(57)【要約】  ヒトCXCR2に免疫特異的に結合するヒト抗体分子が本明細書で開示される。開示するヒト抗体分子はCXCR2機能の強力かつ選択的なアンタゴニストであり、循環好中球の数を強く枯渇させることなしに組織への好中球の動員を防止する。医薬組成物、核酸分子、ベクター、細胞、及び開示した抗体の使用も提供される。
2021532789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトCXCR2に免疫特異的に結合するヒト抗体分子であって、
配列番号167の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに配列番号168の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、又は
配列番号226の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに配列番号227の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3
を含み、
CXCR2のCXCL1誘起活性化又はCXCR2のCXCL5誘起活性化を阻害する、ヒト抗体分子。
【請求項２】
前記重鎖CDR1が配列番号169のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR2が配列番号170のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR3が配列番号171のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR1が配列番号172のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR2が配列番号173のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR3が配列番号174のアミノ酸配列を含むか、又は
前記重鎖CDR1が配列番号228のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR2が配列番号229のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR3が配列番号230のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR1が配列番号201のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR2が配列番号231のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR3が配列番号232のアミノ酸配列を含む、請求項1に記載のヒト抗体分子。
【請求項３】
前記重鎖可変領域が配列番号167のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号168のアミノ酸配列を含むか、又は
前記重鎖可変領域が配列番号226のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号227のアミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載のヒト抗体分子。
【請求項４】
a)前記重鎖可変領域が配列番号98のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
b)前記重鎖可変領域が配列番号99のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
c)前記重鎖可変領域が配列番号100のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
d)前記重鎖可変領域が配列番号101のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
e)前記重鎖可変領域が配列番号102のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
f)前記重鎖可変領域が配列番号103のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
g)前記重鎖可変領域が配列番号104のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
h)前記重鎖可変領域が配列番号105のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
i)前記重鎖可変領域が配列番号106のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
j)前記重鎖可変領域が配列番号107のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
k)前記重鎖可変領域が配列番号108のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
l)前記重鎖可変領域が配列番号162のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
m)前記重鎖可変領域が配列番号163のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
n)前記重鎖可変領域が配列番号164のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
o)前記重鎖可変領域が配列番号165のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;又は
p)前記重鎖可変領域が配列番号166のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む、請求項3に記載のヒト抗体分子。
【請求項５】
a)前記重鎖可変領域が配列番号108のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含むか;
b)前記重鎖可変領域が配列番号162のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含むか;
c)前記重鎖可変領域が配列番号163のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含むか;
d)前記重鎖可変領域が配列番号164のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含むか;
e)前記重鎖可変領域が配列番号165のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含むか;又は
f)前記重鎖可変領域が配列番号166のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含む、請求項4に記載のヒト抗体分子。
【請求項６】
前記重鎖CDR1が配列番号182のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR2が配列番号192のアミノ酸配列を含み、前記重鎖CDR3が配列番号195のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR1が配列番号201のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR2が配列番号205のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖CDR3が配列番号213のアミノ酸配列を含む、請求項1又は2に記載のヒト抗体分子。
【請求項７】
前記重鎖可変領域が配列番号108のアミノ酸配列を含み、前記軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載のヒト抗体分子。
【請求項８】
ヒトIgG1重鎖定常領域を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のヒト抗体分子。
【請求項９】
前記ヒトIgG1重鎖定常領域が配列番号122又は124のアミノ酸配列を含む、請求項8に記載のヒト抗体分子。
【請求項１０】
ヒトIgG2重鎖定常領域を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のヒト抗体分子。
【請求項１１】
前記ヒトIgG2重鎖定常領域が配列番号120のアミノ酸配列を含む、請求項10に記載のヒト抗体分子。
【請求項１２】
ヒトIgG4重鎖定常領域を含む、請求項1から7のいずれか一項に記載のヒト抗体分子。
【請求項１３】
Fab断片、F(ab)2断片、又は一本鎖抗体である、請求項1から12のいずれか一項に記載のヒト抗体分子。
【請求項１４】
請求項1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子を含む医薬組成物。
【請求項１５】
請求項1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子をコードする核酸分子。
【請求項１６】
請求項15に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項１７】
請求項1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子を発現するように形質転換された細胞。
【請求項１８】
対象における気道好中球増加症又は急性肺炎症を治療又は防止する方法であって、
気道好中球増加症又は急性肺炎症を防止又は治療するための治療有効量の請求項1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子又は請求項14に記載の医薬組成物を対象に投与する工程
を含む方法。
【請求項１９】
気道好中球増加症若しくは急性肺炎症又はその両方が、慢性閉塞性肺疾患、重症好中球性喘息又はその両方である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
医薬としての使用のための、請求項1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子又は請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
気道好中球増加症又は急性肺炎症の防止又は治療における使用のための、請求項1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子又は請求項14に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
気道好中球増加症又は急性肺炎症の防止又は治療のための医薬の調製における、請求項1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子又は請求項14に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２３】
気道好中球増加症、急性肺炎症、又はその両方が、慢性閉塞性肺疾患、重症好中球性喘息、又はその両方である、請求項21又は22に記載の使用。
【請求項２４】
好中球の走化をブロックする方法であって、好中球を、請求項1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体に曝露する工程を含む、方法。
【請求項２５】
前記走化が、肺への好中球の遊走である、請求項24に記載の方法。
【請求項２６】
CXCR2シグナル伝達を発現する細胞におけるCXCR1及び/又はCXCR5に応答するCXCR2シグナル伝達をブロックする方法であって、細胞を、請求項1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体に曝露する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、その開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる2018年8月1日出願の米国仮特許出願第62/713,095号の出願日の恩恵を主張する。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCIIフォーマットで電子的に提出された配列表を含み、これは、参照により全体として本明細書に組み込まれる。2019年7月30日に作成したASCIIコピーは102085_005304_SLと命名され、サイズは279,927バイトである。
【０００３】
本出願は、ヒトCXCR2に免疫特異的に結合するヒト抗体分子に向けられる。
【背景技術】
【０００４】
好中球は血液中の最も豊富な白血球である。これは先天性免疫の重要なエフェクター細胞であり、細胞外病原体の除去において中心的な役割を有する。しかし組織への好中球の動員が不適切に制御されると、好中球の慢性的な浸潤及び活性化は炎症性メディエーター及びタンパク質分解酵素の持続的な放出をもたらし、これらが顕在的な組織損傷を惹起することがある。
【０００５】
好中球の遊走及び活性化は、好中球の原形質膜の上のCXCケモカイン受容体1(CXCR1)及びCXCケモカイン受容体2(CXCR2)とELR+CXCケモカイン(CXCL1、2、3、5、6、7、及び8)との相互作用を通して制御される。CXCR2は全てのELR+CXCケモカインの高親和性受容体として作用し、血液から組織への好中球及び単球の可動化及び動員において重要な役割を果たす。ケモカインCXCL6、7、及び8はCXCR1とも相互作用する。CXCR1は呼吸バースト活性及び好中球からのタンパク質分解酵素の放出を制御しており、細菌及び真菌に対する免疫において重要である。
【０００６】
痰の中の好中球数の増加は、喘息の重症化、コルチコステロイドへの不感受性、及び慢性気流閉塞に関連付けられる表現型と関連付けられてきた。気道好中球増加症は急性の喘息の悪化の間に増大する。気道好中球増加症は、肺気腫が優勢な慢性閉塞性肺疾患(COPD)、頻回の悪化を伴うCOPD、及び好酸球の高い活性の証拠があるCOPDを含むCOPDの全ての臨床的表現型の特徴でもある。気道好中球増加症の程度は疾患の重症度及び生理的衰退の割合にも相関する。好中球のタンパク質分解酵素、特に好中球エラスターゼは、COPDの全ての病態学的特徴に関係する。好中球から放出されるタンパク質分解酵素は肺気腫の進行にも関連し、細胞外マトリックスの崩壊にも寄与し、粘液の過分泌にも関連する。これらの関連性は、気道への好中球の浸潤が重症喘息及びCOPDの根底にある病態生理学的プロセスにおいて重要な役割を有する可能性を示唆する。
【０００７】
CXCL1、CXCL5、及びCXCL8は、好中球の動員に関係するCXCR2結合ケモカインである。CXCL1、CXCL5、及びCXCL8は、慢性気道炎症において上方制御され、重症好中球性喘息又はCOPDを有する対象からの痰又は気管支生検材料において上昇する。CXCR2のケモカイン活性化に拮抗(antagonize)することは、これらの炎症性疾患に関連する好中球の組織への動員及び好中球が介在する病態を低減することによる治療戦略の可能性を提案するものである。
【０００８】
しかし、ケモカイン受容体は選択的に拮抗するには困難な標的であることが証明されてきた。望ましい標的特異性及びアンタゴニスト活性を有する化合物の開発における困難さに関わらず、いくつかの小分子CXCR2アンタゴニストが炎症の動物モデルにおいて効果的であることが証明されてきた。それ以外には正常なヒト対象における吸入したオゾン及びリポ多糖で誘起された痰の好中球増加症の研究において顕著な有効性が示されたにも関わらず、好中球性喘息又はCOPDを有する対象における小分子CXCR2アンタゴニストのヒト臨床試験は広範な有効性を示さなかった。過去の喫煙者と比較して、現在喫煙者であるCOPD患者ではベースラインの肺機能(FEV1)の僅かな改善のみが観察された。現在のところ、公開された全ての臨床試験は小分子CXCR2アンタゴニストを使用している。最もよく研究されているものは可逆的かつ選択的なCXCR2アンタゴニスト(CXCL8への結合のIC50=12.5nM)であるダニリキシン(GSK1325756)であり、これは好中球におけるCD11bの上方制御をブロックすることが示されている(たとえばMillerら、BMC Pharmacol Toxicol 2015、16、18頁を参照)。ダニリキシンはCOPDのフェーズIIb試験における第1次エンドポイントに合致することができなかった。その他のCXCR2選択的分子にはSB-566933(Lazaarら、Br. J. Clin. Pharmacol. 2011、72、282〜293頁)及びAZD5069が含まれ、これはCXCR2選択的(CXCR1及びCCR2b受容体において効力は150分の1未満)であり、C5a、LTB4、又はfMLPで誘起されたCD11bの発現には効果を有しない(Nicollsら、J. Pharmacol Exp. Ther. 2015、353、340〜350頁)。CXCR2とCXCR1の両方を阻害する分子にはナバリキシン(SCH 527123、MK-7123; Toddら、Pulm Pharmacol Ther. 2016 Dec、41、34〜39頁)及びラダリキシン(DF2156A; Hiroseら、J Genet Syndr Gene Ther 2013、S3)が含まれる。これらの分子は、COPD、喘息、及びその他の炎症性肺病態、がん、その他を含む多数の適応症について検討されている。
【０００９】
いくつかの研究では、小分子CXCR2アンタゴニストの使用は循環好中球の望ましくない顕著な減少(好中球減少症)をもたらし、これはそのような薬剤の耐用量を制限する可能性がある。好中球減少症はアンタゴニストがCXCR2に完全には特異的でないこと、及び/又はアンタゴニストが全てのCXCR2結合リガンドにわたって活性である場合の結果であり得る。CXCL8及びたとえば関連するCXCケモカインは、成熟した顆粒球の末梢血中への可動化において顕著な役割を有しており、その結果、CXCR2に対するこれらのリガンドの強い拮抗は血液への好中球の正常な遊走を妨害することがある。逆に、CXCR2へのリガンドの結合に続くカルシウムフラックスシグナル伝達を含む下流経路の優先的な拮抗により、血液中に可動化される好中球の望ましい能力を保持しつつ、肺への好中球の望ましくないレベルの遊走に拮抗することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】国際公開WO1998/044001
【特許文献２】国際公開WO1988/001649
【特許文献３】国際公開WO1994/013804
【特許文献４】国際公開WO1992/001047
【特許文献５】国際公開WO2009/085462
【特許文献６】米国特許第8241630号
【特許文献７】国際公開WO2015/169811A2
【特許文献８】国際公開WO2014/170317A1
【特許文献９】国際公開WO2008/151081
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】Millerら、BMC Pharmacol Toxicol 2015、16:18頁
【非特許文献２】Lazaarら、Br. J. Clin. Pharmacol. 2011、72:282〜293頁
【非特許文献３】Nicollsら、J. Pharmacol Exp. Ther. 2015、353:340〜350頁
【非特許文献４】Toddら、Pulm Pharmacol Ther. 2016 Dec、41:34〜39頁
【非特許文献５】Hiroseら、J Genet Syndr Gene Ther 2013、S3
【非特許文献６】Remington's Pharmaceutical Sciences、18版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.、1990年
【非特許文献７】Remington、The Science and Practice of Pharmacy、20版、Mack Publishing、2000年
【非特許文献８】Wu及びKabat、J Exp Med 132:211〜50頁、1970年
【非特許文献９】Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.、1991年
【非特許文献１０】Knappikら、J Mol Biol 296:57〜86頁、2000年
【非特許文献１１】Shiら、J Mol Biol 397:385〜96頁、2010年
【非特許文献１２】Division of AIDS (DAIDS) National Institute of Allergy and Infectious Diseases National Institutes of Health US Department of Health and Human Services  「Table for Grading the Severity of Adult and Pediatric Adverse Events」、Version 2.0、2014年11月
【非特許文献１３】Saunders KO、「Conceptual Approaches to Modulating Antibody Effector Functions and Circulation Half-Life」、Front. Immunol. (2019) 10:1296頁
【非特許文献１４】Miller, B.ら、(2017). Late Breaking Abstract-「Danirixin (GSK1325756) improves respiratory symptoms and health status in mild to moderate COPD-results of a 1 year first time in patient study.」  European Respiratory Journal、50頁
【非特許文献１５】「Safety, Tolerability and Clinical Effect of Danirixin in Adults With Influenza」と題するClinicalTrials.govに記載された研究NCT02469298
【非特許文献１６】De Soyzaら、(2015)「A randomised, placebo-controlled study of the CXCR2 antagonist AZD5069 in bronchiectasis.」、Eur Respir J, 46, 1021〜32頁
【非特許文献１７】Mossら、(2013)「Safety and early treatment effects of the CXCR2 antagonist SB-656933 in patients with cystic fibrosis.」、J Cyst Fibros, 12, 241〜8頁
【非特許文献１８】Nairら、(2012)「Safety and efficacy of a CXCR2 antagonist in patients with severe asthma and sputum neutrophils: a randomized, placebo-controlled clinical trial.」、Clin Exp Allergy, 42, 1097〜103頁
【非特許文献１９】「Combination Study of AZD5069 and Enzalutamide」と題されたClinicalTrials.govに記載された研究番号NCT03177187
【非特許文献２０】Tomassenら、(2016)「Inflammatory endotypes of chronic rhinosinusitis based on cluster analysis of biomarkers.」、J Allergy Clin Immunol, 137, 1449〜1456頁  e4
【非特許文献２１】Stadtmann and Zarbock, (2012)「CXCR2: From Bench to Bedside.」、Front Immunol, 3, 263頁
【非特許文献２２】Josephら、(2017)「CXCR2 Inhibition - a novel approach to treating Coronary heart Disease (CICADA): study protocol for a randomised controlled trial.」Trials, 18, 473頁
【非特許文献２３】Silvaら、(2017)「CXCL1/CXCR2 signaling in pathological pain: Role in peripheral and central sensitization.」、Neurobiol Dis, 105, 109〜116頁
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【非特許文献２５】Piersonら、(2018)「The contribution of neutrophils to CNS autoimmunity.」、Clin Immunol, 189, 23〜28頁
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【非特許文献２７】Frenchら、(2017)「The role of the IL-8 signaling pathway in the infiltration of granulocytes into the livers of patients with alcoholic hepatitis.」、Exp Mol Pathol, 103, 137〜140頁
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【非特許文献２９】Steeleら、(2015)「CXCR2 inhibition suppresses acute and chronic pancreatic inflammation.」、J Pathol, 237, 85〜97頁
【非特許文献３０】Citroら、(2015)「CXCR1/2 inhibition blocks and reverses type 1 diabetes in mice.」、Diabetes, 64, 1329〜40頁
【非特許文献３１】Liuら、(2016)「The CXCL8-CXCR1/2 pathways in cancer.」、Cytokine Growth Factor Rev, 31, 61〜71頁
【非特許文献３２】Qiaoら、「CXCR2 Expression on neutrophils is upregulated during the relapsing phase of ocular Behcet disease」、Curr Eye Res. 2005; 30: 195〜203頁
【非特許文献３３】YOUNG, A.ら、「The Effect of the CXCR1/2 Antagonist SCH257123 in a Mouse Model of Severe Asthma.」、Experimental Biology 2016 Meeting, 2016年、San Diego, USA: The FASEB Journal, 1202.10
【非特許文献３４】CHAPMAN, R. W.ら、「A novel, orally active CXCR1/2 receptor antagonist, Sch527123, inhibits neutrophil recruitment, mucus production, and goblet cell hyperplasia in animal models of pulmonary inflammation.」、J Pharmacol Exp Ther, (2007) 322, 486〜93頁
【非特許文献３５】MAHLER, D. A.ら、「Efficacy and safety of a monoclonal antibody recognizing interleukin-8 in COPD: a pilot study.」、Chest, (2004) 126, 926〜34頁
【非特許文献３６】REUTERSHAN, J.ら、「Critical role of endothelial CXCR2 in LPS-induced neutrophil migration into the lung.」、J Clin Invest, (2006) 116, 695〜702頁
【非特許文献３７】Millerら、「The pharmacokinetics and pharmacodynamics of danirixin (GSK1325756)-a selective CXCR2 antagonist-in healthy adult subjects」、BMC Pharmacology and Toxicology 2015; 16頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
ヒトCXCR2に免疫特異的に結合するヒト抗体分子が本明細書で開示される。開示するヒト抗体分子は現在記載されている小分子CXCR2アンタゴニストより選択的なCXCR2のアンタゴニストであり、現在記載されているCXCR2の抗体アンタゴニストより強力なCXCR2のCXCL1及びCXCL5活性化のアンタゴニストであって、循環好中球数を大きく枯渇させることなしに組織への好中球の動員に拮抗する。ヒト抗体分子は配列番号167の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに配列番号168の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、又は配列番号226の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに配列番号227の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3を含み、ヒトCXCL1又はヒトCXCL5によるヒトCXCR2の活性化を阻害する。ある実施形態では、開示するヒト抗体分子は、持続性重症好中球減少症を誘起することなしに、対象におけるCXCL1又はCXCL5によるCXCR2の活性化を阻害することができる。
【００１３】
ヒト抗体分子を含む医薬組成物も提供される。
【００１４】
ヒト抗体分子をコードする核酸分子、核酸分子を含むベクター、及びヒト抗体分子を発現するように形質転換された細胞も開示される。
【００１５】
対象の末梢組織における好中球増加症、たとえば気道好中球増加症を防止又は治療する方法も、本明細書で開示される。対象の末梢組織における単球を低減する方法も本明細書で開示される。対象の末梢組織における好酸球増加症を低減する方法も開示される。
【００１６】
急性気道炎症を低減する方法、たとえば気管支拡張症における慢性気道炎症を防止又は低減する方法、腫瘍の負荷を低減する方法、がんの成長を阻止又は遅延させる方法、慢性疼痛を低減する方法、多発性硬化症におけるような神経炎症を防止又は低減する方法、肝における炎症を低減する方法、膵における炎症を低減する方法、又はI型糖尿病の症状を低減する方法も本明細書で開示される。方法は、対象における開示した病態を治療又は防止するための治療又は予防に有効な量の開示したヒト抗体分子のいずれか又は開示した医薬組成物のいずれかを対象に投与する工程を含む。
【００１７】
気道好中球増加症又は急性肺炎症の防止又は治療における使用のための、開示したヒト抗体分子又は医薬組成物も提供される。気道好中球増加症又は急性肺炎症の防止又は治療のための医薬の製造におけるヒト抗体分子又は医薬組成物の使用も提供される。
【００１８】
発明の概要並びに以下の詳細な説明は、添付した図面と併せて読めば、更に理解される。開示したヒト抗体分子、方法、及び使用を説明する目的で、ヒト抗体分子、方法、及び使用の例示的な実施形態を図面に示すが、ヒト抗体分子、方法、及び使用は開示した特定の実施形態に限定されない。図面は以下の通りである。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１Ａ】Tango(商標)細胞系アッセイで測定した、例示的な開示された抗CXCR2抗体によるCXCR2のCXCL8誘起活性化の例示的な用量応答阻害研究の結果を示す図である。
【図１Ｂ】Tango(商標)細胞系アッセイで測定した、例示的な開示された抗CXCR2抗体によるCXCR2のCXCL8誘起活性化の例示的な用量応答阻害研究の結果を示す図である。
【図２】ヒト好中球によって発現された天然のヒトCXCR2及びカニクイザル好中球によって発現された天然のカニクイザルCXCR2に対する例示的な開示された抗CXCR2抗体の結合活性を示すドットプロットを示す図である。抗体結合活性は4〜8個の独立した試料から得られた平均蛍光強度(MFI)の平均として定量した。
【図３】Tango(商標)細胞系アッセイで測定した、選択した抗CXCR2抗体によるCXCR2のCXCL1介在活性化の阻害の例示的な用量応答研究の結果を示す図である。
【図４Ａ−１】親BKO-4A8と同様の効力を有する例示的なBKO-4A8バリアントのアミノ酸配列のアラインメントを図示し、コンセンサス配列を提供する図である。図4Aは、可変重鎖配列(BKO-4A8  配列番号17、コンセンサス配列  配列番号167)である。これらの配列の中のCDRの位置決めはKabatに従う。したがって、図4Aのアラインメントの中の53番目のアミノ酸残基はKabatに従って52aの番号を付している(G52aDバリアントは53番目の残基においてGからDへの変化を有しているが、残基は52aと命名する)。図4Aは出現の順にそれぞれ配列番号17、53〜75、及び167、並びに配列番号169〜171のCDR1、CDR2、及びCDR3の配列を開示している。
【図４Ａ−２】親BKO-4A8と同様の効力を有する例示的なBKO-4A8バリアントのアミノ酸配列のアラインメントを図示し、コンセンサス配列を提供する図である。図4Aは、可変重鎖配列(BKO-4A8  配列番号17、コンセンサス配列  配列番号167)である。これらの配列の中のCDRの位置決めはKabatに従う。したがって、図4Aのアラインメントの中の53番目のアミノ酸残基はKabatに従って52aの番号を付している(G52aDバリアントは53番目の残基においてGからDへの変化を有しているが、残基は52aと命名する)。図4Aは出現の順にそれぞれ配列番号17、53〜75、及び167、並びに配列番号169〜171のCDR1、CDR2、及びCDR3の配列を開示している。
【図４Ｂ−１】親BKO-4A8と同様の効力を有する例示的なBKO-4A8バリアントのアミノ酸配列のアラインメントを図示し、コンセンサス配列を提供する図である。図4Bは、可変軽鎖配列(BKO-4A8  配列番号18、コンセンサス配列  配列番号168)である。これらの配列の中のCDRの位置決めはKabatに従う。同様に、図4Bでは96番目のアミノ酸残基は95aと命名する。図4Bは出現の順にそれぞれ配列番号18、76〜97、及び168、並びに配列番号172〜174のCDR1、CDR2、及びCDR3の配列を開示する。
【図４Ｂ−２】親BKO-4A8と同様の効力を有する例示的なBKO-4A8バリアントのアミノ酸配列のアラインメントを図示し、コンセンサス配列を提供する図である。図4Bは、可変軽鎖配列(BKO-4A8  配列番号18、コンセンサス配列  配列番号168)である。これらの配列の中のCDRの位置決めはKabatに従う。同様に、図4Bでは96番目のアミノ酸残基は95aと命名する。図4Bは出現の順にそれぞれ配列番号18、76〜97、及び168、並びに配列番号172〜174のCDR1、CDR2、及びCDR3の配列を開示する。
【図５Ａ−１】例示的なコンビナトリアルBKO-4A8バリアント(「Var」と略す)のアミノ酸配列のアラインメントを親BKO-4A8とともに図示し、これらのバリアントに基づくコンセンサス配列を提供する図である。図5Aは、可変重鎖配列(BKO-4A8  配列番号17、コンセンサス配列  配列番号226)である。図5Aは出現の順にそれぞれ配列番号17、98〜108、163〜165、及び226、並びに配列番号228〜230のCDR1、CDR2、及びCDR3の配列を開示する。
【図５Ａ−２】例示的なコンビナトリアルBKO-4A8バリアント(「Var」と略す)のアミノ酸配列のアラインメントを親BKO-4A8とともに図示し、これらのバリアントに基づくコンセンサス配列を提供する図である。図5Aは、可変重鎖配列(BKO-4A8  配列番号17、コンセンサス配列  配列番号226)である。図5Aは出現の順にそれぞれ配列番号17、98〜108、163〜165、及び226、並びに配列番号228〜230のCDR1、CDR2、及びCDR3の配列を開示する。
【図５Ｂ−１】例示的なコンビナトリアルBKO-4A8バリアント(「Var」と略す)のアミノ酸配列のアラインメントを親BKO-4A8とともに図示し、これらのバリアントに基づくコンセンサス配列を提供する図である。図5Bは、可変軽鎖配列(BKO-4A8  配列番号18、コンセンサス配列  配列番号227)である。図5Bは出現の順にそれぞれ配列番号18、109〜110、及び227、並びに配列番号201及び231〜232のCDR1、CDR2、及びCDR3の配列を開示する。
【図５Ｂ−２】例示的なコンビナトリアルBKO-4A8バリアント(「Var」と略す)のアミノ酸配列のアラインメントを親BKO-4A8とともに図示し、これらのバリアントに基づくコンセンサス配列を提供する図である。図5Bは、可変軽鎖配列(BKO-4A8  配列番号18、コンセンサス配列  配列番号227)である。図5Bは出現の順にそれぞれ配列番号18、109〜110、及び227、並びに配列番号201及び231〜232のCDR1、CDR2、及びCDR3の配列を開示する。
【図６Ａ】Tango(商標)細胞系アッセイで測定した、選抜した抗CXCR2抗体BKO-4A8及び最適化した抗体BKO-4A8-101c、BKO-4A8-103c、BKO-4A8-104c、及びBKO-4A8-105cによるCXCR2のCXCL1媒介活性化の用量応答阻害研究の結果を示す図である。
【図６Ｂ】Tango(商標)細胞系アッセイで測定した、選抜した抗CXCR2抗体BKO-4A8及び最適化した抗体BKO-4A8-101c、BKO-4A8-103c、BKO-4A8-104c、及びBKO-4A8-105cによるCXCR2のCXCL8媒介活性化の用量応答阻害研究の結果を示す図である。
【図７】Tango(商標)細胞系アッセイで測定した、開示した抗CXCR2抗体BKO-4A8-101cによるCXCR2のELR+CXCケモカイン媒介活性化の用量応答阻害研究の結果を示す図である。
【図８】カルシウムフラックスアッセイによって測定した、開示した抗CXCR2抗体BKO-4A8-101cによるCXCR2のCXCL1、CXCL5、及びCXCL8媒介活性化の用量応答阻害研究の結果を示す図である。
【図９】フローサイトメトリー解析によって決定した、異なるヒトIgG定常領域にフォーマットした開示した抗CXCR2抗体BKO-4A8のヒトCXCR2結合活性を示す図である。
【図１０】Tango(商標)細胞系アッセイで測定した、異なるヒトIgG定常領域にフォーマットした開示した抗CXCR2抗体BKO-4A8のCXCL8媒介活性化の用量応答阻害研究の結果を示す図である。
【図１１】抗CXCR2抗体BKO-4A8-101cの種々のヒトCXCRファミリーメンバーとの結合研究の結果を示す図である。結果は、BKO-4A8-101cがヒトCXCRファミリーメンバーの中でCXCR2のみに結合したことを実証した。
【図１２】アイソタイプ対照(ヒトIgG、影を付けていないヒストグラム)を組み込んだフローサイトメトリー(N=8)で評価した、表現型で定義したヒト末梢血造血細胞へのBKO-4A8-101c(影を付けたヒストグラム)の例示的な結合プロファイルを示す図である。発現は好中球で大きかった(図12A)が、単球は中間的なレベルのCXCR2を発現した(図12B)。
【図１３Ａ】ヒトCXCR2トランスジェニックマウスの肺に急性アレルギー(喘息様)炎症の特徴を誘起するハウスダストマイト(HDM)抗原を用いる皮下感作及び鼻内チャレンジ(14日目)の結果を示す図である。具体的には、ほとんど又は全く炎症を有しなかった対照(ナイーブ)マウスと比較して、チャレンジの後のマウスは、好酸球を伴う中程度ないし顕著な多病巣の肺の炎症、及び温和ないし中程度の気管支杯細胞の過形成を示した。BKO-4A8-mIgGによる処置は、ビヒクルと比較して肺の好中球の数(図13A)及び肺の好酸球の数(図13B)、並びに粘液密度スコア(図13C)の顕著な低減を含む病態の重症度の低減をもたらした。
【図１３Ｂ】ヒトCXCR2トランスジェニックマウスの肺に急性アレルギー(喘息様)炎症の特徴を誘起するハウスダストマイト(HDM)抗原を用いる皮下感作及び鼻内チャレンジ(14日目)の結果を示す図である。具体的には、ほとんど又は全く炎症を有しなかった対照(ナイーブ)マウスと比較して、チャレンジの後のマウスは、好酸球を伴う中程度ないし顕著な多病巣の肺の炎症、及び温和ないし中程度の気管支杯細胞の過形成を示した。BKO-4A8-mIgGによる処置は、ビヒクルと比較して肺の好中球の数(図13A)及び肺の好酸球の数(図13B)、並びに粘液密度スコア(図13C)の顕著な低減を含む病態の重症度の低減をもたらした。
【図１３Ｃ】ヒトCXCR2トランスジェニックマウスの肺に急性アレルギー(喘息様)炎症の特徴を誘起するハウスダストマイト(HDM)抗原を用いる皮下感作及び鼻内チャレンジ(14日目)の結果を示す図である。具体的には、ほとんど又は全く炎症を有しなかった対照(ナイーブ)マウスと比較して、チャレンジの後のマウスは、好酸球を伴う中程度ないし顕著な多病巣の肺の炎症、及び温和ないし中程度の気管支杯細胞の過形成を示した。BKO-4A8-mIgGによる処置は、ビヒクルと比較して肺の好中球の数(図13A)及び肺の好酸球の数(図13B)、並びに粘液密度スコア(図13C)の顕著な低減を含む病態の重症度の低減をもたらした。
【図１４Ａ】急性肺炎症のカニクイザルモデルにおける抗体BKO-4A8-101cの抗CXCR2活性の結果を示す図である。リポ多糖(LPS)のエアロゾル吸入(0日目)により、カニクイザルの肺において急性好中球性炎症の特徴を誘起することに成功した。0日目におけるLPSによるチャレンジの1時間前に抗CXCR2抗体BKO-4A8-101c(1mg/kg)で処置することにより、LPSチャレンジの24時間後に気管支肺胞洗浄液中の好中球数の顕著な低減がもたらされた(図14A)。末梢血好中球数は、0日目、14日目、及び28日目に2週間隔で与えたBKO-4A8-101cの3回の繰り返し投与によって影響を受けなかった。群のメディアン及び範囲を示す。N=4(図14B)。
【図１４Ｂ】急性肺炎症のカニクイザルモデルにおける抗体BKO-4A8-101cの抗CXCR2活性の結果を示す図である。リポ多糖(LPS)のエアロゾル吸入(0日目)により、カニクイザルの肺において急性好中球性炎症の特徴を誘起することに成功した。0日目におけるLPSによるチャレンジの1時間前に抗CXCR2抗体BKO-4A8-101c(1mg/kg)で処置することにより、LPSチャレンジの24時間後に気管支肺胞洗浄液中の好中球数の顕著な低減がもたらされた(図14A)。末梢血好中球数は、0日目、14日目、及び28日目に2週間隔で与えたBKO-4A8-101cの3回の繰り返し投与によって影響を受けなかった。群のメディアン及び範囲を示す。N=4(図14B)。
【図１５Ａ】富化したヒト好中球におけるCD11bのケモカイン誘起上方制御の選択的阻害を示す図である。抗CXCR2抗体はCXCL1(p=0.0002)(図15A)及びCXCL5(p=0.0001)(図15B)への応答を有意に阻害した。同じアッセイにおいて抗CXCR2抗体は小分子アンタゴニスト5より有意に阻害が大きかった(p<0.0058)(図15A〜図15B)。CXCL8媒介CD11b上方制御はCXCR1アンタゴニストによって低減した(データ示さず)が、抗CXCR2抗体又はアンタゴニスト5によっては低減しなかった(図15C)。
【図１５Ｂ】富化したヒト好中球におけるCD11bのケモカイン誘起上方制御の選択的阻害を示す図である。抗CXCR2抗体はCXCL1(p=0.0002)(図15A)及びCXCL5(p=0.0001)(図15B)への応答を有意に阻害した。同じアッセイにおいて抗CXCR2抗体は小分子アンタゴニスト5より有意に阻害が大きかった(p<0.0058)(図15A〜図15B)。CXCL8媒介CD11b上方制御はCXCR1アンタゴニストによって低減した(データ示さず)が、抗CXCR2抗体又はアンタゴニスト5によっては低減しなかった(図15C)。
【図１５Ｃ】富化したヒト好中球におけるCD11bのケモカイン誘起上方制御の選択的阻害を示す図である。抗CXCR2抗体はCXCL1(p=0.0002)(図15A)及びCXCL5(p=0.0001)(図15B)への応答を有意に阻害した。同じアッセイにおいて抗CXCR2抗体は小分子アンタゴニスト5より有意に阻害が大きかった(p<0.0058)(図15A〜図15B)。CXCL8媒介CD11b上方制御はCXCR1アンタゴニストによって低減した(データ示さず)が、抗CXCR2抗体又はアンタゴニスト5によっては低減しなかった(図15C)。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
開示したヒト抗体分子、方法、及び使用は、本開示の一部を形成する添付した図面と関連して以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解することができる。開示したヒト抗体分子、方法、及び使用は、本明細書に記載し及び/又は示した特定のヒト抗体分子、方法、及び使用に限定されないこと、並びに本明細書で用いる用語は例として特定の実施形態を説明する目的のみであって、特許を請求するヒト抗体分子、方法、及び使用に限定することを意図しないことを理解されたい。
【００２１】
他に具体的に記述しない限り、可能な機構若しくは作用モード又は改善の理由に関するいかなる記述も説明的であることのみを意味し、開示したヒト抗体分子、方法、及び使用は、いかなるそのような示唆した機構若しくは作用モード又は改善の理由の正確さ又は不正確さによっても束縛されるべきではない。
【００２２】
本明細書を通して、記述はヒト抗体分子及び前記ヒト抗体分子を使用する方法を意味する。開示がヒト抗体分子に関連する特徴又は実施形態を記述するか又はその特許を請求する場合には、そのような特徴又は実施形態は、前記ヒト抗体分子を用いる方法に等しく適用される。同様に、開示がヒト抗体分子を用いる方法に関連する特徴又は実施形態を記述するか又はその特許を請求する場合には、そのような特徴又は実施形態は、そのヒト抗体分子に等しく適用される。
【００２３】
本明細書において数値の範囲が引用又は設定される場合、その範囲は、その終点並びにその範囲内の全ての個別の整数及び分数を含み、また記述した範囲内の値のより大きな群の中のサブグループを形成するこれらの終点並びに内部の整数及び分数の全ての種々の可能な組合せによって形成されるその中のより狭い範囲のそれぞれを、それらの狭い範囲のそれぞれが明示的に引用されているのと同じ程度に含む。本明細書で数値の範囲が記述した値より大きいと記述した場合には、それにも関わらずその範囲は有限であり、その上端において本明細書に記載した本発明の文脈の中で操作可能な値が境界となる。本明細書で数値の範囲が記述した値より小さいと記述した場合には、それにも関わらずその範囲は下端において0でない値が境界となる。本発明の範囲は、範囲を定義する際に引用した特定の値に限定されることを意図しない。全ての範囲は包括的であり、組合せ可能である。
【００２４】
明瞭にするために個別の実施形態の文脈で本明細書に記載した開示したヒト抗体分子、方法、及び使用のある種の特徴は、単一の実施形態で組み合わせて提供してもよいことを認識されたい。逆に、簡略にするために単一の実施形態の文脈で記載した開示したヒト抗体分子、方法、及び使用の種々の特徴は、個別に又は任意の下位の組合せで提供してよい。
【００２５】
記載の態様に関する種々の用語は、明細書及び特許請求の範囲を通して用いられる。そのような用語は、他に指示がなければ当技術における通常の意味を与えられることになる。その他の具体的に定義された用語は、本明細書で提供する定義に合致する様式で解釈することになる。
【００２６】
本明細書で用いる場合、単数形「a」、「an」、及び「the」は、複数を含む。
【００２７】
用語「約」は、数値範囲、カットオフ、又は特定の値に関して用いる場合は、引用した値が記載した値から10%程度まで変動してよいことを示すために用いられる。本明細書で用いる数値の多くは実験的に決定されるので、そのような決定は異なる実験の間で変動する可能性があり、多くの場合に変動することになることが当業者には理解されよう。本明細書で用いる値は、この固有の変動のために不当に限定されると解釈すべきでない。したがって、用語「約」は、特定の値から±10%若しくはそれ未満の変動、±5%若しくはそれ未満の変動、±1%若しくはそれ未満の変動、±0.5%若しくはそれ未満の変動、又は±0.1%若しくはそれ未満の変動を包含するために用いられる。値が先行詞「約」の使用によって表現される場合には、その特定の値が別の実施形態を形成すると理解されることになる。
【００２８】
特定の数値への参照は、文脈によって明確に他が記述されない限り、少なくともその特定の値を含む。
【００２９】
用語「含む」は、用語「実質的に〜からなる」及び「〜からなる」によって包含される例を含むことを意図しており、同様に用語「実質的に〜からなる」は、用語「〜からなる」によって包含される例を含むことを意図する。
【００３０】
本明細書で用いる場合、「抗体分子がCXCR2のCXCL1誘起活性化又はCXCR2のCXCL5誘起活性化を阻害する」等の語句は、Tango(商標)細胞系アッセイにおけるβ-アレスチンの動員で決定して、開示したヒト抗体分子が、CXCL1については1.5〜3.4nM、CXCL5については47.7〜150nMの濃度における0.08〜0.5nMのIC50で、開示したヒト抗体分子の非存在時のCXCL1及び/又はCXCL5誘起CXCR2活性化のレベルと比較して約80%、約85%、約90%、約92%、約95%、約97%、又は約100%、CXCL1誘起又はCXCL5誘起CXCR2活性化を低減させる能力を意味する。
【００３１】
本明細書で用いる場合、「治療する」等の用語は、症状の重症度及び/若しくは頻度の低減、症状の除去、症状の根底にある原因の改良若しくは除去、症状及び/若しくはその根底にある原因の頻度若しくは可能性の低減、並びに/又は記述した病態又は障害によって直接的又は間接的に惹起される損傷の改善若しくは修正のうち少なくとも1つを意味する。治療することは、開示したヒト抗体分子又はそれを含む医薬組成物を受けなかった対象の予想される生存と比較して延長した生存も含んでよい。
【００３２】
本明細書で用いる場合、「防止する」等の用語は、予防又は維持の手段を意味する。そのような予防又は維持の手段を受ける対象には、たとえば遺伝的素因若しくは環境因子による記載した病態若しくは障害を有するリスクにある対象、又は記載した病態若しくは障害を有するために以前に治療を受けたことがあり、維持医薬として(たとえば肺好中球の低いレベルを維持するため)治療有効量の開示したヒト抗体分子若しくは医薬組成物を受けている対象が含まれる。
【００３３】
本明細書で用いる場合、「対象に投与する」及び同様の用語は、開示したヒト抗体分子又はそれを含む医薬組成物が患者に注射/提供され、それにより対象の体内の標的細胞、組織、又は部分が開示したヒト抗体分子と接触させられる手順を指す。
【００３４】
語句「治療有効量」は、それだけに限らないが、本明細書に開示し、記載し、又は例示した生物学的又は治療的な結果等の特定の生物学的又は治療的若しくは予防的な結果を達成するために効果的な、本明細書に記載したような開示したヒト抗体分子又はそれを含む医薬組成物の量を意味する。治療有効量は、疾患の状態、個人の年齢、性別、及び体重、並びに対象において所望の応答を惹起する組成物の能力等の要因に従って変動し得る。治療有効量の例示的な指標には、たとえば対象の満足感の改善、気道好中球増加症の低減等の1つ若しくは複数の末梢組織における好中球増加症の低減、1つ若しくは複数の末梢組織における単球の数の低減、急性気道炎症の低減、たとえば気管支拡張症における慢性気道炎症の低減、腫瘍負荷の低減、がんの成長の阻止若しくは遅延、慢性疼痛の低減、多発性硬化症等における神経炎症の低減、肝における炎症の低減、膵における炎症の低減、又はI型糖尿病の症状の減少が含まれる。
【００３５】
本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」は、活性成分(たとえば開示したヒト抗体分子)と組み合わせた際に、その成分が生物学的活性を保持することを可能にし、対象の免疫系と反応しない任意の材料が含まれる。その例には、それだけに限らないが、リン酸緩衝食塩溶液、水、及び種々の型の湿潤剤(たとえばポリソーベート20、ポリソーベート80、及びトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(「トリス」)の塩類、たとえば塩酸塩、酢酸塩、マレイン酸塩、及び乳酸塩等の標準的な薬学的担体のいずれかが含まれる。また安定剤として添加できるものとしては、アミノ酸類(ヒスチジン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、アルギニン等)、糖類(スクロース、グルコース、トレハロース等)、キレート化剤(たとえばEDTA)、及び抗酸化剤(たとえば還元システイン)がある。エアロゾル又は非経口投与のための好ましい希釈剤は、リン酸緩衝食塩液又は通常(0.9%)の食塩液である。そのような担体を含む組成物は、公知の従来の方法(たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences、18版、A. Gennaro編、Mack Publishing Co.、Easton、Pa.、1990年及びRemington、The Science and Practice of Pharmacy、20版、Mack Publishing、2000年を参照)によって処方される。特定の実施形態では、医薬組成物は非経口送達用の医薬組成物である。
【００３６】
本明細書で用いる用語「対象」は、カニクイザル等のサル、及びヒト、最も好ましくはヒトを意味することを意図する。「対象」及び「患者」は、本明細書では相互交換可能に用いられる。
【００３７】
用語「抗体」及び同様の用語は広い意義を意味し、モノクローナル抗体、抗体断片、二重特異的若しくは多重特異的な抗体、二量体、四量体、若しくは多量体の抗体、及び一本鎖抗体を含む免疫グロブリン分子を含む。免疫グロブリンは重鎖定常ドメインのアミノ酸配列によって5つの主なクラス、即ちIgA、IgD、IgE、IgG、及びIgMに指定することができる。IgA及びIgGは更にアイソタイプIgA1、IgA2、IgG1、IgG2、IgG3、及びIgG4に副分類される。いずれの脊椎動物種の抗体軽鎖も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、明らかに区別される2つの型、即ちカッパ(κ)及びラムダ(λ)のうちの1つに指定することができる。
【００３８】
「抗体断片」は、親の全長抗体の特異的抗原結合特性を保持した免疫グロブリン分子の一部(即ちその抗原結合性断片)を意味する。例示的な抗体断片は、重鎖相補性決定領域(HCDR)1、2、及び3並びに軽鎖相補性決定領域(LCDR)1、2、及び3を含む。その他の例示的な抗体断片は、重鎖可変領域(VH)及び軽鎖可変領域(VL)を含む。抗体断片は、限定なしにFab断片、即ちVL、VH、定常軽(CL)ドメイン及び定常重1(CH1)ドメインからなる一価断片、F(ab)2断片、即ちヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された2つのFab断片を含む二価断片、並びに抗体の単一アームのVLドメイン及びVHドメインからなるFv断片を含む。VHドメイン及びVLドメインは、操作し、合成リンカーを介して相互に連結して、種々の型の一本鎖抗体デザインを形成することができ、その場合、VH/VLドメインは分子内で対を形成し、又はVHドメイン及びVLドメインが別個の一本鎖抗体構築物によって発現される場合には分子間で対を形成して、たとえば国際公開WO1998/044001、WO1988/001649、WO1994/013804、及びWO1992/001047に記載されている一本鎖Fv(scFv)又はダイアボディ等の一価の抗原結合部位を形成することができる。これらの抗体断片は当業者には周知の手法を用いて得られ、断片は全長抗体と同じ様式で有用性についてスクリーニングされる。
【００３９】
それぞれの抗体の重鎖又は軽鎖の可変領域は、(アミノ末端からカルボキシ末端へ)FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4の順で交互に入れ替わる4つの「フレームワーク」領域(FR)と3つの「相補性決定領域」(CDR)からなっている。VHにおける3つのCDRはHCDR1、HCDR2、HCDR3と特定され、VLにおける3つのCDRはLCDR1、LCDR2、LCDR3とそれぞれ特定される。CDRの位置及び大きさは、免疫グロブリンの可変領域の中の配列可変性の領域を特定する規則に基づいて定義される(Wu及びKabat、J Exp Med 132:211〜50頁、1970年; Kabatら、Sequences of Proteins of Immunological Interest、5版、Public Health Service、National Institutes of Health、Bethesda、Md.、1991年)。可変領域の中のアミノ酸残基は、Kabat(同)のスキームに従って番号付けされ得る。「フレームワーク」又は「フレームワーク領域」は、CDRと定義された配列以外の可変領域の残った配列である。
【００４０】
「ヒト抗体」は、その中でフレームワークと抗原結合部位の両方がヒト起源の配列から誘導された重鎖及び軽鎖の可変領域を有する抗体を意味する。抗体が定常領域を含む場合には、定常領域もヒト起源の配列から誘導される。抗体の可変領域がヒト生殖細胞系列免疫グロブリン又は再配列されたヒト免疫グロブリン遺伝子を用いる系から得られた場合には、ヒト抗体はヒト起源の配列「から誘導された」重鎖又は軽鎖の可変領域を含む。そのような系には、ファージ上に呈示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリー及びヒト免疫グロブリン遺伝子座を有するマウス又はラット等のトランスジェニック非ヒト動物が含まれる。「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列又は再配列された免疫グロブリンの配列と比較して、たとえば天然に発生する体細胞変異又はフレームワーク若しくは抗原結合部位における意図的な置換の導入によるアミノ酸の相違を含み得る。典型的には、「ヒト抗体」は、ヒト生殖細胞系列又は再配列された免疫グロブリン遺伝子によってコードされるアミノ酸配列と、アミノ酸配列で少なくとも約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、又は100%同一である。いくつかの例では、「ヒト抗体」は、たとえばKnappikら、J Mol Biol 296:57〜86頁、2000年に記載されているヒトフレームワーク配列解析から誘導されるコンセンサスフレームワーク配列、又はたとえばShiら、J Mol Biol 397:385〜96頁、2010年及び国際公開WO2009/085462に記載されているファージ上に呈示されたヒト免疫グロブリン遺伝子ライブラリーに組み込まれた合成HCDR3を含み得る。
【００４１】
ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン配列から誘導されるが、合成CDR及び/若しくは合成フレームワークを組み込むファージディスプレイ等の系を用いて産生することができ、並びに/又はin vitro変異誘発に供して可変領域若しくは定常領域又はその両方における抗体特性を改善し、それによりin vivoでのヒト抗体生殖細胞系列レパートリーの中で天然には存在しない抗体を生じさせることができる。
【００４２】
「モノクローナル抗体」は、実質的に単一の分子組成物の抗体分子の集合を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対する単一の結合の特異性及び親和性を呈し、又は二重特異的モノクローナル抗体の場合には2つの異なるエピトープに対する二重の結合特異性を呈する。したがって、モノクローナル抗体は、抗体の重鎖からのC末端リジンの除去等の可能な周知の改変、及び細胞内で生成し通常は分泌の際に開裂するN末端リーダー配列の不完全な開裂があるプロセッシングバリエーションを除いて、それぞれの重鎖及びそれぞれの軽鎖における単一のアミノ酸組成を有する抗体の集合を意味する。たとえば、米国特許第8241630号は、抗体集団の5〜15%がリーダー配列を保持する市販の抗体を記載している。モノクローナル抗体は、抗体集団の中に不均一なグリコシル化を有し得る。モノクローナル抗体は単一特異的若しくは多重特異的であってよく、又は一価、二価、若しくは多価であってよい。二重特異的抗体は用語モノクローナル抗体に含まれる。
【００４３】
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合する抗原の一部を意味する。エピトープは通常、アミノ酸又は多糖の側鎖等の化学的に活性な(極性、非極性、又は疎水性等)表面の部分の群からなり、特定の三次元的な構造の特徴、並びに特定の電荷の特徴を有し得る。エピトープは、コンフォメーション的な空間単位を形成する連続的な及び/又は不連続なアミノ酸からなり得る。不連続なエピトープとしては、抗原の直線的な配列の異なる部分からのアミノ酸が、タンパク質分子の折り畳みによって三次元空間で密接に接近する。
【００４４】
「バリアント」は、1つ若しくは複数の修飾、たとえば置換、挿入、又は欠失によって参照ポリペプチド又は参照ポリヌクレオチドと異なるポリペプチド又はポリヌクレオチドを意味する。
【００４５】
語句「免疫特異的に結合する」は、開示したヒト抗体分子が、混合された分子の集団を含む試料中でCXCRファミリーの他の分子と優先的に結合せずに、その標的(抗CXCR2抗体の場合にはCXCR2)と優先的に結合する能力を意味する。CXCR2と免疫特異的に結合するヒト抗体分子は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない(たとえば、抗CXCR2抗体はCXCR2以外の抗原と特異的に結合する抗体を実質的に含まない)。しかし、ヒトCXCR2に免疫特異的に結合する抗体分子は、Macaca fascicularis(カニクイザル)CXCR2を含むヒトCXCR2のオルソログ等の他の抗原に対する交差反応性を有し得る。本明細書で開示した抗体分子は、天然に生成したヒトCXCR2と哺乳動物若しくは原核細胞で組換えによって生成したヒトCXCR2の両方に免疫特異的に結合することができる。
【００４６】
本明細書で用いる場合、「重症持続性好中球減少症」は、2週を超える細胞0.4×109個/L未満の絶対的な末梢血好中球数(ANC)を意味する。重症持続性好中球減少症は、下記のようにグレード分けされ得る。
・グレード1は温和な事象(細胞0.8〜1.0×109個/L)を示す。
・グレード2は中程度の事象(細胞0.6〜0.8×109個/L)を示す。
・グレード3は重症な事象(細胞0.4〜0.6×109個/L)を示す。
・グレード4は致命的な可能性のある事象(細胞0.4×109個/L未満)を示す。
(Division of AIDS (DAIDS) National Institute of Allergy and Infectious Diseases National Institutes of Health US Department of Health and Human Services  「Table for Grading the Severity of Adult and Pediatric Adverse Events」、Version 2.0、2014年11月を参照)
【００４７】
本明細書では以下の略語を用いる。可変重鎖(VH)、可変軽鎖(VL)、相補性決定領域(CDR)、重鎖CDR(HCDR)、軽鎖CDR(LCDR)、CXCケモカイン受容体2(CXCR2)、並びにケモカインリガンド1、2、3、5、6、7、及び8(CXCL1、2、3、5、6、7、及び8)。
【００４８】
開示した抗体分子は、フレームワーク及び/又は定常領域に1つ若しくは複数の置換、欠失、又は挿入を含み得る。いくつかの実施形態では、IgG4抗体分子はS228P置換を含み得る。S228(残基番号はEUインデックスによる)はIgG4抗体分子のヒンジ領域に位置する。セリン(「S」)のプロリン(「P」)への置換は、IgG4のヒンジを安定化し、in vitro及びin vivoにおけるFabアームの交換を防止するために役立つ。いくつかの実施形態では、抗体分子は、抗体分子のin vivo半減期を延長させる1つ若しくは複数の修飾を含み得る。たとえばある実施形態では、抗体はM252Y置換、S254T置換、及びT256E置換(一括して「YTE」置換と称する)を含み得る。M252、S254、及びT256(残基番号はEUインデックスによる)は、重鎖のCH2ドメインに位置する。これらの残基のそれぞれチロシン(「Y」)、スレオニン(「T」)、及びグルタミン酸(「E」)への置換は抗体分子をリソソーム分解から保護し、それにより抗体分子の血清中半減期を延長する。いくつかの実施形態では、抗体分子は重鎖C末端リジン残基の欠失を含み得る。重鎖C末端リジン残基の欠失は、哺乳動物細胞によって生成される際に抗体分子の不均一性を低減する。いくつかの実施形態では、抗体分子は置換、欠失、又は挿入の組合せを含み得る。たとえばいくつかの態様では、開示した抗体分子は、S228Pの置換と重鎖C末端リジン残基の欠失とを含み得る。異なるクラスの抗体定常領域は、抗体依存性細胞性細胞毒性(ADCC)、補体依存性細胞毒性(CDC)、及び抗体依存性ファゴサイトーシス(ADP)等の抗体エフェクター機能の調節に関与していることが公知である。いくつかの実施形態では、開示した抗体分子は、定常領域において1つ若しくは複数のエフェクター機能を低減又は除去する等、1つ若しくは複数の抗体エフェクター機能を調節する1つ若しくは複数の置換、欠失、又は挿入を含み得る。抗体エフェクター機能及び循環半減期に影響する他の改変は既知である。たとえばSaunders KO、「Conceptual Approaches to Modulating Antibody Effector Functions and Circulation Half-Life」、Front. Immunol. (2019) 10:1296頁を参照されたい。
【００４９】
ヒト抗体分子
ヒトCXCR2に免疫特異的に結合するヒト抗体分子が本明細書で開示される。ヒト抗体分子は配列番号167の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに配列番号168の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3を含み、CXCL1又はCXCL5によるCXCR2の活性化を阻害することができる。Table 19(表19)並びに図4A及び図4Bに提供したように、配列番号167及び168はそれぞれ、開示したヒト抗体分子のコンセンサス重鎖可変領域及びコンセンサス軽鎖可変領域を表わす(配列番号167=「コンセンサスVH」、配列番号168=「コンセンサスVL」)。コンセンサスCDR配列は配列番号169、170、171、172、173、及び174として提供される。開示したCDR配列の名称における番号付けは、他に注記しない限り、Kabatに従う。いくつかの実施形態では、ヒト抗体分子は、
配列番号169で提供されるアミノ酸配列SX1X2X3Sを含む重鎖CDR1であって、X1はS、Q、H、L、W、又はYであり;X2はT又はAであり;X3はM、Q、D、H、又はWである、重鎖CDR1、
配列番号170で提供されるアミノ酸配列AX4SX5X6X7RX8TYYADSVKGを含む重鎖CDR2であって、X4はI又はHであり;X5はG又はDであり;X6はR、S、又はQであり;X7はG又はDであり;X8はN又はSである、重鎖CDR2、
配列番号171で提供されるアミノ酸配列QX10X11X12を含む重鎖CDR3であって、X10はM、A、Q、又はKであり;X11はG又はDであり;X12はY、S、又はKである、重鎖CDR3、
配列番号172で提供されるアミノ酸配列IGTSSDVGGYNYVSを含む軽鎖CDR1、
配列番号173で提供されるアミノ酸配列X13VX14X15X16PSを含む軽鎖CDR2であって、X13はE又はDであり;X14はN、D、又はSであり;X15はK、A、D、又はHであり;X16はR又はQである、軽鎖CDR2、並びに
配列番号174で提供されるアミノ酸配列SSX17AGX18NX19FGX20を含む軽鎖CDR3であって、X17はY又はAであり;X18はN、A、S、K、L、W、又はYであり;X19はN、Q、D、H、K、L、又はYであり;X20はV、A、又はKである、軽鎖CDR3
を含み得る。
【００５０】
ヒト抗体分子は配列番号226の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに配列番号227の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3を含み得る。Table 19(表19)並びに図5A及び図5Bに提供したように、配列番号226及び227はそれぞれ、開示したヒト抗体分子のコンセンサス重鎖可変領域及びコンセンサス軽鎖可変領域を表わす(配列番号226=「コンセンサスVH」、配列番号227=「コンセンサスVL」)。コンセンサスCDR配列は配列番号228、229、230、201、231、及び232として提供される。いくつかの実施形態では、ヒト抗体分子は、
配列番号228で提供されるアミノ酸配列SSTX21Sを含む重鎖CDR1であって、X21はM又はQである、重鎖CDR1、
配列番号229で提供されるアミノ酸配列AISGX23GX24X25TYYADSVKGを含む重鎖CDR2であって、X23はR又はSであり;X24はR又はGであり;X25はN又はSである、重鎖CDR2、
配列番号230で提供されるアミノ酸配列QX28GYを含む重鎖CDR3であって、X28はM、K、又はAである、重鎖CDR3、
配列番号201で提供されるアミノ酸配列IGTSSDVGGYNYVSを含む軽鎖CDR1、
配列番号231で提供されるアミノ酸配列EVX30KRPSを含む軽鎖CDR2であって、X30はN又はSである、軽鎖CDR2、並びに
配列番号232で提供されるアミノ酸配列SSYAGX31NNFGVを含む軽鎖CDR3であって、X31はN又はSである、軽鎖CDR3
を含み得る。
【００５１】
開示したヒト抗体分子は、Table 1(表1)に提供した重鎖及び軽鎖のCDRの組合せを含み得る。いくつかの実施形態では、たとえばヒト抗体分子は、配列番号175〜185のうちいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号186〜192のうちいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号194〜200のうちいずれか1つのアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号202〜209のうちいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号210〜225のうちいずれか1つのアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含み得る。
【００５２】
【表１Ａ】
2021532789.tif 000003
【００５３】
【表１Ｂ】
2021532789.tif 000004
【００５４】
【表１Ｃ】
2021532789.tif 000005
【００５５】
いくつかの態様では、ヒト抗体分子は、
それぞれ配列番号176、配列番号186、及び配列番号194;
それぞれ配列番号177、配列番号186、及び配列番号194;
それぞれ配列番号178、配列番号186、及び配列番号194;
それぞれ配列番号179、配列番号186、及び配列番号194;
それぞれ配列番号180、配列番号186、及び配列番号194;
それぞれ配列番号181、配列番号186、及び配列番号194;
それぞれ配列番号182、配列番号186、及び配列番号194;
それぞれ配列番号183、配列番号186、及び配列番号194;
それぞれ配列番号184、配列番号186、及び配列番号194;
それぞれ配列番号185、配列番号186、及び配列番号194;
それぞれ配列番号175、配列番号187、及び配列番号194;
それぞれ配列番号175、配列番号188、及び配列番号194;
それぞれ配列番号175、配列番号189、及び配列番号194;
それぞれ配列番号175、配列番号190、及び配列番号194;
それぞれ配列番号175、配列番号191、及び配列番号194;
それぞれ配列番号175、配列番号192、及び配列番号194;
それぞれ配列番号175、配列番号186、及び配列番号195;
それぞれ配列番号175、配列番号186、及び配列番号196;
それぞれ配列番号175、配列番号186、及び配列番号197;
それぞれ配列番号175、配列番号186、及び配列番号198;
それぞれ配列番号175、配列番号186、及び配列番号199;又は
それぞれ配列番号175、配列番号186、及び配列番号200;
の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号210の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3を含み得る。
【００５６】
いくつかの態様では、ヒト抗体分子は、
それぞれ配列番号175、配列番号186、及び配列番号194の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに
それぞれ配列番号201、配列番号203、及び配列番号210;
それぞれ配列番号201、配列番号204、及び配列番号210;
それぞれ配列番号201、配列番号205、及び配列番号210;
それぞれ配列番号201、配列番号206、及び配列番号210;
それぞれ配列番号201、配列番号207、及び配列番号210;
それぞれ配列番号201、配列番号208、及び配列番号210;
それぞれ配列番号201、配列番号209、及び配列番号210;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号211;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号212;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号213;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号214;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号215;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号216;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号217;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号218;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号219;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号220;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号221;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号222;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号223;
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号224;又は
それぞれ配列番号201、配列番号202、及び配列番号225;
の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3
を含み得る。
【００５７】
いくつかの態様では、ヒト抗体分子は、
それぞれ配列番号182、配列番号192、及び配列番号194;
それぞれ配列番号182、配列番号192、及び配列番号197;
それぞれ配列番号175、配列番号186、及び配列番号197;又は
それぞれ配列番号182、配列番号192、及び配列番号195;
の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに
それぞれ配列番号201、配列番号205、及び配列番号213の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3を含み得る。
【００５８】
ヒト抗体分子は、配列番号182のアミノ酸配列を含む重鎖CDR1、配列番号192のアミノ酸配列を含む重鎖CDR2、配列番号195のアミノ酸配列を含む重鎖CDR3、配列番号201のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR1、配列番号205のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR2、及び配列番号213のアミノ酸配列を含む軽鎖CDR3を含み得る。
【００５９】
Table 19(表19)並びに図4A及び図4Bに提供したように、配列番号167及び168はそれぞれ、開示したヒト抗体分子のコンセンサス重鎖可変領域及びコンセンサス軽鎖可変領域を表わす(配列番号167=「コンセンサスVH」、配列番号168=「コンセンサスVL」)。したがって、開示したヒト抗体分子は、
配列番号167で提供されるアミノ酸配列
【００６０】
【化１】
2021532789.tif 000006
【００６１】
VTVSSを含む重鎖可変領域であって、X1はS、Q、H、L、W、又はYであり;X2はT又はAであり;X3はM、Q、D、H、又はWであり;X4はI又はHであり;X5はG又はDであり;X6はR、S、又はQであり;X7はG又はDであり;X8はN又はSであり;X9はI又はKであり;X10はM、A、Q、又はKであり;X11はG又はDであり;X12はY、S、又はKである、重鎖可変領域、並びに
配列番号168で提供されるアミノ酸配列
【００６２】
【化２】
2021532789.tif 000007
【００６３】
VLを含む軽鎖可変領域であって、X13はE又はDであり;X14はN、D、又はSであり;X15はK、A、D、又はHであり;X16はR又はQであり;X17はY又はAであり;X18はN、A、S、K、L、W、又はYであり;X19はN、Q、D、H、K、L、又はYであり;X20はV、A、又はKである軽鎖可変領域
を含み得る。下線を付した残基は、上で開示したコンセンサスCDRを表わす。
【００６４】
ヒト抗体分子は、
配列番号226で提供されるアミノ酸配列
【００６５】
【化３】
2021532789.tif 000008
【００６６】
VTVSSを含む重鎖可変領域であって、X21はM又はQであり;X22はA又はPであり;X23はR又はSであり;X24はR又はGであり;X25はN又はSであり;X26はR又はKであり;X27はI又はKであり;X28はM、K、又はAである重鎖可変領域、並びに
配列番号227で提供されるアミノ酸配列
【００６７】
【化４】
2021532789.tif 000009
【００６８】
を含む軽鎖可変領域であって、X29はD又はGであり;X30はN又はSであり;X31はN又はSである、軽鎖可変領域
を含み得る。下線を付した残基は、上で開示したコンセンサスCDRを表わす。
【００６９】
ヒト抗体分子は、
a)配列番号98のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
b)配列番号99のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
c)配列番号100のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
d)配列番号101のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
e)配列番号102のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
f)配列番号103のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
g)配列番号104のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
h)配列番号105のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
i)配列番号106のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
j)配列番号107のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
k)配列番号108のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
l)配列番号162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
m)配列番号163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
n)配列番号164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
o)配列番号165のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;又は
p)配列番号166のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
を含み得る。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ヒト抗体分子は、
a)配列番号108のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
b)配列番号162のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
c)配列番号163のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
d)配列番号164のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
e)配列番号165のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;又は
f)配列番号166のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域;
を含む。
【００７１】
ヒト抗体分子は、配列番号108のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域及び配列番号110のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含み得る。
【００７２】
開示したヒト抗体分子は、ヒトIgG1、IgG2、又はIgG4の重鎖定常領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒト抗体分子は、ヒトIgG1重鎖定常領域を含む。好適なヒトIgG1重鎖定常領域には、たとえば配列番号122又は124のアミノ酸配列が含まれる。いくつかの態様では、ヒトIgG1重鎖定常領域は、配列番号122のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ヒトIgG1重鎖定常領域は、配列番号124のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト抗体分子は、ヒトIgG2重鎖定常領域を含む。いくつかの態様では、ヒトIgG2重鎖定常領域は、配列番号120のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒト抗体分子は、ヒトIgG4重鎖定常領域を含む。好適なヒトIgG4重鎖定常領域には、たとえば配列番号116又は118のアミノ酸配列が含まれる。いくつかの実施形態では、ヒトIgG4重鎖定常領域は配列番号116のアミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、ヒトIgG4重鎖定常領域は配列番号118のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトIgG4重鎖可変領域はS228Pの置換を含む。いくつかの実施形態では、ヒトIgG4重鎖定常領域はM252Y、S254T、及びT256Eの置換を含む。いくつかの実施形態では、IgG4定常領域は野生型IgG4に対してカルボキシル末端リジン残基の欠失を含む。
【００７３】
ヒト抗体分子は、ヒトラムダ(λ)軽鎖定常領域又はヒトカッパ(κ)軽鎖定常領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ヒト抗体分子は、ヒトラムダII(λ2)軽鎖定常領域を含む。
【００７４】
ヒト抗体分子は、ヒトIgG1重鎖定常領域及びヒトラムダII軽鎖定常領域を含み得る。ヒト抗体分子は、ヒトIgG2重鎖定常領域及びヒトラムダII軽鎖定常領域を含み得る。ヒト抗体分子は、ヒトIgG4重鎖定常領域及びヒトラムダII軽鎖定常領域を含み得る。
【００７５】
ヒト抗体分子は、全長の抗体又はその抗原結合性断片であり得る。好適な抗原結合性断片には、たとえばFab断片、F(ab)2断片、又は一本鎖抗体が含まれる。
【００７６】
開示したヒト抗体分子は、ヒトCXCR2と選択的に拮抗し、それによりCXCR2のCXCL1又はCXCL5誘起活性化を阻害する。開示したヒト抗体分子はまた、CXCR2のCXCL8誘起活性化を部分的に阻害し得る。開示したヒト抗体分子は、以下の特性の1つ又は複数をも呈し得る。
a)HTS002C-CHEMISCREEN(商標)ヒトCXCR2ケモカイン受容体カルシウム最適化細胞株-において、CXCL1の濃度1.5〜3.4nMでのCXCL1誘起カルシウムフラックスを0.8〜2.4のIC50で阻害する、
b)HTS002C-CHEMISCREEN(商標)ヒトCXCR2ケモカイン受容体カルシウム最適化細胞株-において、CXCL8誘起カルシウムフラックスを実質的に阻害しない、
c)Tango(商標)細胞系アッセイにおいて、CXCL1については1.5〜3.4nM、CXCL5については47.7〜150nMの濃度で、CXCL1又はCXCL5誘起β-アレスチン動員を0.08〜0.5nMのIC50で阻害する、又は
d)重症持続性好中球減少症を惹起せずに、気道好中球増加症を有する対象において気道の好中球増加を低減させる。
【００７７】
本明細書で開示したヒト抗体分子のいずれかを含む医薬組成物も提供される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される担体と組み合わせた本明細書で開示したヒト抗体分子のいずれかを含み得る。
【００７８】
本明細書で開示したヒト抗体分子のいずれかをコードする核酸分子も提供される。本明細書に記載したヒト抗体又はその断片をコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号233〜247として提供される。ヒト抗体重鎖定常領域をコードする例示的なポリヌクレオチドは、配列番号248〜256として提供される。
【００７９】
本明細書で開示した核酸分子を含むベクターも、開示される。
【００８０】
本明細書で開示したヒト抗体分子のいずれかを発現するように形質転換された細胞が、更に提供される。
【００８１】
治療及び使用の方法
CXCR2アンタゴニストは、好中球性及び/若しくは単球性の炎症並びにCXCR2を発現するある種のがんに関連する病状、又は抗がん応答の好中球抑制の要素が存在する病状に関与する広範囲の病態についての臨床試験を含む研究の対象となってきた。CXCR2の小分子アンタゴニストは、たとえば、
(a)COPD(たとえばMiller, B.ら、(2017). Late Breaking Abstract-「Danirixin (GSK1325756) improves respiratory symptoms and health status in mild to moderate COPD-results of a 1 year first time in patient study.」、European Respiratory Journal、50頁を参照);
(b)インフルエンザ(たとえば「Safety, Tolerability and Clinical Effect of Danirixin in Adults With Influenza」と題するClinicalTrials.govに記載された研究NCT02469298を参照);
(c)気管支拡張症(たとえばDe Soyzaら、(2015)「A randomised, placebo-controlled study of the CXCR2 antagonist AZD5069 in bronchiectasis.」、Eur Respir J, 46, 1021〜32頁を参照);
(d)嚢胞性線維症(たとえばMossら、(2013)「Safety and early treatment effects of the CXCR2 antagonist SB-656933 in patients with cystic fibrosis.」、J Cyst Fibros, 12, 241〜8頁を参照);
(e)重症喘息(たとえばNairら、(2012)「Safety and efficacy of a CXCR2 antagonist in patients with severe asthma and sputum neutrophils: a randomized, placebo-controlled clinical trial.」、Clin Exp Allergy, 42, 1097〜103頁を参照);及び
(f)前立腺がん(たとえば「Combination Study of AZD5069 and Enzalutamide」と題されたClinicalTrials.govに記載された研究番号NCT03177187を参照)
について開発されてきた。
【００８２】
更に、CXCR2のアンタゴニストは、慢性副鼻腔炎等の慢性上気道疾患(たとえばTomassenら、(2016)「Inflammatory endotypes of chronic rhinosinusitis based on cluster analysis of biomarkers.」、J Allergy Clin Immunol, 137, 1449〜1456頁  e4を参照);虚血-再灌流傷害を含む血管疾患(たとえばStadtmann and Zarbock, (2012)「CXCR2: From Bench to Bedside.」、Front Immunol, 3, 263頁を参照)及び冠動脈疾患(たとえばJosephら、(2017)「CXCR2 Inhibition - a novel approach to treating Coronary heart Disease (CICADA): study protocol for a randomised controlled trial.」Trials, 18, 473頁を参照);慢性疼痛(たとえばSilvaら、(2017)「CXCL1/CXCR2 signaling in pathological pain: Role in peripheral and central sensitization.」、Neurobiol Dis, 105, 109〜116頁を参照);多発性硬化症(たとえばPiersonら、(2018)「The contribution of neutrophils to CNS autoimmunity.」、Clin Immunol, 189, 23〜28頁及びアルツハイマー病(たとえばLiuら、(2014)「Neuroinflammation in Alzheimer's disease: chemokines produced by astrocytes and chemokine receptors.」、Int J Clin Exp Pathol, 7, 8342〜55頁を参照)を含む神経炎症病態(たとえばVeenstra and Ransohoff, (2012)「Chemokine receptor CXCR2: physiology regulator and neuroinflammation controller?」、J Neuroimmunol, 246, 1〜9頁を参照);アルコール性及び非アルコール性の脂肪肝炎(たとえばFrenchら、(2017)「The role of the IL-8 signaling pathway in the infiltration of granulocytes into the livers of patients with alcoholic hepatitis.」、Exp Mol Pathol, 103, 137〜140頁及びYeら、(2016)「Lipocalin-2 mediates non-alcoholic steatohepatitis by promoting neutrophil-macrophage crosstalk via the induction of CXCR2.」、J Hepatol, 65, 988〜997頁を参照);膵炎(たとえばSteeleら、(2015)「CXCR2 inhibition suppresses acute and chronic pancreatic inflammation.」、J Pathol, 237, 85〜97頁を参照);糖尿病(たとえばCitroら、(2015)「CXCR1/2 inhibition blocks and reverses type 1 diabetes in mice.」、Diabetes, 64, 1329〜40頁を参照);並びに様々な型のがん(たとえばLiuら、(2016)「The CXCL8-CXCR1/2 pathways in cancer.」、Cytokine Growth Factor Rev, 31, 61〜71頁を参照)において有益であり得るという証拠がある。ベーチェット病は好中球の活性化によって特徴付けられ、これもCXCR2と関連付けられている(Qiaoら、「CXCR2 Expression on neutrophils is upregulated during the relapsing phase of ocular Behcet disease」、Curr Eye Res. 2005;30: 195〜203頁)。
【００８３】
本方法は、本明細書に記載した炎症病態を治療又は防止するために、治療有効量の本明細書で開示したヒト抗体分子又は本明細書で開示した医薬組成物のいずれかを対象に投与する工程を含む。いくつかの実施形態では、ヒト抗体分子又はこれを含む医薬組成物は、たとえば痰の好中球数によって決定される気道好中球増加症又は急性肺炎症を治療するための治療有効量で投与される。そのような実施形態では、ヒト抗体分子又はこれを含む医薬組成物を受ける対象は、気道好中球増加症又は急性肺炎症を有する。いくつかの実施形態では、ヒト抗体分子又はこれを含む医薬組成物は、気道好中球増加症又は急性肺炎症を防止するための治療有効量で投与される。そのような実施形態では、ヒト抗体分子又はこれを含む医薬組成物を受ける対象は、たとえば遺伝的素因若しくは環境因子による気道好中球増加症又は急性肺炎症のリスクにあるか、又は気道好中球増加症又は急性肺炎症を有するために以前に治療を受けたことがあり、維持医薬として(たとえば肺好中球の低いレベルを維持するため)治療有効用量の開示したヒト抗体分子若しくは医薬組成物を受けているか、若しくは受けることになっている。
【００８４】
気道好中球増加症又は急性肺炎症の防止又は治療における使用のための、開示したヒト抗体分子又は開示した医薬組成物も、末梢組織における好中球増加症、気道好中球増加症、又は急性若しくは慢性の肺炎症の防止又は治療のための医薬の製造における開示したヒト抗体分子のいずれか又は開示した医薬組成物のいずれかの使用と同様に、提供される。
【００８５】
気道好中球増加症、急性肺炎症、又はその両方は、慢性閉塞性肺疾患、重症好中球性喘息、又はその両方であり得る。
【００８６】
少なくとも1つの実験モデルでは、本明細書に記載した抗体は、炎症性刺激に応答する好酸球の肺への遊走を阻害することが観察される。したがって、抗体は、好酸球性喘息、アレルギー性鼻炎、皮膚の病態、真菌及び寄生虫の感染、自己免疫疾患(炎症性腸疾患、視神経脊髄炎、水疱性類天疱瘡、自己免疫性心筋炎、原発性胆汁性肝硬変、多発性血管炎を伴う好酸球性肉芽腫症(Churg-Strauss症候群)、いくつかのがん、並びに骨髄障害等の、好酸球増加によって特徴付けられる炎症性疾患を治療するために有用である。
【００８７】
理論に縛られるものではないが、好酸球はCXCR2受容体を欠いているので、好酸球の肺への遊走をブロックする本CXCR2抗体の能力は驚くべきことである。炎症性細胞がある部位に遊走するためには、これらはまず、CXCR2を発現することが公知の内皮細胞から作られた血管のライニングを通過しなければならない。したがって、抗体は更に、内皮細胞への影響を通して細胞の遊走を阻害することができる。
【００８８】
内皮細胞に影響する能力は、本抗体ががんにおいて重要な血管形成及び転移に影響することができる可能性も示す。したがって、がんの治療のための方法が本明細書で提供される。
【実施例】
【００８９】
以下の実施例は、本明細書で開示した実施形態のいくつかを更に記述するために提供される。実施例は開示した実施形態を説明することを意図しており、限定することを意図しない。
【００９０】
一般的方法
抗体生成のためのプラスミドの産生
可変領域アミノ酸配列をDNA配列に逆翻訳し、得られるDNAを新たに合成した。合成した重鎖可変領域遺伝子を、コアヒンジ安定化置換S228Pを含むヒトIgG4定常領域(配列番号118)をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターにサブクローニングした。合成したラムダ軽鎖可変領域遺伝子を、ヒトラムダ軽鎖定常領域アミノ酸配列(配列番号134)をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターにサブクローニングした。合成したカッパ軽鎖可変領域遺伝子を、ヒトカッパ軽鎖定常領域アミノ酸配列(配列番号135)をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターにサブクローニングした。
【００９１】
Expi293F(商標)システムを用いる抗体の一時的発現
抗体の重鎖及び軽鎖のプラスミドをExpi293(商標)細胞(Life Technologies社)に共トランスフェクトすることによって抗体を生成した。それぞれ20mLのトランスフェクションのために、20mLのExpi293(商標)発現培地において3.6×107個の細胞が必要であった。トランスフェクションは、メーカーの説明書に従い、ExpiFectamine(商標)293試薬を用いて行なった。
【００９２】
トランスフェクションの後、72時間と84時間の間で遠心分離(3000×g、20分)することによって、抗体を収穫した。他に指示しない限り、全ての抗体はヒンジ安定化置換S228Pを組み込んだヒトIgG4として生成した。
【００９３】
抗体の精製及び緩衝液交換
一時的トランスフェクションから収穫した材料から、メーカーの説明書に従い、プロテインAレジン(MabSelect(商標)SuRe(商標)、GE Healthcare社)を用いて抗体を精製した。
【００９４】
溶出に続いて、8.3mLのSephadex(商標)G-25レジンを含むPD-10脱塩カラム(52-1308-00 BB、GE Healthcare社)を用いて、抗体の緩衝液をクエン酸からSorensenのPBS、pH5.8(59.5mM KH2PO4、7.3mM Na2HPO4.2H20、150mM NaCl)に交換した。
【００９５】
CXCRファミリーメンバーのExpi293F(商標)細胞への一時的トランスフェクション
ヒトCXCR1(配列番号133)、ヒトCXCR2(配列番号125)、ヒトCXCR3(配列番号128)、ヒトCXCR4(配列番号129)、ヒトCXCR5(配列番号130)、ヒトCXCR6(配列番号131)、ヒトCXCR7(配列番号132)、又はカニクイザルCXCR2(配列番号127)のいずれかをコードするポリヌクレオチドを含む市販の哺乳動物発現ベクターpTT5(Durocher、2002年)を用いて、Expi293F(商標)細胞(Life Technologies社)を一時的にトランスフェクトした。
【００９６】
それぞれ10mLのトランスフェクションのために、10μgのプラスミドDNAをOpti-MEM(商標)I Reduced Serum Medium(Cat.no.31985-062)中で全体積1.0mLまで希釈することによって、脂質-DNA複合体を調製した。54μLのExpiFectamine(商標)293 ReagentをOpti-MEM(商標)I Medium中で全体積1.0mLまで希釈した。トランスフェクションはメーカーの説明書に従って行なった。200rpmで回転するオービタルシェーカーの上で、空気中CO2濃度8%の加湿雰囲気下の37℃のインキュベーターで細胞をインキュベートした。トランスフェクションのほぼ18〜24時間後、細胞の生存率を評価し、トランスフェクトした細胞を使用のために収穫した。
【００９７】
一時的にトランスフェクトしたExpi293F(商標)細胞を用いるフローサイトメトリー結合アッセイ
収穫した細胞をFACS緩衝液(1×PBS+0.5%(w/v)ウシ血清アルブミン(BSA)+2mM EDTA、pH7.2)中で再懸濁した。96ウェル丸底プレート中でウェルあたり約2×105個の細胞を加えた。4℃における400g、5分の遠心分離によって細胞をペレット化し、上清を廃棄した。それぞれの試験抗体又は対照抗体25μLを細胞に加え、4℃で30分インキュベートした。100μLのFACS緩衝液で細胞を2回洗浄し、続いて4℃で400g、5分の遠心分離を行なった。
【００９８】
検出のため、50μLの二次抗体(Table 2(表2))を関連する試料に加えた。細胞が受容体を発現していたことを確認するため、トランスフェクトしたCXCRファミリーメンバーに結合した市販の抗体を陽性対照として用いた。200μLのFACS緩衝液で細胞を2回洗浄し、続いて4℃で400g、5分の遠心分離を行なった。試料を取得する前に、細胞を100μLのFACS緩衝液で再懸濁した。FACSCanto(商標)IIサイトメーター(Becton-Dickinson社)上の高スループットサンプラーを用いて試料を取得した。
【００９９】
【表２】
2021532789.tif 000010
【０１００】
ヒトCXCR2細胞系効力アッセイ
Tango(商標)CXCR2細胞系アッセイ:市販のレポーター細胞株Tango(商標)CXCR2-bla U2OSを用いて、CXCL8及びCXCL1(ThermoFisher Scientific社、Australia)によるCXCR2の活性化を阻害する抗体の能力を評価した。細胞はメーカーの指示に従って解凍し、増殖し、培養し、凍結した。
【０１０１】
細胞系アッセイにおける使用のためのTango(商標)CXCR2-bla U2OS細胞の調製:メーカーのプロトコールを改変して、384ウェルプレートの代わりに96ウェルプレートを用いた。簡単には、分裂細胞を使用の1日前に収穫した。細胞を収穫し、生存細胞密度312,500個/mLでアッセイ培地(100% FreeStyle(商標)Expression Medium、Life Technologies社、Cat#12338-018)中に再懸濁した。96ウェルの黒壁透明底の組織培養処理済みプレートに1ウェルあたり128μLの細胞懸濁液を加えた。5% CO2雰囲気中37℃で16〜20時間、細胞を培養して、アッセイに用いた。
【０１０２】
Tango(商標)細胞系アッセイ手順:アッセイは、メーカーのプロトコールに記載されるように設定し、実行した。アゴニスト及びアンタゴニストの両方の効力のアッセイにおいて用いたアゴニストを、Table 3(表3)に提供する。アンタゴニストのアッセイについては、アゴニストはEC50〜EC80の範囲の濃度で用いた。アッセイは、Table 4(表4)に与えるパラメーターで構成したFlexStation(登録商標)3(Molecular Devices社)蛍光プレートリーダーを用いて読み取った。それぞれのウェルについての青色/緑色の発光比を、青色発光値を緑色発光値で除することによって計算した。全ての阻害カーブは、GraphPad Prism(商標)(バージョン7.01)を用いる4パラメーター用量応答に適合した。
【０１０３】
【表３】
2021532789.tif 000011
【０１０４】
【表４】
2021532789.tif 000012
【０１０５】
末梢血の調製
全ヒトバフィーコート、ヒト末梢血バフィーコートから調製したPBMC富化分画、又はカニクイザル全血を、フローサイトメトリーによる抗体結合活性の解析に用いた。簡単には、血液を処理しないか、又は無菌濾過した室温のリン酸塩緩衝食塩液(PBS)で1:1希釈した。30mLの試料を15mLのLymphoprep(商標)(Stem Cell Technologies社、cat#07851)の上に重層した。末梢血単核球細胞(PBMC)は、室温、700gで30分、ブレーキなしで遠心分離することによって富化した。PBMC層を単離し、2mMのEDTAを含むPBS中、200gの低速遠心分離で細胞を洗浄して血小板夾雑物を除去した。全血又はPBMC富化細胞分画を赤血球溶解溶液(BioLegend社、420301)中に再懸濁した。生存細胞数を決定し、細胞をFACS緩衝液(1×PBS+0.5%(w/v)BSA+2mM EDTA pH7.2)中1mLあたり1×107個で再懸濁した。
【０１０６】
全血又はPBMC富化調製物を用いるフローサイトメトリー結合アッセイ:試験抗体を用いて血液好中球集団上のCXCR2を検出する結合アッセイを、本質的には一時的にトランスフェクトしたExpi293F(商標)細胞を用いるアッセイについて記載したように実施した。好中球表面上のヒトCXCR2への抗体の結合を、フルオロフォアであるアロフィコシアニン(APC)に直接コンジュゲートした抗CXCR2抗体を用いて測定した。比較のため、アイソタイプを一致させた対照抗体を含めた。細胞を、リニエージ特異的抗体及び氷冷した3%BSA/PBS中で調製した2μg/mLのAPCコンジュゲート抗CXCR2抗体又はアイソタイプ対照と、4℃で少なくとも30分、インキュベートした。市販の抗CXCR2抗体(クローン48331(R&D Systems社、FAB331A))を陽性対照として用いた。好中球の集団を、特徴的な粒度及び大きさ、並びにCD10(BioLegend社、クローンH110a、カタログ番号312204)に対する市販の抗体の陽性結合によって同定した。細胞は解析の前に洗浄し、固定した(BioLegend社、Fixation buffer、420801)。細胞表面上の蛍光のレベルをフローサイトメトリーで測定した。この方法を用いて、試験した抗CXCR2抗体はヒト及びカニクイザルの両方からの好中球と結合することが検出された。
【０１０７】
ヒトCXCR2トランスジェニックマウスの産生
マウスCXCR2遺伝子のエクソン1の中にヒトCXCR2を挿入する胚幹(ES)細胞における相同組換えを用いることによって、hCXCR2ノックインマウスを産生した。マウスのCXCR2のコーディングエクソンのゲノム位置に相同な5'及び3'アームを有するベクターにヒトCXCR2の単一コーディングエクソンを挿入して、ヒトCXCR2をコードするが、マウスのコーディングしない規制要素を保持した遺伝子構造を生じさせた。このベクターをC57Bl/6マウスのES細胞にエレクトロポレートし、これをC57Bl/6マウスの胚盤胞に組み込んで、偽妊娠した雌マウスに移植した。子供を親C57Bl/6株に戻し交配し、子孫をヒトCXCR2遺伝子の生殖細胞系列トランスミッションについてサザンブロットによってスクリーニングした。ヒトCXCR2にヘテロ接合性のマウスを戻し交配してホモ接合性のヒトCXCR2株を得て、フローサイトメトリーによる抗マウス-及び抗ヒト-CXCR2抗体の結合の解析によって表現型を確認した。
【０１０８】
コンパレーター抗体及び小分子CXCR2アンタゴニスト
アンタゴニスト1は国際公開WO2015/169811A2に記載された抗体HY29GL(この参考文献の配列20及び29のVH及びVL)である。アンタゴニスト2は国際公開WO2014/170317A1に記載された抗体CX1_5(この参考文献の配列115及び114のVH及びVL)である。アンタゴニスト3は抗CXCR2抗体クローン48311(R&D Systems社、カタログ番号MAB331-500)である。アンタゴニスト4は抗CXCR2抗体クローン6C6(BD Biosciences社、カタログ番号555932)である。アンタゴニスト5は小分子CXCR2アンタゴニスト、ダニリキシン(Danirixin)である。アンタゴニスト6は小分子CXCR2アンタゴニストSCH 527123である。
【０１０９】
(実施例1)
抗CXCR2抗体の産生
ヒト可変領域を有する抗CXCR2抗体の産生
ヒト可変領域を有する抗体を発現するように操作したトランスジェニックラット(国際公開WO2008/151081に開示)を用いて、ヒトCXCR2に対する抗体を生じさせた。簡単には、ヒトCXCR2のアミノ酸配列(配列番号125)をコードするプラスミドを用いて、一時的にトランスフェクトしたCXCR2陽性HEK293細胞を用いるフローサイトメトリーによって測定してヒトCXCR2に対する抗体タイターが得られるまで動物を毎週、遺伝子免疫に供した。
【０１１０】
抗CXCR2抗体を発現するハイブリドーマの生成及び増殖
ヒトCXCR2に対するモノクローナル抗体を生成するハイブリドーマを産生するため、最大の抗CXCR2タイターを有する動物からの脾細胞及び/又はリンパ節細胞を単離し、マウスミエローマ細胞(ATCC、CRL-1580)に融合した。細胞を約1×105個/mLで平底マイクロタイタープレートに播種し、続いて選択培地(10% FCS及び1×HAT(Sigma社))中で2週間インキュベートした。96ウェルプレート中、4回の培地交換による連続継代(96ウェルステージ1〜4)により、ハイブリドーマを増殖させ、次いで必要な場合にはT25及びT75フラスコ中に増殖させた。ハイブリドーマの増殖プロセスの間、ヒトCXCR2又はマウスCXCR2(それぞれ配列番号125又は126)を発現するように一時的トランスフェクトした細胞上の細胞系ELISA(cELISA)によって、上清をCXCR2結合活性についてモニターした。ヤギ抗ラットIgG-HRP(Southern Biotech社、#3030-05)二次抗体を用いて、結合した抗体を検出した。
【０１１１】
ヒト可変領域配列を発現するように操作したトランスジェニックラットからのリンパ節及び脾臓細胞を用いて、ハイブリドーマのパネルを産生した。細胞ELISA(cELISA)を用いて、ハイブリドーマの増殖プロセスの間に採取した上清中のヒトCXCR2結合活性を検出した(Table 5(表5))。数回の継代の後、CXCR2に結合する抗体の発現を保持するハイブリドーマを、DNAシーケンシングのために選択した。
【０１１２】
【表５Ａ】
2021532789.tif 000013
【０１１３】
【表５Ｂ】
2021532789.tif 000014
【０１１４】
【表５Ｃ】
2021532789.tif 000015
【０１１５】
【表５Ｄ】
2021532789.tif 000016
【０１１６】
ハイブリドーマ細胞によって生成された抗体のシーケンシング
テンプレートとして非クローナルハイブリドーマ細胞ペレットから生成したRNAを用いる逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)によって、抗体の可変ドメインを単離した。RNAは、GENELUTE(商標)96ウェル全RNA精製キット(Sigma社、#RTN9602、RTN9604)を用い、メーカーのプロトコールに従ってハイブリドーマのプレートから単離した。標準RT-PCRのため、オリゴ(dT)プライマー及びAccuScript PfuUltra(登録商標)II RT-PCRキット(Agilent社、#600184)を用いて、RNAをcDNAに逆転写した。メーカーのプロトコールに従ってcDNA合成反応を組み立て、cDNA合成を42℃、30分で行なった。CDNA末端の5'-迅速増幅(5'-RACE)PCRにおける使用のため、SMARTer(登録商標)RACEキット(Takara社)を用い、メーカーの指示に従ってRNAをcDNAに逆転写して、5'-RACE用cDNAを得た。
【０１１７】
ハイブリドーマのパネルからのヒト抗体可変領域の増幅は、PfuUltraII (Agilent社)又はQ5高忠実度DNAポリメラーゼ(NEB社)を用いるPCRにより、メーカーの指示に従って実施した。ハイブリドーマパネルの重鎖は、げっ歯類重鎖定常領域のDNA配列及びヒト重鎖リーダー配列のDNA配列に特異的なプライマー対を用いて増幅した。ハイブリドーマパネルのラムダ軽鎖可変領域は、ヒトラムダ定常領域のDNA配列及びヒトラムダ鎖リーダー配列のDNA配列に特異的なプライマー対を用いて同様に増幅した。
【０１１８】
得られた精製DNAの濃度を、Nanodrop分光計を用いて評価した。PCR断片のサンガーシーケンシングを、重鎖又は軽鎖のアンプリコンにおいて内部的に結合するように設計したオリゴを用いて実施した。得られたDNA配列を、全長の抗体鎖の産生における使用に先立って、さらなる解析のためにアミノ酸配列に概念上で翻訳した。独特のアミノ酸配列を有する抗体を、全長のヒト抗体への変換のために選択した。
【０１１９】
ヒトCXCR2への結合を有する組換えモノクローナル抗体
CXCR2に結合する抗体を分泌したハイブリドーマから(Table 5(表5)に記載したようにして)選択したハイブリドーマをシーケンシングし、上記のRT-PCRを用いて可変領域のDNA及びアミノ酸を同定した。次いでこれらの抗体可変領域を遺伝子合成によって産生し、「一般的方法」に記載したように哺乳動物発現ベクターにサブクローニングした。Expi293F(商標)細胞中での重鎖及び軽鎖のプラスミドの共発現によって抗体を生成し、「一般的方法」に記載したようにプロテインAカラムクロマトグラフィーによって精製した。いくつかの重鎖及び/又は軽鎖が同じハイブリドーマ細胞から同定された場合には、それぞれの重鎖をそれぞれの軽鎖と対にして、得られた抗体にa、b、c等の添字を付した。精製した抗体をSorensenのPBS pH5.8の中に脱塩し、ヒトCXCR2又はヒトCXCR1でトランスフェクトしたExpi293F(商標)細胞及び模擬トランスフェクトしたExpi293F(商標)細胞への結合についてフローサイトメトリーによって試験した。ハイブリドーマパネルから、さらなる特徴解析のために、ヒトCXCR2に結合するがヒトCXCR1又は模擬トランスフェクトしたExpi293F(商標)細胞に結合しない26個の抗体を同定した。これらの抗体の配列をTable 6(表6)に示す。
【０１２０】
【表６Ａ】
2021532789.tif 000017
【０１２１】
【表６Ｂ】
2021532789.tif 000018
【０１２２】
(実施例2)
抗CXCR2ヒットの機能特徴解析
カニクイザルCXCR2への結合
ヒトCXCR2に結合するがヒトCXCR1又は模擬トランスフェクトしたExpi293F(商標)細胞に結合しない全ての組換え抗体を、本明細書に記載したようにカニクイザルCXCR2タンパク質をコードするプラスミドで一時的にトランスフェクトしたExpi293F(商標)細胞を用いるカニクイザルCXCR2(配列番号127)への結合について試験した。検出できるレベルのカニクイザルCXCR2への結合を有する抗体を更に特徴解析した。
【０１２３】
他のヒトCXCRファミリーメンバーへの結合
他のヒトCXCRファミリーメンバー、CXCR3、CXCR4、CXCR5、CXCR6、及びCXCR7への結合についてのヒト及びカニクイザルのCXCR2交差反応性抗体を、ヒトCXCR3(配列番号128)、CXCR4(配列番号129)、CXCR5(配列番号130)、CXCR6(配列番号131)、又はCXCR7(配列番号132)のいずれかをコードするプラスミドで一時的にトランスフェクトしたExpi293F(商標)細胞を用い、フローサイトメトリーによって試験した。CXCR2に選択的でない抗体は、さらなる解析から無視した。
【０１２４】
ヒトCXCR2のCXCL8介在活性化の阻害
「一般的方法」に記載したようにして、ヒトCXCL8をアゴニストとして用いるTango(商標)CXCR2細胞系アッセイで抗体を試験した。図1A及び図1Bに示すように、8種の抗体がCXCR2のCXCL8誘起活性化を阻害した。これらのアッセイにおいて市販の抗CXCR2抗体6C6(BD Biosciences社、「BD6C6」)を陽性対照として用いた。
【０１２５】
ヒトPBMCによって発現されたヒトCXCR2及びカニクイザルPBMCによって発現されたカニクイザルCXCR2への抗体の結合
CXCR2のCXCL8介在活性化を阻害した8種の抗体を、ヒト及びカニクイザルのPBMC上で発現した天然のCXCR2への結合について試験した。図2に示すように、2種の抗体、即ちBKO-4A8及びBKO-8G3_bは、ヒト及びカニクイザルの両方のCXCR2に高い結合活性を示した。一方3番目の抗体であるBKO-9C3_aはヒトCXCR2にはかなりのレベルの結合、カニクイザルCXCR2には平均を超えるレベルの結合を呈した。
【０１２６】
ヒトCXCR2のCXCL1介在活性化の阻害
「一般的方法」に記載したようにして、CXCL1をアゴニストとして用いるTango(商標)CXCR2細胞系アッセイで抗体BKO-4A8、BKO-8G3_b、及びBKO-9C3_aを試験した。抗体BKO-4A8がこのフォーマットで試験した抗体の中で一貫して最も強力であった。これらの抗体についてのCXCR2のCXCL1活性化の阻害の典型的な曲線を下の図3に示す。
【０１２７】
(実施例3)
抗CXCR2抗体BKO-4A8のアミノ酸配列の最適化
抗CXCR2抗体分子の配列を安定性及び製造性のために最適化する試みにおいて、抗CXCR2抗体BKO-4A8の重鎖及び軽鎖の可変領域のバリアントを構築した。
【０１２８】
それぞれ単一のアミノ酸置換を含む抗体BKO-4A8のバリアントを下記のように生成した。これらのバリアントの概要をTable 7(表7)に提供する。
【０１２９】
【表７Ａ】
2021532789.tif 000019
【０１３０】
【表７Ｂ】
2021532789.tif 000020
【０１３１】
抗体バリアントをコードするプラスミドの部位特異的変異誘発による産生
高忠実度DNAポリメラーゼを用いるプラスミド鎖の変異原性プライマー特異的複製によって、単一のアミノ酸の変化を必要とする抗体鎖をコードするプラスミドを調製した。このプロセスには、テンプレートとしてのスーパーコイル状の二本鎖プラスミドDNA及びいずれも所望の変異を含む2つの相補的な合成オリゴヌクレオチドプライマーを用いた。プライマーの転位を伴わないPCRのサイクリングの間に、それぞれプラスミドの対向する鎖に相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを延長し、交互に切れ目を含む変異したプラスミドのコピーを得た。PCRのサイクリングに続いて、制限酵素DpnIを用いてPCR反応物を処理した。DpnIは元のベクターDNAを優先的に切断し、新たに合成された鎖をそのままで残す。
【０１３２】
長さが40塩基を超える変異原性オリゴヌクレオチドプライマーを必要とする多数のアミノ酸置換を組み込んだバリアントを産生するため、上のプロセスを繰り返して連続的に変化を導入し、又は合成オリゴヌクレオチドのアセンブリーによって遺伝子を新たに合成した。構築した全てのDNA配列は、サンガーDNAシーケンシングによって使用前に確認した。
【０１３３】
抗体バリアントをコードするプラスミドのポリヌクレオチド合成による産生
GeneOptimizer(登録商標)技術を用いて可変領域アミノ酸配列をDNA配列に逆翻訳し、得られるDNAを合成オリゴヌクレオチド(GeneArt社、Germany)のアセンブリーによって新たに合成した。合成した重鎖可変領域とコアヒンジ安定化置換S228Pを含むヒトIgG4定常領域(配列番号118)とを対にしてコードするポリヌクレオチドを発現ベクターにサブクローニングした。合成したラムダ軽鎖可変領域遺伝子をコードするポリヌクレオチドを、ヒトラムダ軽鎖定常領域(配列番号134)をコードする発現ベクターにサブクローニングした。
【０１３４】
BKO-4A8バリアントのCXCR2への結合
それぞれのバリアントの重鎖を親の軽鎖と共発現し、逆も行なった。得られた抗体を精製し、本明細書に記載したように親抗体BKO-4A8に対するCXCR2結合アッセイで試験した。親のBKO-4A8と同様のレベルの結合を有する抗体バリアントをTable 8(表8)に示す。
【０１３５】
【表８Ａ】
2021532789.tif 000021
【０１３６】
【表８Ｂ】
2021532789.tif 000022
【０１３７】
上の抗体バリアントの可変重鎖配列及び可変軽鎖配列のアラインメントをそれぞれ図4A及び図4Bに示す。コンセンサス可変重鎖(「コンセンサスVH」、配列番号167)及びコンセンサス可変軽鎖(「コンセンサスVL」、配列番号168)もこれらの図の中に提供する。
【０１３８】
CXCL1又はCXCL8によるCXCR2の活性化の阻害においてBKO-4A8と同様の効力を有するBKO-4A8の点バリアント
親のBKO-4A8と同様のレベルのCXCR2結合を示す16種の抗体バリアントを、「一般的方法」に記載したようにCXCL1又はCXCL8をアゴニストとして用いる効力アッセイで試験した。Table 9(表9)に示すように、12種の抗体が親のBKO-4A8と同様の効力を有していた。親の重鎖及び軽鎖の配列に対するこれらのバリアントのアミノ酸配列アラインメントを図4A及び図4Bに提供する。
【０１３９】
【表９】
2021532789.tif 000023
【０１４０】
BKO-4A8のコンビナトリアルバリアント
3つの非生殖細胞系列フレームワークアミノ酸を、最も近いヒト生殖細胞系列の配列に見られるアミノ酸に逆置換した(重鎖R75K及びI94K、並びに軽鎖D41G)。重鎖のフレームワーク2にもA40Pの置換を導入した。
【０１４１】
これらの配列を更に最適化することが可能か否かを検討するために、2つ以上のアミノ酸置換を含むコンビナトリアルバリアントのパネルを設計した。Table 10(表10)に、生成した2つの軽鎖バリアント及び11個の重鎖バリアントの全体を記載する。親のBKO-4A8の可変重鎖及び可変軽鎖とのアミノ酸配列のアラインメントをそれぞれ図5A及び図5Bに図示する。コンセンサス可変重鎖(「コンセンサスVH」、配列番号226)及びコンセンサス可変軽鎖(「コンセンサスVL」、配列番号227)もこれらの図の中に提供する。
【０１４２】
【表１０Ａ】
2021532789.tif 000024
【０１４３】
【表１０Ｂ】
2021532789.tif 000025
【０１４４】
それぞれの重鎖をそれぞれの軽鎖と共発現して、配列を最適化した抗体バリアントを生成させた。抗体を精製して、「一般的方法」に記載したようにCXCR2結合活性について試験した。Table 11(表11)に示すように、コンビナトリアル抗体バリアントの大部分は親抗体BKO-4A8と同様のCXCR2結合活性を保持していた。
【０１４５】
【表１１Ａ】
2021532789.tif 000026
【０１４６】
【表１１Ｂ】
2021532789.tif 000027
【０１４７】
【表１１Ｃ】
2021532789.tif 000028
【０１４８】
4個以上のアミノ酸置換を含むさらなる6種の重鎖コンビナトリアルバリアントをTable 12(表12)に提供するように生成させた。親のBKO-4A8重鎖とのアミノ酸配列のアラインメントを図5Aに図示する。それぞれの重鎖を軽鎖c(配列番号110)と共発現して抗体バリアントを生成させた。抗体を精製して「一般的方法」に記載したようにCXCR2結合活性について試験した。CXCR2結合活性は抗体102c及び抗体106cで低減した。
【０１４９】
【表１２】
2021532789.tif 000029
【０１５０】
「一般的方法」に記載したようにCXCL1又はCXCL8をアゴニストとして用いる効力アッセイで抗体を試験した。Table 13(表13)並びに図6A及び図6Bに示すように、コンビナトリアル抗体バリアント103c、104c、及び105cは親抗体と比較して低減した効力を示したが、バリアント101cは親抗体と比較して改善された効力を示した。
【０１５１】
【表１３】
2021532789.tif 000030
【０１５２】
重鎖可変領域「101」及び軽鎖可変領域「c」を含む抗体101cを、その観察された好ましい特性によって、細胞系効力アッセイにおける評価のために選択した。抗体101cをBKO-4A8-101cと改名した。BKO-4A8-101cは5つの重鎖最適化置換及び3つの軽鎖最適化置換を含んでいた。図6A及び図6Bに図示したように、CXCR2のCXCL1又はCXCL8介在活性化を阻害する能力を測定する細胞系効力アッセイにおけるBKO-4A8とBKO-4A8-101cとの比較により、BKO-4A8-101cを最適化する配列の変更は、親のBKO-4A8と比較してその効力を増大させることが示唆された。
【０１５３】
(実施例5)
抗CXCR2アンタゴニスト活性の特徴解析
リガンド介在β-アレスチン動員のBKO-4A8-101cによる阻害の特徴解析
ヒトCXCR2 Tango(商標)細胞株を用いて、アゴニスト活性化CXCR2へのβ-アレスチンの動員を阻害する抗体BKO-4A8-101cの能力を評価した。全てのヒトELR+ケモカインCXCR2リガンドを、アゴニストの計算したEC50値を用いるアンタゴニスト用量応答アッセイで試験した。BKO-4A8-101cは、試験した全てのアゴニストについて得られた同程度のIC50値で、全てのELR+CXCLケモカインによって誘起されたCXCR2介在β-アレスチンシグナル伝達を阻害することができた(Table 14(表14))。BKO-4A8-101cはヒトCXCL1、2、3、5、及び6によるヒトCXCR2の活性化を用量依存的に完全に阻害したが、同じ用量範囲でCXCL7及びCXCL8を部分的にのみ阻害した。4つの独立した実験からの代表的なデータを図7に示す。
【０１５４】
提案したいずれの作用機序にも縛られることを望まないが、観察された選択的なアンタゴニスト活性は、CXCL8が介在する骨髄から循環系への好中球の遊走に実質的に影響せずに、CXCL1及びCXCL5が介在する循環系から組織への好中球の遊走を実質的に完全に阻害することを可能にする治療ウィンドウを提供することが提案される。レポーターアッセイにおいてCXCL8介在β-アレスチンが部分的に阻害されることは、β-アレスチンが介在する受容体の内在化経路が有効であることを示す。
【０１５５】
【表１４】
2021532789.tif 000031
【０１５６】
リガンド介在カルシウムフラックスのBKO-4A8-101cによる阻害の特徴解析
細胞の走化性において役割を有するCXCR2活性化の下流のシグナル伝達経路の1つを、カルシウムの可動化(フラックス)によって特徴解析した。ヒトCXCR2リガンド誘起カルシウムフラックスを阻害するBKO-4A8-101cの能力を、市販のHTS002C-CHEMISCREEN(商標)ヒトCXCR2ケモカイン受容体カルシウム最適化細胞株-で試験した。全てのヒトELR+ケモカインCXCR2リガンドを、計算したアゴニストのEC50値を用いるアンタゴニスト用量応答アッセイで試験した。
【０１５７】
Table 15(表15)に示すように、BKO-4A8-101cはヒトCXCL1、2、3、5、及び6によって誘起されたカルシウムフラックスを用量依存的に強く阻害したが、同じ用量範囲にわたってCXCL7を弱く、CXCL8をわずかに阻害したのみであった。CXCL1、CXCL5、及びCXCL8についての代表的なデータを示す(図8)。
【０１５８】
好中球の走化性応答にCXCR2活性化カルシウム可動性が介在することが公知である。提案したいずれの作用モードにも限定されることを望まないが、本明細書で開示した抗体によって提供される選択的なアンタゴニスト活性は、CXCL8が介在する骨髄から循環系への好中球の遊走に実質的に影響せずに、CXCL1及びCXCL5が介在する肺への好中球の遊走を実質的に完全に阻害することを可能にする治療ウィンドウを提供する可能性がある。それにより、基礎的な好中球介在抗微生物機能を必ずしも損傷することなく、慢性炎症の部位において好中球が介在する病変をブロックすることが可能になる。
【０１５９】
【表１５】
2021532789.tif 000032
【０１６０】
(実施例6)
抗CXCR2抗体のin vitro結合及び機能活性はFc領域によらない
BKO-4A8重鎖の可変領域を、Table 16(表16)に提供する様々なヒトIgG定常領域にフォーマットした。精製した抗体がヒトCXCR2に結合する能力を、ヒトCXCR2(配列番号125)を発現するように一時的にトランスフェクトしたExpi293F(商標)細胞で通常のように評価した。BKO-4A8及びそのバリアントの結合は、蛍光色素をコンジュゲートした抗ヒトIgG軽鎖ラムダ抗体のインキュベーションによって検出した。図9に図示するように、試験し、平均蛍光強度として定量した抗体の結合活性は、抗体Fc領域にはよらなかった。
【０１６１】
【表１６】
2021532789.tif 000033
【０１６２】
市販のレポーター細胞株Tango(商標)CXCR2-bla U2OS(ThermoFisher Scientific社)を用いて、アゴニスト活性化CXCR2へのβ-アレスチンの動員を阻害する抗CXCR2抗体の能力を評価した。アゴニストは、アンタゴニストアッセイのためのアッセイEC50の濃度で供給した。図10に図示するように、用量応答曲線はBKO-4A8の機能活性がFc領域における配列の修飾によって影響されないことを示し、同程度のアンタゴニスト活性が評価した全ての抗体について明らかであった。
【０１６３】
(実施例7)
抗CXCR2抗体BKO-4A8-101cの特異性
図11に図示するように、密接に関連するヒトCXCRファミリーメンバーを発現するように一時的にトランスフェクトしたExpi293F(商標)細胞における結合活性を評価することによって、抗CXCR2抗体BKO-4A8-101cの特異性を試験した。試験したヒトCXCRファミリーメンバーの配列をTable 19(表19)に提供する。BKO-4A8-101cの結合は、蛍光色素をコンジュゲートした抗ヒトIgG抗体のインキュベーションによって検出した。抗CXCR2抗体BKO-4A8-101cは強力かつ排他的にヒトCXCR2に結合することが見出された。
【０１６４】
(実施例8)
初代血液細胞を用いるフローサイトメトリー結合アッセイ
抗CXCR2抗体BKO-4A8-101cを更に特徴解析するため、好中球上のCXCR2に結合する能力を抗凝固処理したヒト血液で試験した。結合は蛍光色素APCに直接コンジュゲートしたBKO-4A8-101cを用いて測定した。APCにコンジュゲートしたアイソタイプを合致させた対照抗体を比較のために含めた。細胞をリニエージ特異的抗体及び2μg/mLのAPCコンジュゲート抗CXCR2抗体又はアイソタイプ対照とともにインキュベートした。細胞表面上の蛍光のレベルをフローサイトメトリーによって測定した。光散乱特性及びZombie Violet定着性生存染料(BioLegend社、423113)に基づいて、細胞デブリ及び非生存細胞を除外した。造血細胞サブセットは、以下の表現型マーカー、即ちTリンパ球=CD3、Bリンパ球=CD20、単球=CD14、及びナチュラルキラーリンパ球=CD56(又はCD3- CD20- CD16+リンパ球)の発現と関連付けたCD45の発現、並びに特徴的な寸法(前方散乱、FSC)及び粒度(側方散乱、SSC)に基づいて同定した。顆粒球は寸法及び粒度、並びにリニエージ特異的マーカー、即ちCD3、CD19、CD20、CD56、及びCD14の結合が存在しないことによって同定した。好中球はCD16及びCD177の高レベルの発現によって更に識別され、一方、好酸球はSiglec-8の発現に基づいて同定した。この方法を用いて、BKO-4A8-101cはヒト血液からの好中球(図12A)及び単球(図12B)に結合した。実験において市販の抗CXCR2抗体(BioLegend社  5E8/CXCR2)を陽性対照として用いた。
【０１６５】
(実施例9)
コンパレーター抗体及び小分子と比較した精製抗体のアゴニスト誘起CXCR2介在機能性応答を阻害する能力
コンパレーター試薬と比較したリガンド介在β-アレスチン動員のBKO-4A8-101cによる阻害の特徴解析
計算したEC50値でヒトリガンドCXCL1、CXCL5、及びCXCL8を用いるTango(商標)CXCR2  β-アレスチン動員アッセイ(Thermo社)によって、BKO-4A8-101cがリガンド活性化CXCR2シグナル伝達をブロックする能力を、コンパレーター抗体及び小分子と比較した(「一般的方法」を参照)。
【０１６６】
BKO-4A8-101cは、既知のCXCR2リガンドのパネルによって誘発されたCXCR2介在β-アレスチン機能活性を様々なリガンドについて同程度のIC50値で阻害した。Table 17(表17)に示すように、抗体はCXCR2依存性β-アレスチン動員のリガンド選択的阻害を示し、CXCL1及びCXCL5に誘起されたβ-アレスチン動員は完全に阻害、CXCL8に誘起されたβ-アレスチン動員は部分的に阻害(70〜80%の範囲)した。
【０１６７】
CXCL1及びCXCL5介在β-アレスチンシグナル伝達を阻害するBKO-4A8-101cの効力は、他のコンパレーター抗体及び小分子について観察されたものと同様又はそれより高かった。IC50値に基づいて、BKO-4A8-101cは、CXCL1又はCXCL5リガンド介在β-アレスチン活性化の阻害においてはコンパレーターCXCR2アンタゴニスト抗体又は小分子より2倍〜39倍効力が高いことが示されたが、CXCR2のCXCL8誘起活性化については不完全な阻害剤であった。CXCL8介在β-アレスチンレポーター活性の阻害が不完全であることは、β-アレスチンが介在する受容体内在化経路が有効であることを示す。
【０１６８】
【表１７】
2021532789.tif 000034
【０１６９】
カルシウム可動化のBKO-4A8-101cによる阻害の特徴解析
CXCL1及びCXCL8によって誘起されたカルシウム可動化のCXCR2による活性化を阻害するアンタゴニストの能力を、市販のHTS002C-CHEMISCREEN(商標)ヒトCXCR2ケモカイン受容体カルシウム最適化安定細胞株(Eurofins Pharma Discovery Services社)で評価した。アンタゴニストアッセイのため、CXCリガンドをそのアッセイEC50濃度(Table 3(表3)参照)で準備した。カルシウム可動化の細胞内測定のため、Fluo-4 NWカルシウムアッセイキット(Life Technologies社)をメーカーのプロトコールに従って用いた。測定はFLIPR Tetraハイスループット細胞スクリーニングシステム(Molecular Devices社)を用いて読み取った。それぞれのウェルからのベース応答を引いたピーク応答を用いて、4パラメーターロジスティック式に合致する阻害用量応答曲線及びIC50値を決定した。
【０１７０】
リガンド誘起カルシウムフラックスをブロックするBKO-4A8-101cの能力を、計算したEC50値においてヒトリガンドCXCL1及びCXCL8を用いてコンパレーター抗体及び小分子と比較した(Table 18(表18))。少なくとも3回の独立した多重測定からのIC50値をTable 18(表18)に示す。BKO-4A8-101cはコンパレーター抗体及び小分子と等価又はそれより強力なCXCL1アンタゴニストであり、ヒトCXCL1によって誘起されたカルシウムフラックスを強力に阻害した。対照的に、BKO-4A8-101c及びその他のコンパレーター抗体はCXCL8によって誘起されたカルシウムフラックスを実質的に阻害せず、一方、コンパレーター小分子CXCR2アンタゴニストはこのアッセイにおいてCXCL8誘起カルシウムフラックスを完全に阻害できることが証明された。CXCR2が介在する好中球の走化性応答はカルシウムの可動化に依存する。提案したいずれの作用機序にも縛られることを望まないが、BKO-4A8-101cで観察された選択的アンタゴニスト活性は、CXCL8が介在する骨髄からの遊走に実質的に影響せずに、CXCL1及びCXCL5が介在する組織への好中球の遊走を実質的に完全に阻害することを可能にする治療ウィンドウを提供する。このリガンド選択性は、好中球の走化性応答を駆動するケモカインの勾配にも影響し得る。
【０１７１】
【表１８】
2021532789.tif 000035
【０１７２】
(実施例10)
重症喘息のマウスモデルにおける肺好中球増加症の抗CXCR2介在阻害
鼻内ハウスダストマイト抽出物(HDM)でチャレンジした感作マウスでは、肺好酸球増加症と杯細胞過形成に関連する好中球増加症とが混合した炎症プロファイルが進行する。好中球性炎症のマウスモデル(CHAPMAN, R. W.ら、「A novel, orally active CXCR1/2 receptor antagonist, Sch527123, inhibits neutrophil recruitment, mucus production, and goblet cell hyperplasia in animal models of pulmonary inflammation.」、J Pharmacol Exp Ther, (2007) 322, 486〜93頁で考察)で作動することが公知の小分子CXCR2アンタゴニストであるSCH527123を10及び30mg/kgの用量で用いる重症喘息モデルが既に報告されている(YOUNG, A.ら、「The Effect of the CXCR1/2 Antagonist SCH257123 in a Mouse Model of Severe Asthma.」、Experimental Biology 2016 Meeting, 2016年、San Diego, USA: The FASEB Journal, 1202.10で考察)。10及び30mg/kgのSCH527123による前処置は、BAL中で好中球細胞の数を最大で30%阻害するのみで、これはハウスダストマイト(HDM)-ビヒクル処置群と比較して有意差がなかった(Youngら、上記で考察)。
【０１７３】
エフェクター機能を低減させたマウスIgG1定常領域にBKO-4A8の可変重鎖及び軽鎖をフォーマットすることによって、抗CXCR2抗体BKO-4A8-mIgG1(配列番号113及び114)を産生させた。雌hCXCR2ノックインマウスを、完全フロイントアジュバント(CFA)中50μgのHDMを0日目に皮下注射することによって感作に供し、また14日目にCFAなしの50mgのHDMで鼻内チャレンジした。5日目及び12日目に腹腔内注射によって動物をビヒクル又はBKO-4A8-mIgG1(10mg/kg)で処置した。炎症性応答は16日目に右肺の気管支肺胞洗浄(BAL)液における細胞の全数及び差数によってエンドポイントで特徴解析した。左肺は組織病理及び粘液生成評価のために10%ホルマリンで固定した。
【０１７４】
図13A、図13B、及び図13Cに示すように、HDMチャレンジの前に抗CXCR2抗体BKO-4A8-mIgG1で処置することによって、ビヒクル処置対照群と比較して、BALの好酸球数(p=0.017)及び好中球数(p=0.028)の有意(>60%)の低減、及び杯細胞過形成の低減(p=0.0052)を含む疾患重症度の低減がもたらされた。統計的評価はMann-Whitney非パラメトリックアンペアードt検定を用いて実施し、ビヒクル群と処置群との統計的有意差を識別するため、Grubbs検定(アルファ=0.01)を用いて異常値を同定した。全ての統計解析はGraphPad Prism(商標)7.01を用いて実施した。
【０１７５】
本モデルにおけるBAL好酸球数の低減は驚くべきことである。好酸球の遊走を抑制するBKO-4A8-mIgG1の能力は、好中球性病態に加えて好酸球性喘息等の好酸球増加症の疾患の治療におけるその有用性を支持するものである。
【０１７６】
(実施例11)
カニクイザルにおけるLPS誘起急性肺炎症
生物製剤にナイーブな(即ち、以前に外因性生物製剤を投与されていない)雄カニクイザルを、0日目、14日目、及び28日目にビヒクル又は1mg/kgの用量で静脈内投与によって投与される抗CXCR2抗体BKO-4A8-101cを受ける群にランダマイズした。0日目に試験抗体で処置した1時間後に、動物をエアロゾル化した細菌性リポ多糖(LPS)20μg/Lに5分間吸入させることによって曝露した(全用量20μg/kg)。これは急性肺炎症のよく確立されたモデルである。炎症性応答は、LPS曝露の24時間後に左肺の気管支肺胞洗浄液における細胞の全数及び差数によって特徴解析し、処置前14日目のナイーブな動物からの一致させた数と比較した。細胞の差数のカウントのために種々の時点で血液を採取し、薬物動態解析のために血清を採取した。
【０１７７】
ビヒクル処置動物において単回のエアロゾルLPS処置は肺への好中球の流入を誘起した。図14Aに図示するように、1mg/kgの抗CXCR2抗体BKO-4A8-101cによる前処置は、カニクイザルにおけるLPS誘起肺好中球増加症を顕著に阻害した。処置は体重損失なしによく忍容された。図14Bに図示するように、BKO-4A8-101cによる処置は、繰り返し抗体投薬の後でも、血中好中球数の測定可能な変化を誘起しなかった。
【０１７８】
CXCR2シグナル伝達は、ストレス、傷害、又は感染に引き続いて組織内細胞によって生成されるケモカインに応答する骨髄から及び末梢組織への好中球の移動に関与する。CXCR2は、好中球の動員及び慢性炎症に関連すると考えられるCXCL1、CXCL5、及びCXCL8等の多数のケモカインに結合する。これらのケモカインは、重症好中球性喘息及びCOPDを有する患者でも上昇している。本明細書においてBKO-4A8-101cは、CXCR2介在シグナル伝達の強力かつ特異的なアンタゴニストであることが示された。提案したいずれの作用機序にも限定されることを望まないが、そのin vitroプロファイル及びカニクイザルにおけるその効力に基づいて、BKO-4A8-101cの抗炎症活性は、CXCL1及びCXCL5介在CXCR2シグナル伝達のアンタゴニズムを介するようである。これらのデータは、CXCR2受容体が炎症性病態における肺への好中球の遊走を制御する主要なケモカイン受容体であるという概念を支持しており、CXCR1/CXCR2炎症軸を部分的にのみ阻害するアプローチであるCOPD患者に投与されたヒト化中和性抗CXCL8抗体に顕著な有効性がないこと(MAHLER, D. A.ら、「Efficacy and safety of a monoclonal antibody recognizing interleukin-8 in COPD: a pilot study.」、Chest, (2004) 126, 926〜34頁で考察)と合致している。BKO-4A8-101cの抗炎症活性の成分は、内皮細胞及び上皮細胞に介在されているであろう。それは、これらの細胞型におけるCXCR2の発現が好中球の動員及び肺の傷害に関連すると考えられるからである(REUTERSHAN, J.ら、「Critical role of endothelial CXCR2 in LPS-induced neutrophil migration into the lung.」、J Clin Invest, (2006) 116, 695〜702頁で考察)。循環好中球数又は他のいずれの測定された安全性パラメーターに影響することなしに、LPSチャレンジに応答して肺の好中球の遊走を阻害するBKO-4A8-101cの実証されたin vivoでの有効性は、その優れた特異性及び選択的アンタゴニスト活性の結果であろう。
【０１７９】
(実施例12)
抗CXCR2抗体はCXCR2受容体を効率的に占拠し、CXCR2介在好中球応答を選択的に抑制する。
受容体占拠アッセイは、特定の細胞上で発現された受容体に対する特定の分子又は薬物の結合を測定するものである。これは、受容体の結合及びその他の薬物動態特徴を評価するために用いることができる定量的アッセイである。
【０１８０】
ヒトCXCR2発現細胞株及び全血から富化したヒト好中球において受容体占拠を検討した。CXCR2受容体の少なくとも85%が2μg/mLの抗体によって占拠された。この量は、HTS002C-CHEMISCREEN(商標)ヒトCXCR2ケモカイン受容体カルシウム最適化細胞-において、CXCL1誘起カルシウムフラックスを、85%を超えて抑制するために十分であった(結果は示されない)。
【０１８１】
CXCR2介在シグナル伝達に効果的に拮抗するために2μg/mLの抗体で十分であったが、これは好中球の機能を妨害しなかった。最終目標の化学誘引物質であるC5a及びfMLFはそれぞれ、C5a受容体(CD88)及びFPR1に結合する。これらの薬剤はいずれも、走化並びに、感染及び炎症に応答する好中球の活性化の広く許容されたマーカーであるCD11bの発現を誘起する。CXCR2抗体は、C5a及びfMLFに応答する好中球CD11bの上方制御又は走化を抑制しなかった(結果は示されない)。
【０１８２】
10μg/ml(70nM)のCXCR2抗体は、全血から分離した(95%まで)ヒト好中球において、CXCL1(p<0.0002、図15A)及びCXCL5(p<0.0001、図15B)に対するCXCR2介在応答に強力かつ特異的に拮抗した。70nMのCXCR2抗体は、このアッセイにおいて1400nMで用いた小分子アンタゴニスト5(ダニリキシン)より大きな効力を示した。これは、アゴニスト5がCD11bのCXCL1誘起ex vivo好中球表面発現を69ng/mL[156nM]のIC50及び620ng/mL(範囲158〜1080ng/ml)[1400nM(範囲356〜2443nM)]のIC90で阻害した以前の報告(Millerら、「The pharmacokinetics and pharmacodynamics of danirixin (GSK1325756)-a selective CXCR2 antagonist-in healthy adult subjects」、BMC Pharmacology and Toxicology 2015; 16頁)と比較される。
【０１８３】
このアッセイにおいて、CXCR2とアンタゴニスト5のいずれも、CXCL8への好中球の応答に顕著に影響しなかった(図15C)。CXCL8はCXCR1とCXCR2の両方に結合する。
【０１８４】
これらのデータは、CXCR2抗体がヒト好中球上のCXCR2の強力かつ選択的な阻害剤であることを実証する。
【０１８５】
当業者には、本発明の好ましい実施形態に対して多数の変更及び修飾を行なうことができ、そのような変更及び修飾は本発明の精神を逸脱することなく行なうことができることが認識される。したがって、添付した特許請求の範囲は、本発明の真の精神及び範囲に含まれる全てのそのような等価の変形を包含することが意図される。
【０１８６】
本明細書に引用又は記載されるそれぞれの特許、特許出願、及び出版物の開示は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１８７】
実施形態
以下の実施形態のリストは、これまでの記載を置き換え又は取り替えるよりも、むしろ補完することを意図する。
実施形態1.
ヒトCXCR2に免疫特異的に結合するヒト抗体分子であって、
配列番号167の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに配列番号168の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、又は
配列番号226の重鎖CDR1、CDR2、及びCDR3、並びに配列番号227の軽鎖CDR1、CDR2、及びCDR3
を含み、
CXCR2のCXCL1誘起活性化又はCXCR2のCXCL5誘起活性化を阻害する、ヒト抗体分子。
実施形態2.
重鎖CDR1が配列番号169のアミノ酸配列を含み、重鎖CDR2が配列番号170のアミノ酸配列を含み、重鎖CDR3が配列番号171のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR1が配列番号172のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR2が配列番号173のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR3が配列番号174のアミノ酸配列を含むか、又は
重鎖CDR1が配列番号228のアミノ酸配列を含み、重鎖CDR2が配列番号229のアミノ酸配列を含み、重鎖CDR3が配列番号230のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR1が配列番号201のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR2が配列番号231のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR3が配列番号232のアミノ酸配列を含む、
実施形態1に記載のヒト抗体分子。
実施形態3.
重鎖可変領域が配列番号167のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号168のアミノ酸配列を含むか、又は
重鎖可変領域が配列番号226のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号227のアミノ酸配列を含む、
実施形態1又は2に記載のヒト抗体分子。
実施形態4.
a)重鎖可変領域が配列番号98のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
b)重鎖可変領域が配列番号99のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
c)重鎖可変領域が配列番号100のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
d)重鎖可変領域が配列番号101のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
e)重鎖可変領域が配列番号102のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
f)重鎖可変領域が配列番号103のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
g)重鎖可変領域が配列番号104のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
h)重鎖可変領域が配列番号105のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
i)重鎖可変領域が配列番号106のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
j)重鎖可変領域が配列番号107のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
k)重鎖可変領域が配列番号108のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
l)重鎖可変領域が配列番号162のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
m)重鎖可変領域が配列番号163のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
n)重鎖可変領域が配列番号164のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;
o)重鎖可変領域が配列番号165のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含むか;又は
p)重鎖可変領域が配列番号166のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号109若しくは110のアミノ酸配列を含む、実施形態3に記載のヒト抗体分子。
実施形態5.
a)重鎖可変領域が配列番号108のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含むか;
b)重鎖可変領域が配列番号162のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含むか;
c)重鎖可変領域が配列番号163のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含むか;
d)重鎖可変領域が配列番号164のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含むか;
e)重鎖可変領域が配列番号165のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含むか;又は
f)重鎖可変領域が配列番号166のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含む、実施形態4に記載のヒト抗体分子。
実施形態6.
重鎖CDR1が配列番号182のアミノ酸配列を含み、重鎖CDR2が配列番号192のアミノ酸配列を含み、重鎖CDR3が配列番号195のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR1が配列番号201のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR2が配列番号205のアミノ酸配列を含み、軽鎖CDR3が配列番号213のアミノ酸配列を含む、
実施形態1又は2に記載のヒト抗体分子。
実施形態7.
重鎖可変領域が配列番号108のアミノ酸配列を含み、軽鎖可変領域が配列番号110のアミノ酸配列を含む、実施形態1から6のいずれか一項に記載のヒト抗体分子。
実施形態8.
ヒトIgG1重鎖定常領域を含む、実施形態1から7のいずれか一項に記載のヒト抗体分子。
実施形態9.
ヒトIgG1重鎖定常領域が配列番号122又は124のアミノ酸配列を含む、実施形態8に記載のヒト抗体分子。
実施形態10.
ヒトIgG2重鎖定常領域を含む、実施形態1から7のいずれか一項に記載のヒト抗体分子。
実施形態11.
ヒトIgG2重鎖定常領域が配列番号120のアミノ酸配列を含む、実施形態10に記載のヒト抗体分子。
実施形態12.
ヒトIgG4重鎖定常領域を含む、実施形態1から7のいずれか一項に記載のヒト抗体分子。
実施形態13.
Fab断片、F(ab)2断片、又は一本鎖抗体である、実施形態1から12のいずれか一項に記載のヒト抗体分子。
実施形態14.
実施形態1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子を含む医薬組成物。
実施形態15.
実施形態1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子をコードする核酸分子。
実施形態16.
実施形態15に記載の核酸分子を含むベクター。
実施形態17.
実施形態1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子を発現するように形質転換された細胞。
実施形態18.
対象における気道好中球増加症又は急性肺炎症を治療又は防止する方法であって、
気道好中球増加症又は急性肺炎症を防止又は治療するための治療有効量の実施形態1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子又は実施形態14に記載の医薬組成物を対象に投与する工程
を含む方法。
実施形態19.
気道好中球増加症若しくは急性肺炎症又はその両方が、慢性閉塞性肺疾患、重症好中球性喘息又はその両方である、実施形態18に記載の方法。
実施形態20.
医薬としての使用のための、実施形態1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子又は実施形態14に記載の医薬組成物。
実施形態21.
気道好中球増加症又は急性肺炎症の防止又は治療における使用のための、実施形態1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子又は実施形態14に記載の医薬組成物。
実施形態22.
気道好中球増加症又は急性肺炎症の防止又は治療のための医薬の調製における、実施形態1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体分子又は実施形態14に記載の医薬組成物の使用。
実施形態23.
気道好中球増加症、急性肺炎症、又はその両方が、慢性閉塞性肺疾患、重症好中球性喘息、又はその両方である、実施形態21又は22に記載の使用。
実施形態24.
好中球の走化をブロックする方法であって、好中球を、実施形態1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体に曝露する工程を含む、方法。
実施形態25.
走化が、肺への好中球の遊走である、実施形態24に記載の方法。
実施形態26.
CXCR2シグナル伝達を発現する細胞におけるCXCR1及び/又はCXCR5に応答するCXCR2シグナル伝達をブロックする方法であって、細胞を、実施形態1から13のいずれか一項に記載のヒト抗体に曝露する工程を含む、方法。
【０１８８】
【表１９Ａ】
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【０１８９】
【表１９Ｂ】
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【０１９０】
【表１９Ｃ】
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【０１９１】
【表１９Ｄ】
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【０１９２】
【表１９Ｅ】
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【０１９３】
【表１９Ｆ】
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【０１９４】
【表１９Ｇ】
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【０１９５】
【表１９Ｈ】
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【０１９６】
【表１９Ｉ】
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【０１９７】
【表１９Ｊ】
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【０１９８】
【表１９Ｋ】
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【０１９９】
【表１９Ｌ】
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【０２００】
【表１９Ｍ】
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【０２０１】
【表１９Ｎ】
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【０２０２】
【表１９Ｏ】
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【０２０３】
【表１９Ｐ】
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【０２０４】
【表１９Ｑ】
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【０２０５】
【表１９Ｒ】
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【０２０６】
【表１９Ｓ】
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【０２０７】
【表１９Ｔ】
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【０２０８】
【表１９Ｕ】
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【０２０９】
【表１９Ｖ】
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【０２１０】
【表１９Ｗ】
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【０２１１】
【表１９Ｘ】
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【０２１２】
【表１９Ｙ】
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【０２１３】
【表１９Ｚ】
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【０２１４】
【表１９ａ】
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【０２１５】
【表１９ｂ】
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【０２１６】
【表１９ｃ】
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【０２１７】
【表１９ｄ】
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【０２１８】
【表１９ｅ】
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【０２１９】
【表１９ｆ】
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【０２２０】
【表１９ｇ】
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【０２２１】
【表１９ｈ】
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【０２２２】
【表１９ｉ】
2021532789.tif 000070
【図１Ａ】
2021532789.tif 000071
【図１Ｂ】
2021532789.tif 000072
【図２】
2021532789.tif 000073
【図３】
2021532789.tif 000074
【図４Ａ−１】
2021532789.tif 000075
【図４Ａ−２】
2021532789.tif 000076
【図４Ｂ−１】
2021532789.tif 000077
【図４Ｂ−２】
2021532789.tif 000078
【図５Ａ−１】
2021532789.tif 000079
【図５Ａ−２】
2021532789.tif 000080
【図５Ｂ−１】
2021532789.tif 000081
【図５Ｂ−２】
2021532789.tif 000082
【図６Ａ】
2021532789.tif 000083
【図６Ｂ】
2021532789.tif 000084
【図７】
2021532789.tif 000085
【図８】
2021532789.tif 000086
【図９】
2021532789.tif 000087
【図１０】
2021532789.tif 000088
【図１１】
2021532789.tif 000089
【図１２】
2021532789.tif 000090
【図１３Ａ】
2021532789.tif 000091
【図１３Ｂ】
2021532789.tif 000092
【図１３Ｃ】
2021532789.tif 000093
【図１４Ａ】
2021532789.tif 000094
【図１４Ｂ】
2021532789.tif 000095
【図１５Ａ】
2021532789.tif 000096
【図１５Ｂ】
2021532789.tif 000097
【図１５Ｃ】
2021532789.tif 000098
【配列表】
2021532789000001.app
【国際調査報告】
2021532789.tif 000099
2021532789.tif 000100
2021532789.tif 000101
2021532789.tif 000102
2021532789.tif 000103
2021532789.tif 000104
2021532789.tif 000105