(57)【要約】  ＩＬ−５抗体、その抗原結合フラグメント、およびそれらの医薬適用が提供される。本発明は、ＩＬ−５抗体ＣＤＲ領域を含むマウス由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、および該ＩＬ−５抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびに該医薬組成物の薬剤としての使用を包含する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＩＬ−５に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントであって、該モノクローナル抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、
（ｉ）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１６〜１８のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号１６〜１８のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１９〜２１のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号１９〜２１のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含むか；または
（ii）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号２２〜２４のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号２２〜２４のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２５〜２７のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号２５〜２７のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含むか；または
（iii）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号２８〜３０のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号２８〜３０のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号３１〜３３のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号３１〜３３のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含むか；または
（iv）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３４〜３６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号３４〜３６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号３７〜３９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号３７〜３９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含むか；または
（ｖ）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号４０〜４２のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号４０〜４２のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号４３〜４５のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号４３〜４５のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含むか；または
（vi）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３４〜３６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号３４、８２、３６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号３７〜３９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号３７〜３９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含む、
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体が組換え抗体であり、好ましくはマウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体からなる群から選択される、請求項１に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
前記ヒト化抗体が、配列番号４９、５７、６３、６９もしくは７５の重鎖可変領域またはそのバリアントを含み、該バリアントが配列番号４９、５７、６３、６９または７５の重鎖可変領域において１〜１０のアミノ酸変異を有する、請求項２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記バリアントが、配列番号４９、５７、６３、６９または７５の重鎖可変領域のＦＲ領域において１〜１０のアミノ酸復帰変異を有し、好ましくは、復帰変異が、配列番号４９の重鎖可変領域におけるＳ４９Ｔ、Ｖ９３ＴおよびＫ９８Ｓまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異が、配列番号５７の重鎖可変領域におけるＳ４９Ｔ、Ｖ９３ＴおよびＫ９８Ｔまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異が、配列番号６３の重鎖可変領域におけるＲ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ｖ、Ｔ７４ＫおよびＬ８３Ｆまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異が、配列番号６９の重鎖可変領域におけるＦ２９Ｉ、Ｒ３８Ｋ、Ｖ４８Ｉ、Ｒ７２Ａ、Ｔ９７Ｆ、およびＣＤＲにおけるＮ５５Ｖ、またはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異が、配列番号７５の重鎖可変領域におけるＲ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ａ、Ｔ７４Ｋ、Ｍ８１Ｌ、Ｌ８３ＦおよびＤ８９Ｅまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記ヒト化抗体が、配列番号５０もしくは５１の重鎖可変領域を含むか、または、配列番号５８もしくは５９の重鎖可変領域を含むか、または、配列番号６４、６５および６６から選択される重鎖可変領域を含むか、または、配列番号７０もしくは７１の重鎖可変領域を含むか、または、配列番号７６〜７９から選択される重鎖可変領域を含む、請求項４に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記ヒト化抗体が、配列番号４６、５４、６０、６７もしくは７２の軽鎖可変領域またはそのバリアントを含み、該バリアントが、配列番号４６、５４、６０、６７または７２の軽鎖可変領域において１〜１０のアミノ酸変異を有する、請求項２に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記バリアントが、配列番号４６、５４、６０、６７または７２の軽鎖可変領域のＦＲ領域において１〜１０のアミノ酸復帰変異を有し、好ましくは、復帰変異が、配列番号４６の軽鎖可変領域におけるＡ４３Ｓ、Ｌ４７Ｖ、Ｇ６６Ｒ、Ｔ６９Ｓ、Ｆ７１ＹおよびＹ８７Ｆまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異が、配列番号５４の軽鎖可変領域におけるＡ４３Ｓ、Ｌ４７Ｍ、Ｆ７１ＹおよびＹ８７Ｆまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異が、配列番号６０の軽鎖可変領域におけるＥ１Ｄ、Ｉ２Ｔ、Ｉ５７Ｖ、Ｖ８４ＴおよびＹ８６Ｆまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異が、配列番号６７の軽鎖可変領域におけるＭ４Ｌ、Ａ４２Ｓ、Ｌ４５ＰおよびＬ４６Ｗまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異が、配列番号７２の軽鎖可変領域におけるＡ４３Ｓ、Ｉ４８ＶおよびＦ７１Ｙまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項６に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記ヒト化抗体が、配列番号４７もしくは４８の軽鎖可変領域を含むか、または、配列番号５５もしくは５６の軽鎖可変領域を含むか、または、配列番号６１もしくは６２の軽鎖可変領域を含むか、または、配列番号６８の軽鎖可変領域を含むか、または、配列番号７３もしくは７４の軽鎖可変領域を含む、請求項７に記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記ヒト化抗体が、
配列番号４９〜５１から選択される重鎖可変領域、および配列番号４６〜４８から選択される軽鎖可変領域を含むか；または
配列番号５７〜５９から選択される重鎖可変領域、および配列番号５４〜５６から選択される軽鎖可変領域を含むか；または
配列番号６３〜６６から選択される重鎖可変領域、および配列番号６０〜６２から選択される軽鎖可変領域を含むか；または
配列番号６９〜７１から選択される重鎖可変領域、および配列番号６７〜６８から選択される軽鎖可変領域を含むか；または
配列番号７５〜７９から選択される重鎖可変領域、および配列番号７２〜７４から選択される軽鎖可変領域を含む、
請求項１〜８のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
前記抗体が、完全な長さの抗体であり、ヒト抗体定常領域をさらに含むものであり、好ましくは、該完全な長さの抗体は、配列番号５２のヒト抗体重鎖定常領域、および配列番号５３のヒト軽鎖定常領域を含む、請求項１〜９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記抗原結合フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ディアボディ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、ヒトＩＬ−５への結合を競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
処置有効量の請求項１〜１２のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、および１つまたはそれ以上の薬学的に許容しうる担体、希釈剤、緩衝剤または賦形剤を含む医薬組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子。
【請求項１５】
請求項１４に記載の単離された核酸分子を含む組換えベクター。
【請求項１６】
請求項１５に記載の組換えベクターで形質転換された宿主細胞であって、該宿主細胞は、原核生物細胞および真核生物細胞、好ましくは真核生物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞からなる群から選択される、宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法であって、請求項１６に記載の宿主細胞を培養培地中で培養して請求項１〜１２のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生成し蓄積すること、および該培養から該モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することを含む、方法。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを使用することを含む、ヒトＩＬ−５を検出または決定する方法。
【請求項１９】
請求項１〜１２のいずれかに記載のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、ヒトＩＬ−５を検出または決定するための試薬。
【請求項２０】
ヒトＩＬ−５が関与する疾患を処置する方法であって、該方法は、ヒトＩＬ−５が関与する疾患を処置するために、請求項１〜１２のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項１３に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載の単離された核酸分子を処置有効量で対象に投与すること含み、該疾患は、好ましくは、喘息、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増多症、チャーグ・ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠的血管性浮腫、好酸球増多筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、蠕虫感染症、ホジキン病、鼻ポリープ、レフラー症候群、蕁麻疹、好酸球性過形成気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症、およびステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群から選択される、方法。
【請求項２１】
疾患または状態を予防または治療するための医薬の製造における請求項１〜１２のいずれかに記載のモノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、または請求項１３に記載の医薬組成物、または請求項１４に記載の単離された核酸分子、またはそれらの組み合わせの使用であって、該疾患または状態はヒトＩＬ−５が関与する疾患であり、該疾患または状態は、好ましくは、喘息、悪性の喘息発作、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増多症、チャーグ・ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠的血管性浮腫、好酸球増多筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、蠕虫感染症、ホジキン病、鼻ポリープ、レフラー症候群、蕁麻疹、好酸球性過形成気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症、およびステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群から選択される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、ＩＬ−５抗体および抗原結合フラグメントに関する。さらに、本開示は、ＩＬ−５抗体のＣＤＲ領域を含むキメラ抗体、ヒト化抗体に関する。本開示は、ＩＬ−５抗体およびその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物、ならびにＩＬ−５関連疾患の診断および処置剤としてのその使用にも関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン−５（ＩＬ−５）は、インターロイキンファミリーの重要な一員であり、Ｔ細胞代替因子（ＴＲＦ）、Ｂ細胞増殖因子ＩＩ（ＢＣＧＦ−ＩＩ）、ＩｇＡ増強因子（ＩｇＡ−ＥＦ）または好酸球分化因子（ＥＤＦ）としても知られる。これは、主としてヘルパーＴ細胞２（Ｔｈ２）により分泌されるホモ二量体糖タンパク質である。ヒトＩＬ−５は、２２個のアミノ酸からなるシグナルペプチドおよび２つのグリコシル化部位を含む、１３４個のアミノ酸残基からなる。ヒトＩＬ−５はマウスＩＬ−５と、アミノ酸レベルで７０％の同一性を有する。活性型ＩＬ−５は、逆平衡構造で２つのペプチド鎖がジスルフィド結合を介して連結したオリゴ二量体の形態であり、ＩＬ−５のモノマーは生物学的に活性でない（Adv Immunol. 1994; 57:145-90）。
【０００３】
好酸球（ＥＯＳ）は、アナフィラキシー反応を伴うアレルギー疾患を包含する、さまざまな肺の炎症性疾患に関与する。そのなかで、喘息は、世界中で約３億人の患者がおり、死亡率が１０％である、慢性の呼吸器炎症性疾患である。その原因にはさまざまなサイトカインが関係し、ＩＬ−５およびその受容体であるＩＬ−５Ｒが喘息の発症において重要な役割を担う。喘息患者において、気管支肺組織に浸潤する炎症細胞が多量に存在し、なかでも好酸球が最も顕著に増加している。多くの研究により、好酸球が、喘息において気道炎症をもたらす主要な細胞の１つであることが示されている（Curr Opin Pulm Med. 2005 Jan; 11(1): 1-6）。ＩＬ−５は、ＥＯＳの分化、成熟、接着、浸潤およびアポトーシスにおいて非常に重要な役割を果たす。多くの動物実験および臨床研究によって、ＩＬ−５は骨髄においてＥＯＳ先祖細胞を活性化し、末梢血および気道におけるＥＯＳの集積を開始させることができ、気道の慢性炎症および過敏症をもたらしうることが示されている（J Immunol. 2014 Oct 15; 193(8):4043-52）。さらに、ＩＬ−５は、ＥＯＳの生存時間を延長し、特定の刺激因子（例えば、ＩｇＡまたはＩｇＧ）に対する脱顆粒反応を亢進させ、好酸球の走化性を仲介しうる（J Asthma Allergy. 2015 Nov 3; 8: 125-34）。喘息患者およびヒト気管支抗原誘発モデルの両方において、ＩＬ−５の発現増加が検出されている（Greenfeder et al, Respiratory Research, 2: 71-79, 2001）。喘息患者に由来する組換えヒトＩＬ−５タンパク質は、好酸球数の増加、気管支過敏症、および好酸球による毒性粒子放出をもたらし得、したがってＩＬ−５は喘息発症における重要な因子であることが示される。
【０００４】
現在、喘息の最も効果的な治療方法は、肺の炎症を軽減するために、ステロールの経鼻または経口投与によって、喘息のいくつかの主要メディエーター（ＩＬ−５を包含する）の発現を抑制することである。しかしながら、ステロールの長期使用は多くの副作用をもたらす。したがって、喘息治療のための新たな医薬ターゲットを見出すことが必要である。ＩＬ−５抗体は、ＩＬ−５の受容体結合を阻害することによって、顕著に肺における好酸球の蓄積を低減し、血液、組織および喀痰における好酸球レベルを低下し、好酸球仲介炎症反応を低下し、肺機能を改善し、重篤な好酸球喘息および再発性喘息の治療において優れた効果を示しうることが、研究により示されている（Drugs. 2017 May; 77(7): 777-784）。現在市販されているＩＬ−５抗体は、GSKから市販されるメポリズマブと、Teva Pharmaから市販されるレスリズマブのみである。ＩＬ−５標的に対する他の抗体が、前臨床研究段階にある。関連する特許の例は、ＷＯ２０１７０３３１２１、ＷＯ２０１６０４０００７、ＷＯ２０１５０９５５３９、ＷＯ２０１２０８３３７０、ＷＯ２０１２１５８９５４、ＷＯ２００６０４６６８９、ＷＯ９６２１０００、ＷＯ９５３５３７５等である。しかしながら、ＩＬ−５誘導好酸球除去および肺機能改善において依然改善が必要である。したがって、喘息のためのさらなる好ましい抗ＩＬ−５治療レジメンを提供するために、選択性が高く、親和性が高く、効果に優れた抗体のさらなる開発が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、ＩＬ−５のアミノ酸配列または立体構造に特異的に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント（ＩＬ−５結合分子とも称する）を提供する。
【０００６】
一側面において、本開示は、ヒトＩＬ−５に結合するモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを提供し、ここで、モノクローナル抗体は重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、
（ｉ）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号１６〜１８のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号１６〜１８のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号１９〜２１のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号１９〜２１のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含むか；または
（ii）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号２２〜２４のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号２２〜２４のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号２５〜２７のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号２５〜２７のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含むか；または
（iii）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号２８〜３０のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号２８〜３０のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号３１〜３３のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号３１〜３３のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含むか；または
（iv）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３４〜３６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号３４〜３６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号３７〜３９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号３７〜３９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含むか；または
（ｖ）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号４０〜４２のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号４０〜４２のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号４３〜４５のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号４３〜４５のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含むか；または
（vi）重鎖可変領域は、それぞれ配列番号３４〜３６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域、または配列番号３４、８２、３６のアミノ酸配列のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＨＣＤＲバリアントを含み；軽鎖可変領域は、それぞれ配列番号３７〜３９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域、または配列番号３７〜３９のアミノ酸配列のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域と３、２または１アミノ酸が相異するＬＣＤＲバリアントを含む。
【０００７】
いくつかの態様において、３、２または１アミノ酸の相異を有する、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントＣＤＲ（３つの重鎖ＣＤＲおよび３つの軽鎖ＣＤＲを包含する）のバリアントは、親和性成熟法によって得られるものである。
【０００８】
いくつかの態様において、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、ＩＬ−５に、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満または１０−１１Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で結合する。
【０００９】
いくつかの態様において、モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトＩＬ−５に特異的に結合し、モノクローナル抗体は、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含み、ここで、
（vii）重鎖可変領域は配列番号１６〜１８のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号１９〜２１のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域を含むか；または
（viii）重鎖可変領域は配列番号２２〜２４のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号２５〜２７のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域を含むか；または
（ix）重鎖可変領域は配列番号２８〜３０のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号３１〜３３のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域を含むか；または
（x） 重鎖可変領域は配列番号３４〜３６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号３７〜３９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域を含むか；または
（xi）重鎖可変領域は配列番号４０〜４２のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号４３〜４５のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域を含むか；または
（xii）重鎖可変領域は配列番号３４、８２、３６のＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３領域を含み、軽鎖可変領域は配列番号３７〜３９のＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３領域を含む。
【００１０】
いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、組換え抗体である。
【００１１】
いくつかの態様において、モノクローナル抗体は、マウス抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体の組換え抗体、またはその抗原結合フラグメントからなる群から選択される。
【００１２】
いくつかの態様において、ヒト化抗体軽鎖および重鎖可変領域の軽鎖および重鎖ＦＲ領域の配列はそれぞれ、ヒト生殖細胞系列の軽鎖および重鎖、またはその変異配列に由来する。
【００１３】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの態様において、ヒト化抗体は、配列番号４９、５７、６３、６９もしくは７５の重鎖可変領域またはそのバリアントを含み、バリアントは、配列番号４９、５７、６３、６９もしくは７５の重鎖可変領域において１〜１０のアミノ酸変異を有する。
【００１４】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの態様において、バリアントは、配列番号４９、５７、６３、６９または７５の重鎖可変領域のＦＲ領域において１〜１０のアミノ酸復帰変異を有し、好ましくは、復帰変異は、配列番号４９の重鎖可変領域におけるＳ４９Ｔ、Ｖ９３ＴおよびＫ９８Ｓまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異は、配列番号５７の重鎖可変領域におけるＳ４９Ｔ、Ｖ９３ＴおよびＫ９８Ｔまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異は、配列番号６３の重鎖可変領域におけるＲ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｍ７０Ｌ、Ｒ７２Ｖ、Ｔ７４ＫおよびＬ８３Ｆまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異は、配列番号６９の重鎖可変領域におけるＦ２９Ｉ、Ｒ３８Ｋ、Ｖ４８Ｉ、Ｒ７２Ａ、Ｔ９７ＦおよびＮ５５Ｖまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異は、配列番号７５の重鎖可変領域におけるＲ３８Ｋ、Ｍ４８Ｉ、Ｒ６７Ｋ、Ｖ６８Ａ、Ｒ７２Ａ、Ｔ７４Ｋ、Ｍ８１Ｌ、Ｌ８３ＦおよびＤ８９Ｅまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１５】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの態様において、ヒト化抗体は、配列番号５０もしくは５１の重鎖可変領域を含むか、または、配列番号５８もしくは５９の重鎖可変領域を含むか、または、配列番号６４、６５および６６から選択される重鎖可変領域を含むか、または、配列番号７０もしくは７１の重鎖可変領域を含むか、または、配列番号７６〜７９から選択される重鎖可変領域を含む。
【００１６】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの態様において、ヒト化抗体は、配列番号４６、５４、６０、６７もしくは７２の軽鎖可変領域またはそのバリアントを含み、バリアントは、配列番号４６、５４、６０、６７もしくは７２の軽鎖可変領域において１〜１０のアミノ酸変異を有する。
【００１７】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの態様において、バリアントは、配列番号４６、５４、６０、６７または７２の軽鎖可変領域のＦＲ領域において１〜１０のアミノ酸復帰変異を有し、好ましくは、復帰変異は、配列番号４６の軽鎖可変領域におけるＡ４３Ｓ、Ｌ４７Ｖ、Ｇ６６Ｒ、Ｔ６９Ｓ、Ｆ７１ＹおよびＹ８７Ｆまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異は、配列番号５４の軽鎖可変領域におけるＡ４３Ｓ、Ｌ４７Ｍ、Ｆ７１ＹおよびＹ８７Ｆまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異は、配列番号６０の軽鎖可変領域におけるＥ１Ｄ、Ｉ２Ｔ、Ｉ５７Ｖ、Ｖ８４ＴおよびＹ８６Ｆまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異は、配列番号６７の軽鎖可変領域におけるＭ４Ｌ、Ａ４２Ｓ、Ｌ４５ＰおよびＬ４６Ｗまたはそれらの組み合わせからなる群から選択されるか、または、復帰変異は、配列番号７２の軽鎖可変領域におけるＡ４３Ｓ、Ｉ４８ＶおよびＦ７１Ｙまたはそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００１８】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの態様において、ヒト化抗体は、配列番号４７もしくは４８の軽鎖可変領域を含むか、または、配列番号５５もしくは５６の軽鎖可変領域を含むか、または、配列番号６１もしくは６２の軽鎖可変領域を含むか、または、配列番号６８の軽鎖可変領域を含むか、または、配列番号７３もしくは７４の軽鎖可変領域を含む。
【００１９】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの態様において、ヒト化抗体は、
配列番号４９〜５１から選択される重鎖可変領域、および配列番号４６〜４８から選択される軽鎖可変領域を含むか；または
配列番号５７〜５９から選択される重鎖可変領域、および配列番号５４〜５６から選択される軽鎖可変領域を含むか；または
配列番号６３〜６６から選択される重鎖可変領域、および配列番号６０〜６２から選択される軽鎖可変領域を含むか；または
配列番号６９〜７１から選択される重鎖可変領域、および配列番号６７〜６８から選択される軽鎖可変領域を含むか；または
配列番号７５〜７９から選択される重鎖可変領域、および配列番号７２〜７４から選択される軽鎖可変領域を含む。
【００２０】
モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントのいくつかの態様において、抗体は、完全な長さの抗体であり、ヒト抗体定常領域をさらに含むものであり、ここで、該重鎖定常領域は好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４抗体重鎖定常領域である。より好ましくは、完全な長さの抗体は、配列番号５２のヒト抗体重鎖定常領域、および配列番号５３のヒト軽鎖定常領域を含む。
【００２１】
いくつかの態様において、抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、二量体化Ｖ領域（ディアボディ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、およびＣＤＲを含むペプチドからなる群から選択される。
【００２２】
本開示は、前記のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントと、ヒトＩＬ−５への結合を競合する、単離されたモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをも提供する。
【００２３】
本開示は、処置有効量の本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメント、および１つまたはそれ以上の薬学的に許容しうる担体、希釈剤、緩衝剤または賦形剤を含む医薬組成物をも提供する。単位用量の医薬組成物中に含まれるモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの量は、好ましくは０．１〜２０００ｍｇ、より好ましくは１〜１０００ｍｇである。
【００２４】
本開示は、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離された核酸分子をも提供する。
【００２５】
本開示は、前記核酸分子を含む組換えベクターをも提供する。
【００２６】
本開示は、本開示の組換えベクターで形質転換された宿主細胞を提供し、ここで、宿主細胞は、原核生物細胞および真核生物細胞、好ましくは真核生物細胞、より好ましくは哺乳動物細胞からなる群から選択される。
【００２７】
本開示は、前記宿主細胞を培養してモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生成し蓄積すること、および該培養からモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを回収することを含む、本開示のモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを生産する方法をも提供する。
【００２８】
本開示は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを使用することを含む、ヒトＩＬ−５を検出または決定する方法をも提供する。
【００２９】
本開示は、前記いずれかのモノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、ヒトＩＬ−５を検出または決定するための試薬をも提供する。
【００３０】
本開示は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを含む、ヒトＩＬ−５が関与する疾患の診断剤をも提供する。
【００３１】
本開示は、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントを使用してヒトＩＬ−５またはＩＬ−５陽性細胞を検出または決定することを含む、ヒトＩＬ−５が関与する疾患の診断方法をも提供する。
【００３２】
本開示は、ヒトＩＬ−５が関与する疾患の診断剤を製造するための、前記モノクローナル抗体またはその抗原結合フラグメントの使用をも提供する。
【００３３】
本開示は、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメントを含むか、または前記医薬組成物を含むか、または前記核酸分子を含む、ヒトＩＬ−５が関与する疾患を処置するための医薬をも提供する。
【００３４】
本開示は、ヒトＩＬ−５が関与する疾患を予防または治療するために、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはそれを含む医薬組成物、または前記核酸分子を薬学的有効量で対象に投与すること含む、ヒトＩＬ−５が関与する疾患を処置するための方法をも提供する。
【００３５】
本開示は、ＩＬ−５が関与する疾患の処置剤を製造するための、前記モノクローナル抗体もしくはその抗原結合フラグメント、またはそれを含む医薬組成物、または前記核酸分子の使用をも提供する。
【００３６】
前記疾患または状態は、好ましくは、喘息、悪性の喘息発作、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増多症、チャーグ・ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠的血管性浮腫、好酸球増多筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、蠕虫感染症、ホジキン病、鼻ポリープ、レフラー症候群、蕁麻疹、好酸球性過形成気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症、およびステロイド依存性好酸球性気管支炎からなる群から選択される。
【００３７】
本開示のＩＬ−５モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、ＩＬ−５に対し高い特異性および高い親和性を有する。ヒト化抗体は免疫原性が大幅に低下されており、マウス抗体に由来する特異性を完全に維持し、インビトロおよびインビボで高い親和性および優れた活性を示す。
【００３８】
本開示のＩＬ−５モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、ＩＬ−５の特異的認識のためにのみ高い選択性を示す。
【００３９】
本開示のＩＬ−５モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、ラットにおいて良好な代謝動態特性を示し、半減期が長く、バイオアベイラビリティが高い。
【００４０】
本開示のＩＬ−５ヒト化抗体分子は、良好な長期安定性を示し、明らかな異常な化学的変化を示さず、高濃度でも明らかな凝集を示さず、純度および熱安定性が高い。
【００４１】
本開示のＩＬ−５モノクローナル抗体または抗原結合フラグメントは、好酸球の増殖を抑制するのに加え、肺機能の改善においても良好な作用を示す。
【図面の簡単な説明】
【００４２】
【図１】ＦＡＣＳ実験において、ＩＬ−５抗体は、ＩＬ−５受容体に対するＩＬ−５の結合を阻害する。
【図２】Ｔｈ２サイトカインに対するＩＬ−５抗体の結合特異性の検出。
【図３】ＩＬ−５抗体によるエンハンスド呼気間欠値（Ｐｅｎｈ）。Ｇ１：正常対照群（ＰＢＳ）；Ｇ２：モデル群（ＩｇＧ）；Ｇ３：ｈ１７０５−００８抗体  １０ｍｐｋ群；Ｇ４：ｈ１７０５−００８抗体  ２ｍｐｋ群；Ｇ５：ｈ１７０６−００９抗体  １０ｍｐｋ群；Ｇ６：ｈ１７０６−００９抗体  ２ｍｐｋ群；Ｇ７：Ｈｕ３９Ｄ１０  １０ｍｐｋ群；＊ｐ＜０．０５、＊＊＜０．０１（ＡＮＯＶＡ／ボンフェローニによるＧ２群との比較）；
【図４】図４Ａ：喘息マウスの肺のＢＡＬＦにおける好酸球のレベル。図４Ｂ：喘息マウス気管粘膜の厚さのスコア。Ｇ１：正常対照群（ＰＢＳ）；Ｇ２：モデル群；Ｇ３：ｈ１７０５−００８抗体  １０ｍｐｋ群；Ｇ４：ｈ１７０５−００８抗体  ２ｍｐｋ群；Ｇ５：ｈ１７０６−００９抗体  １０ｍｐｋ群；Ｇ６：ｈ１７０６−００９抗体  ２ｍｐｋ群；Ｇ７：Ｈｕ３９Ｄ１０  １０ｍｐｋ群；図４Ｃ：喘息マウスの肺のＢＡＬＦにおける好酸球のパーセンテージ。
【図５】図５Ａおよび図５Ｂは、ＢＡＬＦ中の好酸球レベルを低下するＩＬ−５ｍＡｂの能力を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４３】
発明の詳細な説明
１．用語
本開示をより容易に理解するために、いくつかの技術用語および科学用語を定義する。本書において用いられる他の技術用語および科学用語はいずれも、本書において異なる定義が明らかになされない限り、本開示が属する技術分野における通常の技術を有する者に通常理解される意味を有する。
【００４４】
本開示において用いられるアミノ酸の３文字コードおよび１文字コードは、J. biol. chem, 243, p3558 (1968)に記載されるとおりである。
【００４５】
本書において、「抗体」とは、２つの同じ重鎖および２つの同じ軽鎖の間のジスルフィド結合によって４つのペプチド鎖が連結された構造体である免疫グロブリンをさす。異なる免疫グロブリン重鎖定常領域は異なるアミノ酸組成および並びを示し、したがって、異なる抗原性を示す。したがって、免疫グロブリンは、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥの５つのタイプ（免疫グロブリンアイソタイプと称される）に分類することができ、それらの重鎖はそれぞれμ、δ、γ、αおよびεと称される。ヒンジ領域のアミノ酸組成ならびに重鎖ジスルフィド結合の数および位置にしたがって、同じタイプのＩｇはさらに異なるサブタイプに分類することができ、例えばＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４に分類することができる。軽鎖は、定常領域の相異に基づいて、κまたはλ鎖に分類することができる。５つのタイプのＩｇのそれぞれが、κまたはλ鎖を有しうる。
【００４６】
本開示において、本開示に記載される抗体軽鎖は、軽鎖定常領域をさらに含み、これは、ヒトまたはマウスのκ、λ鎖またはそのバリアントを含む。
【００４７】
本開示において、本開示に記載される抗体重鎖は、重鎖定常領域をさらに含み、これは、ヒトまたはマウスのＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４またはそのバリアントを含む。
【００４８】
抗体重鎖および軽鎖のＮ末端に隣接する約１１０アミノ酸の配列は、高度に可変であり、可変領域（Ｆｖ領域）と呼ばれる。残部のＣ末端に近いアミノ酸配列は、比較的安定であり、定常領域と呼ばれる。可変領域は３つの超可変領域（ＨＶＲ）および４つの比較的保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）を含む。抗体の特異性を決定する３つの超可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも称される。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および各重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は、３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域からなり、その並びは、アミノ末端からカルボキシル末端に向かって、次のとおりである：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、およびＦＲ４。軽鎖の３つのＣＤＲ領域はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と称され、重鎖の３つのＣＤＲ領域はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と称される。本書における抗体または抗原結合フラグメントのＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域中のＣＤＲアミノ酸残基の数および位置は、知られているKabatナンバリング基準にしたがう（ＬＣＶＲ１〜３、ＨＣＤＲ１〜３）。
【００４９】
本開示の抗体は、マウス抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体を包含し、好ましくはヒト化抗体である。
【００５０】
本開示において、用語「マウス抗体」とは、当分野の知識および技術にしたがって調製される抗ヒトＩＬ−５モノクローナル抗体をさす。該調製において、試験対象にＩＬ−５抗原を注射し、その後、所望の配列または機能性を有する抗体を発現するハイブリドーマを単離することができる。本開示の好ましい態様において、マウスＩＬ−５抗体またはその抗原結合フラグメントは、マウスκ、λ鎖の軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含むか、またはマウスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。
【００５１】
用語「キメラ抗体」とは、マウス抗体の可変領域とヒト抗体の定常領域との融合による抗体のことであり、キメラ抗体では、マウス抗体によって誘導される免疫反応が減弱されうる。キメラ抗体を作製するために、まず、特定のマウスモノクローナル抗体をつくるハイブリドーマを作製し、次いで、マウスハイブリドーマ由来の可変領域遺伝子をクローン化しうる。次いで、所望のヒト抗体定常領域遺伝子をクローン化し、マウス可変領域遺伝子と連結してキメラ遺伝子を作製し、これを発現ベクターに挿入しうる。最後に真核生物または原核生物系においてキメラ抗体分子を発現させうる。本開示の好ましい一態様において、ＩＬ−５キメラ抗体の軽鎖は、ヒトκ、λ鎖に由来する軽鎖定常領域またはそのバリアントをさらに含む。ＩＬ−５キメラ抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４由来の重鎖定常領域またはそのバリアントを含み、好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４由来の重鎖定常領域を含み、またはアミノ酸変異（例えばＹＴＥ変異または復帰変異）を有するヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２もしくはＩｇＧ４の重鎖定常領域バリアントを含む。
【００５２】
用語「ヒト化抗体」とは、マウスＣＤＲ配列をヒト抗体可変領域フレームワークの中に挿入することによって作製される抗体、すなわち、異なるタイプのヒト生殖細胞系列抗体フレームワーク配列において作製される抗体をさす。ヒト化抗体は、キメラ抗体の持つ多量のマウスタンパク質成分によって誘発される異種反応を克服しうる。そのようなフレームワーク配列は、生殖細胞系列抗体遺伝子配列をカバーする公のＤＮＡデータベース、または刊行物から得ることができる。例えば、生殖細胞系列のヒト重鎖および軽鎖可変領域遺伝子のＤＮＡ配列は、“VBase”ヒト生殖細胞系列配列データベース（ウェブでwww.mrccpe.com.ac.uk/vbaseにて利用可能）に含まれ、また、Kabat, EA, et al, 1991 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed.に記載されている。免疫原性低下によって起こる活性低下を回避するために、ヒト抗体可変領域のフレームワーク配列は、活性維持のために最小限の復帰変異に付されうる。本開示のヒト化抗体は、ＣＤＲ親和性成熟がファージディスプレイによって行われたヒト化抗体をも包含する。本開示の好ましい態様において、ヒト化ＩＬ−５抗体のＣＤＲ配列は、配列番号１６〜２１、２２〜２７、２８〜３３、３４〜３９および４０〜４５からなる群から選択される。ヒト抗体可変領域フレームワークは、抗体重鎖可変領域のＦＲ領域配列がヒト生殖細胞系列重鎖配列およびヒト生殖細胞系列軽鎖配列に由来するものが設計され、選択される。免疫原性低下によって起こる活性低下を回避するために、ヒト抗体可変領域は、活性維持のために最小限の復帰変異（復帰変異とは、ヒト抗体由来ＦＲ領域アミノ酸残基が、元の抗体のものに対応するアミノ酸残基で置換されること）に付されうる。
【００５３】
ＣＤＲの挿入により、抗原と接触するフレームワーク残基が変化することによって、得られるＩＬ−５抗体またはその抗原結合フラグメントの抗原に対する親和性の低下が起こりうる。そのような相互作用は、高度の体細胞の変異の結果でありうる。したがって、ドナーフレームワークアミノ酸をヒト化抗体フレームワークに移すことがさらに必要でありうる。非ヒトＩＬ−５抗体または抗原結合フラグメントに由来する、抗原結合に関与するアミノ酸残基を、マウスモノクローナル抗体可変領域の配列および構造を調べることによって同定することができる。ドナーＣＤＲフレームワークにおける、生殖細胞系列のものとは異なるアミノ酸残基が関係すると考えることができる。最も密接に関連する生殖細胞系列を決定することが可能でないならば、配列を、サブタイプのなかで共通の配列、または相同性パーセンテージの高いマウス配列の共通の配列と比較することができる。まれなフレームワーク残基は、結合において重要な役割を担う、体細胞の高度な変異の結果であると考えられる。
【００５４】
本書において、用語「抗原結合フラグメント」または「機能的フラグメント」なる用語は、抗原（例えばＩＬ−５）との結合能力を維持している１つまたはそれ以上の抗体フラグメントをさす。抗原結合機能を達成するのに、完全長抗体のフラグメントを使用しうることが示されている。用語「抗原結合フラグメント」における結合フラグメントの例には、以下のものが含まれる：（ｉ）Ｆａｂフラグメント、すなわち、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる１価フラグメント；（ii）Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、すなわち、ヒンジ領域においてジスルフィド結合によって連結された２つのＦａｂフラグメントを含む２価フラグメント；（iii）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄフラグメント；（iv）１つのアームの抗体のＶＨおよびＶＬドメインからなるＦｖフラグメント；（ｖ）ＶＨドメインからなる、シングルドメインまたはｄＡｂフラグメント（Ward et al, (1989) Nature 341:544-546）；（vi）個々の相補性決定領域（ＣＤＲ）；および（vii）場合により合成リンカーで連結された、２つまたはそれ以上の別個のＣＤＲの組み合わせ。さらに、ＦｖフラグメントのＶＬ領域およびＶＨ領域は２つの別個の遺伝子によってコードされるが、それらを組換え法によって合成リンカーで連結することができ、それによって、ＶＬおよびＶＨ領域の組み合わせにより形成される１価分子の単一のタンパク質鎖を生成することができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦＶ）と称される；Bird et al. (1988); Science 242: 423-426およびHuston et al (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA85:5879-5883参照）。この一本鎖抗体も、抗体の「抗原結合フラグメント」なる用語に包含されることが意図される。そのような抗体フラグメントは、当分野で知られる従来の技術を用いて得られ、インタクトな抗体のスクリーニングと同じ方法を用いて機能的フラグメントについてスクリーニングされる。抗原結合部分を、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって、つくることができる。抗体は、異なるアイソタイプ、例えばＩｇＧ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４サブタイプ）、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭ抗体の形態でありうる。
【００５５】
本開示の抗原結合フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、一本鎖抗体（ｓｃＦＶ）、二量体化Ｖ領域（ディアボディ）、ジスルフィド安定化Ｖ領域（ｄｓＦｖ）、およびＣＤＲを含むペプチドを包含する。
【００５６】
Ｆａｂは、ＩｇＧ抗体分子をパパイン（Ｈ鎖の位置２２４のアミノ酸残基を切断する）で処理することによって得られる抗体フラグメントである。Ｆａｂフラグメントは分子量が約５００００であり、抗原結合活性を有し、Ｈ鎖のＮ末端側約半分とＬ鎖全体とがジスルフィド結合によって連結されている。
【００５７】
本開示のＦａｂは、ヒトＩＬ−５を特異的に認識し、その細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合する本開示のモノクローナル抗体をパパインで処理することによって生成しうる。Ｆａｂは、抗体ＦａｂをコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂを発現させることによって生成することもできる。
【００５８】
本開示のＦ（ａｂ’）２は、２つのＦａｂ領域がヒンジ部で連結したものを含む、抗原結合活性を有する分子量約１０００００の抗体フラグメントである。Ｆ（ａｂ’）２は、ＩｇＧのヒンジ領域の２つのジスルフィド結合の下流部分をペプシンで切断することによって得られる。
【００５９】
本開示のＦ（ａｂ’）２は、ヒトＩＬ−５を特異的に認識し、その細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合する本開示のモノクローナル抗体をペプシンで処理することによって生成しうる。Ｆ（ａｂ’）２は、後述のＦａｂ’をチオエーテル結合またはジスルフィド結合で連結することによって生成することもできる。
【００６０】
Ｆａｂ’は、抗原結合活性を有する分子量約５００００の抗体フラグメントである。Ｆａｂ’は、前記Ｆ（ａｂ’）２のヒンジ領域のジスルフィド結合を切断することによって得られる。本開示のＦａｂ’は、ヒトＩＬ−５を特異的に認識し、その細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合する本開示のＦ（ａｂ’）２を、還元剤、例えばジチオスレイトールで処理することによって生成しうる。
【００６１】
Ｆａｂ’は、抗体Ｆａｂ’フラグメントをコードするＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入し、該ベクターを原核生物または真核生物に導入してＦａｂ’を発現させることによって生成することもできる。
【００６２】
用語「一本鎖抗体」、「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦＶ」とは、抗体重鎖可変ドメイン（または領域；ＶＨ）および抗体軽鎖ドメイン（または領域；ＶＬ）がリンカーで連結されたものを含む分子をさす。そのようなｓｃＦｖ分子は、下記一般構造を有する：ＮＨ２−ＶＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＯＯＨまたはＮＨ２−ＶＨ−リンカー−ＶＬ−ＣＯＯＨ。従来のある適当なリンカーは、反復されるＧＧＧＧＳアミノ酸配列またはそのバリアントからなり、例えば反復数１〜４のバリアントが用いられる（Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448）。本発明に使用しうる他のリンカーは、Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731、Choi et al.(2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106、Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061、Kipriyanov et al. (1999), J. Mol. Biol. 293:41-56、およびRoovers et al. (2001), Cancer Immunol.に記載されるものでありうる。
【００６３】
本開示のｓｃＦｖは、以下のステップによって生成することができる：ヒトＩＬ−５を特異的に認識し、その細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを得るステップ、ｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製するステップ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ、その後、ｓｃＦｖを発現するように、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入するステップ。
【００６４】
ディアボディは、ｓｃＦｖが二量体化された抗体フラグメントであり、２価の抗原結合活性を有する抗体フラグメントである。２価抗原結合活性において、２つの抗原は同じであるかまたは異なりうる。
【００６５】
本開示のディアボディは、下記ステップで生成することができる：ヒトＩＬ−５を特異的に認識し、その細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを得るステップ、リンカーペプチドが８個またはそれ以下のアミノ酸残基の長さとなるようにｓｃＦｖをコードするＤＮＡを作製するステップ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ、そしてその後、ディアボディを発現するように、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入するステップ。
【００６６】
ｄｓＦｖは、ＶＨおよびＶＬのそれぞれにおける１つのアミノ酸残基をシステイン残基で置換し、該置換されたポリペプチドを該２つのシステイン残基間のジスルフィド結合によって連結することによって得られる。システイン残基に置換されるアミノ酸残基は、知られている方法にしたがう抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる（Protein Engineering, 7, 697 (1994)）。
【００６７】
本開示のｄｓＦｖは、下記ステップで生成することができる：ヒトＩＬ−５を特異的に認識し、その細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬをコードするｃＤＮＡを得るステップ、ｄｓＦｖをコードするＤＮＡを作製するステップ、該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ、そしてその後、ｄｓＦｖを発現するように、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入するステップ。
【００６８】
ＣＤＲを含むペプチドは、ＶＨおよびＶＬの１つまたはそれ以上のＣＤＲ領域によって構築される。複数のＣＤＲを含むペプチドは、直接に、または適当なペプチドリンカーを介して、連結されうる。
【００６９】
本開示のＣＤＲを含むペプチドは、以下のステップによって生成することができる：ヒトＩＬ−５を特異的に認識し、その細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合する本開示のモノクローナル抗体のＶＨおよびＶＬのＣＤＲをコードするＤＮＡを作製するステップ；該ＤＮＡを原核生物発現ベクターまたは真核生物発現ベクターに挿入するステップ；そしてその後、該ペプチドを発現するように、該発現ベクターを原核生物または真核生物に導入するステップ。ＣＤＲを含むペプチドは、化学合成方法、例えばＦｍｏｃ法またはｔＢｏｃ法によって生成することもできる。
【００７０】
本書において、用語「抗体フレームワーク」とは、可変ドメインの抗原結合ループ（ＣＤＲ）の足場の役割を有する可変ドメインＶＬまたはＶＨの部分をさす。これは本質的に、ＣＤＲ以外の可変ドメインである。
【００７１】
用語「アミノ酸の相異」とは、ポリペプチドとそのバリアントとの間の、ポリペプチドフラグメントの長さに沿った１つまたはそれ以上のアミノ酸位置における相異をいう。ここで、バリアントは、該ポリペプチドの１つまたはそれ以上のアミノ酸の置換、挿入または欠失によって得られうる。
【００７２】
用語「エピトープ」または「抗原決定基」とは、免疫グロブリンまたは抗体が特異的に結合する抗原上の部位（例えばＩＬ−５分子上の特定の部位）をさす。エピトープは典型的には、特定の三次構造をとる少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個の連続するかまたは連続しないアミノ酸を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris ed. (1996)を参照されたい。
【００７３】
「特異的に結合する」、「選択的に結合する」なる表現は、抗体が、抗原上の予め決定されたエピトープに結合することをいう。典型的には、抗体は、約１０−８Ｍ未満、例えば約１０−９Ｍ、１０−１０Ｍもしくは１０−１１Ｍ未満の、またはより小さい親和性（ＫＤ）で結合する。
【００７４】
用語「ＫＤ」は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数をいう。典型的には、本開示の抗体はＩＬ−５に、例えばＢＩＡＣＯＲＥ装置を用いる表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）法による測定で、約１０−７Ｍ未満、例えば約１０−８Ｍ、１０−９Ｍもしくは１０−１０Ｍ未満の、またはより小さい平衡解離定数（ＫＤ）で結合する。
【００７５】
用語「競合」とは、同じエピトープを競合する複数の抗原結合タンパク質（例えば、中和抗原結合タンパク質または中和抗体）に関して用いられるとき、抗原結合タンパク質間で競合が起こることを意味し、これは下記アッセイによって決定される：試験する抗原結合タンパク質（例えば、抗体またはその免疫学的に機能的なフラグメント）は、参照抗原結合タンパク質（例えば、リガンドまたは参照抗体）と共通の抗原（例えば、ＩＬ−５抗原またはそのフラグメント）との間の特異的結合を、抑制または阻害（例えば低減）する。抗原結合タンパク質どうしが競合するかを決定するために、多くの種類の競合結合アッセイが利用可能である。そのようなアッセイは、例えば、直接的または間接的な固相放射免疫アッセイ（ＲＩＡ）；直接的または間接的な固相酵素免疫アッセイ（ＥＩＡ）；サンドイッチ競合アッセイ（例えばStahli et al, 1983, Methods in Enzymology 9: 242-253参照）；直接的な固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えばKirkland et al, 1986, J. Immunol. 137: 3614-3619参照）；直接的な固相標識アッセイ；直接的な固相標識サンドイッチアッセイ（例えばHarlow and Lane, 1988, Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press参照）；Ｉ−１２５標識を用いる直接的な固相標識ＲＩＡ（例えばMorel et al, 1988, Molec. Immunol. 25: 7-15参照）；直接的な固相ビオチン−アビジンＥＩＡ（例えばCheung, et al, 1990, Virology 176: 546-552参照）；および直接的な標識ＲＩＡ（Moldenhauer et al, 1990, Scand. J. Immunol. 32: 77-82）である。アッセイは典型的には、試験される標識されていない抗原結合タンパク質と、標識された参照抗原結合タンパク質との両方に結合可能な、（固体表面上または細胞表面上の）精製された抗原の使用を伴う。試験する抗原結合タンパク質の存在下に固体表面または細胞に結合された標識の量を測定することによって、競合阻害が調べられる。試験する抗原結合タンパク質は通常、過剰に存在する。（抗原結合タンパク質と競合する）競合アッセイによって同定される抗原結合タンパク質は、参照抗原結合タンパク質と同じエピトープに結合する抗原結合タンパク質；および参照抗原結合タンパク質が結合するエピトープの十分近くのエピトープ（ここで、該２つのエピトープは、結合を妨害するよう、立体障害し合う）に結合する抗原結合タンパク質を包含する。競合的結合を調べる方法についてのさらなる詳細は、本書の実施例に記載される。典型的には、競合する抗原結合タンパク質は、それが過剰に存在する場合、参照抗原結合タンパク質と共通の抗原との間の特異的結合を少なくとも４０〜４５％、４５〜５０％、５０〜５５％、５５〜６０％、６０〜６５％、６５〜７０％、７０〜７５％または７５％もしくはそれ以上阻害しうる。いくつかの態様において、結合は少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％、９５〜９７％または９７％もしくはそれ以上阻害される。
【００７６】
本書において、用語「核酸分子」とは、ＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子をさす。核酸分子は、一本鎖または二本鎖でありうるが、好ましくは二本鎖のＤＮＡである。核酸は、別の核酸配列との機能的関連性をもって配置されるとき、「作動可能に連結」される。例えば、プロモーターまたはエンハンサーはコーディング配列に、該配列の転写に影響を及ぼす場合、作動可能に連結される。
【００７７】
用語「ベクター」とは、それが連結する別の核酸を輸送することのできる核酸分子をさす。一態様において、ベクターは「プラスミド」であり、「プラスミド」とは、さらなるＤＮＡセグメントがライゲートされていてもよい、環状二本鎖ＤＮＡループをさす。他の一態様において、ベクターはウイルスベクターであり、ここで、さらなるＤＮＡセグメントが該ウイルスゲノムにライゲートされていてもよい。本開示のベクターは、それが導入された宿主細胞内で自己複製可能であるか（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーマル哺乳動物ベクター）、または宿主細胞への導入後に宿主細胞ゲノムと一体化され得、それによって宿主ゲノムと一緒に複製される（例えば、エピソーマルでない哺乳動物ベクター）。
【００７８】
抗体および抗原結合フラグメントを生産および精製する方法は当分野において知られており、例えば、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, chapters 5-8 and 15を参照することができる。当分野で知られる方法によって、例えば、マウスをヒトＩＬ−５またはそのフラグメントで免疫し、その後、生じた抗体を再生、精製およびアミノ酸配列決定することができる。抗原結合フラグメントも、従来の方法で調製することができる。本開示の抗体または抗原結合フラグメントは、非ヒト抗体由来ＣＤＲに１つまたはそれ以上のヒトＦＲ領域を含むように組換えられる。ヒトＦＲ生殖細胞系列配列は、ImMunoGeneTics (IMGT) ウェブサイトhttp://imgt.cines.frから、またはThe Immunoglobulin Facts Book, 2001, ISBN 012441351からのＭＯＥソフトウェア、およびヒト抗体可変生殖細胞系列遺伝子データベースのアラインによって得ることができる。
【００７９】
用語「宿主細胞」とは、発現ベクターが導入されている細胞をさす。宿主細胞は、微生物（例えば細菌）、植物または動物の細胞を包含しうる。形質転換を受けることのできる細菌は、下記のものを包含する：腸内細菌科のメンバー、例えば大腸菌またはサルモネラ属の株；バシラス科のメンバー、例えば枯草菌；肺炎球菌；レンサ球菌およびインフルエンザ菌。適当な微生物は、出芽酵母およびピキア酵母を包含する。適当な動物宿主細胞株は、ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣細胞株）、ＨＥＫ細胞（例としてＨＥＫ２９３Ｅ細胞が挙げられるが、それに限定されない）、およびＮＳ０細胞等を包含するが、それに限定されない。
【００８０】
本開示の組換え抗体または抗原結合フラグメントは、既知の方法を用いて調製および精製しうる。例えば、重鎖および軽鎖をコードするｃＤＮＡ配列を、ＧＳ発現ベクター中にクローン化および組換えしうる。次いで、組換え免疫グロブリン発現ベクターを、ＣＨＯ細胞に安定にトランスフェクトしうる。当分野で知られるより推奨される方法として、哺乳動物発現系によって、抗体のグリコシル化、典型的には、Ｆｃ領域の高度に保存されたＮ末端部位におけるグリコシル化をもたらしうる。適当なクローンは、ヒトＩＬ−５に特異的に結合する抗体の発現について確認されうる。抗体生産のために、陽性クローンを、バイオリアクター内で血清不含有培養培地中で増殖させうる。抗体が分泌された培養培地を、従来の方法で精製しうる。精製のために、例えば、調整緩衝液で平衡化したプロテインＡまたはＧのSepharose FFカラムを使用しうる。カラムを洗って非特異的結合成分を除去し、次いで、結合した抗体をｐＨ勾配によって溶出し、抗体画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出し、収集する。抗体を、一般的な方法で濾過および濃縮しうる。可溶性の混合物および重合体を、一般的な方法、例えばサイズ排除またはイオン交換によって、除去しうる。その後、得られた産物を直ちに冷凍、例えば−７０℃で冷凍するか、または凍結乾燥しうる。
【００８１】
動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体に対しての、「投与」、「投与する」または「処置（処理）」とは、外来の薬剤、処置剤、診断剤または組成物を、動物、ヒト、対象、細胞、組織、器官または生物学的流体と接触させることをさす。「投与」、「投与する」または「処置（処理）」とは、例えば、治療、薬物動態学、診断、研究および実験の方法をさすことができる。細胞の処理は、試薬を細胞と接触させること、および試薬を、細胞と接触した状態にある流体と接触させることを包含する。「投与」、「投与する」または「処置（処理）」とは、細胞の、試薬、診断剤、結合組成物または他の細胞によるインビトロおよびエクスビボの処置をも意味する。ヒト、動物または研究対象に対する「処置（処理）」とは、治療的処置、予防または防止の手段、研究および診断のための適用をさす。
【００８２】
「処置（処理）」とは、処置剤、例えば本開示の任意の抗体またはそのフラグメントを含む組成物を、それが処置活性を示すことがわかっている１つまたはそれ以上の疾患症状を有する患者に、内用または外用で投与することを意味する。典型的には、該剤は、処置される患者または集団の１つまたはそれ以上の疾患症状を、臨床的に測定可能な程度の該症状の改善の誘導または該症状の進行の防止によって、軽減するのに有効な量で投与される。任意の特定の疾患症状の軽減に有効な処置剤の量（「処置有効量」ともいう）は、患者の疾患状態、年齢および体重、ならびに患者において所望の反応を誘導する薬物の能力といった因子によって異なりうる。疾患状態が軽減されたかは、該症状の重篤度または進行状況を評価するために医師または他のヘルスケア提供の専門家により通常用いられる任意の臨床的測定方法によって評価することができる。本開示のある一つの態様（例えば処置方法または製造物品）は、すべての患者における標的疾患症状軽減に有効でないことがあるが、スチューデントのｔ検定、カイ二乗検定、マン-ホイットニーのＵ検定、クラスカル-ウォリス検定（Ｈ−検定）、ヨンクヒール-タプストラ検定、およびウィルコクソン検定といった当分野で知られる任意の統計学的検定法によって決定される統計学的に有意な数の患者において標的疾患症状を軽減しうる。
【００８３】
「保存的改変」または「保存的置換」とは、変化をしばしば、タンパク質の生物学的活性を変えることなくもたらすことができるように、タンパク質中のアミノ酸を、同様の性質（例えば、電荷、側鎖の大きさ、疎水性／親水性、バックボーンのコンフォメーション、および硬さ等）を有する他のアミノ酸に置き換えることをさす。当業者は、ポリペプチドの本質的でない領域における単一のアミノ酸置換は一般的に、実質的に生物学的活性を変化しないことを認識する（Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p. 224 (4th Ed.)参照）。さらに、構造的または機能的に類似するアミノ酸による置換は、生物学的活性を変化させる可能性が低い。
【００８４】
「有効量」とは、医学的状態の症状または徴候を改善または防止するのに十分な量を包含する。有効量とは、診断を可能にするかまたは促進するのに十分な量をも意味する。特定の患者または動物対象に対する有効量は、処置する状態、患者の全身的健康状態、投与経路および投与量、ならびに副作用の重篤度といった因子によって異なりうる。有効量は、顕著な副作用または毒性作用を回避する最大の用量または投与プロトコルでありうる。
【００８５】
「外因（外来）」とは、文脈により生物、細胞または人体の外部で生産される物質のことをさす。「内因（内生）」とは、文脈により生物、細胞または人体の内部で生産される物質のことをさす。
【００８６】
「相同性」とは、２つのポリヌクレオチド配列間、または２つのポリペプチド配列間の配列類似性をさす。比較される２つの配列の両方において、ある位置を同じ塩基またはアミノ酸単量体サブユニットが占める場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれにおいて、ある位置をアデニンが占める場合、それら分子は該位置において相同である。２つの配列間の相同性パーセントは、２つの配列の間でマッチするかまたは相同である位置の数を、比較される位置の数で除し、１００を掛けた関数である。例えば、配列が最適にアラインされたとき、２つの配列間で１０個の位置のうちの６個がマッチするかまたは相同である場合、２つの配列の相同性は６０％であり、２つの配列間で１００個の位置のうちの９５個がマッチするかまたは相同である場合、２つの配列の相同性は９５％である。一般に、比較は、２つの配列が相同性パーセントが最大となるようにアラインされたときに行われる。
【００８７】
本書において「細胞」、「細胞株」および「細胞培養物」なる表現は、互換的に用いられ、いずれもその子孫を包含する。したがって、用語「形質転換体」および「形質転換細胞」は、初代の対象細胞、および継代数に関わらず、それから誘導された培養物を包含する。意図されるかまたはされない変異のために、子孫はＤＮＡの中身において完全に同一ではない可能性があることも理解すべきである。元の形質転換細胞においてスクリーニングされたのと同じ機能または生物学的活性を有する変異子孫が包含される。異なる意味が意図される場合、それは、その文脈から明らかに理解されうる。
【００８８】
本書において「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、微量の核酸、ＲＮＡおよび／またはＤＮＡの特定の部分を増幅する手順または技術をさし、例えば米国特許第４６８３１９５号に記載されている。通常、関心の領域または関心の領域を越える領域の各末端の配列情報が、オリゴヌクレオチドプライマーの設計を可能とするために必要である。そのようなプライマーは、その配列が、増幅するテンプレートの相対する鎖と同一または同様でありうる。２つのプライマーの５’末端ヌクレオチドは、増幅対象の末端に対応する。ＰＣＲは、特定のＲＮＡ配列、全ゲノムＤＮＡからの特定のＤＮＡ配列、および全細胞ＲＮＡから転写されたｃＤＮＡ、バクテリオファージまたはプラスミドの配列等を増幅するために使用することができる。Mullis et al. (1987) Cold Spring Harbor Symp. Ouant. Biol. 51:263; Erlich, ed., (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.)を参照されたい。本開示において用いられるＰＣＲ試験は、核酸試験サンプルをポリメラーゼ反応により増幅する方法の１例であって、それが唯一の方法ではないと解釈される。該方法は、特定の核酸部分を増幅または生産するための、プライマーとしての既知の核酸配列、および核酸ポリメラーゼの使用を含む。
【００８９】
「任意の」または「任意に（場合により）」とは、そのように記載される事象または状況が、起こるかもしれないが必ずしも起こらないことを意味し、記載は、事象または状況が起こるかまたは起こらない例を含む。例えば、「場合により１〜３個の抗体重鎖可変領域を含む」とは、特定の配列の抗体重鎖可変領域が存在することができるが、その存在は必須ではないことを意味する。
【００９０】
「医薬組成物」とは、本開示の１つまたはそれ以上の化合物、またはその生理学的／薬学的に許容される塩もしくはプロドラッグ、および他の化学的成分、例えば生理学的／薬学的に許容される担体および賦形剤を含む混合物をさす。医薬組成物は、生体への投与の促進、活性成分の吸収の促進、およびそれによる生物学的効果の発揮を目的とするものである。
【００９１】
さらに、本開示は、ＩＬ−５が関与する疾患の処置用の薬剤を包含し、該薬剤は、本開示のモノクローナル抗体またはその抗体フラグメントを活性成分として含む。
【００９２】
ＩＬ−５が関与する疾患には、ＩＬ−５が関与するものである限り制限はない。例えば、本開示の分子によって誘導される処置応答は、ヒトＩＬ−５との結合によってもたらされることができ、結果として好酸球誘発刺激が抑制または阻害されうる。したがって、処置適用に適当な製剤および処方において、本開示の分子は、アレルギー性および／またはアトピー性反応、または好酸球が関与する反応、例えば、限定されないが、喘息、喘息発作、悪性の喘息発作、慢性肺炎、アレルギー性鼻炎、通年性アレルギー性鼻炎、アレルギー性気管支肺アスペルギルス症、好酸球増多症、チャーグ・ストラウス症候群、アトピー性皮膚炎、オンコセルカ症皮膚炎、間欠的血管性浮腫、好酸球増多筋痛症候群、好酸球性胃腸炎、蠕虫感染症、ホジキン病、鼻ポリープ、レフラー症候群、蕁麻疹、好酸球性過形成気管支炎、結節性動脈炎、副鼻腔炎、好酸球性食道炎、アレルギー性好酸球性食道炎、アレルギー性結膜炎、オンコセルカ症皮膚炎、子宮内膜症、およびステロイド依存性好酸球性気管支炎等を患う個体に非常に有用である。好ましい態様において、そのような処置により、肺組織に浸潤する好酸球が抑制または低減される。本開示の抗体またはそのフラグメントは、１日３回ないし６箇月毎に１回投与し得、静脈内、皮下、筋肉内、非経口または局所投与しうる。
【００９３】
さらに、本開示は、ＩＬ−５の免疫検出または免疫アッセイ法；ＩＬ−５の免疫検出または免疫アッセイ用の試薬；ＩＬ−５発現細胞の免疫検出または免疫アッセイ；およびＩＬ−５が関与する疾患の診断用の診断剤であって、ヒトＩＬ−５を特異的に認識し、その細胞外領域のアミノ酸配列または立体構造に結合する本開示のモノクローナル抗体または抗体フラグメントを活性成分として含むものに関する。
【００９４】
本開示において、ＩＬ−５の量を検出または測定する方法は、当分野で知られる任意の方法でありうる。例えば、それには免疫検出または免疫アッセイが包含される。
【００９５】
免疫検出または免疫アッセイは、抗体または抗原の量を、標識した抗原または抗体を用いて検出または測定する方法である。免疫検出または免疫アッセイの例は、放射性物質標識免疫学的抗体法（ＲＩＡ）、酵素免疫アッセイ（ＥＩＡまたはＥＬＩＳＡ）、蛍光免疫アッセイ（ＦＩＡ）、発光免疫アッセイ、ウエスタンブロッティング、物理化学的アッセイ等を包含する。
【００９６】
前記ＩＬ−５が関与する疾患は、ＩＬ−５を発現する細胞を本開示のモノクローナル抗体または抗体フラグメントで検出または決定することによって診断することができる。
【００９７】
該ポリペプチドを発現する細胞を検出するために、既知の免疫アッセイ、好ましくは免疫沈降、蛍光細胞染色、免疫組織化学染色等を使用することができる。FMAT8100HTSシステム（Applied Biosystem）による蛍光抗体染色法等を用いることもできる。
【００９８】
本開示において、ＩＬ−５を検出または測定する生体サンプルには、それがＩＬ−５発現細胞を含む可能性がある限り、特に制限はなく、例えば組織細胞、血液、血漿、血清、膵液、尿、便、組織液または培養培地を用いることができる。
【００９９】
本開示のモノクローナル抗体またはその抗体フラグメントを含む診断剤は、所望の診断方法に応じて、抗原−抗体反応を実施するための試薬、または該反応を検出するための試薬をさらに含みうる。抗原−抗体反応を実施するための試薬は、例えば緩衝剤および塩を包含する。該反応を検出するための試薬は、免疫検出または免疫アッセイ法において通常用いられる試薬、例えば、該モノクローナル抗体、その抗体フラグメントまたはそれを含むコンジュゲートを認識する標識された二次抗体、および該標識に対応する基質を包含する。
【実施例】
【０１００】
２．実施例および試験例
下記実施例により本発明をさらに説明するが、実施例は本発明の範囲を限定するものではない。本開示の実施例または試験例において特定の条件を特に示していない実験方法は全般に、従来の条件にしたがって実施され（Molecular Cloning, Laboratory Manual of antibody technology, Cold Spring Harbor Laboratory参照）、または材料または製品の製造者の推奨する条件にしたがって実施される。入手元を特定していない試薬は、市販される試薬である。
【０１０１】
実施例１：ＩＬ−５抗原および検出用タンパク質の調製
ＩＬ−５抗原の設計および発現
Ｈｉｓタグ付きのヒトＩＬ−５、アカゲザルＩＬ−５、マウスＩＬ−５、ラットＩＬ−５、またはヒトＩｇＧ１−Ｆｃフラグメントと融合したヒトＩＬ−５Ｒα受容体細胞外ドメインをコードする配列を、ｐｈｒベクターに挿入して発現プラスミドを作製し、それをＨＥＫ２９３に導入した。トランスフェクション後６日目に、サンプルを４５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞上清を収集した。組換えＩＬ−５またはＩＬ−５α受容体タンパク質を含む上清を、ニッケルカラムを用いて精製し、組換えヒトＩＬ−５−Ｆｃ融合タンパク質を、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを用いて精製した。精製されたタンパク質を、下記実施例において使用することができる。抗原のタンパク質の配列を以下に示す：
【０１０２】
１．ｈｉｓタグ付きのヒトＩＬ−５アミノ酸配列（ｒｈＩＬ−５−ｈｉｓ）：
【化１】
2021502801.tif 000003
（配列番号１）
注：イタリック体はＨｉｓ６タグを示す。
【０１０３】
２．ｈｉｓタグ付きのアカゲザルＩＬ−５アミノ酸配列：
【化２】
2021502801.tif 000004
（配列番号２）
注：イタリック体はＨｉｓ６タグを示す。
【０１０４】
３．ｈｉｓタグ付きのマウスＩＬ−５アミノ酸配列：
【化３】
2021502801.tif 000005
（配列番号３）
注：イタリック体はＨｉｓ６タグを示す。
【０１０５】
４．ｈｉｓタグ付きのラットＩＬ−５アミノ酸配列：
【化４】
2021502801.tif 000006
（配列番号４）
注：イタリック体はＨｉｓ６タグを示す。
【０１０６】
５．ヒトＦｃフラグメントと融合したヒトＩＬ−５α受容体のアミノ酸配列：
【化５】
2021502801.tif 000007
（配列番号５）
注：イタリック体はヒトＦｃタグを示す。
【０１０７】
実施例２：組換えＩＬ−５α受容体およびＩＬ−５α／β受容体細胞株の作製および同定
機能的抗体のスクリーニングのために、本開示において、ＩＬ−５αを発現するＣＨＯ−Ｓ／ＩＬ−５α細胞株、ならびにＩＬ−５αおよびＩＬ−５βの両方を発現するＣＨＯ−Ｓ／ＩＬ−５α／ＩＬ−５β細胞株を作製する。
【０１０８】
具体的には、完全長ヒトＩＬ−５α遺伝子（Ｑ０１３４４）を、哺乳動物細胞発現ベクターｐＴａｒｇｅＴにクローニングし、該線状化プラスミドをＣＨＯ−Ｓ細胞にエレクトロポレーションによって導入した。Ｇ４１８存在下に２週間スクリーニングし、次いで限界希釈を２ラウンド行った。細胞表面上に発現されたＩＬ−５α遺伝子をＦＡＣＳにより検出し、ＩＬ−５α発現レベルの高いＣＨＯ−Ｓ／ＩＬ−５α細胞株を選択し、線状化ｐｃＤＮＡ３．１−ＩＬ−５βにエレクトロポレーションにより導入した。Ｇ４１８およびゼオシンの存在下に２週間スクリーニングし、次いで限界希釈を２ラウンド行った。細胞表面上に発現されたＩＬ−５αおよびＩＬ−５β遺伝子をＦＡＣＳにより検出し、ＩＬ−５αおよびＩＬ−５β発現レベルの高いＣＨＯ−Ｓ／ＩＬ−５α／ＩＬ−５β細胞株を選択した。
【０１０９】
実施例３：抗ヒトＩＬ−５マウスモノクローナル抗体の調製
２群のＢａｌｂ／ｃマウス（５匹／群）および４群のＳＪＬマウス（５匹／群）を、組換えタンパク質ｒｈＩＬ−５−ｈｉｓおよびフロイントアジュバントＣＦＡ（Sigma, Lot#SLBQ1109V）、またはＩＦＡ（Sigma, Lot#SLBJ2845V）によって、１００ｇ／５０ｇ／５０ｇ（高用量群）および２５ｇ／１２．５ｇ／１２．５ｇ（低用量群）の２つの用量で、免疫した。ＥＬＩＳＡ、リガンド−受容体ブロッキングアッセイ、およびＴＦ−１増殖阻害アッセイにより血清力価を調べることによって、ＩＬ−５に対する特異的免疫反応を測定した。特異的免疫反応のより良好なマウスを選択し、殺し、脾臓細胞を採取し、ミエローマ細胞と融合させた。
【０１１０】
一次スクリーニングを、ヒトＩＬ−５に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイを用いることによって行った。ハイブリドーマ細胞を２４ウェルプレートに移し、上清を、ヒト、カニクイザルまたはマウスＩＬ−５に対するＥＬＩＳＡ結合アッセイ、ＩＬ−５受容体に対するＥＬＩＳＡに基づくブロッキングアッセイ、およびＴＦ−１増殖阻害アッセイによって、再スクリーニングした。スクリーニング後、得られた陽性クローンを２ラウンドのサブクローニングに付して、抗体生産のためのハイブリドーマクローンを得た。得られた抗体をアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。
【０１１１】
精製された抗体を、下記試験に付した：ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、エンドトキシン含量検出、さまざまなＩＬ−５に対する親和性のＢｉａｃｏｒｅアッセイ、ＦＡＣＳに基づくＩＬ−５受容体に対するブロッキングアッセイ、およびＴＦ−１増殖阻害アッセイ、好酸球の接着試験、ならびにマウス喘息モデルおよびインビボモルモット中和モデルに対する効果の評価。モノクローナルハイブリドーマ細胞株ｍＡｂ１７０５、ｍＡｂ１７０６、ｍＡｂ１７８０、ｍＡｂ１７７３およびｍＡｂ１７７９を、インビトロおよびインビボの優れた活性のゆえに選択した。
【０１１２】
陽性ハイブリドーマからの配列を次のようにしてクローニングした。対数増殖期のハイブリドーマ細胞を収集し、ＲＮＡを、Trizol（Invitrogen, Cat No. 15596-018）で、製造者の指示またはキットにしたがって抽出し、PrimeScript（商標）逆転写酵素キット（Takara, Cat No. 2680A）を用いて逆転写を行った。逆転写によって得たｃＤＮＡを、マウスＩｇプライマーセット（Novagen, TB326 Rev. B 0503）を用いるＰＣＲ増幅に付し、得られた産物をシーケンスした。ｍＡｂ１７０５、ｍＡｂ１７０６、ｍＡｂ１７８０、ｍＡｂ１７７３およびｍＡｂ１７７９の重鎖および軽鎖可変領域のＤＮＡ配列に対応するアミノ酸配列を得た（ＶＨ／ＶＬのＣＤＲのアミノ酸残基を決定し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによってアノテーションを付与した）：
【０１１３】
ｍＡｂ１７０５マウス重鎖可変領域配列：
【化６】
2021502801.tif 000008
（配列番号６）
ｍＡｂ１７０５マウス軽鎖可変領域配列：
【化７】
2021502801.tif 000009
（配列番号７）
【０１１４】
ｍＡｂ１７０６マウス重鎖可変領域配列：
【化８】
2021502801.tif 000010
（配列番号８）
ｍＡｂ１７０６マウス軽鎖可変領域配列：
【化９】
2021502801.tif 000011
（配列番号９）
【０１１５】
ｍＡｂ１７８０マウス重鎖可変領域配列：
【化１０】
2021502801.tif 000012
（配列番号１０）
ｍＡｂ１７８０マウス軽鎖可変領域配列：
【化１１】
2021502801.tif 000013
（配列番号１１）
【０１１６】
ｍＡｂ１７７３マウス重鎖可変領域配列：
【化１２】
2021502801.tif 000014
（配列番号１２）
ｍＡｂ１７７３マウス軽鎖可変領域配列：
【化１３】
2021502801.tif 000015
（配列番号１３）
【０１１７】
ｍＡｂ１７７９マウス重鎖可変領域配列：
【化１４】
2021502801.tif 000016
（配列番号１４）
ｍＡｂ１７７９マウス軽鎖可変領域配列：
【化１５】
2021502801.tif 000017
（配列番号１５）
【０１１８】
各抗体の軽鎖および重鎖ＣＤＲ配列を表１に示す。
【表１】
2021502801.tif 000018
【０１１９】
Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる活性の結果を表２に示す。
【表２】
2021502801.tif 000019
この結果は、本開示のマウス抗体が抗原に対する高い親和性を有することを示している。
【０１２０】
実施例４：ＩＬ−５関連組換えタンパク質の精製、およびハイブリドーマ抗体および組換え抗体の精製
４．１  ＩＬ−５−Ｆｌａｇ−Ｈｉｓ組換えタンパク質の精製のためのステップ
サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、適当な体積に濃縮した。ＮＩ−ＮＴＡアフィニティーカラム（QIAGEN, Cat No. 30721）をＰＢＳで平衡化し、２〜５カラム体積で洗った。不純物のない細胞発現上清をカラムにロードし、Ａ２８０の値がベースラインに低下するまでＰＢＳで洗った。次いで、カラムをＰＢＳで洗って不純タンパク質を除去した。関心のタンパク質を洗浄緩衝液（イミダゾール２０ｍＭ）および次いで溶出緩衝液（イミダゾール３００ｍＭ）で溶出し、溶出ピークを収集した。
【０１２１】
収集した溶出物を、イオン交換（Hiload 16/600 superdex 200カラム）によってさらに精製した。カラムを約２カラム体積のＰＢＳで平衡化してｐＨ７．４とした。関心のタンパク質を含む溶出緩衝液を濃縮し、さらなる精製のためのカラムにロードした。サンプルを収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびＬＣ−ＭＳによって同定し、使用のためにアリコートに分けた。
【０１２２】
４．２．ハイブリドーマ発現抗体およびＦｃ融合タンパク質の精製
細胞発現上清サンプルを高速で遠心分離して不純物を除去し、次いで、ハイブリドーマ発現上清をプロテインＧカラムを用いて精製し、Ｆｃ融合タンパク質が発現された上清をプロテインＡカラムを用いて精製した。カラムを、Ａ２８０の値がベースラインに低下するまでＰＢＳで洗った。関心のタンパク質を１００ｍＭ酢酸（ｐＨ３．０）で溶出し、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）で中和した。溶出したサンプルを適当に濃縮し、ＰＢＳで予め平衡化したゲルクロマトグラフィーSuperdex 200（GE）によってさらに精製した。凝集物を含まないピークを収集し、使用のためにアリコートに分けた。
【０１２３】
実施例５：抗ヒトＩＬ−５モノクローナル抗体のヒト化デザイン
マウス抗ヒトＩＬ−５モノクローナル抗体のヒト化を、当分野における文献に開示されるように行った。簡潔に述べると、マウス抗体の定常領域をヒト定常領域で置き替え、マウス抗体のＣＤＲを、ＦＲ相同性の最も高いヒト鋳型にグラフトし、抗体コンフォメーションの維持および抗原に対する抗体の結合への影響に重要な役割を担うＦＲ領域のいくつかのアミノ酸残基を復帰変異させた。
【０１２４】
ＩＭＧＴヒト抗体重鎖および軽鎖可変領域生殖細胞系列遺伝子データベースに対しアラインすることによって、ｍＡｂ−１７０５、ｍＡｂ−１７０６、ｍＡｂ−１７８０、ｍＡｂ−１７７３およびｍＡｂ−１７７９抗体アミノ酸配列との同一性の高いヒト生殖細胞系列重鎖および軽鎖可変領域遺伝子をそれぞれ鋳型として選択した。これらマウス抗体のＣＤＲを、対応するヒト由来鋳型に個々にグラフトして、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４の並びの可変領域配列を形成した。アミノ酸残基を決定し、Ｋａｂａｔナンバリングシステムによってアノテーションを付与した。
【０１２５】
ヒトＦＲ領域の選択および重要なアミノ酸の復帰変異
得られたマウス抗体の典型的なＶＨ／ＶＬ ＣＤＲ構造に基づいて、ヒト生殖細胞系列データベースから、相同配列の軽鎖可変領域（ＶＬ）および重鎖可変領域（ＶＨ）を選択した。得られたヒト生殖細胞系列ＶＬおよびＶＨ配列を、ＦＲ相同性に基づいて高から低にランク付けし、最もＦＲ相同性の高い生殖細胞系列配列を主要な鋳型として選択した。マウス抗体のＣＤＲを、ヒト鋳型にグラフトした。次いで、ソフトウェアを用い、マウス抗体の立体構造に基づいて、組み込まれた残基、ＣＤＲ領域と直接相互作用する残基、およびＶＬおよびＶＨのコンフォメーションに大きく影響する残基を復帰変異に付した。さらに、化学的に不安定なアミノ酸残基を最適化して、最終的なヒト化分子を得た。
【０１２６】
５．１  ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７０５のためのヒト化フレームワークの選択
ｈ１７０５ＶＨ用の鋳型としてＩＧＨＶ３−２３＊０４を選択し、ＶＬ用の鋳型としてＩＧＫＶ１−１２＊０１を選択した。ｍＡｂ１７０５のＣＤＲを、ヒト鋳型にグラフトした。組み込まれた残基およびＣＤＲ領域と直接相互作用する残基を、ソフトウェアを用いて見出し、復帰変異に付した。ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域を、表３に示すようにデザインした。
【０１２７】
【表３】
2021502801.tif 000020
注：「グラフト」は、マウス抗体ＣＤＲがヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列にグラフトされたことを意味する。例えば、Ａ４３Ｓとは、アミノ酸配列の天然配列ナンバリングにしたがって、グラフト配列の位置４３のＡがＳに復帰変異されたことを示す。
【０１２８】
【表４】
2021502801.tif 000021
注：本表は、さまざまなバリアントを組み合わせることによって得た配列を示す。例えば、ｈ１７０５−００７は、該ヒト化マウス抗体ｈ１７０５−００７が、２つのバリアント、すなわち軽鎖であるｈ１７０５＿ＶＬ．１Ａと、重鎖であるｈ１７０５＿ＶＨ．１Ａを含むことを示す。
【０１２９】
ヒト化抗体ｈ１７０５の可変領域の特定の配列は次のとおりである：
＞ｈ１７０５＿ＶＬ．１（配列番号４６）
【化１６】
2021502801.tif 000022
＞ｈ１７０５＿ＶＬ．１Ａ（配列番号４７）
【化１７】
2021502801.tif 000023
＞ｈ１７０５＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号４８）
【化１８】
2021502801.tif 000024
＞ｈ１７０５＿ＶＨ．１（配列番号４９）
【化１９】
2021502801.tif 000025
＞ｈ１７０５＿ＶＨ．１Ａ（配列番号５０）
【化２０】
2021502801.tif 000026
＞ｈ１７０５＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号５１）
【化２１】
2021502801.tif 000027
【０１３０】
上記軽鎖可変領域のそれぞれを、配列番号５３の軽鎖定常領域と組み合わせて、最終的なインタクトな軽鎖配列を得た。各重鎖可変領域を、配列番号５２の重鎖定常領域と組み合わせて、最終的な重鎖配列を形成した。
【０１３１】
ヒト化抗体定常領域配列：
＞重鎖ＩｇＧ１定常領域：
【化２２】
2021502801.tif 000028
注：下線は、デザインされたＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４ＴまたはＴ２５６Ｅ変異を示す。
＞軽鎖κ定常領域：
【化２３】
2021502801.tif 000029
【０１３２】
５．２  ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７０６のためのヒト化フレームワークの選択
ｈ１７０６ＶＨ用の鋳型としてＩＧＨＶ３−２３＊０４を選択し、ＶＬ用の鋳型としてＩＧＫＶ１−１２＊０１を選択した。マウスｍＡｂ１７０６のＣＤＲを、ヒト鋳型にグラフトした。組み込まれた残基およびＣＤＲ領域と直接相互作用する残基を、ソフトウェアを用いて見出し、復帰変異に付した。ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域を、表５に示すようにデザインした。
【０１３３】
【表５】
2021502801.tif 000030
注：「グラフト」は、マウス抗体ＣＤＲがヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列にグラフトされたことを意味する。例えば、Ａ４３Ｓとは、アミノ酸配列の天然配列ナンバリングにしたがって、グラフト配列の位置４３のＡがＳに復帰変異されたことを示す。
【０１３４】
【表６】
2021502801.tif 000031
【０１３５】
ヒト化抗体ｈ１７０６の可変領域の特定の配列は次のとおりである：
＞ｈ１７０６＿ＶＬ．１（配列番号５４）
【化２４】
2021502801.tif 000032
＞ｈ１７０６＿ＶＬ．１Ａ（配列番号５５）
【化２５】
2021502801.tif 000033
＞ｈ１７０６＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号５６）
【化２６】
2021502801.tif 000034
＞ｈ１７０６＿ＶＨ．１（配列番号５７）
【化２７】
2021502801.tif 000035
＞ｈ１７０６＿ＶＨ．１Ａ（配列番号５８）
【化２８】
2021502801.tif 000036
＞ｈ１７０６＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号５９）
【化２９】
2021502801.tif 000037
【０１３６】
上記軽鎖可変領域のそれぞれを、配列番号５３の軽鎖定常領域と組み合わせて、最終的なインタクトな軽鎖配列を得た。各重鎖可変領域を、配列番号５２の重鎖定常領域と組み合わせて、最終的な重鎖配列を形成した。
【０１３７】
５．３  ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７８０のためのヒト化フレームワークの選択
ｈ１７８０ＶＨ用の鋳型としてＩＧＨＶ１−２＊０２を選択し、ＶＬ用の鋳型としてＩＧＫＶ３−１１＊０１を選択した。マウスｍＡｂ１７８０のＣＤＲを、ヒト鋳型にグラフトした。組み込まれた残基およびＣＤＲ領域と直接相互作用する残基を、ソフトウェアを用いて見出し、復帰変異に付した。ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域を、表７に示すようにデザインした。
【０１３８】
【表７】
2021502801.tif 000038
注：「グラフト」は、マウス抗体ＣＤＲがヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列にグラフトされたことを意味する。例えば、Ｅ１Ｄとは、アミノ酸配列の天然配列ナンバリングにしたがって、グラフト配列の位置１のＥがＤに復帰変異されたことを示す。
【０１３９】
【表８】
2021502801.tif 000039
【０１４０】
ヒト化抗体ｈ１７８０の可変領域の特定の配列は次のとおりである：
＞ｈ１７８０＿ＶＬ．１（配列番号６０）
【化３０】
2021502801.tif 000040
＞ｈ１７８０＿ＶＬ．１Ａ（配列番号６１）
【化３１】
2021502801.tif 000041
＞ｈ１７８０＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号６２）
【化３２】
2021502801.tif 000042
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１（配列番号６３）
【化３３】
2021502801.tif 000043
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１Ａ（配列番号６４）
【化３４】
2021502801.tif 000044
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号６５）
【化３５】
2021502801.tif 000045
＞ｈ１７８０＿ＶＨ．１Ｃ（配列番号６６）
【化３６】
2021502801.tif 000046
【０１４１】
上記軽鎖可変領域のそれぞれを、配列番号５３の軽鎖定常領域と組み合わせて、最終的なインタクトな軽鎖配列を得た。各重鎖可変領域を、配列番号５２の重鎖定常領域と組み合わせて、最終的な重鎖配列を形成した。
【０１４２】
５．４  ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７７３のためのヒト化フレームワークの選択
ｈ１７７３ＶＨ用の鋳型としてＩＧＨＶ３−７３＊０１を選択し、ＶＬ用の鋳型としてＩＧＫＶ１−３９＊０１を選択した。マウスｍＡｂ１７７３のＣＤＲを、ヒト鋳型にグラフトした。組み込まれた残基およびＣＤＲ領域と直接相互作用する残基を、ソフトウェアを用いて見出し、復帰変異に付した。ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域を、表９に示すようにデザインした。ＣＤＲ領域中の異性化部位を無くすために、ｈ１７７３のＨＣＤＲ２（ＲＩＤＰＡＮＧＤＴＫ  ＨＧＰＫＦＱＧ）中のＮをＶで置換して（すなわちＮ５５Ｖ）、ＨＣＤＲ２バリアントを含む重鎖可変領域および抗体を形成した（該変異ＨＣＤＲ２配列を、配列番号８２：ＲＩＤＰＡＶＧＤＴＫＨＧＰＫＦＱＧに示す。）。
【０１４３】
【表９】
2021502801.tif 000047
注：「グラフト」は、マウス抗体ＣＤＲがヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列にグラフトされたことを意味する。例えば、Ｍ４Ｌとは、アミノ酸配列の天然配列ナンバリングにしたがって、グラフト配列の位置４のＭがLに復帰変異されたことを示す。
【０１４４】
【表１０】
2021502801.tif 000048
【０１４５】
ヒト化抗体ｈ１７７３の可変領域の特定の配列は次のとおりである：
＞ｈ１７７３＿ＶＬ．１（配列番号６７）
【化３７】
2021502801.tif 000049
＞ｈ１７７３＿ＶＬ．１Ａ（配列番号６８）
【化３８】
2021502801.tif 000050
＞ｈ１７７３＿ＶＨ．１（配列番号６９）
【化３９】
2021502801.tif 000051
＞ｈ１７７３＿ＶＨ．１Ａ（配列番号７０）
【化４０】
2021502801.tif 000052
＞ｈ１７７３＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号７１）
【化４１】
2021502801.tif 000053
【０１４６】
上記軽鎖可変領域のそれぞれを、配列番号５３の軽鎖定常領域と組み合わせて、最終的なインタクトな軽鎖配列を得た。各重鎖可変領域を、配列番号５２の重鎖定常領域と組み合わせて、最終的な重鎖配列を形成した。
【０１４７】
５．５  ハイブリドーマクローンｍＡｂ１７７９のためのヒト化フレームワークの選択
ｈ１７７９ＶＨ用の鋳型としてＩＧＨＶ１−２＊０２を選択し、ＶＬ用の鋳型としてＩＧＫＶ１−３３＊０１を選択した。マウスｈ１７７９のＣＤＲを、ヒト鋳型にグラフトした。組み込まれた残基およびＣＤＲ領域と直接相互作用する残基を、ソフトウェアを用いて見出し、復帰変異に付した。ヒト化抗体の軽鎖および重鎖可変領域を、表１１に示すようにデザインした。
【０１４８】
【表１１】
2021502801.tif 000054
注：「グラフト」は、マウス抗体ＣＤＲがヒト生殖細胞系列ＦＲ領域配列にグラフトされたことを意味する。例えば、Ａ４３Ｓは、アミノ酸配列の天然配列ナンバリングにしたがって、グラフト配列の位置４３のＡがＳに復帰変異されたことを示す。
【０１４９】
表１２に示すように、デザインしたヒト化分子をさまざまな分子と組み合わせた。
【表１２】
2021502801.tif 000055
【０１５０】
ヒト化抗体ｈ１７７９の可変領域の特定の配列は次のとおりである：
＞ｈ１７７９＿ＶＬ．１（配列番号７２）
【化４２】
2021502801.tif 000056
＞ｈ１７７９＿ＶＬ．１Ａ（配列番号７３）
【化４３】
2021502801.tif 000057
＞ｈ１７７９＿ＶＬ．１Ｂ（配列番号７４）
【化４４】
2021502801.tif 000058
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１（配列番号７５）
【化４５】
2021502801.tif 000059
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ａ（配列番号７６）
【化４６】
2021502801.tif 000060
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ｂ（配列番号７７）
【化４７】
2021502801.tif 000061
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ｃ（配列番号７８）
【化４８】
2021502801.tif 000062
＞ｈ１７７９＿ＶＨ．１Ｄ（配列番号７９）
【化４９】
2021502801.tif 000063
【０１５１】
上記軽鎖可変領域のそれぞれを、配列番号５３の軽鎖定常領域と組み合わせて、最終的なインタクトな軽鎖配列を得た。各重鎖可変領域を、配列番号５２の重鎖定常領域と組み合わせて、最終的な重鎖配列を形成した。
【０１５２】
本開示において、ＷＯ２０１２００８３３７０Ａ１に開示されるＩＬ５に対する抗体Ｈｕ３９Ｄ１０を陽性対照として用いた。その重鎖および軽鎖の配列を、配列番号８０および８１にそれぞれ示す。
Ｈｕ３９Ｄ１０の重鎖配列：
【化５０】
2021502801.tif 000064
Ｈｕ３９Ｄ１０の軽鎖配列：
【化５１】
2021502801.tif 000065
【０１５３】
実施例６：組換えキメラ抗体およびヒト化抗体の調製
１．組換えキメラ抗体の分子クローニング
ハイブリドーマのスクリーニングによって得た陽性抗体分子をシーケンスして、可変領域をコードする遺伝子配列を得た。得られた配列に基づいてフォワードおよびリバースプライマーを設計し、該遺伝子配列を鋳型としてＰＣＲによって各抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを作製した。次いで、発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ１／ｈκ定常領域遺伝子（ＣＨ１−Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを含む）を用いて、ＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを相同組換えに付して、組換えキメラ抗体完全長発現プラスミドＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ−ｐＨｒ／ＶＬ−ＣＬ−ｐＨｒを作製し、５つのキメラ抗体Ｃｈ１７０５、Ｃｈ１７０６、Ｃｈ１７８０、Ｃｈ１７７３およびＣｈ１７７９を作製した。
【０１５４】
２．ヒト化抗体の分子クローニング
ヒトコドン選好性を以てコーディング遺伝子配列を作成するために、設計されたヒト化抗体配列においてコドン最適化を行った。各抗体のＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを作製するためのＰＣＲプライマーを設計し、次いで、発現ベクターｐＨｒ（シグナルペプチドおよびｈＩｇＧ１／ｈκ定常領域遺伝子（ＣＨ１−Ｆｃ／ＣＬ）フラグメントを含む）でＶＨ／ＶＫ遺伝子フラグメントを相同組換えに付して、ヒト化抗体完全長発現プラスミドＶＨ−ＣＨ１−Ｆｃ−ｐＨｒ／ＶＬ−ＣＬ−ｐＨｒを作製した。
【０１５５】
３．組換えキメラ抗体およびヒト化抗体の発現および精製
抗体軽鎖または重鎖を発現するプラスミドを、ＨＥＫ２９３Ｅ細胞に１：１．２の比で導入した。６日後、発現上清を収集し、高速で遠心分離して不純物を除去し、プロテインＡカラムを用いて精製した。カラムを、Ａ２８０の値がベースラインに低下するまでＰＢＳで洗った。関心のタンパク質を、ｐＨ３．０〜３．５の酸性の溶出緩衝液で溶出し、１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０〜９．０）で中和した。溶出サンプルを適当に濃縮し、ＰＢＳで予め平衡化したゲルクロマトグラフィーSuperdex 200（GE）を用いてさらに精製して、凝集物を除去した。モノマーのピークを収集し、使用のためにアリコートに分けた。
【０１５６】
本開示の抗体の性能および有益な効果を、下記試験方法によって確認した。
【０１５７】
生物学的活性のインビトロ評価
試験例１：Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる、異種ＩＬ−５に対するマウスＩＬ−５抗体の結合
試験するマウスＩＬ−５抗体とヒトＩＬ−５の間の親和性を、Biacore T200（GE）装置を用いて測定した。
試験する分子をプロテインＡバイオセンサーチップで親和捕捉し、次いで、抗原（実施例１で調製した組換えヒトまたはマウスＩＬ５）をチップ表面に流し、反応シグナルをBiacore T200装置でリアルタイムで検出して、結合および解離曲線を得た。各実験サイクルの解離の完了後に、バイオセンサーチップを洗い、グリシン−塩酸再生液（ｐＨ１．５）で再生した。データに、BIAevaluationバージョン４．１ ＧＥソフトウェアを用いて（１：１）Langmuirモデルをフィットさせて、表１３に示す親和性値を得た。
【０１５８】
【表１３】
2021502801.tif 000066
【０１５９】
本試験例は、本開示の抗体ｍＡｂ１７０５、ｍＡｂ１７０６、ｍＡｂ１７８０、ｍＡｂ１７７３およびｍＡｂ１７７９はいずれも、異種（ヒト、サル）ＩＬ−５に対する高い親和性を有することを示す。
【０１６０】
試験例２：Ｂｉａｃｏｒｅアッセイによる、異種ＩＬ−５に対するヒト化ＩＬ−５抗体の親和性
試験するヒト化ＩＬ−５抗体とヒトＩＬ−５の間の親和性を、Biacore T200（GE）装置を用いて測定した。
試験する分子をプロテインＡバイオセンサーチップで親和捕捉し、次いで、抗原（実施例１において調製）をチップ表面に流し、反応シグナルをBiacore T200装置でリアルタイムで検出して、結合および解離曲線を得た。各実験サイクルの解離の完了後に、バイオセンサーチップを洗い、グリシン−塩酸再生液（ｐＨ１．５）で再生した。データに、BIAevaluationバージョン４．１ ＧＥソフトウェアを用いて（１：１）Langmuirモデルをフィットさせて、表１４に示す親和性を得た。
【０１６１】
【表１４】
2021502801.tif 000067
【０１６２】
この結果は、ヒト化ＩＬ−５抗体がヒトＩＬ−５に対し依然高い親和性を有することを示す（ｈ１７０５の各ヒト化バリアントを除き、他のマウス抗体のヒト化バリアントについては、典型的なデータのみを示した）。
【０１６３】
試験例３：ＥＬＩＳＡアッセイにより、マウスＩＬ−５抗体は、ＩＬ−５とＩＬ−５α受容体の間の結合を阻害する
ＩＬ−５が組換え発現ＩＬ−５α受容体タンパク質細胞外領域に結合するのを阻害するＩＬ−５抗体の能力を示すために、ＥＬＩＳＡプレートをＩＬ−５（ＰＢＳ中５μｇ／ｍｌ）でコートし、３７℃で１時間インキュベートし、液を廃棄し、次いでＰＢＳで希釈した５％スキムミルクブロッキング液を２００μｌ／ウェルの量で加えて、インキュベーター内で３７℃で２．５時間ブロックした。ブロッキング完了後、ブロッキング液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴ緩衝液（０．０５％Tween-20を含むＰＢＳ、ｐＨ７．４）で５回洗い、ビオチン標識キット（Dojindo Chemical, LK03）で標識した２５μｌの１０μｇ／ｍｌ  ＩＬ−５Ｒα（１％ＢＳＡ中）を加え、次いで、ＩＬ−５への結合をＩＬ−５Ｒαと競合する、段階希釈した抗体２５μｌを加え、３７℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、プレート中の反応液を廃棄し、プレートをＰＢＳＴで５回洗い、サンプル希釈液で１：６００希釈したストレプトアビジン−ペルオキシダーゼポリマー（Sigma, S2438-250UG）を５０μｌ／ウェルの量で加え、３７℃で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳＴで５回洗った後、ＴＭＢ発色基質（KPL, 52-00-03）を５０μｌ／ウェルの量で加え、室温で３〜１０分間インキュベートし、５０μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を加えて反応を停止した。NOVOStarマイクロプレートリーダーで４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。ＩＬ−５とＩＬ−５Ｒαの間の結合阻害におけるＩＬ−５抗体のＩＣ５０値を計算した。結合を表１５に示す。本開示の抗体はいずれも、ＩＬ−５の受容体への結合を効果的に阻害することができる。
【０１６４】
【表１５】
2021502801.tif 000068
【０１６５】
試験例４：ＦＡＣＳにより、ＩＬ−５抗体はＩＬ−５とＩＬ−５受容体の間の結合を阻害する
細胞表面のＩＬ−５受容体をブロックしうる得られたＩＬ−５抗体を同定するために、ＩＬ−５Ｒα／β両受容体を高度に発現する組換え細胞株ＣＨＯＳを作製した。本試験により、ＩＬ−５抗体が、ＣＨＯＳ細胞株の表面の組換えＩＬ−５α／β受容体へのＩＬ−５の結合をそれぞれ阻害できることが確認された。
【０１６６】
具体的な方法：ＣＨＯ−Ｓ−ＩＬ−５Ｒαおよびβを、１００ｎｇ／ｍｌのＧ４１８および２５ｎｇ／ｍｌのゼオシンを含むＣＤ−ＣＨＯで培養し、細胞培養中の濃度は３×１０６細胞／ｍｌ以下となるようにした。良好な状態のＩＬ−５Ｒα／β−ＣＨＯＳ細胞を遠心分離し（１０００ｒｐｍ、５分間）、ＰＢＳ中の１０％ＦＢＳで１回洗い、カウントし、細胞濃度を４×１０６細胞／ｍｌに調整し、その２５μｌを丸底９６ウェルプレートに入れた。試験する抗体を、１０％ＦＢＳを含むＰＢＳ溶液で、初期濃度２００μｇ／ｍｌで希釈し、８段階で１：１０希釈した。ビオチン標識キット（Dojindo Chemical, LK03）で標識した２５μｌの１００ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−５を、各希釈抗体５０μｌと均一に混合し、細胞の入っている９６ウェルプレートに入れ、４℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、４℃で遠心分離し（４００ｇ、５分間）、上清を廃棄し、遠心分離し、２００ｍｌの予め冷却したＰＢＳで洗い、これを２回繰り返した。１：１３３３希釈したＰＥ−アビジン二次抗体を加え、暗所にて４０℃で４０分間インキュベートし、４℃で遠心分離（４００ｇ、５分間）した後、上清を廃棄し、２００μｌの予め冷却したＰＢＳを加え、細胞を解離し、遠心分離し、４℃で３回洗い、これを３回繰り返し、１００μｌのＰＢＳを加えた。機器を用いてプレートの読み取りを行い、蛍光シグナル値に基づいて、ＩＬ−５とＩＬ−５Ｒα／βの間の結合を阻害するＩＬ−５抗体のＩＣ５０値を計算した。結果を表１６および図１に示す。
【０１６７】
【表１６】
2021502801.tif 000069
この結果は、抗体ｈ１７０５−００８、ｈ１７０６−００９、ｈ１７８０−０１７、ｈ１７７３−００７、ｈ１７７９−０１４が、細胞表面のＩＬ−５受容体に対するＩＬ−５の結合を阻害する、より高い能力を有することを示している。
【０１６８】
試験例５：ＩＬ−５抗体は、ＩＬ−５により誘導されるＴＦ１細胞増殖を阻害する
ＩＬ−５はＴＦ１細胞の増殖を誘導し得、ＩＬ−５抗体は、ＩＬ−５によるＴＦ１細胞増殖刺激を抑制することができる。
【０１６９】
具体的には、ＴＦ−１細胞（ATCC, CRL-2003）を、１０％ＰＢＳおよび２ｎｇ／ｍｌのｒｈＧＭ−ＣＳＦ（Lianke Bio, Catalog No. 96-AF-300-03-20）を含むＲＰＭＩ１６４０中で培養し、細胞密度を１×１０６細胞／ｍｌ以下として、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内でインキュベートした。抗体の検出のために、対数増殖期の細胞を８００ｒｐｍで５分間の遠心分離によりＰＢＳで３回洗い、細胞密度をＲＰＭＩ１６４０（ＦＢＳ：２％、組換えヒトＩＬ−５：１０ｎｇ／ｍｌ）で６０００細胞／ウェル／９０μｌに調節した。試験する抗体の段階希釈物１０μｌを９６ウェルプレートに加え、３日間培養した。３０μｌのcell titerを加え、混合した。読み取り値に基づいてＩＣ５０値を計算した。結合を表１７に示す。
【０１７０】
【表１７】
2021502801.tif 000070
【０１７１】
試験例６：ＩＬ−５抗体は、ＩＬ−５により誘導される好酸球接着を阻害する
ＩＬ−５は、好酸球の分化、成熟、移動および活性化を誘導し得、呼吸器炎症の原因となり喘息を引き起こしうる。ＩＬ−５サイトカインは好酸球接着を促進し好酸球を活性化しうるという性質にしたがって、本試験例では、ヒト末梢血から好酸球を収集し精製し、インビトロでＩＬ−５抗体のＩＬ−５仲介好酸球接着阻害効果を検出することにより、該ＩＬ−５仲介経路を抑制するＩＬ−５特異的抗体の効果を調べた。
【０１７２】
具体的には、ヒト末梢血を、２ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳで５倍希釈し、単球および顆粒球をPercoll（商標）により分離し（密度勾配１．０８８）、顆粒球を含む赤血球層を注意深く吸引し、赤血球を赤血球細胞溶解緩衝液によって除去した。残った細胞をカウントし、ヒトＣＤ１６抗体でコートした分離磁気ビーズ（Miltenyi, Catalog No. 130-045-701）を加え、３０分間インキュベートし、磁気ビーズカラムに流した。主に好酸球からなる細胞画分流出液を直接収集した。得られた好酸球をカウントし、ＩｇＧ抗体で予めコートした９６ウェル細胞培養プレートに、約１×１０４細胞／ウェルで入れ、ヒトＩＬ−５（２０ｎｇ／ｍｌ）およびさまざまな濃度のＩＬ−５抗体分子（１０μｇ／ｍｌで開始し３倍希釈、１０の濃度レベル）を加えた。細胞培養プレートを、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター内で１時間インキュベートし、次いで０．３％ＣＴＡＢを加えて細胞を溶解した。最後に、ペルオキシダーゼ反応基質ＴＭＢを加えて発色させた。ＯＤ４５０吸光度値をマイクロプレートリーダーで測定した。ＩＬ−５のみを加えたウェルにおいて測定された吸光度値が最も高く、ＩＬ−５も抗体試薬も含まないウェルをバックグラウンド対照とした。最大吸光度値に対する各濃度の抗体試薬の阻害値を（最高吸光度値−［抗体試薬］／（最高吸光度値−バックグラウンド対照値）×１００％）として計算し、ＩＣ５０値を計算した。結果を表１８に示す。
【０１７３】
【表１８】
2021502801.tif 000071
この結果は、本開示のヒト化抗体が、ＩＬ−５誘導好酸球接着を阻害する高い能力を有することを示している。
【０１７４】
試験例７：Ｔｈ２サイトカインに対するヒト化ＩＬ−５抗体の特異性の評価
ＩＬ−５はＴｈ２サイトカインの１つである。ＩＬ−５抗体が、他のサイトカインとの交差反応なくＩＬ−５のみを特異的標的とすることを確認するために、ＩＬ２（R&D, 202-IL-010/CF）、ＩＬ４（R&D, 204-IL-050/CF）、ＩＬ−５（R&D, 205-IL-025/CF）、ＩＦＮγ、ＩＬ６（R&D, 7270-IL-025/CF）、ＩＬ９（R&D, 209-IL-010/CF）、ＩＬ１０（R&D, 217-IL-025/CF）、ＩＬ１３（R&D,213-ILB-025/CF）、ＩＬ２５（R&D, 8134-IL-025/CF）、ＩＬ３１（R&D, 2824-IL-010/CF）、およびＩＬ−５とα受容体が共通するＩＬ３（203-IL-050/CF）、ならびにＧＭＣＳＦ（R&D, 215-GM-010/CF）を含む１２種類のＴｈ２および関連サイトカインをFortebioアッセイに用いた。
【０１７５】
具体的には、抗体をプロテインＡバイオセンサー（PALL Fortebio, 18-5010）によって捕捉し、捕捉シグナルを記録し、次いで、４０ｎＭの各サイトカインを加え、新たな結合シグナルを記録した。最後に、ＩＬ−５の結合シグナルを１００％と規定して、他のサイトカインと抗体の間の結合シグナルを調べた。結果を図２に示す。
【０１７６】
この結果は、ヒト化ＩＬ−５抗体ｈ１７０５−００８およびｈ１７０６−００９は、１２種類の関連サイトカインのなかでＩＬ−５にのみ特異的に結合し、他のＴｈ２サイトカインとの交差反応を示さないことを示している。
【０１７７】
薬物動態評価
試験例８：ラットにおけるヒト化ＩＬ−５抗体の薬物動態評価
１８匹の実験用雄ＳＤラット（Sipple-BK Lab Animal Co., Ltd.から提供）を、各群３匹の６群に分けた。Ｈｕ３９Ｄ１０、ｈ１７０５−００８およびｈ１７０６−００９を静脈内および皮下に投与した。別に９匹のＳＤラットに、ｈ１７７３−００７、ｈ１７７９−０１４またはｈ１７８０−０１７を静脈内のみで投与した。静脈内投与群において、投与前、および投与の５分後、８時間後、１日後、２日後、４日後、７日後、１０日後、１４日後、２１日後および２８日後に、抗凝固処理を行わずに全血０．２ｍｌを採取した。血液サンプルを４℃で３０分置き、１０００ｇで１５分間遠心分離し、上清（血清）をＥＰ管にいれ、−８０℃で保存した。皮下投与群において、投与前、および投与の１時間後、２時間後、４時間後、８時間後、１日後、２日後、４日後、７日後、１０日後、１４日後、２１日後および２８日後に、全血を採取した。血清中の抗体濃度をＥＬＩＳＡにより測定した。
【０１７８】
結果は、本開示のヒト化抗体分子は、ラットにおいて半減期が長く、バイオアベイラビリティが高いことを示している。
【０１７９】
【表１９】
2021502801.tif 000072
【０１８０】
インビボ生物学的評価
試験例９：ＯＶＡ誘導マウス喘息モデルにおけるＩＬ−５抗体の効果の評価
本試験例は、卵アルブミン（ＯＶＡ）エアロゾルにより誘導したＢＡＬＢ／ｃマウス喘息モデルにおけるＩＬ−５抗体の効果を、気道炎症反応および気道リモデリングに基づいて評価するものである。
【０１８１】
マウスを体重にしたがって各群１０匹の７群にランダムに分けた：正常対象群（Ｇ１）；モデル群（Ｇ２）；抗体ｈ１７０５−００８による処置群（それぞれ１０ｍｐｋおよび２ｍｐｋの２用量によるＧ３およびＧ４）；抗体ｈ１７０５−００９による処置群（それぞれ１０ｍｐｋおよび２ｍｐｋの２用量によるＧ５およびＧ６）；および陽性抗体Ｈｕ３９Ｄ１０による対照群（Ｇ７、１０ｍｐｋ）。１日目および１４日目に、すべてのマウスを、感作液の腹腔内注射により感作した。２８、２９および３０日目に、群１以外の６群のマウスにＯＶＡエアロゾルチャレンジ液で３０分間チャレンジした。チャレンジの２時間前に、３日連続して１日１回、群２（Ｇ２）にリン酸緩衝液を腹腔内注射し、群３〜７（Ｇ３〜Ｇ７）のマウスに異なる抗体を異なる用量で腹腔内注射した。試験する抗体の新しい溶液を、各注射の直前に調製し、注射を半時間以内に完了した。正常対照として、群１のマウスに、３日間連続して１日１回、リン酸緩衝液の腹腔内注射の２時間後に、エアロゾルＰＢＳで３０分間チャレンジした。
【０１８２】
３１日目に、動物を、気道過敏性についてＷＢＰシステムを用いて調べた。すべての動物に、１．５６２５、３．１２５、６．２５、１２．５、２５、５０ｍｇ／ｍＬの倍増する濃度で、メタコリンのスプレーを吸引させ、各濃度でエンハンスド呼気間欠値を測定した。
【０１８３】
３１日目に、ＷＢＰシステムによる気道反応試験の１時間後に、直径１．２ｍｍの気管カニューレを気管に挿入し、固定し、肺洗浄を２回行い、各回に１％ＢＳＡおよび０．６ｍＭ ＥＤＴＡを含むリン酸緩衝液０．８ｍｌを用いた。回収された洗浄液体積を記録した。
【０１８４】
ＢＡＬＦを４℃において３００ｇで５分間遠心分離し、上清をサイトカイン分析用に保存した。遠心分離後、細胞のカウントのために、細胞を１．５ｍｌのＰＢＳ（１％ＢＳＡおよび０．６ｍＭ ＥＤＴＡを含む）に再懸濁した。ＢＡＬＦ中の細胞総数をヘモサイトメーターでカウントし、トリパンブルー染色アッセイを行った。細胞を塗抹し、好酸球、好中球、マクロファージおよびリンパ球を区別するために、Wright染色液で１分間、次いでGiemsaで７分間染色した。細胞を光学顕微鏡下にカウントした。
【０１８５】
洗浄後に肺組織を採り、１０％中性ホルムアルデヒド溶液に浸漬し、次いで１０％中性ホルムアルデヒド溶液中で固定した。固定した組織をパラフィン包埋し、切断し、Ｈ＆Ｅ染色し、スコア評価した。試験結果を図３ならびに図４Ａおよび４Ｂに示す。
【０１８６】
結果は、高用量（１０ｍｐｋ）の陽性化合物が肺機能を改善できないのに対し、本開示の抗体分子ｈ１７０５−００８およびｈ１７０６−００９は、用量依存的に肺機能を顕著に改善できることを示している（図３参照）。同時に、該２つの抗体は好酸球のレベルおよび粘膜の厚さを顕著に低減させ、同用量（１０ｍｐｋ）の陽性抗体と比較して好酸球量の低減においてより高い能力を示した（図４Ａおよび４Ｂ参照）。同じ種類のマウス喘息モデルにおいて実験を繰り返すことにより、本発明者は、１ｍｇ／ｍｌのｈ１７０５−００８、ｈ１７０６−００９およびｈ１７８０−０１７がいずれも、陽性抗体と比較して、ＢａｌＦ中の好酸球レベルを顕著に低減することを確認した（図４Ｃ参照）。
【０１８７】
試験例１０：モルモットモデルの外来ヒトＩＬ−５誘導急性喘息におけるＩＬ−５抗体のインビボ効果の評価
本試験例において、雄モルモットを用いてヒトＩＬ−５誘導急性喘息モデルを作製し、ｈｕ３９Ｄ１０を陽性抗体として用いて、本開示の５つのヒト化ＩＬ−５モノクローナル抗体が、モルモットにおいてヒトＩＬ−５によって誘導される気管支肺胞洗浄液（ＢＡＬＦ）中の好酸球増加に対し抑制作用を示すかを評価した。モルモットを、各群８〜１０匹の９群に分けた：正常対照群、モデル群、ｈｕ３９（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７０５−００８（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７０６−００９（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７８０−０１７（１ｍｇ／ｋｇ）群、ｈ１７７３−００７（１ｍｇ／ｋｇ）群、およびｈ１７７９−０１４（１ｍｇ／ｋｇ）群。１日目に、モデル群および薬物投与群のモルモットに、プライミングのために１００μｌのヒトＩＬ−５（ＩＬ−５抗原５μｇを含む）を気管内注射し、正常対照群にＰＢＳを気管内注射した。プライミングの２時間後、薬物投与群に上記ＩＬ−５モノクローナル抗体１ｍｇ／ｋｇ（投与体積５ｍｌ／ｋｇ）を腹腔内注射し、モデル群には対応するＩｇＧ抗体を投与し、正常対照群にはＰＢＳを腹腔内投与した。気管内注射の２４時間後、モルモットを麻酔し、気管支肺胞洗浄液を採取した。細胞濃度を５＾１０６／ｍｌに調節し、その１５μｌをスライドガラスに載せ、乾燥し、固定して、ＨＥ染色し、細胞総数および好酸球数を倍率４００で顕微鏡下にカウントした。好酸球のパーセンテージを計算した。結果を図５Ａおよび５Ｂに示す。結果は、本開示の５つのヒト化抗体はいずれも、ＢＡＬＦ中の好酸球のレベルを顕著に低下させることを示している。
【０１８８】
安定性評価
試験例１１：ヒト化抗ＩＬ−５抗体の安定性
１．抗体の化学的安定性
脱アミド化修飾は、抗体において、長期安定性に影響しうる一般的な化学修飾である。特に、ＣＤＲ領域の部分的アミノ酸の高度の脱アミド化、酸化または異性化修飾は、一般に、変異によって回避されるかまたは低減される。さまざまな時点で採取した１００μｇのサンプルを、０．２Ｍ  Ｈｉｓ−ＨＣｌ、８Ｍ  Ｇｕａ−ＨＣｌの１００μｌ溶液（ｐＨ６．０）に溶解し、０．１ｇ／ｍｌのＤＴＴを３μｌ加え、５０℃の水浴内で１時間インキュベートした後、０．０２Ｍ  Ｈｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．０）を用いて２回限外濾過した。酵素分解のために、０．２５ｍｇ／ｍＬのトリプシンを３μｌ加え、３７℃の水浴内で一晩インキュベートした。Agilent 6530 Q-TOFを用いてＬＣ−ＭＳ分析を行った。結果は、本開示のヒト化抗体の化学的安定性は良好であり、抗体は、４０℃の５２９緩衝系中で１箇月の加速反応後に異常な修飾を示さなかったことを示している。
【０１８９】
２．高濃度条件下の抗体凝集度の試験
異なる緩衝系および異なる温度条件で１箇月間にわたり、高濃度における試験抗体の安定性を評価した。５０ｍｇ／ｍｌの濃度での安定性を、ＰＢ９、Ｈｉｓおよび５２９の３つの緩衝系において、４０℃、２５℃、４℃および−８０℃で凍結と解凍を繰り返して調べた。ＳＥＣ−ＨＰＬＣにより、凝集度をモニターした。Waters e2695クロマトグラフを、Waters Xbridge BEH 200A SECカラムと共に用い、移動相としてＰＢＳ（希塩酸でｐＨ６．８に調節）を用いた。タンパク質５０μｇをロードし、流速０．５ｍＬ／分でイソクラティック溶出を行った。本開示のヒト化ＩＬ−５抗体はいずれも、高濃度条件下で顕著な凝集を起こさないことが観察された。４０℃で４週間の加速反応の後、抗体モノマーの純度は、３つの系のいずれにおいても９５％を超えていた。
【０１９０】
３．高濃度条件下の抗体純度の試験
異なる緩衝系および異なる温度条件で１箇月間にわたり、高濃度における試験抗体の安定性を評価した。５０ｍｇ／ｍｌの濃度での安定性を、Ｈｉｓ系において４０℃で調べた。ＣＥ−ＳＤＳにより、純度をモニターした。タンパク質１００μｇを取り、サンプル緩衝液を加えて９５μｌとした。還元モードの分析のために、ジメルカプトエタノール５μｌを加え、非還元モードの分析のためには、ＩＡＡを５μｌ加えた。７０℃の水浴中で１０分間インキュベートし、遠心分離し、上清をロードした。Beckman PA800plus電気泳動装置を用いて、データを収集し解析した。本開示の抗体タンパク質は、高濃度条件下で良好な純度安定性を有し、４０℃で２８日間の加速反応の後、ＣＥ−ＳＤＳ分析により、抗体の主ピークが２％低下したに過ぎないことが示された。
【０１９１】
ＵＮＩＴによる異なる抗体の熱安定性の試験
サンプルを、対応する緩衝液（ＰＢＳ緩衝液）に溶解し、サンプルの濃度を約１ｍｇ／ｍｌに調節した。９μｌをロードした。パラメーター設定：出発温度２０℃；インキュベーション０ｓ；加熱速度０．３℃／分；Plate Hold  ５ｓ；最終温度９５℃。抗体のＴｍ値を測定した。抗体は高いＴｍ値を有し、良好な熱安定性を示す。
【０１９２】
上記説明した発明は、添付の図面および実施例を参照して詳細に説明した。しかしながら、該説明および実施例は、本開示の範囲を限定するものと解釈すべきではない。本書に引用される特許および科学文献はいずれも、その開示全体が、引用により本書に組み込まれるものとする。
【図１】
2021502801.tif 000073
【図２】
2021502801.tif 000074
【図３】
2021502801.tif 000075
【図４Ａ】
2021502801.tif 000076
【図４Ｂ】
2021502801.tif 000077
【図４Ｃ】
2021502801.tif 000078
【図５Ａ】
2021502801.tif 000079
【図５Ｂ】
2021502801.tif 000080
【配列表】
2021502801000001.app
【国際調査報告】
2021502801.tif 000081
2021502801.tif 000082
2021502801.tif 000083
2021502801.tif 000084
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