(57)【要約】  個体において癌を軽減または安定化するための、該個体において既存の免疫応答を動員するための方法、組成物およびキットを提供する。
2021502355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における癌を処置する方法であって、既存の免疫応答を癌部位に動員し、それにより癌を処置する方法。
【請求項２】
既存の免疫応答が天然の既存の免疫応答である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
既存の免疫応答を癌細胞に動員することが、処置の開始前に癌細胞に発現されない抗原を該癌に導入することを含み、ここで、該抗原が、既存の免疫応答の１以上の構成要素により認識される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
腫瘍に抗原を導入する前に、個体が該抗原に対して既存の免疫応答を有することが確認されている、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
既存の免疫応答の存在を確認する工程が、個体由来のサンプルにおいて該抗原に対するＴ細胞応答を同定することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
抗原を導入する工程が、癌に抗原を注射することを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
抗原を導入する工程が、該癌に該抗原をコードする核酸分子を導入することを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
核酸分子がＤＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
核酸分子がＲＮＡである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ＲＮＡが、分解に対してより耐性になるように修飾される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
核酸分子が注射により癌に導入される、請求項７に記載の方法。
【請求項１２】
核酸分子が、ウイルスベクターを用いて癌に導入される、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
ウイルスベクターが、シュウドビリオンを用いて癌に導入される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
シュウドビリオンがパピローマウイルスシュウドビリオンである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
抗原がウイルス抗原である、請求項３から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
抗原が、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質由来の少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドであり、ここで、該少なくとも１つのエピトープが、既存の免疫応答の１以上の構成要素により認識される、請求項３から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
１以上の構成要素がＴ細胞である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
ＣＭＶタンパク質が、ｐｐ５０、ｐｐ６５、ｐｐ１５０、ＩＥ-１、ＩＥ-２、ｇＢ、ＵＳ２、ＵＳ６、ＵＬ１６およびＵＬ１８からなる群より選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
ポリペプチドが、９−１５アミノ酸のＭＨＣ Ｉ制限ペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
ポリペプチドが、少なくとも１５アミノ酸のＭＨＣ ＩＩ制限ペプチドである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
抗原が、配列番号１−６７からなる群より選択される配列と少なくとも９０％同一の配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
抗原が、配列番号１−６７から選択される配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
既存の免疫応答の動員が、Ｂ細胞機能、インターロイキン、ＴＮＦスーパーファミリー、抗原プロセシング、ＭＨＣ、適応免疫、トランスポーター機能、接着、ＮＫ細胞機能、Ｔ細胞機能、ＣＤ分子、白血球機能、補体経路、ミクログリア機能、液性免疫、ＴＬＲ、炎症、樹状細胞機能、インターフェロン、自然免疫、マクロファージ機能、ケモカインおよび受容体、老化、アポトーシス、サイトカインおよび受容体、癌の進行、基本的な細胞機能、細胞周期、および病原体の反応から選択される癌の微小環境を変化させる、請求項３から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
抗原が、ＴＬＲアゴニスト；ＩＬ−１Ｒ８サイトカインアンタゴニスト；静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）；グラム陽性菌から単離されたペプチドグリカン；グラム陽性菌から単離されたリポテイコ酸；グラム陽性菌から単離されたリポタンパク質；酵母細胞壁から単離されたマイコバクテリア、ザイモサンから単離されたリポアラビノマンナン；ポリアデニル酸−ポリウリジル酸；ポリ（ＩＣ）；リポ多糖；モノホスホリルリピドＡ；フラジェリン；ガーディキモド；イミキモド；Ｒ８４８；ＣｐＧモチーフ、ＣＤ４０アゴニストおよび２３ＳリボソームＲＮＡを含むオリゴヌクレオシドから選択される免疫応答を増強する薬剤と組み合わせて投与される、請求項３から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
抗原がｐｏｌｙ−ＩＣと組み合わせて投与される、請求項３から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
癌が固形腫瘍である、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
癌が血液の癌である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
患者において癌を軽減するための、少なくとも１つのＣＭＶペプチド抗原または該ペプチドをコードする核酸、薬学的に許容される担体、容器ならびに該ＣＭＶペプチドの投与について記載するパッケージ添付文書またはラベルを含む、個体における癌に対する既存の免疫応答を動員するためのキット。
【請求項２９】
患者を検査し、患者において癌の部位に対する既存の免疫応答を動員するための、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互引用
本出願は、引用によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１７年１１月６日出願の米国仮特許出願第６２／５８２，０９７号の利益を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、患者の既存の免疫応答を癌に指向させるための方法、組成物およびキットを含む、免疫学および癌治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
持続性の無症候性ウイルス感染は、通常、健康な個体では細胞性免疫および／または体液性免疫によって制御されるが、免疫力が低下した個体では再活性化され得る。一部の慢性ウイルス感染に対する細胞性免疫は年齢とともに増加し、多くの完全に機能するウイルス特異的Ｔ細胞の誘導につながる。サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）は、世界的に蔓延し（ヒト集団の５０〜９０％が感染しており）、かつ健康な個体ではほとんど無症状である、β−ヘルペスウイルスである。ＣＭＶは、生涯にわたる持続的な感染を確立し、発症を阻止するためには永続的な細胞性免疫を必要とする。それゆえに、ＣＭＶの再活性化は、免疫抑制において、例えば造血幹細胞移植において、脅威である。免疫適格性の個体では、ＣＭＶに対するＣＤ４およびＣＤ８ Ｔ細胞応答は、複数のＣＭＶ抗原に対して幅広い反応性および高い強度を示し、一般的なヒト集団で高い有病率を示し、年齢とともに増加する（M. Bajwa et al., J Infect Dis 215、1212-20（2017））。記憶Ｔ細胞のインフレーション（inflation）は、持続的なＣＭＶ感染の特徴であり、ヒトで広く研究されている。ＣＭＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答は、時間とともに拡大する（inflationary）か、一次感染の解消時に静止する（non-inflationary）かによって、２つのタイプに分けられる（G. A. O'Hara, Trends Immunol 33:84-90 (2012)）。持続的なＣＭＶ感染中の抗原の性質および抗原発現のパターンは、メモリー表現型（非インフレ）またはエフェクター表現型を有するＣＤ８＋ Ｔ細胞をもたらす。マウスＣＭＶ感染はまた、ヒトのＣＭＶに対するものを模倣する免疫応答の誘導により、生涯持続的な感染を確立する（Ｉｄ）。
【０００４】
抗腫瘍Ｔ細胞応答の誘導は、癌に対する効果的な免疫療法の開発において最も重要である。現在の免疫療法に反応するのは、一部の癌患者のみである。癌抗原に対するＴ細胞免疫の産生には、高度に個別化されたアプローチが必要であるか、または既存の抗癌Ｔ細胞に依存することが多い。また、癌患者、特に高齢者において強力な新規のＴ細胞免疫を産生することも困難である。個別化されたアプローチは、腫瘍関連抗原、新規抗原（neoantigen）（すなわち、変異した自己抗原）またはウイルス性癌タンパク質に対するワクチンに依存している。他のアプローチは、キメラ抗原受容体形質導入Ｔ細胞の養子移入またはモノクローナル抗体の注入に基づいており、これは腫瘍特異的抗原の困難な同定を必要とし、癌のタイプまたはサブタイプの一部にのみ適用可能である。そして、エクスビボで増殖された腫瘍特異的リンパ球の養子移入は、天然の抗腫瘍応答の利点を採用することを目的とした方法である。これらのアプローチはすべて高度に個別化されており、腫瘍エピトープの同定および／またはエクスビボでの患者の自家細胞の増殖を必要とする。
【０００５】
これと並行して、サイトカインまたはＴＬＲリガンドに基づくインサイチュウ腫瘍免疫療法が用いられてきたが、その多くは自然免疫認識機構を標的にして腫瘍の免疫微小環境を変化させ、免疫原性の癌細胞死を誘導し、エピトープ拡散を促進する。
【０００６】
従って、簡単で、広く適用可能な、抗原にとらわれない、免疫療法の方法論が、直接的な細胞死およびエピトープの拡散促進を通じて、それぞれ初期および長期の癌制御における免疫系の効果を利用するために依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
概要
本発明者らは、高齢者の慢性ウイルス感染を強力に制御するために長年にわたって展開する複雑な適応性細胞介在免疫が、腫瘍増殖の制御に有効なタイプの細胞介在免疫であることを認識していた。このタイプの抗ウイルス免疫を癌処置に利用するために、本発明者らは、腫瘍指向性パピローマウイルスシュウドビリオンを用いて高機能な既存の抗ウイルスＴ細胞を腫瘍環境に直接標的化するか、または最小限のウイルスＣＤ８およびＣＤ４ Ｔ細胞サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エピトープのインサイチュウ注入によって、インサイチュウ免疫療法への新しいアプローチを開発した。腫瘍環境におけるウイルスエピトープの提示は、インサイチュウでのウイルス抗原特異的Ｔ細胞の動員および活性化をもたらし、結果として、ウイルス陰性の腫瘍細胞を異なる方法で死滅させ、腫瘍微小環境を変化させる。このアプローチは、早期および長期的な癌細胞の死滅およびエピトープの拡散の両方を促進し、確立することにより、免疫療法を成功させるためのすべての基準を満たすため、満たされていないニーズに対応している。
【０００８】
従って、本明細書は、癌の部位に既存の免疫応答を動員し、それによって癌を処置することにより、個体の癌を処置する方法を提供する。既存の免疫応答は、癌と診断される前に個体に存在する免疫記憶応答であってもよい。既存の、免疫応答は、天然の既存の免疫応答であり得る。
【０００９】
これらの方法では、癌細胞に既存の免疫応答を動員することは、処置の開始前に癌細胞によって発現されていない抗原を癌に導入することを含んでもよく、ここで、該抗原は既存の免疫応答の１以上の構成要素によって認識される。
【００１０】
これらの方法は、腫瘍に抗原を導入する前に、個体が抗原に対する既存の免疫応答を有することを確認することを含み得る。これらの方法はまた、抗原に対する個体の既存の免疫応答を評価することを含み得る。これらの方法において、既存の免疫応答の存在を確認することは、個体由来のサンプル中の抗原に対するＴ細胞の応答を同定することを含み得る。
【００１１】
これらの方法では、抗原を導入することは、抗原を癌に注入することを含み得る。さらにまたはあるいは、抗原の導入は、抗原をコードする核酸分子を癌に導入することによって達成され得る。これらの方法では、核酸分子はＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。ＲＮＡを用いる場合、ＲＮＡを分解に対してより耐性であるように改変されてよい。核酸分子は、注射によって癌細胞に導入されてよい。さらにまたはあるいは、核酸分子は、ウイルスベクターまたはパピローマウイルスシュウドビリオンなどのシュウドビリオンを用いて癌に導入されてもよい。
【００１２】
これらの方法では、抗原はウイルス抗原であり得る。例えば、抗原は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）タンパク質からの少なくとも１つのエピトープを含むポリペプチドであってもよく、このペプチドは、既存の免疫応答の１以上の構成要素によって認識される。これらの方法において、ＣＭＶタンパク質は、ｐｐ５０、ｐｐ６５、ｐｐ１５０、ＩＥ−１、ＩＥ−２、ｇＢ、ＵＳ２、ＵＳ６、ＵＬ１６およびＵＬ１８からなる群より選択され得る。ポリペプチドは、９−１５マーのＭＨＣ Ｉ制限ペプチドであってもよい。あるいはまたはさらに、ポリペプチドは、少なくとも１５マーのＭＨＣ ＩＩ制限ペプチドであってもよい。あるいはまたはさらに、抗原は、配列番号１−６７の配列から選択される配列と少なくとも９０％同一の配列を含む。これらの方法では、免疫応答の１以上の構成要素はＴ細胞であってもよい。
【００１３】
これらの方法では、既存の免疫応答の動員により、癌の微小環境が変化する可能性がある。
【００１４】
これらの方法では、抗原は、免疫応答を増強する薬剤と組み合わせて投与することができる。例示的な薬剤としては、ＴＬＲアゴニスト；ＩＬ−１Ｒ８サイトカインアンタゴニスト；静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）；グラム陽性菌から単離されたペプチドグリカン；グラム陽性菌から単離されたリポテイコ酸；グラム陽性菌から単離されたリポタンパク質；マイコバクテリアから単離されたリポアラビノマンナン；酵母細胞壁から単離されたザイモサン；ポリアデニル−ポリウリジル酸；ポリ（ＩＣ）；リポ多糖；モノホスホリルリピドＡ；フラジェリン；ガーディキモド（Gardiquimod）；イミキモド；Ｒ８４８；ＣｐＧモチーフ、ＣＤ４０アゴニストおよび２３ＳリボソームＲＮＡを含むオリゴヌクレオシドから選択される薬剤が挙げられる。例示的な方法において、抗原は、ポリＩＣと組み合わせて投与されてよい。
【００１５】
別の側面は、患者を試験し、患者の癌部位に対する既存の免疫応答を動員するためのキットを提供する。これらのキットは、患者における癌の少なくとも１つの症状を軽減するために、少なくとも１つのＣＭＶペプチド抗原または該ペプチドをコードする核酸、薬学的に許容される担体、容器、およびＣＭＶペプチドの投与を示す添付文書またはラベルを含み得る。
【００１６】
この概要は、本発明の全範囲および範囲を代表することを意図したものではなく、またそのように解釈されるべきではない。さらに、本明細書で“本開示”またはその側面への言及は、本発明の特定の態様を意味するものと理解されるべきであり、必ずしもすべての態様を特定の記載に限定するものと解釈されるべきではない。本開示は、添付の図面および態様の説明と同様に、本要約において様々なレベルで詳細に記載されており、本要約における要素、構成要素等の包含または非包含によって、本開示の範囲に関するいかなる制限も意図されていない。本発明のさらなる側面は、詳細な説明から、特に図面と共にとらえると容易に明らかになり得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１Ａは、マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）感染が、ｍＣＭＶペプチドプールに対して大規模なサイトカイン応答を誘導することを示す。図１Ｂは、示されたＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ制限ｍＣＭＶペプチドでのペプチド再刺激後の脾臓ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＦＮ-γ産生を示す。
【図２】図２Ａは、ｍＣＭＶ抗原を発現するＨＰＶ Ｐｓｖを用いた固形腫瘍の腫瘍内導入のための注入プロトコルを示す。図２Ｂおよび２Ｃは、それぞれ、ｍ１２２およびｍ４５を発現するＨＰＶ１６ Ｐｓｖ、または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するＨＰＶ Ｐｓｖの腫瘍内注入後の腫瘍体積を示す。
【図３】図３Ａは、ポリ（Ｉ：Ｃ）（ＰＩＣ）と組み合わせたｍＣＭＶ抗原を発現するＨＰＶ Ｐｓｖを有する固体腫瘍の腫瘍内導入のための注入プロトコルを示す。図３Ｂ−３Ｅは、この腫瘍内導入プロトコルが腫瘍増殖を遅らせることを示す。図３Ｆおよび３Ｇは、ＭＨＣ−Ｉ四量体染色およびＦＡＣＳによって分析された、Ｅ７−、ｍ４５−およびｍ１２２−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞による腫瘍の浸潤を示す。
【図４】図４Ａは、生存に対する効果を示し、図４Ｂは、マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）に感染したＣ５７Ｂｌ／６マウスにおけるＭＣＭＶ ＭＨＣ−Ｉ制限ペプチドの腫瘍内注射後の腫瘍増殖に対する効果を示す。
【図５】図５は、マウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）に感染したＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける腫瘍増殖に対するｍＣＭＶ ＭＨＣ−Ｉ制限ペプチドの異なる用量の腫瘍内注射の効果を示す。
【図６】図６Ａおよび６Ｂは、ｍＣＭＶに感染したＣ５７Ｂｌ／６マウスにおける腫瘍増殖に対するｍＣＭＶ ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ制限ペプチドの組み合わせの腫瘍内注射の効果を示す。図６Ｃは、各ペプチドに対するＭＨＣ−Ｉ四量体を用いたＦＡＣＳによって分析された血中のＥ７−、ｍ４５−、ｍ１２２−特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示し、ｍＣＭＶ ＣＤ４エピトープおよびその後ＣＤ８エピトープでの逐次的な腫瘍内接種が優先的に抗腫瘍免疫を誘導することを示している。
【図７】図７は、二次腫瘍暴露に対する長期的な保護に対する一次腫瘍の完全なクリアランスの効果を示す。
【図８】図８は、ｍＣＭＶ感染が、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいてインフレーション性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を誘導することを示す。
【００１８】
【図９】図９Ａは、インフレーション性および非インフレーション性ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生、およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの産生を示す。図９Ｂは、ＭＨＣ−Ｉ制限ペプチドプールに対するｍＣＭＶ ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるサイトカイン産生を示す。
【図１０】図１０Ａは、ｍＣＭＶペプチドの腫瘍内投与のためのマウスＴＣ１腫瘍モデルの実験プロトコルタイミングを示す。図１０Ｂおよび１０Ｃは、腫瘍担持マウスにおけるｍＣＭＶ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の分布を示す。インフレーション性（ＩＥ３；図１０Ｂ）および非インフレーション性（ｍ４５；図１０Ｃ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、ＭＨＣ−Ｉ四量体染色を用いたＦＡＣＳにより検出した。
【図１１】図１１Ａは、腫瘍微小環境の遺伝子発現解析に用いたマウスＴＣ１腫瘍モデルの実験プロトコルタイミングを示す。図１１Ｂ−１１Ｆは、腫瘍内投与後のＣＤ４５＋細胞（図１１Ｂ）、Ｔｈ１細胞（図１１Ｃ）、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞（図１１Ｄ）、ＮＫ細胞（図１１Ｅ）または樹状細胞（図１１Ｆ）による腫瘍浸潤を示す。
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、ｍＣＭＶ ＣＤ８エピトープの腫瘍内投与が、腫瘍増殖を遅らせ、ポリ（Ｉ：Ｃ）共注入が、腫瘍制御を改善することを示す。図１２Ａは、ＭＨＣ−Ｉ制限ｍＣＭＶペプチド単独＋／−ポリ（Ｉ：Ｃ）の腫瘍内注射の効果を示す。図１２Ｂは、ＭＨＣ−Ｉ制限ｍＣＭＶペプチドの滴定の腫瘍内注射の効果を示す。
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、ポリ（Ｉ：Ｃ）を有するｍＣＭＶ ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩペプチドの腫瘍内注射によるＴＣ１腫瘍暴露からの保護を示す。ＣＤ４、次いでＣＤ８ ＭＣＭＶエピトープでの逐次的な腫瘍内接種は、腫瘍増殖を抑制し(図１３Ａ)、長期生存を促進する(図１３Ｂ)。
【図１４】図１４は、ポリ（Ｉ：Ｃ）（３０ｕｇ）の有無にかかわらず、ＭＨＣ−Ｉ制限された選択されたｍ３８、ｍ４５およびｍ１２２ペプチドで、および／またはＭＨＣ−ＩＩ制限されたｍ１３９選択されたペプチドで、ならびに対照として生理食塩水またはポリ（Ｉ：Ｃ）単独で、６回処置した後の血中のＥ７四量体陽性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す。
【図１５】図１５は、一次腫瘍の完全なクリアランスが、二次腫瘍暴露に対する長期的な保護をもたらすことを示す。
【図１６】図１６は、ポリ（Ｉ：Ｃ）を有するｍＣＭＶ ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩペプチドの腫瘍内注射によるＭＣ３８腫瘍暴露からの保護を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
詳細な説明
本発明は、癌を処置する新規な方法に関する。具体的には、本発明は、癌細胞を攻撃するために個体自身の免疫系を利用する、該個体における癌を処置する方法に関する。本発明の方法は、癌に応答して誘導されたのではなく、環境中の微生物によって誘導された既存の免疫応答を個体が有しているという事実を利用したものである。癌細胞は、通常、既存の免疫応答を誘導した微生物抗原を発現しないため、そのような免疫応答が癌を攻撃することは期待できない。しかしながら、本発明者らは、そのような既存の免疫応答が、癌を攻撃するために動員され得ることを発見した。これを達成することができる１つの方法は、既存の免疫応答によって認識された１以上の抗原を癌に導入することによって、免疫応答の細胞が抗原を提示する癌細胞を攻撃する結果となる。したがって、これらの方法は、癌患者の処置に先立って抗原を発現する癌細胞に向けられていない。例えば、多くの膠芽腫癌細胞は、ＣＭＶ抗原を発現することが判明しており、本開示の方法は、ＣＭＶに対する個人の既存の免疫を用いて、そのような神経膠芽腫を処置するためには用いられない。さらに、癌細胞の破壊は、既存の免疫応答の構成要素が癌細胞抗原に暴露される結果となり得る。これは、癌細胞抗原に対する免疫応答の誘導をもたらし得る。したがって、本発明の一般的な方法は、既存の免疫応答が癌を攻撃するように、個体における既存の免疫応答を癌部位に動員することによって実施され得る。動員は、例えば、個体の既存の免疫応答の構成要素（例えば、Ｔ細胞）によって認識される少なくとも１つの抗原を癌に導入することによって達成され得る。
【００２０】
本発明は、本明細書に記載された特定の態様に限定されるものではなく、そのような態様は様々であり得る。本明細書で用いる用語は、特定の態様のみを説明する目的のためのものであり、限定することを意図していない。
【００２１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いるように、単数形“ａ”、“ａｎ”および“ｔｈｅ”は、文脈が明確に他のことを指示しない限り、複数形の参照語を含む。例えば、核酸分子は、１以上の核酸分子を意味する。このように、用語“ａ”、“ａｎ”、“１以上”および“少なくとも１つ”は互換的に用いられ得る。同様に、用語“含む（complising）”、“含む（including）”および“有する（having）”は互換的に用いられ得る。特許請求の範囲は、任意の要素を除外するように記載されてもよいことがさらに留意される。このように、本明細書は、請求項の要素の暗唱、または“否定的な”制限の使用に関して、“唯一（solely）”、“のみ”などの排他的な用語を用いるための先行詞としての役割を果たすことを意図している。
【００２２】
別の態様の文脈で説明されている本発明の特定の特徴は、単一の態様において組み合わせて提供されてもよい。逆に、簡潔には、単一の態様の文脈で説明されている本発明の様々な特徴は、別々に、または任意の好適な部分的組合せで提供されてもよい。すべての態様の組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、それぞれの組み合わせが個別に明示的に開示されているかのように、本明細書に記載されている。さらに、すべての部分的組合せもまた、本発明によって具体的に包含され、そのような部分的組合せの各々が個別に明示的に開示されているかのように、本明細書に記載されている。
【００２３】
本明細書に記載の文献は、本出願の出願日以前の開示のみを目的として提供される。本明細書のいかなる記載も、本発明が、先行発明を理由にそのような文献に先行する権利を有していないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供された公開日は、実際の公開日とは異なる場合があり、それは別個に確認する必要があるかもしれない。本明細書に記載のすべての文献は、その文献が引用されていることに関連した方法および／または材料を開示し、記載するために、引用により本明細書に包含される。
【００２４】
別段の定義がない限り、本明細書で用いられるすべての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されたものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料がここに記載されている。
【００２５】
一側面は、個体の癌を処置する方法であって、癌に既存の免疫応答を動員し、それによって癌を処置することを含む方法である。
【００２６】
本明細書で用いるように、癌は、細胞分裂および／または細胞の老化を適切に制御することなく異常な細胞が分裂する疾患を意味する。用語、癌は、固形腫瘍だけでなく、血液にかかる癌（blood borne cancer）も包含することを意味する。一般的に、腫瘍は、通常、嚢胞または体液領域を含まない異常な組織の塊である。固形腫瘍には、良性（生命を脅かさない）、または悪性（生命を脅かす）がある。固形腫瘍の異なるタイプは、それを形成する細胞のタイプに応じて命名されている。固形腫瘍の例としては、肉腫、癌およびリンパ腫が挙げられる。血液腫瘍（血液の癌とも呼ばれる）は、骨髄などの血液形成組織、または免疫系の細胞で発生する癌である。血液の癌の例としては、白血病、リンパ腫および多発性骨髄腫が挙げられる。
【００２７】
一部の癌では、元の癌細胞が発生した組織以外の組織に細胞が侵入することがある。癌の中には、癌細胞が血液およびリンパ系を介して体の他の部位に転移するものもある。このように、癌は、通常、がん細胞が発生した臓器または細胞の種類に応じて名前が付けられている。例えば、大腸に由来する癌は大腸癌と呼ばれ、皮膚のメラノサイトに由来する癌はメラノーマと呼ばれるなどである。本明細書で用いる、癌は、癌腫、肉腫、腺癌、リンパ腫、固形腫瘍およびリンパ系の癌を含む白血病、胃癌、腎臓癌、乳癌、肺癌（非小細胞肺癌および小細胞肺癌を含む）、膀胱癌、結腸癌、卵巣癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、脳腫瘍、頭頚部癌、皮膚癌、子宮癌、精巣癌、食道癌、肝臓癌（肝細胞癌を含む)、非ホジキンリンパ腫（例えば、バーキットリンパ腫、小細胞リンパ腫および大細胞リンパ腫）およびホジキンリンパ腫を含むリンパ腫、ならびに多発性骨髄腫を意味し得る。例示的な態様では、癌は肺癌または腺癌である。
【００２８】
本明細書で用いる用語、個体、対象、患者などは、癌を発症する可能性のある任意の哺乳動物を包含することを意味し、好ましい哺乳動物はヒトである。個体、対象および患者という用語は、それ自体で特定の年齢、性別、人種などを表すものではない。したがって、男性であろうと女性であろうと、任意の年齢の個体が、本開示の対象となることが意図される。同様に、本発明の方法は、例えば、コーカシアン（白人）、アフリカ系アメリカ人（黒人）、ネイティブアメリカン、ネイティブハワイアン、ヒスパニック、ラティーノ、アジア人およびヨーロッパ人を含む、任意の人種のヒトに適用することができる。このような特性は重要であり得る。そのような場合、有意な特徴（例えば、年齢、性別、人種など）が示され得る。これらの用語はまた、ヒトおよび非ヒト動物の両方を包含する。癌の検査または処置に適した非ヒト動物としては、コンパニオンアニマル（すなわちペット）、食用動物、作業動物または動物園の動物が含まれるが、これらに限定されない。 
【００２９】
本明細書で用いる、免疫応答または免疫学的応答とは、１以上の抗原に対する体液性応答および／または細胞性応答が個体内に存在することを意味する。本開示の目的のために、“体液性応答”とは、Ｂ細胞および分泌性（ＩｇＡ）分子またはＩｇＧ分子を含む抗体分子によって媒介される免疫応答を意味し、一方、“細胞性応答”とは、Ｔリンパ球および／または他の白血球が介在する応答を意味する。細胞性免疫の重要な側面の一つは、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）による抗原特異的応答を含む。ＣＴＬは、細胞表面の主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）によってコードされるタンパク質と関連して提示されるペプチド抗原に対する特異性を有する。ＣＴＬは、細胞内微生物の破壊、またはそのような微生物に感染した細胞の溶解を誘導し、促進するのに役立つ。細胞性免疫の別の側面は、ヘルパーＴ細胞による抗原特異的な応答を伴う。ヘルパーＴ細胞は、その表面にＭＨＣ分子と関連してペプチド抗原を提示している細胞に対して、非特異的エフェクター細胞の機能を刺激し、活性を集中させるのを助けるように作用する。細胞性免疫応答はまた、活性化されたＴ細胞および／または他の白血球（ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞に由来するものを含む）によって産生されるサイトカイン、ケモカインおよび他のそのような分子の産生を意味する。
【００３０】
したがって、免疫学的応答は、ＣＴＬを刺激するもの、および／またはヘルパーＴ細胞の産生もしくは活性化であってもよい。ケモカインおよび／またはサイトカインの産生もまた刺激され得る。免疫応答はまた、抗体介在免疫応答を含み得る。したがって、免疫応答は、以下の効果のうちの１以上を含み得る：Ｂ細胞による抗体（例えば、ＩｇＡまたはＩｇＧ）の産生；および／または、サプレッサー、細胞傷害性Ｔ細胞またはヘルパーＴ細胞の活性化、および／または抗原に対して特異的に指示されたＴ細胞の活性化。そのような応答は、当技術分野で知られている標準的な免疫アッセイおよび中和アッセイを用いて決定することができる。
【００３１】
本明細書で用いられる、既存の免疫応答とは、癌処置の開始前に個体に存在する免疫応答である。したがって、既存の免疫応答を有する個体は、癌を処置するために抗原を用いた処置の開始に先立って、抗原に対する免疫応答を有する。既存の免疫応答は、天然免疫応答であってもよいし、または誘導される免疫応答であってもよい。本明細書で用いられる、天然の既存の免疫応答とは、個体が意図せずに接触した細菌抗原またはウイルス抗原などの抗原に応答して誘導された個体の免疫応答である。つまり、既存の免疫応答を有する個体は、抗原に対する免疫応答を発生させる意図を持って抗原に曝露されたわけではない。誘導された既存の免疫応答とは、ワクチンを受けたときなど、抗原に意図的に曝露した結果生じる免疫応答のことである。既存の免疫応答は、天然の免疫応答であってもよいし、または誘導された免疫応答であってもよい。
【００３２】
本明細書で用いられる、語句“免疫応答を動員する”とは、既存の免疫応答の構成要素が体内を通って抗原が投与された場所に移動し、その結果、抗原を提示する細胞に対する免疫系の構成要素による攻撃をもたらすように、抗原が個体に投与されるプロセスを意味する。本明細書で用いられる、“免疫応答の構成要素”とは、抗原に結合し、抗原に対する免疫応答を開始させることができる細胞を意味する。本発明の実施に有用な抗原は、既存の免疫系の細胞、特にＴ細胞によって認識され得る任意の分子である。そのような化合物の一例は、細菌またはウイルスタンパク質などのタンパク質である。
【００３３】
本明細書で用いられる、語句“癌を処置する”とは、癌に関する様々な結果を意味する。癌を処置することは、処置された個体における癌細胞の数の増加率を減少させることを含む。増加率のそのような減少は、癌細胞の複製速度の低下に起因し得る。あるいは、癌細胞の複製率は影響を受けず、癌細胞の数の増加は、既存の免疫応答によって殺されてもよい。特定の側面において、癌を処置することは、癌細胞の数の増加が停止するが、一定のレベルに留まる状況を意味する。そのような状況は、既存の免疫応答の動員による癌細胞の複製の阻害のために生じるか、または動員された既存の免疫応答による癌細胞の殺傷の速度と、新しい癌細胞の産生速度のバランスがとれているために生じるかのいずれかである。癌を処置することは、癌の増殖が減少もしくは停止するように癌を安定化させること、または処置された個体における癌細胞の数が減少するようにすること、および／または個体が癌にならない（すなわち、検出可能な癌細胞がない）ようにすることを意味する。
【００３４】
態様では、既存の免疫応答を動員する工程は、既存の免疫応答の１以上の構成要素によって認識される抗原を癌に導入することを含む。好ましい態様において、抗原は、処置前に癌には存在しない。このように、一態様は、個体における癌を処置する方法であって、既存の免疫応答の１以上の構成要素によって認識される抗原を癌に導入することによって既存の免疫応答を該癌に動員することを含み、ここで、抗原は、癌を処置する前に癌に存在していない。したがって、上記のように、既存の免疫応答は、天然の免疫応答であってもよいし、または誘導された免疫応答であってもよい。癌への抗原の導入は、当技術分野で知られている方法を用いて達成することができ、処置される癌のタイプに応じて変化し得る。例えば、癌の１タイプは、固形腫瘍である。そのような癌では、癌細胞は複製して親癌細胞に隣接したままであり、その結果、隣接する癌細胞から形成される組織の塊が形成される。そのような癌は細胞の塊であるため、抗原は、その塊に直接、またはその中に送達され得る。一態様では、個体における癌を処置する方法であって、ここで、癌が固形腫瘍である場合には、既存の免疫応答を固形腫瘍に動員することを含み、この方法は、既存の免疫応答の１以上の構成要素によって認識される抗原を固形腫瘍に導入することによって固形腫瘍に既存の免疫応答をリクルートすることを含み、この場合、この抗原は、処置の前に固形腫瘍に存在しない。一態様では、既存の免疫応答は、天然の免疫応答である。一態様では、既存の免疫応答は、誘導された免疫応答である。一態様では、抗原は、癌（例えば、固形腫瘍）への抗原の注入により、該癌（例えば、固形腫瘍）に送達される。そのような態様では、抗原は、該抗原がそのような分子に直接結合することによって、または抗原の癌細胞による取り込みおよび処理によって、細胞のＭＨＣ Ｉ分子上に表示されることを可能にするように、癌に直接送達される。これらの方法において、抗原は、免疫系への抗原の取り込みおよび／または提示を増強する他の分子または化合物と組み合わせることができる。
【００３５】
上記のように、これらの方法において、抗原はタンパク質であってもよい。これらのタンパク質抗原は、上述したように、癌（例えば、腫瘍）に直接注入されてもよい。したがって、一態様は、個体における癌を処置する方法であって、該癌が固形腫瘍である場合、固形腫瘍に抗原性タンパク質を注入することにより、固形腫瘍に既存の免疫応答を動員することを含み、ここで、抗原性タンパク質は、既存の免疫応答の１以上の構成要素により認識され、ここで、抗原性タンパク質は、処置前に固形腫瘍に存在しない。あるいは、タンパク質抗原は、タンパク質をコードする核酸分子を癌に導入することにより、癌に導入することができる。したがって、一態様では、個体における癌を処置する方法であって、癌が固形腫瘍である場合に、抗原性タンパク質をコードする核酸分子を固形腫瘍に導入することにより、固形腫瘍に既存の免疫応答を動員することを含み、ここで、抗原性タンパク質は、既存の免疫応答の１以上の構成要素により認識され、ここで、抗原性タンパク質は、処置前に固形腫瘍に存在しない。抗原をコードする核酸分子の癌への導入は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法を用いて行うことができる。一態様では、個体における癌を処置する方法であって、癌が固形腫瘍である場合、抗原性タンパク質をコードする核酸分子を固形腫瘍に注入することにより、固形腫瘍に既存の免疫応答を動員することを含み、ここで、抗原性タンパク質は、既存の免疫応答の１以上の構成要素により認識され、ここで、抗原性タンパク質は、処置前に固形腫瘍に存在しない。これらの方法において、抗原をコードする核酸分子は、裸の（naked）核酸分子（すなわち、核酸分子の安定性の送達を増強することを意図した他の分子と複合化していない核酸分子）として注入されてもよく、または注入された抗原をコードする核酸分子は、核酸分子の送達、安定性または寿命を増強することを意図した１以上の化合物と複合化されてもよい。そのような化合物の例としては、脂質、タンパク質、炭水化物および合成ポリマーを含むポリマーが挙げられる。
【００３６】
２以上の抗原をコードする核酸分子は、組換えウイルスまたはシュウドウイルス（シュウドビリオン）などの送達ビヒクルを用いて癌に導入することもできる。本発明の方法を実施するのに有用なウイルスの例としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびパピローマウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。核酸分子を送達するためのこのようなウイルスの使用は、当業者に知られており、米国特許第８，３９４，４１１号にも開示されており、これは引用により本明細書に包含される。本発明の方法を実施するのに有用なシュウドウイルスの例としては、肝炎シュウドウイルス、インフルエンザシュウドウイルス、およびパピローマシュウドウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で用いられるシュウドウイルスとは、癌細胞に結合して侵入することができるウイルス様粒子（ＶＬＰ）に組み立てられたウイルスキャプシドタンパク質からなる粒子を意味する。そのようなシュウドビリオン粒子は、サブゲノム量のウイルス核酸分子をパッケージ化することができるが、好ましくはパッケージ化しない。シュウドビリオンを製造し、使用する方法は、当技術分野で知られており、また、米国特許第６，５９９，７３９号；同第７，２０５，１２６号；および同第６，４１６，９４５号にも記載されており、これらの全てが引用によりその内容全体を本明細書に包含させる。従って、本開示は、個体における癌を処置する方法を提供し、ここで、癌が固形腫瘍である場合、抗原性タンパク質をコードする核酸分子からなる組換えウイルスまたはシュウドウイルスを腫瘍に導入することにより、固形腫瘍に既存の免疫応答を動員することからなり、抗原性タンパク質は、既存の免疫応答の１以上の構成要素により認識され、抗原性タンパク質は、処置前に固形腫瘍に存在していない。本開示の核酸分子を担持したシュウドウイルスを細胞に侵入させると、細胞によるコード化された抗原性タンパク質の発現、およびその後の免疫系への抗原の提示が生じる。これらの方法において、シュウドウイルスは、乳頭腫シュウドウイルスである。
【００３７】
抗原をコードする核酸分子を含むウイルスまたはシュウドウイルスの癌への導入は、当該技術分野で知られている任意の適切な方法を用いて達成することができる。例えば、抗原をコードする核酸分子を含む組換えウイルスまたはシュウドウイルスを、癌の近くに、または癌に直接注入することができる。あるいは、抗原をコードする核酸分子を含む組換えウイルスまたはシュウドウイルスを、該組換えウイルスまたはシュウドウイルスが癌に送達される結果となる経路で個体に投与することができる。そのような経路の例としては、静脈内（ＩＶ）注射、筋肉内（ＩＭ）注射、腹腔内（ＩＰ）注射、皮下（ＳＣ）注射および経口送達が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、一態様は、抗原性タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えウイルスまたはシュウドウイルスを個体に投与することを含む、該個体における癌を処置する方法であって、ここで、該癌が固形腫瘍であり、抗原性タンパク質が既存の免疫応答の１以上の構成要素によって認識され、抗原性タンパク質が処置前に該固形腫瘍に存在しない、方法である。これらの方法において、組換えウイルスまたはシュウドウイルスは、固形腫瘍に直接注入してもよく、または該組換えウイルスもしくはシュウドウイルスは、ＩＶ注射、ＩＭ注射、ＩＰ注射、ＳＣ注射および経口送達から選択される方法を用いて送達してもよい。
【００３８】
本開示の方法は、血液にかかる癌を処置するために用いられ得る。血液にかかる癌、血液の癌、血液腫瘍などは、骨髄などの血液形成組織、または免疫系の細胞で始まる。血液の癌の例としては、白血病、リンパ腫、多発性骨髄腫などが挙げられる。このような癌は、血液形成組織の細胞、または免疫系の細胞が、細胞複製の制御を失い、制御されていない方法で複製を開始するときに始まる。いったん形成されると、血液の癌細胞は血液またはリンパ系内に入り込み、血液および／またはリンパ系における癌細胞の数の著しい増加を引き起こす。例えば、白血病は、血液および骨髄に見いだされる癌である。白血病は、白血球の制御されていない複製によって生じ、その結果、血液およびリンパ組織中の異常白血球の数が大幅に増加する。これらの異常白血球は、正常に機能せず、したがって、白血病を有する個体は、感染症と戦うことができない。したがって、本開示は、既存の免疫応答の１以上の構成要素によって認識される抗原を血液腫瘍の癌細胞に導入することによって、該既存の免疫応答を個体における血液腫瘍の癌細胞に動員することを含む、該個体における血液腫瘍を処置する方法であって、ここで、該抗原は、処置前に血液腫瘍の癌細胞内に存在しないか、または該細胞上に存在しない、方法を提供する。これらの方法では、既存の免疫応答は、天然の免疫応答であってもよいし、または誘導された免疫応答であってもよい。血液癌細胞への抗原の導入は、任意の好適な方法を用いて行うことができる。これらの方法において、抗原は、該抗原の血液腫瘍の癌細胞への送達をもたらす形で、該抗原を個体に投与することにより、血液腫瘍の癌細胞に導入することができる。例えば、抗原は、ＩＶ注射、ＩＭ注射、ＩＰ注射、ＳＣ注射および経口投与から選択される方法を用いて、個体に投与することができる。これらの方法において、抗原は、例えば、該抗原を血液腫瘍の癌細胞上の分子を結合するタンパク質に結合させることにより、該血液腫瘍の癌細胞に標的化することができる。
【００３９】
抗原はまた、抗原性タンパク質をコードする核酸分子を個体の血液腫瘍の癌細胞に導入することにより、該血液腫瘍の癌細胞に導入することもできる。したがって、本開示は、抗原性タンパク質をコードする核酸分子を個体に投与することによって、既存の免疫応答を該血液腫瘍の癌細胞に動員することを含む、該個体における血液腫瘍を処置する方法であって、ここで、該抗原性タンパク質は、既存の免疫応答の１以上の構成成分によって認識され、該抗原性タンパク質は、処置前に血液腫瘍の癌細胞内に、または該細胞上に存在しない、方法を提供する。抗原をコードする核酸分子の個体への投与は、当技術分野で知られている任意の適切な方法を用いて行うことができる。例えば、抗原をコードする核酸分子は、裸の核酸分子として注入することができる。あるいはまたはさらに、抗原をコードする核酸分子は、該核酸分子の送達、安定性または寿命を向上させることを意図した１以上の化合物と複合体化されてもよい。そのような化合物の例としては、脂質、タンパク質、炭水化物および合成ポリマーを含むポリマーが挙げられる。
【００４０】
２以上の抗原をコードする核酸分子は、組換えウイルスまたはシュウドウイルスなどの送達ビヒクルを用いて、血液癌細胞に導入することもできる。そのような送達ビヒクルの例は、本明細書に上記した通りである。本発明の方法を実施するのに有用なウイルスの例としては、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスおよびパピローマウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法を実施するのに有用なシュウドウイルスの例としては、肝炎シュウドウイルス、インフルエンザシュウドウイルスおよびパピローマシュウドウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本開示は、抗原性タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えウイルスまたはシュウドウイルスを腫瘍に導入することにより、固形腫瘍に既存の免疫応答を動員することを含む、個体における血液癌を処置する方法であって、ここで、抗原性タンパク質が、既存の免疫応答の１以上の構成要素によって認識され、抗原性タンパク質が、処置前に血液癌細胞内に、または血液癌細胞上に存在していない、方法を提供する。
【００４１】
抗原をコードする核酸分子を含むウイルスまたはシュウドウイルスの癌への導入は、当技術分野で知られている任意の適切な方法を用いて達成することができる。例えば、抗原をコードする核酸分子を含む組換えウイルスまたはシュウドウイルスは、該組換えウイルスまたはシュウドウイルスが癌に送達される結果となる経路により、個体に投与され得る。そのような経路の例としては、静脈内（ＩＶ）注射、筋肉内（ＩＭ）注射、腹腔内（ＩＰ）注射、皮下（ＳＣ）注射および経口投与が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、本開示は、抗原性タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えウイルスまたはシュウドウイルスを個体に投与することを含む、個体における血液癌を処置する方法であって、ここで、該抗原性タンパク質は、既存の免疫応答の１以上の構成要素によって認識され、該抗原性タンパク質は、処置前に血液癌細胞に存在しないか、または血液癌細胞上に存在しない、方法を提供する。組換えウイルスまたはシュウドウイルスは、ＩＶ注射、ＩＭ注射、ＩＰ注射、ＳＣ注射および経口投与からなる群より選択される方法を用いて送達され得る。
【００４２】
本明細書に記載の方法は、１以上の抗原を用いて、既存の免疫応答を癌に動員する。抗原が既存の免疫応答の１以上の構成要素によって認識され、かつ抗原が処置前に癌細胞内または癌細胞上に存在しない限り、全ての抗原を用いることができる。有用な抗原の例としては、ウイルス抗原および細菌抗原が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法を実施するのに有用なウイルス抗原の一例は、サイトメガロウイルスタンパク質由来の少なくとも１つのエピトープを含む抗原である。本明細書で用いるエピトープは、免疫系によって認識され、それによって免疫応答を誘導するアミノ酸残基のクラスターである。そのようなエピトープは、連続するアミノ酸残基（すなわち、タンパク質中で互いに隣接するアミノ酸残基）から構成されていてもよく、または、非連続なアミノ酸残基（すなわち、タンパク質中で互いに隣接しないアミノ酸残基）から構成されていてもよいが、最終的に折り畳まれたタンパク質中で密接に特別に近接しているアミノ酸残基から構成されていてもよい。エピトープが免疫系によって認識されるためには、少なくとも６個のアミノ酸残基が必要であることは、当技術分野の当業者には一般に理解されている。したがって、本発明の方法は、サイトメガロウイルスタンパク質由来の少なくとも１つのエピトープを含む抗原の使用を含み得る。抗原が癌に対する既存の免疫応答を動員する限り、本発明の方法を実施するのに有用な抗原を産生するために、何らかの適切なＣＭＶタンパク質が用いられ得る。本明細書に記載の方法での使用に適したＣＭＶタンパク質の例としては、ＣＭＶ ｐｐ５０、ＣＭＶ ｐｐ６５、ＣＭＶ ｐｐ１５０、ＣＭＶ ＩＥ−１、ＣＭＶ ＩＥ−２、ＣＭＶ ｇＢ、ＣＭＶ ＵＳ２、ＣＭＶ ＵＬ１６およびＣＭＶ ＵＬ１８が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなタンパク質およびその有用なフラグメントの例は、米国特許公開第２００５／００１９３３４４４号および同第２０１０／０１８３６４７号に開示されており、これらの両方は引用によりその内容全体が本明細書に包含される。有用なフラグメントはまた、配列番号１−６７のアミノ酸配列を含むペプチドのいずれか１つまたはその組み合わせを含み得る。
【００４３】
開示の方法はまた、１以上の抗原を用いて実施することができ、これらの抗原の各々は、独立して、ＣＭＶタンパク質からの少なくとも８個の連続するアミノ酸配列の変異体であるアミノ酸配列を含む。本明細書で用いる変異体とは、対照配列と類似しているが同一ではない配列を有するタンパク質または核酸分子を意味し、変異体タンパク質（または変異体核酸分子によってコードされるタンパク質）の活性（例えば、免疫原性）が有意に変化しないものである。これらの配列の変異は、天然の変異であってもよく、または当業者に知られている遺伝子工学的技術を用いて改変されてもよい。そのような技術の例は、Sambrook J, Fritsch E F, Maniatis T et al., in Molecular Cloning-A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, pp. 9.31-9.57、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に見いだされる。
【００４４】
変異体に関しては、結果として生じる変異体タンパク質が免疫応答を誘導する能力を保持している限り、アミノ酸配列のあらゆるタイプの変更が許容される。このような変異体の例としては、欠失、挿入、置換およびそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。例えば、タンパク質では、１つまたは複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）のアミノ酸が、そのタンパク質の活性に著しい影響を与えることなく、しばしばタンパク質のアミノ末端および／またはカルボキシ末端から除去され得ることは、当業者にはよく理解されている。同様に、１以上の（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個）アミノ酸は、しばしば、そのタンパク質の活性に著しい影響を与えることなく、タンパク質中に挿入され得る。
【００４５】
記載のように、変異体タンパク質は、対照タンパク質（例えば、野生型タンパク質）との相対的なアミノ酸置換を含み得る。タンパク質の活性が著しく影響を受けない限り、任意のアミノ酸置換が許容される。この点で、アミノ酸は、それらの物理的性質に基づいて分類され得ることが当技術分野では理解される。そのような群の例としては、荷電アミノ酸、無荷電アミノ酸、極性無荷電アミノ酸および疎水性アミノ酸が挙げられるが、これらに限定されない。置換を含む好ましい変異体は、アミノ酸が同じ群からのアミノ酸で置換されているものである。このような置換は、保存的置換と呼ばれる。
【００４６】
天然残基は、共通の側鎖特性に基づいてクラス分けされ得る。１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；４）塩基性：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；および、６）芳香族性：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【００４７】
例えば、非保守的な置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスのメンバーと交換することを含み得る。
【００４８】
アミノ酸変異を行う際、アミノ酸の疎水性指数を考慮することができる。各アミノ酸には、その疎水性特性および電荷特性に基づいて親水性指数が割り当てられている。親水性指数としては、イソロイシン（＋４．５）；バリン（＋４．２）；ロイシン（＋３．８）；フェニルアラニン（＋２．８）；システイン／シスチン（＋２．５）；メチオニン（＋１．９）；アラニン（＋１．８）；グリシン（−０．４）；スレオニン（−０．７）；セリン（−０．７）；セリン（−０．８）；トリプトファン（−０．９）；チロシン（−１．３）；プロリン（−１．６）；ヒスチジン（−３．２）；グルタミン酸（−３．５）；グルタミン（−３．５）；アスパラギン（−３．５）；リジン（−３．９）；および、アルギニン（−４．５）が挙げられる。タンパク質に相互作用的な生物学的機能を付与する際の疎水性アミノ酸指数の重要性は、当技術分野で一般に理解されている（Kyte et al., 1982, J. Mol. Biol. 157:105-31）。特定のアミノ酸が、類似の疎水性指数またはスコアを有する他のアミノ酸で置換されても、依然として類似の生物学的活性を保持していてもよいことが知られている。親水性指数に基づいて変更を加える場合には、親水性指数が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内であるアミノ酸が特に好ましく、±０．５以内であるアミノ酸がさらに好ましい。
【００４９】
同様のアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に行うことができることが、特に、それによって作製された生物学的機能性において等価なタンパク質またはペプチドが、本発明の場合のように免疫学的発明での使用を意図している場合には、当技術分野で理解されている。隣接するアミノ酸の親水性によって支配されるタンパク質の最大の局所平均親水性は、その免疫原性および抗原性と相関し、すなわち、タンパク質の生物学的性質と相関する。以下の親水性値は、これらのアミノ酸残基に割り当てられている：アルギニン（＋３．０）；リジン（＋３．０）；アスパラギン酸（＋３．０±１）；グルタミン酸（＋３．０±１）；セリン（＋０．３）；アスパラギン（＋０．２）；グルタミン（＋０．２）；グリシン（０）；スレオニン（−０．４）；プロリン（−０．５±１）；アラニン（−０．５）；ヒスチジン（−０．５）；システイン（−１．０）；メチオニン（−１．３）；バリン（−１．５）；ロイシン（−１．８）；イソロイシン（−１．８）；チロシン（−２．３）；フェニルアラニン（−２．５）；および、トリプトファン（−３．４）。類似の親水性値に基づいて変更を加える場合、親水性値が±２以内のアミノ酸の置換が好ましく、±１以内のアミノ酸が特に好ましく、±０．５以内のアミノ酸がさらに好ましい。また、親水性に基づいて一次アミノ酸配列からエピトープを同定してもよい。 
【００５０】
所望のアミノ酸置換（保存的であるか非保存的であるかにかかわらず）は、そのような置換が望まれる時点で、当業者であれば決定することができる。例えば、アミノ酸置換は、タンパク質の重要な残基を同定するために、またはタンパク質の免疫原性、溶解性または安定性を増加または減少させるために用いることができる。例示的なアミノ酸置換は、以下の表に示されている。
【００５１】
【表１】
2021502355.tif 000003
【００５２】
本明細書で用いる語句“有意にタンパク質の活性に影響を与える”は、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％のタンパク質の活性の低下を意味する。本発明に関して、そのような活性は、例えば、中和抗体を誘導する、またはＴ細胞応答を誘導するタンパク質の能力として測定され得る。そのような活性を決定する方法は、当業者に知られている。
【００５３】
本開示の方法は、ＣＭＶタンパク質から、それぞれ独立して、少なくとも６個の連続アミノ酸、少なくとも１０個の連続アミノ酸、少なくとも２０個の連続アミノ酸、少なくとも３０個の連続アミノ酸、少なくとも５０個の連続アミノ酸、少なくとも７５個の連続アミノ酸、少なくとも７５個の連続アミノ酸、または少なくとも１００個の連続アミノ酸からなる、１以上の抗原を用いてよい。本開示の方法は、それぞれが独立して、ＣＭＶタンパク質から、少なくとも１０個の連続アミノ酸、少なくとも２０個の連続アミノ酸、少なくとも３０個の連続アミノ酸、少なくとも５０個の連続アミノ酸、少なくとも７５個の連続アミノ酸、または少なくとも１００個の連続アミノ酸に対して、少なくとも８５％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を有する１以上の抗原を用いてもよい。本開示の方法は、それぞれが独立して、ＣＭＶタンパク質から、少なくとも６個の連続アミノ酸、少なくとも１０個の連続アミノ酸、少なくとも２０個の連続アミノ酸、少なくとも３０個の連続アミノ酸、少なくとも５０個の連続アミノ酸、少なくとも７５個の連続アミノ酸、または少なくとも１００個の連続アミノ酸を含む、１つまたは複数の抗原を用いてもよい。本開示の方法は、抗原がＭＨＣ Ｉ制限抗原であるＣＭＶタンパク質からの９から１５個の連続アミノ酸残基に対して、それぞれが独立して、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む１以上の抗原を用いてもよい。本開示の方法は、抗原がＭＨＣ Ｉ−制限抗原であるＣＭＶタンパク質からの９から１５個の連続するアミノ酸残基をそれぞれ独立して含む１以上の抗原を用いてもよい。本開示の方法は、抗原がＭＨＣ ＩＩ制限抗原であるＣＭＶタンパク質からの少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基に対して、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む１以上の抗原を用いることができる。本開示の方法は、抗原がＭＨＣ ＩＩ制限抗原であるＣＭＶタンパク質からの少なくとも１５個の連続するアミノ酸残基を含む１以上の抗原を用いてもよい。本開示の方法は、配列番号１−６７のアミノ酸配列からなるペプチドからなる群から選択される配列、またはそれらの任意の組み合わせからなるペプチドと、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む１以上の抗原を用い得る。本開示の方法は、配列番号１−６７のアミノ酸配列を含むペプチドからなる群から選択される配列、またはそれらの任意の組み合わせからなる配列に対して、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、または少なくとも９９％同一のアミノ酸配列からなる１種以上の抗原を用いてもよい。本開示の方法は、配列番号１−６７のアミノ酸配列を含むペプチドからなる群より選択される配列、またはそれらの任意の組み合わせからなる１以上の抗原を用いることができる。
【００５４】
【表２】
2021502355.tif 000004
【表３】
2021502355.tif 000005
【００５５】
本発明の方法は、がんに対する既存の免疫応答を動員することによって、個体のがんを処置することを含む。これらの方法において、個体は、癌処置を開始する前に、抗原に対する既存の免疫応答を有することが知られていてもよい。個体は、癌処置を開始する前に、既存の免疫応答の存在を確認するために検査されてもよい。したがって、これらの方法は、個体が抗原に対する既存の免疫応答を有していることを確認することにより、該個体の癌を処置することを含み、ここで、該抗原は、癌に存在しないか、または癌上に存在しない。次いで、抗原が癌に導入されるように、既存の免疫を有することが確認された個体に該抗原が投与され、それにより癌を処置する。
【００５６】
そのような方法は、何らかの固形腫瘍および／または血液の癌を含む、本明細書に既に記載の癌のいずれかを処置するために用いることができる。
【００５７】
処置されるべき個体が抗原に対する既存の免疫応答を有することを確認する何らかの方法を、本開示の方法を実施するために用いることができる。そのような方法の例としては、個体からのサンプル中で、特定の抗原を認識するＢ細胞、特定の抗原を認識する抗体、特定の抗原を認識するＴ細胞、または特定の抗原に応答して開始されるＴ細胞活性を識別することが挙げられる。個体からのいずれか好適なサンプルは、既存の免疫応答を同定するために用いられ得る。好適なサンプルの例としては、全血、血清、血漿および組織サンプルが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で用いる、Ｂ細胞、Ｔ細胞または抗体による特異的抗原の認識とは、そのようなＢ細胞、Ｔ細胞または抗体が、抗原を特異的に結合する能力を意味する。Ｂ細胞、Ｔ細胞または抗体による抗原の特異的結合とは、Ｂ細胞、Ｔ細胞または抗体が、同じＢ細胞、Ｔ細胞または抗体の抗原とは無関係の分子に対する結合親和性よりも高い親和性で特異的な抗原に結合することを意味する。例えば、ＣＭＶ ｐｐ５０タンパク質の抗原を認識する、またはそれに対して特異的であるＢ細胞、Ｔ細胞または抗体は、ＣＭＶ ｐｐ５０タンパク質と無関係なタンパク質、例えばヒトアルブミンに対する同じＢ細胞、Ｔ細胞または抗体の結合親和性よりも有意に大きい親和性でＣＭＶ ｐｐ５０抗原を結合する。２つの物体間の特異的結合は、それらの解離定数によって科学的に表すことができ、約１０−６未満、約１０−７未満、または約１０−８Ｍ未満であることが多い。分子間の、細胞間と分子間の特異的結合の概念、およびそのような結合を測定する方法は、酵素イムノアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降法、イムノブロットアッセイおよび例えば上記のSambrookらの文献およびHarlow et al., Antibodies, a Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Labs Press, 1988)に記載の他のイムノアッセイを含むが、これらに限定されない、当業者にはよく知られている方法である。そのような方法はまた、引用により本明細書に包含させる米国特許第７，１７２，８７３号にも記載されている。個体からのサンプル中のＴ細胞活性化を測定する方法もまた、当業者には知られている。そのような方法の例は、米国特許公開第２００３／００３４８５号および米国特許第５，７５０，３５６号に開示されており、これらは両方とも、引用により本明細書に包含される。
【００５８】
そのような方法は、一般に、個体からのＴ細胞含有サンプルを抗原と接触させ、Ｔ細胞の活性化のためにサンプルを測定することを含む。Ｔ細胞活性化を測定する方法もまた、当技術分野で周知であり、Walker, S., et al., Transplant Infectious Disease, 2007:9:165-70；および、Kotton, C.N. et al. (2013) Transplantation 96, 333に開示されている。
【００５９】
市販のＣＭＶ検査（QuantiFERON（商標）−CMV、QIAGEN Sciences Inc. Germantown、MD）を、ヘパリン添加全血中の細胞を刺激するためにヒトサイトメガロウイルスタンパク質（ＣＭＶ）を刺激するペプチドカクテルを用いたインビトロ診断テストとして利用できる。疾患／感染に曝された患者は、血液中に特異的なＴ細胞リンパ球を有しており、該疾患／感染を誘導する（priming）抗原（免疫学的に反応性の分子）に対する免疫学的記憶を維持している。誘導された個体から採血された血液への抗原の添加は、抗原特異的エフェクターＴ細胞の迅速な再刺激をもたらし、その結果、サイトカイン（例えば、ＩＦＮ−γ）の放出をもたらす。エフェクターＴ細胞は、プライミング抗原に曝露されたときに迅速に応答し得る。従って、抗原曝露に応答するＩＦＮ−γの産生は、その抗原に対する細胞免疫応答の特異的マーカーである。このＩＦＮ−γ応答は、免疫応答を定量化するために用いることができる。酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の検出は、ＣＭＶ感染に関連するペプチド抗原に対するインビトロ応答を同定するために用いられる。QuantiFERON（商標）−ＣＭＶの使用目的は、ヒトの抗ＣＭＶ免疫のレベルを観測することである。
【００６０】
従って、個体の癌を治療するための本開示の方法のいずれかにおいて、個体は、まず、癌中にまたは癌上に存在しない抗原に対する既存の免疫応答を有することが確認され得る。この既存の免疫応答は、個体からのサンプル中で識別することによって確認され得る。
ｉ）特定の抗原を認識するＢ細胞；
ｉｉ）特定の抗原を認識する抗体；
ｉｉｉ）特定の抗原を認識するＴ細胞；および
ｉｖ）特定の抗原に反応して開始されるＴ細胞活性。
その後、抗原が癌に導入されるように、既存の免疫応答を有することが確認された個体に特異的抗原を投与し、それによって癌を処置することができる。
【００６１】
本開示で提供される方法のいずれかにおいて、本発明の実施態様の範囲内で、免疫調節または動員を増強するために、ＣＭＶ抗原と組み合わせて他の薬剤を用いてもよい（すなわち、投与してもよい）。そのような他の薬剤としては、ＴＬＲアゴニスト；静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩＧ）；グラム陽性細菌から単離されたペプチドグリカン；グラム陽性細菌から単離されたリポテコール酸；グラム陽性細菌から単離されたリポタンパク質；マイコバクテリアから単離されたリポアラビノマンナン；酵母細胞壁から単離されたザイモサン；ポリアデニル−ポリウリジル酸；ポリ（ＩＣ）；リポ多糖類；モノホスホリル脂質Ａ；フラジェリン；ガルディキモド；イミキモド；Ｒ８４８；ＣｐＧモチーフを含むオリゴヌクレオシド、ＣＤ４０アゴニスト、および２３ＳリボソームＲＮＡが挙げられる。これらの方法の好ましい面では、ＴＬＲアゴニストはポリ−ＩＣである。
【００６２】
本開示の別の面は、個体を検査し、該個体において癌に対する既存の免疫応答を動員するためのキットである。このキットは、少なくとも１つのＣＭＶペプチド抗原またはそのペプチドをコードする核酸、薬学的に許容される担体、容器、ならびに患者における癌の少なくとも１つの症状を軽減するためのＣＭＶペプチドの投与を示す添付文書またはラベルを含んでよい。これらのキットは、ＣＭＶ抗原に対する患者の抗原性応答を検査するための手段をさらに含んでもよい。例えば、キットは、全血サンプルを入手し試験するための滅菌されたプラスチックウェア、およびＣＭＶペプチド抗原に対する応答のインビトロ試験、および／またはこれらのペプチド抗原に対するインビトロ応答を同定するための酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によるインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）の検出を含んでもよい。
【実施例】
【００６３】
実施例
例えばヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）のような、通常は宿主によって十分に制御されている慢性ウイルス感染症は、しばしば、加齢に伴い、完全に機能するウイルス特異的Ｔ細胞の数がますます多くなる誘導をもたらす。ｈＣＭＶに対するヒト免疫応答の重要な面を模倣したマウスｍＣＭＶモデルを用いて、本発明者らは、これらの抗ウイルスＴ細胞を腫瘍に誘引し、それに続いて腫瘍細胞の死滅および腫瘍ネオ抗原への強力なエピトープの拡散を誘導して、腫瘍増殖の長期的な制御および同種腫瘍細胞との再暴露からの保護を与える適応免疫応答をもたらす方法および試薬を開発した。
【００６４】
実施例１
マウスサイトメガロウイルス感染は、ｍＣＭＶペプチドプールに対するサイトカイン応答を誘導する
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１ｘ１０４ ｐｆｕのマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）を感染させた。感染後１２日目に血液サンプルを採血した。白血球を、ｍ３８、ｍ４５、ｍ５７、ｍ１２２、１ｍ３９、ｍ１４１およびｍ１６４ ｍＣＭＶタンパク質から選択された免疫原性ペプチド集団で再刺激した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２サイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色によって評価し、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって分析した（図１Ａ）。血液サンプルを、感染から２ヶ月後に採血した。インフレーション性（inflationary）（ｍ１２２）および非インフレーション性（non-inflationary）（ｍ４５）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＭＨＣ−Ｉ四量体染色を用いたＦＡＣＳにより検出した。メモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞応答をｍＣＭＶに対してマッピングした。脾臓を感染から６ヶ月後に採取した。ｍ３８、ｍ４５、ｍ１２２ ＭＨＣ−Ｉ制限およびｍ１３９560-574 ＭＨＣ−ＩＩ制限ｍＣＭＶペプチドでのインビトロ刺激後のＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ産生を、細胞内サイトカイン染色によって評価した（図１Ｂ）。
【００６５】
実施例２
ｍＣＭＶ抗原を発現するＨＰＶ Ｐｓｖを用いた固形腫瘍の腫瘍内導入
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに１ｘ１０４ ｐｆｕのマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）を感染させた。感染から６ヶ月後、マウスに、Ｅ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する２ｘ１０５ ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射（ｓ.ｃ.）した（注射プロトコール、図２Ａ）。腫瘍増殖を電子ノギスを用いて測定した。腫瘍注入後１３日目および１５日目に、ｍ１２２およびｍ４５を発現するＨＰＶ１６ Ｐｓｖ（図２Ｂ）、または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を発現するＨＰＶ Ｐｓｖ（図２Ｃ）を腫瘍内に注射した（Ｐｓｖ当たり１０８感染単位）。
【００６６】
実施例３
ポリ(Ｉ：Ｃ)と組合せてｍＣＭＶ抗原を用いた固形腫瘍の腫瘍内導入
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、１ｘ１０４ ｐｆｕのマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）を感染させた。感染から４ヶ月後、マウスに、Ｅ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する２ｘ１０５ ＴＣ−１腫瘍細胞（図３Ａ）を皮下注射した。腫瘍に、ポリ(Ｉ：Ｃ)（３０μg）（ＰＩＣ）の有無下で、１１日目および１３日目にｍ１２２、ｍ３８およびｍ４５を発現するＨＰＶ１６、１６日目および１８日目にｍ１２２、ｍ３８およびｍ４５を発現するＨＰＶ４５、ならびに２１日目および２３日目にｍ１２２、ｍ３８およびｍ４５を発現するＨＰＶ５８を、または対照ＲＦＰを（ＰｓＶ当たり１０８感染単位）、腫瘍内注射した。腫瘍増殖を、電子ノギスを用いて測定した（図３Ｂ−３Ｅ）。これらの腫瘍体積／増殖データは、ｍＣＭＶ抗原を発現するＨＰＶ Ｐｓｖによる固形腫瘍の腫瘍内導入が腫瘍増殖を遅延させ、ポリ（Ｉ：Ｃ）との共投与がさらに腫瘍増殖を遅延させることを実証している（図３Ｂおよび３Ｄを比較；および、図３Ｃおよび３Ｅを比較）。Ｅ７−（図３Ｆ）、ｍ４５−、およびｍ１２２−（図３Ｇ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞による腫瘍への浸潤を、ＭＨＣ−Ｉ四量体染色およびＦＡＣＳによって分析した。これらのデータは、これらのＣＭＶ抗原をポリ(ＩＣ)と組み合わせて投与したとき、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の腫瘍浸潤が有意に増強されたことを証明する。
【００６７】
実施例４
ｍＣＭＶ ＭＨＣ−Ｉ制限ペプチドの腫瘍内注射は生存率の向上をもたらす
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、１ｘ１０４ ｐｆｕのマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）を感染させた。感染から４ヶ月後、マウスを、Ｅ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する２ｘ１０５ ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射した（図３Ａ）。腫瘍に、１１日目、１３日目、１６日目、１８日目、２１日目および２３日目に、ポリ(Ｉ：Ｃ)（３０ｕｇ）の有無下、選択されたｍ３８、ｍ４５およびｍ１２２ペプチド（各１μｇ）を、および対照として生理食塩水またはポリ（Ｉ：Ｃ）単独を、腫瘍内注射した。動物の死亡を記録し（図４Ａ）、腫瘍増殖を電子ノギスを用いて測定した（図４Ｂ）。これらのデータは、ｍＣＭＶ ＭＨＣ−Ｉ制限ペプチドの腫瘍内注射が腫瘍増殖を遅延させ、生存率の増加をもたらすことを証明している。
【００６８】
実施例５
ｍＣＭＶ ＭＨＣ−Ｉ制限ペプチドの腫瘍内注射は腫瘍増殖を遅延させる
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、１ｘ１０４ ｐｆｕのマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）を感染させた。感染から４ヶ月後に、Ｅ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する２ｘ１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍に、１１日目、１３日目、１６日目、１８日目、２１日目および２３日目に、ポリ（Ｉ：Ｃ)（３０μｇ）の有無下、選択されたｍ３８、ｍ４５およびｍ１２２ペプチドの漸減用量（１μｇ、０．１μｇおよび０．０１μｇ）を、および対照として生理食塩水またはポリ（Ｉ：Ｃ)単独を、腫瘍内注射した。腫瘍増殖を、電子ノギスを用いて測定した（図５）。これらのデータは、ｍＣＭＶ ＭＨＣ−Ｉ制限ペプチドの腫瘍内注射が腫瘍増殖を遅延させることを示している。
【００６９】
実施例６
ｍＣＭＶ ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ制限ペプチドの組合せは腫瘍増殖を遅延させる
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、２．５ｘ１０５ ｍＣＭＶを感染させた。感染から４ヶ月後、マウスにＥ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する２ｘ１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍に、１２日目から２８日目まで、ＭＨＣ−Ｉ制限された選択されたｍ３８、ｍ４５およびｍ１２２ペプチド、および／またはＭＨＣ−ＩＩ制限されたｍ１３９選択されたペプチドまたは生理食塩水を、６回、腫瘍内注射した。すべてのペプチドを、ポリ（Ｉ：Ｃ）（３０μｇ）と共に注射した。群は、ＭＨＣ−Ｉペプチドを６回、またはＭＨＣ−ＩＩペプチドを６回、またはＭＨＣＩおよびＭＨＣＩＩペプチドを共に６回、またはＭＨＣ−Ｉペプチドを３回、次いでＭＨＣ−ＩＩペプチドを３回、またはＭＨＣ−ＩＩペプチドを３回、次いでＭＨＣ−Ｉペプチドを３回を順次注射した。腫瘍増殖を、電子ノギスを用いて測定した（図６Ａおよび６Ｂ）。これらのデータは、ｍＣＭＶ ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ制限ペプチドの組合せの腫瘍内注射が腫瘍増殖を遅延させることを実証している。血中のＥ７−、ｍ４５−、ｍ１２２−特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答もまた、各ペプチドのＭＨＣ−Ｉ四量体を用いたＦＡＣＳによって分析した（図６Ｃ）。これらのデータは、ｍＣＭＶ ＣＤ４エピトープ、次いでＣＤ８エピトープでの逐次的な腫瘍内接種が優先的に抗腫瘍免疫を誘導することを示している。
【００７０】
実施例７
原発腫瘍の完全クリアランスは長期的な腫瘍保護（tumor protection）をもたらす
実施例６に記載の原発腫瘍暴露から生き残った保護Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、第一暴露の反対側の脇腹に、Ｅ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する２ｘ１０５ ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍採取の対照として、若齢（１２週齢）マウスおよび年齢を合わせた（１０月齢の）マウスに、ＴＣ−１腫瘍細胞を暴露した。腫瘍増殖を、電子ノギスを用いて測定した（図７）。これらのデータは、原発腫瘍の完全クリアランスが二次腫瘍暴露に対する長期的な保護をもたらすことを示している。
【００７１】
実施例８
ＭＣＭＶの腫瘍内注射は腫瘍免疫微小環境を変化させる
腫瘍免疫微小環境に対する、ポリＩＣの有無下、ｍＣＭＶ ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ制限ペプチドの腫瘍内注射の効果を、最後の腫瘍内処置の終了の２日後に、Nanostring Cancer immunology遺伝子セット（nCounter）を用いて、ＲＮＡサンプルにおいて免疫遺伝子発現について分析した。結果を、解析した各遺伝子セットのスコア変化としてまとめた。遺伝子セットによる発現の差のグローバルスコアは、生理食塩水処理群（群ごとにｎ＝４）に対する相対的なスコアとした。評価された微小環境特性には以下のものが含まれた。Ｂ細胞機能、インターロイキン、ＴＮＦスーパーファミリー、抗原プロセシング、ＭＨＣ、適応免疫、トランスポーター機能、接着性、ＮＫ細胞機能、Ｔ細胞機能、ＣＤ分子、白血球機能、補体経路、ミクログリア機能、液性免疫、ＴＬＲ、炎症、樹状細胞機能、インターフェロン、自然免疫、マクロファージ機能、ケモカインおよび受容体、老化、アポトーシス、サイトカインおよび受容体、癌の進行、基礎細胞機能、細胞周期ならびに病原体応答。
【００７２】
実施例９
ｍＣＭＶ感染は、インフレーション性（Inflationary）Ｃ５７ＢＬ／６マウスのＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導する
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、５ｘ１０３ ｐｆｕのマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）を感染させた。血液サンプルを、感染の１ヶ月後または５ヶ月後に採血した。インフレーション性（ＩＥ３）および非インフレーション性（ｍ４５）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＭＨＣ−Ｉ四量体染色を用いたＦＡＣＳにより検出した。図８に示すように、ｍＣＭＶ感染は、異なるエフェクターおよびメモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を誘導した。
【００７３】
実施例１０
ｍＣＭＶ感染は、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて強力なＣＤ８＋およびＣＤ４＋ Ｔ細胞応答を誘導する
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、５ｘ１０３ ｐｆｕのマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）を感染させた。感染後１２日目に血液サンプルを採血した。脾臓細胞を、示されたペプチドおよびｍ３８、ｍ４５、ｍ５７、ｍ１２２、ｍ１３９、ｍ１４１およびｍ１６４ ｍＣＭＶタンパク質から選択された免疫原性ペプチドの集団を含む血液細胞で再刺激した。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−２サイトカイン産生を、細胞内サイトカイン染色により評価し、ＦＡＣＳにより分析した（図９Ａ、９Ｂ）。これらの結果は、マウスサイトメガロウイルス感染が大規模なサイトカイン応答を誘導することを示す。
【００７４】
実施例１１
ｍＣＭＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の組織分布
腫瘍保有マウスにおけるｍＣＭＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞の分布を調べた。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、５ｘ１０３ ｍＣＭＶを感染させた。実験スケジュールを図１０Ａに示す。感染から４ヶ月後に、マウスに、Ｅ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する２ｘ１０５ ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射した。リンパ節、脾臓、唾液腺および腫瘍組織を採取し、インフレーション性（ＩＥ３；図１０Ｂ）および非インフレーション性（ｍ４５；図１０Ｃ）特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞を、ＭＨＣ-Ｉ四量体染色を用いたＦＡＣＳにより検出した。常在性記憶Ｔ細胞マーカーの発現を、ＣＤ６９およびＣＤ１０３抗体を用いて評価した。これらの結果は、ＴＣ１腫瘍がｍＣＭＶ特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞によって浸潤されていることを示した。
【００７５】
実施例１２
腫瘍微小環境の遺伝子発現解析 
マウスモデルの腫瘍細胞における遺伝子の発現を、生理食塩水；ポリＩ：Ｃ（ＰＩＣ）（５０μｇ）；ｍＣＭＶ ｍ１３９ペプチド（ＭＨＣ−ＩＩ制限／ＣＤ４）（ＣＤ４）（３μｇ）；ｍＣＭＶ ｍ３８、ｍ１２２、ｍ４５ペプチド（ＭＨＣ−Ｉ制限／ＣＤ８）（ＣＤ８）（各１μｇ）；ｍＣＭＶ ｍ１３９＋ポリＩ：Ｃ（ＰＩＣ ＣＤ４）（各３μｇ）；ｍＣＭＶ ｍ３８、ｍ１２２、ｍ４５ペプチド（ＭＨＣ−Ｉ制限／ＣＤ８）＋ポリＩ：Ｃ（ＰＩＣ ＣＤ８）（各１μｇ）による腫瘍内処置（各群４匹）後に調べた。腫瘍を、ＴＣ１腫瘍細胞を皮下に配置後、１１週、１３週および１６週に３回処置した。実験プロトコルのタイムラインを、図１１Ａに示す。処置および腫瘍採取に続いて、QIACubeを用いて腫瘍ＲＮＡを抽出した。腫瘍細胞遺伝子発現を、tumor PanCancer Immune Profiling Panelの７７０個の遺伝子を形成する遺伝子転写物を測定するNanostring Cancer immunology遺伝子セット（NS_MM_CANCERIMM_C3400）を用いて分析した。簡潔には、正規化されたデータは、特定の生物学的プロセス（適応免疫、抗原プロセシング、Ｔ細胞機能、樹状細胞機能、ＮＫ細胞機能、インターフェロン、ＴＮＦスーパーファミリー遺伝子）内の遺伝子セット発現のヒートマップとして表される。生理食塩水処置に対する遺伝子発現変化のボルケーノプロットを構築する（プロットは、対照処置（生理食塩水）に対する処置群の変化（倍数増加または倍数減少で表される）を統計的有意性をもって表す）。細胞浸潤定量化アルゴリズムを適用する（ＣＤ４５、細胞傷害性ＣＤ８、ＣＤ４ Ｔｈ１、ＮＫ細胞、樹状細胞）。結果は、ＭＨＣ−Ｉ制限／ＣＤ８およびＭＨＣ−Ｉ制限／ＣＤ８＋ ポリ（Ｉ：Ｃ）処置動物において、グローバルな有意差スコアの最大変化を示した。
【００７６】
腫瘍内処置後の腫瘍ＲＮＡ全体の免疫遺伝子のプロファイリングでは、以下の３つの群で免疫遺伝子の有意な上方制御が示された。
１）ｍＣＭＶ ｍ１３９ペプチド：ＭＨＣ−ＩＩ制限／ＣＤ４ − ３ｍｇ（２３０個の遺伝子が上方制御され、４個の遺伝子が下方制御された）。
２）ｍＣＭＶ ｍ３８、ＩＥ３、ｍ４５ペプチド：ＭＨＣ−Ｉ制限／ＣＤ８ − １ｍｇ（３５９個の遺伝子が上方制御され、４３個の遺伝子が下方制御された）。
３）ｍＣＭＶ ｍ３８、ＩＥ３、ｍ４５ペプチド：ＭＨＣ−Ｉ制限／ＣＤ８＋ ポリ（Ｉ：Ｃ）（３０９個の遺伝子が上方制御され、４９個の遺伝子が下方制御された）。
【００７７】
白血球による腫瘍の浸潤もまた、腫瘍内処置後に分析した。図１１Ｂから１１Ｆは、異なる白血球による腫瘍浸潤を示す。これらのデータは、ＣＤ８ ｍＣＭＶエピトープ（ポリ（Ｉ：Ｃ）の有無下）の腫瘍内注射が、腫瘍内のＴ細胞および非Ｔ細胞（ＮＫ細胞）の動員を誘導することを示し；そして、ポリ（Ｉ：Ｃ）と共にＣＤ４ ｍＣＭＶエピトープの腫瘍内注射が、腫瘍内のＴ細胞および非Ｔ細胞（ＮＫ細胞）の動員を誘導することを示し；そして、ＣＤ８またはＣＤ４エピトープと共にポリ（Ｉ：Ｃ）の腫瘍内注射が、腫瘍内の樹状細胞の動員を誘導することを示している。
【００７８】
実施例１３
ｍＣＭＶ ＣＤ８エピトープの腫瘍増殖を遅延せるｍＣＭＶの腫瘍内注射
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、５ｘ１０３ ｐｆｕのマウスサイトメガロウイルス（ｍＣＭＶ）を感染させた。感染から４ヶ月後に、Ｅ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する２ｘ１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍増殖を電子ノギスを用いて測定した。腫瘍を、１１、１３、１６、１８、２１および２３日目に、ポリ（Ｉ：Ｃ）（３０μｇ）の有無下、選択されたＭＨＣ−Ｉ制限ｍ３８、ｍ４５およびｍ１２２ペプチド(各０．０１μｇ、０．１μｇまたは１μｇ）を、および対照として生理食塩水またはポリ（Ｉ：Ｃ）単独を、腫瘍内注射した。図１２Ａおよび１２Ｂは、ｍＣＭＶ ＭＨＣ−Ｉ制限ペプチドの腫瘍内注射が腫瘍増殖を遅延させ、ポリ（Ｉ：Ｃ）共注射が腫瘍制御を改善することを示す。
【００７９】
実施例１４
ポリ（Ｉ：Ｃ）を用いたｍＣＭＶ ＭＨＣ−Ｉおよび／またはＭＨＣ−ＩＩペプチドの腫瘍内注射によるＴＣ１およびＭＣ３８ 腫瘍暴露からの保護
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、５ｘ１０３ ｍＣＭＶを感染させた。感染から４ヶ月後、マウスにＥ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する２ｘ１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍増殖および生存をモニタリングした。腫瘍を、１２日目から２８日目まで、ポリ（Ｉ：Ｃ）（３０μｇ）の有無下、ＭＨＣ−Ｉ制限された選択されたｍ３８、ｍ４５およびｍ１２２ぺプチド、および／またはＭＨＣ−ＩＩ制限された選択されたｍ１３９ペプチド、ならびに対照として生理食塩水またはポリ（Ｉ：Ｃ）単独を、６回、腫瘍内注射した。群は、ＭＨＣ−Ｉペプチドで６回、またはＭＨＣ−ＩＩペプチドで６回、またはＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩペプチドを共に６回、またはＭＨＣ−Ｉペプチドで３回、次いでＭＨＣ−ＩＩペプチドで３回、またはＭＨＣ−ＩＩペプチドで３回、次いでＭＨＣ−Ｉペプチドで３回、を順次注射した。図１３Ａは、ｍＣＭＶ ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩ制限ペプチドの組合せの腫瘍内注射が腫瘍増殖を遅延させることを示し、図１３Ｂは、ＣＤ４（ＭＨＣ−ＩＩ）ｍＣＭＶエピトープ、次いでＣＤ８（ＭＨＣ−Ｉ）ｍＣＭＶエピトープでの逐次的な腫瘍内接種が長期生存を促進することを示している。 
【００８０】
実施例１５
処置後の、血中Ｅ７四量体陽性ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、５ｘ１０３ ｍＣＭＶを感染させた。感染から４ヶ月後、マウスにＥ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する２ｘ１０５のＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍の大きさを電子ノギスを用いて測定した。腫瘍を、１２日目から２８日目まで、ポリ（Ｉ：Ｃ）（３０ｕｇ）の有無下、ＭＨＣ−Ｉ制限された選択されたｍ３８、ｍ４５およびｍ１２２ペプチド、および／またはＭＨＣ−ＩＩ制限された選択されたｍ１３９ペプチド、ならびに対照として生理食塩水またはポリ（Ｉ：Ｃ）単独を、６回、腫瘍内注射した。すべてのペプチドをポリ（Ｉ：Ｃ）（３０ｕｇ）と共に注射した。群は、ＭＨＣ−Ｉペプチドで６回、またはＭＨＣ−ＩＩペプチドで６回、またはＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩペプチドを共に６回、またはＭＨＣ−Ｉペプチドで３回、次いでＭＨＣ−ＩＩペプチドで３回、またはＭＨＣ−ＩＩペプチドで３回、次いでＭＨＣ−Ｉペプチドで３回を順次注射した。血中のＥ７−、ｍ４５−、ｍ１２２−特異的ＣＤ８＋ Ｔ細胞応答を、各ペプチドのＭＨＣ−Ｉ四量対を用いてＦＡＣＳにより分析した。図１４は、ｍＣＭＶ ＣＤ４エピトープ、次いでＣＤ８エピトープでの逐次的な腫瘍内接種が、優先的に抗腫瘍免疫を誘導することを示す。
【００８１】
実施例１６
二次腫瘍暴露に対する長期的な保護
上記のよう一次腫瘍暴露を生き延びた保護されたＣ５７Ｂｌ／６マウスを、一次暴露の反対側の脇腹にＥ６およびＥ７腫瘍性タンパク質を発現する２ｘ１０５ ＴＣ−１腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍増殖を電子ノギスを用いて測定した。腫瘍摂取の対照として、若齢（１２週齢）のおよび年齢を合わせた（１０ヶ月齢）マウスをＴＣ−１腫瘍細胞で暴露した。図１５は、一次腫瘍の完全クリアランスが二次腫瘍暴露に対する長期的な保護をもたらすことを示す。
【００８２】
実施例１７
ポリ（Ｉ：Ｃ）と共にｍＣＭＶ ＭＨＣ−ＩペプチドおよびＭＨＣ−ＩＩペプチドの腫瘍内注射によるＭＣ３８腫瘍暴露からの保護
Ｃ５７Ｂｌ／６マウスを５ｘ１０３ ｍＣＭＶに感染させた。感染の４ヶ月後に、マウスに、ハイパーミュテーションおよびマイクロサテライト不安定性を示するマウス結腸腺癌由来の５ｘ１０５ ＭＣＭ３８腫瘍細胞を皮下注射した。腫瘍増殖をモニタリングした。腫瘍を、１２日目から２８日目まで、ポリ（Ｉ：Ｃ）（３０μｇ）の有無下、ＭＨＣ−Ｉ制限された選択されたｍ３８、ｍ４５およびｍ１２２ペプチド、またはＭＨＣ−ＩＩ制限された選択されたｍ１３９ペプチドのみ、ならびに対照として生理食塩水のみを、６回、腫瘍内注射した。図１６は、一次腫瘍の完全なクリアランスが、二次腫瘍暴露に対する長期的な保護をもたらすことを示す。図１６は、ｍＣＭＶ ＭＨＣ−ＩおよびＭＨＣ−ＩＩＩ制限ペプチドの組合せの腫瘍内注射が、腫瘍増殖を遅延させ、腫瘍クリアランスをもたらすことを示す。
【００８３】
実施例１から１７に記載の試験は、非インフレーション性およびインフレーション性のｍＣＭＶ特異的Ｔ細胞の両方が、潜在的なｍＣＭＶ感染の間に腫瘍に浸潤し、確立された抗ウイルスＴ細胞を固形腫瘍に再指向させることが、腫瘍免疫微小環境の深い変化に、腫瘍の退行を導くことを証明する。データはまた、確立された抗ウイルスＣＤ４＋ Ｔ細胞を固形腫瘍に再指向させることが、腫瘍関連抗原へのエピトープの拡散および腫瘍の完全なクリアランスを促進することを示している。したがって、これらの方法は、既存の抗ウイルスＴ細胞に基づく、広く適用可能な“抗原アゴニスト性”腫瘍処置を提供する。
【００８４】
ＨＰＶ Ｌ１およびＬ２粒子は、多数の腫瘍細胞に対して強い指向性（トロピズム）を示すが、無傷の上皮に結合または感染しない。したがって、ＨＰＶ ＰｓＶまたはＶＬＰは、抗腫瘍剤を遺伝的にまたは直接、腫瘍細胞への担体として用いることができる。
【００８５】
本発明を特定の態様を参照して説明したが、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされ、等価物が代用され得ることは、当業者によって理解されるべきである。さらに、特定の状況、材料、物質の組成物、プロセス、プロセス工程(複数可）を、本発明の目的、精神および範囲に適合させるために、多くの改変がなされてもよい。そのような修正はすべて、特許請求の範囲の範囲内であることが意図されている。
【図１−１】
2021502355.tif 000006
【図１−２】
2021502355.tif 000007
【図２】
2021502355.tif 000008
【図３−１】
2021502355.tif 000009
【図３−２】
2021502355.tif 000010
【図４】
2021502355.tif 000011
【図５】
2021502355.tif 000012
【図６−１】
2021502355.tif 000013
【図６−２】
2021502355.tif 000014
【図６−３】
2021502355.tif 000015
【図７】
2021502355.tif 000016
【図８】
2021502355.tif 000017
【図９−１】
2021502355.tif 000018
【図９−２】
2021502355.tif 000019
【図１０−１】
2021502355.tif 000020
【図１０−２】
2021502355.tif 000021
【図１０−３】
2021502355.tif 000022
【図１１−１】
2021502355.tif 000023
【図１１−２】
2021502355.tif 000024
【図１１−３】
2021502355.tif 000025
【図１２】
2021502355.tif 000026
【図１３】
2021502355.tif 000027
【図１４】
2021502355.tif 000028
【図１５】
2021502355.tif 000029
【図１６】
2021502355.tif 000030
【配列表】
2021502355000001.app
【国際調査報告】
2021502355.tif 000031
2021502355.tif 000032
2021502355.tif 000033