(57)【要約】  本発明は、ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物を有効成分として含む線維化疾患の治療用組成物に関し、より詳細に説明すると、細胞膜でＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現を抑制し、特に肝線維化および肺線維化を治療する効能に優れた線維化疾患の治療用組成物に関する。  【選択図】図１ａ
2021536459.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
化学式Ａで表されるベンズヒドリルチオアセトアミド化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含み、細胞膜でＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現を抑制する効能を有する線維化疾患の治療用組成物であって、
［化学式Ａ］
【化１】
2021536459.tif 000018
前記化学式Ａで、Ｘ１〜Ｘ１０は、水素（Ｈ）またはフッ素（Ｆ）であり、すべて同じでも、異なっていてもよく；Ｙは、硫黄（Ｓ）またはスルホキシド（Ｓ＝Ｏ）であり、＊は、キラル体を意味し；Ｒ１は、水素、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、水酸基、炭素数３〜６の炭素化合物のうちいずれか１つを意味する、
線維化疾患の治療用組成物。
【請求項２】
前記化学式Ａの化合物は、Ｘ１〜Ｘ１０が水素（Ｈ）またはフッ素（Ｆ）であり、Ｙは、硫黄（Ｓ）であり、Ｒ１は、水素（Ｈ）である、請求項１に記載の線維化疾患の治療用組成物。
【請求項３】
前記化学式Ａの化合物は、Ｘ１〜Ｘ１０が水素（Ｈ）またはフッ素（Ｆ）であり、Ｙは、スルホキシド（Ｓ＝Ｏ）であり、Ｒ１は、水素（Ｈ）である、請求項１に記載の線維化疾患の治療用組成物。
【請求項４】
前記化学式Ａの化合物は、２−（ベンズヒドリルスルフィニル）アセトアミド、２−（ベンズヒドリルチオ）−Ｎ−［（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル］アセトアミド、２−（ベンズヒドリルチオ）−Ｎ−フェニルアセトアミド、２−（ベンズヒドリルスルフィニル）−Ｎ−メチルアセトアミド、２−（ベンズヒドリルスルフィニル）−Ｎ−［（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル］アセトアミド、２−（ベンズヒドリルチオ）−エン−メチルアセトアミド、２−［ビス（２−フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド、２−［ビス（３−フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド、２−［ビス（４−フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミドのうちいずれか１つである、請求項１から３のいずれか一項に記載の線維化疾患の治療用組成物。
【請求項５】
前記化学式Ａの化合物は、２−（ベンズヒドリルスルフィニル）アセトアミド（ｍｏｄａｆｉｎｉｌ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の線維化疾患の治療用組成物。
【請求項６】
前記化学式Ａの化合物は、２−［ビス（４−フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド（ｌａｕｆｌｕｍｉｄｅ）である、請求項１から３のいずれか一項に記載の線維化疾患の治療用組成物。
【請求項７】
前記化学式Ａの化合物は、肝線維化および肺線維化を治療する効能を有する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の線維化疾患の治療用組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物を有効成分として含む線維化疾患の治療用組成物に関し、より詳細に説明すると、細胞膜でＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現を抑制し、特に肝線維化および肺線維化を治療する効能に優れた線維化疾患の治療用組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
生体組織の線維化は、コラーゲン等のような細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）が過度に組織に蓄積される現象であり、損傷を受けた組織が回復（ｉｎｊｕｒｙ  ａｎｄ  ｒｅｐａｉｒ）する過程で起こる。このような線維化は、体内のすべての臓器で発生することができ、特に損傷がひどく、広範囲な場合と慢性疾患のように損傷と回復が繰り返される場合に頻繁に発生する。線維化が起こると、損傷した組織が正常機能をすることができない線維化組織に代替されて、臓器の機能が減少する。したがって、線維化が広範囲に発生すると、臓器の機能が大きく減少して各種疾病が誘発される。特に肝、肺、腎臓、心臓など生命に直接的な影響を与える内部臓器で線維化が起こると、健康に致命的な影響を及ぼすことができる。
【０００３】
一般的に線維化が起こる過程は、１）線維化誘発疾患（たいてい慢性疾患）または誘発物質に露出する過程と、２）その結果により発生する線維化過程（炎症、線維化、そして血管新生）に分けることができる。線維化誘発疾患や誘発物質により炎症および損傷が発生すると、この過程に参加する細胞から分泌される成長因子（ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）とサイトカイン等により線維化と血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）が促進される。したがって、線維化疾患は、線維化誘発原因（疾患や物質）を除去したり、線維化過程を抑制したりして治療することができる。
【０００４】
ところが、線維化の原因を完全に除去することは事実上不可能である。特発性肺線維化症のように原因を知らない場合もあり、肝線維化の主な原因である慢性ウイルス性肝炎と脂肪性肝炎、心臓および腎臓線維化を誘発する糖尿病、各種線維化疾病が多く発生する老化など大部分の原因は完治が不可能である。したがって、線維化疾患の治療は、原因疾患に対する治療だけでなく、線維化過程（炎症、線維化、血管新生）を抑制する治療も、必ず併行しなければならない。ところが、未だ線維化過程を抑制する治療剤は開発されていない。
【０００５】
線維化過程には、筋線維芽細胞（ｍｙｏｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）の形成と肝星細胞（ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ）の活性化（肝では活性化した肝星細胞が筋線維化細胞の役割をする）が非常に重要である。肝星細胞の活性化を含む筋線維芽細胞の形成は、線維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）あるいは平滑筋細胞等が活性化したり内皮細胞等が内皮間葉移行（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ−  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｔｒａｎｓｉｔｉｏｎ）したりすることを通じて起こる。そして、筋線維芽細胞が形成されると、細胞増殖が活発になって、筋線維芽細胞の数が大きく増加し、コラーゲンなど細胞外基質の生産が増加し、血管内皮細胞の増殖も活発に起こり、血管新生が促進される。このような線維化過程、すなわち筋線維芽細胞の形成（肝星細胞の活性化を含む）、筋線維芽細胞の増殖、細胞外基質の生成、血管内皮細胞の活性化と血管新生などは、細胞内Ｃａ２＋により活性化する経路（Ｃａ２＋−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ）を通じて起こる。したがって、Ｃａ２＋は、線維化過程で非常に重要な役割をする。
【０００６】
線維芽細胞、肝星細胞、血管内皮細胞においてＣａ２＋の増加には、Ｃａ２＋−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  Ｋ＋  ｃｈａｎｎｅｌｓ、すなわち「ＫＣａチャネル」が非常に重要な役割をする。ＫＣａチャネルが活性化すると、膜電圧を過分極させてＣａ２＋を流入させる動力を提供するためである。このような役割を担当するＫＣａチャネルには、ＫＣａ２．３チャネルとＫＣａ３．１チャネルがある。これらの２つのＫ＋チャネルは、構造と機能が類似しているが、分布する細胞において差異がある。
【０００７】
ＫＣａ２．３チャネルは、大部分の組織細胞でｍＲＮＡが発見されて、体内の大部分の組織に分布している可能性があり（Ｎａｕｎｙｎ  Ｓｃｈｍｉｅｄｅｂｅｒｇｓ  Ａｒｃｈ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００４；３６９（６）：６０２−１５）、肝、神経、血管内皮細胞等に多く分布している。一方、ＫＣａ３．１チャネルは、血管内皮細胞、線維芽細胞、免疫細胞、赤血球等に主に分布している（Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２００７；１４（１３）：１４３７−５７；Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｔａｒｇｅｔｓ．２０１３；１７（１０）：１２０３−１２２０）。
【０００８】
このように細胞内Ｃａ２＋増加を誘発して線維化の進行に大きく寄与すると考えられるＫＣａ２．３チャネルあるいはＫＣａ３．１チャネルは、線維化疾患の治療剤の主なタキッとして研究されている。特にＫＣａ２．３チャネルの選択的抑制剤であるアパミン（ａｐａｍｉｎ）は、線維化過程に重要な内皮間葉移行に対する抑制効果があり、肝線維化と胆道線維化に対する治療効果があることが報告された（Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．２０１４；４５０（１）：１９５−  ２０１；Ｉｎｔ  Ｊ．Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．２０１７；３９（５）：１１８８−１１９４）。
【０００９】
今まで開発されたイオンチャネル抑制薬物は、全部イオンチャネルの活動度を抑制する薬物であり、チャネルタンパク質を通じてイオンの流れを抑制する。ところが、イオンチャネルを通した細胞機能の調節は、このようなチャネル活動度を抑制する方法のみならず、細胞膜に発現するチャネルタンパク質の数を減少（チャネルタンパク質の細胞膜発現の抑制）させる方法でも可能である。ところが、チャネルタンパク質の細胞膜発現水準を調節する薬物は、まだ開発されたことがなくて、このような方法が将来新薬開発のための新しい解決法になることが予想される（Ｃｈｅｍ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．２０１２；７（１０）：１７４１−１７５５）。特に線維化疾患では、成長因子によりＫＣａ２．３チャネルの発現が増加するので、ＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現を抑制する薬物が線維化疾患治療剤として開発され得る。
【００１０】
なお、米国特許ＵＳ４，０６６，６８６およびＵＳ４，１７７，２９０には、本発明に属するベンズヒドリルスルフィニルアセトアミド誘導体（ｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌ  ｓｕｌｆｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｍｉｄｅ  ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）が中枢神経系障害を治療する薬物として提示されており、この化合物は、フランスラフォン社（Ｌａｆｏｎ）により嗜眠症治療剤として開発されて「モダフィニル（ｍｏｄａｆｉｎｉｌ）」という一般名で販売されている。モダフィニル前駆体と知られたアドラフィニル（ａｄｒａｆｉｎｉｌ）、すなわちジフェニルメチルチオアセトヒドロキサム酸（ｄｉｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌ−ｔｈｉｏａｃｅｔｏｈｙｄｒｏｘａｍｉｃ  ａｃｉｄ）も、モダフィニルと同じ効能を有する薬物として開発されている（ＣＮＳ  Ｄｒｕｇ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｖｏｌ５，Ｎｏ．３  １９３−２１２，１９９９）。
【００１１】
また、ＵＳ４，９２７，８５５には、ラフォン（Ｌａｆｏｎ）社によりモダフィニルのＲ−異性体である（−）−ベンズヒドリルスルフィニルアセトアミド［（−）−ｂｅｎｚｈｙｄｒｙｌ  ｓｕｌｆｉｎｙｌ  ａｃｅｔａｍｉｄｅ］が抗うつ病（ａｎｔｉ−ｄｅｐｒｅｓｓａｎｔ）、過眠症（ｈｙｐｅｒｓｏｍｎｉａ）およびアルツハイマーに対する治療効果があることが公知されており、ＵＳ６，１８０，６７８には、Ｒ−モダフィニルがフランスのベトキノール社により老化した犬の行動問題処置、学習効果増進、膀胱調節、記憶増加に関連した効果があることが報告されたことがあり、ＵＳ９，６３７，４４７には、ラウフルミド（ｌａｕｆｌｕｍｉｄｅ）という一般名で知られた２−［ビス（４−フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミドが多動性障害（ＡＤＨＤ）、嗜眠症、てんかん、無気力症候群に対して効果があることが紹介されている。
【００１２】
そして、本発明者は、韓国特許ＫＲ１０−１３４５８６０およびＫＲ１０−１４１４８３１と、これに対応する米国特許ＵＳ９，２５９，４１２でモダフィニルおよびその誘導体がｃＡＭＰを増加させて血管を弛緩させ、また、ＫＣａ３．１電流を抑制して血管疾患とＫＣａ３．１チャネル媒介疾患、すなわち癌、自己免疫疾患等の治療剤として使用され得ると報告したことがある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明者らは、ベンズヒドリルスルフィニルアセトアミド誘導体を含むベンズヒドリルチオアセトアミド化合物に対する薬物学的活性を研究する過程でこのような化合物が驚くべきことにＫＣａ２．３チャネルの細胞膜発現を抑制し、ひいては、マウスモデルで線維化疾患に対する治療効果があるという事実を発見した。
【００１４】
これより、本発明の目的は、ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む新しい線維化疾患の治療用組成物を提供することにある。参考として、本発明において「ベンズヒドリルチオアセトアミド化合物」は、「ベンズヒドリルスルフィニルアセトアミド化合物」を含む概念で使用する。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
本発明による線維化疾患治療用組成物は、下記化学式Ａで表されるベンズヒドリルチオアセトアミド化合物またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含むことを特徴とする。
【００１６】
［化学式Ａ］
【化１】
2021536459.tif 000003
【００１７】
［上記化学式Ａで、Ｘ１〜Ｘ１０は、水素（Ｈ）またはフッ素（Ｆ）であり、すべて同じでも、異なっていてもよく；Ｙは、硫黄（Ｓ）またはスルホキシド（Ｓ＝Ｏ）であり、＊は、キラル体を意味し；Ｒ１は、水素、メチル基、エチル基、メトキシ基、エトキシ基、水酸基、炭素数３〜６の炭素化合物のうちいずれか１つを意味する。］
【００１８】
上記化学式Ａ化合物は、Ｘ１〜Ｘ１０が水素（Ｈ）またはフッ素（Ｆ）であり、Ｙは、硫黄（Ｓ）であり、Ｒ１は、水素（Ｈ）であることを特徴とする。
【００１９】
上記化学式Ａ化合物は、Ｘ１〜Ｘ１０が水素（Ｈ）またはフッ素（Ｆ）であり、Ｙは、スルホキシド（Ｓ＝Ｏ）であり、Ｒ１は、水素（Ｈ）であることを特徴とする。
【００２０】
上記化学式Ａ化合物は、細胞膜でＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現を抑制する効能を有することを特徴とする。
【００２１】
上記化学式Ａ化合物は、特に肝線維化および肺線維化を治療する効能を有することを特徴とする。
【発明の効果】
【００２２】
本発明によるベンズヒドリルチオアセトアミド化合物は、培養細胞を対象とする生体外実験でＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現を抑制する効果があり、ひいては、肝および肺疾患が誘発されたマウスモデルに対する生体内実験でも炎症および線維化を抑制し、肝機能を改善する効果があることが確認された。
【００２３】
したがって、本発明のベンズヒドリルチオアセトアミド化合物は、人体内で発生する各種炎症および線維化疾患、特に肝と肺の炎症および線維化疾患の治療のための薬学的組成物として有用に使用され得、必要に応じて、動物用薬品として開発されることもできることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１ａ】図１ａは、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、そして本発明の化学式Ａ１化合物が血管内皮細胞、線維芽細胞、肝星細胞においてＫＣａ２．３およびＫＣａ３．１チャネルの発現に及ぼす効果を示すものである。
【図１ｂ】図１ｂは、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、そして本発明の化学式Ａ１化合物が血管内皮細胞、線維芽細胞、肝星細胞においてＫＣａ２．３およびＫＣａ３．１チャネルの発現に及ぼす効果を示すものである。
【図１ｃ】ｃは、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、そして本発明の化学式Ａ１化合物が血管内皮細胞、線維芽細胞、肝星細胞においてＫＣａ２．３およびＫＣａ３．１チャネルの発現に及ぼす効果を示すものである。
【図２ａ】図２ａは、ＫＣａ２．３チャネルの発現増加および線維化を誘発するＴＧＦβに露出させた線維芽細胞において化学式Ａ１化合物が線維化マーカーの発現（図２ａ）を示すものである。
【図２ｂ】図２ｂは、ＫＣａ２．３チャネルの発現増加および線維化を誘発するＴＧＦβに露出させた線維芽細胞において化学式Ａ１化合物が細胞増殖に及ぼす効果（図２ｂ）を示すものである。
【図３】図３は、本発明の化学式Ａ１〜Ａ９化合物が肝星細胞においてＫＣａ２．３チャネルの発現に及ぼす効果を示すものである。
【図４】図４は、本発明の化学式Ａ２〜Ａ４、Ａ９化合物に２４時間露出させてＫＣａ２．３チャネルの発現を減少させた肝星細胞においてＫＣａ２．３電流を記録したものである。
【図５】図５は、線維化を誘発するＴＧＦβあるいはＰＤＧＦに２４時間露出させた線維芽細胞において本発明の化学式Ａ２〜Ａ５、Ａ８、Ａ９化合物が細胞増殖に及ぼす効果を示すものである。
【図６ａ】図６ａは、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルで本発明の化学式Ａ１化合物およびその異性体の炎症および線維化抑制効果を組織学的あるいは組織免疫学的方法で示すものである。
【図６ｂ】図６ｂは、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルで本発明の化学式Ａ１化合物およびその異性体の炎症および線維化抑制効果を組織学的あるいは組織免疫学的方法で示すものである。
【図６ｃ】図６ｃは、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルで本発明の化学式Ａ１化合物およびその異性体の炎症および線維化抑制効果を組織学的あるいは組織免疫学的方法で示すものである。
【図６ｄ】図６ｄは、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルで本発明の化学式Ａ１化合物およびその異性体の炎症および線維化抑制効果を組織学的あるいは組織免疫学的方法で示すものである。
【図７ａ】図７ａは、ＴＡＡ（図７ａ）により肝疾患マウスモデルで、本発明の化学式Ａ１〜Ａ５化合物の投与有無による肝機能検査結果を示すものである。
【図７ｂ】図７ｂは、欧米型食餌（図７ｂ）により肝疾患マウスモデルで、本発明の化学式Ａ１〜Ａ５化合物の投与有無による肝機能検査結果を示すものである。
【図８ａ】図８ａは、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルで本発明の化学式Ａ１、Ａ２〜Ａ５化合物の投与による炎症誘発サイトカインのｍＲＮＡ発現変化を示すものである。
【図８ｂ】図８ｂは、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルで本発明の化学式Ａ１、Ａ２〜Ａ５化合物の投与による炎症誘発サイトカインのｍＲＮＡ発現変化を示すものである。
【図８ｃ】図８ｃは、欧米型食餌（ＷＤ）による肝疾患マウスモデルで化学式Ａ１化合物の投与による炎症誘発サイトカインのｍＲＮＡ発現の変化を示すものである。
【図９】図９は、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルで化学式Ａ１化合物の投与有無によって線維化マーカーのｍＲＮＡ発現の変化を示すものである。
【図１０ａ】図１０ａは、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルで化学式Ａ１化合物のＲ−異性体およびＳ−異性体が炎症マーカー（図１０ａ）タンパク質の発現に及ぼす影響を示すものである。
【図１０ｂ】図１０ｂは、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルで化学式Ａ１化合物のＲ−異性体および線維化マーカー（図１０ｂ）タンパク質の発現に及ぼす影響を示すものである。
【図１１】図１１は、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルで化学式Ａ１化合物のＲ−異性体およびＳ−異性体がＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現に及ぼす影響を示すものである。
【図１２】図１２は、ブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）による肺線維化マウスモデルで化学式Ａ９化合物が肺炎症および線維化に及ぼす効果を示すものである。
【図１３ａ】図１３ａは、ブレオマイシンによる肺線維化マウスモデルで化学式Ａ９化合物が炎症マーカー（図１３ａ）タンパク質の発現に及ぼす影響を示すものである。
【図１３ｂ】図１３ｂは、ブレオマイシンによる肺線維化マウスモデルで化学式Ａ９化合物が線維化マーカー（図１３ｂ）タンパク質の発現に及ぼす影響を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
本発明による上記化学式Ａのベンズヒドリルチオアセトアミド化合物は、具体的に次の化学式Ａ１〜化学式Ａ９化合物を含む。
【００２６】
［化学式Ａ１］
【化２】
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【００２７】
上記化学式Ａ１化合物は、「モダフィニル（ｍｏｄａｆｉｎｉｌ）」という一般名称で公知されており、現在嗜眠症治療剤として使用されており、他の精神科疾患の治療に利用するための臨床実験が進行中にある。モダフィニルの化学名は、２−（ベンズヒドリルスルフィニル）アセトアミドであり、公知の方法で合成したり商用化したものを購入したりして使用することができる。
【００２８】
［化学式Ａ２］
【化３】
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【００２９】
［化学式Ａ３］
【化４】
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【００３０】
［化学式Ａ４］
【化５】
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【００３１】
［化学式Ａ５］
【化６】
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【００３２】
［化学式Ａ６］
【化７】
2021536459.tif 000009
【００３３】
［化学式Ａ７］
【化８】
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【００３４】
［化学式Ａ８］
【化９】
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【００３５】
［化学式Ａ９］
【化１０】
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【００３６】
上記化学式Ａ２〜化学式Ａ９化合物は、全部モダフィニルと同じ機序によって細胞膜でＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現を抑制する効能を有し、ひいては、人体の線維化疾患に対する治療効能を有する。このうち、Ａ９化合物は、ラウフルミド（ｌａｕｆｌｕｍｉｄｅ）という一般名称で知られている。
【００３７】
上記化学式Ａ１〜Ａ９化合物の化学名は、次の通りである。各化学名末尾の括弧中に記載されたコード名は、本発明者らが下記実施例で使用したコード名である。
【００３８】
１）化学式Ａ１；２−（ベンズヒドリルスルフィニル）アセトアミド（ＣＢＭ−Ｎ１）
２）化学式Ａ２；２−（ベンズヒドリルチオ）−Ｎ−［（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル］アセトアミド（ＣＢＭ−Ｎ２）
３）化学式Ａ３；２−（ベンズヒドリルチオ）−Ｎ−フェニルアセトアミド（ＣＢＭ−Ｎ３）
４）化学式Ａ４；２−（ベンズヒドリルスルフィニル）−Ｎ−メチルアセトアミド（ＣＢＭ−Ｎ４）
５）化学式Ａ５；２−（ベンズヒドリルスルフィニル）−Ｎ−［（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル］アセトアミド（ＣＢＭ−Ｎ５）
６）化学式Ａ６；２−（ベンズヒドリルチオ）−エン−メチルアセトアミド（ＣＢＭ−Ｎ６）
７）化学式Ａ７；２−［ビス（２−フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド（ＣＢＭ−Ｎ７）
８）化学式Ａ８；２−［ビス（３−フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド（ＣＢＭ−Ｎ８）
９）化学式Ａ９；２−［ビス（４−フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド（ＣＢＭ−Ｎ９）
【００３９】
上記化学式Ａ２〜Ａ６化合物は、韓国特許ＫＲ１０−１３４５８６０等に開示された方法により合成したり、または、商用化したものを購入したりして使用することができるが、上記化学式Ａ７〜Ａ９化合物に対しては、まだ効率的な製造方法が知られていない。それで、本発明では、上記化学式Ａ７〜Ａ９化合物の製造方法を実施例として記載した。
【００４０】
本発明による薬学的組成物は、上記化学式Ａ化合物の薬学的に許容可能な塩を含む。ここで「薬学的に許容可能な塩」は、通常、金属塩、有機塩基との塩、無機酸との塩、有機酸との塩、塩基性または酸性アミノ酸との塩等が含まれ得る。また、本発明による薬学的組成物は、上記化学式Ａ化合物の溶媒化物および水和物を全部含み、可能なすべての立体異性体も含み、ひいては、各化合物の結晶形態または非結晶形態を含むことができる。
【００４１】
本発明による薬学的組成物は、通常の方法によって錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、エアロゾル、滅菌注射溶液等の形態で剤形化され得る。また、使用目的によって経口投与したり非経口投与したりすることができ、非経口投与時に皮膚外用または腹腔内注射、直腸内注射、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射または胸部内注射注入方式を選択することができる。
【００４２】
本発明による薬学的組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食事、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度によって変わることができる。好ましい一日投与量は、有効成分を基準として０．２〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは０．５〜１０ｍｇ／ｋｇであり、一日に１回〜２回投与され得るが、これに制限されない。
【００４３】
［実施例］
１）化合物の合成
１−１）化学式Ａ９化合物の合成
下記反応式を参照して化学式Ａ９化合物（ｌａｕｆｌｕｍｉｄｅ）の合成方法を説明する。丸いフラスコ５００ｍｌに４，４'−ビスフルオロベンズヒドロール（Ｉ）２４ｇを投入し、ここにトリフルオロ酢酸１５０ｍｌを添加して溶解した後、チグリン酸（Ｔｈｉｇｌｉｃ  ａｃｉｄ）１２．０５ｇを添加し、約２時間撹拌を行って、薄層クロマトグラフィーで反応終結を確認した。反応物を減圧蒸留してトリフルオロ酢酸を除去し、中和した後、エチルアセテート有機溶媒で抽出し、マグネシウムサルフェートで乾燥して、粘っこい黄色オイル形態の化合物（ＩＩ）３４．８ｇを定量的収率で得た。
【００４４】
化合物（ＩＩ）３４．８ｇを取って無水エタノール２５０ｍｌに溶解し、濃い硫酸４．２ｇを加えた後、８時間の間還流した。次に、室温に冷却、濃縮してエタノールを除去し、メチレンクロリド溶媒で溶解した後、水で２回洗浄した。さらに５％ＮａＨＣＯ３溶液で洗浄し、無水マグネシウムサルフェートで乾燥して、黄色オイル形態の化合物（ＩＩＩ）３９．１ｇを定量的収率で得た。
【００４５】
化合物（ＩＩＩ）３４．３ｇを丸いフラスコ（５００ｍｌ）に入れ、メタノール２１０ｍｌを添加した後、酸触媒２１．４ｍｌ（酸触媒は４ｇの硫酸を９０ｍｌのイソプロピルアルコールに溶解して製造）を加え、３５％Ｈ２Ｏ２溶液をゆっくり添加した後、一晩中室温で撹拌した。次に、塩化クロリド（ＮａＣｌ）７０ｇを加え、メチレンクロリド溶液で３回抽出して、無水マグネシウムサルフェートで乾燥した後、濃縮して、化合物（ＩＶ）を定量的収率で得た。
【００４６】
化合物（ＩＶ）５．１ｇをメタノール１３ｍｌとともに丸いフラスコ（１００ｍｌ）に入れ、アンモニウムクロリド（ＮＨ４Ｃｌ）１．３ｇを加えた後、９８ｍｌの濃いアンモニウムヒドロキシド溶液（ＮＨ４ＯＨ）を添加した。一晩中撹拌した後、白色エマルジョン状態の溶液を濾過して、４ｇの固体粉末を収得した。固体粉末４ｇをイソプロピルアルコール２８ｇに溶解し、還流を行った後、室温に冷却して、白色結晶状態の化学式Ａ９化合物、すなわち２−［ビス（４−フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミド２．１ｇを得た。
【００４７】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．６８（ｂｓ，１Ｈ）；７．５６−７．５１（ｍ，４Ｈ），７．３３（ｂｓ，１Ｈ），７．２９−７．２４（ｍ，４Ｈ），５．４（ｓ，１Ｈ）；３．４（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ）；３．１６（ｄ，Ｊ＝１３．６Ｈｚ，１Ｈ）
【００４８】
【化１１】
2021536459.tif 000013
【００４９】
１−２）化学式Ａ８化合物の合成
公知の方法で３，３'−ビスフルオロベンズヒドロール（３，３'−ｂｉｓｆｌｕｏｒｏ  ｂｅｎｚｈｙｄｒｏｌ）を合成した（Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ，ｖｏｌ  ５８，４４２，２０１７，ＥＰ  １，４３３，７４４，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ  ４０，８５１，１９９７）。この化合物を出発物質として使用し、上記化学式Ａ９化合物の合成方法を利用して化学式Ａ８化合物、すなわち２−［ビス（３−フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミドを合成した。
【００５０】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．６８（ｂｓ，１Ｈ）；７．５−７．２（ｍ，９Ｈ），５．４（ｓ，１Ｈ）；３．４（ｄ，１Ｈ）；３．１６（ｄ，Ｈｚ，１Ｈ）
【００５１】
１−３）化学式Ａ７化合物の合成
公知の方法で２，２'−ビスフルオロベンズヒドロール（２，２'−ｂｉｓｆｌｕｏｒｏ  ｂｅｎｚｈｙｄｒｏｌ）を合成した（ＥＰ１，６６１，９３０，Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．ｖｏｌ  ５１，＃４，９７６，２００８）。この化合物を出発物質として使用し、上記化学式Ａ９化合物の合成方法を利用して化学式Ａ７化合物、すなわち２−［ビス（２−フルオロフェニル）メタンスルフィニル］アセトアミドを合成した。
【００５２】
１Ｈ  ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ６）：δ７．６８（ｂｓ，１Ｈ）；７．５−７．２（ｍ，９Ｈ），７．３３（ｂｓ，１Ｈ），５．４（ｓ，１Ｈ）；３．４（ｄ，１Ｈ）；３．１６（ｄ，１Ｈ）
【００５３】
２）実験方法
２−１）細胞培養
線維芽細胞（ＣＲＬ−２７９５；Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，ＶＡ）は、ダルベッコ培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ，Ｈｙｃｌｏｎｅ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ）で培養し、ヒト由来血管内皮細胞（ｈｕｍａｎ  ｕｔｅｒｉｎｅ  ｍｉｃｒｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌｓ；ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）は、ＭＶ２培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ  ＧｍｂＨ）で培養し、ヒト由来肝星細胞（ｈｕｍａｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ；Ｉｎｎｏｐｒｏｔ，Ｂｉｚｋｉａ，Ｓｐａｉｎ）は、Ｐ６０１２６培地（Ｉｎｎｏｐｒｏｔ）でそれぞれ培養した。
【００５４】
すべての細胞は、５％二酸化炭素湿式条件で３７℃に維持した。このように培養した細胞は、ＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、本発明の化学式Ａ１〜Ａ９化合物（ＣＢＭ−Ｎ１〜Ｎ９）にそれぞれ２４時間露出させた後、実験を実施した。
【００５５】
２−２）肝疾患マウスモデル構築
本発明の化学式Ａ１〜Ａ５化合物（ＣＢＭ−Ｎ１〜Ｎ５）が、肝炎症および線維化に及ぼす治療効果を確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６自然型マウス（オリエンタルバイオから購入）を対象として次の実験を実施した。まず、マウスで肝疾患を誘発するために、チオアセトアミド（ｔｈｉｏａｃｅｔａｍｉｄｅ，ＴＡＡ）を投与（Ａ実験）したり、脂肪性肝疾患を誘発する欧米型食餌で飼育（Ｂ実験）したりした。マウスは、正常対照群、疾患誘発群、薬物投与群に区分し、これらの３グループに対して、Ａ実験ではそれぞれ１５〜１００匹のマウスを、Ｂ実験ではそれぞれ１０匹のマウスを使用した。各グループのマウスに対する薬物処理方式は、次の通りである。
【００５６】
（１）正常対照群；Ａ実験の正常対照群は、疾患誘発群においてＴＡＡを注入するときに使用したＴＡＡ溶媒を同じ量で週３回腹腔内注入し、Ｂ実験の正常対照群は、正常食餌で飼育した。Ａ実験とＢ実験は、いずれも、ＣＢＭ−Ｎ１溶媒はＣＢＭ−Ｎ１投与時と同じ量をオラルチューブにより週５回投与した。ＴＡＡ溶媒は蒸留水であり、ＣＢＭ−Ｎ１とその誘導体の溶媒は、ＤＭＳＯと蒸留水を１：１の割合で混ぜたものである。添付の図面において、ＣあるいはＣｏｎｔｒｏｌは、正常対照群を意味する。
【００５７】
（２）疾患誘発群；Ａ実験の疾患誘発群は、ＴＡＡを１００ｍｇ／ｋｇずつ週３回腹腔内注入し、Ｂ実験の疾患誘発群は、欧米型食餌（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｄｉｅｔ，ＷＤ、４５％飽和脂肪、０．２％コレステロール、果糖および葡萄糖を含有する水）で飼育した。Ａ実験とＢ実験は、いずれも、ＣＢＭ−Ｎ１溶媒はＣＢＭ−Ｎ１投与時と同じ量をオラルチューブにより週５回投与した。添付の図面においてＴＡＡは、ＴＡＡによる疾患誘発群を意味し、ＷＤは、欧米型食餌による疾患誘発群を意味する。
【００５８】
（３）薬物投与群；Ａ実験では、ＴＡＡ（１００ｍｇ／ｋｇ、３回／週）とともに上記化学式１〜５化合物（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、５回／週）を投与し、Ｂ実験では、欧米型食餌とともにＣＢＭ−Ｎ１〜Ｎ５（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ、５回／週）を投与した。このような方法で１６週間処理したマウスは、麻酔剤を過多投与して即死させた後、肝と血液を摘出した。添付の図面においてＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ２、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ３、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ４およびＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ５は、それぞれ化学式Ａ１〜Ａ５化合物を投与した疾患誘発群を意味する。
【００５９】
２−３）肺炎および肺線維化マウスモデル構築
本発明の化学式Ａ９化合物（ＣＢＭ−Ｎ９）がブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）による肺炎および肺線維化に及ぼす治療効果を確認するために、Ｃ５７ＢＬ／６自然型マウスを対象として次の実験を実施した。まず、マウスを正常対照群、疾患誘発群、薬物投与群に区分し、これらの３つのグループに対してそれぞれ１０匹のマウスを使用した。各グループのマウスに対する薬物処理方式は、次の通りである。
【００６０】
（１）正常対照群：疾患誘発群においてブレオマイシン注入時と同じ量の蒸留水を気道内に注入した。そして、ＣＢＭ−Ｎ９溶媒は、下記疾患誘発群においてＣＢＭ−Ｎ９投与するときと同じ量で週５回腹腔内注射した。
【００６１】
（２）疾患誘発群：ブレオマイシン１．５ｕｎｉｔを気道内に注入した。そして、ＣＢＭ−Ｎ９溶媒は、ＣＢＭ−Ｎ９投与時と同じ量を週５回腹腔内注射した。
【００６２】
（３）薬物投与群；ブレオマイシン１．５ｕｎｉｔを気道内に注入した。そして、ＣＢＭ−Ｎ９（５０ｍｇ／ｋｇ）を週５回腹腔内注射した。
【００６３】
上記のような方法で４週間薬物処理をしたマウスは、麻酔剤を過多投与して即死させた後、肺を摘出した。
【００６４】
２−４）肝および肺組織のパラフィン組織標本の製作および形態学的変化の観察
マウスモデルでそれぞれ化学式Ａ１化合物（ＣＢＭ−Ｎ１）あるいは化学式Ａ９化合物（ＣＢＭ−Ｎ９）の治療効果を組織学的に確認するために、パラフィン組織標本を製作した。肝および肺組織をパラホルムアルデヒド溶液で固定させ、１〜２ｍｍの厚さで切断した。切断した組織をパラフィンに包埋（ｅｍｂｅｄｄｉｎｇ）し、４μｍの厚さで切ってキシレンでパラフィンを除去した後、エタノールでキシレンを除去し、水道水で洗浄した。このような処理した組織に対してヘマトキシリンおよびエオシン染色を実施したり、組織免疫学的染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）したりした。
【００６５】
（１）ヘマトキシリン−エオシン染色：ハリスヘマトキシリン染色溶液で５分間処置して核を先に染色（青色）した後、エオシン溶液で対照染色（ピンク色）を実施した。
【００６６】
（２）炎症マーカーに対する組織免疫学的染色：特異抗体を使用して炎症マーカー（ＣＤ８２、ＣＤ４５）を染色し、リンパ球様細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ）が茶色に染色される。
【００６７】
（３）線維化マーカーに対する組織免疫学的染色：Ｍａｓｓｏｎ'ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色法を利用してコラーゲンを染色したり、Ｒｅｔｉｃｕｌｉｎ染色法でｒｅｔｉｃｕｌｉｎ線維を染色したりした。
【００６８】
２−５）肝機能検査
肝疾患マウスモデルから採取した血液を利用してアスパラギン酸アミノ基転移酵素（ＡＳＴ、ＧＯＴ）とアラニンアミノ基転移酵素（ＡＬＴ、ＧＰＴ）、全体ビリルビン、アルブミン濃度を測定した。肝機能検査方法は、次の表１の通りである。
【００６９】
【表１】
2021536459.tif 000014
【００７０】
２−６）リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）分析
摘出した肝組織で炎症あるいは線維化因子のｍＲＮＡ発現程度をリアルタイムポリメラーゼ連鎖反応で測定した。肝組織のＲＮＡをＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ）で分離し、ＢｃａＢＥＳＴポリメラーゼ（ＴａｋａｒａＳｈｕｚｏ）を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成した後、ポリメラーゼ連鎖反応を行った。
【００７１】
この際、使用した炎症誘発サイトカインおよび線維化マーカーのプライマー配列（配列番号１〜３０）は、下記の表２〜表４の通りである。
【００７２】
【表２】
2021536459.tif 000015
ＫＣａ２．３チャネルプライマー配列
【００７３】
【表３】
2021536459.tif 000016
炎症誘発サイトカインプライマー配列
【００７４】
【表４】
2021536459.tif 000017
線維化マーカープライマー配列
【００７５】
２−７）ウェスタンブロット分析
細胞をタンパク質抽出緩衝液で溶解し、上澄み液でタンパク質の濃度をブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）分析で決定した後、タンパク質３０μｇをＳＤＳ−ＰＡＧＥに加え、ニトロセルロース膜に移した。ニトロセルロース膜を５％のＢＳＡを含むＴＢＳＴ（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ａｎｄ  ０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ−２０，ｐＨ７．６）で室温において１時間の間遮断した。ブロットは、１次抗体と一晩中インキュベーションした後、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼ標識（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ）２次抗体に１時間の間インキュベーションした。バンドを化学発光により視覚化した。データ収集と処理は、発光映像分析器（Ｉｍａｇｅ  ａｎａｌｙｚｅｒ  ＬＡＳ−３０００）とＩＭＡＧＥ  ＧＡＵＳＥソフトウェア（Ｆｕｊｉ  ｆｉｌｍ，Ｊａｐａｎ）を使用して行った。
【００７６】
２−８）ＭＴＴ細胞増殖試験法
細胞を９６−ウェルプレート（９６−ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅｓ）に２×１０４個／ウェル程度で播種した後、細胞増殖を促進するＴＧＦβに２４時間露出させた。そして、各ウェルにＭＴＴ０．１ｍｇを添加した後、４時間の間３７℃で露出させた。その後、培養液を除去し、ジメチルスルホキシド（ｄｉｍｅｔｈｙｌ  ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）で細胞を分解した後、測定機を利用して５９０ｎｍで吸光度を測定した。
【００７７】
２−９）電気生理学的分析
分離培養した単一細胞で細胞全膜電流（ｗｈｏｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｕｒｒｅｎｔ）をパッチクランプ法（ｐａｔｃｈ−ｃｌａｍｐ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）で測定した。細胞全膜電位固定（ｗｈｏｌｅ−ｃｅｌｌ  ｖｏｌｔａｇｅ  ｃｌａｍｐ）細胞でマイクロガラス電極を通じて−１００ｍＶから＋１００ｍＶまでの電圧ランプ（ｖｏｌｔａｇｅ  ｒａｍｐ）を加え、発生する電流を増幅器（ＥＰＣ−１０，ＨＥＫＡ，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ）で増幅した後、１〜４ｋＨｚの標本抽出率で記録した。
【００７８】
標準外用液は、１５０ｍＭのＮａＣｌ、６ｍＭのＫＣｌ、１．５ｍＭのＣａＣｌ２、１ｍＭのＭｇＣｌ２、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、１０ｍＭのグルコース、ｐＨ７．４（ＮａＯＨで滴定）を含み、マイクロガラス電極（ピペット）溶液は、４０ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＫ−ａｓｐａｒｔａｔｅ、２ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１ｍＭのＥＧＴＡ、４ｍＭ  Ｎａの２ＡＴＰ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．２（ＫＯＨで滴定）を含む。ピペット溶液中、自由Ｃａ２＋濃度は、５ｍＭのＥＧＴＡの存在下に適当量のＣａ２＋を加えて１μＭに調節した（ＣａＢｕｆで計算；Ｇ．Ｄｒｏｏｇｍａｎｓ，Ｌｅｕｖｅｎ，Ｂｅｌｇｉｕｍ）。
【００７９】
ＫＣａ２．３電流は、次のような方法で分離した。細胞全膜電位固定された細胞にガラス電極を通じて１μＭのＣａ２＋を注入し、ＫＣａ２．３電流を活性化させる１−エチル−２−ベンズイミダゾリノン（１−ｅｔｈｙｌ−２−ｂｅｎｚｉｍｉｄａｚｏｌｉｎｏｎｅ；１−ＥＢＩＯ、１００μＭ）を加えて記録した電流においてでＫＣａ２．３チャネル抑制剤であるアパミン（２００ｎＭ）により抑制される電流をＫＣａ２．３電流と判定し、記録された電流は、細胞の静電容量で分けて標準化した。
【００８０】
２−１０）統計的分析
実験結果は、平均値±標準誤差（Ｓ．Ｅ．Ｍ）で表現した。統計的な分析は、Ｓｔｕｄｅｎｔ'ｓ  ｔ−ｔｅｓｔで行い、有意な水準０．０５以下を有意な差異があるものと判定した。
【００８１】
３）培養細胞を利用した実験結果
本発明の化学式Ａ１〜Ａ９化合物（ＣＢＭ−Ｎ１〜Ｎ９）についてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＫＣａ２．３チャネルの発現に及ぼす影響を明らかにし、線維化を抑制するかを糾明するために本実験を行った。
【００８２】
３−１）ＫＣａ２．１およびＫＣａ３．１チャネルに及ぼす成長因子とＣＢＭ−Ｎ１の効果
添付の図１ａは、血管内皮細胞でＰＤＧＦ、ＴＧＦβ、ＣＢＭ−Ｎ１がそれぞれＫＣａ２．３チャネルあるいはＫＣａ３．１チャネルの発現に及ぼす効果を示すものである。血管内皮細胞をＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）あるいはＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍｌ）に２４時間露出させると、ＫＣａ２．３チャネルｍＲＮＡ（左側パネル）とタンパク質（中間パネル）の発現を増加した。一方、ＫＣａ３．１チャネルの発現は、ＰＤＧＦ処置により増加しなかった（右側パネル）。そして、ＰＤＧＦでＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現を増加させた細胞にＣＢＭ−Ｎ１を２４時間処置すると、ＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現が有意に減少した（中間パネル）。
【００８３】
添付の図１ｂは、線維芽細胞（左側パネル）あるいは肝星細胞（右側パネル）においてＣＢＭ−Ｎ１がＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現に及ぼす効果を示すものである。試験結果、ＣＢＭ−Ｎ１の処置により安定状態のＫＣａ２．３チャネル発現水準が線維芽細胞で減少し、肝星細胞では濃度依存的に減少した。
【００８４】
添付の図１ｃは、肝星細胞においてＣＢＭ−Ｎ１によるＫＣａ２．３チャネル発現の抑制がＫＣａ２．３電流に及ぼす影響を示すものである。ＣＢＭ−Ｎ１に２４時間露出させた細胞と露出させない細胞との間にＫＣａ２．３電流の大きさを比較した。ＫＣａ２．３電流の大きさは、ＣＢＭ−Ｎ１に露出させない細胞において１８．９８±４．１７ｐＡ／ｐＦ、露出させた細胞において７．７７±２．６５ｍＶ／ｐＦであることが示された。すなわち、ＣＢＭ−Ｎ１によるＫＣａ２．３チャネル発現の抑制によってＫＣａ２．３電流が有意に減少した。このようにＣＢＭ−Ｎ１によりＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現が減少した細胞においてＫＣａ２．３電流が減少するというのは、ＣＢＭ−Ｎ１によりこのチャネルタンパク質の細胞膜発現が減少することを意味する。
【００８５】
３−２）ＣＢＭ−Ｎ１の線維化抑制効果
添付の図２ａおよび図２ｂは、線維芽細胞においてＴＧＦβにより誘発された線維化に対してＣＢＭ−Ｎ１の抑制効果を示すものである。ＴＧＦβによる線維化誘発効果は、線維化マーカーのタンパク質発現程度（図２ａ）と細胞増殖誘発効果（図２ｂ）により判定した、線維芽細胞をＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍｌ）に２４時間露出させると、線維化マーカーであるα−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ（α−ＳＭＡ）、ｃｏｌｌａｇｅｎ  １α（Ｃｏｌ１α）、ｃｏｌｌａｇｅｎ  ３α（Ｃｏｌ３α）タンパク質の量が増加し、細胞増殖が促進された。しかしながら、線維芽細胞をＴＧＦβ＋ＣＢＭ−Ｎ１に２４時間露出させると、線維化マーカーの発現程度が減少し、細胞増殖が抑制された。この結果は、ＣＢＭ−Ｎ１が線維化誘発因子による線維化を抑制することを意味する。
【００８６】
３−３）ＣＢＭ−Ｎ１〜ＣＢＭ−Ｎ９がＫＣａ２．３チャネル発現と細胞増殖に及ぼす効果
添付の図３は、肝星細胞においてＣＢＭ−Ｎ１誘導体がＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現に及ぼす影響を示すものである。具体的に、細胞をＣＢＭ−Ｎ２、ＣＢＭ−Ｎ５、ＣＢＭ−Ｎ８およびＣＢＭ−Ｎ９に２４時間露出させた結果、ＫＣａ２．３チャネルの発現が有意に減少した。
【００８７】
添付の図４は、肝星細胞においてＣＢＭ−Ｎ２〜ＣＢＭ−Ｎ４、ＣＢＭ−Ｎ９によるＫＣａ２．３チャネルの発現抑制がＫＣａ２．３電流に及ぼす効果を示すものである。化合物にそれぞれ２４時間露出させてＫＣａ２．３チャネル発現を抑制させた細胞と化合物に露出させない細胞との間にＫＣａ２．３電流の大きさを比較した結果、ＣＢＭ−Ｎ２〜ＣＢＭ−Ｎ４、ＣＢＭ−Ｎ９に対する露出によりＫＣａ２．３チャネル発現が減少した細胞においてＫＣａ２．３電流の大きさが有意に減少した。
【００８８】
添付の図５は、線維芽細胞においてＴＧＦβあるいはＰＤＧＦによる細胞増殖に及ぼすＣＢＭ−Ｎ２〜ＣＢＭ−Ｎ５、ＣＢＭ−Ｎ８、ＣＢＭ−Ｎ９の効果を示すものである。細胞を線維化誘発因子であるＴＧＦβ（５ｎｇ／ｍｌ）あるいはＰＤＧＦ（２０ｎｇ／ｍｌ）に２４時間露出させると、線維芽細胞の増殖が大きく増加し、このような細胞増殖は、ＣＢＭ−Ｎ２〜ＣＢＭ−Ｎ５、ＣＢＭ−Ｎ８、ＣＢＭ−Ｎ９により大きく減少した。
【００８９】
４）肝疾患マウスモデルに対する実験結果
肝疾患マウスモデルで本発明の化学式Ａ１〜Ａ５化合物（ＣＢＭ−Ｎ１〜ＣＢＭ−Ｎ５）の治療効果を糾明するために、本実験を行った。
【００９０】
４−１）組織学的あるいは免疫組織学的分析
添付の図６ａは、肝組織のヘマトキシリン−エオシン染色結果を示すものであり、上側パネルに点線で表示した部分を拡大して下側パネルに示した。疾患誘発群（ＴＡＡ）の場合、ＴＡＡにより中心静脈（ｃｅｎｔｒａｌ  ｖｅｉｎ，ＣＶ）を中心として近隣部位に炎症が起こるが、中心静脈の近くに多く集まっている核が大きい炎症細胞であるからこれを確認することができた（図６ａの矢印）。特に正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて疾患誘発群において炎症細胞が大きく増加し、薬物投与群（ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１）では、疾患誘発群に比べて炎症細胞の数が大きく減少したことが確認された。
【００９１】
添付の図６ｂは、肝組織の炎症マーカーであるＣＤ８２の染色結果を示すものであり、正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の肝組織では、茶色に染色される細胞がなく、リンパ球様細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｃｅｌｌ）がないことを確認した。一方、ＴＡＡによる疾患誘発群（ＴＡＡ）の肝組織では、中心静脈と中心静脈との間で茶色に染色される細胞が多く発見された。一方、ＴＡＡとＣＢＭ−Ｎ１  Ｒ−異性体あるいはＳ−異性体を共に投与した薬物投与群の肝組織（ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１（Ｒ）あるいはＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１（Ｓ））では、茶色に染色される細胞が非常に微弱に観察されている。
【００９２】
添付の図６ｃは、肝組織のコラーゲン線維に対するＭａｓｓｏｎ'ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ染色結果を示すものであり、コラーゲンが青色に染色された。正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の肝組織は、まだ線維化が進行されない健康な状態であるのに対し、疾患誘発群（ＴＡＡ）の肝組織は、中心静脈周辺と中心静脈と中心静脈との間に青色に染色（矢印部分）されていて、線維化が進行していることを確認した。ところが、ＴＡＡとＣＢＭ−Ｎ１  Ｒ−異性体あるいはＳ−異性体を共に投与した薬物投与群（ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１（Ｒ）、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１（Ｓ））の肝組織では、中心静脈の近所で非常に軽微に線維化が観察された。
【００９３】
添付の図６ｄは、肝組織のＲｅｔｉｃｕｌｉｎ線維の染色結果を示すものであり、Ｒｅｔｉｃｕｌｉｎ線維が黒色に染色された。正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）の肝組織では、Ｒｅｔｉｃｕｌｉｎ線維が観察されなかった一方で、疾患誘発群（ＴＡＡ）の肝組織は、中心静脈周辺と中心静脈と中心静脈との間でＲｅｔｉｃｕｌｉｎ線維（矢印部分）を確認することができた。そして、ＴＡＡとＣＢＭ−Ｎ１  Ｒ−異性体あるいはＳ−異性体を共に投与した薬物投与群の肝組織（ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１（Ｒ）あるいは（ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１（Ｓ））では、Ｒｅｔｉｃｕｌｉｎ線維が非常に軽微に中心静脈の近所だけで観察された。
【００９４】
４−２）血中ＡＬＴ、ＡＳＴ分析を通した肝機能検査
添付の図７ａは、正常対照群と、ＴＡＡによる疾患誘発群、そしてＣＢＭ−Ｎ１〜ＣＢＭ−Ｎ５で処理した薬物投与群に対して施行した肝機能の検査結果である。正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、疾患誘発群（ＴＡＡ）、薬物投与群（ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ２、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ３、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ４、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ５）でＡＬＴは、それぞれ４１．６±７．９ｕｎｉｔｓ／Ｌ、２０９．０±４２．４ｕｎｉｔｓ／Ｌ、７０．３±１４．７ｕｎｉｔｓ／Ｌ、１１３．４±７．９ｕｎｉｔｓ／Ｌ、１０３．０±６．９ｕｎｉｔｓ／Ｌ、１１４．１±８．８ｕｎｉｔｓ／Ｌ、１０６．４±１２．８ｕｎｉｔｓ／Ｌであり、ＡＳＴ血中水準は、それぞれ６０．４±７．５ｕｎｉｔｓ／Ｌ、２１１．１±２２．４ｕｎｉｔｓ／Ｌ、６２．７±１１．６ｕｎｉｔｓ／Ｌ、８３．６±１４．８ｕｎｉｔｓ／Ｌ、７３．４±７．４ｕｎｉｔｓ／Ｌ、６６．６±９．４ｕｎｉｔｓ／Ｌ、６７．７±１０．２ｕｎｉｔｓ／Ｌであることが示された。
【００９５】
そして、図７ｂは、欧米型食餌による疾患誘発群の試験結果を示すものであり、正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、欧米型食餌による疾患誘発群（ＷＤ）、薬物投与群（ＷＤ＋ＣＢＭ−Ｎ１）においてＡＬＴは、それぞれ３８．７±９．７ｕｎｉｔｓ／Ｌ、１８９．８±３７．６ｕｎｉｔｓ／Ｌ、８７．２±２４．７ｕｎｉｔｓ／Ｌであり、ＡＳＴ血中水準は、それぞれ４７．４±１８．２ｕｎｉｔｓ／Ｌ、１７３．５±３１．５ｕｎｉｔｓ／Ｌ、７１．４±１９．８ｕｎｉｔｓ／Ｌであることが示された。
【００９６】
上記の試験結果から、ＴＡＡまたは欧米型食餌により誘発された肝機能の低下は、本発明の化学式Ａ１〜化学式Ａ５化合物（５０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）により有意的に回復することが分かる。
【００９７】
４−３）炎症マーカーに対するｍＲＮＡ検査
添付の図８ａから図８ｃに正常対照群、疾患誘発群、薬物投与群において炎症誘発サイトカインｍＲＮＡ発現を比較した結果を示した。炎症マーカーとしては、炎症が起こったときに増加するＴＮＦα（ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ）、ＣＣＬ２（ｃｈｅｍｏａｔｔｒａｃｔａｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−１）、ＩＬ１２（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−１２）、ＴＧＦ（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ１α、ＩＬ６、ＭＩＰ−２（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ−２）を使用した。炎症因子ｍＲＮＡ水準は、疾患誘発群（ＴＡＡ）において正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて増加し、ＣＢＭ−Ｎ１投与群（ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１）では、疾患誘発群（ＴＡＡ）に比べて減少した（図８ａ）。
【００９８】
また、ＣＢＭ−Ｎ２〜ＣＢＭ−Ｎ５投与群（ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ２、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ３、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ４、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ５）においても疾患誘発群に比べて減少した（図８ｂ）。したがって、本発明の化学式Ａ１〜化学式Ａ５化合物は、炎症誘発サイトカインの発現を減少させてＴＡＡによる炎症性肝疾患に治療効果があることが分かる。
【００９９】
そして、図８ｃは、正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）、欧米型食餌による疾患誘発群（ＷＤ）、薬物投与群（ＷＤ＋ＣＢＭ−Ｎ１）において炎症誘発サイトカインｍＲＮＡ発現を比較した結果である。この際、炎症誘発サイトカインでＣＣＬ２、ＩＬ６、ＩＬ１αを測定した。このような炎症因子ｍＲＮＡ発現水準は、疾患誘発群において正常対照群に比べて増加し、薬物投与群では、疾患誘発群に比べて減少した。
【０１００】
４−４）線維化マーカーに対するｍＲＮＡ検査
添付の図９は、正常対照群、疾患誘発群、薬物投与群において線維化マーカーｍＲＮＡ発現水準を比較した結果を示すものである。線維化マーカーとしては、Ｃｏｌ１α、Ｃｏｌ３α、Ｃｏｌ４α、α−ＳＭＡ、ＴＧＦＲ２（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ２）を使用した。線維化マーカーは、疾患誘発群（ＴＡＡ）において正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて増加していて、炎症により線維化が進行していることが分かる。ところが、ＣＢＭ−Ｎ１投与群（ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１）では、このような線維化因子の水準が減少することを確認した。
【０１０１】
４−５）炎症マーカーまたは線維化マーカータンパク質の発現に及ぼす効果
添付の図１０ａは、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルでＣＢＭ−Ｎ１のＲ−異性体およびＳ−異性体が炎症マーカーのタンパク質発現に及ぼす影響を示すものである。正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて疾患誘発群（ＴＡＡ）の肝組織でＴＩＭＰ−２とＣＣＲ２のタンパク質の発現水準が大きく増加して炎症が進行されたことが示された。しかしながら、ＣＢＭ−Ｎ１  Ｒ−異性体またはＳ−異性体投与群［ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１（Ｒ）、ＴＡＡ＋ＣＢＭ−Ｎ１（Ｓ）］では、ＴＩＭＰ−２とＣＣＲ２のタンパク質の発現水準が減少して炎症が抑制されることを確認した。
【０１０２】
添付の図１０ｂには、ＴＡＡによる肝疾患マウスモデルでＣＢＭ−Ｎ１のＲ−異性体またはＳ−異性体が線維化マーカーのタンパク質発現に及ぼす影響を示した。正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて疾患誘発群（ＴＡＡ）の肝組織でα−ＳＭＡとＣｏｌ１αのタンパク質の発現水準が大きく増加して線維化が進行されたことが示された。しかしながら、ＣＢＭ−Ｎ１  Ｒ−異性体またはＳ−異性体投与群では、α−ＳＭＡとＣｏｌ１αのタンパク質の発現水準が大きく減少して線維化が抑制されることを確認した。
【０１０３】
４−６）ＫＣａ２．３チャネルタンパク質発現に及ぼす効果
添付の図１１にＴＡＡによる肝疾患マウスモデルでＣＢＭ−Ｎ１のＲ−異性体またはＳ−異性体がＫＣａ２．３チャネルタンパク質発現に及ぼす影響を示した。正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて疾患誘発群（ＴＡＡ）の肝組織でＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現水準が大きく増加した。しかしながら、ＣＢＭ−Ｎ１のＲ−異性体あるいはＳ−異性体投与群では、ＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現水準が大きく減少した。このような結果は、ＴＡＡによる肝疾患は、ＫＣａ２．３発現の増加と関連し、ＣＢＭ−Ｎ１の治療効果は、ＫＣａ２．３発現の減少と関連していることを示唆する。
【０１０４】
５）肺疾患マウスモデルに対するＣＢＭ−Ｎ９の実験結果
ブレオマイシンによる肺疾患マウスモデルで本発明の化学式Ａ９化合物（ＣＢＭ−Ｎ９）の治療効果を糾明するために、本実験を行った。
【０１０５】
５−１）組織学的あるいは免疫組織学的分析
添付の図１２は、肺組織でヘマトキシリン−エオシン染色、ＣＤ４５（ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ，ＬＣＡ染色）に対する組織免疫学的染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）、コラーゲンに対するマッソンのトリクローム（Ｍａｓｓｏｎ'ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色結果を示すものである。炎症および線維化程度が正常対照群に比べて疾患誘発群（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）において増加し、ＣＢＭ−Ｎ９投与群（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ＋ＣＢＭ−Ｎ９）において疾患誘発群に比べて減少したことが確認された。
【０１０６】
５−２）炎症または線維化マーカータンパク質の発現に対する分析
図１３ａには、肺疾患マウスモデルでＣＢＭ−Ｎ９が炎症マーカータンパク質発現に及ぼす影響を示した。正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて疾患誘発群（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）の肺組織で炎症マーカーであるＴＩＭＰ−２とＣＣＲ２のタンパク質の発現水準が大きく増加して炎症が進行されたことが示された。ＣＢＭ−Ｎ９薬物投与群（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ＋ＣＢＭ−Ｎ９）では、ＴＩＭＰ−２とＣＣＲ２のタンパク質の発現水準が大きく減少して炎症が抑制されることを確認した。
【０１０７】
図１３ｂには、肺疾患マウスモデルでＣＢＭ−Ｎ９が線維化マーカータンパク質の発現に及ぼす影響を示した。正常対照群（Ｃｏｎｔｒｏｌ）に比べて疾患誘発群（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）の肺組織で線維化マーカーであるα−ＳＭＡとＣｏｌ１αのタンパク質の発現水準が大きく増加して肺線維化が進行されたことが示された。一方、薬物投与群（Ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ＋ＣＢＭ−Ｎ９）では、ＴＩＭＰ−２とＣＣＲ２のタンパク質の発現水準が大きく減少して線維化が抑制されることを確認した。
【０１０８】
６）評価および結論
以上説明したように、本発明による化学式Ａ１〜Ａ９化合物は、培養細胞を対象とする生体外実験で化合物を長期間（２４時間あるいは１６週）投与する場合、ＫＣａ２．３チャネルタンパク質の発現減少を通じて線維化を抑制する効能があることが示された。具体的に、培養した肝星細胞、線維芽細胞、血管内皮細胞を化学式Ａ１〜Ａ９化合物に２４時間露出する場合、ＫＣａ２．３チャネルの細胞膜発現を抑制し、線維化を誘発する成長因子による線維化関連因子（α−ＳＭＡ、Ｃｏｌ１α等）の発現と細胞増殖を抑制することが確認された。
【０１０９】
また、本発明の化学式Ａ１〜Ａ９化合物は、マウスモデルを対象とする生体内試験においても、肝疾患誘発群において炎症および線維化抑制効果があることが確認された。具体的に、肝疾患あるいは肺疾患マウスモデルに対して１６週間上記化学式Ａ１〜Ａ９化合物を投与した結果、炎症および線維化が有意に抑制されることが示された。
【０１１０】
なお、本発明者らが韓国特許ＫＲ１０−１３４５８６０およびＫＲ１０−１４１４８３１とこれに対応する米国特許ＵＳ９，２５９，４１２で明らかにしたように、本発明の化学式Ａ１〜Ａ５化合物は、ｃＡＭＰによるＫＣａ３．１チャネルリン酸化を誘発してＫＣａ３．１チャネル活動度を抑制する効能がある。ところが、このようにｃＡＭＰ増加によりＫＣａ３．１チャネルの活動度を抑制することは、線維化の治療にほとんど効果を有しないと思われる。
【０１１１】
上記特許は、化学式Ａ１〜Ａ５化合物に短期間（数分以内）露出した場合に現れる効果に関するものであり、これらの化合物によるｃＡＭＰ増加は、２０分程度に最高に到達した後、急激に減少して、３時間内に薬物投与前と類似になる（Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ  １４４（４）：１２９２−１３００）。したがって、ｃＡＭＰを通した効果は、長い場合、１時間程度の短い時間の間にのみ持続し、本発明の場合のように、２４時間あるいは１６週間持続する可能性はないためである。
【０１１２】
そして、本発明の図１ａで確認されるように、線維化誘発因子であるＰＤＧＦに２４時間露出する場合、ＫＣａ２．３チャネル発現は大きく増加する一方で、ＫＣａ３．１チャネル発現は増加しなかった。このような結果は、線維化過程では、ＫＣａ２．３チャネル発現の増加が非常に重要な要素であり、本発明による化学式Ａ１〜Ａ９化合物の線維化抑制効果は、ＫＣａ２．３チャネル発現の減少を通じて現れた結果と結論付けることができる。
【０１１３】
なお、本発明では、現実的な限界によって上記化学式Ａ化合物に属するすべての化合物に対して上記のような実験を実施しなかったが、上記化学式Ａ化合物の化学的活性と生体内での代謝メカニズムなどを考慮してみると、上記化学式Ａ化合物は、全部上記化学式Ａ１〜Ａ９化合物と同一または類似の薬理学的効能を有することが推測される。
【図１ａ】
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【図１ｂ】
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【図１ｃ】
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【図２ａ】
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【図２ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【国際調査報告】
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