(57)【要約】  融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスの製造方法が、本明細書中において記載される。いくつかの実施形態において、当該方法は、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体および任意にトランスグルタミナーゼまたはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む第１の成分と、トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む第２の成分と、融合ペプチドを含む第３の成分とを含む、３種の異なる成分を提供する工程を含む。こうした実施形態において、第１の成分または第２の成分はいずれも、融合ペプチドを含まない。いくつかの実施形態において、第１の成分または第２の成分は、予め第３の成分と混合される。第１の成分、第２の成分、および第３の成分が混合されて、共有結合した融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスが形成される。混合は、５日を超えない時間枠内において行なわれる。さらに、本明細書中において、共有結合した融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスを製造するためのキットも記載される。
2021516120.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスの形成方法であって、前記方法は、
ｉ）フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体およびトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）またはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む第１の成分を提供する工程と、
ｉｉ）トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む第２の成分を提供する工程とを含み、
前記第１の成分または前記第２の成分はいずれも、第１のドメインと、第２のドメイン中の共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質ドメインとを含む融合ペプチドを含まず、
前記方法はさらに、
ｉｉｉ）前記融合ペプチドを含む第３の成分を提供する工程であって、前記第３の成分は、フィブリノゲン、フィブリノゲン前駆体、トロンビン、またはトロンビン前駆体のいずれをも含まない、工程と、
ｉｖ）前記第１の成分、前記第２の成分、および前記第３の成分を混合する工程とを含み、
前記工程（ｉｖ）は、５日を超えない、好ましくは３日を超えない、２日を超えない、または１日という時間枠内において行なわれる、方法。
【請求項２】
前記融合ペプチドは、前記第１のドメイン中にＰＴＨを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ＰＴＨは、ＰＴＨ１−８４、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１、およびＰＴＨ１−２５からなる群より選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の成分または前記第２の成分は、カルシウムイオン源をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記工程（ｉｖ）において、前記融合ペプチドは、フィブリンマトリックス中０．０１〜２ｍｇ／ｍＬの濃度範囲内で添加される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の成分はトランスグルタミナーゼ前駆体を含み、前記トランスグルタミナーゼ前駆体は第ＸＩＩＩ因子である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記融合ペプチドは、前記第１のドメインと前記第２のドメインとの間に分解部位をさらに含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記分解部位は酵素切断部位である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記酵素切断部位はプラスミン切断部位である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記方法は無菌条件下において行なわれる、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
好ましくは請求項１〜１０のいずれか１項に記載の、フィブリンマトリックスを製造するためのパーツからなるキットであって、前記キットは、
フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体およびトランスグルタミナーゼ（ＴＧ）またはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む第１の成分と、
トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む第２の成分とを含み、
前記第１の成分または前記第２の成分はいずれも、第１のドメインと、第２ドメイン中の共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質ドメインとを含む融合ペプチドを含まず、
前記キットはさらに、
前記融合ペプチドを含む第３の成分であって、フィブリノゲン、フィブリノゲン前駆体、トロンビン、またはトロンビン前駆体のいずれをも含まない、第３の成分と、
前記第１の成分、前記第２の成分、および前記第３の成分を混合するための少なくとも１つの混合デバイスとを含み、
前記第３の成分と、前記第１の成分および前記第２の成分とは、分けられている、キット。
【請求項１２】
前記第１の成分と前記第２の成分とは分けられている、請求項１１に記載のキット。
【請求項１３】
前記第３の成分は、前記混合デバイスに直接または間接的に接続可能な容器に入っている、請求項１１または１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記第１の成分および前記第２の成分は別々の容器に入っており、前記容器はそれぞれ、前記混合デバイスに接続可能である、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１５】
前記第１の成分および前記第２の成分は、前記混合デバイスの別々の区画に入っている、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１６】
前記成分の各々は別々の一次パッケージに入っており、前記第１の成分の一次パッケージ、前記第２の成分の一次パッケージ、前記第３の成分の一次パッケージ、および前記混合デバイスは、無菌化および無菌包装されている、請求項１１〜１５のいずれか１項に記載のキット。
【請求項１７】
前記工程（ｉｖ）の混合物を、患者の、骨生成を要する部位または骨折の部位に投与する工程をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記部位は、骨折、骨嚢腫、または骨密度が低い状態にある骨である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記部位は脊椎の中にあり、前記患者は脊椎固定を受けている、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスを製造するための方法およびキット、ならびに融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＡＲＴＩＳＳまたはＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）（いずれもＢａｘｔｅｒ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社より）などのフィブリンシーラントは、組織修復において使用するための製品として知られている。ＡＲＴＩＳＳ（登録商標）およびＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）は、２種の成分からなり、適用直前または適用中にこれらが混合される。一方の成分はフィブリノゲン、第ＸＩＩＩ因子、およびアプロチニンを含み、もう一方の成分はトロンビンを含む。当該２種の成分が混合されると、トロンビンが、フィブリノゲンを切断することによってフィブリンポリマーを生成し、かつ第ＸＩＩＩ因子を活性化することによって第ＸＩＩＩａ因子を生成する。この第ＸＩＩＩａ因子はトランスグルタミナーゼであり、フィブリンポリマーを架橋して固体のフィブリンマトリックスを形成する。
【０００３】
フィブリンマトリックスは、トロンビンによりフィブリノゲンが切断され、得られたフィブリンポリマーがカルシウム源および第ＸＩＩＩａ因子の存在下において架橋されて三次元ネットワークが形成される、というプロセスで得られる産物である。
【０００４】
特定の生理活性因子が骨の修復を促進し得ることが知られている。副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）は、８４個のアミノ酸からなるペプチドであり、副甲状腺により産生および分泌される。このホルモンは、多様な組織、特に骨に作用することにより、血清カルシウムレベルの制御において主要な役割を果たしている。そのため、ＰＴＨは、骨障害の処置において特に関心がもたれている。
【０００５】
フィブリンシーラントであるＡＲＴＩＳＳまたはＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）とＰＴＨとを組み合わせるアプローチが試みられている。たとえば、ＵＳ８０３４６１８Ｂ２は、ＰＴＨを含む融合タンパク質を、フィブリノゲンまたはトロンビンのいずれかの溶液と混合すること（本願における「予め混合」すること）を記載する。フィブリンマトリックスを形成するために、融合タンパク質およびフィブリノゲンを含む前駆体溶液を希釈したものを、トロンビンを含む第２の前駆体溶液中に、室温で注入する。次いで、得られた混合物を骨障害部位に適用して、フィブリンマトリックスを形成させる。生理活性因子であるＰＴＨがマトリックスから放出されて、骨組織の再生を局所的に誘発する。
【０００６】
驚くことに、フィブリノゲン溶液中のＰＴＨを含む融合ペプチドは、室温において比較的短期間で分解することが見いだされた（実施例１）。このことは、特に驚くべきことである、というのは、ＡＲＴＩＳＳ（登録商標）およびＴＩＳＳＥＥＬ（登録商標）のフィブリノゲン溶液はアプロチニンを含むためである。アプロチニンは当該化合物のタンパク質分解を防止することが予期された。しかしながら、融合ペプチドを室温において５日より長くフィブリノゲン溶液に曝露すると、ＰＴＨを含む融合ペプチドの実質的な分解が引き起こされることが観察された。この分解が、組織シーラントの工業製造に典型的に必要とされる時間範囲内で生じることから、上述される先行技術において用いられた、融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスを製造するアプローチは、再現性および確実性の点で重大な欠点を有している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
よって、本発明の目的は、先行技術の欠点の克服である。より具体的には、本発明の目的は、再現性および確実性が向上したシーラントとしてのフィブリンマトリックスの製造方法の提供である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
上述される目的は、以下に記載するフィブリンマトリックスを製造するための方法およびキットによって達成された。
【０００９】
融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスの製造方法が、本明細書中において記載される。いくつかの実施形態において、当該方法は、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体および任意にトランスグルタミナーゼまたはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む第１の成分と、トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む第２の成分と、融合ペプチドを含む第３の成分とを含む、３種の異なる成分を提供する工程を含む。こうした実施形態において、第１の成分または第２の成分はいずれも、融合ペプチドを含まない。いくつかの実施形態において、第１の成分または第２の成分は、予め第３の成分と混合される。第１の成分、第２の成分、および第３の成分が混合されて、共有結合した融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスが形成される。混合は、５日を超えない時間枠内において行なわれる。さらに、本明細書中において、共有結合した融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスを製造するためのキットも記載される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】図１Ａは、本明細書中において記載される３つの例示的な方法の工程を示すフロー図である。
【図１Ｂ】図１Ｂは、本明細書中において記載される３つの例示的な方法の工程を示すフロー図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、本明細書中において記載される３つの例示的な方法の工程を示すフロー図である。
【図２Ａ】図２Ａは、本明細書中において記載される方法において、本発明に係る方法において使用される本発明に従って使用するための、４つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるものと、最終混合物を入れるもの）と、接続デバイスと、アダプタとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本明細書中において記載される方法において、本発明に係る方法において使用される本発明に従って使用するための、４つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるものと、最終混合物を入れるもの）と、接続デバイスと、アダプタとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図２Ｃ】図２Ｃは、本明細書中において記載される方法において、本発明に係る方法において使用される本発明に従って使用するための、４つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるものと、最終混合物を入れるもの）と、接続デバイスと、アダプタとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本明細書中において記載される方法において、本発明に係る方法において使用される本発明に従って使用するための、４つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるものと、最終混合物を入れるもの）と、接続デバイスと、アダプタとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本明細書中において記載される方法において、本発明に係る方法において使用される本発明に従って使用するための、４つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるものと、最終混合物を入れるもの）と、接続デバイスと、アダプタとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図３Ａ】図３Ａは、本明細書中において記載される方法において使用するための、３つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるもの）とアダプタとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図３Ｂ】図３Ｂは、本明細書中において記載される方法において使用するための、３つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるもの）とアダプタとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図３Ｃ】図３Ｃは、本明細書中において記載される方法において使用するための、３つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるもの）とアダプタとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図３Ｄ】図３Ｄは、本明細書中において記載される方法において使用するための、３つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるもの）とアダプタとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図４Ａ】図４Ａは、本明細書中において記載される方法において使用するための、３つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるもの）と接続デバイスとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、本明細書中において記載される方法において使用するための、３つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるもの）と接続デバイスとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図４Ｃ】図４Ｃは、本明細書中において記載される方法において使用するための、３つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるもの）と接続デバイスとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図４Ｄ】図４Ｄは、本明細書中において記載される方法において使用するための、３つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるもの）と接続デバイスとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図５Ａ】図５Ａは、第１の成分と第３の成分との混合物または第２の成分と第３の成分との混合物の入った第１の容器と、第１の成分のみまたは第２の成分のみの入った第２の容器とを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図５Ｂ】図５Ｂは、第１の成分と第３の成分との混合物または第２の成分と第３の成分との混合物の入った第１の容器と、第１の成分のみまたは第２の成分のみの入った第２の容器とを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図５Ｃ】図５Ｃは、第１の成分と第３の成分との混合物または第２の成分と第３の成分との混合物の入った第１の容器と、第１の成分のみまたは第２の成分のみの入った第２の容器とを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図５Ｄ】図５Ｄは、第１の成分と第３の成分との混合物または第２の成分と第３の成分との混合物の入った第１の容器と、第１の成分のみまたは第２の成分のみの入った第２の容器とを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図５Ｅ】図５Ｅは、第１の成分と第３の成分との混合物または第２の成分と第３の成分との混合物の入った第１の容器と、第１の成分のみまたは第２の成分のみの入った第２の容器とを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図５Ｆ】図５Ｆは、第１の成分と第３の成分との混合物または第２の成分と第３の成分との混合物の入った第１の容器と、第１の成分のみまたは第２の成分のみの入った第２の容器とを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【図５Ｇ】図５Ｇは、第１の成分と第３の成分との混合物または第２の成分と第３の成分との混合物の入った第１の容器と、第１の成分のみまたは第２の成分のみの入った第２の容器とを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
Ｉ．フィブリンマトリックスの製造方法
融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスの製造方法が開示される。当該方法は、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体、および第ＸＩＩＩａ因子などのトランスグルタミナーゼまたは第ＸＩＩＩ因子などのトランスグルタミナーゼ前駆体を含む第１の成分を提供する第１の工程（ｉ）と、トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む第２の成分を提供する第２の工程（ｉｉ）とを含む。第１の成分または第２の成分はいずれも、第１のドメインと、第２ドメイン中の共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質ドメインとを含む融合ペプチドを含まない。当該方法は、さらに、第１のドメインと、第２ドメイン中の共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質ドメインとを含む融合ペプチドを含む第３の成分を提供する第３の工程（ｉｉｉ）を含む。第３の成分は、フィブリノゲン、またはフィブリノゲン前駆体、またはトロンビン、またはトロンビン前駆体のいずれをも含まない。当該方法のさらなる第４の工程（ｉｖ）において、第１の成分、第２の成分、および第３の成分を混合することによって、共有結合した融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスが形成される。３種の成分の混合は、５日を超えない、好ましくは２〜３日、最も好ましくは１日という時間枠内において行なわれる。任意に、３種の成分は、さらには、１０時間以内、５時間以内、４時間以内、３時間以内、または２時間以内といった１日よりも短い時間枠内、３０分以内、２０分以内、１０分以内、または５分以内といった６０分よりも短い時間枠内、さらには４０秒以内、３０秒以内、２０秒以内、１０秒以内、または５秒以内といった６０秒よりも短い時間枠内において混合される。
【００１２】
任意に、第２の成分が第１の成分と第３の成分との混合物に、または第１の成分が第２の成分と第３の成分との混合物に、５日を超えない、好ましくは２日を超えない、最も好ましくは１日を超えない時間枠内において添加される。たとえば、第１の成分（たとえば、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体およびトランスグルタミナーゼまたはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む）と第３の成分（融合ペプチドを含む）とが混合され、次いで、上限５日間、好ましくは上限２〜３日間、最も好ましくは上限１日間保存され、次いで第２の成分（トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む）と混合されてもよい。同様に、第２の成分（トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む）と第３の成分（融合ペプチドを含む）とが混合され、次いで、上限５日間、好ましくは上限２〜３日間、最も好ましくは上限１日間保存され、次いで第１の成分（たとえば、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体およびトランスグルタミナーゼまたはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む）と混合されてもよい。
【００１３】
工程（ｉｖ）において第１の成分と第２の成分とが混合される実施形態において、好ましくは、第１の成分と第２の成分とを混合する際か、または、第１の成分と第２の成分とを混合してから１日を超えない、好ましくは１時間以内、好ましくは５分以内、好ましくは１分以内、最も好ましくは３０秒以内という時間枠内か、のいずれかのタイミングで、当該混合物に第３の成分が添加される。この実施形態において、当該３種の成分の混合開始から５日以内に、当該３種の成分の混合物が、患者に、投与方法に依存して、投与される。
【００１４】
いくつかの実施形態において、これらの成分は、接続デバイスを使用して混合される。接続デバイスは、当該接続デバイスの中で混合することによって、または２種以上の成分を接続デバイスを介して１つの容器の中に移すことによって、２種または３種の成分を混合するために使用できる。
【００１５】
いくつかの実施形態において、フィブリンマトリックスは、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内でまたは身体に接した状態で形成される。他の実施形態において、マトリックスは、体外で形成された後、こうして予め形成された形状で適用されてもよい。いずれの場合においても、マトリックスは、処置を要する部位に適用されるまたは埋め込まれる。
【００１６】
２種の成分を予め混合したものが、２つの区画を有するデバイスの１つの区画に入っており、残りの成分が当該デバイスの第２の区画に入っていてよく、好ましくは、これらの区画が接続デバイスを介して繋がっていてもよい。２つ以上の区画を有するデバイスの代わりに、当該デバイス内の区画の数と同数の別々の容器を使用してもよく、本明細書中において記載される多区画デバイスと同じ様式で使用してもよい。
【００１７】
２種の成分を、２つの区画を有するデバイス（または、２つの容器）に入れ、残りの成分を第３の区画（または、第３の容器）に入れてもよい。２つの区画を有するデバイスに入れた２種の成分は、接続デバイスを介して混合され、次いでこの接続デバイスが第３の区画に接続されることにより、３種の成分が混合される。好ましくは、２つの区画と第３の区画とは、接続デバイスによって接続される。接続デバイスは、別個のデバイスであってよい、または、２つの区画を有するデバイスの一部もしくは第３の区画の一部であってもよい。任意に、３種の成分は、第３の区画を第４の区画に繋げて、第３の区画と第４の区画との間で混合物を往復させることによって、さらに混合されてもよい。第３の区画と第４の区画とは、接続デバイスによって繋がっていてもよい（たとえば、図２Ｅを参照）。
【００１８】
３種の成分は、別々の区画に入っていて、三元接続デバイスに繋げることによって同時に混合されてもよい、または、３つの区画を有するシリンジに入っていてもよい。好ましくは、３つの区画は接続デバイスに接続される（たとえば、図２Ａ〜２Ｄおよび図４Ｂ〜４Ｃを参照）、または３つの別々の区画のうちの１つの一部として接続デバイスを有する、または３つの区画を有するシリンジの一部として接続デバイスを有する。
【００１９】
代替的には、３種の成分は、３つの独立した区画に入っている。第１の工程において３種の成分のうち２種が混合され、第２の工程においてこの混合物が残りの成分と混合される（たとえば、図３Ａ〜３Ｄおよび図５Ａ〜５Ｅを参照）。個々の区画は、接続デバイスと接続されて、これらの区画の間で混合物を往復させることによって混合が達成されてもよい。
【００２０】
トロンビン前駆体は、プロトロンビンであってよい。プロトロンビンは、第Ｖａ因子および第Ｘａ因子を含む複合体によって活性化される。
【００２１】
上述される成分の混合は、１５℃〜４０℃など、好ましくは２０℃〜３７℃などの周囲温度において行なってよい。
【００２２】
成分３および成分２を含む混合物、または成分３および成分１を含む混合物などの、２種の成分の混合物は、混合後、上限５日間にわたって、２℃〜３０℃において保存してよい。
【００２３】
好ましくは、これらの成分を混合する前の初期フィブリノゲン濃度は、成分溶液１ｍＬあたり１０〜２００ｍｇ、より好ましくは成分溶液１ｍＬあたり３０〜１５０ｍｇ、最も好ましくは成分溶液１ｍＬあたり７２〜１１０ｍｇであり、初期トロンビンは、成分溶液１ｍＬあたり０．１〜１５００ＩＵ、より好ましくは成分溶液１ｍＬあたり０．５〜５００ＩＵ、最も好ましくは成分溶液１ｍＬあたり２〜７ＩＵである。最終混合物中、フィブリノゲン濃度は、フィブリンマトリックス１ｍＬあたり８〜１６０ｍｇ、より好ましくはフィブリンマトリックス１ｍＬあたり２５〜１００ｍｇ、最も好ましくはフィブリンマトリックス１ｍＬあたり３０〜６０ｍｇである。最終混合物中のトロンビン濃度は、フィブリンマトリックス１ｍＬあたり０．０５〜１００ＩＵ、より好ましくはフィブリンマトリックス１ｍＬあたり０．２〜２０ＩＵ、最も好ましくはフィブリンマトリックス１ｍＬあたり１〜４ＩＵである。Ｉ．Ｕ．はトロンビンの１国際単位を表し、第一次国際標準ヒトトロンビン０．０８５３ｍｇ中に含まれる活性として定義される。
【００２４】
また、カルシウム源は、典型的には、これらの成分のうち少なくとも１種の中に存在する。カルシウム源の提供は、トロンビンによる第ＸＩＩＩ因子の活性化にとって必要である。第１の成分、第２の成分、または第３の成分は、カルシウム源をさらに含んでよい。好ましくは、カルシウム源は塩化カルシウムであり、最も好ましくは水和形態（ＣａＣｌ2＊２Ｈ2Ｏ）である。好ましくは、塩化カルシウム濃度は、フィブリンマトリックス１ｍＬあたり０．５〜５ｍｇ、より好ましくは１ｍＬあたり１．５〜３．５ｍｇ、最も好ましくは１ｍＬあたり２．５〜３ｍｇである。成分溶液の１つにおけるカルシウムイオン源の濃度は、典型的には、成分溶液１ｍｌあたり１〜１０ｍｇ、さらにより好ましくは成分溶液１ｍｌあたり３〜７ｍｇ、最も好ましくは成分溶液１ｍｌあたり５〜６ｍｇの範囲内である。
【００２５】
第１の成分溶液中、好ましくはトランスグルタミナーゼ（たとえば、第ＸＩＩＩａ因子）またはトランスグルタミナーゼ前駆体（たとえば、第ＸＩＩＩ因子）の濃度範囲は、トランスグルタミナーゼの場合には成分溶液１ミリリットルあたり０．１〜１００Ｉ．Ｕ．である、またはトランスグルタミナーゼ前駆体の場合には活性化時に当該活性範囲のトランスグルタミナーゼが生成されるような濃度であり、より好ましくは、トランスグルタミナーゼの場合には成分溶液１ミリリットルあたり０．５〜６０Ｉ．Ｕ．である、またはトランスグルタミナーゼ前駆体の場合には活性化時に当該活性範囲のトランスグルタミナーゼが生成されるような濃度であり、最も好ましくは、トランスグルタミナーゼの場合には成分溶液１ミリリットルあたり１〜１０Ｉ．Ｕ．である、またはトランスグルタミナーゼ前駆体の場合には活性化時に当該活性範囲のトランスグルタミナーゼが生成されるような濃度である。
【００２６】
これらの成分を上限５日間という時間枠内において混合することにより、各成分の分解、特に融合ペプチドの分解が回避されるという利点が得られる。また、融合ペプチドのフィブリンマトリックスへの結合効力が、予め混合する手順の場合と同じであることが観察される（実施例２）。
【００２７】
Ｉ．Ａ  ＰＴＨ融合ペプチド
ＰＴＨ融合ペプチドは少なくとも２つのドメインを含んでおり、第１のドメインはＰＴＨを含み、第２のドメインは架橋性基質ドメインを含む。融合ペプチドの第１のドメイン中においてＰＴＨを使用する１つの利点は、骨組織の再生の改善に見い出され得る。ＰＴＨは、骨の再構築を調節し、続いて骨密度を増大させ得る。
【００２８】
架橋性基質ドメインは、好ましくは、その形成中または形成後に、共有結合によってフィブリンマトリックスに架橋できる。架橋性基質ドメインは、好ましくは、酵素のためのドメイン、好ましくはトランスグルタミナーゼのための基質ドメイン（「トランスグルタミナーゼ基質ドメイン」）である。ＰＴＨ融合ペプチドは、組換えによってまたは化学合成によって生成されてよい。ＰＴＨ融合ペプチドは、好ましくは、化学合成によって生成される。また、ＰＴＨ融合ペプチドのアミノ酸配列は、酵素切断部位または加水切断部位をも含んでよく、これにより、ＰＴＨが、その一次構造の変化をほとんどまたは全く伴わずに放出され得る。
【００２９】
Ｉ．Ａ．１  ＰＴＨ
ＰＴＨ融合ペプチドの第１のドメイン中のＰＴＨは、ＰＴＨ１−８４、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１、またはＰＴＨ１−２５、または骨形成特性を示すＰＴＨの任意の変化型もしくはアレル型であってよい。ＰＴＨ１−８４は、骨形成特性を示しかつ骨組織再生を誘発するヒト配列を指し、数値の小さいものは、ＰＴＨの切断型、変化型、およびアレル型を示す。
【００３０】
好ましいＰＴＨ切断型は、ＰＴＨ１−３８、ＰＴＨ１−３４、ＰＴＨ１−３１、またはＰＴＨ１−２５である。最も好ましくはＰＴＨ１−３４である。好ましくは、ＰＴＨはヒトＰＴＨであるが、ウシＰＴＨなどの他の供給源に由来するＰＴＨも好適であり得る。
【００３１】
Ｉ．Ａ．２  トランスグルタミナーゼ基質ドメイン
トランスグルタミナーゼは、タンパク質結合グルタミニル残基のガンマ−カルボキサミド基とリシン残基のイプシロン−アミノ基との間のアシル基転移反応を触媒し、その結果、Ｎ−イプシロン−（ガンマ−グルタミル）リシンイソペプチド側鎖の架橋が形成される。好ましくは、トランスグルタミナーゼ基質ドメインは、組織トランスグルタミナーゼの基質（「組織トランスグルタミナーゼ基質ドメイン」）である。好ましい一実施形態において、基質ドメインは、第ＸＩＩＩａ因子のための基質ドメイン（「第ＸＩＩＩａ因子基質ドメイン」）である。
【００３２】
好ましくは、トランスグルタミナーゼ前駆体は、第ＸＩＩＩ因子である。第ＸＩＩＩ因子は、トロンビンと混合されると、トロンビンのタンパク質分解によって活性化されて、第ＸＩＩＩａ因子となり得る。トロンビンは、さらに、フィブリノゲンを切断してフィブリンとすることによって、反応を開始させる。次いで、第ＸＩＩＩａ因子がフィブリンを共有結合的に架橋して、フィブリンマトリックスが形成される。
【００３３】
トランスグルタミナーゼ基質ドメイン、特に第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインは、フィブリンマトリックス形成中にフィブリンマトリックスにＰＴＨ融合ペプチドを結合するのに好適である。また、共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質ドメインを第２のドメイン中に含むＰＴＨ融合ペプチドも、トランスグルタミナーゼ第ＸＩＩＩａ因子によってフィブリンに共有結合的に架橋されてよい。
【００３４】
本明細書中において記載されるＰＴＨ融合ペプチドの生成において使用するのに好適なトランスグルタミナーゼ基質ドメイン（そのアミノ酸配列を含む）は、ＷＯ０３／０５２０９１（配列表）中に詳細に記載されており、その内容を引用により本明細書に援用する。
【００３５】
架橋性基質ドメインは、ＧＡＫＤＶ（配列番号１）、ＫＫＫＫ（配列番号２）、ＹＲＧＤＴＩＧＥＧＱＱＨＨＬＧＧ（配列番号３）、またはＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号４）を含んでよい。
【００３６】
好ましい第ＸＩＩＩａ因子基質ドメインは、アミノ酸配列ＮＱＥＱＶＳＰＬ（配列番号４）を有する（本明細書中において「ＴＧ」と示される）。
【００３７】
Ｉ．Ａ．３  融合ペプチドの切断部位
融合ペプチドは、第１のドメインと第２のドメインとの間に、切断（または分解）部位、好ましくは酵素切断（または分解）部位をさらに含んでよい。当該切断部位により、ＰＴＨが、一次ペプチド配列の変化をほとんどまたは全く伴わずに、放出され得る。
【００３８】
酵素切断部位は、それぞれの酵素によって認識される特定のアミノ酸配列を含んでよい。上記ドメイン中における当該配列は、細胞遊走に関与する酵素の基質（たとえば、コラゲナーゼ、プラスミン、マトリックスメタロプロテイナーゼ、またはエラスターゼなどの酵素の基質）であるが、好適なドメインはこうした配列に限定されない。好ましくは、酵素切断部位は、プラスミン切断部位である。プラスミノーゲン（プラスミンのプロ酵素）は、フィブリノゲンに関連し得る。任意に、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体を含む成分（本明細書中において「第１の成分」と示される）は、プラスミノーゲンをさらに含む。
【００３９】
ｉ．酵素切断部位
好適なタンパク質分解切断部位は、コラゲナーゼ、プラスミン、エラスターゼ、ストロメライシン、またはプラスミノーゲン活性化因子のための基質を含む。基質の例が以下に列記される。Ｎ１〜Ｎ５は、タンパク質分解が生じる部位からタンパク質のアミノ末端に向かう方向において、１〜５位のアミノ酸を指す。Ｎ１’〜Ｎ４’は、タンパク質分解が生じる部位からタンパク質のカルボキシ末端に向かう方向において、１〜４位のアミノ酸を指す。
【００４０】
【表１】
2021516120.tif 000003
【００４１】
タンパク質分解のために使用できる酵素は、非常に多く存在する。好ましくは、切断部位は、プラスミンおよびマトリックスメタロプロテイナーゼなどの酵素によって切断可能である。
【００４２】
好ましい一実施形態において、配列ＹＫＮＲ（配列番号１３）が、第１のドメインと第２のドメインとの間に存在する。この配列は、プラスミンにより分解され得る。
【００４３】
好ましいＰＴＨ融合ペプチドは、ＴＧｐｌＰＴＨ1-34：ＮＱＥＱＶＳＰＬＹＫＮＲＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ（配列番号１４）である。
【００４４】
別の好ましいＰＴＨ融合ペプチドは、ＴＧ−ＰＴＨ1-34であり、これは、天然ＰＴＨの１〜３４位のアミノ酸とＴＧ（トランスグルタミナーゼ）基質ドメインとを含むが、分解部位は含まない：ＮＱＥＱＶＳＰＬＳＶＳＥＩＱＬＭＨＮＬＧＫＨＬＮＳＭＥＲＶＥＷＬＲＫＫＬＱＤＶＨＮＦ（配列番号１５）。
【００４５】
ｉｉ．加水分解部位
好適な非酵素分解基質は、酸または塩基に触媒される機序によって加水分解される任意の結合を含む。こうした基質は、乳酸またはグリコール酸のオリゴマーなどのオリゴエステルを含む。これらの材料の分解率は、オリゴマーの選択によって制御できる。好ましくは、融合ペプチドは、最終混合物中に、フィブリンマトリックス中０．０１〜２ｍｇ／ｍＬ、任意に、フィブリンマトリックス中０．０１〜１ｍｇ／ｍＬまたはフィブリンマトリックス中０．２〜０．７ｍｇ／ｍＬの濃度範囲内で含まれる。当該方法は、典型的には、無菌条件下において行なわれる。好ましくは、上述される成分は、予め包装されており、無菌的に混合される。これにより、生成物への混入に起因する感染が回避される。
【００４６】
ＩＩ．キット
さらに、上述される方法に係るフィブリンマトリックスを製造するためのパーツからなるキットも開示される。当該キットは、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体およびトランスグルタミナーゼまたはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む第１の成分、ならびに、トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む第２の成分、ならびに、第１のドメインと、第２ドメイン中の共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質とを含む融合ペプチドを含む第３の成分を含む。当該キットは、第１の成分、第２の成分、および第３の成分を混合するための少なくとも１つの接続デバイスをさらに含んでよい。このような接続デバイスは、独立したデバイスであってもよい、または、これらの成分のうち１種の入った容器の一部であってもよい。第３の成分は、第１の成分および第２の成分とは別個に提供される。
【００４７】
第１の成分および第２の成分とは別個に第３の成分を提供することにより、これらの成分の間の望ましくない接触（これにより、当該化合物同士が互いに相溶しないために分解が生じる）が回避される。キットは、さらに、これらの成分を使用直前に混合することを可能とする。
【００４８】
好ましくは、第３の成分は、接続デバイスに直接または間接的に接続可能または接続された容器に入った状態で提供される。第３の成分の入った容器は、無菌包装または無菌化されていてよい。好ましくは、接続デバイスも無菌的に提供される。
【００４９】
この容器は、当技術分野において周知される材料で作られたシリンジ、バイアル、カートリッジ、またはバッグであってよい。
【００５０】
これらの成分の混合は、容器および接続デバイスの内容物を環境に曝露することなく行なわれ、混入のリスクが低減される。
【００５１】
第１の成分および第２の成分は、接続デバイスに接続可能な別々の容器に入った状態で提供されてよい。接続デバイスは、第１の成分の入った容器、第２の成分の入った容器、および第３の成分の入った容器が同時に接続デバイスに直接または間接的に接続できるように構築されてよい。このような接続デバイスは、独立したデバイスであってもよい、または、これらの成分のうち１種以上が入った容器の一部であってもよい。
【００５２】
接続デバイスは、成分の十分な混合に必要とされる容器および／またはさらなる接続デバイスの数に対応した、十分な数の開口部を含む。好ましくは、接続デバイスは、少なくとも１つのスロット、好ましくは１つ、２つ、または３つのスロットを含む。スロットは、接続デバイスの片側または接続デバイスの両側に配置されていてよい開口部である。スロットは、容器を直接または間接的に接続デバイスに連結できるように構成される。直接の接続または連結とは、当該スロットのうちの１つを介して容器が接続デバイスに繋がっていることを意味する。間接的な接続とは、たとえばアダプタやホースなどのさらなる接続デバイスを介して、容器が接続デバイスに接続されることを意味する。さらなる接続デバイスは、接続デバイスのスロットの１つに繋がっていてよい。また、接続デバイスは、容器のうちの１つの一部であって、たとえば、当該容器の開口部に配置されていてもよく、当該容器が、当該容器と第２の容器とを接続デバイスで接続するのに好適な構造を有していてもよい。
【００５３】
アダプタは接続デバイスの１つの型であり、一般的には中空状であって、典型的には、アダプタの両側に２つの開口部を含み、各開口部が、容器の開口部または別の接続デバイスの開口部に繋ぐのに好適な構成を有する。容器を接続デバイスの開口部に間接的に接続する際、当該開口部が、容器中の開口部に直接繋ぐのに好適な構成を有さない場合に、アダプタが使用されることが多い。たとえば、開口部がノズルの形状である場合、アダプタをその端部に繋ぐことにより、接続デバイスのノズルに容器を間接的に接続できる。また、アダプタは、２つの容器を互いに接続するためにも使用でき、この際には、１つの容器をアダプタの一方の側に繋ぎ、もう一方の容器を反対側に繋げばよい。アダプタの中には、アダプタを開閉するためのバルブを含むものもある。
【００５４】
接続デバイスは、一般的に中空状であり、開口部を含む。少なくとも第１の開口部は、第１の容器または第２の接続デバイスに繋げるのに好適であり、少なくとも第２の開口部は、第２の容器または第３の接続デバイスに繋げるのに好適である。任意に、接続デバイスは、上限４つの容器を直接または間接的に接続デバイスに接続するための開口部を有する。任意に、接続デバイスは、フィブリンマトリックスを接続デバイスの外に出して患者の表面に適用できるようにするための開口部を有する。任意に、接続デバイスは、開口部の一方または両方を開閉するためのバルブまたは機構を含む。任意に、接続デバイスは、これらの成分の混合を容易にするためのスタティックミキサーを含む。任意に、接続デバイスは、１種以上の成分を入れる容器の一部である。この実施形態において、接続デバイスの一端は、この容器に直接繋がっており、たとえば、接続デバイスの一端がこの容器と一体化していて開口部として働いてよい。
【００５５】
これらの成分を、別々の容器（または、同じ容器中の別々の区画、または接続デバイスに繋いだ別々の区画）の中に入れて提供することによって、混入、またはこれらの成分が不要に予め混合されることが回避される。
【００５６】
代替的には、第１の成分および第２の成分は、接続デバイスの別々の区画に入った状態、または接続デバイスに接続された別々の容器に入った状態で提供されてよい。第１の成分および第２の成分の混合を可能とするプランジャーがさらに提供されてもよい。接続デバイスは、第３の成分の入った容器を接続するためのスロットをさらに含んでよい。
【００５７】
接続デバイスの別々の区画の中に、または接続デバイスに接続された別々の容器の中に、第１の成分および第２の成分が前もって提供されることによって、包装材料の必要量が少なくて済み、接続デバイスの誤充填によって生じ得る混入が回避される。
【００５８】
好ましくは、各成分は別々の一次パッケージに入っており、第１の成分の一次パッケージ、第２の成分の一次パッケージ、第３の成分の一次パッケージ、および接続デバイスは、無菌化および無菌包装されている。一次パッケージは、成分と直接接触している容器または区画である。
【００５９】
また、骨の生成または骨折の治癒に使用するための、上述される方法によって得ることのできる融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスも開示される。
【００６０】
融合ペプチドは、上述される生理活性因子であるＰＴＨを含んでよい。このようなフィブリンマトリックスの利点は、骨形成を誘発する生理活性因子の放出による骨治癒能力の向上に見い出され得る。
【００６１】
好ましくは、上述される融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスは、骨折、骨嚢腫、または骨密度が低い状態の処置において使用され得る。任意に、フィブリンマトリックスは、骨粗鬆症患者における骨の処置において使用される。骨密度が低い状態は、個体における特定種類の骨（たとえば、脊椎、臀部など）の骨塩量を健康な３０歳成人の正常量と比較することによって特徴づけできる。健康な３０歳成人の平均よりも骨密度が低く、その差が１標準偏差を超える骨を有する個体は、骨密度が低いとみなされる。同じ試験により、健康な３０歳成人の平均よりも骨密度が低く、その差が２．５標準偏差を超える骨を有する個体は、骨粗鬆症であるとみなされる。
【００６２】
また、上述される融合ペプチドを含むフィブリンマトリックスは、１人の患者の２つ以上の骨を融合するための手順、たとえば、脊椎固定を受けている患者の脊椎の複数の部分を融合するための、または、足関節融合を受けている患者の複数の足関節骨を融合するための手順において使用されてもよい。
【００６３】
例示的な実施形態が図面中に記載されており、以下の通りである。
図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃは、本明細書中において記載される３つの例示的な方法の工程を示すフロー図である。
【００６４】
図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、および２Ｅは、本明細書中において記載される方法において、本発明に係る方法において使用される本発明に従って使用するための、４つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるものと、最終混合物を入れるもの）と、接続デバイスと、アダプタとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【００６５】
図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄは、本明細書中において記載される方法において使用するための、３つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるもの）とアダプタとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。
【００６６】
図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、および４Ｄは、本明細書中において記載される方法において使用するための、３つの容器（３種の成分のそれぞれを入れるもの）と接続デバイスとを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。任意に、当該キットは、１つまたは２つの空の容器、および３種の成分のさらなる混合のための第２の接続デバイス（ｃｏｍｍｅｎｔｉｎｇ  ｄｅｖｉｃｅ）、任意にアダプタをも含む。
【００６７】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、５Ｆ、および５Ｇは、第１の成分と第３の成分との混合物または第２の成分と第３の成分との混合物の入った第１の容器と、第１の成分のみまたは第２の成分のみの入った第２の容器とを含むパーツからなるキットの、例示的な実施形態を示す概略図である。また、このキットは、本明細書中において記載される方法において使用するための、接続デバイス、および、任意にアダプタなどの第２の接続デバイスをも含む。また、任意に、このキットは、３種の成分のさらなる混合のための、１つまたは２つの空の容器（１６および１７）、およびアダプタなどの第２の接続デバイスをも含む。
【００６８】
図１は、本明細書中において記載される通りにフィブリンマトリックスを製造するための３つの混合オプションを示す。図１Ａ中、第１の成分１および第２の成分２が提供されている。第１の成分１は、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体およびトランスグルタミナーゼまたはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む。第２の成分は、トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む。第１の成分１と第２の成分２とが混合されて、混合物４が得られる。この混合物４に、第１のドメインと、第２ドメイン中の共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質ドメインとを有する融合ペプチドを含む第３の成分３が添加されて、フィブリンマトリックス５が形成される。
【００６９】
図１Ｂおよび図１Ｃ中には、これらの成分を混合するための２通りの順序が提供される。図１Ｂ中では、第１の成分１が第３の成分３と混合されて、混合物４’となる。この混合物４’に第２の成分２が添加されて、フィブリンマトリックス５が形成される。図１Ｃ中では、第２の成分２と第３の成分３とが混合されて混合物４’’が得られる。この混合物４’’に第１の成分１が添加されて、フィブリンマトリックス５が形成される。
【００７０】
第１の成分１、第２の成分２、および第３の成分３を混合する順序とは独立して、図１Ａ、１Ｂ、および１Ｃ中における３種の成分すべてを混合する時間は５日を超えない。
【００７１】
図２Ａ、２Ｂ、２Ｃ、２Ｄ、および２Ｅ中に、パーツからなるキット、および本明細書中において記載される方法におけるその使用が示される。このキットは図２Ａ中に示され、第１の成分の入った第１の容器（１１）と、第２の成分の入った第２の容器（１２）とを含む。また、第３の成分の入った第３の容器（１３）も提供される。第１の成分は、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体およびトランスグルタミナーゼまたはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む。第２の成分は、トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む。第３の成分は、ＴＧｐｌＰＴＨ1-34などのＰＴＨ融合ペプチドを含み、ＰＴＨ1-34は、切断型のＰＴＨの活性因子であり、ｐｌはプラスミン切断部位であり、ＴＧは第２のドメイン中の共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質である。このキットは、３つのスロット１４’、１４’’、および１４’’’を有する接続デバイス１４をさらに含み、これらのスロットに、図２Ｂ〜２Ｄ中にさらに記載されるように、３つの容器１１、１２、および１３が接続されてよい。さらに、空の容器１６と、アダプタ１５などの第２の接続デバイスとが提供されてもよい。
【００７２】
図２Ｂ中には、容器を接続するための第１の手法が提供される。容器１１および１２は、スロット１４’および１４’’のそれぞれを介して、接続デバイス１４に直接接続される。容器１３は、アダプタ１５などの第２の接続デバイスによって、接続デバイスのスロット１４’’’に接続される。容器１１および１２の内容物を接続デバイス１４中に同時に押し出して、アダプタ１５を通過させることによって、第１の成分と第２の成分との混合物が、容器１３に入った第３の成分へと移される。
【００７３】
図２Ｃ中には、容器を接続するための第２の手法が提供される。容器１１および１３は、スロット１４’および１４’’のそれぞれを介して、接続デバイス１４に直接接続される。容器１２は、アダプタ１５などの第２の接続デバイスによって、接続デバイスのスロット１４’’’に接続される。容器１１および１３の内容物を接続デバイス１４中に同時に押し出して、アダプタ１５を通過させることによって、第１の成分と第３の成分との混合物が、容器１２に入った第２の成分へと移される。
【００７４】
図２Ｄ中には、容器を接続するための第３の手法が提供される。容器１２および１３は、スロット１４’および１４’’のそれぞれを介して、接続デバイス１４に直接接続される。容器１１は、アダプタ１５などの第２の接続デバイスによって、接続デバイスのスロット１４’’’に接続される。容器１２および１３の内容物を接続デバイス１４中に同時に押し出して、アダプタ１５を通過させることによって、第２の成分と第３の成分との混合物が、容器１１に入った第１の成分へと移される。
【００７５】
図２Ｂ中の容器１１および１２、図２Ｃ中の容器１１および１３、ならびに図２Ｄ中の容器１２および１３は、たとえば２つの外筒を備えたシリンジの形状などのように、１つのデバイスにおける２つの区画として提供されてよいことが理解される。図２Ｂ〜２Ｄ中に示される各容器は、図２Ｂ〜２Ｄ中に示されるように、アダプタ１５などの第２の接続デバイスによって、スロット１４’’’に間接的に接続されてよい。代替的には、接続デバイス１４のスロット１４’’’は、アダプタなどの第２の接続デバイスを含んでよく、これにより、各容器への直接の接続を可能としてもよい。また、図２Ｂ〜２Ｄ中に示される構成は、キット内で前もって一部または完全に組み立てられた状態で提供されてもよい。
【００７６】
図２Ｅは、３種の成分をさらに混合するための方法を示す。このようなさらなる混合は、必要である場合もあるし、または、不要である場合もある。図２Ｅ中に示される方法は、さらなる混合の方法の１つを示すが、これが唯一の方法ではない。当該方法においては、接続デバイス１４が空の容器１６で置き換わっており、３種の成分の混合物の入った容器（図２Ｂ中に記載される混合方法については容器１３、図２Ｃ中に記載される混合方法については容器１２、および図２Ｄ中に記載される混合方法については容器１１）に圧力をかけることによって、その内容物が容器１６の中に押し出されて、すべての成分がより良好に混合される。３種の成分の混合物を押して、矢印で示されるように２つの接続された容器の間で往復させることによって、この混合物の均質性が増大し得る。
【００７７】
最後に、フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物の入った容器（すなわち、使用される方法に依存して、容器１１、１２、１３、または１６）が、アダプタ１５から外され、その内容物が、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用される。
【００７８】
図２Ｂ〜２Ｅ中、これらの容器の内容物は、プランジャー、または内容物を容器の外に押し出すための任意の他の好適な機構を使用して、排出されてよい。
【００７９】
図３Ａ、３Ｂ、３Ｃ、および３Ｄ中には、パーツからなるキット、および本明細書中において記載される方法におけるその使用が示される。図３Ａ中に示されるキットは、第１の成分の入った第１の容器（１１）と、第２の成分の入った第２の容器（１２）とを含む。また、第３の成分の入った第３の容器（１３）も提供される。第１の成分は、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体およびトランスグルタミナーゼまたはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む。第２の成分は、トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む。第３の成分は、ＴＧｐｌＰＴＨ1-34などのＰＴＨ融合ペプチドを含み、ＰＴＨ1-34は、切断型のＰＴＨの活性因子であり、ｐｌはプラスミン切断部位であり、ＴＧは第２のドメイン中の共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質である。このキットは、アダプタ１５などの接続デバイスをさらに含む。
【００８０】
図３Ｂ中には、容器の内容物を混合するための第１の方法が提供される。容器１１および１３は、アダプタ１５などの接続デバイスによって接続される。容器１１の内容物が容器１３に移され（または、その逆）、これによって、これら２つの容器の内容物が混合される。これら２種の成分の混合物を押して、矢印で示されるように２つの接続された容器の間で往復させることによって、この混合物の均質性が増大し得る。次いで、第１の成分と第３の成分との混合物の入った容器（すなわち、容器１１または容器１３のいずれか）がアダプタ１５によって容器１２に接続されて、第１の成分と第３の成分との混合物が第２の成分と混合される。３種の成分の混合物を押して、矢印で示されるように２つの接続された容器の間で往復させることによって、この混合物の均質性が増大し得る。最後に、フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物の入った容器が、アダプタ１５から外され、その内容物が、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用される。
【００８１】
図３Ｃ中には、容器の内容物を混合するための第２の方法が提供される。容器１１および１２は、アダプタ１５などの接続デバイスによって接続される。容器１１の内容物が容器１２に移され（または、その逆）、これによって、これら２つの容器の内容物が混合される。これら２種の成分の混合物を押して、矢印で示されるように２つの接続された容器の間で往復させることによって、この混合物の均質性が増大し得る。次いで、第１の成分と第２の成分との混合物の入った容器（すなわち、容器１１または容器１２のいずれか）がアダプタ１５によって容器１３に接続されて、第１の成分と第２の成分との混合物が第３の成分と混合される。３種の成分の混合物を押して、矢印で示されるように２つの接続された容器の間で往復させることによって、この混合物の均質性が増大し得る。最後に、フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物の入った容器が、アダプタ１５から外され、その内容物が、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用される。
【００８２】
図３Ｄ中には、容器の内容物を混合するための第３の方法が提供される。容器１２および１３は、アダプタ１５などの接続デバイスによって接続される。容器１２の内容物が容器１３に移され（または、その逆）、これによって、これら２つの容器の内容物が混合される。これら２種の成分の混合物を押して、矢印で示されるように２つの接続された容器の間で往復させることによって、この混合物の均質性が増大し得る。次いで、第２の成分と第３の成分との混合物の入った容器（すなわち、容器１１または容器１３のいずれか）がアダプタ１５によって容器１１に接続されて、第２の成分と第３の成分との混合物が第１の成分と混合される。３種の成分の混合物を押して、矢印で示されるように２つの接続された容器の間で往復させることによって、この混合物の均質性が増大し得る。最後に、フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物の入った容器が、アダプタ１５から外され、その内容物が、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用される。
【００８３】
図３Ｂ〜３Ｄ中、これらの容器の内容物は、プランジャー、または容器から排出するための任意の他の好適な機構を使用して、排出されてよい。図３Ｂ〜３Ｄ中に示される構成は、キット内で前もって一部または完全に組み立てられた状態で提供されてもよいことが理解される。
【００８４】
図４Ａ、４Ｂ、４Ｃ、および４Ｄ中には、パーツからなるキット、および本明細書中において記載される方法におけるその使用が示される。図４Ａ中に示されるキットは、第１の成分の入った第１の容器（１１）と、第２の成分の入った第２の容器（１２）と、第３の成分の入った第３の容器（１３）とを含む。第１の成分は、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体およびトランスグルタミナーゼまたはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む。第２の成分は、トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む。第３の成分は、ＴＧｐｌＰＴＨ1-34などのＰＴＨ融合ペプチドを含み、ＰＴＨ1-34は、切断型のＰＴＨの活性因子であり、ｐｌはプラスミン切断部位であり、ＴＧは第２のドメイン中の共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質である。
【００８５】
このキットは、３つの容器１１、１２、および１３が接続され得る３つのスロット（１４’、１４’’、および１４’’’）と、空の容器が直接または間接的に接続され得る、または図４Ｂ中に示されるように３種の成分の混合物を放出するために使用できる、第４のスロット１４’’’’と、を有する接続デバイス１４をさらに含む。さらに、３種の成分のさらなる混合のために、１つまたは２つの空の容器１６および／または１７と、アダプタ１５などの第２の接続デバイスとが提供されてもよい。
【００８６】
図４Ｂ中には、容器の内容物を混合するための方法が提供される。容器１１、１２、および１３は、スロット１４’、１４’’、および１４’’’のそれぞれを介して、接続デバイス１４に直接接続される。容器１１、１２、および１３の内容物を接続デバイス１４中に同時に押し出すことによって、第１の成分、第２の成分、および第３の成分が混合される。フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物は、スロット１４’’’’を通して、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用されてよい。これらの容器の内容物は、プランジャー、または内容物を容器の外に押し出すための任意の他の好適な機構を使用して、排出されてよい。
【００８７】
図４Ｃは、３種の成分をさらに混合するための方法を示す。このようなさらなる混合は、必要である場合もあるし、または、不要である場合もあり、図４Ｃ中に示される方法は、さらなる混合方法の１つを示すが、これが唯一の方法ではない。当該方法においては、空の容器１６が、アダプタ１５などの第２の接続デバイスによってスロット１４’’’’に接続され、容器１１、１２、および１３に圧力をかけることによって、それらの内容物が、接続デバイス１４を通って、容器１６に移される。３種の成分の混合物の入った容器１６は、接続デバイスから外されて、フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物を投与するために使用されてもよい。フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物は、容器１６中の開口部を通して、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用されてよい。この容器の内容物は、プランジャー、または内容物を容器の外に押し出すための任意の他の好適な機構を使用して、排出されてよい。
【００８８】
任意に、図４Ｄ中に示されるように、接続デバイスがアダプタから外され、次いで、空の容器１７がアダプタ１５と接続される。その結果、容器１６がアダプタ１５の一端に繋がり、容器１７がアダプタ１５のもう一方の端に繋がる。３種の成分の混合物を押して、矢印で示されるように２つの接続された容器の間で往復させることによって、この混合物の均質性が増大し得る。最後に、フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物の入った容器（容器１６または容器１７のいずれか）が、アダプタ１５から外され、その内容物が、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用される。
【００８９】
図４Ａおよび４Ｂ中の容器１１、１２、および１３は３つの外筒を備えたシリンジとして提供されてもよいことが理解される。図４Ｃ中に示されるように、空の容器１６がアダプタ１５によって１４’’’’に間接的に接続されてもよい、または、接続デバイス１４のスロット１４’’’’がそれ自体、容器１６を接続デバイスのスロット１４’’’に直接接続できるよう好適に構成されていてもよい。また、図４Ｂ中に示される構成は、キット内で前もって一部または完全に組み立てられた状態で提供されてもよい。
【００９０】
図５Ａ、５Ｂ、５Ｃ、５Ｄ、５Ｅ、５Ｆ、および５Ｇ中に、パーツからなるキット、および本明細書中において記載される方法におけるその使用が示される。このキットの異なる形状が、図５Ａおよび５Ｂ中に示される。５Ａは、第１の成分と第３の成分との混合物（１／３）の入った第１の容器１８と、第２の成分（２）の入った第２の容器１９とを含む第１のキットを示す。第１の成分は、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体およびトランスグルタミナーゼまたはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む。第２の成分は、トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む。第３の成分は、ＴＧｐｌＰＴＨ1-34などのＰＴＨ融合ペプチドを含み、ＰＴＨ1-34は切断型のＰＴＨの活性因子であり、ｐｌはプラスミン切断部位であり、ＴＧは第２のドメイン中の共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質である。このキットは、３つのスロット（１４’、１４’’、および１４’’’）を有する接続デバイス１４をさらに含んでよく、ここで、２つの容器１８および１９はスロットのうち２つ（１４’、１４’’）に接続されてよく、空の容器１６が第３のスロット１４’’’に直接または間接的に接続されてよい、または、第３のスロット１４’’’が、図５Ｃ中にさらに記載されるように、３種の成分の混合物を放出するために使用されてよい。さらに、１つまたは２つの空の容器１６および１７と、アダプタ１５などの第２の接続デバイスとが、これらの成分を混合するために、または、図５Ｄおよび５Ｇ中に示されるようにこれらの成分をさらに混合するために、提供されてもよい。
【００９１】
図５Ｂは、第１の成分（１）の入った第１の容器１９と、第２の成分と第３の成分との混合物（２／３）の入った第２の容器１８とを含む第２のキットを示す。第１の成分は、フィブリノゲンまたはフィブリノゲン前駆体およびトランスグルタミナーゼまたはトランスグルタミナーゼ前駆体を含む。第２の成分は、トロンビンまたはトロンビン前駆体を含む。第３の成分は、ＴＧｐｌＰＴＨ1-34などのＰＴＨ融合ペプチドを含み、ＰＴＨ1-34は切断型のＰＴＨの活性因子であり、ｐｌはプラスミン切断部位であり、ＴＧは第２のドメイン中の共有結合架橋性トランスグルタミナーゼ基質である。このキットは、３つのスロット（１４’、１４’’、および１４’’’）を有する接続デバイス１４をさらに含んでよく、ここで、２つの容器１８および１９はスロットのうち２つ（１４’、１４’’）に接続されてよく、空の容器が第３のスロット１４’’’に直接または間接的に接続されてよい、または、第３のスロット１４’’’が、図５Ｃおよび５Ｅ中にさらに記載されるように、３種の成分の混合物を放出するために使用されてよい。さらに、１つまたは２つの空の容器１６および１７と、アダプタ１５などの第２の接続デバイスとが、これらの成分を混合するために、または、図５Ｆおよび５Ｇ中に示されるようにこれらの成分をさらに混合するために、提供されてもよい。
【００９２】
図５Ｃ中には、図５Ａ中に示されるキットの容器の内容物を混合するための第１の方法が提供される。混合物（１／３）の入った容器１８と第２の成分（２）の入った容器１９とは、スロット１４’および１４’’のそれぞれを介して、接続デバイス１４に直接接続される。容器１８および１９の内容物を第１の接続デバイス１４の中に同時に押し出すことによって、第１の成分、第２の成分、および第３の成分が混合される。フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物は、スロット１４’’’を通して、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用されてよい。代替的には、３種の成分は、図５Ｇ中に記載の通りに適用されるよりも前に、さらに混合されてもよい。
【００９３】
図５Ｄ中には、図５Ａ中に示されるキットの容器の内容物を混合するための第２の方法が提供される。混合物（１／３）の入った容器１８と第２の成分（２）の入った容器１９とは、アダプタ１５などの接続デバイスによって、互いに直接接続される。容器１８の内容物が容器１９に移され（または、その逆）、これによって、これら２つの容器の内容物が混合される。３種の成分の混合物を押して、矢印で示されるように２つの接続された容器の間で往復させることによって、この混合物の均質性が増大し得る。最後に、フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物の入った容器が、アダプタ１５から外され、その内容物が、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用される。
【００９４】
図５Ｅ中には、図５Ｂ中に示されるキットの容器の内容物を混合するための第１の方法が提供される。混合物（２／３）の入った容器１８と第１の成分（１）の入った容器１９とは、スロット１４’および１４’’のそれぞれを介して、接続デバイス１４に直接接続される。容器１８および１９の内容物を接続デバイス１４中に同時に押し出すことによって、第１の成分、第２の成分、および第３の成分が混合される。フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物は、スロット１４’’’を通して、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用されてよい。代替的には、３種の成分は、図５Ｇ中に記載の通りに適用されるよりも前に、さらに混合されてもよい。
【００９５】
図５Ｆ中には、図５Ｂ中に示されるキットの容器の内容物を混合するため第２の方法が提供される。混合物（２／３）の入った容器１８と第１の成分（１）の入った容器１９とは、アダプタ１５などの接続デバイスによって、互いに直接接続される。容器１８の内容物が容器１９に移され（または、その逆）、これによって、これら２つの容器の内容物が混合される。３種の成分の混合物を押して、矢印で示されるように２つの接続された容器の間で往復させることによって、この混合物の均質性が増大し得る。最後に、フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物の入った容器が、アダプタ１５から外され、その内容物が、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用される。
【００９６】
図５Ｇは、図５Ｃおよび５Ｅ中に示される方法によって生成した３種の成分をさらに混合するための方法を示す。このようなさらなる混合は、必要である場合もあるし、または、不要である場合もあり、図５Ｇ中に示される方法は、さらなる混合方法の１つを示すが、これが唯一の方法ではない。当該方法においては、空の容器１６が、アダプタ１５などの第２の接続デバイスによってスロット１４’’’に接続され、図５Ｃ中に示される方法のためにまたは図５Ｅ中に示される方法のために、容器１１８および１９に圧力をかけることによって、それらの内容物が第１の接続デバイス１４を通って容器１６に移される。次いで、第１の接続デバイス１４がアダプタ１５から外されて、代わりに、空の容器１７がアダプタ１５に繋げられる。その結果、３種の成分の混合物の入った容器１６が、アダプタ１５などの第２の接続デバイスの一端に接続され、第２の接続デバイス（たとえば、アダプタ１５）の反対側の端が空の容器１７に接続される。３種の成分の混合物を押して、矢印で示されるように２つの接続された容器の間で往復させることによって、この混合物の均質性が増大し得る。最後に、フィブリンマトリックスを形成するための最終混合物の入った容器がアダプタ１５から外され、その内容物が、ｉｎ  ｓｉｔｕにて、体内で、または身体に接した状態で、または体外で適用される。
【００９７】
図５Ａおよび５Ｂ中の容器１８および１９は、２つの外筒を備えたシリンジとして提供されてもよいことが理解される。図５Ｇ中に示されるように、空の容器１６がアダプタ１５などの第２の接続デバイスによって１４’’’に間接的に接続されていてもよい、または、代替的には、接続デバイス１４のスロット１４’’’がそれ自体、容器１６をスロット１４’’’に直接接続できるよう好適に構成されていてもよい。また、図５Ｃ〜５Ｇ中に示される構成は、キット内で前もって一部または完全に組み立てられた状態で提供されてもよい。
【００９８】
これらの容器の内容物は、プランジャー、または内容物を容器の外に押し出すための任意の他の好適な機構を使用して、排出されてよい。
【００９９】
実施例
実施例１：  室温保存されているフィブリノゲン中でのＴＧｐｌＰＴＨ1-34の経時的安定性
フィブリノゲン成分中におけるＴＧｐｌＰＴＨ1-34の経時的安定性を評価するために、ＴＧｐｌＰＴＨ1-34をフィブリノゲン溶液と混合して、室温で保存した。
【０１００】
ＴＧｐｌＰＴＨ1-34を濃度２６６μｇ／ｍｌにてフィブリノゲン溶液に添加して、室温で上限３４日間にわたってインキュベートした。指定の時点において試料を採取し、ＨＰＬＣによってＴＧｐｌＰＴＨ1-34濃度を求めた。簡潔には、関連物質を分離するためにＺｏｒｂａｘ  Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲＰ１８カラム（４．６×１５０ｍｍｍ、５μｍ、３００Ａ）を使用し、ＨＰＬＣ−ＵＶ法によってＴＧｐｌＰＴＨ1-34を定量した。溶出液Ａとして０．１％ＴＦＡ、１％ＡＣＮの水溶液を使用し、溶出液Ｂとして０．１％ＴＦＡのＡＣＮ溶液を使用した。勾配は、０分  ２６％Ｂ、１５分  ３８％Ｂ、１８分  ９０％Ｂ、２２分  ２６％Ｂ、２４分  ２６％Ｂとした。注入した体積は２０μｌであり、流速は１ｍｌ／分とした。カラム温度は３５℃であった。参照標準を使用して検量線を作成した。
【０１０１】
室温（２０〜２５℃）で上限３４日間にわたって保存したフィブリノゲン中におけるＴＧｐｌＰＴＨ1-34の安定性を分析した結果が、表２中に示される。
【０１０２】
【表２】
2021516120.tif 000004
【０１０３】
表２中に示されるように、ＴＧｐｌＰＴＨ1-34は、室温でフィブリノゲン溶液に曝露されると急速に分解した。フィブリンシーラントの製造に必要とされる時間枠内（３〜５日）において、生成物の４．３〜７．８％が既に分解していた。５日後、分解物の量は、最終生成物の適用に許容される範囲を外れたレベルに達する。ＴＧｐｌＰＴＨ1-34は、フィブリノゲンと混合できず、フィブリンシーラントの製造に使用されるプロセスにおいて混合後に５日を超えると使用できない。
【０１０４】
実施例２：異なる調製方法を使用した場合のＴＧｐｌＰＴＨ1-34のフィブリンへの共有結合の比較
２通りの異なる方法によって調製したフィブリンマトリックスにおいて、ＴＧｐｌＰＴＨ1-34のフィブリンマトリックスへの共有結合の割合を、間接的アッセイを使用して求めた。このアッセイによって、マトリックスから洗浄除去できる非共有結合ＴＧｐｌＰＴＨ1-34を求める。第１の方法（予め混合）において、フィブリンシーラントＡＲＴＩＳＳ（登録商標）の２種の成分を解凍して、ＴＧｐｌＰＴＨ1-34をフィブリノゲン成分と濃度２ｍｇ／ｍｌにて予め混合した。混合直後、フィブリンシーラントの２種の成分を再び凍結して、−２０℃において保存した。次いで、試料を解凍して、シーラントの２種の成分を混合した。混合したフィブリンシーラント中におけるＴＧｐｌＰＴＨ1-34の最終濃度は、１ｍｇ／ｍｌであった。
【０１０５】
第２の方法においては、２種のフィブリンシーラント成分を、水に溶解したＴＧｐｌＰＴＨ1-34と直接混合して、最終濃度１ｍｇ／ｍｌとした（図１Ａを参照）。
【０１０６】
これら２通りの方法において、フィブリンマトリックスに共有結合しているＴＧｐｌＰＴＨ1-34の量を評価するために、当該２通りの方法のいずれかによって調製した試料を保持アッセイに供した。試料の５０μｌを１．５ｍｌエッペンドルフチューブに入れた。次いで、フィブリンマトリックスを３７℃において１時間インキュベートした。プロテアーゼ阻害剤（Ｒｏｃｈｅ  Ｃａｔ＃１１８３６１５３００１  ｃＯｍｐｌｅｔｅ（商標）、Ｍｉｎｉ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｃｏ）を添加した抽出バッファー（５０ｍＭトリス  ｐＨ９．４、１Ｍ  ＮａＣｌ、０．１％  Ｔｗｅｅｎ２０）１．５ｍｌを添加することによって、フィブリンマトリックスから非結合ＴＧｐｌＰＴＨ1-34を抽出し、常時振とうしながらインキュベートした。３時間後に上清を採取し、新しい抽出バッファー１．５ｍｌをフィブリンマトリックスに添加した。この抽出工程を、６、２４、３０、および４８時間後に繰り返した。採取した上清を、さらなる処理を行なうまで、−２０℃において保存した。
【０１０７】
非結合ＴＧｐｌＰＴＨ1-34の量を求めるために、５つの採取上清を解凍してプールした。市販のＰＴＨ1-34ＥＬＩＳＡキット（Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ、Ｃａｔ♯６０−３９００）を使用して、製造元の推奨通りにＥＬＩＳＡを行なうことによって、プール中のＴＧｐｌＰＴＨ1-34を求めた。両調製方法につき、独立した実験を２回行なって（フィブリンマトリックス１つあたり、かつ実験１回あたり、試料３つ）、フィブリンマトリックスに結合していないＴＧｐｌＰＴＨ1-34の量を求めた。これらの実験の結果が表３中に示される。
【０１０８】
【表３】
2021516120.tif 000005
【０１０９】
表３中に示されるように、驚くことに、使用した２通りの方法において、フィブリンマトリックスに結合していない量が非常に類似していることが見いだされた。よって、上述される２通りの混合方法は、ＴＧｐｌＰＴＨ1-34のフィブリンマトリックスへの結合が類似している。
【図１Ａ】
2021516120.tif 000006
【図１Ｂ】
2021516120.tif 000007
【図１Ｃ】
2021516120.tif 000008
【図２Ａ】
2021516120.tif 000009
【図２Ｂ】
2021516120.tif 000010
【図２Ｃ】
2021516120.tif 000011
【図２Ｄ】
2021516120.tif 000012
【図２Ｅ】
2021516120.tif 000013
【図３Ａ】
2021516120.tif 000014
【図３Ｂ】
2021516120.tif 000015
【図３Ｃ】
2021516120.tif 000016
【図３Ｄ】
2021516120.tif 000017
【図４Ａ】
2021516120.tif 000018
【図４Ｂ】
2021516120.tif 000019
【図４Ｃ】
2021516120.tif 000020
【図４Ｄ】
2021516120.tif 000021
【図５Ａ】
2021516120.tif 000022
【図５Ｂ】
2021516120.tif 000023
【図５Ｃ】
2021516120.tif 000024
【図５Ｄ】
2021516120.tif 000025
【図５Ｅ】
2021516120.tif 000026
【図５Ｆ】
2021516120.tif 000027
【図５Ｇ】
2021516120.tif 000028
【配列表】
2021516120000001.app
【国際調査報告】
2021516120.tif 000029
2021516120.tif 000030