(57)【要約】  本発明は、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物を有効成分として含むカフェインによる睡眠障害改善用組成物に関する。【選択図】図１２
2021520855.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物を含む、カフェインによる睡眠障害予防または改善用食品組成物。
【請求項２】
前記シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）は、ミカン、キンカン、マンダリン、タンジェリン、スウィーティー、シトロン、スダチ、せとか、カラマンシー、ザボン、シラヌヒ、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、ライム及び柚子から構成された群から選択される一つ以上である、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項３】
前記シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物は、ヘスペリジン及びナリルチンの中でいずれか一つ以上を含むものである、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項４】
前記抽出物は、水、アルコール、エチルアセテート、アセトン、核酸、ジクロロメタンまたはこれらの混合溶媒から抽出された請求項１に記載の食品組成物。
【請求項５】
前記食品組成物はコーヒーである、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項６】
前記食品組成物は食品添加剤である、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項７】
前記睡眠障害は、カフェインによる不眠症または概日リズム睡眠障害（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｒｈｙｔｈｍ  ｓｌｅｅｐ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）である、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項８】
シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物を含む、カフェインによる睡眠障害予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項９】
シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物を個体に投与する段階を含む、カフェインによる睡眠障害予防、改善または治療方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物を有効成分として含むカフェインによる睡眠障害改善用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
カフェイン（Ｃａｆｆｅｉｎｅ）は一部の植物の実、葉、種子などに含有されたアルカロイド（ａｌｋａｌｏｉｄ）の一種で、コーヒー実の種子、お茶の葉、カカオとコーラの実などに入っている。
【０００３】
カフェインは、コーヒー、チョコレート、コーラ、お茶、ソフトドリンク、強壮飲み物及び薬品など様々な食品に含有され、コーヒーはカフェインが含有されている食品の中で最も大衆的な飲み物として脚光を浴びている。
【０００４】
コーヒーは２００ｍＬを基準にしておおよそ５０〜１５０ｍｇのカフェインを含有している。コーヒーに含有されたカフェインは疲労回復及び覚醒作用などの効果を示すので、ストレスと疲労によって疲れ切った現代人は一日一杯以上のコーヒーを飲んでいる。
【０００５】
しかし、カフェインを大量服用したり、心身の弱い人がカフェインを服用する場合、不安、神経過敏、不眠症、頭痛、心臓の震え、心悸亢進などが発生することがある（韓国登録特許第１０‐１２６５２５３号）。
【０００６】
よって、カフェインによる睡眠障害などの副作用を最小化することができる新しい食飲製品を開発するために多くの研究が進められているが、大衆の嗜好を充たすためにカフェイン含量を維持しながらカフェインによる副作用を抑制することができる方法はいまだにない実情である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】韓国登録特許第１０‐１２６５２５３号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明の目的は、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物を含む、カフェインによる睡眠障害改善用食品組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物を含む、カフェインによる睡眠障害予防及び治療用薬学的組成物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
前記のような目的を達成するための本発明の一側面は、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物を含む、カフェインによる睡眠障害改善用食品組成物に関する。
【００１０】
前記「シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）」の辞典的意味はミカン科とのミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）、キンカン属（Ｆｏｒｔｕｎｅｌｌａ）、カラタチ属（Ｐｏｎｔｉｒｕｓ）の３属にわたる総括的名称であり、ナリンギン（Ｎａｒｉｇｉｎ）、ナリンゲニン（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）、ヘスペリジン（Ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）、タンゲレチン（Ｔａｎｇｅｒｅｔｉｎ）、ノビレチン（Ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）など様々な化合物を含む。
【００１１】
前記シトラスは、ミカン、キンカン、マンダリン、タンジェリン、スウィーティー、シトロン、スダチ、せとか、カラマンシー、ザボン、シラヌヒ、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、ライム、柚子などのシトラス系に含まれる果物、及びこれらの未熟果を称し、ミカン属（Ｃｉｔｒｕｓ）植物に属する限り特に制限されない。
【００１２】
前記シトラスに含有されたナリンギン（ｎａｒｉｎｇｉｎ）は、フラボノイド色素の配糖体として抗酸化作用、金属封鎖作用、アスコルビン酸相乗作用を通じて強力な静菌及び抗菌作用をするので、抗菌活性に優れる。
前記ナリンゲニン（Ｎａｒｉｎｇｅｎｉｎ）は、抗菌、抗ウイルス活性だけでなく、抗炎症、抗酸化、坑癌活性があるものとして知られている。
【００１３】
前記ヘスペリジン（Ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）は、脂質分解作用で血圧及び血糖を下げ、毛細管強化作用、脂肪代謝改善作用を通じて血中ＬＤＬコレステロール数値を下げるものとして知られている。
前記タンゲレチン（Ｔａｎｇｅｒｅｔｉｎ）は、神経保護作用とともに、抗炎症、抗酸化、坑癌活性があるものとして知られている。
【００１４】
前記ノビレチン（Ｎｏｂｉｌｅｔｉｎ）は脂質代謝を調節し、気管支平滑筋を弛緩させて喘息治療剤として効果があり、心臓疾患の予防効果があるものとして知られている。
【００１５】
前記「果皮」は果肉の外側を覆っている皮を意味するもので、植物学的な意味で外果皮（ｅｘｏｃａｒｐ）、中果皮（ｍｅｓｏｃａｒｐ）及び内果皮（ｅｎｄｏｃａｒｐ）に分けられ、本発明によるシトラスの果皮は、外果皮及び中果皮を称する。具体的に、本発明のシトラスの果皮は陳皮であってもよく、これに制限されるものではない。
【００１６】
本発明における「陳皮（Ｃｉｔｒｕｓ  Ｕｎｓｈｉｕ  Ｐｅｅｌ）」は、橘のよく実った皮と定義されている薬剤であって、果皮を乾燥させたものを言う。本発明において、陳皮と果皮は混用して使われてもよい。
【００１７】
本発明の一実施例では、ヘスピリジン、ナリルチンまたはこれらの混合物を処理した場合、カフェインによる神経活性が緩和または抑制されることを確認したところ（図９及び図１０）、具体的に前記シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物は、ヘスペリジン及びナリルチンの中でいずれか一つ以上を含むものであってもよい。
【００１８】
本発明における「抽出物」は、溶媒と抽出材料を特定条件下で接触させることで抽出材料に含有された有効成分を分離したものであって、前記抽出物はシトラス果皮抽出物に対する抽出工程によって原料内の有効成分を含むことができる。
【００１９】
前記シトラス果皮抽出物は、天産物から抽出物を抽出する当業界に公知された通常の方法によって、つまり、通常の温度、圧力の条件下で通常の溶媒を使って抽出することができる。
【００２０】
具体的に、前記シトラス果皮抽出物は、水、アルコール、エチルアセテートアセトン、核酸、ジクロロメタンまたはこれらの混合溶媒を使って抽出することができ、より具体的には水を使うことができる。
【００２１】
前記抽出方法は、熱水抽出、冷浸抽出、還流抽出、超音波抽出など様々な方法を利用することができ、好ましくは熱水抽出を利用することができるが、これに制限されない。
【００２２】
本発明のカフェイン（１，３，７‐ｔｒｉｍｅｔｎｙｌｘａｎｔｈｉｎｅ）は、中枢神経系統覚醒剤として広く使われる向精神性物質としてコーヒーの木、カカオ実などに存在し、コーラ、チョコレートなどにも含まれている。前記カフェインは、アデノシンとアデノシン受容体（Ａｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ１  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ及びＡｄｅｎｏｓｉｎｅ  Ａ２ａ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ）結合の抑制剤として作用する物質である。
前記アデノシンは神経調節者として神経伝達物質の生成抑制及びＧＡＢＡ（ガンマ‐アミノ酪酸）生成促進を通じて睡眠を促進し、覚醒を抑制する物質である。
【００２３】
前記ＧＡＢＡ（ガンマ‐アミノ酪酸）は、不安緩和、痙攣予防または改善、鎮静作用、及び睡眠誘導及び改善効果と関係あり、ＧＡＢＡの不活性化によって睡眠障害が発生することがある。
【００２４】
前記ＧＡＢＡとカフェインが一緒に作用すれば、カフェインの効果がより優れてカフェインによってアデノシン収容体が抑制されるし、抑制されたアデノシン受容体は神経伝達物質を過発現させてＧＡＢＡの生成を抑制する。
【００２５】
これによって、カフェインの適当な攝取は中枢神経系と末梢神経系を刺激して集中力向上、眠気防止に役立つが、攝取し過ぎる場合、神経過敏、興奮または不眠などの睡眠障害を引き起こし、内分泌系にも影響を及ぼすことがある。
【００２６】
前記シトラス果皮抽出物は、カフェインと競争的に作用してアデノシン受容体を拮抗させることによって神経活性物質の生成を抑制し、ＧＡＢＡの生成を効果的に増加させて抗不眠効果を具現することができる。前記「拮抗」は構造が類似な物質どうし限定された特定結合部位（ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅ）を取り囲んで競合することである。
【００２７】
本発明の一実施例では、陳皮の他、別の種類のシトラス果皮抽出物も神経活性を緩和させる効果があるか否かを確認した結果、陳皮抽出物と類似したり同等な水準で神経活性度合いが緩和されることを確認した。
【００２８】
また、具体的に、前記シトラス果皮抽出物はカフェインによる睡眠障害を予防または改善することができ、より具体的に、カフェインによる睡眠障害を最小化することができる。
【００２９】
本発明における「睡眠」は、脳が発達した動物の重要な生理機能であって、生存のために不可欠な行動を言う。脳は質のよい睡眠がなければ、高次元の情報を処理する能力を発揮することができない。
【００３０】
本発明における「睡眠障害」は、回復しないまま起きること、真夜中に起きること、目を覚めた後再び眠るに困難を経験すること、眠るのに困難を経験すること、またはあまりにも早起きすることなどで特徴付けられる病態を意味し、韓国において１年間全体成人の中で約１５％程度に影響を与えると報告された疾患である。
前記睡眠障害は任意の、及び全ての睡眠喪失の類型及び等級を意味するものとして広く使われている。睡眠障害は急性または慢性で持続されることがある。
【００３１】
前記睡眠障害は、当業界で知られている全ての種類の睡眠障害を含むことができ、ストレス、健康状態、痛み、投薬、時差ぼけ（ｊｅｔ  ｌａｇ）または騷音などによる睡眠障害であってもよく、具体的にカフェインによる睡眠障害であってもよい。
【００３２】
本発明における「予防」とは、睡眠障害の発生を前もって抑制または遅延させる全ての行為を意味する。予防は完全または部分的であってもよい。この場合、個体の睡眠障害度合いが前記睡眠障害の予防または改善用組成物を使わない場合に比べて減少する現象を意味することがある。
【００３３】
本発明における「改善」とは、治る状態と係るパラメーター、例えば、症状の程度を少なからず減少させる全ての行為を意味する。本発明のシトラス果皮または陳皮抽出物を利用して睡眠障害症状が好転したり、よい方向に変更される全ての行為を含む。
【００３４】
前記シトラス果皮抽出物は、化学物質などと違って天産物来由の物質をそのまま利用するものであるため、これの攝取ないし投与による致命的な副作用が最小化されることができる。
【００３５】
より具体的に、前記睡眠障害はカフェインによる不眠症または概日リズム睡眠障害（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｒｈｙｔｈｍ  ｓｌｅｅｐ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）である。
【００３６】
本発明における「不眠症」は、眠りにくかったり、しょっちゅう目を覚めたり、朝起きるとさっぱりしない症状を単独または複合的に見せる状態を言う。カフェインを服用する時、前記不眠症が発生することは知られており、本発明の組成物はカフェインによる睡眠時間減少を改善させることを確認したところ（図６）、前記不眠症改善用途に活用することができる。
【００３７】
本発明における「概日リズム睡眠障害（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｒｈｙｔｈｍ  ｓｌｅｅｐ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）」は、概日リズムを管掌する身体器官に問題が生じたり、あるいは内的な概日リズムと外部的要因の間の整列が崩れて生じる障害である。代表的な疾患として遅延性あるいは睡眠相前進症候群などがあり、カフェインなどのような化合物によって生理活性または神経活性が影響を受けることによって生体周期が変わって発生することがある。本発明の組成物は、カフェインによる神経活性を緩和できることを確認したので、カフェインによる生体週期変化による概日リズム睡眠障害を改善することができる。
【００３８】
また具体的に、前記食品の形態はコーヒーであってもよいが、これに制限されるものではない。前記コーヒーはレギュラーコーヒーまたはインスタントコーヒーであってもよく、コーヒーの形態は特に制限されない。また具体的に、前記コーヒーはノンカフェインコーヒーを含むことができる。
【００３９】
コーヒー豆は、ジャマイカブルーマウンテン、インドネシアトラジャ、コロンビアスプリーモ、グアテマラアンティグア、ケニアアラビカ、ブラジルサントス、エチオピアモカイルガチェフェなどの豆を使用することができる。このような豆は生豆を乾燥させ、ロースティングした後で粉砕して使うことができ、ロースティングは生豆を加熱して炒めることであって、コーヒーの生豆に熱を加えて生豆の内部組職に物理的、化学的変化を引き起こすことでコーヒー特有の味と香を決める加工処理である。
【００４０】
インスタントコーヒーは、コーヒー豆に糖類及び乳脂などがさらに添加されてもよい。この時、糖類は白砂糖、葡萄糖、デキストリン、果糖、オリゴ糖、プロポリス、トレハロース、ソルビトール、キシリトール、マンニロール、マンチロール、ラムニロール、イノシロール、エリトリロール、パラチノース及びクエルチロールの中で選択されたいずれか一つ以上を使用することができる。また、乳脂は、粉乳、脱脂粉乳及び植物性粉末の中で選択されたいずれか一つ以上を使用することができる。
【００４１】
本発明のシトラス果皮抽出物を含むコーヒーは、コーヒーによる副作用の一つである睡眠障害を防ぐだけでなく、カフェイン過多服用による神経過多活性を抑制することができる。特に、前記シトラス果皮抽出物は、コーヒーに添加されたり含まれることでコーヒー本来の味を変質させず、カフェインと競争的に作用することで、カフェインによって引き起こされる不眠効果を最小化することができる。
【００４２】
本発明のシトラス果皮抽出物を添加することができる食品は前記コーヒーのみならず、ソーセージ、肉類、パン、チョコレート類、スナック類、キャンデー類、お菓子類、ラーメン、ピザ、その他麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種スープ、飲み物、お茶、ドリンク剤、アルコール飲料及びビタミン複合剤などがある。飲み物で剤形化する場合、本発明のシトラス果皮抽出物の他に添加される液体成分はこれに限定されないが、通常の飲み物のように様々な香味剤または天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物は、モノサッカリド（例えば、葡萄糖、果糖など）、ジサッカリド（例えば、マルトース、スクロースなど）及び多糖（例えば、デキストリン、シクロデキストリンなどのような通常の糖）、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールであってもよい。
【００４３】
前記食品の種類は食品添加剤であってもよく、前記食品添加剤は食品の製造、加工、または保存のために食品に添加、混合、浸潤、その他方法によって使われる物質を意味する。前記食品添加剤は天産物と合成品があり、機能と用途によって分類することができる。前記食品添加剤の形態は、粉末、顆粒、錠剤、カプセルまたは液状形態を含むことができ、前記形態に制限されるものではない。
【００４４】
また、前記食品の種類は具体的に健康機能食品であってもよい。前記健康機能食品は様々な栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び増進剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド漸増剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、保存剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に用いられる炭酸化剤などを含むことができる。また、本発明の健康機能食品は、果物及び野菜飲料を製造するための果肉を含むことができる。このような成分は単独で、または組み合わせて使うことができ、このような添加剤の割合は組成物全体重量当たり０．００１ないし５０重量部の範囲で選択されることができる。
【００４５】
前記健康機能食品は食品の生体調節機能を強調した食品であって、物理的、生化学的、生物工学的方法を利用して特定目的に作用及び発現するように付加価置を与えた食品である。このような健康機能食品の成分は、生体防御と身体リズム調節、疾患の防止及び回復に係わる身体調節機能を生体に対して充分発揮するように設計して加工するようになり、食品として認められる食品補助添加剤、甘味料または機能性原料を含有することができる。
【００４６】
本発明のシトラス果皮抽出物を健康機能食品（または健康機能飲料添加物）で使う場合、前記シトラス果皮抽出物をそのまま添加したり、他の食品または食品成分とともに使用し、通常の方法によって適切に使用することができる。前記シトラス果皮抽出物の混合量は、その使用目的（予防、健康または改善、治療的処置）に応じて適宜決まることができる。
【００４７】
本発明の他の一側面は、シトラス果皮抽出物を含む、カフェインによる睡眠障害の予防または治療用薬学的組成物に関する。具体的に、前記睡眠障害はカフェインによる不眠症または概日リズム睡眠障害（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｒｈｙｔｈｍ  ｓｌｅｅｐ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）である。
「睡眠障害」、「不眠症」、「概日リズム睡眠障害」 は、前記説明したとおりである。
【００４８】
本発明の薬学的組成物は、投与するために前記本発明のシトラス果皮抽出物の他に薬学的に認められる担体、賦形剤または希釈剤を含むことができる。前記担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギン酸、ゼラチン、カルシウムホスフェート、ケイ酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、未晶質セルロース、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、タルク、ステアリン酸マグネシウム及び鉱物油を挙げることができる。
【００４９】
また、本発明の薬学的組成物は、如何なる剤形でも適用可能であり、より具体的に、経口用剤形であってもよい。非経口用剤形としては、注射用、塗布用、エアロゾルなどのスプレイ型であってもよい。
【００５０】
本発明のまた別の側面は、シトラス果皮抽出物を含む薬学的組成物を治療を要する個体に薬学的に有効な量で投与する段階を含む睡眠障害の治療方法に関する。具体的に、前記睡眠障害はカフェインによる不眠症または概日リズム睡眠障害である。
「睡眠障害」、「不眠症」、「概日リズム睡眠障害」は、前記説明したとおりである。
【００５１】
本発明における「薬学的に有効な量」は、医学的治療に適用可能な合理的な受恵／危険の割合で疾患を治療するに十分な量を意味し、有効用量の水準は患者の性別、年齢、疾病の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路及び排出の割合、治療期間、同時に使われる薬物を含む要素、及びその他医学分野でよく知られている要素によって決まることができる。
【００５２】
本発明の薬学的組成物は個別治療剤で投与したり、他の治療剤と併用して投与してもよく、従来の治療剤と順次または同時に投与することができる。また、本発明の薬学的組成物は単一または多重投与されてもよい。前記要素を全て考慮して副作用なく、最小限の量で最大の効果を得られる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決まることができる。
【００５３】
本発明の用語「個体」は、本発明による薬学的組成物の投与によって症状がよくなれる睡眠障害を持つ動物またはヒトを含む。本発明による治療用組成物を個体に投与することで睡眠障害を効果的に予防及び治療することができる。
【００５４】
本発明の用語「投与」は、ある適切な方法でヒトまたは動物に所定の物質を取り入れることを意味し、本発明による治療用組成物の投与経路は目的とする組織に逹することができる限り、一般的な経路を通じて経口または非経口投与されることができる。また、本発明による治療用組成物は、有効成分が標的細胞に移動することができる任意の装置によって投与されることができる。
【００５５】
本発明による薬学的組成物の好ましい投与量は、患者の状態及び体重、疾病の度合い、薬物の形態、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択されることができる。
【発明の効果】
【００５６】
本発明の組成物はカフェインによる過度な神経活性を落ち着かせると同時に睡眠障害を改善させる効果を示し、特に短時間でカフェインの神経活性を抑制する効果を超えてカフェインの持続的作用までも抑制することができて、カフェインによって誘導された神経活性を安定させると同時に、睡眠障害を改善させる用途で広く活用されることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５７】
【図１】陳皮サンプル内に含有された成分をＨＰＬＣを通じて確認した結果を示すものである。
【図２】陳皮に含有されたヘスペリジン（Ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）のＨＰＬＣ定量分析結果を示すものである。
【図３】陳皮に含有されたナリルチン（Ｎａｒｉｒｕｔｉｎ）のＨＰＬＣ定量分析結果を示すものである。
【図４】陳皮サンプル（１０ｍｇ）に含有されたヘスペリジン及びナリルチンの含量を示すものである。
【図５】海馬組職切片の培養過程を示すものである。
【図６】海馬組職のマイクロエレクトロードアレイ（ＭＥＡ）のセッティング過程を示すものである。
【図７】マイクロエレクトロードアレイ（ＭＥＡ）実験プロトコル（Ａ）及びｂａｎｄ  ｐａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒを利用したスパイク検出過程（Ｂ）を示すものである。
【図８】陳皮抽出物処理の際にカフェインによる神経活性が緩和されたことを確認した結果を示すものである。（Ａ：カフェイン処理時の神経活性、Ｂ：カフェイン及び陳皮抽出物処理時の神経活性、Ｃ：カフェイン単独処理、及びカフェイン及び陳皮抽出物処理時のウォッシング前の神経活性比較、Ｄ：カフェイン単独処理、及びカフェイン及び陳皮抽出物処理時のウォッシング後の神経活性比較）
【図９】陳皮抽出物に含有されたヘスペリジン、ナリルチンまたはこの混合物の処理の際にカフェインによる神経活性が緩和されたことを確認した結果を示すものである。（Ａ：カフェイン処理時の神経活性、Ｂ：カフェイン及びヘスペリジン処理時の神経活性、Ｃ：カフェイン及びナリルチン処理時の神経活性、Ｄ：カフェイン、ヘスペリジン及びナリルチン処理時の神経活性）
【図１０】陳皮抽出物に含有されたヘスペリジン、ナリルチンまたはこの混合物の処理の際にカフェインによる神経活性が緩和されたことを確認した結果をカフェインウォッシング前及びウォッシング後に比べて示すものである。（Ａ：カフェインウォッシング前、Ｂ：カフェインウォッシング後）
【図１１】睡眠時間を測定するためにＳＤ  ｒａｔに経口投与及び録画する実験過程を示すものである。（Ａ：ＳＤ  ｒａｔへの経口投与過程、Ｂ：睡眠時間を測定するための録画過程）
【図１２】陳皮抽出物の処理の際に睡眠時間が回復されたことを確認した結果を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
以下、本発明を実施例によって詳しく説明する。ただし、下記実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明が下記実施例によって限定されるものではない。
製造例。陳皮抽出物の製造
【００５９】
シトラスの陳皮（Ｇｉｏ  Ｈｅｒｂ  Ｃｏ．、Ｙａｎｇｊｕ、Ｋｏｒｅａ）１００ｇに１０倍（ｗ／ｖ）の蒸留水を加え、１２１℃で４０分間熱水抽出した。抽出液はＷｈａｔｍａｎ  Ｎｏ。１フィルターペーパー（Ｗｈａｔｍａｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌｔｄ．、Ｍａｉｄｓｔｏｎｅ、ＵＫ）を利用してろ過し、ろ過された抽出液は濃縮機（Ｅｙｅｌａ  Ｃｏ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を利用して４０℃で５時間濃縮させた。濃縮された抽出液は、凍結乾燥器（Ｉｌｓｉｎ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．、Ｙａｎｇｊｕ。、Ｋｏｒｅａ）で‐７０℃、５ｍＴｏｒｒで７日間凍結乾燥させた後、グラインダー（Ｉｌｓｉｎ  Ｂｉｏ  Ｃｏ．、Ｙａｎｇｊｕ．、Ｋｏｒｅａ）で粉砕して実験に利用した。上記過程を通じて陳皮を熱水抽出した時の収率は９．８％である。
【００６０】
【表１】
2021520855.tif 000003
実験例１。陳皮抽出物内の含有成分確認
【００６１】
ＨＰＬＣを利用して本発明の陳皮抽出物に含有されている化合物を確認した。具体的に、陳皮抽出物をオートサンプラー（ａｕｔｏｓａｍｐｌｅｒ）、バイナリーポンプ（ｂｉｎａｒｙ  ｐｕｍｐ）、ＰＤＡデテクター（ＰＤＡ  ｄｅｔｅｒｃｔｏｒ）で構成された逆相ＨＰＬＣ（Ｖｌｔｉｍａｔｅ  ３０００；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｔｈａｍ、ＵＳＡ）を利用して測定した。逆相ＨＰＬＣカラムは、Ｃ１８（Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｃ１８、５μｍ、４．６×２５０ｍｍ；Ｓｉｇｍａ、ＭＯ、ＵＳＡ）を使用した。注入容量は１０μＬを０．８ｍＬ／ｍｉｎの速度で注入した。
【００６２】
ＨＰＬＣで溶媒（ｍｏｂｉｌｅ  ｐｈａｓｅ）ＡとＢはそれぞれ１００％の３次蒸留水及び１００％のアセトニトリルを使用し、勾配溶離（ｇｒａｄｉｅｎｔ  ｅｌｕｔｉｏｎ）の構成は０ないし５分では９０％Ａ／１０％Ｂ、５ないし１４分では７５％Ａ／２５％Ｂ、１４ないし２５．５分では４０％Ａ／６０％Ｂ、２５．５ないし３０．５分では２０％Ａ／８０％Ｂ、３０．５ないし３５分では９０％Ａ／１０％Ｂで進めた。全ての化合物は２８０ｎｍの波長で検出し、分析温度は４０℃で維持した。ＨＰＬＣ／ＰＤＡを通じて収集された検体試験溶液のデータは、標準品のｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅとＵＶ  ｓｐｅｃｔｒｕｍ波形を比べて確認した。
【００６３】
その結果、図１に示すように、本発明で使った陳皮サンプルではナリルチン（ｎａｒｉｒｕｔｉｎ）及びヘスペリジン（ｈｅｓｐｅｒｉｄｉｎ）が含まれていることを確認した。
【００６４】
また、陳皮抽出物内の前記ナリルチン及びヘスペリジンの含量を計算し（図２及び図３）、その結果、陳皮抽出物４００μｇ／ｍｌに含有されたナリルチン及びヘスペリジンの含量はそれぞれ１３６μｇ／ｍｌ及び４０μｇ／ｍｌであることを確認した（図４）。
実験例２。神経活性測定
１‐１。海馬組職切片培養（Ｈｉｐｐｏｃａｍｐａｌ  ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ  ｓｌｉｃｅ  ｃｕｌｔｕｒｅ、ＨＯＳＣ）
【００６５】
薄膜を使って脳海馬の切片を器官型（ｏｒｇａｎｏｔｙｐｉｃ）培養する方法は、既に一般的に多く用いる方法を利用した。具体的に、脳海馬は５日齢から７日齢の間のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ白い幼い鼠（Ｏｒｉｅｎｔｂｉｏ  Ｃｏ．、Ｓｅｕｎｇｎａｍ、Ｋｏｒｅａ）から摘出し、組織拍節器を利用して３５０μｍ厚さで切り出した（Ｍｉｃｋｌｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏ．、ＵＫ）。５片〜６片を０．４μｍの孔を持っている薄膜ｉｎｓｅｒｔ（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ‐ＣＭ；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、ＭＡ）の中に配置した後、６‐ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ（ＳＰＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｃｏ．、Ｋｏｒｅａ）に入れて３６℃で５％ＣＯ２（Ｄｏｎｇ‐Ａ  Ｃｏ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を維持する培養器で培養した。培養液（ＭＥＭ；Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｇｙｅｏｎｇｓａｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）、２５％  Ｈａｎｋ’ｓ  ｂａｌａｎｃｅｄ  ｓａｌｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ＨＢＳＳ；Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｇｙｅｏｎｇｓａｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）、６ｇ／Ｌ  Ｄ‐ｇｌｕｃｏｓｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）、１ｍＭ  Ｌ‐ｇｌｕｔａｍｉｎｅ（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）、２５％  ｈｏｒｓｅ  ｓｅｒｕｍ（Ｗｅｌｇｅｎｅ、Ｇｙｅｏｎｇｓａｎ、Ｓｏｕｔｈ  Ｋｏｒｅａ）と、１％  ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ‐ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ、ＵＳＡ）、ｐＨ＝７．１）は二日置きに交換し、培養期間は１２〜１４日で、以後実験に使用した（図５）。
１‐２。ＭＥＡ探針で培養された脳海馬組職の移動
【００６６】
ピンを利用して培養された脳海馬切片を培養薄膜ｉｎｓｅｒｔから用心深く分離した後、０．０１％ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）でコーティングされた直径１０μｍ、間隔１００μｍの８×８マイクロエレクトロードアレイ（ｍｉｃｒｏｅｌｅｃｔｒｏｄｅ  ａｒｒａｙ、ＭＥＡ；Ｍｕｌｔｉ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）に載せた。切片は滅菌された人工脊髓溶液（ａＣＳＦ；１１４ｍＭ  ＮａＣｌ、２６ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、１０ｍＭ  ｇｌｕｃｏｓｅ、３ｍＭ  ＫＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ＝７．４、Ｓｉｇｍａ、Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）で１５分間５％  ＣＯ２及び９５％  Ｏ２混合ガス（Ｄｏｎｇ‐Ａ  Ｃｏ．、Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を注入し、３３℃を維持した状態で安定化させた。以後、脳海馬を含むＭＥＡをＭＥＡ１０６０（Ｍｕｌｔｉ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．、Ｒｅｕｔｌｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）増幅装置に取り付け、ＭＥＡの中の人工脊髓溶液はＡｇ／ＡｇＣｌで接地させた。以後、実験する間は５％  ＣＯ２及び９５％  Ｏ２混合ガスを投入した人工脊髓溶液を３ｍＬ／ｍｉｎの速度で貫流させ、ＭＥＡと人工脊髓溶液は３３℃で維持した（図６）。
１‐３。神経活性測定
【００６７】
安定化が終わった海馬組職を３分間レコーディング（ｒｅｃｏｒｄｉｎｇ）し、以後１ｍＭのカフェイン（Ｓｉｇｍａ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ、ＵＳＡ）が含まれた人工脳脊髓液、または１ｍＭのカフェイン及び分析サンプル（陳皮抽出物４００μｇ／ｍｌ、ヘスペリジン４０μｇ／ｍｌ、ナリルチン１３６μｇ／ｍｌ）が含まれた人工脳脊髓液をそれぞれ２０分間同様の条件で貫流した後、３分レコーディングし、再び人工脳脊髓液のみで２０分間ウォッシングした後、３分をレコーディングして総９分間のデータを得た。
【００６８】
海馬組職があるＭＥＡは、総６０個のチャンネルを通じて各チャンネル当たり２５ｋＨｚのサンプリング速度でデータを読み取り、ＭＣ_Ｒａｃｋ及びＭＣ_Ｄａｔａ  Ｔｏｏｌ（Ｍｕｌｔｉ  Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、ＧｍｂＨ）ソフトウェアを利用してコンピューターを通じて記録される。記録された全体信号の中で意味のあるスパイク（ｓｐｉｋｅ）を抽出するために４段階のｂａｎｄ  ｐａｓｓ  ｆｉｌｔｅｒを利用し、式は以下のとおりである。
【００６９】
【数１】
2021520855.tif 000004
【００７０】
前記式において、Ｘはノイズ（ｎｏｉｓｅ）に対する実効値（ＲＭＳ）を示し、ｋはそれぞれのスレシホールド値（ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ）を決める因子である。ここでは総３つの因子でｔｈｒｅｓｈｏｌｄを構成した（０．６、１及び３）。ｋ値が０．６以上の場合に意味のあるスパイク（ｓｐｉｋｅ）にし、この時のｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ｌｅｖｅｌは‐２１．６３μＶである。この過程は、６０個全チャンネルを対象にしてＭＡＴＬＡＢ（登録商標）（Ｍａｔｈｗｏｒｋｓ  Ｉｎｃ．、Ｎａｔｉｃｋ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ、ＵＳＡ）プログラムを利用して行った（図７）。
その結果、図８に示すように、カフェインによる神経活性が陳皮抽出物を処理した場合緩和されることを確認した。
【００７１】
具体的に、カフェインを処理した場合、神経活性が増加され、カフェインを処理した後でウォッシングしてもカフェインの作用が持続されて神経活性が２００％以上増加した（図８Ａ）。一方、カフェイン及び陳皮抽出物を一緒に処理した場合、カフェインのみ処理した場合に比べて神経活性度合いが著しく減少し、カフェイン単独処理した時と違って、ウォッシングした後も神経活性の持続的増加が表れないことによって神経活性が有意義に増加せずに維持されることを確認した（図８Ｂ）。カフェインを単独で処理した場合、及びカフェイン及び陳皮抽出物を一緒に処理した場合のそれぞれに対してウォッシング前、ウォッシング後どうし比べた場合も、陳皮抽出物を処理した時に著しい神経活動減少効果が表れることを確認した（図８Ｃ及び図８Ｄ）。
【００７２】
特に、カフェインを処理してからウォッシングした後も、神経でのカフェインによる活性は増加されるので、これはカフェインが神経に及ぼす活性作用が短時間に短く表れるよりは持続的に続くことを示すものである。本発明の陳皮抽出物は、前記のように持続的に繋がって増加されるカフェインの効果を抑制することで、神経活性を減少させる効果を示す。
【００７３】
また、陳皮抽出物内に含有されている成分であるヘスペリジン、ナリルチンまたはこの混合物をそれぞれカフェインとともに処理した結果、ヘスペリジンとナリルチンはいずれもカフェインによる神経活性増加を抑制できることを確認した。さらに、ヘスペリジン及びナリルチンをそれぞれ処理する時よりも一緒に処理した時に神経活性がさらに効果的に抑制されることを確認した（図９）。
【００７４】
具体的に、カフェインを処理した場合神経活性が増加され、カフェインを処理してからウォッシングしてもカフェインの作用が持続されて神経活性が２００％以上増加した（図９Ａ）。一方、カフェイン及びヘスペリジン４０μｇ／ｍｌ（陳皮４００μｇ／ｍｌに含有された量）を一緒に処理した場合、カフェインのみ処理した場合に比べて神経活性度合いが著しく減少され、カフェイン単独で処理した時と違ってウォッシングした後も神経活性の持続的増加が表れないことによって神経活性が有意義に増加せずに維持されることを確認した（図９Ｂ）。カフェイン及びナリルチン１３６μｇ／ｍｌ（陳皮４００μｇ／ｍｌに含有された量）を一緒に処理した場合も同様にカフェインのみ処理した場合に比べて神経活性度合いが著しく減少され、カフェインを単独で処理した時と違ってウォッシングした後も神経活性の持続的増加が表れないことによって神経活性が有意義に増加せずに維持されることを確認した（図９Ｃ）。さらに、カフェインとともにヘスペリジン４０μｇ／ｍｌ及びナリルチン１３６μｇ／ｍｌを処理した場合、神経活性減少効果がさらに増加することを確認した（図９Ｄ）。
【００７５】
前記結果を通じてヘスペリジン及びナリルチン成分が神経活性を緩和させることができ、二つの成分を全て含んでいる陳皮抽出物はカフェインによる神経活性を効果的に緩和させることができることを確認した。
【００７６】
さらに、図１０に示すように、カフェインを処理した場合表れた神経活性は、カフェインをウォッシングした後も持続的に表れ、これはカフェインによる神経活性作用が短時間ではなく長時間続くことができ、神経活性が長時間続くことによる副作用の発生可能性を示すものである。
【００７７】
一方、カフェイン単独処理の場合と違って、ヘスペリジン、ナリルチン、ヘスペリジン及びナリルチンの混合物を一緒に処理した場合、ウォッシングした後も神経活性抑制効果が持続されることを確認したので、これはカフェインによって誘導された神経活性がカフェインが取り除かれた後も続くことを抑制できることを示す（図１０）。
実験例３。睡眠障害改善効果確認
３‐１。実験動物
【００７８】
実験動物はＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ  ｒａｔ  ６週齢を選定し、（株）オリエントバイオ（Ｓｅｏｎｇｎａｍ、Ｋｏｒｅａ）から購入した。実験環境を一定に維持するため、１ケージ当たり実験動物は１個体ずつ入れて飼育した。実験動物は２５℃、湿度５０％、照明（１２時間明／暗）が自動に維持され、飲水と食餌が自在に供給される環境で一日間適応期間を経た。全過程は慶煕大学校実験動物倫理委員会の方針と動物実験関連規定にしたがった（ＩＲＢ承認番号：ＫＨＵＡＳＰ（ＳＥ）‐１７‐０３９）。
２‐２。睡眠時間測定
【００７９】
１５個体のＳＤ ｒａｔを３群に分けて実験を行った（ｎ＝５）。１群には水を経口投与し、２群にはカフェイン（２０ｍｇ／Ｋｇ）を経口投与し、３群には陳皮抽出物（１００ｍｇ／Ｋｇ）及びカフェイン（２０ｍｇ／Ｋｇ）を一緒に経口投与した。
【００８０】
げっ歯類が本来夜行性という点に着目して、睡眠時間はＳＤ  ｒａｔが本来睡眠を取らなければならない週間の間測定した。経口投与が終わった後、午前１０時からカムコーダ（Ｓｏｎｙ  Ｃｏ．、Ｔｏｋｙｏ、Ｊａｐａｎ）を利用して５時間ケージを録画して睡眠時間を測定し、測定時間は先行研究を参考した。一日に各群ごとに１個体ずつ総３個体の録画を撮り、個体間に互いに影響を受けないよう、各ケージ当たり１固体ずつおいた。そして、測定する空間の照度は一定に維持し、湿度５０％、温度２５℃を維持し、防音を維持した。睡眠パターン及び時間はＭｕｌｔｉ‐Ｃｈａｎｎｅｌ  Ｓｔｏｐｗａｔｃｈ（Ｔｅｃｈｓｙｓ  Ｃｏ．Ｓｅｏｕｌ、Ｋｏｒｅａ）を利用してｒａｔが目をつぶって、横に丸く伏せている姿勢で５分以上続く場合を睡眠状態と判定し、睡眠を始める時点から睡眠が終わる時までの時間を合算して測定した（図１１）。
【００８１】
その結果、図１２に示すように、カフェインを処理した場合の睡眠時間は正常対照群に比べて約２０〜３０％水準へと減少したが、カフェインと陳皮抽出物を一緒に処理した場合は睡眠時間が約４倍以上回復されることを確認した。
【００８２】
前記のような結果は、本発明の陳皮抽出物はカフェインによる過度な神経活性を落ち着かせると同時に睡眠障害を改善させる効果を示すことを確認したものであって、特に短時間でのカフェインの神経活性を抑制する効果を超えてカフェインの持続的作用までも抑制できることを示す。これによって、本発明の陳皮抽出物はカフェインによって誘導された神経活性を安定させると同時に睡眠障害を改善させる用途で広く活用されることができる。
【００８３】
本実験の結果は平均±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）で示す。各群の計算されたスパイク値やこれらを割合に変換した後、グループ間の差を調査するためにＡＮＯＶＡ  Ｔｕｋｅｙの死後検定を実施した。ｐ＜０．０５、ｐ＜０．０１、ｐ＜０．００１である時、グループの間で統計的に有意義な差があると見た。
実験例４。シトラス果皮抽出物の抗不眠活性確認
【００８４】
シトラス果皮抽出物が抗不眠効果を持つのか否かを確認するために、マンダリン、タンジェリン、スウィーティー、シトロン、スダチ、せとか、カラマンシー、ザボン、シラヌヒ、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、ライム、柚子果皮抽出物に対して実験例２及び実験例３の実験を繰り返して行った。
【００８５】
実験結果、各前記それぞれの果皮抽出物は実施例１の陳皮抽出物と比べて一部差はあったが、類似であったり同等であったりする水準の睡眠障害改善効果を具現した。これを通じて、シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）の果皮抽出物は類似な特性を有し、共通的に抗不眠効果を示すことを確認した。
【００８６】
前述した本発明の説明は例示するためのものであり、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は本発明の技術的思想や必須的特徴を変更せずとも別の具体的な形態に容易に変形可能であるということを理解することができる。よって、以上で述べた実施例は全ての面において例示的なもので、限定的ではないものとして理解しなければならない。例えば、単一型に説明されている各構成要素は分散して実施されてもよく、同様に分散されたものとして説明されている構成要素も結合された形態で実施されてもよい。
【００８７】
本発明の範囲は後述する請求範囲によって示され、請求範囲の意味及び範囲、そしてその均等概念から想到する全ての変更または変形された形態が本発明の範囲に含まれるものとして解釈しなければならない。
【図１】
2021520855.tif 000005
【図２】
2021520855.tif 000006
【図３】
2021520855.tif 000007
【図４】
2021520855.tif 000008
【図５】
2021520855.tif 000009
【図６】
2021520855.tif 000010
【図７】
2021520855.tif 000011
【図８】
2021520855.tif 000012
【図９】
2021520855.tif 000013
【図１０】
2021520855.tif 000014
【図１１】
2021520855.tif 000015
【図１２】
2021520855.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月9日(2020.12.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物を含む、カフェインによる睡眠障害予防または改善用食品組成物。
【請求項２】
前記シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）は、ミカン、キンカン、マンダリン、タンジェリン、スウィーティー、シトロン、スダチ、せとか、カラマンシー、ザボン、シラヌヒ、オレンジ、レモン、グレープフルーツ、ライム及び柚子から構成された群から選択される一つ以上である、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項３】
前記シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物は、ヘスペリジン及びナリルチンの中でいずれか一つ以上を含むものである、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項４】
前記抽出物は、水、アルコール、エチルアセテート、アセトン、核酸、ジクロロメタンまたはこれらの混合溶媒から抽出された請求項１に記載の食品組成物。
【請求項５】
前記食品組成物はコーヒーである、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項６】
前記食品組成物は食品添加剤である、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項７】
前記睡眠障害は、カフェインによる不眠症または概日リズム睡眠障害（ｃｉｒｃａｄｉａｎ  ｒｈｙｔｈｍ  ｓｌｅｅｐ  ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ）である、請求項１に記載の食品組成物。
【請求項８】
シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物を含む、カフェインによる睡眠障害予防及び治療用薬学的組成物。
【請求項９】
シトラス（Ｃｉｔｒｕｓ）果皮抽出物を個体に投与する段階を含む、カフェインによる睡眠障害予防方法。
【国際調査報告】
2021520855.tif 000017
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