(57)【要約】高密度の表面ヒドロキシル基を含有する低世代デンドリマー、およびその合成方法が提供される。特に、比較的低世代において高表面官能基（例えば、第３世代において、わずか１〜２ｎｍのサイズで約１２０個のヒドロキシル）を有するオリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）様デンドリマーを記載する。１つまたは複数の予防用、治療用、および／または診断用薬剤を含むデンドリマー製剤、ならびにその使用する方法も記載する。製剤は、眼、脳および神経系（ＣＮＳ）における、１つまたは複数の疾患、状態、および傷害、特にミクログリアおよびアストロサイトの病理学的活性化と関連する疾患等を処置するための局所、経腸、および／または非経口送達に好適である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
複数のヒドロキシル基を含むデンドリマーであって、
少なくとも１ＯＨ基／ｎｍ３（ヒドロキシル基の数／体積ｎｍ３）のヒドロキシル（−ＯＨ）基体積密度を有するデンドリマー。
【請求項２】
少なくとも５ＯＨ基／ｎｍ３のヒドロキシル（−ＯＨ）基体積密度を有する、請求項１に記載のデンドリマー。
【請求項３】
複数のヒドロキシル基を含むデンドリマーであって、
少なくとも１ＯＨ基／ｎｍ２（ヒドロキシル基の数／表面積ｎｍ２）のヒドロキシル（−ＯＨ）基表面密度を有するデンドリマー。
【請求項４】
少なくとも３ＯＨ基／ｎｍ２のヒドロキシル（−ＯＨ）基表面密度を有する、請求項３に記載のデンドリマー。
【請求項５】
約５００ダルトンから約１００，０００ダルトンの間の分子量を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項６】
約５００ダルトンから約５０，０００ダルトンの間の分子量を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項７】
約１，０００ダルトンから約１０，０００ダルトンの間の分子量を有する、請求項１から４のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項８】
約１ｎｍから約１５ｎｍの間の直径を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項９】
約１ｎｍから約５ｎｍの間の直径を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項１０】
約１ｎｍから約２ｎｍの間の直径を有する、請求項１から７のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項１１】
（ａ）中心コア、（ｂ）１つまたは複数の分岐単位、および（ｃ）末端官能基を含むデンドリマーであって、
各（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）が、独立して、エチレンジアミン、アクリル酸メチル、ジペンタエリスリトール、ペンタエリスリトール、２−（アミノメチル）−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、２−エチル−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、３，３’，３’’，３’’’−シランテトライルテトラキス（プロパン−１−チオール）、３，３−ジビニルペンタ−１，４−ジエン、３，３’，３’’−ニトリロトリプロピオン酸、３，３’，３’’−ニトリロトリス（Ｎ−（２−アミノエチル）プロパンアミド）、３，３’，３’’，３’’’−（エタン−１，２−ジイルビス（アザントリイル））テトラプロパンアミド、３−（カルボキシメチル）−３−ヒドロキシペンタン二酸、２，２’−（（２，２−ビス（（２−ヒドロキシエトキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ビス（エタン−１−オール）、テトラキス（３−（トリクロロシリル）プロピル）シラン、１−チオグリセロール、２，２，４，４，６，６−ヘキサクロロ−１，３，５，２ｌ５，４ｌ５，６ｌ５−トリアザトリホスフィニン、３−（ヒドロキシメチル）−５，５−ジメチルヘキサン−２，４−ジオール、４，４’，４’’−（エタン−１，１，１−トリイル）トリフェノール、２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン、５−（ヒドロキシメチル）ベンゼン−１，２，３−トリオール、５−（ヒドロキシメチル）ベンゼン−１，３−ジオール、１，３，５−トリス（ジメチル（ビニル）シリル）ベンゼン、カルボシロキサンコア、ニトリロトリメタノール、エチレンジアミン、プロパン−１，３−ジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、２，２’，２’’−ニトリロトリス（エタン−１−オール）、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン、ガンマシクロデキストリン、ククルビツリル、ベンゼン−１，２，３，４，５，６−ヘキサチオール、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、キトサン、およびこれらの任意の誘導体からなる群から選択される、デンドリマー。
【請求項１２】
第１世代（Ｇ１）、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８、Ｇ９、Ｇ１０デンドリマーである、請求項１１に記載のデンドリマー。
【請求項１３】
前記コアが、アルキン修飾ジペンタエリスリトールから調製される、請求項１１および１２のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項１４】
前記１つまたは複数の分岐単位が、１つまたは複数のハイパーモノマーから調製される、請求項１１から１３のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項１５】
前記１つまたは複数のハイパーモノマーが、１個のアジド官能基および５個のアリル基を含むＡＢ５直交性ハイパーモノマーであり、５個のアリル基を有するジペンタエリスリトールをモノトシル化トリエチレングリコールアジドと反応させて調製される、請求項１４に記載のデンドリマー。
【請求項１６】
少なくとも１ＯＨ基／ｎｍ２の表面ヒドロキシル基密度を有する、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項１７】
ヒドロキシル基が、少なくとも７ＯＨ基／ｎｍ２の表面ヒドロキシル基密度を有する、請求項１１から１５のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項１８】
約５００ダルトンから約１００，０００ダルトンの間の分子量を有する、請求項１１から１７のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項１９】
約５００ダルトンから約５０，０００ダルトンの間の分子量を有する、請求項１１から１７のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項２０】
約１，０００ダルトンから約１０，０００ダルトンの間の分子量を有する、請求項１１から１７のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項２１】
デンドロンの形態である、請求項１から２０のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項２２】
テクトデンドリマーにさらに組織化されている、請求項１から２０のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項２３】
デンドリマー中にカプセル化、会合、および／またはコンジュゲートされている１つまたは複数の予防用、治療用、および／または診断用薬剤を含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項２４】
前記１つまたは複数の予防用、治療用、および／または診断用薬剤が、約０．０１重量％から約３０重量％、好ましくは約１重量％から約２０重量％、より好ましくは約５重量％から約２０重量％の濃度で、デンドリマー中にカプセル化、会合、および／またはコンジュゲートされている、請求項２３に記載のデンドリマー。
【請求項２５】
前記１つまたは複数の予防用、治療用、および／または診断用薬剤が、必要に応じて１つまたは複数のスペーサーを介して、前記デンドリマーに共有結合によりコンジュゲートされている、請求項２３または２４に記載のデンドリマー。
【請求項２６】
前記１つまたは複数の予防的、治療的、および／または診断的薬剤が、ジスルフィド、エステル、エーテル、チオエステル、カルバメート、カルボネート、ヒドラジン、およびアミドからなる群から選択される１つまたは複数の連結を介して、デンドリマーに共有結合によりコンジュゲートされている、請求項２３から２５のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項２７】
前記スペーサーが、予防的、治療的、および／または診断的薬剤である、請求項２５に記載のデンドリマー。
【請求項２８】
前記スペーサーがＮ−アセチルシステインである、請求項２７に記載のデンドリマー。
【請求項２９】
前記１つまたは複数の治療剤が、抗炎症薬、化学療法薬、血管拡張薬、および抗感染症剤である、請求項２３から２８のいずれか一項に記載のデンドリマー。
【請求項３０】
眼、脳および／または神経系（ＣＮＳ）の１つまたは複数の疾患、状態、および／または傷害を処置、予防、および／またはイメージングするための方法であって、請求項１から２９のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【請求項３１】
眼、脳および／または神経系の１つまたは複数の疾患、状態、および／または傷害が、活性化ミクログリアおよびアストロサイトと関連する疾患、状態、および傷害である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
デンドリマー組成物が、１つまたは複数の活性化ミクログリアおよびアストロサイトを標的とするのに有効な量である、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記デンドリマー組成物が、眼、脳および／または神経系の１つまたは複数の疾患、状態、および／または傷害の１つまたは複数の症状を緩和するのに有効な量である、請求項３０から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記デンドリマー組成物が、静脈内投与される、請求項３０から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
高密度表面ヒドロキシル基を有するデンドリマーを作製する方法であって、
（ａ）第１のモノマーをプロパルギル化することによって１つまたは複数のハイパーコアを調製することであって、前記第１のモノマーが、プロパルギル化のための２つまたはそれを超える反応性基を含むこと、
（ｂ）ｎ個の反応性基にアリル基をコンジュゲートし、第２のモノマーの反応性基のうちの１つに１個のアジド基をコンジュゲートすることによって、（ｎ＋１）個の反応性基を有する前記第２のモノマーから１つまたは複数のハイパーモノマーＡＢｎを調製すること（ｎは、２であるかまたはそれを超える）、
（ｃ）第１世代デンドリマーを得るために、銅（Ｉ）触媒アルキンアジドクリックケミストリーのためにハイパーコアおよびハイパーモノマーを混合すること、
（ｄ）第２世代デンドリマーを得るために、チオール−エンクリックケミストリーのために第１世代デンドリマーを第３のモノマーと混合することであって、前記第３のモノマーが、少なくともチオール基および少なくとも１つのヒドロキシル基を含むこと
を含む方法。
【請求項３６】
前記第１、第２、および第３のモノマーが、独立して、ジペンタエリスリトール、ペンタエリスリトール、２−（アミノメチル）−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、２−エチル−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、３，３’，３’’，３’’’−シランテトライルテトラキス（プロパン−１−チオール）、３，３−ジビニルペンタ−１，４−ジエン、３，３’，３’’ニトリロトリプロピオン酸、３，３’，３’’−ニトリロトリス（Ｎ−（２−アミノエチル）プロパンアミド）、３，３’，３’’，３’’’−（エタン−１，２−ジイルビス（アザントリイル））テトラプロパンアミド、３−（カルボキシメチル）−３−ヒドロキシペンタン二酸、２，２’−（（２，２−ビス（（２−ヒドロキシエトキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ビス（エタン−１−オール）、テトラキス（３−（トリクロロシリル）プロピル）シラン、１−チオグリセロール、２，２，４，４，６，６−ヘキサクロロ−１，３，５，２ｌ５，４ｌ５，６ｌ５−トリアザトリホスフィニン、３−（ヒドロキシメチル）−５，５−ジメチルヘキサン−２，４−ジオール、４，４’，４’’−（エタン−１，１，１−トリイル）トリフェノール、２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン、５−（ヒドロキシメチル）ベンゼン−１，２，３−トリオール、５−（ヒドロキシメチル）ベンゼン−１，３−ジオール、１，３，５−トリス（ジメチル（ビニル）シリル）ベンゼン、カルボシロキサンコア、ニトリロトリメタノール、エチレンジアミン、プロパン−１，３−ジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、２，２’，２’’−ニトリロトリス（エタン−１−オール）、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン、ガンマシクロデキストリン、ククルビツリル、ベンゼン−１，２，３，４，５，６−ヘキサチオール、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、キトサン、およびこれらの任意の誘導体からなる群から選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記１つまたは複数ののハイパーモノマーＡＢｎが、ＡＢ２、ＡＢ３、ＡＢ４、ＡＢ５、ＡＢ６、ＡＢ７、およびＡＢ８である、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記１つまたは複数のハイパーモノマーがＡＢ５である、請求項３３から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１のモノマーおよび前記第２のモノマーが、ジペンタエリスリトールであり、前記第３のモノマーが１−チオグリセロールである、請求項３５から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記デンドリマーが、１つまたは複数の治療的、予防的、および／または診断的薬剤に、さらに複合体化および／またはコンジュゲートされる、請求項３５から３９のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年１１月１０日に出願された米国出願第６２／５８４，６２３号に基づく利点および優先権を主張し、この米国出願は、その全体が参照により援用される。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究に関する説明
本発明は、国立衛生研究所によって付与されたＧｒａｎｔ  ＮＩＢＩＢ−１Ｒ０１ＥＢ０１８３０６−０１、ＮＩＣＨＤ−１Ｒ０１ＨＤ０７６９０１−０１Ａ１、および５Ｒ０１ＥＹ０２５３０４−０４に基づく政府支援のもとでなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表に対する言及
２０１８年１１月１２日に作成され、３，７９２バイトのサイズを有する「ＪＨＵ＿Ｃ＿１４７９８＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」の名称のテキストファイルとして提出された配列表は、３７Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．５２（ｅ）（５）に従い、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【０００４】
発明の分野
本発明は、全般的に、分子送達システムの分野に関し、より詳細には、予防用、治療用、および／または診断用薬剤を対象の中枢神経系に送達し、疾患および／または状態を予防、処置、および／または診断するためのデンドリマーに関する。
【背景技術】
【０００５】
中枢神経系（ＣＮＳ）障害は、世界中でおよそ１０億人の人々に影響を与えており、将来、ヒト母集団に対してより深刻な脅威になると予想される。ＣＮＳ疾患は、非常に複雑なヒト脳の変化または劣化と関連することが多く、科学者および臨床医に困難な課題を提起する。主な死亡原因の中でも、現在の臨床的ケアと患者ニーズとの間で最も急速に拡大する乖離のいくつかはＣＮＳ障害でのものである。これは主に寿命が延びたためであり、神経疾患を患う患者数の増加につながり、世界中の社会経済的および医療的負担の増加をもたらす（W.  M.  Pardridge,  Drug  Discovery  Today,  12,  54  (2007)）。商業的な予測によって、神経治療薬の発見、開発、および臨床移行に向けた医薬品関連団体からの活動的な取組みが期待されるべきであるが、これとは対照的に、後期臨床試験における失敗のリスクが高いために、多くがＣＮＳプロジェクトに関する出資を停止しているかまたは削減している（G.  Wegener,  et  al.,  International  Journal  of  Neuropsychopharmacology,  16,  1687  (2013)）。ＣＮＳ疾患、例えば自己免疫疾患、脳腫瘍、および眼球障害のための治療法の開発における重要な臨床課題は、ＣＮＳ輸送関門に起因してアクセスすることが困難である傷害部位へ、治療法を臨床的に適切に曝露することを達成することである。ほぼ不透過性であるＣＮＳ関門を介した神経薬の不十分な輸送は、原発性脳腫瘍から神経までのＣＮＳ障害、および網膜疾患のための効果的な処置の開発を制限する。神経薬物の開発に対する主な妨げである血液脳関門（ＢＢＢ）は、化学物質の取り込みを調節し、毒素および血液由来病原体の侵入を制限することによって脳組織ホメオスタシスを維持する、動的および高選択的な物理的関門である（W.  A.  Banks,  Nature  Reviews  Drug  Discovery,  15,  275  (2016)）。ＣＮＳの他の部分への薬物送達は、同様の課題、例えば眼疾患を処置するための血液−網膜関門（ＢＲＢ）、および病状−依存性関門、例えば従来の固形腫瘍関門に直面している。
【０００６】
脳の構成、役割および機能を理解する神経科学の分野では驚くべき進歩があったが、神経障害の領域における治療開発は、他の疾患領域、例えば感染性疾患、がんおよび心血管障害の処置に未だ遅れを取っている。脳関連障害の大部分は、米国食品医薬品局（「ＦＤＡ」）によって指定されるオーファンまたはまれな障害に分類される。ＣＮＳ薬物の発見および臨床開発は、任意の他の疾患領域と比較して、前臨床と臨床の両方で、標的化、安全性、有効性、コスト、および失敗のリスクに関して製薬会社に大きな課題を提起する。結果的に、過去１０年で、さまざまな大手製薬会社によるＣＮＳ薬物の発見および開発プロジェクトが中断されている（Wegener,  G.et  al.,  International  Journal  of  Neuropsychopharmacology,  16,  1687  (2013)）。さらに、血液脳関門（「ＢＢＢ」）を介した薬物の不十分な輸送によって、ＣＮＳ関連障害に向けた有効な処置の開発が制限される（Upadhyay,  R.  K.  BioMed  Research  International,  869269  (2014)）。神経障害を処置するために、ＢＢＢを通過し、治療法を十分に送達するための、疾患病状に基づいた革新的なアプローチの開発が大いに必要とされている。
【０００７】
神経障害のための処置の大部分は、高用量での投与を必要とし、全身性の副作用および毒性が生じる。ＣＮＳ関門を回避するための従来の方法は、高侵襲性であり、その結果さらなる付随的な損傷が生じ、合併症のリスクが高いために、反復処置スキームにおいて可能な投薬回数が制限される。局所的に投与される治療法も、脳実質にわたって不十分な拡散を示すことが多く、脳分布が制限されるようになり、毒性を引き起こす高用量が必要になる。化学的または機械的方法を使用してＢＢＢを一時的に破壊することに焦点を当てた最近の戦略は、空間的に非特異的であることが多く、不所望の潜在的な害がある分子ももたらし、有害な免疫応答を誘発する場合もある（X.  Dong,  Theranostics,  8,  1481  (2018)）。神経障害のための現存する治療法における臨床的に顕著なギャップは、ＣＮＳ関門を通過する治療法の送達を強化し、傷害部位における鍵となる疾患細胞を標的とすることができる、革新的、低侵襲的、特殊な薬物送達ビヒクルを開発する喫緊の必要性につながる。
【０００８】
活性化ミクログリア／マクロファージ（ｍｉ／ｍａ）が介在する神経炎症は、多くの神経障害の主要な特質である（M.  T.  Heneka,  et  al.,  Nature  Reviews  2014,  14,  463  (2014)、R.  M.  Ransohoff,  Science,  353,  777  (2016)）。炎症促進性ｍｉ／ｍａが活性化すると、ＢＢＢ／ＢＲＢを破壊し、ニューロンおよびグリアへのアポトーシスシグナルの放出を介して二次的損傷につながる場合がある。抗炎症性の活性化は、血管新生および細胞成長を促進し、同時に免疫応答を抑制する。したがって、免疫モジュレート剤を用いて炎症促進性と抗炎症性の両方のｍｉ／ｍａ表現型を標的とすることは、疾患病状に対して特異的で強力な治療戦略である。全身投与した場合にＣＮＳ関門を効果的に通過し、脳組織にわたって自由に拡散し、ＣＮＳ傷害部位の鍵となる病理学的細胞に局在することができるナノ担体は、非常にまれである（S.  Kannan,  et  al.,  Science  translational  medicine,  4,  130ra46E  (2012)、J.  Kwon,  et  al.,  ACS  Nano  2016,  10,  7926、Y.  Anraku,  et  al.,  Nature  Communications,  8,  1001  (2017)）。好ましい脳輸送特性に加えて、ＣＮＳ障害のためのナノ医薬ベースの治療法の開発における鍵となる目標は、診療所へと好都合に臨床移行することができるナノ構築物を設計することである。臨床的設定において使用される潜在的なナノ粒子に関する主要な基準は、その安全性プロファイルであり；他の所望の特徴には、水溶性、合成再現性、および商業化の成功に向けた大規模生産の実行可能性が含まれる（S.  Mignani,  et  al.,  Advanced  Drug  Delivery  Reviews  (2017)）。
【０００９】
その特有の構造的かつ物理的特徴に基づいて、デンドリマーは、標的を絞った薬物／遺伝子送達、イメージングおよび診断を含むさまざまな生物医学的用途のためのナノ担体としての、前例のない潜在力を示している（Sharma,  A.,  et  al.,  RSC  Advances,  4,  19242  (2014)、Caminade,  A.-M.,  et  al.,  Journal  of  Materials  Chemistry  B,  2,  4055  (2014)、Esfand,  R.,  et  al.,  Drug  Discovery  Today,  6,  427  (2001)、およびKannan,  R.  M.,  et  al.,  Journal  of  Internal  Medicine,  276,  579  (2014)）。
【００１０】
しかし、デンドリマーを構築するための簡易で迅速な戦略の開発に関して発表されている科学報告が多数であるにもかかわらず、依然として重要な課題が存在する。したがって、ＣＮＳを標的とするために標的を絞った送達システムのためのナノ材料の改善が依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】W.  M.  Pardridge,  Drug  Discovery  Today,  12,  54  (2007)
【非特許文献２】G.  Wegener,  et  al.,  International  Journal  of  Neuropsychopharmacology,  16,  1687  (2013)
【非特許文献３】W.  A.  Banks,  Nature  Reviews  Drug  Discovery,  15,  275  (2016)
【非特許文献４】Wegener,  G.et  al.,  International  Journal  of  Neuropsychopharmacology,  16,  1687  (2013)
【非特許文献５】Upadhyay,  R.  K.  BioMed  Research  International,  869269  (2014)
【非特許文献６】X.  Dong,  Theranostics,  8,  1481  (2018)
【非特許文献７】M.  T.  Heneka,  et  al.,  Nature  Reviews  2014,  14,  463  (2014)
【非特許文献８】R.  M.  Ransohoff,  Science,  353,  777  (2016)
【非特許文献９】S.  Kannan,  et  al.,  Science  translational  medicine,  4,  130ra46E  (2012)
【非特許文献１０】J.  Kwon,  et  al.,  ACS  Nano  2016,  10,  7926
【非特許文献１１】Y.  Anraku,  et  al.,  Nature  Communications,  8,  1001  (2017)
【非特許文献１２】S.  Mignani,  et  al.,  Advanced  Drug  Delivery  Reviews  (2017)
【非特許文献１３】Sharma,  A.,  et  al.,  RSC  Advances,  4,  19242  (2014)
【非特許文献１４】Caminade,  A.-M.,  et  al.,  Journal  of  Materials  Chemistry  B,  2,  4055  (2014)
【非特許文献１５】Esfand,  R.,  et  al.,  Drug  Discovery  Today,  6,  427  (2001)
【非特許文献１６】Kannan,  R.  M.,  et  al.,  Journal  of  Internal  Medicine,  276,  579  (2014)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
したがって、本発明の目的は、ＣＮＳへの分子送達を改善するためのデンドリマー組成物およびそれを使用する方法を提供することである。
【００１３】
本発明の目的はまた、脳および中枢神経系の疾患、障害、および傷害、特に活性化ミクログリアおよび／またはアストロサイトと関連するものを処置する手段を提供することである。
【００１４】
本発明のさらなる目的は、局所または全身毒性がほぼまたは全くない、中枢神経系に標的を絞った薬物送達のための、生体適合性である安価なナノ材料を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
発明の要旨
少なくとも１ＯＨ基／ｎｍ３（ヒドロキシル基の数／体積ｎｍ３）の、好ましくは少なくとも５ＯＨ基／ｎｍ３の高密度ヒドロキシル基を有するデンドリマーを記載する。一般的に、これらのデンドリマーは、約５００ダルトンから約１００，０００ダルトンの間、好ましくは約５００ダルトンから約５０，０００ダルトンの間、最も好ましくは約１，０００ダルトンから約１０，０００ダルトンの間の分子量を有する。典型的には、デンドリマーは、約１ｎｍから約１５ｎｍの間、好ましくは約１ｎｍから約５ｎｍの間、最も好ましくは約１ｎｍから約２ｎｍの間の平均直径を有する。
【００１６】
（ａ）中心コア、（ｂ）１つまたは複数の分岐単位、および（ｃ）末端官能基を含むデンドリマーを記載する。（ａ）、（ｂ）、および（ｃ）に関する例示的な化学的部分は、独立して、ジペンタエリスリトール、ペンタエリスリトール、２−（アミノメチル）−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、２−エチル−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、３，３’，３’’，３’’’−シランテトライルテトラキス（プロパン−１−チオール）、３，３−ジビニルペンタ−１，４−ジエン、３，３’，３’’−ニトリロトリプロピオン酸、３，３’，３’’−ニトリロトリス（Ｎ−（２−アミノエチル）プロパンアミド）、３，３’，３’’，３’’’−（エタン−１，２−ジイルビス（アザントリイル））テトラプロパンアミド、３−（カルボキシメチル）−３−ヒドロキシペンタン二酸、２，２’−（（２，２−ビス（（２−ヒドロキシエトキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ビス（エタン−１−オール）、テトラキス（３−（トリクロロシリル）プロピル）シラン、１−チオグリセロール、２，２，４，４，６，６−ヘキサクロロ−１，３，５，２ｌ５，４ｌ５，６ｌ５−トリアザトリホスフィニン、３−（ヒドロキシメチル）−５，５−ジメチルヘキサン−２，４−ジオール、４，４’，４’’−（エタン−１，１，１−トリイル）トリフェノール、２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン、５−（ヒドロキシメチル）ベンゼン−１，２，３−トリオール、５−（ヒドロキシメチル）ベンゼン−１，３−ジオール、１，３，５−トリス（ジメチル（ビニル）シリル）ベンゼン、カルボシロキサンコア、ニトリロトリメタノール、エチレンジアミン、プロパン−１，３−ジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、２，２’，２’’−ニトリロトリス（エタン−１−オール）、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン、ガンマシクロデキストリン、ベンゼン−１，２，３，４，５，６−ヘキサチオール、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、キトサン、およびこれらの誘導体から選択される。一部の実施形態では、デンドリマーは、第１世代（Ｇ１）、Ｇ２、Ｇ３、Ｇ４、Ｇ５、Ｇ６、Ｇ７、Ｇ８、Ｇ９、またはＧ１０デンドリマーである。デンドリマーは、約１から１５ヒドロキシル（−ＯＨ）基／ｎｍ２の間、約３から１５ＯＨ基／ｎｍ２の間、約４から１５ＯＨ基／ｎｍ２の間、約４から１０ＯＨ基／ｎｍ２の間、少なくとも１ＯＨ基／ｎｍ２、少なくとも２ＯＨ基／ｎｍ２、少なくとも３ＯＨ基／ｎｍ２、少なくとも４ＯＨ基／ｎｍ２、少なくとも５ＯＨ基／ｎｍ２の密度の表面ヒドロキシル基、および約５００ダルトンから約１００，０００ダルトンの間、約５００ダルトンから約５０，０００ダルトンの間、約１，０００ダルトンから約２０，０００ダルトンの間、約１０００ダルトンから約１０，０００ダルトンの間の分子量を有する。
【００１７】
表面ヒドロキシル基を算出する方法は当技術分野において公知である。デンドリマー表面積を最初に算出する。ＰＡＭＡＭデンドリマーの場合、表面積を球形と仮定して算出してもよい。Ｇ４ヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーの分子量は約１４，２１５ダルトンであり、測定された直径は４５Å（すなわち、４．５ｎｍ）であり、６４個の表面ヒドロキシル基を有する。Ｇ４ＰＡＭＡＭデンドリマーの推定表面積は、球形と仮定して式Ａ＝４πｒ２で算出し、したがって約６３．６２ｎｍ２である。したがって、Ｇ４ＰＡＭＡＭデンドリマーのヒドロキシル基表面密度は、約１．０１ＯＨ基／ｎｍ２である。同様に、分子量が約２８，８２６ダルトンであり、測定された直径が５４Å（すなわち、５．４ｎｍ）であり、１２８個の表面ヒドロキシル基を有するＧ５ヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーのヒドロキシル基表面密度は、約１．４ＯＨ基／ｎｍ２（９１．６１ｎｍ２の推定表面積に基づいて）である。分子量が約５８，０４８ダルトンであり、測定された直径が６７Å（すなわち、６．７ｎｍ）であり、２５６個の表面ヒドロキシル基を有するＧ６ヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーのヒドロキシル基表面密度は、約１．８２ＯＨ基／ｎｍ２（１４１．０３ｎｍ２の推定表面積に基づいて）である。
【００１８】
デンドリマー中にカプセル化、会合、および／またはコンジュゲートされている１つまたは複数の予防用、治療用、および／または診断用薬剤を含むデンドリマー複合体の組成物も提供される。一般的に、１つまたは複数の予防的、治療的、および／または診断的薬剤は、約０．０１重量％から約３０重量％、好ましくは約１重量％から約２０重量％、より好ましくは約５重量％から約２０重量％の濃度で、デンドリマー複合体中でカプセル化、会合、および／またはコンジュゲートされている。好ましくは、予防的、治療的、および／または診断的薬剤は、ジスルフィド、エステル、エーテル、チオエステル、カルバメート、カルボネート、ヒドラジン、およびアミドからなる群から選択される１つまたは複数の連結を介して、必要に応じて１つまたは複数のスペーサーを介して、デンドリマーに共有結合によりコンジュゲートされている。一部の実施形態では、スペーサーは、予防的、治療的、および／または診断的薬剤、例えばＮ−アセチルシステインである。例示的な活性剤としては、抗炎症薬、化学療法薬、抗けいれん剤、血管拡張薬、および抗感染症剤が挙げられる。
【００１９】
それを必要とする対象に投与することによって、眼、脳および／または中枢神経系（ＣＮＳ）の１つまたは複数の疾患、状態、および／または傷害の１つまたは複数の症状を処置、予防、および／またはイメージングするための高密度表面ヒドロキシル基を有するデンドリマーを使用する方法も記載する。一般的に、これらの状態は、ミクログリアおよびアストロサイトの病理学的活性化と関連する。組成物は、活性化ミクログリアおよびアストロサイトを標的とし、活性化ミクログリアおよびアストロサイトと関連する眼、脳および／または神経系の１つまたは複数の疾患、状態、および／または傷害の１つまたは複数の症状を緩和または予防またはイメージングするのに効果的である。典型的には、デンドリマー複合体は、静脈内に投与する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１Ａ〜１Ｅは、（図１Ａ）低世代の高密度のＰＥＧ系デンドリマー（Ｄ２−ＯＨ−６０）、（図１Ｂ）市販されているビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ−６４−ハイパー分岐（hyperbranched）ポリエステル、（図１Ｃ）第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、（図１Ｄ）８アーム星型ＰＥＧ（８−ＯＨ基）、（図１Ｅ）直鎖状ＰＥＧ（２−ＯＨ基）、および（図１Ｆ）複数のＯＨ基を有する分岐ポリサッカライドデキストランの構造的な説明である。
【００２１】
【図２】図２は、組織１グラム当たりの静脈内注射された用量のパーセントによって測定された、４時間および２４時間の時点での、脳の３カ所のサブ領域（皮質、脳室周囲領域、および海馬）における生後１日目のＣＰ仔ウサギでのＤ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５、ビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５、およびＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５の比較定量分布を示す棒グラフである。
【００２２】
【図３】図３は、組織１グラム当たりの静脈内注射された用量のパーセントによって測定された、２４時間の時点での、脳の３カ所のサブ領域（皮質、脳室周囲領域、および海馬）における生後１日目のＣＰ仔ウサギ対健常仔ウサギでのＤ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５、ビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５、およびＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５の比較定量分布を示す棒グラフである。
【００２３】
【図４】図４は、組織１グラム当たりの静脈内注射された用量のパーセントによって測定された、４時間および２４時間の時点での、脳の３カ所のサブ領域（皮質、脳室周囲領域、および海馬）における生後１日目のＣＰ仔ウサギの主要臓器（心臓、肺、腎臓、および肝臓）および血漿におけるＤ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５、ビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５、およびＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５の比較定量分布を示す棒グラフである。
【００２４】
【図５】図５は、漸増濃度のＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞におけるＭＴＴ細胞生存率アッセイの結果を示す棒グラフである。ｎ＝３。
【００２５】
【図６−１】図６Ａ〜６Ｊは、ＰＥＧＯＬ−６０単独（すなわち、薬物なし）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗炎症および抗酸化特性を示すことを示す棒グラフである：ＢＶ２マウスミクログリアを、１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで３時間刺激し、続いてデンドリマーで２４時間同時処置した：図６Ａ〜６Ｄは、対照、ＬＰＳ、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞におけるＴＮＦα（図６Ａ）、ＩＮＯＳ（図６Ｂ）、ＩＬ１０（図６Ｃ）、およびＩＬ６（図６Ｄ）のｍＲＮＡレベルの倍率変化を示す；図６Ｅ〜６Ｇは、対照、ＬＰＳ、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞におけるＣＤ２０６（図６Ｅ）、Ａｒｇ１（図６Ｆ）、およびＩＬ４（図６Ｇ）のｍＲＮＡレベルの倍率変化を示す；図６Ｈ〜６Ｉは、対照、ＬＰＳ、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞における分泌されたＴＮＦαの量（図６Ｈ）、および反応性種ナイトライト（nitrite）の産生（図６Ｉ）を示す；図６Ｊは、対照、Ｈ２Ｏ２、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞の細胞生存率を示す。
【図６−２】図６Ａ〜６Ｊは、ＰＥＧＯＬ−６０単独（すなわち、薬物なし）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗炎症および抗酸化特性を示すことを示す棒グラフである：ＢＶ２マウスミクログリアを、１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで３時間刺激し、続いてデンドリマーで２４時間同時処置した：図６Ａ〜６Ｄは、対照、ＬＰＳ、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞におけるＴＮＦα（図６Ａ）、ＩＮＯＳ（図６Ｂ）、ＩＬ１０（図６Ｃ）、およびＩＬ６（図６Ｄ）のｍＲＮＡレベルの倍率変化を示す；図６Ｅ〜６Ｇは、対照、ＬＰＳ、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞におけるＣＤ２０６（図６Ｅ）、Ａｒｇ１（図６Ｆ）、およびＩＬ４（図６Ｇ）のｍＲＮＡレベルの倍率変化を示す；図６Ｈ〜６Ｉは、対照、ＬＰＳ、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞における分泌されたＴＮＦαの量（図６Ｈ）、および反応性種ナイトライト（nitrite）の産生（図６Ｉ）を示す；図６Ｊは、対照、Ｈ２Ｏ２、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞の細胞生存率を示す。
【図６−３】図６Ａ〜６Ｊは、ＰＥＧＯＬ−６０単独（すなわち、薬物なし）が、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで抗炎症および抗酸化特性を示すことを示す棒グラフである：ＢＶ２マウスミクログリアを、１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳで３時間刺激し、続いてデンドリマーで２４時間同時処置した：図６Ａ〜６Ｄは、対照、ＬＰＳ、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞におけるＴＮＦα（図６Ａ）、ＩＮＯＳ（図６Ｂ）、ＩＬ１０（図６Ｃ）、およびＩＬ６（図６Ｄ）のｍＲＮＡレベルの倍率変化を示す；図６Ｅ〜６Ｇは、対照、ＬＰＳ、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞におけるＣＤ２０６（図６Ｅ）、Ａｒｇ１（図６Ｆ）、およびＩＬ４（図６Ｇ）のｍＲＮＡレベルの倍率変化を示す；図６Ｈ〜６Ｉは、対照、ＬＰＳ、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞における分泌されたＴＮＦαの量（図６Ｈ）、および反応性種ナイトライト（nitrite）の産生（図６Ｉ）を示す；図６Ｊは、対照、Ｈ２Ｏ２、または１０、５０、１００、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０で２４時間処置されたＢＶ−２細胞の細胞生存率を示す。
【００２６】
【図７−１】図７Ａ〜７Ｆは、ＣＰ仔ウサギの同腹子を、ＰＮＤ１に、ＰＢＳ、ＰＥＧＯＬ−６０単回投薬、およびＰＥＧＯＬ−６０再投薬群に無作為に分割し、ＰＢＳ（ＰＮＤ１）、ＰＥＧＯＬ−６０（ＰＮＤ１）またはＰＥＧＯＬ−６０（ＰＮＤ１およびＰＮＤ３）をそれぞれ与えたＣＰモデルにおけるＰＥＧＯＬ−６０のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す棒グラフである。吸うおよび飲み込む（図７Ａ）、頭の動き（図７Ｂ）ならびに体重増加（図７Ｃ）を含む神経行動学的試験を、処置してから２４、４８および９６時間後における群間で、処置前（ベースライン、０時間）ならびに処置してから２４、４８および９６時間後（ｎ＝６）において行った。ＴＮＦ−α（図７Ｄ）、ＩＬ−１β（図７Ｅ）およびＩＬ−６（図７Ｆ）を含む炎症促進性サイトカインを、ＰＮＤ５（ｎ＝３）において群間で測定した。
【図７−２】図７Ａ〜７Ｆは、ＣＰ仔ウサギの同腹子を、ＰＮＤ１に、ＰＢＳ、ＰＥＧＯＬ−６０単回投薬、およびＰＥＧＯＬ−６０再投薬群に無作為に分割し、ＰＢＳ（ＰＮＤ１）、ＰＥＧＯＬ−６０（ＰＮＤ１）またはＰＥＧＯＬ−６０（ＰＮＤ１およびＰＮＤ３）をそれぞれ与えたＣＰモデルにおけるＰＥＧＯＬ−６０のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性を示す棒グラフである。吸うおよび飲み込む（図７Ａ）、頭の動き（図７Ｂ）ならびに体重増加（図７Ｃ）を含む神経行動学的試験を、処置してから２４、４８および９６時間後における群間で、処置前（ベースライン、０時間）ならびに処置してから２４、４８および９６時間後（ｎ＝６）において行った。ＴＮＦ−α（図７Ｄ）、ＩＬ−１β（図７Ｅ）およびＩＬ−６（図７Ｆ）を含む炎症促進性サイトカインを、ＰＮＤ５（ｎ＝３）において群間で測定した。
【００２７】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｂは棒グラフであり、図８Ａは、同年齢の健常対照（ｎ＝４）と比較した、注射後の異なる時点（１、４、および２４時間；ｎ＝６）での、脳の３カ所のサブ領域（皮質、ＰＶＲ、および海馬）において脳性麻痺を伴う新生仔ウサギにおけるＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の定量的な生体内分布を示す；図８Ｂは、注射後の異なる時点（１、４、および２４時間、ｎ＝６）での新生脳性麻痺仔ウサギの主要臓器および血液血漿におけるＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の定量的な生体内分布を示す。
【図８−２】図８Ａ〜８Ｂは棒グラフであり、図８Ａは、同年齢の健常対照（ｎ＝４）と比較した、注射後の異なる時点（１、４、および２４時間；ｎ＝６）での、脳の３カ所のサブ領域（皮質、ＰＶＲ、および海馬）において脳性麻痺を伴う新生仔ウサギにおけるＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の定量的な生体内分布を示す；図８Ｂは、注射後の異なる時点（１、４、および２４時間、ｎ＝６）での新生脳性麻痺仔ウサギの主要臓器および血液血漿におけるＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の定量的な生体内分布を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
発明の詳細な説明
Ｉ．定義
「薬学的に許容される」という用語は、食品医薬品局などの政府機関のガイドラインに従って、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症がなく、妥当な利点／リスク比率と釣り合いがとれた、ヒトおよび動物の組織との接触での使用に好適な健全な医学的判断の範囲内での化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指す。「担体」または「賦形剤」という用語は、１つまたは複数の活性成分を組み合わせた製剤中の有機または無機、天然または合成不活性成分を指す。一部の実施形態では、担体または賦形剤は、医薬組成物に添加され、化合物の投与を促進する非活性物質であり、および／または生物に顕著な刺激をもたらすことがなく、投与された化合物の生物活性および特性を無効にしない。
【００２９】
「生体適合性」および「生物学的に適合する」という用語は、レシピエントに対して一般的に非毒性であり、レシピエントに対して任意の顕著な有害効果をもたらすことがない、材料、およびその任意の代謝産物または分解産物を一般的に指す。一般的に言うと、生体適合性材料は、患者に投与した場合に顕著な炎症性または免疫応答を誘発しない材料である。
【００３０】
「有効量」または「治療有効量」という用語は、非毒性であるが、所望のまたは言及される結果を与えるのに十分な化合物の量を指す。例えば、有効量は、処置される障害、疾患、または状態の１つまたは複数の症状を減少または阻害するのに、そうでなければ所望の薬理学的および／または生理学的効果を与えるのに十分な投薬量を指していてもよい。正確な投薬量は、さまざまな因子、例えば対象の従属変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、処置される疾患または障害の重症度、ならびに投与される薬剤の投与経路および薬物動態によって変更されることになる。必要とされる正確な量は、種、年齢、および対象の一般的な状態、処置される疾患の重症度、使用される特定の化合物、およびその投与様式にもよるが、対象によって変更されることになる。適切な有効量は、当業者によって判定することができる。
【００３１】
「分子量」という用語は、特に規定がない限り、バルクポリマーの相対的平均鎖長を一般的に指す。実際には、分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）またはキャピラリー粘度測定法を含むさまざまな方法を使用して推定するかまたは特徴づけることができる。ＧＰＣ分子量は、数平均分子量（Ｍｎ）ではなく重量平均分子量（Ｍｗ）として報告される。キャピラリー粘度測定法では、濃度、温度、および溶媒条件の特定のセットを使用し、希釈ポリマー溶液から判定される固有の粘度として分子量の推定値が得られる。
【００３２】
「誘導体」という用語は、これらに限定されないが、本開示の化合物の加水分解、還元、または酸化産物を含む修飾物質を指す。加水分解、還元、および酸化反応は当技術分野において公知である。
【００３３】
「親水性」という用語は、水に対して親和性を有する特性を指す。例えば、親水性ポリマー（または親水性ポリマーセグメント）は、水溶液中で主に溶解性である、および／または水を吸収する傾向があるポリマー（またはポリマーセグメント）である。一般的に、ポリマーの親水性が高いほど、そのポリマーは水に溶解するか、水と混合されるか、または水で濡れる傾向がある。
【００３４】
「疎水性」という用語は、水に対する親和性がないかまたは水をはじく特性を指す。例えば、ポリマー（またはポリマーセグメント）の疎水性が高いほど、そのポリマー（またはポリマーセグメント）は水に溶解しないか、水と混合されないか、または水で濡れない傾向がある。
【００３５】
「治療剤」という用語は、疾患または障害を予防または処置するために投与することができる薬剤を指す。治療剤は、核酸、核酸アナログ、小分子、ペプチド模倣薬、タンパク質、ペプチド、炭水化物もしくは糖、脂質、または界面活性剤、あるいはこれらの組合せであってもよい。
【００３６】
疾患、障害および／または状態に罹りやすいことがあるが、それを有するとはまだ診断されていない動物において生じる疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状を「処置すること」または「予防すること」という用語は、疾患、障害または状態を阻害すること、例えば、その進行を妨げること、ならびに疾患、障害、または状態を軽減すること、例えば、疾患、障害および／または状態の退行をもたらすことを指す。疾患または状態を処置することには、例え基本的な病態生理に影響がなかったとしても、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を回復させること、例えば鎮痛剤を投与することによってそのような薬剤が疼痛の原因を処置しなかったとしても、対象の疼痛を処置することが含まれる。
【００３７】
「標的化部分」という用語は、具体的な場所に局在するかまたはそこから離れて局在する部分を指す。その部分は、例えば、タンパク質、核酸、核酸アナログ、炭水化物、または小分子であってもよい。場所は、組織、特定の細胞型、または細胞内コンパートメントであってもよい。
【００３８】
「組み込まれた」および「カプセル化された」という用語は、薬剤または他の材料を組み込む様式にかかわらず、薬剤を組成物中におよび／または組成物上に組み込むこと、製剤化すること、そうでなければを含むことを指す。
ＩＩ．組成物
Ａ．デンドリマー
【００３９】
デンドリマーは、表面末端基を含む、３次元ハイパー分岐単分散球状多価高分子である（Tomalia,  D.  A.,  et  al.,  Biochemical  Society  Transactions,  35,  61  (2007)、およびSharma,  A.,  et  al.,  ACS  Macro  Letters,  3,  1079  (2014)）。その特有の構造的および物理的特徴のために、デンドリマーは、標的を絞った薬物／遺伝子送達、イメージングおよび診断を含むさまざまな生物医学的用途のためのナノ担体として、前例のない潜在力を示している（Sharma,  A.,  et  al.,  RSC  Advances,  4,  19242  (2014)、Caminade,  A.-M.,  et  al.,  Journal  of  Materials  Chemistry  B,  2,  4055  (2014)、Esfand,  R.,  et  al.,  Drug  Discovery  Today,  6,  427  (2001)、およびKannan,  R.  M.,  et  al.,  Journal  of  Internal  Medicine,  276,  579  (2014)）。
【００４０】
デンドリマーは、薬物／遺伝子送達、標的化、イメージングおよび診断を含むさまざまな生物医学的用途のための潜在的な候補物質として新たに出現したものである（oliman,  GM  et  al.,  Chem.  Commun.  2011,  47,  9572、およびTomalia,  DA  et  al.,  Biochem.  Soc.  Trans.  2007,  35,  61）。いくつかの異なるタイプのデンドリマーの中でも、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）デンドリマーが、それらの市販での入手の可能性、水溶性および生体適合性に起因し、薬物送達用途に関して広範囲に研究されてきた（Tomalia,  DA  et  al.,  Polym  J  1985,  17,  117）。小さなサイズ、および容易に調節可能な複数の表面基の存在によって、これらのナノ粒子は、薬物をＣＮＳに輸送するための優良な担体になる。以前の研究では、非細胞毒性のヒドロキシル末端第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー（約４ｎｍサイズ、任意の標的化リガンドを含まない）が、障害を受けたＢＢＢを通過し、脳の傷害部位において活性化ミクログリアを、健常対照よりも数倍多く標的とすることができる点が示されている（Lesniak,  WG  et  al.,  Mol  Pharm  2013,  10）。これらのデンドリマーは、５００ｍｇ／ｋｇを超える静脈内用量でさえも非毒性であり、腎臓を通して完全なままで除去される。これらの発見は、さまざまな大小の動物モデルで検証された（Kannan,  S  et  al.,  Sci.  Transl.  Med.  2012,  4,  130ra46、Kambhampati,  SP  et  al.,  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci  2015,  56、Nance,  E  et  al.,  J.  Control.  Release  2015,  214,  112、Mishra,  MK  et  al.,  ACS  Nano  2014,  8,  2134、およびNanomedicine  2010,  5,  1317）。活性化ミクログリアにおけるこれらの中性デンドリマーの選択的取り込みおよび局在は、障害を受けたＢＢＢを通過し、脳実質で急速に拡散し、続いて食細胞活性化グリア細胞によって絶えず取り込まれるその能力に起因する場合がある。
【００４１】
最近の研究では、デンドリマー表面基が、その生体内分布に顕著に影響を与える場合があることが示されている（Nance,  E.,  et  al.,  Biomaterials,  101,  96  (2016)）。より詳細には、任意の標的化リガンドを含まない、ヒドロキシル末端第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー（約４ｎｍサイズ）が、脳性麻痺（ＣＰ）のウサギモデルにおいて全身投与した場合、健常対照と比較して、障害を受けたＢＢＢを顕著に多く（２０倍を超えて）通過し、活性化ミクログリアおよびアストロサイトを選択的に標的とすることが示されている（Lesniak,  W.  G.,  et  al.,  Mol  Pharm,  10  (2013)）。Kannan,  S.,  et  al.,  Science  Translational  Medicine,  4,  130ra46  (2012)、Iezzi,  R.,  et  al.,  Biomaterials,  33,  979  (2012)、Mishra,  M.  K.,  et  al.,  ACS  Nano,  8,  2134  (2014)、Kambhampati,  S.  P.,  et  al.,  European  Journal  of  Pharmaceutics  and  Biopharmaceutics,  95,  Part  B,  239  (2015)、Zhang,  F.,  et  al.,  Journal  of  Controlled  Release,  249,  173  (2017)、Guo,  Y.,  et  al.,  PLOS  ONE,  11,  e0154437  (2016)、およびInapagolla,  R.,  et  al.,  International  Journal  of  Pharmaceutics,  399,  140  (2010)を参照のこと。
【００４２】
「デンドリマー」という用語は、これらに限定されるものではないが、内部コアと、この内部コアに付加され、そこから広がる反復単位の層（または「世代」）とを有する分子構成であって、各層が１つまたは複数の分岐点を有し、末端基の外部表面が最も外側の世代に付加されている、分子構成を含む。一部の実施形態では、デンドリマーは、標準デンドリマーまたは「星型バースト（starburst）」分子構造を有する。
【００４３】
一般的に、デンドリマーは、約１ｎｍから約５０ｎｍ、より好ましくは約１ｎｍから約２０ｎｍ、約１ｎｍから約１０ｎｍ、または約１ｎｍから約５ｎｍの直径を有する。一部の実施形態では、直径は、約１ｎｍから約２ｎｍの間である。好ましい実施形態では、デンドリマーは、血液脳関門（「ＢＢＢ」）を通過し、標的細胞に長時間保持されるのに効果的な直径を有する。
【００４４】
好ましい実施形態では、デンドリマーは、複数のヒドロキシル基を含む。一部の例示的な高密度ヒドロキシル基含有デンドリマーとしては、市販されているポリエステル樹状ポリマー、例えばハイパー分岐２，２−ビス（ヒドロキシル−メチル）プロピオン酸ポリエステルポリマー（例えば、ハイパー分岐ビス−ＭＰＡポリエステル−６４−ヒドロキシル、第４世代）、樹状ポリグリセロールが挙げられる。
【００４５】
一部の実施形態では、高密度ヒドロキシル基含有デンドリマーは、オリゴエチレングリコール（ＯＥＧ）様デンドリマーである。例えば、第２世代ＯＥＧデンドリマー（Ｄ２−ＯＨ−６０）は、非常に効率的で、頑強で、原子経済的な化学反応、例えばＣｕ（Ｉ）触媒アルキン−アジドクリックおよび光触媒チオール−エンクリックケミストリーを使用して合成することができる。直交性ハイパーモノマー（orthogonal  hypermonomer）およびハイパーコア戦略を使用することによって、高密度のポリオールデンドリマーを非常に低世代で最小限の反応ステップで達成することができる。このデンドリマー骨格は、非切断性ポリエーテル結合を構造全体にわたって有し、デンドリマーのｉｎ  ｖｉｖｏでの崩壊を回避し、そのようなデンドリマーが単一の実体として身体から消失することを可能にする（非生分解性）。好ましい実施形態では、デンドリマーは、以下の式Ｉで示すとおりである。
【化１】
2021502451.tif 000002
【００４６】
例示的なデンドリマーとしては、これらに限定されるものではないが、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエステル、ポリリシン、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、イプチセン、脂肪族ポリ（エーテル）、および／または芳香族ポリエーテルデンドリマーが挙げられる。デンドリマーは、カルボキシル、アミンおよび／またはヒドロキシル末端を有していてもよい。デンドリマーは、これらに限定されないが、第１世代、第２世代、第３世代、第４世代、第５世代、第６世代、第７世代、第８世代、第９世代、または第１０世代を含む任意の世代であってもよい。一部の実施形態では、デンドリマーは、プラットフォームとして使用されるＰＡＭＡＭデンドリマーであり、ヒドロキシル基の数を増加させるために表面基が修飾されている。
【００４７】
デンドリマー複合体の各デンドリマーは、他のデンドリマーと同様のまたは異なる化学的性質のものであってもよい（例えば、第１のデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含んでいてもよく、一方で、第２のデンドリマーはＰＯＰＡＭデンドリマーを含んでいてもよい）。一部の実施形態では、第１のまたは第２のデンドリマーは、追加の薬剤をさらに含んでいてもよい。マルチアームＰＥＧポリマーとしては、スルフヒドリルまたはチオピリジン末端基を有する少なくとも２つの分岐を有するポリエチレングリコールが挙げられるが；他の末端基、例えばスクシンイミジルまたはマレイミド末端を有するＰＥＧポリマーを使用してもよい。１０ｋＤａから８０ｋＤａの分子量範囲のＰＥＧポリマーを使用してもよい。
【００４８】
一般的に、デンドリマーの完全な構成は、内部コア部分、続いて半径方向に付加された分岐単位（すなわち、世代）に区別することができ、デンドリマーの外部表面において、所望の末端基を有する化学的官能基でさらに装飾されている。
【００４９】
一部の実施形態では、デンドリマーはナノ粒子の形態であり、米国特許出願公開第２０１１／００３４４２２号、同第２０１２／０００３１５５号、および同第２０１３／０１３６６９７号で詳細に説明されている。
【００５０】
デンドリマーの分子量を変更し、具体的な用途に最適化された、薬物放出速度などの特性を有する粒子を形成するポリマーナノ粒子を調製してもよい。デンドリマーは、約１５０Ｄａから１ＭＤａの分子量を有していてもよい。ある特定の実施形態では、ポリマーは、約５００Ｄａから約１００ｋＤａの間、より好ましくは約１ｋＤａから約５０ｋＤａの間、最も好ましくは約１ｋＤａから約２０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００５１】
一部の実施形態では、これらに限定されないが、デンドロンおよびテクトデンドリマーを含む、デンドリマーの異なる変形形態を、１つまたは複数の活性剤を送達するための送達ビヒクルとして使用する。デンドロンは、樹状ウェッジ（wedges）であり、コアに１種類の官能性（官能基、ｆ＝１）を含み、周辺に別の官能性（ｆ＝８、１６、３２など）を含む。テクトデンドリマーは、中心デンドリマーから一般的に構成され、その周辺に複数のデンドリマーが付加されている。一部の実施形態では、活性剤、例えばＮ−アセチルシステインは、デンドロンまたはテクトデンドリマーにコンジュゲートされている。
１．中心コア
【００５２】
多機能性コア部分は、コア周囲の分岐単位（すなわち、世代）の段階的な添加を可能にする。ＰＡＭＡＭのコアは、ジアミン（通常エチレンジアミン）であり、これをアクリル酸メチルと、次いで別のエチレンジアミンと反応させ、０世代（Ｇ−０）ＰＡＭＡＭを作製する。コア部分は、適宜、異なる化学的部分で置き換えてもよい。例えば、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、クリックケミストリーを使用してコアにテトラ（エチレンオキシド）を含有していてもよい（Han  SC  et  al.,  Bull.  Korean  Chem.  Soc.  33,  3501-3504(2012)）。
【００５３】
ジペンタエリスリトール、ペンタエリスリトール、２−（アミノメチル）−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、２−エチル−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、３，３’，３’’，３’’’−シランテトライルテトラキス（プロパン−１−チオール）、３，３−ジビニルペンタ−１，４−ジエン、３，３’，３’’−ニトリロトリプロピオン酸、３，３’，３’’−ニトリロトリス（Ｎ−（２−アミノエチル）プロパンアミド）、３，３’，３’’，３’’’−（エタン−１，２−ジイルビス（アザントリイル））テトラプロパンアミド、３−（カルボキシメチル）−３−ヒドロキシペンタン二酸、２，２’−（（２，２−ビス（（２−ヒドロキシエトキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ビス（エタン−１−オール）、テトラキス（３−（トリクロロシリル）プロピル）シラン、１−チオグリセロール、２，２，４，４，６，６−ヘキサクロロ−１，３，５，２ｌ５，４ｌ５，６ｌ５−トリアザトリホスフィニン、３−（ヒドロキシメチル）−５，５−ジメチルヘキサン−２，４−ジオール、４，４’，４’’−（エタン−１，１，１−トリイル）トリフェノール、２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン、５−（ヒドロキシメチル）ベンゼン−１，２，３−トリオール、５−（ヒドロキシメチル）ベンゼン−１，３−ジオール、１，３，５−トリス（ジメチル（ビニル）シリル）ベンゼン、カルボシロキサンコア、ニトリロトリメタノール、エチレンジアミン、プロパン−１，３−ジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、２，２’，２’’−ニトリロトリス（エタン−１−オール）、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン、ガンマシクロデキストリン、ククルビツリル、ベンゼン−１，２，３，４，５，６−ヘキサチオール、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、またはこれらのアジド、アルキン修飾部分を含む、コア部分として好適な例示的な化学構造を、表１に挙げる。一部の実施形態では、コア部分はキトサンである。したがって、アジド修飾キトサンまたはアルキン修飾キトサンは、クリックケミストリーを使用して分岐単位にコンジュゲートするのに好適である。一部の実施形態では、コア部分は、エチレンジアミンまたはテトラ（エチレンオキシド）である。
【００５４】
一部の実施形態では、コア部分は、式ＩＩで示すような直鎖状または分岐ポリエチレングリセロールである
【化２】
2021502451.tif 000003
【００５５】
Ｘは、アミン、酸、アルデヒド、アルコール、アセチレン、アリル、アクリレート、アジド、トシル、メシレート、チオール、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性化酸、マレイミドであってもよい。
【表１−１】
2021502451.tif 000004
【表１−２】
2021502451.tif 000005
【表１−３】
2021502451.tif 000006
【表１−４】
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【表１−５】
2021502451.tif 000008
【表１−６】
2021502451.tif 000009
２．分岐単位
【００５６】
ジペンタエリスリトール、ペンタエリスリトール、２−（アミノメチル）−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、２−エチル−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−１，３−ジオール、３，３’，３’’，３’’’−シランテトライルテトラキス（プロパン−１−チオール）、３，３−ジビニルペンタ−１，４−ジエン、３，３’，３’’−ニトリロトリプロピオン酸、３，３’，３’’−ニトリロトリス（Ｎ−（２−アミノエチル）プロパンアミド）、３，３’，３’’，３’’’−（エタン−１，２−ジイルビス（アザントリイル））テトラプロパンアミド、３−（カルボキシメチル）−３−ヒドロキシペンタン二酸、２，２’−（（２，２−ビス（（２−ヒドロキシエトキシ）メチル）プロパン−１，３−ジイル）ビス（オキシ））ビス（エタン−１−オール）、テトラキス（３−（トリクロロシリル）プロピル）シラン、１−チオグリセロール、２，２，４，４，６，６−ヘキサクロロ−１，３，５，２ｌ５，４ｌ５，６ｌ５−トリアザトリホスフィニン、３−（ヒドロキシメチル）−５，５−ジメチルヘキサン−２，４−ジオール、４，４’，４’’−（エタン−１，１，１−トリイル）トリフェノール、２，４，６−トリクロロ−１，３，５−トリアジン、５−（ヒドロキシメチル）ベンゼン−１，２，３−トリオール、５−（ヒドロキシメチル）ベンゼン−１，３−ジオール、１，３，５−トリス（ジメチル（ビニル）シリル）ベンゼン、カルボシロキサンコア、ニトリロトリメタノール、エチレンジアミン、プロパン−１，３−ジアミン、ブタン−１，４−ジアミン、２，２’，２’’−ニトリロトリス（エタン−１−オール）、アルファシクロデキストリン、ベータシクロデキストリン、ガンマシクロデキストリン、ククルビツリル、ベンゼン−１，２，３，４，５，６−ヘキサチオール、単糖、二糖、三糖、オリゴ糖、またはこれらのアジド、アルキン修飾部分を含む、分岐単位として好適な例示的な化学構造を、表１に挙げる。一部の実施形態では、分岐単位はキトサンである。したがって、アジド修飾キトサンまたはアルキン修飾キトサンは、クリックケミストリーを使用してコア部分または追加の同じもしくは異なる分岐単位にコンジュゲートするのに好適である。一部の実施形態では、分岐単位は、アクリル酸メチルまたはエチレンジアミンである。
【００５７】
一部の実施形態では、分岐単位は、式ＩＩで示すような直鎖状または分岐ポリエチレングリセロールである。
【００５８】
一部の実施形態では、分岐単位は、ハイパーモノマー、すなわちＡＢｎ構成ブロックである。例示的なハイパーモノマーとしては、ＡＢ４、ＡＢ５、ＡＢ６、ＡＢ７、ＡＢ８構成ブロックが挙げられる。ハイパーモノマー戦略によって、利用可能な末端基の数が大幅に増加する。例示的なハイパーモノマーは、１個のアジド官能基および５個のアリル基を含むＡＢ５直交性ハイパーモノマーであり、５個のアリル基を有するジペンタエリスリトールをモノトシル化トリエチレングリコールアジドと反応させて調製される（スキーム２）。
３．表面基
【００５９】
表面基または末端官能基は、第１級アミン末端基、ヒドロキシル末端基、カルボン酸末端基、チオール末端に限定されない。一部の実施形態では、所望の表面基を、コンジュゲート法のうちの１つを介し、コアおよび分岐単位に対して付加してもよい。
【００６０】
表Ｉに挙げる化学的部分のうちのいずれかを、上述の一般的なコンジュゲート法のうちのいずれかを介し、１つまたは複数の分岐単位をコンジュゲートするための表面基として使用することができる。好ましい実施形態では、表面基は、光化学チオール−エン反応を介し、１つまたは複数の分岐単位にコンジュゲートしている１−チオグリセロールである。
【００６１】
一部の実施形態では、デンドリマーは、特定の組織領域および／または細胞型、好ましくは中枢神経系（ＣＮＳ）および眼の細胞および組織を特異的に標的とすることができる。一部の実施形態では、デンドリマーは、身体における炎症部位を、好ましくはＣＮＳおよび眼の炎症部位を特異的に標的とすることができる。ヒドロキシル末端基を有する直鎖状および星型ポリマーは、脳および網膜の傷害細胞を標的としない。しかし、高密度のヒドロキシル官能基を有するデンドリマーおよび樹状ポリマーは、世代に依存せず、および構成ブロックに依存しない様式で、傷害細胞を効果的に標的とする。例では、新規の合成デンドリマーがミクログリアおよびミクロファージだけではなく、脳傷害に関与する他の細胞をもどのように標的とすると考えるかを記載する。
【００６２】
好ましい実施形態では、デンドリマーは、デンドリマーの周辺に複数のヒドロキシル（−ＯＨ）基を有する。好ましいヒドロキシル（−ＯＨ）基表面密度は、少なくとも１ＯＨ基／ｎｍ２（ヒドロキシル表面基の数／表面積ｎｍ２）である。例えば、一部の実施形態では、ヒドロキシル基表面密度は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０を超え；好ましくは少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０であるかまたは５０を超える。さらなる実施形態では、ヒドロキシル（−ＯＨ）基表面密度は、約１から約５０の間、好ましくは５〜２０ＯＨ基／ｎｍ２（ヒドロキシル表面基の数／表面積ｎｍ２）であり、同時に約５００Ｄａから約１０ｋＤａの間の分子量を有する。
【００６３】
一部の実施形態では、デンドリマーは、外表面上に露出しているヒドロキシル基のフラクションを、デンドリマーの内部コアにあるもう一方のフラクションとともに有していてもよい。好ましい実施形態では、デンドリマーは、少なくとも１ＯＨ基／ｎｍ３（ヒドロキシル基の数／体積ｎｍ３）のヒドロキシル（−ＯＨ）基体積密度を有する。例えば、一部の実施形態では、ヒドロキシル基体積密度は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０であるか、または１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、および５０を超える。一部の実施形態では、ヒドロキシル基体積密度は、約４から約５０基／ｎｍ３の間、好ましくは約５から約３０基／ｎｍ３の間、より好ましくは約１０から約２０基／ｎｍ３の間である。第２世代の高密度のポリヒドロキシデンドリマー（Ｄ２−ＯＨ−６０）の場合、ヒドロキシル基体積密度は約１４基／ｎｍ３である。
【００６４】
好ましい実施形態では、デンドリマーは、ＣＮＳまたは眼の疾患、障害、または傷害と関連する活性化ミクログリアおよび／またはアストロサイトを標的とするのに有効な数のヒドロキシル基を含む。
Ｂ．カップリング剤およびスペーサー
【００６５】
デンドリマー複合体は、デンドリマー、樹状ポリマーまたはハイパー分岐ポリマーにコンジュゲートされたまたは付加された治療的活性剤または化合物を形成していてもよい。必要に応じて、活性剤は、異なる連結、例えばジスルフィド、エステル、カルボネート、カルバメート、チオエステル、ヒドラジン、ヒドラジド、およびアミド連結を介し、１つまたは複数のスペーサー／リンカーを介してデンドリマーにコンジュゲートしている。一部の実施形態では、付加は、薬剤とデンドリマーとの間にジスルフィド架橋を提供する適切なスペーサーを介して生じる。この場合、デンドリマー複合体は、身体で認められる還元条件下、チオール交換反応によって薬剤をｉｎ  ｖｉｖｏで迅速に放出することができる。
【００６６】
「スペーサー」という用語は、治療的、予防的または診断的活性剤をデンドリマーに連結するために使用する化合物を含む。スペーサーは、ポリマーと治療剤または造影剤とを架橋するために一緒に連結されている、単一の化学的実体または２つもしくはそれを超える化学的実体のいずれかとすることができる。スペーサーとしては、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホン、およびカルボネート末端を有する任意の小さな化学的実体、ペプチドまたはポリマーを挙げることができる。
【００６７】
スペーサーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンおよびカルボネート基が末端である化合物の中から選択することができる。スペーサーとしては、チオピリジン末端化合物、例えばジチオジピリジン、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（ＬＣ−ＳＰＤＰ）またはスルホスクシンイミジル６−（３−［２−ピリジルジチオ］−プロピオンアミド）ヘキサノエート（スルホ−ＬＣ−ＳＰＤＰ）があり得る。スペーサーとしては、スルフヒドリル基、例えばグルタチオン、ホモシステイン、システインおよびその誘導体を実質的に有する直鎖状または環状のペプチド、ａｒｇ−ｇｌｙ−ａｓｐ−ｃｙｓ（ＲＧＤＣ）、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−ｄ−Ｐｈｅ−Ｃｙｓ）（ｃ（ＲＧＤｆＣ））、シクロ（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ）、シクロ（Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｐ−ｄ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ）を挙げることもできる。スペーサーは、メルカプト酸誘導体、例えば３メルカプトプロピオン酸、メルカプト酢酸、４メルカプト酪酸、チオラン−２−オン、６メルカプトヘキサン酸、５メルカプト吉草酸ならびに他のメルカプト誘導体、例えば２メルカプトエタノールおよび２メルカプトエチルアミンとすることができる。スペーサーは、チオサリチル酸およびその誘導体、（４−スクシンイミジルオキシカルボニル−メチル−アルファ−２−ピリジルチオ）トルエン、（３−［２−ピリジチオ］プロピオニルヒドラジドとすることができる。スペーサーは、マレイミド末端を有していてもよく、スペーサーとしては、ポリマーまたは小さな化学的実体、例えばビス−マレイミドジエチレングリコールおよびビス−マレイミドトリエチレングリコール、ビス−マレイミドエタン、ビスマレイミドヘキサンが挙げられる。スペーサーとしては、ビニルスルホン、例えば１，６−ヘキサン−ビス−ビニルスルホンを挙げることができる。スペーサーとしては、チオグリコシド、例えばチオグルコースを挙げることができる。スペーサーは、還元タンパク質、例えばウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン、ジスルフィド結合を形成することができる任意のチオール末端化合物とすることができる。スペーサーとしては、マレイミド、スクシンイミジルおよびチオール末端を有するポリエチレングリコールを挙げることができる。
【００６８】
一部の実施形態では、スペーサー／リンカーは、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）リンカー、アリルリンカー、プロパルギルリンカー、エタンチオールリンカー、ピリジンジスルフィドリンカーである。好ましい実施形態では、スペーサー／リンカーは、例えば、エステル連結と比較して生理学的条件下での安定性を改善するために、エーテル、チオエステル、カルバメート、カルボネート、ヒドラジン、またはアミド結合のうちの１つまたは複数を介し、デンドリマーにコンジュゲートしている。
【００６９】
他の実施形態では、異なる連結、例えばエーテル、エステル、カルバメート、カルボネートなどを介した、デンドリマー表面上の異なるリンカー、例えばアリル、プロパルギルなどのライゲーションは、活性剤、例えばＮＡＣをコンジュゲートするためのクリックケミストリーに関与する場合がある。さらなる実施形態では、デンドリマーは、１つのリンカーを介して第１の活性剤に、一方で、異なるリンカーを介して第２の活性剤にコンジュゲートしている。
Ｃ．治療的、予防的および診断的薬剤
【００７０】
広範囲の薬剤が、送達されることになる粒子中に含まれていてもよい。薬剤は、タンパク質もしくはペプチド、糖もしくは炭水化物、核酸もしくはオリゴヌクレオチド、脂質、小分子、またはこれらの組合せとすることができる。核酸は、タンパク質、例えばＤＮＡ発現カセットまたはｍＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチドとすることができる。代表的なオリゴヌクレオチドとしては、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡが挙げられる。一部の実施形態では、活性剤は治療的抗体である。１つまたは複数のタイプの活性剤は、デンドリマーにカプセル化、複合体化またはコンジュゲートされていてもよい。例えば、デンドリマーは、ジスルフィド架橋を介して１つまたは複数のＮＡＣ分子に、およびアミド連結を介して１つまたは複数の抗体にコンジュゲートされている。
【００７１】
例示的な治療剤としては、抗炎症薬、抗増殖薬、化学療法剤、血管拡張薬、神経活性化剤および抗感染症剤が挙げられる。一部の実施形態では、デンドリマーは、ジスルフィド、エステル、エーテル、チオエステル、カルバメート、カルボネート、ヒドラジン、またはアミド結合で終わるスペーサーを介して標的化部分、造影剤、および／または治療剤に連結している。
【００７２】
一部の実施形態では、活性剤は標的化剤である。標的化部分としては、葉酸、直鎖状または環状のいずれかのＲＧＤペプチド、ＴＡＴペプチド、ＬＨＲＨおよびＢＨ３が挙げられる。
１．治療剤
【００７３】
「デンドリマー複合体」という用語は、１つまたは複数の治療的、予防的、または診断的薬剤にコンジュゲートしているかまたはこれらと複合体化されているデンドリマーを指す。１つまたは複数の治療剤は、デンドリマーと複合体化されているか、デンドリマーに共有結合により付加されているか、またはデンドリマー中に分子内分散もしくはカプセル化されていてもよい。一部の実施形態では、２つまたはそれを超える異なる治療剤は、共有および／または非共有結合的相互作用を介してデンドリマーと会合することができる。
【００７４】
デンドリマー複合体は、静脈内注射によって投与した場合、疾患状態下でのみ血液脳関門（ＢＢＢ）を優先的に通過することができ、正常な状態下では通過することはできない。好ましくは、薬剤（複数可）は、標的部位、すなわち疾患および／または傷害部位において薬物を優先的に放出することができるデンドリマーに付加されているかまたはコンジュゲートされている。例えば、一部の薬物は、ｉｎ  ｖｉｖｏで認められる還元条件下で細胞内に放出され得る。薬剤に連結されたデンドリマー複合体は、標的化、疾患部位における局在、薬物放出、およびイメージング目的を含むいくつかの機能を果たすために使用することができる。デンドリマー複合体は、標的化部分ありまたは標的化部分なしでタグ付けすることができる。一部の実施形態では、デンドリマーと薬剤または造影剤との間のジスルフィド結合は、スペーサーまたはリンカー分子を介して形成されている。
【００７５】
一部の実施形態では、分子としては、抗体、例えば、ダクリズマブ、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ（登録商標））、バシリキシマブ、ラニビズマブ、およびペガプタニブナトリウムまたはＳＮ５０などのペプチド、およびＮＦアンタゴニストが挙げられる。
【００７６】
一部の実施形態では、１つまたは複数の治療剤は、疾患または状態の根本的な原因を標的とし、１つまたは複数の治療剤は、疾患または状態のうちの１つまたは複数の症状を軽減する。したがって、白質ジストロフィーの処置に関しては、デンドリマーは、超長鎖脂肪酸産生を予防するかまたは減少させる薬剤、ペルオキシソーム増殖を促進する薬剤、超長鎖脂肪酸除去を促進する薬剤、ＡＢＣＤ２発現を増加させる薬剤、またはこれらの組合せにコンジュゲートすることができる。例は、解離性ステロイド薬のＶＢＰ１５である。
【００７７】
好ましい活性剤としては、これらに限定されるものではないが、超長鎖脂肪酸産生を予防するかまたは減少させる薬剤、ペルオキシソーム増殖を促進する薬剤、超長鎖脂肪酸除去を促進する薬剤（例えば、４−フェニルブチレート）、ＡＢＣＤ２発現を増加させる薬剤（例えば、ベザフィブラート（benzafibrate））、甲状腺ホルモン類似体（例えば、エプロチローム、ソベチローム）、酵素（例えば、ガラクトシルセラミダーゼおよびアリールスルファターゼＡ、アスパルトアシラーゼ）、神経炎症を減少させる薬剤（例えば、Ｎ−アセチルシステイン、ピオグリタゾン、ビタミンＥ）、ならびに遺伝子転写または翻訳に干渉するＲＮＡオリゴヌクレオチドが挙げられる。特に好ましい実施形態では、薬剤は、Ｎ−アセチルシステイン、４−フェニルブチレート、ベザフィブラート、甲状腺ホルモン（Ｔ３）、ソベチローム、ピオグリタゾン、レスベラトロール、ＶＢＰ１５、ビタミンＥ、エルカ酸、補酵素Ｑ１０、クレマスチン、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、アスパルトアシラーゼ（ＡＳＰＡ）、またはアリールスルファターゼＡ（ＡＲＳＡ）である。他の好適な活性剤としては、これらに限定されないが、抗炎症剤、神経活性剤および造影剤が挙げられる。デンドリマーは、１つを超える薬剤および１種類を超える薬剤にコンジュゲートすることができる。
【００７８】
一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗興奮毒性剤および／またはＤ−抗グルタメート剤を含む。例示的な化合物は、ＭＫ８０１、メマンチン、ケタミン、１−ＭＴである。
ａ．抗炎症剤
【００７９】
一部の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の抗炎症剤を含む。抗炎症剤は炎症を減少させ、抗炎症剤としては、ステロイド薬および非ステロイド薬がある。
【００８０】
好ましい抗炎症薬は、Ｎ−アセチルシステインを含む抗酸化薬である。好ましいＮＳＡＩＤＳとしては、メフェナム酸、アスピリン、ジフルニサル、サルサレート、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、ディークケトプロフェン（Deacketoprofen）、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、エレコキシブ、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ、フィロコキシブ、スルホンアニリド、ニメスリド、ニフルム酸、およびリコフェロンがある。
【００８１】
代表的な小分子としては、メチルプレドニゾン、デキサメタゾンなどのステロイド、ＣＯＸ−２阻害剤を含む非ステロイド性抗炎症剤、コルチコステロイド性抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制剤、抗炎症剤および抗血管新生剤、バルプロ酸、Ｄ−アミノホスホノバレレート（D-aminophosphonovalerate）、Ｄ−アミノホスホノヘプタノエート（D-aminophosphonoheptanoate）などの抗興奮毒性剤、バクロフェンなどのグルタメート形成／放出阻害剤、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、サリチレート抗炎症剤、ラニビズマブ、アフリベルセプトを含む抗ＶＥＧＦ剤、ならびにラパマイシンが挙げられる。他の抗炎症薬としては、非ステロイド薬、例えばインドメタシン、アスピリン、アセトアミノフェン、ジクロフェナクナトリウムおよびイブプロフェンが挙げられる。コルチコステロイドは、フルオシノロンアセトニドおよびメチルプレドニゾロンであってもよい。
【００８２】
例示的な免疫モジュレート薬としては、シクロスポリン、タクロリムスおよびラパマイシンが挙げられる。一部の実施形態では、抗炎症剤は、Ｔ細胞などの１つまたは複数の免疫細胞型の作用をブロックするか、または腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−アルファ）、インターロイキン１７−Ａ、インターロイキン１２および２３などの免疫系におけるタンパク質をブロックする生物学的薬物である。
【００８３】
一部の実施形態では、抗炎症薬は、合成または天然の抗炎症性タンパク質である。選択する免疫構成成分に対して特異的な抗体を、免疫抑制療法に加えることができる。一部の実施形態では、抗炎症薬は、抗Ｔ細胞抗体（例えば、抗胸腺細胞グロブリンまたは抗リンパ球グロブリン）、抗ＩＬ−２Ｒα受容体抗体（例えば、バシリキシマブまたはダクリズマブ）、または抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）である。
【００８４】
多くの炎症性疾患は、リポ多糖（ＬＰＳ）に対する受容体であるトル様受容体４（ＴＬＲ４）を介し病理学的に上昇したシグナル伝達に連結している場合がある。したがって、潜在的な抗炎症剤としてのＴＬＲ４阻害剤の発見に大きな関心が寄せられている。近年では、阻害剤Ｅ５５６４に結合するＴＬＲ４の構造が解明され、Ｅ５５６４−結合ドメインを標的とする新規のＴＬＲ４阻害剤の設計および合成が可能になった。このことは、米国特許第８，８８９，１０１号に記載されており、その内容は、参照により組み込まれる。Neal,  et  al.,  PLoS  One.  2013;  8(6):  e65779eによって報告されているように、小分子ライブラリの限定されたスクリーニングアプローチと組み合わせて使用する類似性探索アルゴリズムによって、Ｅ５５６４部位に結合し、ＴＬＲ４を阻害する化合物が同定されている。リード化合物のＣ３４、は、式Ｃ１７Ｈ２７ＮＯ９を有する２−アセトアミドピラノシド（ＭＷ３８９）であり、腸細胞およびマクロファージにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＬＲ４を阻害し、内毒素血症および壊死性腸炎のマウスモデルにおける全身性炎症を減少させる。したがって、一部の実施形態では、活性剤は、１つまたは複数のＴＬＲ４阻害剤である。好ましい実施形態では、活性剤は、Ｃ３４、およびこれらの誘導体、アナログである。
【００８５】
好ましい実施形態では、１つまたは複数の抗炎症薬は、哺乳動物対象に投与した後に、少なくとも１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、好ましくは少なくとも１週間、２週間、または３週間、より好ましくは少なくとも１カ月間、２カ月間、３カ月間、４カ月間、５カ月間、６カ月間、炎症を阻害するのに有効な量でデンドリマーナノ粒子から放出される。
ｂ．化学療法剤
【００８６】
化学療法剤は、ＤＮＡ合成に干渉するかまたはがん細胞において機能することによって作用する、薬学的または治療的活性化合物を一般的に含む。細胞レベルでのその化学的作用に基づいて、化学療法剤は、細胞周期特異的薬剤（細胞周期のある特定の期の間で効果的）および細胞周期非特異的薬剤（細胞周期の全ての期の間で効果的）として分類することができる。化学療法剤の例としては、アルキル化剤、血管新生阻害剤、アロマターゼ阻害剤、代謝拮抗薬、アントラサイクリン、抗腫瘍抗生物質、プラチナ薬、トポイソメラーゼ阻害剤、放射性同位体、放射線増感剤、チェックポイント阻害剤、ＰＤ１阻害剤、植物アルカロイド、解糖阻害剤、およびこれらのプロドラッグがある。
【００８７】
ＰＤ−１阻害剤の例としては、例えばヒトＰＤ−１に特異的な遺伝子操作された完全ヒト免疫グロブリンＧ４（ＩｇＧ４）モノクローナル抗体であるＭＤＸ−１１０６、および米国ＦＤＡによって近年承認されたペンブロリズマブが挙げられる。
【００８８】
代表的な化学療法剤としては、これらに限定されるものではないが、アムサクリン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、クロファラビン、クリサンタスパーゼ、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキソルビシン、エピポドフィロトキシン、エピルビシン、エトポシド、リン酸エトポシド、フルダラビン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシカルブアミド（hydroxycarb  amide）、イダルビシン、イホスファミド、イノテカン、ロイコボリン、リポソーム型ドキソルビシン、リポソーム型ダウノルビシン（daunorubici）、ロムスチン、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メスナ、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラルチトレキセド、サトラプラチン、ストレプトゾシン、テニポシド、テガフール−ウラシル、テモゾロマイド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、タキソール、およびこれらの誘導体、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ（登録商標））、セツキシマブ、およびリツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ（登録商標）またはＭＡＢＴＨＥＲＡ（登録商標））、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ（登録商標））、ならびにこれらの組合せがある。代表的なプロアポトーシス剤としては、これらに限定されるものではないが、フルダラビンタウロスポリン、シクロヘキシミド、アクチノマイシンＤ、ラクトシルセラミド、１５ｄ−ＰＧＪ（２）５、およびこれらの組合せがある。
【００８９】
１つまたは複数の化学療法剤を含むデンドリマー複合体は、ＰＤ−１もしくはＣＴＬＡ−４などのチェックポイントタンパク質を阻害するような免疫療法、養子Ｔ細胞療法、および／またはがんワクチンより前に、またはこれらと組み合わせて使用することができる。適応性Ｔ細胞がん療法のためにｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴ細胞をプライミングおよび活性化する方法は、当技術分野において公知である。例えば、Wang,  et  al,  Blood,  109(11):4865-4872  (2007)およびHervas-Stubbs,  et  al,  J.  Immunol.,  189(7):3299-310  (2012)を参照されたい。がんワクチンの例としては、例えば前立腺がんを処置するための樹状細胞ベースのワクチンであるＰＲＯＶＥＮＧＥ（登録商標）（シプロイセル−Ｔ）が挙げられる（Ledford,  et  al.,  Nature,  519,  17-18  (05  March  2015）。そのようなワクチンおよび他の組成物ならびに免疫療法のための方法は、Palucka,  et  al.,  Nature  Reviews  Cancer,  12,  265-277  (April  2012）でレビューされている。
【００９０】
一部の実施形態では、デンドリマー複合体は、例えば、レット症候群を含む神経発達障害において脳のミクログリアの炎症を処置、イメージング、および／または予防するのに効果的である。好ましい実施形態では、デンドリマー複合体は、抗炎症剤（Ｄ−ＮＡＣ）ならびに抗興奮毒性およびＤ−抗グルタメート剤を送達するために使用することになる。好ましい候補物質は、ＭＫ８０１、メマンチン、ケタミン、１−ＭＴである。
ｃ．神経活性化剤
【００９１】
神経傷害へ向かうグルタメート興奮毒性カスケードを遮断するか、それに影響を与えるか、またはそれを一時的に停止させる試みにおいて、いくつかの薬物が開発され、使用されてきた。１つの戦略は、グルタメート放出を減少させるための「上流」の試みである。薬物のこのカテゴリーとしては、リルゾール、ラモトリジン、およびリファリジンが挙げられ、これらはナトリウムチャネルブロッカーである。通常使用するニモジピンは、電位依存性チャネル（Ｌ型）ブロッカーである。カップリングしたグルタメート受容体自体のさまざまな位置に影響を与える試みも行われている。これらの薬物の一部としては、フェルバメート、イフェンプロジル、マグネシウム、メマンチン、およびニトログリセリンが挙げられる。これらの「下流」薬物は、フリーラジカル形成、一酸化窒素形成、タンパク質分解、エンドヌクレアーゼ活性、およびＩＣＥ様プロテアーゼ形成（プログラムされた細胞死またはアポトーシスを引き起こすプロセスにおける重要な構成成分）のような細胞内事象に影響を与えようとする。
【００９２】
神経変性疾患を処置するための活性剤は、当技術分野において周知であり、処置することになる症状および疾患に基づいて変更してもよい。例えば、パーキンソン疾患のための従来の処置としては、レボドパ（ドーパデカルボキシラーゼ阻害剤またはＣＯＭＴ阻害剤と通常組み合わせる）、ドーパミンアゴニスト、またはＭＡＯ−Ｂ阻害剤を挙げることができる。
【００９３】
ハンチントン疾患のための処置としては、異常行動および運動を減少させる助けとなるドーパミンブロッカー、または運動などを制御するためのアマンタジンおよびテトラベナジンなどの薬物を挙げることができる。舞踏病を減少させる助けとなる他の薬物としては、神経遮断薬およびベンゾジアゼピンが挙げられる。化合物、例えばアマンタジンまたはレマセミドは、予備段階で陽性の結果を示している。運動機能低下および硬直は、特に若年性の場合は、抗パーキンソン病薬で処置してもよく、ミオクローヌス多動症は、バルプロ酸で処置してもよい。精神医学的な症状は、一般的な母集団において使用されるものと同様の医薬品で処置してもよい。選択的セロトニン再取り込み阻害剤およびミルタザピンは、抑うつに推奨されている一方、非定型抗精神病薬は、精神障害および行動障害に推奨される。
【００９４】
抗興奮性毒素のリルゾール（ＲＩＬＵＴＥＫ（登録商標））（２−アミノ−６−（トリフルオロメトキシ）ベンゾチアゾール）は、ＡＬＳを呈する対象において生存期間を改善している。他の医薬品は、大部分の使用が適用外であり、介入することによってＡＬＳに起因する症状を減少することができる。いくつかの処置は、クオリティオブライフを改善し、いくつかの処置は、寿命を延ばすと思われる。一般的なＡＬＳ関連療法は、Gordon,  Aging  and  Disease,  4(5):295-310(2013)（例えば、その中の表１を参照のこと）でレビューされている。いくつかの他の薬剤で、１つまたは複数の臨床試験が、非有効から有望までの範囲の有効性とともに行われている。例示的な薬剤は、Carlesi,  et  al.,  Archives  Italiennes  de  Biologie,  149:151-167  (2011)でレビューされている。例えば、治療法は、興奮毒性を減少させる薬剤、例えばタランパネル（８−メチル−７Ｈ−１，３−ジオキソロ（２，３）ベンゾジアゼピン）、セファロスポリン、例えばセフトリアキソン、もしくはメマンチン、酸化ストレスを減少させる薬剤、例えば補酵素Ｑ１０、マンガノポルフィリン、ＫＮＳ−７６０７０４［（６Ｒ）−４，５，６，７−テトラヒドロ−Ｎ６−プロピル−２，６−ベンゾチアゾール−ジアミン二塩酸塩、ＲＰＰＸ］、もしくはエダラボン（３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン、ＭＣＩ−１８６）、アポトーシスを減少させる薬剤、例えばバルプロ酸を含むヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＴＣＨ３４６（ジベンゾ（ｂ，ｆ）オキセピン−１０−イルメチル−メチルプロパ−２−イニルアミン）、ミノサイクリン、もしくはタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、神経炎症を減少させる薬剤、例えばサリドマイドおよびセラストール（celastol）、向神経剤、例えばインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）もしくは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ヒートショックタンパク質インデューサー、例えばアリモクロモール、またはオートファジーインデューサー、例えばラパマイシンもしくはリチウムを含んでいてもよい。
【００９５】
アルツハイマー疾患のための処置は、例えばアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えばタクリン、リバスチグミン、ガランタミンもしくはドネペジル、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、例えばメマンチン、または抗精神病薬を含んでいてもよい。
【００９６】
レビー小体型認知症のための処置は、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えばタクリン、リバスチグミン、ガランタミンもしくはドネペジル、Ｎ−メチルｄ−アスパルテート受容体アンタゴニストメマンチン、ドーパミン療法、例えば、レボドパもしくはセレギリン、抗精神病、例えばオランザピンもしくはクロザピン、ＲＥＭ障害治療法、例えばクロナゼパム、メラトニン、もしくはクエチアピン、抗抑うつおよび抗不安療法、例えば選択的セロトニン再取り込み阻害剤（シタロプラム、エスシタロプラム、セルトラリン、パロキセチンなど）、またはセロトニンおよびノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ベンラファクシン、ミルタザピン、およびブプロピオン）を含んでいてもよい（例えば、Macijauskiene,  et  al.,  Medicina  (Kaunas),  48(1):1-8  (2012)を参照のこと）。
【００９７】
例示的な神経保護剤も当技術分野において公知であり、例えば、グルタメートアンタゴニスト、抗酸化剤、およびＮＭＤＡ受容体刺激薬を含む。他の神経保護剤および処置は、カスパーゼ阻害剤、栄養素、抗タンパク質凝集剤、治療的低体温、およびエリスロポエチンを含む。
【００９８】
神経機能不全を処置するための他の一般的な活性剤としては、アマンタジンおよび運動症状を処置するための抗コリン作動薬、精神障害を処置するためのクロザピン、認知症を処置するためのコリンエステラーゼ阻害剤、ならびに日中の眠気を処置するためのモダフィニルがある。
ｄ．抗感染症剤
【００９９】
抗生物質としては、ベータラクタム、例えばペニシリンおよびアンピシリン、セファロスポリン、例えばセフロキシム、セファクロル、セファレキシン、セファドロキシル（cephydroxil）、セフポドキシム（cepfodoxime）およびプロキセチル、テトラサイクリン抗生物質、例えばドキシサイクリンおよびミノサイクリン、マクロライド抗生物質、例えばアジスロマイシン、エリスロマイシン、ラパマイシンおよびクラリスロマイシン、フルオロキノロン、例えばシプロフロキサシン、エンロフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシンおよびノルフロキサシン、トブラマイシン、コリスチン、またはアズトレオナム、ならびに抗炎症活性を有することが公知である抗生物質、例えばエリスロマイシン、アジスロマイシン、またはクラリスロマイシンが挙げられる。
２．診断用薬剤
【０１００】
デンドリマーナノ粒子は、投与された粒子の位置を判定するのに有用な診断用薬剤を含んでいてもよい。これらの薬剤はまた、予防的に使用してもよい。例示的な診断的材料としては、常磁性分子、蛍光化合物、磁性分子、および放射線核種が挙げられる。好適な診断用薬剤としては、これらに限定されるものではないが、Ｘ線造影剤および造影媒体が挙げられる。放射線核種も造影剤として使用することができる。例示的な放射性標識としては、１４Ｃ、３６Ｃｌ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５１Ｃｒ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１１１Ｌｎ、１５２Ｅｕ、５９Ｆｅ、６７Ｇａ、３２Ｐ、１８６Ｒｅ、３５Ｓ、７５Ｓｅ、１７５Ｙｂが挙げられる。他の好適なコントラスト剤の例としては、放射線不透過性の気体、または気体放出化合物が挙げられる。一部の実施形態では、デンドリマーナノ粒子中に組み込まれることになる造影剤は、フルオロフォア（例えば、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、フィコエリトリン（ＰＥ））、酵素（例えば、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ）、エレメント粒子（例えば、金粒子）である。
Ｄ．賦形剤およびデバイス
【０１０１】
組成物は、賦形剤と組み合わせて投与することができる。好ましい実施形態では、組成物は、全身経路、例えば注射を介して投与される。典型的な担体は、滅菌水、生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、および他の注射可能な担体である。
【０１０２】
非経口（筋肉内、腹腔内、静脈内（ＩＶ）または皮下注射）、経腸、および局所投与経路によって投与するために製剤化された医薬組成物を記載する。
１．非経口投与
【０１０３】
デンドリマーは、硬膜下、静脈内、髄腔内、脳室内、動脈内、羊膜内、腹腔内、または皮下経路によって非経口で投与することができる。
【０１０４】
液体製剤に関しては、薬学的に許容される担体は、例えば、水性もしくは非水性溶液、懸濁液、エマルションまたは油であってもよい。非経口ビヒクル（皮下、静脈内、動脈内、または筋肉内注射用）としては、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲルおよび固定油がある。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、例えば、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、シクロデキストリン、エマルションまたは懸濁液が挙げられる。デンドリマーは、エマルション、例えば油中水型としても投与することができる。油の例は、石油、動物、植物、または合成起源、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱物油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ、ペトロラタム、および鉱物のものである。非経口製剤として使用するのに好適な脂肪酸としては、例えば、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。
【０１０５】
非経口投与に好適な製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、ならびに目的のレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含んでいてもよい水性および非水性滅菌懸濁液を含んでいてもよい。静脈内ビヒクルは、流体および栄養補給液、電解質補給液、例えばリンゲルデキストロースベースのものを含んでいてもよい。一般的に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液、ならびにグリコール、例えばプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールは、特に注射用溶液に好ましい液体担体である。
【０１０６】
注射可能な組成物のための注射可能な医薬品担体は、当業者であれば周知である（例えば、Pharmaceutics  and  Pharmacy  Practice,  J.B.  Lippincott  Company,  Philadelphia,  PA,  Banker  and  Chalmers,  eds.,  pages  238-250  (1982)、およびASHP  Handbook  on  Injectable  Drugs,  Trissel,  15th  ed.,  pages  622-630  (2009)を参照のこと）。
【０１０７】
対流強化送達（「ＣＥＤ」）のための製剤は、低分子量の塩（sales）および糖、例えばマンニトールの溶液を含む。
２．経腸投与
【０１０８】
デンドリマーは、経腸で投与することができる。担体または希釈剤は、固体製剤用の固体担体もしくは希釈剤、液体製剤用の液体担体もしくは希釈剤、またはこれらの混合物であってもよい。
【０１０９】
液体製剤に関しては、薬学的に許容される担体は、例えば、水性もしくは非水性溶液、懸濁液、エマルションまたは油であってもよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、例えば、生理食塩水および緩衝媒体を含む、水、アルコール／水溶液、シクロデキストリン、エマルションまたは懸濁液がある。
【０１１０】
油の例は、石油、動物、植物、または合成起源のもの、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱物油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ、ペトロラタム、および鉱物である。非経口製剤として使用するのに好適な脂肪酸としては、例えば、オレイン酸、ステアリン酸、およびイソステアリン酸が挙げられる。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、好適な脂肪酸エステルの例である。
【０１１１】
ビヒクルとしては、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲルおよび固定油が挙げられる。製剤は、例えば、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および目的のレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含有していてもよい水性および非水性等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および防腐剤を含んでいてもよい水性および非水性滅菌懸濁液を含む。ビヒクルは、例えば、液体栄養補給液、電解質補給液、例えばリンゲルデキストロースベースのものを含んでいてもよい。一般的に、水、生理食塩水、水性デキストロースおよび関連する糖溶液は、好ましい液体担体である。これらはまた、タンパク質、脂質、糖および人工栄養乳の他の構成成分とともに製剤化される場合もある。
３．局所投与
【０１１２】
活性剤および必要に応じた送達ビヒクルは、局所的に適用してもよい。局所投与は、例えば、外科手術中の露出した組織、血管系に、または組織もしくはプロテーゼに直接適用することを含んでいてもよい。局所投与に好ましい組織は眼である。
ＩＩＩ．デンドリマーナノ粒子を作製するための方法
【０１１３】
デンドリマーを合成する方法およびデンドリマーナノ粒子を作製する方法も記載する。
Ａ．デンドリマー
【０１１４】
デンドリマーは、さまざまな化学的反応ステップを介して調製することができる。デンドリマーは、構築の全ての段階においてその構造を制御できる方法に従って通常合成する。樹状構造は、発散的なまたは収束的な２つの主要な異なるアプローチによって大部分は合成される。
【０１１５】
一部の実施形態では、デンドリマーは、一連の反応、通常はマイケル反応によって外側に延長される多機能性コアから組み立てる発散的な方法を使用して、調製する。戦略は、反応性基および保護基を有するモノマー分子を多機能性コア部分とカップリングさせ、それによってコア周囲の世代が段階的に付加され、続いて保護基が除去されることを伴う。例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）アクリルアミドモノマーをアンモニアコアにカップリングすることによって、ＰＡＭＡＭ−ＮＨ２デンドリマーを最初に合成した。
【０１１６】
他の実施形態では、デンドリマーは、最終的に球の表面に位置する小分子から構築され、反応が内部に向かって進行し、内部に向かって構築され、最終的にはコアに付加される収束的な方法を使用して、調製する。
【０１１７】
デンドリマーを調製するための多くの他の合成経路、例えば、直交性(orthogonal)アプローチ、加速的アプローチ、二段階収束法またはハイパーコアアプローチ、ハイパーモノマー法または分岐モノマーアプローチ、二十指数関数法；直交性カップリング法または２ステップアプローチ、２モノマーアプローチ、ＡＢ２−ＣＤ２アプローチが存在する。
【０１１８】
一部の実施形態では、デンドリマーのコア、１つもしくは複数の分岐単位、１つもしくは複数のリンカー／スペーサー、および／または１つもしくは複数の表面基は、クリックケミストリーを介した、１つまたは複数の銅支援アジド−アルキン付加環化（ＣｕＡＡＣ）、ディールス−ハンノキ反応、チオール−エンおよびチオール−イン反応、ならびにアジド−アルキン反応を用いて、さらなる官能基（分岐単位、リンカー／スペーサー、表面基など）、モノマー、および／または活性剤へのコンジュゲートを可能にするように修飾することができる（Arseneault  M  et  al.,  Molecules.  2015  May  20;20(5):9263-94）。一部の実施形態では、予め作製されたデンドロンは、高密度ヒドロキシルポリマーにクリックする。「クリックケミストリー」は、第１の部分の表面上のアルキン部分（またはそれと同等のもの）と、第２の部分上のアジド部分（例えば、トリアジン組成物に存在する）（またはそれと同等のもの）（または任意の活性末端基、例えば、第１級アミン末端基、ヒドロキシル末端基、カルボン酸末端基、チオール末端基など）との間の１，３−双極性付加環化反応を介した、例えば、２つの異なる部分（例えば、コア基および分岐単位、または分岐単位および表面基）のカップリングを伴う。
【０１１９】
一部の実施形態では、デンドリマー合成は、チオール−エンクリック反応、チオール−インクリック反応、ＣｕＡＡＣ、ディールス−ハンノキクリック反応、アジド−アルキンクリック反応、マイケル付加、エポキシ開環、エステル化、シランケミストリー、およびこれらの組合せからなる群から選択される１つまたは複数の反応に応答する。
【０１２０】
さらなる実施形態では、ＰＥＧ系デンドリマーは、直交性ケミストリーを使用し、少ない反応ステップを用いてグラム規模量で迅速に合成し、広範囲に研究されているＰＡＭＡＭデンドリマーの第４世代と比較して、第２世代において同様の表面密度（約６０個末端のヒドロキシル基）を示す。
【０１２１】
任意の現存する樹状プラットフォームは、高ヒドロキシル含有部分、例えば１−チオ−グリセロールまたはペンタエリスリトールをコンジュゲートすることによって、所望の官能性の、すなわち高密度の表面ヒドロキシル基を有するデンドリマーを作製するために使用することができる。例示的な樹状プラットフォーム、例えばポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリ（プロピレンイミン）（ＰＰＩ）、ポリ−Ｌ−リシン、メラミン、ポリ（エーテルヒドロキシルアミン）（ＰＥＨＡＭ）、ポリ（エステルアミン）（ＰＥＡ）およびポリグリセロールを合成し、研究してもよい。
Ｂ．デンドリマー複合体
【０１２２】
デンドリマー複合体は、デンドリマー、樹状ポリマーまたはハイパー分岐ポリマーにコンジュゲートされたまたは付加された治療的活性剤または化合物から形成することができる。１つまたは複数の活性剤をデンドリマーにコンジュゲートすることは当技術分野において公知であり、米国特許出願公開第２０１１／００３４４２２号、同第２０１２／０００３１５５号、および同第２０１３／０１３６６９７号で詳細に説明されている。
【０１２３】
一部の実施形態では、１つまたは複数の活性剤は、デンドリマーに共有結合により付加される。一部の実施形態では、活性剤は、ｉｎ  ｖｉｖｏで切断されるように設計された部分を連結することを介して、デンドリマーに付加される。連結部分は、加水分解的に、酵素的に、またはこれらの組合せで切断されるように設計し、その結果、ｉｎ  ｖｉｖｏで活性剤の持続放出を提供することができる。活性剤への連結部分およびそれを付加する点の両方の組成は、連結部分の切断が、活性剤または好適なこれらのプロドラッグのいずれかを放出することができるように選択される。連結部分の組成はまた、活性剤の所望の放出速度を考慮して選択してもよい。
【０１２４】
一部の実施形態では、付加は、ジスルフィド、エステル、エーテル、チオエステル、カルバメート、カルボネート、ヒドラジン、またはアミド連結のうちの１つまたは複数を介して生じる。好ましい実施形態では、付加は、薬剤とデンドリマーとの間にジスルフィド架橋を提供する適切なスペーサーを介して生じる。この場合、デンドリマー複合体は、薬剤を、身体で認められる還元条件下、チオール交換反応によってｉｎ  ｖｉｖｏで迅速に放出することができる。形成のための一部の好適なスペーサーは、前述の薬剤とデンドリマーとの間のジスルフィド架橋である。
【０１２５】
連結部分は、１つまたは複数の有機官能基を一般的に含む。好適な有機官能基の例としては、第２級アミド（−ＣＯＮＨ−）、第３級アミド（−ＣＯＮＲ−）、第２級カルバメート（−ＯＣＯＮＨ−；−ＮＨＣＯＯ−）、第３級カルバメート（−ＯＣＯＮＲ−；−ＮＲＣＯＯ−）、尿素（−ＮＨＣＯＮＨ−；−ＮＲＣＯＮＨ−；−ＮＨＣＯＮＲ−、−ＮＲＣＯＮＲ−）、カルビノール（−ＣＨＯＨ−、−ＣＲＯＨ−）、ジスルフィド基、ヒドラゾン、ヒドラジド、エーテル（−Ｏ−）、およびエステル（−ＣＯＯ−、−ＣＨ２Ｏ２Ｃ−、ＣＨＲＯ２Ｃ−）（式中、Ｒは、アルキル基、アリール基、または複素環式基である）が挙げられる。一般的に、連結部分内の１つまたは複数の有機官能基の同一性は、活性剤の所望の放出速度を考慮して選択することができる。さらに、１つまたは複数の有機官能基は、活性剤のデンドリマーへの共有結合的な付加を促進するために選択することができる。好ましい実施形態では、付加は、薬剤とデンドリマーとの間のジスルフィド架橋を提供する適切なスペーサー介して生じる場合がある。デンドリマー複合体は、身体で認められる還元条件下、チオール交換反応によってｉｎ  ｖｉｖｏで薬剤を迅速に放出することができる。
【０１２６】
ある特定の実施形態では、連結部分は、上述の有機官能基のうちの１つまたは複数をスペーサー基と組み合わせて含む。スペーサー基は、オリゴマーおよびポリマー鎖を含む原子の任意のアセンブリーから構成されていてもよいが、スペーサー基における原子の合計数は、好ましくは３から２００原子の間、より好ましくは３から１５０原子の間、より好ましくは３から１００原子の間、最も好ましくは３から５０原子の間である。好適なスペーサー基の例としては、アルキル基、ヘテロアルキル基、アルキルアリール基、オリゴ−およびポリエチレングリコール鎖、ならびにオリゴ−およびポリ（アミノ酸）鎖が挙げられる。スペーサー基の変形形態によって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの抗炎症剤の放出はさらに制御される。連結部分がスペーサー基を含む実施形態では、１つまたは複数の有機官能基は、スペーサー基を抗炎症剤とデンドリマーの両方に接続するために一般的に使用することになる。
【０１２７】
活性剤をデンドリマーに共有結合により付加するのに有用である反応および戦略は、当技術分野において公知である。例えば、March,  "Advanced  Organic  Chemistry,"  5th  Edition,  2001,  Wiley-Interscience  Publication,  New  York)およびHermanson,  "Bioconjugate  Techniques,"  1996,  Elsevier  Academic  Press,  U.S.Aを参照されたい。所与の活性剤の共有結合的な付加に適切な方法は、所望の連結部分ならびに活性剤およびデンドリマーの構造を考慮して選択してもよく、総じて官能基の適合性、保護基の戦略、および不安定な結合の存在に関連する。
【０１２８】
最適な薬物担持は、薬物の選択、デンドリマーの構造およびサイズ、ならびに処置されることになる組織を含む多くの因子に必然的に依存することになる。一部の実施形態では、１つまたは複数の活性薬は、約０．０１重量％から約４５重量％、好ましくは約０．１重量％から約３０重量％、約０．１重量％から約２０重量％、約０．１重量％から約１０重量％、約１重量％から約１０重量％、約１重量％から約５重量％、約３重量％から約２０重量％、および約３重量％から約１０重量％の濃度で、デンドリマーにカプセル化、会合、および／またはコンジュゲーされている。しかし、任意の所与の薬物、デンドリマー、および標的部位に最適な薬物担持は、記載済みのものなどの常用の方法によって同定することができる。
【０１２９】
一部の実施形態では、活性剤および／またはリンカーのコンジュゲートは、１つまたは複数の表面および／または内部ヒドロキシル基を介して生じる。したがって、一部の実施形態では、活性剤／リンカーのコンジュゲートは、コンジュゲート前のデンドリマーの利用可能な全てのヒドロキシル基の約１％、２％、３％、４％、５％を介して生じる。他の実施形態では、活性剤／リンカーのコンジュゲートは、コンジュゲート前のデンドリマーの利用可能な全てのヒドロキシル基の５％未満、１０％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、３５％未満、４０％未満、４５％未満、５０％未満、５５％未満、６０％未満、６５％未満、７０％未満、７５％未満で生じる。好ましい実施形態では、デンドリマー複合体は、ミクログリアおよび／またはアストロサイトを標的とするのに有効量のヒドロキシル基を保持し、同時に眼および／またはＣＮＳの疾患、障害、および／または傷害を処置、予防および／またはイメージングするのに有効量の活性剤にコンジュゲートする。
ＩＶ．使用方法
【０１３０】
デンドリマー複合体組成物を使用する方法も記載する。好ましい実施形態では、デンドリマー複合体は、障害または損傷を受けたＢＢＢを通過し、活性化ミクログリアおよびアストロサイトを標的とする。
Ａ．処置する方法
【０１３１】
製剤は、感染症、炎症、またはがん、特に神経系、特にＣＮＳにまで及ぶ全身性炎症を有するものと関連する障害を処置するために投与してもよい。
【０１３２】
典型的には、デンドリマーと１つまたは複数の治療的、予防的、および／または診断的活性剤との組合せを含む有効量のデンドリマー複合体を、それを必要とする個体に投与する。デンドリマーは、標的化剤も含んでいてもよいが、例で立証されるように、これらは脊髄および脳における傷害組織への送達に必須ではない。
【０１３３】
一部の実施形態では、デンドリマー複合体は、ｉｎ  ｖｉｖｏで認められる還元条件下で、薬物を細胞内に優先的に放出することができるデンドリマーに付加またはコンジュゲートされている薬剤を含む。薬剤は、共有結合により付加されているかまたは分子内分散されているかまたはカプセル化されていてもよい。対象に投与するデンドリマー複合体の量は、対照、例えばデンドリマーを有さない活性剤で処置された対象と比較して、処置されることになる疾患または障害の１つまたは複数の臨床的または分子的症状を減少、予防、そうでなければ緩和するような有効量を送達するように選択する。
Ｂ．処置されることになる状態
【０１３４】
組成物は、眼、脳、および神経系、特にミクログリアおよびアストロサイトの病理学的活性化と関連するものにおける１つまたは複数の疾患、状態、および傷害を処置するのに好適である。組成物は、胃腸障害、眼疾患を含む他の疾患、障害および傷害の処置、ならびに神経が疾患または障害の一因となる他の組織の処置にも使用してもよい。組成物および方法は、予防的使用にも好適である。
【０１３５】
治療的、予防的または診断的薬剤を送達する、好ましくは直径が１５ｎｍ未満であり、表面ヒドロキシル基密度が少なくとも３ＯＨ基／ｎｍ２の、好ましくは１０ｎｍ未満であり、表面ヒドロキシル基密度が少なくとも４ＯＨ基／ｎｍ２の、より好ましくは５ｎｍ未満であり、表面ヒドロキシル基密度が少なくとも５ＯＨ基／ｎｍ２の、最も好ましくは１〜２ｎｍの間であり、ヒドロキシル基表面密度が少なくとも４ＯＨ基／ｎｍ２のデンドリマー複合体組成物は、神経発達疾患、神経変性疾患、壊死性腸炎、および脳がんを含む多くの障害および状態の病因の重大な一因となるミクログリアおよびアストロサイトを選択的に標的とする。したがって、デンドリマー複合体は、ミクログリアおよびアストロサイトの病理学的状態と関連する状態を処置または緩和するのに効果的な投薬量単位量で投与される。一般的に、デンドリマーは、これらの細胞を標的とすることによって、神経炎症を処置するために薬剤を特異的に送達する。
【０１３６】
ミクログリアは、脳および脊髄全体にわたって位置するある種の神経膠（グリア細胞）である。ミクログリアは、脳内に認められる全細胞の１０〜１５％を占める。常在マクロファージ細胞のように、これらは中枢神経系（ＣＮＳ）における活性免疫防御の第１の主要な形態として作用する。ミクログリアは、ＣＮＳ傷害後に鍵となる役割を果たし、傷害のタイミングおよびタイプに基づいて保護性と有害な影響の両方を有する場合がある（Kreutzberg,  G.  W.  Trends  in  Neurosciences,  19,  312  (1996)、Watanabe,  H.,  et  al.,  Neuroscience  Letters,  289,  53  (2000)、Polazzi,  E.,  et  al.,  Glia,  36,  271  (2001)、Mallard,  C.,  et  al.,  Pediatric  Research,  75,  234  (2014)、Faustino,  J.  V.,  et  al.,  The  Journal  of  Neuroscience  :  The  Official  Journal  Of  The  Society  For  Neuroscience,  31,  12992  (2011)、Tabas,  I.,  et  al.,  Science,  339,  166  (2013)、およびAguzzi,  A.,  et  al.,  Science,  339,  156  (2013)）。ミクログリアの機能における変化は、正常な神経発達およびシナプス刈込みにも影響を与える（Lawson,  L.  J.,  et  al.,  Neuroscience,  39,  151  (1990)、Giulian,  D.,  et  al.,  The  Journal  Of  Neuroscience  :  The  Official  Journal  Of  The  Society  For  Neuroscience,  13,  29  (1993)、Cunningham,  T.  J.,  et  al.,  The  Journal  of  Neuroscience  :  The  Official  Journal  Of  The  Society  For  Neuroscience,  18,  7047  (1998)、Zietlow,  R.,  et  al.,  The  European  Journal  Of  Neuroscience,  11,  1657  (1999)、およびPaolicelli,  R.  C.,  et  al.,  Science,  333,  1456  (2011)）。ミクログリアは、傷害後、形態が枝状構造からアメーバ状構造へ顕著に変化し、増殖する。生じた神経炎症は、傷害部位において血液脳関門を破壊し、急性および慢性の神経および希突起膠細胞死をもたらす。したがって、炎症促進性ミクログリアを標的とすることは、強力で効果的な治療的戦略のはずである。神経炎症性疾患において障害を受けたＢＢＢは、薬物を有するナノ粒子の脳への輸送に利用することができる。
【０１３７】
好ましい実施形態では、デンドリマーは、関連する毒性を伴わずに、それを必要とする対象におけるミクログリア介在性病状を処置するのに有効な量で投与される。
【０１３８】
一部の実施形態では、処置されることになる対象はヒトである。一部の実施形態では、処置されることになる対象は、小児または乳児である。全ての方法は、処置を必要とする対象、または前述の組成物の投与から利益を得るであろう対象を特定および選択するステップを含んでいてもよい。
１．眼疾患および傷害
【０１３９】
組成物および方法は、眼と関連する不快感、疼痛、乾燥、涙の過剰分泌、傷害、感染症、熱傷の処置に好適である。
【０１４０】
処置することができる眼障害の例としては、アメーバ性角膜炎、真菌性角膜炎、細菌性角膜炎、ウイルス性角膜炎、糸状虫（onchorcercal）角膜炎、細菌性角結膜炎、ウイルス性角結膜炎、角膜ジストロフィー疾患、フックス内皮ジストロフィー、マイボーム腺機能不全、前部および後部眼瞼炎、結膜充血、結膜壊死、瘢痕性瘢痕および線維症、点状上皮角膜症、糸状角膜炎、角膜びらん、菲薄化、潰瘍および穿孔、シェーグレン症候群、スティーブンジョンソン症候群、自己免疫性ドライアイ疾患、環境性ドライアイ疾患、角膜新血管形成疾患、角膜移植後拒絶の予防および処置、自己免疫性ブドウ膜炎、感染性ブドウ膜炎、前部ブドウ膜炎、後部ブドウ膜炎（トキソ血漿症を含む）、全ブドウ膜炎、硝子体または網膜の炎症性疾患、眼内炎の予防および処置、黄斑浮腫、黄斑変性症、加齢黄斑変性症、増殖性および非増殖性糖尿病性網膜症、高血圧性網膜症、網膜の自己免疫性疾患、原発性および転移性眼内黒色腫、他の眼内転移性腫瘍、解放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、色素性緑内障、ならびにこれらの組合せが挙げられる。他の障害としては、角膜の傷害、熱傷、または剥離、白内障、および眼の加齢による変性またはそれに伴う視覚の変性が挙げられる。
【０１４１】
好ましい実施形態では、処置されることになる眼障害は、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）である。加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）は、中心視野の損失の原因となる、黄斑の神経変性、神経炎症性疾患である。加齢黄斑変性症の病因は、脈絡膜（網膜下血管層）、網膜色素上皮（ＲＰＥ）、網膜神経感覚上皮（neurosensory  retina）下の細胞層、ブルッフ膜および網膜神経感覚上皮自体における慢性神経炎症に関与する。
２．神経疾患および神経変性疾患
【０１４２】
神経変性疾患は、神経および行動機能に影響を与える神経系の慢性進行性障害であり、明らかに組織病理学的および臨床的な症候群につながる生化学的変化に関与する（Hardy  H,  et  al.,  Science.  1998;282:1075-9）。細胞分解機序に対して耐性がある異常タンパク質が細胞内に蓄積する。神経損失のパターンは、１つのグループが影響を受けるのに対して、他のグループは無傷なままであるという意味で、選択的である。疾患に関する明確な誘発事象は存在しないことが多い。神経変性として古典的に記載されている疾患は、アルツハイマー疾患、ハンチントン疾患、およびパーキンソン疾患である。
【０１４３】
活性化ミクログリアおよびアストロサイトが介在する神経炎症は、さまざまな神経障害の主要な特質であり、潜在的な治療標的となる（Hagberg,  H  et  al.,  Annals  of  Neurology  2012,  71,  444、Vargas,  DL  et  al.,  Annals  of  Neurology  2005,  57,  67、およびPardo,  CA  et  al.,  International  Review  of  Psychiatry  2005,  17,  485）。複数の科学報告書が、これらの細胞を標的とすることによって初期の神経炎症を緩和すると、疾患の発症を遅延することができ、ひいては処置に関して長時間の治療域を提供することができることを示唆している（Dommergues,  MA  et  al.,  Neuroscience  2003,  121,  619、Perry,  VH  et  al.,  Nat  Rev  Neurol  2010,  6,  193、Kannan,  S  et  al.,  Sci.  Transl.  Med.  2012,  4,  130ra46、およびBlock,  ML  et  al.,  Nat  Rev  Neurosci  2007,  8,  57）。血液脳関門を通過して治療法を送達することは困難な課題である。神経炎症は血液脳関門（ＢＢＢ）の破壊をもたらす。神経炎症性障害において障害を受けたＢＢＢは、薬物担持ナノ粒子を脳に通過させ、輸送するために利用される場合がある（Stolp,  HB  et  al.,  Cardiovascular  Psychiatry  and  Neurology  2011,  2011,  10、およびAhishali,  B  et  al.,  International  Journal  of  Neuroscience  2005,  115,  151）。
【０１４４】
組成物および方法は、神経疾患もしくは障害または神経変性疾患もしくは障害、または中枢神経系障害を処置するために活性剤を送達することにも使用してもよい。好ましい実施形態では、組成物および方法は、神経疾患もしくは障害または神経変性疾患もしくは障害、または中枢神経系障害と関連する神経炎症の処置および／または緩和において効果的である。方法は、典型的には、認知力を高めるかまたは認知力低下を減少させる、認知機能を高めるかまたは認知機能低下を減少させる、記憶力を高めるかまたは記憶力低下を減少させる、学習能力もしくは可能性を高めるかまたは学習能力もしくは可能性の低下を減少させる、あるいはこれらの組合せのために、有効量の組成物を対象に投与することを含む。
【０１４５】
神経変性は、ニューロン死を含む、ニューロンの構造または機能の進行性の損失を指す。例えば、組成物および方法は、疾患または障害、例えばパーキンソン疾患（ＰＤ）およびＰＤ関連障害、ハンチントン疾患（ＨＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、アルツハイマー疾患（ＡＤ）および他の認知症、プリオン疾患、例えばクロイツフェルトヤコブ疾患、皮質基底核変性症、前頭側頭型認知症、ＨＩＶ関連認知障害、軽度認知障害、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、脊髄小脳失調症（ＳＣＡ）、脊髄性筋萎縮症（ＳＭＡ）、フリードライヒ運動失調症、レビー小体疾患、アルパース疾患、バッテン疾患、脳−眼−顔面−骨格症候群、皮質基底核変性症、ゲルストマン−シュトロイスラー−シャインカー疾患、クールー、リー疾患、単肢筋萎縮症（Monomelic  Amyotrophy）、多系統萎縮症、起立性低血圧を伴う多系統萎縮症（シャイドレーガー症候群）、多発性硬化症（ＭＳ）、脳内鉄蓄積を伴う神経変性症、眼球クローヌスミオクローヌス、後部皮質萎縮症、原発性進行性失語症、進行性核上性麻痺、血管性認知症、進行性多巣性白質脳症、レビー小体型認知症（ＤＬＢ）、ラクナ症候群、水頭症、ウェルニッケコルサコフ症候群、脳炎後認知症、がんおよび化学療法関連の認知障害および認知症、ならびに抑うつ誘発性認知症および偽認知症を呈する対象を処置するために使用することができる。
【０１４６】
一部の実施形態では、障害は、神経細胞を覆うミエリン鞘の成長または維持に対する悪影響によって特徴づけられるペルオキシソーム障害または白質ジストロフィーである。白質ジストロフィーは、例えば、ミエリン塩基性タンパク質の欠乏を伴う１８ｑ症候群、急性播種性脳脊髄炎（Encephalomyeolitis）（ＡＤＥＭ）、急性播種性白質脳炎、急性出血性白質脳症、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）、副腎脊髄神経症（ＡＭＮ）、エカルディグティエール症候群、アレキサンダー疾患、成人発症常染色体優性白質ジストロフィー（ＡＤＬＤ）、神経軸索スフェロイドを伴う常染色体優性びまん性白質脳症（ＨＤＬＳ）、常染色体優性遅発性白質脳症、びまん性ＣＮＳ低髄鞘形成を伴う小児運動失調症（ＣＡＣＨまたは白質消失疾患）、カナバン疾患、皮質下梗塞および白質脳症を伴う常染色体優性脳動脈症（ＣＡＤＡＳＩＬ）、脳腱黄色腫症（ＣＴＸ）、白質脳症を伴う頭蓋骨幹端異形成症、ＲＮＡＳＥＴ２を伴う嚢胞性白質脳症、臨床症状を伴わない広範な大脳白質異常、小脳性運動失調および認知症として現れる家族性成人発症白質ジストロフィー、成人発症型認知症および異常な糖脂質蓄積を伴う家族性白質ジストロフィー、グロボイド細胞白質ジストロフィー（クラッベ疾患）、慢性進行性多発性硬化症を模倣した遺伝性成人発症型白質ジストロフィー、大脳基底核および小脳の萎縮を伴う低髄鞘形成症（ＨＡＢＣ）、低髄鞘形成症、ゴナドトロピン欠乏症、性腺機能低下症および歯数不足症（４Ｈ症候群）、白質ジストロフィーを伴う脂肪膜性骨異形成症（那須疾患）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、皮質下嚢胞を伴う大頭型白質ジストロフィー（ＭＬＣ）、軸索性スフェロイドを伴う神経軸索白質脳症（スフェロイドを伴う遺伝性びまん性白質脳症−ＨＤＬＳ）、新生児副腎白質ジストロフィー（ＮＡＬＤ）、脳の白質異常を伴う眼歯指（Oculodetatoldigital）異形成症、色素性グリアを伴う正染性白質ジストロフィー、卵巣白質ジストロフィー症候群、ペリツェウスメルツバッハー疾患（Ｘ連鎖痙性対麻痺）、レフサム疾患、シェーグレンラルソン症候群、スダン好性白質ジストロフィー、ファンデルクナープ症候群（皮質下嚢胞またはＭＬＣを伴う空胞性白質ジストロフィー）、びまん性中枢神経系低髄鞘形成を伴う白質消失疾患（ＶＷＭ）または小児運動失調症（ＣＡＣＨ）、Ｘ連鎖副腎白質ジストロフィー（Ｘ−ＡＬＤ）、およびツェルウェーガー症候群を含むツェルウェーガースペクトル障害、新生児副腎白質ジストロフィー、乳児レフサム疾患、脳幹および脊髄の関与とラクテート上昇とを伴う白質脳症（ＬＢＳＬ）、またはＤＡＲＳ２白質脳症であってもよい。好ましい実施形態では、白質ジストロフィーは、副腎白質ジストロフィー（ＡＬＤ）（Ｘ連鎖ＡＬＤを含む）、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）、クラッベ疾患（グロボイド白質ジストロフィー）、またはＤＡＲＳ２白質脳症である。
【０１４７】
一部の実施形態では、対象は、興奮毒性障害を有する。興奮毒性は、神経細胞が過剰に刺激されたために損傷を受けるようになるプロセスである。脳卒中、外傷性脳傷害、多発性硬化症、筋萎縮性側索硬化症、アルツハイマー疾患、および脊髄傷害を含むいくつかの状態が、興奮毒性と関連している。神経細胞への損傷は、対応する神経症状をもたらし、どの細胞が損傷を受けたかおよび損傷がどの程度広範であるかによって変動する場合がある。一度損傷を受けると、神経細胞は修復されることができず、患者に永続的な障害が認められる場合がある。神経傷害へ向かうグルタメート興奮毒性カスケードを遮断するか、それに影響を与えるか、またはそれを一時的に停止させる試みにおいて、いくつかの薬物が開発され、使用されてきた。１つの戦略は、グルタメート放出を減少させるための「上流」の試みである。薬物のこのカテゴリーとしては、リルゾール、ラモトリジン、およびリファリジンがあり、これらはナトリウムチャネルブロッカーである。通常使用するニモジピンは、電位依存性チャネル（Ｌ型）ブロッカーである。カップリングしたグルタメート受容体自体のさまざまな位置に影響を与える試みも行われている。これらの薬物の一部としては、フェルバメート、イフェンプロジル、マグネシウム、メマンチン、およびニトログリセリンが挙げられる。これらの「下流」薬物は、フリーラジカル形成、一酸化窒素形成、タンパク質分解、エンドヌクレアーゼ活性、およびＩＣＥ様プロテアーゼ形成（プログラムされた細胞死またはアポトーシスを引き起こすプロセスにおける重要な構成成分）のような細胞内事象に影響を与えようとする。したがって、一部の実施形態では、デンドリマー複合体は、興奮毒性障害を処置するための１つまたは複数の活性剤を含む。
【０１４８】
一部の実施形態では、対象は、神経系障害を有するか、または神経保護を必要とする。例示的な状態および／または対象としては、これらに限定されるものではないが、脳卒中、外傷性脳傷害、脊髄傷害、外傷後ストレス症候群、またはこれらの組合せを有していた対象、これらを呈する対象、またはこれらを発症もしくはこれらに罹患する可能性が高い対象が挙げられる。
【０１４９】
一部の実施形態では、組成物および方法は、神経変性疾患の１つもしくは複数の分子もしくは臨床症状、または神経変性をもたらす１つもしくは複数の機序を減少させるかまたは予防するような有効量でそれを必要とする対象に投与する。
【０１５０】
神経変性疾患を処置するための活性剤は、当技術分野において周知であり、処置することになる症状および疾患に基づいて変更してもよい。例えば、パーキンソン疾患のための従来の処置としては、レボドパ（ドーパデカルボキシラーゼ阻害剤もしくはＣＯＭＴ阻害剤と通常組み合わせる）、ドーパミンアゴニスト、またはＭＡＯ−Ｂ阻害剤を挙げることができる。
【０１５１】
ハンチントン疾患のための処置としては、異常行動および運動を減少させる助けとなるドーパミンブロッカー、または運動などを制御するためのアマンタジンおよびテトラベナジンなどの薬物を挙げることができる。舞踏病を減少させる助けとなる他の薬物としては、神経遮断薬およびベンゾジアゼピンが挙げられる。化合物、例えばアマンタジンまたはレマセミドは、予備段階で陽性の結果を示している。運動機能低下および硬直は、特に若年性の場合は、抗パーキンソン病薬で処置してもよく、ミオクローヌス多動症は、バルプロ酸で処置してもよい。精神医学的な症状は、一般的な母集団において使用されるものと同様の医薬品で処置してもよい。選択的セロトニン再取り込み阻害剤およびミルタザピンは、抑うつに推奨されている一方、非定型抗精神病薬は、精神障害および行動障害に推奨される。
【０１５２】
抗興奮性毒素のリルゾール（ＲＩＬＵＴＥＫ（登録商標））（２−アミノ−６−（トリフルオロメトキシ）ベンゾチアゾール）は、ＡＬＳを呈する対象において生存期間を改善している。他の医薬品は、大部分の使用が適用外であり、介入することによってＡＬＳに起因する症状を減少することができる。いくつかの処置は、クオリティオブライフを改善し、いくつかの処置は、寿命を延ばすと思われる。一般的なＡＬＳ関連療法は、Gordon,  Aging  and  Disease,  4(5):295-310  (2013)（例えば、その中の表１を参照のこと）でレビューされている。いくつかの他の薬剤で、１つまたは複数の臨床試験が、非有効から有望までの範囲の有効性とともに行われている。例示的な薬剤は、Carlesi,  et  al.,  Archives  Italiennes  de  Biologie,  149:151-167  (2011)でレビューされている。例えば、治療法は、興奮毒性を減少させる薬剤、例えばタランパネル（８−メチル−７Ｈ−１，３−ジオキソロ（２，３）ベンゾジアゼピン）、セファロスポリン、例えばセフトリアキソン、もしくはメマンチン、酸化ストレスを減少させる薬剤、例えば補酵素Ｑ１０、マンガノポルフィリン、ＫＮＳ−７６０７０４［（６Ｒ）−４，５，６，７−テトラヒドロ−Ｎ６−プロピル−２，６−ベンゾチアゾール−ジアミン二塩酸塩、ＲＰＰＸ］、もしくはエダラボン（３−メチル−１−フェニル−２−ピラゾリン−５−オン、ＭＣＩ−１８６）、アポトーシスを減少させる薬剤、例えばバルプロ酸を含むヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＴＣＨ３４６（ジベンゾ（ｂ，ｆ）オキセピン−１０−イルメチル−メチルプロパ−２−イニルアミン）、ミノサイクリン、もしくはタウロウルソデオキシコール酸（ＴＵＤＣＡ）、神経炎症を減少させる薬剤、例えばサリドマイドおよびセラストール、向神経剤、例えばインスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）もしくは血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、ヒートショックタンパク質インデューサー、例えばアリモクロモール、またはオートファジーインデューサー、例えばラパマイシンもしくはリチウムを含んでいてもよい。
【０１５３】
アルツハイマー疾患のための処置は、例えばアセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えばタクリン、リバスチグミン、ガランタミンもしくはドネペジル、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、例えばメマンチン、または抗精神病薬を含んでいてもよい。
【０１５４】
レビー小体型認知症のための処置は、例えば、アセチルコリンエステラーゼ阻害剤、例えばタクリン、リバスチグミン、ガランタミンもしくはドネペジル、Ｎ−メチルｄ−アスパルテート受容体アンタゴニストメマンチン、ドーパミン療法、例えば、レボドパもしくはセレギリン、抗精神病、例えばオランザピンもしくはクロザピン、ＲＥＭ障害治療法、例えばクロナゼパム、メラトニン、もしくはクエチアピン、抗抑うつおよび抗不安療法、例えば選択的セロトニン再取り込み阻害剤（シタロプラム、エスシタロプラム、セルトラリン、パロキセチンなど）、またはセロトニンおよびノルアドレナリン再取り込み阻害剤（ベンラファクシン、ミルタザピン、およびブプロピオン）を含んでいてもよい（例えば、Macijauskiene,  et  al.,  Medicina  (Kaunas),  48(1):1-8  (2012)を参照のこと）。
【０１５５】
例示的な神経保護剤も当技術分野において公知であり、例えば、グルタメートアンタゴニスト、抗酸化剤、およびＮＭＤＡ受容体刺激薬を含む。他の神経保護剤および処置は、カスパーゼ阻害剤、栄養素、抗タンパク質凝集剤、治療的低体温、およびエリスロポエチンを含む。
【０１５６】
神経機能不全を処置するための他の一般的な活性剤としては、アマンタジンおよび運動症状を処置するための抗コリン作動薬、精神障害を処置するためのクロザピン、認知症を処置するためのコリンエステラーゼ阻害剤、ならびに日中の眠気を処置するためのモダフィニルがある。
３．神経発達障害
【０１５７】
神経発達障害は、脳が最初から正常に形成されていないことを一般的に示唆する。基本的な神経発達プロセスの異常調節が生じる場合があるか、またはさまざまな形態をとる傷害によって破壊が存在する場合がある。自閉症および注意欠陥多動性障害は、神経発達障害として古典的に記載されている。
【０１５８】
脳性麻痺（ＣＰ）は、最も一般的な小児神経／神経発達障害の１つであり、現在は出生数１０００件当たりおよそ２から３件に影響を与えると推定されている（Kirby,  RS  et  al.,  Research  in  Developmental  Disabilities,  32,  462  (2011)）。ＣＰは幼児期に認識され、その状態が一生続く。ＣＰの最も一般的な原因としては、早産、低酸素症性虚血および胎盤機能不全、新生児仮死および母体−胎児炎症が挙げられる（Dammann,  O.  Acta  Paediatrica  2007,  96,  6、Yoon,  BH  et  al.,  American  Journal  of  Obstetrics  and  Gynecology  2000,  182,  675、およびO'Shea,  TM  et  al.,  Journal  of  child  neurology  2012,  27,  22）。ＣＰは病因学において異質であり、疾患の機序は、非常に複雑であるが、神経炎症は、病因学に関係なく関与する一般的な病態生理学的機序である。神経炎症を標的とし、傷害部位に薬物を直接送達することは有益であり得る。
【０１５９】
組成物および方法は、神経発達障害、例えば脳性麻痺を処置するための活性剤の送達にも使用してもよい。好ましい実施形態では、組成物および方法は、神経発達障害、例えば脳性麻痺と関連する神経炎症を処置および／または緩和するのに効果的である。
【０１６０】
一部の実施形態では、デンドリマー複合体は、例えばレット症候群を含む神経発達障害において脳のミクログリアの炎症を処置、イメージング、および／または予防するのに効果的である。好ましい実施形態では、デンドリマー複合体は、抗炎症剤（Ｄ−ＮＡＣ）ならびに抗興奮毒性およびＤ−抗グルタメート剤を送達するために使用することになる。好ましい候補物質はＭＫ８０１、メマンチン、ケタミン、１−ＭＴである。
【０１６１】
一部の実施形態では、デンドリマー複合体は、自閉症スペクトル障害において脳のミクログリアの炎症を処置、イメージング、および／または予防するのに効果的である。「スペクトル」という用語は、ＡＳＤを呈する小児が有する場合がある障害または能力障害の広範囲の症状、技能、およびレベルを指す。一部の小児は、その症状によって中等度の障害がある一方、他の小児は重度の身体障害がある。the  Diagnostic  and  Statistical  Manual  of  Mental  Disordersの最新版（ＤＳＭ−５）には、アスペルガー症候群はもはや含まれていないが、アスペルガー症候群の特性はＡＳＤの広義のカテゴリーの範囲内に含まれている。
【０１６２】
この時点で、ＡＳＤの側面を処置するためにＦＤＡによって承認された医薬品は、抗精神病のリスペリドン（Ｒｉｓｐｅｒｄａｌ）およびアリプリパゾール（Ａｂｉｌｉｆｙ）のみである。ＡＳＤを呈する小児に適応外処方してもよい一部の医薬品としては、以下のものがある。
【０１６３】
抗精神病医薬品は、重篤な精神病、例えば統合失調症を処置するためにより一般的に使用される。これらの医薬は、ＡＳＤを呈する小児を含む、小児における攻撃性および他の重篤な行動障害を減少させる助けとなる。これらは、反復行動、多動性、および注意力不足を減少させる助けにもなり得る。
【０１６４】
抗うつ医薬品、例えばフルオキセチンまたはセルトラリンは、抑うつおよび不安を処置するために通常処方されるが、ときとして反復行動を減少させるために処方される。一部の抗うつ薬も、ＡＳＤを呈する小児における攻撃性および不安を制御する助けとなる。
【０１６５】
刺激性医薬品、例えばメチルフェニデート（ＲＩＴＡＬＩＮ（登録商標））は、注意欠陥多動性障害（ＡＤＨＤ）を呈するヒトの処置において安全で効果的である。メチルフェニデートは、ＡＳＤを呈する小児における多動性を同様に効果的に処置することが示されている。ＡＳＤを呈する小児の多くは、処置に対して応答しないが、ＡＤＨＤを呈する小児およびＡＳＤを呈していない小児よりもより多くの副作用を示した。
【０１６６】
デンドリマーコンジュゲートは、特に自閉症を呈する患者が、死後の脳標本において活性化ミクログリアおよびアストロサイトの存在が増加することによって、かつサイトカインのＣＳＦレベルにおいて認められるような神経炎症のエビデンスを有することを示す最近の研究を考慮すると、そのような個体の処置および診断に関して有効性を有するはずである。Vargas,  et  al.,  Ann  Neurol.  2005  Jan;57(1):67-81.  Erratum  in:  Ann  Neurol.  2005  Feb;57(2):304。
４．脳腫瘍
【０１６７】
本開示のデンドリマーの効果的な血液脳腫瘍関門（ＢＢＴＢ）の通過および均一な固形腫瘍分布は、脳腫瘍への治療的送達を顕著に強化することができる。そのサイズが小さく、表面電荷が中性に近い高密度ヒドロキシル表面基は、炎症、特に神経炎症と関連する細胞に選択的に局在する。
【０１６８】
組成物および方法は、対象における腫瘍の成長を遅延もしくは阻害すること、腫瘍の成長もしくはサイズを減少させること、腫瘍の転移を阻害もしくは減少させること、および／または腫瘍発症もしくは成長と関連する症状を阻害もしくは減少させることによって、良性または悪性腫瘍を有する対象を処置するのに有用である。
【０１６９】
組成物および方法を用いて処置してもよいがんのタイプとしては、これらに限定されるものではないが、神経膠腫、神経膠芽腫、神経膠肉腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、希突起膠腫、非グリア腫瘍（nonglial  tumor）、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体腫、松果体芽腫、原発性脳リンパ腫、神経節腫、神経鞘腫、脊索腫（cordomas）および下垂体腫瘍を含む脳腫瘍が挙げられる。
【０１７０】
デンドリマー複合体は、脳腫瘍またはそれと関連する症状を処置できることが公知である、１つまたは複数の追加の治療的活性剤と組み合わせて投与してもよい。
【０１７１】
例えば、デンドリマーは、静脈内投与を介して、または腫瘍全体もしくは腫瘍の一部を除去する外科手術中に、脳に投与してもよい。デンドリマーは、化学療法剤、例えば放射線療法を受けている対象の補助療法を強化するための薬剤を送達するために使用してもよく、ヒドロキシル末端デンドリマーは、脳の増殖性疾患においてＤＤＸ３活性を抑制するかまたは阻害するのに有効な量で、少なくとも１つの放射線増感剤に共有結合により連結されている。
【０１７２】
化学療法に加えて、外科的介入および放射線療法も、神経系のがんの処置において使用されることは、当業者であれば理解するであろう。放射線療法は、電離放射線を対象におけるがんの位置の傍で対象に投与することを意味する。一部の実施形態では、放射線増感剤を２つまたはそれを超える用量で投与し、その後、電離放射線を対象におけるがんの位置の傍で対象に投与する。さらなる実施形態では、放射線増感剤、続いて電離放射線の投与は、２回またはそれを超えるサイクルで繰り返すことができる。
【０１７３】
典型的には、電離放射線の用量は、腫瘍のサイズおよび位置により変動するが、用量は、０．１Ｇｙから約３０Ｇｙの範囲、好ましくは５Ｇｙから約２５Ｇｙの範囲である。
【０１７４】
一部の実施形態では、電離放射線は、定位アブレーション放射線療法（ＳＡＢＲ）または定位ボディ放射線療法（ＳＢＲＴ）の形態である。
５．胃腸障害
【０１７５】
自然免疫受容体トル様受容体４（ＴＬＲ４）は、細菌性エンドトキシン（リポ多糖、「ＬＰＳ」）に対する、および炎症または感染障害の間に放出されるさまざまな内因性分子に対する造血および非造血細胞上の受容体として認識されている。感染プロセスと非感染プロセスの両方を含むいくつかの疾患が、ＴＬＲ４シグナル伝達の悪化に起因している。これらの疾患としては、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、腹部敗血症、肺炎、関節炎、膵炎およびアテローム性動脈硬化症が挙げられる。好ましい実施形態では、処置されることになる疾患はＮＥＣである。
【０１７６】
好ましい実施形態では、単一のデンドリマー複合体組成物は、胃腸管および中枢神経系を含むヒト身体の２つの異なる位置において複数の症状を同時に処置および／または診断することができる。例えば、治療的、予防的または診断的薬剤に連結しているデンドリマーを含むデンドリマー複合体組成物は、血液ストリームへ吸収された後、経腸投与を介して胃腸領域を処置し、同時にミクログリアおよびアストロサイトを選択的に標的とすることができる。ミクログリアおよびアストロサイトは、ＮＥＣの病因において鍵となる役割を果たす。
Ｃ．投薬量および有効量
【０１７７】
一部のｉｎ  ｖｉｖｏでのアプローチでは、デンドリマー複合体は、治療有効量で対象に投与する。「有効量」または「治療有効量」という用語は、処置される障害の１つまたは複数の症状を処置、阻害、または緩和するのに、そうでなければ所望の薬理学的および／または生理学的効果を提供するのに十分な投薬量を意味する。正確な投薬量は、さまざまな因子、例えば対象の従属変数（例えば、年齢、免疫系の健康など）、疾患または障害、および行われる処置によって変更される場合がある。
【０１７８】
一般的に、組成物の用量は、約０．０００１から約１０００ｍｇ／処置される対象の体重ｋｇ、約０．０１から約１００ｍｇ／体重ｋｇ、約０．１ｍｇ／体重ｋｇから約１０ｍｇ／体重ｋｇ、および約０．５ｍｇから約５ｍｇ／体重ｋｇとすることができる。対象は、典型的には哺乳動物であり、最も好ましくはヒトである。一般的に、静脈内注射または注入に関しては、投薬量が低い場合がある。
【０１７９】
例えば、デンドリマー複合体組成物は、炎症、特に中枢神経系の炎症、または眼の炎症の部位またはその付近に、１つまたは複数の活性剤を細胞に有効な量で送達することができる。その結果、一部の実施形態では、１つまたは複数の活性剤を含むデンドリマー複合体組成物は、対象における炎症を回復するのに有効な量のものである。好ましい実施形態では、デンドリマー複合体組成物の有効量は、未処置の対照対象と比較して、対象の細胞において顕著な細胞毒性を誘発しない。好ましくは、デンドリマー複合体組成物の量は、未処置の対照と比較して、対象における疾患または障害の炎症および／またはさらに関連する症状を予防するかまたは減少させるのに効果的である。
【０１８０】
一般的に、投与のタイミングおよび頻度は、所与の処置または診断スケジュールの有効性と所与の送達システムの副作用とのバランスをとるように調整されることになる。例示的な投薬頻度は、連続注入、単回および複数回投与、例えば１時間ごと、毎日、毎週、毎月または毎年の投薬を含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、投薬量は、毎日１回、２回、もしくは３回、または隔日、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、もしくは６日ごとに、ヒトに投与される。一部の実施形態では、投薬量は、毎週約１回もしくは２回、２週間ごと、３週間ごと、または４週間ごとに投与される。一部の実施形態では、投薬量は、毎月約１回もしくは２回、２カ月ごと、３カ月ごと、４カ月ごと、５カ月ごと、または６カ月ごとに投与される。
【０１８２】
投薬レジメンは、対象における障害を処置するのに十分な任意の期間の長さとすることができることは、当業者であれば理解するであろう。「慢性の」という用語は、投薬量レジメンの期間の長さが、時間単位、日数単位、週単位、月単位、または場合により年単位の場合があることを意味する。
【０１８３】
一部の実施形態では、レジメンは、治療ラウンド、続いて休薬（例えば、薬物なし）の１つまたは複数のサイクルを含む。治療ラウンドは、例えば、上記で検討された投与のものであってもよい。同様に、休薬は、１、２、３、４、５、６、もしくは７日、または１、２、３、４週、または１、２、３、４、５、もしくは６カ月であってもよい。
【０１８４】
デンドリマー複合体は、上記で検討された状態または疾患を処置できることが公知である１つまたは複数の追加の治療的活性剤と組み合わせて投与することができる。
Ｄ．対照
【０１８５】
デンドリマー複合体組成物の効果は、対照と比較することができる。好適な対照は当技術分野において公知であり、例えば、未処置の細胞または未処置の対象を含む。一部の実施形態では、対照は、処置された対象からのまたは未処置の対象からの未処置の組織である。好ましくは対照の細胞または組織は、処置された細胞または組織と同じ組織由来である。一部の実施形態では、未処置の対照対象は、処置された対象と同じ疾患または状態を患っているかまたはリスクがある。
Ｅ．組合せ
【０１８６】
デンドリマー複合体組成物は、治療的または予防的処置レジメンの一部として、単独、または１つもしくは複数の追加の活性剤と組合せて投与することができる。デンドリマー複合体組成物は、第２の活性剤と同じ日、または異なる日に投与することができる。例えば、デンドリマー複合体組成物を含む組成物は、１日目、２日目、３日目、もしくは４日目に、またはこれらの組合せで投与することができる。
【０１８７】
「組合せ」または「組み合わせられた」という用語は、２つまたはそれを超える薬剤に付随して、それと同時に、またはそれと連続的に投与することを指すために使用される。したがって、組合せは、付随して（例えば、添加混合物として）、個別であるが同時に（例えば、個別の静脈ラインを介して同じ対象に）、または連続的に（例えば、化合物または薬剤のうちの１つを最初に、続いてもう一方を与える）投与することができる。
【実施例】
【０１８８】
（実施例１）
第２世代の高密度なポリヒドロキシデンドリマー（Ｄ２−ＯＨ−６０、ＰＥＧＯＬ−６０としても知られる）の合成
方法および材料
試薬
臭化プロパルギル溶液（８０ｗｔ％、トルエン中）、臭化アリル、水素化ナトリウム（６０％分散体、鉱物油中）、２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン、１−チオグリセロール、Ｎ−（３−ジメチルアミノプロピル）−Ｎ’−エチルカルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）、４−（ジメチルアミノ）ピリジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ）、塩化ｐ−トルエンスルホニル、テトラエチレングリコール、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、γ−（Ｂｏｃ−アミノ）酪酸（ＢＯＣ−ＧＡＢＡ−ＯＨ）、硫酸銅五水和物、アスコルビン酸ナトリウム、無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、および無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入した。Ｃｙ５−モノ−ＮＨＳエステルおよびＦＩＴＣは、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ−ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入した。全ての他のＡＣＳグレード溶媒は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。重水素化溶媒のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ−ｄ６）、水（Ｄ２Ｏ）、メタノール（ＣＤ３ＯＤ）、およびクロロホルム（ＣＤＣｌ３）は、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｉｓｏｔｏｐｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ａｎｄｏｖｅｒ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）から購入した。透析膜（ＭＷカットオフ１０００Ｄａ）は、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｒａｎｃｈｏ  Ｄｏｍｉｎｇｕｅｚ、ＣＡ、ＵＳＡ）から得た。
中間体およびデンドリマーの合成
【０１８９】
化合物２の調製：ジペンタエリスリトール（１）（５ｇ、１９．６６ｍｍｏｌ）を、無水ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）３０ｍｌ中に溶解し、０℃で撹拌した。水素化ナトリウム（５．６６ｇ、２３５．８３ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に少しずつゆっくりと添加し、１５分間撹拌した。続いて臭化プロパルギル（２４．２３ｍｌ、１６３．１０ｍｍｏｌ、８０％ｗ／ｗ溶液のもの、トルエン中）を０℃で添加し、撹拌を室温でさらに６時間継続した。反応混合物を冷却し、水（４０ｍＬ）と酢酸エチル（５０ｍＬ）との間で分割した。有機層を水（３×５０ｍＬ）および食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、真空中で蒸発させた。粗製生成物を、シリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン１５：８５ｖ／ｖ）で精製し、化合物２を６０％の収率で得た。
【０１９０】
化合物３の調製：ジペンタエリスリトール（１）（６ｇ、２３．５９ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）およびテトラヒドロフラン（ＴＨＦ、５０ｍＬ）中に溶解し、溶液を０℃で撹拌した。水素化ナトリウム（６．２３ｇ、２５９．５５ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に少しずつゆっくりと添加し、１５分間撹拌した。続いて無水ＴＨＦ（２０ｍＬ）で希釈した臭化アリル（１１．２ｍＬ、１２９．７７ｍｍｏｌ）を０℃でゆっくりと添加し、撹拌を０℃でさらに３０分間継続し、続いて室温（「ｒｔ」）（２５℃）で９０分間撹拌した。反応を、ＴＬＣを用いて常にモニターした。生成物の最大の形成がＴＬＣで観察されたら、反応を氷でクエンチした。ＴＬＣをＫＭｎＯ４ディップで染色した。反応混合物を冷却し、水（４０ｍＬ）と酢酸エチル（５０ｍＬ）との間で分割した。有機層を水（３×５０ｍＬ）および食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、真空中で蒸発させた。粗製生成物を、シリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン２５：７５ｖ／ｖ）で精製し、化合物３を４０％の収率で得た。1H  NMR  (500  MHz,  CDCl3)  δ  5.87  (ddd,  J  =  22.5,  10.6,  5.4  Hz,  5H),  5.24  (dd,  J  =  17.2,  1.5  Hz,  5H),  5.21  -  5.10  (m,  5H),  4.01  -  3.90  (m,  10H),  3.70  (s,  2H),  3.46  (dd,  J  =  26.4,  13.1  Hz,  14H).
【０１９１】
化合物４の調製：塩化メチレン８０ｍｌ中の塩化ｐ−トルエンスルホニル（１０．５ｇ、５７ｍｍｏｌ）を、２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エタン−１−オール（５ｇ、２８．５ｍｍｏｌ）およびトリエチルアミン（１２ｍｌ、８５ｍｍｏｌ）の混合物に０℃で滴加した。次いで混合物を室温で一晩撹拌した。完了時に、有機層をＨＣｌの希釈溶液で３回、次いで食塩水で洗浄した。塩化メチレンを減圧下で除去し、粗製材料を、ヘキサン中の３０％酢酸エチルを使用してシリカフラッシュクロマトグラフィーで精製し、化合物４を無色油状物として８０％の収率で得た。1H  NMR  (500  MHz,  CDCl3)  δ  7.81  (d,  J  =  8.3  Hz,  2H),  7.35  (d,  J  =  8.2  Hz,  2H),  4.19  -  4.15  (m,  2H),  3.73  -  3.69  (m,  2H),  3.67  -  3.63  (m,  2H),  3.61  (s,  4H),  3.37  (t,  J  =  5.0  Hz,  2H),  2.46  (s,  3H).
【０１９２】
化合物５の調製：化合物３（１ｇ、２．１９ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中に溶解し、０℃で撹拌した。水素化ナトリウム（１３２ｍｇ、５．４７ｍｍｏｌ）を撹拌溶液に少しずつゆっくりと添加し、溶液を１５分間撹拌した。続いて２−（２−（２−アジドエトキシ）エトキシ）エチル４−メチルベンゼンスルホネート４（８６２ｍｇ、２．６３ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加し、撹拌を０℃でさらに１８０分間継続した。反応を、ＴＬＣを用いてモニターした。反応を、塩化アンモニウムの飽和溶液でクエンチし、酢酸エチルで抽出した。有機層を水（３×５０ｍＬ）および食塩水（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで乾燥させ（Ｎａ２ＳＯ４）、ろ過し、真空中で蒸発させた。ＴＬＣを、ＫＭｎＯ４ディップで染色した。粗製生成物を、シリカフラッシュカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル／ヘキサン２５：７５ｖ／ｖ）で精製し、化合物５を７０％の収率で得た。1H  NMR  (500  MHz,  CDCl3)  δ  5.92  (ddt,  J  =  21.5,  10.6,  5.3  Hz,  5H),  5.38  -  5.23  (m,  5H),  5.18  (dd,  J  =  10.5,  1.2  Hz,  5H),  4.06  -  3.90  (m,  10H),  3.82  -  3.55  (m,  10H),  3.55  -  3.34  (m,  18H).ＨＲＭＳ（ＥＳＩ＋−ＴＯＦ）ｍ／ｚ：Ｃ３１Ｈ５３Ｎ３Ｏ９［Ｍ＋Ｈ］＋の計算値：６１２．７７７０、実測値：６１２．３８５２。
【０１９３】
化合物６の調製：磁性撹拌子を備えた５ｍＬのマイクロ波用バイアル中、１：１のＤＭＦおよび水混合物中で、ヘキサプロパルギル化化合物２（１当量）およびアジド誘導体（１アセチレン当たり当量）を懸濁した。そこへ、最小量の水中に溶解したＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ（１アセチレン当たり０．５当量）およびアスコルビン酸ナトリウム（１アセチレン当たり０．５当量）を添加した。バイアルに堅く栓をし、反応物にマイクロ波を５０℃で６時間照射した。反応の完了を、ＴＬＣを用いてモニターし、完了時に反応混合物を酢酸エチル（６０ｍＬ）で希釈した。有機層をＥＤＴＡ飽和溶液で洗浄し（３〜４回）、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、続いて真空中で濃縮した。この手順によって、微量の銅塩が除去されることは広く実証されている。所望の化合物を、溶出液としてＤＣＭ中の３％メタノールを使用し、カラムクロマトグラフィーを使用して精製し、透明油様化合物を６５％の収率で得た。1H  NMR  (500  MHz,  CDCl3)  δ  7.69  (s,  6H),  5.94  -  5.77  (m,  30H),  5.18  (dd,  J  =  57.0,  13.8  Hz,  60H),  4.51  (s,  24H),  3.96  -  3.84  (m,    72H),  3.68  -  3.49  (m,  52H),  3.51  -  3.27  (m,  108H).（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ３５２Ｎ１８Ｏ６１の計算値：４１５３．２４００、実測値：４１５３．４６１０。
【０１９４】
化合物８の調製：１０ｍＬのガラスバイアルに、ＤＭＦ４ｍＬ中の、アルケン末端デンドリマー６（３７０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）および１−チオグリセロール７（１．５４ｍｌ、１７．８ｍｍｏｌ）を入れた。２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（１４０ｍｇ、０．５３ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を、ＵＶ光（３６５ｎｍ）下で１２時間撹拌した。１２時間後、反応を停止させ、反応混合物を、ジエチルエーテルを使用して沈殿させた。形成された沈殿物を、ジエチルエーテルで数回洗浄し、過剰な１−チオグリセロールを除去した。残渣を、ＤＭＦ中に溶解し、１０００ＭＷＣＯに対応する透析膜を使用して、ＤＭＦに対して６時間透析し、続いて水で８時間透析した。次いで精製した生成物を凍結乾燥させ、透明油状物を７０％の収率で得た。1H  NMR  (500  MHz,  MeOD)  δ  8.01  (s,  6H),  4.58  (d,  28H),  3.95  (s,  12H),  3.80  -  3.73  (m,  32H),  3.65  (s,  36H),  3.62  (d,  36H),  3.56  (m,  56H),  3.54-3.51  (m,  60H),  3.48  -  3.44  (m,  30H),  3.40  (s,  50H),  3.37  (s,  60H),  2.73  (dd,  30H),  2.67  (t,  J  =  7.0  Hz,  60H),  2.60  (dd,  28H),  1.95  -  1.76  (m,  60H).  13C  NMR  (126  MHz,  MeOD)  δ  144.7,  124.3,  73.1,  71.4,  70.5,  70.1,  69.4,  64.6,  63.9,  50.0,  47.1,  45.6,  42.1,  35.0,  29.6,  29.1,  26.8.（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）ｍ／ｚ：Ｃ３０４Ｈ５９２Ｎ１８Ｏ１２１Ｓ３０の計算値：７３９７．８８５０、実測値：７４２５．４４８０。ＨＰＬＣ純度：９５．４％、保持時間：８．０分。
動的光散乱（ＤＬＳ）およびゼータ電位（ζ）
【０１９５】
ＰＥＧＯＬ−６０のサイズおよびζ−電位分布を、５０ｍＷ  Ｈｅ−Ｎｅレーザー（６３３ｎｍ）を備えたＺｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｌｔｄ．Ｗｏｒｃｈｅｓｔｅｒ、Ｕ．Ｋ）を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）によって判定した。デンドリマーを、脱イオン水（１８．２Ω）中に溶解し、０．５ｍｇ／ｍＬの濃度とした。溶液を、セルロースアセテート膜（０．２ミクロン、ＰＡＬＬ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）に通してろ過し、ＤＬＳ測定を、２５℃、１７３°の散乱角度で３回繰り返して行った。ゼータ電位測定に関しては、デンドリマーを、１０ｍＭ塩化ナトリウム溶液中に溶解し、０．１ｍｇ／ｍＬの濃度とした。読取りを３回繰り返して行い、平均値を記録した。
核磁気共鳴（１Ｈおよび１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲ）
【０１９６】
１Ｈおよび１３Ｃ｛１Ｈ｝ＮＭＲスペクトルを周囲温度でＢｒｕｋｅｒ  ５００ＭＨｚ分光器に記録した。化学シフトは、内部標準としてのテトラメチルシラン（ＴＭＳ）に対するｐｐｍで報告する。ＣＤＣｌ３（１Ｈ、δ７．２７ｐｐｍ；１３Ｃ、δ７７．０ｐｐｍ（トリプレットの中心の共鳴））、Ｄ２Ｏ（１Ｈ、δ４．７９ｐｐｍ）、およびＣＤ３ＯＤ（１Ｈ、δ３．３１ｐｐｍおよび１３Ｃ、δ４９．０ｐｐｍ）の残りのプロトン性溶媒を、化学シフトを較正するために使用した。１Ｈ  ＮＭＲスペクトルにおける共鳴多重度を、「ｓ」（シングレット）、「ｄ」（ダブレット）、「ｔ」（トリプレット）、および「ｍ」（マルチプレット）として示す。ブロードな共鳴を「ｂ」で示す。
高性能液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）
【０１９７】
化合物の純度を、ＨＰＬＣ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して分析した。ＨＰＬＣは、１５２５バイナリポンプ、インラインデガッサーＡＦ、７１７プラスオートサンプラー、２９９８フォトダイオードアレイ検出器、およびＷａｔｅｒｓ  Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアに対応する２４７５マルチλ蛍光検出器を備えている。５μｍの粒子サイズ、２５ｃｍの長さ、および４．６ｍｍの内径を有するＳｙｍｍｅｔｒｙ  Ｃ１８逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ）を使用した。ＨＰＬＣクロマトグラムを、ＰＤＩ検出器を使用して２１０ｎｍでモニターし、蛍光標識されたコンジュゲートをＰＤＩと蛍光検出器の両方を使用して、６５０と２１０ｎｍの両方でモニターした。注入を、９０：１０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）で開始し、２０分で１０：９０（Ｈ２Ｏ／ＣＡＮ）に漸増し、２５分で９０：１０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）に戻る勾配流量を使用して行い、１ｍＬ／分の流速を維持した。
質量分光法
【０１９８】
正確な質量測定（ＨＲＭＳ）を、ポジティブモードでＥＳＩを使用し、ＣＨ３ＣＮ：Ｈ２Ｏ（９：１）溶媒系に直接流動試料を導入し、Ｂｒｕｋｅｒｍｉｃｒｏ  ＴＯＦ−ＩＩ質量分析計で行った。プロトン化分子イオン［Ｍ＋ｎＨ］ｎ＋または付加物［Ｍ＋ｎＸ］ｎ＋（Ｘ＝Ｎａ、Ｋ、ＮＨ４）を、実験式を確認するために使用した。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ実験は、線形ポジティブモードおよびレーザー強度（poer）５５〜１００％を使用し、Ｂｒｕｋｅｒ  Ａｕｔｏｆｌｅｘ  ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ機器で行った。シナピン酸をマトリックスとして使用した。
結果
【０１９９】
デンドリマー表面の高密度のヒドロキシル基の存在が、神経炎症部位において、これらのデンドリマーの標的を絞った蓄積の駆動力となる場合があることを仮定した。この仮説が動機となり、高密度の表面ヒドロキシル基を有するＰＥＧ系デンドリマーを調製した。神経炎症を標的とする第２世代のＰＥＧデンドリマーナノ粒子は、クリックケミストリーに基づく非常に効率的な化学変換を介し、生体適合性の、安価な水溶性構成ブロックを使用して、６０個のヒドロキシル基を末端にすることで開発した（ＰＥＧＯＬ−６０）。
【０２００】
粒子は、障害を受けたＢＢＢに侵入し、活性化ミクログリア、アストロサイト、および脳／網膜の傷害部位における他の細胞に蓄積する。市販されている同等のヒドロキシル基表面密度（６４ＯＨ）を有するビス−ＭＰＡハイパー分岐ポリエステルデンドリマーも評価した。
【０２０１】
ＰＥＧ系デンドリマー、Ｄ２−ＯＨ−６０（ＰＥＧＯＬ−６０とも称される）の合成を、最小合成ステップで低世代において多くの末端基を達成するために、ハイパーコアおよびハイパーモノマー戦略を使用して行った。デンドリマーを、非常に効率的で頑強な化学反応、例えば銅（Ｉ）触媒アルキンアジドクリック（ＣｕＡＡＣ）およびチオール−エンクリックケミストリーを使用して構築した（Sharma,  A.,  et  al.,  ACS  Macro  Letters,  3,  1079  (2014)、およびRostovtsev,  V.  V.,  et  al.,  Angewandte  Chemie  International  Edition,  41,  2596  (2002)）。ハイパーコア２を、ジペンタエリスリトール１のプロパルギル化をＮａＨおよび臭化プロパルギルの存在下で行うことによって合成し、ヘキサ−プロパルギル化生成物を６０％の収率で得た（スキーム１）。ＮＭＲスペクトルによって、６個のプロパルギルプロトンの存在が明らかに示された。
【化３】
2021502451.tif 000010
【０２０２】
ハイパーモノマー５を、２つの合成ステップで調製した（スキーム２）。第１のステップでは、ジペンタエリスリトール１でアリル化反応を行い、５個のアリル基を有するＡＢ５モノマーを選択的に得、１個のヒドロキシルアームは完全なまま維持した。純粋な生成物３を、カラムクロマトグラフィーを行うことによって、トリ−、テトラ−、ペンタ−およびヘキサ−アリル化生成物の混合物から単離した。次いで化合物３を、モノトシル化トリエチレングリコールアジド４と反応させ、１個のアジド官能基および５個のアリル基を有するＡＢ５直交性ハイパーモノマー５を得た。アジド基の目的は、コア２のＣｕＡＡＣクリック反応に関与することであり、一方、アルケン基は、チオール化モノマーとの光触媒チオール−エンクリック反応に利用することができる。
【化４】
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【０２０３】
次いでハイパーコア２およびハイパーモノマー５にＣｕＡＡＣクリック反応を行い、３０個の末端アルケン官能基を有する第１世代デンドリマー（６）を得た。１Ｈ  ＮＭＲによって、５．８、５．２、および３．９ｐｐｍにおけるアリルプロトンの出現が示された一方、２．４ｐｐｍにおけるプロパルギルプロトンの明白な消失が示された。さらに、１Ｈ  ＮＭＲにおいて７．６９ｐｐｍにトリアゾールプロトンに関するはっきりと鋭いピークが出現した。化合物（６）の理論分子量は４１５３．２４Ｄａであり、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ分析によって、４１５６．４９Ｄａにおいてピークが示され、生成物の形成が裏付けられた。化合物６（Ｄ１−アリル３０）を、チオール−エンクリック反応を介して１−チオグリセロール（７）と反応させ、表面に６０個のヒドロキシル基を有する第２世代デンドリマー（Ｄ２−ＯＨ−６０またはＰＥＧＯＬ−６０、８）を得た。１Ｈ  ＮＭＲによって、アリル末端基の完全な消失、チオグリセロール基からのプロトンの出現（２．８〜２．５ｐｐｍ）、および１．８ｐｐｍにおける特徴的なメチレンプロトンが示された。通常、デンドリマーの１Ｈ  ＮＭＲ特徴づけは、多くのプロトンからの重複シグナルが存在するために困難であるが、ＰＥＧＯＬ−６０の構築に関しては、特徴的なアリルおよびプロパルギル（propragyl）シグナルの連続的な出現および完全な消失によって、その構造を正確に確認するための単純で頑強な特徴づけツールが可能になる。
【化５】
2021502451.tif 000012
【０２０４】
ＨＰＬＣによって、純度がさらに確認され、生成物は、各ステップにおける保持時間でクリアなシフトを示す。Ｄ１−アリル３０（化合物６）は、１２．８分の保持時間を有し、比較的極性の高い最終的なデンドリマーＰＥＧＯＬ−６０（化合物８）は、２１０ｎｍにおいて７．１分の保持時間を有する。ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦスペクトルによって、７４３３Ｄａにおいてピークが示され、７３９８ＤａのＰＥＧＯＬ−６０の理論分子量とほぼ一致する。ＰＥＧＯＬ−６０は、１．９±０．２ｎｍのサイズおよび中性に近いゼータ電位（−１．９０±０．６７ｍＶ）を有する。全ての他の中間体および最終化合物を、１Ｈ  ＮＭＲ、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ、ＨＲＭＳ、およびＨＰＬＣを使用して特徴づけた。
【０２０５】
デンドリマー合成のスケールアップにおける従来の課題を克服するために、高純度および高効率の複雑な樹状構造を生成するための合成戦略が開発されている。ＰＥＧＯＬ−６０の構築に関しては、ハイパーコア−ハイパーモノマーおよび直交性アプローチの組合せを使用し、低世代で高密度の表面ヒドロキシル基を有するこのデンドリマーを構築するための加速スキームを開発した（ＰＡＭＡＭデンドリマーに関しては、第４世代での６４個と比較して第２世代で６０個）（R.  Sharma,  et  al.,  Polymer  Chemistry,  5,  4321  (2014)、R.  Sharma,  et  al.,  Chemical  Communications  2014,  50,  13300）。この加速アプローチを使用して、ＰＥＧＯＬ−６０を、Ｃｕ（Ｉ）−触媒アルキンアジド（ＣｕＡＡＣ）およびチオール−エンクリックケミストリーに基づき、非常に効率的な直交性の化学変換を介し、コアから出発する４つの反応ステップで合成した（V.  V.  Rostovtsev,  et  al.,  Angewandte  Chemie  International  Edition,  41,  2596  (2002)、Hoyle  CE,  et  al.,  Angewandte  Chemie  International  Edition  2010,  49,  1540）。欠陥のないデンドリマーを生成するための鍵は、層ごとの様式で構成ブロックをカップリングするために用いられる化学変換にある。低世代において効率的であると思われる従来のカップリング反応は、立体的な密集のために反応性末端の数が多い高世代で緩慢になり、それが構造的な欠陥および非対称性をもたらす。クリックケミストリーの概念は、実行するのが容易で、非常に頑強で、高収率で、原子経済的で、本質的にモジュール状である反応のプールを含む価値の高い合成ツールとなってきている。クリック変換の列挙の中でも、ＣｕＡＡＣおよびチオール−エンクリックは、非常に簡易で、直交性で、立体選択的であるため、最も強力で広範囲に適用される２つである。これらのクリック変換は、ポリマー化学、バイオコンジュゲート反応、デンドリマー合成、および化学的実体の巨大なライブラリの生成において順調に用いられてきた（Moses  JE  et  al.,  Chemical  Society  Reviews  2007,  36,  1249）。
（実施例２）
蛍光造影剤のデンドリマーナノ粒子へのコンジュゲート
方法および材料
中間体およびデンドリマーの合成
【０２０６】
化合物９の調製：ＤＭＦ（１０ｍＬ）中のデンドリマー８（６２０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＢＯＣ−ＧＡＢＡ−ＯＨ（８５ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＥＤＣ（１６０ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１０３ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を添加した。次いで反応混合物を室温で２４時間撹拌した。完了時に、反応混合物を、ＤＭＦに対して６時間透析し、続いて水で１２時間透析し、４時間ごとに水を交換した。次いで水溶液を凍結乾燥させ、化合物９を得た。1H  NMR  (500  MHz,  MeOD)  δ  7.94  (s,  7H),  4.54  -  4.48  (m,  24H),  3.88  (s,  16H),  3.75  -  3.63  (m,  29H),  3.60  -  3.53  (m,  66H),  3.53  -  3.47  (m,  44H),  3.47  -  3.42  (m,  56H),  3.41  -  3.36  (m,  24H),  3.33  (s,  55H),  3.26  (s,  38H),  2.71  -  2.45  (m,  122H),  1.78  (dd,  J  =  20.4,  14.4  Hz,  68H),  1.39  (s,  45H).ＨＰＬＣ純度：９５．４％、保持時間：１８．２分
【０２０７】
化合物１０の調製：乾燥ＤＣＭ（３ｍＬ）中の化合物９（６２０ｍｇ、０．０８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、トリフルオロ酢酸（０．６ｍＬ）を滴加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで溶媒を蒸発させ、反応混合物をメタノールで希釈し、続いてロータリーエバポレーターで蒸発させた。この方法を数回繰り返し、微量のＴＦＡを除去した。溶媒を蒸発させ、化合物１０をオフホワイト色の吸湿性固形物として定量的収率で得た。
【０２０８】
化合物１１の調製：ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物１０（６００ｍｇ、０．０７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ、溶液のｐＨを７．４に調整するため）を添加し、続いて１ｍＬ  ＤＭＦ中に溶解したＣｙ５  ＮＨＳエステル（５５ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）を添加した。撹拌を室温で１２時間継続した。反応混合物を、ＤＭＦに対して１２時間透析し、４時間ごとにＤＭＦを交換し、続いて水で６時間透析した。次いで水溶液を凍結乾燥させ、化合物１１を青色固形物として％の収率で得た。1H  NMR  (500  MHz,  DMSO)  δ  8.37  (t,  J  =  12.9  Hz,  Cy5  H),  8.00  (s,  トリアゾールH),  7.82  (s,  Cy5  H),  7.64  (t,  J  =  6.9  Hz,  Cy5  H),  7.33  (d,  J  =  8.3  Hz,  Cy5  H),  6.59  (t,  J  =  12.3  Hz,  Cy5  H),  6.31  (d,  J  =  7.6  Hz,  Cy5  H),  4.76  -  4.65  (m,  デンドリマーH),  4.64  -  4.39  (m,  デンドリマーH),  4.14  (m,  デンドリマーH),  3.82  (s,  デンドリマーH),  3.69  -  3.12  (m,  デンドリマーH),  2.72  -  2.30  (m,  デンドリマーH),  1.80  -  1.61  (m,  デンドリマーH),  1.32  -  1.14  (m,  cy5  H),  1.10  (t,  J  =  7.0  Hz,  Cy5  H),  0.99  (t,  J  =  7.2  Hz,  Cy5  H).ＨＰＬＣ純度：９２．３％、保持時間：１２．１分
【０２０９】
化合物１３の調製：ＤＭＦ（２０ｍＬ）中のＧ４−６４ＯＨ−ポリエステル−ハイパー分岐−ビス−ＭＰＡ１２（２ｇ、０．２７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＢＯＣ−ＧＡＢＡ−ＯＨ（２８０ｍｇ、１．３６ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＥＤＣ（４７０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（３０５ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）を添加した。次いで反応混合物を室温で２４時間撹拌した。完了時に、反応混合物を、ＤＭＦに対して１２時間透析し、続いて水で１２時間透析し、３時間ごとに水を交換した。次いで水溶液を凍結乾燥させ、化合物１３を得た。収率：７６％。1H  NMR  (500  MHz,  DMSO)  δ  4.25  -  4.10  (m,  デンドリマーH),  3.59  -  3.34  (m,  デンドリマーH),  1.63  (dt,  J  =  13.8,  6.7  Hz,  gabaリンカーH),  1.37  (s,  BOC  H),  1.15  -  0.95  (m,  デンドリマーH).
【０２１０】
化合物１４の調製：乾燥ＤＣＭ（２ｍｌ）中の化合物１３（１ｇ、０．１３ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＴＦＡ（１．５ｍｌ）を滴加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで溶媒を蒸発させ、反応混合物をメタノールで希釈し、続いてロータリーエバポレーターで蒸発させた。この方法を数回繰り返し、微量のＴＦＡを除去した。溶媒を蒸発させ、化合物１４を定量的収率で得た。
【０２１１】
化合物１５の調製：ＤＭＦ（３ｍＬ）中の化合物１４（２００ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．１ｍｌ、ｐＨを７．４に調整するため）を添加し、続いて１ｍｌ  ＤＭＦ中に溶解したＣｙ５  ＮＨＳエステル（１８．４３ｍｇ、０．０３ｍｍｏｌ）を添加した。撹拌を室温で１２時間継続した。反応混合物を、ＤＭＦに対して１２時間透析し、４時間ごとにＤＭＦを交換し、続いて水で２４時間透析した。次いで水溶液を凍結乾燥させ、化合物１５を青色固形物として８２％の収率で得た。1H  NMR  (500  MHz,  DMSO)  δ  9.41  (s,  CY5  H),  8.37  (t,  J  =  12.8  Hz,  CY5  H),  7.80  (d,  J  =  22.5  Hz,  CY5H),  7.63  (t,  J  =  7.6  Hz,  CY5  H),  7.32  (d,  J  =  8.0  Hz,  CY5  H),  6.58  (t,  J  =  12.2  Hz,  CY5  H),  6.31  (d,  J  =  13.6  Hz,  CY5  H),  5.04  -  4.94  (m,    デンドリマーH),  4.70  -  4.56  (m,  デンドリマーH),  4.31  -  3.97  (m,  デンドリマーH),  3.70  -  3.38  (m,  デンドリマーH),  1.69  (s,  CY5  H),  1.35  -  0.88  (m,  CY5およびデンドリマーH).ＨＰＬＣ純度：１００％、保持時間：１１．５分
【０２１２】
化合物１７の調製：ＤＭＦ（１５ｍＬ）中の８アーム星型ＰＥＧ１０Ｋ（１６）（１ｇ、０．１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＢＯＣ−ＧＡＢＡ−ＯＨ（６１ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ）を添加し、続いてＥＤＣ（１１５ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（７４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を添加した。次いで反応混合物を室温で２４時間撹拌した。完了時に、反応混合物を、ＤＭＦに対して１２時間透析し、続いて水で１２時間透析し、３時間ごとに水を交換した。次いで水溶液を凍結乾燥させ、化合物１７を得た。収率：７０％。1H  NMR  (400  MHz,  DMSO)  δ  4.17  -  4.08  (m,  PEG  H),  3.62  -  3.45  (m,  PEG  H),  1.66  -  1.56  (m,  リンカーH),  1.37  (s,  BOC  H).
【０２１３】
化合物１８の調製：乾燥ＤＣＭ（４ｍＬ）中の化合物１７（１ｇ、０．１ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＴＦＡ（３ｍＬ）を滴加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。次いで溶媒を蒸発させ、反応混合物をメタノールで希釈し、続いてロータリーエバポレーターで蒸発させた。この方法を数回繰り返し、微量のＴＦＡを除去した。溶媒を蒸発させ、化合物１８を定量的収率で得た。
【０２１４】
化合物１９の調製：ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物１８（２５０ｍｇ、０．０２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＤＩＰＥＡ（０．１ｍｌ、ｐＨを７．４に調整するため）を添加し、続いて１ｍｌ  ＤＭＦ中に溶解したフルオレセインイソチオシアネート（１８ｍｇ、０．０４ｍｍｏｌ）を添加した。撹拌を室温で１２時間継続した。反応混合物を、ＤＭＦに対して１２時間透析し、４時間ごとにＤＭＦを交換し、続いて水で２４時間透析した。次いで水溶液を凍結乾燥させ、化合物１９を黄色固形物として定量的収率で得た。1H  NMR  (500  MHz,  DMSO)  δ  6.73  -  6.49  (m,  FITC  H),  4.57  (t,  J  =  5.5  Hz,  PEG  H),  4.13  (dd,  J  =  9.3,  5.0  Hz,  PEG  H),  3.70  -  3.44  (m,  PEG  H),  1.82  -  1.68  (m,  リンカーH)
結果
【０２１５】
蛍光分光法および共焦点顕微鏡を使用して生体内分布を研究するために、蛍光タグのシアニン５（Ｃｙ５）を、デンドリマー、Ｄ２−ＯＨ−６０（化合物８）にコンジュゲートした。フルオロフォアを、その固有の特性をそのまま維持し、生体内分布への任意の影響を回避するために、デンドリマーの２つのアームのみに付加した。イメージング色素を付加するために、Ｄ２−ＯＨ−６０（化合物８）をＥＤＣ、ＤＭＡＰを使用してγ−（Ｂｏｃ−アミノ）酪酸とカップリングさせ、デンドリマー９、Ｄ−ＧＡＢＡ−ＮＨＢＯＣを得、続いてトリフルオロ酢酸／ＤＣＭ（１／５）を使用してＢＯＣ基を脱保護し、アミン基を有するデンドリマー１０を得た。ＴＦＡ塩として２つのアミン基を有するデンドリマー１０を、ｐＨ７．０〜７．５でＣｙ５モノＮＨＳエステルと最終的に反応させ、Ｃｙ５標識デンドリマーＤ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５またはＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５を得た（化合物１１、スキーム４）。１Ｈ  ＮＭＲによって、コンジュゲート時の芳香族領域におけるＣｙ５プロトンの存在が明らかに示され、ＨＰＬＣクロマトグラムによって、Ｄ−ＧＡＢＡ−ＮＨＢＯＣ（化合物９、２１０ｎｍ）に関する８．４分からＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５（化合物１１、２１０および６５０ｎｍ）に関する７．６分への保持時間における明らかなシフトが示された。
【０２１６】
同様の方法論を使用し、Ｃｙ５を、市販されているビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ−６４−ポリエステル−ハイパー分岐ポリマー（化合物１２、スキーム５）およびＧ４−ＰＡＭＡＭ−ＯＨ−６４にも付加した。同様の方法論を使用し、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）を８アーム星型ＰＥＧにコンジュゲートした（スキーム６、化合物１８）。直鎖状ＰＥＧ  ＦＩＴＣおよびデキストランＦＩＴＣを使用した。
【化６】
2021502451.tif 000013
【化７】
2021502451.tif 000014
【化８】
2021502451.tif 000015
（実施例３）
脳におけるＤ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５の定性的脳分布
方法および材料
ＣＰウサギモデルおよびＤ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５の投与
【０２１７】
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．（Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入した妊娠中のニュージーランド白ウサギは、外科手術の１週間前に施設に到着した。全ての動物を周囲条件下（２２℃、５０％相対湿度、および１２時間明／暗サイクル）で飼育し、実験処置と関連する疼痛およびストレスを最小限にするために必要な予防策を研究全体にわたって講じた。実験手順は、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。馴化してから１週間後、妊娠２８日目（Ｇ２８）に、妊娠中のウサギに開腹術を行い、前述のように、合計３，２００ＥＵのリポ多糖（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１２７：Ｂ８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ  ＭＯ）を子宮壁に沿って注射した（Saadani-Makki,  F.,  et  al.,  American  Journal  Of  Obstetrics  And  Gynecology,  199,  651  e1  (2008)、およびKannan,  S.,  et  al.,  Journal  of  Cerebral  Blood  Flow  and  Metabolism  :  Official  Journal  Of  The  International  Society  Of  Cerebral  Blood  Flow  And  Metabolism,  31,  738  (2011)）。仔ウサギは、Ｇ３１（臨月）に自然に生まれており、温度約３２〜３５℃および相対湿度約５０〜６０％のインキュベーター内で維持した。ＬＰＳ注射された雌親からの仔ウサギを、脳性麻痺（ＣＰ）仔ウサギとして定義した。
免疫組織化学
【０２１８】
ＰＮＤ１に、Ｄ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５（５５ｍｇ／ｋｇ、２００μＬ）を動物に静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、注射してから２４時間後に屠殺した。ウサギに麻酔をかけ、ＰＢＳ、続いて１０％ホルマリンを経心的に灌流した。全ての主要臓器（腎臓、肺、肝臓、心臓）、および血漿を単離し、急速冷凍した。脳を取り出し、二等分した。半分は、蛍光定量のために急速冷凍し、もう半分は、１０％ホルマリンで一晩、後固定し、段階的なスクロース溶液（graded  sucrose  solutions）中で凍結保護した。冠状断片（３０μｍ、１：６シリーズ（1:6series））を、３％の０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の標準ロバ血清によってブロッキングした。次いで断片を、ヤギ抗ＩＢＡ１（１：５００、Ａｂｃａｍ、ＭＡ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）とともに４℃で一晩インキュベートした。その後断片を洗浄し、蛍光二次抗体（１：２５０；１：２５０；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）とともに室温で２時間インキュベートした。次に、断片を、ＤＡＰＩ（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１５分間インキュベートした。洗浄後、スライドを乾燥させ、カバースリップを封入媒体とともに載せた（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）。共焦点画像は、Ｚｅｉｓｓ  ＺＥＮ  ＬＳＭ  ７１０（Ｚｅｉｓｓ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて得、ＺＥＮソフトウェアで処理した。
結果
【０２１９】
Ｄ２−ＯＨ−６０のｉｎ  ｖｉｖｏ分布を評価するために、Ｄ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５（５５ｍｇ／ｋｇ）を、生後１日目（ＰＮＤ１）のＣＰ仔ウサギに全身的に（ｉ．ｖ．）注射した。注射してから２４時間後、異なる脳領域、例えば、脳室周囲白質領域（脳梁、側脳室と内包との隅）および皮質におけるＤ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５の分布を分析した。Ｄ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５は、脳の全ての領域に広範囲に分布していたが、脳室周囲領域、例えば脳弓および側脳室においてより高濃度で分布していた。
【０２２０】
Ｄ２−ＯＨ−６０のｉｎ  ｖｉｖｏ分布を、ビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４と比較して評価するために、Ｄ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５およびビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−ｃｙ５（５５ｍｇ／ｋｇ）をＰＮＤ１のＣＰ仔ウサギに全身的に（ｉ．ｖ．）注射した。注射してから２４時間後、Ｄ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５およびビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−ｃｙ５の分布を、ＣＰ仔ウサギの脳において最も重度の脳傷害が発生し、活性化グリア細胞が蓄積した場所である脳室周囲白質領域（脳梁、側脳室と内包との隅）において分析した。Ｄ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５は、ＣＰ仔ウサギにおいて活性化ミクログリア（ＩＢＡ１陽性細胞）と共局在しており、これは、ビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−ｃｙ５と同様であった。Ｄ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５は、ＣＰ仔ウサギにおける脳梁、側脳室と内包との隅を含む脳室周囲白質領域において活性化ミクログリアと共局在していた。さらに、皮質におけるＤ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５およびビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−ｃｙ５の分布も評価した。Ｄ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５は、皮質において枝状ミクログリア（静止ミクログリア）と共局在しており、これもビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−ｃｙ５と同様である。
【０２２１】
次に、Ｄ２−ＯＨ−６０のｉｎ  ｖｉｖｏ分布を、ＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４と比較して評価した。Ｄ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５およびＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４−ｃｙ３（５５ｍｇ／ｋｇ）をＰＮＤ１のＣＰ仔ウサギに全身的に（ｉ．ｖ．）注射した。注射してから２４時間後、Ｄ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５およびＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４−ｃｙ３の分布を、脳室周囲白質領域（脳梁、側脳室の隅）において分析した。Ｄ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５とＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４−ｃｙ３の両方が、ＣＰ仔ウサギにおける活性化ミクログリアと共局在していた。Ｄ２−ＯＨ−６０−ｃｙ５とＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４の両方が、ＣＰ仔ウサギにおける脳室周囲白質領域、例えば脳梁、および側脳室の隅で、活性化ミクログリアと共局在していた。
【０２２２】
直鎖状ＰＥＧ、星型ＰＥＧおよびデキストランのｉｎ  ｖｉｖｏ分布も評価した。直鎖状ＰＥＧ、星型ＰＥＧ、およびデキストラン（５５ｍｇ／ｋｇ）をＰＮＤ１のＣＰ仔ウサギに全身的に（ｉ．ｖ．）注射した。注射してから２４時間後、直鎖状ＰＥＧ、星型ＰＥＧ、およびデキストラン分布を、脳室周囲白質領域（脳梁、側脳室の隅）において分析した。ＣＰ仔ウサギにおける脳室周囲領域（脳梁、および側脳室の隅を含む）で、直鎖状ＰＥＧ、星型ＰＥＧ、またはデキストランは存在しておらず、直鎖状ＰＥＧ、星型ＰＥＧおよびデキストランは、血液−脳−関門を通過しなかったことを示した。
（実施例４）
脳および主要臓器におけるＤ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５、ビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５、およびＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５の定量的生体内分布の比較
方法および材料
【０２２３】
３つのデンドリマーベースのナノ粒子、（Ｄ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５、ビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５、およびＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５）全てを、５５ｍｇ／仔ウサギ体重の重量ｋｇの用量で、生後（ＰＮＤ）１日目の脳性麻痺（ＣＰ）仔ウサギに静脈内投与した。仔ウサギを、注射してから４時間後および２４時間後に屠殺した。仔ウサギをＰＢＳで灌流した。全ての主要臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓）、および血漿を単離し、急速冷凍した。脳を取り出し、定量的生体内分布の項で記述したように、半分は、蛍光定量化用に急速冷凍保存し、もう半分は、共焦点イメージング用にとっておいた。
【０２２４】
蛍光分光法による脳内のデンドリマー分布および定量化を評価するために、脳を、３カ所のサブ領域の、皮質、脳室周囲領域（ＰＶＲ）および海馬へさらに顕微解剖した。図２は、Ｄ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５ならびに市販されているビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５、およびＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５に関するこれらの３カ所のサブ領域における脳分布の比較を示す。高密度の表面ヒドロキシル基を有する３つのデンドリマー全てが、障害を受けた血液脳関門（ＢＢＢ）を通過することができ、皮質、ＰＶＲおよび海馬に同様の量で存在した。ビス−ＭＰＡは、４時間の時点で多く存在するように思われたが、２４時間では少しの違いも示さなかった。ＰＶＲ領域において多くの蓄積を示すＰＡＭＡＭとは異なり、Ｄ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５およびビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５は、３カ所のサブ領域全てにおいて同様の分布を示した。Ｄ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５とビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５の両方が、健常対照と比較して、ＰＮＤ１  ＣＰ仔ウサギの皮質、ＰＶＲおよび海馬において数倍高い取り込みを示した（図３）。他の主要な臓器（心臓、肺、肝臓）全てにおける分布は、腎臓および血漿を除いて、３つのデンドリマー全てに関して同様であった。腎臓および血漿におけるＤ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５およびビス−ＭＰＡ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５の量は、ＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ６４−Ｃｙ５と比較して、４時間と２４時間の両方の時点においてはるかに少なく、それらの循環時間が短く、腎クリアランスが速いことを示した（図４）。
（実施例５）
眼におけるＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の定性的分布
方法および材料
ラット脂質注射ＡＭＤモデルおよびＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の投与
【０２２５】
この実験用ＡＭＤモデルのために、８週齢のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラットを選択した。研究は、ＡＲＶＯガイドラインに従って行い、動物プロトコールはＪｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓで承認された。ラットを、周囲条件（２２℃、５０％相対湿度および１２時間明／暗サイクル）下で飼育した。０日目に０．５Ｍホウ素酸塩緩衝剤（２０μｇ／ｍＬ）中のＨｐＯＤＥ（脂質）２μＬを、マイクロインジェクターを使用して網膜下に注射し、網膜下にブレブを形成した。Ｄ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５の眼球生体内分布を評価するために、脂質を注射してから３日後に、Ｄ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５を滅菌生理食塩水（２００μＬ）中で製剤化し、２０ｍｇ／Ｋｇの濃度で静脈内投与した。ラットを、デンドリマーを投与してから４８時間および７日後に屠殺した。安楽死後、適切な時点で眼球を摘出し、フラットマウント（flat-mount）および断面分析を行った。
組織の処理、免疫組織化学および共焦点イメージング
【０２２６】
フラットマウント：眼球を、氷中のＰＢＳ中で１時間インキュベートし、レンズを含む前部セグメントを除去した。網膜および脈絡膜を分離し、２％ＰＦＡ中に１２時間固定し、続いてヤギ血清で６時間ブロッキングした。ミクログリア／マクロファージを、抗ウサギＩｂａ−１を使用して４℃で１２時間、次にＣｙ３標識化ヤギ抗ウサギ抗体を用いて染色した。ＦＩＴＣ標識化レクチンを使用し、血管および単球を標識し、染色した。フラットマウントを、４ラジアルリラクゼーションカット（4  radial  relaxation  cuts）を使用して準備し、カバースリップに取り付け、タイル、Ｚスタック機能を使用し、共焦点７１０顕微鏡でイメージングした。画像は、Ｚｅｉｓｓソフトウェアを使用して処理した。
【０２２７】
断面：眼球を、５％スクロースを含む２％ＰＦＡ中で３時間固定し、レンズを含む前部セグメントを除去し、後部セグメントを、２０％までのスクロース勾配に供した。組織を、ＯＣＴを使用して凍結保存し、視神経に沿って解剖した（１０μｍ断片）。断片を、ヤギ血清を用いてブロッキングし、ミクログリア／マクロファージに関してはＩｂａ−１、血管および単球に関してはレクチン、ならびに核に関してはＤＡＰＩを使用して染色した。染色した断片を共焦点７１０顕微鏡でイメージングした。
結果
【０２２８】
脳の通過に加えて、加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）の網膜下脂質注射誘発モデルにおけるＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５と活性化ｍｉ／ｍａとの共局在も研究し、眼底疾患に適用するための血液−網膜関門を通過するその能力を判定した（Baba  T,  The  American  Journal  of  Pathology  2010,  176,  3085）。
【０２２９】
ＡＭＤは、酸化ストレス、炎症、および新血管形成を含む複数の活性化ｍｉ／ｍａ介在性病状に関与する、多因子性眼球変性疾患である（Madeira  MH,  Mediators  of  Inflammation  2015,  2015,  15）。毒性脂質の病理学的蓄積は、患者の失明につながり、現在のところ乾燥および初期ＡＭＤのための利用可能な治療法は存在しない。
【０２３０】
ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の標的を絞る能力を、細胞損傷を誘発するために脂質の網膜下注射で作製された乾燥ＡＭＤラットモデルで試験を行い、ブレブと称される新血管形成領域を得た。脈絡膜フラットマウントの共焦点イメージングによって、健常組織において最小限のシグナルで全身投与された後、特にブレブ領域において活性化ｍｉ／ｍａとともに局在したＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５シグナルが示される。
【０２３１】
フラットマウントと断面の両方で、ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５デンドリマーが、網膜と脈絡膜の組織の両方における炎症領域を標的とし、そこで保持されることが実証される。網膜組織では、ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５が、ブレブ境界における放射状血管および毛細血管付近に蓄積したミクログリア細胞に局在していると認められた。血管はレクチンで、ミクログリア／マクロファージはＩｂａ−１で染色し、デンドリマー（ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５）はＣｙ５を使用して、および核はＤＡＰＩで標識した。５倍の拡大倍率によって、静脈内で投与されたデンドリマーは、炎症領域においてのみ局在していると認められたことが実証される。画像の拡大倍率が高くなるにつれて（４０倍）、ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５は網膜のブレブ領域における漏出血管付近の活性化ミクログリア／マクロファージに共局在していると認められたことが実証される。高倍率の画像によって、傷害領域に関連する網膜ミクログリアにおいてＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５が共局在することを明らかに実証し、したがって標的を絞った局在が裏付けられる。
【０２３２】
脈絡膜組織では、デンドリマーは、脈絡膜のブレブ領域のものに対応する傷害領域の活性化マクロファージおよび肥大性網膜色素上皮（ＲＰＥ）においてのみ認められた。脈絡膜組織はレクチン（血管）、Ｉｂａ−１でミクログリア／マクロファージ、およびデンドリマー（Ｄ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５）について染色した。２０倍の画像によって、デンドリマーはブレブ領域で認められることが示され、高倍率画像（４０倍の画像）によって、デンドリマーは、ブレブ領域における活性化マクロファージおよび肥大性網膜色素上皮（ＲＰＥ）に共局在することが確認される。
【０２３３】
生体内分布を詳述するために、後部セグメント（網膜＋脈絡膜複合体）の断面分析を行った。断片によって、網膜では、デンドリマーは、活性化ミクログリア、ミュラーグリア（Muller  glia）（位置に基づいて）および単球に共局在することが示された。ラットの眼の後部セグメントの１０ミクロン断片はレクチン（血管）、ミクログリア／マクロファージ（Ｉｂａ−１）、核（ＤＡＰＩ）、およびＣｙ５を使用して標識したデンドリマー（ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５）について染色した。５倍の画像によって、炎症の特性を呈するブレブ領域を含む後部断片全体（Ｉｂａ−１に対して陽性と標識された蓄積細胞）が示された。高倍率の２０倍画像によって、デンドリマーは、脈絡膜および網膜における活性化ミクログリア／マクロファージと、網膜におけるミュラー細胞との炎症領域においてのみ共局在することが実証される。したがって、断面は、これらの所見を裏付け、ＰＥＧＯＬ−６０は、ブレブ領域における網膜および脈絡膜の活性化ｍｉ／ｍａおよびＣＮＶ血管に局在し、眼の健常領域には局在しないことを示す。
【０２３４】
要約すると、ＰＥＧＯＬ−６０は、全身投与した場合、ラットＡＭＤモデルにおける網膜および脈絡膜で病状依存的生体内分布を示す。これらの結果は、ＰＥＧＯＬ−６０が、利用可能な治療介入がほぼ存在しないＡＭＤ、ならびに他の後部セグメント眼疾患、例えば糖尿病性網膜症、未熟児網膜症、網膜色素変性症、およびブドウ膜炎における全身性の標的を絞った治療法のための有望な薬物担体であることを示唆する（M.  Karlstetter,  et  al.,  Progress  in  Retinal  and  Eye  Research,  45,  30  (2015)）。
（実施例６）
神経膠芽腫（ＧＢＭ）マウスモデルにおいて腫瘍関連マクロファージを標的とするＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５
方法および材料
ＧＢＭマウスモデルおよびＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の投与
【０２３５】
６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から購入し、実験手順は、ＡＣＵＣで承認されたプロトコールのもとで行った。ＧＬ２６１マウスＧＢＭ腫瘍細胞を、１０％熱不活性化ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）、１％ペニシリン／ストレプトマイシン抗生物質（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、および１％ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）が補充された低グルタミンＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーター内で成長させた。細胞をトリプシン剥離（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ；Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＮＹ）を介して採取して接種した。マウスに、標準的な生理食塩水（Ｑｕａｌｉｔｙ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．；Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）中の１００ｍｇ／ｋｇケタミン（Ｈｅｎｒｙ  Ｓｃｈｅｉｎ；Ｍｅｌｖｉｌｌｅ、ＮＹ）および１０ｍｇ／ｋｇキシラジン（ＶｅｔＯｎｅ；Ｂｏｉｓｅ、Ｉｄａｈｏ）のカクテルをＩＰ注射して麻酔をかけた。頭蓋骨の正中線に沿って切開を行い、穿頭孔を開けて、ハミルトンシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｃｏｍｐａｎｙ；Ｒｅｎｏ、ＮＶ）を挿入した。媒体２μＬ中のＧＬ２６１細胞１００，０００個を、定位固定フレームおよび自動シリンジポンプ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ  Ｃｏ．；Ｗｏｏｄ  Ｄａｌｅ、ＩＬ）を介して０．２μＬ／分の速度で右半球線条体に注射した。次いでマウスを縫合し（Ｅｔｈｉｃｏｎ  Ｉｎｃ．；Ｓｏｍｅｒｖｉｌｌｅ、ＮＪ）、外科的回復をモニターした。ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の投与に関しては、接種してから１５日後、マウスに５５ｍｇ／ｋｇＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５を静脈内注射した。マウスを灌流し、投与してから２４時間後に脳を採取した。
ＧＢＭモデルに関する免疫組織化学および共焦点イメージング
【０２３６】
腫瘍を接種してから１４日後に、動物に５５ｍｇ／ｋｇＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５を静脈内投与し、２４時間後に脳を採取した。脳を、１０％ホルマリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）中で２４時間、続いて１０％から３０％スクロース勾配で２４時間それぞれ固定した。次いで脳を凍結させ、冠状に解剖し、３０μｍの薄片にした。脳薄片を、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、および５％標準ヤギ血清（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）が補充された１×ＴＢＳ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）で室温で４時間ブロッキングした。ミクログリアをトマトレクチン（１：１０００、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｓ；Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）で、細胞核をＮｕｃＢｌｕｅ  ＤＡＰＩ細胞染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で標識した。次いでスライドへ、封入媒体（Ｄａｋｏ）とともにカバースリップを載せた。共焦点画像は、Ｚｅｉｓｓ  ＺＥＮ  ＬＳＭ７１０（Ｚｅｉｓｓ）で得、ＺｅｎＬｉｔｅソフトウェアで処理した。
結果
【０２３７】
ＰＥＧＯＬ−６０を、ＧＢＭマウスモデルにおいてさらに評価し、炎症促進性疾患内の活性化ｍｉ／ｍａとのこの特異的な共局在が、標的となる抗炎症Ｍ２−表現型ｍｉ／ｍａにまでも及ぶかどうか、および固形腫瘍全体にわたり均一に分布できるかどうかを評価した。これらの標的となる腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）は、誘発性の抗炎症表現型を有し、がん細胞からの分泌シグナルによって腫瘍成長を促進し、腫瘍殺傷免疫応答を抑制する宿主マクロファージであり、がんと闘う細胞へと、偏りを変更させる（repolarize）ための免疫モジュレート剤にとって理想的な治療標的となる（Yang  Y  et  al.,  Hematol  Oncol  2017,  10,  58）。
【０２３８】
多くの強力な新規の抗がん療法の発見にもかかわらず、これらの処置は臨床的に適切な量でＢＢＢを通過して固形脳腫瘍に侵入することができず、その結果、全身毒性につながるような高用量を必要とするために、臨床的な結果はＧＢＭでは得られていない。広範囲に特徴づけられており、ヒトの免疫プロファイルを厳密に再現することが公知であるＧＢＭのＧＬ２６１頭蓋内注射マウスモデルにおいて、ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の腫瘍を標的とする能力を研究した（Jacobs  VL  et  al.,  ASN  Neuro  2011,  3,  AN20110014）。
【０２３９】
ＧＬ２６１マウスＧＢＭ細胞をマウスの線条体に接種し、接種してから１５日後にＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５を静脈内投与した。
【０２４０】
ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５は、全身投与された場合、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）を選択的に標的とする。投与してから２４時間後に脳を採取し、デンドリマー（Ｃｙ５）、細胞核（ＤＡＰＩ）、およびＴＡＭ（レクチン）に関する共焦点画像を採取し、研究した。ＰＥＧＯＬ−６０は、腫瘍においてＴＡＭと共局在する一方、反対側の半球の健常脳組織では最小限のデンドリマーシグナルを示した。共焦点画像によって、ＰＥＧＯＬ−６０は、腫瘍の中心に完全に侵入し、腫瘍全体にわたってＴＡＭ間に均一に分布することも実証される。デンドリマーが取り込まれると、腫瘍内のＴＡＭにおけるデンドリマーシグナルおよび腫瘍周辺領域で認められる最小シグナルを用いて、腫瘍境界が明確に示される。
【０２４１】
要約すると、ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５は、全身投与された場合、固形腫瘍内のＴＡＭを特異的に標的化する一方、反対側の半球において最小限のシグナルを示すことが実証されている。デンドリマーは、固形腫瘍へ完全に侵入し、全体にわたって分布し、ＢＢＢと従来の関門の両方を克服し、固形腫瘍、例えば発達が不十分な血管系および高い間質液圧へ送達されることが可能である。ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５のシグナルは、腫瘍領域を明確に示し、腫瘍周辺領域にでさえ、脳の健常部分においてｍｉ／ｍａに比べＴＡＭに対して特異性を有することを実証する。これらの発見は、ＰＥＧＯＬ−６０が、健常脳組織に損傷を与えることなく、ＧＢＭにおける固形腫瘍に特異的にかつ全身的に免疫療法を送達する理想的なナノプラットフォームを提供することを示唆する。
（実施例７）
ＰＥＧＯＬ−６０の抗酸化および抗炎症活性のｉｎ  ｖｉｔｒｏ評価
方法および材料
細胞培養
【０２４２】
ＢＶ２マウスミクログリアをＣｈｉｌｄｒｅｎ’ｓ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎの細胞培養施設から得た。細胞を、１０％熱不活性化ウシ胎仔血清および１％ペニシリン／ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中、３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーター内で培養した。細胞を、トリプシン剥離および３日ごとの継代を介し維持した。８０〜９０％のコンフルエンスで細胞を採取し、２４ウェルプレートに播種して、実験を行った。
細胞毒性評価
【０２４３】
ＢＶ−２マウスミクログリア細胞系を、実験の項で記載したように培養し、１ウェル当たり１０，０００個の細胞濃度で９６ウェルプレート（Ｓｉｇｍａ）に１つおきに播種した。次いで細胞を付着させ、２４時間成長させた。１０００μｇ／ｍＬ  ＰＥＧＯＬ−６０の原液を、１０％ＨＩ−ＦＢＳおよび１％ペニシリン−ストレプトマイシンが補充されたＤＭＥＭ媒体中で作製し、ボルテックスし、超音波処理し、滅菌ろ過した。次いでこの溶液を培地で希釈し、１００、１０、１、および０．１μｇ／ｍＬ  ＰＥＧＯＬ−６０原液を作製した。培地を９６ウェルプレートの全てのウェルから吸引し、ＰＥＧＯＬ−６０を含有する培地または新しい培地のいずれかに細胞上で取り換え、これをさらに２４時間培養した。滅菌ＰＢＳ中のＭＴＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の１２ｍＭ原液を作製し、ボルテックスで混合し、超音波処理した。培地を全てのウェルから除去し、ＭＴＴ溶液１０μＬを添加したまま、新しい培地１００μＬを各ウェルへ添加し、これをピペッティングして培地と混合した。次いで細胞をＭＴＴ中で４時間インキュベートし、その後ＭＴＴ培地８５μＬを除去し、ピペッティングでよく混合しながらＤＭＳＯ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）１５０μＬと取り換えた。ＤＭＳＯを、細胞と３７℃で１０分間インキュベートし、その後ウェルをピペッティングして再び混合してから、各ウェルのλ＝５４０ｎｍにおける吸光度を、Ｇｅｎ５ソフトウェア（ＢｉｏＴｅｋ）を実行するＳｙｎｅｒｇｙ  Ｍｘマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ、Ｗｉｎｏｏｓｋｉ、ＶＴ）に読み取った。培地対照のバッググラウンドを差し引いた後、吸光度を、未処置の細胞と比較した比率へ全て変換した。３つのプレートを使用し、処置を各プレートで３回繰り返して行い、平均値を求め、１つのデータ点を作成した。
ＬＰＳ刺激および評価
【０２４４】
ＢＶ２マウスミクログリアを、２４ウェルプレートに播種した。細胞を、血清不含培地中、１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３時間刺激し、続いてＰＥＧＯＬ−６０および１００ｎｇ／ｍｌ  ＬＰＳと２４時間コインキュベートした。ＰＥＧＯＬ−６０を培地中に可溶化し、２０μｍ孔径フィルターに通してシリンジろ過した。培地を採取し、Ｇｒｉｅｓｓ反応（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ；Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を介してナイトライト産生、およびＥＬＩＳＡ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ；Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を介してＴＮＦα分泌を分析した。
【０２４５】
細胞をＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）１ｍＬ中に採取してＰＣＲ分析を行った。簡潔には、クロロホルム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）２００μＬを添加し、試料を振とうし、氷上で１５分間インキュベートした。次いで試料を１２０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、水性フラクションを採取した。イソプロパノール（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）５００μＬを各試料へ添加し、混合し、氷上で１０分間インキュベートした。試料を１２０００ｒｐｍで１５分間再び遠心分離し、ＤＥＰＣ水（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中の７５％エタノールで洗浄した。試料にｎａｎｏｄｒｏｐ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を行い、ＲＮＡ濃度を判定し、ｃＤＮＡ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ；Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ、ＣＡ）へ変換した。試料を、高速ＰＣＲプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）上でｇｒｅｅｎ  ｓｙｂｅｒ試薬（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を用いてＳｔｅｐＯｎｅ  ＰｌｕｓリアルタイムＰＣＲシステム（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）で測定した。相対的発現を、２デルタデルタＣＴ計算を介して判定し、未処置の刺激されていない対照試料に対して正規化した。ＩＬ１０、ｉＮＯＳ、およびＣＤ２０４用のＰＣＲプライマーは、Ｂｉｏｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ）から得た。ＴＮＦα（Ｆ：ＣＣＡ  ＧＴＧ  ＴＧＧ  ＧＡＡ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＴＴ（配列番号１）；Ｒ：ＡＡＧ  ＣＡＡ  ＡＡＧ  ＡＧＧ  ＡＧＧ  ＣＡＡ  ＣＡ（配列番号２）、ＩＬ６（Ｆ：ＴＣＣ  ＡＧＴ  ＴＧＣ  ＣＴＴ  ＣＴＴ  ＧＧＧ  ＡＣ（配列番号３）；Ｒ：ＧＴＧ  ＴＡＡ  ＴＴＡ  ＡＧＣ  ＣＴＣ  ＣＧＡ  ＣＴＴ  Ｇ（配列番号４））、Ａｒｇ１（Ｆ：ＴＣＡＴＧＧＡＡＧＴＧＡＡＣＣＣＡＡＣＴＣＴＴＧ（配列番号５）；Ｒ：ＴＣＡ  ＧＴＣ  ＣＣＴ  ＧＧＣ  ＴＴＡ  ＴＧＧ  ＴＴＡ  ＣＣ（配列番号６））、ＩＬ４（Ｆ：ＴＧＴ  ＡＧＧ  ＧＣＴ  ＴＣＣ  ＡＡＧ  ＧＴ（配列番号７）；Ｒ：ＧＡＡ  ＡＧＡ  ＧＴＣ  ＴＣＴ  ＧＣＡ  ＧＣＴ  Ｃ（配列番号８））、およびＧＡＰＤＨ（Ｆ：ＴＧＴ  ＣＧＴ  ＧＧＡ  ＧＴＣ  ＴＡＣ  ＴＧＧ  ＴＧＴ  ＣＴＴ  Ｃ（配列番号９）；Ｒ：ＣＧＴ  ＧＧＴ  ＴＣＡ  ＣＡＣ  ＣＣＡ  ＴＣＡ  ＣＡＡ（配列番号１０））用のＰＣＲプライマーは、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）から購入した。
酸化ストレス誘発性の細胞死
【０２４６】
ＢＶ２マウスミクログリアをＤ２−ＯＨ−６０で２４時間前処置し、続いて５００μＭ  Ｈ２Ｏ２（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で３時間酸化ストレス傷害を与えた。細胞を、トリプシン処理を介して採取し、トリパンブルー（Ｃｏｒｎｉｎｇ）と１：１で混合し、細胞生存能力を計数した。
結果
【０２４７】
ＰＥＧＯＬ−６０の固有の抗酸化および抗炎症有効性を調査した（Posadas  I  et  al.,    Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  2017,  114,  E7660、Chauhan  AS  et  al.,  Biomacromolecules  2009,  10,  1195）。最初に、ＰＥＧＯＬ−６０は、ＭＴＴアッセイを介して曝露してから２４時間後では、少なくとも１０００μｇ／ｍＬまで細胞毒性が認められなかった（図５；ｎ＝３、ｐ＜０．０５）。
【０２４８】
ＰＥＧＯＬ−６０の治療有効性を査定するために、ＢＶ２マウスミクログリアにＬＰＳを負荷し、炎症促進状態を誘発し、次いでＬＰＳおよびＰＥＧＯＬ−６０で同時処置し、炎症および酸化ストレスのマーカーに関して査定した。任意の抗酸化または抗炎症剤を添加せずにＰＥＧＯＬ−６０で処置すると、ＴＮＦ−α、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびｉＮＯＳを含む炎症促進性サイトカインの発現（図６Ａ〜６Ｄ）、ならびに抗炎症マーカーＣＤ−２０６、Ａｒｇ−１、およびＩＬ−４の上方調節（図６Ｅ〜６Ｇ）が、一般的に用量依存的様式で顕著に減少した。炎症促進マーカーと抗炎症マーカーの両方が、５００μｇ／ｍｌ  ＰＥＧＯＬ−６０の高用量処置で健常レベル付近まで回復した。タンパク質レベルでは、細胞外分泌ＴＮＦα（図６Ｈ；ｐ＜０．００１）およびナイトライトイオン（図６Ｉ；ｐ＜０．００１）が顕著に減少した。
【０２４９】
この強力な抗酸化効果に基づいて、酸化ストレス傷害後のＰＥＧＯＬ−６０の有効性も査定した。ＰＥＧＯＬ−６０を用いた前処置によって、Ｈ２Ｏ２を負荷後の細胞生存率が顕著に改善された（図６Ｊ；ｐ＜０．００１）。この抗酸化効果は、治療ペイロードが存在しないいくつかの他のデンドリマー構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方で認められた結果と一致する（Neibert  K  et  al.,  Molecular  Pharmaceutics  2013,  10,  2502、Posadas  I  et  al.,    Proceedings  of  the  National  Academy  of  Sciences  2017,  114,  E7660、Chauhan  AS  et  al.,  Biomacromolecules  2009,  10,  1195）。この抗酸化効果は、反応性酸素種（ＲＯＳ）を中和するためのスカベンジャーとして作用するデンドリマー骨格の自由電子におそらく起因する。骨格におけるこれらのスカベンジャーの（ＲＯＳ）へのアクセスは、分岐アームによって立体的に阻害され、一連の世代層がそれぞれ内部をさらに遮蔽する可能性がある。ＰＥＧＯＬ−６０は、比較的に低世代で高密度ヒドロキシル基を実現し、ＲＯＳスカベンジングの骨格へのアクセスを可能にするために、優れたナノ担体としての所望の特性を有する。
（実施例８）
ＰＥＧＯＬ−６０のｉｎ  ｖｉｖｏ有効性および安全性プロファイル
方法および材料
ＰＥＧＯＬ−６０のｉｎ  ｖｉｖｏ投与
【０２５０】
ＰＮＤ１に、ＣＰ群における同腹子を、３サブ群：ＰＢＳ、ＰＥＧＯＬ−６０単回投薬およびＰＥＧＯＬ−６０再投薬群に無作為に分割した。ＰＥＧＯＬ−６０（１００ｍｇ／ｋｇ、２００μＬ）静脈内注射の単回投薬を、ＰＥＧＯＬ−６０単回投薬群のウサギへＰＮＤ１に行った。ＰＥＧＯＬ−６０（１００ｍｇ／ｋｇ、２００μＬ）静脈内注射を、ＰＥＧＯＬ−６０再投薬群のウサギへＰＮＤ１およびＰＮＤ３に行った。ＰＢＳ（２００μＬ）静脈内単回投薬注射を、ＰＢＳ群のウサギへＰＮＤ１に行った。投与のために使用する全ての溶液を、０．２μｍ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）を使用して滅菌してから注射した。
行動試験
【０２５１】
動物（ｎ＝６）の一般的な身体状態（例えば、体重増加、食餌摂取量など）を毎日モニターした。実験が知らされていない担当者によって、ＰＮＤ１に、薬物投与前（ベースライン、０時間）、ならびに薬物投与してから２４、４８および９６時間後の神経行動試験を行った。各動物を１０分間ビデオテープに録画し、ウサギに関して記載したように、頭の動きに関して０〜３（０＝最も悪い；３＝最も良い）のスケールでスコア化した（E.  Nance,  et  al.,  Biomaterials,  101,  96  (2016)、Z.  Zhang,  et  al.,  Neurobiology  of  Disease,  94,  116  (2016)）。仔ウサギにＷｏｍｂａｒｏｏウサギミルク代替品（Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｐｅｔｓ  Ｉｎｃ、Ｂｅｌｌｅｖｉｌｌｅ、ＭＩ）を与え、吸う／飲み込むを０〜３（最も悪い〜最も良い）のスケールで査定した（J.  Yang,  et  al.,  Chemical  Reviews,  115,  5274  (2015)）。疾患の表現型の変動の影響を最小限にするために、処置する前（０時間）ならびに処置してから２４、４８および９６時間後の各仔ウサギに関する行動スコアにおける変化を使用し、治療法の有効性を評価した。詳細には、ＰＮＤ１の、処置前（０時間）の各仔ウサギの行動スコアをベースラインスコアとして使用した。処置してから２４、４８および９６時間における各仔ウサギに関する神経行動スコアにおける変化を、以下のように算出した。
ベースラインからの変化（４８）＝スコア（４８時間）−スコア（０時間）またはベースラインからの変化（９６）＝スコア（９６時間）−スコア（０時間）
【０２５２】
各群における仔ウサギの変化の全てを平均し、群間で比較した。
リアルタイムＰＣＲ
【０２５３】
ＰＮＤ５に、全ての群からの仔ウサギ（ｎ＝３）を安楽死させた。脳をすぐに収集し、ＲＮＡｌａｔｅｒ溶液（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）中で貯蔵した。脳室周囲領域（ＰＶＲ）の白質および小脳白質領域を顕微解剖した（約５０ｍｇ）。全てのＲＮＡを、製造業者の取扱説明書に従ってＴＲＩＺＯＬ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して抽出した。ＲＮＡ試料を、Ｎａｎｏｄｒｏｐ  ＮＤ−１０００分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）を使用して定量化した。一本鎖ストランドの相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を、ＲＮＡ分解酵素阻害剤を用いたＨｉｇｈ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用して全てのＲＮＡ試料から最初に逆転写した。Ｆａｓｔ７５００リアルタイムＰＣＲシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を使用し、Ｐｏｗｅｒ  ＳＹＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ、ＵＳＡ）を用い、リアルタイムＰＣＲを行った。増幅条件は、４８℃で３０分、９５℃で１０分、９５°Ｃで１５秒を４０サイクル、６０℃で１分を含む。プライマーをカスタム設計し、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｉｏｗａ、ＵＳＡ）にオーダーした。比較Ｃｔ法を使用し、異なる遺伝子発現を査定した。各試料に関する遺伝子発現レベルを、所与の試料内のグリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）をコードするハウスキーピング遺伝子の発現レベルに対して正規化し（ΔＣｔ）、健常対照群に対する処置群間の違いを使用し、ΔΔＣｔを判定した。２−ΔΔＣｔによって、遺伝子発現において相対的倍率変化が得られた。プライマーは、以下の通りであった。
ＴＮＦ−α（フォワード）ＴＡＧＴＡＧＣＡＡＡＣＣＣＧＣＡＡＧＴＧ（配列番号１１）、
ＴＮＦ−α（リバース）ＣＴＧＡＡＧＡＧＡＡＣＣＴＧＧＧＡＧＴＡＧＡ（配列番号１２）。
ＩＬ−１β（フォワード）ＴＧＣＣＡＡＣＣＣＴＡＣＡＡＣＡＡＧＡＧ（配列番号１３）、
ＩＬ−１β（リバース）ＡＡＡＧＴＴＣＴＣＡＧＧＣＣＧＴＣＡＴＣ（配列番号１４）。
ＩＬ−６（フォワード）ＣＡＴＣＡＡＧＧＡＧＣＴＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧ（配列番号１５）、
ＩＬ−６（リバース）ＣＣＴＴＧＧＡＡＧＧＴＧＣＡＧＡＴＴＧＡ（配列番号１６）。
ＧＡＰＤＨ（フォワード）ＴＧＡＣＧＡＣＡＴＣＡＡＧＡＡＧＧＴＧＧＴＧ（配列番号１７）、
ＧＡＰＤＨ（リバース）ＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＴＧＧＧＴＧＴＣ（配列番号１８）。
結果
【０２５４】
生後（ＰＮＤ）１日目で、ＣＰ同腹子を、３つのサブ群：ＰＢＳ、ＰＥＧＯＬ−６０単回投薬、およびＰＥＧＯＬ−６０再投薬群に無作為に分割した。静脈内注射を介し、ＰＥＧＯＬ−６０単回投薬群のウサギへＰＥＧＯＬ−６０の単回投薬を、滅菌ＰＢＳ２００μＬ中の１００ｍｇ／ｋｇでＰＮＤ１に行った。静脈内注射を介し、ＰＥＧＯＬ−６０再投薬群のウサギへ、ＰＥＧＯＬ−６０を、滅菌ＰＢＳ２００μＬ中の１００ｍｇ／ｋｇでＰＮＤ１およびＰＮＤ３に与えた。静脈内注射を介し、ＰＢＳ群のウサギへ、ＰＢＳ（２００μＬ）の単回投薬をＰＮＤ１に行った。仔ウサギの全身状態、神経行動、および体重を毎日モニターした。群間では、吸うおよび飲み込む、頭部運動、ならびに体重増加に顕著な違いはなかったことが認められた（図７Ａ〜Ｃ）。さらに、群間でサイトカイン発現顕著な変化はなかった（図７Ｄ〜Ｆ）。これらの結果によって、ＰＥＧＯＬ−６０がＣＰ仔ウサギの神経行動スコアをさらに低下させるものではないことが示され、ＰＥＧＯＬ−６０は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用に関して非毒性担体であることを示唆する。
（実施例９）
脳性麻痺（ＣＰ）の新生ウサギモデルにおけるＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５生体内分布の定性的脳分布
方法および材料
ＣＰウサギモデルおよびＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の投与
【０２５５】
Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｉｎｃ．（ＮＣ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）から購入したニュージーランド白ウサギは、繁殖の２週間前に施設に到着した。全ての動物を周囲条件下（２２℃、５０％相対湿度、および１２時間光／暗サイクル）で飼育し、実験処置と関連する疼痛およびストレスを最小限にするために必要な予防策を研究全体にわたって講じた。実験手順は、Ｊｏｈｎｓ  Ｈｏｐｋｉｎｓ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって承認された。妊娠２８日目（Ｇ２８）に、妊娠中のウサギに開腹術を行い、前述のように、合計３，２００ＥＵのリポ多糖（ＬＰＳ、Ｅ．ｃｏｌｉ血清型Ｏ１２７：Ｂ８、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を子宮壁に沿って注射した（F.  Saadani-Makki,  et  al.,  American  journal  of  obstetrics  and  gynecology,  199,  651.e1  (2008)、S.  Kannan,  et  al.,  Developmental  Neuroscience,  33,  231  (2011)、S.  Kannan,  et  al.,  Dev  Neurosci-Basel,  33  (2011)）。ウサギにＰｉｔｏｃｉｎ（登録商標）（０．５単位／ｋｇ）（ＪＨＰ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ、ＭＩ）の静脈内注射をＧ３０で行い、分娩を誘発した。出産後、仔ウサギを約３２〜３５℃の温度および約５０〜６０％の相対湿度のインキュベーター内で維持し、ウサギミルク代替品（Ｗｏｍｂａｒｏｏ；Ｓｏｕｔｈ  Ａｕｓｔｒａｌｉａ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を１日３回与えた。生後１日目（ＰＮＤ１）で、健常対照およびＣＰ仔ウサギに静脈内注射を介してＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５（５５ｍｇ／ｋｇ、２００μＬ）の単回投薬を行った。ＣＰ仔ウサギを、注射してから１、４および２４時間後に屠殺した。健常対照を、注射してから２４時間後に屠殺した。投与のために使用する全ての溶液を、０．２μｍ  Ａｃｒｏｄｉｓｃ（登録商標）シリンジフィルター（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ、ＮＹ）を使用して滅菌してから注射した。
ＣＰモデルに関する免疫組織化学
【０２５６】
ＰＮＤ１に、動物にＰＥＧＯＬ−Ｃｙ５（５５ｍｇ／ｋｇ、２００μＬ）の静脈内（ｉ．ｖ．）投与し、注射してから２４時間後に屠殺した。ウサギに麻酔をかけ、ＰＢＳで経心的に灌流した。全ての主要臓器（腎臓、肺、肝臓、心臓）、および血漿を単離し、急速冷凍した。脳を取り出し、二等分した。半分は、蛍光定量用に急速冷凍し、もう半分は、１０％ホルマリンで４８時間、後固定し、段階的なスクロース溶液中で凍結保護した。冠状断片（３０μｍ、１：６シリーズ）を、３％の０．１Ｍリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の標準ロバ血清によってブロッキングした。ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５およびミクログリアの共局在に関しては、断片をヤギ抗ＩＢＡ１（１：２５０、Ａｂｃａｍ、ＭＡ．Ｕ．Ｓ．Ａ．）とともに４℃で一晩インキュベートした。その後断片を洗浄し、蛍光二次抗体（１：２５０；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＭＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）とともに室温で２時間インキュベートした。次に、断片を、ＤＡＰＩ（１：１０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１５分間インキュベートした。洗浄後、スライドを乾燥させ、カバースリップを封入媒体とともに載せた（Ｄａｋｏ、Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ、ＣＡ、ＵＳＡ）。共焦点画像は、Ｚｅｉｓｓ  ＺＥＮ  ＬＳＭ  ７１０（Ｚｅｉｓｓ、ＣＡ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）を用いて得、ＺＥＮソフトウェアで処理した。
ＣＰ仔ウサギ脳の顕微解剖の手順
【０２５７】
屠殺し、灌流後、各仔ウサギ脳の一方の半球を−８０℃で急速冷凍し、保存してから、本発明者らの近年発表した原稿中の手順概要に従って顕微解剖を行った。簡潔には、脳を、ドライアイスベッド上の使い捨てペトリ皿中で加温し、次いできれいなかみそりの刃を用いて同じ厚さの５つの断片にカットした。脳幹と嗅球を有する前部断片とを廃棄し、その後皮質を、新しい外科用メスの刃を用いて残りの断片から除去し、予め秤量した１．５ｍＬのエッペンドルフ管に入れた。次いで海馬および脳室周囲領域を、拡大鏡下で残りの組織から単離し、予め秤量した別の１．５ｍＬのエッペンドルフ管に入れた。各エッペンドルフ管を再び秤量し、試料の質量を判定し、次いで全ての試料を−８０℃で貯蔵してからホモジネートし、抽出することによって下流処理を行った。３つの皮質試料、２つのＰＶＲ試料、および１つの海馬試料が各脳から得られ、これらそれぞれを一緒に平均化し、各脳の脳サブユニットごとに１つのデンドリマー取り込み値を得た。
組織試料からのデンドリマーの抽出
【０２５８】
簡潔には、臓器（心臓、肺、肝臓、腎臓、脳）を−８０℃から取り出し、氷上でゆっくりと解凍し、秤量した。公知量の組織試料（肝臓、肺、腎臓から３つ、および心臓から２つ）を得るために、臓器を解剖した。脳半球をさらに顕微解剖し、本発明者らが近年発表したプロトコールを使用して、皮質、海馬および脳室周囲領域に分離した。公知量の組織試料を、脳のこれらのサブ領域から得た（皮質から３つ、ＰＶＲから２つおよび海馬から１つ）。組織試料を、Ｂｕｌｌｅｔ  Ｂｌｅｎｄｅｒ  Ｓｔｏｒｍ２４組織ホモジナイザー（Ｎｅｘｔ  Ａｄｖａｎｔａｇｅ  Ｉｎｃ．、Ａｖｅｒｉｌｌ  Ｐａｒｋ、ＮＹ）で、メタノール中の０．９〜２．０ｍｍのステンレス鋼ホモジネート用ビーズとともに１ｍＬ：１００ｍｇの組織比率で、脳に関しては電力レベル６、他の主要な臓器に関しては全て電力レベル１２で、４℃で１０分間ホモジネートした。次いでホモジネートした試料を１５０００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した。透明な上澄みを、ｐｒｏｔｅｉｎ  ｌｏ−ｂｉｎｄエッペンドルフ管へ移し、−８０℃で貯蔵した。
蛍光定量化
【０２５９】
上澄みを解凍し、再び遠心分離し、上澄み１３０μＬを、マイクロキュベット（Ｓｔａｒｎａ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｃ．；Ａｔａｓｃａｄｅｒｏ、ＣＡ）へ移して測定を行った。各試料における蛍光強度を、Ｐａｎｏｒａｍａ３ソフトウェアを実行するＲＦ５３０１ＰＣ蛍光分光光度計（Ｓｈｉｍａｄｚｕ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ、ＭＤ）を使用し、Ｃｙ５（λｅｘ＝６４５ｎｍ、λｅｍ＝６６２ｎｍ）に関して判定した。バックグラウンド蛍光を、健常対照組織の蛍光値から調整した。次いで蛍光強度値を、適切なスリット幅に対するＤ２−ＯＨ−６０−Ｃｙ５の検量線を使用してデンドリマー濃度へ変換した。血漿をｄＰＢＳ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．）中で１０倍に希釈し、次いで０．２μｍ孔径ＰＥＳフィルターに通し、臓器試料に関して上述のように測定した。
結果
【０２６０】
ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＢＢＢに侵入し、神経炎症へ標的を絞る能力を、共焦点顕微鏡および蛍光分光法をそれぞれ使用して、脳性麻痺の新生ウサギモデルにおいて定性的にかつ定量的に評価した。ＣＰは、母体の感染／炎症を含む発達中の脳への傷害／傷害によって引き起こされ、運動、感覚、および認知障害を呈する子孫をもたらす（Rosenbaum  PN  et  al.,  Developmental  Medicine  &  Child  Neurology,  49,  8  (2007)）。未成熟白質におけるびまん性のミクログリアおよびアストロサイトの活性化によって特徴づけられる脳室周囲白質軟化は、ヒトにおけるＣＰの病態生理学的特質のうちの１つである（Haynes  RL  et  al.,  Journal  of  Neuropathology  &  Experimental  Neurology,  62,  441  (2003)）。白質傷害とは別に、ＣＰは、ＣＰ患者の脳の皮質および海馬を含む灰白質領域における神経傷害にも関与する（Andiman  SE  et  al.,  Brain  Pathology,  20,  803  (2010)、C.  R.  Pierson  CR  et  al.,  Acta  Neuropathologica,  114,  619  (2007)）。
【０２６１】
脳梁（白質）、海馬、および皮質におけるＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の取り込みを、脳性麻痺の母体子宮炎症誘発性ラピーヌ（lapine）モデルで、単一の全身性用量を投与してから１、４、および２４時間後に調査した。このモデルは、ヒト患者で認められる特質的なミクログリアおよびアストロサイトの炎症促進性活性化、ならびに代表的な行動マーカー、例えば後肢硬直および痙縮を再現する。ＰＮＤ１に、ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５（５５ｍｇ／ｋｇ）をＣＰ仔ウサギ（ｎ＝３）に静脈内投与し、注射してから１、４、および２４時間後に屠殺し、同等の用量を静脈内投与してから２４時間後に屠殺した健常対照（ｎ＝３）と比較した。ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５と活性化ｍｉ／ｍａとの共局在は、ＣＰ仔ウサギにおける脳梁、海馬、および皮質のアメーバ体（amoeboid  soma）によって短縮されたプロセスで示され、脳におけるこれらの傷害部位の活性化ミクログリアでのデンドリマー蓄積が強く示唆される（Reid  SM  et  al.,  Developmental  Medicine  &  Child  Neurology,  57,  1159  (2015)）。ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５は、これらの活性化ｍｉ／ｍａの核周囲細胞質に主に分布する。ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５が血管から溢出し、脳梁、海馬、および皮質の傷害脳領域で１時間以内に活性化ｍｉ／ｍａにおいて迅速に局在できることが示される。ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５シグナル強度は、活性化ｍｉ／ｍａにおいて４時間で増加し、注射してから２４時間後に同様のレベルで存在しており、傷害部位におけるナノ粒子の蓄積を、局所的持続放出の可能性とともに実証した。対照的に、注射してから２４時間後の健常対照におけるｍｉ／ｍａとの共局在は観察されなかった。
【０２６２】
次に、ＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の定量的な脳および臓器生体内分布を、ＣＰ仔ウサギ（ｎ＝６）において３つの異なる時点（１時間、４時間、および２４時間）で研究し、同年齢の健常対照（ｎ＝５）と比較した。慣例的に行われているように全脳のデンドリマーレベルを測定するのではなく、本発明者らは、脳を顕微解剖し、脳室周囲領域（ＰＶＲ）、海馬、および皮質を分離し、活性化ミクログリアがこのモデルに存在する場合のこれらの領域における局所的取り込みを測定した（A.  Sharma,  et  al.,  Journal  of  Controlled  Release  2018,  283,  175  (2018)）。初期研究では、ＰＶＲにおいて活性化ｍｉ／ｍａの高い関与が示されており、それはマクロファージを脳に動員するための経路としての脳室の役割に起因する可能性がある（W.  G.  Lesniak,  et  al.,  Nance,  Mol  Pharm,  10  (2013),  I.  Corraliza,  Frontiers  in  Cellular  Neuroscience,  8,  262  (2014)）。海馬および皮質は、脳性麻痺の病状に関与する領域であり、それは学習、記憶、および運動機能におけるそれらの役割に起因する（Reid  SM  et  al.,  Developmental  Medicine  &  Child  Neurology,  57,  1159  (2015)）。この顕微解剖は、脳全体とは対照的に、脳のこれらの臨床的に適切なサブ領域における局所的デンドリマー取り込みの評価を可能にする。血管に付着した血液およびデンドリマーの干渉を回避するために、仔ウサギをＰＢＳで灌流した。デンドリマー取り込みにおける顕著な増加が、健常対照と比較して、ＣＰ動物の脳において検出された（図８Ａ）（ｐ＜０．０１、健常対照と比較したスチューデントｔ−検定）。ＣＰ動物の傷害脳領域におけるＰＥＧＯＬ−６０の選択的取り込みは、ｉ）障害を受けたＢＢＢを通過し、ｉｉ）その中性電荷のために脳実質内に有効に拡散し、ｉｉｉ）食細胞活性化ｍｉ／ｍａに取り込まれるその能力のために説明することができる。
【０２６３】
ナノ医薬品ベースの治療法の臨床移行に関する主な懸念は、その疾患領域以外の臓器における望ましくない蓄積である。全ての主要な臓器（心臓、肺、肝臓、脾臓、腎臓）および血漿におけるＰＥＧＯＬ−６０−Ｃｙ５の生体内分布を査定した。結果によって、デンドリマーの身体からの迅速なクリアランスが、全ての時点で、任意の主要な臓器における注射された用量の１％未満の蓄積とともに実証された（図８Ｂ）。同様の傾向が、全ての臓器に関して、４時間後のピーク蓄積、次いで２４時間後のクリアランスとともに観察された。結果は、ホモジネートされた組織抽出物の蛍光分光法によって得、全ての臓器（または全血漿体積）中に注射された用量のパーセント単位として報告した。注射してから２４時間後に血清において０．２％未満のデンドリマーが存在することによって、デンドリマーが循環から迅速に取り除かれたことが示される。興味深いことに、このデンドリマーは、同様のサイズ、形状、および表面ヒドロキシル基の数のナノ粒子であるＰＡＭＡＭ−Ｄ４−ＯＨを用い、このＣＰモデルにおいて以前に観察されたような脳取り込みと同様のレベルを示すが、循環および他の重要臓器からのはるかに速いクリアランス率を示す（W.  G.  Lesniak,  et  al.,  Nance,  Mol  Pharm,  10  (2013),  I.  Corraliza）。２４時間以内の身体からのこの迅速なクリアランス率、および新生ＣＰウサギの脳の傷害領域における持続性の細胞蓄積によって、このデンドリマーは、小児神経炎症性疾患のための治療法を設計するための優良プラットフォームとなる。
【０２６４】
初期研究によって、全身的に投与された、６４個の末端ヒドロキシル基を有するヒドロキシル末端第４世代ポリ（アミドアミン）デンドリマー（ＰＡＭＡＭ−Ｄ４−ＯＨ）は、障害を受けたＣＮＳ関門を通過し、脳傷害部位において活性化ｍｉ／ｍａに特異的に蓄積する一方、神経変性疾患の複数の大小の動物モデルにわたる健常脳組織において最小限の蓄積（ａｃｃｒｕａｌ）を示すことが実証されている（S.  Kannan,  et  al.,  Science  translational  medicine,  4,  130ra46  (2012)、S.  P.  Kambhampati,  et  al.,  Invest  Ophthalmol  Vis  Sci,  56  (2015)）。同様の神経炎症の標的化は、同等のサイズおよび同様の骨格の陽イオン性および陰イオン性デンドリマーでは観察されなかった（Nance,  E.,  et  al.,  Biomaterials,  101,  96  (2016)）。この内因性の標的化能力は、理論によると、他のポリマーナノ粒子で達成することが困難なその特有の分岐構造（第４世代ＰＡＭＡＭでは１ｎｍ２当たり約１ヒドロキシル末端基）によりデンドリマーで可能な高密度の表面ヒドロキシル基から生じる。
【０２６５】
これらの発見が動機となり、ヒドロキシル官能化ＰＥＧ系デンドリマーナノ担体が設計され、ＣＮＳ障害における活性化ｍｉ／ｍａを全身的に標的とするために開発されている。この構築物は、ＰＡＭＡＭデンドリマーよりも低世代においてより高いヒドロキシル表面密度を示すように設計され、低い合成負荷（第２世代では１ｎｍ２当たり約５ヒドロキシル末端基）で同様の神経炎症に標的を絞る能力を有するようになる。臨床移行の必須要件を念頭に置いて、このデンドリマーを、クリックケミストリーに基づいた非常に効率的な化学変換を介し、最小限の反応ステップを用い、水溶性の安価な生体適合性構成ブロックを使用し、単分散の欠陥不含デンドリマーとして開発した。この構築物は、Ｄ２−ＯＨ−６０、またはＰＥＧＯＬ−６０と称され、ＰＥＧ系構成ブロックから作製され、第２世代で６０個のヒドロキシル（中性）表面基を有し、８つの合成ステップで達成される第４世代で６４個のヒドロキシル表面基を有するＰＡＭＡＭ−Ｄ４−ＯＨと比較して、４つの反応ステップで生成される。ＰＥＧＯＬ−６０デンドリマー骨格は、生物システムにおける酵素分解または崩壊を予防するように設計された安定なエーテル連結から主になっており、腎臓を通して無傷のままで排泄される。ＰＥＧＯＬ−６０は、１ｎｍ２当たり５個の基の表面ヒドロキシル末端基のその高密度を介して、固有の神経炎症の標的化を示すように設計されており、小さいサイズ、ほぼ中性電荷、水溶性、および生体適合性を備えているため、合成後の修飾が不要となることによって臨床移行プロセスが円滑になる。
【０２６６】
神経炎症部位において適切な細胞を標的とするＰＥＧＯＬ−６０の能力を、ＣＮＳ疾患の３つの異なるモデルにおいて蛍光分光法ベースの定量化および共焦点顕微鏡を介し、ｉｎ  ｖｉｖｏで検証し、ＢＢＢとＢＲＢの両方を通過し、固形腫瘍に侵入し、疾患に関連するミクログリアおよびマクロファージを標的とするＰＥＧＯＬ−６０の能力を査定した。これを行うために、母体子宮炎症誘発性脳性麻痺（ＣＰ）ウサギモデル、神経膠芽腫（ＧＢＭ）マウス同所性モデル、および網膜下脂質誘発性加齢黄斑変性症（ＡＭＤ）ラットモデルを用いた。全身投与した場合、ＰＥＧＯＬ−６０は、障害を受けたＣＮＳ関門を順調に通過し、脳性麻痺ウサギモデル、神経膠芽腫マウスモデル、および加齢黄斑変性症ラットモデルにおいて、脳または網膜の、活性化ミクログリア／マクロファージ、腫瘍関連マクロファージ、および／または網膜色素上皮細胞に特異的に局在し、同時に末梢臓器から迅速に取り除かれる。
【０２６７】
ＰＥＧＯＬ−６０の固有の治療特性も、ある特定のデンドリマーが、治療ペイロードを加えなくても抗酸化および抗炎症効果を示すという以前の知見に基づき、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで研究した（M.  Hayder,  et  al.,  Science  Translational  Medicine,  3,  81ra35  (2011)、K.  Neibert,  et  al.,  Molecular  Pharmaceutics,  10,  2502  (2013)）。ＰＥＧＯＬ−６０は、抗炎症環境に曝露されたミクログリアにおいて強力な固有の抗酸化および抗炎症効果も示し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで有害効果は示さない。最後に、ＣＰ仔ウサギにおける神経学的行動に対するＰＥＧＯＬ−６０の効果も調査した。
【０２６８】
このヒドロキシルＰＥＧデンドリマーは、脳傷害部位に特異的な治療法を送達し、治療結果を強化するための優れたナノ担体として、広範囲の神経炎症性疾患に適用することができる。
（実施例１０）
大規模なデンドリマー−薬物合成に関する頑強な合成戦略
【０２６９】
ＮＡＣは、天然に存在するアミノ酸Ｌ−システインのＮ−アセチル誘導体であり、抗酸化および抗炎症薬として作用する。小児および成人の診療所で何十年もの間広範囲に使用されてきた。ＮＡＣは、グルタメートモジュレート剤であり、身体の天然の抗酸化物質であるグルタチオンの回復を助ける。神経炎症は、グリア細胞においてグルタチオンの枯渇をもたらし、その結果、その神経保護機能が失われる。タンパク質に結合する場合があるチオール基が存在し、そのバイオアベイラビリティが低いため、ＮＡＣは、通常高用量で与えられる。デンドリマープラットフォームを使用したＮＡＣの標的を絞った送達は、ＮＡＣを、傷害部位における活性化グリア細胞へ選択的に送達するだけではなく、神経毒性の減少を助けることもできる。デンドリマー−ＮＡＣ（Ｄ−ＮＡＣ）は、遊離薬物よりも１００倍優れており、ＣＰのウサギモデル、低酸素性虚血マウスモデル、および異なる動物の他の神経炎症モデルにおいて、顕著な有効性を示している（Kannan,  S  et  al.,  J.  Control.  Release  2015,  214,  112）。
【０２７０】
臨床試験に関するＤ−ＮＡＣの需要を満たすために、このコンジュゲートをキログラム規模で構築するための、十分に確立され、高い再現性がある、頑強な方法論が必要とされる。大規模でＤ−ＮＡＣを合成するための異なる合成戦略を記載する。
【０２７１】
Ｇ４ＰＡＭＡＭデンドリマー−ＮＡＣを、これらの合成戦略を例示するための例として使用する。本明細書で述べる合成方法は、上述のデンドリマーおよび送達されることになる他の薬剤に一般的に適用可能である。
方法および材料
中間体およびデンドリマー−薬物コンジュゲートの合成
【０２７２】
Ｇ４−（ＯＨ）３９（ＧＡＢＡ−ＮＨＢＯＣ）２５（化合物２２）の調製：無水ＤＭＦ（５０ｍｌ）中のＰＡＭＡＭ  Ｇ４−ＯＨ（４．８５ｇ；化合物２１）の撹拌溶液に、Ｂｏｃ−ＧＡＢＡ−ＯＨ（２．４９８ｇ）、ＤＭＡＰ（１．６７ｇ）を添加し、室温（ＲＴ）で５分間撹拌し、透明溶液を作製する。ＥＤＣ．ＨＣｌ（２．９４ｇ）を、反応混合物に３０分間にわたって分けて添加した。反応混合物を、室温で３６時間撹拌した。反応混合物を１ｋＤ  ＭＷカットオフセルロース透析チューブに移し、水に対して２４時間透析し、水を一定時間ごとに３〜４回交換した。透析チューブの内容物を、予め秤量した５０ｍＬのファルコン管に移し、凍結乾燥させ、所望の生成物である化合物２２を白色のふわふわした吸湿性固形物として得た。収率：８５％、５．３ｇ。
【０２７３】
Ｇ４−（ＯＨ）３９（ＧＡＢＡ−ＮＨＴＦＡ）２５（化合物２３）の調製：火炎乾燥させた２５０ｍｌの丸底フラスコに、ＢＯＣ保護されたデンドリマー、化合物２２（５．３ｇｍ）を入れ、ＤＣＭ３０ｍｌを添加し、窒素雰囲気下で化合物を溶解した。溶液を１５分間超音波処理し、均質溶液を作製するために、ＴＦＡ１０ｍｌを撹拌しながら滴加した。反応混合物を室温で１２時間撹拌した。反応の色は、無色から淡褐色に変化した。完了したら、ＤＣＭを蒸発させた。反応混合物をメタノールで希釈し、ロータリーエバポレーターを使用して蒸発させた。この手順を、過剰なＴＦＡが完全になくなるまで繰り返した。この反応混合物を高真空中で３時間放置し、微量の溶媒を全て除去し、化合物２３を、さらに精製することなく次のステップに直接使用することができる白色のふわふわした吸湿性材料として得た。
【０２７４】
化合物２４、２５および２６の調製：化合物２４をＳｉｇｍａから購入し、入手したままで使用した。化合物２５および２６を、以前に公開したプロトコールを使用して合成した（Navath,  R.  S.;  Kurtoglu,  Y.  E.;  Wang,  B.;  Kannan,  S.;  Romero,  R.;  Kannan,  R.  M.  Bioconjugate  Chem.  2008,  19,  2446）。
【０２７５】
Ｎ−アセチル−Ｓ−（（３−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−３−オキソプロピル）チオ）システイン［ＳＰＤＰ−ＮＡＣリンカー］（化合物２７）の調製：火炎乾燥させた１００ｍＬの丸底フラスコに、Ｎ−スクシンイミジル３−（２−ピリジルジチオ）−プロピオネート（ＳＰＤＰ、化合物２６）（５ｇ、１６．０２ｍｍｏｌ）を入れ、不活性雰囲気下、無水テトラヒドロフラン（ＴＨＦ、１５ｍＬ）中で溶解した。ＴＨＦ（１５ｍＬ）中に溶解したＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ、２．８７ｇ、１７．６２ｍｍｏｌ、１．１当量）の溶液を滴加した。反応混合物は、数分以内に黄色に変化した。反応混合物を室温で４時間撹拌した。反応をＴＬＣでモニターし、出発材料（ＳＰＤＰ）が消費されたら、溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去した。粗製生成物を、８０グラムシリカがプレパックされた高性能ｒｅｄｉｓｅｐ  ｇｏｌｄ  Ｒｆ（商標）カートリッジを使用し、流量６０ｍＬ／分を維持したＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ（登録商標）システムで精製した。ＤＣＭでカラムを開始し、純粋な所望の生成物をジクロロメタン中の４％ＭｅＯＨ中に白色粉末として７５．４％（４．４ｇ）の収率で採取した。
【０２７６】
化合物２８（Ｄ−ＮＡＣ）の調製：火炎乾燥さえた５００ｍＬの丸底フラスコ中に、化合物２３（６ｇ）を入れ、それを、不活性雰囲気下、無水ＤＭＦ（４０ｍＬ）中に溶解した。フラスコを超音波処理し、それが透明溶液になるまでボルテックスした。反応混合物のｐＨを、ジイソプロピルエチルアミンを添加することによって７．０〜７．５に調整した。反応混合物を３０分間撹拌し、ｐＨが安定したら、ＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解した化合物２７（４．７６ｇ、３５当量）をゆっくりと添加した。窒素下室温で１２時間反応混合物を撹拌した。反応混合物を１０００カットオフ透析バッグに移し、ＤＭＦに対して６時間、続いて水で２４時間透析し、２〜３時間ごとに溶媒を定期的に交換した。透析チューブの内容物を、予め秤量した５０ｍＬのファルコン管に移し、凍結乾燥させ、デンドリマー−ＮＡＣコンジュゲート、化合物２８を白色のふわふわした粉末として収率：９０％、７．０ｇで得た。最終的なコンジュゲートの程度を、８〜７．５ｐｐｍの間のデンドリマーのＮＨプロトンと１．８ｐｐｍのＮＡＣのＮ−アセチルプロトンおよびおよそ４．４ｐｐｍのＮＡＣの−ＣＨプロトンとを比較して計算した。
【０２７７】
化合物２９（Ｄ−アリル）の調製：乾燥ＤＭＦ（１５ｍＬ）中のＰＡＭＡＭ−Ｇ４−ＯＨ（化合物２１、５３０ｍｇ、０．０３７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＮａＨ（２００ｍｇ、８．３３ｍｍｏｌ）を０℃で分けて添加した。１５分後、臭化アリル（０．１２７ｍＬ、１．４８ｍｍｏｌ）を添加し、撹拌を室温で２４時間継続した。次いで溶液をＤＭＦ、続いて水に対して２４時間透析した。水溶液を凍結乾燥させ、生成物を白色粉末として得た。
【０２７８】
化合物３０の調製：ＤＭＦ（５ｍＬ）中の化合物２９（１９２ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、２−（ｂｏｃ−アミノ）エタンチオール（２００ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）を添加し、続いて触媒量の２，２−ジメトキシ−２−フェニルアセトフェノン（ＤＭＰＡＰ）を添加した。反応混合物を、ＵＶ光下で２４時間撹拌した。反応物をＤＭＦ、続いて水に対して２４時間透析した。水溶液を凍結乾燥させ、生成物を白色粉末として得た。
【０２７９】
化合物３１の調製：ＤＣＭ（２．５ｍＬ）中の化合物３０（２００ｍｇ）の撹拌溶液に、トリフルオロ酢酸（２ｍＬ）を添加し、撹拌を４時間継続した。反応をメタノールでクエンチし、溶媒を減圧下で蒸発させた。メタノールを添加し、数回蒸発させ、ＴＦＡを除去した。残渣を減圧下で乾燥させ、吸湿性固形物を定量的収率で得た。
【０２８０】
エーテルリンカーを介したＤ−ＮＡＣａ（化合物２８ａ）の調製：火炎乾燥させた５００ｍＬの丸底フラスコ中に、化合物３１（３００ｍｇ、０．０１８ｍｍｏｌ）を入れ、それを、不活性雰囲気下、無水ＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解した。フラスコを超音波処理し、それが透明溶液になるまでボルテックスした。反応混合物のｐＨを、ジイソプロピルエチルアミンを添加することによって７．０〜７．５に調整した。反応混合物を３０分間撹拌し、ｐＨが安定したら、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解した化合物２７（３３１ｍｇ、０．９０９ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応混合物を、窒素下、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を１０００カットオフ透析バッグに移し、ＤＭＦに対して６時間、続いて水で２４時間透析し、２〜３時間ごとに溶媒を定期的に交換した。透析チューブの内容物を、予め秤量した５０ｍＬのファルコン管に移し、凍結乾燥させ、デンドリマー−ＮＡＣコンジュゲート、化合物２８ｂを白色のふわふわした粉末として得た。
【０２８１】
化合物３２の調製：ヒドロキシルおよびアミン表面基が混合している化合物３２を、Ｄｅｎｄｒｉｔｅｃｈから購入し、入手したままで使用した。
【０２８２】
Ｄ−ＮＡＣｂ（化合物２８ｂ）の調製：火炎乾燥させた５００ｍＬの丸底フラスコ中に、二官能性デンドリマー、化合物３２（１ｇ、０．０７１ｍｍｏｌ）を入れ、それを、不活性雰囲気下、無水ＤＭＦ（２０ｍＬ）中に溶解した。フラスコを超音波処理し、それが透明溶液になるまでボルテックスした。反応混合物のｐＨを、ジイソプロピルエチルアミンを添加することによって７．０〜７．５に調整した。反応混合物を３０分間撹拌し、ｐＨが安定したら、ＤＭＦ（１０ｍＬ）中に溶解した化合物２７（９１０ｍｇ、２．５ｍｍｏｌ）をゆっくりと添加した。反応混合物を、窒素下、室温で１２時間撹拌した。反応混合物を１０００カットオフ透析バッグに移し、ＤＭＦに対して６時間、続いて水で２４時間透析し、２〜３時間ごとに溶媒を定期的に交換した。透析チューブの内容物を、予め秤量した５０ｍＬのファルコン管に移し、凍結乾燥させ、デンドリマー−ＮＡＣコンジュゲート、化合物２８ｂを白色のふわふわした粉末として得た。
【０２８３】
化合物３３の調製：丸底フラスコに、アルドリチオール−２（６．１９ｇ）を添加し、メタノール２５ｍＬ中に溶解した。次いでメタノール（５ｍＬ）中に溶解した２−メルカプトエタノールを滴加した。反応を室温で一晩継続した。その後、全ての揮発性物質を減圧下で蒸発させた。残渣を、カラムクロマトグラフィーで、ヘキサンおよび酢酸エチルの混合物で溶出して精製した。得られた生成物（化合物３３）を純粋な淡黄色がかった油状物（２．１４ｇ、７５％の収率で）として採取した。
【０２８４】
化合物３４の調製：オーブン乾燥させた丸底フラスコに、Ｎ２ガス下、室温で１０ｍＬの無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解した４−ニトロフェニルクロロホルメート（２．３０ｇ）を添加した。次いで無水ＤＣＭ（５ｍＬ）中に溶解した２−ピリジルジスルファニルエタノール（２．１４ｇ）およびピリジン（０．９ｍＬ）の混合物をこの溶液に添加した。６時間後、無水ＤＣＭ（１０ｍＬ）中に溶解した追加の４−ニトロフェニルクロロホルメート（１．１６ｇ）およびピリジン（０．５ｍＬ）を調製し、反応混合物に添加した。室温で一晩撹拌した後、反応媒体をＤＣＭ（ＡＣＳグレード、１０ｍＬ）で希釈し、１Ｍ  ＨＣｌ（６０ｍＬ）で３回洗浄した。採取した有機層を無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、ろ過した。全ての有機揮発性物質を真空下で蒸発させ、残渣を、ヘキサンおよび酢酸エチルの混合物で溶出するカラムクロマトグラフィーで精製した。生成物（化合物３４）を純粋な黄色油状生成物（３．０８ｇ、７６．２％の収率）として採取した。
【０２８５】
化合物３５、およびカルボネートリンカーを介したＤ−ＮＡＣｃ（化合物２８ｃ）の調製：オーブン乾燥させた２５０ｍＬの丸底フラスコに、無水ＤＭＦ（１５ｍＬ）中に溶解したＰＡＭＡＭ  Ｇ６−ＯＨ（１．００ｇ）を入れた。溶液をＮ２ガス環境下、４０℃の油浴で撹拌した後、無水ＤＭＦ（５ｍＬ）中に溶解したＤＭＡＰを添加した。次いで無水ＤＭＦ１０ｍＬ中に溶解したカルボネートリンカーをこの溶液に添加し、反応混合物を４０℃で４８時間撹拌した。反応の最後で、溶液を移して、透析膜（ＭＷＣＯ８ｋＤ）を使用して溶媒を少なくとも３回交換することによって、ＤＭＦに対して透析した。次いで化合物３５を含有する透析した溶液を、丸底フラスコ中に移し、無水ＤＭＦ（４ｍＬ）中に溶解したＮＡＣ（０．４４ｇ）をこの溶液に滴加した。室温で一晩撹拌した後、溶液を移して、透析膜（ＭＷＣＯ８ｋＤ）を使用してＤＭＦに対して透析し、溶媒を少なくても２回取り換えた。この溶液を無水エチルエーテル（１００ｍＬ）に添加した後、沈殿物を固形生成物として採取し、減圧下で一晩乾燥させた。最後のステップとして、得られた固形物を、ＤＰＢＳ（４５ｍＬ）中に溶解し、ＤＩ水に対して４時間透析した（ＭＷＣＯ８ｋＤ）。透析した溶液を凍結乾燥させ、デンドリマー−ＮＡＣコンジュゲート、Ｄ−ＮＡＣ（化合物２８ｃ）をオフホワイト色固形物（１．５４ｇ）として得た。
【０２８６】
化合物３６の調製：化合物２５（９４．８ｍｇ、０．４１ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ１．０ｍＬ中に溶解し、この透明な溶液に、無水ＤＭＦ３．０ｍＬ中に溶解したＤＭＡＰ（２５．２ｍｇ、０．２１ｍｍｏｌ）およびｐｙＢＯＰ（３２２．７ｍｇ、０．６２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で３０分間撹拌した後、無水ＤＭＦ２．０ｍＬ中に溶解したＧ６−ＯＨ  ＰＡＭＡＭデンドリマー（２００．０ｍｇ、３．４４μｍｏｌ）を添加し、反応物を室温で２日間撹拌した。次いで粗製生成物をＤＭＦに対して透析し、副生成物および過剰な反応物質を除去し、続いてジエチルエーテル中で沈殿させ、ＤＭＦを除去した。最後に、精製した生成物をＨ２Ｏ中に再溶解し、凍結乾燥させ、黄色化合物（２４０．０ｍｇ）として得た。
【０２８７】
エステルリンカーを介したＤ−ＮＡＣｄ（２８ｄ）の調製：化合物３６（２００ｍｇ、５．０２μｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ３．０ｍＬ中に溶解し、次いで無水ＤＭＦ２．０ｍＬ中に溶解したＮＡＣ（５４．６ｍｇ、０．３３４ｍｍｏｌ）を丸底フラスコに添加した。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。次いで、全ての揮発性物質を蒸発させ、粗製生成物を、ＤＭＦに対して透析して副生成物および過剰な反応物質を除去し、続いて水に対して透析して全ての有機溶媒を除去することによって精製した。最後に凍結乾燥させ、淡黄色化合物（１８０．０ｍｇ）として得た。
【０２８８】
Ｄ−ＮＡＣ−ＮＡＣ（化合物３７）の調製：ＤＭＦ（１０ｍＬ）中の化合物２１（４００ｍｇ、０．０２７ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ＮＡＣダイマー（３６３ｍｇ、１．１２ｍｍｏｌ）、ＥＤＣ（３００ｍｇ、１．５６２ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（１３６ｍｇ、１．１１４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４０℃で４８時間撹拌した。反応混合物を１０００カットオフ透析バッグに移し、ＤＭＦに対して２４時間、続いて水で２４時間透析し、２〜３時間ごとに溶媒を定期的に交換した。透析チューブの内容物を、予め秤量した５０ｍＬのファルコン管に移し、凍結乾燥させ、Ｄ−ＮＡＣ−ＮＡＣコンジュゲート３７を淡黄色粉末として得た。
【０２８９】
化合物３８の調製：Ｎ−アセチルシステインを過剰な２，２’−ジチオジピリジンとメタノール中で一晩反応させ、得られた粗製物を、酢酸エチル：ヘキサン（９０：１０）の溶出システムを使用したカラムクロマトグラフィーで精製した。精製した淡黄色化合物（化合物３８）を１ＨＮＭＲ分光法で特徴づけた。
【０２９０】
化合物３９の調製：化合物３８（９１９．６４ｍｇ、３．３８ｍｍｏｌ）を、無水ＤＭＦ４．０ｍＬ中に溶解し、この透明な溶液に、無水ＤＭＦ８．０ｍＬ中に溶解したＤＭＡＰ（２０６．２７ｍｇ、１．６９ｍｍｏｌ）およびｐｙＢＯＰ（２．６４ｇ、５．０７ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を０℃で３０分撹拌した後、無水ＤＭＦ８．０ｍＬ中に溶解したＧ４−ＰＡＭＡＭデンドリマー（０．４０ｍｇ、２８．１４μｍｏｌ）を添加し、反応を室温で３日間継続した。次いで粗製生成物をＤＭＦで希釈し、ＤＭＦに対して透析し、副生成物および過剰な反応物質を除去し、続いてＨ２Ｏで透析し、全ての有機溶媒を除去した。最後に精製した製品を凍結乾燥させ、淡黄色固形物（３５８．０ｍｇ）として得た（製品の理論Ｍｗｔ．：２０３１９ｇｍｏｌ−１、ＮＡＣ／ＰＡＭＡＭ＃：２４、ＮＡＣ（ｗ／ｗ）％：１９．２、ＨＰＬＣ由来の％純度：９０．６４、Ｈｄ：２．３８±０．２６ｎｍ、ＰＤＩ：０．７４、ゼータ電位：４．４１±０．６１ｍＶ）。
【０２９１】
Ｄ−ＮＡＣ−ＮＡＣ（化合物４０）の調製：化合物３９（３００．０ｍｇ、１４．７６μｍｏｌ）およびＮ−アセチルシステイン（１１５．６ｍｇ、０．７１ｍｍｏｌ）をＤＭＦ１５．０ｍＬ中に溶解した。室温で撹拌してから２４時間後、反応混合物をＤＭＦで希釈し、ＤＭＦに対して透析し、過剰な遊離薬物分子を除去し、次いでＨ２Ｏで透析し、全ての有機溶媒を除去した。生成物を冷却ジエチルエーテル中で沈殿させた後、最終的なデンドリマー−薬物コンジュゲートを凍結乾燥させ、淡黄色固形物（化合物４０）（２５０．０ｍｇ）として得た。（製品の理論Ｍｗｔ．：２１５６８ｇｍｏｌ−１、ＮＡＣ／ＰＡＭＡＭ＃：４８、ＮＡＣ（ｗ／ｗ）％：３６．３、ＨＰＬＣ由来の％純度：９８．４７、Ｈｄ：４．９０±０．２４ｎｍ、ＰＤＩ：０．４８、ゼータ電位：３．６４±１．１４ｍＶ）。
結果
【０２９２】
デンドリマー−ＮＡＣは臨床移行しつつある。前臨床／臨床での必要性を満たすために、高度に最適化された体系的な合成プロトコールが必要とされ、キログラム規模量のＤ−ＮＡＣを、最小限の反応ステップ数を用い、高度な再現性、純度および収率で生成することができる。この実施例では、Ｄ−ＮＡＣ合成（戦略１）に関するスケーラブルなプロトコールを記載する。学術研究室では１０グラム規模で、受託研究室ではキログラム規模で検証する。さらに、デンドリマーのリンカーに修飾してＤ−ＮＡＣ構築するための、いくつかの他の好都合で簡易な合成方法論も開発する（戦略２から６）。
戦略１：エステルリンカーを介したＤ−ＮＡＣ
【０２９３】
目標は、複数のレベルでコストを削減する可能性を有するほぼ完璧な合成経路を開発し、設計することである。Ｄ−ＮＡＣ合成に関するスケーラブルな方法を開発し、検証し（スキーム７）、これを将来性のあるｃＧＭＰ製造業者に転送した。この合成プロトコールは（１）合成時間が半分に短縮され、（２）「製造に用い易い」溶媒および試薬を使用しており、（３）純度が改善され、溶媒使用が減少されている。
【０２９４】
合成プロトコールの最も高価な構成要素のうちの１つは、デンドリマー、例えば、第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマーの合成であり、各合成ステップにおいて、精製を行う間にデンドリマーの一部の収率の損失が起きる。この損失を克服するために、デンドリマーの反応ステップ数を、このプロトコールにおいて最小限にする。反応ステップの半分は、小分子合成に関与しており、これは、デンドリマーに取り組むよりも実際に複雑でも高価でもない。
【０２９５】
Ｄ−ＮＡＣは、ジスルフィド結合を介して連結されたＮＡＣに共有結合によりコンジュゲートされる第４世代のヒドロキシル末端ＰＡＭＡＭデンドリマーのコンジュゲートである。Ｄ−ＮＡＣは、デンドリマーに付加された平均２２±３個のＮＡＣ分子を含有する。合成は半収束的な方法で行い、２つの主要な中間体：１）二官能性デンドリマー（化合物２３、スキーム７）、２）ＮＡＣ−ＳＰＤＰ−ＮＨＳ（Ｎ−アセチル−Ｓ−（（３−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−３−オキソプロピル）チオ）システイン）リンカー（化合物２７、スキーム７）の構築を伴う。最終ステップは、これらの２つの中間体をステッチし、最終的なコンジュゲート（化合物２８）を得ることを伴う。
【０２９６】
より詳細には、第１のステップ中に、ＢＯＣ保護された二官能性デンドリマー（化合物２２）を、ＢＯＣ−ＧＡＢＡ−ＯＨおよびカップリング剤（ＥＤＣおよびＤＭＡＰ）の存在下でエステル化反応を使用して構築した。２２〜２５個のリンカーの付加を、コンジュゲートにおける異なる領域からの積分値を比較することによって１Ｈ  ＮＭＲで観察した。ＢＯＣの脱保護を無水ジクロロメタン（ＤＣＭ）中の２５％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）を使用して行い、２２〜２５個の末端アミンを有する二官能性デンドリマー（化合物２３）を得た。プロトンＮＭＲによって、ＢＯＣプロトンに対応するピークの消失が明らかに示された。
【０２９７】
一方、ＮＡＣ−ＳＰＤＰ−ＮＨＳ−リンカー（化合物２７）の合成は３ステップで行った。最初に、３−メルカプトプロピオン酸を２，２’−ジピリジルジスルフィド（化合物２４）と、チオール−ジスルフィド交換によって反応させ、２−カルボキシエチル２−ピリジルジスルフィド（化合物２５）を得た。続いて、Ｎ，Ｎ’−ジシクロヘキシルカルボジイミドを使用し、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドを用いてエステル化し、高反応性のＮ−スクシンイミジルエステルを導入し、化合物２６を得た。Ｎ−アセチルシステインを、チオール−ジスルフィド交換を介して最終的に添加し、Ｎ−アセチル−Ｓ−（（３−（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）−３−オキソプロピル）チオ）システイン（化合物２７）を得た。
【０２９８】
最終的なライゲーションステップ中に、二官能性アミン末端デンドリマー（化合物２３）および活性化ＮＡＣ−ＳＰＤＰ−ＮＨＳ（化合物２７）を、ヒューニッヒ塩基を使用してｐＨ７．５〜８でカップリングし、Ｄ−ＮＡＣ（化合物２８）を得た。全ての中間体および最終的なコンジュゲートを１Ｈ  ＮＭＲおよび質量分光法（ＬＣＭＳ／ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦ）を使用して、十分に特徴づけた。中間体および最終的なＤ−ＮＡＣコンジュゲートの純度を、ＨＰＬＣを使用してアクセスした。Ｄ−ＮＡＣのサイズは、動的光散乱で測定されたように５．６４９ｎｍであり、コンジュゲートは３．９２±１．１８ｍＶの中性ゼータ電位を有する。
【化９】
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【化１０】
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ＮＡＣ担持の再現性
【０２９９】
以前のプロトコール（スキーム８）における第１のステップは、Ｆｍｏｃ−Γ−Ａｂｕ−ＯＨを使用し、これは塩基性条件（ピペリジン／ＤＭＦ）を使用して脱保護する必要があった。この脱保護ステップは重要なステップであり、最終的な薬物の担持効率に影響を与える。デンドリマーとリンカーとの間のエステル連結は、塩基性加水分解する傾向があるため、脱保護のために使用される過剰なピペリジン／ＤＭＦも、リンカーの部分的な切断につながり、異なるバッチにおける最終的な薬物担持に一貫性がなくなる。新しく開発された方法論（スキーム９）では、Ｆｍｏｃ−Γ−Ａｂｕ−ＯＨをＢＯＣ−ＧＡＢＡ−ＯＨと置き換えた。ＢＯＣ保護基は、ＤＣＭ中の２５％ＴＦＡを使用して穏やかな酸性条件において容易に除去することができ、エステル連結を無傷なまま維持する。このステップは、１０ｇ規模で数回再現されており、エステル加水分解がないという一貫した結果を示す。
合成時間の短縮
【０３００】
Ｄ−ＮＡＣの合成に関する以前のプロトコールは、各ステップにおいて、ＤＭＦに対して少なくとも２４時間、続いて水でさらに２４時間透析し（Ｆｍｏｃ−Γ−Ａｂｕ−ＯＨのコンジュゲート後、Ｆｍｏｃ脱保護後、およびＮＡＣのコンジュゲート後）、過剰な試薬および副産物を除去する３つのステップを含有する。新しく開発されたプロトコールでは、方法は、ＤＭＦと水の両方に対する透析の１ステップ（ＮＡＣ−ＳＰＤＰをコンジュゲートした後の最終ステップ）のみを必要とする。さらに、以前の戦略では、全てのステップがデンドリマーに対して行われた。デンドリマーに対する各ステップには、少なくとも２日の透析、続いて２日の凍結乾燥が必要であり、合成に３〜４週間かかる。しかし、新規のプロトコールでは、ＳＰＤＰ−ＮＡＣリンカーを数時間で個別に合成する。これにより、合成の時間枠は顕著に短縮され、７〜１０日で達成することができる。
経済的で産業において用い易いプロトコール
【０３０１】
以前のプロトコールでは、脱保護ステップ中のエステル加水分解を相殺するために、高担持のための過剰なリンカーが必須である。改善された方法論は、より頑強であり、脱保護ステップ中にリンカーの加水分解が存在しないためにリンカーの高担持を必要とせず、コストが抑えられる。さらに、新規のプロトコールでは、ＤＭＦ透析を必要とする１ステップしかないため、環境、経済および産業において用い易い合成となる。デンドリマーは、合成における最も高価な材料である。透析の各ステップでは、一部のデンドリマーの損失を招く。新規のプロトコールでは、デンドリマーに関する合成ステップの数が減少され、コスト削減につながる。
戦略２：エーテルリンカーを介したＤ−ＮＡＣおよび銅不含チオール−エンクリックケミストリー
【０３０２】
デンドリマー−ＮＡＣコンジュゲートを調製するための化学の簡素化の追求では、非常に頑強な化学変換、例えば、チオール−エンクリック、チオール−インクリック、または銅−触媒アルキン−アジドクリック反応が求められる（Sharma,  R  et  al.,  Chem.  Commun.  2014,  50,  13300、Sharma,  R  et  al.,  Polym.  Chem  2014,  5,  4321、Sharma,  R  et  al.,  Polym.  Chem  2015,  6,  1436、Sharma,  R  et  al.,  Nanoscale  2016,  8,  5106、Sharma,  A  et  al.,  RSC  Adv.  2014,  4,  19242、Sharma,  A  et  al.,  ACS  Macro  Lett.  2014,  3,  1079、Sharma,  A  et  al.,  Macromolecules  2011,  44,  521、およびNguyen,  PT  et  al.,  RSC  Adv.  2016,  6,  76360）。過去１０年間で、クリックケミストリーは合成化学の分野に革命をもたらし、非常に複雑なポリマーおよび樹状構造の構築に対して大きく貢献してきた。
【０３０３】
次の試みでは、戦略１における第１のステップで、リンカーをデンドリマーに付加しているエステル連結を、光化学−チオール−エンクリック反応を使用して除去する。デンドリマー表面のこのエステル結合は妨げられ、エステラーゼによって容易に切断されないが、切断可能なジスルフィド結合以外の非切断性連結を有するより頑強なコンジュゲートを開発することが望ましかった。その目的のために、リンカーを、第１のステップでは非切断性エーテル結合によってデンドリマーにコンジュゲートした（スキーム９）。エーテル連結は頑強であり、加水分解を受けず、エステラーゼの基質ではない。
【０３０４】
より詳細には、Ｇ４−ＯＨ（化合物２１）を、水素化ナトリウムの存在下で臭化アリルと反応させた。デンドリマー表面にコンジュゲートされたリンカーの数は、プロトンＮＭＲで、リンカーのＢＯＣプロトンとデンドリマーの内部アミドプロトンとの積分値を比較することによって容易に算出された。次いでＢＯＣを、戦略２で記載したものと同様の条件に従ってＴＦＡを使用して脱保護し、二官能性エーテル連結デンドリマー（化合物３０）を得た。プロトンＮＭＲによって、スペクトル内のＢＯＣプロトンの消失が明らかに示される。二官能性デンドリマーコンジュゲート、化合物３０を、ＳＰＤＰ−ＮＡＣ−リンカー（化合物２７）と最後に反応させ、デンドリマー表面にエーテル連結を有するＤ−ＮＡＣａ（化合物２８ａ）を得た。全ての中間体および最終的なコンジュゲートは、１Ｈ  ＮＭＲおよびＨＰＬＣで特徴づけた。
【０３０５】
コンジュゲートにおけるエーテル結合の存在は非常に安定であり、ＮＡＣの放出に干渉しない。さらに、エステル連結の代わりのエーテル結合が安定性を、ひいてはコンジュゲートの貯蔵期間を改善する場合がある。
【化１１】
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戦略３：アミドリンカーを介したＤ−ＮＡＣ（ＧＡＢＡリンカーを用いない）
【０３０６】
戦略１で記載したＤ−ＮＡＣの合成は、スケーラビリティの点で非常に効率的であり、バルク材料へ容易にアクセスされるようになる。同時に１つの重要な目標は、複数のレベルでコストを削減する可能性を有することになる完全な合成設計を開発することである。デンドリマーに対する反応ステップの数を最小限にし、反応全体のステップを減少させるために、戦略３（スキーム１０）を考案した。この戦略では、完全に収束的な経路を使用し、ＳＰＤＰ−ＮＡＣ−リンカー（化合物２７）を、ＧＡＢＡリンカーを用いず、１つの合成ステップで市販されている二官能性デンドリマーに直接コンジュゲートする。アミンは、デンドリマー表面の固有の部分である。このアプローチの主な利点は、反応ステップの数が大幅に減少され、反応ステップの大部分が安価な小分子合成に関与することを含む。デンドリマーに対しては、１つの反応ステップしか存在しない。ＳＰＤＰ−ＮＡＣ−リンカー（７）を、本報告ですでに記載したように合成し、市販されている二官能性ＰＡＭＡＭデンドリマー（６０％ＯＨ／４０％ＮＨ２、化合物３２）のアミン基を、ＤＭＦ中ｐＨ７．５でさらに反応させ、所望のデンドリマー−ＮＡＣコンジュゲート、化合物２８ｂを得た。全ての中間体および最終化合物を、ＮＭＲ分光法、高分解能質量分光法、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分光法を使用して広範囲に特徴づけた。
【化１２】
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戦略４：カルボネートリンカーを介したＤ−ＮＡＣ（ＧＡＢＡリンカーを用いない）
【０３０７】
デンドリマー−ＮＡＣ合成を改善するための別の試みでは、２−ピリジルジスルフィルエチルカーボネートエステル（ＰＤＥＣ）をリンカーとして使用し、Ｄ−ＮＡＣｃを構築した（戦略４）。Ｄ−ＮＡＣ（化合物２８ｃ）合成のこの新規の方法論は、いくつかの利点を有する。プロトコールでは、ＳＰＤＰクロスリンカーの使用が排除されている。ＳＰＤＰは、バイオコンジュゲートにおいて広範囲に使用されるが、大規模合成に関しては経済的に好ましくない（４，５００ドル／５ｇ、Ｔｏｒｏｎｔｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓによる価格）。ＰＤＥＣリンカーを、安価な試薬を使用して容易に合成することができるために使用した。アルドリチオールを、メルカプトエタノールと反応させ、化合物３３を得た（スキーム１１）。化合物３３の焦点となるヒドロキシルを、４−ニトロフェニルクロロホルメートと反応させ、化合物３４を得、これをＰＡＭＡＭ−ＯＨと直接反応させ、デンドリマーにカルボネート結合を介してリンカーを付加した、化合物３５。最後に、ＮＡＣを、ジスルフィド交換反応を介して導入した（化合物２８ｃ）。
【化１３】
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戦略５：エステルリンカー介したＤ−ＮＡＣ（ＧＡＢＡリンカーを用いない）
【０３０８】
ステップおよび試薬の数を減少させ、コストを削減するために、化合物２５をリンカーとして直接使用した。戦略１で記載したようにＧＡＢＡ−ＢＯＣ−ＯＨをコンジュゲートし、次いでそれを脱保護し、遊離アミンを得る代わりに、ピリジンジスルフィドリンカー（化合物２５）をエステル結合を介してデンドリマーに直接反応させ、化合物３６を得た（スキーム１２）。次いで化合物３６とＮＡＣとのスルフィド交換反応に供し、ＧＡＢＡ不含エステル連結デンドリマー−ＮＡＣコンジュゲート（Ｄ−ＮＡＣｄ、化合物２８ｄ）を得た。この戦略は、プロトコールにおける合成ステップの数を顕著に減少させ、したがって時間が短縮され、より経済的な合成方法となる。
【化１４】
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戦略６：Ｄ−ＮＡＣ−ＮＡＣ（直接的なコンジュゲート）
【０３０９】
ＮＡＣ担持を増加させ、同時にデンドリマーの固有の標的化能力を完全に維持するために（コンジュゲートのための最小限の表面ヒドロキシル基を使用して）、デンドリマーに対して１ヒドロキシル部位当たり２つのＮＡＣ分子を付加する戦略を設計し、開発した（スキーム１３）。この戦略は、次のいくつかの利点を有する：１）デンドリマーに対して同様のヒドロキシル基の数を使用すると、ＮＡＣ担持を２倍にすることができること、２）ＮＡＣ分子の半分は、グルタチオン感受性ジスルフィド連結を介してコンジュゲートされている一方、もう半分は、加水分解し、遊離薬物を放出するためのエステラーゼを必要とするエステル結合を介して連結されていること。これは、ＮＡＣの持続性放出をもたらす場合がある。Ｄ−ＮＡＣ−ＮＡＣを構築するために、Ｎ，Ｎ’−ジアセチル−Ｌ−システイン（ＮＡＣダイマー）を、ＥＤＣおよびＤＭＡＰを使用してエステル連結を介してヒドロキシル基表面に直接コンジュゲートし、ＮＡＣ分子の半分はエステル結合を介してデンドリマー表面にコンジュゲートされており、もう半分はジスルフィド結合を介して別のＮＡＣ分子とコンジュゲートしているＤ−ＮＡＣ−ＮＡＣ（化合物３７）を得た。
【化１５】
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戦略７：Ｄ−ＮＡＣ−ＮＡＣ
【０３１０】
Ｄ−ＮＡＣ−ＮＡＣのためのさらなる合成経路を開発した（スキーム１４）。ＮＡＣをジスルフィド交換反応によってアルドリチオール（化合物２４）と反応させ、化合物３８を得た。化合物３８のＮＡＣの遊離基を利用し、デンドリマーのヒドロキシル基と反応させ、コンジュゲート、化合物３９においてエステル結合を形成した。次いでコンジュゲート、化合物３９を、第２のジスルフィド交換反応によって別のＮＡＣ分子と反応させ、最終的なコンジュゲートＤ−ＮＡＣ−ＮＡＣ（化合物４０）を得た。
【化１６】
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【０３１１】
Ｄ−ＮＡＣを構築するための本明細書において設計する合成プロトコールは、非常に頑強で再現性があり、産業において用い易い溶媒を伴い、最終的なコンジュゲートの迅速な合成を容易に提供する。Ｄ−ＮＡＣの改善された合成によって、他の連結および構成ブロックを有するＤ−ＮＡＣの生成も可能になる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021502451.tif 000037
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