(57)【要約】  プロモーターポリヌクレオチド、シグナルポリペプチド、及び前記シグナルポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチド、及びその用途が提供される。当該のプロモーターポリヌクレオチド及びシグナルポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを含むベクター及び宿主細胞は、外来タンパク質を効率的に発現及び／または細胞外に分泌することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列と８５％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む単離されたプロモーター。
【請求項２】
請求項１に記載のプロモーターを含む組み換えポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記組み換えポリヌクレオチドは、クローニングベクターまたは発現ベクターである、請求項２に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記発現ベクターは、前記プロモーターと作動自在に連結されている第１ポリヌクレオチドを含み、第１ポリヌクレオチドは、産物をコーディングする,請求項３に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項５】
前記産物は、ポリペプチドである、請求項４に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項６】
シグナルポリペプチドをコーディングする第２ポリヌクレオチドが、前記プロモーターと第１ポリヌクレオチドとの間に作動自在に連結されている、請求項２ないし５のうちいずれか１項に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
請求項２ないし６のうちいずれか１項に記載の組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項８】
前記宿主細胞は、乳酸菌またはエスケリキア属に属する、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ビフィドバクテリア属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属、ワイセラ属、ペディオコッカス属またはエンテロコッカス属に属する、請求項８に記載の宿主細胞。
【請求項１０】
請求項７に記載の宿主細胞を培地中で培養して産物を生成する段階と、
前記産物またはその代謝産物を培養物から単離する段階と、を含む産物またはその代謝産物を生産する方法。
【請求項１１】
配列番号３のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたシグナルポリペプチド。
【請求項１２】
請求項１１に記載のシグナルポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチド。
【請求項１３】
プロモーター、請求項１１に記載のシグナルポリペプチドをコーディングする第２ポリヌクレオチド、及びタンパク質をコーディングする第１ポリヌクレオチドを含み、前記第２ポリヌクレオチドは前記プロモーターと作動自在に連結されており、前記第１ポリヌクレオチドは前記第２ポリヌクレオチドとインフレームで融合されているベクター。
【請求項１４】
請求項１３に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
前記宿主細胞は、乳酸菌またはエスケリキア属に属する、請求項１４に記載の宿主細胞。
【請求項１６】
前記乳酸菌は、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ビフィドバクテリア属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属、ワイセラ属、ペディオコッカス属またはエンテロコッカス属に属する、請求項１５に記載の宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１４ないし１６のうちいずれか１項に記載の宿主細胞を培地中で培養してタンパク質を生成する段階と、
前記タンパク質を培養物から単離する段階と、を含むタンパク質を生産する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１２月２９日に韓国特許庁に提出された韓国特許出願第１０−２０１７−０１８４８１９号の優先権を主張し、該開示は、参照により全体として本明細書に導入される。
【０００２】
本発明は、プロモーターポリヌクレオチド、シグナルポリペプチド、及びその用途に関する。
【背景技術】
【０００３】
バクテリア、酵母及びかびのような微生物は、組み換え発現のための宿主としてますます重要になっている。
ラクトバチルス属（Lactobacillus sp.）またはストレプトコッカス属（Streptococcus ｓｐ．）のようなバクテリアは、伝達ビークルとして有用である。さらに、一般的に安全であると見られるＧＲＡＳ（generally recognized as safe）微生物は、ヒトまたは動物にも投与される。
【０００４】
乳酸菌において、外来産物発現を高レベルで達成するためには、乳酸菌から単離され、外来産物、特に、タンパク質を高レベルに発現して分泌することができる新たなプロモーター及びシグナルポリペプチドへの要求がある。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一様相は、単離されたプロモーターを提供する。
他の様相は、前記プロモーターを含む組み換えポリヌクレオチドを提供する。
他の様相は、前記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
他の様相は、前記宿主細胞を使用して産物を生産する方法を提供する。
他の様相は、単離されたシグナルポリペプチド、及びそれをコーディングするポリヌクレオチドを提供する。
他の様相は、単離されたシグナルポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを含む組み換えポリヌクレオチドを提供する。
他の様相は、単離されたシグナルポリペプチドをコーディングする組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。
他の様相は、単離されたシグナルポリペプチドをコーディングする組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を使用し、タンパク質を生産する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
一様相は、配列番号１（以下、「ＰＲ４プロモーター」とも言う）のヌクレオチド配列と８５％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含む単離されたプロモーターを提供する。
【０００７】
他の様相は、前記プロモーターを含む組み換えポリヌクレオチドを提供する。本明細書において、「プロモーター（promoter）」とは、ＲＮＡポリメラーゼが結合し、転写を開始する核酸分子、特に、ＤＮＡ分子上の領域をいう。プロモーターは、一般的に、プロモーターによって調節される転写される配列の上流、すなわち、５’に位置する。前記プロモーターは、構成的プロモーター（constitutive promoter）でもある。前記プロモーターは、配列番号１のヌクレオチド配列と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の配列同一性を有するものでもある。前記プロモーターは、配列番号１のヌクレオチド配列を有するものでもある。
【０００８】
前記組み換えポリヌクレオチドは、ベクターでもある。本明細書において、「ベクター（vector）」とは、そこに連結された他の核酸を増殖させる（propagate）ことができる核酸分子をいう。前記ベクターは、導入される宿主細胞のゲノムに挿入されるベクターだけではなく、自己複製核酸構造（self-replicating nucleic acid structure）としてのベクターを含む。発現ベクター（expression vector）は、作動自在に連結された核酸の発現を指示することができるベクターを示す。前記ベクターには、プラスミドまたはウイルス由来のベクターでもある。
【０００９】
前記ベクターは、クローニングベクターまたは発現ベクターでもある。前記発現ベクターは、前記プロモーターに作動自在に連結されたタンパク質をコーディングするヌクレオチド配列を含んでもよい。
【００１０】
前記発現ベクターは、前記プロモーター、及び産物をコーディングするヌクレオチド配列を含む第１ポリヌクレオチドを含むものでもあり、前記第１ポリヌクレオチドは前記プロモーターと作動自在に連結されている。前記産物は、第１ポリヌクレオチドの発現によって生成されうるものであるならば、いずれも含まれる。前記産物は、ポリペプチドまたは核酸でもある。前記ポリペプチドは、ＩＬ−１０のようなサイトカイン、またはアミラーゼのような酵素でもある。前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡでもある。
【００１１】
本明細書において、用語「作動自在に連結された（operably linked）」とは、転写または翻訳がなされ、機能的な転写産物または翻訳産物を生産させる連結をいう。
【００１２】
前記ベクターは、リボソーム結合部位（ＲＢＳ：ribosomal binding site）、クローニング部位（cloning site）、選抜標識遺伝子（selection marker gene）、転写ターミネーター及び翻訳開始因子からなる群から選択された１以上をさらに含んでもよい。前記クローニング部位は、前記プロモーターと作動自在に連結されたものでもある。前記クローニング部位は、多重クローニング部位でもある。
【００１３】
前記組み換えポリヌクレオチドは、配列番号２のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むシグナルポリペプチドをコーディングする第２ポリヌクレオチド（以下、「ＳＰ４シグナルポリペプチド」とも言う）が、前記プロモーターと第１ポリヌクレオチドとの間に作動自在に連結されているものでもある。その場合、前記第１ポリヌクレオチドは、ポリペプチドをコーディングするものでもある。
【００１４】
本明細書において、「シグナルポリペプチド（signal polypeptide）」とは、分泌タンパク質前駆体のＮ−末端側に存在するが、自然に存在する成熟したタンパク質にはない配列をいう。前記シグナルポリペプチドは、タンパク質前駆体から切られてもよい。一般的に、シグナルポリペプチドは、細胞外に分泌されるとき、プロテアーゼによって切断される。前記プロテアーゼは、一般的に、シグナルペブチダーゼ（signal peptidase）とも言う。前記シグナルポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の同一性を有するものでもある。前記シグナルポリペプチドは、それをコーディングするヌクレオチド配列とインフレームで融合された遺伝子の発現産物を細胞外に分泌させる活性を有する。
【００１５】
本明細書において、タンパク質またはポリペプチド分子の「分泌（secretion）」とは、タンパク質またはポリペプチド分子のバクテリア細胞の外部（outside）への輸送、タンパク質またはポリペプチド分子が培地中に完全に遊離された形態で存在すること、タンパク質またはポリペプチド分子の一部分だけが、バクテリア細胞外に存在すること、及びタンパク質またはポリペプチド分子がバクテリア細胞の表面層上に存在することを含む。
【００１６】
前記シグナルポリペプチドは、ラクトバチルス・パラカセイ（Ｌ．paracasei）由来のものでもあり、分泌促進能を有するものでもある。第２ポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列を有するものでもある。
他の様相は、前記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、バクテリア細胞でもある。前記バクテリア細胞は、グラム陽性バクテリアでもある。前記バクテリア細胞は、乳酸菌またはエスケリキア属に属するものでもある。前記乳酸菌は、ラクトバチルス（Lactobacillus）属、ラクトコッカス（Lactococcus）属、ビフィドバクテリア（bifidobacteria）属、ストレプトコッカス（Streptococcus）属、ロイコノストック（Leuconostoc）属、ワイセラ（Weissella）属、ペディオコッカス（Pediococcus）属またはエンテロコッカス（Enterococcus）属の中に属するものでもある。
【００１７】
前記組み換えポリヌクレオチドは、前記宿主細胞に、通常の核酸導入方法によって導入したものでもある。該核酸導入方法は、電気穿孔、形質転換、形質導入または形質感染を含む。
【００１８】
他の様相は、前記宿主細胞を培地中で培養して産物を生成する段階と、前記産物またはその代謝産物を培養物から単離する段階と、を含む産物またはその代謝産物を生産する方法を提供する。前記産物は、第１ポリヌクレオチドの発現によっても生成されるものであるならば、いずれも含まれる。前記産物は、ポリペプチドまたは核酸でもある。前記ポリペプチドは、ＩＬ−１０のようなサイトカイン、またはアミラーゼのような酵素でもある。前記核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡでもある。前記代謝産物は、前記産物が細胞内でその活性を発揮して作られる物質でもある。例えば、前記産物が酵素である場合、前記代謝産物は、その酵素活性を発揮して生成される直接産物、またはその酵素が属している代謝経路から作られる物質でもある。
【００１９】
前記方法において、前記培養する段階は、選択される宿主細胞により、当該分野に公知された一般的な方法によっても遂行される。前記培養に使用される培地は、糖源として、例えば、グルコース、サッカロース、ラクトース、フラクトース、マルトース、澱粉、のような炭水化物；大豆油、ひまわり油、ひまし油、ヤシ油のようなオイル及び脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸のような脂肪酸；グリセロール、酢酸のような有機酸を、個別的にまたは混合物として含んでもよい。前記培地は、窒素源として、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、大豆粕及び尿素、または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムを、個別的にまたは混合物として含んでもよい。前記培地は、リン源であり、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、または相応するナトリウム含有塩を含んでもよい。前記培地は、例えば、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよい。また、前記培養において、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質、または適切な前駆体が培養物にも添加される。前記物質は、培養過程において、培養物に適切な方式、例えば、回分式または連続式によっても添加される。
【００２０】
前記培養は、好気条件、微好気条件、嫌気条件、あるいはそれらの組み合わせにおいて遂行するものでもある。
【００２１】
前記方法は、前記産物を培養物から単離する段階をさらに含んでもよい。前記単離は、選択される産物の種類により、適切な方法が選択され，行うことができる。前記産物がタンパク質である場合、前記単離は、培養液を遠心単離して細胞を除去し、上澄み液からタンパク質を単離するか、あるいは細胞を回収して破砕し、タンパク質を単離することを含んでもよい。前記単離は、塩析、沈澱、クロマトグラフィ、遠心分離及び濾過のうち１以上の過程を経ることができる。前記クロマトグラフィは、陰イオン交換、陽イオン交換、サイズ排除及び親和性クロマトグラフィのうち１以上でもある。
【００２２】
他の様相は、配列番号２のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたシグナルポリペプチドを提供する。前記シグナルポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列と、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上または１００％の配列同一性を有するものでもある。
【００２３】
他の様相は、前記シグナルポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを提供する。前記シグナルポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチドを有するものでもある。
【００２４】
他の様相は、前記シグナルポリペプチドをコーディングする第２ポリヌクレオチド、及び タンパク質をコーディングする第１ポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供するが、前記第２ポリヌクレオチドは前記プロモーターと作動自在に連結されており、前記第１ポリヌクレオチドは 前記第２ポリヌクレオチドとインフレームで融合されている。
【００２５】
他の様相は、前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、バクテリア細胞でもある。前記バクテリア細胞は、グラム陽性バクテリアでもある。前記バクテリア細胞は、乳酸菌またはエスケリキア属に属するものでもある。前記乳酸菌は、ラクトバチルス属、ラクトコッカス属、ビフィドバクテリア属、ストレプトコッカス属、ロイコノストック属、ワイセラ属、ペディオコッカス属またはエンテロコッカス属に属するものでもある。
【００２６】
前記組み換えポリヌクレオチドは、前記宿主細胞に通常の核酸導入方法によって導入することができる。核酸導入方法は、電気穿孔、形質転換、形質導入または形質感染を含む。
【００２７】
他の様相は、前記宿主細胞に培地中で培養してタンパク質を生成する段階と、前記タンパク質を培養物から単離する段階と、を含むタンパク質を生産する方法を提供する。
【００２８】
前記方法において、前記培養する段階は、選択される宿主細胞ににより、当該分野に公知された一般的な方法によっても遂行される。前記培養に使用される培地は、糖源として、例えば、グルコース、サッカロース、ラクトース、フラクトース、マルトース、澱粉のような炭水化物；大豆油、ひまわり油、ひまし油、ヤシ油のようなオイル及び脂肪；パルミチン酸、ステアリン酸、リノレン酸のような脂肪酸；グリセロール、酢酸のような有機酸を、個別的にまたは混合物として含んでもよい。前記培地は、窒素源として、例えば、ペプトン、酵母抽出物、肉汁、麦芽抽出物、とうもろこし浸漬液、大豆粕及び尿素、または無機化合物、例えば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウムまたは硝酸アンモニウムを、個別的にまたは混合物として含んでもよい。前記培地は、リン源であり、例えば、リン酸二水素カリウム、リン酸水素二カリウム、または相応するナトリウム含有塩を含んでもよい。前記培地は、例えば、成長に必要な硫酸マグネシウムまたは硫酸鉄のような金属塩を含んでもよい。また、前記培養において、アミノ酸及びビタミンのような必須成長物質、または適切な前駆体が培養物にも添加される。前記物質は、培養過程において、培養物に適切な方式、例えば、回分式または連続式によっても添加される。
【００２９】
前記培養は、好気条件、微好気条件、嫌気条件、あるいはそれらの組み合わせにおいて遂行するものでもある。
【００３０】
前記方法は、前記タンパク質を培養物から単離する段階をさらに含んでもよい。前記単離は、培養液を遠心分離して細胞を除去し、上澄み液からタンパク質を単離するか、あるいは細胞を回収して破砕し、タンパク質を単離することを含んでもよい。前記単離は、塩析、沈澱、クロマトグラフィ、遠心分離及び濾過のうち１以上の過程を経ることができる。前記クロマトグラフィは、陰イオン交換、陽イオン交換、サイズ排除及び親和性クロマトグラフィのうち１以上でもある。
【発明の効果】
【００３１】
一様相による単離されたプロモーター、及びそれを含む組み換えポリヌクレオチドは、外来遺伝子の効率的発現に使用することができる。
【００３２】
他の様相による前記組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、外来遺伝子を効率的に発現させることができる。
【００３３】
他の様相による前記宿主細胞を使用して産物を生産する方法は、産物を効率的に生産に使用することができる。
【００３４】
他の様相による単離されたシグナルポリペプチド、それをコーディングするポリヌクレオチド、及びそのポリヌクレオチドを含む組み換えポリヌクレオチドは、外来タンパク質を細胞外に分泌させるのにも使用される。
他の様相による単離されたシグナルポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドを含む組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、外来遺伝子の産物を細胞外に効率的に分泌させることができる。
【００３５】
他の様相による前記宿主細胞を使用し、タンパク質を生産する方法によれば、タンパク質を効率的に生産することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】大腸菌と乳酸菌とのシャトルベクターｐＭＴ４８の構造を示した図である。
【図２】ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターの構造を示した図である。
【図３】ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターを３個種の乳酸菌に形質転換させ、細胞外に発現された程度を確認した結果を示す図である。
【図４】ｐＭＴ５４−ＰＲ４−amylase−ＳＰ４ベクターをＬＭＴ１−２１菌株に形質転換させ、細胞外に発現された程度を確認した結果を示す図である。
【図５】プロモーター強度比較のために、ｐＭＴ５４−Ｐ１１−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクター及びｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターで、ＩＬ−１０のｍＲＮＡレベルを測定したグラフである。
【図６】シグナルペプチド強度比較のために、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４及びｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＵＳＰ４５に形質転換されたＬＭＴ１−２１から分泌されるＩＬ−１０を測量したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００３７】
以下、本発明について、実施例を介して、さらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例によって限定されるものではない。
実施例１：プロモーター及びシグナルポリペプチドのクローニング、及びその効果の確認
１．プロモーター及びシグナルポリペプチドのクローニング
プロモーターと、シグナルポリペプチドをコーディングするヌクレオチド配列は、ＰＣＲによって増幅した。具体的に、Lactobacillus paracasei ＬＭＴ１−２１（受託番号ＫＣＴＣ １３４２２ＢＰ）のゲノムをテンプレートにし、プライマーを使用したＰＣＲにおいて、５９３ｋｂサイズの増幅産物を得た。使用したプライマーは、ＰＳ４＿Ｆ／Ｒ（配列番号４及び５）である。
【００３８】
前記増幅産物をＥｃｏＲＶとＳａｌＩとに切断したｐＭＴ５４ベクターと、Infusion cloning（Clontech）を介して連結した。その後、前記ベクターを、大腸菌Ｔｏｐ１０菌株（Invitrogen社）に、Sambrookら方法（Sambrook et al. Molecular cloning: A laboratory Manual, 2nd edition, 1989）で形質転換させた。その後、形質転換された大腸菌を、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールが添加されたＬＢプレートに塗抹し、コロニーを得た。得られたコロニーからｐＭＴ５４ベクターを回収し、配列を分析した。その結果、ＰＲ４（配列番号１）−ＳＰ４をコーディングするヌクレオチド配列（配列番号３）を含むことを確認した。以下、該ベクターをＭＴ５４−ＰＲ４−ＳＰ４ベクターとする。
【００３９】
前記ｐＭＴ５４ベクターは、ｐＭＴ４８ベクターのＨｉｎｄＩＩＩ酵素及びＸｈｏＩ酵素の部位に、多重クローニング部位（配列番号６）が導入されたベクターである。前記多重クローニング部位は、複数の制限酵素認知部位であるだけではなく、目的タンパク質の発現を確認するためのヒトインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ：human influenza hemagglutinin）がタグされている。ｐＭＴ４８ベクターは、ｐＵＣ１９（New England Biolabs）のＥｃｏＲＩ部位に、プラスミドｐＬＭＴ１−７４の複製原点配列であるＲｅｐ遺伝子（配列番号７）が導入されたものである。ｐＭＴ４８ベクターは、次のように作製された。
【００４０】
まず、キムチから単離されたＬＭＴ１−７４菌株（Leuconostoc mesenteroides ＫＣＴＣ １３１６４ＢＰ）から、Plasmid midi kit（Qiagen, Inc., Valencia, ＣＡ）を利用し、暫定的プラスミドｐＬＭＴ１−７４を単離した。プラスミドｐＬＭＴ１−７４をテンプレートにし、配列番号８及び９のオリゴヌクレオチドをプライマーにしたＰＣＲにより、プラスミドｐＬＭＴ１−７４の複製原点配列であるＲｅｐ遺伝子（配列番号７）を増幅した。増幅された産物をＥｃｏＲＩで切断し、同一酵素で切断したｐＵＣ１９と連結し、ｐＭＴ４８ベクターを得た。また、配列番号７のポリヌクレオチドは、化学的にも合成される。ベクターｐＵＣ１９は、配列番号１０のヌクレオチド配列を有する。
【００４１】
図１は、大腸菌と乳酸菌とのシャトルベクターｐＭＴ４８の構成を示した図面である。前記ベクターにおいて、Ｒｅｐは、配列番号７のヌクレオチド配列を有するものであり、広範囲乳酸菌宿主ベクターであるｐＬＭＴ１−７４の複製原点であるＲｅｐ origin配列の一部分配列であり、乳酸菌に複製能を付与する。Ｅ．ｃｏｌｉ ｏｒｉは、大腸菌のＤＮＡ複製原点であり、ｐＵＣ１９ ｏｒｉ、すなわち、配列番号１１のヌクレオチド配列を有する。ＣＭは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコーディングする遺伝子であり、クロラムフェニコール抵抗性遺伝子である。
【００４２】
２．目的タンパク質ＩＬ−１０クローニング
（１）実験群ベクター作製：ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクター
ＩＬ−１０遺伝子（配列番号１２）は、外部に依頼して合成した（Macrogen Inc.、韓国）。合成された前記遺伝子断片と、前記ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＳＰ４ベクターとに、制限酵素ＳａｌＩ及びＸｈｏＩを処理し、前記ベクターのクローニング部位を切断した。切断された産物を、Gel purification kit（Bioneer社）を使用して精製した後、アルカリホスファターゼを使用し、脱リン酸化させた。そのように準備した前記ベクターＤＮＡ １μｌ、前記遺伝子（ＩＬ−１０）３μｌ、Ｔ４ＤＮＡリガーゼ（Takara社）０．５μｌ及び緩衝溶液１μｌの混合物に、蒸溜水５．５μｌを添加し、総１０μｌ反応混合物を作った。前記反応混合物を、１６℃で１２時間インキュベーションし、前記遺伝子を、前記ベクターのクローニング部位に連結した。得られた連結産物を、前述のところと同一方法で、大腸菌Ｔｏｐ１０菌株に形質転換させ、その配列を確認した。その結果、前記遺伝子が導入されたことを確認し、それらを、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターと命名した。図２は、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターの構造を示した図面である。図２において、promoter、signal peptide及びtarget geneは、ＰＲ４、ＳＰ４及びＩＬ−１０をそれぞれ示す。前記ベクターは、大腸菌と乳酸菌とのシャトルベクターであり、大腸菌複製原点（origin）、乳酸菌複製原点（ｒｅｐ ｇｅｎｅ）及びクロラムフェニコール耐性遺伝子を含む。多重クローニング部位に、プロモーター、シグナルペプチド、標的遺伝子、ＨＡタグ及びＨｉｓタグが連結されている。
【００４３】
（２）対照群１ベクターの作製：ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＵＳＰ４５ベクター
シグナルポリペプチドをコーディングするポリヌクレオチドＳＰ４を、ＵＳＰ４５ポリヌクレオチドに置き換えたことを除き、実験群ベクターと同様の方式でベクターを作製した。それは、同一プロモーターにおいて、他のシグナルポリペプチドがＩＬ−１０タンパク質の細胞外分泌に及ぼず影響を確認するためのものである。
【００４４】
具体的には、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターをテンプレートにし、配列番号１３及び１４のオリゴヌクレオチドをプライマーにしたＰＣＲを介して、前記ベクターにおいて、ＳＰ４が除外された部分を増幅した。ＵＳＰ４５をコーディングするポリヌクレオチド（配列番号１５）は、合成した（Macrogen Inc.、韓国）。前記増幅産物と、ＵＳＰ４５をコーディングするポリヌクレオチドとをInfusion cloning方法で連結し、大腸菌に導入し、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＵＳＰ４５ベクターをクローニングした。ＵＳＰ４５は、ラクトコッカスラクチス（Lactococcus lactis）由来のシグナルポリペプチドであり、相同性プロテナーゼ（ＰｒｔＰ：homologous proteinase）、及びバシラス・ステアロサーモファイラス（Bacillus stearothermophilus）由来のアルファ−アミラーゼのようなタンパク質産物を分泌させる役割を行うと知られている（van Asseldonk M1, et al. Mol Gen Genet. 1993 Sep; 240 (3): 428-34）。
【００４５】
（３）対照群２ベクターの作製：ｐＭＴ５４−Ｐ１１−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクター
プロモーターＰＲ４をＰ１１プロモーターに置き換えたことを除き、実験群ベクターと同様の方式でベクターを作製した。それは、シグナルポリペプチドにおいて、他のプロモーターがＩＬ−１０タンパク質の発現に及ぼす影響を確認するためのものである。Ｐ１１は、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）において、強力な転写開始活性を有する合成プロモーターである（Lars Axelsson, Microbiology (2006), 152, 1011-019）。
【００４６】
具体的には、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターをテンプレートにし、配列番号１６及び１７のオリゴヌクレオチドをプライマーにしたＰＣＲを介して、前記ベクターにおいて、ＰＲ４が除かれた部分を増幅した。Ｐ１１プロモーター（配列番号１８）は、合成した（Macrogen Inc.、韓国）。前記増幅産物とＰ１１プロモーターとをInfusion cloning方法で連結し、大腸菌に導入し、ｐＭＴ５４−Ｐ１１−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターをクローニングした。
【００４７】
３．形質転換及びＩＬ−１０タンパク質発現
（１）ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターのＩＬ−１０タンパク質発現の確認
ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターと、ｐＭＴ５４−Ｐ１１−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターとをそれぞれ３種乳酸菌に形質転換させた。３種乳酸菌は、ラクトバチルス・パラカセイ（Lactobacillus paracasei）ＫＣＴＣ １３４２２ＢＰ、ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacillus plantarum）ＫＣＴＣ １３４２１ＢＰ及びラクトバチルス・ブレビス（Lactobacillus brevis）ＫＣＴＣ １３４２３ＢＰとして、いずれもキムチから単離したものである。それら菌株は、それぞれＬＭＴ１−２１、ＬＭＴ１−９及びＬＭＴ１−４６とも言う。
【００４８】
前記各菌株を、５０ｍＬのＭＲＳ培地（Difco Ｃｏ．，米国）内において、ＯＤ６００が０．５になるまで培養した後、４℃、７，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、細胞ペレットを２５ｍＬ冷ＥＰＳ（ice−cold ＥＰＳ）（ＥＰＳ：１ｍＭ Ｋ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．４、１ｍ ＭｇＣｌ２及び０．５Ｍスクロースを含有）で２回洗浄した。
【００４９】
洗浄後、１ｍＬ冷ＥＰＳに細胞を再懸濁し、電気穿孔法に使用されるコンピテント細胞を製造し、−８０℃低温冷凍庫（deep freezer）に保管した。コンピテント細胞４０μｌと各ベクターＤＮＡ（１μｇ／μｌ）１μｌとをキュベットに入れ、５分間氷に放置した。２５μＦ、８ｋＶ／ｃｍ、４００ｏｈｍｓの条件で電気パルスを与えた後、直ちに１ｍＬ ＭＲＳ液体培地に添加し、３７℃で１時間培養した。その後、培養された細胞を、１０μｇ／ｍｌクロラムフェニコールが含まれたＭＲＳ培地に塗抹し、４８時間３７℃で培養した。
【００５０】
図３は、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターを、３個種の乳酸菌に形質転換させ、細胞外に発現された程度を確認した結果を示す。図３において、対照群は、ベクターであり、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４の代わりに、ｐＭＴ５４−Ｐ１１−ＩＬ１０−ＵＳＰ４５を使用したものである。
【００５１】
図３に示されているように、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターは、３個乳酸菌において、ＩＬ−１０タンパク質を細胞外に発現させたが、対照群は、発現されていない。これにより、ＰＲ４プロモーターが作動し、遺伝子を発現させ、ＳＰ４シグナルペプチドが発現されたタンパク質を細胞外部に分泌したということを示す。
【００５２】
（２）ｍＲＮＡレベルの発現：プロモーターの強度確認
ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターと、ｐＭＴ５４−Ｐ１１−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターとを、（１）と同様の方法により、ラクトバチルス・パラカセイ（Lactobacillus paracasei）ＫＣＴＣ １３４２２ＢＰ（ＬＭＴ１−２１）乳酸菌に形質転換した。
【００５３】
そのように得られた前記ベクターが導入された菌株を、ＭＲＳ液体培地で、３７℃、１６時間、静置培養した。培養物１ｍｌを、７，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄み液を捨てて細胞ペレットを取った。それを、ＲＮＡ ｐｒｅｐ ｋｉｔ（Macherey-nagel、ｃａｔ．ｎｏ ７４０９５５．５０）を利用し、製造社のプロトコル通り、ｍＲＮＡを抽出した。ｍＲＮＡ １００ｎｇをテンプレートとして使用し、ｃＤＮＡを合成した。ｃＤＮＡ合成は、Bioneer社のRoketscript cycle ＲＴ ｐｒｅｍｉｘを利用した。合成されたｃＤＮＡをテンプレートにし、配列番号２０と配列番号２１とのオリゴヌクレオチドをプライマーにし、リアルタイム（ＲＴ：real time）−ＰＣＲを行った。ＲＴ−ＰＣＲは、ＳＹＢＲ ｐｒｅｍｉｘ（takara、ＲＲ８２０Ｂ）を利用し、製造社のプロトコルによって実験を行った。
【００５４】
図５は、形質転換された細胞由来ｃＤＮＡをテンプレートにしたＲＴ−ＰＣＲを示した図面である。図５に示されているように、ｐＭＴ５４−Ｐ１１−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクター、すなわち、対照群ベクターが形質転換されたＬ．Paracasei ＫＣＴＣ １３４２２ＢＰ菌株に比べ、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターが形質転換された菌株において、ＩＬ−１０ｍＲＮＡレベルが顕著に高かった。これにより、ＰＲ４プロモーターがＰ１１プロモーターに比べ、強力に転写を駆動するということを示す。図５のＹ軸の「２△△ＣＴ」は、相対的転写レベルを分析した結果であり、対照群対比で上昇した転写レベルを示す。
【００５５】
（３）タンパク質レベルの発現：シグナルペプチドの強度確認
前記ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクター及びｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＵＳＰ４５ベクターを、（１）と同様の方法により、ラクトバチルス・パラカセイ（Lactobacillus paracasei）ＫＣＴＣ １３４２２ＢＰ（ＬＭＴ１−２１）乳酸菌に形質転換した。
【００５６】
そのように得られた各ベクターが導入された菌株を、ＭＲＳ液体培地で３７℃、１６時間静置培養した。培養物を、ＭＲＳ液体培地に、３（ｖ／ｖ）％になるように接種した後、８時間、同一温度で静置培養した。培養物１ｍｌを、７，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を取った。上澄み液１ｍｌに、卜リクロロ酢酸１００μｌを添加し、４℃で１時間静置し、培陽成分を濃縮した。反応物を、４℃、１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した後、ペレットを１ｍｌ冷アセトンで１回洗浄し、常温で１０分間乾燥させた後、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファ（ｐＨ８．８）１００μｌで溶出した。
【００５７】
溶出液に、４ｘローディングバッファ（Thermo）及び１０ｘ還元剤（Thermo）を添加した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで電気泳動した。前記ゲルを、Ｔｒａｎｓ blot semi-dry cell（ｂｉｏ−ｒａｄ）を利用し、ニトロセルローズ膜に伝達し、ウェスタンブロッティングを行った。具体的には、前記膜を、１％脱脂乳（skim milk）含有ＴＢＳＴバッファで１時間遮断させ、抗ＨＡ抗体（santa cruz）を常温で２時間反応させた後、ＴＢＳＴで５分ずつ３回洗浄した後、ＥＣＬで検出した。ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４ベクターで、ＩＬ−１０遺伝子は、その３’末端側に、ＨＡ遺伝子と作動自在に連結されており、ＨＡタグされた状態に発現される。
【００５８】
図６は、シグナルペプチド強度比較のために、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＳＰ４及びｐＭＴ５４−ＰＲ４−ＩＬ１０−ＵＳＰ４５に形質転換されたＬＭＴ１−２１から分泌されるＩＬ−１０の量を確認したものである。図６に示されているように、ＵＳＰ４５シグナルペプチドに比べ、ＳＰ４シグナルペプチドが発現されたタンパク質をさらに多く分泌させた。
【００５９】
実施例２：ＰＲ４プロモーター及びＳＰ４配列を利用したアミラーゼ遺伝子の発現
実施例１の（２）及び（３）において、ＩＬ−１０遺伝子の代わりに、アルファ−アミラーゼ遺伝子（配列番号１９）及びプライマーＦ／Ｒ（配列番号２２及び２３）を使用したことを除き、同様の過程を経て、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−amylase−ＳＰ４ベクターを製造し、それを、乳酸菌Ｌ．Paracasei ＬＭＴ１−２１に形質転換させ、アルファ−アミラーゼが細胞外に発現される程度を確認した。アルファ−アミラーゼ遺伝子増幅は、 ラクトバチルス・アミロボルス（Lactobacillus amylovorus）（ＫＣＴＣ ３５９７）のゲノムＤＮＡを使用した。
【００６０】
形質転換ＬＭＴ１−２１菌株のアミラーゼ活性度は、ヨード試験を使用した。まず、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−amylase−ＳＰ４ベクターが導入されたＬＭＴ１−２１菌株を、ＭＲＳ液体培地で、３７℃で１２時間、静置培養した。その後、培養物を０．５％可溶性片栗粉と、１０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールとが含有されたＭＲＳプレートに小点サイズに塗布した。それを３７℃で１２時間静置培養し、アミラーゼが十分に片栗粉を分解するようにした。その後、前記ＭＲＳプレート上に、ルゴールヨード溶液（ヨード・ヨード化カリウム溶液）を等しく塗布し、分解されていない片栗粉と反応がなされるようにした。アミラーゼ活性が低いほど、残存片栗粉量が多く、ヨード・片栗粉反応が強く起こって紫色に変わる一方、アミラーゼ活性が高い場合、細胞周辺の残存片栗粉量が少なく、透明な環が生ずることになる。
【００６１】
図４は、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−amylase−ＳＰ４ベクターをＬＭＴ１−２１菌株に形質転換させ、細胞外に発現された程度を確認した結果を示す。図４において、対照群のベクターは、ＰＲ４の代わりにＰ１１プロモーターを使用し、ＳＰ４の代りにＵＳＰ４５を使用したことを除き、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−amylase−ＳＰ４ベクターと同様である。
【００６２】
図４に示されているように、ｐＭＴ５４−ＰＲ４−amylase−ＳＰ４ベクターを使用した実験群は、ＬＭＴ１−２１菌株において、アルファ−アミラーゼを細胞外に発現させ、大きい透明環を形成した一方、対照群は、発現されておらず、環が小さかった。それにより、ＰＲ４が作動し、アミラーゼ遺伝子を発現させ、ＳＰ４によって細胞外に分泌させる能力が上昇するということを示す。
【００６３】
本明細書で説明される実施形態は、説明の目的にのみ考慮されるものであり、限定の目的に考慮されるものではないということが理解されなければならない。各実施形態内の特徴または態様の説明は、典型的に、他の実施形態の他の同様の特徴または態様に利用可能であると見なされなければならない。
【００６４】
図面を参照し、１または複数の実施形態について説明したが、以下の特許請求の範囲に定義される開示の趣旨および範囲から外れることなく、形態および詳細に、さまざまな変更が加えうるということは、当業者には理解されるものである。
【図１】
2021508464.tif 000003
【図２】
2021508464.tif 000004
【図３】
2021508464.tif 000005
【図４】
2021508464.tif 000006
【図５】
2021508464.tif 000007
【図６】
2021508464.tif 000008
【配列表】
2021508464000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年8月25日(2020.8.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１のヌクレオチド配列を有するプローモーター、またはシグナルポリペプチドをコーディングする第２ポリヌクレオチドであって、前記シグナルポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を有するもの、または前記プローモーター及びシグナルポリペプチドをコーディングする前記第２ポリヌクレオチドを含む組み換えポリヌクレオチド。
【請求項２】
クローニングベクターまたは発現ベクターであるものである、請求項１に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項３】
前記プローモーターを含むものである、請求項１または２に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項４】
前記プロモーターに作動可能に連結された第１ポリヌクレオチドをさらに含み、前記第１ポリヌクレオチドは、タンパク質をコーディングするものである、請求項３に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項５】
シグナルポリペプチドをコーディングする第２ポリヌクレオチドをさらに含むものである、請求項４に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項６】
シグナルポリペプチドをコーディングする前記第２ポリヌクレオチドは、前記プローモーターと前記第１ポリヌクレオチドとの間に作動可能に連結されたものである、請求項５に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項７】
シグナルポリペプチドをコーディングする前記第２ポリヌクレオチドは、前記プローモーターに作動可能に連結されており、前記第１ポリヌクレオチドは、シグナルポリペプチドをコーディングする前記第２ポリヌクレオチドにインフレームに融合されたものである、請求項５に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項８】
シグナルポリペプチドをコーディングする前期第２ポリヌクレオチドは、配列番号３のヌクレオチド配列を有するものである、請求項１ないし７のうちいずれか１項に記載の組み換えポリヌクレオチド。
【請求項９】
請求項１ないし８のうちいずれか１項に記載の組み換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項１０】
培地において、請求項９に記載の宿主細胞を培養する段階と、
前記細胞または前記培地からタンパク質を回収する段階とを含む、タンパク質を生産する方法。
【国際調査報告】
2021508464.tif 000009
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2021508464.tif 000011