  １Ａであり、ヒト１６番染色体のｑ１３領域にあり、メタロチオネイン遺伝子ファミリーに属している。メタロチオネインは、システインを豊富に含み、芳香族基を含むアミノ酸を欠き、２価の重金属イオンを結合できる小分子タンパク質である。メタロチオネインは、ヒドロキシル基を含むフリーラジカルによる損傷から細胞を保護し、細胞内の金属イオンのバランスを維持し、重イオンの毒性を取り除く役割を果たしている酸化防止剤である。メタロチオネイン遺伝子機能の喪失は、癌や他の病理学的現象の発生につながる。
【００３４】
前記ＥＰＯ遺伝子はエリスロポエチン遺伝子であり、英語名がｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎであり、ヒト７番染色体のｑ２２．１領域にある。この遺伝子によってコードされるタンパク質は、細胞によって分泌されるグリコシル化サイトカイン（ｃｙｔｏｋｉｎｅ）である。エリスロポエチンは、対応する受容体に結合されると、赤血球の合成を促進することができる。
【００３５】
前記ＳＮＣＧタンパク質は、ＳＮＣＧ遺伝子の産物であるシヌクレイン−γである。ＳＮＣＧ遺伝子の英語名はｓｙｎｕｃｌｅｉｎ  ｇａｍｍａであり、ヒト１０番染色体のｑ２３．２領域にある。この遺伝子はシヌクレイン遺伝子ファミリーのメンバーであり、そのタンパク質配列は次のとおりである。
【００３６】
ＳＮＣＧ遺伝子によってコードされるタンパク質のアミノ酸配列：
ＭＤＶＦＫＫＧＦＳＩＡＫＥＧＶＶＧＡＶＥＫＴＫＱＧＶＴＥＡＡＥＫＴＫＥＧＶＭＹＶＧＡＫＴＫＥＮＶＶＱＳＶＴＳＶＡＥＫＴＫＥＱＡＮＡＶＳＥＡＶＶＳＳＶＮＴＶＡＴＫＴＶＥＥＡＥＮＩＡＶＴＳＧＶＶＲＫＥＤＬＲＰＳＡＰＱＱＥＧＥＡＳＫＥＫＥＥＶＡＥＥＡＱＳＧＧＤ
【００３７】
さらなる態様では、本発明は、食道癌をインビトロで検出する方法を提供し、前記方法は、
検出対象生体サンプル中の標的遺伝子のターゲット配列又はその断片を分離するステップ１）と、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップ２）と、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の検出結果に基づいて生体サンプルの状態を判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップ３）と、を含む。
【００３８】
いくつかの好ましい実施形態によれば、前記方法は、以下のステップ１）〜ステップ５）をさらに含む。
１）検出対象生体サンプルのゲノムＤＮＡを抽出する。
２）ステップ１）で得たＤＮＡサンプルを試薬で処理して、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換し、即ち、標的遺伝子のターゲット配列の５位非メチル化シトシン塩基はウラシル又はほかの塩基に変換され、変換された塩基は、ハイブリッド性能が５位非メチル化シトシン塩基と異なり、且つ検出可能である。
３）ステップ２）で処理したＤＮＡサンプルをＤＮＡポリメラーゼ及び前記標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列を増幅させて増幅産物を生成するか、又は増幅させない。前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはＤＮＡ重合反応が生じると、増幅産物が発生し、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはＤＮＡ重合反応が生じないと、増幅させない。
４）プローブを用いて増幅産物を検出する。
５）前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定する。
【００３９】
さらなる態様では、本発明は、食道癌のインビトロ検出方法を提供し、前記方法は、
被験者の生体サンプル中の前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を決定するステップ１）と、
被験者の生体サンプル中の前記標的タンパク質の濃度を決定するステップ２）と、
前記標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と標的タンパク質の濃度の両方の検出結果に基づいて被験者が食道癌に罹ったか否かを判断することにより、食道癌のインビトロ検出を完了するステップ３）と、を含む。
【００４０】
生体サンプルは被験者の末梢血から分離した血漿又は血清である。
【００４１】
いくつかの好ましい実施形態によれば、前記方法は、以下のステップ１）〜ステップ７）をさらに含む。
１）被験者の末梢血を採取して、血漿又は血清を分離する。
２）血漿又は血清中の遊離ＤＮＡを抽出する。
３）ステップ２）で得た遊離ＤＮＡを試薬で処理して、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換し、即ち、標的遺伝子のターゲット配列の５位非メチル化シトシン塩基はウラシル又はほかの塩基に変換され、変換された塩基は、ハイブリッド性能が５位非メチル化シトシン塩基と異なり、検出可能である。
４）ステップ３）で処理した遊離ＤＮＡをＤＮＡポリメラーゼ及び前記標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列を増幅させて増幅産物を生成するか、又は増幅させない。前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはＤＮＡ重合反応が生じると、増幅産物が発生し、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはＤＮＡ重合反応が生じないと、増幅させない。
５）プローブを用いて増幅産物を検出する。
６）前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定する。
７）ＳＮＣＧ抗体を用いて、免疫反応により血漿又は血清中のＳＮＣＧの濃度を決定する。
【００４２】
好ましくは、典型的なプライマーは、前記標的遺伝子のターゲット配列の断片を含み、前記標的遺伝子のターゲット配列の断片は、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３−４から選ばれる配列に相当する、相補的である、又は中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも９個のヌクレオチドの断片を含む。
【００４３】
好ましくは、典型的なプローブは、前記標的遺伝子のターゲット配列の断片であり、前記標的遺伝子のターゲット配列の断片は、それぞれ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３−４から選ばれる配列に相当する、相補的である、又は中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする少なくとも１５個のヌクレオチドの断片を含む。
【００４４】
好ましくは、典型的なブロッカーは、好ましくは、優先的に非メチル化状態のＤＮＡに結合するブロッカーである。
【００４５】
好ましくは、前記プライマー、プローブ及び／又はブロッカーのうちの１種又は複数種は、以下に示される。
ＭＴ１Ａプライマー  Ｆ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５
ＣＧＧＡＣＧＴＡＡＡＧＧＡＴＴＣ
ＭＴ１Ａプライマー  Ｒ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６
ＧＡＡＡＣＧＡＡＣＴＣＧＡＣＴＡＡＡＣＧ
ＭＴ１Ａプローブ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７
ＴＧＣＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＧＴＴＴＣＧ
ＭＴ１Ａブロッカー
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８
ＣＡＡＡＣＴＣＡＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣ
ＥＰＯプライマー  Ｆ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９
ＡＧＴＣＧＴＡＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴ
ＥＰＯプライマー  Ｒ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０
ＣＡＡＣＧＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧ
ＥＰＯプローブ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１
ＣＧＣＡＡＣＧＡＡＣＧＡＣＣＧＡ
ＥＰＯブロッカー
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２
ＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧ
【００４６】
さらに、前記接触又は増幅は、以下の方法の少なくとも１種を使用することを含む。前記増幅酵素として熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用すること、５−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用すること、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を使用すること、検出可能な標識付きの増幅産物である核酸分子を生成すること。
【００４７】
いくつかの好ましい実施形態によれば、前記標的遺伝子のターゲット配列中の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態は、ＰＣＲ反応のサイクル閾値Ｃｔ値によって決定される。ＰＣＲ反応を使用して生体サンプル中のＤＮＡを分析する方法により、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の検出を簡単に行うことができ、ＰＣＲ反応のサイクル閾値に基づいて、検出対象サンプルが陽性であるかを迅速かつ簡便に判断でき、このため、食道癌を非侵襲的かつ迅速にインビトロで検出する方法を提供している。
【００４８】
前記生体サンプルは、細胞株、組織学的切片、組織生検／パラフィン包埋組織、体液、糞便、結腸流出物、尿、血漿、血清、全血、分離された血液細胞、及び血液から分離された細胞、又はこれらの組み合わせから選択される。前記生体サンプルは、末梢血、全血、血漿、又は血清から選択される。
【００４９】
本発明は、前記組成物を含むキットをさらに提供する。典型的には、前記キットは、被験者の生体サンプルを収納するための容器を含む。さらに、前記キットには、検出結果の使用と解釈に関する説明も含まれている。
【００５０】
本発明は、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態及び標的タンパク質の濃度を検出することにより、食道癌を非侵襲的にインビトロで検出する方法を提供する。本発明者は、食道癌組織におけるＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と正常な食道組織における前記遺伝子のターゲット配列のメチル化状態との間に有意差があることを見出し、食道癌組織では、ＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のターゲット配列にメチル化が発生しているのに対して、正常な食道組織では、ＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のターゲット配列にメチル化が発生していない。したがって、本出願は、サンプル中のＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出することにより食道癌をインビトロで検出する方法を提供し、本発明による方法は、食道癌を非侵襲的かつ迅速に検出できる。
【００５１】
本発明者はさらに、標的遺伝子のターゲット配列のみのメチル化状態の検出と比較して、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と標的タンパク質の濃度の両方を検出すると、検出の特異性に明らかな影響を与えずに食道癌の検出率を大幅に向上させることを見出した。したがって、本出願は、サンプル中のＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のターゲット配列のメチル化状態及びＳＮＣＧタンパク質の濃度を検出することにより、食道癌をインビトロで検出する方法を提供する。本発明による方法は、食道癌を非侵襲的かつ迅速に検出できる。
【００５２】
特に定義されない限り、本明細書における技術用語及び科学用語は、当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。ここで説明したものと類似又は同一の方法と材料は、実験又は実際の応用で使用できるが、以下、材料と方法について説明する。矛盾する場合、本明細書に記載の定義を基準とし、また、材料、方法、及び例は、例示のみを目的としており、限定的なものではない。
【００５３】
本発明は、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態及び標的タンパク質の濃度を高感度かつ特異的に検出できる組成物、及び食道癌を非侵襲的にインビトロ検出するための方法とキットをさらに提供する。
【００５４】
以下、本発明の組成物、キット、核酸配列及び検出方法の実施例を説明する。第１実施形態は、標的遺伝子及び標的遺伝子のターゲット配列を開示し、第２実施形態は、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出するための核酸を含む、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出するための組成物を開示し、第３実施形態は、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態及び標的タンパク質の濃度を検出することにより、食道癌を非侵襲的にインビトロで検出する方法を開示する。
【００５５】
好ましくは、前記核酸検出配列は、前記標的遺伝子のターゲット配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片を含み、前記ヌクレオチドの断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、いくつかの好ましい実施形態では、たとえば、亜硫酸水素塩を使用して検出対象サンプルのＤＮＡを変換する場合、前記核酸検出配列は、標的遺伝子のターゲット配列を亜硫酸水素塩で変換した配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片を含み、前記ヌクレオチドの断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む。
【００５６】
より好ましくは、前記核酸検出配列は、中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で標的遺伝子のターゲット配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片を含み、前記ヌクレオチドの断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、いくつかの好ましい実施形態では、たとえば、亜硫酸水素塩を使用して、検出対象サンプルのＤＮＡを変換する場合、前記核酸検出配列は、中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で標的遺伝子のターゲット配列を亜硫酸水素塩で変換した配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片を含み、前記ヌクレオチドの断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、前記組成物は、遺伝子の５位非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する試薬をさらに含む。好ましくは、該試薬は亜硫酸水素塩である。ＤＮＡの亜硫酸水素塩による修飾は、ＣｐＧのメチル化状態を評価するための既知のツールである。真核細胞のＤＮＡでは、５−メチルシトシンが最も一般的な共有塩基修飾である。５−メチルシトシンとシトシンは同じ塩基ペアリング挙動をするため、５−メチルシトシンはシーケンシングにより同定できない。さらに、ＰＣＲ増幅中に、５−メチルシトシンに備えるエピジェネティックな情報は完全に失われる。ＤＮＡ中の５−メチルシトシンの存在を分析するために最も一般的に使用される方法は、亜硫酸水素塩とシトシンの特異的反応に基づくことであり、その後のアルカリ加水分解の後、メチル化されていないシトシンはペアリング挙動としてチミンに対応するウラシルに変換されるが、これらの条件下では５−メチルシトシンは未修飾のままである。その結果、元のＤＮＡがこのように変換されることによって、以前はハイブリダイゼーション挙動としてシトシンと区別できなかった５−メチルシトシンが、従来の既知の分子生物学技術たとえば増幅及びハイブリダイゼーションによって、残りのシトシンとして検出できるようになる。これらの技術はすべて、さまざまな塩基ペアリング特性に基づいており、完全に利用できるようになる。したがって、典型的には、本出願は、標的遺伝子のターゲット配列内のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を決定するための、亜硫酸水素塩技術と１つ又は複数のメチル化測定技術との組み合わせを提供する。さらに、本発明の方法は、血液又は糞便中の低濃度腫瘍細胞などの不均一な生体サンプルの分析に適している。したがって、そのようなサンプル中のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を分析する場合、当業者は定量的アッセイを使用して、特定のＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態ではなくメチル化レベル（たとえば、パーセンテージ、部数、比率、割合及び程度）を決定することができる。それに対応して、メチル化状況又はメチル化状態という用語はまた、ＣｐＧジヌクレオチド配列のメチル化状態を反映する値を指すこともある。
【００５８】
いくつかの実施形態では、本出願の方法は、具体的には、ステップ１）〜ステップ５）を含む。１）検出対象生体サンプルのゲノムＤＮＡを抽出する。２）ステップ１）で得たＤＮＡサンプルを試薬で処理して、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換し、即ち、標的遺伝子のターゲット配列の５位非メチル化シトシン塩基はウラシル又はほかの塩基に変換され、変換された塩基は、ハイブリッド性能が５位非メチル化シトシン塩基と異なり、且つ検出可能である。３）ステップ２）で処理したＤＮＡサンプルをＤＮＡポリメラーゼ及び前記標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列を増幅させて増幅産物を生成するか、又は増幅させない。前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはＤＮＡ重合反応が生じると、増幅産物が発生し、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはＤＮＡ重合反応が生じないと、増幅させない。４）プローブを用いて増幅産物を検出する。５）前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定する。
【００５９】
いくつかの実施形態では、本出願の方法は、具体的には、ステップ１）〜ステップ７）を含む。１）被験者の末梢血を採取する。２）血漿又は血清中の遊離ＤＮＡを抽出する。３）ステップ２）で得た遊離ＤＮＡを試薬で処理して、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル又はほかの塩基に変換し、即ち、標的遺伝子のターゲット配列の５位非メチル化シトシン塩基はウラシル又はほかの塩基に変換され、変換された塩基は、ハイブリッド性能が５位非メチル化シトシン塩基と異なり、検出可能である。４）ステップ３）で処理したＤＮＡサンプルをＤＮＡポリメラーゼ及び前記標的遺伝子のターゲット配列のプライマーと接触させ、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列を増幅させて増幅産物を生成するか、又は増幅させない。前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはＤＮＡ重合反応が生じると、増幅産物が発生し、前記処理した標的遺伝子のターゲット配列にはＤＮＡ重合反応が生じないと、増幅させない。５）プローブを用いて増幅産物を検出する。６）前記増幅産物が存在するか否かに基づいて、前記標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態を決定する。７）ＳＮＣＧ抗体を用いて、免疫反応（好ましくは、酵素結合免疫吸着アッセイ、ＥＬＩＳＡ）により血漿又は血清中の標的タンパク質の濃度を決定する。
【００６０】
典型的には、前記接触又は増幅は、以下の方法の少なくとも１種を使用することを含む。前記増幅酵素として熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを使用すること、５−３’エキソヌクレアーゼ活性を欠くポリメラーゼを使用すること、ＰＣＲを使用すること、検出可能な標識付きの増幅産物である核酸分子を生成すること。好ましくは、ＰＣＲ方式によりメチル化状態を測定し、たとえば「蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ技術」、メチル化感受性単一ヌクレオチドプライマー伸長反応（Ｍｓ−ＳＮｕＰＥ）、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）やメチル化ＣｐＧアイランド増幅（ＭＣＡ）などの測定方法は、標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態の測定に用いられる。その中でも、「蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ」アッセイは、蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ（ＴａｑＭａｎ）技術を用いたハイスループットの定量的メチル化の測定であり、ＰＣＲステップの後にさらなる操作を必要としない。簡単に言えば、「蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ」方法は、ゲノムＤＮＡの混合サンプルから始まり、この混合サンプルは標準的な操作に従って亜硫酸水素ナトリウムによる反応でメチル化依存性配列差のある混合プールに変換される。次に、蛍光に基づいたＰＣＲを「バイアス」（ｂｉａｓｅｄ）反応（既知のＣｐＧジヌクレオチドと重複したＰＣＲプライマーを使用）で行う。配列差は、増幅レベルと蛍光検出増幅レベルで発生し得る。「蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ」アッセイは、ゲノムＤＮＡサンプルのメチル化状態の定量的テストとして使用でき、ここで、プローブハイブリダイゼーションのレベルで配列の区別が行われる。この定量化方式では、特定のＣｐＧジヌクレオチドと重複した蛍光プローブの存在下で、ＰＣＲ反応によりメチル化に特異的な増幅が行われる。開始ＤＮＡ量用のバイアスなし対照は、プライマーもプローブもいずれのＣｐＧジヌクレオチドも覆わない反応によって提供される。「蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ」方法は、「ＴａｑＭａｎ」、「Ｌｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒ」などの任意の適切なプローブとともに使用できる。ＴａｑＭａｎプローブは、蛍光レポーター（Ｒｅｐｏｒｔｅｒ）とクエンチャー（Ｑｕｅｎｃｈｅｒ）で二重標識されており、ＧＣ含有量が比較的高い領域に特異的に設計され、それによって、それは、ＰＣＲサイクルでフォワードプライマー又はリバースプライマーよりもおよそ１０℃高くなる温度で溶ける。これにより、ＴａｑＭａｎプローブは、ＰＣＲアニーリング／伸長ステップに完全にハイブリダイズしたままである。ＴａｑポリメラーゼがＰＣＲで新しい鎖を酵素的に合成するとき、最終的にアニールされたＴａｑＭａｎプローブに遭遇する。次に、Ｔａｑポリメラーゼの５から３’エンドヌクレアーゼ活性は、ＴａｑＭａｎプローブを消化することによってＴａｑＭａｎプローブを置換し、それにより、蛍光レポーター分子を放出して、リアルタイム蛍光検出システムを使用して現在クエンチされていない信号を定量的に検出する。「蛍光に基づいたリアルタイムＰＣＲ」分析用の典型的な試薬には、標的遺伝子のターゲット配列用のＰＣＲプライマー、非特異的増幅ブロッカー、ＴａｑＭａｎ又はＬｉｇｈｔｃｙｃｌｅｒプローブ、最適化されたＰＣＲバッファー、デオキシヌクレオチド、及びＴａｑポリメラーゼなどが含まれるが、これらに限定されない。
【００６１】
その中で、ＳＮＣＧ抗体を用いて、免疫反応により血漿又は血清中のＳＮＣＧの濃度を決定することは、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって血清中のＳＮＣＧタンパク質の発現レベルを検出することである。
【００６２】
好ましくは、前記ＥＬＩＳＡは「サンドイッチ法」であり、具体的には、該方法は、以下のステップを含む。
１）ＳＮＣＧモノクローナル抗体（マウス）で９６ウェルプレートをコーティングする。
２）１０倍希釈された臨床血清サンプル又は血漿サンプルと階段希釈されたヒトＳＮＣＧタンパク質溶液を加える。
３）ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）標識マウス抗ヒトＳＮＣＧのポリクローナル抗体（ＩｇＧ）を各ウェルに加える。
４）上記混合物を含む免疫反応プレートを、振盪条件下、室温でインキュベートし、洗浄液で反応ウェルを洗浄した後、発色基質を加える。
５）停止液を加えて発色反応を停止させた後、プレートリーダーを使用して各反応ウェルのスペクトルを検出する。
６）階段希釈されたヒトＳＮＣＧタンパク質溶液の検出値を使用して標準曲線を確立し、標準曲線に基づいて臨床血清サンプルを定量化する。
【００６３】
本発明の具体的な実施形態では、特定の数の食道癌サンプル及び正常サンプルのＳＮＣＧ遺伝子の血清又は血漿タンパク質レベルに基づいて、ＳＮＣＧ遺伝子の血清又は血漿タンパク質レベルに対する食道癌及び正常の臨界値が決定される。
【実施例】
【００６４】
実施例１
食道癌組織２３３例と正常な食道組織１７１例の全ゲノムのメチル化チップ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ社製のＨｕｍａｎＭｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ４５０ｋチップ）のデータを分析したことにより、本発明者は、食道癌組織におけるＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のメチル化レベルが正常な食道組織（分析結果は図１に示される）のそれよりも有意に高いことを見出した。さらに、本発明者は、全ゲノムメチル化チップ上のＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のプローブ配列及び対応するメチル化率のデータを分析したことにより、食道癌組織及び正常な食道組織でメチル化の差異が最も明らかなこれらの２つの標的遺伝子の配列断片を見つけ、この配列断片を、これら２つの標的遺伝子のターゲット配列として決定した。
【００６５】
ＭＴ１Ａ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示される。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １
ＣＡＣＣＣＡＧＧＧＧＡＧＣＴＣＡＧＴＧＧＡＣＴＧＴＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＴＧＣＧＣＡＡＡＧＣＣＣＡＧＴＣＣＡＧＧＴＣＡＴＣＡＣＣＴＣＧＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＣＴＣＡＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＧＧＧＣＧＧＧＴＣＣＴＴＴＧＣＧＴＣＣＧＧＣＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡＣＣＡＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣ
【００６６】
ＭＴ１Ａ遺伝子的ターゲット配列の相補的配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に示される。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ２
ＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＴＧＧＴＣＡＧＧＧＧＡＡＡＧＡＧＧＧＣＣＧＧＡＣＧＣＡＡＡＧＧＡＣＣＣＧＣＣＣＴＧＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＴＧＡＧＴＣＣＧＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＴＣＣＧＣＣＣＣＧＣＣＣＧＡＧＧＴＧＡＴＧＡＣＣＴＧＧＡＣＴＧＧＧＣＴＴＴＧＣＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＣＡＡＧＧＣＧＣＡＣＡＧＴＣＣＡＣＴＧＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＧＧＴＧ
【００６７】
ＥＰＯ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示される。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３
ＣＧＣＧＣＡＣＧＣＡＣＡＣＡＴＧＣＡＧＡＴＡＡＣＡＧＣＣＣＣＧＡＣＣＣＣＣＧＧＣＣＡＧＡＧＣＣＧＣＡＧＡＧＴＣＣＣＴＧＧＧＣＣＡＣＣＣＣＧＧＣＣＧＣＴＣＧＣＴＧＣＧＣＴＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣＧＣＧＣＴＧＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＧＣＣＧＧＡＣＣＧＧＧＧＣＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣＧＣＴＣＴＧＣＴＣＣＧＡＣＡＣＣＧＣＧＣＣＣＣＣＴＧＧＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＣＴＣＣＴＣＣＡＧＧＣＣＣＧＴＧＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＡＣＣＧＣＣＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＧＧＡＴＧＡＧＧＧＣＣＣＣＣＧＧＴＧＴＧＧＴＣＡＣＣＣＧＧＣＧＣＧＣＣＣＣＡＧＧＴＣＧ
【００６８】
ＥＰＯ遺伝子的ターゲット配列の相補的配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示される。
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４
ＣＧＡＣＣＴＧＧＧＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＴＧＡＣＣＡＣＡＣＣＧＧＧＧＧＣＣＣＴＣＡＴＣＣＣＧＧＧＡＡＧＣＴＣＧＧＣＧＧＴＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＣＣＣＣＡＣＧＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＡＧＧＧＣＧＧＣＴＧＴＣＣＡＧＧＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＴＣＧＧＡＧＣＡＧＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＧＴＧＧＣＣＣＣＧＧＴＣＣＧＧＣＴＣＣＧＧＧＡＧＧＡＣＡＧＣＧＣＧＧＴＧＣＧＧＣＧＣＡＧＣＧＣＡＧＣＧＡＧＣＧＧＣＣＧＧＧＧＴＧＧＣＣＣＡＧＧＧＡＣＴＣＴＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＣＧＧＧＧＧＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＴＣＴＧＣＡＴＧＴＧＴＧＣＧＴＧＣＧＣＧ
【００６９】
実施例２
ステップ１：分析対象となる生体サンプルのＤＮＡを得た。この供給源は、細胞株、組織学的切片、生検組織、パラフィン包埋組織、体液、糞便、尿、血漿、血清、全血、分離された血液細胞、血液から分離された細胞、及びこれらのすべての可能な組み合わせなど、任意の適切な由来であってもよい。次に、従来技術における任意の標準的な手段によってＤＮＡをサンプルから単離した。簡単に言えば、ＤＮＡが細胞膜に封入されたとき、この生体サンプルは、破壊されて、酵素的、化学的、又は機械的手段によって分解される必要がある。その後、タンパク質及び他の汚染物質をたとえば、プロテインキナーゼＫによる消化により除去した。次に、ＤＮＡを溶液から回収した。これは、塩析、有機抽出やＤＮＡの固体支持体への結合など、さまざまな方法で実現できる。方法の選択は、時間、コスト、必要なＤＮＡの量など、さまざまな要因の影響を受ける。前記サンプルＤＮＡが細胞膜に封入されていない場合（たとえば、血液サンプルからの循環ＤＮＡ）、従来技術におけるＤＮＡを分離及び／又は精製するための標準的な方法を使用することができる。これらの方法には、塩酸グアニジン又は尿素などのカオトロピック塩などのタンパク質分解剤；又はドデシルスルホン酸ナトリウム（ＳＤＳ）、臭化シアンなどの洗剤の使用が含まれる。他の方法には、エタノール沈殿又はプロパノール沈殿、遠心分離による真空濃縮などが含まれるが、これらに限定されない。当業者はまた、限外濾過装置、シリコン表面又は膜、磁性ビーズ、ポリスチレン粒子、ポリスチレン表面、正に帯電した表面及び正に帯電した膜、帯電膜、帯電表面、帯電変換フィルム、帯電変換面などのデバイスを使用することもできる。核酸が抽出されると、ＤＮＡは分析に使用される。
【００７０】
本実施形態では、生体サンプルＤＮＡは、白血球ゲノムＤＮＡ及びＤＮＡメチルトランスフェラーゼで処理した白血球ゲノムＤＮＡである。白血球ゲノムＤＮＡの標的遺伝子のターゲット配列は非メチル化状態であるため、白血球ゲノムＤＮＡは標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の陰性コントロールである。ＤＮＡメチルトランスフェラーゼで処理した白血球ゲノムＤＮＡの標的遺伝子のターゲット配列はメチル化状態であるため、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼで処理した白血球ゲノムＤＮＡは、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の陽性コントロールである。
【００７１】
ステップ２：上記の２種のＤＮＡサンプルを別々に処理して、５位非メチル化シトシン塩基を、ウラシル、チミン又はハイブリダイゼーション挙動がシトシンと異なる別の塩基に変換した。好ましくは、これは亜硫酸水素塩試薬を用いた処理によって達成される。「亜硫酸水素塩試薬」という用語は、亜硫酸水素塩、酸性亜硫酸塩、又はそれらの組み合わせを含む試薬を指し、たとえば、本明細書に開示されるように、メチル化及び非メチル化ＣｐＧジヌクレオチド配列を区別するために使用できる。好ましくは、この亜硫酸水素塩処理は、ｎ−アルキルグリコール、特にジエチレングリコールジメチルエーテル（ＤＭＥ）などを含むがこれらに限定されない変性溶媒の存在下で、又はジオキサン又はそジオキサン誘導体の存在下で行われる。好ましい実施形態では、前記変性溶媒は、１％〜３５％（ｖ／ｖ）の濃度で使用される。また好ましくは、この亜硫酸水素塩反応は、スカベンジャー、たとえば、これに限定されないが、６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン２−カルボン酸のようなクロマン誘導体又はトリヒドロキシ安息香酸及びその誘導体例えば没食子酸などの存在下で行われる。該亜硫酸水素塩による変換は、好ましくは、３０℃〜７０℃の反応温度で行われ、温度は、反応中に一時的に８５℃を超えるまで上昇する。亜硫酸水素塩で処理されたＤＮＡは、定量化される前に精製することが好ましい。これは、従来技術に公知の任意の方法によって行うことができ、たとえば限外濾過であるが、これに限定されない。
【００７２】
ステップ３：本発明のプライマー及び増幅酵素を使用して、処理されたＤＮＡ断片を増幅した。複数のＤＮＡ断片を同じ反応容器で同時に増幅できる。好ましくは、前記増幅産物の長さは、１００〜２,０００塩基対である。検出する生体サンプルのゲノムＤＮＡがメチル化状態と非メチル化状態の混合物である場合、特にメチル化状態のＤＮＡが非メチル化状態のＤＮＡよりもはるかに少ない場合、たとえば、癌患者の末梢血中の遊離ＤＮＡでは、ＰＣＲ増幅プライマーの増幅の特異性を向上させるために、本発明は、ＰＣＲ反応系に標的遺伝子のターゲット配列に特異的なブロッカーを使用する。ブロッカーのヌクレオチド配列の５末端は、フォワード（Ｆ）又はリバース（Ｒ）プライマーの３’末端ヌクレオチド配列とは５ヌクレオチド以上の重複領域を有し、ブロッカーとフォワード（Ｆ）又はリバース（Ｒ）プライマーは、標的遺伝子のターゲットＤＮＡの同じ鎖に相補的であり、ブロッカーの融解温度は、フォワード（Ｆ）又はリバース（Ｒ）プライマーよりも５℃以上高く、ブロッカーのこのヌクレオチド配列は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含み、亜硫酸水素塩で変換されたメチル化していない標的遺伝子のターゲット配列ＤＮＡの配列に相補的である。したがって、検出する生体サンプルのゲノムＤＮＡがメチル化状態と非メチル化状態の混合物である場合、特にメチル化状態のＤＮＡが非メチル化状態のＤＮＡよりもはるかに少ない場合、非メチル化状態のＤＮＡは、亜硫酸水素塩により変換された後、ブロッカーと優先的に結合し、それによって、ＤＮＡテンプレートがＰＣＲプライマーに結合するのを阻害するため、ＰＣＲ増幅は起こらず、一方、メチル化状態のＤＮＡはブロッカーと結合しないため、プライマーと結合し、ＰＣＲ増幅が行われる。その後、増幅により得られた断片を直接的又は間接的に検出する。好ましいマーカーは、蛍光マーカー、放射性核種、又は付着可能な分子断片の形態である。
【００７３】
標的遺伝子のターゲット配列ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １−２及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３−４によれば、本発明では、ＭＴ１Ａ及びＥＰＯという２つの標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出するためのプライマー、プローブ及びブロッカー配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５−１２）が設計された。
【００７４】
好ましくは、前記プライマー、プローブ及び／又はブロッカーのうちの１種又は複数種は以下に示される。
ＭＴ１Ａプライマー  Ｆ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５
ＣＧＧＡＣＧＴＡＡＡＧＧＡＴＴＣ
ＭＴ１Ａプライマー  Ｒ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６
ＧＡＡＡＣＧＡＡＣＴＣＧＡＣＴＡＡＡＣＧ
ＭＴ１Ａプローブ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７
ＴＧＣＧＴＴＴＧＣＧＴＴＣＧＴＴＴＣＧ
ＭＴ１Ａブロッカー
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８
ＣＡＡＡＣＴＣＡＡＣＴＡＡＡＣＡＡＡＣＴＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣ
ＥＰＯプライマー  Ｆ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９
ＡＧＴＣＧＴＡＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴ
ＥＰＯプライマー  Ｒ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １０
ＣＡＡＣＧＣＧＡＴＡＣＧＡＣＧ
ＥＰＯプローブ
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１
ＣＧＣＡＡＣＧＡＡＣＧＡＣＣＧＡ
ＥＰＯブロッカー
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２
ＧＡＧＴＴＴＴＴＧＧＧＴＴＡＴＴＴＴＧＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＧ
【００７５】
本発明では、リアルタイムＰＣＲ検出は、従来技術の標準的な操作に従って、様々な市販のリアルタイムＰＣＲ機器で実行することができる。いくつかの具体的な実施形態によれば、リアルタイムＰＣＲ検出は、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ機器（７５００Ｆａｓｔ）で実行された。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩で変換されたＤＮＡテンプレート２５−４０ｎｇ、３００−６００ｎＭ  プライマーとブロッカー、１５０−３００ｎＭ  プローブ、１ＵＴａｑポリメラーゼ、５０−４００μＭ  各ｄＮＴＰ、１〜１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び２ＸＰＣＲバッファーからなり、最終体積が２μｌ〜１００μｌであった。８５〜９９℃で３〜６０分持続することでプレサイクルでサンプルを増幅し、続いて５０〜７２℃で１〜３０秒間のアニーリングを３５〜５５サイクル行い、４５〜８０℃でアニーリングして５〜９０秒間伸長し、８５〜９９℃で５〜９０秒間変性させた。メチル化された標的遺伝子のターゲット配列についてのみ増幅を観察したことにより、５−メチルシトシンを含む標的遺伝子のターゲット配列のＣｐＧアイランド領域に特異的なプローブで前記遺伝子断片を検出した。そして、いくつかの具体的な実施形態では、β−アクチン遺伝子（ＡＣＴＢ）をＰＣＲの内部コントロールとして使用して、β−アクチン遺伝子配列に相補的なプライマーを使用してβ−アクチン遺伝子アンプリコンを作成し、特定のプローブを用いてβ−アクチン遺伝子アンプリコンを検出した。各サンプルごとに少なくとも１回のリアルタイムＰＣＲを行い、いくつかの具体的な実施形態では、２回又は３回のリアルタイムＰＣＲ検出を行った。
【００７６】
実験結果は、図２に示すとおりであり、本発明による組成物及び検出方法を使用して白血球ゲノムＤＮＡ（標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の陰性コントロール）を検出した場合、ＰＣＲ増幅は発生しておらず、検出結果は陰性であり、つまり、検出されたＤＮＡサンプルの標的遺伝子のターゲット配列はメチル化されておらず、本発明による組成物及び検出方法を使用して、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼで処理した白血球ゲノムＤＮＡ（標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態の陽性コントロール）を検出した場合、ＰＣＲ増幅は発生しており、検出結果は陽性である。つまり、検出されたＤＮＡサンプルの標的遺伝子のターゲット配列はメチル化されたことを示した。このことから、本発明による組成物及び検出方法は、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を特異的に検出することができると判定できた。
【００７７】
実施例３
本出願の具体的な実施形態によれば、特定の数の食道癌サンプル及び正常サンプルの検出結果の平均Ｃｔ値に基づいて、食道癌を正常な標的遺伝子から効果的に区別できるＣｔ値、すなわち臨界値を決定した。標的遺伝子のターゲット配列の少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチドのメチル化状態は、ポリメラーゼ連鎖反応のサイクル閾値Ｃｔ値によって決定され、検出対象となるサンプルのＣｔ値を予め設定された閾値と比較することにより、標的遺伝子に基づく解析結果が陰性（正常）か陽性（食道癌）かを決定する。
【００７８】
本実施例は、以下のステップを含む。
まず、食道癌患者２０例と健常者２２例の血漿サンプルを採取した。すべてのサンプルはＢｉｏＣｈａｉｎ社から入手される。次に、検出対象サンプルの末梢血の遊離ＤＮＡを抽出し、前記ＤＮＡサンプルに対して前処理を行い、５位非メチル化シトシン塩基をウラシル、チミン又はハイブリダイゼーション挙動がシトシンと異なる別の塩基に変換した。本実施例では、当該前処理は亜硫酸水素塩試薬処理によって達成された。前記ＤＮＡの抽出及び処理は、従来技術の任意の標準的な手段によって実行することができ、具体的には、本実施例では、すべてのサンプルＤＮＡ抽出及び亜硫酸水素塩によるＤＮＡ修飾は、ＢｉｏＣｈａｉｎ社製の血漿処理キットを用いて行われた。
【００７９】
次に、処理した上記食道癌患者２０例と健常者２２例のＤＮＡサンプルに上記標的遺伝子プライマー、プローブ及びブロッカーの組み合わせを加え、ＰＣＲにより標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出した。その中で、本実験例で採用されたＰＣＲは、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ機器（７５００）で実行された。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩で変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇ、４５０ｎＭ  プライマー及びブロッカー、２２５ｎＭ  プローブ、１ＵＴａｑ  ポリメラーゼ、２００μＭ  各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び２ＸＰＣＲバッファーからなり、最終体積が５０μｌであった。９４℃で２０分持続したことによりプレサイクルでサンプルを増幅し、続いて６２℃で５秒のアニーリングを４５サイクル行い、５５．５℃で３５秒アニーリングして伸長し、９３℃で３０秒変性させた。
【００８０】
最後に、食道癌患者２０例と健常人２２例のＤＮＡサンプルのそれぞれについて標的遺伝子のターゲット配列のリアルタイムＰＣＲのＣｔ値を測定した。検出結果を図３に示す。１）特定の臨界値が選択され、好ましくは臨界値がＣｔ＝３７であり、本発明による組成物及び検出方法を使用して、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態を検出することにより、食道癌患者を効果的に検出できる。本実施例では、Ｃｔ値が臨界値として３７である場合、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化で食道癌を検出するときの感度は５５％（ＭＴ１Ａ）及び４５％（ＥＰＯ）である。２）標的遺伝子のターゲット配列のメチル化は良好な特異性を持っており、健常人を検出したところ、健常人を検出するときに、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化の特異性は９５％（ＭＴ１Ａ）及び９５％（ＥＰＯ）である。３）ＭＴ１Ａ遺伝子とＥＰＯ遺伝子の両方のメチル化検出結果を組み合わせると、食道癌の検出感度は６０％にまで上昇し、一方、特異性は変わらず、９５％のままである。
【００８１】
実施例４
次に、また食道癌被験者６３例の血漿サンプルを得た。次に、血漿中の遊離ＤＮＡを抽出し、ゲノムＤＮＡサンプルに対して前処理を行い、５’位非メチル化シトシン塩基をウラシル、チミン又はハイブリダイゼーション挙動がシトシンと異なる別の塩基に変換した。本実施例では、当該前処理は亜硫酸水素塩試薬処理によって達成される。前記ＤＮＡの抽出及び処理は、従来技術における任意の標準的な手段によって実行することができ、具体的には、本実施例では、すべてのサンプルのＤＮＡ抽出及び亜硫酸水素塩によるＤＮＡ修飾は、ＢｉｏＣｈａｉｎ社製の血漿処理キットを用いて行われた。次に、処理した上記食道癌被験者６３例のＤＮＡサンプルに、上記ＭＴ１Ａ及びＥＰＯ遺伝子プライマーとプローブの組み合わせ、及び内部参照遺伝子ＡＣＴＢ遺伝子プライマーとプローブの組み合わせを加え、ＰＣＲによりＭＴ１Ａ及びＥＰＯ遺伝子のメチル化状態を検出した。ここで、本実験例で採用されたＰＣＲ増幅条件は次のとおりであった。リアルタイムＰＣＲはＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ機器（７５００）で実行された。ＰＣＲ反応混合物は、亜硫酸水素塩で変換されたＤＮＡテンプレート３５ｎｇ、４５０ｎＭ  プライマー、２２５ｎＭ  プローブ、１ＵＴａｑ  ポリメラーゼ、２００ｕμｍ  各ｄＮＴＰ、４．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２及び２ＸＰＣＲバッファーからなり、最終体積は３０μｌであった。９４℃で２０分持続したことによりプレサイクルでサンプルを増幅し、続いて６２℃で５秒間のアニーリングを４５サイクル行い、５５．５℃で３５秒間アニーリングし、９３℃で３０秒間変性させた。
【００８２】
また、これら食道癌被験者６３例の血漿サンプルについてＳＮＣＧ遺伝子の血清タンパク質レベルを検出した。ＳＮＣＧ遺伝子の血清タンパク質レベルは、素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって検出された。このＥＬＩＳＡ検出技術は、「サンドイッチ法」によってＳＮＣＧ遺伝子の血清タンパク質レベルを検出するものである。まず、９６ウェルプレートをＳＮＣＧモノクローナル抗体（マウス）（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）（１μｇ／ウェル）でコーティングし、次に、１０倍希釈した臨床血清サンプルと段階希釈した（２．５ｎｇ／ｍＬ〜０．０４ｎｇ／ｍＬ）ヒトＳＮＣＧタンパク質溶液（５０μｌ／ウェル）を加え、その後、５０μｌの０．４７μｇ／ｍＬホースラディッシュペルオキシダーゼ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、ＨＲＰ）標識マウス抗ヒトＳＮＣＧのポリクローナル抗体（ＩｇＧ）（ＢｉｏＣｈａｉｎ社製）を各チューブに加えた。上記の混合物を含む免疫反応プレートを、振とう条件下、室温で３時間インキュベートし、反応ウェルを洗浄液で洗浄した後、発色基質を加えた。２Ｍ硫酸を添加して発色反応を停止させた後、プレートリーダー（たとえば、Ｂｉｏ−ＲＡＤ  ５５０）を使用して、各ウェルを４５０ｎｍのスペクトル帯域で検出した。最後に、段階希釈したヒトＳＮＣＧタンパク質溶液の検出値を使用して検量線を確立し、検量線に基づいて臨床曲線サンプルを定量化した。食道癌及び健常人のＳＮＣＧ遺伝子血清レベルの臨界値は２．０ｎｇ／ｍＬであった。
【００８３】
最後に、エフ・ホフマン・ラ・ロシュ（Ｒｏｃｈｅ）社製の電気化学発光免疫検出システムを使用して、ＣＥＡ、ＣＡ１９９、ＣＡ１２５、及びＡＦＰを含む、食道癌被験者６３例のサンプルにおける一般的な癌マーカーのレベルを測定した。
【００８４】
検出結果（図４）から明らかなように、食道癌被験者におけるＭＴ１Ａ及びＥＰＯ遺伝子のメチル化検出とＳＮＣＧタンパク質検出は、陽性率が、一般的に使用される癌マーカー（たとえば、ＣＥＡ、ＣＡ１９９、ＣＡ１２５やＡＦＰ）よりも有意に高かった。また、ＭＴ１Ａ及びＥＰＯ遺伝子のＤＮＡメチル化とＳＮＣＧタンパク質の両方を検出することは、食道癌の検出において優れた相補性が得られ、両者を検出することで、食道癌の検出率が大幅に向上した。また、ＭＴ１Ａ及びＥＰＯ遺伝子のＤＮＡメチル化検出とＳＮＣＧタンパク質検出の相補性は独特であり、一般的な癌マーカー（たとえば、ＣＥＡ、ＣＡ１９９、ＣＡ１２５やＡＦＰ）にはこの特性がなかった。
【００８５】
上記実験結果は、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と標的タンパク質の濃度の両方を検出することにより、食道癌を高感度かつ特異的に検出できることを示している。本発明の標的遺伝子のターゲット配列のメチル化ＤＮＡを検出することにより、食道癌を非侵襲的にインビトロで検出することができ、食道癌の検出率を向上させることができる。
【００８６】
前記のように、本出願は、上記組成物、核酸配列、キット及びそれらの用途、ならびに上記検出方法を利用して、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態及び標的タンパク質の濃度を検出することによって、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と標的タンパク質の濃度を利用して食道癌のインビトロ検出を実現し、それにより、食道癌のインビトロ検出の感度と特異性を効果的に向上させる。リアルタイムＰＣＲを使用して血漿サンプルの遊離ＤＮＡを分析し、また、ＥＬＩＳＡ法を使用して血漿中の標的タンパク質の濃度を分析することにより、標的遺伝子のターゲット配列のメチル化状態と標的タンパク質の濃度の両方を検出することを簡単に実現でき、リアルタイムＰＣＲのＣＴ値及びＥＬＩＳＡによる検出濃度に基づいて、サンプルが陽性であるかどうかを迅速かつ簡単に判定でき、このため、食道癌を非侵襲的且つ迅速にインビトロで検出する方法を提供している。
【００８７】
本発明の様々な態様及び実施例が本明細書に開示されているが、他の態様及び実施例は当業者にとって明らかなことである。本明細書に開示される様々な態様及び実施例は、説明するために過ぎず、限定するものではない。本発明の保護範囲及び要旨は、添付の特許請求の範囲によってのみ決定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月27日(2020.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
食道癌をインビトロで検出するための組成物であって、
ＭＴ１Ａ遺伝子及びＥＰＯ遺伝子のうちの１種又は２種である標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸、且つ
ＳＮＣＧ、即ちγシヌクレイン（γ−ｓｙｎｕｃｌｅｉｎ）である標的タンパク質の濃度を検出するための抗体を含む、組成物。
【請求項２】
前記ＭＴ１Ａ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １に示され、前記ＥＰＯ遺伝子のターゲット配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３に示される、
請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
前記標的遺伝子のターゲット配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片を含み、
前記断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記標的遺伝子のターゲット配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片を含み、
前記断片は、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
標的遺伝子のターゲット配列の５位非メチル化シトシン塩基をウラシルに変換する試薬をさらに含む、及び、
前記標的遺伝子のメチル化状態を検出するための核酸は、
非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーをさらに含む、
請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも９個のヌクレオチドの断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の配列、若しくはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列であり、
前記少なくとも１５個のヌクレオチドの断片は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の配列であり、
ブロッカーは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列又はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の配列である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
標的タンパク質の濃度を検出するための試薬をさらに含み、前記試薬は、酵素結合免疫吸着アッセイ試薬であり、たとえば、前記試薬は、標的タンパク質の濃度を検出するための抗体でコーティングされた反応プレート、ＳＮＣＧプロテアーゼコンジュゲート、基質液、洗浄液及び停止液を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は
前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列中の少なくとも９個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項９】
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片、及び／又は
中程度にストリンジェント又は高度にストリンジェントな条件下で前記ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ３又はその相補的配列にハイブリダイズした少なくとも１５個のヌクレオチドの断片であって、少なくとも１つのＣｐＧジヌクレオチド配列を含む断片をさらに含む、請求項８に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
非メチル化状態のターゲット配列と優先的に結合するブロッカーをさらに含む、請求項９に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ６の配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ７の配列、及び／又は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ８の配列をさらに含む、請求項１１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
食道癌をインビトロで検出するためのオリゴヌクレオチドであって、
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ９及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０の配列を含む、オリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １１の配列、及び／又は
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  １２の配列をさらに含む、請求項１３に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１５】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物又は請求項８〜１４のいずれか１項に記載のオリゴヌクレオチドを含むキット。
【請求項１６】
別の成分として、ヌクレオシド三リン酸、ＤＮＡポリメラーゼ及び前記ＤＮＡポリメラーゼの機能に必要なバッファから選ばれる少なくとも１種をさらに含み、
別の成分として、標的タンパク質の濃度を検出するための抗体でコーティングされた反応プレート、ＳＮＣＧプロテアーゼコンジュゲート、基質液、洗浄液及び停止液から選ばれる少なくとも１種、及びプロトコルをさらに含む請求項１５に記載のキット。
【国際調査報告】
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