(57)【要約】  組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドに関する方法、組成物、プロセス、および使用が提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記組成物は、宿主細胞タンパク質に対して、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％超の重量濃度（ｗ／ｗ）の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む、抗原組成物。
【請求項２】
Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記組成物は、凝集三量体に対して、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、または９６％超の重量濃度（ｗ／ｗ）の非凝集三量体を含む、抗原組成物。
【請求項３】
Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、グリコシル化可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドであり、前記グリコシル化可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、グリコシル化を含めて、５９．５ｋＤａ超、例えば、６０．０ｋＤａ超、６０．５ｋＤａ超、または６１．０ｋＤａ超の分子質量を有する、抗原組成物。
【請求項４】
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の集団を含む抗原組成物であって、
前記集団の各三量体は、
（ａ）Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆプロトマー」）；ならびに
（ｂ）ｐ２７ペプチドの少なくとも１０個のアミノ酸をさらに含む、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆ’プロトマー」）
からなる群から独立に選択される３個の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドから構成され；
かつ、式：
ｎＦ＋（３−ｎ）Ｆ’  （式Ｉ）
［式中、ｎは、０〜３の整数であり、Ｆは、Ｆプロトマーであり、Ｆ’は、Ｆ’プロトマーである。］
により示され；
三量体の集団における組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％が、Ｆ’プロトマーである、抗原組成物。
【請求項５】
Ｆ’プロトマーを含み、前記Ｆ’プロトマーが、切断されていないフューリン切断部位を含むＦ１鎖を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【請求項６】
（ａ）Ｆ’プロトマーが、配列番号８のアミノ酸配列を含むＦ１鎖および配列番号３のアミノ酸配列を含むＦ２鎖を含み；かつ
（ｂ）Ｆプロトマーが、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦ１鎖および配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦ２鎖を含む、
請求項５に記載の抗原組成物。
【請求項７】
前記抗原組成物が凍結乾燥されている、請求項１〜６のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原組成物および薬学上許容可能な担体または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
【請求項９】
アジュバントをさらに含む、請求項８に記載の免疫原性組成物。
【請求項１０】
免疫原性組成物が、ＲＳＶの感染を低減または予防する、請求項８〜９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１１】
請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１３】
ＲＳＶ感染症を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物または請求項８〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項１４】
ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物または請求項８〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
対象がヒト対象である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
医学における使用のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物または請求項８〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１７】
ＲＳＶ感染症の予防または治療のための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組成物または請求項８〜１０のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【請求項１８】
請求項１２に記載の宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに、マルチモーダル陰イオン交換樹脂およびコスモトロピック剤とカオトロピック剤とを含む溶出緩衝液を利用したマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製の工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原組成物を製造する方法。
【請求項１９】
溶出緩衝液が、
（ａ）１５０〜３５０ｍＭ、例えば、２００〜３００ｍＭ、２２５〜２７５ｍＭ、２３０〜２７０ｍＭ、２３５〜２６５ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；
（ｂ）２００〜４００ｍＭ、例えば、２５０〜３５０ｍＭ、２７５〜３２５ｍＭ、２８０〜３２０ｍＭ、２８５〜３１５ｍＭ、２９０〜３１０ｍＭ、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニン
を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
凍結乾燥の工程をさらに含む、請求項１８〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、種々のサンプルから抗原を精製するための方法および組成物、ならびに前記抗原の使用のための方法および組成物を提供する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、パラミクソウイルス科ファミリーに属する重要なヒト病原体である。密接に関連するウイルスには、流行性耳下腺炎ウイルス、麻疹ウイルスおよびパラインフルエンザウイルスが含まれる。ＲＳＶは、乳児の入院の主要原因であり、幼児期の感染は、喘鳴および小児喘息の発生率増加と強く関連している。これは、小児、親および保健医療システムに対して大きな負担をもたらし、介入のために毎年数十億ドルのコストがかかると推定されている。マラリアに続き、ＲＳＶは、１ヵ月齢〜１歳の小児における死亡率の単一の最も一般的な伝染原因である。
【０００３】
ＲＳＶに対して現在ワクチンは存在せず、唯一の予防様式は、融合タンパク質Ｆを標的とするモノクローナル抗体パリビズマブの受動的投与を介したものである。この戦略の法外的なコストによって、毎年ＲＳＶシーズンの始まりに高リスクの乳児にその使用が限定されており、幅広く利用可能な有効なワクチンの必要性がさらに強調されている。他方で、モノクローナル抗体によって与えられる防御は、ウイルスに対する液性免疫が、感染症の予防において有効であることを示唆している。
【０００４】
ウイルスに対する中和抗体の主な標的であるＲＳＶ  Ｆは、ウイルスエンベロープ上に大量に存在するクラスＩ融合糖タンパク質である。他のウイルス融合タンパク質と同様に、Ｆは、ウイルス表面上に三量体の「融合前」状態で存在する。侵入が引き金となると、Ｆは、疎水性の融合ループを細胞膜に挿入し、広範なコンフォメーション変化を受け、エネルギー的に好ましい三量体の「融合後」状態に折り畳まれ、この過程においてウイルス膜と細胞膜とがともに融合される。
【０００５】
前駆体ＲＳＶ  Ｆタンパク質の配列は、シグナルペプチド（２５残基）、３個のヘプタッドリピート（ＨＲＡ、ＨＲＢ、およびＨＲＣ）を含む５２９残基外部ドメイン、膜貫通領域および短い細胞質尾部を含有する。野生型タンパク質は、最終的に２つのフューリン部位において内部で切断される単一ポリペプチド（Ｆ０）として発現する。フューリンタンパク質分解によって、２７アミノ酸ペプチド（ｐ２７）が放出され、タンパク質が２つの鎖、Ｆ１およびＦ２に分離され、これらは、２つのジスルフィド結合によって連結されたままである（Ｃ３７−Ｃ４３９；Ｃ６９−Ｃ２１２）。これらの切断によって、疎水性の融合ペプチドのＮ末端（Ｆ１  Ｎ末端）が遊離し、それが最終的な膜内挿入に利用可能になり、その結果、Ｆがフソゲン（ｆｕｓｏｇｅｎ）として機能することが可能となる。最終的な成熟ＲＳＶ  Ｆタンパク質は、３つのＮ結合型グリコシル化部位（Ｎ２７、Ｎ７０およびＮ５００）におけるグリコシル化も含む。
【０００６】
外因的に発現したＦ外部ドメインは、融合後コンフォメーションにおける高度に安定した三量体に自発的に折り畳まれる。融合後Ｆ結晶構造は、解析されており、２つの重要な、表面が露出した中和エピトープ、部位Ａおよび部位Ｃの保存を示している。
【０００７】
融合前Ｆ構造は、Ｆ外部ドメインと、融合前Ｆ特異的抗体のＦａｂ断片とを同時発現させることによって、解析された。Ｆａｂ断片および２つの関連する抗体は、部位Ｏ（スラッシュ付きＯ、以下「Ｏ」と表記）と名付けられた、その融合前コンフォメーションに独特のＦ上のエピトープを認識する。このエピトープは、分子の頂部付近にあり、残基６０〜７５（Ｆ２）およびＨＲＡヘリックス残基１９６〜２０９（Ｆ１）によって形成される。Ｆがその融合後コンフォメーションに変わる際に生じる広範な構造的再配列において、このエピトープは破壊され、融合前および融合後の分子におけるＨＲＡヘリックスに関して、ループの相対的位置が約１８０ｏ変化する。対照的に、Ｆにおける他の２つの中和部位、部位Ａおよび部位Ｃは、融合前および融合後の両方のコンフォメーションにおいて保存される。四次エピトープ部位Ｖは、β３−β４モチーフと重なっており、融合前ＲＳＶ−Ｆの三量体型に存在する。McLellan et al (2015) "Characterization of a Prefusion-Specific Antibody That Recognizes a Quaternary, Cleavage-Dependent Epitope on the RSV Fusion Glycoprotein," PLOS Pathog, 11:e1005035参照。部位Ｖは、図２に示す。
【０００８】
Ｆ外部ドメインをその融合前コンフォメーションに安定化するために、外部ドメイン配列への３つの主要な変化が必要である。Ｃ末端三量体化ドメインが必要である。例として、発現時に自発的に三量体化するＴ４バクテリオファージフィブリチン分子のＣ末端からの２７残基ドメインであるフォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）が挙げられる。このドメインの非存在下で、しかし、さらなる変化がある場合、Ｆタンパク質は、融合前コンフォメーションをとるが、三量体を形成することはできず、高度に免疫原性ではない。フォルドンは、短い４残基の切断不可能なリンカーＳｅｒ−Ａｌａ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙによって、ＦのＣ末端と連結している。
【０００９】
他の２つの変化は、抗体結合構造に基づいて設計された変異を安定化しており、抗体の添加なしにＦをその融合前の状態に維持する助けとなっている。何度か試験／設計を繰り返した後、二組の変異の組合せが、最良の結果を示した。McLellan et. al. Science (2013) vol. 342 p. 592)においてＤＳ−Ｃａｖ１と名付けられたこの分子は、融合後の状態に変わることを防ぐために、１５５および２９０におけるＳｅｒ残基をＣｙｓに変異させることによって（Ｓ１５５Ｃ−Ｓ２９０Ｃ）、導入されたジスルフィド（「ＤＳ」）を含有する。この分子はまた、頂端での部位Ｏを安定化するために、空洞充填変異Ｓ１９０ＦおよびＶ２０７Ｌを含有する。Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含むこのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、融合後Ｆよりもかなり強力に中和抗体を産生し、ヒト血清中のＲＳＶ特異的中和抗体の８５％超を枯渇させることができる。
【００１０】
ベンチトップ（ｂｅｎｃｈ−ｔｏｐ）量のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを製造する発表済みの方法が、現在利用可能であるにもかかわらず、親和性タグを含まない、すなわちタグの付いていない純粋かつ安定なＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの必要性が依然として存在する；親和性タグ自体は、偽の免疫応答を誘導する可能性があり、または、切断された場合であっても、偽の免疫応答を誘導し得る人工産物の切断後アミノ酸配列を残す可能性がある。さらに、ワクチンにおける使用のために十分な量で組換えによって製造された場合、このＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、免疫原性を低減し得る、組換え産物をタンパク分解し得る、または免疫応答を誘導し得る宿主細胞タンパク質と同時精製される。したがって、宿主細胞タンパク質を実質的に含まないワクチン製造スケールでの純粋かつ安定なＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１１】
出願人は、本明細書において、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む高純度のタグの付いていない組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの組成物を製造する方法、高度に安定したその組成物を製造する方法、ならびに高純度の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを使用するための組成物および方法を提供する。一つの側面において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の集団を含む抗原組成物であって、前記集団の各三量体は、（ａ）Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆプロトマー」）；ならびに（ｂ）ｐ２７ペプチドの少なくとも１０個のアミノ酸をさらに含む、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆ’プロトマー」）からなる群から独立に選択される３個の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドから構成され、式：
ｎＦ＋（３−ｎ）Ｆ’  （式Ｉ）
（式中、ｎは、０〜３の整数であり、Ｆは、Ｆプロトマーであり、Ｆ’は、Ｆ’プロトマーである。）により示され、三量体の集団における組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの少なくとも１％、例えば、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％が、Ｆ’プロトマーである、組成物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１Ａ】野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質の配列を模式的に示す：シグナルペプチド（２５残基）、３個のヘプタッドリピート（ＨＲＡ、ＨＲＢ、およびＨＲＣ）を含む５２９残基外部ドメイン、膜貫通領域（ＴＭ）、短い細胞質尾部、グリコシル化部位（丸付きのＧ）、およびフューリン切断部位（はさみ）。シグナルペプチド（ＳＰ）およびｐ２７ペプチドは、タンパク質成熟段階で除去され、Ｆ１鎖およびＦ２鎖が生じる（菱形の記号＝ｐ２７除去後に残された切断後部位）。
【図１Ｂ】組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換（垂直の文字）ならびにフォルドンとともに示す；他の図の表示は、図１Ａに記載の通りである。
【図２】種々の抗体結合部位を、部位Ｏを含む融合前ＲＳＶ  Ｆタンパク質の図上に示す。
【図３Ａ】製造スケールのバイオリアクターにおける製造時間の増加に対する、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド産生ＣＨＯ細胞クローンの生細胞密度および生存率。
【図３Ｂ】製造スケールのバイオリアクターにおける組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの力価の蓄積。
【図４】実施例に開示される方法によって製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのグリカンプロファイル。ピーク＃２および＃３は、シアル化グリカンを表す。
【図５Ａ】緩衝液中にて５℃で３ヵ月間保存した後の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのＦａｂシフトＳＥＣ−ＬＣの結果。実施例３（Ｆ）参照。左から右に、ピークは、シフトした組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「シフト」）；組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド単独（主要ピーク、「Ｄｓ」）およびシフトしていない組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（微小ピーク、「非シフト」）；部位Ｏ結合Ｆａｂ（主要ピーク、表示せず）、および部位Ｏ結合Ａｂ  Ｆａｂ（微小ピーク、「Ｆａｂ」）である。挿入パネルは、０時点、１ヵ月、３ヵ月、および７ヵ月においてシフトしている（部位Ｏ結合を保持している）組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのパーセントを報告している（図５Ａでは、３ヵ月の材料に対するクロマトグラムのみを示す）。
【図５Ｂ】凍結乾燥した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを４０℃で２週間保存し、次いで、適当な緩衝液で再構成した後の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのＦａｂシフトＳＥＣ−ＬＣの結果：ピークは、図５Ａに表示および記載した通りである。
【図５Ｃ】凍結乾燥した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを５℃で６ヵ月間保存し、次いで、適当な緩衝液で再構成した後の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのＦａｂシフトＳＥＣ−ＬＣの結果：ピークは、図５Ａに表示および記載した通りである。
【図６Ａ】組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド新鮮標準材料（第１のレーン）および組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド３ヵ月安定性材料（第２のレーン）のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（３ヵ月安定性材料の一部は、部位Ｏ結合を失っていた）。しかしながら、ゲルバンドパターンは、新鮮標準と３ヵ月安定性材料との間で非常に類似しており、３ヵ月材料における部位Ｏ結合抗体結合喪失は、タンパク質クリッピング事象に起因するものではなかったことが示唆された。
【図６Ｂ】組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド新鮮標準材料（上段）および３ヵ月安定性材料（下段）の液体クロマトグラフィー−質量分析（ＬＣ−ＭＳ）バタフライペプチドマップ。新鮮標準および３ヵ月材料は、同等のペプチドフィンガープリントを有し、化学修飾、例えば、酸化、脱アミノ化、およびジスルフィド結合スクランブリングも、部位Ｏ結合抗体結合の喪失の原因ではなかったことが示唆された。
【図７】ＬＣ−ＭＳによる脱Ｎグリコシル化組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのインタクト質量の定量。
【図８】組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）クロマトグラム。Ｆ’プロトマー（微小ピーク）の溶出に次いで、Ｆプロトマー（主要ピーク）の溶出が示されている。サンプルの測定は２回行った。
【図９】ＲＰ  ＨＰＬＣによる原薬（抗原組成物）の積分（ｐ２７＝Ｆ’；ＲＳＶ  ｐｒｅＦ＝Ｆ）。
【図１０】ＲＰ−ＵＰＬＣによる原薬（抗原組成物）標準ロード１０μＬの積分（ｐ２７＝Ｆ’；ＲＳＶ  ｐｒｅＦ＝Ｆ）。
【図１１】組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の典型的な弱陽イオン交換プロファイル。ピーク１はＦＦＦであり、ピーク２はＦ’含有三量体である。
【図１２】画分をさらなる分析のために回収した（灰色の網掛け）。
【図１３】組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体（ＲＳＶＰｒｅＦ３と表示｛用語「ＤＳ−Ｃａｖ１」を用いて最初に同定されたが、本明細書では、McLellan et. al. Science (2013) vol. 342 p. 592、ＷＯ２０１４１６０４６３、およびＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３０４９４８８に開示の通りに製造された材料と区別するために、ＲＳＶＰｒｅＦ３と再度名付けた｝、最も下のグラフ線）の逆相液体クロマトグラフィープロファイル、弱陽イオン交換クロマトグラフィーからのピーク１（２番目のグラフ線）およびピーク２（最も下から３番目のグラフ線）。
【図１４】組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド＋Ｒ２９５、およびＲ２９５の弱陽イオン交換クロマトグラフィープロファイル。最も左側のピーク（垂直の点線で示す）は、ＦＦＦ三量体に関する保持時間を表す。左側から２番目のピーク（左側の垂直の太字の破線で示す）は、ＦＦＦ’三量体に関する保持時間を表す（Δ＋５チャージ）。最も右側のピークは、Ｒ２９５Ｆ’Ｆ’Ｆ’（右側の垂直の破線で示す）三量体に関する保持時間を表す（Δ＋６チャージ）。ＦＦ’Ｆ’に関する予測された保持時間でのピークは存在しないことに留意されたい（Δ＋１０チャージ）（太字の破線の円の中の灰色の破線の曲線）。
【図１５】ＲＳＶＰｒｅＦ３およびＤＳ−Ｃａｖ１における高分子量種（ＨＭＷＳ）を、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）を用いて検討した。図１５中のクロマトグラムは、左から右にかけて、ＲＳＶＰｒｅＦ３（左、高い方）およびＤＳ−Ｃａｖ１（右、短い方）に関するピークを示す。ＲＳＶＰｒｅＦ３は、対称であることが認められたが、ＤＳ−Ｃａｖ１は、不均一性のために対称ではないように思われる（分離ピークのない大きなショルダー）。
【図１６】以下のサンプル：ＲＳＶＰｒｅＦ３凍結乾燥サンプル１（４．０５ｓと表示されたピーク）；ＲＳＶＰｒｅＦ３凍結乾燥サンプル２（３．９９ｓと表示されたピーク）；ＲＳＶＰｒｅＦ３液体サンプル（４．０９ｓと表示されたピーク）；ＤＳ−Ｃａｖ１液体サンプル（４．１７ｓと表示されたピーク）に関する分析用超遠心分離（ＡＵＣ）により決定された沈降。
【図１７Ａ】非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより検討した宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）含量。左から右にかけて、レーンは、サイズマーカー；非還元ＲＳＶＰｒｅＦ３；非還元ＤＳ−Ｃａｖ１；還元ＲＳＶＰｒｅＦ３；還元ＤＳ−Ｃａｖ１；およびサイズマーカーである。非還元および還元のＲＳＶＰｒｅＦ３における主要バンドのすぐ上に、ＦＦＦ’を表す微小バンド（Ｆ１＋ｐ２７）が存在することに留意されたい。
【図１７Ｂ】一次Ａｂ：ＧＲＰ７８／ＢｉＰ抗体（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、カタログ番号：ＰＡ１−０１４Ａ、宿主／アイソタイプ：ウサギ／ＩｇＧ、ポリクローナル）；二次Ａｂ：Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７ニワトリ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、Ａ２１４４３）により検出されたＧＲＰ７８を用いたウエスタンブロット（ゲル由来）。
【図１８】ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、ＲＳＶＰｒｅＦ３およびＤＳ−Ｃａｖ１組成物の含量および純度を検討した。ＤＳ−Ｃａｖ１クロマトグラフトレースにおいてｐ２７ピークは存在しないことに留意されたい。
【図１９】弱陽イオン交換（ＷＣＸ）を用いて、ＲＳＶＰｒｅＦ３およびＤＳ−Ｃａｖ１のＦＦＦおよびＦＦＦ’集団を検討した。ＲＳＶＰｒｅＦ３組成物は、２つの別々の対称な十分に分離したピーク（ＦＦＦおよびＦＦＦ’）を示しているが、ＤＳ−Ｃａｖ１は、ＦＦＦとＦＦＦ’との間の保持時間を有する単一の比較的広いピークである。
【図２０】生理食塩水群と比較した、ＤＳ−Ｃａｖ１またはＲＳＶＰｒｅＦ３製剤を投与した群におけるＲＳＶ  Ａ中和抗体（Ｎａｂ）力価のブースティングを測定することによる、雌ウシにおけるＲＳＶＰｒｅＦ３（凍結乾燥）の免疫特徴付け。Ｄ−７＝免疫化の７日前；ｄＰＩ＝免疫化後の日数。
【図２１】ナイーブＣＢ６Ｆ１マウスにおける免疫原性に対するｐ２７の影響を、免疫化後１４日目にナイーブＣＢ６Ｆ１マウスにおけるＦＦＦまたはＦＦＦ’製剤により誘導されたｈＲＳＶ  Ａ中和抗体力価を観察することによって、評価した。ＦＦＦ’は、ＦＦＦにより誘導されたＮＡｂ応答に対して非劣性のＲＳＶ  Ａ中和Ａｂ応答を誘導した。
【図２２Ａ】製造スケールのバイオリアクターにおける製造時間の増加に対する、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド産生ＣＨＯ細胞クローンの生細胞密度および生存率。
【図２２Ｂ】製造スケールのバイオリアクターにおける組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの力価の蓄積。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明の詳細な説明
出願人は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、特定の保存条件下で不安定であり、部位Ｏおよび部位Ｖにおける抗体結合の測定可能な低減（Ｆａｂ抗体シフトアッセイによる）をもたらす自発的なコンフォメーション変化を受け、そのコンフォメーション変化は、緩衝液中での保存中における組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの割合の増加に影響を及ぼすことを観察した。このコンフォメーション変化を受ける組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの画分を停止するまたは最小限にするための組成物および方法が、本明細書において提供される。出願人は、さらに、以前に発表されたＳ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有する組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドよりも、純度が高く、低い凝集、少ない量の部分グリコシル化、および低いｐＩを示すことが認められているＳ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物を、本明細書において提供する。本明細書に開示される組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドおよびそれらを製造する方法は、ＷＯ２０１４１６０４６３に開示の通りに製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドよりも、純度が高く、低い宿主細胞タンパク質含量および低い凝集、少ない量の部分グリコシル化、ならびに低いｐＩを示す組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをもたらすことが予想される。
【００１４】
定義
用語「組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド」または「可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド」とは、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含み、三量体化フォルドンドメインを含むＲＳＶ  Ｆタンパク質を意味する。このような置換されたＲＳＶ  Ｆタンパク質の例は、ＷＯ２０１４１６０４６３に開示されており、置換されたアミノ酸の位置は、それにおいて配列識別子１２４として示される野生型ＲＳＶ  Ｆタンパク質配列を参照して記載されている。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、最終的にフューリンによって内部で切断される単一ポリペプチド（Ｆ０）として発現する。例示的なＦ０組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、図１Ｂに示しており、例示的なＦ０ポリペプチド配列は、配列番号１において示される。フューリンタンパク質分解は、タンパク質を２つの鎖に分離し、１つは、Ｆ１アミノ酸配列を含み、１つは、Ｆ２アミノ酸配列を含むため、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、少なくともＦ１鎖およびＦ２鎖を含む。２つのフューリン切断部位の存在のために、タンパク質分解は、２つの鎖、Ｆ１およびＦ２、ならびにｐ２７ペプチドの放出をもたらし得るが、しかしながら、出願人らは、成熟組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの画分は、１つのフューリン切断部位のみにおいて切断され得、ｐ２７ペプチドは放出されないことを観察している。このことは、本明細書において他所で説明する。
【００１５】
「Ｆ１鎖」とは、切断されたＦ０分子のＣ末端部分を意味する。例示的なＦ１鎖は、図１Ｂに示しており、例示的なＦ１鎖ポリペプチド配列は、配列番号２および配列番号８において示される。
【００１６】
「Ｆ２鎖」とは、シグナルタンパク質が除去されている切断されたＦ０分子のＮ末端部分を意味する。例示的なＦ２鎖は、図１Ｂに示しており、例示的なＦ２鎖ポリペプチド配列は、配列番号３において示される。
【００１７】
「Ｆプロトマー」または「ｐｒｅＦ」とは、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するが、ｐ２７ペプチドアミノ酸配列を欠く組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを意味する。
【００１８】
「Ｆ’プロトマー」または「ｐｒｅＦ’」とは、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するが、ｐ２７ペプチドの少なくとも１０個の隣接するアミノ酸から、最大でｐ２７ペプチドの全体を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを意味する。
【００１９】
「ｐ２７ペプチド」とは、２つのフューリン部位の両方における完全なタンパク質分解を通じて放出されるポリペプチド（Ｆ０）のアミノ酸の全長に相当するアミノ酸配列を意味する。いくつかの実施形態において、フューリンタンパク質分解は、ＲＳＶ株によって変わり得る２７アミノ酸ｐ２７ペプチドを放出する。いくつかの実施形態において、ｐ２７ペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を有する。
【００２０】
「三量体」または「組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体」とは、３個の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのタンパク質複合体であって、各組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、Ｆ１鎖およびＦ２鎖を含み、さらに、複合体の各組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、三量体の構造が、式：
ｎＦ＋（３−ｎ）Ｆ’  （式Ｉ）
（式中、ｎは、０〜３の整数であり、Ｆは、Ｆプロトマーであり、Ｆ’は、Ｆ’プロトマーである。）により示されるように、Ｆ’およびＦプロトマーからなる群から独立に選択される、複合体を意味する。
【００２１】
「切断されていないフューリン切断部位」とは、最小のアミノ酸配列…ＲＸＲＲＸ１…（配列番号９）（式中、ＸおよびＸ１は、任意のアミノ酸である。）を意味する（例えば、Moehring et al. (1993) “Strains of CHO-K1 cells resistant to Pseudomonas exotoxin A and cross-resistant to diphtheria toxin and viruses,” Infect. Immun. 41:998-1009参照）。
【００２２】
「抗原」とは、動物に注入、吸収またはそうでなければ導入される組成物を含む、動物における抗体の産生および／またはＴ細胞応答を刺激し得る化合物、組成物、または物質を意味する。したがって、用語「抗原ポリペプチド」とは、動物における抗体の産生および／またはＴ細胞応答を刺激し得るポリペプチドを意味する。用語「抗原」は、総ての関連する抗原エピトープを含む。用語「エピトープ」または「抗原決定基」は、Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原上の部位を指す。「優性抗原エピトープ」または「優性エピトープ」は、機能的に重要な宿主免疫応答、例えば、抗体応答またはＴ細胞応答が行われるエピトープである。このため、病原体に対する防御免疫応答に関しては、優性抗原エピトープは、宿主免疫系によって認識された際、病原体により引き起こされた疾患からの防御をもたらす抗原エピトープである。用語「Ｔ細胞エピトープ」は、適当なＭＨＣ分子に結合した際、（Ｔ細胞受容体を介して）Ｔ細胞によって特異的に結合されるエピトープを指す。「Ｂ細胞エピトープ」は、抗体（またはＢ細胞受容体分子）によって特異的に結合されるエピトープである。
【００２３】
「抗原組成物」とは、抗原ポリペプチド（ポリペプチドのより高次の形態、例えば、三量体などを含む）または２つ以上の異なる抗原ポリペプチド（それらのより高次の形態を含む）を含む組成物を意味する。本明細書に記載の通り、抗原組成物は、望まれない分子、例えば、抗原組成物が宿主細胞における抗原ポリペプチドの発現から生じる場合の宿主細胞タンパク質、他の汚染分子などを除去するために、精製されてもよい。
【００２４】
「精製」とは、その存在が望まれない成分を組成物から除去する方法を意味する。精製は、相対的な用語であり、総ての微量の望ましくない成分を組成物から除去することを必要とするわけではない。ワクチン製造の文脈において、精製は、遠心分離、透析、イオン交換クロマトグラフィー、およびサイズ排除クロマトグラフィー、アフィニティー精製または沈殿などの方法を含む。このため、用語「精製」は、絶対純度を必要とせず、むしろ、相対語としての意味を持つ。よって、例えば、精製された抗原組成物は、特定の抗原が、その発生環境、例えば、細胞内または生化学的反応チャンバー内にある場合よりも濃縮されている組成物である。実質的に純粋な抗原の調製物は、所望の抗原が、ＥＬＩＳＡ、例えば、Ｃｙｇｎｕｓ  ＣＨＯ  ｈｃｐ  ＥＬＩＳＡによって定量された、調製物の抗原および望まれないタンパク質含量の全量の少なくとも９５％、例えば、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％以上の重量濃度（ｗ／ｗ）を示すように、精製することができる。
【００２５】
「宿主細胞」とは、組換えポリペプチド、例えば、本明細書における組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を意味する。例示的な宿主細胞としては、原核生物の（すなわち、細菌の）宿主細胞、例えば、大腸菌、ならびに、真菌（例えば、酵母）細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯおよびＨＥＫ２９３細胞）を含む多数の真核生物の宿主細胞が挙げられる。
【００２６】
「宿主細胞タンパク質」または「ＨＣＰ」とは、組換えポリペプチドをコードするベクターの非存在下で宿主細胞により産生されるポリペプチドを意味する。例えば、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、宿主細胞タンパク質とはみなされないが、ＧＲＰ７８タンパク質は、宿主細胞タンパク質とみなされる。
【００２７】
「ＧＲＰ７８」とは、７８ｋＤグルコース調節または熱ショック７０タンパク質５（ＨＳＰＡ５）宿主細胞タンパク質、ＣＨＯに対するアクセッション番号ＮＰ＿００１２３３６６８を意味する。
【００２８】
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド三量体の文脈における「非凝集」とは、３個のプロトマーの三量体に関して予測された分子量、すなわち、サイズ排除高圧液体クロマトグラフィー（ＳＥ−ＨＰＬＣ）（本明細書において他所に記載）によって決定された１５０ｋＤａ超であるが２００ｋＤａ未満の分子量を有する三量体を意味する。対照的に、凝集組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド三量体は、三量体のまたはさらにはより高次の二量体として存在し得る。
【００２９】
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの文脈における「シアル化」または「シアル化率（％）」とは、最初に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドからＮ−グリカンを切断し、次いで、切断されたＮ−グリカンを、還元的アミノ化を通じて２−ＡＢで標識し、次いで、切断されたＮ−グリカンを親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって分離し、ＦＬＲおよびＭＳ検出器によって、各ピークにおけるＮグリカンの同一性を検出および定量化する、というように行ったグリカンプロファイリングにより決定された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド上の全Ｎグリカンのうちのシアル化グリカンの割合を意味する。
【００３０】
「免疫原性組成物」とは、例えば、ＲＳＶなどの病原体に対する特異的な免疫応答を誘発することができるヒトまたは動物対象（例えば、実験的状況下で）に対する投与に適切な物質の組成物を意味する。そのようなものとして、免疫原性組成物は、１つ以上の抗原（例えば、ポリペプチド抗原）または抗原エピトープを包含する。免疫原性組成物は、免疫応答を誘発または亢進することができる１つ以上のさらなる成分、例えば、賦形剤、担体、および／またはアジュバントも含み得る。特定の場合において、免疫原性組成物は、病原体により誘発された症状または状態に対して、全体的にまたは部分的に、対象を防御する免疫応答を誘発するために、投与される。いくつかの場合において、病原体により引き起こされた症状または疾患は、対象が病原体に曝露した後、病原体（例えば、ＲＳＶ）の複製を阻害することによって、予防される（または低減もしくは寛解される）。本開示の文脈において、「免疫原性組成物」の用語は、ＲＳＶに対する防御的な曝露前の免疫応答またはＲＳＶに対する対症的な曝露後の免疫応答を誘発する目的で、対象または対象の集団に対する投与を意図した組成物（すなわち、ワクチン組成物またはワクチン）を包含するものと理解される。
【００３１】
「薬学上許容可能な」とは、言及されるものが、対象（例えば、ヒトまたは動物対象）に対する投与に適切であることを意味する。Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 15th Edition (1975)は、免疫原性組成物を含む治療用および／または予防用組成物の医薬送達に適切な組成物および製剤（希釈剤を含む）を記載している。
【００３２】
「アジュバント」とは、免疫応答の産生を非特異的に亢進する剤を意味する。一般的なアジュバントとしては、抗原が吸着されている無機質（ミョウバン、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム）の懸濁液；エマルション、例えば、油中水型、および水中油型（ならびにその異型、例えば、ダブルエマルションおよび可逆的エマルション）、リポ糖、リポ多糖、免疫賦活核酸（例えば、ＣｐＧオリゴヌクレオチド）、リポソーム、Ｔｏｌｌ様受容体アゴニスト（特に、ＴＬＲ２、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７／８およびＴＬＲ９アゴニスト）、ならびにそのような成分の種々の組合せが挙げられる。
【００３３】
「コスモトロピック剤」とは、タンパク質を一般的に安定化する分子またはイオンを作る極性水構造を意味する。いくつかの実施形態において、コスモトロピック剤は、極性分子または荷電分子である。いくつかの実施形態において、コスモトロピック剤は、塩由来の荷電イオンである。
【００３４】
「カオトロピック剤」とは、タンパク質を一般的に不安定化する水構造破壊分子を意味する。いくつかの実施形態において、カオトロピック剤は、極性分子または荷電分子である。いくつかの実施形態において、カオトロピック剤は、塩由来の荷電イオンである。
【００３５】
抗原組成物
いくつかの実施形態において、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記組成物は、宿主細胞タンパク質に対して、９６％超、例えば、９７％超、９８％超、９９％超、９９．１％超、９９．２％超、９９．３％超、９９．４％超、９９．５％超、９９．６％超、９９．７％超、９９．８％超、または９９．９％超の重量濃度（ｗ／ｗ）の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む、組成物が提供される。この実施形態において、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質の重量は、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質の重量に加えられた宿主細胞タンパク質の総合重量と比較される。このため、この実施形態において、抗原組成物は、実質的な量の他の非宿主細胞タンパク質、例えば、さらなる組換え抗原、ポリペプチド免疫刺激剤またはアジュバントなどを含み得、例えば、宿主細胞タンパク質に対して少なくとも９９．９％の重量濃度（ｗ／ｗ）のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をさらに含む。
【００３６】
宿主細胞タンパク質の同一性は、質量分析によって決定され得、量は、以下のように同位体希釈質量分析によって示される。抗原組成物を、決定された濃度に基づいて１，４−ジチオトレイトール（ＤＴＴ）で還元し、イソアセトアミドでアルキル化し、トリプシンで３７℃にて一晩消化する。消化物を酸性化し、データ依存収集モード下で動作するＴｈｅｒｍｏ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｏｒｂｉｔｒａｐなどの装置を用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析する。生データからのピーク一覧を、Ｍａｒｓｃｏｔ検索エンジンなどの検索エンジンを使用して、抗原配列ならびに総ての公知のおよび予測された宿主細胞タンパク質の配列を含むタンパク質データベースに対して検索する。任意の夾雑タンパク質または望まれないタンパク質の量を定量化するために、同位体希釈質量分析法を実施してもよい。
【００３７】
全体的なＨＣＰの量を決定するために、ＥＬＩＳＡアッセイを利用してもよい。適切なＥＬＩＳＡキットは、当技術分野で入手可能であり、製造業者の説明書に従って行う。例えば、ＣＨＯ細胞由来のＨＣＰに関しては、適切なキットは、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＬＬＣ，４３３２  Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｒｄ．ＳＥ，Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ２８４６１から入手可能である。www-dot-cygnustechnologies.comにて閲覧可能な、ＣＨＯ  ＨＣＰ  ＥＬＩＳＡ  Ｐｒｏｄｕｃｔ  Ｉｎｓｅｒｔ，８００−Ｆ０１５，Ｒｅｖ．３，１０Ｊａｎ２０１８を参照。
【００３８】
いくつかの実施形態において、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記組成物は、総タンパク質に対して、９６％超、例えば、９７％超、９８％超、９９％超、９９．１％超、９９．２％超、９９．３％超、９９．４％超、９９．５％超、９９．６％超、９９．７％超、９９．８％超、または９９．９％超の重量濃度（ｗ／ｗ）の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む、組成物が提供される。
【００３９】
いくつかの実施形態において、抗原組成物は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドに対して、０．１９％未満、例えば、０．１８％未満、例えば、０．１７％、０．１６％、０．１５％、０．１４％、０．１３％、０．１２％、０．１１％、０．１０％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１９％、０．０１８％、０．０１７％、０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、または０．０１３％未満の重量濃度（ｗ／ｗ）の宿主細胞タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、抗原組成物は、総タンパク質に対して、０．１８％未満、例えば、０．１７％、０．１６％、０．１５％、０．１４％、０．１３％、０．１２％、０．１１％、０．１０％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２、０．０１９％、０．０１８％、０．０１７％、０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、または０．０１３％未満の重量濃度（ｗ／ｗ）の宿主細胞タンパク質を含む。
【００４０】
いくつかの実施形態において、本明細書における方法によって検出可能な抗原組成物中の唯一の宿主細胞タンパク質は、ＧＲＰ７８宿主細胞タンパク質である。いくつかの実施形態において、抗原組成物は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドに対して、０．１８％未満、例えば、０．１７％、０．１６％、０．１５％、０．１４％、０．１３％、０．１２％、０．１１％、０．１０％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２、０．０１９％、０．０１８％、０．０１７％、０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、または０．０１３％未満の重量濃度（ｗ／ｗ）のＧＲＰ７８宿主細胞タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、抗原組成物は、総タンパク質に対して、０．１８％未満、例えば、０．１７％、０．１６％、０．１５％、０．１４％、０．１３％、０．１２％、０．１１％、０．１０％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２、０．０１９％、０．０１８％、０．０１７％、０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、または０．０１３％未満の重量濃度（ｗ／ｗ）のＧＲＰ７８宿主細胞タンパク質を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、本明細書における方法によって検出可能な抗原組成物中の唯一の宿主細胞タンパク質は、ＧＲＰ７８宿主細胞タンパク質であり、抗原組成物は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドに対して、０．１８％未満、例えば、０．１７％、０．１６％、０．１５％、０．１４％、０．１３％、０．１２％、０．１１％、０．１０％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２、０．０１９％、０．０１８％、０．０１７％、０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、または０．０１３％未満の重量濃度（ｗ／ｗ）のＧＲＰ７８宿主細胞タンパク質を含む。いくつかの実施形態において、本明細書における方法によって検出可能な抗原組成物中の唯一の宿主細胞タンパク質は、ＧＲＰ７８宿主細胞タンパク質であり、抗原組成物は、総タンパク質に対して、０．１８％未満、例えば、０．１７％、０．１６％、０．１５％、０．１４％、０．１３％、０．１２％、０．１１％、０．１０％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２、０．０１９％、０．０１８％、０．０１７％、０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、または０．０１３％未満の重量濃度（ｗ／ｗ）のＧＲＰ７８宿主細胞タンパク質を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態において、抗原組成物は、凝集三量体に対して、８０％超、例えば、８１％超、８２％超、８３％超、８４％超、８５％超、８６％超、８７％超、８８％超、８９％超、９０％超、９１％超、９２％超、９３％超、９４％超、９５％超、９６％超、または９７％超の重量濃度（ｗ／ｗ）の非凝集三量体を含む。
【００４３】
非凝集組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド三量体のパーセンテージを決定するために、ＳＥ−ＨＰＬＣを利用してもよい。そのような実験は、サイズ排除クロマトグラフィーカラム、例えば、東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ  ＵｌｔｒａＳＷ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅカラム、３μｍ、３００Å、７．８×３００ｍｍ、カタログ番号２２８５５６および東ソー社製ＴＳＫｇｅｌ  ＵｌｔｒａＳＷ  Ａｇｇｒｅｇａｔｅガードカラム、３μｍ、６×４０ｍｍ、カタログ番号Ａ０００２７を利用した、ＰＤＡ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  Ａｌｌｉａｎｃｅなどの市販のＨＰＬＣ装置で行ってもよい。許容可能な移動相緩衝液は、１００ｍＭリン酸ナトリウム、３００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０５である。サンプルを、移動相で２２０μｇ／ｍＬに希釈し、ＳＥ−ＨＰＬＣに注入し、０．５ｍＬ／分で３０分間測定を行う。次いで、サンプルのクロマトグラムを、９〜２３．５分の時間枠内で積分する。各サンプル中に存在する低分子量（ＬＭＷ）種および高分子量（ＨＭＷ）種のパーセントの決定を単純化するために、時限群を使用する。例示的な時限群保持時間枠は、以下の通りである：
・ＨＭＷ時限群９．０〜１７．３分。
・主ピークの頂点は、およそ１７．６〜１７．８分に存在する。
・ＬＭＷ時限群１９．１〜２３．５分。
各組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのサンプルのクロマトグラムに存在するＬＭＷ、主ピーク、およびＨＭＷ種のパーセンテージを、時限群を用いて算出する；総ての積分面積を加えて１００％にする必要がある。
【００４４】
いくつかの実施形態において、グリコシル化組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、グリコシル化を含めて、５９．５ｋＤａ超、例えば、６０．０ｋＤａ超、６０．５ｋＤａ超、または６１．０ｋＤａ超の分子量を有する。分子量を決定するために、ＬＣ−ＭＳを利用してもよい。
【００４５】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、等電点ゲル電気泳動によって決定された、７．８未満、例えば、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、７．２、７．１、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７未満、または５．４未満のｐＩを有する。いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、７．８〜５．３、７．４〜５．３、７．０〜５．３、６．８〜５．３、６．６〜５．３、６．４〜５．３、６．２〜５．３、または６．０〜５．３の範囲のｐＩを有する。いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、６．０〜５．３の範囲のｐＩを有する。
【００４６】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、グリカン基を含み、ここで、前記グリカン基の少なくとも４０％、例えば、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、または少なくとも７５％は、ＨＩＬＩＣ−ＦＬＲ／ＭＳを用いたグリカンプロファイリングで決定されるように、シアル化されている。
【００４７】
本明細書における抗原組成物は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の集団を含み、ここで、前記集団の各三量体は、（ａ）Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆプロトマー」）；ならびに（ｂ）ｐ２７ペプチドの少なくとも１０個のアミノ酸をさらに含む、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆ’プロトマー」）からなる群から独立に選択される３個の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドから構成される。かかる実施形態において、三量体は、式：
ｎＦ＋（３−ｎ）Ｆ’  （式Ｉ）
（式中、ｎは、０〜３の整数であり、Ｆは、Ｆプロトマーであり、Ｆ’は、Ｆ’プロトマーである。）により示される。いくつかの実施形態において、ｎは、１〜３の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは、２〜３の整数である。いくつかの実施形態において、ｎは３である。いくつかの実施形態において、三量体の集団における組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの少なくとも１％、例えば、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、または少なくとも２５％は、Ｆ’プロトマーである。ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのＦ’プロトマーおよびＦプロトマーへの分離、ならびにそれらの定量化の決定は、変性条件下での逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって行ってもよい。本明細書において他所に記載するように、ＲＰ−ＨＰＬＣを使用することにより、三量体をＦプロトマーおよびＦ’プロトマーに変性し、次いで、それらの疎水性の差に基づいて、プロトマーを分離する。
【００４８】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの前記三量体の少なくとも１％、例えば、少なくとも２％、少なくとも３％、少なくとも４％、少なくとも５％、少なくとも６％、少なくとも７％、少なくとも８％、少なくとも９％、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、少なくとも３５％、少なくとも３６％、少なくとも３７％、少なくとも３８％、少なくとも３９％、少なくとも４０％、少なくとも４１％、少なくとも４２％、少なくとも４３％、少なくとも４４％、少なくとも４５％は、少なくとも１つのＦ’プロトマーを含む。例えば、一つの実施形態において、プロトマーのおよそ２０％がＦ’であった場合、集団における三量体のおよそ４０％が、少なくとも１つのＦ’プロトマーを含むことが認められた。少なくとも１つのＦ’プロトマーを含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体およびゼロ個のＦ’１プロトマーを含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドへの三量体の分離（およびそれらの定量化）は、自然条件下での弱陽イオン交換液体クロマトグラフィー（ＷＣＸ−ＬＣ）によって行ってもよい。本明細書において他所に記載するように、ＷＣＸ−ＬＣを使用することにより、三量体コンフォメーションを維持し、次いで、それらの内因性変化の差に基づいて分離する。
【００４９】
いくつかの実施形態において、Ｆ’プロトマーは、切断されていないフューリン切断部位を含むＦ１鎖を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ’プロトマーは、Ｆプロトマーの分子量よりも少なくとも１．０ｋＤａ、例えば、少なくとも１．５ｋＤａ、少なくとも２．０ｋＤａ、少なくとも２．５ｋＤａ、少なくとも３．０ｋＤａ大きい分子量を有する。いくつかの実施形態において、ゼロ個のＦ’プロトマーを含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体に対する少なくとも１つのＦ’プロトマーを含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の比は、少なくとも１：１．２；例えば、少なくとも１：１．３；少なくとも１：１．４；少なくとも１：１．５；少なくとも１：１．６；少なくとも１：１．７；少なくとも１：１．８；少なくとも１：１．９；少なくとも１：２．０；少なくとも１：２．１；少なくとも１：２．２；少なくとも１：２．３；少なくとも１：２．４；少なくとも１：２．５；少なくとも１：２．６；少なくとも１：２．７；少なくとも１：２．８；少なくとも１：２．９；少なくとも１：３．０；少なくとも１：３．５；少なくとも１：４；少なくとも１：９；少なくとも１：１９；または少なくとも１：２９である。
【００５０】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の集団は、クロマトグラフィーによって、沈降により検出可能な第１および第２のピークに分離され、前記第１のピークは、約３．９６Ｓの沈降係数を有し、前記第２のピークは、約４．１３Ｓの沈降係数を有する。沈降係数は、実施例３（Ｈ）に記載の通りに決定される。
【００５１】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、Ｆ１鎖およびＦ２鎖を含み、ここで、Ｆ１鎖は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、Ｆ１鎖は、配列番号２のアミノ酸配列を含む。ＦプロトマーおよびＦ’プロトマーの両方とも、この実施形態によって示される。いくつかの実施形態において、Ｆ１鎖は、例えば、Ｆプロトマーの場合、配列番号２のアミノ酸配列からなる。
【００５２】
いくつかの実施形態において、Ｆ’プロトマーは、配列番号６のアミノ酸配列を含むＦ１鎖を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ’プロトマーは、Ｎ末端ｐ２７ペプチドを有するＦ１鎖を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ’プロトマーは、配列番号７のアミノ酸配列を含むＦ１鎖を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、Ｆ１鎖およびＦ２鎖を含み、ここで、Ｆ２鎖は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、Ｆ２鎖は、配列番号３のアミノ酸配列を含み、例えば、それからなる。ＦプロトマーおよびＦ’プロトマーの両方とも、この実施形態によって示される。
【００５４】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、Ｆ１鎖およびＦ２鎖を含み、ここで、Ｆ１鎖は、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｆ２鎖は、配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、Ｆ１鎖は、配列番号２のアミノ酸配列を含み、Ｆ２鎖は、配列番号３のアミノ酸配列を含む、例えば、それからなる。ＦプロトマーおよびＦ’プロトマーの両方とも、この実施形態によって示される。かかる実施形態において、Ｆ１鎖は、適切には、例えば、Ｆプロトマーの場合、配列番号２のアミノ酸配列からなり得る。
【００５５】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、例えば、Ｆ’プロトマーの場合、配列番号８と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦ１鎖および配列番号３と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦ２鎖を含む。適切には、Ｆ１鎖は、配列番号８のアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）、Ｆ２鎖は、配列番号３のアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）。
【００５６】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、例えば、発現中のプロセシング前の、Ｆ０分子の全体を含む。いくつかの実施形態において、Ｆ０分子は、配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。適切には、Ｆ０鎖は、配列番号１のアミノ酸配列を含む（例えば、それからなる）。
【００５７】
前述の配列と配列類似性を共有する組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの改変バリアントも、上記の複数の実施形態の文脈において使用することができる。一般にポリペプチド（およびヌクレオチド）配列に関して、以下に記載の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（およびポリヌクレオチド）配列間の類似性は、配列間の類似性によって表される、あるいは配列同一性として示されることは、当業者により理解されるであろう。配列同一性は、同一性（または類似性）パーセンテージとして測定されることが多く；パーセンテージが高い程、２つの配列の一次構造がより類似している。一般に、２つのアミノ酸（またはポリヌクレオチド）配列の一次構造がより類似している程、フォールディングおよび組立てから生じるより高次の構造が、より類似している。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（およびポリヌクレオチド）配列のバリアントは、通常は、１つまたは少数のアミノ酸欠失、付加または置換を有するが、にもかかわらず、非常に高いパーセンテージのそれらのアミノ酸、一般に、それらのポリヌクレオチド配列を共有する。より重要なことに、バリアントは、本明細書に開示される参照配列の構造的特性、したがってコンフォメーション特性を保持する。
【００５８】
配列同一性を決定する方法は、当技術分野で周知であり、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド、およびそれらをコードする核酸（例えば、以下に記載の通り）に適用可能である。種々のプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981; Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443, 1970; Higgins and Sharp, Gene 73:237, 1988; Higgins and Sharp, CABIOS 5:151, 1989; Corpet et al., Nucleic Acids Research 16:10881, 1988;およびPearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444, 1988において記載されている。Altschul et al., Nature Genet. 6:119, 1994は、配列アラインメント法および相同性の計算の詳細な検討を提示している。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）(Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403, 1990)が、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘとともに使用するために、米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ、ベセスダ、メリーランド州）およびインターネット上を含むいくつかの供給源から入手可能である。このプログラムを使用した配列同一性を決定する方法の説明は、インターネット上のＮＣＢＩウェブサイトで入手可能である。
【００５９】
いくつかの場合において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、それが由来する天然に存在する株のアミノ酸配列に対して、１つ以上のアミノ酸修飾を有する（例えば、前述の安定化修飾に加えて）。このような差は、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失または置換であり得る。バリアントは、通常は、アミノ酸残基の２０％以下、例えば、１５％、１０％、５％、２％、または１％以下が異なる。例えば、結果として得られる組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのコンフォメーションまたは免疫原性エピトープを変化させない、配列番号１、２、３、６、７、および８の例示的なＦ１鎖、Ｆ２鎖、Ｆ０分子、およびｐ２７ペプチドの配列と比較して、０〜５個の位置（例えば、０、１または２個）における最大５個（例えば、１または２個）の残基の欠失、０〜５個の位置（例えば、０、１または２個）における最大５個の残基（例えば、１または２個）の挿入、および最大２０個の残基（例えば、最大１０個の残基、特に、最大５個の残基）の置換を有するものが挙げられる。このため、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの文脈におけるバリアントは、通常、参照タンパク質、例えば、配列番号１、２、３、６、７、および８の例示的なＦ１鎖、Ｆ２鎖、Ｆ０分子、およびｐ２７ペプチドの配列、または本明細書に開示される例示的な組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのいずれかにおいて例示される参照配列と、少なくとも８０％、または８５％、より一般的に、少なくとも９０％以上、例えば９５％、またはさらには９８％もしくは９９％の配列同一性を共有する。本開示の特色として含まれるさらなるバリアントには、ＷＯ２０１４１６０４６３に開示されるバリアントが含まれる。
【００６０】
いくつかの実施形態において、抗原組成物は、前記可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体を含む。このため、いくつかの実施形態において、抗原組成物は、３個の同一のＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む三量体を含む。いくつかの実施形態において、抗原組成物は、三量体の別の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドメンバーと配列レベルで異なる少なくとも１個の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む三量体を含む。いくつかの実施形態において、抗原組成物は、２個の同一の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体と、他の２個の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドと配列レベルで異なる１個の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドとを含む。いくつかの実施形態において、抗原組成物は、３個の異なる組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（各組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、アミノ酸配列レベルで異なる）を含む。
【００６１】
ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードする核酸；それを含む宿主細胞；ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを製造する方法
本開示の別の側面は、上記の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードする組換え核酸に関する。特定の複数の実施形態において、組換え核酸は、選択された原核生物または真核生物の宿主細胞における発現に関して最適化されたコドンである。複製および発現を促進するために、核酸は、ベクター、例えば、原核生物または真核生物の発現ベクターに組み込むことができる。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞も、本開示の特色である。好ましい宿主細胞としては、原核生物の（すなわち、細菌の）宿主細胞、例えば、大腸菌、ならびに、真菌（例えば、酵母）細胞、昆虫細胞、および哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯ、ＶＥＲＯおよびＨＥＫ２９３細胞）を含む多数の真核生物の宿主細胞が挙げられる。
【００６２】
当業者に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードする核酸の製造を導くのに十分な例示的な手順は、Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989; Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3d ed., Cold Spring Harbor Press, 2001; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, 1992 (および2003の補遺);ならびにAusubel et al., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., Wiley & Sons, 1999に記載されている。
【００６３】
本明細書に開示される組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、組換えタンパク質の発現および精製に関する十分確立された手順を用いて、製造される。当業者を導くのに十分な手順は、以下の参考文献：Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 200; and Ausubel et al. Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley & Sons, Inc., 999に記載されている。さらなるおよび具体的な詳細は、以下に示す。以前に開示した核酸は、適切に、宿主細胞に導入することができ、本明細書に記載の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを製造するために使用することができる。
【００６４】
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードする核酸を含む宿主細胞も、本開示の特色である。好ましい宿主細胞としては、原核生物の（すなわち、細菌の）宿主細胞、例えば、大腸菌、ならびに、真菌（例えば、酵母、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)およびピキア・パストリス(Pichia pastoris)）細胞、昆虫細胞、植物細胞、および哺乳動物細胞（例えば、ＣＨＯおよびＨＥＫ２９３細胞）を含む多数の真核生物の宿主細胞が挙げられる。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド核酸は、例えば、発現ベクターなどのベクターを介して、宿主細胞に導入される（例えば、形質導入、形質転換またはトランスフェクトされる）。上記のように、ベクターは、最も典型的にはプラスミドであるが、このようなベクターは、例えば、ウイルス粒子、ファージなどでもあり得る。適切な発現宿主の例としては、細菌細胞、例えば、大腸菌、ストレプトマイセス属、およびネズミチフス菌(Salmonella typhimurium)；真菌細胞、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、ピキア・パストリス(Pichia pastoris)、およびアカパンカビ(Neurospora crassa)；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ(Drosophila)およびヨトウガ(Spodoptera frugiperda)；哺乳動物細胞、例えば、３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＨＥＫ２９３またはＢｏｗｅｓ黒色腫；植物細胞、例えば、藻類細胞などが挙げられる。
【００６５】
宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択、または挿入されたポリヌクレオチド配列の増幅に適当なように改変された従来の栄養培地中ですることができる。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、通常は、発現のために選択された宿主細胞を用いて以前に使用されたものであり、当業者ならびに本明細書で引用した参考文献、例えば、Freshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley- Liss, New Yorkおよび本明細書で引用した参考文献において明らかであろう。本発明の核酸に対応する発現産物も、非動物細胞、例えば、植物、酵母、真菌、細菌などにおいて産生され得る。Sambrook, Berger and Ausubelに加えて、細胞培養に関する詳細は、Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, NY; Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture; Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg New York)およびAtlas and Parks (eds) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, FLに記載されている。
【００６６】
細菌系において、多数の発現ベクターを、発現産物の使用目的に応じて選択することができる。例えば、大量のポリペプチドまたはその断片が抗体の産生に必要な場合、容易に精製される融合タンパク質の高レベルの発現を方向付けるベクターが、好ましく使用される。そのようなベクターとしては、限定されるものではないが、目的のコード配列、例えば、上記の本発明のポリヌクレオチドを、アミノ末端翻訳開始メチオニンおよび触媒的に活性なベータガラクトシダーゼ融合タンパク質を産生するベータガラクトシダーゼのそれに続く７残基の配列と、インフレームでベクター中にライゲートすることができる、多機能性大腸菌クローニングおよび発現ベクター、例えば、ＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社）；ｐＩＮベクター(Van Heeke & Schuster (1989) J Biol Chem 264:5503-5509)；ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ社、マディソン、ウィスコンシン州）が挙げられる。
【００６７】
同様に、サッカロマイセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)などの酵母において、構成的または誘導性プロモーター、例えば、アルファ因子、アルコールオキシダーゼおよびＰＧＨを含有する多数のベクターを、所望の発現産物の産生に使用することができる。総説については、Berger, Ausubel、および例えば、Grant et al. (1987; Methods in Enzymology 153:516-544)参照。哺乳動物宿主細胞において、プラスミドおよびウイルスベースのシステムの両方を含む多数の発現系を利用することができる。
【００６８】
宿主細胞は、挿入された配列の発現を調節する能力または発現したタンパク質を所望の様式で処理する能力に関して、場合により選択される。タンパク質のそのような修飾としては、限定されるものではないが、グリコシル化、（および例えば、アセチル化、カルボキシル化、リン酸化、脂質化およびアシル化）が挙げられる。例えば、タンパク質の前駆体型から成熟型へ切断する（例えば、フューリンプロテアーゼにより）翻訳後プロセシングは、宿主細胞の文脈において場合により実施される。様々な宿主細胞、例えば、３Ｔ３、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、２９３、ＷＩ３８などは、特異的な細胞機構およびそのような翻訳後活性に関する特徴的な機序を有し、導入された異種タンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。
【００６９】
本明細書に開示される組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの長期的な高収率の製造のために、安定した発現系が通常使用される。例えば、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを安定して発現する細胞株は、ウイルス起源の複製または内因性発現エレメントおよび選択可能なマーカー遺伝子を含有する発現ベクターを用いて、宿主細胞内に導入される。ベクターの導入後、細胞を栄養富化培地中で１〜２日間成長させ、次いで、培地を選択培地に入れ替える。選択可能なマーカーの目的は、選択に対して抵抗性を与えることであり、その存在は、導入された配列をうまく発現する細胞の成長および回収を可能にする。例えば、安定して形質転換された細胞の抵抗性群またはコロニーは、細胞型に適切な組織培養法を用いて、増幅することができる。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードする核酸で形質転換された宿主細胞は、細胞培養物からのコードされたタンパク質の発現および回収に適切な条件下で、場合により培養される。
【００７０】
適切な宿主細胞株の形質導入および宿主細胞の適当な細胞密度への成長後、選択されたプロモーターを、適当な手段（例えば、温度変化または化学的誘導）によって誘導し、細胞をさらなる期間培養する。場合により、培地は、プロテイナーゼによる発現タンパク質の分解を増大させる成分および／または添加物を含む。例えば、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを製造するために細胞を培養するのに使用される培地は、細胞または細胞外（例えば、マトリックス）プロテイナーゼによる望ましくない切断を低減または排除するための、プロテアーゼ阻害剤、例えば、キレート剤または小分子阻害剤（例えば、ＡＺ１１５５７２７２、ＡＳ１１１７９３など）を含み得る。
【００７１】
次いで、分泌されたポリペプチド産物を、培養培地から回収する。あるいは、細胞を、一次および二次フィルターを用いた深層濾過、遠心分離により回収し、物理的または化学的手段などによって破壊することができ、得られた粗抽出物を、さらなる精製のために保持する。タンパク質の発現において使用した真核生物または微生物の細胞は、凍結解凍サイクリング、超音波処理、機械的破壊、もしくは細胞溶解剤の使用を含む任意の好都合な方法、または当業者に周知の他の方法によって破壊することができる。
【００７２】
ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを精製する方法
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、次いで、リガンド結合基質を利用したマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製の工程を含む精製方法に、発現したＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供され、ここで、リガンドは、静電相互作用、水素結合、もしくは疎水性相互作用、またはそれらの組合せによってタンパク質と相互作用し得る。
【００７３】
マルチモーダルクロマトグラフィーのための培地は、当業者に公知である。例えば、イオン相互作用、水素結合および疎水性相互作用を含む複数の種類の相互作用を介して、標的分子と相互作用させるために、マルチモーダルイオン交換リガンドを利用してもよい。いくつかの実施形態において、方法は、第１に、ローディング緩衝液の存在下で、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを前記リガンド結合基質にローディングすること、第２に、溶出緩衝液の存在下で、前記リガンド結合基質からＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させることを含む。
【００７４】
いくつかの実施形態において、リガンド結合基質は、マルチモーダル陰イオン交換樹脂である。いくつかの実施形態において、リガンドは、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含む。Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むマルチモーダル陰イオン交換樹脂は、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社から市販されている。インターネットアドレスwww-dot-gehealthcare.comにおいて入手可能なＣａｐｔｏ接着マルチモーダル培地の説明書、２８−９０６４−０５ＡＡを参照。
【００７５】
いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、コスモトロピック剤を含む。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、カオトロピック剤を含む。コスモトロピック剤は、ＨＰＯ４、クエン酸塩、ＳＯ４、Ｆ、ＯＡｃ、ＣＯ２、ＳＯ２、ＳＣＮ、ＨＰＯ２、Ｍｇ、Ｌｉ、Ｚｎ、Ａｌ、ｔｅｒｔ−ブタノール、トレハロース、グルコース、プロリン、およびグルタミン酸塩を含む。カオトロピック剤は、Ｋ、Ｃｓ、ＮＨ４、（ＣＨ３）４Ｎ、ｎ−ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸塩、酢酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フェノール、２−プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、尿素、アルギニン、リシン、およびヒスチジンを含む。例えば、Kgwu et al., (2004) “The Effect of Buffers on Protein Conformational Stability” Pharmaceutical Technology, 28:86-108参照。
【００７６】
いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、コスモトロピック剤およびカオトロピック剤の両方を含む。かかる実施形態において、コスモトロピック剤およびカオトロピック剤の相殺作用は、結合基質に適用される。この方法は、望ましくない宿主細胞タンパク質の付随が最小限で、所望のポリペプチドを溶出させることが認められている。マルチモーダル陰イオン交換は、モノクローナル抗体の精製などの用途に使用されるが、これは、フロースルーモードで行われ、および／または、相殺的なコスモトロピック剤およびカオトロピック剤を含む緩衝液が利用される本実施形態とは対照的に、抗体がｐＨ勾配緩衝液を用いて溶出される場合に行われる。
【００７７】
いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、クエン酸イオンおよびアルギニンを含む。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、１５０〜３５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２００〜３００ｍＭのクエン酸ナトリウム、２２５〜２７５ｍＭのクエン酸ナトリウム、２３０〜２７０ｍＭのクエン酸ナトリウム、２３５〜２６５ｍＭのクエン酸ナトリウム、２４０〜２６０ｍＭのクエン酸ナトリウム、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；および２００〜４００ｍＭのアルギニン、２５０〜３５０ｍＭのアルギニン、２７５〜３２５ｍＭのアルギニン、２８０〜３２０ｍＭのアルギニン、２８５〜３１５ｍＭのアルギニン、２９０〜３１０ｍＭのアルギニン、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニンを含む。一つの実施形態において、溶出緩衝液は、２５０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび３００ｍＭのアルギニンを含む。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５〜２５ｍＭのリン酸ナトリウム、１６〜２４ｍＭのリン酸ナトリウム、１７〜２３ｍＭのリン酸ナトリウム、１８〜２２ｍＭのリン酸ナトリウム、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウムをさらに含む。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む。
【００７８】
電解質溶液の伝導率は、電気を伝導する能力の尺度である。伝導率のＳＩ単位は、メートルあたりのシーメンス（Ｓ／ｍ）である。センチメートルあたりのミリシーメンス（ｍＳ／ｃｍ）は、電気伝導率のＳＩ単位（メートルあたりのシーメンス）の小数である。１ｍＳ／ｃｍ＝０．１Ｓ／ｍ。伝導率の測定は、溶液中のイオン含量を測定するために、多くの産業上の利用において慣例的に使用される。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液の伝導率は、ローディング緩衝液が、２０〜３４ｍＳ／ｃｍ、２１〜３３ｍＳ／ｃｍ、２２〜３２ｍＳ／ｃｍ、２３〜３１ｍＳ／ｃｍ、２４〜３０ｍＳ／ｃｍ、または２５〜２９ｍＳ／ｃｍの伝導率を有するように、目的の標的ポリペプチドでのリガンドのローディングを高めるように好ましく調整してもよい。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液は、２５〜２９ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液の伝導率は、ローディング緩衝液が、１１〜３４ｍＳ／ｃｍ、１３〜３１ｍＳ／ｃｍ、１５〜２７ｍＳ／ｃｍ、１７〜２５ｍＳ／ｃｍ、１９〜２３ｍＳ／ｃｍ、または２０〜２２ｍＳ／ｃｍの伝導率を有するように、目的の標的ポリペプチドでのリガンドのローディングを高めるように好ましく調整してもよい。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液は、１９〜２３ｍＳ／ｃｍの伝導率を有する。
【００７９】
いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液は、１５０〜３００ｍＭ、例えば、１７５〜２７５ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２１０〜２４０ｍＭ、２２０〜２３０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液は、２２５ｍＭの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液は、１００〜３００ｍＭ、例えば、１２０〜２５０ｍＭ、１４０〜２２５ｍＭ、１６０〜２００ｍＭ、１７０〜１９０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液は、１８０ｍＭの塩化ナトリウムを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液および溶出緩衝液は独立に、６．５〜７．９、６．６〜７．８、６．７〜７．７、６．８〜７．６、６．９〜７．５、または７．０〜７．４のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液および溶出緩衝液は独立に、７．０〜７．４のｐＨを有する。
【００８１】
いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液は、７．０〜８．０、７．１〜７．９、７．２〜７．８、または７．３〜７．７のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、ローディング緩衝液は、７．３〜７．７のｐＨを有する。
【００８２】
いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、６．９〜７．９、７．０〜７．８、７．１〜７．７、または７．２〜７．６のｐＨを有する。いくつかの実施形態において、溶出緩衝液は、７．２〜７．６のｐＨを有する。
【００８３】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、およびＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むリガンド結合基質を利用したマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供され、ここで、液体クロマトグラフィー精製は、（ａ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；１５０〜３００ｍＭ、例えば、１７５〜２７５ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２１０〜２４０ｍＭ、２２０〜２３０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ６．５〜７．９、例えば、６．６〜７．８、６．７〜７．７、６．８〜７．６、６．９〜７．５、または７．０〜７．４を含むローディング緩衝液中の基質に、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含有する液体培地をローディングする工程；ならびに（ｂ）（ｉ）１５０〜３５０ｍＭ、例えば、２００〜３００ｍＭ、２２５〜２７５ｍＭ、２３０〜２７０ｍＭ、２３５〜２６５ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）２００〜４００ｍＭ、例えば、２５０〜３５０ｍＭ、２７５〜３２５ｍＭ、２８０〜３２０ｍＭ、２８５〜３１５ｍＭ、２９０〜３１０ｍＭ、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ６．５〜７．９、例えば、６．６〜７．８、６．７〜７．７、６．８〜７．６、６．９〜７．５、または７．０〜７．４を含む溶出緩衝液を利用して、基質からＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程が関与する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、およびＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むリガンド結合基質を利用したマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。ここで、液体クロマトグラフィー精製は、（ａ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；１００〜３００ｍＭ、例えば、１２０〜２５０ｍＭ、１４０〜２２５ｍＭ、１６０〜２００ｍＭ、１７０〜１９０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．０〜８．０、例えば、７．１〜７．９、７．２〜７．８、または７．３〜７．７を含むローディング緩衝液中の基質に、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含有する液体培地をローディングする工程；ならびに（ｂ）（ｉ）１５０〜３５０ｍＭ、例えば、２００〜３００ｍＭ、２２５〜２７５ｍＭ、２３０〜２７０ｍＭ、２３５〜２６５ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）２００〜４００ｍＭ、例えば、２５０〜３５０ｍＭ、２７５〜３２５ｍＭ、２８０〜３２０ｍＭ、２８５〜３１５ｍＭ、２９０〜３１０ｍＭ、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ６．９〜７．９、例えば、７．０〜７．８、７．１〜７．７、または７．２〜７．６を含む溶出緩衝液を利用して、基質からＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程が関与する。
【００８５】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、およびＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むｃａｐｔｏ接着リガンド結合基質を利用したマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供され、ここで、液体クロマトグラフィー精製は、（ａ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；２３５ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含むローディング緩衝液中の基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含有する液体培地をローディングする工程；ならびに（ｂ）（ｉ）２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）３００ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程が関与する。
【００８６】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、およびＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むｃａｐｔｏ接着リガンド結合基質を利用したマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。ここで、液体クロマトグラフィー精製は、（ａ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；２２５ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含むローディング緩衝液中の基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含有する液体培地をローディングする工程；ならびに（ｂ）（ｉ）２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）３００ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程が関与する。
【００８７】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、およびＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むｃａｐｔｏ接着リガンド結合基質を利用したマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供され、ここで、液体クロマトグラフィー精製は、（ａ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；１８０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．３〜７．７を含むローディング緩衝液中の基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を含有する液体培地をローディングする工程；ならびに（ｂ）（ｉ）２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）３００ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ７．２〜７．６を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程が関与する。
【００８８】
いくつかの実施形態において、マルチモーダル液体クロマトグラフィー精製の前に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、陰イオン交換クロマトグラフィーに供する。いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、（ａ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を有するリガンドを含み、樹脂は、１０〜３０ｍＭのリン酸塩および１００〜１３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液で平衡化されている工程；ならびに（ｂ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、樹脂からＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程を含む。第四級アミン基を有する陰イオン交換クロマトグラフィーのための樹脂は、市販されており、例えば、インターネットアドレスwww-dot-gelifesciences.com/bioprocessで入手可能なＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓイオン交換クロマトグラフィーデータファイル２８−９８３７−６３ＡＣを参照のこと。いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、（ａ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を含むＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ基質を含む基質を有するリガンドを含み、樹脂は、２０ｍＭのリン酸塩、１１５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液で平衡化されている工程；ならびに（ｂ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２２５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態において、マルチモーダル液体クロマトグラフィー精製の前に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、陰イオン交換クロマトグラフィーに供する。いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、（ａ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を有するリガンドを含み、樹脂は、１０〜３０ｍＭのリン酸塩および４０〜１２０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液で平衡化されている工程；ならびに（ｂ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３０〜２３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、樹脂からＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程を含む。第四級アミン基を有する陰イオン交換クロマトグラフィーのための樹脂は、市販されており、例えば、インターネットアドレスwww-dot-gelifesciences.com/bioprocessで入手可能なＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓイオン交換クロマトグラフィーデータファイル２８−９８３７−６３ＡＣを参照のこと。いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、（ａ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を含むＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ基質を含む基質を有するリガンドを含み、樹脂は、２０ｍＭのリン酸塩、８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液で平衡化されている工程；ならびに（ｂ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程を含む。
【００９０】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含有する液体培地をローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を有するリガンドを含み、樹脂は、１０〜３０ｍＭのリン酸塩および１００〜１３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液で平衡化されている工程；ならびに（ｂ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；１５０〜３００ｍＭ、例えば、１７５〜２７５ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２１０〜２４０ｍＭ、２２０〜２３０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ６．５〜７．９、例えば、６．６〜７．８、６．７〜７．７、６．８〜７．６、６．９〜７．５、７．０〜７．４、または７．１〜７．３を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むリガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｄ）（ｉ）１５０〜３５０ｍＭ、例えば、２００〜３００ｍＭ、２２５〜２７５ｍＭ、２３０〜２７０ｍＭ、２３５〜２６５ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）２００〜４００ｍＭ、例えば、２５０〜３５０ｍＭ、２７５〜３２５ｍＭ、２８０〜３２０ｍＭ、２８５〜３１５ｍＭ、２９０〜３１０ｍＭ、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ６．５〜７．９、例えば、６．６〜７．８、６．７〜７．７、６．８〜７．６、６．９〜７．５、または７．０〜７．４を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。
【００９１】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含有する液体培地をローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を有するリガンドを含み、樹脂は、１０〜３０ｍＭのリン酸塩および４０〜１２０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液で平衡化されている工程；ならびに（ｂ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３０〜２３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；１００〜３００ｍＭ、例えば、１２０〜２５０ｍＭ、１４０〜２２５ｍＭ、１６０〜２００ｍＭ、１７０〜１９０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．０〜８．０、例えば、７．１〜７．９、７．２〜７．８、または７．３〜７．７を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むリガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｄ）（ｉ）１５０〜３５０ｍＭ、例えば、２００〜３００ｍＭ、２２５〜２７５ｍＭ、２３０〜２７０ｍＭ、２３５〜２６５ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）２００〜４００ｍＭ、例えば、２５０〜３５０ｍＭ、２７５〜３２５ｍＭ、２８０〜３２０ｍＭ、２８５〜３１５ｍＭ、２９０〜３１０ｍＭ、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ６．９〜７．９、例えば、７．０〜７．８、７．１〜７．７、または７．２〜７．６を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。
【００９２】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を含むＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ基質を含む基質を有するリガンドを含み、樹脂は、２０ｍＭのリン酸塩、１１５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液で平衡化されている工程；（ｂ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２２５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；２２５ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むｃａｐｔｏ接着リガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｄ）（ｉ）２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）３００ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。
【００９３】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を含むＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ基質を含む基質を有するリガンドを含み、樹脂は、２０ｍＭのリン酸塩、８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液で平衡化されている工程；（ｂ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；１８０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．３〜７．７を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むｃａｐｔｏ接着リガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｄ）（ｉ）２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）３００ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ７．２〜７．６を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。
【００９４】
いくつかの実施形態において、精製方法は、（ａ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を含むＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ基質を含む基質を有するリガンドを含み、樹脂は、２０ｍＭのリン酸塩、１１５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液で平衡化されている工程；（ｂ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２２５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；２２５ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むｃａｐｔｏ接着リガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｄ）（ｉ）２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）３００ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む。
【００９５】
いくつかの実施形態において、精製方法は、（ａ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を含むＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ基質を含む基質を有するリガンドを含み、樹脂は、２０ｍＭのリン酸塩、８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液で平衡化されている工程；（ｂ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；１８０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．３〜７．７を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むｃａｐｔｏ接着リガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｄ）（ｉ）２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）３００ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ７．２〜７．６を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程の前に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、（ａ）デキストラン硫酸を含む培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、４０〜６０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０で平衡化されている工程；および（ｂ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２７０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程を含む、アフィニティー様クロマトグラフィーの工程に供する。
【００９７】
いくつかの実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程の前に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、（ａ）デキストラン硫酸を含む培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、３０〜６０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０で平衡化されている工程；および（ｂ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２７０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程を含む、アフィニティー様クロマトグラフィーの工程に供する。
【００９８】
デキストラン硫酸を含むアフィニティー様クロマトグラフィーのための培地は、市販されており、例えば、インターネットアドレスwww-dot-gelifesciences.com/bioprocessにおいて入手可能なＣａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳ親和性クロマトグラフィーデータファイル２８−９６１６−４９  ＡＡを参照のこと。いくつかの実施形態において、アフィニティー様クロマトグラフィーは、（ａ）デキストラン硫酸を含むＣａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳ培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、４７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４で平衡化されている工程；および（ｂ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２３５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程を含む。
【００９９】
いくつかの実施形態において、アフィニティー様クロマトグラフィーは、（ａ）デキストラン硫酸を含むＣａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳ培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、４０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１〜７．５で平衡化されている工程；および（ｂ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２〜７．６を含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程を含む。
【０１００】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）デキストラン硫酸を含む培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、４０〜６０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０で平衡化されている工程；（ｂ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２７０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を有するリガンドを含み、樹脂は、１０〜３０ｍＭのリン酸塩および１００〜１３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液で平衡化されている工程；（ｄ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｅ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；１５０〜３００ｍＭ、例えば、１７５〜２７５ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２１０〜２４０ｍＭ、２２０〜２３０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ６．５〜７．９、例えば、６．６〜７．８、６．７〜７．７、６．８〜７．６、６．９〜７．５、または７．０〜７．４を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むリガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｆ）（ｉ）１５０〜３５０ｍＭ、例えば、２００〜３００ｍＭ、２２５〜２７５ｍＭ、２３０〜２７０ｍＭ、２３５〜２６５ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）２００〜４００ｍＭ、例えば、２５０〜３５０ｍＭ、２７５〜３２５ｍＭ、２８０〜３２０ｍＭ、２８５〜３１５ｍＭ、２９０〜３１０ｍＭ、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ６．５〜７．９、例えば、６．６〜７．８、６．７〜７．７、６．８〜７．６、６．９〜７．５、または７．０〜７．４を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。
【０１０１】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）デキストラン硫酸を含む培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、３０〜６０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０で平衡化されている工程；（ｂ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２７０ｍＭの塩化ナトリウム、６．０〜８．０のｐＨを含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を有するリガンドを含み、樹脂は、１０〜３０ｍＭのリン酸塩および４０〜１２０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液で平衡化されている工程；（ｄ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３０〜２３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｅ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；１００〜３００ｍＭ、例えば、１２０〜２５０ｍＭ、１４０〜２２５ｍＭ、１６０〜２００ｍＭ、１７０〜１９０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．０〜８．０、例えば、７．１〜７．９、７．２〜７．８、または７．３〜７．７を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むリガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｆ）（ｉ）１５０〜３５０ｍＭ、例えば、２００〜３００ｍＭ、２２５〜２７５ｍＭ、２３０〜２７０ｍＭ、２３５〜２６５ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）２００〜４００ｍＭ、例えば、２５０〜３５０ｍＭ、２７５〜３２５ｍＭ、２８０〜３２０ｍＭ、２８５〜３１５ｍＭ、２９０〜３１０ｍＭ、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ６．９〜７．９、例えば、７．０〜７．８、７．１〜７．７、または７．２〜７．６を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）デキストラン硫酸を含むＣａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳ培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、４７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４で平衡化されている工程；ならびに（ｂ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２３５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を含むＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ基質を含む基質を有するリガンドを含み、樹脂は、２０ｍＭのリン酸塩、１１５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液で平衡化されている工程；（ｄ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２２５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｅ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；２２５ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むｃａｐｔｏ接着リガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｆ）（ｉ）２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）３００ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）デキストラン硫酸を含むＣａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳ培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、４０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１〜７．５で平衡化されている工程；ならびに（ｂ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２〜７．６を含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を含むＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ基質を含む基質を有するリガンドを含み、樹脂は、２０ｍＭのリン酸塩、８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液で平衡化されている工程；（ｄ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｅ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；１８０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．３〜７．７を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むｃａｐｔｏ接着リガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｆ）（ｉ）２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）３００ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ７．２〜７．６を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、アフィニティー様クロマトグラフィーの工程の前に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、ウイルス不活化の工程に供する。いくつかの実施形態において、アフィニティー様クロマトグラフィーの工程の後に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、ウイルス不活化の工程に供する。いくつかの実施形態において、ウイルス不活化の工程は、界面活性剤を加えることを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス不活化の工程は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む液体培地にポリソルベート８０を加えて、０．５〜２．５％（例えば、０．５〜１．５％）の濃度とすること、および前記液体培地を１５〜２５℃の温度で１０〜２５時間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス不活化の工程は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む液体培地にポリソルベート８０を加えて、０．５〜１．５％の濃度とすること、および前記液体培地を１５〜２５℃の温度で１０〜２５時間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス不活化の工程は、液体培地にポリソルベート８０を加えること、および濃度を１．０％に調整すること、および前記液体培地を制御された室温で１５〜２０時間インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態において、ウイルス不活化の工程は、液体培地にポリソルベート８０を加えること、および濃度を２．０％に調整すること、および前記液体培地を制御された室温で１８〜２４時間インキュベートすることを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む液体培地にポリソルベート８０を加えて、０．５〜１．５％の濃度とする工程、および前記液体培地を１５〜２５℃の温度で１０〜２５時間インキュベートする工程；（ｂ）デキストラン硫酸を含む培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、４０〜６０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０で平衡化されている工程；（ｃ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２７０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｄ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を有するリガンドを含み、樹脂は、１０〜３０ｍＭのリン酸塩および１００〜１３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液で平衡化されている工程；ならびに（ｅ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｆ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；１５０〜３００ｍＭ、例えば、１７５〜２７５ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２１０〜２４０ｍＭ、２２０〜２３０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ６．５〜７．９、例えば、６．６〜７．８、６．７〜７．７、６．８〜７．６、６．９〜７．５、または７．０〜７．４を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むリガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｇ）（ｉ）１５０〜３５０ｍＭ、例えば、２００〜３００ｍＭ、２２５〜２７５ｍＭ、２３０〜２７０ｍＭ、２３５〜２６５ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）２００〜４００ｍＭ、例えば、２５０〜３５０ｍＭ、２７５〜３２５ｍＭ、２８０〜３２０ｍＭ、２８５〜３１５ｍＭ、２９０〜３１０ｍＭ、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ６．５〜７．９、例えば、６．６〜７．８、６．７〜７．７、６．８〜７．６、６．９〜７．５、または７．０〜７．４を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態において、マルチモーダル液体クロマトグラフィー精製に次いで、ウイルス濾過を行う。いくつかの実施形態において、ウイルス濾過に次いで、限外濾過／ダイアフィルトレーションの工程を行う。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）デキストラン硫酸を含む培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、３０〜６０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０で平衡化されている工程；（ｂ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２７０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む液体培地にポリソルベート８０を加えて、０．５〜２．５％の濃度とする工程、および前記液体培地を１５〜２５℃の温度で１０〜２５時間インキュベートする工程；（ｄ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を有するリガンドを含み、樹脂は、１０〜３０ｍＭのリン酸塩および４０〜１２０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液で平衡化されている工程；ならびに（ｅ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、１３０〜２３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｆ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；１００〜３００ｍＭ、例えば、１２０〜２５０ｍＭ、１４０〜２２５ｍＭ、１６０〜２００ｍＭ、１７０〜１９０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．０〜８．０、例えば、７．１〜７．９、７．２〜７．８、または７．３〜７．７を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むリガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｇ）（ｉ）１５０〜３５０ｍＭ、例えば、２００〜３００ｍＭ、２２５〜２７５ｍＭ、２３０〜２７０ｍＭ、２３５〜２６５ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）２００〜４００ｍＭ、例えば、２５０〜３５０ｍＭ、２７５〜３２５ｍＭ、２８０〜３２０ｍＭ、２８５〜３１５ｍＭ、２９０〜３１０ｍＭ、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ６．９〜７．９、例えば、７．０〜７．８、７．１〜７．７、または７．２〜７．６を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態において、マルチモーダル液体クロマトグラフィー精製に次いで、ウイルス濾過を行う。いくつかの実施形態において、ウイルス濾過に次いで、限外濾過／ダイアフィルトレーションの工程を行う。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）液体培地にポリソルベート８０を加える工程、および濃度を１．０％に調整する工程、および前記液体培地を制御された室温で１５〜２０時間インキュベートする工程；（ｂ）デキストラン硫酸を含むＣａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳ培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、４７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４で平衡化されている工程；（ｃ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２３５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｄ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を含むＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ基質を含む基質を有するリガンドを含み、樹脂は、２０ｍＭのリン酸塩、１１５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液で平衡化されている工程；（ｅ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２２５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｆ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；２２５ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むｃａｐｔｏ接着リガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｇ）（ｉ）２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）３００ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ７．０〜７．４を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。いくつかの実施形態において、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むリガンド結合基質を用いたマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製に次いで、０．１μｍ膜を用いた前濾過および１９ｎｍ膜を用いた濾過のさらなる工程を含むウイルス濾過を行う。いくつかの実施形態において、ウイルス濾過に次いで、５０ｋＤａ分子量カットオフ膜および１０ｍＭのリン酸カリウム、５％トレハロースを含むダイアフィルトレーション緩衝液を利用した限外濾過／ダイアフィルトレーションの工程を行う。いくつかの実施形態において、限外濾過／ダイアフィルトレーションの工程に次いで、ポリソルベート８０を加えて、０．０５％の濃度とする工程を行う。いくつかの実施形態において、ポリソルベート８０を加える工程に次いで、約０．２μｍ以下のカットオフを有するフィルターを利用した濾過の工程を行う。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするベクターを含む宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに（ａ）デキストラン硫酸を含むＣａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳ培地に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、４０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１〜７．５で平衡化されている工程；（ｂ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２〜７．６を含む緩衝液を用いて、培地から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｃ）液体培地にポリソルベート８０を加える工程、および濃度を２．０％に調整する工程、および前記液体培地を制御された室温で１８〜２４時間インキュベートする工程；（ｄ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を含むＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ基質を含む基質を有するリガンドを含み、樹脂は、２０ｍＭのリン酸塩、８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液で平衡化されている工程；（ｅ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程；（ｆ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；１８０ｍＭの塩化ナトリウム；ｐＨ７．３〜７．７を含むローディング緩衝液中のＮ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むｃａｐｔｏ接着リガンド結合基質に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質をローディングする工程；ならびに（ｇ）（ｉ）２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム；（ｉｉ）３００ｍＭのアルギニン；および（ｉｉｉ）２０ｍＭのリン酸ナトリウム；ｐＨ７．２〜７．６を含む溶出緩衝液を利用して、基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質を溶出させる工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、本明細書において他所に記載の抗原組成物を製造する方法が提供される。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むリガンド結合基質を用いたマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製に次いで、０．１μｍ膜を用いた前濾過および１９ｎｍ膜を用いた濾過のさらなる工程を含むウイルス濾過を行う。いくつかの実施形態において、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含むリガンド結合基質を用いたマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製に次いで、０．１μｍ膜を用いた前濾過および２０ｎｍ膜を用いた濾過のさらなる工程を含むウイルス濾過を行う。いくつかの実施形態において、ウイルス濾過に次いで、５０ｋＤａ分子量カットオフ膜および１０ｍＭのリン酸カリウム、４％トレハロースを含むダイアフィルトレーション緩衝液を利用した限外濾過／ダイアフィルトレーションの工程を行う。いくつかの実施形態において、限外濾過／ダイアフィルトレーションの工程に次いで、ポリソルベート８０を加えて、０．０５％の濃度とする工程を行う。いくつかの実施形態において、ポリソルベート８０を加える工程に次いで、約０．２μｍ以下のカットオフを有するフィルターを利用した濾過の工程を行う。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、上記の方法に次いで、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを凍結乾燥する工程を行う。組換えタンパク質の凍結乾燥のための方法は公知であり、例えば、Hsu et al. (1992) “Determining the optimum residual moisture in lyophilized protein pharmaceuticals,” Developments in Biological Standardization 74:255-70; Costantine et al. (1998) “Effect of excipients on the stability and structure of lyophilized recombinant human growth hormone,” J. Pharm. Sci. 87:1412-1420参照。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、上記の三量体の集団を、三量体の大部分が少なくとも１つのＦ’プロトマーを含む三量体の集団および三量体の大部分が３つのＦプロトマーを含む三量体の集団に分離する方法が提供され、前記方法は、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーの工程を含む。いくつかの実施形態において、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーの工程は、０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ勾配、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍのクエン酸ナトリウムを利用する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム勾配は、２０カラム体積で行う。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、上記の三量体の集団を、少なくとも１つのＦ’プロトマーを含む三量体の集団および３つのＦプロトマーを含む三量体の集団に分離する方法が提供され、前記方法は、弱陽イオン交換液体クロマトグラフィーの工程を含む。いくつかの実施形態において、弱陽イオン交換液体クロマトグラフィーの工程は、三量体集団を溶出させるために、０ｍＭのＮａＣｌ〜４００ｍＭのＮａＣｌの塩化ナトリウム勾配を利用する。いくつかの実施形態において、塩化ナトリウム勾配は、１ｍＬ／分の流速で２５分間行う。いくつかの実施形態において、弱陽イオン交換は、１００ｍＭのリン酸二水素ナトリウムを含む第１の移動相、１００ｍＭのリン酸水素二ナトリウムを含む第２の移動相、１Ｍの塩化ナトリウムを含む第３の移動相、および水の第４の移動相を用いて行う。これらの方法は、市販の培地および機器、例えば、Ｗａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣ機器を用いたＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社製のＰｒｏＰａｃ  ＷＣＸ−１０カラム（assets.thermofisher.com/TFS-Assets/CMD/manuals/br-21689-propac-wcx-tips-tricks-br21689-en.pdfにおいてインターネットで入手可能）で、製造業者の説明書に従って適切に行われ得る。
【０１１３】
免疫原性組成物および方法
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドおよび薬学上許容可能な担体または賦形剤を含む抗原組成物を含む免疫原性組成物も提供される。薬学上許容可能な担体および賦形剤は周知であり、当業者により選択され得る。例えば、担体または賦形剤は、緩衝液を好ましく含み得る。場合により、担体または賦形剤も、溶解性および／または安定性を安定化する少なくとも１つの成分を含有する。可溶化剤／安定剤の例としては、界面活性剤、例えば、ラウロイルサルコシンおよび／またはＴｗｅｅｎが挙げられる。代替の可溶化剤／安定剤としては、アルギニン、およびガラス形成ポリオール（例えば、スクロース、トレハロースなど）が挙げられる。多数の薬学上許容可能な担体および／または薬学上許容可能な賦形剤が、当技術分野で公知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, by E. W. Martin, Mack Publishing Co., Easton, PA, 5th Edition (975)において記載されている。
【０１１４】
したがって、選択された投与経路で対象に送達するのに適切な製剤を製造するために、適切な賦形剤および担体が、当業者により選択され得る。適切な賦形剤としては、限定されるものではないが、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ソルビトール、トレハロース、Ｎ−ラウロイルサルコシンナトリウム塩、Ｌ-プロリン、非界面活性剤スルホベタイン、塩酸グアニジン、尿素、トリメチルアミンオキシド、ＫＣｌ、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｍｎ２＋、Ｚｎ２＋および他の二価陽イオン関連塩、ジチオトレイトール、ジチオエリトロール、およびβ−メルカプトエタノールが挙げられる。他の賦形剤は、界面活性剤（ツイーン８０、ツイーン２０、トリトンＸ−００、ＮＰ−４０、エンピゲンＢＢ、オクチルグルコシド、ラウロイルマルトシド、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−０８、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−０、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−２、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−４、Ｚｗｉｔｔｅｒｇｅｎｔ  ３−６、ＣＨＡＰＳ、デオキシコール酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムを含む）であり得る。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド、１０ｍＭのリン酸カリウム、５％トレハロース、０．０５％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０を含む。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド、１０ｍＭのリン酸カリウム、４％トレハロース、０．０５％ポリソルベート８０、ｐＨ６．８を含む。
【０１１５】
本明細書において他所に記載するように、凍結乾燥の工程は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドに適用してもよい。このため、いくつかの実施形態において、凍結乾燥した免疫原性組成物が提供される。
【０１１６】
場合により、免疫原性組成物は、アジュバントも含む。ＲＳＶに対する防御免疫応答を誘発する目的で、対象への投与に適切な免疫原性組成物の文脈において、アジュバントは、Ｔｈ１に偏った免疫応答を誘発するように選択される。
【０１１７】
アジュバントは、通常、組成物が投与される対象、または対象の集団においてＴｈ１に偏った免疫応答を亢進するように選択される。例えば、免疫原性組成物が、ＲＳＶ感染症に罹患しやすい（またはそのリスクが高い）特定の年齢群の対象に投与される場合、アジュバントは、対象または対象の集団において安全かつ有効であるように選択される。このため、高齢者の対象（例えば、少なくとも５０歳の対象）における投与のためのＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド組成物を含有する免疫原性組成物を処方する場合、アジュバントは、高齢者の対象において安全かつ有効であるように選択される。同様に、免疫原性組成物が、新生児または乳児の対象（例えば、出生から２歳の間の対象）における投与を意図する場合、アジュバントは、新生児および乳児において安全かつ有効であるように選択される。
【０１１８】
さらに、アジュバントは、通常、免疫原性組成物が投与される投与経路を介して投与される場合、Ｔｈ１免疫応答を亢進するように選択される。例えば、鼻腔投与のために免疫原を処方する場合、プロテオソームおよびプロトリン(ｐｒｏｔｏｌｌｉｎ)が、好ましいＴｈ１偏向アジュバントである。対照的に、免疫原性組成物が、筋肉内投与のために処方される場合、１つ以上のＴＬＲ４アゴニスト（例えば、３Ｄ−ＭＰＬ）、サポニン（例えば、ＱＳ２１）、リポソーム、および／または油性および水性エマルションを含むアジュバントが、好ましく選択される。アジュバントは、便宜上、通常は同時処方されるが、免疫原性組成物と別々に処方してもよい。
【０１１９】
アジュバントが、液体として免疫原性組成物と別々に処方され、免疫原性組成物が凍結乾燥される場合、液体アジュバントは、凍結乾燥した免疫原性組成物を再構成するために利用してもよい。いくつかの実施形態において、液体アジュバント中の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む免疫原性組成物を再構成する工程を含む方法が、提供される。
【０１２０】
目的のアジュバントは、リポソーム製剤中にＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンを含む。
【０１２１】
ＴＬＲ４アゴニストの適切な例は、リポ多糖、適切には、脂質Ａの非毒性誘導体、特に、モノホスホリル脂質Ａ、具体的には、３−脱−Ｏ−アシル化モノホスホリル脂質Ａ（３Ｄ−ＭＰＬ）である。
【０１２２】
３Ｄ−ＭＰＬは、ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ  Ｎ．Ａ．社によって「ＭＰＬ」の名称で販売されており、本書全体を通じて３Ｄ−ＭＰＬという。例えば、米国特許第４，４３６，７２７号；第４，８７７，６１１号；第４，８６６，０３４号および第４，９１２，０９４号参照。３Ｄ−ＭＰＬは、ＧＢ２２２０２１１Ａに記載の方法に従って製造することができる。化学的に、これは、３−脱アシル化モノホスホリル脂質Ａと４、５または６個のアシル化鎖との混合物である。本発明の文脈において、小粒子３Ｄ−ＭＰＬを、水性アジュバント組成物を調製するために使用してもよい。小粒子３Ｄ−ＭＰＬは、０．２２μｍフィルターで無菌濾過され得るような粒子径を有する。このような調製物は、ＷＯ９４／２１２９２に記載されている。
【０１２３】
使用することができる他のＴＬＲ４アゴニストは、ＷＯ９８／５０３９９または米国特許第６，３０３，３４７号に記載されているようなアルキルグルコサミニドホスフェート（ＡＧＰ）である（ＡＧＰを調製する方法も記載されている）。いくつかのＡＧＰはＴＬＲ４アゴニストであり、いくつかのＡＧＰはＴＬＲ４アンタゴニストである。
【０１２４】
本明細書に記載の免疫原性組成物において有用であり得る他のＴＬＲ４アゴニストとしては、ＷＯ２００８／１５３５４１もしくはＷＯ２００９／１４３４５７または文献論文Coler RN et al. (2011) Development and Characterization of Synthetic Glucopyranosyl Lipid Adjuvant System as a Vaccine Adjuvant. PLoS ONE 6(1): e16333. doi:10.1371/journal.pone.0016333およびArias MA et al. (2012) Glucopyranosyl Lipid Adjuvant (GLA), a Synthetic TLR4 Agonist, Promotes Potent Systemic and Mucosal Responses to Intranasal Immunization with HIVgp140. PLoS ONE 7(7): e41144. doi:10.1371/journal.pone.0041144に記載されているようなグルコピラノシル脂質アジュバント（ＧＬＡ）が挙げられる。ＷＯ２００８／１５３５４１またはＷＯ２００９／１４３４５７は、本発明において有用であり得るＴＬＲ４アゴニストを定義する目的で、引用することにより本明細書の一部とされる。
【０１２５】
通常、ＴＬＲ４アゴニスト、例えばリポ多糖、特に３Ｄ−ＭＰＬは、少なくとも９０％純粋であり、例えば、少なくとも９５％純粋であり、特に、少なくとも９８％純粋であり、特に、９９％純粋である。
【０１２６】
本発明における使用のための適切なサポニンは、Ｑｕｉｌ  Ａおよびその誘導体である。Ｑｕｉｌ  Ａは、南アメリカの樹木キラヤ(Quillaja saponaria Molina)から単離されたサポニン調製物であり、１９７４年にＤａｌｓｇａａｒｄらによって、アジュバント活性を有するとして最初に記載された(“Saponin adjuvants”, Archiv. fuer die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, p243-254)。Ｑｕｉｌ  Ａの精製画分は、ＨＰＬＣによって単離されており、これは、Ｑｕｉｌ  Ａに関連する毒性を有さずに、アジュバント活性を保持している（例えば、ＥＰ０３６２２７８参照）。一般的に関心が持たれる画分は、ＱＳ７、ＱＳ１７、ＱＳ１８およびＱＳ−２１、例えば、ＱＳ７およびＱＳ−２１（ＱＡ７およびＱＡ２１としても知られる）を含む。ＱＳ−２１は、特に関心が持たれるサポニンである。
【０１２７】
通常、サポニン、例えばＱｕｉｌ  Ａ、特にＱＳ−２１は、少なくとも９０％純粋であり、例えば、少なくとも９５％純粋であり、特に、少なくとも９８％純粋であり、特に、９９％純粋である。
【０１２８】
有益な特色は、サポニンは、低反応源性組成物中に存在していることであり、そこでは、サポニンは、外因性ステロール、例えば、コレステロールでクエンチされている。適切には、サポニン：ステロール（例えば、ＱＳ２１：コレステロール）の比は、１：１００〜１：１（ｗ／ｗ）、例えば、１：１０〜１：１（ｗ／ｗ）、例えば、１：５〜１：１（ｗ／ｗ）である。
【０１２９】
リポソームのサイズは、リン脂質組成物およびそれらの調製に使用される方法に応じて、３０ｎｍ〜数μｍと変わり得る。
【０１３０】
リポソームは、望ましくは、ＤＯＰＣを含有し、または、ＤＯＰＣおよびステロール（必要に応じて、サポニンおよびＬＴＲ４アゴニストとともに）から本質的になるが、多くの異なる脂質から形成されてよい。
【０１３１】
本発明において、リポソームのサイズは、５０ｎｍ〜２００ｎｍ、特に、６０ｎｍ〜１８０ｎｍ、例えば、７０〜１６５ｎｍの範囲内となる。最適には、リポソームは、安定であるべきであり、濾過による好都合な滅菌を可能にする約１００ｎｍの直径を有するべきである。
【０１３２】
リポソームの構造的完全性は、リポソームのサイズ（Ｚ平均径、Ｚａｖ）および多分散性を測定する動的光散乱法（ＤＬＳ）などの方法、または、リポソームの構造の分析のための電子顕微鏡法により評価してもよい。一つの実施形態において、平均粒子径は、９５〜１２０ｎｍであり、および／または、多分散（ＰｄＩ）指数は、０．３５以下、特に、０．３以下、例えば、０．２以下である。
【０１３３】
場合により、アジュバントは、無機塩、例えば、アルミニウム塩またはカルシウム塩、特に、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびリン酸カルシウムを含み得る。例えば、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウムまたは「ミョウバン」）と組み合わせて３Ｄ−ＭＰＬを含有するアジュバントは、ヒト対象に投与するための免疫原性組成物における処方に適切である。
【０１３４】
異なるアジュバント、例えば、上記のものの組合せは、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド組成物とともに組成物において使用することもできる。例えば、すでに記載したように、ＱＳ２１を３Ｄ−ＭＰＬとともに処方することができる。ＱＳ２１：３Ｄ−ＭＰＬの比は、通常、おおよそ１：１０〜１０：１；例えば、１：５〜５：１、しばしば実質的に１：１である。通常、比は、２．５：１〜１：１の３Ｄ−ＭＰＬ：ＱＳ２１の範囲内である。別の組合せアジュバント製剤としては、３Ｄ−ＭＰＬおよびアルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウムが挙げられる。組合せで処方される場合、この組合せは、抗原特異的Ｔｈ１免疫応答を亢進し得る。
【０１３５】
いくつかの場合において、アジュバント製剤は、水中油型エマルション、または無機塩、例えば、カルシウム塩もしくはアルミニウム塩、例えば、リン酸カルシウム、リン酸アルミニウムもしくは水酸化アルミニウムを含む。
【０１３６】
水中油型エマルションの一つの例は、水性担体中に、代謝性油、例えば、スクアレン、トコール、例えば、トコフェロール、例えば、アルファ−トコフェロール、および界面活性剤、例えば、ポリソルベート８０またはＴｗｅｅｎ８０を含む。水性担体は、例えば、リン酸緩衝生理食塩水であり得る。さらに、水中油型エマルションは、Ｓｐａｎ８５および／またはレシチンおよび／またはトリカプリリンを含有し得る。
【０１３７】
ミョウバンが、例えば、３Ｄ−ＭＰＬと組み合わせて存在する場合、その量は、通常、用量あたり、約１００μｇ〜１ｍｇ、例えば、約１００μｇまたは約２００μｇ〜約７５０μｇ、例えば、約５００μｇである。
【０１３８】
液体製剤のｐＨは、組成物の成分および対象への投与に関する必要な適格性を考慮して、調整する。適切には、液体混合物のｐＨは、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも５．５、少なくとも５．８、少なくとも６である。液体混合物のｐＨは、９未満、８未満、７．５未満または７未満であってもよい。他の複数の実施形態において、液体混合物のｐＨは、４〜９、５〜８、例えば、５．５〜８である。したがって、ｐＨは、適切には、６〜９、例えば、６．５〜８．５となる。特に好ましい実施形態において、ｐＨは、５．８〜６．４である。
【０１３９】
適当な緩衝液は、酢酸塩、クエン酸塩、ヒスチジン、マレイン酸塩、リン酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩およびＴＲＩＳから選択され得る。一つの実施形態において、緩衝液は、リン酸緩衝液、例えば、Ｎａ／Ｎａ２ＰＯ４、Ｎａ／Ｋ２ＰＯ４またはＫ／Ｋ２ＰＯ４である。
【０１４０】
緩衝液は、少なくとも６ｍＭ、少なくとも１０ｍＭまたは少なくとも４０ｍＭの量で、液体混合物中に存在し得る。緩衝液は、１００ｍＭ未満、６０ｍＭ未満または４０ｍＭ未満の量で、液体混合物中に存在し得る。
【０１４１】
非経口投与に関しては、溶液は、細胞の歪みまたは溶解を避けるために、薬学上許容可能なオスモル濃度を有するべきであることは、周知である。薬学上許容可能なオスモル濃度は、一般に、溶液が、およそ等張または少し高張であるオスモル濃度を有することを意味する。適切には、本発明の組成物は、再構成された場合、２５０〜７５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲のオスモル濃度を有し、例えば、オスモル濃度は、２５０〜５５０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲、例えば、２８０〜５００ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であり得る。特に好ましい実施形態において、オスモル濃度は、２８０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲であり得る。
【０１４２】
オスモル濃度は、当技術分野で公知の技法に従って、例えば、市販の浸透圧計、例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．（米国）から入手可能なＡｄｖａｎｃｅｄ（登録商標）モデル２０２０を使用することにより、測定してもよい。
【０１４３】
「等張剤」は、生理学的に耐性があり、製剤と接触する細胞膜への水の正味の流入を防ぐために、製剤に適切な張度を付与する化合物である。いくつかの実施形態において、組成物に使用される等張剤は、塩（または塩の混合物）であり、好都合には、塩は、適切にはおよそ１５０ｍＭの濃度の塩化ナトリウムである。しかしながら、他の複数の実施形態において、組成物は、非イオン性等張剤を含み、組成物中の塩化ナトリウムの濃度は、１００ｍＭ未満、例えば、８０ｍＭ未満、例えば、５０ｍＭ未満、例えば、４０ｍＭ未満、３０ｍＭ未満、特に、２０ｍＭ未満である。組成物中のイオン強度は、１００ｍＭ未満、例えば、８０ｍＭ未満、例えば、５０ｍＭ未満、例えば、４０ｍＭ未満または３０ｍＭ未満であり得る。
【０１４４】
特定の実施形態において、非イオン性等張剤は、ポリオール、例えば、スクロースおよび／またはソルビトールである。ソルビトールの濃度は、例えば、約３％〜約１５％（ｗ／ｖ）、例えば、約４％〜約１０％（ｗ／ｖ）であり得る。等張剤が塩またはポリオールである、免疫学的に活性なサポニン画分およびＴＬＲ４アゴニストを含むアジュバントは、ＷＯ２０１２／０８０３６９に記載されている。
【０１４５】
適切には、０．０５ｍｌ〜１ｍｌ、例えば、０．１〜０．５ｍｌのヒト投与量、特に、約０．５ｍｌ、または０．７ｍｌの投与量である。使用する組成物の容量は、送達の経路および位置に依存し得、皮内経路では低用量が投与される。単位用量容器は、単位用量の投与中の材料の適切な操作を可能にするために過多量を含有してもよい。
【０１４６】
サポニン、例えば、ＱＳ−２１は、ヒト用量あたり１〜１００μｇの量で使用することができる。ＱＳ−２１は、約５０μｇのレベルで使用してもよい。適切な範囲の例は、４０〜６０μｇ、適切には、４５〜５５μｇまたは４９〜５１μｇ、例えば、５０μｇである。さらなる実施形態において、ヒト用量は、約２５μｇのレベルのＱＳ−２１を含む。下限の範囲の例としては、２０〜３０μｇ、適切には、２２〜２８μｇまたは２４〜２６μｇ、例えば、２５μｇが挙げられる。小児または乳児を対象としたヒト用量は、成人を対象とした用量と比較して、減量してもよい（例えば、５０％の減量）。
【０１４７】
リポ多糖などのＴＬＲ４アゴニスト、例えば、３Ｄ−ＭＰＬは、ヒト用量あたり１〜１００μｇの量で使用することができる。３Ｄ−ＭＰＬは、約５０μｇのレベルで使用してもよい。適切な範囲の例は、４０〜６０μｇ、適切には、４５〜５５μｇまたは４９〜５１μｇ、例えば、５０μｇである。さらなる実施形態において、ヒト用量は、約２５μｇのレベルの３Ｄ−ＭＰＬを含む。下限の範囲の例としては、２０〜３０μｇ、適切には、２２〜２８μｇまたは２４〜２６μｇ、例えば、２５μｇが挙げられる。小児または乳児を対象としたヒト用量は、成人を対象とした用量と比較して、減量してもよい（例えば、５０％の減量）。
【０１４８】
ＴＬＲ４アゴニストおよびサポニンの両方がアジュバント中に存在する場合、サポニンに対するＴＬＲ４アゴニストの重量比は、適切には、１：５〜５：１、適切には、１：１である。例えば、３Ｄ−ＭＰＬが５０μｇまたは２５μｇの量で存在する場合、適切には、ＱＳ−２１は、ヒト用量あたり５０μｇまたは２５μｇの量で存在してもよい。
【０１４９】
サポニン：ＤＯＰＣの比は、通常、おおよそ１：５０〜１：１０（ｗ／ｗ）、適切には、１：２５〜１：１５（ｗ／ｗ）であり、好ましくは、１：２２〜１：１８（ｗ／ｗ）、例えば、１：２０（ｗ／ｗ）である。
【０１５０】
免疫原性組成物は、通常、免疫防御量（またはその分割量）の抗原を含有し、従来の技法によって調製することができる。ヒト対象への投与のためのものを含む免疫原性組成物の調製は、一般に、Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, Powell and Newman編, Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al.編, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に記載されている。リポソーム内へのカプセル化は、例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎによる米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質の結合は、例えば、Ｌｉｋｈｉｔｅによる米国特許第４，３７２，９４５号およびＡｒｍｏｒらによる米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【０１５１】
通常、免疫原性組成物の各用量におけるタンパク質の量は、典型的な対象において重大な有害な副作用を引き起こすことなく、免疫防御応答を誘導する量として選択される。この文脈における免疫防御とは、感染に対して完全に防御的であることを必ずしも意味するものではなく、症状または疾患、特に、ウイルスに関連する重度の疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、どの特異的な免疫原が使用されるかに応じて、変わり得る。一般に、各ヒト用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、例えば、約１μｇ〜約１００μｇ、例えば、約１μｇ〜約５０μｇ、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、または約５０μｇを含むことが予想される。免疫原性組成物において利用される量は、対象集団、例えば、乳児、母親（まだ子供を出産していない母親）、または高齢者に基づいて選択される。特定の組成物に関する最適な量は、対象における抗体価および他の応答の観察が関与する標準的な研究によって確認することができる。初回のワクチン接種後、対象は、約４週間で追加免疫を受けることができる。
【０１５２】
選択されたアジュバントにかかわらず、最終製剤中の濃度は、標的集団において安全かつ有効であるように計算されることに留意するべきである。例えば、ヒトにおけるＲＳＶに対する免疫応答を誘発するための免疫原性組成物は、乳児（例えば、初回投与の年齢において、出生〜１歳、例えば、０〜６ヵ月の乳児）または母親集団の個人に好ましく投与される。ＲＳＶに対する免疫応答を誘発するための免疫原性組成物は、高齢者のヒトにも好ましく投与される。アジュバントの選択は、これらの異なる用途において異なり得ること、ならびに各状況に対する最適なアジュバントおよび濃度は、当業者により経験的に決定されることが分かるであろう。
【０１５３】
特定の複数の実施形態において、免疫原性組成物は、ＲＳＶの感染を低減または予防するワクチンである。いくつかの実施形態において、免疫原性組成物は、ＲＳＶの感染後の病理学的応答を低減または予防するワクチンである。場合により、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含有する免疫原性組成物は、ＲＳＶ以外の病原性生物体の少なくとも１つのさらなる抗原を用いて処方される。例えば、病原性生物体は、気道の病原体（例えば、呼吸器感染を引き起こすウイルスまたは細菌）であり得る。特定の場合において、免疫原性組成物は、ＲＳＶ以外の病原性ウイルス、例えば、気道の感染を引き起こすウイルス、例えば、インフルエンザまたはパラインフルエンザに由来する抗原を含有する。他の複数の実施形態において、さらなる抗原は、投与を促進するように、または複数の感染性生物体から対象を防御するために必要な接種の数を低減するように選択される。例えば、抗原は、とりわけ、インフルエンザ、Ｂ型肝炎、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、ポリオウイルス、連鎖球菌または肺炎球菌のうちのいずれか１つ以上に由来し得る。
【０１５４】
したがって、ＲＳＶへの曝露またはＲＳＶによる感染を（その後の治療的にまたはその前の予防的にのいずれかで）処置するための薬剤の調製における組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの使用も、本開示の特色である。同様に、対象におけるＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法が、本開示の特色である。このような方法は、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物の免疫学的に有効な量を、対象、例えば、ヒト対象に投与することを含む。一般に、組成物は、Ｔｈ１に偏った免疫応答を誘発するアジュバントを含む。組成物は、ＲＳＶへの接触後のウイルス性疾患を増強することなく、ＲＳＶに対して特異的な免疫応答を誘発するように処方される。すなわち、組成物は、ＲＳＶの感染を低減もしくは予防する、および／またはＲＳＶの感染後の病理学的応答を低減もしくは予防するＴｈ１に偏った免疫応答をもたらすように処方される。組成物は、種々の異なる経路で投与することができるが、最も一般的には、免疫原性組成物は、筋肉内または鼻腔内投与経路で送達される。
【０１５５】
免疫原性組成物は、通常、免疫防御量（またはその分割量）の抗原を含有し、従来の技法によって調製することができる。ヒト対象への投与のためのものを含む免疫原性組成物の調製は、一般に、Pharmaceutical Biotechnology, Vol.61 Vaccine Design-the subunit and adjuvant approach, Powell and Newman編, Plenurn Press, 1995. New Trends and Developments in Vaccines, Voller et al.編, University Park Press, Baltimore, Maryland, U.S.A. 1978に記載されている。リポソーム内へのカプセル化は、例えば、Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎによる米国特許第４，２３５，８７７号に記載されている。高分子へのタンパク質の結合は、例えば、Ｌｉｋｈｉｔｅによる米国特許第４，３７２，９４５号およびＡｒｍｏｒらによる米国特許第４，４７４，７５７号に開示されている。
【０１５６】
通常、免疫原性組成物の各用量におけるタンパク質の量は、典型的な対象において重大な有害な副作用を引き起こすことなく、免疫防御応答を誘導する量として選択される。この文脈における免疫防御とは、感染に対して完全に防御的であることを必ずしも意味するものではなく、症状または疾患、特に、ウイルスに関連する重度の疾患に対する防御を意味する。抗原の量は、どの特異的な免疫原が使用されるかに応じて、変わり得る。一般に、各ヒト用量は、１〜１０００μｇのタンパク質、例えば、約１μｇ〜約１００μｇ、例えば、約１μｇ〜約５０μｇ、例えば、約１μｇ、約２μｇ、約５μｇ、約１０μｇ、約１５μｇ、約２０μｇ、約２５μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、または約５０μｇを含むことが予定される。免疫原性組成物において利用される量は、対象集団（例えば、乳児、母親、または高齢者）に基づいて選択される。特定の組成物に関する最適な量は、対象における抗体価および他の応答の観察が関与する標準的な研究によって確認することができる。初回のワクチン接種後、対象は、約４−１２週間で追加免疫を受けることができる。例えば、ＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含有する免疫原性組成物を乳児対象に投与する場合、初回およびその後の接種は、この期間中に投与された他のワクチンと同時に投与することができる。
【０１５７】
実施形態、パートＡ
１．Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記組成物は、宿主細胞タンパク質に対して、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、９９．９％超の重量濃度（ｗ／ｗ）の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む、組成物。
【０１５８】
２．Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記組成物は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドに対して、０．１９％、０．１８％、０．１７％、０．１６％、０．１５％、０．１４％、０．１３％、０．１２％、０．１１％、０．１０％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２、０．０１９％、０．０１８％、０．０１７％、０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、または０．０１３％未満の重量濃度（ｗ／ｗ）のＧＲＰ７８宿主細胞タンパク質を含む、組成物。
【０１５９】
３．Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記組成物は、凝集三量体に対して、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％超の重量濃度（ｗ／ｗ）の非凝集三量体を含む、組成物。
【０１６０】
４．Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、グリコシル化可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドであり、前記グリコシル化可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、グリコシル化を含めて、５９．５ｋＤａ超、例えば、６０．０ｋＤａ超、６０．５ｋＤａ超、または６１．０ｋＤａ超の分子質量を有する、組成物。
【０１６１】
５．Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、
（ａ）７．８、７．７、７．６、７．５、７．４、７．３、７．２、７．１、７．０、６．９、６．８、６．７、６．６、６．５、６．４、６．３、６．２、６．１、６．０、５．９、５．８、５．７、５．４未満；または
（ｂ）７．８〜５．３、７．４〜５．３、７．０〜５．３、６．８〜５．３、６．６〜５．３、６．４〜５．３、６．２〜５．３、６．０〜５．３の範囲
のｐＩを有する、組成物。
【０１６２】
６．Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、グリカン基を含み、前記グリカン基の少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％は、ＨＩＬＩＣ−ＦＬＲ／ＭＳを用いたグリカンプロファイリングで決定されるように、シアル化されている、組成物。
【０１６３】
７．前記組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体をさらに含む、パートＡ実施形態１〜２および４〜６に記載の抗原組成物。
【０１６４】
８．前記可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドが、Ｆ１鎖およびＦ２鎖を含む、パートＡ実施形態１〜７に記載の抗原組成物。
【０１６５】
９．前記Ｆ１鎖が、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、パートＡ実施形態１〜８に記載の抗原組成物。
【０１６６】
１０．前記Ｆ２鎖が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、パートＡ実施形態１〜９に記載の抗原組成物。
【０１６７】
１１．前記Ｆ１鎖が、配列番号２のアミノ酸配列を含み、前記Ｆ２鎖が、配列番号３のアミノ酸配列を含む、パートＡ実施形態１〜１０に記載の抗原組成物。
【０１６８】
実施形態、パートＢ
１．組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の集団を含む抗原組成物であって、
前記集団の各三量体は、
（ａ）Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆプロトマー」）；ならびに
（ｂ）ｐ２７ペプチドの少なくとも１０個のアミノ酸をさらに含む、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆ’プロトマー」）
からなる群から独立に選択される３個の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドから構成され；
かつ、式：
ｎＦ＋（３−ｎ）Ｆ’  （式Ｉ）
［式中、ｎは、０〜３の整数であり、Ｆは、Ｆプロトマーであり、Ｆ’は、Ｆ’プロトマーである。］
により示される、組成物。
【０１６９】
２Ａ．組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の集団を含む抗原組成物であって、
前記集団の各三量体は、
（ａ）Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆプロトマー」）；ならびに
（ｂ）ｐ２７ペプチドの少なくとも１０個のアミノ酸をさらに含む、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆ’プロトマー」）
からなる群から独立に選択される３個の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドから構成され；
かつ、式：
ｎＦ＋（３−ｎ）Ｆ’  （式Ｉ）
［式中、ｎは、０〜３の整数であり、Ｆは、Ｆプロトマーであり、Ｆ’は、Ｆ’プロトマーである。］
により示され；
三量体の集団における組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％が、Ｆ’プロトマーである、組成物。
【０１７０】
２Ｂ．Ｆ’プロトマーが、切断されていないフューリン切断部位を含むＦ１鎖を含む、パートＢ実施形態１〜２Ａのいずれか一項に記載の抗原組成物。
【０１７１】
３．Ｆ’プロトマーが、Ｆプロトマーの分子質量よりも少なくとも１．０ｋＤａ、例えば、少なくとも１．５ｋＤａ、少なくとも２．０ｋＤａ、少なくとも２．５ｋＤａ、少なくとも３．０ｋＤａ大きい分子量を有する、パートＢ実施形態１〜２Ｂのいずれか一項に記載の抗原組成物。
【０１７２】
４．ゼロ個のＦ’プロトマーを含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体に対する少なくとも１つのＦ’プロトマーを含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の比が、少なくとも１：１．２；例えば、少なくとも１：１．３；少なくとも１：１．４；少なくとも１：１．５；少なくとも１：１．６；少なくとも１：１．７；少なくとも１：１．８；少なくとも１：１．９；少なくとも１：２．０；少なくとも１：２．１；少なくとも１：２．２；少なくとも１：２．３；少なくとも１：２．４；少なくとも１：２．５；少なくとも１：２．６；少なくとも１：２．７；少なくとも１：２．８；少なくとも１：２．９；少なくとも１：３．０；少なくとも１：３．５；少なくとも１：４；少なくとも１：９；少なくとも１：１９；または少なくとも１：２９である、パートＢ実施形態１〜３のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【０１７３】
５．組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の集団が、クロマトグラフィーによって、沈降により検出可能な第１および第２のピークに分離され、前記第１のピークは、約３．９６Ｓの沈降係数を有し、前記第２のピークは、約４．１３Ｓの沈降係数を有する、パートＢ実施形態１〜４のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【０１７４】
６．Ｆ１鎖が、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、Ｆ２鎖が、配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含む、パートＡ実施形態１〜１１またはパートＢ実施形態１〜５のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【０１７５】
７．Ｆ’プロトマーが、配列番号６のアミノ酸配列を含む、パートＢ実施形態１〜６のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【０１７６】
８．Ｆ’プロトマーが、Ｎ末端ｐ２７ペプチドを有するＦ１鎖を含む、パートＢ実施形態１〜７のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【０１７７】
９．Ｆ’プロトマーが、配列番号７のアミノ酸配列を含むＦ１鎖を含む、パートＢ実施形態１〜８のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【０１７８】
１０．Ｆ’プロトマーが、配列番号８と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦ１鎖および配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦ２鎖を含む、パートＢ実施形態１〜９のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【０１７９】
１１．（ａ）Ｆ’プロトマーが、配列番号８のアミノ酸配列を含むＦ１鎖および配列番号３のアミノ酸配列を含むＦ２鎖を含み；かつ
（ｂ）Ｆプロトマーが、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦ１鎖および配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦ２鎖を含む、
パートＢ実施形態１〜１０のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【０１８０】
１２．前記抗原組成物が凍結乾燥されている、パートＡ実施形態１〜１１またはパートＢ実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【０１８１】
１３．パートＡ実施形態１〜１１またはパートＢ実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の抗原組成物および薬学上許容可能な担体または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
【０１８２】
１４．担体または賦形剤が、緩衝液を含む、パートＢ実施形態１３に記載の免疫原性組成物。
【０１８３】
１５．アジュバントをさらに含む、パートＢ実施形態１３〜１４に記載の免疫原性組成物。
【０１８４】
１６．アジュバントが、Ｔｈ１に偏った免疫応答を誘発する、パートＢ実施形態１５に記載の免疫原性組成物。
【０１８５】
１７．アジュバントが、リポソームを含む、パートＢ実施形態１６に記載の免疫原性組成物。
【０１８６】
１８．アジュバントが、水中油型エマルションを含む、パートＢ実施形態１６に記載の免疫原性組成物。
【０１８７】
１９．アジュバントが、アルミニウム塩を含む、パートＢ実施形態１６に記載の免疫原性組成物。
【０１８８】
２０．アジュバントが、ＴＬＲ４アゴニストを含む、パートＢ実施形態１６〜１９のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【０１８９】
２１．アジュバントが、リポ多糖を含む、パートＢ実施形態２０に記載の免疫原性組成物。
【０１９０】
２２．３Ｄ−ＭＰＬをさらに含む、パートＢ実施形態２０〜２１に記載の免疫原性組成物。
【０１９１】
２３．サポニンをさらに含む、パートＢ実施形態１６〜２２に記載の免疫原性組成物。
【０１９２】
２４．サポニンがＱＳ２１である、パートＢ実施形態２３に記載の免疫原性組成物。
【０１９３】
２５．アジュバントが、高齢者への投与に適切である、パートＢ実施形態１７または１８に記載の免疫原性組成物。
【０１９４】
２６．免疫原性組成物が、ＲＳＶの感染を低減または予防する、パートＢ実施形態１３〜２５のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【０１９５】
２７．免疫原性組成物が、ＲＳＶの感染後の病理学的応答を低減または予防する、パートＢ実施形態１３〜２６のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【０１９６】
２８．ＲＳＶ以外の病原性生物体の少なくとも１つのさらなる抗原をさらに含む、パートＢ実施形態１３〜２７のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【０１９７】
２９．少なくとも１つのさらなる抗原が、ＲＳＶ以外のウイルスのものである、パートＢ実施形態２８に記載の免疫原性組成物。
【０１９８】
３０．ウイルスが、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）、ポリオウイルスおよびインフルエンザウイルスからなる群から選択される、パートＢ実施形態２９に記載の免疫原性組成物。
【０１９９】
３１．少なくとも１つのさらなる抗原が、ジフテリア、破傷風、百日咳、インフルエンザ菌、および肺炎球菌からなる群から選択される、パートＢ実施形態２８に記載の免疫原性組成物。
【０２００】
３２．パートＡ実施形態１〜１１またはパートＢ実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え核酸。
【０２０１】
３３．ＲＳＶ抗原をコードするポリヌクレオチド配列が、選択された宿主細胞における発現に関して最適化されたコドンである、パートＢ実施形態３２に記載の組換え核酸。
【０２０２】
３４．パートＢ実施形態３２または３３に記載の組換え核酸を含む、ベクター。
【０２０３】
３５．ベクターが、原核生物または真核生物の発現ベクターを含む、パートＢ実施形態３４に記載のベクター。
【０２０４】
３６．パートＢ実施形態３２もしくは３３に記載の核酸またはパートＢ実施形態３４もしくは３５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【０２０５】
３７．宿主細胞がＣＨＯ細胞である、パートＢ実施形態３６に記載の宿主細胞。
【０２０６】
３８．ＣＨＯ細胞が、クローン集団のメンバーである、パートＢ実施形態３７に記載の宿主細胞。
【０２０７】
３９．ＲＳＶ感染症を治療するための薬剤の製造における、パートＡ実施形態１〜１１もしくはパートＢ実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の組成物またはパートＢ実施形態１３〜３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
【０２０８】
４０．ＲＳＶ感染症を予防するための薬剤の製造における、パートＡ実施形態１〜１１もしくはパートＢ実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の組成物またはパートＢ実施形態１３〜３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物の使用。
【０２０９】
４１．ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、パートＡ実施形態１〜１１、パートＢ実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の組成物またはパートＢ実施形態１３〜３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、方法。
【０２１０】
４２．免疫原性組成物の投与が、ＲＳＶへの接触後のウイルス性疾患を増強することなく、ＲＳＶに対して特異的な免疫応答を誘発する、パートＢ実施形態４１に記載の方法。
【０２１１】
４３．免疫応答が、Ｔｈ１に偏った免疫応答を含む、パートＢ実施形態４１または４２に記載の方法。
【０２１２】
４４．免疫応答が、ＲＳＶの感染を低減もしくは予防する、および／またはＲＳＶの感染後の病理学的応答を低減もしくは予防する防御免疫応答を含む、パートＢ実施形態４１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【０２１３】
４５．対象がヒト対象である、パートＢ実施形態４１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【０２１４】
４６．鼻腔内経路を介して免疫原性組成物を投与することを含む、パートＢ実施形態４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【０２１５】
４７．筋肉内経路を介して免疫原性組成物を投与することを含む、パートＢ実施形態４１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【０２１６】
４８．医学（医薬）における使用のための、パートＡ実施形態１〜１１、パートＢ実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の組成物、またはパートＢ実施形態１３〜３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【０２１７】
４９．ＲＳＶ感染症の予防または治療のための、パートＡ実施形態１〜１１、パートＢ実施形態１〜１２のいずれか一項に記載の組成物、またはパートＢ実施形態１３〜３１のいずれか一項に記載の免疫原性組成物。
【０２１８】
５０．パートＢ実施形態３６〜３８に記載の宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに、リガンド結合基質を利用したマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製の工程を含む精製方法に、発現したＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、パートＡ実施形態１〜１１またはパートＢ実施形態１〜１２に記載の抗原組成物を製造する方法であって、リガンドは、静電相互作用、水素結合、および疎水性相互作用のうち１つ以上によってタンパク質と相互作用し得る、方法。
【０２１９】
５１．マルチモーダル精製液体クロマトグラフィー精製工程が、第１に、ローディング緩衝液の存在下で、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを前記リガンド結合基質にローディングすること、第２に、溶出緩衝液の存在下で、前記リガンド結合基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させることを含む、パートＢ実施形態５０に記載の方法。
【０２２０】
５２．リガンド結合基質が、マルチモーダル陰イオン交換樹脂である、パートＢ実施形態５０〜５１に記載の方法。
【０２２１】
５３．前記溶出緩衝液が、コスモトロピック剤およびカオトロピック剤を含む、パートＢ実施形態５２に記載の方法。
【０２２２】
５４．リガンドが、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含む、パートＢ実施形態５０〜５３に記載の方法。
【０２２３】
５５．コスモトロピック剤が、ＨＰＯ４、クエン酸塩、ＳＯ４、Ｆ、ＯＡｃ、ＣＯ２、ＳＯ２、ＳＣＮ、ＨＰＯ２、Ｍｇ、Ｌｉ、Ｚｎ、Ａｌ、ｔｅｒｔ−ブタノール、トレハロース、グルコース、プロリン、およびグルタミン酸塩からなる群から選択される、パートＢ実施形態５２〜５４に記載の方法。
【０２２４】
５６．カオトロピック剤が、Ｋ、Ｃｓ、ＮＨ４、（ＣＨ３）４Ｎ、ｎ−ブタノール、エタノール、塩化グアニジニウム、過塩素酸塩、酢酸塩、塩化物、臭化物、ヨウ化物、フェノール、２−プロパノール、ドデシル硫酸ナトリウム、チオ尿素、尿素、アルギニン、リシン、およびヒスチジンからなる群から選択される、パートＢ実施形態５２〜５５に記載の方法。
【０２２５】
５７．溶出緩衝液が、クエン酸イオンおよびアルギニンを含む、パートＢ実施形態５１〜５６に記載の方法。
【０２２６】
５８．溶出緩衝液が、
（ａ）１５０〜３５０ｍＭ、例えば、２００〜３００ｍＭ、２２５〜２７５ｍＭ、２３０〜２７０ｍＭ、２３５〜２６５ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；
（ｂ）２００〜４００ｍＭ、例えば、２５０〜３５０ｍＭ、２７５〜３２５ｍＭ、２８０〜３２０ｍＭ、２８５〜３１５ｍＭ、２９０〜３１０ｍＭ、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニン
を含む、パートＢ実施形態５１〜５７に記載の方法。
【０２２７】
５９．溶出緩衝液が、約２５０ｍＭのクエン酸ナトリウムおよび約３００ｍＭのアルギニンを含む、パートＢ実施形態５８に記載の方法。
【０２２８】
６０．溶出緩衝液が、１０〜３０ｍＭ、例えば、１５〜２５ｍＭ、１６〜２４ｍＭ、１７〜２３ｍＭ、１８〜２２ｍＭ、または１９〜２１ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、パートＢ実施形態５１〜５９に記載の方法。
【０２２９】
６１．溶出緩衝液が、約２０ｍＭのリン酸ナトリウムを含む、パートＢ実施形態６０に記載の方法。
【０２３０】
６２．ローディング緩衝液が、
（ａ）２０〜３４ｍＳ／ｃｍ、例えば、２１〜３３ｍＳ／ｃｍ、２２〜３２ｍＳ／ｃｍ、２３〜３１ｍＳ／ｃｍ、２４〜３０ｍＳ／ｃｍ、２５〜２９ｍＳ／ｃｍ、もしくは２６〜２８ｍＳ／ｃｍ；または
（ｂ）１１〜３４ｍＳ／ｃｍ、１３〜３１ｍＳ／ｃｍ、１５〜２７ｍＳ／ｃｍ、１７〜２５ｍＳ／ｃｍ、１９〜２３ｍＳ／ｃｍ、もしくは２０〜２２ｍＳ／ｃｍ
から選択される伝導率を有する、パートＢ実施形態５１〜６１に記載の方法。
【０２３１】
６３．ローディング緩衝液が、約
（ａ）２６〜２８ｍＳ／ｃｍ；または
（ｂ）２０〜２２ｍＳ／ｃｍ
の伝導率を有する、パートＢ実施形態６２に記載の方法。
【０２３２】
６４．ローディング緩衝液が、
（ａ）１００〜３００ｍＭ、例えば、１７５〜２７５ｍＭ、２００〜２５０ｍＭ、２１０〜２４０ｍＭ、２２０〜２３０ｍＭの塩化ナトリウム；または
（ｂ）１００〜３００ｍＭ、例えば、１２０〜２５０ｍＭ、１４０〜２２５ｍＭ、１６０〜２００ｍＭ、１７０〜１９０ｍＭの塩化ナトリウム
を含む、パートＢ実施形態５１〜６３に記載の方法。
【０２３３】
６５．ローディング緩衝液が、
（ａ）約２２５ｍＭの塩化ナトリウム；または
（ｂ）約１８０ｍＭの塩化ナトリウム
を含む、パートＢ実施形態６４に記載の方法。
【０２３４】
６６．ローディング緩衝液および溶出緩衝液が独立に、
（ａ）６．５〜７．９、例えば、６．６〜７．８、６．７〜７．７、６．８〜７．６、６．９〜７．５、７．０〜７．４；または
（ｂ）６．５〜８．０、例えば、７．０〜７．９、７．１〜７．８、７．２〜７．７
のｐＨを有する、パートＢ実施形態５１〜６５に記載の方法。
【０２３５】
６７．ローディング緩衝液および溶出緩衝液が、
（ａ）各々約７．０〜７．４のｐＨを有する；または
（ｂ）ローディング緩衝液が、約７．３〜７．７のｐＨを有し、溶出緩衝液が、約７．２〜７．６のｐＨを有する、
パートＢ実施形態６６に記載の方法。
【０２３６】
６８．マルチモーダル液体クロマトグラフィー精製の工程の前に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程に供する、パートＢ実施形態５０〜６７に記載の方法。
【０２３７】
６９．陰イオン交換クロマトグラフィーの工程が、
（ａ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、第四級アミン基を含む基質を有するリガンドを含み、樹脂は、
（ｉ）１０〜３０ｍＭのリン酸塩および１００〜１３０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０または
（ｉｉ）１０〜３０ｍＭのリン酸塩および４０〜１３０ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０
を含む緩衝液で平衡化されている工程；ならびに
（ｂ）（ｉ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０または
（ｉｉ）１０〜３０ｍＭのリン酸塩および１３０〜２５０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０
を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程
を含む、パートＢ実施形態６８に記載の方法。
【０２３８】
７０．（ａ）樹脂が、約２０ｍＭのリン酸塩、約１１５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ約７．０〜７．４を含む緩衝液で平衡化されており；組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドが、約２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約２２５ｍＭの塩化ナトリウム、および約ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液を用いて、樹脂から溶出される、または
（ｂ）樹脂が、約２０ｍＭのリン酸塩、約８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ約７．３〜７．７を含む緩衝液で平衡化されており；組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドが、約２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１８０ｍＭの塩化ナトリウム、および約ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液を用いて、樹脂から溶出される、
パートＢ実施形態６９に記載の方法。
【０２３９】
７１．陰イオン交換クロマトグラフィーの工程の前に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、アフィニティー様クロマトグラフィーの工程に供する、パートＢ実施形態６８〜７０に記載の方法。
【０２４０】
７２．アフィニティー様クロマトグラフィーの工程が、
（ａ）デキストラン硫酸を含む樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、
（ｉ）４０〜６０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０；または
（ｉｉ）３０〜６０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０
で平衡化されている工程；
および
（ｂ）１０〜３０ｍＭのリン酸ナトリウム、２００〜２７０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６．０〜８．０を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程
を含む、パートＢ実施形態７１に記載の方法。
【０２４１】
７３．（ａ）樹脂が、
（ｉ）約４７ｍＭのリン酸ナトリウム、約ｐＨ７．０〜７．４または
（ｉｉ）約４０ｍＭのリン酸ナトリウム、約ｐＨ７．１〜７．５
を含む緩衝液で平衡化されており；
および
（ｂ）組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドが、
（ｉ）約２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約２３５ｍＭの塩化ナトリウム、約ｐＨ７．０〜７．４または
（ｉｉ）約２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約２４０ｍＭの塩化ナトリウム、約ｐＨ７．２〜７．６
を含む緩衝液を用いて、樹脂から溶出される、
パートＢ実施形態７２に記載の方法。
【０２４２】
７４．（ａ）アフィニティー様クロマトグラフィーの工程の前に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、ウイルス不活化の工程に供する、または
（ｂ）アフィニティー様クロマトグラフィーの工程の後に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、ウイルス不活化の工程に供する、
パートＢ実施形態７１〜７３に記載の方法。
【０２４３】
７５．ウイルス不活化の工程が、
（ａ）組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む液体培地にポリソルベート８０を加えて、０．５〜１．５％の濃度とすること、および前記液体培地を１５〜２５℃の温度で１０〜２５時間インキュベートすること、または
（ｂ）組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む液体培地にポリソルベート８０を加えて、０．５〜２．５％の濃度とすること、および前記液体培地を１５〜２５℃の温度で１０〜２５時間インキュベートすること
を含む、パートＢ実施形態７１に記載の方法。
【０２４４】
７６．（ａ）液体培地を約１．０％の濃度に調整し、前記液体培地を制御された室温で約１５〜２０時間インキュベートする、または
（ｂ）液体培地を約２．０％の濃度に調整し、前記液体培地を制御された室温で約１８〜２４時間インキュベートする、
パートＢ実施形態７５に記載の方法。
【０２４５】
７７．マルチモーダル液体クロマトグラフィー精製の工程に次いで、ウイルス濾過の工程を行う、パートＢ実施形態５０〜７６に記載の方法。
【０２４６】
７８．ウイルス濾過の工程が、約０．１μｍのカットオフを有する膜を用いた前濾過および約１９ｎｍのカットオフを有する膜を用いた濾過を含む、パートＢ実施形態７７に記載の方法。
【０２４７】
７９．ウイルス濾過の工程に次いで、限外濾過／ダイアフィルトレーションの工程を行う、パートＢ実施形態７７〜７８に記載の方法。
【０２４８】
８０．５０ｋＤａ分子量カットオフ膜ならびに約１０ｍＭのリン酸カリウムおよび約５％トレハロースを含むダイアフィルトレーション緩衝液を利用する、パートＢ実施形態７９に記載の方法。
【０２４９】
８１．組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを凍結乾燥する工程をさらに含む、パートＢ実施形態５０〜８０に記載の方法。
【０２５０】
８２Ａ．液体培地中でパートＢ実施形態３５〜３７に記載の宿主細胞を培養すること、ならびに
（ａ）組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む液体培地にポリソルベート８０を加えて、約１．０％の濃度とすること、および前記液体培地を制御された室温で約１８〜２２時間インキュベートすることを含む、ウイルス不活化の工程；
（ｂ）デキストラン硫酸を含む樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングする工程であって、樹脂は、約５０ｍＭのリン酸ナトリウム、約ｐＨ７．０〜７．４で平衡化されている工程、および約２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約２３５ｍＭの塩化ナトリウム、約ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させる工程を含む、アフィニティー様クロマトグラフィーの工程；
（ｃ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングすること（ここで、樹脂は、第四級アミン基を有するリガンドを含み、樹脂は、約２０ｍＭのリン酸塩および約１１５ｍＭの塩化ナトリウム、約ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液で平衡化されている）；ならびに約２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約２２５ｍＭの塩化ナトリウム、約ｐＨ７．０〜７．４を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させることを含む、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程；
（ｄ）リガンド結合基質を利用するマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製の工程であって、リガンドは、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含み、前記マルチモーダル液体クロマトグラフィー精製は、第１に、ローディング緩衝液の存在下で、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを前記リガンド結合基質にローディングすること（ここで、ローディング緩衝液は、約２２５ｍＭの塩化ナトリウム、約ｐＨ７．０〜７．４を含む）、第２に、溶出緩衝液の存在下で、前記リガンド結合基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させること（ここで、溶出緩衝液は、約２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約３００Ｍｍのアルギニン、約２０Ｍｍのリン酸ナトリウム、約ｐＨ７．０〜７．４を含む）を含む、工程；
（ｅ）約０．１μｍのカットオフを有する膜を用いた前濾過および約１９ｎｍのカットオフを有する膜を用いた濾過を含むウイルス濾過の工程であって、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、膜を通過する、工程；
（ｆ）約５０ｋＤａ分子量カットオフを有する膜および約１０ｍＭのリン酸カリウム、約５％トレハロースを含むダイアフィルトレーション緩衝液を利用して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む保持液を製造する、限外濾過／ダイアフィルトレーションの工程；
（ｇ）約０．２μｍ以下のカットオフを有するフィルターを利用する、濾過の工程
に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む液体培地を供することによって、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを製造することを含む、パートＡ実施形態１〜１１またはパートＢ実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法。
【０２５１】
８２Ｂ．液体培地中でパートＢ実施形態３５〜３７に記載の宿主細胞を培養すること、ならびに
（ａ）デキストラン硫酸を含む樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングすること（ここで、樹脂は、約４０ｍＭのリン酸ナトリウム、約ｐＨ７．１〜７．５で平衡化されている）；および約２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約２４０ｍＭの塩化ナトリウム、約ｐＨ７．２〜７．６を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させることを含む、アフィニティー様クロマトグラフィーの工程；
（ｂ）組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む液体培地にポリソルベート８０を加えて、約２．０％の濃度とすること、および前記液体培地を制御された室温で約１８〜２４時間インキュベートすることを含む、ウイルス不活化の工程；
（ｃ）樹脂に組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをローディングすること（ここで、樹脂は、第四級アミン基を有するリガンドを含み、樹脂は、約２０ｍＭのリン酸塩および約８０ｍＭの塩化ナトリウム、約ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液で平衡化されている）；ならびに約２０ｍＭのリン酸ナトリウム、約１８０ｍＭの塩化ナトリウム、約ｐＨ７．３〜７．７を含む緩衝液を用いて、樹脂から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させることを含む、陰イオン交換クロマトグラフィーの工程；
（ｄ）リガンド結合基質を利用するマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製の工程であって、リガンドは、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンを含み、前記マルチモーダル液体クロマトグラフィー精製は、第１に、ローディング緩衝液の存在下で、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを前記リガンド結合基質にローディングすること（ここで、ローディング緩衝液は、約１８０ｍＭの塩化ナトリウム、約ｐＨ７．３〜７．７を含む）、第２に、溶出緩衝液の存在下で、前記リガンド結合基質から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを溶出させること（ここで、溶出緩衝液は、約２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、約３００Ｍｍのアルギニン、約２０Ｍｍのリン酸ナトリウム、約ｐＨ７．２〜７．６を含む）を含む、工程；
（ｅ）約０．１μｍのカットオフを有する膜を用いた前濾過および約２０ｎｍのカットオフを有する膜を用いた濾過を含むウイルス濾過の工程であって、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、膜を通過する、工程；
（ｆ）約５０ｋＤａ分子量カットオフを有する膜および約１０ｍＭのリン酸カリウム、約４％トレハロースを含むダイアフィルトレーション緩衝液を利用して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む保持液を製造する、限外濾過／ダイアフィルトレーションの工程；
（ｇ）約０．２μｍ以下のカットオフを有するフィルターを利用する、濾過の工程
に、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む液体培地を供することによって、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを製造することを含む、パートＡ実施形態１〜１１またはパートＢ実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法。
【０２５２】
８３．凍結乾燥の工程をさらに含む、パートＢ実施形態８２Ａ〜Ｂのいずれか一項に記載の方法。
【０２５３】
８４．パートＢ実施形態１〜１１のいずれか一項に記載の三量体の集団を、三量体の大部分が少なくとも１つのＦ’プロトマーを含む三量体の集団および三量体の大部分が３つのＦプロトマーを含む三量体の集団に分離する方法であって、前記方法は、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーの工程を含む、方法。
【０２５４】
８５．Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーの工程が、０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ勾配、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍのクエン酸ナトリウムを利用する、パートＢ実施形態８４に記載の方法。
【０２５５】
８６．塩化ナトリウム勾配が、２０カラム体積で行われる、パートＢ実施形態８５に記載の方法。
【０２５６】
全般
特に断りのない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるのと同じ意味を有する。単数形の用語「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈がそうではないことを明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。同様に、用語「または」は、文脈がそうではないことを明らかに示さない限り、「および」を含むものとする。用語「複数の」は、２つ以上を指す。さらに、物質の濃度またはレベル、例えば、溶液成分濃度またはその比、ならびに反応条件、例えば、温度、圧力およびサイクル時間に関して与えられる数値限定は、概算であるものとする。本明細書で使用される用語「約」は、量±１０％を意味するものとする。数値範囲に関する用語「間（〜）」は、範囲が終点を除外すると明確に示さない限り、範囲の終点を含むものとする。
【０２５７】
以下の限定されない図および実施例を参照して、本発明をさらに説明する。
【実施例】
【０２５８】
実施例１  −  ＣＨＯ細胞における組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの製造
Ａ．製造方法
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド配列を、抗原産生のためにＣＨＯ宿主細胞に組み込んだ。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを製造するために、作業用細胞バンクバイアルを解凍し、二酸化炭素インキュベーター中の細胞培養培地を用いた３つの連続した振盪フラスコ工程において、０．２×１０６個／ｍＬの接種生細胞密度にて、およそ３７℃で、制御されたＣＯ２条件下で数日間増幅させ、次いで、およそ３７℃、生理学的ｐＨで、制御されたＣＯ２条件下で、２つの連続したシードバイオリアクターでの増幅を数日間行う。増幅した培養物を用いて、およそ３７℃の温度、生理学的ｐＨで、制御されたＣＯ２条件下で、生細胞密度にて製造バイオリアクターに接種する。バイオリアクターは、２つの異なるフィードを用いて、ワーキングボリューム（ＷＶ）の９０％未満で開始する。第１のフィードは、培養物が約５×１０６個／ｍＬに達した際、毎日ＷＶの１％で行い、第２のフィードは、２日後に毎日ＷＶの０．２％で行う。培養密度が倍増したとき、温度を３５℃未満に下げ、ｐＨをＣＯ２およびＮａＯＨで制御し、溶存酸素を純酸素で制御する。完了後、培養物を回収する。生細胞密度、生存率および産物蓄積プロファイルを、図３Ａおよび図３Ｂに示す。
【０２５９】
培養物について、平行に接続された一次濾過および二次濾過による濾過を行い、清澄な発酵ブロスとして回収する。一次フィルターは、１リットル培養物あたり０．０２２ｍ２の濾過面積を有するＤ０ＨＣであり、二次フィルターは、１リットル培養物あたり０．０１１ｍ２の濾過面積を有するＸ０ＨＣである。濾液を、０．２μＭフィルターでさらに濾過し、下流での精製のために生物学的負荷（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を低減させる。回収物の収率は約７５％であり、４０％の全ＣＨＯ宿主細胞タンパク質および４対数のＣＨＯ宿主ＤＮＡレベルの減少がみられる。
【０２６０】
Ｂ．製造方法の補足
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードする組換えポリヌクレオチド配列を、抗原産生のためにＣＨＯ宿主細胞に組み込んだ。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを製造するために、作業用細胞バンクバイアルを解凍し、二酸化炭素インキュベーター中の細胞培養培地を用いた３つの連続した振盪フラスコ工程において、０．２×１０６個／ｍＬの接種生細胞密度にて、およそ３７℃で、制御されたＣＯ２条件下で数日間増幅させ、次いで、およそ３７℃、生理学的ｐＨで、制御されたＣＯ２条件下で、２つの連続したシードバイオリアクターでの増幅を数日間行う。改変ＤＭ１３３フィードの１回の５％バイオリアクター容量の添加を、第２のシードバイオリアクターのために接種後７０〜７４時間にて行う必要がある。増幅した培養物を用いて、およそ３７℃の温度、生理学的ｐＨで、制御されたＣＯ２条件下で、１．０×１０６個／ｍＬの生細胞密度にて製造バイオリアクターに接種する。バイオリアクターは、接種直前にバイオリアクターに添加した改変ＤＭ１３３フィードの量の２．５％（Ｖ／Ｖ）を用いて、ワーキングボリューム（ＷＶ）の９０％未満で開始する。改変フィードの量の２．５％（Ｖ／Ｖ）を、接種直前にバイオリアクターに添加する。第１のフィードは、２日目から開始して毎日ＷＶの１．２５％で行い、第２のフィードは、２日後にＷＶの０．５％で毎日開始する。培養密度が１０〜１４×１０６個／ｍＬに達したとき、温度を３３℃に下げ、ｐＨをＣＯ２およびＮａＯＨで制御し、溶存酸素を純酸素で制御する。完了後、培養物を回収する。生細胞密度、生存率および産物蓄積プロファイルを、図２３Ａおよび図２３Ｂに示す。
【０２６１】
培養物を、平行に接続された一次濾過および二次濾過による濾過を行い、清澄な発酵ブロスとして回収する。一次清澄化では、培養物を、０．６６ｍ２のフィルター面積のＤ０ＳＰフィルターを介して汲み出す。次いで、部分的に清澄化された回収物を、平行に接続された、０．３３ｍ２のフィルター面積を有するＸ０ＳＰフィルターを介して汲み出す。濾液を、０．２μＭフィルターでさらに濾過し、下流での精製のために生物学的負荷（ｂｉｏｂｕｒｄｅｎ）を低減させる。回収物の収率は約７５％であり、４０％の全ＣＨＯ宿主細胞タンパク質および４対数のＣＨＯ宿主ＤＮＡレベルの減少がみられる。
【０２６２】
実施例２  −  ＣＨＯ細胞からの組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの精製
Ａ．方法
（１）組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの原薬／バルク中間体溶液の製造は、１つの流加細胞培養製造バッチに基づく。
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを回収するために、細胞培養物を、深層濾過により回収する。濾過した回収物を、界面活性剤の添加によるウイルス不活化に供する。ウイルス不活化された中間体を、結合／溶出モードでＣａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳクロマトグラフィーにより捕捉する。次いで、Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒｓ溶出液を、結合／溶出モードでＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーにおいてさらに精製する。Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍＰｒｅｓ溶出液を、結合／溶出モードでＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーにより、さらに精製する。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ溶出液を、ウイルス濾過工程により処理する。次いで、ウイルス濾液を濃縮し、緩衝液を交換し、次いで、最終製剤化（ｆｉｎａｌ  ｅｘｃｉｐｉｅｎｔ）および濃度の調整および０．２μｍ濾過を行う。この精製において使用される総てのクロマトグラフィーゲルは、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製である。
【０２６３】
ウイルス不活化工程の目的は、エンベロープを有するウイルスなどの界面活性剤不耐性ウイルスを排除することである。ポリソルベート８０を、一定撹拌下で回収物質に添加し、標的濃度１．０％を達成する。１５〜２０時間のインキュベーションを、制御された室温で、光保護下で行う。ウイルス不活化の終結を、プロセス工程Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒｓにおけるキャプチャークロマトグラフィーを通じて行い、インキュベーション時間は、Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒｓ工程におけるロードの終了とともに終了する。
【０２６４】
第１の精製工程は、結合／溶出モードで樹脂Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳを用いたアフィニティー様クロマトグラフィーである。Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳカラムの目的は、ウイルス不活化された中間体から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを捕捉すること、容量を低減させること、およびさらなる下流での処理のために一般的な不純物を低減させることである。この工程では、ウイルス不活化されたプールを水で希釈して、標的伝導率６ｍＳ／ｃｍを達成する。伝導率の調整後、４７ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４で予め平衡化されていたＣａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒｓに、材料をロードする。カラムを平衡化緩衝液で洗浄した後、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドプールを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２３５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４で、２００ｃｍ／ｈで溶出させる。
【０２６５】
第２の精製工程は、結合／溶出モードで樹脂Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーである。Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓカラムの目的は、産物の純度を増加させること（ＲＰ−ＨＰＬＣで検証）ならびにＨＣＰおよびＤＮＡを低減させることである。Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍＰｒｅｓクロマトグラフィーは、ウイルス除去工程としても定義される。この工程では、Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒｓ溶出プールの伝導率を、水での希釈により１５．０ｍＳ／ｃｍに調整する。伝導率の調整後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１１５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４で予め平衡化されていたＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓに、材料をロードする。カラムを平衡化緩衝液で洗浄した後、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドプールを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２２５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４で、２００ｃｍ／ｈで溶出させる。
【０２６６】
第３の精製工程は、結合／溶出モードで樹脂Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅを用いた混合モードクロマトグラフィーである。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅカラムの目的は、高分子量種、低分子量種、およびＨＣＰを低減させることである。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーは、ウイルス除去工程としても定義される。この工程では、Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓプールを、２００ｃｍ／ｈでＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅカラムに直接ロードする；カラムは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２２５ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．０〜７．４で予め平衡化されていたものである。カラムを平衡化緩衝液で洗浄した後、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドプールを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、３００ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．０〜７．４で、２００ｃｍ／ｈで溶出させる。
【０２６７】
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅは、凝集体の除去、宿主細胞タンパク質の除去およびウイルスクリアランスに関して最適化されているマルチモーダル陰イオン交換樹脂である。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー樹脂のリガンドは、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンであり；このリガンドは、静電相互作用、水素結合、および疎水性相互作用を介してタンパク質と相互作用することができる。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのプロセスでは、タンパク質を、２７ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．０〜７．４でロードし；ローディング緩衝液は、およそ２２５ｍＭの塩化ナトリウムを含有する。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドが、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅに結合する条件は、サンプルの疎水性成分とＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ樹脂の疎水性成分との相互作用に適するものとする。溶出緩衝液は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、３００ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．０〜７．４からなる。緩衝液の適用後、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅカラムから溶出される。このプロセスにおいて使用される条件では、４．２８対数以上のＭｕＬＶクリアランスおよび３．２対数のＭＶＭクリアランスが許容された。
【０２６８】
【表１】
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【０２６９】
クロマトグラフィー工程に次いで、Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎフィルター（旭化成株式会社）を用いたウイルス濾過工程を行う。０．１μｍ膜を有するＯｐｔｉｃａｐ  ＸＬ５  ＰＶＤＦフィルターを、プレフィルターとして使用する。このプロセス工程の目的は、プロセス中間体プールに存在する潜在的ウイルスを排除することである。
【０２７０】
次の精製工程は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＰｅｌｌｉｃｏｎ  ３  ＰＥＳ  Ｂｉｏｍａｘ（ＭＷＣＯ  ５０ｋＤａ）を用いて行われる限外濾過／ダイアフィルトレーション工程である。この工程の目的は、産物を濃縮し、１０ｍＭのリン酸カリウムおよび５％トレハロースからなるダイアフィルトレーション緩衝液に対してマトリックスを交換することである。ダイアフィルトレーション後の保持液は、システムのすすぎを行う前に、システムから排出する。システムのすすぎ液を、ダイアフィルトレーション後の保持液に加え、１．２ｍｇ／ｍＬ〜１．５ｍｇ／ｍＬの範囲の濃縮を達成する。
【０２７１】
原薬処方工程の目的は、最終原薬賦形剤組成物を、０．０５％ＰＳ−８０の最終含量に調整し、標的の濃度を１ｍｇ／ｍＬに調整することである。次いで、原薬を最終的に０．２μｍ濾過し、アリコートし、冷凍庫システムで凍結させる。原薬は、さらに処理を行うまで、−７０℃で保存する。
【０２７２】
（２）１つの流加細胞培養製造バッチに基づく組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの原薬／バルク中間体溶液の製造は、以下のように達成することもできる。
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを回収するために、細胞培養物を、深層濾過により回収する。濾過した回収物を、結合／溶出モードでＣａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳクロマトグラフィーにより捕捉する。次いで、Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒｓ溶出液を、界面活性剤の添加によるウイルス不活化に供する。ウイルス不活化された中間体を、結合／溶出モードでＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィーにおいてさらに精製する。Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍＰｒｅｓ溶出液を、結合／溶出モードでＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーにより、さらに精製する。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ溶出液を、ウイルス濾過工程により処理する。次いで、ウイルス濾液を濃縮し、緩衝液を交換し、次いで、最終賦形剤および濃度の調整および０．２μｍ濾過を行う。この精製において使用される総てのクロマトグラフィーゲルは、ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社製である。
【０２７３】
第１の精製工程は、結合／溶出モードで樹脂Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳを用いたアフィニティー様クロマトグラフィーである。Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒＳカラムの目的は、回収物から組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを捕捉すること、容量を低減させること、およびさらなる下流での処理のために一般的な不純物を低減させることである。この工程では、回収物を水で希釈して、標的伝導率５．２５ｍＳ／ｃｍを達成する。伝導率の調整後、４０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．１〜７．５で予め平衡化されていたＣａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒｓに、材料をロードする。カラムを平衡化緩衝液で洗浄した後、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドプールを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２４０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．２〜７．６で、２７５ｃｍ／ｈで溶出させる。
【０２７４】
捕捉工程に次いで、ウイルス不活化を行う。ウイルス不活化工程の目的は、エンベロープを有するウイルスなどの界面活性剤不耐性ウイルスを排除することである。ポリソルベート８０を、一定撹拌下で回収物質に添加し、標的濃度２．０％を達成する。１８〜２４時間のインキュベーションを、制御された室温（２２〜２４℃）で、光保護下で行う。ウイルス不活化の終結を、次のクロマトグラフィー工程の前に、ウイルス不活化されたプールの希釈を通じて行う。
【０２７５】
ウイルス不活化に次いで、結合／溶出モードで樹脂Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーを行う。Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓカラムの目的は、産物の純度を増加させること（ＲＰ−ＨＰＬＣで検証）ならびにＨＣＰおよびＤＮＡを低減させることである。Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍＰｒｅｓクロマトグラフィーは、ウイルス除去工程としても定義される。この工程では、Ｃａｐｔｏ  ＤｅＶｉｒｓ溶出プールの伝導率を、水での希釈により１０．９ｍＳ／ｃｍに調整する。伝導率の調整後、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７で予め平衡化されていたＣａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓに、材料をロードする。カラムを平衡化緩衝液で洗浄した後、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドプールを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７で、２００ｃｍ／ｈで溶出させる。
【０２７６】
第３の精製工程は、結合／溶出モードで樹脂Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅを用いた混合モードクロマトグラフィーである。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅカラムの目的は、高分子量種、低分子量種、およびＨＣＰを低減させることである。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィーは、ウイルス除去工程としても定義される。この工程では、Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓプールを、２００ｃｍ／ｈでＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅカラムに直接適用する；カラムは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１８０ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ７．３〜７．７で先に平衡化されていたものである。カラムを平衡化緩衝液で洗浄した後、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドプールを、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、３００ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．２〜７．６で、１５０ｃｍ／ｈで溶出させる。
【０２７７】
Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅは、凝集体の除去、宿主細胞タンパク質の除去およびウイルスクリアランスに関して最適化されているマルチモーダル陰イオン交換樹脂である。Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅクロマトグラフィー樹脂のリガンドは、Ｎ−ベンジル−Ｎ−メチルエタノールアミンであり；このリガンドは、静電相互作用、水素結合、および疎水性相互作用を介してタンパク質と相互作用することができる。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのプロセスでは、タンパク質を、２１ｍＳ／ｃｍ、ｐＨ７．３〜７．７でロードし；ローディング緩衝液は、およそ１８０ｍＭの塩化ナトリウムを含有する。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドが、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅに結合する条件は、サンプルの疎水性成分とＣａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ樹脂の疎水性成分との相互作用に適するものとする。溶出緩衝液は、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、２５０ｍＭのクエン酸ナトリウム、３００ｍＭのアルギニン、ｐＨ７．２〜７．６からなる。緩衝液の適用後、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅカラムから溶出する。このプロセスにおいて使用される条件では、４．８１対数を超えるＭｕＬＶクリアランスおよび３．１５対数を超えるＭＶＭクリアランスが許容された。
【０２７８】
クロマトグラフィー工程に次いで、Ｖｉｒｏｓａｒｔ  ＨＦ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  Ｓｔｅｄｉｍ社）を用いたウイルス濾過工程を行う。０．１μｍ膜を有するＶｉｒｏｓａｒｔ  Ｍａｘフィルターを、プレフィルターとして使用する。このプロセス工程の目的は、プロセス中間体プールに存在する潜在的ウイルスを排除することである。
【０２７９】
次の精製工程は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製のＰｅｌｌｉｃｏｎ  ３  ＰＥＳ  Ｂｉｏｍａｘ（ＭＷＣＯ  ５０ｋＤａ）を用いて行われる限外濾過／ダイアフィルトレーション工程である。この工程の目的は、産物を濃縮し、１０ｍＭのリン酸カリウムおよび４％トレハロースからなるダイアフィルトレーション緩衝液に対してマトリックスを交換することである。ダイアフィルトレーション後の保持液は、システムのすすぎを行う前に、システムから排出する。システムのすすぎ液を、ダイアフィルトレーション後の保持液に加え、処方緩衝液を加えて、０．９ｍｇ／ｍＬ〜１．３ｍｇ／ｍＬの範囲の濃縮を達成する。
【０２８０】
原薬処方工程の目的は、最終原薬賦形剤組成物を、０．０５％ＰＳ−８０の最終含量に調整することである。次いで、原薬を最終的に０．２μｍ濾過し、アリコートし、冷凍庫システムで凍結させる。原薬は、さらに処理を行うまで、−７０℃で保存する。
【０２８１】
【表１Ａ】
2021532764.tif 000003
【０２８２】
Ｂ．生成した原薬中のｐ２７の含量
出願人は、発現中に産生された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドプロトマーの特定の割合において、ｐ２７ペプチドの配列が検出されたことを観察した；これは、ｐ２７ペプチドの配列が検出されなかった組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドプロトマー（「Ｆ」）の割合と区別するため、「Ｆ’」と名付けた。理論に拘束されることを望むものではないが、宿主細胞からの組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの発現中、ある割合のフューリン切断部位が、切断されていないままであると考えられる。
【０２８３】
上記の手順に従って、表２に示されるＲＰ−ＨＰＬＣにより決定された以下の割合のＦ（ｐｒｅＦピークともいう）およびＦ’（ｐｒｅＦ’またはｐ２７ともいう）を有する原薬を製造している。
【０２８４】
【表２】
2021532764.tif 000004
【０２８５】
Ｃ．Ｆ’プロトマーを含有する三量体からのＦプロトマーに富む三量体の分離
以前に記載された方法を用いて精製された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓクロマトグラフィー（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ社）を用いて、さらに精製した。ロード材料（ｐＨ７．１、伝導率１．５ｍＳ／ｃｍ）を、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ＩｍｐＲｅｓカラム（９．４ｍＬ  ＨｉＳｃｒｅｅｎ）に適用した。カラムは、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２で先に平衡化されていた。カラムを平衡化緩衝液で洗浄した後、２０カラム体積（画分サイズ３ｍＬ）での０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ勾配、２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１Ｍのクエン酸ナトリウムで、溶出を行った。画分を、クーマシー染色によるＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルおよびＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。画分を、それらのＲＰ−ＨＰＬＣ純度およびｐ２７ペプチド含量に基づいて、２つのプールにプールした。プール１は、ＲＰ−ＵＰＬＣによる約１００％の主ピークを有する画分からなっていた。プール２は、約３３％のｐ２７（Ｆ’プロトマー）および６７％の主ピークを有する画分からなっていた。したがって、以下の２つの集団が、同定および単離された：約１００％の主ピーク（Ｆプロトマー）を含有する三量体ならびに約３３％のｐ２７ペプチド（Ｆ’プロトマー）および６７％の主ピーク（Ｆプロトマー）を有する別の三量体。
【０２８６】
実施例３
Ａ．宿主細胞タンパク質のプロファイリングおよびＧＲＰ７８の定量化
上記の方法によって製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、表示濃度に基づいてＤＴＴにより還元し、イソアセトアミドによりアルキル化し、トリプシンにより３７℃で一晩消化した。次いで、消化物を酸性化し、データ依存収集モード下で動作するＴｈｅｒｍｏ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｏｒｂｉｔｒａｐを用いて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。生データからのピーク一覧を、Ｍａｓｃｏｔ検索エンジンを使用して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド配列ならびに総ての公知のおよび予測されたＣＨＯタンパク質の配列を含むタンパク質データベースに対して検索した。１つの宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のみが検出され、それはＧＲＰ７８（７８ｋＤａグルコース調節タンパク質）であり、公知のＨＣＰである。
【０２８７】
ＧＲＰ７８の標的定量化も、同位体希釈質量分析法により行った。調製物の宿主細胞タンパク質含量も、ＥＬＩＳＡ、例えば、Ｃｙｇｎｕｓ  ＣＨＯ  ｈｃｐ  ＥＬＩＳＡにより決定した。結果は、本明細書における方法に従って製造された材料中のＧＲＰ７８含量は、０．０１３％であったことを示した。
【０２８８】
Ｂ．凝集
社内で開発したサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）アッセイを用いて、上記の方法によって製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの凝集レベルを評価した。ＳＥＣは、タンパク質をサイズ別に分離する。低分子量種、主ピーク、および高分子量種の％分布を、表３に示す。
【０２８９】
【表３】
2021532764.tif 000005
【０２９０】
Ｃ．Ｎ５００部位の占有率
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、３個のＡｓｎ残基（Ｎ２７、Ｎ７０、およびＮ５００。アミノ酸のナンバリングは、全長ＲＳＶ  Ｆ前駆体に基づく）上のＮ−グリカンによって修飾される。Ｎ５００部位は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの集団の画分において非グリコシル化されてもよい。非グリコシル化Ｎ５００のレベルを決定するために、上記の方法によって製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのトリプシンペプチドを、ＰＮＧａｓｅ  Ｆ処理の前後にＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析し、そこから、Ｋ．Ｉ５００ＮＱＳＬＡＦＩＲ．Ｋ（配列番号４）（非グリコシル化Ｎ５００を表す）およびＫ．Ｉ５００ＤＱＳＬＡＦＩＲ．Ｋ（配列番号５）（グリカンがＰＮＧａｓｅ  Ｆにより除去されたＮ５００を表す）の強度を比較した。結果は、それが約７．２％の不完全なグリコシル化を含むことを示している。
【０２９１】
Ｄ．
１．一次配列の完全性および翻訳後修飾
上記の方法によって製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのインタクト分子量を、Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−Ｓ  ＱＴＯＦ質量分析計でのＬＣ−ＭＳにより分析した。スペクトル逆重畳後、主な種の分子量は、６１，２２６  Ｄａであると決定された。同じ材料を、ＰＮＧａｓｅ  Ｆにより脱−Ｎ−グリコシル化し、次いで、同様に分析した。分子量は５４，１６２Ｄａと決定され、これは、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの一次配列から算出された理論的質量と極めて一致していた。これらの結果は、１）一次配列は予想通りである；および２）予想外の翻訳後修飾（グリコシル化以外）はみられない、という結論を支持している。
【０２９２】
２．ＦＦＦ’三量体およびＦ’プロトマーの含量
次いで、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。図８に示されるように、Ｆ’は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド材料において容易に検出可能であった。ＦＦＦ三量体およびＦ’含有三量体を分離するＷＣＸ−ＬＣも使用した。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、ベースライン時に２つのピーク（Ｆプロトマーのみを含む三量体および少なくとも１つのＦ’プロトマーを含む三量体）に分離した。
【０２９３】
Ｅ．グリカンプロファイル
グリカンのプロファイリングを行った。最初に、上記の方法によって製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドからＮ−グリカンを切断し、次いで、還元的アミノ化を通じて２−ＡＢで標識し、親水性相互作用液体クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）によって分離し、ＦＬＲおよびＭＳ検出器によって検出／定量化した。グリカンの構造（模式的な形態）およびグリカン種の相対的存在量を、図４に示す。予想通り、上記の方法によって製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドにおいて認められたグリカン分子の７５％超が、３つの主なグリカン種、すなわち、ジシアル化／フコシル化二分岐グリカン、モノシアル化／フコシル化二分岐グリカン、および非シアル化／フコシル化二分岐グリカンで表された。この材料におけるグリカンの大部分は、シアル化グリカンである。
【０２９４】
Ｆ．部位Ｏおよび部位Ｖエピトープの完全性
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、特定の保存条件下で不安定であり、部位Ｏおよび部位Ｖにおける抗体結合の測定可能な低減（Ｆａｂ抗体シフトアッセイによる）をもたらす自発的なコンフォメーション変化を受け、そのコンフォメーション変化は、緩衝液中での保存中に経時的に、ＲＳＶＰｒｅＦ３｛用語「ＤＳ−Ｃａｖ１」を用いて最初に同定されたが、本明細書では、McLellan et. al. Science (2013) vol. 342 p. 592、ＷＯ２０１４１６０４６３、およびＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３０４９４８８に開示の通りに製造された材料と区別するために、ＲＳＶＰｒｅＦ３と再度名付けた｝の割合の増加に影響を及ぼすことが観察された。
【０２９５】
Ｆａｂシフトアッセイは、部位Ｏおよび部位Ｖの完全性を評価するために開発された。このアッセイは、サイズ排除クロマトグラフィー−液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＬＣ）を用いて、それぞれ部位Ｏおよび部位Ｖに特異的に結合するＦａｂと予めインキュベートされている組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを分離する。Ｆａｂ結合組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、より大きな分子サイズを有することになり、このため、ＳＥＣカラムからより早く溶出し、したがって、非結合組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドから分離する。結果を表４に示す（アッセイにおいてシフトしていないパーセンテージ）。
【０２９６】
【表４】
2021532764.tif 000006
【０２９７】
Ｇ．等電点（ｐＩ）
上記の方法に従って製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、シアル化Ｎ−グリカンを含有する。等電点ゲル電気泳動を用いて、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド中の異なる電荷種を分離した。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのｐＩは、約５．３〜６．０の間であった。
【０２９８】
Ｈ．沈降速度
走査型紫外可視光学システムを備えたＯｐｔｉｍａ  ＸＬ−Ａ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ社、フラートン、カリフォルニア州）分析用超遠心機を用いて、沈降速度分析用超遠心分離（ＳＶ−ＡＵＣ）実験を行った。総ての実験は、２８０ｎｍでの検出で、３０，０００ＲＰＭのローター速度で、ＡＵＣが温度に達した後の平衡化の１時間後に、１０℃で行った。１２ｍｍセンターピースおよび石英窓を有するチャコール−エポンダブルセクターセルに、サンプルおよび参照をロードした。データは、Ｓｅｄｆｉｔ（Ｐｅｔｅｒ  Ｓｃｈｕｃｋ氏、ＮＩＨの好意）を用いて分析した。上記の方法を用いて製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドに対して、アミノ酸配列に基づいてＳｅｄｎｔｅｒｐを用いて部分的な特定の容量０．７４ｍＬ／ｇを算出し、分析に使用した。分析に用いた緩衝液の密度および粘度も、緩衝液組成物に基づいてＳｅｄｎｔｅｒｐソフトウェアを用いて算出した。３００回のスキャンで、連続的なｃ（ｓ）分布を使用した。この範囲外に沈降するシグナルがないことを確認した後、分布あたり３００点の分解能および０．９５の信頼水準で、０〜１５  スヴェドベリ（Ｓｖｅｄｂｅｒｇｓ）の範囲を使用した。ベースライン、放射状非依存性ノイズ、および時間非依存性ノイズは適合したが、メニスカスおよび底部の位置は、手動で設定した。最も適合する摩擦比を、分析において使用した。
【０２９９】
主ピークは、約１７８ｋＤａの分子量を有する中等度〜高度に伸長した種と一致している。注目すべき点は、高度の非対称性が認められたことである。結晶構造において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、長軸と短軸との間にはわずかな差しかないおよそ扁長楕円体であるようである。約２の摩擦比を有する種は、長軸および短軸が６９．１および２．５ｎｍの扁長楕円体または長軸および短軸が２６．６ｎｍおよび０．６ｎｍの扁平楕円体のいずれかとしてモデル化することができる。
【０３００】
Ｉ．要約
上記の方法に従って製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの物理化学的試験では、少なくとも９９．９％純粋な組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（ｗ／ｗ）が製造されることが認められている。さらに、上記の方法に従って製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのグリコシル化プロファイルは、標準的な方法に従って製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドにおける７つ以上と比較して、３つの主要なグリカンピークで表されるシアル化グリカンの７５％超を示している。上記の方法に従って製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのｐＩは、７．８未満のｐＩを有し、最適なＣＨＯ細胞条件を示している（ｐＩの差は、グリコシル化プロファイルの反映である可能性が高い）。上記の方法に従って製造された凝集レベルは、標準的な方法に従って調製された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドよりも低い。Ｆａｂシフトアッセイにより測定された部位Ｏおよび部位Ｖ結合は、両方とも、液体での保存中に経時的に減少する。さらに、上記で言及した方法は、発表されている組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド組成物よりも低いＨＣＰ含量をもたらす。
【０３０１】
実施例４  −  部位Ｏおよび部位Ｖ結合試験
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、中和抗体によって標的とされる準安定な抗原部位Ｏを有する。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを５℃の液体製剤中で保存した場合、部位Ｏ抗体結合の段階的な喪失が認められた。McLellan et al. (2013) "Structure-Based Design of a Fusion Glycoprotein for Respiratory Syncytial Virus," Science, 342: 592-598。著者らは、重なった結晶構造から、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのヘプタッドリピートＡ（ＨＲＡ）領域における著しい運動および障害が、損なわれた部位Ｏを伴う第２の融合前コンフォメーションをもたらし得ると仮定し、ＨＲＡ領域の二次構造部分を接続するループを安定化する変異が、５℃での長期保存中に部位Ｏを維持することが提唱された。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのＮ６７ＩおよびＳ２１５Ｐ修飾は、５℃で保存した６０日間にわたり、部位Ｏ結合抗体結合の喪失はないことを示した。Krarup et al (2015), "A highly stable prefusion RSVF vaccine derived from structural analysis of the fusion mechanism," Nat Commun, 6:8143。別の研究は、４℃で保存された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド安定性材料において同じ現象を観察し、さらに、部位Ｏの障害は、より露出した部位Ｉエピトープと同様であったことを示した。Flynn (2016) "Stability Characterization of a Vaccine Antigen Based on the Respiratory Syncytial Virus Fusion Protein," Plos One, 10:1-18。本出願人は、部位Ｏ結合の喪失に関係付けられるドメインは、部位Ｖと重複しており、その後、部位Ｖ抗体結合にも影響を及ぼしたことを観察している。
【０３０２】
分析技法および生物物理学的技法の組合せを用いて、部位Ｏ抗体結合喪失の原因をさらに探索した。タンパク質一次配列の改変および凝集が、部位Ｏ抗体結合喪失に寄与することは認められなかった。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、液体溶液中での長期保存後、２つの別々のコンフォメーションに存在するようであった。データを考慮すると、部位Ｏエピトープ自体よりも部位Ｏに近いドメインにおける限局したコンフォメーション変化が、可能性が高いと考えられた。データは、タンパク質安定化試薬は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、液体製剤における部位Ｏ抗体結合効率の喪失から保護しなかったことを示したが、凍結乾燥製剤は保護された。
【０３０３】
Ａ．材料と方法
本試験に用いたタグの付いていない組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドおよび融合後ＲＳＶ−Ｆ材料を、ＣＨＯ細胞において発現させ、広範なカラム分画により細胞培養上清から精製し、中性ｐＨの低レベルの界面活性剤および二糖を有するリン酸緩衝液中で約１ｍｇ／ｍＬにて処方した。総ての他の試薬は、特に断りのない限り、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社にて購入した。
【０３０４】
１．サイズ排除クロマトグラフィーおよびＦａｂシフトアッセイ
１００ｍＭのリン酸ナトリウム、５０ｍＭの塩化ナトリウム緩衝液、ｐＨ７を用いたアイソクラティックモードでのＷａｔｅｒｓ  Ａｃｑｕｉｔｙ  ＵＰＬＣシステムランにてＡｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  ＳＥＣカラム（４．６ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７μｍ）を用いて、サイズ排除クロマトグラフィー液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＬＣ）を行った。流速は０．２ｍｌ／分であり、検出は、２１５ｎｍおよび２８０ｎｍでのＵＶにより行った。Ｆａｂシフトアッセイでは、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを最初に混合し、部位Ｏ結合抗体または部位Ｖ結合抗体Ｆａｂとともに、３７℃でおよそ１時間インキュベートした。次いで、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド、それぞれのＦａｂ、および反応混合物を、ＳＥＣ−ＬＣにより各々測定し、それぞれ遊離組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（シフト不可能な画分）、遊離Ｆａｂおよび組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド／Ｆａｂ複合体（シフトした画分）の保持時間を確立した。クロマトグラムをＥｍｐｏｗｅｒ  ３ソフトウェアを用いて積分し、ピーク面積を相対的定量化に使用した。
【０３０５】
２．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストポリアクリルアミドゲルを用いて、ゲル電気泳動を行った。ＤＴＴを含有するＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプル緩衝液と混合したおよそ１０μｇのサンプルを、最初に７０℃で加熱し、各ウェルにロードし、次いで、２００Ｖで４５分間泳動した。泳動の後、ゲルをクマシーブルーにより染色し、メタノール／水／酢酸溶液で脱染し、次いで、ＢｉｏＲａｄ  ＣｈｅｍｉＤｏｃイメージングシステムで可視化した。
【０３０６】
３．ペプチドマッピング
塩化グアニジニウムで変性された上記に開示された方法に従って製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを、５０ｍＭの重炭酸アンモニウムに緩衝液交換し、５６℃でＤＴＴにより還元し、暗所において室温でヨードアセトアミドによりアルキル化した。トリプシンを、１０：１の酵素基質比で加え、３７℃で一晩インキュベートした。消化物を、ギ酸により酸性化し、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（２．１ｍｍ×１５０ｍｍ、１．７μｍ）に注入し、０．１％ギ酸中アセトニトリルの増加勾配により分離し、検出のためにＷａｔｅｒｓ  Ｘｅｖｏ  Ｇ２−Ｓ  ＱＴＯＦ質量分析計にエレクトロスプレーした。
【０３０７】
４．示差走査蛍光定量法（ＤＳＦ）
ＰｒｏｍｅｔｈｅｕｓナノＤＳＦ機器（ＮａｎｏＴｅｍｐｅｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，  Ｉｎｃ．、ミュンヘン、ドイツ）を用いて、ＤＳＦを行った。１ｍｇ／ｍＬ（約５．５μＭ）の各試験サンプル１０μＬを、細いキャピラリーに加え、機器にロードした。温度傾斜を１℃／分で、２０℃から１１０℃として測定をおこなった。ナノＤＳＦ機器は、内在蛍光法を利用して、温度の関数として３３０ｎｍおよび３５０ｎｍの波長におけるチロシンおよびトリプトファンの蛍光の変化をモニタリングする。タンパク質のアンフォールディングの開始および全体的な融解温度をより正確に決定するために、一次導関数のトレースも生データから引き出している。
【０３０８】
５．円偏光二色性（ＣＤ）
ＣＤ実験を、室温でＣｈｉｒａＳｃａｎ  Ｑ１００分光計（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｐｈｏｔｏｐｈｙｓｉｃｓ，  Ｉｎｃ．、ビバリー、マサチューセッツ州）にて行った。近紫外ＣＤ（２５０〜３４０ｎｍ）データを、石英キュベット（１ｃｍ路長）中のバンド幅１ｎｍの、６０ｎｍ／分での１ｍｇ／ｍＬサンプルに対して収集した。収集したスペクトルを、緩衝液でベースライン補正し、曲線下絶対面積を用いて正規化した。全データを３回収集し、各保存時点の平均を、統計解析を用いて、類似性に関して比較した（データ示さず）。
【０３０９】
６．水素−重水素交換質量分析（ＨＤＸ−ＭＳ）
Ｘｅｖｏ  Ｇ２−Ｓ  ＱＴＯＦ質量分析計に連結されたＬＥＡＰシステムを有するＷａｔｅｒｓ  ＨＤＸマネージャにて、ＨＤＸ−ＭＳ分析を行った。総ての試験材料は、３重反復して分析した。各試験材料を、Ｈ２ＯまたはＤ２Ｏ中１０ｍＭのリン酸カリウムにより、２０倍希釈し、０、０．５、５、１０、３０、および２４０分の時間経過においてインキュベートした。１Ｍの塩酸グアニジン、０．２５ＭのＴｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィン塩酸塩（ＴＣＥＰ）、ｐＨ２．５を等容量加えることにより、交換を０℃で抑制した（ｑｕｅｎｃｈｅｄ）。サンプルを、２０℃でペプシンカラム（Ｗａｔｅｒｓ社）にて直ちに消化した。ペプチドを濃縮し、Ｗａｔｅｒｓ  Ｖａｎｇｕａｒｄプレカラム（２．１×５０ｍｍ）を用いて緩衝液交換し、Ａｃｑｕｉｔｙ  ＢＥＨ  Ｃ１８カラム（１．７μｍ、１．０×１００ｍｍ、Ｗａｔｅｒｓ社）にて０℃で分離し、次いで、ＭＳにおいて分析した。データ解析は、ＰｒｏｔｅｉｎＬｙｎｘ  Ｇｌｏｂａｌ  Ｓｅｒｖｅｒ（ＰＬＧＳ）およびＤｙｎａｍＸソフトウェア（バージョン３．０．０）を用いて行った。
【０３１０】
７．相同性モデル
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｏｐｅｒａｔｉｎｇ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔモデリングプログラムでの２つの異なる結晶構造テンプレート（ｐｄｂｓ：４ｍｍｖおよび４ｊｈｗ）を使用することにより、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドに結合した部位Ｏ結合抗体の相同性モデルを作製した。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド配列を、鋳型配列として使用した。４ｍｍｕ領域におけるフォルドン領域が障害されており、部位Ｏ結合抗体Ｆａｂは、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド構造のいずれにも存在していないことから、２つの結晶構造について実行した。部位Ｖ結合抗体結合／エピトープ部位ＩＩ結合抗体結合組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（部位ＩＩ抗体は、融合前および融合後ＲＳＶ−Ｆに結合する）に関しても、４ｍｍｖおよび４ｚｙｋ結晶構造を用いたＭＯＥにより、相同性モデルを作製した。２つの最終的な相同性モデルの各々に関して、１０個の個々のモデルを作製し、最低エネルギーモデルを、各個々のシステムに対する相同性モデルの最終的な表現として選択した。最終的な相同性モデルを、制約に縛られたＡＭＢＥＲ１０：ＥＨＴ  Ｆｏｒｃｅｆｉｅｌｄで最小化した。
【０３１１】
Ｂ．結果
１．組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、液体製剤中で部位Ｏ結合抗体結合を喪失するが、凍結乾燥製剤中では喪失しない
ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲなどのイムノアッセイ実験の補完として、Ｆａｂシフトアッセイを、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドとその対応する抗体との結合を評価するための別方向の方法として実行した。Ｆａｂおよび組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを３７℃で１時間一緒にインキュベーションした後、次いで、混合サンプルを、非変性条件下で実行したサイズ排除クロマトグラフィーにより分離した。Ｆａｂ結合組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド三量体は、より早く溶出するため、分子量および流体力学的サイズの増加（３個のＦａｂが結合する場合の約３３０ｋＤａに対して、非結合組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド三量体では約１８３ｋＤａ）に起因して、その保持時間は、クロマトグラムの左側にシフトする。シフトした種およびシフトしていない種のピーク面積を比較することにより、部位Ｏ結合抗体結合を喪失している組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのパーセンテージを推定することができる。３ヵ月安定性サンプルの組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド＋部位Ｏ結合抗体Ｆａｂシフトクロマトグラムを、図５に示す。遊離組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド三量体は、およそ９．２分で溶出し、一方、部位Ｏ結合抗体結合組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、８．２分というより短い保持時間にシフトした。このシフトしたピークの非対称性は、おそらく、Ｆａｂの不均一性に起因するものであり、Ｆａｂの１１．２分における溶出ピークも、非対称性を示した。図５Ａに挿入した表に示されるように、この特定の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド材料は、８６％のシフト可能な画分を有しており、総て５℃で液体製剤中において保存した１ヵ月、３ヵ月、および７ヵ月安定性材料において、パーセンテージは、７６％、６９％、および５８％へと段階的に減少した。この観察所見は、多数の以前に報告された結果と一致していた。タンパク質安定化賦形剤を使用するという以前の示唆に反し、本試験で関与した液体製剤は、二糖および非イオン性界面活性剤のレベルを含有していたが、部位Ｏ結合抗体結合の喪失を防ぐことはできなかった。液体製剤と対照的に、同じ製剤賦形剤を有する凍結乾燥組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドでは、４０℃で２週間維持したサンプル（図５Ｂ）および５℃で最大６ヵ月維持したサンプル（図５Ｃ）には、部位Ｏ結合抗体結合喪失は認められなかった。このことは、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、凍結乾燥に適することを確認するものであり、開示される方法に従って製造された組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドおよび他の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドＲＳＶワクチンの有効期間を延長するために、凍結乾燥製剤が好ましい可能性が示唆された。
【０３１２】
２．一次配列の完全性および凝集は、部位Ｏ結合抗体結合喪失の原因ではない
タンパク質クリッピングが生じたかどうかを決定するために、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル泳動を行い、新鮮標準および３ヵ月５℃安定性材料を比較した。成熟組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、分子内ジスルフィド結合によりともに連結されたＦ１およびＦ２ポリペプチドを含む二本鎖分子である。図６Ａに示されるように、還元組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、２つの主バンドとしてゲル上を移動した。約４５ｋＤａの高分子量バンドは、Ｆ１ポリペプチドであり；約１０ｋＤａの低分子量バンドは、Ｆ２ポリペプチドであり；Ｆ１の上の微小バンドは、異なるＦ１グリコフォームであった。全体的に、ゲルバンドパターンは、新鮮標準と３ヵ月安定性材料との間で非常に類似しており、３ヵ月材料における部位Ｏ結合抗体結合喪失（図５Ａ）は、タンパク質クリッピング事象に起因するものではなかったことが示唆された。
【０３１３】
タンパク質凝集が因子であったかどうかを検討するために、新鮮材料、１ヵ月材料、３ヵ月材料、および７ヵ月材料をＳＥＣ−ＬＣにより比較し、結果は、総ての材料において非常に類似した低レベルの高分子量種を示し（データ示さず）、タンパク質凝集は、部位Ｏ結合抗体結合の喪失における因子ではなかったことが示された（挿入パネル、図５Ａ）。
【０３１４】
さらに、９６％超の配列包括度で、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによるペプチドマッピングも行った。図６Ｂに示されるように、新鮮標準および３ヵ月材料は、全く同じペプチドフィンガープリントを有し、化学修飾、例えば、酸化、脱アミノ化、およびジスルフィド結合スクランブリングも、部位Ｏ結合抗体結合の喪失の原因ではなかったことが示唆された。
【０３１５】
３．より高次の構造変化は、部位Ｏ結合抗体結合の喪失と関連する
３．１．円偏光二色性
２５０〜３４０ｎｍの波長での近紫外ＣＤにより、三次構造を検討した。陽性対照としての融合後ＲＳＶ−Ｆは、融合前組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドと大幅に異なるスペクトルを示した（データ示さず）。新鮮標準および１、３、７ヵ月安定性材料は、視覚的に類似したスペクトルを示し、より洗練された統計学的アプローチを用いた分析の後の差を示した。高次構造比較法における現在の傾向は、重み付きスペクトル差（ＷＳＤ）分析を使用することである。Ｔｉｅｒ２統計解析によれば、異なるスペクトルからのＷＳＤ値の総てが、基本比較サンプルの平均の−２σ／＋２σを超えている場合、２つのスペクトルは、統計学的差があるとみなされる。新鮮標準組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド材料の平均ＷＳＤおよび−２σ／＋２σ値は、それぞれ０．０００２２２および０．０００１４８／０．０００２９７であった。１、３、および７ヵ月安定性材料総てに関する総てのＷＳＤ測定値は、新鮮標準組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの−２σ／＋２σ範囲外であった（データ示さず）。さらに、ＷＳＤ値の差は経時的に増加し、ランダムシフトではなく、より高次の構造におけるシフトは、融合後コンフォメーションに向かう１つの方向であったことが示唆された（データ示さず）。
【０３１６】
３．２．示差走査蛍光定量法
新鮮標準材料と安定性組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド材料との間のより高次の構造で検出された差は、視覚的に小さいようであり、これは、限局した小さなコンフォメーション変化に対する近紫外ＣＤの非感受性に起因する可能性があった。コンフォメーション変化をさらに特徴付け、確認するために、開始融解温度（Ｔｏｎｓｅｔ）および融解温度（Ｔｍ）を決定することによって、タンパク質の熱安定性を測定する、ナノ示差走査蛍光定量（ＤＳＦ）機器を用いて、材料の分析および比較を行った。Ｔｏｎｓｅｔは、タンパク質がアンフォールディングを開始する温度であり、Ｔｍは、タンパク質が５０％アンフォールディングされる温度である。より高い構造安定性は、Ｔｍの増加と相関する。ナノＤＳＦは、温度の増加とともにタンパク質がアンフォールディングされる際に生じる内在性のチロシンおよびトリプトファンの蛍光の変化を検出および記録する。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、４個のトリプトファンおよび２０個のチロシンを含有し、それらは、一次配列上の異なる領域および三次元構造上の別々のドメインにおいて十分に広がっている。タンパク質がアンフォールディングされると、埋もれていたトリプトファン残基およびチロシン残基が、水性環境へより曝露される。これに応じて、チロシンおよびトリプトファンの内在蛍光が減少し、その発光ピークは、３３０ｎｍ（埋没環境における場合）から３５０ｎｍ（水性環境における場合）へとシフトする。このため、３５０ｎｍおよび３３０ｎｍにおいて記録される比蛍光シグナルは、タンパク質アンフォールディング事象の開始時に増加し始める。融解温度は、３５０／３３０ｎｍ曲線の中間点であるため、アンフォールディング事象の開始および融解温度を決定するために、記録されたデータの一次導関数を算出した。
【０３１７】
約５．５μＭの濃度の新鮮標準、１ヵ月、３ヵ月、７ヵ月の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドおよび融合後ＲＳＶ−Ｆを、ナノＤＳＦにより分析した。新鮮標準組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、低いＴｏｎｓｅｔおよび複数のピークを有する幅広い融解曲線を示し、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは「柔軟な」構造を有すること、および複数のアンフォールディング事象が関与することが示唆された。最も強い遷移の頂点として記録されたＴｍは、７２．２℃であった。対照的に、融合後ＲＳＶ−Ｆは、高いＴｏｎｓｅｔ、および９２．５℃のＴｍを有する別個の単一事象アンフォールディング曲線を示し、融合後ＲＳＶ−Ｆは、「剛性」でより安定した構造を有することが示唆された。興味深いことに、安定性材料に関しては、Ｔｏｎｓｅｔは大きく変化しないままであったが、融解曲線は、経時的により高い温度にシフトした。約７９．１℃のより高いＴｍを有する新たな遷移が出現し始めた。この遷移の大きさは、５℃において、より長い時間をかけて強まった。同時に、７２．２℃における主要な組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの遷移の大きさは減少した。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド安定性材料の融解曲線は、融合後の方向にシフトしたが、７９．１℃より高い遷移は一度も得られなかった。９２．５℃における融合後ＲＳＶ−Ｆの特徴的な急な遷移は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド安定性サンプルにおいて依然として存在しなかった（データ示さず）。まとめると、これらのデータは、５℃の液体製剤において、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、融合前コンフォメーションよりも相対的に安定であるが、融合後コンフォメーションよりも安定ではない新たなコンフォメーションをとったことを示唆した。新たなコンフォメーションは、融合後の状態にさらに遷移できなかった。
【０３１８】
新たなコンフォメーションの獲得が、部位Ｏ結合抗体結合喪失およびＦａｂシフトアッセイにおけるシフト不可能な画分の増加の原因であったかどうかの検討を行った。ＳＥＣ−ＬＣでの部位Ｏ結合抗体Ｆａｂのシフト不可能な画分ピークを回収し、新鮮標準組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドと同じ製剤に緩衝液交換し、同じ濃度に希釈し、ナノＤＳＦにより同様に分析した。シフト不可能な画分は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド安定性材料が獲得した新たなコンフォメーションと同じＴｏｎｓｅｔおよびＴｍを示し、新鮮標準組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドにおいて認められた７２．２℃の遷移を完全に喪失していた。さらに、部位Ｏ結合抗体のシフトした画分も回収および分析した結果、７９．１℃の遷移の完全な欠如を示した（データ示さず）。まとめると、ＤＳＦデータは、融合前コンフォメーションおよび融合後コンフォメーションの両方と明確に異なる、液体コンフォメーションにおいて組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドが経時的に獲得した新たなコンフォメーションは、部位Ｏ結合抗体結合喪失の根本原因であったこと、ならびに、液体組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド安定性材料において、一方は新たなコンフォメーションをとり、他方は最初の融合前コンフォメーションを保持しているという、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの２つの集団が存在していたことを示唆した。
【０３１９】
３．３．ＨＤＸ−ＭＳ
近紫外ＣＤ法およびナノＤＳＦ法は、全体的なコンフォメーション変化を検出することしかできなかった。３Ｄ構造におけるコンフォメーション変化の正確な１つまたは複数の位置をさらに特定するため、ＨＤＸ−ＭＳにより、新鮮標準および１ヵ月、７ヵ月安定性材料の比較を行った。ＨＤＸ−ＭＳは、溶液中の重水素とのアミド骨格の水素の交換率を測定することにより、溶媒の到達性および／またはタンパク質構造上の特定のドメインの水素結合を探索するものである。この試験において、各サンプルからの計２４９個のペプシン消化ペプチドが、９６．９％の配列包括度を表した。有意な逆交換は認められなかった。有意性の閾値は、各時点において０．２Ｄａに設定した。このため、ペプチドあたり１．２Ｄａを超えるΔ質量（Δｍａｓｓ）のみを、真の差とみなした。ほとんどのペプチドが、試験した３つの材料における重水素化取り込みにおいて差を示さなかったか、または、その差が有意なレベル未満であった。唯一検出された差は、アミノ酸残基１４７〜１６３においてであり、新鮮標準と安定性材料との間のそのような差の大きさは、５℃の液体中でより長時間で増加した。アミノ酸残基１４７〜１６３は、部位Ｏエピトープに直近するβ３−β４ヘアピンβループモチーフ内に存在する。さらに興味深いことに、大部分の部位Ｏエピトープ自体を構成していた５個のペプシン消化ペプチドは、重水素取り込みの差を全く示さなかった。まとめると、ＨＤＸ−ＭＳの結果は、部位Ｏ結合抗体結合の喪失の背景にあるコンフォメーション変化は、溶媒の到達性または部位Ｏ自体における水素結合パターンに影響を及ぼさなかったが；その代わりに、部位Ｏに至るアミノ酸残基１４２〜１６３が、より溶媒曝露となるか、またはさらに水素結合能を失う場合、立体障害が生じている可能性があり、部位Ｏへの部位Ｏ結合抗体Ｆａｂのドッキングと干渉する可能性があることを示唆した。この結果は、このヘアピンドメインを安定化するために、この短配列内への１つまたは複数の変異の導入は、ワクチン抗原としての組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの力価を維持する助けとなる可能性があることを暗示した。
【０３２０】
３．４．コンフォメーション変化は限局している
小さなひと続きのペプチドのみが、重水素取り込みの差を示すことが認められたＨＤＸ−ＭＳ実験は、部位Ｏ結合抗体結合喪失の背景にあるコンフォメーション変化が、全体的な構造変化というよりも局所的であったことをさらに示唆した。５℃の液体製剤中での長期保存が、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドと２つの他のＲＳＶ−Ｆ抗体、すなわち、部位Ｖ結合抗体および部位ＩＩ結合抗体との間の結合に影響を及ぼすかどうかについて、検討を行った。部位Ｖ結合抗体は、融合前ＲＳＶ−Ｆの三量体型にのみ存在する四次エピトープ部位Ｖを認識する強力な中和抗体である。部位ＩＩ結合抗体は、融合前および融合後両方のＲＳＶ−Ｆに存在するエピトープ部位ＩＩを認識する。部位Ｖおよび部位ＩＩは、部位Ｏエピトープから同程度に離れているが、部位Ｖエピトープは、β３−β４モチーフと大きく重複しており（示さず）、一方、部位ＩＩエピトープは重複していない（示さず）。部位Ｖ結合抗体および部位ＩＩ結合抗体Ｆａｂを用いたＦａｂシフトアッセイは、５℃の液体中での長期保存は、部位Ｏ結合抗体の場合と類似した割合の部位Ｖ結合抗体結合喪失をもたらしたが、部位ＩＩ結合抗体結合は影響を受けないままであったことを明らかに示した（示さず）。これらのデータは、コンフォメーション変化は、β３−β４領域の付近で生じたというさらなる証拠を提供した。さらに、これらのデータは、液体製剤中での保存を通じて組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドがとった新たなコンフォメーションは、全体的な構造変化というよりもわずかに限局したものである結果であったことを支持した。
【０３２１】
実施例６  −  液体クロマトグラフィーによるｐｒｅＦ’およびｐｒｅＦの分析的分離
Ｆ’およびＦプロトマーの分析的分離には、２つのアプローチがある。１つ目は、変性条件下での逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）であり、その間、三量体は、ＦおよびＦ’プロトマーに変性され、次いで、プロトマーは、それらの疎水性の差に基づいて分離される；２つ目は、自然条件下での弱陽イオン交換液体クロマトグラフィー（ＷＣＸ−ＬＣ）であり、その間、三量体コンフォメーション（ＦＦＦまたはＦＦＦ’）は維持され、次いで、それらの内因性変化の差に基づいて分離される。
【０３２２】
ＲＰ−ＨＰＬＣによるＦ’およびＦプロトマーの分析的分離
部分的に精製されたおよび精製された原薬および凍結乾燥製剤（組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体）を、逆相（ＲＰ）高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）法を用いることにより分析し、さらに超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）法について最適化した。ＲＰ  ＨＰＬＣおよびＲＰ  ＵＰＬＣの目的は、原薬の濃度および純度を定量的に決定することである。Ｆ’およびＦの２つのピークを、ＲＰカラムでのそれらの疎水性の差に基づいて分離した。ｐ２７ペプチドは、Ｆ’を低疎水性にする親水性Ｎ結合型グリカンによって、広範にグリコシル化される。このため、Ｆ’は、Ｃ１８ベースの逆相カラムでより早く溶出し得る。図９に示される２つのピーク（ピーク番号４および５と命名）を回収し、トリプシンにより消化し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより分析し、その結果、ピーク番号４においてｐ２７ペプチド配列に由来するトリプシンペプチドの存在が示されたが、ピーク番号５においては認められなかった。この結果により、ピーク番号４がＦ’、ピーク番号５がＦであることが明確に確認された。これらのピークの定量化に使用したＲＰ−ＨＰＬＣ法およびＲＰ−ＵＰＬＣ法を、表５に要約する。
【０３２３】
【表５】
2021532764.tif 000007
【０３２４】
両方の方法において、特異性、直線性、再現性、正確度、定量限界、および検出限界に関して徹底的に評価した。原薬の複数のロットを分析したところ、１２％〜１６％の範囲のＦ’が示された。ＨＰＬＣ法およびＵＰＬＣ法から得られた原薬の代表的なクロマトグラムを、図９および図１０に示す。
【０３２５】
ＷＣＸ−ＬＣによるＦＦＦおよびＦＦＦ’三量体の分析的分離
逆相液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの既存の分析法は、Ｆ’およびＦの量を定量化することができるが、これらの方法は変性条件下で行われ、三量体は共有結合されていないため、Ｆ’を含有した三量体の集団は定量化することができない。ギャップが同定され、また、自然条件下での分子を把握し、三量体型を維持しながら三量体中のＦ’の存在を正確に定量化するために、新たな分析法が必要とされた。
【０３２６】
新たな分析法、弱陽イオン交換液体クロマトグラフィー（ＷＣＸ−ＬＣ）が、三量体を特徴付けるために開発されている。この方法は、異なる形態の三量体（ＦＦＦまたはＦＦＦ’）を分離することができる。ｐ２７ペプチドは、細胞培養プロセス中にフューリンによって切断されない、Ｆ’プロトマーのＦ１プロトマーのＮ末端上の２７アミノ酸残基のペプチドである。ＷＣＸ−ＬＣ法は、少なくとも１つのＦ’を含む三量体、すなわちＦＦＦ’からＦＦＦ三量体をベースライン分離することができる。
【０３２７】
イオン交換クロマトグラフィー分離は、分析物の全体的な表面電荷および非変性条件下に基づいている。弱陽イオン交換法は、ｐ２７ペプチドの存在または非存在に基づいて三量体を分離することが可能であるが、それは、この長さのペプチドは、２つのグリコシル化部位上に９個の正電荷のアミノ酸および４個のシアル酸を有し、ｐ２７ペプチドを欠くプロトマーと比較して、正味の５個の正電荷を与えるｐ２７ペプチドの存在をもたらすからである。
【０３２８】
【表６】
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【０３２９】
ＷＣＸ−ＬＣは、三量体がＣ末端フォルドンドメインにより、ともに三量体型を保持する穏やかな非変性条件を用いて行う。組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体は、上記の実験条件に従って弱陽イオン交換クロマトグラフィーに供した場合、ピーク１およびピーク２として表される２つの別々のベースライン分離ピークに分離される（図１１）。ピーク１の下の面積は、総ピーク面積のおよそ３分の２であり、ピーク２の下の面積は、およそ３分の１である。２つのピークの組成を特徴付けるために、図１２に示されるように、自動フラクションコレクターを用いて、時限画分を回収した。これらの画分を濃縮し、以前の項に記載の通り、ＲＰ−ＨＰＬＣによるさらなる分離に供した。ＲＰ−ＨＰＬＣからの結果は、弱陽イオン交換に由来するピーク１は純粋なＦＦＦ三量体であるが、ピーク２はＦ’含有三量体であることを示した（図１３）。ピーク２上のＦ’の組成はおよそ３分の１であり、Ｆは３分の２であり、ピーク２における三量体は、１つのＦ’および２つのＦプロトマーからなることが示唆された。さらなる証拠は、後の項で考察する。
【０３３０】
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の相同性モデリングは、非修飾ｐ２７ペプチドは、三量体の空隙の内側にちょうど適合することを示唆しており、モデリングは、そのペプチドが、グリコシル化モチーフに結合したグリカンを有する場合は、内側に適合しないことを示唆している（示さず）。以前のグリコシル化プロファイリング実験は、ｐ２７ペプチドの両グリコシル化部位は、シアル化二分岐グリカンで完全に装飾されることを示している。さらに、フューリンを用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ処理は、ｐ２７ペプチドを切断する（示さず）。また、先に説明したように、ｐ２７ペプチドは、その側鎖に５個の正電荷を有する。相同性モデリングは、同じ電荷の反発により、好ましい位置が表面に存在することを示している。さらに、表面電荷により分子を分離するクロマトグラフィー法であるＷＣＸ−ＬＣにおいて、Ｆ’含有三量体は、Ｆ’を有さない三量体から分離される。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの証拠は、ｐ２７ペプチドは、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の表面の外に突出するという結論を支持している。
【０３３１】
ＷＣＸ−ＬＣピーク２は、約２の比でＦおよびＦ’プロトマーを含有するという観察所見に加えて、以下の観察所見は、本明細書において試験した三量体は、１つのＦ’プロトマーを有するという結論を支持するものである。第１に、３Ｄ構造モデリングからのＦＦＦ、ＦＦＦ’、およびＦＦ’Ｆの予測ｐＩは、それぞれ８．４６、８．６６、および８．８４である。ＷＣＸ−ＬＣは、溶出のために直線塩勾配を使用する。よって、ＦＦＦ／ＦＦＦ’とＦＦＦ’／ＦＦ’Ｆ’との間の保持時間の差は、およそ同じになるはずである。ＦＦ’Ｆ’の予測保持時間において、ＷＣＸカラムから溶出する検出可能なピークは存在しない。図１４を参照。ＦＦ’Ｆ’ピークに関する推定上の保持時間（破線の円の中の破線の曲線）を示す。
【０３３２】
さらに検討するため、Ｆ１ポリペプチドに安定して結合したｐ２７ペプチドを有するＲＳＶＰｒｅＦ３｛用語「ＤＳ−Ｃａｖ１」を用いて最初に同定されたが、本明細書では、McLellan et. al. Science (2013) vol. 342 p. 592、ＷＯ２０１４１６０４６３、およびＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３０４９４８８に開示の通りに製造された材料と区別するために、ＲＳＶＰｒｅＦ３と再度名付けた｝の変異型（本明細書において「Ｒ２９５」ともいう）を、弱陽イオン交換クロマトグラフィーにより検討した。Ｒ２９５では、３つの正電荷のアミノ酸が、無電荷のアミノ酸に置換されるように、具体的には、第２のアミノ酸におけるＬｙｓ−＞Ｓｅｒ、第３のアミノ酸におけるＡｒｇ−＞Ｇｌｙ、および第４のアミノ酸におけるＡｒｇ−＞Ｓｅｒとなるように、Ｆ１鎖のＮ末端のフューリン切断部位が変異する。これらの変異はフューリン切断を防止し、Ｒ２９５はＦ’Ｆ’Ｆ’三量体の形態で存在する。Ｒ２９５における１つのＦ’は、ｐ２７ペプチドにおいて２個の正味の正電荷（５−３＝２）を有する。このため、通常のＦＦＦとＲ２９５Ｆ’Ｆ’Ｆ’との間の電荷の差は、６個の正電荷（２×３＝６）である。ＷＣＸ−ＬＣにおいて、Ｒ２９５Ｆ’Ｆ’Ｆ’は、上記の予測されたＦＦＦ’三量体よりも約１／２分遅く溶出する。図１４参照。Ｒ２９５Ｆ’Ｆ’Ｆ’と通常のＦＦＦ’との間の電荷の差は、わずか１個（６−５＝１）であるため、これは、ＷＣＸ−ＬＣ法は、１のみの電荷の差を区別できることを示している。さらに、三量体を含むプロトマーの化学的架橋は、共有結合による三量体コンフォメーションを安定化するために利用された。架橋三量体のＬＣ−ＭＳ分析は、ＦＦ’Ｆ’およびＦ’Ｆ’Ｆ’の質量に対応する質量を検出しなかった（データ示さず）。結論として、本明細書において三量体の集団を試験することによって、ＦＦＦおよびＦＦＦ’のみが観察され、一例では、ＦＦＦ’三量体は、全体の約３６％を表している。
【０３３３】
実施例７  −  ＤＳ−Ｃａｖ１と比較したＲＳＶＰｒｅＦ３
実施例１〜４に記載のものを含む技法を用いて、例示的な組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（以下「ＲＳＶＰｒｅＦ３」）を、McLellan et. al. Science (2013) vol. 342 p. 592、ＷＯ２０１４１６０４６３、およびＣｌｉｎｉｃａｌＴｒｉａｌｓ．ｇｏｖ識別子：ＮＣＴ０３０４９４８８に記載のＤＳ−Ｃａｖ１組成物と比較した。以下の要約は、試験で利用したＲＳＶＰｒｅＦ３およびＤＳ−Ｃａｖ１の概要を提供する。
【０３３４】
１．製剤：
ａ．ＲＳＶＰｒｅＦ３
１．１０ｍＭリン酸カリウム、５％トレハロース、０．０５％ポリソルベート８０、ｐＨ７．０
ｉｉ．状態  −  凍結乾燥
ｂ．ＤＳ−Ｃａｖ１
ｉ．２０ｍＭヒスチジン、１００ｍＭ塩化カリウム、１００  ｍＭアルギニン、２．５％スクロース、ｐＨ６．５
ｉｉ．状態は凍結液体
２．製造：
ａ．ＲＳＶＰｒｅＦ３は、ＤＳ−Ｃａｖ１の製造に使用されるＣＨＯ細胞株と異なるＣＨＯ細胞株を用いて製造される。
ｂ．ＲＳＶＰｒｅＦ３は、本明細書において他所に記載の通りに製造されるが、ＤＳ−Ｃａｖ１は、異なる方法を用いて製造される。
【０３３５】
物理化学的試験
ＳＥ−ＨＰＬＣ。ＳＥ−ＨＰＬＣを用いて、高分子量種（ＨＭＷＳ）を検討し、２つの組成物に関する三量体含量を試験し、以下の結果が得られた：
【０３３６】
【表７】
2021532764.tif 000009
【０３３７】
クロマトグラムを図１５に示す。ＤＳ−Ｃａｖ１は、ＲＳＶＰｒｅＦ３よりも、不均一であるようであり、相対的に高いレベルの凝集体を有し、サイズが小さいようである。
【０３３８】
含量および純度。ＲＰ−ＨＰＬＣを用いて、ＲＳＶＰｒｅＦ３およびＤＳ−Ｃａｖ１組成物の含量および純度を検討した。図１８参照。結果を以下の表に要約する。
【０３３９】
【表８】
2021532764.tif 000010
【０３４０】
【表９】
2021532764.tif 000011
【０３４１】
三量体プロファイル。弱陽イオン交換（ＷＣＸ）を用いて、ＲＳＶＰｒｅＦ３およびＤＳ−Ｃａｖ１のＦＦＦおよびＦＦＦ’集団を検討した。結果を以下の表に要約する。
【０３４２】
【表１０】
2021532764.tif 000012
【０３４３】
注目すべきことに、ＤＳ−Ｃａｖ１は、ＦＦＦとＦＦＦ’との間の保持時間（ＲＴ）を有する単一の比較的広いピークを示している。ＲＴにおけるシフトは、ＤＳ−Ｃａｖ１がより塩基性であることを示唆している。ＤＳ−Ｃａｖ１材料には、ＦＦＦ’は存在しない。ＤＳ−Ｃａｖ１のテールは、ＨＣＰ不純物および材料の不均一な性質におそらく起因する。図１９参照。
【０３４４】
ＡＵＣ。沈降速度を利用して、ＲＳＶＰｒｅＦ３およびＤＳ−Ｃａｖ１組成物の分子量を検討した。図１６参照。２つのＲＳＶＰｒｅＦ３凍結乾燥サンプルを測定し；１つのＲＳＶＰｒｅＦ３液体サンプルを測定し；１つのＤＳ−Ｃａｖ１液体サンプルを測定した。ＲＳＶＰｒｅＦ３は、測定間で比較的一貫した挙動を示し、クロマトグラムピークにショルダーがない単一の種が認められた。ＤＳ−Ｃａｖ１の主ピークは、ＲＳＶＰｒｅＦ３よりも低い分子量にみられ、追加のピークが約３秒において認められた。
【０３４５】
ＨＣＰ。非還元および還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＨＣＰキット（Ｃｙｇｎｕｓ  Ｆ５５０キット、Ｃｙｇｎｕｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，４３３２  Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ  Ｓｕｐｐｌｙ  Ｒｄ．，ＳＥ  Ｓｏｕｔｈｐｏｒｔ，ＮＣ  ２８４６１から入手可能）により、および質量分析を用いて、ＨＣＰ含量を検討した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの所見を、以下の表および図１７Ａに要約する。
【０３４６】
【表１１】
2021532764.tif 000013
【０３４７】
ＨＣＰキットおよびＭＳの所見を、以下の表に要約する。
【０３４８】
【表１２】
2021532764.tif 000014
【０３４９】
ＤＳ−Ｃａｖ１は、さらなる同定されたＨＣＰを含有し、それには、以下のものが挙げられる（存在量の降順）：
・ＧＲＰ７８
・グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ
・フォリスタチン関連タンパク質１
・ホスホグリセリン酸キナーゼ
・伸長因子２
・フルクトース二リン酸アルドラーゼＡ
・ピルビン酸キナーゼＰＫＭ
・ペルオキシレドキシン−１
・アルコールデヒドロゲナーゼ
・ペプチジルプロリルシストランスイソメラーゼＡ
・コラーゲンアルファ−１
・レグマイン（イタリック）
・リソソーム保護タンパク質（イタリック）
・クラステリン（Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ）
・プロスタグランジンレダクターゼ
２つのプロテアーゼ（イタリック）が検出されている。プロテアーゼは、組換え組成物においてクリッピングをもたらすことで知られている。
【０３５０】
不純物。最も一般的なＨＣＰは、ＧＲＰ７８である。ＧＲＰ７８は、標的同位体希釈質量分析法（ＩＤＭＳ）により測定した。ＩＤＭＳは、種々の既知量の安定同位体標識標準ペプチドを試験サンプルに加えることにより、機能する。内部標準（ＧＲＰ７８由来の３個のペプチド）の濃度に対してピーク面積比をプロッティングすることにより、標準曲線を作成した。不明のＧＲＰ７８濃度は、分析物の相対シグナル強度を内部標準と比較することにより、内挿的に算出することができる。
【０３５１】
2021532764.tif 000015
【０３５２】
ＤＳ−Ｃａｖ１材料は、ＲＳＶＰｒｅＦ３と比較して少なくとも１０倍高いＧＲＰ７８含量を有する（以下の表および図１７Ｂ参照）。
【０３５３】
【表１３】
2021532764.tif 000016
【０３５４】
グリコプロファイルおよびインタクト分子量（ＭＷ）。インタクトＭＷを、ＬＣ−ＭＳおよびスペクトル逆重畳により決定し、ＲＳＶＰｒｅＦ３は、６１，２２６ＤａのインタクトＭＷを有し（Ｆ’ではなくＦ）、ＤＳ−Ｃａｖ１は、５９，４６１ＤａのインタクトＭＷを有することが明らかにされた。脱グリコシル化の後、両分子とも、５４，１６２．３Ｄａという同じＭＷを有する（算出された理論ＭＷは５４，１６３Ｄａである）。これは、分子の一次配列の完全性および同一性という結論を支持している。ＤＳ−Ｃａｖ１組成物における小さなＭＷは、ＲＳＶＰｒｅＦ３とのグリカンの差に起因すると考えられる。
【０３５５】
【表１４】
2021532764.tif 000017
【０３５６】
免疫学的試験
部位特異的抗体およびポリクローナル血清から構成されるアッセイを用いて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ相対力価（ＩＶＲＰ）を検討し、以下の結果が得られた：
【０３５７】
【表１５】
2021532764.tif 000018
【０３５８】
Ｆａｂシフト（本明細書において他所に記載のアッセイ）を用いて、部位０または部位Ｖ結合の喪失を検討し、以下の結果が得られた：
【０３５９】
【表１６】
2021532764.tif 000019
【０３６０】
ＲＳＶＰｒｅＦ３およびＤＳ−Ｃａｖ１の分析的比較可能性試験の要約
比較可能な特性：
・一次配列の完全性（インタクトおよびペプチドマップ）
・予想外の翻訳後修飾の非存在
・ＤＳＦにより測定された高次構造（熱安定性）
・遠紫外ＣＤにより測定された二次構造
・Ｎ５００における不完全なグリカン占有率
・比較可能な結合（Ｆａｂシフト）
【０３６１】
異なる特性：
・ＤＳ−ＣＡＶ１材料は、全体的な低い純度レベル（凝集、ＨＣＰ）および高いＧＲＰ７８含量を有する
・ＤＳ−Ｃａｖ１は、低いｐ２７含量を有する
・ＤＳ−Ｃａｖ１は、有意に低いｐ２７含量を有する
・ＤＳ−ＣＡＶ１材料は、高い凝集レベルを有する
・ＤＳ−ＣＡＶ１は、非常に異なったグリカンプロファイル、主に中性のおよび小さなグリカンを含有する
・グリカンプロファイルの差のために、ＤＳ−ＣＡＶ１材料は、ＭＷが小さく、ｐＩにおいてより塩基性である
・ＤＳ−ＣＡＶ１材料は、約８のｐＩを有するが、ＲＳＶＰｒｅＦ３材料は、約５〜６のｐＩを有する
【０３６２】
前臨床雌ウシ試験
ＲＳＶＰｒｅＦ３組成物およびＤＳ−Ｃａｖ１組成物の免疫原性を、以下の免疫化およびサンプル回収スケジュールに従って、ＲＳＶ  Ａ  ＮＡｂ（図２０）の観点で比較した：
【０３６３】
2021532764.tif 000020
【０３６４】
Ａｌ（ＯＨ）３または非アジュバントのいずれかで処方されたＲＳＶＰｒｅＦ３ロットは、生理食塩水群と比較して、高いＲＳＶ  Ａ  ＮＡｂ力価を誘発する（１４ｄＰＩにおけるｐ値＜０．０００１）。このため、初回刺激されたウシにおけるＲＳＶＰｒｅＦ３ロットの免疫原性が示された。ＲＳＶＡ  Ｎａｂ力価に基づいて、ＲＳＶＰｒｅＦ３−Ａｌ（ＯＨ）３とＤＳ−Ｃａｖ１−Ａｌ（ＯＨ）３との間に統計学的差が認められ（ＧＭＲ＝２．７、９５％ＣＩ：１．２４〜５．８２）、それらのそれぞれの倍率増加に関しても差が認められ、ＲＳＶ  Ａ  ＮＡｂ力価の高いブースティング（幾何平均比１４ＰＩ／−７日目）が、ＲＳＶＰｒｅＦ３−Ａｌ（ＯＨ）３に対して認められた（２．７倍高く、９５％ＣＩ：１．０３〜７．１２）。
【０３６５】
ナイーブＣＢ６Ｆ１マウスにおけるｐ２７免疫原性の影響
ＲＳＶＰｒｅＦ３誘導ＲＳＶ  Ａ中和抗体応答により、ＦＦＦ’三量体をＦＦＦ三量体と比較した。ＲＳＶＡ中和抗体応答（１４ｄｐＩＩＩ）に関して、ＦＦＦ三量体と比較して、ＦＦＦ’三量体に非劣性が示された（ＧＭＲ＝０．８０、９０％ＣＩ［０．４８，１．３２］）。
配列番号１（Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む前駆体組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド）
2021532764.tif 000021
配列番号２（Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む成熟組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのＦ１鎖）
2021532764.tif 000022
配列番号３（Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む成熟組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドのＦ２鎖）
2021532764.tif 000023
配列番号４（非グリコシル化Ｎ５００を表す）
2021532764.tif 000024
配列番号５（グリカンがＰＮＧａｓｅ  Ｆにより除去されたＮ５００を表す）
2021532764.tif 000025
配列番号６（質量分析により検出可能なｐ２７ペプチドの断片）
2021532764.tif 000026
配列番号７（ｐ２７）
2021532764.tif 000027
配列番号８（Ｆ’プロトマー含有ｐ２７のＦ１鎖）
2021532764.tif 000028
配列番号９（切断されていないフューリン切断部位、ＸおよびＸ１は独立に、任意のアミノ酸である）
2021532764.tif 000029
【図１Ａ】
2021532764.tif 000030
【図１Ｂ】
2021532764.tif 000031
【図２】
2021532764.tif 000032
【図３Ａ】
2021532764.tif 000033
【図３Ｂ】
2021532764.tif 000034
【図４】
2021532764.tif 000035
【図５Ａ】
2021532764.tif 000036
【図５Ｂ】
2021532764.tif 000037
【図５Ｃ】
2021532764.tif 000038
【図６Ａ】
2021532764.tif 000039
【図６Ｂ】
2021532764.tif 000040
【図７】
2021532764.tif 000041
【図８】
2021532764.tif 000042
【図９】
2021532764.tif 000043
【図１０】
2021532764.tif 000044
【図１１】
2021532764.tif 000045
【図１２】
2021532764.tif 000046
【図１３】
2021532764.tif 000047
【図１４】
2021532764.tif 000048
【図１５】
2021532764.tif 000049
【図１６】
2021532764.tif 000050
【図１７Ａ】
2021532764.tif 000051
【図１７Ｂ】
2021532764.tif 000052
【図１８】
2021532764.tif 000053
【図１９】
2021532764.tif 000054
【図２０】
2021532764.tif 000055
【図２１】
2021532764.tif 000056
【図２２Ａ】
2021532764.tif 000057
【図２２Ｂ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月30日(2021.3.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記組成物は、宿主細胞タンパク質に対して、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％、または９９．９％超の重量濃度（ｗ／ｗ）の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む、抗原組成物。
【請求項２】
Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換え呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記組成物は、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドに対して、０．１９％、０．１８％、０．１７％、０．１６％、０．１５％、０．１４％、０．１３％、０．１２％、０．１１％、０．１０％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１９％、０．０１８％、０．０１７％、０．０１６％、０．０１５％、０．０１４％、または０．０１３％未満の重量濃度（ｗ／ｗ）のＧＲＰ７８宿主細胞タンパク質を含む、抗原組成物。
【請求項３】
Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記組成物は、凝集三量体に対して、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、または９６％超の重量濃度（ｗ／ｗ）の非凝集三量体を含む、抗原組成物。
【請求項４】
Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを含む抗原組成物であって、前記可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、グリコシル化可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドであり、前記グリコシル化可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドは、グリコシル化を含めて、５９．５ｋＤａ超、例えば、６０．０ｋＤａ超、６０．５ｋＤａ超、または６１．０ｋＤａ超の分子質量を有する、抗原組成物。
【請求項５】
組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの三量体の集団を含む抗原組成物であって、
前記集団の各三量体は、
（ａ）Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆプロトマー」）；ならびに
（ｂ）ｐ２７ペプチドの少なくとも１０個の連続するアミノ酸をさらに含む、Ｓ１５５Ｃ、Ｓ２９０Ｃ、Ｓ１９０Ｆ、およびＶ２０７Ｌ置換を有するＦ１鎖を含む組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチド（「Ｆ’プロトマー」）
からなる群から独立に選択される３個の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドから構成され；
かつ、式：
ｎＦ＋（３−ｎ）Ｆ’  （式Ｉ）
［式中、ｎは、０〜３の整数であり、Ｆは、Ｆプロトマーであり、Ｆ’は、Ｆ’プロトマーである。］
により示され；
三量体の集団における組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドの少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％が、Ｆ’プロトマーである、抗原組成物。
【請求項６】
Ｆ’プロトマーが、ｐ２７ペプチドの少なくとも１０個の連続するアミノ酸からｐ２７ペプチド全体までを含む、請求項５に記載の抗原組成物。
【請求項７】
Ｆ’プロトマーがｐ２７ペプチド全体を含む、請求項６に記載の抗原組成物。
【請求項８】
Ｆ’プロトマーを含み、前記Ｆ’プロトマーが、切断されていないフューリン切断部位を含むＦ１鎖を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【請求項９】
（ａ）Ｆ’プロトマーが、配列番号８のアミノ酸配列を含むＦ１鎖および配列番号３のアミノ酸配列を含むＦ２鎖を含み；かつ
（ｂ）Ｆプロトマーが、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦ１鎖および配列番号３と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むＦ２鎖を含む、
請求項８に記載の抗原組成物。
【請求項１０】
前記抗原組成物が凍結乾燥されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗原組成物。
【請求項１１】
請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗原組成物および薬学上許容可能な担体または賦形剤を含む、免疫原性組成物。
【請求項１２】
アジュバントをさらに含む、請求項１１に記載の免疫原性組成物。
【請求項１３】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む、組換え核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１５】
ＲＳＶ感染症を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物または請求項１１もしくは１２に記載の免疫原性組成物の使用。
【請求項１６】
ＲＳＶに対する免疫応答を誘発する方法であって、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の組成物または請求項１１もしくは１２に記載の免疫原性組成物を対象に投与することを含む、方法。
【請求項１７】
対象がヒト対象である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
医学における使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗原組成物または請求項１１もしくは１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項１９】
ＲＳＶ感染症の予防または治療のための、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗原組成物または請求項１１もしくは１２に記載の免疫原性組成物。
【請求項２０】
請求項１４に記載の宿主細胞を培養して、組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを発現させること、ならびに、マルチモーダル陰イオン交換樹脂およびコスモトロピック剤とカオトロピック剤とを含む溶出緩衝液を利用したマルチモーダル液体クロマトグラフィー精製の工程を含む精製方法に、発現した組換えＲＳＶ可溶性Ｆタンパク質ポリペプチドを供することを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の抗原組成物を製造する方法。
【請求項２１】
溶出緩衝液が、
（ａ）１５０〜３５０ｍＭ、例えば、２００〜３００ｍＭ、２２５〜２７５ｍＭ、２３０〜２７０ｍＭ、２３５〜２６５ｍＭ、２４０〜２６０ｍＭ、または２４５〜２５５ｍＭのクエン酸ナトリウム；
（ｂ）２００〜４００ｍＭ、例えば、２５０〜３５０ｍＭ、２７５〜３２５ｍＭ、２８０〜３２０ｍＭ、２８５〜３１５ｍＭ、２９０〜３１０ｍＭ、または２９５〜３０５ｍＭのアルギニン
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
凍結乾燥の工程をさらに含む、請求項１７または１８に記載の方法。
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月19日(2021.4.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021532764000001.app
【国際調査報告】
2021532764.tif 000068
2021532764.tif 000069