(57)【要約】  本明細書では、α−１，３−グリコシド結合を有する不溶性αグルカンのアグリゲートを含む組成物が開示される。これらのアグリゲートは、約５０ｎｍ〜約３００ｎｍの平均流体力学的半径及び約１．６〜約２．４のフラクタル次元を有する。いくつかの開示される態様における不溶性α−グルカンのアグリゲートは、樹枝状である。これらの組成物を調製する方法が更に開示される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
不溶性α−グルカンのアグリゲートを含む組成物であって、前記アグリゲートは、約５０〜３００ｎｍの平均流体力学的半径及び約１．６〜２．４のフラクタル次元を有し、及び前記不溶性α−グルカンは、α−１，３−グリコシド結合を含む、組成物。
【請求項２】
前記アグリゲートは、樹枝状である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記アグリゲートは、約５０〜１５０ｎｍの平均流体力学的半径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記アグリゲートは、約６０〜１２０ｎｍの平均流体力学的半径を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記アグリゲートは、約１．９〜２．１のフラクタル次元を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
前記アグリゲートは、約５〜２５ｎｍの平均サイズを有する前記不溶性α−グルカンの粒子を含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項７】
前記不溶性α−グルカンの個々の分子は、それぞれ少なくとも約６００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記アグリゲートのアグロメレートを含み、前記アグロメレートは、約１〜２００ミクロンの平均サイズを有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項９】
前記アグロメレートは、約１〜１１０ミクロンの平均サイズを有する、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
前記不溶性α−グルカンは、少なくとも５０％のα−１，３−グリコシド結合を有する、請求項１に記載の組成物。
【請求項１１】
前記不溶性α−グルカンは、少なくとも９０％のα−１，３−グリコシド結合を有する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
家庭用品、パーソナルケア製品、医薬製品、工業製品又は食品の形態である、請求項１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１に記載の不溶性α−グルカンのアグリゲートを生成する方法であって、
（ａ）少なくとも水、スクロース及び少なくとも約４０％の収率で不溶性α−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させることと；
（ｂ）工程（ａ）で生成された前記不溶性α−グルカンの分散液を調製することと
を含む方法。
【請求項１４】
工程（ｂ）は、工程（ａ）で生成された前記不溶性α−グルカンのウェットケーキを調製することと、前記ウェットケーキを水又は水溶液中に分散させることとを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１３に記載の方法に従って生成された不溶性α−グルカンのアグリゲートを含む組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、参照により本明細書に全体として組み込まれる米国仮特許出願第６２／５８４，１５０号明細書（２０１７年１１月１０日出願）の利益を主張するものである。
【０００２】
本開示は、多糖材料の分野に属する。例えば、本開示は、特有形態を有する不溶性α−グルカンのアグリゲートを含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
電子的に提出された配列表の参照
配列表の正式な写しは、約３１５キロバイトのサイズを有して本明細書と同時に提出される、２０１８年１１月６日に作成された２０１８１１０６＿ＣＬ６６１７ＷＯＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔのファイル名を有するＡＳＣＩＩフォーマットの配列表としてＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出される。このＡＳＣＩＩフォーマット文献に含まれる配列表は、本明細書の一部であり、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００４】
多糖類を様々な用途に使用することが望まれているため、研究者らは、生分解性であり、且つ再生可能に供給される原料から経済的に製造することができる多糖類を探求してきた。このような多糖類の１つは、α−１，３−グルカン、すなわちα−１，３−グリコシド結合を有することを特徴とする不溶性グルカンポリマーである。このポリマーは、例えば、ストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）から単離されたグルコシルトランスフェラーゼ酵素を使用して調製されている（非特許文献１）。また、例えば、特許文献１は、酵素的に生成されたα−１，３−グルカンから紡糸繊維を調製することを開示している。様々な他のグルカン材料も、新規又は改良された用途を開発するために研究されてきた。例えば、特許文献２は、混合されたα−１，３及びα−１，６結合を有するいくつかの不溶性グルカンの酵素的合成を開示している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第７００００００号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２０１５／０２３２８１９号明細書
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｓｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １４１：１４５１−１４６０，１９９５
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
この研究にも関わらず、不溶性α−グルカンの新たな形態は、様々な用途でこの材料の経済的価値及び性能特性を向上させるために所望されている。このニーズに対処するために、ここで、特有の形態的特徴を有する不溶性α−グルカンアグリゲートを含む組成物が開示される。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
一実施形態では、本開示は、不溶性α−グルカンのアグリゲートを含む組成物であって、アグリゲートは、約５０〜３００ｎｍの平均流体力学的半径及び約１．６〜２．４のフラクタル次元を有し、及び不溶性α−グルカンは、α−１，３−グリコシド結合を含む、組成物に関する。
【０００９】
別の実施形態では、本開示は、本明細書の不溶性α−グルカンのアグリゲートを生成する方法であって、（ａ）少なくとも水、スクロース及び少なくとも約４０％の収率で不溶性α−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させることと；（ｂ）工程（ａ）で生成された不溶性α−グルカンの分散液を調製することとを含む方法に関する。本開示は、本方法に従って生成された不溶性α−グルカンのアグリゲートを含む組成物にも関する。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】一次球状粒子の拡散によって形成されるアグリゲートのコンピュータシミュレーションからの典型的な樹枝状構造である。各構造のフラクタル次元が提供される。このような構造は、いくつかの態様では、少なくとも部分的に一次棒状粒子のアグリゲートから形成されると考えられる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
【表１】
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【００１２】
【表２】
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【００１３】
【表３】
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【００１４】
引用する全ての特許文献及び非特許文献の開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１５】
特に開示しない限り、本明細書で用いられるような用語「１つの（ａ）」及び「１つの（ａｎ）」は、１つ以上（すなわち少なくとも１つ）の言及される特徴を包含することを意図する。
【００１６】
存在する場合、特に記載しない限り、全ての範囲は、包括的であり、結合可能である。例えば、「１〜５」（すなわち１〜５）の範囲が挙げられる場合、挙げられた範囲は、範囲「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２及び４〜５」、「１〜３及び５」などを含むものと解釈されるべきである。
【００１７】
用語「α−グルカン」、「α−グルカンポリマー」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。α−グルカンは、α−グリコシド結合によって互いに連結されるグルコースモノマー単位を含むポリマーである。典型的な実施形態では、本明細書のα−グルカンは、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のα−グリコシド結合を含む。本明細書のα−グルカンポリマーの例としては、α−１，３−グルカンが挙げられる。
【００１８】
用語「ポリα−１，３−グルカン」、「α−１，３−グルカン」、「α−１，３−グルカンポリマー」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。α−１，３−グルカンは、グリコシド結合により互いに連結されるグルコースモノマー単位を含むポリマーであり、少なくとも約３０％のグリコシド結合がα−１，３である。特定の実施形態では、α−１，３−グルカンは、少なくとも約９０％又は９５％のα−１，３グリコシド結合を含む。本発明のα−１，３−グルカンにおける他の結合の大部分又は全ては、典型的には、α−１，６であるが、いくつかの結合は、α−１，２及び／又はα−１，４であり得る。
【００１９】
用語「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｌｉｎｋａｇｅ）」、「グリコシド結合（ｇｌｙｃｏｓｉｄｉｃ  ｂｏｎｄ）」、「結合」などは、本明細書では同じ意味で用いられ、炭水化物（糖）分子を別の炭水化物などの別の基に連結する共有結合を指す。本明細書で使用される、用語「α−１，３−グリコシド結合」は、隣接したα−Ｄ−グルコース環上の炭素１及び３を介してα−Ｄ−グルコース分子を互いに連結する共有結合のタイプを指す。本明細書で使用される、用語「α−１，６−グリコシド結合」は、隣接したα−Ｄ−グルコース環上の炭素１及び６を介してα−Ｄ−グルコース分子を互いに連結する共有結合を指す。本明細書におけるグルカンポリマーのグリコシド結合は、「グリコシド結合」とも呼ぶことができる。本明細書では、「α−Ｄ−グルコース」を「グルコース」と呼ぶ。
【００２０】
本明細書のα−グルカンのグリコシド結合プロファイルは、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して決定することができる。例えば、結合プロファイルは、核磁気共鳴（ＮＭＲ）分光法（例えば、１３Ｃ  ＮＭＲ又は１Ｈ  ＮＭＲ）を使用する方法を用いて決定することができる。使用し得るこれらの方法及び他の方法は、例えば、Ｆｏｏｄ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅｓ：Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｅｄ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ３，Ｓ．Ｗ．Ｃｕｉ，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ  ＬＬＣ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ，２００５）に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２１】
本明細書の大きいα−グルカンポリマーの「分子量」は、重量平均分子量（Ｍｗ）又は数平均分子量（Ｍｎ）として表すことができ、その単位は、ダルトン又はグラム／モルである。代わりに、大きいα−グルカンポリマーの分子量は、ＤＰｗ（重量平均重合度）又はＤＰｎ（数平均重合度）として表すことができる。オリゴ糖などのより小さいα−グルカンの分子量は、典型的には、「ＤＰ」（重合度）として提供され得、これは、単にα−グルカン内に含まれるグルコースの数を指す。高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）又はゲル浸透クロマトグラフィー（ＧＰＣ）によるなど、これらの様々な分子量の測定値を算出するための様々な手法が当該技術分野で知られている。
【００２２】
本明細書の用語「スクロース」は、α−１，２−グリコシド結合によって連結されたα−Ｄ−グルコース分子及びβ−Ｄ−フルクトース分子から構成される非還元二糖を指す。スクロースは、一般に砂糖として知られている。代わりに、スクロースは、「α−Ｄ−グルコピラノシル−（１→２）−β−Ｄ−フルクトフラノシド」と呼ばれ得る。「α−Ｄ−グルコピラノシル」及び「グルコシル」は、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００２３】
用語「粒子」、「一次粒子」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。粒子は、以下の実施例で採用されている技術（又は同様の技術）を使用した微粒子系中で最も小さい特定可能な単位であり、アグリゲートの亜単位である。本明細書の粒子は、約５〜２５ｎｍ（ナノメートル）の平均サイズを有する。いくつかの態様におけるサイズは、粒子直径及び／又は最長粒子寸法の長さ（例えば、棒状粒子の長さ）を指し得る。平均サイズは、例えば、少なくとも５０、１００、５００、１０００、２５００、５０００若しくは１００００又はそれを超える粒子の直径及び／又は最長寸法の平均に基づき得る。
【００２４】
用語「アグリゲート」、「粒子アグリゲート」、「粒子クラスター」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。アグリゲートは、粒子を含む一団又は塊であり、典型的には、水又は水溶液中の粒子のクラスタリング／アグリゲーション（集合すること）により形成される。本明細書のアグリゲートは、例えば、水又は水溶液中の粒子の分散後に形成することができる。アグリゲートは、アグロメレートに含まれ得る。本明細書のアグリゲートは、約５０〜３００ｎｍの平均流体力学的半径（Ｒｈ）を有する。代わりに、いくつかの態様におけるサイズは、アグリゲートの流体力学的直径（Ｄｈ）、直径及び／又は最長アグリゲート寸法の長さを指し得る。前述の任意の平均測定値は、例えば、少なくとも５０、１００、５００、１０００、２５００、５０００若しくは１００００又はそれを超えるアグリゲートで得ることができる。
【００２５】
本明細書で開示されるアグリゲートの「流体力学的半径」（Ｒｈ）は、以下の実施例及び／又は例えば米国特許出願公開第２０１７／００５５５４０号明細書若しくは同第２０１０／００５６３６１号明細書（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）で記載される方法論に従った動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定することができる。ＤＬＳは、光相関分光法（ＰＣＳ）又は準弾性光散乱と呼ばれることもある。アグリゲートの流体力学的半径は、アグリゲートと同じ方法で拡散する仮想剛体球の半径である。開示のアグリゲートは、典型的には、非球状で動的な動き（タンブリング）であるため、このような測定がなされる。アグリゲートのサイズは、必要に応じて、Ｒｈ値の２倍の流体力学的直径（Ｄｈ）に関して表すこともできる。
【００２６】
本明細書で使用される用語「フラクタル次元」は、アグリゲート構造の開放性を記載する。アグリゲートのフラクタル次元がその開放性をどのように特徴付けるかを説明するには、例えば、１０ｎｍの粒子を含む１００ｎｍのアグリゲートを考慮することが教示的である。本実施例におけるアグリゲートのフラクタル次元が３である場合、アグリゲートの中心の密度は、アグリゲートの周辺部の密度と同じである。３のフラクタル次元は、内部表面積の観点から、空間を埋める対象を記述し、閉じた構造を示す。アグリゲートのフラクタル次元が２である場合、アグリゲートの周辺部の密度は、その中心の密度の１０分の１である。アグリゲートのフラクタル次元が１である場合、アグリゲートの周辺部の密度は、その中心の密度の１００分の１である。本開示のアグリゲートは、大きい内部表面積を有するオープン構造を有し；これらの１．６〜２．４のフラクタル次元は、アグリゲートの中心から周辺部に向かっての密度の減少を示す。平均フラクタル次元は、例えば、少なくとも５０、１００、５００、１０００、２５００、５０００若しくは１００００又はそれを超えるアグリゲートのフラクタル次元の平均に基づき得る。
【００２７】
用語「樹枝状」などの用語は、任意選択的に、不溶性α−グルカンアグリゲートの樹木状／分枝状の性質／構造を特徴付けるために本明細書で使用され得る。
【００２８】
用語「棒状」、「棒形状」などの用語は、いくつかの態様において、一次粒子を特徴付けるために使用され得る。棒状である粒子は、典型的には、その断面直径よりも大きい（例えば、少なくとも１０％）長さを有する円筒形の形状を有する。
【００２９】
本明細書で使用される用語「アグロメレート」は、アグリゲートのクラスターを指す。本明細書のアグロメレートは、約１〜２００ミクロン（マイクロメートル）の平均サイズを有する。いくつかの態様におけるサイズは、アグロメレートの直径及び／又は最長アグロメレート寸法の長さを指し得る。平均サイズは、例えば、少なくとも５０、１００、５００、１０００、２５００、５０００若しくは１００００又はそれを超えるアグロメレートの直径及び／又は最長寸法の平均に基づき得る。
【００３０】
用語「グルコシルトランスフェラーゼ」、「グルコシルトランスフェラーゼ酵素」、「ＧＴＦ」、「グルカンスクラーゼ」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼの活性は、生成物であるα−グルカン及びフルクトースを製造するための基質スクロースの反応を触媒する。ＧＴＦ反応の他の生成物（副生成物）としては、グルコース、様々な可溶性グルコ−オリゴ糖及びロイクロースを挙げることができる。グルコシルトランスフェラーゼ酵素の野生型形態は、一般に、（Ｎ末端からＣ末端の方向に）、シグナルペプチド（これは、典型的には、切断プロセスにより除かれる）、可変ドメイン、触媒ドメイン及びグルカン結合ドメインを含有する。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼは、ＣＡＺｙ（Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ−Ａｃｔｉｖｅ  ＥｎＺｙｍｅｓ）データベース（Ｃａｎｔａｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３７：Ｄ２３３−２３８，２００９）によれば、グリコシドヒドロラーゼファミリー７０（ＧＨ７０）の下に分類される。
【００３１】
本明細書の用語「グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン」は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素にα−グルカン合成活性を付与するグルコシルトランスフェラーゼ酵素のドメインを指す。グルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインは、好ましくは、この活性を有する任意の他のドメインの存在を必要としない。
【００３２】
用語「酵素反応」、「グルコシルトランスフェラーゼ反応」、「グルカン合成反応」、「反応組成物」、「反応配合物」などは、本明細書では同じ意味で用いられ、通常、水、スクロース、少なくとも１種の活性グルコシルトランスフェラーゼ酵素を最初に含み、任意選択的に他の成分も最初に含む反応を指す。グルコシルトランスフェラーゼ反応が通常開始した後、グルコシルトランスフェラーゼ反応に更に存在し得る成分としては、フルクトース、グルコース、ロイクロース、可溶性グルコ−オリゴ糖（例えば、ＤＰ２〜ＤＰ７）（これらは、使用されるグルコシルトランスフェラーゼに応じて生成物又は副生物と考えられ得る）／又はＤＰ８以上（例えば、ＤＰ１００以上）の不溶性α−グルカン生成物及びが挙げられる。少なくとも８又は９の重合度（ＤＰ）を有するα−１，３−グルカンなどの特定のグルカン生成物は、非水溶性であるため、グルカン合成反応で溶解されず、むしろ溶液外に存在する（例えば、反応から沈殿したため）可能性があることが理解されるであろう。それは、水、スクロース及びグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させる工程が実施されるグルカン合成反応中である。本明細書で使用される用語「好適な反応条件下」は、グルコシルトランスフェラーゼ酵素活性によってスクロースからα−グルカン生成物への変換を支援する反応条件を指す。このような反応中、中に入れたスクロースに元々由来するグルコシル基は、酵素的に転移され、α−グルカンポリマー合成に使用される。したがって、このプロセスに関与するグルコシル基は、任意選択的に、グルコシルトランスフェラーゼ反応のグルコシル成分又は部分（又は同様の用語）と称され得る。
【００３３】
本明細書のいくつかの態様におけるグルコシルトランスフェラーゼ反応での不溶性α−グルカン生成物の「収率」は、変換されたスクロースに基づくモル収率を表す。α−グルカン生成物のモル収率は、変換されたスクロースのモルで除した不溶性α−グルカン生成物のモルに基づいて算出することができる。変換されたスクロースのモルは、以下のように算出することができる：（初期スクロースの質量−最終スクロースの質量）／スクロースの分子量［３４２ｇ／ｍｏｌ］。このモル収率計算は、α−グルカンに対する反応の選択性の尺度であると見なすことができる。いくつかの態様では、グルコシルトランスフェラーゼ反応における不溶性α−グルカン生成物の「収率」は、反応のグルコシル成分に基づくことができる。このような収率（グルコシルに基づく収率）は、次式を用いて評価することができる：不溶性α−グルカン収率＝（（ＩＳ／２−（ＦＳ／２＋ＬＥ／２＋ＧＬ＋ＳＯ））／（ＩＳ／２−ＦＳ／２））×１００％。グルコシルトランスフェラーゼ反応のフルクトース残余を評価して、該当する場合、ＨＰＬＣデータが範囲外ではない（９０〜１１０％は、許容されると見なされる）ことを保証し得る。フルクトース残余は、次の式を使用して評価することができる：フルクトース残余＝（（１８０／３４２×（ＦＳ＋ＬＥ）＋ＦＲ）／（１８０／３４２×ＩＳ））×１００％。上の２つの式では、ＩＳは、［初期のスクロース］であり、ＦＳは、［最終のスクロース］であり、ＬＥは、［ロイクロース］であり、ＧＬは、［グルコース］であり、ＳＯは、［可溶性オリゴマー］（グルコ−オリゴ糖）であり、ＦＲは、［フルクトース］である（二重括弧で示された前述の各基質／生成物の濃度は、グラム／Ｌ単位であり、例えばＨＰＬＣにより測定した際の濃度である）。
【００３４】
本明細書の不溶性α−グルカンの「ケーキ」は、少なくとも、（ｉ）約５０重量％〜９０重量％の水又は水溶液、及び（ｉｉ）約１０重量％〜５０重量％の不溶性α−グルカンを含む、凝縮、圧縮、梱包、圧搾及び／又は圧縮された形態の調製物を指す。いくつかの態様におけるケーキは、「濾過ケーキ」又は「ウェットケーキ」と称される場合もある。本明細書のケーキは、典型的には、柔らかく、固体様の稠度を有する。
【００３５】
用語「体積によるパーセント」、「体積パーセント」、「体積％」、「ｖ／ｖ％」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。溶液中の溶質の体積パーセントは、次式を用いて求めることができる：［（溶質の体積）／（溶液の体積）］×１００％。
【００３６】
用語「重量によるパーセント」、「重量パーセント（ｗｔ％）」、「重量−重量パーセント（％ｗ／ｗ）」などは、本明細書では同じ意味で用いられる。重量によるパーセントは、組成物、混合物又は溶液中に物質が含まれる場合に質量基準での物質の百分率を指す。
【００３７】
本明細書で用いられる用語「水性液体」、「水性流体」などは、水又は水溶液を意味し得る。本明細書の「水溶液」は、１種以上の溶解塩を含むことができ、ここで、いくつかの実施形態では、最大全塩濃度は、約３．５重量％であり得る。本明細書の水性液体は、典型的には、液体中の唯一の溶媒として水を含むが、水性液体は、任意選択的に、水に混和する１種以上の他の溶媒（例えば、極性有機溶媒）を含むことができる。したがって、水溶液は、少なくとも約１０重量％の水を有する溶媒を含むことができる。
【００３８】
本明細書の「水性組成物」は、例えば、少なくとも約１０重量％の水を含む液体成分を有する。水性組成物の例としては、例えば、混合物、溶液、分散液（例えば、コロイド分散液）、懸濁液及びエマルションが挙げられる。特定の実施形態における水性組成物は、本明細書に開示の不溶性α−グルカンのアグリゲートを含むことができ、この場合、アグリゲートが不溶性であるとすると、水性組成物は、任意選択的に、液体中固体組成物と特徴付けることができる。
【００３９】
本明細書で使用する場合、用語「コロイド分散液」は、分散相及び分散媒体を有する不均一系、すなわち微視的に分散した不溶性粒子が別の物質（例えば、水又は水性溶液などの水性組成物）全体に懸濁していることを指す。本明細書のコロイド分散液の例は、親水コロイドである。親水コロイドなどのコロイド分散液の粒子の全て又は一部は、本開示のアグリゲートを含むことができる。用語「分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓａｎｔ）」及び「分散剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）」は、分散液の形成及び／又は安定化を促進する物質を意味するため、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００４０】
「不溶性」、「水不溶性（ａｑｕｅｏｕｓ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）」、「水不溶性（ｗａｔｅｒ−ｉｎｓｏｌｕｂｌｅ）」（及び同様の用語）（例えば、不溶性α−１，３−グルカン）であるグルカンは、水又は他の水性条件に溶解しない（又は認め得るほどに溶解しない）（ここで、水性条件は、任意選択的に、４〜９のｐＨ（例えば、ｐＨ６〜８）及び／又は約１〜８５℃（例えば、２０〜２５℃）の温度を有することを更に特徴とする）。対照的に、「可溶性」、「水溶性（ａｑｕｅｏｕｓ−ｓｏｌｕｂｌｅ）」、「水溶性（ｗａｔｅｒ−ｓｏｌｕｂｌｅ）」などである本明細書の特定のオリゴ糖などのグルカン（例えば、８未満のＤＰを有するα−１，３−グルカン）は、これらの条件下でかなり溶解する。
【００４１】
本明細書で使用される用語「粘度」は、流動を引き起こす傾向を示す力に（水性又は非水性の）流体が抵抗する程度の尺度を指す。本明細書において使用できる粘度の様々な単位としては、例えば、センチポアズ（ｃＰ、ｃｐｓ）及びパスカル秒（Ｐａ・ｓ）が挙げられる。１センチポアズは１／１００ポアズであり；１ポアズは、０．１００ｋｇ・ｍ−１・ｓ−１に等しい。
【００４２】
ポリペプチドアミノ酸配列に関して本明細書で用いられるような用語「配列同一性」、「同一性」などは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許出願公開第２０１７／０００２３３６号明細書に定義されているとおりであり、決定される。
【００４３】
本明細書には、様々なポリペプチドアミノ酸配列及びポリヌクレオチド配列が特定の実施形態の特徴として開示されている。本明細書に開示した配列と少なくとも約７０〜８５％、８５〜９０％又は９０％〜９５％同一であるこれらの配列のバリアントを使用又は参照することができる。代わりに、バリアントアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示した配列と少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有し得る。バリアントアミノ酸配列又はポリヌクレオチド配列は、開示した配列と同一の機能／活性又は開示した配列の少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％の機能／活性を有する。メチオニンで始まらない、本明細書に開示した任意のポリペプチドアミノ酸配列は、典型的には、アミノ酸配列のＮ末端に少なくとも開始メチオニンを更に含むことができる。対照的に、メチオニンで始まる本明細書に開示した任意のポリペプチドアミノ酸配列は、このようなメチオニン残基を任意選択的に欠失し得る。
【００４４】
用語「〜と整列する」、「〜に対応する」などは、本明細書において同じ意味で用いられ得る。本明細書のいくつかの実施形態は、配列番号６２の少なくとも１つの特定のアミノ酸残基に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を含むグルコシルトランスフェラーゼに関する。（１）クエリ配列が対象配列と整列し得る場合（例えば、この場合、アラインメントは、クエリ配列及び対象配列［又は対象配列の部分配列］が少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％同一であることを示す）、及び（２）クエリアミノ酸位置が（１）のアラインメントにおいて対象アミノ酸位置と一直線に整列する（一直線に一列に並ぶ）場合、グルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸位置又はその部分配列は、（例えば、触媒ドメイン又は触媒ドメインに加えてグルカン結合ドメイン）（このようなアミノ酸位置又は配列を「クエリ」位置又は配列と呼ぶことができる）、配列番号６２の特定のアミノ酸残基（そのようなアミノ酸位置又は配列を「対象」位置又は配列と呼ぶことができる）に対応するように特徴付けることができる。一般に、開示された本明細書に記載される任意のアラインメントアルゴリズム、ツール及び／又はソフトウェア（例えば、ＢＬＡＳＴＰ、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＣｌｕｓｔａｌＶ、Ｃｌｕｓｔａｌ−Ｏｍｅｇａ、ＥＭＢＯＳＳ）を用いて、対象配列（配列番号６２又は配列番号６２の部分配列）とクエリアミノ酸配列とを整列させて、同一性パーセントを決定することができる。まさに更なる例として、Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ［例えば、バージョン５．０．０以降］，Ｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１６：２７６−２７７，２０００）のＮｅｅｄｌｅプログラムにおいて実行されるようなニードルマン−ヴンシュアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３，１９７０）を使用して、クエリ配列を本明細書の対象配列と整列させることができる。このようなＥＭＢＯＳＳアラインメントのパラメータとは、例えば、ギャップオープンペナルティ１０、ギャップ伸長ペナルティ０．５、ＥＢＬＯＳＵＭ６２（ＢＬＯＳＵＭ６２のＥＭＢＯＳＳバージョン）置換マトリックスを含み得る。
【００４５】
本明細書の配列番号６２の特定のアミノ酸置換残基のナンバリングは、配列番号６２の全長アミノ酸配列に関する。配列番号６２の最初のアミノ酸（すなわち１位、Ｍｅｔ−１）は、シグナルペプチドの開始点である。別段の開示がなされていなければ、本明細書の置換は、配列番号６２の全長アミノ酸配列に関する。
【００４６】
本明細書の「非天然グルコシルトランスフェラーゼ」（代わりに、「変異体」、「バリアント」、「改変された」などは、このようなグルコシルトランスフェラーゼを記載するために同様に用いられる）は、配列番号６２の特定のアミノ酸残基に対応する位置で少なくとも１つのアミノ酸置換を有する。ほとんどの場合、このような少なくとも１つのアミノ酸置換は、非天然グルコシルトランスフェラーゼの天然対応物（親）において同じ位置で一般に（自然に）存在するアミノ酸残基に代わるものである。天然対応物のグルコシルトランスフェラーゼにおいて関連した部位で一般に存在するアミノ酸は、アラインメントがなされる配列番号６２の特定のアミノ酸残基と同じである（又は保存されている）ことが多い。非天然グルコシルトランスフェラーゼは、任意選択的に、その天然対応物配列に対して他のアミノ酸変化（変異、欠失及び／又は挿入）を有し得る。
【００４７】
本明細書の置換／アラインメントを説明することは、有益であり得る。配列番号１２（ＧＴＦ０５４４）は、ストレプトコッカス・ソブリナス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｏｂｒｉｎｕｓ）のグルコシルトランスフェラーゼのトランケート型である。配列番号１２のＬｅｕ−１９３は、配列番号６２のＬｅｕ−３７３に対応することに留意されたい（アラインメントは示さず）。例えば、配列番号１２が１９３位で変異されて、Ｌｅｕ残基を異なる残基（例えば、Ｇｌｎ）で置換する場合、配列番号１２の１９３位で変異したバージョンは、配列番号６２のＬｅｕ−３７３に対応する位置でアミノ酸置換を有する非天然グルコシルトランスフェラーゼに相当すると言うことができる。
【００４８】
用語「単離された」は、天然に存在しない形態又は環境にある物質（又はプロセス）を意味する。単離された物質の非限定的な例としては、本明細書の不溶性α−グルカンのアグリゲート又は粒子などの天然に存在しない任意の物質（並びにこれらの材料の任意のものを調製するのに使用される酵素反応及び他のプロセス）が挙げられる。本明細書に開示される実施形態は、合成物／人工物（人間の介入／関与以外には製造できない）であり、且つ／又は天然に存在しない特性を有すると考えられる。
【００４９】
本明細書で使用される「増加した」という用語は、増加した量又は活性が比較される量又は活性より少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、５０％、１００％又は２００％多い量又は活性を指すことができる。用語「増加した」、「上昇した」、「増強された」、「より多い」、「改善された」などの用語は、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００５０】
不溶性α−グルカンの新たな形態は、様々な用途でこの材料の経済的価値及び性能特性を向上させるために所望されている。このニーズに対処するために、ここで、特有の形態的特徴を有する不溶性α−グルカンアグリゲートを含む組成物が開示される。
【００５１】
本開示の特定の実施形態は、不溶性α−グルカンのアグリゲートを含む組成物であって、アグリゲートは、約５０〜３００ｎｍ（ナノメートル）の平均流体力学的半径及び約１．６〜２．４のフラクタル次元を有し、及び不溶性α−グルカンは、α−１，３−グリコシド結合を含む、組成物に関する。開示されたアグリゲートのフラクタル次元範囲は、それらが大きい内部表面積を有することを示し、これは、開示されたアグリゲートが、例えば、大きい内部表面積を利用する用途において有用であることを示す。
【００５２】
本明細書のアグリゲートの平均流体力学的半径は、約５０〜３００ｎｍである。いくつかの態様では、アグリゲートの平均流体力学的半径は、約５０、６０、７０、８０、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、５０〜３００、５０〜２５０、５０〜２００、５０〜１５０、６０〜１４０、６０〜１３０、６０〜１２０、６０〜１１５、６０〜１１０、６０〜１０５、６０〜１００、７０〜１３０、７０〜１２０、７０〜１１５、７０〜１１０、７０〜１０５、７０〜１００、８０〜１３０、８０〜１２０、８０〜１１５、８０〜１１０、８０〜１０５、８０〜１００、９０〜１３０、９０〜１２０、９０〜１１５、９０〜１１０、９０〜１０５、９０〜１００、１００〜１３０、１００〜１２０、１００〜１１５、１００〜１１０又は１００〜１０５ｎｍである。更にいくつかの態様では、アグリゲートの平均流体力学的半径は、約又は最大約３００、３５０、４００、４５０又は５００（すなわちそれぞれ流体力学的直径で６００、７００、８００、９００又は１０００ｎｍ）（又はそれらの間の任意の範囲）であり得る。アグリゲートの流体力学的半径は、以下の実施例及び／又は例えば米国特許出願公開第２０１７／００５５５４０号明細書又は同第２０１０／００５６３６１号明細書（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）で記載される方法論に従った動的光散乱法（ＤＬＳ）により測定することができる。いくつかの態様では、アグリゲートの流体力学的半径は、比エネルギーで約又は少なくとも約８、９、１０、１１又は１２ｋＪ／ｋｇ（例えば、約３０〜５０、３５〜４５又は４０分）の剪断力（例えば、超音波処理を用いて）を適用することにより、不溶性α−グルカンの分散液（例えば、約０．０５〜０．１５又は０．１ｍｇ／ｍＬ）を破壊した後に測定されるとおりであり得る。この測定は、例えば、剪断力適用終了後、直ちに（例えば、１〜５又は１〜１０分以内）又は約１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６、４２若しくは４８分以内になされ得る。いくつかの更なる又は代替的な態様におけるアグリゲートサイズは、電子顕微鏡法（透過型［ＴＥＭ］又は走査型［ＳＥＭ］）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、小角Ｘ線散乱（ＳＡＸＳ）、中性子小角散乱（ＳＡＮＳ）、光散乱などの当該技術分野において公知の任意の好適な技術を使用して、且つ／又は以下の実施例で開示される技術を用いることによって測定することができる。
【００５３】
本明細書の不溶性α−グルカンのアグリゲートは、約１．６〜２．４のフラクタル次元を有する。いくつかの態様では、フラクタル次元は、約１．６、１．７、１．８、１．９、１．９５、２．０、２．０５、２．１、２．２、２．３、２．４、１．６〜２．４、１．７〜２．４、１．８〜２．４、１．９〜２．４、１．９５〜２．４、２．０〜２．４、１．６〜２．３、１．７〜２．３、１．８〜２．３、１．９〜２．３、１．９５〜２．３、２．０〜２．３、１．６〜２．２、１．７〜２．２、１．８〜２．２、１．９〜２．２、１．９５〜２．２、２．０〜２．２、１．６〜２．１、１．７〜２．１、１．８〜２．１、１．９〜２．１、１．９５〜２．１、２．０〜２．１、１．６〜２．０５、１．７〜２．０５、１．８〜２．０５、１．９〜２．０５、１．９５〜２．０５又は２．０〜２．０５であり得る。フラクタル次元は、散乱（光散乱、Ｘ線散乱［例えば、ＳＡＸＳ］又は中性子散乱［例えば、ＳＡＮＳ］）などの当該技術分野において公知の任意の好適な技術を使用して、且つ／又は以下の実施例で開示される技術を用いることによって測定することができる。本明細書のアグリゲートは、任意選択的に、形状／形態が平坦であることを特徴とする。一般に、フラクタル次元が２．０に近いほど（２．０から上に近づくと）、形状は、より平坦になる。いくつかの態様におけるフラクタル次元は、流体力学的半径が約１０〜１５０、１０〜１２５、１０〜１１０又は１０〜１００ｎｍであるアグリゲートに関して測定され得る。しかし、上記（例えば、最大５００ｎｍ）の任意の流体力学的半径（又はそれらの範囲）のアグリゲートのフラクタル次元も必要に応じて測定され得る。
【００５４】
いくつかの態様におけるアグリゲートは、樹枝状であり、したがって樹木状又は分枝状構造を有する。アグリゲートの樹枝状の性質は、例えば、図１で示すとおりである。この樹枝状は、アグリゲートを形成する不溶性α−グルカン粒子のフラクタル組織から生じると考えられる。本明細書アグリゲートの樹枝状は、顕微鏡法（例えば、低温ＴＥＭ［別名クライオＴＥＭ］などの例えば透過型電子顕微鏡法［ＴＥＭ］）により、且つ／又以下の実施例で開示される技術を用いることによって検出することができる。
【００５５】
本明細書のアグリゲートは、大きい表面積を有する。いくつかの態様におけるアグリゲートの表面積は、約又は少なくとも約１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、１５０〜２５０、１５０〜２２５、１７５〜２５０又は１７５〜２２５ｍ２／ｇであると考えられる。いくつかの特定の態様における表面積は、約１３〜１７ｎｍ（例えば、約１５ｎｍ）の平均サイズを有する粒子を含むアグリゲートを特徴付ける。
【００５６】
本明細書のアグリゲートは、不溶性α−グルカンの粒子（一次粒子）を含む。これらの粒子は、例えば、約５〜２５ｎｍの平均サイズを有し得る。いくつかの態様では、不溶性α−グルカンの粒子は、約５、１０、１５、２０、２５、１０〜２０、１０〜１８、１０〜１６、１２〜２０、１２〜１８、１２〜１６、１４〜２０、１４〜１８又は１４〜１６ｎｍの平均サイズを有し得る。粒径は、当該技術分野において公知の任意の好適な技術（例えば、ＳＡＸＳなど、アグリゲートサイズを測定するために上記で記載したように）を使用して、且つ／又以下の実施例で開示される技術を用いることによって測定することができる。いくつかの態様におけるアグリゲートは、不溶性α−グルカン粒子からなる。粒子は、例えば、球状及び／又は棒状形状であり得る。いくつかの態様では、本明細書のアグリゲートの粒子の約０％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％は、（ｉ）球状、（ｉｉ）棒状又は合計で最大約８０％、８５％、９０％、９５％若しくは１００％の（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせであると考えられる。いくつかの態様では、一次粒径（例えば、直径）は、小角散乱（例えば、データを、Ｂｅａｕｃａｇｅ［１９９５，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．２８：７１７−７２８、参照により本明細書に組み込まれる］などのユニバーサルフィットにかけたもの）を使用して、粒子の旋回半径（Ｒｇ）を計算して測定することができ、次いでこれを、次の式で粒子直径（Ｄ）：
【数１】
2021502436.tif 000006
を計算するために使用する。本明細書に開示する任意の水性系において、最大数ＭＪ／ｋｇの比エネルギーを有する剪断力にさらされた場合（例えば、比エネルギーで最大約３、４、５、６、７又は８ＭＪ／ｋｇであることが検討される）（例えば、最大３０〜４０分間）、アグリゲートは、一般に、破壊に対して抵抗力がある（一般に、引き裂かれることに対して耐性がある）。例えば、最大８０％、８５％、９０％又は９５％のアグリゲートは、本明細書の剪断力にさらされた場合、一次粒子まで破壊されないと考えられる。
【００５７】
本明細書の粒子中の不溶性α−グルカンの個々の分子は、それぞれ例えば約又は少なくとも約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１１００、１２００、２００〜１２００、４００〜１２００、６００〜１２００、２００〜１０００、４００〜１０００又は６００〜１０００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有し得る。いくつかの態様では、粒子中に約６、７、８、９、１０、１１、１２、６〜１２又は８〜１２個の不溶性α−グルカンの個々の分子が存在し得る。この分子数は、典型的には、粒子の個々の分子ＤＰｗ及びサイズに依存する（例えば、１４〜１６ｎｍの粒子は、それぞれ８００ＤＰｗである１０個の分子を有し得る）。
【００５８】
特定の実施形態における組成物は、本明細書に開示するアグリゲートのアグロメレートを含み得る。アグロメレートは、例えば、約１、５、１０、２５、５０、７５、９０、１００、１１０、１２５、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、１〜２００、２．５〜２００、５〜２００、７．５〜２００、１〜１５０、２．５〜１５０、５〜１５０、７．５〜１５０、１〜１２５、２．５〜１２５、５〜１２５、７．５〜１２５、１〜１１０、２．５〜１１０、５〜１１０、７．５〜１１０、１〜１００、２．５〜１００、５〜１００、７．５〜１００、１〜９０、２．５〜９０、５〜９０、７．５〜９０、１〜５０、５〜５０、１０〜５０又は２５〜５０ミクロン（マイクロメートル）の平均サイズを有し得る。本明細書に開示する任意の水性系では、本明細書のアグロメレートは、典型的には、例えば、比エネルギーで約又は少なくとも約８、９、１０、１１又は１２ｋＪ／ｋｇ（例えば、約３、４、５、６、８又は１０分間）の剪断力により剪断され／破壊され／引き裂かれ、より小さいアグロメレート又は構成成分アグリゲートを生成し得る。そのような剪断力を取り除くと、順次、アグリゲートは、アグロメレートに再集合することができる。いくつかの態様では、本明細書に開示のアグロメレートサイズ値は、Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ（登録商標）（Ｍａｌｖｅｒｎ）などの好適な粒径分析器（例えば、光散乱に基づく）を使用して、且つ／又は以下の実施例に記載されたようにして測定した際に粒径分布のメジアン径（Ｄ５０）を表す。いくつかの態様におけるアグロメレートサイズは、破壊なし（例えば、超音波処理なし）のアグロメレートについて測定したとおりである。
【００５９】
本開示のアグリゲートは、α−１，３−グリコシド結合を含む不溶性α−グルカンを含む。いくつかの態様では、不溶性α−グルカンを構成するグリコシド結合の少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％又は１００％（又は５０％〜１００％の任意の整数）は、α−１，３結合である。したがって、いくつかの態様では、不溶性α−グルカンは、約５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％又は０％未満（又は０％〜５０％の任意の整数値）のα−１，３ではないグリコシド結合を有する。典型的には、α−１，３でないグリコシド結合は、ほとんど又は全部がα−１，６である。α−グルカン内に存在するα−１，３結合の割合が高くなるほど、ポリマー内で分枝点を形成する特定の結合の発生率が低くなるため、α−グルカンが直鎖状である確率が高くなることが理解されるであろう。したがって、１００％のα−１，３結合を有する不溶性α−グルカンは、完全に直鎖状であると考えられる。特定の実施形態では、不溶性α−グルカンは、分枝点を有していないか、又はポリマー内のグリコシド結合のパーセントとして約５％、４％、３％、２％又は１％未満の分枝点を有する。分枝点の例としては、α−１，３結合骨格に由来するα−１，６、α−１，２及びα−１，４分枝点が含まれる。
【００６０】
本明細書の不溶性α−グルカンは、いくつかの態様では、約又は少なくとも約１００のＤＰｗ又はＤＰｎの分子量を有し得る。いくつかの実施形態におけるＤＰｗ又はＤＰｎは、約又は少なくとも約１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００又は１２００（又は１００〜１２００の任意の整数）であり得る。α−グルカンのＤＰｗ又はＤＰｎは、任意選択的に、これらの値のいずれか２つの間の範囲（例えば、１００〜１２００、４００〜１２００、７００〜１２００、１００〜１０００、４００〜１０００、７００〜１０００）として表すことができる。
【００６１】
本明細書のα−グルカンは、本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応の条件（例えば、ｐＨ４〜８、下記を参照されたい）などの非苛性水性系で不溶性である。一般に、本明細書における水性系中のグルカンポリマーの溶解度は、その結合プロファイル、分子量及び／又は分枝度に関連する。例えば、≧９５％の１，３結合を有するα−１，３−グルカンは、一般に、８以上のＤＰｗで２０℃の水性条件において不溶性である。一般に、分子量が増大するにつれて、α−１，３−グルカンの不溶性に必要なα−１，３結合の割合が減少する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、不溶性α−グルカンは、少なくとも約３０％のα−１，３結合並びにα−グルカン中のα−１，３及びα−１，６結合の両方の合計を１００％にするパーセンテージのα−１，６結合を含み得る。例えば、α−１，３及びα−１，６結合のパーセンテージは、それぞれ約３０〜４０％及び６０〜７０％であり得る。いくつかの態様では、少なくとも約３０％のα−１，３結合を含む不溶性α−グルカンは、直鎖である。少なくとも約３０％のα−１，３結合を含む不溶性α−グルカンを生成するためのグルコシルトランスフェラーゼは、米国特許出願公開第２０１５／０２３２８１９号明細書に開示され、それらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
いくつかの実施形態における不溶性α−グルカンは、（ｉ）少なくとも約１０００００ダルトンの分子量を有する（例えば、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のα−１，６結合を有する）デキストランを含む主鎖と、（ｉｉ）少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のα−１，３−グルコシド結合を含むα−１，３−グルカン側鎖とを有するコポリマー（例えば、グラフトコポリマー）の形態であり得る。このようなコポリマーは、国際公開第２０１７／０７９５９５号パンフレット（参照により本明細書に組み込まれる）に開示されるとおりであり得る。
【００６４】
前述の結合プロファイル及び／又は分子量プロファイルのいずれかを例えば本明細書において組み合わせて、本明細書の不溶性α−グルカンを適切に特徴付けることができる。いくつかの態様では、このようなα−グルカンの結合及び／又は分子量プロファイルは、全てが参照により本明細書に組み込まれる以下の刊行物：米国特許第７００００００号明細書及び同第８８７１４７４号明細書；米国特許出願公開第２０１５／０２３２８１９号明細書、国際公開第２０１７／０７９５９５号パンフレットのいずれかに開示されるとおりであり得る。前述の実施形態の不溶性α−グルカンは、例えば、グルカン合成反応及び以下で開示される反応後プロセスのいずれかの生成物であり得る。
【００６５】
本明細書の不溶性α−グルカンは、交互（１，３及び１，６結合の交互）を含まず、水溶性である。本明細書の不溶性α−グルカンは、典型的には、不活性容器中で（典型的には、無細胞条件下で）酵素的に誘導され、細胞壁（例えば、真菌細胞壁）から誘導されない。
【００６６】
本開示の特定の実施形態は、本明細書に記載の不溶性−α−グルカンのアグリゲートを生成（調製）する方法に関する。このような方法は、（ａ）少なくとも水、スクロース及び少なくとも約４０％の収率で不溶性α−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させることと；（ｂ）工程（ａ）で生成された不溶性α−グルカンの分散液を調製することとを含む。工程（ａ）は、任意選択的に、グルコシルトランスフェラーゼ反応又は反応組成物を調製／提供することを含むことを特徴とし得る。工程（ａ）は、上記で開示されるような任意の不溶性α−グルカン分子（例えば、≧９０％又は≧９５％のα−１，３結合）を生成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を用い得る。分散工程（ｂ）は、工程（ａ）で合成される不溶性α−グルカンのアグリゲートを生成する。
【００６７】
本明細書に開示されるようなグルコシルトランスフェラーゼ反応は、少なくとも水、スクロース及び不溶性α−グルカンを生成する本明細書のグルコシルトランスフェラーゼを接触させることを含む。これら及び任意選択的に他の試薬は、一緒に添加することができるか、又は下記で考察するような任意の順序で添加することができる。本明細書の接触工程は、任意の数の方法において実施できる。例えば、所望の量のスクロースを最初に水に溶解させ（任意選択的に、他の成分、例えば緩衝剤成分もこの調製段階で添加され得る）、その後、グルコシルトランスフェラーゼ酵素を添加することができる。溶液は、静止させたままであり得るか、又は例えば撹拌若しくはオービタルシェイカーによる振盪によってかき混ぜられ得る。グルコシルトランスフェラーゼ反応は、バッチ、フェドバッチ、継続的な方法又はこれらの方法の任意の変形形態によって実施され得る。
【００６８】
特定の実施形態における反応の完了は、視覚的に（例えば、不溶性α−グルカンがもはや蓄積しない）、且つ／又は溶液中に残ったスクロース（残留スクロース）の量を測定することによって決定でき、この場合、少なくとも約９０％、９５％又は９９％のスクロース消費率が反応完了を指示し得る。いくつかの態様では、反応は、そのスクロース含量が約２〜５ｇ／Ｌ以下になった場合に完了したと見なし得る。開示したプロセスの反応は、例えば、約１時間〜約２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、３６、４８、６０、７２、９６、１２０、１４４又は１６８時間実施され得る。反応は、任意選択的に、例えば少なくとも約６５℃で少なくとも約３０〜６０分間加熱することによって終了させ、且つ／又は別の方法で処理して、グルコシルトランスフェラーゼ活性を停止させることができる。
【００６９】
本明細書の反応組成物の温度は、必要に応じて制御される場合があり、例えば約５〜５０℃、２０〜４０℃、３０〜４０℃、２０〜３０℃、２０〜２５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃又は４０℃であり得る。
【００７０】
本明細書の反応組成物中のスクロースの初期濃度は、例えば、約２０〜４００ｇ／Ｌ、７５〜１７５ｇ／Ｌ又は５０〜１５０ｇ／Ｌであり得る。いくつかの態様では、初期スクロース濃度は、少なくとも約５０、７５、１００、１５０若しくは２００ｇ／Ｌであるか、又は約５０〜６００ｇ／Ｌ、１００〜５００ｇ／Ｌ、５０〜１００ｇ／Ｌ、１００〜２００ｇ／Ｌ、１５０〜４５０ｇ／Ｌ、２００〜４５０ｇ／Ｌ若しくは２５０〜６００ｇ／Ｌである。「スクロースの初期濃度」は、全ての反応成分（例えば、少なくとも水、スクロース、グルコシルトランスフェラーゼ酵素）が加えられた／合わせられた直後の反応組成物におけるスクロース濃度を指す。
【００７１】
特定の実施形態における反応組成物のｐＨは、約４．０〜９．０、４．０〜８．５、４．０〜８．０、５．０〜８．０、５．５〜７．５又は５．５〜６．５であり得る。いくつかの態様では、ｐＨは、約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５又は８．０であり得る。ｐＨは、リン酸塩、トリス、クエン酸塩又はこれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない好適な緩衝剤を添加又は混入することによって調節又は制御することができる。本明細書の反応組成物中の緩衝剤濃度は、例えば、約０．１〜３００ｍＭ、０．１〜１００ｍＭ、１０〜１００ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ又は５０ｍＭであり得る。
【００７２】
グルコシルトランスフェラーゼ反応物は、本明細書に開示の１つ以上の反応条件を適用するのに好適な任意の容器（例えば、不活性容器／コンテナ）に入れることができる。いくつかの態様における不活性容器は、ステンレス鋼製、プラスチック製若しくはガラス製であり得（又はこれらの構成要素の２つ以上を含み得）、また特定の反応物を含有するのに好適なサイズであり得る。例えば、不活性容器の体積／容量（及び／又は本明細書の反応組成物の体積）は、約又は少なくとも約１、１０、５０、１００、５００、１０００、２５００、５０００、１００００、１２５００、１５０００又は２００００リットルであり得る。不活性容器は、任意選択的に撹拌装置を備えることができる。例えば、前述の特徴のいずれかは、本明細書の単離反応を特徴付けるために使用され得る。
【００７３】
本明細書の反応組成物は、例えば、１種、２種又はそれを超える異なるグルコシルトランスフェラーゼ酵素を含有し得る。いくつかの実施形態では、１種又２種のグルコシルトランスフェラーゼ酵素のみが反応組成物に含まれる。本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ反応は、無細胞（例えば、細胞全体が存在しない）であり得、典型的には無細胞（例えば、細胞全体が存在しない）である。
【００７４】
本明細書の不溶性α−グルカンを合成するのに好適な他の条件及び／又は成分の例は、米国特許公開第２０１４／００８７４３１号明細書、同第２０１７／０１６６９３８号明細書及び同第２０１７／０００２３３５号明細書に開示されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素は、少なくとも約４０％の収率で不溶性α−グルカンを合成する。いくつかの態様におけるグルコシルトランスフェラーゼ酵素による不溶性α−グルカンの収率は、約又は少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％又は９６％であり得る。いくつかの態様における収率は、反応のグルコシル成分に基づいて評価され得る。このように、工程（ａ）は、任意選択的に、反応組成物のグルコシル成分に基づき、少なくとも約４０％の収率で不溶性α−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を使用することを特徴とし得る。いくつかの態様における収率は、ＨＰＬＣ又はＮＩＲ分光法を使用して測定され得る。収率は、例えば、約１６〜２４時間（例えば、約２０時間）行われる反応において達成することができる。
【００７６】
少なくとも約４０％の収率で不溶性α−グルカンを合成する本明細書のグルコシルトランスフェラーゼ酵素の例としては、後述のように特定の非天然グルコシルトランスフェラーゼが挙げられる。例えば、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２６、２８、３０、３４又は５９と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなることができ、（ｉｉ）少なくとも４０％の収率で不溶性α−グルカンを生成することができる非天然グルコシルトランスフェラーゼを提供する少なくとも１つのアミノ酸置換を有し得る（好適な置換の例を以下に記載する）。前述のアミノ酸配列を有するグルコシルトランスフェラーゼの不溶性α−グルカン生成物に関する特定の情報が表２（以下）において提供される。本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、典型的には、例えば約３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％又は２７％未満の不溶性α−グルカン収率を有する親対応物（例えば、天然及び／又は非置換）を有する。
【００７７】
【表４】
2021502436.tif 000007
【００７８】
いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、少なくとも４０％の不溶性α−グルカン収率に付随する、表３（下方、実施例１）の置換に対応する少なくとも１つのアミノ酸置換を含む（配列番号６２の位置ナンバリングに対応するこのような少なくとも１つの置換の位置ナンバリング）。いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、少なくとも４０％の不溶性α−グルカン収率に付随する、表４又は表５（下方、実施例１）の一連の置換に対応する一連のアミノ酸置換を含む（配列番号６２の位置ナンバリングに対応するこの置換セットの位置ナンバリング）。
【００７９】
いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）少なくとも１つのアミノ酸置換又は一連のアミノ酸置換（上記の）を含み、且つ（ｉｉ）配列番号４のアミノ酸残基５５〜９６０、配列番号６５の残基５４〜９５７、配列番号３０の残基５５〜９６０、配列番号２８の残基５５〜９６０又は配列番号２０の残基５５〜９６０と少なくとも約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一であるグルコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含むか又はそれからなる。このような非天然グルコシルトランスフェラーゼは、例えば、非水溶性であるα−グルカンを生成することができ、且つ少なくとも約５０％（例えば、≧９０％又は９５％）のα−１，３結合を含み、任意選択的に、少なくとも１００のＤＰｗを更に有すると考えられる。例えば、配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７位を有するグルコシルトランスフェラーゼは、１００％のα−１，３結合及び少なくとも４００のＤＰｗを有するα−１，３−グルカンを生成できる（データは示さず、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１７／０００２３３５号明細書の表６を参照されたい）ことに留意されたい。配列番号６５（ＧＴＦ７５２７）、３０（ＧＴＦ２６７８）、４（ＧＴＦ６８５５）、２８（ＧＴＦ２９１９）及び２０（ＧＴＦ２７６５）は、それぞれの野生型対応物と比較して、シグナルペプチドドメイン及び可変ドメインの全部分又は実質的部分が欠如するグルコシルトランスフェラーゼをそれぞれ表すことに更に留意されたい。したがって、これらのグルコシルトランスフェラーゼ酵素の各々は、後にグルカン結合ドメインが続く触媒ドメインを有する。これらの酵素中の触媒ドメイン配列のおよその位置は、次のとおりである：７５２７（配列番号６５の残基５４〜９５７）、２６７８（配列番号３０の残基５５〜９６０）、６８５５（配列番号４の残基５５〜９６０）、２９１９（配列番号２８の残基５５〜９６０）、２７６５（配列番号２０の残基５５〜９６０）。ＧＴＦ２６７８、６８５５、２９１９及び２７６５の（およその）触媒ドメインのアミノ酸配列は、ＧＴＦ７５２７のおよその触媒ドメイン配列（すなわち配列番号６５のアミノ酸５４〜９５７）とそれぞれ約９４．９％、９９．０％、９５．５％及び９６．４％の同一性を有する。これらの特定のグルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴＦ２６７８、６８５５、２９１９及び２７６５）の各々は、１００％のα−１，３結合及び少なくとも４００のＤＰｗを有するα−１，３−グルカンを生成することができる（データは示さず、米国特許出願公開第２０１７／０００２３３５号明細書の表４を参照されたい）。この活性及び前述の触媒ドメインの関連性（高い同一性パーセント）に基づいて、本明細書に開示の少なくとも１つのアミノ酸置換を更に有する前述の触媒ドメインの１つを有する本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼは、少なくとも約５０％（例えば、≧９０％又は９５％）のα−１，３結合及び少なくとも１００のＤＰｗを含むα−グルカンを生成することができると考えられる。
【００８０】
いくつかの態様では、非天然グルコシルトランスフェラーゼは、（ｉ）少なくとも１つのアミノ酸置換又は一連のアミノ酸置換（上記の）を含み、且つ（ｉｉ）配列番号６２若しくは配列番号４（その開始メチオニンを有しない）又は配列番号４の５５〜９６０位（およその触媒ドメイン）などのその部分配列と少なくとも約４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６９％、７０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％同一であるアミノ酸配列を含むか又はそれからなる。
【００８１】
本明細書の非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素は、細菌などの微生物源から誘導することができる。細菌グルコシルトランスフェラーゼ酵素の例は、ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種、ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種又はラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種から誘導されるものである。ストレプトコッカス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）種の例としては、Ｓ．サリバリウス（Ｓ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｓ．ソブリナス（Ｓ．ｓｏｂｒｉｎｕｓ）、Ｓ．デンチロウセッティ（Ｓ．ｄｅｎｔｉｒｏｕｓｅｔｔｉ）、Ｓ．ダウネイ（Ｓ．ｄｏｗｎｅｉ）、Ｓ．ミュータンス（Ｓ．ｍｕｔａｎｓ）、Ｓ．オラリス（Ｓ．ｏｒａｌｉｓ）、Ｓ．ガロリティクス（Ｓ．ｇａｌｌｏｌｙｔｉｃｕｓ）及びＳ．サングイニス（Ｓ．ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）が挙げられる。ロイコノストック（Ｌｅｕｃｏｎｏｓｔｏｃ）種の例としては、Ｌ．メセンテロイデス（Ｌ．ｍｅｓｅｎｔｅｒｏｉｄｅｓ）、Ｌ．アメリビオスム（Ｌ．ａｍｅｌｉｂｉｏｓｕｍ）、Ｌ．アルゲンチナム（ａｒｇｅｎｔｉｎｕｍ）、Ｌ．カルノスム（Ｌ．ｃａｒｎｏｓｕｍ）、Ｌ．シトレウム（Ｌ．ｃｉｔｒｅｕｍ）、Ｌ．クレモリス（Ｌ．ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、Ｌ．デキストラニカム（Ｌ．ｄｅｘｔｒａｎｉｃｕｍ）及びＬ．フルクトサム（Ｌ．ｆｒｕｃｔｏｓｕｍ）が挙げられる。ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）種の例としては、Ｌ．アシドフィルス（Ｌ．ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、Ｌ．デルブリュキイ（Ｌ．ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）、Ｌ．ヘルベチクス（Ｌ．ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、Ｌ．サリバリウス（Ｌ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、Ｌ．カゼイ（Ｌ．ｃａｓｅｉ）、Ｌ．クルバツス（Ｌ．ｃｕｒｖａｔｕｓ）、Ｌ．プランタルム（ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、Ｌ．サケイ（ｓａｋｅｉ）、Ｌ．ブレビス（Ｌ．ｂｒｅｖｉｓ）、Ｌ．ブフネリ（Ｌ．ｂｕｃｈｎｅｒｉ）、Ｌ．フェルメンタム（Ｌ．ｆｅｒｍｅｎｔｕｍ）及びＬ．ロイテリ（Ｌ．ｒｅｕｔｅｒｉ）が挙げられる。
【００８２】
本明細書のアグリゲート生成方法の工程（ｂ）は、工程（ａ）で生成された不溶性α−グルカンの分散液を調製することを含む。この分散液は、例えば、コロイド状分散液であり得る。工程（ａ）のグルコシルトランスフェラーゼ反応により生成された不溶性α−グルカンは、例えば、反応から除去され、次いで任意の好適な方法を用いて水又は水溶液中に分散させることができる。いくつかの態様では、このような分散は、任意の好適な手段を用いて高剪断を適用することにより、実施することができる。高剪断は、比エネルギーで約若しくは少なくとも約８、９、１０、１１若しくは１２ｋＪ／ｋｇのものであり得、且つ／又は例えば約若しくは最大約３０００、４０００、６０００、８０００、１００００、１２０００、１４０００若しくは１５０００ｒｐｍで混合することを含み得る。高剪断は、例えば、約３、４、５、６、８又は１０分間適用され得る。高剪断を適用するのに好適な手段としては、例えば、分散機、ソニケータ（例えば、ウルトラソニケータ）、ホモミキサー、ホモジナイザー（例えば、回転式又はピストン、ロータステータ）、マイクロ流動化装置、遊星型ミキサー、コロイドミル、ジェットミル、ボルテックスなどの好適な分散器具並びに／又は以下の実施例及び／若しくは国際公開第２０１６／１２６６８５号パンフレット若しくは同第２０１６／０３０２３４号パンフレット、米国特許第５７６７１７６号明細書、同第６１３９８７５号明細書、同第８７２２０９２号明細書若しくは米国特許出願公開第２０１７／００５５５４０号明細書若しくは同第２０１８／００２１２３８号明細書（これらの刊行物の全ては、参照により本明細書に組み込まれる）で記載されるような任意の方法論を用いることを含む。
【００８３】
本開示の方法の工程（ａ）で生成された不溶性α−グルカンは、典型的には、工程（ｂ）で不溶性α−グルカンを分散させる前に単離して、アグリゲートを得る。特定の実施形態では、不溶性α−グルカン生成物の単離は、遠心分離及び／又は濾過の工程を少なくとも実施することを含み得る。単離は、任意選択的に、不溶性α−グルカンを水又は他の水性液体（例えば、本明細書の水溶液を用いて）で１回、２回又はそれを超えて洗浄することを更に含み得る。洗浄容量は、任意選択的に、例えば不溶性α−グルカンを生成するのに使用されるグルコシルトランスフェラーゼ反応の容量の少なくとも約１０〜１００％であり得る。洗浄は、必要に応じて、置換洗浄又はリスラリー洗浄などの様々な方式で行うことができる。本明細書の単離は、不溶性α−グルカンを乾燥させることを含まない。
【００８４】
いくつかの態様における不溶性α−グルカンの分散液の調製は、工程（ａ）のグルコシルトランスフェラーゼ反応で生成された不溶性α−グルカンのウェットケーキを調製することと、ウェットケーキを水又は水溶液中に分散させることとを含み得る。ウェットケーキ調製のための不溶性α−グルカンの単離は、少なくとも、遠心分離工程（すなわちウェットケーキはペレット化されたグルカンである）及び／又は濾過工程（すなわちウェットケーキは濾過されたグルカンである）を行うことを含み得る。例えば、本明細書のウェットケーキは、漏斗、フィルター（例えば、回転真空ドラムフィルター、クロスフローフィルター、スクリーンフィルター、ベルトフィルター、スクリュープレス又は膜の圧搾機能有り若しくは有りのフィルタープレスなどの表面フィルター；或いはサンドフィルターなどのデプスフィルター）及び／又は遠心分離を使用して得ることができ；濾過は、例えば、重力、真空若しくはプレス濾過によってなされ得る。ウェットケーキの単離は、任意選択的に、上記のように、それを洗浄することを更に含み得る。本明細書のウェットケーキは、例えば、少なくとも（ｉ）約５０重量％〜９０重量％の水又は水溶液、及び（ｉｉ）約１０重量％〜５０重量％の不溶性α−グルカンを含み得る。いくつかの態様におけるウェットケーキは、例えば、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、１０〜５０、１０〜４０、１０〜３０、１０〜２０、２０〜５０、２０〜４０、２０〜３０、３０〜５０、３０〜４０、４０〜５０、３０〜４５、３５〜４５、３７．５〜４２．５、３５〜４０又は４０〜４５重量％の不溶性α−グルカン（水又は水溶液を最大１００重量％添加）を含み得る。いくつかの態様では、ウェットケーキの水性部分は、本明細書の水溶液について記載されたことに従った溶質及び／又はｐＨプロファイルを有する。
【００８５】
本開示の組成物は、例えば、上記の方法で生成した不溶性α−１，３−グルカンのアグリゲートを含み得る。
【００８６】
本明細書の不溶性α−グルカンのアグリゲートは、例えば、約又は少なくとも約０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、１．６、１．８、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９又は９０重量％の重量％で水性組成物（例えば、コロイド状分散液）などの組成物中に存在することができる。水性組成物の液体成分は、例えば、水又は水溶液であり得る。水溶液の溶媒は、典型的には、水であるか、又は例えば約若しくは少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、９５若しくは９８重量％の水を含み得る。
【００８７】
いくつかの態様における水溶液は、（検出可能な）溶解糖類を有さないか、又は約０．１〜１．５、０．１〜１．２５、０．１〜１．０、０．１〜．７５、０．１〜０．５、０．２〜０．６、０．３〜０．５、０．２、０．３、０．４、０．５若しくは０．６重量％の溶解糖類を有する。このような溶解糖類は、例えば、スクロース、フルクトース、ロイクロース及び／又は可溶性グルコ−オリゴ糖を含み得る。いくつかの態様における水溶液は、１つ以上の塩／緩衝剤（例えば、Ｎａ＋、Ｃｌ−、ＮａＣｌ、ホスフェート、トリス、シトレート）（例えば、０．１、０．５、１．０、２．０又は３．０重量％以下）及び／又は例えば約４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０、８．５、９．０、４．０〜９．０、４．０〜８．５、４．０〜８．０、５．０〜９．０、５．０〜８．５、５．０〜８．０、６．０〜９．０、６．０〜８．５若しくは６．０〜８．０のｐＨを有し得る。
【００８８】
本開示のアグリゲートを含む組成物は、例えば、約又は少なくとも約１０、２５、５０、１００、２５０、５００、７５０、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１００００、１１０００、１２０００、１３０００、１４０００、１５０００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、１０００００、２５００００、５０００００又は１００００００センチポアズ（ｃＰ）の粘度を有し得る。粘度は、粘度計若しくは流動計を使用して、又は当該技術分野において公知の任意の他の手段を使用して測定できる。例えば、約又は少なくとも約１０、６０、１５０、２５０、６００、８００、１０００又は１０〜１０００ｒｐｍ（１分当たりの回転）の回転剪断速度は、本明細書の組成物の粘度を測定する場合に適用され得る。粘度は、任意の好適な温度（例えば、４〜３０、２０〜３０、２０〜２５又は３〜１１０℃）及び／又は任意の好適な圧力（例えば、大気圧、約７６０トル）で測定され得る。
【００８９】
本開示のアグリゲートを含む組成物は、いくつかの態様では、非水性（例えば、乾燥組成物）であり得る。そのような実施形態の例としては、粉末、顆粒、マイクロカプセル、フレーク又は粒状物質の任意の他の形態が挙げられる。他の例としては、例えば、ペレット、バー、カーネル、ビーズ、タブレット、スティック又は他のアグロメレートなどのより大きい組成物が挙げられる。非水性又は乾燥組成物は、典型的にはその中に含まれた３、２、１、０．５又は０．１重量％未満の水を有する。
【００９０】
水性組成物又は非水性組成物（上記）など、本明細書のアグリゲートを含む組成物は、家庭用ケア製品、パーソナルケア製品、工業製品、医薬製品又は食品、例えば米国特許出願公開第２０１６／０３１１９３５号明細書、同第２０１６／０３０４６２９号明細書、同第２０１５／０２３２７８５号明細書、同第２０１５／０３６８５９４号明細書、同第２０１５／０３６８５９５号明細書及び同第２０１６／０１２２４４５号明細書並びに国際公開第２０１６／１６０７３７号パンフレット、同第２０１６／１６０７３８号パンフレット、同第２０１６／１３３７３４号パンフレット及び同第２０１６／１６０７４０（これらは、参照により全て本明細書に組み込まれる）のいずれかに記載されるようなものの形態であり得る。いくつかの態様では、アグリゲートを含む組成物は、前述の刊行物のいずれかで開示されるような家庭用ケア製品、パーソナルケア製品、工業製品、医薬製品又は食品の少なくとも１つの構成成分／成分を含み得る。
【００９１】
本明細書のアグリゲートを含む組成物は、任意選択的に、１つ以上の活性酵素を含有し得る。好適な酵素の非限定的な例としては、プロテアーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、ペルオキシダーゼ、脂肪分解酵素（例えば、金属脂肪分解酵素）、キシラナーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ（例えば、アリールエステラーゼ、ポリエステラーゼ）、ペルヒドロラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ペクチン酸リアーゼ、マンナナーゼ、ケラチナーゼ、レダクターゼ、オキシダーゼ（例えば、コリンオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ）、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、メタロプロテイナーゼ、アマドリアーゼ、ガラクトシダーゼ、ガラクタナーゼ、カタラーゼ、カラギナーゼ、ラクターゼ、ホスファターゼ、ポリガラクツロナーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、トランスグルタミナーゼ、キシログルカナーゼ、キシロシダーゼ、金属プロテアーゼ、アラビノフラノシダーゼ、フィターゼ、イソメラーゼ、トランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ（例えば、本明細書に開示されるような）、アミラーゼ（例えば、グルコアミラーゼ、α−アミラーゼ、β−アミラーゼ）又はこれらの組み合わせが挙げられる。酵素が含まれる場合、酵素は、本明細書の組成物中において、活性酵素として（例えば、純粋酵素タンパク質として計算される）、例えば約０．０００１〜０．１重量％（例えば、０．０１〜０．０３重量％）含まれ得る。
【００９２】
本明細書の組成物中には、少なくとも１つ、２つ又はそれを超えるセルラーゼが含まれ得る。本明細書のセルラーゼは、エンドセルラーゼ活性（ＥＣ３．２．１．４）、エキソセルラーゼ活性（ＥＣ３．２．１．９１）又はセロビアーゼ活性（ＥＣ３．２．１．２１）を有し得る。本明細書のセルラーゼは、セルラーゼ活性を維持するための好適な条件下で活性を有する「活性セルラーゼ」である。そのような好適な条件を決定することは、当該技術分野の技術の範囲内に含まれる。
【００９３】
本明細書のセルラーゼは、細菌又は真菌などの任意の微生物源由来であり得る。化学変性されたセルラーゼ又はタンパク質工学により産出された突然変異体セルラーゼが含まれる。好適なセルラーゼとしては、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）属、ストレプトミセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）属、フミコラ（Ｈｕｍｉｃｏｌａ）属、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）属、チエラビア（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ）属及びアクレモニウム（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）属由来のセルラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。他の例として、セルラーゼは、フミコラ・インソレンス（Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓ）、ミセリオフソラ・サーモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）又はフザリウム・オキシスポルム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）由来であり得る。これら及び他のセルラーゼは、参照により本明細書に全体が組み込まれる米国特許第４４３５３０７号明細書、同第５６４８２６３号明細書、同第５６９１１７８号明細書、同第５７７６７５７号明細書及び同第７６０４９７４号明細書に開示されている。例示的なトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）セルラーゼは、米国特許第４６８９２９７号明細書、同第５８１４５０１号明細書、同第５３２４６４９号明細書並びに国際公開第９２／０６２２１号パンフレット及び同第９２／０６１６５号パンフレットに開示されており、これらの文献は、全て参照により本明細書に組み込まれる。例示的なバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属セルラーゼは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６５６２６１２号明細書に開示されている。例えば、上記のいずれかなどのセルラーゼは、好ましくは、Ｎ末端シグナルペプチドが欠如する成熟形にある。本明細書において有用な市販されているセルラーゼとしては、ＣＥＬＬＵＺＹＭＥ（登録商標）及びＣＡＲＥＺＹＭＥ（登録商標）（Ｎｏｖｏｚｙｍｅｓ  Ａ／Ｓ）；ＣＬＡＺＩＮＡＳＥ（登録商標）及びＰＵＲＡＤＡＸ（登録商標）ＨＡ（ＤｕＰｏｎｔ  Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）並びにＫＡＣ−５００（Ｂ）（登録商標）（花王株式会社）が挙げられる。
【００９４】
１つ以上のセルラーゼは、本明細書に開示した組成物を調製する場合に１つの成分として直接的に添加することができる。代わりに、１つ以上のセルラーゼは、開示した組成物中に間接的に（意図せずに）提供される可能性がある。例えば、セルラーゼは、組成物を調製するために使用される非セルラーゼ酵素調製物中に存在することによって本明細書の組成物中に提供する可能性がある。その中にセルラーゼが間接的に提供されている組成物中のセルラーゼは、例えば、約０．１〜１０ｐｐｂ（例えば、１ｐｐｍ未満）で存在する可能性がある。
【００９５】
織物が処理される水性組成物中のセルラーゼの有効濃度は、当業者が容易に決定することができる。織物ケアプロセスにおいて、セルラーゼは、織物が処理される水性組成物（例えば、洗浄液）中において、例えば最低約０．０１〜０．１ｐｐｍの全セルラーゼタンパク質又は約０．１〜１０ｐｐｂの全セルラーゼタンパク質（例えば、１ｐｐｍ未満）から、最大で約１００、２００、５００、１０００、２０００、３０００、４０００又は５０００ｐｐｍまでの全セルラーゼタンパク質である濃度で存在し得る。
【００９６】
本明細書に開示される組成物及び方法の非限定的例としては、以下が挙げられる。
１．不溶性α−グルカンのアグリゲートを含む組成物であって、アグリゲートは、約５０〜３００ｎｍの平均流体力学的半径及び約１．６〜２．４のフラクタル次元を有し、及び不溶性α−グルカンは、α−１，３−グリコシド結合を含む、組成物。
２．アグリゲートは、樹枝状である、実施形態１に記載の組成物。
３．アグリゲートは、約５０〜１５０ｎｍの平均流体力学的半径を有する、実施形態１又は２に記載の組成物。
４．アグリゲートは、約６０〜１２０ｎｍの平均流体力学的半径を有する、実施形態１、２又は３に記載の組成物。
５．アグリゲートは、約１．９〜２．１のフラクタル次元を有する、実施形態１、２、３又は４に記載の組成物。
６．アグリゲートは、約５〜２５ｎｍの平均サイズを有する不溶性α−グルカンの粒子を含む、実施形態１、２、３、４又は５に記載の組成物。
７．不溶性α−グルカンの個々の分子は、それぞれ少なくとも約６００の重量平均重合度（ＤＰｗ）を有する、実施形態１、２、３、４、５又は６に記載の組成物。
８．アグリゲートのアグロメレートを含み、アグロメレートは、約１〜２００ミクロンの平均サイズを有する、実施形態１、２、３、４、５、６又は７に記載の組成物。
９．アグロメレートは、約１〜１１０ミクロンの平均サイズを有する、実施形態８に記載の組成物。
１０．不溶性α−グルカンは、少なくとも５０％のα−１，３−グリコシド結合を有する、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８又は９に記載の組成物。
１１．不溶性α−グルカンは、少なくとも９０％のα−１，３−グリコシド結合を有する、請求項１０に記載の組成物。
１２．家庭用品、パーソナルケア製品、医薬製品、工業製品又は食品の形態である、実施形態１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０又は１１に記載の組成物。
１３．実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の不溶性α−グルカンのアグリゲートを生成する方法であって、（ａ）少なくとも水、スクロース及び少なくとも約４０％の収率で不溶性α−グルカンを合成するグルコシルトランスフェラーゼ酵素を接触させることと；（ｂ）工程（ａ）で生成された不溶性α−グルカンの分散液を調製することとを含む方法。
１４．工程（ｂ）は、工程（ａ）で生成された不溶性α−グルカンのウェットケーキを調製することと、ウェットケーキを水又は水溶液中に分散させることとを含む、実施形態１３に記載の方法。
１５．実施形態１３又は１４に記載の方法に従って生成された不溶性α−１，３−グルカンのアグリゲートを含む組成物。
【実施例】
【００９７】
以下の実施例において、本開示の実例を更に示す。これらの実施例は、本明細書の特定の好ましい態様を示しているが、単に説明の目的でのみ示されていると理解されるべきである。上述の考察及びこれらの実施例から、当業者であれば、本明細書に開示した実施形態の本質的な特徴を確認することができ、本発明の趣旨及び範囲を逸脱しない範囲において、本明細書に開示した実施形態を様々な使用及び条件に適合させるために様々な変更形態及び修飾形態をなし得る。
【００９８】
実施例１
高収率で不溶性α−１，３−グルカンを生成する非天然グルコシルトランスフェラーゼ
本実施例は、少なくとも４０％の収率で不溶性α−グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素を同定することを記載する。
【００９９】
本実施例におけるアミノ酸置換を調製するために使用されるグルコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、配列番号４（ＧＴＦ６８５５）であり、これは、本質的にはストレプトコッカス・サリバリウス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）ＳＫ１２６（表１を参照されたい）由来の全長野生型グルコシルトランスフェラーゼ（配列番号６２によって表される）のＮ末端がトランケートされた（シグナルペプチド及び可変領域が除去された）バージョンである。配列番号４においてなされる置換は、配列番号４の各アミノ酸残基／位置（配列番号４のＭｅｔ−１残基を除く）が配列番号６２内のアミノ酸残基／位置と適宜に対応するため、天然のアミノ酸残基に対する置換として特徴付けられ得る。少なくともスクロース及び水を含む反応において、配列番号４のグルコシルトランスフェラーゼは、典型的には、約１００％のα−１，３結合及び４００以上のＤＰｗを有するα−グルカンを生成する（例えば、米国特許第８８７１４７４号明細書及び同第９１６９５０６号明細書並びに米国特許出願公開第２０１７／０００２３３６号明細書（これらの文献は、参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。不溶性であるこのα−グルカン生成物は、例えば、濾過を介して酵素的合成後に単離することができる。
【０１００】
単一アミノ酸置換
部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）由来のＧＴＦ６８５５バリアント（各々が表３に記載のような単一アミノ酸置換を有する）は、それぞれ細菌的に発現され、精製され、１００ｐｐｍの濃度に正規化された。次に、α−１，３グルカン合成反応における基質としてスクロースを用いて各酵素調製物を（三重に）選別した。各反応において生成されたα−１，３グルカンポリマーの量を決定することに加えて、可溶性糖生成物（フルクトース、グルコース、ロイクロース、グルコ−オリゴ糖）及び各反応の残留スクロースを約２０時間のインキュベーション後にＨＰＬＣによって分析した。
【０１０１】
各ＧＴＦ（ＧＴＦ６８５５及びその各バリアント）をスクロースとともに反応に投入して、収率及び選択性を測定した。各反応を次のとおり実施した：３７．５μＬの１００ｐｐｍ酵素試料（ＢＳＡ検量線に基づくｐｐｍ）を２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ５．７中の２６２．５μＬの８６ｇ／Ｌスクロース（７５ｇ／Ｌ終濃度）に添加し、３０℃で一晩（約２０時間）インキュベートした。このインキュベーション後、各反応を８０℃で１時間のインキュベーションによりクエンチした。クエンチされた各反応の２００μＬアリコートを、０．４５μｍフィルタープレート（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ０．４５μｍ  親水性）を介して真空濾過し、各濾液をＨＰＬＣ糖分析のための調製物中において５倍希釈した（１０μＬの試料＋４０μＬの２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４／ＮａＨ２ＰＯ４）。これらの反応（約２０時間）のプロファイルが表３において提供される。
【０１０２】
【表５】
2021502436.tif 000008
【０１０３】
【表６】
2021502436.tif 000009
【０１０４】
【表７】
2021502436.tif 000010
【０１０５】
【表８】
2021502436.tif 000011
【０１０６】
表３は、少なくとも４０％の収率で不溶性α−グルカンを合成するのに本明細書で有用な非天然グルコシルトランスフェラーゼを生成するために用いられ得るアミノ酸置換の例を示す。
【０１０７】
複数のアミノ酸置換
要約すると、配列番号４（ＧＴＦ６８５５）に対して、特定の組み合わせのアミノ酸置換を行った。これらの置換は、下の表４及び表５に列記される。
【０１０８】
表４の各バリアント酵素を、以下と同じ又は類似のパラメータを用いてグルカン合成反応に投入した：容器、１２０ｒｐｍで撹拌される２５０ｍＬのくぼみ付き振盪フラスコ；初期ｐＨ、５．７；反応容量、５０ｍＬ；スクロース、７５ｇ／Ｌ；ＧＴＦ、酵素を異種性発現する大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞の１．５ｍＬの溶解物；ＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ；温度、３０℃；時間、約２０〜２４時間。
【０１０９】
表５の各バリアント酵素を、以下と同じ又は類似のパラメータを用いてグルカン合成反応に投入した：容器、ガラス撹拌棒上にテフロン（Ｔｅｆｌｏｎ）（登録商標）刃傾斜タービン（４５°角）を備え、５０〜２００ｒｐｍで撹拌した５００ｍＬのジャケット付き反応器；初期ｐＨ、５．５；反応容量、５００ｍＬ；スクロース、１０８ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、１ｍＭ；温度、３９℃；時間、約１８〜２４時間；前のα−１，３−グルカン合成反応からの濾液、５０体積％。
【０１１０】
これらの反応のα−１，３−グルカン収率（上記と同様に測定された）を表４及び表５に示す。
【０１１１】
【表９】
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【０１１２】
【表１０】
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【０１１３】
表４及び表５は、少なくとも４０％の収率で不溶性α−グルカンを合成するのに本明細書で有用な非天然グルコシルトランスフェラーゼを生成するために用いられ得るアミノ酸置換のセットの例を示す。
【０１１４】
したがって、少なくとも４０％の収率で不溶性α−グルカンを合成する非天然グルコシルトランスフェラーゼ酵素が同定された。例えば、これらの酵素を使用し、下記実施例２で見られるような、本明細書のアグリゲートを生成するために不溶性α−グルカンを合成することができる。
【０１１５】
実施例２
不溶性α−グルカンのアグリゲート及びアグロメレートの調製及び分析
本実施例は、不溶性α−グルカンアグリゲートの調製及び分析を記載する。実施例１（上記）で記載されるような非天然グルコシルトランスフェラーゼによって触媒される反応において合成された不溶性α−１，３−グルカンを分散させることにより、これらのアグリゲートを調製した。
【０１１６】
グルカン合成反応は、５０〜９５％の収率（反応のグルコシル成分に基づく）で不溶性α−１，３−グルカンを生成する、実施例１に記載のグルコシルトランスフェラーゼ酵素を用いて調製された。実施例１に記載されているものと同様の方法によって反応を実施した。各反応に続き、各α−１，３−グルカン生成物（不溶性、約１００％α−１，３結合）の試料を濾過し、洗浄して、ほとんどのフルクトース及び他の残留糖類を除去し、濾過装置を使用して、約１０〜４０重量％の固形物に加工した。得られたグルカン濾過ケーキ（「ウェットケーキ」）は、約９０〜７５重量％の水を含有し、乾燥させなかった。場合により、濾過ケーキは、約０．４重量％の糖類を有することがわかった。
【０１１７】
個々のα−１，３−グルカン生成物の分散液を、水で希釈したウェットケーキ（１００：１  水：試料）をボルテックスすることにより調製した。次いで、各分散液を処理し、以下のとおりに分析した。
【０１１８】
分散液（２０ｍＬ）を、分割したばかりのマイカ上に堆積させ、３０秒間放置し、次いで５０００ｒｐｍで３０秒間スピンオフした。次いで、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）を使用して、堆積したアグリゲート化構造を画像化した。この画像は、当初、高度にアグリゲート化した球状粒子を示しているように見えたが、更なる分析により、アグリゲート化した粒子は、伸張した棒状粒子を含むことが認められた。一次粒子は、高さプロファイルに一連のバンプを使用して、画像を横断してラインスキャンすることにより測定することができた。このプロファイルから、横方向の粒径を約３０ｎｍであると測定することができた。この測定は、プローブの横幅によって渦巻き状になっているため、過大評価である可能性が非常に高い。ＡＦＭ画像は、粒子サイズが均一であることも示した。
【０１１９】
第２の試料を透過電子顕微鏡（ＴＥＭ）グリッド上で同様に調製し、分散液を乾燥させることで粒子を堆積させた。ＴＥＭ画像は、球状及び棒状粒子のアグリゲートを示した。これらの粒子のサイズは、かなり均一に見えた。球状粒子は、画像から直径約６．５ｎｍであると推定された。粒子は、機器の真空中で過度に乾燥することから高度にアグリゲート化するため、確実な測定は、困難であった。確実に、調製条件のため、重合したままのグルカンの元の大きい表面積及び非常に開いた構造が崩壊して高度にアグリゲート化した構造を形成し、次いでこれが画像に記録された。このＴＥＭの結果は、一次粒子のいくつかが球状であり、サイズが均一であり、且つ直径約１０ｎｍであることを示すのに有用であった。しかし、粒子間の制限を覆い隠し、おそらく個々の粒子のサイズを変更する構造的崩壊により、サイズの正確な測定が困難であったことに注意されたい。
【０１２０】
アグリゲート化したα−１，３−グルカンについてのＴＥＭ画像をカーボンブラック及びヒュームドシリカについてのＴＥＭ画像と比較した。シリカ粒子は、グルカンの粒子よりも大きく（約１５ｎｍ）見えるいくらかのアグリゲーションを示し、より大きい多分散性を示した。α−１，３−グルカンとカーボンブラックとの間の比較を同じ粒径で実施したが、カーボンブラック試料は、直径約３０ｎｍで多分散性が高かった。α−１，３−グルカン、カーボンブラック及びシリカのＴＥＭ画像の比較から導き出せる最も強力な結論は、これらの３つの材料の粒子形状が球状であるということである。これらの観察にも関わらず、アグリゲートのα−１，３−グルカン粒子は、棒状の形状でもあり得ることが（上で）認められてきた。
【０１２１】
α−１，３−グルカン、カーボンブラック及びシリカの球状粒子についてのＴＥＭ画像を、米国特許出願公開第２０１７／０３２７８５７号明細書及び国際公開第２０１６１０６０１１号パンフレット（両方の参考文献は、参照により本明細書に組み込まれる）で開示されるように生成された酵素的重合化セルロースにより形成される小平板状粒子と比較した。セルロース鎖の重合度は、低かった（約１５ＤＰｗ）。セルロースの分散液を乾燥させることにより、試料調製の同様の手順（上記）を実施した。平坦なマイカ表面上で乾燥させると、酵素的重合化セルロースは、小平板を形成した。小平板は、表面に平らに置かれ、多面的に見えた。小平板の平坦な表面は、大きく且つ非対称であり、約１００ｎｍのサイズで２：１よりも大きいアスペクト比を有していた。これらの平坦な粒子は、紛れもなく非球状であった。酵素的重合化セルロース材料のフィルムは、透明である一方、α−１，３−グルカンによって形成されたフィルムは、不透明であった。この違いは、α−１，３−グルカンのアグリゲート及びアグロメレートによるものであり、これは、光を散乱させ、観察された不透明度を生じさせる。しかし、セルロースフィルムの透明性は、フィルム形成中に生じる小平板の積層の完全性による。上記で提供された情報から、α−１，３−グルカンの一次粒子の形状が球状であることに疑いはほとんどない。これらの観察にも関わらず、アグリゲートのα−１，３−グルカン粒子は、棒状の形状でもあり得ることが（上で）認められてきた。
【０１２２】
小角Ｘ線散乱及び中性子散乱（ＳＡＸＳ、ＳＡＮＳ）は、一次粒子及びアグリゲートのサイズを測定するのに使用され得る分析技術である。顕微鏡法と異なり、散乱は、高解像度の顕微鏡測定でサンプリングされたはるかに小さい体積（約１０−９ｍｍ３）と比較して大きい体積（約１ｍｍ３）を平均する。顕微鏡法は、粒子形状を特定するのに有用であるが、散乱は、平均粒径を測定するのに有用である。ＳＡＸＳデータから粒径を測定するための正則化及び最大エントロピー法の使用は、十分に文書化されている（Ｉｌａｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｊｅｍｉａｎ，２００９，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．４２：３４７−３５３；Ｊｅｍｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｃｔａ  Ｍｅｔａｌｌ．Ｍａｔｅｒ．３９：２４７７−２４８７；両方が参照により本明細書に組み込まれる）。上記の方法論に従って調製されたα−１，３−グルカンの２重量％分散液からＳＡＸＳデータを収集した。角度２θで散乱した波長λの入射Ｘ線放射に対して、散乱強度対散乱ベクトルの大きさ、０．００１５≦ｑ（＝４πｓｉｎθ／λ）≦０．４Å−１の二重対数プロットが作成された。本研究に含まれる試料を表６に列挙した。同様の散乱プロファイルは、これらの試料の全てについて観察された。最大ｑのデータは、材料の最小フィーチャからの散乱に対応する。Ｉ約ｑ−４の末端依存性を有する明確なポロッド（Ｐｏｒｏｄ）範囲は、０．０５≦ｑ≦０．２Å−１の範囲内で観察された。この依存性は、鋭い界面を有する粒子の存在によるものである。明確なギニエ（Ｇｕｉｎｉｅｒ）領域は、０．０２≦ｑ≦０．０５Å−１の範囲内で観察され、これは、以下でより詳細に指定されているように、直径約１５ｎｍの一次粒径によるものである。０．００２≦ｑ≦０．０２Å−１の範囲内でＩ約ｑ−２の依存性が観察され、これは、１０〜１００ｎｍの長さスケール内のアグリゲートからの散乱に対応する。最大エントロピー法（Ｉｌａｖｓｋｙ  ａｎｄ  Ｊｅｍｉａｎ，２００９；Ｊｅｍｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）をこれらのデータに適用した。０．０１≦ｑ≦０．１Å−１の範囲内のデータは、この分析に含まれ、前に指定したギニエ範囲を括弧でくくった。この手順から得られた体積粒径分布関数は、対数正規形状に近似し、これは、体積分布対粒子直径の線形対数プロットにおいてガウス分布を有した。各試料の中央値を表６で表にした。表にされた中央値全ての平均は、１２．３ｎｍである。この一次粒径の測定値は、３０ｎｍのＡＦＭ値及び６．５ｎｍのＴＥＭ値の中間値である（上記）。これらの分布の半値全幅は、約１４ｎｍであり、±７ｎｍの分散度についての推定値を得た。±７ｎｍの分散度は、フーリエ変換手順により引き起こされる過大評価である。サイズ及び分散度の値は、別法を用いて以下に記述した。
【０１２３】
【表１１】
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【０１２４】
広範囲の散乱ベクトルの大きさ、３×１０−５≦ｑ≦０．４Å−１（１ｎｍ〜１０μｍの長さスケールの範囲に対応する）の範囲内でデータを収集した。Ｘ線又は中性子線源で動作する小角及び超小角の機器を使用し、これらのデータを収集した（ＳＡＸＳ、ＵＳＡＸＳ、ＳＡＮＳ、ＵＳＡＮＳ）。これらの機器は、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｈｏｔｏｎ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｃｈｉｃａｇｏ近郊、ＩＬ）、ＮＩＳＴ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｎｅｕｔｒｏｎ  Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）及びＥｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｓｔａｔｉｏｎ（Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＤＥ）においてシンクロトロンで設置されていた。最大ｑのデータは、材料の最小フィーチャからの散乱に対応する。Ｉ約ｑ−４の末端依存性を有する明確なポロッド範囲は、０．０５≦ｑ≦０．２Å−１の範囲内で観察された。この依存性は、鋭い界面を有する粒子の存在によるものである。明確なギニエ領域は、０．０２≦ｑ≦０．０５Å−１の範囲内で観察され、これは、直径約１５ｎｍの一次粒径によるものである。０．００２≦ｑ≦０．０２Å−１の範囲内でＩ約ｑ−２の依存性が観察され、これは、１０〜１００ｎｍの長さスケール内のアグリゲートからの散乱に対応する。３×１０−５≦ｑ≦０．００２Å−１の範囲内でＩ約ｑ−３の依存性が観察され、これは、１００ｎｍ〜１０μｍの長さスケール内のアグリゲートからの散乱に対応する。アグリゲート及びアグロメレートの内部構造は、これらの散乱対象のフラクタル次元として特定される二重対数プロットの傾きから推定できる。１０〜１００ｎｍの長さスケール内のアグリゲートは、本質的に樹枝状である一方、アグロメレートは、空間充填されている。
【０１２５】
表７に列挙されている試料のデータは、Ｂｅａｕｃａｇｅ（１９９５，Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔ．２８：７１７−７２８；参照により本明細書に組み込まれる）のユニバーサルフィット法に従ってフィッティングした。一次粒子の旋回半径（Ｒｇ１）は、フィッティングされたパラメータの１つであった。フラクタル次元であるＦＤ２は、この手順によっても決定され、このパラメータの結果を以下に議論する。これらのパラメータを表７で表にした。
【０１２６】
【表１２】
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【０１２７】
データフィッティングは、数回実施され、フィッティングされたパラメータについて表７に示されているエラーは、フィッティングされた値の平均二乗偏差から決定された。Ｒｇ１についてのボックスプロットは、中央の２つの四分位数が５．５〜６．５ｎｍであることを示し、そのため、Ｒｇ１は、６ｎｍ前後に狭く分布することを示す。粒子形状が球状であると仮定すると、一次粒径の直径Ｄは、１５．５±１．５ｎｍである。引用された誤差は、表にした値の±標準偏差に対応する。球状粒子について、旋回半径と直径との間の関係は、
【数２】
2021502436.tif 000016
である。単一α−１，３−グルカン鎖が８００ＤＰｗの重合度を有すると仮定される場合、一次粒子１つ当たりの鎖の数は、表８で示されるように、約１０±３である。１つの一次粒子当たりの８００ＤＰｗという鎖の数は、粒径が１５．５ｎｍの場合には約１３という多いものであり得るか、又は粒径が１２．３ｎｍの場合には鎖が６つという少ないものであり得、これは、最大エントロピー法から上記で決定された直径であった。１４．３ｎｍの中間直径に関して、小球１つ当たり８００ＤＰｗ鎖の計算数は、１０である。一次粒子１つ当たりの鎖の数の計算において、粒子は、１．４ｇ／ｃｃの密度を有する球状小球であると仮定され、これは、１．６ｇ／ｃｃの結晶密度に基づく非晶質α−１，３−グルカンの密度の推定値（約８５％）である。これらの計算にも関わらず、アグリゲートのα−１，３−グルカン粒子は、棒状の形状でもあり得ることが（上で）認められてきた。
【０１２８】
【表１３】
2021502436.tif 000017
【０１２９】
１０〜１００ｎｍの長さスケール内のアグリゲートのフラクタル次元であるＦＤ２の値を表７で表にした。パラメータＦＤ２の周波数プロットを作図した。アグリゲートのフラクタル次元は、２を超えるとほぼ均一に分布するが、２未満の値は、記録されなかった。一次球状粒子の拡散によって形成されるアグリゲートのコンピュータシミュレーションからの典型的な樹枝状構造を図１に示す。アグリゲーションプロセスが拡散により制限されるか又はアグリゲーションプロセスにより制限されるかに応じて、構造は、わずかに異なる。それらの典型的なフラクタル次元は、それぞれ１．７１及び２．３であるが、これらの値の範囲内の変動は、シミュレーションの仮定に応じて発生する。これらのシミュレーションからの樹枝状構造及びフラクタル次元は、ヒュームドシリカ又はカーボンブラックを有するなどのコロイドアグリゲーションで観察されるものの典型である。したがって、コロイドアグリゲーションの結果に基づく同様の推論により、グルカンアグリゲートの構造によって約２の制限値が課せられるため、２未満の値が観察されなかった（表７）と推測することができる。アグリゲートのサイズ分布は、多分非常に高度に多分散性である。２より大きいフラクタル次元の近似値は、１０〜１００ｎｍの長さスケール内の小さいアグリゲートのアグロメレートから発生した可能性があり、ＦＤ２のより大きい値に向かって近似にバイアスをかける。
【０１３０】
高剪断（マイクロ流動化装置の剪断速度約１０７ｓ−１）を、アグロメレート領域内の大きい強度を特徴とする分散したα−１，３−グルカン試料に適用した。剪断前に、５×１０−３≦ｑ≦０．０２Å−１の範囲内でＩ約ｑ−２の依存性が観察され、３×１０−４≦ｑ≦５×１０−３Å−１の範囲内でＩ約ｑ−４の依存性が観察された。剪断後に、３×１０−４≦ｑ≦０．０２Å−１の最大範囲内でＩ約ｑ−２の依存性が観察され、Ｉ約ｑ−４依存性が消失した。剪断は、アグロメレートの強度を低下させる効果があり、アグリゲートから生じる散乱の範囲は、Ｉ約ｑ２に依存して、少なくともディケードのより低いｑに拡大された。これらの結果は、アグロメレートがアグリゲートに比べて比較的不安定であることを示した。剪断適用後、アグリゲートは、残存するが、剪断は、アグロメレートを分散させる効果があった。
【０１３１】
Ｍａｓｔｅｒｓｉｚｅｒ（登録商標）２０００（Ｍａｌｖｅｒｎ）からの光散乱の結果は、表９で見られるように、α−１，３−グルカン構造の階層型モデルも支持する。超音波処理されていないグルカン試料（約２０μｍ）のアグロメレート粒径は、１５ｍＬの脱イオン水中で３分間の超音波処理（９ｋＪ／ｋｇ）で約１桁（約３μｍまで）減少した。
【０１３２】
【表１４】
2021502436.tif 000018
【０１３３】
超音波処理は、一般に、光散乱により測定した際、フロック及びアグロメレートサイズを減少させる効果を有した。上記のように調製及び超音波処理（９ｋＪ／ｋｇで３分）したα−１，３−グルカン分散液は、メジアン径（Ｄ５０）約４．３μｍのアグロメレートをもたらした。超音波処理前は、Ｄ５０が２１．１μｍであった。超音波処理パワーの関数としてのアグロメレートサイズは、超音波処理前のＤ５０が約２５μｍであると記録された非常に大きいα−１，３−グルカンアグロメレートを粉砕するには、約１０ｋＪ／ｋｇの最小比エネルギーが必要である可能性があることを示した。約１０ｋＪ／ｋｇで始まり、超音波処理の比エネルギーが増大すると、測定されたアグロメレートＤ５０は、減少し、１ＭＪ／ｋｇを超える電力設定で約５μｍにおいて安定した。高い周波数の超音波処理は、測定されたアグロメレートサイズに大きい影響を与えた。概して、これらの結果は、α−１，３−グルカンアグロメレートが高度に多分散性及び不安定であり、それらのサイズが剪断及び超音波処理の影響を受け得ることを示す。
【０１３４】
α−１，３−グルカン分散液の内部構造は、表１０に示すように、液体クロマトグラフィーシステムに接続されるか（オンライン）又はカラムなしで使用される（オフライン）かのいずれかである、様々な検出器よって分析される。
【０１３５】
【表１５】
2021502436.tif 000019
【０１３６】
クロマトグラフィーシステムには、流体力学クロマトグラフィーモードで最大１ミクロンのサイズ分離を行うためのシリカ系モノリシックカラムが装備されていた。このようなモノリシックカラムは、１つのカラムで高い透過性（２〜３μｍ直径）及び大きい表面積（直径最大５０ｎｍ）の両方を達成する二峰性多孔質構造体を含む。
【０１３７】
０．１ｍｇ／ｍＬのα−１，３−グルカンの分散液を４０分間超音波処理（９ｋＪ／ｋｇ）した。アグリゲートのサイズ分布（ＰＳＤ’ｓ）は、超音波処理後、０、３６０及び１４４０分でＤＬＳによりオフラインで測定した。測定されたＰＳＤ’ｓは、狭く（約±１５％の分散度）、それぞれ１１１、１８０及び２７１ｎｍという約平均粒径値（Ｒｈで）で分布した。１．２μｍ  Ａｃｒｏｄｉｃｋ（商標）メンブレンに通して、このような分散液をタール化アルミニウムプレート上に濾過すると、材料が１０％のみ失われたことが示された。
【０１３８】
Ｒｈ＝１８０ｎｍ（１ＤＬＳ当たり）を有する多糖分散液を、モノリスカラム及び表１０に列挙された３つのオンライン検出器を装備した三重検出クロマトグラフィーシステムに注入した。比較のために、粒子直径の異なる（３００ｎｍ及び４００ｎｍ）ポリスチレン球の２つの分散液も０．１ｍｇ／ｍの濃度で調製し、同じクロマトグラフィーシステムに注入した。直径Ｄを有する固体球の場合、
【数３】
2021502436.tif 000020
及び
【数４】
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である。
【０１３９】
したがって、直径４００ｎｍ及び３００ｎｍの球体は、それぞれＲｈ＝１９４ｎｍ及び１４５ｎｍを有する。より小さいポリスチレン粒子（３００ｎｍ）が後にカラムから溶出し、続いてグルカン分散液及びより大きい粒子（４００ｎｍ）が溶出することが観察され、流体力学的クロマトグラフィーモードでサイズによる分離が確認された。
【０１４０】
超音波処理された（４０分）α−１，３−グルカン分散液の内部構造（フラクタル次元）は、構造パラメータ
【数５】
2021502436.tif 000022
により特徴付けられ、これは、フラクタル次元に反比例する。表１１に示されるように、ρは、低いフラクタル次元を有するオープン構造が増えると増加する。更に、静的光散乱強度の角度依存性は、分散した対象の立体構造を特徴付けるようにも使用され得る。
【０１４１】
【表１６】
2021502436.tif 000023
【０１４２】
構造パラメータρ及び散乱強度の角度依存性による配座解析の実施例として、２つの非常に異なる散乱対象を比較した。６０ｎｍ直径ポリスチレン（ＰＳ）球の分散液を０．１ｍｇ／ｍＬで調製した。この剛体球の分散液を０．１ｍｇ／ｍＬで４００ｋＤａのプルラン鎖の分散液と比較した。これらの分散液は、非常に異なるフラクタル次元の対象を含み、モノリシックカラム技術（上記）により分離された。散乱強度を濃度対
【数６】
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で割ったプロットを、角度θによって散乱された光について、溶出プロファイルの頂点で収集されたＭＡＬＳデータから作成した。固体球の場合、頂点は、溶出時間の１８．６分で発生し、プルラン鎖について、頂点は、１９．４分におけるものであった。したがって、予想どおり、散乱プロファイルは、ＰＳ球の場合には固体球のモデル、プルランの場合にはランダムコイルのモデルによって非常によくフィッティングした（ＡＳＴＲＡ（商標）ソフトウェア、Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ））。決定係数は、いずれの近似でもＲ２＝０．９９よりも高かった。ポリスチレン球に関するＭＡＬＳ（ＤＬＳ）からのＲｇ（Ｒｈ）の測定値は、２６．４（３４）ｎｍであり、ρ＝０．７８を得た（これは、表９の期待値０．８と一致する）。２４（１４）ｎｍのプルランＲｇ（Ｒｈ）値について、ρ＝１．７の値を得た（これは、オープン構造を説明し、表１１のランダムコイルに対応する値と一致する）。
【０１４３】
超音波処理されたα−１，３−グルカン分散液のモノリシック分離をＰＳ球及びプルランの分散液と同じ方法により試験した（上記）。０．１ｍｇ／ｍＬで調製されたα−１，３−グルカン分散液を４０分間超音波処理（９ｋＪ／ｋｇ）した後、６時間分析した。測定で３５６（２０１．３）ｎｍのＭＡＬＳ（ＤＬＳ）からのＲｇ（Ｒｈ）の平均値及びρ＝１．７７を得た。ＰＳＤは、非常に狭く、散乱プロファイルは、ランダムコイル（Ｒ２＝０．９９）の機能的な形態に非常によくフィッティングし、固体球の機能的な形態に全くフィッティングしなかった。これらの調査結果は、本明細書の構造であるα−１，３−グルカンアグリゲートが非常にオープンであり、フラクタル次元が低いことを示す。
【図１】
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【国際調査報告】
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