(57)【要約】  コンセンサスメルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）Ｔ抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む核酸分子および組成物。免疫調節方法およびＭＣＶに対する免疫応答を誘導する方法が開示される。ＭＣＶによる感染症を治療する方法およびＭＣＶと関連したメルケル細胞癌を治療または予防する方法が開示される。修飾コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原が開示される。【選択図】図１Ａ
2021511320.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも１つの修飾メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）Ｔ抗原をコードする核酸分子を含む免疫原性組成物であって、前記Ｔ抗原が、天然ＭＣＶ  Ｔ抗原の少なくとも１つの発癌性の特徴を破壊する少なくとも１つの変異を含む、免疫原性組成物。
【請求項２】
前記少なくとも１つの発癌性の特徴が、ＣＲ１結合、ＤｎａＪ結合、ホファターゼｐｐ２Ａ結合結合、Ｒｂ結合、ＡＴＰａｓｅ活性、ヘリカーゼ活性、シャペロンタンパク質結合、ｈＶａｍ６ｐ結合、Ｆｂｘｗ７結合、起点結合、および形質転換からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの変異が、Ｄ４４、Ｗ２０９、Ｅ２１６、Ｌ１４２、Ｌ９１、Ｋ９２、Ｄ９３、Ｙ９４、およびＭ９５からなる群から選択されるアミノ酸での変異である、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項４】
少なくとも１つの変異が、Ｄ４４Ｎ変異、Ｗ２０９Ａ、Ｅ２１６Ｋ変異、Ｌ１４２Ａ変異、Ｌ９１Ａ変異、Ｋ９２Ａ変異、Ｄ９３Ａ変異、Ｙ９４Ａ変異、およびＭ９５Ａ変異からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項５】
前記ＭＣＶ  Ｔ抗原が、ラージＴ抗原（ＬＴＡｇ）、スモールｔ抗原（ＳＴＡｇ）、およびこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項６】
前記核酸分子が、
ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、
ｃ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列、ならびに
ｄ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項７】
前記核酸分子が、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項８】
前記核酸分子が、
ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、
ｃ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに
ｄ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の免疫原性断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項９】
前記ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、開始コドン、ＩｇＥリーダー配列、および終止コドンからなる群から選択される少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結している、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
前記核酸分子が、配列番号７で記載されるアミノ酸配列に作動可能に連結した、
ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、
ｃ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列、ならびに
ｄ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、請求項９に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
前記核酸分子が、配列番号７をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、
ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、
ｃ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに
ｄ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の免疫原性断片、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１０に記載の免疫原性組成物。
【請求項１２】
前記核酸分子が、発現ベクターを含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
前記核酸分子が、ウイルス粒子に組み込まれている、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１４】
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１５】
アジュバントをさらに含む、請求項１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１６】
ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、
ｃ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列、ならびに
ｄ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１７】
前記核酸分子が、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子からなる群から選択される、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１８】
前記核酸分子が、
ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、
ｃ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに
ｄ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の免疫原性断片からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項１９】
前記コードされたペプチドが、開始コドン、ＩｇＥリーダー配列、および終止コドンからなる群から選択される少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結している、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項２０】
前記核酸分子が、配列番号７で記載されるアミノ酸配列に作動可能に連結した、
ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、
ｃ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列、ならびに
ｄ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片、
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドをコードする、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
前記核酸分子が、配列番号７をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、
ａ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、
ｂ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択される前記ヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、
ｃ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列、ならびに
ｄ）配列番号１、配列番号３、および配列番号５からなる群から選択されるヌクレオチド配列の免疫原性断片、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の核酸分子。
【請求項２２】
前記核酸分子が、発現ベクターを含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項２３】
前記核酸分子が、ウイルス粒子を含む、請求項１６に記載の核酸分子。
【請求項２４】
ペプチドを含む免疫原性組成物であって、前記ペプチドが、
ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、
ｃ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列、ならびに
ｄ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、免疫原性組成物。
【請求項２５】
ａ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、
ｂ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、
ｃ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列、ならびに
ｄ）配列番号２、配列番号４、および配列番号６からなる群から選択される前記アミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド。
【請求項２６】
ＭＣＶ  Ｔ抗原に対する免疫応答を誘導することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、請求項１に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２７】
投与することが、エレクトロポレーションおよび注射のうちの少なくとも１つを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
ＭＣＶ関連病理を治療または予防することを必要とする対象においてそれを行う方法であって、請求項１に記載の免疫原性組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２９】
投与することが、エレクトロポレーションおよび注射のうちの少なくとも１つを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＭＣＶ関連病理が、ＭＣＶ感染症およびメルケル細胞癌のうちの少なくとも１つである、請求項２８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月１９日に出願された、米国仮特許出願第６２／６１９，１６１号の優先権を主張し、この内容は、その全体が本明細書に参照によって組み込まれる。
【０００２】
本発明は、免疫応答を誘導し、ＭＣＶに感染した個体を治療するため、および／またはメルケル細胞癌（ＭＣＣ）を治療もしくは予防するためのワクチンに関する。本発明は、コンセンサスＭＣＶラージＴ抗原（ＬＴＡｇ）およびスモールｔ抗原（ＳＴＡｇ）癌タンパク質ならびにそれをコードする核酸分子に関する。
【背景技術】
【０００３】
メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）は、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）、侵襲性の強いヒト皮膚癌とのその関連のために最近注目されている。米国では毎年約１，５００の新たな症例のＭＣＣが診断され、ＭＣＣを有する対象の死亡率は、４６％のままである。ＭＣＣは、皮膚Ｔ細胞リンパ腫および慢性骨髄性白血病よりも多くの患者を殺す。ＭＣＣの大部分（約７５％）は、クローン的に統合されたウイルスＤＮＡを含有し、ウイルスＴ抗原転写物およびタンパク質を発現する。
【０００４】
現在は、臨床試験において試験されているＭＣＣに対するワクチンはない。したがって、当該技術分野には、ＭＣＶおよびＭＣＣに対する治療ワクチンのニーズがある。本発明は、この満たされていないニーズを満たす。
【発明の概要】
【０００５】
一実施形態では、本発明は、少なくとも１つの修飾メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）Ｔ抗原をコードする核酸分子を含む免疫原性組成物であって、Ｔ抗原が、天然ＭＣＶ  Ｔ抗原の少なくとも１つの発癌性の特徴を破壊する少なくとも１つの変異を含む、免疫原性組成物に関する。一実施形態では、少なくとも１つの発癌性の特徴は、ＣＲ１結合、ＤｎａＪ結合、ホファターゼｐｐ２Ａ結合結合、Ｒｂ結合、ＡＴＰａｓｅ活性、ヘリカーゼ活性、シャペロンタンパク質結合、ｈＶａｍ６ｐ結合、Ｆｂｘｗ７結合、起点結合、および形質転換のうちの少なくとも１つである。
【０００６】
一実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｄ４４、Ｗ２０９、Ｅ２１６、Ｌ１４２、Ｌ９１、Ｋ９２、Ｄ９３、Ｙ９４、またはＭ９５のうちの少なくとも１つのアミノ酸での変異である。一実施形態では、少なくとも１つの変異は、Ｄ４４Ｎ変異、Ｗ２０９Ａ、Ｅ２１６Ｋ変異、Ｌ１４２Ａ変異、Ｌ９１Ａ変異、Ｋ９２Ａ変異、Ｄ９３Ａ変異、Ｙ９４Ａ変異、またはＭ９５Ａ変異のうちの少なくとも１つである。一実施形態では、修飾ＭＣＶ  Ｔ抗原は、Ｄ４４Ｎ変異、Ｗ２０９Ａ、またはＥ２１６Ｋ変異のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、修飾ＭＣＶ  Ｔは、Ｄ４４Ｎ変異、Ｗ２０９Ａ、およびＥ２１６Ｋ変異を含む。
【０００７】
一実施形態では、少なくとも１つのＭＣＶ  Ｔ抗原は、ラージＴ抗原（ＬＴＡｇ）またはスモールｔ抗原（ＳＴＡｇ）である。一実施形態では、少なくとも１つのＭＣＶ  Ｔ抗原は、ＬＴＡｇおよびＳＴＡｇの組み合わせである。
【０００８】
一実施形態では、核酸分子は、ａ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【０００９】
一実施形態では、核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
【００１０】
一実施形態では、核酸分子は、ａ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のうちの少なくとも１つに対してヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のうちの少なくとも１つに対してヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、ｃ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列、またはｄ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列の免疫原性断片のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【００１１】
一実施形態では、ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結している。一実施形態では、制御配列は、開始コドン、ＩｇＥリーダー配列、または終止コドンのうちの少なくとも１つである。
【００１２】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号７で記載されるアミノ酸配列に作動可能に連結した、ａ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００１３】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号７をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、ａ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のうちの少なくとも１つに対してヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のうちの少なくとも１つに対してヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、ｃ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列、またはｄ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列の免疫原性断片のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
一実施形態では、核酸分子は、発現ベクターを含む。
【００１５】
一実施形態では、核酸分子は、ウイルス粒子に組み込まれている。
【００１６】
一実施形態では、免疫原性組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
一実施形態では、免疫原性組成物は、アジュバントをさらに含む。
【００１７】
一実施形態では、本発明は、ａ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドをコードする核酸分子に関する。
【００１８】
一実施形態では、核酸分子は、ＤＮＡ分子またはＲＮＡ分子である。
【００１９】
一実施形態では、核酸分子は、ａ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のうちの少なくとも１つに対してヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のうちの少なくとも１つに対してヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、ｃ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列、またはｄ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列の免疫原性断片のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
一実施形態では、ペプチドをコードするヌクレオチド配列は、少なくとも１つの制御配列に作動可能に連結している。一実施形態では、制御配列は、開始コドン、ＩｇＥリーダー配列、または終止コドンのうちの少なくとも１つである。
【００２１】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号７で記載されるアミノ酸配列に作動可能に連結した、ａ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含むペプチドをコードする。
【００２２】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号７をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結した、ａ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のうちの少なくとも１つに対してヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列、ｂ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のうちの少なくとも１つに対してヌクレオチド配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するヌクレオチド配列の免疫原性断片、ｃ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列、またはｄ）配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５のヌクレオチド配列の免疫原性断片のうちの少なくとも１つのヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
一実施形態では、核酸分子は、発現ベクターを含む。
【００２４】
一実施形態では、核酸分子は、ウイルス粒子に組み込まれている。
【００２５】
一実施形態では、本発明は、ペプチドを含む免疫原性組成物に関し、ペプチドは、ａ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
【００２６】
一実施形態では、本発明は、ペプチドに関し、ペプチドは、ａ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約９０％の同一性を有するアミノ酸配列、ｂ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のうちの少なくとも１つに対してアミノ酸配列の少なくとも６０％にわたって少なくとも約９０％の同一性を含む免疫原性断片、ｃ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列、またはｄ）配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６のアミノ酸配列の少なくとも６０％を含む免疫原性断片のうちの少なくとも１つのアミノ酸配列を含む。
【００２７】
一実施形態では、本発明は、ＭＣＶ  Ｔ抗原に対する免疫応答を誘導することを必要とする対象においてそれを行う方法に関し、方法は、修飾メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）Ｔ抗原であって、天然ＭＣＶ  Ｔ抗原の少なくとも１つの発癌性の特徴を破壊する少なくとも１つの変異を含む、Ｔ抗原をコードする核酸分子を含む免疫原性組成物を、対象に投与することを含む。
【００２８】
一実施形態では、投与する方法は、エレクトロポレーションまたは注射のうちの少なくとも１つを含む。
【００２９】
一実施形態では、本発明は、ＭＣＶ関連病理を治療または予防することを必要とする対象においてそれを行う方法に関し、方法は、修飾メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）Ｔ抗原であって、天然ＭＣＶ  Ｔ抗原の少なくとも１つの発癌性の特徴を破壊する少なくとも１つの変異を含む、Ｔ抗原をコードする核酸分子を含む免疫原性組成物を、対象に投与することを含む。
【００３０】
一実施形態では、投与する方法は、エレクトロポレーションまたは注射のうちの少なくとも１つを含む。
【００３１】
一実施形態では、ＭＣＶ関連病理は、ＭＣＶ感染症またはメルケル細胞癌のうちの少なくとも１つである。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１Ａ】図１Ａ〜図１Ｂを含み、ＬＴＡｇおよびＳＴＡｇの模式図を提供する。図１Ａは、ＬＴＡｇおよびＳＴＡｇの発癌性の特徴を描写する。図１Ｂは、核酸ワクチンのＬＴＡｇおよびＳＴＡｇの設計が、いくつかの変異を組み込んで、発癌性の特徴を破壊することを描写する。＊Ｄ４４Ｎ−は、シャペロンタンパク質への結合を遮断し、＊Ｗ２０９Ａ−は、ｈＶａｍ６ｐへの結合を遮断し、＊Ｅ２１６Ｋ−は、Ｒｂへの結合を遮断し、形質転換を防止し、＊Ｌ１４２Ａ−は、ＰＰ２Ａへの結合を遮断し、＊９１−９５ＬＫＤＹＭ−＞ＡＡＡＡＡ−は、Ｆｂｘｗ７への結合を遮断し、形質転換を防止する。
【図１Ｂ】同上。
【図２Ａ】図２Ａ〜図２Ｂを含み、コンセンサスＬＴＡｇおよびＳＴＡｇの模式図を提供する。図２Ａは、全ての利用可能なＮＣＢＩ  ＬＴＡｇ配列から設計されたＬＴＡｇのコンセンサス配列の図を描写する。図２Ｂは、全ての利用可能なＮＣＢＩ  ＳＴＡｇ配列から設計されたＳＴＡｇのコンセンサス配列の図を描写する。これらの抗原配列は、合成され、哺乳動物発現プラスミドにクローニングされ、インビボでの合成コンセンサス抗原の発現のためのプラスミドＤＮＡ構築物を作製した。
【図２Ｂ】同上。
【図３】インビトロでのコンセンサスＭＣＣ  ＬＴＡｇの発現を示す例示的な実験データを描写する。コンセンサスＭＣＣ  ＳＴＡｇの発現は、ＳＴＡｇを標的とする有効な抗体の欠如によって検出されなかった。
【図４Ａ】図４Ａ〜図４Ｂを含み、ＬＴＡｇおよびＳＴＡｇ単独または組み合わせでのワクチン接種後の免疫応答の誘導を示す例示的な実験データ提供する。図４Ａは、実験設計を描写する。マウスは、プラスミドＤＮＡを受け、続いて０日目、１４日目、および２８日目に筋肉内エレクトロポレーションが行われた。１週間後、脾臓細胞が分析のために収集された。４つの群のマウスがワクチン接種された：群１−ｐＶａｘ−空ベクター対照、群２−ＬＴＡｇワクチン、群３−ＳＴＡｇワクチン、群４−同じ部位でのＬＴＡｇおよびＳＴＡｇワクチン。図４Ｂは、空対照ベクター（ｐＶａｘ）でのワクチン接種後ではなく、ＬＴＡｇおよびＳＴＡｇ単独または組み合わせでのワクチン接種後の免疫応答の誘導を示す実験データを描写する。これらの実験について、ペプチドは、変異を不活性化することなく、対応する配列に一致した。
【図４Ｂ】同上。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｂを含み、ＬＴＡｇおよびＳＴＡｇの免疫優性エピトープを特徴とする例示的な実験データを提供する。図５Ａは、ＬＴＡｇワクチン接種の免疫優性エピトープを描写する。図５Ｂは、ＳＴＡｇワクチン接種の免疫優性エピトープを描写する。
【図５Ｂ】同上。
【図６】ヒトメルケル細胞癌試料におけるＭＣＣラージＴ切断の程度の分析についての結果を描写する。データは、ＧｅｎＢａｎｋにおける４２のラージＴ細胞からまとめられた。
【図７】図７Ａ〜図７Ｆを含み、ＬＴＡｇペプチドでの５時間のワクチン接種および刺激後のサイトカインについてのＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを示す例示的な実験データを提供する。図７Ａは、ＩＦＮγについてのＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図７Ｂは、ＴＮＦαについてのＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図７Ｃは、ＩＬ−２についてのＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図７Ｄは、ＩＦＮγについてのＣＤ４+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図７Ｅは、ＴＮＦαについてのＣＤ４+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図７Ｆは、ＩＬ−２についてのＣＤ４+Ｔ細胞応答のレベルを表す。
【図８】ＬＴＡｇワクチン接種がロバストな多機能性ＣＤ８  Ｔ細胞を誘導することを示す例示的な実験データを描写する。
【図９】ＬＴＡｇワクチン接種がロバストな多機能性ＣＤ４  Ｔ細胞を誘導することを示す例示的な実験データを描写する。
【図１０】ＬＴＡｇワクチン接種が、ＣＤ１０７ａ、ＩＦＮγ、およびＴ−ｂｅｔを共発現する細胞毒性の可能性を有するＣＤ８  Ｔ細胞を誘導することを示す例示的な実験データを描写する。
【図１１】ラージＴおよびスモールＴ抗原ワクチンが、一次抗体としてマウス血清を使用して示された、体液性応答を起こすことを示す例示的な実験データを描写する。
【図１２】ＬＴＡｇワクチンが遺伝的に多様なＣＤ−１非近交マウスにおいてロバストな免疫応答を誘導することを示す例示的な実験データを描写する。
【図１３】ＳＴＡｇワクチンが遺伝的に多様なＣＤ−１非近交マウスにおいて免疫応答を誘導することを示す例示的な実験データを描写する。
【図１４】図１４Ａ〜図１４Ｆを含み、ＬＴＡｇペプチドでの５時間のＣＤ−１非近交マウスにおけるワクチン接種および刺激後のサイトカインについてのＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを示す例示的な実験データを提供する。図１４Ａは、ＩＦＮγについてのＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図１４Ｂは、ＴＮＦαについてのＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図１４Ｃは、ＩＬ−２についてのＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図１４Ｄは、ＩＦＮγについてのＣＤ４+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図１４Ｅは、ＴＮＦαについてのＣＤ４+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図１４Ｆは、ＩＬ−２についてのＣＤ４+Ｔ細胞応答のレベルを表す。
【図１５】図１５Ａ〜図１５Ｆを含み、ＳＴＡｇペプチドでの５時間のＣＤ−１非近交マウスにおけるワクチン接種および刺激後のサイトカインについてのＣＤ４+およびＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを示す例示的な実験データを提供する。図１５Ａは、ＩＦＮγについてのＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図１５Ｂは、ＴＮＦαについてのＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図１５Ｃは、ＩＬ−２についてのＣＤ８+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図１５Ｄは、ＩＦＮγについてのＣＤ４+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図１５Ｅは、ＴＮＦαについてのＣＤ４+Ｔ細胞応答のレベルを表す。図１５Ｆは、ＩＬ−２についてのＣＤ４+Ｔ細胞応答のレベルを表す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）感染症は、メルケル細胞癌（ＭＣＣ）と関連し、これは現在４６％の死亡率を有する。
【００３４】
一実施形態では、本発明は、ＭＣＶおよびＭＣＣに対する核酸ワクチンを含む。一実施形態では、ワクチンは、コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原をコードするプラスミドを含む。一実施形態では、コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原は、ラージＴ抗原（ＬＴＡｇ）である。一実施形態では、コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原は、スモールｔ抗原（ＳＴＡｇ）である。一実施形態では、コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原は、天然Ｔ抗原の発癌性の特徴を破壊する変異をさらに含む。ワクチン候補として、向上されたＤＮＡ（ＤＮＡ）ベースのプラットフォームは、遺伝子最適化および送達技法における多くの利点を提供する。そのようなものとして、各ＭＣＶ  Ｔ抗原は、遺伝的に最適化し、修飾された哺乳動物発現ベクターにサブクローニングし、次いでインビボエレクトロポレーション（ＥＰ）を用いて送達することができる。
【００３５】
合成コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原構築物でのワクチン接種は、ロバストな免疫応答を起こすので、前臨床齧歯類研究におけるワクチン接種は非常に強力であった。
【００３６】
いくつかの実施形態では、戦略は、合成コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原についてのコード配列を使用する。ＬＴＡｇおよびＳＴＡｇについてのコード配列が提供される。いくつかの実施形態では、戦略は、単一の合成コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原についてのコード配列を使用する。いくつかの実施形態では、戦略は、複数の合成コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原についてのコード配列を使用する。
【００３７】
ワクチンについての候補として、ＤＮＡワクチンは、急速で安価なアップスケール生成、室温での安定性、および輸送しやすさを含む多数の利点を示し、その全ては、このプラットフォームを経済的および地理的観点からさらに向上させる。プラスミドの合成性質のために、抗原配列は、新たに出現する株に応答して迅速かつ容易に修飾および／または追加のワクチン成分を含むように拡張することができる。
【００３８】
プラスミドＤＮＡベクターおよびそれらのコードされた抗原遺伝子の最適化は、インビボ免疫原性の増加をもたらした。細胞取り込みおよびその後の抗原発現は、高度に濃縮されたプラスミドワクチン製剤がインビボエレクトロポレーション、ワクチン接種部位内の短い矩形波電気パルスを使用してプラスミドを一時的透過性細胞に駆動する技術で投与される場合、実質的に増幅される。理論では、ＤＮＡプラスミドのカクテルは、任意の数の可変抗原に対する高度に特殊化された免疫応答を誘導するためにアセンブルすることができる。免疫性は、種特異的サイトカイン遺伝子をコードするプラスミド分子アジュバントとの共送達、および抗原アミノ酸配列の「コンセンサス操作」によってさらに誘導し、特定の株へのワクチン誘導免疫性のバイアスを助けることができる。
【００３９】
１．定義．
別段に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書が、定義を含み、優先するであろう。本発明の実施または試験において本明細書に記載されるものと類似または同等の方法および材料を使用することができるが、好ましい方法および材料が以下に記載される。本明細書で言及される全ての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、それらの全体において参照によって組み込まれる。本明細書に開示される材料、方法、および例は、例示的のみであり、限定的であることを意図しない。
【００４０】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ（ｓ））」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ（ｓ））」、「有すること」、「有する」、「できる」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ（ｓ））」という用語およびそれらの派生語は、本明細書で使用される場合、追加の行為または構造の可能性を妨げない、オープンエンドな移行句、用語、または語であることを意図する。「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という単数形は、文脈が別段に明示しない限り、複数の参照物を含む。本開示はまた、明示的に記載されるか否かにかかわらず、本明細書で提示される実施形態またはエレメント「を含む」、「からなる」、および「から本質的になる」他の実施形態を企図する。
【００４１】
本明細書で使用される「アジュバント」とは、ワクチンの抗原性を向上させるために核酸ワクチンに添加される任意の分子を意味し得る。
【００４２】
「抗体」とは、クラスＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、もしくはＩｇＥの抗体、または断片、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄを含む、その断片もしくは誘導体、および一本鎖抗体、ダイアボディ、二重特異性抗体、二機能性抗体、ならびにそれらの誘導体を意味し得る。抗体は、哺乳動物の血清試料から単離された抗体、ポリクローナル抗体、親和性精製抗体、またはそれらの混合物であり得、これは、所望のエピトープまたはそれに由来する配列に対する十分な結合特異性を示す。
【００４３】
本明細書で互換的に使用される「抗体断片」または「抗体の断片」とは、抗原結合部位または可変領域を含むインタクトな抗体の一部分を指す。部分は、インタクトな抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じて、ＣＨ２、ＣＨ３、またはＣＨ４）を含まない。抗体断片の例は、これらに限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、ダイアボディ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、１つの軽鎖可変ドメインのみを含有する一本鎖ポリペプチド、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチド、１つの重鎖可変領域のみを含有する一本鎖ポリペプチド、および重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有する一本鎖ポリペプチドを含む。
【００４４】
「抗原」とは、宿主において免疫応答を起こす能力を有するタンパク質を指す。抗原は、抗体によって認識され、結合され得る。抗原は、体内から、または外部環境が起源であり得る。
【００４５】
本明細書で使用される「コード配列」または「コード核酸」とは、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸（ＲＮＡまたはＤＮＡ分子）を指すことを意味し得る。コード配列は、プロモーターを含む制御エレメントに作動可能に連結した開始（ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ）および終結シグナル、ならびに核酸が投与される個体または哺乳動物の細胞における発現を誘導することができるポリアデニル化シグナルをさらに含み得る。コード配列は任意に、Ｎ末端メチオニンをコードする開始コドンまたはＩｇＥもしくはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをさらに含み得る。
【００４６】
本明細書で使用される「補体」または「相補的」とは、核酸が核酸分子のヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体間のＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ（例えば、Ａ−Ｔ／ＵおよびＣ−Ｇ）またはＨｏｏｇｓｔｅｅｎ塩基対合を意味し得ることを意味し得る。
【００４７】
本明細書で使用される「コンセンサス」または「コンセンサス配列」とは、複数の配列（例えば、特定のウイルス抗原の複数の配列）の整列の分析に基づいて構築される、合成ヌクレオチド配列、または対応するポリペプチド配列を意味し得る。
【００４８】
本明細書で使用される「定電流」とは、組織、または当該組織を画定する細胞が、電気パルスが同組織に送達される期間にわたって受けるか、または経験する電流を定義する。電気パルスは、本明細書に記載されるエレクトロポレーション装置から送達される。本明細書で提供されるエレクトロポレーション装置は、好ましくは、即時フィードバックを有する、フィードバックエレメントを有するので、この電流は、電気パルスの寿命にわたって当該組織において定アンペア数に留まる。フィードバックエレメントは、パルスの持続期間を通して組織（または細胞）の抵抗を測定し、エレクトロポレーション装置にその電気エネルギー出力を変更させる（例えば、電圧を増加させる）ことができ、したがって同じ組織における電流は、電気パルス（マイクロ秒台）を通して、およびパルス間で一定のままである。いくつかの実施形態では、フィードバックエレメントは、コントローラーを含む。
【００４９】
本明細書で使用される「電流フィードバック」または「フィードバック」とは、互換的に使用され得、提供されたエレクトロポレーション装置の活性応答を意味し得、これは、電流を一定のレベルで維持するために、電極間の組織における電流を測定し、適宜にＥＰ装置によって送達されるエネルギー出力を変更することを含む。この一定のレベルは、パルス配列または電気処理の開始前にユーザーによって予め設定される。その中の電気回路が、電極間の組織における電流を連続的に監視し、その監視された電流（または組織内の電流）を予め設定された電流と比較し、エネルギー出力調節を連続的に行って、監視される電流を予め設定されたレベルに維持することができるように、フィードバックは、エレクトロポレーション装置のエレクトロポレーションコンポーネント、例えば、コントローラーによって達成され得る。フィードバックループは、アナログ閉ループフィードバックであるので、即時であり得る。
【００５０】
本明細書で使用される「分散電流」とは、本明細書に記載されるエレクトロポレーション装置の様々な針電極アレイから送達される電流のパターンを意味し得、パターンは、エレクトロポレートされる組織の任意の領域上でのエレクトロポレーション関連熱ストレスの発生を最小化するか、または好ましくは排除する。
【００５１】
本明細書で互換的に使用される「エレクトロポレーション」、「電気透過化」、または「電気運動向上」（「ＥＰ」）とは、生体膜において微視的経路（細孔）を誘導するための膜貫通電場パルスの使用を指し得、それらの存在は、プラスミド、オリゴヌクレオチド、ｓｉＲＮＡ、薬物、イオン、および水などの生体分子が細胞膜の一方の側から他方へと通過することを可能にする。
【００５２】
本明細書で使用される「内因性抗体」とは、体液性免疫応答の誘導のために有効用量の抗原が投与される対象において生み出された抗体を指し得る。
【００５３】
本明細書で使用される「フィードバックメカニズム」とは、ソフトウェアまたはハードウェア（ファームウェア）のいずれかによって行われるプロセスを指し得、そのプロセスは、（エネルギーのパルスの送達の前、その間、および／またはその後）所望の組織のインピーダンスを受け、現在値、好ましくは電流と比較し、予め設定された値を達成するために送達されるエネルギーのパルスを調節する。フィードバックメカニズムは、アナログ閉ループ回路によって行われ得る。
【００５４】
「断片」は、全長ポリペプチド配列またはヌクレオチド配列のパーセンテージを意味し得る。断片は、親ヌクレオチド配列もしくはアミノ酸配列またはそのバリアントの全長の２０％以上、２５％以上、３０％以上、３５％以上、４０％以上、４５％以上、５０％以上、５５％以上、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９１％以上、９２％以上、９３％以上、９４％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上のパーセントを含み得る。
【００５５】
本明細書で使用される「遺伝子構築物」は、抗体などのタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指す。遺伝子構築物はまた、ＲＮＡを転写するＤＮＡ分子を指し得る。コード配列は、プロモーターを含む制御エレメントに作動可能に連結した開始および終結シグナル、ならびに核酸分子が投与される個体の細胞における発現を誘導することができるポリアデニル化シグナルを含む。本明細書で使用される場合、「発現可能な形態」という用語は、個体の細胞に存在する場合、コード配列が発現されるように、タンパク質をコードするコード配列に作動可能に連結した必要な制御エレメントを含有する遺伝子構築物を指す。
【００５６】
２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において本明細書で使用される「同一」または「同一性」は、配列が特定された領域にわたって同じである残基の特定されたパーセントを有することを意味し得る。パーセンテージは、２つの配列を最適に整列し、２つの配列を特定された領域にわたって比較し、両方の配列において同一の残基が発生する位置の数を決定して一致した位置の数をもたらし、一致した位置の数を特定された領域における位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージをもたらすことによって、計算され得る。２つの配列が異なる長さであるか、または整列が１つ以上の千鳥状末端を生成し、比較の特定された領域が単一の配列のみを含む場合、単一の配列の残基は、計算の分母には含まれるが、分子には含まれない。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較する場合、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、同等物とみなされ得る。同一性は、手動で、またはＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ  ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを用いることによって実施され得る。
【００５７】
本明細書で使用される「インピーダンス」とは、フィードバックメカニズムを議論する場合に使用され得、オームの法則に従って電流値に変換することができ、よって予め設定された電流との比較を可能にする。
【００５８】
本明細書で使用される「免疫応答」は、提供されたワクチンを介した１つ以上のコンセンサス抗原の導入に応答した、宿主の免疫系、例えば、哺乳動物のそれの活性化を意味し得る。免疫応答は、細胞性もしくは体液性応答、または両方の形態であり得る。
【００５９】
本明細書で使用される「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」は、共有結合的に一緒に連結した少なくとも２つのヌクレオチドを意味し得る。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列を定義する。よって、核酸はまた、描写された一本鎖の相補鎖を包含する。核酸の多くのバリアントは、所与の核酸と同じ目的のために使用され得る。よって、核酸はまた、実質的に同一の核酸およびその補体を包含する。一本鎖は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズし得るプローブを提供する。よって、核酸はまた、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを包含する。
【００６０】
核酸は、一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または二本鎖および一本鎖配列の両方の部分を含有し得る。核酸は、ＤＮＡ、ゲノムおよびｃＤＮＡの両方、ＲＮＡ、またはハイブリッドであり得、核酸は、デオキシリボ−およびリボ−ヌクレオチドの組み合わせ、ならびにウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。核酸は、化学合成方法によって、または組換え方法によって得られ得る。
【００６１】
本明細書で使用される「作動可能に連結」とは、遺伝子の発現が、これによって空間的に接続される、プロモーターの制御下にあることを意味し得る。プロモーターは、その制御下で遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に配置され得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、プロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御するプロモーターと遺伝子との間の距離とおよそ同じであり得る。当該技術分野で知られているように、この距離における変動は、プロモーター機能の喪失なしに順応され得る。
【００６２】
本明細書で使用される「ペプチド」、「タンパク質」、または「ポリペプチド」は、アミノ酸の連結配列を意味することができ、天然、合成、または天然および合成の修飾もしくは組み合わせであり得る。
【００６３】
本明細書で使用される「プロモーター」は、細胞における核酸の発現を与え、活性化し、または向上させることができる合成または天然由来分子を意味し得る。プロモーターは、その発現をさらに向上させるため、ならびに／または空間的発現および／もしくは時間的発現を変更するために、１つ以上の特異的転写制御配列を含み得る。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千塩基対ほどに配置することができる、遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含み得る。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む源に由来し得る。プロモーターは、構成的に、あるいは細胞、発現が起こる組織もしくは器官に対して、または発現が起こる発生段階に対して、または生理的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外部刺激に応答して差別的に、遺伝子成分の発現を制御し得る。プロモーターの代表的な例は、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレーター−プロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターを含む。
【００６４】
「シグナルペプチド」および「リーダー配列」は、本明細書で互換的に使用され、本明細書に記載されるタンパク質のアミノ末端で連結することができるアミノ酸配列を指す。シグナルペプチド／リーダー配列は、典型的には、タンパク質の局在化を誘導する。本明細書で使用されるシグナルペプチド／リーダー配列は、好ましくは、それが生成される細胞からのタンパク質の分泌を促進する。シグナルペプチド／リーダー配列は、多くの場合、タンパク質の残部から開裂され、多くの場合、細胞からの分泌後、成熟タンパク質と称される。シグナルペプチド／リーダー配列は、タンパク質のＮ末端で連結される。
【００６５】
本明細書で使用される「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、第１の核酸分子（例えば、プローブ）が第２の核酸分子（例えば、標的）に、核酸の複合体混合物のようにハイブリダイズするであろう平均条件を意味し得る。ストリンジェントな条件は、配列依存的であり、異なる状況では異なるであろう。ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度ｐＨでの特定の配列についての熱融解点（Ｔｍ）よりも約５〜１０℃低くなるように選択され得る。Ｔｍは、標的に相補的なプローブの５０％が平衡状態で標的配列にハイブリダイズする温度（定義されたイオン強度、ｐＨ、および核酸濃度下）であり得る（標的配列が過剰に存在するので、Ｔｍでは、プローブの５０％は平衡状態で使用中である）。ストリンジェントな条件は、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３で約０．０１〜１．０Ｍナトリウムイオン濃度（または他の塩）などの、約１．０Ｍナトリウムイオン未満であり、温度が、短いプローブ（例えば、約１０〜５０ヌクレオチド）について少なくとも約３０℃および長いプローブ（例えば、約５０ヌクレオチド超）について少なくとも約６０℃であるものであり得る。ストリンジェントな条件はまた、ホルムアミドなどの不安定化剤の添加で達成され得る。選択的または特異的ハイブリダイゼーションについて、正のシグナルは、バックグラウンドハイブリダイゼーションの少なくとも２〜１０倍であり得る。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、以下を含む：５０％ホルムアミド、５ｘＳＳＣ、および１％ＳＤＳ、４２℃でインキュベート、または５ｘＳＳＣ、１％ＳＤＳ、６５℃でインキュベート、０．２ｘＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳで６５℃で洗浄。
【００６６】
本明細書で使用される「対象」および「患者」は、これらに限定されないが、哺乳動物（例えば、ウシ、ブタ、ラクダ、ラマ、ウマ、ヤギ、ウサギ、ヒツジ、ハムスター、モルモット、ネコ、イヌ、ラット、およびマウス、非ヒト霊長類（例えば、カニクイザルまたはアカゲザルなどのサル、チンパンジーなど）、ならびにヒト）を含む、任意の脊椎動物を互換的に指す。いくつかの実施形態では、対象は、ヒトまたは非ヒトであり得る。
【００６７】
本明細書で使用される「実質的に相補的」とは、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の補体に少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であること、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを意味し得る。
【００６８】
本明細書で使用される「実質的に同一」とは、第１の配列が、第２の配列の補体に実質的に相補的である場合、第１および第２の配列が、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００以上のヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、または核酸に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％であることを意味し得る。
【００６９】
本明細書で使用される「治療」または「治療すること」は、疾患を予防、抑制、抑圧、または完全排除する手段を通した疾患からの対象の保護を意味することができる。疾患を予防することは、本発明のワクチンを、疾患の発症前に対象に投与することを含む。疾患を抑制することは、本発明のワクチンを、疾患の誘導後だがその臨床的出現前に対象に投与することを含む。疾患を抑圧することは、本発明のワクチンを、疾患の臨床的出現後に対象に投与することを含む。
【００７０】
核酸に対して本明細書で使用される「バリアント」は、（ｉ）参照されたヌクレオチド配列の部分もしくは断片、（ｉｉ）参照されたヌクレオチド配列もしくはその部分の補体、（ｉｉｉ）参照された核酸もしくはその補体に実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）参照された核酸、その補体、もしくはそれに実質的に同一な配列にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を意味し得る。
【００７１】
アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるペプチドまたはポリペプチドに対する「バリアント」は、少なくとも１つの生物学的活性を保持する。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されたタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味し得る。アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、典型的には小さな変更を含むものとして当該技術分野で認識される。これらの小さな変更は、当該技術分野で理解されるように、部分的に、アミノ酸のハイドロパシーインデックスを考慮することによって特定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２  （１９８２）。アミノ酸のハイドロパシーインデックスは、その疎水性および電荷の考慮に基づく。類似のハイドロパシーインデックスのアミノ酸は、置換され、依然としてタンパク質機能を保持し得ることが当該技術分野で知られている。一態様では、±２のハイドロパシーインデックスを有するアミノ酸が置換される。アミノ酸の親水性はまた、生物学的機能を保持するタンパク質をもたらすであろう置換を明らかにするために使用することができる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の考慮は、そのペプチドの最も大きな局所平均親水性、抗原性および免疫原性と十分に相関することが報告されている有用な尺度の計算を可能にする。米国特許第４，５５４，１０１号は、参照によって本明細書に完全に組み込まれる。類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、当該技術分野で理解されるように、生物学的活性、例えば、免疫原性を保持するペプチドをもたらすことができる。置換は、互いに±２以内の親水性値を有するアミノ酸で行われ得る。アミノ酸の疎水性インデックスおよび親水性値の両方は、そのアミノ酸の特定の側鎖によって影響される。その観察と一貫して、生物学的機能と適合性であるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、電荷、サイズ、および他の特性によって明らかになるように、アミノ酸、および特にそれらのアミノ酸の側鎖の相対類似性に依存することが理解される。
【００７２】
バリアントは、完全遺伝子配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一であるヌクレオチド配列であり得る。ヌクレオチド配列は、遺伝子配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。バリアントは、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって実質的に同一であるアミノ酸配列であり得る。アミノ酸配列は、アミノ酸配列またはその断片の全長にわたって８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一であり得る。
【００７３】
本明細書で使用される「ベクター」は、複製起点を含有する核酸分子を意味し得る。ベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターまたは宿主ゲノムに統合するベクターのいずれかであり得る。
【００７４】
本明細書における数値範囲の列挙について、同じ精度でその間に介在する各数が明示的に企図される。例えば、６〜９の範囲について、６および９に加えて数７および８が企図され、６．０〜７．０の範囲について、数６．０、６．１、６．２、６．３、６．４、６．５、６．６、６．７、６．８、６．９、および７．０が明示的に企図される。
【００７５】
２．説明
本発明は、ＭＣＶ  Ｔ抗原をコードする最適化コンセンサス配列を提供する。一実施形態では、最適化コンセンサス配列によってコードされるＭＣＶ  Ｔ抗原は、哺乳動物において免疫応答を引き出すことができる。一実施形態では、最適化コンセンサス配列によってコードされるＭＣＶ  Ｔ抗原は、これに対して免疫応答を誘導することができる免疫原として特に効果的にするエピトープ（複数可）を含むことができる。
【００７６】
最適化コンセンサス配列は、２つ以上のＭＣＶ  Ｔ抗原に由来するコンセンサス配列であり得る。最適化コンセンサス配列は、改善した発現のためのコンセンサス配列および／または修飾（複数可）を含むことができる。修飾は、コドン最適化、ＲＮＡ最適化、増加した翻訳開始のためのｋｏｚａｋ配列の付加、および／または免疫原性を増加させるための免疫グロブリンリーダー配列の付加を含むことができる。最適化コンセンサス配列によってコードされるＭＣＶ  Ｔ抗原は、免疫グロブリンシグナルペプチド、例えば、これらに限定されないが、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）または免疫グロブリン（ＩｇＧ）シグナルペプチドなどのシグナルペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、最適化コンセンサス配列によってコードされる抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）タグを含むことができる。最適化コンセンサス配列によってコードされる抗原は、対応する非最適化抗原よりも強い細胞性および／または体液性免疫応答を引き出すように設計することができる。
【００７７】
本明細書では、ＭＣＶ感染症を有する遺伝的に多様な対象においてＭＣＶに対する免疫性を誘導するために使用することができるＭＣＶ  Ｔ抗原が提供される。一実施形態では、本発明は、哺乳動物においてＭＣＶ  Ｔ抗原に対する免疫応答を起こすことができる１つ以上の核酸分子を含む免疫原性組成物を提供する。本発明はまた、哺乳動物においてＭＣＶ  Ｔ抗原に対する免疫応答を起こすことができる単離された核酸分子を提供する。一実施形態では、核酸分子は、コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原をコードする最適化されたヌクレオチド配列を含む。
【００７８】
一実施形態では、ＭＣＶ  Ｔ抗原は、天然ＭＣＶ  Ｔ抗原の少なくとも１つの発癌性の特徴を低減または破壊するように修飾される。様々な実施形態では、ＭＣＶ  Ｔ抗原は、ＣＲ１結合、ＤｎａＪ結合、ホファターゼｐｐ２Ａ結合結合、Ｒｂ結合、ＡＴＰａｓｅ活性、ヘリカーゼ活性、シャペロンタンパク質結合、ｈＶａｍ６ｐ結合、Ｆｂｘｗ７結合、起点結合、および形質転換のうちの少なくとも１つを低減または破壊するように修飾される。一実施形態では、ＭＣＶ  Ｔ抗原は、天然Ｔ抗原配列に対してＤ４４、Ｗ２０９、Ｅ２１６、Ｌ１４２、Ｌ９１、Ｋ９２、Ｄ９３、Ｙ９４、またはＭ９５での少なくとも１つ変異を含む。一実施形態では、ＭＣＶ  Ｔ抗原は、Ｄ４４Ｎ変異、Ｗ２０９Ａ、Ｅ２１６Ｋ変異、Ｌ１４２Ａ変異、Ｌ９１Ａ変異、Ｋ９２Ａ変異、Ｄ９３Ａ変異、Ｙ９４Ａ変異、およびＭ９５Ａ変異のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、ＭＣＶ  ＬＴＡｇは、Ｄ４４Ｎ変異、Ｗ２０９Ａ、およびＥ２１６Ｋ変異のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、ＭＣＶ  ＬＴＡｇは、Ｄ４４Ｎ変異、Ｗ２０９Ａ、およびＥ２１６Ｋ変異を含む。一実施形態では、ＭＣＶ  ＳＴＡｇは、Ｄ４４Ｎ変異、Ｌ１４２Ａ変異、Ｌ９１Ａ変異、Ｋ９２Ａ変異、Ｄ９３Ａ変異、Ｙ９４Ａ変異、およびＭ９５Ａ変異のうちの少なくとも１つを含む。一実施形態では、ＭＣＶ  ＳＴＡｇは、Ｄ４４Ｎ変異、Ｌ１４２Ａ変異、Ｌ９１Ａ変異、Ｋ９２Ａ変異、Ｄ９３Ａ変異、Ｙ９４Ａ変異、およびＭ９５Ａ変異を含む。
【００７９】
ＭＣＶ  Ｔ抗原についてのコンセンサスアミノ酸配列は、配列番号２、配列番号４、およびそれらのバリアント、ならびに配列番号２、配列番号４、およびそれらのバリアントの断片を含む。修飾された合成コンセンサスＭＣＶ  ＬＴＡｇの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２として提供される。修飾された合成コンセンサスＭＣＶ  ＳＴＡｇの例示的なアミノ酸配列は、配列番号２として提供される。
【００８０】
一実施形態では、本発明は、修飾された合成コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原をコードするヌクレオチド配列を含む核酸分子を含む組成物を提供する。一実施形態では、修飾された合成コンセンサスＭＣＶ  ＬＴＡｇをコードするヌクレオチド配列は、配列番号１として提供され、これは、配列番号２をコードする。一実施形態では、修飾された合成コンセンサスＭＣＶ  ＳＴＡｇをコードするヌクレオチド配列は、配列番号３として提供され、これは、配列番号４をコードする。
【００８１】
様々な実施形態では、本発明は、修飾されたＬＴＡｇおよび修飾されたＳＴＡｇの組み合わせ、またはそれをコードする１つ以上の核酸分子を含む組成物を提供する。組成物は、単一のプラスミド、または２つ以上の異なるプラスミドなどの２つ以上の異なる核酸分子の複数のコピーのような、単一の核酸分子の複数のコピーを含み得る。
【００８２】
組成物は、複数のコンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原についてのコード配列を含有する、プラスミドなどの単一の核酸分子を含み得る。一実施形態では、組成物は、ＭＣＶ  ＬＴＡｇおよびＭＣＶ  ＳＴＡｇをコードするヌクレオチド配列を含む単一の核酸分子を含み得る。一実施形態では、各コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原についての各コード配列は、別個のプラスミド上にある。
【００８３】
したがって、複数のコンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む組成物は、単一のプラスミド上にあり得る。一実施形態では、組成物は、単一のプロモーター下でＭＣＶ  ＬＴＡｇおよびＭＣＶ  ＳＴＡｇをコードする単一のプラスミドを含む。そのような実施形態では、ＭＣＶ  ＬＴＡｇをコードする配列およびＭＣＶ  ＳＴＡｇをコードする配列は、融合ペプチド配列、例えば、フューリン開裂配列によって連結され得る。フューリン開裂部位によって連結した、修飾された合成コンセンサスＭＣＶ  ＬＴＡｇおよびＭＣＶ  ＳＴＡｇを含む単一の構築物の例示的なアミノ酸配列は、配列番号６として提供される。一実施形態では、フューリン開裂配列によって連結した、修飾された合成コンセンサスＭＣＶ  ＬＴＡｇおよびＭＣＶ  ＳＴＡｇをコードする単一のヌクレオチド配列は、配列番号５として提供され、これは、配列番号６をコードする。
【００８４】
一実施形態では、最適化されたコンセンサスコードＭＣＶ  Ｔ抗原は、１つ以上の制御エレメントに作動可能に連結している。一実施形態では、制御エレメントは、リーダー配列である。一実施形態では、リーダー配列は、ＩｇＥリーダー配列である。一実施形態では、ＩｇＥリーダー配列は、配列番号７で記載されるアミノ酸配列を有する。したがって、一実施形態では、本発明は、配列番号７で記載されるアミノ酸配列に作動可能に連結した、配列番号２、配列番号４、または配列番号６で記載されるアミノ酸配列に関する。一実施形態では、本発明は、配列番号７で記載されるアミノ酸配列に作動可能に連結した、配列番号２、配列番号４、または配列番号６で記載されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に関する。
【００８５】
一実施形態では、制御エレメントは、開始コドンである。したがって、一実施形態では、本発明は、５’末端に開始コドンを含むヌクレオチド配列に作動可能に連結した、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５、またはその断片もしくはホモログで記載されるヌクレオチド配列に関する。一実施形態では、本発明は、Ｎ末端で開始コドン（例えば、メチオニン）によってコードされるアミノ酸に作動可能に連結した、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６、またはその断片もしくはホモログで記載されるアミノ酸配列に関する。
【００８６】
一実施形態では、制御エレメントは、少なくとも１つの終止コドンである。したがって、一実施形態では、本発明は、３’末端に少なくとも１つの終止コドンを含むヌクレオチド配列に作動可能に連結した、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５、またはその断片もしくはホモログで記載されるヌクレオチド配列に関する。一実施形態では、ヌクレオチド配列は、翻訳終結の効率を高めるために２つの終止コドンに作動可能に連結している。
【００８７】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するペプチドをコードすることができる。一実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５で記載されるヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、配列は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５で記載されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するヌクレオチド配列であり得る。他の実施形態では、配列は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６で記載されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列であり得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５で記載されるヌクレオチド配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するＤＮＡ配列からの転写物であるＲＮＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６で記載されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするＲＮＡ配列を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、全長コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原をコードするヌクレオチド配列を含み得る。核酸分子は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６をコードする配列を含み得る。核酸分子は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５のヌクレオチド配列を含み得る。核酸分子は、例えば、ＩｇＥまたはＩｇＧシグナルペプチドなどのシグナルペプチドをコードするコード配列を任意に含み得る。
【００９０】
コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６で記載されるアミノ酸配列を有するペプチドであり得る。いくつかの実施形態では、抗原は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６で記載されるアミノ酸配列の全長にわたって少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有することができる。
【００９１】
配列番号２、配列番号４、または配列番号６の免疫原性断片を提供することができる。免疫原性断片は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６の全長の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含むことができる。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、例えば、免疫グロブリンリーダー、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列を含まない。
【００９２】
配列番号２、配列番号４、または配列番号６の免疫原性断片に相同のアミノ酸配列を有するタンパク質の免疫原性断片を提供することができる。そのような免疫原性断片は、配列番号２、配列番号４、または配列番号６に９５％相同であるタンパク質の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含むことができる。いくつかの実施形態は、本明細書におけるコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に対して９６％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書におけるコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に対して９７％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書におけるコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に対して９８％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態は、本明細書におけるコンセンサスタンパク質配列の免疫原性断片に対して９９％の相同性を有する免疫原性断片に関する。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、例えば、免疫グロブリンリーダー、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列を含む。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、リーダー配列を含まない。
【００９３】
一実施形態では、核酸分子の免疫原性断片は、全長最適化コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原の少なくとも１つの免疫優性または準免疫優性エピトープをコードする。
【００９４】
いくつかの実施形態は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５の全長の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％を含む配列番号１、配列番号３、または配列番号５の免疫原性断片に関する。免疫原性断片は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５の断片に少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％相同であり得る。いくつかの実施形態では、免疫原性断片は、例えば、免疫グロブリンリーダー、例えば、ＩｇＥリーダーなどのリーダー配列をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、断片は、リーダー配列をコードするコード配列を含まない。
【００９５】
一実施形態では、核酸分子は、配列番号１、配列番号３、または配列番号５に少なくとも９０％相同な配列を含む。
一実施形態では、核酸分子は、本明細書に記載されるコンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原配列をコードするＲＮＡ配列を含む。例えば、核酸は、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６、これらのバリアント、これらの断片、またはこれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上をコードするＲＮＡ配列を含み得る。
【００９６】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、コード配列のＮ末端上のＭＣＶ  Ｔ抗原マイナスＩｇＥリーダー配列についてコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ核酸分子は、コード配列のＮ末端に付着し、プロモーターに作動可能に連結したＩｇＥリーダー配列をさらに含む。
【００９７】
核酸分子は、コード配列のＣ末端に結合したポリアデニル化配列をさらに含むことができる。一実施形態では、核酸分子は、最適化されたコドンである。
【００９８】
ワクチンおよび免疫原性組成物
最適化されたコンセンサス配列、最適化されたコンセンサスコード抗原、これらの断片、これらのバリアント、またはこれらの組み合わせを含む、ワクチンなどの免疫原性組成物が提供される。免疫原性組成物は、ＭＣＶ  Ｔ抗原に対する免疫原性組成物が投与された対象の免疫応答を有意に誘導することができる。ワクチンは、複数の核酸分子、またはこれらの組み合わせを含み得る。ワクチンは、治療的または予防的免疫応答を誘導するために提供され得る。
【００９９】
免疫原性組成物は、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン、ペプチドワクチン、または混合ワクチンであり得る。ワクチンは、抗原をコードする最適化されたコンセンサスヌクレオチド配列を含むことができる。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、これらのバリアント、これらの断片、またはこれらの組み合わせであり得る。ヌクレオチド配列はまた、ペプチド結合によって抗原に連結しているリンカー、リーダー、またはタグ配列をコードする追加の配列を含むことができる。ペプチドワクチンは、抗原、そのバリアント、その断片、またはその組み合わせであり得る。混合ＤＮＡおよびペプチドワクチンは、上記の最適化されたコンセンサスヌクレオチド配列およびコードされた抗原を含むことができる。
【０１００】
ワクチンは、ＤＮＡワクチンであり得る。ＤＮＡワクチンは、米国特許第５，５９３，９７２号、第５，７３９，１１８号、第５，８１７，６３７号、第５，８３０，８７６号、第５，９６２，４２８号、第５，９８１，５０５号、第５，５８０，８５９号、第５，７０３，０５５号、および第５，６７６，５９４号に開示され、これらは、参照によって完全に本明細書に組み込まれる。ＤＮＡワクチンは、これが染色体に統合するのを阻害するエレメントまたは試薬をさらに含むことができる。
【０１０１】
ワクチンは、１つ以上のＭＣＶ  Ｔ抗原のＲＮＡであり得る。ＲＮＡワクチンは、細胞に導入することができる。
【０１０２】
ワクチンは、弱毒性生ワクチン、抗原を送達するために組換えベクターを使用するワクチン、サブユニットワクチン、および糖タンパク質ワクチン、例えば、限定されないが、各々、参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第４，５１０，２４５号、第４，７９７，３６８号、第４，７２２，８４８号、第４，７９０，９８７号、第４，９２０，２０９号、第５，０１７，４８７号、第５，０７７，０４４号、第５，１１０，５８７号、第５，１１２，７４９号、第５，１７４，９９３号、第５，２２３，４２４号、第５，２２５，３３６号、第５，２４０，７０３号、第５，２４２，８２９号、第５，２９４，４４１号、第５，２９４，５４８号、第５，３１０，６６８号、第５，３８７，７４４号、第５，３８９，３６８号、第５，４２４，０６５号、第５，４５１，４９９号、第５，４５３，３６４号、第５，４６２，７３４号、第５，４７０，７３４号、第５，４７４，９３５号、第５，４８２，７１３号、第５，５９１，４３９号、第５，６４３，５７９号、第５，６５０，３０９号、第５，６９８，２０２号、第５，９５５，０８８号、第６，０３４，２９８号、第６，０４２，８３６号、第６，１５６，３１９号、および第６，５８９，５２９号に記載されるワクチンであり得る。
【０１０３】
本発明のワクチンは、ワクチン自体が病気または死を引き起こさないように安全である、病気に対する保護である、保護Ｔ細胞応答を誘導する、投与しやすさ、副作用の少なさ、生物学的安定性、および用量あたりのコストの低さを提供するなどの、有効なワクチンに必要な特徴を有することができる。
【０１０４】
本明細書では、哺乳動物においてＭＣＶに対する免疫応答を起こすことができる免疫原性組成物が提供される。免疫原性組成物は、上記で議論される各プラスミドを含み得る。免疫原性組成物は、複数のプラスミド、またはこれらの組み合わせを含み得る。免疫原性組成物は、治療的または予防的免疫応答を誘導するために提供され得る。
【０１０５】
免疫原性組成物は、１つ以上のコンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原をコードする核酸分子を送達するために使用され得る。免疫原性組成物は、好ましくは、プラスミドを含む組成物である。
【０１０６】
免疫原性組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含み得る。薬学的に許容される賦形剤は、ビヒクル、アジュバント、担体、または希釈剤としての機能的分子であり得る。薬学的に許容される賦形剤は、トランスフェクション促進剤であり得、これは、表面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体、小胞、例えば、スクアレンおよびスクアレン、ヒアルロン酸、脂質、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。
【０１０７】
トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含む、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸であり、より好ましくは、ポリ−Ｌ−グルタミン酸は、免疫原性組成物中に６ｍｇ／ｍｌ未満の濃度で存在する。トランスフェクション促進剤はまた、表面活性剤、例えば、免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭＳ）、フロイント不完全アジュバント、モノホスホリル脂質Ａを含むＬＰＳ類似体、ムラミルペプチド、キノン類似体および小胞、例えば、スクアレンおよびスクアレンを含み得、ヒアルロン酸はまた、遺伝子構築物と共に投与されて使用され得る。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物はまた、脂質などのトランスフェクション促進剤、レシチンリポソームもしくは、ＤＮＡ−リポソーム混合物（例えば、Ｗ０９３２４６４０を参照されたい）として、当該技術分野で知られている他のリポソームを含む、リポソーム、カルシウムイオン、ウイルスタンパク質、ポリアニオン、ポリカチオン、もしくはナノ粒子、または他の既知のトランスフェクション促進剤を含み得る。好ましくは、トランスフェクション促進剤は、ポリ−Ｌ−グルタミン酸（ＬＧＳ）を含む、ポリアニオン、ポリカチオン、または脂質である。免疫原性組成物中のトランスフェクション剤の濃度は、４ｍｇ／ｍｌ未満、２ｍｇ／ｍｌ未満、１ｍｇ／ｍｌ未満、０．７５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．５００ｍｇ／ｍｌ未満、０．２５０ｍｇ／ｍｌ未満、０．１００ｍｇ／ｍｌ未満、０．０５０ｍｇ／ｍｌ未満、または０．０１０ｍｇ／ｍｌ未満である。
【０１０８】
薬学的に許容される賦形剤は、１つ以上のアジュバントであり得る。アジュバントは、同じプラスミドから、もしくは代替のプラスミドから発現するか、または免疫原性組成物において上記プラスミドと組み合わせたタンパク質として送達される他の遺伝子であり得る。１つ以上のアジュバントは、ＣＣＬ２０、α−インターフェロン（ＩＦＮ−α）、β−インターフェロン（ＩＦＮ−β）、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、欠失したシグナル配列をコードするシグナル配列またはコード配列を有し、任意にＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチドまたはＩｇＥからのものなどの異なるシグナルペプチドをコードするコード配列を含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的断片またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるタンパク質および／またはタンパク質をコードする核酸分子であり得る。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、アジュバントは、ＣＣＬ−２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、またはＲＡＮＴＥＳからなる群から選択されるタンパク質をコードする１つ以上のタンパク質および／または核酸分子であり得る。ＩＬ−１２構築物および配列の例は、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、２０１１年１２月１２日に出願されたＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９７／０１９５０２号および対応する米国特許出願第０８／９５６，８６５号、ならびに米国仮特許出願第６１／５６９６００号に開示される。ＩＬ−１５構築物および配列の例は、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０４／１８９６２号および対応する米国特許出願第１０／５６０，６５０号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０７／００８８６号および対応する米国特許出願第１２／１６０，７６６号、ならびにＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１０／０４８８２７号に開示される。ＩＬ−２８構築物および配列の例は、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ０９／０３９６４８号および対応する米国特許出願第１２／９３６，１９２号に開示される。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物および配列の例は、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示される。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示される。ＲＡＮＴＥＳおよび他の構築物および配列の例は、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１９９９／００４３３２号および対応する米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示される。ＲＡＮＴＥＳ構築物および配列の他の例は、参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ１１／０２４０９８号に開示される。ケモカインＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、およびＭＥＣ構築物および配列の例は、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＵＳ２００５／０４２２３１号および対応する米国特許出願第１１／７１９，６４６号に開示される。ＯＸ４０および他の免疫調節剤の例は、米国特許出願第１０／５６０，６５３号に開示され、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。ＤＲ５および他の免疫調節剤の例は、米国特許出願第０９／６２２４５２号に開示され、これは、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１１０】
免疫原性組成物は、参照によって完全に組み込まれる、１９９４年４月１日に出願された米国特許出願第０２１，５７９号に記載される遺伝子ワクチン促進剤をさらに含み得る。
【０１１１】
免疫原性組成物は、コンセンサス抗原およびプラスミドを約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、または好ましくは約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、またはより好ましくは約１ミリグラム〜約２ミリグラムの量で含み得る。いくつかの好ましい実施形態では、本発明による薬学的組成物は、約５ナノグラム〜約１０００マイクログラムのＤＮＡを含む。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約０．１〜約５００マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約１〜約３５０マイクログラムのＤＮＡを含有する。いくつかの好ましい実施形態では、薬学的組成物は、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラム、約１ナノグラム〜１００ミリグラム、約１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約０．１マイクログラム〜約１０ミリグラム、約１ミリグラム〜約２ミリグラム、約５ナノグラム〜約１０００ミリグラム、約１０ナノグラム〜約８００マイクログラム、約０．１〜約５００マイクログラム、約１〜約３５０マイクログラム、約２５〜約２５０マイクログラム、約１００〜約２００マイクログラムのコンセンサス抗原またはそのプラスミドを含有する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本発明による薬学的組成物は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ナノグラムの本発明の核酸分子を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラムの本発明の核酸分子を含むことができる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、少なくとも１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇ以上の本発明の核酸分子を含むことができる。
【０１１３】
他の実施形態では、薬学的組成物は、これを含む１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００ナノグラムまでの本発明の核酸分子を含むことができる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、これを含む１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２０５、２１０、２１５、２２０、２２５、２３０、２３５、２４０、２４５、２５０、２５５、２６０、２６５、２７０、２７５、２８０、２８５、２９０、２９５、３００、３０５、３１０、３１５、３２０、３２５、３３０、３３５、３４０、３４５、３５０、３５５、３６０、３６５、３７０、３７５、３８０、３８５、３９０、３９５、４００、４０５、４１０、４１５、４２０、４２５、４３０、４３５、４４０、４４５、４５０、４５５、４６０、４６５、４７０、４７５、４８０、４８５、４９０、４９５、５００、６０５、６１０、６１５、６２０、６２５、６３０、６３５、６４０、６４５、６５０、６５５、６６０、６６５、６７０、６７５、６８０、６８５、６９０、６９５、７００、７０５、７１０、７１５、７２０、７２５、７３０、７３５、７４０、７４５、７５０、７５５、７６０、７６５、７７０、７７５、７８０、７８５、７９０、７９５、８００、８０５、８１０、８１５、８２０、８２５、８３０、８３５、８４０、８４５、８５０、８５５、８６０、８６５、８７０、８７５、８８０、８８５、８９０、８９５、９００、９０５、９１０、９１５、９２０、９２５、９３０、９３５、９４０、９４５、９５０、９５５、９６０、９６５、９７０、９７５、９８０、９８５、９９０、９９５、または１０００マイクログラムまでの本発明の核酸分子を含むことができる。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、これを含む１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、または１０ｍｇまでの本発明の核酸分子を含むことができる。
【０１１４】
免疫原性組成物は、使用される投与の方式に従って製剤化され得る。注射可能な免疫原性組成物薬学的組成物は、滅菌、パイロジェンフリー、および無粒子であり得る。等張性製剤または溶液が使用され得る。等張性のための添加剤は、クロリド、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを含み得る。免疫原性組成物は、血管収縮剤を含み得る。等張性溶液は、リン酸緩衝食塩水を含み得る。免疫原性組成物は、ゼラチンおよびアルブミンを含む安定化剤をさらに含み得る。安定化することは、免疫原性組成物製剤へのＬＧＳまたはポリカチオンもしくはポリアニオンなど、製剤が室温または周囲温度で長時間にわたって安定であることを可能にし得る。
【０１１５】
免疫原性組成物は、室温（２５℃）で１週間超、いくつかの実施形態では２週間超、いくつかの実施形態では３週間超、いくつかの実施形態では４週間超、いくつかの実施形態では５週間超、およびいくつかの実施形態では６週間超にわたって安定であり得る。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１か月超、２か月超、３か月超、４か月超、５か月超、６か月超、７か月超、８か月超、９か月超、１０か月超、１１か月超、または１２か月超にわたって安定である。いくつかの実施形態では、ワクチンは、１年超、２年超、年超、または５年超にわたって安定である。一実施形態では、免疫原性組成物は、冷蔵（２〜８℃）下で安定である。したがって、一実施形態では、免疫原性組成物は、凍結冷鎖を必要としない。免疫原性組成物は、その意図される使用を可能にする（例えば、対象において免疫応答を起こす）ために十分な期間にわたってその生物学的活性を保持する場合、安定である。例えば、保存され、出荷される、などの免疫原性組成物について、免疫原性組成物は、数か月〜数年間安定なままであることが望ましくあり得る。
【０１１６】
免疫応答
免疫原性組成物は、組成物が投与された対象において免疫応答を誘導することができる。誘導された免疫応答は、ＭＣＶ  Ｔ抗原に特異的であり得る。誘導された免疫応答は、最適化コンセンサスコード抗原に関連したＭＣＶ  Ｔ抗原と反応性であり得る。様々な実施形態では、関連抗原は、最適化コンセンサスコード抗原のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するアミノ酸配列を有する抗原を含む。様々な実施形態では、関連抗原は、本明細書に開示される最適化コンセンサスヌクレオチド配列に対する少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の相同性を有するヌクレオチド配列によってコードされる抗原を含む。
【０１１７】
免疫原性組成物は、免疫原性組成物が投与された対象において体液性免疫応答を誘導することができる。誘導された体液性免疫応答は、ＭＣＶ  Ｔ抗原に特異的であり得る。誘導された体液性免疫応答は、最適化コンセンサスコード抗原に関連したＭＣＶ  Ｔ抗原と反応性であり得る。体液性免疫応答は、免疫原性組成物が投与された対象において約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍誘導することができる。体液性免疫応答は、免疫原性組成物が投与された対象において、免疫原性組成物が投与されていない対象または非最適化ＭＣＶ  Ｔ抗原が投与された対象と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍誘導することができる。
【０１１８】
免疫原性組成物によって誘導された体液性免疫応答は、免疫原性組成物が投与されていない対象と比較して免疫原性組成物が投与された対象と関連したＩｇＧ抗体の増加したレベルを含むことができる。これらのＩｇＧ抗体は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関連したＭＣＶ  Ｔ抗原に特異的であり得る。これらのＩｇＧ抗体は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関連したＭＣＶ  Ｔ抗原と反応性であり得る。免疫原性組成物が投与された対象と関連したＩｇＧ抗体のレベルは、免疫原性組成物が投与されていない対象と比較して約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍増加させることができる。免疫原性組成物が投与された対象と関連したＩｇＧ抗体のレベルは、免疫原性組成物が投与されていない対象または非最適化ＭＣＶ  Ｔ抗原が投与された対象と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１５．５倍、または少なくとも約１６．０倍増加させることができる。
【０１１９】
免疫原性組成物は、免疫原性組成物が投与された対象において細胞性免疫応答を誘導することができる。誘導された細胞性免疫応答は、最適化コンセンサスコード抗原に関連したＭＣＶ  Ｔ抗原に特異的であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、最適化コンセンサスコード抗原に関連したＭＣＶ  Ｔ抗原と反応性であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ８+Ｔ細胞応答を引き出すことを含むことができる。引き出されたＣＤ８+Ｔ細胞応答は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関連したＭＣＶ  Ｔ抗原と反応性であり得る。引き出されたＣＤ８+Ｔ細胞応答は、多機能性であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ８+Ｔ細胞応答を引き出すことを含むことができ、ＣＤ８+Ｔ細胞は、インターフェロン−ガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの組み合わせを生成する。
【０１２０】
誘導された細胞性免疫応答は、免疫原性組成物が投与されていない対象と比較して免疫原性組成物が投与された対象と関連した増加したＣＤ８+Ｔ細胞応答を含むことができる。免疫原性組成物が投与された対象と関連したＣＤ８+Ｔ細胞応答は、免疫原性組成物が投与されていない対象と比較して約２倍〜約３０倍、約３倍〜約２５倍、または約４倍〜約２０倍増加させることができる。免疫原性組成物が投与された対象と関連したＣＤ８+Ｔ細胞応答は、免疫原性組成物が投与されていない対象または非最適化ＭＣＶ  Ｔ抗原が投与された対象と比較して、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、少なくとも約１５．０倍、少なくとも約１６．０倍、少なくとも約１７．０倍、少なくとも約１８．０倍、少なくとも約１９．０倍、少なくとも約２０．０倍、少なくとも約２１．０倍、少なくとも約２２．０倍、少なくとも約２３．０倍、少なくとも約２４．０倍、少なくとも約２５．０倍、少なくとも約２６．０倍、少なくとも約２７．０倍、少なくとも約２８．０倍、少なくとも約２９．０倍、または少なくとも約３０．０倍増加させることができる。
【０１２１】
誘導された細胞性免疫応答は、ＭＣＶ  Ｔ抗原に対して反応性であるＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ／Ｔ−ｂｅｔトリプルポジティブＣＤ８  Ｔ細胞の増加した頻度を含むことができる。免疫原性組成物が投与された対象と関連したＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγ／Ｔ−ｂｅｔトリプルポジティブＣＤ８  Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物が投与されていない対象または非最適化ＭＣＶ  Ｔ抗原が投与された対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍増加させることができる。
【０１２２】
誘導された細胞性免疫応答は、ＭＣＶ  Ｔ抗原に対して反応性であるＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγダブルポジティブＣＤ８  Ｔ細胞の増加した頻度を含むことができる。免疫原性組成物が投与された対象と関連したＣＤ１０７ａ／ＩＦＮγダブルポジティブＣＤ８  Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物が投与されていない対象または非最適化ＭＣＶ  Ｔ抗原が投与された対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、または１４倍増加させることができる。
【０１２３】
免疫原性組成物によって誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ４+Ｔ細胞応答を引き出すことを含み得る。引き出されたＣＤ４+Ｔ細胞応答は、最適化コンセンサス抗原に遺伝的に関連したＭＣＶ  Ｔ抗原と反応性であり得る。引き出されたＣＤ４+Ｔ細胞応答は、多機能性であり得る。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ４+Ｔ細胞応答を引き出すことを含むことができ、ＣＤ４+Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−２、またはＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの組み合わせを生成する。
【０１２４】
誘導された細胞性免疫応答は、ＩＦＮ−γを生成するＣＤ４+Ｔ細胞の増加した頻度を含むことができる。免疫原性組成物が投与された対象と関連したＣＤ４+ＩＦＮ−γ+Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物が投与されていない対象または非最適化ＭＣＶ  Ｔ抗原が投与された対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、または２０倍増加させることができる。
【０１２５】
誘導された細胞性免疫応答は、ＴＮＦ−αを生成するＣＤ４+Ｔ細胞の増加した頻度を含むことができる。免疫原性組成物が投与された対象と関連したＣＤ４+ＴＮＦ−α+Ｔ細胞の頻度は、免疫原性組成物が投与されていない対象または非最適化ＭＣＶ  Ｔ抗原が投与された対象と比較して、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２１倍、または２２倍増加させることができる。
【０１２６】
誘導された細胞性免疫応答は、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの両方を生成するＣＤ４+Ｔ細胞の増加した頻度を含むことができる。免疫原性組成物が投与された対象と関連したＣＤ４+ＩＦＮ−γ+ＴＮＦ−α+の頻度は、免疫原性組成物が投与されていない対象または非最適化ＭＣＶ  Ｔ抗原が投与された対象と比較して、少なくとも約２倍、２．５倍、３．０倍、３．５倍、４．０倍、４．５倍、５．０倍、５．５倍、６．０倍、６．５倍、７．０倍、７．５倍、８．０倍、８．５倍、９．０倍、９．５倍、１０．０倍、１０．５倍、１１．０倍、１１．５倍、１２．０倍、１２．５倍、１３．０倍、１３．５倍、１４．０倍、１４．５倍、１５．０倍、１５．５倍、１６．０倍、１６．５倍、１７．０倍、１７．５倍、１８．０倍、１８．５倍、１９．０倍、１９．５倍、２０．０倍、２１倍、２２倍、２３倍、２４倍、２５倍、２６倍、２７倍、２８倍、２９倍、３０倍、３１倍、３２倍、３３倍、３４倍、または３５倍増加させることができる。
【０１２７】
免疫原性組成物は、筋肉または皮膚などの異なる組織に投与される場合、免疫応答をさらに誘導することができる。免疫原性組成物は、エレクトロポレーション、もしくは注射を介して、または皮下、もしくは筋肉内に投与される場合、免疫応答をさらに誘導することができる。
【０１２８】
ベクター
上記のヌクレオチド構築物は、１つ以上のベクターに配置することができる。１つ以上のベクターは、複製起点を含有することができる。１つ以上のベクターは、プラスミド、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。１つ以上のベクターは、自己複製染色体外ベクター、または宿主ゲノムに統合するベクターのいずれかであり得る。
【０１２９】
ベクターは、これらに限定されないが、プラスミド、発現ベクター、組換えウイルス、組換え「裸のＤＮＡ」ベクターの任意の形態などを含む。「ベクター」は、細胞に感染、トランスフェクト、一時的または永久的に形質導入することができる核酸を含む。ベクターは、裸の核酸、またはタンパク質もしくは脂質と複合体化された核酸であり得ることが認識されるであろう。ベクターは任意に、ウイルスもしくは細菌核酸および／もしくはタンパク質、ならびに／またはメンブレン（例えば、細胞膜、ウイルス脂質エンベロープなど）を含む。ベクターは、これに限定されないが、ＤＮＡの断片が付着し、複製され得る、レプリコン（例えば、ＲＮＡレプリコン、バクテリオファージ）を含む。ベクターはよって、これらに限定されないが、ＲＮＡ、自立自己複製環状または線状ＤＮＡまたはＲＮＡ（例えば、プラスミド、ウイルスなど、例えば、米国特許第５，２１７，８７９号を参照されたい）を含み、発現および非発現プラスミドの両方を含む。組換え微生物または細胞培養物が「発現ベクター」の宿主となるものとして記載される場合、これは、染色体外環状および線状ＤＮＡならびに宿主染色体（複数可）に組み込まれたＤＮＡの両方を含む。ベクターが宿主細胞によって維持されている場合、ベクターは、自立構造として有糸分裂中に細胞によって安定に複製され得るか、または宿主のゲノム内に組み込まれるかのいずれかである。
【０１３０】
１つ以上のベクターは、発現構築物であり得、これは一般的には、特定の遺伝子を標的細胞に導入するために使用されるプラスミドである。発現ベクターが細胞内に入ると、遺伝子によってコードされるタンパク質が、細胞転写および翻訳機構リボソーム複合体によって生成される。プラスミドは、エンハンサーおよびプロモーター領域として作用し、発現ベクター上で運ばれる遺伝子の効率的な転写をもたらす制御配列を含有するように頻繁に操作される。本発明のベクターは、多量の安定なメッセンジャーＲＮＡ、およびしたがってタンパク質を発現する。
ベクターは、強いプロモーター、強い終結コドン、プロモーターとクローン化遺伝子との間の距離の調節、ならびに転写終結配列およびＰＴＩＳ（ポータブル翻訳開始配列）の挿入などの発現シグナルを有し得る。
【０１３１】
（１）発現ベクター
１つ以上のベクターは、環状プラスミドまたは線状核酸であり得る。環状プラスミドおよび線状核酸は、適切な対象細胞における特定のヌクレオチド配列の発現を誘導することができる。組換え核酸構築物を含む１つ以上のベクターは、キメラであり得、その成分のうちの少なくとも１つが、その他の成分のうちの少なくとも１つに対して非相同であることを意味する。
【０１３２】
（２）プラスミド
１つ以上のベクターは、プラスミドであり得る。プラスミドは、細胞を組換え核酸構築物でトランスフェクトするために有用であり得る。プラスミドは、組換え核酸構築物を対象に導入するために有用であり得る。プラスミドはまた、プラスミドが投与される細胞における遺伝子発現に十分に適し得る、制御配列を含み得る。
【０１３３】
プラスミドはまた、プラスミドを染色体外に維持し、細胞においてプラスミドの複数のコピーを生成するために、哺乳動物の複製起点を含み得る。プラスミドは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）からのｐＶＡＸ１、ｐＣＥＰ４、またはｐＲＥＰ４であり得、これは、Ｅｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルス複製起点および核抗原ＥＢＮＡ−１コード領域を含み得、これは、統合なしに高コピーエピソーム複製を生成し得る。プラスミドの骨格は、ｐＡＶ０２４２であり得る。プラスミドは、複製欠損アデノウイルス５型（Ａｄ５）プラスミドであり得る。
【０１３４】
プラスミドは、ｐＳＥ４２０（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これは、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるタンパク質生成に使用され得る。プラスミドはまた、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得る、これは、酵母のＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ株におけるタンパク質生成に使用され得る。プラスミドはまた、ＭＡＸＢＡＣ（商標）完全バキュロウイルス発現システム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）のものであり得、これは、昆虫細胞におけるタンパク質生成に使用され得る。プラスミドはまた、ｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）であり得、これは、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞などの哺乳動物細胞におけるタンパク質生成に使用され得る。
【０１３５】
（３）ＲＮＡ
一実施形態では、核酸は、ＲＮＡ分子である。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるＤＮＡ配列から転写される。例えば、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、配列番号１、配列番号３、もしくは配列番号５、そのバリアント、またはその断片のうちの１つに少なくとも９０％相同なＤＮＡ配列によってコードされる。別の実施形態では、ヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号４、もしくは配列番号６、そのバリアント、またはその断片のうちの１つに少なくとも９０％相同なポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列によって転写されるＲＮＡ配列を含む。したがって、一実施形態では、本発明は、ＭＣＶ  Ｔ抗原のうちの１つ以上をコードするＲＮＡ分子を提供する。ＲＮＡは、プラス鎖であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、逆転写などの任意の介在複製ステップを必要とすることなく細胞によって翻訳することができる。本発明で有用なＲＮＡ分子は、５′キャップ（例えば、７−メチルグアノシン）を有し得る。このキャップは、ＲＮＡのインビボ翻訳を向上させることができる。本発明で有用なＲＮＡ分子の５′ヌクレオチドは、５′三リン酸基を有し得る。キャップＲＮＡでは、これは、５′−５′架橋を介して７−メチルグアノシンに連結され得る。ＲＮＡ分子は、３′ポリ−Ａテールを有し得る。それはまた、その３′末端近くにポリ−Ａポリメラーゼ認識配列（例えば、ＡＡＵＡＡＡ）を含み得る。本発明で有用なＲＮＡ分子は、一本鎖であり得る。本発明で有用なＲＮＡ分子は、合成ＲＮＡを含み得る。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ分子は、裸のＲＮＡ分子である。一実施形態では、ＲＮＡ分子は、ベクター内に含まれる。
【０１３６】
一実施形態では、ＲＮＡは、５’および３’ＵＴＲを有する。一実施形態では、５’ＵＴＲは、０〜３０００ヌクレオチドの長さである。コード領域に付加される５’および３’ＵＴＲ配列の長さは、これらに限定されないが、ＵＴＲの異なる領域にアニールするＰＣＲのプライマーを設計することを含む、異なる方法によって変更することができる。このアプローチを用いて、当業者は、転写ＲＮＡのトランスフェクション後の最適な翻訳効率を達成するために必要な５’および３’ＵＴＲ長を修飾することができる。
【０１３７】
５’および３’ＵＴＲは、目的の遺伝子についての自然発生、内因性５’および３’ＵＴＲであり得る。あるいは、目的の遺伝子に内因性ではないＵＴＲ配列は、ＵＴＲ配列をフォワードおよびリバースプライマーに組み込むことによって、またはテンプレートの任意の他の修飾によって付加することができる。目的の遺伝子に内因性ではないＵＴＲ配列の使用は、ＲＮＡの安定性および／または翻訳効率を修飾するために有用であり得る。例えば、３’ＵＴＲ配列におけるＡＵ富化エレメントは、ＲＮＡの安定性を低下させる可能性があることが知られている。したがって、３’ＵＴＲは、当該技術分野において周知であるＵＴＲの特性に基づいて転写されたＲＮＡの安定性を増加させるように選択または設計することができる。
【０１３８】
一実施形態では、５’ＵＴＲは、内因性遺伝子のＫｏｚａｋ配列を含有することができる。あるいは、目的の遺伝子に内因性ではない５’ＵＴＲが、上記のＰＣＲによって付加されている場合、コンセンサスＫｏｚａｋ配列は、５’ＵＴＲ配列を付加することによって再設計することができる。Ｋｏｚａｋ配列は、いくつかのＲＮＡ転写物の翻訳の効率を増加させることができるが、全てのＲＮＡについて効率的な転写を可能にするために必要とされるわけではないようである。多くのＲＮＡのＫｏｚａｋ配列の要件は、当該技術分野において知られている。他の実施形態では、５’ＵＴＲは、ＲＮＡウイルスに由来し得、このＲＮＡゲノムは、細胞において安定である。他の実施形態では、様々なヌクレオチド類似体は、ＲＮＡのエキソヌクレアーゼ分解を妨げるために３’または５’ＵＴＲにおいて使用することができる。
【０１３９】
一実施形態では、ＲＮＡは、５’末端および３’ポリ（Ａ）テールの両方にキャップを有し、これは、リボソーム結合、翻訳の開始、および細胞におけるＲＮＡの安定性を決定する。
【０１４０】
一実施形態では、ＲＮＡは、ヌクレオシド修飾ＲＮＡである。ヌクレオシド修飾ＲＮＡは、例えば、安定性の増加、生得免疫原性の低さまたは不在、および翻訳の向上を含む、非修飾ＲＮＡに対する特定の利点を有する。
【０１４１】
（４）環状および線状ベクター
１つ以上のベクターは、細胞ゲノムへの統合によって標的細胞を形質転換するか、または染色体外に存在し得る、環状プラスミド（例えば、複製起点を有する自己複製プラスミド）であり得る。ベクターは、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであるか、または組換え核酸構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／もしくは軽鎖ポリペプチドを発現することができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【０１４２】
本明細書ではまた、エレクトロポレーションを介して対象に効率的に送達し、組換え核酸構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現することができる、線状核酸、または線状発現カセット（「ＬＥＣ」）が提供される。ＬＥＣは、リン酸骨格が全くない任意の線状ＤＮＡであり得る。ＬＥＣは、任意の抗生物質耐性遺伝子および／またはリン酸骨格を含有しない場合がある。ＬＥＣは、所望の遺伝子発現に関連していない他のヌクレオチド配列を含有しない場合がある。
【０１４３】
ＬＥＣは、線状化することができる任意のプラスミドに由来し得る。プラスミドは、組換え核酸構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／または軽鎖ポリペプチドを発現することができるものであり得る。プラスミドは、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）またはｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）であり得る。プラスミドは、ＷＬＶ００９、ｐＶＡＸ、ｐｃＤＮＡ３．０、もしくはｐｒｏｖａｘであるか、または組換え核酸構築物によってコードされる重鎖ポリペプチドおよび／もしくは軽鎖ポリペプチドを発現することができる任意の他の発現ベクターであり得る。
【０１４４】
ＬＥＣは、ｐｃｒＭ２であり得る。ＬＥＣは、ｐｃｒＮＰであり得る。ｐｃｒＮＰおよびｐｃｒＭＲは、それぞれ、ｐＮＰ（Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／３４）およびｐＭ２（Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／９９）に由来し得る。
【０１４５】
（５）ウイルスベクター
一実施形態では、本発明の核酸を細胞に送達することができるウイルスベクターが本明細書において提供される。発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）、およびＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）、ならびに他のウイルス学および分子生物学マニュアルに記載される。ベクターとして有用であるウイルスは、これらに限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、およびレンチウイルスを含む。一般に、適切なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーター配列、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つ以上の選択可能なマーカーを含有する。（例えば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８、および米国特許第６，３２６，１９３号を参照されたい。ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えば、ヒト細胞に挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【０１４６】
（６）ベクターを調製する方法
本明細書では、組換え核酸構築物が配置されている１つ以上のベクターを調製するための方法が提供される。最終サブクローニングステップ後、ベクターは、当該技術分野における既知の方法を用いて、大規模発酵タンクにおける細胞培養物を接種するために使用することができる。
【０１４７】
他の実施形態では、最終サブクローニングステップ後、ベクターは、１つ以上のエレクトロポレーション（ＥＰ）装置で使用することができる。ＥＰ装置は、以下でより詳細に記載される。
【０１４８】
１つ以上のベクターは、既知の装置および技法の組み合わせを用いて製剤化または製造することができるが、好ましくは、それらは、２００７年５月２３日に出願された、許諾、同時係属米国仮特許出願第６０／９３９，７９２号に記載されるプラスミド製造技法を用いて製造される。いくつかの例では、本明細書に記載されるＤＮＡプラスミドは、１０  ｍｇ／ｍＬ以上の濃度で製剤化することができる。製造技法はまた、許諾特許、２００７年７月３日に発行された、米国特許第７，２３８，５２２号に記載されるものを含む、米国特許出願第６０／９３９７９２号に記載されるものに加えて、当業者に一般的に知られている様々な装置およびプロトコルを含むか、または組み込む。上記参照出願および特許、それぞれ、米国特許出願第６０／９３９，７９２号および米国特許第７，２３８，５２２号は、それらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０１４９】
複数のベクター
免疫原性組成物は、単一のプラスミド、または２つ以上の異なるプラスミドなどの２つ以上の異なる核酸分子の複数のコピーのような、単一の核酸分子の複数のコピーを含み得る。例えば、免疫原性組成物は、複数の２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個以上の異なる核酸分子を含み得る。そのような組成物は、複数の２、３、４、５、６個以上の異なるプラスミドを含み得る。
【０１５０】
免疫原性組成物は、ＭＣＶ  Ｔ抗原のコード配列を集合的に含有する、プラスミドなどの、核酸分子を含み得る。免疫原性組成物は、複数の抗原のコード配列を集合的に含有する、プラスミドなどの、核酸分子を含み得る。一実施形態では、抗原は、ＭＣＶ  Ｔ抗原および１つ以上の追加の癌抗原である。免疫原性組成物は、１つ以上のＭＣＶ  Ｔ抗原および１つ以上の癌抗原のコード配列を集合的に含有する、プラスミドなどの、核酸分子を含み得る。
【０１５１】
癌抗原
免疫原性組成物は、腫瘍関連病理を治療または予防するために、１つ以上の癌抗原、例えば、ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３（非変異体）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ−変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、Ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＴＲＰ−２、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３ガングリオシド、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、精子線維鞘タンパク質、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ  １、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ  ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１（プロタミン２）、ＭＡＤ−ＣＴ−２、およびＦＯＳ関連抗原１を含むことができる。免疫原性組成物は、腫瘍関連病理を治療または予防するために、１つ以上の癌抗原ＷＴ１、ＭＵＣ１、ＬＭＰ２、ＨＰＶ  Ｅ６  Ｅ７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、イディオタイプ、ＭＡＧＥ  Ａ３、ｐ５３（非変異体）、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＳＭＡ、ＧＤ２、ＣＥＡ、ＭｅｌａｎＡ／ＭＡＲＴ１、Ｒａｓ−変異体、ｇｐ１００、ｐ５３変異体、プロテイナーゼ３（ＰＲ１）、Ｂｃｒ−ａｂｌ、チロシナーゼ、サバイビン、ＰＳＡ、ｈＴＥＲＴ、ＥｐｈＡ２、ＰＡＰ、ＭＬ−ＩＡＰ、ＡＦＰ、ＥｐＣＡＭ、ＥＲＧ、ＮＡ１７、ＰＡＸ３、ＡＬＫ、アンドロゲン受容体、サイクリンＢ１、ポリシアル酸、ＭＹＣＮ、ＴＲＰ−２、ＲｈｏＣ、ＧＤ３、フコシルＧＭ１、メソテリン、ＰＳＣＡ、ＭＡＧＥ  Ａ１、ｓＬｅ（ａ）、ＣＹＰ１Ｂ１、ＰＬＡＣ１、ＧＭ３ガングリオシド、ＢＯＲＩＳ、Ｔｎ、ＧｌｏｂｏＨ、ＥＴＶ６−ＡＭＬ、ＮＹ−ＢＲ−１、ＲＧＳ５、ＳＡＲＴ３、ＳＴｎ、炭酸脱水酵素ＩＸ、ＰＡＸ５、ＯＹ−ＴＥＳ１、精子タンパク質１７、ＬＣＫ、ＨＭＷＭＡＡ、精子線維鞘タンパク質、ＡＫＡＰ−４、ＳＳＸ２、ＸＡＧＥ  １、Ｂ７Ｈ３、レグマイン、Ｔｉｅ  ２、Ｐａｇｅ４、ＶＥＧＦＲ２、ＭＡＤ−ＣＴ−１（プロタミン２）、ＭＡＤ−ＣＴ−２、およびＦＯＳ関連抗原を、最適化されたコンセンサスコードＭＣＶ  Ｔ抗原とさらに組み合わせることができる。癌抗原の他の組み合わせはまた、腫瘍関連病理を治療または予防するために適用され得る。
【０１５２】
方法
本明細書では、本明細書に記載される１つ以上の免疫原性組成物を対象に投与することによって、これを必要とする対象においてＭＣＶ関連疾患を治療、これに対して保護、および／または予防する方法が提供される。対象への免疫原性組成物の投与は、対象において免疫応答を誘導するか、または引き出すことができる。誘導された免疫応答は、疾患、例えば、ＭＣＶ感染症、またはＭＣＶ感染症と関連したＭＣＣに対して治療、予防、および／または保護するために使用することができる。
【０１５３】
本明細書では、これに対する免疫応答を誘導することができる、それらをＭＣＶまたはＭＣＣに対して特に有効にするエピトープを含むコンセンサス抗原の遺伝子構築物およびタンパク質を提供するために免疫原性組成物を送達するための方法が提供される。免疫原性組成物またはワクチン接種を送達する方法は、治療的および予防的免疫応答を誘導するために提供され得る。ワクチン接種プロセスは、哺乳動物においてＭＣＶまたはＭＣＣに対する免疫応答を起こし得る。免疫原性組成物は、哺乳動物の免疫系の活性を調節し、免疫応答を向上させるために個体に送達され得る。免疫原性組成物の送達は、細胞において発現し、細胞の表面に送達される核酸分子としてのコンセンサス抗原のトランスフェクションであり得、この後、免疫系は、細胞性、体液性、または細胞性および体液性応答を認識および誘導する。免疫原性組成物の送達は、上記で議論される免疫原性組成物を哺乳動物に投与することによって、ＭＣＶまたはＭＣＣに対して哺乳動物において免疫応答を誘導するか、または引き出すために使用され得る。
【０１５４】
哺乳動物の細胞への免疫原性組成物およびプラスミドの送達後、トランスフェクトされた細胞は、免疫原性組成物から注射されたプラスミドの各々についてのコンセンサス抗原を発現および分泌するであろう。これらのタンパク質は、免疫系によって異物として認識され、それらに対して抗体が作製されるであろう。これらの抗体は、免疫系によって維持され、ＭＣＶによるその後の感染症に対する有効な応答を可能にするであろう。
【０１５５】
免疫原性組成物は、哺乳動物において免疫応答を引き出すために哺乳動物に投与され得る。哺乳動物は、ヒト、霊長類、非ヒト霊長類、ウシ（ｃｏｗ）、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ヒツジ、ヤギ、アンテロープ、バイソン、スイギュウ、バイソン、ウシ（ｂｏｖｉｄ）、シカ、ハリネズミ、ゾウ、ラマ、アルパカ、マウス、ラット、およびニワトリであり得る。
【０１５６】
誘導された免疫応答は、誘導された体液性免疫応答および／または誘導された細胞性免疫応答を含むことができる。体液性免疫応答は、約１．５倍〜約１６倍、約２倍〜約１２倍、または約３倍〜約１０倍誘導することができる。誘導された細胞性免疫応答は、ＣＤ８+Ｔ細胞応答を含むことができ、これは、約２倍〜約３０倍、約３倍〜約２５倍、または約４倍〜約２０倍誘導される。
【０１５７】
免疫原性組成物用量は、１μｇ〜１０ｍｇの活性成分／体重ｋｇ／回であり得、２０μｇ〜１０ｍｇの成分／体重ｋｇ／回であり得る。免疫原性組成物は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日毎に投与することができる。有効な治療のための免疫原性組成物用量の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。
【０１５８】
免疫原性組成物は、薬学分野において当業者に周知の標準的な技法に従って製剤化することができる。そのような組成物は、特定の対象の年齢、性別、体重、および状態、ならびに投与経路などの因子を考慮して、医学分野において当業者に周知の投与量および技法によって投与することができる。
【０１５９】
免疫原性組成物は、予防的または治療的に投与することができる。予防的投与では、免疫原性組成物は、免疫応答を誘導するために十分な量で投与することができる。治療的適用では、免疫原性組成物は、これを必要とする対象に、治療効果を引き出すために十分な量で投与される。これを達成するために十分な量は、「治療有効用量」として定義される。この使用に有効な量は、例えば、投与される免疫原性組成物レジメンの特定の組成物、投与の方法、疾患の病期および重症度、対象の一般的な健康状態、ならびに処方医師の判断に依存するであろう。
【０１６０】
免疫原性組成物は、当該技術分野において周知の方法によって、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−６４８（１９９７））、Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６年１２月３日に発行された、米国特許第５，５８０，８５９号）、Ｆｅｌｇｎｅｒ（１９９７年１２月３０日に発行された、米国特許第５，７０３，０５５号）、およびＣａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７年１０月２１日に発行された、米国特許第Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，６７９，６４７号）に記載されるように投与することができ、これらの全ての内容は、それらの全体において参照によって本明細書に組み込まれる。免疫原性組成物のＤＮＡは、個体に、例えば、ワクチン銃を用いて、投与することができる粒子またはビーズと複合体化することができる。当業者であれば、生理的に許容される化合物を含む、薬学的に許容される担体の選択が、例えば、発現ベクターの投与経路に依存することを知っているであろう。
【０１６１】
免疫原性組成物は、様々な経路を介して送達することができる。典型的な送達経路は、非経口投与、例えば、皮内、筋肉内、または皮下送達を含む。他の経路は、経口投与、鼻腔内、および膣内経路を含む。特に免疫原性組成物のＤＮＡについて、免疫原性組成物は、個体の組織の間質空間に送達することができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，５８０，８５９号、および第５，７０３，０５５号、その全ての内容は、それらの全体において参照によって本明細書に組み込まれる）。免疫原性組成物はまた、筋肉に投与することができるか、あるいは皮内もしくは皮下注射を介して、または経皮的に、例えば、イオントフォレシスによって投与することができる。免疫原性組成物の表皮投与も使用することができる。表皮投与は、表皮の最外層を機械的または化学的に刺激して、刺激物に対する免疫応答を促進することを含むことができる（Ｃａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，６７９，６４７号、この内容は、その全体において参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１６２】
免疫原性組成物はまた、鼻腔を介した投与のために製剤化することができる。担体が固体である、経鼻投与に適した製剤は、例えば、約１０〜約５００ミクロンの範囲の粒子サイズを有する粗粉末を含むことができ、これは、嗅ぎとる方法で、すなわち、鼻の近くで保持された粉末の容器からの鼻腔を通した急速な吸入によって投与される。製剤は、点鼻スプレー、点鼻液、またはネブライザーによるエアロゾル投与によるものであり得る。製剤は、免疫原性組成物の水性または油性溶液を含むことができる。
【０１６３】
免疫原性組成物は、懸濁液、シロップ、またはエリキシルなどの液体調製物であり得る。免疫原性組成物はまた、滅菌懸濁液または乳濁液など、非経口、皮下、皮内、筋肉内、または静脈内投与（例えば、注射可能な投与）のために調製することができる。
【０１６４】
免疫原性組成物は、リポソーム、マイクロスフェア、または他のポリマーマトリックスに組み込むことができる（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，７０３，０５５号、Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ，Ｌｉｐｏｓｏｍｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．  Ｉｔｏ  ＩＩＩ  （２ｎｄ  ｅｄ．  １９９３）、その内容は、それらの全体において参照によって本明細書に組み込まれる）。リポソームは、リン脂質または他の脂質からなり得、作製および投与することが比較的簡単である非毒性、生理的に許容される、代謝可能な担体であり得る。
【０１６５】
ワクチンでの癌治療の方法
ワクチンは、哺乳動物における免疫応答を起こすか、または引き出すために使用することができ、免疫応答は、それを必要とする哺乳動物または対象の癌または腫瘍（例えば、ＭＣＣ）に反応性であるか、またはこれに向けられる。引き出された免疫応答は、癌または腫瘍成長を予防することができる。
【０１６６】
引き出された免疫応答は、癌または腫瘍細胞の転移を予防および／または低減することができる。したがって、ワクチンは、ワクチンが投与された哺乳動物または対象において癌または腫瘍を治療および／または予防する方法において使用することができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、（１）Ｂ細胞応答を介して体液性免疫性を誘導して、単球走化性タンパク質−１（ＭＣＰ−１）生成を遮断し、これによって骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）を遅らせ、腫瘍成長を抑制する抗体を生み出し、（２）細胞毒性Ｔリンパ腫、例えば、ＣＤ８＋（ＣＴＬ）を増加させて、腫瘍細胞を攻撃および殺滅し、（３）Ｔヘルパー細胞応答を増加させ、（４）ＩＦＮ−γおよびＴＦＮ−αを介して炎症性応答を増加させるか、または好ましくは前述の全てによって、クリアランスを媒介するか、または腫瘍細胞の成長を防止することができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、免疫応答は、ワクチンが投与された対象において様々な組織または系（例えば、脳または神経系）への損傷またはその炎症を引き起こさない、体液性免疫応答および／または抗原特異的細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答を起こすことができる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、対象において、無腫瘍生存を増加し、腫瘍質量を低減し、腫瘍生存を増加し、またはそれらの組み合わせであり得る。投与されたワクチンは、対象において無腫瘍生存を２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％以上増加させることができる。投与されたワクチンは、免疫化後の対象において腫瘍質量を２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、および７０％以上低減することができる。投与されたワクチンは、対象において、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、骨髄由来抑制細胞によって分泌されるサイトカインの増加を防止および阻害することができる。いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、対象における癌または腫瘍組織内のＭＣＰ−１の増加を防止および阻害し、それによって対象における癌または腫瘍組織の血管新生を低減することができる。
【０１７０】
投与されたワクチンは、対象において腫瘍生存を２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、および７０％以上増加させることができる。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ワクチンが投与された対象において損傷することも、または病気もしくは死を引き起こすこともなく、癌または腫瘍細胞もしくは組織を標的とする抗原特異的免疫応答を確立して、１つ以上のＭＣＶ  Ｔ抗原を発現する癌または腫瘍を除去または排除するために、末梢に（以下により詳細に記載されるように）投与することができる。
【０１７１】
投与されたワクチンは、対象における細胞性免疫応答を約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍に増加させることができる。いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、対象における細胞性免疫応答を約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍に増加させることができる。
【０１７２】
投与されたワクチンは、対象におけるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）レベルを約５０倍〜約６０００倍、約５０倍〜約５５００倍、約５０倍〜約５０００倍、約５０倍〜約４５００倍、約１００倍〜約６０００倍、約１５０倍〜約６０００倍、約２００倍〜約６０００倍、約２５０倍〜約６０００倍、または約３００倍〜約６０００倍に増加させることができる。いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、対象におけるＩＦＮ−γレベルを約５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、２５０倍、３００倍、３５０倍、４００倍、４５０倍、５００倍、５５０倍、６００倍、６５０倍、７００倍、７５０倍、８００倍、８５０倍、９００倍、９５０倍、１０００倍、１１００倍、１２００倍、１３００倍、１４００倍、１５００倍、１６００倍、１７００倍、１８００倍、１９００倍、２０００倍、２１００倍、２２００倍、２３００倍、２４００倍、２５００倍、２６００倍、２７００倍、２８００倍、２９００倍、３０００倍、３１００倍、３２００倍、３３００倍、３４００倍、３５００倍、３６００倍、３７００倍、３８００倍、３９００倍、４０００倍、４１００倍、４２００倍、４３００倍、４４００倍、４５００倍、４６００倍、４７００倍、４８００倍、４９００倍、５０００倍、５１００倍、５２００倍、５３００倍、５４００倍、５５００倍、５６００倍、５７００倍、５８００倍、５９００倍、または６０００倍に増加させることができる。
【０１７３】
ワクチン用量は、１μｇ〜１０ｍｇの活性成分／体重ｋｇ／回であり得、２０μｇ〜１０ｍｇの成分／体重ｋｇ／回であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日毎に投与することができる。有効な治療のためのワクチン用量の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。
【０１７４】
チェックポイント阻害剤での組み合わせ療法
本発明はまた、１つ以上のチェックポイント阻害剤と組み合わせて上記のワクチンを用いて哺乳動物における免疫応答を増加させる方法に向けられる。一実施形態では、上記のワクチンは、ＭＣＶ  Ｔ抗原およびチェックポイントタンパク質に対する抗体を含むことができる。本明細書で使用される「チェックポイント阻害剤」は、癌免疫療法の分野において一般的に理解されるように、免疫チェックポイントを遮断する阻害剤または分子を含む。より一般的なチェックポイント阻害剤は、免疫チェックポイントタンパク質を遮断する抗体である。免疫チェックポイントタンパク質は、これらに限定されないが、ＰＤ１、ＰＤＬ１、ＰＤＬ２、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＣＤ４０、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＤＮＡＭ−１、ＴＩＧＩＴ、ＴＭＩＧＤ２、およびＤＣ−ＳＩＧＮを含む。既知のチェックポイント阻害剤のいくつかの例は、これらに限定されないが、イピリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、ピジリズマブ、アベルマブなどを含む。
【０１７５】
組み合わせは、単一の製剤中にあり得るか、または別々であり、順に（まずＭＣＶ  Ｔ抗原、次いでチェックポイント阻害剤、またはまずチェックポイント阻害剤、次いでＭＣＶ  Ｔ抗原のいずれかで）投与することができる。いくつかの実施形態では、ＭＣＶ  Ｔ抗原は、チェックポイント阻害剤が対象に投与される約３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、０．２５時間、０．５時間、０．７５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間前に対象に投与することができる。他の実施形態では、チェックポイント阻害剤は、ＭＣＶ  Ｔ抗原が対象に投与される約３０秒、１分、２分、３分、４分、５分、１０分、１５分、２０分、２５分、３０分、３５分、４０分、４５分、５０分、５５分、６０分、０．２５時間、０．５時間、０．７５時間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、８４時間、９６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、１４日、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、２１日、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、または８週間前に対象に投与することができる。
【０１７６】
ＭＣＶ  Ｔ抗原およびチェックポイント阻害剤の組み合わせは、ＭＣＶ  Ｔ抗原を単独で含むワクチンよりも効率的に免疫系を誘導する。このより効率的な免疫応答は、特定の癌の治療および／または防止における増加した有効性を提供する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、免疫応答は、約０．５倍〜約１５倍、約０．５倍〜約１０倍、または約０．５倍〜約８倍増加させることができる。あるいは、ワクチンが投与された対象における免疫応答は、少なくとも約０．５倍、少なくとも約１．０倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約２．０倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３．０倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４．０倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５．０倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６．０倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７．０倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８．０倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９．０倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０．０倍、少なくとも約１０．５倍、少なくとも約１１．０倍、少なくとも約１１．５倍、少なくとも約１２．０倍、少なくとも約１２．５倍、少なくとも約１３．０倍、少なくとも約１３．５倍、少なくとも約１４．０倍、少なくとも約１４．５倍、または少なくとも約１５．０倍増加させることができる。
【０１７８】
依然として他の代替の実施形態では、ワクチンが投与された対象における免疫応答は、約５０％〜約１５００％、約５０％〜約１０００％、または約５０％〜約８００％増加させることができる。他の実施形態では、ワクチンが投与された対象における免疫応答は、少なくとも約５０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１５０％、少なくとも約２００％、少なくとも約２５０％、少なくとも約３００％、少なくとも約３５０％、少なくとも約４００％、少なくとも約４５０％、少なくとも約５００％、少なくとも約５５０％、少なくとも約６００％、少なくとも約６５０％、少なくとも約７００％、少なくとも約７５０％、少なくとも約８００％、少なくとも約８５０％、少なくとも約９００％、少なくとも約９５０％、少なくとも約１０００％、少なくとも約１０５０％、少なくとも約１１００％、少なくとも約１１５０％、少なくとも約１２００％、少なくとも約１２５０％、少なくとも約１３００％、少なくとも約１３５０％、少なくとも約１４５０％、または少なくとも約１５００％増加させることができる。
【０１７９】
ワクチン用量は、１μｇ〜１０ｍｇの活性成分／体重ｋｇ／回であり得、２０μｇ〜１０ｍｇの成分／体重ｋｇ／回であり得る。ワクチンは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、または３１日毎に投与することができる。有効な治療のためのワクチン用量の数は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０であり得る。
【０１８０】
メルケル細胞癌
ワクチンは、哺乳動物における免疫応答を起こすか、または引き出すために使用することができ、免疫応答は、それを必要とする哺乳動物または対象においてメルケル細胞癌（ＭＣＣ）に反応性であるか、またはこれに向けられる。引き出された免疫応答は、ＭＣＣ成長を防止することができる。引き出された免疫応答は、ＭＣＣ成長を低減することができる。引き出された免疫応答は、ＭＣＣからの癌または腫瘍細胞の転移を予防および／または低減することができる。したがって、ワクチンは、ワクチンが投与された哺乳動物または対象においてＭＣＣを治療および／または予防する方法において使用することができる。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、（１）Ｂ細胞応答を介して体液性免疫性を誘導して、ＭＣＣ細胞によって発現したＭＣＶ  Ｔ抗原を標的とする抗体を生み出し、（２）細胞毒性Ｔリンパ腫、例えば、ＣＤ８＋（ＣＴＬ）を増加させて、ＭＣＣ細胞を攻撃および殺滅し、（３）Ｔヘルパー細胞応答を増加させ、（４）ＩＦＮ−γおよびＴＦＮ−αを介して炎症性応答を増加させるか、または前述の全てによって、クリアランスを媒介するか、またはＭＣＣの成長を防止することができる。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、対象において、無ＭＣＣ生存を増加し、ＭＣＣ質量を低減し、ＭＣＣ生存を増加し、またはそれらの組み合わせであり得る。投与されたワクチンは、対象において無ＭＣＣ生存を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、および４５％以上増加させることができる。投与されたワクチンは、免疫化後の対象においてＭＣＣ質量を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％以上低減することができる。投与されたワクチンは、対象において、単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ−１）、骨髄由来抑制細胞によって分泌されるサイトカインの増加を防止および阻害することができる。いくつかの実施形態では、投与されたワクチンは、対象におけるＭＣＣ組織内のＭＣＰ−１の増加を防止および阻害し、それによって対象におけるＭＣＣ組織の血管新生を低減することができる。投与されたワクチンは、対象においてＭＣＣ生存を３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、および６０％以上増加させることができる。
【０１８３】
併用治療
免疫原性組成物は、ＣＣＬ２０、α−インターフェロン、γ−インターフェロン、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＴＮＦβ、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮成長因子（ＥＧＦ）、皮膚Ｔ細胞誘引性ケモカイン（ＣＴＡＣＫ）、上皮胸腺発現ケモカイン（ＴＥＣＫ）、粘膜関連上皮ケモカイン（ＭＥＣ）、ＩＬ−１２、欠失したシグナル配列を有し、任意にＩｇＥシグナルペプチドなどの異なるシグナルペプチドを含むＩＬ−１５を含むＩＬ−１５、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−２８、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−ｌα、ＭＩＰ−１β、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管成長因子、線維芽細胞成長因子、ＩＬ−７、神経成長因子、血管内皮成長因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｌｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩｋＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦｋＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫ  ＬＩＧＡＮＤ、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０  ＬＩＧＡＮＤ、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、およびそれらの機能的断片またはそれらの組み合わせをコードする他のタンパク質および／または遺伝子と組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態では、免疫原性組成物は、以下の核酸分子および／またはタンパク質：ＣＣＬ２０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＣＴＡＣＫ、ＴＥＣＫ、ＭＥＣ、およびＲＡＮＴＥＳ、またはそれらの機能的断片のうちの１つ以上をコードするコード配列を含む核酸分子からなる群から選択される核酸分子、ならびにＣＣＬ０２、ＩＬ−１２タンパク質、ＩＬ−１５タンパク質、ＩＬ−２８タンパク質、ＣＴＡＣＫタンパク質、ＴＥＣＫタンパク質、ＭＥＣタンパク質、もしくはＲＡＮＴＥＳタンパク質、またはそれらの機能的断片からなる群から選択されるタンパク質のうちの１つ以上と組み合わせて投与される。
【０１８４】
免疫原性組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介した、口腔内投与を介した、胸腔内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、髄腔内、および関節内、またはそれらの組み合わせを含む、異なる経路によって投与され得る。獣医学的使用について、組成物は、通常の獣医学診療に従って適切に許容される製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適した投与レジメンおよび投与経路を容易に決定することができる。免疫原性組成物は、従来のシリンジ、無針注射装置、「微粒子衝撃遺伝子銃」、または他の物理的方法、例えば、「エレクトロポレーション」（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、または超音波によって投与され得る。
【０１８５】
免疫原性組成物のプラスミドは、哺乳動物に、インビボエレクトロポレーションを伴うおよび伴わない、ＤＮＡ注射（ＤＮＡワクチン接種とも称される）、リポソーム媒介性、ナノ粒子促進性、組換えベクター、例えば、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルス関連ウイルス、および組換えワクシニアを含むいくつかの周知の技術によって送達され得る。コンセンサス抗原は、ＤＮＡ注射を介して、インビボエレクトロポレーションと共に送達され得る。
【０１８６】
エレクトロポレーション
エレクトロポレーションを介した免疫原性組成物の投与は、哺乳動物の所望の組織に、細胞膜において可逆的な細孔を形成させるために有効なエネルギーのパルスを送達するように構成することができるエレクトロポレーション装置を使用して達成され得、好ましくは、エネルギーのパルスは、ユーザーによる予め設定された電流入力に類似する定電流である。エレクトロポレーション装置は、エレクトロポレーションコンポーネントおよび電極アセンブリまたはハンドルアセンブリを含み得る。エレクトロポレーションコンポーネントは、コントローラー、電流波形発生器、インピーダンステスター、波形ロガー、入力エレメント、状態報告エレメント、通信ポート、メモリーコンポーネント、電源、および電源スイッチを含む、エレクトロポレーション装置の様々なエレメントのうちの１つ以上を含み、組み込み得る。エレクトロポレーションは、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを促進するために、インビボエレクトロポレーション装置、例えば、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ  ＥＰシステム（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）またはＥｌｇｅｎエレクトロポレーター（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｐｌｙｍｏｕｔｈ  Ｍｅｅｔｉｎｇ，ＰＡ）を用いて達成され得る。
【０１８７】
エレクトロポレーションコンポーネントは、エレクトロポレーション装置の１つのエレメントとして機能し得、他のエレメントは、エレクトロポレーションコンポーネントと通信した別のエレメント（またはコンポーネント）である。エレクトロポレーションコンポーネントは、エレクトロポレーション装置の２つ以上のエレメントとして機能し得、これは、エレクトロポレーションコンポーネントとは別のエレクトロポレーション装置のまた他のエレメントと通信し得る。１つの電気機械または機械装置の部分として存在するエレクトロポレーション装置のエレメントは、エレメントが１つの装置として、または互いに通信した別のエレメントとして機能することができるので、限定されない場合がある。エレクトロポレーションコンポーネントは、所望の組織において定電流を生成し、フィードバックメカニズムを誘導するエネルギーのパルスを送達することができ得る。電極アセンブリは、空間配置において複数の電極を有する電極アレイを含み得、電極アセンブリは、エレクトロポレーションコンポーネントからエネルギーのパルスを受け、電極を通してこれを所望の組織に送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中に中性であり、所望の組織におけるインピーダンスを測定し、インピーダンスをエレクトロポレーションコンポーネントに通信する。フィードバックメカニズムは、測定されたインピーダンスを受信し得、定電流を維持するためにエレクトロポレーションコンポーネントによって送達されるエネルギーのパルスを調節することができる。
【０１８８】
複数の電極は、分散パターンでエネルギーのパルスを送達し得る。複数の電極は、プログラムされた配列下での電極の制御を通して分散パターンでエネルギーのパルスを送達し得、プログラムされた配列は、ユーザーによってエレクトロポレーションコンポーネントに入力される。プログラムされた配列は、順に送達される複数のパルスを含み得、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスのその後のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つによって送達される。
【０１８９】
フィードバックメカニズムは、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって行われ得る。フィードバックメカニズムは、アナログ閉ループ回路によって行われ得る。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓ、または１μｓ毎に発生するが、好ましくは、リアルタイムフィードバックまたは即時（すなわち、応答時間を決定するための利用可能な技法によって決定されるように実質的に即時）である。中性電極は、所望の組織におけるインピーダンスを測定し得、インピーダンスをフィードバックメカニズムと通信し、フィードバックメカニズムは、インピーダンスに応答し、予め設定された電流に類似する値で定電流を維持するためにエネルギーのパルスを調節する。フィードバックメカニズムは、エネルギーのパルスの送達中に連続的および即時に定電流を維持し得る。
【０１９０】
本発明の免疫原性組成物の送達を促進し得るエレクトロポレーション装置およびエレクトロポレーション方法の例は、Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号、Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．によって提出された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載されるものを含み、この内容は、それらの全体において参照によって本明細書に組み込まれる。免疫原性組成物の送達を促進するために使用され得る他のエレクトロポレーション装置およびエレクトロポレーション方法は、米国特許法第１１９条（ｅ）下で、２００６年１０月１７年に出願された、米国仮特許出願第６０／８５２，１４９号、および２００７年１０月１０日に出願された、同第６０／９７８，９８２号の優先権を主張する、２００７年１０月１７日に出願された、同時係属中の、共同所有される米国特許出願第１１／８７４０７２号に提供されるものを含み、これらの全ては、それらの全体において本明細書に組み込まれる。
【０１９１】
Ｄｒａｇｈｉａ−Ａｋｌｉ，ｅｔ  ａｌ．による米国特許第７，２４５，９６３号は、モジュラー電極システムおよび体または植物における選択された組織の細胞への生体分子の導入を促進するためのそれらの使用を記載する。モジュラー電極システムは、複数の針電極、皮下針、プログラム可能な定電流パルスコントローラーから複数の針電極までの導電リンクを提供する電気コネクター、および電源を含み得る。オペレーターは、支持構造上に載置される複数の針電極を把握し、それらを体または植物における選択された組織にしっかりと挿入することができる。生体分子は次いで、皮下針を介して選択された組織に送達される。プログラム可能な定電流パルスコントローラーが有効化され、定電流電気パルスが複数の針電極に適用される。適用された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞への生体分子の導入を促進する。米国特許第７，２４５，９６３号の内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１９２】
Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．によって提出された米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号は、体または植物における選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために使用され得るエレクトロポレーション装置を記載する。エレクトロポレーション装置は、その操作がソフトウェアまたはファームウェアによって特定される電気運動装置（「ＥＫＤ装置」）を含む。ＥＫＤ装置は、ユーザーの制御およびパルスパラメータの入力に基づいてアレイにおける電極間の一連のプログラム可能な定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。エレクトロポレーション装置はまた、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスク、注射針のための中央注射チャネル、および除去可能なガイドディスクを含む。米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号の内容全体は、参照によって本明細書に組み込まれる。
【０１９３】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許出願公開第２００５／００５２６３０号に記載される電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または器官にも深く浸透するように適合され得る。電極アレイの構成のために、注射針（選択の生体分子を送達するための）はまた、標的器官に完全に挿入され、注射は、電極によって予め画定される領域において、標的組織に垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許出願公開第２００５／００５２６３号に記載される電極は、好ましくは、２０ｍｍ長および２１ゲージである。
【０１９４】
加えて、エレクトロポレーション装置およびその使用を組み込むいくつかの実施形態では、以下の特許：１９９３年１２月２８日に発行された米国特許第５，２７３，５２５号、２０００年８月２９日に発行された米国特許第６，１１０，１６１号、２００１年７月１７日に発行された同第６，２６１，２８１号、および２００５年１０月２５日に発行された同第６，９５８，０６０号、ならびに２００５年９月６日に発行された米国特許第６，９３９，８６２号に記載されるものであるエレクトロポレーション装置が企図される。さらに、様々な装置のいずれかを用いるＤＮＡの送達に関する、２００４年２月２４日に発行された米国特許第６，６９７，６６９号、ＤＮＡを注射する方法に関する、２００８年２月５日に発行された米国特許第７，３２８，０６４号で提供される主題をカバーする特許が、本明細書において企図される。上記特許は、それらの全体において参照によって組み込まれる。
【０１９５】
インビトロおよびエクスビボでの抗原の生成
一実施形態では、最適化されたコンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原は、インビトロまたはエクスビボで生み出される。例えば、一実施形態では、最適化されたコンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原をコードする核酸は、インビトロまたはエクスビボ細胞において導入および発現することができる。
【０１９６】
遺伝子を細胞に導入および発現するための方法は、当該技術分野で知られている。発現ベクターの文脈において、ベクターは、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌、酵母、または昆虫細胞に、当該技術分野における任意の方法によって容易に導入することができる。例えば、発現ベクターは、宿主細胞に、物理的、化学的、または生物学的手段によってトランスフェクトすることができる。
【０１９７】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を生成するための方法は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照されたい。宿主細胞へのポリヌクレオチドの導入のための好ましい方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションである。
【０１９８】
宿主細胞に目的のポリヌクレオチドを導入するための生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターの使用を含む。ウイルスベクター、および特にレトロウイルスベクターは、遺伝子を哺乳動物、例えば、ヒト細胞に挿入するために最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ関連ウイルスなどに由来し得る。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号および第５，５８５，３６２号を参照されたい。
【０１９９】
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入するための化学的手段は、高分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズなどのコロイド分散システム、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベースのシステムを含む。インビトロおよびインビボでの送達ビヒクルとしての使用のための例示的なコロイドシステムは、リポソーム（例えば、人工膜小胞）である。
【０２００】
非ウイルス送達システムが利用される場合、例示的な送達ビヒクルは、リポソームである。脂質製剤の使用は、宿主への核酸の導入（インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）のために企図される。別の態様では、核酸は、脂質と会合し得る。脂質と会合した核酸は、リポソームの水性内部に封入されるか、リポソームの脂質二層内に散在されるか、リポソームおよびオリゴヌクレオチドの両方と会合した連結分子を介してリポソームに付着されるか、リポソームに捕捉されるか、リポソームと複合体化されるか、脂質を含有する溶液に分散されるか、脂質と混合されるか、脂質と組み合わされるか、脂質に懸濁液として含有されるか、ミセルと含有もしくは複合体化されるか、またはそうでなければ脂質と会合され得る。脂質、脂質／ＤＮＡ、または脂質／発現ベクター会合組成物は、溶液中の任意の特定の粒子構造に限定されない。例えば、それらは、二層構造に、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在し得る。それらはまた、単純に溶液に散在され得、場合によってはサイズまたは形状が均一ではない凝集体を形成する。脂質は、自然発生または合成脂質であり得る脂肪物質である。例えば、脂質は、細胞質において自然発生する脂肪滴ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびそれらの誘導体、例えば、脂肪酸、アルコール、アミン、アミノアルコール、およびアルデヒドを含有する化合物のクラスを含む。
【実施例】
【０２０１】
本発明は、以下の実施例においてさらに例示される。これらの実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しながら、例示としてのみ与えられることが理解されるべきである。上記議論およびこれらの実施例から、当業者は、本発明の本質的な特徴を確認することができ、その趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な使用および条件に適合するように本発明の様々な変更および修飾を行うことができる。よって、本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の様々な修飾は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような修飾はまた、添付の特許請求の範囲内に該当することが意図される。
【０２０２】
実施例１：メルケル細胞ポリオーマウイルスを標的とする核酸ワクチン
メルケル細胞ポリオーマウイルス（ＭＣＶ）Ｔ抗原を標的とする核酸ワクチンが開発されている（図１および図２）。ラージＴ抗原（ＬＴＡｇ）およびスモールｔ抗原（ＳＴＡｇ）を表す最適化された合成コンセンサスＭＣＶ  Ｔ抗原配列は、哺乳動物発現プラスミドＤＮＡに個別にクローニングし（図３）、筋肉内エレクトロポレーションを介してマウスに送達した（図４Ａ）。免疫化後、ＤＮＡワクチン構築物は、ＭＣＶ  Ｔ抗原ペプチドに対するロバストな抗体およびＴ細胞応答を起こした（図４Ｂ〜図１５）。
【０２０３】
図４Ｂ、図７、図１２、および図１４は、ＬＴＡｇワクチンがＣ５７Ｂｌ／６およびＣＤ−１非近交マウスにおいて高度に免疫原性であることを示す。図８〜図１０は、ＬＴＡｇワクチン接種がロバストな、多機能性ＣＤ４およびＣＤ８  Ｔ細胞、ならびに細胞毒性ＣＤ８  Ｔ細胞をもたらすことを示す。
【０２０４】
図４Ｂおよび図１５は、ＳＴＡｇワクチンがＣ５７Ｂｌ／６およびＣＤ−１マウスにおいて免疫原性であることを示す。図１５は、両方のＣＤ４およびＣＤ８応答がＣＤ−１マウスのＩＦＮγ／ＴＮＦαについて検出されたことを示す。
【０２０５】
図１１は、両方のワクチンがＣ５７Ｂｌ／６マウスにおいて体液性応答を起こすことを示す。
【０２０６】
実施例２：配列
配列番号１：修飾された合成コンセンサスＭＣＶ  ＬＴＡｇをコードするヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＧＣＣＣＣＣＡＡＣＴＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＣＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＧＴＴＴＧＡＣＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＣＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＡＡＣＣＣＡＣＡＣＧＧＣＡＣＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＣＡＣＣＡＴＣＣＧＧＡＴＣＴＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＧＧＣＴＣＴＴＴＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＣＧＡＴＡＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＧＡＧＧＡＧＣＣＴＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＡＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＡＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＡＧＧＡＣＣＧＡＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＣＧＡＴＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＧＣＴＣＣＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＣＣＣＣＴＴＣＴＡＧＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＡＡＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧＴＴＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＡＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＣＴＡＣＣＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＴＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＡＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＧＡＴＡＡＧＡＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＧＣＡＴＧＣＧＡＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＴＧＴＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＡＡＧＡＴＧＣＣＴＧＡＧＡＴＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＣＣＣＴＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＣＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＴＴＡＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＴＡＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＡＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＣＧＡＧＴＣＴＡＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＣＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＴＣＧＡＴＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＡＣＡＴＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＴＣＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＣＣＴＡＧＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＣＣＡＴＴＣＧＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＴＡＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＴＣＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＧＣＧＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＴＡＣＴＴＴＡＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＡＴＡＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧ
【０２０７】
配列番号２：修飾された合成コンセンサスＭＣＶ  ＬＴＡｇのアミノ酸配列
ＭＤＬＶＬＮＲＫＥＲＥＡＬＣＫＬＬＥＩＡＰＮＣＹＧＮＩＰＬＭＫＡＡＦＫＲＳＣＬＫＨＨＰＮＫＧＧＮＰＶＩＭＭＥＬＮＴＬＷＳＫＦＱＱＮＩＨＫＬＲＳＤＦＳＭＦＤＥＶＤＥＡＰＩＹＧＴＴＫＦＫＥＷＷＲＳＧＧＦＳＦＧＫＡＹＥＹＧＰＮＰＨＧＴＮＳＲＳＲＫＰＳＳＮＡＳＲＧＡＰＳＧＳＳＰＰＨＳＱＳＳＳＳＧＹＧＳＦＳＡＳＱＡＳＤＳＱＳＲＧＰＤＩＰＰＥＨＨＥＥＰＴＳＳＳＧＳＳＳＲＥＥＴＴＮＳＧＲＥＳＳＴＰＮＧＴＳＶＰＲＮＳＳＲＴＤＧＴＡＥＤＬＦＣＤＫＳＬＳＳＰＥＰＰＳＳＳＥＥＰＥＥＰＰＳＳＲＳＳＰＲＱＰＰＳＳＳＡＥＥＡＳＳＳＱＦＴＤＥＥＹＲＳＳＳＦＴＴＰＫＴＰＰＰＦＳＲＫＲＫＦＧＧＳＲＳＳＡＳＳＡＳＳＡＳＦＴＳＴＰＰＫＰＫＫＮＲＥＴＰＶＰＴＤＦＰＩＤＬＳＤＹＬＳＨＡＶＹＳＮＫＴＶＳＣＦＡＩＹＴＴＳＤＫＡＩＥＬＹＤＫＩＥＫＦＫＶＤＦＫＳＲＨＡＣＥＬＧＣＩＬＬＦＩＴＬＳＫＨＲＶＳＡＩＫＮＦＣＳＴＦＣＴＩＳＦＬＩＣＫＧＶＮＫＭＰＥＭＹＮＮＬＣＫＰＰＹＫＬＬＱＥＮＫＰＬＬＮＹＥＦＱＥＫＥＫＥＡＳＣＮＷＮＬＶＡＥＦＡＣＥＹＥＬＤＤＨＦＩＩＬＡＨＹＬＤＦＡＫＰＦＰＣＱＫＣＥＮＲＳＲＬＫＰＨＫＡＨＥＡＨＨＳＮＡＫＬＦＹＥＳＫＳＱＫＴＩＣＱＱＡＡＤＴＶＬＡＫＲＲＬＥＭＬＥＭＴＲＴＥＭＬＣＫＫＦＫＫＨＬＥＲＬＲＤＬＤＴＩＤＬＬＹＹＭＧＧＶＡＷＹＣＣＬＦＥＥＦＥＫＫＬＱＫＩＩＱＬＬＴＥＮＩＰＫＹＲＮＩＷＦＫＧＰＩＮＳＧＫＴＳＦＡＡＡＬＩＤＬＬＥＧＫＡＬＮＩＮＣＰＳＤＫＬＰＦＥＬＧＣＡＬＤＫＦＭＶＶＦＥＤＶＫＧＱＮＳＬＮＫＤＬＱＰＧＱＧＩＮＮＬＤＮＬＲＤＨＬＤＧＡＶＡＶＳＬＥＫＫＨＶＮＫＫＨＱＩＦＰＰＣＩＶＴＡＮＤＹＦＩＰＫＴＬＩＡＲＦＳＹＴＬＨＦＳＰＫＡＮＬＲＤＳＬＤＱＮＭＥＩＲＫＲＲＩＬＱＳＧＴＴＬＬＬＣＬＩＷＣＬＰＤＴＴＦＫＰＣＬＱＥＥＩＫＮＷＫＱＩＬＱＳＥＩＳＹＧＫＦＣＱＭＩＥＮＶＥＡＧＱＤＰＬＬＮＩＬＩＥＥＥＧＰＥＥＴＥＥＴＱＤＳＧＴＦＳＱ
【０２０８】
配列番号３：修飾された合成コンセンサスＭＣＶ  ＳＴＡｇをコードするヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＣＧＡＡＡＧＧＡＧＡＧＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＧＣＣＣＣＴＡＡＣＴＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＣＣＣＡＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＴＧＡＧＧＴＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＴＴＣＣＣＣＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＴＧＣＧＣＣＴＧＴＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＣＡＴＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＧＴＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＡＣＡＴＧＧＧＡＧＴＣＣＴＴＣＧＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＡＧＡＡＡＣＣＧＡＣＴＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＴＣＴＧＣＡＴＣＴＧＴＴＣ
【０２０９】
配列番号４：修飾された合成コンセンサスＭＣＶ  ＳＴＡｇのアミノ酸配列
ＭＤＬＶＬＮＲＫＥＲＥＡＬＣＫＬＬＥＩＡＰＮＣＹＧＮＩＰＬＭＫＡＡＦＫＲＳＣＬＫＨＨＰＮＫＧＧＮＰＶＩＭＭＥＬＮＴＬＷＳＫＦＱＱＮＩＨＫＬＲＳＤＦＳＭＦＤＥＶＳＴＫＦＰＷＥＥＹＧＴＡＡＡＡＡＱＳＧＹＮＡＲＦＣＲＧＰＧＣＭＬＫＱＬＲＤＳＫＣＡＣＩＳＣＫＬＳＲＱＨＣＳＬＫＴＬＫＱＫＮＣＡＴＷＧＥＣＦＣＹＱＣＦＩＬＷＦＧＦＰＰＴＷＥＳＦＤＷＷＱＫＴＬＥＥＴＤＹＣＬＬＨＬＨＬＦ
【０２１０】
配列番号５：フューリン開裂部位と連結した修飾された合成コンセンサスＬＴＡｇおよびＳＴＡｇをコードするヌクレオチド配列
ＡＴＧＧＡＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＣＡＧＧＡＡＧＧＡＧＡＧＡＧＡＧＧＣＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＣＧＣＣＣＣＣＡＡＣＴＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＣＣＣＴＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＣＣＣＴＧＴＧＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＴＡＣＣＣＴＧＴＧＧＴＣＣＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＴＣＣＧＡＴＴＴＣＴＣＴＡＴＧＴＴＴＧＡＣＧＡＧＧＴＧＧＡＴＧＡＧＧＣＣＣＣＴＡＴＣＴＡＣＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＡＧＴＧＧＴＧＧＣＧＣＴＣＣＧＧＣＧＧＣＴＴＣＴＣＴＴＴＴＧＧＣＡＡＧＧＣＣＴＡＣＧＡＧＴＡＣＧＧＣＣＣＴＡＡＣＣＣＡＣＡＣＧＧＣＡＣＣＡＡＴＡＧＣＡＧＧＴＣＣＡＧＡＡＡＧＣＣＡＡＧＣＴＣＣＡＡＣＧＣＣＡＧＣＡＧＧＧＧＡＧＣＡＣＣＡＴＣＣＧＧＡＴＣＴＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＡＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＧＧＣＴＡＣＧＧＣＴＣＴＴＴＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＣＡＧＧＣＣＴＣＴＧＡＣＡＧＣＣＡＧＴＣＣＡＧＡＧＧＣＣＣＣＧＡＴＡＴＣＣＣＡＣＣＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＧＡＧＧＡＧＣＣＴＡＣＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＧＧＣＴＣＴＡＧＣＴＣＣＣＧＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＡＣＣＡＡＣＡＧＣＧＧＣＡＧＧＧＡＧＴＣＴＡＧＣＡＣＣＣＣＡＡＡＣＧＧＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＣＣＡＡＧＧＡＡＴＴＣＣＴＣＴＡＧＧＡＣＣＧＡＣＧＧＡＡＣＣＧＣＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＴＴＣＴＧＣＧＡＴＡＡＧＴＣＣＣＴＧＡＧＣＴＣＣＣＣＴＧＡＧＣＣＴＣＣＡＴＣＴＡＧＣＴＣＣＧＡＧＧＡＧＣＣＡＧＡＧＧＡＧＣＣＣＣＣＴＴＣＴＡＧＣＡＧＧＴＣＣＴＣＴＣＣＣＡＧＡＣＡＧＣＣＡＣＣＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＧＧＡＧＧＣＡＡＧＣＴＣＣＴＣＴＣＡＧＴＴＣＡＣＣＧＡＣＧＡＧＧＡＧＴＡＣＡＧＧＡＧＣＴＣＣＴＣＴＴＴＴＡＣＣＡＣＣＣＣＴＡＡＧＡＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＴＴＣＴＣＣＣＧＧＡＡＧＣＧＣＡＡＧＴＴＴＧＧＡＧＧＣＴＣＴＡＧＧＡＧＣＴＣＣＧＣＣＴＣＴＡＧＣＧＣＣＴＣＣＴＣＴＧＣＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＴＣＣＡＡＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＧＡＡＣＡＧＡＧＡＧＡＣＡＣＣＣＧＴＧＣＣＴＡＣＣＧＡＣＴＴＴＣＣＴＡＴＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＧＡＴＴＡＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＧＣＣＧＴＧＴＡＣＴＣＴＡＡＴＡＡＧＡＣＣＧＴＧＡＧＣＴＧＴＴＴＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＣＣＡＣＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＴＣＧＡＧＣＴＧＴＡＣＧＡＴＡＡＧＡＴＣＧＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＧＡＣＴＴＣＡＡＧＴＣＣＡＧＧＣＡＣＧＣＡＴＧＣＧＡＧＣＴＧＧＧＡＴＧＴＡＴＣＣＴＧＣＴＧＴＴＣＡＴＣＡＣＣＣＴＧＴＣＣＡＡＧＣＡＣＣＧＣＧＴＧＴＣＴＧＣＣＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＴＴＴＧＴＡＣＣＡＴＣＴＣＣＴＴＴＣＴＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧＧＧＣＧＴＧＡＡＴＡＡＧＡＴＧＣＣＴＧＡＧＡＴＧＴＡＣＡＡＣＡＡＣＣＴＧＴＧＣＡＡＧＣＣＣＣＣＴＴＡＣＡＡＧＣＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＡＡＣＡＡＧＣＣＡＣＴＧＣＴＧＡＡＴＴＡＣＧＡＧＴＴＣＣＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＡＡＧＧＡＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＴＧＧＡＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＣＧＡＧＴＴＣＧＣＣＴＧＴＧＡＧＴＡＣＧＡＧＣＴＧＧＡＣＧＡＴＣＡＣＴＴＴＡＴＣＡＴＣＣＴＧＧＣＣＣＡＣＴＡＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＡＡＧＣＣＡＴＴＴＣＣＣＴＧＣＣＡＧＡＡＧＴＧＴＧＡＧＡＡＣＡＧＧＴＣＴＡＧＡＣＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＣＡＡＧＧＣＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＣＡＣＣＡＣＴＣＣＡＡＴＧＣＣＡＡＧＣＴＧＴＴＴＴＡＣＧＡＧＴＣＴＡＡＧＡＧＣＣＡＧＡＡＧＡＣＣＡＴＣＴＧＣＣＡＧＣＡＧＧＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣＴＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＡＴＧＡＣＣＡＧＧＡＣＣＧＡＧＡＴＧＣＴＧＴＧＣＡＡＧＡＡＧＴＴＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＧＧＣＴＧＣＧＣＧＡＣＣＴＧＧＡＴＡＣＣＡＴＣＧＡＴＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＡＣＡＴＧＧＧＣＧＧＣＧＴＧＧＣＣＴＧＧＴＡＣＴＧＣＴＧＴＣＴＧＴＴＣＧＡＧＧＡＧＴＴＴＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＧＡＴＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＣＴＧＡＣＣＧＡＧＡＡＣＡＴＣＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＡＡＡＴＡＴＣＴＧＧＴＴＣＡＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＣＴＧＧＣＡＡＧＡＣＣＡＧＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＴＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＧＧＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＣＡＴＣＡＡＴＴＧＣＣＣＴＡＧＣＧＡＴＡＡＧＣＴＧＣＣＡＴＴＣＧＡＧＣＴＧＧＧＣＴＧＴＧＣＣＣＴＧＧＡＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＴＴＧＡＧＧＡＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＴＡＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＣＣＣＧＧＣＣＡＧＧＧＣＡＴＣＡＡＣＡＡＴＣＴＧＧＡＴＡＡＣＣＴＧＣＧＧＧＡＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＣＣＧＴＧＡＧＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＡＡＧＣＡＣＧＴＧＡＡＣＡＡＧＡＡＧＣＡＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＡＴＣＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＴＧＡＣＴＡＣＴＴＴＡＴＣＣＣＡＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＧＣＣＣＧＣＴＴＣＴＣＴＴＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＧＣＣＣＣＡＡＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＣＡＧＣＣＴＧＧＡＴＣＡＧＡＡＴＡＴＧＧＡＧＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＧＧＣＧＣＡＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＣＧＧＡＡＣＣＡＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＡＴＣＴＧＧＴＧＴＣＴＧＣＣＴＧＡＣＡＣＣＡＣＣＴＴＣＡＡＧＣＣＡＴＧＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＴＣＡＡＧＡＡＣＴＧＧＡＡＧＣＡＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＴＧＡＧＡＴＣＡＧＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＴＴＴＴＧＴＣＡＧＡＴＧＡＴＣＧＡＧＡＡＣＧＴＧＧＡＧＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＡＣＣＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＴＣＣＴＧＡＴＣＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＣＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＧＡＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＴＣＴＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＧＣＡＡＡＡＧＧＡＧＧＴＣＴＧＡＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＡＡＴＣＧＧＡＡＡＧＡＧＡＧＡＧＡＡＧＣＣＣＴＧＴＧＣＡＡＡＣＴＧＣＴＧＧＡＡＡＴＣＧＣＣＣＣＡＡＡＣＴＧＴＴＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＴＧＡＡＧＧＣＣＧＣＣＴＴＣＡＡＧＡＧＧＴＣＴＴＧＣＣＴＧＡＡＧＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＡＣＡＡＧＧＧＣＧＧＣＡＡＴＣＣＣＧＴＧＡＴＣＡＴＧＡＴＧＧＡＧＣＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＴＧＧＡＧＣＡＡＧＴＴＴＣＡＧＣＡＧＡＡＴＡＴＣＣＡＣＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＣＧＡＣＴＴＣＴＣＣＡＴＧＴＴＴＧＡＴＧＡＧＧＴＧＡＧＣＡＣＣＡＡＧＴＴＣＣＣＴＴＧＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＧＣＡＣＡＧＴＣＣＧＧＣＴＡＴＡＡＣＧＣＣＡＧＧＴＴＴＴＧＣＡＧＡＧＧＣＣＣＡＧＧＣＴＧＴＡＴＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＧＡＣＴＣＣＡＡＧＴＧＣＧＣＣＴＧＴＡＴＣＴＣＴＴＧＣＡＡＧＣＴＧＡＧＣＣＧＣＣＡＧＣＡＣＴＧＴＴＣＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＣＴＧＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＴＴＧＣＧＣＣＡＣＡＴＧＧＧＧＣＧＡＧＴＧＣＴＴＣＴＧＴＴＡＴＣＡＧＴＧＴＴＴＴＡＴＣＣＴＧＴＧＧＴＴＣＧＧＣＴＴＴＣＣＣＣＣＴＡＣＡＴＧＧＧＡＧＴＣＣＴＴＣＧＡＴＴＧＧＴＧＧＣＡＧＡＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＡＡＣＴＧＡＴＴＡＣＴＧＴＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＣＡＣＣＴＧＴＴＣ
【０２１１】
配列番号６：フューリン開裂部位と連結した修飾された合成コンセンサスＬＴＡｇおよびＳＴＡｇのアミノ酸配列。
ＭＤＬＶＬＮＲＫＥＲＥＡＬＣＫＬＬＥＩＡＰＮＣＹＧＮＩＰＬＭＫＡＡＦＫＲＳＣＬＫＨＨＰＮＫＧＧＮＰＶＩＭＭＥＬＮＴＬＷＳＫＦＱＱＮＩＨＫＬＲＳＤＦＳＭＦＤＥＶＤＥＡＰＩＹＧＴＴＫＦＫＥＷＷＲＳＧＧＦＳＦＧＫＡＹＥＹＧＰＮＰＨＧＴＮＳＲＳＲＫＰＳＳＮＡＳＲＧＡＰＳＧＳＳＰＰＨＳＱＳＳＳＳＧＹＧＳＦＳＡＳＱＡＳＤＳＱＳＲＧＰＤＩＰＰＥＨＨＥＥＰＴＳＳＳＧＳＳＳＲＥＥＴＴＮＳＧＲＥＳＳＴＰＮＧＴＳＶＰＲＮＳＳＲＴＤＧＴＡＥＤＬＦＣＤＫＳＬＳＳＰＥＰＰＳＳＳＥＥＰＥＥＰＰＳＳＲＳＳＰＲＱＰＰＳＳＳＡＥＥＡＳＳＳＱＦＴＤＥＥＹＲＳＳＳＦＴＴＰＫＴＰＰＰＦＳＲＫＲＫＦＧＧＳＲＳＳＡＳＳＡＳＳＡＳＦＴＳＴＰＰＫＰＫＫＮＲＥＴＰＶＰＴＤＦＰＩＤＬＳＤＹＬＳＨＡＶＹＳＮＫＴＶＳＣＦＡＩＹＴＴＳＤＫＡＩＥＬＹＤＫＩＥＫＦＫＶＤＦＫＳＲＨＡＣＥＬＧＣＩＬＬＦＩＴＬＳＫＨＲＶＳＡＩＫＮＦＣＳＴＦＣＴＩＳＦＬＩＣＫＧＶＮＫＭＰＥＭＹＮＮＬＣＫＰＰＹＫＬＬＱＥＮＫＰＬＬＮＹＥＦＱＥＫＥＫＥＡＳＣＮＷＮＬＶＡＥＦＡＣＥＹＥＬＤＤＨＦＩＩＬＡＨＹＬＤＦＡＫＰＦＰＣＱＫＣＥＮＲＳＲＬＫＰＨＫＡＨＥＡＨＨＳＮＡＫＬＦＹＥＳＫＳＱＫＴＩＣＱＱＡＡＤＴＶＬＡＫＲＲＬＥＭＬＥＭＴＲＴＥＭＬＣＫＫＦＫＫＨＬＥＲＬＲＤＬＤＴＩＤＬＬＹＹＭＧＧＶＡＷＹＣＣＬＦＥＥＦＥＫＫＬＱＫＩＩＱＬＬＴＥＮＩＰＫＹＲＮＩＷＦＫＧＰＩＮＳＧＫＴＳＦＡＡＡＬＩＤＬＬＥＧＫＡＬＮＩＮＣＰＳＤＫＬＰＦＥＬＧＣＡＬＤＫＦＭＶＶＦＥＤＶＫＧＱＮＳＬＮＫＤＬＱＰＧＱＧＩＮＮＬＤＮＬＲＤＨＬＤＧＡＶＡＶＳＬＥＫＫＨＶＮＫＫＨＱＩＦＰＰＣＩＶＴＡＮＤＹＦＩＰＫＴＬＩＡＲＦＳＹＴＬＨＦＳＰＫＡＮＬＲＤＳＬＤＱＮＭＥＩＲＫＲＲＩＬＱＳＧＴＴＬＬＬＣＬＩＷＣＬＰＤＴＴＦＫＰＣＬＱＥＥＩＫＮＷＫＱＩＬＱＳＥＩＳＹＧＫＦＣＱＭＩＥＮＶＥＡＧＱＤＰＬＬＮＩＬＩＥＥＥＧＰＥＥＴＥＥＴＱＤＳＧＴＦＳＱＲＧＲＫＲＲＳＤＬＶＬＮＲＫＥＲＥＡＬＣＫＬＬＥＩＡＰＮＣＹＧＮＩＰＬＭＫＡＡＦＫＲＳＣＬＫＨＨＰＮＫＧＧＮＰＶＩＭＭＥＬＮＴＬＷＳＫＦＱＱＮＩＨＫＬＲＳＤＦＳＭＦＤＥＶＳＴＫＦＰＷＥＥＹＧＴＡＡＡＡＡＱＳＧＹＮＡＲＦＣＲＧＰＧＣＭＬＫＱＬＲＤＳＫＣＡＣＩＳＣＫＬＳＲＱＨＣＳＬＫＴＬＫＱＫＮＣＡＴＷＧＥＣＦＣＹＱＣＦＩＬＷＦＧＦＰＰＴＷＥＳＦＤＷＷＱＫＴＬＥＥＴＤＹＣＬＬＨＬＨＬＦ
【０２１２】
配列番号７：ＩｇＥリーダー配列のアミノ酸配列
ＭＤＷＴＷＩＬＦＬＶＡＡＡＴＲＶＨＳ
【０２１３】
前述の詳細な説明および添付の例は、単に例示的であり、本発明の範囲に対する限定として解釈されるものではなく、これは、単独で添付の特許請求の範囲およびそれらの同等物によって定義されることが理解される。
【０２１４】
開示される実施形態に対する様々な変更および修飾は、当業者には明らかであろう。限定なしに、化学構造、置換分、誘導体、中間体、合成物、組成物、製剤、または本発明の使用方法に関連するもの含む、そのような変更および修飾は、その趣旨および範囲から逸脱することなく行われ得る。
【図１Ａ】
2021511320.tif 000003
【図１Ｂ】
2021511320.tif 000004
【図２Ａ】
2021511320.tif 000005
【図２Ｂ】
2021511320.tif 000006
【図３】
2021511320.tif 000007
【図４Ａ】
2021511320.tif 000008
【図４Ｂ】
2021511320.tif 000009
【図５Ａ】
2021511320.tif 000010
【図５Ｂ】
2021511320.tif 000011
【図６】
2021511320.tif 000012
【図７】
2021511320.tif 000013
【図８】
2021511320.tif 000014
【図９】
2021511320.tif 000015
【図１０】
2021511320.tif 000016
【図１１】
2021511320.tif 000017
【図１２】
2021511320.tif 000018
【図１３】
2021511320.tif 000019
【図１４】
2021511320.tif 000020
【図１５】
2021511320.tif 000021
【配列表】
2021511320000001.app
【国際調査報告】
2021511320.tif 000022