(57)【要約】本発明は、健常対象の消化管の健康を促進するためのコリオバクテリウム綱（Coriobacteriia）の微生物の使用に関する。ケノデオキシコール酸（CDCA）の産生のための方法およびリトコール酸（LCA）の産生のための方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
健常対象の消化管の健康を促進するためのコリオバクテリウム綱（Coriobacteriia）の微生物の使用。
【請求項２】
微生物が、組成物内に、好ましくは食品組成物および／または飼料組成物内に提供される、請求項1記載の使用。
【請求項３】
微生物が、1日超、2日超、3日超、4日超、5日超、6日超、7日超、8日超、9日超、10日超、11日超、12日超、13日超、14日超、15日超、16日超、17日超、18日超、19日超、20日超、21日超、22日超、23日超、24日超、25日超、26日超、27日超、28日超、29日超、30日超、31日超、32日超、33日超、34日超、35日超、36日超、37日超、38日超、39日超、40日超、41日超、42日超、43日超、44日超、45日超、46日超、47日超、48日超、49日超、50日超、60日超、70日超、またはそれより多い日数にわたり提供され、好ましくは該微生物が42日間または44日間提供される、請求項1または2記載の使用。
【請求項４】
微生物が、組成物1kgあたり0.25*109コロニー形成単位（CFU）、0.5*109CFU、0.75*109CFU、1.0*109CFU、1.25*109CFU、1.5*109CFU、1.75*109CFU、2.0*109CFU、2.25*109CFU、2.5*109CFU、2.75*109CFU、3.0*109CFU、3.25*109CFU、3.5*109CFU、3.75*109CFU、1.0*109CFU、1.25*109CFU、1.5*109CFU、1.75*109CFU、4.0*109CFU、またはそれより多いCFUの用量で提供され、好ましくは該微生物が組成物1kgあたり少なくとも2.2*109コロニー形成単位の用量で提供される、前記請求項のいずれか一項記載の使用。
【請求項５】
微生物が、エガセラ目（Eggerthellales）の微生物である、前記請求項のいずれか一項記載の使用。
【請求項６】
微生物が、エガセラ科（Eggerthellaceae）の微生物である、前記請求項のいずれか一項記載の使用。
【請求項７】
微生物が、DSM11798株の微生物である、前記請求項のいずれか一項記載の使用。
【請求項８】
微生物が、グリコケノデオキシコール酸（G-CDCA）をケノデオキシコール酸（CDCA）に変換する、前記請求項のいずれか一項記載の使用。
【請求項９】
微生物が、対象において胆汁酸のグリコリトコール酸（GLCA）および／またはタウロリトコール酸（TLCA）を増加させる、前記請求項のいずれか一項記載の使用。
【請求項１０】
消化管の健康を促進することが、腸の完全性を促進することを含む、前記請求項のいずれか一項記載の使用。
【請求項１１】
対象にラクツロースおよびラムノースを与えてから6時間後の尿中ラクツロース／ラムノース比が、ラクツロースおよびラムノースを与えた時点での尿中ラクツロース／ラムノース比よりも低い場合に、腸の完全性が促進されている、前記請求項のいずれか一項記載の使用。
【請求項１２】
健常対象が、疾患も障害も患っていない対象である、前記請求項のいずれか一項記載の使用。
【請求項１３】
健常対象が、該対象から得られた血漿試料中で測定されたある濃度の胆汁酸を有し、胆汁酸の該濃度が、対照試料中に存在する胆汁酸の濃度と同等である、前記請求項のいずれか一項記載の使用。
【請求項１４】
ケノデオキシコール酸（CDCA）の産生のための方法であって、
（a）コリオバクテリウム綱の微生物をグリコケノデオキシコール酸（G-CDCA）と接触させる工程
を含み、それによってケノデオキシコール酸が得られる、方法。
【請求項１５】
（a）前記請求項のいずれか一項記載の微生物、および
（b）プレバイオティクス、および／または
（c）プロバイオティクス
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の技術分野
本発明は、健常対象の消化管の健康を促進するためのコリオバクテリウム綱（Coriobacteriia）の微生物の使用に関する。ケノデオキシコール酸（CDCA）の産生のための方法およびリトコール酸（LCA）の産生のための方法も提供する。
【背景技術】
【０００２】
説明
一般的な生物医学の文献では、胆汁酸または胆汁酸塩は24個の炭素原子を有し、これは、25〜27個の炭素原子を有し原始的な脊椎動物（例えばシーラカンスおよびサメ）ならびにより原始的でない脊椎動物（例えば爬虫類および両生類）の胆汁酸プールに存在する「原始的な」胆汁酸（C27、C26、C25胆汁酸）に対置されて、C24胆汁酸と略記される。高等脊椎動物では、C24胆汁酸は胆汁の大部分を占めている（Hofmann et al. (1992) 「A proposed nomenclature for bile acids」 Lipid Res. 1992 Apr; 33(4):599-604（非特許文献1））。肝臓は、コレステロールを消費して胆汁酸を合成し、また、再吸収された胆汁酸を血液から回収する。それらは、肝細胞から、コレステロールおよびリン脂質とともに、急な濃度勾配に逆らって胆汁内へ分泌される。したがって、食間には、胆汁酸のプールのほとんどが、すぐに使用できる準備のできた状態で胆嚢内に存在している。
【０００３】
一次胆汁酸とは、このように肝臓によって合成されたものであり、主としてコール酸（CA）およびケノデオキシコール酸（CDCA）を含む。これらは主にグリシンおよびタウリンと抱合されて胆汁に分泌され、それゆえ、増大した水溶性を有する。胆汁酸は、腸内に放出されると、食事脂肪および脂溶性ビタミンの吸収を促進する。
【０００４】
二次胆汁酸は、腸内細菌が行う修飾によって一次胆汁酸から誘導される。主な修飾は脱抱合、3位、7位および12位でのヒドロキシル基の酸化、ならびに7-脱ヒドロキシル化である。主な二次胆汁酸はリトコール酸（LCA）およびデオキシコール酸（DCA）である。
【０００５】
しかしながら、胆汁酸は消化に関与するだけでなく、健康および疾患に対する作用も有する。加えて、それらはシグナル伝達分子として機能する。例えば、胆汁酸は、多因子の一つとして消化管微生物叢の構成に影響を与えることができ、または抗菌活性を発揮することができる（Boesjes and Brufau (2014) 「Metabolic effects of bile acids in the gut in health and disease」 Current Medicinal Chemistry, 21, 2822-2829（非特許文献2））。
【０００６】
特に胆汁酸は、早期離乳子ブタの消化管の完全性および働きに対する作用を媒介する。入手可能なエビデンスでは、腸の萎縮および機能不全の実験モデルにおいて、胆汁酸により制御される腸のシグナル伝達経路を活性化することが内在性GLP-2の放出を刺激するのを可能にし、それによって消化管の完全性を改善することが示されている（de Diego-Cabero et al. (2015) 「Bile acid mediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets.」 BMC veterinary research 11:111（非特許文献3））。
【０００７】
この文脈において、腸管バリアおよび消化管の健康は、概して、腸管腔から体内へ移動し得る病原体の量を決定し、これが後に疾患に対する感受性を高める、ということに留意されたい。加えて、腸管上皮がより良好に機能すればするほど、より多くの栄養分が吸収され、これが次いで動物の成長能力を決定する。それゆえ、腸管バリアの健康は動物の繁栄に重大な影響を及ぼす。
【０００８】
基本的に、例えば離乳期の子ブタの腸管バリアを強化するための、3つの異なる戦略を特徴付けることができる：
1）  飼料摂取量を増やすための飼料の嗜好性の改善；
2）  腸管バリアの損傷によって生じる損失を補うための必須栄養分の追加；
3）  腸管バリアを強化する生物学的活性物質の追加。
【０００９】
上記の問題および欠点に対処するために、一方では離乳したばかりの子ブタにおいて効果的であり他方では実際的な条件の下で簡単に適用可能である給餌構想を、作り出す必要があった。
【００１０】
さらに、当技術分野においては、健常対象における消化管の健康を促進する方法／使用を開発する必要があった。
【００１１】
本発明の解決策は以下に記載され、実施例に例示され、添付の図面に示され、かつ、添付の特許請求の範囲に反映される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Hofmann et al. (1992) 「A proposed nomenclature for bile acids」 Lipid Res. 1992 Apr; 33(4):599-604
【非特許文献２】BoesjesおよびBrufau (2014) 「Metabolic effects of bile acids in the gut in health and disease」 Current Medicinal Chemistry, 21, 2822-2829
【非特許文献３】de Diego-Cabero et al. (2015) 「Bile acid mediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets.」 BMC veterinary research 11:111
【発明の概要】
【００１３】
本発明は、健常対象の消化管の健康を促進するためのコリオバクテリウム綱の微生物の使用に関する。
【００１４】
加えて、本発明は、ケノデオキシコール酸（CDCA）の産生のための方法に関し、該方法は、
a）コリオバクテリウム綱の微生物をグリコケノデオキシコール酸（G-CDCA）と接触させる工程
を含み、それによってケノデオキシコール酸が得られる。
【００１５】
また、リトコール酸（LCA）の産生のための方法も提供し、該方法は、
a）コリオバクテリウム綱の微生物をケノデオキシコール酸（CDCA）と接触させる工程
を含み、それによってリトコール酸が得られる。
【００１６】
本発明はまた、
a）コリオバクテリウム綱の微生物を健常対象と接触させる工程
を含む、健常対象の消化管の健康を促進するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
添付の図面は以下を示す。
【００１８】
【図１】インビトロの実験で得られた結果。
【図２】離乳子ブタにおける胆汁酸の血漿濃度（平均±標準偏差、42日目）に対するBBSH 797の効果。動物（n＝8）に、離乳飼料（A群）またはBBSH 797を追加した離乳飼料（2.2*109コロニー形成単位/kg飼料、B群）のいずれかを42日間与えた。2群間の統計的有意差（p＜0.05）を上付き文字（a、b）で表示している。
【図３】糖溶液の投与（500mgラクトース/kg体重、100mgラムノース/kg体重、43日目）から6時間後の離乳子ブタの尿中のラクツロース／ラムノース比に対するBBSH 797の影響。動物（n＝8）に、離乳飼料（A群）またはBBSH 797を追加した離乳飼料（2.2*109コロニー形成単位/kg飼料、B群）のいずれかを44日間与えた。2群間の統計的有意差（p＜0.05）を上付き文字（*）で表示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
驚くべきことに、コリオバクテリウム綱のある微生物、すなわちDSM 11798株が、対象の消化管の健康を促進することが見出された。本発明者らは、対象の腸管バリアを強化する給餌戦略を発見した。これは、細菌BBSH 797（エガセラ科（Eggerthellaceae）の新属（genus novus））、株番号11798（DSM 11798）を対象の飼料に追加することによって達成される。
【００２０】
BBSH 797の飼料への追加は、離乳したばかりの子ブタにおいて胆汁酸グリコリトコール酸およびタウロリトコール酸の有意な増加を導く。これらの胆汁酸はメッセンジャーとして作用し、離乳子ブタにおける消化管の完全性の有意な改善へと最終的に導く分子カスケードを開始させる。より正確には、BBSH 797の補充は、離乳子ブタの血漿中のグリコリトコール酸およびタウロリトコール酸の明確な上昇をもたらす。これらの物質はTGR5受容体において強い天然アゴニストとして作用するため、このことは生物学的に妥当である（Schaap et al. (2014) 「Bile acid receptors as targets for drug development」 Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology 11(1):55-67；Kawamata et al. (2003) 「A G protein-coupled receptor responsive to bile acids*」 vol. 278, no. 11, pp. 9435-9440）。これらの受容体は、特定の腸管上皮細胞（L細胞）の細胞膜中に位置する。これらの受容体は、活性化するとカスケードを誘発し、これが、グルカゴン様ペプチド2（GLP-2）というペプチドの放出へと最終的に導く。
【００２１】
注目すべきことに、外来性GLP-2は、粘膜の成長、経細胞輸送、および、傍細胞透過性を制御するタイトジャンクション構成タンパク質の発現を回復させることができる。さらに、GPL-2の慢性投与は、小腸および結腸において絨毛の高さおよび陰窩の深さを増加させることができる。また、GPL-2の長時間作用性類似体の投与は腸の重量および酵素の活性を増加させることができることも示されている。GPL-2のこれらのプラスの効果のいくつかは早期離乳動物において得られた（de Diego-Cabero et al. (2015) 「Bile acid mediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets.」 BMC veterinary research 11:111）。同様に、Connor et al. (2016)は、GPL-2が種々の腸管反応を開始させ、これが消化管の健康の向上を導き、最も注目すべきことに消化管バリアを強化することを見出した（Connor et al. (2016) 「Glucagon-like peptide 2 and its benefcial effects on gut function and health in production animals」 Domestic Animal Endocrinology 56, S56-S65）。
【００２２】
本発明者らが行ったさらなる実験によって、グリコリトコール酸およびタウロリトコール酸の胆汁酸濃度の上昇ならびに／またはBBSH 797の投与と腸管バリアの改善との間に相関関係があることが示された。腸管バリアの完全性は二重糖アッセイ（dual-sugar assay）を使用して評価した。この試験の原理は、ラクツロースおよびラムノースの同時投与に基づく。二糖であるラクツロースは、個々の腸管上皮細胞間の狭い間隙を通って傍細胞的にのみ、血流に入る。一方、単糖であるラムノースは、傍細胞的に、および腸管細胞を通って経細胞的に、体内に輸送される。腸管バリアが弱まると、間質腔が次第に多孔質になり、その結果として、比べるとより大量の二糖が吸収される。従って、尿中ラクツロース／ラムノース比が上昇する。無傷のまたは強化された腸管バリアは、低下した尿中ラクツロース／ラムノース比と関連付けられる（Wijtten et al., (2011) 「Intestinal barrier function and absorption in pigs after weaning: a review.」 Br J Nutr 105:967-981）。本出願の実施例は、BBSH 797の数週間の投与が尿中ラクツロース／ラムノース比の有意な低下をもたらしたことを示す。これは、BBSH 797を適用すると腸の完全性が強化されることを試験している。したがって、BBSH 797によって消化管の健康が促進される。
【００２３】
加えて、驚くべきことに、BBSH 797はグリコケノデオキシコール酸をケノデオキシコール酸に変換する能力を有することが、インビトロの実験において見出された。文献によると、後者はGLP-2の放出を導くことができる。de Diego-Caberoにおいて説明されているように、GLP-2の増加は腸の完全性の改善をもたらす（de Diego-Cabero et al. (2015) 「Bile acid mediated effects on gut integrity and performance of early-weaned piglets.」 BMC veterinary research 11:111）。
【００２４】
このように、本発明は、健常対象の消化管の健康を促進するためのコリオバクテリウム綱の微生物の使用に関する。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「コリオバクテリウム綱の微生物」とは、コリオバクテリウム綱の任意の微生物であり得る。本明細書に記載のコリオバクテリウム綱の分類学的な分類は、Gupta et al. (2013) 「Molecular signatures for the class Coriobacteriia and its different clades; proposal for division of the class Coriobacteriia into the emended order Coriobacteriales, containing the emended family Coriobacteriaceae and Atopobiaceae fam. nov., and Eggerthellales ord. nov., containing the family Eggerthellaceae fam. nov.」 Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 63 (Pt 9), pp. 3379-3397、ならびにNCBI Taxonomy Browser（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Taxonomy/Browser/wwwtax.cgi、2017年10月15日にオンラインで利用可能であったバージョン）、ならびにLPSN bacterioi.netオンラインツール（http://www.bacterio.net/eggerthella.html、2017年10月15日にオンラインで利用可能であったバージョン）に基づく。
【００２６】
コリオバクテリウム綱に包含される微生物の例示的な目は、コリオバクテリウム目（Coriobacteriales）およびエガセラ目（Eggerthellales）である。本発明で使用される微生物はコリオバクテリウム目またはエガセラ目の微生物であることが想定される。さらに、本発明で使用される微生物はコリオバクテリウム目の微生物であることが想定される。また、本発明で使用される微生物はエガセラ目の微生物であることが企図される。
【００２７】
コリオバクテリウム目の微生物は、コリオバクテリウム目の中の任意の微生物を含み得る。コリオバクテリウム目に含まれる例示的な科は、例えば、アトポビウム科（Atopobiaceae）、コリオバクテリウム科（Coriobacteriaceae）、および未分類のコリオバクテリウム目である。エガセラ目の微生物は、エガセラ目の中の任意の微生物を含み得る。エガセラ目に含まれる例示的な科は、例えば、エガセラ科および未分類のエガセラ目である。本発明で使用される微生物はコリオバクテリウム科の微生物であることが想定される。また、本発明で使用される微生物はエガセラ科の微生物であることが企図される。
【００２８】
アトポビウム科に含まれる例示的な属は、例えば、アトポビウム属（Atopobium）、リバニオコッカス属（Libaniococcus）、オルセネラ属（Olsenella）、および未分類のアトポビウム科である。エガセラ科に含まれる例示的な属は、例えば、アドレルクラウチア属（Adlercreutzia）、アラビア属（Arabia）、アサッカロバクター属（Asaccharobacter）、クリプトバクテリウム属（Cryptobacterium）、デニトロバクテリウム属（Denitrobacterium）、エガセラ属（Eggerthella）、エンテロラブダス属（Enterorhabdus）、ゴルドニバクター属（Gordonibacter）、パラエガセラ属（Paraeggerthella）、フォニシバクター属（Phonicibacter）、ラウルティバクター属（Raoultibacter）、スラッキア属（Slackia）、および未分類のエガセラ科である。本発明は、本発明で使用される微生物が未分類のエガセラ科の属のものであることを企図する。コリオバクテリウム科に含まれる例示的な属は、例えば、コリンセラ属（Collinsella）、コリオバクテリウム属（Coriobacterium）、および未分類のクリオバクテリアル目（Chriobacteriales）である。本発明で使用される微生物はエガセラ科の微生物であることが想定される。本発明で使用される微生物はDSM11798属の微生物であることが想定される。
【００２９】
さらに、本発明で使用される微生物は、本明細書においてBBSH 797とも称されるDSM11798株の微生物であり得ることが想定される。DSM11798は、1997年9月17日にDSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROOGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH（マシェローダー・ヴェク（Mascheroder Weg）1b、D-38124 ブラウンシュヴァイク（Braunschweig）、ドイツ）に寄託された。
【００３０】
本発明で使用される微生物は、SEQ ID NO. 1（DSM11798の16S-RNA配列）およびまたはSEQ ID NO: 2の配列に対して、少なくとも70％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、または100％の配列同一性を有する核酸分子を含み得ることが企図される。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「核酸分子」または「核酸」なる用語は、プリン塩基およびピリミジン塩基を含む塩基のヌクレオチド配列を有する任意の核酸分子を包含し、該塩基は該核酸分子によって含まれ、それによって該塩基は核酸分子の一次構造を表す。当業者に容易に理解されるように、核酸配列には、DNA、cDNA、ゲノムDNA、RNA、センス鎖およびアンチセンス鎖が含まれ得るか、または、非天然もしくは誘導体化ヌクレオチド塩基が含有されてもよい。ポリヌクレオチドは、任意のポリリボヌクレオチドまたはポリデオキシリボヌクレオチドから構成され得、これは非修飾RNAもしくはDNAまたは修飾RNAもしくはDNAであってもよい。「RNA」なる用語は、任意のRNA分子を含んでもよい。例示的なRNA分子には、メッセンジャーRNA（mRNA）、トランスファーRNA、またはリボソームRNAが含まれる。核酸分子は16S rRNAであってもよい。
【００３２】
DNAおよびRNAに対しては種々の修飾が行われ得る；それゆえ、「核酸分子」なる用語は、化学的、酵素的、または代謝的に修飾された形態を包含し得る。「修飾」塩基には、例えば、トリチル化塩基、およびイノシンなどの特殊な塩基が含まれる。修飾核酸分子は、例えば、本明細書に記載の核酸分子の検出のための方法において使用され得る。
【００３３】
本発明によると、2つ以上の核酸分子の文脈における「同一な」または「パーセント同一性」なる用語は、当技術分野において公知の配列比較アルゴリズムを使用した、または手作業によるアライメントおよび目視検査による測定で、ある比較ウィンドウにわたってまたは指定領域にわたって最大の対応関係となるように比較およびアライメントした場合に、同じであるかまたは同じであるヌクレオチドを特定のパーセンテージで有する（例えば、少なくとも95％、96％、97％、98％、または99％同一性）、2つ以上の配列または部分配列を指す。例えば、80％〜95％またはそれより高い配列同一性を有する配列は、実質的に同一であると考えられる。そのような定義は、試験配列の相補物にも当てはまる。当業者にとって、例えば当技術分野において公知のCLUSTALWコンピュータプログラム（Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673-4680）またはFASTDB（Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245）に基づくアルゴリズムなどのアルゴリズムを使用して配列間のパーセント同一性を決定する方法は公知であろう。
【００３４】
当業者はBLASTおよびBLAST 2.4アルゴリズム（Altschul Nucl. Acids Res. 25 (1977), 3389-3402）も利用可能である。核酸配列のためのBLASTNプログラムは、デフォルトとして、ワードサイズ（W）28、期待閾値10、および両方の鎖の比較を使用する。さらに、BLOSUM62スコア行列（Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 89, (1989), 10915）を使用することができる。
【００３５】
例えば、Basic Local Alignment Search Toolを意味するBLAST 2.4（Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389-3402；Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300；Altschul, J. Mol. Biol. 215 (1990), 403-410）を、局所的な配列アライメントを検索するために使用することができる。
【００３６】
本発明で使用される微生物を得る方法は、当業者に公知である。通常これは、供給源から、例えばDSM11799からの本発明で使用される微生物の単離を用いる。次いで、微生物を培養物中または発酵溶液中で増殖させることができる。あるいは、微生物を含む供給源を培養物中または発酵溶液中で直接増殖させることができる。増殖後、微生物を精製してもよい。また、微生物が増殖している培養物または発酵溶液を使用することも想定される。
【００３７】
例えば、そのような微生物は、国際公開公報第99/35240号に記載のように得ることができる。そこに記載されているように、DSM 11798株は、共培養物DSM 11799から得ることができる。DSM 11799株もまた、1997年9月17日にDSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROOGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH（マシェローダー・ヴェク1b、D-38124 ブラウンシュヴァイク、ドイツ）に寄託されていることに留意されたい。
【００３８】
活性グラム陽性菌であるBBSH 797（DSM 11798）は当初（そして度々）、グラム陰性菌を標的とする抗生物質を使用した標準嫌気性条件下で、いくつかのウシ第一胃内容物から単離された。関心対象の微生物を単離および入手する方法は当業者に公知である。
【００３９】
さらに、本発明で使用される微生物は嫌気性グラム陽性菌であり得ることが企図される。追加的または代替的に、本発明で使用される微生物は棒状の外観を有し得る。追加的または代替的に、本発明で使用される微生物は非胞子形成性であり得る。追加的または代替的に、本発明で使用される微生物は0.1〜3μmの長さであり得る。微生物は、両方とも個々に、対で、または、長い鎖状、特に最大約150μmで、存在してもよい。そのようなパラメータを測定する方法は当業者に公知である。
【００４０】
追加的または代替的に、本発明で使用される微生物は、本明細書の他の箇所にも記載されているように、G-CDCAをCDCAに変換する能力を有し得る。追加的または代替的に、本発明で使用される微生物は、本明細書の他の箇所にも記載されているように、CDCAをLCAに変換する能力を有し得る。
【００４１】
本発明で使用される微生物を、「完全な」単細胞微生物として、かつしたがって目に見えて無傷の微生物として、使用することができる。本発明で使用される微生物は生存可能なまたは生存している微生物であり得ることも企図される。
【００４２】
微生物の調製物が使用可能であることも想定される。これは、微生物が完全体として存在していなくてもよく、細胞断片として存在していてもよいこと、または、そのDNAおよび／もしくは16SrRNAまたは微生物の特定の酵素が存在していることを意味する。
【００４３】
例えば、BBSH 797が組成物中に存在することを、またはBBSH 797が本発明において使用されたかどうかを検出するために、DNA抽出と、16SrRNAをコードするDNAのPCR増幅と、PCR増幅産物のDNA配列決定の標準的方法を使用した、16SrRNA配列の分析を行うことができる。
【００４４】
追加的または代替的に、特に飼料などの組成物については、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（qPCR）をBBSH 797の検出および同定のために使用することができる。したがって、標準的方法を用いてDNAを試料／組成物から抽出および精製することができる。qPCR検出は、SEQ ID NO. 1に示すBBSH 797 16SrRNA遺伝子配列（追加的または代替的に、SEQ ID NO. 2に示すcpn60遺伝子も）のようなマーカー遺伝子の検出に基づき得る。16SrRNA遺伝子は保存領域および可変領域を含有するので、BBSH 797の特異的な検出のために、プライマーは、Matsuki et al. 2004に記載されているように可変領域を標的としていることができ、それによって、飼料材料のような試料からのBBSH 797 RNA配列の特異的増幅が可能になる（Matsuki et al. (2004)「Use of 16S rRNA Gene-Targeted Group-Specific Primers for Real-Time PCR Analysis of Predominant Bacteria in Human Feces.」Applied and Environmental Microbiology 70(12): 7220-7228）。qPCR反応のあいだ、得られる蛍光信号はPCR産物の量に比例し、試料中の標的配列の存在についての情報をもたらす。融解曲線分析は増幅産物の特異性についてのさらなる情報をもたらし、これは配列依存的な融解挙動を示す。
【００４５】
それゆえ、微生物なる用語はまた、微生物の調製物も包含する。本発明はまた、微生物が微生物の調製物として使用されることも企図する。そのような調製物は、さらなる分子および／またはタンパク質および／または物質、例えば本発明で使用される微生物を単離するおよび／または増殖させるときに使用した緩衝液からの残留物（left over）も含み得る。
【００４６】
本発明で使用される微生物は、組成物内に提供されてもよい。基本的に、微生物は、本発明の使用および方法に適した任意の組成物内に提供されてもよい。
【００４７】
それゆえ、本発明はまた、健常対象の消化管の健康を促進するためのコリオバクテリウム綱の微生物を含む組成物の使用に関する。例示的な組成物には、食品組成物、飼料組成物、例えば飲用の、液体組成物が含まれる。本発明で使用される微生物は食品組成物および／または飼料組成物内に提供され得ることが想定される。本発明で使用される微生物はまた、家畜飼料添加物または家畜飼料添加物の調製物として提供され得る。
【００４８】
したがって、本発明はまた、健常対象の消化管の健康を促進するための組成物の調製のためのコリオバクテリウム綱の微生物の使用に関する。
【００４９】
そのような食品組成物および／または飼料組成物を調製する方法は当業者に公知であり、とりわけ国際公開公報第99/35240号に記載されている。
【００５０】
例えば、本発明で使用される微生物を含む培養物または発酵溶液を、例えば遠心分離もしくはろ過により、および／または安定化により、特に凍結乾燥もしくは噴霧乾燥またはカプセル化により、濃縮することができる。これに関して、例えば、本発明で使用される微生物を含む培養物または発酵溶液を、遠心分離もしくはろ過により液体を除去することによって、および／または発酵溶液から直接安定化を行うことによって、第一工程で濃縮することができる。充填剤、放出剤、および／または担体材料、例えばケイ酸アルミニウム、珪藻土、糖質、糖アルコール、デンプン、乳およびホエー粉末、タンパク質加水分解物、酵母、海藻ミール、ならびに／またはポリビニルポリピロリドン（PVPP）が、本明細書に記載の組成物中に存在することも想定される。酵母および／または海藻ミールを担体として加えることも想定される。珪藻土を放出剤として加えることも想定される。これらの担体または充填剤を加えることによって、例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥、ペレット化のカプセル化の工程などの後続の安定化工程において、本発明で使用される微生物の培養物が担体上に直接付着することができる固形生成物を得ることが可能である。微生物またはその混合培養物は、大きな内部表面積を有する物質、例えば陶土、ケイ酸アルミニウム、ゼオライトなどの上に付着させてもよい。特に、微生物は酵母および／または海藻ミールに付着させてもよい。
【００５１】
組成物は、追加的または代替的に、担体材料および／または充填剤および／または放出剤を含んでもよい。担体材料および／または充填剤を加えることにより、望ましいならば、家畜飼料中に含有される可能性のある分解されるべき有害な物質を物理的に該物質に結合させることが可能であり、その結果、それらは代謝に利用できなくなる。この場合、特に、ケイ酸アルミニウム、珪藻土、糖質、糖アルコール、デンプン、乳およびホエー粉末、タンパク質加水分解物、酵母、ならびに／またはポリビニルポリピロリドンを、担体材料および／または充填剤として使用することができる。
【００５２】
本発明で使用される組成物は、噴霧乾燥もしくは凍結乾燥したコリオバクテリウム綱の微生物を1〜99重量％、好ましくは0.5〜1重量％含んでもよく、ならびに／または99〜1重量％の担体材料および／もしくは充填剤を含んでもよい。
【００５３】
組成物は家畜飼料添加物であってもよい。家畜飼料添加物は、飼料／食品組成物などの組成物1000kgあたり0.1〜8.0kg、特に、飼料／食品組成物などの組成物1000kgあたり0.5〜2.0kgの量で適用されてもよい。
【００５４】
組成物は、追加的または代替的に、1つまたは複数のプロバイオティクスを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「プロバイオティクス」とは、摂取すると健康上の恩恵が得られると考えられている微生物である。プロバイオティクスは投与時に生きていなければならない。基本的に、任意のプロバイオティクスを使用することができる。本発明における使用に適したプロバイオティクスは当業者に公知である。
【００５５】
それゆえ、組成物は、本発明で使用される微生物とは異なる1種類または複数種類の微生物を含んでもよい。基本的に、任意の適切な微生物を組成物に加えてもよい。例示的な微生物には、バクテロイデス・フラジリス（Bacteroides fragilis）、B.ブルガタス（B. vulgatus）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、ならびに、ラクトバチルス属（Lactobacillus）の種、およびビフィドバクテリウム・ビフィドゥム（Bifidobacterium bifidum）またはその生物学的機能等価物などのビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）の種、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）などのクロストリジウム属（Clostridium）の種、ならびにユーバクテリウム属（Eubacteria）の種が含まれる。
【００５６】
組成物は、追加的または代替的に、1つまたは複数のプレバイオティクスを含んでもよい。本明細書で使用される場合、「プレバイオティクス」とは、有益な微生物（例えば細菌および真菌）の増殖または活性を誘導する食品成分である。より正確には、プレバイオティクスとは、胃腸管ミクロフローラの組成および／または活性の両方における、恩恵をもたらす特定の変化を可能にする、選択的に発酵された成分であり得る。基本的に、任意のプレバイオティクスを使用することができる。本発明における使用に適したプレバイオティクスは当業者に公知である。
【００５７】
プレバイオティクスは、消化されずに上部胃腸管を通過し、そして、大腸でコロニー形成している有益な細菌の増殖または活性を、それらの基質として作用することによって刺激する、非消化性繊維化合物であり得る。プレバイオティクスを含みかつ本組成物に加えることができる食品には、アラビアゴム、生/乾燥チコリの根、生/乾燥キクイモ、生/乾燥タンポポの若葉、生/乾燥ニンニク、生/乾燥リーキ、生/乾燥タマネギ、生アスパラガス、生小麦ふすま、全粒小麦粉、および加熱済/生バナナが含まれる。プレバイオティクスはまた、Slavin (2013) 「Fiber and Prebiotics: Mechanisms and Health Benefits」 Nutrients. 5(4): 1417-1435に記載されるような繊維を含んでもよい。プレバイオティクスはまた、ガラクトオリゴ糖であってもよい。
【００５８】
したがって、組成物は、追加的または代替的に、ガラクトオリゴ糖の1つまたは複数の供給源を含んでもよい。例えば、組成物は、液乳、乾燥粉乳、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、脂肪入り粉乳、ホエー粉末、発酵乳製品、飲料、穀類、パン、食品および飼料サプリメント、栄養補助食品、動物用飼料、家禽用飼料、または全く任意の他の食品もしくは飲料のうちの1つまたは複数をさらに含んでもよい。さらなるガラクトオリゴ糖、およびガラクトオリゴ糖を入手できる方法は、例えば、Torres et al. (2010)「Galacto-Oligosaccharides: Production, Properties, Applications, and Significance as Prebiotics」 Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, Volume 9, Issue 5, p. 438-454に記載されている。
【００５９】
組成物は、追加的または代替的に、ビタミン、ミネラル、酵素、および、マイコトキシンを解毒するための構成成分の群から選択される、少なくとも1つの構成成分を含んでもよい。酵素は、プロテアーゼ、アミラーゼ、セルラーゼまたはグルカナーゼ、ヒドロラーゼ、脂肪分解酵素、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、オキシドレダクターゼ、フィターゼ、およびキシラナーゼの群、ならびに／またはそれらの組み合わせから選択されてもよい。マイコトキシン解毒性構成成分は、マイコトキシン解毒性酵素、例えばアフラトキシンオキシダーゼ、エルゴタミンヒドロラーゼ、エルゴタミンアミダーゼ、オクラトキシンアミダーゼ、フモニシンカルボキシルエステラーゼ、フモニシンアミノトランスフェラーゼ、アミノポリオールアミンオキシダーゼ、デオキシニバレノールエポキシドヒドロラーゼ、ゼアラレノンヒドロラーゼ；またはマイコトキシン解毒性微生物；またはマイコトキシン結合性構成成分、例えば微生物の細胞壁、もしくは無機物質、例えばベントナイトから選択されてもよい。組成物がベントナイトおよび／またはフモニシンアミノトランスフェラーゼ、例えばEC 3.1.1.87を含んでもよいこともまた、想定される。
【００６０】
さらに、本発明で使用される微生物または組成物は、1日超、2日超、3日超、4日超、5日超、6日超、7日超、8日超、9日超、10日超、11日超、12日超、13日超、14日超、15日超、16日超、17日超、18日超、19日超、20日超、21日超、22日超、23日超、24日超、25日超、26日超、27日超、28日超、29日超、30日超、31日超、32日超、33日超、34日超、35日超、36日超、37日超、38日超、39日超、40日超、41日超、42日超、43日超、44日超、45日超、46日超、47日超、48日超、49日超、50日超、60日超、70日超、またはそれより多い日数にわたり提供され得ることが想定される。例えば、本発明で使用される微生物は42日間または44日間提供され得る。本発明で使用される微生物はまた、70日未満、60日未満、50日未満、45日未満、40日未満、またはそれより少ない日数にわたり、提供され得る。
【００６１】
さらに、本発明で使用される微生物は、1kgあたり0.25*109コロニー形成単位、0.5*109コロニー形成単位、0.75*109コロニー形成単位、1.0*109コロニー形成単位、1.25*109コロニー形成単位、1.5*109コロニー形成単位、1.75*109コロニー形成単位、2.0*109コロニー形成単位、2.25*109コロニー形成単位、2.5*109コロニー形成単位、2.75*109コロニー形成単位、3.0*109コロニー形成単位、3.25*109コロニー形成単位、3.5*109コロニー形成単位、3.75*109コロニー形成単位、4.0*109コロニー形成単位、4.25*109コロニー形成単位、4.5*109コロニー形成単位、4.75*109コロニー形成単位、5.0*109コロニー形成単位、またはそれより多いコロニー形成単位の用量で提供され得ることが企図される。微生物は、例えば食品および／または飼料（組成物）としての、対象が取り込むことができる組成物中に、そのような用量で提供され得る。例えば、本発明で使用される微生物は、1kgあたり少なくとも2.2*108コロニー形成単位、5.0*108コロニー形成単位、7.0*108コロニー形成単位、1.0*109コロニー形成単位、2.0*109コロニー形成単位、または少なくとも2.2*109コロニー形成単位の用量で提供され得る。微生物は、対象が取り込むことができる組成物、例えば食品および／または飼料（組成物）中に、そのような用量で提供され得る。本発明で使用される微生物は、1kgあたり5.0*109コロニー形成単位未満、4.5*109コロニー形成単位未満、4.0*109コロニー形成単位未満、3.5*109コロニー形成単位未満、3.0*109コロニー形成単位未満、2.5*109コロニー形成単位未満、2.0*109コロニー形成単位未満、1.5*109コロニー形成単位未満、またはそれより少ないコロニー形成単位の用量で提供され得る。微生物は、対象が取り込むことができる組成物、例えば食品および／または飼料（組成物）中に、そのような用量で提供され得る。本発明で使用される微生物は、1kgあたり5.0*109コロニー形成単位未満、4.5*109コロニー形成単位未満、4.0*109コロニー形成単位未満、3.5*109コロニー形成単位未満、3.0*109コロニー形成単位未満、2.5*109コロニー形成単位未満、2.0*109コロニー形成単位未満、1.5*109コロニー形成単位未満、1.0*109コロニー形成単位未満、9.0*108コロニー形成単位未満、8.0*108コロニー形成単位未満、7.0*108コロニー形成単位未満、6.0*108コロニー形成単位未満、5.0*108コロニー形成単位未満、4.0*108コロニー形成単位未満、3.0*108コロニー形成単位未満、2.0*108コロニー形成単位未満、1.0*108コロニー形成単位未満、またはそれより少ないコロニー形成単位の用量で提供され得る。微生物は、対象が取り込むことができる組成物、例えば食品および／または飼料（組成物）中に、そのような用量で提供され得る。本発明で使用される微生物は、1kgあたり7.0*109〜1.0*108コロニー形成単位、6.0*109〜2.0*108コロニー形成単位、5.0*109〜3.0*108コロニー形成単位、4.0*109〜5.0*108コロニー形成単位、3.0*109〜6.0*108コロニー形成単位、または2.5*109〜8.5*108コロニー形成単位の用量で提供され得る。微生物は、対象が取り込むことができる組成物、例えば食品および／または飼料（組成物）中に、そのような用量で提供され得る。
【００６２】
本発明で使用される微生物が飼料添加物として提供される場合、その家畜飼料におけるコロニー形成単位の数値が本明細書に記載の（最終または給餌）飼料／食品組成物などの最終組成物中で使用されるコロニー形成単位の数値よりもはるかに高い可能性があることは、明らかである。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「コロニー形成単位」または「CFU」なる用語は、試料中の生存可能な細菌の数を推定する尺度である。生存可能とは、制御された条件下で二分裂により増殖する能力と定義される。CFUを決定する方法は当業者に公知である。
【００６４】
また、本発明は、本発明で使用される微生物がグリコケノデオキシコール酸（G-CDCA）をケノデオキシコール酸（CDCA）に変換する能力を有するまたは変換することも企図する。
【００６５】
さらに、本発明は、本発明で使用される微生物が、対象において、胆汁酸のグリコリトコール酸（GLCA）および／またはタウロリトコール酸（TLCA）を、例えば該微生物の投与前のGLCAおよび／もしくはTLCAのレベル／濃度と比較してまたは適当な対照と比較して増加させることができることを、想定する。例えば、胆汁酸のグリコリトコール酸（GLCA）および／またはタウロリトコール酸（TLCA）は、試料において、例えば対象から得られた血漿試料などの血液試料において、測定され得る。GLCAおよびTLCAの存在を測定する方法は当業者に公知である。例えば、これらの胆汁酸は、HPLCまたは市販のELISAキットを使用して測定してもよい。
【００６６】
本明細書に記載の微生物は、健常対象の消化管の健康を促進するために使用される。
【００６７】
本明細書に記載の「消化管の健康」なる用語は、消化管の健康状態を意味する。任意のマーカー／特徴／形態学的側面などを、消化管の健康を判定するために使用することができる。そのようなマーカー／特徴／形態学的側面は当業者に公知である。例示的な方法が、とりわけDerikx et al. (2010) 「Non-invasive markers of gut wall integrity in health and disease」 World Journal of Gastrology 16(42):5272-5279に記載されている。
【００６８】
さらに、腸の完全性が増加した／促進されたら消化管の健康が促進されているとみなされることが企図される。それゆえ、本発明はまた、健常対象の腸の完全性を促進するためのコリオバクテリウム綱の微生物の使用に関する。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「腸の完全性」とは、腸管（上皮）バリアの完全性を意味する。腸管（上皮）バリアは消化管の生理的機能を維持し、かつ、細菌およびウイルスなどの環境からの潜在的に有害なストレス要因に対する、ならびに食品中に存在する天然の抗原および毒素に対する、宿主防御の最前線として働くことができる。物理的な腸管バリアは、タイトジャンクションによって連結された上皮細胞によって主に形成され、これは、管腔表面近くの隣接する上皮細胞を封鎖するネットワークを形成し、それゆえ管腔の抗原の傍細胞輸送を妨げる。通常は完璧である腸管上皮バリアの破損は、「リーキー」ガットの発生または腸完全性の損傷をもたらす。崩壊した腸管タイトジャンクションは、管腔抗原の傍細胞的浸潤を許す可能性があり、かつ、炎症性腸疾患（IBD）などの慢性的腸炎の発症および促進における中心的な病原因子と考えられている。腸の完全性（腸管バリアの機能）を評価し得る方法は当業者に公知であり、例えばWang et al. (2015) 「Methods to determine intestinal permeability and bacterial translocation during liver disease.」 J Immunol Methods; 421: 44-53、またはGrootjans et al. (2010) 「Non-invasive assessment of barrier integrity and function of the human gut」 World J Gastrointest Surg; 2(3): 61-69に記載されている。
【００７０】
例えば、対象にラクツロースおよびラムノースを与えてから6時間後の尿中ラクツロース／ラムノース比が、ラクツロースおよびラムノースを与えた時点での尿中ラクツロース／ラムノース比よりも低い場合に、腸の完全性が促進されたと考えることができる。本明細書の他の箇所に説明されているように、対象は健常対象であり得る。
【００７１】
胆汁酸のグリコリトコール酸および／またはタウロリトコール酸が、対照と比較してある程度増加している場合に、消化管の健康／腸の完全性が促進されたと考えることもできる。例えば、そのような増加は、本発明で使用される微生物を与えた対象の胆汁酸グリコリトコール酸および／またはタウロリトコール酸を、本発明で使用される微生物を与えていない対象と比較したときに見られる増加と、同様の増加であり得る。そのような比較では、グリコリトコール酸および／またはタウロリトコール酸の濃度は、本発明で使用される微生物を与えた対象において増加する。代替的または追加的に、胆汁酸のグリコリトコール酸および／またはタウロリトコール酸は、本発明で使用される微生物を与える前の対象と比較して、本発明で使用される微生物を与えた対象で増加し得る。それゆえ、後に検出されるグリコリトコール酸および／またはタウロリトコール酸の濃度における増加と同様の増加もまた、消化管の健康を促進すると考えることができる。
【００７２】
「対象」なる用語は、本発明の目的に適した任意の対象を指す。対象は脊椎動物であり得る。それゆえ、対象は、哺乳類、鳥類、両生類、爬虫類、または魚類であり得る。哺乳類には、家畜、競技用動物、ペット、霊長類、ヒト、マウス、およびラットが含まれるがこれらに限定されない。哺乳類は、ヒト、イヌ、ネコ、マウス、ラットなどであり得る。対象はまた、ウマ、雌ウシ、ブタ、ヤギ、ニワトリ、ヒツジ、ロバ、ウサギ、アルパカ、ラマ、ガチョウ、雄ウシ、シチメンチョウなどであり得る。対象はまた、ヒトであり得る。対象は動物であり得、好ましくは対象は哺乳類であり得る。例えば、対象は、ブタ、好ましくは子ブタ、好ましくは離乳子ブタであり得る。
【００７３】
対象は「健常対象」であり得る。健常対象は、疾患も障害も患っていない対象であってもよい。好ましくは、「健常対象」の定義には、例えば食品または飼料中に存在する毒素による中毒を患っていない対象が含まれる。好ましくは、「健常対象」の定義には、有害な消化管フローラによる影響を受けていない対象が含まれる。より好ましくは、有害な消化管フローラには、有害な細菌フローラが含まれる。例えば、健常対象は、対照レベルまたは対照値と同等の胆汁酸濃度を有し得る。また、健常対象は、該対象から得られた血漿試料中で測定される、ある濃度の1つまたは複数の胆汁酸を有し得、その胆汁酸濃度は、対照試料中に存在する胆汁酸の濃度と同等である。特に、（健常）対象から得られた血漿試料中で測定されたときの胆汁酸GLCAおよび／またはTLCAの濃度は、対照試料中で測定されたGLCAおよび／またはTLCAの濃度と同等である（ほぼ同じである）。そのような胆汁酸は、対象から得られた血漿試料中で測定することができる。そのような胆汁酸を測定する方法は当業者に公知であり、本明細書にも記載されている。
【００７４】
対象はまた、疾患または障害に苦しんでいる対象であってもよい。そのような障害または疾患には、例えば、消化管に影響を及ぼす疾患または障害が含まれ得る。健常対象はまた、離乳動物であり得る。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「対照」とは、本発明の方法／使用に適した任意の対照を指す。例えば、対照は、バイオマーカー／マーカーの濃度、例えば対照試料中で測定される本明細書に記載の特定の胆汁酸の濃度であり得る。代替的または追加的に、対照はまた、当業者に公知の手段および方法によって測定された対照値であってもよい。
【００７６】
例えば、バイオマーカー／マーカー（例えば胆汁酸）の対照レベル／濃度は、健常対象、例えば消化管の疾患または本明細書に記載の疾患に苦しんでいない動物から得られる試料中の該マーカーの濃度であり得る。それゆえ、対照試料は、例えば、健常対象（例えば、いかなる疾患または障害にも苦しんでいない、特に、消化管に影響を及ぼすいかなる疾患または障害にも苦しんでいない、動物などの対象）から得ることができる。そして、マーカー、例えば本明細書に記載の胆汁酸の濃度をこの対照試料中で測定し、比較のための対照値を提供することができる。対照試料を得ることができる対象は、例えば、試料を得る対象または試験されるべき対象と同じ年齢でありかつ／または同じ体重などを有することができる。例えば、対照または対照試料は、対象から得られる試料と同じタイプのものであり得る。
【００７７】
本発明の目的のための対照には、健常（対照）対象、好ましくは疾患も障害も有しない、特に、消化管に影響を及ぼす疾患も障害も有しない対象、またはさらに、健常対照群を表す標準的対照、または消化管疾患についての、当技術分野で公知の一般的標準も含まれ得る。対照群の対象は、理想的には、併発の疾患または障害を有さず、特に、いかなる消化管疾患も有さない。対照群は、数人の健常者、例えば3人以上、好ましくは5人以上、より好ましくは10人、20人、30人、40人、または50人の群であり得、健康は公知の方法を用いて調べることができ、そのいくつかは本明細書にも述べられている。
【００７８】
対照はまた、離乳した対象であってもよい。対照はまた、本発明で使用される微生物を与えていない対象であってもよい。
【００７９】
本発明はまた、ケノデオキシコール酸（CDCA）の産生のための方法に関し、該方法は、
a）コリオバクテリウム綱の微生物をグリコケノデオキシコール酸（G-CDCA）と接触させる工程
を含み、それによってケノデオキシコール酸が得られる。
【００８０】
追加的または代替的に、本発明はまた、ケノデオキシコール酸（CDCA）の産生のための方法に関し、該方法は、
a）コリオバクテリウム綱の微生物をタウロケノデオキシコール酸（T-CDCA）と接触させる工程
を含み、それによってケノデオキシコール酸が得られる。
【００８１】
本発明で使用される微生物は、T-CDCA／G-CDAをCDCAに変換するのに必要なこの脱抱合工程を行う能力を有し、これは、本明細書に記載の実施例から見て取れる。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「ケノデオキシコール酸」（ケノデソキシコール酸、ケノコール酸、および3α,7α-ジヒドロキシ-5β-コラン-24-酸またはCDCAとしても公知である）は、胆汁酸として存在する。このカルボン酸の塩はケノデオキシコール酸塩と呼ばれる。ケノデオキシコール酸は、肝臓によって産生される主な胆汁酸の1つである。これは水に不溶性であるが、アルコールおよび酢酸に可溶性であり、165〜167℃の融点を有する。ケノデオキシコール酸は、肝臓において、いくつかの酵素工程を伴うプロセスによってコレステロールから合成され得る。他の胆汁酸と同様、これは肝臓においてタウリンまたはグリシンと抱合され得、タウロケノデオキシコール酸（T-CDCA）またはグリコケノデオキシコール酸（G-CDCA）を形成する。特に、そのような抱合体はC-24 Nアシルアミド結合によって形成され、これは胆汁酸をそのアミノ抱合体（グリシンおよびタウリン）に接続させる。しかしながらこれは、種によっては、C-25 Nアシルアミド結合、C-26 Nアシルアミド結合、またはC-27 Nアシルアミド結合であってもよい。
【００８３】
典型的に、抱合胆汁酸のC-24 Nアシルアミド結合の加水分解は、胆汁酸塩ヒドロラーゼ（BSH）によって触媒される。ほとんどのBSHはグリシン抱合型胆汁酸およびタウリン抱合型胆汁酸の両者を加水分解するが、いくつかは強い特異性を呈する。BSH遺伝子は、消化管微生物叢の主要な細菌属において検出されており、該酵素は、例えば、バクテロイデス・フラジリス、B.ブルガタス、クロストリジウム・パーフリンジェンス、リステリア・モノサイトゲネス、ならびにラクトバチルス属およびビフィドバクテリウム属のいくつかの種から精製することができる。
【００８４】
それゆえ、本発明の方法が奏功することを確認するために、以下の試験を行うことができる。第一に、本発明で使用される微生物の培養物と、この変換が可能な細菌のうちの1つ、例えばクロストリジウム・パーフリンジェンスを含む、第二の培養物とを、T-CDCAおよび／またはG-CDCAと接触させる。一定時間の後、培養上清をサンプリングして、CDCAの存在について分析する。両方の培養物にCDCAが存在しているならば、本発明の方法が奏功することが示される。
【００８５】
本方法は、T-CDCAおよび／またはG-CDCAを、本発明で使用される微生物を含む調製物と接触させる工程を含んでもよい。例えば、調製物は、本発明で使用される微生物の細胞質構成成分のみを含んでもよい。
【００８６】
本方法は、ケノデオキシコール酸を精製する工程をさらに含んでもよい。
【００８７】
加えて、そのような反応を行う方法ならびに適切な緩衝液等は当業者に公知であり、本明細書における実施例にも記載されている。さらに、大規模バイオリアクターなどのバイオリアクターにおいて本方法が行われることが企図される。
【００８８】
本発明の方法により得られるケノデオキシコール酸は、任意の目的のために使用することができる。例えば、これは、胆石を溶解するための方法において使用することができる。追加的または代替的に、本発明の方法により得られるケノデオキシコール酸を、脳腱黄色腫症、C型肝炎感染症、および／または便秘の処置において使用することができる。
【００８９】
本発明はまた、リトコール酸（LCA）の産生のための方法に関し、該方法は、
a）コリオバクテリウム綱の微生物をケノデオキシコール酸（CDCA）と接触させる工程
を含み、それによってリトコール酸が得られる。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「3α-ヒドロキシ-5β-コラン-24-酸」または「LCA」としても公知である「リトコール酸」なる用語は、界面活性剤として、吸収のために脂肪を可溶化するように作用する、胆汁酸である。LCAは、例えば細菌の7α-デヒドロキシラーゼによりCDCAから産生されることが知られている。クロストリジウム属およびユーバクテリウム属の株がそのような7-脱ヒドロキシル化を行えることが公知である。
【００９１】
例えば、肝細胞において、一次胆汁酸および二次胆汁酸の両方が側鎖上のC-24（またはC-25、C-26、もしくはC-27）カルボン酸においてアミノ酸抱合を受け、したがって、胆管中のほとんどすべての胆汁酸がグリシン抱合形態で存在している。結腸における細菌の作用により、ステロイド骨格の「B」環における炭素7のヒドロキシル官能基の還元によってケノデオキシコール酸からLCAが産生され得る。LCAは、産生後、G-LCA（または本明細書で使用されるGLCA）を形成するようにグリシンと抱合されるようになり得る。LCAはまた、産生後、T-LCA（または本明細書で使用されるTLCA）を形成するようにタウリンと抱合されるようになり得る。
【００９２】
注目すべきことに、本明細書に記載のインビボ実施例において、グリコリトコール酸およびタウロリトコール酸の増加が見出された。リトコール酸は、例えば肝細胞においてグリシンまたはタウリンと抱合されるようになるので、リトコール酸自体も増加しているに違いないことが明らかである。注目すべきことに、本明細書に記載の実施例において（例えば図2において）、リトコール酸が測定され、A群（本発明で使用される微生物を与えられていない）と比較してB群（本発明で使用される微生物を与えられている）において数字の上で増加していた。このように、有意ではないにもかかわらず、128.7から155.9nMへのLCAの増加（データは実施例において示さず）がB群において検出された。LCAはCDCAから産生されるので、CDCAの変換の増加があるに違いない。それゆえ、本発明の微生物はCDCAからLCAへの変換を行う能力も有するということもまた、妥当と思われる。
【００９３】
本方法は、CDCAを、本発明で使用される微生物を含む本明細書に記載の調製物と接触させる工程を含んでもよい。例えば、調製物は、本発明で使用される微生物の細胞質構成成分のみを含んでもよい。
【００９４】
本方法は、LCAを精製する工程をさらに含んでもよい。
【００９５】
加えて、そのような反応を行う方法ならびに適切な緩衝液等は当業者に公知であり、本明細書における実施例にも記載されている。さらに、大規模バイオリアクターなどのバイオリアクターにおいて本方法が行われることが企図される。
【００９６】
本発明の方法により得られるLCAは、任意の目的のために使用されることができる。例えば、LCAを、結腸がんなどのがんを処置するために、またはビタミンD受容体を活性化するための方法において、使用してもよい。
【００９７】
本発明で使用される微生物によってケノデオキシコール酸／リトコール酸が産生されること、または、実際にT-CDCAおよび／もしくはG-CDCAまたはLCAが物質として利用されることを確認する方法は、当業者に公知である。例えば、この目的のための市販のELISAキットが入手可能である。さらに、本明細書における実施例にも1つの方法が記載されている。あるいは、ケノデオキシコール酸／LCAの存在を、同じく当業者に公知であるクロマトグラフィー法によって決定することもできる。
【００９８】
本発明はまた、
a）健常対象をコリオバクテリウム綱の微生物と接触させる工程
を含む、健常対象の消化管の健康を促進するための方法に関する。
【００９９】
本発明の方法に関しては、本発明の使用について述べたことを準用する。
【０１００】
本発明はまた、対象の消化管の健康の促進における使用のためのコリオバクテリウム綱の微生物に関し、好ましくは該対象は疾患または障害に苦しんでいる。コリオバクテリウム綱の微生物を、本明細書に記載の疾患または障害に苦しんでいる対象を処置するために使用することもできる。
【０１０１】
コリオバクテリウム綱の微生物を、本明細書に記載の疾患または障害に苦しんでいる対象の処置のための組成物を調製するために使用することもできる。組成物は、健常対象の消化管の健康を促進するための組成物に関して本明細書に記載されたさらなる成分を含んでもよい。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「処置すること」または「処置」なる用語は、症状の寛解または改善を目的とした、例えば消化管に影響を及ぼす疾患に罹患している対象に対する、好ましくは医薬の形態での、本発明で使用される微生物の投与を含み得る。
【０１０３】
対象は任意の疾患、例えば消化管の疾患を患っていてもよい。例示的な疾患には、敗血症、下痢、炎症性腸疾患、過敏性腸疾患、肥満、糖尿病、肝疾患、慢性心疾患、セリアック病、およびがんが含まれる。
【０１０４】
対象は免疫系の疾患を患っていてもよい。
【０１０５】
本発明はまた、ケノデオキシコール酸（CDCA）の産生のための方法に関し、該方法は、
a）コリオバクテリウム綱の微生物をタウロケノデオキシコール酸および／またはグリコケノデオキシコール酸（G-CDCA）と接触させる工程
を含み、それによってケノデオキシコール酸が得られる。
【０１０６】
本発明はまた、
a）健常対象をコリオバクテリウム綱の微生物と接触させる工程
を含む、健常対象の消化管の健康を促進するための方法に関する。
【０１０７】
本発明はまた、本発明で使用される微生物を含むキットに関する。キットは、プレバイオティクスおよび／またはプロバイオティクスをさらに含んでもよい。例えば、キットは、本発明で使用される微生物とは異なる少なくとも1種類の微生物を含んでもよい。例えば、本発明で使用される微生物とは異なる微生物は、クロストリジウム属、例えばクロストリジウム・パーフリンジェンス、ユーバクテリウム属、バクテロイデス・フラジリス、B.ブルガタス、リステリア・モノサイトゲネス、ラクトバチルス属、およびビフィドバクテリウム属から選択され得る。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、文脈上別段の明記がない限り、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、複数の言及物を含むということに留意されたい。それゆえ、例えば、「1つの試薬（a reagent）」への言及は、1つまたは複数のそのような異なる試薬を含み、「その方法（the method）」への言及は、本明細書に記載の方法に対して改変可能またはその代わりに代用可能である、当業者に公知である均等な工程および方法への言及を含む。
【０１０９】
別段の指示がない限り、一連の要素に先行する「少なくとも」なる用語は、その一連の要素のすべてを指すと理解すべきである。当業者は、単なる慣例的な実験法を使用して、本明細書に記載の発明の特定の態様の多くの均等物を認識するかまたは確認できるであろう。そのような均等物は、本発明によって包含されることが意図される。
【０１１０】
「および／または」なる用語は、本明細書のいかなる箇所で使用されていても、「および」、「または」、および「該用語によって接続された要素のすべてまたはそれらの任意の他の組み合わせ」の意味を含む。
【０１１１】
「〜未満」または「〜超」なる用語は、具体的な数を含まない。
【０１１２】
例えば、20未満とは、示された数よりも小さいことを意味する。同様に、〜超、または、〜よりも大きいとは、示された数を上回ることまたは示された数よりも大きいことを意味し、例えば、80％超とは、80％という示された数を上回ることまたはそれよりも大きいことを意味する。
【０１１３】
本明細書および添付の特許請求の範囲を通して、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む」なる語、ならびに「含み」および「含んでいる」などの変形物は、述べられた整数もしくは工程または整数の群もしくは工程の群を含むが任意の他の整数もしくは工程または整数の群もしくは工程の群を除外するものではないことを意味するということが、理解されるであろう。本明細書で使用されるとき、「含む」なる用語は、「含有する」もしくは「包含する」なる用語に置き換えることができ、または本明細書で使用されるときには「有する」なる用語に置き換えることができることもある。本明細書で使用されるとき、「からなる」とは、明示されていないいかなる要素、工程、または成分も除外する。
【０１１４】
「〜を包含する」なる用語は、「〜を包含するがそれに限定されない」を意味する。「〜を包含する」と「〜を包含するがそれに限定されない」は交換可能に使用される。
【０１１５】
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコール、材料、試薬、および物質などに限定されず、したがって変更可能であるということを、理解すべきである。本明細書で使用される専門用語は、単に特定の態様の説明のみを目的とするにすぎず、添付の特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することは意図しない。
【０１１６】
本明細書の本文を通して引用されたすべての刊行物（すべての特許、特許出願、科学刊行物、説明書などを含む）は、上記のものであろうと下記のものであろうと、全体として参照により本明細書に組み入れられる。本明細書における全ては、本発明が先行発明によるそのような開示に先行する権利を与えられないことを認めるものとして解釈されるべきではない。参照により組み入れられる資料が本明細書と矛盾するまたは不一致である限りにおいては、本明細書があらゆるそのような資料に優先するであろう。
【０１１７】
本明細書において引用したすべての文書および特許文書の内容は、全体として参照により組み入れられる。
【０１１８】
本出願においては以下の配列が使用される。
2021508256.tif 000002
2021508256.tif 000003
【０１１９】
本発明およびその利点についてのより良い理解が、単なる例示を目的として提供される以下の実施例から得られるであろう。実施例は、本発明の範囲を限定することを意図するものでは決してない。
【実施例】
【０１２０】
発明の実施例
実施例1：BBSH 797によるG-CDCAの脱抱合
本実施例で使用する緩衝溶液：
ミネラル溶液I：K2HPO4（6g/L）、KH2PO4（6g/L）、(NH4)2SO4（6g/L）、NaCl（12g/L）、蒸留水を加えて1Lにする。
ミネラル溶液II：MgSO4 x 7H2O（2.5g/L）、蒸留水を加えて1Lにする。
ミネラル溶液III：CaCl2 x 2H2O（3g/L）、蒸留水を加えて1Lにする。
ビタミン溶液：ビオチン（ビタミンH、2mg/L）、葉酸（2mg/L）、ピリドキシンHCl（ビタミンB6、10mg/L）、チアミンHCl（ビタミンB1、5mg/L）、リボフラビン（ビタミンB2、5mg/L）、ニコチンアミド（5mg/L）、D,L-パントテナート（Pantotheinate）（5mg/L）、シアノコバラミン（ビタミンB12、0.1mg/L）、メナジオン（100mg/L）、フィロキノン（Phyllochinon）（ビタミンK1、22mg/L）、p-アミノ安息香酸（5mg/L）、チオクト酸（5mg/L）、蒸留水を加えて1Lにする；4℃で保存。
微量元素溶液（TE）：ZnSO4 x 7H2O（0.10g/L）、MnCl2 x 7H2O（0.03g/L）、H3BO3（0.30g/L）、CuCl2 x 2H2O（0.01g/L）、CoCl2 x 6H2O（0.20g/L）、NiCl2 x 6H2O（0.02g/L）、Na2MoO4 x 2H2O（0.03g/L）、蒸留水を加えて1Lにする；4℃で保存。
ヘミン溶液（10000ppm）：ヘミン1gを1M NaOH溶液50mlに溶解した。その後EtOH（92.7％ v/v）50mlを加えた。4℃で保存。
リン酸緩衝液：0.5M KH2PO4パッファー（Puffer）＋0.5M Na2HPO4 x 2H2O、pH＝6.9、ろ過滅菌。
システイン-Na2S溶液（還元剤）：この溶液は、セプタムキャップ付きのSchottフラスコ中でN2雰囲気下にて作製する。システインHCl 0.5gを、加熱したN2曝気蒸留水18.2mlに溶解した。4M NaOH（pH 10）1.8mlおよびNa2S 0.5gを加えた。新しく調製し、ろ過滅菌し、4℃で保存。
希釈緩衝液：75mlのミネラル溶液I、II、およびIIIそれぞれを、ビタミン溶液10ml、微量元素溶液0.5ml、ヘミン溶液0.5mlおよびシステインHCl 0.5gと合わせ、蒸留水を加えて1Lにする。pH＝6.8〜6.9（4M NaOH溶液で調整）、121℃で15分間オートクレーブし、新しく調製！
【０１２１】
BBSH 797がGCDCAを脱抱合してCDCAにする能力を測定するために、インキュベーション実験を行った。そのために、以下の3つのタイプのバッチを三つ組で作製した：
GCDCAおよびBBSH 797（4.09E+6 CFU/mL）を含有する、バッチT
BBSH 797なしでGCDCAのみを含有する、バッチC1
不活性化BBSH 797（4.09E+6 CFU/mL）とともにGCDCAを含有する、バッチC2。
不活性化BBSH 797とは、BBSH 797が生存可能でないことを意味する。
t=0およびインキュベーションの48時間後にサンプリングを行った。
【０１２２】
詳細には、以下の手順を行った：
希釈緩衝液をろ過滅菌し、2.5％（v/v）リン酸緩衝液および1％（v/v）還元剤を加えて最終希釈緩衝液を得た。すべての処理実験（Tバッチ）および不活性化対照（C2バッチ）については、最終希釈緩衝液18mlを無菌の25ml Schottフラスコに入れた。陰性対照（C1バッチ）については、最終希釈緩衝液20mLを無菌の25mL Schottフラスコに入れた。GCDCA溶液200μLをすべてのバッチに加えて、最終濃度5μMを得た。
【０１２３】
BBSH 797培養物を凍結乾燥物から増殖させ、BBSH 797接種材料（4.09E+7 CFU/mL）を最終希釈緩衝液中で調製した。この接種材料から2mLをTバッチに加えて、細胞密度4.09E+6 CFU/mLのBBSH 797を有する20mL（GDCA溶液の体積は無視）を得た。BBSH 797接種材料（4.09E+7 CFU/mL）の一部を、90℃の水浴中で15分間インキュベートすることによって不活性化した。この不活性化接種材料から2mLをC2バッチに加えて、4.09E+6 CFU/mLの不活性化BBSH 797に等しい細胞密度を有する20mL（GDCA溶液の体積は無視）を得た。
【０１２４】
t＝0分の時点で、すべてのバッチを振盪により均質化し、試料（t0試料、1mL）を採取し、それらを直ちに95℃まで5分間加熱し、-20℃で保存した。
【０１２５】
すべてのバッチを37℃で48時間さらにインキュベートした。48時間後にすべてのバッチを振盪により均質化し、試料（t＝48h試料、1mL）を採取し、それらを直ちに95℃まで5分間加熱し、-20℃で保存した。GCDCAおよびCDCAの定量化の前にすべての試料を解凍し、16,600×gで10分間遠心分離した。清澄な試料10μlをHPLC溶離液（20％アセトニトリル＋80％蒸留水）990μLで希釈し、GCDA量およびCDCA量を定量化した。
【０１２６】
得られた結果を図1にまとめる。図1から見て取れるのは、対照バッチ両方（C1およびC2）でGCDCAのCDCAへの転換は確認されなかったということである。したがってGCDCAは、自然には脱抱合されず（C1）、不活性化（死滅）BBSH 797微生物によっても脱抱合されない。処理（Tバッチ）については、t＝0h試料が既に、インキュベーション培地において、C1試料およびC2試料と比較して有意に減少したGCDCA濃度（1.59μM）を示しているとおり、生存している微生物によってGCCAが非常に急速に取り込まれることがはっきりと示されている。さらに、生存しているBBSH 797によってGCDCAが脱抱合され、CDCAが生成される（t＝0hで0.02μM CDCA、t＝48hで1.06μM CDCA）。より多くのGCDCAおよびCDCAがTバッチのインキュベーション緩衝液中で見出されなかった理由は、微生物内での両方の物質の中間蓄積に起因し得る。
【０１２７】
このように、活性BBSH 797のみがGCDCAをCDCAに変換する能力を有する。これらのデータから、BBSH 797は抱合胆汁酸のC24 Nアシルアミド結合を（ならびにしたがって、恐らくC25 Nアシルアミド結合、C26 Nアシルアミド結合、およびC27 Nアシルアミド結合も）加水分解できると結論付けることができる。したがって、BBSH 797はこの加水分解を行うことができる1つまたは複数の酵素を含んでいると予想することができる。また、BBSH 797の存在下でタウリン抱合型CDCAも加水分解状態になり得ると予想することができる。
【０１２８】
要約すると、インビトロの実験によって、グリコケノデオキシコール酸のケノデオキシコール酸への変換が示された。文献によると、後者はGLP-2の放出を導き、それゆえ腸の完全性の改善を導く（Diego-Cabero et al., 2015）。インビトロの実験に基づいて、腸管バリアに対するBBSH 797の効果を評価するために離乳子ブタを用いてインビボの研究を行った。
【０１２９】
実施例2：給餌実験
実験設定：
合計16匹の子ブタ（O-HYB、4〜5週齢、約10kg）を、離乳後に2つの異なる群に分けた。A群には、その構成成分が動物の年齢に適合されている飼料組成物（完全離乳飼料）を与えた。B群においては、同じ離乳飼料にBBSH 797を加えた（2.2*109コロニー形成単位/tkg離乳飼料組成物のBBSH 797の最終飼料中濃度）。44日間の試験期間にわたって、飼料を1日2回給与した。子ブタは、飲料水を自由に飲み、制御された条件（空間、温度、湿度、および照明）下で保たれ、エンリッチメントとして子ブタ用玩具を与えられた。動物は訓練された者によって毎日世話をされて、獣医師によって管理された。
【０１３０】
サンプリング：
42日目に、個々の血液試料を、すべての動物の頭蓋大静脈から採取した（Primavette（登録商標）EDTA、Kabe Laboratory GmbH、ニュームブレヒト-エルゼンロート（Nuembrecht-Elsenroth）、ドイツ）。遠心分離（2.300×g、10分）した後、2つのアリコート（それぞれ100μL）をドライアイス上に載せてBiocrates Life Sciences AG（インスブルック、オーストリア）へ輸送した。試料はそこで、胆汁酸濃度が測定されるまで-80℃で保存された。
【０１３１】
42日目および43日目に、子ブタを代謝ケージ内で保持した。これらの2日間、午前9時前後に、動物に、ラクツロース（500mg/kg体重）およびラムノース（100mg/kg体重）を含有する寒天をおよそ15ml与えた。続いて、糖溶液の投与後0〜2時間、2〜4時間、および4〜6時間という3つの異なる期間のそれぞれにおいて採尿した。加えて、最初の糖投与の直前に尿試料を採取した（ブランク試料）。尿試料は、ラクツロース／ラムノース比の分析まで、-20℃で保存した。
【０１３２】
試料の分析：
胆汁酸の測定のため、市販の胆汁酸試験キット（Biocrates Life Sciences AG、インスブルック、オーストリア）を使用した。この目的のために、試料を乾燥フィルタースポット技術により抽出し、次いで液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（Thermo Fisher Scientific TSQ、ネガティブエレクトロスプレーイオン化、多重反応モニタリングモード）により分析した。合計20種類の一次および二次胆汁酸を、外部標準（7点の較正曲線）および内部標準（10個の同位体標識標準）を使用して定量化した。次いでデータを、Thermo Fisher Scientific Xcalibur（商標）およびBiocrates MetIDQソフトウェアを使用して評価した。
【０１３３】
結果および考察：
42日目に、B群で、胆汁酸のグリコリトコール酸およびタウロリトコール酸の有意な増加が観察された（図2）。それらは、アミノ酸（グリシンまたはタウリン）が結合した二次胆汁酸である。一般に、一次胆汁酸（コール酸、ケノデオキシコール酸）の二次胆汁酸（デオキシコール酸、リトコール酸）への変換は腸管微生物を介して生じる。それゆえ、さまざまな細菌の属、例えばバクテロイデス属（Bacteroides）、ビフィドバクテリウム属、またはクロストリジウム属における必須の酵素的代謝プロセス（脱抱合、7-ヒドロキシル化）が記載されている（Gerard, 2014）。BBSH 797（コリオバクテリウム科の新属、株番号DSM 11798）については、そのような報告は今のところ入手可能でない。
【０１３４】
ラクツロースおよびラムノースの測定については、尿を、メタノールを用いていくつかの中間工程を経て1.6*106倍に希釈した。続いて、LC-MS法によってラクツロースおよびラムノースを測定した。このためには、Triple Quad 5500質量分析計（AB Sciex、カナダ）を接続したAgilent 1290 Infinity I機器（Agilent Technologies、米国）を使用した。分析物を、Luna NH2 150×2.0mmカラム（Phenomenex、英国、30℃、0.250mL/min、10分間のアセトニトリル勾配溶出）にて分離した。質量分析計は、ネガティブエレクトロスプレーイオン化を用いて多重反応モニタリングモード（ラクツロースについては、m/z 341→m/z 161およびm/z 341→m/z 101；ラムノースについては、m/z 163→m/z 59およびm/z 163→m/z 103）で動作させた。データを、Analystソフトウェア（AB Sciex、カナダ）と、MS-Excel（Microsoft、USA）にて算出したラクツロース／ラムノース比とを使用して分析した。
【０１３５】
この実験では、上昇した胆汁酸濃度と改善された腸管バリアとの間の相関関係を実証することができた。腸管バリアの完全性は、二重糖アッセイを使用して評価した。この試験の原理は、ラクツロースおよびラムノースの同時投与に基づく。二糖であるラクツロースは、個々の腸管上皮細胞間の狭い間隙を通って傍細胞的にのみ、血流に入る。一方、単糖であるラムノースは、傍細胞的に、および腸管細胞を通って経細胞的に、体内に輸送される。腸管バリアが弱まると、間質腔が次第に多孔質になり、その結果として、比べるとより大量の二糖が吸収される。従って、尿中ラクツロース／ラムノース比が上昇する。無傷のまたは強化された腸管バリアは、低下した尿中ラクツロース／ラムノース比と関連付けられる（本明細書において引用されたWijtten et al., 2011）。行った実験では、BBSH 797の数週間の投与が尿中ラクツロース／ラムノース比の有意な低下をもたらした（p＝0.0173、図3）。
【０１３６】
実施例3：健常対象における体重増加および飼料要求率（FCR）に対するBBSH 797の効果
実験設定：
約4〜10週齢の雌雄混合の離乳子ブタ（遺伝子型：O-HYB FI [（ランドレース×ラージホワイト）×ピエトレン]）に耳標を付け、それぞれ重さを計り、対照群（CG）、試験群（TG）、または高濃度試験群（hTG）のいずれかに割り当てた。動物は、健常群から選択した。対照群（CG）の動物には、抗生物質、抗コクシジウム薬、プロバイオティクス、植物性添加物、および有機酸のいずれも含有しない基礎食を与えた。1日目〜14日目は、基礎食の飼料には以下の成分が％（w/w）単位で含有されていた：トウモロコシ、30；オオムギ、32.9；サンフラワー油、0.6；ポテトタンパク質、7；加圧調理したトウモロコシ、6；ダイズタンパク質濃縮物、5.7；加圧調理したコムギ、4；デキストロース、4；ラクトース、3；パーム核、ココヤシ脂肪、2.5；第一リン酸カルシウム、1.23；リン酸マグネシウム、0.1；塩化ナトリウム、0.43；ビタミンプレミックス、0.1；微量元素プレミックス、0.15；L-リジン、0.56；DL-メチオニン、0.17；L-スレオニン、0.16；L-トリプトファン、0.08；甘味料、0.02。15日目〜42日目は、基礎食の飼料に以下の成分が％（w/w）単位で含有されていた：トウモロコシ、40.7；オオムギ、35；ダイズ48％、20；サンフラワー油、0.5；第一リン酸カルシウム、0.94；炭酸カルシウム、1.31；リン酸マグネシウム、0.2；塩化ナトリウム、0.46；ビタミンプレミックス、0.1；微量元素プレミックス、0.15；L-リジン、0.4；DL-メチオニン、0.12；L-スレオニン、0.12。試験群（TG）の動物には対照群と同じ基礎食を与えたが、飼料には、BBSH 797（DSM 11798）を、飼料1kgあたり2.2*109CFUの最終濃度まで追加的に補充した。高濃度試験群（hTG）の動物にもCGと同じ基礎食を与えたが、飼料には、BBSH 797（DSM 11798）を、飼料1kgあたり2.2*1011CFUの最終濃度まで追加的に補充した。処置期間は42日間であった。全試験期間中、動物は不断給餌とした。新鮮な飲料水を、同じく自由に供給した。気候条件はコンピュータ操作し、離乳子ブタのための標準的な推奨に従って自動調節し、毎日記録した。午前中および午後に、農場のスタッフが動物の全体健康状態をチェックし、飼料および水の一定供給、適正な温度、ならびに換気を確実にするよう飼育設備を制御した。加えて、試験の間の動物の良好な健康状態を確認するため、獣医師が動物を定期的に調べた。試験中、檻ごとに飼料摂取量を正確に測定した。体重は、1日目、14日目、および42日目に個々に測定した。檻ごとの1日平均飼料摂取量は、1日目〜42日目の間、ならびに15日目〜42日目の間で測定した。檻ごとの平均飼料摂取量および平均体重を使用して、体重増加に対する給餌量の比（飼料要求率、FCR）の平均値を算出した。
【０１３７】
結果：
全試験期間を通して、すべての動物は、いかなる認知可能な健康問題もいかなる臨床疾患症状もないままであり、減量も生じなかった。体重増加に対する、BBSH 797による飼料補充の有益な効果を以下の表1に示す。
【０１３８】
（表１）健常動物における体重増加に対するBBSH 797による飼料補充の効果
2021508256.tif 000004
【０１３９】
また、飼料要求率（FCR）とも称される、体重増加に対する給餌量の比は、BBSH 797を補充していない基礎食のみを与えた動物よりも、BBSH 797補充基礎食を与えた動物において向上したことが見出された。1日目〜42日目の期間では、FCRは、基礎食のみを与えた動物の1.63kg/kgから、BBSH 797補充基礎食を与えた動物の1.54kg/kgまで向上した。15日目〜42日目の期間では、FCRは、基礎食のみを与えた動物の1.69kg/kgから、BBSH 797補充基礎食を与えた動物の1.59kg/kgまで向上した。本明細書における実施例で示されているように、BBSH 797による飼料補充は健常動物の消化管の健康を促進し、これによりBBSH 797補充飼料を与えた動物の体重増加と飼料要求率の両方の改善をもたらした一方で、有害な作用は観察されなかった。
【０１４０】
参考文献リスト
2021508256.tif 000005
2021508256.tif 000006
【図１】
2021508256.tif 000007
【図２】
2021508256.tif 000008
【図３】
2021508256.tif 000009
【配列表】
2021508256000001.app
【国際調査報告】
2021508256.tif 000010
2021508256.tif 000011
2021508256.tif 000012