(57)【要約】界面区画に由来する刺激された生体材料であって、該組成物が、それを必要とする対象体に投与されると、自然の組織の生成および治癒を増大させることができる組成物を開示する。
2021511936.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
界面区画に由来する刺激された生体材料を含む組成物であって、該組成物が、それを必要とする対象体に投与されると、自然の組織の生成および治癒を増大させることができる、組成物。
【請求項２】
界面区画に由来する刺激された生体材料が、無細胞である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
刺激された生体材料が、哺乳類の界面区画の異種集団に由来する生体材料を含む、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
界面区画に由来する刺激された生体材が、哺乳類の界面区画の異種集団に関連する複数のインタラクトームを含む、請求項3に記載の組成物。
【請求項５】
刺激された生体材料が、生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体を含む、請求項4に記載の組成物。
【請求項６】
生存しているコアの強力な細胞実体が、LGR4、LGR5、LGR6、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される1つ以上のロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体のRNA転写物および／またはポリペプチドを発現する、請求項5に記載の組成物。
【請求項７】
生存しているコアの強力な細胞実体が、Pax 7、Pax 3、MyoD、Myf 5、ケラチン15、ケラチン5、分化抗原群34（CD34）、Sox9、c-Kit+、Sca-1+、またはそれらの任意の組合せの1つ以上のRNA転写物および／またはポリペプチドを発現する、請求項5または6に記載の組成物。
【請求項８】
支持実体が、間葉由来の細胞集団を含む、請求項5〜7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
支持実体が、細胞集団、細胞外マトリックス構成要素、またはそれらの任意の組合せを含む、請求項5〜8のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１０】
細胞外マトリックス構成要素が、ヒアルロン酸、エラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外小胞、酵素および糖タンパク質の1つ以上を含む、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
刺激された生体材料が、骨組織界面、皮膚組織界面、筋骨格組織界面、脂肪組織界面または軟骨組織界面に由来する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
骨組織界面が、皮質周囲組織界面、層状構造周囲組織界面、小柱周囲組織界面、皮質海綿組織界面、またはそれらの任意の組合せである、請求項11に記載の組成物。
【請求項１３】
刺激された生体材料が、三胚葉性組織界面に由来する、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
組成物が、医薬品、酵素、分子、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される薬剤をさらに含む、請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
請求項1〜14のいずれか一項に記載の組成物およびその使用のための指示書を含むキット。
【請求項１６】
有効量の請求項11〜12または14のいずれか一項に記載の組成物を対象体に投与することを含む、それを必要とする対象体において組織再生を増大させる方法。
【請求項１７】
有効量の請求項1〜14のいずれか一項に記載の組成物を対象体に投与することを含む、それを必要とする対象体において自然の組織の治癒を増大させる方法。
【請求項１８】
対象体が、変性骨疾患に罹患している、請求項16または17に記載の方法。
【請求項１９】
変性骨疾患が、骨関節症または骨粗鬆症である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
対象体が、骨折を患っている、請求項16〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
骨折が、安定骨折、開放複合骨折、横骨折、斜骨折または粉砕骨折である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
自然の組織が皮膚であり、組成物の投与が対象体において瘢痕を予防および軽減する、請求項17に記載の方法。
【請求項２３】
請求項1〜13のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、
組織検体の哺乳類の界面区画の少なくとも一部を刺激して、刺激された生体材料を生成する工程であって、哺乳類の界面区画が哺乳類の界面区画の異種集団を含む工程；および
刺激された生体材料の画分を単離する工程
を含む、方法。
【請求項２４】
哺乳類の界面区画の一部が、機械的刺激、化学的刺激、酵素的刺激、エネルギー的刺激、電気的刺激、生物学的刺激、またはそれらの任意の組合せを用いて、刺激される、請求項23に記載の方法。
【請求項２５】
刺激が、生体適合性材料の存在下で生じる、請求項23または24に記載の方法。
【請求項２６】
生体適合性材料が、医薬品、酵素、分子、およびそれらの組合せからなる群より選択される、請求項23〜25のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
生体適合性伝達剤を刺激された生体材料に加える工程をさらに含む、請求項23〜26のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
刺激された生体材料の画分が、無細胞画分である、請求項23〜27のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
組織検体が、複数のドナーから得られる、請求項23〜28のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
組織検体および生体適合性材料は、容積比で約1：1から約3：1である、請求項25〜29のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
刺激された生体材料の単離画分を保存する工程をさらに含む、請求項23〜30のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
刺激された生体材料の単離画分が、乾燥または凍結乾燥により保存される、請求項31に記載の方法。
【請求項３３】
安定化剤を刺激された生体材料の単離画分に加える工程をさらに含む、請求項23〜32のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
生体適合性伝達剤が、アルギン酸、ゼラチン、石油、コラーゲン、鉱油、ヒアルロン酸、クリスタロイド、コンドロイチン硫酸、エラスチン、アルギン酸ナトリウム、シリコン、PCL/エタノール、レシチン、ポロキサマー、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される、請求項27に記載の方法。
【請求項３５】
哺乳類の界面区画の刺激された一部を、刺激された生体材料を単離する前に、約12〜72時間インキュベートする工程をさらに含む、請求項23〜34のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
刺激された生体材料の画分が、遠心分離、ろ過、またはそれらの組合せにより単離される、請求項23〜35のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
刺激が、哺乳類の界面区画の異種集団のインタラクトームに1つ以上の変化をもたらす、請求項23〜36のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
刺激された生体材料の単離画分が、細胞内インタラクトーム、細胞間インタラクトーム、細胞外インタラクトーム、経細胞インタラクトーム、細胞周囲インタラクトーム、およびそれらの組合せより選択される複数のインタラクトームを含む、請求項23〜37のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（関連出願の相互参照）
本願は、2018年12月6日出願の米国仮出願第62/776,329号および2018年1月26日出願の米国仮出願第62/622,489号に基づいて優先権を主張する。両出願の内容は、出典明示によりその全体として本明細書の一部とする。
【０００２】
（発明の分野）
本開示は、一般に、中間基質に対する作用により三胚葉由来の多細胞システムを変化させる生体材料含有組織の開発に関する。
【背景技術】
【０００３】
直接または間接的に生体物質（biological material）システムに影響を及ぼす能力、および／または標的生体材料（biomaterial）における機能的活性を活性化、向上および／または調節する能力は、長く従来の医用生体工学の試みの目標となっている。生体材料および／または医用生体工学への伝統的なアプローチは、古典的に教えられた組織工学三要素（triad）の周囲にしばしば設計され、これにより細胞型、分子作用物質および／または足場／マトリックスが単独または組合せで用いられて、作用物質が配置された組織におけるプロセスを強化または増強する。従って、該作用物質である細胞実体、分子作用物質および／または足場／マトリックスは、制限、無効および／または不足（例えば、細胞老化、分子誤用、有害な微小環境の選択および／または足場／マトリックスの人工化））をもたらす、インタラクトームを含むより完全なシステムの単離で単離、合成および／または構築される。生体材料基質の開発におけるこのような還元主義的アプローチは、不完全な無力システムをもたらす。その後、このような不完全なシステムは、本質的に基質の固有の均衡を変化させ、および／または外部システムに影響を及ぼし、システム全体の意図しない結果および／または不均衡をもたらす。
【０００４】
一般的に、三胚葉性起源に由来する組織化された生物学的システムは、外胚葉、中胚葉および内胚葉と一般的に称される3つの主要な胚葉から発達する。このような胚葉から、組織化された細胞の構造、機能および生命が生み出される。このような胚葉の適切な繁殖、ならびにこのような胚葉の間および／またはその内部で発生する、その結果生じる「相互」および「内部」相互作用は、より高度な構造（例えば、付属器、組織、器官）の形成をもたらす。
【０００５】
三胚葉性生物体において、段階的胚葉発生中の細胞性能の低下、およびそれに伴う胚層の伝播は、一部には、細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および／または細胞周囲のインタラクトームの相対的な変化の結果として発生する。細胞および／または細胞以下の組織化へのこのような変化は、より秩序だった構造、より複雑な基質およびより機能的なシステムの段階的な形成をもたらす。このような実体および／または進化した構造の相対的で進行性でかつ変化の方向、ならびに生理的極性は、一部には、アクティベーターとレスポンダーの間に存在する有機および無機作用物質の接触した流束勾配により発生し、故に、いずれかおよび／または両者に作用し得る。これらの作用物質は、個別の原因および効果のメカニズム／関係に相関する。
【０００６】
細胞性能および細胞実体および関連材料の組織化の状態は、段階的な成熟および発生を通して推移および変化するが、このような生理学の基本的な構成要素は保存されたままである。構造的配向および機能に対するこれらの変化および／または維持された保存の一部は、細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および／または細胞周囲のインタラクトームの間および／またはその内部に位置する相互作用物質、ならびにこのような有機および無機作用物質、細胞実体および／または関連材料の間の相対的な接触している力学に関連する。
【０００７】
機能的な組織化された細胞実体の基本的な例である組織は、共通の構造および機能を有する相互作用する細胞の組織化されたグループを有する。生理学的に、哺乳類の組織は、上皮（例えば、皮膚）、結合（例えば、緩い結合組織、密な結合組織、靭帯、腱、軟骨および骨）、筋肉（例えば、心臓組織、平滑組織および骨格組織）および神経の4つの基本的カテゴリーに組織化される。各タイプの組織は、生理学的生命維持で独特の役割を果たす。従って、組織の破壊は、傷害、疾患または生命の喪失をもたらし得る。
【０００８】
三胚葉由来のシステム（例えば、組織）における高度な構造への有害な作用および／または破壊を考慮すると、代償（reparation）が、線維症、瘢痕の形成および乱れによる構造の不十分な修復（repair）をもたらし得るため、組織構造の生成、再生および／または新生は、破壊された構造の単なる代償より好ましい。治癒の促進された形態は、結果として得られる構造および／または関連システムのより優れた機能的能力をもたらすため、瘢痕形成より好ましい。
【０００９】
皮膚は、新生および／または再生などの治癒の促進された形態が瘢痕形成より望ましい例示的な組織である。皮膚は、物理的および機械的バリアの保護、病原体からの免疫学的保護、体温調節、体性感覚を含む不可欠なニーズを満たし、外分泌および内分泌の役割を提供する重要（vital）かつ重大（critical）な器官である。皮膚の物理的および構造的完全性は、外皮系が機能するために、維持されなければならない。
【００１０】
インタラクトーム内の重大な相互依存性構成要素を取り囲む複雑さの更なる例は、(1)止血；(2)炎症；(3)増殖；および(4)成熟の、4つの基本的および従来の進行段階に一般的に単純化される、細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および細胞周囲の事象の、無数の複雑で、進化的に保存されたカスケードを含む、皮膚創傷治癒で観察され得る。三胚葉由来の組織系は、通常の変動スペクトルの外側で損傷および／または変化されると、段階的な修復プロセスによりしばしば応答する。これらの段階の進行を通して、一部には、接触している区画および／またはインタラクトームの内部および／またはその間の時間、空間および／または材料の制限のため、不規則性のスペクトルが存在するようになり得る。このような不規則性と、ネイティブおよび／またはセミネイティブの構造、機能、配向、プロセスまたは下流状態の生成、再生および新生との間には、逆相関関係が存在する。
【００１１】
皮膚組織を含む外皮系内の限界相関の不規則性の例は、瘢痕形成において見られ得る。瘢痕組織は、正常な皮膚組織と組成的および構造的に異なる。組成に関して、瘢痕組織は、不規則に配向した細胞外材料、細胞実体／集団の相対的比率の変化、ならびにそれ故に種々の接触した勾配およびインタラクトームプロファイルで主に構成される。例えば、皮膚システムによる酵素勾配の減少は、このような状況で生存できるように機能し得る細胞集団のために選択する。このような状況において、筋線維芽細胞集団のレベルの増加が存在し、その後、不規則に配向した細胞外材料の合成および沈着に寄与する。これらの材料および関連細胞集団は、さらに、瘢痕形成、収縮、およびより高い架橋、より高い密度、より低い弾性のコラーゲン構造を増加させるように、システムに影響を与える。環境、細胞実体、相対勾配、界面作用物質および／またはインタラクトームプロファイルの変化から生じる選択圧は、システム内の作用物質、材料、基質、生成物および実体の選択的存在の促進をもたらす。これらの選択圧がさらに可変物の選択組成を指示するため、システム全体は、インタラクトームおよび細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および／または細胞周囲の区画界面の構成要素を再配向および／または再指示する。
【００１２】
このような有能な技術を妨げている分野内の関連する制限は、富化幹細胞実体、古典的な固定伝播因子および／または合成した足場またはマトリックスの、3つの主要な独立した構成要素に主に焦点を当てた、古典的な教えおよび関連するアルゴリズムから生じている。このような構成要素は重要であるが、このような細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および／または細胞周囲の区画において動的プロセスおよび相互作用を生じる、界面および関連インタラクトームを考慮せずに、不完全なままである。
【００１３】
生体材料は、生存および／または動的なシステムの相互作用を制御、影響および／または変更するために、単独でまたはより大きなシステムの一部として用いられ得る、形態および／または機能を取るように、発展させた、集合させたおよび／または指示された、物質（substance）、作用物質（agent）および／または構成要素（component）である。このような生体材料は、後にこのようなより大きなシステムの下流の影響に反応し得る、より大きなシステムを制御、影響および／または変更するために、さらに用いられ得る。
【００１４】
促進剤は、生体材料または生物学的システムおよび／またはそれらのサブ構成要素に関連するため、原因と効果の関係の形式を駆動、増強、調節、変更するおよび／またはその他の方法で影響を与えることにより、該システム内の変化を促進する。
【００１５】
生理物理的に応答性の材料、物質および／または基質の配向、構造、反応性、機能および／または下流の結果を指示する際の複合インタラクトームおよび／または細胞内、細胞間および／または細胞外の区画の界面内の個別の選択圧の値のこのような理解の下に、自己伝播構造の生成、再生および新生の改善が現在必要とされている。
【発明の概要】
【００１６】
本発明は、一般に、生体材料促進剤基質の組成物、および多細胞システムから活性化生体材料組成物を製造する方法、およびそれから生じた組成物に関する。便宜のため、本願発明は、混成界面接続生体材料促進剤基質（Composite-Interfacing, Biomaterial Accelerant Substrate；CIBAS）と称する。
【００１７】
本開示の一態様は、付属器、界面、組織および／または器官ならびに関連するサブ構成要素を含み得るがこれに限定されない、組織化された構造の生成、新生および／または再生に関する。
【００１８】
本開示の別の一態様は、CIBASが、より優れたシステムの活性化、増強および／または調節を含むがこれに限定されない直接的または間接的効果によって、材料および／または作用物質と組み合わされる、システムに影響を及ぼす技術の利用に関する。
【００１９】
本開示の別の一態様は、伝達および／または保存のためのベクター、担体、媒体、組み合わせた材料の特性および／または機能を含み得るがこれに限定されない、他の形態の作用物質のための伝達剤としての技術の利用に関する。
【００２０】
本開示の別の一態様は、他の材料、実体、システム、製剤および／または作用物質の形態への基質、投入物、添加物および／または補足物としての技術の利用に関する。
【００２１】
本開示の一態様は、界面区画に由来する刺激された生体材料を含む組成物であって、該組成物が、それを必要とする対象体に投与されると、自然の組織の生成および治癒を増大させることができる組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
特許または出願ファイルには、カラーで作成された図面が少なくとも1つ含まれる。カラー図面を含むこの特許または特許出願公開のコピーは、請求および必要な手数料の支払いにより、官庁から提供される。
【００２３】
本発明の利点が容易に理解されるために、添付の図面に示す特定の実施態様を参照することにより、本発明のより具体的な説明を行う。これらの図面は本発明の典型的な実施態様のみを示し、それ故にその範囲を制限するとみなされるものではないと理解して、添付の図面を用いて本発明をさらに具体的かつ詳細に記載し、説明する。
【００２４】
【図１】図1は、本明細書に記載の組成物の効果を示す実験用ラット検体L71およびL72を示す。
【００２５】
【図２】図2は、実施例5においてウサギの軟骨検体から製造した材料の平均ラマンスペクトルを示す。ウサギの軟骨由来の溶液（上）およびウサギの軟骨由来のゲル（下）の平均ラマンスペクトルを示す。
【００２６】
【図３】図3は、実施例6においてウサギの骨検体から製造した材料の平均ラマンスペクトルを示す。ウサギの長骨由来の溶液（上）、ウサギの長骨由来の凍結乾燥ゲル（中央）およびウサギの長骨由来のゲル（下）の平均ラマンスペクトルを示す。
【００２７】
【図４】図4は、実施例7においてウサギの周囲の筋肉を伴う長骨検体から製造した材料の平均ラマンスペクトルを示す。ウサギの周囲の筋肉を伴う長骨由来の溶液（上）、ウサギの周囲の筋肉を伴う長骨由来の凍結乾燥ゲル（中央）およびウサギの周囲の筋肉を伴う長骨由来のゲル（下）の平均ラマンスペクトルを示す。
【００２８】
【図５】図5は、実施例8においてウサギの管腔骨（骨髄）検体から製造した材料の平均ラマンスペクトルを示す。
【００２９】
【図６】図6は、実施例9においてウサギの筋肉検体から製造した材料の平均ラマンスペクトルを示す。ウサギの筋肉由来の溶液（上）、ウサギの筋肉由来の凍結乾燥ゲル（中央）およびウサギの筋肉由来のゲル（下）の平均ラマンスペクトルを示す。
【００３０】
【図７】図7は、実施例10においてウサギの腱結合組織検体から製造した材料の平均ラマンスペクトルを示す。
【００３１】
【図８】図8は、実施例11においてウサギの骨性脊椎検体から製造した材料の平均ラマンスペクトルを示す。
【００３２】
【図９】図9は、25.12 1/秒（オレンジ）、158.1 1/秒（緑）および1000 1/秒（青）の剪断速度における、ウサギの周囲の筋肉を伴う長骨由来のゲルからの実施例12に記載のレオメトリーデータを示す。
【００３３】
【図１０】図10は、25.12 1/秒（オレンジ）、158.1 1/秒（緑）および1000 1/秒（青）の剪断速度における、実施例12に記載のウサギの筋肉から製造したゲルの、粘度対温度を示す。
【００３４】
【図１１】図11は、実施例12に記載のpH6.5およびpH7.5におけるウサギの脊椎から製造したゲルの、粘度対剪断速度を示す。
【００３５】
【図１２】図12は、圧縮試験で用いた凍結乾燥後の本明細書に記載の特定の組成物の弾性率（kPA）を示す。値の範囲は、異なる孔サイズの足場の強度の差を示す。
【００３６】
【図１３】図13は、圧縮試験で用いた凍結乾燥後の本明細書に記載の特定の組成物の弾性率（kPA）を示す。
【００３７】
【図１４】図14は、凍結乾燥した骨由来の本明細書に記載の組成物の構造的特徴を示す：（上）明視野（Brighfield）顕微鏡画像、（中央）構造を示す多光子共焦点画像、および（下）多孔構造を示す走査型電子顕微鏡（SEM）。
【００３８】
【図１５】図15は、凍結乾燥した筋由来の本明細書に記載の組成物の構造的特徴を示す：（上）明視野顕微鏡画像、（中央）構造を示す多光子共焦点画像、および（下）多孔構造を示す走査型電子顕微鏡（SEM）。
【００３９】
【図１６】図16は、凍結乾燥した軟骨由来の本明細書に記載の組成物の構造的特徴を示す：（上）明視野顕微鏡画像、（中央）構造を示す多光子共焦点画像、および（下）多孔構造を示す走査型電子顕微鏡（SEM）。
【００４０】
【図１７】図17は、本明細書に記載の分画された流体組成物の特定のナノ粒子の特徴を示す。H#は、相関する粒子プロファイルおよび両を有する画分を示す。このような粒子は、特定のブラウン運動特徴を示すものである。
【００４１】
【図１８】図18は、本明細書に記載の組成物の特定の視覚的特徴を示す。
【００４２】
【図１９】図19は、様々なインタラクトームを示す。
【００４３】
【図２０】図20は、実施例15に従って測定した組成物（例えばCIBAS）の圧縮率を示す。
【００４４】
【図２１】図21は、実施例16に従って測定したマウスの筋肉由来の組成物（例えばCIBAS）についてのタンパク質濃度を示す。
【００４５】
【図２２】図22は、実施例16に従って測定したウサギの骨由来の組成物（例えばCIBAS）についてのタンパク質濃度を示す。
【００４６】
【図２３】図23は、実施例16に従って測定したマウスの筋肉由来およびマウスの骨由来の組成物についての比較タンパク質濃度を示す。
【００４７】
【図２４】図24は、実施例16に従って測定したマウスの筋肉由来およびマウスの骨由来の組成物についての比較タンパク質濃度を示す。
【００４８】
【図２５】図25は、実施例16に従って測定したマウスの骨由来の組成物についてのタンパク質濃度を示す。
【００４９】
【図２６】図26は、実施例17に従って測定したマウスの筋肉/骨由来の組成物、マウスの筋肉由来の組成物およびマウスの骨由来の組成物についての測定バイオマーカーの濃度を示す。
【００５０】
【図２７】図27は、実施例17に従って測定したマウスの筋肉/骨由来の組成物、マウスの筋肉由来の組成物およびマウスの骨由来の組成物についてのオステオプロテゲリンの濃度を示す。
【００５１】
【図２８】図28は、実施例17に従って測定したマウスの筋肉/骨由来の組成物、マウスの筋肉由来の組成物およびマウスの骨由来の組成物についてのSOSTの濃度を示す。
【００５２】
【図２９】図29は、実施例18に従って測定したウサギの筋肉由来の組成物（例えばCIBAS）（下）および自然のウサギの筋肉（上）の比較ラマンスペクトルを示す。
【００５３】
【図３０】図30は、実施例18に従って測定したウサギの脂肪由来の組成物（例えばCIBAS）（下）および自然のウサギの脂肪（上）の比較ラマンスペクトルを示す。
【００５４】
【図３１】図31は、実施例18に従って測定したウサギの軟骨由来の組成物（例えばCIBAS）（下）および自然のウサギの軟骨（上）の比較ラマンスペクトルを示す。
【００５５】
【図３２】図32は、実施例18に従って測定したウサギの骨由来の組成物（例えばCIBAS）（下）および自然のウサギの骨（上）の比較ラマンスペクトルを示す。
【００５６】
【図３３】図33は、実施例18に従って測定したヒトの皮膚由来の組成物（例えばCIBAS）（下）および自然のヒトの皮膚（上）の比較ラマンスペクトルを示す。
【００５７】
【図３４】図34は、実施例23に従った細胞生存率実験の結果を示す。
【００５８】
【図３５】図35は、実施例17に従って測定した肝臓由来の組成物（例えばCIBAS）についてのIL6、オステオプロテゲリンおよびインスリンの濃度を示す。
【００５９】
【図３６】図36は、実施例17に従って測定した軟骨由来の組成物（例えばCIBAS）についてのIL6、オステオプロテゲリン、インスリンおよびレプチンの濃度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本明細書の全体を通して「一の実施態様」、「ある実施態様」または同様の用語への言及は、実施態様に関連して記載される特定の特徴、構造または特性が本発明の少なくとも1つの実施態様に含まれることを意味する。したがって、本明細書の全体を通して「一実施態様において」、「ある実施態様において」または同様の用語の語句の出現は、必ずしもではないが、すべて同じ実施態様を指す場合がある。
【００６１】
また、本発明の記載される特徴、構造または特性は、1つ以上の実施態様においてあらゆる適切な方法で組み合され得る。以下の説明において、本発明の実施態様の完全な理解を提供するために、多数の複数の詳細が含まれている。しかしながら、当業者は、本発明が1つ以上の特定の詳細なしでまたは他の方法、構成要素、材料などを用いて実施され得ること認識するだろう。他の例では、周知の構造、材料または操作は、本発明の態様を曖昧にするのを避けるために、詳細には示されていないかまたは説明されていない。したがって、本開示の範囲を逸脱することなく、他の実施態様は利用され得て、変更がなされ得ること理解されたい。よって、以下の詳細な説明を限定的な意味で取るべきではない。
【００６２】
本開示は、一般に、界面区画が破壊され、その中の細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および／または細胞周囲のインタラクトームが組み合わされ、それ故に活性化する、三胚葉性多細胞システムに由来する組成物に関する。本開示はまた、一般に、このような組成物の製造方法およびこのような組成物の使用に関する。
【００６３】
本開示の一態様は、下流の有用性のために組成物と生体適合性伝達剤を組み合わせることに関する。
【００６４】
本開示の一態様は、組成物と更なる材料、複合材料および／または作用物質を組み合わせることに関する。また、組成物と更なる材料、複合材料およびまたは作用物質の組合せを開示する。
【００６５】
本開示の一態様は、三胚葉由来の多細胞システムにおいて利用されるプロセスを増大、促進、制御および／または阻止する組成物に関する。
【００６６】
本開示の一態様は、細胞実体および／または細胞ベースのシステムにおいて利用される同化、異化および／または代謝に関与するプロセスを変化させる組成物に関する。
【００６７】
本開示の一態様は、細胞および／または組織の機能的活性を促進する組成物に関する。
【００６８】
本開示の態様はまた、細胞または組織の構造の乱れ（例えば、組織および多細胞システム内における細胞老化、瘢痕形成および線維形成過程を含むがこれに限定されない）を予防および軽減する組成物に関する。
【００６９】
本開示の一態様は、三胚葉由来の検体の細胞周囲界面の選択的な捕捉および変化、ならびに刺激された組成物の活性化および単離に関する。
【００７０】
界面区画に由来する刺激された生体材料を含む組成物を開示する。組成物は、それを必要とする対象体に投与されると、自然の組織の生成および治癒を増大させることができる。
【００７１】
一実施態様において、界面区画に由来する刺激された生体材料は、無細胞である。一実施態様において、刺激された生体材料は、哺乳類の界面区画の異種集団に由来する生体材料を含む。一実施態様において、界面区画に由来する刺激された生体材料は、哺乳類の界面区画の異種集団に関連する複数のインタラクトームを含む。
【００７２】
一実施態様において、刺激された生体材料は、生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体。一実施態様において、生存しているコアの強力な細胞実体は、LGR4、LGR5、LGR6、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される1つ以上のロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体のRNA転写物および／またはポリペプチドを発現する。一実施態様において、生存しているコアの強力な細胞実体は、Pax 7、Pax 3、MyoD、Myf 5、ケラチン15、ケラチン5、分化抗原群34（CD34）、Sox9、c-Kit+、Sca-1+、またはそれらの任意の組合せの1つ以上のRNA転写物および／またはポリペプチドを発現する。一実施態様において、支持実体は、間葉由来の細胞集団を含む。一実施態様において、支持実体は、細胞集団、細胞外マトリックス構成要素、またはそれらの任意の組合せを含む。一実施態様において、細胞外マトリックス構成要素は、ヒアルロン酸、エラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外小胞、酵素および糖タンパク質の1つ以上を含む。
【００７３】
一実施態様において、刺激された生体材料は、骨組織界面に由来する。一実施態様において、骨組織界面は、皮質周囲組織界面、層状構造周囲組織界面、小柱周囲組織界面、皮質海綿組織界面、またはそれらの任意の組合せである。一実施態様において、刺激された生体材料は、三胚葉性組織界面に由来する。
【００７４】
一実施態様において、組成物は、医薬品（pharmaceutical）、酵素、分子、およびそれらの任意の組合せからなる群より選択される薬剤（agent）をさらに含む。
【００７５】
また、界面区画に由来する刺激された生体材料を含む組成物であって、該組成物が、それを必要とする対象体に投与されると、自然の組織の生成および治癒を増大させることができる、組成物を製造する方法を開示する。方法は、組織検体の哺乳類の界面区画の少なくとも一部を刺激して、刺激された生体材料を生成する工程を含み、ここで、哺乳類の界面区画は、哺乳類の界面区画の異種集団を含む。方法は、刺激された生体材料の画分を単離する工程を含む。一実施態様において、刺激された生体材料の画分は、無細胞画分である。
【００７６】
一実施態様において、哺乳類の界面区画の一部は、機械的刺激、化学的刺激、酵素的刺激、エネルギー的刺激、電気的刺激、生物学的刺激、またはそれらの任意の組合せを用いて、刺激される。一実施態様において、刺激は、生体適合性材料の存在下で生じる。一実施態様において、生体適合性材料は、医薬品（pharmaceutical agent）、酵素、分子、およびそれらの組合せからなる群より選択される。一実施態様において、組織検体および生体適合性材料は、容積比で約1：1から約3：1である。
【００７７】
一実施態様において、方法は、生体適合性伝達剤を刺激された生体材料に加える工程をさらに含む。一実施態様において、生体適合性伝達剤は、アルギン酸、ゼラチン、石油、コラーゲン、鉱油、ヒアルロン酸、クリスタロイド、コンドロイチン硫酸、エラスチン、アルギン酸ナトリウム、シリコン、PCL/エタノール、レシチン、ポロキサマー、およびそれらの任意の組合せより選択される。
【００７８】
一実施態様において、組織検体は、複数のドナーから得られる。
【００７９】
一実施態様において、方法は、刺激された生体材料の単離画分を保存する工程をさらに含む。一実施態様において、刺激された生体材料の単離画分は、乾燥または凍結乾燥により保存される。
【００８０】
一実施態様において、方法は、安定化剤を刺激された生体材料の単離画分に加える工程をさらに含む。
【００８１】
一実施態様において、方法は、哺乳類の界面区画の刺激された一部を、刺激された生体材料を単離する前に、約12〜72時間インキュベートする工程をさらに含む。一実施態様において、刺激された生体材料の画分は、遠心分離、ろ過、またはそれらの組合せにより単離される。
【００８２】
一実施態様において、刺激は、哺乳類の界面区画の異種集団のインタラクトームに1つ以上の変化をもたらす。一実施態様において、刺激された生体材料の単離画分は、細胞内インタラクトーム、細胞間インタラクトーム、細胞外インタラクトーム、経細胞インタラクトーム、細胞周囲インタラクトーム、およびそれらの組合せより選択される複数のインタラクトームを含む。
【００８３】
組織検体の界面区画を破壊して、少なくとも1つのインタラクトームの少なくとも一部を活性化する工程；および破壊された界面区画から無細胞組成物を単離する工程を含む製造方法を開示する。一実施態様において、組織検体は、三胚葉性動物からである。
【００８４】
また、組織検体の界面区画を破壊して、複数のインタラクトームの各々の少なくとも一部を活性化し、組み合わせる工程；および破壊された界面区画から無細胞組成物を単離する工程を含む製造方法を開示する。複数のインタラクトームは、細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および細胞周囲のインタラクトーム、およびそれらの組合せより選択され得る。
【００８５】
一実施態様において、組織検体は、哺乳類の（例えば、ラット、マウス、ウサギ、ブタ、ウマ、ヒト、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ、霊長類、雌ウシ、雄ウシ、ラクダ、ロバ、モルモットまたはバイソン）である。組織検体は、複数のドナーからの複数の組織検体であり得る。あるいは、組織検体は、単一のドナーからの1つ以上の組織検体であり得る。
【００８６】
本明細書に記載の組成物は、保存され得る。例えば、保存は、組成物を乾燥または凍結乾燥することにより達成され得る。
【００８７】
界面活性剤は、本明細書に記載の組成物に加えられ得る。安定化剤は、本明細書に記載の組成物に加えられ得る。例えば、安定化剤は、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシアパタイト、クリスタロイド、有機溶液、分子、構成要素、およびそれらの組合せからなる群より選択され得る。
【００８８】
本開示は、一つにまとめられた細胞実体の内部またはその間に存在する外部および内部の材料界面部に基づく。これらの界面は、独特であり、集団および／またはサブ集団における各細胞の完全なインタラクトームの集合全体に動的に相互依存する。これらの状況における各細胞は、非静的で外部の勾配、力およびシステムからさらに作用を受ける、それを取り囲む材料の複雑なサブネットワーク（例えば、他の細胞、細胞外マトリックス、基質、作用物質、因子および代謝産物を含むがこれに限定されない）に接触する。
【００８９】
生体材料および／または医用生体工学への従来のアプローチは、細胞内部またはその間のこれらの相互に作用する複雑なサブネットワーク（すなわち、インタラクトーム）を無視している。細胞-組織のプロセス、経路およびニッチな環境を維持、制御、調節および／または促進する際にシステム内の細胞実体中におよび／またはその間に存在する、従来見過ごされていた相互に作用する複雑なサブネットワークおよび／またはインタラクトームの重要性は、本明細書に記載の組成物の根底にある。本明細書に記載の組成物は、このようなイントラクトームを合わせ、活性化することを可能とする。
【００９０】
上記のとおり、本明細書に記載の組成物は、混成界面接続生体材料促進剤基質（Composite-Interfacing, Biomaterial Accelerant Substrate；CIBAS）とも称され得る。
【００９１】
CIBASは、不完全なシステムおよび／または不完全なシステムの部分的なサブネットワークの作用物質と複合体化および／または相互作用し、それにより機能性生成物の形成を促進するように、反応性の作用物質を不完全なシステムに提供することによって、反応性の三胚葉由来の材料システムに作用する。細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および／または細胞周囲の区画全体で適格なおよび／または機能的に完全な界面およびインタラクトームの適切な伝播は、このような構造が配置されたより優れたシステムとの統合および／または関連が可能である、機能性自己伝播構造の生成、再生および／または新生させる治癒および／または回復をもたらすものである。
【００９２】
機能性生成物の形成は、より組織化された構造の形成、反応内での生成物の形成、および／または材料の化学的、電気的、電気化学的および／または物理的状態の変化として説明され得る。
【００９３】
CIBASは、例えば、ゲノム、エピゲノム、トランスクリプトーム、エピトラスクリプトーム、プロテオミクスおよび／またはエピプロテオミクスの材料、細胞以下のオルガネラまたは細胞以下の構造ならびにこのような構造の誘導体、細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および／または細胞周囲のマトリックス、足場、粒子、繊維および／または構造要素、同化、異化および／または代謝のプロセスおよび材料ならびにこのような材料の誘導体、化学的、電気化学的および／または電気的な環境、材料力学、材料力、材料動力学および／または材料熱力学、有機材料および／または生体、組織および／または器官系、細胞、細胞実体および／または細胞のシステムおよび複合システムを含むがこれらに限定されない、材料の合成、変化、修正、調節、制御、組織化または破壊によって環境を変更することによりそれが配置されている環境を変化させることができる。
【００９４】
CIBASは、医療、健康、治療、研究、非医療、製造、技術関連、防衛関連および栄養用途を含むがこれらに限定されない、いくつかの使用分野にわたる多数の使用および用途を有する。例えばCIBASは、細胞および／または組織製品、医療機器、生物製剤製品、治療薬、小分子製品および／または医薬品の開発に関連する用途などの医学における臨床製品用途で用いられ得る。別の例として、統合、組成および／またはマルチ材料合成によって、CIBASは、組み合された製品タイプのために、他の1つまたは複数の技術と組み合され得る。更なる例として、CIBASは、細胞、組織および器官のシステムおよび／またはそれらの誘導体の生成、再生、新生、増大、変化、組織化および／または破壊に関連する用途で用いられ得る。例として、本明細書に記載の組成物は、投与時に瘢痕を予防または軽減し得る。
【００９５】
別の例として、CIBASは、研究用とおよび研究関連製品（例えば、臨床製品タイプおよび複合技術および／または製品タイプの研究開発に関連する用途、研究製品、研究の試験、研究および開発のための発明の使用に関連する用途、生物の外部生命支援、バイオリアクター、培養または維持の開発に関連する用途を含むがこれに限定されない）で利用され得る。
【００９６】
別の例として、CIBASは、医学および／または非医学的取り組みの用途（例えば、薬理学および／または美容用途を含むがこれに限定されない）で利用され得る。例えば、特定の実施形態は、細胞遊走および増殖を調節し、それにより炎症を低減し、創傷治癒を促進し、瘢痕を低減し、最終的にすべての組織における構造および機能の修復、再生および回復を促進し得る。特定の実施態様は、前処置として、プレコンディショニングとして、傷害と同時に、傷害前または傷害後に直接に提供され得る。特定の実施態様は、美容および／または臨床手術の前または後のケロイド瘢痕形成を低減し得る。特定の実施態様は、限定されないが、心臓、骨、脳、脊髄、網膜、末梢神経ならびに急性および慢性傷害または疾患の対象である他の組織および器官を含むがこれに限定されない器官および組織を対象とする疾患または手術によって引き起こされる内部損傷を処置するのに用いられ得る。
【００９７】
更なる例として、CIBASは、関連技術の派生物の開発、他の技術のための伝達剤の開発、他の技術のための活性化または調節剤の開発、および／または有機または無機生成のための小分子、タンパク質、オルガネラまたは細胞以下の材料の製造または合成の開発で用いられ得る。
【００９８】
別の例として、CIBASは、非生物の開発で用いられ得る。
【００９９】
別の例として、CIBASは、軍事、武器、および／または防衛の派生物の開発に関連する用途で用いられ得る。
【０１００】
さらに別の例として、CIBASは、食品、栄養、栄養素、ニュートラシューティカルズおよび／または栄養補助食品の開発、および／または人工知能、適格なおよび／または伝播のシステムおよび／または複合システムのユニットの開発で用いられ得る。
【０１０１】
組成物を得ることは、界面区画を壊して、機能性材料（例えば、組織）を組織化することができる周囲の界面接続反応性材料（PiRM）を提供することを含む。組成物の一実施態様は、処理のために界面から離れて導かれる界面周辺に存在する反応性細胞子孫の標的化画分である。
【０１０２】
周囲界面接続反応性材料（PiRM）の組成物は、細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および／または細胞周囲の区画の内部および／またはその間にインタラクトームの材料を含む。特定の実施態様において、組成物は、細胞から細胞内の材料；細胞から細胞の材料（すなわち、細胞間）；細胞から細胞外の材料；細胞から経細胞の材料；および細胞から細胞周囲の材料である、単一の組成物に自然には配列しない構成要素を含む。組成物は、組織（例えば、皮膚組織）検体内の界面区画に由来し得る。
【０１０３】
界面区画は、完全な界面区画または亜区画界面のいずれかで、細胞-組織の環境および／または多細胞の環境および／または操作された細胞システムから得られ得る。
【０１０４】
完全な界面区画は、本明細書に開示されるように設計されると、本明細書に記載の組成物が生じるのに必要な材料を更なる処理によって供給するかまたは供給し得る、該領域内に配置される内容物材料を指す。
【０１０５】
以下でより詳細に記載するように、対象とする各材料基質および／または組織について、完全な界面区画は、その独特な機能またはこのような機能の構成要素に寄与する基質および／または組織の本質的な構成要素を含む。
【０１０６】
亜区画界面はまた、本明細書に開示されるように設計されると、本明細書に記載の組成物が生じるのに必要な材料を更なる処理によって供給するかまたは供給し得る、該領域内に配置される内容物材料を指す。亜区画界面は、完全な界面区画の一部を指す。
【０１０７】
三胚葉由来の材料界面部分を取り囲む界面区画は、当業者に利用可能な装置（例えば、レーザー走査型多光子共焦点顕微鏡により）を用いて配置され得る。界面区画は、通常の収集、生検、パンチ、吸引、切断、制限、消化、抽出、切除、解離、分離、除去、分割および／または単離プロトコールを含むがこれに限定されない、当業者によって理解される様々な方法により得られ得る。界面の分離は、目下の用途に十分な材料、例えばあるサイズの創傷を処置するのに必要とされる材料の容量／質量が得られたときに完了する。
【０１０８】
界面区画は、このような区画および／または亜区画を周囲の材料から移動させ、材料の完全な破壊なしで材料の固有の組織化を変化させ、そして細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および／または細胞周囲の材料の最小分極を得るように破壊される。本明細書で用いられる「最小分極」は、組織の単位が、機能性分極組織を組織化することができるのに必要である生体材料の人工操作により達成される分極の程度を指す。人工操作は、機械的、化学的、酵素的、エネルギー的、電気的、生物学的および／または他の物理的方法を用いて達成され得る。
【０１０９】
機械的、化学的、酵素的、エネルギー的、電気的、生物学的および／または物理的メカニズムを含むがこれに限定されない、標的材料の破壊のための様々な方法は、当業者に理解される。例えば、周囲の物質からの材料の標的化レーザーキャプチャー顕微鏡法は、完全な界面区画または亜区画界面を生じさせ得る。一実施態様において、破壊は、界面区画の固有の組織化を機械的、物理的、エネルギー的、化学的および電気的に少なくとも1つ変化させることにより達成される。
【０１１０】
一実施態様において、破壊は、生体適合性材料の存在下で生じる。生体適合性材料は、例えば固体、液体および／または気体を含むがこれに限定されない、作用物質の様々な状態を形成し得る。一実施態様において、生体適合性材料は、溶液（例えば、0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸リンゲル液、水中の5%デキストロース、3.2％クエン酸ナトリウム）である。生体適合性材料は、抗生物質、例えば抗ブドウ球菌抗生物質（例えば、微生物集団を変化させる）を含み得る。一実施態様において、生体適合性材料は、医薬品、酵素、分子、およびそれらの組合せからなる群より選択される。組織検体および生体適合性材料は、例えば、容積比で約1：1から約1：2であり得る。あるいは、組織検体および生体適合性材料は、例えば、容積比で約1：1から約2：1または約1：1から約3：1であり得る。例えば、容積比は、約1：1、約2：1または約3：1であり得る。
【０１１１】
界面区画の破壊は、機能性材料（例えば、機能性分極組織）を組織化することができる、周囲界面接続反応性材料（PiRM）を提供する。一実施態様において、本明細書に記載の方法により生成されるPiRMは、インビボで機能性材料（例えば、機能性分極組織）を組織化することができる。
【０１１２】
一実施態様において、本明細書に記載の方法により生成されるPiRMは、エクスビボで機能性材料（例えば、機能性分極組織）を組織化することができる。
【０１１３】
一実施態様において、本明細書に記載の方法により生成されるPiRMは、インビトロで機能性材料（例えば、機能性分極組織）を組織化することができる。
【０１１４】
界面区画の破壊中に、細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および／または細胞周囲のインタラクトームの無細胞構成要素は、組成物を提供するのに利用され得る。
【０１１５】
界面区画の破壊後、破壊された界面区画は、インキュベートされ得る。インキュベートは、破壊された界面区画、例えば約8〜約12時間撹拌することを含み得る。特定の実施態様において、破壊された界面区画の撹拌は、約8〜約72時間、約12〜約72時間、約24〜約72時間、約36〜約72時間、約48〜約72時間または約60〜約72時間起こり得る。例示的な時間は、約12時間、約24時間、約36時間、約48時間、約60時間および約72時間を含むがこれに限定されない。
【０１１６】
組成物は、機能的溢出、ろ過、分画、選択的捕捉、選択、遠心分離、濃縮、補助的還元、分離、段階的分配、分配、加圧、溶解、消化、乳化、プロトン化および／または沈殿を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の様々な方法で単離され得る。一例として、組成物の単離は、遠心分離などによる組成物の機械的分離を含み得る。別の例として、単離は、遠心分離後などに組成物のろ過を含み得る。例えば、ろ過は、組成物を約10μm〜約100μmのフィルターに通過させることを含み得る。ろ過は、組成物を約1μmフィルター、約5μmフィルター、約10μmフィルター、約15μmフィルター、約20μmフィルター、約30μmフィルター、約40μmフィルター、約50μmフィルター、約60μmフィルター、約70μmフィルターおよび約85μmフィルター、約100μmフィルター、約200μmフィルター、約300μmフィルター、約400μmフィルターまたは約500μmフィルターに通過させることを含み得る。
【０１１７】
本明細書で用いられる用語「促進剤」は、プロセスを促進するために用いられる物質を意味すると理解されるべきである。
【０１１８】
本明細書で用いられる用語「無細胞」は、完全な細胞を本質的に含まないが、生物学的に重要ではないレベルの完全な細胞を含み得ること、および／または細胞および／または残留物が組織の特性と相互作用しないように細胞残留物が残っていることを意味すると理解されるべきである。完全な細胞除去の程度は、組成物を調製するのに用いられる正確な供給源および方法、ならびに組成物の最終的な有用性および所望の状態に依存する。
【０１１９】
本明細書で用いられる、対象体への組成物の「投与」は、その意図される機能を実施するために組成物を対象体へ導入または送達するあらゆる経路を含む。投与は、移植、経口、鼻腔内、非経腸（静脈内、筋肉内、腹腔内または皮下）、直腸、髄腔内または局所を含むが、これらに限定されない、任意の適切な経路で行われ得る。投与は、自己投与および他者による投与を含む。例示的な投与方法は、注射、局所適用、コーティングおよび含浸を含むがこれに限定されない。
【０１２０】
用語「生体材料」は、個人のクオリティ・オブ・ライフを維持または改善するために、あらゆる期間用いられ得て、あらゆる組織、器官または機能を部分的または全体的に増強または置き換える、合成または天然由来の薬物以外のあらゆる物質または物質の組合せを意味すると理解されるべきである。
【０１２１】
他に断らない限り、本明細書で用いられる用語「複合」は、複数のパーツまたは構成要素から構成されることを意味すると理解されるべきである。
【０１２２】
本明細書で用いられる「コアの強力な細胞実体」は、細胞間コミュニケーション、遊走、走化性、増殖、分化、分化転換、脱分化、一過性増幅、非対称分裂が可能であり、幹細胞、前駆細胞およびTA細胞（transit-amplifying cell）を含む細胞実体を指す。コアの強力な細胞実体は、例えば、特定の細胞以下バイオマーカー（すなわち、DNA、RNAおよびタンパク質）についてアッセイすることにより特定または確立され得る。いくつかの実施態様において、コアの強力な細胞実体は、1つ以上のロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体（LGR）、例えばLGR4、LGR5、LGR6、またはそれらの組合せのRNA転写物および／またはポリペプチドを発現する。これに加えてまたはこれとは別に、いくつかの実施態様において、コアの強力な細胞実体は、Pax 7、Pax 3、MyoD、Myf 5、ケラチン15、ケラチン5、分化抗原群34（CD34）、Sox9、c-Kit+、Sca-1+、およびそれらの任意の組合せの1つ以上のRNA転写物および／またはポリペプチドを発現する。コアの強力な細胞実体のためのバイオマーカーの更なる例は、Wong et al., International Journal of Biomaterials, vol. 2012, Article ID 926059, 8 pages, 2012に記載されている。
【０１２３】
本明細書で用いられる用語「有効量」は、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量、例えば、本明細書に記載の疾患もしくは状態または本明細書に記載の疾患もしくは状態に関連する1つ以上の兆候または症状の予防または軽減をもたらす量を指す。治療的または予防的用途の文中において、対象体に投与される組成物の量は、組成物、疾患または状態の程度、種類および重症度、ならびに個人の特徴、例えば一般的な健康状態、年齢、性別、体重、薬物耐性に応じて変化する。当業者は、これらおよび他の要因に応じて適切な投与量を決定することができる。組成物はまた、1つ以上のさらなる治療用化合物と組み合わせて投与され得る。本明細書に記載の方法では、治療組成物は、本明細書に記載の疾患または状態の1つ以上の兆候または症状を有する対象体に投与され得る。
【０１２４】
本明細書で用いられる「細胞外マトリックス」および「細胞外マトリックス構成要素」は、ヒアルロン酸、エラスチン、コラーゲン、フィブロネクチン、ラミニン、細胞外小胞、酵素および糖タンパク質などの細胞外高分子であって、周囲の細胞に構造的および生化学的支持を提供する三次元ネットワークとして組織化された分子を指す。
【０１２５】
本明細書で用いられる用語「機能性材料」、「機能性組織」および「機能性分極組織」は、同じ起源を有し、自然の対応組織で観察されるもの同様の生物学的機能を実行する細胞および細胞外マトリックスを指す。いくつかの実施態様において、「機能性材料」、「機能性組織」または「機能性分極組織」は、自然の対応組織で観察されるものと同様の極性、密度、柔軟性などの特性を示す。
【０１２６】
本明細書で用いられる用語「インタラクトーム」は、細胞または細胞材料の間および／またはその内部に生じる一連の分子相互作用を指す。インタラクトームの例は、細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および細胞周囲のインタラクトームを含むがこれに限定されない。
【０１２７】
用語「界面」は、生体および／または有機材料と、他の生体材料または有機／無機材料の間の接する領域を意味すると理解されるべきである。
【０１２８】
本明細書で用いられる用語「界面区画」は、組織界面を含む組織検体の一部を指す。
【０１２９】
本明細書で用いられる用語「材料界面」は、2つ以上の異なるまたは区別可能な細胞が、他の材料、基質または因子を含んでもよくまたは含まなくてもよい環境および／またはシステムにおいて互いに接近、接触（contact）、混合（merge）、統合、組み込み、合体（unite）、癒合（coalesce）、複合（combine）、配合（compound）、融合、隣接（abut）、接触（touch）、境界（border）、併合（meld）、コミュニケーション、シナプス、接合、相互作用、共有、凝集、接続、侵入、取り囲むまたは形成する領域、エリアおよび／または場所を指す。この他の環境および／またはシステムは、本明細書に記載の組成物と相互作用するのに用いられ得る。
【０１３０】
本明細書で用いられる「刺激された」は、電気的刺激、酸素勾配、ケモカイン受容体結合、パラクリン受容体結合、細胞膜変化、細胞骨格変化、細胞の物理的操作、生理学的勾配の変化、温度変化、小分子相互作用、ヌクレオチドおよびリボヌクレオチド、例えば低分子干渉RNAの導入を含み、遺伝子発現の変化、タンパク質翻訳の変化、細胞内および細胞間シグナル伝達の変化、小胞の膜への結合の変化、ATPの生成および消費の変化、細胞の伝達性の変化のうちの表現型／結果の1つ以上を誘導するのに十分である、シグナルの1つまたは組合せにより実施され得る組織界面に存在する異種の哺乳類の組織／細胞に生物学的状態を活性化させる（例えば、変化させる）ことを指す。
【０１３１】
用語「基質」は、生物体がその上でまたはそれから生息するか、成長するかまたは栄養素を得る表面または材料を意味すると理解されるべきである。
【０１３２】
本明細書で用いられる「支持実体」は、コアの強力な細胞実体に構造的および生化学的支持を提供する非幹細胞集団（例えば、支持細胞実体）および／または細胞外マトリックス材料を指す。いくつかの実施態様において、支持細胞実体は、増殖および／または分化細胞を含み得る。これに加えてまたはこれとは別に、いくつかの実施態様において、支持細胞実体は、バイオマーカー、例えばBMPr1a、BMP2、BMP6、FGF、Notch受容体、δリガンド、CXCL12、Sonic Hedge Hog、VEGF、TGFβ、Wnt、HGF、NG2およびα平滑筋アクチンの発言により特定され得る。いくつかの実施態様において、支持細胞実体は、間葉由来の細胞集団を含む。
【０１３３】
本明細書で用いられる「組織界面」は、独立した、所望により関係のない組織システムが相互作用し、互いにコミュニケーションする場所を指す。いくつかの実施態様において、組織界面の構成要素は、増殖、分化、遊走、同化、異化、刺激、または細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および細胞周囲のコミュニケーションまたはそれらの任意の組合せの少なくとも1つを含むがこれに限定されない、細胞形成および細胞発生および／または代謝を現在促進している／促進した。
【０１３４】
例示的な組織界面は、割球頂端細胞界面、割球側方細胞界面、割球基底細胞界面、外胚葉頂端細胞界面、外胚葉側方細胞界面、外胚葉基底細胞界面、中胚葉頂端細胞界面、中胚葉側方細胞界面、中胚葉基底細胞界面、内胚葉頂端細胞界面、内胚葉側方細胞界面、内胚葉基底細胞界面、皮膚組織界面、骨組織界面、筋骨格組織界面、平滑筋組織界面、心筋組織界面、軟骨組織界面、脂肪組織界面、消化管組織界面、肺組織界面、食道組織界面、胃組織界面、腎臓組織界面、肝臓組織界面、膵臓組織界面、血管組織界面、リンパ組織界面、中枢神経組織界面、泌尿生殖器組織界面、腺組織界面、歯組織界面、末梢神経組織界面、出生組織界面および視覚組織界面を含むがこれに限定されない。
【０１３５】
皮膚組織界面は、上皮-真皮組織界面、乳頭真皮-網状真皮組織界面、真皮-下真皮（hypodermal）界面、下真皮-真皮下（subdermal）界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１３６】
骨組織界面は、皮質周囲組織界面、層状構造周囲組織界面、小柱周囲組織界面、皮質海綿組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１３７】
筋骨格組織界面は、筋-筋内（epimysial）組織界面、筋-筋周囲（perimysial）組織界面、筋-筋外（endomysial）組織界面、筋-筋膜組織界面、腱-筋肉組織界面、腱-骨組織界面、靭帯-骨組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１３８】
平滑筋組織界面は、血管周囲組織界面、内臓周囲組織界面、神経周囲組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１３９】
心筋組織界面は、心内膜-心筋組織界面、心筋-心外膜組織界面、心外膜-心膜組織界面、心膜-脂肪組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１４０】
軟骨組織界面は、軟骨-軟骨周囲組織界面、軟骨-軟骨内（endochondrial）組織界面、軟骨内-軟骨下（sub軟骨）骨界面、軟骨-軟骨内骨界面、軟骨内-軟骨下骨界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１４１】
脂肪組織界面は、脂肪-血管周囲組織界面、脂肪-ストーマ周囲組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１４２】
消化管組織（小腸および大腸）界面は、粘膜-粘膜下組織界面、粘膜下-筋層組織界面、筋層-漿膜組織界面、漿膜-腸間膜組織界面、筋-神経組織界面、粘膜下-神経組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１４３】
肺組織界面は、粘膜-粘膜下組織界面、粘膜下-筋層組織界面、粘膜下-軟骨組織界面、筋肉-外膜組織界面、導管-外膜組織界面、実質-漿膜組織界面、漿膜-腸間膜組織界面、筋-神経組織界面、粘膜下-神経組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１４４】
食道組織界面は、粘膜-粘膜下組織界面、粘膜下-筋層組織界面、筋層-外膜組織界面、筋-神経組織界面、粘膜下-神経組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１４５】
胃組織界面は、粘膜-粘膜下組織界面、粘膜下-筋層組織界面、筋層-漿膜組織界面、筋-神経組織界面、粘膜下-神経組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１４６】
腎臓組織界面は、莢膜（capsule）-皮質組織界面、皮質-髄質組織界面、神経-実質組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１４７】
肝臓組織界面は、導管上皮-実質組織界面を含み得る。
【０１４８】
膵臓組織界面は、導管上皮-実質組織界面、腺上皮-実質組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１４９】
血管組織界面は、内皮-中膜（tunica）組織界面、中膜-中膜組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１５０】
リンパ組織（リンパ節、脾臓、胸腺）界面は、皮質-髄質組織界面、髄質-莢膜組織界面、莢膜-髄組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１５１】
中枢神経組織界面は、硬膜-皮質組織界面、皮質灰白質-髄質白質組織界面、髄膜-神経組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１５２】
泌尿生殖器組織界面は、上皮-粘膜組織界面、粘膜-筋肉組織界面、筋肉-外膜組織界面、身体-血管組織界面、身体-筋肉組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１５３】
腺組織界面は、上皮-実質組織界面を含み得る。
【０１５４】
歯組織界面は、象牙質-髄組織界面を含み得る。
【０１５５】
末梢神経組織界面は、神経上-神経周囲組織界面、神経周囲-神経外組織界面、神経外-軸索組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１５６】
出生組織界面は、羊膜-流体組織界面、上皮-上皮下組織界面、上皮-間質組織界面、緻密（compact）-線維芽細胞組織界面、線維芽細胞-中間組織界面、中間-網状組織界面、羊膜（amnio）-絨毛膜（chroion）組織界面、網状-栄養芽細胞組織界面、栄養芽細胞-子宮組織界面、栄養芽細胞-脱落膜組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１５７】
視覚組織界面は、上皮-膜組織界面、膜-間質組織界面、間質-膜組織界面、膜-内皮組織界面、内皮-流体組織界面、強膜-脈絡膜組織界面、脈絡膜-上皮性組織界面、上皮-セグメント光受容体組織界面、セグメント光受容体-膜組織界面、膜-外核層組織界面、外核層-外網状組織界面、外網状-内網状組織界面、内網状-神経節組織界面、神経節-神経線維組織界面、神経線維組織界面-膜組織界面、またはそれらの任意の組合せを含み得る。
【０１５８】
一実施態様において、CIBASは、単離された組成物である。他の実施態様において、単離された組成物は、改変されて、CIBASを提供する。
【０１５９】
生体適合性伝達剤は、組成物に加えられ得る。例えば、組成物は、生体適合性伝達剤を用いて、例えば注射用製剤、局所液体製剤、局所ゲル製剤、美容液（serum）、軟膏剤、フォーム剤、クリーム剤、ペースト剤、ローション剤または散剤を含むがこれに限定されない剤形に製剤化され得る。例示的な生体適合性伝達剤は、アルギン酸、ゼラチン、石油、コラーゲン、鉱油、ヒアルロン酸、クリスタロイド、コンドロイチン硫酸、エラスチン、アルギン酸ナトリウム、シリコン、PCL/エタノール、レシチン、ポロキサマー、1×HBSS、10×HBSS、1×PBS/DPBS、10×PBS/DPBS、10×DMEM、RPMI、生理食塩水、生理食塩水クエン酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、クエン酸、およびそれらの任意の組合せを含む。組成物は、医薬的に許容される界面活性剤（例えば、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤など）と組み合され得る。
【０１６０】
生体適合性伝達剤は、有機材料が生存（subsist）および／または存在（exist）し得る1つ以上の構成要素を含み得る。したがって、生体適合性伝達剤は、有機材料が配置および生存および／または存在し得る固体、液体、気体を含み得るがこれらに限定されない。
【０１６１】
一実施態様において、組成物は、単一の組織タイプ、例えば、脂肪、骨、脳、脊髄、軟骨、心臓、肝臓、筋肉、膵臓、皮膚または腱に由来する材料を含み得る。
【０１６２】
特定の実施態様において、組成物は、複数の異なる組織愛プ、例えば、骨と筋肉、および凝血塊／血清と骨などに由来する材料を含み得る。
【０１６３】
特定の実施態様において、組成物は、更なる処理（例えば、凍結乾燥、透析、すすぎ、熱硬化、架橋（例えば、EDC/NHS、グルタルアルデヒドまたは塩化カルシウムと）、乾燥、成形／組織化、エレクトロスピニング、またはそれらの任意の組合せ）を受け得る。別の例として、組成物は、乾燥または凍結乾燥（cryodesiccate）（すなわち、凍結乾燥（freeze-dry））され得る。乾燥および凍結乾燥、例示的な保存方法である。別の例として、組成物は、更なる治療剤（例えば、小分子）を含み得る。さらに別の例として、組成物（単離または製剤化されている）を吸収性創傷被覆材（例えば、メッシュ、ガーゼ、綿、フォーム、テープ、コラーゲン、スポンジ、マトリックス、または包帯）に加え得る。組成物はまた、ロイシンリッチリピート含有Gタンパク質共役受容体ファミリー（LGR）内で認識される配列、またはこの配列ファミリーと接触する作用物質を含み得る。
【０１６４】
別の例として、組成物（単離または製剤化されている）は、生体適合性基質に加えられ得る。例えば、3Dプリントされた骨足場は、単離された組成物に浸され得る。さらに、例えば、エレクトロスピニングされた骨足場は、組成物に浸され得る。エレクトロスピニングは、通常数百ナノメートルの直径の、ポリマー溶液または「メルト」の帯電した糸を強制的に引き伸ばすことによって繊維構造を生成するプロセスである。エレクトロスピニングされた繊維構造への生理活性構成要素の組み込みは、生理活性構成要素を含む溶液中にエレクトロスピニングされた繊維を物理的に浸すことを含み得る。
【０１６５】
本明細書に記載の組成物は、組織治癒を促進し、空隙を満たし、本質的な構造を維持し、その生物学的および機械的特性を介して別個の組織表面を橋渡しするために、足場または空隙充填剤の代替物として、または他のデバイスと組み合わせて機能し得る。したがって、本明細書に記載の組成物は、整形外科手術、神経外科手術、形成外科手術、歯科外科手術および皮膚外科手術を含むがこれらに限定されない移植手術において適用され得る。
【０１６６】
本明細書に記載の組成物は、インビトロまたはエクスビボにおける細胞または組織培養において細胞増殖をサポートするために培地として機能し得る。本明細書に記載の安定化された組成物は、インビトロまたはエクスビボにおける細胞または組織培養のための足場またはマトリックスとして有用である。細胞または組織培養のための培地または安定化された組成物として、本明細書に記載の組成物は、組織工学および再生医学の研究開発で有用である。
【０１６７】
本明細書に記載の組成物は、自家であり得る。あるいは、本明細書に記載の組成物は、同種であり得る。あるいは、本明細書に記載の組成物は、異種であり得る。
【０１６８】
一実施態様において、本明細書に記載の組成物は、ナノ粒子ヒストグラムプロファイリングによって特徴付けられる。ヒストグラムは、典型的には、エキソソームなどの天然に存在するナノ粒子を含むナノ粒子の集団の分布およびサイズ、ならびに特定の範囲にわたるナノ粒子サイズの濃度を示す。ヒストグラムは、モードなし、1つのモードまたは複数のモードで構成し得る。ヒストグラムの「ピーク」または「モード」は、典型的には、所与の特定のプロファイルで最も高い頻度（濃度）で現れる値またはデータ範囲を表す。
【０１６９】
他の実施態様において、本明細書に記載の組成物は、ラマン分光法によって特徴付けられる。ラマンスペクトルは、典型的には、ピークのラマン強度対ラマンシフトをプロットした図によって表される。ラマン分光法の「ピーク」は、「吸収帯」としても知られている。所与のラマンスペクトルの特徴的なピークは、ピークの位置およびその相対強度に従って選択され得る。
【０１７０】
当業者は、所与の組成物についてのラマンピークシフトおよび／または強度の測定は誤差の範囲内で変化することを認識する。逆波数（cm-1）で表されるピークシフトの値は、誤差範囲を許容する。典型的には、誤差範囲は、「±」により表される。例えば、約「1310±10」のラマンシフトは、約1310＋10、すなわち約1320から約1310−10、すなわち約1300までの範囲を示す。試料調製技術、装置に適用されるキャリブレーション技術、人の操作上の変動などに応じて、当業者は、ラマンシフトの適切な誤差範囲が±12；±10；±8；±5；±4、±3、±1、またはそれ未満であり得ることを認識する。
【０１７１】
ラマン分光分析のために用いられる方法および装置の更なる詳細については、実施例のセクションに記載する。
【０１７２】
一実施態様において、組成物は、約856±4 cm-1、約965±4 cm-1、約1446±4 cm-1、約1656±4 cm-1および約2900±4 cm-1におけるピークを含むラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、約856±12 cm-1、約965±12 cm-1、約1446±12 cm-1、約1656±12 cm-1および約2900±12 cm-1におけるピークを含むラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、約856±10 cm-1、約965±10 cm-1、約1446±10 cm-1、約1656±10 cm-1および約2900±10 cm-1におけるピークを含むラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、約856±8 cm-1、約965±8 cm-1、約1446±8 cm-1、約1656±8 cm-1および約2900±8 cm-1におけるピークを含むラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、約856±5 cm-1、約965±5 cm-1、約1446±5 cm-1、約1656±5 cm-1および約2900±5 cm-1におけるピークを含むラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、約856±3 cm-1、約965±3 cm-1、約1446±3 cm-1、約1656±3 cm-1および約2900±3 cm-1におけるピークを含むラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、約856±1 cm-1、約965±1 cm-1、約1446±1 cm-1、約1656±1 cm-1および約2900±1 cm-1におけるピークを含むラマンスペクトルを示す。
【０１７３】
一実施態様において、組成物は、表1A、1B、1C、1D、1E、1Fまたは1Gに示すピークを含むラマンスペクトルを有する。
【表１】
2021511936.tif 000003
【０１７４】
一実施態様において、組成物は、表2A、2B、2C、2D、2E、2Fまたは2Gに示すピークを含むラマンスペクトルを有する。
【表２】
2021511936.tif 000004
【０１７５】
一実施態様において、組成物は、表3A、3B、3C、3D、3E、3Fまたは3Gに示すピークを含むラマンスペクトルを有する。
【表３】
2021511936.tif 000005
【０１７６】
一実施態様において、組成物は、表4A、4B、4C、4D、4E、4Fまたは4Gに示すピークを含むラマンスペクトルを有する。
【表４】
2021511936.tif 000006
【０１７７】
一実施態様において、組成物は、図2、図3、図4、図5、図6、図7および図8のラマンスペクトルの1つと実質的に同様のラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、図2のラマンスペクトルの1つと実質的に同様のラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、図3のラマンスペクトルの1つと実質的に同様のラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、図4のラマンスペクトルの1つと実質的に同様のラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、図5のラマンスペクトルの1つと実質的に同様のラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、図6のラマンスペクトルの1つと実質的に同様のラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、図7のラマンスペクトルの1つと実質的に同様のラマンスペクトルを示す。一実施態様において、組成物は、図8のラマンスペクトルの1つと実質的に同様のラマンスペクトルを示す。
【０１７８】
また、本明細書に記載の組成物およびその使用のための指示書を含むキットを開示する。
【０１７９】
また、有効量の本明細書に記載の組成物を対象体に投与することを含む、それを必要とする対象体において組織再生を増大させる方法を開示する。
【０１８０】
また、有効量の本明細書に記載の組成物を対象体に投与することを含む、それを必要とする対象体において自然の組織の治癒を増大させる方法を開示する。一実施態様において、自然の組織は皮膚であり、組成物の投与は対象体において瘢痕を予防および軽減する。
【０１８１】
一実施態様において、対象体は、変性骨疾患に罹患している。一実施態様において、変性骨疾患は、骨関節症または骨粗鬆症である。一実施態様において、対象体は、骨折（bone fractureまたはbreak）を患っている。一実施態様において、骨折は、安定骨折、開放複合骨折、横骨折、斜骨折または粉砕骨折である。
【０１８２】
例示的実施態様
1. 下記工程：
組織検体の界面区画を破壊して、複数のインタラクトームの各々の少なくとも一部を活性化し、組み合わせる工程；および
破壊された界面区画から無細胞組成物を単離する工程
を含む製造方法。
2. 破壊が、生体適合性材料の存在下で生じる、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
3. 生体適合性材料が、医薬品、酵素、分子、およびそれらの組合せからなる群より選択される、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
4. 生体適合性伝達剤を組成物に加える工程をさらに含む、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
5. 組成物を保存する工程をさらに含む、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
6. 破壊された界面区画をインキュベートする工程をさらに含む、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
7. 組織検体が、哺乳類のである、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
8. 組織検体が、複数のドナーからの複数の組織検体を含む、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
9. 組織検体および生体適合性材料が、容積比で約1：1から約1：2である、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
10. 容積比が、約1：1である、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
11. 破壊が、界面区画の固有の組織化を機械的、物理的、エネルギー的、化学的および電気的に少なくとも1つ変化させることにより達成される、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
12. 保存が、組成物を乾燥または凍結乾燥することにより達成される、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
13. 界面活性剤を組成物に加える工程をさらに含む、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
14. 安定化剤を組成物に加える工程をさらに含む、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
15. 安定化剤が、コラーゲン、コンドロイチン硫酸、ヒドロキシアパタイト、クリスタロイド、有機溶液、分子、構成要素、およびそれらの組合せからなる群より選択される、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
16. 複数のインタラクトームが、細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および細胞周囲のインタラクトーム、およびそれらの組合せより選択される、先行する項のいずれかに記載の製造方法。
17. 先行する項のいずれかに記載の製造方法により製造される組成物。
18. 先行する項のいずれかに記載の製造方法により製造される組成物を投与することを含む方法。
19. 組成物が、投与時に瘢痕を予防または軽減する、先行する項のいずれかの方法。
20. 三胚葉性組織界面に由来する、細胞内、細胞間、細胞外、経細胞および細胞周囲のインタラクトームおよびそれらの組合せより選択される、刺激された無細胞材料を含む組成物。
【実施例】
【０１８３】
実施例1
システム、材料、基質および／または組織から、複合外皮組織の形態を収集、抽出、切除、除去、生検、パンチ、解離、消化、切断、引抜、単離、分割または分離する。このような作用は、機械的、化学的、酵素的、電気的、生物学的および／または物理的メカニズムによって生じ得る。
【０１８４】
複合外皮組織を溶液A［等張の生体適合性溶液（例えば、0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸リンゲル液、水中の5%デキストロース、3.2％クエン酸ナトリウム）+/-抗菌薬］中に5分間入れ、静かに撹拌するか、揺り動かすか、振とうするかまたは撹拌する。
【０１８５】
複合外皮組織を溶液B［等張の生体適合性溶液（例えば、0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸リンゲル液、水中の5%デキストロース、3.2％クエン酸ナトリウム）］中に5分間入れ、静かに撹拌するか、揺り動かすか、振とうするかまたは撹拌する。
【０１８６】
複合外皮組織を溶液A中に5分間入れ、静かに撹拌するか、揺り動かすか、振とうするかまたは撹拌する。
【０１８７】
複合外皮組織を溶液B中に5分間入れ、静かに撹拌するか、揺り動かすか、振とうするかまたは撹拌する。
【０１８８】
複合外皮組織を溶液Bから取り出し、溶液C［等張の生体適合性溶液（例えば、0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸リンゲル液、水中の5%デキストロース、3.2％クエン酸ナトリウム）］に入れ、界面に配置する。装置および／またはサポートシステムを用いて、界面に配置し得る。
【０１８９】
完全な界面が存在しない場合、界面の亜区画またはサブセットが存在するかまたは存在すると可能性が高いエリアに配置する。
【０１９０】
界面区画を収集、抽出、切除、除去、生検、パンチ、解離、消化、切断、引抜、単離、分割または分離する。
【０１９１】
無細胞組成物を
a. 撹拌、圧力、剪断および／または他の形態の非物質化によって、界面を機械的、物理的および／またはエネルギー的に変化させること；
b. イオン材料を化学的および／または電気的に変化させること；または
c. 界面をエネルギー的に破壊すること；そして無細胞組成物を単離すること
により得る。
【０１９２】
実施例2
システム、材料、基質および／または組織から、複合外皮組織の形態を収集、抽出、切除、除去、生検、パンチ、解離、消化、切断、引抜、単離、分割または分離する。このような作用は、機械的、化学的、酵素的、電気的、生物学的および／または物理的メカニズムによって生じ得る。
【０１９３】
複合外皮組織を溶液A［等張の生体適合性溶液（例えば、0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸リンゲル液、水中の5%デキストロース、3.2％クエン酸ナトリウム）+/-抗菌薬］中に5分間入れ、静かに撹拌するか、揺り動かすか、振とうするかまたは撹拌する。
【０１９４】
複合外皮組織を溶液B［等張の生体適合性溶液（例えば、0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸リンゲル液、水中の5%デキストロース、3.2％クエン酸ナトリウム）］中に5分間入れ、静かに撹拌するか、揺り動かすか、振とうするかまたは撹拌する。
【０１９５】
複合外皮組織を溶液A中に5分間入れ、静かに撹拌するか、揺り動かすか、振とうするかまたは撹拌する。
【０１９６】
複合外皮組織を溶液B中に5分間入れ、静かに撹拌するか、揺り動かすか、振とうするかまたは撹拌する。
【０１９７】
複合外皮組織を溶液Bから取り出し、溶液C［等張の生体適合性溶液（例えば、0.9％NaCl、HBSS、PBS、DMEM、RPMI、乳酸リンゲル液、水中の5%デキストロース、3.2％クエン酸ナトリウム）］に入れ、界面に配置する。装置および／またはサポートシステムを用いて、界面を探し得る。
【０１９８】
完全な界面が存在しない場合、界面の亜区画またはサブセットが存在するかまたは存在すると可能性が高いエリアを探す。
【０１９９】
界面区画を収集、抽出、切除、除去、生検、パンチ、解離、消化、切断、引抜、単離、分割または分離する。
【０２００】
無細胞組成物を
d. 撹拌、圧力、剪断および／または他の形態の非物質化によって、界面を機械的、物理的および／またはエネルギー的に変化させること；
e. イオン材料を化学的および／または電気的に変化させること；または
f. 界面をエネルギー的に破壊すること；そして無細胞組成物を単離すること
により得る。
【０２０１】
組成物を製剤化する。
【０２０２】
貯蔵、輸送、保存、使用、配備または変更のために、生体適合性ベクターに製剤化された組成物を加える。あるいは、材料はまた、材料が存続および／または増殖することを可能にする、生存しているシステム、部分的に生存しているシステムおよび／または合成支持システムに直接配置され得る。
【０２０３】
材料は、このようなシステムおよび／または環境内における一次材料の機能、外観、構造、構成、挙動および／または存在を変更するように、他の材料に直接および／または間接的に、素材は、変化、変更、制御、操作、調整、修正、変形、変換、変異、再構築、進化、適応、統合および／または差し引きされ得る。
【０２０４】
固体、半固体、液体、半液体、粒子、線維、足場、マトリックス、分子、基質、材料、細胞実体、組織実体、デバイス、生物学的、治療的、高分子、化学的、薬剤、生物体、媒体および／または合成物質のうちの1つまたはそれらの組合せを包含し得る媒介物を利用することにより、一次生成物として機能するために、必要に応じて、標的の環境および／またはシステム内に製剤化された組成物を配置する。
【０２０５】
実施例3：皮膚由来の組成物の製造
皮膚組織検体を、12週齢のルイスラットの背部から取り除き、冷やしたHBSS中で保存し、続いて滅菌検体カップにおいてHBSSおよび0.1 mg/mLゲンタマイシンの溶液中で5分間すすいだ。
【０２０６】
層流フードにおいて、組織を検体容器から個々に取り除き、ペトリ皿に入れた。その後、組織検体と同容量のHBSS＋ディスパーゼ5U/μLを各ペトリ皿に加えた。
【０２０７】
その後、検体を揺動器（rocker）に37℃＋5％CO2にて6時間置いた。その後、材料を50ccコニカルチューブに入れた。さらに同容量の停止剤を検体に加えた。
【０２０８】
等量のRPMIを材料に加え、揺動器に4℃にて一晩置いた。
【０２０９】
揺り動かした後、混合物を10,000 rpmにて10分間遠心分離に供し、上清および残りの組織破片のペレットを得た。層流フードにおいて、各皮膚組織検体から上清を取り除き、40μmフィルターでろ過した。
【０２１０】
800 mLの蒸留水＋10×［8 gのNaCl、400 mgのKCl、140 mgのCaCl2、100 mgのMgSO4-7H2O、100 mgのMgCl2-6H2O、60 mgのNa2HPO4、60 mgのKH2PO4、1 gのグルコースおよび350 mgのNaHCO3］を含有する塩基から作った、1：1のストック溶液にろ液を加えた。その後、合わせた溶液を遠心管に入れ、4℃にて保存した。
【０２１１】
半固体材料（遠心分離後の上部から単離した）を管から取り除き、凍結乾燥のための型に入れた。使用前に、型にシリコン剥離スプレーを噴霧した。凍結乾燥機の設定には、500〜600 mTorrの真空度、1.7℃/分の勾配率、-29℃にて2時間の凍結、-18℃にて40時間の一次乾燥および29℃にて1時間の二次乾燥が含まれた。
【０２１２】
実施例4：ラマン分光法の実験条件
10倍の対物レンズ（N.A. 0.25）および785 nmのレーザー波長（サンプリングポイントで28 mWのパワー）を有する共焦点ラマン顕微鏡（Thermo Fisher Raman DXR）を用いて、スペクトルを収集した。試料上の推定スポットサイズは2.1μmであり、分解能は2.3〜4.3 cm-1であった。用いた共焦点開口部は25μmのスリットであり、波数500〜3500 cm-1の間のスペクトルを収集した。ラマンスペクトルを、深い空乏の電荷結合素子（CCD）検出器で記録した。記録されたラマンスペクトルをデジタル化し、OMNICソフトウェアを用いてパソコンに表示した。表面全体の4つの異なるポイントから合計3〜4のスペクトルを収集した。ラマン分光分析を、分散ラマン用のOMNICソフトウェアを用いて実施した。OMNIC（Thermo Scientic）ソフトウェアで利用可能な独自の機能を使用し、多項式ベースラインフィッティング（6次）を用いてすべてのスペクトルからバックグラウンド蛍光を除き、スペクトルを正規化した。特定の標本の異なる場所から収集されたスペクトルを平均化して、個々の検体を表した。スペクトルデータは、300のS/N比で2秒間の露出を用いて収集し、検体が均質であり、収集したスペクトルがバルク材料を表すことを確実にした。本明細書に記載の異なる組成物についての代表的なラマンシフト分光法データは、以下で見つけることができる。
【０２１３】
実施例5：軟骨由来の材料から製造した組成物の特性評価
軟骨由来の材料から本明細書に記載のように製造した組成物をラマン分光法により特性評価した。図2は、溶液組成物の平均ラマンスペクトルおよび凍結乾燥組成物の平均ラマンスペクトルを示す。
【０２１４】
実施例6：骨由来の材料から製造した組成物の特性評価
骨由来の材料から本明細書に記載のように製造した組成物をラマン分光法により特性評価した。図3は、組成物の平均ラマンスペクトル：溶液状材料の平均ラマンスペクトル（上）、凍結乾燥した材料の平均ラマンスペクトル（中央）およびゲル状材料（下）の平均ラマンスペクトルを示す。
【０２１５】
実施例7：筋骨格由来の材料から製造した組成物の特性評価
筋骨格由来の材料から本明細書に記載のように製造した組成物をラマン分光法により特性評価した。図4は、組成物：溶液組成物（上）、凍結乾燥組成物（中央）およびゲル組成物（下）の平均ラマンスペクトルを示す。
【０２１６】
実施例8：海綿骨由来の材料から製造した組成物の特性評価
海綿骨由来の材料から本明細書に記載のように製造した組成物をラマン分光法により特性評価した。図5は、ゲル組成物の平均ラマンスペクトルを示す。
【０２１７】
実施例9：筋由来の材料から製造した組成物の特性評価
筋由来の材料から本明細書に記載のように製造した組成物をラマン分光法により特性評価した。図6は、溶液組成物（上）、凍結乾燥組成物（中央）およびゲル組成物（下）の平均ラマンスペクトルを示す。
【０２１８】
実施例10：腱から製造した組成物の特性評価
腱由来の材料から本明細書に記載のように製造した組成物をラマン分光法により特性評価した。図7は、ゲル組成物の平均ラマンスペクトルを示す。
【０２１９】
実施例11：骨梁由来の材料から製造した組成物の特性評価
骨梁由来の材料から本明細書に記載のように製造した組成物をラマン分光法により特性評価した。図8は、ゲル組成物（上）、凍結乾燥組成物（中央）および溶液組成物（下）の平均ラマンスペクトルを示す。
【０２２０】
実施例12：レオロジー実験条件
図9において、直径35mmのプレートジオメトリとThermo Scientificのペルチェプレート温度制御システムを備えたHAAKE Modular Advanced Rheological Systemを用いて、ゲルのレオロジー特性を決定した。粘度試験は、1〜1000 1/秒の剪断速度ステップ試験で構成され、対数的に16ステップを分布させた。図9において、ゲルを4℃から取り出し、室温（20℃）および水浴（37℃）に置いた。4日後、レオロジー試験を実施した。4℃の試料を、4℃の冷蔵庫から取り出した直後に試験した。
【０２２１】
図10において、ゲルを4℃から取り出し、室温（20℃）および水浴（37℃）に置いた。4日後、レオロジー試験を実施した。4℃の試料を、4℃の冷蔵庫から取り出した直後に試験した。
【０２２２】
図11において、ゲルを4℃から取り出し、室温にて（20℃）1時間置いた。室温で温めた後、2つの試料をレオメーターで試験した。第1の試料は、初期pHが6.5であった。第2の試料は、1M NaOHを用いてpH7.5に調整した。レオロジー試験は、1〜1000 1/秒の剪断速度ステップで構成され、対数的に16ステップを分布させた。
【０２２３】
実施例13：SEM（走査型透過電子顕微鏡）およびInstronの万能試験機（UTM）を用いた組成物の特性評価
足場の内部構造および微細構造を、走査型電子顕微鏡（SEM）により試験し、電子後方散乱検出器を備えたEVO 10 LS Environmental Scanning Electron Microscope（Carl Zeiss Microscopy LLC, NY）を用いた。破砕が生じるまで0.5 mm/分の一定のクロスヘッド速度で1 kNの負荷能力を持つ電子型UTM（Instron, MA, USA）を用いて、足場について圧縮試験をした。圧縮荷重および変位を、試験中に0.1秒間隔で記録した。平均弾性率を決定するために、各タイプの足場について5つの試料を試験した。
【０２２４】
実施例14：凍結乾燥ゲルおよび溶液組成物の製造
長骨（ウサギ）、周囲の筋肉を伴う長骨（ウサギおよびマウス）および筋肉（ウサギおよびマウス）の各々について、凍結乾燥組成物、ゲル組成物および溶液組成物を製造した。各製造の材料および方法を以下に記載する。
【０２２５】
方法：
組織を第1洗浄、第1すすぎ、第2洗浄、第2すすぎの順番で清浄化にした。洗浄は、0.01％（w/v）ゲンタマイシンを含む生理食塩水中での5分間の撹拌から構成された。すすぎは、生理食塩水中での5分間の撹拌から構成された。清浄化後、組織を、組織界面を破壊することにより処理して、生存しているコアの強力な細胞実体が一連のLGR4、LGR5および／またはLGR6を発現する生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体の集合体を含む刺激された組成物を作製した。処理した組織を、10×HBSS対組織の容量比が1：1で、50 mLコニカルチューブに入れた。組織およびHBSSを4℃にて36〜48時間揺り動かし、その後5000 rpmにて15分間遠心分離した。上清を取り除き、40μmメッシュを通してろ過し、凍結乾燥のための型に入れた。使用前に、型にシリコン剥離スプレーを噴霧した。凍結乾燥機の設定には、500〜600 mTorrの真空度、1.7℃/分の勾配率、-29℃にて2時間の凍結、-18℃にて40時間の一次乾燥および29℃にて1時間の二次乾燥が含まれた。
【０２２６】
透析：
1. 組成物を#40サイズのメッシュを通してろ過する。
2. 透析チューブ（Spectra/Por Dialysis Membrane MWCO: 100-500 D, Spectrum Labs 131057）に組成物を負荷する。
3. 負荷された透析チューブを、振とう機上の冷蔵庫内の所望の浸透圧の適切なバッファに1：100の試料対バッファの容量で入れる。例えば：
a. 5×HBSSで2〜3時間、続いて1×HBSSで4〜5時間、続いて1×HBSSで一晩
4. 試料を透析チューブから取り除き、コニカルチューブに収集し、1200 gおよび4℃にて20分間遠心分離する。
6. 上清を溶液から取り除き、工程2.bと同容量を得る。
【０２２７】
すすぎ：
すすぎを以下の手順に従って実施した：
1. 組成物を#40サイズのメッシュ（Cell dissociation sieve, Sigma CD1-1KT）を通してろ過する。
2. 組成物を所望の型に負荷する。
3. 試料を凍結乾燥する（24時間プロファイル、Labconco凍結乾燥機）
4. 試料を型から取り出す。
5. 以下の詳細を用いて生理食塩水中で試料をすすぐ。
a. 各すすぎは、5 mgの試料ごとに1 mLの生理食塩水からなる。
b. すすぎ1回当たり10分間、合計5回のすすぎ（各すすぎで新しい生理食塩水に置き換える）。
【０２２８】
実施例15：圧縮率
実施例14で製造した凍結乾燥組成物を、破壊点に到達するまで1 mm/分の一定クロスヘッド速度にて1 kNの負荷荷重を有する電子型UTM（万能試験機）（Instron, MA, USA）を用いて、圧縮（率）強度について試験した。N=2の試料を各タイプについて試験した。荷重および変位値を、試験中に0.1秒間隔で記録した。図20は、ウサギの筋肉および骨の凍結乾燥組成物の圧縮率を示す。
【０２２９】
実施例16：タンパク質分析
MILLIPLEX（登録商標）MAP Mouse Angiogenesis/Growth Factor Magnetic Bead Panelを、実施例14で製造した筋肉および骨の組成物のタンパク質アッセイとして用いた。特に、24プレックス（血清/血漿用）キットであるMAGPMAG-24Kを、以下の分析対象物の同時定量に用いた：アンギオポエチン-2、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、sFasL、sAlk-1、アンフィレグリン、レプチン、IL-1b、ベータセルリン、EGF、IL-6、エンドグリン、エンドセリン-1、FGF-2、フォリスタチン、HGF、PECAM-1、IL-17a、PLGF-2、KC、単球走化性タンパク質-1（MCP-1）、プロラクチン、MIP-1a、間質細胞由来因子（SDF-1）、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-Aおよび腫瘍壊死因子（TNF）。図21〜25は、タンパク質アッセイの結果を示す。
【０２３０】
実施例17：バイオマーカー分析
MILLIPLEX（登録商標）MAP Mouse Bone Magnetic Bead Panel - Bone Metabolism Multiplex Assayを実施例14で製造した筋肉および骨の組成物の特性評価に用いた。Milliplex（登録商標）MAP Mouse Bone Magnetic Bead Panelは、任意の組合せで下記を測定するのに必要なすべての要素を含む：ACTH（副腎皮質刺激ホルモン）、DKK-1（Dickkopf WNTシグナル伝達経路阻害剤1）、IL-6、インスリン、レプチン、TNFα、OPG（オステオポテグリン）、SOSTおよびFGF-23。図26〜28は、このアッセイの結果を示す。図35および36はまた、それぞれ肝臓由来の組成物および軟骨由来の組成物についてのこのアッセイ結果を示す。
【０２３１】
実施例18：ラマン分光比較分析
方法：
組織を第1洗浄、第1すすぎ、第2洗浄、第2すすぎの順番で清浄化した。洗浄は、0.01％（w/v）ゲンタマイシンを含む生理食塩水中での5分間の撹拌から構成された。すすぎは、生理食塩水中での5分間の撹拌から構成された。清浄化後、組織を、組織界面を破壊することにより処理して、生存しているコアの強力な細胞実体が一連のLGR4、LGR5および／またはLGR6を発現する生存しているコアの強力な細胞実体および支持実体の集合体を含む刺激された組成物を作成した。処理した組織を、生理食塩水対組織の容量比が1：1で、50 mLコニカルチューブに入れた。組織および生理食塩水を4℃にて36〜48時間揺り動かし、その後5000 rpmにて15分間遠心分離した。上清を取り除き、100μmメッシュを通してろ過し、分析のために-20℃にて保存した。ラマン分光分析を実施例4に従って実施し、組成物を自然の組織検体と比較した。
【０２３２】
結果：
図29〜33は、ラマン分光比較分析の結果、組成物の分子フィンガープリントと当該組成物が由来する代表的な自然の組織検体との間の対応する差異を示す。図29は、ウサギの筋肉由来の組成物（下）のラマンスペクトルを示し、自然のウサギの筋肉（上）のものと比較した分子フィンガープリントの変化を示す。図30は、ウサギの脂肪由来の組成物（下）のラマンスペクトルを示し、自然のウサギの脂肪（上）のものと比較した分子フィンガープリントの変化を示す。図31は、ウサギの軟骨由来の組成物（下）のラマンスペクトルを示し、自然のウサギの軟骨（上）のものと比較した分子フィンガープリントの変化を示す。図32は、ウサギの骨由来の組成物（下）のラマンスペクトルを示し、自然のウサギの骨（上）のものと比較した分子フィンガープリントの変化を示す。図33は、ヒトの皮膚由来の組成物（下）のラマンスペクトルを示し、自然のヒトの皮膚（上）のものと比較した分子フィンガープリントの変化を示す。
【０２３３】
実施例19：筋肉由来の組成物の製造
鋭的剥離を用いてウサギ大腿筋肉を採取する。組織を脱イオン水で3サイクルすすぎ、続いて等張液（例えば0.9％NaCl）ですすぐ。組織を分離し、10 gの組織を50 ccコニカルチューブ（コニカルA）へ入れ、40 mLのコラゲナーゼ/トリプシン溶液（50 mlのDMEM/F12中、0.2％トリプシン、0.2％コラゲナーゼIV型、50μg/mlゲンタマイシン）と合わせることにより、細胞および非細胞界面を破壊する。組み合わせたものを30分間37℃にて静かに撹拌する。同等の容量の停止剤と合わせる。溶液を1000 RPMにて10分間遠心分離し、上清を50ccコニカルに移す（コニカルB）。コニカルAの内容物を、40μLのDNase（2 U/μL）を含む10 mL DMEM/F12中に再懸濁させ、時々撹拌しながら室温にて5分間インキュベートする。1000 RPMにて5分間遠心分離し、上清をコニカルBに移す。10 mL DMEM/F12を含むコニカルAの内容物をすすぎ、室温にて120分間撹拌する。100 RPMにて2分間遠心分離する。複合外皮組織および上清をコニカルBに移す。20 mLの0.9％NaClをコニカルAに加え、細胞間の区画を将来合わせるおよび／またはさらに分離するために4℃にてインキュベートする。コニカルAの内容物の添加までコニカルBを4℃にてインキュベートする。その後、コニカルBを室温にて120分間インキュベートし、続いて揺動器において4℃にて一晩インキュベートする。得られた組成物は、4.8〜8.5の範囲内のpHおよび199および800 mOsm/Kgの浸透圧を有するべきである。半固体および上清を、所望の表面積および高さのシリコン剥離スプレーでコーティングされた開放面の容器に移し、所望の厚さまで満たす。生成物を、500〜600 mTorrの真空度、1.0℃/分の勾配率、-35℃にて3時間の凍結、-20℃にて45時間の一次乾燥および29℃にて1時間の二次乾燥を含む凍結乾燥条件を用いて凍結乾燥することで、保存または固化することができる。得られた組成物を、保存してもよく、または必要に応じて、0.9％NaCl、HBSS、DMEM/F12またはRPMIなどの生体適合性化合物と組み合わせて、適用に必要な物理的特性および粘度をもたらすことができる。
【０２３４】
実施例20：筋肉/骨由来の組成物の製造
鋭的剥離を用いて、関連する骨組織のセグメントを含むウサギの大腿筋肉をまとめて採取し、適切なサイズの容器に移す。組織を脱イオン水に5分間浸す。溶液をデカントし、処理を合計3サイクル繰り返す。組織を、0.01％（w/v）ゲンタマイシンを含む等張液に5分間浸す。その後、組織を、0.5：1から1：10（v/v）の比で1×〜10×（すなわち1×〜10×NaCl）の濃度範囲を有する生体適合性溶液を合わせ、機械的に分離し、5 mm3〜1 cm3のサイズの微粒子を得る。10 mM〜0.5Mの濃度までEDTAを加え、揺動器において4℃にて一晩インキュベートする。得られた組成物を1000 RPMにて15分間遠心分離し、残りの組織を溶液から取り除いた。残りの破壊された細胞界面を、10×HBSSと1：1容量で合わせ、揺動器において室温にて2時間インキュベートし、その後4℃にて一晩保存する。溶液を100 RPMにて5分間遠心分離する。複合外皮組織および上清を、所望のサイズおよび表面積の開放面のシリコン即座剥離（silicone ready release）コーティングされた容器に移す。組成物を37℃にて48時間熱乾燥する。乾燥後、試料を、保存のために-20℃にて凍結してもよく、または0.9％NaClと穏やかに合わせ、4℃にて2時間インキュベートし、100 RPMにて5分間遠心分離し、上清を捨ててもよい。
【０２３５】
実施例21：脂肪由来の組成物の製造
褐色ウサギの皮下、内臓および／または脂肪組織を採取し、50 ccコニカルチューブに入れ、0.01％（w/v）ゲンタマイシンを含む等張液に4℃にて10分間浸す。その後、組織を50 ccコニカルチューブに移し、等張液（例えば1×HBSS、0.9％NaClまたは1×DMEM）と合わせ、4℃にて5分間激しく振とうする。組成物を500 RPMにて2分間遠心分離し、上清を捨て、サイクルをさらに2回繰り返す。組成物を10×DMEMと1：1（v/v）で合わせ、揺動器において室温にて2時間インキュベートする。組成物を50ccコニカルチューブに移し、100μmフィルターに3回通し、900gにて15分間遠心分離する。油状分離物を取り除き、残りの分離した界面および上層を50 ccコニカルに移し、4℃にて一晩インキュベートする。更なる不動態油状分離物を取り除く。組成物の一貫性を、塩化カルシウムまたはグルタルアルデヒドを含む更なる処理剤との架橋によりさらに強化することができる。
【０２３６】
実施例22：脂肪由来の組成物の製造
褐色ウサギの皮下、内臓および／または脂肪組織を採取し、50 ccコニカルチューブに入れ、0.01％（w/v）ゲンタマイシンを含む等張液に4℃にて10分間浸す。その後、組織を50 ccコニカルチューブに移し、等張液（例えば 1×HBSS、0.9％NaClまたは1×DMEM）と合わせ、4℃にて5分間激しく振とうする。組成物を500 RPMにて2分間遠心分離し、上清を捨て、サイクルをさらに2回繰り返す。組成物を、DMEMおよび0.1％コラゲナーゼと37℃にて1時間合わせ、続いてディスパーゼ5 U/μLと37℃にて2時間合わせる。組成物を同等の容量の停止剤と合わせる。組織を2000 RPMにて10分間遠心分離する。油/脂肪層を取り除き、残りの細胞が接触し分離された材料を、0.5：1（v/v）で10×HBSSと揺動器において室温にて2時間合わせる。組織を600 VPMにてボルテックスし、1：1（v/v）で5×HBSSと合わせ、4℃にて2時間揺り動かす。組織を600 VPMにてボルテックスし、1：1（v/v）で1×HBSSと合わせ、4℃にて一晩揺り動かす。複合外皮組織および上清を、所望のサイズおよび表面積の開放面のシリコン即座剥離（silicone ready release）コーティングされた容器に移す。組成物を25℃にて4時間熱乾燥し、続いて37℃にて40時間硬化させる。乾燥後、試料を、保存のために-20℃にて凍結してもよく、または0.9％NaClと穏やかに合わせ、4℃にて2時間インキュベートし、100 RPMにて5分間遠心分離し、上清を捨ててもよい。
【０２３７】
実施例23：細胞生存率実験
ヒト骨肉腫細胞（MG-63）単独（コントロール）、または様々な骨組織由来の組成物または市販のヒト由来の脱灰骨マトリックス（DBM）との共培養を、Alamar blueアッセイを用いて生存率/増殖について評価した。図34に示すように、組織由来の組成物と共培養した細胞は、コントロール細胞と比較して生存率の増加を示した、これは、本明細書に記載の組成物が、細胞の増殖および生存率を増加させたことを示している。したがって、図34は、本明細書に記載の組成物が刺激された生体材料を含み、自然の組織の生成または治癒を増大させることを示す。
【０２３８】
方法：
細胞調製：
1. MG-63細胞（継代数P+5）を完全DMEM（10％FBS、50μg/mlゲンタマイシン）培地中で解凍し、コンフルエントになるまで（約1週間）75cm2フラスコにおいてプレート化した。細胞をトリプシン処理し、4つの新しい75 cm2フラスコに移し、コンフルエントまで増殖させ、その後再度トリプシン処理し、20個の新しいフラスコに移した。コンフルエントなフラスコをトリプシン処理し、18 mlの凍結培地（90％ウシ胎児血清、10％DMSO）に再懸濁させ、Nalgene Cryo1 C Freeing Container（Cat# 5100-001）において-80℃にて凍結した。細胞バイアルラベルは次のとおりである：
MG-63 細胞株（ヒト骨肉腫）
Sigma Cat# 86051601；Lot# 14K002
継代数8
2. 残りの細胞を3つのフラスコに入れ、約90％コンフルエントまで生存率実験のために増殖させた。
3. 足場プラグを48ウェルプレートに入れ、500μlの完全DMEMで1時間再水和した（注：カラム6を500μlの培地のみで満たし、足場なしのコントロールとした）。
4. MG-63細胞をトリプシン処理し、培地に再懸濁させた。1ウェル（125μl容量）当たり合計0.5×105細胞を列D〜Fの各ウェルに加えた。更なる125μlの完全DMEMを列Cのウェルに加えて、無細胞コントロールとした。細胞を37℃、5％CO2にて一晩インキュベートした。
【０２３９】
分光光度測定によるalamarBlueを用いた細胞毒性または増殖の測定：
1. 対数増殖期にある細胞を採取し、細胞数を決定した。細胞数を1×104細胞/mlに調整した。
2. 細胞をプレート化し、試験する試薬と合わせた。
3. 続いて振とうによる混合を行い、その後alamarBlueをウェルの容量の10％と等しい量で無菌的に加えた。
4. 培養物をalamarBlueと4〜8時間インキュベートした。N.B.
5. 細胞毒性または増殖を、蛍光の分光光度測定を用いて測定した。
6. インキュベート後、吸光度を570 nmおよび600 nmの波長にて測定した。ブランクの培地のみ用いた。
7. 細胞毒性および増殖アッセイにおける処理細胞とコントロール細胞間の減少のパーセント差を
処理細胞とコントロール細胞間のパーセント差＝［(O2×A1)−(O1×A2)／(O2×P1)−(O1×P2)］×100
により計算した。
【０２４０】
前述の詳細な説明から、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および組成物に改変および変更がなされ得ることは明らかであろう。説明した実施態様は、すべての点で、限定的ではなく、例示的なものとしてのみ見なされるべきである。したがって、本発明の範囲は、前述の説明ではなく、特許請求の範囲によって示される。請求項の意味および同等性の範囲内にあるすべての変更は、それらの範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【国際調査報告】
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