(57)【要約】  コラーゲン産生植物イベント、それを検出するためのＤＮＡ分子およびその植物育種法における使用が提供される。
2021532780.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
タバコＤＮＡを含む試料から検出可能な組み換えＤＮＡ分子であって、前記分子のヌクレオチド配列は：
ａ）配列番号６または９と少なくとも９９％同一である、または
ｂ）前記（ａ）と完全に相補的なヌクレオチド配列であり、
前記組み換えＤＮＡ分子の存在が、前記試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  ＤＮＡまたはその子孫に対する指標となる、組み換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするＤＮＡプローブとして機能するに足る長さを有するポリヌクレオチドセグメントを含むＤＮＡ分子であって、前記ハイブリダイゼーション条件下における前記ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションは、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の指標となる、ＤＮＡ分子。
【請求項３】
前記組み換えＤＮＡ分子が：
ａ）配列番号６または９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列、または
ｂ）前記（ａ）と完全に相補的なヌクレオチド配列
を含む、請求項２に記載のＤＮＡ分子。
【請求項４】
第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子を含む一対のＤＮＡ分子であって、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡを含む試料と共に増幅反応に使用したときにプライマーとして機能して、前記試料中の前記タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の前記組み換えＤＮＡの指標となるアンプリコンを生成し、前記アンプリコンは、配列番号６または９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む、一対のＤＮＡ分子。
【請求項５】
試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫ＤＮＡの指標となる組み換えＤＮＡの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記試料を請求項２または３に記載のＤＮＡ分子と接触させ、そして
（ｂ）前記ＤＮＡ分子と前記組み換えＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する
ことを含み、
前記ハイブリダイゼーションは、前記試料中に存在する、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となる、方法。
【請求項６】
試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
（ａ）前記試料を、請求項４に記載の一対のＤＮＡ分子と接触させ、
（ｂ）前記一対のＤＮＡ分子を用いて、ＤＮＡアンプリコンを製造するのに十分な増幅反応を実施し、
（ｃ）前記反応中の前記ＤＮＡアンプリコンの存在を検出する
ことを含み、
前記ＤＮＡアンプリコンは、配列番号６または９と少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記アンプリコンの存在は、試料中の前記タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となる、方法。
【請求項７】
配列番号１〜５、７〜８、１０〜１９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列の少なくとも１種を検出する工程をさらに含む、請求項５または６に記載の方法。
【請求項８】
配列番号６または９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む、タバコ植物、その部分または細胞。
【請求項９】
ＬＨ３、Ｐ４Ｈｂ、コラーゲンアルファ１および／またはコラーゲンアルファ２の存在および／または配向を検出する工程をさらに含む、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法または植物。
【請求項１０】
前記存在および／または配向は、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８と少なくとも９９％同一である、請求項９に記載の方法または植物。
【請求項１１】
前記存在および／または配向は、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８と同一である、請求項９に記載の方法または植物。
【請求項１２】
前記タバコ植物が、前記タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８を含むタバコ植物の任意の世代の子孫である、請求項８に記載のタバコ植物、その部分または細胞。
【請求項１３】
配列番号１〜５、７〜８、１０〜１９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列の少なくとも１種を含む、請求項８に記載のタバコ植物、その部分または細胞。
【請求項１４】
前記子孫が自殖または交雑のタバコ植物である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子、方法または植物。
【請求項１５】
前記子孫が、表２０、２１、２１ａおよび２２のいずれか１つに記載のものである、請求項１４に記載のＤＮＡ分子、方法または植物。
【請求項１６】
前記組み換えＤＮＡ分子が、表２０、２１、２１ａおよび２２のいずれか１つに記載のタバコ・イベントまたはその子孫から誘導したものである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子、方法または植物。
【請求項１７】
前記ヌクレオチド配列が配列番号３４および３５に記載のものである、請求項１、３、４、５〜１２のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子、方法または植物。
【請求項１８】
（ａ）請求項８−１７のいずれか一項に記載の植物を栽培し、
（ｂ）前記植物からプロコラーゲンを単離する
ことを含む、プロコラーゲンの製造方法。
【請求項１９】
請求項１８に記載の方法で得ることのできるプロコラーゲン。
【請求項２０】
プロコラーゲンの加工方法であって、
（ａ）請求項８−１８のいずれか一項に記載の植物のタンパク質調製物を提供し、
（ｂ）前記タンパク質調製物を、プロコラーゲンをコラーゲンへと加工することのできる、効果的な量の酵素と接触させる
ことを含む、方法。
【請求項２１】
前記酵素がフィシンを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
検出可能な量の、配列番号６または９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列またはその完全な相補鎖を含む、タバコ種子。
【請求項２３】
検出可能な量の、配列番号１〜５、７〜８、１０〜１９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列またはその完全な相補鎖を含む、請求項２２に記載のタバコ種子。
【請求項２４】
検出可能な量の請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子を含む、非生存タバコ植物材料。
【請求項２５】
イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  ＤＮＡの存在の指標となるアンプリコンを製造するＤＮＡ増幅方法で試験した際に、テンプレートとして機能するＤＮＡを含む、タバコ植物またはタバコ植物部分。
【請求項２６】
イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８を含むタバコ植物またはタバコ種子の接合状態を決定するための方法であって、
タバコＤＮＡを含む試料を、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８の指標となる第１のアンプリコンおよびイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８を含まない本来のタバコゲノムＤＮＡの指標となる第２のアンプリコンを製造可能なプライマーセットと接触させることを含み、
ｉ）前記試料および前記プライマーセットで核酸増幅反応を実施し、
ｉｉ）前記核酸増幅反応において、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８の指標となる前記第１のアンプリコン、またはイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８を含まない本来のタバコゲノムＤＮＡの指標となる前記第２のアンプリコンを検出し、試料中の前記第１のアンプリコンのみの存在が、ホモ接合性のイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  ＤＮＡの指標となり、前記第１のアンプリコンおよび前記第２のアンプリコンの両方の存在が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８アレルがヘテロ接合性のタバコ植物の指標となる、あるいは
イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  ＤＮＡと特異的にハイブリダイズする少なくとも第１のプローブと、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８の異種ＤＮＡの挿入によって破壊されたタバコゲノムＤＮＡに特異的に結合するが、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  ＤＮＡにはハイブリダイズしない少なくとも第２のプローブとを含むプローブセットを、タバコＤＮＡを含む試料と接触させることを含み、
ｉ）前記プローブセットを前記試料とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせ、前記ハイブリダイゼーション条件下における前記第１のプローブのみのハイブリダイゼーションの検出が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８のホモ接合性アレルの指標となり、前記ハイブリダイゼーション条件下における前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの両方のハイブリダイゼーションの検出が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８のヘテロ接合性アレルの指標となる、方法。
【請求項２７】
改善された農業的性質を有する植物を製造する方法であって、
（ａ）請求項８〜１７のいずれか一項に記載の植物を、育種プログラムおよび／または遺伝子組み換えおよび／またはゲノム編集に付し、
（ｂ）改善された農業的性質を示す植物を選抜する、
ことを含む方法。
【請求項２８】
前記子孫が、ＳａｍｓｕｎとのＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８ハイブリッドを含む、請求項１〜２７のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子、方法または植物。
【請求項２９】
タバコＤＮＡを含む試料から検出可能な組み換えＤＮＡ分子であって、前記分子のヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一である、または
ｂ）前記（ａ）と完全に相補的なヌクレオチド配列であり、
前記組み換えＤＮＡ分子の存在が、前記試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９  ＤＮＡまたはその子孫に対する指標となる、組み換えＤＮＡ分子。
【請求項３０】
試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の組み換えＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするＤＮＡプローブとして機能するに足る長さを有するポリヌクレオチドセグメントを含むＤＮＡ分子であって、前記ハイブリダイゼーション条件下における前記ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションは、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の指標となる、ＤＮＡ分子。
【請求項３１】
前記組み換えＤＮＡ分子が：
ａ）配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列、または
ｂ）前記（ａ）と完全に相補的なヌクレオチド配列
を含む、請求項３０に記載のＤＮＡ分子。
【請求項３２】
第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子を含む一対のＤＮＡ分子であって、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の組み換えＤＮＡを含む試料と共に増幅反応に使用したときにプライマーとして機能して、前記試料中の前記タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の前記組み換えＤＮＡの指標となるアンプリコンを生成し、前記アンプリコンは、配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む、一対のＤＮＡ分子。
【請求項３３】
試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫ＤＮＡの指標となる組み換えＤＮＡの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記試料を請求項３０または３１に記載のＤＮＡ分子と接触させ、そして
（ｂ）前記ＤＮＡ分子と前記組み換えＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する
ことを含み、
前記ハイブリダイゼーションは、前記試料中に存在する、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となる、方法。
【請求項３４】
試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の組み換えＤＮＡの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
（ａ）前記試料を、請求項３２に記載の一対のＤＮＡ分子と接触させ、
（ｂ）前記一対のＤＮＡ分子を用いて、ＤＮＡアンプリコンを製造するのに十分な増幅反応を実施し、
（ｃ）前記反応中の前記ＤＮＡアンプリコンの存在を検出する
ことを含み、
前記ＤＮＡアンプリコンは、配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、前記アンプリコンの存在は、試料中の前記タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となる、方法。
【請求項３５】
配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む、タバコ植物、その部分または細胞。
【請求項３６】
前記タバコ植物が、前記タバコ・イベント  Ａ３−２９−３０５−１７−０９を含むタバコ植物の任意の世代の子孫である、請求項３５に記載のタバコ植物、その部分または細胞。
【請求項３７】
配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列の少なくとも１種を含む、請求項３５に記載のタバコ植物、その部分または細胞。
【請求項３８】
前記子孫が自殖または交雑のタバコ植物である、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子、方法または植物。
【請求項３９】
前記子孫が、表２０〜３０のいずれか１つに記載のものである、請求項３８に記載のＤＮＡ分子、方法または植物。
【請求項４０】
前記組み換えＤＮＡ分子が、表２０〜３０のいずれか１つに記載のタバコ・イベントまたはその子孫から誘導したものである、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子、方法または植物。
【請求項４１】
（ａ）請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の植物を栽培し、
（ｂ）前記植物からプロコラーゲンを単離する
ことを含む、プロコラーゲンの製造方法。
【請求項４２】
請求項４１に記載の方法で得ることのできるプロコラーゲン。
【請求項４３】
プロコラーゲンの加工方法であって、
（ａ）請求項３５〜４１のいずれか一項に記載の植物のタンパク質調製物を提供し、
（ｂ）前記タンパク質調製物を、プロコラーゲンをコラーゲンへと加工することのできる、効果的な量の酵素と接触させる
ことを含む、方法。
【請求項４４】
前記酵素がフィシンを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
検出可能な量の、配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列またはその完全な相補鎖を含む、タバコ種子。
【請求項４６】
検出可能な量の、配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列またはその完全な相補鎖を含む、請求項４５に記載のタバコ種子。
【請求項４７】
検出可能な量の請求項２９に記載の組み換えＤＮＡ分子を含む、非生存タバコ植物材料。
【請求項４８】
イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９  ＤＮＡの存在の指標となるアンプリコンを製造するＤＮＡ増幅方法で試験した際に、テンプレートとして機能するＤＮＡを含む、タバコ植物またはタバコ植物部分。
【請求項４９】
イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９を含むタバコ植物またはタバコ種子の接合状態を決定するための方法であって、
タバコＤＮＡを含む試料を、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９の指標となる第１のアンプリコンおよびイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９を含まない本来のタバコゲノムＤＮＡの指標となる第２のアンプリコンを製造可能なプライマーセットと接触させることを含み、
ｉ）前記試料および前記プライマーセットで核酸増幅反応を実施し、
ｉｉ）前記核酸増幅反応において、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９の指標となる前記第１のアンプリコン、またはイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９を含まない本来のタバコゲノムＤＮＡの指標となる前記第２のアンプリコンを検出し、試料中の前記第１のアンプリコンのみの存在が、ホモ接合性のイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９  ＤＮＡの指標となり、前記第１のアンプリコンおよび前記第２のアンプリコンの両方の存在が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９アレルがヘテロ接合性のタバコ植物の指標となる、あるいは
イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９  ＤＮＡと特異的にハイブリダイズする少なくとも第１のプローブと含み、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９の異種ＤＮＡの挿入によって破壊されたタバコゲノムＤＮＡに特異的に結合するが、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９  ＤＮＡにはハイブリダイズしない少なくとも第２のプローブとを含むプローブセットを、タバコＤＮＡを含む試料と接触させることを含み、
ｉ）前記プローブセットを前記試料とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせ、前記ハイブリダイゼーション条件下における前記第１のプローブのみのハイブリダイゼーションの検出が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９のホモ接合性アレルの指標となり、前記ハイブリダイゼーション条件下における前記第１のプローブおよび前記第２のプローブの両方のハイブリダイゼーションの検出が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９のヘテロ接合性アレルアレルの指標となる、方法。
【請求項５０】
改善された農業的性質を有する植物を製造する方法であって、
（ａ）請求項３５−４０のいずれか一項に記載の植物を、育種プログラムおよび／または遺伝子組み換えおよび／またはゲノム編集に付し、
（ｂ）改善された農業的性質を示す植物を選抜する、
ことを含む方法。
【請求項５１】
前記子孫が、Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８とのＡ３−２９−３０５−１７−０９ハイブリッドを含む、請求項２９〜５０のいずれか一項に記載のＤＮＡ分子、方法または植物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１８年７月３１日出願の米国仮特許出願第６２／７１２，２８９号の優先権を主張するものであり、その内容全体を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【０００２】
配列表の記載
本願の出願と同時に提出された、２０１９年７月３０日作成の１３１，０７２バイトのＡＳＣＩＩファイル「７８２９２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」を本明細書の一部を構成するものとしてここに援用する。
【０００３】
本発明は、そのいくつかの実施形態が、タバコのトランスジェニックイベント、並びにその検出方法およびその使用に関連する。
【背景技術】
【０００４】
コラーゲンは、脊椎動物および他の多くの多細胞生物の構造の完全性を担う主たる構造タンパク質である。Ｉ型コラーゲンは、骨および腱の主なコラーゲン成分であり、皮膚、大動脈および肺に大量に見いだされる。Ｉ型コラーゲン繊維は、大きな引張強度と限られた伸張性を提供する。Ｉ型コラーゲンに最も多く存在する分子型は、２つの異なるアルファ鎖である［アルファ１（Ｉ）］２およびアルファ２（Ｉ）で構成されたヘテロ三量体である。すべての繊維状コラーゲン分子が繰り返しＧｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレットから構成された３つのポリペプチド鎖を有し、ここでＸおよびＹは任意のアミノ酸であるが、多くの場合、イミノ酸であるプロリンおよびヒドロキシプロリンである。
【０００５】
繊維形成コラーゲンは、球状のＮ末端およびＣ末端伸長プロペプチドを含む前駆体プロコラーゲンとして合成される。プロコラーゲンの生合成は、プロリンおよびリシンの水酸化、Ｎ結合およびＯ結合グリコシル化、並びに鎖間および鎖内の両方のジスルフィド結合形成を含む翻訳後修飾の関与する複雑な工程である。これら修飾を行う酵素は、正しく整列され、熱的に安定な三重らせん分子のフォールディングおよびアセンブリを確実にするために、互いに協調して機能する。性質上、コラーゲンの三重らせん構造の安定性には、コラーゲン鎖内にヒドロキシプロリン残基を形成するための、酵素プロリル−４−ヒドロキシラーゼ（Ｐ４Ｈ）によるプロリンのヒドロキシル化が必要である。
【０００６】
各プロコラーゲン分子は、３つの構成ポリペプチド鎖から組み立てられる。ポリペプチド鎖が同時翻訳的に小胞体の膜を横切って移動すると、プロリンおよびリシン残基のヒドロキシル化がＧｌｙ−Ｘ−Ｙ繰り返し領域内で生じる。一度ポリペプチド鎖が小胞体のルーメン内に完全に移動すると、Ｃ−プロペプチドは折りたたまれる。その後、３つのプロアルファ鎖はそれぞれのＣ−プロペプチドを介して三量体を形成するように会合し、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ繰り返し領域がそのＣ末端に核形成点（ｎｕｃｌｅａｔｉｏｎ  ｐｏｉｎｔ）を設けることを可能にして、鎖の正しい整列を確実にする。Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ領域は、次に三重らせんを形成するように、ＣからＮの方向に折りたたまれる。
【０００７】
リシルヒドロキシラーゼ（ＬＨ、ＥＣ  １．１４．１１．４）、ガラクトシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．５０）およびグルコシルトランスフェラーゼ（ＥＣ  ２．４．１．６６）は、コラーゲンの翻訳後修飾に関与する酵素である。これらは特定の位置のリシル残基をヒドロキシリシル残基、ガラクトシルヒドロキシリシル残基、そしてグルコシルガラクトシルヒドロキシリシル残基に順次修飾する。これら構造はコラーゲン固有のものであり、その機能的活性に必須である（Wang et al, 2002）。１つのヒト酵素、リシルヒドロキシラーゼ３（ＬＨ３）が、ヒドロキシリシン結合炭水化物形成において３つのすべての連続した工程を触媒することができる。
【０００８】
ＷＯ２００６／０３５４４２およびＷＯ２００９／１２８０７６は、トランスジェニックなタバコ植物において、コラーゲン鎖のみならず、その修飾を担う酵素単位（上述したＰ４ＨおよびＬＨ３）も構成する５つの導入遺伝子を発現させることによる、ヒトプロコラーゲンの製造を開示する。得られるヒトＩ型プロコラーゲンは、Stein et al. (2009) Biomacromolecules 10:2640-5 2009に記載されているように、動物組織であれ、ヒト組織であれ、任意の組織由来コラーゲンと比べたときに、優れた生物学的機能を発揮する。
植物による外来遺伝子の発現は、植物ゲノム内の位置、おそらくはクロマチン構造（例：ヘテロクロマチン）またはインサート位近傍の転写調節因子（例：エンハンサー）の近さによって影響されることが知られている（Weising et al. (1988) Ann. Rev. Genet 22: 421-477）。同時に、ゲノム内の異なる位置の複数の組み換え遺伝子の存在は、植物の全体的な表現型に対して、様々な形で影響を与える。それ故に、目的の導入遺伝子の最大発現によって特徴づけられるイベントを同定するためには、大量のイベントのスクリーニングが多くの場合必要である。例えば、植物および他の生物において、イベント間でも、導入遺伝子の発現レベルは大きく異なりうることが観察されている。さらに発現には、導入遺伝子コンストラクトに存在する転写調節因子から予測されるパターンに対応しない空間的または時間的なパターンの違い、例えば、種々の植物組織における組み換え遺伝子の相対発現量の違い、があり得る。組み換え遺伝子挿入は内因性遺伝子発現に影響を与え得ることも観察された。これらの理由から、数百から数千の異なるイベントを製造し、商業目的のための所望の組み換え遺伝子発現レベルとパターンを有する単一のイベントのためにこれら複数のイベントのスクリーニングを行うことは一般的である。所望のレベルまたはパターンの組み換え遺伝子発現を有するイベントは、一般的な育種方法を用いた有性異系交雑による他の遺伝的背景への組み換え遺伝子の遺伝質浸透に有用である。このような交雑種の子孫は、元の形質転換体の組み換え遺伝子の発現特徴を維持する。この戦略は、一年を通じて高い収率を保証し得る、生存環境に良く適合した複数の品種における信頼できる遺伝子発現を保証するために用いられる。
【０００９】
追加の関連技術：
ＷＯ２００６／０３５４４２
ＷＯ２００９／１２８０７６
【発明の概要】
【００１０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、タバコＤＮＡを含む試料から検出可能な組み換えＤＮＡ分子であって、当該分子のヌクレオチド配列は：
ａ）配列番号６または９と少なくとも９９％同一である、または
ｂ）上記前記（ａ）と完全に相補的なヌクレオチド配列であり、
組み換えＤＮＡ分子の存在が、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  ＤＮＡまたはその子孫に対する指標となる、組み換えＤＮＡ分子が提供される。
【００１１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするＤＮＡプローブとして機能するに足る長さを有するポリヌクレオチドセグメントを含むＤＮＡ分子であって、ハイブリダイゼーション条件下におけるＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションは、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の指標となる、ＤＮＡ分子が提供される。
【００１２】
本発明のいくつかの実施形態においては、組み換えＤＮＡ分子は、
ａ）配列番号６または９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列、または
ｂ）上記（ａ）と完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００１３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子を含む一対のＤＮＡ分子であって、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡを含む試料と共に増幅反応に使用したときにプライマーとして機能して、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となるアンプリコンを生成し、アンプリコンは、配列番号６または９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む、一対のＤＮＡ分子が提供される。
【００１４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫ＤＮＡの指標となる組み換えＤＮＡの存在を検出するための方法であって、当該方法は：
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で試料を本明細書に記載のＤＮＡ分子と接触させ、そして
（ｂ）ＤＮＡ分子と組み換えＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する
ことを含み、
ハイブリダイゼーションは、試料中に存在する、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となる、方法が提供される。
【００１５】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
（ａ）試料を、本明細書に記載の一対のＤＮＡ分子と接触させ、
（ｂ）一対のＤＮＡ分子を用いて、ＤＮＡアンプリコンを製造するのに十分な増幅反応を実施し、
（ｃ）反応中の前記ＤＮＡアンプリコンの存在を検出する
ことを含み、
ＤＮＡアンプリコンは、配列番号６または９と少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、アンプリコンの存在は、試料中の前記タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となる、方法が提供される。
【００１６】
本発明のいくつかの実施形態においては、当該方法は、配列番号１〜５、７〜８、１０〜１９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列の少なくとも１種を検出する工程をさらに含む。
【００１７】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、配列番号６または９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む、タバコ植物、その部分または細胞が提供される。
【００１８】
本発明のいくつかの実施形態においては、当該方法または植物は、ＬＨ３、Ｐ４Ｈｂ、コラーゲンアルファ１および／またはコラーゲンアルファ２の存在および／または配向を検出する工程をさらに含む。
【００１９】
本発明のいくつかの実施形態においては、存在および／または配向は、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８と少なくとも９９％同一である。
【００２０】
本発明のいくつかの実施形態においては、存在および／または配向は、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８と同一である。
【００２１】
本発明のいくつかの実施形態においては、タバコ植物は、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８を含むタバコ植物の任意の世代の子孫である。
【００２２】
本発明のいくつかの実施形態においては、タバコ植物、その部分または細胞は、配列番号１〜５、７〜８、１０〜１９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列の少なくとも１種を含む。
【００２３】
本発明のいくつかの実施形態においては、子孫は自殖または交雑のタバコ植物である。
【００２４】
本発明のいくつかの実施形態においては、子孫は表２０、２１、２１ａおよび２２のいずれか１つに記載のものである。
【００２５】
本発明のいくつかの実施形態においては、組み換えＤＮＡ分子は、表２０、２１、２１ａおよび２２のいずれか１つに記載のタバコ・イベントまたはその子孫から誘導したものである。
【００２６】
本発明のいくつかの実施形態においては、ヌクレオチド配列は配列番号３４および３５に記載のものである。
【００２７】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、プロコラーゲンの製造方法であって、
（ａ）本明細書に記載のいずれか一項に記載の植物を栽培し、
（ｂ）前記植物からプロコラーゲンを単離する
ことを含む、方法が提供される。
【００２８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、本明細書に記載の方法で得ることのできるプロコラーゲンが提供される。
【００２９】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、プロコラーゲンの加工方法であって、
（ａ）本明細書に記載の植物のタンパク質調製物を提供し、
（ｂ）タンパク質調製物を、プロコラーゲンをコラーゲンへと加工することのできる、効果的な量の酵素と接触させる
ことを含む、方法が提供される。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態においては、酵素はフィシンを含む。
【００３１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、検出可能な量の、配列番号６または９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列またはその完全な相補鎖を含む、タバコ種子が提供される。
【００３２】
本発明のいくつかの実施形態においては、タバコ種子は検出可能な量の、配列番号１〜５、７〜８、１０〜１９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列またはその完全な相補鎖を含む。
【００３３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、検出可能な量の請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子を含む、非生存タバコ植物材料が提供される。
【００３４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  ＤＮＡの存在の指標となるアンプリコンを製造するＤＮＡ増幅方法で試験した際にテンプレートとして機能するＤＮＡを含む、タバコ植物またはタバコ植物部分が提供される。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８を含むタバコ植物またはタバコ種子の接合状態を決定するための方法であって、
タバコＤＮＡを含む試料を、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８の指標となる第１のアンプリコンおよびイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８を含まない本来のタバコゲノムＤＮＡの指標となる第２のアンプリコンを製造可能なプライマーセットと接触させることを含み、
ｉ）試料およびプライマーセットで核酸増幅反応を実施し、
ｉｉ）核酸増幅反応において、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８の指標となる第１のアンプリコン、またはイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８を含まない本来のタバコゲノムＤＮＡの指標となる第２のアンプリコンを検出し、試料中の第１のアンプリコンのみの存在が、ホモ接合性のイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  ＤＮＡの指標となり、第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンの両方の存在が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８アレルがヘテロ接合性のタバコ植物の指標となる、あるいは
イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  ＤＮＡと特異的にハイブリダイズする少なくとも第１のプローブと、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８の異種ＤＮＡの挿入によって破壊されたタバコゲノムＤＮＡに特異的に結合するが、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  ＤＮＡにはハイブリダイズしない少なくとも第２のプローブとを含むプローブセットを、タバコＤＮＡを含む試料と接触させることを含み、
ｉ）プローブセットを試料とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション条件下における第１のプローブのみのハイブリダイゼーションの検出が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８のホモ接合性アレルの指標となり、ハイブリダイゼーション条件下における第１のプローブおよび２のプローブの両方のハイブリダイゼーションの検出が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８のヘテロ接合性アレルの指標となる、方法が提供される。
【００３６】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、改善された農業的性質を有する植物を製造する方法であって、
（ａ）植物を育種プログラムおよび／または遺伝子組み換えおよび／またはゲノム編集に付し、
（ｂ）改善された農業的性質を示す植物を選抜する、
ことを含む方法が提供される。
【００３７】
本発明のいくつかの実施形態においては、子孫はＳａｍｓｕｎとのＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８ハイブリッドを含む。
【００３８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、タバコＤＮＡを含む試料から検出可能な組み換えＤＮＡ分子であって、分子のヌクレオチド配列が、
ａ）配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一である、または
ｂ）上記（ａ）と完全に相補的なヌクレオチド配列であり、
組み換えＤＮＡ分子の存在が、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９  ＤＮＡまたはその子孫に対する指標となる、組み換えＤＮＡ分子が提供される。
【００３９】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の組み換えＤＮＡとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするＤＮＡプローブとして機能するに足る長さを有するポリヌクレオチドセグメントを含むＤＮＡ分子であって、ハイブリダイゼーション条件下におけるＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションは、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の指標となる、ＤＮＡ分子が提供される。
【００４０】
本発明のいくつかの実施形態においては、組み換えＤＮＡ分子は：
ａ）配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列、または
ｂ）上記（ａ）と完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子を含む一対のＤＮＡ分子であって、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の組み換えＤＮＡを含む試料と共に増幅反応に使用したときにプライマーとして機能して、試料中の前記タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となるアンプリコンを生成し、アンプリコンは、配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列を含む、一対のＤＮＡ分子が提供される。
【００４２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫ＤＮＡの指標となる組み換えＤＮＡの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で試料を本明細書に記載のＤＮＡ分子と接触させ、そして
（ｂ）ＤＮＡ分子と組み換えＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出することを含み、
ハイブリダイゼーションは、試料中に存在する、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となる方法が提供される。
【００４３】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の組み換えＤＮＡの存在を検出するための方法であって：
（ａ）試料を、本明細書に記載の一対のＤＮＡ分子と接触させ、
（ｂ）一対のＤＮＡ分子を用いて、ＤＮＡアンプリコンを製造するのに十分な増幅反応を実施し、
（ｃ）反応中のＤＮＡアンプリコンの存在を検出することを含み、
ＤＮＡアンプリコンは、配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含み、アンプリコンの存在は、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となる方法が提供される。
【００４４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列を含む、タバコ植物、その部分または細胞が提供される。
【００４５】
本発明のいくつかの実施形態においては、タバコ植物はタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９を含むタバコ植物の任意の世代の子孫である。
【００４６】
本発明のいくつかの実施形態においては、少なくとも１種のヌクレオチド配列は、配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列である。
【００４７】
本発明のいくつかの実施形態においては、子孫は自殖または交雑のタバコ植物である。
【００４８】
本発明のいくつかの実施形態においては、子孫は表２０〜３０のいずれか１つに記載のものである。
【００４９】
本発明のいくつかの実施形態においては、組み換えＤＮＡ分子は、表２０〜３０のいずれか１つに記載のタバコ・イベントまたはその子孫から誘導したものである。
【００５０】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、
（ａ）本明細書に記載の植物を栽培し、
（ｂ）植物からプロコラーゲンを単離する
ことを含む、プロコラーゲンの製造方法が提供される。
【００５１】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、本明細書に記載の方法で得ることのできるプロコラーゲンが提供される。
【００５２】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、プロコラーゲンの加工方法であって、
（ａ）本明細書に記載の植物のタンパク質調製物を提供し、
（ｂ）タンパク質調製物を、プロコラーゲンをコラーゲンへと加工することのできる、効果的な量の酵素と接触させる
ことを含む方法が提供される。
【００５３】
本発明のいくつかの実施形態においては、酵素はフィシンを含む。
【００５４】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、検出可能な量の、配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列またはその完全な相補鎖を含む、タバコ種子が提供される。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態においては、タバコ種子は検出可能な量の、配列番号１〜１９と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列またはその完全な相補鎖を含む。
【００５６】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、検出可能な量の本明細書に記載の組み換えＤＮＡ分子を含む、非生存タバコ植物材料が提供される。
【００５７】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９  ＤＮＡの存在の指標となるアンプリコンを製造するＤＮＡ増幅方法で試験した際にテンプレートとして機能するＤＮＡを含む、タバコ植物またはタバコ植物部分が提供される。
【００５８】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９を含むタバコ植物またはタバコ種子の接合状態を決定するための方法であって、
タバコＤＮＡを含む試料を、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９の指標となる第１のアンプリコンおよびイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９を含まない本来のタバコゲノムＤＮＡの指標となる第２のアンプリコンを製造可能なプライマーセットと接触させることを含み、
ｉ）試料およびプライマーセットで核酸増幅反応を実施し、
ｉｉ）核酸増幅反応において、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９の指標となる第１のアンプリコン、またはイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９を含まない本来のタバコゲノムＤＮＡの指標となる第２のアンプリコンを検出し、試料中の第１のアンプリコンのみの存在が、ホモ接合性のイベントＡ３−２９−３０５−１７−０９  ＤＮＡの指標となり、第１のアンプリコンおよび第２のアンプリコンの両方の存在が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９アレルがヘテロ接合性のタバコ植物の指標となる、あるいは
イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９  ＤＮＡと特異的にハイブリダイズする少なくとも第１のプローブとを含み、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９の異種ＤＮＡの挿入によって破壊されたタバコゲノムＤＮＡに特異的に結合するが、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９  ＤＮＡにはハイブリダイズしない少なくとも第２のプローブとを含むプローブセットを、タバコＤＮＡを含む試料と接触させることを含み、
ｉ）プローブセットを試料とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせ、ハイブリダイゼーション条件下における第１のプローブのみのハイブリダイゼーションの検出が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９のホモ接合性アレルの指標となり、ハイブリダイゼーション条件下における第１のプローブおよび第２のプローブの両方のハイブリダイゼーションの検出が、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９のヘテロ接合性アレルアレルの指標となる、方法が提供される。
【００５９】
本発明のいくつかの実施形態の一態様において、改善された農業的性質を有する植物を製造する方法であって、
（ａ）本明細書に記載の植物を、育種プログラムおよび／または遺伝子組み換えおよび／またはゲノム編集に付し、
（ｂ）改善された農業的性質を示す植物を選抜する、
ことを含む方法が提供される。
【００６０】
本発明のいくつかの実施形態においては、子孫はＶｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８とのＡ３−２９−３０５−１７−０９ハイブリッドを含む。
【００６１】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および／または科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書において記載されるものと同様または同等の方法および材料を、本発明の実施形態の実施または試験において使用できるが、例示的方法および／または材料を以下に記載する。矛盾する場合には、定義を含む本特許明細書が優先される。さらに、材料、方法および実施例は、単に例示的なものであって、必ずしも制限を意図するものではない。
【００６２】
本発明のいくつかの実施形態を、添付の図面を参照して、単に例として本明細書において記載する。以下、図面の詳細に具体的に参照するが、ここに示す特徴は例示であり、本発明の実施形態の例示的考察を目的とするものであることを強調する。これに関して、図面を伴う説明は、本発明の実施形態をいかに実施し得るかを当業者に明らかにする。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】育種イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９のＦ１〜Ｆ５系統の概略図である。緑の塗りつぶしは選抜した系統および系統を示す。
【図２】全Ｆ５系統におけるプール・プロコラーゲン（ＰＣ）収率の解析を示すグラフである。プールのＰＣ−ＥＬＩＳＡは、Ａ３−２９  Ｆ４系統３０５−０９およびその種々のＦ５誘導体が、他の試験した（Ｆ５集団へと分離する）Ｆ４系統の子孫と比べて最も収率が高いことを一貫して示唆している。すべてのＦ５系統においてｎ＝２であり、対照においてｎ＝３である。エラーバーは、連続した解析におけるＰＣ濃度の範囲を示す。選抜した植物は赤で塗りつぶされており、対照は塗りつぶしなしである。
【図３】選抜したＦ５系／系統の各植物におけるＰＣ収率解析を示すグラフである。７つの最も優れた植物を「勝者」のＥＬＩＳＡのために選抜した。最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ｆ５  Ａ３−２９−３０５−１７−０９植物個体のＰＣ濃度。
【図４】最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−４３４−１９−１５  Ｆ５植物個体におけるＰＣ濃度を表すグラフである。３つの最も優れた植物を「勝者」のＥＬＩＳＡのために選抜した（赤い塗りつぶし）。
【図５】最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−３０５−１７−１７  Ｆ５植物個体におけるＰＣ濃度を表すグラフである。３つの最も優れた植物を「勝者」のＥＬＩＳＡのために選抜した（赤い塗りつぶし）。試験は常に特定の植物の種子に対して行われたため、結果は、次の世代を表すことに注意されたい。
【図６】最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−３０５−１７−０２  Ｆ５植物個体におけるＰＣ濃度を表すグラフである。これら植物からは「勝者」のＥＬＩＳＡのための選抜は行わなかった。
【図７】最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−３５３−０４−４２  Ｆ５植物個体におけるＰＣ濃度を表すグラフである。３つの最も優れた植物を「勝者」のＥＬＩＳＡのために選抜した（赤い塗りつぶし）。
【図８】最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−３５３−０４−４２  Ｆ５植物個体におけるＰＣ濃度を表すグラフである。最も優れた植物を「勝者」のＥＬＩＳＡのために選抜した（赤い塗りつぶし）。
【図９】最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−３５３−０４−７２  Ｆ５植物個体におけるＰＣ濃度を表すグラフである。これら植物からは「勝者」のＥＬＩＳＡのための選抜は行わなかった。
【図１０】最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−３０５−１３−１８  Ｆ５植物個体におけるＰＣ濃度を表すグラフである。これら植物からは「勝者」のＥＬＩＳＡのための選抜は行わなかった。
【図１１】「勝者」である各Ｆ５植物の比較ＰＣ収率の解析を示すグラフである。勝者のＥＬＩＳＡの２回の連続した解析である（１回目が濃い色で、２回目が薄い色である）。結果は、対照系統（Ａ３−２９−  Ｆ１）に対するパーセンテージで示した。すべての試料が、対照と比べて高いＰＣ収率を示した。２例においては、２回のＥＬＩＳＡのうちの１回の値が対象に非常に近かった（３０５−１７−１７  ＃１６および３５３−０４−１９  ＃８）。それぞれの色が異なる系統を表す。
【図１２】全Ｆ６系統のプールのＰＣ収率の解析を表すグラフである。Ｆ６実生（ｎ＝１）のバルクＰＣ濃度。Ａ３−２９  Ｆ６系統の子孫、特にＡ３−２９−３０５−１７−０９系統およびＡ３−２９−３０５−１７−１７系統において、一貫した相対的に高いＰＣレベルが見られた。それぞれの色が異なる系統を表す。
【図１３】完全に成長した、選抜したＦ６系統（ｎ＝３）のプールのＰＣ濃度を表すグラフである。ＰＣ収率の最も高い系統はＦ５−３０５−１７−０９の子孫であった。ＰＣレベルは５０％以下の増加を示し、これはＡ３−２９  Ｆ１系統と同等であり、Ｚ１産生系統の最大３．５倍であった。最も優れた４系統を各植物の解析のために用いた。それぞれの色が異なる系統を表す。
【図１４】選抜したＦ６系統の各植物におけるＰＣ収率解析を示すグラフである。最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１０  Ｆ６植物個体におけるＰＣ濃度である。１つの最も優れた植物を「勝者」のＥＬＩＳＡのために選抜した（赤い塗りつぶし）。
【図１５】最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６植物個体におけるＰＣ濃度を表すグラフである。２つの高ＰＣ収率植物を「勝者」のＥＬＩＳＡのために選抜した（赤い塗りつぶし）。
【図１６】最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−２５  Ｆ６植物個体におけるＰＣ濃度を表すグラフである。３つの高ＰＣ収率植物を「勝者」のＥＬＩＳＡのために選抜した。
【図１７】最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−３７  Ｆ６植物個体におけるＰＣ濃度を表すグラフである。４つの高ＰＣ収率植物を「勝者」のＥＬＩＳＡのために選抜した。
【図１８】最も収率の高い植物個体の単離を示す、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１５  Ｆ６植物個体におけるＰＣ濃度を表すグラフである。１つの高ＰＣ収率植物を「勝者」のＥＬＩＳＡのために選抜した（赤い塗りつぶし）。
【図１９】ウエスタンブロット（ＷＢ）解析の写真である。抗ＣＯＬ免疫ブロット解析は試験したすべての植物がＡ３−２９  Ｆ１対照（赤い矢印）よりも高いＰＣレベルを有すること示した。
【図２０】ウエスタンブロット（ＷＢ）解析の写真である。抗Ｐ４Ｈα免疫ブロット解析。試験した候補のうち、植物３７−０１および１８−２５（赤い矢印）はより低いＰ４Ｈα発現を示したが、植物３７−３１および２５−０５はより高いＰ４Ｈα発現を示した（青い矢印）。
【図２１】ウエスタンブロット（ＷＢ）解析の写真である。抗Ｐ４Ｈβ免疫ブロット解析。試験した候補のうち、植物２５−０５および３７−０１（赤い矢印）は低下を示したが、植物１８−３３、３７−１０、１８−２５、１５−１３および２５−０４はＰ４Ｈαの増加を示した（青い矢印）。
【図２２】インサートの特徴を示す模式図である。ＥＰはイベントプライマー、Ｇｐは遺伝子プライマー、ＬＢＰは左境界部プライマー、ＲＢＰは左境界部プライマー。
【図２３】ゲノム上のイベント１の位置を示す模式図である。
【図２４】ゲルＰＣＲ上のイベント１の特徴付けを示す。図２４Ａ：右接合部用のイベント１特異的プライマーを用いたインサートの特徴付け。図２４Ｂ：左接合部用のイベント１特異的プライマーを用いたインサートの特徴付け。プライマーは、表３５、イベント＃１および表３６〜３７に示す。
【図２５】境界部接合部ＰＣＲの結果を示す。図２５Ａ−Ｂ：ゲノムプライマーおよび境界部プライマーを用いた左境界部ＰＣＲであり、アンプリコンサイズは１〜４００ｂｐであり、図２５Ｂ：ゲノムプライマーおよび境界部プライマーを用いた右境界部ＰＣＲであり、アンプリコンサイズは１〜５００ｂｐ。プライマーは、表３５、イベント＃１および表３６〜３７に示す。
【図２６−１】イベント１（配列番号１〜４）のＰＣＲ産物およびサンガーシーケンシングである。
【図２６−２】イベント１（配列番号１〜４）のＰＣＲ産物およびサンガーシーケンシングである。
【図２６−３】イベント１（配列番号１〜４）のＰＣＲ産物およびサンガーシーケンシングである。
【図２６−４】イベント１（配列番号１〜４）のＰＣＲ産物およびサンガーシーケンシングである。
【図２６−５】イベント１（配列番号１〜４）のＰＣＲ産物およびサンガーシーケンシングである。
【図２６−６】イベント１（配列番号１〜４）のＰＣＲ産物およびサンガーシーケンシングである。
【図２７】ゲノム上のイベント２（Ｐ４Ｈ ａｌｐｈａ）位置の模式図である。
【図２８】イベント２の特徴付けを示す。図２８Ａ：イベント２左接合部用の特異的プライマーを用いたインサートの特徴付け。図２８Ｂ：イベント２右接合部用の特異的プライマーを用いたインサートの特徴付け。プライマーは、表３５、イベント＃２および表３６〜３７に示す。
【図２９】サンガ−解析によるイベントの特徴付け。境界部接合部ＰＣＲ：図２９ＡとＢは、ゲノムプライマーおよび境界部プライマーを用いた左境界部ＰＣＲであり、アンプリコンサイズはそれぞれ１〜４００ｂｐ、２〜４５００ｐｂであり、図２９Ｃ：ゲノムプライマーおよび境界部プライマーを用いた右境界部ＰＣＲであり、１〜約８００ｂｐ。プライマーは、表３５、イベント＃２および表３６〜３７に示す。
【図３０−１】イベント２（配列番号５〜９）のＰＣＲ産物およびサンガーシーケンシングである。
【図３０−２】イベント２（配列番号５〜９）のＰＣＲ産物およびサンガーシーケンシングである。
【図３０−３】イベント２（配列番号５〜９）のＰＣＲ産物およびサンガーシーケンシングである。
【図３０−４】イベント２（配列番号５〜９）のＰＣＲ産物およびサンガーシーケンシングである。
【図３１】ゲノム上のイベント３の位置を示す模式図である。
【図３２】イベント３左接合部プライマーを用いたインサートの特徴付けである（表３５参照）。
【図３３】境界部ＰＣＲを示す。図３３のＡとＢは、ゲノムプライマーおよび境界部プライマーを用いた左境界部ＰＣＲであり、アンプリコンサイズ、１〜８００ｂｐ、２〜約２Ｋｂであり、プライマーは、表３５、イベント＃３および表３６〜３７に示す。
【図３４−１】ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を示す（配列番号１０〜１４）。
【図３４−２】ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を示す（配列番号１０〜１４）。
【図３４−３】ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を示す（配列番号１０〜１４）。
【図３４−４】ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を示す（配列番号１０〜１４）。
【図３４−５】ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を示す（配列番号１０〜１４）。
【図３５】ゲノム上のイベント４の位置を示す模式図である。
【図３６】イベント４左境界部プライマーを用いたインサートの特徴付けを示す。プライマーは、表３５、イベント＃４および表３６〜３７に示す。
【図３７−１】ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を示す（配列番号１５〜１６）。
【図３７−２】ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を示す（配列番号１５〜１６）。
【図３８】ゲノム上のイベント５位置を示す模式図である。
【図３９】イベント５左接合部プライマーを用いたインサートの特徴付けを示す。プライマーは、表３５、イベント＃５および表３６〜３７に示す。
【図４０】境界部接合部ＰＣＲを示す。ゲノムプライマーを用いた左境界部ＰＣＲ、アンプリコンサイズは２〜約３Ｋｂ、３〜２Ｋｂ。プライマーは、表３５、イベント＃５および表３６〜３７に示す。
【図４１−１】ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を示す（配列番号１７〜１９）。
【図４１−２】ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を示す（配列番号１７〜１９）。
【図４１−３】ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を示す（配列番号１７〜１９）。
【図４１−４】ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を示す（配列番号１７〜１９）。
【図４２】選抜したＦ１植物におけるＰＣ濃度（ｍｇ／Ｋｇ葉）、葉のバイオマス（ｇｒ／植物）および総ＰＣ（ｄｇ）を表す棒グラフである。Ｆ１における全組み換え遺伝子は半接合性であり、よってＰＣ濃度は、そのポテンシャルに対して半分のみを表すと予想された。多くの植物におけるバイオマス収率（葉の重量）のポテンシャルは非常に高いようであった（１０００ｇｒ／植物以上）。
【図４３】産生系統「Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６  バルク」から選抜したＦ３植物および３つの対照におけるＰＣ濃度（ｍｇ／ｋｇ葉）（赤い棒）を表す棒グラフである。少なくとも１４の異なる植物が、現在の産生系統（赤い矢印）と比べて、ＰＣのより良い収率を示した。
【図４４】選抜したＦ４植物におけるＰＣ濃度（ｍｇ／ｋｇ葉、青い棒）および葉の重量（ｇｒ、オレンジの点）を表す棒グラフである。全ての植物が、産生系統「Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６  バルク」と比べて、はるかに高いＰＣ濃度および／またははるかに高いバイオマス量を示した。
【図４５】期待値を示す。Ｐ４ｈＢ＋ＬＨ３およびＰ４Ｈａ：  ＭＷ（ラダーＩＩＩ），Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ５，ＷＴ，ＮＴＣ。Ｃｏｌａ２：  ＭＷ：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ５，２−３００，ＷＴ，ＮＴＣ，Ｃｏｌａ１  ＭＷ，Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ５，２−２７２，ＷＴ，ＮＴＣ。以下のサンプルの順番で全系統を評価した。１：  ＭＷ（ＰＣＲＢＩＯラダーＩＩＩ）、２：  Ａ３−２９  Ｆ１、３：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９  Ｆ４、４：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−Ｆ４、５：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊、６：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊＊、７：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊＊＊、８：  Ｓａｍｓｏｎ  ＷＴ＊、９：  Ｓａｍｓｏｎ  ＷＴ＊＊、１０：  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８  ＷＴ＊、１１：  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８  ＷＴ＊＊、１２：  ［Ｋ３５８×Ａ３−２９−３０５−１７−０９］−３５−１９−２１−１８−１３    Ｆ６＊、１３：  Ｋ３５８×Ａ３−２９−３０５−１７−０９］−３５−１９−２１−１８−１３    Ｆ６＊＊。アステリックスは二重であることを示す。
【図４６】図４６は以下を示す。上部パネル：Ｐ４ＨｂおよびＬＨ３の右境界部。下部パネル：Ｐ４Ｈａの右境界部。以下のサンプルの順番で全系統評価した。１：  ＭＷ（ＰＣＲＢＩＯラダーＩＩＩ）、２：  Ａ３−２９  Ｆ１、３：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９  Ｆ４、４：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−Ｆ４、５：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊、６：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊＊、７：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊＊＊、８：  Ｓａｍｓｏｎ  ＷＴ＊、９：  Ｓａｍｓｏｎ  ＷＴ＊＊、１０：  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８  ＷＴ＊、１１：  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８  ＷＴ＊＊、１２：［Ｋ３５８×Ａ３−２９−３０５−１７−０９］−３５−１９−２１−１８−１３  Ｆ６＊、１３：  Ｋ３５８×Ａ３−２９−３０５−１７−０９］−３５−１９−２１−１８−１３  Ｆ６＊＊。
【図４７】図４７は以下を示す。上部パネル：Ｃｏｌａ２の左境界部。下部パネル：Ｃｏｌａ１の左境界部プライマーＭＰ＿Ｃｏｌ＿  ３ＲおよびＲＰ２。以下のサンプルの順番で全系統を評価した。１：  ＭＷ  （ＰＣＲＢＩＯラダーＩＩＩ）、２：  Ａ３−２９  Ｆ１、３：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９  Ｆ４、４：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−Ｆ４、５：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊、６：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊＊、７：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊＊＊、８：  Ｓａｍｓｏｎ  ＷＴ＊、９：  Ｓａｍｓｏｎ  ＷＴ＊＊、１０：  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８  ＷＴ＊、１１：  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８  ＷＴ＊＊、１２：［Ｋ３５８×Ａ３−２９−３０５−１７−０９］−３５−１９−２１−１８−１３  Ｆ６＊、１３：  Ｋ３５８×Ａ３−２９−３０５−１７−０９］−３５−１９−２１−１８−１３  Ｆ６＊＊。
【図４８】Ｃｏｌａ１左境界部プライマーであるＭＰ＿Ｃｏｌ＿４ＲおよびＲＰ２を示す。
【図４９】図４９は以下を示す。左上部パネル：ＭＷ  ＰＣＲＢＩＯラダーＩＩＩ、Ｐ４Ｈｂ＋ＬＨ３の右境界部、期待値８００ｂｐ。右上：ＭＷ  ＰＣＲＢＩＯラダーＩＩＩ、Ｐ４Ｈａの右境界部、期待値８００ｂｐ。左下部：ＭＷ  ＰＣＲＢＩＯラダーＩＩＩ、Ｃｏｌａ２の左境界部、期待値８００ｂｐ。右下部：ＭＷ  ＰＣＲＢＩＯラダーＩＩ、Ｃｏｌａ１の左境界部、期待値３ｋｂ。
【図５０】ＭＷ  ＰＣＲＢＩＯ  ラダーＩＩを示し、Ｃｏｌａ１の左境界部の期待値は２ｋｂである。
【００６４】
発明の詳細な説明
本発明は、そのいくつかの実施形態が、タバコのトランスジェニックイベント、並びにその検出方法およびその使用に関連する。
【００６５】
本発明の少なくとも１つの実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、必ずしもその用途が以下の説明又は実施例で例示される詳細に限定されるものではないことを理解すべきである。本発明は他の実施形態が可能であり、様々な手段で実施又は実行することが可能である。
【００６６】
本発明者らは以前に、ヒトプロコラーゲンの製造に用いることのできるトランスジェニック植物系統を作製した。これらトランスジェニック系統は、ＷＯ２００６／０３５４４２およびＷＯ２００９／１２８０７６に記載のように、ヒトコラーゲン１アルファ１（Ｃｏｌａ１）、ヒトコラーゲン１アルファ２（Ｃｏｌａ２）、ヒトＰ４Ｈアルファ（Ｐ４Ｈａ）およびＰ４Ｈベータ（Ｐ４Ｈｂ）と、ヒトＬＨ３を含む５つの組み換え遺伝子を発現した。
【００６７】
本発明の態様を実施するに当たり、本発明者らは、ヒトＩ型プロコラーゲン（ＰＣ）の収率の高いトランスジェニックタバコ植物系統を開発した。育種プログラムは、やがてホモ接合性の増強をもたらす、自己交雑と高収率の子孫の選抜というサイクルの繰り返しに基づく。ホモ接合性の系統は、より高いプロコラーゲン収率を得るため、および種子による繁殖という選択の両方において好ましい。種子に基づく繁殖は、苗の価格を著しく低下させ、商業生産のための苗を得るためのサイクルを短くするはずである。結果は、Ｆ４系統およびＦ５系統と、２０−２７９（Ｐ４Ｈα、Ｐ４Ｈβ、ＬＨ３）を２−３７２（Ｃｏｌ１、Ｃｏｌ２）と交雑した結果であるＺ１、即ち半接合性Ｓａｍｓｕｎ系統Ｆ１との比較に基づく（図１３参照）。その優越性は、Ｆ４（Ａ３−２９−３０５−１７−０９）およびその子孫、例えば、異なる遺伝的背景等のＦ５（Ａ３−２９−３０５−０９−１８）やそれらの自己交雑体またはハイブリッドによって表されている（図４２〜４４のみならず、後述する実施例とその中の表を参照）。
【００６８】
次に本発明者らは、イベント、この場合は複数の挿入部位、の存在を検出可能であることが、目的の組み換え遺伝子がその染色体上の位置と共に有性交雑の子孫に含まれているかどうかを確認するために有利であることを認識した。さらに、特定のイベントを検出するための方法は、市販前承認を必要とする規制への準拠および組み換え作物由来製品の標示や、環境モニタリング、畑の作物の性質のモニタリング、収穫作物由来製品のモニタリングにおける使用、さらには規制または契約条項を守るべき集団による条項遵守の保証に用いるうえで有用になり得る。よって、本発明者らは、勝者たるイベント（Ａ３−２９−３０５−１７−０９またはＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８）またはその子孫あるいはこれらのハイブリッドの存在を検出するための貴重なマーカーとして使用可能な分子接合部を特定した。イベントは、サンプル中のイベントの存在を検出するために有用な特定の独自のＤＮＡセグメントによって特徴づけられる。
【００６９】
Ａ３−２９−３０５−１７−０９植物またはＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８植物は、より農業的に優れた産生系統の産生のみならず、植物におけるプロコラーゲン収率の増加を達成するために、野生型タバコ栽培品種のバックグラウンドにイベントを導入することを目的として、育種プログラムにも使用された（実施例３および４参照）。例えば、ハイブリッド（Ｆ１）、図４２は、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８とＳａｍｓｕｎ系統との交雑を示す。ハイブリッドＫ３５８×Ａ３−２９−３０５−１７−０９（Ｆ４）が図４３〜４４に示される。どのようにしてこのようなハイブリッドを提供したかについてのさらなる記載が表２０〜３０にある。
【００７０】
本明細書で使用する「プロコラーゲン」という用語は、Ｎ末端プロペプチドとＣ末端プロペプチドを含むヒトコラーゲン分子を意味する。例示的なヒトプロコラーゲンアミノ酸配列を配列番号２５及び２６に示す。
これら配列は、配列番号２０および２１のヌクレオチド配列によってコードされる。
【００７１】
本明細書の定義によると、「Ｐ４Ｈ」とは、コラーゲンアルファ鎖のヒドロキシル化［すなわち、Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレット中のプロリン（Ｙ）位のみのヒドロキシル化］が可能なヒトＰ４Ｈ酵素である。Ｐ４Ｈは２つのサブユニット、それぞれＧｅｎｂａｎｋ  Ｎｏｓ．  Ｐ０７２３７およびＰ１３６７４のアルファおよびベータから構成される。両方のサブユニットが活性酵素の形成に必須であるが、ベータサブユニットはさらにシャペロン機能を有する。これら配列は配列番号２２および２３によってコードされる。
【００７２】
本明細書の定義によると、「ＬＨ３」または「リシルヒドロキシラーゼ３」とは、ヒドロキシリシン結合炭水化物形成に見られる３つの連続した修飾ステップをすべて触媒することのできる、Ｇｅｎｂａｎｋ  Ｎｏ．Ｏ６０５６８の酵素である。
【００７３】
ＬＨ３は配列番号２４によってコードされる。
【００７４】
初期系統の形質転換に用いられた発現カセット（図１参照）は、ＷＯ２００６／０３５４４２によって提供され、したがってこれは、イベントを構成する組み換えＤＮＡ配列の原料を示す。
【００７５】
上述したように、挿入イベントの分子特徴付けは、当該系統および「勝者」イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９  Ｆ４の自己受粉の上位産物であるＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ５、で実施した。
【００７６】
したがって、本発明の一態様によると、配列番号１〜１９（例：６または９）と少なくとも９９％同一ヌクレオチド配列あるいはその完全な相補鎖を含むタバコ植物、その部分または細胞が提供される。
【００７７】
配列番号と少なくとも９９％同一のヌクレオチド配列が「イベント」を表す。
【００７８】
本明細書における「イベント」という用語は、挿入ＤＮＡ（組み換えＤＮＡ）と、本明細書において「接合部」とも呼ぶ、挿入ＤＮＡのすぐ隣のタバコ隣接ゲノム配列（５’または３’）とを含む、トランスジェニック植物のＤＮＡを表す。このようなＤＮＡは独自のものであり、挿入ＤＮＡを含む１つの親系統（例：  Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ５）と、挿入ＤＮＡを含まない安定な親系統との有性交雑の結果として目的の組み換え遺伝子を含む挿入ＤＮＡを受け継ぐ子孫に転送されると考えられる。
【００７９】
本願明細書のどこにおいても、配列番号６または９と少なくとも９９％同一であるまたはその完全な相補鎖であるＤＮＡイベントの解析または存在は、配列番号１〜５、７〜８、１０〜１８および／または１９と少なくとも９９％同一であるまたはその完全な相補鎖であるヌクレオチド配列の解析または存在を伴ってもよい。
【００８０】
代わりに、配列番号１〜１９（例：６または９）と少なくとも９９％同一であるまたはその完全な相補鎖である任意のヌクレオチド配列を解析してもよい。
【００８１】
本明細書の定義によると、「安定な親系統」という句は、放任受粉された近交系であって、自己受粉および植え付けという複数のサイクルにわたって安定な植物を表す。特定の実施形態によると、本発明の親系統においては、ゲノムの９５％がホモ接合性の形態である。
【００８２】
よってイベントは、交雑または自己受粉によって次の世代（子孫）に転送することができる。再発する親系統への繰り返し起こる戻し交雑後であっても、イベントは、交配の結果である子孫の同じ染色体位置に存在する。
【００８３】
この場合、イベントは、配列番号１〜１９で表される１０のＤＮＡ  接合部、あるいはそれと少なくとも９９％（例：少なくとも９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８％、例えば１００％）同一なヌクレオチド配列を含む。
【００８４】
イベントは、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９またはすべて（１０）の接合部の存在を決定することで同定することができる。
【００８５】
特定の実施形態によると、組み換え遺伝子のそれぞれが、ヘテロ接合性の植物のゲノム中に少なくとも１コピー存在するか、またはホモ接合性の植物に少なくとも２コピー（例えば、少なくとも３コピー、少なくとも４コピー）存在する（例：Ｐ４Ｈｂ−ＬＨ３は２か所に存在する）。
【００８６】
イベントのＤＮＡは、イベントを含むタバコ植物、タバコ種子およびタバコ組織の各細胞および各ゲノムの１つの染色体に存在する。タバコゲノムはメンデルの法則に従って子孫に伝達されるため、仮にタバコ植物がイベント挿入に関してホモ接合性の場合、各子孫タバコ植物および細胞は、イベント挿入を含有する親染色体の各アレルにイベントＤＮＡを含み、親から子孫へと遺伝される。しかし、仮にイベントＤＮＡを含有するタバコゲノムがヘテロ接合性またはハイブリッドの親の場合、ハイブリッドの親の交雑に参加する花粉の約５０％および胚珠の約５０％がタバコ・イベントＤＮＡを含み、その結果、イベントＤＮＡを含む子孫の混合集団となり、ハイブリッドの交雑によって生まれる子孫の割合において、このようなイベントＤＮＡの伝達される子孫の割合は、約５０から約７５パーセントの範囲のどこかである。
【００８７】
本明細書における「配列同一性」または「同一性」または文法的な同義語は、本明細書における２つの核酸配列の文脈において、２つの配列をアラインしたときに同じ残基を含むことを意味する。
【００８８】
同一性は、例えば、任意の相同性比較ソフトウェア、例えば、デフォルトパラメータ等を使用する全米バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェアを使用して決定することができる。
【００８９】
特定の実施形態によると、植物は本明細書の記載のイベントを含む。
【００９０】
本明細書における「植物」という用語は、植物体、接木、および植物の子孫、並びに種子、シュート、茎、根、根茎、若木を含む植物部分、並びに植物の細胞、組織および器官を意味する。植物は、懸濁培養、胚、分裂領域、カルス組織、葉、配偶体、胞子体、花粉および小胞子を含む、任意の形態でもよい。特定の実施形態によると、植物は葉または種子である。
【００９１】
特定の実施形態によると、植物部分はＤＮＡ（例：イベントのＤＮＡ）を含む。
【００９２】
本明細書における「タバコ」とは、Nicotiana属の 任意の植物であり、N. tabacum、N. glauca、N. rusticaおよびN. glutinosaが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
特定の実施形態によると、タバコはN. tabacumに属する栽培品種である。
【００９４】
特定の実施形態によると、タバコはN. glaucaに属する栽培品種である。
【００９５】
特定の実施形態によると、タバコはN. rusticaに属する栽培品種である。
【００９６】
特定の実施形態によると、栽培品種は、下記品種からなる群より選択したものである。N. tabacum cv. Cuban habano 2000、N. tabacum cv. Burley Original、N. glauca Blue tree、N. tabacum cv. Virginia、N. tabacum cv.KY160、N. tabacum cv. Virginia K326、N. tabacum cv. Virginia K358、N. tabacum cv. Burley TN86、N. tabacum cv. Burley TN90、N. tabacum cv. PG04、N. tabacum cv. KY171LC、N. tabacum cv. Maryland、N. tabacum cv. Samsun NN、N. tabacum cv. MD 609、N. tabacum cv. Tukish izmir、N. tabacum cv. Virginia gold 1、N. tabacum cv. Narrow leat Madole、N. tabacum cv. Banket AA、N. tabacum cv. Lizard tail Orinoco、N. tabacum cv. Virginia k346、N. tabacum cv. Black mammoth、N. tabacum cv. Cuban criollo 98、N. tabacum cv. Cuban criollo 98、N. tabacum cv. Cuban criollo 98、N. tabacum perique、N. tabacum little wood、N. tabacum little wood N.およびtabacum cv. Burley Hampton。
【００９７】
使用可能な特定のタバコ栽培品種の追加の例としては、ｂｒｉｇｈｔｌｅａｆ、ｂｕｒｌｅｙ、ｃａｖｅｎｄｉｓｈ、ｃｏｒｏｊｏ、ｃｒｉｏｌｌｏ、ｏｒｉｅｎｔａｌ、ｐｅｔｉｔｅ  Ｈａｖａｎａ、ＳＲ１、ｔｈｕｏｃ  ｌａｏ、ｔｙｐｅ  ２２、ｗｉｌｄ  ｔｏｂａｃｃｏ、ＸａｎｔｈｉおよびＹ１が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
本明細書における「子孫」という単語は、イベントを含む本発明の植物と、イベントを含むか含まない任意の他の植物との交雑によって生じる子または第１世代（即ち、Ａ３−２９−３０５−１７−９−１８）およびさらなる後代を表す。本発明の子孫は、イベントを有する本発明の植物の任意の交雑の子孫である。
【００９９】
「子孫」は、栄養繁殖または増殖によって得られた、本発明のイベントを有する植物も含む。
【０１００】
よって、特定の実施形態によると、タバコ植物は、（上記の）イベントＡ３−２９−３０５−１７−９−１８または（自殖または同一の背景または異なる栽培品種との交雑の結果である）その任意の子孫、あるいは栄養繁殖または増殖によって得られたタバコ植物を表す。
【０１０１】
特定の実施形態によると、子孫はＦ５、Ｆ６、Ｆ７、Ｆ８、Ｆ９またはＦ１０である。
【０１０２】
特定の実施形態によると、植物はハイブリッド植物（例：ハイブリッド種子）である。
【０１０３】
特定の実施形態によると、植物は近交系植物である。
【０１０４】
このような子孫としては、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８−３３−２  Ｆ７、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８−３３−１０  Ｆ７、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−２５−０４−１９  Ｆ７、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−３７−２８−３１  Ｆ７のみならず、イベントを含む限り実施例３および４に記載のハイブリッド（例えば、表２０、２１、２１ａおよび２２に示したもの）も挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１０５】
子孫は自己受粉（「自殖」としても知られる）を行って、植物の真の育種系統、即ち、組み換え遺伝子がホモ接合性の植物を作製することもできる。適切な子孫の自殖は、組み換え遺伝子（少なくとも１、２、３、４または５種の組み換え遺伝子）がホモ接合性の植物を製造することができる。
【０１０６】
代わりに、子孫植物を他殖し、他の関連のない植物と交雑して、品種またはハイブリッドの種子または植物を作製してもよい。他の関連のない植物はトランスジェニックでも、非トランスジェニックでもよい。本発明の品種またはハイブリッドの種子または植物は、よって、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−９−１８の特定および固有のＤＮＡを含む第１の親と、農業的に貴重な性質（例：生物および／または非生物ストレスに対する耐性、成長力、収率、バイオマス等、例えば、実施例３〜４を参照）を有する第２の親とを有性交雑することで誘導してもよく、その結果、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−９−１８の特定および固有のＤＮＡを含み、且つ交雑と選抜の結果である農業的に貴重な性質を有するハイブリッドを得てもよい。これは雑種強勢の結果とも考えられる。各親は、本発明の種子または植物、即ち、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−９−１８のＤＮＡを含む少なくとも１種のアレルを有する種子をもたらす限り、ハイブリッドまたは近交／品種でもよい。
【０１０７】
親植物への戻し交雑および非トランスジェニック植物との他殖も、栄養繁殖と同様に想定される。他の形質および作物に一般的に使用される育種方法に関する記載は複数の文献の１つ、例えば、Fehr, in Breeding Methods for Cultivar Development, Wilcox J. ed., American Society of Agronomy, Madison WI (1987)に見出すことができる。
【０１０８】
特定の実施形態によると、植物は生育温度１２〜３６℃によって特徴づけられる。
【０１０９】
以下の測定を収穫時（例：収穫段階、例：６０日）に行った。
【０１１０】
特定の実施形態によると、植物（例：ハイブリッド）は、少なくとも１０％、３０％、５０％、７０％、１００％、２００％、２５０％または３００％高いバイオマスによって表される、Ａ３−２９系統よりも高い成長力によって特徴づけられる。
【０１１１】
特定の実施形態によると、植物（例：ハイブリッド）は、少なくとも３０％、５０％、７０％、１００％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、５００％またはそれ以上のプロコラーゲン収率（ｍｇ／ｋｇ葉）によって表される、３−２９系統またはＺ１系統よりも高い収率によって特徴づけられる。
【０１１２】
特定の実施形態によると、植物（例：ハイブリッド）は、Ａ３−２９系統よりも高い葉の重量、例えば、少なくとも４５０ｇ／植物、によって特徴づけられる。特定の実施形態によると、葉の重量はＡ３−２９系統（例：Ａ３−２９−３０５−１７−９  Ｆ４またはＡ３−２９−３０５−１７−９−１８  Ｆ５のハイブリッドで少なくとも５０％）のそれよりも、３０％、４０％、５０％も高い。
【０１１３】
特定の実施形態によると、プロコラーゲン（例：Ｆ４、Ｆ５またはそれらのハイブリッド）の濃度は高い、例えば、６０ｍｇ／Ｋｇ湿った葉を超える。
【０１１４】
特定の実施形態によると、プロコラーゲン収率は６０〜２００ｍｇ／植物である。
既に記載したように、本発明者らはイベントを特徴付け、ここにイベントを同定するための分子ツールを提供する。
【０１１５】
従って、本発明の一態様によると、タバコＤＮＡを含む試料から検出可能な組み換えＤＮＡ分子であって、前記分子のヌクレオチド配列は：
ａ）配列番号１〜１９（例：６または９）と少なくとも９９％同一である、または
ｂ）前記（ａ）と完全に相補的なヌクレオチド配列であり、
前記組み換えＤＮＡ分子の存在が、前記試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  ＤＮＡまたはその子孫に対する指標となる、組み換えＤＮＡ分子が提供される。
【０１１６】
本発明の一態様によると、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡと、（例えば、表３１のような）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特異的にハイブリダイズするＤＮＡプローブとして機能するに足る長さを有するポリヌクレオチドセグメントを含むＤＮＡ分子であって、前記ハイブリダイゼーション条件下における前記ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションは、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の指標となる、ＤＮＡ分子が提供される。
【０１１７】
本発明の一態様によると、第１のＤＮＡ分子および第２のＤＮＡ分子を含む一対のＤＮＡ分子であって、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡを含む試料と共に増幅反応に使用したときにプライマーとして機能して、前記試料中の前記タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の前記組み換えＤＮＡの指標となるアンプリコンを生成し、前記アンプリコンは、配列番号１〜１９（例：６または９）と少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８％、例：１００％）同一なヌクレオチド配列を含む、一対のＤＮＡ分子が提供される。
【０１１８】
本発明の一態様によると、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫ＤＮＡの指標となる組み換えＤＮＡの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記試料を本明細書に記載のＤＮＡ分子と接触させ、そして
（ｂ）前記ＤＮＡ分子と前記組み換えＤＮＡとのハイブリダイゼーションを検出する
ことを含み、
前記ハイブリダイゼーションは、前記試料中に存在する、タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となる、方法が提供される。例示的なストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は表３１に記載されているが、当業者は、明確なハイブリダイゼーションが得られる範囲内でそれをどのように変更すればよいかを知っているはずである。
【０１１９】
本発明の一態様によると、試料中のタバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡの存在を検出するための方法であって、前記方法は：
（ａ）前記試料を、イベントの増幅のためのプライマーとして機能し得る一対のＤＮＡ分子と接触させ、
（ｂ）前記一対のＤＮＡ分子を用いて、ＤＮＡアンプリコンを製造するのに十分な増幅反応を実施し、
（ｃ）前記反応中の前記ＤＮＡアンプリコンの存在を検出する
ことを含み、
前記ＤＮＡアンプリコンは、配列番号１〜１９（例：６または９）と少なくとも９９％（例えば、少なくとも９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８％、例：１００％）同一であるヌクレオチド配列を含み、前記アンプリコンの存在は、試料中の前記タバコ・イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８またはその子孫の組み換えＤＮＡの指標となる、方法が提供される。
【０１２０】
特定の態様において、組み換えＤＮＡ分子は、
ａ）配列番号１〜１９（例：６または９）と少なくとも９９％同一なヌクレオチド配列、または
ｂ）前記（ａ）と完全に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０１２１】
特定の態様において、子孫は、表２０、２１、２１ａおよび２２のいずれか１つに記載のものである。
【０１２２】
特定の態様において、組み換えＤＮＡ分子は、配列番号１〜１９（例：６または９）と少なくとも９９％同一の配列、またはその完全な相補鎖を含むタバコ・イベントまたはその子孫から誘導したものである。
【０１２３】
特定の態様において、ヌクレオチド配列は配列番号６または９に記載のものである。
【０１２４】
本明細書における「組み換えＤＮＡ」は、組み換え遺伝子の配列、シス作動性調節配列（例：プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）または発現に用いるＤＮＡカセットの配列（例：左境界部、右境界部等）を含む合成ＤＮＡである。
【０１２５】
特定の実施形態によると、組み換えＤＮＡはイントロン配列を含まない。
【０１２６】
特定の実施形態によると、接合部は、組み換え組み換え配列と共に、タバコ植物のゲノム配列を５’から３’または３’から５’方向に含み、方向は組み換え配列がゲノムＤＮＡのセンス鎖またはアンチセンス鎖に組み込まれているかによって異なる。
【０１２７】
本明細書における「試料」とは、実質的に純粋なタバコＤＮＡである組成物、またはタバコＤＮＡを含む組成物である。いずれの場合も、試料は生物学的な試料である、即ち、生物材料を含むものである（しかし、非生物材料も含んでもよい）。例としてイベントを含むタバコまたはその子孫のゲノムから、直接または間接的に、得たまたは誘導したＤＮＡが挙げられるが、これに限定されるものではない。「直接」とは、タバコ細胞の破砕（または破砕されたタバコ細胞を含むタバコの試料を入手し）、検出を目的としてゲノムＤＮＡを暴露することでタバコゲノムから直接ＤＮＡを得る当業者の能力を意味する。
【０１２８】
「間接的」とは、標的または特定の参照ＤＮＡ、即ち、特定の試料中のイベントの存在の指標となると本明細書に記載されている新規且つ固有の接合部を、タバコ細胞の破砕または破砕されたタバコ細胞を含むタバコの試料の入手といった直接的な方法以外の方法で得る当業者の能力を意味する。このような間接的な手段としては、標的配列に特異性をもって結合するように設計された特定のプローブまたはプライマーを用い、イベント中のヌクレオチド配列を増幅、あるいは測定する特徴づけことのできるＤＮＡの増幅（即ち、アガロースまたはアクリルアミドゲル等の効果的なマトリクスを介して他のＤＮＡ配列から分離することで測定する）、あるいはアンプリコンの直接配列解析による特徴づけ、あるいはアンプリコンのベクターへのクローニングおよびこのようなベクター内に存在する挿入アンプリコンの直接シーケンシングが挙げられるが、これらに限定されるものではない。代わりに、トランスジェニックＤＮＡがタバコ染色体に挿入された位置に対応し、イベントの定義に使用できるものに対応するタバコ染色体中のＤＮＡのヌクレオチド配列を種々の方法でクローニングし、そして特定の試料または特定のタバコゲノム中の存在を同定し、特徴づける。このようなＤＮＡ配列を接合部配列と呼ぶ。これらは、挿入ＤＮＡとタバコゲノムとの接合点が配列中に含まれる限り、任意の長さの、挿入ＤＮＡおよび隣の（隣接する）タバコ染色体ＤＮＡである。配列番号１〜１９（例：６または９）（あるいは、少なくとも９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８％、例：１００％、同一なそれらのホモログ）およびそれぞれの逆向きの相補鎖が、上記セグメント（および先に定義した少なくとも９９％同一のホモログ）の代表的なものである。ここで同定した特定の配列は、イベントまたはそこに含まれるコンストラクトに固有に存在する。このような配列を直接配列解析、配列に結合したプローブの検出、または本明細書に記載の特定のアンプリコンのサイズまたは組成の観察によって同定し、、特定のタバコの生殖質またはゲノムに存在するおよび／またはタバコＤＮＡを含む特定の生物学的試料に存在する場合、当該配列は当該試料中のイベントまたはそこに含まれるコンストラクトの存在の指標となる。隣接ゲノム配列（即ち、挿入トランスジェニックＤＮＡの隣のＤＮＡ配列のタバコゲノムセグメント）には少しの変動が見られることが知られており、よって、少なくとも９９％またはそれ以上（例えば、少なくとも９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８％、例：１００％）の同一性という限定は、タバコゲノム間のこのような異形および多型を考慮したものである。
【０１２９】
本発明のヌクレオチド配列（組み換え遺伝子）の位置／配向は、図２３、２７、３１、３５、および３８に示されている。代表的なアンプリコンの配列番号１〜１９は図２６、３０、３４、３７および４０に模式的に示されている。１種（例：配列番号６または９）または２種またはそれ以上のこれらヌクレオチド配列の試料中の存在は、当該試料がタバコ細胞または部分、よってタバコＤＮＡ（任意で、配列番号１〜５、７〜８、１０〜１９のいずれか、およびそれに少なくとも９９％同一な配列またはその完全な相補鎖）を含むとき、イベントの指標となる。
【０１３０】
「誘導された」という単語を使用するときは、特定のＤＮＡ分子がタバコ植物ゲノム中にあるか、またはタバコ植物ＤＮＡ中に検出可能に存在することを意図している。「検出可能に」とは、特定のＤＮＡ配列が増幅され、そのサイズおよび／または配列が特徴づけられるか、あるいはＤＮＡ配列解析によって明らかとなる能力を意味する。さらには、プローブが特定のＤＮＡ配列、即ち、標的ＤＮＡ配列、に特異的に結合する能力、およびそれに続く、プローブの標的への結合を検出する能力も意味する。本発明の特定のＤＮＡセグメントまたは標的ＤＮＡセグメントはイベントを含むタバコ内に存在する。
【０１３１】
本発明のＤＮＡ分子は、挿入されたトランスジェニックイベントＤＮＡおよびその隣にある、即ち、隣接する、挿入ＤＮＡの両端のタバコゲノムＤＮＡのいずれかの末端の接合部に固有である、またはタバコ・イベント挿入ＤＮＡに固有である。これら分子は、本明細書に記載のプローブ、プライマー、場合によってはＤＮＡ配列解析を用いた方法によって解析された特定の試料中に存在する場合、試料中の一定量のイベント・タバコの存在の指標となる。タバコ・イベントＤＮＡに固有のこのようなＤＮＡ分子は、種々の方法、固有のＤＮＡ分子に特異的に結合するように設計されたプローブ核酸分子の使用と、続く固有のＤＮＡに対するこのようなプローブの結合の検出、およびプローブとして機能する少なくとも２種の異なるＤＮＡ分子（但し、このような分子の配列は上記プローブよりも特異性がいくらか低い）を用いた熱増幅方法によって同定および特徴づけることができる。当業者は、適切なハイブリダイゼーション条件下で特定の標的ＤＮＡをプローブまたはプライマーと接触させることが、プローブまたはプライマーの標的ＤＮＡセグメントへの結合をもたらすことを理解する。
【０１３２】
本発明のＤＮＡ分子は、増幅可能なＤＮＡの標的セグメントであってもよい。特定試料の増幅方法によって得られた、示された長さの１種以上のアンプリコンとして検出されたときは、このような試料中のイベントまたはそこに含まれるコンストラクトの存在の指標となり得る。このようなＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドセグメントは、さらに本明細書および後の実施例で定義したように、配列番号６または９および所望により配列番号１〜５、７〜８、１０〜１８および／または１９、またはこれらに少なくとも９９％同一な配列（上記参照）のヌクレオチド配列を有してもよい。プライマー分子および／またはプローブはキットの形状で、対照を含む必要な試薬と共に提供し、使用説明書と一緒に梱包することもできる。
【０１３３】
本明細書で使用するプローブは、本明細書で定義したストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において特定の標的ＤＮＡセグメント、即ち、試料中のイベントＤＮＡ内に存在し、その存在の指標となる固有のセグメント、に結合するという機能を果たすのに十分な長さのＤＮＡ分子またはポリヌクレオチドセグメントを含んでもよい。このようなプローブは、タバコ・イベントＤＮＡにのみ存在する単一の接合部または他の新規配列のみ、または２種以上のこのような接合部セグメントに結合するように設計することができる。タバコＤＮＡを含むと推定される試料からのこのようなプローブのＤＮＡ分子への結合の検出は、試料中のタバコ・イベントの存在の指標となる。
【０１３４】
本イベントは複数の接合部を含むことから、複数の接合部に対する多重増幅を（即ち、ペア以上のプライマーを同時に使用して）実施することもできる。
【０１３５】
プライマーは、特定のＤＮＡ標的セグメントを増幅する熱増幅反応に使用するための異なるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドセグメントのペアを含んでもよい。ペア中の各プライマーは、増幅の目的とするＤＮＡのセグメント内または近傍のＤＮＡの幾分特異的なセグメントに結合するように設計される。プライマーは、核酸配列のポリメライゼーションにおける局所領域として機能するように結合し、１種または複数種のアンプリコン（ＤＮＡの増幅した標的セグメント）の産生がもたらされる。本発明においては、特定の生物学的試料中のタバコ・イベントＤＮＡに固有のセグメントに結合し、本明細書に記載の接合部セグメントの１種または複数種を含む特定のアンプリコンを増幅するように設計されたプライマーの使用による、ポリメラーゼ反応の完了または停止後のそのようなアンプリコンの検出および／または特徴づけは、特定試料中のタバコ・イベント存在の指標となる。当業者は、当該増幅方法に慣れており、本明細書における増幅に関する具体的な記載は不要である。
【０１３６】
本明細書における「プローブ」とは、単離された核酸配列であって、公知の検出可能な標識またはレポーター分子、例えば、放射性同位元素、リガンド、化学発光剤、蛍光発光剤、または酵素が取り付けられていてもよいものである。当該プローブは標的核酸の鎖、本発明においては、イベントを含む植物またはイベントＤＮＡを含む試料由来のタバコＤＮＡ鎖に相補的である。本発明におけるプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸に限定されず、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合してイベントの存在の検出に使用することのできる、ポリアミドおよび他のプローブでもよい。
【０１３７】
ＤＮＡプライマーは、プライマーと標的ＤＮＡ鎖との間でハイブリッドを形成するために、相補的なイベントＤＮＡ鎖（標的ＤＮＡ鎖）に核酸ハイブリダイゼーションによってアニーリングし、次にポリメラーゼ（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）によって、標的ＤＮＡ鎖に沿って伸長される単離されたポリ核酸である。本発明のＤＮＡプライマーペアまたはＤＮＡプライマーセットは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または他の公知のポリ核酸増幅方法による標的核酸配列（即ち、イベントＡ３−２９−３０５−１７−０９）の増幅に有用な２つのＤＮＡプライマーである。
【０１３８】
ＤＮＡプローブおよびＤＮＡプライマーは、長さが少なくとも１１核酸またはそれ以上、あるいは少なくとも１８核酸またはそれ以上、少なくとも２４核酸またはそれ以上、または少なくとも３０核酸またはそれ以上（例：長さが１１〜１００、１５〜１００、２０〜１００、３０〜１００、１１〜５０、１５〜５０、２０〜５０、３０〜５０ヌクレオチド）でもよい。当該プローブおよびプライマーは、高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で標的配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さとなるように選ばれる。好ましくは、本発明のプローブおよびプライマーは標的配列と完全な類似性を有する。しかし、標的配列とは異なるが、標的配列にハイブリダイズする能力を保持するプローブの設計は可能である（例えば、少なくとも１つのミスマッチ、２つのミスマッチ、３つのミスマッチ、４つのミスマッチ、５つのミスマッチまたはモードを含むもの、例：少なくとも３００ｂｐの配列中に少なくとも１０個のミスマッチを有するもの）。
【０１３９】
本願で開示した隣接ゲノムＤＮＡおよびインサート（組み換え）配列に基づくプライマーおよびプローブは、公知の方法、例えば、再クローニングおよびそのようなＤＮＡ分子のシーケンシングによって、開示したＤＮＡ配列を確認（そして必要であれば修正）するために使用することができる。
【０１４０】
特定の実施形態によると、本発明の核酸プローブおよびプライマーは、標的ＤＮＡ分子（即ち、イベント）にストリンジェントな条件下でハイブリダイズする。任意の公知または公知でない核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を、試料中のトランスジェニック植物からＤＮＡの存在を同定するために使用することができる。核酸セグメントまたはその断片とも呼ばれるポリ核酸分子は、特定の環境下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズすることができる。本明細書において、２つのポリ核酸分子は、２つの分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成可能な時に、互いに特異的にハイブリダイズすることができる。核酸分子は、互い完全な相補性を示すときに他の核酸分子の「相補鎖」となる。本明細書において、１つの分子の各ヌクレオチドが他の分子のヌクレオチドに対して相補的なとき、分子が「完全な相補性」を示すと言える。２つの分子は、少なくとも一般的な「低ストリンジェンシー」の条件下で互いにアニーリングした状態を保つのに十分な安定性をもってハイブリダイズすることができるとき、「最低限に相補的」と言える。同様に、分子が一般的な「高ストリンジェンシー」の条件下で互いにアニーリングした状態を保つのに十分な安定性をもってハイブリダイズすることができるとき、「相補的」であると言える。一般的なストリンジェンシーの条件は、Sambrook et al, 1989およびHaymes et al, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)に記載されている。よって、完全な相補性からの離脱も、当該離脱が分子の二本鎖構造の形成能を完全に排除しない限り許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブとして働くためには、使用する特定の溶媒および塩濃度において、安定な二本鎖構造を形成するに足る十分な相補性を示す配列であればよい。
【０１４１】
本明細書における実質的に相同な配列は、高ストリンジェンシーの条件下において比較する核酸配列の相補鎖に対して特異的にハイブリダイズする核酸配列である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシーの条件としては、例えば、６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中で約４５℃、次に２．０×ＳＳＣで５０°Ｃの洗浄が当業者に知られており、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N.Y. (1989), 6.3.1-6.3.6に記載されている。例えば、洗浄工程の塩濃度は、低ストリンジェンシーの約２．０×ＳＳＣで５０℃から高ストリンジェンシーの約０．２×ＳＳＣで５０℃の中から選択することができる。さらに、洗浄工程の温度は低ストリンジェンシーの条件である室温、約２２°Ｃ、から高ストリンジェンシーの条件である約６５℃まで増加させることもできる。温度および塩の両方を変化させてもよく、また、温度または塩の一方を固定して他方を変化させてもよい。好ましい実施形態において、本発明のポリ核酸は、配列番号６または９、および所望により配列番号１〜５、７〜８、１０〜１８および／または１９に示した核酸分子、あるいはそれらの相補鎖または断片の１種または複数種と、（本明細書に記載または当業界で知られる）ストリンジェントな条件下で特異的にハイブリダイズすることができる。
【０１４２】
使用可能なプローブおよびプライマーの具体例は、後述する実施例２に示されている。
標的ＤＮＡ分子へのプローブのハイブリダイゼーションは、当業者に公知の任意の複数の方法によって検出することができ、蛍光タグ、放射性タグ、抗体に基づくタグ、蛍光タグおよび化学発光タグが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１４３】
（例えば、ＰＣＲによる）プライマーペアを用いた標的核酸配列の増幅において、「ストリンジェントな条件」は、ＤＮＡ熱増幅反応において、プライマーペアが対応の野生型配列（またはその相補配列）を有するプライマーが結合し得る標的核酸配列にのみハイブリダイズし、好ましくは固有の増幅産物、即ちアンプリコンを産生する条件である。このような条件の具体例は、後述する実施例２に示されている。
【０１４４】
「（標的配列）に特異的」という用語は、プローブまたはプライマーが、例えば、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、イベントを含む試料中の標的配列にのみハイブリダイズする、あるいはイベントを構成しない配列への防ぐことのできないハイブリダイゼーションが（例えば、サイズ、配列等によって）容易に識別可能であることを表す。
【０１４５】
本明細書における「増幅したＤＮＡ」または「アンプリコン」は、ポリ核酸テンプレートの一部を構成する標的ポリ核酸分子に対するポリ核酸増幅方法の産物である。
【０１４６】
例えば、有性交雑によって得られたタバコ植物が本発明のイベントを含むか否か決定するために、タバコ植物組織試料から抽出したＤＮＡを、イベントの異種挿入ＤＮＡに隣接する領域内のゲノムＤＮＡ配列から誘導し、ポリメラーゼによって挿入ＤＮＡの５’から３’の方向に伸長させた第１のプライマーを含むプライマーペアを用いてポリ核酸増殖方法に付すことができる。第２のプライマーは、異種挿入ＤＮＡ分子から誘導し、ポリメラーゼによって、第１のプライマーを誘導した隣接ゲノムＤＮＡの５’から３’の方向に伸長させる。
【０１４７】
代わりに、インサートポリヌクレオチド配列全体を含むアンプリコンを産生するために、挿入異種ＤＮＡの両側のゲノム配列からプライマーペアを誘導することもできる。
挿入トランスジェニックＤＮＡの隣の植物ゲノム配列から誘導したプライマーペアのメンバーは、挿入ＤＮＡ配列から距離を置いた位置にあり、この距離は１ヌクレオチドベースペア〜約２００００ヌクレオチドベースペアの範囲となり得る。
【０１４８】
「アンプリコン」という用語の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応において形成され得るプライマーダイマーを特異的に排除する。
【０１４９】
実用的な理由から、サイズの範囲が限られた、例えば、サイズが１００〜１０００ベースのアンプリコンを産生するプライマーを設計すべきである。より小さな（長さの短いポリヌクレオチドの）アンプリコンは、通常、熱増幅反応によってより高い信頼性で製造され、より短いサイクル時間を可能にし、そしてアガロースゲルで容易に分離および可視化されるか、あるいはエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）様アッセイに適応させることができる。より小さなアンプリコンは、ＤＮＡアンプリコン検出のための当業界で知られた方法によって製造および検出することができる。さらに、プライマーペアを用いて産生したアンプリコンは、ベクターにクローニングし、増殖させて単離し、シーケンシングするか、あるいは、当業界で広く確立された方法によって直接シーケンシングする。また、プライマーは、タバコゲノムの小さな部分も（増幅によって）カバーするように設計しなければならない。このような小さな部分は、例え、他の遺伝的背景との交雑によってより長いゲノム配列が失われたとしても、イベントの同定に十分でなければならない。
【０１５０】
本発明の教示に基づき使用可能な特異的なプライマーの一例が、後述する実施例２に示されている（例：配列番号２７〜４７）。
【０１５１】
ポリ核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、種々のポリ核酸増幅方法の任意の方法によって達成することができる。増幅方法は公知であり、特に下記に記載されている。米国特許第４，６８３，１９５号および第４，６８３，２０２号明細書、およびPCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, ed. Innis et al, Academic Press, San Diego, 1990。ＰＣＲ増幅方法は、最大２２ｋｂ（キロベース）のゲノムＤＮＡおよび最大４２ｋｂのバクテリオファージＤＮＡを増幅するように開発されている（Cheng et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:5695-5699, 1994）。これらの方法および当業界で公知の他のＤＮＡ増幅方法を本発明に使用することができる。
【０１５２】
これら方法によって産生された指標となるアンプリコンは、複数の技術によって検出してもよい。
【０１５３】
サンガーシーケンシングおよびナノポアベースシーケンシングは、後述する実施例の実施例２において非常に詳細に説明した。
【０１５４】
他のこのような方法としては、遺伝的ビット解析（Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｂｉｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ）（Nikiforov, et al. Nucleic acid Res. 22:4167-4175, 1994）であり、ここでＤＮＡオリゴヌクレオチドは、隣の隣接ゲノムＤＮＡ配列および挿入ＤＮＡ配列に重なるように設計される。オリゴヌクレオチドをマイクロプレートのウェル内に固定する。目的の領域の（挿入配列内の１つのプライマーと、隣の隣接ゲノム配列の中の１つとを使用した）ＰＣＲの後、一本鎖ＰＣＲ産物を固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせて、ＤＮＡポリメラーゼおよび予測される次の塩基に特異的な標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰｓ）を用いた一塩基伸長反応のテンプレートとして機能させる。読み取りは蛍光でも、ＥＬＩＳＡをベースとするものでもよい。シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション、および一塩基伸長の成功によってもたらされた組み換え遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
【０１５５】
別の方法は、Winge（Innov. Pharma. Tech. 00: 18-24, 2000）に記載のピロシーケンシング技術であるこの方法では、隣のゲノムＤＮＡおよびインサートＤＮＡ接合部に重なるオリゴヌクレオチドを設計する。オリゴヌクレオチドを目的の領域の一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズさせ（１つのプライマーが挿入配列で、１つが隣接ゲノム配列）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホスルフェートおよびルシフェリンの存在下でインキュベートする。ＤＮＴＰｓを個別に添加し、その導入が光シグナルもたらし、それを測定する。光シグナルは、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一または複数塩基の伸長の成功に基づく組み換え遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
【０１５６】
Chen, et al.（Genome Res. 9:492- 498, 1999）に記載の蛍光偏光法は、本発明のアンプリコンの検出に使用可能な方法である。この方法を用いて、隣のゲノムＤＮＡおよびインサートＤＮＡ接合部に重なるオリゴヌクレオチドを設計する。オリゴヌクレオチドを目的の領域の一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズさせ（１つのプライマーが挿入ＤＮＡ配列で、１つが隣接ゲノムＤＮＡ配列）、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートする。一塩基伸長はｄｄＮＴＰの取り込みをもたらす。取り込みは偏光の変化として蛍光光度計を用いて測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション、および単一塩基伸長の成功に基づく組み換え遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
【０１５７】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（カリフォルニア州、フォスターシティー、ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）は、ＤＮＡ配列の存在の検出および定量のための方法として公表されており、製造者の提供する説明書から完全に理解できるものである。簡単に言うと、ゲノムの隣接部およびインサートＤＮＡ接合部に重なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（１つのプライマーが挿入ＤＮＡ配列内で、１つが隣接ゲノムＤＮＡ配列内）を熱安定ポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓの存在下でサイクル化する。ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションは、ＦＲＥＴプローブ上のクエンチング部分からの蛍光部分の開裂と放出をもたらす。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功に基づく組み換え遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
【０１５８】
分子ビーコンの配列検出における使用は、Tyangi, et al.（Nature Biotech.U:303-308, 1996）に記載されている。簡単に言うと、隣接ゲノムおよびインサートＤＮＡ接合部に重なるＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブを設計する。ＦＲＥＴプローブの固有の構造は、その蛍光部分とクエンチング部分とが近接した状態を保つ二次構造を含有するようにする。ＦＲＥＴプローブおよびＰＣＲプライマー（１つのプライマーが挿入ＤＮＡ配列内で、１つが隣接ゲノムＤＮＡ配列内）を熱安定ポリメラーゼおよびｄＮＴＰｓの存在下でサイクル化する。ＰＣＲ増幅の成功に続くＦＲＥＴプローブの標的配列へのハイブリダイゼーションは、プローブの二次構造および蛍光部分とクエンチング部分との空間分離の除去をもたらす。そして蛍光シグナルが得られる。蛍光シグナルは、増幅およびハイブリダイゼーションの成功に基づく隣接／組み換え遺伝子インサート配列の存在を示す。
【０１５９】
ＤＮＡ増幅方法に基づくＤＮＡ検出キットは、標的ＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、適切な反応条件下において指標となるアンプリコンを増幅するＤＮＡプライマー分子を含む。キットは、アガロースゲルに基づく検出方法または指標となるアンプリコンを検出するための公知の任意の数の方法を提供してもよい。ＤＮＡ検出キットは、本明細書に記載した組成物を用いて開発し、それを試料中のタバコ・イベントＤＮＡの同定に有用でありイベントＤＮＡを含むタバコ植物の育種方法に適用することもできる。
【０１６０】
本発明は、イベントＤＮＡを含むタバコ植物由来のＤＮＡの存在を試料中から検出するためのプライマーまたはプローブとして使用可能な例示的なＤＮＡ分子を提供する。このようなプライマーまたはプローブは、標的核酸配列に特異的であり、それ故に本明細書に記載の方法によるタバコ・イベント核酸配列の同定に有用である。
【０１６１】
上述したように、本発明のプローブおよびプライマーは、標的配列と完全な同一性を有してもよいが、標的配列とは異なるが、標的配列に優先的にハイブリダイズする能力を保持するプライマーおよびプローブの設計は可能である。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するためには、使用する特定の溶媒および塩濃度において、安定な二本鎖構造を形成するに足る十分な相補性を示す配列であればよい。任意の公知の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅方法を、試料中のタバコ・イベントにおけるトランスジェニックＤＮＡの存在を同定するために使用することができる。プローブおよびプライマーの長さは、通常、少なくとも約１１ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、または少なくとも約３０ヌクレオチドまたはそれ以上である。このようなプローブおよびプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下において標的ＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする。
【０１６２】
特定の態様において、プライマーまたはプローブの長さは、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、または少なくとも４０ヌクレオチドである（例：配列番号１〜１９に１００％相補的である）。
【０１６３】
一般的なストリンジェンシーの条件は、Sambrook et al, 1989およびHaymes et al, Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press, Washington, DC (1985)に記載されている。
【０１６４】
熱増幅方法を含む当業者に知られる任意の数の方法を、本願で開示するＤＮＡ分子またはその断片の単離および操作に使用することができる。ＤＮＡ分子またはその断片はまた、自動オリゴヌクレオチドシンセサイザーで一般的に実施される化学的手段による直接合成等の他の技術によっても得ることができる。したがって、本明細書で提供するＤＮＡ分子および対応するヌクレオチド配列は、種々の用途の中でも、タバコ・イベントの同定、タバコ・イベントを含む植物品種またはハイブリッドの選抜、試料中のトランスジェニックタバコ・イベント由来ＤＮＡの存在の検出、および試料中のタバコ・イベントまたはイベントを含むタバコ植物から誘導した植物部分の存在および／または不存在のモニタリングに有用である。
【０１６５】
よって、本発明の一態様によると、改善された農業的性質を有する植物を製造する方法であって、
（ａ）イベントを含む植物を、育種プログラムおよび／または遺伝子組み換えおよび／またはゲノム編集に付し、
（ｂ）改善された農業的性質を示す植物を選抜する、
ことを含む方法が提供される。
【０１６６】
トランスジェニック形質転換およびゲノム編集技術は、当業者に広く知られている。同定に使用する技術にかかわらず、一旦、プロコラーゲン発現子孫が同定されると、このような植物は、その発現を最大にする条件下で栽培される。核酸またはタンパク質プローブ（例：抗体）を用いて外因性ｍＲＮＡおよび／またはポリペプチドの存在を確定することで、形質転換植物によってもたらされる子孫も選抜することが可能である。後者のアプローチは、（例えば、分画した植物抽出物のプロービングによって）発現ポリペプチド成分の局在化を可能にし、よって、正しいプロセッシングおよびアセンブリを実証する。
【０１６７】
このような植物の栽培に続き、典型的にはプロコラーゲンを収穫する。成熟した植物組織／細胞を収穫し、そして当業界で知られる任意の生化学的手法を用いてプロコラーゲン分子を単離する。
【０１６８】
よって、本発明の一態様によると、
（ａ）イベントを含む植物を栽培し、
（ｂ）前記植物からプロコラーゲンを単離する
ことを含む、プロコラーゲンの製造方法が提供される。
【０１６９】
本明細書に記載の方法によって得ることができるプロコラーゲンも提供する。
【０１７０】
選抜した栽培品種の要求に応じて植物を生育させることができる点に留意されたい。例えば、本発明者らは、イベントを含み、且つ１２〜３６℃の温度範囲で高収率プロコラーゲン産生（上述した通り、例えば、６０ｍｇ／植物超）が可能なハイブリッドを作製することができた。
【０１７１】
従って、本発明の実施形態は、プロコラーゲンの精製方法も提供する。
【０１７２】
当該方法は、プロコラーゲン調製物（単離プロコラーゲン産物）を提供し、プロコラーゲンを精製する。
【０１７３】
プロコラーゲンは、当業界で知られる任意のタンパク質精製技術を用いて、完全に精製しても、部分精製でもよい。このような方法は、典型的にはサイズ、電荷または結合親和性による精製である。
【０１７４】
一実施形態によると、プロコラーゲンは、プロコラーゲン含有組成物に含まれ、その少なくとも０．１％、少なくとも０．２５％、少なくとも０．５％、少なくとも１％、少なくとも２．５％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９９％または１００％がプロコラーゲンである。プロコラーゲン組成物に含まれる他の成分に特に限定はないが、コラーゲン、ヒアルロン酸、アルギン酸塩、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、酸化セルロース、セルロースウイスカーズおよびでんぷんが挙げられる。
【０１７５】
本明細書における「精製」とは、天然の環境または組み換えホスト内の蓄積部位からタンパク質と単離することを意味する。小分子からの分離は、典型的には、セルロースメンブランなどを用いる透析によって行う。ゲルろ過クロマトグラフィーは、より排除性の高い技術として典型的には使用される。代わりに、または追加として、硫酸アンモニウム等による、典型的にはタンパク質精製、例えば、フィブリノーゲンの沈殿、に使用する塩析を用いる。さらに代わりに、または追加として、イオン交換クロマトグラフィーを用い、プロコラーゲンをその正味電荷に基づき分離する。アフィニティークロマトグラフィーも目的タンパク質の単離のための強力なアプローチである。より具体的には、抗体を用いるか、または特定の化学基に対するタンパク質の天然の引力に基づく親和性結合方法である。
【０１７６】
本発明のプロコラーゲンを精製または半精製するための例示的な方法は、後述する実施例に詳細に記載する。
【０１７７】
プロコラーゲンはさらにコラーゲンに処理されてもよい。
【０１７８】
本明細書における「コラーゲン」は、三重らせん構造を有し、且つ繰り返しＧｌｙ−Ｘ−Ｙトリプレット（但し、ＸおよびＹは任意のアミノ酸でよいが、多くの場合、イミノ酸、即ち、プロリンおよびヒドロキシプロリンである）を含むポリペプチドに関連する。本発明によると、コラーゲンはＮプロペプチドおよびＣプロペプチドを除いたＩ型コラーゲンである。
【０１７９】
当該コラーゲンは、テロコラーゲンまたはアテロコラーゲンでもよい。
【０１８０】
一実施形態によれば、本発明のコラーゲンはテロペプチドを十分に含んでおり、適切な条件下で原線維を形成することができるようになっている。
【０１８１】
従って、例えば、コラーゲンはアテロコラーゲン、テロコラーゲン又はプロコラーゲンとすることができる。
【０１８２】
本明細書で使用する「アテロコラーゲン」という用語は、プロコラーゲンに通常含まれるＮ末端及びＣ末端プロペプチドの両方を欠いているが、適切な条件下で原線維を形成することができるようにテロペプチドを十分に含むコラーゲン分子を意味する。
【０１８３】
本明細書で使用する「テロコラーゲン」という用語は、プロコラーゲンに通常含まれるＮ末端及びＣ末端プロペプチドの両方を欠いているが、テロペプチドを含むコラーゲン分子を意味する。線維性コラーゲンのテロペプチドは、天然のＮ／Ｃプロテイナーゼによる消化後のＮ末端及びＣ末端プロペプチドのレムナントである。
【０１８４】
コラーゲンを含む組み換えプロペプチドまたはテロペプチドを正しく開裂することのできるプロテアーゼは当業界で知られている。これらにはある種の植物由来プロテアーゼ、例えばフィシン（ＥＣ  ３．４．２２．３）、およびある種の細菌由来プロテアーゼ、例えばスブチリシン（ＥＣ  ３．４．２１．６２）やニュートラーゼ（ｎｅｕｔｒａｓｅ）が挙げられる。
【０１８５】
プロコラーゲンまたはテロコラーゲンを、プロテアーゼがプロペプチドまたはテロペプチドを開裂できる条件下でプロテアーゼと接触させる。典型的には、選択した特定のプロテアーゼに基づき条件を決定する。よって、例えば、プロコラーゲンをプロテアーゼと共に最大１５時間、濃度１〜２５ｍｇ／ｍｌおよび温度約１０〜２０℃の条件でインキュベートすることができる。
【０１８６】
プロテアーゼ消化に続き、作製したアテロコラーゲンを、例えば、ＷＯ２００９／０５３９８５に記載のように塩析でさらに精製して、最終産物を、植物または植物細胞から作製したプロコラーゲンをニュートラーゼ、スブチリシン、フィシンおよび組み換えヒトトリプシンからなる群より選んだプロテアーゼによって処理したアテロコラーゲンの精製組成物とし、それを当業界で公知の方法（例：クーマシー染色、ウエスタン解析等によるサイズの解析）で解析する。
【０１８７】
精製に続き、アテロコラーゲンに酸性溶液（例：１０ｍＭのＨＣｌ）を添加して再可溶化してもよい。このような酸性溶液は精製アテロコラーゲンの保存に有用である。
【０１８８】
例えば、フィシンによる消化に続き、アテロコラーゲンは、上記酸性溶液の中和の際に原繊維を形成する能力を維持している。一実施形態によると、本発明の方法によって作製した精製および再可溶化したアテロコラーゲンの少なくとも７０％が原繊維を形成可能である。一実施形態によると、本発明の方法によって作製した精製および再可溶化したアテロコラーゲンの少なくとも９０％が原繊維を形成可能である。
【０１８９】
原繊維形成能は、作製したアテロコラーゲンが医薬用途に有用であることを示し、医薬用途としては、美容整形、火傷患者の治療補助、骨再生および広範にわたる歯科、整形外科および外科的目的が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【０１９０】
他の実施形態において、コラーゲンは、上述した複数の種類のコラーゲンおよび／またはプロコラーゲンの混合物である。
【０１９１】
製造方法にかかわらず、一度プロコラーゲンまたはコラーゲンを入手したら、対象にそのまま、または医薬組成物として、または医療機器によって投与することができる。
【０１９２】
本明細書で使用される「医薬組成物」とは、本明細書の記載した１種または複数種の活性材料と共に、生理学的に適切な担体や賦形剤等の他の化学成分を含む、製剤を意味する。医薬組成物の目的は、生物への活性材料（例：プロコラーゲン）の投与を容易にすることである。
【０１９３】
本明細書では、用語「活性材料」は、意図する生物学的効果（即ち、創傷治癒の促進および線維症の治療）を担うプロコラーゲンまたはコラーゲンである。
【０１９４】
以下、互換的に使用することができる「生理学的に許容し得る担体」と「薬学的に許容し得る担体」という語句は、生物に対して大きな刺激を引き起こさず、投与された化合物の生物活性及び特性を無効にしない担体又は希釈剤を意味する。アジュバントはこれらの語句に含まれる。
【０１９５】
本明細書において、「賦形剤」は、医薬組成物に添加されて本発明の有効成分の投与をさらに容易にする、不活性な物質を指す。
【０１９６】
薬剤の処方および投与のための技術は“Remington’s Pharmaceutical Sciences” Mack Publishing Co., Easton, PAの最新版に見出すことが可能であり、その内容は、本記載をもって本願に組み込まれたものとする。
【０１９７】
医薬組成物は単位剤形に処方することができる。このような形状においては、製剤は、適量の、例えば単回投与に適した、活性材料を含む単位投与量に細分する。単位剤形はパッケージ化された製剤でもよく、パッケージには個別の量の製剤、例えば、粘着包帯、非粘着性の包帯、ふき取りシート（ｗｉｐｅ）、乳児用ふき取りシート（ｂａｂｙ  ｗｉｐｅ）、ガーゼ、パッドおよび衛生用パッドを含む。
【０１９８】
本発明の医薬組成物は、局所的に適用する、例えば、対象の組織領域（例：傷）への組成物の直接投与を行ってもよい。医薬組成物の投与の適切な経路としては、例えば、局所（例：皮膚、毛髪、爪、頭皮等の角質組織）、皮下、粘膜（例：校内、膣内、眼内、筋肉内への投与が挙げられる。
【０１９９】
本発明の医薬組成物は、活性材料および生理学的に許容される担体を含む組成物を注射によって投与することもできる。局所投与のためには、組成物を傷および／または傷ついた組織の周りの健康な組織（例：皮膚）、あるいはその両方、例えば、皮下、に注射することができる。
【０２００】
本発明の医薬組成物は当業界で公知の方法、例えば、公知の混合、溶解、顆粒化、糖衣化、湿式粉砕、乳状化、カプセル化、捕捉化または凍結乾燥のための工程によって製造することができる。
【０２０１】
活性材料は、適切なベヒクル、例えば、滅菌済み、パイロジェンフリーの水性溶液で使用前に構成することのできる粉末状でもよい。
【０２０２】
本発明にしたがって使用する医薬組成物は、活性材料を製剤にする工程を容易にする、賦形剤および補助剤を含む生理学的に許容される担体の１種または複数種を用いて公知の方法で処方することができる。正しい処方は選択する投与方法に依存する。
【０２０３】
治療的有効量の決定は、特に本明細書の詳細の開示に基づけば、当業者の能力の範囲内である。治療は、例えば、大量の傷組織が形成される前（傷ついた組織に繊維芽細胞が招集される前など）に実施することができる。しかし、本発明は、任意の他の治癒段階でプロコラーゲンまたはコラーゲンを投与することも想定する。
【０２０４】
本発明の方法に使用する任意の製剤において、治療的有効量または投与量は、初めにｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイによって概算することができる。さらに投与量は、所望の濃度または力価を達成するように、組織培養系または動物モデルで処方することもできる。動物モデルは投与基準を確立するために使用してもよい。例えば、糖尿病のラットまたはマウスの創傷モデルを使用することができる［Galeano et al., Diabetes. (2004) 53(9):2509-17］。還流と生存といった評価項目以外にも、組織学的および機能的な基準を、種々のパラメーターの効能を求めて、最適な効率を達成するために使用することができる。
【０２０５】
このような情報は、ヒトに有用な投与量をより正確に決定するために使用することができる。
【０２０６】
本明細書に記載のペプチドの毒性および治療的有効性は、培養細胞または実験動物に対する標準的な薬学的手法によって決定することができる。このようなｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび培養細胞アッセイおよび動物実験で得られるデータは、ヒトに用いる投与量の範囲を設計するために使用することができる。投与量は、使用する投与形態および用いる投与経路によって変化しうる。正確な処方、投与経路および投与量は、患者の状態を鑑みて個別の医師が選択することができる（例えば、Fingl et al., 1975 (1975), "The Pharmacological Basis of Therapeutics," Ch. 1, p.1.参照）。
【０２０７】
病状の重症度(例：傷または痣の面積、深さおよび程度)および皮膚の反応性に基づき、投与は単回でも複数回でもよく、治療の日程は数日から数週間、または治療が見られるまで、または病状の消失が達成されるまでにわたる。例示的な実施形態においては、本発明の医薬組成物は少なくとも１日１回投与する。
【０２０８】
組成物の投与量は、当然のことながら、治療を受ける対象、傷の重症度、投与方法、担当医の判断等に依存する。
【０２０９】
本発明の組成物は、所望により、活性成分を含む１種以上の単位剤形を含むことが可能なＦＤＡ承認キット等のパック又はディスペンサーデバイスとして提供することができる。パックは、例えば、ブリスターパック等の金属又はプラスチック箔を含むことができる。パック又はディスペンサーデバイスには投与用説明書を添付することができる。パック又はディスペンサーには、医薬品の製造、使用又は販売を規制する政府機関によって定められた形式の容器に関連する通知を添付することもでき、この通知は、組成物の形態やヒト又は動物への投与に関する機関による承認を反映している。このような通知は、例えば、処方薬に関して米国食品医薬品局によって承認された標識、又は承認された製品の添付文書に関するものとすることができる。上で更に詳述したように、適合性のある医薬担体で処方した本発明の調製物を含む組成物を調製し、適切な容器に入れ、示された病態の治療用に標識することもできる。
【０２１０】
本発明の医薬組成物はｉｎ  ｖｉｖｏで使用されるため、組成物は高純度であり且つ有害になり得る汚染物を含まない、例えば、少なくとも国際食品（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄ）（ＮＦ）グレードであり、通常は少なくとも解析グレードであり、好ましくは医薬グレードである。与えられた化合物はその使用前に合成されていなければならないが、この限りにおいて、このような合成またはその後の精製は、合成または精製の過程において使用され得る任意の汚染し得る毒性物質を実質的に含まない製品をもたらすことが好ましい。
【０２１１】
治療効果を高めるために、本発明の医薬組成物に追加の薬剤を加えてもよい。傷の治癒の促進、繊維症の治療および／または血管新生の促進のための薬剤をプロコラーゲンまたはコラーゲンと共に単一の組成物（例：単一の容器に）に処方することができる。あるいは所望により、個別の容器に入れるか、製造品に加えて、使用説明書を添付する。このような薬剤としては、以下が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
細胞外マトリクス成分（例：ビトロネクチン、ラミニン、コラーゲン、エラスチン）、成長因子（例：ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＩＧＦ１、ＩＧＦ２、ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＫＧＦ、ＨＧＦ、ＶＥＧＦ、ＳＤＦ−１、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＴＧＦａｌｐｈａ、ＴＧＦ ｂｅｔａ、ＮＧＦ、ＰＤＷＨＦおよびＥＣＧＦ）、
低酸素誘導因子（例：ＨＩＦ−１アルファとベータおよびＨＩＦ−２）、
ホルモン（例：インスリン、成長ホルモン（ＧＨ）、ＣＲＨ、レプチン、プロラクチン、オキサンドロロンおよびＴＳＨ）、
血管新生因子（例：アンジオゲニンおよびアンジオポイエチン）、
凝固因子および抗凝固因子（例：第Ｉ因子、第ＸＩＩＩ因子、組織因子、カルシウム、ｖＷＦ、タンパク質Ｃ、タンパク質Ｓ、タンパク質Ｚ、フィブリノネクチン、アンチトロンビン、ヘパリン、プラスミノーゲン、低分子量ヘパリン（クレキサン（Ｃｌｉｘａｎ））、高分子量キニノーゲン（ＨＭＷＫ）、プレカリクレイン、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター１（ＰＡＩ１）、プラスミノーゲンアクチベーターインヒビター２（ＰＡＩ２）、ウロキナーゼ、トロンボモジュリン、組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔＰＡ）、アルファ２−アンチプラスミンおよびタンパク質Ｚ関連プロテアーゼ阻害剤（ＺＰＩ））、
サイトカイン（ＩＬ−１アルファ、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３およびＩＦＮアルファ、ＩＦＮベータおよびＩＦＮガンマ）、
骨形成タンパク質（ＢＭＰｓ）、
ケモカイン（例：ＭＣＰ−１またはＣＣＬ２）、
酵素（例：エンドグリコシダーゼ、エクソグリコシダーゼ、エンドヌークレアーゼ、エクソエンドヌークレアーゼ、ペプチダーゼ、リパーゼ、オキシダーゼ、デカルボキシラーゼ、ヒドラーゼ、コンドロイチナーゼ、コンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、ヒアルロニダーゼ、ケラタナーゼ、ヘパラナーゼ、ヘパラナーゼ・スプライス・バリアント、コラーゲナーゼ、トリプシン、カタラーゼ）、
神経伝達物質（例：アセチルコリンおよびモノアミン）、神経ペプチド（例：物質Ｐ）、
ビタミン（例：Ｄ−ビオチン、塩化コリン、葉酸、ミオイノシトール、ナイアシンアミド、Ｄ−パントテン酸、カルシウム塩、ピリドキサールＨＣｌ、ピロドキシンＨＣｌ、リボフラビン、チアミンＨＣｌ、ビタミンＢ１２、ビタミンＥ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＢ１−６、ビタミンＫ、ビタミンＡおよびビタミンＰＰ）、
炭水化物（例：グルコース、マンノース、マルトースおよび果糖といった単糖／二糖／多糖類）、
イオン類、キレート化剤（例：Ｆｅキレート化剤、Ｃａキレート化剤）、
抗酸化剤（例：ビタミンＥ、ケルセチン、スーパーオキシドスキャベンジャー、スーパーオキシドジスムターゼ、Ｈ２Ｏ２スキャベンジャー、フリーラジカルスキャベンジャー、Ｆｅスキャベンジャー）、
脂肪酸（例：トリグリセリド、リン脂質、コレステロール、遊離脂肪酸および非遊離脂肪酸、脂肪アルコール、リノレイン酸、オレイン酸およびリポ酸）、
抗体（例：ペニシリン、セファロスポリンおよびテトラサイクリン）、
鎮痛剤、麻酔剤、抗細菌剤、抗酵母剤、抗真菌剤、抗ウイルス剤、プロバイオティック薬剤、抗原虫剤、鎮痒薬、抗皮膚炎薬、制吐薬、抗炎症薬、抗角化症薬（ａｎｔｉｈｙｐｅｒｋｅｒａｔｏｌｙｉｃ  ａｇｅｎｔｓ）、発汗抑制剤、抗乾癬薬、抗脂漏薬、抗ヒスタミン薬、
アミノ酸（例：必須および非必須アミノ酸、特にグルタミンおよびアルギニン）、
硫酸塩（例：硫酸カルシウム）、
ステロイド（例：アンドロゲン、エストロゲン、プロゲスターゲン、グルココルチコイドおよびミネラルコルチコイド）、カテコールアミン（例：エプネフリンおよびノルエピネフリン）、ヌクレオシドおよびヌクレオチド（例：プリンおよびピリミジン）、
プロスタグランジン（例：プロスタグランジンＥ２）、ロイコトリエン、エリスロポイエチン（例：トロンボポイエチン）、プロテオグリカン（例：ヘパラン硫酸、ケラタン硫酸）、
ヒドロキシアパタイト（例：ヒドロキシアパタイト（Ｃａ１０（ＰＯ４）６（ＯＨ）２））、
ハプトグロブリン（Ｈｐ１−１、Ｈｐ２−２およびＨｐ１−２）、
スーパーオキシドジスムーターゼ（例：ＳＯＤ１／２／３）、
一酸化窒素、一酸化窒素ドナー（例：ニトロプルシド、米国、ミズーリ−州、セントルイス、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、
グルタチオンペルオキシダーゼ、水和化合物（例：バソプレシン）、
細胞（例：血小板）、細胞培地（例：Ｍ１９９、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＲＰＭＩ、イスコーブ）、
血清血清（例：ヒト血清、ウシ胎仔血清、ウシ胎仔血清）、
バッファー（例：ＨＥＰＥＳ、重炭酸ナトリウム）、洗浄剤（例：Ｔｗｅｅｎ）、殺菌剤、
ハーブ類、果物抽出物、野菜抽出物（例：キャベツ、キュウリ）、花抽出物、植物抽出物、
フラビノイド（例：ザクロジュース）、スパイス、葉類（例：緑茶、カモミール）、ポリフェノール（例：赤ワイン）、はちみつ、レクチン、
微粒子、ナノ粒子（リポソーム）、ミセル、炭酸カルシウム（ＣａＣＯ３、例：沈殿炭酸カルシウム、粉砕した炭酸カルシウム、アルバカー（ａｌｂａｃａｒ）、ＰＣＣ、ＧＣＣ）、カルサイト、石灰岩、大理石粉末、石灰岩粉末、石灰およびチョーク（例：白墨、シャンパーニュ産チョーク、フランス産チョーク）。
【０２１２】
本組成物は、水素、アルキル基、アリール基、ハロゲン、ヒドロキシル基、アルコキシ基、アルキルアミノ基、ジアルキルアミノ基、アシル基、カルボキシル基、カルボアミド基、スルフォンアミド基、アミノアシル基、アミド基、アミノ基、ニトロ基、有機セレン化合物、炭化水素および環状炭化水素を含む、原料、物質、元素または材料をさらに含んでもよい。
【０２１３】
本組成物は他の物質、例えば、過酸化ベンゾイル、血管収縮剤、血管拡張剤、サリチル酸、レチノイン酸、アザライン酸、乳酸、グリコール酸、ピルビン酸、タンニン、ベンジリデン樟脳（ｂｅｎｚｌｉｄｅｎｅｃａｍｐｈｏｒ）およびその誘導体、アルファヒドロキシイソ界面活性剤（ａｌｐｈａ  ｈｙｄｒｏｘｙｉｓ，  ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ）と組み合わせてもよい。
【０２１４】
本発明のいくつかの実施形態における組成物は、ポリエチレングリコール（例：ＰＥＧ、ＳＥ−ＰＥＧ）と生体共役反応により結合してもよい。ポリエチレングリコールは、活性材料の（例：プロテアーゼ活性に対する）安定性および／または（例：血液、消化液等の生物流体中の）溶解性を保持しながら、その生物活性を保存し、半減期を延ばすことができる。
【０２１５】
本発明の組成物は、パテ、軟膏、吸入剤、織／不織パッド、包帯、スポンジ、ゲルまたはハイドロゲルに処方する（例えば、ゼラチンやヒアルロン酸と共に処方する）、あるいはポリアクリレートまたはオレオゲル（例：水とユーセリンで作られたもの）を基材として処方することもできる。
【０２１６】
水相および油相の両方を含むオレオゲルは、具体的には、羊毛蝋アルコールとパラフィンの主成分とするユーセリヌム・アンヒドリクム（Ｅｕｃｅｒｉｎｕｍ  ａｎｈｙｄｒｉｃｕｍ）に基づくものであり、その水のパーセンテージおよび主原料は異なってもよい。さらに粘度に影響する追加の親油性成分、例えば、グリセリン、種々の鎖長さのポリエチレングリコール（例：ＰＥＧ４００）、アーモンド油等の植物油、液状パラフィン、中性油等を添加してもよい。本発明のハイドロゲルはゲル形成剤と水を用いて製造することができ、ゲル形成剤は、特にセルロースエステル等のセルロース誘導体およびヒドロキシエチルヒドロキシプロピル誘導体（例：チロース）等のエーテルといった天然の産物、あるいはカルボポールやカルボマー等（例：Ｐ９３４、Ｐ９４０、Ｐ９４１）のポリアクリル酸誘導体といった合成製品からも選択される。これらは公知の規定に基づき、アルコール懸濁液にゲル形成用基材を添加することで製造または重合することができる。
【０２１７】
ゲル中のプロコラーゲンの例示的な量としては、ゲル１００ｇ当たり０．０１〜３０ｇ、ゲル１００ｇ当たり０．０１〜１０ｇ、ゲル１００ｇ当たり０．０１〜８ｇ、ゲル１００ｇ当たり０．１〜５ｇが挙げられる。
【０２１８】
さらに、本発明の本態様における医薬組成物は、皮膚科学的に許容される担体も含む。
【０２１９】
「皮膚科学的に許容される担体」という表現は、皮膚、即ち、角質組織、への局所投与に適した担体であって、優れた審美的特性を有し、本発明の活性剤および任意の他の成分と共存可能であり、且つ哺乳類にとって安全で毒性のないものを示す。
【０２２０】
活性剤の経皮的吸収を増強するためには、１種または複数の種様々な薬剤を医薬組成物に添加することができる。このような薬剤としては、ジメチルスルホキシド、ジメチルアセタミド、ジメチルホルムアミド、界面活性剤、アゾン、アルコール、アセトン、プロピレングリコールおよびポリエチレングリコールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２２１】
本発明の組成物に使用する担体は、広範囲にわたる形態をとることができる。具体例には乳状担体が含まれ、このような担体としてはｏ／ｗ型、ｗ／ｏ型、ｗ／ｏ／ｗ型およびｏ／ｗ／シリコーン型のエマルション、クリーム、軟膏、水溶液、ローション、石鹸、ペースト、エマルション、ゲル、スプレー、フォーム、またはエアゾールが挙げられるが、これらに限定されるものではない。当業者には理解されるように、組成部中の成分の水溶解性／分散性に応じて、与えられ成分は主としては水相または油/シリコーン相に分配される。
【０２２２】
本発明におけるエマルションは、通常、薬学的に効果的な量の本願で開示する薬剤と、脂質または油とを含む。脂質および油は動物、植物、または石油由来でもよいし、天然または合成（即ち、人の製造したもの）でもよい。適切な乳状化剤の例は、例えば、米国特許第３，７５５，５６０号（１９７３年８月２８日にDickert, et al.に付与）、米国特許第４，４２１，７６９号（１９８３年１２月２０日にDixon, et al.に付与）、およびMcCutcheon's Detergents and Emulsifiers, North American Edition, pages 317-324 (1986)に記載されており、各文献の開示は本参照をもって本明細書に援用する。
【０２２３】
エマルションは、角質組織に投与したときの泡立ちを最小に抑えるための消泡剤をさらに含んでもよい。消泡剤としては、高分子量シリコーンおよびこのような目的で当業界で使用される他の材料が挙げられる。
【０２２４】
ｏ／ｗ型エマルションを含む適切な担体の例は、米国特許第５，０７３，３７１（Turner, D. J. et al.に対して１９９１年１２月１７日に発行）および米国特許第５，０７３，３７２（Turner, D. J. et al.に対して１９９１年１２月１７日に発行）に記載されており、各文献の開示は本参照をもって本明細書に援用する。構造化剤、親水性界面活性剤および水を含む特に好ましいｏ／ｗ型エマルションについては後述する。
【０２２５】
好ましいｏ／ｗ型エマルションは、液晶ゲル網目構造の形成を補助する構造化剤を含む。論理によって縛られるものではないが、構造化剤は組成物にレオロジー特性を付与するのを補助し、組成物の安定性に貢献する。構造化剤は乳状化剤または界面活性剤としても機能し得る。
【０２２６】
多種にわたるアニオン界面活性剤も本発明に使用することができる。例えば、米国特許第3,929,678号（Laughlin et al.に対して１９７５年１２月３０日に発行）を参照。当文献の開示は本参照をもって本明細書に援用する。さらに両性又は双性界面活性剤も本発明に使用することができる。
【０２２７】
本発明の医薬組成物は、製薬および化粧業界において皮膚への投与に使用される任意の種々の形態に処方することが可能であり、このような形態としては後述する溶液、ローション、スプレー、クリーム、軟膏、膏薬、ゲル、油、洗浄剤が挙げられる。
【０２２８】
本発明の医薬または化粧用組成物は、処置した皮膚部分に残り、容易に蒸発せず、および／または水ですすいでも容易には除去されず、石鹸、クレンザーおよび／またはシャンプーの補助によって除去可能にするために十分な粘性を示すように処方してもよい。
【０２２９】
上記性質を有する組成物は当業者によく知られており、Remington's Pharmaceutical Sciences, 1990 (supra)、およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed., Williams & Wilkins (1995)に詳細に記載されている。
【０２３０】
本発明の局所用組成物としては、ローションおよびクリームが挙げられるが、これらに限定されるものではなく、これらは皮膚科学的に許容される保湿剤を含んでもよい。本明細書における「保湿剤」とは、乾燥の予防または緩和に有用であるだけでなく、防止にも有用な材料を意味する。種々の適切な保湿剤が知られており、本発明において使用することができる。例えば、Sagarin, Cosmetics, Science and Technology, 2nd Edition, Vol. 1, pp. 3243 (1972)を参照されたい。当該文献には保湿剤として適切な材料が数多く例示されており、本参照をもってそれを本明細書に援用する。好ましい保湿剤はグリセリンである。
【０２３１】
本発明におけるローションおよびクリームは、通常、溶液担体系（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｓｙｓｔｅｍ）および１種以上の保湿剤を含む。
【０２３２】
本発明の局所投与する医薬または化粧用組成物には、例えば、医薬または化粧用組成物に香りや皮膚栄養因子を追加するために追加成分を添加してもよい。
【０２３３】
このような成分は、ヒト角質組織における使用に適当として、健全な医薬判断の範囲内で、毒性、不適応、不安定、アレルギー応答を誘導しないものから選択されたものである。さらにこのような任意の成分は、本初性の活性化合物の利点を許容できない程に変化させない限り、有用である。
【０２３４】
ＣＴＦＡ  Ｃｏｓｍｅｔｉｃ  Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ  （１９９２）は、本発明の組成物における使用に適した、スキンケア業界で使用される広範囲にわたる、非限定的な化粧材料を開示する。このような材料の分類の例としては、研磨剤、吸収剤、香料といった審美成分、顔料、色素／着色剤、エッセンシャルオイル、皮膚感覚惹起剤、収れん剤（例：丁子油、メントール、カンファー、ユーカリオイル、オイゲノール、乳酸メンチルエステル、ウィッチヘーゼル蒸留物）、抗ニキビ薬、固結防止剤、消泡剤、抗微生物剤（例：ヨードプロピルブチルカルバメート）、抗酸化剤、バインダー、生物学的添加剤、緩衝剤、嵩高剤、キレート化剤、化学添加物、着色剤、化粧用収れん剤、化粧用殺生物剤、変性剤、医薬用収れん剤、外用鎮痛剤、組成物のフィルム形成能および持続性を補助するためのフィルム形成剤または材料（例：ポリマー）（例：エイコセンとビニルピロリドンとの共重合体）、乳白剤、ｐＨ調節剤、推進薬、還元剤、捕捉剤、皮膚調整剤（例：多目的および閉塞性の浸潤剤）、皮膚沈静化および／または治癒剤（例：パンテノールおよびエチルパンテノールなどの誘導体）、アロエベラ、パントテン酸およびその誘導体、アラントイン、ビサボロールおよびグリチルリチン酸二カリウム（ｄｉｐｏｔａｓｓｉｕｍ  ｇｌｙｃｙｆｆｈｉｚｉｎａｔｅ）、皮膚処置剤、増粘剤、およびビタミンとその誘導体が挙げられる。
【０２３５】
本発明のプロコラーゲンは、化粧品会社がすでに開発したまたは開発中の製品に導入することができる。化粧品会社としては、エスティーローダー、ヘレナルビンスタインおよびロレアルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３６】
本発明の医薬または化粧用組成物は直接皮膚に投与することができる。代わりに、当業界で知られている種々の経皮薬剤送達システム、例えば、時間に応じて組成物を皮膚に報酬する経皮パッチ、を用いた正常な皮膚投与によって送達することもできる。当業界で知られている他の薬剤送達システムとしては、加圧エアロゾルボトル、イオン泳動または音波泳動が挙げられる。イオン泳動は、皮膚の透過性を高め、経皮送達を容易にするために使用される。米国特許第５，６６７，４８７号および第５，６５８，２４７号は、皮膚を介した治療薬の超音波−イオン泳動仲介移動に適したイオン音波装置（ｉｏｎｏｓｏｎｉｃ  ａｐｐａｒａｔｕｓ）を開示する。代わりに、または加えて、リポソームまたはミセルを送達ベヒクルとして使用することもできる。
【０２３７】
頭皮に傷や虚血が生じる場合もあるため、本発明の医薬組成物は、頭皮および毛髪に対する使用に適した保湿剤、界面活性剤および／またはコンディショナーをさらに含んでもよい。
【０２３８】
保湿剤としては、鉱物油、鉱油等の炭化水素油およびワックス、オリーブ油、パーム油、ひまし油、コーン油、ダイズ油等の植物性および動物性の油および脂肪、ラノリン、ラノリン油、ラノリンワックス、ラノリンアルコール等のラノリンおよびその誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の保湿剤としては、ミリスチン酸、ステアリン酸、イソステアリン酸、パルミチン酸といった炭素原子数10〜20の脂肪酸のエステル、具体的には、ミリスチン酸メチル、ミリスチン酸プロピル、ミリスチン酸ブチル、ステアリン酸プロピル、イソステアリン酸プロピル、パルミチン酸プロピル等が挙げられる。他の保湿剤としては、ステアリン酸、ミリスチン酸、ラウリル酸、イソステアリン酸、パルミチン酸といった炭素原子数10〜20の脂肪酸が挙げられる。保湿剤としては、セチルアルコール、ミリスチルアルコール、ラウリルアルコール、イソスステアリルアルコール、ステアリルアルコール等といった炭素原子数10〜20の脂肪アルコールもさらに挙げられる。
【０２３９】
保湿剤/界面活性剤は、毛髪に使用するための本発明の医薬組成物を処方する際に使用することが好ましい。
【０２４０】
界面活性剤の具体例としては、親水性のアルキレンオキシド、ポリエチレンオキシド、プロピレンオキシド、ブチレンオキシド、ポリエチレンオキシドまたはポリエチレングリコールと縮合可能な遊離反応性水素を有する疎水性のアルキル、アルケンまたはアルキル芳香族官能基のポリオキシアルキレンオキシド（ｓｐｏｌｙｏｘｙａｌｋｙｌｅｎｅ  ｏｘｉｄｅ）縮合産物が挙げられるが、これらに限定されるものではない。特に効果的なものは、オクチルフェノールと約７から約１３モルのエチレンオキシドとの縮合産物である、Ｒｏｈｍ  ＆  Ｈａａｓ  Ｃｏｍｐａｎｙが販売する商標ＴＲＩＴＯＮ  １００（登録商標）シリーズの製品である。
【０２４１】
香料、安定化剤、染料、抗微生物剤、抗細菌剤、抗凝固剤、紫外線吸収剤等の他の材料も、毛髪への使用用の本発明の組成物に含まれている。
【０２４２】
毛髪への使用用の本発明の組成物を安定化し、所望により増粘のために、酸加水分解に安定なコンディショナー剤、例えば少なくとも１種の四級アンモニア部分をエトキシル化モナカット（ｍｏｎｏｑｕａｔ）と共に有するシリコーン化合物、も使用されることが好ましい。
【０２４３】
組成物の審美的性質を高め、組成物の毛髪への適用を容易にするために、任意の増粘剤が含まれてもよい。例示的な増粘剤としては、メチルセルロース、ヒドロキシブチルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルエチルセルロースおよびヒドロキシエチルセルロース、ジ（水素化タロウ）フタル酸アミド、架橋マレイン酸無水物−メチルビニルエーテル共重合体、グアーガム、キサンタンガムおよびアラビアゴムが挙げられる。
【０２４４】
コンディショナー組成物の担体は大部分が水であるが、組成物の製造を容易にする、または粘度の調整といった審美的性質の付与を目的として、有機溶媒を含めることもできる。適切な溶媒としては、エチルアルコールおよびイソプロピルアルコール等の低級アルコール、２−ブトキシエタノール、エチレングリコールモノエチルエーテル、プロピレングリコールおよびジエチレングリコールモノエチルエーテルまたはモノメチルエーテル等のグリコールエーテル、これらの混合物が挙げられる。
【０２４５】
不透明なコンディショナーに使用することのできる、本発明を限定することのない調整剤としては、ステアリルトリメチルアンモニウムクロリド、ベヘントリメチルアンモニウムクロリド、セトリモニウムブロミド、ソイトリモニウムクロリド、タロウトリモニウムクロリド、二水素化タロウジメチルアンモニウムクロリド、ベヘントリメチルアンモニウムメトスルフェート、Ｐｅｇ−２オレアンモニウムクロリド、二水素化タロウジメチルアンモニウムブロミド、二水素化タロウジメチルアンモニウムメトスルフェート、パルミチルトリメチルアンモニウムクロリド、水素化タロウトリメチルアンモニウムクロリド、水素化タロウトリメチルアンモニウムブロミド、ジセチルジメチルアンモニウムクロリド、ジステアリルジメチルアンモニウムクロリド、ジパルミチジメチルアンモニウムクロリド、水素化タロウトリメチルアンモニウムメトスルフェート、セトリモニウムトシレート、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリドおよびジタロウジメチルアンモニウムクロリドが挙げられる。
【０２４６】
シャンプー処方は、頭皮の状態（例：傷害、乾癬）を処置するために時には有利である。
【０２４７】
本発明のシャンプー組成物は、液状、粉末状、ゲル状および顆粒状から必要に応じて選択した形状で提供してもよい。水または低級アルコールを溶媒として用いた液状組成物が好ましく、水を用いた液状組成物が特に好ましい。本発明の教示にしたがって使用することのできるシャンプー組成物は、さらに米国特許第６１９４３６３号および米国特許第６００７８０２号に記載されている。
【０２４８】
本発明のプロコラーゲンは、ＷＯ２００９／１２８０７６に記載のような、生体適合性および／または生分解性のポリマーベースのマトリックス、例えば、シート、フィルム、メンブラン、スポンジおよびゲル、に組み込むことができることを認識されたい。他の例示的な応用はＷＯ２０１４／１４７６２２に記載されている。
【０２４９】
本願に記載のようにして製造したコラーゲンは、組織および臓器の３Ｄバイオプリンティングに含めることができる。
【０２５０】
近年、３Ｄバイオプリンティングは、移植および組織モデリングに適した複雑なスキャフォールド、組織および臓器の需要に対応する多くの医薬用途において、より多くの支持を得ている。これまでにコラーゲンは、生物分子をプリンティングに適応させる、具体的にはバイオインク（ＢｉｏＩｎｋ）がプリンティングの最中に制御された流動性を保持し、ＵＶから可視光の範囲内の光の照射によって硬化してハイドロゲルを形成するようにするために、化学的に修飾されている。修飾コラーゲンの固有粘度およびずり減粘の特性は、インクジェット、レーザー励起前方転写法（ＬＩＦＴ）およびステレオリソグラフィーを含む、種々のプリント技術のためのバイオインクを容易に処方可能にする柔軟性を与える。化学修飾と照射エネルギーの組み合わせの制御によって、固い軟骨から柔らかな脂肪に至る天然組織の特性に適合するように、得られる足場の物理的性質を厳密の制御することが可能になる。
【０２５１】
本明細書の記載のようにして製造されたコラーゲンは、審美的および美容整形的兆候に使用することができる。このような目的において、コラーゲンは単独で、またはヒアルロン酸等の他の成分と組み合わせて、充填剤として皮膚下に注射するために使用することのできる、皮膚充填剤組成物の形成に用いることができる。
【０２５２】
本明細書で使用する「約」という用語は、±１０％を意味する。
【０２５３】
「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」という用語及びその活用形は「含んでいるが、それに限定されない」ことを意味する。
【０２５４】
「〜から成る」という用語は「含んでおり、それに限定される」ことを意味する。
【０２５５】
「〜から本質的に成る」という用語は、組成物、方法又は構造が追加の成分、段階及び／又は部分を含み得ることを意味するが、これは、追加の成分、段階及び／又は部分が、請求項に記載の組成物、方法又は構造の基本的且つ新規な特性を実質的に変更しない場合に限られる。
【０２５６】
本明細書で使用する、単数形を表す「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他を示さない限り、複数も対象とする。例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」又は「少なくとも１種の化合物」という用語の場合には、複数の化合物が含まれ、それらの混合物も含み得る。
【０２５７】
本願全体を通して、本発明の様々な実施形態は範囲形式にて示すことができる。範囲形式での記載は、単に利便性や簡潔さのためであり、本発明の範囲の柔軟性を欠く制限ではないことを理解されたい。従って、範囲の記載は可能な部分範囲の全て、及びその範囲内の個々の数値を具体的に開示していると考えるべきである。例えば、１〜６のような範囲の記載は、１〜３、１〜４、１〜５、２〜４、２〜６、３〜６等の部分範囲だけでなく、その範囲内の個々の数値、例えば、１、２、３、４、５及び６も具体的に開示していると考えるべきである。これは範囲の大きさに関わらず適用される。
【０２５８】
本明細書において数値範囲を示す場合、それは示される範囲内の任意の引用数（分数又は整数）を含むことを意図する。第１の指示数と第２の指示数「との間の範囲」という表現と、第１の指示数「から」第２の指示数「までの範囲」という表現は、本明細書で交換可能に使用され、第１の指示数及び第２の指示数と、それらの間の分数及び整数の全てを含むことを意図する。
【０２５９】
本明細書で使用する「方法」という用語は、所定の課題を達成するための様式、手段、技術及び手順を意味し、化学、薬理学、生物学、生化学及び医療の各分野の従事者に既知のもの、又は既知の様式、手段、技術及び手順から従事者が容易に開発できるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０２６０】
本明細書で使用する「治療する」という用語は、病態の進行の抑止、実質的な阻害、遅延又は逆転、病態の臨床的又は審美的症状の実質的な寛解、或いは病態の臨床的又は審美的症状の出現の実質的な予防を包含する。
【０２６１】
特定の配列表に参照する場合、そのような参考は、微少な配列の変異を含む、相補鎖に実質的に対応する配列をも包含するものと理解されたい。配列の変異は、例えばシーケンシングエラー、クローニングエラー、または塩基置換、塩基欠失もしくは塩基付加を生じる他の変化の結果であるが、但し、このような変異の頻度は５０ヌクレオチド中に１未満、または１００ヌクレオチド中に１未満、または２００ヌクレオチド中に１未満、または５００ヌクレオチド中に１未満、または１０００ヌクレオチド中に１未満、または５，０００ヌクレオチド中に１未満、または１０，０００ヌクレオチド中に１未満である。
【０２６２】
本出願に開示する配列番号（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ）は、例えその配列番号の配列がＤＮＡ配列の形式のみまたはＲＮＡ配列の形式のみで表されている場合でも、その配列番号が記載される文脈に応じて、ＤＮＡ配列とＲＮＡ配列のいずれを示してもよいことを理解されたい。
【０２６３】
本発明のある特性が、明瞭さのために、別々の実施形態に関連して記載されている場合でも、これら特性は組み合わされて１つの実施形態として提供可能であることを理解されたい。反対に、簡潔さのために、１つの実施形態に関連して記載されている本発明の種々の特性は、個別に、または好適な部分的組み合わせ、または好適であると考えられる、ここに記載した本発明の他の実施形態として提供してもよい。種々の実施形態に関連して記載された特定の特性は、これらの要素無しでは実施形態が実施不可能である場合を除いて、これらの実施形態の必須要件と見なすものではない。
【０２６４】
上述のように本明細書に記載され、後述の特許請求の範囲で請求される本発明の様々な実施形態及び様相は、以下の実施例によって実験的に支持される。
【実施例】
【０２６５】
ここで、以下の実施例を参照するが、これらの実施例は、上述の記載と共に本発明の幾つかの実施形態を非限定的に説明するものである。
【０２６６】
ここで、以下の実施例を参照するが、これらの実施例は、上述の記載と共に本発明の幾つかの実施形態を非限定的に説明するものである。
【０２６７】
一般的に、本明細書で使用される命名法、および本発明に用いる実験手順は、分子技術、生化学的技術、微生物学的技術および組換えＤＮＡ技術を含む。そのような技術は、文献において完全に説明されている。例えば下記を参照されたい。"Molecular Cloning: A laboratory Manual" Sambrook et al., (1989)、"Current Protocols in Molecular Biology" Volumes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994)、Ausubel et al., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989)、Perbal, "A Practical Guide to Molecular Cloning", John Wiley & Sons, New York (1988)、Watson et al., "Recombinant DNA", Scientific American Books, New York; Birren et al. (eds) "Genome Analysis: A Laboratory Manual Series", Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1998)、米国特許第４，６６６，８２８号明細書、同第４，６８３，２０２号明細書、同第４，８０１，５３１号明細書、同第５，１９２，６５９号明細書および同第５，２７２，０５７号明細書に示されるような方法論、"Cell Biology: A Laboratory Handbook", Volumes I-III Cellis, J. E., ed. (1994)、"Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Technique" by Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Third Edition、"Current Protocols in Immunology" Volumes I-III Coligan J. E., ed. (1994)、Stites et al. (eds), "BasicおよびClinical Immunology" (8th Edition), Appleton & Lange, Norwalk, CT (1994)、Mishell and Shiigi (eds), "Selected Methods in Cellular Immunology", W. H. Freeman and Co., New York (1980)を参照のこと、入手可能なイムノアッセイは、特許および科学文献に広範に記載されている、例えば、米国特許第３，７９１，９３２号明細書、同第３，８３９，１５３号明細書、同第３，８５０，７５２号明細書、同第３，８５０，５７８号明細書、同第３，８５３，９８７号明細書、同第３，８６７，５１７号明細書、同第３，８７９，２６２号明細書、同第３，９０１，６５４号明細書、同第３，９３５，０７４号明細書、同第３，９８４，５３３号明細書、同第３，９９６，３４５号明細書、同第４，０３４，０７４号明細書、同第４，０９８，８７６号明細書、同第４，８７９，２１９号明細書、同第５，０１１，７７１号明細書および同第５，２８１，５２１号明細書、"Oligonucleotide Synthesis" Gait, M. J., ed. (1984)、"Nucleic acid Hybridization" Hames, B. D.,およびHiggins S. J., eds. (1985)、"Transcription and Translation" Hames, B. D.およびHiggins S. J., Eds. (1984)、"Animal Cell Culture" Freshney, R. I., ed. (1986); "Immobilized Cells and Enzymes" IRL Press, (1986)、"A Practical Guide to Molecular Cloning" Perbal, B., (1984)および"Methods in Enzymology" Vol. 1-317, Academic Press、"PCR Protocols: A Guide To Methods and Applications", Academic Press, San Diego, CA (1990)、Marshak et al., "Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manual" CSHL Press (1996)。これらすべては、本明細書に完全に記載されたのと同様に、参照により本発明に組み込まれる。他の一般的な参考文献を、本明細書を通じて提供する。それらに記載された手順は、当技術分野において十分周知であると考えられ、読者の便宜のために提供される。それらに含まれるすべての情報は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２６８】
実施例１
Ａ３−２９  Ｆ１から誘導したＦ５およびＦ６系統の高プロコラーゲン収率系統の選抜およびＺ１との比較
育種プログラムは、ヒトＩ型プロコラーゲン（ＰＣ）の高い収率を示すトランスジェニックタバコ植物の開発を目的とする。育種プログラムは、５つのヒト遺伝子で形質転換したタバコ植物に基づく［ＷＯ２００６／０３５４４２参照］。育種プログラムのゴールは、やがてホモ接合性の増強をもたらす、自己交雑と高収率子孫の選抜というサイクルの繰り返しによる半接合性Ａ３−２９系統における組み換え遺伝子のコピー数の増加である。ホモ接合性の系統は、それの示すより高いプロコラーゲン収率と、種子による繁殖が可能という両方の観点から好ましい。種子による繁殖は苗の価格を顕著に低下させ、商業生産のための苗の入手サイクルを短縮するはずである。
【０２６９】
研究のために選抜した種子祖先系統は、Ａ３−２９Ｆ１系統の子孫である２３のＦ５兄弟子孫である（図１）。２３のＦ５兄弟のうち、１７系統をそのＰＣ収率に基づいて、Ｆ６世代のさらなるスクリーニングのための最適候補となる可能性系統として選抜した。
【０２７０】
育種プログラムがさらに進んだ雑種世代へと進むほど、元の半接合性植物がホモ接合性となる確率は高まる。本研究は、（上述の）現状の半接合性Ｚ１系統を置き換える最適な候補を決定するために、最も優れた単離系統におけるＰＣ産生レベルを評価した。
【０２７１】
目的
本実験の範囲は、ＰＣ産生系統Ｚ１と比べて、最もプロコラーゲン収率の高い植物系統を育種プログラム（Ａ３−２９系統の系統）から単離することである。個体植物間のヘテロ接合性のレベルを求め、Ｃｏｌ１ａｌｐｈａ１、Ｃｏｌ１ ａｌｐｈａ２、Ｐ４ＨａｌｐｈａおよびＰ４Ｈ ｂｅｔａに必要な遺伝的構成をウエスタンブロッティング（ＷＢ）で確認した。選抜したＦ５植物のＦ６種子および選抜したＦ６植物のＦ７種子をさらなる農場試験のために回収した。
【０２７２】
本実施例は２つの連続した育種サイクル（Ｆ５からＦ６およびＦ６からＦ７）のまとめである。
【０２７３】
材料および方法
ＥＬＩＳＡによる葉のプロコラーゲンレベルの測定：
葉抽出物中のプロコラーゲン量を定量するためにサンドウィッチＥＬＩＳＡを開発した。このＥＬＩＳＡアッセイは、１層のマウス抗ヒトプロコラーゲンＩ型Ｃ末端（ＴＡＫＡＲＡ  ｃａｔ．  Ｎｏ．  ＭＯ１２）と、続くプロコラーゲンＩ型−Ｎ末端クローンＭ−５８に対するラットモノクローナル抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＭＡＢ１９１２）によるプロコラーゲンの特異的捕捉に基づく。定量化はＡＬＰ結合ヤギ抗ラット抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｃａｔ＃  ＡＰ１３６Ａ）を使用し、続く適切な気質を用いた比色定量によって達成した。
【０２７４】
ウエスタンブロットによるコラーゲンの評価
葉の抽出物または精製材料を初めにＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分離し、分離したタンパク質をニトロセルロースメンブランに転写した。コラーゲン関連ペプチドを、抗コラーゲン１型ウサギポリクロナール抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＃２３４１６７）またはウサギ抗ヒトコラーゲンＩ型ポリクロナール抗体（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ  ＃ＡＢ７４５）を用いて検出した。メンブランは後からＡＬＰ結合アフィニティ精製ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｃｈｅｍｉｃｏｎ＃  ＡＰ１３２Ａ）および続く適切な基質（ＳＩＧＭＡ  ＦＡＳＴ  ＢＣＩＰ／ＮＢＴ：  Ｓｉｇｍａ  ＃Ｂ５６５５）でプローブ化した。
【０２７５】
植物の繁殖および栽培
Ｆ５の育種サイクル
Ｚ１系統およびＡ３−２９系統のＦ１苗を組織培養で繁殖させ、温室で丈夫にした。種子から繁殖させた２３のＦ５系統の苗をトレイに植え付けた。図１は、系統交雑を示す。Ａ３−２９はＷＯ２００９／１２８０７６にも記載されている。特定の配列（配列番号２０〜２４）およびそのアミノ酸配列（配列番号２５〜２６）はｃＤＮＡ解析で立証した。
【０２７６】
Ｆ６の育種サイクル
Ｚ１系統およびＡ３−２９系統のＦ１苗を組織培養で繁殖させ、温室で約２．５週間にわたり丈夫にした。
【０２７７】
２５の種子に基づく苗は種苗場で繁殖させた。
【０２７８】
系統および野外計画（ｆｉｅｌｄ  ｐｌａｎｎｉｎｇ）
Ｆ５の育種サイクル：
Ａ３−２９  Ｆ５系統のそれぞれを個別の列に植え付けた。対照のＡ３−２９  Ｆ１植物およびＺ１植物は、対照植物と試験植物系統との均等な比較を確実にするために各列の中心に置いた。
【０２７９】
下記に、研究したＦ５系統を列挙する（表１）。
【０２８０】
【表１】
2021532780.tif 000003
【０２８１】
Ｆ６の育種サイクル：
以下のサイクルにおいて、全１７の「勝者」（上記参照）の種子をトレイで栽培し、実生の段階でプールとして分析した。スーパーファミリー３５３−０４−１９を４つの余分なＦ６ファミリーで拡張した。３つの異なるＦ５種子系統であるＡ３−２９−３６６−０２系統およびＺ１系統を参照および対照として解析した（図１２参照）。
【０２８２】
１３の高ＰＣ収率Ｆ６系統を選抜し、植え付けた。各系統は個別の列に植え付けた。対照のＡ３−２９  Ｆ１植物およびＺ１植物は、対照植物と試験植物系統との均等な比較を確実にするために各列の中心に置いた。
【０２８３】
下記表２に、研究したＦ５−Ｆ６系統を列挙する。
【０２８４】
【表２】
2021532780.tif 000004
【０２８５】
葉のサンプリングおよび解析
Ｆ５サイクル
プールしたプロコラーゲンのサンプリングは、最初に温室への植え付けから約４５日後に行った。各個別の植物の下から７〜１２番の位置の葉６枚を回収してプール系統用の袋に加えた。選抜した２３系統のそれぞれと対照植物を解析した。各対照系統について、３つ葉のプールをサンプリングし、３つの１００ｇの試料を処理した。各Ｆ５系統のそれぞれについて、２つの葉のプールをサンプリングした（図２参照）。
【０２８６】
最もＰＣ収率の高い８系統、即ち、収率の最も高い２つの系統の全個体植物および続く６種のベストな系統の最大２０のランダムに選択した個体植物を個別植物ＰＣ解析のために選抜した。１０〜１３位から１６〜１８位の連なった葉の中の一定の数および一定位置の葉を、記載した選抜した植物からサンプリングし、解析した（図３〜１０参照）。
【０２８７】
結果は、異なる試験間の偏差を打ち消すために、各ＥＬＩＳＡプレートで並行して繰り返し解析された６つの対照試料（３つのＺおよび３つのＡ３−２９）に対して相対的に解析した。５の異なる系統中のＰＣ収率の最も高い１７の個体植物を、比較「ほぼ勝者」ＥＬＩＳＡで再度解析した（図１１）。
【０２８８】
自己受粉成熟種子を選抜した各植物から回収した。
【０２８９】
Ｆ６サイクル
３〜４週齢の４０個の実生をサンプリングして４０〜６０ｇの単一の試料としてプールし、すりつぶしてＥＬＩＳＡで解析した（図１２）。
【０２９０】
２種の最もＰＣ収率の高いファミリーの両方から、１１の高ＰＣ収率系統を個別の植物をプロコラーゲン解析のために選抜し、２つの余分なＦ６系統を個別の植物解析に加えた（３０５−１７−０９−１０および３０５−１７−１７−０２）（図１２）。個別のプロコラーゲンサンプリングは温室への植え付けから６１日後に実施し、下記の例外を除いて解析した：各個別の植物を同様にサンプリングした、即ち一定数および一定の位置の３〜６の連なった葉を（植物成長の途中の）下から１０〜１３枚から１６〜１８枚の間の位置からサンプリングした。１３系統のそれぞれと、Ａ３−２９  Ｆ１系統の２４の対照植物を解析した。対照植物としては、プールはより低い位置即ち、下から５〜７枚から９〜１２枚の間でサンプリングした。各プールバッグから３つの試料を取りだし、３つの１００ｇの試料をすりつぶして、プールによるサンプリングを最もよく代表するようにした。各試料について約２０本の試料をＥＬＩＳＡアッセイのために用意した。２つの個別のＥＬＩＳＡアッセイを対象および選抜した植物で実施した。結果を解析し、対照試料と比較した（図１３参照）。５系統を個体植物解析のために選抜した（図１４〜１８を参照）。
【０２９１】
対照植物と比較して、関連タンパク質の存在を確認するために、勝者植物をウエスタンブロット解析（抽出物はコラーゲンに消化）によって試験した（図１９〜２１）。選抜した植物は、マスター植物バンクへの導入のために枝および組織培養で増やし、さらなる育種選抜のための自己種子産生に使用した。
【０２９２】
実施例２
Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ５におけるイベントの特徴づけ
４種の組み換えＤＮＡコンストラクトを含む遺伝的に修飾された植物であるＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ５のゲノムＤＮＡ試料を解析した。Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリード、ｉｌｌｕｍｉｎａショートリードメイトペア、ナノポアウルトラロングリードおよびナノポアベースシーケンシング技術を使用した。ＰＣＲおよびサンガーシーケンシングは、結果の立証に使用した。
【０２９３】
合計５つの挿入イベントを同定した。
【０２９４】
すべてのプライマー配列、説明および関連する図への参照を表＃３５〜３８に示した。
【０２９５】
【表３】
2021532780.tif 000005
【０２９６】
注：
境界部ＰＣＲ：  イベントが１度特定されたら、インサート（ベクター領域）の左および右境界部用にプライマーを設計する。これらプライマーは、ゲノム（イベント）特異的プライマーと組み合わせて使用する。
遺伝子ＰＣＲ：  ＰＣＲは、遺伝子特異的プライマーと、ゲノム（イベント特異的）プライマーとの組み合わせを使用して実施した。アンプリコンはナノポアシーケンシングプラットホームを用いて流した。表３５参照。
【０２９７】
イベント１−Ｐ４Ｈ ｂｅｔａ＋ＬＨ３
イベント１の位置を図２３に模式的に示した。コンストラクトは上部スキームに示した。
【０２９８】
【表４】
2021532780.tif 000006
【０２９９】
【表５】
2021532780.tif 000007
【０３００】
注：
イベント１−右接合部プライマー増幅。形質転換系統からは約８００ｂｐの産物が期待された。しかし対照および形質転換系統において、３５０ｂｐの非特異的増幅バンドが予測された。
【０３０１】
（インサート全体および左接合部にわたる）イベント１−左接合部プライマー増幅。形質転換系統からは約８０００ｂｐの産物が期待された。しかし形質転換系統には、約２５００ｂｐの非特異的増幅バンドが存在した。
【０３０２】
プライマーイベント１−右接合部（図２４のＡ、Ｂ）を用いた、形質転換系統のＰＣＲ産物のシーケンシングを以下のとおり実施した。配列は、コンストラクトおよびゲノムコンティグの間の接合部を捉えている。
【０３０３】
【表６】
2021532780.tif 000008
【０３０４】
図２５および２６は、ゲル電気泳動およびシーケンシングのそれぞれによる、イベント１の増幅の結果を示す。
【０３０５】
結論
イベント１（Ｐ４Ｈ ｂｅｔａ＋ＬＨ３）として挿入されたコンストラクトは、ナノポアベースのシーケンシングのみならず、サンガーシーケンシング法によって、左および右境界部にわたることが確認された。
【０３０６】
イベント２−Ｐ４Ｈａｌｐｈａ
図２７は、植物のゲノムに導入されたイベント２の模式図を示す。
【０３０７】
【表７】
2021532780.tif 000009
【０３０８】
【表８】
2021532780.tif 000010
【０３０９】
イベントの特徴づけは、図２８のＡ〜Ｂに示され、これはナノポアベースのシーケンシングで得られたものである。
【０３１０】
イベントはさらにサンガーＰＣＲによって特徴づけられ、プライマーは下記および表９に示されている。
【０３１１】
【表９】
2021532780.tif 000011
【０３１２】
結果は図２９のＡ〜Ｃおよび図３０に、それぞれゲル電気泳動およびシーケンシングによって示されている。
【０３１３】
Ｐ４Ｈ ａｌｐｈａのイベント２として挿入されたコンストラクトは、ナノポアベースのシーケンシングのみならず、サンガーシーケンシング法によって、左および右境界部にわたることが確認された。インサートは逆向きであった（図２７）。
【０３１４】
イベント３  −  Ｃｏｌａｌｐｈａ２
図３１は、ゲノム内のイベント３の位置の模式図を示す。
【０３１５】
【表１０】
2021532780.tif 000012
【０３１６】
図３２は、イベント３左接合部プライマーを用いたインサートの特徴づけを示す。
【０３１７】
【表１１】
2021532780.tif 000013
【０３１８】
【表１２】
2021532780.tif 000014
【０３１９】
図３３のＡ〜Ｂは、境界部接合部ＰＣＲを示す。図３３のＡ〜Ｂ）  ゲノムプライマーおよび境界部プライマーを用いた左境界部ＰＣＲ、アンプリコンのサイズは１〜８００ｂｐ、２〜約２Ｋｂ。
【０３２０】
ナノポアベースのシーケンシングおよびサンガーシーケンシングの結果を図３４に示した。
【０３２１】
Ｃｏｌａｌｐｈａ２のイベント３として挿入したコンストラクト−左境界部は、ナノポアベースのシーケンシングのみならず、サンガーシーケンシング法によって確認された。境界部のＰＣＲは右境界部を増幅したが、サンガーシーケンシングは技術的な理由から失敗した。図３４においては、領域（右境界部ベクターおよびゲノムスキャフォールド）はより明るい色で印をつけた。
【０３２２】
イベント４  −  Ｐ４Ｈｂｅｔａ（ＬＨ３）
図３５は、ゲノム内のイベント４の位置の模式図を示す。
【０３２３】
【表１３】
2021532780.tif 000015
【０３２４】
【表１４】
2021532780.tif 000016
【０３２５】
図３６は、イベント４左接合部プライマーを用いたインサートの特徴づけを示す。
【０３２６】
【表１５】
2021532780.tif 000017
【０３２７】
Ｐ４Ｈ ｂｅｔａ（ＬＨ３）のイベント４として挿入したコンストラクトについて、左境界部は、ナノポアベースのシーケンシングのみならず、サンガーシーケンシング法によって確認された。境界部のＰＣＲは右境界部を増幅したが、サンガーシーケンシングは技術的な理由から失敗した。
【０３２８】
イベント５  −  Ｃｏｌａｌｐｈａ１
図３８は、ゲノム内のイベント５の位置の模式図を示す。
【０３２９】
【表１６】
2021532780.tif 000018
【０３３０】
【表１７】
2021532780.tif 000019
【０３３１】
図３９は、イベント５左接合部プライマーを用いたインサートの特徴づけを示す。
【０３３２】
【表１８】
2021532780.tif 000020
【０３３３】
図４０は、境界部接合部ＰＣＲを示す。ゲノムプライマーおよび境界部プライマーを用いた左境界部ＰＣＲ、アンプリコンのサイズは２〜約３Ｋｂ、３〜２Ｋｂ。
【０３３４】
Ｃｏｌ  ａｌｐｈａ１のイベント５として挿入したコンストラクト−左境界部は、ナノポアベースのシーケンシングのみならず、サンガーシーケンシング法によって確認された。Ｃｏｌ  ａｌｐｈａ１は逆向きだった。境界部のＰＣＲは右境界部を増幅したが、サンガーシーケンシングは技術的な理由から失敗した。図４１においては、領域（右境界部ベクターおよびゲノムスキャフォールド）はより明るい色で印をつけた。
【０３３５】
実施例３
プロコラーゲン産生植物品種の作製
【０３３６】
目的
本研究の目的は、高ＰＣ収率且つより農業的性能に優れた産生系統となる新品種の可能性について検討することである。
【０３３７】
上記目的を達成するために、品種のスクリーニングと並行して、全５種のＰＣ組み換え遺伝子を以下の５種類の半接合性ドナーに基づく品種に導入するための交雑プログラムを実施した：Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６バルク、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８−３３−２  Ｆ７、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８−３３−１０  Ｆ７、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−２５−０４−１９  Ｆ７、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−３７−２８−３１  Ｆ７。
【０３３８】
主たる範囲は、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ５系統と比べて総バイオマス収率およびＰＣ収率の向上が見込まれる系統を選択することであった。
【０３３９】
材料および方法
品種のスクリーニングおよび交雑プログラム
２８の異なる品種の種子を種苗場に植え付け、４０〜５０日後に以下の４つの生産場所に移植した：メロムゴラン（ＭＧ）、エインヤハブ（ＥＹ）、カリア（Ｋ）および実験用温室。苗は、列当たり５植物／メートルの密度で移植した。
【０３４０】
Ｆ１のスクリーニング
Ｆ１種子を交雑体から収穫し、種苗場に植え付けた。植え付けは２回に分けて行った。
【０３４１】
野外計画
品種のスクリーニングおよび交雑プログラム
各生産場所において、各品種の６−１０株の植物を移植した（下記表１９）。
【０３４２】
温室においては、各品種の４株の植物を列当たり２．５植物／メートルの密度で移植し、５つのＰＣ組み換え遺伝子ドナー（下記参照）のそれぞれの４株の植物をツリーフローチャート（各２列）に移植した。栽培期間中、観察を継続した。
【０３４３】
温室内の各植物について、（より多くの自己受粉種子を産生する）系統を維持するために、１つの花序を紙袋で覆った。
【０３４４】
交雑プログラムにおいては、交雑育種を行うために、各変種の１０の花序の雄蕊を除去した。交雑育種においては、各品種の２の花序を異なるＰＣ組み換え遺伝子雄性ドナーと交雑させた（合計１０の交雑／品種）（下記表２０）。  
雄性ドナーは４種の選抜したＦ８系統（Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８−３３−２、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８−３３−１０、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−２５−０４−１９、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−３７−２８−３１）および産生系統（Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ５）であった。
【０３４５】
【表１９】
2021532780.tif 000021
【０３４６】
【表２０−１】
2021532780.tif 000022
【０３４７】
【表２０−２】
2021532780.tif 000023
【０３４８】
【表２０−３】
2021532780.tif 000024
【０３４９】
【表２０−４】
2021532780.tif 000025
【０３５０】
【表２０−５】
2021532780.tif 000026
【０３５１】
【表２０−６】
2021532780.tif 000027
【０３５２】
【表２０−７】
2021532780.tif 000028
【０３５３】
Ｆ１スクリーニング
各Ｆ１交雑体の１０株の植物を温室内に、列当たり２．５植物／メートルの密度で、５植物／交雑体の２列からなるブロックデザインに植え付けた。交雑体は、ヘテロ強制の可能性についてより良い効果を得るために、雌系統の群ごとに分けた（下記表２１）。
【０３５４】
【表２１−１】
2021532780.tif 000029
【０３５５】
【表２１−２】
2021532780.tif 000030
【０３５６】
【表２１−３】
2021532780.tif 000031
【０３５７】
【表２１−４】
2021532780.tif 000032
【０３５８】
植物栽培およびモニタリング
品種のスクリーニング
各場所において、個別に、構造およびバイオマス収率の可能性（具体的な特徴なし）に着目しながら、総合的な農学的性能に基づき目視による植物のスコア付けを行った（下記表２２）。主たる範囲は生産場所および効率的なバイオマス産生の可能性に適合した品種を見出すことであった。
【０３５９】
同時に、５株の雄性ドナーを用いた交雑育種を温室で実施した。
【０３６０】
観察が完了するまで植物を生産場所で栽培した。交雑育種植物は、自己受粉種子および交雑受粉種子が収穫できる完熟状態になるまで温室内で育てた。
【０３６１】
交雑育種
交雑育種計画は、排水に関する茎の病気故に、２回に分けて実施した。
【０３６２】
交雑育種計画における優先順位付けを決定し、さらに生産場所における品種の連続スクリーニングおよびモニタリングに基づき、計画した交雑のいくつかの断念も決定した。目視選別により、１７品種を潜在的な親として同定した（表２１ａ）。
【０３６３】
Ｆ１スクリーニング
植物を温室内で栽培した。各植物について、自己受粉種子（Ｆ２種子）を産生するために、１つの花序を紙袋で覆った。自己受粉種子が完熟し、種子が収穫されるまで植物を栽培した。
【０３６４】
Ｆ１植物を、農学的性能、特に構造およびバイオマス収率の可能性について、目視でモニタリングした。
【０３６５】
【表２２】
2021532780.tif 000033
【０３６６】
解析
分子解析
各Ｆ１ファミリーから５株の植物をサンプリングし、５種のＰＣ（プロコラーゲン）産生遺伝子のそれぞれの存在について、ＲＴ−ＰＣＲを用いて分析した。５種の組み換え遺伝子のうちの少なくとも３種の存在がＲＴ−ＰＣＲ解析で明らかとなった植物を、ＥＬＩＳＡを用いたｐｃ含量のさらなる解析のためにサンプリングした。ＥＬＩＳＡ解析には、移植から６４日目に、各植物からすべての葉を摘み取り、処理してＥＬＩＳＡで解析した。さらに、各植物について葉の重量を測定した（図４２）。
【０３６７】
結果
品種のスクリーニング−スコア付けおよび優先順位付け
【０３６８】
【表２３−１】
2021532780.tif 000034
【０３６９】
【表２３−２】
2021532780.tif 000035
【０３７０】
【表２３−３】
2021532780.tif 000036
【０３７１】
【表２３−４】
2021532780.tif 000037
【０３７２】
【表２３−５】
2021532780.tif 000038
【０３７３】
【表２３−６】
2021532780.tif 000039
【０３７４】
【表２３−７】
2021532780.tif 000040
【０３７５】
【表２３−８】
2021532780.tif 000041
【０３７６】
【表２３−９】
2021532780.tif 000042
【０３７７】
【表２３−１０】
2021532780.tif 000043
【０３７８】
【表２３−１１】
2021532780.tif 000044
【０３７９】
【表２３−１２】
2021532780.tif 000045
【０３８０】
【表２３−１３】
2021532780.tif 000046
【０３８１】
【表２３−１４】
2021532780.tif 000047
【０３８２】
【表２３−１５】
2021532780.tif 000048
【０３８３】
Ｆ１の組み換え遺伝子、バイオマスおよびＰＣ
選抜した植物の大部分が、ＲＴ−ＰＣＲ解析において、５種の組み換え遺伝子すべての存在を示した。次世代の選抜サイクルの際に使用する解析方法の精度および感度を評価するために、１種の遺伝子について負の結果を示した数種の植物を対照として選抜した。
【０３８４】
Ｃｏｌ２が欠損した植物によるＰＣ産生は、ホモ三量体の産生によって説明することができる。他の遺伝子が欠損した植物によるＰＣ産生は、ＲＴ−ＰＣＲ解析の不正確さによって説明することができる。
【０３８５】
実施例４
ほぼホモ接合性のＡ３−２９  Ｆ４系統およびＮ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｖｒ．  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８品種から半接合性植物を得るための育種計画
製造用タバコ系統によるプロコラーゲン（ＰＣ）収率向上を目的として、ＰＣ産生遺伝子の新規タバコ品種への導入について育種プログラムで検討した。これは、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮに基づく現在の製造系統であるＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８を置き換えるために行われた。
【０３８６】
当該目的のために、種々のタバコ品種に対する大規模スクリーニングを実施し、ＰＣ産生用の遺伝的背景となる、Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮの潜在的な代替となる４種の栽培品種を選抜した。以下の新規栽培品種にコラーゲン産生系を導入するために、４系統のすべてをＡ３−２９−３０５−１７−０９  Ｆ４植物と交雑させた：品種番号１（Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｖｒ．  Ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、３（Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｖｒ．  Ｃｕｂａｎ  Ｈａｂａｎｏ  ２０００）、１１（Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｖｒ．  Ｂｌａｃｋ  ｍａｍｍｏｔｈ）および１５（Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｖｒ．  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８）。本研究の結果に基づき、Ａ３−２９−３０５−１７−０９  Ｆ４×Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８の交雑に集中することを決定した。
【０３８７】
さらなる育種のために、最も性能の高い交雑種（Ａ３−２９−３０５−１７−０９  Ｆ４×Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｖｒ．  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８）を選抜した。
【０３８８】
本研究の最大の目的は、可能なハイブリッド、即ち、ほぼ純粋にホモ接合性の種子に基づくＡ３−２９  Ｆ６系統（Ｓａｍｓｕｎを背景とする、ＰＹ１４／００６）と、新規なＮｉｃｏｔｉａｎａの遺伝的背景との掛け合わせに基づく成長力の組み合わせについて検討し、総バイオマスおよびＰＣの収率の高められた、新規な、栽培品種の混合された、将来の産生系統を作製することにある。初期系統は、おそらくその５０％が、Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．  Ｓａｍｓｕｎ  ＮＮの背景におけるＰＣ産生組み換え遺伝子のフルセットを提供する種子に基づくＡ３−２９系統（Ｆ４）からなる。種子に基づくＡ３−２９系統（Ｆ６）単独と比較したときに、ＰＣ収率×バイオマス収率の総生産量の向上が可能となるように、これを（５０％の）より優れた農業的性質を提供する新規な遺伝的背景と組み合わせる。選択した遺伝的背景はバイオマスの収率が最も高く、且つ所望の農業的性質の追加も可能である。
【０３８９】
本研究の特定の目的は、現在の産生系統の代替となる、選抜した交雑種（Ａ３−２９−３０５−１７−０９  Ｆ４×Ｎ．  ｔａｂａｃｕｍ  ｖｒ．  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８）に基づく新規な育種系統の開発である。
【０３９０】
材料および方法
植物の繁殖、栽培およびスクリーニング
［Ａ３−２９−３０５−１７−０９  Ｆ４（雌）×Ｎ．ｔａｂａｃｕｍ  ｖｒ．  Ｖｉｒｇｉｎｉａ  Ｋ３５８（雄）］の交雑によりＦ１植物を作製した。
【０３９１】
各植物について、自己受粉種子を確実にするために、１つの花序を紙袋で覆うことで、Ｆ２〜Ｆ４種子を作製した。種子を含む完熟した鞘を収穫し、その後、種子を分離し隔離した箱で保存した。
【０３９２】
種子を種苗場に藩種し、温室に移すまで約４５日間栽培し、列当たり２．５植物／メートルの密度で植え付けた。  
成長力と構造
各世代の植物を、一般的な農業的性能に基づき目視で選抜した。Ｆ４世代では、葉のバイオマスを測定した。
【０３９３】
遺伝的スクリーニング
５種の組み換え遺伝子の存在はＲＴ−ＰＣＲを用いて確認した。
【０３９４】
各遺伝子に対して、確認したｃＤＮＡ配列（配列番号２０〜２４）に基づき、新鮮な葉から抽出したＤＮＡを用いるＲＴ−ＰＣＲを設計した。
【０３９５】
プロコラーゲンレベル
植物中のプロコラーゲンレベルを、上述した標準的な抽出およびＥＬＩＳＡプロトコルを用いて、ＥＬＩＳＡで決定した。
【０３９６】
Ｆ２世代
Ｆ１種子を起源とする３５株の植物をイェソード実験温室に移植した（表２５参照）。
【０３９７】
各植物について、自己受粉種子を産生するために、１つの花序を紙袋で覆った。この段階では、遺伝的試験によってのみ植物のスクリーニングを行い、ＰＣ含量は見なかった。Ｆ２植物は、ＲＴ−ＰＣＲを用いて、全５種の組み換え遺伝子の存在について２回のスクリーニングを実施した。１回目のスクリーニングでは、３５株中２５株の植物が全５種の遺伝子の存在を示した（表２８）。遺伝的スクリーニング方法の効率を試験するために、３２株の植物を自己交雑およびさらなる育種のために選抜した。
【０３９８】
Ｆ３世代
３２種のＦ２ファミリーのそれぞれの約３５株の植物（合計１０５０株の植物）を、列当たり５植物／メートルの密度でイェソード実験温室に移植した（表２６）。各植物について、自己受粉種子を産生するために、１つの花序を紙袋で覆った。
【０３９９】
植物およびその植物ファミリーについて、全栽培期間にわたり、その性質と構造について記述した。最も優れた農業的性質によって特徴づけられるファミリーの植物をＲＴ−ＰＣＲでスクリーニングした。一連の陽性対照に基づき、０．１を超えるＲＴ−ＰＣＲ結果を陽性（組み換え遺伝子が存在する）として計数した。最もＲＴ−ＰＣＲ結果の良い植物を、ＥＬＩＳＡを用いたＰＣ含量のさらなる解析のためにサンプリングした。ＥＬＩＳＡ解析用には、移植から７７日後に、高さ１メートルの位置の葉３〜４枚を各植物から摘み取り、処理して、ＥＬＩＳＡプロトコルに基づき解析した（表２９）。
【０４００】
そのＰＣ濃度および全組み換え遺伝子に対するＲＴ−ＰＣＲ値に基づき、さらなる育種のために３０株の植物を選抜した（図４５）。選抜した植物は、次世代およびさらな育種のために、自己受粉種子の完熟後に収穫した。
【０４０１】
Ｆ４世代
３０種のＦ３選抜植物のそれぞれの約４０株の植物（合計１２５０株の植物）を、列当たり５植物／メートルの密度でイェソード実験温室に移植した（表２７）。各植物について、自己受粉種子を産生するために、１つの花序を紙袋で覆った。
【０４０２】
植物およびその植物ファミリーについて、全栽培期間にわたり、その性質と構造について記述した。最も優れた農業的性質によって特徴づけられるファミリーの植物をＲＴ−ＰＣＲでスクリーニングした。ＲＴ−ＰＣＲ結果を安定なＮ．  ｔａｂａｃｕｍ遺伝子（ｓｃｆｌｄ８）と比較した。ｓｃｆｌｄ８遺伝子と同じまたはそれ以上の値を陽性（組み換え遺伝子が存在する）として計数した。最もＲＴ−ＰＣＲ結果の良い植物を、ＥＬＩＳＡを用いたＰＣ含量のさらなる解析のためにサンプリングした。ＥＬＩＳＡ解析用には、移植から７７日後に、高さ１メートルの位置の葉３〜４枚を各植物から摘み取り、処理して、ＥＬＩＳＡプロトコルに基づき解析した（表３０）。
【０４０３】
さらにＥＬＩＳＡ解析に回された各植物について、葉を収穫し、その重量を計測した（Ｔａｂｌｅ  ３０）。
【０４０４】
葉の重量、ＰＣ濃度およびＲＴ−ＰＣＲ結果に基づき、３０株の植物を選抜した（図４４）。選抜した植物は、次世代およびさらな育種のために、自己受粉種子の完熟後に収穫した。
【０４０５】
【表２４】
2021532780.tif 000049
【０４０６】
【表２５−１】
2021532780.tif 000050
【０４０７】
【表２５−２】
2021532780.tif 000051
【０４０８】
【表２６−１】
2021532780.tif 000052
【０４０９】
【表２６−２】
2021532780.tif 000053
【０４１０】
結果
Ｆ２世代
【０４１１】
【表２７】
2021532780.tif 000054
【０４１２】
Ｆ３世代
【０４１３】
【表２８−１】
2021532780.tif 000055
【０４１４】
【表２８−２】
2021532780.tif 000056
【０４１５】
【表２８−３】
2021532780.tif 000057
【０４１６】
【表２８−４】
2021532780.tif 000058
【０４１７】
Ｆ４世代
【０４１８】
【表２９−１】
2021532780.tif 000059
【０４１９】
【表２９−２】
2021532780.tif 000060
【０４２０】
【表２９−３】
2021532780.tif 000061
【０４２１】
【表２９−４】
2021532780.tif 000062
【０４２２】
【表２９−５】
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【０４２３】
実施例５
作製系統におけるゲノムインサートイベントの立証
１３株の個別の植物を温室内で栽培した。各植物からＤＮＡ抽出およびＰＣＲ解析のために若芽をサンプリングした。増殖期の切片（約０．５ｃｍ）を小さなチューブに摘み取り、ＤＮＡ抽出のために氷中で運搬した。
【０４２４】
標準的なＣＴＡＢ／クロロホルム法を用いてＤＮＡを抽出した。ＤＮＡの品質はＮａｎｏｄｒｏｐを用いて評価した。ＰＣＲは下記表にしたがって実施した。
【０４２５】
【表３０】
2021532780.tif 000064
【０４２６】
結果：
結果を図４５〜４８に示した。図４６の下部パネルに示したＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ５およびその子孫に特徴的な、レーン５〜７のＰ４Ｈａの右境界部に固有の導入部位に特に注目されたい。
【０４２７】
より具体的には、境界部ＰＣＲは、全ての対照試料（Ｓａｍｓｏｎ  ＷＴおよびＫ３５８  ＷＴ）において非特異的であった。Ｐ４Ｈｂ＋ＬＨ３  ＰＣＲは、下記系統において期待されたバンドを示した：  Ａ３−２９  Ｆ１、Ａ３−２９−３０５−１７−０９  Ｆ４、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−Ｆ４、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊＊およびＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊＊＊。Ｐ４Ｈａについては、下記系統において期待されたバンドを示した：Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊、Ａ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊＊およびＡ３−２９−３０５−１７−０９−１８  Ｆ６＊＊＊。Ｃｏｌａ２については、期待されたバンドがすべてのトランスジェニック系統で示された。Ｃｏｌａ１については、両方のプライマーペアによって期待されたバンドがすべてのトランスジェニック系統で示された。星は種子を起源とする個体植物を示す。
【０４２８】
【表３１】
2021532780.tif 000065
【０４２９】
【表３２】
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【０４３０】
【表３３】
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【０４３１】
【表３４−１】
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【０４３２】
【表３４−２】
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【０４３３】
【表３５】
2021532780.tif 000070
【０４３４】
【表３６】
2021532780.tif 000071
【０４３５】
【表３７】
2021532780.tif 000072
【０４３６】
本発明をその具体的な実施形態との関連で説明したが、多くの代替、修正及び変更が当業者には明らかであろう。従って、このような代替、修正及び変更は全て、添付の特許請求の範囲の趣旨と広い範囲内に含まれることを意図するものである。
【０４３７】
本明細書で言及した全ての刊行物、特許及び特許出願は、個々の刊行物、特許及び特許出願の各々が具体的且つ個別に本明細書の一部を構成するものとして援用される場合と同程度に、それらの全体が本明細書の一部を構成するものとして援用される。更に、本願における如何なる参考文献の引用又は特定も、このような参考文献が本発明の先行技術として利用可能なことを容認するものとして解釈されるべきではない。各項の見出しが使用される範囲において、必ずしも限定として解釈されるべきではない。
【０４３８】
さらに本願の優先権に係る書類も、本参照をもって本明細書に完全に組み込まれたものとする。
【配列表フリーテキスト】
【０４３９】
配列番号１：  イベント１のナノポアＰＣＲ配列
配列番号２：  イベント１のナノポアＰＣＲ配列
配列番号３：  イベント１の境界部ＰＣＲサンガ−配列、左境界部
配列番号４：  イベント１の境界部ＰＣＲサンガ−配列、右境界部
配列番号５：  イベント２のナノポアＰＣＲ配列：左接合部
配列番号６：  イベント２のナノポアＰＣＲ配列：右接合部
配列番号７：  イベント２の境界部ＰＣＲサンガ−配列、左境界部配列２−３Ｆ（１８２５Ｆ）
配列番号８：  イベント２の境界部ＰＣＲサンガ−配列、左境界部２−４Ｆ（フォワード  配列＿９Ｒ）
配列番号９：  イベント２の境界部ＰＣＲサンガ−配列、右境界部
配列番号１０：  イベント３のナノポアＰＣＲ配列：左境界部
配列番号１１：  イベント３の境界部ＰＣＲサンガ−配列、左境界部配列３−２Ｆ（フォワード＿１４７３１Ｆ）
配列番号１２：  イベント３の境界部ＰＣＲサンガ−配列、左境界部配列１−３Ｒ（リバース＿ＲＰ１）
配列番号１３：  イベント３の境界部ＰＣＲサンガ−配列、左境界部３−１Ｆ（フォワード配列＿ＭＰ＿Ｃｏｌ＿５Ｒ）
配列番号１４：  イベント３の境界部ＰＣＲサンガ−配列、左境界部３−３Ｒ（リバース配列＿ＲＰ２）
配列番号１５：  イベント４のナノポアＰＣＲ配列：左境界部
配列番号１６：  境界部ＰＣＲサンガ−配列、左境界部
配列番号１７：  イベント５のナノポアＰＣＲ配列：左境界部
配列番号１８：  境界部ＰＣＲサンガ−配列、左境界部配列５−２Ｆ（ＭＰ＿Ｃｏｌ＿３Ｒ）
配列番号１９：  境界部ＰＣＲサンガ−配列、配列５−１Ｆ（２＿ＭＰ＿Ｃｏｌ＿４Ｒ）
配列番号２０：  ヒトコラーゲンアルファ１（Ｉ）鎖に融合した、チオールプロテアーゼアリューレイン前駆体の大麦遺伝子に対する液胞シグナル配列のコード領域を含む合成配列
配列番号２１：  ヒトコラーゲンアルファ２（Ｉ）鎖に融合した、チオールプロテアーゼアリューレイン前駆体の大麦遺伝子に対する液胞シグナル配列のコード領域を含む合成配列
配列番号２２：  ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼアルファ１サブユニットに融合した、チオールプロテアーゼアリューレイン前駆体の大麦遺伝子に対する液胞シグナル配列のコード領域を含む合成配列
配列番号２３：  ヒトプロリル４−ヒドロキシラーゼベータ１サブユニットに融合した、チオールプロテアーゼアリューレイン前駆体の大麦遺伝子に対する液胞シグナル配列のコード領域を含む合成配列
配列番号２４：  ヒトリシルヒドロキシラーゼ３に融合した、チオールプロテアーゼアリューレイン前駆体の大麦遺伝子に対する液胞シグナル配列のコード領域を含む合成配列
配列番号２７：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２８：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号２９：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３０：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３１：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３２：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３３：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３４：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３５：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３６：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３７：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３８：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号３９：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４０：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４１：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４２：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４３：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４４：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４５：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４６：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
配列番号４７：  単鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチド
【図１】
2021532780.tif 000073
【図２】
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【図３】
2021532780.tif 000075
【図４】
2021532780.tif 000076
【図５】
2021532780.tif 000077
【図６】
2021532780.tif 000078
【図７】
2021532780.tif 000079
【図８】
2021532780.tif 000080
【図９】
2021532780.tif 000081
【図１０】
2021532780.tif 000082
【図１１】
2021532780.tif 000083
【図１２】
2021532780.tif 000084
【図１３】
2021532780.tif 000085
【図１４】
2021532780.tif 000086
【図１５】
2021532780.tif 000087
【図１６】
2021532780.tif 000088
【図１７】
2021532780.tif 000089
【図１８】
2021532780.tif 000090
【図１９】
2021532780.tif 000091
【図２０】
2021532780.tif 000092
【図２１】
2021532780.tif 000093
【図２２】
2021532780.tif 000094
【図２３】
2021532780.tif 000095
【図２４】
2021532780.tif 000096
【図２５】
2021532780.tif 000097
【図２６−１】
2021532780.tif 000098
【図２６−２】
2021532780.tif 000099
【図２６−３】
2021532780.tif 000100
【図２６−４】
2021532780.tif 000101
【図２６−５】
2021532780.tif 000102
【図２６−６】
2021532780.tif 000103
【図２７】
2021532780.tif 000104
【図２８】
2021532780.tif 000105
【図２９】
2021532780.tif 000106
【図３０−１】
2021532780.tif 000107
【図３０−２】
2021532780.tif 000108
【図３０−３】
2021532780.tif 000109
【図３０−４】
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【図３１】
2021532780.tif 000111
【図３２】
2021532780.tif 000112
【図３３】
2021532780.tif 000113
【図３４−１】
2021532780.tif 000114
【図３４−２】
2021532780.tif 000115
【図３４−３】
2021532780.tif 000116
【図３４−４】
2021532780.tif 000117
【図３４−５】
2021532780.tif 000118
【図３５】
2021532780.tif 000119
【図３６】
2021532780.tif 000120
【図３７−１】
2021532780.tif 000121
【図３７−２】
2021532780.tif 000122
【図３８】
2021532780.tif 000123
【図３９】
2021532780.tif 000124
【図４０】
2021532780.tif 000125
【図４１−１】
2021532780.tif 000126
【図４１−２】
2021532780.tif 000127
【図４１−３】
2021532780.tif 000128
【図４１−４】
2021532780.tif 000129
【図４２】
2021532780.tif 000130
【図４３】
2021532780.tif 000131
【図４４】
2021532780.tif 000132
【図４５】
2021532780.tif 000133
【図４６】
2021532780.tif 000134
【図４７】
2021532780.tif 000135
【図４８】
2021532780.tif 000136
【図４９】
2021532780.tif 000137
【図５０】
2021532780.tif 000138
【配列表】
2021532780000001.app
【国際調査報告】
2021532780.tif 000139
2021532780.tif 000140
2021532780.tif 000141
2021532780.tif 000142
2021532780.tif 000143