(57)【要約】  本発明は、液体サンプル中の標的ペプチドを検出するためのラテラルフローアッセイ装置であって、（ａ）固体支持体、（ｂ）前記固体支持体の第１の端部でサンプルを最初に受容し、任意に前処理するためのサンプルパッド、（ｃ）前記固体支持体の第２の端部の吸収パッド、（ｄ）乾燥状態で粒子と前記標的ペプチドとの可動性コンジュゲートを含むコンジュゲートパッドであって、前記粒子にコンジュゲートされた標的ペプチドはビオチン化され、該粒子はその表面にビオチン結合タンパク質を含み、（ｅ）以下を含む標的ペプチド反応膜、（ｉ）前記標的ペプチドに対する固定化された第１の捕捉試薬を含む捕捉領域、および（ｉｉ）任意に、粒子対照コンジュゲートに対する固定化された第２の補足試薬を含む対照領域を含み、前記サンプルパッド、コンジュゲートパッド、反応膜および吸収パッドは前記固体支持体に取り付けられて、前記サンプルパッドから前記コンジュゲートパッドを介した前記反応膜への毛細管流動を可能にし、前記標的ペプチドによる粒子の充填は、前記粒子の最大充填容量の約２０％〜約５５％である、前記ラテラルフローアッセイ装置に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
液体サンプル中の標的ペプチドを検出するためのラテラルフローアッセイ装置であって、
（ａ）固体支持体、
（ｂ）前記固体支持体の第１の端部でサンプルを最初に受容し、任意に前処理するためのサンプルパッド、
（ｃ）前記固体支持体の第２の端部の吸収パッド、
（ｄ）乾燥状態で粒子と前記標的ペプチドとの可動性コンジュゲートを含むコンジュゲートパッドであって、前記粒子にコンジュゲートされた標的ペプチドはビオチン化され、該粒子はその表面にビオチン結合タンパク質を含み、
（ｅ）以下を含む標的ペプチド反応膜
（ｉ）前記標的ペプチドに対する固定化された第１の捕捉試薬を含む捕捉領域、および
（ｉｉ）任意に、粒子対照コンジュゲートに対する固定化された第２の捕捉試薬を含む対照領域
を含み、
前記サンプルパッド、コンジュゲートパッド、反応膜および吸収パッドは前記固体支持体に取り付けられて、前記サンプルパッドから前記コンジュゲートパッドを介した前記反応膜への毛細管流動を可能にし、
前記標的ペプチドによる粒子の充填は、前記粒子の最大充填容量の約２０％〜約５５％である、前記ラテラルフローアッセイ装置。
【請求項２】
前記装置がストリップ装置、特に免疫クロマトグラフィーストリップ装置である、請求項１に記載のラテラルフローアッセイ装置。
【請求項３】
前記粒子が、金コロイドナノ粒子、着色ラテックスビーズ、磁性粒子、カーボンナノ粒子、セレンナノ粒子、銀ナノ粒子および量子ドットからなる群から選択される、請求項１または２に記載のラテラルフローアッセイ装置。
【請求項４】
前記粒子が金コロイドナノ粒子である、請求項３に記載のラテラルフローアッセイ装置。
【請求項５】
前記粒子が実質的に球形であり、直径が１０〜１００ｎｍ、有利には２０〜６０ｎｍ、最も有利には４０ｎｍである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイ装置。
【請求項６】
前記ビオチン結合タンパク質が、アビジン、ストレプトアビジンおよび脱グリコシル化アビジンからなる群から選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイ装置。
【請求項７】
前記脱グリコシル化アビジンがニュートラアビジンである、請求項６に記載のラテラルフローアッセイ装置。
【請求項８】
前記標的ペプチドによる前記粒子の充填が、前記粒子の最大充填容量の約２０％〜約３５％である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイ装置。
【請求項９】
前記粒子がその表面上にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイ装置。
【請求項１０】
前記液体サンプルが、尿、血漿血清、全血、汗および唾液からなる群から選択される体液であり、典型的には尿である、請求項１〜９のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイ装置。
【請求項１１】
前記標的ペプチドがＣ末端架橋テロペプチドＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ−ＩＩ）である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイ装置。
【請求項１２】
液体サンプル中の標的ペプチドの検出、有利には定量的検出のための方法であって、
（ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の装置のサンプルパッドに前記液体サンプルを適用して、前記サンプルパッドからコンジュゲートパッドを介して反応膜へのサンプルの流れを可能にする工程、
（ｂ）捕捉領域においてコンジュゲートの存在または量を検出する工程、および
（ｃ）任意に、対照領域において対照コンジュゲートの存在または量を検出する工程
を含み、
前記捕捉領域におけるコンジュゲートの存在もしくは不存在または検出量は、それぞれ前記液体サンプル中の標的ペプチドの不存在もしくは存在または量を示す、前記方法。
【請求項１３】
液体サンプル中の標的ペプチドの定量化のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の装置の使用。
【請求項１４】
疾患または健康状態の診断または予後診断のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の装置の使用。
【請求項１５】
対象、典型的には変形性関節症を有する対象における軟骨劣化を判断するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の装置の使用。
【請求項１６】
疾患または健康状態を診断または予後診断する方法であって、
（ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載の装置のサンプルパッドに液体サンプルまたは希釈液体サンプルを適用して、前記サンプルパッドからコンジュゲートパッドを介して反応膜へのサンプルの流れを可能にする工程、
（ｂ）捕捉領域においてコンジュゲートの存在または量を検出する工程、および
（ｃ）任意に、対照領域において対照コンジュゲートの存在または量を検出する工程
を含み、
前記捕捉領域におけるコンジュゲートの存在もしくは不存在または検出量は、それぞれ前記液体サンプル中の標的ペプチドの不存在もしくは存在または量を示し、
前記液体サンプル中の標的ペプチドの不存在もしくは存在または量を、前記疾患または健康状態の診断または予後診断の指標とする、前記方法。
【請求項１７】
前記疾患が変形性関節症であり、前記標的ペプチドがＣＴＸ−ＩＩである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
追加の工程、
（ｄ）所定の閾値を超えるＣＴＸ−ＩＩの存在がサンプル中に検出された場合、またはサンプル中のＣＴＸ−ＩＩの量が前記サンプルにおける所定の閾値を超える場合、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容可能な塩もしくは誘導体、例えばヒランＧ−Ｆ２０を含む関節内補充薬を前記対象に処方する工程
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
追加の工程、
（ｄ）所定の閾値を超えるＣＴＸ−ＩＩの存在がサンプル中に検出された場合、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容可能な塩もしくは誘導体、例えばヒランＧ−Ｆ２０を含む関節内補充薬を前記対象に投与する工程
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
対象における変形性関節症等の軟骨疾患に関連する疼痛の治療における使用のための、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容可能な塩もしくは誘導体、例えばヒランＧ−Ｆ２０を含む関節内補充薬であって、前記対象の尿サンプル中のＣＴＸ−ＩＩの濃度が請求項１〜１１のいずれか一項に記載のラテラルフローアッセイ装置を使用して測定され、前記尿サンプル中のＣＴＸ−ＩＩの濃度に応じて、関節内補充薬が前記対象に投与される、前記関節内補充薬。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、診断方法および装置の分野に関し、特にラテラルフロー免疫アッセイに関する。
【背景技術】
【０００２】
ラテラルフローアッセイ（ＬＦＡ）は、ユーザーフレンドリーで、比較的安価で高速な診断アッセイの特定の形式である。それらは、例えば、診療現場での診断において使用することができ、生物学的サンプル、環境サンプルまたは食品サンプル中のポリペプチドおよび核酸等の分析物の定性的または定量的検出を提供する。
【０００３】
ラテラルフローアッセイは、血液や尿等のサンプルの成分が毛細管力によって反応膜に輸送されるクロマトグラフィーシステムで構成されている。免疫化学反応（すなわち、抗体−抗原）は、しばしば検出に使用される。サンプルは毛細管力によって膜を横切って移動する。標準的なラテラルフローアッセイには、少なくとも次の４つの部分を有する：サンプルパッド、すなわち液体サンプルが適用される領域；捕捉試薬（例えば、抗体）と組み合わせた標識タグを含むコンジュゲートパッド；標的抗原−抗体相互作用のための試験ラインおよび対照ラインを含む反応膜（通常はニトロセルロース膜）；および残存するサンプルを保存する吸収パッド（総説として、Bahadir ＆ Sezginturk, Trends in Analytical Chemistry (2016) 82, 286-306; Sajid et al., J. Saudi Chem. Soc. (2015) 19, 689-705; Koczula & Gallotta, Essays in Biochemistry (2016) 60, 111-120を参照されたい）。
【０００４】
ＬＦＡの典型的な構成としては、検出される分析物に対する２つの異なる抗体を利用するサンドイッチ免疫アッセイと、サンプル内の標識化されていない分析物分子と競合する標識化された分析物分子を含む競合免疫アッセイが挙げられる。この目的で使用される標的としては、金またはカーボンナノ粒子等のナノ粒子およびラテックスビーズが挙げられる。
【０００５】
ラテラルフローアッセイは、細菌抗原（例えば、ＷＯ２０１４／０５９２７４Ａ１、ＷＯ９９／０５５２４Ａ１を参照された）、および心臓トロポニンＩ、ミオグロビン等のタンパク質バイオマーカー（例えば、Zhu et al., Clinical Chemistry (2011) 57:12, 1732-1738を参照されたい）、およびコラーゲンテロペプチド（例えば、Lee et al., Sensors (2013) 13, 165-174を参照されたい）。
【０００６】
コラーゲンのＮ末端およびＣ末端テロペプチド（それぞれＮＴＸおよびＣＴＸ）は、骨代謝回転のマーカーである（Lee et al., loc. cit.））。コラーゲンタイプＩＩのヒトＣ末端架橋テロペプチドであるＣＴＸ−ＩＩは、例えば、変形性関節症（ＯＡ）および関節リウマチ（ＲＡ）等の関節疾患における軟骨劣化のマーカーであることが知られている（Christgau et al., Bone (2001) 29(3):209-15； Garnero et al., Ann. Rheum. Dis. (2001) 60:619-626；Mouritzen et al., Ann. Rheum. Dis. (2003) 62:332-336）。
【０００７】
ＣＴＸ−ＩＩを検出するための免疫アッセイは市販されており、例えば、ＬｉｆｅＳｐａｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社（シアトル、ワシントン州、米国）からの競合ＥＩＡおよびサンドイッチＥＬＩＳＡキットが挙げられる。
【０００８】
しかしながら、利用可能なアッセイは感度が比較的低いか、かつ／または診療現場（ＰＯＣ）で使用することができない。
【発明の概要】
【０００９】
本発明によれば、高感度、高ダイナミックレンジで、患者が来院する診療所等の診療現場において使用することができるラテラルフロー免疫アッセイの方法および装置が提供される。これは、検査が医療研究所に限定され、検体を診療現場から送り出し、結果を得るために数時間または数日待つ必要があり、その間、必要な情報がない状態で診療を継続しなければならないか、または結果が得られるまで診療が中断される当技術分野において利用可能な方法とは対照的である。
【００１０】
特に、本発明は、液体サンプル中の標的ペプチドを検出するためのラテラルフローアッセイ装置であって：
（ａ）固体支持体、
（ｂ）前記固体支持体の第１の端部でサンプルを最初に受容し、任意に前処理するためのサンプルパッド、
（ｃ）前記固体支持体の第２の端部の吸収パッド、
（ｄ）乾燥状態で粒子と前記標的ペプチドとの可動性コンジュゲートを含むコンジュゲートパッドであって、前記粒子にコンジュゲートされた標的ペプチドがビオチン化され、該粒子がその表面にビオチン結合タンパク質を含むコンジュゲートパッド、
（ｅ）以下を含む標的ペプチド反応膜
（ｉ）前記標的ペプチドに対する固定化された第１の捕捉試薬を含む捕捉領域、および
（ｉｉ）任意に、対照コンジュゲートに対する固定化された第２の捕捉試薬を含む対照領域
を含み、
前記サンプルパッド、コンジュゲートパッド、反応膜および吸収パッドが前記固体支持体に取り付けられて、前記サンプルパッドから前記コンジュゲートパッドを介した前記反応膜への毛細管流動を可能にする前記装置に関する。
【００１１】
本明細書において有利なことに、前記標的ペプチドによる粒子の充填は、前記粒子の最大充填容量の約２０％〜約５５％である。
【００１２】
本発明の装置は、免疫アッセイにおいて使用するための免疫クロマトグラフィー装置であり、有利にはストリップ形式である。本発明の装置は、特に、液体サンプル中の標的ペプチドの定量的検出に使用することができる。
【００１３】
本発明によれば、さらに、液体サンプル中の標的ペプチドの検出、特に定量的検出のための方法であって、
（ａ）本発明の装置のサンプルパッドに前記液体サンプルを適用して、前記サンプルパッドからコンジュゲートパッドを介して反応膜へのサンプルの流れを可能にする工程、
（ｂ）捕捉領域においてコンジュゲートの存在または量を検出する工程、および
（ｃ）任意に、対照領域において対照コンジュゲートの存在または量を検出する工程
を含み、
前記捕捉領域におけるコンジュゲートの存在もしくは不存在または検出量が、それぞれ前記液体サンプル中の標的ペプチドの不存在もしくは存在または量を示す前記方法に関する。
【００１４】
具体的な態様において、本発明の装置および方法は、ＣＴＸ−ＩＩの検出に使用される。本発明の装置および方法は、診断および予後診断の方法、ならびに対象を層別化するための方法および／または治療モニタリング中に使用することができる。ＣＴＸ−ＩＩの検出の場合、本発明の装置および方法は、例えば、変形性関節症の患者を診断または予後診断するために使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、本発明のラテラルフロー免疫アッセイの例示的な構成を示す。１：サンプル；１０：固体支持体；１１：サンプルパッド；１２：コンジュゲートパッド；１３：吸収パッド；２０：反応膜；２１：試験ライン；２２：対照ライン。
【図２】図２は、本発明の競合ＬＦＡの例示的かつ典型的な構成および経過を示す。Ａ：試験開始前；Ｂ：陰性試験；Ｃ：陽性試験；１：サンプル；１２：コンジュゲートパッド；２１：試験ライン；２２：対照ライン。
【図３】図３は、ＣＴＸ−ＩＩが５０％充填されている本発明のコンジュゲートを示す。
【図４】図４は、粒子における異なる充填率（１０％、３０％、５０％、１００％）のＣＴＸ−ＩＩにおける試験ラインの強度、およびサンプル中の異なる濃度のＣＴＸ−ＩＩにおける試験ラインの強度を示す。
【図５】図５は、サンプル中の異なるＣＴＸ−ＩＩ濃度、およびコンジュゲートの異なるＣＴＸ−ＩＩ充填率（対数目盛）についての単位の強度（リーダーによって読み取られたもの）を示す。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
本発明は、液体サンプル、特に尿または血液等の生物学的サンプル中のペプチド分析物（オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質）を検出するためのラテラルフローアッセイ装置、特にストリップ形式のラテラルフローアッセイ装置に関する。前記アッセイは、標的ペプチドにコンジュゲートした検出可能な粒子を使用する競合免疫アッセイである。前記コンジュゲートにおいて、標的ペプチドはビオチン化され、粒子はその表面にビオチン結合タンパク質を含み、その結果、標的ペプチドのビオチン部分がビオチンとビオチン結合タンパク質との相互作用を介して粒子に結合される。好適な粒子としては、例えば、金ナノ粒子が挙げられ、好適なビオチン結合タンパク質としては、ニュートラアビジン、ストレプトアビジンおよびアビジンが挙げられる。
【００１７】
本発明は、液体サンプル中の標的ペプチドを検出するためのラテラルフローアッセイ装置であって、
（ａ）固体支持体、
（ｂ）前記固体支持体の第１の端部でサンプルを最初に受容し、任意に前処理するためのサンプルパッド、
（ｃ）前記固体支持体の第２の端部の吸収パッド、
（ｄ）乾燥状態で粒子と前記標的ペプチドとの可動性コンジュゲートを含むコンジュゲートパッドであって、前記粒子にコンジュゲートされた標的ペプチドがビオチン化され、該粒子がその表面にビオチン結合タンパク質を含むコンジュゲートパッド、
（ｅ）以下を含む標的ペプチド反応膜
（ｉ）前記標的ペプチドに対する固定化された第１の捕捉試薬を含む捕捉領域、および
（ｉｉ）任意に、対照コンジュゲートに対する固定化された第２の捕捉試薬を含む対照領域
を含み、
前記サンプルパッド、コンジュゲートパッド、反応膜および吸収パッドが前記固体支持体に取り付けられて、前記サンプルパッドから前記コンジュゲートパッドを介した前記反応膜への毛細管流動を可能にする前記装置に関する。
【００１８】
本発明の装置において、標的ペプチドによる粒子の充填は、有利には、粒子の最大充填容量の約２０％〜約５５％である。
【００１９】
本発明の装置は、免疫アッセイにおいて使用するための装置であり、有利にはストリップ形式である。特に、本発明の装置は、液体サンプル中の標的ペプチドの定量的検出に使用することができる。試験領域および対照領域（存在する場合）は、通常、ラインの形態をとる。したがって、本明細書では、それらはそれぞれ「試験ライン」および「対照ライン」と呼ばれることもある。
【００２０】
「対照コンジュゲート」は、例えば、金ナノ粒子等の粒子と、対照領域に結合する対照ペプチドとのコンジュゲートであり得る。対照ペプチドは、有利には、粒子に非共有結合（「コンジュゲート」）され得る。対照領域は、捕捉試薬、例えば、前記対照ペプチドに対する抗体またはその抗原結合断片、または前記対照ペプチドに結合することができる結合タンパク質を含む。本明細書において、有利には、対照ペプチドはビオチン化対照ペプチドであり、対照領域はニュートラアビジン等のビオチン結合タンパク質を含む。例示的な対照ペプチドは、有利にビオチン化されるウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である。対照ペプチドは、検出されるサンプル中に通常は存在しないことが有利である。対照コンジュゲート（存在する場合）は、標的ペプチドのコンジュゲート（「標的コンジュゲート」または「標的ペプチドコンジュゲート」）としてコンジュゲートパッド上に存在する。標的ペプチドコンジュゲートおよび対照ペプチドコンジュゲートは、例えば、装置のコンジュゲートパッドに添加する前に混合することができる。したがって、特定の対照コンジュゲートは、金コロイドナノ粒子等のナノ粒子およびＢＳＡ等のビオチン化対照ペプチドを含む。
【００２１】
本発明の文脈において「ペプチド」は、ペプチド（アミド）結合によって連結されたアミノ酸モノマーの鎖である。本明細書において「ペプチド」という用語は、オリゴペプチド、ポリペプチドおよびタンパク質を包含する。
【００２２】
本発明の文脈において「オリゴペプチド」は、アミド結合によって一緒に保持された典型的には２〜９個のアミノ酸残基の単一の（典型的には）直鎖である。本発明の文脈において「ポリペプチド」は、アミド結合によって一緒に保持された、多くの（典型的には１０以上、特に１０〜約１００）アミノ酸残基の単一の（典型的には）直鎖である。また、タンパク質は、本発明の意味においてペプチドである。それらは通常少なくとも５０アミノ酸の長さであり、複数のポリペプチド鎖を含み得る。ほとんどの場合、ペプチドは上述したように直鎖状であるが、場合によっては分岐または架橋することもある。そのようなペプチドもまた、本発明の文脈において「ペプチド」という用語に包含される。
【００２３】
ラテラルフローアッセイ装置の典型的な構成を図１に示す。装置は、サンプルパッド（１１）、コンジュゲートパッド（１２）、吸収パッド（１３）および反応膜（２０）が取り付けられている固体支持体を備える。固体支持体（「バッキングカード（backing card）」）は、実際のアッセイのパッドおよび膜を支持するが、それ以外の場合は、サンプルと分析物との反応または流れには関与しない。バッキングカードは、例えばポリ塩化ビニル（ＰＶＣ）で構成される。バッキングカード上のパッドおよび膜のアセンブリは、必須ではないが、通常はプラスチック製のハウジング内にある。ハウジングは、通常、サンプルを適用するためにサンプルパッド上に少なくとも１つの開口部（「サンプルポート」）を備える。対照ラインおよび試験ラインを可視化（例えば、開口部または窓を介して）して、結合された標識を検出または測定する。ハウジングは、使用者がサンプルパッド以外の場所にサンプルを適用するのを防ぐ。ハウジングはまた、膜への不注意な飛沫からストリップを保護するのに役立つ。ハウジングの外部ラベルを使用して、試験ラインおよび対照ラインの位置を示し、その他の情報を提供することもできる。ハウジングは、既製のカセットとして入手することもでき、ストリップの周りに合うようにカスタム設計することもできる。これらの選択肢を決定するには、ユニットコスト、設計コスト、ストリップとのサイズの互換性、および外部ラベルの要求のバランスを取る必要がある。内部のピンおよびバーを使用して、サンプルポートおよび表示窓に対してストリップを所定の位置に保持することができる。それらは、試験ストリップが実行されている間、材料を互いに密接に接触させる。
【００２４】
パッドに使用される材料としては、多孔質マトリックスが挙げられる。最も一般的には、綿糸くず（cotton linter）等のセルロース系材料（すなわち、濾紙）がパッドに使用される。ガラス繊維フィルターも使用できるが、最も一般的にはコンジュゲートパッドに使用される。
【００２５】
「サンプルパッド」は、適用時にサンプルを受容し、コンジュゲートパッドへのサンプルの均一な分散を促進する。また、液体がコンジュゲートパッドに入る速度に影響を及ぼし、装置があふれるのを防ぐことができる。さらに、サンプルパッドは、サンプルを処理（例えば、血液サンプルの場合のサンプル成分の分離、干渉の除去、ｐＨの調整、粘度の増大、成分の可溶化、および／またはコンジュゲートと分析物または他の成分との間の非特異的結合の防止、または反応膜への非特異的結合の防止）するために、タンパク質、界面活性剤、増粘剤および緩衝塩等の追加の成分を含み得る。
【００２６】
「コンジュゲートパッド」は、粒子と標的ペプチドとの乾燥した可動性コンジュゲートを含む。サンプルがコンジュゲートパッドに流入すると、コンジュゲートはパッド材料を持ち上げ、サンプルの前部とともに反応膜に移動する。したがって、サンプルパッドは、コンジュゲート（粒子−標的ペプチド）を、すべての試験ストリップにおいて一定量のサンプルを反応膜に送達する。該当する場合、コンジュゲートパッドは、乾燥した可動性の対照コンジュゲートも含む。
【００２７】
本発明の装置は「吸収パッド」を有する。吸収パッドは試験ストリップの遠位端部に配置され、残りのサンプルを保持する。吸収パッドは、膜を介して液体を吸い上げ、処理された液体を収集する。さらに、吸収パッドは、試験ストリップに入るサンプルの総量を増加させる。
【００２８】
「反応膜」は、試験ラインおよび対照ラインにおいて捕捉試薬に不可逆的に結合する。通常、反応膜は、ニトロセルロース、ポリフッ化ビニリデン、ナイロンまたはポリエーテルスルホン等のポリマーから構成される。ニトロセルロースは、反応膜に最適な選択肢である。ニトロセルロース膜は、硝酸エステルの強力な双極子とタンパク質内のペプチド結合の強力な双極子との相互作用を介して、タンパク質（抗体またはビオチン結合タンパク質等）に静電的に結合する。
【００２９】
上記パッド、特に反応膜は、被覆テープで保護することができる。被覆テープは、少なくとも試験ラインおよび対照ラインの領域で透明でなければならない。
【００３０】
本明細書における「捕捉試薬」（本明細書において「生体認識分子」とも呼ばれる）は、標的ペプチド、または対照領域の場合は対照ペプチドを特異的に認識することができる分子を指す。最も一般的には、補足試薬は抗体、またはＦａｂフラグメント等のその抗原結合フラグメントである。抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。
【００３１】
「第１の捕捉試薬」は、（サンプル中に遊離している（すなわち、非標識分析物）か、粒子に結合している（すなわち、「標識」競合標的ペプチド）かに関係なく）標的ペプチドに特異的である。任意の「第２の捕捉試薬」は、対照コンジュゲート（ペプチド、例えば、ＢＳＡ等のビオチン化対照ペプチドに対する捕捉分子としてのニュートラアビジン）に結合し、すなわちポジティブ対照である。
【００３２】
本明細書における「分析物」という用語は、サンプル中の検出または測定される標的分子を指す。分析物は、タンパク質または短いオリゴペプチド等のペプチドである。ペプチドは、第１の捕捉試薬によって特異的に結合することができる少なくとも１つのエピトープを有する。
【００３３】
「サンプル」は、生物学的サンプル、環境サンプルまたは食品サンプル等であり得る。尿、全血、唾液、汗、血漿または血清のような体液等の生物学的サンプルが最も一般的なサンプルである。ここでは、尿が典型的なサンプルである。血液サンプルの場合、装置は、血清または血漿から血球を分離するためのフィルターマトリックスを含み得る。
【００３４】
サンプルは、サンプルパッドに適用する前に希釈バッファーで希釈されてもよい。典型的な希釈は１：２（サンプル：希釈バッファー）である。典型的な希釈バッファーは、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ＢＳＡ、および／またはＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００等の非イオン性界面活性剤を含み得る。
【００３５】
本発明におけるコンジュゲートの「粒子」は、競合する標的ペプチドの検出可能な標識（例えば、着色標識）として機能する。特に、粒子は、金コロイドナノ粒子、着色ラテックスビーズ、磁性粒子、炭素ナノ粒子、セレンナノ粒子、銀ナノ粒子および量子ドットからなる群から選択される。金コロイドナノ粒子は、本発明の文脈において特に好適である。そのような金ナノ粒子は、例えば、米国ミズーリ州セントルイスのＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社から市販されている。
【００３６】
典型的には、本発明の文脈における粒子は、実質的に球形であり、１０〜１００ｎｍ、有利には２０〜６０ｎｍ、最も有利には４０ｎｍの直径を有する。直径４０ｎｍの金ナノ粒子が最も有利である。
【００３７】
本発明の文脈において「ビオチン結合タンパク質」は、アビジン、ストレプトアビジンおよび脱グリコシル化アビジンからなる群から選択され得る。脱グリコシル化アビジンはニュートラアビジンとして知られており、本発明において最も好適なビオチン結合タンパク質もある。これらのビオチン結合タンパク質は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から市販されている。
【００３８】
金粒子等の粒子にコンジュゲートさせる標的ペプチドおよび対照ペプチドは、市販されている（例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から）標準的なビオチン化試薬（例えば、ビオチンｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（ビオチン−ＮＨＳ））を使用してビオチン化することができる。
【００３９】
標的ペプチドコンジュゲートの生成中、金ナノ粒子等の粒子とビオチン結合タンパク質とが完全にコンジュゲートされ、すなわち、粒子の表面がビオチン結合タンパク質で飽和される。ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を、非特異的な相互作用をブロックするために添加され得る。したがって、粒子は、その表面にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）をさらに含み得る。ニュートラアビジン等のビオチン結合タンパク質は、通常、４つのビオチン分子に結合することができる。この能力を使用して、ビオチン化された標的ペプチドを粒子に間接的にコンジュゲートさせ、粒子への標的ペプチドの充填（すなわち被覆）を調整することができる。ビオチン化標的ペプチドを粒子とビオチン結合タンパク質との複合体に添加した後、任意に遊離ビオチンを溶液に添加して、ビオチン結合タンパク質の遊離ビオチン結合部位を飽和させることができる。
【００４０】
本発明者らは、ビオチン化標的ペプチドの粒子への最大以下の充填（被覆）により、感度およびダイナミックレンジに関して最良の結果がもたらされることを見出した。したがって、本明細書において、標的ペプチドによる粒子への充填（被覆）は、粒子の最大充填（被覆）容量の約２０％〜約５５％、典型的には粒子の最大充填（被覆）容量の約２５％〜約５０％、より典型的には粒子の最大充填（被覆）容量の約２５％〜約４５％、さらにより典型的には粒子の最大充填（被覆）容量の約２５％〜約４０％、より好適には粒子の最大充填（被覆）容量の約２５％〜約３５％、最も好適には粒子の最大充填（被覆）容量の約３０％である。通常、ニュートラアビジン等のビオチン結合タンパク質は最大４つのビオチン分子に結合できるため、絶対数で表した標的ペプチドの粒子への充填は、上記のパーセンテージに基づいて計算することができる。例えば、４０ｎｍの金ナノ粒子ＯＤ１（５２６ｎｍ）の１ｍｌ溶液は、その表面において約４．１７×１０−１１ｍｏｌのニュートラアビジンの最大結合容量を有する。これは、４０ｎｍの金粒子溶液１ｍｌあたり約１．６７×１０−１０ｍｏｌのビオチン（またはビオチン化標的ペプチド）に相当する。したがって、例えばビオチン化標的ペプチドを３０％充填すると、４０ｎｍの金粒子溶液（５２６ｎｍにおけるＯＤ１）１ｍｌあたり約５．２×１０−１１ｍｏｌのビオチン化標的ペプチドに相当する。
【００４１】
標的コンジュゲートおよび任意に対照コンジュゲート等の試薬、ならびに捕捉分子は、例えば、好適な分配プラットフォームを使用することにより、パッドまたは反応膜に分配することができる。例えば、コンジュゲートはコンジュゲートパッドに噴霧することができ、次いでパッドを乾燥させて、コンジュゲートパッド上で、乾燥した可動性のコンジュゲートがもたらされる。
【００４２】
本発明はまた、液体サンプル中の標的ペプチドを検出するための方法であって、
（ａ）本発明の装置のサンプルパッドに前記液体サンプルを適用して、前記サンプルパッドからコンジュゲートパッドを介して反応膜へのサンプルの流れを可能にする工程、
（ｂ）捕捉領域においてコンジュゲートの存在または量を検出する工程、および
（ｃ）任意に、対照領域において対照コンジュゲートの存在または量を検出する工程
を含み、
前記捕捉領域におけるコンジュゲートの存在もしくは不存在または検出量が、それぞれ前記液体サンプル中の標的ペプチドの不存在もしくは存在または量を示す前記方法に関する。
【００４３】
この方法は、サンプル中の標的ペプチドの定量に特に有用である。
【００４４】
したがって、本発明の方法を実施する場合、および／または標的ペプチドを検出または定量するために本発明の装置を使用する場合、サンプル（または場合によっては希釈サンプル）をサンプルパッド（例えば、ハウジングを使用する場合にはサンプルポート）に適用する。次に、サンプルはコンジュゲートパッドを介して反応膜に輸送される。コンジュゲートパッド上で、コンジュゲートは可溶化され、反応膜に輸送される。試験ラインの強度は、元のサンプル中の分析対象物（すなわち、標的ペプチド）の濃度に依存する。サンプル中の濃度が低いほど、コンジュゲートした標的ペプチドとサンプル中の標的ペプチドとの間の競合により、強度が強くなる。添付の図２は、このアッセイを示す。
【００４５】
試験ライン（および場合によっては対照ライン）における強度は、例えば、ドイツのベルリンのｏｐＴｒｉｃｏｎ  ＧｍｂＨから市販されている適切なリーダーを使用して検出することができる。本発明の装置は、例えば、特定の形状および寸法を有することによって、特定のリーダーに適合し得る。
【００４６】
さらに、本発明は、本発明の装置を含む、液体サンプル中の標的ペプチドを検出するためのキットに関する。キットは、装置に適用する前にサンプルを希釈するための希釈バッファーおよび／またはサンプルまたは希釈サンプルをサンプルパッドに適用するためのピペットを含む１つ以上の容器をさらに含み得る。キットには、使用説明書も含まれ得る。
【００４７】
本発明の装置または本発明のキットは、液体サンプル中の標的ペプチドの定量化に使用することができる。標的ペプチドの性質に応じて、装置およびキットは、疾患または健康状態の診断または予後診断に使用することができる。例えば、特定の疾患、健康状態または予後を示すバイオマーカー（例えば、ペプチドホルモン、マーカータンパク質）は、本発明の文脈において決定することができる。特に、本発明の装置、キットおよび方法は、対象の診断、予後診断、リスク評価、リスク層別化、モニタリングおよび／または治療管理のために使用することができる。本明細書において「対象」という用語は、生きているヒト、または哺乳動物等の非ヒト動物を指し、特にヒトを指す。対象は、最も好適には患者である。本明細書において使用される「患者」という用語は、医療を受けている、または疾患もしくは病状のために医療を受けるべき生きているヒトまたは非ヒト動物（通常はヒト）を指す。これには、病状の兆候について検査されている、明確な病気のない人が含まれる。したがって、本明細書に記載の方法およびアッセイは、ヒトおよび家畜の両方の疾患に適用可能である。
【００４８】
本発明の文脈における「診断」は、対象における疾患または臨床状態の認知および（早期の）検出に関連し、鑑別診断も包含し得る。また、特定の実施形態において、疾患または臨床状態の重症度の評価は「診断」という用語に包含され得る。
【００４９】
「予後診断」は、特定の疾患または臨床状態に罹患している対象について転帰（outcome）または特定のリスクの予測に関する。これには、当該対象についての回復の可能性または有害な結果の可能性の推定が包含され得る。
【００５０】
「モニタリング」または「治療モニタリング」は、例えば、疾患の進行または疾患や障害の進行に対する特定の治療の影響を分析するために、すでに診断された疾患、障害、合併症またはリスクを追跡することに関する。本発明において、「リスク層別化」という用語は、対象のさらなる予後診断に従って、対象を異なるリスク群にグループ化することに関する。リスク層別化は、予防的および／または治療的手段を適用するための層別化にも関する。
【００５１】
本発明の文脈において「患者管理」という用語は：
・病院または集中治療室への入院の決定、
・患者を専門病院または専門病院ユニットに移す決定、
・集中治療室または病院からの早期退院の評価、および／または
・リソースの割り当て（例えば、医師および／または看護スタッフ、診断、治療、手術）
を指す。
【００５２】
「疾患の重症度の評価」という用語は、疾患の進行、有害事象の可能性、高い入院費用の可能性、および長期の入院またはリハビリテーションの可能性を含む、患者の疾患の状態の評価に関する。
【００５３】
したがって、一つの態様において、本発明は、疾患または健康状態を診断または予後診断する方法であって、
（ａ）本発明の装置のサンプルパッドに液体サンプルを適用して、前記サンプルパッドからコンジュゲートパッドを介して反応膜へのサンプルの流れを可能にする工程、
（ｂ）捕捉領域においてコンジュゲートの存在または量を検出する工程、および
（ｃ）任意に、対照領域において対照コンジュゲートの存在または量を検出する工程
を含み、
前記捕捉領域におけるコンジュゲートの存在もしくは不存在または検出量が、それぞれ前記液体サンプル中の標的ペプチドの不存在もしくは存在または量を示し、
前記液体サンプル中の標的ペプチドの不存在もしくは存在または量が、前記疾患または健康状態の診断または予後診断の指標とされる前記方法に関する。
【００５４】
変形性関節症における破壊を測定するために現在利用可能な検査の限界を考慮すると（例えば、関節腔狭小化のＸ線写真による評価は軟骨喪失の間接的な指標に過ぎない）、軟骨劣化の生物学的マーカーは非常に高く評価される。例えば、標的ペプチドは、軟骨劣化のマーカーであり、変形性関節症（ＯＡ）および関節リウマチ（ＲＡ）等の関節疾患、特にＯＡの診断のためのマーカーであるＣ末端架橋テロペプチドＩＩ型コラーゲン（ＣＴＸ−ＩＩ）であり得る。
【００５５】
ＩＩ型コラーゲンは軟骨の主要なコラーゲンであり、軟骨細胞と滑膜細胞によって分泌されるタンパク質分解酵素によって分解される。これらの酵素の作用から放出されたＣＴＸ−ＩＩペプチドは、尿から排出される。したがって、尿のＣＴＸ−ＩＩは、変形性関節症または関節リウマチに罹患している対象にとって、初期の軟骨劣化の生化学的感受性マーカーである（Garnero et al., 2000; loc. cit.）。
【００５６】
したがって、本発明の装置は、対象（典型的には、変形性関節症、特に膝または股関節の変形性関節症、より具体的には膝の変形性膝関節症に罹患している患者）の軟骨劣化を検出するために使用され得、軟骨疾患の存在または程度に応じて特定の薬を用いて対象を治療することを決定し得る。
【００５７】
軟骨の劣化に関連する疾患、特に変形性関節症（例えば、膝または股関節の変形性関節症、典型的には膝の変形性関節症）の治療、特に変形性関節症に関連する疼痛の治療に好適な薬剤は、ヒアルロン酸（ヒアルロナン（ＨＡ）とも呼ばれる）、またはヒアルロン酸ナトリウム等のその薬学的に許容可能な塩または誘導体を含む関節内補充薬（viscosupplement）である。ＨＡは、例えば架橋によって頻繁に改変される。ＨＡベースの関節内補充薬は、通常、関節内に投与され、例えば、膝関節の関節内空間に注入される。特定のヒアルロナンは、Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）およびＳｙｎｖｉｓｃ−Ｏｎｅ（登録商標）（サノフィ社）等の製品に含まれる「ｈｙｌａｎＧ−Ｆ２０」である。そのような関節内補充薬および対応する投薬量および投与スキームは、例えば、ＵＳ７，９３１，０３０およびＷＯ２００６／０７３８３５Ａ２に記載されている。
【００５８】
ＨＡは、動物起源、例えば、雄鶏の冠または臍帯に由来するもの、または非動物起源、例えば、細菌発酵したものであり得る。細菌発酵されたＨＡは、例えば、Cooney et al. (1999) Biotechnol. Prog., 15:898-910に記載されているように製造することができる。細菌発酵したＨＡも市販されている（例えば、資生堂、日本；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国）。上記のように、ＨＡは、誘導体化されていてもよく（例えば、架橋されているか、そうでなければ修飾または安定化されている）、または誘導体化されていなくてもよい。架橋剤の例としては、アルデヒド、エポキシド、ポリアジリル、グリシジルエーテル（例えば、１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル）およびジビニルスルホンが挙げられる。
【００５９】
したがって、本発明の文脈において「ヒアルロン酸」、「ヒアルロナン」および「ＨＡ」という用語は、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩または誘導体、特に「ヒランＧ−Ｆ２０」、より具体的には製品Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）およびＳｙｎｖｉｓｃ−Ｏｎｅ（登録商標）（サノフィ社）を包含する。
【００６０】
したがって、本発明はまた、対象における軟骨疾患、特に変形性関節症、より具体的には股関節または膝の変形性関節症、特に膝の変形性関節症に関連する疼痛を治療する方法（すなわち、軟骨疾患に関連する疼痛を緩和する方法）に関し、本発明の装置を使用して前記対象の尿サンプル中のＣＴＸ−ＩＩの濃度を決定することを含み、尿サンプル中のＣＴＸ−ＩＩの濃度に応じて患者がヒランＧ−Ｆ２０等のヒアルロン酸、例えばＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）またはＳｙｎｖｉｓｃ−Ｏｎｅ（登録商標）で治療され、またはそうではなく、前記サンプル中のＣＴＸ−ＩＩの濃度に基づいてヒランＧ−Ｆ２０等のヒアルロン酸、例えばＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）またはＳｙｎｖｉｓｃ−Ｏｎｅ（登録商標）を使用する治療レジメンが決定される。ヒランＧ−Ｆ２０等のヒアルロン酸含有医薬品、例えばＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）またはＳｙｎｖｉｓｃ−Ｏｎｅ（登録商標）は通常、罹患している関節、特に膝または股関節に注射される。同様に、本発明は、対象における軟骨疾患、特に変形性関節症、より具体的には股関節または膝の変形性関節症、特に膝の変形性関節症に関連する疼痛の治療において使用するためのヒランＧ−Ｆ２０等のヒアルロン酸、例えばＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）またはＳｙｎｖｉｓｃ−Ｏｎｅ（登録商標）に関し、本発明の装置を使用して前記対象の尿サンプル中のＣＴＸ−ＩＩの濃度が決定され、前記尿サンプル中のＣＴＸ−ＩＩの濃度に応じて患者がヒランＧ−Ｆ２０等のヒアルロン酸、例えばＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）またはＳｙｎｖｉｓｃ−Ｏｎｅ（登録商標）で治療され、またはそうでなく、前記サンプル中のＣＴＸ−ＩＩの濃度に基づいてヒランＧ−Ｆ２０等のヒアルロン酸、例えばＳｙｎｖｉｓｃ（登録商標）またはＳｙｎｖｉｓｃ−Ｏｎｅ（登録商標）を使用する治療レジメンが決定される。
【００６１】
したがって、本発明の疾患または健康状態を診断または予後診断する方法の文脈において、前記方法は、
（ｄ）所定の閾値を超えるＣＴＸ−ＩＩの存在がサンプル中に検出された場合、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容可能な塩もしくは誘導体、例えばヒランＧ−Ｆ２０を含む関節内補充薬を前記対象に処方する工程
をさらに含んでいてもよい。
【００６２】
また、本発明の疾患または健康状態を診断または予後診断する方法の文脈において、前記方法は、
（ｄ）所定の閾値を超えるＣＴＸ−ＩＩの存在がサンプル中に検出された場合、ヒアルロン酸またはその薬学的に許容可能な塩もしくは誘導体、例えばヒランＧ−Ｆ２０を含む関節内補充薬を前記対象に投与する工程
をさらに含んでいてもよい。
【００６３】
したがって、本発明はさらに、対象における変形性関節症等の軟骨疾患に関連する疼痛の治療における使用のための、ヒアルロン酸、またはヒランＧ−Ｆ２０等のその薬学的に許容可能な塩もしくは誘導体を含む関節内補充薬であって、前記対象の尿サンプル中のＣＴＸ−ＩＩの濃度が本発明のラテラルフローアッセイ装置を使用して測定され、前記尿サンプル中のＣＴＸ−ＩＩの濃度に応じて、関節内補充薬が前記対象に投与される前記関節内補充薬に関する。
【００６４】
換言すれば、本発明はさらに、対象における変形性関節症等の軟骨疾患に関連する疼痛の治療における使用のための、ヒアルロン酸、またはヒランＧ−Ｆ２０等のその薬学的に許容可能な塩もしくは誘導体含む医薬組成物であって、前記対象の尿中のＣＴＸ−ＩＩの濃度が本発明のラテラルフローアッセイ装置を使用して測定され、前記尿サンプル中のＣＴＸ−ＩＩの濃度に応じて、医薬組成物が前記対象に投与される前記医薬組成物に関する。
【００６５】
結果として、また、本明細書において既に説明したように、本発明はまた、対象における変形性関節症等の軟骨疾患に関連する疼痛を治療する方法であって、本発明のラテラルフローアッセイ装置により所定の閾値を超えるＣＴＸ−ＩＩの存在が前記対象のサンプル中、特に尿サンプル中に検出された場合、前記対象にヒアルロン酸、またはヒランＧ−Ｆ２０（例えば、Ｓｙｎｖｉｓｃ（登録商標）またはＳｙｎｖｉｓｃ−Ｏｎｅ（登録商標））等のその薬学的に許容可能な塩もしくは誘導体を含む関節内補充薬を投与することを含む前記方法に関する。
【００６６】
一つの態様において、本発明は、尿サンプル中のＣＴＸ−ＩＩを検出するためのラテラルアッセイ装置であって：
（ａ）固体支持体、
（ｂ）前記固体支持体の第１の端部でサンプルを最初に受容し、任意に前処理するためのサンプルパッド、
（ｃ）前記固体支持体の第２の端部の吸収パッド、
（ｄ）乾燥状態で粒子（特に金ナノ粒子）とＣＴＸ−ＩＩとの可動性コンジュゲートを含むコンジュゲートパッドであって、前記粒子にコンジュゲートされたＣＴＸ−ＩＩがビオチン化され、該粒子がその表面にビオチン結合タンパク質（特にニュートラアビジン）を含む前記コンジュゲートパッド、
（ｅ）以下を含む反応膜
（ｉ）標的ペプチドに対する固定化された第１の捕捉試薬（特に抗体）を含む捕捉領域、および
（ｉｉ）任意に、対照コンジュゲート（特にビオチン化ＢＳＡ）に対する固定化された第２の捕捉試薬（特にニュートラアビジン）を含む対照領域
を含み、
前記サンプルパッド、コンジュゲートパッド、反応膜および吸収パッドが前記固体支持体に取り付けられて、前記サンプルパッドから前記コンジュゲートパッドを介した前記反応膜への毛細管流動を可能にする前記装置に関する。
【００６７】
本明細書において、ＣＴＸ−ＩＩの粒子（特に金ナノ粒子）への充填（被覆）は、粒子の最大充填（被覆）容量の約２０％〜約５５％、典型的には粒子の最大充填（被覆）容量の約２５％〜約５０％、より典型的には粒子の最大充填（被覆）容量の約２５％〜約４５％、さらにより典型的には粒子の最大充填（被覆）容量の約２５％〜約４０％、より好適には粒子の最大充填（被覆）容量の約２５％〜約３５％、最も好適には粒子の最大充填（被覆）容量の約３０％である。
【００６８】
ＣＴＸ−ＩＩに対するポリクローナル抗体は、ウサギ等の動物を免疫することで産生することができる。次いで、例えばアフィニティークロマトグラフィーを使用して、例えば前記動物の血清から抗体を精製することができる。モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を産生するための方法は、当技術分野でよく知られている。
【００６９】
尿中のクレアチニンは（腎疾患がない場合）個体において比較的一定であるため、尿サンプル中の標的ペプチドの濃度を決定する場合、キャリブレーター（calibrator）として尿中クレアチニン濃度がさらに決定されてもよい。この目的のために、装置はさらに、クレアチニンを測定するための比色分析または蛍光分析のための反応領域（「クレアチニン反応領域」）を含んでいてもよい。サンプル（または場合によっては希釈サンプル）の一部をクレアチニンアッセイに追加して、クレアチニン濃度を測定することができる。特に、これは、本発明によるＣＴＸ−ＩＩの検出のための装置および方法に適用される。
【００７０】
クレアチニンアッセイは、例えば、本発明のラテラルフロー免疫アッセイと並行して装置内に配置されるストリップ形態のラテラルフローアッセイであり得る。したがって、クレアチニンアッセイは、サンプルパッドおよび反応領域（ラテラルフロー免疫アッセイの反応膜と同様）を含んでいてもよい。
【００７１】
クレアチニンアッセイは、通常、「乾式化学」試験であり、すなわち、当該アッセイは、例えば、追加のサンプルパッドで乾燥された乾燥状態の可動性指示薬色素（または色素組成物）を含む。クレアチニンを検出するための典型的な色素組成物は、酸化可能な色素（キノリン等）、Ｃｕ２＋イオンおよびヒドロキシペルオキシドを含む。クレアチニンがサンプル中に存在する場合、第二銅イオンとクレアチニンとの間で複合体が形成される。このＣｕ２＋−クレアチニン複合体は、ヒドロキシペルオキシドの存在下で色素、特にキノリンを酸化する。前記色素の酸化は、リーダーを使用して検出することができる色の変化をもたらす。クレアチニンを検出するための好適なアッセイは、例えば、ＵＳ５，３７４，５６１およびＵＳ６，００１，６５６に記載されている。
【実施例】
【００７２】
実施例１：ＣＴＸ−ＩＩ−ニュートラアビジン−金コンジュゲートの生成
すべてのインキュベーション工程（カップリング、ブロッキング、飽和等）は、室温においてタンブラーシェーカーにおいて行った。
【００７３】
工程１−ニュートラアビジン−金コンジュゲート：
１ｍｌの４０ｎｍ金コロイドＯＤ５２６ｎｍ１溶液当たり７．５μｇのニュートラビジンを、５ｍＭのホウ酸ナトリウム緩衝液中で２時間カップリングした。次いで、溶液を１％ＢＳＡで３０分間ブロッキングした。遠心分離（１％ＢＳＡによる洗浄工程を含む）をした後、コンジュゲートペレットを１％ＢＳＡを含む２ｍＭホウ酸緩衝液に再懸濁し、０．２２μｍでろ過した。結果物はニュートラアビジン−金コンジュゲートであった。ニュートラアビジン−金コンジュゲートには、金粒子１ｍｌ当たり２．５μｇのニュートラアビジンが充填されていると想定される。ニュートラアビジンの分子量（６００００ｇ／ｍｏｌ）を考慮すると、これは、金溶液１ｍｌ当たり４．１７×１０−１１ｍｏｌのニュートラアビジンのモル充填に相当する。１つのニュートラアビジン分子にはビオチンの結合部位が４つあるため、理論的には１ｍｌの溶液当たり１．６７×１０−１０ｍｏｌのビオチン分子（および結果としてＣＴＸ−ＩＩ等の標的ペプチド）がニュートラアビジン−金コンジュゲートに結合することができる。これは、本明細書で言うところの１００％の充填に相当する。
【００７４】
過剰な金が作用するように７．５μｇの金をカップリングに使用し、再現性のある充填を得た。
【００７５】
工程２−ＣＴＸ−ＩＩ−ニュートラアビジン−金コンジュゲート：
ニュートラアビジン−金コンジュゲートＯＤ５２６ｎｍ１溶液当たり５．２×１０−１１ｍｏｌのビオチン化ＣＴＸ−ＩＩを、１％ＢＳＡを含む２ｍＭホウ酸緩衝液中で１時間カップリングした。次いで、フリーの（free）ビオチン結合部位を１ｍｌのニュートラアビジン−金コンジュゲートＯＤ５２６ｎｍ１当たり２．５×１０−４ｍｏｌのビオチンで１時間飽和させた。遠心分離後、コンジュゲートペレットを再懸濁緩衝液に再懸濁し、０．２２μｍでろ過した。結果物はＣＴＸ−ＩＩ−ニュートラアビジン−金コンジュゲートであった。
【００７６】
１ｍｌのニュートラアビジンコンジュゲートＯＤ５２６ｎｍ１は、理論的には１．６７×１０−１０ｍｏｌのビオチンと結合することができる。ＣＴＸ−ＩＩ抗原は、１ｍｏｌのＣＴＸ−ＩＩが１ｍｏｌのビオチンに結合するように合成的にビオチン化された。したがって、理論的には、１．６７×１０−１０ｍｏｌのビオチン化ＣＴＸ−ＩＩが１ｍｌのニュートラアビジン−金コンジュゲートに結合した。これは、本明細書で言うところの１００％の充填に相当する。５．２×１０−１１ｍｏｌのビオチン化ＣＴＸ−ＩＩを１ｍｌのニュートラアビジン−金−コンジュゲートに添加するだけで、結合部位の約３０％のみが占有され；したがって、これは３０％の充填と呼ばれる。この場合、結合部位の残りの７０％は、過剰に添加されたビオチンで飽和される。
【００７７】
実施例２：ＣＴＸ−ＩＩ免疫アッセイ
アッセイの原理
ＣＴＸ−ＩＩラテラルフロー装置（ＬＦＤ）は、以下の構成要素を備えた競合免疫アッセイ（図１および２を参照されたい）である：
−サンプル：分析物としてＣＴＸ−ＩＩを含むヒト尿（Ｔｒｉｔｏｎ（商標）  Ｘ−１００を含むＰＢＳで１：２に希釈）；
−コンジュゲートパッド：金コロイドナノ粒子とＣＴＸ−ＩＩとのコンジュゲート、および金コロイドナノ粒子とビオチン化ＢＳＡとの対照コンジュゲート
−試験ライン：抗ＣＴＸ−ＩＩ抗体。
【００７８】
サンプル中のＣＴＸ−ＩＩおよび金−ＣＴＸ−ＩＩコンジュゲートは、試験ライン（抗ＣＴＸ−ＩＩ抗体）への結合をめぐって競合する。金コンジュゲートが試験ラインに結合すると、試験ラインは赤く表示される（サンプル中のＣＴＸ−ＩＩ濃度が比較的低い場合）。金粒子は色付きの標識として機能する。サンプル中に含まれるＣＴＸ−ＩＩが多いほど、試験ラインの強度は低くなる。試験ラインの色の強度は、リーダーを使用して読み取られ、予め記録された検量線を使用して濃度に変換される。対照ライン（ポジティブ対照）は、試験の検証に使用される。
【００７９】
金ナノ粒子は、再現性と安定性を確保するために、ニュートラアビジン（および非特異的相互作用をブロックするためのＢＳＡ）と完全に結合している。ニュートラアビジンは４つのビオチン分子に結合することができる。この機能は、ビオチン化ＣＴＸ−ＩＩと金ナノ粒子とを間接的にコンジュゲートさせ、金ナノ粒子へのＣＴＸ−ＩＩの充填を調整するために使用される（図３を参照されたい）。
【００８０】
材料および方法
金−ＣＴＸ−ＩＩコンジュゲートを下記の通り構築した：４０ｎｍの金粒子とニュートラアビジン（ＯＤ１金ナノ粒子懸濁液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社またはＢＢＩ  ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ社）１ｍｌ当たり５μｇのニュートラアビジン）とをコンジュゲートし、次いで、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）でブロッキングした（ＯＤ：光学密度（ＯＤ１＝光学密度１））。次いで、コンジュゲートしたニュートラアビジンにビオチン化ＣＴＸ−ＩＩを充填した。ＣＴＸ−ＩＩとインキュベーションした後、遊離ビオチンを溶液に添加してニュートラアビジンのフリーのビオチン結合部位を飽和させた。
【００８１】
充填したＣＴＸ−ＩＩの量を計算するために、２．５μｇのニュートラアビジンが１ｍｌの金粒子懸濁液に実際に結合し、１ｍｏｌのニュートラアビジンが４ｍｏｌのビオチンに結合すると仮定した。
【００８２】
結果（図４および５も参照されたい）：
ａ）１００％の充填の場合（コンジュゲートのために過剰なＣＴＸ−ＩＩ）：
−サンプル中ＣＴＸ−ＩＩ濃度０μｇ／ｌでは試験ラインの強度が低かった
−サンプル中ＣＴＸ−ＩＩ濃度１０μｇ／ｌでは試験ラインの強度に視覚的に認識できる低下はなかった（競合は１００μｇ／ｌのＣＴＸ−ＩＩでのみ視覚的に認識可能であった）
−したがって、感度を上げるためにＣＴＸ−ＩＩの充填を減らす必要があった。
ｂ）５０％の充填の場合：
−１００％の充填と同様の感度であるが、０μｇ／ｌのＣＴＸ−ＩＩでの試験ラインはより強度が高かった
ｃ）３０％の充填の場合：
−０μｇ／ｌのＣＴＸ−ＩＩで試験ラインの強度が高かった
−１０μｇ／ｌのＣＴＸ−ＩＩで試験ライン強度に視覚的に認識できる低下がみられた
ｄ）１０％の充填の場合：
−試験ラインの強度が高かった；サンプル中のＣＴＸ−ＩＩによる強度の視覚的に認識できる低下はなかった
【００８３】
結論：
間接的なカップリング（例えば、ニュートラアビジンを介した）は、一般に、ＣＴＸ−ＩＩの粒子への充填の調整を可能にして、アッセイを最適化し、特に、この場合、充填を最適な３０％の充填に低下させることができる。この充填では、試験ラインの染色はサンプル中の低ＣＴＸ−ＩＩ濃度で顕著であり、高ＣＴＸ−ＩＩ濃度で低かった。目視検査（図４）はリーダーを使用して確認された（図５）。そのような最適化は、従来技術の方法を使用して不可能である広い濃度範囲にわたって高感度を可能にするものである。
【００８４】
１００％の充填では、ＣＴＸ−ＩＩ濃度が低い場合でも試験ラインの強度が非常に弱く、信号強度がリーダーの線形範囲外になるように、アッセイ全体のコンジュゲート濃度を下げる必要がある。
【００８５】
逆の構成（すなわち、非競合アッセイ；金ナノ粒子とコンジュゲートした抗ＣＴＸ−ＩＩ抗体、試験ラインにおけるＣＴＸ−ＩＩ）も試験された。しかしながら、１００％の充填が必要なため、感度が不十分であった。さらに、この逆の構成は、競合アッセイの構成よりも高価であった。
【００８６】
本明細書で引用された文書は、その全体が参照により組み込まれる。
【図１】
2021520484.tif 000002
【図２】
2021520484.tif 000003
【図３】
2021520484.tif 000004
【図４】
2021520484.tif 000005
【図５】
2021520484.tif 000006
【国際調査報告】
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