(57)【要約】  組成物は、ホモバニリルアルコール（ＨＶＡ）又は以前に同定されていなかった異性体（ｉｓｏＨＶＡ）のうちの少なくとも１つを含有する。追加的に又は代替的に、組成物は、ＨＶＡ及び／又はｉｓｏＨＶＡの前駆体（例えば、ヒドロキシチロソール、オレウロペインアグリコン、オレウロペイン、ジメチルオレウロペイン、オレウロシド、ベルバスコシド、又はこれらの混合物）を含有し、また、前駆体をＨＶＡ及び／又はｉｓｏＨＶＡ（並びに／又は生体内でメチル化に供されて、ＨＶＡ及び／若しくはｉｓｏＨＶＡを形成する中間体化合物）に生体内で変換する少なくとも１つのプロバイオティクス及び／又は少なくとも１つの酵素も含有する。組成物は、個体に投与されて、高齢者における運動障害を処置若しくは発生を低減する；骨形成を刺激する及び／若しくは骨吸収を阻害する；滑膜炎の処置を必要とする、若しくは滑膜炎のリスクがある個体における滑膜炎を処置若しくは発生を低減する；滑膜炎を有する若しくは滑膜炎から回復中の個体における滑膜炎に続く関節軟骨の分解を処置若しくは発生を低減する；又は軟骨の損傷を処置若しくは発生を低減することができる。【選択図】  なし
2021502336.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
高齢者における運動障害を処置又は運動障害の発生を低減する方法であって、（ｉ）１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分と同時投与され、前記構成成分は、グリコシダーゼ活性若しくはエステラーゼ活性のうちの少なくとも１つを有し、また所望によりメチルトランスフェラーゼ活性も有する、治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体、又は（ｉｉ）治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、のうちの少なくとも１つを前記高齢者に経口投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
前記高齢者が、老齢の個体である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記高齢者が、フレイル、プレフレイル、サルコペニア、サルコペニアから回復中である、骨粗鬆症、骨関節炎、栄養不良、栄養不良のリスクがある、リハビリテーションを受けている、来年中にリハビリテーションを受ける予定である、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される状態を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記高齢者への前記投与が、少なくとも１ヶ月間、１日１回である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
食品組成物が、前記高齢者に投与され、前記ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の少なくとも一部、並びに／又はホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前記前駆体の少なくとも一部を提供する濃縮植物抽出物を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記濃縮植物抽出物が、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に富み、オレウロペイン、ベルバスコシド、ルテオリン−７−グルコシド、アピゲニン−７−グルコシド、ジオスメチン−７−グルコシド、ルテオリン、ジオスメチン、ルチン、カテキン、チロソール、ヒドロキシチロソール、バニリン、バニリン酸、及びコーヒー酸からなる群から選択される少なくとも１つの化合物が低減されており又は実質的に含まず、所望により、少なくともオレウロペインが低減されている又は実質的に含まない、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記食品組成物が、オレウロペイン、ベルバスコシド、ルテオリン−７−グルコシド、アピゲニン−７−グルコシド、ジオスメチン−７−グルコシド、ルテオリン、ジオスメチン、ルチン、カテキン、チロソール、ヒドロキシチロソール、バニリン、バニリン酸、及びコーヒー酸からなる群から選択される少なくとも１つの化合物を実質的に含まない、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記濃縮植物抽出物が、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体に富む、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記前駆体が、ヒドロキシチロソール、オレウロペインアグリコン、オレウロペイン、ジメチルオレウロペイン、オレウロシド、ベルバスコシド、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
骨形成と骨吸収との間の不均衡を含む状態を有する個体における骨形成を刺激する及び／又は骨吸収を阻害する方法であって、（ｉ）１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分と同時投与され、前記構成成分は、グリコシダーゼ活性若しくはエステラーゼ活性のうちの少なくとも１つを有し、また所望によりメチルトランスフェラーゼ活性も有する、有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体、又は（ｉｉ）有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体のうちの少なくとも１つを前記個体に経口投与する工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記状態が、骨粗鬆症、ページェット病、プロテーゼ周囲の骨溶解、転移性骨疾病、甲状腺機能亢進症、癌による高カルシウム血症、多発性骨髄腫、歯周病、骨関節炎、骨減少症、骨折に起因する骨欠損、骨折治癒、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記個体への前記投与が、少なくとも１ヶ月間、１日１回である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記前駆体が、ヒドロキシチロソール、オレウロペインアグリコン、オレウロペイン、ジメチルオレウロペイン（ｄｅｍｅｔｈｙｌｏｌｅｕｒｏｐｅｉｎ）、オレウロシド、ベルバスコシド、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
食品組成物が、前記個体に投与され、前記ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の少なくとも一部、並びに／又はホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前記前駆体の少なくとも一部を提供する濃縮植物抽出物を含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記濃縮植物抽出物が、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に富み、オレウロペイン、ベルバスコシド、ルテオリン−７−グルコシド、アピゲニン−７−グルコシド、ジオスメチン−７−グルコシド、ルテオリン、ジオスメチン、ルチン、カテキン、チロソール、ヒドロキシチロソール、バニリン、バニリン酸、及びコーヒー酸からなる群から選択される少なくとも１つの化合物が低減されており又は実質的に含まず、所望により、少なくともオレウロペインが低減されている又は実質的に含まない、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記濃縮植物抽出物が、ヒドロキシチロソール、オレウロペインアグリコン、オレウロペイン、ジメチルオレウロペイン、オレウロシド、ベルバスコシド、及びこれらの混合物からなる群から選択されるホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体に富む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
滑膜炎の処置を必要とする個体における滑膜炎を処置する、滑膜炎のリスクがある個体における滑膜炎の発生を低減する、又は滑膜炎を有する若しくは滑膜炎から回復中の個体における滑膜炎に続く関節軟骨の分解を処置若しくは発生を低減する方法であって、（ｉ）１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分と同時投与され、前記構成成分は、グリコシダーゼ活性若しくはエステラーゼ活性のうちの少なくとも１つを有し、また所望によりメチルトランスフェラーゼ活性も有する、治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体、又は（ｉｉ）治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、のうちの少なくとも１つを前記個体に経口投与する工程を含む、方法。
【請求項１８】
前記滑膜炎が、狼瘡、痛風、関節リウマチ、骨関節炎、骨軟骨炎疾病、変形性関節症、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される状態に関連する、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記個体への前記投与が、少なくとも１ヶ月間、１日１回である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
食品組成物が、前記個体に投与され、前記ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の少なくとも一部、並びに／又はホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前記前駆体の少なくとも一部を提供する濃縮植物抽出物を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
前記濃縮植物抽出物が、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に富み、オレウロペイン、ベルバスコシド、ルテオリン−７−グルコシド、アピゲニン−７−グルコシド、ジオスメチン−７−グルコシド、ルテオリン、ジオスメチン、ルチン、カテキン、チロソール、ヒドロキシチロソール、バニリン、バニリン酸、及びコーヒー酸からなる群から選択される少なくとも１つの化合物が低減されており又は実質的に含まず、所望により、少なくともオレウロペインが低減されている又は実質的に含まない、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記濃縮植物抽出物が、ヒドロキシチロソール、オレウロペインアグリコン、オレウロペイン、ジメチルオレウロペイン、オレウロシド、ベルバスコシド、及びこれらの混合物からなる群から選択されるホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体に富む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
軟骨の損傷の処置を必要とする又は軟骨の損傷のリスクがある個体における軟骨の損傷を処置又は発生を低減する方法であって、（ｉ）１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分と同時投与され、前記構成成分は、グリコシダーゼ活性若しくはエステラーゼ活性のうちの少なくとも１つを有し、また所望によりメチルトランスフェラーゼ活性も有する、治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体、又は（ｉｉ）治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、のうちの少なくとも１つを前記個体に経口投与する工程を含む、方法。
【請求項２４】
前記個体が、老齢の個体である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記個体への前記投与が、少なくとも１ヶ月間、１日１回である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記前駆体が、ヒドロキシチロソール、オレウロペインアグリコン、オレウロペイン、ジメチルオレウロペイン、オレウロシド、ベルバスコシド、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２７】
食品組成物が、前記個体に投与され、前記ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の少なくとも一部、並びに／又はホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前記前駆体の少なくとも一部を提供する濃縮植物抽出物を含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２８】
前記濃縮植物抽出物が、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に富み、オレウロペイン、ベルバスコシド、ルテオリン−７−グルコシド、アピゲニン−７−グルコシド、ジオスメチン−７−グルコシド、ルテオリン、ジオスメチン、ルチン、カテキン、チロソール、ヒドロキシチロソール、バニリン、バニリン酸、及びコーヒー酸からなる群から選択される少なくとも１つの化合物が低減されている又は実質的に含まず、所望により、少なくともオレウロペインが低減されている又は実質的に含まない、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記濃縮植物抽出物が、ヒドロキシチロソール、オレウロペインアグリコン、オレウロペイン、ジメチルオレウロペイン、オレウロシド、ベルバスコシド、及びこれらの混合物からなる群から選択されるホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体に富む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
（ｉ）１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分を伴い、前記構成成分は、グリコシダーゼ活性若しくはエステラーゼ活性のうちの少なくとも１つを有し、また所望によりメチルトランスフェラーゼ活性も有する、治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体、又は（ｉｉ）治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、のうちの少なくとも１つを、（ａ）骨又は軟骨代謝の均衡を維持又は回復すること、（ｂ）骨又は軟骨の健康を維持又は改善すること、（ｃ）高齢者における運動性を維持又は改善すること、（ｄ）滑膜炎を処置又は予防すること、及び（ｅ）これらの組み合わせからなる群から選択される効果を得るのに有効な量で含む、組成物。
【請求項３１】
前記組成物が、タンパク質、炭水化物、脂肪、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される構成成分を含む食品製品である、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３２】
前記前駆体が、ヒドロキシチロソール、オレウロペインアグリコン、オレウロペイン、ジメチルオレウロペイン、オレウロシド、ベルバスコシド、及びこれらの混合物からなる群から選択される、請求項３０に記載の組成物。
【請求項３３】
（ｉ）骨又は軟骨代謝の均衡を維持又は回復すること、（ｉｉ）骨又は軟骨の健康を維持又は改善すること、（ｉｉｉ）高齢者における運動性を維持又は改善すること、（ｉｖ）滑膜炎を処置又は予防すること、及び（ｖ）これらの組み合わせからなる群から選択される効果を得る組成物の作製方法であり、有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を、タンパク質、炭水化物、及び脂肪からなる群から選択される少なくとも１つの成分に加える工程を含む、方法。
【請求項３４】
酸味料、増粘剤、ｐＨ調整用緩衝剤又は試剤、キレート剤、着色剤、乳化剤、賦形剤、香料、ミネラル、浸透剤、医薬的に許容される担体、防腐剤、安定剤、糖、甘味料、調質剤、ビタミン、ミネラル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される食品添加物を、前記少なくとも１つの成分に加える工程を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物中のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の量を定量する工程を更に含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
（ｉ）骨又は軟骨代謝の均衡を維持又は回復すること、（ｉｉ）骨又は軟骨の健康を維持又は改善すること、（ｉｉｉ）高齢者における運動性を維持又は改善すること、（ｉｖ）滑膜炎を処置又は予防すること、及び（ｖ）これらの組み合わせからなる群から選択される効果を得る組成物の作製方法であり、
ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を含む濃縮植物抽出物を形成する工程であって、前記濃縮植物抽出物は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体を含む出発植物材料から形成され、前記濃縮植物抽出物を形成する前記工程は、前記出発植物材料中の前記前駆体の少なくとも一部を、（ａ）前記濃縮植物抽出物中のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、並びに／又は（ｂ）前記濃縮植物抽出物中の中間体化合物に生物変換する工程を行う活性を有する有効量の細菌及び／又は酵素を用いた、前記出発植物材料の生体外での処理を含む、濃縮植物抽出物を形成する工程と、
前記組成物中に前記濃縮植物抽出物を含ませる工程と、を含む、方法。
【請求項３７】
前記組成物が、前記濃縮植物抽出物に加えて、タンパク質、炭水化物、及び脂肪からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記出発植物材料が、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に加えて、１つ以上の他の化合物を含み、前記濃縮植物抽出物は、前記１つ以上の他の化合物に対するホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の比が、前記出発植物材料中の比よりも高い、請求項３６に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つ以上の他の化合物が、オレウロペインを含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記出発植物材料が、オリーブ葉抽出物を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４１】
前記酵素の前記活性が、β−グルコシダーゼ活性又はエステラーゼ活性のうちの少なくとも１つを含み、所望により、メチルトランスフェラーゼ活性を更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４２】
前記前駆体が、オレウロペイン又はその誘導体のうちの少なくとも１つを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記濃縮植物抽出物及び／又は前記組成物中のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の量を定量する工程を更に含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
前記細菌及び／又は酵素が、前記組成物を投与される個体において、メチルトランスフェラーゼによって、生体内で治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に変換される量の中間体化合物を生体外で形成するのに充分な量で細菌を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４５】
前記細菌及び／又は酵素が、前記濃縮植物抽出物中に、治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を生体外で形成するのに充分な総量で細菌及び酵素を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４６】
前記細菌が、前記濃縮植物抽出物中に、治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を生体外で形成するのに充分な総量で、第１の酵素活性を有する第１の菌株と、前記第１の酵素活性と異なる第２の酵素活性を有する第２の菌株と、を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４７】
前記酵素が、前記濃縮植物抽出物中に、治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を生体外で形成するのに充分な総量で、第１の酵素活性を有する第１の酵素と、前記第１の酵素活性と異なる第２の酵素活性を有する第２の酵素と、を含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項４８】
（ｉ）骨又は軟骨代謝の均衡を維持又は回復すること、（ｉｉ）骨又は軟骨の健康を維持又は改善すること、（ｉｉｉ）高齢者における運動性を維持又は改善すること、（ｉｖ）滑膜炎を処置又は予防すること、及び（ｖ）これらの組み合わせからなる群から選択される効果を得る組成物の作製方法であり、
ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体を、タンパク質、炭水化物、及び脂肪からなる群から選択される少なくとも１つの成分に加える工程と、
前記少なくとも１つの成分に、前記組成物を投与される個体において前記前駆体の少なくとも一部を有効量の（ａ）ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、並びに／又は（ｂ）メチルトランスフェラーゼに供され得る中間体化合物に生体内で変換することができる量の酵素を加えて、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を形成する工程と、を含む、方法。
【請求項４９】
前記前駆体が、前記少なくとも１つの成分に加えられたオリーブ葉抽出物によって提供される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記前駆体が、オレウロペイン又はその誘導体のうちの少なくとも１つを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記組成物中のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の量を定量する工程を更に含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
少なくとも１つのプロバイオティクス菌株を選択する方法であって、前記方法は、
（ａ）複数の菌株のインシリコ分析によりβ−グルコシダーゼコード遺伝子及び／又はインビトロ分析によりβ−グルコシダーゼ活性を有するプロバイオティクス菌株を同定する工程と、
（ｂ）複数の菌株のインシリコ分析によりエステラーゼエンコード遺伝子及び／又はインビトロ分析によりエステラーゼ活性を有するプロバイオティクス菌株を同定する工程と、
（ｃ）ｉ）β−グルコシダーゼ活性を有するものとして工程（ａ）において同定された前記プロバイオティクス菌株、及びエステラーゼ活性を有するものとして工程（ｂ）において同定された前記プロバイオティクス菌株の細菌培養物、又はｉｉ）β−グルコシダーゼ活性及びエステラーゼ活性の両方を有するものとして工程（ａ）及び（ｂ）において同定された前記プロバイオティクス菌株の細菌培養物を用いて、出発量のオレウロペイン及び／又はヒドロキシチロソールを発酵させる工程と、
（ｄ）工程（ｃ）における酵素又は発酵が、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を形成するかどうかを同定する工程と、
（ｅ）工程（ｃ）における発酵時間に比して残存する前記出発量のオレウロペイン及び／又はヒドロキシチロソールの割合を測定する工程と、
（ｆ）２４時間未満の時間をかけて工程（ｃ）において前記出発量のオレウロペイン及び／又はヒドロキシチロソールの少なくとも１０重量％を消費し、かつ工程（ｃ）においてホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を形成するプロバイオティクス菌株を同定する工程と、を含む、方法。
【請求項５３】
インシリコ分析による工程（ａ）におけるプロバイオティクス菌株の同定が、前記プロバイオティクス菌株のゲノムを提供し、前記プロバイオティクス菌株の前記ゲノム中のβ−グルコシダーゼ酵素をコードする遺伝子の配列類似性検索を行うことによって行われ、インシリコ分析による工程（ｂ）におけるプロバイオティクス菌株の同定が、前記プロバイオティクス菌株のゲノムを提供し、前記プロバイオティクス菌株の前記ゲノム中のエステラーゼ酵素をコードする遺伝子の配列類似性検索を行うことによって行われる、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
工程（ｆ）において同定された前記プロバイオティクス菌株を食品製品に組み込むことを更に含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記工程（ｆ）において同定された前記プロバイオティクス菌株を食品製品に組み込むことが、工程（ｆ）において同定された前記プロバイオティクス菌株を、タンパク質、炭水化物、及び脂質からなる群から選択される少なくとも１つの食用成分に加えることを含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
軟骨の損傷を処置又は予防する方法であって、（ｉ）治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、又は（ｉｉ）ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体と、前記前駆体の少なくとも一部をホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体に変換することができるプロバイオティクスとの組み合わせ、のうちの少なくとも１つを、軟骨の損傷の処置を必要とする又は軟骨の損傷のリスクがある個体に投与する工程を含み、前記組み合わせが、治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を提供する量で投与される、方法。
【請求項５７】
ホモバニリルアルコール異性体を含む口腔用組成物。
【請求項５８】
ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体と、
１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分であって、グリコシダーゼ活性、エステラーゼ活性、及びメチルトランスフェラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、構成成分と、を含む、口腔用組成物。
【請求項５９】
前記少なくとも１つの活性が、少なくともメチルトランスフェラーゼ活性を含む、請求項５８に記載の口腔用組成物。
【請求項６０】
１つ以上の追加のオリーブポリフェノールを更に含む、請求項５８に記載の口腔用組成物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
[0001]本開示は、一般に、オレウロペイン代謝産物、及びまたオレウロペイン代謝産物を含む組成物に関し、更に、骨及び／又は軟骨の健康の維持又は改善に関する。組成物は、追加的に又は代替的に、骨及び／又は軟骨疾患を予防、緩和、及び／又は処置することができる。より具体的には、本開示は、ホモバニリルアルコール（ＨＶＡ）及びその以前に同定されていない異性体３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノール（別法として３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネチルアルコールと呼称され得る）に関する。例えば、口腔用組成物は、ＨＶＡ異性体を含有し得る。
【０００２】
[0002]骨量は、生涯にわたって変化し、遺伝的、機械的、及びホルモン的メカニズムによって調節される。骨塩の獲得は小児期に生じ、骨量は２０歳前後にピークに達する。この期間中、骨形成は骨吸収を超える。人生の後期、特に閉経期の頃又は老齢の個体群では、骨代謝回転がより高く、過剰な骨吸収により、骨量、マイクロアーキテクチャ、構造、及び強度が徐々に低下することに起因して、骨量及び質が低下している。
【０００３】
[0003]骨形成と骨吸収との間の均衡の回復は、骨を維持するために重要である。この骨リモデリングプロセスは、骨の細胞レベルで調節され、それには、骨形成細胞（骨芽細胞）と骨吸収細胞（破骨細胞）との間の緊密な相互作用を含む。健康な成体（ヒト又は動物）では、骨芽細胞及び破骨細胞の協調作用により、経時的に骨量を維持し、同時に、骨の吸収及び新規の合成によって骨組織のリモデリングを確実にする。
【０００４】
[0004]健康な成体では、破骨細胞及び骨芽細胞の形成速度は、骨形成と骨吸収との間の均衡を実現する。しかしながら、骨粗鬆症の個体では、骨リモデリングプロセスにおける不均衡が生じており、これにより、骨の減少が形成速度よりも急速に進行するようになる。この不均衡は、年齢に伴いほとんどの個体においてある程度存在するようになるが、女性の場合には閉経時に加速され、男性の場合には、高齢期で生じ、骨粗鬆症につながる可能性がある。したがって、ヒト及び他の哺乳動物では、さまざまな疾患が骨吸収及び骨形成の不均衡な代謝に関連し、骨粗鬆症をもたらす。
【０００５】
[0005]更に、ヒト及び動物では、骨形成を増加させる必要があることを特徴とする多くの状態が存在する。例えば、骨折は、骨の完全な修復を速めるために、骨形成が刺激される必要がある。骨成長の刺激はまた、歯周病、骨の転移性疾病、骨溶解性疾病、及び結合組織の修復が必要とされる状態、例えば、軟骨の欠損又は外傷の瘢痕化又は再生のためにも必要である。骨形成又は同化の刺激はまた、原発性及び二次性副甲状腺機能亢進症、並びに糖尿病に関連する骨粗鬆症、及び糖質コルチコイドに関連する骨粗鬆症の場合においても必要である。
【０００６】
[0006]骨形成を刺激する及び／若しくは骨吸収を阻害するための現在の処置の成果は限られている。
【０００７】
[0007]別の関節疾患には骨関節炎があり、この疾患は老齢者における障害の第１の原因である。骨関節炎は、関節の関節軟骨の変性疾病であり、最も一般的な形態の関節炎である。骨関節炎の主要な特徴は、滑膜増殖、軟骨下骨の硬化及び厚さ、関節縁での骨棘形成、靭帯弛緩、並びに筋萎縮（これら全てが骨関節炎の臨床症状の一因となる）などの他の関節構造の変化を伴う、関節軟骨の進行性の損傷及び減少である。これらの症状としては、重度の痛み、こり、関節運動の低下、及び障害が挙げられる。
【０００８】
[0008]現在、骨関節炎のための治療法は存在せず、療法は、症状の改善を目的とした対症療法のみである。例えば、痛み及び炎症は、鎮痛剤（アセトアミノフェンなど）及び非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）を使用して治療される。更に、これらの薬物の使用は、多くの場合、胃腸又は心臓血管リスクなどの副作用を伴う。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
[0009]オレウロペイン（ＯＥ）は、オリーブツリー（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）の主要なフェノール化合物であり、未加工のオリーブ果実及び葉中に多量に存在する。本発明者らは、オリーブ葉抽出物の摂取後の、尿中のその代謝産物の同定によって、ＯＥ代謝を調査した。本明細書で後に詳細に記載されるように、液体クロマトグラフィー質量分析法（ＬＣ−ＭＳ）が開発され、ヒドロキシチロソール、ホモバニリルアルコール、及びホモバニリルアルコール異性体３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノール（別法として３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネチルアルコールと呼称される）の定量について充分に検証した。ホモバニリルアルコール異性体３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノールは、初めて同定された。
【００１０】
[0010]また本明細書で後に詳細に記載されるように、軟骨細胞に対するオレウロペインのいくつかの代謝産物の効果について試験した。予想外に、合成形態のホモバニリルアルコール及びその異性体は、オレウロペイン代謝産物の主要な循環形態のうちの１つであるヒドロキシチロソールよりも有効である。
【００１１】
[0011]更にこの点に関して、本発明者らは、ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、又はこのようなＨＶＡ及び／若しくは異性体が豊富なポリフェノール抽出物を含有する組成物を提供した。また、本明細書で詳細に記載されるように、本発明者らは、オリーブポリフェノールの有効性を高めるために、ＨＶＡ及び／又はその異性体のその場又は生体内での産生に都合よい栄養溶液を提供した。
【００１２】
[0012]更にこの点に関して、本発明者らは、ホモバニリルアルコール又はその異性体中に組成物を得る及び／又は濃縮するための１つの可能な経路が、オリーブポリフェノールの供給源を、（ａ）グリコシダーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性のあるプロバイオティクス及び／又は酵素、並びに（ｂ）メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＣＯＭＴ）の組み合わせに供して、ホモバニリルアルコール及び／又は異性体を得ることであると指摘した。このような反応は、上記の組み合わせとともに、オリーブポリフェノール源を同時投与することによって、生体外（発酵＋メチル化）又はその場で実現され得る。ホモバニリルアルコール又はその異性体を得るためのもう１つの可能な経路は、オリーブポリフェノール源を、グリコシダーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性のあるプロバイオティクス又は酵素に供して、ホモバニリルアルコール及びＨＶＡ異性体前駆体を生体外（発酵）又はその場で（同時摂取）産生することである。次いで、このような前駆体を、生体内で、哺乳動物の酵素カテコール−Ｏ−メチルトランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）に供して、ホモバニリルアルコール及び／又はその異性体を生体内で得る（例えば、量を増やす）。本明細書にて開示された実施形態のうちのいくつかは、これらの経路のうちの少なくとも１つを有利に用いて、驚くべき及び予期せぬ治療効果及び予防効果を達成する。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
[0013]例えば、好ましい実施形態は、以下の方法のうちの１つ以上を利用して、オリーブポリフェノール源を、ホモバニリルアルコール（若しくは異性体）又は都合のよいＨＶＡ（及び異性体）経路を用いて、生体内で生成又は濃縮する。
[0014]生体外（発酵）又はその場で（同時投与）のプロバイオティクス（グリコシダーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性）＋生体内でのＣＯＭＴ（メチルトランスフェラーゼ）
[0015]生体外（発酵）でのプロバイオティクス（グリコシダーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性）＋生体外でのメチルトランスフェラーゼ
[0016]プロバイオティクス（グリコシダーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性）及びメチルトランスフェラーゼ（このような活性を有する酵素又はプロバイオティクス）（同時投与）
[0017]両方の活性（グリコシダーゼ及び／又はエステラーゼ及びメチルトランスフェラーゼ）を有するプロバイオティクス（発酵又は同時投与）
[0018]酵素カクテル（グリコシダーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性）＋生体内でのＣＯＭＴ
[0019]酵素カクテル（グリコシダーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性）＋生体外でのメチルトランスフェラーゼ酵素。
[0020]酵素カクテル（グリコシダーゼ活性及び／又はエステラーゼ活性）＋生体外での細菌（例えば、ＣＯＭＴ活性を有するプロバイオティクス）
【００１４】
[0021]このような実施形態において、生体外でのメチル化の少なくとも一部が任意選択的に初めに生じ、続いてプロバイオティクス及び／又は酵素のエステラーゼ活性／グリコシダーゼ活性が生じ得、追加的に又は代替的に、生体外でのメチル化は、プロバイオティクス及び／又は酵素のエステラーゼ活性／グリコシダーゼ活性後に生じ得る。
【００１５】
[0022]特に好ましい実施形態は、合成形態又は（発酵に続くメチル化により）生体外で調製された形態のいずれかで、ＨＶＡ又はその異性体を含有する（又はそれらが豊富な）組成物を利用する。別の特に好ましい実施形態は、オリーブポリフェノール源（例えば、オリーブ葉抽出物、オリーブ油生産の廃棄物、オレウロペインを含有する抽出物）及びまた１つ以上の構成成分を含有する組成物を利用して、例えば、オリーブ葉抽出物＋プロバイオティクス＋ＣＯＭＴ又は両方の活性を有するプロバイオティクスの同時投与により、摂取中にＨＶＡ経路を生じさせ／支持する。更に別の特に好ましい実施形態は、オリーブポリフェノール源＋１つ以上の構成成分を含有する組成物を利用して、摂取中にＨＶＡ前駆体（ヒドロキシチロソール又はオレウロペインアグリコン）を産生／支持し、メチル化の最後の工程は、哺乳動物のメチルトランスフェラーゼによって体内で実現される。
【００１６】
[0023]したがって、一実施形態において、本開示は、高齢者における運動障害を処置する又は運動障害の発生を低減する方法であって、治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を高齢者に経口投与する工程を含む、方法を提供する。高齢者は、老齢の個体であってよく、及び／又はフレイル、プレフレイル、サルコペニア、サルコペニアから回復中である、骨粗鬆症、骨関節炎、栄養不良、栄養不良のリスクがある、リハビリテーションを受けている、来年中にリハビリテーションを受ける予定である、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される状態を有してよい。
【００１７】
[0024]追加的に又は代替的に、治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体、例えば、ヒドロキシチロソール、オレウロペインアグリコン、オレウロペイン、ジメチルオレウロペイン、オレウロシド、又はベルバスコシドのうちの１つ以上などのＨＶＡの前駆体を高齢者に経口投与することができる。
【００１８】
[0025]一実施形態において、高齢者への投与は、例えば食品組成物において、少なくとも１ヶ月間、１日１回である。食品組成物は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の少なくとも一部を提供する濃縮植物抽出物を含むことができ、好ましくは濃縮植物抽出物は、出発植物材料と比較して、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の濃度が増加している。濃縮植物抽出物は、オレウロペイン、ベルバスコシド、ルテオリン−７−グルコシド、アピゲニン−７−グルコシド、ジオスメチン−７−グルコシド、ルテオリン、ジオスメチン、ルチン、カテキン、チロソール、ヒドロキシチロソール、バニリン、バニリン酸、及びコーヒー酸からなる群から選択される少なくとも１つの化合物、並びにオリーブ葉抽出物及びオリーブ油生産の廃棄物（マージン）中に存在する他のフェノール化合物が低減されている又は実質的に含まない場合がある。所望により、濃縮植物抽出物は、少なくともオレウロペインが低減されている又は実質的に含まない。
【００１９】
[0026]追加的に又は代替的に、濃縮植物抽出物は、ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体、例えば、ヒドロキシチロソール、オレウロペインアグリコン、オレウロペイン、ジメチルオレウロペイン、オレウロシド、又はベルバスコシドのうちの１つ以上などのＨＶＡの前駆体の少なくとも一部を提供することができる。このような実施形態において、好ましくは濃縮植物抽出物は、出発植物材料と比較して、前駆体の濃度が増加している。濃縮植物抽出物は、１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分と同時投与される場合があり、この構成成分は、グリコシダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有し、また所望によりメチルトランスフェラーゼ活性も有する。
【００２０】
[0027]別の実施形態において、本開示は、骨形成と骨吸収との間の不均衡を含む状態を有する個体における骨形成を刺激する及び／又は骨吸収を阻害する方法であって、（ｉ）１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分と同時投与され、この構成成分は、グリコシダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有し、また所望によりメチルトランスフェラーゼ活性も有する、有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体、又は（ｉｉ）有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、のうちの少なくとも１つを個体に経口投与する工程を含む、方法を提供する。状態は、骨粗鬆症、ページェット病、プロテーゼ周囲の骨溶解、転移性骨疾病、甲状腺機能亢進症、癌による高カルシウム血症、多発性骨髄腫、歯周病、骨関節炎、骨減少症、骨折に起因する骨欠損、骨折治癒、及びこれらの組み合わせからなる群から選択され得る。個体への投与は、少なくとも１ヶ月間、１日１回であることができる。
【００２１】
[0028]別の実施形態において、本開示は、滑膜炎の処置を必要とする個体における滑膜炎を処置する、滑膜炎のリスクがある個体における滑膜炎の発生を低減する、又は滑膜炎を有する若しくは滑膜炎から回復中の個体における滑膜炎に続く関節軟骨の分解を処置若しくは発生を低減する方法であって（ｉ）１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分と同時投与され、この構成成分は、グリコシダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有し、また所望によりメチルトランスフェラーゼ活性も有する、治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体、又は（ｉｉ）治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、のうちの少なくとも１つをこの個体に経口投与する工程を含む、方法を提供する。滑膜炎は、狼瘡、痛風、関節リウマチ、骨関節炎、骨軟骨炎疾病、変形性関節症、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される状態に関連し得る。個体への投与は、少なくとも１ヶ月間、１日１回であることができる。
【００２２】
[0029]別の実施形態において、本開示は、軟骨の損傷の処置を必要とする又は軟骨の損傷のリスクがある個体における軟骨の損傷を処置又は発生を低減する方法であって、（ｉ）１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分と同時投与され、この構成成分は、グリコシダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有し、また所望によりメチルトランスフェラーゼ活性も有する、治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体、又は（ｉｉ）治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、のうちの少なくとも１つをこの個体に経口投与する工程を含む、方法を提供する。高齢者は、老齢の個体であってもよい。個体への投与は、少なくとも１ヶ月間、１日１回であることができる。
【００２３】
[0030]別の実施形態において、本開示は、（ｉ）１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分と同時投与され、この構成成分は、グリコシダーゼ活性及びエステラーゼ活性を有し、また所望によりメチルトランスフェラーゼ活性も有する、治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体、又は（ｉｉ）治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、のうちの少なくとも１つを、（ａ）骨又は軟骨代謝の均衡を維持又は回復すること、（ｂ）骨又は軟骨の健康を維持又は改善すること、（ｃ）高齢者における運動性を維持又は改善すること、（ｄ）滑膜炎を処置又は予防すること、及び（ｅ）これらの組み合わせからなる群から選択される効果を得るのに有効な量で含む、組成物を提供する。組成物は、タンパク質、炭水化物、脂質及びこれらの組み合わせからなる群から選択される構成成分を含む食品製品である。
【００２４】
[0031]別の実施形態において、本開示は、（ａ）骨又は軟骨代謝の均衡を維持又は回復すること、（ｂ）骨又は軟骨の健康を維持又は改善すること、（ｃ）高齢者における運動性を維持又は改善すること、（ｄ）滑膜炎を処置又は予防すること、及び（ｅ）これらの組み合わせからなる群から選択される効果を得る組成物の作製方法を提供する。本方法は、（ｉ）ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、又は（ｉｉ）ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体のうちの少なくとも１つを含む濃縮植物抽出物を形成する工程であって、この濃縮植物抽出物は、オリーブポリフェノールを含む出発植物材料から形成され、この濃縮植物抽出物を形成する工程は、出発植物材料中のオリーブポリフェノールの少なくとも一部を、（ｉ）ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、又は（ｉｉ）ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体のうちの少なくとも１つへ生物変換する工程を行う活性を有する有効量の細菌及び／又は酵素を用いた、出発植物材料の生体外での処理を含む、濃縮植物抽出物を形成する工程と、組成物中に濃縮植物抽出物を含ませる工程と、を含む。
【００２５】
[0032]一実施形態において、組成物は、濃縮植物抽出物に加えて、タンパク質、炭水化物、及び脂肪からなる群から選択される少なくとも１つの成分を含む。
【００２６】
[0033]一実施形態において、出発植物材料は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に加えて、１つ以上の他の化合物を含み、濃縮植物材料は、１つ以上の他の化合物に対するホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の比が、出発植物材料における比よりも高い。
【００２７】
[0034]一実施形態において、出発植物材料は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体に加えて、１つ以上の他の化合物を含み、濃縮植物材料は、１つ以上の他の化合物に対する前駆体の比が、出発植物材料における比よりも高い。
【００２８】
[0035]一実施形態において、出発植物材料は、オリーブ葉抽出物又はオリーブ油生産の廃棄物を含む。
【００２９】
[0036]一実施形態において、細菌及び／又は酵素の活性は、β−グルコシダーゼ活性又はエステラーゼ活性のうちの少なくとも１つを含み、所望により、メチルトランスフェラーゼ活性を更に含む。
【００３０】
[0037]一実施形態において、前駆体は、オレウロペイン又はその誘導体のうちの少なくとも１つを含む。
【００３１】
[0038]一実施形態において、本方法は、濃縮植物抽出物及び／又は組成物中のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の量を定量する工程を更に含む。
【００３２】
[0039]一実施形態において、細菌及び／又は酵素は、組成物を投与される個体においてメチルトランスフェラーゼによって、生体内で治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に変換される量の中間体化合物を生体外で形成するのに充分な量で細菌を含む。
【００３３】
[0040]一実施形態において、細菌及び／又は酵素は、濃縮植物抽出物中に、治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を生体外で形成するのに充分な総量で、細菌及び酵素を含む。
【００３４】
[0041]一実施形態において、細菌は、濃縮植物抽出物中に、治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を生体外で形成するのに充分な総量で、第１の酵素活性を有する第１の菌株と、第１の酵素活性と異なる第２の酵素活性を有する第２の菌株と、を含む。
【００３５】
[0042]一実施形態において、酵素は、濃縮植物抽出物中に、治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を生体外で形成するのに充分な総量で、第１の酵素活性を有する第１の酵素と、第１の酵素活性と異なる第２の酵素活性を有する第２の酵素と、を含む。
【００３６】
[0043]別の実施形態において、本開示は、（ｉ）骨又は軟骨代謝の均衡を維持又は回復すること、（ｉｉ）骨又は軟骨の健康を維持又は改善すること、（ｉｉｉ）高齢者における運動性を維持又は改善すること、（ｉｖ）滑膜炎を処置又は予防すること、及び（ｖ）これらの組み合わせからなる群から選択される効果を得る組成物の作製方法を提供する。本方法は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体を、タンパク質、炭水化物、及び脂肪からなる群から選択される少なくとも１つの成分に加える工程と、少なくとも１つの成分に、組成物を投与される個体において前駆体の少なくとも一部を有効量の（ａ）ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、並びに／又は（ｂ）メチルトランスフェラーゼに供され得る中間体化合物、に生体内で変換することができる量の酵素を加えて、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を形成する工程と、を含む。
【００３７】
[0044]一実施形態において、前駆体は、少なくとも１つの成分に加えられたオリーブ葉抽出物によって提供される。
【００３８】
[0045]一実施形態において、前駆体は、オレウロペイン又はその誘導体のうちの少なくとも１つを含む。
【００３９】
[0046]一実施形態において、本方法は、組成物中のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の量を定量する工程を更に含む。
【００４０】
[0047]別の実施形態において、本開示は、少なくとも１つのプロバイオティクス菌株を選択する方法であって、この方法は、（ａ）複数の菌株のインシリコ分析によりβ−グルコシダーゼコード遺伝子及び／又はインビトロ分析によりβ−グルコシダーゼ活性を有するプロバイオティクス菌株を同定する工程と、（ｂ）複数の菌株のインシリコ分析によりエステラーゼコード遺伝子及び／又はインビトロ分析によりエステラーゼ活性を有するプロバイオティクス菌株を同定する工程と、（ｃ）ｉ）β−グルコシダーゼ活性を有するものとして工程（ａ）において同定されたプロバイオティクス菌株、及びエステラーゼ活性を有するものとして工程（ｂ）において同定されたプロバイオティクス菌株の細菌培養物、又はｉｉ）β−グルコシダーゼ活性及びエステラーゼ活性の両方を有するものとして工程（ａ）及び（ｂ）において同定されたプロバイオティクス菌株の細菌培養物を用いて、出発量のオレウロペイン及び／又はヒドロキシチロソールを発酵させる工程と、（ｄ）工程（ｃ）における酵素又は発酵が、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を形成するかを同定する工程と、（ｅ）工程（ｃ）における発酵時間に比して残存する出発量のオレウロペイン及び／又はヒドロキシチロソールの割合を測定する工程と、（ｆ）２４時間未満の時間をかけて工程（ｃ）において出発量のオレウロペイン及び／又はヒドロキシチロソールの少なくとも１０重量％を消費し、工程（ｃ）においてホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を形成するプロバイオティクス菌株を同定する工程と、を含む、方法を提供する。
【００４１】
[0048]一実施形態において、インシリコ分析による工程（ａ）におけるプロバイオティクス菌株の同定は、プロバイオティクス菌株のゲノムを提供し、プロバイオティクス菌株のゲノム中のβ−グルコシダーゼ酵素をコーディングする遺伝子の配列類似性検索を行うことによって行われ、インシリコ分析による工程（ｂ）におけるプロバイオティクス菌株の同定は、プロバイオティクス菌株のゲノムを提供し、プロバイオティクス菌株のゲノム中のエステラーゼ酵素をコーディングする遺伝子の配列類似性検索を行うことによって行われる。
【００４２】
[0049]一実施形態において、本方法は、工程（ｆ）において同定されたプロバイオティクス菌株を食品製品に組み込むことを更に含む。工程（ｆ）において同定されたプロバイオティクス菌株を食品製品に組み込むことは、工程（ｆ）において同定されたプロバイオティクス菌株を、タンパク質、炭水化物、及び脂質からなる群から選択される少なくとも１つの食用成分に加えることを含むことができる。
【００４３】
[0050]別の実施形態において、本開示は、軟骨の損傷を処置又は予防する方法であって、（ｉ）治療若しくは予防有効量のホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体、又は（ｉｉ）ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体と、前駆体の少なくとも一部をホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体に変換することができるプロバイオティクスとの組み合わせ、のうちの少なくとも１つを、軟骨の損傷の処置を必要とする又は軟骨の損傷のリスクがある個体に経口投与する工程を含み、この組み合わせが、治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を提供する量で投与される、方法を提供する。
【００４４】
[0051]別の実施形態において、本開示は、ホモバニリルアルコール異性体を含む口腔用組成物を提供する。更に別の実施形態において、本開示は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体と、１つ以上の細菌、１つ以上の酵素、及びこれらの混合物からなる群から選択される構成成分であって、この構成成分は、グリコシダーゼ活性、エステラーゼ活性、及びメチルトランスフェラーゼ活性、好ましくは少なくともメチルトランスフェラーゼ活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を有する、構成成分と、を含む、口腔用組成物を提供する。これらの口腔用組成物は、所望により、１つ以上のオリーブポリフェノールを更に含むことができる。
【００４５】
[0052]本開示によって提供される１つ以上の実施形態の利点は、老化した、フレイル、又はプレフレイルである個体における運動性であり（例えば、このような個体は、リハビリテーションから回復中又はサルコペニアのリスクがある個体である）、特にそのような個体における骨及び関節への有益な効果が提供される。
【００４６】
[0053]本開示によって提供される１つ以上の実施形態の別の利点は、骨減少症（骨量の軽度の減少）を処置又は発生を低減すること、若年個体における骨成長を促進すること、及び／又は骨形成と骨吸収との間の比率の不均衡と関係する疾患を処置又は発生を低減することである。
【００４７】
[0054]本開示によって提供される１つ以上の実施形態の更に別の利点は、骨粗鬆症、プロテーゼ周囲の骨溶解、歯周病、骨関節炎、及び／又は骨減少症に罹患している対象において、骨形成を刺激すること又は骨吸収を阻害することである。
【００４８】
[0055]本開示によって提供される１つ以上の実施形態の更に別の利点は、骨形成及び／若しくは軟骨の同化を増強すること；軟骨の損傷を処置若しくは発生を低減すること；並びに／又は老化中の滑膜炎及び後続の関節軟骨の分解（骨関節炎）を制限することである。
【００４９】
[0056]追加の特徴及び利点は、以降の発明の詳細な説明及び図面に記載され、これらにより明らかとなろう。
[0057]
【図面の簡単な説明】
【００５０】
【図１】オレウロペインの化学構造を示す。
【図２】文献に報告されている所見に基づいて示唆される、哺乳動物及び微生物の酵素によるオレウロペインの代謝経路を示す。
【図３Ａ】本明細書にて開示された実施例１におけるオレウロペインアグリコングルクロニドの同定を示すグラフである。図３Ａは、グルクロニダーゼ及びスルファターゼで処理されていない尿試料である。
【図３Ｂ】本明細書にて開示された実施例１におけるオレウロペインアグリコングルクロニドの同定を示すグラフである。図３Ｂは、グルクロニダーゼ及びスルファターゼで処理された尿試料である。
【図３Ｃ】本明細書にて開示された実施例１におけるオレウロペインアグリコングルクロニドの同定を示すグラフである。図３Ｃは、グルクロニダーゼ及びスルファターゼで処理されていない尿試料である。
【図３Ｄ】本明細書にて開示された実施例１におけるオレウロペインアグリコングルクロニドの同定を示すグラフである。図３Ｄは、グルクロニダーゼ及びスルファターゼで処理された尿試料である。
【図４Ａ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ５５３での［Ｍ−Ｈ］−種のＣＩＤプロダクトイオンスペクトルを示すグラフである。
【図４Ｂ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ５５３での［Ｍ−Ｈ］−種のＣＩＤプロダクトイオンスペクトルを示すグラフである。
【図４Ｃ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ５５３での［Ｍ−Ｈ］−種のＣＩＤプロダクトイオンスペクトルを示すグラフである。
【図５】文献（主なフラグメントは表２において太字である）に基づく、本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ３７７での［Ｍ−Ｈ］−のプロダクトイオンスペクトル（ＲＴ＝９．５６）及びフラグメントの同一性を示す。
【図６Ａ】オレウロペインアグリコンの化学構造を示す。
【図６Ｂ】オレウロペインアグリコンのアルデヒド形態を示す。
【図７Ａ】本明細書にて開示された実施例１におけるオレウロペインアグリコン硫酸塩の同定を示す。図７Ａは、グルクロニダーゼ及びスルファターゼで処理されていない尿試料である。
【図７Ｂ】本明細書にて開示された実施例１におけるオレウロペインアグリコン硫酸塩の同定を示す。図７Ｂは、グルクロニダーゼ及びスルファターゼで処理された尿試料である。
【図７Ｃ】本明細書にて開示された実施例１におけるオレウロペインアグリコン硫酸塩の同定を示す。図７Ｃは、ｍ／ｚ４５７での［Ｍ−Ｈ］−のプロダクトイオンスペクトル（ＲＴ＝９．５２）である。
【図８Ａ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ３２９での［Ｍ−Ｈ］−のプロダクトイオンスペクトルを示す。
【図８Ｂ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ３２９での［Ｍ−Ｈ］−のプロダクトイオンスペクトルを示す。
【図８Ｃ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ３２９での［Ｍ−Ｈ］−のプロダクトイオンスペクトルを示す。
【図８Ｄ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ３２９での［Ｍ−Ｈ］−のプロダクトイオンスペクトルを示す。
【図９Ａ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ２３３での［Ｍ−Ｈ］−のプロダクトイオンスペクトルを示す。
【図９Ｂ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ２３３での［Ｍ−Ｈ］−のプロダクトイオンスペクトルを示す。
【図９Ｃ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ２３３での［Ｍ−Ｈ］−のプロダクトイオンスペクトルを示す。
【図９Ｄ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ２３３での［Ｍ−Ｈ］−のプロダクトイオンスペクトルを示す。
【図１０Ａ】本明細書にて開示された実施例１におけるＭＳ３スペクトル（４０９→２３３）を示す。
【図１０Ｂ】本明細書にて開示された実施例１におけるＭＳ３スペクトル（４０９→２３３）を示す。
【図１１】本明細書にて開示された実施例１におけるトランジション３４３→１１３でのＭＲＭによるＨＶＯＨグルクロニドの探索を示す。
【図１２Ａ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ１６７での第１の前駆［Ｍ−Ｈ］−及びｍ／ｚ１５２での第２の前駆イオンのＭＳ３分析を示す。
【図１２Ｂ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ１６７での第１の前駆［Ｍ−Ｈ］−及びｍ／ｚ１５２での第２の前駆イオンのＭＳ３分析を示す。
【図１２Ｃ】本明細書にて開示された実施例１におけるｍ／ｚ１６７での第１の前駆［Ｍ−Ｈ］−及びｍ／ｚ１５２での第２の前駆イオンのＭＳ３分析を示す。
【図１３Ａ】ホモバニリルアルコールの化学構造を示す。
【図１３Ｂ】ホモバニリルアルコールの異性体（３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノール又は３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネチルアルコール）を示す。
【図１４】ヒドロキシチロソール（ＨＴ）及びホモバニリルアルコール（ＨＶＯＨ）の酸化を示す。
【図１５】本明細書にて開示された実施例１における、基準の尿中（各被験体の左カラム、青色）及びオリーブ葉抽出物の摂取後の尿中（各被験体の右カラム、オレンジ色）における可能性のある各オレウロペイン代謝産物の量の概算を示し、縦軸はピーク下の面積であり、横軸は被験体１〜５である。
【図１６Ａ】本明細書にて開示された実施例２からコラーゲン発現データを示す。
【図１６Ｂ】本明細書にて開示された実施例２からマトリックスメタロプロテアーゼ発現データを示す。
【図１６Ｃ】本明細書にて開示された実施例２からマトリックスメタロプロテアーゼ発現データを示す。
【図１７Ａ】本明細書にて開示された実施例２から炎症関連遺伝子発現データを示す。
【図１７Ｂ】本明細書にて開示された実施例２から炎症関連遺伝子発現データを示す。
【図１８Ａ】本明細書にて開示された実施例２からコラーゲン同化及び異化データを示す。
【図１８Ｂ】本明細書にて開示された実施例２からコラーゲン同化及び異化データを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
[0076]定義
[0077]以下、いくつかの定義を示す。しかしながら定義が以下の「実施形態」の項にある場合もあり、上記の見出し「定義」は、「実施形態」の項におけるそのような開示が定義ではないことを意味するものではない。
【００５２】
[0078]本明細書に記載する全てのパーセンテージは、別途記載のない限り、組成物の総重量によるものである。本明細書で使用するとき、「約」、「およそ」、及び「実質的に」は、数値範囲内、例えば、参照数字の−１０％から＋１０％の範囲内、好ましくは−５％から＋５％の範囲内、より好ましくは、参照数字の−１％から＋１％の範囲内、最も好ましくは参照数字の−０．１％から＋０．１％の範囲内の数を指すものと理解される。
【００５３】
[0079]本明細書における全ての数値範囲は、その範囲内の全ての整数又は分数を含むと理解されるべきである。更に、これらの数値範囲は、この範囲内の任意の数又は数の部分集合を対象とする請求項を支持するために与えられていると解釈すべきである。例えば、１〜１０という開示は、１〜８、３〜７、１〜９、３．６〜４．６、３．５〜９．９などの範囲を支持するものと解釈すべきである。
【００５４】
[0080]本開示及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「１つの」（「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」）には、別段の指示がない限り、複数の参照物も含まれる。したがって、例えば、「１つの構成成分（ａ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」又は「その構成成分（ｔｈｅ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ）」についての言及は、２つ以上の構成成分を含む。
【００５５】
[0081]「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、排他的にではなく包含的に解釈されるべきである。同様にして、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」及び「又は（ｏｒ）」は全て、このような解釈が文脈から明確に妨げられない限りは包括的なものであると解釈される。しかしながら、本明細書に開示されている組成物は、本明細書において具体的に開示されていない要素を含まない場合がある。したがって、「含む／備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を用いた実施形態の開示は、特定されている構成成分「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」及び「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」実施形態の開示を含む。「本質的になる」組成物とは、参照された構成成分を少なくとも５０重量％、好ましくは参照された構成成分を少なくとも７５重量％、より好ましくは参照された構成成分を少なくとも８５重量％、最も好ましくは参照された構成成分を少なくとも９５重量％含むことをいう。本明細書で開示される任意の実施形態は、本明細書で開示される任意の他の実施形態と組み合わせることができる。
【００５６】
[0082]「Ｘ及び／又はＹ」の文脈で使用される「及び／又は」という用語は、「Ｘ」、又は「Ｙ」、あるいは「Ｘ及びＹ」と解釈されるべきである。同様に、「Ｘ又はＹのうちの少なくとも１つ」は、「Ｘ」、又は「Ｙ」、あるいは「Ｘ及びＹ」と解釈されるべきである。例えば、「ホモバニリルアルコール又は３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノールのうちの少なくとも１つ」は、「ホモバニリルアルコール」、又は「３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノール」、又は「ホモバニリルアルコール及び３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノールの両方」と解釈されるべきである。
【００５７】
[0083]本明細書において使用する場合、「例」及び「例えば〜など」という用語は、その後に用語の列挙が続くときは特に、単に例示的かつ説明的なものにすぎず、排他的又は網羅的なものとみなされるべきではない。本明細書で使用するとき、状態が別の状態と「関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）」又は「関係する（ｌｉｎｋｅｄ  ｗｉｔｈ）」とは、状態が同時に発生することを意味し、好ましくは、状態が同じ基礎状態によって引き起こされることを意味し、最も好ましくは、特定された状態のうちの１つが、他の特定された状態によって引き起こされることを意味する。
【００５８】
[0084]用語「食品」、「食品製品」、及び「食品組成物」は、ヒトなどの個体による摂取が意図され、かかる個体に対して少なくとも１種の栄養分を提供する、製品又は組成物を意味する。本明細書で使用するとき、「食品製品」は、飲料を包含する。食品製品は、典型的には、タンパク質、脂質、炭水化物のうちの少なくとも１つを含み、所望により１つ以上のビタミン及びミネラルを含む。本開示の組成物には、本願明細書に記載されている多くの実施形態が含まれ、本願明細書に開示される要素、並びに本願明細書に記載される又はその他の食餌療法において有用である何らかの追加の若しくは任意的な成分、構成成分又は要素を含む、それらからなる、又はそれらから本質的になることができる。
【００５９】
[0085]プロバイオティクスは、適切な量で投与されると、ホストに健康上のメリットを与える微生物である。
【００６０】
[0086]「被験体／対象」又は「個体」は、家畜又はコンパニオンアニマル（例えば、イヌ又はネコ）、好ましくはヒトなどの哺乳動物である。「予防」は、状態又は疾患のリスク、発生、及び／又は重症度を低減させることを含む。本明細書で使用するとき、「有効量」とは、欠乏を処置又は予防する、個体の疾患若しくは医学的状態を処置又は予防する、又はより一般的には、症状を軽減させる、疾患の進行を管理する、若しくは個体に対して栄養学的、生理学的若しくは医学的利益を提供する、量である。
【００６１】
[0087]ヒトの文脈における用語「老齢（ｅｌｄｅｒｌｙ）」は、少なくとも６０歳、好ましくは６３歳以上、より好ましくは６５歳以上、最も好ましくは７０歳以上の年齢を意味する。ヒトの文脈における用語「高齢者（ｏｌｄｅｒ  ａｄｕｌｔ）」は、少なくとも４５歳、好ましくは５０歳以上、より好ましくは５５歳以上の年齢を意味し、老齢の個体を含む。
【００６２】
[0088]サルコペニアは、加齢に伴う筋肉質量及び筋機能（筋力及び歩行速度を含む）の低下として定義される。
【００６３】
[0089]本明細書で使用するとき、「フレイル」は、複数の生理学的システムにわたる予備能及び機能における、老化に関連する減退に起因する脆弱性が高まることにより、日常的又は急性のストレッサーに対処する能力が損なわれる、臨床的に認識可能な状態として定義される。確立された定量的基準が存在しないため、フレイルは、Ｆｒｉｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｇｅｒｏｎｔｏｌｏｇｙ：ＭＥＤＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ  ２００１，Ｖｏｌ．５６Ａ，Ｎｏ．３，Ｍ１４６−Ｍ１５６）によって、エネルギー低下を示す５つの表現型基準のうち３つに合致することとして運用上定義されている：（１）筋力低下（ｗｅａｋｎｅｓｓ）（性別及び体格指数で補正して、ベースラインで集団の下位２０％の握力）、（２）持久力及びエネルギーの低下（ＶＯ２  ｍａｘと関連する自己申告による疲労）、（３）歩行速度の低下（ｓｌｏｗｎｅｓｓ）（１５フィートの歩行時間を基準とし、性別及び身長で補正して、ベースラインで集団の下位２０％）、（４）身体活動の低下（ベースラインで一週間当たりの消費キロカロリーの重みつき得点、性別ごとに特定された身体活動の五分位のうち最下位；例えば、男性については３８３ｋｃａｌ／週未満、女性については２７０ｋｃａｌ／週未満）、及び／又は意図しない体重減少（過去１年間で１０ポンド）。Ｆｒｉｅｄ  ＬＰ，Ｔａｎｇｅｎ  ＣＭ，Ｗａｌｓｔｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．，「Ｆｒａｉｌｔｙ  ｉｎ  ｏｌｄｅｒ  ａｄｕｌｔｓ：ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｏｒ  ａ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ．」Ｊ．Ｇｅｒｏｎｔｏｌ．Ａ．Ｂｉｏｌ．Ｓｃｉ．Ｍｅｄ．Ｓｃｉ．５６（３）：Ｍ１４６ーＭ１５６（２００１）。これらの基準のうちの１つ又は２つが存在するプレフレイル段階は、フレイルに進行するリスクが高いことを特定する。
【００６４】
[0090]本明細書で使用するとき、「有効量」とは、欠乏を予防する、個体の疾患若しくは医学的状態を治療する、又はより一般的には、症状を軽減させる、疾患の進行を管理する、若しくは個体に対して栄養学的、生理学的若しくは医学的利益を提供する、量である。相対的な用語「改善された（ｉｍｐｒｏｖｅｄ）」、「増加した（ｉｎｃｒｅａｓｅｄ）」、「向上した（ｅｎｈａｎｃｅｄ）」などは、本明細書にて開示された組成物の効果、すなわち、ホモバニリルアルコール又は３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノールのうちの少なくとも１つを含む組成物の、これらの化合物を含まないがそれ以外は同一である組成物と比較した効果を指す。
【００６５】
[0091]「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」及び「処置する（ｔｒｅａｔ）」という用語は、（標的とする病態又は疾患の発症を予防する及び／又は遅らせる）予防用の（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃ）又は予防的な（ｐｒｅｖｅｎｔｉｖｅ）処置の両方、及び診断された病態又は疾患を治癒させる、遅らせる、その症状を減弱する、かつ／又はその進行を止める治療手段を含む、治癒的、治療的又は疾患修飾性処置、並びに疾患にかかるリスクを有する、又は疾患にかかったと推測される患者に加えて病気である、又は疾患若しくは医学的状態に罹患していると診断された患者の処置を含む。「処置」及び「処置する」という用語は、完治するまで対象が処置されることを必ずしも意味するものではない。「処置」及び「処置する」という用語はまた、疾患に罹患してはいないが不健康な状態を発症しやすい個体の健康を維持及び／又は促進することも指す。「処置」及び「処置する」という用語はまた、１つ以上の主たる予防又は治療手段の相乗作用、又は別の増強作用を含むことも意図している。非限定的例として、処置は、患者、介護者、医師、看護師、又は別の医療専門家によって行われ得る。
【００６６】
[0092]本明細書で使用するとき、「関連する（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ）」及び「関係する（linked with）」は、同時に発生することを意味し、好ましくは、同じ基礎状態によって引き起こされることを意味し、最も好ましくは、特定された状態のうちの１つが、他の特定された状態によって引き起こされることを意味する。
【００６７】
[0093]本明細書で使用するとき、「単位剤形」という用語は、対象とするヒト及び動物の単位投与量として好適な、物理的に別個の単位を指し、各単位は、医薬的に許容される希釈剤、担体、又はビヒクルと関連して、所望の効果をもたらすのに充分な量の所定量の本明細書にて開示された組成物を含有する。単位剤形の仕様は、用いられる特定の化合物、得られる効果、及びホスト内の各化合物に関連する薬力学による。
【００６８】
[0094]「ホモバニリルアルコール」（「ＨＶＡ」又は「ＨＶＯＨ」）は、図１３Ａに示す化合物である。別法として、「ｉｓｏＨＶＡ」、「ｉｓｏＨＶＯＨ」、「３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノール」、又は「３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネチルアルコール」と呼ばれる「ホモバニリルアルコール異性体」は、図１３Ｂに示す化合物である。
【００６９】
[0095]実施形態
[0096]本開示の一態様は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を含む組成物である。一実施形態において、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の少なくとも一部は、例えば、ヒドロキシチロソールをカテコール部分（フェニル環の３−ＯＨ又は４−ＯＨ上）のメチル化に供することによって、例えば、ヒドロキシチロソールのいずれかのヒドロキシル基上のカテコール−Ｏ−メチル−トランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）によって、化学合成によって得ることができる。
【００７０】
[0097]追加的に又は代替的に、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の少なくとも一部は、抽出によって得ることができる。例えば、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の少なくとも一部は、モクセイ（Ｏｌｅａｃｅａｅ）科の植物、好ましくは、オリーブ（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）（オリーブツリー）などのモクセイ科に属する植物の茎、葉、果実、又は核のうちの１つ以上などの植物からの抽出によって得ることができる。
【００７１】
[0098]一実施形態において、組成物は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の少なくとも一部を提供する植物抽出物（例えば、モクセイ科の植物由来）を含む。このような実施形態において、植物抽出物は、好ましくは、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に富み、これにより、植物抽出物は、出発植物材料の１つ以上の他の構成成分に対するホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の比が、出発植物材料中の比よりも高い。特定の実施形態において、組成物は、任意の外因性のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を含有せず、すなわち、濃縮植物抽出物は、組成物中に、全てのホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を提供する。
【００７２】
[0099]非限定的な例として、出発植物材料は、その中のオレウロペインの少なくとも一部を、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に生物変換することを含み得る酵素処理に供され得る。得られた抽出物を組成物に使用して、組成物中に、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の少なくとも一部を提供することができる。特定の実施形態において、酵素のうちの１つ以上は、β−グルコシダーゼ活性又はエステラーゼ活性のうちの少なくとも１つ、好ましくは両方を有する。いくつかの実施形態において、酵素のうちの１つ以上は、メチルトランスフェラーゼ活性を有する。酵素は、前駆体をホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体又は中間体化合物に変換する能力を定量的に分析試験することによって同定され得る。
【００７３】
[0100]一実施形態において、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の少なくとも一部は単離され、これにより、抽出物（及び／又は総じて組成物）は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体が単離される出発植物材料の１つ以上の他の構成成分を実質的に含まない、又は完全に含まない。化合物を「実質的に含まない」抽出物は、抽出物が１．０重量％未満の化合物、好ましくは０．５重量％未満の化合物、より好ましくは０．２重量％未満、最も好ましくは０．１重量％未満を有することを意味する。同様に、化合物を「実質的に含まない」組成物は、組成物が１．０重量％未満の化合物、好ましくは０．５重量％未満の化合物、より好ましくは０．２重量％未満、最も好ましくは０．１重量％未満の化合物を有することを意味する。
【００７４】
[0101]モクセイからの植物材料中の化合物（ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体以外）の非限定的例としては、オレウロペオシド（オレウロペイン及びベルバスコシド）；フラボン（ルテオリン−７−グルコシド、アピゲニン−７−グルコシド、ジオスメチン−７−グルコシド、ルテオリン、及びジオスメチン）；フラボノール（ルチン）；フラバン−３−オール（カテキン）、及び置換フェノール（チロソール、ヒドロキシチロソール、バニリン、バニリン酸、及びコーヒー酸）が挙げられる。更に、これらの化合物に関して、組成物の一実施形態は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に富んだモクセイからの植物抽出物を含み、これにより、植物抽出物は、これらの化合物のうちの１つ以上に対するホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の比が、抽出に供された出発植物材料中の比と比較してより高い。追加的に又は代替的に、抽出物（及び／又は全体として組成物）は、これらの化合物のうちの１つ以上が低減されている又は実質的に含まない又は完全に含まなくてもよい。これらの化合物のうちの１つ以上が「低減される」とは、出発材料中よりも抽出物中の化合物の濃度が低いことを意味する。
【００７５】
[0102]本開示の別の態様は、ホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の前駆体、例えば、オレウロペイン又はヒドロキシチロソールのうちの少なくとも１つと、前駆体をホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体へ生物変換する少なくとも１つの工程を行うプロバイオティクスと、を含む組成物である。プロバイオティクスは、前駆体をホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に変換する能力を定量的に分析試験することによって、例えば、複数の菌株のインシリコ分析においてゲノムを使用してプロバイオティクス菌株を同定すること、プロバイオティクス菌株による前駆体のインビトロ生物変換（微生物による脱グリコシル化及び／又は加水分解）を評価すること、プロバイオティクス菌株がホモバニリルアルコール及び／若しくはホモバニリルアルコール異性体の生体内形成を改善するかを判定すること（所望により、担体マトリックスの効果を判定すること）、初代軟骨細胞及び骨芽細胞培養を使用してインビトロ有効性を評価すること、並びに／又は前駆体及びプロバイオティクス菌株が骨及び関節の健康転帰に及ぼす影響を調査する臨床試験を使用すること、のうちの１つ以上によって、複数のプロバイオティクス株から同定され得る。
【００７６】
[0103]特定の実施形態において、プロバイオティクス菌株（又はプロバイオティクス菌株の混合物）は、
[0104]（ａ）複数の菌株のインシリコ分析によりβ−グルコシダーゼコード遺伝子及び／又はインビトロ分析によりβ−グルコシダーゼ活性を有するプロバイオティクス菌株を同定する工程と、
[0105]（ｂ）複数の菌株のインシリコ分析によりエステラーゼコード遺伝子及び／又はインビトロ分析によりエステラーゼ活性を有するプロバイオティクス菌株を同定する工程と、
[0106]（ｃ）ｉ）β−グルコシダーゼ活性を有するものとして工程（ａ）において同定されたプロバイオティクス菌株、及びエステラーゼ活性を有するものとして工程（ｂ）において同定されたプロバイオティクス菌株の細菌培養物、又はｉｉ）β−グルコシダーゼ活性及びエステラーゼ活性の両方を有するものとして工程（ａ）及び（ｂ）において同定されたプロバイオティクス菌株の細菌培養物を用いて、前駆体（例えば、オレウロペイン又はヒドロキシチロソール）を発酵させる工程と、
[0107]（ｄ）工程（ｃ）の発酵中に形成された代謝産物が、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を含むかを同定する工程と、
[0108]（ｅ）工程（ｃ）における発酵時間に比して残存するオレウロペインの割合を測定する工程と、
[0109]（ｆ）プロバイオティクス菌株又はプロバイオティクス菌株混合物を選択する工程であって、プロバイオティクス菌株又はプロバイオティクス菌株混合物は、２４未満の時間をかけて工程（ｃ）において少なくとも１０重量％のオレウロペインを消費し、工程（ｃ）の発酵中に形成された代謝産物は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を含む、選択する工程と、を含む方法によって同定される。
【００７７】
[0110]いくつかの実施形態において、プロバイオティクスは、前駆体から中間体代謝産物を形成する第１のプロバイオティクスと、中間体からホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を形成する第２のプロバイオティクスと、を含む。
【００７８】
[0111]一実施形態において、前駆体及びプロバイオティクスは、同時投与、例えば、別々の組成物で連続的に投与され得る。用語「連続的に」は、前駆体がプロバイオティクスなしで第１の時間に投与され、プロバイオティクスが前駆体なしで第１の時間に続く第２の時間に投与されるように、前駆体及びプロバイオティクスが逐次的に投与されることを意味する。連続投与間の時間は、例えば、同じ日に１秒若しくは数秒、数分、若しくは数時間；同じ月に１日若しくは数日、若しくは数週間；又は同じ年に１か月若しくは数か月であってもよい。連続投与の順序は逆であってもよい。
【００７９】
[0112]更にこの点に関して、前駆体並びにプロバイオティクス及び／又は酵素の「同時投与」は、プロバイオティクスが前駆体を消費した及び／又は前駆体を消費する個体に投与されることを意味し、必ずしも同じ組成物で同時に投与されるという意味ではない。同じ組成物での併用投与が実際には好ましいが、本開示はこの実施形態に限定されない。例えば、「同時投与」はまた、同じ日内、好ましくは同じ時間内の投与も包含する。前駆体及びプロバイオティクスが同じ組成物中に含まれる場合、保存時の前駆体の発酵を予防するために、前駆体はプロバイオティクスから分離され得る。例えば、プロバイオティクスは、前駆体とは別に封入されてもよい。好ましくは、プロバイオティクスは、投与後、例えば、個体の消化管内で前駆体とのみ反応する。
【００８０】
[0113]一部の個体は、前駆体をホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体に変換する活性を既に有するプロバイオティクスを含有する細菌叢を有することができる。したがって、場合によっては、組成物の投与は、細菌をより多く提供することによって、これらのプロバイオティクスの治療効果及び／又は予防効果を高める。
【００８１】
[0114]本開示の別の態様は、治療又は予防有効量の本明細書にて開示された組成物のうちの１つ以上を個体に投与する方法である。例えば、１回以上の投与量の組成物（例えば、１つ以上の単位剤形）を投与して、治療又は予防有効量のホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を個体に提供することができる。
【００８２】
[0115]このような方法の非限定的例としては、骨形成を刺激すること及び／又は骨吸収を予防することにより、骨代謝の均衡を維持又は回復する方法、軟骨の損傷を阻害又は減少させることにより軟骨の同化を刺激することによって、軟骨代謝回転に関係する疾患を処置又は予防する方法、骨疾患（例えば、骨粗鬆症などの、骨形成：骨吸収の比率の不均衡に関連する疾患）を予防若しくは処置する、又は骨の健康を維持するための方法、若年個体の成長期間中に骨形成及び／又は軟骨の同化を刺激する方法、最大骨量を増加させるために、成体における（例えば、閉経期前後の女性、健康な成体、健康な老体、及び骨関節炎前の成体における）骨形成及び／又は軟骨の同化を刺激する方法、老化で生じる骨喪失（骨減少症）を処置又は予防する方法、骨折から生じた骨欠乏症を処置する方法、並びに滑膜炎（例えば、狼瘡、痛風、又は関節リウマチ、骨関節炎、骨軟骨炎、及び変形性関節症のうちの１つ以上などの関節炎に関連する滑膜炎）を処置又は予防する方法が挙げられる。
【００８３】
[0116]いくつかの実施形態において、組成物は、例えば、関節機能（例えば、骨機能及び／又は軟骨機能）を維持又は改善することによって、高齢者における運動障害を処置又は予防するために投与される。高齢者は、フレイル、プレフレイル、サルコペニア、サルコペニアから回復中である、骨粗鬆症、骨関節炎、栄養不良、栄養不良のリスクがある、リハビリテーションを受けている、（例えば、来年中に、好ましくは６か月以内に、より好ましくは来月中に）リハビリテーションを受ける予定である、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される状態を有し得る。
【００８４】
[0117]組成物を投与される個体は、疾患又は状態のリスクがある場合があり、その場合、組成物の有効量は、予防有効投与量であり、又は個体は、疾患又は状態を有する場合があり、その場合、組成物の有効量は、治療有効量である。いくつかの実施形態において、本方法は、投与前に、状態を有するものとして又は状態のリスクがあるものとして個体を識別することを含む。
【００８５】
[0118]一実施形態において、組成物は、少なくとも１カ月、好ましくは少なくとも２カ月、より好ましくは少なくとも３、４、５又は６カ月、最も好ましくは少なくとも１年の期間にわたって個体に投与される。この期間中に、組成物は、少なくとも１週間に１日、好ましくは１週間に少なくとも２日、より好ましくは１週間に少なくとも３、４、５又は６日、最も好ましくは、１週間に７日、個体に投与できる。組成物は、１日１回投与することも、１日に複数の個別用量で投与することもできる。
【００８６】
[0119]いくつかの実施形態において、組成物は、米国特許出願公開第２０１６／００４５５１９号、同第２０１６／０１２０８９１号、及び同第２０１６／０２６３１３９号に開示される方法のうちの１つに使用され、これらの全体が参考として本明細書に組み込まれている。
【００８７】
[0120]組成物の有効量は、具体的な組成物、患者の年齢及び状態、並びに処置される具体的な疾患又は疾病によって変化する。しかしながら、一般的な実施形態において、組成物は、１日当たり０．０１ｍｇ〜２ｇのホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体、好ましくは１日当たり０．１ｍｇ〜１ｇのホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体、より好ましくは１日当たり１ｍｇ〜２００ｍｇのホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を提供する量で、個体に投与されてもよい。
【００８８】
[0121]本開示の別の態様は、（ｉ）骨又は軟骨代謝の均衡を維持又は回復すること、（ｉｉ）骨又は軟骨の健康を維持又は改善すること、（ｉｉｉ）高齢者における運動性を維持又は改善すること、（ｉｖ）滑膜炎を処置又は予防すること、及び（ｖ）これらの組み合わせからなる群から選択される効果を得る組成物の作製方法である。組成物及び方法は、追加的に又は代替的に、骨及び／又は軟骨疾患を予防、緩和、及び／又は処置することができる。組成物は、好ましくは食品製品である。
【００８９】
[0122]一実施形態において、本方法は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を、タンパク質、炭水化物、脂質、及びこれらの混合物からなる群から選択される成分に加えることを含む。追加的に又は代替的に、本方法は、タンパク質、炭水化物、脂質、及びこれらの混合物からなる群から選択される成分に、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体の前駆体（例えば、オレウロペイン及びヒドロキシチロソール）と、前駆体の生物変換の少なくとも１つの工程が可能なプロバイオティクスとの組み合わせを加えることを含んでもよい。
【００９０】
[0123]一実施形態において、本方法は、組成物の１つ以上の成分（例えば、モクセイの抽出物）を、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体中の１つ以上の成分を濃縮する酵素に供することを含む。この酵素処理は、１つ以上の成分を組成物の他の成分に加える前及び／又は後に行われ得る。
【００９１】
[0124]組成物（例えば、食品製品）は、投与前に作製され得（例えば、組成物は、作製され、パッケージ化され、次いで、組成物を自分自身若しくは別の個体に投与する消費者によって購入される）、又は投与と実質的に同時に作製され得る（組成物は、組成物を自分自身若しくは別の個体に投与する個体によって、投与前３０分未満、好ましくは投与前１５分未満、より好ましくは投与前１０分未満、最も好ましくは投与前５分未満に作製される）。
【００９２】
[0125]組成物は、ホモバニリルアルコール及び／又はホモバニリルアルコール異性体を、有効量で含むことができる。追加的に又は代替的に、組成物は、前駆体と、プロバイオティクスとの組み合わせを、有効量で含むことができる。例えば、組成物の１回分の供給又は投与には有効量を含むことができ、パッケージは１回分以上の供給又は投与量を含むことができる。
【００９３】
[0126]組成物は、酸味料、増粘剤、ｐＨ調整用緩衝剤又は試剤、キレート剤、着色剤、乳化剤、賦形剤、香料、ミネラル、浸透剤、医薬的に許容される担体、防腐剤、安定剤、糖、甘味料、調質剤、ビタミン、ミネラル、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される食品添加物を含むことができる。
【００９４】
[0127]組成物は、骨質のための追加の成分、例えば、タンパク質、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＫ２、カルシウム、リン、マグネシウム、亜鉛、ヘスペリジン（フラバノン）、又はこれらの組み合わせを含むことができる。組成物は、関節の質のための追加成分を含むことができ、この関節の質のための追加成分は、短期的な関節の質のための少なくとも１つの成分、例えば、グルコサミン（例えば、グルコサミン硫酸塩）、コンドロイチン（例えば、コンドロイチン硫酸塩）、ヒアルロン酸（例えば、ヒアルロン酸が豊富な雄鶏のとさかの抽出物）、若しくはこれらの組み合わせ（好ましくは少なくともヒアルロン酸）、及び／又は長期的な関節の質のための少なくとも１つの成分、例えば、ビタミンＣ、別のポリフェノール（例えば、クルクミン、ケルセチン、及び／又はルチン）、オメガ−３脂肪酸、若しくはこれらの組み合わせを含む。関節の質のための他の好適な追加成分の非限定的例としては、コラーゲン、加水分解コラーゲン、ボスウェリア・セラータ（Ｂｏｓｗｅｌｌｉａ  ｓｅｒｒａｔａ）、ローズヒップ、及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【００９５】
[0128]タンパク質は、ホエイ、例えば、天然ホエイ、インタクトの非加水分解ホエイ、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、酸ホエイ、スイートホエイ、変性スイートホエイ（カゼイノグリコマクロペプチドを除去したスイートホエイ）、ホエイタンパク質の画分、又はホエイタンパク質加水分解物；カゼイン；大豆タンパク質などの野菜のタンパク質；及びこれらの組み合わせであり得る。カゼインは、遊離形態で、又は塩、例えば、ナトリウム塩、カルシウム塩又はカリウム塩の形態で、提供されてもよい。タンパク質は、植物性タンパク質を含んでよいが、一部の実施形態において、組成物はグルテンフリーである。
【００９６】
[0129]タンパク質は、酸又は酵素で処理した動物性及び植物性タンパク質から調製された、高度に加水分解されたタンパク質加水分解物、例えば、カゼイン加水分解物、ホエイ加水分解物、カゼイン／ホエイ加水分解物、大豆加水分解物、及びこれらの混合物であってもよい。「高度に加水分解された」タンパク質加水分解物とは、未変性のタンパク質が、ペプチド断片の大部分が１，０００ダルトン未満の分子量を有する、好ましくはペプチド断片の少なくとも約７５％、最も好ましくは少なくとも約９５％が約１，０００ダルトン未満の分子量を有する、ペプチド断片に加水分解されていることを意味する。遊離アミノ酸及び合成短鎖ペプチドを、タンパク質加水分解物の代用としても、タンパク質加水分解物に添加してもよい。
【００９７】
[0130]一実施形態において、タンパク質は、米国特許出願公開第２００９／００３５４３７号及びその対応する欧州特許第１８３９４９２（Ａ１）号に記載されているような、並びにＣ．Ｓｃｈｍｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．のＳｏｆｔ  Ｍａｔｔｅｒ  ６：４８７６−４８８４（２０１０）（ここでは、ホエイタンパク質ミクロゲル（ＷＰＭ）と呼称される）で更に特徴付けされているようなホエイタンパク質ミセルを含む。特に、「ホエイタンパク質ミセル」は、米国特許出願公開第２００９／００３５４３７号及びその対応出願である欧州特許第１８３９４９２（Ａ１）号に開示されているプロセスによって得られたホエイタンパク質ミセル濃縮物中に含まれるミセルである。この開示において、ホエイタンパク質ミセル濃縮物の製造プロセスは、ａ）ホエイタンパク質水溶液のｐＨを３．０〜８．０の値に調整する工程と、ｂ）水溶液を８０〜９８℃の温度にかける工程と、ｃ）工程ｂ）で得られた分散液を濃縮する工程と、を含む。この工程によって、調製されたミセルは非常に狭域のサイズ分布を有し、調製されたミセルの８０％超が直径１μｍ未満のサイズを有し、好ましくは１００ｎｍ〜９００ｎｍのサイズである。ホエイタンパク質ミセルは液体濃縮物又は粉末形態とすることもできる。重要なことに、液体濃縮物形態、粉末形態、又は粉末から例えば水で再構成した場合のいずれであっても、ホエイタンパク質の基本的なミセル構造は維持される。ホエイタンパク質ミセルは、粉末として分散液中で物理的に安定であり、更に噴霧乾燥中又は凍結乾燥中でも物理的に安定である。
【００９８】
[0131]好適な炭水化物の非限定的例としては、デンプン、スクロース、ラクトース、グルコース、フルクトース、コーンシロップ固体、マルトデキストリン、変性デンプン、アミロースデンプン、タピオカデンプン、トウモロコシデンプン、キシリトール、ソルビトール、又はこれらの組み合わせが挙げられる。好適な脂質の非限定的例としては、植物性脂肪（例えば、オリーブ油、コーン油、ヒマワリ油、高オレイン酸ヒマワリ油、菜種油、キャノーラ油、ヘーゼルナッツ油、大豆油、パーム油、ココナッツ油、カシス種子油、ルリヂサ油、レシチンなど）、動物性脂肪（乳脂肪など）、又はこれらの組み合わせが挙げられる。脂肪源はまた、これらの脂肪の精製度の低い種類（例えば、ポリフェノール含有物としてオリーブ油）であってもよい。
【００９９】
[0132]組成物は、例えば、健康飲料として、既製の飲料として、所望により、ジュース、ミルクシェイク、ヨーグルト飲料、スムージー、又は大豆ベースの飲料を含むソフト飲料として、任意の経口栄養形態であることができ；フードバーであることができ；又は焼成製品、シリアルバー、乳製品バー、スナック食品、スープ、朝食シリアル、ミューズリ、キャンディ、タブ、クッキー、ビスケット、クラッカー（ライスクラッカーなど）、及び乳製品などの任意の種類の食品中に分散され得る。
【０１００】
[0133]組成物は、例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ、又は液体の形態であってもよい。組成物は、保護ハイドロコロイド（ガム、タンパク質、加工デンプンなど）、結合剤、被膜形成剤、カプセル化剤／材、壁／殻材、マトリックス化合物、コーティング、乳化剤、界面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ワックス、レシチンなど）、吸着剤、担体、充填剤、共化合物、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動剤、矯味剤、増量剤、ゼリー化剤及びゲル形成剤を更に含有してもよい。
【０１０１】
[0134]実施例
[0135]以下の非限定的例は、本明細書にて開示された化合物、組成物、及び方法を支持する実験データを提示する。
【０１０２】
[0136]実施例１：尿中のオレウロペイン代謝産物ヒドロキシチロソール、ホモバニリルアルコール、及び新たに同定されたホモバニリルアルコールの異性体の定量のためＬＣ−ＭＳ法の検証
[0137]概説
[0138]オレウロペイン（ＯＥ）は、オリーブツリー（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ）の主要なフェノール化合物であり、未加工のオリーブ果実及び葉中に多量に存在する。オリーブ葉抽出物の摂取後の、尿中のその代謝産物の同定によって、その代謝を調査した。ＬＣ−ＭＳ方法を開発し、ヒドロキシチロソール、ホモバニリルアルコール、及びホモバニリルアルコール異性体３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノール（別名として３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネチルアルコールと呼称される）の定量について完全に検証した。３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノールは、初めて同定された。
【０１０３】
[0139]具体的には、尿試料を酵素処理してグルクロニド及び硫酸塩部分を加水分解し、定量される遊離形態を放出させた。液液抽出による試料精製後、クロマトグラフィー分離をＡｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（１．７μｍ、２．１×１５０ｍｍ）で動作させた。移動相は、０．２５ｍＬ／分の流速での勾配条件下で、１ｍｍｏｌ／Ｌの酢酸アンモニウム緩衝液及びメタノールで構成した。ヒドロキシチロソール、ホモバニリルアルコール、及びホモバニリルアルコール異性体３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノール（別名として３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネチルアルコールと呼称される）を同定し、高速液体クロマトグラフィーエレクトロスプレーイオン化タンデム型質量分析法（ＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）によって、及び対応する化学的に合成された標準物質と比較することによって定量した。
【０１０４】
[0140]結果は以下のとおりであった。オリーブ葉抽出物の摂取後に尿中に排泄された主なオレウロペイン代謝産物は、ヒドロキシチロソール、ホモバニリルアルコール、及びホモバニリルアルコール異性体として同定された。ホモバニリルアルコール異性体がオレウロペイン代謝産物として報告されるのはこれが初めてである。これらの化合物はまた、ヒドロキシチロソールの場合と同様に、グルクロニド若しくは硫酸塩部分、又は両方との抱合体として検出された。いくつかのオレウロペインアグリコン（ａｌｇｙｃｏｎｅｓ）も硫酸塩又はグルクロニドと抱合していることが見出された。親化合物のオレウロペインも代謝産物のエレノール酸も遊離形態又は抱合形態で検出することができなかった。
【０１０５】
[0141]方法の性能は、線形性、検出限界、定量限界、精度、信頼度、及び不確実性の判定によって評価した。
【０１０６】
[0142]結論として、ＬＣ−ＭＳ法を、ヒドロキシチロソール、ホモバニリルアルコール、及びホモバニリルアルコール異性体の同時定量のために開発及び検証した。
【０１０７】
[0143]イントロダクション
[0144]軽度から中程度の膝の不快感及び可動性の懸念を有する５５歳以上の健康な消費者における、関節機能の改善及び軟骨の損傷の制限に対する、オリーブ葉抽出物の有効可能性について試験した。
【０１０８】
[0145]オレウロペイン（ＯＥ）は、オリーブツリー（Ｏｌｅａ  ｅｕｒｏｐａｅａ  Ｌ．）の主要なフェノール化合物であり、この試験で使用されるオリーブ葉抽出物の約４０％に相当し、ＯＥは、この抽出物の主要活性化合物であると仮定される。オリーブ葉抽出物の摂取による健康効果の測定と並行して、活性化合物の生物学的利用能を証明する有益なデータを裏付けるために、オレウロペインの吸収を追跡した。この分析を達成するために、分析方法が必要であった。
【０１０９】
[0146]オレウロペインなどの化合物の吸収を追跡する理想的な状況は、摂取後の様々な時点で、摂取された化合物及びその代謝産物の血漿循環濃度を測定することである。しかしながら、オリーブ葉抽出物の摂取後の様々な時点で血液試料を採取し、試験に参加する全ての被験体に関して、このような動態を取得することは技術的に実現可能ではなかった。代替法では、誤った時点を選択したり、吸収のピークを逃すリスクがあるが、摂取後に血液試料を１回だけ採取し、個体内の吸収の変動性を知ることができた。これらの理由から、ＯＥ吸収の後に、一晩の間に回収された尿試料をプールし、試料中に排出された親化合物及び／又はその代謝産物の測定を行った。
【０１１０】
[0147]生体液（血漿又は尿）中のフェノール化合物及びそれらの代謝産物の循環濃度及び吸収動態は、化合物が摂取されるマトリックス、摂取される投与量、試料採取の時点、各個体の微生物叢、及び各個体の代謝による。ＯＥ吸収の測定に最も適切な分析手法を開発するために、パイロット試験を実施した。具体的には、５名の被験体から、ベースライン（オリーブ葉抽出物の摂取前）、及びオリーブ葉抽出物の２つのカプセルの摂取の間に尿を採取した。
【０１１１】
[0148]このパイロット試験により、以下を可能にした。
[0149]（１）試料採取、例えば、ビン詰め、保存、及び安定性の技術的実現可能性の試験。
[0150]（２）オリーブ葉抽出物の摂取後の尿ＯＥ代謝産物の同定、及び最も代表的なＯＥ代謝産物の選択。
[0151]（３）分析方法、例えば、試料調製、検出、及びクロマトグラフィー分離の開発。
[0152]（４）方法の検証中に標的とする濃度範囲を決定。
【０１１２】
[0153]材料及び方法
[0154]分析方法（試料調製、脱抱合条件、クロマトグラフィー検出及び分離）は、市販の尿に化学標準をスパイクすることによって最初に開発した。脱抱合条件は、利用可能な抱合体であるヒドロキシチロソール硫酸塩及びホモバニリルアルコールグルクロニドを使用することによって決定した。市販の化学標準は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸；３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸；ホモバニリン酸；ホモバニリルアルコール；ホモバニリルアルコールグルクロニド（バニリルメタノールグルクロニド）；ヒドロキシチロソール；ヒドロキシチロソール硫酸塩（ヒドロキシチロソール硫酸トリエチルアンモニウム塩）；及びバニリン酸とした。
【０１１３】
[0155]簡潔に述べると、試料調製は、酸性化メタノールを使用したタンパク質沈殿後の酢酸エチルを用いた液液抽出で構成した。
【０１１４】
[0156]クロマトグラフィー分析に関して、Ｃ１８−カラムＡｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ  ＢＥＨ  Ｃ１８  １．７μｍ，２．１ｍｍ×１５０ｍｍ（Ｗａｔｅｒｓ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を使用する逆相超高性能液体クロマトグラフィーによって、オレウロペイン代謝産物を分離した。システムは、エレクトロスプレーイオン化源を備えたＱｔｒａｐ  ５５００質量分析計検出器（ＡＢＳｃｉｅｘ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）と連結された、ＬＣシステムＡｃｑｕｉｔｙ（商標）ＵＰＬＣ（登録商標）（Ｗａｔｅｒｓ  ＡＧ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）で構成した。単位分解能でのネガティブ動作モードで検出を行った。
【０１１５】
[0157]オレウロペイン代謝産物抱合体（硫酸塩及びグルクロニド）の分析では、移動相に酸を使用する必要があった。溶媒Ａは、０．１％ギ酸水溶液で構成し、一方、溶媒Ｂはメタノールとした。しかしながら、未抱合形態の検出は、ヒドロキシチロソール用の溶媒Ａには０．１％酢酸水溶液を用い、ホモバニリルアルコール用の溶媒ＡにはｐＨ５．１の１ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸アンモニウム緩衝液を用いるとより良好であった。
【０１１６】
[0158]結果
[0159]尿中のオレウロペイン代謝産物の検出のための手法は、ＯＥ生物学的利用能の文献レビューに基づくものとした。図１に示すように、ＯＥ構造は、ヒドロキシチロソール（Ａ）、エレノール酸（Ｂ）、及びグルコース（Ｃ）に対応する３つの単位に細分化することができる。
【０１１７】
[0160]そのサイズにより、ＯＥは、緊密な接合部を通じた受動的な傍細胞拡散によって腸障壁を横断することができない。その極性及び糖部分の存在により、ＯＥは、経細胞拡散によって障壁を横断することができず、これまで文献に報告されていない能動輸送を必要とするであろう。他のポリフェノールについて示されるように、吸収前の分子の脱グリコシルは、その透過に必要なものであると思われる。ほとんどの場合、アグリコン（脱グリコシルされた）として吸収されたときに、身体に生体異物とみなされると、ＯＥは、哺乳動物細胞（主に腸及び肝臓）により、硫酸塩、グルクロニド、又はメチル基と抱合することで、より極性になり、尿を通して排出される。実際に、ＯＥアグリコンのグルクロニド、硫酸塩、及びメチル抱合体は、文献（Ｇａｒｃｉａ−Ｖｉｌｌａｌｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ（２０１４）５３：１０１５−１０２７）に報告されている。
【０１１８】
[0161]腸の上部での吸収が少ないため、ＯＥは結腸に到達し、微生物叢によって分解される。この微生物による代謝は、オレウロペインアグリコン、並びにヒドロキシチロソール、エレノール酸、及びグルコースの産生につながる。次いで、産生されたフェノール化合物は、吸収され、硫酸塩、グルクロニド、又はメチル基と抱合される場合もされない場合もある。吸収前に、それらはまた、酸化反応によって微生物叢によってより小さい化合物へと更に代謝される場合があり、代謝産物は、吸収後に、硫酸塩、グルクロニド、又はメチル基と抱合し得る。
【０１１９】
[0162]図２は、文献に報告されている所見に基づいて示唆される、哺乳動物及び微生物の酵素によるオレウロペインの代謝経路を示す。尿試料において可能性のあるオレウロペイン代謝産物の検出及び同定は、この示唆される代謝経路に基づくものであった。
【０１２０】
[0163]具体的には、オリーブ葉抽出物の摂取後に採取された尿試料の予備分析を、ネガティブイオンモードでのエレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ）によって行い、予想されるオレウロペイン代謝産物及び抱合体の理論上のｍ／ｚでの様々な［Ｍ−Ｈ］−イオンをスキャンした（表１）。
【０１２１】
【表１】
2021502336.tif 000003
【０１２２】
[0164]イオンの検出をもとに、それらの同一性は以下によって確認した。
[0165]脱抱合酵素の使用（スルファターゼとグルクロニダーゼとの組み合わせによる試料の処理）後の、可能性のあるグルクロニド形態又は硫酸塩形態の消失
[0166]オリーブ葉抽出物の摂取前に採取された尿試料と比較したオリーブ葉抽出物の摂取後の具体的な存在
[0167]酵素処理後の対応する未抱合の親化合物の濃度の増加
[0168]ＭＳ２又はＭＳ３フラグメント化及び検出された化合物の同定
[0169]プロダクトイオンスキャンと、対応する化学標準（市販されている場合）について得られたものとの比較
【０１２３】
[0170]親化合物としてのオレウロペイン（ＯＥ）は、存在しないため、又は検出限界下の量で存在するため、尿中で検出されなかった。
【０１２４】
[0171]エレノール酸硫酸塩のイオンも、エレノール酸グルクロニドのイオンもいずれも（ＥＡ−Ｓ又はＥＡ−Ｇ）検出することができなかった。ｍ／ｚ２４１での［Ｍ−Ｈ］−イオンを探索したときにいくつかのピークが検出されたが、それらのピークは、ＥＡであると確認することができなかった。
【０１２５】
[0172]図３Ａに示すように、オレウロペインアグリコングルクロニド（ＯＥＡ−Ｇ）を探索すると、ｍ／ｚ５３３でいくつかの［Ｍ−Ｈ］−イオンが検出された。試料を脱抱合酵素（グルクロニダーゼ及びスルファターゼ）で処理したとき、これらのピークのうちの２つ（ＲＴ＝８．７６及び８．９８分）は消失した（図３Ｂ）。
【０１２６】
[0173]同時に、ｍ／ｚ３７７での［Ｍ−Ｈ］−イオン（ＯＥＡ）を探索することにより、２つのピークが出現した。ＭＳ２分析により、ＲＴ＝８．７６及び８．９８分でのピーク（図４Ａ〜図４Ｃ）がＯＥＡグルクロニドであることを確認した。実際に、ｍ／ｚ５５３での［Ｍ−Ｈ］−種のＣＩＤプロダクトイオンスペクトルは、両方のピークについて、以下でフラグメントを示した。
【０１２７】
[0174]ｍ／ｚ３７７：アグリコン部分（ＯＥＡ）による電荷保持力があるＯＥＡ−Ｇからのグリコシド結合の開裂に起因する、無水グルクロン酸に対応する１７６ａｍｕのニュートラルロス
[0175]ｍ／ｚ２４１：エレノール酸の［Ｍ−Ｈ］−イオン
[0176]ｍ／ｚ１５３：ヒドロキシチロソールの［Ｍ−Ｈ］−イオン
[0177]ｍ／ｚ１６５：エレノール酸フラグメントとして報告された（Ｄｉｅｒｋｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）
[0178]ｍ／ｚ１９７：［ＯＥＡ−Ｈ−Ｃ９Ｈ８Ｏ４］−（Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【０１２８】
[0179]ｍ／ｚ３７７でのスキャンによりＯＥＡを探索すると、２つの［Ｍ−Ｈ］−イオンが検出され、オリーブ葉抽出物の摂取後に採取された試料を脱抱合酵素で処理したときに（図３Ｄ）、脱抱合前の同じ試料と比較して（図３Ｃ）、対応するクロマトグラムピークが大きくなった、又は現れた（被験体による）。ＯＥＡの同一性は、ＭＳ２によってＲＴ＝９．５６分でのピークについて確認することができた。図５及び表２は、ＲＴ＝９．５６分であるｍ／ｚ３７７での［Ｍ−Ｈ］−イオンのＣＩＤプロダクトイオンスペクトルを示し、これは、ＯＥＡについて文献で報告されているｍ／ｚでのフラグメントイオンを呈した。これらのデータは、ＲＴ＝９．５６分でのピークがオレウロペインアグリコンであることを示唆している。強力で充分なプロダクトイオンスペクトルを得て、化合物を確実に同定するには、ＲＴ＝７．０６分でのピークは小さすぎた。
【０１２９】
[0180]ｍ／ｚ３７７でのイオンについて得られた両ピーク（ＲＴ＝９．５６分でＯＥＡとして確認済、及びＲＴ＝７．０６分でＯＥＡとして充分には確認されていない）はまた、パイロット試験に含まれた被験体５名中３名の基準試料中にも存在した。オレウロペインアグリコンは、これらの被験体によるオリーブ油又はオリーブの消費に由来する可能性がある（Ｄｉ  Ｍａｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １３８（２０１３）１３８１−１３９１）。実際に、油を調製するためのオリーブの成熟又は加工中、ＯＥは加水分解され、ＯＥＡが生成される（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｒａｐｉｄ  Ｃｏｍｍｕｎ．Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍ．２００９；２３：５１−５９）。そのデカルボキシメチル化形態（３，４−ＤＨＰＥＡ−ＥＤＡ）と共に、３，４−ジヒドロキシフェニルエタノール−エレノール酸（３，４−ＤＨＰＥＡ）とも呼称されるＯＥＡは、オリーブ油の最も豊富な化合物のうちの１つである。ｍ／ｚ３７７での２つのアニオンは、オレウロペインアグリコン（図６Ａ）及びそのアルデヒド形態（図６Ｂ）に対応し得るものであり、これらは、異なる立体異性体として存在することが報告されている（Ｐｅｒｅｚ−Ｔｒｕｊｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１０）。しかしながら、ＲＴ＝７．０６分でのピークの同一性を確認するために、更なる分析が必要とされるだろう。
【０１３０】
【表２】
2021502336.tif 000004
【０１３１】
[0181]可能性のあるオレウロペイン硫酸塩（ＯＥ−Ｓ）を探索すると、ｍ／ｚ４５７において２つのイオンが検出され（図７Ａ）、試料が酵素処理されたときに消失する２つの近接ピーク（図７Ｂ）が検出された。ｍ／ｚ４５７での［Ｍ−Ｈ］−のＣＩＤプロダクトイオンスペクトル（図７Ｃ）は、ＯＥＡに特異的であると文献で報告されているフラグメントイオンを呈した：ｍ／ｚ１２０．８、ｍ／ｚ１５３．３、ｍ／ｚ１６４．９、及びｍ／ｚ１９７．１（上述のとおり）。ｍ／ｚ２１６．９でのフラグメントイオンは、オリーブ油ＯＥＡの様々な異性体についてＦｕ  ｅｔ  ａｌ．（Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．２００９）によって報告されている。
【０１３２】
[0182]ヒドロキシチロソールグルクロニド（ＨＴ−Ｇ）を探索すると、ｍ／ｚ３２９において３つのイオン（ＲＴ＝２．０５、２．２７、及び２．４６分、図８Ａ〜図８Ｄ）が検出された。これらは酵素処理後に消失し、抱合化合物に対応することを示唆している。ＲＴ＝２．２７及び２．４６分のｍ／ｚ３２９におけるイオンのＣＩＤプロダクトイオンスペクトルは、ｍ／ｚ１５３（ヒドロキシチロソールイオン）及び１２３（１５３からの３０ａｍｕの損失に由来し、ヒドロキシチロソールからのＣＨ２ＯＨの損失に対応する）におけるフラグメントを呈した。ＲＴ＝２．０５分におけるピークは、ｍ／ｚ１５３でプロダクトイオンをもたらしたが、またｍ／ｚ１３５及び１３８．２でもフラグメントイオンをもたらし、これらは、ＨＴから得られるものとして同定され得なかった。これらの所見は、少なくとも２つの形態のＨＴグルクロニドが存在することを強く示唆している（ＲＴ＝２．２７及び２．４６分）。これらの２つの化合物は、３−ＯＨ又は４−ＯＨ上のいずれかに結合したグルクロニドとの抱合ヒドロキシチロソールの異性体に対応し得た。ＲＴ＝２．０５分での化合物の同一性を明らかにするために、より多くの作業が必要となるだろう。
【０１３３】
[0183]ヒドロキシチロソール硫酸塩（ＨＴ−Ｓ）を探索すると、ｍ／ｚ２３３において３つのイオン（図９Ａ〜図９Ｄ）がまた検出され、これらは、酵素処理により消失した。ｍ／ｚ２３３での［Ｍ−Ｈ］−種のＣＩＤプロダクトイオンスペクトルは、ＲＴ＝２．８４分でのピークのみがＨＴを表すフラグメントを呈した（ｍ／ｚ１５３及び１２３）ことを示した。ＲＴ＝２．７４分で検出されたイオンは、ｍ／ｚ１５３、また１０９でもフラグメントイオンをもたらした。ＨＴは、３，４−ジヒドロキシ安息香酸（３，４−ＤＨＢＡ）と同じ質量を有するように見え、３，４−ＤＨＢＡのプロダクトイオンスペクトルの第２のフラグメントは、ｍ／ｚ１０９を有する。これらの結果は、ＲＴ＝２．７４分でのピークが３，４−ジヒドロキシ安息香酸硫酸塩（３，４−ＤＨＢＡ−Ｓ）であることを示唆している。ｍ／ｚ２３３で見いだされた第３のイオン（ＲＴ＝２．５０分）は、ｍ／ｚ３２９での［Ｍ−Ｈ］−のプロダクトイオン分析の場合と同様に、ｍ／ｚ１５３におけるプロダクトイオンフラグメント及び同じ未同定のフラグメントをもたらし、これは、ｍ／ｚ１３５及び１３８．２を意味する。これは、同じ化合物に対応するに違いないが、硫酸化されている。ｍ／ｚ１３５及び１３８．２でフラグメントイオンをもたらすこの化合物を同定するためには、さらなる調査が必要とされるだろう。
【０１３４】
[0184]文献（Ｇａｒｃｉａ−Ｖｉｌｌａｌｂａ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ（２０１４）５３：１０１５−１０２７）に報告されているように、ＨＴについて可能性のあるスルホ−グルクロニド抱合体（ｍ／ｚ４０９での［Ｍ−Ｈ］−）の存在を調査した。この質量対電荷比について１つのピークが検出され、ＭＳ３によって、ＨＴのスルホ−グルクロニド抱合体との同一性が確認された（図１０Ａ及び図１０Ｂ）。実際に、ｍ／ｚ４０９での第１の前駆体イオン及びｍ／ｚ２３３での第２の前駆イオンのプロダクトイオンを探索することにより、ヒドロキシチロソールに特有のｍ／ｚ１２３及び１５３でのプロダクトイオンが得られた。
【０１３５】
[0185]また、ヒドロキシチロソールは、オリーブ葉抽出物の消費前を意味する基準試料においても検出された。３，４−ジヒドロキシフェニルエタノール（ＤＯＰＥＴ）とも呼称されるヒドロキシチロソールは、神経伝達物質ドーパミンの代謝産物であり、体内に少量でもともと存在する。
【０１３６】
[0186]多重反応モニタリング（ＭＲＭ）（ＨＶＯＨ−Ｇについて３４３→１１３、ＨＶＯＨ−Ｓについて２４７→１６７、及びＨＶＯＨについて１６７→１５２）によってピークを探索すると、いくつかのピークが検出されたため、ホモバニリルアルコール（ＨＶＯＨ）並びにそのグルクロニド及び硫酸塩抱合体（ＨＶＯＨ−Ｇ及びＨＶＯＨ−Ｓ）の検出及び同定は困難であった。これは、尿中に排泄された他の分子が、ＨＶＯＨと同様のフラグメント化のパターンを有していたことを意味した。
【０１３７】
[0187]ＨＶＯＨ−Ｇを探索すると、トランジション３４３→１１３でＭＲＭによって検出されたピークのうちの１つのみ（ＲＴ＝３．３４分、図１１）を、市販の対応する化学標準と比較することにより、ＨＶＯＨグルクロニドとして明確に同定することができた。トランジション２４７→１６７について得られたピークに関しては、ＭＳ３でさえも、ＨＶＯＨ−Ｓの明確な同定は不可能であった。
【０１３８】
[0188]前述のように、トランジション１６７→１５２でＭＲＭによっていくつかのピークが検出された。ＭＳ３フラグメント化により、２つのピークが化学標準ＨＶＯＨと同じＣＩＤプロダクトイオンスペクトルを有し（図１２Ａ〜図１２Ｃ）、ｍ／ｚ１２１及び１２２でのフラグメントイオンを呈したことを確認した。ＲＴ＝６．４４分でのピークは、３−ＯＨ上にメチルを有するＨＶＯＨである（化学標準と比較することにより）。ＲＴ＝６．９９分でのピークは、４−ＯＨ上にメチル基を表示することができるＨＶＯＨの異性体として暫定的に同定される（図１３Ａ及び図１３Ｂ）。これは、市販されていない化学標準の使用によって確認する必要があるだろう。
【０１３９】
[0189]オリーブ葉抽出物の摂取後の試料及び基準試料中で、ＨＴ、ＨＶＯＨなどを検出した。ＨＶＯＨは、アルコール消費に反応して産生された内因性ヒドロキシチロソール又はヒドロキシチロソールのメチル化の生成物であり得、基準試料中のその存在を説明する。理論的には、カテコール部分（フェニル環の３−ＯＨ又は４−ＯＨ上）のメチル化は、ヒドロキシチロソールのヒドロキシル基のいずれかに対しカテコール−Ｏ−メチル−トランスフェラーゼ（ＣＯＭＴ）によって行われ得る。したがって、両方の形態が体内に存在し得る。しかしながら、ＣＯＭＴは、他のヒドロキシルよりも１つのヒドロキシルを好む場合があり（Ｔｈａｋｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｖｏｌ．２６１，Ｎｏ．１２，Ｉｓｓｕｅ  ｏｆ  Ａｐｒｉｌ  ２５，ｐｐ  ５４０４４４１３  １９８６）、異性体のうちの１つが他の異性体よりも豊富であり得ることを示唆している。
【０１４０】
[0190]他のフェノール化合物は、ヒドロキシチロソールの代謝産物として記載されており、またＯＥの代謝産物であり得た。実際に、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸（ＤＨＰＡ）及びホモバニリン（ＨＶＡ）酸は、生理食塩水溶液に溶解したＨＴを摂取した被験体の尿中、及びＨＴの経口投与又は静脈内投与後のラットの尿中で検出されている。ＤＨＰＡ及びＨＶＡは、ＨＴ及びＨＶＯＨそれぞれの酸化から生じており（図１４）、哺乳動物及び／又は微生物酵素の反応に由来するものであるならば、酸化は依然として明らかにされていない。これまでのところ、ＨＴの代謝産物としては報告されていないものの、プロトカテク酸とも呼称される３，４−ジヒドロキシ安息香酸（３，４−ＤＨＢＡ）は酸化によるＤＨＰＡの代謝産物であり得、そのため、ＨＴの間接的代謝産物であり得た。バニリン酸（ＶＡ）は、ＨＶＡの酸化生成物であり得（図１４）、そのためＨＴの間接的代謝産物であり得た。
【０１４１】
[0191]ＤＨＰＡ、ＨＶＡ、３，４−ＤＨＢＡ、及びＶＡは、市販されている。それらの検出を促進するために、尿試料を酵素処理して、これらのフェノール化合物の未抱合形態を放出した。これらは全て、オリーブ葉抽出物の摂取後及び基準試料中で検出されたが、試料中のそれらの量の評価は、これらの存在が成分摂取又は別の食品源から生じたのかを明らかにするために必要であった。
【０１４２】
[0192]同定された代謝産物の相対量を最初に評価して、これらの尿中への排出がオリーブ葉抽出物の摂取後に増加したかどうかを明らかにした。この評価は、量を反映する、対応するクロマトグラフィーピーク下の面積の測定に基づくものであった。図１５は、３，４−ジヒドロキシ安息香酸、３，４−ジヒドロキシフェニル酢酸、及びホモバニリン酸が、オリーブ葉抽出物の摂取後の全ての被験体の尿試料において増加しているわけではないことを示す。バニリン酸の量は、被験体２及び４の尿中では強く増加するが、被験体１、３及び５においてはそれほど増加していない。バニリン酸は、オリーブ葉中で検出されており（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）、着香料として広く使用されているため、オリーブ葉抽出物の摂取に特異的ではない可能性がある。ヒドロキシチロソール及びホモバニリルアルコールは、いくつかの被験体の基準試料中に存在しているものの、オリーブ葉抽出物の摂取後に特に増加する２つの代謝産物である。ＨＴ及びＨＶＯＨは、オリーブ葉抽出物からのＯＥの摂取を追跡するのに最良の代謝産物であると思われる。また、ＨＶＯＨの暫定的に同定された異性体は、オリーブ葉抽出物（図示せず）の摂取に応答すると思われる。
【０１４３】
[0193]尿試料中のＨＴ及びＨＶＯＨ量を予め概算し、方法検証中の濃度の範囲をより良好に対象とするために、外部較正曲線（溶媒中の標準曲線）を使用して、ＨＴ及びＨＶＯＨを定量した。
【０１４４】
【表３】
2021502336.tif 000005
【０１４５】
【表４】
2021502336.tif 000006
【０１４６】
【表５】
2021502336.tif 000007
【０１４７】
【表６】
2021502336.tif 000008
【０１４８】
[0194]結果は、ＨＴ（表３）は、ＨＶＯＨ（表４）よりも多量に尿中に排泄されたことを示す。オリーブ葉抽出物の摂取及びＯＥの代謝から生じるＨＴ及びＨＶＯＨは、主に抱合形態として尿中に排泄される。しかしながら、両方の化合物の遊離形態もまた、オリーブ葉抽出物の摂取から生じる。
【０１４９】
[0195]ＨＶＯＨの暫定的に同定された異性体の濃度を、ＨＶＯＨの化学標準を使用して推定した。ＨＶＯＨとは対照的に、ＨＶＯＨの異性体は基準試料には存在せず、オリーブ葉抽出物の摂取に特異的である。
【０１５０】
[0196]ＯＥＡの絶対定量を可能にする化学標準は市販されていないが、クロマトグラフィーピーク下の面積の測定により、依然として試料の比較は可能である。ＯＥＡ（２×１０６）のクロマトグラフィピーク下の面積の平均は、ＨＴ（７．７×１０６）で得られたものの範囲内である。これは、ＯＥＡの量が無視できないこと、及びその尿分泌を追跡するべきであることを強く示唆している。
[0197]結論
【０１５１】
【表７】
2021502336.tif 000009
【０１５２】
[0198]表７は、所見を要約するものである。検出及び同定された様々な化合物の中で、ヒドロキシチロソール、ホモバニリルアルコール、及びオレウロペインアグリコンの３つは、オリーブ葉抽出物の摂取を表すことが示唆される。また、ホモバニリルアルコールの異性体も同定した。このパイロット試験はまた、アグリコンの化学標準をスパイクした市販の尿試料を使用して事前に開発したクロマトグラフ条件も改善した。
【０１５３】
[0199]ホモバニリルアルコールは文献に報告されているが、オレウロペイン又はヒドロキシチロソールの摂取後に必ず検出されているわけではない。ホモバニリルアルコールは、主に、ＧＣ−ＭＳを使用したときに報告されていることから、この結果は、使用される方法の感度によるものと考えられる。我々の知見に関し、同定された当該ホモバニリルアルコールの異性体の報告はこれが初めてである。
【０１５４】
[0200]実施例２：軟骨細胞データ
[0201]アルギネートビーズ中の軟骨細胞を、２時間のポリフェノール前処理に供し、続いて２４時間のＩＬ１−α刺激に供した。結果を図１６Ａ〜図１６Ｃに示す。これらの図は、オレウロペイン代謝産物は、炎症誘発性の異化作用から保護することを示す。
【０１５５】
[0202]図１６Ａに関して、コラーゲン−ＩＩは、関節の細胞外マトリックスの主要な構造構成要素の同化関連遺伝子である。この遺伝子に関するデータによると、１０μＭのポリフェノールで保護的な効果の傾向が示された。ホモバニリルアルコールの異性体、すなわち、３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノール（又は別法として３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネチルアルコールと呼称される）は、有意な効果を有した（「ｉｓｏＨＶＯＨ」）。
【０１５６】
[0203]図１６Ｂ及び図１６Ｃに関しては、マトリックスメタロプロテアーゼ（例えば、ＭＭＰ−３及びＭＭＰ−１３）は、コラーゲン分解及び関節炎症に関与する。ヒドロキシチロソールを除いて、１０μＭで試験した全てのポリフェノールで保護効果が見出された。
【０１５７】
[0204]次いで、軟骨細胞中のオレウロペイン代謝産物の抗炎症効果を研究した。結果を図１７Ａ及び図１７Ｂに示す。
【０１５８】
[0205]図１７Ａに関して、一酸化窒素シンターゼ（ｉＮＯＳ）の誘導性アイソフォームは、ＮＯ生成に関係する炎症関連遺伝子である。この遺伝子に関し、データは、１０μＭでのポリフェノールの保護効果の傾向を示した。ホモバニリルアルコールの異性体、すなわち、３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネタノール（又は別法として３−ヒドロキシ−４−メトキシフェネチルアルコールと呼称される）は、２μＭ及び１０μＭの両方で有意な効果を有した（「ｉｓｏＨＶＯＨ」）。
【０１５９】
[0206]図１７Ｂに関して、シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）は、別の炎症関連遺伝子である。プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）経路に関係する。ＯＬＰ、ＥＡ、及びＨＶＯＨは、２μＭで効率的であった。ＯＬＰ、ＯＥＡ、及びＨＶＯＨは、１０μＭで効率的であった。
【０１６０】
[0207]次に、オレウロペイン代謝産物が炎症を起こした軟骨細胞におけるコラーゲンの分解を防止することが示された（図１８Ａ及び図１８Ｂ）。この点に関して、細胞外マトリックス中のコラーゲンは、細胞によって合成された（すなわち、同化）コラーゲンに相当する。図１８Ａは、ＯＥＡ及びＨＴの保護効果を示す。培地中のコラーゲンは、細胞によって分解され、培地中に放出された（すなわち、異化）コラーゲンに相当する。図１８Ｂは、ＥＡ、ＨＶＯＨ、及びｉｓｏＨＶＯＨによる強力な抗分解効果（対照よりも改善）を示す。
【０１６１】
[0208]本明細書に記載されている、本発明の好ましい実施形態に対する様々な変更及び改変が、当業者には明らかであることを理解されたい。かかる変更及び改変は、本発明の主題の趣旨及び範囲から逸脱することなく、かつ意図される利点を損なわずに、行うことができる。したがって、かかる変更及び改変は、添付の特許請求の範囲に包含されることが意図されている。
【図１】
2021502336.tif 000010
【図２】
2021502336.tif 000011
【図３Ａ】
2021502336.tif 000012
【図３Ｂ】
2021502336.tif 000013
【図３Ｃ】
2021502336.tif 000014
【図３Ｄ】
2021502336.tif 000015
【図４Ａ】
2021502336.tif 000016
【図４Ｂ】
2021502336.tif 000017
【図４Ｃ】
2021502336.tif 000018
【図５】
2021502336.tif 000019
【図６Ａ】
2021502336.tif 000020
【図６Ｂ】
2021502336.tif 000021
【図７Ａ】
2021502336.tif 000022
【図７Ｂ】
2021502336.tif 000023
【図７Ｃ】
2021502336.tif 000024
【図８Ａ】
2021502336.tif 000025
【図８Ｂ】
2021502336.tif 000026
【図８Ｃ】
2021502336.tif 000027
【図８Ｄ】
2021502336.tif 000028
【図９Ａ】
2021502336.tif 000029
【図９Ｂ】
2021502336.tif 000030
【図９Ｃ】
2021502336.tif 000031
【図９Ｄ】
2021502336.tif 000032
【図１０Ａ】
2021502336.tif 000033
【図１０Ｂ】
2021502336.tif 000034
【図１１】
2021502336.tif 000035
【図１２Ａ】
2021502336.tif 000036
【図１２Ｂ】
2021502336.tif 000037
【図１２Ｃ】
2021502336.tif 000038
【図１３Ａ】
2021502336.tif 000039
【図１３Ｂ】
2021502336.tif 000040
【図１４】
2021502336.tif 000041
【図１５】
2021502336.tif 000042
【図１６Ａ】
2021502336.tif 000043
【図１６Ｂ】
2021502336.tif 000044
【図１６Ｃ】
2021502336.tif 000045
【図１７Ａ】
2021502336.tif 000046
【図１７Ｂ】
2021502336.tif 000047
【図１８Ａ】
2021502336.tif 000048
【図１８Ｂ】
2021502336.tif 000049
【国際調査報告】
2021502336.tif 000050
2021502336.tif 000051
2021502336.tif 000052
2021502336.tif 000053
2021502336.tif 000054
2021502336.tif 000055
2021502336.tif 000056
2021502336.tif 000057