(57)【要約】  内因性ＲＮＡ分子を編集するための組成物および方法が提供される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記細胞に送達するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
【請求項２】
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＲＮＡ編集酵素がデアミナーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、これらの断片、およびこれらの変異体からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドまたはその変異体である、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号４６との少なくとも９０％の同一性を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記内因性ＲＮＡが中枢神経系細胞で発現されるＲＮＡである、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記内因性ＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ガイドＲＮＡが、編集されるヌクレオチドの上流または下流に１つまたは複数のミスマッチをさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルまたはその変異体である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記核局在化シグナルが、配列番号４７または１、２もしくは３つの置換、付加もしくは欠失を有する配列番号４７を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記核局在化シグナルがＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルであり、前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
ａ）およびｂ）の前記核酸分子が単一ベクター内に含まれる、請求項１から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を前記細胞に送達するステップを含み、
前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的に認識される配列を含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
【請求項２０】
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記内因性ＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記ガイドＲＮＡが、編集されるヌクレオチドの上流または下流に１つまたは複数のミスマッチをさらに含む、請求項１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、請求項１９から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、請求項１９から２５のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルおよび／または機能を変化させる、請求項１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、請求項１９から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
対象の中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法であって、
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記対象に投与するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み、
前記ＲＮＡ編集酵素は、前記中枢神経系の遺伝性疾患に関連するミスマッチ突然変異を修正する、方法。
【請求項３１】
前記中枢神経系の遺伝性疾患がレット症候群である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２  ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびこれらの断片または変異体から選択される、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドまたはその変異体である、請求項３０から３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号４６との少なくとも９０％の同一性を含む、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、請求項３０から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルまたはその変異体である、請求項３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記核局在化シグナルが、配列番号４７または１、２もしくは３つの置換、付加もしくは欠失を有する配列番号４７を含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記核局在化シグナルがＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルであり、前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、請求項３０に記載の方法。
【請求項４３】
ａ）およびｂ）の前記核酸分子が単一ベクター内に含まれる、請求項３０から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記ベクターがウイルスベクターである、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
対象の中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法であって、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を前記対象に投与するステップを含み、前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的に認識される配列を含む、方法。
【請求項４７】
前記中枢神経系の遺伝性疾患がレット症候群である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２  ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、請求項４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１もしくはＡＤＡＲ２またはこれらの変異体である、請求項４６から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、請求項４６から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、請求項４６から５２のいずれか一項記載の方法。
【請求項５４】
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルおよび／または機能を変化させる、請求項４６から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、請求項４６から５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項５５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１０月６日に出願された米国仮特許出願第６２／５６９３７６号に対する米国特許法第１１９条（ｅ）に基づく優先権を主張するものである。前記出願は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって授与された助成金番号ＮＳ０８７７２６の下で政府支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【０００３】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
これと共に電子的に提出されたテキストファイルの内容は、全体が参照により本明細書に組み込まれる：配列表のコンピュータ読取可能な形式のコピー（ファイル名：ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔ；データ記録日：２０１８年１０月９日；ファイルサイズ：４４．６ＫＢ）。
【０００４】
本発明は、核酸編集の分野に関する。具体的には、ＲＮＡ、特に核内の内因性ＲＮＡを治療的に編集するための組成物および方法が開示される。
【背景技術】
【０００５】
本発明が属する分野の先行技術を説明するために、本明細書全体を通していくつかの刊行物および特許文書が引用されている。これらの引用の各々は、完全に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００６】
遺伝物質を編集または改変する戦略、例えば、種々の遺伝子編集技術で進歩が見られる。しかしながら、特に神経系において、疾患の原因となる突然変異を修正する方法論の必要性が残っている。
【０００７】
レット症候群は、転写因子メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）の散発的突然変異によって引き起こされる神経発達障害である（Ａｍｉｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２３：１８５−１８８）。ＭＥＣＰ２はＸ染色体上に位置する。哺乳動物における遺伝子量補償（ｄｏｓａｇｅ  ｃｏｍｐｅｎｓａｔｉｏｎ）機序のため、レット症候群に罹患した女性はモザイクであり、野生型細胞と突然変異型細胞との間でおよそ５０：５０に分かれる。ＭＥＣＰ２突然変異を有する女性は、発話および意図的な手の動きなどの初期の発達上のマイルストーンの後退を経験し、次いで、呼吸を含む重度の運動異常を獲得し、平均で４０歳までに死亡する（Ｎｅｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：９４４−９５０；Ｐｅｒｃｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：９５１−９５５）。ＭＥＣＰ２に突然変異を有し、Ｘ染色体が１つしかない男性は、なおさらに深刻な疾患を発症し、通常２歳未満で死亡する（Ｓｃｈｕｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，７４：１１６−１２６）。レット症候群の治療法はない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ａｍｉｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２３：１８５−１８８
【非特許文献２】Ｎｅｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，（２０１０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：９４４−９５０
【非特許文献３】Ｐｅｒｃｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６８：９５１−９５５
【非特許文献４】Ｓｃｈｕｌｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｃｌｉｎ．Ｇｅｎｅｔ．，７４：１１６−１２６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明の一態様によると、細胞内、特に細胞の核内の内因性ＲＮＡの配列を編集する方法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、ｉ）核局在化シグナルと、ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素とを含む融合タンパク質をコードする核酸分子、およびｉｉ）１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸分子を細胞に送達するステップを含む。ガイドＲＮＡは、ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含む。ガイドＲＮＡはまた、内因性ＲＮＡ中の標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミスマッチを含む。一定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、例えばＡＤＲＡＲ１またはＡＤＡＲ２である。一定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドであり、ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列がＢｏｘＢ配列である。一定の実施形態では、内因性ＲＮＡが、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである。一定の実施形態では、核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルである。これらの方法の核酸分子は、ウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター）などの単一のベクター内に含まれていてもよい。
【００１０】
本発明の別の態様によると、細胞内、特に細胞の核内の内因性ＲＮＡの配列を編集する追加の方法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、１つまたは複数のガイドＲＮＡをコードする核酸分子を細胞に送達するステップを含み、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡに作用するヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）などの内因性デアミナーゼによって特異的に認識される（１又は複数の）配列および／または構造を含む。ガイドＲＮＡはまた、内因性ＲＮＡ中の標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミスマッチを含む。一定の実施形態では、ＡＤＡＲがＡＤＲＡ１またはＡＤＡＲ２である。一定の実施形態では、内因性ＲＮＡが、メチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである。一定の実施形態では、核酸分子が、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）内に含まれる。
【００１１】
本発明の別の態様によると、細胞内、特に細胞の核内の内因性ＲＮＡの配列を編集する追加の方法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子（例えば、ＡＡＶ内）を細胞に送達するステップを含み、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的に認識される（１又は複数の）配列および／または構造を含む。したがって、種々の態様では、本編集する方法を、組換えＲＮＡ編集酵素の非存在下で（例えば、組換えＡＤＡＲの非存在下で）行うことができる。よって、実施形態では、本方法が、本明細書に記載される編集に影響を及ぼすための内因性ＡＤＡＲ活性を請け負う。
【００１２】
本発明の別の態様によると、対象のレット症候群を処置、抑制および／または予防する方法が提供される。一定の実施形態では、本方法が、本発明のＲＮＡ編集法を使用するステップを含む。例えば、本方法は、ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードする核酸分子およびガイドＲＮＡをコードする核酸分子を対象に投与するステップを含み得、融合タンパク質は核局在化シグナルを含む。一定の実施形態では、本方法が、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を対象に投与するステップを含み、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）などの内因性ヒトデアミナーゼによって特異的に認識される（１又は複数の）配列および／または（１又は複数の）構造を含み、ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、内因性ＭＥＣＰ２  ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】編集効率が配列依存性であることを示している。図１Ａは、ＭｅＣＰ２におけるメチルＤＮＡ結合ドメイン（ＭＢＤ）、転写リプレッサードメイン（ＴＲＤ）、およびＮＣｏＲ相互作用ドメイン（ＮＩＤ）に対する３つのＧ＞Ａ突然変異の位置を示す概略図である。図１Ｂは、部位特異的ＲＮＡ編集のコア構成要素の概略図である。ハイブリッドエディターゼ（Ｅｄｉｔａｓｅ）は、バクテリオファージλ（λＮ）由来のＲＮＡ結合ドメインと、ＲＮＡ  ２に作用するヒトアデノシンデアミナーゼ（ｈＡＤＡＲ２）の触媒ドメイン（デアミナーゼドメイン）を含む。核局在化シグナル（ＮＬＳ）の３つのコピーと、ヒトインフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）エピトープタグの２つのコピーも含まれているが、示されていない。ガイドＲＮＡはＭｅｃｐ２  ｍＲＮＡに相補的で、λＮ  ＲＮＡ結合ドメインによって認識されるヘアピン（ステムループ）を含む。標的Ａに対して、編集効率を高めるためにガイドにＣが導入されている。図１Ｃは、ガイドを用いた（上）または用いない（下）、ガイドエディターゼのＮ２Ａ神経芽細胞腫細胞へのトランスフェクション後のＭｅｃｐ２Ｗ１０４Ｘ  ｃＤＮＡの配列決定クロマトグラムである。図１Ｄは、Ｍｅｃｐ２  ｃＤＮＡの直接配列決定法を使用して定量化された、図１Ｃのデータを含む、ＡからＩへの編集％（平均±ＳＤ；ｎ＝３）を示す図である。薄灰色バー、エディターゼのみでトランスフェクトされた細胞；濃灰色バー、エディターゼおよびガイドでトランスフェクトされた細胞。＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を使用した一元配置分散分析。ｎｓ：有意でない。
【図２】Ｍｅｃｐ２  ｍＲＮＡに対する部位特異的Ａ−Ｇミスマッチのガイドを使用して、より効率的なエディターゼによるオフターゲット編集を減少させることができることを示している。図２Ａは、ガイドＲＮＡおよびエディターゼＷＴまたはエディターゼＥ４８８ＱのＮ２Ａ細胞へのトランスフェクション後のＲ１０６Ｑ（平均±ＳＤ、ｎ＝３）部位でのＡからＩへの編集％（平均±ＳＤ；ｎ＝３、図２Ｂのデータを含む）を示す図である。図２Ｂは、エディターゼＷＴ（上）またはエディターゼＥ４８８Ｑ（下）で編集したＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ  ｃＤＮＡの代表的なクロマトグラムである。図２Ｃは、２つの異なるガイドＲＮＡに対するＭｅｃｐ２  ｍＲＮＡを示す図である。標準ガイド（上）は、編集を増強するために、標的Ａ（太字で強調）でＡ−Ｃミスマッチ（Ｒ１０６Ｑ）を含む。改変ガイド（下）は、この部位での編集を阻害するためにアステリスクでマークされたオフターゲットＡでＡ−Ｇミスマッチを含む。提供される標的配列は、配列番号５２である。図２Ｄは、Ｎ２Ａ細胞をエディターゼＥ４８８Ｑおよび標的部位でのみミスマッチを含むガイド（上）またはオンターゲットＡ−Ｃミスマッチとオフターゲット部位でのＡ−Ｇミスマッチの両方を含む改変ガイド（下）でトランスフェクションした後のＭｅｃｐ２  ｃＤＮＡのクロマトグラムである。図２Ｅは、Ａ−Ｇミスマッチを含むガイドにより、オフターゲット編集が大幅に減少する（平均±ＳＤ；ｎ＝３、図２Ｄのデータを含む）ことを示す図である。図２Ｆは、オフターゲットＡ−Ｇミスマッチの存在は、Ｒ１０６Ｑ部位での編集には影響を及ぼさない（平均±ＳＤ；ｎ＝３、図２Ｄのデータを含む）。薄灰色バー、エディターゼのみでトランスフェクトされた細胞；濃灰色バー、エディターゼおよびガイドでトランスフェクトされた細胞；黒色バー、エディターゼおよびＡ−Ｇミスマッチを含むガイドでトランスフェクトされた細胞。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１、ボンフェローニ事後検定を使用した一元配置分散分析。ｎｓ：有意でない。
【図３】初代ニューロンのＡＡＶ１／２形質導入後の内因性ＭｅＣＰ２  ｍＲＮＡの配列分析を示している。図３Ａは、ＡＡＶ１／２ウイルスによる形質導入の７日後、Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙ海馬ニューロン（ＤＩＶ１４）から単離されたｃＤＮＡの配列分析による編集の定量化（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を示す図である。＋ガイドは、ニューロンのシナプシンＩプロモーターの制御下にあるエディターゼおよびそれぞれＵ６プロモーターの制御下で発現される６コピーのガイドを含むＡＡＶ１／２を指す。ガイドは、Ｒ１０６Ｑの標的ＡでのＣミスマッチおよびオフターゲットＡ  Ｔ１０５ＴでのＧミスマッチを含む。対照ウイルスは、シナプシンＩプロモーターの制御下でエディターゼをコードするが、いずれのガイド配列も欠く（−ガイド）。＊＊＊＊対応のない両側ｔ検定によりＰ＜０．０００１。図３Ｂは、ガイドＲＮＡ領域に対するＭｅｃｐ２  ｍＲＮＡ（配列番号５２）および一次アミノ酸配列（配列番号５３）を示す図である。標的Ａは太字で示され、アステリスクはオフターゲット編集されたＡ残基を示す。ガイドのヘアピンは、λＮペプチドによって認識されるＢｏｘＢ配列の位置を表す。グラフは、Ｍｅｃｐ２  ｍＲＮＡ内のオフターゲット部位での編集の定量化を提供する（平均±ＳＤ；ｎ＝３）。残基Ｎ１２６Ｓがガイド領域の外にある。
【図４】部位特異的ＲＮＡ編集がＭｅＣＰ２タンパク質レベルを上昇させ、それによって編集後の内因性疾患の原因となるタンパク質の機能的回復を示していることを示す図である。エディターゼのみまたはエディターゼとガイドを発現しているＡＡＶ１／２で７日前に形質導入されたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙまたは野生型（ＷＴ、Ｍｅｃｐ２＋／ｙ）同胞海馬ニューロン（ＤＩＶ１４）からの全細胞可溶化物の代表的なウエスタンブロットが提供される。ガイドは、Ｒ１０６Ｑ部位でのＣミスマッチおよびオフターゲットＡ、Ｔ１０５ＴでのＧミスマッチを含む。グラフは、各条件がβ−アクチンに正規化されたウエスタンブロットの定量化（平均±ＳＤ、ｎ＝３）を提供する。薄灰色バー、エディターゼのみで形質導入された細胞。濃灰色バー、エディターゼおよびガイドで形質導入された細胞。＊＊＊対応のない両側ｔ検定によりＰ＜０．００１。
【図５】部位特異的ＲＮＡ編集が、ＭｅＣＰ２がヘテロクロマチンに結合する能力を回復することを示しており、編集後の内因性タンパク質の機能の回復を示している。エディターゼ（ＨＡ）およびＭｅＣＰ２について免疫標識された海馬ニューロン（ＤＩＶ１４）の代表的な共焦点画像を示している。ＤＡＰＩ染色は、核の輪郭を描き、ヘテロクロマチン構造（ｈｅｔｅｒｏｃｈｒｏｍａｔｉｃ  ｆｏｃｉ）を示す。挿入図は、隣接パネルでより高い倍率とより高いゲインで撮像された細胞の境界を定める。図５Ａは、野生型（Ｍｅｃｐ２＋／ｙ）ニューロン培養物を示す図である。図５Ｂは、エディターゼのみ（ガイドなし）を発現するＡＡＶ１／２ウイルスが形質導入されたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙニューロン培養物を示す図である。これらのニューロンは、ヘテロクロマチン中にＭｅＣＰ２濃縮を決して示さなかった。図５Ｃは、エディターゼおよび標的ＡでＣミスマッチを含むガイドを発現するＡＡＶ１／２ウイルスが形質導入されたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙニューロン培養物を示す図である。図５Ｄは、エディターゼおよび標的ＡでＣミスマッチを含むガイドを発現するＡＡＶ１／２ウイルスが形質導入されたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙニューロン培養物を示す図である。図５Ｄ中、＋および−は、それぞれ、ヘテロクロマチン中にＭｅＣＰ２濃縮が存在するおよび存在しない核を示している。スケールバー、１０μｍ。図５Ｅ〜図５Ｇ：各ヒストグラムは、３つのスライド（平均±ＳＤ）の各々の３つのフィールドからの細胞の定量化（エディターゼのみ、ｎ＝１３４；エディターゼおよびガイド、ｎ＝１３７）を表す。図５Ｅは、非感染細胞からのシグナルを閾値処理した後、ＨＡ核染色によって同定されたエディターゼ＋細胞の百分率を示す図である。百分率は、ＤＡＰＩ＋細胞の総数に対するものである。図５Ｆは、ヘテロクロマチン（構造）中にＭｅＣＰ２濃縮を有するエディターゼ＋細胞の百分率を示す図である。図５Ｇは、ヘテロクロマチン（構造）中にＭｅＣＰ２濃縮を有する全ての細胞の百分率を示す図である。ｎｓ：有意でない。
【図６】エディターゼのみまたはエディターゼとガイドＲＮＡをコードするＡＡＶベクターで処置された野生型マウスまたはＭｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａ（Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ）マウスの脳の歯状ニューロンヘテロクロマチンにおけるＭｅＣＰ２強度のグラフである。
【図７】種々のガイドＲＮＡの概略図と、処置していない、または２つのＢｏｘＢステムループを有するガイドＲＮＡ、ＧｌｕＡ２からのＲ／Ｇ結合部位を含むガイドＲＮＡもしくは内部ループを有するガイドＲＮＡで処置したＨＥＫ細胞におけるＭｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａ（Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ）の編集％のグラフである。ＨＥＫ細胞はまた、ＣＭＶプロモーターの制御下で完全長天然ＡＤＡＲ２  ｃＤＮＡでトランスフェクトされた。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明は、一部は、部位特異的ＲＮＡ編集を利用して、ＲＮＡレベル（例えば、ｍＲＮＡ）で、疾患の原因となる点突然変異、例えば、レット症候群の根底にあるメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＤＮＡ結合ドメイン遺伝子のグアノシンからアデノシンへの（Ｇ＞Ａ）突然変異を修復することができるという驚くべき発見に基づく。重要なことに、この部位特異的ＲＮＡ編集は、とりわけ、内因性ＲＮＡを修復し、タンパク質機能を回復するのに有用である。したがって、実施形態では、本発明は、部位特異的ＲＮＡ編集のための組成物および方法に関する。
【００１５】
生殖系列または神経細胞に限局してヒトでレット症候群を引き起こすＭｅｃｐ２の突然変異を有するよう操作されたマウスは、レット症候群の患者と同様の成長異常、不安および運動障害を示す（Ｇｕｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２７：３２２−３２６；Ｌｉｏｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７５：４９７−５００；Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２７：３２７−３３１）。マウスでの研究は、最も強いレット症候群表現型が神経学的であり、ニューロンとグリアの両方に影響を及ぼすことを示している（Ｌｉｏｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔｕｒｅ  ４７５：４９７−５００；Ｌｕｉｋｅｎｈｕｉｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０１：６０３３−６０３８）が、多くの他の組織も影響を受ける可能性がある（Ｒｏｓｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：４３８９−４４０４）。ヒトと同様に、雄レットマウスは雌マウスよりも重症である。例えば、雌レットマウスは正常な寿命を生きるが、雄マウスは生後３〜４か月で死亡する（Ｇｕｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２７：３２２−３２６；Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２７：３２７−３３１）。細胞レベルでは、レットの雄および雌マウスの神経細胞は、細胞体、核が小さく、プロセスの複雑さが減少しており（Ｂｅｌｉｃｈｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎｅｕｒｏｂｉｏｌ．Ｄｉｓ．，３４：７１−７７；Ｂｅｌｉｃｈｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｊ．Ｃｏｍｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５１４：２４０−２５８；Ｆｕｋｕｄａ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，６４：５３７−５４４；Ｋｉｓｈｉ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，２７：３０６−３２１；Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｒａｉｎ  １３５：２６９９−２７１０；Ｔｒｏｐｅａ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０６：２０２９−２０３４；Ｓｔｕｓｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ３１８９６）、罹患したヒト細胞を思い出させる（Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．，５４：１９５−２０１；Ｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  １３：４４６−４５８；Ｂｅｌｉｃｈｅｎｋｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎｅｕｒｏｒｅｐｏｒｔ．，５：１５０９−１５１３；Ｂａｕｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ４５：１５８１−１５８６）。重要なことに、条件付きＣｒｅリコンビナーゼ（Ｇｕｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５：１１４３−１１４７）または遺伝子療法アプローチ（Ｓｉｎｎｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１０６−１１５；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１８０−１９０；Ｇａｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃ��．，３３：１３６１２−１３６２０；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２１：１８−３０）を介したＭｅｃｐ２ヌルマウスでのＭｅＣＰ２の回復により、疾患の後期でさえ、レット様症候群および細胞欠損の多くが逆行する。表現型の逆転は、ヒトで、レット症候群を遺伝子置換戦略で処置することができることを示している（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｂｒａｉｎ  １３５：２６９９−２７１０；Ｓｉｎｎｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１０６−１１５；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１８０−１９０；Ｇａｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３３：１３６１２−１３６２０；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２１：１８−３０）。しかしながら、ヒトでのＭＥＣＰ２遺伝子にかかる重複は、ＭｅＣＰ２過剰発現および重度の神経障害をもたらす（Ｖａｎ  Ｅｓｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ａｍ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ．，７７：４４２−４５３）。さらに、マウスのＭｅＣＰ２は様々な神経細胞型で様々なレベルで発現され、マウスでのＭｅＣＰ２機能の喪失は遺伝子発現の細胞特異的変化をもたらす（Ｓｋｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，３７：４５７−４６８；Ｂａｌｌａｓ，ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１２：３１１−３１７；Ｓｈａｈｂａｚｉａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，１１：１１５−１２４；Ｓｕｇｉｎｏ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３４：１２８７７−１２８８３；Ｌｉｎｈｏｆｆ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｃｅｌｌ  １６３：２４６−２５５）。これらの所見は、神経系の多様な細胞型にわたって正常なＭｅＣＰ２レベルおよび細胞生理学を回復するために微調整しなければならないＭＥＣＰ２遺伝子置換の課題を強調している。
【００１６】
本明細書では、ＲＮＡが正常な転写産物の環境で修復されるので、ＲＮＡのレベルでＭＥＣＰ２突然変異を修復すると、ＭＥＣＰ２過剰発現と細胞型特異的調節の両方の問題が、回避されることが示されている。レット症候群の根底にあるグアノシンからアデノシンへの（Ｇ＞Ａ）突然変異（Ｆｙｆｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１８：７０９−７１３）を標的とした。天然酵素のファミリーであるＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）は、内因性ｍＲＮＡにおいてＡをイノシン（Ｉ）に加水分解的に脱アミノ化する（Ｂａｓｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｃｅｌｌ  ５５：１０８９−１０９８；Ｂａｓｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ４８：６０７−６１３；Ｍｅｌｃｈｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３７９：４６０−４６４；Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｍｅｔｈｏｄｓ  １５：５１−６２；Ｋｉｍ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９１：１１４５７−１１４６１）。イノシン塩基はシトシン（Ｃ）と対になり、リボソームによってＧとして翻訳される（Ｂａｓｉｌｉｏ，ｅｔ  ａｌ．（１９６２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，４８：６１３−６１６）。ＡＤＡＲファミリーのメンバーの１つであるＡＤＡＲ２は、脳で高レベルに発現され、転写後に、一次転写産物の脱アミノ化を通して、イオンチャネル透過性などのタンパク質機能を変化させる（Ｂｈａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：９５０−９５６；Ｓｏｍｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６７：１１−１９；Ｂｕｒｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：３０３−３０８）。ＡＤＡＲ２による自然編集は、その触媒活性に加えて、編集のために標的Ａをエクソンに適切に配置するプレｍＲＮＡのイントロンによって媒介される二本鎖ＲＮＡ構造の認識が必要である（Ｂｈａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：９５０−９５６；Ｄａｗｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７９：４９４１−４９５１；Ｈｉｇｕｃｈｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃｅｌｌ  ７５：１３６１−１３７０；Ｍａａｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１２２２１−１２２２６；Ｌｏｍｅｌｉ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：１７０９−１７１３；Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９４：４３５４−４３５９）。ヒトＡＤＡＲ２（ｈＡＤＡＲ２）のクローニング触媒ドメインは、通常終止コドンで、異種的に発現されるｍＲＮＡのＧ＞Ａ修復を標的とするために、種々の構成で、利用されてきた（Ｈａｎｓｗｉｌｌｅｍｅｎｋｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１３７：１５８７５−１５８８１；Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ  ９：２０２１−２０２５；Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，５３：６２６７−６２７１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４２：ｅ８７；Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５−１８２９０）。１つのアプローチでは、ＡＤＡＲ２の天然ＲＮＡ結合ドメインが、ナノモル濃度の親和性で特異的短ＲＮＡヘアピンに結合する（Ａｕｓｔｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１２４：１０９６６−１０９６７）バクテリオファージラムダ（λＮ；Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５−１８２９０）由来のＲＮＡ結合ペプチドで置き換えられた。次いで、異種ｍＲＮＡの標的編集が、λＮ認識ステムループおよび標的ｍＲＮＡに相補的な領域を含むＲＮＡガイドと共にハイブリッドＡＤＡＲ２タンパク質を発現させることによって達成される（Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５−１８２９０）。
【００１７】
以前は、内因性ＲＮＡもｍＲＮＡも、特に機能的タンパク質を生成するように修復されることに関して、部位特異的ＲＮＡ編集によって修復されてこなかった。しかしながら、内因性Ｍｅｃｐ２におけるＧ＞Ａ突然変異に対するこのアプローチが、本明細書で初めて実証されている。Ｍｅｃｐ２の突然変異は、十分確立された機能をコードするドメインにある。さらに、修復の忠実度を、配列分析、ウエスタンブロッティング、および単一細胞レベルでの免疫化学によって監視することができる。ここでは、内因性Ｍｅｃｐ２転写産物内のＧ＞Ａ突然変異を有効に修復するために、組換えｈＡＤＡＲ２−λＮタンパク質（本明細書ではエディターゼとも呼ばれる）を使用した。トランスフェクトマウス神経芽細胞腫（Ｎ２Ａ）細胞でのＭｅｃｐ２編集のパラメータを決定した後、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を使用して、ＤＮＡ結合ドメインに重度のヒトＧ＞Ａ突然変異を含むレット症候群マウスモデルからの初代ニューロン培養を形質導入した（ＭｅＣＰ２３１７Ｇ＞Ａ；ＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑ）。この突然変異により、ＭｅＣＰ２タンパク質レベルが低下し、ヘテロクロマチンへの結合が大幅に減少する。突然変異ＲＮＡの編集効率を最初にニューロンで定量化し、次いで、編集によってＭｅＣＰ２タンパク質レベルが救済され、ニューロン、グリアおよび非神経細胞型を含む細胞内のＭｅＣＰ２の重要な特性であるヘテロクロマチン構造における結合の濃縮につながるかどうかを試験した。本明細書に提示される結果は、部位特異的ＲＮＡ編集が、レット症候群ならびに遺伝子療法を受けられる他の神経疾患の根底にある疾患の原因となるＭＥＣＰ２突然変異を治療的に修復できることを示している。
【００１８】
本発明によると、細胞内の核酸分子を編集する方法が提供される。特定の実施形態では、編集される核酸分子が、ＲＮＡ分子、特に核内のＲＮＡ分子（例えば、一次転写産物、プレｍＲＮＡ、またはｍＲＮＡ（例えば、核からの輸送前のｍＲＮＡ））である。特定の実施形態では、編集される核酸分子が、内因性および／または核転写産物である。ＣＲＩＳＰＲ技術などの遺伝子編集では、ゲノムのオフターゲット突然変異が永続的である。対照的に、細胞内のＲＮＡターンオーバーは、ＲＮＡ内のオフターゲット突然変異が一時的であることを意味する。さらに、ＲＮＡ編集は、ＣＲＩＳＰＲゲノム編集とは異なり、段階的であり得る。結果として、オフターゲット突然変異は必ずしも１００％まで編集されるわけではない。
【００１９】
実施形態では、本発明は、タンパク質発現および／または機能の微調整を提供する核酸分子をＲＮＡ編集する方法を提供する。例えば、本発明の方法は、編集されていない状態と比較して、タンパク質発現および／または機能の正常レベルの回復を可能にする。本明細書に記載される処置の文脈において、本発明の方法は、未処置の状態と比較して、正常レベルまたは少なくとも正常レベルに近いタンパク質発現および／または機能の回復を可能にする。
【００２０】
実施形態では、本発明は、例えば記載される療法の文脈で、（例えば、投薬を介して）調整可能な一過的編集を提供する核酸分子をＲＮＡ編集する方法を提供する。例えば、本発明は、標的ＲＮＡの可逆的編集を可能にする。
【００２１】
特定の実施形態では、編集される細胞が非分裂細胞である。特定の実施形態では、編集される細胞がニューロンおよび／またはグリア細胞である。特定の実施形態では、編集される細胞が非神経細胞である。特定の実施形態では、編集される細胞がニューロンである。細胞（例えば、ニューロン）は、中枢神経系（例えば、脳、脊髄）および／または末梢神経系にあり得る。細胞は、（例えば、インビボ処置方法で）処置される対象に存在し得る、または細胞は、インビトロで処置され、次いで、対象に投与され得る（例えば、エキソビボ処置方法）。
【００２２】
本発明の一定の実施形態では、本方法が、１）ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子および２）ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子を細胞に送達するステップを含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインが、ＲＮＡ編集酵素のＮ末端に連結される。実施形態では、ＲＮＡ編集酵素およびＲＮＡ結合ドメインを含む融合物が、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含まない。実施形態では、ＲＮＡ編集酵素およびＲＮＡ結合ドメインを含む融合物が、少なくとも１つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）をさらに含む。例えば、ＲＮＡ編集酵素およびＲＮＡ結合ドメインを含む融合物は、１、２、３、４、５またはそれ以上のＮＬＳをさらに含む。複数のＮＬＳが使用される場合、各ＮＬＳは互いに直接連結していてもよいし、または１〜約５個のアミノ酸のアミノ酸リンカーによって分離されていてもよい。特定の実施形態では、ＮＬＳが、融合タンパク質のＮ末端にある。ＮＬＳの例は、Ｋｏｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００９）２８４：４７８−４８５；参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。特定の実施形態では、ＮＬＳが、コンセンサス配列Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）（配列番号５８）（例えば、単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、コンセンサス配列（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ１０〜１２（Ｋ／Ｒ）３／５（配列番号５９）（式中、（Ｋ／Ｒ）３／５は、５つのアミノ酸のうち少なくとも３つがリジンまたはアルギニンのいずれかであることを表す）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳがｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳを含む。特定の実施形態では、ｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳが、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５４）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳがヌクレオプラスミンＮＬＳである。特定の実施形態では、ヌクレオプラスミンＮＬＳが、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６０）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳを含む。特定の実施形態では、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳが、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４７）を含む。特定の実施形態では、融合物が、３つのＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（例えば、配列ＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号６７））を含む。種々の実施形態では、ＮＬＳが、上記の配列（例えば、配列番号５８、５９、６０、４７、５４または６７）中に、これらの配列が１つまたは複数の置換、付加または欠失（例えば、約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約１０、または約１５（約１〜５、または約１〜１０、または約１〜１５を含む）の置換、付加または欠失）を含むように、突然変異／変異を含み得る。特定の実施形態では、ＮＬＳ内のリジンアミノ酸がアルギニンアミノ酸で置換されていてもよい、および／またはＮＬＳ内のアルギニンアミノ酸がリジンアミノ酸で置換されていてもよい。融合タンパク質は、融合タンパク質のＮ末端で、精製タグ（例えば、ＨＡタグ）をさらに含んでいてもよい。
【００２３】
本発明の核酸分子は、単一ベクター内に含まれていてもよいし、または別々のベクターに含まれていてもよい。例えば、ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子およびガイドＲＮＡをコードする核酸分子は、単一ベクター内に含まれる。核酸分子は、連続的に（前または後に）および／または同時に（同時的に）細胞に送達され得る。核酸分子は、同じ組成物または別個の組成物で（例えば、別個のベクターに含まれる場合）送達され得る。特定の実施形態では、核酸分子が、単一ベクター、特にＡＡＶベクターなどのウイルスベクターで送達される。
【００２４】
特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素がヒトである。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素がデアミナーゼである。デアミナーゼの例としては、限定されないが、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）、アポリポタンパク質Ｂ  ｍＲＮＡ編集酵素、触媒ポリペプチド様（ＡＰＯＢＥＣ（例えば、ＡＰＯＢＥＣ１、ＡＰＯＢＥＣ３Ａ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ））、および活性化誘導シチジンデアミナーゼ（ＡＩＣＤＡまたはＡＩＤ；Ｃ：ＧはＴ：Ａに変換される）が挙げられる。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、ＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２またはＡＤＡＲ３などのＡＤＡＲである。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素がＡＤＡＲ１である（例えば、Ｇｅｎｅ  ＩＤ：１０３およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１１１１．５およびＮＰ＿００１１０２．３ならびにこれらのアイソフォーム参照）。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素がＡＤＡＲ２である。ＲＮＡ編集酵素が完全長未満であってもよい。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素がその天然のＲＮＡ結合ドメインを欠いている。例えば、ＲＮＡ編集酵素が、酵素の触媒ドメインを含んでもよい、または酵素の触媒ドメインからなってもよい。
【００２５】
ヒトＡＤＡＲ１のアミノ酸配列の例は、
ＭＮＰＲＱＧＹＳＬＳ  ＧＹＹＴＨＰＦＱＧＹ  ＥＨＲＱＬＲＹＱＱＰ  ＧＰＧＳＳＰＳＳＦＬ  ＬＫＱＩＥＦＬＫＧＱ  ＬＰＥＡＰＶＩＧＫＱ  ＴＰＳＬＰＰＳＬＰＧ  ＬＲＰＲＦＰＶＬＬＡ  ＳＳＴＲＧＲＱＶＤＩ  ＲＧＶＰＲＧＶＨＬＲ  ＳＱＧＬＱＲＧＦＱＨ  ＰＳＰＲＧＲＳＬＰＱ  ＲＧＶＤＣＬＳＳＨＦ  ＱＥＬＳＩＹＱＤＱＥ  ＱＲＩＬＫＦＬＥＥＬ  ＧＥＧＫＡＴＴＡＨＤ  ＬＳＧＫＬＧＴＰＫＫ  ＥＩＮＲＶＬＹＳＬＡ  ＫＫＧＫＬＱＫＥＡＧ  ＴＰＰＬＷＫＩＡＶＳ  ＴＱＡＷＮＱＨＳＧＶ  ＶＲＰＤＧＨＳＱＧＡ  ＰＮＳＤＰＳＬＥＰＥ  ＤＲＮＳＴＳＶＳＥＤ  ＬＬＥＰＦＩＡＶＳＡ  ＱＡＷＮＱＨＳＧＶＶ  ＲＰＤＳＨＳＱＧＳＰ  ＮＳＤＰＧＬＥＰＥＤ  ＳＮＳＴＳＡＬＥＤＰ  ＬＥＦＬＤＭＡＥＩＫ  ＥＫＩＣＤＹＬＦＮＶ  ＳＤＳＳＡＬＮＬＡＫ  ＮＩＧＬＴＫＡＲＤＩ  ＮＡＶＬＩＤＭＥＲＱ  ＧＤＶＹＲＱＧＴＴＰ  ＰＩＷＨＬＴＤＫＫＲ  ＥＲＭＱＩＫＲＮＴＮ  ＳＶＰＥＴＡＰＡＡＩ  ＰＥＴＫＲＮＡＥＦＬ  ＴＣＮＩＰＴＳＮＡＳ  ＮＮＭＶＴＴＥＫＶＥ  ＮＧＱＥＰＶＩＫＬＥ  ＮＲＱＥＡＲＰＥＰＡ  ＲＬＫＰＰＶＨＹＮＧ  ＰＳＫＡＧＹＶＤＦＥ  ＮＧＱＷＡＴＤＤＩＰ  ＤＤＬＮＳＩＲＡＡＰ  ＧＥＦＲＡＩＭＥＭＰ  ＳＦＹＳＨＧＬＰＲＣ  ＳＰＹＫＫＬＴＥＣＱ  ＬＫＮＰＩＳＧＬＬＥ  ＹＡＱＦＡＳＱＴＣＥ  ＦＮＭＩＥＱＳＧＰＰ  ＨＥＰＲＦＫＦＱＶＶ  ＩＮＧＲＥＦＰＰＡＥ  ＡＧＳＫＫＶＡＫＱＤ  ＡＡＭＫＡＭＴＩＬＬ  ＥＥＡＫＡＫＤＳＧＫ  ＳＥＥＳＳＨＹＳＴＥ  ＫＥＳＥＫＴＡＥＳＱ  ＴＰＴＰＳＡＴＳＦＦ  ＳＧＫＳＰＶＴＴＬＬ  ＥＣＭＨＫＬＧＮＳＣ  ＥＦＲＬＬＳＫＥＧＰ  ＡＨＥＰＫＦＱＹＣＶ  ＡＶＧＡＱＴＦＰＳＶ  ＳＡＰＳＫＫＶＡＫＱ  ＭＡＡＥＥＡＭＫＡＬ  ＨＧＥＡＴＮＳＭＡＳ  ＤＮＱＰＥＧＭＩＳＥ  ＳＬＤＮＬＥＳＭＭＰ  ＮＫＶＲＫＩＧＥＬＶ  ＲＹＬＮＴＮＰＶＧＧ  ＬＬＥＹＡＲＳＨＧＦ  ＡＡＥＦＫＬＶＤＱＳ  ＧＰＰＨＥＰＫＦＶＹ  ＱＡＫＶＧＧＲＷＦＰ  ＡＶＣＡＨＳＫＫＱＧ  ＫＱＥＡＡＤＡＡＬＲ  ＶＬＩＧＥＮＥＫＡＥ  ＲＭＧＦＴＥＶＴＰＶ  ＴＧＡＳＬＲＲＴＭＬ  ＬＬＳＲＳＰＥＡＱＰ  ＫＴＬＰＬＴＧＳＴＦ  ＨＤＱＩＡＭＬＳＨＲ  ＣＦＮＴＬＴＮＳＦＱ  ＰＳＬＬＧＲＫＩＬＡ  ＡＩＩＭＫＫＤＳＥＤ  ＭＧＶＶＶＳＬＧＴＧ  ＮＲＣＶＫＧＤＳＬＳ  ＬＫＧＥＴＶＮＤＣＨ  ＡＥＩＩＳＲＲＧＦＩ  ＲＦＬＹＳＥＬＭＫＹ  ＮＳＱＴＡＫＤＳＩＦ  ＥＰＡＫＧＧＥＫＬＱ  ＩＫＫＴＶＳＦＨＬＹ  ＩＳＴＡＰＣＧＤＧＡ  ＬＦＤＫＳＣＳＤＲＡ  ＭＥＳＴＥＳＲＨＹＰ  ＶＦＥＮＰＫＱＧＫＬ  ＲＴＫＶＥＮＧＥＧＴ  ＩＰＶＥＳＳＤＩＶＰ  ＴＷＤＧＩＲＬＧＥＲ  ＬＲＴＭＳＣＳＤＫＩ  ＬＲＷＮＶＬＧＬＱＧ  ＡＬＬＴＨＦＬＱＰＩ  ＹＬＫＳＶＴＬＧＹＬ  ＦＳＱＧＨＬＴＲＡＩ  ＣＣＲＶＴＲＤＧＳＡ  ＦＥＤＧＬＲＨＰＦＩ  ＶＮＨＰＫＶＧＲＶＳ  ＩＹＤＳＫＲＱＳＧＫ  ＴＫＥＴＳＶＮＷＣＬ  ＡＤＧＹＤＬＥＩＬＤ  ＧＴＲＧＴＶＤＧＰＲ  ＮＥＬＳＲＶＳＫＫＮ  ＩＦＬＬＦＫＫＬＣＳ  ＦＲＹＲＲＤＬＬＲＬ  ＳＹＧＥＡＫＫＡＡＲ  ＤＹＥＴＡＫＮＹＦＫ  ＫＧＬＫＤＭＧＹＧＮ  ＷＩＳＫＰＱＥＥＫＮ  ＦＹＬＣＰＶ（配列番号７２）である。
【００２６】
特定の実施形態では、ＡＤＡＲ１のデアミナーゼドメインが、配列番号７２のアミノ酸８３９〜１２２２を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、そのデアミナーゼドメインの配列番号７２との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列を含む。
【００２７】
特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインを含む。特定の実施形態では、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインが、ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号Ｕ８２１２０のアミノ酸２９９〜７０１を含む。特定の実施形態では、ＡＤＡＲ２またはそのデアミナーゼドメインが、Ｅ４８８Ｑ突然変異を含む（Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７）。特定の実施形態では、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインが、
ＬＨＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲ
ＲＫＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩ
ＳＲＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴ
ＳＰＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧＥＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳ
ＩＱＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧ
ＳＬＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦ
ＳＶＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬ
ＲＳＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳ
ＬＴＰ（配列番号５５；Ｅ４８８が示される）を含む。
【００２８】
特定の実施形態では、ヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメインが、
ＬＨＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲ
ＲＫＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩ
ＳＲＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴ
ＳＰＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧＱＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳ
ＩＱＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧ
ＳＬＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦ
ＳＶＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬ
ＲＳＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳ
ＬＴＰ（配列番号７１；Ｅ４８８Ｑが示される）を含む。
【００２９】
特定の実施形態では、ＲＮＡ編集酵素が、配列番号５５または７１との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列を含む。
【００３０】
上記のように、ＲＮＡ編集酵素はＲＮＡ結合ドメインに連結されている。ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡ結合ドメインに直接（すなわち、リンカー配列なしで）連結されてもよいし、またはポリペプチドリンカーを介して連結されてもよい。例えば、ポリペプチドリンカーは、１〜約５０個のアミノ酸、１〜約２５個のアミノ酸、１〜約２０個のアミノ酸、１〜約１５個のアミノ酸、１〜約１０個のアミノ酸、または１〜約５個のアミノ酸を含み得る。特定の実施形態では、リンカーが、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４４）を含み（式中、ｎは、１〜約１０、特に１〜約５である）を含む。例えば、リンカー配列は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）であり得る。種々の実施形態では、リンカーが、上記の配列（例えば、配列番号４４または４５）中に、これらの配列が１つまたは複数の置換、付加または欠失（例えば、約１、または約２、または約３、または約４、または約５、または約１０、または約１５（約１〜５、または約１〜１０、または約１〜１５を含む）の置換、付加または欠失）を含むように、突然変異／変異を含み得る。
【００３１】
ＲＮＡ結合ドメインは、特定のＲＮＡ配列および／またはＲＮＡ構造（例えば、ヘアピン）を特異的に認識する任意のポリペプチドであり得る。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインが、人工ＲＮＡ結合ドメイン、特にＲＮＡに対して高い親和性を有するものである。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインが、ファージＲＮＡ結合ドメインである（例えば、Ｋｅｒｙｅｒ−Ｂｉｂｅｎｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ（２００８）１００：１２５−１３８参照）。例えば、ＲＮＡ結合ドメインは、λＮペプチド（例えば、Ｃｉｌｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ（１９９７）３：５７−６７参照）またはファージＭＳ２コートタンパク質（例えば、Ｊｏｈａｎｓｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｍ．Ｖｉｒｏｌ．（１９９７）８：１７６−１８５参照）である。特定の実施形態では、λＮペプチドが、アミノ酸配列：ＭＮＡＲＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮ（配列番号４６）を含む。特定の実施形態では、λＮペプチドが、配列番号４６との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列を含む。
【００３２】
実施形態では、融合タンパク質が、アミノ酸リンカーを介してヒトＡＤＡＲ２のデアミナーゼドメイン（例えば、配列番号５５または７１）のアミノ末端に連結されたλＮペプチド（配列番号４６）を含む。特定の実施形態では、リンカーが、配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号４４；式中、ｎは１〜約１０または１〜約５である）または配列ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号４５）を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質が、配列：
ＭＮＡＲＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＨＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰ
ＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲＲＫＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴ
ＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩＳＲＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬ
ＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴＳＰＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥ
ＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧＥＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳＩＱＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬ
ＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧＳＬＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹ
ＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦＳＶＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶ
ＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬＲＳＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳ
ＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳＬＴＰ（配列番号６８）を含む。
【００３３】
特定の実施形態では、融合タンパク質が、Ｎ末端で少なくとも１つのＮＬＳをさらに含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（例えば、配列番号４７）を含む。特定の実施形態では、融合体が、３つのＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（例えば、配列番号６７）を含む。特定の実施形態では、融合タンパク質が、配列：
ＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶＤＰＫＫＫＲＫＶＭＮＡＲＴＲＲＲＥＲＲＡＥＫＱＡＱＷＫＡＡＮＧＧＧＧ
ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＬＨＬＤＱＴＰＳＲＱＰＩＰＳＥＧＬＱＬＨＬＰＱＶＬＡＤＡＶＳＲＬＶＬＧＫＦＧＤ
ＬＴＤＮＦＳＳＰＨＡＲＲＫＶＬＡＧＶＶＭＴＴＧＴＤＶＫＤＡＫＶＩＳＶＳＴＧＴＫＣＩＮＧＥＹＭＳＤＲＧ
ＬＡＬＮＤＣＨＡＥＩＩＳＲＲＳＬＬＲＦＬＹＴＱＬＥＬＹＬＮＮＫＤＤＱＫＲＳＩＦＱＫＳＥＲＧＧＦＲＬＫ
ＥＮＶＱＦＨＬＹＩＳＴＳＰＣＧＤＡＲＩＦＳＰＨＥＰＩＬＥＥＰＡＤＲＨＰＮＲＫＡＲＧＱＬＲＴＫＩＥＳＧ
ＥＧＴＩＰＶＲＳＮＡＳＩＱＴＷＤＧＶＬＱＧＥＲＬＬＴＭＳＣＳＤＫＩＡＲＷＮＶＶＧＩＱＧＳＬＬＳＩＦＶ
ＥＰＩＹＦＳＳＩＩＬＧＳＬＹＨＧＤＨＬＳＲＡＭＹＱＲＩＳＮＩＥＤＬＰＰＬＹＴＬＮＫＰＬＬＳＧＩＳＮＡ
ＥＡＲＱＰＧＫＡＰＮＦＳＶＮＷＴＶＧＤＳＡＩＥＶＩＮＡＴＴＧＫＤＥＬＧＲＡＳＲＬＣＫＨＡＬＹＣＲＷＭ
ＲＶＨＧＫＶＰＳＨＬＬＲＳＫＩＴＫＰＮＶＹＨＥＳＫＬＡＡＫＥＹＱＡＡＫＡＲＬＦＴＡＦＩＫＡＧＬＧＡＷ
ＶＥＫＰＴＥＱＤＱＦＳＬＴＰ（配列番号６９）を含む。
【００３４】
特定の実施形態では、融合タンパク質が、配列番号６８または６９との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列を含む。
【００３５】
本発明のガイドＲＮＡは、標的配列を標的とするまたはこれに特異的にハイブリダイズする配列（例えば、相補的配列）、およびＲＮＡ結合ドメインによって認識される配列を含む。ガイドＲＮＡは、変更または編集されるヌクレオチド（例えば、アデノシン）に向けられた標的配列とのミスマッチを含む。本明細書で使用される場合、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、核酸分子が標的配列と１００％相補的である必要があることを意味しない。むしろ、変更／編集される（１又は複数の）ミスマッチヌクレオチドを含まない配列は、標的配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％相補的、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％相補的であり得る。しかしながら、本明細書で説明されるように、配列は、オフターゲット編集を減少させるために、追加のミスマッチ（例えば、Ｇミスマッチ）を含み得る。実施形態では、配列が、約１個、または約２個、または約３個、または約４個、または約５個、または約１０個、または約１５個（約１〜５個、または約１〜１０個、または約１〜１５個を含む）のミスマッチを含み得る。特定の実施形態では、相補性の領域（例えば、ガイドＲＮＡと標的配列との間）が、少なくとも約１０個、少なくとも約１２個、少なくとも約１５個、少なくとも約１７個、少なくとも約２０個、少なくとも約２５個、少なくとも約３０個、少なくとも約３５個、またはそれ以上のヌクレオチドである。特定の実施形態では、相補性の領域（例えば、ガイドＲＮＡと標的配列との間）が、約１５〜約３０個のヌクレオチド、約１５〜約２５個のヌクレオチド、約２０〜約３０個のヌクレオチド、約２０〜約２５個のヌクレオチド、または約２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、または２５個のヌクレオチドである。典型的には、ガイドＲＮＡと標的配列との間のミスマッチが、ガイドＲＮＡと標的配列との間の相補性の領域の中央（例えば、ガイドＲＮＡ配列の中央５０％以内）に向かっている。特定の実施形態では、標的配列が配列番号５２を含む。
【００３６】
ガイドＲＮＡは、細胞内のＲＮＡに対する正しいまたは所望の編集を含む。ガイドＲＮＡを使用して、ミスセンス突然変異およびナンセンス突然変異を含む、任意の突然変異、特に点突然変異を修正することができる。例えば、レット症候群では、共通のＧ＞Ａ突然変異が存在する。これらの突然変異により、アミノ酸変化Ｒ１０６Ｑ（ＣＡＡ）、Ｗ１０４Ｘ（ＵＡＧ）およびＲ３０６Ｈ（ＣＡＣ）が得られる。ナンセンス突然変異の場合、これらはＣからＴへの突然変異で、Ａが３’位置にあって終止コドンを形成する、または中央位置にある（例えば、ＵＡＧからＵＧＧ）。ナンセンス突然変異を編集して、終止コドンを削除することができる。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、（例えば、ＡＤＡＲによって）Ａが脱アミノ化され得るように、これらの突然変異体のＡと一致するＣを含む。
【００３７】
本発明のガイドＲＮＡは、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される１つまたは複数の配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される２つの配列を含む。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される２つの配列が、ミスマッチまたは標的配列と特異的にハイブリダイズする配列の両側にあり得る。例えば、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される１つの配列（例えば、ＢｏｘＢ）が、標的突然変異の約１５〜２０または約１６〜１８ヌクレオチド５’に位置し、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される第２の配列（例えば、ＢｏｘＢ）が、標的突然変異の約８〜１２または約１０ヌクレオチド３’に位置する。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される配列が、ガイドＲＮＡの末端にない（すなわち、ガイドＲＮＡの末端の配列が標的配列と相補的であり得る）。ＲＮＡ結合ドメインによって認識される２つ以上の配列が存在する場合、それらの配列は同じであっても異なっていてもよいが、好ましくは同じＲＮＡ結合ドメインによって認識される。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインによって認識される配列がＢｏｘＢ配列である。特定の実施形態では、ＢｏｘＢ配列が、ＧＣＣＣＵＧＡＡＡＡＡＧＧＧＣ（配列番号４８）またはＧＧＣＣＣＵＧＡＡＡＡＡＧＧＧＣＣ（配列番号４９）を含む。特定の実施形態では、ＢｏｘＢ配列が、配列番号４８または４９との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する。
【００３８】
特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、表１に示される配列（ＤＮＡ分子のＲＮＡバージョンを含む）を標的とする、または配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、表１に示される配列との少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列を標的とするまたは配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、配列番号１５〜２２、特に配列番号１５、１７、１９または２１の１つを含む、あるいは配列番号１５〜２２、特に配列番号１５、１７、１９または２１の１つとの少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列を含む。
【００３９】
ガイドＲＮＡをコードする核酸配列を含む核酸分子は、ガイドＲＮＡをコードする核酸配列の複数のコピーを含み得る。例えば、核酸分子は、それぞれプロモーターの制御下にある、ガイドＲＮＡをコードする核酸配列の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のコピーを含み得る。
【００４０】
特定の実施形態では、本発明の核酸分子が、ベクター（例えば、プラスミド）、特にウイルスベクターを介して、細胞に送達され（例えば、感染、トランスフェクション、電気穿孔等を介して）、発現される。本発明の発現ベクターは、強力なプロモーター、構成的プロモーター、組織もしくは細胞特異的プロモーター、ユビキタスプロモーター、および／または制御プロモーターを使用することができる。特定の実施形態では、ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子のプロモーターが、組織または細胞特異的プロモーターである。特定の実施形態では、プロモーターがニューロン特異的プロモーターまたはユビキタスプロモーターである。プロモーターの例は、当技術分野で周知であり、それだけに限らないが、シナプスプロモーター、特にシナプシンＩプロモーター、ＣＡＧプロモーターおよびＭＥＣＰ２プロモーターを含む。ガイドＲＮＡに関して、ＲＮＡプロモーターの例は当該分野で周知であり、それだけに限らないが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーター（例えば、Ｕ６およびＨ１；例えば、Ｍｙｓｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：２５０２−０９）または短ＲＮＡを発現することが知られている他のプロモーターを含む。特定の実施形態では、プロモーターがヒトＵ６プロモーターである。本発明の分子を発現するための発現ベクターの例としては、限定されないが、プラスミドおよびウイルスベクター（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、レトロウイルスおよびレンチウイルス）が挙げられる。特定の実施形態では、ベクターがＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−１２および他の血清型およびハイブリッドＡＡＶベクター；例えば、ＡＡＶ１、またはＡＡＶ２、またはＡＡＶ３、またはＡＡＶ４、またはＡＡＶ５、またはＡＡＶ６、またはＡＡＶ７、またはＡＡＶ８、またはＡＡＶ９、またはＡＡＶ１０、またはＡＡＶ１１、またはＡＡＶ１２）である。特定の実施形態では、ベクターが、ニューロンおよび／またはグリアに感染することができる。
【００４１】
別の態様によると、ＲＮＡ編集および治療方法を含む本発明の方法が、上記のように、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸を細胞に送達するステップを含むが、ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子を使用しない。ＡＤＡＲ（例えば、ＡＤＡＲ  １〜３）は、神経系で高レベルまで発現される。よって、本発明のガイドＲＮＡは、ＡＤＡＲ酵素、特にＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２などの内因性デアミナーゼ酵素を内因性ＭＥＣＰ２  ＲＮＡに引き付けることができる。よって、実施形態では、本発明は、内因性ＡＤＡＲ酵素の関与を可能にし、組換えＡＤＡＲ酵素を必要としない。ガイドＲＮＡのみを使用することによって、非哺乳動物ＲＮＡ結合ドメインに対する潜在的な免疫応答が回避される。さらに、この方法によって、高度反復性ガイド配列をＡＡＶベクターに含めることが可能になり、オフターゲット編集が減少する。本発明のこの態様の特定の実施形態では、ガイドが、標的配列を標的とするまたはこれに特異的にハイブリダイズする配列（例えば、相補的配列）、およびデアミナーゼ、特にＡＤＡＲ（例えば、ＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２）によって認識される配列を含む。ガイドＲＮＡは、限定されないが、ＲＮＡヘアピン（例えば、ＡＤＡＲの自然標的に基づく）、ＡＤＡＲによって認識される二本鎖「バルジ」を作成するミスマッチ、および／または内因性ＡＤＡＲによる標的編集で通常必要とされる任意の他の配列を含み得る。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、１つ、２つ、またはそれ以上のＢｏｘＢ配列を含む。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、ＧｌｕＲ２からのＲ／Ｇ結合部位を含む（Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４５（５）：２７９７−２８０８；Ｆｕｋｕｄａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，７：４１４７８；例えば、ＧＵＧＧＡＡＵＡＧＵＡＵＡＡＣＡＡ−ＵＡＵＧＣＵＡＡＡＵＧＵＵＧＵＵＡＵＡＧＵＡＵＣＣＣＡＣ（配列番号７０）、あるいは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性、特に少なくとも９５％、９７％、９９％または１００％の相同性または同一性を有する配列を含む）。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、内部ループを有することを含む（Ｌｅｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９１（１）：１−１３；例えば、４個、６個、８個、１０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含むループ）。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、ＭＥＣＰ２  ＲＮＡと相補的な領域、編集用のミスマッチ（例えば、Ａ：Ｃ）を含み、オフターゲット編集用のＡ：Ｇミスマッチを含んでいてもよい。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子が、本明細書に記載されるベクター内に含まれる。特定の実施形態では、ガイドＲＮＡが、Ｕ６プロモーターまたは低分子ＲＮＡを発現する他のプロモーターから発現される。
【００４２】
本発明によると、中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法が提供される。本発明によると、進行性神経発達疾患を処置、抑制および／または予防する方法が提供される。例えば、本発明は、実施形態で、対象のＲＮＡの突然変異を特徴とする遺伝性中枢神経系疾患の処置、抑制および／または予防を提供する。実施形態では、本発明は、異常なＧ突然変異の回復によるＲＮＡの正常タンパク質への翻訳を直接的または間接的に回復することによって、例えば読み取られるＲＮＡをＧとして編集することによって、進行性神経発達疾患を処置、抑制および／または予防する方法を提供する。
【００４３】
本発明によると、レット症候群を含む進行性神経発達疾患を含む、中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法は、インビボまたはエキソビボで有効である。例えば、インビボ法の場合、（１又は複数の）本核酸分子（例えば、記載される融合タンパク質をコードする、例えば、記載されるガイドＲＮＡをコードする）を対象に投与する。エキソビボ法では、細胞（同系または同種）を本核酸分子（例えば、記載される融合タンパク質をコードする、例えば、記載されるガイドＲＮＡをコードする）と接触させ、対象に導入する。処置に関する実施形態は、インビボ法およびエキソビボ法に等しく適用される。
【００４４】
本発明によると、ＭＥＣＰ２遺伝子に関連する遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法が提供される。実施形態では、本発明は、機能的ＭＥＣＰ２タンパク質のレベルを非疾患または健康な対象のレベルまで回復するための、例えばＲＮＡレベルでの、遺伝子編集を提供する。Ｍｅｃｐ２は、ヒトまたはマウス、特にヒトであり得る。実施形態では、本発明は、疾患状態に対して機能的ＭＥＣＰ２タンパク質のレベルを上昇させるための、例えばＲＮＡレベルでの、遺伝子編集を提供する。実施形態では、ＭＥＣＰ２遺伝子に関連する遺伝性疾患が、新生児脳症、小頭症、Ｘ連鎖知的障害、ＰＰＭ−Ｘ症候群（躁うつ病、錐体路徴候、パーキンソン症候群および巨精巣症）、双極性障害、パーキンソン症候群、筋緊張増加、誇大反射、および巨精巣症、またはこれらの組み合わせである。実施形態では、ＭＥＣＰ２遺伝子に関連する遺伝性疾患が、男性または女性対象に影響を及ぼす。
【００４５】
本発明によると、レット症候群を処置、抑制および／または予防する方法が提供される。特定の実施形態では、レット症候群が、ＭｅＣＰ２のＧ＞Ａ突然変異を特徴とする。例えば、レット症候群は、ＭＥＣＰ２のＲ１０６Ｑ、Ｗ１０４ＸまたはＲ３０６Ｈ変異を特徴とし得る。ヒトＭＥＣＰ２の例示的なアミノ酸およびヌクレオチド配列は、ＧｅｎＢａｎｋ  Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ４２０４およびＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００４９９２．３およびＮＰ＿００４９８３．１で提供される（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＭ＿００１１１０７９２．１、ＮＰ＿００１１０４２６２．１、ＮＭ＿００１３１６３３７．１およびＮＰ＿００１３０３２６６．１のアイソフォームも参照）。特定の実施形態では、レット症候群が、ＭｅＣＰ２のＲ１０６Ｑ突然変異を含む。特定の実施形態では、本方法が、ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子、およびガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子を投与するステップを含む。特定の実施形態では、本方法が、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子を投与するステップを含む。核酸分子は、対象に直接投与され得る、または細胞に送達され、次いで、これが対象に投与され得る。
【００４６】
特定の実施形態では、ＭＥＣＰ２のアミノ酸配列が、
ＭＶＡＧＭＬＧＬＲＥ  ＥＫＳＥＤＱＤＬＱＧ  ＬＫＤＫＰＬＫＦＫＫ  ＶＫＫＤＫＫＥＥＫＥ  ＧＫＨＥＰＶＱＰＳＡ
ＨＨＳＡＥＰＡＥＡＧ  ＫＡＥＴＳＥＧＳＧＳ  ＡＰＡＶＰＥＡＳＡＳ  ＰＫＱＲＲＳＩＩＲＤ  ＲＧＰＭＹＤＤＰＴＬ
ＰＥＧＷＴＲＫＬＫＱ  ＲＫＳＧＲＳＡＧＫＹ  ＤＶＹＬＩＮＰＱＧＫ  ＡＦＲＳＫＶＥＬＩＡ  ＹＦＥＫＶＧＤＴＳＬ  ＤＰＮＤＦＤＦＴＶＴ  ＧＲＧＳＰＳＲＲＥＱ  ＫＰＰＫＫＰＫＳＰＫ  ＡＰＧＴＧＲＧＲＧＲ  ＰＫＧＳＧＴＴＲＰＫ
ＡＡＴＳＥＧＶＱＶＫ  ＲＶＬＥＫＳＰＧＫＬ  ＬＶＫＭＰＦＱＴＳＰ  ＧＧＫＡＥＧＧＧＡＴ  ＴＳＴＱＶＭＶＩＫＲ
ＰＧＲＫＲＫＡＥＡＤ  ＰＱＡＩＰＫＫＲＧＲ  ＫＰＧＳＶＶＡＡＡＡ  ＡＥＡＫＫＫＡＶＫＥ  ＳＳＩＲＳＶＱＥＴＶ
ＬＰＩＫＫＲＫＴＲＥ  ＴＶＳＩＥＶＫＥＶＶ  ＫＰＬＬＶＳＴＬＧＥ  ＫＳＧＫＧＬＫＴＣＫ  ＳＰＧＲＫＳＫＥＳＳ  ＰＫＧＲＳＳＳＡＳＳ  ＰＰＫＫＥＨＨＨＨＨ  ＨＨＳＥＳＰＫＡＰＶ  ＰＬＬＰＰＬＰＰＰＰ  ＰＥＰＥＳＳＥＤＰＴ  ＳＰＰＥＰＱＤＬＳＳ  ＳＶＣＫＥＥＫＭＰＲ  ＧＧＳＬＥＳＤＧＣＰ  ＫＥＰＡＫＴＱＰＡＶ  ＡＴＡＡＴＡＡＥＫＹ  ＫＨＲＧＥＧＥＲＫＤ  ＩＶＳＳＳＭＰＲＰＮ  ＲＥＥＰＶＤＳＲＴＰ  ＶＴＥＲＶＳ（配列番号５６）である。
【００４７】
Ｒ１０６、Ｗ１０４およびＲ３０６は下線付きで上に示される。
【００４８】
特定の実施形態では、ＭＥＣＰ２をコードする核酸が、
ａｔｇｇ  ｔａｇｃｔｇｇｇａｔ  ｇｔｔａｇｇｇｃｔｃ  ａｇｇｇａａｇａａａ  ａｇｔｃａｇａａｇａ  ｃｃａｇｇａｃｃｔｃ  ｃａｇｇｇｃｃｔｃａ  ａｇｇａｃａａａｃｃ  ｃｃｔｃａａｇｔｔｔ  ａａａａａｇｇｔｇａ  ａｇａａａｇａｔａａ  ｇａａａｇａａｇａｇ  ａａａｇａｇｇｇｃａ  ａｇｃａｔｇａｇｃｃ  ｃｇｔｇｃａｇｃｃａ  ｔｃａｇｃｃｃａｃｃ  ａｃｔｃｔｇｃｔｇａ  ｇｃｃｃｇｃａｇａｇ  ｇｃａｇｇｃａａａｇ  ｃａｇａｇａｃａｔｃ
ａｇａａｇｇｇｔｃａ  ｇｇｃｔｃｃｇｃｃｃ  ｃｇｇｃｔｇｔｇｃｃ  ｇｇａａｇｃｔｔｃｔ  ｇｃｃｔｃｃｃｃｃａ  ａａｃａｇｃｇｇｃｇ  ｃｔｃｃａｔｃａｔｃ  ｃｇｔｇａｃｃｇｇｇ  ｇａｃｃｃａｔｇｔａ  ｔｇａｔｇａｃｃｃｃ  ａｃｃｃｔｇｃｃｔｇ  ａａｇｇｃｔｇｇａｃ  ａｃｇｇａａｇｃｔｔ  ａａｇｃａａａｇｇａ  ａａｔｃｔｇｇｃｃｇ  ｃｔｃｔｇｃｔｇｇｇ  ａａｇｔａｔｇａｔｇ  ｔｇｔａｔｔｔｇａｔ  ｃａａｔｃｃｃｃａｇ  ｇｇａａａａｇｃｃｔ  ｔｔｃｇｃｔｃｔａａ  ａｇｔｇｇａｇｔｔｇ  ａｔｔｇｃｇｔａｃｔ  ｔｃｇａａａａｇｇｔ  ａｇｇｃｇａｃａｃａ  ｔｃｃｃｔｇｇａｃｃ  ｃｔａａｔｇａｔｔｔ  ｔｇａｃｔｔｃａｃｇ  ｇｔａａｃｔｇｇｇａ  ｇａｇｇｇａｇｃｃｃ  ｃｔｃｃｃｇｇｃｇａ  ｇａｇｃａｇａａａｃ  ｃａｃｃｔａａｇａａ  ｇｃｃｃａａａｔｃｔ  ｃｃｃａａａｇｃｔｃ  ｃａｇｇａａｃｔｇｇ  ｃａｇａｇｇｃｃｇｇ  ｇｇａｃｇｃｃｃｃａ  ａａｇｇｇａｇｃｇｇ  ｃａｃｃａｃｇａｇａ  ｃｃｃａａｇｇｃｇｇ  ｃｃａｃｇｔｃａｇａ  ｇｇｇｔｇｔｇｃａｇ  ｇｔｇａａａａｇｇｇ  ｔｃｃｔｇｇａｇａａ  ａａｇｔｃｃｔｇｇｇ  ａａｇｃｔｃｃｔｔｇ  ｔｃａａｇａｔｇｃｃ  ｔｔｔｔｃａａａｃｔ  ｔｃｇｃｃａｇｇｇｇ  ｇｃａａｇｇｃｔｇａ  ｇｇｇｇｇｇｔｇｇｇ  ｇｃｃａｃｃａｃａｔ  ｃｃａｃｃｃａｇｇｔ  ｃａｔｇｇｔｇａｔｃ  ａａａｃｇｃｃｃｃｇ  ｇｃａｇｇａａｇｃｇ  ａａａａｇｃｔｇａｇ  ｇｃｃｇａｃｃｃｔｃ  ａｇｇｃｃａｔｔｃｃ  ｃａａｇａａａｃｇｇ  ｇｇｃｃｇａａａｇｃ  ｃｇｇｇｇａｇｔｇｔ  ｇｇｔｇｇｃａｇｃｃ  ｇｃｔｇｃｃｇｃｃｇ  ａｇｇｃｃａａａａａ  ｇａａａｇｃｃｇｔｇ  ａａｇｇａｇｔｃｔｔ  ｃｔａｔｃｃｇａｔｃ  ｔｇｔｇｃａｇｇａｇ  ａｃｃｇｔａｃｔｃｃ  ｃｃａｔｃａａｇａａ  ｇｃｇｃａａｇａｃｃ  ｃｇｇｇａｇａｃｇｇ  ｔｃａｇｃａｔｃｇａ  ｇｇｔｃａａｇｇａａ  ｇｔｇｇｔｇａａｇｃ  ｃｃｃｔｇｃｔｇｇｔ  ｇｔｃｃａｃｃｃｔｃ  ｇｇｔｇａｇａａｇａ  ｇｃｇｇｇａａａｇｇ  ａｃｔｇａａｇａｃｃ  ｔｇｔａａｇａｇｃｃ  ｃｔｇｇｇｃｇｇａａ  ａａｇｃａａｇｇａｇ  ａｇｃａｇｃｃｃｃａ  ａｇｇｇｇｃｇｃａｇ  ｃａｇｃａｇｃｇｃｃ  ｔｃｃｔｃａｃｃｃｃ  ｃｃａａｇａａｇｇａ  ｇｃａｃｃａｃｃａｃ  ｃａｔｃａｃｃａｃｃ  ａｃｔｃａｇａｇｔｃ  ｃｃｃａａａｇｇｃｃ  ｃｃｃｇｔｇｃｃａｃ  ｔｇｃｔｃｃｃａｃｃ  ｃｃｔｇｃｃｃｃｃａ  ｃｃｔｃｃａｃｃｔｇ  ａｇｃｃｃｇａｇａｇ  ｃｔｃｃｇａｇｇａｃ  ｃｃｃａｃｃａｇｃｃ  ｃｃｃｃｔｇａｇｃｃ  ｃｃａｇｇａｃｔｔｇ  ａｇｃａｇｃａｇｃｇ  ｔｃｔｇｃａａａｇａ  ｇｇａｇａａｇａｔｇ  ｃｃｃａｇａｇｇａｇ  ｇｃｔｃａｃｔｇｇａ  ｇａｇｃｇａｃｇｇｃ  ｔｇｃｃｃｃａａｇｇ  ａｇｃｃａｇｃｔａａ  ｇａｃｔｃａｇｃｃｃ  ｇｃｇｇｔｔｇｃｃａ  ｃｃｇｃｃｇｃｃａｃ  ｇｇｃｃｇｃａｇａａ  ａａｇｔａｃａａａｃ  ａｃｃｇａｇｇｇｇａ  ｇｇｇａｇａｇｃｇｃ  ａａａｇａｃａｔｔｇ  ｔｔｔｃａｔｃｃｔｃ  ｃａｔｇｃｃａａｇｇ  ｃｃａａａｃａｇａｇ  ａｇｇａｇｃｃｔｇｔ  ｇｇａｃａｇｃｃｇｇ  ａｃｇｃｃｃｇｔｇａ  ｃｃｇａｇａｇａｇｔ  ｔａｇｃｔｇａ（配列番号５７）である。
【００４９】
実施形態では、本発明は、古典的レット症候群および変異型レット症候群（別名、非定型レット症候群）を含むレット症候群を処置、抑制および／または予防する方法を提供する。実施形態では、レット症候群が、Ｚａｐｐｅｌｌａ変異型、Ｈａｎｅｆｅｌｄ変異型、Ｒｏｌａｎｄｏ変異型および／または「不完全型」変異型である。
【００５０】
実施形態では、本発明は、限定されないが、運動失調、制御されない手の動き（例えば、手もみもしくは絞り、拍手、擦り、洗浄、または手から口への運動）、後天性小頭症、自閉症様行動、呼吸不規則性、摂食および嚥下困難、成長遅延、低血圧、パニック発作、歯ぎしり（ブラキシズムＢｒｕｘｉｓｍ）、振戦、失行症、心臓不規則性（例、ＱＴ間隔および／またはＴ波異常）、ならびに発作を含むレット症候群の１つまたは複数の症状の減少、改善および／または抑止を提供する。
【００５１】
実施形態では、本組成物が、例えばレット症候群を処置、抑制および／または予防する本方法に、以下のいずれかと組み合わせて使用され得る：トリデカン酸、フィンゴリモド（例えば、ＧＩＬＥＮＹＡ）、ケタミン、ＥＰＩ−７４３（バチキノン）、サリゾタン（ＥＭＤ−１２８、１３０）、スタチン（例えば、ロバスタチン）、三環系抗うつ薬（ＴＣＡ、例えばデシプラミン）、酢酸グラチラマー（例えば、ＣＯＰＡＸＯＮＥ）、デキストロメトルファン、および／または経口コレステロール２４−ヒドロキシラーゼ（ＣＨ２４Ｈ）阻害剤（例えば、ＴＡＫ−９３５／ＯＶ９３５）。
【００５２】
上記のように、本発明は、レット症候群を抑制、処置および／または予防するための核酸分子、ベクター、および組成物および方法を提供する。本明細書に記載される少なくとも１つの核酸を含む組成物も、本発明に含まれる。特定の実施形態では、組成物が、少なくとも１つのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子（例えば、発現ベクター）と、少なくとも１つの医薬的に許容される担体とを含む。組成物は、ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子をさらに含み得る。特定の実施形態では、核酸分子の全てが、単一の発現ベクター（例えば、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶ））内にコードされる。あるいは、核酸分子が、少なくとも１つの薬学的に許容される担体を含む別個の組成物内に含まれてもよい。本発明はまた、少なくとも１つのガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子（例えば、発現ベクター）を含む第１の組成物と、ＲＮＡ結合ドメインに連結または融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする少なくとも１つの核酸分子を含む第２の組成物とを含むキットを包含する。第１および第２の組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含み得る。特定の実施形態では、本発明のキットが、少なくとも１つのガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードする核酸分子（例えば、発現ベクター）および／またはＲＮＡ結合ドメインに連結もしくは融合されたＲＮＡ編集酵素をコードする核酸分子を含む第１の組成物を含む。第１および第２の組成物は、少なくとも１つの薬学的に許容される担体をさらに含み得る。
【００５３】
上記で説明されるように、本発明の組成物は、レット症候群を処置するのに有用である。治療上有効量の組成物が、それを必要とする対象に投与され得る。投与量、方法および投与時間は、本明細書で提供される教示が与えられれば、当業者により容易に決定可能である。
【００５４】
本明細書に記載される成分は、一般に、製剤として患者に投与される。本明細書で使用される「患者」または「対象」という用語は、ヒトまたは動物の対象を指す。本発明の成分は、指示される疾患または障害を処置するために医師の指導の下で治療的に使用され得る。
【００５５】
本発明の成分を含む製剤は、水、緩衝生理食塩水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、油、界面活性剤、懸濁化剤またはこれらの適切な混合物などの許容される媒体（例えば、薬学的に許容される担体）を用いて投与用に好都合に製剤化され得る。選択された媒体中の薬剤の濃度は変動してよく、媒体は、製剤の所望の投与経路に基づいて選択され得る。従来の媒体または薬剤が投与される薬剤と適合しない場合を除いて、製剤へのその使用が企図される。
【００５６】
適切な製剤の選択は、選択された投与方法に依存する。例えば、本発明の成分は、任意の所望の組織（例えば、脳）または周囲領域への直接注射によって投与され得る。この場合、製剤は、血液または標的組織と適合する媒体中に分散された成分を含む。
【００５７】
治療は、例えば、非経口的に、血流中への注射（例えば、静脈内）によって、または皮下、筋肉内もしくは腹腔内注射によって投与され得る。特定の実施形態では、治療が、（例えば、処置される組織への）直接注射によって投与される。注射用の製剤が当技術分野で知られている。治療を投与する方法として注射が選択された場合、生物学的効果を発揮するのに十分な量の分子が標的細胞に到達することを確実にするための措置をとらなければならない。
【００５８】
有効成分としての本発明の化合物を医薬担体と緊密に混和して含有する医薬組成物は、従来の医薬配合技術によって調製することができる。担体は、例えば、静脈内、経口または非経口など、投与に望ましい調製の形態に応じて多種多様な形態をとることができる。経口剤形の調製では、例えば、経口液体調製物（例えば、懸濁剤、エリキシルおよび液剤など）の場合、例えば、水、グリコール、油、アルコール、香味剤、保存剤、着色剤などの通常の医薬媒体；または経口固形調製物（例えば、散剤、カプセル剤および錠剤など）の場合、デンプン、糖、希釈剤、造粒剤、潤滑剤、結合剤、崩壊剤などの担体のいずれかを使用することができる。注射可能な懸濁液を調製することができ、その場合、適切な液体担体、懸濁化剤などを使用することができる。
【００５９】
本発明の製剤は、投与の容易さおよび投薬量の均一性のために投薬単位形態で製剤化され得る。本明細書で使用される投薬単位形態は、処置を受けている患者に適した製剤の物理的に別個の単位を指す。各投薬量は、選択された医薬担体と共に所望の効果を生み出すように計算された量の有効成分を含むべきである。適切な投薬単位を決定するための手順は、当業者に周知である。投薬単位は、患者の体重に基づいて比例的に増加または減少し得る。特定の病的状態を緩和するための適切な濃度は、当技術分野で知られているように、投薬濃度曲線計算によって決定され得る。
【００６０】
本発明の方法は、本発明の（１又は複数の）組成物の投与後の対象の疾患または障害を監視して、方法の有効性を監視するステップをさらに含み得る。例えば、対象がレット症候群の特徴について監視され得る。
【００６１】
定義
以下の定義は、本発明の理解を容易にするために提供される：
単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「この（ｔｈｅ）」は、文脈上別段の意味を有することが明らかな場合を除き、複数の指示対象を含む。
【００６２】
「薬学的に許容される」は、動物、特にヒトでの使用について、連邦政府もしくは州政府の規制当局による承認、または米国薬局方もしくはその他の一般的に認められている薬局方に列挙されていることを示す。
【００６３】
「担体」は、例えば、希釈剤、アジュバント、保存剤（例えば、チメルソール（Ｔｈｉｍｅｒｓｏｌ）、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）８０、ポリソルベート８０）、乳化剤、緩衝液（例えば、トリスＨＣｌ、酢酸塩、リン酸塩）、抗微生物剤、増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）、賦形剤、補助剤または本発明の活性剤と共に投与されるビヒクルを指す。薬学的に許容される担体は、水および油（石油、動物、植物または合成起源のものを含む）などの無菌液体であり得る。水または生理食塩水ならびにデキストロースおよびグリセロール水溶液が、特に注射液のための担体として好ましく使用される。適切な医薬担体は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ）；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．；およびＲｏｗｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ．，Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒに記載されている。
【００６４】
本明細書で使用される「処置する」という用語は、（例えば、１つまたは複数の症状における）患者の状態の改善、状態の進行の遅延等を含む、疾患に罹患した患者に利益を与えるあらゆる種類の処置を指す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「予防する」という用語は、対象が状態を発症する確率の低下をもたらす、状態を発症するリスクがある対象の予防的処置を指す。
【００６６】
化合物または医薬組成物の「治療上有効量」は、特定の障害もしくは疾患および／またはその症状を予防、抑制または処置するのに有効な量を指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、動物、特に哺乳動物、特にヒトを指す。
【００６８】
「単離」という用語は、その製造中の存在する他の成分からの化合物の分離を指す。「単離」は、他の化合物もしくは材料との人工的もしくは合成混合物、または基本的な活性を実質的に妨害しないが、例えば、不完全な精製または安定剤の添加により存在し得る不純物の存在を除外することを意図していない。
【００６９】
「リンカー」、「リンカードメイン」および「連結」という用語は、共有結合または少なくとも２つの化合物、例えばＲＮＡ編集酵素とＲＮＡ結合ドメインを共有結合的に結合する原子の鎖を含む化学的部分を指す。リンカーは、アミノ酸配列（例えば、１〜５０個のアミノ酸、１〜２５個のアミノ酸、１〜２０個のアミノ酸、１〜１５個のアミノ酸、１〜１０個のアミノ酸、または１〜５個のアミノ酸）であり得る。
【００７０】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２つ以上、好ましくは３つ以上のリボ−および／またはデオキシリボヌクレオチドで構成される核酸分子を含む。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、種々の因子、ならびにオリゴヌクレオチドの特定の適用および使用に依存する。
【００７１】
本明細書で使用される「核酸」または「核酸分子」は、一本鎖または二本鎖のいずれかのＤＮＡまたはＲＮＡ分子を指し、一本鎖の場合、線状または環状形態のその相補的配列の分子を指す。核酸分子の議論において、特定の核酸分子の配列または構造は、５’から３’方向に配列を提供する通常の慣例に従って、本明細書に記載され得る。本発明の核酸に関して、「単離核酸」という用語が時々使用される。この用語は、ＤＮＡに適用される場合、それが起源をもつ生物の自然に存在するゲノム中で直接隣接する配列から分離されたＤＮＡ分子を指す。例えば、「単離核酸」は、プラスミドもしくはウイルスベクターなどのベクターに挿入された、または原核もしくは真核細胞または宿主生物のゲノムＤＮＡに組み込まれたＤＮＡ分子を含み得る。
【００７２】
「ベクター」は、プラスミド、コスミド、バクミド、ファージまたはウイルスなどの遺伝子要素であり、これに別の遺伝子配列または要素（ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれか）が結合され得る。結合した配列または要素の複製をもたらすために、ベクターがレプリコンであってもよい。ベクターはＲＮＡまたはＤＮＡのいずれかであり得、一本鎖または二本鎖であり得る。ベクターは、限定されないが、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの、宿主細胞または生物のポリヌクレオチドまたはポリペプチドコード配列の発現を促進する転写および翻訳制御配列などの発現オペロンまたは要素を含み得る。
【００７３】
「発現オペロン」は、プロモーター、エンハンサー、翻訳開始シグナル（例えば、ＡＴＧまたはＡＵＧコドン）、ポリアデニル化シグナル、ターミネーターなどの、宿主細胞または生物の核酸またはポリペプチドコード配列の発現を促進する転写および翻訳制御配列を有し得る核酸セグメントを指す。「発現ベクター」は、宿主細胞または生物における核酸またはポリペプチドコード配列の発現を促進するベクターである。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「核局在化シグナル」（ＮＬＳ）は、結合したポリペプチドの細胞の核への移動を促進する分子またはポリペプチドを指す。特定の実施形態では、核局在化シグナルが、タンパク質を核に向けるペプチドである。典型的には、ＮＬＳは主に塩基性の正に帯電したアミノ酸（特に、リジンおよびアルギニン）を含む。ＮＬＳは、単節型、双節型（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）または多節型（ｍｕｌｔｉｐａｒｔｉｔｅ）であり得る。ＮＬＳは、典型的には短ペプチドである（例えば、約２０個未満のアミノ酸、約１５個未満のアミノ酸、または約１０個未満のアミノ酸）。ＮＬＳの例は、Ｋｏｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（２００９）２８４：４７８−４８５；参照により本明細書に組み込まれる）に提供されている。特定の実施形態では、ＮＬＳが、コンセンサス配列Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）（配列番号５８）（例えば、単節型（ｍｏｎｏｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、コンセンサス配列（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ１０〜１２（Ｋ／Ｒ）３／５（配列番号５９）（式中、（Ｋ／Ｒ）３／５は、５つのアミノ酸のうち少なくとも３つがリジンまたはアルギニンのいずれかであることを表す）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、ＳＶ４０ラージＴ抗原ＮＬＳ（例えば、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号４７））である。特定の実施形態では、ｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳが、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号５４）を含む。特定の実施形態では、ＮＬＳが、ヌクレオプラスミンＮＬＳ  ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫ（配列番号６０）である。提供される配列に関して、リジンおよびアルギニンアミノ酸は交換可能である。
【００７５】
種々の実施形態では、ＮＬＳを含めることにより、例えばＮＬＳの非存在下での編集に対して、オフターゲット編集を減少させるまたは抑止する。例えば、種々の実施形態では、ＮＬＳを含む本遺伝子編集方法が、オフターゲット編集を約１０％、または約２０％、または約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約１００％減少させる。種々の実施形態では、ＮＬＳを含む本遺伝子編集方法が、オフターゲット編集を約２倍、または約３倍、または約５倍、または約１０倍、または約３０倍減少させる。
【００７６】
以下の実施例は、本発明の種々の実施形態を例示するために提供される。実施例は例示であり、本発明を限定することを決して意図していない。
【００７７】
［実施例１］
材料および方法
プラスミド構築
野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインに融合されたλＮペプチドをコードするｐｃＤＮＡ  ３．１＋プラスミド（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を入手した（Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５−１８２９０）。エディターゼＥ４８８Ｑ  ｃＤＮＡを、野生型エディターゼのオーバーラップＰＣＲによって作製し、ｐｃＤＮＡ３．１＋にクローニングした。ＨＡエピトープの２つのコピーおよびＳＶ４０  ＮＬＳの３つのコピーをハイブリッドエディターゼのフレームにインフレームでおよびＮ末端に挿入することによって、両バージョンのエディターゼをｐｃＤＮＡ３．１＋中で改変した（ｐＧＭ１０９０、野生型；ｐＧＭ１０９１、Ｅ４８８Ｑ）。Ｍｅｃｐ２−ＢｏｘＢガイドについては、３つの異なるＭｅｃｐ２  Ｇ＞Ａ突然変異を表す合成オリゴヌクレオチド、およびそれらのアンチセンス配列を、Ｂｓａ１オーバーハングとアニーリングし、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６ポリリンカー［ｐＧＭ１０９９（Ｗ１０４Ｘ）、ｐＧＭ１１８１（３０６Ｈ）、ｐＧＭ１０８５（Ｒ１０６Ｑ）］（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。オフターゲットＡ−Ｇミスマッチを含むＭｅｃｐ２−ＢｏｘＢガイド（ｐＧＭ１１０８９）もｐＥＮＴＲ／Ｕ６にある。Ｍｅｃｐ２編集基質については、マウスＭｅｃｐ２  Ｅ１アイソフォームｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ寄託番号ＮＰ＿００１０７５４４８．１）のＥｃｏＲＩ−ＫｐｎＩ断片を、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）のマルチクローニングサイトにクローニングした。Ｍｅｃｐ２の個々のＧ＞Ａ突然変異を、同じ制限酵素部位のオーバーハングを用いてオーバーラップＰＣＲによって作製し、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のｅＧＦＰとの融合タンパク質としてインフレームでクローニングした。全てのサブクローニングを配列分析によって検証した。プラスミド構築およびＰＣＲ増幅で使用したプライマー配列を表１に示す。
【表１】
2021502058.tif 000003
2021502058.tif 000004
【００７８】
プラスミド構築物
λＮペプチドと野生型ＡＤＡＲ２触媒ドメインの融合ｃＤＮＡ（エディターゼ）を含む最初の構築物が記載されている（Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５−１８２９０）。これを、ＨＡエピトープタグの２つのコピー、引き続いてハイブリッドエディターゼ（ｐＧＭ１０９０）にインフレームおよびＮ末端のＳＶ４０  ＮＬＳの３つのコピーを含むよう改変した。これを行うために、ＨＡエピトープタグの２つのコピーおよびコザック配列をコードする２つの一本鎖オリゴヌクレオチドを、ＥｃｏＲＩおよびＢｓｐｅＩオーバーハングとアニーリングし、λＮドメイン配列に５’で連結した。ＳＶ４０  ＮＬＳの３つのコピーを、ｐＥＣＦＰ−Ｎｕｃ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＰＣＲによって増幅し、ＢｓｐＥＩオーバーハングを使用してＨＡエピトープタグとλＮドメインの間に付加した。ＡＤＡＲ２触媒ドメインにＥ４８８Ｑ突然変異を含むプラスミドｐＧＭ１０９１を、同じステップを使用して作製した。
【００７９】
ＡＡＶ形質導入実験に使用したプラスミドｐＧＭ１２５８は、シナプシンＩプロモーターの制御下にあるエディターゼｃＤＮＡ、およびそれぞれヒトＵ６プロモーターの制御下にあるオフターゲットＡ−Ｇミスマッチを有するＭｅｃｐ２Ｒ１０６ＱガイドＤＮＡの６つのコピーを含む。Ｕ６−Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド領域を導入するために、ヒトＵ６プロモーターおよびプラスミドｐＸ５５２（６０９５８；Ａｄｄｇｅｎｅ；Ｓｗｉｅｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３：１０２−１０６）からのＣＲＩＳＰＲ  ｓｇＲＮＡ配列を制限消化（ＮｄｅＩ／ＡｐａＩ）によって除去し、６つのＵ６−Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド配列をこれらの部位の間に２つのステップで挿入した。最初のステップで、Ｕ６−Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド領域の３つのコピーを、以下の制限部位：ＮｄｅＩ／ＭｆｅＩ、ＭｆｅＩ／ＳｐｅＩおよびＳｐｅＩ／ＮｈｅＩ＋ＡｐａＩ（ｐＧＭ１２５７）を有するＰＣＲアンプリコン（ｐＧＭ１１０８鋳型）の４方向ライゲーションによってｐＸ５５２にクローニングした。第２のステップで、Ｕ６−Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑガイド領域の３つの追加のコピーを、以下の制限部位：ＮｈｅＩ／ＳａｃＩ、ＳａｃＩ／ＡｆＩＩＩおよびＡｆＩＩＩ／ＡｐａＩを付加するプライマーを使用して、ｐＧＭ１１０８からのＰＣＲ増幅によって作製した。最終プラスミドｐＧＭ１２５８を、ＮｈｅＩ／ＡｐａＩで消化したｐＧＭ１２５７の制限、および３つのＵ６−Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ  ＰＣＲアンプリコンによる４方向ライゲーションによって作製した。エディターゼｃＤＮＡをｐＧＭ１２５８に導入するために、エディターゼのＯＲＦに対応する配列をプラスミドｐＧＭ１０９１から増幅し、ＮｃｏＩおよびＥｃｏＲＩオーバーハングを使用して、ｐＧＭ１２５７のシナプシンＩプロモーターの下流に付加した。
【００８０】
ＡＡＶベクターおよびウイルス調製
ヒトシナプシンＩプロモーターを含むＡＡＶ１／２バックボーンベクター、ｐＸ５５２を、Ａｄｄｇｅｎｅから入手した（プラスミド６０９５８；Ｓｗｉｅｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３：１０２−１０６）。ガイドｃＤＮＡ（ｐＧＭ１１８６、エディターゼのみ；ｐＧＭ１２５８、エディターゼとＲ１０６Ｑガイド）の６つのコピーを用いないでおよび用いて、ｅＧＦＰ−ＫＡＳＨコード配列をＨＡタグ付きＮＬＳエディターゼｃＤＮＡで置き換えることによってｐＸ５５２を改変した。ウイルスを作製する前に、エディターゼおよびガイド配列を配列分析によって検証した。
【００８１】
各ＡＡＶ１／２キメラベクターを、アデノウイルスフリートランスフェクション法（Ｍａｔｓｕｓｈｉｔａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，５：９３８−９４５；Ｅａｒｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，９１：ｅ０１９８０−１６）によって、１ベクター当たり３つの２２５ｃｍ２フラスコのスケールで、ヒト胎児由来腎臓２９３（ＨＥＫ２９３）細胞で作製した。各フラスコで、約２×１０７個のＨＥＫ２９３細胞を、ＤＮＡ：ＰＥＩ重量比１：２でポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と混合した以下の４つのプラスミドＤＮＡ合計４５μｇでトランスフェクトした。プラスミドＤＮＡ混合物は、１５μｇのｐＨｅｌｐｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ）、それぞれ７．５μｇのｐＨＬＰ１９−１およびｐＨＬＰ１９−２、ならびに２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）を有するＡＡＶベクターゲノム配列を含むＡＡＶベクターエディターゼ組換えプラスミドの１つ（１５μｇ）を含んでいた。ｐＨＬＰ１９−１はＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ１  ＶＰタンパク質を供給するＡＡＶ１ヘルパープラスミドであり、ｐＨＬＰ１９−２はＡＡＶ２  Ｒｅｐタンパク質およびＡＡＶ２  ＶＰタンパク質を供給するＡＡＶ２ヘルパープラスミドである（Ｇｒｉｍｍ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０２：２４１２−２４１９）。トランスフェクションの３日後、細胞を収集した。次いで、ＡＡＶベクター粒子を細胞溶解によって細胞から回収し、ＨｉＴｒａｐ（商標）ヘパリンカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ；Ｄｅｓｔｅｒｒｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，１１６：１８０５−１８１８）を使用して精製した。各ウイルス力価を、エディターゼコード配列に対して作製されたプローブを使用した定量的ドットブロットアッセイによって決定した。
【００８２】
細胞培養
Ｎｅｕｒｏ２Ａ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−１３１）を、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内３７℃で、１０％ＦＢＳ（ロット番号ＡＡＣ２０−０９５５；ＨｙＣｌｏｎｅ）中ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に維持した。初代ニューロンを、標的相同組換え（Ｊａｎｅｌｉａ  Ｆａｒｍｓ）によって作製され、遺伝子型判定によって特徴付けられたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウス系統から誘導した。全ての動物実験が、オレゴン健康科学大学の動物実験委員会によって承認された。子（Ｐ０）を断頭によって殺し、脳を２５  ｍＭ  Ｈｅｐｅｓを含む氷冷ハンクス基礎塩溶液（ＨＢＳＳ、ｐＨ７．４）中で解剖した。個々の海馬を髄膜なしで切除し、遺伝子型によってプールした。組織を、３７℃で１０分間、ＨＢＳＳ中１％トリプシンおよび０．０１％ＤＮａｓｅ  Ｉで処置した。組織片をＨＢＳＳ中室温で３回すすぎ、２５ｍＭグルコース、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％ウマ血清（ロット番号Ｂ０２３０７−７０２１；ＨｙＣｌｏｎｅ）、および１％ＦＢＳを含む最小必須培地（Ｇｉｂｃｏ）で分離した。ニューロンを、０．４μｍフィルターを通して濾過することによって分離し、Ｎｅｕｒｏｂａｓａｌ−Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、１×Ｇｌｕｔａｍａｘ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、２％Ｂ２７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、およびペニシリン／ストレプトマイシンからなるニューロン増殖培地中、ポリ−Ｌ−リジンコーティング皿に１２ウェル皿中１ウェル当たり５×１０５個細胞、または９６ウェルガラスチャンバー中５×１０４個の密度で蒔いた。２４時間後、ニューロンに完全な培地交換を受けさせて細胞破片を除去した。２〜３日毎に半分の培地を交換した。細胞を５％ＣＯ２中３７℃で維持した。
【００８３】
Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウスの作製および遺伝子型判定
Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウスを作製するための標的化ベクターは、Ｍｅｃｐ２エクソン３、引き続いてイントロン３のフリッパーゼ認識標的（ｆｒｔ）隣接ネオマイシンカセット、Ｍｅｃｐ２エクソン４の最初の１．２ｋｂ、およびホスホグリセリン酸キナーゼプロモーター（ＰＧＫ）から発現されるネオマイシン耐性遺伝子からなっていた。線形構築物をマウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）に電気穿孔し、正しく標的化されたクローンをＧ４１８感受性および配列決定によって同定した。ノックインＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ対立遺伝子を発現するマウスを、標準的な手順によってｍＥＳＣから作製した。ネオマイシン耐性カセットを、Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウスと、Ｒｏｓａ  ２６遺伝子座からのフリッパーゼリコンビナーゼを発現するマウス（在庫番号００９０８６；Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ）を交配することによって除去した。カセットの除去を配列決定によって確認した。
【００８４】
Ｍｅｃｐ２遺伝子の第３のイントロンの領域を増幅する以下のプライマー：Ｍｅｃｐ２−Ｒ１０６Ｑ  Ｆｗｄ（５′  ｇｇａｃｃｔａｔｇｔａｔｇａｔｇａｃｃｃ  ３′（配列番号５０））およびＭｅｃｐ２−Ｒ１０６Ｑ  Ｒｅｖ（５′  ｇｇｔｃａｔｔｇｇｇｃｔａｇａｃｔｇａａ  ３′（配列番号５１））を使用して、Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑマウスの遺伝子型判定を実施した。Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑノックイン動物のアンプリコンは、ネオマイシンカセットを除去するために使用された残りのｆｒｔ部位を含んでいるので、ＰＣＲ産物が野生型よりも９３塩基対大きくなっている（３９２ｂｐ対２９９ｂｐ）。
【００８５】
ＲＮＡ編集
Ｎ２Ａ細胞を分析するために、１２ウェルプレート中１ウェル当たり１．３×１０３個細胞の密度で細胞を播種した。２４時間後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中２：１比のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＤＮＡを使用して、細胞を野生型またはＥ４８８Ｑエディターゼ（ｐＧＭ１０９０および１０９１）、１コピーのガイド（ｐＧＭ１０９９、ｐＧＭ１１８１またはｐＧＭ１１０８）、およびＭｅｃｐ２−ｅｇｆｐ  ｃＤＮＡ（ｐＧＭ１１７４、ｐＧＭ１１７２またはｐＧＭ１１７３）を含むプラスミドでトランスフェクトした。１ウェル当たり添加したプラスミドＤＮＡの量は、１２５ｎｇの標的、２５０ｎｇのエディターゼおよび２．５μｇのガイドであった。７２時間後、細胞を収集し、製造元の指示に従ってＰｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡフリー（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、残留プラスミドＤＮＡを除去した。全ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写し、オリゴｄＴを使用してプライミングした。トランスフェクトＭｅｃｐ２−ｅｇｆｐ  ｃＤＮＡを、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３のＣＭＶプロモーターの５’プライマーおよびｅｇｆｐ遺伝子の逆方向プライマーを使用したＰＣＲによって配列分析のために増幅した。初代ニューロンの編集分析のために、ＤＩＶ７で、５×１０５個の海馬初代ニューロンを、細胞１個当たり３〜６×１０４個ウイルスゲノムの感染多重度でＡＡＶ１／２で形質導入した。ウイルス量は、全培地量の５％を超えなかった。トランスフェクション１週間後に細胞を収集し、トランスフェクトＮ２Ａ細胞について記載されるように編集効率について分析した。
【００８６】
逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）およびＰＣＲ産物の直接配列決定によって、ＡからＩへの編集の効率を決定した。アンチセンス鎖からの配列ピーク高さの定量化を、Ｂｉｏｅｄｉｔソフトウェアパッケージ（ｍｂｉｏ．ｎｃｓｕ．ｅｄｕ／ＢｉｏＥｄｉｔ／  ｂｉｏｅｄｉｔ．ｈｔｍｌ；Ｆｉｌｅ  ＞  Ｂａｔｃｈ  Ｅｘｐｏｒｔ  ｏｆ  Ｒａｗ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｔｒａｃｅ  Ｄａｔａ）を使用して、四色素トレース配列を処理することによって決定した。次いで、各部位での編集量を、所与の部位でのＴ（非編集）およびＣ（編集）ピークの最大高さを使用し、編集されたｃＤＮＡの百分率を計算して決定した｛１００％×［Ｃ高さ／（Ｔ高さ＋Ｃ高さ）］｝。５％編集検出限界を、比率が低下するＲ１０６Ｑ突然変異体と野生型Ｍｅｃｐ２プラスミドを含む混合物のＧ−Ａピーク高さを測定することによって決定した。センス鎖のＡ／Ｇピーク高さを使用するよりも正確であるため、アンチセンス鎖のＣ／Ｔピーク高さを定量化した（Ｅｇｇｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２：３１９）。しかしながら、明確にするために、全てのクロマトグラムを逆相補鎖で示している。
【００８７】
ウエスタンブロッティング
ＡＡＶ１／２で形質導入された初代海馬ニューロンを、１００μＬの全細胞溶解緩衝液（２５ｍＭ  トリス、ｐＨ７．６、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０；Ｓｉｇｍａ）、１％デオキシコール酸、０．１％ＳＤＳ、プロテアーゼ阻害剤（完全ＥＤＴＡフリー；Ｒｏｃｈｅ）、１ｍＭ  βメルカプトエタノール、および２５０ユニット／ｍＬベンゾナーゼ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に溶解した。可溶化物を４℃で１０分間、９３００×ｇで遠心分離し、可溶性画分を単離した。ＢＣＡタンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）を使用して、タンパク質濃度を測定した。等量のタンパク質可溶化物を、Ｍｏｐｓ−ＳＤＳ泳動緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中ＮｕＰａｇｅ（登録商標）４〜１２％ビス−トリスゲル（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で分離し、タンパク質をニトロセルロース膜（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）にブロッティングした。膜を、１ｘ  ＴＢＳＴ（０．０５％Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０を含むＴＢＳ）中３％ＢＳＡで１時間ブロッキングし、次いで、ウサギ抗ｍＭｅＣＰ２（Ｃｏｖａｎｃｅ）またはウサギ抗β−アクチン（８２２７；Ａｂｃａｍ）のいずれかと４℃で一晩インキュベートした。１ｘＴＢＳＴで３回洗浄した後、ブロットを抗ウサギＩｇＧ  ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６８０（１：１００００希釈；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と１時間インキュベートした。Ｏｄｙｓｓｅｙ（登録商標）Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してブロットを定量化した。
【００８８】
免疫染色
海馬初代ニューロンを、室温で２０分間、ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定した細胞を、室温で１０分間、１×ＰＢＳＧ（１×ＰＢＳ中０．１Ｍグリシン）で２回洗浄した。次いで、細胞をブロッキングし、４°Ｃで１時間、透過処理し［０．５％Ｉｇｅｐａｌ  ＣＡ−６３０、Ｓｉｇｍａ；１ｘＰＢＳ中３％ＢＳＡ（ソース）］、加湿チャンバー中４℃で一晩、ＭｅＣＰ２（ウサギｍＡｂ  Ｄ４Ｆ３；Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）およびＨＡ（ラットｍＡｂ  ３Ｆ１０；Ｒｏｃｈｅ）に対して産生された一次抗体とインキュベートした。細胞を０．５％Ｉｇｅｐａｌを含む１×ＰＢＳで３回洗浄し、二次抗体Ａｌｅｘａ  ４８８およびＡｌｅｘａ  ５６８（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）と１時間インキュベートした。０．５％Ｉｇｅｐａｌを含む１×ＰＢＳでさらに洗浄した後、細胞を３００ｎＭ  ＤＡＰＩと５分間インキュベートし、次いで、１×ＰＢＳで再度洗浄した。細胞を、ＰｒｏＬｏｎｇ（登録商標）Ｇｏｌｄ褪色防止試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して一晩マウントした。全ての画像を、４０倍水浸対物レンズを使用して、Ｚｅｉｓｓ  ７１０共焦点顕微鏡で０．５μｍの光学切片のｚスタックとして取得した。ＨＡおよびＭｅＣＰ２蛍光像を、全ての試料にわたって同じ設定を使用して取得した。総細胞数または抗体陽性細胞の数を、ＩｍａｇｅＪ細胞カウンタープラグイン（国立衛生研究所、ｉｍａｇｅｊ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｊ、バージョン１．６０＿６５（３２ビット））によって決定した。
【００８９】
統計分析
全ての統計は、ＧｒａｐｈＰａｄバージョン６．０ソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ）を使用して実施した。Ｎ２Ａ細胞でのＡからＩへの編集の百分率を、一元配置分散分析を使用して分析し、引き続いて、ボンフェローニ事後検定を使用して分析した。Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙ形質導入ニューロンでのＡからＩへの編集のレベル、ＭｅＣＰ２タンパク質レベルを比較するウエスタンブロット、およびヘテロクロマチン構造でのＭｅＣＰ２濃縮を示すニューロンの数を、それぞれ対応のないｔ検定を使用して分析した。全ての実験結果を平均±ＳＤとして表す。
【００９０】
結果
異種的に発現されるＭｅｃｐ２  ｍＲＮＡへの標的化エディターゼによってＭｅｃｐ２  Ｇ＞Ａ突然変異を修復することができる
ヒトＭＥＣＰ２には古典的レット症候群を引き起こす少なくとも３つのＧ＞Ａ突然変異がある。ＭｅＣＰ２Ｒ１０６ＱとＭｅＣＰ２Ｗ１０４Ｘの２つの突然変異はメチルＤＮＡ結合ドメイン（ＭＢＤ）内に存在し、１つの、ＭｅＣＰ２Ｒ３０６ＨはＮＣｏＲ相互作用ドメイン（ＮＩＤ）に存在する（Ｆｙｆｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１８：７０９−７１３；Ｌｙｓｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１６：８９８−９０２）（図１Ａ）。エディターゼがこれらの突然変異を修復できるかどうかを決定するために、エディターゼ、ガイドＲＮＡおよびＭｅｃｐ２  ｃＤＮＡのＮ２Ａ細胞への一過的トランスフェクション後に、編集を試験した。異種的に発現されるＭｅＣＰ２タンパク質を内因性のものと区別するために、異種的に発現されるＭｅＣＰ２にＣ末端ｅＧＦＰをタグ付けした。エディターゼおよびＭｅｃｐ２−ｇｆｐ  ｃＤＮＡが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期遺伝子プロモーター−エンハンサーから発現され、ガイドが、ヒトＵ６核内低分子ＲＮＡ遺伝子プロモーターから発現された。ＡＤＡＲ２が一次転写産物として核内の内因性ｍＲＮＡを編集するので、λＮペプチドに加えて、シミアンウイルス４０ラージＴ抗原核局在化シグナル（ＮＬＳ）の３つのコピーを、エディターゼに付加した（Ｄｅｓｔｅｒｒｏ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｓｃｉ．，１１６：１８０５−１８１８）。各ガイドＲＮＡは、λＮペプチドによって認識される配列を表す２つのステムループ（ＢｏｘＢ）を含んでいる。１つのＢｏｘＢステムループは標的Ａの５’の１６〜１８塩基に位置し、２つ目は標的Ａの３’の１０塩基に位置する（図１Ｂ）。標的Ａに対するステムループの数および位置は、研究に基づき（Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５−１８２９０）、トランスフェクション分析でＭｅｃｐ２について経験的に決定した。編集は、相補的ガイドのその部位でのＣミスマッチで最適であり（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４２：ｅ８７；Ｗｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＲＮＡ  ７：８４６−８５８；Ｋａｌｌｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：４８７４−４８８１）、全てのＭｅｃｐ２ガイドｍＲＮＡがこのミスマッチを含んでいる。
【００９１】
Ｎ２Ａ細胞を、エディターゼ、ＭｅＣＰ２−ＧＦＰをコードする別個のプラスミド、およびガイド配列を含むまたは欠く第３のプラスミドでコトランスフェクトした。３日後、サンガー法を使用して、Ｍｅｃｐ２−ｇｆｐ  ｍＲＮＡの標的領域から合成されたｃＤＮＡを分析した（図１Ｃおよび図１Ｄ）。標的Ａ位置での相対ピーク高さを決定することによって、編集効率を測定した。３つ全てのＭｅｃｐ２突然変異がガイド依存的に編集され、二本鎖ＲＮＡを必要とするＡＤＡＲ２媒介編集と一致していた（図１Ｃおよび図１Ｄ）。標的Ａの編集％は、ＡＤＡＲ２触媒ドメインの配列優先性と同様に、５’ヌクレオチドの環境によって変化した（Ｅｇｇｉｎｇｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．，２：３１９；Ｌｅｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１２８７５−１２８８４）。具体的には、インビトロスクリーニングに基づいて、ＡＤＡＲ２触媒ドメインによるＡ脱アミノ化に最適な５’ヌクレオチド階層はＵ＞Ａ＞Ｃ＞Ｇであり、最も最適な３’ヌクレオチドはＣ〜Ｇ〜Ａ＞Ｕである。Ｗ１０４Ｘ（ＵＡＧ）が最も効率的に編集され（７６±１０％）、Ｒ３０６Ｈ（ＣＡＣ、３４±３％）およびＲ１０６Ｑ（ＣＡＡ、２５±２％）が続くが、Ｍｅｃｐ２の場合、統計学的に差はなかった（図１Ｄ）。Ｍｅｃｐ２  Ｇ＞Ａ突然変異を修復するためのエディターゼシステムをさらに最適化するために、ヒト患者ではＷ１０４Ｘ突然変異よりも一般的であり、Ｒ３０６Ｈよりも重度の形態のレット症候群を引き起こすために、Ｒ１０６Ｑに焦点を当てた（Ｆｙｆｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ．Ｎｅｕｒｏｌ．，１８：７０９−７１３；Ｃｕｄｄａｐａｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｊ．Ｍｅｄ．Ｇｅｎｅｔ．，５１：１５２−１５８）。
【００９２】
デアミナーゼドメインの突然変異、Ｅ４８８Ｑはハイブリッドエディターゼの編集効率を増加させる
Ｅ４８８Ｑ突然変異を含むｈＡＤＡＲ２触媒ドメインは、触媒速度（Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｋｕｔｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９：Ｅ３２９５−Ｅ３３０４）と基質ＲＮＡに対する触媒ドメインの親和性（Ｌｅｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３９：１２８７５−１２８８４）の両方を増加させることによって、Ａ＞Ｉ編集効率を増加させる。この特徴により、Ｅ４８８Ｑ突然変異が、好ましくない５’および３’環境のより高い編集レベルを達成することが可能になる（Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｋｕｔｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９：Ｅ３２９５−Ｅ３３０４）。ＥｄｉｔａｓｅＥ４８８Ｑが、最適以下５’Ｃを有するＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑの標的Ａの編集効率を増加させるかどうかを試験するために、Ｎ２Ａ細胞をＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ−ｅｇｆｐおよびエディターゼＥ４８８Ｑ  ｃＤＮＡでコトランスフェクトした。配列分析により、編集にはガイド発現が必要であり、Ｍｅｃｐ２  ｍＲＮＡの編集％が、野生型エディターゼと比較してエディターゼＥ４８８Ｑで約２倍増加することが示された（５１±１１％対２２±５％、ｎ＝３、Ｐ＜０．０１）（図２Ａ）。
【００９３】
ハイブリッドエディターゼに野生型ｈＡＤＡＲ２またはｈＡＤＡＲ２Ｅ４８８Ｑ触媒ドメインを使用して、トランスフェクトＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ−ｅｇｆｐ  ｃＤＮＡのガイド領域内に１つのオフターゲット編集部位を検出した（図２Ｂ）。この部位で編集すると、サイレントコドン変化Ｔ１０５Ｔ（ＡＣＡ＞ＡＣＧ）が生じる。オフターゲット部位でのＧミスマッチは、トランスフェクト基質におけるオフターゲット編集を減少させることができる（Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，５３：６２６７−６２７１）。ＧミスマッチがＭｅｃｐ２  ｍＲＮＡのオフターゲット編集も減少させるかどうかを決定するために、Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ−ｅｇｆｐ  ｃＤＮＡ、エディターゼＥ４８８Ｑ、および近くのオフターゲットＡでＧミスマッチを有するガイドをコードするプラスミドでトランスフェクトしたＮ２Ａ細胞で編集効率を分析した（図２Ｃ）。Ａ−Ｇミスマッチを含むガイドでエディターゼを標的とした場合、オフターゲット編集の量が有意に減少した（４．９±０％ミスマッチあり、３３±５％ミスマッチなし、ｎ＝３、Ｐ＜０．０００１；図２Ｄおよび図２Ｅ）が、標的Ａでの編集には有意な効果はなかった（図２Ｄおよび図２Ｆ）。編集イベントの全てで、ガイドＲＮＡの存在が必要であった（図２Ｅおよび図２Ｆ）。
【００９４】
部位特異的ＲＮＡ編集は内因性のレットの原因となる突然変異を修復し、タンパク質レベルおよびＭｅＣＰ２機能を回復する
次に、エディターゼＥ４８８Ｑが（ｉ）内因性Ｍｅｃｐ２  ｍＲＮＡのＲ１０６Ｑミスセンス突然変異を修復し、（ｉｉ）タンパク質レベルを回復し、（ｉｉｉ）マウスでのレット様症状を逆転するのに必要な特徴的な機能的特徴であるヘテロクロマチンに結合するＭｅＣＰ２の能力を回復することができるかどうかを試験した（Ｇａｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３３：１３６１２−１３６２０）。これらの試験では、ニューロンをマウスから単離し、内因性Ｍｅｃｐ２遺伝子にＲ１０６Ｑ突然変異を含むように操作した。培養ニューロンを、２つのＡＡＶ（ＡＡＶ１／２）のいずれかで形質導入した。両ウイルスがヒトシナプシンＩプロモーターの制御下でエディターゼＥ４８８Ｑを発現し（Ｓｗｉｅｃｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３：１０２−１０６）、１つのウイルスはそれぞれがヒトＵ６プロモーターの制御下にある６コピーのガイド（オフターゲットミスマッチガイド；図２Ｃ）をさらに含んでいた。他のウイルスは対照として機能し、全てのガイド配列を欠いていた。海馬ニューロンをＰ０  Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙマウスから作製し、インビトロで７日（ＤＩＶ７）のＡＡＶ１／２ハイブリッドカプシドを有するガイド含有または対照ＡＡＶベクターで形質導入した。さらに７日間ウイルスを発現させた後、Ｍｅｃｐ２  ｃＤＮＡを実験培養物および対照培養物から調製し、サンガー法によって分析した。エディターゼとガイドの両方を発現する培養物では、Ｍｅｃｐ２  ｍＲＮＡの７２±５％が修復されるが（図３Ａ）、ガイドを欠く対照ウイルスで形質導入したニューロンでは編集が検出されなかった。Ｒ１０６Ｑでの編集に加えて、配列分析は、Ｍｅｃｐ２  ｃＤＮＡ内のいくつかのオフターゲット編集部位も同定した（図３Ｂ）。オフターゲット部位は、ガイドＲＮＡに相補的な領域内で主に発生したが、１つのイベントはガイドの外（Ｎ１２６Ｓ）で発生した。
【００９５】
ウエスタンブロッティングによりＡＡＶ１／２形質導入培養物中のＭｅＣＰ２タンパク質の量を測定することによって、ＲＮＡ編集の機能的結果を試験した。ＭＢＤの他の突然変異と同様に（Ｇｏｆｆｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：２７４−２８３；Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：５５８−５７０）、ＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑタンパク質レベルは野生型レベルと比較して低下している（図４）。突然変異ＭｅＣＰ２タンパク質のレベルの低下は、不安定化が原因である可能性がある（Ｇｏｆｆｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：２７４−２８３）。突然変異初代ニューロンにおけるエディターゼおよびガイドの発現は、エディターゼのみの発現と比較して、ＭｅＣＰ２タンパク質レベルを約３倍増加させた（図４；１２．９±１％ガイドなしと比較して、３５．３±２％ガイドあり、ｎ＝３、Ｐ＜０．００１）。これは、編集後の内因性疾患の原因となるタンパク質の機能的回復を初めて実証している。
【００９６】
ＭｅＣＰ２は、インビトロとインビボの両方でメチル−ＣｐＧに高い親和性で結合し（Ｓｋｅｎｅ，ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．，３７：４５７−４６８；Ｌａｇｇｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）ＰＬｏＳ  Ｇｅｎｅｔ．，１３：ｅ１００６７９３）、これは正常な機能にとって重要な特性である。マウス細胞では、ＭｅＣＰ２のＭＢＤの突然変異により、ｍＣＧが豊富な増幅サテライト配列を含むヘテロクロマチンへの結合が減少する（Ｂｒｏｗｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｈｕｍ．Ｍｏｌ．Ｇｅｎｅｔ．，２５：５５８−５７０；Ｈｅｃｋｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ｅＬｉｆｅ  ３：ｅ０２６７６）。ＭＢＤ突然変異であるＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑも、インビトロでメチル−ＣｐＧへの結合減少を示す（Ｙａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）ＡＣＳ  Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，１１：２７０６−２７１５）。ＭｅＣＰ２Ｒ１０６Ｑが細胞内の結合を同様に減少させたかどうか、およびＧ＞Ａ突然変異Ｍｅｃｐ２  ＲＮＡの編集がヘテロクロマチンの濃縮を回復するかどうかを決定するために、核を、ガイドを含むまたは対照としてガイドを含まない、ＨＡタグ付きエディターゼをコードするＡＡＶ１／２で形質導入したＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙニューロン培養物で免疫標識した（図５）。ＤＮＡのＡ−Ｔに富む領域に強く結合する蛍光指示薬であるＤＡＰＩ（４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール）を使用して、核およびヘテロクロマチンを同定した。野生型ニューロン（Ｍｅｃｐ２＋／ｙ）からの培養物では、核が、機能的なＭＢＤを反映して、ＤＡＰＩ染色ヘテロクロマチン（構造）で古典的ＭｅＣＰ２濃縮を示した（図５Ａ）。対照的に、ガイド配列を欠いたエディターゼウイルスで形質導入したＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ／ｙ同胞から調製した培養物では、ＭｅＣＰ２免疫蛍光が、ＤＮＡへの結合を妨げるＭＢＤの突然変異が予想されるように、核全体に散在して分布していた（Ｇｏｆｆｉｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，１５：２７４−２８３；Ｈｅｃｋｍａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）ｅＬｉｆｅ  ３：ｅ０２６７６）（図５Ｂ）。染色の強度も野生型核より低く、おそらく不安定化ＭｅＣＰ２タンパク質を反映している。対照的に、エディターゼとガイドＲＮＡの両方を発現するＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑニューロンは、野生型核と同様のレベルまでのＭｅＣＰ２免疫蛍光の明確な増加、およびヘテロクロマチン構造でＭｅＣＰ２タンパク質の濃縮を示し、ＭＢＤの機能的回復を示した（図５Ｃおよび図５Ｄ）。免疫蛍光の結果を定量化するために、ガイドの存在に関係なく、細胞の同じ割合でエディターゼが発現されることを３つの実験で最初に決定した（エディターゼのみ６７±７％、エディターゼおよびガイド６７±１０％；それぞれｎ＝１３４および１３７細胞；図５Ｅ）。次いで、エディターゼおよびガイドで形質導入された培養物において、エディターゼを発現している細胞の７４±１１％（図５Ｆ）および全細胞の４９±８％が、ヘテロクロマチン構造でＭｅＣＰ２の濃縮を示している（図５Ｇ）ことが決定された。ＭｅＣＰ２の濃縮は、ガイドを欠くウイルスで形質導入されたＭｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ核のヘテロクロマチン構造内で検出されず、編���がガイドの存在に依存していることを示す配列決定結果と一致している。
【００９７】
ＡＤＡＲは、アフリカツメガエル卵母細胞で外因性ｍＲＮＡのＧ＞Ａ突然変異を修復するために使用されてきた（Ｗｏｏｌｆ，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９２：８２９８−８３０２）。本明細書に提示されるデータは、操作されたｈＡＤＡＲ２触媒ドメインを使用した部位特異的ＲＮＡ編集が内因性突然変異ｍＲＮＡを修復し、突然変異によって引き起こされる細胞欠陥を逆転することができることを実証している。
【００９８】
マウスおよびヒトでは、３つの遺伝子がＡＤＡＲタンパク質をコードしているが、ＡＤＡＲ１とＡＤＡＲ２のみがＡからＩへの触媒活性を示す（Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｋ．（２０１０）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７９：３２１−３４９）。天然ＡＤＡＲ媒介編集は、脳のタンパク質機能を転写後に調節するために非常に重要であり、イオンチャネルおよび受容体で最初に示されている（Ｂｈａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１１：９５０−９５６；Ｓｏｍｍｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｃｅｌｌ  ６７：１１−１９；Ｂｕｒｎｓ，ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８７：３０３−３０８）が、多くの他のタンパク質および非コードＲＮＡにも及ぶことが現在知られている（Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，３５３：１１１−１２１；Ｎｉｓｈｉｋｕｒａ，Ｋ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，１７：８３−９６）。ＡＤＡＲ２触媒ドメインは、異種ｍＲＮＡを編集するその能力のため（Ｖｏｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，５３：６２６７−６２７１；Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４２：ｅ８７；Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１１０：１８２８５−１８２９０；Ｗｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＲＮＡ  ７：８４６−８５８）およびその十分特徴付けられた編集機序のため（Ｋｕｔｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９：Ｅ３２９５−Ｅ３３０４；Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）
Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２３：４２６−４３３）に、焦点を当てられた。実際、エディターゼが触媒ドメイン内にＥ４８８Ｑ突然変異を含む場合に、Ｍｅｃｐ２  ｍＲＮＡの編集効率の向上が見られた（Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７；Ｋｕｔｔａｎ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１０９：Ｅ３２９５−Ｅ３３０４；Ｐｈｅｌｐｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４３：１１２３−１１３２）。二本鎖ＲＮＡに複合化されたｈＡＤＡＲ２触媒ドメインの構造の解明（Ｍａｔｔｈｅｗｓ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２３：４２６−４３３）が、ＭｅＣＰ２および他の突然変異についての編集効率および特異性をさらに最適化するための他の突然変異を作製するための価値ある資源を提供する（Ｗａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：９８７２−９８８０）。以前の取り組みとは対照的に、ＡＤＡＲは通常、核内の一次転写産物を編集するため、ここでの構築物の全てが、特に内因性ｍＲＮＡの編集効率を増加させるＮＬＳを含んでいた（Ｗｏｎｇ，ｅｔ  ａｌ．（２００１）ＲＮＡ  ７：８４６−８５８）。
【００９９】
トランスフェクト細胞では、標的ＡでのエディターゼＥ４８８Ｑを使用したより高い編集効率により、ガイド領域内の１つの部位でのオフターゲット編集も高くなった。単一オフターゲット編集部位は、Ｇ−Ａミスマッチを使用することによって減少した（Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ，ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４２：ｅ８７）。特に、標的ｍＲＮＡ以外の高度に発現されているｍＲＮＡを表す５つのｃＤＮＡの配列決定は、オフターゲット編集を示さなかった（Ｍｏｎｔｉｅｌ−Ｇｏｎｚａｌｅｚ，ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４４：ｅ１５７）。しかし、また驚くべきことに、ニューロンを用いた本試験では、オフターゲット編集部位が、トランスフェクトＭｅｃｐ２  ｍＲＮＡと内因性Ｍｅｃｐ２  ｍＲＮＡとの間で異なっていた。具体的には、内因性の修復されたＭｅｃｐ２  ｍＲＮＡでは、ｃＤＮＡから発現されたＭｅｃｐ２  ｍＲＮＡには存在しないガイド領域内および外側のいくつかの追加のオフターゲット編集部位が見られた（図３Ｂ）。トランスフェクトＭｅｃｐ２  ｍＲＮＡと内因性Ｍｅｃｐ２  ｍＲＮＡとの間のオフターゲット編集部位の違いは、ＲＮＡの折りたたみおよび他の下流プロセシングイベントに影響を及ぼし得る配列の違いを反映している可能性がある。重要なことに、内因性Ｍｅｃｐ２  ｍＲＮＡのオフターゲット部位のいずれもレット症候群を引き起こすことが報告されていない（Ｆｙｆｅ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ．Ｃｈｉｌｄ  Ｎｅｕｒｏｌ．，１８：７０９−７１３）。レット症候群マウスモデルをさらに使用して、症候性マウスの野生型ＭｅＣＰ２の回復によって細胞および行動症状が逆転することを示すことができる（Ｇｕｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１５：１１４３−１１４７；Ｓｉｎｎｅｔｔ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１０６−１１５；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．，５：１８０−１９０；Ｇａｒｇ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．，３３：１３６１２−１３６２０；Ｇａｄａｌｌａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２１：１８−３０）。
【０１００】
［実施例２］
Ｍｅｃｐ２突然変異Ｍｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａを有するマウスを使用して、インビボで本方法を試験した。Ｍｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａ突然変異は、Ｒ１０６Ｑアミノ酸変化を有するＭｅＣＰ２をもたらす。手短に言えば、Ｍｅｃｐ２突然変異Ｍｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａを有するマウスを、６コピーのガイドＲＮＡを使用してまたは使用しないで、本発明のＥ４８８Ｑ突然変異を有するエディターゼをコードするＡＡＶベクターで処置した。その向神経性の特性のために、ＰＨＰ．Ｂカプシドを有するＡＡＶベクター（ＡＡＶ９変異体）を使用した（Ｈｏｒｄｅａｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２６（３）：６６４−６６８）。１．１×１０１０ウイルスゲノム相当物（ｖｇｅ）のＡＡＶをマウスの海馬に定位的に注射した。直接ウイルス注射の３〜４週間後、マウスをと殺し、ＭｅＣＰ２機能を脳で検出した。表２に見られるように、インビボでの効率的な標的化ＲＮＡ編集および脳のＭｅＣＰ２機能の回復が観察された。さらに、ＲＮＡ配列分析に基づいて、歯状顆粒ニューロンでのＡからＩへの編集効率が３９％であると決定され、ＣＡ１ニューロンでのＡからＩへの編集効率が６４％であると決定された。図６に見られるように、歯状ヘテロクロマチンのＭｅＣＰ２強度は、ガイドＲＮＡを有さないＡＡＶを注射したマウスと比較して、ガイドＲＮＡを有するＡＡＶを注射したマウスの方で高かった。これらの結果は、ＭｅＣＰ２  ＤＮＡ結合能力の救済を示している。
【表２】
2021502058.tif 000005
【０１０１】
表２：インビボでエディターゼ酵素を発現し、機能的ＭｅＣＰ２を示す細胞数の定量化．エディターゼおよびガイドＲＮＡをコードするＡＡＶ  ＰＨＰ．ＢをＭｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａマウスの海馬に注射した。注射の３週間後、マウスを免疫組織化学のために処理した。非感染細胞からのシグナルを閾値処理した後、注射したマウスの脳切片のＨＡ免疫染色によってエディターゼ＋細胞を同定した。百分率は、ＤＡＰＩによって同定された細胞の総数に対するものである。ヘテロクロマチン（構造）内のＭｅＣＰ２濃縮を示すエディターゼ＋細胞の百分率は、ＭｅＣＰ２タンパク質機能の回復を示す。ｎ＝８６４細胞。
【０１０２】
［実施例３］
プラスミド構築
アミノ末端Ｆｌａｇタグを含む完全長ヒトＡＤＡＲ２をコードする配列を、酵母発現ベクターからｐｃＤＮＡ  ３．１＋（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にサブクローニングした。完全長ＡＤＡＲ２を動員するよう設計されたＭｅｃｐ２ガイドを発現させるために、合成オリゴヌクレオチドをＢｓａ１オーバーハングとアニーリングし、ｐＥＮＴＲ／Ｕ６ポリリンカー［ｐＧＭ１０９９（２ｘＢｏｘＢガイドＷ１０４Ｘ）、ｐＧＭ１１９２（内部ループガイドＷ１０４Ｘ）、ｐＧＭ１３１０（ＧｌｕＡ２ステムループＷ１０４Ｘ］（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にクローニングした。Ｍｅｃｐ２３１１Ｇ＞Ａ（Ｗ１０４Ｘ）突然変異を含むＭｅｃｐ２編集基質は実施例１に記載されている。全てのサブクローニングを配列分析によって検証した。プラスミド構築およびＰＣＲ増幅で使用したプライマー配列を表３に示す。
【０１０３】
細胞培養
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−３２１６）を、５％ＣＯ２加湿インキュベーター内３７℃で、１０％ＦＢＳ中ＤＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）に維持した。
【０１０４】
ＲＮＡ編集
完全長ＡＤＡＲ２を使用した編集を分析するために、１２ウェルプレート中１ウェル当たり１．３×１０３個細胞の密度でＨＥＫ２９３Ｔ細胞を播種した。２４時間後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）低血清培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中２：１比のＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（商標）２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とＤＮＡを使用して、細胞を完全長ヒトＡＤＡＲ２（ｐＧＭ１１５５）、１コピーのガイド（ｐＧＭ１０９９、ｐＧＭ１１９２またはｐＧＭ１３１０）、およびＭｅｃｐ２３１１Ｇ＞Ａ−ｅｇｆｐ  ｃＤＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした。１ウェル当たり添加したプラスミドＤＮＡの量は、１２５ｎｇの標的、２５０ｎｇのヒトＡＤＡＲ２および２．５μｇのガイドであった。７２時間後、細胞を収集し、製造元の指示に従ってＰｕｒｅｌｉｎｋ（登録商標）ＲＮＡ  Ｍｉｎｉキット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、全ＲＮＡを単離した。ＴＵＲＢＯ  ＤＮＡフリー（商標）キット（Ａｍｂｉｏｎ）を使用して、残留プラスミドＤＮＡを除去した。全ＲＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＩＩＩ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して逆転写し、オリゴｄＴを使用してプライミングした。トランスフェクトＭｅｃｐ２３１１Ｇ＞Ａ−ｅｇｆｐ  ｃＤＮＡを、ｐＥＧＦＰ−Ｎ３のＣＭＶプロモーターの５’プライマーおよびｅｇｆｐ遺伝子の逆方向プライマーを使用したＰＣＲによって配列分析のために増幅した。
【表３】
2021502058.tif 000006
【０１０５】
結果
ヒト胎児由来腎臓（ＨＥＫ）細胞を、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの制御下、完全長ヒトＡＤＡＲ２およびＭｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａでトランスフェクトした。ヒトＡＤＡＲ２は、内因性ＡＤＡＲ２を模倣した完全長天然ＡＤＡＲ２分子であった。Ｍｅｃｐ２３１７Ｇ＞Ａ突然変異は、Ｒ１０６Ｑアミノ酸変化（Ｍｅｃｐ２Ｒ１０６Ｑ）をもたらす。次いで、細胞を、１）上記の２つのＢｏｘＢステムループを有するガイドＲＮＡ（例えば、実施例１参照）、２）ＧｌｕＡ２からのＲ／Ｇ結合部位を含むガイドＲＮＡ（Ｗｅｔｔｅｎｇｅｌ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４５（５）：２７９７−２８０８；Ｆｕｋｕｄａ，ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｓｃｉ．Ｒｅｐ．，７：４１４７８）、または３）内部ループを有するガイドＲＮＡ（Ｌｅｈｍａｎｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２９１（１）：１−１３）で処置した。図７に見られるように、２つのＢｏｘＢステムループを含むガイドＲＮＡを含むガイドＲＮＡは、完全長ＡＤＡＲ２を動員して、トランスフェクトＨＥＫ細胞でＭｅｃｐ２  ＲＮＡを編集することができた。これらの結果は、標的ＲＮＡ配列に加えて、通常は標的ＲＮＡに含まれていない配列の存在を含み得る、標的ＲＮＡへの完全長ＡＤＡＲの動員を実証している。
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態のいくらかを上で記載し、具体的に例示してきたが、本発明がこのような実施形態に限定されることを意図していない。以下の特許請求の範囲に示される、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の修正を行うことができる。
【図１−１】
2021502058.tif 000007
【図１−２】
2021502058.tif 000008
【図２−１】
2021502058.tif 000009
【図２−２】
2021502058.tif 000010
【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
2021502058000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月5日(2020.6.5)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、
好ましくは前記内因性ＲＮＡは前記細胞内の核内にあり、
該方法は、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子を前記細胞に送達するステップを含み、
前記ガイドＲＮＡは、内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的に認識される配列および／または構造を含み、好ましくは前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２であり、より好ましくは前記ＡＤＡＲが配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含み、  前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミスマッチを含む、前記方法。
【請求項２】
前記内因性ＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
編集を受けるヌクレオチドが（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡ中の点突然変異、好ましくは疾患の原因となる点突然変異であり、より好ましくは、（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡ中のグアニンからアデノシンへの突然変異である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
編集を受けるヌクレオチドが、ナンセンス突然変異であり、編集により終止コドンが削除される、または、前記ガイドＲＮＡがＣからＴへのナンセンス突然変異を３´位置のＡの脱アミノ化により修正することができる、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ガイドＲＮＡが、編集されるヌクレオチドの上流または下流に１つまたは複数のミスマッチをさらに含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、または、前記内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルおよび／または機能を変化させる、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれ、好ましくは前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子を対象に投与することにより、前記対象の中枢神経系の遺伝性疾患、好ましくはレット症候群を処置、抑制および／または予防する方法であって、細胞中の内因性ＲＮＡの標的配列を編集することを含み、好ましくは前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にあり、前記ガイドＲＮＡは、内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的に認識される配列および／または構造を含み、ＡＤＡＲは好ましくはＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２またはこれらの変異体であり、より好ましくは、ＡＤＡＲは配列番号５５と少なくとも９０％の同一性を含む、前記方法。
【請求項１０】
前記ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２  ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを含む、好ましくは前記突然変異ヌクレオチドは、編集されることで終止コドンが削除されるナンセンス突然変異のような、疾患の原因となる点突然変異であり、または、前記ガイドＲＮＡはＣからＴへのナンセンス突然変異を３´位置のＡの脱アミノ化により修正することができる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、および／または、内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、請求項９または１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルおよび／または機能を変化させる、請求項９から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、好ましくは前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、請求項９から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ａ）標的配列を標的とする、または標的配列と特異的にハイブリダイズする、好ましくはＭＥＣＰ２  ＲＮＡに相補的な領域を含む配列であって、変更または編集されるヌクレオチドで標的配列とのミスマッチを含み、好ましくは当該ミスマッチがＡ：Ｃミスマッチである配列、および
ｂ）内因性デアミナーゼによって認識される配列および／または構造であって、好ましくは前記内因性デアミナーゼはＡＤＡＲであり、より好ましくはＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２である配列および／または構造、
を含むガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子。
【請求項１５】
前記編集されるヌクレオチドが点突然変異であり、好ましくはＭＥＣＰ２  ＲＮＡ内の疾患の原因となる点突然変異であり、より好ましくはＭＥＣＰ２  ＲＮＡ内のグアノシンからアデノシンへの突然変異である、請求項１４に記載のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子。
【請求項１６】
前記編集されるヌクレオチドは、終止コドンを削除するように編集され得るナンセンス突然変異であり、または、前記ガイドＲＮＡがＣからＴへのナンセンス突然変異を３´位置のＡの脱アミノ化により修正することができる、請求項１４または１５に記載のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子。
【請求項１７】
前記ガイドＲＮＡが、ＡＤＡＲの自然標的に基づくＲＮＡヘアピンのようなＲＮＡヘアピン、および／またはＡＤＡＲによって認識される二重鎖バルジを作り出すミスマッチを含む、請求項１４から１６のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子。
【請求項１８】
前記ガイドＲＮＡが、１、２またはそれ以上のＢｏｘＢ配列またはＧｌｕＲ２からのＲ／Ｇ結合部位を含み、好ましくは前記ＧｌｕＲ２からのＲ／Ｇ結合部位は、配列番号７０、またはこれと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子。
【請求項１９】
前記ガイドＲＮＡが内部ループを含む、好ましくは４個、６個、８個、１０個、またはそれ以上のヌクレオチドを含むループを含む、請求項１４から１８のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子。
【請求項２０】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１５〜２０および６３〜６６のいずれか一つと少なくとも８０％の同一性を有する配列を含む、請求項１４から１９のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸分子。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１０６】
本発明の好ましい実施形態のいくらかを上で記載し、具体的に例示してきたが、本発明がこのような実施形態に限定されることを意図していない。以下の特許請求の範囲に示される、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、種々の修正を行うことができる。
一態様において、本発明は以下を包含する。
[項目１]
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記細胞に送達するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
[項目２]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目１に記載の方法。
[項目３]
前記ＲＮＡ編集酵素がデアミナーゼである、項目１に記載の方法。
[項目４]
前記ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である、項目１に記載の方法。
[項目５]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２、これらの断片、およびこれらの変異体からなる群から選択される、項目４に記載の方法。
[項目６]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目５に記載の方法。
[項目７]
前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドまたはその変異体である、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
[項目８]
前記ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号４６との少なくとも９０％の同一性を含む、項目７に記載の方法。
[項目９]
前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、項目１から８のいずれか一項に記載の方法。
[項目１０]
前記内因性ＲＮＡが中枢神経系細胞で発現されるＲＮＡである、項目１から９のいずれか一項に記載の方法。
[項目１１]
前記内因性ＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである、項目１０に記載の方法。
[項目１２]
前記ガイドＲＮＡが、編集されるヌクレオチドの上流または下流に１つまたは複数のミスマッチをさらに含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
[項目１３]
前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルまたはその変異体である、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
[項目１４]
前記核局在化シグナルが、配列番号４７または１、２もしくは３つの置換、付加もしくは欠失を有する配列番号４７を含む、項目１３に記載の方法。
[項目１５]
前記核局在化シグナルがＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルであり、前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、項目１に記載の方法。
[項目１６]
ａ）およびｂ）の前記核酸分子が単一ベクター内に含まれる、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
[項目１７]
前記ベクターがウイルスベクターである、項目１６に記載の方法。
[項目１８]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目１７に記載の方法。
[項目１９]
細胞内の内因性ＲＮＡの標的配列を編集する方法であって、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を前記細胞に送達するステップを含み、
前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的に認識される配列を含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記内因性ＲＮＡの標的配列と特異的にハイブリダイズし、編集されるヌクレオチドでミスマッチを含む、方法。
[項目２０]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目１９に記載の方法。
[項目２１]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１またはＡＤＡＲ２である、項目１９に記載の方法。
[項目２２]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目２１に記載の方法。
[項目２３]
前記内因性ＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡである、項目１９に記載の方法。
[項目２４]
前記ガイドＲＮＡが、編集されるヌクレオチドの上流または下流に１つまたは複数のミスマッチをさらに含む、項目１９から２３のいずれか一項に記載の方法。
[項目２５]
前記内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、項目１９から２４のいずれか一項に記載の方法。
[項目２６]
前記内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、項目１９から２５のいずれか一項記載の方法。
[項目２７]
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルおよび／または機能を変化させる、項目１９から２６のいずれか一項に記載の方法。
[項目２８]
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、項目１９から２７のいずれか一項に記載の方法。
[項目２９]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目２８に記載の方法。
[項目３０]
対象の中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法であって、
ａ）ＲＮＡ結合ドメインに連結されたＲＮＡ編集酵素を含む融合タンパク質をコードする核酸分子、および
ｂ）ガイドＲＮＡをコードする核酸分子
を、前記対象に投与するステップを含み、
前記融合タンパク質は、核局在化シグナルを含み、
前記ガイドＲＮＡは、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される配列を含み、
前記ＲＮＡ編集酵素は、前記中枢神経系の遺伝性疾患に関連するミスマッチ突然変異を修正する、方法。
[項目３１]
前記中枢神経系の遺伝性疾患がレット症候群である、項目３０に記載の方法。
[項目３２]
前記ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２  ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを含む、項目３１に記載の方法。
[項目３３]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
[項目３４]
前記ＲＮＡ編集酵素が、ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）である、項目３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
[項目３５]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１、ＡＤＡＲ２およびこれらの断片または変異体から選択される、項目３４に記載の方法。
[項目３６]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目３５に記載の方法。
[項目３７]
前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドまたはその変異体である、項目３０から３６のいずれか一項に記載の方法。
[項目３８]
前記ＲＮＡ結合ドメインが、配列番号４６との少なくとも９０％の同一性を含む、項目３７に記載の方法。
[項目３９]
前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、項目３０から３８のいずれか一項に記載の方法。
[項目４０]
前記核局在化シグナルが、ＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルまたはその変異体である、項目３０から３９のいずれか一項に記載の方法。
[項目４１]
前記核局在化シグナルが、配列番号４７または１、２もしくは３つの置換、付加もしくは欠失を有する配列番号４７を含む、項目４０に記載の方法。
[項目４２]
前記核局在化シグナルがＳＶ４０ラージＴ抗原核局在化シグナルであり、前記ＲＮＡ結合ドメインがλＮペプチドであり、前記ＲＮＡ編集酵素がＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）であり、前記ＲＮＡ結合ドメインによって特異的に認識される前記配列がＢｏｘＢ配列である、項目３０に記載の方法。
[項目４３]
ａ）およびｂ）の前記核酸分子が単一ベクター内に含まれる、項目３０から４２のいずれか一項に記載の方法。
[項目４４]
前記ベクターがウイルスベクターである、項目４３に記載の方法。
[項目４５]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目４４に記載の方法。
[項目４６]
対象の中枢神経系の遺伝性疾患を処置、抑制および／または予防する方法であって、ガイドＲＮＡをコードする核酸分子を前記対象に投与するステップを含み、前記ガイドＲＮＡは、ＲＮＡに作用する内因性ヒトアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ）によって特異的に認識される配列を含む、方法。
[項目４７]
前記中枢神経系の遺伝性疾患がレット症候群である、項目４６に記載の方法。
[項目４８]
前記ガイドＲＮＡがメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭＥＣＰ２）ＲＮＡと特異的にハイブリダイズし、前記内因性ＭＥＣＰ２  ＲＮＡの突然変異ヌクレオチドでミスマッチを含む、項目４７に記載の方法。
[項目４９]
前記内因性ＲＮＡが前記細胞の核内にある、項目４６から４８のいずれか一項に記載の方法。
[項目５０]
前記ＡＤＡＲがＡＤＡＲ１もしくはＡＤＡＲ２またはこれらの変異体である、項目４６から４９のいずれか一項に記載の方法。
[項目５１]
前記ＡＤＡＲが、配列番号５５との少なくとも９０％の同一性を含む、項目５０に記載の方法。
[項目５２]
内因性ＡＤＡＲが前記ガイドＲＮＡを認識する、項目４６から５１のいずれか一項に記載の方法。
[項目５３]
内因性ＡＤＡＲが、前記内因性ＲＮＡのヌクレオチドの塩基を脱アミノ化する、項目４６から５２のいずれか一項記載の方法。
[項目５４]
前記標的配列の前記編集が、前記標的配列によってコードされるタンパク質のレベルおよび／または機能を変化させる、項目４６から５３のいずれか一項に記載の方法。
[項目５５]
前記核酸分子がウイルスベクター内に含まれる、項目４６から５４のいずれか一項に記載の方法。
[項目５６]
前記ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、項目５５に記載の方法。
【国際調査報告】
2021502058.tif 000019
2021502058.tif 000020
2021502058.tif 000021
2021502058.tif 000022