(57)【要約】本発明は、遺伝子組み換えトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９、事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物、植物細胞、種子、植物部分、後代植物、及び商品生産物を提供する。本発明はまた、事象ＭＯＮ９５３７９に特異的なポリヌクレオチドならびに事象ＭＯＮ９５３７９の使用及び検出方法ならびに事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物、植物細胞、種子、植物部分、後代植物、及び商品生産物を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及びそれらの完全相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡ分子。
【請求項２】
請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子であって、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９、すなわち、当該事象を含む種子の代表的なサンプルである種子が、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２５０２７として寄託されている前記事象に由来する、前記組み換えＤＮＡ分子。
【請求項３】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でサンプルのトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡプローブとして機能するのに十分な長さのポリヌクレオチドセグメントを含むＤＮＡ分子であって、前記ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での前記ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションの検出が、前記サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの存在を診断するものである、前記ＤＮＡ分子。
【請求項４】
前記サンプルが、トウモロコシ植物、トウモロコシ植物細胞、トウモロコシ種子、トウモロコシ植物部分、トウモロコシ後代植物、加工トウモロコシ種子、トウモロコシを含む動物飼料、トウモロコシ油、コーンミール、コーンフラワー、コーンフレーク、トウモロコシふすま、トウモロコシ製のパスタ、トウモロコシバイオマス、ならびにトウモロコシ及びトウモロコシ部分を用いて製造される燃料製品を含む、請求項３に記載のＤＮＡ分子。
【請求項５】
第一のＤＮＡ分子及び前記第一のＤＮＡ分子とは異なる第二のＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子の対であって、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの存在を診断するアンプリコンを生成する増幅反応において、前記トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９鋳型ＤＮＡを含む前記サンプルとともに用いられた場合にＤＮＡプライマーとして機能する前記ＤＮＡ分子の対であり、前記アンプリコンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、前記ＤＮＡ分子の対。
【請求項６】
サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの診断となるＤＮＡセグメントの存在を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルを請求項３に記載のＤＮＡ分子と接触させること、
ｂ）前記サンプル及び前記ＤＮＡ分子をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること、ならびに
ｃ）前記サンプル中の前記ＤＮＡへの前記ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションを検出することを含む前記方法であり、
前記検出は、前記サンプル中の前記トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの存在を診断するものである、前記方法。
【請求項７】
サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの診断となるＤＮＡセグメントの存在を検出する方法であって、
ａ）前記サンプルを請求項５に記載のＤＮＡ分子の対と接触させること、
ｂ）ＤＮＡアンプリコンを生成するのに十分な増幅反応を行うこと、及び
ｃ）前記反応物における前記ＤＮＡアンプリコンの存在を検出することを含む前記方法であり、
前記ＤＮＡアンプリコンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む、前記方法。
【請求項８】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチド分子を含むトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、トウモロコシ細胞、またはその部分。
【請求項９】
鱗翅目害虫の食餌に提供した場合、殺虫性である、請求項８に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、トウモロコシ細胞、またはその部分。
【請求項１０】
前記鱗翅目害虫が、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、夜蛾科のガの幼虫（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、南西部のマツマダラメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サトウキビ害虫（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、及びモロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）からなる群から選択される、請求項９に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、トウモロコシ細胞、またはその部分。
【請求項１１】
前記トウモロコシ植物が、前記トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物の任意の世代の後代としてさらに定義される、請求項８に記載のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、トウモロコシ細胞、またはその部分。
【請求項１２】
昆虫の寄生からトウモロコシ植物を保護する方法であって、鱗翅目害虫の食餌に、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物の細胞または組織の殺虫有効量を提供することを含む、前記方法。
【請求項１３】
前記鱗翅目害虫が、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、夜蛾科のガの幼虫（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、南西部のマツマダラメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サトウキビ害虫（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、及びモロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
虫害抵抗性トウモロコシ植物を産生する方法であって、
ａ）２つの異なるトウモロコシ植物のうちの少なくとも一方が遺伝子組み換えトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含む前記２つの異なるトウモロコシ植物を雌雄交配すること、
ｂ）前記交配の後代から種子または組織をサンプリングすること、
ｃ）ステップ（ｂ）からの前記サンプル中でトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの診断となるＤＮＡセグメントの存在を検出してトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含む後代を特定すること、及び
ｄ）トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含む前記後代を選択することを含む、前記方法。
【請求項１５】
配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０、またはそれらの完全相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を検出可能な量含むトウモロコシ種子。
【請求項１６】
請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子を検出可能な量含む無生物トウモロコシ植物材料。
【請求項１７】
請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子を検出可能な量含む微生物。
【請求項１８】
植物細胞である、請求項１７に記載の微生物。
【請求項１９】
請求項１に記載の組み換えＤＮＡ分子を含む商品生産物。
【請求項２０】
さらに、全粒または加工トウモロコシ種子、トウモロコシを含む動物飼料、トウモロコシ油、コーンミール、コーンフラワー、コーンフレーク、トウモロコシふすま、トウモロコシバイオマス、ならびにトウモロコシ及びトウモロコシ部分を用いて製造される燃料製品からなる群から選択される、請求項１９に記載の商品生産物。
【請求項２１】
事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの存在を診断するアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅法で試験する場合に鋳型として機能するＤＮＡを含むトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはそのトウモロコシ種子。
【請求項２２】
事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物またはトウモロコシ種子の接合性を特定する方法であって、
ａ）トウモロコシＤＮＡを含むサンプルを、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８またはＣｒｙ１Ｄａ＿７をコードする毒素コード配列の１つのアンプリコンを生成することが可能なプライマー対と接触させること、
ｂ）トウモロコシＤＮＡを含む前記サンプルを、前記トウモロコシ植物において単一配列及びホモ接合性であることが既知の内部標準のアンプリコンを生成することが可能なプライマー対と接触させること、
ｃ）前記ＤＮＡサンプルを、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８またはＣｒｙ１Ｄａ＿７をコードする前記毒素コード配列の１つに特異的にハイブリダイズする第一のプローブ、及び前記トウモロコシ植物において単一配列及びホモ接合性であることが既知の前記内部標準ゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする第二のプローブを少なくとも含むプローブセットと接触させること、
ｄ）リアルタイムＰＣＲを使用してＤＮＡ増幅反応を行い、前記毒素コード配列及び前記単一配列ホモ接合性内部標準に対応するアンプリコンのサイクル閾値（Ｃｔ値）を特定すること、
ｅ）前記単一配列ホモ接合性内部標準のアンプリコンのＣｔ値と、前記毒素コード配列のアンプリコンのＣｔ値間の差（ΔＣｔ）を計算すること、ならびに
ｆ）接合性を特定することを含む前記方法であり、ΔＣｔ約ゼロ（０）は、挿入された事象ＭＯＮ９５７３９のＴ−ＤＮＡのホモ接合性を示し、ΔＣｔ約一（１）は、挿入された事象ＭＯＮ９５３７９のＴ−ＤＮＡのヘテロ接合性を示す、前記方法。
【請求項２３】
前記プライマー対が、配列番号１８と配列番号１９の組み合わせ、及び配列番号２１と配列番号２２の組み合わせからなる群から選択され、前記プローブが、配列番号２０及び配列番号２３である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記プライマー対が、配列番号１８と配列番号１９の組み合わせ、及び配列番号２４と配列番号２５の組み合わせからなる群から選択され、前記プローブが、配列番号２０及び配列番号２６である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記挿入された事象ＭＯＮ９５３７９のＴ−ＤＮＡのヘテロ接合性を示すΔＣｔ約一（１）が、０．７５〜１．２５の範囲である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物またはトウモロコシ種子の接合性を特定する方法であって、
ａ）トウモロコシＤＮＡを含むサンプルを、事象ＭＯＮ９５３７９の診断となる第一のアンプリコン及び事象ＭＯＮ９５３７９を含まない天然トウモロコシゲノムＤＮＡの診断となる第二のアンプリコンを生成することが可能な少なくとも２つの異なるプライマー対を含むプライマー対のセットと接触させること、
ｂ）核酸増幅反応を前記サンプル及び前記プライマー対のセットで行うこと、
ｃ）前記核酸増幅反応物において、事象ＭＯＮ９５３７９の診断となる前記第一のアンプリコン、もしくは事象ＭＯＮ９５３７９を含まない天然のトウモロコシゲノムＤＮＡの診断となる前記第二のアンプリコンを検出すること、この場合、前記第一のアンプリコンのみの存在は、事象ＭＯＮ９５３７９に対してホモ接合性のトウモロコシ植物もしくはトウモロコシ種子の診断であり、前記第一のアンプリコン及び前記第二のアンプリコンの両方の存在は、事象ＭＯＮ９５３７９に対してヘテロ接合性のトウモロコシ植物もしくはトウモロコシ種子の診断であること、または
ｉ）トウモロコシＤＮＡを含むサンプルを、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも第一のプローブ及び事象ＭＯＮ９５３７９のヘテロ接合性ＤＮＡの挿入によって中断されたトウモロコシゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡにハイブリダイズしない少なくとも第二のプローブを含むプローブセットと接触させること、ならびに
ｉｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で前記プローブセットと前記サンプルをハイブリダイズすること、この場合、前記ハイブリダイゼーション条件下での前記第一のプローブのみのハイブリダイゼーションの検出は、事象ＭＯＮ９５３７９に対してホモ接合性のトウモロコシ植物もしくはトウモロコシ種子の診断であり、前記ハイブリダイゼーション条件下での前記第一のプローブ及び前記第二のプローブの両方のハイブリダイゼーションの検出は、事象ＭＯＮ９５３７９に対してヘテロ接合性のトウモロコシ植物もしくはトウモロコシ種子の診断であることを含む、前記方法。
【請求項２７】
前記プライマー対のセットが、配列番号１５と配列番号１６の組み合わせ、及び配列番号１５と配列番号２７の組み合わせを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記プローブセットが、配列番号１７及び配列番号２８を含む、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１８年７月３０日に出願された米国仮出願第６２／７１１，８１０号の利益を主張する。当該仮出願は、参照することにより全体として本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
ＭＯＮＳ４６３ＷＯ＿ＳＴ２５の名称のファイルに含まれる配列表は、７５キロバイト（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）にて測定）であり、２０１９年７月２６日に作成され、電子申請により本明細書とともに提出され、参照することにより組み込まれる。
【０００３】
本発明は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に存在する及び／またはそれから単離される組み換えＤＮＡ分子に関する。本発明はまた、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含む遺伝子組み換えトウモロコシ植物、植物部分、及び種子、細胞、及び農産物、ならびにそれらの使用方法ならびにトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の存在の検出方法に関する。トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含む遺伝子組み換えトウモロコシ植物、部分、種子及び細胞は、鱗翅目科の昆虫の寄生に対して抵抗性を示す。
【背景技術】
【０００４】
トウモロコシ（ｚｅａ  ｍａｙｓ）は重要な作物であり、世界の多くの地域の主な食糧源である。農業形質及び産物の品質の改善のため、バイオテクノロジー法がトウモロコシに適用されている。１つのかかる農業形質は、虫害抵抗性であり、これは、トウモロコシ植物のゲノムに挿入される異種昆虫毒素、別名導入遺伝子の発現を介して達成される。
【０００５】
遺伝子組み換え植物、植物部分、種子または細胞におけるかかる導入遺伝子の発現は、多くの様々な要因、すなわち、導入遺伝子発現を駆動するカセットに使用される要素及びカセット内のそれら要素の相互作用等によって影響され得る。これは、各発現カセットが別の形質を与える導入遺伝子を有する２つ以上の発現カセットを含む遺伝子組み換え挿入ではさらに複雑であり、多重遺伝子遺伝子組み換え事象としても知られる。商業的に有用な多重遺伝子遺伝子組み換え事象は、当該遺伝子組み換え挿入における導入遺伝子の各々が、各形質に必要な方法で発現することを必要とする。これを達成するために、個々の発現カセットを最初に設計して植物で試験し、発現に起因する負の表現型をもたらさずに最高の昆虫活性を示す発現カセットを各形質について選択する。次に、１つの形質に関して選択した発現カセットを、他の形質に関して選択した発現カセットと組み合わせて単一の構築物にする。複数の構築物を、異なる方向を使用して設計して最良の抵抗性を与え、かつ負の表現型または負の農学、例えば、収量の低下の発生を防止する。該構築物を試験し、すべての発現カセットが一緒に十分に機能し、各導入遺伝子が適切に発現されることを確認する。次に、該選択した組み合わせ及び発現カセットの方向を単一の遺伝子組み換え挿入物として使用して数百の遺伝子組み換え事象を生成する。各事象は、当該構築物を異なる遺伝子位置へランダムに挿入した結果である。
【０００６】
各遺伝子組み換え事象は、その分子プロファイル及び染色体への挿入点が固有である。事象の創出に関する変動性のため、各固有の事象は、商業用途用に優れた事象を選択するため、複数世代の植物にわたって分析する、すなわち、各ステップで、分子特性化、タンパク質発現の有効性、及び農学を評価する必要がある。遺伝子組み換え植物、植物部分、種子または細胞における事象の性能、ひいてはその有効性は、当該導入遺伝子挿入の遺伝子位置によって影響され得る。特に、該事象の有効性は、組み込み部位またはクロマチン構造に対するシス及び／またはトランス因子によって影響を受け得る。事象は、同じ遺伝子組み換え挿入を有することができるにもかかわらず、異なる導入遺伝子発現レベルならびに組織及び発達段階にわたる性能を様々な生殖質において、または特定の生育条件下で有する場合がある。また、いくつかの事象間に望ましくない表現型が存在する場合もあれば、農学的な違いがある場合もある。従って、所望の形質に対して優れた特性を有し、当該事象を商業目的に適したものにするのに必要とされる最適な表現型及び農業特性を有する事象を選択するため、個々の植物の形質転換事象の多数を生成及び分析する必要がある。さらに、商業用途用の多重遺伝子事象の創出には、厳密な分子特性化、温室試験、及び複数年にわたる圃場試験が複数の場所で、及び様々な条件下で必要なため、広範な農学、表現型、及び分子データが収集され得る。商業目的に有用な事象を選択するため、得られたデータをその後科学者や農学者が分析する必要がある。選択後、かかる事象は次に、植物育種法を用いて、複数の虫害抵抗形質を有する単一の遺伝子座として、特定の地域の生育条件に適切に適応する新たな生殖質に遺伝子移入され、本発明の事象によって付与される形質とは異なる形質を付与する他の異なる事象とともに繁殖させることによって、スタック／組み合わせられ得る。
【発明の概要】
【０００７】
本発明は、トウモロコシの鱗翅目害虫に対する殺虫制御をもたらす新規な遺伝子組み換えトウモロコシ事象であるＭＯＮ９５３７９を提供する。本発明はまた、ＭＯＮ９５３７９を含む遺伝子組み換え植物、植物細胞、種子、植物部分、及び商品生産物を提供する。別の実施形態では、本発明は、事象ＭＯＮ９５３７９に、ならびに事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物、植物細胞、種子、植物部分、後代植物、及び商品生産物に特異的なポリヌクレオチドを提供する。さらに別の実施形態では、事象ＭＯＮ９５３７９に関連する方法を提供する。
【０００８】
従って、１つの態様では、本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、及びそれらの完全相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む組み換えＤＮＡ分子を提供する。
【０００９】
１つの実施形態では、該組み換えＤＮＡ分子は、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２５０２７として寄託されている当該事象を含む種子のサンプルのトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に由来する。
【００１０】
本発明の別の態様は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でサンプルのトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡと特異的にハイブリダイズするＤＮＡプローブとして機能するのに十分な長さのポリヌクレオチドセグメントを含むＤＮＡ分子を提供し、この場合、該ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での該ＤＮＡ分子のハイブリダイゼーションの検出は、該サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの存在を診断するものである。ある特定の実施形態では、該サンプルは、トウモロコシ植物、トウモロコシ植物細胞、トウモロコシ種子、トウモロコシ植物部分、トウモロコシ後代植物、加工トウモロコシ種子、トウモロコシを含む動物飼料、トウモロコシ油、コーンミール、コーンフラワー、コーンフレーク、トウモロコシふすま、トウモロコシ製のパスタ、トウモロコシバイオマス、ならびにトウモロコシ及びトウモロコシ部分を用いて製造される燃料製品を含む。
【００１１】
本発明のさらに別の態様は、第一のＤＮＡ分子及び該第一のＤＮＡ分子とは異なる第二のＤＮＡ分子を含むＤＮＡ分子の対を提供し、これは、当該サンプル中の当該トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの存在を診断するアンプリコンを生成する増幅反応において、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９鋳型ＤＮＡを含むサンプルとともに用いられた場合にＤＮＡプライマーとして機能し、この場合、該アンプリコンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１２】
本発明の別の実施形態は、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの診断となるＤＮＡセグメントの存在を検出する方法であり、該方法は、ａ）プローブとして機能し、ストリンジェントな条件下でトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９と特異的にハイブリダイズするＤＮＡ分子に該サンプルを接触させること、ｂ）該サンプル及び該ＤＮＡ分子をストリンジェントなハイブリダイゼーション条件に供すること、ならびにｃ）該ＤＮＡ分子の該サンプル中の該ＤＮＡへのハイブリダイゼーションを検出することを含み、該検出が、該サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの存在を診断するものである。
【００１３】
本発明のさらに別の実施形態は、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの診断となるＤＮＡセグメントの存在を検出する方法であり、該方法は、ａ）本発明のＤＮＡ分子の対に該サンプルを接触させること、ｂ）ＤＮＡアンプリコンを生成するのに十分な増幅反応を行うこと、及びｃ）該反応物における該ＤＮＡアンプリコンの存在を検出することを含み、この場合、該ＤＮＡアンプリコンは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む。
【００１４】
本発明の別の実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む組み換えポリヌクレオチド分子を含むトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、トウモロコシ細胞、またはその部分である。このトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、トウモロコシ細胞、またはその部分は、鱗翅目害虫の食餌に提供した場合、殺虫性である。鱗翅目害虫には、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、夜蛾科のガの幼虫（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、南西部のマツマダラメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サトウキビ害虫（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、及びモロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）が含まれ得る。さらに、該トウモロコシ植物は、該トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物の任意の世代の後代としてさらに定義することができる。
【００１５】
本発明のさらに別の実施形態は、昆虫の寄生からトウモロコシ植物を保護する方法であり、該方法は、鱗翅目害虫の食餌に、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物の細胞または組織の殺虫有効量を提供することを含む。この場合もやはり、企図される鱗翅目害虫には、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、夜蛾科のガの幼虫（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、南西部のマツマダラメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サトウキビ害虫（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、及びモロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）が含まれる。
【００１６】
本発明の別の実施形態は、以下を含む虫害抵抗性トウモロコシ植物を産生する方法である：ａ）当該２つの異なるトウモロコシ植物のうちの少なくとも一方が遺伝子組み換えトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含む２つの異なるトウモロコシ植物を雌雄交配すること、ｂ）ステップ（ａ）の後代から種子または組織をサンプリングすること、ｃ）ステップ（ｂ）からの該サンプル中でトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含む後代を検出すること、及びｄ）トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含む当該後代を選択すること。
【００１７】
本発明のさらなる実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０、またはそれらの完全相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を検出可能な量含むトウモロコシ種子、無生物トウモロコシ植物材料、または微生物である。
【００１８】
本発明のさらに別の実施形態は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０、またはそれらの完全相補体からなる群から選択されるヌクレオチド配列を含む商品生産物である。企図される商品生産物としては、全粒または加工トウモロコシ種子、トウモロコシを含む動物飼料、トウモロコシ油、コーンミール、コーンフラワー、コーンフレーク、トウモロコシふすま、トウモロコシバイオマス、ならびにトウモロコシ及びトウモロコシ部分を用いて製造される燃料製品が挙げられる。
【００１９】
本発明の別の実施形態は、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの存在を診断するアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅法で試験する場合に鋳型として機能するＤＮＡを含むトウモロコシ植物、トウモロコシ植物部分、またはそのトウモロコシ種子である。
【００２０】
本発明のさらに別の実施形態は、事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物またはトウモロコシ種子の接合性を特定する以下を含む方法である：ａ）トウモロコシＤＮＡを含むサンプルを、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８またはＣｒｙ１Ｄａ＿７をコードする毒素コード配列の１つのアンプリコンを生成することが可能なプライマー対と接触させること、ｂ）トウモロコシＤＮＡを含む該サンプルを、該トウモロコシ植物において単一配列及びホモ接合性であることが既知の内部標準のアンプリコンを生成することが可能なプライマー対と接触させること、ｃ）該ＤＮＡサンプルを、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８またはＣｒｙ１Ｄａ＿７をコードする毒素コード配列の１つに特異的にハイブリダイズする第一のプローブ、及び該トウモロコシ植物において単一配列及びホモ接合性であることが既知の内部標準ゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする第二のプローブを少なくとも含むプローブセットと接触させること、ｄ）リアルタイムＰＣＲを使用してＤＮＡ増幅反応を行い、該毒素コード配列及び該単一配列ホモ接合性内部標準に対応するアンプリコンのサイクル閾値（Ｃｔ値）を特定すること、ｅ）該単一配列ホモ接合性内部標準のアンプリコンのＣｔ値と、該毒素コード配列のアンプリコンのＣｔ値間の差（ΔＣｔ）を計算すること、ならびにｆ）接合性を特定すること。この場合、ΔＣｔ約ゼロ（０）は、挿入された事象ＭＯＮ９５７３９のＴ−ＤＮＡのホモ接合性を示し、ΔＣｔ約一（１）は、挿入された事象ＭＯＮ９５３７９のＴ−ＤＮＡのヘテロ接合性を示す。本方法のある特定の実施形態では、該プライマー対は、配列番号１８と配列番号１９の組み合わせ、及び配列番号２１と配列番号２２の組み合わせからなる群から選択され、該プローブは、配列番号２０及び配列番号２３である。別の実施形態では、該プライマー対は、配列番号１８と配列番号１９の組み合わせ、及び配列番号２４と配列番号２５の組み合わせからなる群から選択され、該プローブは配列番号２０及び配列番号２６である。本発明のさらに別の実施形態では、挿入された事象ＭＯＮ９５３７９のＴ−ＤＮＡのヘテロ接合性を示すΔＣｔ約一（１）は、０．７５〜１．２５の範囲である。
【００２１】
本発明のさらなる実施形態は、事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物またはトウモロコシ種子の接合性を特定する以下を含む方法である：ａ）トウモロコシＤＮＡを含むサンプルを、事象ＭＯＮ９５３７９の診断となる第一のアンプリコン及び事象ＭＯＮ９５３７９を含まない天然トウモロコシゲノムＤＮＡの診断となる第二のアンプリコンを生成することが可能な少なくとも２つの異なるプライマー対を含むプライマー対のセットと接触させること、ｉ）核酸増幅反応を該サンプル及び該プライマー対のセットで行うこと、ｉｉ）該核酸増幅反応物において、事象ＭＯＮ９５３７９の診断となる第一のアンプリコン、もしくは事象ＭＯＮ９５３７９を含まない天然のトウモロコシゲノムＤＮＡの診断となる第二のアンプリコンを検出すること、この場合、該第一のアンプリコンのみの存在は、事象ＭＯＮ９５３７９に対してホモ接合性のトウモロコシ植物もしくはトウモロコシ種子の診断であり、該第一のアンプリコン及び該第二のアンプリコンの両方の存在は、事象ＭＯＮ９５３７９に対してヘテロ接合性のトウモロコシ植物もしくはトウモロコシ種子の診断であること、またはｂ）トウモロコシＤＮＡを含むサンプルを、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも第一のプローブ及び事象ＭＯＮ９５３７９のヘテロ接合性ＤＮＡの挿入によって中断されたトウモロコシゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡにハイブリダイズしない少なくとも第二のプローブを含むプローブセットと接触させること、ｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該プローブセットと該サンプルをハイブリダイズすること、この場合、該ハイブリダイゼーション条件下での該第一のプローブのみのハイブリダイゼーションの検出は、事象ＭＯＮ９５３７９に対してホモ接合性のトウモロコシ植物もしくはトウモロコシ種子の診断であり、該ハイブリダイゼーション条件下での該第一のプローブ及び該第二のプローブの両方のハイブリダイゼーションの検出は、事象ＭＯＮ９５３７９に対してヘテロ接合性のトウモロコシ植物もしくはトウモロコシ種子の診断である。本方法の１つの実施形態では、該プライマー対のセットは、配列番号１５と配列番号１６の組み合わせ、及び配列番号１５と配列番号２７の組み合わせを含む。本方法の別の実施形態では、該プローブセットは、配列番号１７及び配列番号２８を含む。
【００２２】
本発明の前述の及び他の態様は、以下の詳細な説明からより明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の配列を表す。水平方向のライン及びボックスは、配列番号１０（［１０］）に対する配列番号１（［１］）、配列番号２（［２］）、配列番号３（［３］）、配列番号４（［４］）、配列番号５（［５］）、配列番号６（［６］）、配列番号７（［７］）、配列番号８（［８］）、配列番号９（［９］）、配列番号１１（［１１］）、及び配列番号１２（［１２］）の位置に対応する。ＳＱ５１２１９（配列番号１５）（［１５］）、ＳＱ２１５２４（配列番号１６）（［１６］）、ＳＱ５０９９８（配列番号２１）（［２１］）、ＳＱ５０９９７（配列番号２２）（［２２］）、ＳＱ５０４８５（配列番号２４）（［２４］）及びＳＱ５０４８４（配列番号２５）（［２５］）にラベルを付ける水平方向の矢印は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を検出するために使用することができるプライマーのサブセットのおおよその位置を表す。ＰＢ１０２６９（配列番号１７）（［１７］）、ＰＢ５０３４０（配列番号２３）（［２３］）、ＰＢ５０１３８（配列番号２６）（［２６］）にラベルを付ける水平方向の矢印は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の検出に使用することができるＤＮＡプローブのおおよその位置を表す。「Ｅ」はエンハンサー要素を表し、「Ｐ」はプロモーター要素を表し、「Ｌ」はリーダー（５’ＵＴＲ）要素を表し、「Ｉ」はイントロン要素を表し、「Ｔ」は３’ＵＴＲを表し、「Ｃｒｙ１Ｂ．８６８」はＣｒｙ１Ｂ．８６８コード配列要素を表し、「Ｃｒｙ１Ｄａ＿７」はＣｒｙ１Ｄａ＿７コード配列要素を表し、「ＬｏｘＰ」は、Ｃｒｅリコンビナーゼマーカー切除が生じる部位を表し、マーカー切除後に、後方に２つのＬｏｘＰ部位の１つを残しており、「ＬＢ」はＴ−ＤＮＡの左縁を表す。
【図２】事象ＭＯＮ９５３７９を形成するための組み込み前、組み込み後、及びＣｒｅ切除後のＴ−ＤＮＡカセットの図表示である。上の水平方向のボックスは、事象ＭＯＮ９５３７９を形質転換するために使用したプラスミドベクターにおけるＴ−ＤＮＡカセットを表し、配列番号１３（［１３］）（「組み込み前のＴ−ＤＮＡ」）として示す。［１３］の下の水平方向の矢印は、２つの導入遺伝子カセットに含まれる個々の遺伝要素を表す。「ＬＢ」はＴ−ＤＮＡ左縁要素を表し、「Ｅ」はエンハンサー要素を表し、「Ｐ」はプロモーター要素を表し、「Ｌ」はリーダー（５’ＵＴＲ）要素を表し、「Ｉ」はイントロン要素を表し、「Ｔ」は３’ＵＴＲを表し、「Ｃｒｙ１Ｂ．８６８」はＣｒｙ１Ｂ．８６８コード配列要素を表し、「Ｃｒｙ１Ｄａ＿７」はＣｒｙ１Ｄａ＿７コード配列要素を表し、「ＣＰ４」はＣＰ４選択可能なマーカーを表し、「ＴＳ」は標的化配列を表し、「ＬｏｘＰ」は、Ｃｒｅリコンビナーゼマーカー切除が生じる部位を表し、「ＲＢ」はＴ−ＤＮＡの右縁要素を表す。中央の水平方向のボックス、「組み込み後の挿入Ｔ−ＤＮＡ」は、形質転換後にトウモロコシゲノムに組み込まれたＴ−ＤＮＡカセットを表し、ここでは、組み込みの過程でＴ−ＤＮＡの右縁（ＲＢ）が失われた。下の水平方向のボックス、「Ｃｒｅ切除後の挿入Ｔ−ＤＮＡ」は、ＣＰ４選択可能マーカーカセットが切除された後の組み込みＴ−ＤＮＡカセットを表し、後方に２つのＬｏｘＰ部位の１つ及びＬＢ領域を残している。
【図３】マーカーフリーのトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を生成するための育種プロセスの図表示である。Ｒ０世代の事象（「形質転換体」）は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の生成に使用される二元形質転換ベクターによる最初の形質転換から得られるものである。その後の「Ｒ」世代（Ｒ１、及びＲ２）は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９をもたらした最初のＲ０形質転換体に由来する植物の自家受粉を通して産生される後続世代を表す。Ｔ−ＤＮＡ挿入に対してホモ接合性であるＲ２形質転換体を、Ｃｒｅリコンビナーゼの発現のための導入遺伝子カセットを含むエリート遺伝子組み換えトウモロコシ系統と他家受粉してＦ１世代を得るが、該後代の多くはＣｒｅリコンビナーゼ切除によってＣＰ４選択可能なマーカーカセットを失っている。半接合性のＴ−ＤＮＡ陽性ＣＰ４陰性植物を選択して自家受粉し、Ｆ２世代を得る。ＣＰ４マーカーを有さず、Ｃｒｅリコンビナーゼ導入遺伝子カセットを欠く挿入Ｔ−ＤＮＡ対立遺伝子に対してホモ接合性のＦ２植物を選択し、自家受粉させ、Ｆ３世代を生じさせる。Ｆ３世代植物を自家受粉させ、純粋系統のＦ４ゴールドスタンダード種子を生じさせる。
【００２４】
配列の簡単な説明
配列番号１は、トウモロコシゲノムＤＮＡの５’結合領域及び組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットを表す５０ヌクレオチドの配列である。配列番号１は、配列番号１０内でヌクレオチド位置８３８〜８８７に見出される。
【００２５】
配列番号２は、組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットの３’結合領域及びトウモロコシゲノムＤＮＡを表す５０ヌクレオチドの配列である。配列番号２は、配列番号１０内でヌクレオチド位置１４，１５６〜１４，２０５に見出される。
【００２６】
配列番号３は、トウモロコシゲノムＤＮＡの５’結合領域及び組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットを表す１００ヌクレオチドの配列である。配列番号３は、配列番号１０内でヌクレオチド位置８１３〜９１２に見出される。
【００２７】
配列番号４は、組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットの３’結合領域及びトウモロコシゲノムＤＮＡを表す１００ヌクレオチドの配列である。配列番号４は、配列番号１０内でヌクレオチド位置１４，１３１〜１４，２３０に見出される。
【００２８】
配列番号５は、トウモロコシゲノムＤＮＡの５’結合領域及び組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットを表す２００ヌクレオチドの配列である。配列番号５は、配列番号１０内でヌクレオチド位置７６３〜９６２に見出される。
【００２９】
配列番号６は、組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットの３’結合領域及びトウモロコシゲノムＤＮＡを表す２００ヌクレオチドの配列である。配列番号６は、配列番号１０内でヌクレオチド位置１４，０８１〜１４，２８０に見出される。
【００３０】
配列番号７は、トウモロコシゲノムＤＮＡの５’結合領域及び組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットを表す１，１６０ヌクレオチドの配列である。配列番号７は、配列番号１０内でヌクレオチド位置１〜１，１６０に見出される。
【００３１】
配列番号８は、組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットの３’結合領域及びトウモロコシゲノムＤＮＡを表す１，１７８ヌクレオチドの配列である。配列番号８は、配列番号１０内でヌクレオチド位置１４，０３９〜１５，２１６に見出される。
【００３２】
配列番号９は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の遺伝子組み換え挿入Ｔ−ＤＮＡに対応する１３，３１８ヌクレオチドの配列である。
【００３３】
配列番号１０は、１５，２１６ヌクレオチドの配列であり、５’ゲノム隣接ＤＮＡヌクレオチド配列、事象ＭＯＮ９５３７９における挿入Ｔ−ＤＮＡヌクレオチド配列、及び３’ゲノム隣接ＤＮＡヌクレオチド配列のコンティグヌクレオチド配列に対応し、配列番号１１（ヌクレオチド１〜８６２）、配列番号９（ヌクレオチド８６３〜１４，１８０）、及び配列番号１２（ヌクレオチド１４，１８１〜１５，２１６）を含む。
【００３４】
配列番号１１は、挿入Ｔ−ＤＮＡまでの５’隣接トウモロコシゲノムＤＮＡを表す８６２ヌクレオチドの配列である。配列番号１１は、配列番号１０内でヌクレオチド位置１〜８６２に見出される。
【００３５】
配列番号１２は、挿入Ｔ−ＤＮＡ後の３’隣接トウモロコシゲノムＤＮＡを表す１，０３６ヌクレオチドの配列である。配列番号１２は、配列番号１０内でヌクレオチド位置１４，１８１〜１５，２１６に見出される。
【００３６】
配列番号１３は、１８，３７６ヌクレオチドの配列であり、トウモロコシを形質転換してトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を生成するのに使用される二元プラスミド形質転換ベクターに含まれる導入遺伝子カセットを表す。
【００３７】
配列番号１４は、Ｃｒｅを介した切除及び組み換えに使用されるＬｏｘＰ部位を表す３５ヌクレオチドの配列である。マーカー切除後に残存するＬｏｘＰ部位は、配列番号１０内でヌクレオチド位置１，０８０〜１，１１４に見出すことができる。
【００３８】
配列番号１５は、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを特定するために使用されるＳＱ５１２１９と呼ばれる熱増幅プライマーに対応する２０ヌクレオチドの配列であり、配列番号１０の位置８３３〜８５２に対応するヌクレオチド配列と同一である。
【００３９】
配列番号１６は、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを特定するために使用されるＳＱ２１５２４と呼ばれる熱増幅プライマーに対応する３０ヌクレオチドの配列であり、配列番号１０の位置９０５〜９３４に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。
【００４０】
配列番号１７は、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを特定するために使用されるＰＢ１０２６９と呼ばれるプローブに対応する１６ヌクレオチドの配列であり、配列番号１０の位置８８６〜９０１に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。
【００４１】
配列番号１８は、該事象及びＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイの内部対象として使用されるＳＱ２０２２２と呼ばれる熱増幅プライマーに対応する２４ヌクレオチドの配列であり、トウモロコシゲノムの領域にハイブリダイズする。
【００４２】
配列番号１９は、該事象及びＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイの内部対照として使用されるＳＱ２０２２１と呼ばれる熱増幅プライマーに対応する２８ヌクレオチドの配列であり、トウモロコシゲノムの領域にハイブリダイズする。
【００４３】
配列番号２０は、該事象及びＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイの内部対象をとして使用されるＰＢ５０２３７と呼ばれるプローブに対応する２９ヌクレオチドの配列であり、トウモロコシゲノムの領域にハイブリダイズする。
【００４４】
配列番号２１は、事象ＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイに使用されるＳＱ５０９９８と呼ばれる熱増幅プライマーに対応する２０ヌクレオチドの配列であり、配列番号１０内のＣｒｙ１Ｂ．８６８のコード配列にハイブリダイズし、配列番号１０の位置２，８０９〜２，８２８に対応するヌクレオチド配列と同一である。
【００４５】
配列番号２２は、事象ＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイに使用されるＳＱ５０９９７と呼ばれる熱増幅プライマーに対応する２０ヌクレオチドの配列であり、配列番号１０内のＣｒｙ１Ｂ．８６８のコード配列にハイブリダイズし、配列番号１０の位置２，８５２〜２，８７１に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。
【００４６】
配列番号２３は、事象ＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイに使用されるＰＢ５０３４０と呼ばれるプローブに対応する１８ヌクレオチドの配列であり、配列番号１０内のＣｒｙ１Ｂ．８６８のコード配列にハイブリダイズし、配列番号１０の位置２，８３３〜２，８５０に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。
【００４７】
配列番号２４は、事象ＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイに使用されるＳＱ５０４８５と呼ばれる熱増幅プライマーに対応する１９ヌクレオチドの配列であり、配列番号１０内のＣｒｙ１Ｄａ＿７のコード配列にハイブリダイズし、配列番号１０の位置１２，８２０〜１２，８３８に対応するヌクレオチド配列と同一である。
【００４８】
配列番号２５は、事象ＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイに使用されるＳＱ５０４８４と呼ばれる熱増幅プライマーに対応する１８ヌクレオチドの配列であり、配列番号１０内のＣｒｙ１Ｄａ＿７のコード配列にハイブリダイズし、配列番号１０の位置１２，８５５〜１２，８７２に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。
【００４９】
配列番号２６は、事象ＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイに使用されるＰＢ５０１３８と呼ばれるプローブに対応する１４ヌクレオチドの配列であり、配列番号１０内のＣｒｙ１Ｄａ＿７のコード配列にハイブリダイズし、配列番号１０の位置１２，８４０〜１２，８５３に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。
【００５０】
配列番号２７は、事象ＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイに使用されるＰＮＥＧＤＮＡと呼ばれる熱増幅プライマーに対応する２１ヌクレオチドの配列であり、事象ＭＯＮ９５３７９を生成するために使用されたＴ−ＤＮＡがトウモロコシゲノムに挿入された際に削除されたトウモロコシゲノムＤＮＡの領域にハイブリダイズする。プライマーＳＱ５１２１９とＰＮＥＧＤＮＡの組み合わせに由来するアンプリコンは、事象ＭＯＮ９５３７９が挿入されたＴ−ＤＮＡを欠く野生型対立遺伝子の診断である。
【００５１】
配列番号２８は、事象ＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイに使用されるＰＲＢＮＥＧＤＮＡと呼ばれるプローブに対応する１４ヌクレオチドの配列であり、事象ＭＯＮ９５３７９を生成するために使用されたＴ−ＤＮＡがトウモロコシゲノムに挿入された際に削除されたトウモロコシゲノムＤＮＡの領域にハイブリダイズする。
【発明を実施するための形態】
【００５２】
本発明は、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７の発現によるトウモロコシの鱗翅目害虫に対する殺虫制御をもたらす遺伝子組み換えトウモロコシ事象であるＭＯＮ９５３７９を提供する。具体的には、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９におけるＣｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７の昆虫阻害タンパク質の発現は、鱗翅目害虫ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、夜蛾科のガの幼虫（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、南西部のマツマダラメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サトウキビ害虫（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、及びモロコシマダラメイガ（Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）に対する抵抗性を与える。事象ＭＯＮ９５３７９は、化学殺虫剤が多くの場合これら昆虫の適切な防除をもたらさないことから、または生育期に複数回の散布を必要とし、環境への化学殺虫剤の投入を増加させ、トウモロコシ生産のコストを増大させることから、トウモロコシ市場におけるこれら昆虫の防除の大きなニーズを満たす。
【００５３】
事象ＭＯＮ  ９５３７９への言及は、事象ＭＯＮ９５３７９への言及と同等であることを理解されたい。それらは同義であり、同じ遺伝子組み換えトウモロコシ事象を表す。
【００５４】
植物形質転換技術は、外来ＤＮＡ（遺伝子組み換えＤＮＡとしても知られる）を細胞のゲノムの染色体にランダムに挿入し、「遺伝子組み換え」または「組み換え」細胞とも呼ばれる遺伝子操作された細胞を生成するために使用される。この技術を使用して、多くの個々の細胞が形質転換され、各々が該外来ＤＮＡの該ゲノムへのランダムな挿入に起因する固有の「遺伝子組み換え事象」または「事象」を生じる。遺伝子組み換え植物はその後、個々の遺伝子組み換え細胞から再生される。これにより、そのゲノムの安定な部分として固有に挿入された遺伝子組み換え事象を含む遺伝子組み換え植物の全細胞が得られる。その後この遺伝子組み換え植物を使用して、各々が固有の遺伝子組み換え事象を含む後代植物を産生することができる。
【００５５】
トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９は、単一のＴ−ＤＮＡ二元系でのトウモロコシ未熟胚のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換プロセスによって生成された。この系では、単一のＴ−ＤＮＡを備えた１つの二元プラスミドベクターを使用するＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株が使用された。該Ｔ−ＤＮＡ構築物は、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７をコードする昆虫毒素コード配列の発現用の２つの導入遺伝子カセット、ならびにグリホサート選択を用いた形質転換トウモロコシ細胞の選択に使用される導入遺伝子カセット（ＣＰ４）を含んでいた。該Ｔ−ＤＮＡ構築物は配列番号１３であり、図２（「組み込み前のＴ−ＤＮＡ」）に示されている。組み込みの過程で、図２（「組み込み後の挿入Ｔ−ＤＮＡ」）に示す通り、Ｔ−ＤＮＡの右縁が失われた。該グリホサート選択カセットは、両側に腸内細菌ファージＰ１に由来するＣｒｅリコンビナーゼによって認識されるＬｏｘＰ認識部位が隣接していた（Ｌａｒｒｙ  Ｇｉｌｂｅｒｔｓｏｎ（２００３）Ｃｒｅ−ｌｏｘ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ：Ｃｒｅ−ａｃｔｉｖｅ  ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  ｐｌａｎｔ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２１：１２，５５０−５５５）。
【００５６】
本明細書に具体的に記載するように、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９は、以下の複雑な研究及び開発のプロセスによって生成された：（１）数百のプラスミドベクター構築物、すなわち、殺虫タンパク質のコード配列、転写調節要素のコード配列、ならびに該構築物内のカセットの数及び方向に関して異なる構築物を開発し、トウモロコシ細胞に形質転換して数千の事象を創出し、これらを試験及び分析し、事象ＭＯＮ９５３７９を生成するために使用される構築物の選択を与え、（２）数百のトウモロコシ細胞を、事象ＭＯＮ９５３７９を生成するために使用される構築物で形質転換し、各植物が固有の遺伝子組み換え事象を含む遺伝子組み換え植物の集団を創出し、該事象を再生及び試験し、（３）様々な遺伝的背景における分子特性、有効性、タンパク質発現、及び農学特性の試験及び分析を含め、厳密な複数年の事象選択プロセス後に、最終的な事象ＭＯＮ９５３７９を選択し、（４）トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９内のグリホサート選択カセットを、インビボＣｒｅ切除を介して除去し、「マーカーフリー」の最終的な事象ＭＯＮ９５３７９を創出した。このようにして、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９が生成され、広範な農学目的に有用な固有の優れた事象として選択された。
【００５７】
トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９のゲノムに挿入されたプラスミドＤＮＡは、詳細な分子解析によって特徴づけられた。この分析には、挿入数（トウモロコシゲノム内の組み込み部位の数）、ゲノム挿入位置（挿入が生じたトウモロコシゲノムの特定の部位）、コピー数（１つの遺伝子座内のＴ−ＤＮＡのコピー数）、及び遺伝子組み換え挿入ＤＮＡの完全性が含まれていた。この詳細な分子解析により、組み込まれたＣｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７発現カセットを含むＴ−ＤＮＡは、グリホサート（ＣＰ４）選択カセットの組み込み及びＣｒｅ切除後にインタクトのままであることが示された。本明細書で使用される、「発現カセット」または「カセット」は、形質転換細胞によって発現される異なる要素の組み合わせを含む組み換えＤＮＡ分子である。表１は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に対応するＤＮＡ配列である配列番号１０に含まれる要素のリストを示す。
表１．トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の説明
【表１】
2021532744.tif 000002
2021532744.tif 000003
【００５８】
トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９は、トウモロコシゲノムの単一の遺伝子座への挿入物として特徴づけられ、トウモロコシゲノムに天然に出現することも他の遺伝子組み換えトウモロコシ事象に出現することも知られていない、すなわち、事象ＭＯＮ９５３７９に固有の挿入ＤＮＡの一部及びトウモロコシゲノムＤＮＡにわたる２つの新たな遺伝子座または結合配列（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８に記載の配列）をもたらす。これらの結合配列は、トウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子、及びトウモロコシ植物またはトウモロコシ植物製品、例えば、トウモロコシ商品生産物における事象ＭＯＮ９５３７９の存在を検出するのに有用である。事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ細胞、トウモロコシ種子、トウモロコシ植物部分、またはトウモロコシ植物組織を含む、または含むと疑われる生体サンプル中のこれらの様々な結合セグメントの存在の特定に使用するために開発されたＤＮＡ分子プローブ及びプライマー対を本明細書に記載する。
【００５９】
サンプルとは、実質的に純粋なトウモロコシＤＮＡである組成物、またはトウモロコシＤＮＡを含む組成物のいずれかを指すことを意図している。いずれの場合も、該サンプルは生体サンプルであり、すなわち、それは、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９のゲノムから直接または間接的に得られるまたはそれに由来するＤＮＡを含むがこれに限定されない生体材料を含む。「直接」とは、トウモロコシ細胞を破砕することによって（または破砕されたトウモロコシ細胞を含むトウモロコシのサンプルを得ることによって）及び検出の目的で該ゲノムＤＮＡを曝露することによって、トウモロコシゲノムからＤＮＡを直接得る当業者の能力を指す。「間接的に」とは、標的または特定の参照ＤＮＡ、すなわち、特定のサンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９の存在を診断するものとして本明細書に記載する新規かつ固有の結合セグメントを、トウモロコシ細胞の破砕を介して直接入手すること、または破砕されたトウモロコシ細胞を含むトウモロコシサンプルを得ること以外の方法で得る当業者の能力を指す。かかる間接的手段としては、当該標的配列に特異的に結合するように設計された特定のプローブによって標的化されたＤＮＡ配列を含むＤＮＡセグメントの増幅、あるいは測定すること及び特徴づけることができる、すなわち、いくつかの効率の良いマトリックス、例えば、アガロースもしくはアクリルアミドゲル等を介したＤＮＡの他のセグメントからの分離によって測定すること、または当該アンプリコンの直接配列分析、もしくは該アンプリコンをベクターにクローニングし、かかるベクター内に存在する挿入アンプリコンの直接の配列決定によって特徴づけることができるＤＮＡセグメントの増幅が挙げられるがこれらに限定されない。
【００６０】
詳細な分子解析により、事象ＭＯＮ９５３７９は、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７発現カセットの各々の１つのコピーを備えた単一のＴ−ＤＮＡ挿入物を含むことが実証された。事象ＭＯＮ９５３７９において、該形質転換構築物からは、トウモロコシゲノムへの植物形質転換プラスミドからの遺伝子組み換えＤＮＡトランスファーに使用されたＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの左縁領域の部分以外のさらなる要素は特定されなかった。最後に、サンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９の存在を診断する特定のアンプリコンを生成する熱増幅及びＤＮＡ配列分析を行い、任意に割り当てられた５’及び３’の挿入物−植物ゲノム結合部を特定し、当該挿入物内の該要素の構成を確認し、挿入された遺伝子組み換えＤＮＡ（配列番号９）の完全ＤＮＡ配列を決定した。配列番号１１は、配列番号９として示される挿入Ｔ−ＤＮＡ配列に隣接する八百六十二（８６２）塩基対（ｂｐ）の５’ＬＨ２４４トウモロコシゲノムＤＮＡ配列を表す配列である。配列番号１２は、配列番号９として示される挿入Ｔ−ＤＮＡ配列に隣接する千三十六（１，０３６）ｂｐの３’ＬＨ２４４トウモロコシゲノムＤＮＡ配列を表す配列である。配列番号７は、配列番号９として示される挿入Ｔ−ＤＮＡ配列の二百九十八（２９８）ｂｐと結合した挿入Ｔ−ＤＮＡに隣接する八百六十二（８６２）塩基対（ｂｐ）の５’ＬＨ２４４トウモロコシゲノムＤＮＡ配列を表す配列である。配列番号８は、配列番号９として示される挿入Ｔ−ＤＮＡ配列に隣接する千三十六（１，０３６）ｂｐの３’ＬＨ２４４トウモロコシゲノムＤＮＡ配列を備えた挿入Ｔ−ＤＮＡ配列の百四十二（１４２）ｂｐを表す配列である。配列番号１０はトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に対応し、５’ＬＨ２４４隣接配列、事象ＭＯＮ９５３７９の遺伝子組み換え挿入物、及び３’ＬＨ２４４隣接ＤＮＡ配列を含む連続した配列（コンティグ）を含み、それ故、該挿入物−植物ゲノム結合部の配列を含む。
【００６１】
本明細書で特に断りのない限り、用語は、関連技術の当業者による従来の使用法に従って理解されるべきである。分子生物学における一般的な用語の定義は、当業者に既知の他の情報源とともに、Ｒｉｅｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｓｓａｒｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ：Ｃｌａｓｓｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ，５ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１、及びＬｅｗｉｎ，Ｇｅｎｅｓ  Ｖ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４に見出され得る。本明細書で使用される、「トウモロコシ」という用語は、Ｚｅａ属、好ましくは、Ｚｅａ  ｍａｙｓに属する種を意味し、事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物と交配することができるすべての植物種を含み、野生トウモロコシ種及び種間の交配を許可するＺｅａ属に属する植物が含まれる。
【００６２】
本発明は、毒性量の殺虫タンパク質Ｃｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７を発現する発現カセットを含むＤＮＡ構築物で形質転換された遺伝子組み換え植物を提供する。毒性量とは、有効量、殺虫量、殺虫有効量、標的昆虫抑制量、有効殺虫量、鱗翅類目昆虫の食餌における殺虫量、及び関連技術の当業者による従来の使用法に従って理解されるべき他の同様の用語を意味する。本明細書に開示する方法に従い当該ＤＮＡ構築物を用いて形質転換されたトウモロコシ植物は、鱗翅目害虫に抵抗性がある。
【００６３】
遺伝子組み換え「植物」は、異種ＤＮＡ、すなわち、目的のいくつかの有効な特徴を含むポリ核酸構築物による植物細胞の形質転換、該植物細胞のゲノムへの導入遺伝子の挿入から生じる植物の再生、ならびに特定のゲノム位置への挿入及び再生された遺伝子組み換え植物の有効な特徴の数によって特徴づけられる特定の植物の選択によって産生される。「事象」という用語は、挿入ＤＮＡ、及び該挿入ＤＮＡに直接隣接する隣接ゲノム配列を含む元の形質転換体由来のＤＮＡを指す。かかるＤＮＡは固有のものであり、当該挿入ＤＮＡ（例えば、元の形質転換体及び自殖に由来する後代）を含む親系統ならびに当該挿入ＤＮＡを含まない親系統の雌雄交配の結果として、目的の導入遺伝子を含む該挿入ＤＮＡを受ける後代に移行すると期待される。本発明はまた、元の形質転換体植物及び異種ＤＮＡを含む該形質転換体の後代を提供する。かかる後代は、該事象を含む植物及び別の植物間の雌雄異系交配によって産生される可能性があり、この場合、該後代は異種ＤＮＡを含む。反復親への戻し交配を繰り返した後でも、該事象は、該交配種の後代の同じ染色体位置に存在する。
【００６４】
本明細書で使用される、「組み換え」という用語は、通常は自然界には見られず、人間の介入によって創出された非天然ＤＮＡ、タンパク質、または生物を指す。「組み換えＤＮＡ分子」は、天然には一緒に生じないＤＮＡ分子の組み合わせを含むＤＮＡ分子であり、人間の介入の結果である。例えば、互いに異種である少なくとも２つのＤＮＡ分子、例えば、導入遺伝子を含むＤＮＡ分子及び該導入遺伝子に隣接する植物ゲノムＤＮＡの組み合わせからなるＤＮＡ分子は、組み換えＤＮＡ分子である。
【００６５】
本明細書で言及される「ＤＮＡ」及び「ＤＮＡ分子」という用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子を指す。ＤＮＡ分子はゲノム起源であっても合成起源であってもよく、慣例により５’（上流）末端から３’（下流）末端である。本明細書で使用される、「ＤＮＡ配列」という用語は、ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列を指す。慣例により、本発明のＤＮＡ配列及びその断片は、２本鎖相補的ＤＮＡ配列鎖のうちの１本の鎖のみを参照して開示される。含意及び意図により、本明細書に提供する配列の相補的配列（相補鎖の配列）は、当技術分野では逆相補的配列とも呼ばれ、これらは本発明の範囲内であり、請求項に係る主題の範囲内にあることが明示的に意図される。
【００６６】
本明細書で使用される、「断片」という用語は、全体のより小さな部分を指す。例えば、配列番号１０の断片は、完全な配列番号１０の配列の少なくとも約１２個の連続したヌクレオチド、少なくとも約１３個の連続したヌクレオチド、少なくとも約１４個の連続したヌクレオチド、少なくとも約１５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約１６個の連続したヌクレオチド、少なくとも約１７個の連続したヌクレオチド、少なくとも約１８個の連続したヌクレオチド、少なくとも約１９個の連続ヌクレオチド、少なくとも約２０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約２５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約３０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約３５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約４０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約４５個の連続したヌクレオチド、少なくとも約５０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約６０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約７０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約８０個の連続したヌクレオチド、少なくとも約９０個の連続したヌクレオチド、または少なくとも約１００個の連続したヌクレオチドである配列を含む。
【００６７】
本出願において「単離されたＤＮＡ分子」または同等の用語もしくは句への言及は、ＤＮＡ分子が、単独で、または他の組成物と組み合わせて存在するが、その自然環境内には存在しないものであることを意味することを意図している。例えば、核酸要素、例えば、コード配列、イントロン配列、非翻訳リーダー配列、プロモーター配列、転写終結配列等、生物のゲノムのＤＮＡ内で天然に見られるものは、該要素が当該生物のゲノム内にあり、それが天然に見出されるゲノム内の位置にある限り、「単離された」とは見なされない。しかしながら、これら要素の各々、及びこれら要素の下位部分は、該要素が当該生物のゲノム内になく、それが天然に見出されるゲノム内の位置にない限り、本開示の範囲内で「単離された」になる。同様に、殺虫タンパク質またはそのタンパク質の任意の天然に存在する殺虫バリアントをコードするヌクレオチド配列は、該ヌクレオチド配列が、該タンパク質をコードする配列が天然に見出される細菌のＤＮＡ内にない限り、単離されたヌクレオチド配列である。天然に存在する殺虫タンパク質のアミノ酸配列をコードする合成ヌクレオチド配列は、本開示の目的のため、単離されたと見なされる。本開示の目的のため、任意の遺伝子組み換えヌクレオチド配列、すなわち、植物もしくは細菌の細胞のゲノムに挿入されたＤＮＡの、または染色体外ベクターに存在するＤＮＡのヌクレオチド配列は、それが該細胞を形質転換するのに使用されるプラスミドもしくは同様の構造内に存在するか、該植物もしくは細菌のゲノム内に存在するか、または該植物もしくは細菌に由来する組織、後代、生体サンプルもしくは商品生産物において検出可能な量存在するかどうかにかかわらず、単離されたヌクレオチド配列であると見なされる。いかなる場合でも、該単離されたＤＮＡ分子は、それが核酸、核酸配列、ポリヌクレオチド配列等と呼ばれるかどうかにかかわらず、化学分子である。これは、植物細胞内または植物ゲノム内に存在する場合、及び植物細胞外に存在する場合の両方で工業上の利用可能性を示し、ひいては該分子が位置する場所に関係なくかかる有用性を示す、及び示すことが意図される、新規な発明に関する分子である。
【００６８】
遺伝子組み換え挿入物の一端のホスホジエステル結合による隣接トウモロコシゲノムＤＮＡへの結合にわたる領域のＤＮＡ配列は、「結合部」と呼ばれる。結合部は、当該遺伝子組み換え挿入物と隣接ＤＮＡの１つの連続した分子としての結合点である。１つの結合部は、当該遺伝子組み換え挿入物の５’末端に見出され、他方は該遺伝子組み換え挿入物の３’末端に見出され、本明細書では、それぞれ、５’及び３’結合部と呼ばれる。「結合部の配列」とは、事象の５’または３’結合部にわたる任意の長さのＤＮＡ配列を指す。トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の結合部の配列は、配列番号１０を使用する当業者には明らかである。事象ＭＯＮ９５３７９の結合部の配列の例は、配列番号１〜８として提供されている。図１は、配列番号１０に対する結合部の配列の５’から３’に配置された物理的配列を示している。事象ＭＯＮ９５３７９の結合部の配列は、事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物、種子、または細胞のゲノムの一部として存在してもよい。植物、植物の部分、種子、または細胞由来のサンプル中の結合部の配列の任意の１つ以上の特定は、該ＤＮＡが事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシから得られたことを示し、事象ＭＯＮ９５３７９の存在を診断するものである。
【００６９】
事象ＭＯＮ９５３７９の結合部の配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号１０からなる群からの配列によって表され得る。例えば、該結合部の配列は、配列番号１及び配列番号２として提供されるヌクレオチド配列によって任意に表され得る。代替的に、該結合部の配列は、配列番号３及び配列番号４として提供されるヌクレオチド配列によって任意に表され得る。代替的に、該結合部の配列は、配列番号５及び配列番号６として提供されるヌクレオチド配列によって任意に表され得る。代替的に、該結合部の配列は、配列番号７及び配列番号８として提供されるヌクレオチド配列によって任意に表され得る。これらのヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって結合され、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９においては、組み換え植物細胞ゲノムの一部として存在する。
【００７０】
トウモロコシ植物、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ植物部分に由来するサンプル中の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号１０の１つ以上の特定は、該ＤＮＡがトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９から得られたという診断である。本発明は、このように、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０として提供されるヌクレオチド配列の少なくとも１つを含むＤＮＡ分子を提供する。配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０として提供される配列の少なくとも１つを含むのに十分な遺伝子組み換えトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９由来の任意のＤＮＡのセグメントは、本発明の範囲内である。さらに、この段落に記載されている配列のいずれかに相補的な配列を含む任意のポリヌクレオチドは、本発明の範囲内である。
【００７１】
本発明は、サンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含むトウモロコシ植物に由来するＤＮＡの存在を検出するためのプライマーまたはプローブのいずれかとして使用することができる例示的なＤＮＡ分子を提供する。かかるプライマーまたはプローブは、標的核酸配列に特異的であり、それ故、本明細書に記載の本発明の方法によるトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の核酸配列の特定に有用である。
【００７２】
「プローブ」は、標的核酸の鎖に相補的であり、ハイブリダイゼーション法において有用な核酸分子である。プローブは、従来の検出可能な標識またはレポーター分子、例えば、放射性同位体、リガンド、化学発光剤、または酵素を結合してもよい。かかるプローブは、標的核酸の鎖に相補的であり、本発明の場合、事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物由来であるか事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含むサンプル由来であるかにかかわらず、事象ＭＯＮ９５３７９由来のＤＮＡ鎖に相補的である。本発明に従うプローブは、デオキシリボ核酸またはリボ核酸だけでなく、標的ＤＮＡ配列に特異的に結合し、その標的ＤＮＡ配列の存在を検出するために使用することができるポリアミド及び他のプローブ材料も含む。トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を検出するためのプローブとして有用な例示的なＤＮＡ配列は、配列番号１７（ＰＢ１０２６９）、配列番号２３（ＰＢ５０３４０）、配列番号２６（ＰＢ５０１３８）として提供される。
【００７３】
「プライマー」は、通常、熱増幅を伴う特定のアニーリングまたはハイブリダイゼーション法で使用するために設計されるＤＮＡ分子である。プライマー対は、熱増幅（ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）等）で鋳型ＤＮＡ（トウモロコシゲノムＤＮＡのサンプル等）とともに使用してアンプリコンを生成することができ、かかる反応から生成されるアンプリコンは、該プライマーが該鋳型にハイブリダイズした２つの部位間に位置する該鋳型ＤＮＡの配列に対応するＤＮＡ配列を有する。
【００７４】
プライマーは通常、相補的な標的ＤＮＡ鎖にハイブリダイズして、該プライマーと標的ＤＮＡ鎖間にハイブリッドを形成するように設計されており、該プライマーの存在は、該標的ＤＮＡ鎖を鋳型として使用して該プライマーの伸長（すなわち、伸長するヌクレオチド分子へのさらなるヌクレオチドの重合）を開始するためのポリメラーゼによる認識点である。プライマー対とは、通常は熱増幅反応または他の従来の核酸増幅法において、該プライマー対の個々のメンバーによる結合の標的となる位置間のポリヌクレオチドセグメントを直線的に増幅する目的で、二本鎖ヌクレオチドセグメントの逆鎖を結合する２つのプライマーの使用を指す。プライマーとして有用な例示的なＤＮＡ分子は、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２５及び配列番号２７として提供される。
【００７５】
配列番号１５と配列番号１６のプライマー対は、第一のＤＮＡ分子及び該第一のＤＮＡ分子とは異なる第二のＤＮＡ分子として有用であり、両方とも、各々、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを診断するアンプリコンを生成するため、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に由来する鋳型ＤＮＡとの熱増幅反応に一緒に使用した場合、ＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さの配列番号１０の連続したヌクレオチドである。配列番号２１と配列番号２２のプライマー対は、第一のＤＮＡ分子及び該第一のＤＮＡ分子とは異なる第二のＤＮＡ分子として有用であり、両方とも、各々、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの接合性を診断するアンプリコンを生成するため、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に由来する鋳型ＤＮＡとの熱増幅反応に一緒に使用した場合、ＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さの配列番号１０の連続したヌクレオチドである。配列番号２４と配列番号２５のプライマー対は、第一のＤＮＡ分子及び該第一のＤＮＡ分子とは異なる第二のＤＮＡ分子として有用であり、両方とも、各々、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの接合性を診断するアンプリコンを生成するため、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に由来する鋳型ＤＮＡとの熱増幅反応に一緒に使用した場合、ＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さの配列番号１０の連続したヌクレオチドである。配列番号１８と配列番号１９のプライマー対は、第一のＤＮＡ分子及び該第一のＤＮＡ分子とは異なる第二のＤＮＡ分子として有用であり、両方とも、各々、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の診断及びトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの接合性の両方に対する内部対照として機能するアンプリコンを生成するため、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に由来する鋳型ＤＮＡとの熱増幅反応に一緒に使用した場合、ＤＮＡプライマーとして機能するのに十分な長さのトウモロコシゲノム内の遺伝子座の連続したヌクレオチドである。
【００７６】
ＤＮＡプローブ及びＤＮＡプライマーは、一般に、長さが十一（１１）ポリヌクレオチド以上、多くの場合十八（１８）ポリヌクレオチド以上、二十四（２４）ポリヌクレオチド以上、または三十（３０）ポリヌクレオチド以上である。かかるプローブ及びプライマーは、高ストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下で、標的配列に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さのものであるように選択される。好ましくは、本発明に従うプローブ及びプライマーは、該標的配列と完全な配列相同性を有するが、標的配列にハイブリダイズする能力を保持する該標的配列とは異なるプローブは、従来の方法によって設計され得る。
【００７７】
本発明の核酸プローブ及びプライマーは、ストリンジェントな条件下で標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズする。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法を使用して、サンプル中の遺伝子組み換え植物由来のＤＮＡの存在を特定することができる。核酸セグメントまたはその断片とも呼ばれるポリ核酸分子は、ある特定の状況下で他の核酸分子に特異的にハイブリダイズすることが可能である。
【００７８】
本明細書で使用される、２つのポリ核酸分子は、該２つの分子が逆平行の二本鎖核酸構造を形成することが可能な場合、互いに特異的にハイブリダイズすることが可能であると言われる。核酸分子は、それらが完全な相補性を示す場合、別の核酸分子の「相補体」であると言われる。本明細書で使用される分子は、該分子の１つのすべてのヌクレオチドが他の分子のヌクレオチドと相補的である場合、「完全な相補性」を示すと言われる。２つの分子は、それらが、少なくとも従来の「低ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールされたままであるようにするのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、「最小限に相補的」であると言われる。同様に、該分子は、それらが、従来の「高ストリンジェンシー」条件下で互いにアニールされたままであるようにするのに十分な安定性で互いにハイブリダイズすることができる場合、「相補的」であると言われる。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９により、及びＨａｙｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．により、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８５）に記載されている。完全な相補性からの逸脱は従って、かかる逸脱が二本鎖構造を形成する当該分子の能力を完全に排除しない限り許容される。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するためには、使用される特定の溶媒及び塩濃度下で安定な二本鎖構造を形成することができるのに十分に配列が相補的であることだけが必要とされる。
【００７９】
本明細書で使用される、実質的に相同な配列とは、高ストリンジェンシー条件下で比較されている核酸配列の相補体に特異的にハイブリダイズする核酸配列である。ＤＮＡハイブリダイゼーションを促進する適切なストリンジェンシー条件、例えば、約４５℃での６．０×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、それに続く５０℃での２．０×ＳＳＣの洗浄は、当業者に既知であるか、または、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），６．３．１−６．３．６に見出すことができる。例えば、該洗浄ステップにおける該塩濃度は、５０℃で約２．０×ＳＳＣの低ストリンジェンシーから５０℃で約０．２×ＳＳＣの高ストリンジェンシーまで選択することができる。さらに、該洗浄ステップの温度は、室温での低ストリンジェンシー条件（約２２℃）から約６５℃での高ストリンジェンシー条件に上昇させることができる。温度と塩の両方を変化させる場合もあれば、温度または塩濃度のいずれかを一定に保ち、他の可変要素を変化させる場合もある。好ましい実施形態では、本発明のポリ核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０、またはその相補体またはその断片に記載される核酸分子の１つ以上に、中程度にストリンジェントな条件下、例えば、約２．０×ＳＳＣ及び約６５℃で特異的にハイブリダイズする。特に好ましい実施形態では、本発明の核酸は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、または配列番号１０、またはその相補体またはその断片に記載される核酸分子の１つ以上に、高ストリンジェンシー条件下で特異的にハイブリダイズする。本発明の１つの態様では、本発明の好ましいマーカー核酸分子は、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８、または配列番号９、または配列番号１０、またはその相補体、またはその断片に記載される核酸配列を有する。該プローブの該標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーションは、当業者に既知の様々な方法で検出することができる。これらとしては、蛍光タグ、放射性タグ、抗体ベースのタグ、及び化学発光タグを挙げることができるがこれらに限定されない。
【００８０】
特定の増幅プライマー対を使用する標的核酸配列の増幅（例えば、ＰＣＲによる）に関して、「ストリンジェントな条件」とは、該プライマー対が、ＤＮＡ熱増幅反応において、対応する野生型配列（またはその相補体）を有するプライマーが結合する標的核酸配列にのみハイブリダイズし、好ましくは、固有の増幅産物、すなわち、アンプリコンを生成することを可能にする条件である。
【００８１】
「（標的配列）に特異的」という用語は、プローブまたはプライマーが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的配列を含むサンプル中の該標的配列にのみハイブリダイズすることを示す。
【００８２】
本明細書で使用される、「増幅ＤＮＡ」または「アンプリコン」とは、ポリ核酸鋳型の一部である標的ポリ核酸分子を対象とするポリ核酸増幅法の産物を指す。例えば、雌雄交配から生じるトウモロコシ植物が、本発明の事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物由来の遺伝子組み換え植物ゲノムＤＮＡを含むかどうかを特定するため、トウモロコシ植物組織サンプルから抽出したＤＮＡは、事象ＭＯＮ９５３７９の異種挿入ＤＮＡに隣接する領域のゲノムＤＮＡ配列に由来する第一のプライマーを含むプライマー対を使用したポリ核酸増幅法に供されることがあり、該挿入ＤＮＡの５’から３’の方向にポリメラーゼによって伸長される。第二のプライマーは、該異種挿入ＤＮＡ分子に由来し、該第一のプライマーが由来する隣接ゲノムＤＮＡの５’から３’の方向にポリメラーゼによって伸長される。アンプリコンは、長さが該プライマー対プラス１ヌクレオチド塩基対、またはプラス約５０ヌクレオチド塩基対、またはプラス約２５０ヌクレオチド塩基対、またはプラス約４５０ヌクレオチド塩基対以上の複合した長さの範囲であり得る。代替的に、プライマー対は、該挿入異種ＤＮＡの両側のゲノム配列に由来して、挿入ポリヌクレオチド配列全体を含むアンプリコンを生成することができる（例えば、事象ＭＯＮ９５３７９ゲノムにおいて本明細書で特定された挿入ＤＮＡ配列（配列番号９）を含むＤＮＡ分子を増幅する、配列番号１０の５’末端のゲノム部分から単離されたフォワードプライマー及び配列番号１０の３’末端のゲノム部分から単離されたリバースプライマー）。挿入された遺伝子組み換えＤＮＡに隣接する植物ゲノム配列に由来するプライマーペアのメンバーは、該挿入ＤＮＡ配列からある距離に置かれ、この距離は、１ヌクレオチド塩基対から約２万ヌクレオチド塩基対までの範囲であり得る。「アンプリコン」という用語の使用は、ＤＮＡ熱増幅反応で形成され得るプライマーのダイマーを特異的に除外する。
【００８３】
実際上は、限られたサイズ範囲、例えば、１００〜１０００塩基のアンプリコンを生成するプライマーを設計する必要がある。より小さな（より短いポリヌクレオチド長）サイズのアンプリコンは、通常、熱増幅反応でより確実に生成され、サイクル時間を短くし、容易にアガロースゲルでの分離及び可視化をすることもできれば、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）様アッセイでの使用に適している場合もある。より小さなアンプリコンは、当技術分野で既知のＤＮＡアンプリコン検出法によって生成及び検出することができる。さらに、該プライマー対を使用して生成されたアンプリコンは、ベクターにクローニングし、増殖させ、単離し、配列決定することもできれば、当技術分野で確立された方法で直接配列決定することもできる。事象ＭＯＮ９５３７９またはその後代の診断となるアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅法に有用な配列番号１１と配列番号９の組み合わせ、または配列番号１２と配列番号９の組み合わせに由来する任意のプライマー対は、本発明の態様である。事象ＭＯＮ９５３７９またはその後代の診断となるアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅法に有用な配列番号１１、またはその相補体の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む任意の単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子は、本発明の態様である。事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物またはその後代の診断となるアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅法に有用な配列番号１２、またはその相補体の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む任意の単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子は、本発明の態様である。事象ＭＯＮ９５３７９またはその後代の診断となるアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅法に有用な配列番号９、またはその相補体の少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む任意の単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子は、本発明の態様である。
【００８４】
ポリ核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含めた当技術分野で既知の様々なポリ核酸増幅法のいずれかによって達成することができる。増幅法は当技術分野で既知であり、とりわけ、米国特許第４，６８３，１９５号及び第４，６８３，２０２号ならびにＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ：Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｅｄ．Ｉｎｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９９０に記載されている。ＰＣＲ増幅法は、最大２２ｋｂ（キロベース）のゲノムＤＮＡ及び最大４２ｋｂのバクテリオファージＤＮＡを増幅するために開発された（Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：５６９５−５６９９，１９９４）。これらの方法及び当技術分野で既知の他のＤＮＡ増幅法を本発明の実施において使用してもよい。トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９由来の異種ＤＮＡ挿入物の配列または隣接ゲノムＤＮＡの配列は、本明細書に提供する配列由来のプライマーを使用して、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含むトウモロコシ種子またはアクセッション番号ＰＴＡ−１２５０２７を有するＡＴＣＣに寄託された事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含むトウモロコシ種子から成長したトウモロコシ植物由来のかかるＤＮＡ分子を増幅し、その後当該ＰＣＲアンプリコンまたはクローニングされたそのＤＮＡ断片の標準的なＤＮＡ配列決定により、検証（及び必要に応じて修正）することができる。
【００８５】
これらの方法によって生成された診断アンプリコンは、複数の技術によって検出され得る。１つのかかる方法は、遺伝的ビット分析であり（Ｎｉｋｉｆｏｒｏｖ，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．２２：４１６７−４１７５，１９９４）、ここでは、隣接する隣接ゲノムＤＮＡ配列及び挿入ＤＮＡ配列の両方と重複するＤＮＡオリゴヌクレオチドが設計される。該オリゴヌクレオチドは、マイクロタイタープレートのウェルに固定化される。目的の領域のＰＣＲ（挿入された配列中の１つのプライマー及び隣接する隣接ゲノム配列に１つを使用）に続いて、一本鎖ＰＣＲ産物は、該固定化オリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、ＤＮＡポリメラーゼ及び予想される次の塩基に特異的な標識ジデオキシヌクレオチド三リン酸（ｄｄＮＴＰ）を用いた一塩基伸長反応の鋳型として機能することができる。読み出しは、蛍光でもＥＬＩＳＡベースでもよい。信号は、増幅、ハイブリダイゼーション、及び一塩基伸長の達成による当該導入遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
【００８６】
別の方法は、パイロシークエンシング技術であり、Ｗｉｎｇｅ（Ｉｎｎｏｖ．Ｐｈａｒｍａ．Ｔｅｃｈ．００：１８−２４，２０００）に記載されている。この方法では、隣接するゲノムＤＮＡ及び挿入ＤＮＡ結合部と重複するオリゴヌクレオチドが設計される。該オリゴヌクレオチドは、目的の領域からの一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズされ（１つのプライマーは挿入された配列中、１つは隣接ゲノム配列中）、ＤＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、スルフリラーゼ、ルシフェラーゼ、アピラーゼ、アデノシン５’ホスホ硫酸及びルシフェリンの存在下でインキュベートされる。ＤＮＴＰは個別に追加され、その組み込みにより、光信号が生じ、これが測定される。光信号は、増幅、ハイブリダイゼーション、及び一塩基または多塩基伸長の達成による当該導入遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
【００８７】
Ｃｈｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，（Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．９：４９２−４９８，１９９９）により記載される蛍光偏光は、本発明のアンプリコンを検出するのに使用することができる方法である。この方法を使用して、ゲノム隣接及び挿入ＤＮＡ結合部と重複するオリゴヌクレオチドが設計される。該オリゴヌクレオチドは、目的の領域からの一本鎖ＰＣＲ産物にハイブリダイズされ（１つのプライマーは挿入ＤＮＡ中、１つは隣接ゲノムＤＮＡ配列中）、ＤＮＡポリメラーゼ及び蛍光標識ｄｄＮＴＰの存在下でインキュベートされる。単一塩基伸長により、該ｄｄＮＴＰが組み込まれる。取り込みは、蛍光光度計を使用した偏光の変化として測定することができる。偏光の変化は、増幅、ハイブリダイゼーション、及び一塩基伸長の達成による当該導入遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
【００８８】
リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）では、ＰＣＲの進行状況を発生時に（すなわち、リアルタイムで）観察することができる。データは、ＰＣＲの最後ではなく、ＰＣＲプロセスを通して収集される。リアルタイムＰＣＲでは、反応は、一定数のサイクル後に蓄積された標的の量ではなく、標的の増幅が最初に検出された際のサイクル中の時点によって特徴づけられる。リアルタイムＰＣＲアッセイでは、蛍光信号の蓄積によって陽性反応が検出される。核酸標的の開始コピー数が多いほど、蛍光の有意な増加が早く観察される。サイクル閾値（Ｃｔ値）は、蛍光信号が閾値を超える（すなわち、バックグラウンドレベルを超える）のに必要なサイクル数として定義される。Ｃｔレベルは、サンプル中の標的核酸の量に反比例する（すなわち、Ｃｔ値が低いほど、サンプル中の標的核酸の量は多い）。
【００８９】
Ｔａｑｍａｎ（登録商標）（ＰＥ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｏｓｔｅｒ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）は、リアルタイムＰＣＲを使用してＤＮＡ配列の存在を検出及び定量化する方法とされており、製造業者が提供する使用説明書において十分に理解されている。簡潔には、ゲノム隣接及び挿入ＤＮＡ結合部と重複するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。該ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（１つのプライマーは挿入ＤＮＡ配列中、１つは隣接ゲノム配列中）は、熱安定性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下でサイクルに供される。該ＦＲＥＴプローブのハイブリダイゼーションにより、該ＦＲＥＴプローブの消光部分から離れた蛍光部分の切断及び放出が生じる。蛍光信号は、増幅及びハイブリダイゼーションの達成による当該導入遺伝子／ゲノム配列の存在を示す。
【００９０】
分子標識は、配列検出における使用のために説明されており、Ｔｙａｎｇｉ，ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０３−３０８，１９９６）に記載されている。簡潔には、隣接ゲノム及び挿入ＤＮＡ結合部と重複するＦＲＥＴオリゴヌクレオチドプローブが設計される。該ＦＲＥＴプローブの固有の構造により、該蛍光部分と消光部分を近接近に維持する二次構造が含まれる。該ＦＲＥＴプローブ及びＰＣＲプライマー（１つのプライマーは挿入ＤＮＡ配列中、１つは隣接ゲノム配列中）は、熱安定性ポリメラーゼ及びｄＮＴＰの存在下でサイクルに供される。ＰＣＲ増幅の達成に続いて、該ＦＲＥＴプローブの該標的配列へのハイブリダイゼーションにより、該プローブの二次構造の除去ならびに該蛍光及び消光部分の空間的隔離がもたらされる。蛍光信号が生じる。蛍光信号は、増幅及びハイブリダイゼーションの達成による当該隣接／導入遺伝子挿入配列の存在を示す。
【００９１】
ＤＮＡ増幅法に基づくＤＮＡ検出キットは、標的ＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、適切な反応条件下で診断アンプリコンを増幅するＤＮＡプライマー分子を含む。該キットは、アガロースゲルに基づく検出法、または当技術分野で既知の診断アンプリコンを検出する様々な方法を提供し得る。ＤＮＡ検出キットは、本明細書に開示する組成物を使用して開発することができ、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの特定に有用であり、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含むトウモロコシ植物を育種する方法に適用することができる。配列番号１０に記載されるトウモロコシゲノム領域の任意の部分及び配列番号１０に記載される挿入された遺伝子組み換えＤＮＡの任意の部分と相同または相補的であるＤＮＡプライマーを含むキットは、本発明の対象である。該ＤＮＡ分子は、ＤＮＡ増幅法（ＰＣＲ）で、またはポリ核酸ハイブリダイゼーション法、すなわち、サザン解析、ノーザン解析のプローブとして使用することができる。本発明のキットは、任意に、本明細書に記載の検出または診断反応を行うための試薬または説明書も含み得る。
【００９２】
本発明に従うプローブ及びプライマーは、標的配列と完全な配列同一性を有し得るが、標的配列に選択的にハイブリダイズする能力を保持する標的配列とは異なるプライマー及びプローブは、従来の方法によって設計され得る。核酸分子がプライマーまたはプローブとして機能するためには、使用される特定の溶媒及び塩濃度下で安定な二本鎖構造を形成することが可能であるために十分に配列が相補的であることだけが必要とされる。任意の従来の核酸ハイブリダイゼーションまたは増幅法を使用して、サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９由来の遺伝子組み換えＤＮＡの存在を特定することができる。プローブ及びプライマーは、一般に、少なくとも約１１ヌクレオチド、少なくとも約１８ヌクレオチド、少なくとも約２４ヌクレオチド、または少なくとも約３０ヌクレオチドまたはそれ以上の長さである。かかるプローブ及びプライマーは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、標的ＤＮＡ配列に特異的にハイブリダイズする。従来のストリンジェンシー条件は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９により、及びＨａｙｍｅｓ  ｅｔ  ａｌ．により、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＤＣ（１９８５）に記載されている。
【００９３】
熱増幅法を含めた当業者に周知の様々な方法を使用して、本発明に開示するＤＮＡ分子、またはその断片を単離及び操作することができる。ＤＮＡ分子、またはその断片はまた、他の技術によって、例えば、自動オリゴヌクレオチド合成装置を使用して一般に実施されるように、化学的手段によって該断片を直接合成することによっても得ることができる。
【００９４】
本明細書に提供するＤＮＡ分子及び対応するヌクレオチド配列は従って、とりわけ、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の特定、サンプル中の遺伝子組み換えトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９由来のＤＮＡの存在の検出、ならびにトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の存在及び／または不在に関するサンプルの観察または事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物由来の植物部分の観察に有用である。
【００９５】
本発明は、トウモロコシ植物、トウモロコシ植物細胞、トウモロコシ種子、トウモロコシ植物部分（例えば、花粉、胚珠、絹糸、穂、葯、穂軸、根組織、茎組織、葉組織）、トウモロコシ後代植物、及びトウモロコシ商品生産物を提供する。これらのトウモロコシ植物、トウモロコシ植物細胞、トウモロコシ種子、トウモロコシ植物部分、トウモロコシ後代植物、及びトウモロコシ商品生産物は、検出可能な量の本発明のポリヌクレオチド、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０として提供される配列の少なくとも１つを有するポリヌクレオチドを含む。本発明のトウモロコシ植物、植物細胞、種子、植物部分、及び後代植物はまた、１つ以上のさらなる導入遺伝子を含み得る。かかるさらなる導入遺伝子は、虫害抵抗性の向上、水利用効率の向上、収量性の向上、耐乾燥性の向上、種子品質の向上、及び／または除草剤耐性の向上が挙げられるがこれらに限定されない所望の形質を付与するタンパク質またはＲＮＡ分子をコードする任意のヌクレオチド配列でよい。
【００９６】
本発明は、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含む遺伝子組み換えトウモロコシ植物に由来するトウモロコシ植物、トウモロコシ植物細胞、トウモロコシ種子、トウモロコシ植物部分（例えば、花粉、胚珠、絹糸、穂、葯、穂軸、根組織、茎組織、葉組織）、トウモロコシ後代植物を提供する。事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含むトウモロコシ種子の代表的なサンプルは、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ（登録商標））とのブダペスト条約に従って寄託されている。ＡＴＣＣリポジトリは、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含む種子に対して、特許寄託指定ＰＴＡ−１２５０２７を割り当てた。
【００９７】
本発明は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子をそのゲノムに含む微生物を提供する。かかる微生物の例は、遺伝子組み換え植物細胞である。微生物、例えば、本発明の植物細胞は、以下を含むがこれらに限定されない多くの工業用途において有用である：（ｉ）科学研究または工業研究のための研究ツールとしての使用、（ｉｉ）内因性または組み換え炭水化物、脂質、核酸、もしくはタンパク質製品、またはその後の科学研究もしくは工業製品として使用され得る小分子を生産するための培養における使用、及び（ｉｉｉ）その後に農業研究または生産に使用され得る遺伝子組み換え植物または植物組織培養物を生産するための現代の植物組織培養技術との使用。微生物、例えば、遺伝子組み換え植物細胞の生産及び使用は、現代の微生物学的技術及び人間の介入を利用して、人工の固有の微生物を生産する。このプロセスでは、組み換えＤＮＡが植物細胞のゲノムに挿入され、天然に存在する植物細胞とは別の固有の遺伝子組み換え植物細胞が創出される。この遺伝子組み換え植物細胞は次に、現代の微生物学技術を使用して細菌や酵母細胞によく似て培養することができ、未分化の単細胞状態で存在し得る。遺伝子組み換え植物細胞の新たな遺伝的構成及び表現型は、当該異種ＤＮＡを当該細胞のゲノムに組み込むことによって創出される技術的効果である。本発明の別の態様は、本発明の微生物の使用方法である。本発明の微生物、例えば、遺伝子組み換え植物細胞の使用方法としては、（ｉ）当該細胞のゲノムに組み換えＤＮＡを組み込むことで遺伝子組み換え細胞を生成し、その後この細胞を使用して同じ異種ＤＮＡを有するさらなる細胞を誘導する方法、（ｉｉ）組み換えＤＮＡを含む細胞を現代の微生物学技術を用いて培養する方法、（ｉｉｉ）培養細胞から内因性または組み換え炭水化物、脂質、核酸、またはタンパク質産物を生成及び精製する方法、ならびに（ｉｖ）現代の植物組織培養技術を遺伝子組み換え植物細胞とともに使用して、遺伝子組み換え植物または遺伝子組み換え植物組織培養物を生産する方法が挙げられる。
【００９８】
本発明の植物は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に挿入された導入遺伝子を含めた事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを後代に伝え得る。本明細書で使用される、「後代」としては、祖先植物由来の事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含む、及び／または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含む任意の植物、植物細胞、種子、及び／または再生可能な植物部分が挙げられる。植物、後代、及び種子は、事象ＭＯＮ９５３７９の導入遺伝子に対してホモ接合性でもヘテロ接合性でもよい。後代は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物によって産生された種子及び／またはトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物の花粉を受粉した植物によって産生された種子から成長し得る。
【００９９】
後代植物を、自家受粉（「自殖」としても知られる）させ、純粋育種系統の植物、すなわち、当該導入遺伝子に対してホモ接合性の植物を生成してもよい。適切な後代の自殖で、追加された外因性遺伝子の両方にホモ接合性の植物を産生することができる。
【０１００】
代替的に、後代植物を、異種交配、例えば、別の無関係の植物と交配し、変種またはハイブリッド種子もしくは植物を産生してもよい。該他の無関係の植物は、遺伝子組み換えでも非遺伝子組み換えでもよい。本発明の変種またはハイブリッド種子もしくは植物を、従って、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の特異的かつ固有のＤＮＡを欠く第一の親を、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含む第二の親と雌雄交配することによって誘導し、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の特異的かつ固有のＤＮＡを含むハイブリッドを得てもよい。各親は、該交配または育種によって本発明の植物または種子、すなわち、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９のＤＮＡ及び／または配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含む少なくとも１つの対立遺伝子を有する種子が生じる限り、ハイブリッドでも近交系／変種でもよい。２つの異なる遺伝子組み換え植物を交配して、２つの独立して分離した、追加された外因性遺伝子を含むハイブリッド後代を産生してもよい。例えば、トウモロコシに虫害抵抗性を付与するＣｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７を含む事象ＭＯＮ９５３７９を、他の遺伝子組み換えトウモロコシ植物と交配して、両方の遺伝子組み換え親の特徴を有する植物を産生することができる。この一例は、鱗翅目抵抗性をトウモロコシに付与するＣｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７を含む事象ＭＯＮ９５３７９と、１つ以上のさらなる形質、例えば、除草剤耐性、虫害抵抗性、または耐乾燥性を有する植物との交配により、鱗翅目虫害抵抗性を有しかつ少なくとも１つまたはそれ以上のさらなる形質を有する後代植物または種子を得ることである。栄養繁殖と同様、親植物への戻し交配及び非遺伝子組み換え植物との異種交配もまた企図される。異なる形質及び作物に一般に使用される他の育種法の説明は、いくつかの参考文献の１つ、例えば、Ｆｅｈｒ，ｉｎ  Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｗｉｌｃｏｘ  Ｊ．ｅｄ．，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ（１９８７）に見出すことができる。
【０１０１】
本発明の植物、後代、種子、細胞及び植物部分はまた、１つ以上のさらなるトウモロコシ形質または遺伝子組み換え事象、特にトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物を該さらなる形質（複数可）または遺伝子組み換え事象を含む別のトウモロコシ植物と交配することによって導入されるものを含み得る。かかる形質（複数可）または遺伝子組み換え事象としては、虫害抵抗性の向上、除草剤耐性、水利用効率の向上、収量性の向上、耐乾燥性の向上、種子品質の向上、栄養価の向上、ハイブリッド種子の産生、または病害もしくは真菌耐性が挙げられるがこれらに限定されない。トウモロコシの遺伝子組み換え事象は当業者に既知である。例えば、かかる形質のリストは、米国農務省（ＵＳＤＡ）の動植物検疫所（ＡＰＨＩＳ）によって提供されており、そのウェブサイト：ｗｗｗ．ａｐｈｉｓ．ｕｓｄａ．ｇｏｖで見出すことができる。２つ以上の遺伝子組み換え事象は、それ故、各々１つ以上の遺伝子組み換え事象を含む２つの親植物を交配し、後代種子を集め、該２つ以上の遺伝子組み換え事象を含む後代種子または植物を選択することにより後代種子または植物において組み合わせてもよい。これらのステップは、後代において所望の遺伝子組み換え事象の組み合わせが達成されるまで繰り返され得る。親植物への戻し交配及び非遺伝子組み換え植物との異種交配もまた企図され、栄養繁殖である。
【０１０２】
本発明は、事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物に由来する植物部分を提供する。本明細書で使用される、「植物部分」とは、事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物に由来する材料から構成される植物の任意の部分を指す。植物部分としては、花粉、胚珠、絹糸、穂、葯、穂軸、根組織、茎組織、及び葉組織が挙げられるがこれらに限定されない。植物部分は、生存、非生存、再生可能、及び／または非再生可能であり得る。
【０１０３】
本発明は、商品生産物を提供し、これは、事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物に由来し、事象ＭＯＮ９５３７９に特異的な核酸を検出可能な量含む。本明細書で使用される、「商品生産物」は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含むトウモロコシ植物、全粒もしくは加工トウモロコシ種子、または１つ以上の植物細胞及び／または植物部分に由来する材料からなる任意の組成物または産物を指す。非生存商品生産物としては、非生存種子、全粒または加工種子、種子部分、及び植物部分、トウモロコシを含む動物飼料、トウモロコシ油、コーンミール、コーンフラワー、コーンフレーク、トウモロコシふすま、トウモロコシ製パスタ、トウモロコシバイオマス、ならびにトウモロコシ及びトウモロコシ部分を用いて製造される燃料製品が挙げられるがこれらに限定されない。生存商品生産物としては、種子、植物、及び植物細胞が含まれるがこれらに限定されない。事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物は、従って、通常トウモロコシから得られる任意の商品生産物を製造するために使用することができる。事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物に由来する任意のかかる商品生産物は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に対応する少なくとも検出可能な量の特異的かつ固有のＤＮＡを含んでもよく、具体的には、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含むポリヌクレオチドを検出可能な量含み得る。本明細書に開示する検出方法を含め、ヌクレオチド分子の任意の標準的な検出方法が使用され得る。商品生産物は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を該商品生産物に任意の検出可能な量含む場合、本発明の範囲内に含まれる。
【０１０４】
本発明のトウモロコシ植物、トウモロコシ植物細胞、トウモロコシ種子、トウモロコシ植物部分（例えば、花粉、胚珠、絹糸、穂、葯、穂軸、根組織、茎組織、葉組織）、トウモロコシ後代植物、及び商品生産物は、それ故、とりわけ、農業目的のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含む種子及び／または植物部分を生産する目的で植物を育てること、植物育種及び研究目的でトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含む後代を産生すること、工業用途及び研究用途のための微生物学的技術での使用、ならびに消費者への販売用として有用である。
【０１０５】
本発明の事象ＭＯＮ９５３７９に特異的かつ固有のＤＮＡ配列を含む虫害抵抗性トウモロコシ植物を産生する方法を提供する。これらの方法で使用される遺伝子組み換え植物は、当該導入遺伝子に対してホモ接合性でもヘテロ接合性でもよい。これらの方法で産生される後代植物は、変種でもハイブリッド植物でもよく、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物によって産生された種子及び／またはトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物の花粉を受粉した植物によって産生された種子から成長してもよく、また、当該導入遺伝子に対してホモ接合性でもヘテロ接合性でもよい。後代植物を、その後自家受粉させ、純粋育種系統の植物、すなわち、当該導入遺伝子に対してホモ接合性の植物を生成してもよく、別の方法として、異種交配、例えば、別の無関係の植物と交配させ、変種もしくはハイブリッド種子または植物を産生してもよい。
【０１０６】
サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ植物に由来するＤＮＡの存在を検出する方法を提供する。１つの方法は、（ｉ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ植物からＤＮＡサンプルを抽出すること、（ｉｉ）ＤＮＡ配列決定に適切な条件下で、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡに特異的なＤＮＡ配列を生成することが可能な少なくとも１つのプライマーに該ＤＮＡサンプルを接触させること、（ｉｉｉ）ＤＮＡシーケンシング反応を行うこと、及びその後（ｉｖ）当該ヌクレオチド配列が、それに含まれる構築物の事象ＭＯＮ９５３７９に特異的なヌクレオチド配列、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるものを含むことを確認することからなる。別の方法は、（ｉ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ植物からＤＮＡサンプルを抽出すること、（ｉｉ）ＤＮＡ増幅に適切な条件下で、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡからアンプリコンを生成することが可能なプライマー対に該ＤＮＡサンプルを接触させること、（ｉｉｉ）ＤＮＡ増幅反応を行うこと、及びその後（ｉｖ）当該アンプリコン分子を検出すること及び／または当該アンプリコンのヌクレオチド配列が、事象ＭＯＮ９５３７９に特異的なヌクレオチド配列、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０からなる群から選択されるものを含むことを確認することからなる。該アンプリコンは、事象ＭＯＮ９５３７９に特異的であるものであるべきであり、例えば、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８、または配列番号９、または配列番号１０を含むアンプリコンであるべきである。該アンプリコン内の事象ＭＯＮ９５３７９に特異的なヌクレオチド配列の検出は、当該サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９特異的ＤＮＡの存在を決定及び／または診断する。ＤＮＡ増幅に適切な条件下で事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡからアンプリコンを生成することが可能なプライマー対の例は、配列番号１５及び配列番号１６として提供される。他のプライマー対は、当業者によって容易に設計される場合があり、配列番号１、または配列番号２、または配列番号３、または配列番号４、または配列番号５、または配列番号６、または配列番号７、または配列番号８を含むアンプリコンを生成し、この場合、かかるプライマー対は、当該挿入物に隣接するゲノム領域内に少なくとも１つのプライマー及び当該挿入物内に第二のプライマーを含む。サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ植物由来のＤＮＡの存在を検出する別の方法は、（ｉ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ植物からＤＮＡサンプルを抽出すること、（ｉｉ）事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡに特異的なＤＮＡプローブに該ＤＮＡサンプルを接触させること、（ｉｉｉ）該プローブと該ＤＮＡサンプルをストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズさせること、及びその後（ｉｖ）該プローブと該標的ＤＮＡサンプル間のハイブリダイゼーションを検出することからなる。事象ＭＯＮ９５３７９に特異的なＤＮＡプローブの配列の例は、配列番号１７として提供される。他のプローブは、当業者によって容易に設計される場合があり、当該挿入物に隣接するゲノムＤＮＡの少なくとも１つの断片ならびに挿入ＤＮＡの少なくとも１つの断片、例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、及び配列番号１０に提供される配列を含む。該ＤＮＡサンプルへのプローブのハイブリダイゼーションの検出は、当該サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９特異的ＤＮＡの存在を診断するものである。ハイブリダイゼーションの欠如は、代替的に、当該サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９特異的ＤＮＡがないことを診断するものである。
【０１０７】
サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの特定に有用であり、適切な事象のＤＮＡを含むトウモロコシ植物を育種する方法にも適用することができるＤＮＡ検出キットを提供する。かかるキットは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０の断片を含むＤＮＡプライマー及び／またはプローブを含む。かかるキットの一例は、サンプル中に事象ＭＯＮ９５３７９を含む遺伝子組み換えトウモロコシ植物由来のＤＮＡの存在及び／または不在を検出するのに有用なＤＮＡプローブとして機能するのに十分な長さの配列番号１０の連続ヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡ分子を含む。事象ＭＯＮ９５３７９を含む遺伝子組み換えトウモロコシ植物由来のＤＮＡは、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含む。サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの存在及び／または非存在を決定、検出、または診断するのに有用な、ＤＮＡプローブとして使用するのに十分なＤＮＡ分子は、配列番号１７として提供される。他のプローブは、当業者によって容易に設計される場合があり、配列番号１０の少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３１、少なくとも３２、少なくとも３３、少なくとも３４、少なくとも３５、少なくとも３６、少なくとも３７、少なくとも３８、少なくとも３９、または少なくとも４０個の連続したヌクレオチドを含むべきであり、該事象由来のＤＮＡを特定するために、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡに十分に固有であるべきである。
【０１０８】
別のタイプのキットは、サンプル中の遺伝子組み換えトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に由来するＤＮＡの存在及び／または不在を検出するのに有用なアンプリコンを生成するのに有用なプライマー対を含む。かかるキットは、標的ＤＮＡサンプルを本明細書に記載のプライマー対と接触させ、その後、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０から選択される少なくとも１つの配列を有するＤＮＡ分子を含むアンプリコンを生成するのに十分な核酸増幅反応を行い、次に該アンプリコンの存在及び／または不在を検出することを含む方法を採用する。かかる方法はまた、アンプリコンまたはその断片を配列決定することを含んでもよく、これは、当該標的ＤＮＡサンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９特異的ＤＮＡの存在を決定、すなわち、診断するものである。他のプライマー対は、当業者によって容易に設計される場合があり、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、及び配列番号１０に提供されるがこれらに限定されない配列の少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、または少なくとも３０個の連続したヌクレオチドを含むべきであり、該事象由来のＤＮＡを特定するために、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡに十分に固有であるべきである。
【０１０９】
本発明のキット及び検出方法は、とりわけ、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の特定、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物の変種またはハイブリッドを選択すること、サンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９を含む遺伝子組み換えトウモロコシ植物由来のＤＮＡの存在の検出、ならびに事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物の存在及び／または不在に関するサンプルの観察、または事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ植物由来の植物部分の観察に有用である。
【０１１０】
トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９由来の異種ＤＮＡ挿入物の配列、結合部の配列、または隣接配列は、本明細書に提供する配列由来のプライマーを使用して、該事象由来のかかる配列を増幅し、その後該アンプリコンまたはクローニングされたＤＮＡの標準的なＤＮＡ配列決定により、検証（及び必要に応じて修正）することができる。
【０１１１】
サンプル中のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ植物に由来するＤＮＡの導入遺伝子の対立遺伝子の接合性を検出する方法を提供する。１つの方法は、（ｉ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ植物からＤＮＡサンプルを抽出すること、（ｉｉ）事象ＭＯＮ９５３７９の診断となる第一のアンプリコンを生成することが可能なプライマー対に該ＤＮＡサンプルを接触させること、（ｉｉｉ）事象ＭＯＮ９５３７９を含まない天然のトウモロコシゲノムＤＮＡの診断となる第二のアンプリコンを生成することが可能なプライマー対に該ＤＮＡサンプルを接触させること、（ｉｖ）ＤＮＡ増幅反応を行うこと、及びその後（ｖ）当該アンプリコンを検出することからなり、この場合、該第一のアンプリコンのみの存在は、当該サンプル中のホモ接合性の事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの診断であり、該第一のアンプリコン及び該第二のアンプリコンの両方の存在は、事象ＭＯＮ９５３７９対立遺伝子に対するトウモロコシ植物のヘテロ接合性の診断である。例示的なプライマー対のセットは、事象ＭＯＮ９５３７９の診断となるアンプリコンを生成する配列番号１５及び配列番号１６、ならびに事象ＭＯＮ９５３７９を含まない非挿入野生型トウモロコシゲノムＤＮＡの診断となるアンプリコンを生成する配列番号１５及び配列番号２７として提示される。プローブのセットはまた、上記のプライマー対のセットを使用したリアルタイムＰＣＲフォーマットで使用されるかかる増幅法に組み込むこともできる。例示的なプローブのセットは、配列番号１７（事象ＭＯＮ９５３７９のアンプリコンの診断）及び配列番号２８（事象ＭＯＮ９５３７９を含まない野生型トウモロコシゲノムＤＮＡのアンプリコンの診断）として提示される。
【０１１２】
接合性を特定するための別の方法は、（ｉ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ植物からＤＮＡサンプルを抽出すること、（ｉｉ）事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも第一のプローブ及び、事象ＭＯＮ９５３７９のヘテロ接合性ＤＮＡの挿入によって中断されたトウモロコシゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズし、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡにハイブリダイズしない少なくとの第二のプローブを含むプローブのセットに該ＤＮＡサンプルを接触させること、（ｉｉｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で該プローブのセットと該サンプルをハイブリダイズすることからなり、この場合、該ハイブリダイゼーション条件下での該第一のプローブのみのハイブリダイゼーションの検出は、当該サンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡのホモ接合性対立遺伝子の診断であり、該ハイブリダイゼーション条件下での該第一のプローブ及び該第二のプローブの両方のハイブリダイゼーションの検出は、ＤＮＡサンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９のヘテロ接合性対立遺伝子の診断である。 
【０１１３】
接合性を特定するためのさらに別の方法は、（ｉ）少なくとも１つのトウモロコシ細胞、トウモロコシ組織、トウモロコシ種子、またはトウモロコシ植物からＤＮＡサンプルを抽出すること、（ｉｉ）該ＤＮＡサンプルを、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８またはＣｒｙ１Ｄａ＿７をコードする毒素コード配列の１つのアンプリコンを生成することが可能なプライマー対と接触させること、（ｉｉｉ）該ＤＮＡサンプルを、該トウモロコシ植物において単一配列及びホモ接合性であることが既知の内部標準のアンプリコンを生成することが可能なプライマー対と接触させること、（ｉｖ）該ＤＮＡサンプルを、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８またはＣｒｙ１Ｄａ＿７をコードする毒素コード配列の１つに特異的にハイブリダイズする少なくとも第一のプローブ、及び該トウモロコシ植物において単一配列及びホモ接合性であることが既知の内部標準ゲノムＤＮＡに特異的にハイブリダイズする少なくとも第二のプローブを含むプローブセットと接触させること、（ｖ）リアルタイムＰＣＲを使用してＤＮＡ増幅反応を行い、該毒素コード配列及び該単一配列ホモ接合性内部標準に対応するアンプリコンのサイクル閾値（Ｃｔ値）を特定すること、（ｖｉ）該単一配列ホモ接合性内部標準のアンプリコンのＣｔ値と、該毒素コード配列のアンプリコンのＣｔ値間の差（ΔＣｔ）を計算すること、ならびに（ｖｉｉ）接合性を特定することからなり、この場合、ΔＣｔ約ゼロ（０）は、挿入Ｔ−ＤＮＡのホモ接合性を示し、ΔＣｔ約一（１）は、挿入Ｔ−ＤＮＡのヘテロ接合性を示す。ヘテロ接合性及びホモ接合性事象は、ΔＣｔ値単位約一（１）で識別される。複数の要因、例えば、増幅効率及び理想的なアニーリング温度によりリアルタイムＰＣＲで観察される通常の変動を考慮すると、「約一（１）」の範囲は、ΔＣｔ０．７５〜１．２５として定義される。接合性を特定するための上記方法のプライマー対及びプローブは、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８コード配列及び内部標準からアンプリコンを増幅及び検出してもよいし、Ｃｒｙ１Ｄａ＿７コード配列及び内部標準からアンプリコンを増幅及び検出してもよい。Ｃｒｙ１Ｂ．８６８コード配列及び内部標準に対応するアンプリコンを検出するための例示的なプライマー対は、配列番号１８と配列番号１９の組み合わせ（内部標準）及び配列番号２１と配列番号２２の組み合わせ（Ｃｒｙ１Ｂ．８６８）として提示される。付随する例示的なプローブは、配列番号２０（内部標準）及び配列番号２３（Ｃｒｙ１Ｂ．８６８）として提示される。Ｃｒｙ１Ｄａ＿７コード配列及び内部標準に対応するアンプリコンを検出するための例示的なプライマー対は、配列番号１８と配列番号１９の組み合わせ（内部標準）及び配列番号２４と配列番号２５の組み合わせ（Ｃｒｙ１Ｄａ＿７）として提示される。付随する例示的なプローブは、配列番号２０（内部標準）及び配列番号２６（Ｃｒｙ１Ｄａ＿７）として提示される。
【０１１４】
寄託情報
事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ種子の代表的なサンプルの寄託は、米国バージニア州マナッサスユニバーシティブルバード１０８０１、郵便番号２０１１０に住所を有するアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）とのブダペスト条約に従って、２０１８年４月２０日になされ、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−１２５０２７を割り当てられた。該寄託へのアクセスは、特許商標局長官及び長官が請求に応じて権利を有すると決定した者への出願の係属中利用可能である。当該特許が発行されると、一般の人々に対する利用可能性のすべての制限が取り消し不能の形で解除される。該寄託は、三十（３０）年、または最後の請求から五（５）年、もしくは当該特許の有効期間のいずれか長い方の期間、寄託機関に保持され、その間に必要に応じて交換される。
【実施例】
【０１１５】
以下、実施例を挙げ、本発明をさらに詳しく説明する。要約すると、百二十五（１２５）個の構築物の構造及び試験、約一万七百八十五（１０，７８５）個の事象（概念実証及び商用の両方）、ならびにトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の創出及び選択に必要な、厳密な分子、農学、及び圃場試験を通した数十万の個々の植物の六（６）年にわたる分析である。
【０１１６】
これらの実施例は、本発明のある特定の好ましい実施形態を実証する。当業者には、この後の実施例に開示する技術が、本発明の実施において、本発明者らが発見したアプローチが十分に機能することを表し、ひいてはその実施に関する好ましい方法の例を構成すると見なされ得ることを理解されたい。しかしながら、当業者には、本開示に照らして、本発明の主旨及び範囲から逸脱することなく、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ得るが、それでもなお同様なまたは類似する結果を得ることができることを理解されたい。
【０１１７】
実施例１
発現カセット試験、構築物の設計、植物試験及び構築物の選択
植物における導入遺伝子の発現は、多くの異なる要因の影響を受ける。表現型の異常をもたらさない一方、殺虫タンパク質と植物での発現を駆動する異なる発現要素の適切な組み合わせを見つける必要がある。さらに、該発現要素自体及びカセット内のそれらの組み合わせ及び方向の他に、植物中での導入遺伝子の発現は、おそらくはクロマチン構造（例えば、ヘテロクロマチン）または組み込み部位への転写調節要素（例えば、エンハンサー）の近接近に起因して、染色体挿入位置によって影響されることが知られている（Ｋｕｒｔ  Ｗｅｉｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｆｏｒｅｉｇｎ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔｓ：ｔｒａｎｓｆｅｒ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．２２：４２１−７７）。例えば、植物及び他の生物では、染色体挿入位置が異なる事象間で、同じ構築物から導入された遺伝子の発現レベルに大きなばらつきがある可能性があることが観察されている。異なる染色体挿入位置はまた、発現の空間的または時間的パターンの違いを生み出す可能性があり、これは、導入された遺伝子構築物に存在する転写調節要素から予想されるパターンに対応しない可能性がある。
【０１１８】
これらの理由から、多くの場合、多数の構築物及び形質転換事象を創出及びスクリーニングして構築物を識別し、その後、農学または表現型の異常型を産生もしない一方で導入された目的の遺伝子の最適な発現を実証する事象を識別することが必要とされる。
【０１１９】
これらの理由から、鱗翅目に対して活性であり、農学、収量、またはスタックの生存率に悪影響を及ぼさない殺虫タンパク質を含む遺伝子組み換えトウモロコシ植物の開発には、広範な研究、開発、及び分析が必要であった。具体的には、六（６）年間で、百二十五（１２５）個の異なるプラスミドベクター構築物由来の約一万七百八十五（１０，７８５）個の概念実証及び商用遺伝子組み換え事象が開発され、試験され、分析された。
【０１２０】
本実施例は、事象の創出に好ましい構築物を識別するため、百二十五（１２５）個の異なる構築物のトウモロコシ植物における設計及び試験を記載する。各構築物は、殺虫タンパク質及び転写調節要素のコード配列に関して異なっていた。植物における殺虫タンパク質の発現に使用するのに最適な構築物を選択するための試験を行った。各構築物は、発現カセットの組成（殺虫タンパク質及び発現要素の両方）、方向、及びタンパク質が葉緑体を標的とするかどうかによって異なる固有の構造を有していた。
【０１２１】
最初の概念実証及び発達段階では、二十六（２６）個の異なるプロモーター、二十六（２６）個の異なるイントロン、及び十（１０）個の異なる昆虫毒素コード配列の異なる組み合わせを含む百十七（１１７）個の構築物を使用して約六千（６，０００）個の形質転換事象を生成した。導入遺伝子（複数可）の存在についての最初の分子特性化の後、五千五十二（５，０５２）個の単一及び二重配列形質転換トウモロコシ事象を、さらなる特性化及び有効性試験に選択した。これらの事象を、表現型または農学の異常型、昆虫毒素タンパク質の発現のレベル、及び選択された鱗翅目害虫種に対する有効性について評価した。得られた有効性及びタンパク質発現データを、表現型及び農学の異常型に関する任意の情報とともに使用して、効果のないタンパク質、発現要素及び組み合わせを排除したとともに、次の開発段階に使用される二元商用形質転換プラスミド構築物をより少数設計した。
【０１２２】
次の開発段階では、八（８）個の新たな構築物を創出した。これらの構築物は、異なる方向（収束または発散）の二（２）〜四（４）個の昆虫毒素導入遺伝子発現カセットの組み合わせを含んでいた。これらの八（８）個の構築物を使用して、合計五千七百三十三（５，７３３）個の形質転換事象（「形質転換体」とも呼ばれる）を生成した。培養でのシュート形成後、視覚的特徴及び早期分子解析を基に、形質転換事象のサブセットを選択した。合計八百二十三（８２３）個の形質転換事象を選択し、ポットに移植し、さらなる試験のために成長させた。
【０１２３】
得られたＲ０世代の形質転換事象を、選択された鱗翅目種に対する有効性、毒素タンパク質の発現、植物の健康状態、種子リターン、ならびに表現型及び農学の異常型について分析した。このＲ０世代の事象を分子的にも特性化し、カセットの完全性及びトウモロコシゲノムへの適切な挿入を確実にした。多くの事象は、農学分析及び分子特性試験に合格しなかったため、試験から除外された。さらに、八（８）個の構築物中一（１）個は、表現型が異常型の事象を生成したため、このＲ０段階でさらなる試験から除外された。これらの農学的問題に加えて、後に実施された作用機序（「ＭＯＡ」）試験により、この構築物に含まれる昆虫毒素タンパク質が、市販のタンパク質と重複するＭＯＡを示すことが実証された。
【０１２４】
作用機序試験は、八（８）個の構築物中四（４）個に共通する昆虫タンパク質の１つで行った。これらの試験により、この昆虫タンパク質が、市販のタンパク質と重複するＭＯＡを有することが実証された。現在利用されている商用殺虫タンパク質と類似または重複するＭＯＡを示すタンパク質は、類似のＭＯＡを有するタンパク質を昆虫集団に対して無効にし得る耐性発現のために望ましくない。従って、これらの四（４）個の構築物、及びそれらから生じる事象を除外した。前に述べた通り、四（４）個の除外された構築物中一（１）個は同様に、Ｒ０段階で表現型が異常型の事象を生成した。
【０１２５】
次の開発段階では、残りの四（４）個の構築物由来の百五十（１５０）個の事象をさらに、Ｆ１（ヘテロ接合ハイブリッド）／Ｒ１（ホモ接合近交系）及びＲ２世代で、有効性、種子リターン及び分離、表現型及び農学の異常型、ならびにさらなる分子特性化に関して評価した。残りの四（４）個の構築物から二（２）個の構築物をこの段階で、育成に関する基準の１つ以上を満たさなかったためにさらなる試験から除外し、（２）個の構築物由来の事象をさらなる評価に残した。
【０１２６】
七十七（７７）個の事象、事象ＭＯＮ９５３７９を生成するために使用した構築物（「構築物ＭＯＮ９５」）由来の４１（４１）個及び他の構築物（「構築物１」）由来の３６（３６）個の事象を、Ｒ２近交系及びＦ１ハイブリッドとして、有効性、種子リターン及び分離、表現型及び農学の異常型ならびにさらなる分子特性化に関して評価した。これらの評価の結果を基に、構築物１に関連する事象の優先順位を下げ、棚上げし、保存した。
【０１２７】
従って、様々な構築物の多数回の試験及び比較により、配列番号１３、構築物ＭＯＮ９５として提供される導入遺伝子カセットが、最良の分子特性化及び農業生産力を備えた、鱗翅目害虫種であるツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ、Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、夜蛾科のガの幼虫（ＣＥＷ、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、南西部のマツマダラメイガ（ＳＷＣＢ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、サトウキビ害虫（ＳＣＢ、Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）、及びモロコシマダラメイガ（ＬＳＣＢ、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）に対する有効性に関して最良の選択肢であることが分かった。
【０１２８】
表２は、得られた形質転換事象数（「プラグド」）、Ｒ０事象として成長用に選択された形質転換事象数（「移植」）、ならびに各構築物が、構築物ＭＯＮ９５の選択につながった評価、研究及び開発プロセスで除外された時点を示す。
表２．事象構築物の選択。
【表２】
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【０１２９】
実施例２
圃場試験、分子検査及び事象の選択
本実施例は、構築物ＭＯＮ９５によって創出された事象の複数年にわたる複数の場所での圃場試験における分子特性化、分析、及び試験を記載し、これが最終的な事象であるＭＯＮ９５３７９の選択につながる。
【０１３０】
表３は、最終的な事象であるＭＯＮ９５３７９を選択するために使用したプロセスを示す。商用形質転換Ｒ０のスクリーニングの際、構築物ＭＯＮ９５から二百十（２１０）個のＲ０形質転換事象が誘導され、成長用に選択された。最初の二百十（２１０）個の選択されたＲ０形質転換事象のうち、百四十七個の事象（１４７）を、有効性、タンパク質発現、種子リターン及び植物の健康状態、または分子特性化に関する懸念により除外した。これにより、次の開発段階、すなわち、Ｆ１スクリーニング及びＲ１育種段階でのアッセイ及び試験用に六十三（６３）個の事象が残された。この段階では、温室試験での有効性への懸念により、十一（１１）個の事象が除外された。この育種からの種子のリターンが不十分であったこと及び／または得られた種子の分離分析から、さらなる三（３）個の事象が除外された。最後に、分子特性化で発見された問題のためにさらに五（５）個の事象が除外され、分子サザン分析で発見された問題のために三（３）個の事象が除外され、四十一（４１）個の事象が次の世代のアッセイに残された。試験のＲ２／Ｆ１段階において、残りの四十一（４１）個の事象のうちの二（２）個が、さらなる分子サザン特性化で発見された問題のために除外され、三十九（３９）個の事象が残された。
【０１３１】
残った三十九（３９）個の事象を、以下の２つの異なる同時並行試験段階に進めた：１）さらなる圃場試験、及び２）選択カセットのＣｒｅ切除及びゴールドスタンダード種子の産生。事象は、これらの同時並行試験段階の各々で除外された。
【０１３２】
Ｃｒｅ切除の過程で、グリホサート選択カセットのｃｒｅ切除後の分子特性化で発見された問題のため、十一（１１）個の事象が除外された。さらに、別の六（６）個の事象が、ゴールドスタンダード種子産生の過程で分子特性化において発見された問題のために除外された。
【０１３３】
同時圃場試験の過程で、２０１６年の米国での圃場試験から収集されたデータを基に、さらなる四（４）個の事象が有効性の懸念のために除外され、さらなる十二（１２）個の事象が農学的な懸念のために除外された。その後、ブラジルでの圃場試験から収集されたデータを基に、有効性の懸念から別の事象が除外された。次に、２０１７年の米国での圃場試験の過程で実施されたバイオインフォマティクス解析により、さらなる三（３）個の事象がその後の試験から除外され、２つの事象、すなわち、事象１及びＭＯＮ９５３７９が残された。米国、ブラジル、アルゼンチン及びプエルトリコでの複数の圃場試験からの事象の農学のさらなる分析の後、各事象の分子特性化、タンパク質発現、有効性及び農学のすべての特徴を比較した場合に、事象ＭＯＮ９５３７９は事象１より高位だったため、これが商業化のための事象として選択された。
表３．ＭＯＮ９５３７９事象の選択。
【表３】
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【０１３４】
実施例３
トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９におけるグリホサート選択カセットのＣｒｅ切除
本実施例は、インビボＣｒｅ切除によるトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９からのグリホサート選択カセットの除去を記載する。このグリホサート選択カセットは、形質転換事象を選択するために使用した。この選択カセットを除去することにより、「マーカーフリー」の事象が創出され、殺虫タンパク質発現カセットのみが最終的な事象に残った。
【０１３５】
図３は、マーカーフリーの事象ＭＯＮ９５３７９トウモロコシ事象を生成するために使用される育種プロセスを示す。トウモロコシ品種ＬＨ２４４の未熟胚を、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介形質転換プロセスを用いて構築物ＭＯＮ９５（配列番号１３として提示され、図２に示される）で形質転換した。構築物ＭＯＮ９５は、三（３）個の発現カセット、すなわち、殺虫タンパク質Ｃｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７の発現用の二（２）個の発現カセット、ならびにグリホサート選択を用いる形質転換植物細胞の選択に使用される単一のカセットを含む。この選択カセットの両側には、ＬｏｘＰ  Ｃｒｅリコンビナーゼ認識部位が隣接した。
【０１３６】
形質転換後、Ｒ０形質転換体を二（２）世代にわたって自家受粉させ、その間、様々なアッセイ、例えば、有効性、タンパク質発現、種子リターン及び植物の健康状態、及び分子特性化を基に多くの事象を除外した。Ｒ２世代までに、最初の二百十（２１０）個の事象から三十九（３９）個の事象が残った。この三十九（３９）個のホモ接合Ｒ２世代の事象を、腸内細菌ファージＰ１由来のＣｒｅリコンビナーゼ酵素を発現する形質転換トウモロコシ植物のエリート系統と交配した。
【０１３７】
Ｒ２世代の事象を、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する植物と交配したこの段階は、「Ｃｒｅ交配」として識別される。具体的には、この段階で、雄花を取り除いた（雌）、配列番号１３に対してホモ接合性のＲ２世代の植物を、Ｃｒｅリコンビナーゼ酵素の発現に使用される導入遺伝子カセットに対してホモ接合性の遺伝子組み換えトウモロコシ植物（雄）と他家受粉させた。Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する雄ドナーの花粉は、配列番号１３を含む雌植物の絹糸の組織に落ちた後に発芽する。花粉管が胚嚢に入ると、花粉管が破裂し、Ｃｒｅリコンビナーゼを発現する雄ドナーの２つの精子が解放される。１つの精子の核が卵核と融合し、接合子を形成する。他方の精核は、２つの極核の１つと融合し、これが次に他方の極核と融合して、一次内乳核を確立する。
【０１３８】
従って、Ｃｒｅリコンビナーゼ発現植物を雄花粉ドナーとして使用する場合、得られた交配種の胚と内乳の両方が、細胞が分裂して発達し、トウモロコシ穀粒（すなわち、種子）になるにつれてＣｒｅリコンビナーゼを発現する。Ｃｒｅリコンビナーゼは、ＬｏｘＰ部位の逆方向反復配列に結合し、発現カセットに隣接する２つのＬｏｘＰ部位の８塩基対のスペーサ領域で交差を触媒し、組み換えによって組み込まれたＴ−ＤＮＡに１つのＬｏｘＰ部位を残してマーカーのカセットを切除する（図２、「Ｃｒｅ切除後の挿入Ｔ−ＤＮＡ」参照）。
【０１３９】
Ｃｒｅ交配から得られたＦ１後代は、ＣＰ４選択カセットが欠落しているものを選択し、自家受粉させた。このプロセスを通して、２つの対立遺伝子、すなわち、Ｃｒｅリコンビナーゼ対立遺伝子及び事象ＭＯＮ９５３７９の生成に使用されるＴ−ＤＮＡの対立遺伝子が、得られるＦ２集団で分離し、一方または両方の対立遺伝子に対してホモ接合性またはヘテロ接合性の後代が生じる。
【０１４０】
Ｃｒｅリコンビナーゼ対立遺伝子の欠落及び配列番号９に対してホモ接合性を示したＦ２後代、すなわち、Ｃｒｅ切除後の遺伝子組み換え挿入Ｔ−ＤＮＡを選択した。これらの選択されたＦ２後代を自家受粉させ、配列番号９に対してホモ接合性のＦ３世代を生じさせた。
【０１４１】
さらなる自家受粉により、Ｆ３後代の種子（Ｆ４種子）を得、これらを純度についてアッセイし、「ゴールドスタンダード種子」と指定した。Ｆ４は、ゴールドスタンダード種子の第一世代であった。
【０１４２】
このグリホサート選択マーカーカセットの切除は、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７の発現に影響を与えなかった。トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９からＣｒｅ切除を介してグリホサート選択カセットを除去することにより、最終的な事象にグリホサートに対する耐性を追加することなく、鱗翅目害虫抵抗性の遺伝子組み換えトウモロコシ事象が提供された。この「マーカーフリー」事象は、他のトウモロコシ遺伝子組み換え事象とのトウモロコシ育種スタックを構築する際の柔軟性を確保し、事象ＭＯＮ９５３７９を組み込む多様な製品を提供し、最終的な育種スタックにさらなる形質を与えるための複数の選択肢を可能にする。
【０１４３】
実施例４
トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９は、鱗翅目害虫のツマジロクサヨトウ、夜蛾科のガの幼虫、南西部のマツマダラメイガ、サトウキビ害虫に抵抗性を示す
本実施例は、鱗翅目害虫に対するＭＯＮ９５３７９事象の活性を記載する。昆虫毒素タンパク質Ｃｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９で一緒に発現された場合、ツマジロクサヨトウ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）、夜蛾科のガの幼虫（Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ｚｅａ）、南西部のマツマダラメイガ（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｇｒａｎｄｉｏｓｅｌｌａ）、及びサトウキビ害虫（Ｄｉａｔｒａｅａ  ｓａｃｃｈａｒａｌｉｓ）に対する抵抗性を与える。
【０１４４】
構築物ＭＯＮ９５の形質転換及び挿入後、四十一（４１）個のＲ０事象を葉のディスクを使用したバイオアッセイ用に選択した。植物の葉のディスクを使用したバイオアッセイは、米国特許第８，３４４，２０７号に記載されているものと同様に実施した。非形質転換ＬＨ２４４トウモロコシ植物を使用して、陰性対照として使用される組織を得た。各ウェルに、葉のディスクごとに１匹の昆虫を有するウェルを含むプレートを三（３）日間インキュベートした。三（３）日後、プレートを調べた。陰性対照の葉のディスクの少なくとも五十パーセント（５０％）が摂取された場合に遺伝子組み換え事象の葉のディスクの測定を行った。陰性対照の葉のディスクの五十パーセント（５０％）未満がまだ摂取されていなかった場合、五十パーセント（５０％）の目標が達成されるまで、昆虫に摂食を続けさせた。葉の損傷（「葉の損傷等級」または「ＬＤＲ」）及び死亡率の測定を各ウェルに関して行った。各測定値の平均を決定した。葉の損傷等級は一（１）から十一（１１）の範囲であり、摂取された葉のディスクのパーセンテージを反映している。表４は、Ｒ０の葉のディスクのアッセイに使用した葉の損傷等級スケールを示す。この等級スケールでは、陰性対照は常に少なくとも１０のＬＤＲを有する。
表４．Ｒ０の葉のディスクのアッセイに関する葉の損傷等級（ＬＤＲ）スケール。
【表４】
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【０１４５】
表５は、ＭＯＮ９５３７９事象を含む構築物ＭＯＮ９５によって形質転換された四十一（４１）個の事象に関する葉の損傷等級の平均を示す。表５に見られるように、２つの殺虫タンパク質、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７の発現は、ツマジロクサヨトウ（ＦＡＷ）、夜蛾科のガの幼虫（ＣＥＷ）、及び南西部のマツマダラメイガ（ＳＷＣＢ）に対する抵抗性をもたらした。陰性対照のＬＤＲは１０〜１１であった。ＦＡＷ及びＳＷＣＢは、葉のディスクの少なくとも五十パーセント（５０％）を摂取した陰性対照と比較して、事象ＭＯＮ９５３７９の葉のディスクの約五パーセント（５％）しか摂取しなかった。ＣＥＷに関しては、葉のディスクの少なくとも五十パーセント（５０％）を摂取した陰性対照と比較して、葉のディスクの約６．２５％しか摂取されなかった。さらに、ＦＡＷ及びＣＥＷの百パーセント（１００％）は、事象ＭＯＮ９５３７９を含む葉のディスクの摂取後に死亡した。
表５．葉の損傷等級（ＬＤＲ）の平均スコアならびにＣｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７を発現するＲ０植物に対する平均死亡率。
【表５】
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【０１４６】
これらの四十一（４１）個の事象を非遺伝子組み換え９３ＩＤＩ３種植物と交配した。構築物ＭＯＮ９５を含むＦ１ヘテロ接合性後代植物を選択した。各事象について約五（５）個のＦ１植物に、温室にて各害虫種を人工的に寄生させた。ＦＡＷに関しては、約四十（４０）匹の新生体を使用して、Ｖ６〜Ｖ８段階の輪生体の各Ｆ１植物に寄生させた。ＳＷＣＢに関しては、約三十（３０）匹の新生体を使用して、Ｖ６〜Ｖ１０段階の輪生体のＦ１植物に寄生させた。ＦＡＷ及びＳＷＣＢの葉の損傷の測定は、寄生後約十四（１４）日で行った。表６及び７は、葉の損傷を評価するために使用した損傷等級スケールを示す。
表６．ＦＡＷが寄生したトウモロコシ植物に関する葉の損傷等級スケール。
【表６】
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表７．ＳＷＣＢが寄生したトウモロコシ植物に関する葉の損傷等級スケール。
【表７】
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【０１４７】
ＳＷＣＢ寄生Ｆ１植物は、ＳＷＣＢによって生じた茎の穴の長さについても評価した。茎の穴の長さを測定するために、トウモロコシ植物のトウモロコシの茎をほぼ目の高さで折り、その上部を使用して穴の損傷を調べた。ダブルハンドルナイフを使用して茎を分割し、ＳＷＣＢによって開けられたトンネルの長さをセンチメートル（ｃｍ）単位で測定した。これらの実験では、トンネルの長さは十センチメートル（１０ｃｍ）以内であった。
【０１４８】
さらに、各事象について五（５）本のＦ１植物にもＣＥＷを寄生させ、ＣＥＷによってトウモロコシの穂に生じた損傷の量を測定した。約四十（４０）匹のＣＥＷの幼虫を各植物に寄生させるために用い、Ｒ１段階の植物の緑絹糸上に置いた。寄生から二十一（２１）日後、成長中の穂を調べ、損傷をｃｍ２の穂の損傷として記録した。
【０１４９】
表８は、ＦＡＷ及びＳＷＣＢが寄生したＦ１事象に関する葉の損傷等級、ＳＷＣＢによって生じた茎の穴の長さ、ならびにＣＥＷによって生じた穂の損傷の平均を示しており、「ＮＴ」は試験されていないことを示す。
表８．ＦＡＷ及びＳＷＣＢが寄生したＦ１遺伝子組み換えトウモロコシ植物に関する葉の損傷等級、ＳＷＣＢによって生じた茎の穴の長さ、ならびにＣＥＷによって生じた穂の損傷の平均
【表８】
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【０１５０】
表８に見られるように、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９に対する葉の損傷は、陰性対照と比較すると、ＦＡＷ及びＳＷＣＢの両方で最小限であった。基本的に、昆虫が事象ＭＯＮ９５３７９のＦ１の葉を摂食し始めると、事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシの葉でのＣｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７殺虫タンパク質の発現により、昆虫の葉の摂取が停止する。ＳＷＣＢによるトンネルの掘削は、事象ＭＯＮ９５３７９では観察されなかったが、陰性対照では広範囲のトンネルの掘削が見られた。ＣＥＷによる穂の損傷に関しては、穂の損傷は陰性対照と比較してはるかに少なく、いくつかの市販の遺伝子組み換えトウモロコシ事象で観察される穂の損傷に相当した。Ｆ１アッセイで使用した寄生の規模は、自然界で通常見られるものよりもはるかに大きかった。このＦ１アッセイにより、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９が、ＦＡＷ、ＳＷＣＢ、及びＣＥＷの優れた制御をもたらすことが実証された。
【０１５１】
２０１６年の夏に、実施例２／表３に記載のＲ２／Ｆ１後に残った三十九（３９）個の事象からのＦ１後代を、ＦＡＷ、ＣＥＷ、及びＳＷＣＢに対する抵抗性について、人工的な寄生を使用した圃場試験でアッセイした。複数の場所を抵抗性のアッセイに使用した。
【０１５２】
ＦＡＷ抵抗性は、三（３）箇所、すなわち、イリノイ州ジャージービル、イリノイ州トーマスボロ、及びテネシー州ユニオンシティでアッセイした。各場所で、各事象は、三（３）つの圃場試験区にて、試験区当たり一（１）列及び１列当たり三十（３０）個の種子を使用してアッセイした。四十（４０）匹のＦＡＷ新生体を使用して、初期及び中期輪生体段階（Ｖ４及びＶ７成長期）で各植物に２度寄生させた。表６に示したスケールを使用して、葉の摂食による損傷等級を評価した。
【０１５３】
ＳＷＣＢ抵抗性は、三（３）箇所、すなわち、アーカンソー州ジョーンズボロの一（１）箇所、及びテネシー州ユニオンシティの二（２）箇所でアッセイした。各場所で、各事象は、三（３）つの圃場試験区にて、試験区当たり一（１）列及び１列当たり三十（３０）個の種子を使用してアッセイした。三十（３０）匹のＳＷＣＢ新生体を使用して、中期輪生体段階（Ｖ７〜Ｖ８）で各植物に寄生させた。花粉が五十パーセント（５０％）落ちた時点で、これらの植物に、再度植物当たり三十（３０）匹のＳＷＣＢ新生体を寄生させた。茎のトンネル損傷を、前述の通りに評価した。
【０１５４】
ＣＥＷ抵抗性は、五（５）箇所、すなわち、イリノイ州ジャージービル、アーカンソー州ジョーンズボロ、イリノイ州モンマス、イリノイ州トーマスボロ、及びテネシー州ユニオンシティでアッセイした。各場所で、各事象は、三（３）つの圃場試験区にて、試験区当たり一（１）列及び１列当たり三十（３０）個の種子を使用してアッセイした。絹糸が新鮮かつ緑色であり、いくつかの穂の形成が始まった時点（Ｒ１〜Ｒ３期）で植物に寄生させた。ＣＥＷ卵のストリップを寄生に使用した。各ストリップは約四十（４０）個の卵を含んでいた。一（１）片のストリップを、卵を穂に向け、絹糸に近づけて、各植物の穂と茎の間に置いた。穂の損傷の評価は、寄生の二十一（２１）日〜二十八（２８）日後に特定した。この時までに、昆虫は幼虫から蛹の段階に進んでいる。穂の損傷は前述の通りに測定した。
【０１５５】
ＦＡＷ及びＳＷＣＢについては、三（３）箇所すべてのデータを使用した。ＣＥＷについては、様々な圃場条件のため、アーカンソー州ジョーンズボロのデータのみを使用することができた。表９は、調べた各事象及び陰性対照のＦＡＷによる葉の損傷等級、ＳＷＣＢによるトンネル長さ、及びＣＥＷによる穂の損傷の測定値の平均を示す。
表９．２０１６年の圃場有効性試験に関するＦＡＷによる葉の損傷等級、ＳＷＣＢによるトンネル長さ、及びＣＥＷによる穂の損傷の平均
【表９】
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【０１５６】
表９に示すように、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９は、陰性対照と比較して、ＦＡＷ、ＳＷＣＢ、及びＣＥＷの優れた制御をもたらした。これらのアッセイにおける寄生のレベルは、自然条件下、圃場で通常遭遇するものよりもはるかに高く、高い昆虫圧力（ｉｎｓｅｃｔ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ）下での事象ＭＯＮ９５３７９の優れた性能を実証した。
【０１５７】
同時圃場試験及び選択カセットのＣｒｅ切除及びゴールドスタンダード種子の生産の過程で、これら事象のさらなる特性化を行った。広範な分子特性化、有効性、発現、及び農学試験の結果、二（２）個の事象、すなわち、事象１及びＭＯＮ９５３７９を残して事象が試験から除外された。農学試験で観察された収量障害（ｙｉｅｌｄ  ｄｒａｇ）を基に事象１の優先順位を下げ、事象ＭＯＮ９５３７９を残して進めた。
【０１５８】
アルゼンチンにおいて、２０１６年〜２０１７年の生育期に、事象ＭＯＮ９５３７９を自然の寄生条件下、温帯及び亜熱帯で、ＦＡＷ、ＣＥＷ、及びＳＣＢに対する抵抗性についてアッセイした。表６に示したスケールを使用して、アルゼンチンの亜熱帯で成長した事象ＭＯＮ９５３７９のＦＡＷによる葉の損傷等級を特定した。ＳＣＢによるトンネル掘削データは、アルゼンチンの温帯の二（２）箇所からの事象ＭＯＮ９５３７９に関して得た。ＣＥＷによる穂の損傷データは、アルゼンチンの温帯の二（２）箇所及び亜熱帯の三（３）箇所からの事象ＭＯＮ９５３７９に関して得た。表１１は、２０１６〜２０１７年のアルゼンチンの生育期の事象ＭＯＮ９５３７９及び陰性対照に関する自然の寄生条件下でのＦＡＷによる葉の損傷等級、ＳＣＢによるトンネル長さ、及びＣＥＷによる穂の損傷の平均を示す。
表１０．２０１６〜２０１７年のアルゼンチン圃場有効性試験に関するＦＡＷによる葉の損傷等級、ＳＣＢによるトンネル長さ、及びＣＥＷによる穂の損傷の平均
【表１０】
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【０１５９】
表１０に見られるように、事象ＭＯＮ９５３７９は、アルゼンチンにおける自然の寄生条件下、陰性対照と比較して、ＦＡＷ、ＳＣＢ、及びＣＥＷに対する抵抗性をもたらした。
【０１６０】
事象ＭＯＮ９５３７９は、プエルトリコにおいて三（３）回の生育期（２０１６年１月、２０１６年７月、及び２０１７年１月）にわたり、市販のトウモロコシ事象（ＭＯＮ８９０３４、これはＣｒｙ１ａ．１０５及びＣｒｙ２Ａｂ２を発現する）に耐性のＦＡＷに対する抵抗性に関しても評価した。表１１は、表６に示したスケールに基づいて、事象ＭＯＮ８９０３４及び陰性対照と比較した三（３）回の生育期の各々に関する葉の損傷等級の平均を示す。
表１１．事象ＭＯＮ８９０３４耐性ＦＡＷで自然に寄生された事象ＭＯＮ９５３７９及び事象ＭＯＮ８９０３４に関する葉の損傷等級の平均
【表１１】
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【０１６１】
表１１に見られるように、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９は、陰性対照と比較して、高い自然圧力下で事象ＭＯＮ８９０３４耐性ＦＡＷに対する抵抗性を実証した。
【０１６２】
２０１７年の夏に、事象ＭＯＮ９５３７９を、２０１６年の夏に関して記載したものと同様の方法を用い、米国にて、ＦＡＷ、ＳＷＣＢ、及びＣＥＷに対する抵抗性について評価した。ＦＡＷ抵抗性は、三（３）箇所、すなわち、イリノイ州ジャージービル、イリノイ州トーマスボロ、及びイリノイ州モンマスにてアッセイした。各場所で、各事象は、三（３）つの圃場試験区にて、試験区当たり一（１）列及び１列当たり三十（３０）個の種子を使用してアッセイした。四十（４０）匹のＦＡＷ新生体を使用して、各植物に２度寄生させた。最初の寄生はＶ５期付近で行った。イリノイ州モンマス及びイリノイ州ジャージービルでの植物に対する二度目の寄生は、Ｖ８期付近で行った。低孵化率及び悪天候のため、イリノイ州トーマスボロでは二度目の寄生は不可能であった。表６に示したスケールを使用して、ＦＡＷによる葉の摂食損傷等級を評価した。
【０１６３】
ＳＷＣＢ抵抗性は、三（３）箇所、すなわち、アーカンソー州ジョーンズボロの一（１）箇所、及びイリノイ州ユニオンシティの二（２）箇所でアッセイした。各場所で、各事象は、三（３）つの圃場試験区にて、試験区当たり一（１）列及び１列当たり三十（３０）個の種子を使用してアッセイした。三十（３０）匹のＳＷＣＢ新生体を使用して、各植物に２度寄生させた。通常の条件下では、最初の寄生は中期輪生体段階（Ｖ７〜Ｖ８）で列の半分に行うが、寄生は約１週間遅れた。それにもかかわらず、高い昆虫圧力が確立された。花粉が五十パーセント（５０％）落ちた時点で、植物の列の後半に、植物当たり三十（３０）匹のＳＷＣＢ新生体を寄生させた。茎のトンネル損傷を、前述の通りに評価した。
【０１６４】
ＣＥＷ抵抗性は、六（６）箇所、すなわち、イリノイ州ジャージービル、アーカンソー州ジョーンズボロ、アーカンソー州パラゴルド、イリノイ州モンマス、及びテネシー州ユニオンシティの二箇所でアッセイした。各場所で、各事象は、三（３）つの圃場試験区にて、試験区当たり一（１）列及び１列当たり三十（３０）個の種子を使用してアッセイした。昆虫の不足のため、イリノイ州モンマス及びイリノイ州ジャージービルでの寄生は、絹糸が新鮮かつ緑色の時点よりも二（２）〜三（３）週間遅れて寄生させた。モンマスでは、約二十二（２２）匹の新生体を使用して各植物に寄生させた。イリノイ州ジャージービルでは、二十三（２３）〜二十四（２４）匹の新生体を使用して、一部開いたトウモロコシの穂に寄生させた。アーカンソー州ジョーンズボロでは、三（３）列のうちの一（１）列には、植物当たり約三十（３０）匹の新生体を与え、他の二（２）列には、植物当たり十六（１６）〜（１８）匹の新生体を与えた。アーカンソー州パラグールドでは、三（３）列すべてに植物当たり約三十（３０）匹の新生体を与えた。テネシー州ユニオンシティの二箇所では、昆虫の入手可能性に起因して寄生が遅れた。両方の場所で、植物当たり十八（１８）匹の新生体を与えた。穂の損傷の評価は、寄生の二十一（２１）〜二十八（２８）日後に特定した。穂の損傷は前述の通りに表した。人工的な寄生は、マーカー含有及びマーカーフリーの両事象ＭＯＮ９５３７９植物で行った。さらに、マーカー含有事象ＭＯＮ９５３７９植物用の場所で、自然の昆虫圧力を使用したアッセイも行った。表１２及び１３は、マーカー含有及びマーカーフリーの事象ＭＯＮ９５３７９植物のＦＡＷによる葉の損傷等級、ＳＷＣＢによるトンネル長さ、及びＣＥＷによる穂の損傷を示す。
表１２．人工的及び自然の寄生条件下、選択マーカーのＣｒｅ切除前の事象ＭＯＮ９５３７９植物のＦＡＷによる葉の損傷等級、ＳＷＣＢによるトンネル長さ、及びＣＥＷによる穂の損傷の平均。
【表１２】
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表１３．人工寄生下、マーカーフリーの事象ＭＯＮ９５３７９植物のＦＡＷによる葉の損傷等級、ＳＷＣＢによるトンネル長さ、及びＣＥＷによる穂の損傷の平均。
【表１３】
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【０１６５】
表１２及び１３に見られるように、事象ＭＯＮ９５３７９は、人工（マーカー含有及びマーカーフリー）ならびに自然（マーカーフリー）の寄生条件下で、ＦＡＷ、ＳＷＣＢ、及びＣＥＷに対する抵抗性をもたらした。
【０１６６】
２０１８年、ブラジルでの圃場試験において自然の寄生条件下、事象ＭＯＮ９５３７９と事象ＭＯＮ８９０３４のハイブリッド交配種を、ＦＡＷに対する抵抗性に関してアッセイした。圃場試験は、ゴイアス州サンタエレナデゴイアスで行った。この場所には、遺伝子組み換えトウモロコシ事象ＭＯＮ８９０３４に耐性のあるＦＡＷ集団が存在する。事象ＭＯＮ９５３７９×ＭＯＮ８９０３４交配種に対応する遺伝子組み換えトウモロコシ植物、事象ＭＯＮ８９０３４、及び従来のトウモロコシ植物（陰性対照）を植えた。Ｖ６期において、葉の損傷等級スコアを、事象ＭＯＮ９５３７９×ＭＯＮ８９０３４の交配種に対応する六十（６０）本の植物、事象ＭＯＮ８９０３４に対応する三十（３０）本の植物、及び三十（３０）本の陰性対照について、表６に示したスケールを用いて測定した。さらに、ＦＡＷ新生体、二ミリメートル（２ｍｍ）を超え、１．５センチメートル以下の幼虫、及び１．５センチメートルを超える幼虫の数を各植物について記録した。表１４は、事象ＭＯＮ９５３７９×ＭＯＮ８９０３４交配種、事象ＭＯＮ８９０３４、及び陰性対照の葉の損傷等級の平均ならびにこれらトウモロコシ植物で観察された新生体及び幼虫の数を示す。
表１４．事象ＭＯＮ９５３７９×ＭＯＮ８９０３４交配種、事象ＭＯＮ８９０３４及び陰性対照に関するブラジルの２０１８年の圃場試験からのＦＡＷによる葉の損傷等級の平均ならびに新生体及び幼虫の数
【表１４】
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【０１６７】
表１４に見られるように、事象ＭＯＮ９５３７９×ＭＯＮ８９０３４の交配種は、自然の寄生条件下、陰性対照と比較して、ＦＡＷに対する抵抗性をもたらした。事象ＭＯＮ９５３７９×ＭＯＮ８９０３４の交配種はまた、事象ＭＯＮ８９０３４耐性ＦＡＷがＦＡＷの集団内に存在する条件下で、事象ＭＯＮ８９０３４より良い成績を収めた。新生体及び幼虫に関しては、事象ＭＯＮ９５３７９×ＭＯＮ８９０３４の交配種に対応する植物では観察されなかった。事象ＭＯＮ８９０３４植物で二（２）ミリメートル〜一センチメートル半（１．５）の新生体及び幼虫が観察された。陰性対照植物は、事象ＭＯＮ８９０３４植物よりもさらに多くの幼虫を有することが観察され、１．５センチメートルを超えて成長した幼虫を有していた。
【０１６８】
実施例５
モロコシマダラメイガに対するトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の活性のアッセイ
本実施例は、鱗翅目害虫であるモロコシマダラメイガ（ＬＳＣＢ、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）に対する組み換えトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の活性のアッセイを記載する。
【０１６９】
事象ＭＯＮ９５３７９を、陰性対照植物とともに温室で栽培し、これらにＬＳＣＢ新生体を寄生させた。十（１０）本の事象ＭＯＮ９５３７９植物及び九（９）本の陰性対照植物を個々のポットで栽培した。植え付けから九（９）日後、各植物に植物当たり十（１０）匹のＬＳＣＢ新生体を感染させた。寄生から二十二（２２）日後、表１５に示した０〜４の損傷等級スケールを使用して、これらの植物を調べ、損傷を等級に分けた。
表１５．ＬＳＣＢによる植物の損傷等級スケール。
【表１５】
2021532744.tif 000020
【０１７０】
各植物に関して得られたＬＳＣＢ損傷等級を表１６に示す。
表１６．各寄生植物に関するＬＳＣＢによる植物の損傷。
【表１６】
2021532744.tif 000021
【０１７１】
表１６に見られるように、ＬＳＣＢは、陰性対照植物に広範囲の損傷を与え、そのうち四（４）本は「枯れ」として等級に分けられ、四（４）本は「重大な損傷」として等級に分けられ、一（１）本のみが「中程度の損傷」として等級に分けられた。対照的に、ＬＳＣＢが寄生した事象ＭＯＮ９５３７９植物は損傷を示さなかった。
【０１７２】
遺伝子組み換えトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９は、モロコシマダラメイガ（ＬＳＣＢ、Ｅｌａｓｍｏｐａｌｐｕｓ  ｌｉｇｎｏｓｅｌｌｕｓ）に対する抵抗性をもたらした。
【０１７３】
実施例６
トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９は、非形質転換ＬＨ２４４トウモロコシ植物に一貫した収量及び同様の農学を提供する
本実施例は、遺伝子組み換えトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９が、非形質転換ＬＨ２４４トウモロコシ植物に対して圃場での一貫した収量及び同様の農学をもたらすことを実証する。
【０１７４】
グリホサート選択カセットのＣｒｅ切除前の事象ＭＯＮ９５３７９に対応する植物を用いて圃場試験を実施し、対照植物と比較した収量及び農学の様々な態様を特定した。収量の測定値を計算し、１エーカー当たりのブッシェル（ｂｕ／エーカー）として表した。植物の高さと穂の高さをインチ（ｉｎ）単位で測定した。五十パーセント（５０％）の花粉の落下及び五十パーセント（５０％）のシルキングを植え付け後の日数（ＤＡＰ）で表した。穀物のかさ密度、すなわち、単位体積の重量の大きさである容積重を、ポンド・パー・ブッシェル（ｌｂ／ｂｕ）で表した。ＵＳＤＡは、水分含量１５．５％を基に、１ブッシェルのトウモロコシの標準容積重を五十六ポンド・パー・ブッシェル（５６ｌｂ／ｂｕ）と定めた。トウモロコシの穀粒の水分率は、湿重量ベースで表した。水分含量は種子中の水の量であり、通常はパーセンテージで表される。それは、湿重量ベース（種子の生体重のパーセンテージとして表される場合）または乾燥重量ベース（種子の乾燥重量のパーセンテージとして表される場合）のいずれかで表すことができる。水分率の特定は、種子を破壊する。水分率（湿潤ベース）は、以下の簡単な式で計算され得る：
Ｍｗｂ＝（Ｗｗ／Ｗｗ＋Ｗｄ）×１００
式中、Ｗｗは水の重量に等しく、Ｗｄは乾物重量に等しい。
【０１７５】
米国での２０１６年の生育期に、グリホサートマーカーカセットのＣｒｅ切除前の事象ＭＯＮ９５３７９近交系及びハイブリッドの収量及び農学的測定値を特定した。表１７及び１８は、それぞれ、事象ＭＯＮ９５３７９の近交系及びハイブリッドについて測定された収量及び農学特性を示す。近交系の比較用の陰性対照植物は、非形質転換品種ＬＨ２４４であった。事象ＭＯＮ９５３７９を含むハイブリッドは、近交系事象ＭＯＮ９５３７９をトウモロコシ品種９３ＩＤＩ３と他家受粉することによって創出し、非形質転換対照は、ＬＨ２４４×９３ＩＤＩ３交配種であった。
表１７．非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９近交系に関する収量及び農学。
【表１７】
2021532744.tif 000022
表１８．非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９ハイブリッドに関する収量及び農学。
【表１８】
2021532744.tif 000023
【０１７６】
表１７及び１８に見られるように、２０１６年の米国の圃場試験での事象ＭＯＮ９５３７９の収量及び他の農学的測定値は、対照と比較して、近交系及びハイブリッドの両方で相対的に同じであった。近交系及びハイブリッドならびにそれらのそれぞれの対照間の変動は、許容範囲内であり、これにより、事象ＭＯＮ９５３７９のトウモロコシゲノムへのＴ−ＤＮＡの挿入によって、収量及び他の農学特性に悪影響がなかったことが実証された。
【０１７７】
アルゼンチンでの２０１６〜２０１７年の生育期に、グリホサートマーカーカセットのＣｒｅ切除前の事象ＭＯＮ９５３７９近交系及びハイブリッドの収量及び農学も調べた。表１９及び２０は、事象ＭＯＮ９５３７９近交系について測定された収量及び農学特性を示す。近交系の比較用の陰性対照植物は、非形質転換品種ＬＨ２４４であった。事象ＭＯＮ９５３７９を含むハイブリッドは、事象ＭＯＮ８９０３４×ＭＯＮ８９５３７９を他家受粉することによって創出した。遺伝子組み換え対照は、事象ＭＯＮ８８０１７×事象ＭＯＮ８９０３４であった。非遺伝子組み換え対照は、ＬＨ２４４×９３ＩＤＩ３交配種であった。表２１は、事象ＭＯＮ９５３７９ハイブリッドについて測定された収量及び農学特性を示しており、「ＮＣ」は計算されていないことを示す。
表１９．非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９近交系に関する収量及び農学。
【表１９】
2021532744.tif 000024
表２０．非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９近交系に関する収量及び農学。
【表２０】
2021532744.tif 000025
表２１．遺伝子組み換え及び非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９ハイブリッドに関する収量及び農学。
【表２１】
2021532744.tif 000026
【０１７８】
表１９〜２１に見られるように、これらの収量及び他の農学特性の測定値は、対照と比較して、事象ＭＯＮ９５３７９の近交系及びハイブリッドで相対的に同じであった。
【０１７９】
２０１７年の米国での圃場試験において、グリホサートマーカーカセットのＣｒｅ切除前の事象ＭＯＮ９５３７９近交系及びハイブリッドの収量及び農学を再度測定した。近交系及びハイブリッドの対照は、２０１６年の米国での圃場試験で使用されたものと同様であった。表２２は、非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９近交系の収量及び農学特性を示し、表２３及び２４は、２０１７年の米国での圃場試験において事象ＭＯＮ９５３７９ハイブリッドについて測定された収量及び農学特性を非遺伝子組み換え対照と比較して示す。
表２２．非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９近交系に関する収量及び農学。
【表２２】
2021532744.tif 000027
表２３．非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９ハイブリッドに関する収量及び農学。
【表２３】
2021532744.tif 000028
表２４．非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９ハイブリッドに関する収量及び農学。
【表２４】
2021532744.tif 000029
【０１８０】
表２２〜２４に見られるように、事象ＭＯＮ９５３７９が２０１７年の米国での圃場試験で実証された収量及び他の農学特性は、近交系及びハイブリッド系統の両方に対する非形質転換対照と同様であった。
【０１８１】
アルゼンチンでの２０１８〜２０１９年の生育期に、グリホサートマーカーカセットのＣｒｅ切除後の事象ＭＯＮ９５３７９近交系及びハイブリッドの圃場試験での農学及び収量を測定した。近交系の対照は、２０１７年の米国での圃場試験で使用されたものと同様であった。これらのハイブリッドは、エリート品種８０ＩＤＭ２との交配によって産生された。表２５及び２６は、非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９近交系の収量及び農学特性を示し、表２７は、２０１８〜２０１９年のアルゼンチンでの圃場試験において事象ＭＯＮ９５３７９ハイブリッドについて測定された収量及び農学特性を非遺伝子組み換え対照と比較して示す。
表２５．非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９近交系に関する収量及び農学。
【表２５】
2021532744.tif 000030
表２６．非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９近交系に関する収量及び農学。
【表２６】
2021532744.tif 000031
表２７．非遺伝子組み換え対照と比較した事象ＭＯＮ９５３７９ハイブリッドに関する収量及び農学。
【表２７】
2021532744.tif 000032
【０１８２】
表２５〜２７に見られるように、事象ＭＯＮ９５３７９が２０１７〜２０１８年のアルゼンチンでの圃場試験で実証された収量及び他の農学特性は、近交系及びハイブリッド系統の両方に対する非形質転換対照と同様であった。
【０１８３】
従って、要するに、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９は、米国及びアルゼンチンでの四（４）つの別々の生育期にわたって同様の収量及び他の農学特性を示した。事象ＭＯＮ９５３７９は、非遺伝子組み換え及び遺伝子組み換え対照と比較して、収量に悪影響を与えることも、測定された他の農学特性に変化を引き起こすこともない。
【０１８４】
実施例７
トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイ
以下の実施例は、トウモロコシサンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９の存在を特定するのに有用な方法を記載する。ＰＣＲプライマー対及びプローブを、トウモロコシゲノムＤＮＡと事象ＭＯＮ９５３７９の挿入ＤＮＡ間に形成された固有の結合部を事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲで特定する目的で設計した。トウモロコシサンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９の存在を事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲで特定するために使用した条件の例を表２８及び表２９に示す。
【０１８５】
オリゴヌクレオチドフォワードプライマーＳＱ２１５２９（配列番号１５）の配列は、配列番号１０の位置８３３〜８５２に対応するヌクレオチド配列と同一である。オリゴヌクレオチドリバースプライマーＳＱ２１５２４（配列番号１６）の配列は、配列番号１０の位置９０５〜９３４に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。オリゴヌクレオチドプローブＰＢ１０２６９（配列番号１７）の配列は、配列番号１０の位置８８６〜９０１に対応するヌクレオチド配列の逆相補体と同一である。プライマーＳＱ２１５２９（配列番号１５）及びＳＱ２１５２４（配列番号１６）とともに、蛍光標識（例えば、６−ＦＡＭ（商標）蛍光標識）されてもよいプローブＰＢ１０２６９（配列番号１７）をエンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲアッセイに使用し、サンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９に由来するＤＮＡの存在を特定することができる。
【０１８６】
ＳＱ２１５２９（配列番号１５）、ＳＱ２１５２４（配列番号１６）、及びＰＢ１０２６９（配列番号１７）に加えて、他のプライマー及び／またはプローブを、サンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９に由来するＤＮＡの存在を検出するのに固有かつ有用な配列番号１０内の配列を増幅またはこれにハイブリダイズするように設計することができることは、当業者には明らかであるはずである。
【０１８７】
標準的な分子生物学試験実施基準に従って、サンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９を検出するための事象識別用のＰＣＲアッセイを開発した。標準的なＰＣＲアッセイまたはＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲアッセイのパラメータを、サンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９に由来するＤＮＡの存在を検出するのに使用されるプライマー対とプローブ（例えば、蛍光タグ、例えば、６−ＦＡＭ（商標）で標識されたプローブ）の各セットで最適化した。ＰＣＲ反応の対照は、内部対照として使用されるトウモロコシゲノム内の領域に特異的な内部対照プライマー及び内部対照プローブ（例えば、ＶＩＣ（登録商標）標識）を含み、プライマーＳＱ２０２２２（配列番号１８）、ＳＱ２０２２１（配列番号１９）、及びＶＩＣ（登録商標）標識プローブＰＢ５０２３７（配列番号２０）である。
【０１８８】
概して、サンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９の検出用に最適化したパラメータは、プライマー及びプローブの濃度、鋳型ＤＮＡの量、ならびにＰＣＲ増幅サイクルのパラメータを含んでいた。この分析の対照は、事象ＭＯＮ９５３７９を含むトウモロコシ由来の陽性対照、非遺伝子組み換えトウモロコシ由来の陰性対照、及び鋳型ＤＮＡを含まない陰性対照を含む。
表２８．ＭＯＮ９５３７９事象特異的エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲ反応成分。
【表２８】
2021532744.tif 000033
表２９．エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）サーモサイクラー条件。
【表２９】
2021532744.tif 000034
【０１８９】
実施例８
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用した事象ＭＯＮ９５３７９の接合性を特定するためのアッセイ及び昆虫毒素導入遺伝子の検出
以下の実施例は、トウモロコシサンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９における事象ＭＯＮ９５３７９の接合性を特定するのに有用な方法及び昆虫毒素導入遺伝子の検出に有用な方法を記載する。ＰＣＲプライマー対及びプローブは、事象ＭＯＮ９５３７９を引き起こしたＴ−ＤＮＡ挿入に対して陽性及び陰性の対立遺伝子の特定の特性を特定する目的で設計される。
【０１９０】
接合性アッセイは、事象を含む植物がその事象のＤＮＡに対してホモ接合性である（すなわち、その染色体対の各染色体上の同じ位置に外因性ＤＮＡを含む）か、その事象のＤＮＡに対してヘテロ接合性である（すなわち、その染色体対の一方の染色体にのみ外因性ＤＮＡを含む）か、または野生型である（すなわち、その事象のＤＮＡに対してヌル）かどうかを特定するのに有用である。
【０１９１】
エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅法を使用して、事象ＭＯＮ９５３７９の接合性アッセイを開発した。このアッセイでは、プライマー対及びプローブを使用して、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の生成に使用されるＴ−ＤＮＡ内に含まれるＣｒｙ１Ｂ．８６８及びＣｒｙ１Ｄａ＿７をコードする２つの昆虫毒素コード配列の一方に対応するアンプリコンを検出する。さらに、プライマー対及びプローブを使用して、トウモロコシゲノム内に位置し、ホモ接合型対立遺伝子として存在することが既知の単一配列内部対照を検出する。
【０１９２】
このアッセイでは、二（２）つのプライマー対と二（２）つのプローブをサンプルと混合した。Ｃｒｙ１Ｂ．８６８毒素コード配列の存在を検出する接合性アッセイで使用したＤＮＡプライマーは、プライマーＳＱ５０９９８（配列番号２１）及びＳＱ５０９９７（配列番号２２）であった。Ｃｒｙ１Ｂ．８６８毒素コード配列の存在を検出する接合性アッセイで使用したＶＩＣ（登録商標）標識ＤＮＡプローブは、ＰＢ５４３４０（配列番号２３）であった。Ｃｒｙ１Ｄａ＿７毒素コード配列の存在を検出する接合性アッセイで使用したＤＮＡプライマーは、プライマーＳＱ５０４８５（配列番号２４）及びＳＱ５０４８４（配列番号２５）であった。Ｃｒｙ１Ｄａ＿７毒素コード配列の存在を検出する接合性アッセイで使用したＶＩＣ（登録商標）標識ＤＮＡプローブは、ＰＢ５０１３８（配列番号２６）であった。両方の接合性検出アッセイは、同じ内部対照を使用する。内部対照用のプライマーは、ＳＱ２０２２２（配列番号１８）及びＳＱ２０２２１（配列番号１９）であり、内部対照用の６ＦＡＭ（商標）標識プローブは、ＰＢ５０２３７（配列番号２０）であった。表３０及び３１に示すように、Ｃｒｙ１Ｂ．８６８またはＣｒｙ１Ｄａ＿７のいずれかのＤＮＡプライマー及びプローブを、内部対照用のプライマー及びプローブと混合した。
表３０．Ｃｒｙ１Ｂ．８６８検出用のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９接合性ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲ。
【表３０】
2021532744.tif 000035
表３１．Ｃｒｙ１Ｄａ＿７検出用のトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９接合性ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲ。
【表３１】
2021532744.tif 000036
【０１９３】
接合性が不明な葉のサンプル由来のＤＮＡ、非形質転換トウモロコシ植物由来のＤＮＡの陰性対照、ＤＮＡを欠く陰性対照、及びＣｒｙ１Ｂ．８６８またはＣｒｙ１Ｄａ＿７に対してホモ接合性の遺伝子組み換え植物由来のＤＮＡを使用した陽性対照を使用して、どの毒素コード配列が検出に使用されるかに応じて、別々の反応物を混合する。これらの反応物をその後表３２に示した熱サイクルに供する。
表３２．接合性ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）サーモサイクラー条件。
【表３２】
2021532744.tif 000037
【０１９４】
増幅後、毒素コード配列及び単一配列ホモ接合性内部標準に対応するアンプリコンのサイクル閾値（Ｃｔ値）を特定した。単一配列ホモ接合性内部標準アンプリコンのＣｔ値と毒素コード配列アンプリコンのＣｔ値の差（ΔＣｔ）を特定した。接合性に関しては、ΔＣｔ約ゼロ（０）は、挿入事象ＭＯＮ９５３７９Ｔ−ＤＮＡのホモ接合性を示し、ΔＣｔ約一（１）は、挿入事象ＭＯＮ９５３７９Ｔ−ＤＮＡのヘテロ接合性を示した。昆虫毒素コード配列に対応するアンプリコンの欠如は、そのサンプルが挿入事象ＭＯＮ９５３７９Ｔ−ＤＮＡに関してヌルであることを示した。ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）熱増幅法のＣｔ値は、複数の要因、例えば、増幅効率及び理想的なアニーリング温度により、ある程度の変動がある。従って、「約一（１）」の範囲は、ΔＣｔ０．７５〜１．２５として定義される。
【０１９５】
事象ＭＯＮ９５３７９との交配から得られた各後代について、後代の接合性の特定における正確さを確保するために、両方の毒素コード配列のアッセイを実施した。
【０１９６】
実施例９
ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）を使用したトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の接合性を特定するためのアッセイ
以下の実施例は、トウモロコシサンプル中の事象ＭＯＮ９５３７９の接合性を特定するのに有用な方法を記載する。
【０１９７】
ＰＣＲプライマー対及びプローブは、事象ＭＯＮ９５３７９を引き起こしたＴ−ＤＮＡ挿入に対して陽性及び陰性の対立遺伝子の特定の特性を特定する目的で設計される。事象特異的接合性ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲに使用され得る条件の例を表３３及び３４に示す。このアッセイでは、三つのプライマー及び二つのプローブをサンプルと混合した。接合性アッセイで使用したＤＮＡプライマーは、プライマーＳＱ５０２１９（配列番号１５）、ＳＱ２１５２４（配列番号１６）、及びＰＷＴＤＮＡ（配列番号２７）であった。接合性アッセイで使用したプローブは、６ＦＡＭ（商標）標識プローブＰＢ１０２６９（配列番号１７）及びＶＩＣ（登録商標）標識プローブＰＲＷＴＤＮＡ（配列番号２８）であった。プライマーＳＱ５０２１９（配列番号１５）及びＳＱ２１５２４（配列番号１６）ならびに６ＦＡＭ（商標）標識プローブＰＢ１０２６９（配列番号１７）は、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの診断となる。ＳＱ５０２１９（配列番号１５）及びＰＷＴＤＮＡ（配列番号２７）ならびにＶＩＣ（登録商標）標識プローブＰＲＷＴＤＮＡ（配列番号２８）は、事象ＭＯＮ９５３７９のコピーがない場合の診断、すなわち、それらが野生型対立遺伝子の診断になる。
【０１９８】
ＰＣＲ反応でこれら３つのプライマーと２つのプローブを事象ＭＯＮ９５３７９に対してヘテロ接合性の植物から抽出したＤＮＡと混合した場合、６ＦＡＭ（商標）標識プローブＰＢ１０２６９（配列番号１７）及びＶＩＣ（登録商標）標識プローブＰＲＷＴＤＮＡ（配列番号２８）の両方からの蛍光信号が存在し、これが、事象ＭＯＮ９５３７９に対して植物がヘテロ接合性であることを示し、その診断となる。ＰＣＲ反応でこれら３つのプライマーと２つのプローブを事象ＭＯＮ９５３７９に対してホモ接合性の植物から抽出したＤＮＡと混合した場合、６ＦＡＭ（商標）標識プローブＰＢ１０２６９（配列番号１７）のみからの蛍光信号が存在し、ＶＩＣ（登録商標）標識プローブＰＲＷＴＤＮＡ（配列番号２８）からの蛍光信号は存在しない。ＰＣＲ反応でこれら３つのプライマーと２つのプローブを事象ＭＯＮ９５３７９に対してヌルの植物（すなわち、野生型）から抽出したＤＮＡと混合した場合、ＶＩＣ（登録商標）標識プローブＰＲＷＴＤＮＡ（配列番号２８）のみからの蛍光信号が存在する。この分析の鋳型ＤＮＡサンプル及び対照は、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡを含むトウモロコシから（既知のホモ接合性及び既知のヘテロ接合性サンプルの両方から）の陽性対照、非遺伝子組み換えトウモロコシからの陰性対照ならびに鋳型ＤＮＡを含まない陰性対照であった。
表３３．事象ＭＯＮ９５３７９接合性ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）ＰＣＲ
【表３３】
2021532744.tif 000038
表３４．接合性ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）サーモサイクラー条件
【表３４】
2021532744.tif 000039
【０１９９】
実施例１０
任意のＭＯＮ９５３７９育種事象におけるトウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の識別
以下の実施例は、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９を使用した任意の育種活動の後代内のＭＯＮ９５３７９事象を識別し得る方法を記載する。
【０２００】
ＤＮＡプライマー対を使用し、トウモロコシ事象ＭＯＮ９５３７９の診断となるアンプリコンを生成する。事象ＭＯＮ９５３７９の診断となるアンプリコンは、少なくとも１つの結合部の配列を含む。事象ＭＯＮ９５３７９の結合部の配列は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、及び配列番号８（それぞれ、図１の［１］、［２］、［３］、［４］、［５］、［６］、［７］、及び［８］）である。配列番号１は、トウモロコシゲノムＤＮＡの５’結合領域及び組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットを表す五十（５０）ヌクレオチドの配列である。配列番号１は、配列番号１０のヌクレオチド位置８３８〜８８７に位置する。配列番号２は、トウモロコシゲノムＤＮＡの３’結合領域及び組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットを表す五十（５０）ヌクレオチドの配列である。配列番号２は、配列番号１０のヌクレオチド位置１４１５６〜１４２０５に位置する。配列番号３は、トウモロコシゲノムＤＮＡの５’結合領域及び組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットを表す百（１００）ヌクレオチドの配列である。配列番号３は、配列番号１０のヌクレオチド位置８１３〜９１２に位置する。配列番号４は、トウモロコシゲノムＤＮＡの３’結合領域及び組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットを表す百（１００）ヌクレオチドの配列である。配列番号４は、配列番号１０のヌクレオチド位置１４，１３１〜１４，２３０に位置する。配列番号５は、トウモロコシゲノムＤＮＡの５’結合領域及び組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットを表す二百（２００）ヌクレオチドの配列である。配列番号５は、配列番号１０のヌクレオチド位置７６３〜９６２に位置する。配列番号６は、トウモロコシゲノムＤＮＡの３’結合領域及び組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットを表す二百（２００）ヌクレオチドの配列である。配列番号６は、配列番号１０のヌクレオチド位置１４，０８１〜１４，２８０に位置する。配列番号７は、トウモロコシゲノムＤＮＡの５’結合領域及び組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットを表す千百六十（１，１６０）ヌクレオチドの配列である。配列番号７は、配列番号１０のヌクレオチド位置１〜１，１６０に位置する。配列番号８は、組み込まれた遺伝子組み換え発現カセットの３’結合領域及びトウモロコシゲノムＤＮＡを表す千百七十八（１，１７８）ヌクレオチドの配列である。配列番号８は、配列番号１０のヌクレオチド位置１４，０３９〜１５，２１６に位置する。
【０２０１】
事象ＭＯＮ９５３７９の診断となるアンプリコンを生成するプライマー対は、隣接配列（配列番号１１及び配列番号１２）ならびに挿入Ｔ−ＤＮＡ（配列番号９）に基づくプライマー対を含む。配列番号１、または配列番号３、または配列番号５、または配列番号７が見出される診断アンプリコンを得るため、５’隣接トウモロコシゲノムＤＮＡ（配列番号１１、配列番号１０の塩基１〜８６２）を基にしてフォワードプライマー分子を設計し、挿入Ｔ−ＤＮＡ（配列番号９、配列番号１０の位置８６３〜１４，１８０）を基にしてリバースプライマー分子を設計する。この場合、これらプライマー分子は、配列番号１１及び配列番号９に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの連続したヌクレオチドである。配列番号２、または配列番号４、または配列番号６、または配列番号８が見出される診断アンプリコンを得るため、挿入Ｔ−ＤＮＡ（配列番号９、配列番号１０の位置８６３〜１４，１８０）を基にしてフォワードプライマー分子を設計し、３’隣接トウモロコシゲノムＤＮＡ（配列番号１２、配列番号１０の位置１４，１８１〜１５，２１６）を基にしてリバースプライマー分子を設計する。この場合、これらプライマー分子は、配列番号９及び配列番号１２に特異的にハイブリダイズするのに十分な長さの連続したヌクレオチドである。
【０２０２】
実際上は、限られたサイズ範囲、好ましくは、２００〜１０００塩基のアンプリコンを生成するプライマーを設計する必要がある。より小さなサイズのアンプリコンは、通常、ＰＣＲ反応でより確実に生成され、サイクル時間を短くし、容易にアガロースゲルでの分離及び可視化をすることもできれば、エンドポイントＴＡＱＭＡＮ（登録商標）様アッセイでの使用に適している場合もある。さらに、該プライマー対を使用して生成されたアンプリコンは、ベクターにクローニングし、増殖させ、単離し、配列決定することもできれば、当技術分野で確立された方法で直接配列決定することもできる。事象ＭＯＮ９５３７９またはその後代の診断となるアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅法に有用な配列番号１１と配列番号９、または配列番号１２と配列番号９の組み合わせに由来する任意のプライマー対は、本発明の態様である。事象ＭＯＮ９５３７９またはその後代の診断となるアンプリコンを生成するＤＮＡ増幅法に有用な配列番号１１、配列番号９または配列番号１２またはそれらの相補体の少なくとも十一（１１）個の連続したヌクレオチドを含む任意の単一の単離されたＤＮＡポリヌクレオチドプライマー分子は、本発明の態様である。
【０２０３】
この分析の増幅条件の例を表２８及び２９に示す。事象ＭＯＮ９５３７９の診断となるアンプリコンを生成するこれらの方法の任意の修飾または配列番号１１もしくは配列番号１２に相同もしくは相補的なＤＮＡプライマーの使用、または事象ＭＯＮ９５３７９の導入遺伝子挿入物（配列番号９）に含まれる遺伝要素のＤＮＡ配列は、当技術分野の範囲内である。診断アンプリコンは、少なくとも１つの導入遺伝子／ゲノム結合ＤＮＡまたはその実質的な部分に相同または相補的なＤＮＡ分子を含む。
【０２０４】
植物組織サンプルを含む事象ＭＯＮ９５３７９の分析は、事象ＭＯＮ９５３７９を含む植物由来の陽性組織対照、事象ＭＯＮ９５３７９を含まないトウモロコシ植物由来の陰性対照（例えば、ＬＨ２４４）、及びトウモロコシのゲノムＤＮＡを含まない陰性対照を含むべきである。プライマー対は、内因性のトウモロコシＤＮＡ分子を増幅し、ＤＮＡ増幅条件の内部対照として機能する。さらなるプライマー配列は、ＤＮＡ増幅法の技術に精通した業者によって、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号９から選択することができる。表２８及び表２９に示した方法によるアンプリコンの生成用に選択される条件は異なる場合があるが、事象ＭＯＮ９５３７９ＤＮＡの診断となるアンプリコンが生じる。表２８及び表２９の方法内の、またはそれらを修飾したＤＮＡプライマー配列の使用は、本発明の範囲内である。事象ＭＯＮ９５３７９の診断となる、配列番号１１、配列番号１２、または配列番号９に由来する少なくとも１つのＤＮＡプライマー配列によって生成されるアンプリコンは、本発明の態様である。
【０２０５】
ＤＮＡ増幅法に使用した場合に事象ＭＯＮ９５３７９またはその後代の診断アンプリコンを生成する配列番号１１、配列番号１２、または配列番号９に由来する十分な長さの連続したヌクレオチドの少なくとも１つのＤＮＡプライマーを含むＤＮＡ検出キットは、本発明の態様である。ＤＮＡ増幅法で試験した場合、そのゲノムが事象ＭＯＮ９５３７９の診断となるアンプリコンを生成するトウモロコシ植物または種子は、本発明の態様である。事象ＭＯＮ９５３７９のアンプリコンのアッセイは、表２９に示す通り、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＧｅｎｅＡｍｐ（商標）ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ  ９７００、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ  Ｒｏｂｏｃｙｃｌｅｒ（登録商標）、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ（登録商標）Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ（登録商標）Ｇｒａｄｉｅｎｔサーモサイクラーまたは事象ＭＯＮ９５３７９の診断となるアンプリコンを生成するのに使用することができる任意の他の増幅システムを使用して行われ得る。
【０２０６】
本明細書に引用され、本発明にとって重要であるすべての刊行物及び公開特許文書は、個々の刊行物または特許出願が、参照することにより組み込まれることが具体的かつ個別に示された場合と同程度に、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【０２０７】
本発明の原理を例示及び説明したため、当業者には、かかる原理から逸脱することなく、本発明が配置及び詳細において修飾され得ることが明らかであるはずである。本出願人らは、添付の特許請求の範囲の主旨及び範囲内にあるすべての修飾を主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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