(57)【要約】本発明は、免疫原性試験および他のインビトロＴ細胞反応性試験のために、ワクチン接種、免疫寛容の誘導、ＴＣＲの遮断、ＭＨＣ媒介性毒素送達およびＣＡＲを用いたＴ細胞の再指向のための主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法に関する。本発明はさらに、候補ペプチドのＭＨＣ結合親和性を決定するための方法に関する。本発明は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を発現させること、前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む、方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を発現させること、前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む、方法。
【請求項２】
（ｉ）組換えＭＨＣベータおよび／またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファおよび／またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）前記細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること；
（ｉｖ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞からＤＮＡを単離すること；
（ｖ）前記細胞表面上にＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記ＤＮＡに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を発現させること、前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、ならびに前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現のレベル、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む、方法。
【請求項４】
（ｉ）組換えＭＨＣベータおよび／またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファおよび／またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）前記細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること；
（ｉｖ）前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体の細胞表面発現のレベルを決定すること
（ｖ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞からＤＮＡを単離すること；
（ｖｉ）前記細胞表面上にＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記ＤＮＡに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖および膜貫通ドメインならびに細胞外ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖および膜貫通ドメインを含むＭＨＣクラスＩＩ分子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＨＣ分子が、前記細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および膜貫通ドメインならびにベータ−２ミクログロブリンを含むＭＨＣクラスＩ分子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＭＨＣ−ペプチド複合体が、前記候補ペプチド、ベータ−２マクログロブリン、前記細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および膜貫通ドメインを含む融合タンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ＭＨＣアルファ鎖がＹ８４Ａ突然変異を有する、請求項６または７に記載の方法。
【請求項９】
ＭＨＣ分子の各鎖が膜貫通ドメインを含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記膜貫通ドメインが前記ＭＨＣ分子のネイティブ膜貫通ドメインである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記膜貫通ドメインが、ＴＣＲα／β、ＴＣＲγ／δ、ＣＤ３γ／δ／ε／ζ、ＣＤ４またはＣＤ８α／βなどの異種分子の膜貫通ドメインである、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記レポーター細胞株が哺乳動物細胞株である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記レポーター細胞株が、前記ＭＨＣクラスＩＩペプチドローディング機構を欠く細胞株である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記レポーター細胞株がＴ細胞ハイブリドーマである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記レポーター細胞株が、機能的ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ−２−ミクログロブリン遺伝子を欠く細胞株である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記レポーター細胞株が、欠陥または欠失ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ−２−ミクログロブリン遺伝子を有するＴ細胞ハイブリドーマである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記候補ペプチドが、個々の腫瘍由来突然変異を有する腫瘍特異的ペプチドである、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記突然変異がＳＮＶである、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記候補ペプチドが、免疫反応を引き起こす抗原である、請求項１〜１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記候補ペプチドが、免疫原性試験を受けている化合物である、請求項１〜１６に記載の方法。
【請求項２１】
それらの表面上にＭＨＣを効率的に発現するレポーター細胞を、ＦＡＣＳベースまたはＭＡＣＳベースの細胞選別により濃縮する、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞表面に提示された前記候補ペプチドの配列を、ＰＣＲおよびシークエンシングにより決定する、前述の請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記候補ペプチドが、ワクチンとして使用するためのものである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ワクチンが腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）ベースの癌ワクチンである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記候補ペプチドが、それが含む前記エピトープの少なくとも１つに対する免疫寛容を誘導するために使用するためのものである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記候補ペプチドが、ＭＨＣ分子との関連でＴＣＲを遮断するために使用するためのものである、請求項１〜２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記候補ペプチドが、細胞への、特にＴ細胞へのＭＨＣ媒介性毒素送達に使用するためのものである、請求項１〜２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記候補ペプチドが、ＭＨＣ−ＣＡＲを用いてＴ細胞を再指向させるために使用するためのものである、請求項１〜２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記候補ペプチドが、免疫原性試験に使用するためのものである、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記候補ペプチドが、Ｔ細胞反応性試験に使用するためのものである、請求項１〜２２または２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
候補ペプチドのＭＨＣ結合親和性を決定するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を発現させること、前記レポーター細胞の表面上に前記ＭＨＣ−ペプチド複合体を提示するレポーター細胞を検出すること、およびこのような提示／発現のレベルを決定することを含む、方法。
【請求項３２】
（ｉ）少なくとも１つの膜貫通領域に接続された組換えＭＨＣアルファまたはベータドメインの上流にクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファまたはベータドメインと一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞を検出すること、
（ｉｖ）このような提示／発現のレベルを決定すること
を含む、請求項３１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、免疫原性試験および他のインビトロＴ細胞反応性試験のために、ワクチン接種、免疫寛容の誘導、ＴＣＲの遮断および、ＭＨＣ媒介性毒素送達を含むインビボおよび／またはインビトロ介入のための主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｔ細胞は、免疫系において中心的な役割を果たす。Ｔ細胞の機能は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により提示されるペプチドに含まれるエピトープの認識に大きく依存する。ＡＰＣは、ほぼすべての有核細胞タイプであり得るが、樹状細胞（ＤＣ）などのプロフェッショナルＡＰＣは、提示において特に効率的である。異なる機能を有するＴ細胞の異なるセットがあり、特に、ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞は、プロフェッショナルＡＰＣにより提示されるＭＨＣＩＩ結合エピトープ、またはほとんどの細胞タイプにより提示されるＭＨＣＩ結合エピトープをそれぞれ認識する。ＭＨＣ分子は、短い線状ペプチドの形態の細胞抗原またはエピトープをＴ細胞に提示する際に重要な役割を果たす。
【０００３】
ＭＨＣは、アルファおよびベータ鎖と、これらの鎖により形成された溝に結合したペプチドとからなる。空のＭＨＣ分子が細胞表面からダウンレギュレートされて分解されるように、この複合体の安定性はペプチド結合に大きく依存する。それにもかかわらず、空のＭＨＣ分子は細胞の表面上に存在し、細胞外ペプチドに結合してそれらをＴ細胞に提示し得る。さらに、空のＭＨＣの２つの異なる異性体が記載された（Ｒａｂｕｎｏｗｉｔｚら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，９，６９９−７０９（１９９８））：より低い安定性の活性異性体およびより高い安定性の不活性異性体。個人のＭＨＣレパートリーは多遺伝子性であり、ＭＨＣ遺伝子は非常に多型である。したがって、個人が発現し得るＭＨＣのセットは、別のランダムな個人のセットとは非常に異なる可能性が高い。
【０００４】
ＭＨＣを有するペプチドは、Ｔ細胞の表面上に存在するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と相互作用し、これがＴ細胞の活性化につながる。樹状細胞またはマクロファージなどのＡＰＣは、食作用により、または受容体媒介性エンドサイトーシスにより抗原を内在化し得る。
【０００５】
Ｔ細胞の活性を制御するために、それらの特定のペプチドリガンドを決定し、ＭＨＣ−ペプチド複合体とＴＣＲとの相互作用を制御またはモジュレートすることが重要である。したがって、ＭＨＣへのペプチド結合親和性を決定することが重要である。適切なペプチドまたはＭＨＣ−ペプチド複合体は、様々な用途に使用され得る。それらは、例えば、反応性Ｔ細胞を識別もしくは濃縮するために、またはインビトロ免疫原性試験のために使用され得る。それらはまた、ＴＣＲを遮断するために、インビボで毒素をＴ細胞に送達するために、またはＭＨＣ含有キメラ抗原受容体ＭＨＣ−ＣＡＲを用いてＴ細胞を再指向させるために（Ｊｙｏｔｈｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０，１２１５−１２２０（２００２））、そうでなければこのエピトープに特異的なＴ細胞を活性化するであろうエピトープに対する免疫寛容を誘導するために使用され得る。ワクチン、特に癌細胞の排除のためにＴ細胞を活性化するための腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）ベースの癌ワクチンの開発は、現代医学の主要な目標である。腫瘍特異的ペプチド、いわゆるネオ抗原は腫瘍細胞にのみ存在し、正常組織には全く存在しない。このような腫瘍特異的ペプチドは、新規タンパク質配列の形成をもたらす腫瘍特異的ＤＮＡ変化により作られる。異なる腫瘍内および腫瘍間の細胞の遺伝的不均一により、それらが同じ器官から発生した場合であっても、患者の腫瘍に存在するネオ抗原のセットは、主にこの患者に特異的である。腫瘍特異的ペプチドは、ＭＨＣとの関連で、腫瘍細胞およびいわゆる抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上にディスプレイされる。腫瘍特異的ペプチドが細胞表面上に提示されると、それらは、免疫系により認識および破壊され得る。したがって、腫瘍特異的ペプチドを含有するワクチンは、免疫系を刺激して、これらの分子を表面上に提示する癌細胞を検出および破壊し得る。
【０００６】
最近、腫瘍に蓄積する体細胞突然変異から生じるＴＳＡは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）により頻繁に認識されることが示されている（Ｌｉｎｎｅｍａｎｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １−７（２０１４））。腫瘍ＤＮＡのエクソームシークエンシングおよび健常組織由来のＤＮＡとの比較は、患者の腫瘍細胞に特異的なこのような体細胞突然変異の発見を可能にする。しかしながら、通常、多くの突然変異が検出されるが（Ｖｏｒｍｅｈｒら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３９，１４−２２（２０１６））、技術的問題のためだけではなく自己免疫のリスクを最小化するためにも、１つのワクチンでは、ごくわずかのＴＳＡ（すなわち、腫瘍特異的ペプチド）を混合すべきである。抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、すべての可能なペプチドをそれらのＭＨＣ分子上に提示するのではなく、患者に特異的な特定のＭＨＣ対立遺伝子に適合するサブセットを提示するので、これらのＴＳＡの選択は重要である。ＡＰＣにより効率的に提示されるペプチド、特に腫瘍特異的ペプチドの選択は、Ｔ細胞が関与する多くの用途に重要であり、依然として腫瘍ワクチン設計のボトルネックである。この問題を解決するために、候補ペプチドは、通常、バイオインフォマティクス分析を用いて予測されたそれらのＭＨＣ結合親和性にしたがってランク付けされる（Ｓａｈｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １−１９（２０１７）；Ｏｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ５４７，２１７−２２１（２０１７））。しかしながら、最近のデータは、特にＭＨＣクラスＩＩエピトープについて、ペプチド提示のバイオインフォマティクス予測のパフォーマンスが極めて低いことを示している（Ｓｏｆｒｏｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４６，３１９−３２８（２０１５））。抗原提示レポーター細胞株を使用して、（そのＴＣＲを介した）ＭＨＣ−ペプチド複合体へのＴ細胞の結合を測定する「ウェットラボ」法が開示されている；国際公開第２０１６０９７３３４号。そのレポーター細胞株は、Ｔ細胞のＴＣＲへの結合により、レポーター細胞株におけるレポーター遺伝子を活性化するＭＨＣ−ペプチド複合体を含むキメラ抗原受容体を発現する。間接的には、十分に安定なＭＨＣ−ペプチド複合体のみがレポーター細胞株の表面に出現し、Ｔ細胞と相互作用し、最終的にはレポーターを活性化するので、その方法を用いてＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性も測定される。しかしながら、レポーター遺伝子の活性化はまた、ペプチドのエピトープへのＴＣＲの親和性および他の免疫調節因子に依存するので、その方法は、ＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性を特異的に測定することを可能にしない。
したがって、ＡＰＣにより効率的に提示されるペプチド、特にＴＳＡを確実に決定するための手段および方法を提供する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｊｙｏｔｈｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０，１２１５−１２２０（２００２）
【非特許文献２】Ｌｉｎｎｅｍａｎｎら、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １−７（２０１４）
【非特許文献３】Ｖｏｒｍｅｈｒら、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３９，１４−２２（２０１６）
【非特許文献４】Ｓａｈｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ  １−１９（２０１７）
【非特許文献５】Ｏｔｔら、Ｎａｔｕｒｅ  ５４７，２１７−２２１（２０１７）
【非特許文献６】Ｓｏｆｒｏｎら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４６，３１９−３２８（２０１５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
今回、本発明は、本発明の特許請求の範囲および以下の実施形態でより具体的に定義されるこのような手段および方法を提供するという点で、この必要性を満たす。
【０００９】
その主な態様において、本発明は、以下に関するものである。
【００１０】
１．主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を発現させること、前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む、方法。
【００１１】
２．（ｉ）組換えＭＨＣベータおよび／またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファおよび／またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）前記細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること；
（ｉｖ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞からＤＮＡを単離すること；
（ｖ）前記細胞表面上にＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記ＤＮＡに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、態様１に記載の方法。
【００１２】
３．主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を発現させること、前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、ならびに前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現のレベル、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む、方法。
【００１３】
４．（ｉ）組換えＭＨＣベータおよび／またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファおよび／またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）前記細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離すること；
（ｉｖ）前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体の細胞表面発現のレベルを決定すること
（ｖ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞からＤＮＡを単離すること；
（ｖｉ）前記細胞表面上にＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記ＤＮＡに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定すること
を含む、態様３に記載の方法。
【００１４】
５．前記ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖および膜貫通ドメインならびに細胞外ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖および膜貫通ドメインを含むＭＨＣクラスＩＩ分子である、態様１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【００１５】
６．前記ＭＨＣ分子が、前記細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および膜貫通ドメインならびにベータ−２ミクログロブリンを含むＭＨＣクラスＩ分子である、態様１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【００１６】
７．前記ＭＨＣ−ペプチド複合体が、前記候補ペプチド、ベータ−２マクログロブリン、前記細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および膜貫通ドメインを含む融合タンパク質である、態様１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【００１７】
８．前記ＭＨＣアルファ鎖がＹ８４Ａ突然変異を有する、態様６または７に記載の方法。
【００１８】
９．ＭＨＣ分子の各鎖が膜貫通ドメインを含む、態様１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【００１９】
１０．前記膜貫通ドメインが前記ＭＨＣ分子のネイティブ膜貫通ドメインである、態様１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【００２０】
１１．前記膜貫通ドメインが、ＴＣＲα／β、ＴＣＲγ／δ、ＣＤ３γ／δ／ε／ζ、ＣＤ４またはＣＤ８α／βなどの異種分子の膜貫通ドメインである、態様１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【００２１】
１２．前記レポーター細胞株が哺乳動物細胞株である、態様１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【００２２】
１３．前記レポーター細胞株が、前記ＭＨＣクラスＩＩペプチドローディング機構を欠く細胞株である、態様１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【００２３】
１４．前記レポーター細胞株がＴ細胞ハイブリドーマである、態様１３に記載の方法。
【００２４】
１５．前記レポーター細胞株が、機能的ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ−２−ミクログロブリン遺伝子を欠く細胞株である、態様１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【００２５】
１６．前記レポーター細胞株が、欠陥または欠失ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ−２−ミクログロブリン遺伝子を有するＴ細胞ハイブリドーマである、態様１５に記載の方法。
【００２６】
１７．前記候補ペプチドが、個々の腫瘍由来突然変異を有する腫瘍特異的ペプチドである、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
【００２７】
１８．前記突然変異がＳＮＶである、態様１７に記載の方法。
【００２８】
１９．前記候補ペプチドが、免疫反応を引き起こす抗原である、態様１〜１６に記載の方法。
【００２９】
２０．前記候補ペプチドが、免疫原性試験を受けている化合物である、態様１〜１６に記載の方法。
【００３０】
２１．それらの表面上にＭＨＣを効率的に発現するレポーター細胞を、ＦＡＣＳベースまたはＭＡＣＳベースの細胞選別により濃縮する、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
【００３１】
２２．前記細胞表面に提示された前記候補ペプチドの配列を、ＰＣＲおよびシークエンシングにより決定する、前述の態様のいずれか一項に記載の方法。
【００３２】
２３．前記候補ペプチドが、ワクチンとして使用するためのものである、態様１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【００３３】
２４．前記ワクチンが腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）ベースの癌ワクチンである、態様２３に記載の方法。
【００３４】
２５．前記候補ペプチドが、それが含む前記エピトープの少なくとも１つに対する免疫寛容を誘導するために使用するためのものである、態様１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【００３５】
２６．前記候補ペプチドが、ＭＨＣ分子との関連でＴＣＲを遮断するために使用するためのものである、態様１〜２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
【００３６】
２７．前記候補ペプチドが、細胞への、特にＴ細胞へのＭＨＣ媒介性毒素送達に使用するためのものである、態様１〜２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
【００３７】
２８．前記候補ペプチドが、ＭＨＣ−ＣＡＲを用いて細胞を再指向させるために使用するためのものである、態様１〜２２または２５のいずれか一項に記載の方法。
【００３８】
２９．前記候補ペプチドが、免疫原性試験に使用するためのものである、態様１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【００３９】
３０．前記候補ペプチドが、Ｔ細胞反応性試験に使用するためのものである、態様１〜２２または２９のいずれか一項に記載の方法。
【００４０】
３１．候補ペプチドのＭＨＣ結合親和性を決定するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を発現させること、前記レポーター細胞の表面上に前記ＭＨＣ−ペプチド複合体を提示するレポーター細胞を検出すること、およびこのような提示／発現のレベルを決定することを含む、方法。
【００４１】
３２．（ｉ）少なくとも１つの膜貫通領域に接続された組換えＭＨＣアルファまたはベータドメインの上流にクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファまたはベータドメインと一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞を検出すること、
（ｉｖ）このような提示／発現のレベルを決定すること
を含む、態様３１に記載の方法。
【００４２】
本発明は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を発現させること、前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む方法を提供する。
【００４３】
本発明は、少なくとも部分的には、哺乳動物細胞株における組換えペプチド−ＭＨＣ複合体の表面発現レベルを定量的に直接測定し得るという驚くべき発見に基づく。抗体染色およびフローサイトメトリーに基づく標準的な実験技術により、Ｔ細胞および／または精巧なレポーター系を伴う複雑な共培養系を用いずに、ペプチド−ＭＨＣ複合体のこのような直接測定が実行可能であったことはさらに驚くべきことである。バイオインフォマティクスアプローチに基づく予測が常に非常に正確であるとは限らないことは当業者に公知であり得るが、最先端のバイオインフォマティクス法が、本明細書に開示される方法により決定される特定のＭＨＣ変異体へのペプチドの結合を完全に予測することができなかったことは依然として驚くべきことである。組換えＭＣＲ（国際公開第２０１６０９７３３４号に開示されているペプチド−ＭＨＣ−ＴＣＲキメラ）複合体に含まれるＭＨＣの検出が、分析すべき特定のペプチドおよび／またはＭＨＣ変異体にかかわらずＣＤ３ｅ抗体で可能であったことはさらに驚くべきことである。理論に縛られるものではないが、本明細書に開示される方法は、異なる抗体を使用して異なるＭＨＣ変異体を検出する場合に導入され得る技術的変動を伴わずに、主にＭＨＣによるペプチド提示の生物学的変動を測定することを可能にする。
【００４４】
ペプチドをＭＨＣ分子に共有結合的に付着させて、ペプチドプロセシング／ローディング機構の必要性を克服し得る。このアプローチは、安定ＭＨＣ四量体を生産するために（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ８，６７５−６８２（１９９８））、様々なＭＨＣディスプレイ方法において（Ｃｒａｗｆｏｒｄら、ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ  ２，ｅ９０（２００４）；Ｗｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２４，７０１−７０９（２０１１））、ＡＰＣ上に単一ペプチドを発現するマウスを生成するために（Ｉｇｎａｔｏｗｉｃｚら、Ｃｅｌｌ  ８４，５２１−５２９（１９９６））、またはＴ細胞を他のＴ細胞に再指向させるように設計されたＣＡＲにおいて（Ｊｙｏｔｈｉら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０，１２１５−１２２０（２００２））使用されている。多くの場合、酵母または昆虫細胞の表面上における発現を可能にするためにＭＨＣ分子を突然変異させなければならず（Ｗｅｎら、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２４，７０１−７０９（２０１１））、いくつかの研究では、さらなるジスルフィド架橋を組み込むことにより、ＭＨＣの溝でペプチドを安定化するための措置が取られた（Ｔｒｕｓｃｏｔｔら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７８，６２８０−６２８９（２００７））。
【００４５】
しかしながら、本発明との関連において、ＭＨＣペプチドローディングが不可能な細胞では、テザーされたペプチドを有しない組換えＭＨＣ分子は、過剰発現された場合であっても、細胞表面上で検出不能または不安定（低レベルで検出可能）であることが示されている（図４）。
【００４６】
したがって、Ｒａｂｕｎｏｗｉｔｚ（Ｒａｂｕｎｏｗｉｔｚら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ，９，６９９−７０９（１９９８））により記載されている空のＭＨＣの比較的安定な異性体は、存在する場合であっても、非プロフェッショナル抗原提示細胞の表面上で非常に長く存続しない。重要なことに、本発明との関連において、組換えＭＨＣにテザーされたすべてのペプチドが、ＭＨＣ複合体の効率的な細胞表面発現につながるわけではないことが示されている。実際、いくつかは、表面上における発現を妨げる（図２ａおよびｂ）。したがって、未感染レポーター細胞および／または共有結合ペプチドもしくは不安定なＭＨＣ−ペプチド複合体を有しないＭＨＣを形質導入したレポーター細胞と比較して、適切なレポーター細胞株の表面上では、テザーされた候補ペプチドを有する組換えＭＨＣ分子の発現が高いことは、ＭＨＣによる効率的なペプチド提示の指標として使用され得る。換言すれば、組換えＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞は、前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現を、未感染レポーター細胞または共有結合ペプチドもしくは不安定なＭＨＣ−ペプチド複合体を有しないＭＨＣを形質導入したレポーター細胞のバックグラウンドシグナルと比較することにより検出され得る。さらに、このような提示／発現のレベルの測定（図２ａおよび７）は、それらのＭＨＣ結合能力によるペプチドのランク付けの形成を可能にする。ＭＨＣにより提示されるペプチドの検出および／またはランク付けは、必要な場合にはいつでも、１つまたはそれを超える正規化工程、例えば、共有結合的に結合された候補ペプチドを有しないかまたは候補ペプチドもしくはランダムペプチドと不安定な相互作用を発揮する各ＭＨＣ変異体のバックグラウンドシグナルによる正規化を含み得る。当技術分野で周知の正規化および／または標準化方法は、必要な場合にはいつでも、組換えＭＨＣ−ペプチド複合体の測定された表面発現に基づいてＭＨＣへの候補ペプチドの結合親和性を決定するために使用され得る。
【００４７】
特定の実施形態では、候補ペプチドのランク付けおよび／またはＭＨＣへの候補ペプチドの結合親和性の決定は、抗ＣＤ３ｅ、抗ＣＤ３δまたは抗ＣＤ３γ抗体を使用するＣＤ３染色により決定される組換えＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現と直接相関し得る。好ましくは、ＭＨＣは、前記ＣＤ３染色との前記相関のためにＭＣＲに含まれる。
【００４８】
今回、適切に設計されたＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体を使用して、ＡＰＣにより効率的に提示される候補ペプチドを識別し得ることが初めて示された。
【００４９】
さらに、本発明の範囲内において、ＴＣＲの膜貫通ユニットに融合されたＭＨＣのネイティブ細胞外ドメインに連結されたペプチドから構成されるＭＨＣ−ＴＣＲ融合タンパク質（ＭＣＲ）を使用する場合、すべてのＭＨＣクラスＩＩペプチド組み合わせが細胞の表面上に効率的に発現されるわけではないことが見出された。例えば、様々なＭＨＣ−ペプチド組み合わせを試験したところ、インフルエンザマトリックスタンパク質１（ＭＰ１）由来ペプチドの差次的表面発現が観察された。重要なことに、ペプチド結合予測分析は、ＭＨＣペプチド結合親和性について同様のパターンを示さなかった。
【００５０】
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態の候補ペプチドを識別するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）候補ペプチドを含むライブラリー、特に、組換えＭＨＣベータおよび／またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成する工程；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファおよび／またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入する工程；
（ｉｉｉ）細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞を検出する工程；
（ｉｖ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞からＤＮＡを単離する工程；
（ｖ）前記細胞表面上に提示されたＭＨＣ−ペプチド複合体内の前記候補ペプチドの配列を決定する工程
を含む方法に関する。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）」という用語は、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩ遺伝子ならびにそれによりコードされるタンパク質を指す。ＭＨＣ−Ｉ、ＭＨＣ−ＩＩ、ＭＨＣ−１およびＭＨＣ−２という用語は、これらのクラスの分子を示すために本明細書で様々に使用される。
【００５２】
特定の実施形態では、本発明は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）により提示される候補ペプチドを識別するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を発現させること、前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現を示すレポーター細胞を検出すること、ならびに前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現のレベル、および前記細胞表面に提示された候補ペプチドの配列を決定することを含む方法に関する。
【００５３】
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態の候補ペプチドを識別するための方法であって、以下の工程：
（ｉ）組換えＭＨＣベータおよび／またはアルファ鎖の上流にインフレームでクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成する工程；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファおよび／またはベータ鎖と一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入する工程；
（ｉｉｉ）前記細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を発現する細胞を検出および単離する工程；
（ｉｖ）前記１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体の細胞表面発現のレベルを決定する工程
（ｖ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞からＤＮＡを単離する工程；
（ｖｉ）前記細胞表面上にＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞から単離された前記ＤＮＡに組み込まれたベクターによりコードされる候補ペプチドの配列を決定する工程
を含む方法に関する。
【００５４】
哺乳動物では、クラスＩおよびクラスＩＩと指定される２つのタイプのＭＨＣ分子がある。ＭＨＣクラスＩ分子は、体内のほぼすべての有核細胞上に存在し、ＣＤ８＋細胞により認識される。ＭＨＣクラスＩＩ分子は、主に免疫系のプロフェッショナルＡＰＣ上に発現され、ＣＤ４＋細胞により認識される。この分子は、抗原性サブタイプによりさらに細分化される。ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）とも称されるヒトＭＨＣクラスＩ分子は、ＨＬＡ−Ａ、−Ｂおよび−Ｃと指定される。ヒトＭＨＣクラスＩｌ分子は、ＨＬＡ−ＤＲ、−ＤＱおよび−ＤＰと指定される。
【００５５】
ＭＨＣクラスＩ分子は、体のほぼすべての細胞上に見られる。ＭＨＣクラスＩ分子は、β２ミクログロブリン（β２ｍ）と称される約１２ｋＤａの単型（ヒト）非ＭＨＣコード軽（β）鎖タンパク質と非共有結合的に会合した多型重鎖（α）から構成されるヘテロ二量体である。重α鎖は、それぞれが約９０個のアミノ酸（Ｎ末端にα１、α２およびα３）と、約４０アミノ酸の膜貫通領域と、約３０アミノ酸の細胞質尾部とを含有する３つの細胞外ドメインからなる約４５ｋＤａの多型膜貫通糖タンパク質である。膜遠位ドメインであるα１およびα２ドメインは、８〜１０アミノ酸のペプチドに結合するための十分なサイズのペプチド結合溝または間隙を形成するのに対して、α３ドメインは原形質膜の近位にある。提示されるペプチドは、α１およびα２ドメインの中央領域におけるペプチド結合溝により保持される。
【００５６】
ＭＨＣクラスＩ分子は、いくつかの特殊な細胞タイプ、特に抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージ、樹状細胞およびＢ細胞にのみ見られる。クラスＩＩ  ＭＨＣ分子は、非共有結合的相互作用により会合する３３ｋＤのα鎖および２８ｋＤａのβ鎖の２つの異なるポリペプチド鎖を含有する。クラスＩ  ＭＨＣ分子と同様に、クラスＩＩ  ＭＨＣ分子は、細胞外ドメイン、膜貫通セグメントおよび細胞質尾部を含有する膜結合糖タンパク質である。
【００５７】
これらの非共有結合的ヘテロ二量体複合体における各鎖は、２つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含有する。細胞外ドメインは、それぞれα鎖およびβ鎖についてα１およびα２ドメインならびにβ１およびβ２ドメインである。クラスＩＩ分子の膜遠位ドメインは、α１およびβ１ドメインから構成され、典型的には長さが１３〜１８アミノ酸、あるいは１０〜１８アミノ酸またはそれよりも長いペプチドに結合するための十分なサイズを有するペプチド結合溝または間隙を形成する。クラスＩＩα２およびβ２の膜近位ペアは、Ｉｇ定常（Ｃ）ドメインとの構造類似性を有する。ヒトでは、クラスＩＩαおよびβ鎖遺伝子の３つのペアが存在し、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＰおよびＨＬＡ−ＤＱとして公知である。ＨＬＡ−ＤＲについて、最高レベルの多型が記録されている。
【００５８】
本明細書で使用される場合、候補ペプチドは、８〜１８アミノ酸または最大５０アミノ酸の長さを有するペプチドを指す。ＭＨＣクラスＩに結合する候補ペプチドの好ましい長さは、８、９または１０アミノ酸である。ＭＨＣクラスＩＩに結合する候補ペプチドの好ましい長さは、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７または１８アミノ酸である。特に、候補ペプチドは、組換え核酸によりコードされるＭＨＣ−ペプチド複合体に含まれる。
【００５９】
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つの方法であって、前記ＭＨＣ分子が、細胞外ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖および膜貫通ドメインならびに細胞外ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖および膜貫通ドメインを含むＭＨＣクラスＩＩ分子である方法に関する。
【００６０】
他の実施形態では、ＭＨＣ分子は、細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および膜貫通ドメインならびにベータ−２ミクログロブリンを含むＭＨＣクラスＩ分子である。
【００６１】
また別の実施形態では、ＭＨＣ−ペプチド複合体は、候補ペプチド、ベータ−２マクログロブリン、細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖および膜貫通ドメインを含む融合タンパク質である。
【００６２】
ＭＨＣクラスＩ分子について、アルファ鎖におけるＹ８４Ａ突然変異はペプチド結合ポケットを開き、連結ペプチドのより良好な調節を可能にすることが示されている（Ｍｉｔａｋｓｏｖ，Ｖら、Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ  １４，９０９−９２２（２００７））。
【００６３】
したがって、特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子のＭＨＣアルファ鎖は、Ｙ８４Ａ突然変異を有する。例えば、Ｙ８４Ａ突然変異は、部位特異的変異誘発により導入され得る。
【００６４】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つの方法であって、前記ＭＨＣ分子が１つまたは２つの膜貫通ドメインを含む方法に関する。
【００６５】
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つの方法であって、前記膜貫通ドメインが前記ＭＨＣ分子のネイティブ膜貫通ドメインである方法に関する。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「ネイティブ膜貫通ドメイン」という用語は、ＭＨＣ分子の膜貫通部分の構造特性をそのネイティブ状態に維持するＭＨＣ膜貫通ドメインを指す。
【００６７】
特定の実施形態では、膜貫通ドメインは、限定されないが、ＴＣＲα／β、ＴＣＲγ／δ、ＣＤ３γ／δ／ε／ζ、ＣＤ４またはＣＤ８α／βを含む異種分子の膜貫通ドメインである。
【００６８】
本発明の方法を行うためのレポーター細胞株は、生物学的用途で使用され得る任意の細胞株または細胞株の誘導体であり得る。適切な細胞株またはその誘導体は、例えば限定されないが、ヒト、マウス、ラット、サル、ハムスター、魚、カエルもしくは昆虫起源、または酵母、例えば限定されないが、ＨＥＫ、ＣＨＯ、３Ｔ３、ハイブリドーマ、ＨｅＬａ、Ｓｆ９、Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  ２細胞、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＵＶＥＣ、ＨＬ−６０、ＭＣＦ−７、Ｓａｏｓ−２細胞、ＩＭＲ−９０、Ｒａｗ  ２６４．７、ＰＣ３、Ｖｅｒｏ、Ｃｏｓ、ＧＨ３、ＰＣ１２、イヌＭＤＣＫ、アフリカツメガエルＡ６またはゼブラフィッシュＡＢ９のものである。
【００６９】
特定の実施形態では、前記レポーター細胞株は、哺乳動物細胞株である。
【００７０】
適切な哺乳動物細胞株は、例えば限定されないが、Ｔ細胞ハイブリドーマ、Ｔ細胞クローン、Ｊｕｒｋａｔ、ＢＷ５１４７α−β融合パートナー、骨髄腫、ＨＥＫ、ＣＨＯ、３Ｔ３である。
【００７１】
特に、本発明において使用するために適切なレポーター細胞株、好ましくは哺乳動物細胞株は、細胞に元々存在する内因性タンパク質由来ペプチドをディスプレイする能力を欠くものである。したがって、細胞は、目的のペプチドライブラリー由来の候補ペプチドを有するＭＨＣ−ペプチド複合体のみを提示するはずである。ペプチドのプロセシングおよびディスプレイのためのＭＨＣ分子へのそれらのローディングは、プロセシングおよび提示機構を構成する複数の分子種が関与する多段階プロセスである。ＭＨＣクラスＩ分子は、ペプチドをＥＲに移行させるＴＡＰ（抗原プロセシングに関連するトランスポーター）と称されるトランスポーターを介してペプチドがロードされ、ＥＲにおいて、それらはＭＨＣクラスＩ分子に結合する。ＭＨＣクラスＩＩ分子のローディングは、食作用またはオートファジーにより起こる；ＭＨＣクラスＩＩ分子はファゴリソソームに送達され、細胞表面への移動前にペプチドがロードされる。ＭＨＣクラスＩＩ分子のペプチドプロセシング／ローディング機構は、ＡＰＣにのみ存在する。
【００７２】
上記によれば、一実施形態では、本発明の方法を行うために適切なレポーター細胞株は、ＭＨＣクラスＩＩペプチドローディング機構を欠くものである。好ましくは、ＭＨＣクラスＩＩペプチドローディング機構を欠くレポーター細胞株は、哺乳動物細胞株である。
【００７３】
特定の実施形態では、レポーター細胞株は、Ｔ細胞ハイブリドーマである。
【００７４】
別の実施形態では、本発明の方法を行うために適切なレポーター細胞株は、機能的ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ−２−ミクログロブリン遺伝子を欠くものである。
【００７５】
特定の実施形態では、レポーター細胞株は、欠陥または欠失ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ−２−ミクログロブリン遺伝子を有するＴ細胞ハイブリドーマである。欠陥または欠失ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ−２−ミクログロブリン遺伝子を有するレポーター細胞株の他の例としては、限定されないが、Ｔ細胞およびＢ細胞クローンまたはハイブリドーマ、ＨＥＫ細胞または３Ｔ３細胞が挙げられる。
【００７６】
エクソームシークエンシングは、腫瘍にユニークに存在するＴＳＡを識別するために使用され得る。例えば、ＴＳＡは、患者由来の腫瘍ＤＮＡをシークエンシングし、それを健常被験体由来のＤＮＡと比較することにより識別され得る。ＴＳＡは、各患者の腫瘍および正常ＤＮＡをシークエンシングすることにより、単一の患者についても識別され得る。この分析に基づいて、それぞれが腫瘍由来突然変異を有する複数の候補ペプチドは、ＭＨＣ−ペプチド複合体の生成に使用され得る。したがって、本発明の一実施形態では、ペプチドのライブラリーが使用される。これらのペプチドは、腫瘍由来突然変異を有し得るか、またはネイティブペプチドであり得る。
【００７７】
したがって、様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つの方法であって、前記候補ペプチドが、個々の腫瘍由来突然変異を有する腫瘍特異的ペプチドである方法に関する。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「腫瘍由来突然変異」という用語は、核酸配列における突然変異であって、腫瘍に特異的であり、健常組織由来のＤＮＡに存在しない突然変異を指す。
【００７９】
特定の実施形態では、腫瘍由来突然変異は一塩基変異（ＳＮＶ）である。ＳＮＶとしては、限定されないが、ｐ５３、ＫＲＡＳおよびＢＲＡＦの様々な突然変異が挙げられる。
【００８０】
別の実施形態では、候補ペプチドは、免疫反応を引き起こす抗原である。例えば、ペプチドは、病原体に由来し得る。
【００８１】
また別の実施形態では、候補ペプチドは、免疫原性試験を受けている化合物である。
【００８２】
一実施形態では、本発明は、候補ペプチドのライブラリーを使用する方法であって、前記ライブラリーがネイティブペプチドの突然変異体を含む方法に関する。例えば、ネイティブペプチドは、所定のＭＨＣ分子により効率的に提示されないことが公知であり得る。したがって、所定のＭＨＣ分子によってより効率的に提示されるペプチド突然変異体をスクリーニングするために、突然変異体ペプチドを含むライブラリーが使用され得る。
【００８３】
別の実施形態では、本発明は、候補ペプチドのライブラリーを使用する方法であって、前記ライブラリーが、目的の細胞または病原体由来のｃＤＮＡまたはＤＮＡのランダムな剪断または消化により生成されたペプチドを含む方法に関する。このようなライブラリーは、このような細胞に存在するすべてのペプチドをカバーする。例えば、癌組織または自己免疫攻撃を受けている組織からＭＨＣディスプレイライブラリーの生成は、所定のＭＨＣにより提示される可能性があるすべての組織ペプチドの定義を可能にするであろう。したがって、将来的には、試験を実施する必要がなく、特定のペプチドが特定のＭＨＣにより効率的に提示されるかを表で調べ得る。
【００８４】
一実施形態では、ＭＨＣ−ペプチド複合体ライブラリーは、組換え発現ベクターを使用して生成される。組換え発現ベクターは、（２）ｍＲＮＡに転写されてタンパク質に翻訳される所望のタンパク質（例えば、ＭＨＣ−ペプチド複合体）をコードするヌクレオチド配列ならびに（３）適切な転写および翻訳開始および終了配列に作動可能に連結された（１）遺伝子発現において調節的役割を有する作用物資、例えばプロモーター、オペレーターまたはエンハンサーのアセンブリを含む複製可能なＤＮＡ構築物である。プロモーターおよび他の調節エレメントの選択は、一般に、目的のレポーター細胞株により変動する。発現ベクターは、多くの場合、「プラスミド」（これは、それらのベクター形態では染色体に結合していない環状二本鎖ＤＮＡループを指す）の形態である。適切な原核生物発現ベクターとしては、大腸菌由来のプラスミド、例えばＣｏｌ  Ｅ１、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびそれらの誘導体、より広い宿主範囲のプラスミド、例えばＲＰ４、ファージＤＮＡ、例えばファージラムダおよびその様々な誘導体、Ｍ１３などが挙げられる。さらなる大腸菌ベクターは、例えば、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８２）およびＳａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されている。しかしながら、本発明は、同等の機能を果たし、その後に当技術分野で公知になるこのような他の形態の発現ベクターを含むことを意図する。エピソームとして複製する真核生物発現ベクター、例えばｐＣＥＰ４もしくはＢＫＶまたはウイルス由来の他のベクター、例えばレトロウイルス、例えばｐＭＹ、ｐＭＸ、ｐＳＩＲ、アデノウイルス、例えばｐＡｄなどが用いられ得る。発現ベクターでは、転写または翻訳を制御する調節エレメントは、一般に、哺乳動物、微生物、ウイルスまたは昆虫遺伝子に由来し得る。複製起点により通常付与される複製能力と、形質転換体の認識を容易にするための選択遺伝子とがさらに組み込まれ得る。真核生物ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターは、典型的には、真核生物発現ベクター、例えばＳＶ４０ベクター、パピローマウイルスベクターおよびエプスタインバーウイルス由来のベクターにおいて使用される。他の例示的な真核生物ベクターとしては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ−５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、ならびにＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスプロモーター、ルース肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーターまたは真核細胞における発現に有効であることが示されている他のプロモーターの指令下でタンパク質の発現を可能にする他の任意のベクターが挙げられる。
【００８５】
「プロモーター」は、核酸の転写を指令する一連の核酸制御配列として定義される。本明細書で使用される場合、プロモーターは、転写開始部位の近くに必要な核酸配列、例えばポリメラーゼＩＩ型プロモーターの場合にはＴＡＴＡエレメントを含む。プロモーターはまた、必要に応じて、転写開始部位から数千塩基対ほどに位置し得る遠位エンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含む。真核生物宿主細胞において使用するためのプロモーターは当業者に公知である。このようなプロモーターの例示的な例としては、限定されないが、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来のプロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）プロモーター、例えばＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーターモロニーウイルスプロモーター、ＡＬＶプロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えばＣＭＶ前初期プロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ならびにヒト遺伝子、例えばヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋肉クレアチンおよびヒトメタロチオネイン由来のプロモーターが挙げられる。適切なプロモーターのさらに他の例としては、ＣＡＧプロモーター（ＣＭＶエンハンサー、ニワトリβ−アクチンプロモーターおよびウサギβ−グロビンスプライシングアクセプターおよびポリ（Ａ）配列を含むハイブリッドプロモーター）が挙げられる。
【００８６】
「作動可能に連結された」という用語は、核酸発現制御配列（例えば、プロモーターまたは一連の転写因子結合部位）と第２の核酸配列との間の機能的連結を指し、発現制御配列は、第２の配列に対応する核酸の転写を指令する。
【００８７】
ＭＨＣペプチドライブラリーは、当技術分野で公知の標準的な技術を使用して発現ベクターを宿主細胞に形質導入することにより、適切なレポーター細胞株に導入される。適切な方法は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）に記載されている。形質導入のためのシュードレトロウイルスを生産するために、レトロウイルスタンパク質ＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶを一定に発現するパッケージング細胞株（例えば、フェニックス細胞株）に、ＬＴＲ、パッケージングシグナルおよび目的の遺伝子（この場合、ＭＨＣ鎖を有するペプチド）から構成されるウイルスゲノムを含有する構築物が一過性トランスフェクトされる。あるいは、ＨＥＫ、３Ｔ３のような適切な細胞株に、レトロウイルスタンパク質ＧＡＧ、ＰＯＬおよびＥＮＶを別個にコードするベクターと、ＬＴＲ、パッケージングシグナルおよび目的の遺伝子から構成されるウイルスゲノムとの混合物が一過性トランスフェクトされる。これらの一般に使用される戦略は、標的細胞に感染して目的の遺伝子をそれらのゲノムＤＮＡに導入することができる欠陥シュードレトロウイルスの生産を保証する。しかしながら、シュードレトロウイルスは、ゲノムにｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を有しないので、感染標的細胞は、レトロウイルスを産生することができない。あるいは、ＭＨＣ−ペプチドライブラリーは、脂質、リン酸カルシウム、カチオン性ポリマーもしくはＤＥＡＥ−デキストランに基づく試薬のトランスフェクションにより、またはエレクトロポレーションにより、適切なレポーター細胞株に導入され得る。
【００８８】
レポーター細胞株の「感染」および「形質導入」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
【００８９】
細胞表面露出ＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞を検出するための方法は、当技術分野で公知である。適切な方法としては、細胞選別技術、例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）および磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）が挙げられる。
【００９０】
したがって、様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つの方法であって、表面上にＭＨＣを効率的に発現するレポーター細胞を、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）により濃縮する方法に関する。
【００９１】
ＦＡＣＳは、細胞により発現される１つまたはそれを超える特定のポリペプチドの存在、非存在またはレベルに基づいて、細胞の集団を１つまたはそれを超える下位集団に分離する方法を指す。ＦＡＣＳは、細胞を下位集団に分類するために、個々の細胞の光学特性（蛍光を含む）に依拠する。本明細書に記載される方法を行うために適切なセルソーターは当技術分野で周知であり、市販されている。例示的なセルソーターとしては、ＭｏＦｌｏソーター（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ，Ｆｏｒｉ  Ｃｏｌｌｉｎｓ，Ｃｏｌｏ．）、ＦＡＣＳＡｒｉａ（商標）、ＦＡＣＳＡｒｒａｙ（商標）、ＦＡＣＳ  Ｖａｎｔａｇｅ（商標）、ＢＤ（商標）ＬＳＲ  ＩＩおよびＦＡＣＳＣａｉｉｂｕｒ（商標）（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，Ｃａｌｉｆ．）、ならびにＳｏｎｙ、Ｂｉｏ−ＲａｄおよびＢｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒなどの他の商業供給業者により生産された他の同等のセルソーターが挙げられる。
【００９２】
別の実施形態では、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つの方法であって、表面上にＭＨＣを効率的に発現するレポーター細胞を、ＭＡＣＳベースの細胞選別により濃縮する方法に関する。
【００９３】
「ＭＡＣＳ」は、細胞により発現される１つまたはそれを超えるＭＡＣＳ選択性ポリペプチドの存在、非存在またはレベルに基づいて、細胞の集団を１つまたはそれを超える下位集団に分離する方法を指す。ＭＡＣＳは、細胞を下位集団に選別するために、タグ付きの個々の細胞の感受性特性に依存する。ＭＡＣＳの場合、磁気ビーズ（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ  Ｂｅｒｇｉｓｃｈ  Ｇｌａｄｂａｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ；１３０−０４８−４０２から入手可能なもの）が標識として使用され得る。本明細書に記載される方法を行うために適切なＭＡＣＳセルソーターは当技術分野で周知であり、市販されている。例示的なＭＡＣＳセルソーターとしては、ａｕｔｏＭＡＣＳ  Ｐｒｏ  Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）が挙げられる。
【００９４】
様々な実施形態では、細胞は、ＭＨＣ−１もしくはＭＨＣ−ＩＩに特異的な抗体と、またはハイブリッドに関連するタンパク質を検出する抗体と接触され得る。例えば、ＭＨＣ細胞外ドメインがＴＣＲ膜貫通領域に融合される場合、ＣＤ３γ、ＣＤ３δまたはＣＤ３εを検出する抗体が使用され得る。抗体は、検出可能な標識に直接コンジュゲートされ得る。あるいは、検出可能な標識にコンジュゲートされた二次抗体であって、一次抗体に特異的な二次抗体が細胞と接触され得る。使用に適切な検出可能な標識としては、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段により検出可能な任意の化合物が挙げられる。本発明における有用な標識としては、ビオチン、磁気ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光標識（例えば、フルオレセイン、テキサスレッド、ローダミン、緑色蛍光タンパク質、ダンシル、ウンベリフェロン、ＰＥ、ＡＰＣ、ＣＹ５、Ｃｙ７、ＰｅｒＣＰ、Ａｌｅｘａ色素など）、放射性標識（例えば、３Ｈ、１２５１、３５Ｓ、１Ｃまたは３２Ｐ）、酵素（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼなど）および比色標識、例えばコロイド状金または着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。様々な適切な蛍光標識は、例えば、Ｔｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｐｒｏｂｅｓ  ａｎｄ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，１１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎにさらに記載されている。
【００９５】
選別は、どれほど多くの蛍光標識が使用されたかに応じて、非蛍光細胞の集団および蛍光細胞の少なくとも１つの集団をもたらす。蛍光細胞を有する少なくとも１つの細胞集団の存在は、少なくとも１つの候補ペプチドがＡＰＣにより効率的に提示されることを示す。したがって、ＦＡＣＳは、細胞の集団を選別して、表面露出ＭＨＣ−ＩまたはＭＨＣ−ＩＩを含む細胞が濃縮された細胞の集団を生産することを可能にする。
【００９６】
本発明の実施形態は、当業者に公知のＤＮＡ単離方法を利用する。一般に、目的は、細胞の核に存在するＤＮＡを他の細胞成分から分離することである。ＤＮＡの単離は、通常、細胞の溶解または分解から始まる。このプロセスは、タンパク質構造の破壊に必須であり、核からの核酸の放出を可能にする。溶解は、タンパク質を変性させるための界面活性剤またはプロテアーゼ（タンパク質を消化する酵素）、例えばプロテイナーゼＫまたはいくつかの場合ではその両方を含有する塩溶液中で行われる。それは、細胞の分解および膜の溶解をもたらす。ＤＮＡ単離方法としては、限定されないが、フェノール：クロロホルム抽出、高塩分沈殿、アルカリ変性、イオン交換カラムクロマトグラフィー、樹脂結合および常磁性ビーズ結合が挙げられる。
【００９７】
本発明の実施形態は、当業者に公知のｃＤＮＡ生成方法を利用する。一般に、目的は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）のテンプレートとして使用するために、細胞内に存在する単離されたＲＮＡをコピーＤＮＡと称されるＤＮＡに変換することである。ＲＮＡの単離は、通常、細胞の溶解または分解から始まる。このプロセスは、タンパク質構造の破壊に必須であり、それからの核酸の放出を可能にする。溶解は、通常、フェノール含有溶液（例えば、ＴＲＩｚｏｌ（商標））中で行われる。それは、細胞の分解および膜の溶解をもたらし、他の細胞成分からのＲＮＡの分離を可能にする。次いで、単離されたＲＮＡは、逆転写酵素（例えば、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（商標）、Ｇｏｓｃｒｉｐｔ（商標））によりｃＤＮＡに変換される。
【００９８】
次いで、細胞表面上に提示されたＭＨＣ−ペプチド複合体内の候補ペプチドの配列は、ＰＣＲにより増幅され、当技術分野で公知の任意の方法によりシークエンシングされ得る。
【００９９】
様々な実施形態では、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つの方法であって、前記候補ペプチドの配列を、ＰＣＲおよびシークエンシングにより決定する方法に関する。
【０１００】
一実施形態では、候補ペプチドの配列は、デジタルＰＣＲにより決定される。デジタルポリメラーゼ連鎖反応（デジタルＰＣＲ、ＤｉｇｉｔａｌＰＣＲ、ｄＰＣＲまたはｄｅＰＣＲ）は、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡを含む核酸を直接定量してクローン増幅するために使用され得る従来のポリメラーゼ連鎖反応法の改良版である。
【０１０１】
シークエンシングはまた、マイクロ流体工学を使用して実施され得る。マイクロ流体工学は、少量の流体を取り扱うマイクロスケールデバイスを伴う。マイクロ流体工学は、少量の流体、特に１μｌ未満の容量を正確かつ再現可能に制御および分配し得るので、マイクロ流体工学の適用は、大幅なコスト削減を提供する。マイクロ流体工学技術の使用は、サイクル時間を減少させ、結果が出るまでの時間を短縮し、スループットを増加させる。さらに、マイクロ流体工学技術の組み込みは、システムの統合および自動化を増強する。マイクロ流体反応は、一般に、微小液滴中で行われる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、シークエンシングは、限定されないが、パイロシークエンシング、シークエンシングバイライゲーション、単一分子シークエンシング、合成によるシーケンス（ＳＢＳ）、大規模並列クローン、大規模並列単一分子ＳＢＳ、大規模並列単一分子リアルタイム、大規模並列単一分子リアルタイムナノポア技術を含む第２世代シークエンシング（または次世代またはＮｅｘｔ−Ｇｅｎ）、第３世代（またはＮｅｘｔ−Ｎｅｘｔ−Ｇｅｎ）または第４世代（またはＮ３−Ｇｅｎ）シークエンシング技術を使用して実施される。ＭｏｒｏｚｏｖａおよびＭａｒｒａは、Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，９２：２５５（２００８）においてこのような技術の総説を提供する。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、シークエンシングの前、その後またはそれと同時に、核酸が増幅される。核酸増幅技術の例示的な非限定的な例としては、限定されないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、転写媒介性増幅（ＴＭＡ）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）および核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）が挙げられる。当業者は、特定の増幅技術（例えば、ＰＣＲ）は、増幅の前にＲＮＡがＤＮＡに逆転写されることを必要とする（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ）のに対して、他の増幅技術は、ＲＮＡを直接増幅する（例えば、ＴＭＡおよびＮＡＳＢＡ）ことを認識するであろう。
【０１０４】
一実施形態では、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つの方法であって、前記候補ペプチドが、ワクチンとして使用するためのものである方法に関する。
【０１０５】
特定の実施形態では、ワクチンは、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）ベースの癌ワクチンである。
【０１０６】
「ワクチン接種」または同等の用語は、当技術分野で十分に理解されている。例えば、ワクチン接種という用語は、抗原に対する被験体の免疫反応を増加させ、したがって疾患に抵抗するかまたはそれを克服する能力を増加させるプロセスであると理解され得る。「ワクチン」は、疾患（例えば、癌）の予防および／または処置のための免疫を生成するための組成物を意味すると理解すべきである。したがって、ワクチンは、抗原を含む医薬であり、ワクチン接種により特定の防御および保護物質を生成するためにヒトまたは動物で使用されることを意図する。「ＴＳＡベースの癌ワクチン」という用語は、腫瘍特異的抗原のプールされたサンプル、例えば少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つまたはそれを超える腫瘍特異的ペプチドを含有するワクチンを指すことを意味する。ワクチンが有効であるために、抗原またはエピトープを含有する短い線状ペプチドは、ＭＨＣによりＡＰＣの表面上に提示されなければならない。発現されるＭＨＣ変異体のセットは、異なる個体間で大きく異なる。
【０１０７】
再発性腫瘍由来突然変異は、より広範な患者コホートに適用可能なＴＳＡベースの癌ワクチンの開発を可能にする公的腫瘍特異的抗原として機能し得る。したがって、本発明の方法は、特定のＭＨＣ変異体を含有する患者を識別し、これらの共通／公的ＴＳＡを免疫系に効率的に提示するために使用され得る。しかしながら、多くの腫瘍由来突然変異は、患者特異的変化に由来すると思われ、これらの変化のいずれかが、ＭＨＣへのＴＳＡペプチドの結合に影響を与え得る。したがって、本発明の方法はまた、個別化ワクチンのための患者特異的候補ペプチドを識別するために使用され得る。
【０１０８】
さらに、多くの場合、患者の腫瘍は多くのＴＳＡを含み、その各々は、腫瘍細胞のサブセットにのみ含まれ得る。したがって、いくつかの実施形態では、候補ＴＳＡのセットは、腫瘍細胞の異なるセット由来のＴＳＡからなり得る。したがって、癌ワクチンの開発における重要な工程は、患者の腫瘍細胞に含まれ、好ましくはそこで十分に発現されるＴＳＡ候補から、その患者で発現されるＭＨＣへの高い親和性を有する候補を選択することである。最適な免疫反応のために、ワクチンに含まれるＴＳＡのセットは、それぞれＭＨＣＩＩまたはＭＨＣＩ−ペプチド複合体を認識するＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞の両方をさらに活性化すべきである。したがって、本発明の方法は、患者の特定のＭＨＣＩＩおよびＭＨＣＩ変異体に結合するＴＳＡを識別するために使用され得る。
【０１０９】
一実施形態では、候補ペプチドは、それが含むエピトープの少なくとも１つに対する免疫寛容を誘導するために使用するためのものである。本明細書で使用される場合、「免疫寛容」は、特定の抗原または複数の抗原に対する宿主の免疫学的反応性の減少を指す。抗原は、寛容の非存在下では望ましくない免疫反応を引き起こす免疫決定因子／エピトープを含む。免疫寛容は、移植拒絶、自己免疫、アレルギー反応または別の望ましくない免疫反応を予防または改善するために誘導され得る。理論に縛られるものではないが、免疫寛容は、免疫反応の負の調節因子として作用する制御性Ｔ細胞の生成により達成され得る。異なるタイプのＴ細胞のバランスはまた、ＴＣＲとＭＨＣ−ペプチド複合体との相互作用に依存し得る。したがって、本発明の方法は、そのペプチドに対する免疫寛容を生成するために適切なＭＨＣ−ペプチド複合体を選択するために使用され得る。免疫寛容を達成するための他の可能な機構は、特定のＴ細胞のＴＣＲの遮断および／または特定のＴ細胞の死滅を含む。
【０１１０】
したがって、一実施形態では、候補ペプチドは、ＭＨＣ分子との関連でＴＣＲを遮断するために使用するためのものである。「ＴＣＲの遮断」は、天然ＴＣＲ−ＭＨＣ相互作用を遮断するペプチド−ＭＨＣ複合体を含む任意の薬剤を指す。ＭＨＣ−ペプチド複合体のＴＣＲ遮断有効性を予測するために、その複合体の安定性が重要である。
【０１１１】
別の実施形態では、候補ペプチドは、細胞への、特にＴ細胞へのＭＨＣ媒介性毒素送達に使用するためのものである。
【０１１２】
「ＭＨＣ媒介性毒素送達」は、毒素を細胞、特にＴ細胞に送達して細胞の死を引き起こすために、毒性剤（タンパク質など）をペプチド−ＭＨＣ四量体または他のＭＨＣ多量体に共有結合的に連結する方法を指す。
【０１１３】
本明細書に開示される方法は、特定のＭＨＣ−ペプチドペアの安定性を測定することを可能にし、したがって、特にインビボ用途のために、特定のＴＣＲの遮断または特定のＴ細胞の死滅の使用のためのＭＨＣ−ペプチド複合体を開発するために使用され得る。
【０１１４】
また別の実施形態では、候補ペプチドは、ＭＨＣ−ＣＡＲを介してＴ細胞を他のペプチド−ＭＨＣ特異的Ｔ細胞に再指向させるために使用するためのものである。
【０１１５】
ＣＤ２４７（ＣＤ３ゼータ）の細胞内鎖に連結された抗体から構成されるＣＡＲを用いた、他の細胞へのＴ細胞の再指向は一般に使用されており、既に臨床にある。ＣＤ２４７（ＣＤ３ゼータ）の細胞内鎖に連結されたペプチド−ＭＨＣから構成されるＣＡＲを備えるＴ細胞、特に細胞傷害性Ｔ細胞またはＭＣＲを備えるＴ細胞は、これらの受容体を使用して、これらのペプチド−ＭＨＣ複合体に特異的なＴ細胞を認識し、それらを死滅させ得る（Ｊｙｏｔｈｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ，２０，１２１５−１２２０（２００２））。本明細書に開示される方法は、特定のＭＨＣ−ペプチドペアの安定性を測定することを可能にし、したがって、特にインビボ用途のために、特定のＴ細胞の再指向死滅のためのＣＡＲまたはＭＣＲにおける使用のためのＭＨＣ−ペプチド複合体を開発するために使用され得る。
【０１１６】
免疫反応をモジュレートする多くの治療では、その免疫反応に関与するＴＣＲの識別が必要とされる。これらのＴＣＲを識別し、ＴＣＲと、ＭＨＣ−ペプチド複合体に含まれるエピトープとの相互作用に依拠することを可能にする当技術分野で周知の様々な方法がある。重要な前提条件は、ＭＨＣ−ペプチド複合体がどのようにして、ＡＰＣの表面に提示されるかという情報である。実験的インビトロアッセイで使用されるＡＰＣのＭＨＣによりエピトープが提示されない場合、そのエピトープに結合する適切なＴＣＲが識別され得ない。さらに、このようなアッセイでＡＰＣにより提示されるライブラリーまたはＭＨＣ−ペプチド複合体において、ペプチドの１つが優先的に提示される場合、これは、最適以下のＴＣＲの選択につながり得る。したがって、最適化されたＴＣＲの識別および選択プロセスのために、ＭＨＣ−ペプチド複合体の提示に関連する不確実性を克服することが重要である。したがって、本発明の方法は、特定のＭＨＣへの特定のペプチドの親和性に関する定量的情報を提供し、エピトープを認識するＴＣＲを識別するために、またはこのようなＴＣＲを発現するＴ細胞を濃縮するために使用されるインビトロアッセイのための適切な複合体を選択するために使用され得る。
【０１１７】
一実施形態では、候補ペプチドは、Ｔ細胞反応性試験に使用するためのものである。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞反応性」という用語は、Ｔ細胞活性化を誘発する物質の能力を指す。より具体的には、「Ｔ細胞反応性」は、Ｔ細胞の増殖、分化および／またはサイトカイン産生を誘導するペプチドの能力を意味する。Ｔ細胞反応性アッセイは当技術分野で周知であり、多くの場合、ＭＨＣ−ペプチド複合体を提示するＡＰＣとＴ細胞との共培養を含む。それらのアッセイは、細胞療法のためにＴ細胞を増殖させるために、または例えば適応Ｔ細胞療法もしくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法のために特定のエピトープに結合するＴＣＲを識別するために使用され得る。Ｔ細胞反応性試験は、免疫原性試験にさらに使用され得る。
【０１１９】
特定の実施形態では、候補ペプチドは、免疫原性試験に使用するためのものである。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「免疫原性試験」という用語は、生物療法薬に対する潜在的な免疫反応を測定することを指す。生物療法薬は、それらの安全性および有効性に影響を与え得る免疫反応を誘発し得る。免疫原性試験は、臨床および前臨床研究中に体液性（抗体）または細胞性（Ｔ細胞）反応をモニタリングおよび評価するために用いられる。通常、生物療法薬の免疫原性の試験は、生物療法薬に対して特異的に生成された抗体を測定することを伴う。本発明の方法を用いて、ＭＨＣ分子、特に個体に特異的なＭＨＣにより効率的に提示されるペプチドであって、したがって、インビトロ手順でＴ細胞媒介性免疫反応を誘発する可能性があるペプチドを識別することが可能である。これは、化合物の全体的な免疫原性プロファイルのより完全かつ正確な像を提供するために役立ち得、同時に、患者または臨床試験参加者の負担を軽減し得る
【０１２１】
さらなる実施形態では、本発明は、ＭＨＣ分子のアルファまたはベータドメインの細胞外部分に共有結合的に結合された候補ペプチド、ＭＨＣベータドメインの細胞外部分、および異種分子の少なくとも１つの膜貫通ドメインを含むＭＨＣ−ペプチド複合体を提供する。
【０１２２】
一実施形態では、本発明は、前述の実施形態のＭＨＣ−ペプチド複合体であって、前記膜貫通ドメインが、ＴＣＲα／β、ＴＣＲγ／δ、ＣＤ３γ／δ／ε／ζ、ＣＤ４またはＣＤ８α／βなどの異種分子の膜貫通ドメインであるＭＨＣ−ペプチド複合体を提供する。
【０１２３】
一実施形態では、ＭＨＣ分子は、細胞外ＭＨＣクラスＩＩアルファ鎖、細胞外ＭＨＣクラスＩＩベータ鎖および少なくとも２つの膜貫通ドメインを含むＭＨＣクラスＩＩ分子である。
【０１２４】
別の実施形態では、ＭＨＣ分子は、細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖、ベータ−２マクログロブリンおよび少なくとも１つの膜貫通ドメインを含むＭＨＣクラスＩ分子である。
【０１２５】
また別の実施形態では、ＭＨＣ分子は、ペプチド、β２−ミクログロブリンおよび細胞外ＭＨＣクラスＩアルファ鎖の融合物ならびに少なくとも１つの膜貫通ドメインを含むＭＨＣハイブリッド分子である。
【０１２６】
特定の実施形態では、ＭＨＣクラスＩ分子のＭＨＣアルファ鎖は、Ｙ８４Ａ突然変異を有する。
【０１２７】
様々な実施形態では、本発明は、ＭＨＣ−ペプチド複合体であって、候補ペプチドが、個々の腫瘍由来突然変異を有する腫瘍特異的ペプチドであるＭＨＣ−ペプチド複合体を提供する。
【０１２８】
特定の実施形態では、腫瘍由来突然変異は、一塩基変異（ＳＮＶ）である。
【０１２９】
さらなる実施形態では、本発明は、前述の実施形態のいずれか１つで定義されるＭＨＣ−ペプチド複合体をコードするヌクレオチド配列を含む組換え構築物を提供する。
【０１３０】
またさらなる実施形態では、本発明は、前述の実施形態の組換え構築物に連結されたプロモーター配列を含む発現カセットを提供する。
【０１３１】
別の実施形態では、本発明は、前述の実施形態の発現カセットを含むベクターを提供する。
【０１３２】
また別の実施形態では、本発明は、本発明のＭＨＣ−ペプチド複合体を含む細胞を提供する。
【０１３３】
一実施形態では、本発明は、ＭＨＣクラスＩＩペプチド複合体を含む前述の実施形態の細胞であって、ＭＨＣクラスＩＩペプチドローディング機構を欠く哺乳動物細胞である細胞に関する。
【０１３４】
別の実施形態では、細胞は、ＭＨＣクラスＩペプチド複合体を含み、細胞は、機能的ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ−２−ミクログロブリン遺伝子を欠く哺乳動物細胞である。
【０１３５】
また別の実施形態では、細胞は、ＭＨＣクラスＩペプチド複合体を含み、細胞は、欠陥または欠失ＴＡＰ１、ＴＡＰ２および／またはベータ−２−ミクログロブリン遺伝子を有するＴ細胞ハイブリドーマである。
【０１３６】
候補ペプチドのＭＨＣ結合親和性を決定するための方法であって、レポーター細胞株において、共有結合的に結合された候補ペプチドを含む組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を発現させること、および前記レポーター細胞の表面上に前記ＭＨＣ−ペプチド複合体を提示するレポーター細胞を検出すること（このような提示／発現のレベルの測定を含む）を含む方法が本発明によりさらに含まれる。レポーター細胞株は、哺乳動物細胞株であり得る。一実施形態では、使用される哺乳動物細胞株は、ネイティブ細胞株に対して変化した特徴を示し、例えば、それは、酵素欠失、突然変異ならびに／または酵素および／もしくはＭＨＣ分子の過剰発現を有する。
【０１３７】
一実施形態では、本発明は、前述の実施形態の方法であって、
（ｉ）膜貫通領域に接続された組換えＭＨＣアルファまたはベータドメインの上流にクローニングされた候補ペプチドを含むライブラリーを生成すること；
（ｉｉ）このようなライブラリーを、対応するＭＨＣアルファまたはベータドメインと一緒に適切なレポーター細胞株に形質導入すること；
（ｉｉｉ）それらの細胞表面上に１つまたはそれを超えるＭＨＣ−ペプチド複合体を提示する細胞を検出すること、
（ｉｖ）このような提示／発現のレベルを決定すること
を含む方法に関する。
【０１３８】
本発明の方法はまた、ハイスループットスクリーニングに適用され得る。ハイスループットスクリーニング（ＨＴＳ）技術は、大規模な細胞の迅速なプロセシングを定義するために一般に使用される。特定の実施形態では、複数のスクリーニングは、異なる候補ペプチドライブラリーと並行して実行され得る。ハイスループットスクリーニングシステムは市販されており、典型的には、すべてのサンプルおよび試薬のピペッティング、液体の分注、時限的なインキュベーション、ならびにアッセイに適切な検出器によるマイクロプレートの最終的な読み取りを含む手順全体を自動化する。これらの構成可能なシステムは、ハイスループットおよび迅速な起動、ならびに高度な柔軟性およびカスタマイズを提供する。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」という用語は、少なくとも２つの共有結合的に付着したアミノ酸を意味する。一般に、ＭＨＣクラスＩペプチドは、長さが８または９アミノ酸であるが、長さが７〜１０アミノ酸で変動し得る。ＭＨＣクラスＩｌペプチドは、長さが１５〜２４アミノ酸であり得る。必要に応じて、それらは、長さが１０アミノ酸〜３０アミノ酸またはそれを超えて変動し得る。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、ＭＨＣへのペプチドの結合もしくは「結合親和性」またはペプチドとＭＨＣとの相互作用は、ペプチド結合溝または間隙で起こるペプチド−ＭＨＣ相互作用を指す。このような結合または相互作用はまた、自然に起こり得る。
【０１４１】
本明細書で使用される、ＭＨＣへのペプチドの「共有結合的結合」または「テザー」は、共有結合が遺伝子工学により生成される組換えＭＨＣ−ペプチド複合体を指す。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、ＭＨＣ−ペプチド複合体は、ペプチドがＭＨＣに結合した複合体を指す。この結合は、ペプチド結合溝もしくは間隙を介して、および／またはＭＨＣへのペプチドの共有結合的結合により起こり得る。
【０１４３】
組換えＭＨＣ−ペプチド複合体では、本明細書で使用される場合、候補ペプチドは常にＭＨＣに共有結合的に結合しているが、ペプチドは、ＭＨＣの間隙に効率的に結合してもよいしまたは結合しなくてもよい。
【０１４４】
ＭＨＣ−ペプチド複合体の安定性は、前記ＭＨＣ−ペプチド複合体の表面発現と相関するペプチド結合溝で起こるペプチド−ＭＨＣ相互作用の安定性を指す。それは、共有結合的ペプチド−ＭＨＣ結合の安定性を指さない。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、それ自体またはその一部に対する免疫反応を誘発することができるペプチドまたはタンパク質の全部または一部を指す。この免疫反応は、抗体産生、または特定の免疫学的コンピテントセルの活性化、またはその両方を伴い得る。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「ペプチドローディング機構」という用語は、ペプチドをＭＨＣ分子にロードするために必要なすべての必要な構成要素を指す。例えば、ＭＨＣクラスＩペプチドローディング機構は、ほとんどすべての細胞に存在し、とりわけ、ＴＡＰトランスポーター、タパシンおよびカルレティキュリンを含む。ＭＨＣクラスＩＩペプチドローディング機構は、ＡＰＣにのみ一定に存在するが、それは、Ｔ細胞のような他の細胞で誘導され得る。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「膜貫通ドメイン」という用語は、細胞膜を貫通することができる主に疎水性のアミノ酸配列として定義される。「膜貫通領域」という用語は、本明細書では「膜貫通ドメイン」の同義語として使用される。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「ライブラリー」または同等の用語は、複数の分子を意味する。ＭＨＣ−ペプチド複合体の場合、ライブラリーは、十分に構造的に多様なペプチドの集団を提供して、確率的に十分な範囲の細胞反応をもたらし、所望の反応を示す１つまたはそれを超える細胞を提供する。好ましい実施形態では、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも５０個、より好ましくは少なくとも２００個、最も好ましくは少なくとも１０００個のペプチドが、本発明の方法において同時に分析される。ライブラリーは、ライブラリーのサイズおよび多様性を最大化するように設計され得る。
【０１４９】
「組換え」という用語は、例えば、細胞または核酸、タンパク質またはベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入またはネイティブ核酸もしくはタンパク質の変化により改変されていること、または細胞が、そのように改変された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態内に見られない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異常に発現されるか、低く発現されるか、もしくは全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。組換え核酸は、元々、一般には例えばポリメラーゼおよびエンドヌクレアーゼを使用した核酸の操作により、天然では通常見られない形態でインビトロで形成される。このようにして、異なる配列の操作可能な連結が達成される。したがって、線状形態の単離された核酸、または通常は接続されないＤＮＡ分子を連結することによりインビトロで形成された発現ベクターは両方とも、本発明の目的では組換え体であるとみなされる。組換え核酸が作製され、宿主細胞または生物に再導入されたら、それは、非組換え的に、すなわち、インビトロ操作ではなく宿主細胞のインビボ細胞機構を使用して複製すると理解される；しかしながら、このような核酸は、組換え的に生産されたら、その後に非組換え的に複製されるが、本発明の目的では依然として組換え体であるとみなされる。同様に、本発明のＭＨＣ−ペプチド複合体などの組換えタンパク質は、組換え技術を使用して、すなわち、上記組換え核酸の発現を介して作製されたタンパク質である。
【０１５０】
「異種」という用語は、核酸の部分に関して使用される場合、核酸が、天然では互いに同じ関係で通常は見られない２つまたはそれを超える部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には、２つまたはそれを超える配列を有するように組換え的に生産され、例えば、新たな機能的核酸、例えばある供給源由来のプロモーターおよび別の供給源由来のコード領域を作製するように配置された非関連遺伝子から組換え的に生産される。同様に、異種タンパク質は、多くの場合、天然では互いに同じ関係に見られない２つまたはそれを超える部分配列（例えば、融合タンパク質）を指す。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「癌」という用語は、異常細胞の急速かつ無制御な成長を特徴とする疾患として定義される。癌細胞は局所的に、または血流およびリンパ系を介して体の他の部分に拡散し得る。様々な癌の例としては、限定されないが、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、皮膚癌、膵臓癌、結腸直腸癌、腎癌、肝臓癌、脳癌、リンパ腫、白血病、肺癌などが挙げられる。
【０１５２】
さらに、特許請求の範囲では、「含む」という単語は、他のエレメントまたは工程を除外せず、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」という不定冠詞は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。
【０１５３】
特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が関係する分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料は、本発明の実施または試験に使用され得るが、適切な方法および材料が以下に記載される。矛盾する場合には、定義を含む本明細書が優先される。加えて、材料、方法および例は例示にすぎず、限定することを意図しない。
【０１５４】
本発明の特定の実施形態は、以下の実施例によりさらに例示される。しかしながら、本発明は、これらの実施例の具体的な詳細に限定されないことを理解すべきである。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を実証するために含まれる。以下の実施例に開示されている技術は、本発明の実施において十分に機能するために本発明において使用される技術に相当し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると考えられ得ることが当業者により認識されるはずである。しかしながら、当業者は、本開示を考慮して、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、本発明の精神および範囲から逸脱せずに同様または類似の結果を依然として得ることができることを認識するはずである。
【図面の簡単な説明】
【０１５５】
【図１】図１は、ＭＨＣ−ＴＣＲ融合分子（ＭＣＲ２）およびネイティブＭＨＣクラスＩＩの構造を示す。
【０１５６】
【図２−１】インフルエンザマトリックスタンパク質１ペプチドＭＰ１１０３−１２０（ａ）、ＭＰ１６２−７２（ｂ）またはインフルエンザｃＤＮＡ由来ペプチドのライブラリー（ｃ）に共有結合的に連結されたヒトＭＨＣ分子のアルファおよびベータ鎖（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿４、ＤＲＢ１＿１５およびＤＲＢ５＿１）を有するＭＣＲをコードする構築物を作製した。ＭＨＣクラスＩＩ欠損細胞株の形質導入後、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＡＰＣ抗体を使用して、ＦＡＣＳによりＭＣＲ表面発現を測定した。グラフは、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿４−ＭＰ１１０３−１２０複合体を含有するＭＣＲの効率的な表面発現を示すが、ＭＣＲを含有するＤＲＢ１＿１５−ＭＰ１１０３−１２０は、非常に低いレベルで検出可能であった（ａ）。本発明者らは、ＤＲＢ５＿１−ＭＰ１１０３−１２０を含有するＭＣＲをほとんど検出しなかったが（ａ）、ＤＲＢ５＿１−ＭＰ１６２−７２を含有するＭＣＲの効率的な発現を検出した（ｂ）。重要なことに、インフルエンザｃＤＮＡ由来ペプチドのライブラリーをＨＬＡ  ＤＢＲ１＿４またはＨＬＡ  ＤＲＢ１＿１５にテザーしたところ、同様のレベルのＭＣＲ表面発現が観察された（ｃ）。「ＵＩ」は、未感染細胞を意味する。
【図２−２】同上。
【図２−３】同上。
【０１５７】
【図３】図３は、異なるペプチド（ｐｅｐ１、ｐｅｐ２およびｐｅｐ３）を有する様々なＨＬＡベータ鎖を含有するＭＣＲを形質導入した細胞を抗ＨＬＡ−ＤＲおよび抗ＣＤ３ｅで染色した分析例を示す。二重陽性染色は、両抗体が、ＭＣＲ表面発現および対角線形状の集団（ＭＣＲとＣＤ３鎖との効率的な会合）の検出において同等に効率的であることを示す。
【０１５８】
【図４】図４は、共有結合的に連結されたペプチドを有しないＭＨＣおよびＭＣＲ分子の低い表面発現を示す。ＨＬＡ−ＤＲＢ１．４（左）またはＭＣＲ２−ＤＲＢ１．４構築物（右）を形質導入した細胞をαＨＬＡ−ＤＲ（上）またはαＣＤ３（下）のいずれかで染色した。
【０１５９】
【図５】図５は、免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）分析リソースを使用した、ＭＰ１１０３−１２０に対するペプチド結合予測を示す。
【０１６０】
【図６】図６は、コアエピトープＭＰ１１０７−１１７を含有する異なるペプチドを有する様々なＨＬＡ−ＤＲＢ鎖を含有するＭＣＲを形質導入した細胞のＦＡＣＳ分析を示す。抗ＣＤ３ｅまたは抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＰＥ抗体を使用して、ＭＣＲ表面発現を測定した。グラフは、コアＭＰ１１０７−１１７ペプチドが、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿４上にのみ効率的に提示され得、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿１５およびＨＬＡ−ＤＲＢ５＿１により提示され得ないこと、ならびに隣接ペプチド領域が主要な役割を果たさないことを示す。ＰＣＲおよびシークエンシングにより、すべてのサンプルにおけるＭＣＲの存在を確認した（示さず）。
【０１６１】
【図７】図７  マウスＭＣＲのアルファ鎖にテザーされたランダムペプチドのライブラリーをレポーター細胞に形質導入し、表面上にＭＣＲを発現する単一細胞を選別し、例示的なクローンの配列を決定した。グラフは、抗マウスＭＨＣクラスＩＩで染色したこのようなペプチドを有するＭＣＲを有する例示的なクローンのＦＡＣＳ分析および対応するペプチド配列を表す。
【実施例】
【０１６２】
実施例１−インフルエンザマトリックスタンパク質１ペプチドを含有するＭＣＲの差次的表面発現
本発明者らは、ＴＣＲの膜貫通ユニットに融合されたＭＨＣのネイティブ細胞外ドメインに連結されたペプチドから構成されるＭＨＣ−ＴＣＲ融合タンパク質（ＭＣＲ）を構築した（図１；国際公開第２０１６／０９７３３４号も参照のこと）。特に、共有結合的に連結されたインフルエンザマトリックスタンパク質１ペプチド（ＭＰ１１０３−１２０）、ＭＰ１６２−７２またはインフルエンザｃＤＮＡ由来ペプチドのライブラリーを有するベータ鎖と共に、ヒトＭＨＣ分子のアルファおよびベータ鎖を有するＭＣＲ（ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿４、ＤＲＢ１＿１５、およびＤＲＢ５＿１）をコードする構築物を生成した。標準的なプロトコールにしたがって、エコトロピックフェニックスパッケージング細胞株でレトロウイルス含有上清を生産し、これを使用して、レポーター細胞株および選別細胞に感染させた。ＭＨＣクラスＩＩ欠損細胞株（Ｔ細胞ハイブリドーマ）の形質導入後、抗ＨＬＡ−ＤＲ  ＡＰＣ抗体を使用してＦＡＣＳによりＭＣＲ表面発現を測定した（図２）。ＨＬＡ  ＤＲＢ１＿４にテザーされたアミノ酸１０３〜１２０を含むＭＰ１由来ペプチドは、哺乳動物レポーター細胞株の表面上におけるＭＣＲの効率的な発現をもたらす。ＨＬＡ  ＤＲＢ１＿１５にテザーされた同じペプチドは、非常に低いＭＣＲ発現をもたらし、ＨＬＡ  ＤＲＢ５＿１の状況では全く発現されない（図２ａ）。しかしながら、アミノ酸６２〜７２を含む別のＭＰ１由来ペプチドは、試験した他のＨＬＡ以外のＨＬＡ  ＤＲＢ５−１を含有するＭＣＲの効率的な発現をもたらす（図２ｂ）。重要なことに、インフルエンザｃＤＮＡ由来ペプチドのライブラリーをＨＬＡ  ＤＢＲ１＿４またはＨＬＡ  ＤＲＢ１＿１５にテザーしたところ、同様のレベルの表面発現が観察されたが、これは、ＨＬＡ１＿４およびＨＬＡ１＿１５が両方とも、ＭＣＲの一部として細胞表面上に効率的に発現され得ることを示している（図２ｃ）。公開されている研究（Ｓｃｈｍｉｄら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ２００７）から、アミノ酸１０３〜１１７および１０７〜１２１を含むＭＰ１ペプチドは、ＨＬＡ  ＤＲＢ１−４により効率的に提示されることが公知であるが、これは、共有結合的に付着されたペプチドがＭＨＣペプチド結合溝に効率的に結合する場合にのみ、ＭＨＣ複合体は、抗体染色で検出され得る表面発現について十分に安定であることを示唆している。図６はさらに、コアＭＰ１１０７−１１７ペプチドが、隣接ペプチド領域にかかわらず、ＨＬＡ−ＤＲＢ１＿４上にのみ効率的に提示され得ることを示す。
【０１６３】
実施例２−異なる抗体によるＭＣＲ表面発現の検出
異なるペプチド（ｐｅｐ１、ｐｅｐ２およびｐｅｐ３）を有する様々なＨＬＡベータ鎖を含有するＭＣＲの表面発現を、抗ＨＬＡ−ＤＲおよび抗ＣＤ３ｅを使用した抗体染色で検出し、ＢＤＦｏｒｔｅｓｓａフローサイトメーターで分析した（図３）。二重陽性染色は、両抗体が、ＭＣＲ表面発現の検出において効率的であること、および抗ＣＤ３ｅ染色を普遍的に使用して、異なるＨＬＡ対立遺伝子を有するＭＣＲを検出し得ることを示す。さらに、対角線形状の集団は、ＭＣＲとＣＤ３鎖との効率的な会合を示す。
【０１６４】
実施例３−ＭＰ１１０３−１２０に対するＭＨＣ結合親和性予測
免疫エピトープデータベース（ＩＥＤＢ）分析リソースを使用して、ＭＰ１１０３−１２０に対するＭＨＣ結合親和性が予測された（Ｗａｎｇ，Ｐら、Ａ  Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ＭＨＣ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  Ｃｏｎｓｅｎｓｕｓ  Ａｐｐｒｏａｃｈ．ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ  ４，ｅ１００００４８（２００８）；Ｗａｎｇ，Ｐら、Ｐｅｐｔｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＨＬＡ  ＤＲ，ＤＰ  ａｎｄ  ＤＱｍｏｌｅｃｕｌｅｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  １１，５６８（２０１０））。ＭＰ１１０３−１２１について、本発明の方法は、ＨＬＡ  ＤＲＢ  ４＿１が最も結合してＨＬＡの高い表面発現をもたらし、ＨＬＡ  ＤＲＢ  １＿１５が中程度に結合して低い表面発現をもたらし、ＨＬＡ  ＤＲＢ  ５＿１が全く結合しないことを示した。しかしながら、ＩＥＤＢ分析リソースを使用したところ、ペプチド結合予測分析は、ＨＬＡ  ＤＲＢ５＿１が最良のＭＰ１１０３−１２０結合物であることを示した（図５）。
【０１６５】
実施例４−アルファ鎖に融合されたペプチドを含有するＭＣＲの表面発現の検出。
本発明者らは、アルファ鎖にテザーされたランダムペプチドを有するマウスＭＣＲのライブラリーを構築した。ＭＨＣクラスＩＩ欠損細胞株（Ｔ細胞ハイブリドーマ）の形質導入後、抗ＭＨＣ抗体を使用して、ＦＡＣＳによりＭＣＲ表面発現を測定した（図７）。多くの異なるペプチドを有するＭＣＲの効率的な発現が検出されたが、これは、ＭＣＲのアルファ鎖に連結されたペプチドもまた、表面発現に十分なほどにＭＨＣ複合体を安定化し得ることを示している。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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