(57)【要約】  本出願は、ＤＮＡベクター、特に導入遺伝子の送達および発現のための直鎖状で連続的な構造を有する閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の合成的合成および無細胞合成の方法を説明する。本発明は、閉端ＤＮＡベクターの産生のためのインビトロプロセス、その方法および使用によって産生される対応するＤＮＡベクター産物、ならびに本発明のプロセスにおいて有用なオリゴヌクレオチドおよびキットに関する。本明細書に記載される方法を使用して産生されたＤＮＡベクターは、細胞株、例えば細菌または昆虫細胞株での産生中に導入された汚染物質による望ましくない副作用がない。さらに本明細書では、本明細書の方法を使用して合成されたｃｅＤＮＡベクターを使用した、インビトロ、エクスビボ、およびインビボでの信頼できる遺伝子発現のための方法および細胞株が提供される。
2021511047.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
閉端ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
第１のＩＴＲを含む第１の一本鎖ＩＴＲ分子を提供することと、
第２のＩＴＲを含む第２の一本鎖ＩＴＲ分子を提供することと、
発現カセット配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドを提供することと、
前記第１のＩＴＲ分子の５´および３´末端を前記二本鎖分子の第１の末端にライゲーションし、前記第２のＩＴＲ分子の５´および３´末端を前記二本鎖分子の第２の末端にライゲーションして、前記ＤＮＡベクターを形成することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記第１のＩＴＲおよび前記第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが合成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記二本鎖発現カセット配列が、前記発現カセット配列を含む二本鎖ＤＮＡ構築物からの切除によって得られた、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記二本鎖ＤＮＡ構築物内で、前記発現カセット配列が、５´末端で第１の制限エンドヌクレアーゼ切断部位と隣接し、３´末端で第２の制限エンドヌクレアーゼ切断部位と隣接する、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記二本鎖ＤＮＡ構築物が、バクミド、プラスミド、小環、または直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記第１の制限エンドヌクレアーゼおよび前記第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ制限エンドヌクレアーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記第１の制限エンドヌクレアーゼおよび前記第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる制限エンドヌクレアーゼである、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記第１のＩＴＲおよび前記第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、前記発現カセット配列へのライゲーションの前にアニーリングされる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記第１のＩＴＲおよび前記第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、それぞれ、前記発現カセット配列の前記第１の末端または前記発現カセット配列の前記第２の末端に相補的なオーバーハング領域を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記ライゲーションが、化学ライゲーションおよびタンパク質支援ライゲーションから選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ライゲーションが、Ｔ４リガーゼまたはＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によって行われる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第１のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記第２のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１のＩＴＲおよび前記第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのＲＢＥ部位を含む、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
前記第１のＩＴＲおよび前記第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、ＡＡＶ  ＩＴＲまたはＡＡＶ由来のＩＴＲである、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記第１のＩＴＲの配列が、表４Ｂもしくは表５に示される左ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号２、５〜９、３２〜４８から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記第２のＩＴＲの配列が、表４Ａもしくは表５に示される右ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号１、３、１０〜１４、１５〜３１から選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記発現カセット配列が、少なくとも１つのシス調節エレメントを含む、請求項１〜１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１９】
前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサー、転写後調節エレメント、およびポリアデニル化シグナルからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記発現カセット配列が、導入遺伝子配列を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記導入遺伝子配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドの長さである、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記導入遺伝子配列が、タンパク質をコードする、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記導入遺伝子配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記導入遺伝子配列が、機能的ヌクレオチド配列である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２７】
前記閉端ＤＮＡベクターが、ｃｅＤＮＡベクターである、請求項１〜２６のいずれかに記載の方法。
【請求項２８】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、精製される、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
請求項１〜２８のいずれかに記載の方法によって生成される、閉端ＤＮＡベクター。
【請求項３０】
請求項２９に記載の閉端ＤＮＡベクターおよび任意で賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項３１】
閉端ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
発現カセット、
前記発現カセットの上流（５´末端）にある第１のＩＴＲ、
前記発現カセットの下流（３´末端）にある第２のＩＴＲ、
および制限エンドヌクレアーゼが前記発現カセットの遠位にあるように、前記ＩＴＲに隣接する少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む二本鎖ＤＮＡ構築物を、
前記二本鎖ＤＮＡ構築物を前記制限エンドヌクレアーゼ切断部位で切断して、前記二本鎖ＤＮＡ構築物から前記制限エンドヌクレアーゼ切断部位の間の配列を切除することができる１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させることと、前記切除された配列の５´および３´末端をライゲーションして、閉端ＤＮＡベクターを形成することと、を含む、方法。
【請求項３２】
前記二本鎖ＤＮＡ構築物が、バクミド、プラスミド、小環、または直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記切除を行うために、単一の制限エンドヌクレアーゼが使用される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記切除を行うために、２つの異なる制限エンドヌクレアーゼが使用される、請求項３１または３２に記載の方法。
【請求項３５】
前記ライゲーションが、化学ライゲーションおよびタンパク質支援ライゲーションから選択される、請求項１〜３４のいずれかに記載の方法。
【請求項３６】
前記ライゲーションが、Ｔ４リガーゼまたはＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によって行われる、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、請求項３１〜３６のいずれかに記載の方法。
【請求項３８】
前記第２のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、請求項３１〜３７のいずれかに記載の方法。
【請求項３９】
前記第１のＩＴＲおよび前記第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのＲＢＥ部位を含む、請求項３１〜３８のいずれかに記載の方法。
【請求項４０】
前記第１のＩＴＲおよび前記第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、ＡＡＶ  ＩＴＲまたはＡＡＶ由来のＩＴＲである、請求項３１〜３９のいずれかに記載の方法。
【請求項４１】
前記第１のＩＴＲの配列が、表４Ｂもしくは表５に示される左ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号２、５〜９、３２〜４８から選択される、請求項３１〜４０のいずれかに記載の方法。
【請求項４２】
前記第２のＩＴＲの配列が、表４Ａもしくは表５に示される右ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号１、３、１０〜１４、１５〜３１から選択される、請求項３１〜４１のいずれかに記載の方法。
【請求項４３】
前記発現カセット配列が、少なくとも１つのシス調節エレメントを含む、請求項３１〜４２のいずれかに記載の方法。
【請求項４４】
前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサー、転写後調節エレメント、およびポリアデニル化シグナルからなる群から選択される、請求項３１〜４３のいずれかに記載の方法。
【請求項４５】
前記転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択される、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記発現カセット配列が、導入遺伝子配列を含む、請求項３１〜４６のいずれかに記載の方法。
【請求項４８】
前記導入遺伝子配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドの長さである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記導入遺伝子配列が、タンパク質をコードする、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記導入遺伝子配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記導入遺伝子配列が、機能的ヌクレオチド配列である、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記閉端ＤＮＡベクターが、ｃｅＤＮＡベクターである、請求項３１〜５１のいずれかに記載の方法。
【請求項５３】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、精製される、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項３１〜５４のいずれかに記載の方法によって生成される、閉端ＤＮＡベクター。
【請求項５５】
請求項５４に記載の閉端ＤＮＡベクターおよび任意で賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項５６】
ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
５´から３´の方向に順番に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
アンチセンス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、および
アンチセンス第１のＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ分子を合成することと、
前記一本鎖分子からヘアピンを含むポリヌクレオチドを形成することと、前記５´および３´末端をライゲーションして、前記閉端ＤＮＡベクターを形成することと、を含む、方法。
【請求項５７】
前記センス第１のＩＴＲ、前記センス発現カセット配列、前記センス第２のＩＴＲ、前記アンチセンス第２のＩＴＲ、前記アンチセンス発現カセット配列、および前記アンチセンス第１のＩＴＲのうちの少なくとも１つが合成される、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記一本鎖ＤＮＡ分子が、前記センス第１のＩＴＲ、前記センス発現カセット配列、前記センス第２のＩＴＲ、前記アンチセンス第２のＩＴＲ、前記アンチセンス発現カセット配列、および前記アンチセンス第１のＩＴＲのうちの１つ以上をオリゴヌクレオチドとして合成し、そのようなオリゴヌクレオチドをライゲーションして前記一本鎖ＤＮＡ分子を形成することによって構築される、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記一本鎖ＤＮＡ分子が、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドからの前記分子の切除、続いて前記切除された二本鎖断片の変性により前記一本鎖ＤＮＡ分子を産生することによって提供される、請求項５６または５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記一本鎖分子からヘアピンを含むポリヌクレオチドを形成するステップが、前記ＩＴＲのうちの１つ以上がヘアピンループを形成する条件下で前記一本鎖分子をアニーリングすることによって行われる、請求項５６〜５９のいずれかに記載の方法。
【請求項６１】
前記ライゲーションが、化学ライゲーションおよびタンパク質支援ライゲーションから選択される、請求項５６〜６０のいずれかに記載の方法。
【請求項６２】
前記ライゲーションが、Ｔ４リガーゼまたはＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によって行われる、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記センス第１のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、請求項５６〜６２のいずれかに記載の方法。
【請求項６４】
前記センス第２のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、請求項５６〜６３のいずれかに記載の方法。
【請求項６５】
前記センス第１のＩＴＲ、前記アンチセンス第１のＩＴＲ、前記センス第１のＩＴＲ、および前記センス第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのＲＢＥ部位を含む、請求項５６〜６４のいずれかに記載の方法。
【請求項６６】
前記センス第１のＩＴＲおよび前記センス第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、ＡＡＶ  ＩＴＲまたはＡＡＶ由来のＩＴＲである、請求項５６〜６５のいずれかに記載の方法。
【請求項６７】
前記センス第１のＩＴＲの配列が、表４Ｂもしくは表５に示される左ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号２、５〜９、３２〜４８から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記第２のＩＴＲの配列が、表４Ａもしくは表５に示される右ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号１、３、１０〜１４、１５〜３１から選択される、請求項６６に記載の方法。
【請求項６９】
前記センス発現カセット配列が、少なくとも１つのシス調節エレメントを含む、請求項５６〜６８のいずれかに記載の方法。
【請求項７０】
前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサー、転写後調節エレメント、およびポリアデニル化シグナルからなる群から選択される、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記センス発現カセット配列が、導入遺伝子配列を含む、請求項５６〜７２のいずれかに記載の方法。
【請求項７４】
前記導入遺伝子配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドの長さである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記導入遺伝子配列が、タンパク質をコードする、請求項７３に記載の方法。
【請求項７６】
前記導入遺伝子配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記導入遺伝子配列が、機能的ヌクレオチド配列である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７８】
前記閉端ＤＮＡベクターが、ｃｅＤＮＡベクターである、請求項５６〜７７のいずれかに記載の方法。
【請求項７９】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、精製される、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
請求項５６〜７９のいずれかに記載の方法によって生成される、閉端ＤＮＡベクター。
【請求項８１】
請求項８０に記載の閉端ＤＮＡベクターおよび任意で賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項８２】
閉端ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
５´から３´の方向に順番に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、および
アンチセンス発現カセット配列を含む、一本鎖ＤＮＡ分子を合成することと、
前記分子をアニーリングすることと、を含む、方法。
【請求項８３】
前記センス第１のＩＴＲ、前記センス発現カセット配列、前記センス第２のＩＴＲ、および前記アンチセンス発現カセット配列のうちの少なくとも１つが合成される、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
前記一本鎖ＤＮＡ分子が、前記センス第１のＩＴＲ、前記センス発現カセット配列、前記センス第２のＩＴＲ、および前記アンチセンス発現カセット配列のうちの１つ以上を合成し、そのようなオリゴヌクレオチドをライゲーションして前記一本鎖ＤＮＡ分子を形成することによって構築される、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記一本鎖ＤＮＡ分子が、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドからの前記分子の切除、続いて前記切除された二本鎖断片の変性により前記一本鎖ＤＮＡ分子を産生することによって提供される、請求項８２または８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記アニーリングステップは、前記センス第１のＩＴＲおよび前記センス第２のＩＴＲの一方または両方がヘアピンループを形成する結果となる、請求項８２〜８５のいずれかに記載の方法。
【請求項８７】
前記センス第１のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、請求項８２〜８６のいずれかに記載の方法。
【請求項８８】
前記センス第２のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、請求項８２〜８７のいずれかに記載の方法。
【請求項８９】
前記センス第１のＩＴＲおよび前記センス第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのＲＢＥ部位を含む、請求項８２〜８８のいずれかに記載の方法。
【請求項９０】
前記センス第１のＩＴＲおよび前記センス第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、ＡＡＶ  ＩＴＲまたはＡＡＶ由来のＩＴＲである、請求項８２〜８９のいずれかに記載の方法。
【請求項９１】
前記センス第１のＩＴＲの配列が、表４Ｂもしくは表５に示される左ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号２、５〜９、３２〜４８から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記第２のＩＴＲの配列が、表４Ａもしくは表５に示される右ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号１、３、１０〜１４、１５〜３１から選択される、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記センス発現カセット配列が、少なくとも１つのシス調節エレメントを含む、請求項８２〜９２のいずれかに記載の方法。
【請求項９４】
前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサー、転写後調節エレメント、およびポリアデニル化シグナルからなる群から選択される、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択される、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記センス発現カセット配列が、導入遺伝子配列を含む、請求項８２〜９６のいずれかに記載の方法。
【請求項９８】
前記導入遺伝子配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドの長さである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記導入遺伝子配列が、タンパク質をコードする、請求項９７に記載の方法。
【請求項１００】
前記導入遺伝子配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記導入遺伝子配列が、機能的ヌクレオチド配列である、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０２】
前記閉端ＤＮＡベクターが、ｃｅＤＮＡベクターである、請求項８２〜１０１のいずれかに記載の方法。
【請求項１０３】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、精製される、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
請求項８２〜１０３のいずれかに記載の方法によって生成される、閉端ＤＮＡベクター。
【請求項１０５】
請求項１０４に記載の閉端ＤＮＡベクターおよび任意で賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１０６】
閉端ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
５´から３´の方向に順番に、
第１の制限エンドヌクレアーゼ切断部位、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、および
第２の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、二本鎖ＤＮＡ構築物を提供することと、
前記二本鎖ＤＮＡ構築物を、前記第１の制限エンドヌクレアーゼ切断部位および前記第２の制限エンドヌクレアーゼ切断部位で前記二本鎖ＤＮＡ構築物を切断することができる１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させて、前記二本鎖ポリヌクレオチドから前記制限エンドヌクレアーゼ切断部位の間の前記二本鎖配列を切除することと、
前記切除された二本鎖配列をセンス鎖とアンチセンス鎖とに分離することと、
前記センス鎖および前記アンチセンス鎖の各々が閉端ＤＮＡベクターを形成する、アニーリングステップを実施することと、を含む、方法。
【請求項１０７】
前記二本鎖ＤＮＡ構築物が、バクミド、プラスミド、小環、または直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記切除を行うために、単一の制限エンドヌクレアーゼが使用される、請求項１０６または１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記切除を行うために、２つの異なる制限エンドヌクレアーゼが使用される、請求項１０６または１０７に記載の方法。
【請求項１１０】
前記アニーリングステップは、前記センス第１のＩＴＲおよび前記センス第２のＩＴＲの一方または両方がヘアピンループを形成する結果となる、請求項１０６〜１０９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１１】
前記センス第１のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、請求項１０６〜１１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１１２】
前記センス第２のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、請求項１０６〜１１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１１３】
前記センス第１のＩＴＲおよび前記センス第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのＲＢＥ部位を含む、請求項１０６〜１１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１１４】
前記センス第１のＩＴＲおよび前記センス第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、ＡＡＶ  ＩＴＲまたはＡＡＶ由来のＩＴＲである、請求項１０６〜１１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１１５】
前記センス第１のＩＴＲの配列が、表４Ｂもしくは表５に示される左ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号２、５〜９、３２〜４８から選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記第２のＩＴＲの配列が、表４Ａもしくは表５に示される右ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号１、３、１０〜１４、１５〜３１から選択される、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１７】
前記センス発現カセット配列が、少なくとも１つのシス調節エレメントを含む、請求項１０６〜１１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１８】
前記シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサー、転写後調節エレメント、およびポリアデニル化シグナルからなる群から選択される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
前記転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
前記プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択される、請求項１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
前記センス発現カセット配列が、導入遺伝子配列を含む、請求項１０６〜１２０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２２】
前記導入遺伝子配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドの長さである、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２３】
前記導入遺伝子配列が、タンパク質をコードする、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２４】
前記導入遺伝子配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、請求項１２３に記載の方法。
【請求項１２５】
前記導入遺伝子配列が、機能的ヌクレオチド配列である、請求項１２１に記載の方法。
【請求項１２６】
前記閉端ＤＮＡベクターが、ｃｅＤＮＡベクターである、請求項１０６〜１２５のいずれかに記載の方法。
【請求項１２７】
前記ｃｅＤＮＡベクターが、精製される、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
請求項１０６〜１２７のいずれかに記載の方法によって生成される、閉端ＤＮＡベクター。
【請求項１２９】
請求項１２８に記載の閉端ＤＮＡベクターおよび任意で賦形剤を含む、薬学的組成物。
【請求項１３０】
請求項１〜２８、３１〜５３、５６〜７９、８２〜１０３、および１０６〜１２７のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる、単離された閉端ＤＮＡベクター。
【請求項１３１】
請求項１〜２８、３１〜５３、５６〜７９、８２〜１０３、および１０６〜１２７のいずれかに記載のプロセスによって得られた単離された閉端ＤＮＡベクターを含む、遺伝医学。
【請求項１３２】
請求項１３０に記載の閉端ＤＮＡベクターを含む、細胞。
【請求項１３３】
請求項１３０に記載の閉端ＤＮＡベクターを含む、トランスジェニック動物。
【請求項１３４】
請求項１〜２８、３１〜５３、５６〜７９、８２〜１０３、および１０６〜１２７のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを投与することによって対象を治療する、方法。
【請求項１３５】
治療用タンパク質を対象に送達するための方法であって、
請求項１〜２８、３１〜５３、５６〜７９、８２〜１０３、および１０６〜１２７のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを含む組成物を対象に投与することを含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、治療用タンパク質をコードする、方法。
【請求項１３６】
前記治療用タンパク質が、治療用抗体である、請求項１３５に記載の方法。
【請求項１３７】
パケット挿入物とともに容器に包装された、請求項１〜２８、３１〜５３、５６〜７９、８２〜１０３、および１０６〜１２７のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターと、ナノ担体と、を含む、キット。
【請求項１３８】
請求項１〜２８、３１〜５３、５６〜７９、８２〜１０３、および１０６〜１２７のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキット。
【請求項１３９】
第１のＩＴＲを含む第１の一本鎖ＩＴＲ分子と、第２のＩＴＲを含む第２の一本鎖ＩＴＲ分子と、前記第１の一本鎖ＩＴＲ分子および前記第２の一本鎖ＩＴＲ分子を二本鎖ポリヌクレオチド分子にライゲーションするための少なくとも１つの試薬と、を含む、請求項１〜２８のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキット。
【請求項１４０】
請求項３１〜５３のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキットであって、
ａ．発現カセット、前記発現カセットの上流（５´末端）にある第１のＩＴＲ、前記発現カセットの下流（３´末端）にある第２のＩＴＲ、および制限エンドヌクレアーゼが前記発現カセットの遠位にあるように、前記ＩＴＲに隣接する少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む二本鎖ＤＮＡ構築物であって、前記発現カセットが、導入遺伝子の挿入のための制限エンドヌクレアーゼを有する、二本鎖ＤＮＡ構築物と、
ｂ．ライゲーションのための少なくとも１つのライゲーション試薬と、を含む、キット。
【請求項１４１】
請求項５６〜７９のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキットであって、
ａ．５´から３´の方向に順番に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
アンチセンス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、および
アンチセンス第１のＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ分子であって、
前記センス発現カセット配列および前記アンチセンス発現カセット配列が、導入遺伝子の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、一本鎖ＤＮＡ分子と、
ｂ．ライゲーションのための少なくとも１つのライゲーション試薬と、を含む、キット。
【請求項１４２】
請求項８２〜１０３のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキットであって、
ａ．５´から３´の方向に順番に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、および
アンチセンス発現カセット配列を含む、一本鎖ＤＮＡ分子であって、
前記センス発現カセット配列および前記アンチセンス発現カセット配列が、導入遺伝子の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、一本鎖ＤＮＡ分子と、
ｂ．ライゲーションのための少なくとも１つのライゲーション試薬と、を含む、キット。
【請求項１４３】
請求項１０６〜１２７のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキットであって、
ａ．５´から３´の方向に順番に、
第１の制限エンドヌクレアーゼ切断部位、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、および
第２の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、二本鎖ＤＮＡ構築物であって、
前記センス発現カセット配列および前記アンチセンス発現カセット配列が、導入遺伝子の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、二本鎖ＤＮＡ構築物と、
ｂ．ライゲーションのための少なくとも１つのライゲーション試薬と、を含む、キット。
【請求項１４４】
ライゲーションのための前記少なくとも１つの試薬が、化学ライゲーションのための試薬である、請求項１３８〜１４３のいずれかに記載のキット。
【請求項１４５】
ライゲーションのための少なくとも１つの試薬が、タンパク質支援ライゲーションのための試薬である、請求項１４４に記載のキット。
【請求項１４６】
前記ライゲーションが、Ｔ４ライゲーションまたはＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によって行われる、請求項１４６に記載のキット。
【請求項１４７】
前記第１の一本鎖ＩＴＲ分子および前記第２の一本鎖ＩＴＲ分子が、それらの末端に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、請求項１３８〜１４６のいずれかに記載のキット。
【請求項１４８】
前記キットが、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ酵素をさらに含む、請求項１３８〜１４７のいずれかに記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の下、２０１８年１月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／６１９，３９２号の利益を主張し、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる配列表を含む。２０１９年１月１７日に作成された前述のＡＳＣＩＩコピーは、０８０１７０−０９１３１０−ＷＯＰＴ＿ＳＬ．ｔｘｔという名前が付けられ、サイズは１０２，８０４バイトである。
【０００３】
本発明は、対象または細胞において導入遺伝子または単離されたポリヌクレオチドを発現させる目的のための非ウイルス性ベクターの産生を含む、遺伝子療法の分野に関する。例えば、本開示は、非ウイルス性ＤＮＡベクターを合成する無細胞法を提供する。本開示はまた、それによって産生される核酸構築物およびそれらの使用方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
遺伝子療法は、遺伝子発現プロファイルにおける異常によって引き起こされる遺伝子突然変異または後天性疾患のいずれかを罹患している患者の臨床転帰を改善することを目的とする。遺伝子療法は、欠陥遺伝子、または障害、疾患、悪性腫瘍などをもたらし得る異常調節もしくは発現、例えば過小発現もしくは過剰発現から生じる医学的状態の治療または予防を含む。例えば、欠陥遺伝子によって引き起こされる疾患もしくは障害は、補正遺伝物質を患者に送達することによって治療、予防、もしくは改善され得るか、または患者の体内で遺伝物質の治療的発現をもたらす、患者への補正遺伝物質を用いてなど、欠陥遺伝子を改変もしくはサイレンシングすることによって治療、予防、もしくは改善され得る。
【０００５】
遺伝子療法の基礎は、転写カセットに活性遺伝子産物（導入遺伝子と称される場合がある）を供給することであり、例えば、正の機能獲得効果、負の機能喪失効果、または別の結果をもたらし得る。遺伝子療法を使用して、他の要因によって引き起こされる疾患または悪性腫瘍を治療することもできる。ヒト単一遺伝子障害は、標的細胞への正常遺伝子の送達および発現によって治療され得る。患者の標的細胞中の補正遺伝子の送達および発現は、操作されたウイルスおよびウイルス遺伝子送達ベクターの使用を含む、多くの方法を介して実行され得る。使用可能な多くのウイルス由来ベクター（例えば、組み換えレトロウイルス、組み換えレンチウイルス、組み換えアデノウイルスなど）の中で、組み換えアデノ関連ウイルス（ｒＡＡＶ）は、遺伝子療法において多用途ベクターとして人気を集めている。
【０００６】
アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルスファミリーに属し、より具体的にはディペンドパルボウイルス属を構成する。ＡＡＶ由来のベクター（すなわち、組み換えＡＡＶ（ｒＡＶＶ）またはＡＡＶベクター）は、（ｉ）それらが筋細胞およびニューロンを含む多種多様な非分裂および分裂細胞型に感染する（形質導入する）ことができるため、（ｉｉ）それらがウイルス構造遺伝子を欠いていることによって、ウイルス感染に対する宿主細胞反応、例えばインターフェロン媒介性反応を減少させるため、（ｉｉｉ）野生型ウイルスが、ヒトにおいて非病理的であるとみなされるため、（ｉｖ）宿主細胞ゲノム中に組み込むことができる野生型ＡＡＶと対照的に、複製欠損ＡＡＶベクターは、ｒｅｐ遺伝子を欠き、一般にエピソームとして持続し、したがって挿入変異または遺伝毒性の危険性を制限するため、ならびに（ｖ）他のベクター系と比較して、ＡＡＶベクターは、一般に比較的不良な免疫原であるとみなされるため、著しい免疫反応を誘起せず（ｉｉを参照）、したがって治療導入遺伝子のベクターＤＮＡおよび潜在的に長期発現の持続を得るため、遺伝物質を送達するために魅力的である。
【０００７】
しかしながら、ＡＡＶ粒子を遺伝子送達ベクターとして使用することには、いくつかの重大な欠陥が存在する。ｒＡＡＶに関連する１つの重大な欠点は、約４．５ｋｂの異種ＤＮＡの制限されたウイルスパッケージング能力であり（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６、Ａｔｈａｎａｓｏｐｏｕｌｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００４、Ｌａｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）、結果として、ＡＡＶベクターの使用は、１５０，０００Ｄａ未満のタンパク質コーディング能力に制限されている。第２の欠点は、集団における野生型ＡＡＶ感染の流行の結果として、ｒＡＡＶ遺伝子療法の候補を、患者からベクターを排除する中和抗体の存在についてスクリーニングする必要があることである。第３の欠点は、初回治療から排除されなかった患者への再投与を予防するカプシド免疫原性に関する。患者における免疫系は、「ブースター」ショットとして有効に作用するベクターに反応して、将来の治療を妨げる高力価抗ＡＡＶ抗体を生成する免疫系を刺激し得る。いくつかの最近の報告は、高用量状況における免疫原性との関係を示している。一本鎖ＡＡＶ  ＤＮＡが異種遺伝子発現前に二本鎖ＤＮＡに変換されなければならないことを考えると、別の顕著な欠点は、ＡＡＶ媒介性遺伝子発現の始まりが比較的遅いことである。
【０００８】
追加として、カプシドを有する従来のＡＡＶビリオンは、ＡＡＶゲノム、ｒｅｐ遺伝子、およびｃａｐ遺伝子を含有する１つまたは複数のプラスミドを導入することによって産生される（Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。しかしながら、そのようなカプシド化ＡＡＶウイルスベクターは、ある特定の細胞および組織型を非効率的に形質導入し、カプシドはまた、免疫反応を誘導することもわかった。
【０００９】
したがって、遺伝子療法のためのアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの使用は、（患者免疫反応に起因する）患者への単回投与、最小ウイルスパッケージング能力（約４．５ｋｂ）に起因するＡＡＶベクター中の送達に好適な導入遺伝子遺伝物質の制限された範囲、および遅いＡＡＶ媒介性遺伝子発現に起因して制限される。
【００１０】
治療または他の目的のためにインビボで１つ以上の所望の導入遺伝子を送達することができ、ＡＡＶおよび他のウイルスベクター系の上記の欠点を回避する閉端ＤＮＡベクターが開発されている。しかしながら、そのようなｃｅＤＮＡベクターを産生する方法は、伝統的な細菌または昆虫細胞の産生方法に依存してきた。そのような方法は、ベクターを産生するために使用される細胞からの汚染物質（例えば、核酸汚染物質）をもたらす可能性があり、除去するのに不便であるかまたは費用がかかり、ｃｅＤＮＡ治療製剤に含まれる場合、望ましくない副作用を有する可能性がある。したがって、そのような汚染物質または精製方法の他のアーチファクトによって導入されるものなどの、最小のオフターゲット効果で遺伝子発現を制御する方法で使用される組み換えベクターの生成を可能にする技術の分野が必要である。本明細書で提供される方法は、そのような問題を軽減または回避する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ウイルスおよびウイルス由来のＤＮＡを産生するための従来の方法は、典型的には、真核細胞、例えば哺乳動物または昆虫細胞を使用する。一般的に使用される１つの昆虫細胞株は、Ｓｆ９である。しかしながら、これらの細胞には、酵素、および複製されるＤＮＡに有害な影響を与える可能性のある他のタンパク質の両方が含まれているだけでなく、細胞溶解物から所望のＤＮＡを精製するプロセスにより、その存在が所望のＤＮＡ産物の精製をより困難にし得る細胞性核酸が導入される。さらに、そのような不純物または汚染物質は、所望のＤＮＡが投与される対象において、一連の有害なおよび／または望ましくない影響を有する可能性がある。追加として、そのような伝統的な細胞ベースの産生方法は、産生されるＤＮＡベクター産物の量に関して問題が生じる可能性があり、望ましい収量を生み出すために細胞株自体または産生技術の大幅なエンジニアリングが必要になることは珍しくない。本明細書に記載される技術は、限定されないが、閉端ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）などの閉環ヘアピンループを含有するＤＮＡベクターを、従来の手段よりも高い純度および量で簡単に産生することができる合成産生方法に関するものであり、上記で詳述される懸念を回避する。
【００１２】
本明細書に記載される発明は、無細胞系であり得る合成産生系を使用して閉端ＤＮＡベクターを産生するための合成産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、閉端ＤＮＡベクターは、細胞、組織、または系における遺伝子発現を制御する方法において、または所望の細胞、組織、または系に新しい遺伝物質を導入するために使用できるｃｅＤＮＡベクターである。特定の一実施形態では、本明細書に記載される技術は、修飾型ＡＡＶ逆位末端反復配列（ＩＴＲ）および例えば１つ以上の発現可能な導入遺伝子を含有するＤＮＡベクターを作製する新規無細胞法に関する。本明細書に開示される方法を使用して、無細胞系で任意の閉端ヘアピンループを含有するＤＮＡベクターを産生することができ、本明細書では共有結合性閉端を持つＤＮＡの一本鎖（直鎖状、連続、および非カプシド化構造）から形成されたｃｅＤＮＡベクターを指す。
【００１３】
本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターの産生を使用して例示される、閉端ＤＮＡベクターを生成するための１つの例示的な合成産生方法は、二本鎖ＤＮＡ構築物から閉端ＤＮＡベクターを形成する分子全体を切除することに関する。そのような実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物には、５´から３´に順番に、第１の制限エンドヌクレアーゼ部位、上流ＩＴＲ、発現カセット、下流ＩＴＲ、および第２の制限エンドヌクレアーゼ部位が提供される。次いで、二本鎖ＤＮＡ構築物を１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させて、制限エンドヌクレアーゼ切断部位の両方で二本鎖切断を生成する。１つのエンドヌクレアーゼが両方の部位を標的にすることも、制限部位が閉端ベクターテンプレート領域内に存在しない限り、各部位を異なるエンドヌクレアーゼによって標的とすることもできる。これにより、制限エンドヌクレアーゼ部位の間の配列が、残りの二本鎖ＤＮＡ構築物から切除される。この切除された分子は、遊離５´および３´末端を有し、これらは次いで、ｃｅＤＮＡベクターを形成するためにライゲーションされる。いくつかの態様では、切除された分子は、最初にアニーリングされて、遊離５´および３´末端のライゲーションの前にヘアピン形成を促進する。いくつかの態様では、不要な二本鎖ＤＮＡ構築物骨格は、骨格中の固有の切断部位に特異的な１つ以上の制限エンドヌクレアーゼによって切断されるため、精製中に分解され、より容易に排除される。
【００１４】
本明細書に開示される合成産生方法を使用して、ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、完全なベクターを形成するための様々なオリゴヌクレオチドの集成を伴う。そのような実施形態において、いくつかの実施形態では、ヘアピンまたは他の３次元構成（例えば、ホリデイジャンクション構成）にある５´オリゴヌクレオチドおよび３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、５´および３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットまたは異種核酸配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。任意で、ライゲーションステップの前にオリゴを３次元構成に折りたたむことを容易にする条件にオリゴ（複数可）をさらすステップが追加される。図１１Ｂは、５´ＩＴＲオリゴヌクレオチドおよび３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることを含む、ｃｅＤＮＡベクターを生成する例示的な方法を示す。いくつかの実施形態では、５´および３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、５´および３´ヘアピンオリゴヌクレオチドであるか、またはヘアピン構造もしくは異なる３次元構成（例えば、ＴもしくはＹ字型ホリデイジャンクション）を有し、任意で、インビトロＤＮＡ合成によって提供され得る。いくつかの実施形態では、５´および３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、対応する制限エンドヌクレアーゼ粘着末端を有する二本鎖ポリヌクレオチドに相補的な粘着末端を有するように制限エンドヌクレアーゼで切断されている。いくつかの実施形態では、５´ＩＴＲオリゴヌクレオチドのヘアピンの末端は、二本鎖ポリヌクレオチドの５´センス鎖および３´アンチセンス鎖に相補的である粘着末端を有する。いくつかの実施形態では、３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドのヘアピンの末端は、二本鎖ポリヌクレオチドの３´センス鎖および５´アンチセンス鎖に相補的である粘着末端を有する。いくつかの実施形態では、５´ＩＴＲオリゴヌクレオチドおよび３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドのヘアピンの末端は、二本鎖ポリヌクレオチドの各末端への指向性ライゲーションが達成され得るように、異なる制限エンドヌクレアーゼ粘着末端を有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲオリゴヌクレオチドの一方または両方の末端は、オーバーハングを有さず、そのようなＩＴＲオリゴ（複数可）は、平滑末端結合によって二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションされる。いくつかの態様では、不要な二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド骨格は、骨格中の固有の切断部位に特異的な１つ以上の制限エンドヌクレアーゼによって切断されるため、精製中に分解され、より容易に排除される。
【００１５】
ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）を産生する別の例示的な方法は、発現カセットを含む一本鎖の直鎖状ＤＮＡの形成、およびその後のライゲーションによるＤＮＡ分子の閉鎖を伴う。この実施形態では、ＤＮＡベクターは、５´から３´方向に、第１のセンス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、アンチセンス第２のＩＴＲ、アンチセンス発現カセット配列、およびアンチセンス第１のＩＴＲを含み、次いで閉端ｃｅＤＮＡベクターを形成するために遊離端をライゲーションする一本鎖直鎖状ＤＮＡを、当該技術分野において知られている任意の手段により合成することによって調製される。一実施形態では、産生される例示的なＤＮＡベクターとしてｃｅＤＮＡベクターの産生を使用して、ｃｅＤＮＡベクターの産生のために得られる一本鎖ＤＮＡ分子は、５´から３´に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
アンチセンス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、および
アンチセンス第１のＩＴＲを含む。
【００１６】
この例示的な方法において、一実施形態では、センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、アンチセンス第２のＩＴＲ、アンチセンス発現カセット配列、およびアンチセンス第１のＩＴＲのうちの１つ以上を包含する、オリゴヌクレオチドを合成することができる。上記に示されるような一本鎖ＤＮＡ分子を形成するために、そのようなオリゴヌクレオチドのうちの１つ以上がライゲーションされ得る。一本鎖ＤＮＡ分子が形成されると、分子の遊離３´および５´末端がライゲーションによって結合され、ｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。
【００１７】
閉端ＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、発現カセット配列に隣接する少なくとも１つのＩＴＲを含み、またアンチセンス発現カセット配列も含む、一本鎖配列の合成によるものである。非限定的な一例では、ｃｅＤＮＡベクターは、以下の方法によって産生される。
【００１８】
５´から３´に順番に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、および
アンチセンス発現カセット配列を含む、一本鎖配列が
提供される。一実施形態では、一本鎖配列は、当該技術分野で知られている任意の方法によって直接合成することができる。別の実施形態では、一本鎖配列は、センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、およびアンチセンス発現カセット配列のうちの１つ以上を含む２つ以上のオリゴをライゲーションにより結合することによって構築され得る。
【００１９】
さらに別の実施形態では、一本鎖配列は、二本鎖ＤＮＡ構築物からの配列の切除と、その後の切除された二本鎖断片からの鎖の分離によって得ることができる。より具体的には、第１の制限部位、センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、アンチセンス発現カセット配列、および第２の制限部位を５´から３´に順番に含む、二本鎖ＤＮＡ構築物が提供される。２つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位の間の領域は、そのような切断部位（複数可）を認識する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼによる切断によって切除される。得られる切除された二本鎖ＤＮＡ断片は、センス鎖およびアンチセンス鎖が、所望の一本鎖配列断片に分離されるように処理される。
【００２０】
一本鎖配列は、センス第１のＩＴＲおよび／またはセンス第２のＩＴＲによる１つ以上のヘアピンループの形成、ならびにアンチセンス発現カセット配列へのセンス発現カセット配列の相補的結合を促進するためのアニーリングステップに供される。その結果が、ライゲーションを形成する必要のない閉端構造である。アニーリングパラメータおよび技法は、当技術分野で周知である。
【００２１】
本明細書に開示されるようなＤＮＡベクターを生成するための合成産生方法のすべての態様では、ライゲーションステップは、化学ライゲーションステップまたは酵素的ライゲーションステップであり得る。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、ライゲーションコンピテント酵素、例えばＤＮＡリガーゼを使用して行い、例えば５´および３´粘着性オーバーハング、または平滑末端をライゲーションすることができる。いくつかの実施形態では、ライゲーション酵素は、Ｒｅｐタンパク質以外のリガーゼ酵素である。いくつかの実施形態では、ライゲーション酵素は、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質である。
【００２２】
本明細書に開示されるようなＤＮＡベクターを生成するための合成方法のすべての態様では、方法は、インビトロ方法である。好ましい実施形態では、方法は、無細胞方法であり、すなわち、細胞、例えば昆虫細胞中またはその存在下では実施されない。
【００２３】
合成産生方法のための１つ以上の酵素またはオリゴヌクレオチド成分のうちの１つ以上が細胞から産生され、精製された形態で本発明の方法において使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、合成産生方法は無細胞方法であるが、制限酵素および／またはリガーゼ酵素を細胞から産生することができる。一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼまたはリガーゼ酵素のうちの１つ以上を発現する発現ベクターを含む、細菌細胞などの細胞が存在し得る。したがって、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるＤＮＡベクターを生成するための無細胞合成方法を主に対象とするが、一実施形態では、細胞、例えば、昆虫細胞ではなく細菌細胞が存在し、方法で必要な酵素のうちの１つ以上を発現するように使用され得る、合成産生方法も包含される。
【００２４】
本明細書に記載される技術の一態様は、合成産生方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを生成することである。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端（直鎖状、連続、および非カプシド化構造）を有する相補的ＤＮＡの連続鎖から形成されるカプシド不含直鎖状二重鎖ＤＮＡ分子であり、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）配列および３’ＩＴＲ配列を含み、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、互いに対して同じ対称の３次元構成（すなわち、対称もしくは実質的に対称）を有し得るか、または代替として５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲは、互いに対して異なる３次元構成（すなわち、非対称ＩＴＲ）を有し得る。さらに、ＩＴＲは、同じまたは異なる血清型に由来し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるか、または３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループを有するように、対称の３次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得る（すなわち、それらは同じであるか、または互いに対して鏡像である）。いくつかの実施形態では、一方のＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。
【００２５】
したがって、本明細書に記載される技術のいくつかの態様は、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ  ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾されたＡＡＶ逆位末端反復（ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ−ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ−ＷＴ  ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含む、ｃｅＤＮＡベクターの合成産生に関する。
【００２６】
本発明の態様は、本明細書に記載されるような細胞、組織、器官、系、または対象における所望の導入遺伝子の発現に有用なｃｅＤＮＡベクターを産生するための合成産生方法に関する。特に、本明細書では、無細胞環境でｃｅＤＮＡベクターを含むがこれに限定されない閉端ＤＮＡベクターを産生し、それによって不純物の量を制限し、所与のベクター産物の有効性および／または安全性に影響し得る産生プロセス中の汚染物質の導入を防ぐための方法が提供される。そのような方法を使用して、任意の所望の導入遺伝子を発現するＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターを合成することができる。導入遺伝子は、所与の疾患の治療、最適な健康の促進、疾患の発症の予防、診断目的のために、または所与の用途について当業者が望むように選択することができる。
【００２７】
この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、導入遺伝子は、関心対象のタンパク質をコードし、例えば、関心対象のタンパク質は、受容体、毒素、ホルモン、酵素、または細胞表面タンパク質である。この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、関心対象のタンパク質は、受容体である。この態様および本明細書で提供される他のすべての態様の別の実施形態では、関心対象のタンパク質は、酵素である。標的となる例示的な遺伝子および関心対象のタンパク質は、本明細書の使用方法および治療方法のセクションにおいて詳細に記載されている。
【００２８】
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
１．閉端ＤＮＡベクターを調製する方法であって、（ｉ）第１のＩＴＲを含む第１の一本鎖ＩＴＲ分子を提供することと、（ｉｉ）第２のＩＴＲを含む第２の一本鎖ＩＴＲ分子を提供することと、（ｉｉｉ）発現カセット配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドを提供し、第１のＩＴＲ分子の５´および３´末端を二本鎖分子の第１の末端にライゲーションし、第２のＩＴＲ分子の５´および３´末端を二本鎖分子の第２の末端にライゲーションして、ＤＮＡベクターを形成することと、を含む、方法。
２．閉端ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
（ｉ）発現カセット、（ｉｉ）発現カセットの上流（５´末端）にある第１のＩＴＲ、（ｉｉｉ）発現カセットの下流（３´末端）にある第２のＩＴＲ、および（ｉｉｉ）制限エンドヌクレアーゼが発現カセットの遠位にあるように、ＩＴＲに隣接する少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、二本鎖ＤＮＡ構築物を、
二本鎖ＤＮＡ構築物を制限エンドヌクレアーゼ切断部位で切断して、二本鎖ＤＮＡ構築物から制限エンドヌクレアーゼ切断部位の間の配列を切除することができる１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させることと、切除された配列の５´および３´末端をライゲーションして、閉端ＤＮＡベクターを形成することと、を含む、方法。
３．ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
５´から３´の方向に順番に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
アンチセンス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、および
アンチセンス第１のＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ分子を合成することと、
一本鎖分子からヘアピンを含むポリヌクレオチドを形成することと、５´および３´末端をライゲーションして、閉端ＤＮＡベクターを形成することと、を含む、方法。
４．閉端ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
５´から３´の方向に順番に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、および
アンチセンス発現カセット配列を含む、一本鎖ＤＮＡ分子を合成することと、
分子をアニーリングすることと、を含む、方法。
５．閉端ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
５´から３´の方向に順番に、
第１の制限エンドヌクレアーゼ切断部位、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、および
第２の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、二本鎖ＤＮＡ構築物を提供することと、
二本鎖ＤＮＡ構築物を、第１の制限エンドヌクレアーゼ切断部位および第２の制限エンドヌクレアーゼ切断部位で二本鎖ＤＮＡ構築物を切断することができる１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させて、二本鎖ポリヌクレオチドから制限エンドヌクレアーゼ切断部位の間の二本鎖配列を切除することと、
切除された二本鎖配列をセンス鎖とアンチセンス鎖とに分離することと、
センス鎖およびアンチセンス鎖の各々が閉端ＤＮＡベクターを形成する、アニーリングステップを実施することと、を含む、方法。
６．二本鎖ＤＮＡ構築物が、バクミド、プラスミド、小環、または直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子である、パラグラフ１〜５のいずれかに記載の方法。
７．切除を行うために、単一の制限エンドヌクレアーゼが使用される、パラグラフ１〜６のいずれかに記載の方法。
８．切除を行うために、２つの異なる制限エンドヌクレアーゼが使用される、パラグラフ１〜７のいずれかに記載の方法。
９．センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、アンチセンス第２のＩＴＲ、アンチセンス発現カセット配列、およびアンチセンス第１のＩＴＲのうちの少なくとも１つが合成される、パラグラフ１〜８のいずれかに記載の方法。
１０．一本鎖ＤＮＡ分子が、センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、アンチセンス第２のＩＴＲ、アンチセンス発現カセット配列、およびアンチセンス第１のＩＴＲのうちの１つ以上をオリゴヌクレオチドとして合成し、そのようなオリゴヌクレオチドをライゲーションして一本鎖ＤＮＡ分子を形成することによって構築される、パラグラフ１〜９のいずれかに記載の方法。
１１．一本鎖ＤＮＡ分子が、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチドからの分子の切除、続いて切除された二本鎖断片の変性により一本鎖ＤＮＡ分子を産生することによって提供される、パラグラフ１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．一本鎖分子からヘアピンを含むポリヌクレオチドを形成するステップが、ＩＴＲのうちの１つ以上がヘアピンループを形成する条件下で一本鎖分子をアニーリングすることによって行われる、パラグラフ１〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが合成される、パラグラフ１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．二本鎖発現カセット配列が、発現カセット配列を含む二本鎖ＤＮＡ構築物からの切除によって得られた、パラグラフ１〜１３のいずれかに記載の方法。
１５．二本鎖ＤＮＡ構築物内で、発現カセット配列が、５´末端で第１の制限エンドヌクレアーゼ切断部位と隣接し、３´末端で第２の制限エンドヌクレアーゼ切断部位と隣接する、パラグラフ１〜１４のいずれかに記載の方法。
１６．二本鎖ＤＮＡ構築物が、バクミド、プラスミド、小環、または直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子である、パラグラフ１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．第１の制限エンドヌクレアーゼおよび第２の制限エンドヌクレアーゼが、同じ制限エンドヌクレアーゼである、パラグラフ１〜１６のいずれかに記載の方法。
１８．第１の制限エンドヌクレアーゼおよび第２の制限エンドヌクレアーゼが、異なる制限エンドヌクレアーゼである、パラグラフ１〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、発現カセット配列へのライゲーションの前にアニーリングされる、パラグラフ１〜１８のいずれかに記載の方法。
２０．第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、それぞれ、発現カセット配列の第１の末端または発現カセット配列の第２の末端に相補的なオーバーハング領域を含む、パラグラフ１〜１９のいずれかに記載の方法。
２１．ライゲーションが、化学ライゲーションおよびタンパク質支援ライゲーションから選択される、パラグラフ１〜２０のいずれかに記載の方法。
２２．ライゲーションが、Ｔ４リガーゼまたはＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によって行われる、パラグラフ１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．第１のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、パラグラフ１〜２２のいずれかに記載の方法。
２４．第２のＩＴＲが、野生型ＩＴＲおよび修飾型ＩＴＲから選択される、パラグラフ１〜２３のいずれかに記載の方法。
２５．第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、少なくとも１つのＲＢＥ部位を含む、パラグラフ１〜２４のいずれかに記載の方法。
２６．第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲのうちの少なくとも１つが、ＡＡＶ  ＩＴＲまたはＡＡＶ由来のＩＴＲである、パラグラフ１〜２５のいずれかに記載の方法。
２７．第１のＩＴＲの配列が、表３、表４Ｂ、もしくは表５に示される左ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号２、５〜９、３２〜４８から選択される、パラグラフ１〜２６のいずれかに記載の方法。
２８．第２のＩＴＲの配列が、表３、表４Ａ、もしくは表５に示される右ＩＴＲ配列のうちのいずれかまたは配列番号１、３、１０〜１４、１５〜３１から選択される、パラグラフ１〜２７のいずれかに記載の方法。
２９．発現カセット配列が、少なくとも１つのシス調節エレメントを含む、パラグラフ１〜２８のいずれかに記載の方法。
３０．シス調節エレメントが、プロモーター、エンハンサー、転写後調節エレメント、およびポリアデニル化シグナルからなる群から選択される、パラグラフ１〜２９のいずれかに記載の方法。
３１．転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ１〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．プロモーターが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択される、パラグラフ１〜３１のいずれかに記載の方法。
３３．発現カセット配列が、導入遺伝子配列を含む、パラグラフ１〜３２のいずれかに記載の方法。
３４．導入遺伝子配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドの長さである、パラグラフ１〜３３のいずれかに記載の方法。
３５．導入遺伝子配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ１〜３４のいずれかに記載の方法。
３６．導入遺伝子配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、パラグラフ１〜３５のいずれかに記載の方法。
３７．導入遺伝子配列が、機能的ヌクレオチド配列である、パラグラフ１〜３６のいずれかに記載の方法。
３８．閉端ＤＮＡベクターが、ｃｅＤＮＡベクターである、パラグラフ１〜３７のいずれかに記載の方法。
３９．ｃｅＤＮＡベクターが、精製される、パラグラフ１〜３８のいずれかに記載の方法。
４０．パラグラフ１〜３９のいずれかに記載の方法によって生成される、閉端ＤＮＡベクター。
４１．パラグラフ１〜４０のいずれかに記載の閉端ＤＮＡベクターおよび任意で賦形剤を含む、薬学的組成物。
４２．パラグラフ１〜６または６〜３９のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる、単離された閉端ＤＮＡベクター。
４３．パラグラフ１〜４２のいずれかに記載のプロセスによって得られた単離された閉端ＤＮＡベクターを含む、遺伝医学。
４４．パラグラフ４０に記載の閉端ＤＮＡベクターを含む、細胞。
４５．パラグラフ４０に記載の閉端ＤＮＡベクターを含む、トランスジェニック動物。
４６．パラグラフ１〜５または６〜３９のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを投与することによって対象を治療する、方法。
４７．治療用タンパク質を対象に送達するための方法であって、
請求項４０に記載の閉端ＤＮＡベクター、またはパラグラフ１〜５もしくは６〜３９のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを含む組成物を対象に投与することを含み、少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列が、導入遺伝子または治療用タンパク質をコードする、方法。
４８．治療用タンパク質が、治療用抗体、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質である、パラグラフ４７に記載の方法。
４９．パケット挿入物とともに容器に包装された、請求項４０に記載の閉端ＤＮＡベクター、またはパラグラフ１〜５もしくは６〜３９のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターと、ナノ担体と、を含む、キット。
５０．パラグラフ１〜５または６〜３９のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキット。
５１．第１のＩＴＲを含む第１の一本鎖ＩＴＲ分子と、第２のＩＴＲを含む第２の一本鎖ＩＴＲ分子と、第１の一本鎖ＩＴＲ分子および第２の一本鎖ＩＴＲ分子を二本鎖ポリヌクレオチド分子にライゲーションするための少なくとも１つの試薬と、を含む、パラグラフ１〜３９のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキット。
５２．（ｉ）発現カセット、発現カセットの上流（５´末端）にある第１のＩＴＲ、発現カセットの下流（３´末端）にある第２のＩＴＲ、および制限エンドヌクレアーゼが発現カセットの遠位にあるように、ＩＴＲに隣接する少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む二本鎖ＤＮＡ構築物であって、発現カセットが、導入遺伝子の挿入のための制限エンドヌクレアーゼを有する、二本鎖ＤＮＡ構築物と、（ｉｉ）ライゲーションのための少なくとも１つのライゲーション試薬と、を含む、パラグラフ２〜３９のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキット。
５３．（ｉ）５´から３´方向に順番に、センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、アンチセンス第２のＩＴＲ、アンチセンス発現カセット配列、およびアンチセンス第１のＩＴＲを含む一本鎖ＤＮＡ分子であって、センス発現カセット配列およびアンチセンス発現カセット配列が、導入遺伝子の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、一本鎖ＤＮＡ分子と、（ｉ）ライゲーションのための少なくとも１つのライゲーション試薬と、を含む、パラグラフ３〜３９のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる、閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキット。
５４．（ｉ）５´から３´方向に順番に、センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、およびアンチセンス発現カセット配列を含む一本鎖ＤＮＡ分子であって、センス発現カセット配列およびアンチセンス発現カセット配列が、導入遺伝子の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、一本鎖ＤＮＡ分子と、（ｉｉ）ライゲーションのための少なくとも１つのライゲーション試薬と、を含む、パラグラフ４〜３９のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる、閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキット。
５５．（ｉ）５´から３´方向に順番に、第１の制限エンドヌクレアーゼ切断部位、センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、アンチセンス発現カセット配列、および第２の制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む二本鎖ＤＮＡ構築物であって、センス発現カセット配列およびアンチセンス発現カセット配列が、導入遺伝子の挿入のための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する、二本鎖ＤＮＡ構築物と、（ｉｉ）ライゲーションのための少なくとも１つのライゲーション試薬と、を含む、パラグラフ５〜３９のいずれかに記載のプロセスによって得られるか、または得ることができる、閉端ＤＮＡベクターを産生するためのキット。
５６．ライゲーションのための少なくとも１つの試薬が、化学ライゲーションのための試薬である、パラグラフ４９〜５５のいずれかに記載のキット。
５７．ライゲーションのための少なくとも１つの試薬が、タンパク質支援ライゲーションのための試薬である、パラグラフ４９〜５６のいずれかに記載のキット。
５８．ライゲーションが、Ｔ４ライゲーションまたはＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質によって行われる、パラグラフ４９〜５７のいずれかに記載のキット。
５９．第１の一本鎖ＩＴＲ分子および第２の一本鎖ＩＴＲ分子が、それらの末端に制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む、パラグラフ４９〜５８のいずれかに記載のキット。
６０．キットが、少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼ酵素をさらに含む、パラグラフ４９〜５９のいずれかに記載のキット。
【００２９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、共有結合性閉端を有する合成的に産生された非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）に関し、ｃｅＤＮＡベクターは、野生型逆位末端反復配列の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、任意に異種核酸配列は、導入遺伝子をコードし、ベクターは、ウイルスカプシド中に存在しない。
【００３０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、共有結合性閉端を有する合成的に産生された非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）に関し、ｃｅＤＮＡベクターは、非対称逆位末端反復配列（非対称ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、非対称ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、任意に異種核酸配列は、導入遺伝子をコードし、ベクターは、ウイルスカプシド中に存在しない。
【００３１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、共有結合性閉端を有する合成的に産生された非ウイルス性カプシド不含ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクター）に関し、ｃｅＤＮＡベクターは、対称突然変異体逆位末端反復配列の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含み、任意に異種核酸配列は、導入遺伝子をコードし、ベクターは、ウイルスカプシド中に存在しない。
【００３２】
本発明のこれらおよび他の態様は、下記でさらに詳述される。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
上記に簡単に要約され、以下により詳細に論じられる本開示の実施形態は、添付の図面に描かれた本開示の例示的な実施形態を参照することによって理解することができる。しかしながら、添付の図面は、本開示の典型的な実施形態のみを示し、したがって、本開示は他の等しく有効な実施形態を認めることができるため、範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【００３４】
【図１Ａ】非対称ＩＴＲを含む、ｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。この実施形態では、例示的なｃｅＤＮＡベクターは、ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを含む。導入遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位（Ｒ３／Ｒ４）に挿入される。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）−発現カセットの上流（５’端）の野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲと隣接し、したがって、発現カセットに隣接する２つのＩＴＲは、互いに対して非対称である。
【図１Ｂ】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを備えた非対称ＩＴＲを含む、ｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）−発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の野生型ＩＴＲと隣接する。
【図１Ｃ】エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含む発現カセットを備えた非対称ＩＴＲを含むための、ｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、互いに対して非対称である２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）、発現カセットの上流（５’端）の修飾型ＩＴＲおよび下流（３’端）の修飾型ＩＴＲと隣接し、５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲの両方は、修飾型ＩＴＲであるが、異なる修飾を有する（すなわち、同じ修飾を有しない）。
【図１Ｄ】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを備えた、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、ｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲおよび３’修飾型ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。
【図１Ｅ】エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含む発現カセットを備えた、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、ｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、５’修飾型ＩＴＲおよび３’修飾型ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの修飾型逆位末端反復（ＩＴＲ）に隣接している。
【図１Ｆ】ＣＡＧプロモーター、ＷＰＲＥ、およびＢＧＨｐＡを含む発現カセットを備えた、本明細書で定義される対称のＷＴ−ＩＴＲまたは実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲを含む、ｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。導入遺伝子、例えば、ルシフェラーゼ導入遺伝子をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位に挿入される。発現カセットは、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ  ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ−ＩＴＲ）に隣接している。
【図１Ｇ】エンハンサー／プロモーター、導入遺伝子、転写後エレメント（ＷＰＲＥ）、およびポリＡシグナルを含む発現カセットを備えた、本明細書で定義される対称の修飾型ＩＴＲまたは実質的に対称の修飾型ＩＴＲを含む、ｃｅＤＮＡベクターの例示的な構造を示す。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、ＣＡＧプロモーターとＷＰＲＥとの間のクローニング部位への導入遺伝子の挿入を可能にする。発現カセットは、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ  ＩＴＲが対称または実質的に対称である、２つの野生型逆位末端反復（ＷＴ−ＩＴＲ）に隣接している。
【図２Ａ】Ａ−Ａ’アーム、Ｂ−Ｂ’アーム、Ｃ−Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）の特定を有するＡＡＶ２（配列番号５２）の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を提供し、末端分解部位（ｔｒｓ）も示す。ＲＢＥは、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８のいずれかと相互作用すると考えられる一連の４つの二重四量体を含有する。さらに、ＲＢＥ’はまた、構築物中の野生型ＩＴＲまたは突然変異型ＩＴＲ上で集成したＲｅｐ複合体と相互作用すると考えられる。ＤおよびＤ’領域は、転写因子結合部位および他の保存構造を含有する。
【図２Ｂ】Ａ−Ａ’アーム、Ｂ−Ｂ’アーム、Ｃ−Ｃ’アーム、２つのＲｅｐ結合部位（ＲＢＥおよびＲＢＥ’）の特定を有するＡＡＶ２の野生型左ＩＴＲのＴ形ステムループ構造を含む、野生型左ＩＴＲ（配列番号５３）中の提案されたＲｅｐ触媒ニッキングおよびライゲーション活性を示し、また末端分解部位（ｔｒｓ）、ならびにいくつかの転写因子結合部位を含むＤおよびＤ’領域、ならびに他の保存構造も示す。
【図３Ａ】野生型左ＡＡＶ２  ＩＴＲ（配列番号５４）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（ポリヌクレオチド配列）（左）および二次構造（右）を提供する。
【図３Ｂ】左ＩＴＲの例示的な突然変異型ＩＴＲ（修飾型ＩＴＲとも称される）配列を示す。例示的な突然変異型左ＩＴＲ（ＩＴＲ−１、左）（配列番号１１３）のＡ−Ａ’アーム、Ｃアーム、およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。
【図３Ｃ】野生型右ＡＡＶ２  ＩＴＲ（配列番号５５）のＡ−Ａ’ループ、ならびにＢ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’アームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および二次構造（右）を示す。
【図３Ｄ】例示的な右修飾型ＩＴＲを示す。例示的な突然変異体右ＩＴＲ（ＩＴＲ−１、右）（配列番号１１４）のＡ−Ａ’アーム、ならびにＢ−Ｂ’およびＣアームのＲＢＥ含有部分の一次構造（左）および予測される二次構造（右）が示される。左および右のＩＴＲ（例えば、ＡＡＶ２  ＩＴＲまたは他のウイルス血清型または合成ＩＴＲ）の任意の組み合わせを、本明細書で教示されるように使用することができる。図３Ａ〜３Ｄポリヌクレオチド配列の各々は、本明細書に記載されるようにｃｅＤＮＡを産生するために使用される配列を指す。プラスミドまたはバクミド／バキュロウイルスゲノム中のｃｅＤＮＡベクター構成および予測されたＧｉｂｂｓ自由エネルギー値から推定される対応するｃｅＤＮＡ二次構造もまた、図３Ａ〜３Ｄの各々に含まれる。
【図４Ａ】ｃｅＤＮＡを作製するための無細胞合成の一実施形態を示す概略図である。図４Ａの方法の産生物は、図４Ｂの下流プロセスに従って単離し、特徴付けることができる。
【図４Ｂ】ｃｅＤＮＡ産生を確認するための非限定的な生化学的方法を示す。
【図４Ｃ】図４Ａの無細胞ｃｅＤＮＡ産生プロセス中に得られたｃｅＤＮＡの存在を特定するためのプロセスを説明する概略図である。図４Ｃは、左が未切断であるか、または制限エンドヌクレアーゼで消化された後、未変性ゲルまたは変性ゲルのいずれかで電気泳動に供される例示的なｃｅＤＮＡの概略的予想バンドを示す。左端の概略図は、未変性ゲルであり、その二重鎖および未切断形態で、ｃｅＤＮＡが少なくとも単量体および二量体状態で存在し、より速く移動する小さい単量体および単量体のサイズの２倍である、より遅く移動する二量体として見えることを示唆する、多重バンドを示す。左から二番目の概略図は、ｃｅＤＮＡが制限エンドヌクレアーゼで切断されたとき、元のバンドが消え、分裂後に残存する予想断片サイズに対応する、より速く移動する（例えば、より小さい）バンドが出現することを示す。変性条件下、元の二重鎖ＤＮＡは単鎖であり、相補鎖が共有結合されるため、未変性ゲル上で観察されるものより２倍大きい種として移動する。したがって、右から二番目の概略図において、消化されたｃｅＤＮＡは、未変性ゲル上で観察されるものと同様のバンディング分布を示すが、バンドは、未変性ゲル対応物のサイズの２倍の断片として移動する。右端の概略図は、変性条件下の未切断のｃｅＤＮＡが、単鎖開環として移動し、したがって観察されたバンドは、環が開いていない未変性条件下で観察されるもののサイズの２倍であることを示す。この図において、「ｋｂ」を使用して、文脈に応じて、ヌクレオチド鎖の長さ（例えば、変性条件で観察される単鎖分子の場合）または塩基対の数（例えば、未変性条件で観察される二本鎖分子の場合）に基づくヌクレオチド分子の相対サイズを示す。図４Ｄは、非連続的な構造を有するＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡは、ｃｅＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、中性条件および変性条件の両方において、異なるサイズ（１ｋｂおよび２ｋｂ）を有する２つのＤＮＡ断片を生成し得る。図４Ｄはまた、直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡを示す。ｃｅＤＮＡベクターは、制限エンドヌクレアーゼによって切断され得、変性条件ではなく中性条件において１ｋｂおよび２ｋｂとして移動する２つのＤＮＡ断片を生成することができ、鎖は接続されたままであり、２ｋｂおよび４ｋｂとして移動する単鎖を産生する。
【図４Ｄ】同上。
【図５】エンドヌクレアーゼでの消化を有する（＋）または有しない（−）ｃｅＤＮＡベクターの変性ゲル流動例の例示的な図である（ｃｅＤＮＡ構築物１および２の場合ＥｃｏＲＩ、ｃｅＤＮＡ構築物３および４の場合ＢａｍＨ１、ｃｅＤＮＡ構築物５および６の場合ＳｐｅＩ、ならびにｃｅＤＮＡベクター７および８の場合ＸｈｏＩ）。アスタリスクで強調されたバンドのサイズを判定し、図の下に示した。
【図６Ａ−１】本明細書に記載される実施形態で使用するためのＩＴＲを合成するための例示的なＩＴＲおよび例示的なオリゴを示す。図６Ａは、ＡｒｖＩＩ制限部位を有する５´ＷＴ−ＩＴＲを生成するための例示的なオリゴヌクレオチド（ＷＴ−Ｌ−オリゴ−１）を示す。図６Ａは、トップ配列を配列番号１５６として、理想的な構造を出現順にそれぞれ配列番号１３４、１５８、および１５７として、予測された構造を配列番号１３４として、ならびにＷＴ−Ｌ−オリゴ−１を配列番号１３４として開示する。図６Ｂは、ＡｒｖＩＩ制限部位を有する５´ＷＴ−ＩＴＲを生成するための例示的なオリゴヌクレオチド（ＷＴ−Ｌ−オリゴ−２）を示す。図６Ｂは、出現順にそれぞれ配列番号１３５および１３５を開示する。図６Ｃは、ＳｂｆＩ制限部位を有する３´ＷＴ−ＩＴＲを生成するための別の例示的なオリゴヌクレオチド（ＷＴ−Ｒ−オリゴ−３）を示す。図６Ｃは、出現順にそれぞれ配列番号１５９、１３６、および１３６を開示する。図６Ｄは、ＤｒａＩＩＩ制限部位を有する３´ｍｏｄ−ＩＴＲを生成するための別の例示的なオリゴヌクレオチド（ＭＵ−Ｒ−オリゴ−１）を示す。図６Ｄは、出現順にそれぞれ配列番号１６０、１３７、および１３７を開示する。
【図６Ａ−２】同上。
【図６Ａ−３】同上。
【図６Ｂ−１】同上。
【図６Ｂ−２】同上。
【図６Ｃ−１】同上。
【図６Ｃ−２】同上。
【図６Ｄ−１】同上。
【図６Ｄ−２】同上。
【図７Ａ−１】本明細書に記載される無細胞合成を使用してｃｅＤＮＡベクターを合成するための例示的なＩＴＲおよび例示的なオリゴを示す。図７Ａは、ＡｒｖＩＩ制限部位を有する５´ＷＴ−ＩＴＲを生成するための例示的なオリゴヌクレオチド（ＷＴ−Ｌ−オリゴ−１）を示す。図８Ａは、出現順にそれぞれ配列番号１３８および１３８を開示する。図７Ｂは、ＡｒｖＩＩ制限部位を有する５´ＷＴ−ＩＴＲを生成するための例示的なオリゴヌクレオチド（ＷＴ−Ｌ−オリゴ−２）を示す。図８Ｂは、出現順にそれぞれ配列番号１６１、１３９、および１３９を開示する。図７Ｃは、ＳｂｆＩ制限部位を有する３´ＷＴ−ＩＴＲを生成するための別の例示的なオリゴヌクレオチド（ＷＴ−Ｒ−オリゴ−３）を示す。図８Ｃは、出現順にそれぞれ配列番号１４０および１４０を開示する。図７Ｄは、ＤｒａＩＩＩ制限部位を有する３´ｍｏｄ−ＩＴＲを生成するための別の例示的なオリゴヌクレオチド（ＭＵ−Ｒ−オリゴ−１）を示す。図８Ｄは、出現順にそれぞれ配列番号１４１および１４１を開示する。図７Ｅは、ＳｂｆＩ制限部位を有する３´ｍｏｄ−ＩＴＲを生成するための別の例示的なオリゴヌクレオチド（ＭＵ−Ｒ−オリゴ６）（配列番号１４２）を示す。図８Ｅは、出現順にそれぞれ配列番号１４２および１４２を開示する。
【図７Ａ−２】同上。
【図７Ｂ−１】同上。
【図７Ｂ−２】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図７Ｄ】同上。
【図７Ｅ】同上。
【図８−１】３´修飾型ＩＴＲを生成するために使用される例示的なオリゴヌクレオチドを示す。図８は、出現順にそれぞれ配列番号１６０および１６２を開示する。
【図８−２】同上。
【図９−１】本明細書に記載されるある特定の実施形態による例示的なＤＮＡベクターおよびその集成の図を示す。特に、５´ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ分子の５´末端にライゲーションされ、３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、二本鎖ＤＮＡ分子の３´にライゲーションされる。５´ＩＴＲオリゴヌクレオチドの末端は、二本鎖ＤＮＡ分子の´５センス鎖および３´アンチセンス鎖に相補的であり（すなわち、それらは同じ制限エンドヌクレアーゼ部位を有する）、同様に、３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドの末端は、二本鎖ＤＮＡ分子の´３センス鎖および５´アンチセンス鎖に相補的である。図９は、左側で出現順にそれぞれ配列番号１３４、１５８、および１５７を開示し、右側で出現順にそれぞれ配列番号１６３、１３７、および１６４を開示する。
【図９−２】同上。
【図１０Ａ】修飾型ＩＴＲの最低エネルギー構造（「ＩＴＲ−６（左）」の配列番号１１１）を提供する。
【図１０Ｂ】修飾型ＩＴＲの最低エネルギー構造（「ＩＴＲ−６（右）」配列番号１１２）を提供する。それらは、単一アームを有するヘアピン構造を形成すると予測される。それらの未展開のＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、−５４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌであると予測される。
【図１１Ａ】ｃｅＤＮＡベクターの概略図であり、２つのヘアピンループ（ＢおよびＣ領域）を含むＩＴＲならびにＲＰＥを含むＡおよびＤ領域、任意で、関心対象の遺伝子を含むカセットのいずれかの側に隣接するＴＲＳ、任意のプロモーター／エンハンサー領域、任意の転写後応答エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、および任意のポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモンから、ＢＧＨｐＡ）を示す。
【図１１Ｂ】合成され、結合されて最終的なｃｅＤＮＡベクターを形成する異なるオリゴの概略図を示す。
【図１２】ｃｅＤＮＡベクターを合成的に調製するために使用される例示的な方法の概略図である。
【図１３Ａ】実施例６に従って合成的に産生された２つの野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターの概略図を描く。
【図１３Ｂ】実施例６に従ってＷＴ／ＷＴ  ＩＴＲを有する精製されたｃｅＤＮＡベクターのバイオアナライザー分析から得られたクロマトグラムである。クロマトグラムの各ピークからのデータを表８に示す。
【図１４Ａ】左野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ、および実施例５に従って合成的に産生された右切断突然変異体ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターの概略図を描く。
【図１４Ｂ】実施例６に従ってＷＴ／突然変異体ＩＴＲを有する精製されたｃｅＤＮＡベクターのバイオアナライザー分析から得られたクロマトグラムである。クロマトグラムの各ピークからのデータを表９に示す。
【図１５Ａ】実施例６に従って合成的に産生された、左切断突然変異体ＩＴＲおよび異なる右切断突然変異体ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターの概略図を描く。
【図１５Ｂ】実施例６に従って非対称突然変異体／突然変異体ＩＴＲを有する精製されたｃｅＤＮＡベクターのバイオアナライザー分析から得られたクロマトグラムである。クロマトグラムの各ピークからのデータを表１０に示す。
【図１６Ａ】左野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ、および伝統的にＳｆ９細胞の産生を利用して産生された右切断突然変異体ＩＴＲを有するｃｅＤＮＡベクターの概略図を描く。
【図１６Ｂ】ＷＴ／突然変異体ＩＴＲを有する精製された伝統的に産生されたｃｅＤＮＡベクターのバイオアナライザー分析から得られたクロマトグラムである。クロマトグラムの各ピークからのデータを表１１に示す。
【図１７−１】実施例７に示されるインビトロ細胞発現アッセイの結果を描き、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現を、ＨｅｐａＲＧ細胞における伝統的にＳｆ９により産生されたｃｅＤＮＡベクターからのそれと比較する。使用した各構築物の概略図は、ヌクレオフェクションによる示されたｃｅＤＮＡベクターの導入から６日後にそのｃｅＤＮＡベクターで処理された細胞の蛍光顕微鏡画像のすぐ上に示されている（白いスポットは、ＧＦＰ導入遺伝子発現細胞集団を表す）。
【図１７−２】同上。
【図１７−３】同上。
【図１７−４】同上。
【図１７−５】同上。
【図１８Ａ】実施例８に従って合成的または伝統的に産生されたｃｅＤＮＡベクターで治療されたマウスからのインビボ撮像データの３日目および７日目の定量結果を示すグラフを提供する。
【図１８Ｂ】治療後７日目の治療マウス（図１８Ａのグラフに対して定量化が行われた）の生のＩＶＩＳ画像を提供し、マウスの治療に使用されるｃｅＤＮＡの産生方法にかかわらず、ルシフェラーゼ発現の大部分が予想どおり肝臓に限局していたことを実証している。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本明細書で提供される方法および組成物は、一部には、限定されないが、Ｓｆ９細胞株などの昆虫細胞株で産生されたＤＮＡベクターと比較して不純物が少ないおよび／もしくは収率が高いｃｅＤＮＡベクターを含む、閉端ＤＮＡベクターを生成するのに有用な合成産生方法の発見に基づき、かつ／あるいは産生プロセスは簡素化されるか、または伝統的な細胞ベースの産生方法と比較してより効率的もしくは費用効果的にされる。一実施形態では、細胞は、ＤＮＡベクターを複製するために使用されず、したがって、産生は無細胞である。これにより、本明細書では、細胞を使用せずに閉端ＤＮＡベクターを合成する方法が提供される。いくつかの実施形態では、昆虫細胞を使用せずに閉端ＤＮＡベクターを合成する方法が本明細書で提供される。また、本明細書では、ｃｅＤＮＡベクター組成物を含む、本明細書の合成産生方法を使用して産生された閉端ＤＮＡベクター組成物、ならびにそのような閉端ＤＮＡベクターおよびｃｅＤＮＡベクターの使用が提供される。
【００３６】
本発明は、閉端ＤＮＡベクターの産生のためのインビトロプロセス、本明細書の方法およびそれらの使用によって産生される対応するＤＮＡベクター産物、ならびに本発明のプロセスにおいて有用なオリゴヌクレオチドおよびキットに関する。
【００３７】
本明細書に記載される方法によって作製された閉端ＤＮＡベクターは、細胞、組織、または対象において導入遺伝子を発現するためにより安全に使用できるという点で、他のベクターよりも有利である。すなわち、得られるベクターは、細菌または昆虫細胞の汚染物質を含まないため、そのような無細胞方法により直鎖状ベクターを生成することによって、望ましくない副作用を潜在的に最小限に抑えることができる。合成産生方法はまた、より高い純度の望ましいベクターをもたらし得る。合成産生方法はまた、そのようなベクターの伝統的な細胞ベースの産生方法よりも効率的かつ／または費用効果的であり得る。
【００３８】
本明細書に記載されるように合成されたベクターは、任意の所望の導入遺伝子、例えば、所与の疾患を治療または治癒するための導入遺伝子を発現することができる。当業者は、従来の組み換えベクターを用いた従来の遺伝子治療方法で使用される任意の導入遺伝子が、例えば、本明細書に記載される合成方法によって作製されたｃｅＤＮＡベクターによる発現に適合できることを容易に認識するであろう。
【００３９】
Ｉ．定義
本明細書で別途定義されない限り、本出願に関して使用される科学的および技術的用語は、本開示が属する技術分野における当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。免疫学および分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｔｈｅ  Ｍｅｒｃｋ  Ｍａｎｕａｌ  ｏｆ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１９ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｍｅｒｃｋ  Ｓｈａｒｐ＆ Ｄｏｈｍｅ  Ｃｏｒｐ．出版，２０１１（ＩＳＢＮ  ９７８−０−９１１９１０−１９−３）、Ｒｏｂｅｒｔ  Ｓ．Ｐｏｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｆｉｅｌｄｓ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，６ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，ＵＳＡ（２０１３），Ｋｎｉｐｅ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｈｏｗｌｅｙ，Ｐ．Ｍ．（ｅｄ．），Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．，１９９９−２０１２（ＩＳＢＮ  ９７８３５２７６００９０８）、およびＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（ｅｄ．），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，１９９５（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｂｙ  Ｗｅｒｎｅｒ  Ｌｕｔｔｍａｎｎ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２００６、Ｊａｎｅｗａｙ‘ｓ  Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ，Ａｌｌａｎ  Ｍｏｗａｔ，Ｃａｓｅｙ  Ｗｅａｖｅｒ（ｅｄｓ．），Ｔａｙｌｏｒ＆ Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，２０１４（ＩＳＢＮ  ０８１５３４５３０５，９７８０８１５３４５３０５）、Ｌｅｗｉｎ’ｓ  Ｇｅｎｅｓ  ＸＩ，ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  ｂｙ  Ｊｏｎｅｓ＆ Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１４（ＩＳＢＮ−１４４９６５９０５５）、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｇｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊｏｓｅｐｈ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，４ｔｈ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ  １９３６１１３４１４）、Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂａｓｉｃ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ（２０１２）（ＩＳＢＮ  ０４４４６０１４９Ｘ）、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ，Ｊｏｎ  Ｌｏｒｓｃｈ（ｅｄ．）Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，２０１３（ＩＳＢＮ  ０１２４１９９５４２）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＣＰＭＢ），Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ  Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，２０１４（ＩＳＢＮ０４７１５０３３８Ｘ，９７８０４７１５０３３８５），Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＣＰＰＳ），Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００５、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（ＣＰＩ）（Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，ＡＤＡ  Ｍ  Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ  Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ  Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅ，（ｅｄｓ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００３（ＩＳＢＮ  ０４７１１４２７３５，９７８０４７１１４２７３７）に見出すことができ、これらの内容はすべて、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「無細胞産生」、「合成閉端ＤＮＡベクター産生」、および「合成産生」という用語、ならびにそれらの文法的に関連する対応物は、交換可能に使用され、細胞による、または細胞内での、あるいは細胞抽出物の使用による、分子の複製または他の増殖を伴わない方法での１つ以上の分子の産生を指す。合成産生は、産生された分子の細胞汚染物質（例えば、細胞タンパク質または細胞核酸）による汚染を回避し、さらに産生プロセス中の分子の望ましくない細胞特異的修飾（例えば、メチル化またはグリコシル化または他の翻訳後修飾）を回避する。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「異種ヌクレオチド配列」および「導入遺伝子」は、交換可能に使用され、本明細書で開示されるｃｅＤＮＡベクターに組み込まれ、それによって送達および発現され得る、関心対象の（カプシドポリペプチドをコードする核酸以外の）核酸を指す。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「発現カセット」および「転写カセット」および「遺伝子発現ユニット」という用語は、交換可能に使用され、導入遺伝子の転写を配向するのに十分な１つ以上のプロモーターまたは他の調節配列に操作可能に連結された導入遺伝子を含むが、カプシドをコードする配列、他のベクター配列、または逆位末端反復領域を含まない核酸の直鎖状ストレッチを指す。発現カセットは、追加として、１つ以上のシス作用性配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、またはリプレッサー）、１つ以上のイントロン、および１つ以上の転写後調節エレメントを含んでもよい。
【００４３】
本明細書で交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、または多重らせんＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基または他の天然、化学的もしくは生化学的修飾、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。「オリゴヌクレオチド」は、一般に、一本鎖または二本鎖ＤＮＡの約５〜約１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、この開示の目的のために、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られており、遺伝子から単離するか、または当該技術分野で知られている方法によって化学的に合成することができる。「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能であるように、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）および二本鎖ポリヌクレオチドを含むと理解されるべきである。
【００４４】
本明細書で使用される「核酸構築物」という用語は、天然に存在する遺伝子から単離されるか、またはそうでなければ天然に存在しないような方法で核酸のセグメントを含むように修飾されるか、または合成のものである、一本鎖または二本鎖の核酸分子を指す。核酸構築物という用語は、核酸構築物が本開示のコード配列の発現に必要な制御配列を含む場合、「発現カセット」という用語と同義である。「発現カセット」は、プロモーターに操作可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。
【００４５】
「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ）が、非共有結合する、すなわち、ワトソン・クリック塩基対および／またはＧ／Ｕ塩基対を形成する、温度および溶液イオン強度の適切なインビトロおよび／またはインビボ条件下で配列特異的、逆平行方法で別の核酸に「アニール」または「ハイブリダイズ」する（すなわち、核酸は、相補的核酸に特異的に結合する）のを可能にするヌクレオチドの配列を含むことを意味する。当該技術分野で知られているように、標準的なワトソン・クリック塩基対合には、チミジン（Ｔ）とのアデニン（Ａ）対合、ウラシル（Ｕ）とのアデニン（Ａ）対合、およびシトシン（Ｃ）とのグアニン（Ｇ）対合が含まれる。さらに、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションのために、グアニン（Ｇ）塩基がウラシル（Ｕ）と対合することも当該技術分野で知られている。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡアンチコドン塩基対合の状況で、遺伝暗号の縮重（すなわち、冗長性）を部分的に担っている。この開示の文脈において、対象のＤＮＡ標的化ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）のグアニン（Ｇ）は、ウラシル（Ｕ）に相補的であるとみなされ、逆もまた同様である。したがって、対象のＤＮＡ標的ＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖）の所与のヌクレオチド位置でＧ／Ｕ塩基対を作製できる場合、その位置は、非相補的であるとみなされないが、代わりに相補的であるとみなされる。
【００４６】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、および「タンパク質」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、コードおよび非コードアミノ酸、化学的または生化学的に修飾または誘導体化されたアミノ酸、および修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含み得る、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。
【００４７】
特定のＲＮＡまたはタンパク質遺伝子産物を「コードする」ＤＮＡ配列は、特定のＲＮＡおよび／またはタンパク質に転写されるＤＮＡ核酸配列である。ＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されるＲＮＡ（ｍＲＮＡ）をコードし得るか、またはＤＮＡポリヌクレオチドは、タンパク質に翻訳されないＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、またはＤＮＡ標的ＲＮＡ、「非コード」ＲＮＡまたは「ｎｃＲＮＡ」とも呼ばれる）をコードし得る。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「ゲノムセーフハーバー遺伝子」または「セーフハーバー遺伝子」という用語は、内因性遺伝子活性に重大な悪影響を及ぼすことなく、または癌を促進することなく、配列が予測可能な方法で統合および機能し得る（例えば、関心対象のタンパク質を発現する）ように、核酸配列を挿入することができる遺伝子または遺伝子座を指す。いくつかの実施形態では、セーフハーバー遺伝子はまた、挿入された核酸配列が非セーフハーバー部位よりも効率的かつ高レベルで発現され得る遺伝子座または遺伝子である。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「遺伝子送達」という用語は、外来ＤＮＡが遺伝子療法の適用のために宿主細胞に導入されるプロセスを意味する。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「末端反復」または「ＴＲ」という用語は、少なくとも１つの最小限必要な複製起源、および回文ヘアピン構造を含む領域を含む、任意のウイルス末端反復配列または合成配列を含む。Ｒｅｐ結合配列（「ＲＢＳ」）（ＲＢＥ（Ｒｅｐ結合エレメント）とも称される）および末端分解部位（「ＴＲＳ」）は、一緒に「最小限必要な複製起源」を構成し、したがって、ＴＲは、少なくとも１つのＲＢＳおよび少なくとも１つのＴＲＳを含む。ポリヌクレオチド配列の所与のストレッチ内で互いの逆相補鎖であるＴＲは、典型的に、各々「逆位末端反復」または「ＩＴＲ］と称される。ウイルスの文脈において、ＩＴＲは、複製、ウイルスパッケージング、統合、およびプロウイルスレスキューを媒介する。本明細書で本発明において予想外に見出されたように、全長にわたって逆相補鎖でないＴＲは、依然としてＩＴＲの従来の機能を行うことができ、したがって、ＩＴＲという用語は、本明細書において、ｃｅＤＮＡベクターの複製を媒介することができるｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター中のＴＲを指すように使用される。複合ｃｅＤＮＡベクター構成中、２つより多くのＩＴＲまたは非対称ＩＴＲ対が存在し得ることは、当業者によって理解されるであろう。ＩＴＲは、ＡＡＶ  ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ  ＩＴＲであり得るか、またはＡＡＶ  ＩＴＲもしくは非ＡＡＶ  ＩＴＲに由来し得る。例えば、ＩＴＲは、パルボウイルスおよびディペンドウイルス（例えば、イヌパルボウイルス、ウシパルボウイルス、マウスパルボウイルス、ブタパルボウイルス、ヒトパルボウイルスＢ−１９）を包含するＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科に由来し得るか、またはＳＶ４０複製の起源として役立つＳＶ４０ヘアピンは、切断、置換、欠失、挿入、および／もしくは付加によってさらに修飾され得る、ＩＴＲとして使用され得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーウイルスは、脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅおよび無脊椎動物に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅの２つのサブファミリーで構成されている。ディペンドパルボウイルスは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジ種を含むが、これらに限定されない脊椎動物宿主における複製が可能である、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）のウイルスファミリーを含む。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
【００５１】
「野生型ＩＴＲ」または「ＷＴ−ＩＴＲ」は、例えば、Ｒｅｐ結合活性およびＲｅｐニッキング能力を保持する、ＡＡＶまたは他のディペンドウイルスにおける天然に存在するＩＴＲ配列の配列を指す。任意のＡＡＶ血清型からのＷＴ−ＩＴＲのヌクレオチド配列は、遺伝コードまたはドリフトの縮退のために、天然に存在する正準配列とわずかに異なる場合があり、したがって本明細書における使用のために包含されるＷＴ−ＩＴＲ配列は、産生プロセス中に発生する天然に存在する変化（例えば、複製エラー）の結果としてＷＴ−ＩＴＲ配列を含む。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ」または「実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する野生型ＩＴＲである単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＷＴ−ＩＴＲの対を指す。例えば、変化が配列の特性および全体的な３次元構造に影響を及ぼさない限り、天然に存在する正準配列から逸脱する１つ以上のヌクレオチドを有する場合でも、ＩＴＲが野生型の配列であるとみなすことができる。いくつかの態様では、逸脱するヌクレオチドは、保存的配列変化を表す。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（例えば、デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、他のＷＴ−ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有する。実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲは、３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’ループを有する。実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲは、適切なＲｅｐタンパク質と対合する操作可能なＲｅｐ結合部位（ＲＢＥまたはＲＢＥ’）および末端分解部位（ｔｒｓ）を有することを決定することによって、ＷＴとして機能的に確認することができる。任意に、許容条件下での導入遺伝子発現を含む他の機能を試験することができる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「修飾型ＩＴＲ」または「ｍｏｄ−ＩＴＲ」または「突然変異体ＩＴＲ」の語句は、本明細書で交換可能に使用され、同じ血清型からのＷＴ−ＩＴＲと比較して、少なくとも１つ以上のヌクレオチドに突然変異を有するＩＴＲを指す。突然変異は、同じ血清型のＷＴ−ＩＴＲの３次元空間構成と比較して、ＩＴＲのＡ、Ｃ、Ｃ’、Ｂ、Ｂ’領域のうちの１つ以上の変化をもたらし得、３次元空間構成（すなわち、幾何学的空間におけるその３次元構造）の変化をもたらし得る。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「非対称ＩＴＲ対」とも呼ばれる「非対称ＩＴＲ」という用語は、全長にわたって逆相補鎖ではない単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内のＩＴＲの対を指す。非限定的な一例として、非対称ＩＴＲ対は、それらの３次元構造が、幾何学的空間において異なる形状であるように、それらの同族ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有しない。言い換えると、非対称のＩＴＲ対は、全体的な幾何学的構造が異なり、すなわち、３次元空間でのそれらのＡ、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’ループの構成が異なる（例えば、同族ＩＴＲと比較して、１つのＩＴＲは、短いＣ−Ｃ’アームおよび／または短いＢ−Ｂ’ループを有し得る）。２つのＩＴＲ間の配列の相違は、１つ以上のヌクレオチド付加、欠失、切断、または点突然変異に起因し得る。一実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のＩＴＲは、野生型ＡＡＶ  ＩＴＲ配列であり得、他方のＩＴＲは、本明細書で定義される修飾型ＩＴＲ（例えば、非野生型または合成ＩＴＲ配列）であり得る。別の実施形態では、非対称ＩＴＲ対のどちらのＩＴＲも野生型ＡＡＶ配列ではなく、２つのＩＴＲは、幾何学的空間において異なる形状（すなわち、異なる全体的な幾何学的構造）を有する修飾型ＩＴＲである。いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対の一方のｍｏｄ−ＩＴＲは、短いＣ−Ｃ’アームを有することができ、他のＩＴＲは、それらが同族の非対称ｍｏｄ−ＩＴＲと比較して、異なる３次元空間構成を有するように異なる修飾（例えば、単一アーム、または短いＢ−Ｂ’アームなど）を有し得る。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「対称ＩＴＲ」という用語は、野生型ディペンドウイルスＩＴＲ配列に対して突然変異または修飾され、それらの全長にわたって逆相補鎖である単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の一対のＩＴＲを指す。どちらのＩＴＲも野生型ＩＴＲ  ＡＡＶ２配列ではなく（すなわち、それらは修飾型ＩＴＲであり、突然変異体ＩＴＲとも呼ばれる）、ヌクレオチドの付加、欠失、置換、切断、または点突然変異により、野生型ＩＴＲとは配列が異なり得る。本明細書では便宜上、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して５’（その上流）に位置するＩＴＲは、「５’ＩＴＲ」または「左ＩＴＲ」と称され、ｃｅＤＮＡベクター中の発現カセットに対して３’（その下流）に位置するＩＴＲは、「３’ＩＴＲ」または「右ＩＴＲ」と称される。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「実質的に対称の修飾型ＩＴＲ」または「実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対」という用語は、両方がそれらの全長にわたって逆相補配列を有する単一のｃｅＤＮＡゲノムまたはｃｅＤＮＡベクター内の修飾型ＩＴＲの対を指す。例えば、修飾型ＩＴＲは、変化が特性および全体的な形状に影響を及ぼさない限り、逆相補配列から逸脱するいくつかのヌクレオチド配列がある場合でも、実質的に対称とみなすことができる。非限定的な一例として、配列は、正準配列に対して少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性（デフォルト設定でＢＬＡＳＴを使用して測定される）を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、それらの同族の修飾型ＩＴＲに対して対称の３次元空間構成を有する。言い換えると、実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対は、３次元空間に構成された同じＡ、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’ループを有する。いくつかの実施形態では、ｍｏｄ−ＩＴＲ対からのＩＴＲは、異なる逆相補鎖ヌクレオチド配列を有し得るが、依然として同じ対称の３次元空間構成を有し得る。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ全体的な３次元形状をもたらす突然変異を有する。例えば、ｍｏｄ−ＩＴＲ対の一方のＩＴＲ（例えば、５’ＩＴＲ）は、１つの血清型に由来し得、他方のＩＴＲ（例えば、３’ＩＴＲ）は、異なる血清型に由来し得るが、両方が同じ対応する突然変異を有し得（例えば、５’ＩＴＲがＣ領域に欠失を有する場合、異なる血清型の同族の修飾型３’ＩＴＲは、Ｃ’領域の対応する位置に欠失を有する）、それにより修飾型ＩＴＲ対が同じ対称の３次元空間構成を有する。そのような実施形態では、修飾型ＩＴＲ対の各ＩＴＲは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６の組み合わせなどの異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２）に由来し得、１つのＩＴＲの修飾は、異なる血清型の同族のＩＴＲの対応する位置に反映される。一実施形態では、実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対は、ＩＴＲ間のヌクレオチド配列の相違が特性または全体的な形状に影響を与えず、それらが３次元空間で実質的に同じ形状を有する限り、一対の修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ−ＩＴＲ）を指す。非限定的な例として、ｍｏｄ−ＩＴＲは、ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアライメント検索ツール（Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ））またはデフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなどの当該該技術分野において周知の標準的な手段によって決定される、正準ｍｏｄ−ＩＴＲに対して少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有し、またそれらの３次元構造が幾何学的空間で同じ形状になるように、対称の３次元空間構成を有する。実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対は、３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ−Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ−ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ−ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡおよびＢ−Ｂ’ループの同様の３次元構造を有する。
【００５７】
「隣接する」という用語は、別の核酸配列に対するある核酸配列の相対位置を指す。一般に、配列ＡＢＣでは、Ｂの両側にＡおよびＣが隣接している。配置ＡｘＢｘＣについても同様である。したがって、隣接する配列は、隣接される配列の前または後に続くが、隣接される配列と連続している、またはすぐ隣である必要はない。一実施形態では、隣接するという用語は、直鎖状二重鎖ｃｅＤＮＡベクターの各末端における末端反復を指す。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡゲノム」という用語は、少なくとも１つの逆位末端反復領域をさらに組み込む発現カセットを指す。ｃｅＤＮＡゲノムは、１つ以上のスペーサー領域をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡゲノムは、ＤＮＡの分子間二重鎖ポリヌクレオチドとして、プラスミドまたはウイルスゲノムに組み込まれる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡスペーサー領域」という用語は、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡゲノム中の機能的エレメントを分離する介在配列を指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、最適機能性のための所望の処理で２つの機能的エレメントを保持する。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、例えば、プラスミドまたはバキュロウイルス内のｃｅＤＮＡゲノムの遺伝的安定性を提供する、または増大させる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡスペーサー領域は、クローニング部位などに便利な位置を提供することによって、ｃｅＤＮＡゲノムの容易な遺伝子操作を促進する。例えば、ある特定の態様では、いくつかの制限エンドヌクレアーゼ部位を含有するオリゴヌクレオチド「ポリリンカー」、または既知のタンパク質（例えば、転写因子）結合部位を有しないように設計された非オープンリーディングフレーム配列をｃｅＤＮＡゲノム中に位置付けて、シス作用性因子を分離することができ、例えば、末端分解部位と、上流転写調節エレメントとの間に６ｍｅｒ、１２ｍｅｒ、１８ｍｅｒ、２４ｍｅｒ、４８ｍｅｒ、８６ｍｅｒ、１７６ｍｅｒなどを挿入する。同様に、スペーサーを、ポリアデニル化シグナル配列と３’末端分解部位との間に組み込むことができる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「Ｒｅｐ結合部位」、「Ｒｅｐ結合エレメント」、「ＲＢＥ」、および「ＲＢＳ」という用語は、交換可能に使用され、Ｒｅｐタンパク質（例えば、ＡＡＶ  Ｒｅｐ７８またはＡＡＶ  Ｒｅｐ６８）の結合部位を指し、Ｒｅｐタンパク質による結合時に、Ｒｅｐタンパク質が、ＲＢＳを組み込む配列上でその部位特異的エンドヌクレアーゼ活性を実行できるようにする。ＲＢＳ配列およびその逆相補鎖は、一緒に単一ＲＢＳを形成する。ＲＢＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたＲＢＳ配列である５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０）を含む。任意の既知のＲＢＳ配列は、他の既知のＡＡＶ  ＲＢＳ配列および他の天然に既知のまたは合成ＲＢＳ配列を含む、本発明の実施形態において使用され得る。理論に束縛されるものではないが、Ｒｅｐタンパク質のヌクレアーゼドメインは、二重鎖ヌクレオチド配列ＧＣＴＣに結合し、したがって２つの既知のＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質は、二重鎖オリゴヌクレオチド、５’−（ＧＣＧＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）（ＧＣＴＣ）−３’（配列番号６０）に直接結合し、安定に集成すると考えられる。加えて、可溶性凝集配座異性体（すなわち、不定数の相互関連Ｒｅｐタンパク質）は解離し、Ｒｅｐ結合部位を含有するオリゴヌクレオチドに結合する。各Ｒｅｐタンパク質は、各鎖上の窒素塩基およびホスホジエステル骨格の両方と相互作用する。窒素塩基との相互作用は、配列特異性を提供するが、ホスホジエステル骨格との相互作用は、非配列特異性または低配列特異性であり、タンパク質−ＤＮＡ複合体を安定させる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「末端分解部位」および「ＴＲＳ」という用語は、本明細書で交換可能に使用され、Ｒｅｐが、細胞ＤＮＡポリメラーゼ、例えばＤＮＡ  ｐｏｌ  δまたはＤＮＡ  ｐｏｌ  εを介してＤＮＡ伸長の基質として役立つ３’ＯＨを生成する５’チミジンとのチロシン−ホスホジエステル結合を形成する領域を指す。代替として、Ｒｅｐ−チミジン複合体は、配位ライゲーション反応に関与し得る。いくつかの実施形態では、ＴＲＳは、最小限で非塩基対チミジンを包含する。いくつかの実施形態では、ＴＲＳのニッキング効率は、ＲＢＳからの同じ分子内のその距離によって少なくとも部分的に制御され得る。受容体基質が相補的ＩＴＲであるとき、得られる産生物は、分子間二重鎖である。ＴＲＳ配列は、当該技術分野において既知であり、例えば、ＡＡＶ２において特定されたヘキサヌクレオチド配列である５’−ＧＧＴＴＧＡ−３’（配列番号６１）を含む。他の既知のＡＡＶ  ＴＲＳ配列、ＡＧＴＴ（配列番号６２）、ＧＧＴＴＧＧ（配列番号６３）、ＡＧＴＴＧＧ（配列番号６４）、ＡＧＴＴＧＡ（配列番号６５）などの他の天然に既知のまたは合成ＴＲＳ配列、およびＲＲＴＴＲＲ（配列番号６６）などの他のモチーフを含む、任意の既知のＴＲＳ配列を、本発明の実施形態において使用することができる。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−プラスミド」という用語は、分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むプラスミドを指す。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バクミド」という用語は、Ｅ．ｃｏｌｉにおいてプラスミドとして伝播することができる分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含み、それによりバキュロウイルスのシャトルベクターとして操作し得る、感染性バキュロウイルスゲノムを指す。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス」という用語は、バキュロウイルスゲノム内の分子間二重鎖としてｃｅＤＮＡゲノムを含むバキュロウイルスを指す。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルス感染昆虫細胞」および「ｃｅＤＮＡ−ＢＩＩＣ」という用語は、交換可能に使用され、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスに感染した無脊椎動物宿主細胞（限定されないが、昆虫細胞（例えば、Ｓｆ９細胞）を含む）を指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「閉端ＤＮＡベクター」という用語は、少なくとも１つの共有結合性閉端を有し、ベクターの少なくとも一部が分子内二重鎖構造を有する、カプシド不含ＤＮＡベクターを指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「ｃｅＤＮＡベクター」および「ｃｅＤＮＡ」という用語は、交換可能に使用され、少なくとも１つの末端パリンドロームを含む閉端ＤＮＡベクターを指す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡは、２つの共有結合性閉端を含む。
【００６８】
本明細書で定義されるように、「レポーター」は、検出可能な読み出しを提供するために使用することができるタンパク質を指す。レポーターは、一般に、蛍光、色、または発光などの測定可能なシグナルを産生する。レポータータンパク質コード配列は、細胞または生物中の存在が容易に観察されるタンパク質をコードする。例えば、蛍光タンパク質は、特定波長の光で励起されたときに細胞を蛍光させ、ルシフェラーゼは、細胞に光を生成する反応を触媒させ、β−ガラクトシダーゼなどの酵素は、基質を着色産生物に変換する。実験または診断目的のために有用な例示的なレポーターポリペプチドとしては、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリンホスファターゼ（ＡＰ）、チミジンキナーゼ（ＴＫ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、および他の蛍光タンパク質、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、ならびに当該技術分野において周知の他のものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「エフェクタータンパク質」という用語は、例えば、レポーターポリペプチドとして、あるいはより適切には、細胞を殺傷するポリペプチド、例えば毒素、または選択された薬剤もしくはその欠失で細胞を殺傷しやすくする薬剤として、検出可能な読み出しを提供するポリペプチドを指す。エフェクタータンパク質は、宿主細胞のＤＮＡおよび／またはＲＮＡを直接標的または損傷する任意のタンパク質またはペプチドを含む。例えば、エフェクタータンパク質としては、宿主細胞ＤＮＡ配列を標的とする制限エンドヌクレアーゼ（ゲノム因子であるか染色体外因子であるかにかかわらず）、細胞生存に必要な、ポリペプチド標的を分解するプロテアーゼ、ＤＮＡギラーゼ阻害剤、およびリボヌクレアーゼ型毒素が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成生物的回路によって制御されるエフェクタータンパク質の発現は、別の合成生物的回路における因子として関与し得、それによって生物的回路系の反応性の範囲および複雑性を拡張する。
【００７０】
転写調節因子は、関心対象の遺伝子の転写を活性化または抑制する、転写アクチベーターおよびリプレッサーを指す。プロモーターは、特定の遺伝子の転写を開始する核酸の領域である。転写アクチベーターは、典型的に、転写プロモーターの近くに結合し、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を直接開始する。リプレッサーは、転写プロモーターに結合し、ＲＮＡポリメラーゼによる転写開始を立体的に妨害する。他の転写調節因子は、それらが結合する場所、ならびに細胞条件および環境条件に応じて、アクチベーターまたはリプレッサーのいずれかとして役立ち得る。転写調節因子クラスの非限定的な例としては、ホメオドメインタンパク質、亜鉛フィンガータンパク質、翼状らせん（フォークヘッド）タンパク質、およびロイシン−ジッパータンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「リプレッサータンパク質」または「誘導因子タンパク質」は、調節配列エレメントに結合するタンパク質であり、調節配列エレメントに操作可能に連結した配列の転写をそれぞれ抑制または活性化する。本明細書に記載される好ましいリプレッサーおよび誘導因子タンパク質は、少なくとも１つの入力剤または環境入力の存在または非存在に敏感である。本明細書に記載される好ましいタンパク質は、例えば、分離可能なＤＮＡ結合および入力剤結合、または反応性エレメントもしくはドメインを含む形態のモジュールである。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「担体」としては、任意かつすべての溶媒、分散媒質、ビヒクル、コーティング、希釈剤、抗細菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤、緩衝剤、担体溶液、懸濁液、コロイドなどが挙げられる。薬学的活性物質に対するそのような媒質および薬剤の使用は、当該技術分野において周知である。補充的活性成分を組成物に組み込むこともできる。「薬学的に許容される」という語句は、宿主に投与されたときに、毒性反応、アレルギー性反応、または同様の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「入力剤反応性ドメイン」は、条件または入力剤に結合するか、またはそうでなければ連結ＤＮＡ結合融合ドメインをその条件もしくは入力の存在に対して反応性にするように、条件または入力剤に反応する転写因子のドメインである。一実施形態では、条件または入力の存在は、入力剤反応性ドメインまたはそれが融合するタンパク質の立体構造変化をもたらし、それが転写因子の転写調節活性を修飾する。
【００７４】
「インビボ」という用語は、多細胞動物などの生物中または生物内で起こるアッセイまたはプロセスを指す。本明細書に記載される態様のうちのいくつかでは、方法または使用は、細菌などの単細胞生物が使用されるときに「インビボで」起こると言われ得る。「エクスビボ」という用語は、多細胞動物または植物、例えば、とりわけ外植片、培養細胞（一次細胞および細胞株を含む）、形質転換細胞株、および抽出組織または細胞（血液細胞を含む）の体外に無傷膜を有する生細胞を使用して実行される方法および使用を指す。「インビトロ」という用語は、細胞抽出物などの無傷膜を有する細胞の存在を必要としないアッセイおよび方法を指し、非細胞系、例えば細胞抽出物などの細胞または細胞系を含まない媒質にプログラム可能な合成生物的回路を導入することを指し得る。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、タンパク質またはＲＮＡをコードする異種標的遺伝子であり得る、核酸配列の転写を駆動することによって、別の核酸配列の発現を調節する任意の核酸配列を指す。プロモーターは、構成的、誘導性、抑制性、組織特異性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの調節タンパク質および分子が結合し得る、遺伝子エレメントを含有し得る。本明細書に記載される態様のいくつかの実施形態では、プロモーターは、プロモーター自体の発現を調節する転写因子の発現を駆動することができる。プロモーター配列内では、転写開始部位、ならびにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメインが見出されるであろう。真核生物プロモーターは、必ずしもそうではないが、多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子の発現を駆動することができる。プロモーター配列は、その３’末端で転写開始部位によって結合され、バックグラウンドより上で検出可能なレベルで転写を開始するのに必要な最小数の塩基または要素を含むように上流（５’配向）に伸びる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「エンハンサー」という用語は、１つ以上のタンパク質（例えば、活性因子タンパク質または転写因子）に結合して、核酸配列の転写活性化を増加させるシス作用性調節配列（例えば、５０〜１，５００塩基対）を指す。エンハンサーは、それらが調節する遺伝子開始部位の上流または遺伝子開始部位の下流で最大１，０００，０００塩基対に位置付けられ得る。エンハンサーは、非関連遺伝子のイントロン領域内またはエクソン領域内に位置付けられ得る。
【００７７】
プロモーターは、それが調節する核酸配列の発現を駆動する、または転写を駆動すると言うことができる。「操作可能に連結された」、「操作可能に位置付けられた」、「操作可能に連結された」、「制御下」、および「転写制御下」という語句は、プロモーターが、核酸配列に関して正しい機能的位置および／または配向にあり、その配列の転写開始および／または発現を制御するように調節することを示す。本明細書で使用される場合、「逆位プロモーター」は、核酸配列が逆配向にあるプロモーターを指し、それによりコード鎖であったものは、今は非コード鎖であり、逆も同様である。逆位プロモーター配列を様々な実施形態で使用して、スイッチの状態を調節する。加えて、様々な実施形態では、プロモーターをエンハンサーと併せて使用することができる。
【００７８】
プロモーターは、所与の遺伝子または配列のコードセグメントおよび／またはエクソンの上流に位置する５’非コード配列を単離することによって取得され得る、遺伝子または配列と天然に関連するものであり得る。そのようなプロモーターは、「内因性」と呼ばれ得る。同様に、いくつかの実施形態では、エンハンサーは、その配列の下流または上流のいずれかに位置する、核酸配列と天然に関連するものであり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、コード核酸セグメントは、「組み換えプロモーター」または「異種プロモーター」の制御下で位置付けられ、これらの両方が、その自然環境において操作可能に連結されたコードされた核酸配列と通常は関連しないプロモーターを指す。組み換えまたは異種エンハンサーは、その自然環境において所与の核酸配列と通常は関連しないエンハンサーを指す。そのようなプロモーターまたはエンハンサーは、他の遺伝子のプロモーターまたはエンハンサー、任意の他の原核、ウイルス性、または真核細胞から単離されたプロモーターまたはエンハンサー、および「天然に存在」しない合成プロモーターまたはエンハンサーを含み得、すなわち、異なる転写調節領域の異なるエレメント、および／または当該技術分野において既知である遺伝子操作の方法を通じて発現を変更する突然変異を含み得る。プロモーターおよびエンハンサーの核酸配列を合成的に産生することに加えて、プロモーター配列は、本明細書に開示される合成生物的回路およびモジュールに関して、ＰＣＲを含む組み換えクローニングおよび／または核酸増幅技術を使用して産生され得る（例えば、米国特許第４，６８３，２０２号、米国特許第５，９２８，９０６号を参照されたく、各々は参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ミトコンドリア、クロロプラストなどの非核性細胞小器官内の配列の転写および／または発現を配向する制御配列が同様に用いられ得ることが企図される。
【００８０】
本明細書に記載される場合、「誘導性プロモーター」は、誘導因子もしくは誘導剤の存在下、それによって影響されるとき、またはそれによって接触されるときに、転写活性を開始または強化することによって特徴付けられるものである。本明細書に定義される場合、「誘導因子」または「誘導剤」は、内因性であり得るか、または誘導性プロモーターからの転写活性を誘導することにおいて活性であるような方法で投与される、通常は外因性の化合物またはタンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、誘導因子または誘導剤、すなわち、化学物質、化合物、またはタンパク質は、それ自体が核酸配列の転写または発現の結果であり得（すなわち、誘導因子は、別の構成成分またはモジュールによって発現される誘導因子タンパク質であり得る）、それ自体が誘導性プロモーターの制御下であり得る。いくつかの実施形態では、誘導性プロモーターは、リプレッサーなどのある特定の薬剤の非存在下で誘導される。誘導性プロモーターの例としては、テトラサイクリン、メタロチオニン、エクジソン、哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、およびマウス乳腺腫瘍ウイルス長末端反復（ＭＭＴＶ−ＬＴＲ））、ならびに他のステロイド反応性プロモーター、ラパマイシン反応性プロモーターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８１】
本明細書で交換可能に使用される「ＤＮＡ調節配列」、「制御エレメント」、および「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどの転写および翻訳制御配列を指し、これらは非コード配列（例えば、ＤＮＡ標的化ＲＮＡ）またはコード配列（例えば、部位特異的修飾ポリペプチドもしくはＣａｓ９／Ｃｓｎ１ポリペプチド）の転写を提供および／もしくは調節し、かつ／またはコードされたポリペプチドの翻訳を調節する。
【００８２】
「操作可能に連結された」とは、そのように記載された構成成分が、それらが意図された方法で機能することを許可する関係にある並列を指す。例えば、プロモーターがその転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コード配列に操作可能に連結されている。「発現カセット」は、ｃｅＤＮＡベクターにおける導入遺伝子の転写を指示するのに十分なプロモーターまたは他の調節配列に操作可能に連結されている異種ＤＮＡ配列を含む。好適なプロモーターには、例えば、組織特異的プロモーターが含まれる。プロモーターは、ＡＡＶ起源でもあり得る。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、本発明によるｃｅＤＮＡベクターでの予防的治療を含む治療が提供される、ヒトまたは動物を指す。通常、動物は、限定されないが、霊長類、齧歯類、飼育動物、または狩猟動物などの脊椎動物である。霊長類としては、チンパンジー、カニクイザル、クモザル、およびマカク、例えば、アカゲザルが挙げられるが、これらに限定されない。齧歯類としては、マウス、ラット、ウッドチャック、フェレット、ウサギ、およびハムスターが挙げられる。飼育動物および狩猟動物としては、ウシ、ウマ、ブタ、シカ、バイソン、バッファロー、ネコ種、例えば、飼いネコ、イヌ種、例えば、イヌ、キツネ、オオカミ、トリ種、例えば、ニワトリ、エミュー、ダチョウ、および魚、例えば、トラウト、ナマズ、およびサケが挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に記載される態様のある特定の実施形態では、対象は、哺乳類、例えば、霊長類またはヒトである。対象は、男性または女性であり得る。追加として、対象は、幼児または子供であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、新生児または胎児対象であり得、例えば、対象は、子宮内に存在する。好ましくは、対象は、哺乳類である。哺乳類は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳類は、疾患および障害の動物モデルを代表する対象として有利に使用され得る。追加として、本明細書に記載される方法および組成物は、飼育動物および／またはペットに使用され得る。ヒト対象は、任意の年齢、性別、人種、または民族グループ、例えば、コーカサス人（白人）、アジア人、アフリカ人、黒人、アフリカ系アメリカ人、アフリカ系ヨーロッパ人、スペイン人、中東人などであり得る。いくつかの実施形態では、対象は、臨床設定において患者または他の対象であり得る。いくつかの実施形態では、対象は、既に治療を受けている。いくつかの実施形態では、対象は、胚、胎児、新生児、幼児、子供、青年、または成人である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胎児、ヒト新生児、ヒト幼児、ヒト子供、ヒト青年、またはヒト成人である。いくつかの実施形態では、対象は、動物胚、または非ヒト胚もしくは非ヒト霊長類胚である。いくつかの実施形態では、対象は、ヒト胚である。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、本開示の核酸構築物またはｃｅＤＮＡ発現ベクターによる形質転換、トランスフェクション、形質導入などを受けやすい任意の細胞型を含む。非限定的な例として、宿主細胞は、単離された初代細胞、多能性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞）、人工多能性幹細胞、またはいくつかの不死化細胞株（例えば、ＨｅｐＧ２細胞）のいずれかであり得る。あるいは、宿主細胞は、組織、器官、または生物における原位置またはインビボの細胞であり得る。
【００８５】
「外因性」という用語は、その天然源以外の細胞中に存在する物質を指す。本明細書で使用される「外因性」という用語は、通常見られず、核酸またはポリペプチドをそのような細胞または生物に導入することが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸（例えば、ポリペプチドをコードする核酸）またはポリペプチドを指し得る。あるいは、「外因性」とは、それが比較的少量で見られ、細胞または生物における核酸またはポリペプチドの量を増加させること、例えば、異所性発現またはレベルをもたらすことが望まれる、人の手が関与するプロセスによって細胞または生物などの生物系に導入された核酸またはポリペプチドを指し得る。これとは対照的に、「内因性」という用語は、生物系または細胞に対して天然である物質を指す。
【００８６】
「配列同一性」という用語は、２つのヌクレオチド配列間の関連性を指す。本開示の目的のために、２つのデオキシリボヌクレオチド配列間の配列同一性の程度は、ＥＭＢＯＳＳパッケージのＮｅｅｄｌｅプログラム（ＥＭＢＯＳＳ：Ｔｈｅ  Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，上記）、好ましくはバージョン３．０．０以降において実装されるように、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，上記）を使用して決定される。使用される任意のパラメータは、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ拡張ペナルティ０．５、およびＥＤＮＡＦＵＬＬ（ＮＣＢＩ  ＮＵＣ４．４のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスである。「最長同一性」とラベル付けされたＮｅｅｄｌｅの出力（−ｎｏｂｒｉｅｆオプションを使用して取得される）は、同一性パーセントとして使用され、次のように計算される：（同一のデオキシリボヌクレオチド×１００）／アラインメントの長さ−アラインメントにおけるギャップの総数）。アラインメントの長さは、好ましくは少なくとも１０ヌクレオチド、好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド、より好ましくは少なくとも５０ヌクレオチド、および最も好ましくは少なくとも１００ヌクレオチドである。
【００８７】
本明細書で使用される「相同性」または「相同」という用語は、必要に応じて配列を整列させ、ギャップを導入して最大の配列同一性パーセントを達成した後、標的染色体上の対応する配列のヌクレオチド残基と同一である相同性アームのヌクレオチド残基のパーセンテージとして定義される。ヌクレオチド配列相同性パーセントを決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公的に入手可能なコンピューターソフトウェアを使用して、当該技術の範囲内である様々な方法で達成され得る。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列を整列させるための適切なパラメータを決定することができる。いくつかの実施形態では、例えば修復テンプレートの相同性アームの核酸配列（例えば、ＤＮＡ配列）は、配列が、宿主細胞の対応する未変性または未編集の核酸配列（例えば、ゲノム配列）と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％以上同一である場合、「相同」とみなされる。
【００８８】
本明細書で使用される「異種」という用語は、それぞれ天然の核酸またはタンパク質には見られないヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。異種核酸配列は、天然に存在する核酸配列（またはその変異体）に（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、キメラポリペプチドをコードするキメラヌクレオチド配列を生成し得る。異種核酸配列は、変異体ポリペプチドに（例えば、遺伝子操作によって）連結されて、融合変異体ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を生成し得る。
【００８９】
「ベクター」または「発現ベクター」は、細胞において結合されたセグメントの複製をもたらすために別のＤＮＡセグメント、すなわち「挿入」が結合され得る、プラスミド、バクミド、ファージ、ウイルス、ビリオン、またはコスミドなどのレプリコンである。ベクターは、宿主細胞への送達のために、または異なる宿主細胞間の移動のために設計された核酸構築物であり得る。本明細書で使用される場合、ベクターは、起源および／または最終形態でウイルス性または非ウイルス性であり得るが、本開示の目的のために、「ベクター」は、その用語が本明細書で使用されるとき、一般にｃｅＤＮＡベクターを指す。「ベクター」という用語は、適切な制御エレメントと関連する場合に複製することができ、遺伝子配列を細胞に移すことができる任意の遺伝的エレメントを包含する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは組み換えベクターであり得る。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「発現ベクター」という用語は、ベクター上の転写調節配列に連結された配列からのＲＮＡまたはポリペプチドの発現を指示するベクターを指す。発現される配列は、必ずしもそうではないが、細胞にとって異種であることが多い。発現ベクターは、追加のエレメントを含むことができ、例えば、発現ベクターは、２つの複製系を有することができるため、それを２つの生物、例えば発現の場合はヒト細胞、ならびにクローニングおよび増幅の場合は原核生物宿主で維持することができる。「発現」という用語は、ＲＮＡおよびタンパク質、また必要に応じて、例えば、転写、転写処理、翻訳およびタンパク質の折りたたみ、修飾および処理を含むがこれらに限定されない分泌タンパク質の産生に関与する細胞プロセスを指す。「発現産物」には、遺伝子から転写されたＲＮＡ、および遺伝子から転写されたｍＲＮＡの翻訳によって得られたポリペプチドが含まれる。「遺伝子」という用語は、適切な調節配列に操作可能に連結された場合に、インビトロまたはインビボでＲＮＡに転写される核酸配列（ＤＮＡ）を意味する。遺伝子には、コード領域の前後の領域、例えば、５’未翻訳（５’ＵＴＲ）または「リーダー」配列および３’ＵＴＲまたは「トレーラー」配列、ならびに個々のコードセグメント（エクソン）間の介在配列（イントロン）が含まれる場合と含まれない場合がある。
【００９１】
「組み換えベクター」とは、異種核酸配列を含むベクター、またはインビボで発現することができる「導入遺伝子」を意味する。本明細書に記載されるベクターは、いくつかの実施形態では、他の好適な組成物および治療法と組み合わせることができることを理解されたい。いくつかの実施形態では、ベクターは、エピソームである。好適なエピソームベクターの使用は、対象における関心対象のヌクレオチドを高コピー数の染色体外ＤＮＡに維持し、それによって染色体組み込みの潜在的な影響を排除する手段を提供する。
【００９２】
本明細書で使用される「遺伝性疾患」という語句は、ゲノムの１つ以上の異常、特に出生時から存在する状態によって部分的または完全に、直接的または間接的に引き起こされる疾患を指す。異常は、突然変異、挿入、または欠失であり得る。異常は、遺伝子のコード配列またはその調節配列に影響を与える可能性がある。遺伝性疾患は、ＤＭＤ、血友病、嚢胞性線維症、ハンチントン舞踏病、家族性高コレステロール血症（ＬＤＬ受容体欠損）、肝芽腫、ウィルソン病、先天性肝ポルフィリン症、肝代謝の遺伝性疾患、レッシュ・ナイハン症候群、鎌状赤血球貧血、サラセミア、色素性乾皮症、ファンコーニ貧血、網膜色素変性症、毛細血管拡張性運動失調症、ブルーム症候群、網膜芽細胞腫、およびテイ・サックス病であり得るが、これらに限定されない。
【００９３】
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」という用語は、方法または組成物に必須であるが、必須であるか否かにかかわらず、不特定要素の包含に対して開放されている、その組成物、方法、およびそれぞれの構成成分（複数可）に関して使用される。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、その実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない要素の存在を許容する。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」の使用は、限定ではなく包含を示す。
【００９５】
「からなる」という用語は、実施形態の説明において列挙されてない任意の要素を除いて、本明細書に記載される組成物、方法、およびそれらそれぞれの構成成分を指す。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「から本質的になる」という用語は、所与の実施形態に必要な要素を指す。この用語は、本発明の実施形態の基本的かつ新規または機能的な特徴（複数可）に物質的に影響を及ぼさない追加の要素の存在を許容する。
【００９７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が別途明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「方法」に対する言及は、本明細書に記載される、および／または本開示などを読むことにより当業者に明らかとなるであろうタイプの１つ以上の方法、および／またはステップを含む。同様に、「または」という語は、文脈が別途明らかに示されない限り、「および」を含むことが意図される。本明細書に記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料は、下記で説明される。省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、ラテン語のｅｘｅｍｐｌｉ  ｇｒａｔｉａに由来し、本明細書では非限定的な例を示すように使用される。したがって、省略形「例えば（ｅ．ｇ．）」は、「例えば（ｆｏｒ  ｅｘａｍｐｌｅ）」と同義である。
【００９８】
作動例または別途示される場合を除いて、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数は、すべての場合において「約」という用語によって修飾されるものとして理解されたい。パーセンテージに関連して使用される「約」という用語は、±１％を意味する場合がある。本発明は、以下の実施例によってさらに詳細に説明されるが、本発明の範囲は、それに限定されてはならない。
【００９９】
本明細書に開示される本発明の代替要素または実施形態のグループ化は、限定として解釈されるべきではない。各グループのメンバーは、個別に、またはグループの他のメンバーまたは本明細書で見られる他の要素との任意の組み合わせで参照および特許請求することができる。グループの１つ以上のメンバーは、利便性および／または特許性の理由から、グループに含める、またはグループから削除することができる。そのような任意の包含または削除が発生した場合、本明細書では、明細書が修正されたグループを含むとみなされ、したがって添付の特許請求の範囲で使用されているすべてのマーカッシュグループの記述を満たす。
【０１００】
いずれかの態様のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される開示は、人間のクローン化プロセス、人間の生殖細胞系列の遺伝的同一性を修正するプロセス、産業もしくは商業目的でのヒト胚の使用、または人もしくは動物にいかなる実質的な医学的利益ももたらすことなく苦しみを引き起こす可能性が高い動物、およびそのようなプロセスから生じる動物の遺伝的同一性を修正するためのプロセスに関係しない。
【０１０１】
本明細書では、本発明の様々な態様の説明内で他の用語が定義されている。
【０１０２】
文献参照、発行済み特許、公開済みの特許出願、および係属中の特許出願を含む、本出願を通して引用されるすべての特許および他の出版物は、例えば、本明細書に記載される技術に関連して使用され得るそのような刊行物に記載される方法論を説明および開示する目的で、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。これらの出版物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供されている。この点に関するいかなるものも、発明者が先行発明のおかげで、またはいかなる他の理由のためにもそのような開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。日付に関するすべての記述またはこれらの文書の内容に関する表現は、出願人が入手できる情報に基づいており、これらの文書の日付または内容の正確さに関するいかなる承認も構成するものではない。
【０１０３】
本開示の実施形態の説明は、網羅的であること、または本開示を開示された正確な形態に限定することを意図したものではない。本開示の特定の実施形態および実施例が、例示の目的で本明細書で説明されているが、当業者が認識するように、本開示の範囲内で様々な同等の修正が可能である。例えば、方法のステップまたは機能は、所与の順序で提示されるが、代替実施形態は、異なる順序で機能を実施してもよく、または機能は実質的に同時に実施されてもよい。本明細書で提供される開示の教示は、必要に応じて他の手順または方法に適用することができる。本明細書に記載される様々な実施形態は、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることができる。本開示の態様は、必要に応じて、上記の参考文献および出願の構成、機能、および概念を用いて本開示のさらなる実施形態を提供するように修正することができる。さらに、生物学的機能の同等性の考慮により、種類または量の生物学的または化学的作用に影響を与えることなく、タンパク質構造にいくつかの変更を加えることができる。詳細な説明に照らして、これらの変更および他の変更を本開示に加えることができる。そのような修正はすべて、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。
【０１０４】
前述の実施形態のいずれかの特定の要素は、他の実施形態の要素と組み合わせるか、または置き換えることができる。さらに、本開示のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で説明されたが、他の実施形態もそのような利点を示し得、すべての実施形態が本開示の範囲内にあるために必ずしもそのような利点を示す必要はない。
【０１０５】
本明細書に記載される技術は、以下の実施例によってさらに説明されており、決してこれらをさらに限定するものと解釈されるべきではない。本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコル、および試薬などに限定されず、そのようなものとして変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態のみを説明する目的のためであり、単に特許請求の範囲によって定義される、本発明の範囲を限定することを意図しない。
【０１０６】
ＩＩ．ｃｅＤＮＡベクターを含む環状ＤＮＡベクターの詳細な合成産生方法。
本明細書に記載される技術は、一般に、細胞または細胞株の非存在下で閉端ＤＮＡベクターを生成するための方法を対象とする。そのように、得られたベクターは、従来の細胞産生方法論を使用して作製された同等のベクターよりも不純物が少ない。
【０１０７】
Ａ．一般的な合成産生方法
いくつかの実施形態では、いかなる微生物学的ステップの使用も必要としない、ｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの合成のためのプロセスが、本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、プロセスは、制限エンドヌクレアーゼを使用する酵素切断ステップおよびライゲーションステップを使用する系での閉端ＤＮＡベクターの合成を可能にし、閉端ＤＮＡベクターを生成する。ほぼすべての実施形態では、ＤＮＡベクター産生のための合成系は、無細胞系である。いくつかの実施形態では、無細胞系は、昆虫無細胞系である。
【０１０８】
合成産生方法のための１つ以上の酵素またはオリゴヌクレオチド成分のうちの１つ以上が細胞から産生され、精製された形態で本発明の方法において使用され得ることは、当業者によって理解されるであろう。したがって、いくつかの実施形態では、合成産生方法は無細胞方法であるが、制限酵素および／またはリガーゼ酵素を細胞から産生することができる。
【０１０９】
一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼおよび／またはライゲーションコンピテントタンパク質は、細胞、例えば細菌細胞において発現ベクターから発現または提供することができる。一実施形態では、制限エンドヌクレアーゼまたはリガーゼ酵素のうちの１つ以上を発現する発現ベクターを含む、細菌細胞などの細胞が存在し得る。したがって、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるＤＮＡベクターを生成するための無細胞合成方法を主に対象とするが、一実施形態では、細胞、例えば、昆虫細胞ではなく細菌細胞が存在し、方法で必要な酵素のうちの１つ以上を発現するように使用され得る、合成産生方法も包含される。そのような実施形態では、制限エンドヌクレアーゼおよび／またはライゲーションコンピテントタンパク質を発現する細胞は、昆虫細胞ではない。細胞が存在し、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼまたはライゲーションコンピテントタンパク質を発現するすべての実施形態では、細胞は、閉端ＤＮＡベクターを複製しない。言い換えると、細胞の細胞内機構は複製されないか、またはＤＮＡベクターの複製に関与しない。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の合成は、二本鎖ＤＮＡ構築物または１つ以上のオリゴヌクレオチドのいずれかから始まるインビトロ無細胞プロセスで実行される。二本鎖ＤＮＡ構築物または１つ以上のオリゴヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼで切断され、ライゲーションされてＤＮＡ分子を形成する。いくつかの実施形態では、化学的に合成することができるオリゴヌクレオチドであるため、典型的に細菌内で繁殖する必要のある所望の配列全体をコードする大きな出発テンプレートの使用を回避する。所望のＤＮＡ配列が合成されると、それは、本明細書に開示されるように、切断され、他のオリゴヌクレオチドとライゲーションされ得る。本明細書に開示される方法を使用した閉端ＤＮＡベクターの生成における複数のオリゴヌクレオチドの使用は、ＤＮＡベクター生成へのモジュラーアプローチを可能にし、末端反復、例えばＩＴＲの調整および／または特定の選択、ならびに末端反復のスペーシング、また合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター内の異種核酸配列の選択を可能にする。
【０１１１】
Ｂ．ＤＮＡベクターの合成産生の方法
細胞ベースの方法を使用して様々なＩＴＲ構成を有するを含むｃｅＤＮＡベクターの産生のためのある特定の方法は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号および２０１８年１２月６日に出願された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の実施例１に記載されており、各々は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
対照的に、本明細書で提供される方法は、合成産生方法、例えば、いくつかの実施形態では、無細胞産生方法に関し、本明細書では「合成閉端ＤＮＡベクター産生」または「合成産生」とも呼ばれる。
【０１１３】
本明細書では、閉端ＤＮＡベクターの合成産生方法を、ｃｅＤＮＡベクターの合成産生を利用して例証し、説明する。いくつかの実施形態では、合成産生方法は、無細胞方法、例えば、無昆虫細胞方法である。いくつかの実施形態では、合成産生方法は、バクミド、またはバキュロウイルス、または両方の非存在下で行われる。代替実施形態では、合成産生方法は、細胞、例えば、細菌細胞、例えば、制限エンドヌクレアーゼを発現する細胞、および／またはライゲーションコンピテントＲｅｐタンパク質などの使用を包含し得る。そのような実施形態では、細胞は、ポリヌクレオチドベクターテンプレートが安定して組み込まれた細胞株であり得、制限エンドヌクレアーゼタンパク質および／またはリガーゼコンピテントタンパク質、例えば、限定されないが、Ｒｅｐタンパク質などを、本明細書に記載される合成産生方法で使用されるオリゴヌクレオチドを含む反応混合物に導入するために使用され得る。
【０１１４】
本明細書に開示される合成産生方法を使用して生成されたｃｅＤＮＡベクターを生成および単離するためのプロセスの例は、図４Ａ〜４Ｅおよび以下の実施例セクションの特定の実施例に記載されている。
【０１１５】
本明細書に開示されるような閉端ＤＮＡベクターを生成するための合成産生方法のすべての態様では、ライゲーションステップは、化学ライゲーションステップまたは酵素的ライゲーションステップであり得る。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、ライゲーションコンピテント酵素、例えばＤＮＡリガーゼを使用して行い、例えば５´および３´粘着性オーバーハング、または平滑末端をライゲーションすることができる。いくつかの実施形態では、ライゲーション酵素は、Ｒｅｐタンパク質以外のリガーゼ酵素である。いくつかの実施形態では、ライゲーション酵素は、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質である。
【０１１６】
本明細書に開示されるような閉端ＤＮＡベクターを生成するための合成方法のすべての態様では、方法は、インビトロ方法である。好ましい実施形態では、方法は、無細胞方法であり、すなわち、細胞、例えば昆虫細胞中または存在下では実施されない。代替実施形態では、合成産生方法のための１つ以上の酵素は、細胞、例えば非昆虫細胞から産生するか、または発現させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、制限エンドヌクレアーゼまたはリガーゼ酵素のうちの１つ以上を発現する発現ベクターを含む、細菌細胞などの細胞が存在し得る。したがって、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示される閉端ＤＮＡベクターを生成するための無細胞合成方法を主に対象とするが、細胞、例えば、細菌細胞を使用して、方法で必要な酵素のうちの１つ以上を発現させることができる合成産生方法もまた包含される。
【０１１７】
（ｉ）二本鎖ＤＮＡ構築物からの合成産生方法
一態様では、閉端ＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物から閉端ＤＮＡベクターを形成する分子全体を切除し、続いて分子を閉じるために末端をライゲーションすることによって生成される。そのような実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物には、５´から３´に順番に、第１の制限エンドヌクレアーゼ部位、上流ＩＴＲ、発現カセット、下流ＩＴＲ、および第２の制限エンドヌクレアーゼ部位が提供される。次いで、二本鎖ＤＮＡ構築物を１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させて、制限エンドヌクレアーゼ切断部位の両方で二本鎖切断を生成する。１つのエンドヌクレアーゼが両方の部位を標的にすることも、制限部位が閉端ベクターテンプレート領域内に存在しない限り、各部位を異なるエンドヌクレアーゼによって標的とすることもできる。これにより、制限エンドヌクレアーゼ部位の間の配列が、残りの二本鎖ＤＮＡ構築物から切除される。この切除された分子は、遊離５´および３´末端を有し、これらは次いで、閉端ＤＮＡベクターを形成するためにライゲーションされる。ライゲーションは、例えば、Ｒｅｐまたはファージタンパク質などのライゲーション機能を持つタンパク質を使用することによって、または化学ライゲーションによって行うことができる。いくつかの態様では、５’から３’方向のベクター長は、ＡＡＶビリオン中でカプシド化されることが知られている最大長を超える。いくつかの態様では、長さは、４．６ｋｂ超、または５ｋｂ超、または６ｋｂ超である。いくつかの態様では、切除された分子は、最初にアニールされて、遊離５´および３´末端のライゲーションの前にヘアピン形成を促進する。いくつかの態様では、不要な二本鎖ＤＮＡ構築物骨格は、骨格中の固有の切断部位に特異的な１つ以上の制限エンドヌクレアーゼによって切断されるため、精製中に分解され、より容易に排除される。いくつかの態様では、前述の方法は、ライゲーションステップの前に、切除されたｄｓＤＮＡ分子を加熱または融解して一本鎖ポリヌクレオチドを形成するステップをさらに含むことができる。いくつかの態様では、２つの制限エンドヌクレアーゼ部位は、配列が同一である。いくつかの態様では、２つの制限エンドヌクレアーゼ部位を切断して、平滑末端を提供することができる。
【０１１８】
（ｉｉ）一本鎖分子からの合成産生方法（変異体１）
本明細書に開示される合成産生方法を使用して、閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、閉端を有する一本鎖の直鎖状ＤＮＡを使用し、最初にセンス方向、続いてアンチセンス方向に発現カセットに隣接する２つのＩＴＲを含む。したがって、いくつかの実施形態では、方法は、ａ）５´から３´に、センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、アンチセンス第２のＩＴＲ、アンチセンス発現カセット配列、およびアンチセンス第１のＩＴＲを含む一本鎖分子を合成することと、ｂ）一本鎖分子内での少なくとも１つのヘアピンループの形成を容易にすることと、ｃ）５´および３´末端をライゲーションしてｃｅＤＮＡベクターを形成することと、を含む。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを合成する様々な方法、例えば、オリゴヌクレオチドのインビトロまたはインシリコ合成が当該技術分野において知られており、当該技術分野で知られている任意の方法をステップａ）で使用することができる。前述の方法における「センス」および「アンチセンス」という用語は、ポリヌクレオチド上の構造エレメントの配向を指す。エレメントのセンスバージョンおよびアンチセンスバージョンは、互いの逆の相補鎖である。ヘアピンループ配列は、任意のヌクレオチド配列、好ましくはその全長に沿ってｄｓＤＮＡを形成するようにハイブリダイズしないものであり得る。ＤＮＡをライゲーションして直鎖状二本鎖構造を形成する方法は、当該技術分野で知られており、非限定的な実施例では、ウイルスタンパク質、例えばＲｅｐ、またはファージ、またはポックス、タンパク質、または化学ライゲーションを使用する。
【０１１９】
この実施形態では、閉端ＤＮＡベクター、例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、センスおよびアンチセンスＩＴＲが隣接する発現カセットをコードする一本鎖の直鎖状ＤＮＡ配列を提供することによって産生され、次いでライゲーションによって閉端とされる。産生される例示的な閉端ＤＮＡベクターとしてｃｅＤＮＡベクターの産生を使用すると、ｃｅＤＮＡベクターの産生のための一本鎖ＤＮＡ分子は、５´から３´に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
アンチセンス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、および
アンチセンス第１のＩＴＲを含む。
【０１２０】
この例示的な方法では、オリゴヌクレオチドは、上に示されるように順番にライゲーションされ、アンチセンス第１のＩＴＲは、センス第１のＩＴＲに相補的であり、同様にアンチセンス第２のＩＴＲおよびアンチセンス発現カセット配列は、それぞれセンス第２のＩＴＲおよびセンス発現カセット配列に相補的である。ライゲーションステップは、遊離５´および３´末端を結合し、閉端ＤＮＡベクター、ｃｅＤＮＡの形成をもたらす。
【０１２１】
本明細書に開示されるような閉端ＤＮＡベクターを生成するための合成産生方法のすべての態様では、ライゲーションステップは、化学ライゲーションステップまたは酵素的ライゲーションステップであり得る。いくつかの実施形態では、ライゲーションは、ライゲーションコンピテント酵素、例えばＤＮＡリガーゼを使用して行い、例えば５´および３´粘着性オーバーハング、または平滑末端をライゲーションすることができる。いくつかの実施形態では、ライゲーション酵素は、Ｒｅｐタンパク質以外のリガーゼ酵素である。いくつかの実施形態では、ライゲーション酵素は、ＡＡＶ  Ｒｅｐタンパク質である。
【０１２２】
（ｉｉｉ）５´および３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを使用した合成産生
別の態様は、ａ）第１のＩＴＲを含む第１の一本鎖ＩＴＲ分子を合成（および／または提供）することと、ｂ）第２のＩＴＲを含む第２の一本鎖ＩＴＲ分子を合成（および／または提供）することと、ｃ）発現カセット配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドを提供することと、ｄ）第１のＩＴＲ分子の５´および３´末端を二本鎖分子の第１の末端にライゲーションし、第２のＩＴＲ分子の５´および３´末端を二本鎖分子の第２の末端にライゲーションして、ＤＮＡベクターを形成することと、を含む。ライゲーションステップの前に、ＩＴＲ分子および／または二本鎖ポリヌクレオチドを制限酵素と接触させて、適合末端、例えばオーバーハングを生成して、所望の位置での適切なライゲーションを確保することができる。いくつかの実施形態では、３つのエレメントは、平滑末端を備えている。各ＩＴＲと二本鎖ポリヌクレオチドとのライゲーションは、連続的または同時であり得る。一実施形態では、ライゲーションステップは、ヘアピンを形成する一本鎖５´から３´オリゴのライゲーションを伴う。
【０１２３】
そのような実施形態では、閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクターは、いくつかの実施形態では、ヘアピンまたは他の３次元構成（例えば、Ｔ−もしくはＹ−ホリデイジャンクション構成）にある５´および３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、５´および３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットまたは異種核酸配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。任意で、ライゲーションステップの前にオリゴを３次元構成に折りたたむことを容易にする条件にオリゴ（複数可）をさらすステップが追加される。図１１Ｂは、５´ＩＴＲオリゴヌクレオチドおよび３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることを含む、ｃｅＤＮＡベクターを生成する例示的な方法を示す。いくつかの実施形態では、５´および３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、５´および３´ヘアピンオリゴヌクレオチドであるか、または異なる３次元構成（例えば、ホリデイジャンクション）を有し、任意で、インビトロＤＮＡ合成によって提供され得る。いくつかの実施形態では、５´および３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、対応する制限エンドヌクレアーゼ粘着末端を有する二本鎖ポリヌクレオチドに相補的な粘着末端を有するように制限エンドヌクレアーゼで切断されている。いくつかの実施形態では、５´ＩＴＲオリゴヌクレオチドのヘアピンの末端は、二本鎖ポリヌクレオチドの５´センス鎖および３´アンチセンス鎖に相補的である粘着末端を有する。いくつかの実施形態では、３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドのヘアピンの末端は、二本鎖ポリヌクレオチドの３´センス鎖および５´アンチセンス鎖に相補的である粘着末端を有する。いくつかの実施形態では、５´ＩＴＲオリゴヌクレオチドおよび３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドのヘアピンの末端は、二本鎖ポリヌクレオチドへの指向性ライゲーションが達成され得るように、異なる制限エンドヌクレアーゼ粘着末端を有する。いくつかの実施形態では、ＩＴＲオリゴヌクレオチドの一方または両方の末端は、オーバーハングを有さず、そのようなＩＴＲオリゴ（複数可）は、平滑末端結合によって二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションされる。前述の方法におけるＩＴＲ分子は、当該技術分野で知られている任意の方法によって合成および／またはライゲーションすることができる。オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドを合成する様々な方法、例えば、固相ＤＮＡ合成、ホスホルアミダイトＤＮＡ合成、およびＰＣＲが、当該技術分野で知られている。ＩＴＲ分子は、ＩＴＲを含むＤＮＡ構築物から切除することもできる。核酸をライゲーションする様々な方法、例えば化学ライゲーションまたはライゲーションコンピテントタンパク質、例えばリガーゼ、ＡＡＶ  Ｒｅｐ、もしくはトポイソメラーゼとのライゲーションが、当該技術分野で知られている。
【０１２４】
（ｉｖ）ライゲーションを必要としない合成産生方法
いくつかの実施形態では、閉端ＤＮＡベクターの合成産生は、発現カセット配列に隣接する少なくとも１つのＩＴＲを含み、またアンチセンス発現カセット配列も含む、一本鎖配列の合成によるものである。非限定的な一実施例では、ｃｅＤＮＡベクターは、以下の方法によって産生される。
【０１２５】
５´から３´に順番に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、および
アンチセンス発現カセット配列を含む、一本鎖配列が
提供される。一実施形態では、一本鎖配列は、当該技術分野で知られている任意の方法によって直接合成することができる。別の実施形態では、一本鎖配列は、センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、およびアンチセンス発現カセット配列のうちの１つ以上を含む２つ以上のオリゴをライゲーションにより結合することによって構築され得る。
【０１２６】
さらに別の実施形態では、一本鎖配列は、二本鎖ＤＮＡ構築物からの配列の切除と、その後の切除された二本鎖断片からの鎖の分離によって得ることができる。より具体的には、第１の制限部位、センス第１のＩＴＲ、センス発現カセット配列、センス第２のＩＴＲ、アンチセンス発現カセット配列、および第２の制限部位を、５´から３´に順番に含む、二本鎖ＤＮＡ構築物が提供される。２つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位の間の領域は、そのような切断部位（複数可）を認識する少なくとも１つの制限エンドヌクレアーゼによる切断によって切除される。得られる切除された二本鎖ＤＮＡ断片は、センス鎖およびアンチセンス鎖が、所望の一本鎖配列断片に分離されるように処理される。
【０１２７】
一本鎖配列は、センス第１のＩＴＲおよび／またはセンス第２のＩＴＲによる１つ以上のヘアピンループの形成、およびアンチセンス発現カセット配列へのセンス発現カセット配列の相補的結合を促進するためのアニーリングステップに供される。その結果が、ライゲーションを形成する必要のない閉端構造である。アニーリングパラメータおよび技術は、当技術分野で周知である。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、配列番号４のポリヌクレオチドを含み、野生型ＩＴＲは、配列番号１のポリヌクレオチドを含む。
【０１２９】
本明細書に提供される方法によって産生されたＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイによって判定して、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する（図４Ｃ）。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組み換えられて突然変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、いくつかの実施形態では、直鎖状で連続的な構造のベクターが好ましい。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミドとは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性後に分離される可能性があるが、これらのＤＮＡベクターは、相補鎖を有し、単一ＤＮＡ分子である。好ましくは、ベクターは、プラスミドとは異なり、原核生物型のＤＮＡ塩基メチル化なしに産生することができる。
【０１３０】
図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のｃｅＤＮＡプラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルである。ｃｅＤＮＡは、実施例の上記図４Ｃに関して考察されるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。
【０１３１】
Ｃ．ｃｅＤＮＡベクターの単離および精製：
例示的な閉端ＤＮＡベクターである、ｃｅＤＮＡベクターを生成および単離する方法が、本明細書に記載されている。例えば、本明細書に記載される合成方法によって産生される閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクターは、最後のライゲーション反応後の適切な時点で採取または収集することができ、ｃｅＤＮＡベクターの高収率産生を達成するために最適化することができる。閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡの精製のための当業者に知られている任意の手段によって精製され得る。一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、ＤＮＡ分子として精製される。一般に、任意の当該技術分野において既知の核酸精製方法、ならびに市販のＤＮＡ抽出キットが採用され得る。
【０１３２】
代替として、反応混合物をクロマトグラフ分離に供することによって、精製を実施することができる。非限定的な一例として、このプロセスは、核酸を保持するイオン交換カラム（例えば、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ  Ｑ（登録商標））上に反応混合物を負荷し、次いで溶出し（例えば、１．２Ｍ  ＮａＣｌ溶液で）、ゲル濾過カラム（例えば、６高速流ＧＥ）上でさらなるクロマトグラフ精製を実施することによって実施され得る。次いで、ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクターは、例えば沈殿によって回収される。
【０１３３】
ｃｅＤＮＡベクターの存在は、細胞から単離されたベクターＤＮＡをＤＮＡベクター上に単一認識部位を有する制限酵素で消化すること、ならびにゲル電気泳動を使用し、消化されたＤＮＡ材料および未消化のＤＮＡ材料の両方を分析して、直鎖状で非連続的なＤＮＡと比較して特徴的なバンドの直鎖状で連続的なＤＮＡの存在を確認することによって確認され得る。図４Ｂおよび図４Ｃは、本明細書におけるプロセスによって産生された閉端ｃｅＤＮＡベクターの存在を特定するための一実施形態を示す。
【０１３４】
国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の図５は、実施例に記載される方法を使用して、複数のｃｅＤＮＡプラスミド構築物からｃｅＤＮＡの産生を確認するゲルを示す。ｃｅＤＮＡは、実施例の図４Ｃに関して考察されるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される合成産生方法によって産生される閉端ＤＮＡベクターは、本明細書で論じられるような様々な適切な方法によってインビトロまたはインビボで標的細胞に送達され得る。ベクターのみを適用または注入することができる。ベクターは、トランスフェクション試薬または他の物理的手段の助けなしに細胞に送達され得る。代替として、ベクターは、細胞へのＤＮＡの進入を促進するトランスフェクション試薬または他の物理的手段、例えば、リポソーム、アルコール、高ポリリジン化合物、高アルギニン化合物、リン酸カルシウム、微小胞、マイクロインジェクションなどを使用して送達され得る。
【０１３６】
Ｄ．合成産生方法を使用して産生された環状ＤＮＡベクター
本明細書では、ＤＮＡ分子および閉端ＤＮＡベクターのインビトロ産生の様々な方法が提供される。いくつかの実施形態では、閉端ＤＮＡベクターは、本明細書に記載されるように、ｃｅＤＮＡベクターである。代替実施形態では、閉端ＤＮＡベクターは、例えばダンベルＤＮＡベクターまたはドッグボーンＤＮＡベクターである（例えば、参照によりその内容全体が本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１０／００８６６２６を参照）。
（２０１７）：６５。
【０１３７】
ＩＩＩ．ｃｅＤＮＡベクター全般
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生される閉端ＤＮＡベクターは、導入遺伝子を発現し得るｃｅＤＮＡベクターを含む、ｃｅＤＮＡベクターである。本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、サイズによって制限されず、それにより、例えば、単一ベクターからの導入遺伝子の発現に必要なすべての構成成分の発現を可能にする。ｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、発現カセットなどの分子の少なくとも一部分にわたって二重鎖、例えば、自己相補的である（例えば、ｃｅＤＮＡは、二本鎖環状分子ではない）。ｃｅＤＮＡベクターは、共有結合性閉端を有し、したがって、例えば、１時間以上３７℃でエキソヌクレアーゼ消化（例えば、エキソヌクレアーゼＩまたはエキソヌクレアーゼＩＩＩ）に対して耐性である。
【０１３８】
一般に、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ  ＩＴＲを含む。ＩＴＲ配列は、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ  ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾されたＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ−ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ−ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ−ＷＴ  ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択される。
【０１３９】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む方法および組成物が本明細書に包含され、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。使用のために包含される非限定的な例示的リポソームナノ粒子系が、本明細書に開示されている。いくつかの態様では、本開示は、ｃｅＤＮＡおよびイオン化脂質を含む脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られたｃｅＤＮＡを用いて作製および負荷される脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、本明細書に組み込まれる。
【０１４０】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターには、ウイルスカプシド内の制限された空間によって課されるパッケージングの制約はない。これは、制御エレメント、例えば、本明細書に開示される調節スイッチ、大きな導入遺伝子、複数の導入遺伝子などの挿入を許可する。
【０１４１】
図１Ａ〜１Ｅは、非限定的な例示的ｃｅＤＮＡベクターの概略図、または対応するｃｅＤＮＡプラスミドの配列を示す。ｃｅＤＮＡベクターはカプシドを含まず、第１のＩＴＲ、導入遺伝子を含む発現カセット、および第２のＩＴＲをこの順序でコードするプラスミドから得ることができる。発現カセットは、導入遺伝子の発現を可能にするおよび／または制御する１つ以上の調節配列を含み得、例えば、発現カセットは、エンハンサー／プロモーター、ＯＲＦレポーター（導入遺伝子）、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ）、ならびにポリアデニル化および終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ）のうちの１つ以上をこの順番で含み得る。
【０１４２】
発現カセットはまた、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）および／または２Ａエレメントを含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書において「調節スイッチ」と題するセクションに記載されている、導入遺伝子の発現を制御および調節するための調節スイッチを含み、所望される場合、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の制御された細胞死を可能にするキルスイッチである調節スイッチを含み得る。
【０１４３】
発現カセットは、４０００ヌクレオチド超、５０００ヌクレオチド、１０，０００ヌクレオチド、もしくは２０，０００ヌクレオチド、もしくは３０，０００ヌクレオチド、もしくは４０，０００ヌクレオチド、または５０，０００ヌクレオチド、または約４０００〜１０，０００ヌクレオチド、もしくは１０，０００〜５０，０００ヌクレオチドの間の任意の範囲、または５０，０００ヌクレオチド超を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜５０，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜７５，０００ヌクレオチド長の範囲の導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜１０，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１０００〜１０，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、５００〜５，０００ヌクレオチド長の範囲である導入遺伝子を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターは、カプシド化ＡＡＶベクターのサイズ制限を有さず、したがって、大サイズの発現カセットの送達が効率的な導入遺伝子をもたらすようにすることができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、原核細胞特異的メチル化を欠いている。
【０１４４】
ｃｅＤＮＡ発現カセットは、例えば、レシピエント対象において存在しない、不活性、もしくは不十分な活性であるタンパク質をコードする発現可能な外因性配列（例えば、オープンリーディングフレーム）もしくは導入遺伝子、または所望の生物学的もしくは治療的効果を有するタンパク質をコードする遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、欠陥遺伝子または転写産物の発現を訂正するように機能することができる遺伝子産物をコードすることができる。原則として、発現カセットは、突然変異のために減少もしくは欠如しているタンパク質、ポリペプチド、もしくはＲＮＡをコードする、または過剰発現が本開示の範囲内であるとみなされる場合に治療効果をもたらす任意の遺伝子を含み得る。
【０１４５】
発現カセットは、対象の疾患または障害を治療するために有用な任意の導入遺伝子を含み得る。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、ポリペプチドをコードする核酸、または非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲなど）、ならびに対象のゲノム中のウイルス配列、例えば、ＨＩＶウイルス配列などを含む外因性遺伝子およびヌクレオチド配列を含むがこれらに限定されない、任意の関心対象の遺伝子を対象に送達し、発現させることができる。好ましくは、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、治療目的（例えば、医療、診断、もしくは獣医学的使用）または免疫原性ポリペプチドに使用される。ある特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、またはＲＮＡ（コードまたは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせを含む、任意の関心対象の遺伝子を対象において発現させるのに有用である。
【０１４６】
発現カセットはまた、ポリペプチド、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＲＮＡ（コードもしくは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードし得る。発現カセットは、実験または診断の目的で使用されるレポータータンパク質をコードする外因性配列、例えばβ−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野において周知の他のものを含み得る。
【０１４７】
発現カセット、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの発現構築物で提供される配列は、標的宿主細胞に最適化されたコドンであり得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」または「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えばマウスまたはヒトの細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、または相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的には、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化およびカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０  Ｆｏｘ  Ｍｉｌｌ  Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ  ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）または別の公開データベースを使用して決定することができる。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、治療遺伝子である。いくつかの実施形態では、治療遺伝子は、抗体、または抗体断片、またはその抗原結合断片、例えば、中和抗体または抗体断片などである。
【０１４９】
特に、治療遺伝子は、例えば、疾患、機能不全、傷害、および／または障害のうちの１つ以上の症状の治療、予防、および／または改善における使用のための、タンパク質（複数可）、ポリペプチド（複数可）、ペプチド（複数可）、酵素（複数可）、抗体、抗原結合断片、ならびにその変異体および／または活性断片を含むが、これらに限定されない１種以上の治療剤（複数可）である。例示的な治療遺伝子は、本明細書において「治療の方法」と題されたセクションに記載されている。
【０１５０】
プラスミド系発現ベクターとは異なるｃｅＤＮＡベクターの多くの構造特徴が存在する。本明細書における合成方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、以下の特徴：元の（すなわち、挿入されていない）細菌ＤＮＡの欠失、原核細胞複製起源の欠失、自蔵である（すなわち、Ｒｅｐ結合および末端分解部位（ＲＢＳおよびＴＲＳ）を含む２つのＩＴＲ以外のいかなる配列も、ＩＴＲ間の外因性配列も必要としない）、真核起源（すなわち、それらは真核細胞中で産生される）のヘアピンを形成するＩＴＲ配列の存在、ならびに細菌型ＤＮＡメチル化、または実際に所与の細胞型における産生と関連し、哺乳動物宿主によって異常であるとみなされる任意の他のメチル化の非存在のうちの１つ以上を有し得る。一般に、本ベクターは、いかなる原核細胞ＤＮＡも含有しないことが好ましいが、いくつかの原核細胞ＤＮＡが、外因性配列として、非限定的な例としてプロモーターまたはエンハンサー領域に挿入されてもよいことが企図される。ｃｅＤＮＡベクターをプラスミド発現ベクターと区別する別の重要な特徴は、ｃｅＤＮＡベクターが、閉端を有する一本鎖直鎖状ＤＮＡであるが、プラスミドは、常に二本鎖ＤＮＡである。
【０１５１】
本明細書に提供される合成方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、好ましくは、制限酵素消化アッセイによって判定して、非連続的な構造ではなく直鎖状で連続的な構造を有する（図４Ｃ）。直鎖状で連続的な構造は、細胞エンドヌクレアーゼによる攻撃に対してより安定であると同時に、組み換えられて突然変異誘発を引き起こす可能性が低いと考えられる。したがって、直鎖状で連続的な構造のｃｅＤＮＡベクターは、好ましい実施形態である。連続的な直鎖状の一本鎖分子内二重鎖ｃｅＤＮＡベクターは、ＡＡＶカプシドタンパク質をコードする配列なしに、終端に共有結合している可能性がある。これらのｃｅＤＮＡベクターは、細菌起源の環状二重鎖核酸分子であるプラスミド（本明細書に記載されるｃｅＤＮＡプラスミドを含む）とは構造的に異なる。プラスミドの相補鎖は、変性に続いて分離されて２つの核酸分子を産生することができるが、反対に、ｃｅＤＮＡベクターは、相補鎖を有するが、単一ＤＮＡ分子であり、したがって変性された場合でも単一分子のままである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、プラスミドとは異なり、原核細胞タイプのＤＮＡ塩基メチル化なしに産生され得る。したがって、ｃｅＤＮＡベクターおよびｃｅＤＮＡ−プラスミドは、構造（特に、直鎖状対環状）およびこれらの異なる対象物（下記を参照）を産生および精製するために使用される方法の両方に関して、またｃｅＤＮＡ−プラスミドの場合は原核細胞タイプおよびｃｅＤＮＡベクターの場合は真核細胞タイプのものである、それらのＤＮＡメチル化に関して異なる。
【０１５２】
プラスミド系発現ベクターを超える本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを使用するいくつかの利点があり、そのような利点としては、次のことが挙げられるが、これらに限定されない。１）プラスミドは、細菌ＤＮＡ配列を含有し、原核細胞特異的メチル化、例えば、６−メチルアデノシンおよび５−メチルシトシンメチル化に供されるが、カプシド不含ＡＡＶベクター配列は、真核細胞起源であり、原核細胞特異的メチル化を受けず、結果として、カプシド不含ＡＡＶベクターは、プラスミドと比較して炎症および免疫反応を誘導する可能性が低い。２）プラスミドは、産生プロセス中に耐性遺伝子の存在を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは必要としない。３）環状プラスミドは、細胞への導入時に核に送達されず、細胞ヌクレアーゼによる分解をバイパスするために過負荷を必要とするが、ｃｅＤＮＡベクターは、ヌクレアーゼに対する耐性を付与するウイルスシスエレメント、すなわちＩＴＲを含有し、核に対して標的化され、送達されるように設計され得る。ＩＴＲ機能に不可欠な最小定義エレメントは、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０））および末端分解部位（ＴＲＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＡＧＴＴＧＧ−３’（配列番号６４））に加えて、ヘアピン形成を可能にする可変パリンドローム配列であると仮定する。４）ｃｅＤＮＡベクターは、報告によれば受容体のＴｏｌｌ様ファミリーのメンバーに結合し、Ｔ細胞媒介性免疫反応を誘起する原核細胞由来のプラスミドにおいてしばしば見出されるＣｐＧジヌクレオチドの過剰提示を有しない。対照的に、本明細書に開示されるカプシド不含ＡＡＶベクターでの形質導入は、様々な送達試薬を使用し、従来のＡＡＶビリオンで形質導入することが困難である細胞および組織型を効率的に標的とし得る。
【０１５３】
ＩＶ．ＩＴＲ
本明細書に開示されているように、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた導入遺伝子または異種核酸配列を含み、これらの用語が本明細書に定義されるように、ＩＴＲ配列は、非対称ＩＴＲ対または対称もしくは実質的に対称のＩＴＲ対であり得る。本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、（ｉ）少なくとも１つのＷＴ  ＩＴＲおよび少なくとも１つの修飾型ＡＡＶ逆位末端反復（ｍｏｄ−ＩＴＲ）（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、（ｉｉ）ｍｏｄ−ＩＴＲ対が互いに対して異なる３次元空間構成を有する、２つの修飾型ＩＴＲ（例えば、非対称の修飾型ＩＴＲ）、または（ｉｉｉ）各ＷＴ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称のＷＴ−ＷＴ  ＩＴＲ対、または（ｉｖ）各ｍｏｄ−ＩＴＲが同じ３次元空間構成を有する、対称もしくは実質的に対称の修飾型ＩＴＲ対のうちのいずれかから選択されるＩＴＲ配列を含み得、本開示の方法は、限定されないが、リポソームナノ粒子送達系などの送達系をさらに含み得る。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲ配列は、２つのサブファミリー：脊椎動物に感染するＰａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅおよび昆虫に感染するＤｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅを含む、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーのウイルスに由来し得る。Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｎａｅ亜科（パルボウイルスと称される）は、ディペンドウイルス族を含み、そのメンバーは、ほとんどの条件下で、増殖性感染のためにアデノウイルスまたはヘルペスウイルスなどのヘルパーウイルスとの共感染を必要とする。ディペンドウイルス族は、通常はヒト（例えば、血清型２、３Ａ、３Ｂ、５、および６）または霊長類（例えば、血清型１および４）に感染するアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、ならびに他の温血動物に感染する関連ウイルス（例えば、ウシ、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ関連ウイルス）を含む。パルボウイルスおよびＰａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅファミリーの他のメンバーは、Ｋｅｎｎｅｔｈ  Ｉ．Ｂｅｒｎｓ，″Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ：Ｔｈｅ  Ｖｉｒｕｓｅｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，″Ｃｈａｐｔｅｒ  ６９  ＦＩＥＬＤＳ  ＶＩＲＯＬＯＧＹ（３ｄ  Ｅｄ．１９９６）に一般に記載されている。
【０１５５】
ＩＴＲは、明細書において例証されており、本明細書における例は、ＡＡＶ２  ＷＴ−ＩＴＲであるが、当業者であれば、上述のように、任意の既知のパルボウイルス、例えば、ディペンドウイルス、例えばＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８ゲノムからのＩＴＲを使用できることを認識する。例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ００６２６０；ＮＣ００６２６１）、キメラＩＴＲ、または任意の合成ＡＡＶからのＩＴＲ。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、温血動物、例えば、鳥類（ＡＡＡＶ）、ウシ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、およびヒツジアデノ関連ウイルスに感染し得る。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、Ｂ１９パルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ０００８８３）、マウスからの微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）、ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１７０１）、ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）に由来する。いくつかの実施形態では、本明細書で論じられるように、５’ＷＴ−ＩＴＲは、１つの血清型に由来し、３’ＷＴ−ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。
【０１５６】
熟練者であれば、ＩＴＲ配列が、二本鎖ホリデイジャンクションの一般構造を有し、典型的には、Ｔ形またはＹ形ヘアピン構造であり（例えば、図２Ａおよび図３Ａを参照）、各ＷＴ−ＩＴＲが、より大きなパリンドロームアーム（Ａ−Ａ’）に埋め込まれた２つのパリンドロームアームまたはループ（Ｂ−Ｂ’およびＣ−Ｃ’）、ならびに一本鎖Ｄ配列によって形成される（これらのパリンドローム配列の順序は、ＩＴＲのフリップまたはフロップ配向を定義する）ことを知っている。例えば、異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜ＡＡＶ６）からのＩＴＲの構造分析および配列比較を参照されたい。Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６−４３９、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００５；３６４−３７９、Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １９９９；２６１；８−１４に記載されている。当業者は、本明細書に提供される例示的なＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に基づいて、ｃｅＤＮＡベクターまたはｃｅＤＮＡ−プラスミドで使用するための任意のＡＡＶ血清型からＷＴ−ＩＴＲ配列を容易に決定することができる。例えば、Ｇｒｉｍｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２００６；８０（１）；４２６−４３９に記載される異なるＡＡＶ血清型（ＡＡＶ１〜ＡＡＶ６、ならびにトリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）およびウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ））からのＩＴＲの配列比較を参照されたい。これは、他の血清型からの左ＩＴＲに対するＡＡＶ２の左ＩＴＲの同一性％を示す：ＡＡＶ−１（８４％）、ＡＡＶ−３（８６％）、ＡＡＶ−４（７９％）、ＡＡＶ−５（５８％）、ＡＡＶ−６（左ＩＴＲ）（１００％）、およびＡＡＶ−６（右ＩＴＲ）（８２％）。
【０１５７】
Ａ．対称ＩＴＲ対
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、５’から３’方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ  ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５’ＩＴＲ）および第２のＩＴＲ（３’ＩＴＲ）は、互いに対して対称または実質的に対称であり、すなわち、ｃｅＤＮＡベクターは、対称の３次元空間構成を有するＩＴＲ配列を含み得、それによりそれらの構造は、幾何学的空間で同じ形状であるか、または３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’、Ｂ−Ｂ’ループを有する。そのような実施形態では、対称のＩＴＲ対、または実質的に対称のＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲではない修飾型ＩＴＲ（例えば、ｍｏｄ−ＩＴＲ）であり得る。ｍｏｄ−ＩＴＲ対は、野生型ＩＴＲからの１つ以上の修飾を有し、互いに逆相補（逆位）である同じ配列を有し得る。代替実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応するまたは同じ対称の３次元形状を有し得る。
【０１５８】
（ｉ）野生型ＩＴＲ
いくつかの実施形態では、対称のＩＴＲ、または実質的に対称のＩＴＲは、本明細書に記載されるように野生型（ＷＴ−ＩＴＲ）である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ−ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のＷＴ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ−ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称的な３次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。
【０１５９】
したがって、本明細書で開示されるように、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの隣接する野生型逆位末端反復（ＷＴ−ＩＴＲ）配列の間に位置付けられた導入遺伝子または異種核酸配列を含み、互いに逆相補（逆位）であるか、または代替として互いに実質的に対称である。すなわち、ＷＴ−ＩＴＲ対は、対称の３次元空間構成を有する。いくつかの実施形態では、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＷＴ−ＩＴＲ）は、機能性Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ、例えば、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’、配列番号６０）および機能性末端分解部位（ＴＲＳ、例えば５’−ＡＧＴＴ−３’、配列番号６２）を含む。
【０１６０】
一態様では、ｃｅＤＮＡベクターは、２つのＷＴ逆位末端反復配列（ＷＴ−ＩＴＲ）（例えば、ＡＡＶ  ＷＴ−ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた異種核酸をコードするベクターポリヌクレオチドから取得可能である。すなわち、両方のＩＴＲが野生型配列を有するが、必ずしも同じＡＡＶ血清型のＷＴ−ＩＴＲである必要はない。すなわち、いくつかの実施形態では、一方のＷＴ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他方のＷＴ−ＩＴＲは、異なるＡＡＶ血清型に由来し得る。そのような実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、それらは、対称の３次元空間構成を維持しながら、１つ以上の保存的ヌクレオチド修飾を有することができる。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し、３’ＷＴ−ＩＴＲは、同じまたは異なるＡＡＶ血清型に由来する。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ−ＩＴＲは、互いの鏡像であり、すなわち、それらは対称である。いくつかの実施形態では、５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ−ＩＴＲは、同じＡＡＶ血清型に由来する。
【０１６１】
ＷＴ  ＩＴＲは周知である。一実施形態では、２つのＩＴＲは、同じＡＡＶ２血清型に由来する。ある特定の実施形態では、他の血清型からのＷＴを使用することができる。相同であるいくつかの血清型、例えば、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８がある。一実施形態では、密接に相同なＩＴＲ（例えば、類似のループ構造を有するＩＴＲ）を使用することができる。別の実施形態では、より多様なＡＡＶ  ＷＴ  ＩＴＲ、例えばＡＡＶ２およびＡＡＶ５を使用することができ、さらに別の実施形態では、実質的にＷＴであるＩＴＲを使用することができる、すなわち、それはＷＴの基本ループ構造を有するが、特性を変更しないかまたは影響しないいくつかの保存的ヌクレオチド変化を有する。同じウイルス血清型に由来するＷＴ−ＩＴＲを使用する場合、１つ以上の調節配列をさらに使用することができる。ある特定の実施形態では、調節配列は、ｃｅＤＮＡの活性の調整を可能にする調節スイッチである。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される技術の一態様は、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターに関し、ｃｅＤＮＡベクターは、２つの野生型逆位末端反復配列（ＷＴ−ＩＴＲ）の間に操作可能に位置付けられた少なくとも１つの異種ヌクレオチド配列を含み、ＷＴ−ＩＴＲは、同じ血清型、異なる血清型に由来し得るか、または互いに対して実質的に対称であり得る（すなわち、それらの構造が幾何学的空間で同じ形状であるように対称の３次元空間構成を有するか、または３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’ループを有する）。いくつかの実施形態では、対称ＷＴ−ＩＴＲは、機能性末端分解部位およびＲｅｐ結合部位を含む。いくつかの実施形態では、異種核酸配列は、導入遺伝子をコードし、ベクターは、ウイルスカプシドにはない。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲは同じであるが、互いの逆相補鎖である。例えば、５’ＩＴＲの配列ＡＡＣＧは、対応する部位の３’ＩＴＲのＣＧＴＴ（すなわち、逆相補鎖）であり得る。一実施例では、５’ＷＴ−ＩＴＲセンス鎖は、ＡＴＣＧＡＴＣＧの配列を含み、対応する３’ＷＴ−ＩＴＲセンス鎖は、
【化１】
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（すなわち、ＡＴＣＧＡＴＣＧの逆相補鎖）を含む。いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ  ｃｅＤＮＡは、末端分解部位および複製タンパク質結合部位（ＲＰＳ）（複製タンパク質結合部位と呼ばれることもある）、例えばＲｅｐ結合部位をさらに含む。
【０１６４】
ＷＴ−ＩＴＲを含むｃｅＤＮＡベクターで使用するための例示的なＷＴ−ＩＴＲ配列は、ＷＴ−ＩＴＲの対（５’ＷＴ−ＩＴＲおよび３’ＷＴ−ＩＴＲ）を示す本明細書の表２に示されている。
【０１６５】
例示的な実施例として、本開示は、調節スイッチの有無にかかわらず、導入遺伝子（例えば、遺伝子編集配列）に操作可能に連結されたプロモーターを含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを提供し、ｃｅＤＮＡはカプシドタンパク質を欠き、（ａ）ＷＴ−ＩＴＲをコードするｃｅＤＮＡ−プラスミド（例えば、図１Ｆ〜１Ｇを参照）から産生され、各ＷＴ−ＩＴＲは、そのヘアピン二次構成で同じ数の分子内二重化塩基対を有し（好ましくはこれらの参照配列と比較して、この構成のいかなるＡＡＡまたはＴＴＴ末端ループの欠失も除外する）、および（ｂ）実施例１の未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるｃｅＤＮＡの同定のためのアッセイを使用してｃｅＤＮＡとして同定される。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、隣接するＷＴ−ＩＴＲは、互いに実質的に対称である。この実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲが同一の逆相補鎖ではないように、５’ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶの１つの血清型に由来し、３’ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶの異なる血清型に由来し得る。例えば、５’ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、３’ＷＴ−ＩＴＲは、異なる血清型（例えば、ＡＡＶ１、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、および１２）に由来し得る。いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、または昆虫ＡＡＶのうちのいずれかから選択される２つの異なるパルボウイルスから選択され得る。いくつかの実施形態では、ＷＴ  ＩＴＲのそのような組み合わせは、ＡＡＶ２およびＡＡＶ６からのＷＴ−ＩＴＲの組み合わせである。一実施形態では、実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲは、一方が他方のＩＴＲに対して反転されたときに、少なくとも９０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％、およびその間のすべてのポイントであり、同じ対称の３次元空間構成を有する。いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ対は、それらが対称の３次元空間構成を有する、例えば、Ａ、Ｃ−Ｃ’、Ｂ−Ｂ’、およびＤアームの同じ３次元構成を有するため、実質的に対称である。一実施形態では、実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ対は、他方に対して反転され、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％、およびその間のすべてのポイントであり、一方のＷＴ−ＩＴＲは、５´−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３´（配列番号６０）のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する。いくつかの実施形態では、実質的に対称のＷＴ−ＩＴＲ対は、互いに対して反転され、少なくとも９５％同一、少なくとも９６％．．．９７％．．．９８％．．．９９％．．．９９．５％、およびその間のすべてのポイントであり、一方のＷＴ−ＩＴＲは、ヘアピン二次構造形成を可能にする可変パリンドローム配列に加えて、５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０）のＲｅｐ結合部位（ＲＢＳ）および末端分解部位（ｔｒｓ）を保持する。相同性は、ＢＬＡＳＴ（ベーシックローカルアラインメント検索ツール）、デフォルト設定のＢＬＡＳＴＮなど、当該技術分野で周知の標準的な手段によって決定することができる。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、ＩＴＲの構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質（例えば、Ｒｅｐ７８またはＲｅｐ６８）との機能的相互作用に関与する任意の構造エレメントであり得る。ある特定の実施形態では、構造エレメントは、ＩＴＲと大きなＲｅｐタンパク質との相互作用に対する選択性を提供する。すなわち、少なくとも部分的に、どのＲｅｐタンパク質がＩＴＲと機能的に相互作用するかを判定する。他の実施形態では、構造エレメントは、Ｒｅｐタンパク質がＩＴＲに結合されたとき、大きなＲｅｐタンパク質と物理的に相互作用する。各構造エレメントは、例えば、ＩＴＲの二次構造、ＩＴＲのヌクレオチド配列、２つ以上のエレメント間の空間、または上記のうちのいずれかの組み合わせであり得る。一実施形態では、構造エレメントは、ＡおよびＡ’アーム、ＢおよびＢ’アーム、ＣおよびＣ’アーム、Ｄアーム、Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＥ）およびＲＢＥ’（すなわち、相補的ＲＢＥ配列）、ならびに末端分解部位（ｔｒｓ）からなる群から選択される。
【０１６８】
単なる例として、表１は、ＷＴ−ＩＴＲの例示的な組み合わせを示す。
【０１６９】
表１：同じ血清型もしくは異なる血清型、または異なるパルボウイルスからのＷＴ−ＩＴＲの例示的な組み合わせ。示されている順序は、ＩＴＲ位置を示すものではなく、例えば、「ＡＡＶ１、ＡＡＶ２」は、ｃｅＤＮＡが５’位置にＷＴ−ＡＡＶ１  ＩＴＲおよび３’位置にＷＴ−ＡＡＶ２  ＩＴＲ、またはその逆、５’位置にＷＴ−ＡＡＶ２  ＩＴＲおよび３’位置にＷＴ−ＡＡＶ１  ＩＴＲを含み得ることを明示する。略語：ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型２（ＡＡＶ２）、ＡＡＶ血清型３（ＡＡＶ３）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、またはＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）；ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ、およびＡＡＶ−ＤＪ８ゲノム（例えば、ＮＣＢＩ：ＮＣ００２０７７；ＮＣ００１４０１；ＮＣ００１７２９；ＮＣ００１８２９；ＮＣ００６１５２；ＮＣ００６２６０；ＮＣ００６２６１）、温血動物のＩＴＲ（トリＡＡＶ（ＡＡＡＶ）、ウシＡＡＶ（ＢＡＡＶ）、イヌ、ウマ、およびヒツジＡＡＶ）、Ｂ１９パルボウイルスからのＩＴＲ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ０００８８３）、マウスからの微小ウイルス（ＭＶＭ）（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００１５１０）；ガチョウ：ガチョウパルボウイルス（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＮＣ００１７０１）；ヘビ：ヘビパルボウイルス１（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＣ００６１４８）。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【０１７０】
単なる例として、表２は、いくつかの異なるＡＡＶ血清型からの例示的なＷＴ−ＩＴＲの配列を示す。
【表２】
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【０１７１】
いくつかの実施形態では、ＷＴ−ＩＴＲ配列のヌクレオチド配列は、（例えば、１、２、３、４もしくは５個以上のヌクレオチドまたはその中の任意の範囲を修飾することにより）修飾され得、それにより修飾は、相補的ヌクレオチドの置換、例えば、Ｃの場合はＧ、およびその逆、Ａの場合はＴ、およびその逆である。
【０１７２】
本発明のある特定の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、配列番号１、２、５〜１４のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列からなるＷＴ−ＩＴＲを有しない。本発明の代替実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターが、配列番号１、２、５〜１４のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を含むＷＴ−ＩＴＲを有する場合、隣接するＩＴＲもＷＴであり、ｃｅＤＮＡは、例えば、本明細書および国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号に開示されているように、調節スイッチを含む（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の表１１を参照）。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示されるような調節スイッチ、および配列番号１、２、５〜１４からなる群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択されたＷＴ−ＩＴＲを含む。
【０１７３】
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、操作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、およびＲＢＥ’部分を保持するＷＴ−ＩＴＲ構造を含み得る。例示の目的で野生型ＩＴＲを使用する図２Ａおよび図２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構造部分内のｔｒｓ部位の操作のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ−結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０））および末端分解部位（ＴＲＳ、５’−ＡＧＴＴ（配列番号６２））を含む１つ以上の機能性ＷＴ−ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＷＴ−ＩＴＲは、機能的である。ｃｅＤＮＡベクターが互いに実質的に対称である２つのＷＴ−ＩＴＲを含む代替実施形態では、少なくとも１つのＷＴ−ＩＴＲが機能的であり、少なくとも１つのＷＴ−ＩＴＲが非機能的である。
【０１７４】
Ｂ．非対称ＩＴＲ対または対称ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターの一般的な修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ−ＩＴＲ）
本明細書で論じられるように、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、対称ＩＴＲ対または非対称ＩＴＲ対を含み得る。どちらの場合も、一方または両方のＩＴＲは修飾型ＩＴＲであり得、その違いは、第１の場合（すなわち、対称ｍｏｄ−ＩＴＲ）では、ｍｏｄ−ＩＴＲは、同じ３次元空間構成を有する（すなわち、同じＡ−Ａ’、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’アーム構成を有する）が、第２の場合（すなわち、非対称ｍｏｄ−ＩＴＲ）では、ｍｏｄ−ＩＴＲは、異なる３次元空間構成を有する（すなわち、Ａ−Ａ’、Ｃ−Ｃ’、およびＢ−Ｂ’アームの異なる構成を有する）ことである。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、野生型ＩＴＲ配列（例えば、ＡＡＶ  ＩＴＲ）と比較して、欠失、挿入、および／または置換によって修飾されるＩＴＲである。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲのうちの少なくとも１つは、機能性Ｒｅｐ結合部位（ＲＢＳ；例えば、ＡＡＶ２の場合は５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’、配列番号６０）および機能性末端分解部位（ＴＲＳ；例えば、５’−ＡＧＴＴ−３’、配列番号６２）を含む。一実施形態では、ＩＴＲのうちの少なくとも１つは、非機能性ＩＴＲである。一実施形態では、異なるまたは修飾型ＩＴＲは各々、異なる血清型からの野生型ＩＴＲではない。
【０１７６】
ＩＴＲの特定の変更および突然変異が本明細書において詳細に説明されているが、ＩＴＲの文脈では、「変更型」または「突然変異型」または「修飾型」とは、ヌクレオチドが野生型、参照、または元のＩＴＲ配列に対して挿入、欠失、および／または置換されたことを示す。変更型または突然変異型ＩＴＲは、操作されたＩＴＲであり得る。本明細書で使用される場合、「操作された」とは、人の手によって操作された態様を指す。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドの少なくとも１つの態様、例えば、その配列が、人の手によって操作され、それが天然に存在するときの態様とは異なるとき、「操作された」とみなされる。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、ｍｏｄ−ＩＴＲは、合成のものであり得る。一実施形態では、合成ＩＴＲは、２つ以上のＡＡＶ血清型からのＩＴＲ配列に基づく。別の実施形態では、合成ＩＴＲは、ＡＡＶ系配列を含まない。さらに別の実施形態では、合成ＩＴＲは、上記のＩＴＲ構造を保存するが、わずかなＡＡＶ源配列を有するか、または全く有しない。いくつかの態様では、合成ＩＴＲは、野生型Ｒｅｐまたは特定血清型のＲｅｐと選好的に相互作用し得るか、または場合によっては、野生型Ｒｅｐによって認識されず、突然変異型Ｒｅｐによってのみ認識される。
【０１７８】
熟練者であれば、既知の手段によって他の血清型における対応する配列を判定することができる。例えば、Ａ、Ａ’、Ｂ、Ｂ’、Ｃ、Ｃ’、またはＤ領域中に変化が存在するかどうかを判定し、別の血清型における対応する領域を判定する。ＢＬＡＳＴ（登録商標）（ベーシックローカルアライメント検索ツール）または他の相同性アラインメントプログラムをデフォルト状態で使用して、対応する配列を判定することができる。本発明は、異なるＡＡＶ血清型の組み合わせからｍｏｄ−ＩＴＲを含む集団および複数のｃｅＤＮＡベクターをさらに提供する。すなわち、１つのｍｏｄ−ＩＴＲは、１つのＡＡＶ血清型に由来し得、他のｍｏｄ−ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得る。理論に束縛されるものではないが、一実施形態では、１つのＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲ配列に由来し得るか、またはそれに基づき得、ｃｅＤＮＡベクターの他のＩＴＲは、ＡＡＶ血清型１（ＡＡＶ１）、ＡＡＶ血清型４（ＡＡＶ４）、ＡＡＶ血清型５（ＡＡＶ５）、ＡＡＶ血清型６（ＡＡＶ６）、ＡＡＶ血清型７（ＡＡＶ７）、ＡＡＶ血清型８（ＡＡＶ８）、ＡＡＶ血清型９（ＡＡＶ９）、ＡＡＶ血清型１０（ＡＡＶ１０）、ＡＡＶ血清型１１（ＡＡＶ１１）、またはＡＡＶ血清型１２（ＡＡＶ１２）の任意の１つ以上のＩＴＲ配列に由来し得るか、またはそれに基づき得る。
【０１７９】
任意のパルボウイルスＩＴＲを、ＩＴＲとして、または塩基ＩＴＲとして修飾に使用することができる。好ましくは、パルボウイルスは、ディペンドウイルスである。より好ましくは、ＡＡＶである。選択される血清型は、その血清型の組織向性に基づき得る。ＡＡＶ２は、広い組織向性を有し、ＡＡＶ１は、ニューロンおよび骨格筋を選好的に標的し、ＡＡＶ５は、ニューロン、網膜色素上皮、および光受容体を標的とする。ＡＡＶ６は、骨格筋および肺を選好的に標的とする。ＡＡＶ８は、肝臓、骨格筋、心臓、および膵臓組織を選好的に標的とする。ＡＡＶ９は、肝臓、骨格、および肺組織を選好的に標的とする。一実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲに基づく。
【０１８０】
より具体的には、構造エレメントが特定の大きなＲｅｐタンパク質と機能的に相互作用する能力は、構造エレメントを修飾することによって変更され得る。例えば、構造エレメントのヌクレオチド配列は、ＩＴＲの野生型配列と比較して修飾され得る。一実施形態では、ＩＴＲの構造エレメント（例えば、Ａアーム、Ａ’アーム、Ｂアーム、Ｂ’アーム、Ｃアーム、Ｃ’アーム、Ｄアーム、ＲＢＥ、ＲＢＥ’、およびｔｒｓ）を除去し、異なるパルボウイルスからの野生型構造エレメントと置き換えることができる。例えば、置換構造は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ヘビパルボウイルス（例えば、ロイヤルパイソンパルボウイルス）、ウシパルボウイルス、ヤギパルボウイルス、トリパルボウイルス、イヌパルボウイルス、ウマパルボウイルス、エビパルボウイルス、ブタパルボウイルス、または昆虫ＡＡＶからのものであり得る。例えば、ＩＴＲは、ＡＡＶ２  ＩＴＲであり得、ＡもしくはＡ’アームまたはＲＢＥは、ＡＡＶ５からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＩＴＲは、ＡＡＶ５  ＩＴＲであり得、ＣまたはＣ’アーム、ＲＢＥ、およびｔｒｓは、ＡＡＶ２からの構造エレメントと置き換えることができる。別の実施例では、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ５  ＩＴＲであり得、ＢおよびＢ’アームは、ＡＡＶ２  ＩＴＲ  ＢおよびＢ’アームで置き換えられる。
【０１８１】
単なる例として、表３は、修飾型ＩＴＲの領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの例示的な修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を示し、Ｘは、対応する野生型ＩＴＲに対するそのセクションにおける少なくとも１つの核酸の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を示す。いくつかの実施形態では、Ｃおよび／またはＣ’および／またはＢおよび／またはＢ’の領域のうちのいずれかにおける少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。例えば、修飾が、単一アームＩＴＲ（例えば、単一Ｃ−Ｃ’アーム、もしくは単一Ｂ−Ｂ’アーム）、または修飾型Ｃ−Ｂ’アームもしくはＣ’−Ｂアーム、または少なくとも１つの切断されたアーム（例えば、切断されたＣ−Ｃ’アームおよび／もしくは切断されたＢ−Ｂ’アーム）を有する２つのアームＩＴＲのうちのいずれかをもたらす場合、少なくとも単一アーム、または２つのアームＩＴＲのアーム（１つのアームは切断され得る）のうちの少なくとも１つは、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。いくつかの実施形態では、切断されたＣ−Ｃ’アームおよび／または切断されたＢ−Ｂ’アームは、末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を有する。
【表３】
2021511047.tif 000008
【０１８２】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される非対称ＩＴＲ対または対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対を含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターで使用するためのｍｏｄ−ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’とＣとの間、ＣとＣ’との間、Ｃ’とＢとの間、ＢとＢ’との間、およびＢ’とＡとの間から選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣもしくはＣ’またはＢもしくはＢ’領域中の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、依然としてステムループの末端ループを保存する。いくつかの実施形態では、ＣとＣ’との間および／またはＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ｔヌクレオチド（すなわち、ＴＴＴ）を保持する。代替実施形態では、ＣとＣ’との間および／またはＢとＢ’との間の少なくとも１つのヌクレオチドの任意の修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）は、少なくとも１つの末端ループに３つの連続Ａヌクレオチド（すなわち、ＡＡＡ）を保持する。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’、Ａ、および／またはＤから選択される領域のうちのいずれか１つ以上における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ領域における少なくとも１つの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）も含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＡおよび／またはＡ’領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のための修飾型ＩＴＲは、表３に示される修飾の組み合わせのうちのいずれか１つ、またＤ領域における少なくとも１つのヌクレオチドの修飾（例えば、欠失、挿入、および／または置換）を含み得る。
【０１８３】
一実施形態では、構造エレメントのヌクレオチド配列を修飾して（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲）、修飾型構造エレメントを産生することができる。一実施形態では、ＩＴＲに対する特定の修飾が本明細書に例示されているか（例えば、配列番号３、４、１５〜４７、１０１〜１１６、もしくは１６５〜１８７）、または２０１８年１２月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図７Ａ〜７Ｂに示されている（例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の配列番号９７〜９８、１０１〜１０３、１０５〜１０８、１１１〜１１２、１１７〜１３４、５４５〜５４）。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０以上のヌクレオチド、またはその中の任意の範囲を修飾することによって）修飾され得る。他の実施形態では、ＩＴＲは、配列番号３、４、１５〜４７、１０１〜１１６、もしくは１６５〜１８７の修飾型ＩＴＲのうちの１つ、あるいは配列番号３、４、１５〜４７、１０１〜１１６、もしくは１６５〜１８７の、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表２〜９（すなわち、配列番号１１０〜１１２、１１５〜１９０、２００〜４６８）に示されている、Ａ−Ａ’アームおよびＣ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’アームのＲＢＥ含有セクションと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し得る。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、例えば、特定アームの全部、例えば、Ａ−Ａ’アームの全部もしくは一部、またはＢ−Ｂ’アームの全部もしくは一部、またはＣ−Ｃ’アームの全部もしくは一部の除去または欠失、あるいはステム（例えば、単一アーム）をキャップする最終ループが依然として存在する限り、ループのステムを形成する１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去（例えば、２０１８年１２月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図７ＡのＩＴＲ−２１を参照）を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｂ−Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る（例えば、２０１８年１２月６日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２の図３ＢのＩＴＲ−１または図７ＡのＩＴＲ−４５を参照）。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去、およびＢ−Ｂ’アームからの１、２、３、４、５、６、７、８、９、またはそれ以上の塩基対の除去を含み得る。塩基対の除去の任意の組み合わせが想起され、例えば、Ｃ−Ｃ’アームにおける６つの塩基対、およびＢ−Ｂ’アームにおける２つの塩基対が除去され得る。例示的な実施例として、図３Ｂは、修飾型ＩＴＲが、少なくとも１つのアーム（例えば、Ｃ−Ｃ’）が切断される２つのアームを含むように、Ｃ部分およびＣ’部分の各々から欠失された少なくとも７つの塩基対、Ｃ領域とＣ’領域との間のループ中のヌクレオチドの置換、ならびにＢ領域およびＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を有する例示的な修飾型ＩＴＲを示す。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲはまた、Ｂ領域およびＢ’領域の各々からの少なくとも１つの塩基対の欠失を含み、それによりＢ−Ｂ’アームもＷＴ  ＩＴＲに対して切断される。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１〜５０（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０）ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して１〜３０ヌクレオチド欠失を有し得る。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、全長野生型ＩＴＲ配列に対して２〜２０ヌクレオチド欠失を有する。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲは、ＤＮＡ複製（例えば、Ｒｅｐタンパク質によるＲＢＥへの結合、もしくは末端分解部位でのニッキング）に干渉しないように、ＡまたはＡ’領域のＲＢＥ含有部分にいかなるヌクレオチド欠失も含まない。いくつかの実施形態では、本明細書における使用のために包含される修飾型ＩＴＲは、本明細書に記載されるＢ、Ｂ’、Ｃ、および／またはＣ領域に１つ以上の欠失を有する。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、対称ＩＴＲ対または非対称ＩＴＲ対を含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示されるような調節スイッチ、および配列番号３、４、１５〜４７、１０１〜１１６、または１６５〜１８７からなる群のうちのいずれかから選択されるヌクレオチド配列を有する選択された少なくとも１つの修飾型ＩＴＲを含む。
【０１８８】
別の実施形態では、構造エレメントの構造は、修飾され得る。例えば、構造エレメントは、ステムの高さおよび／またはループ内のヌクレオチドの数の変化。例えば、ステムの高さは、約２、３、４、５、６、７、８、もしくは９ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。一実施形態では、ステムの高さは約５ヌクレオチド〜約９ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用し得る。別の実施形態では、ステムの高さは、約７ヌクレオチドであり得、Ｒｅｐと機能的に相互作用し得る。別の例では、ループは３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲を有し得る。
【０１８９】
別の実施形態では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥ内のＧＡＧＹ結合部位またはＧＡＧＹ関連結合部位の数は、増加または減少され得る。一実施例では、ＲＢＥまたは伸長ＲＢＥは、１、２、３、４、５、もしくは６以上のＧＡＧＹ結合部位、またはその中の任意の範囲を含み得る。各ＧＡＧＹ結合部位は、独立して、配列がＲｅｐタンパク質に結合するのに十分である限り、正確なＧＡＧＹ配列またはＧＡＧＹと同様の配列であり得る。
【０１９０】
別の実施形態では、２つのエレメント（限定されないが、ＲＢＥおよびヘアピンなど）の間の空間を変更して（例えば、増加または減少）、大きなＲｅｐタンパク質との機能的相互作用を変更することができる。例えば、空間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、もしくは２１ヌクレオチド以上、またはその中の任意の範囲であり得る。
【０１９１】
本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に開示される野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲ構造に関して修飾されるＩＴＲ構造を含み得るが、依然として操作可能なＲＢＥ、ｔｒｓ、およびＲＢＥ’部分を保持する。図２Ａおよび図２Ｂは、ｃｅＤＮＡベクターの野生型ＩＴＲ構部分内のｔｒｓ部位の操作のための１つの可能な機序を示す。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、Ｒｅｐ−結合部位（ＲＢＳ、ＡＡＶ２の場合５’−ＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０））および末端分解部位（ＴＲＳ、５’−ＡＧＴＴ（配列番号６２））を含む１つ以上の機能的ＩＴＲポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＩＴＲ（野生型または修飾型ＩＴＲ）は、機能的である。ｃｅＤＮＡベクターが、互いに異なるか、または非対称である２つの修飾型ＩＴＲを含む代替実施形態では、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、機能的であり、少なくとも１つの修飾型ＩＴＲは、非機能的である。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、本明細書に提供されるように、配列番号５００〜５２９からなる、または本質的にそれからなる任意の配列から選択される修飾型ＩＴＲを有しない。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、配列番号５００〜５２９から選択される任意の配列から選択されるＩＴＲを有しない。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの修飾型ＩＴＲ（例えば、左または右ＩＴＲ）は、ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内に修飾を有する。ループアーム、切断アーム、またはスペーサー内に修飾を有するＩＴＲの例示的な配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表２（すなわち、配列番号１３５〜１９０、２００〜２３３）；表３（例えば、配列番号２３４〜２６３）；表４（例えば、配列番号２６４〜２９３）；表５（例えば、本明細書の配列番号２９４〜３１８）；表６（例えば、配列番号３１９〜４６８）；および表７〜９（例えば、配列番号１０１〜１１０、１１１〜１１２、１１５〜１３４）または表１０Ａもしくは１０Ｂ（例えば、配列番号９、１００、４６９〜４８３、４８４〜４９９）に列挙されている。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対または対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対を含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターにおける使用のための修飾型ＩＴＲは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号の表２、３、４、５、６、７、８、９、および１０Ａ〜１０Ｂに示されるもののうちのいずれか、またはそれらの組み合わせから選択される。
【０１９５】
上記のクラスの各々に非対称ＩＴＲ対または対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対を含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターで使用するための追加の例示的な修飾型ＩＴＲを表４Ａおよび４Ｂに示す。表４Ａの右修飾型ＩＴＲの予測二次構造は、２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図７Ａに示され、表４Ｂの左修飾型ＩＴＲの予測二次構造は、２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号（その全体が本明細書に組み込まれる）の図７Ｂに示される。
【０１９６】
表４Ａおよび表４Ｂは、例示的な右および左修飾型ＩＴＲを示す。
【０１９７】
表４Ａ：例示的な修飾型右ＩＴＲこれらの例示的な修飾型右ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０）、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ（配列番号６９）、スペーサー補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号７０）、およびＲＢＥ’（すなわち、ＲＢＥに対する補体）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ（配列番号７１）を含み得る。
【表４Ａ】
2021511047.tif 000009
【０１９８】
表４Ｂ：例示的な修飾型左ＩＴＲこれらの例示的な修飾型左ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０）、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ（配列番号６９）、スペーサー補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号７０）、およびＲＢＥ補体（ＲＢＥ’）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ（配列番号７１）を含み得る。
【表４Ｂ】
2021511047.tif 000010
【０１９９】
一実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、５´から３´方向に、第１のアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）逆位末端反復（ＩＴＲ）、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、本明細書に記載される発現カセット）、および第２のＡＡＶ  ＩＴＲを含み、第１のＩＴＲ（５´ＩＴＲ）および第２のＩＴＲ（３´ＩＴＲ）は、互いに非対称である。すなわち、それらは互いに異なる３次元空間構成を有する。例示的な実施形態として、第１のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、突然変異型または修飾型ＩＴＲであり得るか、またはその逆であり、第１のＩＴＲは、突然変異型または修飾型ＩＴＲであり得、第２のＩＴＲは、野生型ＩＴＲであり得る。いくつかの実施形態では、第１のＩＴＲおよび第２のＩＴＲは、両方ともｍｏｄ−ＩＴＲであるが、異なる配列を有するか、または異なる修飾を有し、したがって同じ修飾型ＩＴＲではなく、異なる３次元空間構成を有する。言い換えると、非対称ＩＴＲを用いたｃｅＤＮＡベクターは、ＷＴ−ＩＴＲに対する１つのＩＴＲのいかなる変更も他のＩＴＲに反映されないＩＴＲを含むか、あるいは非対称ＩＴＲが修飾された非対称ＩＴＲ対を有する場合は、互いに対して異なる配列および異なる３次元形状を有し得る。ｃｅＤＮＡベクター中の、ｃｅＤＮＡ−プラスミドを生成するために使用するための例示的な非対称ＩＴＲは、表４Ａおよび４Ｂに示されている。
【０２００】
代替実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、２つの対称的なｍｏｄ−ＩＴＲを含む。すなわち、両方のＩＴＲは、同じ配列を有するが、互いの逆相補鎖（逆位）である。いくつかの実施形態では、対称ｍｏｄ−ＩＴＲ対は、同じＡＡＶ血清型からの野生型ＩＴＲ配列と比較して、欠失、挿入、または置換の少なくとも１つまたは任意の組み合わせを含む。対称ＩＴＲの付加、欠失、または置換は同じであるが、互いの逆相補鎖である。例えば、５’ＩＴＲのＣ領域への３ヌクレオチドの挿入は、３’ＩＴＲのＣ’領域の対応するセクションへの３つの逆相補ヌクレオチドの挿入に反映される。単に説明の目的でのみ、付加が５’ＩＴＲのＡＡＣＧである場合、付加は、対応する部位における３’ＩＴＲのＣＧＴＴである。例えば、５’ＩＴＲセンス鎖が
【化２】
2021511047.tif 000011
であり、ＧとＡとの間に
【化３】
2021511047.tif 000012
の付加を伴い、配列
【化４】
2021511047.tif 000013
をもたらす場合。対応する３’ＩＴＲセンス鎖は、
【化５】
2021511047.tif 000014
であり、ＴとＣとの間に
【化６】
2021511047.tif 000015
（すなわち、ＡＡＣＧの逆相補鎖）の付加を伴い、配列
【化７】
2021511047.tif 000016
をもたらす。
【０２０１】
代替実施形態では、修飾型ＩＴＲ対は、本明細書で定義されるように実質的に対称であり、すなわち、修飾型ＩＴＲ対は、異なる配列を有し得るが、対応するまたは同じ対称の３次元形状を有し得る。例えば、１つの修飾型ＩＴＲは、１つの血清型に由来し得、他の修飾型ＩＴＲは、異なる血清型に由来し得るが、それらは同じ領域において同じ突然変異（例えば、ヌクレオチド挿入、欠失、または置換）を有する。言い換えると、単なる説明の目的で、５’ｍｏｄ−ＩＴＲは、ＡＡＶ２に由来し得、Ｃ領域に欠失を有し、３’ｍｏｄ−ＩＴＲは、ＡＡＶ５に由来し得、Ｃ’領域に対応する欠失を有する。５’ｍｏｄ−ＩＴＲおよび３’ｍｏｄ−ＩＴＲが同じまたは対称の３次元空間構成を有することを条件として、それらは本明細書における修飾型ＩＴＲ対としての使用に包含される。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対は、３次元空間で同じＡ、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループを有する。例えば、実質的に対称のｍｏｄ−ＩＴＲ対の修飾型ＩＴＲがＣ−Ｃ’アームの欠失を有する場合、同族のｍｏｄ−ＩＴＲは、Ｃ−Ｃ’ループの対応する欠失を有し、またその同族のｍｏｄ−ＩＴＲの幾何学的空間に同じ形状の残りのＡおよびＢ−Ｂ’ループの同様の３次元構造を有する。単なる例として、実質的に対称のＩＴＲは、それらの構造が幾何学的空間において同じ形状であるように、対称空間構成を有し得る。これは、例えば、Ｇ−Ｃ対が、例えばＣ−Ｇ対に、もしくはその逆に修飾されたとき、またはＡ−Ｔ対がＴ−Ａ対に、もしくはその逆に修飾されたときに起こり得る。したがって、
【化８】
2021511047.tif 000017
としての修飾型５’ＩＴＲ、および
【化９】
2021511047.tif 000018
としての修飾型３’ＩＴＲ（すなわち、
【化１０】
2021511047.tif 000019
）
の上記の例示的な実施例を使用し、例えば、５’ＩＴＲが
【化１１】
2021511047.tif 000020
を有していた場合（付加部のＧは、Ｃに修飾される）、これらの修飾型ＩＴＲは、依然として対称であり、実質的に対称の３’ＩＴＲは、付加部のＴを対応するａに修飾することなく、
【化１２】
2021511047.tif 000021
を有する。いくつかの実施形態では、修飾型ＩＴＲ対が対称立体化学を有するため、そのような修飾型ＩＴＲは、実質的に対称である。
【０２０３】
表５は、例示的な対称修飾型ＩＴＲ対（すなわち、左修飾型ＩＴＲおよび対称右修飾型ＩＴＲ）を示す。配列の太字（赤）部分は、図３１Ａ〜４６Ｂにも示されている部分的なＩＴＲ配列（すなわち、Ａ−Ａ’、Ｃ−Ｃ’およびＢ−Ｂ’ループの配列）を識別する。これらの例示的な修飾型ＩＴＲは、ＲＢＥであるＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣ−３’（配列番号６０）、スペーサーであるＡＣＴＧＡＧＧＣ（配列番号６９）、スペーサー補体ＧＣＣＴＣＡＧＴ（配列番号７０）、およびＲＢＥ’（すなわち、ＲＢＥに対する補体）であるＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣ（配列番号７１）を含み得る。
【表５−１】
2021511047.tif 000022
【表５−２】
2021511047.tif 000023
【表５−３】
2021511047.tif 000024
【０２０４】
いくつかの実施形態では、非対称ＩＴＲ対を含むｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の表４Ａ〜４Ｂのいずれか１つ以上に示されるＩＴＲ配列もしくはＩＴＲ部分配列、あるいは２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号（その全体が本明細書に組み込まれる）の図７Ａもしくは７Ｂに示されているか、または２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）の表２、３、４、５、６、７、８、９、もしくは１０Ａ〜１０Ｂに開示されている配列における修飾のうちのいずれかに対応する修飾を有するＩＴＲを含み得る。
【０２０５】
Ｖ．例示的なｃｅＤＮＡベクター
上記のように、本開示は、合成的に産生された組み換えｃｅＤＮＡ発現ベクター、および上記の非対称のＩＴＲ対、対称のＩＴＲ対、または実質的に対称のＩＴＲ対のうちのいずれか１つを含む導入遺伝子をコードするｃｅＤＮＡベクターに関する。ある特定の実施形態では、本開示は、隣接するＩＴＲ配列および導入遺伝子を有する合成的に産生された組み換えｃｅＤＮＡベクターに関し、ＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、または実質的に対称であり、ｃｅＤＮＡは、隣接するＩＴＲの間に位置する関心対象のヌクレオチド配列（例えば、導入遺伝子の核酸を含む発現カセット）をさらに含み、当該核酸分子は、ウイルスカプシドタンパク質コード配列を欠いている。
【０２０６】
合成的に産生されたｃｅＤＮＡ発現ベクターは、少なくとも１つのＩＴＲが変更されている場合、本明細書に記載されるヌクレオチド配列（複数可）を含む組み換えＤＮＡ手順に都合よく供することができる任意のｃｅＤＮＡベクターであってよい。本開示の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターが導入される宿主細胞と適合性がある。ある特定の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、直鎖状であってもよい。ある特定の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、染色体外実体として存在し得る。ある特定の実施形態では、本開示の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、宿主細胞のゲノムへのドナー配列の組み込みを可能にするエレメント（複数可）を含み得る。本明細書で使用される場合、「導入遺伝子」および「異種ヌクレオチド配列」は同義である。
【０２０７】
ここで図１Ａ〜１Ｇを参照すると、本開示のｃｅＤＮＡベクターを合成的に産生するのに有用な２つの非限定的プラスミドの機能的構成成分の概略図が示されている。図１Ａ、１Ｂ、１Ｄ、１Ｆは、ｃｅＤＮＡベクターの構築物またはｃｅＤＮＡプラスミドの対応する配列を示し、ここで、第１および第２のＩＴＲ配列は、本明細書で定義されるように、互いに対して非対称、対称、または実質的に対称である。いくつかの実施形態では、発現可能な導入遺伝子カセットは、必要に応じて、エンハンサー／プロモーター、１つ以上の相同性アーム、ドナー配列、転写後調節エレメント（例えば、ＷＰＲＥ、例えば、配列番号６７））、ならびにポリアデニル化および終結シグナル（例えば、ＢＧＨポリＡ、例えば、配列番号６８）を含む。
【０２０８】
図５は、本明細書および実施例に記載されるような合成プロセスを使用して産生されるｃｅＤＮＡベクターの産生を確認するゲルである。ｃｅＤＮＡベクターの生成は、上記の図４Ｂに関して、および実施例で論じられるように、ゲル中の特徴的なバンドパターンによって確認される。
【０２０９】
Ａ．調節エレメント
本明細書に記載され、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、本明細書で定義される非対称のＩＴＲ対または対称のＩＴＲ対を含み得、シス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含み得る。シス調節エレメントとしては、プロモーター、リボスイッチ、インスレーター、ｍｉｒ調節エレメント、転写後調節エレメント、組織および細胞型特異的プロモーター、ならびにエンハンサーが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＩＴＲは、導入遺伝子のプロモーターとして作用し得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を調節するための追加の構成成分、例えば、本明細書に記載される調節スイッチを含み、導入遺伝子、またはｃｅＤＮＡベクターを含む細胞を殺傷し得るキルスイッチの発現を調節する。本発明で使用され得る調節スイッチを含む調節エレメントは、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）においてより完全に論じられている。
【０２１０】
実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、調節配列、およびヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子調節配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている。ある特定の実施形態では、調節配列は、宿主細胞におけるヌクレアーゼの発現を制御するのに適している。ある特定の実施形態では、調節配列は、本開示のヌクレアーゼ（複数可）をコードするヌクレオチド配列などのプロモーター配列に操作可能に連結された遺伝子の転写を指示することができる、好適なプロモーター配列を含む。ある特定の実施形態では、第２のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の５’末端に連結されたイントロン配列を含む。ある特定の実施形態では、エンハンサー配列がプロモーターの上流に提供されて、プロモーターの効力を増大させる。ある特定の実施形態では、調節配列は、エンハンサーおよびプロモーターを含み、第２のヌクレオチド配列は、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列の上流のイントロン配列を含み、イントロンは、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位（複数可）を含み、プロモーターは、ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結されている。
【０２１１】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号６７）およびＢＧＨポリＡ（配列番号６８）などのシス調節エレメントの特定の組み合わせをさらに含み得る。発現構築物における使用のための好適な発現カセットは、ウイルスカプシドによって課されるパッケージング制約によって制限されない。
【０２１２】
（ｉ）．プロモーター：
当業者は、本発明の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターで使用されるプロモーターが、それらが促進する特定の配列に対して適切に調整されるべきであることを理解するであろう。例えば、ガイドＲＮＡは、その機能が、未変性ＤＮＡ上の特定の標的配列と二重鎖を形成して組み換え事象を発生させるため、プロモーターを全く必要としない場合がある。対照的に、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされるヌクレアーゼは、プロモーターから恩恵を受けるため、ベクターから効率的に、かつ任意に調節可能な方法で発現させることができる。
【０２１３】
本発明の発現カセットは、全体発現レベルとともに細胞特異性に影響を及ぼし得るプロモーターを含む。導入遺伝子発現の場合、それらは、非常に活発なウイルス由来の最初期プロモーターを含み得る。発現カセットは、導入遺伝子発現を特定の細胞型に制限し、無秩序な異所性発現から生じる毒性効果および免疫反応を低減するために組織特異的真核細胞プロモーターを含有し得る。好ましい実施形態では、発現カセットは、ＣＡＧプロモーター（配列番号７２）などの合成調節エレメントを含有し得る。ＣＡＧプロモーターは、（ｉ）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）早期エンハンサーエレメント、（ｉｉ）プロモーター、ニワトリβ−アクチン遺伝子の第１のエクソンおよび第１のイントロン、ならびに（ｉｉｉ）ウサギβ−グロブリン遺伝子のスプライスアクセプターを含む。代替として、発現カセットは、α−１−抗トリプシン（ＡＡＴ）プロモーター（配列番号７３もしくは配列番号７４）、肝臓特異的（ＬＰ１）プロモーター（配列番号７５もしくは配列番号７６）、またはヒト伸長因子−１α（ＥＦ１ａ）プロモーター（例えば、配列番号７７もしくは配列番号７８）を含有し得る。いくつかの実施形態では、発現カセットは、１つ以上の構成的プロモーター、例えば、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを有する）、またはサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）最初期プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを有する、例えば、配列番号７９）を含む。代替として、誘導性プロモーター、導入遺伝子の未変性プロモーター、組織特異的プロモーター、または当該技術分野において既知の様々なプロモーターを使用することができる。
【０２１４】
上記のものを含む好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得るため、ウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは、原核生物または真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス長末端配列（ＬＴＲ）プロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６、例えば、配列番号８０）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，４９７−５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｓｅｐ．１；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）（例えば、配列番号８１または配列番号１５５）、ＣＡＧプロモーター、ヒトα１−抗チプシン（ＨＡＡＴ）プロモーター（例えば、配列番号８２）などが挙げられるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、これらのプロモーターは、それらの下流イントロン含有端で変更され、１つ以上のヌクレアーゼ切断部位を含む。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位（複数可）を含有するＤＮＡは、プロモーターＤＮＡに対して外来である。
【０２１５】
一実施形態では、使用されるプロモーターは、治療用タンパク質をコードする遺伝子の未変性プロモーターである。治療用タンパク質をコードするそれぞれの遺伝子のプロモーターおよび他の調節配列は既知であり、特徴付けられている。使用されるプロモーター領域は、１つ以上の追加の調節配列（例えば、未変性）、例えば、エンハンサー（例えば、配列番号７９および配列番号８３）をさらに含み得る。
【０２１６】
本発明に従う使用のための好適なプロモーターの非限定的な例としては、例えば、ＣＡＧプロモーター（配列番号７２）、ＨＡＡＴプロモーター（配列番号８２）、ヒトＥＦ１−αプロモーター（配列番号７７）、またはＥＦ１ａプロモーター（配列番号７８）、ＩＥ２プロモーター（例えば、配列番号８４）、およびラットＥＦ１−αプロモーター（配列番号８５）、または１Ｅ１プロモーター断片（配列番号１２５）が挙げられる。
【０２１７】
（ｉｉ）．ポリアデニル化配列：
ポリアデニル化配列をコードする配列は、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターから発現されたｍＲＮＡを安定化するため、および核輸送および翻訳を助けるために、ｃｅＤＮＡベクター中に含まれ得る。一実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、ポリアデニル化配列を含まない。他の実施形態では、ベクターは、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも１５、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも４５、少なくとも５０、またはそれ以上のアデニンジヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化配列は、約４３ヌクレオチド、約４０〜５０ヌクレオチド、約４０〜５５ヌクレオチド、約４５〜５０ヌクレオチド、約３５〜５０ヌクレオチド、またはその間の任意の範囲を含む。
【０２１８】
発現カセットは、当該技術分野において既知のポリアデニル化配列またはその変形、例えば、ウシＢＧＨｐＡ（例えば、配列番号６８）もしくはウイルスＳＶ４０ｐＡ（例えば、配列番号８６）から単離された天然に存在する配列、または合成配列（例えば、配列番号８７）を含み得る。いくつかの発現カセットはまた、ＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ＵＳＥは、ＳＶ４０ｐＡまたは異種ポリＡシグナルと組み合わせて使用され得る。
【０２１９】
発現カセットはまた、導入遺伝子の発現を増加させるために、転写後エレメントを含み得る。いくつかの実施形態では、ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＰ）転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）（例えば、配列番号６７）を使用して、導入遺伝子の発現を増加させる。他の転写後処理エレメント、例えば、単純ヘルペスウイルスまたはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のチミジンキナーゼ遺伝子からの転写後エレメントを使用することができる。分泌配列は、導入遺伝子、例えば、ＶＨ−０２およびＶＫ−Ａ２６配列、例えば、配列番号８８および配列番号８９に連結され得る。
【０２２０】
（ｉｉｉ）．核局在化配列
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼをコードするベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＮＬＳを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のＮＬＳは、アミノ末端またはその近く、カルボキシ末端またはその近く、またはこれらの組み合わせ（例えば、アミノ末端における１つ以上のＮＬＳおよび／またはカルボキシ末端における１つ以上のＮＬＳ）に位置する。複数のＮＬＳが存在する場合、各々を他のＮＬＳから独立して選択することができ、それにより、単一のＮＬＳが複数のコピーに、および／または１つ以上のコピーに存在する１つ以上の他のＮＬＳと組み合わせて存在する。ＮＬＳの非限定的な例を表６に示す。
【表６】
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【０２２１】
Ｅ．ｃｅＤＮＡベクターの追加の構成成分
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子発現のための他の構成成分をコードするヌクレオチドを含み得る。例えば、特定の遺伝子標的事象を選択するには、保護ｓｈＲＮＡをマイクロＲＮＡに埋め込み、アルブミン遺伝子座などの高活性遺伝子座に部位特異的に統合するように設計された組み換えｃｅＤＮＡベクターに挿入することができる。そのような実施形態は、Ｎｙｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｏ  ｓｅｌｅｃｔ  ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｊｕｎｅ  ８，２０１６に記載されているような任意の遺伝的背景における遺伝子修飾肝細胞のインビボ選択および拡大のための系を提供し得る。本開示のｃｅＤＮＡベクターは、形質転換、トランスフェクト、形質導入などされた細胞の選択を可能にする１つ以上の選択可能なマーカーを含み得る。選択可能なマーカーは、その産生物が殺生物剤またはウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求性に対する原栄養性、ＮｅｏＲなどを提供する遺伝子である。ある特定の実施形態では、正の選択マーカーが、ＮｅｏＲなどのドナー配列に組み込まれる。負の選択マーカーは、ドナー配列の下流に組み込むことができ、例えば、負の選択マーカーをコードする核酸配列ＨＳＶ−ｔｋを、ドナー配列の下流の核酸構築物に組み込むことができる。
【０２２２】
実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されているように遺伝子編集に使用することができ、５´相同性アーム、３´相同性アーム、ポリアデニル化部位上流、および５´相同性アームに近接のうちの１つ以上を含み得る。例示的な相同性アームは、５´および３´アルブミン相同性アーム（配列番号１５１および１５２）またはＣＣＲ５  ５´および３´相同性アーム（例えば、配列番号１５３、１５４）である。
【０２２３】
Ｆ．調節スイッチ
分子調節スイッチは、シグナルに反応して、状態の測定可能な変化を生成するものである。そのような調節スイッチは、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターと有用に組み合わせて、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現の出力を制御することができる。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を微調整するのに役立つ調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的封じ込め機能として役立ち得る。いくつかの実施形態では、スイッチは、ｃｅＤＮＡベクターにおける関心対象の遺伝子の、制御可能かつ調節可能な発現を開始または停止（すなわち、シャットダウン）するように設計された「オン／オフ」スイッチである。いくつかの実施形態では、スイッチは、一旦スイッチが起動されると、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞がプログラム細胞死を受けるよう指示することができる「キルスイッチ」を含み得る。ｃｅＤＮＡベクターでの使用に含まれる例示的な調節スイッチは、導入遺伝子の発現を調節するために使用することができ、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）においてより完全に論じられている。
【０２２４】
（ｉ）バイナリ調節スイッチ
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子の発現を制御可能に調整するのに役立ち得る調節スイッチを含む。例えば、ｃｅＤＮＡベクターのＩＴＲの間に位置する発現カセットは、追加として、関心対象の遺伝子に操作可能に連結された調節領域、例えば、プロモーター、シスエレメント、リプレッサー、エンハンサーなどを含み得、この調節領域は、１つ以上の共因子または外因性薬剤によって調節される。単なる例として、調節領域は、小分子スイッチまたは誘導性もしくは抑制性プロモーターによって調節され得る。誘導性プロモーターの非限定的な例は、ホルモン誘導性または金属誘導性プロモーターである。他の例示的な誘導性プロモーター／エンハンサーエレメントとしては、ＲＵ４８６誘導性プロモーター、エクジソン誘導性プロモーター、ラパマイシン誘導性プロモーター、およびメタロチオネインプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２５】
（ｉｉ）小分子調節スイッチ
様々な当該技術分野において既知の小分子系調節スイッチは、当該技術分野において既知であり、本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターと組み合わせて、調節スイッチによって制御されるｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、直交リガンド／核受容体対、例えば、レチノイド受容体変異形／ＬＧ３３５およびＧＲＱＣＩＭＦＩ（Ｔａｙｌｏｒ，ｅｔ  ａｌ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０（２０１０）：１５に開示されているものなどの、操作可能に連結された導入遺伝子の発現を制御する人工プロモーターとともに）；操作されたステロイド受容体、例えば、プロゲステロンに結合することはできないが、ＲＵ４８６（ミフェプリストン）には結合するＣ末端切断を有する修飾型プロゲステロン受容体（米国特許第５，３６４，７９１号）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａからのエクジソン受容体およびそれらのエクジステロイドリガンド（Ｓａｅｚ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，９７（２６）（２０００），１４５１２−１４５１７）、またはＳａｎｄｏ  Ｒ  ３ｒｄ；Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３，１０（１１）：１０８５−８に開示される抗生物質トリメトプリム（ＴＭＰ）によって制御されるスイッチのうちのいずれか１つまたは組み合わせから選択され得る。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、米国特許第８，７７１，６７９号および同第６，３３９，０７０号に開示されているものなどのプロドラッグ活性化スイッチである。
【０２２６】
（ｉｉｉ）「パスコード」調節スイッチ
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、「パスコードスイッチ」または「パスコード回路」であり得る。パスコードスイッチは、特定の条件が起こったときに、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現の制御の微調整を可能にする。すなわち、導入遺伝子の発現および／または抑制が起こるためには、条件の組み合わせが存在する必要がある。例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも条件ＡおよびＢが起こらなければならない。パスコード調節スイッチは、任意の数の条件であり得、例えば、導入遺伝子の発現が起こるためには、少なくとも２、または少なくとも３、または少なくとも４、または少なくとも５、または少なくとも６、または少なくとも７、またはそれ以上の条件が存在する。いくつかの実施形態では、少なくとも２つの条件（例えば、Ａ、Ｂ条件）が起こる必要があり、いくつかの実施形態では、少なくとも３つの条件が起こる必要がある（例えば、Ａ、Ｂ、およびＣまたはＡ、Ｂ、およびＤ）。単なる例として、パスコード「ＡＢＣ」調節スイッチを有するｃｅＤＮＡからの遺伝子発現が起こるためには、条件Ａ、Ｂ、およびＣが存在しなければならない。条件Ａ、Ｂ、およびＣは、以下のとおりであり得る。条件Ａは、病態または疾患の存在であり、条件Ｂは、ホルモン反応であり、条件Ｃは、導入遺伝子の発現に対する反応である。例えば、導入遺伝子が欠陥ＥＰＯ遺伝子を編集する場合、条件Ａは、慢性腎疾患（ＣＫＤ）の存在であり、条件Ｂは、対象が腎臓中に低酸素状態を有する場合に起こり、条件Ｃは、腎臓中のエリスロポエチン産生細胞（ＥＰＣ）動員が不全であるか、または代替としてＨＩＦ−２活性化が不全である。一旦酸素レベルが増加するか、または所望のＥＰＯレベルに達すると、導入遺伝子は、３つの条件が起こるまで再度オフになり、オンに戻る。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターにおける使用のために包含されるパスコード調節スイッチまたは「パスコード回路」は、生物学的封じ込め条件を定義するために使用される環境シグナルの範囲および複雑性を拡張するために、ハイブリッド転写因子（ＴＦ）を含む。既定条件の存在下で細胞死をトリガーするデッドマンスイッチとは対照的に、「パスコード回路」は、特定の「パスコード」の存在下での細胞生存または導入遺伝子発現を可能にし、所定の環境条件またはパスコードが存在する場合にのみ導入遺伝子発現および／または細胞生存を可能にするように容易に再プログラムされ得る。
【０２２８】
本明細書に開示される調節スイッチ、例えば、小分子スイッチ、核酸系スイッチ、小分子−核酸ハイブリッドスイッチ、転写後導入遺伝子調節スイッチ、翻訳後調節放射線制御スイッチ、低酸素媒介性スイッチ、および本明細書に開示される当業者に既知の他の調節スイッチのうちのいずれかおよびすべての組み合わせを、本明細書に開示されるパスコード調節スイッチにおいて使用することができる。使用のために包含される調節スイッチはまた、レビュー論文Ｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｒ  Ｓｏｃ  Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ．１２：２０１４１０００（２０１５）において考察され、Ｋｉｓの表１に要約されている。いくつかの実施形態では、パスコード系における使用のための調節スイッチは、表１１のスイッチのうちのいずれか、またはそれらの組み合わせから選択され得る。
【０２２９】
（ｉｖ）．導入遺伝子発現を制御するための核酸系調節スイッチ
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによって発現された導入遺伝子を制御するための調節スイッチは、核酸系制御機序に基づく。例示的な核酸制御機序は、当該技術分野において既知であり、使用が想定される。例えば、そのような機序としては、リボスイッチ、例えば、ＵＳ２００９／０３０５２５３、ＵＳ２００８／０２６９２５８、ＵＳ２０１７／０２０４４７７、ＷＯ２０１８／０２６７６２Ａ１、米国特許第９，２２２，０９３号、および欧州特許出願第ＥＰ２８８０７１号に開示されるもの、またＶｉｌｌａ  ＪＫ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｓｐｅｃｔｒ．２０１８  Ｍａｙ；６（３）によるレビューに開示されるものなどが挙げられる。ＷＯ２０１８／０７５４８６およびＷＯ２０１７／１４７５８５に開示されるものなどの、代謝物反応性転写バイオセンサーもまた含まれる。使用が想定される他の当該技術分野において既知の機序としては、ｓｉＲＮＡまたはＲＮＡｉ分子（例えば、ｍｉＲ、ｓｈＲＮＡ）による導入遺伝子のサイレンシングが挙げられる。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、ｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子に対して相補的であるＲＮＡｉ分子をコードする調節スイッチを含み得る。導入遺伝子は、ｃｅＤＮＡベクターによって発現されたとしてもそのようなＲＮＡｉが発現される場合、相補的ＲＮＡｉ分子によってサイレンシングされ、導入遺伝子がｃｅＤＮＡベクターによって発現されたときにＲＮＡｉが発現されない場合、導入遺伝子は、ＲＮＡｉによってサイレンシングされない。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２００２／００２２０１８に開示されている組織特異的自己不活化調節スイッチであり、これにより調節スイッチは、そうでなければ導入遺伝子発現が不利益となり得る部位において、導入遺伝子発現を意図的にスイッチオフする。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、ＵＳ２０１４／０１２７１６２および米国特許第８，３２４，４３６号に開示されるリコンビナーゼ可逆的遺伝子発現系である。
【０２３１】
（ｖ）．転写後および翻訳後調節スイッチ。
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによって発現された関心対象の導入遺伝子または遺伝子を制御するための調節スイッチは、転写後修飾系である。例えば、そのような調節スイッチは、ＵＳ２０１８／０１１９１５６、ＧＢ２０１１／０７７６８、ＷＯ２００１／０６４９５６Ａ３、欧州特許第２７０７４８７号、およびＢｅｉｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｓｙｎｔｈ．Ｂｉｏｌ．，２０１５，４（５），ｐｐ  ５２６−５３４、Ｚｈｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１６  Ｎｏｖ  ２；５．ｐｉｉ：ｅ１８８５８に開示されているように、テトラサイクリンまたはテオフィリンに感受性であるアプタザイムリボスイッチであり得る。いくつかの実施形態では、当業者であれば、導入遺伝子、およびリガンド感受性（オフスイッチ）アプタマーを含有し、その最終結果がリガンド感受性オンスイッチである、阻害性ｓｉＲＮＡの両方をコードすることができると想定される。
【０２３２】
（ｖｉ）．他の例示的な調節スイッチ
任意の既知の調節スイッチを合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター中で使用して、環境変化によってトリガーされるものを含む、ｃｅＤＮＡベクターによって発現された導入遺伝子の遺伝子発現を制御することができる。追加の例としては、Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ８；１００５１（２０１８）のＢＯＣ方法、遺伝子コード拡張および非生理的アミノ酸、放射線制御型または超音波制御型オン／オフスイッチが挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｓｃｏｔｔ  Ｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０００  Ｊｕｌ；７（１３）：１１２１−５、米国特許第５，６１２，３１８号、同第５，５７１，７９７号、同第５，７７０，５８１号、同第５，８１７，６３６号、およびＷＯ１９９９／０２５３８５Ａ１を参照）。いくつかの実施形態では、調節スイッチは、例えば、米国特許第７，８４０，２６３号、ＵＳ２００７／０１９００２８Ａ１に開示されている、埋め込み可能な系によって制御され、遺伝子発現は、ｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子に操作可能に連結されたプロモーターを活性化する電磁エネルギーを含む、１つ以上のエネルギー形態によって制御される。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターにおける使用が想定される調節スイッチは、低酸素媒介性またはストレス活性化スイッチ、例えば、ＷＯ１９９９／０６０１４２Ａ２、米国特許第５，８３４，３０６号、同第６，２１８，１７９号、同第６，７０９，８５８号、ＵＳ２０１５／０３２２４１０、Ｇｒｅｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ９，Ｓ３６８に開示されるものなど、ならびにＦＲＯＧ、ＴＯＡＤ、およびＮＲＳＥエレメント、および条件的に誘導可能なサイレンスエレメント（例えば、米国特許第９，３９４，５２６号に開示される、低酸素反応エレメント（ＨＲＥ）、炎症反応エレメント（ＩＲＥ）、および剪断応力活性化エレメント（ＳＳＡＥ）を含む）である。そのような実施形態は、虚血後、または虚血性組織および／もしくは腫瘍において、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現をオンにするために有用である。
【０２３４】
（ｉｖ）．キルスイッチ
本発明の他の実施形態は、キルスイッチを含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターに関する。本明細書に開示されるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞が殺滅されるか、または導入されたｃｅＤＮＡベクターを対象の系から永久に除去する手段としてプログラム細胞死を受けるようにすることができる。本発明の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターにおけるキルスイッチの使用が、通常は、対象が許容可能に喪失し得る限定数の細胞、またはアポトーシスが望ましい細胞型（例えば、癌細胞）へのｃｅＤＮＡベクターの標的と結びつけられることは、当業者によって理解されるであろう。すべての態様では、本明細書に開示される「キルスイッチ」は、入力生存シグナルまたは他の指定条件の非存在下でｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の急速かつロバストな細胞殺滅をもたらすように設計される。言い換えれば、本明細書においてｃｅＤＮＡベクターによりコードされるキルスイッチは、ｃｅＤＮＡベクターを含む細胞の細胞生存を、特定の入力シグナルによって定義される環境に制限し得る。そのようなキルスイッチは、対象から合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを除去すること、またはコードされた導入遺伝子を発現しないことを保証することが望ましいときに、生物学的封じ込め機能として役立つ。
【０２３５】
ＶＩ．薬学的組成物
別の態様では、薬学的組成物が提供される。薬学的組成物は、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生された閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクター、および薬学的に許容される担体または希釈剤を含む。
【０２３６】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、対象の細胞、組織、または器官へのインビボ送達のために対象に投与するのに好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。典型的に、薬学的組成物は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む。例えば、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、治療的投与（例えば、非経口投与）の所望の経路に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。治療目的のための薬学的組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高濃度の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクターに好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌注射液は、必要に応じて、上記に列挙した成分の１つまたは組み合わせとともに、適切な緩衝液に必要量の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクター化合物を組み込んだ後、ｃｅＤＮＡベクター含む濾過滅菌によって調製することができ、核酸中の導入遺伝子をレシピエントの細胞に送達するように製剤化して、その中の導入遺伝子またはドナー配列の治療的発現をもたらし得る。この組成物はまた、薬学的に許容される担体を含み得る。
【０２３７】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを含む薬学的に活性な組成物は、細胞、例えば対象の細胞に様々な目的のための導入遺伝子を送達するように製剤化することができる。
【０２３８】
治療目的のための薬学的組成物は、典型的に、無菌であり、製造および貯蔵の条件下で安定していなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソーム、または高濃度の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクターに好適な他の秩序構造として製剤化され得る。無菌の注入可能な溶液は、適切な緩衝液中の必要量の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡベクター化合物を、上記で列挙した成分のうちの１つまたは組み合わせに組み込んだ後、濾過滅菌することによって調製され得る。
【０２３９】
本明細書に開示されるように、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、局所、全身、羊膜内、くも膜下腔内、頭蓋内、動脈内、静脈内、リンパ内、腹腔内、皮下、気管、組織内（例えば、筋肉内、心臓内、肝内、腎臓内、脳内）、くも膜下腔内、膀胱内、結膜（例えば、眼窩外、眼窩内、眼窩後、網膜内、網膜下、脈絡膜、脈絡膜下、間質内、前房内、および硝子体内）、蝸牛内、ならびに粘膜（例えば、経口、直腸、鼻）投与に好適な薬学的組成物に組み込まれ得る。高圧静脈内または動脈内注射を介した受動組織形質導入、ならびに細胞内注入、例えば、核内微量注入もしくは細胞質内注入もまた企図される。
【０２４０】
いくつかの態様では、本明細書で提供される方法は、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む１つ以上の閉端ＤＮＡベクターを宿主細胞に送達することを含む。本明細書ではまた、そのような方法によって産生される細胞、およびそのような細胞を含むかまたはそのような細胞から産生される生物（動物、植物、または真菌など）も提供される。核酸の送達方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、マイクロインジェクション、バイオリスティック、リポソーム、免疫リポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸複合体、裸のＤＮＡ、およびＤＮＡでの薬剤強化取り込みが含まれ得る。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号、同第４，９４６，７８７号、および同第４，８９７，３５５号に記載されており、リポフェクション試薬は、市販されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。送達は、細胞（例えば、インビトロもしくはエクスビボ投与）または標的組織（例えば、インビボ投与）に対するものであり得る。
【０２４１】
核酸を細胞に送達するための様々な技法および方法が、当該技術分野において既知である。例えば、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、リポプレックス、またはコアシェルナノ粒子に製剤化され得る。典型的に、ＬＮＰは、核酸（例えば、ｃｅＤＮＡ）分子、１つ以上のイオン化またはカチオン性脂質（もしくはそれらの塩）、１つ以上の非イオン性または中性脂質（例えば、リン脂質）、凝集を防ぐ分子（例えば、ＰＥＧもしくはＰＥＧ−脂質複合体）、および任意にステロール（例えば、コレステロール）で構成される。
【０２４２】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを細胞に送達するための別の方法は、細胞により内在化されるリガンドと核酸を結合させることによる。例えば、リガンドは、細胞表面上の受容体に結合し、エンドサイトーシスを介して内在化され得る。リガンドは、核酸中のヌクレオチドに共有結合され得る。核酸を細胞中に送達するための例示的な複合体は、例えば、ＷＯ２０１５／００６７４０、ＷＯ２０１４／０２５８０５、ＷＯ２０１２／０３７２５４、ＷＯ２００９／０８２６０６、ＷＯ２００９／０７３８０９、ＷＯ２００９／０１８３３２、ＷＯ２００６／１１２８７２、ＷＯ２００４／０９０１０８、ＷＯ２００４／０９１５１５、およびＷＯ２０１７／１７７３２６に記載されている。
【０２４３】
核酸、および本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、トランスフェクションによって細胞に送達することもできる。有用なトランスフェクション方法としては、脂質媒介性トランスフェクション、カチオン性ポリマー媒介性トランスフェクション、またはリン酸カルシウム沈殿が挙げられるが、これらに限定されない。トランスフェクション試薬は、当該技術分野において周知であり、ＴｕｒｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｐｒｏ−Ｊｅｃｔ試薬（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（商標）Ｐタンパク質トランスフェクション試薬（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、ＣＨＡＲＩＯＴ（商標）タンパク質送達試薬（Ａｃｔｉｖｅ  Ｍｏｔｉｆ）、ＰＲＯＴＥＯＪＵＩＣＥ（商標）タンパク質トランスフェクション試薬（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、２９３フェクチン、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）２０００、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）３０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＤＭＲＩＥ−Ｃ、ＣＥＬＬＦＥＣＴＩＮ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＣＥ（商標）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）、ＦＵＧＥＮＥ（商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＡＭ（商標）（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ，Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ＴＦＸ−１０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−２０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＦＸ−５０（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩＮ（商標）（ＢｉｏＲａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，Ｃａｌｉｆ．）、ＳＩＬＥＮＴＦＥＣＴ（商標）（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＣ−ｃｈｏｌ（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ）、ＧＥＮＥＰＯＲＴＥＲ（商標）（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  １（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ，Ｌａｆａｙｅｔｔｅ，Ｃｏｌｏ．）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ２（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ３（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＤＨＡＲＭＡＦＥＣＴ  ４（商標）（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）、ＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＩＩ（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）、およびＥＳＣＯＲＴ（商標）ＩＶ（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．）が挙げられるが、これらに限定されない。ｃｅＤＮＡなどの核酸もまた、当業者に既知のマイクロフルイディクス方法を介して細胞に送達され得る。
【０２４４】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、インビボでの細胞の形質導入のために生物に直接投与することもできる。投与は、分子を血液または組織細胞と最終的に接触させるために通常使用される経路のうちのいずれかによるものであり、注入、注射、局所適用、および電気穿孔が挙げられるが、これらに限定されない。そのような核酸を投与する好適な方法は、当業者によって使用可能かつ周知であり、特定の組成物を投与するために２つ以上の経路が使用され得るが、特定の経路は、多くの場合、別の経路よりも即時であり、効果的な反応をもたらし得る。
【０２４５】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの導入のための方法は、例えば、米国特許第５，９２８，６３８号に記載されている方法により、造血幹細胞に送達することができる。
【０２４６】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、対象の細胞または標的臓器への送達のためにリポソームに付加することができる。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。例示的なリポソームおよびリポソーム製剤は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号および２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示されている。例えば、「薬学的製剤」と題されるセクションを参照されたい。
【０２４７】
当該技術分野で既知の様々な送達方法またはその修正を使用して、本明細書に記載される合成プロセスを使用してインビトロまたはインビボで産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、機械的、電気的、超音波、流体力学的、またはレーザー系エネルギーによって細胞膜に一時的な貫通を作製することによって送達され、それにより標的化細胞へのＤＮＡ進入が促進される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、サイズ制限されたチャネルを通して細胞を圧搾することによるか、または当該技術分野において既知の他の手段によって細胞膜を一時的に崩壊させることにより送達され得る。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは単独で、裸のＤＮＡとして皮膚、甲状腺、心筋、骨格筋、または肝臓細胞中に直接注入される。場合によっては、ｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子銃によって送達される。カプシド不含ＡＡＶベクターでコーティングされた金またはタングステン球状粒子（１〜３μｍ径）は、加圧ガスによって高速に加速され、標的組織細胞中に貫通することができる。
【０２４８】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターおよび薬学的に許容される担体を含む組成物は、本明細書で具体的に企図される。いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、脂質送達系、例えば、本明細書に記載されるリポソームで製剤化される。いくつかの実施形態では、そのような組成物は、熟練した開業医によって望まれる任意の経路によって投与される。組成物は、経口、非経口、舌下、経皮、直腸、経粘膜、局所、吸入を介して、口腔内投与を介して、胸膜内、静脈内、動脈内、腹腔内、皮下、筋肉内、鼻腔内、くも膜下腔内、および関節内またはそれらの組み合わせを含む、異なる経路によって対象に投与され得る。獣医学的使用のために、組成物は、通常の獣医学的慣習に従って適切に許容される製剤として投与され得る。獣医師は、特定の動物に最も適切な投与計画および投与経路を容易に決定することができる。組成物は、従来のシリンジ、無針注射デバイス、「マイクロプロジェクタイルボンバードメント遺伝子ガン」、または電気穿孔（「ＥＰ」）、「流体力学的方法」、もしくは超音波などの他の物理的方法によって投与することができる。
【０２４９】
場合によっては、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、内臓および肢全体の骨格筋への、任意の水溶性化合物および粒子の直接細胞内送達のための単純かつ非常に効率的な方法である流体力学的注入によって送達される。
【０２５０】
場合によっては、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、膜中にナノスコピック孔を作製することにより、超音波によって送達され、内臓または腫瘍の細胞へのＤＮＡ粒子の細胞内送達を促進するため、閉端ＤＮＡのサイズおよび濃度は、この系の効率性において大きな役割を果たす。場合によっては、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、磁場を使用してマグネトフェクションによって送達され、核酸を含む粒子を標的細胞に濃縮する。
【０２５１】
場合によっては、化学送達系は、例えば、カチオン性リポソーム／ミセルまたはカチオン性ポリマーに俗するポリカチオン性ナノマー粒子による負電荷核酸の圧縮を含むナノマー複合体を使用することによって使用され得る。送達方法に使用されるカチオン性脂質としては、一価カチオン性脂質、多価カチオン性脂質、グアニジン含有化合物、コレステロール誘導体化合物、カチオン性ポリマー（例えば、ポリ（エチレンイミン）、ポリ−Ｌ−リジン、プロタミン、他のカチオン性ポリマー）、および脂質−ポリマーハイブリッドが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５２】
Ａ．エキソソーム：
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、エキソソームに被包されることによって送達される。エキソソームは、多胞体と形質膜との融合に続いて、細胞外環境中に放出されるエンドサイトーシス起源の小膜小胞である。それらの表面は、ドナー細胞の細胞膜からの脂質二層からなり、それらは、エキソソームを産生したｓ細胞からのサイトゾルを含有し、表面上の親細胞からの膜タンパク質を呈する。エキソソームは、上皮細胞、ＢおよびＴリンパ球、マスト細胞（ＭＣ）、ならびに樹状細胞（ＤＣ）を含む様々な細胞型によって産生される。いくつかの実施形態では、１０ｎｍ〜１μｍ、２０ｎｍ〜５００ｎｍ、３０ｎｍ〜２５０ｎｍ、５０ｎｍ〜１００ｎｍの直径を有するエキソソームが、使用のために想定される。エキソソームは、それらのドナー細胞を使用するか、または特定の核酸をそれらに導入するかのいずれかによって、標的細胞への送達のために単離され得る。当該技術分野において既知の様々なアプローチを使用して、本発明のカプシド不含ＡＡＶベクターを含有するエキソソームを産生することができる。
【０２５３】
Ｂ．微粒子／ナノ粒子：
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子によって送達される。一般に、脂質ナノ粒子は、例えば、Ｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）．Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  ５（３）：４９８−５０７によって開示されるように、イオン化アミノ脂質（例えば、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート、ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡ、ホスファチジルコリン（１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＤＳＰＣ）、コレステロール、およびコート脂質（ポリエチレングリコール−ジミリストールグリセロール、ＰＥＧ−ＤＭＧ）を含む。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜約１０００ｎｍの間の平均直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、３００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約１０〜約３００ｎｍの間の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、２００ｎｍ未満の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、約２５〜約２００ｎｍの間の直径を有する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子調製物（例えば、複数の脂質ナノ粒子を含む組成物）は、サイズ分布を有し、平均サイズ（例えば、直径）は、約７０ｎｍ〜約２００ｎｍであり、より典型的に、平均サイズは、約１００ｎｍ以下である。
【０２５５】
当該技術分野で既知の様々な脂質ナノ粒子を使用して、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを送達することができる。例えば、脂質ナノ粒子を使用する様々な送達方法は、米国特許第９，４０４，１２７号、同第９，００６，４１７号、および同第９，５１８，２７２号に記載される。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、金ナノ粒子によって送達される。一般に、核酸は、例えば、Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）．Ｇｏｌｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．２２（６）；１０７５−１０８３によって記載されるように、金ナノ粒子に共有結合され得るか、または金ナノ粒子に非共有結合され得る（例えば、電荷−電荷相互作用によって結合される）。いくつかの実施形態では、金ナノ粒子−核酸複合体は、例えば、米国特許第６，８１２，３３４号に記載されている方法を使用して産生される。
【０２５７】
Ｃ．複合体
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、複合される（例えば、細胞取り込みを増加させる薬剤に共有結合される）。「細胞取り込みを増加させる薬剤」は、脂質膜を通した核酸の輸送を促進する分子である。例えば、核酸は、親油性化合物（例えば、コレステロール、トコフェロールなど）、細胞貫通ペプチド（ＣＰＰ）（例えば、ペネトラチン、ＴＡＴ、Ｓｙｎ１Ｂなど）、およびポリアミン（例えば、スペルミン）に複合され得る。細胞取り込みを増加させる薬剤のさらなる例は、例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ（２０１３）．Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）；７９１−８０９に開示されている。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、ポリマー（例えば、ポリマー分子）または葉酸塩分子（例えば、葉酸分子）に複合される。一般に、ポリマーに複合された核酸の送達は、例えば、ＷＯ２０００／３４３４３およびＷＯ２００８／０２２３０９に記載されているように、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，９８７，３７７号によって記載されているように、ポリ（アミド）ポリマーに複合される。いくつかの実施形態では、本開示によって記載される核酸は、米国特許第８，５０７，４５５号に記載されているように、葉酸分子に複合される。
【０２５９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるように、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、例えば、米国特許第８，４５０，４６７号に記載されるように、炭水化物に複合される。
【０２６０】
Ｄ．ナノカプセル
代替として、本明細書に開示されるように、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターのナノカプセル製剤を使用することができる。ナノカプセルは、一般に、安定かつ再生可能な方法で物質を捕捉することができる。細胞内ポリマー過負荷に起因する副作用を避けるために、そのような微細粒子（およそ０．１μｍのサイズ）は、ポリマーを使用して、インビボで分解され得るように設計されるべきである。これらの要件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリレートナノ粒子が、使用のために企図される。
【０２６１】
Ｅ．リポソーム
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、対象の細胞または標的臓器への送達のためにリポソームに付加することができる。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
【０２６２】
リポソームの形成および使用は、一般に、当業者に既知である。改善された血清安定性および循環半減期を有するリポソームが開発された（米国特許第５，７４１，５１６号）。さらに、潜在的な薬物担体としてのリポソームおよびリポソーム様調製物の様々な方法が記載されている（米国特許第５，５６７，４３４号、同第５，５５２，１５７号、同第５，５６５，２１３号、同第５，７３８，８６８号、および同第５，７９５，５８７号）。
【０２６３】
Ｆ．例示的なリポソームおよび脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）組成物
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、細胞、例えば導入遺伝子の発現を必要とする細胞への送達のためにリポソームに付加することができる。リポソームは、少なくとも１つの脂質二層を有する小胞である。リポソームは、典型的に、製剤開発の文脈において薬物／治療剤送達のための担体として使用される。それらは、細胞膜と融合し、その脂質構造を再配置することによって作用して、薬物または活性製剤成分（ＡＰＩ）を送達する。そのような送達のためのリポソーム組成物は、リン脂質、特にホスファチジルコリンを有する化合物で構成されるが、これらの組成物はまた、他の脂質を含んでもよい。
【０２６４】
ｃｅＤＮＡを含む脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号および２０１８年１２月６日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に開示されており、各々が参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれ、本明細書に開示される方法および組成物での使用が想定されている。
【０２６５】
いくつかの態様では、本開示は、免疫原性／抗原性を低減し、化合物（複数可）に対する親水性および疎水性を提供し、投与頻度を低減することができる、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）官能基を有する１つ以上の化合物（いわゆる「ＰＥＧ化化合物」）を含む、リポソーム製剤を提供する。または、リポソーム製剤は、単にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーを追加の構成成分として含む。そのような態様では、ＰＥＧまたはＰＥＧ官能基の分子量は、６２Ｄａ〜約５，０００Ｄａであり得る。
【０２６６】
いくつかの態様では、本開示は、延長放出または制御放出プロファイルを有するＡＰＩを、数時間〜数週間の期間にわたって送達するリポソーム製剤を提供する。いくつかの関連態様では、リポソーム製剤は、脂質二層によって結合される水性チャンバを含み得る。他の関連態様では、リポソーム製剤は、数時間〜数週間の期間にわたってＡＰＩを放出する、高温で物理的移行を経る構成成分を有するＡＰＩを封入する。
【０２６７】
いくつかの態様では、リポソーム製剤は、スフィンゴミエリンおよび本明細書に開示される１つ以上の脂質を含む。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、Ｏｐｔｉｓｏｍｅを含む。
【０２６８】
いくつかの態様では、本開示は、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）複合脂質、ＨＳＰＣ（水素化ダイズホスファチジルコリン）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＤＳＰＥ（ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）；ＤＳＰＣ（ジステアロイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＣ（ジオレオイルホスファチジルコリン）；ＤＰＰＧ（ジパルミトイルホスファチジルグリセロール）；ＥＰＣ（卵ホスファチジルコリン）；ＤＯＰＳ（ジオレオイルホスファチジルセリン）；ＰＯＰＣ（パルミトイルオレオイルホスファチジルコリン）；ＳＭ（スフィンゴミエリン）；ＭＰＥＧ（メトキシポリエチレングリコール）；ＤＭＰＣ（ジミリストイルホスファチジルコリン）；ＤＭＰＧ（ジミリストイルホスファチジルグリセロール）；ＤＳＰＧ（ジステアロイルホスファチジルグリセロール）；ＤＥＰＣ（ジエルコイルホスファチジルコリン）；ＤＯＰＥ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスホエタノールアミン）、硫酸コレステリル（ＣＳ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ＤＯＰＣ（ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−ホスファチジルコリン）、またはそれらの任意の組み合わせから選択される１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。
【０２６９】
いくつかの態様では、本開示は、リン脂質、コレステロール、およびＰＥＧ化脂質を５６：３８：５のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤の全体脂質含有量は、２〜１６ｍｇ／ｍＬである。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびＰＥＧ化脂質を、それぞれ３：０．０１５：２のモル比で含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基、エタノールアミン官能基、およびＰＥＧ化脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基およびコレステロールを含有する脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、ＰＥＧ化脂質は、ＰＥＧ−２０００−ＤＳＰＥである。いくつかの態様では、本開示は、ＤＰＰＧ、ダイズＰＣ、ＭＰＥＧ−ＤＳＰＥ脂質複合体、およびコレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。
【０２７０】
いくつかの態様では、本開示は、ホスファチジルコリン官能基を含有する１つ以上の脂質、およびエタノールアミン官能基を含有する１つ以上の脂質を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、１つ以上のホスファチジルコリン官能基を含有する脂質、エタノールアミン官能基を含有する脂質、およびステロール、例えば、コレステロールを含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、ＤＯＰＣ／ＤＥＰＣ、およびＤＯＰＥを含む。
【０２７１】
いくつかの態様では、本開示は、１種以上の薬学的賦形剤、例えば、スクロースおよび／またはグリシンをさらに含むリポソーム製剤を提供する。
【０２７２】
いくつかの態様では、本開示は、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含むリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、本開示は、一般的なナノ粒子に対する相対サイズでより大きく、約１５０〜２５０ｎｍのサイズであるリポソーム製剤を提供する。いくつかの態様では、リポソーム製剤は、凍結乾燥粉末である。
【０２７３】
いくつかの態様では、本開示は、リポソームの外側に単離されたｃｅＤＮＡを有する混合物に弱塩基を付加することにより、本明細書に開示または記載されるｃｅＤＮＡベクターで作製され、負荷されたリポソーム製剤を提供する。この付加は、リポソームの外側のｐＨをおよそ７．３に増加させ、ＡＰＩをリポソーム中に駆動する。いくつかの態様では、本開示は、リポソームの内側で酸性であるｐＨを有するリポソーム製剤を提供する。そのような場合、リポソームの内側は、ｐＨ４〜６．９、より好ましくはｐＨ６．５であり得る。他の態様では、本開示は、リポソーム内薬物安定化技術を使用することにより作製されたリポソーム製剤を提供する。そのような場合、ポリマーまたは非ポリマー高電荷アニオンおよびリポソーム内捕捉剤、例えばポリリン酸塩またはオクタ硫酸スクロースが利用される。
【０２７４】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクター、およびイオン化脂質を含む、脂質ナノ粒子を提供する。例えば、プロセスにより得られたｃｅＤＮＡを用いて作製および負荷される脂質ナノ粒子製剤は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号に開示されており、本明細書に組み込まれる。これは、イオン化脂質をプロトン化し、粒子のｃｅＤＮＡ／脂質会合および核形成に好ましいエネルギー論を提供する、低ｐＨでのエタノール脂質と水性ｃｅＤＮＡとの高エネルギー混合によって達成され得る。粒子は、水性希釈および有機溶媒の除去によってさらに安定化され得る。粒子は、所望のレベルに濃縮され得る。
【０２７５】
一般に、脂質粒子は、約１０：１〜３０：１の全脂質対ｃｅＤＮＡ（質量または重量）比で調製される。いくつかの実施形態では、脂質対ｃｅＤＮＡ比（質量／質量比、ｗ／ｗ比）は、約１：１〜約２５：１、約１０：１〜約１４：１、約３：１〜約１５：１、約４：１〜約１０：１、約５：１〜約９：１、または約６：１〜約９：１の範囲内であり得る。脂質およびｃｅＤＮＡの量を調整して、所望のＮ／Ｐ比、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれ以上のＮ／Ｐ比を提供し得る。一般に、脂質粒子製剤の全体脂質含有量は、約５ｍｇ／ｍＬ〜約３０ｍｇ／ｍＬの範囲であり得る。
【０２７６】
イオン化脂質は、典型的に、核酸カーゴ、例えばｃｅＤＮＡを低ｐＨで凝縮させるため、および膜会合および膜融合性を駆動するために用いられる。一般に、イオン化脂質は、正に電荷される、または例えばｐＨ６．５以下の酸性条件下でプロトン化される少なくとも１つのアミノ基を含む脂質である。イオン化脂質はまた、本明細書ではカチオン性脂質と称される。
【０２７７】
例示的なイオン化可脂質は、国際ＰＣＴ特許公開第ＷＯ２０１５／０９５３４０号、同第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、同第ＷＯ２０１８／０１１６３３号、同第ＷＯ２０１７／０４９２４５号、同第ＷＯ２０１５／０６１４６７号、同第ＷＯ２０１２／０４０１８４号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１５／０７４０８５号、同第ＷＯ２０１６／０８１０２９号、同第ＷＯ２０１７／００４１４３号、同第ＷＯ２０１７／０７５５３１号、同第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、同第ＷＯ２０１１／０２２４６０号、同第ＷＯ２０１３／１４８５４１号、同第ＷＯ２０１３／１１６１２６号、同第ＷＯ２０１１／１５３１２０号、同第ＷＯ２０１２／０４４６３８号、同第ＷＯ２０１２／０５４３６５号、同第ＷＯ２０１１／０９０９６５号、同第ＷＯ２０１３／０１６０５８号、同第ＷＯ２０１２／１６２２１０号、同第ＷＯ２００８／０４２９７３号、同第ＷＯ２０１０／１２９７０９号、同第ＷＯ２０１０／１４４７４０号、同第ＷＯ２０１２／０９９７５５号、同第ＷＯ２０１３／０４９３２８号、同第ＷＯ２０１３／０８６３２２号、同第ＷＯ２０１３／０８６３７３号、同第ＷＯ２０１１／０７１８６０号、同第ＷＯ２００９／１３２１３１号、同第ＷＯ２０１０／０４８５３６号、同第ＷＯ２０１０／０８８５３７号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０１号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０６号、同第ＷＯ２０１０／０５４４０５号、同第ＷＯ２０１０／０５４３８４号、同第ＷＯ２０１２／０１６１８４号、同第ＷＯ２００９／０８６５５８号、同第ＷＯ２０１０／０４２８７７号、同第ＷＯ２０１１／０００１０６号、同第ＷＯ２０１１／０００１０７号、同第ＷＯ２００５／１２０１５２号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０５号、同第ＷＯ２０１３／１２６８０３号、同第ＷＯ２００６／００７７１２号、同第ＷＯ２０１１／０３８１６０号、同第ＷＯ２００５／１２１３４８号、同第ＷＯ２０１１／０６６６５１号、同第ＷＯ２００９／１２７０６０号、同第ＷＯ２０１１／１４１７０４号、同第ＷＯ２００６／０６９７８２号、同第ＷＯ２０１２／０３１０４３号、同第ＷＯ２０１３／００６８２５号、同第ＷＯ２０１３／０３３５６３号、同第ＷＯ２０１３／０８９１５１号、同第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、同第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、および同第ＷＯ２０１３／０８６３５４号、ならびに米国特許公開第ＵＳ２０１６／０３１１７５９号、同第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、同第ＵＳ２０１６／０１５１２８４号、同第ＵＳ２０１７／０２１０６９７号、同第ＵＳ２０１５／０１４００７０号、同第ＵＳ２０１３／０１７８５４１号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１５／０１４１６７８号、同第ＵＳ２０１５／０２３９９２６号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、同第ＵＳ２０１７／０１１９９０４号、同第ＵＳ２０１２／０１４９８９４号、同第ＵＳ２０１５／００５７３７３号、同第ＵＳ２０１３／００９０３７２号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５２３号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２０１３／０２７４５０４号、同第ＵＳ２００９／００２３６７３号、同第ＵＳ２０１２／０１２８７６０号、同第ＵＳ２０１０／０３２４１２０号、同第ＵＳ２０１４／０２００２５７号、同第ＵＳ２０１５／０２０３４４６号、同第ＵＳ２０１８／０００５３６３号、同第ＵＳ２０１４／０３０８３０４号、同第ＵＳ２０１３／０３３８２１０号、同第ＵＳ２０１２／０１０１１４８号、同第ＵＳ２０１２／００２７７９６号、同第ＵＳ２０１２／００５８１４４号、同第ＵＳ２０１３／０３２３２６９号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１１／０２５６１７５号、同第ＵＳ２０１２／０２０２８７１号、同第ＵＳ２０１１／００７６３３５号、同第ＵＳ２００６／００８３７８０号、同第ＵＳ２０１３／０１２３３３８号、同第ＵＳ２０１５／００６４２４２号、同第ＵＳ２００６／００５１４０５号、同第ＵＳ２０１３／００６５９３９号、同第ＵＳ２００６／０００８９１０号、同第ＵＳ２００３／００２２６４９号、同第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号、同第ＵＳ２０１３／０１１６３０７号、同第ＵＳ２０１０／００６２９６７号、同第ＵＳ２０１３／０２０２６８４号、同第ＵＳ２０１４／０１４１０７０号、同第ＵＳ２０１４／０２５５４７２号、同第ＵＳ２０１４／００３９０３２号、同第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、同第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、同第ＵＳ２０１３／０１９５９２０号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２７８】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、以下の構造を有するＭＣ３（６Ｚ，９Ｚ，２８Ｚ，３１Ｚ）−ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１９−イル−４−（ジメチルアミノ）ブタン酸（ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡまたはＭＣ３）である：
【化１３】
2021511047.tif 000026
【０２７９】
脂質ＤＬｉｎ−ＭＣ３−ＤＭＡは、Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．（２０１２），５１（３４）：８５２９−８５３３に記載されており、この内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／０７４０８５（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、脂質ＡＴＸ−００２である。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１２／０４０１８４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、（１３Ｚ，１６Ｚ）−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−ノニルドコサ−１３，１６−ジエン−１−アミン（化合物３２）である。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、ＷＯ２０１５／１９９９５２（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている、化合物６または化合物２２である。
【０２８３】
無制限に、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の２０〜９０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、イオン化脂質モル含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の２０〜７０％（ｍｏｌ）、３０〜６０％（ｍｏｌ）、または４０〜５０％（ｍｏｌ）であり得る。いくつかの実施形態では、イオン化脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の約５０ｍｏｌ％〜約９０ｍｏｌ％を含む。
【０２８４】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、非カチオン性脂質をさらに含み得る。非イオン性脂質としては、両親媒性脂質、中性脂質、およびアニオン性脂質が挙げられる。したがって、非カチオン性脂質は、中性の非電荷、双性イオン性、またはアニオン性脂質であり得る。非カチオン性脂質は、典型的に、膜融合性を強化するために用いられる。
【０２８５】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターを含む方法および組成物での使用が想定される例示的な非カチオン性脂質は、２０１８年９月７日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５００４２号、および２０１８年１２月６日に出願された同第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号に記載されている。
【０２８６】
例示的な非カチオン性脂質は、国際出願公開第ＷＯ２０１７／０９９８２３号および米国特許公開第ＵＳ２０１８／００２８６６４号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０２８７】
非カチオン性脂質は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０〜３０％（ｍｏｌ）を構成し得る。例えば、非カチオン性脂質含有量は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の５〜２０％（ｍｏｌ）または１０〜１５％（ｍｏｌ）である。様々な実施形態では、イオン化脂質対中性脂質のモル比は、約２：１〜約８：１の範囲である。
【０２８８】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、リン脂質を全く含まない。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、膜統合性を提供するために、ステロールなどの構成成分をさらに含み得る。
【０２８９】
脂質ナノ粒子中で使用され得る１つの例示的なステロールは、コレステロールおよびその誘導体である。例示的なコレステロール誘導体は、国際出願第ＷＯ２００９／１２７０６０号および米国特許公開第ＵＳ２０１０／０１３０５８８号に記載されており、これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９０】
ステロールなどの膜統合性を提供する構成成分は、脂質ナノ粒子中に存在する全脂質の０〜５０％（ｍｏｌ）を構成し得る。いくつかの実施形態では、そのような構成成分は、脂質ナノ粒子の全脂質含有量の２０〜５０％（ｍｏｌ）、３０〜４０％（ｍｏｌ）である。
【０２９１】
いくつかの態様では、脂質ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または複合脂質分子をさらに含み得る。一般に、これらを使用して、脂質ナノ粒子の凝集を阻害し、かつ／または立体安定化を提供する。例示的な複合脂質としては、ＰＥＧ−脂質複合体、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質複合体、ポリアミド−脂質複合体（ＡＴＴＡ−脂質複合体など）、カチオン性−ポリマー脂質（ＣＰＬ）複合体、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、複合脂質分子は、ＰＥＧ−脂質複合体、例えば、（メトキシポリエチレングリコール）−複合脂質である。例示的なＰＥＧ−脂質複合体としては、ＰＥＧ−ジアシルグリセロール（ＤＡＧ）（１−（モノメトキシ−ポリエチレングリコール）−２，３−ジミリストイルグリセロール（ＰＥＧ−ＤＭＧ））、ＰＥＧ−ジアルキルオキシプロピル（ＤＡＡ）、ＰＥＧ−リン脂質、ＰＥＧ−セラミド（Ｃｅｒ）、ＰＥＧ化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）、ＰＥＧコハク酸ジアシルグリセロール（ＰＥＧＳ−ＤＡＧ）（４−Ｏ−（２’，３’−ジ（テトラデカノイルオキシ）プロピル−１−Ｏ−（ｗ−メトキシ（ポリエトキシ）エチル）ブタンジオエート（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ））、ＰＥＧジアルコキシプロピルカルバム、Ｎ−（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール２０００）−１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンナトリウム塩、またはそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。追加の例示的なＰＥＧ−脂質複合体は、例えば、ＵＳ５，８８５，６１３、ＵＳ６，２８７，５９１、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００３／００７７８２９、ＵＳ２００５／０１７５６８２、ＵＳ２００８／００２００５８、ＵＳ２０１１／０１１７１２５、ＵＳ２０１０／０１３０５８８、ＵＳ２０１６／０３７６２２４、およびＵＳ２０１７／０１１９９０４に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９２】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、ＵＳ２０１８／００２８６６４（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている化合物である。
【０２９３】
いくつかの実施形態では、ＰＥＧ−脂質は、ＵＳ２０１５／０３７６１１５またはＵＳ２０１６／０３７６２２４（これら両方の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に開示されている。
【０２９４】
ＰＥＧ−ＤＡＡ複合体は、例えば、ＰＥＧ−ジラウリルオキシプロピル、ＰＥＧ−ジミリスチルオキシプロピル、ＰＥＧ−ジパルミチルオキシプロピル、またはＰＥＧ−ジステアリルオキシプロピルであり得る。ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、ＰＥＧ−ジラウリルグリセロール、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリセロール、ＰＥＧ−ジステリルグリセロール、ＰＥＧ−ジラウリルグリカミド、ＰＥＧ−ジミリスチルグリカミド、ＰＥＧ−ジパルミトイルグリカミド、ＰＥＧ−ジステリルグリカミド、ＰＥＧ−コレステロール（１−［８’−（コレスト−５−エン−３［β］−オキシ）カルボキシアミド−３’，６’−ジオキサオクタニル］カルバモイル−［ω］−メチル−ポリ（エチレングリコール）、ＰＥＧ−ＤＭＢ（３，４−ジテトラデコキシルベンジル−［ω］−メチル−ポリ（エチレングリコール）エーテル）、および１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］のうちの１つ以上であり得る。いくつかの実施例では、ＰＥＧ−脂質は、ＰＥＧ−ＤＭＧ、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−２０００］からなる群から選択され得る。
【０２９５】
ＰＥＧ以外の分子と複合した脂質は、ＰＥＧ−脂質の代わりに使用することもできる。例えば、ポリオキサゾリン（ＰＯＺ）−脂質複合体、ポリアミド−脂質複合体（ＡＴＴＡ−脂質複合体など）、およびカチオン性−ポリマー脂質（ＣＰＬ）複合体を、ＰＥＧ−脂質の代わりに、またはそれに加えて使用することができる。例示的な複合脂質、すなわち、ＰＥＧ−脂質、（ＰＯＺ）−脂質複合体、ＡＴＴＡ−脂質複合体、およびカチオン性ポリマー−脂質は、国際特許出願公開第ＷＯ１９９６／０１０３９２号、同第ＷＯ１９９８／０５１２７８号、同第ＷＯ２００２／０８７５４１号、同第ＷＯ２００５／０２６３７２号、同第ＷＯ２００８／１４７４３８号、同第ＷＯ２００９／０８６５５８号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１７／１１７５２８号、同第ＷＯ２０１７／０９９８２３号、同第ＷＯ２０１５／１９９９５２号、同第ＷＯ２０１７／００４１４３号、同第ＷＯ２０１５／０９５３４６号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、同第ＷＯ２０１２／０００１０４号、および同第ＷＯ２０１０／００６２８２号、米国特許出願公開第ＵＳ２００３／００７７８２９号、同第ＵＳ２００５／０１７５６８２号、同第ＵＳ２００８／００２００５８号、同第ＵＳ２０１１／０１１７１２５号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１８／００２８６６４号、同第ＵＳ２０１５／０３７６１１５号、同第ＵＳ２０１６／０３７６２２４号、同第ＵＳ２０１６／０３１７４５８号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、同第ＵＳ２０１３／０３０３５８７号、および同第ＵＳ２０１１０１２３４５３号、ならびに米国特許第ＵＳ５，８８５，６１３号、同第ＵＳ６，２８７，５９１号、同第ＵＳ６，３２０，０１７号、および同第ＵＳ６，５８６，５５９号に記載されており、これらすべての内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の追加の化合物は、治療剤であり得る。治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、治療目的に好適な任意のクラスから選択され得る。言い換えれば、治療剤は、所望の治療目的および生物作用に従って選択され得る。例えば、ＬＮＰ内のｃｅＤＮＡが、癌を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗癌剤（例えば、化学療法剤、標的癌療法（小分子、抗体、または抗体−薬物複合体を含むが、これらに限定されない）であり得る。別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、感染症を治療するために有用である場合、追加の化合物は、抗菌剤（例えば、抗生物質または抗ウイルス化合物）であり得る。さらに別の実施例では、ｃｅＤＮＡを含有するＬＮＰが、免疫疾患または障害を治療するために有用である場合、追加の化合物は、免疫反応を調節する化合物（例えば、免疫抑制剤、免疫刺激性化合物、または１つ以上の特定の免疫経路を調節する化合物）であり得る。いくつかの実施形態では、異なるタンパク質または異なる化合物（治療剤など）をコードするｃｅＤＮＡなどの、異なる化合物を含有する異なる脂質ナノ粒子の異なるカクテルを、本発明の組成物および方法で使用することができる。
【０２９７】
いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫調節剤である。例えば、追加の化合物は、免疫抑制剤である。いくつかの実施形態では、追加の化合物は、免疫刺激剤である。
【０２９８】
本明細書では、脂質ナノ粒子に封入された合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター、および薬学的に許容される担体または賦形剤を含む薬学的組成物もまた提供される。
【０２９９】
いくつかの態様では、本開示は、１種以上の薬学的賦形剤をさらに含む脂質ナノ粒子製剤を提供する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子製剤は、スクロース、トリス、トレハロース、および／またはグリシンをさらに含む。
【０３００】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、粒子の脂質部分と複合体化するか、脂質ナノ粒子の脂質位置に封入することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡを含むＤＮＡベクターは、脂質ナノ粒子の脂質位置に完全に封入され得、それによって例えば水溶液中のヌクレアーゼによる分解からそれを保護する。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子において本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、３７℃で少なくとも約２０、３０、４５、または６０分間のヌクレアーゼへの脂質ナノ粒子の曝露後に実質的に分解されない。いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子中のｃｅＤＮＡは、３７℃で少なくとも約３０、４５、もしくは６０分、または少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、もしくは３６時間の血清中の粒子のインキュベーション後に実質的に分解されない。
【０３０１】
ある特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、対象、例えばヒトなどの哺乳動物に対して実質的に非毒性である。いくつかの態様では、脂質ナノ粒子製剤は、凍結乾燥粉末である。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、脂質ナノ粒子は、少なくとも１つの脂質二層を有する固体コア粒子である。他の実施形態では、脂質ナノ粒子は、非二層構造、すなわち非ラメラ（すなわち、非二層）形態を有する。制限なしに、非二重層の形態には、例えば、３次元のチューブ、ロッド、立方対称などが含まれ得る。例えば、脂質ナノ粒子の形態（ラメラ対非ラメラ）は、ＵＳ２０１０／０１３０５８８（その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるＣｒｙｏ−ＴＥＭ分析を使用して容易に評価され、特性化され得る。
【０３０３】
いくつかのさらなる実施形態では、非ラメラ形態を有する脂質ナノ粒子は、高電子密度である。いくつかの態様では、本開示は、単一ラメラ構造または多ラメラ構造のいずれかである脂質ナノ粒子を提供する。いくつかの態様では、本開示は、多胞体粒子および／または発泡系粒子を含む脂質ナノ粒子を提供する。
【０３０４】
脂質構成成分の組成物および濃度を制御することによって、脂質複合体が脂質粒子外で交換する速度、順に脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御することができる。さらに、例えば、ｐＨ、温度、またはイオン強度を含む他の変数を使用して、脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を変化および／または制御することができる。脂質ナノ粒子が膜融合性になる速度を制御するために使用され得る他の方法は、本開示に基づいて当業者に明らかとなるであろう。脂質複合体の組成物および濃度を制御することによって、脂質粒径を制御できることも明らかとなるであろう。
【０３０５】
製剤化されたカチオン性脂質のｐＫａは、核酸の送達のためのＬＮＰの有効性と相関し得る（Ｊａｙａｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（２０１２），５１（３４），８５２９−８５３３、Ｓｅｍｐｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２８，１７２−１７６（２０１０）を参照。それら両方は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）。ｐＫａの好ましい範囲は、約５〜約７である。カチオン性脂質のｐＫａは、２−（ｐ−トルイジノ）−６−ナフタレンスルホン酸（ＴＮＳ）の蛍光に基づくアッセイを使用し、脂質ナノ粒子中で判定され得る。
【０３０６】
ＶＩＩ．閉端ＤＮＡベクターを送達する方法
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、様々な適切な方法によってインビトロまたはインビボで標的細胞に送達することができる。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターのみを適用または注入することができる。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、トランスフェクション試薬または他の物理的手段の助けなしに細胞に送達することができる。代替として、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡは、細胞へのＤＮＡの進入を促進する任意の当該技術分野において既知のトランスフェクション試薬または他の当該技術分野において既知の物理的手段、例えば、リポソーム、アルコール、高ポリリジン化合物、高アルギニン化合物、リン酸カルシウム、微小胞、マイクロインジェクション、電気穿孔などを使用して送達され得る。
【０３０７】
別の実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳または眼）に投与される。例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、脊髄、脳幹（延髄、脳橋）、中脳（視床下部、視床、視床上部、脳下垂体、黒質、松果体）、小脳、終脳（線条体、後頭葉、側頭葉、頭頂葉、および前頭葉、皮質、基底核、海馬、および偏桃体を含む大脳）、辺縁系、新皮質、線条体、大脳、ならびに下丘中に導入されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターはまた、網膜、角膜、および／または視神経などの眼の異なる領域に投与されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、脳脊髄液中に（例えば、腰椎穿刺によって）送達されてもよい。ｃｅＤＮＡベクターは、さらに、血液脳関門が撹乱された状況（例えば、脳腫瘍または脳梗塞）において、ＣＮＳに血管内投与されてもよい。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、当該技術分野において既知の任意の経路によってＣＮＳの所望の領域（複数可）に投与され得、髄腔内、眼内、脳内、脳室内、静脈内（例えば、マンニトールなどの糖の存在下）、鼻腔内、耳内、眼内（例えば、硝子体内、網膜下、前房）、および眼周囲（例えば、テノン下領域）送達、ならびに運動ニューロンへの逆行性送達を伴う筋肉内送達を含むが、これらに限定されない。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、ＣＮＳの所望の領域または区画への直接注入（例えば、定位注入）によって液体製剤で投与される。他の実施形態では、例えば、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、所望の領域への局所適用によって、またはエアロゾル製剤の鼻腔内投与によって提供され得る。眼への投与は、液滴の局所適用によって行われてもよい。さらなる代替例として、例えば、ｃｅＤＮＡベクターは、固体の徐放性製剤として投与され得る（例えば、米国特許第７，２０１，８９８号を参照）。さらに追加の実施形態では、例えば、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、逆行性輸送に使用して、運動ニューロンが関与する疾患および障害（例えば、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）など）を治療、改善、および／または予防することができる。例として、例えば、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、筋組織に送達され、そこからニューロン中に移動し得る。
【０３１０】
ＶＩＩＩ．ｃｅＤＮＡベクターの追加の使用
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生された組成物、およびｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを使用して、様々な目的で標的遺伝子または導入遺伝子を発現させることができる。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産生物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態または障害の治療、予防、または改善に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。得られる導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象に導入され得る（例えば、発現され得る）。いくつかの実施形態では、得られる導入遺伝子は、発現の増加、遺伝子産物の活性、または遺伝子の不適切な上方調節（得られる導入遺伝子が、その発現を抑制する、または他の方法でその発現を低減させる）に関連した疾患を治療するのに十分な量で対象において発現され得る。さらに他の実施形態では、得られる導入遺伝子は、未変性遺伝子の欠陥コピーを置換または補足する。導入遺伝子は、それ自体が転写される遺伝子のオープンリーディングフレームでなくてもよいことが当業者によって理解されるであろう。代わりに、それは標的遺伝子のプロモーター領域またはリプレッサー領域であり得、ｃｅＤＮＡベクターは、関心対象の遺伝子の発現をそのように調整する結果でそのような領域を修飾し得る。
【０３１１】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態の治療または予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。
【０３１２】
ＩＸ．使用の方法
合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター、例えば、本明細書に開示されるようなｃｅＤＮＡベクターはまた、関心対象のヌクレオチド配列（例えば、導入遺伝子）を標的細胞（例えば、宿主細胞）に送達するための方法において使用され得る。この方法は、特に導入遺伝子を、それを必要とする対象の細胞に送達するため、および関心対象の疾患を治療するための方法であり得る。本発明は、導入遺伝子の発現の治療効果が生じるように、対象の細胞内のｃｅＤＮＡベクターにコードされる導入遺伝子、例えばタンパク質、抗体、ｍｉＲＮＡなどの核酸などのインビボ発現を可能にする。これらの結果は、閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）送達のインビボおよびインビトロ両方の形態で見られる。
【０３１３】
加えて、本発明は、当該関心対象の核酸または導入遺伝子を含む本発明の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の多回投与を含む、それを必要とする対象の細胞中の遺伝子編集分子の送達のための方法を提供する。本発明のｃｅＤＮＡベクターは、カプシド形成されたウイルスベクターに対して典型的に観察されるような免疫応答を誘導しないため、そのような複数回投与戦略は、ｃｅＤＮＡベースの系においてより大きな成功を収めるであろう。
【０３１４】
合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）核酸（複数可）は、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の有害作用なしに、十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、静脈内（例えば、リポソーム製剤）、選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、筋肉内、および他の投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。所望される場合、投与経路を組み合わせることができる。
【０３１５】
閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）の送達は、送達遺伝子置換に限定されない。例えば、本明細書に記載される合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）は、遺伝子療法の一部を提供するために提供される他の送達系とともに使用されてもよい。本開示に従って合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターと組み合わせることができる系の１つの非限定的な例は、導入遺伝子の効果的な遺伝子発現のために１つ以上の補因子または免疫抑制因子を別々に送達する系を含む。
【０３１６】
本発明はまた、治療有効量の合成的に産生された閉端ＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡベクター）を、任意で薬学的に許容される担体とともに、それを必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞または組織）に導入することを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。例えば、選択される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、例えば、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。例えば、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
【０３１７】
本明細書に提供される合成的に産生された組成物およびベクターを使用して、様々な目的のために導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、研究目的のため、例えば、導入遺伝子を内包する体細胞トランスジェニック動物モデルを作成するため、例えば、導入遺伝子産生物の機能を研究するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを作成するために使用されることが意図されるタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態の治療または予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。導入遺伝子は、遺伝子の発現の低減、発現の欠失、または機能不全に関連した疾患を治療するのに十分な量で患者に導入され得る（例えば、発現され得る）。
【０３１８】
原則として、発現カセットは、突然変異によって減少もしくは欠如しているタンパク質またはポリペプチドをコードする、または過剰発現が本発明の範囲内であると考えられるときに、治療効果をもたらす核酸または任意の導入遺伝子を含み得る。
【０３１９】
合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、１種のｃｅＤＮＡベクターに限定されない。そのようなものとして、別の態様では、異なる導入遺伝子、または異なるプロモーターもしくはシス調節エレメントに操作可能に連結されるが同じ導入遺伝子を含む複数のｃｅＤＮＡベクターは、標的細胞、組織、器官、または対象に同時にまたは順次に送達され得る。したがって、この戦略では、複数の遺伝子の遺伝子療法または遺伝子送達を同時に行うことができる。導入遺伝子の異なる部分を別々のｃｅＤＮＡベクターに分離することも可能であり（例えば、導入遺伝子の機能に必要な異なるドメインおよび／または補因子）、同時にまたは異なる時間に投与することができ、別々に調節可能であり得、それによって追加レベルの導入遺伝子の発現の制御を付加する。送達はまた、複数回、および重要なことに、ウイルスカプシドの非存在に起因する抗カプシド宿主免疫反応の欠失を仮定して、後に増加または減少する用量で臨床状況において遺伝子療法のために実施され得る。カプシドが存在しないため、抗カプシド反応は起こらないと予想される。
【０３２０】
本発明はまた、治療有効量の本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（特に筋細胞または組織）に導入することを含む、対象における疾患を治療する方法を提供する。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装されるｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、ｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
【０３２１】
Ｘ．治療の方法
本明細書に記載される技術はまた、開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを作製するための方法、ならびにそれを様々な方法（例えば、原位置外、インビトロおよびインビボ適用、方法論、診断手順、ならびに／または遺伝子療法レジメン）で使用する方法を実証する。
【０３２２】
治療有効量の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、任意に薬学的に許容される担体とともに、治療を必要とする対象の標的細胞（例えば、筋細胞もしくは組織、または他の罹患した細胞型）に導入することを含む、対象における疾患または障害を治療する方法が、本明細書に提供される。ｃｅＤＮＡベクターは、担体の存在下で導入され得るが、そのような担体は必要とされない。実装される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、疾患を治療するために有用な関心対象のヌクレオチド配列を含む。特に、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、対象に導入されたときに、外因性ＤＮＡ配列によってコードされる所望のポリペプチド、タンパク質、またはオリゴヌクレオチドの転写を指示することができる制御エレメントに操作可能に連結された所望の外因性ＤＮＡ配列を含み得る。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、上記および本明細書の別の場所に提供される任意の好適な経路を介して投与され得る。
【０３２３】
１種以上の薬学的に許容される緩衝剤、希釈剤、または賦形剤とともに本発明の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの１つ以上を含む、ｃｅＤＮＡベクター組成物および製剤が、本明細書で開示される。そのような組成物は、疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全の１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための、１つ以上の診断的または治療的キットに含まれ得る。一態様では、疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全は、ヒト疾患、傷害、障害、外傷、または機能不全である。
【０３２４】
本明細書に記載される技術の別の態様は、診断的または治療的に有効な量の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象に提供するための方法を提供し、この方法は、本明細書に開示されるある量の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、それを必要とする対象の細胞、組織、または器官に、ｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の発現を可能にするのに有効な時間にわたって提供し、それによって診断的または治療的に有効な量のｃｅＤＮＡベクターによって発現されるタンパク質、ペプチド、核酸を対象に提供することを含む。さらなる態様では、対象は、ヒトである。
【０３２５】
本明細書に記載される技術の別の態様は、対象における疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷のうちの少なくとも１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターのうちの１つ以上を、それを必要とする対象に、対象の疾患、障害、機能不全、傷害、異常状態、または外傷の１つ以上の症状を診断、予防、治療、または改善するための量および時間にわたって投与するステップを含む。さらなる態様では、対象は、ヒトである。
【０３２６】
別の態様は、疾患または疾患状態の１つ以上の症状を治療または低減するためのツールとしての、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの使用である。欠陥遺伝子が知られているいくつかの遺伝疾患が存在し、典型的に、通常は一般に劣性的に遺伝される酵素の欠乏状態と、調節または構造タンパク質に関与し得るが、典型的には常に優性的に遺伝されるとは限らない不均衡状態との２つのクラスに分類される。欠乏状態の疾患の場合、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用し、導入遺伝子を送達して、置換療法のために正常な遺伝子を罹患した組織に運び入れるとともに、いくつかの実施形態では、アンチセンス突然変異を使用して、疾患の動物モデルを創り出すことができる。不均衡疾患状態の場合、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、モデルシステムにおいて病態を創り出すことができ、次いでこれを使用して、その病態に対処する試みに使用することができる。したがって、本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターおよび方法は、遺伝子疾患の治療を可能にする。本明細書で使用される場合、病態は、疾患を引き起こす、またはそれをより重篤にする欠乏または不均衡を部分的または全体的に修繕することによって治療される。
【０３２７】
Ａ．宿主細胞：
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、対象の宿主細胞に導入遺伝子を送達する。いくつかの実施形態では、対象の宿主細胞は、ヒト宿主細胞であり、例えば、血液細胞、幹細胞、造血細胞、ＣＤ３４＋細胞、肝細胞、癌細胞、血管細胞、筋細胞、膵臓細胞、神経細胞、眼もしくは網膜細胞、上皮もしくは内皮細胞、樹状細胞、線維芽細胞、または哺乳類起源の任意の他の細胞（無制限に、肝（すなわち、肝臓）細胞、肺細胞、心臓細胞、膵臓細胞、腸細胞、横隔膜細胞、腎（すなわち、腎臓）細胞、ニューロン細胞、血液細胞、骨髄細胞、もしくは遺伝子療法が企図される対象の任意の１つ以上の選択された組織を含む）が挙げられる。一態様では、対象宿主細胞は、ヒト宿主細胞である。
【０３２８】
本開示はまた、本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む、上記のような組み換え宿主細胞に関する。したがって、当業者には明らかであるように、目的に応じて複数の宿主細胞を使用することができる。ドナー配列を含む構築物または合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを宿主細胞に導入して、ドナー配列が、前述のように染色体組み込み体として維持されるようにする。宿主細胞という用語は、複製中に生じる突然変異のために親細胞と同一ではない親細胞の任意の子孫を包含する。宿主細胞の選択は、ドナー配列およびその供給源に大きく依存する。宿主細胞はまた、哺乳類、昆虫、植物、または真菌細胞などの真核生物であってもよい。一実施形態では、宿主細胞は、ヒト細胞（例えば、初代細胞、幹細胞、または不死化細胞株）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターをエクスビボで投与され、次いで遺伝子治療事象の後に対象に送達され得る。宿主細胞は、任意の細胞型、例えば、体細胞または幹細胞、人工多能性幹細胞、または血液細胞、例えば、Ｔ細胞もしくはＢ細胞、または骨髄細胞であり得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、同種細胞である。例えば、Ｔ細胞ゲノム操作は、癌免疫療法、ＨＩＶ療法（例えば、ＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５などの受容体ノックアウト）などの疾患調整、および免疫不全療法に有用である。Ｂ細胞上のＭＨＣ受容体は、免疫療法の標的となり得る。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾型宿主細胞、例えば、骨髄幹細胞、例えば、ＣＤ３４＋細胞、または人工多能性幹細胞を、治療用タンパク質の発現のために患者に移植して戻すことができる。
【０３２９】
Ｂ．ｃｅＤＮＡベクターで治療される例示的な導入遺伝子および疾患
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターはまた、欠陥遺伝子を訂正するために有用である。非限定的な例として、デュシェン型筋ジストロフィーのＤＭＤ遺伝子は、本明細書に開示されるように合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して送達することができる。
【０３３０】
合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物は、任意の遺伝性疾患の治療に使用され得る。非限定的な例として、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物は、トランスサイレチンアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）、突然変異体タンパク質が神経、心臓、胃腸系などでミスフォールドして凝集する奇病の治療に使用することができる。本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、突然変異体疾患遺伝子（ｍｕｔＴＴＲ）の欠失によって疾患を治療できることが本明細書で企図される。遺伝性疾患のそのような治療は、疾患の進行を止めることができ、確立された疾患の後退または疾患の少なくとも１つの症状の少なくとも１０％の軽減を可能にし得る。
【０３３１】
別の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物は、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症（ＯＴＣ欠損症）、高アンモニア血症、または新生児もしくは幼児のアンモニアを解毒する能力を損なう他の尿素サイクル障害の治療に使用することができる。先天性代謝のすべての疾患と同様に、野生型対照と比較した酵素活性の部分的回復でさえ（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）、ＯＴＣ欠乏症を有する対象の少なくとも１つの症状ＯＴＣの低減および／または生活の質の改善に十分であり得る。一実施形態では、ＯＴＣをコードする核酸は、インビボタンパク質置換のためにアルブミン内因性プロモーターの後ろに挿入され得る。
【０３３２】
別の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物を、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素をコードする核酸配列を送達することによるフェニルケトン尿症（ＰＫＵ）の治療において使用して、ＰＫＵ患者に毒性であり得る食事性フェニルアラニンの蓄積を低減することができる。先天性代謝のすべての疾患と同様に、野生型対照と比較した酵素活性の部分的回復でさえ（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）、ＰＫＵを有する対象のＰＫＵの少なくとも１つの症状の低減および／または生活の質の改善に十分であり得る。一実施形態では、フェニルアラニンヒドロキシラーゼをコードする核酸を、インビボタンパク質置換のためにアルブミン内因性プロモーターの後ろに挿入することができる。
【０３３３】
別の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物は、酵素をコードする核酸配列を送達して、ＧＳＤを有する対象における異常なグリコーゲン合成または分解を訂正することによる、グリコーゲン蓄積症（ＧＳＤ）の治療に使用され得る。本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターおよび方法を使用して送達および発現され得る酵素の非限定的な例には、グリコーゲンシンターゼ、グルコース−６−ホスファターゼ、酸−αグルコシダーゼ、グリコーゲン分岐酵素、グリコーゲン分岐酵素、筋肉グリコーゲンホスホリラーゼ、肝臓グリコーゲンホスホリラーゼ、筋肉ホスホフルクトキナーゼ、ホスホリラーゼキナーゼ、グルコース輸送体−２（ＧＬＵＴ−２）、アルドラーゼＡ、β−エノラーゼ、ホスホグルコムターゼ−１（ＰＧＭ−１）、およびグリコゲニン−１が含まれる。先天性代謝のすべての疾患と同様に、野生型対照と比較した酵素活性の部分的回復でさえ（例えば、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％）、ＧＳＤを有する対象のＧＳＤの少なくとも１つの症状の低減および／または生活の質の改善に十分であり得る。一実施形態では、異常なグリコーゲン貯蔵を訂正するために酵素をコードする核酸を、インビボタンパク質置換のためにアルブミン内因性プロモーターの後ろに挿入することができる。
【０３３４】
本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターはまた、レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）、ポリＱリピートを含むポリグルタミン病、およびα−１アンチトリプシン欠乏症（Ａ１ＡＴ）のうちのいずれかの治療での使用も企図されている。ＬＣＡは、失明を引き起こす稀な先天性眼疾患であり、以下の遺伝子：ＧＵＣＹ２Ｄ、ＲＰＥ６５、ＳＰＡＴＡ７、ＡＩＰＬ１、ＬＣＡ５、ＲＰＧＲＩＰ１、ＣＲＸ、ＣＲＢ１、ＮＭＮＡＴ１、ＣＥＰ２９０、ＩＭＰＤＨ１、ＲＤ３、ＲＤＨ１２、ＬＲＡＴ、ＴＵＬＰ１、ＫＣＮＪ１３、ＧＤＦ６、および／またはＰＲＰＨ２のうちのいずれか１つにおける突然変異によって引き起こされ得る。本明細書では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターおよび組成物および方法が、ＬＣＡの症状の原因である遺伝子（複数可）のエラーを訂正するために、ＬＣＡに関連する１つ以上の遺伝子の送達に適合され得ることが企図される。ポリグルタミン病には、歯列核淡蒼球ルイ体萎縮症、ハンチントン病、脊髄および球根筋萎縮症、ならびに脊髄小脳失調１型、２型、３型（マシャド・ジョセフ病としても知られている）、６型、７型、および１７型が含まれるが、これらに限定されない。Ａ１ＡＴ欠乏症は、α−１アンチトリプシンの産生不良を引き起こす遺伝性疾患であり、血液および肺での酵素活性の低下を招き、次にそれが罹患した対象の肺気腫または慢性閉塞性肺疾患につながり得る。本明細書に概説されるようなｃｅＤＮＡベクターまたはその組成物を使用したＡ１ＡＴ欠損症を有する対象の治療が、本明細書で具体的に企図される。本明細書では、ＬＣＡ、ポリグルタミン病またはＡ１ＡＴ欠損症の治療のための所望のタンパク質をコードする核酸を含むｃｅＤＮＡベクターを、治療を必要とする対象に投与できることが企図される。
【０３３５】
さらなる実施形態では、本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む組成物を使用して、とりわけウイルス配列、病原体配列、染色体配列、転座接合部（例えば、癌に関連する転座）、非コードＲＮＡ遺伝子またはＲＮＡ配列、疾患関連遺伝子を送達することができる。
【０３３６】
関心対象の任意の核酸または標的遺伝子は、本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによって送達または発現され得る。標的核酸および標的遺伝子には、ポリペプチドをコードする核酸、または非コード核酸（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉＲなど）、好ましくは治療剤（例えば、医療、診断、もしくは獣医用途用）、または免疫原性ポリペプチド（例えば、ワクチン用）が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによって標的とされる標的核酸または標的遺伝子は、１つ以上のポリペプチド、ペプチド、リボザイム、ペプチド核酸、ｓｉＲＮＡ、ＲＮＡｉｓ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、アンチセンスポリヌクレオチド、抗体、抗原結合断片、またはそれらの任意の組み合わせをコードする。
【０３３７】
特に、本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによる発現のための遺伝子標的または導入遺伝子は、例えば、限定されないが、疾患、機能不全、傷害、および／または障害のうちの１つ以上の症状の治療、予防、および／または改善における使用のための、タンパク質（複数可）、ポリペプチド（複数可）、ペプチド（複数可）、酵素（複数可）、抗体、抗原結合断片、ならびにその変異型、および／または活性断片をコードし得る。一態様では、疾患、機能不全、外傷、傷害、および／または障害は、ヒト疾患、機能不全、外傷、傷害、および／または障害である。
【０３３８】
発現カセットはまた、ポリペプチド、センスもしくはアンチセンスオリゴヌクレオチド、またはＲＮＡ（コードもしくは非コード；例えば、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、およびそれらのアンチセンス対応物（例えば、ａｎｔａｇｏＭｉＲ））をコードし得る。発現カセットは、実験または診断の目的で使用されるレポータータンパク質をコードする外因性配列、例えばβ−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野において周知の他のものを含み得る。
【０３３９】
発現カセット、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの発現構築物で提供される配列は、宿主細胞に最適化されたコドンであり得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」または「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えばマウスまたはヒトの細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、または相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的には、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化およびカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．，２１９０  Ｆｏｘ  Ｍｉｌｌ  Ｒｄ．Ｓｕｉｔｅ  ３００，Ｈｅｒｎｄｏｎ，Ｖａ．２０１７１）または別の公開データベースを使用して決定することができる。
【０３４０】
多くの生物は、特定のコドンを使用して、成長するペプチド鎖における特定のアミノ酸の挿入をコードする偏向を示す。生物間のコドン使用頻度の違いであるコドン優先またはコドン偏向は、遺伝暗号の縮退によってもたらされ、多くの生物の間で十分に文書化されている。コドン偏向は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳効率と相関関係があることが多く、特に翻訳されるコドンの特性および特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の可用性に依存すると考えられている。細胞内の選択されたｔＲＮＡの優勢は、一般にペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンの反映である。したがって、コドン最適化に基づいて、所与の生物における最適な遺伝子発現のために遺伝子を調整することができる。
【０３４１】
多種多様な動物、植物、および微生物種で利用可能な多数の遺伝子配列を考えると、コドン使用頻度の相対頻度を計算することが可能である（Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．″Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００″Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００））。
【０３４２】
本明細書に記載されるように、本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、タンパク質もしくはペプチド、または治療核酸配列をコードすることができ、または治療剤としては、１種以上のアゴニスト、アンタゴニスト、抗アポトーシス因子、阻害剤、受容体、サイトカイン、細胞毒、エリスロポエチン剤、糖タンパク質、増殖因子、増殖因子受容体、ホルモン、ホルモン受容体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、神経増殖因子、向神経活性ペプチド、向神経活性ペプチド受容体、プロテアーゼ、プロテアーゼ阻害剤、タンパク質デカルボキシラーゼ、タンパク質キナーゼ、タンパク質キナーゼ阻害剤、酵素、受容体結合タンパク質、輸送タンパク質もしくはその１種以上の阻害剤、セロトニン受容体、またはその１種以上の取り込み阻害剤、セルピン、セルピン受容体、腫瘍抑制剤、診断的分子、化学療法剤、細胞毒、あるいはそれらの任意の組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４３】
合成的に産生されたｃｅＤＮＡ遺伝子ベクターはまた、遺伝子発現の除去にも有用である。例えば、一実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを使用して、アンチセンス核酸または機能的ＲＮＡを発現させ、標的遺伝子のノックダウンを誘導することができる。非限定的な例として、ＨＩＶ受容体であるＣＸＣＲ４およびＣＣＲ５の発現は、初代ヒトＴ細胞において首尾よく切除されている。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳｃｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５），ＰＮＡＳ  １１２（３３）：１０４３７−１０４４２を参照されたい。標的化阻害の別の遺伝子はＰＤ−１であり、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、阻害核酸またはＲＮＡｉまたは機能的ＲＮＡを発現させてＰＤ−１の発現を阻害することができる。ＰＤ−１は、悪性腫瘍で起こる慢性的に活性なＴ細胞に免疫チェックポイント細胞表面受容体を発現する。上記のＳｃｈｕｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、罹患した遺伝子を標的とする導入遺伝子を発現させることによって、欠陥遺伝子を訂正するために有用である。本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによる治療の影響を受けやすい疾患または障害の非限定的な例は、参照により全体が本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１４／０１７０７５３号のそれらの遺伝子およびそれらの関連遺伝子とともに表Ａ〜Ｃに示されている。
【０３４５】
代替実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、セーフハーバー遺伝子、例えば不活性イントロンにおける治療用タンパク質またはレポータータンパク質の発現のための発現カセットの挿入に使用される。ある特定の実施形態では、プロモーターレスカセットが、セーフハーバー遺伝子に挿入される。そのような実施形態では、プロモーターレスカセットは、セーフハーバー遺伝子調節エレメント（プロモーター、エンハンサー、およびシグナル伝達ペプチド）を利用することができ、セーフハーバー遺伝子座での挿入の非限定的な例は、Ｂｌｏｏｄ（２０１５）１２６（１５）：１７７７−１７８４（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているアルブミン遺伝子座への挿入である。アルブミンへの挿入は、血液への導入遺伝子の分泌を可能にするという利点を有する（例えば、実施例２２を参照）。さらに、ゲノムセーフハーバー部位は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｐａｐａｐｅｔｒｏｕ，ＥＲ＆ Ｓｃｈａｍｂａｃｈ，Ａ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２４（４）：６７８−６８４（２０１６）またはＳａｄｅｌａｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １２：５１−５８（２０１２）（各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる）に記載されている技法を使用して決定され得る。アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ゲノムのセーフハーバー部位（例えば、ＡＡＶＳ１セーフハーバー部位）は、本明細書に記載される方法および組成物とともに使用され得る（例えば、Ｏｃｅｇｕｅｒａ−Ｙａｎｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０１：４３−５５（２０１６）またはＴｉｙａｂｏｏｎｃｈａｉ，Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  １２（３）：６３０−７（２０１４）を参照（各々の内容は、参照によりそれら全体が本明細書に組み込まれる））。例えば、ＡＡＶＳ１ゲノムセーフハーバー部位は、胚性幹細胞（例えば、ヒト胚性幹細胞）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）における造血特異的導入遺伝子発現および遺伝子サイレンシングの目的のために、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターおよび組成物とともに使用することができる。さらに、染色体１９上のＡＡＳＶ１セーフハーバー部位に挿入するための、合成または市販の相同性指向修復ドナーテンプレートを、本明細書に記載されるようなｃｅＤＮＡベクターまたは組成物とともに使用できることが本明細書において企図される。例えば、相同性指向修復テンプレート、およびガイドＲＮＡは、例えば、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）から商業的に購入し、ｃｅＤＮＡベクターにクローニングすることができる。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、導入遺伝子を発現させるか、またはＴ細胞中の標的遺伝子をノックアウトするもしくはその発現を減少させるために、例えば、養子細胞移入および／またはＣＡＲ−Ｔ治療の改善のためにＴ細胞を操作するために使用される（例えば、実施例２４を参照）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子をノックアウトする導入遺伝子を発現させることができる。Ｔ細胞の治療に関連するノックアウトの非限定的な例は、ＰＮＡＳ（２０１５）１１２（３３）：１０４３７−１０４４２に記載されており、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０３４７】
Ｃ．遺伝子療法のための追加の疾患：
一般に、上記の説明に従って本明細書に開示される合成方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して任意の導入遺伝子を送達して、遺伝子発現に関する任意の障害に関連する症状を治療、予防、または改善することができる。例示的な病態としては、嚢胞性線維症（および他の肺の疾患）、血友病Ａ、血友病Ｂ、サラセミア、貧血症および他の血液障害、ＡＩＤＳ、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症、癲癇および他の神経障害、癌、糖尿病、筋ジストロフィー（例えば、デュシェンヌ型、ベッカー型）、ハーラー病、アデノシンデアミナーゼ欠損症、代謝障害、網膜変性疾患（および他の眼の疾患）、ミトコンドリオパチー（例えば、レーベル遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）、リー症候群、および亜急性硬化性脳炎）、ミオパチー（例えば、顔面肩甲上腕型ミオパチー（ＦＳＨＤ）および心筋症）、固形臓器（例えば、脳、肝臓、腎臓、心臓）の疾患などが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、代謝障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ欠損症）を有する個体の治療において有利に使用され得る。
【０３４８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、遺伝子または遺伝子産物中の突然変異によって引き起こされる疾患または障害を治療、改善、および／または予防することができる。ｃｅＤＮＡベクターで治療され得る例示的な疾患または障害としては、代謝疾患または障害（例えば、ファブリー病、ゴーシェ病、フェニルケトン尿症（ＰＫＵ）、グリコーゲン蓄積疾患）；尿素サイクル疾患または障害（例えば、オルニチントランスカルバミラーゼ（ＯＴＣ）欠損症）；リソソーム蓄積疾患または障害（例えば、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ、ハンター症候群））；肝疾患または障害（例えば、進行性家族性肝内胆汁うっ滞（ＰＦＩＣ）；血液疾患または障害（例えば、血友病（ＡおよびＢ）、サラセミア、および貧血症）；癌および腫瘍、ならびに遺伝子疾患または障害（例えば、嚢胞性線維症）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３４９】
なおもさらなる態様として、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを用いて、導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される、ホルモンまたは増殖因子をコードする導入遺伝子）の発現レベルを調節することが望ましい状況において、異種ヌクレオチド配列を送達することができる。
【０３５０】
したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、疾患または障害をもたらす遺伝子産生物の異常なレベルおよび／または機能（例えば、タンパク質中の非存在または欠損）を訂正することができる。ｃｅＤＮＡベクターは、機能的タンパク質を産生し、かつ／またはタンパク質のレベルを修正して、タンパク質中の非存在もしくは欠損によって引き起こされる特定の疾患もしくは障害から生じる症状を緩和もしくは低減するか、または利益を付与することができる。例えば、ＯＴＣ欠損症の治療は、機能的ＯＴＣ酵素を産生することによって達成され得る。血友病ＡおよびＢの治療は、第ＶＩＩＩ因子、第ＩＸ因子、および第Ｘ因子のレベルを修正することによって達成され得る。ＰＫＵの治療は、フェニルアラニンヒドロキシラーゼ酵素のレベルを修正することによって達成され得る。ファブリー病またはゴーシェ病の治療は、それぞれ機能的αガラクトシダーゼまたはβグルコセレブロシダーゼを産生することによって達成され得る。ＭＬＤまたはＭＰＳＩＩの治療は、それぞれ機能的アリールスルファターゼＡまたはイズロネート−２−スルファターゼを産生することによって達成され得る。嚢胞性線維症の治療は、機能的嚢胞性線維症の膜貫通コンダクタンス調節剤を産生することによって達成され得る。グリコーゲン蓄積疾患の治療は、機能的Ｇ６Ｐａｓｅ酵素機能を回復することによって達成され得る。ＰＦＩＣの治療は、機能的ＡＴＰ８Ｂ１、ＡＢＣＢ１１、ＡＢＣＢ４、またはＴＪＰ２遺伝子を産生することによって達成され得る。
【０３５１】
代替実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、アンチセンス核酸をインビトロまたはインビボで細胞に提供することができる。例えば、導入遺伝子が、ＲＮＡｉ分子である場合、標的細胞中のアンチセンス核酸またはＲＮＡｉの発現は、細胞による特定のタンパク質の発現を減少させる。したがって、ＲＮＡｉ分子またはアンチセンス核酸である導入遺伝子を投与して、それを必要とする対象における特定のタンパク質の発現を減少させることができる。アンチセンス核酸をインビトロで細胞に投与して、細胞生理学を調節する、例えば、細胞または組織培養系を最適化することもできる。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターによってコードされる例示的な導入遺伝子としては、Ｘ、リソソーム酵素（例えば、タイ・サックス病に関連するヘキソサミニダーゼＡ、またはハンター症候群／ＭＰＳ  ＩＩに関連するイズロネートスルファターゼ）、エリスロポエチン、アンジオスタチン、エンドスタチン、スーパーオキシドジスムターゼ、グロビン、レプチン、カタラーゼ、チロシンヒドロキシラーゼ、ならびにサイトカイン（例えば、インターフェロン、β−インターフェロン、インターフェロン−γ、インターロイキン−２、インターロイキン−４、インターロイキン１２、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、リンホトキシンなど）、ペプチド増殖因子およびホルモン（例えば、ソマトトロピン、インスリン、インスリン様増殖因子１および２、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）、神経増殖因子（ＮＧＦ）、神経栄養因子−３および４、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア由来増殖因子（ＧＤＮＦ）、形質転換増殖因子−αおよび−βなど）、受容体（例えば、腫瘍壊死因子受容体）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、１つ以上の所望の標的に特異的なモノクローナル抗体をコードする。いくつかの例示的な実施形態では、２つ以上の導入遺伝子が、ｃｅＤＮＡベクターによってコードされる。いくつかの例示的な実施形態では、導入遺伝子は、関心対象の２つの異なるポリペプチドを含む融合タンパク質をコードする。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、本明細書に定義されるように、全長抗体または抗体断片を含む、抗体をコードする。いくつかの実施形態では、抗体は、本明細書に定義されるように、抗原結合ドメインまたは免疫グロブリン可変ドメイン配列である。他の例示的な導入遺伝子配列は、自殺遺伝子産生物（チミジンキナーゼ、シトシンデアミナーゼ、ジフテリア毒素、チトクロームＰ４５０、デオキシシチジンキナーゼ、および腫瘍壊死因子）、癌治療において使用される薬物に対する耐性を付与するタンパク質、および腫瘍抑制因子遺伝子産生物をコードする。
【０３５３】
代表的な実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターによって発現される導入遺伝子は、筋ジストロフィーの治療を必要とする対象における治療のために使用され得る。この方法は、治療、改善、または予防に有効な量の、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターを投与することを含み、ｃｅＤＮＡベクターは、異種核酸をコードするジストロフィン、ミニジストロフィン、マイクロジストロフィン、ミオスタチンプロペプチド、フォリスタチン、アクチビンＩＩ型可溶性受容体、ＩＧＦ−１、抗炎症性ポリペプチド、例えば、ＩκＢ優性突然変異体、サルコスパン、ウトロフィン、マイクロジストロフィン、ラミニン−α２、α−サルコグリカン、β−サルコグリカン、γ−サルコグリカン、δ−サルコグリカン、ＩＧＦ−１、ミオスタチンもしくはミオスタチンポリペプチドに対する抗体もしくは抗体断片、および／またはミオスタチンに対するＲＮＡｉを含む。特定の実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、本明細書の別の場所に記載されるように、骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋に投与され得る。
【０３５４】
いくつかの実施形態では、通常は血液中で循環するポリペプチド（例えば、酵素）もしくは機能的ＲＮＡ（例えば、ＲＮＡｉ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ）の産生のため、あるいは障害（例えば、代謝障害、例えば糖尿病（例えば、インスリン）、血友病（例えば、ＶＩＩＩ）、ムコ多糖障害（例えば、スライ症候群、ハーラー症候群、シャイエ症候群、ハーラー・シャイエ症候群、ハンター症候群、サンフィリポ症候群Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、モルキオ症候群、マロトー・ラミー症候群など）またはリソソーム蓄積症（ゴーシェ病［グルコセレブロシダーゼ］、ポンペ病［リソソーム酸α−グルコシダーゼ］もしくはファブリー病［α−ガラクトシダーゼＡ］）またはグリコーゲン蓄積疾患（ポンペ病［リソソーム酸αグルコシダーゼ）を治療、改善、および／または予防するための他の組織への全身送達のため、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、導入遺伝子を骨格筋、心筋、または横隔膜筋に送達することができる。代謝障害を治療、改善、および／または予防するための他の好適なタンパク質は、上に記載される。
【０３５５】
他の実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、代謝障害の治療、改善、および／または予防を必要とする対象においてそれを行う方法において、導入遺伝子を送達することができる。例示的な代謝障害およびポリペプチドをコードする導入遺伝子が、本明細書に記載される。任意に、ポリペプチドが分泌される（例えば、その未変性状態の分泌ポリペプチドであるポリペプチド、または例えば、当該技術分野において既知のような分泌シグナル配列との操作可能な会合によって分泌されるように操作されたポリペプチド）。
【０３５６】
本発明の別の態様は、先天性心疾患またはＰＡＤの治療、改善、および／または予防を必要とする対象においてそれを行う方法に関し、その方法は、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを哺乳類対象に投与することを含み、ｃｅＤＮＡベクターが、例えば、筋形質小胞体Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ２ａ）、血管新生因子、ホスファターゼ阻害剤Ｉ（Ｉ−１）、ホスホランバンなどのＲＮＡｉ；ホスホランバン阻害剤または優性陰性分子、例えばホスホランバンＳ１６Ｅ、ホスホランバン遺伝子を調節する亜鉛フィンガータンパク質、β２−アドレナリン受容体、β２−アドレナリン受容体キナーゼ（ＢＡＲＫ）、ＰＩ３キナーゼ、カルサルシン、β−アドレナリン受容体キナーゼ阻害剤（βＡＲＫｃｔ）、タンパク質ホスファターゼ１の阻害剤１、Ｓ１００Ａ１、パルバルブミン、アデニリルシクラーゼ６型、Ｇ−タンパク質連結受容体キナーゼ２型ノックダウンに影響を及ぼす分子、例えば、切断された構成的活性型のβＡＲＫｃｔ、Ｐｉｍ−１、ＰＧＣ−１α、ＳＯＤ−１、ＳＯＤ−２、ＥＣ−ＳＯＤ、カリクレイン、ＨＩＦ、チモシン−β４、ｍｉｒ−１、ｍｉｒ−１３３、ｍｉｒ−２０６、および／またはｍｉｒ−２０８をコードする導入遺伝子を含む。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを、任意の好適な手段によって、任意に、ｃｅＤＮＡベクターを含む呼吸域粒子のエアロゾル懸濁液を投与することによって、対象の肺に投与することができ、これを対象が吸入する。呼吸域粒子は、液体または固体であり得る。ｃｅＤＮＡベクターを含む液体粒子のエアロゾルは、当業者に既知であるように、圧力駆動型エアロゾル噴霧器または超音波噴霧器を用いるなど、任意の好適な手段によって産生され得る。例えば、米国特許第４，５０１，７２９号を参照されたい。本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む固体粒子のエアロゾルは、薬学分野において既知の技法によって、任意の固体粒子薬剤エアロゾル生成器を用いて同様に産生され得る。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、ＣＮＳ（例えば、脳、眼）の組織に投与することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、遺伝子障害、神経変性障害、精神障害、および腫瘍を含むＣＮＳの疾患を治療、改善、または予防するために投与され得る。ＣＮＳの例示的な疾患としては、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、カナバン病、リー病、レフサム病、トゥーレット症候群、原発性側索硬化症、筋委縮性側索硬化症、進行性筋萎縮、ピック病、筋ジストロフィー、多発性硬化症、重症筋無力症、ビンスワンガー病、脊椎または頭部傷害に起因する外傷、タイ・サック病、リーシュ・ナイアン病、癲癇、脳梗塞、気分障害（例えば、抑うつ、双極性感情障害、持続性感情障害、二次気分障害）を含む精神障害、統合失調症、薬物依存（例えば、アルコール依存および他の薬物依存）、ノイローゼ（例えば、不安症、強迫性障害、身体表現性障害、解離性障害、悲痛、産後うつ病）、精神病（例えば、幻覚および妄想）、認知症、偏執病、注意欠陥障害、精神性的障害、睡眠障害、疼痛障害、摂食または体重障害（例えば、肥満、悪液質、拒食症、および過食症）、ならびにＣＮＳの癌および腫瘍（例えば、下垂体腫瘍）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３５９】
本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターで治療、改善、または予防され得る眼障害としては、網膜、後視床路、および視神経に関与する眼科障害（例えば、網膜色素変性、糖尿病性網膜症、および他の網膜変性疾患、ブドウ膜炎、加齢性黄斑変性、緑内障）が挙げられる。多くの眼科疾患および障害は、（１）血管新生、（２）炎症、および（３）変性の３種類の適応症のうちの１つ以上に関連している。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを用いて、抗血管新生因子、抗炎症性因子、細胞変性を遅らせる、細胞節約を促進する、または細胞増殖を促進する因子、およびそれらの組み合わせを送達することができる。糖尿病性網膜症は、例えば、血管新生によって特徴付けられる。糖尿病性網膜症は、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）のいずれかで１つ以上の抗血管新生因子を送達することによって治療され得る。１つ以上の神経栄養因子を、眼内（例えば、硝子体内）または眼周囲のいずれかに共送達することもできる。本発明のｃｅＤＮＡベクターを治療、改善、または予防され得る追加の眼疾患としては、地図状萎縮、血管性または「滲出型」黄斑変性、スタルガルト病、レーバー先天黒内障（ＬＣＡ）、アッシャー症候群、弾性線維性偽性黄色腫（ＰＸＥ）、Ｘ連鎖性網膜色素変性（ＸＬＲＰ）、Ｘ連鎖性網膜分離症（ＸＬＲＳ）、全脈絡膜萎縮、レーバー遺伝性視神経萎縮症（ＬＨＯＮ）、色盲、錐体杆体変性、フックス角膜内皮変性症、糖尿病黄斑浮腫、ならびに眼の癌および腫瘍が挙げられる。
【０３６０】
いくつかの実施形態では、炎症性眼疾患または障害（例えば、ブドウ膜炎）は、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターによって治療、改善、または予防され得る。１つ以上の抗炎症性因子は、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターの眼内（例えば、硝子体または前眼房）投与によって発現され得る。他の実施形態では、網膜変性（例えば、網膜色素変性症）を特徴とする眼の疾患または障害は、本発明のｃｅＤＮＡベクターによって治療、改善、または予防され得る。１つ以上の神経栄養因子をコードする、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターの眼内（例えば、硝子体投与）を使用して、そのような網膜変性に基づく疾患を治療することができる。いくつかの実施形態では、血管新生および網膜変性（例えば、加齢性黄斑変性）の両方に関与する疾患または障害は、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターで治療され得る。加齢性黄斑変性は、眼内に１つ以上の神経栄養因子および／または眼内もしくは眼周囲（例えば、テノン嚢下領域内）に１つ以上の抗血管新生因子をコードする、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを投与することによって治療され得る。緑内障は、増加した眼圧および網膜神経節細胞の喪失を特徴とする。緑内障の治療は、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターを使用して興奮毒性損傷から細胞を保護する１種以上の神経保護剤の投与を含む。したがって、そのような薬剤としては、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸塩（ＮＭＤＡ）アンタゴニスト、サイトカイン、および神経栄養因子は、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、眼内、任意に硝子体内に送達され得る。
【０３６１】
他の実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、発作を治療する、例えば、発作の徴候、発生率、または重症度を低減することができる。発作の治療的処置の有効性は動作的（例えば、揺動、眼もしくは口のチック）および／または電子記録的手段（ほとんどの発作は、顕著な電子記録的異常を有する）によって評価され得る。したがって、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、経時的に複数の発作によってマークされる癲癇を治療することもできる。代表的な一実施形態では、脳下垂体腫瘍を治療するために、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターを使用して、ソマトスタチン（またはその活性断片）が脳に投与される。この実施形態に従い、ソマトスタチン（またはその活性断片）をコードする本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、脳下垂体への微小注入によって投与される。同様に、そのような治療を使用して、末端肥大症（脳下垂体からの異常な成長ホルモン分泌）を治療することができる。ソマトスタチンの核酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｊ００３０６）およびアミノ酸（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号Ｐ０１１６６、処理された活性ペプチドソマトスタチン−２８およびソマトスタチン−１４を含有する）配列は、当該技術分野において既知のとおりである。特定の実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターは、米国特許第７，０７１，１７２号に記載される分泌シグナルを含む導入遺伝子をコードすることができる。
【０３６２】
本発明の別の態様は、インビボでの対象への全身送達のためのアンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、または他の機能的ＲＮＡ（例えば、リボザイム）を産生するための、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターの使用に関する。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、アンチセンス核酸、リボザイム（例えば、米国特許第５，８７７，０２２号に記載される）、スプライソソーム媒介性トランススプライシングに影響を及ぼすＲＮＡ（Ｐｕｔｔａｒａｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：２４６、米国特許第６，０１３，４８７号、米国特許第６，０８３，７０２号を参照）、遺伝子サイレンシングを媒介する干渉ＲＮＡ（ＲＮＡｉ）（Ｓｈａｒｐ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８７：２４３１を参照）または他の非翻訳ＲＮＡ、例えば「ガイド」ＲＮＡ（Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：４９２９、Ｙｕａｎらへの米国特許第５，８６９，２４８号）などをコードする導入遺伝子を含み得る。
【０３６３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターはまた、レポーターポリペプチド（例えば、緑色蛍光タンパク質またはアルカリホスファターゼなどの酵素）をコードする導入遺伝子をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、実験または診断の目的で有用なレポータータンパク質をコードする導入遺伝子は、β−ラクタマーゼ、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、アルカリホスファターゼ、チミジンキナーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ルシフェラーゼ、および当該技術分野において周知の他のもののうちのいずれかから選択される。いくつかの態様では、レポーターポリペプチドをコードする導入遺伝子を含む合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを、診断目的のために、またはそれらが投与される対象におけるｃｅＤＮＡベクターの活性のマーカーとして使用することができる。
【０３６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、宿主染色体と相同性を共有し、宿主染色体上の遺伝子座と組み替える、導入遺伝子または異種ヌクレオチド配列を含み得る。このアプローチを利用して、宿主細胞中の遺伝子欠陥を訂正することができる。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成産生方法によって産生されたｃｅＤＮＡベクターは、対象における免疫原性ポリペプチドを発現するため、例えば、ワクチン接種のために使用され得る導入遺伝子を含み得る。導入遺伝子は、当該技術分野において既知の関心対象の任意の免疫原をコードし得、ヒト免疫不全ウイルス、インフルエンザウイルス、ｇａｇタンパク質、腫瘍抗原、癌抗原、細菌抗原、ウイルス抗原などからの免疫原が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３６６】
Ｄ．ｃｅＤＮＡベクターを使用した良好な遺伝子発現の試験
当該技術分野で周知のアッセイを使用して、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによる遺伝子送達の効率を試験することができ、インビトロおよびインビボの両方のモデルで実施され得る。合成的に産生されたｃｅＤＮＡによる所望の導入遺伝子のノックインまたはノックアウトは、所望の導入遺伝子のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルを測定することによって（例えば、逆転写ＰＣＲ、ウエスタンブロット分析、および酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ））当業者により評価され得る。合成的に産生されたｃｅＤＮＡによる核酸変更（例えば、点突然変異、ＤＮＡ領域の欠失）は、ゲノム標的ＤＮＡのディープシーケンシングによって評価することができる。一実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡは、例えば、蛍光顕微鏡法または発光プレートリーダーによりレポータータンパク質の発現を調べることによって、所望の導入遺伝子の発現を評価するために使用できるレポータータンパク質を含む。インビボ適用の場合、タンパク質機能アッセイを使用して、所与の遺伝子および／または遺伝子産物の機能を試験して、遺伝子発現が成功したかどうかを判断することができる。例えば、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス調節因子遺伝子（ＣＦＴＲ）の点突然変異は、アニオン（例えば、Ｃｌ−）をアニオンチャネルを介して移動させる能力を阻害し、機能的（すなわち非突然変異型）ＣＦＴＲ遺伝子をｃｅＤＮＡベクターとともに対象に送達することによって訂正され得ることが想定される。ｃｅＤＮＡベクターの投与後、当業者は、アニオンがアニオンチャネルを通って移動する能力を評価して、ＣＦＴＲ遺伝子が送達および発現されたかどうかを決定することができる。当業者は、インビトロまたはインビボでタンパク質の機能性を測定するための最良の試験を決定することができるであろう。
【０３６７】
本明細書では、細胞または対象におけるｃｅＤＮＡベクターからの導入遺伝子の遺伝子発現の効果は、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１０か月、少なくとも１２か月、少なくとも１８か月、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年にわたって継続し得るか、または永続的であり得ることが企図される。
【０３６８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される発現カセット、発現構築物、またはｃｅＤＮＡベクター中の導入遺伝子は、宿主細胞に対して最適化されたコドンであり得る。本明細書で使用される場合、「最適化されたコドン」または「コドン最適化」という用語は、関心対象の脊椎動物、例えばマウスまたはヒト（例えば、ヒト化）の細胞中の発現強化のために、少なくとも１つ、２つ以上、または相当数の未変性配列（例えば、原核細胞配列）のコドンを、その脊椎動物の遺伝子中でより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンと置き換えることによって、核酸配列を修飾するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のある特定のコドンに対して特定の偏向を呈する。典型的には、コドン最適化は、元の翻訳されたタンパク質のアミノ酸配列を変更しない。最適化されたコドンは、例えば、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅ（登録商標）コドン最適化およびカスタム遺伝子合成プラットフォーム（Ａｐｔａｇｅｎ，Ｉｎｃ．）または別の公的に入手可能なデータベースを使用して判定され得る。
【０３６９】
ＸＩ．投与
特定の実施形態では、２回以上の投与（例えば、２、３、４回またはそれ以上の投与）を用いて、様々な間隔の期間にわたって（例えば、毎日、毎週、毎月、毎年など）、所望のレベルの遺伝子発現を達成することができる。
【０３７０】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの例示的な投与形態としては、経口、直腸、経粘膜、鼻腔内、吸入（例えば、エアロゾルを介した）、頬側（例えば、舌下）、膣、髄腔内、眼内、経皮、内皮内、子宮内（または卵内）、非経口（例えば、静脈内、皮下、皮内、頭蓋内、筋肉内［骨格、横隔膜、および／または心筋への投与を含む］、胸膜内、脳内、および動脈内）、局所（例えば、気道表面を含む皮膚および粘膜表面への、ならびに経皮投与）、リンパ内など、ならびに直接組織または器官注入（例えば、肝臓、眼、骨格筋、心筋、横隔膜、筋肉、もしくは脳への）が挙げられる。
【０３７１】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの投与は、脳、骨格筋、平滑筋、心臓、横隔膜、気道上皮、肝臓、腎臓、脾臓、膵臓、皮膚、および眼からなる群から選択される部位を含むが、これらに限定されない、対象の任意の部位に対して行われ得る。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの投与はまた、腫瘍（例えば、腫瘍またはリンパ節内またはその付近）に対するものであり得る。任意の所与の症例における最も好適な経路は、治療、改善、および／または予防される病態の性質および重症度、ならびに使用されている特定のｃｅＤＮＡベクターの性質に依存する。追加として、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡは、単一のベクターまたは複数のｃｅＤＮＡベクター（例えば、ｃｅＤＮＡカクテル）中に複数の導入遺伝子を投与できるようにする。
【０３７２】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの、本発明に従う骨格筋への投与としては、肢（例えば、上腕、下腕、上肢、および／または下肢）、腰、首、頭（例えば、舌）、咽頭、腹部、骨盤／会陰、および／または指の骨格筋への投与が挙げられるが、これらに限定されない。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内、四肢灌流（任意に、脚および／もしくは腕の単離された四肢灌流、例えば、Ａｒｒｕｄａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｂｌｏｏｄ  １０５：３４５８−３４６４を参照）ならびに／または直接筋肉内注入によって骨格筋に送達され得る。特定の実施形態では、本明細書に開示されるｃｅＤＮＡベクターは、対象（例えば、ＤＭＤなどの筋ジストロフィーを有する対象）に、四肢灌流、任意に単離された四肢灌流（例えば、静脈内または動脈内投与による）によって投与される。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、「流体力学的」技法を用いることなく投与され得る。
【０３７３】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの、心筋への投与としては、左心房、右心房、左心室、右心室、および／または中隔への投与が挙げられる。本明細書に記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、静脈内投与、大動脈内投与などの動脈内投与、直接心臓注入（例えば、左心房、右心房、左心室、右心室への）、および／または冠動脈灌流によって心筋に送達され得る。横隔膜筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。平滑筋への投与は、静脈内投与、動脈内投与、および／または腹腔内投与を含む任意の好適な方法によって行われ得る。一実施形態では、投与は、平滑筋内、その付近、および／またはその上に存在する内皮細胞に対して行われ得る。
【０３７４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、骨格筋、横隔膜筋、および／または心筋に投与される（例えば、筋ジストロフィーまたは心疾患（例えば、ＰＡＤもしくはうっ血性心不全）を治療、改善、および／または予防するため）。
【０３７５】
Ａ．エクスビボ治療
いくつかの実施形態では、細胞を対象から除去し、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターをその中に導入した後、細胞を対象に戻す。エクスビボでの治療のために対象から細胞を除去し、続いて対象に戻す方法は、当該技術分野において既知である（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号を参照されたく、その開示は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。代替として、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、別の対象からの細胞中に、培養細胞中に、または任意の他の好適な源からの細胞中に導入され、これらの細胞は、それを必要とする対象に投与される。
【０３７６】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターで形質導入された細胞は、好ましくは、薬学的担体と組み合わせて「治療有効量」で対象に投与される。当業者であれば、いくらかの利益が対象にもたらされる限り、治療効果が完全または治癒的である必要はないことを理解するであろう。
【０３７７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、望ましくはインビトロ、エクスビボ、またはインビボで細胞中で産生される任意のポリペプチドである、導入遺伝子（時には異種ヌクレオチド配列と呼ばれる）をコードすることができる。例えば、本明細書で前述される治療の方法におけるｃｅＤＮＡベクターの使用とは対照的に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、例えば、抗原またはワクチンの産生のために、培養した細胞、およびそれから単離された発現遺伝子産物中に導入されてもよい。
【０３７８】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、獣医学および医療の両方の用途で使用することができる。上記のエクスビボ遺伝子送達方法に好適な対象としては、鳥類（例えば、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、ウズラ、七面鳥、およびキジ）および哺乳動物（例えば、ヒト、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、ネコ、イヌ、およびウサギ類）が挙げられ、哺乳動物が好ましい。ヒト対象が最も好ましい。ヒト対象は、新生児、幼児、少年、および成人を含む。
【０３７９】
本明細書に記載される技術の一態様は、導入遺伝子を細胞に送達する方法に関する。典型的には、インビトロ方法では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターを、本明細書に開示される方法および当技術分野で既知の他の方法を使用して細胞に導入することができる。本明細書に開示されている、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、好ましくは、生物学的に有効な量で細胞に投与される。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターがインビボで細胞に（例えば、対象に）投与される場合、ｃｅＤＮＡベクターの生物学的に有効な量は、標的細胞における導入遺伝子の形質導入および発現をもたらすのに十分な量である。
【０３８０】
Ｂ．用量範囲
インビボおよび／またはインビトロアッセイを任意に用いて、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの使用のための最適投与量範囲を特定するのを助けることができる。製剤に用いられる正確な用量はまた、投与経路および病態の重症度に依存し、当業者の判断および各対象の状況に従って決定されるべきである。有効用量は、インビトロまたは動物モデル試験系に由来する用量反応曲線から推定され得る。
【０３８１】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターは、所望の組織の細胞をトランスフェクトし、過度の有害作用なしに、十分なレベルの遺伝子導入および発現をもたらすのに十分な量で投与される。従来の薬学的に許容される投与経路としては、「投与」セクションで上述されるもの、例えば選択された器官への直接送達（例えば、肝臓への門脈内送達）、経口、吸入（鼻腔内および気管内送達を含む）、眼内、静脈内、筋肉内、皮下、皮内、および他の非経口投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。投与経路は、所望の場合、組み合わせることができる。
【０３８２】
特定の「治療効果」を達成するために必要な合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの量の用量は、核酸投与の経路、治療効果を達成するために必要な遺伝子またはＲＮＡ発現のレベル、治療される特定の疾患または障害、および遺伝子（複数可）、ＲＮＡ産物（複数可）、または得られる発現タンパク質（複数可）の安定性を含むが、これらに限定されないいくつかの因子に基づいて変化する。当業者は、前述の因子ならびに当該技術分野において周知の他の因子に基づいて、特定疾患または障害を有する患者を治療するための合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター用量範囲を容易に判定することができる。
【０３８３】
最適な治療反応を提供するように、投与量レジームを調整することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、繰り返し投与することができ、例えば、いくつかの用量が毎日投与され得るか、または治療状況の急迫によって示されるように、用量を比例的に低減することができる。当業者は、オリゴヌクレオチドが細胞に投与されるか、または対象に投与されるかにかかわらず、対象オリゴヌクレオチドの投与の適切な用量およびスケジュールを容易に判定することができる。
【０３８４】
「治療有効量」は、臨床治験を通じて判定され得る比較的広い範囲内に含まれ、特定の用途に依存する（神経細胞は、極少量を必要とするが、全身注入は、多量を必要とする）。例えば、ヒト対象の骨格筋または心筋への直接インビボ注入の場合、治療有効量は、およそ約１μｇ〜１００ｇのｃｅＤＮＡベクターとなる。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターを送達するためにエキソソームまたは微粒子が使用される場合、治療有効量は、経験的に判定され得るが、１μｇ〜約１００ｇのベクターを送達することが予想される。さらに、治療上有効な量とは、疾患の１つ以上の症状の低減をもたらすが、著しいオフターゲットまたは著しい有害副作用には至らない、対象に影響を与えるのに十分な量の導入遺伝子を発現するｃｅＤＮＡベクターの量である。
【０３８５】
薬学的に許容される賦形剤および担体溶液の配合は、様々な治療レジメンにおいて本明細書に記載される特定の組成物を使用するための好適な投与および治療レジメンの開発と同様に、当業者に周知である。
【０３８６】
インビトロトランスフェクションの場合、細胞（１×１０６細胞）に送達される、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターの有効量は、およそ０．１〜１００μｇのｃｅＤＮＡベクター、好ましくは１〜２０μｇ、より好ましくは１〜１５μｇまたは８〜１０μｇとなる。より大きなｃｅＤＮＡベクターは、より高い用量を必要とする。エキソソームまたは微粒子が使用される場合、有効なインビトロ用量は、経験的に判定されるが、一般に同量のｃｅＤＮＡベクターを送達することが意図される。
【０３８７】
治療は、単一用量または複数用量の投与を必要とし得る。いくつかの実施形態では、複数の用量を対象に投与することができ、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、ウイルスカプシドの非存在に起因して、抗カプシド宿主免疫反応を誘起する誘起せず、その製剤は、その合成産生に起因して望ましくない細胞汚染物質を含有しないため、実際に、必要に応じて複数の用量を投与することができる。そのようなものとして、当業者は、適切な用量数を判定することができる。投与される用量数は、例えば、およそ１〜１００、好ましくは２〜２０用量であり得る。
【０３８８】
任意の特定の理論に束縛されるものではないが、本開示によって記載される合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの投与によって誘起される典型的な抗ウイルス免疫反応の欠失（すなわち、カプシド構成成分の非存在）は、複数の場合に合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターを宿主に投与できるようになる。いくつかの実施形態では、異種核酸が対象に送達される場合の数は、２〜１０回の範囲内（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０回）である。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターは、１０回より多く対象に送達される。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦日（例えば、２４時間）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、２、３、４、５、６、または７暦日あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴週（例えば、７歴日）あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、２週間に１回（例えば、２暦週期間に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、１暦月あたり１回（例えば、３０歴日に１回）だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、６暦月あたり１回だけ対象に投与される。いくつかの実施形態では、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターの用量は、歴年（例えば、３６５日または閏年では３６６日）あたり１回だけ対象に投与される。
【０３９０】
Ｃ．単位剤形
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、単位剤形で便宜的に提示され得る。単位剤形は、典型的に、薬学的組成物の１つ以上の投与経路に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、吸入による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、蒸発器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、噴霧器による投与に適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、エアロゾル化器による投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、経口投与のため、頬側投与のため、または舌下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、静脈内、筋肉内、または皮下投与のために適合される。いくつかの実施形態では、単位剤形は、髄腔内または脳室内投与のために適合される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、局所投与のために製剤化される。単一剤形を産生するために担体材料と複合され得る活性成分の量は、一般に、治療効果をもたらす化合物の量となる。
【０３９１】
ＸＩＩ．様々な用途
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生された組成物および閉端ＤＮＡベクター（ｃｅＤＮＡベクターを含む）を使用して、上記のような様々な目的で導入遺伝子を送達することができる。いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、タンパク質をコードするか、または機能的ＲＮＡであり得、いくつかの実施形態では、研究目的、例えば、１つ以上の突然変異を有する体細胞トランスジェニック動物モデルを創り出すため、例えば、標的遺伝子の機能を研究するために修飾されたタンパク質または機能的ＲＮＡであり得る。別の実施例では、導入遺伝子は、疾患の動物モデルを創り出すためにタンパク質または機能的ＲＮＡをコードする。
【０３９２】
いくつかの実施形態では、導入遺伝子は、哺乳類対象における疾患状態の治療、改善、または予防に有用である、１つ以上のペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質をコードする。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターによって発現された導入遺伝子は、異常な遺伝子配列に関連する疾患を治療するのに十分な量で患者に投与され得、これは標的遺伝子の発現の低減、発現の欠如、または機能不全のうちのいずれか１つ以上をもたらし得る。
【０３９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、診断およびスクリーニング方法における使用のために想定され、これにより導入遺伝子は、細胞培養系または代替としてトランスジェニック動物モデルにおいて一時的または安定して発現される。
【０３９４】
本明細書に記載される技術の別の態様は、哺乳類細胞の集団を形質導入する方法を提供する。全体的かつ一般的な意味において、この方法は、少なくとも有効量の本明細書に開示される合成的に産生されたｃｅＤＮＡのうちの１つ以上を含む組成物を、その集団の１つ以上の細胞に導入するステップを含む。
【０３９５】
追加として、本発明は、１つ以上の追加の成分で配合されるか、またはそれらの使用のために１つ以上の指示で調製された、本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクター組成物を含む開示された閉端ＤＮＡのうちの１つ以上を含む、組成物、ならびに治療および／または診断キットを提供する。
【０３９６】
本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含む閉端ＤＮＡベクターが投与される細胞は、任意のタイプのものであり得、神経細胞（末梢および中枢神経系の細胞、特に脳細胞を含む）、肺細胞、腎細胞、上皮細胞（例えば、胃および呼吸器上皮細胞）、筋細胞、樹状細胞、膵細胞（島細胞を含む）、肝細胞、心筋細胞、骨細胞（例えば、骨髄幹細胞）、造血幹細胞、脾臓細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、内皮細胞、前立腺細胞、生殖細胞などが挙げられるが、これらに限定されない。代替として、細胞は、任意の前駆細胞であり得る。さらなる代替として、細胞は、幹細胞（例えば、神経幹細胞、肝幹細胞）であり得る。なおもさらなる代替として、細胞は、癌または腫瘍細胞であり得る。さらに、細胞は、上に示されるように、任意の種の起源に由来し得る。
【０３９７】
いくつかの実施形態では、本出願は、以下のパラグラフのうちのいずれかに定義され得る。
１．ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
発現カセット、
発現カセットの上流（５´末端）にあるＩＴＲ、
発現カセットの下流（３´末端）にあるＩＴＲ、
および制限エンドヌクレアーゼが発現カセットの遠位にあるように、ＩＴＲに隣接する少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ切断部位を含む二本鎖ＤＮＡを、
二本鎖ＤＮＡ構築物を制限エンドヌクレアーゼ部位で切断して、ＤＮＡ構築物から制限エンドヌクレアーゼ部位の間の配列を切除することができる１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させることと、
切除された配列の５´および３´末端をライゲーションしてＤＮＡベクターを形成することと、を含み、少なくとも１つのＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、方法。
２．二本鎖ＤＮＡ構築物が、バクミド、プラスミド、小環、または直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子である、パラグラフ１に記載の方法。
３．発現カセットの上流のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、パラグラフ１または２に記載の方法。
４．野生型ＩＴＲが、配列番号１、２、または５〜１４のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ３に記載の方法。
５．発現カセットの下流のＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、パラグラフ１〜４のいずれかに記載の方法。
６．修飾型ＩＴＲが、配列番号３のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ５に記載の方法。
７．発現カセットの上流のＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、パラグラフ１または２に記載の方法。
８．修飾型ＩＴＲが、配列番号４のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ７に記載の方法。
９．発現カセットの下流のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、パラグラフ７または８に記載の方法。
１０．野生型ＩＴＲが、配列番号１のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ９に記載の方法。
１１．ＩＴＲが、複製コンピテントである、パラグラフ１〜１０のいずれかに記載の方法。
１２．ＩＴＲが、ＡＡＶ  ＩＴＲである、パラグラフ１〜１１のいずれかに記載の方法。
１３．発現カセット配列が、シス調節エレメントを含む、パラグラフ１〜１２のいずれかに記載の方法。
１４．シス調節エレメントが、転写後調節エレメントおよびＢＧＨポリＡシグナルからなる群から選択される、パラグラフ１３に記載の方法。
１５．転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ１４に記載の方法。
１６．発現カセットが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択されるプロモーターをさらに含む、パラグラフ１〜１５のいずれかに記載の方法。
１７．当該発現カセットが、配列番号７２、配列番号１２３または配列番号１２４、配列番号６７、および配列番号６８のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ１６に記載の方法。
１８．当該発現カセットが、外因性配列をさらに含む、パラグラフ１〜１７のいずれかに記載の方法。
１９．外因性配列が、少なくとも２０００または５０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ１〜１８に記載の方法。
２０．外因性配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ１９に記載の方法。
２１．外因性配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、パラグラフ２０に記載の方法。
２２．ＤＮＡベクターが、直鎖状で連続的な構造を有する、パラグラフ１〜２１のいずれかに記載の方法。
２３．パラグラフ１〜２２のいずれかに記載の方法によって生成される、ＤＮＡベクター。
２４．パラグラフ２３に記載のＤＮＡベクターおよび任意で賦形剤を含む、薬学的組成物。
２５．ＤＮＡベクターを生成するためのポリヌクレオチドであって、
発現カセット、
発現カセットの上流（５´末端）にあるＩＴＲ、
発現カセットの下流（３´末端）にあるＩＴＲ、
および制限エンドヌクレアーゼが発現カセットの遠位にあるように、ＩＴＲに隣接する少なくとも２つの制限エンドヌクレアーゼ部位を含み、少なくとも１つのＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、ポリヌクレオチド。
２６．ポリヌクレオチドが、バクミド、プラスミド、小環、または直鎖状二本鎖ＤＮＡ分子である、パラグラフ２５に記載のポリヌクレオチド。
２７．発現カセットの上流のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、パラグラフ２５または２６に記載のポリヌクレオチド。
２８．野生型ＩＴＲが、配列番号２のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ２７に記載のポリヌクレオチド。
２９．発現カセットの下流のＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、パラグラフ２５〜２８のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
３０．修飾型ＩＴＲが、配列番号３のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ２９に記載のポリヌクレオチド。
３１．発現カセットの上流のＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、パラグラフ２５または２６に記載のポリヌクレオチド。
３２．修飾型ＩＴＲが、配列番号４のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ３１に記載のポリヌクレオチド。
３３．発現カセットの上流のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、パラグラフ３１または３２に記載のポリヌクレオチド。
３４．野生型ＩＴＲが、配列番号１のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ３３に記載のポリヌクレオチド。
３５．野生型ＩＴＲが、複製コンピテントである、パラグラフ２５〜３４のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
３６．ＩＴＲが、ＡＡＶ  ＩＴＲである、パラグラフ２５〜３５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
３７．発現カセットが、シス調節エレメントを含む、パラグラフ２５〜３６のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
３８．シス調節エレメントが、転写後調節エレメントおよびＢＧＨポリＡシグナルからなる群から選択される、パラグラフ３７に記載のポリヌクレオチド。
３９．転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ３８に記載のポリヌクレオチド。
４０．発現カセットが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択されるプロモーターをさらに含む、パラグラフ２５〜３９のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
４１．当該発現カセットが、配列番号７２、配列番号１２３または配列番号１２４、配列番号６７、および配列番号６８のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ４０に記載のポリヌクレオチド。
４２．当該発現カセットが、外因性配列をさらに含む、パラグラフ２５〜４１のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
４３．外因性配列が、少なくとも５０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ４２に記載のポリヌクレオチド。
４４．外因性配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ４３に記載のポリヌクレオチド。
４５．外因性配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、パラグラフ４４記載のポリヌクレオチド。
４６．ＤＮＡベクターが、直鎖状で連続的な構造を有する、パラグラフ２５〜４５のいずれかに記載のポリヌクレオチド。
４７．ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
５´から３´に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
ヘアピン配列、
アンチセンス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、および
アンチセンス第１のＩＴＲを含む、一本鎖ＤＮＡ分子を合成することと、
一本鎖分子からヘアピンポリヌクレオチドを形成することと、
５´および３´末端をライゲーションしてＤＮＡベクターを形成することと、を含み、少なくとも１つのＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、方法。
４８．第１のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、パラグラフ４７に記載の方法。
４９．野生型ＩＴＲが、配列番号２のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ４８に記載の方法。
５０．第２のＩＴＲが修飾型ＩＴＲである、パラグラフ４７〜４９のいずれかに記載の方法。
５１．修飾型ＩＴＲが、配列番号３のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ５０に記載の方法。
５２．第１のＩＴＲ上流が、修飾型ＩＴＲである、パラグラフ４７に記載の方法。
５３．修飾型ＩＴＲが、配列番号４のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ５２に記載の方法。
５４．第２のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、パラグラフ５２または５３に記載の方法。
５５．野生型ＩＴＲが、配列番号１のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ５４に記載の方法。
５６．野生型ＩＴＲが、複製コンピテントである、パラグラフ４７〜５５のいずれかに記載の方法。
５７．ＩＴＲが、ＡＡＶ  ＩＴＲである、パラグラフ４７〜５６のいずれかに記載の方法。
５８．発現カセット配列が、シス調節エレメントを含む、パラグラフ４７〜５７のいずれかに記載の方法。
５９．シス調節エレメントが、転写後調節エレメントおよびＢＧＨポリＡシグナルからなる群から選択される、パラグラフ５８に記載の方法。
６０．転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ５９に記載の方法。
６１．発現カセットが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択されるプロモーターをさらに含む、パラグラフ４７〜６０のいずれかに記載の方法。
６２．当該発現カセットが、配列番号７２、配列番号１２３または配列番号１２４、配列番号６７、および配列番号６８のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ６１に記載の方法。
６３．当該発現カセットが、外因性配列をさらに含む、パラグラフ４７〜６２のいずれかに記載の方法。
６４．外因性配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ６３に記載の方法。
６５．外因性配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ６３に記載の方法。
６６．外因性配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、パラグラフ６５に記載の方法。
６７．ＤＮＡベクターが、直鎖状で連続的な構造を有する、パラグラフ４７〜６６のいずれかに記載の方法。
６８．パラグラフ４７〜６７のいずれかに記載の方法によって生成される、ＤＮＡベクター。
６９．
パラグラフ６８に記載のＤＮＡベクターと、
任意で賦形剤と、を含む、薬学的組成物。
７０．ＤＮＡベクターを調製する方法であって、
第１のＩＴＲを含む第１の一本鎖ＩＴＲ分子を合成することと、
第２のＩＴＲを含む第２の一本鎖ＩＴＲ分子を合成することと、
発現カセット配列を含む二本鎖ポリヌクレオチドを提供することと、
第１のＩＴＲ分子の５´および３´末端を二本鎖分子の第１の末端にライゲーションし、第２のＩＴＲ分子の５´および３´末端を二本鎖分子の第２の末端にライゲーションして、ＤＮＡベクターを形成することと、を含む、方法。
７１．二本鎖ポリヌクレオチドが、二本鎖ＤＮＡ構築物から二本鎖分子を切除することによって提供される、パラグラフ７０に記載の方法。
７２．第１のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、パラグラフ７０または７１に記載の方法。
７３．野生型ＩＴＲが、配列番号２のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ７２に記載の方法。
７４．第２のＩＴＲが、修飾型ＩＴＲである、パラグラフ７０〜７３のいずれかに記載の方法。
７５．修飾型ＩＴＲが、配列番号３のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ７４に記載の方法。
７６．第１のＩＴＲ上流が、修飾型ＩＴＲである、パラグラフ７０または７１に記載の方法。
７７．修飾型ＩＴＲが、配列番号４のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ７６に記載の方法。
７８．第２のＩＴＲが、野生型ＩＴＲである、パラグラフ７６または７７に記載の方法。
７９．野生型ＩＴＲが、配列番号１のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ７８に記載の方法。
８０．野生型ＩＴＲが、複製コンピテントである、パラグラフ７０〜７９のいずれかに記載の方法。
８１．ＩＴＲが、ＡＡＶ  ＩＴＲである、パラグラフ７０〜８０のいずれかに記載の方法。
８２．発現カセット配列が、シス調節エレメントを含む、パラグラフ７０〜８１のいずれかに記載の方法。
８３．シス調節エレメントが、転写後調節エレメントおよびＢＧＨポリＡシグナルからなる群から選択される、パラグラフ８２に記載の方法。
８４．転写後調節エレメントが、ＷＨＰ転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）を含む、パラグラフ８３に記載の方法。
８５．発現カセットが、ＣＡＧプロモーター、ＡＡＴプロモーター、ＬＰ１プロモーター、およびＥＦ１ａプロモーターからなる群から選択されるプロモーターをさらに含む、パラグラフ７０〜８４のいずれかに記載の方法。
８６．当該発現カセットが、配列番号７２、配列番号１２３または配列番号１２４、配列番号６７、および配列番号６８のポリヌクレオチドを含む、パラグラフ７０〜８５に記載の方法。
８７．当該発現カセットが、外因性配列をさらに含む、パラグラフ７０〜８６のいずれかに記載の方法。
８８．外因性配列が、少なくとも２０００ヌクレオチドを含む、パラグラフ７０〜８７に記載の方法。
８９．外因性配列が、タンパク質をコードする、パラグラフ８８に記載の方法。
９０．外因性配列が、レポータータンパク質、治療用タンパク質、抗原、遺伝子編集タンパク質、または細胞毒性タンパク質をコードする、パラグラフ８８に記載の方法。
９１．ＤＮＡベクターが、直鎖状で連続的な構造を有する、パラグラフ７０〜９０のいずれかに記載の方法。
９２．パラグラフ７０〜９１のいずれかに記載の方法によって生成される、ＤＮＡベクター。
９３．パラグラフ９２に記載のＤＮＡベクターおよび任意で賦形剤を含む、薬学的組成物。
９４．ライゲーションステップが、化学ライゲーションを含む、パラグラフ１〜２２、４７〜６７、および７０〜９１のいずれかに記載の方法。
９５．ライゲーションステップが、ライゲーションコンピテントタンパク質とのライゲーションを含む、パラグラフ１〜２２、４７〜６７、および７０〜９１のいずれかに記載の方法。
９６．ライゲーションコンピテントタンパク質が、ＡＡＶ  Ｒｅｐである、パラグラフ９５に記載の方法。
９７．ＩＴＲＳが、配列番号１０１および配列番号１０２、配列番号１０３および配列番号１０４、配列番号１０５および配列番号１０６、配列番号１０７および配列番号１０８、配列番号１０９および配列番号１１０、配列番号１１１および配列番号１１２、配列番号１１３および配列番号１１４、ならびに配列番号１１５および配列番号１１６、もしくは配列番号１〜４８、配列番号１６５〜１８７のうちのいずれかからなる群から、または表２、４Ａ、４Ｂ、もしくは５のうちのいずれかに記載されている配列から選択されるＩＴＲの対から選択される、パラグラフ１、２５、４７、および７０のいずれかに記載の方法。
９８．本明細書に開示される１つ以上の方法のステップを含むプロセスによって得られるか、または得ることができる、単離されたＤＮＡベクター。
９９．パラグラフ１〜２２のいずれか１つに記載のステップを含む方法によって得られる、単離されたＤＮＡベクター。
１００．パラグラフ１〜２２のいずれか１つに記載のステップを含む方法によって得られる、単離されたＤＮＡベクター。
１０１．パラグラフ４７〜６７のいずれか１つに記載のステップを含む方法によって得られる、単離されたＤＮＡベクター。
１０２．パラグラフ４７〜６７のいずれか１つに記載のステップを含む方法によって得られる、単離されたＤＮＡベクター。
１０３．パラグラフ７０〜９６のいずれか１つに記載のステップを含む方法によって得られる、単離されたＤＮＡベクター。
１０４．パラグラフ７０〜９６のいずれか１つに記載のステップを含む方法によって得られる、単離されたＤＮＡベクター。
１０５．本明細書に開示される単離されたＤＮＡベクターを含む、遺伝医学。
１０６．パラグラフ２３〜４６のいずれか１つに記載の単離されたＤＮＡベクターを含む、遺伝医学。
１０７．パラグラフ９７〜１０３のいずれか１つに記載の単離されたＤＮＡベクターを含む、遺伝医学。
【実施例】
【０３９８】
以下の実施例は、限定ではない例証によって提供される。本明細書に記載される合成プロセスを使用して産生されたｃｅＤＮＡベクターを含むＤＮＡベクターは、本明細書に記載される野生型または修飾型ＩＴＲのうちのいずれかを含む、対称または非対称ＩＴＲ構成のうちのいずれかから構築され得ること、および以下の例示的な方法を使用して、そのようなｃｅＤＮＡベクターを構築し、その活性を評価できることを当業者は理解するであろう。これらの方法は、ある特定のｃｅＤＮＡベクターを用いて例示されているが、それらは、説明に沿って任意のｃｅＤＮＡベクターを含む任意のＤＮＡベクターに適用可能である。
【０３９９】
実施例１：昆虫細胞ベースの方法を使用したｃｅＤＮＡベクターの構築
比較目的で、実施例１は、昆虫細胞ベースの方法およびポリヌクレオチド構築物テンプレートを使用するｃｅＤＮＡベクターの産生を記載し、また参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ１８／４９９９６の実施例１にも記載される。例えば、実施例１に従って本発明のｃｅＤＮＡベクターを生成するために使用されるポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、および／またはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスであり得る。理論に限定されるものではないが、許容宿主細胞中、例えば、Ｒｅｐの存在下、２つの対称ＩＴＲ（ＩＴＲのうちの少なくとも１つが、野生型ＩＴＲ配列に対して修飾されている）および発現構築物を有するポリヌクレオチド構築物テンプレートは、ｃｅＤＮＡベクターを産生するように複合する。ｃｅＤＮＡベクター産生は、第１の、テンプレート骨格（例えば、ｃｅＤＮＡ−プラスミド、ｃｅＤＮＡ−バクミド、ｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスゲノムなど）からのテンプレートの切除（「レスキュー」）、および第２の、切除したｃｅＤＮＡベクターのＲｅｐ媒介型複製の２つのステップを経る。
【０４００】
昆虫細胞を使用する方法でｃｅＤＮＡベクターを産生するための例示的な方法は、本明細書に記載されるｃｅＤＮＡ−プラスミドに由来する。図１Ａおよび１Ｂを参照すると、各ｃｅＤＮＡ−プラスミドのポリヌクレオチド構築物テンプレートは、左修飾型ＩＴＲおよび右修飾型ＩＴＲの両方を含み、ＩＴＲ配列の間には、（ｉ）エンハンサー／プロモーター、（ｉｉ）導入遺伝子のクローニング部位、（ｉｉｉ）転写後応答エレメント（例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、および（ｉｖ）ポリアデニル化シグナル（例えば、ウシ成長ホルモン遺伝子（ＢＧＨｐＡ）から）を有する。固有の制限エンドヌクレアーゼ認識部位（Ｒ１〜Ｒ６）（図１Ａおよび図１Ｂに示される）もまた、各構成成分の間に導入して、構築物中の特定部位への新たな遺伝子構成成分の導入を促進した。Ｒ３（ＰｍｅＩ）ＧＴＴＴＡＡＡＣ（配列番号１２３）およびＲ４（ＰａｃＩ）ＴＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号１２４）酵素部位は、導入遺伝子のオープンリーディングフレームを導入するために、クローニング部位の中に設計される。これらの配列を、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから取得したｐＦａｓｔＢａｃ  ＨＴ  Ｂプラスミドにクローニングした。
【０４０１】
ｃｅＤＮＡ−バクミドの産生：
ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を、製造元の指示によるプロトコルに従って、試験プラスミドまたは制御プラスミドのいずれかで形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のプラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドを生成した。バクミドおよびトランスポサーゼプラスミドの形質転換体および維持のために選択する抗生物質とともに、Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニングに基づいて（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）正の選択をスクリーニングすることによって、組み換えバクミドを選択した。β−ガラクトシダーゼ指標遺伝子を妨害する転位によって引き起こされる白色コロニーを採取し、１０ｍＬの培地中で培養した。
【０４０２】
組み換えｃｅＤＮＡ−バクミドをＥ．ｃｏｌｉから単離し、ＦｕｇｅｎｅＨＤを使用してＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。付着したＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、２５℃のＴ２５フラスコ中の５０ｍＬの培地で培養した。４日後、培養培地（Ｐ０ウイルスを含有する）を細胞から取り除き、０．４５μｍフィルターで濾過し、感染性バキュロウイルス粒子を細胞または細胞残屑から分離した。
【０４０３】
任意に、第１世代のバキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって５０〜５００ｍＬの培地中で増幅させた。オービタルシェーカー培養器内の懸濁液培養物中の細胞を、１３０ｒｐｍ、２５℃で維持し、細胞が（１４〜１５ｎｍのナイーブ直径から）１８〜１９ｎｍの直径に到達するまで、細胞直径および生存性、ならびに約４．０Ｅ＋６細胞／ｍＬの密度を監視した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離後に収集し、細胞および残屑を除去した後、０．４５μｍフィルターで濾過した。
【０４０４】
試験構築物を含むｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性または力価を判定した。具体的には、２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、２５〜２７℃でインキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０４０５】
「Ｒｅｐ−プラスミド」は、Ｒｅｐ７８（配列番号１３１もしくは１３３）またはＲｅｐ６８（配列番号１３０）およびＲｅｐ５２（配列番号１３２）またはＲｅｐ４０（配列番号１２９）の両方を含むｐＦＡＳＴＢＡＣ（商標）二重発現ベクター（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）において産生された。Ｒｅｐ−プラスミドを、製造元によって提供されるプロトコルに従って、ＤＨ１０Ｂａｃコンピテント細胞（ＭＡＸ  ＥＦＦＩＣＩＥＮＣＹ（登録商標）ＤＨ１０Ｂａｃ（商標）コンピテント細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中に形質転換した。ＤＨ１０Ｂａｃ細胞中のＲｅｐ−プラスミドとバキュロウイルスシャトルベクターとの間の組み換えを誘導して、組み換えバクミド（「Ｒｅｐ−バクミド」）を生成した。Ｘ−ｇａｌおよびＩＰＴＧを含有する細菌寒天平板上のＥ．ｃｏｌｉ中の青白スクリーニング（Φ８０ｄｌａｃＺΔＭ１５マーカーは、バクミドベクターからのβ−ガラクトシダーゼ遺伝子のα−相補性を提供する）を含む正の選択によって、組み換えバクミドを選択した。単離された白色コロニーを採取し、１０ｍＬの選択培地（ＬＢブロス中のカナマイシン、ゲンタマイシン、テトラシクリン）中に播種した。組み換えバクミド（Ｒｅｐ−バクミド）をＥ．ｃｏｌｉから単離し、Ｒｅｐ−バクミドをＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞中にトランスフェクトして、感染性バキュロウイルスを産生した。
【０４０６】
Ｓｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を、５０ｍＬの培地中で４日間培養し、感染性組み換えバキュロウイルス（「Ｒｅｐ−バキュロウイルス）を、培養物から単離した。任意に、第１世代のＲｅｐ−バキュロウイルス（Ｐ０）を、ナイーブＳｆ９またはＳｆ２１昆虫細胞を感染させることによって増幅させ、５０〜５００ｍＬの培地中で培養した。感染３日後〜８日後の間に、培地中のＰ１バキュロウイルス粒子を、遠心分離によって細胞を分離するか、または濾過もしくは別の分画プロセスのいずれかによって収集した。Ｒｅｐ−バキュロウイルスを収集し、バキュロウイルスの感染活性を判定した。具体的には、２．５×１０６細胞／ｍＬの４×２０ｍＬ  Ｓｆ９細胞培養物を、次の希釈１／１０００、１／１０，０００、１／５０，０００、１／１００，０００のＰ１バキュロウイルスで処理し、インキュベートした。感染性は、細胞直径増加の速度および細胞周期停止、ならびに細胞生存性の変化によって４〜５日間にわたって毎日判定した。
【０４０７】
ｃｅＤＮＡベクターの生成および特性評価
次いで、（１）ｃｅＤＮＡ−バクミドまたはｃｅＤＮＡ−バキュロウイルスを含有する試料、および（２）上記のＲｅｐ−バキュロウイルスのいずれかを含有するＳｆ９昆虫細胞培養培地を、Ｓｆ９細胞（２．５Ｅ＋６細胞／ｍＬ、２０ｍＬ）の新鮮な培養物に、それぞれ１：１０００および１：１０，０００の比で添加した。次いで、細胞を２５℃、１３０ｒｐｍで培養した。同時感染の４〜５日後に、細胞の直径および生存率が検出される。細胞直径が１８〜２０ｎｍに到達し、生存性が約７０〜８０％であったとき、細胞培養物を遠心分離し、培地を取り除き、細胞ペレットを収集した。最初に、細胞ペレットを、適量の水性培地（水または緩衝液のいずれか）に再懸濁する。ｃｅＤＮＡベクターを単離し、Ｑｉａｇｅｎ  ＭＩＤＩ  ＰＬＵＳ（商標）精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ、カラムあたり０．２ｍｇの処理された細胞ペレット質量）を使用して、細胞から精製した。
【０４０８】
Ｓｆ９昆虫細胞から産生および精製されるｃｅＤＮＡベクターの収率は、最初に、２６０ｎｍでのＵＶ吸光度に基づいて判定した。精製されたｃｅＤＮＡベクターは、実施例５に記載される電気泳動方法論を使用して、適切な閉端構成について評価され得る。
【０４０９】
実施例２：二本鎖ＤＮＡ分子からの切除によるｃｅＤＮＡ産生
二本鎖ＤＮＡ分子の切除を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する１つの例示的な方法。手短に言えば、ｃｅＤＮＡベクターは、二本鎖ＤＮＡ構築物を使用して生成され得る。例えば、図７Ａ〜８Ｅを参照されたい。いくつかの実施形態では、二本鎖ＤＮＡ構築物はｃｅＤＮＡプラスミドであり、例えば、２０１８年１２月６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６４２４２号の図６などを参照されたい）。
【０４１０】
いくつかの実施形態では、ｃｅＤＮＡベクターを作製するための構築物は、本明細書に記載される調節スイッチを含む。
【０４１１】
例示の目的で、実施例３は、この方法を使用して生成された例示的な閉端ＤＮＡベクターとして、ｃｅＤＮＡベクターを産生することを説明する。しかしながら、この実施例では、ＩＴＲおよび発現カセット（例えば、異種核酸配列）を含む二本鎖ポリヌクレオチドの切除に続いて、本明細書に記載される遊離３´および５´末端のライゲーションによって閉端ＤＮＡベクターを生成するインビトロ合成産生方法を例証するためにｃｅＤＮＡベクターが例示されているが、当業者は、上で例証されるように、ドギーボーンＤＮＡ、ダンベルＤＮＡなどを含むが、これらに限定されない任意の所望の閉端ＤＮＡベクターが生成されるように、二本鎖ＤＮＡポリヌクレオチド分子を修飾できることを認識する。実施例３に記載される合成産生方法によって産生され得る例示的なＤＮＡベクターは、「ＩＩ  Ｄ．合成産生方法を使用して産生されるＤＮＡベクター」、「ＩＩＩ．ｃｅＤＮＡベクター全般」、および「ＩＶ．例示的なｃｅＤＮＡベクター」と題されるセクションで論じられている。
【０４１２】
この方法は、（ｉ）二本鎖ＤＮＡ構築物から発現カセットをコードする配列を切除することと、（ｉｉ）ＩＴＲのうちの１つ以上でヘアピン構造を形成することと、（ｉｉｉ）ライゲーションによって、例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼによって遊離５´および３´末端を結合することとを伴う。
【０４１３】
二本鎖ＤＮＡ構築物は、５´から３´に順番に、第１の制限エンドヌクレアーゼ部位、上流ＩＴＲ、発現カセット、下流ＩＴＲ、および第２の制限エンドヌクレアーゼ部位を含む。次いで、二本鎖ＤＮＡ構築物を１つ以上の制限エンドヌクレアーゼと接触させて、制限エンドヌクレアーゼ部位の両方で二本鎖切断を生成する。１つのエンドヌクレアーゼが両方の部位を標的とすることも、制限部位がｃｅＤＮＡベクターテンプレート内に存在しない限り、各部位を異なるエンドヌクレアーゼによって標的とすることもできる。これにより、制限エンドヌクレアーゼ部位の間の配列が、残りの二本鎖ＤＮＡ構築物から切除される（図９を参照）。ライゲーションすると、閉端ＤＮＡベクターが形成される。
【０４１４】
この方法で使用されるＩＴＲの一方または両方は、野生型ＩＴＲであり得る。修飾型ＩＴＲが使用されてもよく、ここで修飾は、ＢおよびＢ´アームならびに／またはＣおよびＣ´アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得（例えば、図６〜８および１０を参照）、２つ以上のヘアピンループ（例えば、図６〜８を参照）または単一のヘアピンループ（例えば、図１０Ａ〜１０Ｂを参照）を有し得る。ヘアピンループ修飾型ＩＴＲは、既存のオリゴの遺伝子修飾によって、または新規の生物学的合成および／もしくは化学合成によって生成され得る。
【０４１５】
非限定的な例では、図１０Ａ〜１０Ｂ（配列番号１１１および１１２）に提供されるＩＴＲ−６左および右は、ＡＡＶ２の野生型ＩＴＲからのＢ−Ｂ´およびＣ−Ｃ´アームに４０ヌクレオチドの欠失を含む。修飾型ＩＴＲに残っているヌクレオチドは、単一のヘアピン構造を形成すると予測される。構造を展開するＧｉｂｂｓ自由エネルギーは、約−５４．４ｋｃａｌ／ｍｏｌである。機能的Ｒｅｐ結合部位またはＴｒｓ部位の任意の欠失を含む、ＩＴＲへの他の修飾を行うこともできる。
【０４１６】
実施例３：オリゴヌクレオチド構築によるｃｅＤＮＡ産生
様々なオリゴヌクレオチドの集成を伴う合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法が提供される。この実施例では、ｃｅＤＮＡベクターは、５´オリゴヌクレオチドおよび３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを合成し、ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって産生される。図１１Ｂは、５´ＩＴＲオリゴヌクレオチドおよび３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドを、発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションする例示的な方法を示す。
【０４１７】
例示の目的で、実施例３は、この方法を使用して生成された例示的な閉端ＤＮＡベクターとして、ｃｅＤＮＡベクターを生成することを説明する。しかしながら、この実施例では、本明細書に記載されるように、ＩＴＲ−オリゴヌクレオチドを発現カセット（例えば、異種核酸配列）を含む二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションすることによって閉端ＤＮＡベクターを生成するインビトロ合成産生方法を例証するためにｃｅＤＮＡベクターが例示されているが、当業者は、上で例証されるように、ドギーボーンＤＮＡ、ダンベルＤＮＡなどを含むが、これらに限定されない任意の所望の閉端ＤＮＡベクターが生成されるように、方法のパラメータを修飾できることを認識する。実施例３に記載される合成産生方法によって産生され得る例示的なＤＮＡベクターは、「ＩＩ  Ｄ．合成産生方法を使用して産生されるＤＮＡベクター」、「ＩＩＩ．ｃｅＤＮＡベクター全般」、および「ＩＶ．例示的なｃｅＤＮＡベクター」と題されるセクションで論じられている。
【０４１８】
ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡ合成の任意の方法（例えば、インビトロＤＮＡ合成方法論）によって提供され得、遊離５´末端および遊離３´末端を持つ直鎖状分子として提供される。ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、二次塩基対合構造（例えば、ステムループまたはヘアピン）を形成し得るが、一次構造は、直鎖状一本鎖分子である。表７は、図１１に例証されるように、二本鎖ＤＮＡ構築物の５´および３´にライゲーションされ得る例示的なＩＴＲオリゴヌクレオチドを示す。
【表７】
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【０４１９】
本明細書に開示されるように、ＩＴＲオリゴヌクレオチドは、ＷＴ−ＩＴＲ（例えば、図６Ａ、図６Ｂを参照）、または修飾型ＩＴＲ（例えば、図７Ａおよび図７Ｂを参照）を含み得る。修飾型ＩＴＲは、ＢおよびＢ´アームならびに／またはＣおよびＣ´アームを形成する配列における野生型ＩＴＲからの１つ以上のヌクレオチドの欠失、挿入、または置換を含み得る。無細胞合成で使用される、本明細書に記載されるＷＴ−ＩＴＲまたはｍｏｄ−ＩＴＲを含むＩＴＲオリゴヌクレオチドは、遺伝子修飾または生物学的および／もしくは化学的合成によって生成することができる。本明細書で論じられるように、実施例２および３のＩＴＲオリゴヌクレオチドは、本明細書で論じられるように、対称または非対称構成のＷＴ−ＩＴＲまたは修飾型ＩＴＲ（ｍｏｄ−ＩＴＲ）を含み得る。
【０４２０】
合成プロセスの一部として、１つ以上の制限エンドヌクレアーゼ部位をＩＴＲのステム部分に導入することができる。図６Ａ〜７Ｅは、制限エンドヌクレアーゼ部位が組み込まれている実施形態を含む、例示的なＩＴＲオリゴヌクレオチド配列および構造を提供する。
【０４２１】
発現カセットを含む二本鎖ポリヌクレオチドは、各鎖に遊離５´および３´末端を有する直鎖状分子として提供される。二本鎖ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ合成を介して、ＰＣＲ鎖集成によって、またはプラスミドもしくは他のベクターからそのような分子を切除することによって提供され得る。例えば、図１１Ｂを参照されたい。
【０４２２】
次いで、二本鎖ポリヌクレオチドを５´および３´ＩＴＲオリゴヌクレオチドと連続的または同時に接触させ、ＩＴＲオリゴヌクレオチドを二本鎖ポリヌクレオチドにライゲーションして、ｃｅＤＮＡベクターを形成する。例えば、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、標準的なライゲーション反応を実施する。
【０４２３】
図１１Ｂに示されるものなどのいくつかの実施形態では、ＩＴＲオリゴヌクレオチドおよび二本鎖ポリヌクレオチドは、相補的オーバーハングを提供するために、相補的オーバーハングおよびそれらの末端を備え、かつ／または同じ制限エンドヌクレアーゼで切断され得る。平滑末端ライゲーションを実施することもできる。
【０４２４】
分子は、段階的に集成され得る。例えば、オリゴはアニーリングされ、続いてアニーリングされた二本鎖オリゴが互いにライゲーションされる。２つのオリゴ鎖をアニーリングするには、オリゴを好適な緩衝液で等モル量で混合し（例えば、１００ｍＭ酢酸カリウム、３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）、９４℃で２分間加熱し、徐々に冷却する。重要な二次構造のないオリゴの場合、冷却ステップは、ヒートブロックまたは水浴から室温に試料を移動させるのと同じくらい簡単であり得る。多くの二次構造を有すると予測されるオリゴの場合、より緩やかな冷却／アニーリングステップが有益である。これは、オリゴ溶液を水浴またはヒートブロックに入れ、機械のプラグを抜く／電源を切ることによって行われる。アニーリングされたオリゴヌクレオチドは、ヌクレアーゼを含まない緩衝液中で希釈され、４℃で二本鎖のアニーリングされた形態で保存され得る。
【０４２５】
実施例４：一本鎖ＤＮＡ分子によるｃｅＤＮＡ産生
合成方法を使用してｃｅＤＮＡベクターを産生する別の例示的な方法は、センス発現カセット配列に隣接する２つのセンスＩＴＲを含む一本鎖ＤＮＡを使用し、アンチセンス発現カセットに隣接する２つのアンチセンスＩＴＲに共有結合し、次いで、この一本鎖の直鎖状ＤＮＡの末端をライゲーションして、閉端一本鎖分子を形成する。非限定的な一例は、一本鎖ＤＮＡ分子を合成および／または産生し、分子の一部をアニーリングして、二次構造の１つ以上の塩基対合領域を有する単一の直鎖状ＤＮＡ分子を形成し、次いで遊離５´および３´末端を互いにライゲーションして、閉じた一本鎖分子を形成する。
【０４２６】
例示の目的で、実施例４は、この方法を使用して生成された例示的なＤＮＡベクターとして、ｃｅＤＮＡベクターを産生することを説明する。しかしながら、この実施例では、本明細書に記載されるようにすることによって閉端ＤＮＡベクターを生成するインビトロ合成産生方法を例証するためにｃｅＤＮＡベクターが例示されているが、当業者は、上で例証されるように、ドギーボーンＤＮＡ、ダンベルＤＮＡなどを含むが、これらに限定されない任意の所望の閉端ＤＮＡベクターが生成されるように、方法のパラメータを修飾できることを認識する。実施例３に記載される合成産生方法によって産生され得る例示的なＤＮＡベクターは、「ＩＩ  Ｄ．合成産生方法を使用して産生されるＤＮＡベクター」、「ＩＩＩ．ｃｅＤＮＡベクター全般」、および「ＩＶ．例示的なｃｅＤＮＡベクター」と題されるセクションで論じられている。
【０４２７】
ｃｅＤＮＡベクターの産生のための例示的な一本鎖ＤＮＡ分子は、５´から３´に、
センス第１のＩＴＲ、
センス発現カセット配列、
センス第２のＩＴＲ、
アンチセンス第２のＩＴＲ、
アンチセンス発現カセット配列、および
アンチセンス第１のＩＴＲを含む。
【０４２８】
実施例４の例示的な方法で使用するための一本鎖ＤＮＡ分子は、本明細書に記載される任意のＤＮＡ合成方法論、例えば、インビトロＤＮＡ合成によって形成され得るか、またはヌクレアーゼでＤＮＡ構築物（例えば、プラスミド）を切断し、得られたｄｓＤＮＡ断片を融解して、ｓｓＤＮＡ断片を提供することによって提供され得る。
【０４２９】
アニーリングは、センス配列およびアンチセンス配列の対の計算された融解温度を下回って温度を下げることによって達成され得る。融解温度は、特定のヌクレオチド塩基含有量、および使用している溶液の特性、例えば塩濃度に依存する。任意の所与の配列および溶液の組み合わせの融解温度は、当業者によって容易に計算される。
【０４３０】
アニーリングされた分子の遊離５´および３´末端は、互いにライゲーションされるか、またはヘアピン分子にライゲーションされてｃｅＤＮＡベクターを形成することができる。好適な例示的ライゲーション方法論およびヘアピン分子は、実施例２および３に記載されている。
【０４３１】
実施例５：ｃｅＤＮＡの精製および／または産生の確認
例えば、実施例１〜４に記載される方法を含む、本明細書に記載される方法によって産生されたＤＮＡベクター産物のいずれも、例えば、熟練者に一般に知られている方法を使用して、不純物、未使用成分、または副産物を除去するために精製することができ、かつ／または分析して、産生されたＤＮＡベクター（この例では、ｃｅＤＮＡベクター）が所望の分子であることを確認することができる。ＤＮＡベクター、例えばｃｅＤＮＡの精製のための例示的な方法は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｍｉｄｉ  Ｐｌｕｓ精製プロトコル（Ｑｉａｇｅｎ）を使用することおよび／またはゲル精製によるものである。
【０４３２】
以下は、ｃｅＤＮＡベクターの同一性を確認するための例示的な方法である。
【０４３３】
ｃｅＤＮＡベクターは、図４Ｃに例示されるような未変性条件または変性条件下で、アガロースゲル電気泳動によって特定することによって評価することができ、（ａ）制限エンドヌクレアーゼ切断およびゲル電気泳動分析後の、未変性ゲルに対して変性ゲル上で２倍のサイズで移行する特徴的なバンドの存在、ならびに（ｂ）未切断材料の変性ゲル上の単量体および二量体（２ｘ）バンドの存在は、ｃｅＤＮＡベクターの存在に特有である。
【０４３４】
単離されたｃｅＤＮＡベクターの構造を、精製されたＤＮＡを、選択された制限エンドヌクレアーゼで消化することによって、ａ）ｃｅＤＮＡベクター内の単一切断部位のみの存在、およびｂ）０．８％変性アガロースゲル（＞８００ｂｐ）上で分画したときに明らかに見えるほど十分に大きい、得られる断片についてさらに分析した。図４Ｃおよび４Ｄに示されるように、非連続的な構造を有する直鎖状ＤＮＡベクターおよび直鎖状で連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、それらの反応産物のサイズによって区別することができ、例えば、非連続的な構造を有するＤＮＡベクターは、１ｋｂおよび２ｋｂ断片を産生することが期待されるが、連続的な構造を有するｃｅＤＮＡベクターは、２ｋｂおよび４ｋｂ断片を産生することが期待される。
【０４３５】
したがって、定義によって必要とされるように、単離されたｃｅＤＮＡベクターが共有結合性閉端であることを定性的に実証するために、試料を、特定のＤＮＡベクター配列の文脈において、単一制限部位を有すると特定された制限エンドヌクレアーゼで消化させ、好ましくは、等しくないサイズ（例えば、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐ）の２つの切断産物をもたらす。変性ゲル（２つの相補的ＤＮＡ鎖を分離する）上の消化および電気泳動に続いて、直鎖状の非共有結合的に閉じたＤＮＡは、２つのＤＮＡ鎖が連結され、展開されて２倍の長さであるとき（但し、一本鎖である）、１０００ｂｐおよび２０００ｂｐのサイズで溶解するが、共有結合的に閉じたＤＮＡ（すなわち、ｃｅＤＮＡベクター）は、２倍サイズ（２０００ｂｐおよび４０００ｂｐ）で溶解するであろう。さらに、ＤＮＡベクターの単量体、二量体、およびｎ量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解する（図４Ｃを参照）。
【０４３６】
本明細書で使用される場合、「未変性ゲルおよび変性条件下でのアガロースゲル電気泳動によるＤＮＡベクターの特定のためのアッセイ」という語句は、制限エンドヌクレアーゼ消化に続いて、消化産物の電気泳動的評価を実施することによって、ｃｅＤＮＡの閉端性を評価するためのアッセイを指す。１つのそのような例示的アッセイを以下に示すが、当業者であれば、この実施例に関する当該技術分野において既知の多くの変形が可能であることを理解するであろう。およそ１／３×および２／３×のＤＮＡベクター長の産生物を生成するであろう関心対象のｃｅＤＮＡベクターに対する単一切断酵素であるように、制限エンドヌクレアーゼが選択される。これは、未変性ゲルおよび変性ゲルの両方でバンドを溶解する。変性前に、試料から緩衝液を取り除くことが重要である。Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットまたは脱塩「スピンカラム」、例えば、ＧＥ  ＨＥＡＬＴＨＣＡＲＥ  ＩＬＵＳＴＲＡ（商標）ＭＩＣＲＯＳＰＩＮ（商標）Ｇ−２５カラムは、エンドヌクレアーゼ消化のための当該技術分野において既知のいくつかのオプションである。アッセイは、例えば、ｉ）ＤＮＡを適切な制限エンドヌクレアーゼ（複数可）で消化すること、２）例えば、Ｑｉａｇｅｎ  ＰＣＲクリーンアップキットに適用し、蒸留水で溶出すること、ｉｉｉ）１０×変性溶液（１０×＝０．５Ｍ  ＮａＯＨ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）を添加し、１０×色素を添加し、緩衝せず、１０×変性溶液を、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび２００ｍＭ  ＮａＯＨで以前にインキュベートされた０．８〜１．０％ゲル上で４×に添加することによって調製されたＤＮＡラダーと一緒に分析して、ＮａＯＨ濃度が、ゲルおよびゲルボックス中で均一であり、１×変性溶液（５０ｍＭ  ＮａＯＨ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ）の存在下でゲルを流動させることを保証することを含む。当業者であれば、サイズおよび所望のタイミングの結果に基づいて、電気泳動を実行するために使用する電圧を理解すであろう。電気泳動後に、ゲルを排出し、１×ＴＢＥまたはＴＡＥ中で中和し、蒸留水または１×ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄを含む１×ＴＢＥ／ＴＡＥに移す。次いで、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  ＦｉｓｈｅｒのＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｏｌｄ核酸ゲル染料（ＤＭＳＯ中１０，０００Ｘ濃縮物）および落射蛍光灯（青色）またはＵＶ（３１２ｎｍ）を用いてバンドを可視化することができる。前述のゲルベースの方法は、ｃｅＤＮＡベクターをゲルバンドから単離し、それを復元できるようにすることによって、精製目的に適合させることができる。
【０４３７】
生成されたｃｅＤＮＡベクターの純度は、任意の当該技術分野において既知の方法を使用して評価され得る。１つの例示的な非限定的方法として、試料の全体ＵＶ吸光度に対するｃｅＤＮＡ−プラスミドの寄与は、ｃｅＤＮＡベクターの蛍光強度を標準と比較することによって推定され得る。例えば、ＵＶ吸光度に基づいて、４μｇのｃｅＤＮＡベクターをゲル上に負荷し、ｃｅＤＮＡベクター蛍光強度が、１μｇであることが知られている２ｋｂバンドに相当する場合、１μｇのｃｅＤＮＡベクターが存在し、ｃｅＤＮＡベクターは、全ＵＶ吸光材料の２５％である。次いで、ゲル上のバンド強度を、バンドが表す計算されたインプットに対してプロットする。例えば、全ｃｅＤＮＡベクターが８ｋｂであり、切除された比較バンドが２ｋｂである場合、バンド強度は、全インプットの２５％としてプロットされ、この場合、１．０μｇのインプットに対して０．２５μｇとなる。ｃｅＤＮＡベクタープラスミド滴定を使用して、標準曲線をプロットする場合、回帰直線等式を使用して、ｃｅＤＮＡベクターバンドの量を計算し、次いで、これを使用して、ｃｅＤＮＡベクターにより表される全インプットのパーセント、または純度パーセントを判定することができる。
【０４３８】
実施例６：合成アプローチを使用したｃｅＤＮＡベクターの構築
本明細書に記載されるｃｅＤＮＡベクターの合成構築の一例として、以下の手順を使用した。ｃｅＤＮＡベクターの概略図を図１１Ａに示し、関心対象の遺伝子と、任意でプロモーター／エンハンサー、転写後調節エレメント、および／またはポリアデニル化配列とを有するカセットに隣接するヘアピンループＩＴＲを示す。簡単に言うと、構築方法は、正しいライゲーションを促進してｃｅＤＮＡベクターを適切に形成するために相補的なオーバーハングＤＮＡ末端を持つｃｅＤＮＡベクターのいくつかのセグメントの構築（図１１Ａおよび図１１Ｂを参照）、続いて不要なライゲーション産物を除去するための精製を伴っていた。
【０４３９】
より詳細には、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドは、（ａ）所望のＩＴＲ構造（例えば、野生型または突然変異体）および（ｂ）ヘアピンループＢおよびＣと、カセットオリゴデオキシヌクレオチド（「オリゴ」）へと操作された制限部位においてエンドヌクレアーゼ切断によって創り出されたオーバーハングに相補的であるＲＰＥエレメントとの間のＩＴＲ配列のＡステムのオーバーハング領域を含む、各ＩＴＲのために設計され、ここでは２つのオーバーハング領域間のライゲーションが所望される。２つのＩＴＲオリゴの各々のオーバーハングは、図Ａ（Ｂ）でそれぞれＲ１およびＲ２としてラベル付けされている。各ＩＴＲオリゴは、ゲルまたはカラム精製を含む伝統的な方法を使用して、水中の最終濃度１０〜１００μＭで合成された後、９５℃で２分間アニーリングし、氷浴で急冷した。野生型ＡＡＶ２  ＩＴＲを用いてｃｅＤＮＡベクターを構築するために、合成されたオリゴデオキシヌクレオチドは次のとおりであった。
【０４４０】
左ＩＴＲ（「左オリゴ−１」）（ＡｖｒＩＩ制限部位切断オーバーハングに相補的なＲ１オーバーハングを含む）：
５´ＣＴＡＧＧＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣ３´（配列番号１３５）および
右ＩＴＲ（「右オリゴ−２」）（ＳｂｆＩ制限部位切断オーバーハングに相補的なＲ２オーバーハングを含む）：
５´ＧＧＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＣＣＴＧＣＡ３´（配列番号１３６）。
【０４４１】
カセット領域（図Ａ（Ｂ）で「遺伝子発現ユニット」と表示される）は、任意の伝統的なヌクレオチド構築方法によって作製され得るが、この実施例では、プラスミド産生系を使用して便宜的に産生した。ＣＡＧプロモーター、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）オープンリーディングフレーム、ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列、ならびにＩＴＲ  ＤおよびＲＰＥ領域（まとめて、配列番号１４６）を親プラスミド（配列番号１４７）に挿入した。
【０４４２】
遺伝子発現ユニットの制限部位および各ＩＴＲオリゴのオーバーハングは、相補的なオーバーハングにより、ＩＴＲオリゴの、正しい方向での遺伝子発現ユニットへの特定のライゲーションを容易にするために選択された。この特定の実施例では、５´遺伝子発現ユニットのＡｖｒＩＩ切断により生じるオーバーハングに相補的になるように、オーバーハング領域を左ＩＴＲに設計した。しかしながら、左ＩＴＲオリゴの末端残基自体は、ＡｖｒＩＩ制限部位を構築しないため、酵素はオーバーハングを切断しない。ホモ二量体化の場合、オリゴのこの同じ領域がＡｐａＬＩ制限部位を形成するため、ＡｐａＬＩを使用して、左ＩＴＲオリゴの不要なホモ二量体が切断され、それらの単量体状態に戻ることを保証することができる。同様のアプローチを右ＩＴＲでも採用し、オーバーハング領域は、遺伝子発現ユニットの３´末端で操作されたＳｂｆ１サイトでの切断によって生成されるオーバーハングに相補的になるように設計した。右のＩＴＲオリゴの末端領域は、ＳｂｆＩによって認識されないが、代わりにオリゴのホモ二量体化の事象においてＮｈｅ１部位を形成するように設計されているため、その酵素による切断によってホモ二量体化を制御することができる。最後に、制限部位ＤｒａＩＩＩおよびＢｓａＩは、親プラスミドの骨格に固有の部位として存在し、不要な骨格断片の除去を容易にするために利用した。これらの様々な制限部位は、便宜上選択されたものであり、当業者は、制限部位の任意の組み合わせを容易に操作して、利用可能な試薬および基礎となるヌクレオチド構築物と適合する同じ結果を達成することができる。
【０４４３】
遺伝子発現ユニットを含むプラスミドを使用してＥ．ｃｏｌｉを形質転換し、プラスミドを維持するための選択圧を、標準的な技法を使用して、培地にアンピシリンを含めることによって維持した。プラスミドＤＮＡは、ＤＮＡ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）および製造元が推奨する精製方法を使用して採取した。プラスミドからの遺伝子発現ユニットの切除（図１２に示されるステップ１Ｂ）は、制限エンドヌクレアーゼ切断ステップによって実施した。１００μＬの反応体積で、２０ｐｍｏｌの親プラスミドを、３％の３つの制限酵素ＡｖｒＩＩ、ＳｂｆＩ、およびＡｐａＬＩの各々と組み合わせた。反応を３７℃で４時間インキュベートした。
【０４４４】
次に、ＩＴＲオリゴおよび遺伝子発現ユニットＤＮＡセグメントをライゲーションした（図１２のステップ２）。総体積が４００μＬになるように、２０ｐｍｏｌの消化された親プラスミド反応（１００μＬ）を、１０％のＡＴＰ含有ライゲーション緩衝液、２％のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、および２％のこれらの制限エンドヌクレアーゼ：ＡｖｒＩＩ、ＳｂｆＩ、ＡｐａＬＩ、ＮｈｅＩの各々とともに、１６０ｐｍｏｌのアニーリングされた左右ＩＴＲの各々と組み合わせた。リガーゼはライゲーションをもたらしたが、ＡｖｒＩＩおよびＳｂｆＩ酵素は、遺伝子発現ユニットがホモ二量体化しないことを保証し、ＡｐａＬ１およびＮｈｅＩ酵素は、ＩＴＲオリゴがホモ二量体化しないことを保証した。反応を２２℃で４〜１６時間インキュベートした後、反応を６５℃で２０分間加熱することによって、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを不活性化した。
【０４４５】
反応から残りの親プラスミドを除去するために、混合物を、ＩＴＲオリゴまたは遺伝子発現ユニットのいずれかではなく、親プラスミド骨格のみを切断することが知られている制限エンドヌクレアーゼ酵素で処理した（図１２のステップ３を参照）。したがって、４００μＬの直前の反応混合物を、１０％の製造元が推奨する制限酵素緩衝液、３％のＤｒａＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素、および５％のＢｓａＩ制限エンドヌクレアーゼ酵素と組み合わせて、水中１ｍＬの総反応体積にする。反応を３７℃で１〜２時間インキュベートした。
【０４４６】
次いで、不要なライゲーションされていないオリゴおよび親プラスミド骨格の残りの断片を、エキソヌクレアーゼ消化によって除去した（図１２のステップ４）。１ｍＬの前の反応に、１０％の製造元が推奨するエキソヌクレアーゼ反応緩衝液、１０％のＡＴＰ（１０ｍＭ）、および８％のＴ５エキソヌクレアーゼ、ならびに総反応体積を５ｍＬにするのに十分な水を添加した。反応を３７℃で１〜４時間インキュベートした。Ｔ５エキソヌクレアーゼは一本鎖ＤＮＡを切断するため、ライゲーションされていないオーバーハングを持つオリゴまたは骨格断片のいずれも、酵素によって消化される。
【０４４７】
反応をエタノール沈殿（図１２のステップ５）に供して、精製に備えてＤＮＡを濃縮した。Ｔ５エキソヌクレアーゼ切断による５ｍＬの全反応体積を、＞１２．５ｍＬの総反応体積で１０％の３Ｍ酢酸ナトリウムおよび２．５倍体積のエタノールと組み合わせた。混合物を−８０℃で少なくとも２０分間インキュベートし、次いで４℃での遠心分離によりＤＮＡをペレット化した。ペレットを７０％エタノールで洗浄し、遠心分離により再ペレット化した。得られた洗浄済みＤＮＡペレットを、１ｍＬの水に再懸濁した。ｃｅＤＮＡベクターを、標準的なＤＮＡ精製シリカカラム（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して精製し、タンパク質および残りの小さなＤＮＡ断片を排除した（図１２のステップ６）。
【０４４８】
得られた精製ＷＴ／ＷＴ  ＩＴＲ  ｃｅＤＮＡベクターの試料を標準ラダーでスパイクし、製造元が推奨する条件およびキット（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＤＮＡ−１２０００キット）を使用し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して分析した。得られたクロマトグラフを図１３Ｂに示す。２つの最大のピークは、単量体および二量体ｃｅＤＮＡベクターの予想サイズに対応し、オリゴ二量体の予想サイズで非常に小さなピークが見られた。これは、最終精製ステップ後の試料全体が実質的に純粋なｃｅＤＮＡベクターであることを示していた。クロマトグラフからの表のピークデータを表８に示す。
【表８−１】
2021511047.tif 000028
【表８−２】
2021511047.tif 000029
【０４４９】
この方法論は、異なるＩＴＲオリゴで数回繰り返され、図１４Ａに示されるＷＴ／突然変異体ｃｅＤＮＡベクター、および図１５Ａに示される非対称の突然変異体／突然変異体ｃｅＤＮＡベクター、ならびにそのようなＩＴＲ対の各々の文脈において、緑色蛍光タンパク質ではなく遺伝子発現ユニットカセットにルシフェラーゼを含む代替ｃｅＤＮＡベクター変異体を含む、異なるｃｅＤＮＡベクターの合成産生をもたらした。ＧＦＰ  ｃｅＤＮＡ構築物のバイオアナライザーの結果は、それぞれ図１４Ｂおよび図１５Ｂに示され、ＷＴ／ＷＴ  ｃｅＤＮＡベクター試料（図１３Ｂ）で得られた結果と非常に類似していた。各々のピークデータ表を、それぞれ下の表９および表１０に示す。
【表９−１】
2021511047.tif 000030
【表９−２】
2021511047.tif 000031
【表１０】
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【０４５０】
伝統的なＳｆ９昆虫細胞法によって産生されたｃｅＤＮＡベクター（ＷＴ／突然変異体）（図１６Ａ）もバイオアナライザー分析を受けた。クロマトグラフは図１６Ｂに示され、特に合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター分析で見られるものよりも多くの、マルチマーおよびサブモノマーピークを含む、ｃｅＤＮＡのいくつかの追加の種を含む。表８〜１１のピークパラメータデータを比較することによってわかるように、合成的に産生された試料は、＞６５％の単量体ｃｅＤＮＡベクターであり、場合によっては＞８５％の単量体ｃｅＤＮＡベクターであるが、Ｓｆ９で産生されたｃｅＤＮＡベクター試料は、＜３５％の単量体ｃｅＤＮＡベクターであり、試料には多数の追加のｃｅＤＮＡベクター種が存在していた。
【表１１−１】
2021511047.tif 000033
【表１１−２】
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【０４５１】
得られたｃｅＤＮＡベクターが適切な共有結合性閉端ｃｅＤＮＡベクター構造を有していたことを確認するために、各々の試料をｃｅＤＮＡベクターに単一の制限部位を有する制限エンドヌクレアーゼで消化し、好ましくはサイズが等しくない２つの切断産物を生じる。変性ゲルでの消化および電気泳動の後、非共有結合で閉じた直鎖状ＤＮＡは、予想される２つの断片に対応するサイズでゲル上を移行するバンドを表示する。（ｃｅＤＮＡベクターのような）直鎖状の共有結合で閉じたＤＮＡは、代わりに、２つのＤＮＡ鎖が連結され、切断時に展開されて長さが２倍になるため、切断産物の予想サイズの２倍で移行するバンドを有するはずである。さらに、ｃｅＤＮＡベクターの単量体、二量体、および多量体形態の消化は、多量体ＤＮＡベクターの末端間連結に起因して、同じサイズの断片としてすべて溶解する。合成およびＳｆ９で産生されたｃｅＤＮＡベクターの各々をこのゲル電気泳動法で評価したところ、各試料が同様のバンディングパターンを有し、すべてのｃｅＤＮＡベクターが適切な共有結合性閉端構造を有していたことを示す。
【０４５２】
すべての試薬の量を調整して、所望の量のｃｅＤＮＡベクターの産生をもたらすことができることは、当業者によって理解されるであろう。
【０４５３】
実施例７：ｃｅＤＮＡベクターは細胞内で導入遺伝子を発現する
合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターが伝統的にＳｆ９で産生されたｃｅＤＮＡベクターと同様に導入遺伝子を発現できたかどうかを評価するために、培養細胞中のｃｅＤＮＡベクターの発現を蛍光タンパク質（ＧＦＰ）産生および蛍光発光の程度によって測定した。ヒト肝細胞（ＨｅｐａＲＧ細胞株、Ｌｏｎｚａ）を７．５×１０４細胞／ｍＬの濃度で播種した。製造元のプロトコルに従って、市販のデバイス（Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）、Ｌｏｎｚａ）を使用して、所望のｃｅＤＮＡベクターを培養細胞に導入した。１５０ｎｇ／ウェルの各構築物を含む１６ウェルストリップを、２０μＬの量でヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクトした試料に、９６ウェルプレートの各ウェルにおいて８０μＬの培地を添加し、各ウェルの最終容量を１００μＬにした。培地はヌクレオフェクションの２４時間後に交換し、その後週に２回交換した。図１４Ａに示されるｃｅＤＮＡベクターを含むプラスミドを対照として使用した。Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞撮像顕微鏡を使用して、各培養物の蛍光をヌクレオフェクションの６日後に測定した。この系をインキュベーター内に位置付け、所望のタイムフレームにわたって細胞のタイムラプス相および蛍光写真を自動的に撮影する。
【０４５４】
結果を図１７に示す。ＧＦＰの発現は、明るい白い斑点として現れる。ＷＴ／突然変異体ＩＴＲを有するＳｆ９産生ｃｅＤＮＡベクターで処理された細胞は、プラスミド処理された細胞で見られるのと同様のＧＦＰ発現を有していた。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクター（ＷＴ／ＷＴ、ＷＴ／Ｍｕｔ、および非対称突然変異体）の３つすべてが、アッセイでプラスミドコントロールまたは伝統的にＳｆ９で産生されたｃｅＤＮＡベクターのいずれかよりも高い蛍光およびスポット数を示した。蛍光のこの相対的な増加は、少なくとも部分的には、伝統的に産生された材料よりも合成的に産生された材料の純度が高いためであり得る。結果は、合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターが、コードされた導入遺伝子を少なくとも伝統的にＳｆ９で産生されたｃｅＤＮＡベクターと同等、おそらくそれ以上に発現すること、したがって合成的に産生された材料が期待どおりに機能することを示している。
【０４５５】
実施例８：マウスにおけるｃｅＤＮＡベクターからのタンパク質発現
上記の合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターからのホタルルシフェラーゼ導入遺伝子のインビボタンパク質発現は、伝統的に産生された同等のｃｅＤＮＡベクターと比較して、マウスにおいてインビボで評価した。３０匹のおよそ４週齢の雄ＣＤ−１  ＩＧＳマウス（Ｅｎｖｉｇｏ）に、５ｍＬ／ｋｇ量の（ａ）ＬＮＰ−Ｓｆ９で産生されたＷＴ／Ｍｕｔ  ｃｅＤＮＡ、（ｂ）ＬＮＰ−Ｓｆ９で産生されたＭｕｔ／Ｍｕｔ（非対称）ｃｅＤＮＡ、（ｃ）ＬＮＰ−Ｓｆ９で産生されたＷＴ／ＷＴ  ｃｅＤＮＡベクター、（ｄ）ＬＮＰ合成ＷＴ／ＷＴ  ｃｅＤＮＡベクター、（ｅ）ＬＮＰ合成ＷＴ／Ｍｕｔ  ｃｅＤＮＡ、または（ｆ）対照ＬＮＰ−ポリＣ中０．５ｍｇ／ｋｇを単回静脈内投与した。注射後２８日間マウスを評価し、０、１、および２８日目に全血を採取した。各マウス全体のインビボ撮像（ＩＶＩＳ）は、３、７、１４、２１、および２８日目に、２．５ｍＬ／ｋｇの腹腔内注射を介して各マウスに１５０ｍｇ／ｋｇ（６０ｍｇ／ｍＬ）のルシフェリンを投与することによって実施し、必要に応じてマウスの被毛を剃毛した。各ルシフェリン注射後１５分以内に、各マウスを麻酔して撮像する。動物を２８日目に絶命させ、肝臓および脾臓を採取し、ＩＶＩＳによってエクスビボで撮像した。ルシフェラーゼ発現は、ルシフェラーゼＥＬＩＳＡアッセイ（ＭＡＸＤＩＳＣＯＶＥＲＹ（登録商標）、ＢＩＯＯ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ／ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）、および肝臓試料のルシフェラーゼのｑＰＣＲによって、これらの組織でさらに評価される。
【０４５６】
３日目および７日目のＩＶＩＳ分析の結果を、図１８ＡおよびＢに示す（７日目のデータ）。ｃｅＤＮＡで処置されたマウスの各群では、背景レベルを上回る有意な蛍光が見られた。合成的に産生されたｃｅＤＮＡベクターで処置されたマウスで検出された蛍光は、伝統的に産生されたｃｅＤＮＡで処置されたマウスで検出された蛍光と少なくとも同じくらい大きく、場合によってはより大きかった。７日目のデータに関して図１８Ｂに見られるように、蛍光の大部分は、各処置群について予想されるように肝臓に局在化した。この結果は、合成方法によって産生されたｃｅＤＮＡが、Ｓｆ９で産生されたｃｅＤＮＡベクターと同様にインビボで機能することを示している。
【０４５７】
参考文献
特許および特許出願を含むがこれらに限定されない、本明細書および本明細書の実施例で引用されるすべての刊行物および参考文献は、あたかも個々の刊行物または参考文献が、完全に記載されるように参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されるかのように、それら全体が参照により組み込まれる。この出願が優先権を主張する任意の特許出願もまた、刊行物および参考文献について上述した方法で、参照により本明細書に組み込まれる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
2021511047.tif 000036
【図１Ｃ】
2021511047.tif 000037
【図１Ｄ】
2021511047.tif 000038
【図１Ｅ】
2021511047.tif 000039
【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
2021511047.tif 000043
【図３Ａ】
2021511047.tif 000044
【図３Ｂ】
2021511047.tif 000045
【図３Ｃ】
2021511047.tif 000046
【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021511047.tif 000049
【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2021511047.tif 000051
【図５】
2021511047.tif 000052
【図６Ａ−１】
2021511047.tif 000053
【図６Ａ−２】
2021511047.tif 000054
【図６Ａ−３】
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【図６Ｂ−１】
2021511047.tif 000056
【図６Ｂ−２】
2021511047.tif 000057
【図６Ｃ−１】
2021511047.tif 000058
【図６Ｃ−２】
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【図６Ｄ−１】
2021511047.tif 000060
【図６Ｄ−２】
2021511047.tif 000061
【図７Ａ−１】
2021511047.tif 000062
【図７Ａ−２】
2021511047.tif 000063
【図７Ｂ−１】
2021511047.tif 000064
【図７Ｂ−２】
2021511047.tif 000065
【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
2021511047.tif 000067
【図７Ｅ】
2021511047.tif 000068
【図８−１】
2021511047.tif 000069
【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０Ａ】
2021511047.tif 000073
【図１０Ｂ】
2021511047.tif 000074
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
2021511047.tif 000082
【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１７−５】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
2021511047.tif 000092
【配列表】
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【国際調査報告】
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