(57)【要約】本発明は以下を含む操作された細胞に関する。（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および（ｉｉ）細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い操作されたポリヌクレオチド。本発明者らはここで、操作された細胞が小分子、特に治療用小分子を産生することを可能にする遺伝子導入合成生物学経路をコードする操作された細胞を提供する。タンパク質とは対照的に、小分子は、例えば、細胞に浸透し、シグナル伝達経路および代謝経路を含む主要な細胞内経路を破壊する可能性がある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）；および
（ｉｉ）前記細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い操作されたポリヌクレオチド、
を含む操作された細胞。
【請求項２】
前記１つまたはより多い酵素が少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの酵素を含む請求項１に記載の細胞。
【請求項３】
前記１つまたはより多い酵素が１つの操作されたポリヌクレオチドによってコードされる、任意の上記請求項に記載の細胞。
【請求項４】
前記操作されたポリヌクレオチドがオペロンである、請求項２または３に記載の細胞。
【請求項５】
前記１つまたはより多い酵素が単一のオープンリーディングフレームでコードされ、各酵素が切断部位により分けられる、請求項２から４に記載の細胞。
【請求項６】
前記切断部位がＦＭＤ−２Ａ様ペプチドをコードする配列などの自己切断部位である請求項５に記載の細胞。
【請求項７】
前記治療用小分子が細胞毒性分子、細胞増殖抑制分子、前記腫瘍の分化を誘導することが可能な薬剤および炎症性分子から選択される、任意の上記請求項に記載の細胞。
【請求項８】
前記治療用小分子がバイオラセインまたはミコフェノール酸である、請求項７に記載の細胞。
【請求項９】
前記治療用小分子がバイオラセインであり、前記操作されたポリヌクレオチドがトリプトファンからバイオラセインを合成するために必要なＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤおよびＶｉｏＥ酵素をコードする１つまたはより多いポリヌクレオチドである、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
前記バイオラセインオペロンが、配列番号１として示される配列を含むポリペプチド、またはそれに対して少なくとも８０％配列同一性を有する改変体をコードする、請求項９に記載の細胞。
【請求項１１】
前記操作された細胞が、前記治療用小分子に対して低下した感度を有するようにさらに操作される、任意の上記請求項記載の細胞。
【請求項１２】
前記治療用小分子がミコフェノール酸であり、前記細胞がさらにミコフェノレートに対して耐性のある変異イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２を発現する、請求項１１に記載の細胞。
【請求項１３】
前記１つまたはより多い酵素の発現が前記ＣＡＲまたは遺伝子導入ＴＣＲへの抗原の結合により誘導される、任意の上記請求項に記載の細胞。
【請求項１４】
前記１つまたはより多い酵素の発現が腫瘍微小環境により誘導される、任意の上記請求項に記載の細胞。
【請求項１５】
前記１つまたはより多い酵素の発現が前記細胞への第二小分子の結合により誘導される、任意の上記請求項に記載の細胞。
【請求項１６】
前記細胞がアルファ―ベータＴ細胞、ＮＫ細胞、ガンマ―デルタＴ細胞またはサイトカイン誘導キラー細胞である、任意の上記請求項に記載の細胞。
【請求項１７】
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入ＴＣＲをコードする第一の核酸配列；および
（ｉｉ）細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い核酸配列、
を含む核酸構築物。
【請求項１８】
前記第一および第二核酸配列が共発現部位により分けられる、請求項１７に記載の核酸構築物。
【請求項１９】
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入ＴＣＲをコードする第一核酸配列；および
（ｉｉ）細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い核酸配列、
を含む核酸配列のキット。
【請求項２０】
請求項１７または１８に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項２１】
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入ＴＣＲをコードする核酸配列を含む第一ベクター；および
（ｉｉ）細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素を含む第二ベクター
を含むベクターのキット。
【請求項２２】
前記１つもしくはより多い酵素が請求項１から１５のいずれかで定義される、請求項１７もしくは１８に記載の核酸構築物、請求項１９に記載の核酸配列のキット、請求項２０に記載のベクターまたは請求項２１に記載のベクターのキット。
【請求項２３】
請求項１から１５のいずれかに記載の細胞、請求項１７または１８に記載の核酸構築物、請求項１９で定義されるような第一核酸配列および第二核酸配列、請求項２０に記載のベクターまたは請求項２１で定義されるような第一および第二ベクターを含む医薬組成物。
【請求項２４】
疾患の治療および／または予防における使用のための請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
疾患の治療および／または予防方法であって、前記方法は、それを必要としている被験者への請求項２３に記載の医薬組成物を投与するステップを含む、疾患の治療および／または予防方法。
【請求項２６】
以下のステップを含む、請求項２５に記載の方法
（ｉ）細胞包含試料を単離するステップ；
（ｉｉ）請求項１７または１８で定義されるような核酸構築物、請求項１９に記載のベクターまたは請求項２０で定義されるような第一および第二ベクターでの、前記細胞へ形質導入またはトランスフェクションするステップ；ならびに
（ｉｉｉ）被験者に（ｉｉ）由来の前記細胞を投与するステップ。
【請求項２７】
前記細胞が自己由来である請求項２６に記載の前記方法。
【請求項２８】
前記細胞が同種異系である請求項２６に記載の前記方法。
【請求項２９】
疾患の前記治療および／または予防のための医薬の製造における、請求項２３に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３０】
前記疾患が癌である、請求項２４に記載の使用のための前記医薬組成物、請求項２５から２８のいずれかに記載の前記方法または請求項２９に記載の前記使用。
【請求項３１】
前記癌が固形腫瘍癌である、請求項３０に記載の、使用のための前記医薬組成物、方法、または前記使用。
【請求項３２】
請求項１７または１８に記載の核酸構築物、請求項１９で定義されるような第一核酸配列および第二核酸配列、請求項２０に記載のベクターまたは請求項２１で定義されるような第一および第二ベクターを導入するステップを含む、請求項１から１５のいずれかに記載の細胞を作製する方法。
【請求項３３】
前記細胞が被験者から単離した試料由来である、請求項３２記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する操作された細胞に関する。特に、前記細胞によって発現される治療薬を拡大するためのアプローチに関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
抗原特異的Ｔ細胞は、標的抗原に天然に特異的な末梢血Ｔ細胞の選択的拡大によって生成され得る。しかしながら、ほとんどの癌抗原に特異的な多数のＴ細胞を選択して拡大することは困難であり、頻繁に不可能である。統合型ベクターによる遺伝子治療は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の遺伝子導入発現が、末梢血Ｔ細胞のバルク集団のエクスビボウイルスベクター形質導入により、任意の表面抗原に特異的な多数のＴ細胞の生成を可能にするため、この問題の解決策を提供する。
【０００３】
ＣＡＲ  Ｔ細胞はリンパ系悪性腫瘍において成功している。しかしながら、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法を使用して固形癌治療する場合、追加の課題が提示される。リンパ性癌が固形癌よりもＣＡＲ  Ｔ細胞療法に適している可能性がある理由はいくつかある。例として、Ｔ細胞は通常、リンパ系腫瘍の典型的な疾患部位に移動するが、固形腫瘍では、ＣＡＲ  Ｔ細胞は疾患部位に転位するはずである。したがって、はるかに少ないＴ細胞が固形腫瘍にアクセスできる可能性がある。
【０００４】
さらに、固形腫瘍の微小環境はＴ細胞に敵対的である可能性がある。例えば、阻害性受容体は上方制御される可能性がある。腫瘍微小環境には、阻害性Ｔ細胞、骨髄性または間質細胞など、多様な種類の阻害性細胞が含まれている可能性がある。したがって、固形腫瘍へのアクセスを獲得するＴ細胞は、それらの活性が阻害される可能性がある。上記の要因は、ＣＡＲ  Ｔ細胞が固形腫瘍に侵入し、生着するのを妨げる障壁を形成する可能性もある。
【０００５】
さらに、固形腫瘍細胞は、リンパ系癌細胞よりも死滅させるのが困難な可能性がある。例えば、リンパ系腫瘍はしばしばアポトーシスに近く、単一のＣＡＲ  Ｔ細胞／腫瘍細胞相互作用は、リンパ系腫瘍細胞の死滅を誘導するのに十分である可能性がある。
【０００６】
腫瘍微小環境は、ＣＡＲ  Ｔ細胞を伴う全身性薬剤の同時投与によって調節され得る。全身性薬剤は、阻害経路（例えば、ＰＤ１／ＰＤＬ１）を遮断する抗体であり得る。この全身性薬剤は腫瘍の代謝を阻害する小分子（ＩＤＯ阻害剤など）または細胞毒性薬であり得る。
【０００７】
しかしながら、そのような全身アプローチの限界は、薬剤の全身分布が毒性をもたらす可能性があることである。さらに、場合によっては、薬剤はＣＡＲ  Ｔ細胞に対して毒性がある可能性がある。
【０００８】
あるいは、ＣＡＲ  Ｔ細胞を操作して、腫瘍微小環境を変化させ、Ｔ細胞および他の免疫細胞の腫瘍微小環境へのアクセスを増加させることができるタンパク質因子を放出することを含むいくつかの戦略が開発されている。
【０００９】
これらのタンパク質因子には、サイトカイン、ケモカイン、ｓｃＦｖまたは阻害経路を遮断する抗体、または微小環境の完全性を破壊する酵素さえ含まれる。
【００１０】
タンパク質因子は、ＣＡＲと共発現する因子をコードするオープンリーディングフレームを使用して、ＣＡＲ  Ｔ細胞内で容易にコード化できる。しかしながら、ＣＡＲ  Ｔ細胞によって腫瘍微小環境に放出された場合でも、タンパク質の生体内分布は限られている。例として、分泌されたタンパク質は細胞に浸透しない可能性があり、したがってそれらの活性は表面受容体の調節に限定される可能性がある。
【００１１】
したがって、固形腫瘍の標的化において操作された細胞、特にＣＡＲまたは遺伝子導入ＴＣＲを発現する操作された免疫細胞の有効性を改善するための代替アプローチが依然として必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１２】
本発明者らはここで、操作された細胞が小分子、特に治療用小分子を産生することを可能にする遺伝子導入合成生物学経路をコードする操作された細胞を提供する。タンパク質とは対照的に、小分子は、例えば、細胞に浸透し、シグナル伝達経路および代謝経路を含む主要な細胞内経路を破壊する可能性がある。
【００１３】
したがって、第１の局面において、本発明は、以下を含む操作された細胞を提供する。（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および（ｉｉ）細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い操作されたポリヌクレオチド。
【００１４】
１つまたはより多い酵素は、１つまたはより多い操作されたポリヌクレオチドによってコードされ得る。１つまたはより多い酵素は、１つの操作されたポリヌクレオチドによってコードされ得る。適切には、操作されたポリヌクレオチドはオペロンであり得る。
【００１５】
１つまたはより多い酵素は、１つまたはより多いオープンリーディングフレームにコードされ得る。１つまたはより多い酵素は、単一のオープンリーディングフレームにコードされ得る。適切には、各酵素は、切断部位によって分離され得る。切断部位は、ＦＭＤ−２Ａ様ペプチドをコードする配列などの自己切断部位であり得る。
【００１６】
１個またはより多い酵素は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個または少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、少なくとも１１個、少なくとも１２個、少なくとも１３個、少なくとも１４個、または少なくとも１５個の酵素を含み得る。
【００１７】
１個またはより多い酵素は、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個または少なくとも５個の酵素を含み得る。
【００１８】
治療用小分子は、細胞毒性分子、細胞増殖抑制分子、腫瘍の分化を誘導することができる薬剤、および炎症性分子から選択され得る。適切には、治療用小分子はバイオラセインまたはミコフェノール酸であり得る。
【００１９】
一実施形態において、治療用小分子はバイオラセインである。操作されたポリヌクレオチドは、トリプトファンからバイオラセインを合成するために必要なＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤおよびＶｉｏＥ酵素をコードする１つまたはより多いオープンリーディングフレームを含み得る。適切には、操作されたポリヌクレオチドは、トリプトファンからバイオラセインを合成するために必要なＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤおよびＶｉｏＥ酵素をコードする単一のオープンリーディングフレームを含み得る。バイオラセインオペロンは、配列番号１として示される配列を含むポリペプチドまたはそれに対して少なくとも８０％の配列同一性を有する改変体をコードし得る。
【００２０】
別の実施形態おいて、小分子はゲラニオールである
【００２１】
操作された細胞は、治療用小分子に対する感度が低下するようにさらに操作され得る。例えば、治療用小分子はミコフェノール酸であり得、細胞はさらに、ミコフェノール酸に対する感度が低下した変異イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ２を発現し得る。
【００２２】
適切には、１つまたはより多い酵素の発現は、ＣＡＲまたは遺伝子導入ＴＣＲへの抗原の結合によって誘導され得る。
【００２３】
１つまたはより多い酵素の発現は、腫瘍微小環境によって誘導され得る。
【００２４】
１つまたはより多い酵素の発現は、細胞への第２の小分子の結合によって誘導され得る。適切には、第２の小分子は医薬小分子であり得る。
【００２５】
細胞は、アルファ−ベータＴ細胞、ＮＫ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞またはサイトカイン誘導性キラー細胞であり得る。
【００２６】
さらなる局面において、本発明は、以下を含む核酸構築物を提供する：
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入ＴＣＲをコードする第１の核酸配列、および（ｉｉ）細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い核酸配列。
【００２７】
適切には、細胞内で組み合わせて発現される場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素は、単一の核酸配列上にコードされる。
【００２８】
第１および第２の核酸配列は、共発現部位によって分離され得る。
【００２９】
さらなる局面において、本発明は、以下を含む核酸配列のキットを提供する：
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入ＴＣＲをコードする第１の核酸配列、および（ｉｉ）細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い核酸配列。
【００３０】
適切には、細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素は、単一の核酸配列上にコードされる。
【００３１】
別の局面において、本発明は、本発明による核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００３２】
別の局面において、本発明は、以下を含むベクターのキットを提供する：
（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入ＴＣＲをコードする核酸配列を含む第１のベクター、および（ｉｉ）細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多いベクター。
【００３３】
適切には、細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素は、単一のベクターによってコードされる。
【００３４】
本発明による核酸構築物、核酸配列のキット、ベクターまたはベクターのキットは、本発明の第１の局面について定義された１つまたはより多い酵素を含み得る。
【００３５】
さらなる局面において、本発明は、医薬組成物を提供する。この医薬組成物は本発明による細胞、核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列、ベクター、または、第１および第２のベクターを含む。
【００３６】
さらなる局面において、本発明は、疾患の治療および／または予防に使用するための本発明による医薬組成物を提供する。
【００３７】
別の局面において、本発明は、疾患を治療および／または予防する方法に関する。それは本発明による医薬組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
【００３８】
方法は、以下のステップを含み得る。
（ｉ）試料含有細胞の単離
（ｉｉ）本発明による核酸構築物、ベクターまたは第１および第２のベクターによる細胞の形質導入またはトランスフェクション、ならびに
（ｉｉｉ）（ｉｉ）由来の細胞を対象に投与すること。
【００３９】
細胞は自己由来であり得る。細胞は異質遺伝子型であり得る。
【００４０】
さらなる局面において、本発明は、疾患の治療および／または予防のための医薬の製造における本発明による医薬組成物の使用に関する。
【００４１】
疾患は癌であり得る。癌は固形腫瘍癌であり得る。
【００４２】
別の局面において、本発明は、本発明による細胞を作製するための方法に関する。本発明は核酸構築物、第１の核酸配列および第２の核酸配列、本発明のベクターまたは第１および第２のベクターを細胞に導入するステップを含む。
【００４３】
細胞は、対象から単離された試料に由来し得る。
【００４４】
本発明の利点は、固形腫瘍の部位で、他の点では有毒な小分子の非常に高い局所濃度を可能にすることである。小分子は、本発明の操作された細胞から容易に拡散することができ、腫瘍細胞に拡散して、直接的な毒性または調節効果を発揮することができる。したがって、本発明の操作された細胞による治療用小分子の産生は、治療用小分子の全身投与に関連する潜在的な毒性作用の欠点を低減しながら、固形腫瘍の標的化に関連するいくつかの問題を改善できる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】ａ）従来のＣＡＲを示す概略図。（ｂ）から（ｄ）：ＣＡＲエンドドメインのさまざまな世代および順列：（ｂ）ＦｃεＲ１−γまたはＣＤ３ζエンドドメインを介してＩＴＡＭ信号のみを送信した初期設計、追加の（ｃ）１つまたは（ｄ）２つの共刺激信号を同じ複合エンドドメイン内に送信した後の設計。
【図２】（ａ）バイオラセイン生合成経路の要約。（ｂ）真核生物の形式に変換され、ＦＭＤ−２Ａのようなペプチドによって分離された単一のフレームとして５つの酵素すべてがコード化されたバイオラセインのオペロン。
【図３】メバロン酸経路の概要
【図４】テルペン生合成の概要
【図５】トリテルペン前駆体からジンセノサイドの合成
【図６】増加するゲラニオール濃度に対する４Ｔ１またはＳＫＯＶ３ヒト細胞株の感度
【図７】ゲラニオール生産ＣＡＲ構築物の存在に対するＳＫＯＶ３細胞の感度
【図８】カフェイン生合成遺伝子ＣＡＸＭＴ１およびＣＣＳ１遺伝子で形質導入されたヒト細胞株によるカフェインの生産
【図９】１００μＭキサントシンの存在下で、２つのドナーから分離されたＰＢＭＣのカフェイン発現
【図１０】付着性腫瘍細胞株におけるバイオラセイン濃度の増加の毒性
【図１１】ＳｕｐＴ１  Ｔ細胞株の二重形質導入によるＳｕｐＴ１細胞でのバイオラセインの生産
【図１２】ＳｕｐＴ１細胞が生産するバイオラセインはＳＫＯＶ３腫瘍細胞に対する毒性である。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
１つまたはより多い酵素
本発明は、以下を含む操作された細胞を提供する。（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および（ｉｉ）細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い操作されたポリヌクレオチド。
【００４７】
本明細書中で使用される場合、「操作されたポリヌクレオチド」とは、細胞ゲノム中に天然に存在しないポリヌクレオチドをいう。そのような操作されたポリヌクレオチドは、例えば、本明細書中に記載されるような標準的な形質導入またはトランスフェクション法を使用して細胞に導入され得る。例えば、操作されたポリヌクレオチドは、レトロウイルスベクターを使用して細胞に移入され得る。
【００４８】
小分子は、タンパク質ができるように単純な遺伝子によって直接コードすることはできない。しかしながら、本発明は、細胞内で組み合わせて発現される場合に小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素の発現を通じて小分子を生産することができる操作された細胞を提供する。
【００４９】
１つまたはより多い酵素は、本明細書中では遺伝子導入合成生物学経路と呼ばれ得る。適切には、１つまたはより多い酵素は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つまたは少なくとも５つの酵素を含む。例えば、遺伝子導入合成生物学経路は、２、３、４、５、またはより多い酵素を含むか、またはそれらからなることができる。
【００５０】
したがって、本発明の細胞は、翻訳されたときに細胞内の出発物質を治療用小分子に段階的に変換する酵素のセットをコードすることができる。
【００５１】
適切には、１つまたはより多い酵素は、１つまたはより多い操作されたポリヌクレオチドにコードされる。例えば、１つまたはより多い酵素は、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、またはより多い操作されたポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００５２】
一実施形態において、遺伝子導入合成生物学経路の各酵素は、別個の操作されたポリヌクレオチドによってコードされる。
【００５３】
遺伝子導入合成生物学経路の各酵素の発現は、プロモーターなどの調節配列によって制御することができる。適切には、遺伝子導入合成生物学経路の各酵素の発現は、各酵素が細胞内で同時に発現されるように、関連する調節配列によって制御され得る。適切には、遺伝子導入合成生物学経路の各酵素の発現は、同じ調節配列によって制御され得、その結果各酵素が細胞内で同時に発現される。
【００５４】
適切には、遺伝子導入合成生物学経路の１つまたはより多い酵素（例えば、遺伝子導入合成生物学経路における律速酵素）の発現は、誘導性調節要素によって制御され得、その結果、治療的小分子の生産は、制御可能な方法に導入され得る。遺伝子導入合成生物学経路の１つまたはより多い酵素の誘導可能な発現のための適切な実施形態は、本明細書中に記載されている。
【００５５】
好ましくは、遺伝子導入合成生物学経路の複数の酵素は、操作されたポリヌクレオチドによってコードされる。例えば、遺伝子導入合成生物学経路の２つ、３つ、４つ、５つ、または５つより多い酵素は、操作されたポリヌクレオチドによってコードされ得る。
【００５６】
遺伝子導入合成生物学経路の１つより多い酵素（例えば、すべての必要な酵素）をコードする操作されたポリヌクレオチドは、遺伝子導入合成生物学経路発現カセットと呼ばれ得る。
好ましくは、遺伝子導入合成生物学経路を形成するために必要とされるすべての酵素は、単一の操作されたポリヌクレオチドによってコードされる。
【００５７】
１つより多い酵素が操作されたポリヌクレオチドによってコードされる実施形態において、酵素は、同じ調節要素（例えば、同じプロモーター）の制御下で単一のリーディングフレームとしてコードされ得る。
【００５８】
適切な共発現部位を使用して、遺伝子導入合成生物学経路の酵素を単一のオープンリーディングフレームとして共発現させることができる。
【００５９】
共発現部位は、切断部位をコードする配列であり得、その結果、操作されたポリヌクレオチドは、切断部位によって連結された遺伝子導入合成生物学経路の酵素をコードする。典型的には、共発現部位は、遺伝子導入合成生物学経路の別個の酵素をコードする隣接するポリヌクレオチド配列の間に位置する。
【００６０】
適切には、操作されたポリヌクレオチドに複数の共発現部位が存在する実施形態において、同じ共発現部位が使用される（すなわち、同じ共発現部位が、遺伝子導入合成生物学経路の別々の酵素をコードするヌクレオチド配列の各隣接ペア間に存在する）。
【００６１】
好ましくは、共発現部位は切断部位である。切断部位は、２つのポリペプチドが分離されることを可能にする任意の配列であり得る。切断部位は、自己切断性であり得、その結果、ポリペプチドが生成されると、外部切断活性を必要とせずに、個々のペプチドに即座に切断される。
【００６２】
「切断」という用語は、本明細書中では便宜上使用されているが、切断部位は、古典的な切断以外のメカニズムによってペプチドを別個の実体に分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（下記参照）の場合、宿主細胞のプロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解または翻訳効果（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ（２００１）Ｊ．  Ｇｅｎ．  Ｖｉｒｏｌ．  ８２：１０２７−１０４１）と、「切断」活性を説明するためにさまざまなモデルが提案されている。そのような「切断」の正確なメカニズムは、切断部位が、タンパク質をコードする核酸配列の間に配置されたときにタンパク質を別個の実体として発現させる限り、本発明の目的にとって重要ではない。
【００６３】
切断部位は、フ−リン切断部位であり得る。
【００６４】
フーリンはサブチリシン様プロタンパク質転換酵素ファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在的な前駆体タンパク質を生物学的に活性な産物に処理するプロタンパク質転換酵素である。フーリンは、カルシウム依存性のセリンエンドプロテアーゼであり、対となる塩基性アミノ酸処理部位で前駆体タンパク質を効率的に切断できる。フーリン基質の例には、副甲状腺ホルモン、形質転換増殖因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロベータセクレターゼ、膜１型マトリックスメタロプロテアーゼ、プロ神経増殖因子のベータサブユニット、およびフォンヴィレブランド因子が含まれる。フーリンは、基本的なアミノ酸ターゲット配列（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ´）のすぐ下流のタンパク質を切断し、ゴルジ体で濃縮される。
【００６５】
切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得る。
【００６６】
ＴＥＶプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼである非常に配列特異的なシステインプロテアーゼである。ＴＥＶプロテアーゼは、その標的切断部位に非常に特異的であり、したがって、インビトロおよびインビボの両方での融合タンパク質の制御された切断のために頻繁に使用される。コンセンサスＴＥＶ切断部位はＥＮＬＹＦＱ＼Ｓである（「＼」は切断されるペプチド結合を示す）。ヒト細胞などの哺乳動物細胞はＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞で発現される実施形態において、外因性ＴＥＶプロテアーゼも哺乳動物細胞で発現されなければならない。
【００６７】
切断部位は、自己切断ペプチドをコードし得る。
【００６８】
「自己切断ペプチド」とは、タンパク質および自己切断ペプチドを含むポリペプチドが生成される場合に、任意の外部切断活性の必要なしに、それが直ちに「切断」されるか、または明確におよびに別々に第１および第２のポリペプチドに分離されるように機能するペプチドをいう。
【００６９】
自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの一次２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端での２Ａ「切断」によって媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）および馬鼻炎Ａウイルスなどのアフトウイルスにおいて、２Ａ領域は約１８アミノ酸の短い断片であり、これは、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存したプロリン残基）とともに、それ自身のＣ末端で「切断」を媒介することができる自律的要素を表す（上記のＤｏｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ（２００１））。
【００７０】
「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルス、およびトリパノソーマ種内の反復配列ならびに上記の細菌配列（Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．、２００１）で発見されている。
【００７１】
共発現（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）配列は、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現する（ｃｏ−ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ）配列は内部プロモーターであり得る。
【００７２】
適切には、操作されたポリヌクレオチドはオペロンであり得る。オペロンは、単一のプロモーターの制御下にある複数の遺伝子を含む機能性ポリヌクレオチド単位である。遺伝子は一緒にｍＲＮＡ鎖に転写され、そして、細胞質で一緒に翻訳されるか、またはトランススプライシングを受けて、別々に翻訳されるモノシストロン性ｍＲＮＡ（すなわち、それぞれが単一の遺伝子産物をコードするｍＲＮＡのいくつかの鎖）を作成する。この結果、オペロンに含まれる遺伝子は一緒に発現するか、まったく発現しないかのどちらかになる。
【００７３】
治療用小分子
治療用小分子は、癌の治療に有効な任意の小分子であり得る。
【００７４】
「治療用小分子」は、その通常の意味に従って本明細書で使用され、低分子量（例えば、９００ダルトン未満）の医薬分子を指す。
【００７５】
本発明で使用することができる広範な小分子を生成するのに適した遺伝子導入合成生物学経路は、当該分野で公知である。例として、小分子は、アルカロイド、テルペノイド、フラボノイド、ポリケチドまたは非リボソームペプチド、糖または糖アルコールであり得る。
【００７６】
アルカロイドは、細菌、真菌、植物、および動物を含む、さまざまな生物によって生成される低分子量の窒素含有化合物である。ほとんどのアルカロイドは、トリプトファン、チロシン、オルニチン、ヒスチジンおよびリジンなどのアミノ酸の脱炭酸を介して誘導され、重要な薬理活性を持っている。たとえば、サンギナリンは抗癌治療薬としての可能性を示しており、ビスベンジルイソキノリンアルカロイドテトランドリンには免疫調節作用を有する。そして、多くのインドロカルバゾールアルカロイドは血管新生を阻害するため、および癌治療として臨床試験に入っている。
【００７７】
アルカロイドは、それらが由来するアミノ酸に従って、モルフィナン−、プロトベルベリン−、麦角−、ピロリジジン−、キノリジジン−、フラノキノリン−アルカロイドなどの多くの群に分類できる。
【００７８】
サンギナリンなどのベンジルイソキノリンアルカロイドは、Ｍａｇｎｏｌｉａｃｅａｅ（マグノリア科）、Ｒａｎｕｎｃｕｌａｃｅａｅ（キンポウゲ科）、Ｂｅｒｂｅｒｉｄａｃｅａｅ（マメ科）、Ｐａｐａｖｅｒａｃｅａｅ（ケシ科）などの多くの種で、チロシンからレチクリンを介して合成される。チロシンからレチクリンへの初期経路は多くの植物種に共通であるが、後期経路ではより多様性がある。
【００７９】
治療用小分子は、細胞毒性分子、細胞増殖抑制分子、腫瘍の分化を誘導できる薬剤および炎症性分子から選択することができる。
【００８０】
細胞毒性分子は、細胞に対して直接毒性があり、細胞死を誘導することができる分子を指す。例えば、細胞毒性分子は、細胞内のＤＮＡ合成、タンパク質合成および／または代謝プロセスを妨害し得る。
【００８１】
例示的な細胞毒性分子としては、バイオラセイン、ミコフェノール酸、テルペン／イソプレノイド（例えば、ゲラニオール、オフィオボリン誘導体などのセスタテルペン；タキソール）、トリテルペノイド（例えば、ジンセノサイド、オレアノール酸、ウルソール酸、ベツリン酸（ｂｅｔｕｌｉｎｉｃ  ａｃｉｄ）またはプロトパナキサジオール（ｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ））、シクロスポリン、タクロリムス、メトトレキサート、サンギナリンおよびフルオロウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８２】
細胞毒性分子は、以下の型の１つから選択され得る。シクロホスファミドなどのアルキル化剤、ダウノルビシンなどのアントラサイクリン、シタラビンなどの代謝拮抗剤、ビンクリスチンなどのビンカアルカロイド、およびエトポシドなどのトポイソメラーゼ阻害剤。
【００８３】
細胞増殖抑制分子は、細胞周期および細胞増殖を調節することができる分子、特に細胞増殖停止を誘導することができる分子を指す。たとえば、すべてのトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）は、特定の型の急性骨髄性白血病の分化を誘導し得る。
【００８４】
バイオラセインの合成
適切には、治療用小分子はバイオラセインであり得る。
【００８５】
バイオラセインは、主にＣｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（クロモバクテリウム属）の細菌から単離されたインドール誘導体である。バイオラセインは重要な抗腫瘍特性を示す。たとえば、バイオラセインはＭＯＬＴ−４白血病、ＮＣＩ−Ｈ４６０非小細胞肺癌およびＫＭ１２結腸癌細胞株に対して活性を持つ。
【００８６】
バイオラセインは、２つのトリプトファン分子の酵素的縮合によって形成され、５つのタンパク質の作用を必要とする（図２を参照）。その生産に必要な遺伝子は、ｖｉｏＡＢＣＤＥと呼ばれ得る（Ａｕｇｕｓｔ  ｅｔ  ａｌ．；  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ｖｏｌ．２、ｎｏ．４、ｐｐ．５１３−５１９、２０００  参照により本明細書に援用される）。そしてこれらの遺伝子は、大腸菌などの他の細菌宿主内でクローニングされ、そして発現されている。ｖｉｏＡＢＣＤＥ遺伝子は、酵素ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤおよびＶｉｏＥをコードする。
【００８７】
１つまたはより多い操作されたポリヌクレオチドはＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤおよびＶｉｏＥをコードし得、その結果、本発明の操作された細胞がトリプトファンからバイオラセインを合成することができる。
【００８８】
ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤおよびＶｉｏＥのアミノ酸配列を、それぞれ配列番号１から５として以下に示す。
【化１】
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【化２】
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【００８９】
ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤおよびＶｉｏＥポリペプチドを互いにフレーム内に含み、口蹄様２Ａ配列で分離された、例示的なバイオラセイン単一オペロンリーディングフレームを、配列番号６として示す。この配列において、２Ａペプチド配列を太字の斜体で示す。バイオラセインＯＲＦをコードする核酸配列を、配列番号７として示す。
【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【００９０】
細胞内で組み合わせて発現された場合に治療用小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素は、配列番号１から６として示される１つまたはより多い配列を含み得る。またはこれら酵素は少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するそれら配列の改変体を含み得る。ただし改変体ＶｉｏＡ、ＶｉｏＢ、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤおよび／またはＶｉｏＥポリペプチドが、細胞内でトリプトファンからバイオラセインを形成するのに必要な能力を保持している場合においてである。
【００９１】
２つのポリペプチド配列間の同一性パーセントは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから無料で入手できるＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定できる。適切には、同一性パーセントは、参照および／またはクエリー配列全体にわたって決定される。
【００９２】
ゲラニル二リン酸由来テルペノイドの合成
治療用小分子はテルペノイドであり得る。
【００９３】
テルペンは二次代謝産物の最大の群を構成し、すべての公知の生物群によって合成される。テルペン（またはイソプレノイド）には幅広い用途があるが、多くは抗癌特性を持つ。すべてのテルペンは、２つの５炭素構成要素、イソペンテニルリン酸（ＩＤＰ）およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＤＰ）から合成される。これらの構成要素は、２つの経路によって合成される。ヒトにおいてはメバロン酸経路が使用され、最終産物は、コレステロール合成およびタンパク質プレニル化の前駆体を含むさまざまな機能に利用される（図３を参照）。
【００９４】
ＩＤＰおよびＤＭＡＤＰは、さまざまな酵素によって組み合わされ、５つの炭素の組み合わせが異なる多くの中間体を生成する。たとえば、ゲラニル二リン酸（Ｃ１０）、ゲラニルゲラニル二リン酸（Ｃ２０）、スクアレン（Ｃ３０）などである（図４を参照）。
【００９５】
これらの組み合わせは、多様なテルペノイド製品の生産をもたらす幅広いテルペン合成酵素の基質である。
【００９６】
より複雑なイソプレノイドのさらなる合成はまた、操作された細胞における複数の酵素の発現によっても達成され得る。単純なイソプレノイドは、単一の酵素ステップを使用してメバロン酸経路前駆体から合成し得る。
【００９７】
たとえば、多くの植物種によって合成されたモノテルペノイドであるゲラニオールは、ばら油の主成分であり、抗癌機能を持っていることが示されている。ゲラニオールは、Ｖａｌｅｒｉａｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（バレリアナオフィシナリス）由来の単一のゲラニオール合成酵素遺伝子の発現により、ゲラニル二リン酸から酵母細胞で合成できる（Ｚｈａｏ、Ｊ．  ｅｔ  ａｌ．；（２０１６）；  Ａｐｐ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１００、４５６１−４５７１  参照により本明細書に援用される）。
【００９８】
したがって、本発明で使用するための１つまたはより多い酵素は、ゲラニオール合成酵素を含み得る。Ｖａｌｅｒｉａｎａ  ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ由来の、例示的なゲラニオール合成酵素は、配列番号８（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号−ＫＦ９５１４０６に対応）として示される。
【化８】
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【００９９】
ゲラニオール合成酵素は、配列番号８として示される配列または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。ただし改変体配列は、ゲラニル二リン酸からゲラニオールを生成する能力を保持する場合においてである。ゲラノイルを合成する改変酵素の能力は、例えば、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）または質量分析を使用して分析し得る。
【０１００】
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．（コウジカビ種）の単一遺伝子を使用して、その多くが強力な細胞毒性活性を有するオフィオボリン（Ｏｐｈｉｏｂｏｌｉｎ）誘導体などのより複雑なセスタテルペンを合成できる（Ｃｈａｉ  ｅｔ  ａｌ；（２０１６）；  Ｓｃｉ．Ｒｅｐｏｒｔｓ；  ６、１−１１  参照により本明細書に援用される）。
【０１０１】
したがって、本発明で使用するための１つまたはより多い酵素は、オフィオボリンＦ合成酵素を含み得る。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｃｌａｖａｔｕｓ由来の例示的なオフィオボリンＦ合成酵素は、配列番号９（ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号−Ａ１８Ｃ３に対応）として示される。
【化９】
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【化１０】
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【０１０２】
オフィオボリンＦ合成酵素は、配列番号９として示される配列または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。ただし改変体配列は、ジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）、ゲラニル二リン酸、ファルネシル二リン酸またはゲラニルゲラニル二リン酸からオフィオボリンを生成する能力を保持する場合においてである。
【０１０３】
ゲラニオールおよびオフィオボリンは比較的単純なイソプレノイドであるが、それらの合成は、複数の酵素を使用してより複雑なイソプレノイドを合成する可能性を示している。テルペン誘導体のさらなる例は、複雑な三環式ジテルペンのタキソールであり、ゲラニオール合成に必要なＩＤＰおよびＤＭＡＤＰ前駆体から合成するために最大１９の酵素を必要とする。この合成経路および関与する酵素は、Ｃｒｏｔｅａｕ  ｅｔ  ａｌ  （２００６）  Ｔａｘｏｌ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．  ５：７５−９７で概説されている。
【０１０４】
スクアレンからのトリテルペノイドの合成
治療用小分子はトリテルペノイドであり得る。
【０１０５】
コレステロールは、プレニル化前駆体と同様の前駆体を必要とするメバロン酸経路に由来する細胞産物であるが、スクアレンの合成に関する酵素が、その経路から転換してコレステロールを生成する（図３）。スクアレンはトリテルペンであり、その多くが抗癌活性を有する多種多様なトリテルペン由来化合物（図５）の合成の前駆体である。
【０１０６】
４つの植物由来酵素の発現により、酵母で複雑なジンセノサイドを生成することが可能になる（Ｗａｎｇ、Ｐ．  ｅｔ  ａｌ．；（２０１５）；  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．２９、９７−１０５  参照により本明細書に援用される）。抗癌活性を有するジンセノサイドに加えて、オレアノール酸またはプロトパナキサジオールなどの前駆体化合物は抗癌特性を有する。
【０１０７】
したがって、本発明で使用するための１つまたはより多い酵素は、ジンセノサイドを生成することができる酵素の群を含み得る。ジンセノサイドを生成することができる４つの酵素の、例示的な群を、配列番号１０から１３として示す。
【化１１】
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【化１２】
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【０１０８】
ジンセノサイドを産生することができる遺伝子導入合成生物学経路は、配列番号１０から１３として示される１つもしくはより多いアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。例えば、ジンセノサイドを産生することができる遺伝子導入合成生物学経路は、配列番号１０から１３として示される少なくとも２つ、少なくとも３つもしくは４つすべてのアミノ酸配列、または少なくとも８０％の配列同一性を有するその改変体を含み得る。
【０１０９】
配列番号１０から１３として示される配列の１つの改変体は、少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有し得る。ただし改変体配列が配列番号１０から１３の１つとして示される参照配列を有する対応する酵素の機能的活性を保持するという条件においてである。
【０１１０】
したがって、限られた数の植物遺伝子の発現により、多数の抗癌化合物の産生が可能になる。さらなるトリテルペン修飾酵素のエンジニアリングにより、多種多様なより複雑なイソプレノイドの生産が可能になる。
【０１１１】
治療用小分子に対する感度
いくつかの実施形態において、本発明の操作された細胞は、遺伝子導入合成生物学経路によって産生される治療用小分子に対する感度が低下するようにさらに操作される。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「感度の低下」は、本発明の操作された細胞が、例えば、同等の対照細胞と比較して、治療用小分子の細胞毒性効果に対して感受性が低いことを意味し、この同等の対照細胞は、（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、および（ｉｉ）細胞内で組み合わせて発現させる場合に、治療小分子を合成することができる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い操作されたポリヌクレオチド、を発現するが、上記治療用小分子に対する感度が低下するようには操作されていない。
【０１１３】
適切には、本発明の細胞は、治療用小分子に対する感度が低下するように操作されていない同等の対照細胞と比較して、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％または少なくとも５０％小分子の効果に対して感受性が低いものであり得る。
【０１１４】
小分子の効果は、当該分野で公知である方法および分析を使用して決定し得る。例として、小分子の効果は、アネキシンＶ上方制御のフローサイトメトリー検出または７ＡＡＤ染色などの細胞死分析を使用して決定し得る。問題の腫瘍に適切な系統マーカーを使用することにより、フローサイトメトリーによって分化を評価することもできる。腫瘍の静止は、単純なカウントまたはトリチウム化チミジンの取り込みによって細胞増殖を測定することによって決定できる。腫瘍に対する小分子のより詳細な効果は、ＲＮＡｓｅｑ分析によって決定できる。
【０１１５】
本発明の細胞は、関連する治療用小分子に対する耐性を提供する変異を導入することにより、治療用小分子に対する感度が低下するように操作することができる。
【０１１６】
適切な薬物耐性機構および変異は当該分野で公知であり、例えば、Ｚａｈｒｅｄｄｉｎｅ他によって要約されている（Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ；  ２０１３；  ４（２８）；  １−８  参照により本明細書に援用される）。
【０１１７】
耐性変異を含むタンパク質をコードするポリヌクレオチドを導入する方法は当該分野で公知であり、例えば、レトロウイルスベクターを使用している細胞への移入を含有する。関連する変異を野生型ポリペプチド配列に導入する方法も当該分野で公知であり、部位指向変異誘発を含有するが、これに限定されない。
【０１１８】
治療用小分子および耐性変異の適切な組み合わせには、以下の表２に記載されているものを含有するが、これらに限定されない。
【表２】
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【０１１９】
治療用小分子の発現誘導
いくつかの実施形態において、遺伝子導入合成生物学経路の発現は、誘導性調節要素によって制御され得る。
【０１２０】
遺伝子導入合成生物学経路を形成するために一つより多い酵素が必要な場合、遺伝子導入合成生物学経路における律速酵素の発現は、誘導性調節要素によって制御され得る。
【０１２１】
例えば、遺伝子導入合成生物学経路の発現は、ＣＡＲもしくはＴＣＲへの抗原の結合、腫瘍微小環境に存在する要因、または、細胞への第二の小分子の結合によって誘導され得る。
【０１２２】
そのような制御機構の利点は、本発明の操作された細胞が、全身に送達されると毒性である治療用小分子を生成する遺伝子導入合成生物学経路を発現し得ることである。
【０１２３】
遺伝子導入合成生物学経路が誘導可能な方法で発現され得る機構の例には、（ａ）腫瘍微小環境の因子によって引き起こされる発現（例：ＣＡＲまたは遺伝子導入ＴＣＲへの同種抗原の結合）（ｂ）小分子医薬品による発現誘発を含有するが、これらに限定されない。
【０１２４】
腫瘍微小環境の因子によって誘導される遺伝子導入合成生物学経路の発現は、操作された本Ｔ細胞が遺伝子導入合成生物学経路のみを発現し、したがって腫瘍に局在している場合は治療用小分子を生成することを意味する。したがって、この誘導可能な発現は、全身作用（例えば毒性作用）を低減することが予想される。
【０１２５】
遺伝子導入合成生物学経路の発現が誘導され得る例示的な機構には、Ｔ細胞の活性化に続いて活性化されるプロモーターの使用を含有する。および、遺伝子導入合成生物学経路の発現を調節するための、Ｎｏｔｃｈ応答要素と組み合わせたｓｃＦＶ−Ｎｏｔｃｈキメラ受容体の使用も含まれる。
【０１２６】
適切には、遺伝子導入合成生物学経路（または遺伝子導入合成生物学経路における律速酵素）の発現は、Ｔ細胞の活性化に続いて活性化されるプロモーターの制御下にあり得る。ここで、ＣＡＲまたはＴＣＲが抗原を認識すると、Ｔ細胞が活性化され、誘導性プロモーターからの転写が刺激され、遺伝子導入合成生物学経路が提供されて、治療用小分子が産生される。
【０１２７】
Ｔ細胞活性化に続いて誘導発現を達成するための例示的な方法は、遺伝子導入合成生物学経路（または遺伝子導入合成生物学経路における律速酵素）のプロモーター要素としてのＮＦＡＴ認識配列の使用を含有する。コンセンサスＮＦＡＴ認識配列はＧＧＡＡＡＡ（配列番号１４）である。このアプローチは、ＮＦＡＴ依存性ＩＬ１２分泌を達成するために以前Ｃｈｍｉｅｌｅｗｓｋｉ他によって使用されていた（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ。７１、５６９７−５７０６（２０１１）  参照により本明細書に援用される）。
【０１２８】
さらなるアプローチには、キメラＮｏｔｃｈ受容体の使用を含有する。これはｓｃＦｖをＮｏｔｃｈに移植する受容体である。ｓｃＦｖがその同族の標的を認識する場合に、受容体（転写因子）のエンドドメインが膜から放出され、核内の遺伝子を活性化する（Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．；  Ｃｅｌｌ  １６４、７８０−７９１（２０１６）  参照により本明細書に援用される）。
【０１２９】
遺伝子導入合成生物学経路（または遺伝子導入合成生物学経路における律速酵素）の発現はまた、腫瘍微小環境に関する因子の下流で活性化される調節要素を使用することによって誘導され得る。
【０１３０】
適切には、因子は、非腫瘍微小環境と比較して腫瘍微小環境で増加する可溶性因子である。例えば、腫瘍微小環境において増加する因子は、非腫瘍微小環境と比較して、腫瘍微小環境において１０、２０、５０、１００、５００または１０００倍高いレベルで存在し得る。例えば、腫瘍微小環境に関する因子は、乳酸、オルニチン酸、アデノシン酸、イノシン酸、グルタミン酸またはキヌレン酸であり得る。
【０１３１】
腫瘍微小環境における可溶性因子を検出するためのアプローチは、例えば、ＷＯ  ２０１７／０２９５１１に記載されている。
【０１３２】
小分子医薬品によって誘導される遺伝子導入合成生物学経路（または遺伝子導入合成生物学経路における律速酵素）の発現は、小分子医薬品が投与され、細胞によって認識される場合において、操作された本細胞が遺伝子導入合成生物学経路のみを発現し、したがって治療用小分子を生成することを意味する。したがって、この誘導性発現は、操作された細胞が腫瘍に局在化したときに操作された細胞が遺伝子導入合成生物学経路を一度に発現するように誘導できるので、全身作用（例えば毒性作用）を低減することが期待される。特に、遺伝子導入合成生物学経路の発現は、小分子医薬品の対象への投与により誘導される。さらに、毒性が生じる場合、遺伝子導入合成生物学経路による治療用小分子の産生は、投与される小分子医薬品の量を低減するか、または小分子医薬品の取りやめによって制御することができる。
【０１３３】
適切な小分子医薬品は特に限定されず、当技術分野で周知である。例として、小分子医薬品は、以下のリストから選択することができる：テトラサイクリン、ミノサイクリン、タモキシフェン、ラパマイシンおよびラパマイシン類似体、二量体化の化学的誘導物質ＡＰ１９０３（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５、１０４３７−１０４４２（１９９８））、クメルマイシン、エクジステロイドおよび半合成エクジステロイド（Ｌａｐｅｎｎａ  ｅｔ  ａｌ、ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ  ４、５５−６８（２００９））およびＳＨＬＤ１（Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ、Ｃｅｌｌ  １２６、９９５−１００４（２００６））。
【０１３４】
遺伝子導入合成生物学経路（または遺伝子導入合成生物学経路における律速酵素）の発現は、「Ｔｅｔオペロン」を使用して達成することができる。ここでタンパク質（ｔｅｔＲ）は、テトラサイクリンに応答してｔｅｔ応答ＤＮＡ要素への結合を調節する立体構造の変化を受ける。スイッチオン（Ｔｅｔ−ｏｎ）またはスイッチオフ（Ｔｅｔ−ｏｆｆ）するＴｅｔ転写システムが記載されており、当該分野で公知である（Ｓａｋｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ；  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ。４、６５８−６６８（２０１６）  参照により本明細書に援用される）。
【０１３５】
他の転写スイッチは、免疫原性が低いという点でＴｅｔシステムに勝る利点があり得ると記載されている。そのようなシステムの一つが半合成Ｏ−アルキルエクジステロイドシステム（Ｒｈｅｏｓｗｉｔｃｈ）である（Ｌａｐｅｎｎａ，Ｓ．  ｅｔ  ａｌ；  ＣｈｅｍＭｅｄＣｈｅｍ  ４、５５−６８（２００９）  参照により本明細書に援用される）。
【０１３６】
小分子医薬品による遺伝子導入合成生物学経路（または遺伝子導入合成生物学経路における律速酵素）の発現を制御するためのさらなるアプローチは、小分子再補完を含む。ここでは、酵素は２つの部分に分かれており、個別には機能しない。各パーツは、小分子ヘテロ二量体化システム（ＦＲＢ／ＦＫＢＰ１２およびラパマイシンなど）の一部に取り付けられている。薬物の存在下で、酵素が一緒になり、合成が活性化される。この実例は、Ａｚａｄ他によって提供される（Ａｎａｌ．Ｂｉｏａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．４０６、５５４１−５５６０（２０１４））  参照により本明細書に援用される）。
【０１３７】
小分子医薬品を用いた遺伝子導入合成生物学経路（または遺伝子導入合成生物学経路における律速酵素）の発現を制御するためのさらなるアプローチは、ドメインを不安定化することである。ここで、特定のタンパク質ドメインは、小分子医薬品がない場合に不安定になるように操作されている。この不安定化ドメインが遺伝子導入合成生物学経路の重要な酵素と融合している場合、それはユビキチン化および分解の標的となるため、治療用小分子の合成が妨げられる。小分子医薬品の存在下では、不安定化ドメインは安定化され、融合酵素はユビキチン化されない。したがって、遺伝子導入合成生物学経路は、機能し、治療用小分子を生成することができる。このシステムの例は、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ他によって記載される（Ｃｅｌｌ  １２６、９９５−１００４（２００６）＆Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４、１１２３−１１２７（２００８）  参照により本明細書に援用される）。
【０１３８】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
図１に模式的に示される古典的なＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）と細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）とを結合するキメラ型１膜貫通タンパク質である。バインダーは典型的にモノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるが、それは抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットに基づくか、または標的抗原用リガンドに基づくことができる。スペーサードメインは膜からバインダーを単離し、そしてそれを適切な配向にさせるのに必要であり得る。使用される共通のスペーサードメインはＩｇＧ１のＦｃである。より小型のスペーサーは、抗原に応じて、例えばＣＤ８α由来の茎や、単にＩｇＧ１ヒンジのみでさえ十分であり得る。膜貫通ドメインは、細胞膜内のタンパク質を固定し、スペーサーをエンドドメインに結合する。
【０１３９】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζいずれかのγ鎖の細胞内部分由来のエンドドメインを有した。結果的に、これらの第一世代の受容体は免疫シグナル１を伝達した。この伝達は同種の標的細胞のＴ細胞殺傷を引き起こすのに十分であったが、増殖および生存するように十分にＴ細胞を活性化させることはできなかった。この限界を克服するために、複合エンドドメインを構築していた。Ｔ細胞共刺激性分子の細胞内部分とＣＤ３ζの細胞内部分との融合により、抗原認識後に活性化および共刺激性シグナルを同時に伝達できる第二世代受容体がもたらされた。最も一般的に使用される共刺激性ドメインは、ＣＤ２８のドメインである。これは最も強力な共刺激性シグナル、すなわちＴ細胞増殖を引き起こす免疫シグナル２を供給する。生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメインを含有するいくつかの受容体も記載されている。活性化、増殖および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有する、さらに強力な第３世代ＣＡＲが今記載されている。
【０１４０】
ＣＡＲをコードする核酸は、例えばレトロウイルスベクターを使用してＴ細胞に移入することができる。この方法において、多数の抗原特異的なＴ細胞を養子細胞移入のために生成することができる。ＣＡＲが標的抗原と結合する際、これによりＣＡＲが発現するＴ細胞に活性化シグナルを伝達させる。したがって、ＣＡＲはＴ細胞の特異性および細胞毒性を標的抗原を発現する細胞に指向する。
【０１４１】
抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは抗原を認識する古典的なＣＡＲの一部である。
【０１４２】
抗体の抗原結合部位、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体に基づくものを含む多数の抗原結合ドメインが、当該分野で公知である。例えば、抗原結合ドメインは以下を含み得る。モノクローナル抗体由来の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、標的抗原の天然リガンド、標的に十分な親和性を有するペプチド、ラクダ類などの単一ドメインバインダー、Ｄａｒｐｉｎのような単一の人工バインダー、またはＴ細胞受容体由来の一本鎖。
【０１４３】
様々な腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）は以下の表１で示されるように公知である。本発明で使用される抗原結合ドメインは表１に示されるようにＴＡＡに結合可能なドメインであり得る。
【表１】
2021502102.tif 000015
【０１４４】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは膜にまたがる古典的なＣＡＲの配列である。それは疎水性アルファヘリックスを含む。膜貫通ドメインはＣＤ２８由来であり得、良好な受容体安定性を与える。
【０１４５】
シグナルペプチド
ＣＡＲはシグナルペプチドを含み得る。その結果、ＣＡＲがＴ細胞などの細胞に発現する際、新生タンパク質は小胞体に、その後にＣＡＲが発現される細胞表面に指向させられる。
【０１４６】
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを包含し得る。シグナルペプチドはアミノ酸の短い正電荷のストレッチで開始され得る。これは転移の間のポリペプチドの適切なトポロジーにするのを助ける。シグナルペプチドの最後に、シグナルペプチダーゼにより認識され、切断する典型的なアミノ酸のストレッチがある。シグナルペプチダーゼは転移の完了の間または後のいずれかで切断し、遊離のシグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。遊離のシグナルペプチドはその後特異的なプロテアーゼによって消化される。
【０１４７】
スペーサードメイン
ＣＡＲはスペーサー配列を含み、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと結合し得る。フレキシブルスペーサーは、抗原結合ドメインを異なる方向に指向させ結合を促進させる。
【０１４８】
例えばスペーサー配列は、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはヒトＣＤ８茎またはマウスＣＤ８茎を含み得る。あるいはスペーサーは、ＩｇＧ１  Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８茎と同様の長さおよび／もしくはドメイン間隔特性を有する代替リンカー配列を含み得る。ヒトＩｇＧ１スペーサーはＦｃ結合モチーフを取り除くために変更され得る。
【０１４９】
細胞内シグナル伝達ドメイン
細胞内シグナル伝達ドメインは古典的なＣＡＲのシグナル伝達の一部である。
【０１５０】
最も一般的に使用されるシグナル伝達ドメイン構成要素は、ＣＤ３ゼータエンドドメインの構成要素であり、３つのＩＴＡＭを包含する。これは抗原が結合した後、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達する。ＣＤ３ゼータは十分なコンピテントな活性化シグナルを提供しないかもしれず、追加の共刺激性シグナル伝達が必要であり得る。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０はＣＤ３ゼータと使用して、増殖／生存シグナルを伝達することができ、または３つすべてが一緒に使用できる（図１Ｂに図示する）。
【０１５１】
細胞内シグナル伝達ドメインはＴ細胞シグナル伝達ドメインであるかそれを含み得る。
【０１５２】
細胞内シグナル伝達ドメインは１つまたはより多い免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み得る。ＩＴＡＭは、免疫系の特定の細胞表面タンパク質の細胞質側末端において２回繰り返す４つのアミノ酸の保存配列である。モチーフは、任意の２つの他のアミノ酸によりロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンを含有し、記号ＹｘｘＬ／Ｉを与える。これら記号のうち２つは、典型的には、分子のテイルにおける６と８との間のアミノ酸により分離される（ＹｘｘＬ／Ｉｘ（６−８）ＹｘｘＬ／Ｉ）。
【０１５３】
ＩＴＡＭは免疫細胞においてシグナル変換に重要である。ここで、ＩＴＡＭは、ＣＤ３およびＴ細胞受容体のζ鎖の複合体、ＣＤ７９アルファおよびＢ細胞受容体のベータ鎖の複合体、ならびに特定のＦｃ受容体などの重要な細胞シグナル伝達分子の末端で発見される。これらのモチーフの中のチロシン残基はそれらのリガンドと受容体分子の相互作用に続いてリン酸化され、細胞のシグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキングサイトを形成する。
【０１５４】
細胞内シグナル伝達ドメイン構成要素は、３つのＩＴＡＭを含有するＣＤ３ζエンドドメインを含む、から本質的になる、またはからなるものであり得る。古典的にＣＤ３ζエンドドメインは、抗原の結合後に、Ｔ細胞に活性化シグナルを伝達する。しかしながら、本発明の文脈において、操作されたＢ２Ｍを含むＭＨＣ／ペプチド複合体が異なるＴ細胞上でＴＣＲに結合した後、ＣＤ３ζエンドドメインはＴ細胞に活性化シグナルを伝達する。
【０１５５】
細胞内シグナル伝達ドメインは、追加の共刺激性シグナルを含み得る。例えば、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７としても知られている）がＣＤ３ζとともに使用され得る、またはＣＤ２８およびＯＸ４０はＣＤ３ζとともに使用されることができ、増殖／生存シグナルを伝達する。
【０１５６】
したがって、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζエンドドメインのみ、４−１ＢＢ、ＣＤ２８またはＯＸ４０エンドドメインから選択される１つまたはより多くの共刺激性ドメインと合わせたＣＤ３ζエンドドメイン、および／あるいは４−１ＢＢ、ＣＤ２８またはＯＸ４０のいくつかまたはすべての組み合わせを含むことができる。
【０１５７】
エンドドメインは、１つまたはより多くの以下のものを含み得る。ＩＣＯＳエンドドメイン、ＣＤ２エンドドメイン、ＣＤ２７エンドドメインまたはＣＤ４０エンドドメイン。
【０１５８】
エンドドメインは、配列番号１５から１８として示される配列、または少なくとも８０、８５、９０、９５、９８もしくは９９％の配列同一性を有するそれらの改変体を含み得る。ただし改変体配列が細胞に活性化シグナル伝達する能力を保持する条件においてである。
【０１５９】
２つのポリペプチド配列間の同一性パーセントは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖから無料で利用可能なＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定できる。適切には、同一性パーセントは、参照および／またはクエリ―配列の全体にわたって決定される。
【化１３】
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【０１６０】
遺伝子導入Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
遺伝子導入Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合するペプチドとして抗原のフラグメントを認識することを担う、Ｔ細胞表面において見られる分子である。
【０１６１】
ＴＣＲは二つの異なるプロテイン鎖で構成されているヘテロ二量体である。ヒトにおいては、Ｔ細胞の９５％で、ＴＣＲはアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖（それぞれＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）からなる。一方、Ｔ細胞の５％では、ＴＣＲはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（それぞれＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）からなる。
【０１６２】
ＴＣＲが抗原ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と関与するとき、Ｔリンパ球はシグナル変換を通して活性化される。
【０１６３】
従来の抗体指向標的抗原とは対照的に、ＴＣＲによって認識される抗原は、ペプチド／ＭＨＣ複合体として処理され細胞表面に送達される、潜在的な細胞内タンパク質のアレイ全体を含み得る。
【０１６４】
ＴＲＡおよびＴＲＢ遺伝子、またはＴＲＧおよびＴＲＤ遺伝子を、ベクターを用いて細胞内に人工的に導入することによって、異種性の（すなわち、非天然の）ＴＣＲ分子を発現するように細胞を操作することが可能である。例えば、操作されたＴＣＲの遺伝子を自己のＴ細胞に再導入し、Ｔ細胞養子療法のために患者に戻して移入させることができる。そのような「異種性の」ＴＣＲは、本明細書中では「遺伝子導入ＴＣＲ」とも呼ばれ得る。
【０１６５】
細胞
本発明の細胞は、Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、またはサイトカイン誘導キラー細胞などの免疫エフェクター細胞であり得る。
【０１６６】
Ｔ細胞は、アルファ―ベータＴ細胞またはガンマ―デルタＴ細胞であり得る。
【０１６７】
本細胞は、患者自身の末梢血液（第一者）、またはドナー末梢血液からの造血性の肝細胞移植（第二者）の設定において、または関係のないドナーからの末梢血液（第三者）由来であり得る。例えば、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体での処理によって、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子で形質導入されることに先立って活性化および／または拡大され得る。
【０１６８】
代替的に、細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞からＴ細胞へのエクスビボ分化に由来し得る。代替的に、その溶解性の機能を保持する不死化Ｔ細胞株が使用され得る。
【０１６９】
本細胞は造血性肝細胞（ＨＳＣ）であり得る。ＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ［末梢血液肝細胞（ＰＢＳＣ）］などのサイトカインの薬理用量の投与による動員後、末梢血液の白血球フェレーシスによって適切に一致したドナーの骨髄から、または分娩後に胎盤から集められた臍帯血（ＵＣＢ）から移植用に得られることができる。髄、ＰＢＳＣ、またはＵＣＢは処理することなく移植されてもよいし、ＨＳＣがＣＤ３４表面抗原に対するモノクローナル抗体を用いた免疫選択によって濃縮されてもよい。
【０１７０】
本発明の細胞は操作された細胞である。したがって、ＣＡＲまたは遺伝子導入ＴＣＲをコードする第一の核酸配列および治療用小分子を合成できる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い核酸配列は、アルファ―ベータＴ細胞、ＮＫ細胞、ガンマ―デルタＴ細胞またはサイトカイン誘導キラー細胞によって自然には発現されない。
【０１７１】
核酸配列の核酸構築物／キット
本発明は以下を含む核酸配列を提供する。（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入ＴＣＲをコードする第一の核酸配列、および（ｉｉ）本明細書で定義されるような、細胞内で組み合わせて発現した際に、治療用小分子を合成できる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い核酸配列。
【０１７２】
適切には、細胞内で組み合わせて発現した際に治療用小分子を合成できる１つまたはより多い酵素は、単一の核酸配列上でコードされる。
【０１７３】
本発明はさらに、本発明による核酸配列を含むキットを提供する。例えば、キットは以下を含み得る。（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入ＴＣＲをコードする第一の核酸配列、および（ｉｉ）本明細書で定義されるような細胞内で組み合わせて発現した際に、治療用小分子を合成できる１つまたはより多い酵素をコードする１つまたはより多い核酸配列。
【０１７４】
適切には、細胞内で組み合わせて発現した際に治療用小分子を合成できる１つまたはより多い酵素は、単一の核酸配列上でコードされる。
【０１７５】
本明細書で使われる場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」は互いに同義であると意図される。
【０１７６】
遺伝コードの縮重の結果として、多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が同じポリペプチドをコードできることが、当業者によって理解されている。加えて、当業者が、慣習的な技術を使用して、本明細書に記載のポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響しないヌクレオチド置換物を用いて、ポリペプチドが発現する任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映できることが理解されるべきである。適切には、本発明のポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞における、特に本明細書に記載される免疫エフェクター細胞における発現を可能にするように最適化されているコドンである。
【０１７７】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。それらは一本鎖または二本鎖であり得る。それらはまた、中に合成または修飾ヌクレオチドを含有するポリヌクレオチドでもあり得る。多くの異なる型のオリゴヌクレオチドに対する修飾が当該分野で公知である。これらは、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３´および／または５´末端でアクリジンまたはポリリジン鎖の付加を含む。本明細書に記載される使用の目的のために、ポリヌクレオチドは当技術分野で利用可能な任意の方法によって修飾され得ることが理解されるべきである。そのような修飾は、目的のポリヌクレオチドのインビボ活性または寿命を強めるために実行され得る。
【０１７８】
ヌクレオチド配列に関する用語「改変体」、「ホモログ」、または「誘導体」は、任意の配列から、または配列への、１つの（またはより多くの）核酸の置換、改変、修飾、交換、欠失または付加を含む。
【０１７９】
共発現部位
共発現部位は、以下の両方の共発現を可能にする核酸配列を参照するために本明細書で使用される。（ｉ）ＣＡＲまたはＴＣＲ、および（ｉｉ）本明細書で定義されるような細胞内の組み合わせで発現する際に、治療用小分子を合成できる１つまたはより多い酵素。
【０１８０】
共発現部位は切断部位をコードする配列であり得、その結果、核酸構築物は切断部位により連結した２つのポリペプチドを含むように生成する。切断部位は自己切断性であり得、その結果、ポリペプチドが生成される際に、それは任意の外部切断活性の必要なしに個々のペプチドに速やかに切断する。適切な自己切断ポリペプチドは本明細書に記載される。
【０１８１】
共発現配列は配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）であり得る。共発現配列は内部プロモーターであり得る。
【０１８２】
ベクター
本発明は、本発明の１つまたはより多い核酸配列もしくは核酸構築物を含むベクターまたはベクターのキットも提供する。そのようなベクターは、核酸配列または構築物を宿主細胞に導入するために使用され得る。その結果、それはＣＡＲまたは遺伝子導入ＴＣＲおよび細胞内の組み合わせで発現する際に、治療用小分子を合成できる１つまたはより多い酵素を発現する。
【０１８３】
例えばベクターは、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンベースベクターもしくは合成ｍＲＮＡなどの、プラスミドまたはウイルスベクターであり得る。
【０１８４】
ベクターは、細胞をトランスフェクトまたは形質導入することが可能であり得る。
【０１８５】
医薬組成物
本発明は、本発明の細胞、核酸構築物、第一核酸配列および第二核酸配列、ベクターまたは第一および第二ベクターを含有する医薬組成物にも関する。特に本発明は、本発明による細胞を含有する医薬組成物に関する。
【０１８６】
医薬組成物はさらに、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤を含み得る。医薬組成物は必要に応じて、１つまたはより多いさらなる薬学的に活性なポリペプチドおよび／または化合物を含み得る。例えば、そのような製剤は、静脈内注入において適切な形態であり得る。
【０１８７】
治療方法
本発明は、本発明の細胞（例えば上記記載の医薬組成物において）の被験体への投与のステップを含む疾患の治療および／または予防の方法を提供する
【０１８８】
疾患の治療方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。この点において、疾患に関する少なくとも１つの症状を軽減、低減もしくは改善させるため、および／または疾患の進行を減速、低減、阻止するために、細胞は既存の疾患または状態を有する被験体へ投与され得る。
【０１８９】
疾患の予防方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。この点において、上記細胞は疾患に未だ罹患していない、および／または疾患の症状を全く示さない被験体に投与し、疾患の原因を予防もしくは損なうか、または、疾患に関する少なくとも１つの症状について低減もしくは発症を防止することができる。被験体は、疾患の素因を有するか、または疾患を発症するリスクがあると考えられ得る。
【０１９０】
方法は以下のステップを含み得る。
（ｉ）細胞含有試料を単離するステップ；
（ｉｉ）本発明により提供される核酸配列またはベクターで、そのような細胞に形質導入またはトランスフェクトするステップ；
（ｉｉｉ）被験体に（ｉｉ）由来の細胞を投与するステップ
【０１９１】
本発明は、疾患の治療および／または予防に使用するための本発明の細胞、核酸構築物、第一核酸配列および第二核酸配列、ベクター、または第一および第二ベクターを提供する。特に、本発明は、疾患の治療および／または予防に使用するための本発明の細胞を提供する。
【０１９２】
本発明は、疾患の治療および／または予防用の医薬の製造において、本発明の本発明の細胞、核酸構築物、第一核酸配列および第二核酸配列、ベクター、または第一および第二ベクターの使用にも関する。特に、本発明は、疾患の治療および／または予防用の医薬の製造における細胞の使用に関する。
【０１９３】
本発明の方法によって治療および／または予防される疾患は、以下を含む細胞の免疫拒絶であり得る。（ｉ）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）または遺伝子導入ＴＣＲ、および（ｉｉ）本明細書で定義されるような細胞内の組み合わせで発現する際に、治療用小分子を合成できる１つまたはより多い酵素。
【０１９４】
上記方法は、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎癌（腎細胞）、白血病、肺癌、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵癌、前立腺癌および甲状腺癌などの癌疾患治療用であり得る。
【０１９５】
好ましくは、上記方法は、膀胱癌、乳癌、結腸癌、子宮内膜癌、腎癌（腎細胞）、肺癌、黒色腫、神経芽腫、肉腫、神経膠腫、膵癌、前立腺癌および甲状腺癌などの固形腫瘍の治療用であり得る。
【０１９６】
本発明の細胞、特にＣＡＲ細胞は、癌細胞のような標的細胞を死滅させることができるものであり得る。標的細胞は、ＴＡＡの発現、例えば上記表１で提供するＴＡＡの発現によって認識可能であり得る。
【０１９７】
細胞作製方法
本発明のＣＡＲまたは遺伝子導入ＴＣＲ発現細胞は、ウイルスベクターでの形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡのトランスフェクションを含む多くの方法のうちの１つによって、ＣＡＲまたはＴＣＲと、細胞内で組み合わせて発現した際に治療用小分子を合成できる１つまたはより多い酵素とをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって、生成され得る。
【０１９８】
本発明の細胞は以下によって作製され得る
（ｉ）被験体または上記リストの他供給源の１つ由来の細胞含有試料の単離；および
（ｉｉ）インビトロまたはエクスビボでの、上記で定義されるような１つまたはより多い核酸配列もしくは核酸構築物の細胞への形質導入またはトランスフェクション。
次に、上記細胞は精製によって、例えば抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて選択され得る。
【０１９９】
本開示は、本明細書で開示される例示的な方法および材料によって制限されず、そして本明細書記載のものと同様または同等の任意の方法および材料が、本開示の実施形態の実施または試験において使用され得る。数値範囲は、範囲を定義する数を含んでいる。特に断りがない限り、任意の核酸配列は左から右に５´から３´配向で記載され、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ配向でそれぞれ記載される。
【０２００】
値の範囲が提供される際、文脈から明らかにそうでないと示した場合を除いて、その範囲の上限および下限の間の、下限の単位の１０分の１までの各中間値も具体的に開示されていると理解される。所定の範囲内の任意の所定の値または中間値と、その所定の範囲内の任意の他の所定の値または中間値との間のより小さい各範囲は、本開示内に含まれる。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して範囲内に含んでもよいし除外してもよく、上限および下限のいずれか一方が上記のより小さな範囲に含まれる場合、上限および下限のいずれも上記のより小さな範囲に含まれない場合、または上限おおよび下限の両方が上記のより小さい範囲内に含まれる場合の各範囲もまた、本開示内に含まれ、これは所定の範囲内の任意の具体的に除外された上限および下限を前提とする。所定の範囲が上限および下限の一方または両方を含む場合、それらが含む上限および下限のいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本開示に含まれる。
【０２０１】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでない場合を除き、複数の指示対象を包含することに注意しなければならない。
【０２０２】
本明細書で使用される用語、「含んでいる」、「含む」、および「備える」は、「含有している」、「含有する」、または「包含している」、「包含する」と同義であり、包括的またはオープンエンドであり、追加の、記載されていないメンバー、要素、または方法のステップを除外しない。用語「含んでいる」、「含む」、および「含む」は、用語「からなる」も含有する。
【０２０３】
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日より前のそれらの開示のためにのみ提供される。本明細書中のいかなるものも、そのような刊行物が本明細書に添付された特許請求の範囲に対する先行技術を構成することの承認として解釈されるべきではない。
【０２０４】
次に、本発明を実施例によりさらに記載するが、これは当業者が本発明を実施するのを助けることを意図しており、決して本発明の範囲を限定することを意図していない。
【実施例】
【０２０５】
実施例１  哺乳動物細胞中のバイオラセインの生産
バイオラセインは多数のバクテリア種により合成されるトリプトファン誘導体である。それは複雑な生合成経路によって作製され、この生合成経路は認識された抗癌剤であるレベッカマイシンおよびスタウロスポリンも生成する（図２ａ）。
【０２０６】
示される最初の研究は、次のように、バイオラセインに対する２つの腫瘍細胞株（４Ｔ１およびＳｋｏｖ）の感度を測定するために実施された。接着細胞を２４ウェルプレートに２×１０４／ウェルの密度で播種し、２４時間接着させた。次に、細胞を指示された濃度のバイオラセインと共に７２時間インキュベートした。細胞を回収し、生細胞を計数し、ビヒクル処理対照（１００％に設定）に対して正規化した。結果を図１０に示す。
【０２０７】
バイオラセインの合成は、ＶｉｏＡ、Ｂ、Ｃ、ＤおよびＥの５つの遺伝子からなる生合成オペロンを必要とする（図２ｂ）。このオペロンを、ＶｉｏＡおよびＶｉｏＢ遺伝子と、ＶｉｏＣ、ＶｉｏＤおよびＶｉｏＥ遺伝子とをそれぞれ包含している、２つの別々のレトロウイルス発現プラスミドに分割した。バイオラセインの産生には、５つの遺伝子すべての発現が必要である。
【０２０８】
バイオラセイン生合成遺伝子を、レトロウイルス形質導入によってＳｕｐＴ１細胞に導入した。バイオラセインの自然蛍光により、フローサイトメトリー分析を使用して、ＳｕｐＴ１  Ｔ細胞株におけるバイオラセイン生産を測定することが可能であった（図１１）。
【０２０９】
バイオラセインを生産するＳｕｐＴ１  Ｔ細胞とＳＫＯＶ３細胞のインキュベーションにより、バイオラセイン生産がＳＫＯＶ３細胞の増殖を抑制することを実証した（図１２）。バイオラセインに対するＳＫＯＶ３細胞の感度を実証するために、バイオラセイン生合成オペロンを発現し、したがってバイオラセインを合成するＳｕｐＴ１を、次のようにＳＫＯＶ３細胞と共培養した。核局在赤色蛍光タンパク質（ｍＫＡＴＥ）を発現するＳＫＯＶ３細胞を、ウェルあたり１０，０００細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。翌日、指示されたｓｕｐＴ１細胞をＳＫＯＶ３細胞に、総容量２００ｕｌの細胞培養液中、ウェルあたり２０，０００細胞の密度で添加した。細胞をＩｎｃｙｃｕｔｅ生細胞イメージャーで継続的に監視し、生存可能なＳＫＯＶ３細胞の数を、赤色蛍光核の存在を数えることによって１時間ごとに計数した。
【０２１０】
実施例２  ＡＭＬにおけるＣＡＲ  Ｔ細胞機能に対するバイオラセインの効果
正常なヒトＴ細胞に、骨髄性抗原ＣＤ３３を認識するＣＡＲを、バイオラセインをコードする上記のレンチウイルスベクターとともに形質導入する。ＣＤ３３  ＣＡＲでのみ形質導入される対照Ｔ細胞も生成する。同じドナー由来の非形質導入Ｔ細胞、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞およびＣＤ３３  ＣＡＲ／バイオラセインＴ細胞を、ＡＭＬ細胞株ＨＬ６０と、１、２、５および７日間、異なるエフェクターと標的の比率で共培養する。残存ＨＬ６０標的細胞量を、フローサイトメトリーによって決定する。ＨＬ６０細胞を使用したＡＭＬのＮＳＧマウスモデルを、ＣＤ３３  ＣＡＲ細胞およびＣＤ３３  ＣＡＲ／バイオラセイン細胞で処理することにより検査する。
【０２１１】
実施例３  ゲラニオールの生産
ゲラニオールは、インビトロで癌細胞に対して抗増殖／アポトーシス促進効果を提示する、多くの植物種によって合成されるモノテルペノイド化合物である。それは酵素ゲラニオール合成酵素の作用によって、前駆体のゲラニル二リン酸から生産される。さらに、ゲラニル二リン酸は、ゲラニオール合成酵素を欠くヒト細胞のメバロン酸経路の産物である。
【０２１２】
腫瘍細胞株のゲラニオールに対する感度を検査するために、ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞または４Ｔ１乳癌細胞を４８ウェルプレートにウェルあたり２×１０４細胞の密度で播種し、指示されたゲラニオールの濃度で２４時間インキュベートした（図６）。次に細胞を回収し、生存細胞を計数し、ビヒクルウェル内の生細胞数（１００％に設定）に対して正規化した。
【０２１３】
ＳｕｐＴ１  Ｔ細胞株におけるゲラニオールの生産を、別個の酵素、または直接融合したゲラニオール合成酵素いずれかとして、ヒトファルネシル二リン酸合成酵素（ＦＤＰＳ）遺伝子と共発現したＶａｌｅｒｉａ  Ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ（セイヨウカノコソウ）由来のゲラニオール合成酵素（ＧＳ）遺伝子のレトロウイルス形質導入による導入によって開始した。ＦＤＰＳは、宿主細胞の代謝経路由来のゲラニル二リン酸前駆体分子の生産を促進するために導入した（下の表を参照）。すべての構築物を、抗ＣＤ１９抗体ＨＤ３７に基づき、そして４１ＢＢおよびＣＤ３ｚｅｔａエンドドメインを保有する抗ＣＤ１９  ＣＡＲと共発現した。いくつかのケースにおいては、ＦＤＰＳは、ゲラニオールリン酸の生産を増強すると報告されているＫ２６６Ｇ変異を包含していた。
【表３】
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【０２１４】
卵巣ＳＫＯＶ３細胞株のゲラニオールに対する感度を実証するために、上記の表に記載されているＦＤＰＳおよびＧＳ構築物を発現するＳｕｐＴ１を、次のようにＳＫＯＶ３細胞と共培養した。核局在赤色蛍光タンパク質（ｍＫＡＴＥ）を発現するＳＫＯＶ３細胞をウェルあたり５，０００細胞の密度で９６ウェルプレートに播種し、一晩接着させた。翌日、指示された形質導入されたＳｕｐＴ１細胞を、総容量２００ｕｌの細胞培養培地中、ウェルあたり２０，０００細胞の密度でＳＫＯＶ３細胞に添加した。ＳＫＯＶ３細胞のアポトーシスを誘導するエトポシドを、１０ｕｇ／ｍｌの濃度で細胞殺傷／阻害の陽性対照として使用した。細胞をＩｎｃｙｃｕｔｅ生細胞イメージャーで継続的に監視し、生存ＳＫＯＶ３細胞の数を、赤色蛍光核の存在を数えることによって１時間ごとに計数した。
【０２１５】
これらの構築物を発現するＳｕｐＴ１  Ｔ細胞とＣＤ１９陰性ＳＫＯＶ３卵巣癌細胞株とを共培養すると、ゲラニオール生産ＧＳ遺伝子を欠く対照ＣＡＲと比較して、ＳＫＯＶ３細胞の増殖阻害が増加した（図７）。
【０２１６】
実施例４  カフェインの生産
カフェインは、多数の植物種によって合成されるプリン誘導体であり、Ｔ細胞上に発現する免疫調節性アデノシンＡ２ＡＲ受容体の公知の拮抗薬である。Ｃｏｆｆｅａ  ａｒａｂｉｃａ（カフェインアラビカ）由来のカフェイン生合成遺伝子カフェインメチル転移酵素（ＣＡＸＭＴ１）およびＣａｍｅｌｌｉａ  ｓｉｎｅｎｓｉｓ（チャノキ）由来のカフェイン合成酵素（ＣＣＳ１）のＳｕｐＴ１  Ｔ細胞株への導入により、これらのヒト細胞株によるカフェインの生産がもたらされた。前駆体のキサントシンを添加することで、カフェインの生産をさらに高めることができた（図８）。カフェインの生産を、指示された量のキサントシンの存在下で、２ｍｌ培養培地で１×１０６の形質導入細胞を培養することにより監視した。７２時間後、上清を回収し、遠心分離により細胞を取り除き、ＥＬＩＳＡによりカフェインレベルを決定した。
カフェインの生産を、ＣＤ１９  ＣＡＲ（ＨＤ３７）の存在下または非存在下で、ＣＡＸＭＴ１およびＣＣＳ遺伝子でレトロウイルスによって形質導入されたヒト初代ＰＢＭＣにおいても観察した（図９）。５０ｕＭのキサントシンの存在下で５×１０５の形質導入細胞を培養することにより、カフェインの生産を監視した。７２時間後、上清を回収し、遠心分離により細胞を取り除き、ＥＬＩＳＡによりカフェインレベルを決定した。
【０２１７】
上記の明細書で言及されたすべての刊行物は、参照により本明細書中に援用される。本発明の記載された方法ならびにシステムの様々な修正および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者に明らかである。本発明は特定の好ましい実施形態に関連して記載されてきたが、請求される本発明はそのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解するべきである。実際、分子生物学または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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