(57)【要約】  本開示は、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡに同時に結合し、ＣＤ１３７に対して特異的なシングルドメイン抗体およびＰＳＭＡに結合する部分を含んでなる物質に関する。本開示はまた、例えばがんの処置または検出における、そのような物質の治療応用および診断応用にも関する。
2021502810.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および
ｂ）ＰＳＭＡに結合する部分
を含んでなる、単離された結合性分子。
【請求項２】
ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、配列番号１もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号２もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号３もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３、または、配列番号４２５もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号４２６もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号４２７もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３、および配列番号４２７もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる、請求項１に記載の単離された結合性分子。
【請求項３】
ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、ヒトフレームワーク領域を含んでなる、請求項１または２に記載の単離された結合性分子。
【請求項４】
ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、表２もしくは３に記載の完全長の配列またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項５】
ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、配列番号４、３１２、８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２、８７６、８８０もしくは４２８またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項６】
ＰＳＭＡに結合する部分が、抗体、抗体断片、抗体模倣物または他のポリペプチドから選択される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項７】
前記抗体断片が、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体またはその断片から選択される、請求項６に記載の単離された結合性分子。
【請求項８】
前記シングルドメイン抗体がＶＨシングルドメイン抗体である、請求項７に記載の単離された結合性分子。
【請求項９】
前記ＶＨシングルドメイン抗体が、配列番号８１２もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号８１３もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号８１４もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなるか、または、前記ＶＨシングルドメイン抗体が、配列番号８３７もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号８３８もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号８３９もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる、請求項８に記載の単離された結合性分子。
【請求項１０】
ＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、表６もしくは７に記載の完全長の配列またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項１１】
ＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、配列番号８１５、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５もしくは８４０またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項１２】
配列番号４もしくは４２８を有するシングルドメイン抗体１．１もしくは２．１、あるいは、配列番号３１２、８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２もしくは８７６またはそれと少なくとも７５％の配列相同性を有するシングルドメイン抗体が、それぞれ配列番号８１５、８２２もしくは８４０を有するシングルドメイン抗体３．１、３．８もしくは４．１と連結されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項１３】
少なくとも約１０−６Ｍ〜約１０−１２ＭのＫｄの親和性でＣＤ１３７に結合することができる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項１４】
約１０−６Ｍ〜約１０−１２ＭのＫｄの親和性でＰＳＭＡに結合することができる、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項１５】
ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、ペプチドリンカーにより、ＰＳＭＡに結合する部分と連結されている、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項１６】
前記リンカーが（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（式中、ｎは１〜１０から選択される整数である）から選択される、請求項１５に記載の結合性分子。
【請求項１７】
毒素、酵素、放射性同位体、半減期延長部分、標識、治療分子および他の化学部分から選択される１つまたは複数の部分とコンジュゲートされている、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項１８】
前記半減期延長部分が、アルブミン結合性部分、トランスフェリン結合性部分、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの断片、および、ヒト血清アルブミンに結合するアルブミン結合性ペプチドまたはシングルドメイン抗体からなる群から選択される、請求項１７に記載の単離された結合性分子。
【請求項１９】
ヒトＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、単一特異性エンティティとしてＣＤ１３７に結合した場合、ＣＤ１３７シグナル伝達を生じない、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項２０】
ヒトＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、ヒトＶ、ＤおよびＪ領域を含んでなるトランスジーンを発現するトランスジェニック齧歯類から得られたまたは得ることができる、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の単離された結合性分子。
【請求項２１】
前記齧歯類が、機能的な内因性の軽鎖および重鎖を産生しない、請求項２０に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項２２】
請求項２１に記載の結合性分子および薬学的担体を含んでなる、医薬組成物。
【請求項２３】
疾患の処置に使用するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子または請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記疾患ががんである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子または請求項２２に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前立腺がんまたは前立腺障害を処置する方法であって、治療有効量の、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子または請求項２２に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項２６】
前記がんが、前立腺がん、肺がん、神経膠芽腫、腎臓がん、膀胱がん、精巣がん、神経内分泌がん、結腸がん、および乳がんである、請求項２４に記載の結合性分子または請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子をコードする核酸配列を含んでなる、核酸分子。
【請求項２８】
請求項２７に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項２９】
請求項２７に記載の核酸分子または請求項２８に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項３０】
前記宿主細胞が、細菌、酵母、ウイルスまたは哺乳動物細胞である、請求項２９に記載の宿主細胞。
【請求項３１】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子を産生する方法であって、
宿主細胞において前記結合性分子をコードする核酸を発現させる工程、および
宿主細胞から結合性分子を単離する工程を含んでなる、方法。
【請求項３２】
ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化および／またはサイトカイン放出を誘導する方法であって、
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子または請求項２２に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項３３】
ヒトＰＳＭＡ活性を低減させるｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、
ヒトＰＳＭＡを請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子と接触させる工程を含んでなる、方法。
【請求項３４】
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子または請求項２２に記載の医薬組成物を含んでなる、キット。
【請求項３５】
ＣＤ１３７およびＰＳＭＡの下流シグナル伝達経路を同時に活性化するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子または請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３６】
ＣＤ１３７およびＰＳＭＡの下流シグナル伝達経路を同時刺激する方法であって、
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子または請求項２２に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項３７】
ＰＳＭＡ陽性腫瘍細胞または組織の近傍で局所Ｔ細胞応答を誘導するための、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子または請求項２２に記載の医薬組成物の使用。
【請求項３８】
ＰＳＭＡ陽性腫瘍細胞または組織の近傍で局所Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、
請求項１〜２１のいずれか一項に記載の結合性分子または請求項２２に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
がんは、依然として世界において主な死因の１つである。最近の試験では、世界中で推定１２７０万のがん症例が示されている。この数字は、２０３０年までに２１００万に増加すると予想されている（Vinay and Kwon 2014）。
【０００２】
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳ９）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する１型膜貫通糖タンパク質である。これは、活性化されたマウスＴ細胞のｃＤＮＡからＫｗｏｎら（１９８９）によって最初にクローン化された。これは、その後、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫおよびＮＫ  Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、好中球ならびに好酸球上で認められる広範な免疫細胞発現パターンを有することが示されている。発現は、非造血細胞、例えば、上皮、内皮および平滑筋細胞上、ならびに腫瘍細胞株上でも報告されている。ＣＤ１３７発現は、主に活性化誘導性であるが、低レベルの構成的発現が、ＴｒｅｇおよびＤＣを含む一部の細胞型で示されている。
【０００３】
２５５アミノ酸ヒトＣＤ１３７タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１５５２）は、１７アミノ酸シグナルペプチド配列、４つのシステインリッチドメインを含有する細胞外領域、２７アミノ酸膜貫通領域および短い４２アミノ酸細胞内ドメインからなる。これは、細胞表面上で単量体および二量体の両方として存在する。ＣＤ１３７に対する主なリガンドは、ＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ、４−１ＢＢ−Ｌ、ＴＮＦＳ９）であるが、受容体凝集を促進するガレクチン−９（Madireddi et al 2014）およびフィブロネクチンなどのマトリックスタンパク質（Chalupny et al, 1992）との相互作用も報告されている。ＣＤ１３７リガンドは、樹状細胞、Ｂ細胞およびマクロファージなどの活性化された抗原提示細胞上で主に発現される。
【０００４】
三量体ＣＤ１３７リガンドとＣＤ１３７との相互作用は、受容体のクラスタ形成、ならびにキナーゼ調節およびＮｆＫＢ経路の活性化をもたらすタンパク質のＴＲＡＦファミリーなどのシグナル伝達分子の動員をもたらす。このように、ＣＤ１３７のクラスタ形成は、下流シグナル伝達の開始および調節のために非常に重要である。
【０００５】
アゴニスト抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで用いた試験では、活性化時、ＣＤ１３７は、「シグナロソーム」と呼ばれるエンドソーム区画に迅速に内部移行され、そこからシグナル伝達を維持することが示されている（Sanchez-Paulete et al 2016における論評）。
【０００６】
ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＨＶＥＭ、ＣＤ３０、およびＧＩＴＲなどの同時刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーは、最初のＴ細胞活性化後のＴ細胞応答の維持に関与する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＣＤ１３７は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介シグナル伝達を調節する同時刺激受容体として作用する。ＴＣＲ活性化とともにＣＤ１３７のライゲーションは、増殖、サイトカイン産生を促進し、抗アポトーシスＢ細胞リンパ腫−特大（Ｂｃｌ−ｘｌ）およびＢ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ−２）経路の誘導を通じてアポトーシスを阻害する。ＮＫ細胞上でのＣＤ１３７の架橋は、ＩＦＮ−γの分泌および増殖を刺激することが示されている。ＣＤ１３７刺激に対する樹状細胞応答には、増強された成熟および抗原提示、ならびにサイトカインＩＬ−６、ＩＬ１２およびＩＬ−２７ならびにＴ細胞機能を調節できるインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）などの酵素の分泌が含まれる。ＣＤ１３７は、腫瘍血管内皮上で細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）および血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）をアップレギュレートすることもでき、それにより、エフェクター細胞の遊走および腫瘍微小環境における活性化Ｔ細胞の保持が誘導される。
【０００７】
抗ＣＤ１３７抗体によるＣＤ１３７の架橋は、肉腫、肥満細胞腫、神経膠腫、リンパ腫、骨髄腫、および肝細胞癌を含む多数のモデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの強力な抗腫瘍効果を有することが示されている。ＣＤ８＋細胞枯渇試験では、この効果は、主に細胞溶解性Ｔ細胞の増殖および浸潤に関与し、腫瘍細胞の溶解をもたらすことが実証されている。しかしながら、ＤＣ、ＮＫ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞などの他の種類の細胞の寄与が、一部の腫瘍モデルにおいて報告されている。さらに、抗ＣＤ１３７療法は、免疫記憶応答を誘発し、自己免疫反応を阻害することが示されている（Vinay et al 2012における論評）。
【０００８】
既存のアゴニスト療法は、全身性のＣＤ１３７作用をもたらし、望まれない副作用に至ることが示されている。ＣＤ１３７シグナル伝達の活性化は、マウスモデルにおける重度の毒性と関連している。完全ヒトＩｇＧ４抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体（Ｕｒｅｌｕｍａｂ（登録商標）、ＢＭＳ−６６３５１３）の臨床試験では、好中球減少症、肝酵素の上昇および高用量での重度の肝毒性が報告され、試験中止に至った。この重度の毒性は、これも単剤療法および併用療法のアプローチの両方として臨床試験中である完全ヒトＩｇＧ２（ＰＦ−０５０８２５６６）では認められなかった。
【０００９】
同時刺激ＴＮＦＲを標的とするアゴニスト抗体は、ＦｃγＲの関与（engagement）を必要とすることが示されている（Bulliard et al）。このように、ＦｃγＲを介した非標的クラスタ形成は、それによりアゴニスト抗体がこれらの標的に作用する機序に影響を及ぼし得る。
【００１０】
既存の療法で認められた毒性プロファイルを考慮すると、毒性を低減させた代替のＣＤ１３７結合性分子の使用に基づいた、代替のがん療法の必要性が存在する。特に、細胞の表面でＣＤ１３７と効果的に関与し（engage）、肝毒性を含む毒性を低減させた標的ＣＤ１３７アゴニストの臨床的必要性が存在する。
【００１１】
前立腺がんは、先進国の男性において最も一般的に診断される非皮膚関連悪性腫瘍である。男性６名中１名が前立腺がんと診断されると推定されている。
【００１２】
前立腺がんに対する現在の処置には、手術、放射線、およびアジュバントホルモン療法が挙げられる。これらの治療法は、疾患の初期において比較的有効であるが、限局性前立腺がんと最初に診断された患者の大部分は、最終的に再発する。化学療法は、進行性前立腺がんの戦いにおいて最も広く使用されているアプローチの１つであるが、その治療効力は、特異性の欠如および関連する毒性のために、通常不十分である。前立腺がん細胞への標的送達の欠如が、実現可能な治療効果の達成における主な障壁の１つである。従って、前立腺抗がん剤の選択性を増加させる戦略の重大な必要性が、依然として存在する（Barve et al）。
【００１３】
前立腺がんの診断は、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）などの血清に基づくマーカーの使用後、大幅に改善している。加えて、前立腺腫瘍関連抗原は、腫瘍イメージング、診断、および標的化治療のための標的を与える。前立腺腫瘍関連マーカーである前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）は、そのような標的である。
【００１４】
ＰＳＭＡは、前立腺分泌上皮細胞膜に高度に制限された７５０残基のＩＩ型膜貫通糖タンパク質である。これは、前立腺がん細胞ならびに非前立腺固形腫瘍新脈管構造および他の固形腫瘍において高度に発現し、健常な前立腺、腎臓、肝臓、小腸、および脳を含む他の組織において、より低いレベルで発現する。ＰＳＭＡの発現は、前立腺疾患の進行および転移とともに増加し、このため、その発現レベルは、腫瘍の攻撃性と相関している。様々な免疫組織学的試験が、良性前立腺上皮細胞におけるＰＳＭＡレベルと比較して、前立腺癌の実質的に総ての例においてＰＳＭＡレベルが増加していることを実証している。前立腺上皮内新生物、後期アンドロゲン非依存性前立腺がん、ならびにリンパ節、骨、軟部組織、および肺に限局した二次性前立腺腫瘍を含む疾患の全段階において、強いＰＳＭＡ染色が認められる。このように、ＰＳＭＡは、前立腺がん細胞に対するバイオマーカーとして広く使用されている。
【００１５】
ＰＳＭＡは、１９アミノ酸内部部分、２４アミノ酸膜貫通部分、および７０７アミノ酸外部部分という３部構造を有する。これは、神経ペプチドＮ−アセチルアスパルチルグルタミン酸およびグルタミン酸コンジュゲート葉酸誘導体を処理するその能力に基づいた、グルタミン酸カルボキシペプチダーゼ活性を有する非共有結合ホモ二量体を形成する。ＰＳＭＡは、エンドサイトーシス経路によって迅速かつ効率的に内部移行され、膜へと再度迅速に再利用される。
【００１６】
本発明は、がんの処置に使用するための、代替の抗体に基づく処置の必要性に取り組む。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡの両方に対する特異性を有する新規な結合性分子（binding molecule）に関する。本発明者らは、ＣＤ１３７に結合し、ＣＤ１３７に対するＣＤ１３７Ｌの結合を阻害するシングル可変重鎖ドメイン抗体を同定した。それらの抗体は、単一特異性フォーマット（monospecific format）で、すなわち、第２の標的に結合する別の部分と連結されることなく、ＣＤ１３７に結合した場合、ＣＤ１３７シグナル伝達を生じない。しかしながら、腫瘍特異抗原に結合する部分に連結された場合、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＣＤ１３７シグナル伝達を誘発する。このように、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、第２の抗原を標的とする結合パートナーなしに、ＣＤ１３７と結合した場合、受容体のクラスタ形成を誘導せず、アゴニスト活性を示さない一方で、二特異性分子におけるＣＤ１３７および腫瘍特異抗原の二重関与（dual engagement）は、ＣＤ１３７アゴニズムをもたらす。従って、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡと同時に関与する（simultaneously engage）多特異性の結合性分子におけるサブユニットとして使用することができる。
【００１８】
本明細書に記載される二特異性および多特異性分子は、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡに結合し、両方の標的と同時に関与する。この二重関与は、ＣＤ１３７活性化をもたらし、それにより、腫瘍微小環境に対する作用部位を制限し、既存のＣＤ１３７療法の望ましくない効果を最小限にできる可能性がある。
【００１９】
一つの態様において、
ａ）ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および
ｂ）ＰＳＭＡに結合する部分
を含んでなるか、またはそれらからなる、単離された結合性分子が提供される。
【００２０】
一つの実施形態において、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号１もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号２もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号３もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３、または配列番号４２５もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号４２６もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号４２７もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。
【００２１】
一つの実施形態において、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、ヒトフレームワーク領域を含んでなる。
【００２２】
一つの実施形態において、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、表２もしくは３に記載の完全長の配列またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなる。
【００２３】
一つの実施形態において、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、以下の配列：配列番号４、３１２、４２８、８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２、８７６もしくは８８０またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列のうちの１つを含んでなるか、またはそれからなる。
【００２４】
一つの実施形態において、ＰＳＭＡに結合する部分は、抗体、抗体断片、抗体模倣物、ＣＤ１３７の天然リガンドを模倣するタンパク質、または他のポリペプチドから選択される。
【００２５】
一つの実施形態において、前記抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、シングルドメイン抗体またはその断片から選択される。
【００２６】
一つの実施形態において、前記シングルドメイン抗体は、シングルＶＨドメイン抗体である。
【００２７】
一つの実施形態において、前記シングルＶＨドメイン抗体は、配列番号８１２もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号８１３もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号８１４もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなるか、または前記ＶＨシングルドメイン抗体は、配列番号８３７もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号８３８もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号８３９もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。
【００２８】
一つの実施形態において、ＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、表６もしくは７に記載の完全長の配列またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列を含んでなる。
【００２９】
一つの実施形態において、ＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体部分は、配列番号８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５もしくは８４０またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列を含んでなる。
【００３０】
一つの実施形態において、配列番号４、３１２、８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２、８７６、８８０もしくは４２８のうちの１つを有するシングルドメイン抗体１．１もしくは２．１、またはその変異体（例えば、１〜１０または１〜２０個のアミノ酸置換を有する分子）は、それぞれ配列番号８１５、８２２または８４０を有するシングルドメイン抗体３．１、３．８または４．１と連結されている。
【００３１】
一つの実施形態において、単離された結合性分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２ＭのＫｄの親和性、またはそれより大きい親和性で、ＣＤ１３７に結合することができる。
【００３２】
一つの実施形態において、単離された結合性分子は、少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２ＭのＫｄの親和性、またはそれより大きい親和性で、ＰＳＭＡに結合することができる。
【００３３】
一つの実施形態において、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、ペプチドリンカーにより、ＰＳＭＡに結合する部分と連結されている。
【００３４】
一つの実施形態において、前記リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーから選択され、式中、ｎは１〜１０である。
【００３５】
本発明の単離された結合性分子は、ＰＳＭＡに結合する部分と連結されたＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなってもよい。一つの実施形態において、単離された結合性分子は、毒素、酵素、放射性同位体、半減期延長部分、標識、治療分子または他の化学部分とコンジュゲートされている。
【００３６】
一つの実施形態において、前記半減期延長部分は、アルブミン結合部分、トランスフェリン結合部分、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの断片、およびアルブミン結合ペプチドまたはヒト血清アルブミンに結合するシングルドメイン抗体からなる群から選択される。
【００３７】
一般的に、ヒトＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、単一特異性エンティティ（monospecific entity）としてＣＤ１３７に結合した場合、ＣＤ１３７シグナル伝達を生じない。
【００３８】
一つの実施形態において、ヒトＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、ヒトＶ、ＤおよびＪ領域を含んでなるトランスジーンを発現するトランスジェニック齧歯類から得られたまたは得ることができる。
【００３９】
一つの実施形態において、前記齧歯類、例えばマウスは、機能的な内因性の軽鎖および重鎖を産生しない。
【００４０】
本明細書に記載される結合性分子を含んでなる、例えば、本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体および薬学的担体を含んでなる医薬組成物も提供される。
【００４１】
がん、前立腺がんまたはＰＳＭＡ陽性腫瘍などの疾患の処置に使用するための、本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物も提供される。
【００４２】
がんを処置する方法であって、治療有効量の、本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法も提供される。
【００４３】
一つの実施形態において、前記がんは、前立腺がん、肺がん、神経膠芽腫、腎臓がん、膀胱がん、精巣がん、神経内分泌がん、結腸がん、および乳がんである。
【００４４】
本明細書に記載される結合性分子をコードする核酸配列を含んでなる核酸分子も提供される。
【００４５】
本明細書に記載される核酸分子を含んでなるベクターも提供される。
【００４６】
本明細書に記載される核酸分子またはベクターを含んでなる宿主細胞も提供される。
【００４７】
一つの実施形態において、宿主細胞は、細菌、酵母、ウイルス、植物または哺乳動物細胞である。
【００４８】
本明細書に記載される結合性分子を産生する方法であって、宿主細胞において前記結合性分子をコードする核酸を発現させる工程および宿主細胞から結合性分子を単離する工程を含んでなる方法も提供される。
【００４９】
ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化および／またはサイトカイン放出を誘導する方法であって、本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法も提供される。
【００５０】
ヒトＰＳＭＡ活性を低減させるｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、ヒトＰＳＭＡを上記の結合性分子と接触させる工程を含んでなる方法も提供される。
【００５１】
本明細書に記載される結合性分子または本明細書に記載される医薬組成物を含んでなるキットも提供される。
【００５２】
ＣＤ１３７およびＰＳＭＡの下流シグナル伝達経路を活性化する、例えば同時に活性化するための、上記の結合性分子または医薬組成物の使用も提供される。
【００５３】
ＣＤ１３７およびＰＳＭＡの下流シグナル伝達経路を活性化する、例えば同時に活性化する方法であって、本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法も提供される。
【００５４】
ＣＤ１３７およびＰＳＭＡを二重関与させる方法であって、本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法も提供される。
【００５５】
ＰＳＭＡ陽性腫瘍細胞または組織の近傍で局所Ｔ細胞応答を誘導するための、本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物の使用も提供される。
【００５６】
ＰＳＭＡ陽性腫瘍細胞または組織の近傍で局所Ｔ細胞応答を誘導する方法であって、本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法も提供される。
【００５７】
本発明を、以下の非制限的な図面においてさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】二重結合細胞に基づくＥＬＩＳＡ。ＣＨＯヒトＰＳＭＡ発現細胞をプレートに播種し、一価ＶＨまたは二特異性分子を添加した。引き続きＣＤ１３７ｈｕＦｃを添加し、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを用いて結合を検出した。二特異性分子のみが結合シグナルの増加を示し、二重標的結合が確認された。
【図２】Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるＣＤ１３７シグナル伝達の活性化。（Ａ）ＣＨＯ  ＰＳＭＡ細胞、（Ｂ）ＤＵ１４５  ＰＳＭＡ細胞または（Ｃ）ＤＵ１４５親細胞（二特異性試験）／培地のみ（抗体試験）を、ＪｕｒｋａｔヒトＣＤ１３７ＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポーター細胞とともに培養した。相対発光シグナル（ＲＬＵ）を、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路のＣＤ１３７媒介活性化から生じたルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の読み取り値として測定した。一価Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ１．１および２．１は、応答を刺激することができなかった。二特異性Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨは、ＰＳＭＡ依存的および濃度依存的にＣＤ１３７シグナル伝達を刺激した。応答のレベルはＰＳＭＡ発現レベル依存的であり、より高い最大応答が、ＰＳＭＡのより高い発現の存在下で認められた。抗ＣＤ１３７抗体応答は、ＰＳＭＡ発現非依存的であった。ＰＳＭＡ発現細胞の存在下での二特異性分子は、ＣＤ１３７シグナル伝達を効果的に刺激することができた。
【図３】Ｔ細胞におけるサイトカイン産生の増強。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＣＤ３抗体の存在下で、ＰＳＭＡ発現細胞または非発現親細胞と共培養した。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ１．１一価および二特異性分子、Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ２．１一価および二特異性分子、抗ＣＤ１３７コンパレータ抗体ならびに抗ＰＳＭＡ抗体。上清を４８時間後に回収し、ＩＬ−２のレベルを決定した。（Ａ）ＰＳＭＡ発現細胞および非ＰＳＭＡ発現細胞の存在下でのＩＬ−２応答の増強、（Ｂ）ＰＳＭＡ発現細胞の存在下での３匹の異なるＴ細胞ドナーに関するＩＬ−２応答。（ＣおよびＤ）ＩＬ−２応答の濃度依存性。（Ｅ）ＰＳＭＡ発現細胞の存在下でのインターフェロン−γの産生。一価Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨは、アッセイにおいてＩＬ２またはＩＦＮ−γ産生を刺激しなかった。ＰＳＭＡ発現細胞の存在下での二特異性分子は、サイトカインＩＬ−２産生を効果的に増強することができた。抗ＣＤ１３７抗体（可溶性、非架橋）は、ＰＳＭＡ非依存的応答においてＩＬ−２産生を増強した。
【図４】二特異性分子の作用機序。この図面は、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡの両方に結合し、腫瘍選択的Ｔ細胞アゴニズムをもたらす結合性分子の作用機序を例示したものである。
【図５】ＴＮＦα産生の増強。ＳＥＢ予備刺激したＰＢＭＣを、（Ａ）ＣＨＯ  ＰＳＭＡ細胞または（Ｂ）ＣＨＯ親細胞および１ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢのいずれかの存在下で、１ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢおよびＨｕｍａｂｏｄｙ構築物４．１−６ＧＳ−１．１、３．８−６ＧＳ−１．１または対照ＶＨで、３日間処置した。ＴＮＦ−α濃度（平均±標準偏差）を、３レプリケートウェルから決定した。
【図６】ｉｎ  ｖｉｖｏ実験：ＤＵ１４５  ＰＳＭＡ／ｈｕ  ＰＢＭＣ移植ＮＣＧマウスにおけるＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）の効果。ＤＵ１４５  ＰＳＭＡ前立腺細胞株を移植したＨｕＰＢＭＣ移植ＮＣＧマウスからのプール腫瘍容積データ。第４〜６群（３匹のｈｕＰＢＭＣドナー、各群ドナーあたりｎ＝５のマウス）を、９〜３２日目にＰＢＳ（隔週）で、３３〜４５日目に４．１−６ＧＳ−１．１−ＶＨ（ＭＳＡ）（３ｍｇ／ｋｇ、毎日）で処置した。第７〜９群（３匹のｈｕＰＢＭＣドナー、ドナーあたりｎ＝５のマウス）を、９〜３２日目に対照抗ＣＤ１３７抗体（３ｍｇ／ｋｇ、隔週）で処置した。第３群（非ｈＰＢＭＣ移植群、ｎ＝５のマウス）は、無処置とした。腫瘍移植後４６日目に、腫瘍容積を測定した。統計的有意性（マン・ホイットニーのＵ検定）：＊＊＝Ｐ＜０．０１、第３群との比較。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明の実施形態を以下にさらに詳しく説明する。以下の節では、様々な実施形態を説明する。明らかに反対であることを示していない限り、そのように定義された各々の態様を、他の任意の態様または複数の態様と組み合わせてもよい。特に、好ましいかまたは有利であることが示された任意の特色を、好ましいかまたは有利であることが示された他の任意の特色または複数の特色と組み合わせてもよい。
【００６０】
一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびにそれらの技術は、当技術分野で周知であり、当技術分野で一般的に使用される。本開示の方法および技術は、それ以外であることを示していない限り、当技術分野で周知の、ならびに本明細書を通して引用および考察される様々な一般的なおよびより特定の参考文献に記載される通常の方法に従って実施される。例えば、Green and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, Zhiqiang An (編), Wiley, (2009);およびAntibody Engineering, 第2版, 1および2巻, Ontermann and Dubel編, Springer-Verlag, Heidelberg (2010)を参照されたい。
【００６１】
酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般的に実施されているように、または本明細書に記載されているように製造元の説明書に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、および送達、ならびに患者の処置に関しては、標準的な技術を使用する。上記の特性を測定するための好適なアッセイも、実施例において説明する。
【００６２】
本明細書に使用される用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖で構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子もしくはその抗原結合部分、またはＩｇ分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持するその任意の機能的断片、突然変異体（mutant）、変異体（variant）、もしくは誘導体を広範に指す。
【００６３】
完全長の抗体では、各々の重鎖は、重鎖可変領域またはドメイン（本明細書においてＨＣＶＲと省略される）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域またはドメイン（本明細書においてＬＣＶＲと省略される）および軽鎖定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。
【００６４】
重鎖および軽鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができ、それらの領域の間にはより保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が介在する。各々の重鎖および軽鎖可変領域は、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で整列する。
【００６５】
免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）またはサブクラスの分子であり得る。
【００６６】
用語「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域の各々には、可変領域の各々に関してＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲが存在する。用語「ＣＤＲの組」は、抗原に結合することができる単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、当技術分野で公知の異なるシステムに従って異なるように定義することができる。
【００６７】
Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいており、最も一般的に使用される(Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391およびKabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242)。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造ループの位置を指している（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。Ｋａｂａｔの付番システムは、可変ドメインにおける残基（軽鎖のおよそ１〜１０７位の残基および重鎖の１〜１１３位の残基）を指す場合に一般的に使用される。別のシステムは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）付番スキームである。ＩＭＧＴ付番スキームは、Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005) に記載されている。
【００６８】
本明細書において、Ｋａｂａｔによって記載されるシステムを使用する。用語「Ｋａｂａｔ付番」、「Ｋａｂａｔ定義」および「Ｋａｂａｔ表記」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、当技術分野で認識されるように、抗体の重鎖および軽鎖可変領域または抗原結合部分における他のアミノ酸残基より可変(すなわち、超可変)であるアミノ酸残基の付番システムを指す。
【００６９】
キメラ抗体は、１つの種に由来する抗体、好ましくは齧歯類抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含み、抗体分子の定常ドメインがヒト抗体の定常ドメインに由来する組換えタンパク質である。
【００７０】
ヒト化抗体は、１つの種の抗体、例えば齧歯類抗体のＣＤＲが、齧歯類抗体の重鎖および軽鎖可変鎖からヒト重鎖および軽鎖可変ドメイン（例えば、フレームワーク領域配列）に移植されている組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のそれに由来する。特定の複数の実施形態において、親（齧歯類）抗体からの限定数のフレームワーク領域アミノ酸残基を、ヒト抗体フレームワーク領域配列に置換してもよい。
【００７１】
用語「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合する領域を含んでなる抗体の一部または抗体断片を指す。抗原結合部位は、１つまたは複数の抗体可変ドメインによって提供され得る。抗原結合部位は、一般的に、抗体または抗体断片における会合したＶＨおよびＶＬ内に含まれる。
【００７２】
抗体断片は、抗体の一部、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、重鎖、軽鎖、重（ＶＨ）鎖ドメイン、可変軽（ＶＬ）鎖ドメイン、およびその他である。完全長の抗体の機能的断片は、完全長の抗体の標的特異性を保持する。従って、組換えの機能的抗体断片、例えばＦａｂ（断片、抗体）、ｓｃＦｖ（一本鎖可変鎖断片）、およびシングルドメイン抗体（ｄＡｂ）は、ｍＡｂに基づく治療薬の代替として治療薬を開発するために使用されている。
【００７３】
ｓｃＦｖ断片（約２５ｋＤａ）は、２つの可変ドメイン、ＶＨおよびＶＬからなる。天然において、ＶＨおよびＶＬドメインは、疎水性相互作用を介して非共有結合により会合し、解離する傾向がある。しかしながら、ドメインを親水性のフレキシブルリンカーに連結して一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を作製することによって、安定な断片を工学操作することができる。
【００７４】
最小の抗原結合性断片は、単一の可変断片、すなわち単一の可変重（ＶＨ）鎖ドメインまたは単一の可変軽（ＶＬ）鎖ドメインである。ＶＨおよびＶＬドメインはそれぞれ、抗原に結合することができる。軽鎖／重鎖パートナーに対する結合はそれぞれ、または実際には完全長の抗体の他の部分の存在は、標的結合にとって必要ではない。サイズが１つのシングルドメイン（ＶＨまたはＶＬドメインに対応）に縮小した、抗体の抗原結合性エンティティ（antigen-binding entity）は、一般的に、「シングルドメイン抗体」または「シングル免疫グロブリン可変ドメイン」と呼ぶ。このように、シングルドメイン抗体（約１２〜１５ｋＤａ）は、ＶＨまたはＶＬドメインのいずれかからなるが、完全長の抗体の他の部分を含まない。軽鎖を天然的に欠如するラクダ化重鎖のみの抗体に由来するシングルドメイン抗体、ならびにヒト重鎖ドメインを有するシングルドメイン抗体が記載されている（Muyldermans 2001, Holliger 2005）。抗原結合性シングルＶＨドメインも、例えば、免疫マウスの脾臓由来のゲノムＤＮＡから増幅され、大腸菌において発現したマウスＶＨ遺伝子のライブラリから同定されている（Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546）。Ｗａｒｄらは、単離されたシングルＶＨドメインを「ｄＡｂ」、すなわち「ドメイン抗体」と命名した。用語「ｄＡｂ」または「ｓｄＡｂ」は、一般的に、抗原に特異的に結合するシングル免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬ）ポリペプチドを指す。そのような分子は、それぞれＶＨまたはＶＬ結合ドメインのみを有するが、完全長の抗体の他の部分を含まない。それ以外であることを明記していない限り、本明細書に使用される場合、この用語は、ＶＨドメインを有するシングルドメイン抗体を指す。療法に使用するためには、ヒトシングルドメイン抗体が好ましく、その主な理由は、ヒトシングルドメイン抗体は、患者に投与した場合、免疫応答を引き起こす可能性が低いからである。
【００７５】
このように、用語「シングルドメイン抗体」、「ＶＨドメイン抗体」、「シングルＶＨドメイン抗体」、「ＶＨシングルドメイン抗体」、「シングル可変ドメイン」、「シングル可変ドメイン抗体」、「シングル可変重鎖ドメイン抗体」または「免疫グロブリンシングル可変ドメイン（ＩＳＶ）」は、総て当技術分野で周知であり、標的抗原に結合する抗体の単一の可変断片を記載する。これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。上記のこれらの用語、具体的には、本明細書に使用される「シングル重鎖ドメイン抗体」、「シングル可変重鎖ドメイン抗体」、「シングルＶＨドメイン抗体」、「ＩＳＶ」、および「ＶＨシングルドメイン」は、軽鎖または他の抗体断片の非存在下で抗原に対する結合特異性を保持する抗体の一部、すなわち抗体の単一の重鎖可変断片、例えばＶＨドメインを記載する。そのような分子、例えばシングル可変重鎖ドメイン抗体は、軽鎖の非存在下で抗原に結合することができる。シングル可変重鎖ドメイン抗体は、完全長の抗体の他の部分を含まず、ＶＨドメインのみを含む。このように、本明細書に使用される場合、これらの用語、具体的にはシングルドメイン抗体は、ＶＨドメインのみからなり、抗体の他の部分を有さない結合部分を指す。本明細書に説明するように、下記に例証されるＣＤ１３７結合性エンティティ（CD137 binding entity）はＶＨシングルドメイン抗体であり、好ましい複数の実施形態において、ＰＳＭＡ結合性エンティティ（PSMA binding entity）もＶＨシングルドメイン抗体である。
【００７６】
以下に説明するように、複数の実施形態は、ＣＤ１３７抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体／免疫グロブリンシングル可変重鎖ドメインを含んでなるか、またはそれからなる、およびＰＳＭＡに結合する部分も含んでなる単離された結合性分子に関する。このように、シングル可変重鎖ドメイン抗体（すなわちＶＨドメイン）は、軽鎖の非存在下でＣＤ１３７に結合することができる。ヒトシングル可変重鎖ドメイン抗体（「ＶＨドメイン抗体」）が、特に好ましい。そのような結合性分子はまた、本明細書においてＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）と呼ばれる。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）は、Ｃｒｅｓｃｅｎｄｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｌｔｄの登録商標である。
【００７７】
用語「単離された」は、その自然環境から単離された部分を指す。例えば、用語「単離された」は、他のシングルドメイン抗体または結合性分子、抗体または抗体断片を実質的に含まないシングルドメイン抗体または結合性分子を指す。その上、単離されたシングルドメイン抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００７８】
各々のＶＨドメイン抗体は、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含んでなり、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で整列した。このように、本発明の一つの実施形態において、ドメインは、以下の式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有するヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメインである。
【００７９】
本発明のシングルドメイン抗体に対して、その特性を改善するためにＣ末端またはＮ末端ＶＨフレームワーク配列に対する修飾を行ってもよい。例えば、ＶＨドメインは、Ｃ末端またはＮ末端の伸長を含んでなり得る。Ｃ末端伸長は、残基ＶＴＶＳＳ（配列番号７８８）で終止するＶＨドメインのＣ末端に付加することができる。
【００８０】
一つの実施形態において、本発明のシングルドメイン抗体は、１〜５０の残基、例えば１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、１〜２０、１〜３０または１〜４０個の追加のアミノ酸のＣ末端伸長を含んでなる。一つの実施形態において、本発明のシングルドメイン抗体は、ヒトＣＨ１ドメインの追加のアミノ酸を含んでなり、このためＣ末端はＣＨ１ドメイン内に伸長する。例えば、Ｃ末端伸長は、中性非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｉ、ＦもしくはＷまたは中性極性アミノ酸、例えばＳもしくはＴを含んでなってもよい。Ｃ末端伸長はまた、ペプチドリンカーまたはタグ、例えば、配列番号７９０〜７９７から選択され得る。
【００８１】
さらなるＣ末端またはＮ末端残基は、例えば、本発明のシングルドメイン抗体を、分子の検出を助ける別の部分またはタグにコンジュゲートするために使用されるペプチドリンカーであり得る。そのようなタグは当技術分野で周知であり、例えばリンカーＨｉｓタグ、例えばヘキサＨｉｓ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号７８９）またはｍｙｃタグを含む。
【００８２】
本明細書に使用される場合、用語「相同性」または「同一性」は一般的に、配列を整列させた後に、およびいくつかの実施形態においては最大の百分率相同性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮することなく比較される参照ポリペプチドの残基と同一である配列におけるアミノ酸残基の百分率を指す。このように、２つのアミノ酸配列間の百分率相同性は、２つの配列間の百分率同一性と同等である。Ｎ末端もしくはＣ末端の伸長、タグ、または挿入はいずれも、同一性または相同性を低減させると解釈すべきではない。アライメントのための方法およびコンピュータープログラムは周知である。２つのアミノ酸配列間の百分率同一性は、周知の数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。
【００８３】
本発明の様々な態様のいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載されるシングルドメイン抗体の可変ドメインは、ヒト可変ドメイン（本明細書に使用される場合、ＶＨはヒトドメインを指す）、ラクダ化可変ドメイン（ＶＨＨ）、ヒト化ＶＨＨドメイン、ラクダ化ＶＨドメイン、配列改変ＶＨもしくはＶＨＨドメインである。一つの実施形態において、本明細書に記載されるシングルドメイン抗体の可変ドメインは、ＶＨドメインである。
【００８４】
本明細書に使用される場合、ヒトＶＨドメインは、完全にヒトのまたは実質的に完全にヒトのＶＨドメインを含む。本明細書に使用される場合、用語ヒトＶＨドメインはまた、例えば、ＷＯ２０１６／０６２９９０および以下の実施例に記載されるように、特に目的の抗原による免疫に応答して完全にヒトの免疫グロブリン重鎖座を発現するトランスジェニックマウスによって作製される重鎖のみの抗体から単離されるＶＨドメインも含む。一つの実施形態において、ヒトＶＨドメインはまた、ヒトＶＨドメインアミノ酸に由来するもしくは基づく、またはヒトＶＨ核酸配列から産生されるＶＨドメインも含み得る。このため、用語ヒトＶＨドメインは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来するまたはそれによってコードされる、例えば、完全ヒトＶＨ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおいて産生される重鎖のみの抗体から得られる可変重鎖領域を含む。いくつかの実施形態において、実質的にヒトのＶＨドメイン、またはヒトＶＨドメインに由来するもしくは基づくＶＨドメインは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばランダムもしくは部位特異的変異誘発によって導入された変異、またはｉｎ  ｖｉｖｏで体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。従って、用語「ヒトＶＨドメイン」は、例えば、配列ライアビリティ(liabilities)を除去するために１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されている実質的にヒトのＶＨドメイン、すなわちヒトＶＨドメインも含む。例えば、実質的にヒトのＶＨドメイン、ＶＨドメインは、生殖系列ヒト配列と比較して最大１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０または最大２０個のアミノ酸改変を含み得る。
【００８５】
しかしながら、本明細書に使用される場合の用語「ヒトＶＨドメイン」または「実質的にヒトのＶＨドメイン」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含まないと意図される。一つの実施形態において、本明細書に使用される場合の用語「ヒトＶＨドメイン」は、１つまたは複数の既定の残基をラクダ化ＶＨＨドメインにおいて見出され得る特定の残基へと変化させるために、ＶＨドメイン配列における既定の位置を選択して既定の位置で１つまたは複数の点突然変異を導入するように、例えば通常の変異誘発法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで特に改変されているヒトＶＨドメインであるラクダ化ＶＨドメインを含まないと意図される。
【００８６】
用語「ＫＤ」は、「平衡解離定数」を指し、平衡時の滴定測定で得た値、または解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を結合速度定数（Ｋｏｎ）で除算することによって得た値を指す。「ＫＡ」は、親和性定数を指す。結合速度定数、解離速度定数、および平衡解離定数は、抗原に対する抗体の結合親和性を表すために使用される。結合および解離速度定数を決定する方法は、当技術分野で周知である。蛍光ベースの技術を使用することにより、高い感度が得られ、平衡時に生理的緩衝液中で試料を調べることができる。他の実験アプローチおよび機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイを使用することができる。
【００８７】
本開示に使用される特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的結合」または「特異的に結合する」、または「特異的である」という用語は、例えば、標的に対するＫＤが少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍである、またはそれより大きい親和性を有する分子によって示され得る。一つの実施形態において、用語「特異的結合」は、分子が、他の任意のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する場合の結合を指す。
【００８８】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、または他の改変を有する本明細書に記載されるシングルＶＨドメイン抗体のいずれかの変異体であり、シングルドメイン抗体の生物機能を保持しているＶＨシングルドメイン抗体を含んでなる結合性分子が提供される。このように、変異体ＶＨシングルドメイン抗体の配列を、操作することができる。改変は、ネイティブ配列のＶＨシングルドメイン抗体またはポリペプチドと比較してアミノ酸配列に変化が起こるシングルドメイン抗体またはポリペプチドをコードする１つまたは複数のコドンの１つまたは複数の置換、欠失、または挿入を含み得る。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の、類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸への交換、例えばロイシンのセリンへの交換、すなわち保存的アミノ酸交換の結果であり得る。挿入または欠失は、任意選択で約１〜２５、例えば、１〜５、１〜１０、１〜１５または１〜２０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の範囲であり得る。配列においてアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に作製すること、および得られた変異体を、完全長または成熟ネイティブ配列によって示される活性に関して試験することによって、許容される多様性を決定してもよい。本明細書に記載されるＶＨシングルドメイン抗体の変異体は、非変異体分子と少なくとも５０％、例えば少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有し、好ましくは、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有する。
【００８９】
一つの実施形態において、改変は、保存的配列改変である。本明細書において使用される場合、用語「保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に有意に影響を及ぼさないまたは変化させないアミノ酸改変を指すと意図される。そのような保存的改変は、アミノ酸置換、付加、および欠失を含む。改変は、当技術分野で公知の標準的な技術、例えば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発によって本発明のｓｄＡｂに導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換する置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。このように、本発明のシングルドメイン抗体のＣＤＲ領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と交換することができ、変化した抗体を、本明細書に記載される機能的アッセイを使用して機能（すなわち、ＣＤ１３７結合）の保持に関して試験することができる。
【００９０】
このように、これらのアミノ酸変化は、典型的に、ポリペプチドの生物活性、機能、または他の所望の特性、例えば抗原に対するその親和性またはその特異性を変化させることなく作製することができる。いくつかの場合において、これらの変化は、抗体、例えばシングルＶＨドメイン抗体のその標的抗原に対する親和性を改善するために行われる。一般的に、ポリペプチドの非必須領域における一アミノ酸置換は、生物活性を実質的に変化させない。さらに、構造または機能が類似であるアミノ酸の置換は、ポリペプチドの生物活性を破壊する可能性がより低い。本明細書に記載されるポリペプチドおよびペプチドを構成するアミノ酸残基の略語、およびこれらのアミノ酸残基の保存的置換を、以下の表１に示す。
【００９１】
【表１】
2021502810.tif 000003
【００９２】
いくつかの実施形態において、結合性分子は、非改変のシングルドメイン抗体と比較して、１つまたは複数の配列改変を含んでなり、結合親和性、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、低減された免疫原性、または溶解性などの特性の１つまたは複数が改善されている、表２、３および４に示される抗体から選択されるシングルドメイン抗体の変異体であるＶＨシングルドメイン抗体を含む。
【００９３】
当業者は、本明細書に記載される抗原結合性分子を同定する、得る、および最適化するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ発現ライブラリを含む異なる方法が存在することを承知しているであろう。これを実施例においてさらに説明する。ディスプレイ（例えば、リボソームおよび／またはファージディスプレイ）および／または変異誘発（例えば、誤りがちな変異誘発）などの、当技術分野で公知の最適化技術を使用することができる。従って、本発明はまた、本明細書に記載のシングルドメイン抗体の配列最適化変異体も含んでなる。
【００９４】
一つの実施形態において、シングルドメイン抗体の免疫原性を減少させる改変を行うことができる。例えば、１つのアプローチは、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応するヒト生殖系列配列に復帰させることである。より具体的には、体細胞変異を受けたシングルドメイン抗体は、シングルドメイン抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含んでもよい。そのような残基は、シングルドメイン抗体フレームワーク配列を、シングルドメイン抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定することができる。一つの実施形態において、総てのフレームワーク残基は生殖系列配列である。
【００９５】
フレームワーク領域配列におけるアミノ酸残基の１つまたは複数を、その生殖系列構成に戻すために、例えば部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発によって、体細胞変異を生殖系列配列に「逆変異」させることができる。
【００９６】
別のタイプのフレームワーク改変は、Ｔ細胞エピトープを除去するために、フレームワーク領域内の、またはさらに１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１つまたは複数の残基を変異させ、それによって抗体の潜在的免疫原性を低減させることを伴う。
【００９７】
さらに別の実施形態において、グリコシル化を改変する。例えば、無グリコシル化抗体（すなわち、抗体はグリコシル化を欠如する）を作製することができる。グリコシル化を、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化させることができる。そのような炭水化物改変は、例えば抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を変化させることによって行うことができる。例えば、それによって１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位が除去され、それによってその部位でのグリコシル化が除去される１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。そのような無グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。
【００９８】
一つの実施形態において、１つまたは複数の置換は、ＣＤＲ１、２または３領域に存在する。例えば、ＣＤＲ１、２または３における１、２、３、４または５個以上のアミノ酸置換が存在し得る。別の例において、１または２個のアミノ酸欠失が存在する。一つの実施形態において、１つまたは複数の置換は、フレームワーク領域に存在する。例えば、ＣＤＲ１、２または３における１〜１０個以上のアミノ酸置換が存在し得る。別の例において、１〜１０個以上のアミノ酸欠失が存在し得る。
【００９９】
用語「エピトープ」、または「抗原性決定基」は、それに対してＶＨシングルドメイン抗体を含む、免疫グロブリン、抗体、抗体断片が特異的に結合する、抗原（例えば、ＰＳＭＡまたはＣＤ１３７）の表面上の部位を指す。一般的に、抗原は複数のまたは多くの異なるエピトープを有し、多くの異なる抗体と反応する。特異的にという用語は、線形エピトープおよびコンフォメーションエピトープを含む。タンパク質抗原内のエピトープは、連続するアミノ酸（通常、線形エピトープ）、またはタンパク質の三次元フォールディングによって近位となる不連続なアミノ酸（通常、コンフォメーションエピトープ）の両方によって形成され得る。連続するアミノ酸から形成されたエピトープは、必ずしも常ではないが典型的に、変性溶媒に曝露されても保持されるが、三次元フォールディングによって形成されたエピトープは、変性溶媒による処置によって典型的に失われる。エピトープは典型的に、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５アミノ酸をユニークな空間的コンフォメーションで含む。どのエピトープが所定の抗体または抗体断片に結合しているかを決定する方法（すなわち、エピトープマッピング）は、当技術分野で周知であり、例えばイムノブロッティング、および免疫沈降アッセイを含み、重複するまたは連続するペプチドを、所定の抗体または抗体断片との反応性に関して試験する。２つの抗体が同一または立体的に重複するエピトープを認識する場合、抗体は、参照抗体と「本質的に同じエピトープ」に結合する。２つのエピトープが同一または立体的に重複するエピトープに結合するか否かを決定するための最も広く使用され、迅速な方法は、競合アッセイであり、これは、標識抗原または標識抗体のいずれかを使用して、異なるフォーマットに構成することができる。
【０１００】
本発明者らは、意外にも、単一特異性フォーマットで、すなわち、第２の抗原に特異的な別の部分と連結されることなく、ＣＤ１３７を標的とした場合、ＣＤ１３７に特異的に結合するが、ＣＤ１３７受容体のクラスタ形成を誘導しないシングル可変重鎖ドメイン抗体を同定した。従って、一価または単一特異性フォーマットでの本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体の結合は、ＣＤ１３７シグナル伝達を活性化せず、ＣＤ１３７シグナル伝達をもたらさない。例えば、二特異性融合タンパク質としての、第２の抗原に特異的な別の部分とともに本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体が提供されない限り、本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体の結合は、ＣＤ１３７シグナル伝達を刺激せず、ここで、本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体は、腫瘍特異抗原に結合する部分、例えば、腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体と連結されている。
【０１０１】
本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体が、結合性分子の一部として、例えばＰＳＭＡに結合する部分、例えばＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体とともに融合タンパク質として提供される場合、ＣＤ１３７および標的部分に対する結合は、ＣＤ１３７受容体のクラスタ形成およびＣＤ１３７シグナル伝達をもたらす。このように、ＣＤ１３７シグナル伝達の誘導は、両標的、すなわちＣＤ１３７およびＰＳＭＡの二重関与を必要とする。これは、腫瘍微小環境における局在したＣＤ１３７シグナル伝達をもたらす。二特異性分子による両標的の同時関与のみが、ＣＤ１３７活性化をもたらす。腫瘍の近傍における標的特異的活性化は、制御できない副作用に至る全身性のＣＤ１３７作用を回避する可能性がある。結合性分子は、Ｆｃ受容体に対する結合以外の機序を介して、細胞の表面でＣＤ１３７と効果的に関与し、ひいては、望まれない肝毒性を回避する。同時に、それらの結合性分子は、ＰＳＭＡを発現する細胞と関与する。
【０１０２】
本発明者らは、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡの両方に結合する結合性分子を説明する。用語「結合性分子（binding molecule）」および「結合性物質（binding agent）」は、本明細書において互換的に使用される。本明細書に使用される結合性分子は、少なくとも２つの標的、すなわちＣＤ１３７およびＰＳＭＡに特異的に結合する結合性分子を指し、ＣＤ１３７に結合する１つのサブユニット／エンティティ（entity）／部分（moiety）は、ＰＳＭＡに結合する第２のサブユニット／エンティティ／部分とコンジュゲート／連結されている。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される結合性分子は融合タンパク質であり、ＣＤ１３７に結合する１つのポリペプチドは、ＰＳＭＡに結合する第２のポリペプチドとコンジュゲート／連結されている。
【０１０３】
一つの態様において、本発明は、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡの両方に結合し、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる単離された多特異性の結合性分子に関する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、本明細書に記載される通りである。
【０１０４】
本発明の多特異性の結合性分子の特性は、治療方法および使用ならびに本明細書に記載される医薬製剤（pharmaceutical formulation）に利用することができる。
【０１０５】
一つの態様において、本発明は、
ａ）ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および
ｂ）ＰＳＭＡに結合する部分
を含んでなるか、またはそれからなる単離された結合性分子に関する。
【０１０６】
このように、ＣＤ１３７に結合するエンティティは、軽鎖および重鎖を含んでなる完全長の抗体ではなく、シングル可変重鎖ドメイン、すなわちＶＨドメインのみである。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、以下の表（表２および３）に記載の本明細書に記載される配列番号を有するＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体のうちの１つから選択され、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って定義される。
【０１０７】
ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体およびＰＳＭＡに結合する部分は、例えばペプチドリンカーにより連結されている。例えば、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、そのＮまたはＣ末端で、ＰＳＭＡに結合する部分に連結させることができる。
【０１０８】
ＰＳＭＡに結合する部分は、抗体、抗体模倣物、抗体足場、抗体断片または他のポリペプチドから選択され得る。抗体断片は、抗体の一部、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、重鎖、軽鎖、重鎖もしくは可変軽鎖ドメイン、重鎖もしくは可変軽鎖ドメイン、またはその一部、例えばＣＤＲから選択され得る。
【０１０９】
一つの実施形態において、ＰＳＭＡに結合するエンティティは、ＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、例えばヒトＶＨドメイン抗体である。いくつかの実施形態において、ＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、本明細書に記載されるおよび以下の表における配列番号を有するＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体のうちの１つから選択される。
【０１１０】
一つの実施形態において、
ａ）ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および
ｂ）ＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体
を含んでなるか、またはそれからなる結合性分子が提供される。
【０１１１】
このように、結合性分子は、２つのシングル可変重鎖ドメインを有し、１つはＣＤ１３７に結合し、１つはＰＳＭＡに結合する。完全長の抗体の他のドメイン／鎖は存在しない。いくつかの実施形態において、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体およびＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、ヒトＶＨドメイン抗体である。
【０１１２】
一つの態様において、本発明者らは、例えば本明細書に記載される配列番号を有するＰＳＭＡに結合する別の部分と連結された、例えば本明細書に記載される（例えば表２または３に記載される）配列番号を有するＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子を提供し、結合性分子は、以下の特性のうち１つまたは複数を示す：
（ａ）実施例において測定されるＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する；
（ｂ）ヒトＣＤ１３７リガンドと細胞の表面に発現したヒトＣＤ１３７との間の相互作用を阻害する。これは、実施例４に示されるように測定することができる；
（ｃ）マウスＣＤ１３７に結合しない；
（ｄ）ＣＤ１３７を発現する細胞に結合し、ＰＳＭＡを発現する細胞に同時に結合する。これは、実施例５に示されるように測定することができる；
（ｅ）レポーター遺伝子活性を増加させる。これは、実施例５に示されるように測定することができる；
（ｆ）ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞成長を阻害する；
（ｇ）ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進する；
（ｈ）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化を誘導する；
（ｉ）ＣＤ８＋細胞からのＩＬ−２産生を刺激する。これは、実施例５に示されるように測定することができる；
（ｊ）腫瘍特異的Ｔ細胞活性化を誘導する；
（ｋ）実施例において測定されるように、Ｔ細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達を活性化する；
（ｌ）活性化誘導細胞死を阻害する；
（ｍ）Ｔ細胞生存を増強する；
（ｎ）全身性のＴ細胞活性化を制限する；
（ｏ）Ｔ細胞の細胞傷害性エフェクター機能を増強する；
（ｐ）腫瘍抗原陽性腫瘍における抗腫瘍細胞の局所活性化を促進する；
（ｑ）抗体依存性細胞傷害性を増強する；
（ｒ）ＣＤ１３７およびＰＳＭＡに同時に結合する；
（ｓ）カニクイザルＣＤ１３７に結合する；
（ｔ）Ｔ−ｒｅｇ細胞の制御因子機能を逆転させる；
（ｕ）ＮＫ細胞を活性化する；かつ／または
（ｖ）実施例６に示されるように、マウスにおいて対照群と比較して腫瘍容積を減少させる。
【０１１３】
一つの実施形態において、結合性分子は、上記の特性のうち２つ以上、例えば、特性の任意の組合せを含む、上記の一覧から選択される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１個または総ての特性を示す。一つの実施形態において、結合性物質は、ヒトＣＤ１３７リガンドと細胞の表面に発現したヒトＣＤ１３７との間の相互作用を阻害する。
【０１１４】
一つの実施形態において、結合性分子は、少なくとも２つのサブユニット、すなわちＰＳＭＡ結合サブユニットに融合されたＣＤ１３７結合サブユニットを含んでなる融合タンパク質であり、ＣＤ１３７結合サブユニットは、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体である。一つの実施形態において、結合性分子は、ＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体と連結されたＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる融合タンパク質である。リンカーは、以下にさらに説明されるように、例えばＧＳ残基を有するペプチドリンカー、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、式中、ｎ＝１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。
【０１１５】
結合性物質は、多特異性、例えば二特異性または三特異性である。二特異性分子は、２つの異なる標的に結合する。三特異性分子は、２つの異なる標的に結合する。一価分子は、１つの結合性エンティティを有する。二価分子は、同じまたは異なる標的に結合する２つの結合性エンティティを有する。
【０１１６】
一つの実施形態において、結合性分子は、ＣＤ１３７に結合する第１のＶＨシングルドメイン抗体（ＶＨ（Ａ））、およびＰＳＭＡに結合する第２のＶＨシングルドメイン抗体（ＶＨ（Ｂ））を含んでなり、例えば、以下の式：ＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ｂ）を有する。ＶＨ（Ａ）は、例えばペプチドリンカーにより、ＶＨ（Ｂ）とコンジュゲートされている、すなわち連結されている。Ｌは、リンカーを表す。
【０１１７】
各々のＶＨは、ＣＤＲおよびＦＲ領域を含んでなる。このように、結合性分子は、以下の式：ＦＲ１（Ａ）−ＣＤＲ１（Ａ）−ＦＲ２（Ａ）−ＣＤＲ２（Ａ）−ＦＲ３（Ａ）−ＣＤＲ３（Ａ）−ＦＲ４（Ａ）−Ｌ−ＦＲ１（Ｂ）−ＣＤＲ１（Ｂ）−ＦＲ２（Ｂ）−ＣＤＲ２（Ｂ）−ＦＲ３（Ｂ）−ＣＤＲ３（Ｂ）−ＦＲ４（Ｂ）を有し得る。シングルＶＨドメインＡおよびＢの順序は特に限定されず、そのため、本発明のポリペプチドにおいて、シングル可変ドメインＡはＮ末端に位置してもよく、シングル可変ドメインＢはＣ末端に位置してもよく、またはその逆であってもよい。
【０１１８】
本明細書に記載される様々な実施形態において使用される用語「ペプチドリンカー」は、１つまたは複数のアミノ酸を含んでなるペプチドを指す。ペプチドリンカーは、１〜４４個のアミノ酸、より詳しくは、２〜２０個のアミノ酸を含んでなる。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であるか、または本明細書に記載される。好適な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、Ｇおよび／またはＳ残基を含むリンカー、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎまたはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、式中、「ｎ」は一般的に、１〜１０の間の数字、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一つの実施形態において、ペプチドは、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号７９０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７９１）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７９２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７９３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７９４）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号７９５）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号７９６）、ＧＧＳＧ（配列番号７９７）からなる群から選択される。
【０１１９】
上記の融合タンパク質は、エフェクター細胞の表面上のＣＤ１３７および腫瘍細胞の細胞表面に提示されたＰＳＭＡに二重関与／結合、例えば同時関与／結合することができる。二重結合、例えば同時結合は、ＣＤ１３７受容体のクラスタ形成をもたらし、ＣＤ１３７シグナル伝達が生じる。これは、Ｔ細胞活性化をもたらす。いくつかの実施形態において、二重結合、例えば同時結合は、腫瘍抗原特異的エフェクター細胞活性化をもたらし、腫瘍細胞死滅をもたらす。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、一価シングル重鎖ドメイン抗体がＣＤ１３７に結合するＥＣ５０値と類似するまたは少なくとも同等のＥＣ５０値で、ＣＤ１３７に結合することができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、実施例に示されるＥＣ５０値でＣＤ１３７に結合する。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質は、本質的に実施例に記載の通りに、機能的Ｔ細胞活性化におけるＴ細胞応答を同時刺激することができ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質は、機能的Ｔ細胞活性化におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮγの分泌ならびにＴ細胞増殖を誘導することができ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される融合ポリペプチドもまた、標的腫瘍、すなわち、融合タンパク質が結合する腫瘍抗原に対して陽性である細胞の近傍でＩＬ−２および／またはＩＦＮγの分泌を局所誘導することができる。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＣＤ１３７発現細胞および腫瘍抗原発現細胞の二重標的を介した相乗作用をもたらすことができ得る。
【０１２３】
腫瘍の微小環境におけるＣＤ１３７およびＰＳＭＡの二重標的、例えば同時標的は、抗腫瘍活性を増強し、腫瘍成長を低減し得る。さらに、ＣＤ１３７シグナル伝達を局所で誘発することにより、副作用が低減され得る。ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＴＲＡＦファミリーメンバーの動員およびキナーゼの活性化をもたらす。Ｔ細胞媒介シグナル伝達は、ＣＤ８＋細胞を活性化誘導死から保護する。Ｔ細胞を同時刺激するための本明細書に記載される融合タンパク質の使用も提供される。
【０１２４】
一つの実施形態において、本明細書に記載される結合性分子は、実施例に示される方法に従って測定された少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２ＭのＫＤ、またはそれより大きい親和性で、ＣＤ１３７に結合する。一つの実施形態において、本明細書に記載される結合性分子は、実施例に示される方法に従って測定された少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２ＭのＫＤ、またはそれより大きい親和性で、ＰＳＭＡに結合する。結合は、実施例のように測定することができる。いくつかの実施形態において、本発明の結合性分子は、本明細書において詳しく説明し、実施例で示される、ＩＣ５０および／またはＥＣ５０値を有する。本明細書に記載される結合性分子は、優れた安定性を示す。
【０１２５】
別の態様において、本明細書に記載される融合タンパク質をコードする核酸分子が提供される。例えば、核酸分子は、本明細書に明記されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体をコードする核酸、および本明細書に明記されるＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体をコードする核酸を含んでなる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでなってもよく、完全または部分的に合成または組換えによって産生されてもよい。本明細書に記載されるヌクレオチド配列という言及は、明記された配列を有するＤＮＡ分子を包含し、本文がそれ以外であることを必要としていない限り、ＵがＴの代わりに置換されている明記された配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０１２６】
さらに、本発明は、上記で定義される少なくとも１つの核酸を含んでなる核酸構築物に関する。構築物は、プラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態であり得る。
【０１２７】
本発明はまた、上記の１つまたは複数の核酸構築物を含んでなる単離された組換え宿主細胞にも関する。宿主細胞は、細菌、ウイルス、植物、哺乳動物または他の適した宿主細胞であり得る。一つの実施形態において、細胞は、大腸菌細胞である。別の実施形態において、細胞は酵母細胞である。別の実施形態において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【０１２８】
一つの実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質を作製する方法が提供され、方法は、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの発現にとって適した条件で宿主細胞を培養する工程、およびシングルドメイン抗体を単離する工程を含んでなる。
【０１２９】
結合性分子に含まれる例示的な免疫グロブリン
上記のように、結合性分子は、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体（ＣＤ１３７結合サブユニット）、およびＰＳＭＡに結合する部分（ＰＳＭＡ結合サブユニット）を含んでなる。例えば、結合性分子は、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、ＰＳＭＡに結合する別のポリペプチドと連結される融合タンパク質であり得る。以下に、ＣＤ１３７結合サブユニットおよびＰＳＭＡ結合サブユニットの例を提供する。
【０１３０】
結合性分子に含まれ、ＣＤ１３７に結合する例示的な免疫グロブリン
ＣＤ１３７に結合し、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡの両方に結合する結合性分子のサブユニットのうちの１つを形成し得るシングル可変重鎖ドメイン抗体の例を説明し、これらは、本発明の様々な実施形態において使用することができる。
【０１３１】
ＣＤ１３７は、免疫応答の重要な制御因子であり、従って、がん療法における重要な標的である。Ｔ細胞同時刺激受容体ＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞上で誘導され、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）の防止、細胞周期進行の促進、細胞傷害性ならびにＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αなどの１型サイトカインの産生の増強、ならびに記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加といった、多様な非常に重要な役割を果たす。アゴニスト抗体によるｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ１３７誘発は、腫瘍に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強する。ＣＤ１３７媒介抗がん効果は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびとりわけ、高量のＩＦＮ−γの活性化を誘導するその能力に基づく。ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ相互作用は、インフルエンザウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などのウイルスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の正の制御因子としても考えられている。ＣＤ１３７は、最初のＴ細胞活性化後のＴ細胞応答の持続に関与する。
【０１３２】
重要なことに、ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＣＤ１３７受容体のクラスタ形成を必要とする。そのようなクラスタ形成は、三量体ＣＤ１３７リガンドとＣＤ１３７受容体との相互作用により媒介され、タンパク質のＴＲＡＦファミリーなどのシグナル伝達分子の動員をもたらす。これは次に、キナーゼ調節およびＮｆ−ＫＢシグナル伝達経路の活性化をもたらす。転写因子のＮＦ−κＢファミリーは、炎症および自然免疫において重要な役割を有する。さらに、ＮＦ−κＢは、がんの発生および進行の多くの段階における重要なプレーヤーとしてますます認識されている。
【０１３３】
本明細書に記載されるシングルドメイン抗体は、野生型ヒトＣＤ１３７（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０７０１１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５６１）に特異的に結合する。野生型ヒトＣＤ１３７に関するアミノ酸配列（配列番号７８６）およびヌクレオチド配列を以下に示す（配列番号７８７）。
【０１３４】
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号７８６）
【０１３５】
ATGGGAAACAGCTGTTACAACATAGTAGCCACTCTGTTGCTGGTCCTCAACTTTGAGAGGACAAGATCATTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGTGA（配列番号７８７）
【０１３６】
それ以外であることを明記していない限り、本明細書において使用される用語ＣＤ１３７は、ヒトＣＤ１３７を指す。ＣＤ１３７は、「４−１ＢＢ」、「ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９」、「ＴＮＦＲＳ９」、「リンパ球活性化により誘導された」および「ＩＬＡ」としても知られ、これらの用語は、互換的に使用され、ヒトＣＤ１３７の変異体、アイソフォームを含む。
【０１３７】
用語「ＣＤ１３７結合性分子／タンパク質／ポリペプチド／物質（agent）／部分（moiety）」、「ＣＤ１３７抗原結合性分子／タンパク質／ポリペプチド／物質（agent）／部分（moiety）」、「抗ＣＤ１３７シングルドメイン抗体」、「抗ＣＤ１３７シングル免疫グロブリン可変ドメイン」、「抗ＣＤ１３７重鎖のみの抗体（anti-CD137 heavy chain only antibody）」または「抗ＣＤ１３７抗体」は総て、ヒトＣＤ１３７抗原に特異的に結合することができる分子を指す。結合反応は、例えば無関係な特異性の抗体を使用する陰性対照試験を基準とする標準的な方法によって示され得る。
【０１３８】
目的の抗原、例えばヒトＣＤ１３７に「結合する」または「結合することができる」、本明細書に記載される多特異性の結合性物質は、抗体が、抗原ＣＤ１３７を発現する細胞または組織の標的化において治療剤として有用であるように十分な親和性で抗原に結合する結合性物質である。結合は、ＣＤ１３７の細胞外ドメインに対するものである。
【０１３９】
本発明の結合性分子は、ヒトＣＤ１３７に特異的に結合する。言い換えれば、ＣＤ１３７抗原に対する結合は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる。それらの結合性分子は、マウスＣＤ１３７と交叉反応しない。一つの実施形態において、ｓｄＡｂは、ヒトＣＤ１３７に結合し、同様にサル（例えば、カニクイザル）ＣＤ１３７にも結合する。
【０１４０】
一つの態様において、多特異性分子において使用される一価シングルドメイン抗体は、一価のエンティティとして（すなわち、ＰＳＭＡに結合するエンティティとともに多特異性フォーマットで提供されない場合）、以下の特性のうち１つまたは複数を示す：
（ａ）実施例において測定されるＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する；
（ｂ）ＣＤ１３７を発現する細胞に結合するが、ＣＤ１３７を発現しない細胞には結合しない。これは、ＦＭＡＴアッセイにおいて測定することができる；
（ｃ）最小限の細胞内部移行を示す。これは、実施例に示されるように測定することができる；
（ｄ）ＣＤ１３７リガンドと細胞の表面に発現したＣＤ１３７との間の相互作用を阻害する。これは、ＦＭＡＴアッセイにおいて測定することができる。
（ｅ）Ｔ細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達を活性化しない。これは、実施例に示されるように測定することができる；
（ｆ）ＣＤ８＋細胞からのＩＬ−２産生を刺激しない。これは、実施例５に示されるように測定することができる；
（ｇ）マウスＣＤ１３７に結合しない；
（ｈ）実施例に示される良好な安定性を提供する；かつ／または
（ｉ）レポーター遺伝子活性を増加させず、このため、アゴニストＣＤ１３７シグナル伝達を誘発しない。これは、実施例５に示されるように測定することができる。
【０１４１】
例示的な配列の特徴
一つの態様において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表２に示されるシングルドメイン抗体のうちの１つに関して示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３、または一組のＣＤＲ（すなわちＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３）を含んでなり、前記組は、表２に示されるシングルドメイン抗体のうちの１つに関して示されるものである。一つの態様において、これは、それと少なくとも４０％または７５％の相同性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含んでなる。例えば、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号１もしくはそれと少なくとも４０％、７５％もしくは８０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号２もしくはそれと少なくとも４０％、７５％もしくは８０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号３もしくは少なくとも４０％、７５％もしくは８０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３、または配列番号５もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号６もしくはそれと少なくとも４０％、７５％もしくは８０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号７もしくはそれと少なくとも４０％、７５％もしくは８０％の相同性を有する配列などを含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。
【０１４２】
上記のおよび本明細書に一般的に使用される配列相同性は、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性であり得る。
【０１４３】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ヒトフレームワーク領域を含んでなる。
【０１４４】
別の態様において、本発明によるシングル可変重鎖ドメイン抗体は、表２に示される完全長の配列またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列を含んでなるか、またはそれからなる。例えば、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表２に記載の配列から選択される配列、すなわち配列番号４、８、１２、１６、２０など、またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列を有する。配列相同性は、少なくとも５０％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性であり得る。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＶＨシングルドメイン抗体１．１〜１．８９もしくは１．９０〜１．１０６に関して示されるＣＤＲ１、２、および３を含んでなる、または、ＶＨシングルドメイン抗体１．１〜１．８９もしくは１．９０〜１．１０６（すなわち、配列番号３６４、３６８、３７２、３７６、３８０、３８４、３８８、３９２、３９６、４００、４０４、４０８、４１２、４１６、４２０もしくは４２４）に関して示される完全長の配列を含んでなるか、もしくはそれからなる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表２に示されるＶＨシングルドメイン抗体ＶＨ１．１０７〜１．１１４（例えば、配列番号８７３、８７４、８７５）に関して示されるＣＤＲ１、２、および３またはそれと少なくとも７５％、８０％もしくは９０％の相同性を有する配列を含んでなる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表２に示されるＶＨ１．１０７〜１．１１４、すなわち、ＶＨ１．１０７、１．１０８、１．１０９、１．１１０、１．１１１、１．１１２、１．１１３もしくは１．１１４、すなわち、配列番号８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２、８７６もしくは８８０またはそれと少なくとも７５％、８０％もしくは９０％の相同性を有する配列から選択される。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＶＨ１．１１３またはそれと少なくとも７５％、８０％もしくは９０％の相同性を有する配列である。
【０１４５】
【表２】
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【０１４６】
一つの態様において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表３に示されるシングルドメイン抗体のうちの１つに関して示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を含んでなり、または、それと少なくとも７５％の相同性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含んでなる。例えば、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号４２５もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号４２６もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号４２７もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３、または配列番号４２９もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号４３０もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号４３１などを含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。配列相同性は、少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性であり得る。
【０１４７】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ヒトフレームワーク領域を含んでなる。
【０１４８】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表３に示される完全長の配列またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列を含んでなるか、またはそれからなる。例えば、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表３に示される配列から選択される配列、例えば配列番号４２８、４３２、４３６、４４０など、またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列を有する。配列相同性は、少なくとも５０％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性であり得る。
【０１４９】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＶＨシングルドメイン抗体２．４１〜２．５１に関して示されるＣＤＲ１、２、および３を含んでなる、または、ＶＨシングルドメイン抗体２．４１〜２．５１（すなわち、配列番号５８８、５９２、５９６、６００、６０４、６０８、６１２、６１６、もしくは６２０）に関して示される完全長の配列を含んでなるか、もしくはそれからなる。
【０１５０】
【表３】
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【０１５１】
一つの実施形態において、結合性分子は、ＣＤ１３７に結合する１つまたは複数のシングルドメイン抗体、例えば表２および３における上記の１つまたは２つのシングルドメイン抗体を含んでなってもよい。
【０１５２】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、または他の改変を有する表２または表３に示される上記のシングルＶＨドメイン抗体のいずれかの変異体であり、シングルドメイン抗体の生物機能を保持しているＶＨシングルドメイン抗体が提供される。このように、変異体ＶＨシングルドメイン抗体の配列を、操作することができる。改変は、本明細書において他所に記載する。一つの実施形態において、ＶＨｓ１．０７〜１．１１３の変異体、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の置換を有するＶＨ１．１１３が提供される。
【０１５３】
置換の例
一つの実施形態において、変異体は、配列番号４（ＶＨ１．１）に関する１つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ：
・Ｆ３７Ｖ
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ
・Ｅ６５Ｋ
・Ｖ７０Ｉ
・Ｖ７９Ｌ
・Ｆ３７Ｖ  ＋  Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ
・Ｆ３７Ｖ  ＋  Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０１Ｖ  ＋  Ｄ１０５Ｉ
・Ｆ３７Ｖ  ＋  Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９ＬＦＧＬ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０１Ｅ  ＋  Ｄ１０５Ｉ
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０５Ｉ
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｄ５４Ｇ、Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｄ５４Ｅ、
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｄ１０１Ｅ
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｄ１０１Ｖまたは
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０１Ｖ  ＋  Ｄ１０５Ｉ、Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０１Ｅ  ＋  Ｄ１０５Ｉ
を含んでなる。
【０１５４】
一つの実施形態において、変異体は、配列番号４（ＶＨ１．１）に関する１つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ：
ａ）Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０１→以下のＦ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｗ、Ｒ、Ｇから選択される任意のアミノ酸；
ｂ）Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０５→以下のＦ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｗ、Ｒ、Ｇから選択される任意のアミノ酸、または
ｃ）Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ、Ｄ１０１→以下のＦ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｗ、Ｒ、Ｇから選択される任意のアミノ酸  ＋  Ｄ１０５→以下のＦ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｗ、Ｒ、Ｇから選択される任意のアミノ酸
を含んでなる。
【０１５５】
一つの実施形態において、変異体は、配列番号３１２（ＶＨ１．７８）に関する１つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ：
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｔ２５Ｓ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｓ８４Ｎ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｆ９５Ｙ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｔ２５Ｓ  ＋  Ｓ８４Ｎ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｔ２５Ｓ  ＋  Ｆ９５Ｙ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｓ８４Ｎ  ＋  Ｆ９５Ｙ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｔ２５Ｓ  ＋  Ｓ８４Ｎ  ＋  Ｆ９５Ｙまたは
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｔ２５Ｓ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｓ８４Ｎ  ＋  Ｆ９５Ｙ
を含んでなる。
【０１５６】
一つの実施形態において、変異体は、配列番号４２８（ＶＨ２．１）に関する１つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ：
・Ｖ２０Ｌ、
・Ｆ３７Ｉ、
・Ｎ８５Ｓ、
・Ｎ９５Ｙ、
・Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｈ９５Ｙ、
・Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｆ３７Ｉ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ、Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ、
・Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｆ３７Ｉ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ  ＋  Ｓ１０１Ａ、
・Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｆ３７Ｉ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ  ＋  Ｓ１０１Ｐまたは
・Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ  ＋  Ｓ１０１Ａ、Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ  ＋Ｓ１０１Ａ
を含んでなる。
【０１５７】
一つの実施形態において、変異体は、配列番号６２４（ＶＨ２．１）に関する１つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ：
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｉ５７Ｔ  ＋  Ｌ１０３Ｍ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｉ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ａ１０１Ｔ  ＋  Ｌ１０３Ｖ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｖ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｉ５７Ｔ  ＋  Ａ１０１Ｅ  ＋  Ｌ１０３Ｌ  ＋  Ｔ１０４Ｗ  ＋  Ｔ１０７Ｖ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｌ１０３Ｔ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｖ
・Ｙ３２Ｈ  ＋  Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｓ５２Ｇ  ＋  Ｓ５４Ｄ  ＋  Ｄ５６Ａ  ＋  Ｉ５８Ｌ  ＋  Ａ１０１Ｌ  ＋  Ｔ１０４Ｐ  ＋  Ｔ１０７Ｉ  ＋  Ｎ１１１Ｈ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ａ１０１Ｔ  ＋  Ｌ１０３Ｖ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｖ  ＋  Ｎ１１１Ｓ
・Ａ２８Ｔ  ＋  Ｓ３０Ｔ  ＋  Ｙ３３Ｗ  ＋  Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｇ５３Ｓ  ＋  Ｓ５４Ｄ  ＋  Ｄ５６Ｋ  ＋  Ｉ５７Ｔ  ＋  Ｌ１０３Ｍ  ＋  Ｔ１０４Ｐ  ＋  Ｔ１０７Ｉ  ＋  Ｎ１１１Ｙ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｌ１０３Ｔ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｖ  ＋  Ｎ１１１Ｓ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｉ５７Ｔ  ＋  Ｓ１０１Ｅ  ＋  Ｔ１０４Ｗ  ＋  Ｔ１０７Ｖ  ＋  Ｎ１１１Ｓまたは
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｉ５７Ｔ  ＋  Ｌ１０３Ｍ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｉ  ＋  Ｎ１１１Ｓ
を含んでなる。
【０１５８】
ＣＤ１３７ポリペプチドをコードする例示的な核酸
上記に示されるシングルドメイン抗体をコードする単離された核酸を、以下に記載する。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み得る。一つの態様において、本発明は、ＣＤＲ、例えばＣＤＲ３、２つもしくは３つのＣＤＲの組、または上記に示される本発明のＶＨシングルドメイン抗体をコードする核酸を提供する。
【０１５９】
【表４】
2021502810.tif 000022
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2021502810.tif 000024
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2021502810.tif 000037
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【０１６０】
【表５】
2021502810.tif 000039
2021502810.tif 000040
2021502810.tif 000041
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2021502810.tif 000046
【０１６１】
一つの実施形態において、核酸配列は、上記で選択される配列のうちの１つと少なくとも５０％の配列相同性を有する。一つの実施形態において、前記配列相同性は、少なくとも５０％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。一つの実施形態において、核酸は、配列番号６２９、７０６、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７または７３５のうちの１つから選択される。
【０１６２】
結合性分子に含まれ、ＰＳＭＡに結合する例示的な免疫グロブリン
ＰＳＭＡに結合し、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡの両方に結合する結合性分子のサブユニットのうちの１つを形成し得る部分、例えばシングル可変重鎖ドメイン抗体の例を説明し、これらは、本発明の様々な実施形態において使用することができる。
【０１６３】
ＰＳＭＡ結合性分子は、野生型ヒトＰＳＭＡに結合する（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０４６０９）。単量体に関する配列を以下に示す（配列番号８４２）。
1 MWNLLHETDS AVATARRPRW LCAGALVLAG GFFLLGFLFG WFIKSSNEAT NITPKHNMKA
61 FLDELKAENI KKFLYNFTQI PHLAGTEQNF QLAKQIQSQW KEFGLDSVEL AHYDVLLSYP
121 NKTHPNYISI INEDGNEIFN TSLFEPPPPG YENVSDIVPP FSAFSPQGMP EGDLVYVNYA
181 RTEDFFKLER DMKINCSGKI VIARYGKVFR GNKVKNAQLA GAKGVILYSD PADYFAPGVK
241 SYPDGWNLPG GGVQRGNILN LNGAGDPLTP GYPANEYAYR RGIAEAVGLP SIPVHPIGY
301 DAQKLLEKMG GSAPPDSSWR GSLKVPYNVG PGFTGNFSTQ KVKMHIHSTN EVTRIYNVIG
361 TLRGAVEPDR YVILGGHRDS WVFGGIDPQS GAAVVHEIVR SFGTLKKEGW RPRRTILFAS
421 WDAEEFGLLG STEWAEENSR LLQERGVAYI NADSSIEGNY TLRVDCTPLM YSLVHNLTKE
481 LKSPDEGFEG KSLYESWTKK SPSPEFSGMP RISKLGSGND FEVFFQRLGI ASGRARYTKN
541 WETNKFSGYP LYHSVYETYE LVEKFYDPMF KYHLTVAQVR GGMVFELANS IVLPFDCRDY
601 AVVLRKYADK IYSISMKHPQ EMKTYSVSFD SLFSAVKNFT EIASKFSERL QDFDKSNPIV
661 LRMMNDQLMF LERAFIDPLG LPDRPFYRHV IYAPSSHNKY AGESFPGIYD ALFDIESKVD
721 PSKAWGEVKR QIYVAAFTVQ AAAETLSEVA
【０１６４】
一つの実施形態において、本発明のＰＳＭＡ結合性分子は、野生型ヒトＰＳＭＡおよび／またはカニクイザルＰＳＭＡに結合する。本明細書に使用される用語「ＰＳＭＡ結合性分子」、「ＰＳＭＡ結合タンパク質」、「抗ＰＳＭＡシングルドメイン抗体」または「抗ＰＳＭＡ抗体」は総て、ヒトＰＳＭＡ抗原に結合することができる分子を指す。用語「ＰＳＭＡ結合性分子」は、ＰＳＭＡ結合タンパク質を含む。結合反応は、無関係な特異性の抗体を使用する陰性対照試験を基準とする、例えばその受容体に対するＰＳＭＡ結合の阻害を決定するための結合アッセイ、競合アッセイ、もしくはバイオアッセイ、または任意の種類の結合アッセイを含む標準的な方法（定性アッセイ）によって示され得る。好適なアッセイを実施例において示す。
【０１６５】
目的の抗原、例えばＰＳＭＡに「結合する」または「結合することができる」、本明細書に記載されるシングルドメイン抗体および多価または多特異性の結合性物質を含む本発明の結合性分子は、それが抗原を発現する細胞または組織の標的化において治療法に有用であるように十分な親和性でＰＳＭＡ抗原に結合する、すなわち標的とする結合性分子である。
【０１６６】
例示的な配列
ＰＳＭＡに結合するシングルＶＨドメイン抗体は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１７／１２２０１７に記載の通りであり得る。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号８１２またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号８１３またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号８１４またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号８３７またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号８３８またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号８３９またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。
【０１６７】
配列相同性は、７５、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性であり得る。
【０１６８】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ヒトフレームワーク領域を含んでなる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表６もしくは７に示されるシングル可変重鎖ドメイン抗体、またはそれと少なくとも８０％の相同性を有する配列から選択される。ＰＳＭＡ結合性エンティティは、その一部、例えばＣＤＲ３からも選択され得る。
【０１６９】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、または８４０から選択される配列を含んでなる。一つの実施形態において、配列は、配列番号８２２であるか、またはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％もしくは７５％の相同性を有する配列からである。配列相同性は、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性であり得る。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、もしくは８４０から選択される配列、またはその変異体、例えば１〜１０もしくは１〜２０個の置換を有する変異体を含んでなる。
【０１７０】
【表６】
2021502810.tif 000047
【０１７１】
【表７】
2021502810.tif 000048
【０１７２】
【表８】
2021502810.tif 000049
【０１７３】
一つの実施形態において、変異体は、置換を含んでなる。典型的な改変を、本明細書において他所に説明する。
【０１７４】
例示的な核酸
上記に示されるシングルドメイン抗体をコードする核酸を、表７ｂにおいて以下に記載する。
【０１７５】
【表９】
2021502810.tif 000050
2021502810.tif 000051
【０１７６】
一つの実施形態において、結合性分子は、ＰＳＭＡに結合する１つまたは複数のシングルドメイン抗体、例えば上記の１つまたは２つのシングルドメイン抗体を含んでなってもよい。
【０１７７】
一つの実施形態において、結合性分子は、ＰＳＭＡに結合する１つまたは複数のシングルドメイン抗体、例えば上記の１つまたは２つのシングルドメイン抗体を含んでなってもよい。一つの実施形態において、結合性分子は、ＰＳＭＡに結合する２つのシングルドメイン抗体を含んでなり、各々は、ＰＳＭＡの異なるエピトープに結合し、それにより、二パラトープ性ＰＳＭＡ結合性物質を提供する。
【０１７８】
例示的な結合性分子
それぞれＣＤ１３７およびＰＳＭＡに結合する上記のシングル可変重鎖ドメイン抗体の任意の組合せを、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡ発現細胞の二重関与のための結合性物質に使用することができる。このように、一つの実施形態において、上記に開示される、例えば表２または３のいずれかに記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体のいずれかを、表６ａ、６ｂまたは７のいずれかに記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体のいずれかと、融合タンパク質において組み合わせることができる。
【０１７９】
このように、一つの実施形態において、融合タンパク質は、配列番号４、８、１２、１６、２０、２４、２８、４８、５２、５６、６０、６４、６８、７２、７６、８０、８４、８８、９２、９６、１００、１０４、１０８、１１２、１１６、１２０、１２４、１２８、１３２、１３６、１４０、１４４、１４８、１５２、１５６、１６０、１６４、１６８、１７２、１７６、１８０、１８４、１８８、１９２、１９６、２００、２０４、２０８、２１２、２１６、２２０、２２４、２２８、２３２、２３６、２４０、２４４、２４８、２５２、２５６、２６０、２６４、２６８、２７２、２７６、２８０、２８４、２８８、２９２、２９６、３００、３０４、３０８、３１２、３１６、３２０、３２４、３２８、３３２、３３６、３４０、３４４、４４８、３５２、３５６、３６０、３６４、３６８、３７２、３７６、３８０、３８４、３８８、３９２、３９６、４００、４０４、４０８、４１２、４１６、４２０、４２４、８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２、８７６もしくは８８０から選択される配列、またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を有するシングルドメイン抗体、および配列番号８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５もしくは８４０から選択される配列、またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を有するシングルドメイン抗体を含んでなる。一つの実施形態において、配列は、配列番号８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２、８７６もしくは８８０、またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列から選択される。
【０１８０】
別の実施形態において、融合タンパク質は、配列番号４２８、４３２、４３６、４４０、４４４、４４８、４５２、４５６、４６０、４６４、４６８、４７２、４７６、４８０、４８４、４８８、４９２、４９６、５００、５０８、５１２、５１６、５２０、５２４、５２８、５３２、５３６、５４０、５４４、５４８、５５２、５５６、５６０、５６４、５６８、５７２、５７６、５８０、５８４、５８８、５９２、５９６、６００、６０４、６０８、６１２、６１６、６２０、６２４もしくは６２８から選択される配列、またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を有するシングルドメイン抗体、および配列番号８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５もしくは８４０から選択される配列、またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を有するシングルドメイン抗体を含んでなる。一つの実施形態において、配列番号４もしくは４２８を有するシングルドメイン抗体１．１もしくは２．１、または配列番号３１２、８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２、８７６、８８０もしくは４２８を有するシングルドメイン抗体は、それぞれ配列番号８１５、８２２もしくは８４０を有するシングルドメイン抗体３．１、３．８もしくは４．１と連結されている。一つの実施形態において、配列番号８７６を有するシングルドメイン１．１１３は、それぞれ配列番号８１５、８２２または８４０を有するシングルドメイン抗体３．１、３．８または４．１と連結されている。一つの実施形態において、配列番号８７６を有するシングルドメイン１．１１３は、配列番号８４０を有するシングルドメイン抗体４．１と連結されている。一つの実施形態において、融合タンパク質は、シングルドメイン抗体４．１または３．８および配列番号９０１に示されるシングルドメイン抗体と連結されたシングルドメイン抗体１．１１３を含んでなるか、またはそれからなる。シングルドメイン抗体の順序は異なり得、例えば、ＣＤ１３７結合シングルドメイン抗体は、ＰＳＭＡ結合性分子の３’または５’に位置し得る。配列番号９０１に示されるシングルドメイン抗体は、好ましくはＣ末端に位置する。
【０１８１】
２つのシングルドメイン抗体は、本明細書に記載されるペプチドリンカー、例えばＧ４Ｓリンカーにより、融合タンパク質において連結させることができる。一つの実施形態において、本発明は、以下の表８に記載の（すなわち、タンパク質のうちの１つから選択される、および（すなわち、配列番号８０６〜８１１のタンパク質および核酸構築物のうちの１つから選択される）融合タンパク質およびそのような融合タンパク質をコードする核酸、または実施例における表１０に記載の（すなわち、配列番号８８９〜９００のタンパク質および核酸構築物から選択される）融合タンパク質およびそのような融合タンパク質をコードする核酸のうちの１つに関する。一つの実施形態において、タンパク質は、（Ｇ４Ｓ）ｎペプチドリンカー（式中、ｎは、本明細書に定義される通りであり、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である）により連結された本明細書に記載される４．１または１．１１３と定義されるシングルドメイン抗体（すなわち４．１−（Ｇ４Ｓ）ｎ−１．１１３）を含んでなる。一つの実施形態において、タンパク質は、配列番号８４４、８４６、８９０または８９４から選択される。一つの実施形態において、タンパク質は、任意選択でＨＳＡ結合ｓｄＡｂを含む配列番号８９０を含んでなるか、またはそれからなる。一つの実施形態において、タンパク質は、配列番号８９１の核酸配列によってコードされる。
【０１８２】
【表１０】
2021502810.tif 000052
2021502810.tif 000053
【０１８３】
結合性分子の例示的な改変
一つの実施形態において、上記の結合性物質は、さらなる結合性分子を含んでなる。このように、結合性物質は、例えば、三特異性または四特異性であり得る。
【０１８４】
一つの実施形態において、結合性分子は、ＣＤ１３７に結合する第１のＶＨシングルドメイン抗体（ＶＨ（Ａ））、およびＰＳＭＡに結合する第２の部分、例えばＶＨシングルドメイン抗体（ＶＨ（Ｂ））を含んでなる。これは、別の抗原に結合する第３、第４、第５などの部分、例えばＶＨシングルドメイン抗体（すなわちＶＨ（Ｃ）、ＶＨ（Ｄ）、ＶＨ（Ｅ））をさらに含んでなる。このように、一つの実施形態において、結合性分子は、以下の式（式中、ＶＨは、本明細書に定義されるシングルドメイン抗体、すなわち完全長の抗体の他の部分を含まず、抗原に対する結合を保持するシングルＶＨドメインを意味する）：ＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ｂ）−Ｌ−ＶＨ（Ｘ）ｎを有し、式中、Ｘは、標的ＶＨ（Ａ）およびＶＨ（Ｂ）が結合する以外の標的に結合するＶＨを表し、式中、Ｘは、１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。Ｌは、リンカー、例えばペプチドリンカーを表す。他所に説明するように、ＰＳＭＡまたは別の標的に結合する部分は、抗体もしくはその断片または他のポリペプチドから選択され得る。
【０１８５】
別の実施形態において、さらなる部分は、結合性分子の半減期を延長させるように作用し得る。さらなる部分は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に結合するタンパク質、例えばペプチド、抗体またはその一部、例えばＶＨまたはＣＤＲを含んでなり得る。一つの実施形態において、さらなる部分は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に結合するＶＨドメインを含んでなり得る。一つの実施形態において、ＨＳＡに結合するＶＨドメインは、配列番号９０１またはそれと少なくとも９０％の配列相同性を有する配列である。さらなる部分は、血清アルブミン、例えばＨＳＡまたはその変異体、例えばＨＳＡ  Ｃ３４Ｓを含んでなり得る。さらに、例えばＶＨドメインがＦｃドメインに融合されている、ＶＨドメインおよびＦｃドメインを含んでなる本明細書に記載される結合性分子も提供される。
【０１８６】
本明細書に使用される場合の用語「半減期」は、例えば、配列もしくは化合物の分解、および／または天然の機序による配列もしくは化合物の排除または隔離のために、アミノ酸配列、化合物またはポリペプチドの血清中濃度がｉｎ  ｖｉｖｏで５０％減少するのに要する時間を指す。半減期は、本発明の対応するＶＨシングルドメイン抗体の半減期より少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、または２０倍超増加させてもよい。例えば、半減期の増加は、本発明の対応するＶＨシングルドメイン抗体または融合タンパク質と比較して１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、またはさらに２４、４８、または７２時間超であり得る。本発明のアミノ酸配列、化合物またはポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、それ自体公知の任意の様式で、例えば薬物動態解析によって決定することができる。適した技術は、当業者に明らかであろう。半減期は、例えば、パラメーター、例えばｔ１／２アルファ、ｔ１／２ベータ、および曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して表すことができる。
【０１８７】
一つの実施形態において、結合性物質は、検出可能な標識または機能的標識によって標識される。標識は、フルオロフォア、蛍光剤、放射標識、酵素、化学発光剤、核磁気共鳴活性標識、または光感作剤を含むがこれらに限定されない、シグナルを産生するまたは産生するように誘導することができる任意の分子であり得る。このように、結合は、蛍光もしくは発光、放射活性、酵素活性、または吸光を検出することによって検出および／または測定してもよい。
【０１８８】
さらに他の複数の実施形態において、結合性物質は、少なくとも１つの治療部分（therapeutic moiety）、例えば薬物、酵素、または毒素にカップリングされる。一つの実施形態において、治療部分は、毒素、例えば細胞傷害性放射性核種、化学毒素、またはタンパク質毒素である。
【０１８９】
別の態様において、本発明の結合性物質は、例えば化学改変、特にＰＥＧ化によって、またはリポソームへの取り込みによって、または血清アルブミンタンパク質を使用することによって、半減期を増加させるように改変される。半減期の増加は、分子を抗体断片、例えば半減期を増加させるＶＨドメインとコンジュゲートすることによって、与えることもできる。
【０１９０】
上記の多価の結合性物質を生成するために、２つ以上の結合性分子をリンカー、例えばポリペプチドリンカーによって接続することができる。適したリンカーには、例えばＧＳ残基を有するリンカー、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが挙げられ、式中、ｎ＝１〜１０以上、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０であり、実施例の特定の配列を他所に提供する。
【０１９１】
シングルドメイン抗体および結合性分子を作製する例示的な方法
多特異性分子に使用するための本明細書に記載されるシングルドメイン抗体は、それぞれＣＤ１３７またはＰＳＭＡ抗原による刺激時に重鎖のみの抗体を発現するトランスジェニック齧歯類から得ることができる。トランスジェニック齧歯類、例えばマウスは、好ましくは内因性の抗体遺伝子を発現する許容量が低減されている。このように、一つの実施形態において、齧歯類は、内因性の軽鎖および／または重鎖抗体遺伝子を発現する許容量が低減されている。従って、齧歯類は、例えば以下に詳しく説明するように、機能的な軽鎖および／または重鎖が産生されないように、内因性のカッパおよびラムダ軽鎖ならびに／または重鎖抗体遺伝子の発現を妨害する改変を含んでなり得る。
【０１９２】
標的抗原に結合することができるヒト重鎖のみの抗体を産生する方法は、
ａ）トランスジェニック齧歯類、例えばマウスを標的抗原（すなわちＰＳＭＡまたはＣＤ１３７）によって免疫する工程であって、前記齧歯類が、再構成されていないヒト重鎖Ｖ遺伝子を含んでなる核酸構築物を発現し、機能的な内因性の軽鎖または重鎖を作製することができない工程、および
ｂ）ヒト重鎖のみの抗体を単離する工程
を含んでなる。
【０１９３】
さらなる工程は、例えば、前記齧歯類、例えばマウスからＶＨドメイン配列を含んでなる配列のライブラリを生成する工程によって、および前記ライブラリからＶＨドメイン配列を含んでなる配列を単離する工程によって、前記重鎖のみの抗体からＶＨドメインを単離する工程を含み得る。
【０１９４】
標的抗原に結合することができるシングルＶＨドメイン抗体を産生する方法は、
ａ）トランスジェニック齧歯類、例えばマウスを標的抗原によって免疫する工程であって、前記齧歯類、例えばマウスが、再構成されていないヒト重鎖Ｖ遺伝子を含んでなる核酸構築物を発現し、機能的な内因性の軽鎖または重鎖を作製することができない工程、
ｂ）前記齧歯類、例えばマウスからＶＨドメイン配列を含んでなる配列のライブラリを生成する工程、および
ｃ）前記ライブラリからＶＨドメイン配列を含んでなる配列を単離する工程
を含んでなる。
【０１９５】
さらなる工程は、例えば実施例に示される機能的アッセイを使用することによって、標的抗原に結合するシングルＶＨドメイン抗体または重鎖のみの抗体を同定する工程を含み得る。
【０１９６】
本明細書に記載されるポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物、および組成物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現ライブラリを使用して調製または生成する方法は、以下の工程：
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸配列の組、コレクション、またはライブラリを提供する工程；
ｂ）標的抗原に結合することができる／標的抗原に対して親和性を有するアミノ酸配列に関して、前記組、コレクション、またはライブラリをスクリーニングする工程；および
ｃ）標的抗原に結合することができる／標的抗原に対して親和性を有するアミノ酸配列（複数）を単離する工程
を含んでなり得る。
【０１９７】
上記の方法において、アミノ酸配列の組、コレクション、またはライブラリは、例えばスクリーニングを容易にするために、ファージ、ファージミド、リボソーム、または適した微生物（例えば、酵母）上に提示され得る。アミノ酸配列（の組、コレクション、またはライブラリ）を提示およびスクリーニングするための適した方法、技術、および宿主生物は、当業者に明らかである（例えば、Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press;第1版(10月28日, 1996年) Brian K. Kay, Jill Winter, John McCaffertyを参照されたい）。
【０１９８】
ライブラリ、例えばファージライブラリは、抗原特異的な重鎖のみの抗体を発現する細胞または組織を単離する工程、単離された細胞または組織に由来するｍＲＮＡからＶＨドメイン（複数）をコードする配列をクローニングする工程、およびライブラリを使用してコードされるタンパク質を提示する工程によって生成される。ＶＨドメイン（複数）は、細菌、酵母、または他の発現系において発現させることができる。
【０１９９】
本明細書に記載の様々な態様および実施形態において、齧歯類という用語は、マウスまたはラットに関連し得る。一つの実施形態において、齧歯類はマウスである。マウスは、非機能的な内因性のラムダ軽鎖座を含み得る。このように、マウスは、機能的な内因性のラムダ軽鎖を作製しない。一つの実施形態において、ラムダ軽鎖座を、部分的もしくは完全に欠失させるか、または挿入、逆位、組換え事象（recombination event）、遺伝子編集、もしくは遺伝子サイレンシングを通して非機能的にする。例えば、少なくとも定常領域遺伝子Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３を欠失させてもよく、または上記の挿入もしくは他の改変を通して非機能的にしてもよい。一つの実施形態において、マウスが機能的なラムダ軽鎖を作製しないように、座を機能的に沈黙化させる。
【０２００】
さらに、マウスは、非機能的な内因性のカッパ軽鎖座を含んでなり得る。このように、マウスは、機能的な内因性のカッパ軽鎖を作製しない。一つの実施形態において、カッパ軽鎖座を、部分的もしくは完全に欠失させるか、または挿入、逆位、組換え事象、遺伝子編集、もしくは遺伝子サイレンシングを通して非機能的にする。一つの実施形態において、マウスが機能的なカッパ軽鎖を作製しないように、座を機能的に沈黙化させる。
【０２０１】
機能的に沈黙化した内因性のラムダおよびカッパＬ鎖座を有するマウスは、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００３／０００７３７に開示されるように作製してもよい。
【０２０２】
さらに、マウスは、非機能的な内因性の重鎖座を含んでなり得る。このように、マウスは、機能的な内因性の重鎖を作製しない。一つの実施形態において、重鎖座を、部分的もしくは完全に欠失させるか、または挿入、逆位、組換え事象、遺伝子編集、もしくは遺伝子サイレンシングを通して非機能的にする。一つの実施形態において、マウスが機能的な重鎖を作製しないように、座を機能的に沈黙化させる。
【０２０３】
例えば、ＷＯ２００４／０７６６１８（その全体が参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているように、８個総ての内因性の重鎖定常領域免疫グロブリン遺伝子（μ、δ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂ、ε、およびα）がマウスにおいて存在しないか、もしくはそれらが非機能的となる程度に部分的に存在せず、または遺伝子δ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂおよびεは存在しないが、隣接する遺伝子μおよびαは、それらが非機能的となる程度に部分的に存在せず、または遺伝子μ、δ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂ、およびεは存在しないが、αはそれが非機能的となる程度に部分的に存在せず、またはδ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂ、ε、およびαは存在しないが、μはそれが非機能的となる程度に部分的に存在しない。部分的に欠失させるとは、内因性の座の遺伝子配列が、機能的な内因性の遺伝子産物が座によってコードされない程度に、すなわち機能的産物が座から発現されないように、欠失しているかまたは例えば挿入によって破壊されていることを意味する。別の実施形態において、座は機能的に沈黙化している。
【０２０４】
一つの実施形態において、マウスは、非機能的な内因性の重鎖座、非機能的な内因性のラムダ軽鎖座、および非機能的な内因性のカッパ軽鎖座を含んでなる。従って、マウスは、いかなる機能的な内因性の軽鎖または重鎖も産生しない。このように、マウスはトリプルノックアウト（ＴＫＯ）マウスである。
【０２０５】
トランスジェニックマウスは、異種の、好ましくはヒトの重鎖座を発現させるためのベクター、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含んでなり得る。ＹＡＣは、酵母において非常に大きいＤＮＡインサートをクローニングするために使用することができるベクターである。天然の酵母染色体のような挙動を示すために必須の３つ総てのシス作用型構造エレメント（自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア（ＣＥＮ）、および２つのテロメア（ＴＥＬ））を含んでなることに加えて、大きいＤＮＡインサートを許容できることにより、それらは、染色体様の安定性にとって、および酵母細胞における伝播の正確性にとって必要な最小サイズ（１５０ｋｂ）に到達することができる。ＹＡＣの構築および使用は、当技術分野で周知である（例えば、Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopedia of Life Sciences, 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group）。
【０２０６】
例えば、ＹＡＣは、ＣＨ１ドメイン、マウスエンハンサー、および調節領域を欠如するマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせて、再構成されていない過剰なヒトＶＨ、Ｄ、およびＪ遺伝子を含んでなり得る。ヒトＶＨ、Ｄ、およびＪ遺伝子は、ヒトＶＨ、Ｄ、およびＪ座であり、それらは完全にヒトである再構成されていない遺伝子である。
【０２０７】
当技術分野で公知の代替方法を、内因性のマウスまたはラット免疫グロブリン遺伝子の欠失または不活化のために、およびＣＨ１ドメイン、マウスエンハンサー、および調節領域を欠如するマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせて、ヒトＶＨ、Ｄ、およびＪ遺伝子の導入のために使用してもよい。
【０２０８】
トランスジェニックマウスは、実施例に例証するように標準的な技術に従って作製することができる。トランスジェニックマウスを作製するための２つの最も特徴付けられた経路は、新鮮な受精卵母細胞の前核への遺伝子材料のマイクロインジェクションを介して、または安定にトランスフェクトした胚性幹細胞を桑実胚もしくは胚盤胞期の胚に導入することを介して行われる。遺伝子材料を導入する方法にかかわらず、操作された胚は、偽妊娠雌性レシピエントに移入され、そこで妊娠を継続させて、候補となるトランスジェニック子孫を産まれさせる。これらの広範な方法の間の主な差は、ＥＳクローンを、使用前に広範にスクリーニングして、トランスジェニック動物を作製することができる点である。これに対し、前核マイクロインジェクションは、その導入後の宿主ゲノムに遺伝子材料が組み込まれることに依存しており、一般的に、トランスジーンの取り込みの成功は、子孫が産まれるまで確認することができない。
【０２０９】
トランスジーンの取り込みの成功が起こるか否かを補助および決定するために当技術分野で公知の多くの方法が存在する。トランスジェニック動物は、ゲノムへの構築物のランダムな組み込み、部位特異的組み込み、または相同組換えを含む複数の手段によって作製することができる。薬物抵抗性マーカー（ポジティブ選択）、リコンビナーゼ、組換え媒介カセット交換、ネガティブ選択技術、および組換え効率を改善するためのヌクレアーゼの使用を含む、トランスジーンの組み込みおよびその後の改変を促進および選択するために使用することができる様々なツールおよび技術が存在する。これらの方法のほとんどがＥＳ細胞の改変において一般的に使用されている。しかしながら、技術の一部は、前核注射を介して媒介される遺伝子導入を増強するために有用性を有し得る。
【０２１０】
さらなる精密化を使用して、所望のバックグラウンド内でトランスジェニック系統をより効率的に生成することができる。上記のように、好ましい複数の実施形態において、内因性のマウス免疫グロブリン発現を沈黙化させて、薬物探索のために利用することができる重鎖のみのレパートリーを発現させるために、導入されたトランスジーンのみを使用することができるようにする。遺伝子操作されたマウス、例えば総ての内因性の免疫グロブリン座（マウス重鎖、マウスカッパ鎖、およびマウスラムダ鎖）を沈黙化させたＴＫＯマウスを、上記のように使用することができる。導入された任意のトランスジーンのこのＴＫＯバックグラウンドへの移入は、通常の交配、またはプロセスを効率的に拡大させるためにＩＶＦ工程を含めることによる交配のいずれかによって行うことができる。しかしながら、同様に、遺伝子導入手順の際にＴＫＯバックグラウンドを含めることも可能である。例えば、マイクロインジェクションの場合、卵母細胞はＴＫＯドナーに由来してもよい。同様に、ＴＫＯ胚からのＥＳ細胞を、遺伝子導入において使用するために誘導することができる。
【０２１１】
免疫グロブリン座を発現するようにトランスジーンが導入されているトリプルノックアウトマウスを、本明細書においてＴＫＯ／Ｔｇと呼ぶ。一つの実施形態において、マウスはＷＯ２０１６／０６２９９０に記載されている通りである。
【０２１２】
本明細書に記載される融合タンパク質は、例えばペプチドリンカーをコードする核酸配列を使用して、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体をコードする核酸を、ＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体をコードする核酸に連結させることによって、生成することができる。次に、そのような融合核酸分子を適した宿主細胞において発現させる。
【０２１３】
結合性分子の例示的な治療応用
別の態様において、本明細書に記載される結合性分子、および任意選択で薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物が提供される。本明細書に記載される結合性分子または本発明の医薬組成物は、経口、局所表面、非経口、舌下、直腸、膣、眼、鼻腔内、肺、皮内、硝子体内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、脳内、経皮、経粘膜、吸入、または特に耳、鼻、眼、もしくは皮膚への局所表面、または吸入を含むがこれらに限定されない任意の通常の経路によって投与することができる。
【０２１４】
非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、直腸内、膀胱内、皮内、局所表面、または皮下投与が挙げられる。好ましくは、組成物は非経口投与される。
【０２１５】
薬学的に許容される担体または媒体は、微粒子であり得て、そのため、組成物は例えば錠剤または散剤形態である。用語「担体」は、それとともに本発明の薬物抗体が投与される希釈剤、アジュバント、または賦形剤を指す。そのような薬学的担体は、液体、例えば水、ならびに石油、動物、植物、もしくは合成起源の油を含む油、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油、およびその他であり得る。担体は、食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素、およびその他であり得る。加えて、補助剤、安定剤、濃化剤、潤滑剤、および着色剤を使用することができる。一つの実施形態において、動物に投与する場合、本発明のシングルドメイン抗体または組成物および薬学的に許容される担体は無菌的である。水は、本発明の薬物抗体を静脈内投与する場合の好ましい担体である。食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、液体担体として、特に注射可能溶液として使用することができる。適した薬学的担体はまた、賦形剤、例えばデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、およびその他を含む。本発明の組成物は、望ましければ、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。
【０２１６】
本発明の医薬組成物は、液体、例えば溶液、乳剤、または懸濁剤の形態であり得る。液体は、注射、輸注（例えば、ＩＶ輸注）、または皮下による送達にとって有用であり得る。
【０２１７】
経口投与のために意図される場合、組成物は好ましくは固体または液体形態であり、半固体、半液体、懸濁剤、およびゲル形態は、本明細書において固体または液体のいずれかであると考えられる形態に含まれる。
【０２１８】
経口投与のための固体組成物として、組成物を、散剤、顆粒剤、圧縮錠、丸剤、カプセル剤、チューインガム、カシェ剤、または類似の形態に製剤化することができる。そのような固体組成物は典型的に、1つまたは複数の不活性な希釈剤を含む。加えて、以下のうちの１つまたは複数が存在し得る：結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロース、またはゼラチン；賦形剤、例えばデンプン、ラクトース、またはデキストリン；崩壊剤、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、コーンスターチ、およびその他；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料；ならびに着色剤。組成物がカプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル）の形態である場合、これは、上記のタイプの材料に加えて、液体担体、例えばポリエチレングリコール、シクロデキストリン、または脂肪油を含み得る。
【０２１９】
組成物は、液体、例えばエリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、または懸濁剤の形態であり得る。液体は、経口投与または注射による送達にとって有用であり得る。経口投与が意図される場合、組成物は、甘味剤、保存剤、色素／着色剤、および香味増強剤のうちの１つまたは複数を含んでなり得る。注射による投与のための組成物では、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤、および等張剤のうちの１つまたは複数も同様に含めることができる。
【０２２０】
組成物は、１つまたは複数の投与単位の形態をとり得る。
【０２２１】
特定の複数の実施形態において、処置を必要とする領域に組成物を局所投与するか、または静脈内注射もしくは輸注によって組成物を投与することが望ましい場合がある。
【０２２２】
特定の障害または状態の処置において有効／活性である療法の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、最適な投与量範囲を同定するために役立つように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを任意選択で使用することができる。組成物に使用される正確な用量もまた、投与経路および疾患または障害の重症度に依存し、医師の判断および各々の患者の状況に従って決定すべきである。年齢、体重、性別、食事、投与時間、排泄速度、宿主の状態、薬物の組合せ、反応感度、および疾患の重症度のような要因を考慮に入れるべきである。
【０２２３】
典型的に、量は、組成物の少なくとも約０．０１重量％の本発明のシングルドメイン抗体である。経口投与が意図される場合、この量は、組成物の約０．１重量％〜約８０重量％の範囲に変化し得る。好ましい経口組成物は、組成物の約４重量％〜約５０重量％の本発明のシングルドメイン抗体を含んでなり得る。
【０２２４】
本発明の好ましい組成物は、非経口用量単位が本発明のシングルドメイン抗体の約０．０１重量％〜約２重量％を含むように調製される。本発明はまた、本発明の結合性分子を含んでなるデバイス、例えばプレフィルドシリンジにも関する。
【０２２５】
注射による投与に関して、組成物は、典型的に対象の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは対象の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの間、およびより好ましくは対象の体重の約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇを含んでなり得る。一つの実施形態において、組成物は、約１〜３０ｍｇ／ｋｇ、例えば約５〜２５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜５ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与スケジュールは、例えば１週間に１回から２、３、または４週間に１回まで異なり得る。
【０２２６】
本明細書において使用される場合、「処置する」、「処置している」、または「処置」は、疾患または障害を阻害または軽減することを意味する。例えば、処置は、疾患または障害に関連する症状の発生の延期、および／または前記疾患とともに発生するまたは発生すると予想されるそのような症状の重症度の低減を含み得る。用語は、既存の症状を改善する、さらなる症状を予防する、およびそのような症状の基礎となる原因を改善または予防することを含む。このように、用語は、処置される哺乳動物、例えばヒト患者の少なくとも一部に有益な結果が付与されることを表す。多くの医学的処置は、処置を受ける患者の総てではないが一部にとって有効である。
【０２２７】
用語「対象」または「患者」は、処置、観察、または実験の対象である動物を指す。単なる例に過ぎないが、対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコを含むがこれらに限定されない。
【０２２８】
本明細書に使用される場合、用語「有効量」は、細胞、組織、または対象に単独で投与される場合、または追加の治療剤と組み合わせて投与される場合に、投与の条件下で所望の治療効果または予防効果を達成するために有効である本明細書に記載される結合性分子の量を意味する。
【０２２９】
本発明はさらに、がん、特に前立腺がんの予防および／または処置のための方法であって、対象に本発明の結合性分子を投与する工程を含んでなり、それを必要とする対象に、薬学的有効量（pharmaceutically active amount）の、本発明の結合性分子および／または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法に関する。特に、本発明は、がん、特に前立腺がんの予防および／または処置のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量の、本発明の結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法に関する。
【０２３０】
本発明はまた、疾患の処置に使用するための本発明の結合性分子にも関する。本発明はまた、がん、特に前立腺がんまたは前立腺障害の処置に使用するための本発明の結合性分子にも関する。「前立腺がん」は、前立腺の組織から生じたがんの全段階および全形態を指す。本発明はまた、ＰＳＭＡの異常な発現を特徴とする疾患の処置にも関する。
【０２３１】
別の態様において、本発明は、疾患の処置における本発明の結合性分子の使用に関する。別の態様において、本発明は、がん、例えば前立腺がんまたは前立腺障害の処置のための医薬の製造における本発明の結合性分子の使用に関する。
【０２３２】
本発明の結合性分子は、疾患の処置、予防、または改善とっても有用である。一つの実施形態において、疾患は、ＰＳＭＡ陽性細胞と関連する。一つの実施形態において、疾患はがんである。一つの実施形態において、がんは、ＰＳＭＡ陽性腫瘍と関連する。
【０２３３】
ＰＳＭＡの発現は、他のがん、より具体的には、これらのがんと関連する新脈管構造において検出されている。通常の（明細胞）腎細胞癌、膀胱上皮移行癌、精巣胎児性癌、神経内分泌癌、結腸癌、および乳癌を含む広範な癌腫、ならびに様々な種類の悪性腫瘍が、それらの新脈管構造においてＰＳＭＡを発現することが一貫して強く認められた。一つの実施形態において、処置されるがんは、ＰＳＭＡを発現する新脈管構造における腫瘍から選択される、例えば、腎臓がん、膀胱がん、精巣がん、神経内分泌がん、結腸がん、および乳がんから選択される。
【０２３４】
一つの態様において、がんは、局所進行切除不能、転移性、または再発性がんである。
【０２３５】
一つの実施形態において、がんは、以下の非制限的な一覧：前立腺がん、肺がんまたは神経膠芽腫から選択される。一つの実施形態において、疾患は、男性生殖器系における前立腺を冒すいずれの疾患も指す前立腺障害である。前立腺は、精巣のホルモン分泌に依存する。
【０２３６】
本発明の結合性分子は、唯一の活性成分として、または１つもしくは複数の他の治療部分および／もしくは細胞傷害性部分と組み合わせて投与してもよい。一つの実施形態において、結合性分子は、毒性部分とコンジュゲートされてもよい。
【０２３７】
一つの実施形態において、シングルドメイン抗体は手術と組み合わせて使用される。
【０２３８】
他の剤との例示的な組合せ
一価または多価分子を含む本発明の分子または医薬組成物は、唯一の活性成分として、または１つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて投与してもよい。治療剤は、疾患の処置において有用である化合物または分子である。治療剤の例には、抗体、抗体断片、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、および放射性同位体が挙げられる。抗体分子には、完全な抗体またはその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはシングルドメイン抗体、例えばＶＨドメイン、抗体模倣タンパク質、またはＣＤ１３７の天然リガンドを模倣するタンパク質が挙げられる。
【０２３９】
抗がん治療は、治療剤または放射線治療を含んでもよく、これには、遺伝子治療、ウイルス治療、ＲＮＡ治療、骨髄移植、ナノ治療、標的化抗がん治療、または腫瘍溶解薬が挙げられる。他の治療剤の例には、他のチェックポイント阻害剤、抗新生物剤、免疫原性剤、減弱化がん様細胞、腫瘍抗原、抗原提示細胞、例えば腫瘍由来抗原もしくは核酸をパルスした樹状細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮａ２、ＧＭ−ＣＳＦ）、標的化低分子および生物学的分子（例えば、シグナル伝達経路の構成要素、例えばチロシンキナーゼの調節剤、および受容体チロシンキナーゼの阻害剤、およびＥＧＦＲアンタゴニストを含む腫瘍特異的抗原に結合する薬剤）、抗炎症剤、細胞傷害剤、放射性毒素剤、または免疫抑制剤および免疫刺激サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞、化学療法が挙げられる。一つの実施形態において、投与は手術と組み合わせられる。本発明の結合性分子は、他の治療と同時または異なる時期に、例えば、同時、個別に、または連続的に投与され得る。
【０２４０】
免疫応答を調節する例示的な方法、腫瘍成長を阻害する例示的な方法など
さらに別の態様において、対象における免疫応答を調節する方法であって、対象における免疫応答が調節されるように、対象に、本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法が提供される。好ましくは、結合性分子は、対象における免疫応答を増強する、刺激する、または増加させる。
【０２４１】
さらなる態様において、対象における腫瘍細胞の成長を阻害するまたは腫瘍退縮を促進する方法であって、対象に、治療有効量の、本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法が提供される。
【０２４２】
さらなる態様において、ＣＤ１３７の下流シグナル伝達経路を活性化する方法であって、対象に、本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法が提供される。
【０２４３】
さらなる態様において、Ｔリンパ球の活性化および／または増殖を誘導する方法であって、対象に、本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法が提供される。
【０２４４】
さらなる態様において、ＣＤ１３７発現細胞および腫瘍抗原、すなわちＰＳＭＡ発現細胞を二重標的とする方法であって、対象に、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法が提供される。
【０２４５】
さらなる態様において、ＣＤ１３７発現細胞および腫瘍抗原、すなわちＰＳＭＡ発現細胞の二重標的のための、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物が提供される。例えば、結合性分子は、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および本明細書に記載されるＰＳＭＡに結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる。
【０２４６】
例示的な免疫コンジュゲート
別の態様において、少なくとも１つの治療剤および／または診断剤、すなわち造影剤にコンジュゲートされた本明細書に記載される結合性分子を含んでなる免疫コンジュゲートが提供される。
【０２４７】
例示的なキット
別の態様において、本発明は、本発明の結合性分子を含んでなる、診断する、処置する、予後を判定する、またはモニターするために前立腺がんを検出するためのキットを提供する。キットは、使用説明書を含んでなってもよい。キットは、上記の本発明の標識結合性分子および１つまたは複数の標識を検出するための１つまたは複数の化合物を含み得る。凍結乾燥型で包装された、または水性媒体中で包装された本発明の結合性分子も提供される。キットは、試薬（例えば、再構成のための）および／または使用説明書および／または投与のためのデバイスを含み得る。
【０２４８】
例示的な非治療応用
本発明はまた、本発明の結合性分子を使用した検出方法にも関する。ヒトＰＳＭＡに結合する能力を考慮すると、本明細書に開示されるヒトＰＳＭＡ結合性分子は、通常のイムノアッセイ、例えば酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または組織免疫組織化学を使用して、ＰＳＭＡ（例えば、生体試料、例えば血清または血漿中の）を検出するために使用することができる。特に、本発明はまた、がん、特に前立腺がんの進行を診断するまたはモニターするｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏの方法にも関する。ｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法は、試験試料中のＰＳＭＡタンパク質の存在を検出する工程、およびこれを正常対象からの対照試料または正常対象に対する基準値もしくは基準値範囲と比較する工程を含んでなる。試料は、血液、血漿、血清、精液、尿または組織生検から選択され得る。
【０２４９】
方法は、（ａ）試料（ならびに任意選択で参照、例えば陽性および／または陰性対照試料）を本発明のＰＳＭＡ結合性分子と接触させる工程、および（ｂ）試料中のＰＳＭＡに結合した結合性分子または非結合結合性分子のいずれかを検出して、それにより、生体試料中のＰＳＭＡを検出する工程を含み得る。結合性分子は、検出可能な物質で直接的または間接的に標識して、結合または非結合抗体の検出を促進することができる。適した検出可能な物質としては、様々な酵素、補欠分子族、蛍光物質、発光物質および放射性物質が挙げられる。
【０２５０】
ｉｎ  ｖｉｖｏの方法は、例えば対象におけるイメージングによって、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＰＳＭＡの存在を検出する工程を含んでなってもよい。この方法において、本発明のＰＳＭＡ結合性分子は、結合を検出するために標識される。このように、本発明の標識分子は、造影剤として使用され得る。
【０２５１】
本発明の結合性分子を標識する工程の代替として、検出可能な物質で標識されたＰＳＭＡ標準および非標識ヒトＰＳＭＡ結合性分子を使用した競合イムノアッセイによって、ヒトＰＳＭＡを生体液においてアッセイすることができる。このアッセイでは、生体試料、標識ＰＳＭＡ標準およびヒトＰＳＭＡ結合性分子を合わせ、非標識結合性分子に結合した標識ＰＳＭＡ標準の量を決定する。生体試料中のヒトＰＳＭＡの量は、ＰＳＭＡ結合性分子に結合した標識ＰＳＭＡ標準の量と反比例する。同様に、検出可能な物質で標識されたＰＳＭＡ標準および非標識ヒトＰＳＭＡ結合性分子を使用した競合イムノアッセイによって、ヒトＰＳＭＡを生体液においてアッセイすることもできる。
【０２５２】
本明細書に開示される結合性分子は、例えば、ＰＳＭＡを含有する細胞培養物、ヒト対象、または本明細書に開示される結合性分子が交叉反応するＰＳＭＡを有する他の哺乳動物対象におけるＰＳＭＡ活性を阻害するために使用することができる。一つの実施形態において、ＰＳＭＡ活性を阻害するまたは増加させる方法であって、ＰＳＭＡ活性が阻害されるまたは増加するように、ＰＳＭＡを本明細書に開示される結合性分子と接触させる工程を含んでなる方法が提供される。例えば、ＰＳＭＡを含有するまたは含有すると思われる細胞培養物において、本明細書に開示される結合性分子を培養培地に添加して、培養物におけるＰＳＭＡ活性を阻害することができる。
【０２５３】
従って、一つの実施形態において、本発明はまた、ＰＳＭＡを発現する細胞、例えばがん様または非がん様前立腺細胞を剥離するまたは死滅させる方法にも関する。本発明の方法は、細胞を剥離するまたは死滅させるのに十分な量で、細胞を本発明のＰＳＭＡ結合性分子と接触させる工程を含む。方法は、例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏまたは生体外で、培養物における細胞に使用することができる。
【０２５４】
図面および実施例を参照して本明細書に記載される結合性分子または医薬組成物も提供される。本明細書において特に定義していない限り、本開示に関連して使用した科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。前述の開示は、本開示を作製および使用するための方法、ならびにその最善の様式を含む本発明の範囲に包含される主題の一般的説明を提供するが、当業者が本開示を実践することができるように、以下の実施例を提供する。しかしながら、当業者は、これらの実施例の細部が本発明を制限すると解釈すべきではなく、その範囲は、本開示に添付される特許請求の範囲およびその同等物から理解されるべきであることを認識するであろう。本開示の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示を考慮すれば当業者に明らかであろう。
【０２５５】
本明細書において言及した総ての文書は、遺伝子受託番号の参照、科学刊行物および特許刊行物の参照を含む、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２５６】
本明細書において使用される場合の「および／または」は、他方の存在下または非存在下での２つの明記された特色または構成要素の各々の具体的開示であると解釈すべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、各々が本明細書において個々に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の具体的開示であると解釈すべきである。本文がそれ以外であることを指示していない限り、上記の特色の説明および定義は、本発明の任意の特定の態様または実施形態に限定されず、記載の総ての態様および実施形態に等しく適用される。
【０２５７】
本発明を、ここで非制限的な実施例においてさらに説明する。
【実施例】
【０２５８】
実施例１．ＣＤ１３７およびＰＳＭＡに対して特異的なＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨの単離
ＣＤ１３７またはＰＳＭＡに対して特異的なＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨを、沈黙化マウス免疫グロブリン座およびヒト重鎖抗体遺伝子を含有するトランスジーンを有するＣｒｅｓｃｅｎｄｏの専売のトランスジェニックマウスを免疫することによって、生成した。
【０２５９】
内因性の重鎖および軽鎖抗体発現に関して沈黙化されているバックグラウンド内の生殖系列構成にヒト重鎖抗体トランスジェニック座を有するマウス（トリプルノックアウト、またはＴＫＯ）を、既に記述されている通りに作製した（WO2004/076618, WO2003/000737, Ren et  al., Genomics, 84, 686, 2004; Zou et al., J. Immunol., 170, 1354, 2003およびWO2016/062990）。簡単に説明すると、トランスジェニックマウスを、ＣＨ１ドメイン、マウスエンハンサー、および調節領域を欠如するマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせて過剰なヒトＶＨ、Ｄ、およびＪ遺伝子を含んでなる酵母人工染色体（ＹＡＣ）を、新鮮な受精卵母細胞の前核へのマイクロインジェクション後に誘導した。使用したＹＡＣは、複数のヒト重鎖Ｖ遺伝子、複数のヒト重鎖ＤおよびＪ遺伝子、マウスＣＨ１遺伝子、およびマウス３’エンハンサー遺伝子を含んだ。これはＣＨ１エクソンを欠如する。
【０２６０】
マウスを、組換えヒトＣＤ１３７またはＰＳＭＡタンパク質で免疫した。免疫スケジュールの最後に、リンパ節および脾臓をＲＮＡ抽出物のために回収した。重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列をＰＣＲによって増幅し、ファージミドベクターにクローン化した。ライブラリ生成の標準プロトコールに従った上記の免疫したマウスからのライブラリの生成、細菌ペリプラズム抽出物の標準スクリーニング手順、最適化、シークエンシングおよび精製方法を含む、標準ファージディスプレイ技術を使用して、標的タンパク質に結合したＶＨを単離した。クローン１．１、２．１、３．１および４．１に対するアミノ酸および核酸配列を、表２、３、５、６および７に示す。
【０２６１】
例えば、ＰＳＭＡ結合サブユニットは、ＷＯ２０１７／１２２０１７に開示される通りに生成してもよい。ＣＤ１３７に結合するＶＨの生成に関しては、８〜１２週齢のＴｇ／ＴＫＯマウスを、ヒトＣＤ１３７−ヒトＦｃキメラタンパク質（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４１Ｂ−Ｈ５２５８）、ヒトＣＤ１３７−Ｈｉｓタグタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カスタム製品）、ヒトＣＤ１３７を過剰発現するＣＨＯ細胞（標準的な方法を使用して施設内で生成された細胞株）、または組換えタンパク質およびＣＨＯヒトＣＤ１３７発現細胞の組合せによって免疫した。次に、血清を免疫の前後にマウスから回収し、ＣＤ１３７抗原による免疫に応答した血清中ヒトＣＤ１３７反応性重鎖抗体の存在に関してＥＬＩＳＡによってチェックした。
【０２６２】
上記の免疫したマウスからのライブラリの生成は、以下に概要するライブラリ生成の標準プロトコールに従った。脾臓全体、鼠径部および上腕リンパ節を含む組織を、数匹の免疫したマウスからＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）に回収した。全ＲＮＡを上清から抽出し、ＶＨ配列を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ−ＰＣＲ高正確性キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２５７４−０３５）を使用して、製造元のプロトコールに従ってＲＮＡ試料から得た。ライブラリファージストックの調製およびファージディスプレイ選択は、公表された方法（Antibody Engineering, Benny Lo編, 8章, 161〜176頁, 2004）に従って実施した。ほとんどの場合、パニングアプローチと組み合わせたファージディスプレイを使用して、結合ＶＨドメインを単離した。しかしながら、可溶性タンパク質選択、細胞に基づく選択、およびストレス（例えば、熱）下で実施する選択を含む、多様な異なる選択方法が当技術分野において十分に記載されている。ライブラリの選択後、ヒトＣＤ１３７を発現するＣＨＯ細胞に結合し、ＣＨＯ親細胞に結合せず、ＣＨＯ細胞の表面に発現したヒトＣＤ１３７と組換えヒトＣＤ１３７リガンドタンパク質との間の相互作用を阻害する特定のＶＨを、細菌ペリプラズム抽出物のシングルポイントスクリーニングによって同定した。上清中のＨｉｓタグＶＨのＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞および非ＣＤ１３７特異的結合の決定のためのＣＨＯ親細胞に対する結合を、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ）を使用して評価した。結合アッセイと並行して、ペリプラズム抽出物を、ＦＭＡＴフォーマットにおけるヒトＣＤ１３７リガンドタンパク質とＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞との相互作用を阻害する能力に関して試験した。ＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞に結合し、ＣＨＯ親細胞に結合せず、ＣＤ１３７リガンドに結合するＣＤ１３７を阻害するＶＨのファミリーを同定した。上記のように同定した各々の個々のＶＨクローンをファージミドからシークエンシングし、ＶＨ生殖系列およびＣＤＲ３アミノ酸類似性に基づいて群分けした。代表的なクローンをさらに特徴付けした。さらなるクローンを、それぞれクローンＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ１．１およびＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ２．１の配列最適化によって生成し、結合活性を改善し、生殖系列に配列を復帰させ、または生物物理学的配列ライアビリティ(liabilities)、例えば異性化または脱アミド部位を除去した。精製ＶＨを、標準的な手順を使用して得た。表２に、ファミリー１のＶＨｓの配列を示し、表３に、ファミリー２のＶＨｓの配列を示す。
【０２６３】
精製Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨを、ヒトＣＤ１３７タンパク質、アカゲザルＣＤ１３７Ｆｃ組換えタンパク質、マウスＣＤ１３７タンパク質、腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーＯＸ４０およびＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連）、ＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞、ＣＨＯ親細胞ならびにヒトＴ細胞に対する結合に関して試験した。ＶＨは、ヒトおよびアカゲザルＣＤ１３７に結合したが、マウスＣＤ１３７タンパク質には結合しなかった。ＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞およびＣＨＯ親細胞に対する連続希釈したＶＨの結合を、ＦＭＡＴアッセイフォーマットを使用して実施した。ＶＨは、ＣＨＯヒトＣＤ１３７発現細胞に結合したが、ＣＨＯ親細胞に結合しなかった。初代Ｔ細胞に対する一価シングルドメイン抗体の結合を、フローサイトメトリーを使用して測定した。本明細書に記載されるＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨは、予備刺激したＣＤ８＋細胞に結合した。精製Ｈｕｍａｂｏｄｙ  ＶＨが、ＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞に対するＣＤ１３７リガンドの結合を阻害する能力も、ＦＭＡＴリガンド阻害アッセイにおいて測定した。ＶＨは、ヒトＣＤ１３７に対するヒトＣＤ１３７リガンドの結合を阻害した。機能的アッセイも実施し、ＣＤ１３７に結合する一価ＶＨがＣＤ１３７アゴニストとして作用する能力を、ＣＤ１３７およびＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を使用してレポーター遺伝子アッセイにおいて評価した。それらの活性を、相互作用を回避する可能性が増加している二価および三価分子、ならびに腫瘍抗原ＰＳＭＡに結合したＶＨと連結したＣＤ１３７  ＶＨからなる二特異性分子と比較した。二特異性分子において、ＣＤ１３７アゴニズムは、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡを発現した細胞の両方の同時関与から生じた。
【０２６４】
実施例２．二特異性構築物の生成および安定性試験
グリシン／セリンリッチ配列（Ｇ４Ｓ）ｘ（式中、ｘは、Ｇ４Ｓリピートの数であり、２〜１２反復単位の範囲をとる）のリンカーを使用して、単離されたＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ核酸配列を連結させることによって、多価構築物を生成した。各々のＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）をコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲによって増幅した。産物を、ＶＨシングルドメイン抗体配列が（Ｇ４Ｓ）ｘリンカーと隣接するより大きな断片に構築し、制限酵素に基づく方法によって発現ベクターにライゲートした。プラスミドを、標準的な分子生物学技術に従って微生物発現系に形質転換した。インサートの存在を標準的なコロニーＰＣＲ法によって確認し、ベクター特異的および内部プライマーを使用して、Ｓａｎｇｅｒシークエンシングによって配列を確認し、完全な配列包括度を確実なものとした。二特異性分子の生成に関しては、第１および第２の配列は同じではなく、一方の配列は、ＣＤ１３７に対して特異的なＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨに対応し、もう一方は、腫瘍関連抗原ＰＳＭＡに結合するＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）に対応していた。別の例において、一価および二特異性の結合性物質を、半減期延長Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）核酸配列（ＭＳＡ結合性物質）と任意選択で連結させた。二特異性および三特異性構築物は、微生物細胞系によって発現させた。安定性試験のために、精製二特異性および三特異性ＶＨを、サイズ排除クロマトグラフィーに供した。代表的な構築物に関する例示的なデータを、表９に示す。
【０２６５】
【表１１】
2021502810.tif 000054
【０２６６】
三特異性融合タンパク質およびそのような融合タンパク質をコードする核酸の例を、以下に示す。二価分子の例も以下に示す（表１０）。
【０２６７】
【表１２】
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【０２６８】
実施例３：ＣＤ１３７およびＰＳＭＡに対する結合
３．１  細胞結合
ＣＨＯヒトＣＤ１３７、ＣＨＯ親、ＣＨＯヒトＰＳＭＡ、ＤＵ１４５  ＰＳＭＡおよびＤＵ１４５親細胞に対するＨｉｓタグ分子の結合を、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ）を使用して評価した。試薬は総て、ＰＢＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＦＭＡＴアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製した。連続希釈した試料を、３８４ウェル黒色透明ボトムアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６５５）に移し、１．５ｎＭ抗Ｈｉｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０５−９４９）、３ｎＭヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ、カタログ番号１１５−５４５−０７１）およびＤＲＡＱ５（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６２２５１）によって予め染色した２０００個／ウェルとともに室温で少なくとも２時間インキュベートした。次に、ＴＴＰ  Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌプレートリーダーにおいて、４８８ｎｍおよび６４０ｎｍで励起後、ＦＬ２（５０２ｎｍ〜５３７ｎｍ）およびＦＬ５（６７７〜８００ｎｍ）チャネルにおいて蛍光発光を測定した。データを、ＦＬ５の境界およびピーク強度でゲートを設定し、ゲート設定したデータのＦＬ２平均蛍光強度の中央値を、ＶＨ結合の決定のために使用した。結合に関する例示的なＥＣ５０値を表１１に示す。一価ＣＤ１３７特異的Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ、ＣＤ１３７結合アームを有する二特異性および三特異性分子は、ＣＨＯ  ＣＤ１３７発現細胞に結合した。一価ＰＳＭＡ特異的Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ、ＰＳＭＡ結合アームを有する二特異性および三特異性分子は、ＰＳＭＡ発現細胞に結合した。
【０２６９】
【表１３】
2021502810.tif 000063
【０２７０】
初代Ｔ細胞に対する一価シングルドメイン抗体の結合を、フローサイトメトリーを使用して測定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によりヒト血液から単離した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造元のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）に従ってネガティブ選択単離キットを使用して精製した。ＣＤ８＋Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１倍Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地において、ＰＭＡ／イオノマイシンで４８〜７２時間刺激した。細胞を９６ウェルプレートに移し、染色緩衝液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％アジ化ナトリウム）で１０分間ブロックした後、染色緩衝液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）中の連続希釈したＶＨで、４℃にて３０分〜１時間インキュベートした。細胞を遠心分離により洗浄した後、ＶＨ結合を、抗Ｈｉｓ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０５−９４９）およびヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−５４５−０７１）を使用して検出した。生細胞の識別に、Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  ｎｅａｒ  ＩＲ染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｌ１０１１９）を使用した。さらに洗浄した後、細胞を固定し、蛍光をフローサイトメトリーにより測定した。結合（２〜３匹のドナー）に関する平均ＥＣ５０値を表９に示す。一価ＣＤ１３７特異的Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨおよびＣＤ１３７結合アームを有する二特異性分子は、予備刺激したＣＤ８＋細胞に結合した。
【０２７１】
３．２  親和性速度論
精製一価ＶＨ、およびＰＳＭＡ−ＣＤ１３７標的二特異性分子の結合速度論を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ３８４機器で決定した。抗原との相互作用を調べるために、ＣＤ１３７−Ｆｃタグタンパク質（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４１Ｂ−Ｈ５２５８）またはＰＳＭＡ−ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４２３４−ＺＮ）を、アミンカップリングによってＡＲ２Ｇバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８−５０８２）上に固定した。一価ＶＨおよび二特異性分子を、速度論緩衝液（０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ、１倍ＰＢＳ）中で連続希釈し（一般的に、最高濃度である１２〜２５ｎＭの間で開始する１：２希釈シリーズ）、固定したタンパク質に対する結合を、結合相および解離相中に調べた。１８０秒の結合相および６００秒の解離相を使用して、ＰＳＭＡ結合を測定した。１８０秒の結合相および６００秒の解離相を使用して、ＣＤ１３７結合を測定した。リファレンスを差し引いたデータを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して１：１結合モデルにフィットさせた。得られた例示的な速度論および結合親和性データを表１２に示す。
【０２７２】
【表１４】
2021502810.tif 000064
【０２７３】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＶＨとヒトおよびアカゲザルＣＤ１３７−ヒトＩｇＧ１Ｆｃタグ付きタンパク質との間の相互作用を調べた。単一サイクル速度論アッセイを使用して、相互作用の速度論および親和性を評価した。実験は、流速３０μｌ／分でＨＢＳ−ＥＰ＋アッセイ緩衝液において２５℃で実施した。プロテインＧチップを使用して、２μｇ／ｍｌまで希釈されたＦｃタグ付き組換えＣＤ１３７を７秒にわたりフローセルの１つに捕捉した。いずれの捕捉されたＣＤ１３７も有さない第２のフローセルを、参照細胞として使用した。ＶＨの３倍希釈シリーズを、６０ｎＭの最高濃度から５点濃度で作製した。結合速度論は、これらをチップ表面に流すことによって追跡した。結合工程の各々の接触時間は１８０秒間であり、解離工程は、アカゲザルおよびヒトＣＤ１３７でそれぞれ１８００および３６００秒であった。各ランの後、センサーをグリシンｐＨ１．５で再生し、捕捉されたＣＤ１３７を除去した。データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用してダブルリファレンスを差し引いた後に、１：１結合モデルにフィットさせた。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）１．１１３に関する平均速度論定数（±標準偏差）は、ヒトＣＤ１３７Ｆｃに対する結合に関しては、ｋａ  ３．６Ｅ＋０６  ±  １．６Ｅ＋０６（１／Ｍｓ）、Ｋｄｉｓ  ３．０Ｅ−０４  ±  １．１Ｅ−０４（１／ｓ）およびＫＤ  ８．５Ｅ−１１  ±  ７．８Ｅ−１２（Ｍ）であり、アカゲザルＣＤ１３７Ｆｃに対する結合に関しては、ｋａ  １．１Ｅ＋０６  ±  ２．２Ｅ＋０５（１／Ｍｓ）、Ｋｄｉｓ  ２．８Ｅ−０４  ±  ６．８Ｅ−０６（１／ｓ）およびＫＤ  ２．７Ｅ−１０  ±  ５．２Ｅ−１１であった。ＨＳＡ−４ＧＳに結合する構築物４．１−６ＧＳ−１．１１３−６ＧＳ−ＶＨに関する平均速度論定数（±標準偏差）は、ヒトＣＤ１３７Ｆｃに対する結合に関しては、ｋａ  ５．６Ｅ＋０５（１／Ｍｓ）、Ｋｄｉｓ  １．７Ｅ−０５（１／ｓ）およびＫＤ  ３．１Ｅ−１１（Ｍ）であり、アカゲザルＣＤ１３７Ｆｃに対する結合に関しては、ｋａ  ４．４Ｅ＋０５（１／Ｍｓ）、Ｋｄｉｓ  ５．２Ｅ−０５（１／ｓ）およびＫＤ  １．２Ｅ−１０（Ｍ）であった。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）１．１１３は、他の分子と比較してカニクイザルに対する良好な結合を示し、他の分子と比較して良好な開発可能性の特徴（安定性および発現）も示した。
【０２７４】
３．３  同時関与
３つの標的の関与も、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ機器を使用して実証した。結合１  −  プロテインＧバイオセンサー上に捕捉されたＣＤ１３７Ｆｃに対する三特異性分子の結合。結合２  −  ヒト血清アルブミンの結合、結合３  −  ＨＳＡ解離を最小限にするためのヒト血清アルブミンの存在下でのＰＳＭＡの結合。これは、三特異性分子が標的に同時に結合することができることを示した。
【０２７５】
二特異性分子によるＣＤ１３７およびＰＳＭＡの二重標的関与を、ＥＬＩＳＡフォーマットを使用して、およびＴ細胞を用いたフローサイトメトリーによって評価した。ＥＬＩＳＡのために、ＣＨＯ−ＰＳＭＡ細胞（２００００個／ウェル）を、Ｌ−グルタミン＋ブラストサイジン＋テトラサイクリンを補充したＨａｍｓ  Ｆ１２において９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号３５３８７２）に播種し、３７℃にて５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。その後の総ての工程は、室温で実施し、各工程間にＰＢＳによる洗浄を含めた。プレートをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１時間ブロックした後、連続希釈したＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨを添加し、１時間結合させた。非結合ＶＨを除去した後、１ｎＭ  ＣＤ１３７ｈｕＦｃ（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４１Ｂ−Ｈ５２５８）をウェルに添加し、１時間インキュベートした。その後、抗ｈｕＦｃ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−０９８）の１：３０００希釈液を１時間添加し、ＴＭＢを添加することによってプレートを展開した。０．５Ｍ硫酸を添加することによって反応を停止させ、プレートを吸光度４５０ｎｍでのＢＭＧ  ＰｈｅｒａＳｔａｒで読み取った。図１に、二特異性分子はヒトＣＤ１３７およびヒトＰＳＭＡの両方に同時に結合できることを実証した代表的なデータを示す。ＰＭＡ／イオノマイシンで４８時間予備刺激したヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、遠心分離によってＦＡＣＳ緩衝液（１０％ヒト血清および０．０５％アジ化ナトリウムを補充したＰＢＳ）で洗浄した。連続希釈した二特異性および三特異性Ｈｕｍａｂｏｄｙ  ＶＨ構築物を、氷上で１時間細胞に添加した。プレートをＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した後、５ｎＭビオチン化ＰＳＭＡ、２０ｎＭストレプトアビジンＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８およびＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ＮｅａｒＩＲ細胞染色希釈液を含有する検出ミックスを添加した。プレートを４℃で１時間インキュベートした後、遠心分離によってＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄した。細胞を、１倍ＢＤ細胞固定液を添加することによって固定した後、遠心分離によってＰＢＳで２回洗浄し、細胞ペレットをＰＢＳに再懸濁させた。蛍光を、ｉＱｕｅ  Ｐｌｕｓ  Ｓｃｒｅｅｎｅｒ（ＩｎｔｅｌｌｉＣｙｔ）でのＲＬ２−Ｈチャネル（Ｌｉｖｅ／Ｄｅａｄ染色）およびＢＬ１−Ｈチャネル（ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８染色）において測定した。二特異性および三特異性分子は、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞およびＰＳＭＡタンパク質に同時に結合することができた。
【０２７６】
細胞株に対する結合も、３．１項に従って蛍光マイクロボリュームアッセイ技術を使用して測定した。ＰＳＭＡ発現細胞に対する結合の検出に、ＣＤ１３７ｈｕＦｃ／抗ヒトＦｃ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８を使用した。
【０２７７】
ＥＬＩＳＡデータは、ｎ＝３の測定値に関する平均ＥＣ５０（±ＳＤ）である。示したフローサイトメトリーデータは、少なくとも６匹の異なるヒトＴ細胞ドナーに関する平均ＥＣ５０（±ＳＤ）である（表１３）。構築物４．１−６ＧＳ−１．１１３−６ＧＳ−ＶＨ  ＨＳＡ−４ＧＳは、ＦＭＡＴアッセイにおいてＣＨＯカニクイザルＰＳＭＡ細胞に結合した（平均ＥＣ５０±ＳＤ（Ｍ）  ５．７Ｅ−１０  ±  ４．６Ｅ−１１、０．５７ｎＭ  ｎ＝３）。
【０２７８】
【表１５】
2021502810.tif 000065
【０２７９】
実施例４．ＣＤ１３７Ｌ結合の阻害
Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨｓを、ＦＭＡＴフォーマットにおけるヒトＣＤ１３７リガンドタンパク質とＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞との相互作用を阻害する能力に関して試験した。ＦＭＡＴアッセイ緩衝液において連続希釈したＶＨを、０．２ｎＭ〜０．４ｎＭ  ＣＤ１３７Ｌ−ｈｕＦｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号１５６９３−１０１Ｈ）、３ｎＭ  Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８ヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ断片特異的ヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−５４５−０９８）およびＤＲＡＱ５によって予め染色した２０００個の細胞とともに室温で少なくとも２時間インキュベートした。ＦＭＡＴアッセイ緩衝液を含む総結合対照および過剰量の非Ｆｃタグ付き競合物質を含む非特異的結合対照を、データ正規化のために各々のプレートに設定した。ＴＴＰ  Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ、およびデータ正規化に使用したゲート設定したＦＬ２平均蛍光強度の中央値を使用して、蛍光シグナルを測定した。データを、非特異的結合対照ウェルから決定したバックグラウンドシグナルを差し引いた後の総結合対照の％（％対照）として表記した。一価および二特異性フォーマットでのＶＨは、ＣＤ１３７リガンドに対するＣＤ１３７結合を阻害した（表１４）。
【０２８０】
【表１６】
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【０２８１】
実施例５  機能活性
５．１  共培養機能活性アッセイ
二特異性分子がＣＤ１３７アゴニストとして作用する能力を、ＣＤ１３７およびＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ細胞ならびにヒトＰＳＭＡを発現する細胞を使用して共培養レポーター遺伝子アッセイにおいて評価した。アッセイは、高ＰＳＭＡ発現細胞（ＣＨＯ  ＰＳＭＡ）および低ＰＳＭＡ発現細胞（ＤＵ１４５  ＰＳＭＡ）を使用して実施した。ＰＳＭＡ発現細胞または親細胞（５０００個／ウェル）を、３８４ウェル白色透明ボトム組織培養処理プレート内に一晩播種した。ＣＨＯ細胞に関しては、培地を翌日に除去し、アッセイ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１倍Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ  １６４０）と交換した。連続希釈した単量体ＶＨ、二特異性およびＪｕｒｋａｔレポーター細胞を、アッセイ培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１倍Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ  １６４０）において調製し、ウェルに添加した。ＣＯ２インキュベータ中で３７℃にて５〜６時間インキュベートした後、ＢｉｏＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ７９４０）を添加し、ＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒで発光シグナルを測定することによって、ルシフェラーゼレポーター発現のレベルを決定した。図２は、ＣＤ１３７−ＰＳＭＡ  ＶＨ二特異性分子によるＮＦ−ｋＢ経路の濃度およびＰＳＭＡ依存的な刺激を例示したものである。ＰＳＭＡ発現のレベルは最大応答を決定し、低発現ＤＵ１４５  ＰＳＭＡ細胞と比較してＣＨＯ  ＰＳＭＡ高ＰＳＭＡ発現細胞株に対してより高い最大レベルが得られた（図２ｂ）。抗ＣＤ１３７抗体は、ＮＦ−ｋＢ駆動レポーター遺伝子活性をＰＳＭＡ非依存的に刺激する（図２ｃ）。実験は、二特異性分子において、ＣＤ１３７アゴニズムは、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡを発現した細胞の両方の同時関与から生じたことを示している。
【０２８２】
５．２  ＩＬ−２放出
二特異性分子を、共培養アッセイにおいてＴ細胞からのＩＬ−２放出を誘導するそれらの能力に関してさらに試験した。ＤＵ１４５  ＰＳＭＡまたは親ＤＵ１４５細胞を、培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１倍Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁し、５ｕｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４−００３７−８２）でプレコーティングしておいた９６ウェル平底プレートに２００００個／ウェルの密度で播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によりヒト血液から単離した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造元のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）に従ってネガティブ選択単離キットを使用して精製した。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ、二特異性およびベンチマーク抗体を、培地において調製し、Ｔ細胞（１０００００個／ウェル）とともにアッセイプレートに添加した。３７℃、５％ＣＯ２での４８時間のインキュベーション後に上清を回収し、ＩＬ−２レベルを、製造元の説明書（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６４ＩＬ２ＰＥＢ）に従ってヒトＩＬ−２アッセイキットを使用して定量した。ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＬ−２産生の刺激は、抗ＣＤ１３７ベンチマーク抗体に関してはＰＳＭＡと非依存的であったが、ＰＳＭＡ依存的（図３ａ）および濃度依存的（図３ｂ、３ｄ）であった。最大応答レベルは、抗体および二特異性分子の両方に対してＴ細胞ドナー依存的であった（図３ｃ）。インターフェロンγも誘導された（図３ｅ）。
【０２８３】
５．３．スーパー抗原活性化細胞の刺激
健常ドナーからのＰＢＭＣを、処置前に１６時間、１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）で刺激した。ＣＨＯ細胞またはＰＳＭＡを発現するＣＨＯ細胞を、１０，０００個／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）構築物を添加し、終濃度５０ｎＭおよび４倍希釈シリーズとした。ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣを、１ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢを含む培地に７５，０００個／ウェルで添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。サイトカイン測定のために上清を回収した。ＴＮＦ−αを、製造元の説明書に従ってＣｉｓｂｉｏ  ＨＴＲＦキット（６２ＨＴＮＦＡＰＥＧ）を使用して測定した。ＴＮＦ−αは、ＰＳＭＡを発現する細胞の存在下で、二特異性Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）依存的な用量反応様式で増加した。ＰＳＭＡの非存在下では誘導はみられなかった（図５）。
【０２８４】
実施例６．ＤＵ１４５  ＰＳＭＡ／ｈｕ  ＰＢＭＣ移植ＮＣＧマウスにおけるＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）の効果
雄ＮＣＧマウス（ＮＯＤ−Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｃｄ５２Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６Ｃｄ２２／ＮｊｕＣｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に対し、５０％マトリゲル中１×１０７個のＤＵ１４５  ＰＳＭＡ細胞を右側腹部に皮下注射した。８日目に、ｈＰＢＭＣ（ＨｅｍａＣａｒｅ  ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を、尾静脈を介して移植した。非移植マウスを対照群として使用した。次に、マウスを、腹膜内投与したＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）または対照ＣＤ１３７アゴニスト抗体で処置し、体重、臨床観察、および腫瘍容積を記録した。拘束、飼育、外科手技、食餌および液体の調節、ならびに獣医学的ケアに関してＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの推奨に特別に従い、ＡＡＡＬＡＣによって公認されているＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ（ＣＲ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）において試験を実施した。半減期延長二特異性Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）処置群は、対照群と比較して減少した腫瘍容積を示した（図６）。
【０２８５】
実施例７  二重トランスジェニックヒト化ＦｃＲｎ／ＨＳＡマウスにおける半減期延長分子の単回静脈内投与の薬物動態解析
実験は、ｇｅｎＯｗａｙ（登録商標）によるヒト新生児型Ｆｃ受容体／アルブミンマウスモデルを使用して実施した。この二重ヒト化新生児型Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）／アルブミンマウスモデルは、自己受容体−リガンド相互作用を維持し、ヒトにおける生理学的薬物クリアランスを模倣しており、従って、アルブミン結合小分子および通常の薬物動態を測定および最適化するため、ならびに循環する生物学的製剤およびバイオシミラー薬の半減期を試験および予測するための独特な信頼性の高いツールである（Viuff D, Antunes F, Evans L, Cameron J, Dyrnesli H, Thue Ravn B, Stougaard M, Thiam K, Andersen B, Kjaerulff S, Howard KA. 2016. Generation of a double transgenic humanized neonatal Fc receptor (FcRn)/albumin mouse to study the pharmacokinetics of albumin-linked drugs. J Control Release）。
【０２８６】
ｈＦｃＲｎ／ＨＳＡヒト化マウスは、ＷＴマウスよりも予測可能な「ヒト様」薬物動態の結果を提供する。このモデルは、ＨＳＡ結合性薬剤の薬物動態、分布および毒性のｉｎ  ｖｉｖｏ評価に十分適している。
【０２８７】
薬物動態を試験するためのこれらの実験において、三特異性分子（４．１−６ＧＳ−１．１１３−６ＧＳ−ＶＨ  ＨＳＡ−４ＧＳ）を使用した。
【０２８８】
簡単に説明すると、雄ｇｅｎＯｗａｙ（登録商標）ヒトＨＳＡ／ＦｃＲｎ  Ｔｇマウスに対し、尾静脈を介した２ｍｇ／ｋｇの三特異性（ｎ＝３）の単回静脈内注射によって投与した。血液試料を、投与前、ならびに伏在静脈を介した薬物投与後０．０８３ｈ、１ｈ、８ｈ、２４ｈ、４８ｈ、７２ｈおよび９６ｈに回収した。投与後１６８ｈに、全動物を安楽死させ、血液を回収した。血漿を分離し、アッセイを実施するまで−８０℃で保存した。捕捉としてのビオチン化ヒトＰＳＭＡおよび検出としてのヒトＣＤ１３７Ｄｙｌｉｇｈｔ６５０を使用して、Ｇｙｒｏｌａｂイムノアッセイプラットフォームで血漿試料を分析した。データは、血漿中濃度を得るためのＧｙｒｏｓを使用して分析した。データの薬物動態解析は、ＰＫ  Ｓｏｌｖｅｒ  ２．０を使用して実施した。
【０２８９】
試験の結果は、分子は、ヒトＨＳＡ／ＦｃＲｎ  Ｔｇマウスにおいて２ｍｇ／ｋｇで静脈内投与した場合、半減期１８．１３±０．４１２時間（ｎ＝３）を有することを示している。
【０２９０】
参考文献
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【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図３Ｅ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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