(57)【要約】  本発明は、高発現株を迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクター、及び高発現株を迅速にスクリーニングする方法を提供する。前記方法は、外因性の赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ）と、アスペルギルス・フミガーツスの細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド（ＡｆＭＰ１）とを融合発現し、この融合遺伝子（ＤｓＲｅｄ−ＡｆＭＰ１）をトリコデルマ・リーゼイのゲノムに統合して、トリコデルマ・リーゼイの表面に赤色蛍光タンパク質が表示される菌株を構築する。表面に赤色蛍光タンパク質が表示されるトリコデルマ・リーゼイ菌株がフローサイトメーターでスクリーニングされることにより、セルラーゼ活性の向上に有益な遺伝子変化を迅速にスクリーニングすることができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子発現カセットにおいて上流から下流まで、ｃｂｈ１プロモーター、赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄ、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子ＡｆＭｐ１及びｃｂｈ１ターミネーターという要素が順に含まれ、ここで、ＤｓＲｅｄ遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示され、ＡｆＭｐ１遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されることを特徴とする、セルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクター。
【請求項２】
請求項１に記載のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクターを含む組換えトリコデルマ・リーゼイ。
【請求項３】
請求項１に記載のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクターの応用。
【請求項４】
ｃｂｈ１プロモーター、赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄ、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子ＡｆＭｐ１及びｃｂｈ１ターミネーターという要素が含まれている遺伝子発現カセットをプラスミドに導入することにより、組換え発現ベクターを得るステップであって、ここで、ＤｓＲｅｄ遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示され、ＡｆＭｐ１遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるステップ（１）と、
前記ステップ（１）で構築された前記組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、組換え株を得るステップ（２）と、
前記組換え株を培養し、前記組換え株の表面に赤色蛍光タンパク質の発現を誘導するステップ（３）と、
赤色蛍光を示す前記組換え株をスクリーニングするステップ（４）と、
を含むことを特徴とする組換えトリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法。
【請求項５】
前記ステップ（４）において、表面に赤色蛍光を示す前記組換え株をフローサイトメーターでスクリーニングすることを特徴とする請求項４に記載の組換えトリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法。
【請求項６】
ｃｂｈ１プロモーター、赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄ、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子ＡｆＭｐ１及びｃｂｈ１ターミネーターという要素が含まれている遺伝子発現カセットをプラスミドに導入することにより、組換え発現ベクターを得るステップであって、ここで、ＤｓＲｅｄ遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示され、ＡｆＭｐ１遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるステップ（１）と、
前記ステップ（１）で構築された前記組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、組換えトリコデルマ・リーゼイを得るステップ （２）と、
前記ステップ（２）で得られた前記組換えトリコデルマ・リーゼイに、タンパク質分泌の経路関連遺伝子を導入するか、又は、前記ステップ（２）で得られた前記組換えトリコデルマ・リーゼイにベクター又は遺伝子をランダムに挿入することにより、前記組換えトリコデルマ・リーゼイの変異体ライブラリーを得るステップ （３）と、
表面に強烈な赤色蛍光を示す前記組換えトリコデルマ・リーゼイをフローサイトメーターでスクリーニングするステップ （４）と、
前記ステップ（４）でスクリーニングされた前記組換えトリコデルマ・リーゼイのセルラーゼ酵素活性を測定し、セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換えトリコデルマ・リーゼイを取得するステップ（５）と、
を含むことを特徴とする高酵素活性のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法。
【請求項７】
前記ステップ（３）において、前記タンパク質分泌の経路関連遺伝子は、ｂｉｐ１遺伝子、ｈａｃ１遺伝子、ｆｔｔ１遺伝子、ｓｓｏ２遺伝子、ｓａｒ１遺伝子及びｙｐｔ１遺伝子を含むことを特徴とする請求項６に記載の高酵素活性のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法。
【請求項８】
前記ステップ（３）において、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介を介して前記組換えトリコデルマ・リーゼイを形質転換することにより、前記組換えトリコデルマ・リーゼイの変異体ライブラリーを得ることを特徴とする請求項６に記載の高酵素活性のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法。
【請求項９】
赤色蛍光タンパク質遺伝子と、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子とのＤｓＲｅｄ−ＡｆＭＰ１融合遺伝子が含まれている組換え発現ベクターを構築するステップであって、ここで、ＤｓＲｅｄ遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示され、ＡｆＭｐ１遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるステップ（１）と、
前記ステップ（１）で構築された前記組換え発現ベクターを用いて菌株を形質転換することにより、組換え株を得るステップ（２）と、
前記ステップ（２）で得られた前記組換え株に、スクリーニング待ちの標的遺伝子を導入するか、又は、前記ステップ（２）で得られた前記組換え株にベクター又は遺伝子をランダムに挿入することにより、前記組換え株の変異体ライブラリーを得るステップ（３）と、
表面に赤色蛍光を示す前記組換え株をフローサイトメーターでスクリーニングするステップ（４）と、
前記ステップ（４）でスクリーニングされて表面に赤色蛍光を示す前記組換え株のセルラーゼ酵素活性を測定し、セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換え株を取得するステップ（５）と、
セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換え株に発現される外因性標的遺伝子、又は干渉された内因性遺伝子を特定して、セルラーゼ酵素活性の向上に関係するタンパク質分泌の経路関連遺伝子を取得するステップ（６）と、
を含むことを特徴とするセルラーゼ酵素活性の向上に関係するタンパク質分泌の経路関連遺伝子を迅速にスクリーニングする方法。
【請求項１０】
前記組換え株は、トリコデルマ・リーゼイであることを特徴とする請求項９に記載のセルラーゼ酵素活性の向上に関係するタンパク質分泌の経路関連遺伝子を迅速にスクリーニングする方法。
【請求項１１】
前記タンパク質分泌の経路関連遺伝子は、ｂｉｐ１遺伝子、及びｈａｃ１遺伝子のうち少なくとも１つを含むことを特徴とする請求項９に記載のセルラーゼ酵素活性の向上に関係するタンパク質分泌の経路関連遺伝子を迅速にスクリーニングする方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、農業生物学の技術分野に関する。具体的には、組換え株を迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクター及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
植物細胞壁は、主にセルロース（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、ヘミセルロース（ｈｅｍｉｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）及びリグニン（ｌｉｇｎｉｎ）から構成される。ここで、細胞壁を構築する主成分としてのセルロースは、８０００〜１００００個のグルコースがβ−１，４−グリコシド結合を介して連結される天然の線状高分子ポリマーであり、その基本単位がセロビオースである。植物細胞壁のセルロース多糖類を発酵性の単純なオリゴ糖及び単糖（例えば、グルコース）に分解するには、複雑なセルラーゼ酵素系の相乗効果が必要である。
【０００３】
トリコデルマ・リーゼイは、主要な糸状菌の１つであり、セルラーゼを分泌する強力な性能を持っている。工業上、改良されたトリコデルマ・リーゼイは、セルラーゼの産出量１００ｇ／Ｌ以上に達することができるので、植物細胞壁多糖類の分解及び関連用途において重要な応用価値を有する。
【０００４】
トリコデルマ・リーゼイのセルラーゼ系は、２つのエキソセルラーゼと、５つのエンドセルラーゼと、１つのβ−グルコシダーゼと、３つの溶解性多糖モノオキシゲナーゼ（ｌｙｔｉｃ ｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ ｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ、ＬＰＭＯｓ、即ち、元ＧＨ６１ファミリーの一つ）とを含む。
【０００５】
トリコデルマ・リーゼイの遺伝子操作システムの継続的な最適化に伴い、形質転換効率については基本的に産業界のニーズを満たせるが、大量の形質転換体が得られた際に、標的タンパク質を効率的に発現する形質転換体をどのようにスクリーニングするかが問題の鍵となる。トリコデルマ・リーゼイは、糸状菌であり、一般的な単一の純粋なコロニーと異なる多核コロニーであり、多核菌糸が絡み合って形成された定数群体のような構造である。高い偽陽性率の背景を持つ形質転換プレートから純粋な形質転換体を得るために、繁雑な単胞子分離プロセスにより単核胞子を分離する必要がある。このため、遺伝改良の期間が過度に長くなり、ひいては高発現株のスクリーニングに手間がさらにかかる。
【０００６】
フローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）は、液流中の単一細胞又は他の生物学的粒子を迅速に定量分析／スクリーニングする技術である。フローサイトメーターは、何万もの細胞を高速で分析し、１つの細胞から複数の細胞特性パラメータを同時に測定して定性的又は定量的分析を実行することができ、高速、高精度、高正確性などの特徴がある。しかしながら、従来のフロー検出技術は、転写段階に影響を与える調節因子の変化しか検出できず、転写段階の後期における調節因子の変化を検出することができない。トリコデルマ・リーゼイセルラーゼは、転写、翻訳、輸送、グリコシル化修飾などの複数の重要なステップの後、細胞内発現でなく、分泌発現を実行する。従って、転写性能の変化しか検出できない従来のフロー検出技術は、酵素活性が向上したセルラーゼをスクリーニングする要件に満たしていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
酵素活性が向上したトリコデルマ・リーゼイ形質転換体を迅速にスクリーニングすることができないという従来技術の課題を解決するために、本発明は、組換え株を迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクター、迅速スクリーニング方法及びその応用を提供する。本発明は、トリコデルマ・リーゼイセルラーゼの高収量株を迅速にスクリーニングすることができ、スクリーニング時間を大幅に短縮し、スクリーニングの効率を向上させ、実際の生産ニーズを満たすように高収量の純粋な形質転換体が得られる。
【０００８】
本発明の目的は、高発現株を迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクターを提供することである。
【０００９】
本発明の別の目的は、前記組換え発現ベクターを含む組換え株を提供することである。
【００１０】
本発明の別の目的は、セルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法を提供することである。
【００１１】
本発明の別の目的は、高酵素活性のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法を提供することである。
【００１２】
本発明の具体的な実施形態によれば、高発現株を迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクターは、前記組換え発現ベクターの遺伝子発現カセットにおいて上流から下流まで、ｃｂｈ１プロモーター、赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄ、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子ＡｆＭｐ１及びｃｂｈ１ターミネーターという要素が順に含まれ、ここで、ＤｓＲｅｄ遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示され、ＡｆＭｐ１遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示される。
【００１３】
ｃｂｈ１プロモーターのヌクレオチド配列が次のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示される。
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【００１４】
ＤｓＲｅｄ遺伝子のヌクレオチド配列が次のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示される。
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【００１５】
ＡｆＭｐ１遺伝子のヌクレオチド配列が次のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示される。
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【００１６】
ｃｂｈ１ターミネーターのヌクレオチド配列が次のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示される。
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【００１７】
本発明は、高発現株を迅速にスクリーニングするための組換え発現ベクターの組換え株をさらに提供する。前記組換え株は、トリコデルマ・リーゼイであることが好ましい。
【００１８】
本発明は、組換えトリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法をさらに提供する。前記方法は、
ｃｂｈ１プロモーター、赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄ、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子ＡｆＭｐ１及びｃｂｈ１ターミネーターという要素が含まれている遺伝子発現カセットをプラスミドに導入することにより、組換え発現ベクターを得るステップであって、ここで、ＤｓＲｅｄ遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示され、ＡｆＭｐ１遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるステップ（１）と、
前記ステップ（１）で構築された前記組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、組換え株を得るステップ（２）と、
前記組換え株を培養し、前記組換え株の表面に赤色蛍光タンパク質の発現を誘導するステップ（３）と、
赤色蛍光を示す前記組換え株をスクリーニングするステップ（４）と、を含む。
【００１９】
本発明の具体的な実施形態によれば、表面に赤色蛍光を示す前記組換え株はフローサイトメーターでスクリーニングされる。
【００２０】
本発明は、高酵素活性のセルラーゼ高発現トリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法をさらに提供する。前記方法は、
ｃｂｈ１プロモーター、赤色蛍光タンパク質遺伝子ＤｓＲｅｄ、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子ＡｆＭｐ１及びｃｂｈ１ターミネーターという要素が含まれている遺伝子発現カセットをプラスミドに導入することにより、組換え発現ベクターを得るステップであって、ここで、ＤｓＲｅｄ遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示され、ＡｆＭｐ１遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるステップ（１）と、
前記ステップ（１）で構築された前記組換え発現ベクターを用いて宿主細胞を形質転換することにより、組換えトリコデルマ・リーゼイを得るステップ（２）と、
前記ステップ（２）で得られた前記組換えトリコデルマ・リーゼイに、タンパク質分泌の経路関連遺伝子を導入するか、又は、前記ステップ（２）で得られた前記組換えトリコデルマ・リーゼイにベクター又は遺伝子をランダムに挿入することにより、前記組換えトリコデルマ・リーゼイの変異体ライブラリーを得るステップ（３）と、
表面に強烈な赤色蛍光を示す前記組換えトリコデルマ・リーゼイをフローサイトメーターでスクリーニングするステップ（４）と、
前記ステップ（４）でスクリーニングされた前記組換えトリコデルマ・リーゼイのセルラーゼ酵素活性を測定し、セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換えトリコデルマ・リーゼイを取得するステップ（５）と、を含むことを特徴とする。
【００２１】
本発明の具体的な実施形態によれば、セルラーゼ酵素活性の向上に関係する前記タンパク質分泌の経路関連遺伝子を迅速にスクリーニングする方法は、前記ステップ（３）において、タンパク質分泌の経路関連遺伝子は、ｂｉｐ１遺伝子、ｈａｃ１遺伝子、ｆｔｔ１遺伝子、ｓｓｏ２遺伝子、ｓａｒ１遺伝子及びｙｐｔ１遺伝子を含む。
【００２２】
ｂｉｐ１遺伝子のヌクレオチド配列が次のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示される。
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【００２３】
ｈａｃ１遺伝子のヌクレオチド配列が次のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示される。
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【００２４】
本発明の具体的な実施形態によれば、タンパク質分泌の経路関連遺伝子を高発現させる菌株を迅速にスクリーニングする方法は、前記ステップ（３）において、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介を介して組換え株を形質転換することにより、前記組換え株の遺伝子変異体ライブラリーが構築される。
【００２５】
本発明の具体的な実施形態によれば、前記ステップ（３）において、組換えベクターのスクリーニングでは、Ｔｉプラスミドをバックボーンプラスミドとして、Ｔｉプラスミドにｐｒｙ４遺伝子が連結されている。ｐｒｙ４遺伝子のヌクレオチド配列が次のＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ ７に示される。
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【００２６】
前記スクリーニングのマーカー遺伝子は、ｐｙｒ４であり、栄養選択性マーカー遺伝子、即ちオロチジン５′一リン酸デカルボキシラーゼの遺伝子である。
【００２７】
本発明は、セルラーゼ酵素活性の向上に関係するタンパク質分泌の経路関連遺伝子を迅速にスクリーニングする方法をさらに提供する。前記方法は、
赤色蛍光タンパク質遺伝子と、細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチド遺伝子とのＤｓＲｅｄ−ＡｆＭＰ１融合遺伝子が含まれている組換え発現ベクターを構築するステップであって、ここで、ＤｓＲｅｄ遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示され、ＡｆＭｐ１遺伝子のヌクレオチド配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示されるステップ（１）と、
前記ステップ（１）で構築された前記組換え発現ベクターを用いて菌株を形質転換することにより、組換え株を得るステップ（２）と、
前記ステップ（２）で得られた前記組換え株に、スクリーニング待ちの標的遺伝子を導入するか、又は、前記ステップ（２）で得られた前記組換え株にベクター又は遺伝子をランダムに挿入することにより、前記組換え株の変異体ライブラリーを得るステップ（３）と、
表面に赤色蛍光を示す組換え株をフローサイトメーターでスクリーニングするステップ（４）と、
前記ステップ（４）でスクリーニングされて表面に赤色蛍光を示す前記組換え株のセルラーゼ酵素活性を測定し、セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換え株を取得するステップ（５）と、
セルラーゼ酵素活性が向上した前記組換え株に発現される外因性標的遺伝子、又は干渉された内因性遺伝子を特定して、セルラーゼ酵素活性の向上に関係するタンパク質分泌の経路関連遺伝子を取得するステップ（６）と、を含む。
【００２８】
本発明は、以下の有益な効果を有する。
【００２９】
本発明は、融合遺伝子発現カセットが含まれている組換え発現ベクターを構築し、ｃｂｈ１プロモーター、ｃｂｈ１遺伝子シグナルペプチド配列、赤色蛍光タンパク質遺伝子、アスペルギルス・フミガーツス由来のＭＰ１固定タンパク質シグナルペプチド配列、及びｃｂｈ１遺伝子ターミネーターが発現カセットにおいて上流から下流まで順番に連結される。このような組換え発現ベクターは、菌株の表面に蛍光を示すことを誘導し、迅速なスクリーニングに寄与する。
【００３０】
本発明は、セルラーゼ高発現組換えトリコデルマ・リーゼイを迅速にスクリーニングする方法を提供する。セルラーゼを発現する組換えトリコデルマ・リーゼイの赤色蛍光強度の強さに基づいて、セルラーゼ発現性が特定される。赤色蛍光強度が強いほど、組換えトリコデルマ・リーゼイのセルラーゼ発現性が高い。本発明は、ＤｓＲｅｄの発現をＴ.ｒｅｅｓｅｉセルラーゼの発現と関連させるために、ＤｓＲｅｄ遺伝子をセルラーゼプロモーターの制御下に置く。ＣＢＨ１は、トリコデルマ・リーゼイの中で最も発現量の多いセルラーゼであり、分泌タンパク質の５０〜６０％を占める。従って、ＤｓＲｅｄ遺伝子を強誘導型のＣＢＨ１プロモーターの下流に連結した際、その赤色の深さは、ｃｂｈ１プロモーターの誘導程度と正の相関がある。次に、ＤｓＲｅｄとフローサイトメーターとをカップリングさせて、リコデルマ・リーゼイセルラーゼの高収量株をハイスループットスクリーニングする。シグナルペプチドを含む赤色蛍光タンパク質が細胞壁に効果的に固定され、赤色蛍光強度が強いほど組換えトリコデルマ・リーゼイのセルラーゼ発現性が高くなることは、実験により証明された。赤色蛍光タンパク質の蛍光強度は、セルラーゼの発現量を好適に示すことができる。細胞壁における赤色蛍光タンパク質の蛍光強度は、発酵液中のセルラーゼ分泌の量と正の相関がある。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
【図１】トリコデルマ・リーゼイの集まり（コロニー）を示し、左側がＳＵＳ２（即ち、出発菌株）を示し、右側がＳＵＳ４（即ち、ｐＤｓＲｅｄ−ＡｆＭＰ１プラスミドが形質転換・導入された陽性形質転換体）を示す図である。
【図２】蛍光顕微鏡下でのトリコデルマ・リーゼイの菌糸を示し、左側が、表面に赤色蛍光タンパク質を示すトリコデルマ・リーゼイの菌糸を示し、右側が、明視野下、蛍光顕微鏡で観察されたトリコデルマ・リーゼイの菌糸を示す図である。
【図３】分泌経路に関連するプラスミド形質転換体のフローサイトメーターによるフロースクリーニング図である。
【図４】フロースクリーニングされた分泌経路関連形質転換体のコロニーＰＣＲ結果を示す図である。ここで、４−１がｈａｃ１コロニーＰＣＲであり、４−２がｂｉｐ１コロニーＰＣＲであり、４−３がｙｐｔ１コロニーＰＣＲであり、４−４がｓｓｏ２コロニーＰＣＲであり、４−５がｓａｒ１コロニーＰＣＲであり、４−６がｆｔｔ１コロニーＰＣＲである。
【図５】出発菌株と、分泌経路関連遺伝子の形質転換体の振とうフラスコ発酵液のEG酵素活性測定結果とを示す図である。
【図６】修飾された分泌経路関連遺伝子の形質転換体のコピー数を示す図である。
【図７】アグロバクテリウムに形質転換されたＴｉ−ｐｙｒ４プラスミドを確認するコロニーＰＣＲ結果を示す図である。
【図８】アグロバクテリウムにおいて、ランダム挿入の変異体ライブラリーのフローサイトメーターによるフロースクリーニング図である。
【図９】フロースクリーニングされたアグロバクテリウムにおいて、ランダム挿入の形質転換体コロニーのＰＣＲ検証結果を示す図である。
【図１０】アグロバクテリウムにおいて、ランダム挿入の形質転換体の酵素活性測定結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００３２】
当業者が明細書を参照して実施できるように、以下、添付の図面を参照して本発明をさらに詳細に説明する。
【００３３】
以下の実施例に使用される実験方法は、別段の記載がない限りいずれも従来の方法である。
【００３４】
以下の実施例に使用される材料、試薬等は、別段の記載がない限りいずれも商業的供給源から入手することができる。
【００３５】
実施例に記載されるＭＭ培地の成分は、５．０ｇ／Ｌの（ＮＨ4）2ＳＯ4、１５．０ｇ／ＬのＫＨ2ＰＯ4、０．６ｇ／ＬのＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、０．００３７ｇ／ＬのＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、０．００５ｇ／ＬのＦｅＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１４ｇ／ＬのＺｎＳＯ4・７Ｈ2Ｏ、０．００１６ｇ／ＬのＭｎＳＯ4・Ｈ2Ｏ、２０ｇ／Ｌのグルコース（又は、Ａｖｉｃｅｌ（アビセル）等の炭素源）を含む。使用する溶剤は、水である。
【００３６】
実施例１  トリコデルマ・リーゼイの細胞表面に赤色蛍光タンパク質を表示
【００３７】
１．赤色蛍光タンパク質と、アスペルギルス・フミガーツスの細胞表面にタンパク質を固定させるシグナルペプチドとの融合遺伝子（ＤｓＲｅｄ−ＡｆＭＰ１）を発現する組換えプラスミドｐＤｓＲｅｄ−ＡｆＭＰ１が構築される。
【００３８】
ＤｓＲｅｄを含むプラスミドにおいてＤｓＲｅｄ遺伝子断片を増幅し、ＡｆＭＰ１を含むプラスミドにおいてＡｆＭＰ１遺伝子断片を増幅した。ここで、ＤｓＲｅｄ遺伝子のＦ末端プライマーには、５１ｂｐのｃｂｈ１遺伝子シグナルペプチド配列が含まれている。その２つの断片は、ｏｖｅｒｌａｐ  ＰＣＲによって連結された。
【００３９】
トリコデルマ・リーゼイのＴｕ６ゲノムからｃｂｈ１のプロモーター及びターミネーターを増幅し、 ｃｂｈ１ｐ−ＤｓＲｅｄ−ＡｆＭｐ−ｃｂｈ１ｔ発現カセットを構築した。同時に、ｐＡＰＡプラスミドを線形化してｃｂｈ１ｐ−ＤｓＲｅｄ−ＡｆＭｐ−ｃｂｈ１ｔ発現カセットとシームレスなスプライシングで生体内の相同組換えを行った。次に、大腸菌を形質転換し、陽性形質転換体を選び出して、そしてプラスミドを抽出した。
【００４０】
２．トリコデルマ・リーゼイ菌株ＳＵＳ２においてｐＤｓＲｅｄ−ＡｆＭｐ１融合遺伝子が発現される。
【００４１】
トリコデルマ・リーゼイＳＵＳ２をジャガイモ培地（ＰＤＡ）プレートに接種し、胞子形成まで３０℃で７日間静置培養した。次に、胞子をこすり落とし、ウリジン（ｕｒｉｄｉｎｅ）を含むＰＤＢ培地１００ｍＬに接種し、３０℃、１８０ｒｐｍで一晩振とう培養した。発芽した菌糸を１２層のガーゼでろ過して収集し、１０ｍｇ／ｍＬの酵母細胞壁溶解酵素を加え、３０℃で１〜２時間消化した。プロトプラストを収集して、ＰＥＧ媒介形質転換によるプロトプラスト形質転換法によってｐＤｓＲｅｄ−ＡｆＭｐ１プラスミドをトリコデルマ・リーゼイＳＵＳ２菌株に形質転換・導入した。
【００４２】
形質転換体は、１Ｍソルビトールを含むＭＭ−グルコース寒天培地上で増殖及び選択をした。クローンを１つ選び、ＭＭ−ラクトース寒天培地上に接種して、インキュベーター内に３０℃で５日間培養し、色の変化を観察する。肉眼で視認できる赤色が発現され、図１に示すように、正常に形質転換されてｐＤｓＲｅｄ−ＡｆＭｐ１プラスミドを発現する陽性形質転換体の表面に赤色蛍光タンパク質が表示される。この形質転換体は、ＳＵＳ４と命名される。
【００４３】
本発明は、トリコデルマ・リーゼイで細胞表面に表示・発現される赤色蛍光タンパク質により、細胞表面に赤色蛍光タンパク質が発現される形質転換体を取得した。形質転換体がＭＭ−Ａｖｉｃｅｌ中で２４時間培養された後、図２に示すように、共焦点顕微鏡で赤色蛍光タンパク質の発現が観察できた。
【００４４】
実施例２  高セルラーゼ酵素活性のセルラーゼ高発現形質転換体のスクリーニング
【００４５】
１．トリコデルマ・リーゼイＳＵＳ４においてトリコデルマ・リーゼイ由来のタンパク質分泌の経路関連遺伝子が表現される。
【００４６】
トリコデルマ・リーゼイ由来のタンパク質分泌の経路関連遺伝子が表現される遺伝子断片を６つ（それぞれが、ｂｉｐ１遺伝子、ｈａｃ１遺伝子、ｆｔｔ１遺伝子、ｓｓｏ２遺伝子、ｓａｒ１遺伝子、ｙｐｔ１遺伝子である。）選択し、適切なプロモーター及びターミネーターと連結して、ｅｎｏ１ｐ−ｂｉｐ１−ｅｎｏ１ｔ、ｅｎｏ１ｐ−ｈａｃ１−ｅｎｏ１ｔ、ｐｄｃ１ｐ−ｆｔｔ１−ｐｄｃ１ｔ、ｐｄｃ１ｐ−ｓｓｏ２−ｐｄｃ１ｔ、ｇｐｄ１ｐ−ｓａｒ１−ｇｐｄ１ｔ、ｇｐｄ１ｐ−ｙｐｔ１−ｇｐｄ１ｔ発現カセットがそれぞれ構築された。
【００４７】
ｐＡＰＡプラスミドを線形化して、前述の６つの遺伝子断片のぞれぞれと１：２のモル比でシームレスなスプライシングの方法で連結することにより、６種類の分泌経路関連プラスミド（ｐＡＰＡ−ｅｎｏ１−ｂｉｐ１、ｐＡＰＡ−ｅｎｏ１−ｈａｃ１、ｐＡＰＡ−ｐｄｃ１−ｓｓｏ２、ｐＡＰＡ−ｐｄｃ１−ｆｔｔ１、ｐＡＰＡ−ｇｐｄ１−ｓａｒ１及びｐＡＰＡ−ｇｐｄ１−ｙｐｔ１）が構築された。組換えプラスミドを大腸菌Ｔのコンピテントセルに形質転換し、大腸菌コロニーに対してコロニーＰＣＲを行うことにより、６つの断片がそれぞれｐＡＰＡに連結されているか否かを識別する。ＰＣＲ陽性と識別された大腸菌コロニーを選び出し、１ｍＬ  ＬＢ（１００μｇ／ｍＬアンピシリン含有）培地上に接種して、３７℃、２２０ｒｐｍで一晩振とう培養した後、プラスミドを抽出して、形質転換用に用意した。前述の６種類の分泌経路関連プラスミドを等体積混合した後、ＰＥＧ媒介形質転換によるプロトプラスト形質転換法によってトリコデルマ・リーゼイＳＵＳ４菌株に形質転換・導入した。
【００４８】
形質転換体の菌塊を新しいスクリーニング培地ＰＤＡに移し、各プレートに４個の形質転換体を移し、胞子形成まで２８℃で培養を続けた。８ｍＬの滅菌水でプレート上の胞子（全部の形質転換体の胞子）を洗い流して、再懸濁し、よく混ぜて、２００メッシュのふるいでろ過し、底部が尖った形状の無菌遠心分離管に入れた。即ち、フローサイトメーターで分析・スクリーニングするための胞子懸濁液が得られ、胞子濃度は１０6個〜１０8個の胞子を含むように制御された。
【００４９】
形質転換体の胞子の分析をフローサイトメーターで行い、サンプルの圧力を１０００ＥＰＳ（１秒あたり信号粒子１０００個を分析する。）に設けた。前方角散乱光の面積と幅チャートにより、付着力とノイズ信号を取り除いた。蛍光信号を４８８ｎｍレーザーで励起した。表現された胞子クラスターを見分けるように、ＲＦＰ表現されたネガティブコントロール株を用いて電圧を設定した。陰性胞子と陽性胞子との信号差に応じて、陽性胞子の領域をゲーティングし、全てのサンプルを同じ方法で分析した。蛍光信号が最も強い胞子を、ＰＤＡを含む６ウェルプレートに直接スクリーニングした。全部で３６個の形質転換体をスクリーニングして、胞子形成まで培養した。フロースクリーニング図は、図３に示す。
【００５０】
スクリーニングされた形質転換体の胞子を２５ｍＬ液体ＭＭ−ｇｌｕｃｏｓｅに接種し、３０℃、１８０ｒｐｍ、１ｄで振とう培養した。ゲノムＤＮＡを抽出し、発現タンパク質分泌に関連する６つの組換えプラスミドがトリコデルマ・リーゼイ細胞に正常に形質転換されたか否かを、ＰＣＲにより検証した。
【００５１】
フローサイトメーターでスクリーニングされた分泌経路関連の形質転換体に対して、スクリーニングされた赤色蛍光増強の形質転換体がどの分泌経路関連プラスミドを含むかを特定するように、６対の分泌経路関連プライマーを用いてそれぞれコロニーＰＣＲを行った。使用されたプライマーが次の表に示され、ＰＣＲ断片のサイズが約２００ｂｐである。電気泳動の結果を図４に示す。
【００５２】
【表１】
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【００５３】
図４に示すように、フローサイトメーターでスクリーニングされた３６個の形質転換体のうち、３１個の形質転換体がコロニーＰＣＲされた。ここで、２２個がｈａｃ１遺伝子を含む形質転換体であり、９個がｂｉｐ１遺伝子を含む形質転換体である。さらに、この２つの形質転換体の配列を配列決定した。その他の４個の分泌経路関連プラスミドはいずれも増幅されなかった。実験結果から分かるように、ｈａｃ１遺伝子及びｂｉｐ１遺伝子は、ＤｓＲｅｄ−ＡｆＭＰ１形質転換体菌株のセルラーゼ生産能力に増強効果がある。一方、他の４種類の分泌関連遺伝子の過剰発現は、現在の菌株と培養条件下でセルラーゼの分泌発現を促進することができない。
【００５４】
２．分泌に関連する組換えプラスミド形質転換体のセルラーゼ酵素活性が測定される。
【００５５】
（１）スクリーニングされた形質転換体の誘導培養
【００５６】
出発菌株の胞子及びフローサイトメーターでスクリーニングされた胞子を、１００ｍＬ ＭＭ−ｇｌｕｃｏｓｅ培地にそれぞれ１×１０7個接種した。３０℃、１８０ｒｐｍ、１ｄで振とう培養した。菌糸を１２層のガーゼでろ過して収集した後、大量の滅菌水で洗い流して、残留グルコースを除去した。
【００５７】
等量（５００ｍｇ）の菌糸を量って取り出し、１００ｍＬ ＭＭ−Ａｖｉｃｅｌ液体培地に接種し、出発菌株及び各形質転換体のそれぞれに３つの並行実験を実行した。３０℃、１８０ｒｐｍ、１６８ｈで振とう培養して、セルラーゼ生産を誘導した。７２時間目から、２４ｈ毎に発酵ブロスを収集し、４℃の冷蔵庫に保管した。
【００５８】
（２）セルラーゼ酵素活性の測定
【００５９】
１）セルラーゼの抽出
【００６０】
期間毎に収集された２ｍＬ発酵ブロスを８０００ｒｐｍで遠心分離し、上清液を取得した。
【００６１】
２）セルラーゼ酵素活性の測定
【００６２】
出発菌株ＳＵＳ４及びコロニーＰＣＲされた３１個の形質転換体に対して、酵素活性を測定した。３〜６ｄの発酵ブロスを取り出し、それぞれのエンドセルラーゼ活性（ＣＭＣ酵素活性）を測定した。
【００６３】
エンドセルラーゼ活性は、カルボキシメチルセルロースナトリウム（ＣＭＣ）を基質として測定される。１０００ｍｇのカルボキシメチルセルロースナトリウムを取り出し、クエン酸／リン酸水素二ナトリウム緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．０）を用いて５０ｍＬに希釈し、２％のカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液を取得した。
【００６４】
１００μＬの酵素溶液を取り出し、１０ｍＬのクエン酸／リン酸水素二ナトリウム緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．０）に加えて、１０１倍に希釈した酵素溶液を得た。各試験管に、２％のカルボキシメチルセルロースナトリウム溶液及びクエン酸／リン酸水素二ナトリウム緩衝液（０．０５Ｍ、ｐＨ５．０）をそれぞれ０．４５ｍＬ加えて、５０℃のウォーターバスで温度を一致させた後、希釈された酵素溶液０．１ｍＬ（ブランク試料には、この段階では加えない。）を加えて、均一に振って混ぜた。５０℃のウォーターバスで３０ｍｉｎ温度を保ち、そして急冷した。各試験管に１．５ｍＬのＤＮＳ試薬を加え、さらにブランク試料に０．１ｍＬの酵素溶液を加えて、均一に混合した。沸騰したお湯で１０ｍｉｎ沸騰させ、そして急冷した。０号試験管を参照として、５４０ｎｍでの吸光度を測定した。５０℃、ｐＨ５．０の条件下で、１ｍＬの液体酵素が１時間毎にカルボキシメチルセルロースナトリウムを加水分解して１μｍｏｌの還元糖（グルコース計算量）を生産するために必要な酵素の量は、酵素活性単位（Ｕ）として定義される。
【００６５】
酵素活性の測定結果として、図５に示されるように、酵素活性が増加した形質転換体が合計で７個ある。ここで、３個がｈａｃ１遺伝子を含む形質転換体であり、ＳＵＳ４−Ｈ７、ＳＵＳ４−Ｈ２８、ＳＵＳ４−Ｈ４３と命名され、４個がｂｉｐ遺伝子を含む形質転換体であり、ＳＵＳ４−Ｂ３、ＳＵＳ４−Ｂ５、ＳＵＳ４−Ｂ２６、ＳＵＳ４−Ｂ３１と命名される。
【００６６】
３．形質転換体のコピー数を識別する。
【００６７】
形質転換体のコピー数の識別は、ｑＲＴ−ＰＣＲの方法を採用して、テンプレートとして７個の形質転換体のゲノムを選択し、ａｃｔｉｎ遺伝子を内部参照遺伝子として、各ゲノムを５倍に希釈し、１μＬをテンプレートとして使用する。プライマーは以下の通りである。
【００６８】
RTQactF（5'-ＴGAGAGCGGTGGTATCCACG-3'）
RTQactR（5'-GGTACCACCAGACATGACAATGTTG-3'）
RTQhacF（5'-ACAACGTCCTGCAGTGTCAA-3'）
RTQhacR（5'-ＴAGCGATCTGCATCAAGGGC-3'）
RTQbipF（5'-AAGAAGGTTACCCACGCCG-3'）
RTQbipR（5'-ATCAAAGGTACCACCACCGAG-3'）
【００６９】
Ｂｇｌ３Ｐ１遺伝子のコピー数は、２?ΔΔCt法で相対定量された。形質転換体のコピー数の識別結果は、図６Ａ及び図６Ｂに示された。定量的ＰＣＲ分析により、染色体にＨＡＣ１及びＢＩＰ１遺伝子の１〜２個のコピーが組み込まれていることが示された。
【００７０】
実施例３  高酵素活性のセルラーゼ高発現形質転換体をスクリーニングするための遺伝子変異体ライブラリーの構築
【００７１】
１．アグロバクテリウムｐＴｉ−ｐｙｒ４プラスミドを構築する。
【００７２】
トリコデルマ・リーゼイ形質転換ｐｙｒ４遺伝子を増幅して、アグロバクテリウムｐＴｉ−ｐｙｒ４プラスミドを構築した。
【００７３】
構築されたｐＴｉ−ｐｙｒ４プラスミドを、アグロバクテリウム・ツメファシエンスのコンピテントセルＡＧＬ１に形質転換した。このプラスミドは、リーゼイ形質転換のスクリーニングマーカー遺伝子ｐｙｒ４を含み、更にアグロバクテリウムランダム挿入に用いられる左腕（ＬＢ）と右腕（ＲＢ）を含む。
【００７４】
形質転換体コロニーが成長した後、検証のために単一のコロニーを選択した。コロニーＰＣＲにより、標的遺伝子ｐｒｙ４が検証された。図７に示すように、増幅された標的断片５００ｂｐが、事前検証済みの断片のサイズと一致している。配列決定した結果、同定が確認された。
【００７５】
２．アグロバクテリウムｐＴｉ−ｐｙｒ４ランダム挿入のトリコデルマ・リーゼイ変異体ライブラリーを構築する。
【００７６】
標的プラスミドｐＴｉ−ｐｙｒ４が形質転換・導入されたアグロバクテリウム（３μＬ）を、５０μｇ/ ｍＬカナマイシンと２５μｇ/ ｍＬリファンピシンとが含まれている３ｍＬ  ＬＢ液体に接種し、シェーカーを用いて２８℃、２２０ｒｐｍで培養した。
【００７７】
ＳＵＳ４トリコデルマ・リーゼイ胞子懸濁液を調製し、セロハンで覆われているＣＭプレートに塗布して、２４℃で３時間程度、事前発芽した。前述のアグロバクテリウム液１００μＬを、トリコデルマ・リーゼイの真性菌糸が事前発芽されたＣＭプレートに塗布して、２５℃の暗所で共同培養した。これにより、アグロバクテリウム・ツメファシエンス媒介形質転換によるトリコデルマ・リーゼイ変異体ライブラリーが得られた。
【００７８】
ウラシルとセファロスポリンとが含まれていないＭＭプレートにおいて、一次スクリーニング、二次スクリーニングにより、正常に成長できるコロニーが得られた。疑似形質転換体と見なされ、ゲノムＤＮＡを抽出して、ＰＣＲにより形質転換体が確認された。
【００７９】
３．アグロバクテリウムｐＴｉ−ｐｙｒ４ランダム挿入の変異体ライブラリーが、フローサイトメーターでスクリーニングされる。
【００８０】
アグロバクテリウム媒介形質転換により、ｐＴｉ−ｐｙｒ４プラスミドがＳＵＳ４菌株のプロトプラストに形質転換され、アグロバクテリウム形質転換の変異体ライブラリーが構築された。更に、レプリカ平板法によって、形質転換体が、転写膜を介してセファロスポリンを含むＰＤＡプレートに移された。図８に示すように、胞子形成後にフロースクリーニングすることにより、表面に赤色蛍光が表示されるトリコデルマ・リーゼイ菌株がフロースクリーニングされた。
【００８１】
プライマーを用いて、フロースクリーニングすることによって得られた形質転換体にプラスミドｐＴｉ−ｐｒｙ４が含まれているか否かを確認した。図９に示すように、ＳＵＳ４に形質転換されてスクリーニングされた後に４個がこのプラスミドを含むということが、確認された。それぞれがＳＵＳ４−Ｔ７、ＳＵＳ４−Ｔ３３、ＳＵＳ４−Ｔ３７、ＳＵＳ４−Ｔ４７である。
【００８２】
４．フロースクリーニングすることによって得られたアグロバクテリウムｐＴｉ−ｐｙｒ４ランダム挿入の形質転換体は、酵素活性が分析される。
【００８３】
フロースクリーニングすることによって得られた形質転換体は、ＳＵＳ４を対照菌株として、振とうフラスコ発酵されて分析が行われた。ＭＭ＋Ａｖｉｃｅｌ誘導後、サンプリングして上清中のＣＭＣ−Ｎａの酵素活性を測定した。図１０に示すように、振とうフラスコ発酵により、４株の形質転換体は、エンドグルカナーゼ活性（２６．３〜３３．３Ｕ／ｍＬ）がそれぞれ親株（１１．１Ｕ／ｍＬ）よりも高いことが分かった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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