(57)【要約】  本発明は、（ベクター）ワクチンの分野、特に新規なＥＨＶ挿入部位ＵＬ４３に関する。本発明は、目的の遺伝子、特に抗原コード配列の発現に好適な関連する発現カセットおよびベクターにさらに関する。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
（ｉｉ）配列番号１９ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２６ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４３隣接領域と、
（ｉｉｉ）配列番号２０ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２７ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４４隣接領域と
を含む発現カセット。
【請求項２】
請求項１に記載の発現カセットを含むウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター。
【請求項３】
（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
（ｉｉ）配列番号１９ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２６ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４３隣接領域と、
（ｉｉｉ）配列番号２０ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２７ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４４隣接領域と
を含むウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター。
【請求項４】
ＵＬ４３に挿入された、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含むウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター。
【請求項５】
ＵＬ４３に挿入された、目的の第１のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは抗原コード配列と、第２の挿入部位、好ましくはＵＬ５６またはＵＳ４に挿入された、目的の第２のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは別の抗原コード配列とを含むウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター。
【請求項６】
ＵＬ４３への挿入が、ＵＬ４３における部分欠損、トランケーション、置換、改変などによって特徴づけられ、ＵＬ４４が機能性を維持する、請求項２〜５のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
【請求項７】
ＵＬ４３への挿入が、ＲａｃＨのＵＬ４３内のおよそ約８７０ｂｐ部分（配列番号２１）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／もしくは同一配列の欠損によって特徴づけられる、請求項２〜６のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
【請求項８】
配列番号１９、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２７ならびにこれらの配列のいずれか１つの７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの隣接領域を含む、請求項２〜７のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
【請求項９】
前記抗原コード配列が、動物、例えば、ブタ、家禽もしくはウシなどの食物生産動物またはネコ、イヌもしくはウマなどの伴侶動物に感染する病原体に関する、請求項２〜８のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは項１に記載の発現カセット。
【請求項１０】
ＵＬ５６および／またはＵＳ４などの別の挿入部位に挿入されていてもよい、少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列をさらに含む、請求項２〜９のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
【請求項１１】
１つまたは２つもしくはそれ以上の目的の配列もしくは遺伝子または抗原コード配列に作動可能に連結されているプロモーター配列が、ＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイスルポリヘドリンプロモーター、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片、好ましくは、ｐ４３０（配列番号３）である前記機能的断片、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片、好ましくは、ｐ４５５（配列番号４）である前記機能的断片、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、またはｐ４２２（配列番号５）もしくはその機能的断片もしくはその相補的ヌクレオチド配列からなる群から選択される、請求項２〜１０のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは請求項１もしくは９に記載の発現カセット。
【請求項１２】
抗原コード配列が、リスト：シュマレンベルクウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコモルビリウイルス、破傷風菌、結核菌、アクチノバチルス・プルロニューモニアから選択される病原体由来である、請求項２〜１１のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは請求項１もしくは９もしくは１１のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項１３】
抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であるか、または抗原コード配列が、ブタＡ型インフルエンザウイルス由来のヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列である、請求項２〜１２のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは請求項１もしくは９もしくは１１〜１２のいずれか１項に記載の発現カセット。
【請求項１４】
抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、請求項１３に記載のＥＨＶベクターまたは発現カセット。
【請求項１５】
ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９からなる群から選択される、項２〜１４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
【請求項１６】
ＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４である、項２〜１５のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載のＥＨＶ−１ベクターを含む免疫原性組成物。
【請求項１８】
動物を免疫する方法であって、請求項１７に記載の免疫原性組成物をそのような動物に投与するステップを含む方法。
【請求項１９】
必要とする動物において病原体によって引き起こされる臨床徴候を軽減または防止する方法であって、治療有効量の請求項１７に記載の免疫原性組成物を動物に投与するステップを含む方法。
【請求項２０】
動物が、ブタ、子ブタもしくは雌ブタ、家禽、ウシ、ウマ、イヌまたはネコである、請求項１８または１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．  １．８２１〜１．８２５に従って配列表を含有する。本出願に付随する配列表は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
Ａ．技術分野
２、本発明は、（ベクター）ワクチンの分野、特に新規のＥＨＶ挿入部位ＵＬ４３に関する。本発明は、目的の遺伝子、特に抗原コード配列の発現に好適な関連する発現カセットおよびベクターにさらに関する。本発明のウイルスベクターは、免疫原性組成物またはワクチンの産生に有用である。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ．関連技術の背景および説明
ウマの病原体、ウマアルファヘルペスウイルス１型（ウマ流産ウイルス、ＥＨＶ−１）は、ヘルペスウイルス目の、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス亜科のバリセロウイルス属に属する。およそ１５０，０００塩基対の二本鎖ＤＮＡゲノムを有する大きなエンベロープウイルスである。バリセロウイルス亜属の他の重要なメンバーは、ヒトアルファヘルペスウイルス３型（水痘帯状疱疹ウイルス）、ブタアルファヘルペスウイルス１型（仮性狂犬病ウイルス）、ウシアルファヘルペスウイルス１型（感染性気管支炎ウイルス）、およびウマアルファヘルペスウイルス４型（ウマ鼻肺炎ウイルス、ＥＨＶ−４）（http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)）。ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４は風土性であり、世界中のウマに影響を及ぼす。ＥＨＶ−４は、上気道に、大抵は軽度の感染を引き起こすが、ＥＨＶ−１は、株および宿主の免疫状態によって呼吸器症状から流産および致死性の脳脊髄障害の範囲の疾患を含む全身感染を引き起こし得る。ＥＨＶ−１に対して使用許諾を得た２つの改変生ワクチン（ＭＬＶ）がアメリカおよびヨーロッパで現在入手可能であり、それぞれＲｈｉｎｏｍｕｎｅ（登録商標）（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｉｎｇｅｌｈｅｉｍ）およびＰｒｅｖａｃｃｉｎｏｌ（登録商標）（ＭＳＤ）である。両方とも、弱毒化のためにブタ上皮細胞において２５６回継代された、古典的に弱毒化したＥＨＶ−１  ＲａｃＨ株を含有する（Ma et al. 2013）。弱毒化のメカニズムは、分子レベルで調査されてきた。Osterrieder et al. (1996)は、ＲａｃＨがｏｒｆ６７（ＩＲ６）の２つのゲノムコピーを欠如し、１つのコピーの回復が毒性を回復させるのに十分であったことを示した。さらに、免疫抑制ウイルスタンパク質をコードするｏｒｆ１（ＵＬ５６）のコード配列の９０％より多くを除去する１２８３ｂｐの欠損を持つ。他の変異もまた、弱毒化に影響するが、これまでのところ詳細には調査されていない。これら全てのことから、ＲａｃＨは非常に安全なワクチン株である。ワクチン接種動物における継代による毒性への復帰は、仮に可能だとしてもその可能性が極めて低いからである。
【０００３】
ウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ワクチン株ＲａｃＨ：ｐＲａｃＨおよびｐＲａｃＨ−ＳＥの全ゲノムを持つ大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の細菌人工染色体（ＢＡＣ）の２つのバリアントは、ベクターワクチン開発のプラットフォームとして公知である。ＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥはｐＲａｃＨ、元々はＫｌａｕｓ  Ｏｓｔｅｒｒｉｅｄｅ，ＦＵ  Ｂｅｒｌｉｎの研究室でクローニングされたＢＡＣをもとに作製された。ｐＲａｃＨは、糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ；Wellington et al., 1996）をコードするｏｒｆ７１（ＵＳ５）が欠損している。その場所に、ＢＡＣベクター配列およびＧＦＰ発現カセットが導入された。ｐＲａｃＨから未改変ＥＨＶ−１  ＲａｃＨをレスキューするため、ウイルス複製の間に、ＢＡＣベクター配列部分およびＧＦＰ発現カセットが相同組換えによってｏｒｆ７１（ＵＳ５）によって置き換えられ、元々のＲａｃＨゲノムが回復されるように、それは、全ｏｒｆ７１（ＵＳ５）プラス隣接領域を含有するプラスミドとコトランスフェクトされなければならなかった。ＢＡＣベクター配列／ＧＦＰ発現カセットが細胞培養でのトランスフェクション時に自己切断可能（ＳＥ）になるように、ｐＲａｃＨは本発明において改変された（Tischer et al., 2007）。この改善されたＢＡＣはｐＲａｃＨ−ＳＥと名づけられた。ｐＲａｃＨおよびｐＲａｃＨ−ＳＥは、ｐＲａｃＨ−ＳＥがｏｒｆ７１（ＵＳ５）修復ウイルスのレスキューを著しく促進する点が違うのみで、両方ともベクターワクチン開発のためのプラットフォームとなり得る。
【０００４】
ＥＨＶ−１  ＲａｃＨベースのベクターワクチンは、ブタ、ウシ、およびイヌを含むいくつかの哺乳動物種で免疫性を引き出すことができることが示された（Rosas et al. 2007, Rosas et al. 2008, Trapp et al. 2005, Said et al. 2013）。病原体の抗原タンパク質をコードする遺伝子は、組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨによって発現され得る。ＥＨＶ−１−ＲａｃＨゲノムは、大腸菌においてそのＢＡＣ形態で操作し、通常導入遺伝子発現カセットを挿入することによってさらなるタンパク質を発現するように調製することができる（Tischer et al., 2010）。培養した許容細胞においてｐＲａｃＨ−ＳＥ  ＤＮＡをトランスフェクションすると、ＥＨＶ−１複製が細胞の転写因子によって開始される。ウイルスＤＮＡポリメラーゼの活性は、全てのＢＡＣベクター関連配列の欠損およびＥＨＶ−１  ＲａｃＨゲノムのその元々の状態への回復をもたらす。感染性ウイルスが生成され、それはＲａｃＨと区別がつかない。
ｐＲａｃＨ−ＳＥが、例えば導入遺伝子発現カセットの挿入によって、大腸菌中で操作される場合、許容細胞へのトランスフェクション後に再構築されたウイルスは改変を保持し、さらなる遺伝子を発現するであろう。組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨはベクターワクチンとして使用することができる。
【０００５】
野生型ＥＨＶ−１株は、それらのゲノムの長いユニーク断片の一端にｏｒｆ１（ＵＬ５６）、ｏｒｆ２、およびｏｒｆ３と呼ばれる３つのオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を保持する（配列座標  １２９８−３６１４；図１）。Ｏｒｆ１（ＵＬ５６）およびｏｒｆ３は、ＤＮＡの１つの鎖に連続して配置されているが、ｏｒｆ２は相補鎖にコードされている。ワクチン株ＲａｃＨは、ｏｒｆ１および２に影響を及ぼす領域内に１２８３ｂｐの欠損があり、これは、これらの遺伝子はウイルス複製に必須ではないことを示している。このため、その部位は導入遺伝子挿入部位となる。この挿入部位はＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）と呼ばれる。
しかしながら、ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）挿入部位に挿入され得る導入遺伝子のサイズおよび数は、通常制限される。したがって、ＥＨＶベクターの能力を増強するため、ＥＨＶベクター、特に組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨベクターに導入遺伝子を挿入する、およびＥＨＶベクター、特に組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨベクターから導入遺伝子を発現する、新しいおよび代わりの方法の満たされていない要求がある。
【発明の概要】
【０００６】
ＥＨＶベクターの能力を増大させるために、本発明は、ＥＨＶベクター骨格に導入遺伝子を挿入する、およびＥＨＶベクター骨格から導入遺伝子を発現する、新しいおよび代わりの方法を提供する。
本発明は、ＥＨＶベクター、特に組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨに導入遺伝子配列を挿入するためにおよびＥＨＶベクター、特に組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨからトランスジェニックタンパク質を発現するために使用することができる、新しい、代わりの導入遺伝子挿入部位ＵＬ４３に関する。
【０００７】
ＥＨＶベクターの新規の「ＵＬ４３挿入部位」は、ＵＬ４３（ＯＲＦ１７）に関する部分欠損、トランケーション、置換、改変などによって特徴づけられる。ＵＬ４３の完全な欠損は、糖タンパク質ＣをコードするＵＬ４４のプロモーターに影響を与える可能性があるため、完全なＵＬ４３の欠損は、ウイルス複製に不利であり、したがってワクチン製造および有効性に不利であると予想される。新規のＵＬ４３挿入部位、および／またはＵＬ４３への（発現カセットの）挿入は、ＵＬ４４が機能性または無傷の状態を維持するように機能的に規定される。
【０００８】
特定の態様では、ＵＬ４３挿入部位は、ＲａｃＨのＵＬ４３（配列番号１８）内のおよそ８７０ｂｐ部分（配列番号２１）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相同配列の欠損を包含する。ＲａｃＨゲノム配列の欠損部分は、配列番号２１として示される（完全なＲａｃＨゲノム配列が不明であるのでヌクレオチド番号は入手不可能）。別の特定の態様では、ＵＬ４３挿入部位は、野生型ＥＨＶ−１  Ｖ５９２株（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ４６４０５２．１）のＵＬ４３の理論的８７０ｂｐ欠損（逆相補的ｎｔ２３０２１〜２４２２６）（配列番号２３）を包含する。この欠損部分は、野生型Ｖ５９２（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ４６４０５２．１）ゲノム配列の逆相補的ヌクレオチド２３３５３および２４２２６（配列番号２４）に対応する。
【０００９】
本発明では、「隣接領域」は、目的の配列または遺伝子、好ましくは抗原コード配列、を含む発現カセットのＥＨＶゲノムへの組換えを指示する。これらの隣接領域は、ＥＨＶに天然に存在する。Ｕｐ  ＵＬ４３隣接領域（２２６ｂｐ、配列番号１９）およびＵｐ  ＵＬ４４隣接領域（３０５ｂｐ、配列番号２０）は、ＵＬ４３部位に使用される全てのトランスファーベクター／プラスミドの古典的相同組換えに選択される。野生型ＥＨＶ−１  Ｖ５９２株（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ４６４０５２．１）では、対応する配列は、逆相補的ヌクレオチド２４２２７〜２４４５２（隣接領域ｕｐ  ＵＬ４３、配列番号２６）および逆相補的ヌクレオチド２３０４９〜２３３５４（隣接領域ｕｐ  ＵＬ４４、配列番号２７）に位置する。
トランスファープラスミドｐＵ−ｍＣ７０−ＢＧＨ（配列番号３７）の図２１、トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１（配列番号２８）の図２２、およびトランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１（配列番号２９）の図３のプラスミド／ベクターマップは、新規のＯＲＦ７０挿入部位を含む発現カセットを含むベクターの例である。トランスファーベクターｐＵ−１−３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３０）の図２３、およびトランスファープラスミドｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３１）の図４のプラスミド／ベクターマップは、ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）挿入部位を含む発現カセットを含むベクターの例である。
【００１０】
トランスファーベクターｐＵＵＬ４３−ｐ４２２−１８Ｋ１８（配列番号３４）の図２４、トランスファープラスミドｐＵＵＬ４３−４２２−ｍＣ−１８Ｋ１８（配列番号３５）の図１４、およびトランスファープラスミドｐＵＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ−１８Ｋ１８（配列番号３６）の図１６のプラスミド／ベクターマップは、新規のＵＬ４３挿入部位を含む発現カセットを含むベクターの例である。
本発明は、１つのプロモーターの調節下でＲＮＡウイルス由来機能（２ａペプチド、ＩＲＥＳ部位）によって２つの導入遺伝子を結合するのではなく１つのベクター骨格から２つの異なる導入遺伝子を発現するＥＨＶベクターにさらに関する。
本発明は、１つのプロモーターの調節下でＲＮＡウイルス由来機能（２ａペプチド、ＩＲＥＳ部位）によって２つまたは３つの導入遺伝子を結合するのではなく１つのベクター骨格から２つまたは３つの異なる導入遺伝子を発現するＥＨＶベクターにさらに関する。
【００１１】
本発明は、新規のＵＬ４３挿入部位に挿入された目的の第１の配列または遺伝子と、ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）などの確立された挿入部位または他の挿入部位ＯＲＦ７０（ＵＳ４）に挿入された目的の第２の配列または遺伝子とを含むウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター、好ましくは、ＥＨＶ−１、ＲａｃＨまたはＲａｃＨ−ＳＥに、さらに関する。加えて、本発明は、ウマアルファヘルペスウイルス３型（ＥＨＶ−３）、ウマアルファヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ−４）、ウマアルファヘルペスウイルス８型（ＥＨＶ−８）、ウマアルファヘルペスウイルス９型（ＥＨＶ−９）、ウシアルファヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）、ウシアルファヘルペスウイルス５型（ＢＨＶ−５）、イヌアルファヘルペスウイルス１型、およびネコアルファヘルペスウイルス１型を含む、他のヘルペスウイルス属、特にアルファヘルペスウイルス属、特にバリセロウイルス属に基づくベクターに、さらに関する。
【００１２】
本発明は、新しいＵＬ４３挿入部位に挿入された目的の第１の配列または遺伝子と、他の挿入部位ＯＲＦ７０（ＵＳ４）に挿入された目的の第２の配列または遺伝子と、ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）などの確立された挿入部位に挿入された目的の第三の配列または遺伝子とを含むウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター、好ましくは、ＥＨＶ−１、ＲａｃＨまたはＲａｃＨ−ＳＥに、さらに関する。加えて、本発明は、ウマアルファヘルペスウイルス３型（ＥＨＶ−３）、ウマアルファヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ−４）、ウマアルファヘルペスウイルス８型（ＥＨＶ−８）、ウマアルファヘルペスウイルス９型（ＥＨＶ−９）、ウシアルファヘルペスウイルス１型（ＢＨＶ−１）、ウシアルファヘルペスウイルス５型（ＢＨＶ−５）、イヌアルファヘルペスウイルス１型、およびネコアルファヘルペスウイルス１型を含む、他のヘルペスウイルス属、特にアルファヘルペスウイルス属、特にバリセロウイルス属に基づくベクターに、さらに関する。
本発明は、そのようなベクターを含む哺乳動物宿主細胞、およびそのような宿主細胞を使用してベクターワクチンを生成する方法、ならびに本発明のウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクターを含む免疫原性組成物およびワクチンにさらに関する。
【００１３】
本発明は、ｐ４２２を含むプロモーター配列（配列番号５）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその機能的断片の相補的ヌクレオチド配列にさらに関し、前記プロモーター配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす。本発明は、７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の配列同一性および／または相同性を有するプロモーター配列の機能的断片にも関する。
したがって、上記の技術的問題の解決策は請求項に特徴づけられる記載および実施形態によって達成され、その異なる態様内の本発明は請求項に従って実施される。
【００１４】
これらの特性は、新規記載のＵＬ４３挿入部位から少なくとも１つの抗原を発現する、または新規記載のＵＬ４３挿入部位とＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）などの別の挿入部位および／もしくは他の挿入部位ＯＲＦ７０（ＵＳ４）とから同様の効率で並行して少なくとも２つの異なる抗原を発現するＥＨＶに基づく組換えベクターワクチン、好ましくは、ＥＨＶ−１  ＲａｃＨに基づく組換えベクターワクチンの作製を可能にする。ワクチンの標的が２つの異なる病原体からなる場合、ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）のような確立された挿入部位および／または他の挿入部位ＯＲＦ７０（ＵＳ４）と並行して新しいＵＬ４３挿入部位を利用することは、１つだけの抗原成分を発現するベクターに比べて、商品原価を有意に削減することができ、明らかな利点となる。
【００１５】
これらの特性は、新規記載のＵＬ４３挿入部位から少なくとも１つの抗原を発現する、または新規記載のＵＬ４３挿入部位とＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）のような別の挿入部位もしくは他の挿入部位ＯＲＦ７０（ＵＳ４）とから同様の効率で並行して少なくとも２つの異なる抗原を発現する、または新規記載のＵＬ４３挿入部位と他の挿入部位ＯＲＦ７０（ＵＳ４）とＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）のような別の挿入部位とから並行して少なくとも３つの異なる抗原を発現するＥＨＶに基づく組換えベクターワクチン、好ましくは、ＥＨＶ−１  ＲａｃＨに基づく組換えベクターワクチンの作製を可能にする。ワクチンの標的が２つの異なる病原体からなる場合、ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）のような確立された挿入部位または他の挿入部位ＯＲＦ７０（ＵＳ４）と並行して新しいＵＬ４３挿入部位を利用することは、１つだけの抗原成分を発現するベクターに比べて、商品原価を有意に削減することができ、明らかな利点となる。ワクチンの標的が３つの異なる病原体からなる場合、ＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）のような確立された挿入部位および他の挿入部位ＯＲＦ７０（ＵＳ４）と並行して新しいＵＬ４３挿入部位を利用することは、１つまたは２つだけの抗原成分を発現するベクターに比べて、商品原価を有意に削減することができ、明らかな利点となる。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、先行技術につきものの問題を解決し、当技術の状態の明らかな進歩を提供する。
【００１７】
一般的には、本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
（ｉｉ）配列番号１９ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２６ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４３隣接領域と、
（ｉｉｉ）配列番号２０ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２７ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４４隣接領域と
を含む発現カセットを提供する。
【００１８】
本発明は、本発明の発現カセットを含むウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス、例えば、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ベクター、最も具体的にはＲａｃＨ株をさらに提供する。
本発明は、本発明の発現カセットを含むウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター、好ましくは、ＥＨＶ−１またはＲａｃＨ株を提供する。
【００１９】
本発明は、
（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
（ｉｉ）配列番号１９ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２６ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４３隣接領域と、
（ｉｉｉ）配列番号２０ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２７ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４４隣接領域と
を含むウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス、例えば、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ベクター、最も具体的にはＲａｃＨ株に、さらに関する。
【００２０】
有利なことには、本発明により提供される実験データは、抗原の挿入および発現に使用することができるＥＨＶベクター内の新しい挿入部位が得られたことを開示する。さらに、今般、新しい挿入部位が得られたことにより、異なる挿入部位への抗原の挿入、および異なる挿入部位からの抗原の発現、および１つより多くの抗原の発現がそれぞれ可能になる。
本発明は、ＵＬ４３に挿入された、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含むウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス、例えば、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ベクター、最も具体的にはＲａｃＨ株に、さらに関する。
【００２１】
本発明は、ＵＬ４３に挿入された、目的の第１のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは抗原コード配列と、第２の挿入部位、好ましくはＵＬ５６（ｏｒｆ１／３）またはＵＳ４（ｏｒｆ７０）に挿入された、目的の第２のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは別の抗原コード配列とを含むウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス、例えば、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ベクター、最も具体的にはＲａｃＨ株に、さらに関する。本発明の前記ＥＨＶベクターの特定の態様では、少なくとも２つの目的の遺伝子は、制御配列、好ましくはプロモーター配列に、作動可能に連結されている。
本発明のベクターの特定の態様では、ＵＬ４３への挿入は、ＵＬ４３における部分欠損、トランケーション、置換、改変などによって特徴づけられ、ＵＬ４４は機能性を維持する。
本発明のベクターの別の特定の態様では、ＵＬ４３への挿入は、ＲａｃＨのＵＬ４３内の約８７０ｂｐ部分（配列番号２１）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／もしくは同一配列の欠損によって特徴づけられる。
【００２２】
本発明のベクターの別の特定の態様では、ＵＬ４３への挿入は、ＲａｃＨのＵＬ４３内の８７０ｂｐ部分（配列番号２１）の欠損またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／もしくは同一配列の任意の他の株における欠損によって特徴づけられる。
本発明のベクターのさらなる特定の態様では、ＵＬ４３への挿入は、野生型ＥＨＶ−１  Ｖ５９２株（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ４６４０５２．１）のＵＬ４３内のおよそ８７０ｂｐ欠損によって特徴づけられ、野生型Ｖ５９２ゲノム配列の欠損部分は、ヌクレオチド２３３５３〜２４２２６の間（配列番号２４）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／もしくは同一配列に位置する。
【００２３】
本発明のベクターの別の特定の態様では、ＥＨＶベクター、具体的にはＥＨＶ−１ベクターは、（ｉ）配列番号１９、配列番号２６からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ４３隣接領域と、（ｉｉ）配列番号２０、配列番号２７からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ４４隣接領域とを含む。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列は、天然に存在しない、および／または組換えである。
本発明のベクターまたは発現カセットの別の特定の態様では、前記目的のヌクレオチド配列は、組換えおよび／または異種性および／または外来性である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記抗原コード配列は、動物、例えば、ブタ、家禽もしくはウシなどの食物生産動物またはネコ、イヌもしくはウマなどの伴侶動物に感染する病原体に関する。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記ベクターまたは発現カセットは、終結シグナルまたはポリアデニル化配列などの少なくとも１つのさらなる追加の制御配列をさらに含む。
本発明のベクターまたは発現カセットの別の特定の態様では、前記ベクターまたは発現カセットは、終結シグナルおよび／またはポリアデニル化配列などの追加の制御配列をさらに含む。
【００２４】
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記ベクターまたは発現カセットは、少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列をさらに含む。一態様では、少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列は、例えばＩＲＥＳ／２ａペプチドを介して、同じ挿入部位ＵＬ４３に挿入されている。別の態様では、前記ベクターまたは発現カセットは、少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含み、別の挿入部位に、好ましくはＵＬ５６および／またはＵＳ４に挿入されている。
【００２５】
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる態様では、少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列は、ＵＬ５６に挿入されている。ＵＬ５６（ＯＲＦ１／３）挿入部位は、先行技術分野で説明されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる態様では、少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列は、ＵＳ４（ＯＲＦ７０）に挿入されている。
代わりの導入遺伝子挿入部位ＵＳ４（ＯＲＦ７０）を使用して、ＥＨＶベクター、特に組換えＥＨＶ−１またはＥＨＶ−１  ＲａｃＨに導入遺伝子を挿入すること、およびＥＨＶベクター、特に組換えＥＨＶ−１またはＥＨＶ−１  ＲａｃＨから導入遺伝子を発現することができる。
【００２６】
ＥＨＶベクターの「ＵＳ４（ＯＲＦ７０）挿入部位」は、ＵＳ４（ＯＲＦ７０）に関する部分欠損、トランケーション、置換、改変などによって特徴づけられる。ＵＳ４（ＯＲＦ７０）の完全な欠損は、ｇｐＩＩをコードするＵＳ５（ＯＲＦ７１）のプロモーターに影響を与えることになるため、完全なＵＳ４（ＯＲＦ７０）の欠損は、ウイルス複製に不利であり、したがってワクチン製造および有効性に不利であると予想される。ＵＳ４（ＯＲＦ７０）挿入部位、および／またはＵＳ４（ＯＲＦ７０）への（発現カセットの）挿入は、ＵＳ５（ＯＲＦ７１）が機能性または無傷な状態を維持するように機能的に規定される。
【００２７】
特定の態様では、ＵＳ４（ＯＲＦ７０）挿入部位は、ＲａｃＨのＵＳ４（ＯＲＦ７０）内のおよそ８０１ｂｐ部分（配列番号１７）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％相同配列の欠損を包含する。ＲａｃＨゲノム配列の欠損部分は、配列番号１７として示される（完全なＲａｃＨゲノム配列が不明であるのでヌクレオチド番号は入手不可能）。別の特定の態様では、ＯＲＦ７０挿入部位は、野生型ＥＨＶ−１  ａｂ４株（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）のＯＲＦ７０内の理論的８０１ｂｐ欠損（配列番号１６）を包含する。欠損部分は、野生型ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）ゲノム配列のヌクレオチド１２７６８１〜１２８４８２の間（配列番号１６）に位置する。
【００２８】
本発明では、「隣接領域」は、目的の配列または遺伝子、好ましくは抗原コード配列、を含む発現カセットのＥＨＶゲノムへの組換えを指示する。これらの隣接領域は、ＥＨＶに天然に存在する。Ｕｐ７０隣接領域（４１７ｂｐ、配列番号９）およびＵｐ７１隣接領域（４３１ｂｐ、配列番号１０）は、ｏｒｆ７０部位に使用される全てのトランスファーベクター／プラスミドの古典的相同組換えに選択される。野生型ＥＨＶ−１  ａｂ４株（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）では、対応する配列は、ヌクレオチド１２７２６４〜１２７６８０（隣接領域ｕｐ  ｏｒｆ７０、配列番号１１）および１２８４８３〜１２８９１３（隣接領域ｕｐ  ｏｒｆ７１、配列番号１２）に位置する。ＲＥＤ組換えの場合、隣接領域は、ＸｂａＩ制限消化に起因してトランケートされる。これらのトランケートされた隣接領域は、上記の、４１７ｂｐ「クラシカルな」隣接領域（Ｕｐ７０隣接領域、配列番号９）の３’の２８３ｂｐ、および４３１ｂｐ「クラシカルな」隣接領域（Ｕｐ７１隣接領域、配列番号１０）の５’の１１４ｂｐと同一である。これらのトランケートされた隣接領域は、配列番号１３として含まれる名称Ｕｐ７０隣接領域（２８３ｂｐ）、および配列番号１４として含まれる名称Ｕｐ７１隣接領域（１４４ｂｐ）である。これらの様々な隣接領域は、同じＯＲＦ７０挿入部位を規定する。隣接領域は、配列番号９、１１、１３などの１つの「左」隣接領域および配列番号１０、１２、１４などの１つの「右」隣接領域というペアで、常に使用される。
【００２９】
本発明のベクターのさらなる態様では、ベクターは、
（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
（ｉｉ）配列番号９ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号１１ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、ならびに配列番号１３ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの左ＵＳ４（ＯＲＦ７０）隣接領域と、
（ｉｉｉ）配列番号１０ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号１２ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、ならびに配列番号１４ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの右ＵＳ４（ＯＲＦ７０）隣接領域と
をさらに含む。
【００３０】
本発明は、
（ｉ）目的の第１の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
配列番号１９ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２６ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４３隣接領域と、
配列番号２０ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２７ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４４隣接領域と
を含み、かつ
（ｉｉ）目的の第２の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
配列番号９ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号１１ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、ならびに配列番号１３ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの左ＵＳ４（ＯＲＦ７０）隣接領域と、
配列番号１０ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号１２ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、ならびに配列番号１４ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの右ＵＳ４（ＯＲＦ７０）隣接領域と
を含むウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ベクター、最も具体的にはＲａｃＨ株に、さらに関する。
【００３１】
本発明のベクターのさらなる態様では、ＵＳ４（ＯＲＦ７０）へのベクター挿入は、ＲａｃＨのＵＳ４（ＯＲＦ７０）内のおよそ８０１ｂｐ部分（配列番号１７）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／もしくは同一配列の欠損によって特徴づけられる。
【００３２】
本発明のベクターのさらなる態様では、ベクターは、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３および配列番号１４ならびにこれらの配列のいずれか１つの７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの隣接領域を含む。
本発明のベクターのさらなる態様では、ベクターは、（ｉ）配列番号９、配列番号１１、および配列番号１３からなる群から選択される少なくとも１つの左ＵＳ４（ＯＲＦ７０）隣接領域と、（ｉｉ）配列番号１０、配列番号１２、および配列番号１４からなる群から選択される少なくとも１つの右ＵＳ４（ＯＲＦ７０）隣接領域とを含む。
【００３３】
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる態様では、目的の第２のさらなるヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列は、ＵＳ４に挿入されており、目的の第３のさらなるヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列は、ＵＬ５６に挿入されている。
本発明のベクターの特定の態様では、目的の遺伝子は、制御配列、好ましくはプロモーター配列に、作動可能に連結されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる態様では、目的の遺伝子は、制御配列、好ましくは、プロモーター配列または本明細書に記載のＥＨＶベクターに、作動可能に連結されており、少なくとも２つの目的の遺伝子が、制御配列、好ましくはプロモーター配列に、作動可能に連結されている。
【００３４】
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる態様では、１つまたは２つもしくはそれ以上の目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列は、ＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイスルポリヘドリンプロモーター、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片、好ましくは、ｐ４３０（配列番号３）である前記機能的断片、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片、好ましくは、ｐ４５５（配列番号４）である前記機能的断片、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、またはｐ４２２（配列番号５）もしくはその機能的断片もしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列からなる群から選択される。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる態様では、少なくとも１つの目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列は、ｐ４２２（配列番号５）またはその機能的断片またはそれらの相補的ヌクレオチド配列である。
本発明のベクターまたは発現カセットの特定の態様では、少なくとも２つの目的の遺伝子は、制御配列、好ましくはプロモーター配列に、作動可能に連結されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、少なくとも２つの目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列は、異なる。
【００３５】
本発明のベクターまたは発現カセットの別の特定の態様では、少なくとも１つの目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列は、ｐ４２２（配列番号５）またはその機能的断片もしくは誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列であり、別の目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列は、ｐ４３０（配列番号３）またはその機能的断片もしくは誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列であり、別の目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列は、ｐ４５５（配列番号４）またはその機能的断片もしくは誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、ポリアデニル化配列は、ＢＧＨｐＡ、７１ｐＡ（配列番号６）、または１８ｐＡ（配列番号７）である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、ＥＨＶベクターまたは発現カセットは、組換えである。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記目的の配列もしくは外来性ヌクレオチド配列または目的の遺伝子は、抗原コード配列である。
【００３６】
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、抗原コード配列は、リスト：シュマレンベルクウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコモルビリウイルス、破傷風菌、結核菌、アクチノバチルス・プルロニューモニアから選択される病原体由来である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、抗原コード配列は、ヘマグルチニンコード配列である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、ブタＡ型インフルエンザウイルス由来である。
【００３７】
ヨーロッパ内で最も高頻度に見られる４つのＡ型インフルエンザ株は、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１（トリＨ１Ｎ１およびパンデミックＨ１Ｎ１）亜型である。それ故、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１（トリＨ１Ｎ１およびパンデミックＨ１Ｎ１）亜型に対して非常に効果があるワクチンであって、したがってこれらのブタＩＡＶ野外株に対して非常に広範な防御を提供するワクチンが、必要である。
さらに、多価ワクチンは、一般に一価ワクチンより対費用効果が高く、時間効率がよいので、多価ワクチンを有することは有利である。
【００３８】
本明細書に記載のＥＨＶ−ベクターベースワクチンは、改変生ワクチン（ＭＬＶ）でないことから、生ＩＡＶが生成されも動物に与えられもせず、結果として、ワクチン株の毒性への潜在的な復帰およびブタまたはヒト由来の野外株との遺伝子組換えまたは再集合を防止するので、ブタＩＡＶに対して究極の安全性を提供する。さらに、死菌ワクチン（現行標準）とは対照的に、ベクターワクチンは、ブタＩＡＶ中和抗体を誘導することのみならず、ＭＨＣクラスＩ経路とＭＨＣクラスＩＩ経路の両方によってブタＩＡＶに対する細胞免疫を強力に刺激することも期待される。それ故、ベクターベースのＳＩＡＶワクチンが必要である。加えて、ＩＡＶヘマグルチニンを発現するベクターワクチンは、インフルエンザウイルスの他の抗体誘導タンパク質がベクターワクチンの一部ではないので、感染動物とワクチン接種を受けた動物との区別（ＤＩＶＡ）を可能にする。したがって、ＮＰおよびＮは両方ともウイルス構造タンパク質であり、標準的な死菌ワクチンに含有されるが、ワクチン接種は、ＮＰ（核タンパク質）に特異的な抗体もＮ（ノイラミニダーゼ）に特異的な抗体も誘導しないだろう。
【００３９】
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、外来性抗原コード配列は、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ亜型は、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８からなる群から選択される。
【００４０】
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、外来性抗原コード配列は、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２５９５４３／２００３（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｄｅｎｍａｒｋ／１３７７２−１／２００３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／ＭＤ００４０３５２Ｒ／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｈｕｎｇａｒｙ／１３５０９／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１３９６２／９５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｃｏｔｅｓ  ｄ’Ａｒｍｏｒ／１１２１／００（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／１／７７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／２３６１９／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｃｏｔｅ  ｄ’Ａｒｍｏｒ／３６３３／８４、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／１９５８５２／９２、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｆｉｎｉｓｔｅｒｅ／２８９９／８２、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／９／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８１／７８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｌｌｉｎｏｉｓ／１０００８４／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｌｌｉｎｏｉｓ／１０００８５Ａ／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｌｌｉｎｏｉｓ／２１５８７／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｎｄｉａｎａ／１７２６／８８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｎｄｉａｎａ／９Ｋ０３５／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｎｄｉａｎａ／Ｐ１２４３９／００、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／３０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／１５／３０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／５３３／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／５６９／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／３４２１／９０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／８５４８−１／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／９３０／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／１７６７２／８８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１５１３−１／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１５２３／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｋｏｒｅａ／ＣＹ０２／０２、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／５５５５１／００、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／５９３／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／９０８８−２／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｅｂｒａｓｋａ／１／９２、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｅｂｒａｓｋａ／２０９／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／１２／８５、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１６４９７／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／３５９２２／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／９３５２３／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／９８２２５／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｅｄｅｎｒｏｄｅ／７Ｃ／９６、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｈｉｏ／８９１／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｋｌａｈｏｍａ／１８７１７／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｋｌａｈｏｍａ／１８０８９／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｎｔａｒｉｏ／０１９１１−１／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｎｔａｒｉｏ／０１９１１−２／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｎｔａｒｉｏ／４１８４８／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｎｔａｒｉｏ／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｑｕｅｂｅｃ／１９２／８１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｑｕｅｂｅｃ／１９２／９１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｑｕｅｂｅｃ／５３９３／９１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｔａｉｗａｎ／７３１０／７０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ／２４／７７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｔｅｘａｓ／４１９９−２／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１２５／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１３６／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１６３／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１６４／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１６６／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１６８／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２３５／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２３８／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／４５７／９８５、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／４５８／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／４６４／９８およびＡ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１４０９４／９９からなる株の群から選択される。
【００４１】
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、外来性抗原コード配列は、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２）からなる株の群から選択される。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、外来性抗原コード配列は、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ亜型は、Ｈ１および／またはＨ３である。
【００４２】
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、抗原コード配列は、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、ＥＨＶベクターまたは発現カセットは、ＮＰ（核タンパク質）インフルエンザ抗原コード配列もＮ（ノイラミニダーゼ）インフルエンザ抗原コード配列も含まない。
【００４３】
ｐ４２２を有するＵＬ４３のＨ１ｐｄｍ：
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、プロモーター配列ｐ４２２（配列番号５）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列は、配列番号４４（Ｈ１ｐｄｍ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、ＥＨＶベクターは、２つまたはそれより多くのヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列を含む。
【００４４】
ｐ４３０を有するＵＬ５６のＨ１ａｖ：
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、配列番号４６（Ｈ１ａｖ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、ＵＬ５６に挿入されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、本明細書に記載のヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、プロモーター配列ｐ４３０（配列番号３）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【００４５】
ｐ４５５を有するＵＳ４のＨ３：
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、配列番号４５（Ｈ３）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列である。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、前記さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、ＵＳ４に挿入されている。
本発明のベクターまたは発現カセットのさらなる特定の態様では、本明細書に記載のヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列は、プロモーター配列ｐ４５５（配列番号４）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている。
【００４６】
組合せ
本発明は、
ＵＬ４３に挿入された配列番号４４（Ｈ１ｐｄｍ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列ｐ４２２（配列番号５）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と、さらに、
ＵＬ５６に挿入された配列番号４６（Ｈ１ａｖ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列ｐ４３０（配列番号３）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と
を含むウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）にさらに関する。
【００４７】
本発明は、
ＵＬ４３に挿入された配列番号４４（Ｈ１ｐｄｍ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列ｐ４２２（配列番号５）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と、さらに
ＵＳ４に挿入された配列番号４５（Ｈ３）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列ｐ４５５（配列番号４）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と
を含むウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）にさらに関する。
【００４８】
本発明は、
ＵＬ４３に挿入された配列番号４４（Ｈ１ｐｄｍ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列ｐ４２２（配列番号５）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と、さらに
ＵＬ５６に挿入された配列番号４６（Ｈ１ａｖ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列ｐ４３０（配列番号３）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と、さらに
ＵＳ４に挿入された配列番号４５（Ｈ３）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されているプロモーター配列ｐ４５５（配列番号４）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列と
を含むウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）にさらに関する。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９からなる群から選択される。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、ＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４である。
本発明のベクターの別の態様では、ＥＨＶベクターは、ＥＨＶ−１、好ましくはＲａｃＨである。
【００４９】
本発明は、
ａ．ＵＬ４３への、目的の第１のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列
を含む、ベクターまたはウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）にさらに関し、
ｂ．前記目的の第１のヌクレオチド配列は、制御核酸配列／プロモーター配列、好ましくは、ｐ４５５、ｐ４３０またはｐ４２２と作動可能に連結されていてもよく、
ｃ．前記目的の第１のヌクレオチド配列は、（さらなる）制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは、ＢＧＨｐＡ、７１ｐＡ（配列番号６）または１８ｐＡ（配列番号７）と作動可能に連結されていてもよい。
【００５０】
特定の態様では、ベクターまたはＥＨＶは、
ａ．第２の挿入部位、好ましくはＵＬ５６またはＵＳ４への、目的の第２のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列
をさらに含み、
ｂ．前記目的の第２のヌクレオチド配列は、制御核酸配列／プロモーター配列、好ましくは、ｐ４５５、ｐ４３０またはｐ４２２と作動可能に連結されていてもよく、
ｃ．前記目的の第２のヌクレオチド配列は、（さらなる）制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは、ＢＧＨｐＡ、７１ｐＡ（配列番号６）または１８ｐＡ（配列番号７）と作動可能に連結されていてもよい。
【００５１】
特定の態様では、ベクターまたはＥＨＶは、
ａ．第３の挿入部位、好ましくはＵＬ５６またはＵＳ４への、目的の第３のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列
をさらに含み、
ｂ．前記目的の第３のヌクレオチド配列は、制御核酸配列／プロモーター配列、好ましくは、ｐ４５５、ｐ４３０またはｐ４２２と作動可能に連結されていてもよく、
ｃ．前記目的の第３のヌクレオチド配列は、制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは７１ｐＡ、ＢＧＨｐＡ、または１８ｐＡと作動可能に連結されていてもよい。
【００５２】
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、ＥＨＶベクター、具体的にはＥＨＶ−１、より具体的にはＲａｃＨベクターの、ｏｒｆ７０（ＵＳ４）部位への、相同組換えまたはＲＥＤ媒介組換え（両方とも上記を参照されたい）のための隣接領域を含むプラスミド、例えば、トランスファープラスミドｐＵ−ｍＣ７０−ＢＧＨ（配列番号３７）および／またはトランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１（配列番号２８）、および／またはトランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１（配列番号２９）および／またはトランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１Ｋ７１（配列番号３２）にさらに関する。
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、ＥＨＶベクター、具体的にはＥＨＶ−１、より具体的にはＲａｃＨベクターの、ＵＬ４３部位への、相同組換えまたはＲＥＤ媒介組換え（両方とも上記を参照されたい）のための隣接領域を含むプラスミド、例えば、トランスファープラスミドｐＵＵＬ４３−４２２−１８Ｋ１８（配列番号３４）またはｐＵＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ−１８Ｋ１８（配列番号３６）にさらに関する。
【００５３】
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、ＥＨＶベクター、具体的にはＥＨＶ−１、より具体的にはＲａｃＨベクターの、ｏｒｆ１／３（ＵＬ５６）部位への、相同組換えまたはＲＥＤ媒介組換え（両方とも上記を参照されたい）のための隣接領域と、制御核酸、好ましくはプロモーター、好ましくはｐ４３０とを含むプラスミド、例えば、トランスファーベクターｐＵ−１−３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３０）、および／またはトランスファープラスミドｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３１）および／またはトランスファープラスミドｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３３）に、さらに関する。
【００５４】
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、ＥＨＶベクター、具体的にはＥＨＶ−１、より具体的にはＲａｃＨベクターの、ＵＬ４３部位への、相同組換えまたはＲＥＤ媒介組換え（両方とも上記を参照されたい）のための隣接領域と、制御核酸、好ましくはプロモーター、好ましくはｐ４２２とを含むプラスミド、例えば、トランスファーベクターｐＵＵＬ４３−４２２−１８Ｋ１８（配列番号３４）またはトランスファープラスミドｐＵＵＬ４３−４２２−ｍＣ−１８Ｋ１８（配列番号３５）もしくはｐＵＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ−１８Ｋ１８（配列番号３６）にさらに関する。
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、ＥＨＶベクター、具体的にはＥＨＶ−１、より具体的にはＲａｃＨベクターの、ｏｒｆ７０（ＵＳ４）部位への、相同組換えまたはＲＥＤ媒介組換え（両方とも上記を参照されたい）のための隣接領域と、制御核酸、好ましくはプロモーター、好ましくはｐ４５５とを含むプラスミド、例えば、トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１（配列番号２８）、および／またはトランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１（配列番号２９）および／またはトランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１Ｋ７１（配列番号３２）にさらに関する。
【００５５】
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、ＥＨＶベクター、具体的にはＥＨＶ−１、より具体的にはＲａｃＨベクターの、ＵＬ５６（ｏｒｆ１／３）部位への、相同組換えまたはＲＥＤ媒介組換え（両方とも上記を参照されたい）のための隣接領域と、制御核酸配列、好ましくはプロモーター、好ましくはｐ４３０とを含むプラスミド、例えば、トランスファーベクターｐＵ−１−３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３０）、および／またはトランスファープラスミドｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３１）および／またはトランスファープラスミドｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３３）にさらに関する。
【００５６】
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、ＥＨＶベクター、具体的にはＥＨＶ−１、より具体的にはＲａｃＨベクターの、ＵＬ５６（ｏｒｆ１／３部位）への、相同組換えまたはＲＥＤ媒介組換え（両方とも上記を参照されたい）のための隣接領域と、制御核酸配列、好ましくはプロモーター、好ましくはｐ４３０と、第２の制御核酸、好ましくはポリアデニル化配列、好ましくはＢＧＨポリアデニル化配列とを含むプラスミド、例えば、トランスファーベクターｐＵ−１−３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３０）、および／またはトランスファープラスミドｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３１）および／またはトランスファープラスミドｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３３）にさらに関する。
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、ＥＨＶベクター、具体的にはＥＨＶ−１、より具体的にはＲａｃＨベクターの、Ｕｓ４（ｏｒｆ７０部位）への、相同組換えまたはＲＥＤ媒介組換え（両方とも上記を参照されたい）のための隣接領域と、制御核酸配列、好ましくはプロモーター、好ましくはｐ４５５と、第２の制御核酸、好ましくはポリアデニル化配列、好ましくは７１ｐＡポリアデニル化配列とを含むプラスミド、例えば、トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１（配列番号２８）、および／またはトランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１（配列番号２９）および／またはトランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１Ｋ７１（配列番号３２）にさらに関する。
【００５７】
本発明は、ウイルスベクターゲノム内の特異的標的部位への、好ましくは、ＥＨＶベクター、具体的にはＥＨＶ−１、より具体的にはＲａｃＨベクターの、ＵＬ４３部位への、相同組換えまたはＲＥＤ媒介組換え（両方とも上記を参照されたい）のための隣接領域と、制御核酸配列、好ましくはプロモーター、好ましくはｐ４２２と、第２の制御核酸、好ましくはポリアデニル化配列、好ましくは１８ｐＡポリアデニル化配列（配列番号７）とを含むプラスミド、例えば、トランスファーベクターｐＵＵＬ４３−４２２−１８Ｋ１８（配列番号３４）、および／またはトランスファープラスミドｐＵＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ−１８Ｋ１８（配列番号３６）および／またはトランスファープラスミドｐＵＵＬ４３−４２２−ｍＣ−１８Ｋ１８（配列番号３５）にさらに関する。
【００５８】
本発明は、本発明に記載のベクターを産生する方法であって、
ａ．目的の第１のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列をＵＬ４３に挿入するステップを含み、
ｂ．前記目的の第１のヌクレオチド配列を制御核酸配列／プロモーター配列、好ましくはｐ４５５、ｐ４３０またはｐ４２２と作動可能に連結するステップ、
ｃ．前記目的の第１のヌクレオチド配列を（さらなる）制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは、ＢＧＨｐＡ、７１ｐＡ（配列番号６）または１８ｐＡ（配列番号７）と作動可能に連結するステップ
を含んでいてもよい方法にさらに関する。
【００５９】
特定の態様では、方法は、
ａ．目的の第２のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列を第２の挿入部位、好ましくはＵＬ５６またはＵＳ４に挿入するステップ
をさらに含み、
ｂ．前記目的の第２のヌクレオチド配列を制御核酸配列／プロモーター配列、好ましくは、ｐ４５５、ｐ４３０またはｐ４２２と作動可能に連結するステップ、
ｃ．前記目的の第２のヌクレオチド配列を制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは、ＢＧＨｐＡ、７１ｐＡ（配列番号６）または１８ｐＡ（配列番号７）と作動可能に連結するステップ
をさらに含んでいてもよい。
【００６０】
特定の態様では、方法は、
ａ．目的の第３のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列を第３の挿入部位、好ましくはＵＬ５６またはＵＳ４に挿入するステップ
をさらに含み、
ｂ．前記目的の第３のヌクレオチド配列を制御核酸配列／プロモーター配列、好ましくは、ｐ４５５、ｐ４３０またはｐ４２２と作動可能に連結するステップ、
ｃ．前記目的の第３のヌクレオチド配列を制御核酸、例えばポリアデニル化配列、好ましくは、ＢＧＨｐＡ、７１ｐＡ（配列番号６）または１８ｐＡ（配列番号７）と作動可能に連結させるステップ
をさらに含んでいてもよい。
本発明は、本発明に記載のベクターからなり、トランスフェクション試薬および指示リーフレットからなってもよいキットにさらに関する。
本発明は、本発明に記載のベクターを含むことを特徴とする哺乳動物宿主細胞にも関する。
【００６１】
本発明は、宿主細胞を調製する方法であって、
ａ．本発明に記載の哺乳動物宿主細胞に本発明に記載のベクターを感染させるステップ、
ｂ．感染細胞を好適な条件下で培養するステップ
によって特徴づけられ、
ｃ．前記宿主細胞を回収するステップ
によって特徴づけられていてもよい方法にさらに関する。
本発明は、ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクターにおける、具体的にはウマアルファヘルペスウイルス、例えばＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９における、より具体的にはウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）ベクターにおける、最も具体的にはＲａｃＨにおけるＵＬ４３の、前記ウマヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクターにおける挿入部位としての使用であって、前記挿入部位が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列の発現を支持／助長し、前記ＵＬ４３挿入部位が、ＵＬ４３における部分欠損、トランケーション、置換、改変などを含み、ＵＬ４４が、機能性を維持する、使用にさらに関する。
本発明は、免疫原性組成物またはワクチンを製造するための、本発明に記載のベクターまたは本発明に記載の哺乳動物宿主細胞の使用にさらに関する。
【００６２】
本発明は、
ａ．本発明に記載のベクター、および／または
ｂ．ウイルス、改変生ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのような、本発明に記載のベクターにより発現されるポリペプチド
を含み、
ｃ．薬学的または獣医学に許容される担体または賦形剤
を含んでいてもよい、
免疫原性組成物にさらに関し、
好ましくは、前記担体は経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適であり、
好ましくは、前記免疫原性組成物は、ウイルスを含む。特定の態様では、前記ウイルスは、感染性ウイルスである。
【００６３】
本発明は、
ａ．本発明に記載のベクター、および／または
ｂ．改変生ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのような、本発明に記載のベクターにより発現されるポリペプチド、および
ｃ．薬学的または獣医学に許容される担体または賦形剤
を含む、ワクチンまたは医薬組成物にさらに関し、
好ましくは、前記担体は、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適であり、
ｄ．前記ワクチンは、アジュバントをさらに含んでいてもよい。
好ましくは、ワクチンは、本明細書に記載のＥＨＶベクターを含む。好ましくは、免疫原性組成物は、薬学的または獣医学的に許容される担体または賦形剤を含む。
本発明の一態様では、前記薬学的に許容される担体は、細胞培養培地または生理学的再懸濁緩衝剤である。
本発明の一態様では、前記再懸濁緩衝剤は、リン酸緩衝生理食塩水である。
【００６４】
特定の態様では、前記免疫原性組成物またはワクチンまたは医薬組成物は、本発明のベクターまたは発現カセットを含み、前記抗原コード配列は、ブタに感染する病原体に関する。さらなる特定の態様では、前記病原体は、ブタＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）である。さらなる特定の態様では、前記抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）抗原であり、特に前記ヘマグルチニン抗原はＡ型インフルエンザウイルスに由来する。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２））、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２））、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））、および／またはＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２））である。さらなる特定の態様では、前記抗原は、配列番号４４、４５、４６、および４７からなる群から選択される配列番号によりコードされる配列を含むか、またはそのような配列からなる。別の特定の態様では、前記抗原は、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含むか、またはそのような配列からなる。
本発明は、本明細書に記載の１つまたは複数のＥＨＶベクターを含む、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンにさらに関する。
【００６５】
本発明は、ｐ４２２を含むプロモーター配列（配列番号５）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその機能的断片の相補的ヌクレオチド配列にさらに関し、前記プロモーター配列は、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらす。
【００６６】
本発明は、プロモーター配列ｐ４２２（配列番号５）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片およびその機能的断片の相補的ヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、
プロモーター配列が、目的の配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列、より好ましくは目的の異種および／もしくは外来性配列、目的の遺伝子または目的の抗原コード配列に作動可能に連結されており、
前記プロモーター配列が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらし、
前記プロモーター配列が、好ましくは異種プロモーター配列、より好ましくは外来性プロモーター配列である、
発現カセットにも関する。
本発明は、本明細書に記載のプロモーター配列または発現カセットを含む、ベクターにも関する。
本発明のプロモーターまたは発現カセットまたはベクターのさらなる特定の態様では、プロモーター配列の機能的断片は、ｐ４２２の配列（配列番号５）と７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の配列同一性および／または相同性を有する。
【００６７】
本発明のプロモーターまたは発現カセットまたはベクターのさらなる特定の態様では、プロモーター配列の前記機能的断片は、１００ヌクレオチド、好ましくは１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００ヌクレオチド、最も好ましくは４１０もしくは４２０ヌクレオチドの長さを有するか、またはプロモーター配列の機能的断片は、１００〜４２２ヌクレオチド、２００〜４２２ヌクレオチド、３００〜４２２ヌクレオチドもしくは３５０〜４２２ヌクレオチドの間の長さを有する。
【００６８】
本発明の発現カセットまたはベクターのさらなる特定の態様では、前記発現カセットまたはベクターは、終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、またはＩＲＥＳおよび／もしくは２ａペプチドのような制御エレメントなどの、１つまたは複数のさらなる制御配列を含む。
本発明の発現カセットまたはベクターのさらなる特定の態様では、発現カセットまたはベクターは、ポリアデニル化配列、好ましくは、ＢＧＨｐＡ、７１ｐＡ（配列番号６）または１８ｐＡ（配列番号７）をさらに含む。
本発明のベクターのさらなる特定の態様では、前記ベクターは、組換えおよび／または異種および／または外来性ベクターである。
本発明のベクターのさらなる特定の態様では、前記ベクターは、ウイルスベクター、好ましくは、ヘルペスウイルス科、例えば、ウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）、ウマアルファヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ−４）、ならびにＰｒＶ（仮性狂犬病ウイルス）およびＢＨＶ−１（ウシヘルペスウイルス１型）のような他のバリセロウイルス属、アデノウイルス科（ＡｄＶ）、例えばＣＡｄＶ（イヌアデノウイルス）、アデノ随伴ウイルス科、バキュロウイルス科、レンチウイルス科、例えばレトロウイルス属、ならびにポックスウイルス科からなる群から選択される、ウイルスのベクターである。
本発明のベクターのさらなる特定の態様では、前記ベクターは、ヘルペスウイルス科のメンバー、好ましくはアルファヘルペスウイルス属（ｇｅｎｕｓ  Ａｌｐｈａｈｅｒｐｅｓｖｉｒｉｎａｅ）のメンバー、より好ましくはバリセロウイルス亜属のメンバーであり、最も好ましくはウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）である。
【００６９】
ＤＩＶＡ
効果的なＤＩＶＡの大きな利点は、ワクチン接種を受けた動物集団において試料を採取する前に急性感染しているまたはある期間（少なくとも約３週間）感染している食物生産動物（好ましくはブタ）の検出を可能にすること、したがって、動物集団における病原体（好ましくはブタインフルエンザウイルス）の拡散または再導入をモニターする可能性をもたらすことである。したがって、それは、検査室試験の結果に基づいて、ワクチン接種を受けたブタ集団にはブタＡ型インフルエンザウイルスがないと、ある程度の信頼レベルで、推定することを可能にする。
マーカーワクチンは、迅速かつ有効な投与を容易にし、野外ウイルス（疾患関連）で感染した動物とワクチン接種を受けた動物との判別を可能にする。
本発明の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、Ｎ（ノイラミニダーゼ）インフルエンザ抗原コード配列および／またはＮＰ（核タンパク質）インフルエンザ抗原コード配列をコードするいかなる抗原コード配列も含まない。
【００７０】
対照的に、野生型ブタＡ型インフルエンザウイルスでの動物の感染後の、または改変生ワクチンでのワクチン接種を受けた、または不活性化全ウイルスでのワクチン接種を受けた、または母性由来の残留抗体を有する、感染した／ワクチン接種を受けた動物は、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）に対する特異的抗体を産生する／有する。しかし、本発明に記載の免疫原性組成物でのワクチン接種を受けた動物では、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）に対するそのような特異的抗体を検出することができない。
【００７１】
本発明の免疫原性組成物でのワクチン接種のみを受けた動物は、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）に対するいかなる特異的抗体も、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）をそれぞれコードするいかなるブタＡ型インフルエンザウイルス特異的配列も有さないことから、例示的な免疫試験および／またはゲノム解析試験により、本発明の免疫原性組成物でのワクチン接種のみを受けた動物を、野生型ブタインフルエンザウイルスで感染した、または改変生ワクチンでのワクチン接種を受けた、または不活性化全ウイルスワクチンでのワクチン接種を受けた、または母性由来の残留抗体を有する動物と、区別することができる。
【００７２】
本発明は、ブタＡ型インフルエンザウイルスで感染した食物生産動物を、本明細書に記載の免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンでのワクチン接種を受けた食物生産動物と区別する方法であって、
ａ）食物生産動物から試料を採取するステップ、および
ｂ）免疫試験および／またはゲノム解析試験で前記試料を分析するステップ
を含む方法を提供する。
本発明の一態様では、免疫試験は、試料が、ブタインフルエンザのＮ（ノイラミニダーゼ）タンパク質またはＮＰ（核タンパク質）タンパク質を特異的に認識する抗体を含むかどうかを試験することを含む。
本発明の一態様では、食物生産動物は、ブタインフルエンザのＮ（ノイラミニダーゼ）タンパク質またはＮＰ（核タンパク質）タンパク質を特異的に認識する抗体が検出された場合、ブタＡ型インフルエンザウイルスで感染している。
本発明の一態様では、ゲノム解析試験は、試料が、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）をコードするブタＡ型インフルエンザウイルス特異的配列を含むかどうかを試験することを含む。
本発明の一態様では、食物生産動物は、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）をコードするブタＡ型インフルエンザウイルス特異的配列が検出された場合、ブタＡ型インフルエンザウイルスで感染している。
【００７３】
本発明の一態様では、免疫試験は、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）もしくはＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）であり、またはゲノム解析試験は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）もしくはリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）である。
本発明の一態様では、食物生産動物は、ブタである。
本発明の一態様では、試料は、血清試料である。
【００７４】
好ましくは、野生型ＳＩＡＶのＮ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）に特異的な抗体は、ＳＩＡＶで感染している疑いがあるブタまたは本発明に記載のワクチンでのワクチン接種を受けたブタからの気道の切片においてＳＩＡＶ抗原を検出するために使用される。そのような場合、感染したブタの試料、または改変生ワクチンでのワクチン接種を受けた試料、または不活性化全ウイルスワクチンでのワクチン接種を受けた試料、または母性由来の残留抗体を有する試料のみが、前記Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）特異的抗体による陽性結果を示すことになる。対照的に、本発明のワクチンでのワクチン接種を受けたブタの試料は、本発明のワクチンにはそのような抗原が非存在（ヘマグルチニンのみ）であるのため、前述のＮ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）特異的抗体による結果を示さないことになる。
しかし、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）のエピトープは、進化的に保存され、ＳＩＡＶに特異的であり、中和抗体の標的である。
【００７５】
したがって、試験は、例えば、マイクロウェルアッセイプレートと架橋した野生型ＳＩＡＶのＮ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）エピトープを有するウェルを含み得る。前記架橋は、好ましくは、例えばポリ−Ｌ−リシンなどのアンカータンパク質によって行われる。野生型Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）エピトープを得るための発現システムは、当業者に周知である。あるいは、前記Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）エピトープを化学的に合成することもできるだろう。
【００７６】
本発明に記載のワクチンでのワクチン接種のみを受けた動物は、野生型Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）エピトープに対する抗体を産生しなかった。しかし、そのような動物は、本発明に記載のＨＡ（ヘマグルチニン）エピトープに対する抗体を産生した。結果として、いずれの抗体も、野生型Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）エピトープで被覆されたウェルと結合しない。対照的に、ウェルが本発明に記載のＨＡエピトープで被覆されていた場合、抗体は、前記置換ＨＡエピトープと結合する。
本発明の一態様では、ＥＬＩＳＡは、間接的ＥＬＩＳＡ、サンドイッチＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡまたはブロッキングＥＬＩＳＡである。
しかし、様々なＥＬＩＳＡ技術が当業者には周知である。ＥＬＩＳＡは、例示的に、Wensvoort G. et al., 1988 (Vet.Microbiol. 17(2): 129-140)により、Robiolo B. et al., 2010 (J. Virol.Methods. 166(1 -2): 21-27)により、およびColijn, E.O. et al., 1997 (Vet. Microbiology 59: 15-25)により記載されている。
【００７７】
好ましくは、呼吸器細胞および逆転写酵素のＲＮＡ単離、続いてのｃＤＮＡの増幅により、野外ＳＩＡＶで感染しているまたは改変生ワクチンでのワクチン接種を受けたまたは不活性化全ウイルスワクチンでのワクチン接種を受けたまたは母性由来の残留抗体を有する動物と、本発明のワクチンでのワクチン接種のみを受けた動物とを区別する試験が、提供される。Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）に特異的なプライマーを使用して、ＰＣＲを行うことができる。そのような場合、ブタは、陽性ＰＣＲシグナルがあった場合、野生型ＳＩＡＶで感染している。しかし、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）特異的配列を増幅できなかった場合、動物は、本発明のワクチンでのワクチン接種を受けていた。
【００７８】
さらに、Ｎ（ノイラミニダーゼ）および／またはＮＰ（核タンパク質）および／または特異的ＨＡ（ヘマグルチニン）のいずれかを認識する、リアルタイムベース技術のプライマーおよび／またはプローブを使用してもよい。しかし、そのような方法は、当技術分野において周知である。
本発明の別の態様では、ゲノム解析試験は、ＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）、ＲＴ−ＰＣＲ（逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応）またはリアルタイムＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）である。
【００７９】
本発明は、感染と関連するまたは感染によって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を低減するための免疫原性組成物またはワクチンを調製する方法であって、
ａ．本発明に記載の哺乳動物宿主細胞に本発明に記載のベクターを感染させるステップ、
ｂ．感染細胞を好適な条件下で培養するステップ
ｃ．感染細胞培養物を回収するステップ
を含み、
ｄ．ステップｃ）の回収した感染細胞培養物を精製するステップ、
ｅ．前記回収した感染細胞培養物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含んでいてもよい方法にさらに関する。
医学的使用：
本発明は、動物を免役する方法であって、そのような動物に本明細書に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンを投与するステップを含む方法にさらに関する。
本発明は、必要とする動物において病原体によって引き起こされる臨床徴候を軽減または予防する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンを動物に投与するステップを含む方法にさらに関する。
【００８０】
本発明は、必要とする動物においてブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候を軽減または防止する方法であって、治療有効量の本明細書に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンを動物に投与するステップを含む方法にさらに関する。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、前記動物は、ブタ、子ブタもしくは雌ブタ、家禽、ウシ、ウマ、イヌまたはネコである。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンは、１回投与される。
単回用量が１回だけ投与されることは理解される。好ましくは、単回用量は、約０．２ｍｌ〜２．５ｍｌの間、より好ましくは約０．２ｍｌ〜２．０ｍｌの間、よりいっそう好ましくは約０．２ｍｌ〜１．７５ｍｌの間、さらにより好ましくは約０．２ｍｌ〜１．５ｍｌの間、よりいっそう好ましくは約０．４ｍｌ〜１．２５ｍｌの間、よりいっそう好ましくは約０．４ｍｌ〜１．０ｍｌの間の総体積を有し、単回０．５ｍｌ用量または１．０ｍｌ用量が最も好ましい。単回用量は０．５ｍｌ、１ｍｌ、１．５ｍｌまたは２ｍｌの総体積を有することが、最も好ましい。
【００８１】
好ましくは、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、子ブタに、それらが３週齢に達する前に投与される。好ましくは、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、１日齢〜２１日齢、より好ましくは１日齢〜１０日齢の間、よりいっそう好ましくは１日齢〜９日齢の間、よりいっそう好ましくは１日齢〜８日齢の間、よりいっそう好ましくは１日齢〜７日齢の間、よりいっそう好ましくは１日齢〜６日齢の間、よりいっそう好ましくは１日齢〜５日齢の間、よりいっそう好ましくは１日齢〜４日齢の間、よりいっそう好ましくは１日齢〜３日齢の間、よりいっそう好ましくは１または２日齢、および最も好ましくは１日齢の子ブタの各々に投与される。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンは、動物に生後最初の３週間以内、生後最初の２週間以内、生後第１週以内または生後第１日以内に投与される。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンは、２回の投与で投与される。
【００８２】
しかし、初回投与が２回目（追加免疫）投与の投与前に投与される、２回またはそれ以上の投与で、免疫原性組成物を動物に投与することができる。好ましくは、初回投与は、生後最初の２週間以内、より好ましくは生後第１週以内、よりいっそう好ましくは生後第１日以内に投与される。好ましくは、２回目の投与は、初回投与の少なくとも１５日後に投与される。より好ましくは、２回目の投与は、初回投与後１５〜４０日の間に投与される。よりいっそう好ましくは、２回目の投与は、初回投与の少なくとも１７日後に投与される。さらにより好ましくは、２回目の投与は、初回投与後１７〜３０日の間に投与される。よりいっそう好ましくは、２回目の投与は、初回投与の少なくとも１９日後に投与される。さらにより好ましくは、２回目の投与は、初回投与後１９〜２５日の間に投与される。最も好ましくは、２回目の投与は、初回投与の少なくとも２１日後に投与される。２回投与レジメンの好ましい態様では、免疫原性組成物の初回投与と２回目の投与の両方が、同量で投与される。好ましくは、各投与は、上で指定した好ましい量での投与であり、初回および２回目の投与が１ｍｌの用量であるのが最も好ましい。初回および２回目の投与レジメンに加えて、代わりの実施形態は、後続の投与をさらに含む。例えば、３回目、４回目または５回目の投与をこれらの態様で投与することができるだろう。好ましくは、後続の３回目、４回目および５回目の投与レジメンは、初回投与と同量で投与され、これらの投与間の時間枠は、上述の初回投与と２回目の投与の間のタイミングと一致する。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンは、動物に生後第１週以内に投与され、２回目が生後第２、第３または第４週以内に投与される。
【００８３】
免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、好ましくは、局所または全身投与される。従来使用されている好適な投与経路は、経口投与、または非経口投与、例えば、鼻腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、腹腔内投与、皮下投与、および吸入である。しかし、化合物の性質および作用様式に依存して、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンを他の経路で投与することもできる。しかし、免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは筋肉内または鼻腔内投与されるのが最も好ましい。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、前記免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンは、筋肉内または鼻腔内投与される。
【００８４】
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、前記免疫原性組成物またはＤＩＶＡワクチンは、１×１０4〜１×１０9の組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ50)、好ましくは１×１０4〜１×１０8の間のＴＣＩＤ50、よりいっそう好ましくは１×１０4〜１×１０7  ＴＣＩＤ50のＥＨＶベクターを含む。
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンは、１×１０4〜１×１０7  ＴＣＩＤ50のＥＨＶベクターを含む。
【００８５】
本発明の医学的使用または方法のさらなる特定の態様では、前記方法は、同じ種の免疫されていない対照群の動物と比較して、体重減少の軽減、直腸温度低下、臨床症状軽減、（中和）抗体の誘導増加、またはこれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメーターの向上をもたらす。
【００８６】
上記の本発明の医学的使用の特定の態様または上記の動物を免疫する方法では、前記抗原コード配列は、ブタに感染する病原体に関する。さらなる特定の態様では、前記病原体は、ブタＡ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）である。さらなる特定の態様では、前記抗原は、ヘマグルチニン（ＨＡ）抗原であり、特に、前記ヘマグルチニン抗原は、Ａ型インフルエンザウイルスに由来する。例えば、Ａ型インフルエンザウイルスは、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２））、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２））、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））、および／またはＡ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２））である。さらなる特定の態様では、前記抗原は、配列番号４４、４５、４６、および４７からなる群から選択される配列番号によりコードされる配列を含むか、またはそのような配列からなる。別の特定の態様では、前記抗原は、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする配列を含むか、またはそのような配列からなる。
【００８７】
本発明は、動物における病原体と関連する疾患に対するワクチンを、動物、好ましくはブタ、家禽もしくはウシなどの食物生産動物またはネコ、イヌもしくはウマなどの伴侶動物に接種するための、および／または動物において病原体と関連するもしくは病原体によって引き起こされる１つもしくは複数の臨床徴候の発生率もしくは重症度を低減するための、キットであって、
ａ）前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサー、および
ｂ）本発明に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチン
を含み、
ｃ）指示リーフレット
を含んでもよいキットにも関する。
【００８８】
定義
特に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術および科学用語は、出願時に本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。用語の意味および範囲は、明らかであるはずであるが、あらゆる潜在的な多義性がある場合には、本明細書で提供した定義は、任意の辞書の定義または外部の定義よりも優先される。さらに、文脈によって特に必要とされない限り、単数形の用語は複数を含み、複数形の用語は単数を含む。本明細書では、特に言及しない限り、「または（or）」の使用は「および／または（and/or）」を意味する。さらに、用語「含む（including）」ならびに「含む（includes）」および「含まれる（included）」など他の形態の使用は限定されない。本明細書で参照した全ての特許および刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００８９】
本発明の実施は、他に示さない限り、当技術分野の範囲内である、ウイルス学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、タンパク質化学、および免疫学の従来の技術を用いる。そのような技術は文献で完全に説明されている。例えば、Sambrook, Fritsch & Maniatis, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Vols. I, II and III, Second Edition (1989)；DNA Cloning, Vols. I and II (D. N. Glover ed. 1985)；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed. 1984)；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984)；Animal Cell Culture (R. K. Freshney ed. 1986)；Immobilized Cells and Enzymes (IRL press, 1986)；Perbal, B., A Practical Guide to Molecular Cloning (1984)；the series, Methods In Enzymology (S. Colowick and N. Kaplan eds., Academic Press, Inc.)；Protein purification methods - a practical approach (E.L.V. Harris and S. Angal, eds., IRL Press at Oxford University Press)；およびHandbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds., 1986, Blackwell Scientific Publications)を参照。
【００９０】
本発明を詳細に記載する前に、本発明は特定のＤＮＡ、ポリペプチド配列またはプロセスのパラメーターに限定されず、当然変化し得るものと理解される。本明細書で使用する用語は、単に本発明の特定の実施形態を記載する目的のためであり、限定することを意図しないことも理解される。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（a）」「１つの（an）」および「その（the）」は、文脈が特に明確に規定しない限り、複数の参照を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「抗原（an antigen）」という言及は２つまたはそれ以上の抗原の混合物を含み、「賦形剤（an excipient）」という言及は２つまたはそれ以上の賦形剤の混合物を含むなどである。
【００９１】
分子生物学定義
用語「ベクター」は、当技術分野で公知のように、遺伝材料を宿主細胞に伝達するために使用されるポリヌクレオチド構築物、典型的にはプラスミドまたは細菌人工染色体を指す。ベクターは、例えば、細菌、ウイルス、ファージ、細菌人工染色体、コスミド、またはプラスミドであってよい。本明細書で使用する場合、ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかから構成されるまたはＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかを含有することができる。いくつかの実施形態では、ベクターはＤＮＡから構成される。いくつかの実施形態では、ベクターは感染性ウイルスである。そのようなウイルスベクターは、細胞培養でも宿主動物でもウイルスベクターの複製に機能を持たない外来遺伝子を有するように操作されたウイルスゲノムを含有する。本開示の特定の態様に従って、ベクターは、遺伝材料の単なる伝達、宿主細胞または生物のトランスフェクションのため、ワクチン、例えばＤＮＡワクチンとしての使用のため、または遺伝子発現目的のためなど、様々な態様のために使用され得る。遺伝子発現は、遺伝子と呼ばれる特定のポリヌクレオチド配列によって導かれるように細胞におけるタンパク質の生合成を記載する用語である。特定の態様では、ベクターは、適切な環境に存在する場合に、ベクターが有する１つまたは複数の遺伝子によってコードされるタンパク質の発現を導くことができるベクターである「発現ベクター」であってよい。
【００９２】
ベクターおよび発現のためにベクター（または組換え体）を作製および／または使用する方法は、特に、米国特許第４，６０３，１１２号、第４，７６９，３３０号、第５，１７４，９９３号、第５，５０５，９４１号、第５，３３８，６８３号、第５，４９４，８０７号、第４，７２２，８４８号、第５，９４２，２３５号、第５，３６４，７７３号、第５，７６２，９３８号、第５，７７０，２１２号、第５，９４２，２３５号、第３８２，４２５号、ＰＣＴ国際公開第９４／１６７１６号、国際公開第９６／３９４９１号、国際公開第９５／３００１８号、Paoletti, "Applications of pox virus vectors to vaccination: An update, "PNAS USA 93: 11349-11353, October 1996；Moss, "Genetically engineered poxviruses for recombinant gene expression, vaccination, and safety," PNAS USA 93: 11341-11348, October 1996；Smith et al., U.S. Pat. No. 4,745,051(recombinant baculovirus)；Richardson, C. D. (Editor), Methods in Molecular Biology 39, "Baculovirus Expression Protocols" (1995 Humana Press Inc.)；Smith et al., "Production of Human Beta Interferon in Insect Cells Infected with a Baculovirus Expression Vector", Molecular and Cellular Biology, December, 1983, Vol. 3, No. 12, p. 2156-2165；Pennock et al., "Strong and Regulated Expression of Escherichia coli B-Galactosidase in Infect Cells with a Baculovirus vector, "Molecular and Cellular Biology March 1984, Vol. 4, No. 3, p. 406；ＥＰＡ０３７０５７３；米国特許出願第９２０，１９７号、１９８６年１０月１６日出願；欧州特許出願公開第２６５７８５号；米国特許第４，７６９，３３１号
【００９３】
（組換えヘルペスウイルス）；Roizman, "The function of herpes simplex virus genes: A primer for genetic engineering of novel vectors," PNAS USA 93:11307-11312, October 1996；Andreansky et al., "The application of genetically engineered herpes simplex viruses to the treatment of experimental brain tumors," PNAS USA 93: 11313-11318, October 1996；Robertson et al., "Epstein-Barr virus vectors for gene delivery to B lymphocytes", PNAS USA 93: 11334-11340, October 1996；Frolov et al., "Alphavirus-based expression vectors: Strategies and applications," PNAS USA 93: 11371-11377, October 1996；Kitson et al., J. Virol. 65, 3068-3075, 1991；米国特許第５，５９１，４３９号、第５，５５２，１４３号；国際公開第９８／００１６６号；両方とも１９９６年７月３日に出願された、許可された米国特許出願第０８／６７５，５５６号、および第０８／６７５，５６６号（組換えアデノウイルス）；Grunhaus et al., 1992, "Adenovirus as cloning vectors," Seminars in Virology (Vol. 3) p. 237-52, 1993；Ballay et al. EMBO Journal, vol. 4, p. 3861-65, Graham, Tibtech 8, 85-87, April, 1990；Prevec et al., J. Gen Virol. 70, 42434；ＰＣＴ  ＷＯ９１／１１５２５；Felgner et al. (1994), J. Biol. Chem. 269, 2550-2561, Science, 259: 1745-49, 1993；およびMcClements et al., "Immunization with DNA vaccines encoding glycoprotein D or glycoprotein B, alone or in combination, induces protective immunity in animal models of herpes simplex virus-2 disease", PNAS USA 93: 11414-11420, October 1996；および米国特許第５，５９１，６３９号、第５，５８９，４６６号、および第５，５８０，８５９号、ならびに国際公開第９０／１１０９２号、国際公開第９３／１９１８３号、国際公開第９４／２１７９７号、国際公開第９５／１１３０７号、国際公開第９５／２０６６０号；Tang et al., Nature, and Furth et al., Analytical Biochemistry, relating to DNA expression vectorsに開示の方法によるまたは類似してよい。また、国際公開第９８／３３５１０号；Ju et al., Diabetologia, 41: 736-739, 1998 (lentiviral expression system)；Sanford et al.,米国特許第４，９４５，０５０号；Fischbachet al. (Intracel)；国際公開第９０／０１５４３号；Robinson et al., Seminars in Immunology vol. 9, pp. 271-283 (1997), (DNA vector systems)；Szoka et al.,米国特許第４，３９４，４４８号（生細胞にＤＮＡを挿入する方法）；McCormick et al.,米国特許第５，６７７，１７８号（細胞変性ウイルスの使用）；および米国特許第５，９２８，９１３号（遺伝子送達のためのベクター）；ならびに本明細書で引用した他の文献も参照。
用語「ウイルスベクター」は宿主細胞にそれが入り込むと特定の生物活性、例えばベクターによって運ばれた導入遺伝子の発現をもたらすように、組換えＤＮＡ技術によって操作された遺伝子改変ウイルスを記載する。特定の態様では、導入遺伝子は抗原である。ウイルスベクターは標的細胞、組織、または生物において複製可能であってもなくてもよい。
【００９４】
ウイルスベクターの生成は、例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, N.Y. (1989)) or K. Maramorosch and H. Koprowski (Methods in Virology Volume VIII, Academic Press Inc. London, UK (2014))に記載されるように、限定はされないが、制限エンドヌクレアーゼによる消化、ライゲーション、形質転換、プラスミド精製、ＤＮＡシーケンシング、細胞培養へのトランスフェクションの標準的な技術を含む、当技術分野で周知の好適な遺伝子工学技術を使用して達成され得る。
ウイルスベクターは、任意の公知の生物のゲノムからの配列を組み込むことができる。配列は、それらの自然な形態に組み込まれることができ、または任意の方法で改変され、所望の活性を得ることができる。例えば、配列は、挿入、欠損または置換を含むことができる。
【００９５】
ウイルスベクターは２つまたはそれ以上の目的のタンパク質のコード領域を含むことができる。例えば、ウイルスベクターは、目的の第１のタンパク質のコード領域および目的の第２のタンパク質のコード領域を含むことができる。目的の第１のタンパク質および目的の第２のタンパク質は同じまたは異なっていてもよい。いくつかの実施形態では、ウイルスベクターは、目的の第３または第４のタンパク質のコード領域を含むことができる。目的の第３および第４のタンパク質は同じまたは異なっていてもよい。１つのウイルスベクターによってコードされる目的の２つまたはそれ以上のタンパク質の全長は異なり得る。例えば、２つまたはそれ以上のタンパク質の全長は、少なくとも約２００アミノ酸であってよい。少なくとも約２５０アミノ酸、少なくとも約３００アミノ酸、少なくとも約３５０アミノ酸、少なくとも約４００アミノ酸、少なくとも約４５０アミノ酸、少なくとも約５００アミノ酸、少なくとも約５５０アミノ酸、少なくとも約６００アミノ酸、少なくとも約６５０アミノ酸、少なくとも約７００アミノ酸、少なくとも約７５０アミノ酸、少なくとも約８００アミノ酸、またはそれ以上。
好ましいウイルスベクターは、ＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４またはＰｒＶ（仮性狂犬病ウイルス）またはＢＨＶ−１（ウシヘルペスウイルス１）のような他のバリセロウイルス由来などのヘルペスウイルスベクターを含む。
【００９６】
本開示の特定の態様に従って、用語「ウイルスベクター」または代わりに「ウイルス構築物」は、ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−４などのヘルペスウイルス科から選択されるウイルス由来の組換えウイルス構築物を指す。好ましいウイルスベクターは、ＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４に由来するなどのヘルペスウイルスベクターを含む。
用語「ウイルスベクター」および「ウイルス構築物」は交換可能に使用することができる。
用語「構築物」は、本明細書で使用する場合、人工的に生成されたプラスミド、ＢＡＣ、または組換えウイルスなどの組換え核酸を指す。
【００９７】
用語「プラスミド」は、細菌宿主細胞内の細菌染色体とは独立して複製する細胞質のＤＮＡを指す。本発明の特定の態様では、用語「プラスミド」および／または「トランスファープラスミド」は、例えばウイルスベクターへの挿入のための発現カセットの構築に有用な組換えＤＮＡ技術のエレメントを指す。別の特定の態様では、用語「プラスミド」は、ＤＮＡワクチン接種目的のために有用なプラスミドを特定するために使用され得る。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、交換可能であり任意の核酸を指す。
【００９８】
用語「核酸」、「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、「ポリヌクレオチド」、「ポリヌクレオチド配列」、「ＲＮＡ配列」または「ＤＮＡ配列」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドおよびその断片および部分、ならびにゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、それらは一本鎖または二本鎖であってよく、センスまたはアンチセンス鎖を表してよい。配列は、非コード配列、コード配列、または両方の混合であってよい。本発明の核酸配列は、当業者に周知の標準的な技術を使用して調製され得る。
用語「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、５つの生物学的に生じる塩基（アデニン、グアニン、チミン、シトシンおよびウラシル）以外の塩基から構成される核酸も特別に含む。
【００９９】
用語「制御核酸」、「制御エレメント」および「発現調節エレメント」は交換可能に使用され、特定の宿主生物において作動可能に連結されたコード配列の発現に影響し得る核酸分子を指す。これらの用語は、プロモーター、プロモーター配列、ＲＮＡポリメラーゼと転写因子の基本的な相互作用に必要なコアエレメント、上流エレメント、エンハンサーおよび応答エレメントを含む、転写を促進または制御する全てのエレメントに広く使用され、全てのエレメントをカバーする。原核生物における例示的な制御エレメントは、プロモーター、オペレーターシーケンスおよびリボソーム結合部位を含む。真核細胞において使用される制御エレメントは、限定はされないが、転写および翻訳調節配列、例えばプロモーター、エンハンサー、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、ピコルナウイルス２Ａ配列等を含むことができ、コード配列の発現および／または宿主細胞におけるコードポリペプチドの産生を提供および／または制御する。
【０１００】
「配列内リボソーム進入部位」または「ＩＲＥＳ」は、ＩＲＥＳの５’の遺伝子に非依存的に翻訳開始を機能的に促進し、動物細胞において２つのシストロン（オープンリーディングフレーム）が単一の転写物から翻訳されるようにする配列を記載する。ＩＲＥＳは、そのすぐ下流のオープンリーディングフレームの翻訳のための非依存的なリボソーム進入部位を提供する。ポリシストロニックであり得る、すなわちｍＲＮＡから順に翻訳されるいくつかの異なるポリペプチドをコードする細菌ｍＲＮＡとは異なり、動物細胞のほとんどのｍＲＮＡは、モノシストロニックであり１つのポリペプチドのみの合成のためにコードする。真核細胞におけるポリシストロニック転写により、翻訳は翻訳開始部位の最も５’側から開始され、最初の終止コドンで終結され、転写物はリボソームから放出され、ｍＲＮＡにおいて最初にコードされたポリペプチドのみの翻訳をもたらす。真核細胞では、転写物の第２のまたは続くオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたＩＲＥＳを有するポリシストロニック転写は、その下流のオープンリーディングフレームの連続的な翻訳を可能にし、同じ転写物によってコードされた２つまたはそれ以上のポリペプチドを産生する。ＩＲＥＳは様々な長さであってよく、例えば、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）、ピコルナウイルス（例えば、口蹄疫ウイルス、ＦＭＤＶまたはポリオウイルス（ＰＶ）、またはＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）など、様々な起源由来であってよい。ベクター構築物における様々なＩＲＥＳ配列およびそれらの使用が記載され、当技術分野で周知されている。下流のコード配列は、下流の遺伝子の発現にネガティブに影響しないであろう任意の距離でＩＲＥＳの３’端に作動可能に連結されている。ＩＲＥＳと下流の遺伝子の始まりの間の最適なまたは許容的な距離は、距離を変化させ、距離の関数として発現を測定することによって容易に決定することができる。
用語「２ａ」または「２ａペプチド」は、リボソームスキッピングとして定義されたプロセスによって、翻訳の際にタンパク質間の切断を媒介することができるリンカーとして機能する短いオリゴペプチド配列を意味し、２ａおよび「２ａ様」と記載される。そのような２ａおよび「２ａ様」配列（ピコナウイルス科および他のウイルスまたは細胞配列に由来する）は、複数の遺伝子配列を単一の遺伝子に鎖状につなぐために使用され、同じ細胞内でのそれらの共発現を確実にすることができる（Luke and Ryan, 2013参照）。
【０１０１】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」または「プロモーター配列」は、ＲＮＡポリメラーゼの結合を許容し、遺伝子の転写を導くヌクレオチド配列を意味する。典型的には、プロモーターは、遺伝子の５’非コード領域、遺伝子の転写開始部位の近位に位置する。転写の開始に機能するプロモーター内の配列エレメントは、コンセンサスヌクレオチド配列によって特徴づけられることが多い。プロモーターの例としては、限定はされないが、細菌、酵母、植物、ウイルス、および哺乳動物（ウマ、ブタ、ウシ、家禽、イヌ、ネコおよびヒトを含む）などの動物、トリまたは昆虫由来のプロモーターが挙げられる。プロモーターは、誘導性、抑圧可能、および／または構成的であり得る。誘導性プロモーターは、温度の変化など、培養条件のいくつかの変化に応じてそれらの調節下でＤＮＡからの転写のレベルの増加を開始する（Ptashne, 2014）。当業者に周知のプロモーターの例は、例えば、ＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイルスポリヘドリンプロモーターである。
【０１０２】
本発明に関して本明細書で使用される場合、用語プロモーターは、特に、機能的断片、例えば、４ｐｇＧ６００（配列番号１）またはその相補的ヌクレオチド配列のトランケーションを指し、好ましくは、配列同一性は、長さ全体にわたって（少なくとも）７２％である（またはそれより高い）。さらに、本発明に関して本明細書で使用される場合、用語プロモーターは、特に、機能的断片、例えば、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）またはその相補的ヌクレオチド配列のトランケーションを指し、好ましくは、配列同一性は、長さ全体にわたって（少なくとも）７８％である（またはそれより高い）。さらに、本発明に関して本明細書で使用される場合、用語プロモーターは、特に、ｐ４２２（配列番号５）またはその機能的断片またはそれらの相補的ヌクレオチド配列を指す。最も好ましくは、「プロモーター」は、ｐ４３０（配列番号３）、ｐ４５５（配列番号４）、またはｐ４２２（配列番号５）を指す。本発明に関して本明細書でさらに使用される場合、用語プロモーターは、例えば、配列同一性が７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％同一または相同であるような小さい置換、変異または逆位を有する、ｐ４３０（配列番号３）またはｐ４５５（配列番号４）または４ｐｇＧ６００（配列番号１）または４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的誘導体を特に指す。
【０１０３】
用語「４ｐｇＧ４３０」、「ｐ４３０」、「ｇＧ  ４３０」および「４３０」は、本明細書、図、配列表などを通して同義語として、交換可能に使用される。用語「４ｐＭＣＰ４５５」、「ｐ４５５」、「ＭＣＰ  ４５５」および「４５５」は、本明細書、図、配列表などを通して同義語として、交換可能に使用される。用語ｐ４２２および４２２は、本明細書、図、配列表などを通して同義語として、交換可能に使用される。
【０１０４】
用語「エンハンサー」は、ｃｉｓ位置にあるポリヌクレオチド配列を意味し、プロモーターの活性に作用し、したがって、このプロモーターに機能的に結合した遺伝子またはコード配列の転写を刺激する。プロモーターとは異なり、エンハンサーの効果は位置および方向に非依存的であり、したがってそれらは、イントロン内またはコード領域内でさえも転写ユニットの前または後に位置することができる。エンハンサーは、転写ユニットのすぐ近くとプロモーターからかなり距離のある位置の両方に位置し得る。プロモーターと物理的および機能的なオーバーラップを有することもできる。当業者は、様々な起源由来の（およびＧｅｎＢａｎｋなどのデータバンクに寄託された、例えばＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー）多くのエンハンサーを把握しており、それらは非依存的なエレメントまたはポリヌクレオチド配列内にクローニングされたエレメントとして利用可能である（例えば、ＡＴＣＣに寄託され、または市販され、および個々の起源）。多くのプロモーター配列はまた、頻繁に使用されるＣＭＶプロモーターなどのエンハンサー配列も含有する。ヒトＣＭＶエンハンサーは、これまでに同定された最も強いエンハンサーの１つである。誘導性エンハンサーの１つの例は、メタロチオネインエンハンサーであり、グルココルチコイドまたは重金属によって刺激され得る。
【０１０５】
用語「相補的ヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどのポリヌクレオチドの２対の鎖の１つの鎖を記載する。相補的な鎖のヌクレオチド配列は、各アデノシンはチミン（またはＲＮＡの場合はウラシル）、各グアニンはシトシン、逆もまた同様になるように、その対の鎖のヌクレオチド配列を写す。例えば、５’−ＧＣＡＴＡＣ−３’の相補的ヌクレオチド配列は３’−ＣＧＴＡＴＧ−５’、またはＲＮＡの場合は３’−ＣＧＵＡＵＧ−５’である。
【０１０６】
用語「遺伝子」、「目的の遺伝子」は、本明細書で使用する場合、同じ意味を有し、目的の産物をコードする任意の長さのポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、コード配列の前（５’非コードまたは非翻訳配列）および後（３’非コードまたは非翻訳配列）に制御配列をさらに含んでよい。選択された配列は全長またはトランケート、融合、またはタグ化遺伝子であってよく、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはＤＮＡ断片であってよい。ポリペプチドまたはＲＮＡをコードするゲノムＤＮＡは、成熟メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）からスプライシングされ、したがって、同じポリペプチドまたはＲＮＡをコードするｃＤＮＡには存在しない、非コード領域（すなわち、イントロン）を含み得ることが通常理解される。それは、天然配列、すなわち自然発生的な形態であってよく、または変異され、または異なる起源由来の配列を含んでもよく、そうでなければ所望のように改変されてもよい。これらの改変は、選択された宿主細胞またはタグ付けにおけるコドン利用を最適化するコドン最適化を含む。さらに、それらは、例えば（潜在性の）スプライスドナー、アクセプター部位および枝分かれ点、ポリアデニル化シグナル、ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、リボソーム進入部位、繰り返し配列、二次構造（例えば、ステムループ）、転写因子または他の制御因子の結合部位、制限酵素部位等のｃｉｓ作用性部位の除去または付加を含み、限定はされないが、わずかな例を挙げることができる。選択された配列は、分泌、細胞質、核、膜結合または細胞表面ポリペプチドをコードすることができる。
【０１０７】
本明細書で使用する場合、用語「目的のヌクレオチド配列」は、それが必ずしも遺伝子を含まないが、遺伝子または他の遺伝情報のエレメントまたは部分、例えばｏｒｉ（複製オリジン）を含み得るため、目的の遺伝子よりも、より一般的な用語である。目的のヌクレオチド配列は、それがコード配列を含むかどうかに非依存的な任意のＤＮＡまたはＲＮＡ配列であり得る。
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、翻訳開始シグナルまたはＡＴＧもしくはＡＵＧなどの開始コドン、および終止コドンを含み、ポリペプチド配列に潜在的に翻訳され得る、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸配列の長さを指す。
用語「ＵＬ（長いユニーク）」は、ＥＨＶ、好ましくはＥＨＶ−１ゲノムの長いユニーク断片を記載する略語である。
用語「ＵＳ（短いユニーク）」は、ＥＨＶ、好ましくはＥＨＶ−１ゲノムの短いユニーク断片を記載する略語である。
用語「転写」は、細胞でのｍＲＮＡの生合成を記載する。
【０１０８】
用語「発現」は、本明細書で使用する場合、宿主細胞内での核酸配列の転写および／または翻訳を指す。本発明の特定の態様に従って、用語「発現」は、宿主細胞内での異種および／または外来性核酸配列の転写および／または翻訳を指す。宿主細胞における所望の産物の発現レベルは、細胞に存在する相当するＲＮＡまたはｍＲＮＡの量、または選択された配列によってコードされる所望のポリペプチドの量のいずれかに基づいて決定され得る。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡプロテクション、細胞内ＲＮＡのｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションによって、またはＲＴｑＰＣＲ（逆転写後の定量的ＰＣＲ）によって定量され得る。選択された配列から発現されたタンパク質は、様々な方法、例えばＥＬＩＳＡによって、ウェスタンブロットによって、ラジオイムノアッセイによって、免疫沈降によって、タンパク質の生物活性のアッセイによって、またはタンパク質の免疫染色後のＦＡＣＳ解析によって定量され得る。
【０１０９】
用語「発現カセット」または「転写ユニット」または「発現ユニット」は、転写される１つまたは複数の遺伝子を含有するベクター、構築物またはポリヌクレオチド配列内の領域を定義し、転写される遺伝子をコードするヌクレオチド配列ならびに発現カセット内に含有される制御エレメントを含有するポリヌクレオチド配列が、互いに作動可能に連結されている。それらは、プロモーターから転写され、転写は、少なくとも１つのポリアデニル化シグナルによって終結される。１つの特定の態様では、それらは１つの単一のプロモーターから転写される。結果として、異なる遺伝子は少なくとも転写的に連結されている。１つより多くのタンパク質または産物は転写され、各転写ユニット（マルチシストロン転写ユニット）から発現される。各転写ユニットは、ユニット内に含有される任意の選択された配列の転写および翻訳に必要な制御エレメントを含むであろう。各転写ユニットは、同じまたは異なる制御エレメントを含有し得る。例えば、各転写ユニットは、同じターミネーターを含有してもよく、ＩＲＥＳエレメントまたはイントロンは、転写ユニット内での遺伝子の機能的な連結に使用され得る。ベクターまたはポリヌクレオチド配列は１つより多くの転写ユニットを含有し得る。
【０１１０】
用語「発現増加」、「力価または生産性増加」または「発現または生産性改善」により、好適な対照との比較、例えば、ｃＤＮＡによってコードされるタンパク質対イントロン含有遺伝子によってコードされるタンパク質による、宿主細胞に導入された異種および／または外来性配列、例えば治療タンパク質をコードする遺伝子の発現、合成または分泌の増加を意味する。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍または５倍増加した場合、力価または生産性増加がある。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍または少なくとも１．５倍または少なくとも２倍または少なくとも３倍増加した場合も、力価または生産性増加がある。本発明に記載の細胞が、本明細書に記載の本発明による方法に従って培養される場合、およびこの細胞が、特定の生産性または力価において少なくとも１．２倍〜５倍、好ましくは１．５倍〜５倍、より好ましくは２倍〜５倍、特に好ましくは３倍〜５倍増加した場合も、特別な力価または生産性増加がある。「発現増加」は、そのうえ、より多くの細胞が目的の遺伝子／配列を実際に発現することを意味し得る。例えば、発現増加は、本発明の新しいプロモーターが、他のプロモーターと比較して、ウイルス複製サイクル中により長い期間活性であることを意味し得る。
【０１１１】
発現、力価または生産性増加は、本発明に記載の異種ベクターを使用することによって得ることができる。これは、追加の選択可能マーカーとして、１つまたは複数の蛍光タンパク質（例えばＧＦＰ）または細胞表面マーカーを含有する組換え宿主細胞のＦＡＣＳアシスト選択などの他の手法と組み合わせることができる。発現増加を得る他の方法、および使用することができる異なる方法の組合せも、例えばクロマチン構造（例えば、ＬＣＲ、ＵＣＯＥ、ＥＡＳＥ、アイソレーター、Ｓ／ＭＡＲｓ、ＳＴＡＲエレメント）の操作のためのｃｉｓ活性エレメントの使用、（人工）転写因子の使用、内在性または異種および／または外来性遺伝子発現を上方制御するための天然または合成剤による細胞の処置、ｍＲＮＡまたはタンパク質の安定性（半減期）の改善、ｍＲＮＡ翻訳の開始の改善、エピソーム性プラスミドの使用による遺伝子用量の増加（複製オリジンとしてウイルス配列の使用に基づく、例えばＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＥＢＶ、またはＢＰＶ）、ＤＮＡコンカテマーに基づく増幅促進配列またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅システムの使用に基づく。
【０１１２】
「発現増加」を測定するためのアッセイは、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳベースのタンパク質測定、例えば、多重反応モニタリング（ＭＲＭ）；抗体ベースの検出方法、例えば、ウェスタンブロット、ドットブロット、または免疫拡散法、およびフローサイトメトリー；ならびに赤血球凝集反応アッセイによる生物活性の測定である。
「プロモーター活性」は、それぞれのプロモーターの調節下で転写されるｍＲＮＡの定量によって間接的に測定される。ｍＲＮＡは、内因性の標準と比較して、ＲＴｑＰＣＲによって定量される。
用語「ウイルス力価」は、ウイルス調製物の容積当たりの感染ユニットの測定である。ウイルス力価は、生物学的手順のエンドポイントであり、並行して行った試験の特定の割合で効果を示す希釈率として定義される（Reed and Muench, 1938）。特に、１ミリリットル当たりの組織培養感染量５０（ＴＣＩＤ５０／ｍｌ）は、その希釈率で並行して接種された細胞培養の数の５０％が感染する、ウイルス調製物の希釈率を与える。
「転写制御エレメント」は、通常、発現される遺伝子配列の上流のプロモーター、転写開始および終結部位、およびポリアデニル化シグナルを含む。
用語「転写開始部位」は、転写一次産物、すなわちｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる最初の核酸に相当する構築物の核酸を指す。転写開始部位は、プロモーター配列とオーバーラップしてよい。
【０１１３】
「終結シグナル」または「ターミネーター」または「ポリアデニル化シグナル」または「ポリＡ」または転写終結部位」または「転写終結エレメント」は、真核生物のｍＲＮＡの３’端の特異的部位での切断、および切断された３’端での約１００〜２００アデニンヌクレオチド（ポリＡテイル）の配列の転写後組込みを引き起こし、したがって、ＲＮＡポリメラーゼに転写を終結させるシグナル配列である。ポリアデニル化シグナルは切断部位および下流に位置する配列の約１０〜３０ヌクレオチド上流に配列ＡＡＴＡＡＡを含む。ｔｋ  ポリＡ、ＳＶ４０後期および初期ポリＡ、ＢＧＨ  ポリＡ（例えば、米国特許第５，１２２，４５８号に記載）またはハムスター増殖ホルモンポリＡ（国際公開第２０１００１０１０７号）など、様々なポリアデニル化エレメントが公知である。
【０１１４】
「翻訳制御エレメント」は、発現される各個々のポリペプチドに翻訳開始部位（ＡＵＧ）、終止コドンおよびポリＡシグナルを含む。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、いくつかの構築物に含まれてよい。発現を最適化するため、発現される核酸配列の５’−および／または３’−非翻訳領域を除去、付加、または変更し、転写または翻訳のいずれかのレベルで、発現を干渉または減少させ得る、任意の潜在的に余分で不適切な代わりの翻訳開始コドンまたは他の配列を除外することが得策であり得る。コンセンサスリボソーム結合部位（Ｋｏｚａｋ配列）は開始コドンのすぐ上流に挿入され、翻訳、したがって発現を増強することができる。このリボソーム結合部位周辺の増加Ａ／Ｕ含量は、さらにリボソーム結合により効果的である。
【０１１５】
定義により、宿主細胞に挿入された全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれによりコードされるそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、異なる（ウイルス）種に由来する場合、宿主細胞に対して、「外来性」、「外来性配列」、「外来性遺伝子」、「外来性コード配列」と呼ばれる。したがって、本発明のＥＨＶ−４ベースのプロモーターは、ＥＨＶ−１ウイルスベクターを考慮して外来性である。抗原など目的の配列または遺伝子に関して本明細書で使用する場合、用語「外来性」は、目的の前記配列または遺伝子、特に前記抗原はその天然種の背景の外で発現されることを意味する。したがって、ブタＩＡＶ由来のＨ３、Ｈ１ａｖまたはＨ１ｐｄｍ抗原は、ＥＨＶ−１ベクターに関する外来性の抗原の例である。ＥＨＶ−１以外の異なる病原体に由来する任意の配列は、したがって、本発明の特定の態様に記載の目的の外来配列もしくは遺伝子または抗原である。
【０１１６】
定義により、宿主細胞に挿入された全てのポリヌクレオチド配列または全ての遺伝子およびそれによりコードされるそれぞれのタンパク質またはＲＮＡは、宿主細胞に対して、「異種、「異種配列」、「異種遺伝子」、「異種コード配列」、「導入遺伝子」または「異種タンパク質」と呼ばれる。これは、導入される配列または導入される遺伝子が、宿主細胞の内在性配列または内在性遺伝子と同一である場合でさえも適用する。例えば、異なる部位で、またはＥＨＶ−４野生型ウイルスにおいてよりも改変形態でＥＨＶ−４ウイルスベクターに導入されるＥＨＶ−４プロモーター配列は、定義により、異種配列である。抗原など目的の配列または遺伝子に関して本明細書で使用する場合、用語「異種」は、目的の前記配列または遺伝子、特に前記抗原は、その天然亜種の背景の外で発現されることを意味する。したがって、抗原、例えばＥＨＶ−１を除く任意のウマアルファヘルペスウイルス、例えばＥＨＶ−３、ＥＨＶ−８由来の抗原など、目的の任意の非ＥＨＶ−１特異的配列または遺伝子は、したがって、目的の異種配列もしくは遺伝子または本発明の特定の態様に記載の抗原である。
用語「非天然型」は、この文脈において天然には生じない抗原などの目的の任意の配列または遺伝子、例えば異なる種由来の抗原などの目的のハイブリッド配列もしくは配列もしくは遺伝子、または人工的な変異、挿入、欠損等により天然の産物ではない、抗原などの目的の配列もしくは遺伝子を意味する。
【０１１７】
用語「組換え」は、本発明の明細書を通して、用語「非天然型」、「異種」および「外来性」と交換可能に使用される。したがって、「組換え」タンパク質は、異種または外来性ポリヌクレオチド配列のいずれかから発現されるタンパク質である。ウイルスに関して使用される場合、用語組換えは、ウイルスゲノムの人工的な操作によって産生されるウイルスを意味する。外来性抗原コード配列など、異種または外来性配列を含むウイルスは、組換えウイルスである。用語組換えウイルスおよび用語非天然型ウイルスは、交換可能に使用される。
したがって、用語「異種ベクター」は、異種または外来性ポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。用語「組換えベクター」は、異種または組換えポリヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。
【０１１８】
本明細書で使用する場合、用語「作動可能に連結される」は、制御エレメントと遺伝子またはそのコード領域の間の接続を記載するために使用される。典型的には、遺伝子発現は、１つまたは複数の制御エレメント、例えば、限定はされないが、構成的または誘導性プロモーター、組織特異的制御エレメント、およびエンハンサーの調節下に置かれる。遺伝子またはコード領域は、制御エレメントと「作動可能に連結される（operably linked to）」または「作動可能に連結される（operatively linked to）」または「作動可能に関連する（operably associated with）」と言われ、遺伝子またはコード領域が制御エレメントによって調節または影響されることを意味する。例えば、プロモーターがコード配列の転写または発現に影響する場合、プロモーターはコード配列に作動可能に連結される。
さらに、本明細書の範囲内で、用語「機能的連結」、「機能的に連結された」または「作動可能に連結された」は、２つまたはそれ以上の核酸配列または配列エレメントが、それらが意図した方法で機能するように配置されることを意味する。例えば、ｃｉｓ位置で連結された遺伝子配列の転写を調節または調整することができる場合、ポロモーター／エンハンサーまたはターミネーターは、コード遺伝子配列に機能的に連結される。通常、必ずしもそうではないが、機能的に連結されたＤＮＡ配列は隣接し、２つのポリペプチドコード領域を合わせる必要がある場合または分泌シグナルペプチドの場合、隣接し、リーディングフレームである。しかしながら、作動可能に連結されたプロモーターは、通常、上流に位置し、作動可能に連結されたターミネーターは、通常、コード配列の下流に位置するが、必ずしもそれと隣接していない。エンハンサーは、それらがコード配列の転写を増加する限り、必ずしも隣接していない。このため、それらはコード配列の上流に位置することも、下流に位置することもあり、いくらか距離を隔てていることもある。ポリアデニル化部位は、コード配列を通ってポリアデニル化シグナルまで転写が進行するようにコード配列の３’端に位置する場合、コード配列に作動可能に連結される。連結は、例えば、好適な制限部位もしくは平滑末端でのライゲーションにより、または融合ＰＣＲ法を使用することにより、当技術分野で公知の組換え方法によって達成される。合成オリゴヌクレオチドリンカーまたはアダプターは、好適な制限部位が存在しない場合、従来の実行と一致して使用され得る。
【０１１９】
したがって、プロモーター配列の、用語「機能的断片」または「機能的誘導体」は、断片または誘導体が依然としてプロモーター活性が有効であることを意味する。プロモーター活性を評価する方法の機能アッセイは当業者に周知である（Bustin 2000, Nolan et al. 2006）。そのような機能アッセイの例示的な実施形態としては、例えば、プロモーター動態実験が挙げられる。プロモーターまたはその断片がレポーター導入遺伝子の転写を導く発現カセットを有するベクターウイルスを感染させた細胞は、異なる時間インキュベートされる。全ＲＮＡは、感染後の異なる時間で回収された試料から調製される。ＤＮＡｓｅＩ消化によるコンタミネートしたＤＮＡの破壊後、ＲＮＡは逆転写される。ＲＮＡ調製物からのコンタミネートしたＤＮＡの除去の成功を実証するため、１つの複製試料が逆転写酵素（ＲＴ）の添加によって処理され、２つ目の複製はＲＴの添加無しで処理される。生じるｃＤＮＡは精製され、従来のＰＣＲの鋳型として使用される。ＲＴの添加によって処理された試料のみがＰＣＲ産物を産生するはずである。これらのｃＤＮＡは、次いで、レポーター導入遺伝子のプライマーによるｑＰＣＲに、ウイルスベクターの必須遺伝子（内部標準遺伝子）のプライマーによるものと並行して使用することができ、その転写は、感染および複製の効率のための内部標準を提供する。レポーターのｑＰＣＲ値は、内部標準遺伝子のｑＰＣＲ値を使用して、異なる構築物および感染後の時間の間でノーマライズされる。これは、異なるプロモーターおよびその断片のプロモーター活性の解釈を可能にする。
【０１２０】
「配列相同性」は、本明細書で使用する場合、２つの配列の関連性を決定する方法を指す。配列相同性を決定するため、２つまたはそれ以上の配列が最適にアラインされ、必要であればギャップが導入される。しかしながら、「配列同一性」とは対照的に、配列相同性を決定する場合には、保存的なアミノ酸置換は一致としてカウントされる。
【０１２１】
言い換えると、参照配列と９５％の配列相同性を有する比較できるポリペプチドまたはポリヌクレオチドを得るため、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の参照配列のアミノ酸残基またはヌクレオチドが一致しなければならず、別のアミノ酸またはヌクレオチドとの保存的な置換を含まなければならない。代わりに、参照配列における、保存的な置換を含まない、全アミノ酸残基またはヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までのアミノ酸またはヌクレオチドの数が、参照配列に挿入され得る。好ましくは、相同配列は、少なくとも５０、さらにより好ましくは１００、さらにより好ましくは２５０、さらにより好ましくは５００ヌクレオチドのストレッチを含む。
【０１２２】
当技術分野で公知のように、「配列同一性」は、２つまたはそれ以上のポリペプチド配列または２つまたはそれ以上のポリヌクレオチド配列、すなわち、参照配列と、参照配列と比較される所与の配列の間の関係を指す。配列同一性は、配列が最適にアラインされた後に所与の配列を参照配列と比較することによって決定され、そのような配列のストリング間の一致により決定されるように、最も高い程度の配列類似性を産生する。そのようなアライメントにより、配列同一性は、位置ごとに確認され、例えば配列は、その位置で、ヌクレオチドまたはアミノ酸残基が同一である場合、特定の位置で「同一」である。そのような位置同一性の総数は、次いで参照配列のヌクレオチドまたは残基の総数によって割られ、％配列同一性を与える。配列同一性は、限定はされないが、Computational Molecular Biology, Lesk, A. N., ed., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing：Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York (1993)；Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey (1994)；Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinge, G., Academic Press (1987)；Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York (1991)；およびCarillo, H., and Lipman, D., SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988)に記載のものを含む公知の方法によって容易に算出することができ、その教示は参照により本明細書に組み込まれる。配列同一性を決定する好ましい方法は、試験した配列間で最大の一致を与えるように設計される。配列同一性を決定する方法は、所与の配列間の配列同一性を決定する一般的に利用可能なコンピュータープログラムでコード化される。そのようなプログラムの例としては、限定はされないが、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)）、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)が挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムはＮＣＢＩおよび他の供給元から公的に利用可能である（BLAST Manual, Altschul, S. et al., NCVI NLM NIH Bethesda, MD 20894, Altschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990)、その教示は参照により本明細書に組み込まれる）。これらのプログラムは、所与の配列と参照配列の間に最高レベルの配列同一性を産生するため、デフォルトのギャップ重み付けを使用して配列を最適にアラインする。例として、参照ヌクレオチド配列に対して、例えば、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％「配列同一性」を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドによって、所与のポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列のそれぞれ１００ヌクレオチド当たり１５まで、好ましくは１０まで、さらにより好ましくは５までの点変異を含み得ることを除いて、所与のポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％同一性を有するヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドにおいて、参照配列のヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までが欠損または別のヌクレオチドによって置換され、参照配列の総ヌクレオチドの１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％、６％、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％、０．１％までのヌクレオチドの数が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変異は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置またはそれらの末端位置間のどこでも起こることがあり、参照配列、または参照配列内の１つまたは複数の隣接基のいずれかのヌクレオチド中で個々に分散される。同様に、参照アミノ酸配列に対して、例えば、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する所与のアミノ酸配列を有するポリペプチドによって、所与のポリペプチド配列が、参照アミノ酸配列のそれぞれ１００アミノ酸当たり１５まで、好ましくは１０、９、８、７、６まで、さらにより好ましくは５、４、３、２、１までのアミノ酸変化を含み得ることを除いて、ポリペプチドの所与のアミノ酸配列が参照配列と同一であることが意図される。言い換えると、参照アミノ酸配列と、少なくとも８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、さらにより好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％配列同一性を有する所与のポリペプチド配列を得るため、参照配列のアミノ酸残基の１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％までが欠損または別のアミノ酸と置換され、参照配列のアミノ酸残基の総数の１５％まで、好ましくは１０％、９％、８％、７％まで、さらにより好ましくは５％、４％、３％、２％、１％までのアミノ酸の数が参照配列に挿入され得る。参照配列のこれらの変更は、参照アミノ酸配列のアミノもしくはカルボキシ末端位置、またはそれらの末端位置間のどこでも起こることがあり、参照配列または参照配列内の１つまたは複数の隣接基のいずれかの残基中で個々に分散される。好ましくは、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。しかしながら、配列同一性を決定する場合、保存的置換は一致として含まれない。
【０１２３】
用語「配列同一性」または「パーセント同一性」は、本明細書において交換可能に使用される。本発明の目的のため、２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するため、配列は最適な比較目的のためにアラインされることが本明細書において規定される（例えば、ギャップが、第２のアミノ酸または核酸配列との最適なアライメントのために第１のアミノ酸または核酸の配列に導入され得る）。相当するアミノ酸またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸またはヌクレオチド残基が、次いで比較される。第１の配列の位置が、第２の配列の相当する位置と同じアミノ酸またはヌクレオチド残基によって占められる場合、分子はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一の位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一な位置の数／位置の総数（すなわちオーバーラップする位置）×１００）。好ましくは、２つの配列は同じ長さである。
配列比較は、比較される２つの配列の全長にわたって、または２つの配列の断片にわたって行われ得る。典型的には、比較は、比較される２つの配列の全長にわたって行われる。しかしながら、配列同一性は、例えば、２０、５０、１００またはそれ以上の隣接するアミノ酸残基の領域にわたって行われ得る。
【０１２４】
当業者は、２つの配列間の相同性を決定するために、いくつかの異なるコンピュータープログラムが利用可能であることを知っている。例えば、配列の比較および２つの配列間のパーセント同一性の決定は、数値計算用アルゴリズムを使用して達成され得る。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸または核酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｕｍ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックス、および１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み付けならびに１、２、３、４、５、または６の長さ重み付けのいずれかを使用して、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.accelrys.com/products/gcg/で入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれるＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ（J. Mol. Biol. (48): 444-453 (1970)）アルゴリズムを使用して決定される。当業者は、これら全ての異なるパラメーターがわずかに異なる結果をもたらすが、２つの配列の全体的なパーセンテージ同一性は、異なるアルゴリズムを使用する場合著しくは変更されないことを認識する。
【０１２５】
本発明のタンパク質配列または核酸配列は、「問い合わせ配列」としてさらに使用され、公共のデータベースに対して検索を実施し、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を同定する。そのような検索は、Altschul, et al. (1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のＢＬＡＳＴＮおよびＢＬＡＳＴＰプログラム（バージョン２．０）を使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索はＢＬＡＳＴＰプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実施され、本発明のタンパク質分子に相同のアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付きアライメントを得るため、Altschul et al.  (1997) Nucleic Acids Res. 25(17): 3389-3402に記載されるように、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが利用され得る。ＢＬＡＳＴおよびＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えばＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）のデフォルトのパラメーターが使用され得る。http://www.ncbi.nlm.nih.gov/の国立バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照されたい。
【０１２６】
ＥＨＶ−１およびＥＨＶ−４／組換えベクター技術の定義
用語「ウマ（equid）」または「ウマ（equine）」または「ウマ（equin）」は、ウマ、ロバ、およびシマウマを含み、好ましくはウマである、ウマ科を意味するまたはウマ科に属する。さらに、用語「ウマ（equid）」または「ウマ（equine）」または「ウマ（equin）」は、ウマ科のメンバーのハイブリッドも包含する（例えば、ラバ、ケツテイ等）。
「ヘルペスウイルス」または「ヘルペスウイルスベクター」は、ヘルペスウイルス目のヘルペスウイルス科の種を指す。
【０１２７】
用語「ウマヘルペスウイルスベクター」または「ウマヘルペスウイルス」または「ＥＨＶ」は、ウマに感染するヘルペスウイルス科のメンバーを意味する。これまでのところ、８つの異なる種のウマヘルペスウイルスが同定され、５つはアルファヘルペスウイルス亜科（ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８、およびＥＨＶ−９）に属し、３つはガンマヘルペスウイルス科に属する。（http://www.ictvonline.org/virustaxonomy.asp Virus Taxonomy: 2015 Release EC 47, London, UK, July 2015; Email ratification 2016 (MSL #30)）。
用語「ＥＨＶ−１」は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス１型を意味する。ＥＨＶ−１の非限定的な参照配列は、例えば野生型ＥＨＶ−１株ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）またはＲａｃＨ（Hubert 1996）。
用語ＥＨＶ−４は、ヘルペスウイルス科のアルファヘルペスウイルス属のバリセロウイルス亜属のメンバー、ウマアルファヘルペスウイルス４型を意味する。
【０１２８】
用語「ＯＲＦ７０に挿入された」は、ウマアルファヘルペスウイルス１型オープンリーディングフレーム７０をコードする位置で、ゲノムＤＮＡにＤＮＡ断片が挿入されたことを意味する。本発明の特定の態様では、言及される挿入は、ＯＲＦ７０の５’の８０１塩基対の欠損をもたらし、３’端の残りの４２３ｂｐは無傷なままで残すが、ｏｒｆ７０遺伝子産物糖タンパク質Ｇの発現を無くす。ＥＨＶ−１を含むいくつかのアルファヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｇは、感染細胞から分泌され、炎症促進性サイトカインの結合によって免疫調節性タンパク質として機能することが示された。ウイルスベクターでのその発現が無くなると、無傷な糖タンパク質Ｇを発現する野生型ＥＨＶ−１と比較した場合、ウイルス感染の免疫原性を増大させるはずである。
用語「ＵＬ４３に挿入された」は、ウマアルファヘルペスウイルス１型オープンリーディングフレームＵＬ４３（ＯＲＦ１７）をコードする位置で、ゲノムＤＮＡにＤＮＡ断片が挿入されたことを意味する。本発明の特定の態様では、言及される挿入は、ＵＬ４３の５’の８７０塩基対の欠損をもたらし、３’末端の残りの３３６ｂｐを無傷なまま残すがＵＬ４３遺伝子産物ｐＵＬ４３の発現を消失させた。ＥＨＶ−１のｐＵＬ４３は、ＭＨＣ−Ｉの提示に干渉することにより、ｐＵＬ５６とともに免疫調節性タンパク質として機能することが示された。
【０１２９】
用語「ＯＲＦ１／３に挿入された」は、ワクチン株ＥＨＶ−１  ＲａｃＨの弱毒化手順中の継代での偶発的な欠損によって、ＯＲＦ１の９０％および全ＯＲＦ２を含む１２８３ｂｐの断片が欠失する位置で、ウイルスゲノムにＤＮＡ断片が挿入されたことを意味する。この挿入部位は、この位置からの導入遺伝子の発現がウイルスの複製と干渉する可能性が極端に少ないと予測されたため、選択された。
ワクチンの定義
「免疫原性または免疫学的組成物」は、組成物に対する細胞または抗体媒介性免疫応答の宿主での免疫学的応答を引き出す少なくとも１つの抗原、またはその免疫原性部分を含む物質の組成物を指す。
【０１３０】
本明細書で使用する用語「抗原」は、当技術分野で周知であり、免疫原性、すなわち免疫原である物質、ならびに免疫学的不応性、または免疫不応答、すなわち外来物質に対する体の防御機構による反応の欠如を誘導する物質を含む。本明細書で使用する場合、用語「抗原」は、エピトープを含有するまたは含む、全長タンパク質ならびにそのペプチド断片を意味することが意図される。
用語「食物生産動物」は、例えば、ブタ、ウシ、家禽、魚等、ヒトによる消費のために使用される動物を意味し、好ましくは、食物生産動物はブタおよびウシを意味し、最も好ましくはブタである。
【０１３１】
本明細書で使用する場合、「免疫原性組成物」は、例えば、本明細書に記載のように免疫学的応答を引き出すウイルス表面タンパク質など、ポリペプチドまたはタンパク質を指し得る。用語「免疫原性断片」または「免疫原性部分」は、１つまたは複数のエピトープを含み、したがって、本明細書に記載の免疫学的応答を引き出すタンパク質またはポリペプチドの断片またはトランケートおよび／または置換形態を指す。一般に、そのようなトランケートおよび／または置換形態、または断片は、全長タンパク質からの少なくとも６個の隣接するアミノ酸を含む。そのような断片は、当技術分野で周知のいくつかのエピトープマッピング技術を使用して同定され得る。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, New Jersey参照。例えば、線状エピトープは、タンパク質分子の部分に相当する多数のペプチドを固体支持体上で同時合成し、ペプチドが依然として支持体に結合しているうちに、ペプチドを抗体と反応させることによって決定され得る。そのような技術は公知であり、当技術分野で記載されている。例えば、米国特許第４，７０８，８７１号；Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3998-4002；およびGeysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23:709-715参照。同様に、構造エピトープは、例えば、Ｘ線結晶解析および二次元核磁気共鳴によるなどアミノ酸の空間的な構造を決定することにより容易に同定される。上記のＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓを参照。合成抗原も、例えばポリエピトープ、隣接エピトープ、および他の組換えまたは合成由来の抗原の定義内に含まれる。例えば、Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23:2777-2781；Bergmann et al. (1996), J. Immunol. 157:3242-3249；Suhrbier, A. (1997), Immunol. and Cell Biol. 75:402-408；およびGardner et al., (1998) 12th World AIDS Conference, Geneva, Switzerland, June 28-July 3, 1998参照。（その教示および内容は全て本明細書に参照により組み込まれる。）
用語「免疫化」は、免疫させる食物産生動物への免疫原性組成物の投与による能動免疫化に関し、それにより、そのような免疫原性組成物に含まれる抗原に対する免疫応答を引き起こす。
用語「必要とする（in need）」または「必要とする（of need）」は、本明細書で使用する場合、投与／処置が健康または臨床徴候へのブーストまたは改善、または本発明に従って免疫原性組成物を受ける動物の健康への任意の他の正の薬効と関連することを意味する。
【０１３２】
本明細書で使用する場合、用語「ワクチン」は、動物の免疫学的応答を誘導する少なくとも１つの免疫学的活性成分、および可能だが必ずではない活性成分の免疫学的活性を増強する１つまたは複数のさらなる成分を含む医薬組成物を指す。ワクチンは、医薬組成物に典型的なさらなる成分をさらに含み得る。区別すると、ワクチンの免疫学的活性成分は、いわゆる改変生ワクチン（ＭＬＶ）でのその元々の形態または弱毒化粒子のいずれかの完全なウイルス粒子、またはいわゆる死菌ワクチン（ＫＶ）での適切な方法によって不活性化された粒子を含み得る。別の形態では、ワクチンの免疫学的活性成分は、生物の適切なエレメント（サブユニットワクチン）を含んでよく、これらのエレメントは、粒子全体を破壊すること、またはそのような粒子を含有する増殖培地のいずれか、および任意選択により所望の構造を産生する続く精製ステップによって、または例えば細菌、昆虫、哺乳動物、もしくは他の種に基づく好適なシステムの使用による適切な操作を含む合成プロセスによって、さらに任意選択により続く単離および精製手順、または好適な医薬組成物（ポリヌクレオチドワクチン接種）を使用する遺伝材料の直接組込みによるワクチンを必要とする動物における合成プロセスの誘導によって生成される。ワクチンは、１つのまたは同時に１つより多くの上記のエレメントを含み得る。本発明の特定の態様内で使用される場合、「ワクチン」は生ワクチンまたは生ウイルスを指し、組換えワクチンとも呼ばれる。本発明の別の特定の態様では、「ワクチン」は、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む不活性化または死菌ウイルスを指す。したがって、ワクチンは、サブユニットワクチンまたは死菌（ＫＶ）または不活性化ワクチンであってよい。
【０１３３】
用語「感染多重度（Ｍ．Ｏ．Ｉ．）」は、どのくらいのウイルス調製物の感染単位、例えばＴＣＩＤ５０が、細胞当たり使用され培養細胞に感染するかを記載する。例えば、０．０１のＭ．Ｏ．Ｉ．は、１つの感染ユニットが接種される培養容器中１００個の細胞全てを意味する。
用語「ＤＮＡワクチン接種」または「ポリヌクレオチドワクチン接種」は、好適な医薬組成物を使用する遺伝材料の直接接種を意味する。
【０１３４】
不活性化の様々な物理的および化学的方法が当技術分野で公知である。用語「不活性化」は、照射（紫外線（ＵＶ）、Ｘ線、電子ビームまたはガンマ照射）、加熱、または化学的に処置され、その免疫原性を保持しながらそのようなウイルスまたは細菌を不活性化または死滅させた、以前は毒性だったまたは非毒性ウイルスまたは細菌を指す。好適な不活性化剤としては、ベータ−プロピオラクトン、バイナリーまたはベータまたはアセチルエチレンイミン、グルテルアルデヒド（gluteraldehyde）、オゾン、およびホルマリン（ホルムアルデヒド）が挙げられる。
ホルマリンまたはホルムアルデヒドによる不活性化のため、ホルムアルデヒドを、典型的には水およびメチルアルコールと混合して、ホルマリンを作製する。メチルアルコールの添加により、活性化プロセス中の分解または交差反応を防ぐ。一実施形態では、３７％ホルムアルデヒド溶液の約０．１〜１％を使用して、ウイルスまたは細菌を不活性化する。材料は不活性化されるが、高用量による副作用が起こるほど多くないことを確実にするように、ホルマリンの量を調節することが重要である。
【０１３５】
より詳細には、ウイルスの文脈における用語「不活性化」は、ウイルスがｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏでそれぞれ複製することができないことを意味し、細菌の文脈における用語「不活性化」は、細菌がｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで増殖できないことを意味する。例えば、用語「不活性化」は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで繁殖し、次いでもはや複製できないように化学的または物理的な手段を使用して不活性化されたウイルスを指し得る。別の例では、用語「不活性化」は、繁殖し、次いでワクチンの成分として使用され得るバクテリンを生じるなど、細菌、細菌の断片または成分の懸濁液を生じる、化学的または物理的な手段を使用して不活性化された細菌を指し得る。
本明細書で使用される場合、用語「不活性化」、「死菌」または「ＫＶ」は交換可能に使用される。
用語「生ワクチン」は、生きた生物または複製可能なウイルスもしくはウイルスベクターのいずれかを含むワクチンを指す。
【０１３６】
「医薬組成物」は、それが投与される生物の、または住み着いている生物の、または生物上の生理学、例えば免疫学的機能を改変することができる１つまたは複数の成分から基本的になる。用語は、限定はされないが、抗生物質または駆虫薬、ならびに、例えば、限定はされないが、プロセシング特性、無菌性、安定性、経腸または非経口経路、例えば、経口、鼻腔内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、または他の好適な経路を介して組成物を投与する可能性、投与後の耐性、または調節性放出特性などの特定の他の目的を達成するために一般に使用される他の構成成分を含む。そのような医薬組成物の１つの非限定的な例は、単に、実証目的のために挙げられ、以下のように調製され得る：感染細胞培養の細胞培養上澄み液は安定剤（例えば、スペルミジンおよび／またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と混合され、混合物は続いて他の方法により凍結乾燥または脱水される。ワクチン接種の前に、混合物は次いで、水溶液（例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または非水性溶液（例えば、油エマルジョン、アルミニウムベースのアジュバント）中で再水和される。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「薬学的にまたは獣医学的に許容される担体」は、ありとあらゆる溶媒、分散培地、コーティング、アジュバント、安定化剤、希釈剤、保存剤、抗菌および抗真菌剤、等張剤、吸着遅延剤などを含む。いくつかの好ましい実施形態、特に本発明での使用のための凍結乾燥免疫原性組成物、安定化剤を含むものは、凍結乾燥またはフリーズドライのための安定剤を含む。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、本発明の免疫原性組成物はアジュバントを含有する。本明細書で使用する場合、「アジュバント」は、水酸化アルミニウムおよびリン酸アルミニウム、サポニン、例えばＱｕｉｌ  Ａ、ＱＳ−２１（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  ＭＡ）、ＧＰＩ−０１００（Ｇａｌｅｎｉｃａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）、油中水型エマルジョン、水中油型エマルジョン、水中油中水型エマルジョンを含み得る。エマルジョンは、特に、軽質流動パラフィンオイル（ヨーロッパ薬局方型）；スクアランまたはスクアレンなどのイソプレノイドオイル；アルケンのオリゴマー化から生じるオイル、特にイソブテンまたはデセン；線状アルキル基を含有する酸のまたはアルコールのエステル、より具体的には、植物油、オレイン酸エチル、プロピレングリコールジ−（カプリル酸／カプリン酸）、グリセリルトリ−（カプリル酸／カプリン酸）またはプロピレングリコールジオレエート；分枝脂肪酸またはアルコールのエステル、特にイソステアリン酸のエステルに基づき得る。オイルは乳化剤と組み合わせて使用され、エマルジョンを形成する。乳化剤は、好ましくは非イオン性界面活性剤、特にソルビタンのエステル、マンニド（例えば、無水マンニトールオレエート）のエステル、グリコールのエステル、ポリグリセリンのエステル、プロピレングリコールのエステル、およびオレイン酸、イソステアリン酸、リシノール酸またはヒドロキシステアリン酸の、エトキシル化されていてもよいエステル、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンコポリマーブロック、特にプルロニック（登録商標）製品、特にＬ１２１である。Hunter et al., The Theory and Practical Application of Adjuvants (Ed.Stewart-Tull, D. E. S.), JohnWiley and Sons, NY, pp51-94 (1995) and Todd et al., Vaccine 15:564-570 (1997)参照。例示的なアジュバントは、"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" edited by M. Powell and M. Newman, Plenum Press, 1995の１４７頁に記載されているＳＰＴエマルジョン、およびこの同じ書籍の１８３頁に記載されているエマルジョンＭＦ５９である。
【０１３９】
アジュバントのさらなる例は、アクリル酸またはメタクリル酸のポリマーおよび無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーから選択される化合物である。有利なアジュバント化合物は、特に糖または多価アルコールのポリアルケニルエーテルと架橋されたアクリル酸またはメタクリル酸のポリマーである。これらの化合物は用語カルボマーで公知である（Phameuropa Vol. 8, No. 2, June 1996）。当業者は、少なくとも３個、好ましくは８個以下のヒドロキシル基を有し、少なくとも３個のヒドロキシルの水素原子が少なくとも２個の炭素原子を有する不飽和脂肪族ラジカルで置き換えられているポリヒドロキシル化化合物と架橋したそのようなアクリルポリマーについて記載している米国特許第２，９０９，４６２号を参照することもできる。好ましいラジカルは、２〜４個の炭素原子を含有するもの、例えば、ビニル、アリルおよび他のエチレン性不飽和基である。不飽和ラジカルは、それ自体がメチルなどの他の置換基を含有し得る。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）の名称で販売されている製品（ＢＦ  Ｇｏｏｄｒｉｃｈ、Ｏｈｉｏ、ＵＳＡ）が特に適している。これらは、アリルスクロースまたはアリルペンタエリスリトールと架橋されている。それらとしては、Ｃａｒｂｏｐｏｌ  ９７４Ｐ、９３４Ｐおよび９７１Ｐを挙げることができる。ＣＡＲＢＯＰＯＬ（登録商標）９７１Ｐの使用が最も好ましい。無水マレイン酸とアルケニル誘導体のコポリマーは、コポリマーＥＭＡ（Ｍｏｎｓａｎｔｏ）であり、これらは無水マレイン酸とエチレンのコポリマーである。これらのポリマーを水に溶解させることにより酸性溶液が生じ、これを、免疫原性組成物、免疫学的組成物またはワクチン組成物自体が組み込まれるアジュバント溶液をもたらすために、好ましくは生理的なｐＨまで中和する。
【０１４０】
さらに好適なアジュバントとしては、多くの他のものもあり、限定はされないが、ＲＩＢＩアジュバント系（Ｒｉｂｉ  Ｉｎｃ．）、ブロックコポリマー（ＣｙｔＲｘ、Ａｔｌａｎｔａ  ＧＡ）、ＳＡＦ−Ｍ（Ｃｈｉｒｏｎ、Ｅｍｅｒｙｖｉｌｌｅ  ＣＡ）、モノホスホリルリピドＡ、アブリジン脂質−アミンアジュバント、大腸菌由来の熱不安定性エンテロトキシン（組換えまたは他の方法）、コレラ毒素、ＩＭＳ１３１４またはムラミルジペプチド、または天然に存在するもしくは組換えサイトカインもしくはその類似体または内在性サイトカイン放出の刺激薬が挙げられる。
【０１４１】
アジュバントは、用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で、好ましくは用量当たり約１００μｇ〜約１０ｍｇの量で、より好ましくは用量当たり約５００μｇ〜約５ｍｇの量で、さらにより好ましくは用量当たり約７５０μｇ〜約２．５ｍｇの量で、最も好ましくは用量当たり約１ｍｇの量で添加することができると予測される。あるいは、アジュバントは、最終製品の容積で約０．０１〜５０％の濃度、好ましくは約２％〜３０％の濃度、より好ましくは約５％〜２５％の濃度、なおさらに好ましくは約７％〜２２％の濃度、および最も好ましくは１０％〜２０％の濃度であってよい。
「希釈剤」としては、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロール等を挙げることができる。等張剤としては、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、およびラクトースを挙げることができる。安定剤としては、とりわけ、アルブミンおよびエチレンジアミン四酢酸のアルカリ塩が挙げられる。
「単離された」は、その天然の状態から「人間の手によって」変更されたこと、すなわち、それが天然に存在する場合、その元々の環境から変更または取り出された、またはその両方であることを意味する。例えば、本明細書でその用語が用いられる場合、生きている生物内に天然に存在するポリヌクレオチドまたはポリペプチドは「単離され」ていないが、その天然の状態で共存する材料から分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、「単離され」ている。
【０１４２】
「弱毒化」は、病原体の毒性を低下させることを意味する。本発明では、「弱毒化」は「非病原性」と同義である。本発明では、弱毒化ウイルスは、感染の臨床徴候を引き起こさないが標的動物における免疫応答を誘導することはできるように毒性を低下させたものであるが、弱毒化ウイルス、特に請求項のようにＥＨＶ−１  ＲａｃＨウイルスベクターを感染させた動物における臨床徴候の発生率または重症度が、弱毒化していないウイルスまたは病原体を感染させ、弱毒化ウイルスを受けていない「対照群」の動物と比較して低下することも意味し得る。この場合、用語「低下する／低下した」は、上記で定義された対照群と比較して少なくとも１０％、好ましくは２５％、さらにより好ましくは５０％、なおより好ましくは６０％、さらにより好ましくは７０％、なおより好ましくは８０％、さらにより好ましくは９０％、および最も好ましくは１００％の低下を意味する。したがって、例えば請求項のように弱毒化ウイルスベクターなどの、弱毒化した非病原性病原体、特に請求項のようにＥＨＶ−１（好ましくはＲａｃＨ）ウイルスベクターが、改変生ワクチン（ＭＬＶ）または改変生免疫原性組成物の生成に好適である。
【０１４３】
用語「処置および／または予防」は、集団における感染（特にブタＡ型インフルエンザウイルス感染）の発生率の減少または特定の感染によって引き起こされるまたは特定の感染（特にブタＡ型インフルエンザウイルス感染）と関連する臨床徴候の重症度の減少を指す。したがって、用語「処置および／または予防」は、病原体によって感染される集団の動物の数の減少（特にブタＡ型インフルエンザウイルス＝その特定のブタＡ型インフルエンザウイルス感染の発生率の低下）、または通常本明細書に提供する有効量の免疫原性組成物を受ける動物の群での感染（特にブタＡ型インフルエンザウイルス感染）と関連するまたは感染（特にブタＡ型インフルエンザウイルス感染）によって引き起こされる臨床徴候の重症度のそのような免疫原性組成物を受けない動物の群と比較した減少を指す。
【０１４４】
「処置および／または予防」は一般に、有効量の本発明の免疫原性組成物の、そのような処置／予防を必要とするまたはそのような処置／予防が有益であり得る動物または動物の集団への投与を含む。用語「処置」は、その動物またはその集団の少なくともいくらかの動物がそのような病原体（特にブタＡ型インフルエンザウイルス）によってすでに感染し、そのような動物はそのような病原体感染（特にブタＡ型インフルエンザウイルス）によって引き起こされるまたはそのような病原体感染（特にブタＡ型インフルエンザウイルス）と関連するいくつかの臨床徴候をすでに示す場合の、有効量の免疫原性組成物の１回の投与を指す。用語「予防」は、病原体（特にブタＡ型インフルエンザウイルス）によるそのような動物のいずれの感染よりも前の、または少なくともそのような動物または動物の群のどの動物もそのような病原体（特にブタＡ型インフルエンザウイルス）による感染によって引き起こされるまたはそのような病原体（特にブタＡ型インフルエンザウイルス）による感染と関連するいずれの臨床徴候も示さない場合の、動物への投与を指す。用語「予防」および「防止」は、本出願において交換可能に使用される。
【０１４５】
本明細書で使用する場合、用語「臨床徴候」は、病原体（特にブタＡ型インフルエンザウイルス）からの動物の感染の徴候を指す。感染の臨床徴候は、選択された病原体によって変わる。そのような臨床徴候の例としては、限定はされないが、呼吸困難、耳炎、ざらざらの被毛、微熱、うつ病、食欲低下が挙げられる。しかしながら、臨床徴候は、限定はされないが、生きた動物から直接観察可能な臨床徴候も挙げられる。生きた動物から直接観察可能な臨床徴候の例としては、鼻汁および眼漏、無気力、咳、喘鳴、動悸、体温上昇、体重減少、脱水症状、跛行、消耗、皮膚の蒼白、発育不全等が挙げられる。
本明細書では、「有効用量」は、限定はされないが、抗原が投与される動物における臨床症状の減少をもたらす免疫応答を引き出す、または引き出すことができる抗原の量を意味する。
【０１４６】
本明細書で使用する場合、用語「有効量」は、組成物の文脈では、動物において感染または付随する疾患の発生率を低下させるまたはその重症度を軽減する免疫応答を誘導することができる免疫原性組成物の量を意味する。特に、有効量は、用量当たりのコロニー形成単位（ＣＦＵ）を指す。あるいは、療法の文脈では、用語「有効量」は、疾患もしくは障害、または１つもしくは複数のその症状の重症度または持続時間を低下または好転させるため、疾患または障害の前進を予防するため、疾患または障害の後退を引き起こすため、疾患または障害に付随する１つまたは複数の症状の再発、発生、発症、または進行を予防するため、または、別の療法または治療剤による予防もしくは処置を増強もしくは改善するために十分である療法の量を指す。
「免疫応答」または「免疫学的応答」は、限定はされないが、目的の（免疫原性）組成物またはワクチンに対する細胞および／または抗体により媒介される免疫応答の発生を意味する。通常、免疫応答または免疫学的応答は、限定はされないが、以下の作用の１つまたは複数を含む：目的の組成物またはワクチンに含まれる１つまたは複数の抗原を特異的に対象とする抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、および／または細胞傷害性Ｔ細胞の産生または活性化。好ましくは、宿主は治療的または防御的な免疫学的（記憶）応答のいずれかを示し、したがって、新しい感染に対する抵抗性が増強され、および／または疾患の臨床的な重症度が低下する。そのような防御は、症状の数、症状の重症度の低下、もしくは病原体の感染に伴う症状の１つまたは複数の欠如、ウイルス血症の発症の遅延、ウイルスの持続性の低下、全ウイルス負荷量の減少および／またはウイルス排泄の減少のいずれかによって実証される。
【０１４７】
「疾患に対する防御」、「防御免疫」、「機能免疫」、「臨床症状の減少」、「中和抗体および／または血清変換の誘導／産生」、および同様の句は、１つまたはそれ以上の本発明の治療用組成物、またはこれらの組合せの投与によって生じる、疾患または状態に対する部分的または完全な応答を意味し、その結果、疾患または感染に暴露された免疫されていない対象において予測されるものよりも生じる有害作用が少ないことを意味する。すなわち、ワクチン接種された対象では感染の有害作用の重症度が低下する。ワクチン接種された対象では、感染が減少し得る、遅くなり得る、または場合により完全に予防され得る。本明細書では、感染の完全な予防を意味する場合には、明確に記載される。完全な予防と記載されていない場合、この用語は、部分的な予防を含む。
【０１４８】
本明細書では、「臨床徴候の発生率および／または重症度の低下」または「臨床症状の減少」は、限定はされないが、野生型感染と比較した、群内の感染した対象の数の減少、感染の臨床徴候を示す対象の数の減少もしくは排除、または１または複数の対象に存在する任意の臨床徴候の重症度の低下を意味する。例えば、病原体負荷量の減少、病原体の排出、病原体の伝染の減少、またはマラリアの任意の症候性の臨床徴候の減少のいずれかを指すべきである。好ましくは、本発明の治療用組成物を受けた１またはそれ以上の対象において、組成物を受けておらず感染する対象と比較して、これらの臨床徴候が少なくとも１０％減少する。より好ましくは、本発明の組成物を受けた対象において臨床徴候が少なくとも２０％、好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％、さらにより好ましくは少なくとも５０％減少する。
【０１４９】
本明細書では、用語「防御の増大」は、限定はされないが、ワクチン接種された対象の群における感染因子による感染に付随する１つまたは複数の臨床症状が、ワクチン接種されていない対象の対照群に対して統計的に優位に減少することを意味する。用語「統計的に有意な臨床症状の減少」は、限定はされないが、感染因子によるチャレンジ後に、ワクチン接種された対象の群における少なくとも１つの臨床症状の発生頻度が、ワクチン接種されていない対照群よりも少なくとも１０％、好ましくは２０％、より好ましくは３０％、さらにより好ましくは５０％、およびさらにより好ましくは７０％低いことを意味する。
「長期にわたる防御」は、少なくとも３週間、より好ましくは少なくとも３ヵ月、なおより好ましくは少なくとも６ヵ月にわたって持続する「改善された有効性」を指す。家畜の場合、長期にわたる防御は、動物が食肉用に販売される平均年齢まで持続するものとされることが最も好ましい。
【０１５０】
ウイルスによって誘導される、用語「ウイルス血症の減少」は、限定はされないが、動物の血流に入るウイルスの減少を意味し、ウイルス血症のレベル、すなわち血清ｍＬ当たりのウイルスＤＮＡまたはＲＮＡのコピー数または血清デシリットル当たりのプラーク形成コロニーの数が、組成物を受けておらず、感染し得る動物と比較して少なくとも５０％、本発明の組成物を受けた動物の血清中で減少する。より好ましくは、ウイルス血症レベルは、本発明の組成物を受けた動物で、少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９９．９％、より好ましくは少なくとも９９．９９％、およびさらにより好ましくは少なくとも９９．９９９％減少する。
【０１５１】
用語「病原体」は、当業者に周知である。しかしながら、用語「病原体」は、細菌またはウイルスを含む。用語「病原体」は、シュマレンベルクウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢症ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコモルビリウイルス、破傷風菌、結核菌、アクチノバチルス・プルロニューモニアのような病原体を含む。
用語「食物産生動物」は、ブタ、ウシ、家禽、魚等、好ましくはブタのようなヒトの消費のために使用される動物を意味する。
本明細書で使用する場合、用語「ウイルス血症」は、動物、特に哺乳動物、トリ、または昆虫の血流中でウイルス粒子が複製および／または循環する状態として特に理解される。
「安全性」は、ワクチン接種された動物において、ワクチン接種後に、限定はされないが、ウイルスに基づくワクチンの毒性への潜在的な復帰、持続性の全身性疾病またはワクチン投与の部位における許容できない炎症などの臨床的に有意な副作用を含む、有害な結果が存在しないことを指す。
用語「ワクチン接種（vaccination）」または「ワクチン接種すること（vaccinating）」またはその変形は、本明細書で使用する場合、限定はされないが、動物に投与されると、動物における免疫応答を直接または間接的に引き出すまたは引き出すことができる本発明の免疫原性組成物の投与を含むプロセスを意味する。
「死亡率」とは、本発明の文脈では、感染によって引き起こされる死亡を指し、感染が、苦痛を予防し、その生涯に人道的な終わりをもたらすために動物を安楽死させるほど重症である状況を含む。
製剤
組成物を投与する対象は、限定はされないが、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、家禽（例えば、ニワトリ）、ヤギ、ネコ、イヌ、ハムスター、マウスおよびラット、を含む動物であることが好ましく、最も好ましくは、哺乳動物はブタである。
【０１５２】
本発明の製剤は、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。ワクチンは、有効な免疫量の１つまたは複数の免疫原性組成物および生理学的に許容されるビヒクルを含む。製剤は投与の形式に適したものであるべきである。
免疫原性組成物は、所望であれば、微量の湿潤剤または乳化剤、またはｐＨ緩衝剤も含有してよい。免疫原性組成物は、液剤、懸濁剤、エマルジョン、錠剤、ピル、カプセル剤、持続放出製剤、または散剤であってよい。経口製剤としては、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、でんぷん、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準の担体を挙げることができる。
【０１５３】
処置の方法
投与の好ましい経路としては、限定はされないが、鼻腔内、経口、皮内、および筋肉内が挙げられる。飲料水での投与、最も好ましくは単回用量が望ましい。当業者は、本発明の組成物が、１用量、２用量、またはそれ以上の用量で、ならびに他の投与経路によって投与することもできることを理解するであろう。例えば、そのような他の経路としては、皮下、皮内、腹腔内、皮内が挙げられ、所望の処置の持続時間および効果に応じて、本発明による組成物は、１回または数回、また断続的に、例えば、数日、数週間または数ヵ月にわたって毎日、異なる投与量、例えば、約１０3〜１０8ＴＣＩＤ５０（上記のウイルス力価を参照）で投与することができる。本発明の特定の態様では、特に生ウイルス／生ワクチンに関して、投与量は約１０3〜１０8ＴＣＩＤ５０である。
組成物は、所望であれば、活性成分を含有する１つまたは複数の単位剤形を含有し得るパックまたはディスペンサーデバイス中に存在してよい。このパックは、例えば、ブリスターパックなどの金属またはプラスチックホイルを含んでよい。このパックまたはディスペンサーデバイスには、投与、好ましくは哺乳動物、特にブタに投与するための指示書が添付されていてよい。そのような容器に関しては、医薬品または生物学的製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形態で通知され、その通知は、ヒトへの投与のための製造、使用または販売機関による認可を反映している。
【０１５４】
抗原定義
用語「ブタインフルエンザウイルス」は、当業者に公知である。用語ブタインフルエンザウイルスは、ブタインフルエンザを引き起こすオルソミクソウイルス科のＡ型またはＣ型インフルエンザウイルスを指す。オルソミクソウイルスは３つの群：Ａ型、Ｂ型およびＣ型を有するが、Ａ型およびＣ型インフルエンザウイルスのみがブタに感染する。好ましくは、ブタインフルエンザウイルスは、Ａ型ブタインフルエンザウイルスである。ブタインフルエンザウイルスの亜型は、Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２、Ｈ３Ｎ２、およびＨ３Ｎ１を含む。Ｈ９Ｎ２およびＨ５Ｎ１はブタにも見出され得る。好ましくは、ブタインフルエンザウイルスは、ブタから単離されたインフルエンザウイルスである。
【０１５５】
用語「ＨＡ」または「Ｈ」、「ＮＡ」または「Ｎ」および「ＮＰ」は当業者に公知である。しかしながら、一般に、Ａ型インフルエンザウイルスは、多くの可能な組合せをもたらし得る（Ｈ１Ｎ１、Ｈ１Ｎ２〜Ｈ２Ｎ１、Ｈ２Ｎ２〜Ｈ５Ｎ１、Ｈ５Ｎ２などと名づけられる）、１７Ｈ（ヘマグルチニン）および１０Ｎ（ノイラミニダーゼ）亜型に分けられる。Ｈ（ヘマグルチニン）およびＮ（ノイラミニダーゼ）は、ＳＩＡＶのようなＡ型インフルエンザウイルスの表面糖タンパク質である。さらに、Ｎは、中和抗体の主要な抗原性標的である。さらに、ＮＰ（ヌクレオタンパク質）はヌクレオカプシドを形成する。
ＤＩＶＡ定義
用語「ＤＩＶＡ（感染動物とワクチン接種を受けた動物の区別）」は、ワクチン接種を受けた動物を自然感染動物と区別するために使用され得るワクチンを指す。
【０１５６】
用語「試料」は、体液の試料、分離細胞の試料、または組織もしくは臓器由来の試料を指す。体液の試料は、周知の技術により得ることができ、好ましくは血液、血漿、血清または尿の試料、より好ましくは血液、血漿または血清の試料を含む。組織または臓器試料は、任意の組織または臓器から、例えば生検により、得ることができる。分離細胞は、体液または組織もしくは臓器から、遠心分離または細胞選別などの分離技術により得ることができる。
用語「得られた」は、好ましくは沈殿、カラムなどを使用する、当業者に公知の単離および／または精製ステップを含み得る
【０１５７】
用語「免疫試験」および「ゲノム解析試験」は、本発明に記載の免疫原性組成物でのワクチン接種を受けた動物と、天然に存在する（疾患関連）ブタインフルエンザウイルスで感染した動物とを区別するための根拠となる。免疫試験の例としては、酵素免疫学的または免疫化学的検出法、例えば、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着検定法）、ＥＩＡ（酵素免疫測定法）、ＲＩＡ（放射免疫測定法）、サンドイッチ酵素免疫試験、蛍光抗体試験（ＦＡＴ）、電気化学発光サンドイッチ免疫測定法（ＥＣＬＩＡ）、解離増強ランタニド蛍光免疫測定法（ＤＥＬＦＩＡ）もしくは固相免疫試験、免疫蛍光検査（ＩＦＴ）、免疫組織学的染色、ウェスタンブロット分析、または当業者が利用可能な任意の他の好適な方法が挙げられる。使用されるアッセイに依存して、抗原または抗体を、酵素、フルオロフォアまたは放射性同位体により標識することができる。例えば、Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc., New York, N.Y. (1994)；およびFrye et al., Oncogen 4: 1153-1157, 1987を参照されたい。
【０１５８】
用語「ゲノム解析試験」は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、リアルタイムＰＣＲ（ｒ−ＰＣＲ）またはリアルタイム逆転写ＰＣＲ（ｒＲＴ−ＰＣＲ）、Ｔｅｍｐｌｅｘ−ＰＣＲ、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、およびポリメラーゼと特異的オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用する等温増幅法に基づく、ゲノム解析方法を指す。前述の増幅方法は、当技術分野において周知である。
【０１５９】
条項
以下の条項が本明細書に記載される：
本発明は、以下の条項を提供する：
１．（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
（ｉｉ）配列番号１９ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２６ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４３隣接領域と、
（ｉｉｉ）配列番号２０ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２７ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一のものからなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４４隣接領域と
を含む発現カセット。
２．条項１に記載の発現カセットを含むウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター。
３．（ｉ）少なくとも１つの目的の外来性ヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列であって、プロモーター配列に作動可能に連結されている目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列と、
（ｉｉ）配列番号１９ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２６ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４３隣接領域と、
（ｉｉｉ）配列番号２０ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列、配列番号２７ならびにその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの上流ＵＬ４４隣接領域と
を含むウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター。
４．ＵＬ４３に挿入された、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列を含むウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター。
５．ＵＬ４３に挿入された、目的の第１のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは抗原コード配列と、第２の挿入部位、好ましくはＵＬ５６またはＵＳ４に挿入された、目的の第２のヌクレオチド配列または遺伝子、好ましくは別の抗原コード配列とを含むウマアルファヘルペスウイルス（ＥＨＶ）ベクター。
【０１６０】
６．ＵＬ４３への挿入が、ＵＬ４３における部分欠損、トランケーション、置換、改変などによって特徴づけられ、ＵＬ４４が機能性を維持する、条項２〜５のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
７．ＵＬ４３への挿入が、ＲａｃＨのＵＬ４３内のおよそ８７０ｂｐ部分（配列番号２１）またはその７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／もしくは同一配列の欠損によって特徴づけられる、条項２〜６のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
８．配列番号１９、配列番号２０、配列番号２６、配列番号２７ならびにこれらの配列のいずれか１つの７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％相同および／または同一配列からなる群から選択される、少なくとも１つの隣接領域を含む、条項２〜７のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
９．（ｉ）配列番号１９、配列番号２６からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ４３隣接領域と、（ｉｉ）配列番号２０、配列番号２７からなる群から選択される少なくとも１つの上流ＵＬ４４隣接領域とを含む、条項２〜８のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
１０．前記目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、天然に存在しない、および／または組換えである、条項２〜９のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは条項１に記載の発現カセット。
１１．前記目的のヌクレオチド配列が、組換えおよび／または異種性および／または外来性である、条項２〜１０のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは条項１もしくは１０に記載の発現カセット。
１２．前記抗原コード配列が、動物、例えば、ブタ、家禽もしくはウシなどの食物生産動物またはネコ、イヌもしくはウマなどの伴侶動物に感染する病原体に関する、条項２〜１１のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは条項１もしくは１０〜１１のいずれか１項に記載の発現カセット。
【０１６１】
１３．終結シグナルまたはポリアデニル化配列などの、追加の制御配列をさらに含む、条項２〜１２のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは条項１もしくは１０〜１２のいずれか１項に記載の発現カセット。
１４．ＵＬ５６および／またはＵＳ４などの別の挿入部位に挿入されていてもよい、少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列をさらに含む、条項２〜１３のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
１５．少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、ＵＬ５６に挿入されている、条項２〜１４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
１６．少なくとも１つのさらなる目的のヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、ＵＳ４に挿入されている、条項２〜１５のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
１７．目的の第２のさらなるヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、ＵＳ４に挿入されており、目的の第３のさらなるヌクレオチド配列、好ましくは別の目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列が、ＵＬ５６に挿入されている、条項２〜１４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
１８．目的の遺伝子が、制御配列、好ましくはプロモーター配列に作動可能に連結されている、条項２〜１７のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター、または少なくとも２つの目的の遺伝子が、制御配列、好ましくはプロモーター配列に作動可能に連結されている、条項５〜１７に記載のＥＨＶベクター。
１９．１つまたは２つもしくはそれ以上の目的の配列または遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列が、ＳＶ４０ラージＴ、ＨＣＭＶおよびＭＣＭＶ最初期遺伝子１、ヒト伸長因子アルファプロモーター、バキュロウイスルポリヘドリンプロモーター、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の機能的断片、好ましくは、ｐ４３０（配列番号３）である前記機能的断片、４ｐｇＧ６００（配列番号１）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の機能的断片、好ましくは、ｐ４５５（配列番号４）である前記機能的断片、４ｐＭＣＰ６００（配列番号２）の相補的ヌクレオチド配列の機能的断片、またはｐ４２２（配列番号５）もしくはその機能的断片もしくはそれらの相補的ヌクレオチド配列からなる群から選択される、条項２〜１８のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは条項１もしくは１０〜１３のいずれか１項に記載の発現カセット。
【０１６２】
２０．少なくとも１つの目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列が、ｐ４２２（配列番号５）またはその機能的断片またはそれらの相補的ヌクレオチド配列である、条項２〜１９のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは条項１もしくは１０〜１３もしくは１９のいずれか１項に記載の発現カセット。
２１．少なくとも２つの目的の遺伝子に作動可能に連結されているプロモーター配列が異なる、条項５〜２０のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
２２．組換えである、条項２〜２１のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは条項１もしくは１０〜１３もしくは１９〜２０のいずれか１項に記載の発現カセット。
２３．前記目的の配列もしくは外来性ヌクレオチド配列または目的の遺伝子が、抗原コード配列である、条項２〜２２のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは条項１もしくは１０〜１３もしくは１９〜２０もしくは２２のいずれか１項に記載の発現カセット。
２４．抗原コード配列が、リスト：シュマレンベルクウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、ブタ生殖器呼吸器症候群ウイルス、ブタサーコウイルス、ブタコレラウイルス、アフリカブタコレラウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、ウシウイルス性下痢ウイルス、狂犬病ウイルス、ネコモルビリウイルス、破傷風菌、結核菌、アクチノバチルス・プルロニューモニアから選択される病原体由来である、条項２〜２３のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは条項１もしくは１０〜１３もしくは１９〜２０もしくは２２〜２３のいずれか１項に記載の発現カセット。
【０１６３】
２５．抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列である、条項２〜２４のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは条項１もしくは１０〜１３もしくは１９〜２０もしくは２２〜２４のいずれか１項に記載の発現カセット。
２６．ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、ブタＡ型インフルエンザウイルス由来である、条項２５に記載のＥＨＶベクターまたは発現カセット。
２７．外来性抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ亜型が、Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３、Ｈ４、Ｈ５、Ｈ６、Ｈ７、Ｈ８、Ｈ９、Ｈ１０、Ｈ１１、Ｈ１２、Ｈ１３、Ｈ１４、Ｈ１５、Ｈ１６、Ｈ１７およびＨ１８からなる群から選択される、条項２５または２６に記載のＥＨＶベクターまたは発現カセット。
２８．外来性抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／２５９５４３／２００３（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｄｅｎｍａｒｋ／１３７７２−１／２００３（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／ＭＤ００４０３５２Ｒ／２００９（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｈｕｎｇａｒｙ／１３５０９／２００７（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１３９６２／９５（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｃｏｔｅｓ  ｄ’Ａｒｍｏｒ／１１２１／００（Ｈ１Ｎ１）、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／１／７７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｃｏｌｏｒａｄｏ／２３６１９／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｃｏｔｅ  ｄ’Ａｒｍｏｒ／３６３３／８４、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｅｎｇｌａｎｄ／１９５８５２／９２、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｆｉｎｉｓｔｅｒｅ／２８９９／８２、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１０／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／９／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／８１／７８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｌｌｉｎｏｉｓ／１０００８４／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｌｌｉｎｏｉｓ／１０００８５Ａ／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｌｌｉｎｏｉｓ／２１５８７／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｎｄｉａｎａ／１７２６／８８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｎｄｉａｎａ／９Ｋ０３５／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｎｄｉａｎａ／Ｐ１２４３９／００、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／３０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／１５／３０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／５３３／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／５６９／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／３４２１／９０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／８５４８−１／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／９３０／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｏｗａ／１７６７２／８８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１５１３−１／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１５２３／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｋｏｒｅａ／ＣＹ０２／０２、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／５５５５１／００、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／５９３／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｍｉｎｎｅｓｏｔａ／９０８８−２／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｅｂｒａｓｋａ／１／９２、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｅｂｒａｓｋａ／２０９／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／１２／８５、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／１６４９７／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／３５９２２／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／９３５２３／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ／９８２２５／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｅｄｅｎｒｏｄｅ／７Ｃ／９６、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｈｉｏ／８９１／０１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｋｌａｈｏｍａ／１８７１７／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｋｌａｈｏｍａ／１８０８９／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｎｔａｒｉｏ／０１９１１−１／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｎｔａｒｉｏ／０１９１１−２／９９、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｎｔａｒｉｏ／４１８４８／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｏｎｔａｒｉｏ／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｑｕｅｂｅｃ／１９２／８１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｑｕｅｂｅｃ／１９２／９１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｑｕｅｂｅｃ／５３９３／９１、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｔａｉｗａｎ／７３１０／７０、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｔｅｎｎｅｓｓｅｅ／２４／７７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｔｅｘａｓ／４１９９−２／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１２５／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１３６／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１６３／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１６４／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１６６／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１６８／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２３５／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／２３８／９７、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／４５７／９８５、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／４５８／９８、Ａ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／４６４／９８およびＡ／Ｓｗｉｎｅ／Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ／１４０９４／９９からなる株の群から選択される、条項２５〜２７のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは発現カセット。
【０１６４】
２９．外来性抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）およびＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２）からなる株の群から選択される、条項２５〜２８のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは発現カセット。
３０．外来性抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ亜型が、Ｈ１および／またはＨ３である、条項２５〜２９のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは発現カセット。
３１．抗原コード配列が、ヘマグルチニンコード配列であり、ヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６および配列番号４７に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、最小９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む、条項２５〜３０のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは発現カセット。
３２．ＮＰ（核タンパク質）インフルエンザ抗原コード配列もＮ（ノイラミニダーゼ）インフルエンザ抗原コード配列も含まない、条項２５〜３１のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは発現カセット。
【０１６５】
３３．プロモーター配列ｐ４２２（配列番号５）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列が、配列番号４４（Ｈ１ｐｄｍ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列に作動可能に連結されている、条項２５〜３２のいずれか１項に記載のＥＨＶベクターまたは発現カセット。
３４．２つまたはそれ以上のヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列を含む、条項２〜３３に記載のＥＨＶベクター。
３５．さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号４６（Ｈ１ａｖ）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列である、条項３４に記載のＥＨＶベクター。
３６．前記さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、ＵＬ５６に挿入されている、条項３５に記載のＥＨＶベクター。
３７．条項３５に記載のヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、プロモーター配列ｐ４３０（配列番号３）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、条項３５または３６に記載のＥＨＶ。
３８．さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、配列番号４５（Ｈ３）に記載のアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、最小９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一性を有するアミノ酸配列をコードする核酸配列である、条項３４〜３７に記載のＥＨＶベクター。
３９．前記さらなるヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、ＵＳ４に挿入されている、条項３８に記載のＥＨＶベクター。
【０１６６】
４０．条項３８に記載のヘマグルチニンインフルエンザ抗原コード配列が、プロモーター配列ｐ４５５（配列番号４）またはその機能的断片もしくは機能的誘導体またはそれらの相補的ヌクレオチド配列に作動可能に連結されている、条項３８または３９に記載のＥＨＶベクター。
４１．ＥＨＶ−１、ＥＨＶ−３、ＥＨＶ−４、ＥＨＶ−８およびＥＨＶ−９からなる群から選択される、条項２〜４０のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
４２．ＥＨＶ−１またはＥＨＶ−４である、条項２〜４１のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
４３．ＥＨＶ−１、好ましくはＲａｃＨである、条項２〜４２のいずれか１項に記載のＥＨＶベクター。
４４．条項２〜４３に記載のベクターを含むことを特徴とする、哺乳動物宿主細胞。
４５．免疫原性組成物またはワクチンを製造するための、条項２〜４３に記載のベクターまたは条項４４に記載の哺乳動物宿主細胞の使用。
４６．ａ．条項２〜４３に記載のベクター、および／または
ｂ．ウイルス、改変生ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのような、条項２〜４３に記載のベクターにより発現されるポリペプチド
を含み、
ｃ．薬学的または獣医学に許容される担体または賦形剤
を含んでいてもよく、好ましくは前記担体が、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適である、
免疫原性組成物であって、
好ましくは、感染性ウイルスなどのウイルスを含む免疫原性組成物。
４７．ａ．条項２〜４３に記載のベクター、および／または
ｂ．改変生ウイルス、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）などのような、条項２〜４３に記載のベクターにより発現されるポリペプチド、および
ｃ．薬学的または獣医学に許容される担体または賦形剤
を含み、好ましくは前記担体が、経口、皮内、筋肉内または鼻腔内適用に好適である、
ワクチンまたは医薬組成物であって、
前記ワクチンが、アジュバントをさらに含んでいてもよい、ワクチンまたは医薬組成物。
【０１６７】
４８．条項２〜４３のいずれか１項に記載の１つまたは複数のＥＨＶベクターを含む、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチン。
４９．感染と関連するまたは感染によって引き起こされる１つまたは複数の臨床徴候の発生率または重症度を低減するための免疫原性組成物またはワクチンを調製する方法であって、
ａ．条項４１に記載の哺乳動物宿主細胞に条項２〜４３に記載のベクターを感染させるステップ、
ｂ．感染細胞を好適な条件下で培養するステップ、
ｃ．感染細胞培養物を回収するステップ
を含み、
ｄ．ステップｃ）の回収した感染細胞培養物を精製するステップ、
前記回収した感染細胞培養物を薬学的に許容される担体と混合するステップ
を含んでいてもよい方法。
５０．動物に免疫する方法であって、前記動物に前記免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンを投与するステップを含む方法で使用するための、条項４６〜４８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチン。
５１．必要とする動物において病原体によって引き起こされる臨床徴候を軽減または防止する方法であって、治療有効量の前記免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンを動物に投与するステップを含む方法で使用するための、条項４６〜４８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチン。
【０１６８】
５２．必要とする動物においてブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候を軽減または防止する方法であって、治療有効量の前記免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンを動物に投与するステップを含む方法で使用するための、条項４６〜４８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチン。
５３．動物を免疫する方法であって、条項４６〜４８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンをそのような動物に投与するステップを含む方法。
５４．必要とする動物において病原体によって引き起こされる臨床徴候を軽減または防止する方法であって、治療有効量の条項４６〜４８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンを動物に投与するステップを含む方法。
５５．必要とする動物においてブタインフルエンザウイルスによって引き起こされる臨床徴候を軽減または防止する方法であって、治療有効量の条項４６〜４８のいずれか１項に記載の免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンを動物に投与するステップを含む方法。
５６．動物が、ブタ、子ブタもしくは雌ブタ、家禽、ウシ、ウマ、イヌまたはネコである、条項５０〜５５のいずれか１項に記載の方法または使用。
５７．免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンが１回投与される、条項５０〜５６のいずれか１項に記載の方法または使用。
５８．免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンが、動物に生後最初の６週間以内、生後最初の２週間以内、生後第１週以内または生後第１日以内に投与される、条項５０〜５７のいずれか１項に記載の方法または使用。
５９．免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンが、２回の投与で投与される、条項５０〜５８のいずれか１項に記載の方法または使用。
【０１６９】
６０．免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンが、動物に生後第１週以内に投与され、２回目が生後第２、第３または第４週以内に投与される、条項５９に記載の方法または使用。
６１．前記免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンが、筋肉内または鼻腔内投与で投与される、条項５０〜６０のいずれか１項に記載の方法または使用。
６２．免疫原性組成物、ワクチンまたはＤＩＶＡワクチンが、１×１０4〜１×１０7  ＴＣＩＤ５０のＥＨＶベクターを含む、条項５０〜６１のいずれか１項に記載の方法または使用。
６３．前記方法が、同じ種の免疫されていない対照群の動物と比較して、体重減少の軽減、直腸温度低下、臨床症状軽減、（中和）抗体の誘導増加、またはこれらの組合せからなる群から選択される有効性パラメーターの向上をもたらす、条項５０〜６２のいずれか１項に記載の方法または使用。
６４．動物における病原体と関連する疾患に対するワクチンを、動物、好ましくはブタ、家禽もしくはウシなどの食物生産動物またはネコ、イヌもしくはウマなどの伴侶動物に接種するための、および／または動物において病原体と関連するもしくは病原体によって引き起こされる１つもしくは複数の臨床徴候の発生率もしくは重症度を低減するための、キットであって、
ａ）前記動物にワクチンを投与することができるディスペンサー、および
ｂ）条項４６に記載の免疫原性組成物、条項４７に記載のワクチン、または条項４８に記載のＤＩＶＡワクチン
を含み、
ｃ）指示リーフレット
を含んでもよいキット。
６５．プロモーター配列が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列、の発現をもたらす、ｐ４２２を含むプロモーター配列（配列番号５）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片またはその機能的断片の相補的ヌクレオチド配列。
【０１７０】
６６．プロモーター配列ｐ４２２（配列番号５）またはその相補的ヌクレオチド配列またはその機能的断片およびその機能的断片の相補的ヌクレオチド配列を含む発現カセットであって、
プロモーター配列が、目的の配列、好ましくは目的の遺伝子、例えば抗原コード配列、より好ましくは目的の異種および／もしくは外来性配列、目的の遺伝子または目的の抗原コード配列に作動可能に連結されており、
前記プロモーター配列が、目的のヌクレオチド配列、好ましくは目的の遺伝子、より好ましくは抗原コード配列の発現をもたらし、
前記プロモーター配列が、好ましくは異種プロモーター配列、より好ましくは外来性プロモーター配列である、
発現カセット。
６７．条項６５または６６に記載のプロモーター配列または発現カセットを含むベクター。
６８．プロモーター配列の機能的断片が、ｐ４２２の配列（配列番号５）と７０％、８０％、８５％、好ましくは９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、より好ましくは９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％の配列同一性および／または相同性を有する、条項６５〜６７のいずれか１項に記載のプロモーターまたは発現カセットまたはベクター。
６９．プロモーター配列の前記機能的断片が、１００ヌクレオチド、好ましくは１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００ヌクレオチド、最も好ましくは４１０もしくは４２０ヌクレオチドの長さを有するか、またはプロモーター配列の機能的断片が、１００〜４２２ヌクレオチド、２００〜４２２ヌクレオチド、３００〜４２２ヌクレオチドもしくは３５０〜４２２ヌクレオチドの間の長さを有する、条項６５〜６８のいずれか１項に記載のプロモーターまたは発現カセットまたはベクター。
７０．ポリアデニル化配列、好ましくは、ＢＧＨｐＡ、７１ｐＡ（配列番号６）または１８ｐＡ（配列番号７）をさらに含む、条項６６〜６９のいずれか１項に記載の発現カセットまたはベクター。
【０１７１】
７１．終結シグナル、ポリアデニル化シグナル、またはＩＲＥＳおよび／もしくは２ａペプチドのような制御エレメントなどの、１つまたは複数のさらなる制御配列を含む、条項６６〜７０のいずれか１項に記載の発現カセットまたはベクター。
７２．組換えおよび／または異種および／または外来性ベクターである、条項６７〜７１のいずれか１項に記載のベクター。
７３．ウイルスベクター、好ましくは、ヘルペスウイルス科、例えば、ウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）、ウマアルファヘルペスウイルス４型（ＥＨＶ−４）、ならびにＰｒＶ（仮性狂犬病ウイルス）およびＢＨＶ−１（ウシヘルペスウイルス１型）のような他のバリセロウイルス属、アデノウイルス科（ＡｄＶ）、例えばＣＡｄＶ（イヌアデノウイルス）、アデノ随伴ウイルス科、バキュロウイルス科、レンチウイルス科、例えばレトロウイルス属、ならびにポックスウイルス科からなる群から選択される、ウイルスベクターである、条項６７〜７２のいずれか１項に記載のベクター。
７４．ヘルペスウイルス科のメンバー、好ましくはアルファヘルペスウイルス属のメンバー、より好ましくはバリセロウイルス亜属のメンバーであり、最も好ましくはウマアルファヘルペスウイルス１型（ＥＨＶ−１）である、条項６７〜７３のいずれか１項に記載のベクター。
【０１７２】
シーケンス概要：
以下の配列は、本発明において本明細書に詳細に記載され、開示される。
プロモーターおよびポリＡ配列
（配列番号１）６００ｂｐ  ＤＮＡ断片４ｐｇＧ６００
（配列番号２）６００ｂｐ  ＤＮＡ断片４ｐＭＣＰ６００：
（配列番号３）詳細には、６００ｂｐプロモーターが、４ｐｇＧについて４３０ｂｐにトランケートされた、新たな名称：ｐ４３０
（配列番号４）および４ｐＭＣＰについて４４９ｂｐにトランケートされた、新たな名称：ｐ４５５
（配列番号５）ｐ４２２プロモーターの配列
（配列番号６）７１ｐＡポリアデニル化配列の配列
（配列番号７）１８ｐＡポリアデニル化配列の配列
挿入領域配列
（配列番号８）ＲａｃＨのＵＳ４（ｏｒｆ７０）配列
（配列番号９）Ｕｐ７０隣接領域（４１７ｂｐ）
（配列番号１０）Ｕｐ７１隣接領域（４３１ｂｐ）
（配列番号１１）１２７２６４〜１２７６８０（隣接領域ｕｐ  ｏｒｆ７０） 
（配列番号１２）１２８４８４〜１２８９１３（隣接領域ｕｐ  ｏｒｆ７１）
（配列番号１３）Ｕｐ７０隣接領域（２８３ｂｐ）＝４１７ｂｐ「クラシカルな」隣接領域の３’の２８３ｂｐと同一
（配列番号１４）Ｕｐ７１隣接領域（１４４ｂｐ）＝４３１ｂｐ「クラシカルな」隣接領域の５’の１４４ｂｐと同一
（配列番号１５）ｗｔ  ａｂ４株のＵＳ４（ｏｒｆ７０）ｎｔ１２７６８１〜１２８９１６の配列
（配列番号１６）野生型ａｂ４（Ｇｅｎｂａｎｋ受入番号ＡＹ６６５７１３．１）ゲノム配列のｏｒｆ７０（ＵＳ４）の欠損部分：ｎｔ１２７６８１〜１２８４８２
（配列番号１７）ＲａｃＨゲノム配列のｏｒｆ７０（ＵＳ４）の欠損部分（完全ゲノム配列が不明であるためｎｔ番号入手不可能）
（配列番号１８）ＲａｃＨのＵＬ４３の配列
（配列番号１９）上流組換え領域Ｕｐ  ＵＬ４３の配列
【０１７３】
（配列番号２０）下流組換え領域ＵＰ  ＵＬ４４の配列
（配列番号２１）ＲａｃＨのＵＬ４３の欠損部分の配列
（配列番号２２）ＲａｃＨのＵＬ４３の保持３’末端の配列
（配列番号２３）ｗｔ  ＥＨＶ−１  Ｖ５９２のＵＬ４３の配列（逆相補的ｎｔ２３０２１〜２４２２６）
（配列番号２４）ｗｔ  ＥＨＶ−１  Ｖ５９２のＵＬ４３の欠損部分（８７０ｂｐ）（逆相補的ｎｔ２３３５３〜２４２２６）
（配列番号２５）ｗｔ  ＥＨＶ−１  Ｖ５９２のＵＬ４３リーディングフレームの保持部分（逆相補的ｎｔ２３０２１〜２３３５４）
（配列番号２６）ｗｔ  ＥＨＶ−１  Ｖ５９２の対応する上流組換え領域Ｕｐ  ＵＬ４３の配列（逆相補的ｎｔ２４２２７〜２４４５２）
（配列番号２７）ｗｔ  ＥＨＶ−１  Ｖ５９２の対応する下流組換え領域Ｕｐ  ＵＬ４４の配列（逆相補的ｎｔ２３０４９〜２３３５４）
プラスミド配列
（配列番号２８）トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１のヌクレオチド配列
（配列番号２９）トランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１のヌクレオチド配列
（配列番号３０）トランスファーベクターｐＵ−１−３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨのヌクレオチド配列
（配列番号３１）トランスファープラスミドｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨのヌクレオチド配列
（配列番号３２）トランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１Ｋ７１のヌクレオチド配列
（配列番号３３）トランスファープラスミドｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−ＢＧＨＫＢＧＨのヌクレオチド配列
（配列番号３４）トランスファーベクターｐＵＵＬ４３−ｐ４２２−１８Ｋ１８のヌクレオチド配列
（配列番号３５）トランスファープラスミドｐＵＵＬ４３−ｐ４２２−ｍＣ−１８Ｋ１８のヌクレオチド配列
（配列番号３６）トランスファープラスミドｐＵＵＬ４３−ｐ４２２−Ｈ１ｐｄｍ−１８Ｋ１８のヌクレオチド配列
（配列番号３７）トランスファープラスミドｐＵｍＣ７０のヌクレオチド配列
プライマー配列
ｏｒｆ７０／ＵＳ４挿入領域について
（配列番号３８）フォワードプライマーＡＧＧＣＴＣＧＴＧＣＧＣＧＧＡＴＡＣＡＴＣＧ
（配列番号３９）リバースプライマーＴＴＣＧＧＧＧＣＴＧＴＴＡＧＡＣＴＣＣＴＣＣ
ｏｒｆ１／３／ＵＬ５６挿入領域について
（配列番号４０）フォワードプライマーＣＣＡＡＣＴＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＡＧＡＣＣＣ
（配列番号４１）リバースプライマーＡＧＣＧＣＧＣＣＣＣＧＴＡＣＣＣＡＧＴＧＧＧ
ＵＬ４３挿入領域について
（配列番号４２）フォワードプライマーＣＧＡＣＧＣＧＣＧＴＣＧＧＡＧＧ
（配列番号４３）リバースプライマーＧＴＴＡＴＡＡＡＣＡＴＡＣＣＡＴＧＣＡＣＣ
Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンのアミノ酸配列
（配列番号４４）ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２））］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＲ０１７４６．１  Ｈ１ｐｄｍ
（配列番号４５）ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２））］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢＳ５０３０２．２  Ｈ３
（配列番号４６）ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＦＲ７６６２３．１  Ｈ１ａｖ
（配列番号４７）ヘマグルチニン［Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／４６７５／２００３（Ｈ１Ｎ２））］；ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＤＫ９８４７６．１*  Ｈ１ｈｕ
【０１７４】
以下の図面は本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれる。本発明は、これらの図面の１つまたは複数を本明細書で提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによってよりよく理解することができる。
【図面の簡単な説明】
【０１７５】
【図１】野生型（ｗｔ）ＥＨＶ−１  ａｂ４株のＵＬ５６（ｏｒｆ１／３）領域と弱毒化ワクチン株ＥＨＶ−１  ＲａｃＨのＵＬ５６（ｏｒｆ１／３）領域とを比較する概略図である。ｏｒｆ１、ｏｒｆ２、ｏｒｆ３＝ＥＨＶ−１ゲノムの最初の３つのオープンリーディングフレーム；ｏｒｆ１は、ＵＬ５６と名づけられた他のアルファヘルペスウイルス属のホモログを有するＦｌａｎｋ  Ａ、Ｆｌａｎｋ  Ｂ＝ｏｒｆ１／３（ＵＬ５６）部位への導入遺伝子発現カセットの挿入のための組換え領域（先行技術）
【図２】ＵＳ４（ｏｒｆ７０）挿入部位の略図である。ＵＬ＝長いユニーク断片 ＵＳ＝短いユニーク断片ＩＲ＝内部逆方向反復ＴＲ＝末端逆方向反復ｇＧ＝糖タンパク質ＧｐＡ＝コード配列の終端のポリアデニル化配列ｇｐＩＩ＝糖タンパク質ＩＩｏｒｆ＝オープンリーディングフレームｏｒｆ６９、ｏｒｆ７０、ｏｒｆ７１＝ＵＳ３、ＵＳ４、ＵＳ５（ｏｒｆ７０／ＵＳ４挿入部位に適しているオープンリーディングフレーム）Δｏｒｆ１／３＝ｏｒｆ１／３（ＵＬ５６）挿入部位（先行技術）ｂｐ＝塩基対
【図３】トランスファープラスミドｐＵ−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１のプラスミドマップを示す図である。Ｈ３＝Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨ３をコードするオープンリーディングフレーム７１ｐＡ＝発明開示ＥＭ  Ｐ２０１６−０２２に記載の新しいポリＡ配列Ｉ−ＳｃｅＩ＝制限エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの切断部位プロモーターａｐｈ＝原核生物カナマイシン耐性遺伝子プロモーターＫａｎａ＝カナマイシン（Ｋａｎａｍｙｃｉｎｅ）耐性遺伝子３’末端ＯＲＦ７０＝挿入部位の下流の組換え領域ＯＲＩ＝プラスミドの複製起点ＡＰr＝プラスミドのアンピシリン耐性（ｒｅｓｉｓｔｅｎｃｅ）遺伝子上流ｏｒｆ７０＝挿入部位の上流の組換え領域ｐ４５５＝新しいプロモーターｐ４５５ｂｐ＝塩基対
【図４】トランスファーベクターｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨのプラスミドマップを示す図である。Ｈ１ａｖ＝Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨ１ａｖをコードするオープンリーディングフレームＢＧＨｐＡ＝ウシ成長ホルモン遺伝子のポリＡ配列Ｉ−ＳｃｅＩ＝制限エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの切断部位プロモーターａｐｈ＝原核生物カナマイシン耐性遺伝子プロモーターＫａｎａ＝カナマイシン耐性遺伝子Ｆｌａｎｋ  Ａ＝挿入部位の上流の組換え領域ＯＲＩ＝プラスミドの複製起点ＡＰr＝プラスミドのアンピシリン耐性遺伝子Ｆｌａｎｋ  Ｂ＝挿入部位の下流の組換え領域ｐ４３０＝新しいプロモーターｐ４３０ｂｐ＝塩基対
【図５】ＵＳ４（ｏｒｆ７０）挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のゲノムの概略図である。ｏｒｆ６９／ＵＳ３：ｏｒｆ７０（ＵＳ４）の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム番号６９（ＵＳ３）ｐ４５５：本明細書に記載の新しいプロモーターＨ３：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン７１ｐＡ：新しいポリアデニル化配列Δｏｒｆ７０（ＵＳ４）：構造ウイルス糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）をコードする、ｏｒｆ７１（ＵＳ５）のプロモーターを含有するｏｒｆ７０（ＵＳ４）の残りの部分ｂｐ＝塩基対
【図６】ＵＬ５６（ｏｒｆ１／３）挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖのゲノムの概略図である。ｐ４３０：本明細書に記載の新しいプロモーターＨ１ａｖ：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニンＢＧＨｐＡ：ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列Δｏｒｆ１／ＵＬ５６：ｏｒｆ１（ＵＬ５６）の残りの部分Ｏｒｆ３：ＥＨＶ−１オープンリーディングフレームｏｒｆ３（他のアルファヘルペスウイルス科のホモログなし）ｂｐ＝塩基対
【図７】２つの挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（ｒＥＨＶ−１−ＲａｃＨ−ＳＥ  Ｂ）のゲノムの概略図である。ｐ４３０：本明細書に記載の新しいプロモーターＨ１ａｖ：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニンＢＧＨｐＡ：ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列Δｏｒｆ１／ＵＬ５６：ｏｒｆ１（ＵＬ５６）の残りの部分Ｏｒｆ３：ＥＨＶ−１オープンリーディングフレームｏｒｆ３（他のアルファヘルペスウイルス科のホモログなし）ｏｒｆ６９／ＵＳ３：ｏｒｆ７０（ＵＳ４）の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム番号６９（ＵＳ３）ｐ４５５：本明細書に記載の新しいプロモーターＨ３：導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン７１ｐＡ：新しいポリアデニル化配列Δｏｒｆ７０（ＵＳ４）：構造ウイルス糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）をコードする、ｏｒｆ７１（ＵＳ５）のプロモーターを含有するｏｒｆ７０（ＵＳ４）の残りの部分ｂｐ＝塩基対
【図８】トランスファープラスミドｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−ＢＧＨＫＢＧＨのプラスミドマップを示す図である。ｐ４３０＝新しいプロモーターｐ４３０Ｈ１ｈｕ＝Ａ型インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨ１ｈｕをコードするオープンリーディングフレームＢＧＨｐＡ＝ウシ成長ホルモン遺伝子のポリＡ配列Ｉ−ＳｃｅＩ＝制限エンドヌクレアーゼＩ−ＳｃｅＩの切断部位プロモーターａｐｈ＝原核生物カナマイシン耐性遺伝子プロモーターＫａｎａ＝カナマイシン耐性遺伝子Ｆｌａｎｋ  Ａ＝挿入部位の上流の組換え領域ＯＲＩ＝プラスミドの複製起点Ｆｌａｎｋ  Ｂ＝挿入部位の下流の組換え領域Ｉ−Ｃｅｕ＝ＲＥＤ組換えのための断片の放出のためのホーミングエンドヌクレアーゼｂｐ＝塩基対
【図９】トランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ−７１Ｋ７１のプラスミドマップを示す図である。上流ｏｒｆ７０＝挿入部位の上流の組換え配列ｐ４５５＝本明細書に記載の新しいプロモーターＨ１ｐｄｍ＝導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨ１ｐｄｍ７１ｐＡ＝新しいポリアデニル化配列３’末端ｏｒｆ７０＝挿入部位の下流の組換え配列プロモーターａｐｈ＝原核生物カナマイシン耐性遺伝子プロモーターＫａｎａ＝カナマイシン耐性遺伝子ｂｐ＝塩基対ＳｃａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ＝制限エンドヌクレアーゼ切断部位
【図１０】ＵＳ４（ｏｒｆ７０）挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍのゲノムの概略図である。ｏｒｆ６９／ＵＳ３＝ｏｒｆ７０（ＵＳ４）の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム番号６９（ＵＳ３）ｐ４５５＝本明細書に記載の新しいプロモーターＨ１ｐｄｍ＝導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン  Ｈ１ｐｄｍ７１ｐＡ＝新しいポリアデニル化配列Δｏｒｆ７０（ＵＳ４）：構造ウイルス糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）をコードする、ｏｒｆ７１（ＵＳ５）のプロモーターを含有するｏｒｆ７０（ＵＳ４）の残りの部分ｂｐ＝塩基対
【図１１】ＵＬ５６（ｏｒｆ１／３）挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕのゲノムの概略図である。ｐ４３０＝本明細書に記載の新しいプロモーターＨ１ｈｕ＝導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨ１ｈｕＢＧＨｐＡ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列Δｏｒｆ１／ＵＬ５６＝ｏｒｆ１（ＵＬ５６）の残りの部分Ｏｒｆ３＝ＥＨＶ−１オープンリーディングフレームｏｒｆ３（他のアルファヘルペスウイルス科のホモログなし）ｂｐ＝塩基対
【図１２】挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ｈｕ−７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ（ウイルスＤ）のゲノムの概略図である。ｐ４３０＝本明細書に記載の新しいプロモーターＨ１ｈｕ＝導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニンＨ１ｈｕＢＧＨｐＡ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列Δｏｒｆ１／ＵＬ５６＝ｏｒｆ１（ＵＬ５６）の残りの部分Ｏｒｆ３＝ＥＨＶ−１オープンリーディングフレームｏｒｆ３（他のアルファヘルペスウイルス科のホモログなし）ｏｒｆ６９／ＵＳ３＝ｏｒｆ７０（ＵＳ４）の挿入部位の上流のオープンリーディングフレーム番号６９（ＵＳ３）ｐ４５５＝本明細書に記載の新しいプロモーターＨ１ｐｄｍ＝導入遺伝子インフルエンザウイルスヘマグルチニン  Ｈ１ｐｄｍ７１ｐＡ＝新しいポリアデニル化配列Δｏｒｆ７０（ＵＳ４）＝構造ウイルス糖タンパク質ＩＩ（ｇｐＩＩ）をコードする、ｏｒｆ７１（ＵＳ５）のプロモーターを含有するｏｒｆ７０（ＵＳ４）の残りの部分ｂｐ＝塩基対
【図１３】新しい導入遺伝子挿入部位ＵＬ４３の構築の概略図である。ＵＬ４４、ＵＬ４３、ＵＬ４２：挿入領域内のオープンリーディングフレーム１８ｐＡ：新しいポリアデニル化部位４２２プロモーター：新しいｐ４２２プロモーターｂｐ：塩基対
【図１４】トランスファープラスミドｐＵＵＬ４３−４２２−ｍＣ−１８Ｋ１８のプラスミドマップを示す図である。ＵｐＵＬ４３＝挿入部位の上流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列ＵｐＵＬ４４＝挿入部位の下流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列４２２プロモーター＝導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターｍＣ＝導入遺伝子（自己蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ）１８ｐＡ＝新しいポリアデニル化配列Ｉ−Ｓｃｅ１＝Ｉ−Ｓｃｅ１の切断部位プロモーターａｐｈ＝カナマイシン耐性遺伝子の発現を駆動する原核生物プロモーターＫａｎａ＝カナマイシン耐性ｏｒｆＰ（ＢＬＡ）＝アンピシリン耐性遺伝子の発現を駆動する原核生物プロモーターＡＰ（Ｒ）＝アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＩ＝プラスミド複製起点Ｐ（ＬＡＣ）＝ベータガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺの原核生物プロモーターＩ−Ｃｅｕ＝ホーミングエンドヌクレアーゼ（ｅｎｄｏｃｕｃｌｅａｓｅ）Ｉ−Ｃｅｕの認識部位
【図１５】ＵＬ４３挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−ＵＬ４３−４２２−ｍＣのゲノムの概略図である。ＵＬ＝ＥＨＶゲノムの長いユニーク断片ＵＳ＝ＥＨＶゲノムの短いユニーク断片ＩＲＳおよびＴＲＳ＝短いユニーク断片を挟む（framing）内部および末端反復領域ＵＬ４４、ＵＬ４３、ＵＬ４２＝挿入領域内のオープンリーディングフレームΔＵＬ４３＝ＵＬ４３の残りの部分１８ｐＡ＝新しいポリアデニル化部位ｐ４２２＝新しいｐ４２２プロモーターｂｐ＝塩基対
【図１６】トランスファープラスミドｐＵＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ−１８Ｋ１８のプラスミドマップを示す図である。ＵｐＵＬ４３＝挿入部位の上流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列ＵｐＵＬ４４＝挿入部位の下流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列４２２プロモーター＝導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターＨ１ｐｄｍ＝導入遺伝子（Ａ型インフルエンザヘマグルチニンＨ１ｐｄｍ）１８ｐＡ＝新しいポリアデニル化配列Ｉ−Ｓｃｅ１＝Ｉ−Ｓｃｅ１の切断部位プロモーターａｐｈ＝カナマイシン耐性遺伝子の発現を駆動する原核生物プロモーターＫａｎａ＝カナマイシン耐性ｏｒｆＰ（ＢＬＡ）＝アンピシリン耐性遺伝子の発現を駆動する原核生物プロモーターＡＰ（Ｒ）＝アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＩ＝プラスミド複製起点Ｐ（ＬＡＣ）＝ベータガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺの原核生物プロモーターＩ−Ｃｅｕ＝ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−Ｃｅｕの認識部位
【図１７】ＵＬ４３挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−ＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍのゲノムの概略図である。ＵＬ＝ＥＨＶゲノムの長いユニーク断片ＵＳ＝ＥＨＶゲノムの短いユニーク断片ＩＲＳおよびＴＲＳ＝短いユニーク断片を挟む内部および末端反復領域ＵＬ４４、ＵＬ４３、ＵＬ４２＝挿入領域内のオープンリーディングフレームΔＵＬ４３＝ＵＬ４３の残りの部分１８ｐＡ＝新しいポリアデニル化部位Ｈ１ｐｄｍ＝導入遺伝子（Ａ型インフルエンザヘマグルチニンＨ１ｐｄｍ）ｐ４２２＝新しいｐ４２２プロモーターｂｐ＝塩基対
【図１８】挿入領域を拡大したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のゲノムの概略図である。Δｏｒｆ１／ＵＬ５６：発現カセットの境界部のＵＬ５６の残りの部分ｐ４３０：新しいプロモーターｐ４３０ＢＧＨｐＡ：ウシ成長ホルモンポリアデニル化部位Ｈ１ａｖ、Ｈ３、Ｈ１ｐｄｍ：導入遺伝子（Ａ型インフルエンザヘマグルチニン）Δｏｒｆ７０／ＵＳ４：発現カセットの境界部のＵＳ４の残りの部分ｏｒｆ６９（ＵＳ３）およびｏｒｆ７１（ＵＳ５）：ＵＳ４挿入領域内のオープンリーディングフレーム７１ｐＡ：新しいポリアデニル化配列ＵＬ４４、ＵＬ４３、ＵＬ４２：ＵＬ４３挿入領域内のオープンリーディングフレーム１８ｐＡ：新しいポリアデニル化部位ｐ４２２：新しいｐ４２２プロモーターｂｐ：塩基対
【図１９】ウェスタンブロットを示す図である。４つの異なる抗体とともにインキュベートした４反復ブロットａ：インフルエンザＨＡ  Ｈ１ａｖに対する自社モノクローナル抗体とともにインキュベートしたブロットｂ：インフルエンザＨＡ  Ｈ３に特異的な市販のウサギ抗血清とともにインキュベートしたブロットｃ：インフルエンザＨＡ  Ｈ１ｐｄｍに対する自社モノクローナル抗体とともにインキュベートしたブロットｄ：ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩに対する自社モノクローナル抗体とともにインキュベートしたブロット
【図２０】マウス血清のＡ型インフルエンザウイルス中和試験の結果を示す図である。ウイルス中和試験を、入手可能な量のマウス血清に依存して２回反復または３回反復で行った。中和価を１００  ＴＣＩＤ５０にノーマライズし、中和能力の逆数として示した。*エラーバーは標準偏差を示す。
【図２１】トランスファープラスミドｐＵｍＣ７０のプラスミドマップを示す図である。３’末端ｏｒｆ６９＝トランスファーベクターに含有されているｏｒｆ６９（ＵＳ３）の部分ｕｐ７０＝挿入部位の上流の組換え配列ｍＣｈｅｒｒｙ＝導入遺伝子（自己蛍光タンパク質ｍＣｈｅｒｒｙ）ＢＧＨｐＡ＝ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列ｕｐ７１＝挿入部位の下流の組換え配列３’末端ｏｒｆ７０＝挿入物の下流のｏｒｆ７０（ＵＳ４）の残りの部分ｂｐ＝塩基対ＳｃａＩ、ＥｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＮｏｔＩ、ＫｐｎＩ、ＢａｍＨＩ、ＸｂａＩ＝制限エンドヌクレアーゼ切断部位
【図２２】トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１のプラスミドマップを示す図である。Ｕｐ７０＝挿入部位の上流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列Ｕｐ７１＝挿入部位の下流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列４ｐＭＣＰ４５５＝導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターＥＨＶ−４ｏｒｆ７１ｐＡｐＡ＝新しいポリアデニル化配列７１ｐＡＩ−Ｓｃｅ１＝Ｉ−Ｓｃｅ１の切断部位プロモーターａｐｈ＝カナマイシン耐性遺伝子の発現を駆動する原核生物プロモーターＫａｎａ＝カナマイシン耐性ｏｒｆＰ（ＢＬＡ）＝アンピシリン耐性遺伝子の発現を駆動する原核生物プロモーターＡＰ（Ｒ）＝アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＩ＝プラスミド複製起点Ｐ（ＬＡＣ）＝ベータガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺの原核生物プロモーターＩ−Ｃｅｕ＝ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−Ｃｅｕの認識部位ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ、ＸｂａＩ＝制限エンドヌクレアーゼ切断部位ｂｐ＝塩基対
【図２３】トランスファーベクターｐＵ１／３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨのプラスミドマップを示す図である。Ｆｌａｎｋ  Ａ＝挿入部位の上流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列Ｆｌａｎｋ  Ｂ＝挿入部位の下流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列４ｐｇＧ４３０＝導入遺伝子の発現を駆動するプロモーターＢＧＨｐＡ＝ウシ成長ホルモン遺伝子のポリアデニル化配列Ｉ−Ｓｃｅ１＝Ｉ−Ｓｃｅ１の切断部位プロモーターａｐｈ＝カナマイシン耐性遺伝子の発現を駆動する原核生物プロモーターＫａｎａ＝カナマイシン耐性ｏｒｆＩ−Ｃｅｕ＝ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−Ｃｅｕの認識部位ＫｐｎＩ、ＮｏｔＩ＝制限エンドヌクレアーゼ切断部位ｂｐ＝塩基対
【図２４】トランスファープラスミドｐＵＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ−１８Ｋ１８のプラスミドマップを示す図である。ＵｐＵＬ４３＝挿入部位の上流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列ＵｐＵＬ４４＝挿入部位の下流に隣接するウイルスゲノムＤＮＡ配列ｐ４２２＝導入遺伝子の発現を駆動するプロモーター１８ｐＡ＝新しいポリアデニル化配列Ｉ−Ｓｃｅ１＝Ｉ−Ｓｃｅ１の切断部位プロモーターａｐｈ＝カナマイシン耐性遺伝子の発現を駆動する原核生物プロモーターＫａｎａ＝カナマイシン耐性ｏｒｆＰ（ＢＬＡ）＝アンピシリン耐性遺伝子の発現を駆動する原核生物プロモーターＡＰ（Ｒ）＝アンピシリン耐性遺伝子ＯＲＩ＝プラスミド複製起点Ｐ（ＬＡＣ）＝ベータガラクトシダーゼをコードするｌａｃＺの原核生物プロモーターＩ−Ｃｅｕ＝ホーミングエンドヌクレアーゼＩ−Ｃｅｕの認識部位ｂｐ＝塩基対
【０１７６】
【表１】
2021516551.tif 000002
【実施例】
【０１７７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技法は本発明の実施において十分に機能することを本発明者らが発見した代表的な技法であり、したがって、それを実施するための好ましい方式を構成するとみなすことができることが当業者には理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示されている特定の実施形態に多くの変更を行うことができ、それでもなお本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく同様または類似の結果が得られることを理解するべきである。
【０１７８】
（実施例１）
新しい挿入部位ＯＲＦ７０／ＵＳ４の確立
ＥＨＶ−１ベクターの能力を増強するために、本発明者らは、１つのプロモーターの調節下でＲＮＡウイルス由来の機能によって２つの導入遺伝子を結合するのではなく１つのベクター骨格から２つの異なる導入遺伝子を発現する方法を見つけようとした。本発明者らは、ヘルペスウイルスゲノムが、２つの独立した導入遺伝子挿入部位を並行して使用することを許容するであろうと仮定した。ＥＨＶ−１  ＯＲＦ７０／ＵＳ４が好適な導入遺伝子挿入部位であるかどうかを判定するために、ｏｒｆ７０／ＵＳ４（１２３６ｂｐ）の５’末端の８０１塩基対を、自己蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質（Shaner et al. 2004）をコードする発現カセットに、古典的相同組換えによって置き換えた。プラスミドｐＵ−ｍＣ７０−ＢＧＨのマップは、図２１にある（配列番号３７）。相同組換えに使用したＤＮＡ断片をｐＵ−ｍＣ７０−ＢＧＨからＸｂａＩで切り出した。ゲル精製した断片をＥＨＶ−１  ＲａｃＨのウイルスゲノムＤＮＡとともにＲＫ１３細胞にコトランスフェクトした。組換えベクターウイルスの効率的レスキューおよび培養細胞における効率的複製を、ライブ蛍光およびウイルス滴定により証明した（図示なし）。ｏｒｆ７０／ＵＳ４の３分の２の欠損には、ｏｒｆ７０／ＵＳ４によりコードされる糖タンパク質Ｇの発現を消失させるという追加の恩恵があった。ＥＨＶ−１の糖タンパク質Ｇは、宿主の免疫応答を弱める非構造性分泌ケモカイン結合タンパク質であることが分かっていた（Drummer et al., 1998; Bryant et al., 2003）。ベクターワクチンは、ワクチン接種者の免疫応答を刺激することを意図したものであるので、ウイルスベクターのこの特定の免疫抑制機能の除去は、ウイルスベクタープラットフォームＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥの性能をさらに向上させる可能性がある。
【０１７９】
（実施例２）
組換えＥＨＶ−１ベクターワクチンにおけるｐ４５５プロモーターを有する新しいＯＲＦ７０／ＵＳ４挿入部位の使用および組換えウイルスの構築
ｐ４５５プロモーター：
第１の動物実験には、ブタ由来Ａ型インフルエンザウイルスからのインフルエンザヘマグルチニンＨ３亜型（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＢＳ５０３０２．２）を使用した。そのコード配列を合成し、トランスファーベクターｐＵ７０−ｐ４５５−７１Ｋ７１（配列番号２８）にサブクローニングし、それによって、Ｈ３を新しいｐ４５５プロモーターおよび新しい７１ｐＡポリアデニル化シグナルの調節下に置き、ｏｒｆ７０への挿入のための組換え領域でカセットを挟む、トランスファープラスミドｐＵ７０−ｐ４５５−Ｈ３−７１Ｋ７１を生成した（図３、配列番号２９）。
ＲＥＤ組換えシステム（Tischer et al. 2006）を使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異誘発により、発現カセットｐ４５５−Ｈ３−７１をｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ７０／ＵＳ４に挿入してｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３を生成した。
【０１８０】
ＰＫ／ＷＲＬ細胞にｐＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３をトランスフェクトし、組換えウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３（図５）をレスキューし、２回、プラーク精製した。発現カセットの正しい挿入を、挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングにより検証した。感染細胞における導入遺伝子の発現を間接免疫蛍光アッセイにより分析した。
【０１８１】
ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１の回復を、ＩＦＡ（図示なし）によりおよびモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ社所有のもの）を使用するウェスタンブロット（図１９）により確認した。感染細胞の原形質膜上のＨ３の三量体の出現を、ニワトリ赤血球を使用する赤血球吸着試験によりアッセイした（図示なし）。ＰＫ／ＷＲＬ細胞においてＴＣＩＤ50／ｍｌとして決定したピーク力価は、親ウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥの力価と同じ範囲内であり、これは、導入遺伝子発現がウイルス複製に悪影響を及ぼさなかったことを示す（図示なし）。このことを、レスキュー後にＰＫ／ＷＲＬ細胞のｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ７０−ｐ４５５−Ｈ３を第２０継代（Ｐ２０）まで継代させることにより確認した。Ｐ５、Ｐ１０、Ｐ１５およびＰ２０で、ウイルスを滴定、シーケンシングおよびウェスタンブロットにより特徴づけ、Ｐ１０およびＰ２０でさらにＩＦＡにより特徴づけ、ＨＡ発現ならびにプロモーターおよびポリＡ配列とともにＨＡコード挿入物の遺伝的安定性を確認した。
モノクローナル抗Ｈ３抗体およびウマ抗ＥＨＶ抗血清を使用するＰ２０で感染させた細胞におけるウイルスプラークの二重免疫蛍光アッセイ（ｄＩＦＡ）により、事実上、全てのＥＨＶ−１誘導プラークがＨ３も発現することを確認した（図示なし）。全ての試験で組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３の安定性が認められた。
【０１８２】
（実施例３）
組換えＥＨＶ−１ベクターワクチンにおける新しいｐ４３０プロモーターの使用および組換えウイルスの構築
ｐ４３０プロモーター： 
新たに同定したｐ４３０プロモーターを使用して、Ｈ１Ｎ１ウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１）、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＦＲ７６６２３．１）から別のインフルエンザヘマグルチニンの発現を駆動した。このウイルス分離株のヘマグルチニン遺伝子はトリＩＡＶが起源であるので、それをＨ１ａｖと呼ぶことにする。Ｈ１ａｖを合成し、ｏｒｆ１／３／ＵＬ５６挿入領域のトランスファーベクターｐＵ１／３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３０）にサブクローニングして、ｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨ＿Ｋ＿ＢＧＨ（図４、配列番号３１）を生成した。Ｈ１ａｖの発現を、ｐ４３０プロモーターおよびウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリＡシグナルの調節下に置いた。
ＲＥＤ組換えシステム（Tischer et al. 2006）を使用するｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異誘発により、発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨをｐＲａｃＨ−ＳＥのｏｒｆ１／３／ＵＬ５６に挿入してｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖを生成した。
【０１８３】
ＰＫ／ＷＲＬ細胞にｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖをトランスフェクトし、組換えウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ（図６）をレスキューし、２回、プラーク精製した。発現カセットの正しい挿入を、挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物のシーケンシングにより検証した。感染細胞における導入遺伝子の発現を、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）によりならびにモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット（図１９）により分析した。抗体ＰＡ−３４９２９による７５ｋＤａで泳動する広いバンドの特異的検出は、組換えＨＡ糖タンパク質のその配列から予測して予想された出現と一致する。
【０１８４】
ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１／ＵＳ５の回復を、ＩＦＡによりならびにモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ社所有のもの）を使用するウェスタンブロット（図１９）により確認した。ＰＫ／ＷＲＬ細胞におけるＴＣＩＤ５０／ｍｌとして決定したピーク力価は、親ウイルスＲａｃＨ−ＳＥの力価と同じ範囲内であり、これは、導入遺伝子発現がウイルス複製に悪影響を及ぼさなかったことを示す（図示なし）。
【０１８５】
発現された組換えヘマグルチニンが予想どおりにプロセシングされ、輸送されるかどうかを試験するために、ＶＥＲＯ細胞にｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ（親）を０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させたかまたはＶＥＲＯ細胞を未感染のままにしておいた。感染後２４時間、感染および未感染生細胞をＰＢＳ中のニワトリ赤血球の懸濁液とともにインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、蛍光Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２核染色剤で染色した。トリの赤血球は細胞核を含有するので、それらをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色することができ、それらは、蛍光顕微鏡観察によってごく小さな青色の点のように見える。ヘマグルチニンを発現しないｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥを感染させた細胞と比較して、ニワトリ赤血球の吸着は、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖまたはｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のどちらかを感染させた細胞上で有意に増加した（図示なし）。このことから、ヘマグルチニンが、本物のインフルエンザウイルス感染により産生された場合と同様に、翻訳され、プロセシングされ、ベクターウイルス感染細胞の原形質膜に輸送されたと、結論づけることができる。
感染細胞の赤血球吸着のこの明確な表現型により、トランスジェニックタンパク質の効率的発現を示し、ＥＨＶ−１ベクター感染細胞の細胞表面での機能的ＨＡ三量体の形成を示唆する、ウェスタンブロットおよび免疫蛍光アッセイによる知見が裏づけられる。
【０１８６】
（実施例４）
組換えＥＨＶ−１ベクターワクチンにおける新しいＯＲＦ７０挿入部位およびＯＲＦ１／３（ＵＬ５６）挿入部位の並行した使用
２つの新しいプロモーターを並行して使用することができることを明らかにするために、２つの異なるＡ型インフルエンザウイルス亜型の２つの異なるヘマグルチニンを発現する組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨを生成した。
Ｈ３に対する市販のポリクローナル抗体（ＰＡ５−３４９３０）とＨ１ａｖおよびＨ１ｐｄｍに対する自社モノクローナル抗体についての特異性ならびにこれらの交差反応性の欠如は、図１９に示されているように感染細胞のウェスタンブロットから明らかである。同一の試料を、４つの異なる抗体とのインキュベーション前に、４反復ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動させてナイロン膜に転写した。
【０１８７】
Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））のヘマグルチニンをコードするオープンリーディングフレームを合成し、トランスファーベクターｐＵ１−３−ｐ４３０−ＢＧＨＫＢＧＨ（配列番号３０）にクローニングし、その結果、ｐＵ１−３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨ（図４、配列番号３１）を得た。組換えＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３で始めて、ｐＵ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨＫＢＧＨ（図４、配列番号３１）内に組み立てた発現カセットｐ４３０−Ｈ１ａｖ−ＢＧＨを、２ステップＲＥＤ組換えによりｏｒｆ１／３／ＵＬ５６挿入部位に挿入して、ｐＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３を生成した。ＰＫ／ＷＲＬ細胞にｐＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３をトランスフェクトし、組換えウイルスｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（図７）をレスキューし、２回、プラーク精製した。
【０１８８】
この組換えウイルスの略称は、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ＿Ｂである。発現カセットの正しい挿入を、隣接配列とともに挿入領域の高忠実度ＰＣＲ産物をシーケンシングすることにより検証した。感染細胞における導入遺伝子の発現を、間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ、図示なし）によりならびにモノクローナルおよびポリクローナル抗体を使用するウェスタンブロット（図１９）により分析した。ＥＨＶ−１  ｇｐＩＩをコードするｏｒｆ７１／ＵＳ５の回復を、ＩＦＡ（図示なし）によりおよびモノクローナル抗体Ａｉ２Ｇ７（ＢＩ社所有のもの）を使用するウェスタンブロット（図１９）により確認した。
図１９に示されているように、導入遺伝子Ｈ３とＨ１ａｖの両方が、二重挿入組換えｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３（Ｂ）で感染させた細胞培養物において並行して発現された。導入遺伝子発現は、安定しており、ＡＩ−ＳＴ  Ａ１細胞（ＢＩ社の自社ブタ精巣細胞株、表３）において第１１継代まで試験してウイルス力価を損なわせなかった。
【０１８９】
２つの新しいプロモーターｐ４３０およびｐ４５５は、細胞培養でのｒＥＨＶ１−ＲａｃＨ−ＳＥ複製という状況下で機能性であることが分かった。個々の導入遺伝子に特異的なウェスタンブロットにおけるシグナルの同等の強度から推論して、ウイルス複製サイクル中の活性レベルは、非常に類似しているように見える。これらの特性が、ＥＨＶ−１  ＲａｃＨに基づく組換えベクターワクチンの作出、または２つの異なる抗原を並行して同様の効率で発現する他のベクタープラットフォームの作出を可能にする。ワクチンの標的が２つの異なる病原体からなる場合、２つのポリアデニル化配列と組み合わせた２つの挿入部位における２つの新しいプロモーターの利用は、１つだけの抗原成分を発現するベクターに比べて、商品原価を有意に削減することができ、明らかな利点となる。
【０１９０】
（実施例５）
二価ＥＨＶ−１ベクターを利用したＡ型インフルエンザウイルスワクチンの生成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ特徴づけおよびｉｎ  ｖｉｖｏ試験
下で説明するように、本明細書に記載の本発明では、Ｈ３Ｎ２およびＨ１Ｎ１血清亜型／血清型トリブタＩＡＶに由来する上記４つのブタＩＡＶヘマグルチニン（ＨＡ）抗原のうちの２つが１つの組換えＥＨＶ−１ベクターウイルスにより発現される。ブタＩＡＶに対するこの新しい二価ワクチンは、例えば、本明細書に記載のワクチンでのワクチン接種のみを受けた動物はブタＩＡＶ  ＨＡタンパク質しか発現しないのでこれらの動物ではブタＩＡＶタンパク質ＮＰまたはＮＡに対する抗体が検出されず、しかし、ブタＩＡＶ野外株によって感染した動物ではブタＩＡＶタンパク質ＮＰまたはＮＡに対する抗体が検出されることにより、ＤＩＶＡ特徴をもたらす。
新しい二価ブタＩＡＶワクチンをｉｎ  ｖｉｔｒｏで特徴づけ、マウスにおいてＡ型インフルエンザウイルス中和抗体を誘導するその能力についてｉｎ  ｖｉｖｏで試験した。
【０１９１】
発現された組換えヘマグルチニンが予想どおりにプロセシングされ、輸送されるかどうかを試験するために、ＶＥＲＯ細胞にｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ（親）を０．０１のｍ．ｏ．ｉ．で感染させたかまたはＶＥＲＯ細胞を未感染のまま放置した。感染後２４時間、感染および未感染生細胞をＰＢＳ中のニワトリ赤血球の懸濁液とともにインキュベートし、ＰＢＳで洗浄し、蛍光Ｈｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２核染色剤で染色した。トリの赤血球は細胞核を含有するので、それらをＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２で染色することができ、それらは、蛍光顕微鏡観察によってごく小さな青色の点のように見え、ヘマグルチニンを発現しないｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥを感染させた細胞と比較して、ニワトリ赤血球の吸着は、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖまたはｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−７０−ｐ４５５−Ｈ３のどちらかを感染させた細胞上で有意に増加した（図示なし）。このことから、ヘマグルチニンが、本物のインフルエンザウイルス複製により産生された場合と同様に、翻訳され、プロセシングされ、ベクターウイルス感染細胞の原形質膜に輸送されたと、結論づけることができる。感染細胞の赤血球吸着のこの表現型により、トランスジェニックタンパク質の効率的発現を示し、ＥＨＶ−１ベクター感染細胞の細胞表面での機能的ＨＡ三量体の形成を示唆する、ウェスタンブロット（図１９）および免疫蛍光アッセイ（図示なし）による知見が裏づけられる。
【０１９２】
２つの挿入部位と２つの新しいプロモーターとを有する増強されたＥＨＶ−１ベクターは、２つのインフルエンザウイルスヘマグルチニンを並行して発現することが分かった。ＩＦＡにより判定したときの細胞内局在化およびウェスタンブロット（図１９）により判定したときのＳＤＳ−ＰＡＧＥでの移動度は、文献から公知のＡ型インフルエンザウイルス感染細胞において発現される本物の未切断ヘマグルチニンに対応した。
組換えｒＥＨＶ−１の遺伝的安定性および表現型安定性を、細胞培養で継代させることにより、５継代ごとにウイルス力価を判定して証明した。挿入領域の配列を１０継代ごとに確認し、ウェスタンブロットにより導入遺伝子発現も確認した（図示なし）。発現の忠実度は、メトセル−オーバーレイ下のプラークの二重ＩＦＡにより、抗ＥＨＶ抗体および導入遺伝子特異的抗体で染色したプラークをカウントして評価した。
【０１９３】
（実施例６）
二価ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨベクターワクチンでのワクチン接種を受けたマウスにおける２つの抗原に対する中和抗体応答の誘導
ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ  ＳＥ  Ｂ（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３、図７参照）をＢａｌｂ／ｃマウスの免疫化に使用して、発現された導入遺伝子がブタ以外の別の種において免疫原性であること、および鼻腔内適用により中和抗体が２つの抗原のいずれに対しても誘導されることを実証した。
【０１９４】
詳細には、１群当たり５匹の３〜５週齢Ｂａｌｂ／ｃマウスの３群に、研究０日目および２１日目に、４０μｌのｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ  ＳＥ  Ｂ（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−１／３−４３０−Ｈ１ａｖ−７−４５５−Ｈ３、第１群）、または４０μｌの空のベクター（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ、第２群、ベクター対照）、または４０μｌの組織培養培地（第３群陰性対照）のいずれかをそれぞれ鼻腔内接種した。第１および２群についての感染性組換えＥＨＶ−１投与量は、それぞれ、１×１０5  ＴＣＩＤ５０／４０μｌであった。研究０日目（１回目の接種の前）、７日目、１４日目、２１日目（２回目の接種の前）、２８日目および３５日目にマウスから採血した。血清を血液試料から調製し、−８０℃で凍結保存した。
【０１９５】
ベクターウイルスに対する抗体の検出の免疫蛍光アッセイ
空のベクターＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥ１．２からレスキューしたウイルスであるｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ１２１２を０．００１の感染多重度（ＭＯＩ）でＡＩ−ＳＴ細胞に感染させた。感染後２４時間、特有のプラークを観察し、細胞を間接免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）用に処理した。ＰＢＳで１：５０希釈した３群全ての最終採血の血清（２回目のワクチン接種の１４日後に得た）を試験した。陽性対照として、ＥＨＶ−１でのワクチン接種を受けたウマからの血清を１：５００希釈物で使用した。二次抗体は、マウス血清については市販のＦＩＴＣ結合ウサギ抗マウスＩｇＧであり、ウマ血清についてはＣｙ５結合ヤギ抗ウマＩｇＧであり、これらの抗体を１：２００希釈で使用した。抗体結合を蛍光顕微鏡観察により評価した。ワクチン接種を受けた全てのマウスは、ＩＦＡにおいてｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ感染細胞と反応する抗体を生じさせた。未感染細胞にはいずれの被験血清も結合しなかった。マウスの陰性対照群からの血清は、感染細胞とも、未感染細胞とも、いかなる特異的結合も示さなかった。データを下記の表に要約する。
【表２】
2021516551.tif 000003
このことから、マウスの鼻孔へのｒＥＨＶ−１の接種が感染およびウイルス複製をもたらし、その結果、マウス免疫系が刺激されて抗ＥＨＶ−１抗体が産生されたと、結論づけることができる。
【０１９６】
ウイルス中和試験（ＶＮＴ）
Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＡＶ）（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／７６８０／２００１（Ｈ３Ｎ２））または（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｎｔ／１３２／２００５（Ｈ１Ｎ１））のどちらかに由来する発現導入遺伝子に対する防御免疫の誘導を明らかにするために、マウス血清をそれぞれのウイルスに対する中和活性ついて試験した（Allwinn et al. 2010; Trombetta et al. 2014）。中和試験に使用したＩＡＶは、２０１４年以降のドイツのブタからの分離株、具体的には、Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｒｍａｎｙ／ＡＲ４５２／２０１４（Ｈ３Ｎ２）およびＡ／ｓｗｉｎｅ／Ｇｅｒｍａｎｙ／ＡＲ１１８１／２０１４（Ｈ１Ｎ１）であった。これらは、ワクチン標的を得た株とは異種であるので、マウス血清によるこれらのウイルスの一切の中和が、ｒＥＨＶ−１ワクチン接種による防御免疫の広範かつ効率的な誘導を示すことになる。陰性対象血清として、インフルエンザウイルス抗体に対して陰性であることが分かっていたブタからの血清を使用した。
【０１９７】
Ａ型インフルエンザウイルス中和試験：
ウイルス中和および９６ウェルプレートでの逆滴定のためのＭＤＣＫ細胞を使用前に２日間、３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートした。それぞれのＩＡＶストックＨ３Ｎ２およびＨ１ａｖＮ１を氷上で解凍し、ゲンタマイシンと２倍濃度のトリプシンとを含有するＭＥＭ（ＭＥＭ／Ｇｅｎｔａ／２ｘトリプシン）で希釈した。
試験した血清は、第１群（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ  ＳＥ  Ｂ）、第２群（空のベクター）、陽性対照（不活性化多価ＩＡＶワクチンでのワクチン接種を受けたブタからの血清）、および陰性対照についての最終採血からのものであった。
【０１９８】
血清を熱不活性化し、２回または３回の独立した試験で、それぞれ、１：１６で開始して１：４０９６まで段階的に１：２希釈した。ＩＡＶを、およそ１００  ＴＣＩＤ５０／中和反応に希釈した。中和反応物を２時間、３７℃、５％ＣＯ2でインキュベートした。使用したウイルスの逆滴定を４回反復で行った。増殖培地を除去し、ゲンタマイシンとトリプシンとを含有する培地でＭＤＣＫ細胞を洗浄した後、中和反応物または逆滴定のウイルス希釈物を添加した。中和反応物またはウイルス希釈物をそれぞれＭＤＣＫ細胞に添加した後、ＶＮＴおよび滴定プレートを３７℃／５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。その後、接種材料を除去し、ゲンタマイシンとトリプシンとを含有する新鮮培地を細胞に重層した。感染後５日間ＣＰＥをモニターし、記述した。試験で実際に使用したウイルス力価をReed and Munchに従ってＴＣＩＤ５０／ｍｌとして算出し、被験血清がインフルエンザウイルスの典型的なＣＰＥの誘導を防止した希釈度を報告した。下記の表を参照されたい。
【０１９９】
【表３】
2021516551.tif 000004
【０２００】
【表４】
2021516551.tif 000005
【０２０１】
独立した試験の結果を比較するために、血清希釈度の逆数とそれによって中和されたそれぞれの力価とを掛けることによって中和能力を算出した。次いで、３回の試験の平均値を１００で割って１００  ＴＣＩＤ５０の中和を反映させた（表４、５および６）。データを要約し、図２０にグラフで示す。
【０２０２】
ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ  ＳＥ  Ｂでのワクチン接種を受けた全てのマウスは、Ｈ３Ｎ２およびＨ１ａｖＮ１亜型の異種株であるそれぞれのＩＡＶに対する中和抗体を生じさせた。したがって、ｐ４５５プロモーター（Ｈ３）の調節下にあるｏｒｆ７０挿入部位から、および並行して、ｐ４３０プロモーター（Ｈ１ａｖ）の調節下にあるｏｒｆ１／３挿入部位からＩＡＶのヘマグルチニンを発現するｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥによる二重鼻腔内適用は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて防御免疫反応をうまく刺激した。
ベクターｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥを２つの異なる導入遺伝子の並行発現に使用して、鼻腔内ワクチン接種後に免疫応答を刺激することができると、結論づけることができる。
【０２０３】
ウェスタンブロット
１．感染：１０μｌの解凍ウイルスストックを増殖培地に直接添加することにより、６ウェルプレートにおける３つのウェル各々のＡＩ−ＳＴ細胞の融合性単層に組換えウイルスをおよそ１のＭ．Ｏ．Ｉで感染させた。３つのウェルは、未感染のままにしておいた。感染および未感染細胞を２日間インキュベートし、次いで、ウェスタンブロット用に処理した。感染に使用したウイルスを下記の表（表２）に要約する。
【０２０４】
【表５】
2021516551.tif 000006
【０２０５】
２．ライセートの調製：プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充したＲＩＰＡ緩衝剤（ＲＩＰＡ＋ＰＩ）を次のように調製した：０．７ｍｌの１０×ＲＩＰＡ溶解緩衝剤Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅカタログ番号２０−１８８を６．３ｍｌのＨ2Ｏに添加し、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号ＢＰ２４７０−１、および１錠のＣｏｍｐｌｅｔｅ（商標）Ｍｉｎｉプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅカタログ番号１１  ８３６  １５３  ００１）を７ｍｌの１×ＲＩＰＡ緩衝剤に溶解した。未感染対照を培地にかき集め、３つの複製ウェルからの懸濁液を１５ｍｌ遠心分離管にプールし、氷上に置いた。感染細胞を培地ですすぎ落とし、３つの複製ウェルからの懸濁液を１５ｍｌ遠心分離管にプールし、氷上に置いた。細胞を１０００ｘｇ、４℃で５分間、遠心分離により沈降させた。上清を注意深く吸引し、細胞ペレットをＲＩＰＡ＋ＰＩに（未感染細胞は３００μｌに、感染細胞は１５０μｌに）再懸濁させた。懸濁液を氷上で３０分間インキュベートし、１０分ごとにボルテックスした。懸濁液を１．５ｍｌ微量遠心管に移し、未溶解物質を微量遠心分離機での１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間の遠心分離により沈降させた。透明な上清を新しい１．５ｍｌ微量遠心管に移し、使用するまで−８０℃で保管した。
【０２０６】
３．ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびナイロン膜への転写：材料：ＢｉｏＲａｄ  Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ  Ｆｒｅｅ  Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌ、４〜２０％、２６ウェル、カタログ番号５６７−８０９５；Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ｄｕａｌ  Ｃｏｌｏｕｒ  Ｍａｒｋｅｒ、カタログ番号１６１−０３７４；Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｐｌｕｓ  Ａｌｌ  Ｂｌｕｅ  Ｍａｒｋｅｒ、カタログ番号１６１−０３７３；Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｔｒａｎｓ  Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏ転写キット、Ｍｉｄｉ形式カタログ番号１７０−４１５９；Ｂｉｏ  Ｒａｄ  ４ｘ  Ｌａｅｍｍｌｉ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（カタログ番号１６１−０７４７）（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｍａｎｎｓｔｒａｓｓｅ  １６４、Ｄ−８０９３９  Ｍｕｎｉｃｈ）；ＴＧＳ泳動緩衝液（Sambrook et al.）、ブロッキング溶液１：ＰＢＳＴ中の５％ＦＢＳ（Sambrook et al.）；ＰＢＳＴ。還元剤を添加せずに試料を調製した。試料を氷上で解凍し、１体積の４×Ｌａｅｍｍｌｉ緩衝液と混合し、６分間、９６℃で煮沸し、ゲルの負荷までＲＴで保持した。ゲルを３０分間、２３０ｍＡで泳動させ、次いで、ＢｉｏＲａｄ  Ｔｒａｎｓ  Ｂｌｏｔ  Ｔｕｒｂｏシステムを使用して電気泳動転写用に組み立てた。転写を２．５Ａ、２５Ｖ、１０分に設定した。膜を滅菌蒸留Ｈ2Ｏですすぎ、ＰＢＳＴ中の５％ＦＢＳである２５ｍＬのブロッキング溶液とともに３０分間、４℃でインキュベートした。
【０２０７】
抗体インキュベーションおよび検出
材料：Ｉｍｍｕｎ−Ｓｔａｒ  ＷｅｓｔｅｒｎＣ  Ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｃｅｎｔ  Ｋｉｔ（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｍａｎｎｓｔｒａｓｓｅ  １６４、Ｄ−８０９３９  Ｍｕｎｉｃｈ）カタログ番号１７０−５０７０
一次抗体：図１９の説明文のａ〜ｄを参照されたい。
二次抗体：ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗マウス、（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＃１１５−０３５−１４６）  １：５０００。
全てのインキュベーションは、絶えず攪拌しながら十分な体積で行った。抗体を５％ＦＢＳ／ＴＢＳＴで希釈した。一次抗体を終夜４℃でインキュベートした。抗体溶液を除去し、ブロットを３回、ＴＢＳＴで５〜１０分間洗浄した。希釈二次抗体をブロットとともに１時間、ＲＴでインキュベートし、除去し、ブロットを３回、ＴＢＳＴで５〜１０分間洗浄した。ブロットを透明プラスチックシートプロテクター上に配置した。過酸化水素とＬｕｍｉｎｏ／Ｅｎｈａｎｃｅｒ溶液を混合し（１ｍｌ＋１ｍｌ（ブロットごとに合計２ｍｌ））、ピペットでブロット上に移し、３〜５分間インキュベートした。その後、膜をＣｈｅｍｉＤｏｃＸＲＳイメージングシステム（Ｂｉｏ  Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  ＧｍｂＨ、Ｈｅｉｄｅｍａｎｎｓｔｒａｓｓｅ  １６４、Ｄ−８０９３９  Ｍｕｎｉｃｈ）内に配置し、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを使用してシグナルを記録した。
【０２０８】
ウイルス滴定
感染前日に、ＡＩ−ＳＴ細胞を、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ−Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｏｎｅ  Ｂｅｃｔｏｎ  Ｃｉｒｃｌｅ、Ｄｕｒｈａｍ、ＮＣ  ２７７１２、ＵＳＡ；ＲＥＦ  ３５３０７２）の１０％ＦＢＳを補充したＭＥＭに、２×１０4細胞／ウェルで播種した。ウイルスストックを急速解凍し、氷上に置いた。段階１：１０希釈物を、ＭＥＭで、希釈度ごとに１．２ｍｌの体積で調製した。１００μｌ／ウェルのウイルス希釈物を細胞、希釈度ごとに１つの縦列で８ウェル、に添加した。各プレートの縦列１１および１２は、１００μｌ／ウェルのＭＥＭの添加により培地対照としての役割を果たした。滴定を３回反復で行い、細胞を５日間、３７℃／５％ＣＯ2でインキュベートした。細胞培養物を顕微鏡で検査し、ＥＨＶ−１  ＲａｃＨの典型的なＣＰＥが観察されたウェルを記録した。Reed and Muench (1938)による方法に従ってＴＣＩＤ５０／ｍｌとして力価を算出した。
【０２０９】
（実施例７）
新しいＵＬ４３挿入部位の確立
前の実施例に記載のＥＨＶ−ベクタープラットフォームを使用して、２つだけの抗原をそれらの本物の形態で並行して発現させることができる。２つのベクターワクチンのブレンドは、商品原価を増加させ、そしてまた複製効率が組換えウイルスによって異なる場合（この可能性は高い）には導入遺伝子の偏った発現をもたらす可能性がある。配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）またはピコルナウイルス２ａペプチド（２ａ）のどちらかにより１つの挿入部位内で２つの抗原を結合させる方法があるが、これらの技術は、この課題に十分なものではない。別個の下流翻訳産物の合成をもたらすリボソームスキップを誘発する２ａペプチド（Donnelly et al., 2001）によって２つの導入遺伝子を結合させた場合、発現されるタンパク質うちの第１のタンパク質がそのＣ末端に付加された２ａペプチドからの１９個のアミノ酸残基を有することになるので、２ａペプチドは、この第１のタンパク質を構造的に変化させることになる。第２のタンパク質のＮ末端には、プロリンである１つのアミノ酸残基が付加されることになる（Ryan et al., 1994）。この１つの追加のアミノ酸は、ＨＡのシグナルペプチドで切断除去されることになるので、全く重要でない可能性が非常に高いとはいえ、第１のＨＡの１９アミノ酸テールの方は、三量体化に干渉し、十分な有効性を妨げる可能性がある。記載した障害を克服するための解決法を見つけるために、本発明者らは、ｐＲａｃＨ−ＳＥにおける第３の導入遺伝子発現部位を確立した。
【０２１０】
統一アルファヘルペスウイルス命名法の使用
様々なアルファヘルペスウイルスの第１のゲノム配列が利用可能であることから、コンピューターで同定したオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）に、ウイルスごとにそれぞれのゲノム内のそれらの位置に従って個々に番号をつけた。その後、アルファヘルペスウイルス遺伝子の大多数が異なる種に存在するホモログであることが判明した。データの比較を容易にするために、遺伝子および遺伝子産物にヒトヘルペスウイルス１型のゲノムにおけるそれらのホモログの名称を割り当てることは、今では一般的な方法である。したがって、本発明者らは、表１に収載するような新しい命名法に従ってＥＨＶ  ｏｒｆの旧名を変更した。
【０２１１】
【表６】
2021516551.tif 000007
挿入部位の構築については、やはり、ＤＮＡポリメラーゼ処理能力因子をコードする遺伝子ＵＬ４２および糖タンパク質ＣをコードするＵＬ４４の上流および下流の推定プロモーターおよびポリＡシグナルを破壊しないように注意しなければならなかった。
新しいＵＬ４３挿入部位の構築を図１３に示す。
【０２１２】
例えば、ＵＬ４３（配列番号１８）の５’末端の８７０塩基対（配列番号２１）を、ＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥのＲＥＤ組換えにより、自己蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質をコードする発現カセットに置き換えた。ｍＣｈｅｒｒｙのオープンリーディングフレーム（ｏｒｆ）を、推定プロモーター（ｐ４２２、配列番号５）と、カプシドトリプレックスサブユニット２をコードするＥＨＶ−４  ＵＬ１８のポリＡ配列（配列番号７）との調節下に置いた。
１８ｐＡポリアデニル化配列（配列番号７）を、１．ｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ変異誘発の第２のステップ（第２のＲＥＤ）中にＫａｎａの欠損のための相同領域として役立つ、２．導入遺伝子のポリアデニル化シグナルとして機能する、２重機能を果たすように、カナマイシン耐性発現カセット（Ｋａｎａ）の上流および下流でのＲＥＤ組換えのためにトランスファーベクターに導入した。トランスファーベクターｐＵＵＬ４３−４２２−ｍＣ−１８Ｋ１８のマップについては、図１４を参照されたい。
【０２１３】
ウイルスゲノム内での組換えのための隣接領域と、発現カセットと、カナマイシン耐性カセットとを包含するｐＵＵＬ４３−４２２−ｍＣ−１８Ｋ１８（図１４；配列番号３５）の断片を、ホーミング制限エンドヌクレアーゼＩ−ＣｅｕＩを使用してトランスファーベクターから切り取り、アガロースゲル電気泳動により精製した。次いで、精製されたＤＮＡ断片を、ｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ  ＲＥＤ組換え（Tischer et al. 2006）によりＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥに挿入した。配列の完全性を確認した後、組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−ＵＬ４３−４２２−ｍＣｈｅｒｒｙ（図１５）を許容細胞培養物に対するトランスフェクション後にレスキューし、プラーク精製した。蛍光ｍＣｈｅｒｒｙタンパク質の発現は、蛍光顕微鏡観察により調査したとき、新しい挿入部位の新しい発現カセットが機能性であることを示した（図示なし）。
ベクターワクチンとしての第３の挿入部位の性能を試験するために、ブタ由来Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ｓｗｉｎｅ／Ｉｔａｌｙ／１１６１１４／２０１０（Ｈ１Ｎ２）  ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＤＲ０１７４６）からのインフルエンザヘマグルチニンＨ１ｐｄｍ亜型（配列番号４４）をｐＲａｃＨ−ＳＥの新しい部位に挿入した。
【０２１４】
このために、ｍＣｈｅｒｒｙをコードするｏｒｆをトランスファーベクターｐＵＵＬ４３−４２２−ｍＣ−１８Ｋ１８（図１４；配列番号３５）から切り取り、Ｈ１ｐｄｍをコードするｏｒｆを代わりに挿入した。したがって、得られたトランスファープラスミドをｐＵＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ−１８Ｋ１８（図１６、配列番号３６）と名づけた。ウイルスゲノム内での組換えのための隣接領域と、発現カセットと、カナマイシン耐性カセットとを包含するｐＵＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ−１８Ｋ１８の断片を、ホーミング制限エンドヌクレアーゼＩ−ＣｅｕＩを使用してトランスファーベクターから切り取り、アガロースゲル電気泳動により精製した。次いで、精製されたＤＮＡ断片を、ｅｎ−ｐａｓｓａｎｔ  ＲＥＤ組換え（Tischer et al. 2006）によりＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥに挿入した。配列の完全性を確認した後、組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−ＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ（配列番号１７）を許容細胞培養物に対するトランスフェクション後にレスキューし、プラーク精製した。
【０２１５】
同じ手順を使用して、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−Ｂに基づく組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ（ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−ｏｒｆ１／３−ｐ４３０−Ｈ１ａｖ−７０−ｐ４５５−Ｈ３、図７）を生成した。生成された三重挿入組換え体を、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−ＵＬ５６−４３０−Ｈ１ａｖ−ＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ−ＵＳ４−４５５−Ｈ３（略記ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−Ｅ、図１８）と名づけた。
【０２１６】
三重挿入ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−ＵＬ５６−４３０−Ｈ１ａｖ−ＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍ−ＵＳ４−４５５−Ｈ３（ｒＥＨＶ−１−Ｅと略記する）のゲノムの略図を図１８に示す。先行構築物の名称は、元のＥＨＶ−ｏｒｆ命名法を使用するが、新しい三重挿入ウイルス名は、遺伝子をヒトヘルペスウイルス１型のそれらのホモログに従って名づける、アルファヘルペスウイルスの統一命名法に基づく。
組換えプラーク精製ウイルスを、挿入部位領域のシーケンシング（図示なし）、ウェスタンブロット（図１９）およびウイルス滴定（表３）によって特徴づけた。
二重挿入組換えＥＨＶ−１であるｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−ＵＬ５６−４３０−Ｈ１ｈｕ−ＵＳ４−４５５−Ｈ１ｐｄｍ（略記ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−Ｄ、図１２）を使用して、導入遺伝子の発現強度を比較した。単一挿入ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥに加えて、ｐ４５５プロモーターの調節下にある新しいｏｒｆ７０／ＵＳ４発現部位からＩＡＶ  ＨＡ  Ｈ１ｐｄｍを発現するｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−ｏｒｆ７０−ｐ４５５−Ｈ１ｐｄｍ（図１０）を試験に含めた。
【０２１７】
新しい組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−ＵＬ４３−４２２−Ｈ１ｐｄｍおよびＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−Ｅの発現強度を、他の２つの、Ｈ１ｐｄｍを発現するｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥと比較して評価するために、ウェスタンブロット分析を行った。加えて、異なるＩＡＶ  ＨＡを発現する全ての単一挿入ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥと２つの二重挿入ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ  ＢおよびＤとをそれぞれ含めた。使用したウイルスのリストについては、表２を参照されたい。
【０２１８】
【表７】
2021516551.tif 000008
【０２１９】
ヘマグルチニンＨ１ａｖもしくはＨ１ｐｄｍに対するまたはＥＨＶ−１糖タンパク質ＩＩに対する３つの自社単一特異性モノクローナル抗体、および市販のポリクローナル抗Ｈ３抗体を使用した。方法は、異なる被験組換えウイルスで感染した細胞において発現された導入遺伝子の量の半定量的評価を可能にした。細胞培養対照としての細胞は未感染のままにしておき、バックグラウンドウイルス対照としては、レスキューして「空の」ベクター骨格ＢＡＣ（ＳＥ）から精製したｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥを使用した。組換えＥＨＶ−１  Ｂ、Ｄ、Ｅ、ＳＥ、ａｖ、ｈｕ、Ｈ３、４ｐ、４３ｐ（表２を参照されたい）で感染したまたは未感染のままにしておいたＡＩ−ＳＴ細胞培養物を感染の３０時間後に回収し、還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥ用に処理した。電気泳動後、タンパク質をナイロン膜に電気泳動転写させ、ＨＡ  Ｈ１ａｖ、Ｈ１ｐｄｍもしくはＥＨＶ−１  糖タンパク質ＩＩのいずれかに対するモノクローナル抗体またはＨＡ  Ｈ３に対する市販のウサギポリクローナル抗体とともにインキュベートした。ウェスタンブロット（図１９ｄ）は、９つ全てのウイルスの感染および複製の成功を確証した。Ｂ、Ｄ、ａｖ、ｈｕ、Ｈ３、４ｐ、４３ｐおよびＳＥ感染細胞に発現したｇｐＩＩの量は同様に見え、これは、同等の複製効率を示す。Ｅ感染細胞におけるｇｐＩＩ量は、他のものと比較して有意に低減される。ウェスタンブロット（図１９ａおよび１９ｂ）は、新しい組換えＥによるヘマグルチニンＨ１ａｖおよびＨ３の発現をそれぞれ確証する。Ｂと比較して、これらの量は同等に見える。対照的に、新しい組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−Ｅおよび−４３ｐにより発現されたヘマグルチニンＨ１ｐｄｍの量（ウェスタンブロット（図１９ｃ））は、同一のタンパク質が４５５プロモーターの調節下にあるＵＳ４（ｏｒｆ７０）挿入部位に発現されるＤおよび４ｐと比較すると、大いに低減されるように見える。
【０２２０】
３つのヘマグルチニンの並行した発現がウイルス複製効率を損なわせるかどうかを評価するために、ｒＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥ−Ｂ、−Ｄおよび−Ｅを、ＡＩ−ＳＴ細胞において第１１継代まで継代させ、三重反復実験として並行して力価を判定した（表３）。全ての力価は同等の範囲内であり、これは、第３の導入遺伝子発現カセットが細胞培養条件下でウイルス適応性に対して明らかな悪影響を及ぼさなかったことを示す。
【表８】
2021516551.tif 000009
【０２２１】
まとめると、組換えＥＨＶ−１は、３つの異なる発現部位から３つの異なるＡ型インフルエンザヘマグルチニンを並行して発現することが分かった。４３０および４５５プロモーターの調節下にそれぞれあるＵＬ５６（ｏｒｆ１／３）およびＵＳ４（ｏｒｆ７０）からの発現は、同等の強度の発現であったが、新しい４２２プロモーターの調節下にある新しい部位ＵＬ４３からの発現は、より弱かった。また、ｐ４２２プロモーターの調節下にあるＵＬ４３の新しい挿入部位からヘマグルチニンＨ１ｐｄｍのみを発現する組換えＥＨＶ−１  ＲａｃＨ−ＳＥでは、ｐ４５５プロモーターの調節下にあるＵＳ４（ｏｒｆ７０）挿入部位から発現される同じタンパク質と比較して、量が低減されるようであった。したがって、この新規発現システムは、目標が、ＵＬ５６部位およびＵＳ４部位から発現されるものに加えて第３の導入遺伝子のあまり強くない発現を求めるものである場合、選択肢となる。ＵＬ４３部位からのより少ない発現は、発現されるタンパク質が、大量に存在すると細胞培養中に毒性効果を発揮することが公知である場合、有利である。さらに、タンパク質の特定の比率が、目的のために、例えば、特異的比率での異なるウイルス構造タンパク質からなるウイルス様粒子の形成のために、必要とされる場合、強い発現部位と弱い発現部位の組合せを使用することができる。加えて、より弱い導入遺伝子発現は、発現されるタンパク質に組換えベクターウイルスを不安定化する傾向がある場合、望ましい可能性がある。
【０２２２】
増強ＥＨＶ−１ベクターＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥを、ウマ、イヌおよびブタを含む哺乳動物種の多様な病原体に対するベクターワクチンの生成（Trapp et al. 2005、Rosas et al. 2007a、2007b, 2008）のプラットフォームとして使用することができる。３つの異なる導入遺伝子をそれらの本物の形態で増強ベクターウイルスにより並行して発現させることができる。３つの異なる抗原は、１つの病原体からの３つの血清型を示すこともあり、またはワクチンが設計される種の異なる病原体に由来することもある。加えて、ウマ病原体の抗原を発現する増強ＥＨＶ−１ベクターｐＲａｃＨ−ＳＥに基づいて生成されたベクターワクチンには、ＥＨＶ−１感染に対するワクチン接種も行うことになるので、四価であるという推定上の可能性がある。
増強ＥＨＶ−１ベクターＢＡＣ  ｐＲａｃＨ−ＳＥに関する情報は、ＢＩ社を除けば、発表も提示もされていない。
【０２２３】
本願において開示し、特許請求の範囲に記載する組成物および方法の全ては、本開示を踏まえて、過度の実験なしに作製および実行することができる。本発明の組成物および方法を好ましい実施形態に関して説明したが、変形形態を、これらの組成物および方法に、ならびに本明細書に記載の方法のステップもしくは一連のステップに、本発明の概念、趣旨および範囲を逸脱することなく適用することができることは、当業者には明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理的にも関連している特定の薬剤を本明細書に記載の薬剤の代わりに用いることができ、さらに同じまたは同様の結果が達成されることになることは、明らかであろう。当業者には明らかなそのような同様の代用品および変更形態の全てが、後続の特許請求の範囲により規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【０２２４】
（参考文献）
以下の参考文献は、それにより本明細書に記載のものを補足する例示的な処置上のまたは他の詳細が提供される限りでは、明確に参照により本明細書に組み込まれる。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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