(57)【要約】  本発明は、骨髄性白血病の治療のための方法における使用のための、ＣＤ３３などの標的に特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＣＤ３などのエフェクターに特異的に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトであって、少なくとも２つの段階を含む段階的な投与を適用する、１４日間を超える１つ以上の治療サイクルであって、治療サイクル後、任意選択により、コンストラクトの投与を伴わない期間が続く、１つ以上の治療サイクルにおいて投与される、二重特異性抗体コンストラクトを提供する。さらに、本発明は、治療有効量のそのような二重特異性抗体コンストラクトの投与を含む、骨髄性白血病の治療のための方法及び骨髄性白血病の治療のための医薬組成物の調製のためのそのような二重特異性抗体コンストラクトの使用を提供する。
2021532140.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
好ましくは骨髄性白血病の治療のための方法における使用のための、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトであって、１つ以上の治療サイクルにおいて投与され、少なくとも１つの治療サイクルは、少なくとも２つの投与段階を適用する、少なくとも３つの異なる投与量における前記二重特異性抗体コンストラクトの１４日を超える投与を含み、任意選択により、その後、前記コンストラクトの投与を伴わない期間が続き、
前記二重特異性抗体コンストラクトは、以下の工程：
（ａ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第１の投与量の投与、続いて
（ｂ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第２の投与量の投与であって、前記第２の投与量は、前記第１の投与量を超える、投与、続いて
（ｃ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第３の投与量の投与であって、前記第３の投与量は、前記第２の投与量を超える、投与、任意選択により、続いて
（ｄ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第４の投与量の投与であって、前記任意選択による第４の投与量は、前記第３の投与量を超える、投与
を含むスケジュールに従って前記１つ以上の治療サイクルの少なくとも１つで投与される、二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項２】
１つの治療サイクルにおいて前記二重特異性抗体コンストラクトを投与する期間は、少なくとも１５日、好ましくは１５〜６０日、より好ましくは２８〜５６日、好ましくは２８日である、請求項１に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項３】
工程（ａ）における前記第１の投与量は、１日当たり少なくとも５μｇ、好ましくは１日当たり５〜２０μｇの範囲、より好ましくは１日当たり１０μｇであり、工程（ｂ）における前記第２の投与量は、１日当たり少なくとも３０μｇ、好ましくは１日当たり３０〜２４０μｇの範囲、より好ましくは１日当たり６０又は２４０μｇであり、且つ工程（ｃ）における前記第３の投与量及び工程（ｄ）における前記任意選択による第４の投与量は、１日当たり少なくとも２４０μｇ、好ましくは１日当たり２４０〜１５００μｇの範囲、好ましくは１日当たり２４０〜９６０μｇの範囲、より好ましくは１日当たり４８０〜９６０μｇの範囲である、請求項１又は２に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項４】
工程（ａ）における前記第１の投与量の投与の期間は、１〜４日、好ましくは２又は３日であり、工程（ｂ）における前記第２の投与量の投与の期間は、２〜５日、好ましくは２又は３日であり、且つ工程（ｃ）における前記第３の投与量及び工程（ｄ）における前記任意選択による第４の投与量の投与の期間は、ともに７〜５２日、好ましくは１４〜５２日、より好ましくは２２、２３又は５２日である、請求項１に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項５】
前記骨髄性白血病の前記治療は、２つ以上の治療サイクル、好ましくは２、３、４、５、６又は７つの治療サイクルを含み、少なくとも１、２、３、４、５、６又は７つの治療サイクルは、１４日を超える二重特異性抗体コンストラクト投与を含む、請求項２〜４のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項６】
少なくとも１つの治療サイクル後、前記コンストラクトの投与を伴わない期間、好ましくは治療を伴わない少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日が続く、請求項２〜５のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項７】
少なくとも１つの治療サイクル後、前記コンストラクトの投与を伴わない期間が続かない、請求項２〜５のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項８】
前記治療の第１のサイクルのみは、工程（ａ）による前記投与を含む一方、その後のサイクルは、工程（ｂ）による前記用量で開始する、請求項５〜７のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項９】
一本鎖二重特異性抗体コンストラクトである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項１０】
前記二重特異性抗体コンストラクトの前記第１の結合ドメインは、配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００、好ましくは９４〜９６及び９８〜１００からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項１１】
前記二重特異性抗体コンストラクトの前記第２の結合ドメインは、配列番号１４８〜１５３、１５４〜１５９、１６０〜１６５、１６６〜１７１、１７２〜１７７、１７８〜１８３、１８４〜１８９、１９０〜１９５、１９６〜２０１及び２０２〜２０７、好ましくは２０２〜２０７からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項１２】
配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８からなる群から選択される、好ましくは配列番号１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８、より好ましくは配列番号１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む一本鎖コンストラクトである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項１３】
ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤並びに／又はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシ尿素、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストンデメチラーゼ阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランス型レチノイン酸）からなる群から選択される１つ以上のエピジェネティック因子と組み合わせて投与され、
（ａ）前記ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤及び／又は１つ以上のエピジェネティック因子は、前記二重特異性抗体コンストラクトの前記投与前に投与されるか；
（ｂ）前記ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤及び／又は１つ以上のエピジェネティック因子は、前記二重特異性抗体コンストラクトの前記投与後に投与されるか；又は
（ｃ）前記ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤及び／又は１つ以上のエピジェネティック因子並びに前記二重特異性抗体コンストラクトは、同時に投与される、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項１４】
前記ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤及び／又は１つ以上のエピジェネティック因子は、前記二重特異性抗体コンストラクトの投与の７日前まで投与される、請求項１３に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項１５】
前記エピジェネティック因子は、ヒドロキシ尿素である、請求項１４に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項１６】
前記骨髄性白血病は、急性骨髄芽球性白血病、好ましくは再発性又は難治性急性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤白血病、真性多血症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄肉腫及び急性混合性白血病からなる群から選択される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の使用のための二重特異性抗体コンストラクト。
【請求項１７】
骨髄性白血病の治療を、それを必要とする患者において行うのための方法であって、１つ以上の治療サイクルにおいて、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトを投与することを含み、前記少なくとも１つの治療サイクルは、少なくとも２つの投与段階を適用する、少なくとも３つの異なる投与量における前記二重特異性抗体コンストラクトの１４日を超える投与を含み、
前記二重特異性抗体コンストラクトは、以下の工程：
（ａ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第１の投与量の投与、続いて
（ｂ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第２の投与量の投与であって、前記第２の投与量は、前記第１の投与量を超える、投与、続いて
（ｃ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第３の投与量の投与であって、前記第３の投与量は、前記第２の投与量を超える、投与、任意選択により、続いて
（ｄ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第４の投与量の投与であって、前記任意選択による第４の投与量は、前記第３の投与量を超え、任意選択により、その後、前記コンストラクトの投与を伴わない期間が続く、投与
を含むスケジュールに従って１つの治療サイクルで投与される、方法。
【請求項１８】
１つの治療サイクルにおいて前記二重特異性抗体コンストラクトを投与する期間は、少なくとも１５日、好ましくは１５〜６０日、より好ましくは２８〜５６日、好ましくは２８日である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
工程（ａ）における前記第１の投与量は、１日当たり少なくとも５μｇ、好ましくは１日当たり５〜２０μｇの範囲、より好ましくは１日当たり１０μｇであり、工程（ｂ）における前記第２の投与量は、１日当たり少なくとも３０μｇ、好ましくは１日当たり３０〜２４０μｇの範囲、好ましくは１日当たり６０又は２４０μｇであり、且つ工程（ｃ）における前記第３の投与量及び任意選択による工程（ｄ）における前記任意選択による第４の投与量は、１日当たり少なくとも２４０μｇ、好ましくは１日当たり１２０〜１５００μｇ、好ましくは１日当たり２４０〜９６０μｇ、より好ましくは１日当たり４８０〜９６０μｇの範囲である、請求項１７又は１８に記載の方法。
【請求項２０】
工程（ａ）における前記第１の投与量の投与の期間は、１〜４日、好ましくは２又は３日であり、工程（ｂ）における前記第２の投与量の投与の期間は、２〜５日、好ましくは２又は３日であり、且つ工程（ｃ）及び任意選択による工程（ｄ）における前記第３の用量及び前記任意選択による第４の用量の投与の期間は、７〜５２日、好ましくは１４〜２３日、より好ましくは２２、２３、５０又は５２日である、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記骨髄性白血病の前記治療は、２つ以上の治療サイクル、好ましくは２、３、４、５、６又は７つの治療サイクルを含み、少なくとも１、２、３、４、５、６又は７つの治療サイクルは、１４日を超える二重特異性抗体コンストラクト投与を含む、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記治療後、前記二重特異性抗体コンストラクトの投与を伴わない期間、好ましくは治療を伴わない少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日が続く、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記治療後、前記二重特異性抗体コンストラクトの投与を伴わない少なくとも１４日の期間が続く、請求項１７〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記治療の第１のサイクルのみは、工程（ａ）による前記投与を含む一方、その後のサイクルは、工程（ｂ）による前記用量で開始する、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記コンストラクトは、一本鎖二重特異性抗体コンストラクトである、請求項１７〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記二重特異性抗体コンストラクトの前記第１の結合ドメインは、配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００、好ましくは９４〜９６及び９８〜１００からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含む、請求項１７〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記二重特異性抗体コンストラクトの前記第２の結合ドメインは、配列番号１４８〜１５３、１５４〜１５９、１６０〜１６５、１６６〜１７１、１７２〜１７７、１７８〜１８３、１８４〜１８９、１９０〜１９５、１９６〜２０１及び２０２〜２０７、好ましくは２０２〜２０７からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含む、請求項１７〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記二重特異性抗体コンストラクトは、配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８からなる群から選択される、好ましくは配列番号１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８、より好ましくは配列番号１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む一本鎖コンストラクトである、請求項１７〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
少なくとも１つのＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤並びに／又はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシ尿素、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストンデメチラーゼ阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランス型レチノイン酸）からなる群から選択される１つ以上のエピジェネティック因子を投与することをさらに含み、前記少なくとも１つのＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤及び／又は１つ以上のエピジェネティック因子は、
（ａ）前記二重特異性抗体コンストラクトの前記投与前；
（ｂ）前記二重特異性抗体コンストラクトの前記投与後；又は
（ｃ）前記二重特異性抗体コンストラクトと同時に投与される、請求項１７〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記１つのＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤又は１つ以上のエピジェネティック因子は、前記二重特異性抗体コンストラクトの投与の７日前まで投与される、請求項１７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記エピジェネティック因子は、ヒドロキシ尿素である、請求項１７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記骨髄性白血病は、急性骨髄芽球性白血病、好ましくは再発性又は難治性急性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤白血病、真性多血症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄肉腫及び急性混合性白血病、急性混合型白血病からなる群から選択される、請求項１７〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
好ましくは骨髄性白血病の治療のための方法における、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトの使用であって、前記二重特異性抗体コンストラクトは、１つ以上の治療サイクルにおいて投与され、少なくとも１つの治療サイクルは、少なくとも２つの投与段階を適用する、少なくとも３つの異なる投与量における前記二重特異性抗体コンストラクトの１４日を超える投与を含み、任意選択により、その後、前記二重特異性コンストラクトの投与を伴わない期間が続き、
前記二重特異性抗体コンストラクトは、以下の工程：
（ａ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第１の投与量の投与、続いて
（ｂ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第２の投与量の投与であって、前記第２の投与量は、前記第１の投与量を超える、投与、続いて
（ｃ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第３の投与量の投与であって、前記第３の投与量は、前記第２の投与量を超える、投与、任意選択により、続いて
（ｄ）前記二重特異性抗体コンストラクトの第４の投与量の投与であって、前記任意選択による第４の投与量は、前記第３の投与量を超える、投与
を含むスケジュールに従って前記１つ以上の治療サイクルの少なくとも１つで投与される、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、好ましくは骨髄性白血病の治療のための方法における使用のための、ＣＤ３３などの標的に特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＣＤ３などのエフェクターに特異的に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトであって、１４日間を超える期間にわたって投与され、任意選択により、その後、コンストラクトの投与を伴わない少なくとも７日間の期間が続く、二重特異性抗体コンストラクトに関する。さらに、本発明は、治療有効量のそのような二重特異性抗体コンストラクトの投与を含む、骨髄性白血病の治療のための方法及び骨髄性白血病の治療のための医薬組成物の調製のためのそのような二重特異性抗体コンストラクトの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢｉＴＥ（登録商標）（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）抗体コンストラクトなどの二重特異性抗体コンストラクトは、２つの柔軟に連結された抗体に由来する結合ドメインから構成される組換え体タンパク質コンストラクトである。二重特異性抗体コンストラクトの１つの結合ドメインは、標的細胞上の選択された腫瘍関連表面抗原に特異的であり；第２の結合ドメインは、Ｔ細胞上のＴ細胞受容体複合体のサブユニットであるＣＤ３に特異的である。それらの特別な設計により、ＢｉＴＥ（登録商標）抗体コンストラクトは、Ｔ細胞を標的細胞と一過的に結び付け、同時に標的細胞に対するＴ細胞の固有の細胞溶解能を強力に活性化するのに独特に適している。二重特異性抗体コンストラクトの第一世代（国際公開第９９／５４４４０号パンフレット及び国際公開第２００５／０４０２２０号パンフレットを参照されたい）は、ブリナツモマブ及びソリトマブとしてクリニックに展開した。これらの二重特異性抗体コンストラクトは、持続静注を介して投与される。例えば、Ｂ急性リンパ芽球性白血病において、ブリナツモマブは、４週間の注入として投与され、１週目の初期用量が低く、第１のサイクルの残りの治療及び開始から全ての他のサイクルの用量が高い。第２のサイクルを開始する前、２週間の無治療期間がある。同様の投与計画は、用量の増加及び２つのサイクル間の２週間の無治療期間も伴う少なくとも２８日間にわたる持続静注として投与されたソリトマブのために使用された。
【０００３】
二重特異性抗体コンストラクトの第一世代の重要なさらなる開発は、ヒト及びマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）のＣＤ３ε鎖のＮ末端において、コンテクストに依存しないエピトープに結合する二重特異性抗体コンストラクトをもたらすことであった（国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット）。したがって、そのような二重特異性抗体コンストラクトは、これまで対処されていない治療上のニーズに対応するための汎用性のある手段になっている。
【０００４】
そのようなニーズの１つは、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、特に再発性又は難治性ＡＭＬ（ｒ／ｒ  ＡＭＬ）の効率的且つ安全な療法である。ＩＤＨ１／２変異のような特定の変異を有するＡＭＬの場合を除いて、標準的な救援療法が存在しないため、再発性又は難治性ＡＭＬを有する患者の予後は、芳しくない。治験薬の大部分の試験は、ｒ／ｒ  ＡＭＬにおいて開始し、異なる特徴を有する広範な患者を得た。予後に関する履歴の文脈は、将来のプロトコル及び新規の薬剤の開発のための基準として使用され得る。そのような履歴の文脈の分析は、全生存期間を明らかにし、無事象生存期間は、中程度であり、且つ後の救援により減少された。年齢、細胞遺伝学、前駆疾患、初発／療法に誘発されたＡＭＬ、最初の寛解の期間及び血小板数は、生存期間と関連した。重要なことに、大多数の場合、患者、特にｒ／ｒ  ＡＭＬ患者の大部分は、持続性の第２の又は後の寛解、すなわち疾患の長期間の改善又はさらに治癒を達成できない。したがって、さらなる治療手段及びその最適化された使用の必要性がある。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】国際公開第９９／５４４４０号
【特許文献２】国際公開第２００５／０４０２２０号
【特許文献３】国際公開第２００８／１１９５６７号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
ＣＤ３３は、とりわけ、大部分の患者及び白血病性の幹細胞におけるＡＭＬ芽細胞上で見出されるミエロイド分化抗原として知られるシアル酸依存的サイトアドヘシン分子である。したがって、ＣＤ３３は、骨髄性白血病に関する有望なマーカー及びそのような疾患の治療における標的分子として同定されている。この目的のため、白血病性の骨髄芽球上に存在するＣＤ３３抗原に対して向けられる組換えモノクローナル抗体に連結された細胞傷害性抗生物質であるマイロターグ（登録商標）（ゲムツズマブオゾガマイシン）は、迅速承認により、ＡＭＬを有する患者のために米国で承認された。しかしながら、その薬物は、検証的試験で臨床的有用性が実証されず、市販後の状況下で静脈閉塞症のリスクの増加が認められた後、製造業者によって自発的に米国市場から一時的に回収された。ゲムツズマブオゾガマイシンで認められる頻繁に報告される毒性には、好中球減少症及び血小板減少症が含まれ、より少ない頻度で報告される毒性には、急性輸注反応（アナフィラキシー）、肝毒性及び静脈閉塞症に関連する事象が含まれた。ＣＤ３３に基づく薬剤が有し得る前記副作用を鑑みて、有望なＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトがＡＭＬの治療における使用のために提案されており、１治療サイクル内の投与期間は、以前に最大１４日に制限された。そのため、好中球減少症、特に顆粒球減少症などの重篤な副作用は、回避されるはずである。重篤な副作用を回避することは、既に、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトなどの強力な薬剤を導入する際の主要且つ重要な成果である一方、同時にその治療能力を最大限に活用して、疾患を効果的且つ持続的に治療することが強く望まれている。したがって、副作用を回避し、且つ同時に前記コンストラクトの治療能力を最大限に活用する、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの改善された投与を提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
第１の態様では、本発明は、好ましくは骨髄性白血病の治療のための方法における使用のための、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトであって、１つ以上の治療サイクルにおいて投与され、少なくとも１つの治療サイクルは、少なくとも２つの投与段階を適用する、少なくとも３つの異なる投与量における二重特異性抗体コンストラクトの１４日を超える投与を含み、任意選択により、その後、二重特異性抗体コンストラクトの投与を伴わない期間が続き、
二重特異性抗体コンストラクトは、以下の工程：
（ａ）二重特異性抗体コンストラクトの第１の投与量の投与、続いて
（ｂ）二重特異性抗体コンストラクトの第２の投与量の投与であって、前記第２の投与量は、前記第１の用量を超える、投与、続いて
（ｃ）二重特異性抗体コンストラクトの第３の投与量の投与であって、前記第３の投与量は、前記第２の投与量を超える、投与、任意選択により、続いて
（ｄ）二重特異性抗体コンストラクトの第４の投与量の投与であって、前記任意選択による第４の用量は、前記第３の投与量を超える、投与
を含むスケジュールに従って１つ以上の治療サイクルの少なくとも１つで投与される、二重特異性抗体コンストラクトに関する。
【０００８】
本発明の一態様において、全ての工程（ａ）〜（ｃ）又は（ｄ）を含む１つの治療サイクルにおいて二重特異性抗体コンストラクトを投与する期間は、少なくとも１５日、好ましくは１５〜６０日、より好ましくは２８〜５６日、好ましくは２８日であることが想定される。
【０００９】
本発明の一態様において、工程（ａ）における第１の投与量は、１日当たり少なくとも５μｇ、好ましくは１日当たり５〜２０μｇの範囲、好ましくは１日当たり１０μｇであり、工程（ｂ）における第２の投与量は、１日当たり少なくとも３０μｇ、好ましくは１日当たり３０〜２４０μｇの範囲、好ましくは１日当たり６０又は２４０μｇであり、且つ工程（ｃ）における第３の投与量及び工程（ｄ）における任意選択による第４の投与量は、１日当たり少なくとも２４０μｇ、好ましくは１日当たり２４０〜１５００μｇ、より好ましくは１日当たり４８０〜９６０μｇの範囲であることが想定される。
【００１０】
本発明の一態様において、工程（ａ）における第１の投与量の投与の期間は、１〜４日、好ましくは２又は３日であり、工程（ｂ）における第２の投与量の投与の期間は、２〜５日、好ましくは２又は３日であり、且つ工程（ｃ）における第３の投与量及び工程（ｄ）における任意選択による第４の投与量の投与の期間は、ともに７〜５２日、好ましくは１４〜２３又は５２日、より好ましくは２２、２３又は５２日であることが想定される。
【００１１】
本発明の一態様において、骨髄性白血病の治療は、２つ以上の治療サイクル、好ましくは２、３、４、５、６又は７つの治療サイクルを含み、少なくとも１、２、３、４、５、６又は７つの治療サイクルは、１４日を超える二重特異性抗体コンストラクト投与を含むことが想定される。
【００１２】
本発明の一態様において、少なくとも１つの治療サイクル後、二重特異性抗体コンストラクトの投与を伴わない期間、好ましくは治療を伴わない少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日が続くことが想定される。
【００１３】
本発明の一態様において、少なくとも１つの治療サイクル後、コンストラクトの投与を伴わない期間が続かないことが想定される。
【００１４】
本発明の一態様において、治療の第１のサイクルのみは、工程（ａ）による投与を含む一方、その後のサイクルは、工程（ｂ）による投与量で開始することが想定される。
【００１５】
本発明の一態様において、二重特異性抗体コンストラクトの第１の結合ドメインは、一本鎖二重特異性抗体コンストラクトであることが想定される。
【００１６】
本発明の一態様において、二重特異性抗体コンストラクトの第１の結合ドメインは、配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００、好ましくは９４〜９６及び９８〜１００からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含むことが想定される。
【００１７】
本発明の一態様において、二重特異性抗体コンストラクトの第２の結合ドメインは、配列番号１４８〜１５３、１５４〜１５９、１６０〜１６５、１６６〜１７１、１７２〜１７７、１７８〜１８３、１８４〜１８９、１９０〜１９５、１９６〜２０１及び２０２〜２０７、好ましくは２０２〜２０７からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含むことが想定される。
【００１８】
本発明の一態様において、二重特異性抗体コンストラクトは、配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８からなる群から選択される、好ましくは配列番号１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８、より好ましくは配列番号１０４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む一本鎖コンストラクトであることが想定される。
【００１９】
本発明の一態様において、二重特異性抗体コンストラクトは、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤並びに／又はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシ尿素、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストンデメチラーゼ阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランス型レチノイン酸）からなる群から選択される１つ以上のエピジェネティック因子と組み合わせて投与され、
（ａ）ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤及び／又は１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与前に投与されるか；
（ｂ）ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤及び／又は１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与後に投与されるか；又は
（ｃ）ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤及び／又は１つ以上のエピジェネティック因子並びに二重特異性抗体コンストラクトは、同時に投与されることが想定される。
【００２０】
本発明の一態様において、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤＬ−１阻害剤及び／又は１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与前、好ましくは二重特異性抗体コンストラクトの投与の１、２、３、４、５、６又は７日前に投与されることが想定される。
【００２１】
本発明の一態様において、エピジェネティック因子は、ヒドロキシ尿素であることが想定される。
【００２２】
本発明の一態様において、骨髄性白血病は、急性骨髄芽球性白血病、好ましくは再発性又は難治性急性骨髄性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤白血病、真性多血症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄肉腫及び急性混合性白血病からなる群から選択されることが想定される。
【００２３】
本発明の別の態様において、骨髄性白血病の治療を、それを必要とする患者において行うための方法であって、１つ以上の治療サイクルにおいて、治療有効量の、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトを投与することを含み、少なくとも１つの治療サイクルは、少なくとも２つの投与段階を適用する、少なくとも３つの投与量における二重特異性抗体コンストラクトの１４日を超える投与を含み、
二重特異性抗体コンストラクトは、以下の工程：
（ａ）二重特異性抗体コンストラクトの第１の投与量の投与、続いて
（ｂ）二重特異性抗体コンストラクトの第２の投与量の投与であって、前記第２の投与量は、前記第１の投与量を超える、投与、続いて
（ｃ）二重特異性抗体コンストラクトの第３の投与量の投与であって、前記第３の投与量は、前記第２の投与量を超える、投与、任意選択により、続いて
（ｄ）二重特異性抗体コンストラクトの第４の投与量の投与であって、前記任意選択による第４の投与量は、前記第３の投与量を超え、任意選択により、その後、コンストラクトの投与を伴わない期間が続く、投与
を含むスケジュールに従って１つの治療サイクルで投与される、方法が提供されることが想定される。
【００２４】
本発明の別の態様において、１つの治療サイクルにおいて二重特異性抗体コンストラクトを投与する期間は、少なくとも１５日、好ましくは１５〜６０日、より好ましくは２８〜５６日、より好ましくは２８日であることが想定される。
【００２５】
本発明の別の態様において、工程（ａ）における第１の投与量は、１日当たり少なくとも５μｇ、好ましくは１日当たり５〜２０μｇの範囲、より好ましくは１日当たり１０μｇであり、工程（ｂ）における第２の投与量は、１日当たり少なくとも３０μｇ、好ましくは１日当たり３０〜２４０μｇの範囲、好ましくは１日当たり６０又は２４０μｇであり、且つ工程（ｃ）における第３の投与量及び任意選択による工程（ｄ）における任意選択による第４の投与量は、１日当たり少なくとも２４０μｇ、好ましくは１日当たり１２０〜１５００μｇ、好ましくは１日当たり２４０〜９６０μｇ、より好ましくは１日当たり４８０〜９６０μｇの範囲であることが想定される。
【００２６】
本発明の別の態様において、工程（ａ）における第１の投与量の投与の期間は、１〜４日、好ましくは２又は３日であり、工程（ｂ）における第２の投与量の投与の期間は、２〜５日、好ましくは２又は３日であり、且つそれぞれ工程（ｃ）及び任意選択による工程（ｄ）における第３の用量及び任意選択による第４の用量の投与の期間は、７〜５２日、好ましくは１４〜２３日、より好ましくは２２、２３、５０又は５２日であることが想定される。
【００２７】
本発明の別の態様において、骨髄性白血病の治療は、２つ以上の治療サイクル、好ましくは２、３、４、５、６又は７つの治療サイクルを含み、少なくとも１、２、３、４、５、６又は７つの治療サイクルは、それぞれ１４日を超える二重特異性抗体コンストラクト投与を含むことが想定される。
【００２８】
本発明の別の態様において、治療後、二重特異性抗体コンストラクトの投与を伴わない期間、好ましくは治療を伴わない少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日が続くことが想定される。
【００２９】
本発明の別の態様において、治療後、二重特異性抗体コンストラクトの投与を伴わない少なくとも１４日の期間が続くことが想定される。
【００３０】
本発明の別の態様において、治療の第１のサイクルのみは、工程（ａ）による投与を含む一方、その後のサイクルは、工程（ｂ）による用量で開始することが想定される。
【００３１】
本発明の別の態様において、コンストラクトは、一本鎖二重特異性抗体コンストラクトであることが想定される。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
【図１】第１の１２名の患者コホートを含むＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトに対する第Ｉ相臨床試験の概要である。
【図２】第Ｉ相臨床試験における第１の１２名の患者コホートに関する抗腫瘍活性の概要である。試験コホートに関する抗腫瘍効果：２４０μｇ／ｄの標的投与量（３つの投与量を含む治療サイクル内の第３の投与量）で２の完全寛解、１２０μｇ／ｄで１のＣＲｉ及び２４０μｇ／ｄでの１、１．５μｇ／ｄでの１名の患者は、ＭＬＦＳ（＜５％芽球、血液学的回復がない）を有した。ＣＲを有する患者は、ベースラインでｂｍ芽球  約５％〜１０％（斑状疾患より推定された）を有し、フローサイトメトリーによって２９日目までに２．５％まで減少していたが、形態学的には残存ＡＭＬ及び正常〜富細胞性骨髄並びに最も重要なこととして末梢血数の回復のエビデンスはなかった。（説明文：ＣＲ：完全寛解、ＣＲｉ：不完全な数の回復を有する完全寛解、ＭＬＦＳ：形態学的無白血病状態）。
【図３】ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクト治療下での腫瘍応答に対する概要：腫瘍応答の指標としてのＣＤ３３ｘＣＤ３投与量に依存した骨髄（ＢＭ）吸引液の芽球数の変化［％］である。
【図４】それぞれの治療サイクルにおける患者応答の概要である。
【図５】長期の標的用量曝露及びＣＲＳ副作用の軽減のための段階的な投与を示す、Ｒ／Ｒ  ＡＭＬを有する患者において持続ＩＶ注入としてＡＭＧ  ３３０を評価する第１相用量漸増試験である。
【図６】ＤＬＴ期間にコホート１１（２４０μｇ）、１２（２４０μｇ）及び１３（３０μｇ）において治療された患者の末梢血中の絶対好中球数が示される。平均±ＳＥが示される。Ｇ４線（下方のベースライン）及びＧ３ライン（上方のベースライン）は、ＣＴＣＡＥによってグレード４及び３の好中球減少症を示す。
【図７】ＤＬＴ期間にコホート１１（１０、３０及び２４０μｇ）、１２（２４０μｇ）及び１３（３０μｇ）において治療された患者の末梢血中の血小板数が示される。平均±ＳＥが示される。Ｇ４線（下方のベースライン）及びＧ３ライン（上方のベースライン）は、ＣＴＣＡＥによってグレード４及び３の好中球減少症を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
市販承認を有する二重特異性抗体コンストラクトであるブリナツモマブは、４週間の持続静注（第１週に関して５μｇ／ｍ２／日及びその後、１５μｇ／ｍ２／日）によって急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）の治療において与えられ、その後、最大５サイクルにわたる２週間の無治療（すなわち１サイクル）が続く。そうすることで、治療は、Ｂ細胞系列に制限される区画であるＣＤ１９＋細胞の区画を消失させる。
【００３４】
ＣＤ３３に特異的なＢｉＴＥ（登録商標）を試験する動物試験において、そのような分子に関して提案される作用機序と一致して、循環好中球、血小板及び赤血球量の減少を含む一過性の骨髄抑制が観察された。白血球の減少は、活性化された動物試験における予想される増加とともに、提案された作用機序と一致して、循環好中球、血小板及び赤血球量の減少を含む一過性の骨髄抑制をもたらした。白血球の減少は、予想される活性化Ｔリンパ球の増加及びサイトカインレベルの増加とともに、全ての用量群において観察された。発熱性好中球減少症及び好中球減少症は、血液学的悪性腫瘍を有し、且つ前の併用化学療法を有する患者において観察される一般的な事象である。
【００３５】
出血は、ＡＭＬの治療において一般的且つ潜在的に重篤な合併症であり、大部分が血小板減少症に続いて起こる。出血性合併症の中で、重篤な出血を引き起こす凝固因子及び血小板の消費を伴う血液凝固の強力な血管内活性化に起因する播種性血管内凝固（ＤＩＣ）症候群が特に重要である。ＡＭＬを有する成人患者において、入院の日に１％の致死的出血が観察されており、全ては、白血球増加症又は急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）の存在下である。ＡＭＬを有する患者における最近のデータは、９．９％の出血性死の割合を示す。加えて、このＡＭＬ患者集団において、汎血球減少患者及び終末出血における未解決の感染症間の強力な相関があり得る。
【００３６】
免疫無防備状態の患者は、一般的な市中感染症及び日和見感染症の両方になりやすいこともよく受け入れられている。感染症は、癌患者における罹患率及び死亡率の主な原因であり、特定の癌は、免疫低下と本質的に関連しているが、感染症のリスクは、主に細胞障害性及び免疫抑制療法の強度及び期間に関連する。
【００３７】
しかしながら、急性骨髄性白血病において、状況は、急性リンパ芽球性白血病と比較して異なる。骨髄区画は、生存に必要なより広い細胞系列を含む。したがって、ＡＬＬにおけるブリナツモマブの投与スキームを、ＡＭＬに特異的な二重特異性抗体コンストラクトを使用するＡＭＬの治療に単純に移行させることはできない。ＣＤ３３＋細胞除去療法の手法を使用するＡＭＬの効率的な治療のために、治療は、効果的であるように十分に長く、且つ例えば日和見感染症に対抗するために免疫力を維持することを鑑みて、生存に不可欠な骨髄区画におけるそれらの細胞型に対する毒性を最小化するように十分に短い必要がある。加えて、投与量は、有効性のためにも十分である必要がある。
【００３８】
この問題は、例えば、好ましくは骨髄性白血病の治療のための方法における使用のための、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＣＤ３（ＣＤ３３／ＣＤ３）に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトを提供することによって解決され、二重特異性抗体コンストラクトは、１つ以上の治療サイクルにおいて投与され、１つの治療サイクルは、少なくとも２つの投与段階を適用する、少なくとも３つの異なる投与量における二重特異性抗体コンストラクトの１４日を超える投与を含み、任意選択により、その後、コンストラクトの投与を伴わない期間が続く。
【００３９】
少なくとも３つの漸増投与量レベルによる少なくとも二重の段階的な投与を適用する本発明に一致する投与スケジュールを使用して、１４日を超えるＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクト（例えば、配列番号１０４）投与期間中に骨髄白血病細胞を効率的に除去することができるが、依然として患者に、治療サイクル間のコンストラクトの投与を伴わない期間において骨髄区画を回復させることが可能である。少なくとも２４０μｇの標的投与量、すなわち治療サイクル内の最後の工程の最大投与量を採用することは、好ましくは、本明細書で実証されるとおり、疾患の完全寛解を可能にする。同時に、本発明による段階的な投与は、好ましくは、以前に許容できると予想されたものより長い標的用量に対する曝露にもかかわらず、サイトカイン放出症候群又はその症状などの重篤な免疫性の副作用のリスクを著しく低減する。本発明による段階的な投与を適用する、すなわち少なくとも３つの漸増投与量をもたらす少なくとも２つの投与段階を適用することにより、患者は、最大５２日など、長期間標的投与量に曝露され得る。前記最大期間は、それぞれ２日間続く第１及び第２の工程、並びに残りの第１の治療サイクルの２４日続く第３の工程、並びに前の段階的な投与を伴わない第３の投与量のみを含む後続の（第２の）治療サイクルの標的投与量の別の２８日に起因する。したがって、治療サイクル間の無治療期間（すなわち本発明による二重特異性抗体コンストラクトが中断されずに投与される場合）の少なくとも１つは、不必要であり得る。したがって、第１の関係する治療サイクルの標的投与量は、即座に、中断されることなく後続の、すなわち第２の関係する治療サイクルの同じ標的投与量に続く。そのため、長期間持続する治療効果及び最終的に罹患し、治療を受けた患者のＡＭＬ疾患の根絶のための前提条件として、ＡＭＬ芽球及び白血病幹細胞を根絶するという治療目標を実現するために、患者の標的投与量への曝露が大幅に拡大される。したがって、本発明による方法は、好ましくは、長期間持続する治療効果、すなわち造血幹細胞及び骨髄性白血病幹細胞を有効に根絶する必要性並びにＣＲＳなどの重篤且つ治療を終了させる可能性のある副作用の回避又は減弱の必要性を均衡させる方法を提供する。特に、最も高いグレード５（当技術分野で一般的に定義されるとおり）のＣＲＳ事象を好ましくは回避することができ、比較的高いグレード３及び４のＣＲＳ事象の発生を著しく減少させることができ、すなわち、それぞれグレード３は、典型的には、治療された患者の最大１０％で発生し、グレード４は、典型的には、治療された患者の最大５％で発生する。
【００４０】
本発明に関連して、１つの治療サイクルにおける二重特異性抗体コンストラクトへの患者の曝露の期間は、２つの治療サイクルが無治療期間によって隔てられていない場合、１４日より長く、最大６０日であり得る。通常、少なくとも２つ、好ましくは３つの投与段階を含む各治療サイクル後、患者の回復を可能にする無治療期間が続く。しかしながら、長期の標的投与量曝露が、ＡＭＬ芽球に加えて白血病幹細胞に対処するために必要となる場合、２つの治療サイクルは、無治療期間を離れることによって互いに繋げられる。しかしながら、十分な患者の回復を可能にしながらもなお標的投与量の曝露時間を延長するために、無治療期間を伴わずに２つ以下の治療サイクルが互いに続くことが好ましい。
【００４１】
前記２つの治療サイクルが繋げられる場合、先の治療サイクルに続く後の治療サイクルは、１つのみの投与量を有し、段階的な投与がないことによって特徴付けられる。これは、先の治療サイクルの段階的な投与が、直後の治療サイクル（すなわち繋げられた２つのサイクル間に無治療期間がない）においてもＣＲＳなどの副作用（特により高いグレード３及び４並びに最高グレード５）のリスクを低減するという事実によって促進されるが、それは、先の治療サイクル後の治療サイクルが、先の治療サイクルの適用された段階的な投与から利益を得るためである。したがって、最高グレードの副作用ＣＲＳは、完全に回避することができ、比較的高いグレード３及び４は、希発の一桁の発生率まで減弱できた。治療の中断は、治療された患者の大部分で回避することができ、高度に進行したｒ／ｒ  ＡＭＬに罹患している高位の患者を治療するための継続的な有効用量投与を確保できた。
【００４２】
したがって、本発明に関連して、治療サイクルの少なくとも１つは、本明細書に記載されるとおりの特定の段階的な投与のための要件を満たさなければならない。１つのみの治療サイクルが適用される場合、前記１つの治療サイクルは、段階的な投与を含む。無治療期間によって隔てられていない２つの治療サイクルが適用される場合、本明細書に記載される特定の少なくとも３段階の特定の段階的な投与の要件を満たすために２つの治療サイクルの最初のみで十分である。
【００４３】
本明細書に参照されるとおりの曝露の期間は、通常、１つの治療サイクルを通して適用される少なくとも３つの異なる投与量の全てに対する全体の曝露を指す。標的用量に対する典型的な曝露は、比較的短く、すなわち治療サイクル内の第３又は任意選択による第４の最大（標的）投与量に達する前の第１及び第２（及び任意選択による第３）の投与量の期間によって短縮される。標的投与量のそのような曝露は、例えば、５６、５５、５４、５３、５２、５１、５０、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５又は１４日間続き得、これは、同時に、本発明によるＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクト（例えば、配列番号１０４）の抗腫瘍効果の完全な活用を可能にする。結果的に、本投与計画は、サイトカイン放出症候群及びその症状などの薬物投与の初期中の副作用を、本明細書に記載される段階的な投与を使用することによって最小化しながら、治療される患者の標的用量への長期の曝露を可能にする。同時に、本明細書に記載されるとおりの投与スケジュール又は投与計画によって制限される優れた有効性は、好ましくは、治療される患者における腫瘍量の著しい減少により、より好ましくはそれぞれ１つの治療サイクル又は複数の治療サイクルの後の部分的又はさらに完全寛解又は度重なる完全寛解において実証される。
【００４４】
疾患（ＡＭＬ）の完全寛解を臨床的に実証した本発明による典型的な治療サイクルは、１日当たり１０μｇの第１の投与量で２又は３日の連続した日数、その直後の１日当たり６０μｇの第２の投与量で２、３又は４日間、その直後の１日当たり２４０μｇの第３の投与量で２１、２２又は２３日間、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクト（例えば、配列番号１０４）を投与することを含み、全体的な治療サイクル期間は、２８日である。代わりに、好ましい治療サイクルは、１日当たり１０μｇの第１の投与量で２又は３日の連続した日数、その直後の１日当たり６０μｇの第２の投与量で２、３又は４日間、その直後の１日当たり４８０μｇの第３の投与量で２１、２２又は２３日間を含み、全体的な治療サイクル期間は、２８日である。代わりに、好ましい治療サイクルは、１日当たり１０μｇの第１の投与量で２又は３日の連続した日数、その直後の１日当たり６０μｇの第２の投与量で２、３又は４日間、その直後の１日当たり６００μｇの第３の投与量で２１、２２又は２３日間を含み、全体的な治療サイクル期間は、２８日である。代わりに、好ましい治療サイクルは、１日当たり１０μｇの第１の投与量で２又は３日の連続した日数、その直後の１日当たり６０、１２０又は２４０μｇの第２の投与量で２、３又は４日間、その直後の１日当たり７２０μｇの第３の投与量で２１、２２又は２３日間を含み、全体的な治療サイクル期間は、２８日である。代わりに、好ましい治療サイクルは、１日当たり１０μｇの第１の投与量で２又は３日の連続した日数、その直後の１日当たり６０、１２０又は２４０μｇの第２の投与量で２、３又は４日間、その直後の１日当たり８４０μｇの第３の投与量で２１、２２又は２３日間を含み、全体的な治療サイクル期間は、２８日である。代わりに、好ましい治療サイクルは、１日当たり１０μｇの第１の投与量で２又は３日の連続した日数、その直後の１日当たり６０又は１２０μｇの第２の投与量及び１日当たり１２０又は２４０μｇの第３の投与量で合わせて２日間、その直後の１日当たり８４０μｇの第４の投与量で２１、２２又は２３日間を含み、全体的な治療サイクル期間は、２８日である。代わりに、好ましい治療サイクルは、１日当たり１０μｇの第１の投与量で２又は３日の連続した日数、その直後の１日当たり６０又は１２０μｇの第２の投与量及び１日当たり１２０又は２４０μｇの第３の投与量で合わせて２日間、その直後の１日当たり９６０μｇの第４の投与量で２１、２２又は２３日間を含み、全体的な治療サイクル期間は、２８日である。そのような治療サイクルは、より適切な説明のために図５においても表される。
【００４５】
既に１日当たり２４０μｇの標的投与量が、ＭＲＤ＋であるが、好ましくはＭＲＤ−でもある疾患ＡＭＬの完全寛解をもたらし得ることは、本発明に関連して顕著な発見であった。本明細書に記載されるような比較的高い標的投与量は、ＡＭＬ芽球に加えて白血病幹細胞をさらに数量的に根絶し、且つ再発のリスクを低減する可能性があり、したがって患者により長い無病状態を提供し、患者の生活の質を向上させる。
【００４６】
好ましくは、本発明に関連して、用量制限毒性（ＤＬＴ）期間を標準の４週まで短縮することができ（標的用量に対して少なくとも１４日）、ＣＲＳの発症及びその回復、効率的な患者内増加並びに全体的な患者の安全性をモニタリングすることを可能にする。
【００４７】
当技術分野において知られるとおり、一般的な骨髄前駆細胞である骨髄芽球、単球を含む骨髄細胞の表面上でのＣＤ３３の発現は、フローサイトメトリーによって文献において実証されている。さらに、マクロファージの表面上でのＣＤ３３発現は、免疫組織化学により実証されている。骨髄区画におけるそれらのＣＤ３３＋細胞集団は、本明細書に記載される二重特異性抗体コンストラクトを有する患者の治療下で除去される。それらの細胞集団のいくつかが、それ自体、骨髄区画における他の細胞集団に関する前駆細胞であるという事実に起因して、一般的な骨髄前駆細胞の下流の全ての細胞型の造血が影響を受け、骨髄抑制をもたらす。さらなる作用の方法として、本発明によるＣＤ３３二重特異性抗体コンストラクトは、骨髄抑制因子（すなわちＭＤＳＣ）を解消することもでき、局所微小環境内の免疫抑制に寄与する。
【００４８】
骨髄性白血病の順調な治療のために、本明細書に記載される二重特異性抗体コンストラクトによる患者の効果のある曝露（すなわち一定の長さの曝露）は、Ｔ細胞活性化／増殖及びそれらのＴ細胞の細胞障害活性を誘導することが要求される。しかしながら、上記の観察に基づいて、二重特異性抗体コンストラクトの投与期間が長く続くほど、汎血球減少が長くなることが予想される。これを念頭に置いて、本発明の根底にある問題の解決策は、白血病細胞の効果的な除去を可能にする二重特異性抗体コンストラクトの曝露の長さ及び用量を、患者の骨髄区画を回復させる無治療期間と均衡させることである。これは、上記の投与スキームによって反映される。
【００４９】
投与を伴わない期間は、例えば、細菌感染に対する防御に重要な骨髄細胞を再構築するために、骨髄区画のための回復期間として役立つ。投与を伴わない要求される最小期間の長さは、通常、残留している腫瘍量に依存する。例えば、部分奏効を示した患者では、期間は、１、２、３、４、５又は６日、好ましくは７日などの７日以下と短いことができる一方、より高い残存腫瘍量及び骨髄区画へのより多くの損傷を有する患者は、通常、骨髄細胞を再構築するために、より長い期間、典型的には少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３又は１４日、好ましくは１４日を必要とする。一般に、標的用量への患者の曝露は、最大化され、且つ同時に、多くの場合に危篤状態にあり、典型的には迅速な有効性を必要とする患者のための治療サイクルの迅速な全体シークエンスを可能にするために、無治療回復期間を含む単一の治療サイクルの期間を可能な限り制限することが想定される。
【００５０】
本発明の特定の実施形態において、１４日を超える投与期間を含む第１の治療サイクルは、標的用量まで患者の比較的長い曝露を与え、それにより後続の治療サイクルが、１４日を超える投与期間を必要としない場合があるようなレベルまで腫瘍量を減少させる。そのような場合、第１の治療サイクル後の治療サイクルは、十分な効率が達成されていることを条件として、最大で１４日間続く場合があり、１サイクル内の回復期間比に対して比較的長い治療によって副作用のリスクを低減する。代わりに、第２、第３、第４又は任意の後続の治療サイクルは、１４日を超えて続いた後、最大で１４日の長さの１つ以上の治療サイクルが続く場合がある。また、１４日を超える投与の治療サイクルは、有効性及び副作用の軽減を平均化するために、最大１４日の投与の治療サイクルと交互に行われ得る。
【００５１】
有効用量を標的癌細胞まで到達させる時間を浪費せず、同時にＣＲＳなどの重篤な副作用を誘発するリスクを低減する投与スキームを提供することは、本明細書に記載されるとおりの本発明の特定の成果である。時間を浪費することは、重篤且つ進行が早い進行性疾患に罹患している治療される患者の利益にはならないであろう。他方で、迅速すぎる段階的な投与によってＣＲＳなどの副作用を誘発させることは、過度の毒性に起因する治療の中断又は放棄をもたらす可能性がある。両方の不利益が本発明による方法によって軽減される。また、第４の工程を加えることにより、投与量間のギャップは、低減され、それによりＣＲＳの可能性も低減される。したがって、本発明に関連して、例えば１日当たり少なくとも４８０、７２０又は９６０μｇの高い標的投与量が適用され、４つの工程（例えば、１日当たり３０−２４０−６００−９００μｇ）を含む段階的な投与は、以前の工程の投与量と標的投与量との間のより小さいギャップに起因して、同じ期間をかけて実施される場合でも、３つの工程（例えば、１日当たり３０−２４０−９００μｇ）を含む段階的な投与に対して好ましい。
【００５２】
本発明による方法は、ＣＲＳなどの重篤な副作用を回避又は減弱する。特に、最も高いグレード５（当技術分野で一般的に定義されるとおり）のＣＲＳ事象を好ましくは回避することができ、比較的高いグレード３及び４のＣＲＳ事象の発生を著しく減少させることができ、すなわち、それぞれグレード３は、典型的には、治療された患者の最大１０％で発生し、グレード４は、典型的には、本明細書に記載されるとおりの方法を経験している治療された患者の最大５％で発生する。
【００５３】
当業者が認識しているとおり、各再発後、新たな完全寛解は、達成するのがより一層困難である。二重特異性抗体コンストラクトによる本明細書に記載される療法を経験している患者は、通常、既に標準的な化学療法を経験しており、寛解及び再発を経た可能性があるという事実を仮定すれば、著明な活性が本発明による方法によって与えられる必要がある。したがって、高投与量の二重特異性抗体コンストラクト、例えば配列番号１０４への長期の曝露は、本明細書に記載されるとおり好ましい。これは、通常、４つの異なり且つ上昇的な投与量、すなわち第１、第２、第３及び第４の用量を意味する３つの投与段階を含む段階的な投与を必要とする。したがって、そのような好ましい治療サイクルは、１日当たり１０μｇの第１の投与量で２又は３日の連続した日数、その直後の１日当たり６０又は１２０μｇの第２の投与量及び１日当たり１２０又は２４０μｇの第３の投与量で合わせて２日間、その直後の１日当たり８４０μｇの第４の投与量で２１、２２又は２３日間を含み、全体的な治療サイクル期間は、２８日である。代わりに、好ましい治療サイクルは、１日当たり１０μｇの第１の投与量で２又は３日の連続した日数、その直後の１日当たり６０又は１２０μｇの第２の投与量及び１日当たり１２０又は２４０μｇの第３の投与量で合わせて２日間、その直後の１日当たり９６０μｇの第４の投与量で２１、２２又は２３日間を含み、全体的な治療サイクル期間は、２８日である。２つの治療サイクルが合わせられ、間欠的な無投与期間を伴わずに互いに続く場合、第４の有効投与量の適用は、最大５２日の期間を有する。そのようなパラメーターは、例えば、高投与量の二重特異性抗体コンストラクト、例えば配列番号１０４への長期の曝露と考えられ、本明細書に記載されるとおり好ましい
【００５４】
活性化合物、例えば二重特異性化合物の血清レベルが既定の閾値未満に下がるとき、投与期間の終わりに達したと理解される。そのような閾値に関する例は、ＥＣ９０値未満の血清レベル、好ましくはＥＣ５０値未満、より好ましくはＥＣ１０値未満である。そのようなＥＣ値は、アッセイに一致するエフェクター細胞としてＣＤ３３＋標的細胞及びヒトＰＢＬを使用して、細胞障害アッセイにおいて定義され得る。
【００５５】
短い血清半減期を有することが知られる、本発明に関連して好ましいＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクト（配列番号１０４を参照されたい）などの二重特異性一本鎖抗体コンストラクトの場合、マウスにおけるＣＤ３３ＸＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの半減期は、６．５〜８．７時間であるが、ヒトにおけるＣＤ３３ＸＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの予測される半減期は、約２時間であり、血清レベルは、持続ｉｖ投与を止めた後の短い時間内、すなわち投与期の終わりのほぼ直後に上記の閾値未満に低下するであろう。
【００５６】
本発明に好適な二重特異性抗体コンストラクトの特定のＥＣｘ値の決定のためのアッセイは、本明細書の下記の実施例において記載される。
【００５７】
用語「用量」は、典型的には、マイクログラム［μｇ］などの質量の単位における本明細書に記載される薬剤、すなわち二重特異性抗体コンストラクトの測定された量として本明細書で理解される。
【００５８】
用語「投与量」は、典型的には、１日当たりのマイクログラム［μｇ／ｄ］などの時間当たりの質量の単位における本明細書に記載される薬剤、すなわち二重特異性抗体コンストラクトの用量の適用の比率として本明細書で理解される。本発明に関連して、適用は、ＩＶ注入、好ましくは持続ＩＶ注入（ＣＩＶ）である。その点で、投与、すなわち治療用二重特異性抗体コンストラクトの投入は、提供される投与期間中に中断されない。
【００５９】
用語「治療サイクル」は、適用されることになる少なくとも３つの投与量をもたらす少なくとも２つの投与段階を含む治療期間として本明細書で理解され、投与量は、それらのシークエンスの順序毎に増加している。１つの治療サイクル内の前記投与は、本明細書に記載されるとおりの段階的な投与を適用する１つの治療サイクル内で投与される異なる投与量間の任意の無治療期間によって中断されないことが好ましい。代わりに、持続注入は、治療サイクルの全体にわたって好ましくは中断されることなく、治療される患者に対して継続する。完了後、前記治療サイクル後、通常、休止期間（無投与期間、すなわち無治療）が続き得、治療期間及び無治療期間のその組合せは、規則的なスケジュールで繰り返される。例えば、４週間の治療後に２週間の休止が続くことが１つの治療サイクルである。このサイクルが規則的なスケジュール上で複数回繰り返されるとき、それは、治療の過程を構成する。
【００６０】
用語「段階的な投与」は、ＣＲＳなどの治療関連副作用を回避するために、好ましくは１つの治療サイクル内で投与量を増加させる一連の適用として本明細書で理解される。
【００６１】
用語「投与段階」は、ある投与量から別のものへの変化として本明細書で理解される。したがって、段階的な投与が３つの異なる投与量を提供する場合、２つの投与段階が適用されなければならず、すなわちそれぞれ第１から第２の投与段階及び第２から第３の投与段階への変化である。
【００６２】
本発明に関連して、寛解は、疾患ＡＭＬの徴候及び症状の低減又は消失のいずれかとして理解される。本用語は、この減少が生じる期間を指すためにも使用され得る。本明細書では、寛解は、部分寛解又は完全寛解と見なされ得る。例えば、ＡＭＬの部分寛解は、見出され得るとおり、例えば身体検査、放射線学的試験又は血液若しくは尿検査からのバイオマーカーレベルに対するＡＭＬの測定可能なパラメーターにおける５０％以上の減少として定義され得る。
【００６３】
本発明に関連して、完全寛解は、通常、疾患の徴候の全体的な消失である。状態が完全寛解にある患者は、再発、すなわち疾患の再出現の可能性があるにもかかわらず、治癒又は回復したと見なされる場合がある。
【００６４】
本発明に関連して、番号を伴わない完全寛解（ＣＲ）は、通常、第１のＣＲを意味し、例えば、新たにＡＭＬと診断された患者は、１つ以上のサイクルで化学療法を受け、すなわち本発明による二重特異性抗体コンストラクトを受ける前に寛解に至り、それが第１のＣＲ（通常、単にＣＲと呼ばれる）であり、続いて再発し、いくつかの他の療法を受け、再び寛解に至り、それが目下第２の完全寛解（ＣＲ２）などである。
【００６５】
用語「コホート」は、典型的な特徴を共有する、すなわち同じ段階的な投与、投与量及び適用期間によって特徴付けられる同じ治療サイクルを経験する患者の群として本発明に関連して理解される。
【００６６】
用語「有効投与量」は、ＡＭＬ芽球及び白血病幹細胞が効率的に殺される標的用量である。この用量は、通常、１つの治療サイクルの最も高い及び好ましくは最後の投与量である。
【００６７】
用語「二重特異性抗体コンストラクト」は、２つの別個の標的構造の特異的な結合に好適な構造を有する分子を指す。本発明に関連して、そのような二重特異性抗体コンストラクトは、標的、好ましくは標的細胞の細胞表面上のＣＤ３３及びエフェクター、好ましくはＴ細胞の細胞表面上のＣＤ３に特異的に結合する。しかしながら、本明細書に記載されるとおりの好ましい投与、すなわちサイトカイン放出症候群などの副作用を軽減する段階的な投与及び有効性を最大化する長期の曝露は、Ｔ細胞の細胞表面上のＣＤ３に加えて、ＣＤ３３と異なる別の標的を標的化する他の二重特異性抗体コンストラクトにも適用される。二重特異性抗体コンストラクトの好ましい実施形態において、少なくとも１つ、より好ましくは二重特異性抗体コンストラクトの両方の結合ドメインは、抗体の構造及び／又は機能に基づく。そのようなコンストラクトは、本発明に一致して「二重特異性抗体コンストラクト」として称され得る。
【００６８】
用語「抗体コンストラクト」は、その構造及び／又は機能が抗体、例えば全長又は完全免疫グロブリン分子の構造及び／又は機能に基づく分子を指す。したがって、抗体コンストラクトは、その特異的な標的若しくは抗原に結合することができ、且つ／又は抗体若しくはそのフラグメントの可変重鎖（ＶＨ）及び／若しくは可変軽鎖（ＶＬ）ドメインから導き出される。さらに、本発明による結合パートナーに結合するドメインは、本発明による抗体コンストラクトの結合ドメインとして本明細書で理解される。通常、本発明による結合ドメインは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件を含む。この最小要件は、例えば、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）、好ましくは６つ全てのＣＤＲの存在によって定義され得る。抗体の最小構造要件を定義する代替の手法は、特異的な標的の構造、それぞれエピトープ領域を構成する標的タンパク質のタンパク質ドメイン（エピトープクラスター）内での抗体のエピトープの定義であるか、又は定義された抗体のエピトープと競合する特異的な抗体を参照することによる。本発明によるコンストラクトに基づく抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換え抗体、キメラ抗体、脱免疫抗体、ヒト化抗体及びヒト抗体を含む。
【００６９】
本発明による抗体コンストラクトの結合ドメインは、例えば、上で参照された群のＣＤＲを含み得る。好ましくは、それらのＣＤＲは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）のフレームワーク内に含まれるが、それが両方を含む必要はない。Ｆｄフラグメントは、例えば、２つのＶＨ領域を有し、多くの場合、インタクトな抗原結合ドメインの一部の抗原結合機能を保持している。抗体フラグメント、抗体バリアント又は結合ドメインの形式についてのさらなる例としては、（１）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインを有する一価のフラグメントであるＦａｂフラグメント；（２）ヒンジ領域でのジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂフラグメントを有する二価のフラグメントであるＦ（ａｂ’）２フラグメント；（３）２つのＶＨ及びＣＨ１ドメインを有するＦｄフラグメント；（４）抗体の１つのアームのＶＬ及びＶＨドメインを有するＦｖフラグメント、（５）ＶＨドメインを有するｄＡｂフラグメント（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）；（６）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びに（７）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）が挙げられ、後者が好ましい（例えば、ｓｃＦＶライブラリー由来のもの）。本発明による抗体コンストラクトの実施形態の例は、例えば、国際公開第００／００６６０５号パンフレット、国際公開第２００５／０４０２２０号パンフレット、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレット、国際公開第２０１０／０３７８３８号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３７号パンフレット、国際公開第２０１３／０２６８３３号パンフレット、米国特許出願公開第２０１４／０３０８２８５号明細書、米国特許出願公開第２０１４／０３０２０３７号明細書、国際公開第２０１４／１４４７２２号パンフレット、国際公開第２０１４／１５１９１０号パンフレット及び国際公開第２０１５／０４８２７２号パンフレットに記載されている。
【００７０】
さらに、用語「抗体コンストラクト」の定義は、一価、二価及び多価（ｐｏｌｙｖａｌｅｎｔ）／多価（ｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔ）コンストラクト、したがって１つのみの抗原性構造に特異的に結合する単一特異性コンストラクト並びに異なる結合ドメインを通じて２つ以上の抗原性構造、例えば２つ、３つ以上に特異的に結合する二重特異性及び多重特異性（ｐｏｌｙｓｐｅｃｉｆｉｃ）／多重特異性（ｍｕｌｔｉｓｐｅｃｉｆｉｃ）コンストラクトを含む。さらに、用語「抗体コンストラクト」の定義は、１つのみのポリペプチド鎖からなる分子及び鎖が同一（ホモ二量体、ホモ三量体若しくはホモオリゴマー）であるか又は異なる（ヘテロ二量体、ヘテロ三量体若しくはヘテロオリゴマー）かのいずれかであり得る２つ以上のポリペプチド鎖からなる分子を含む。上で特定された抗体及びバリアント又はその誘導体に関する例は、とりわけ、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９８８）及びＵｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，ＣＳＨＬ  Ｐｒｅｓｓ（１９９９），Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｅｂｅｌ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，２ｎｄ  ｅｄ．２０１０及びＬｉｔｔｌｅ，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００９において記載される。
【００７１】
本発明の抗体コンストラクトは、「インビトロで作製された抗体コンストラクト」であることが好ましい。本用語は、可変領域の全て又は一部（例えば、少なくとも１つのＣＤＲ）が非免疫細胞の選択、例えばインビトロファージディスプレイ、タンパク質チップ又は抗原結合能に関して候補配列を試験することができる任意の他の方法において作製される、上記定義による抗体コンストラクトを指す。したがって、本用語は、好ましくは、動物の免疫細胞におけるゲノム再編成によってのみ作製される配列を除外する。「組換え抗体」は、組換えＤＮＡ技術又は遺伝子工学の使用により作製された抗体である。
【００７２】
本発明の二重特異性抗体コンストラクトのある実施形態は、「一本鎖抗体コンストラクト」である。それらの一本鎖抗体コンストラクトは、単一のペプチド鎖からなる抗体コンストラクトの上記の実施形態のみを含む。
【００７３】
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）又はモノクローナル抗体コンストラクトは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体、すなわち少量存在する可能性がある、考えられる天然に存在する変異及び／又は翻訳後修飾（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である集団を含む個々の抗体を指す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、異なる決定基（又はエピトープ）に対して誘導された異なる抗体を通常含む従来の（ポリクローナル）抗体製剤とは対照的に、抗原上の単一の抗原部位又は決定基に対して誘導される。それらの特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養によって合成されるため、他の免疫グロブリンが混入しない点で有利である。修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とすると解釈されるべきではない。
【００７４】
モノクローナル抗体の調製には、継続的な細胞株培養により産生される抗体をもたらす任意の技術を用いることができる。例えば、使用されるモノクローナル抗体は、Ｋｏｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作られ得るか、又は組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書を参照されたい）によって作られ得る。ヒトモノクローナル抗体を産生するさらなる技術の例としては、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  ４（１９８３），７２）及びＥＢＶ−ハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．（１９８５），７７−９６）が挙げられる。
【００７５】
次に、ハイブリドーマを、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）及び表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥ（商標））分析などの標準的な方法を使用してスクリーニングして、指定の抗原に特異的に結合する抗体を産生する１つ以上のハイブリドーマを同定することができる。例えば、組換え抗原、天然に存在する形態、その任意のバリアント又はフラグメント並びにその抗原性ペプチドなど、任意の形態の関連抗原が免疫原として使用され得る。ＢＩＡｃｏｒｅシステムで採用されている表面プラズモン共鳴を使用して、標的細胞の表面抗原ＣＤ３３又はＣＤ３イプシロンンなどの標的抗原のエピトープに結合するファージ抗体の効率を高めることができる（Ｓｃｈｉｅｒ，Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ７（１９９６），９７−１０５；Ｍａｌｍｂｏｒｇ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８３（１９９５），７−１３）。
【００７６】
モノクローナル抗体を作製する別の例示的な方法としては、タンパク質発現ライブラリー、例えばファージディスプレイ又はリボソームディスプレイライブラリーのスクリーニングが挙げられる。ファージディスプレイについては、例えば、Ｌａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．、米国特許第５，２２３，４０９号明細書、Ｓｍｉｔｈ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２８：１３１５−１３１７、Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）に記載されている。
【００７７】
ディスプレイライブラリーの使用に加えて、関連抗原を使用して、非ヒト動物、例えば齧歯類（マウス、ハムスター、ウサギ又はラットなど）を免疫化することができる。一実施形態では、非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子の少なくとも一部を含む。例えば、マウス抗体産生が欠損したマウス系統を、ヒトＩｇ（免疫グロブリン）遺伝子座の大きいフラグメントを用いて改変することが可能である。ハイブリドーマ技術を用いて、所望の特異性を有する遺伝子由来の抗原特異的モノクローナル抗体を作製し、選択し得る。例えば、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ（商標）、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１、米国特許出願公開第２００３−００７０１８５号明細書、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット及び国際公開第９６／３３７３５号パンフレットを参照されたい。
【００７８】
モノクローナル抗体は、非ヒト動物から得た後、当技術分野で知られる組み換えＤＮＡ技術を用いて、例えばヒト化、脱免疫、キメラ化などの改変を行うこともできる。改変抗体コンストラクトの例としては、非ヒト抗体のヒト化バリアント、「親和性成熟」抗体（例えば、Ｈａｗｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５４，８８９−８９６（１９９２）及びＬｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０，１０８３２−１０８３７（１９９１）を参照されたい）及びエフェクター機能が改変された抗体変異体（例えば、米国特許第５，６４８，２６０号明細書、前掲のＫｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０）及び前掲のＬｉｔｔｌｅ（２００９）を参照されたい）が挙げられる。
【００７９】
免疫学において、親和性成熟とは、免疫反応の過程で抗原に対する親和性の増大した抗体をＢ細胞が産生するプロセスである。同一抗原への反復曝露により、宿主は、親和性が連続的に増大する抗体を産生することになる。天然のプロトタイプと同様に、インビトロ親和性成熟は、変異と選択の原理に基づいている。インビトロ親和性成熟を問題なく使用して、抗体、抗体コンストラクト及び抗体フラグメントを最適化している。ＣＤＲ内部のランダム変異は、放射線、化学的変異原又はエラープローンＰＣＲを用いて導入される。加えて、遺伝的多様性は、チェイン・シャッフリング法によって増大させることができる。ファージディスプレイのようなディスプレイ方法を用いた２又は３ラウンドの変異及び選択により、通常、低ナノモル範囲の親和性を有する抗体フラグメントが得られる。
【００８０】
抗体コンストラクトの好ましいタイプのアミノ酸置換変種は、親抗体（例えば、ヒト化抗体又はヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基の置換を伴うものである。一般に、さらなる開発のために選択されて得られるバリアントは、それらが生成された親抗体と比べて向上した生物学的特性を有することになる。そのような置換バリアントを生成するための簡便な方法には、ファージディスプレイを用いる親和性成熟が含まれる。簡潔に説明すると、いくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）は、それぞれの部位で可能な全てのアミノ酸置換が生じるように変異される。そのようにして生成された抗体バリアントは、各粒子内にパッケージされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物との融合体として、繊維状ファージ粒子から一価形態で提示される。次に、ファージディスプレイされたバリアントを、本明細書に開示されるとおりにそれらの生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。改変のための超可変領域部位候補を同定するために、アラニンスキャニング変異導入法を実施して、抗原結合に有意に寄与する超可変領域残基を同定し得る。代わりに又は加えて、結合ドメインと、例えばヒト標的細胞の表面抗原ＣＤ３３との間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を分析することが有益な場合がある。そのような接触残基及び隣接残基は、本明細書で詳述される技術による置換の候補である。そのようなバリアントを生成してから、バリアントのパネルに対して、本明細書に記載されるとおりのスクリーニングを施し、１つ以上の関連するアッセイにおいて優れた特性を有する抗体をさらなる開発のために選択し得る。
【００８１】
本発明のモノクローナル抗体及び抗体コンストラクトは、特に重鎖及び／若しくは軽鎖の一部が特定の種に由来するか、又は特定の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体中の対応する配列と同一若しくは相同である一方、鎖の残部は、所望の生物活性を示す限り、別の種に由来するか、又は別の抗体のクラス若しくはサブクラスに属する抗体並びにそのような抗体のフラグメント中の対応する配列と同一若しくは相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）を含む（米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））が挙げられる。本明細書における目的のキメラ抗体には、非ヒト霊長類（例えば、旧世界ザル、類人猿など）に由来する可変ドメイン抗原結合配列及びヒト定常領域配列を含む「霊長類化」抗体が含まれる。キメラ抗体を作製するための様々な方法が記載されている。例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．ＳｃＬ  Ｕ．Ｓ．Ａ．８１：６８５１，１９８５；Ｔａｋｅｄａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３１４：４５２，１９８５、Ｃａｂｉｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，５６７号明細書；Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第４，８１６，３９７号明細書；Ｔａｎａｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，欧州特許第０１７１４９６号明細書；欧州特許第０１７３４９４号明細書；及び英国特許第２１７７０９６号明細書を参照されたい。
【００８２】
抗体、抗体コンストラクト又は抗体フラグメントは、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに開示される方法によるヒトＴ細胞エピトープの特異的欠失（「脱免疫化」と呼ばれる方法）によっても改変され得る。簡潔に説明すると、ＭＨＣクラスＩＩに結合するペプチドについて、抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインを分析することができる。これらのペプチドは、潜在的なＴ細胞エピトープ（国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに定義される）に相当する。潜在的なＴ細胞エピトープの検出には、国際公開第９８／５２９７６号パンフレット及び国際公開第００／３４３１７号パンフレットに記載されるとおり、「ペプチドスレッディング法」と呼ばれるコンピュータモデリング手法を適用することができ、加えて、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合ペプチドのデータベースにおいて、ＶＨ及びＶＬ配列に存在するモチーフを検索することができる。これらのモチーフは、１８の主要ＭＨＣクラスＩＩ  ＤＲアロタイプのいずれかに結合するため、潜在的なＴ細胞エピトープとなる。検出された潜在的なＴ細胞エピトープは、可変ドメイン内の少数のアミノ酸残基を置換することにより、又は好ましくは単一のアミノ酸置換により除去することができる。通常、保存的置換がなされる。全てではないが、多くの場合、ヒト生殖細胞系列の抗体配列内の位置に共通するアミノ酸が使用され得る。ヒト生殖細胞系列配列については、例えば、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；Ｃｏｏｋ，Ｇ．Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ  Ｖｏｌ．１６（５）：２３７−２４２；及びＴｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ  Ｊ．１４：１４：４６２８−４６３８において開示される。Ｖ  ＢＡＳＥ総覧は、ヒト免疫グロブリン可変領域配列の包括的な総覧を提供する（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ，ＬＡ．ｅｔ  ａｌ．ＭＲＣ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫによる編集）。これらの配列をヒト配列の供給源として、例えばフレームワーク領域及びＣＤＲに使用することができる。例えば、米国特許第６，３００，０６４号明細書に記載されるコンセンサスヒトフレームワーク領域を使用することもできる。
【００８３】
「ヒト化」抗体、抗体コンストラクト又はそのフラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２又は抗体の他の抗原結合部分配列）は、非ヒト免疫グロブリン由来の最小限の配列を含有する、大部分がヒト配列である抗体又は免疫グロブリンである。ほとんどの場合、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域（ＣＤＲともいう）由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有するマウス、ラット、ハムスター又はウサギなどの非ヒト（例えば、齧歯類）種（ドナー抗体）の超可変領域由来の残基により置換されているヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。場合により、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基により置換される。さらに、本明細書で使用する場合、「ヒト化抗体」は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基も含む場合がある。これらの改変は、抗体の性能をさらに洗練させ、最適化するためになされる。ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）、通常、ヒト免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部分も含む場合がある。さらなる詳細については、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｅｉｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３−３２９（１９８８）；及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．，２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【００８４】
ヒト化抗体又はそのフラグメントは、抗原結合に直接関与しないＦｖ可変ドメインの配列をヒトＦｖ可変ドメイン由来の均等な配列で置換することによって生成することができる。ヒト化抗体又はそのフラグメントを生成するための例示的な方法は、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２−１２０７；Ｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ４：２１４並びに米国特許第５，５８５，０８９号明細書、米国特許第５，６９３，７６１号明細書、米国特許第５，６９３，７６２号明細書、米国特許第５，８５９，２０５号明細書及び米国特許第６，４０７，２１３号明細書により提供される。それらの方法は、重鎖又は軽鎖の少なくとも１つに由来する免疫グロブリンＦｖ可変ドメインの全て又は一部分をコードする核酸配列を単離、操作及び発現することを含む。そのような核酸を、上記のとおりの所定の標的に対する抗体を産生するハイブリドーマ及び他の供給源から得ることができる。次に、ヒト化抗体分子をコードする組換えＤＮＡが適切な発現ベクターにクローニングされ得る。
【００８５】
ヒト化抗体は、ヒト重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するが、内在性のマウス免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子を発現することができないマウスなどのトランスジェニック動物を用いても作製され得る。Ｗｉｎｔｅｒは、本明細書に記載されるヒト化抗体の調製に使用され得る例示的なＣＤＲ移植法を記載している（米国特許第５，２２５，５３９号明細書）。特定のヒト抗体のＣＤＲの全ては、非ヒトＣＤＲの少なくとも一部分で置換されるか又はＣＤＲの一部のみが非ヒトＣＤＲで置換され得る。所定の抗原に対するヒト化抗体の結合に必要とされる数のＣＤＲを置換することのみが必要である。
【００８６】
ヒト化抗体は、保存的置換、コンセンサス配列置換、生殖細胞系列置換及び／又は復帰変異の導入によって最適化することができる。このような改変免疫グロブリン分子は、当技術分野で知られる複数の技術のいずれかによって作製することができる（例えば、Ｔｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８０：７３０８−７３１２，１９８３、Ｋｏｚｂｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，４：７２７９，１９８３、Ｏｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，９２：３−１６，１９８２及び欧州特許第２３９４００号明細書）。
【００８７】
用語「ヒト抗体」、「ヒト抗体コンストラクト」及び「ヒト結合ドメイン」は、例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）（前掲）によって記載されたものを含む、当技術分野で知られるヒト生殖細胞系列免疫グロブリン配列に実質的に対応する可変及び定常領域又はドメインなどの抗体領域を有する抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインを含む。本発明のヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム変異誘発若しくは部位特異的変異誘発により、又はインビボでの体細胞変異により導入される変異）を例えばＣＤＲ、特にＣＤＲ３に含み得る。ヒト抗体、抗体コンストラクト又は結合ドメインは、ヒト生殖細胞系列の免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基で置換された少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はそれを超える位置を有し得る。本明細書で使用されるヒト抗体、抗体コンストラクト及び結合ドメインの定義は、Ｘｅｎｏｍｏｕｓｅなどの技術又はシステムを使用することによって得ることができる、非人為的且つ／又は遺伝的に改変された抗体のヒト配列のみを含む完全ヒト抗体も意図している。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本発明の抗体コンストラクトは、「単離された」又は「実質的に純粋な」抗体コンストラクトである。「単離された」又は「実質的に純粋な」は、本明細書に開示される抗体コンストラクトの記載に使用されるとき、その産生環境の成分から同定、分離及び／又は回収されている抗体コンストラクトを意味する。好ましくは、抗体コンストラクトは、その産生環境からの他の全ての成分との関連を含まないか又は実質的に含まない。組換えトランスフェクト細胞から生じる成分などのその産生環境の混入成分は、通常、ポリペプチドについての診断又は治療用途を妨げる材料であり、これは、酵素、ホルモン及び他のタンパク質性又は非タンパク質性溶質を含み得る。抗体コンストラクトは、例えば、所与の試料中の全タンパク質の少なくとも約５重量％又は少なくとも約５０重量％を構成し得る。単離されたタンパク質は、環境に応じて総タンパク質含量の５重量％〜９９．９重量％を構成し得ると理解される。ポリペプチドが高い濃度レベルで作製されるように、誘導性プロモーター又は高発現プロモーターの使用によって著しく高濃度でポリペプチドが作製され得る。この定義は、当技術分野で知られる多様な生物体及び／又は宿主細胞での抗体コンストラクトの産生を含む。好ましい実施形態では、抗体コンストラクトは、（１）スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端若しくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、又は（２）クーマシーブルー若しくは好ましくは銀染色を用いた非還元若しくは還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで精製されることになる。ただし、通常、単離された抗体コンストラクトは、少なくとも１つの精製工程によって調製されることになる。
【００８９】
用語「結合ドメイン」は、本発明との関係では、それぞれ標的分子（抗原）及びＣＤ３上の所与の標的エピトープ又は所与の標的部位と（特異的に）結合する／それらと相互作用する／それらを認識するドメインを特徴付ける。第１の結合ドメインの構造及び機能（標的細胞の表面抗原ＣＤ３３を認識すること）並びにまた好ましくは第２の結合ドメイン（ＣＤ３）の構造及び／又は機能は、抗体、例えば完全長又は全免疫グロブリン分子の構造及び／又は機能に基づく。本発明によれば、第１の結合ドメインは、３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）の存在によって特徴付けられる。第２の結合ドメインは、好ましくは、標的結合を可能にする抗体の最小構造要件も含む。より好ましくは、第２の結合ドメインは、少なくとも３つの軽鎖ＣＤＲ（すなわちＶＬ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）並びに／又は３つの重鎖ＣＤＲ（すなわちＶＨ領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）を含む。第１及び／又は第２の結合ドメインは、既存の（モノクローナル）抗体由来のＣＤＲ配列をスキャフォールドに移植する以外のファージディスプレイ又はライブラリースクリーニング法によって作製されるか又は得られることが想定される。
【００９０】
本発明によれば、結合ドメインは、ポリペプチドの形態であることが好ましい。このようなポリペプチドは、タンパク質性部分及び非タンパク質性部分（例えば、化学的リンカー又はグルタルアルデヒドなどの化学的架橋剤）を含み得る。タンパク質（そのフラグメント、好ましくは生物学的に活性なフラグメント及び通常３０未満のアミノ酸を有するペプチドを含む）は、（アミノ酸の鎖をもたらす）共有ペプチド結合を通じて相互に結合された２つ以上のアミノ酸を含む。本明細書で使用する場合、用語「ポリペプチド」は、通常、３０を超えるアミノ酸からなる分子群を表す。ポリペプチドは、二量体、三量体及びより高次のオリゴマーなどの多量体をさらに形成し、すなわち２つ以上のポリペプチド分子からなる場合もある。そのような二量体、三量体などを形成するポリペプチド分子は、同一であっても又はなくてもよい。このような多量体の対応する高次構造は、したがって、ホモ又はヘテロ二量体、ホモ又はヘテロ三量体などと称される。ヘテロ多量体の例は、その天然に存在する形態において、２つの同一のポリペプチド軽鎖及び２つの同一のポリペプチド重鎖からなる抗体分子である。用語「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、例えば、グリコシル化、アセチル化、リン酸化などのような翻訳後修飾による修飾がなされた天然修飾ペプチド／ポリペプチド／タンパク質も指す。本明細書で参照される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」又は「タンパク質」は、ペグ化などの化学修飾されたものでもあり得る。このような修飾は、当技術分野でよく知られており、本明細書で以下に記載される。
【００９１】
少なくとも１つのヒト結合ドメインを含む抗体及び抗体コンストラクトは、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター又はウサギ）などの非ヒト可変及び／又は定常領域を有する抗体又は抗体コンストラクトに伴う問題の一部を回避する。このような齧歯類由来タンパク質が存在すると、抗体又は抗体コンストラクトの迅速なクリアランスをもたらす可能性があるか、又は患者による抗体又は抗体コンストラクトに対する免疫反応を発生させる可能性がある。齧歯類由来抗体又は抗体コンストラクトの使用を避けるために、齧歯類が完全ヒト抗体を産生するようにヒト抗体機能を齧歯類に導入することにより、ヒト又は完全ヒト抗体／抗体コンストラクトを生成することができる。
【００９２】
ＹＡＣにおいてメガベースサイズのヒト遺伝子座をクローニング及び再構築する能力及びそれらをマウス生殖細胞系列に導入する能力は、非常に大きいか又は粗くマッピングされた遺伝子座の機能的要素の解明並びにヒト疾患の有用なモデルの生成にとって強力な手法を提供する。さらに、マウス遺伝子座をそれらのヒト均等物で置換するそのような技術を使用すれば、発生期のヒト遺伝子産物の発現及び調節、それらと他の系との伝達並びに疾患の誘発及び進行へのそれらの関与について独特の見解を得ることができるであろう。
【００９３】
このような戦略の重要な実用化は、マウス液性免疫系の「ヒト化」である。内在性免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子が不活性化されたマウスへのヒトＩｇ遺伝子座の導入により、抗体のプログラムされた発現及び構築並びにＢ細胞の発生におけるそれらの役割の基礎となる機構を研究する機会が得られる。さらに、このような戦略であれば、ヒト疾患における抗体療法の可能性を実現する上で重要なマイルストーンとなる完全ヒトモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の作製にとって理想的な供給源を得ることができるであろう。完全ヒト抗体又は抗体コンストラクトは、マウス又はマウス由来ｍＡｂに固有の免疫原性及びアレルギー反応を最小化し、それによって投与される抗体／抗体コンストラクトの有効性及び安全性を増大させることが期待される。完全ヒト抗体又は抗体コンストラクトの使用により、化合物の反復投与を必要とする慢性及び再発性のヒト疾患、例えば炎症、自己免疫及び癌の治療に大幅な利点が得られるものと期待され得る。
【００９４】
この目標に向けた手法の１つは、マウス抗体の産生に欠損があるマウス系統をヒトＩｇ遺伝子座の大きいフラグメントを用いて操作することであり、これは、このようなマウスが、マウス抗体を生じずに広範なレパートリーのヒト抗体を産生するであろうとの予測に立つものであった。大きいヒトＩｇフラグメントは、可変遺伝子の広範な多様性並びに抗体の産生及び発現の適切な調節を保持すると考えられる。抗体の多様化及び選択並びにヒトタンパク質に対する免疫寛容の欠如のためにマウス機構を利用することにより、これらのマウス系統において再現されるヒト抗体レパートリーは、ヒト抗原を含む目的の任意の抗原に対して高親和性の抗体を産生するはずである。ハイブリドーマ技術を使用すれば、所望の特異性を有する抗原特異的ヒトｍＡｂを容易に作製及び選択することができるであろう。この一般的な戦略は、最初のＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウス系統の生成と関連して実証された（Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１（１９９４）を参照されたい）。このＸｅｎｏＭｏｕｓｅ系統は、可変領域及び定常領域のコア配列を含有したヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれ２４５ｋｂ及び１９０ｋｂサイズの生殖細胞系列配置フラグメントを含有する酵母人工染色体（ＹＡＣ）を用いて操作された。このヒトＩｇを含有するＹＡＣは、抗体の再編成及び発現の両方に関してマウス系への適合性があることが証明されており、不活性化されたマウスＩｇ遺伝子を置換することが可能であった。これは、それらがＢ細胞の発生を誘導して、完全ヒト抗体の成体様ヒトレパートリーを産生し、抗原特異的ヒトｍＡｂを産生する能力によって実証された。これらの結果は、多数のＶ遺伝子、追加の調節エレメント及びヒトＩｇ定常領域を含有するヒトＩｇ遺伝子座の大部分の導入が、感染及び免疫化に対するヒト液性応答を特徴とする実質的に完全なレパートリーを再現し得ることも示唆した。最近、Ｇｒｅｅｎらの研究を発展させ、ヒト重鎖遺伝子座及びカッパ軽鎖遺伝子座のそれぞれのメガベースサイズの生殖細胞系列配置ＹＡＣフラグメントの導入により、ヒト抗体レパートリーのおよそ８０％超が導入された。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）及び米国特許出願公開第０８／７５９，６２０号明細書を参照されたい。
【００９５】
ＸｅｎｏＭｏｕｓｅマウスの作製は、米国特許出願公開第０７／４６６，００８号明細書、同第０７／６１０，５１５号明細書、同第０７／９１９，２９７号明細書、同第０７／９２２，６４９号明細書、同第０８／０３１，８０１号明細書、同第０８／１１２，８４８号明細書、同第０８／２３４，１４５号明細書、同第０８／３７６，２７９号明細書、同第０８／４３０，９３８号明細書、同第０８／４６４，５８４号明細書、同第０８／４６４，５８２号明細書、同第０８／４６３，１９１号明細書、同第０８／４６２，８３７号明細書、同第０８／４８６，８５３号明細書、同第０８／４８６，８５７号明細書、同第０８／４８６，８５９号明細書、同第０８／４６２，５１３号明細書、同第０８／７２４，７５２号明細書及び同第０８／７５９，６２０号明細書；並びに米国特許第６，１６２，９６３号明細書、同第６，１５０，５８４号明細書、同第６，１１４，５９８号明細書、同第６，０７５，１８１号明細書及び同第５，９３９，５９８号明細書並びに日本特許第３０６８１８０Ｂ２号公報、同第３０６８５０６Ｂ２号公報及び同第３０６８５０７Ｂ２号公報でさらに議論及び詳述されている。Ｍｅｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １５：１４６−１５６（１９９７）及びＧｒｅｅｎ  ａｎｄ  Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓ  Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３−４９５（１９９８）、欧州特許第０４６３１５１Ｂ１号明細書、国際公開第９４／０２６０２号パンフレット、国際公開第９６／３４０９６号パンフレット、国際公開第９８／２４８９３号パンフレット、国際公開第００／７６３１０号パンフレット及び国際公開第０３／４７３３６号パンフレットも参照されたい。
【００９６】
代替的な手法において、ＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．を含む他社は、「ミニ遺伝子座」手法を利用している。ミニ遺伝子座手法では、Ｉｇ遺伝子座からのフラグメント（個々の遺伝子）を含めることにより外因性Ｉｇ遺伝子座が模倣される。したがって、１つ以上のＶＨ遺伝子、１つ以上のＤＨ遺伝子、１つ以上のＪＨ遺伝子、μ定常領域及び第２の定常領域（好ましくはγ定常領域）が動物への挿入用コンストラクトとして形成される。この手法は、Ｓｕｒａｎｉらに対する米国特許第５，５４５，８０７号明細書並びにＬｏｎｂｅｒｇ及びＫａｙのそれぞれに対する米国特許第５，５４５，８０６号明細書、同第５，６２５，８２５号明細書、同第５，６２５，１２６号明細書、同第５，６３３，４２５号明細書、同第５，６６１，０１６号明細書、同第５，７７０，４２９号明細書、同第５，７８９，６５０号明細書、同第５，８１４，３１８号明細書、同第５，８７７，３９７号明細書、同第５，８７４，２９９号明細書及び同第６，２５５，４５８号明細書、Ｋｒｉｍｐｅｎｆｏｒｔ及びＢｅｒｎｓに対する米国特許第５，５９１，６６９号明細書及び同第６，０２３．０１０号明細書、Ｂｅｒｎｓらに対する米国特許第５，６１２，２０５号明細書、同第５，７２１，３６７号明細書及び同第５，７８９，２１５号明細書、並びにＣｈｏｉ及びＤｕｎｎに対する米国特許第５，６４３，７６３号明細書、並びにＧｅｎＰｈａｒｍ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌの米国特許出願公開第０７／５７４，７４８号明細書、同第０７／５７５，９６２号明細書、同第０７／８１０，２７９号明細書、同第０７／８５３，４０８号明細書、同第０７／９０４，０６８号明細書、同第０７／９９０，８６０号明細書、同第０８／０５３，１３１号明細書、同第０８／０９６，７６２号明細書、同第０８／１５５，３０１号明細書、同第０８／１６１，７３９号明細書、同第０８／１６５，６９９号明細書、同第０８／２０９，７４１号明細書に記載されている。欧州特許第０５４６０７３Ｂ１号明細書、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット、国際公開第９２／２２６４５号パンフレット、国際公開第９２／２２６４７号パンフレット、国際公開第９２／２２６７０号パンフレット、国際公開第９３／１２２２７号パンフレット、国際公開第９４／００５６９号パンフレット、国際公開第９４／２５５８５号パンフレット、国際公開第９６／１４４３６号パンフレット、国際公開第９７／１３８５２号パンフレット及び国際公開第９８／２４８８４号パンフレット並びに米国特許第５，９８１，１７５号明細書も参照されたい。さらに、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｔｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）、Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）及びＴｕａｉｌｌｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）、Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）を参照されたい。
【００９７】
Ｋｉｒｉｎも、マイクロセル融合によって大きい染色体片又は染色体全体が導入された、マウスからのヒト抗体の産生を実証した。欧州特許出願第７７３  ２８８号明細書及び同第８４３  ９６１号明細書を参照されたい。Ｘｅｎｅｒｅｘ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓは、ヒト抗体の潜在的作成技術を開発中である。この技術では、ＳＣＩＤマウスがヒトリンパ細胞、例えばＢ細胞及び／又はＴ細胞で再構成される。次に、マウスは、抗原で免疫化され、その抗原に対して免疫応答を生じ得る。米国特許第５，４７６，９９６号明細書；同第５，６９８，７６７号明細書；及び同第５，９５８，７６５号明細書を参照されたい。
【００９８】
ヒト抗マウス抗体（ＨＡＭＡ）反応は、産業界がキメラ又は別の方法でヒト化された抗体を作製する要因となった。しかしながら、ある種のヒト抗キメラ抗体（ＨＡＣＡ）反応は、特に慢性又は複数回用量での抗体の利用において観察されることになると予想される。したがって、ＨＡＭＡ若しくはＨＡＣＡ反応の懸念及び／又は影響をなくすために、標的細胞の表面抗原に対する完全ヒト結合ドメイン及びＣＤ３に対する完全ヒト結合ドメインを含む抗体コンストラクトを提供することが望ましいと考えられる。
【００９９】
用語「に（特異的に）結合する」、「（特異的に）認識する」、「（特異的に）向けられる」及び「と（特異的に）反応する」は、本発明に基づいて、結合ドメインが、標的タンパク質又は抗原（標的細胞の表面抗原ＣＤ３３／ＣＤ３）上に位置するエピトープの１つ以上、好ましくは少なくとも２つ、より好ましくは少なくとも３つ及び最も好ましくは少なくとも４つのアミノ酸と相互作用するか又は特異的に相互作用することを意味する。
【０１００】
用語「エピトープ」は、抗体若しくは免疫グロブリン又は抗体若しくは免疫グロブリンの誘導体若しくはフラグメントなどの結合ドメインが特異的に結合する抗原上の部位を指す。「エピトープ」は、抗原性であり、したがって、エピトープという用語は、本明細書において「抗原性構造」又は「抗原決定基」と称する場合もある。したがって、結合ドメインは、「抗原相互作用部位」である。前記結合／相互作用は、「特異的認識」も定義すると理解される。用語「エピトープ」は、完全な抗原構造を説明することとして本出願に関連して理解されるが、用語「エピトープの一部」は、所与の結合ドメインの特定のエピトープの１つ以上の部分群を説明するために使用され得る。
【０１０１】
「エピトープ」は、連続したアミノ酸又はタンパク質の三次元フォールディングによって並列される非連続アミノ酸の両方によって形成され得る。「線状エピトープ」は、アミノ酸の一次配列が認識されるエピトープを含むエピトープである。線状エピトープは、通常、特有の配列内に少なくとも３つ又は少なくとも４つ及びより一般的に少なくとも５つ、又は少なくとも６つ、又は少なくとも７つ、例えば約８〜約１０のアミノ酸を含む。
【０１０２】
「立体構造エピトープ」は、線状エピトープとは対照的に、エピトープを含むアミノ酸の一次配列が、認識されるエピトープを定義する唯一の要素ではないエピトープ（例えば、アミノ酸の一次配列が必ずしも結合ドメインによって認識されないエピトープ）である。一般に、立体構造エピトープは、線状エピトープと比較して多数のアミノ酸を含む。立体構造エピトープの認識に関して、結合ドメインは、抗原、好ましくはペプチド若しくはタンパク質又はそれらのフラグメントの三次元構造を認識する（本発明に関連して、結合ドメインの１つに対する抗原が標的細胞の表面抗原ＣＤ３３内に含まれる）。例えば、タンパク質分子が折り畳まれて三次元構造を形成する場合、立体構造エピトープを形成する特定のアミノ酸及び／又はポリペプチド骨格が並列した状態になり、それによって抗体がそのエピトープを認識できるようになる。エピトープの立体構造を決定する方法としては、ｘ線結晶構造解析、二次元核磁気共鳴（２Ｄ−ＮＭＲ）分光分析及び部位特異的スピンラベル法及び電子常磁性共鳴（ＥＰＲ）分光法が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０３】
結合ドメインとエピトープ又はエピトープクラスターとの間の相互作用は、結合ドメインが特定のタンパク質又は抗原（本明細書では、それぞれ標的細胞の表面抗原ＣＤ３３及びＣＤ３）上のエピトープ又はエピトープクラスターに対して測定可能な親和性を示し、且つ一般に標的細胞の表面抗原ＣＤ３３又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対して著しい反応性を示さないことを意味する。「測定可能な親和性」は、約１０−６Ｍ（ＫＤ）又はそれより強い親和性を有する結合を含む。好ましくは、結合親和性が約１０−１２〜１０−８Ｍ、１０−１２〜１０−９Ｍ、１０−１２〜１０−１０Ｍ、１０−１１〜１０−８Ｍ、好ましくは約１０−１１〜１０−９Ｍである場合、結合を特異的と見なす。結合ドメインが標的と特異的に反応するか又は標的に結合するかどうかは、とりわけ、標的タンパク質又は抗原に対する前記結合ドメインの反応を標的細胞の表面抗原ＣＤ３３又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対する前記結合ドメインの反応と比較することにより、容易に試験することができる。好ましくは、本発明の結合ドメインは、標的細胞の表面抗原ＣＤ３３又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に本質的に又は実質的に結合しない（すなわち、第１の結合ドメインは、標的細胞の表面抗原ＣＤ３３以外のタンパク質に結合することができず、第２の結合ドメインは、ＣＤ３以外のタンパク質に結合することができない）。
【０１０４】
用語「本質的／実質的に結合しない」又は「結合することができない」は、本発明の結合ドメインが標的細胞の表面抗原ＣＤ３３又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に結合せず、すなわち標的細胞の表面抗原ＣＤ３３又はＣＤ３のそれぞれに対する結合を１００％とした場合、標的細胞の表面抗原ＣＤ３３又はＣＤ３以外のタンパク質又は抗原に対して３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％又は５％超の反応性を示さないことを意味する。
【０１０５】
特異的結合は、結合ドメイン及び抗原のアミノ酸配列内の特異的モチーフによってもたらされると考えられる。したがって、結合は、それらの一次、二次及び／又は三次構造の結果として並びに前記構造の二次的修飾の結果として生じる。抗原相互作用部位とその特異抗原との特異的相互作用により、抗原に対する前記部位の単純な結合が生じ得る。さらに、抗原相互作用部位とその特異抗原との特異的相互作用により、例えば抗原の立体構造変化の誘導、抗原のオリゴマー化などにより、代替的に又は追加的にシグナルの開始がもたらされ得る。
【０１０６】
用語「可変」は、配列内で可変性を示し、特定の抗体の特異性及び結合親和性の決定に関与する、抗体又は免疫グロブリンドメインの一部分（すなわち「可変ドメイン」）を指す。可変重鎖（ＶＨ）と可変軽鎖（ＶＬ）との対がともに単一の抗原結合部位を形成する。
【０１０７】
可変性は、抗体の可変ドメイン全体に均一に分布しているのではなく、重鎖及び軽鎖可変領域の各々のサブドメインに集中している。これらのサブドメインは、「超可変領域」又は「相補性決定領域」（ＣＤＲ）と呼ばれる。可変ドメインのより保存的な（すなわち非超可変）部分は、「フレームワーク」領域（ＦＲＭ）と呼ばれ、抗原結合表面を形成する三次元空間内における６つのＣＤＲのための足場を提供する。天然に存在する重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、大部分がβシート配置をとる４つのＦＲＭ領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）をそれぞれ含み、これらは、ループ接続を形成し、場合によりβシート構造の一部を形成する３つの超可変領域によって接続される。各鎖の超可変領域は、ＦＲＭによって近接して一体に保持されており、他の鎖の超可変領域とともに抗原結合部位の形成に寄与する（前掲のＫａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．を参照されたい）。
【０１０８】
用語「ＣＤＲ」及びその複数形である「ＣＤＲｓ」は、相補性決定領域を指し、その３つが軽鎖可変領域の結合特性を構成し（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２及びＣＤＲ−Ｌ３）、３つが重鎖可変領域の結合特性を構成する（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２及びＣＤＲ−Ｈ３）。ＣＤＲは、抗体と抗原との特異的相互作用を担う残基の大部分を含み、したがって抗体分子の機能的活性に寄与する。ＣＤＲは、抗原特異性の主要な決定基である。
【０１０９】
ＣＤＲの境界及び長さの厳密な定義は、各種の分類及び付番方式に従う。したがって、ＣＤＲは、本明細書に記載される付番方式を含む、Ｋａｂａｔ、Ｃｈｏｔｈｉａ、接触又は任意の他の境界定義によって表わされ得る。境界が異なっていても、これらの方式の各々は、可変配列内のいわゆる「超可変領域」を構成する部分において、ある程度の重複を有する。したがって、これらの方式によるＣＤＲの定義は、長さ及び隣接するフレームワーク領域に関する境界領域が相違する場合がある。例えば、Ｋａｂａｔ（異種間の配列可変性に基づく手法）、Ｃｈｏｔｈｉａ（抗原−抗体複合体の結晶学的研究に基づく手法）及び／又はＭａｃＣａｌｌｕｍを参照されたい（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，前掲；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９８７，１９６：９０１−９１７；及びＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６２：７３２）。抗原結合部位の特性決定のためのさらに別の基準は、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアによって用いられるＡｂＭ定義である。例えば、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｖａｒｉａｂｌｅ  Ｄｏｍａｉｎｓ．Ｉｎ：Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｌａｂ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅｄ．：Ｄｕｅｂｅｌ，Ｓ．ａｎｄ  Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ，Ｒ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ）を参照されたい。２つの残基同定技法が、重複するが、同一ではない領域を定義する限り、それらを組み合わせてハイブリッドＣＤＲを定義することができる。しかしながら、いわゆるＫａｂａｔ方式による付番が好ましい。
【０１１０】
典型的には、ＣＤＲは、カノニカル構造として分類することのできるループ構造を形成する。用語「カノニカル構造」は、抗原結合（ＣＤＲ）ループがとる主鎖の立体構造を指す。比較構造研究から、６つの抗原結合ループの５つは、利用可能な立体構造の限られたレパートリーのみを有することが見出された。各カノニカル構造をポリペプチド骨格のねじれ角によって特徴付けることができる。したがって、抗体間の対応するループは、ループの大部分において、高いアミノ酸配列の可変性が見られるにも関わらず、非常に類似した三次元構造を有し得る（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ．，１９８７，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，１９８９，３４２：８７７；Ｍａｒｔｉｎ  ａｎｄ  Ｔｈｏｒｎｔｏｎ，Ｊ．ＭｏＩ．Ｂｉｏｌ，１９９６，２６３：８００）。さらに、取られるループ構造と、その周囲のアミノ酸配列との間に関連性がある。特定のカノニカルクラスのコンホメーションは、ループの長さにより、且つそのループ内及び保存されたフレームワーク内（すなわちループ外）の重要な位置に存在するアミノ酸残基により決定される。したがって、特定のカノニカルクラスへの割り当ては、これらの重要なアミノ酸残基の存在に基づいて行われ得る。
【０１１１】
用語「カノニカル構造」は、例えば、Ｋａｂａｔ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，前掲）により分類されるとおり、抗体の線状配列に関する考慮も含み得る。Ｋａｂａｔの付番スキーム（方式）は、抗体可変ドメインのアミノ酸残基を一貫した様式で付番するために広く採用されている基準であり、本明細書の他の箇所でも言及されるように本発明で適用される好ましいスキームである。更なる構造の検討が抗体のカノニカル構造を決定するために使用される場合もある。例えば、Ｋａｂａｔの付番法では十分に反映されない相違をＣｈｏｔｈｉａらの付番方式によって記載することができ、且つ／又は他の技術、例えば結晶学及び二次元若しくは三次元コンピュータモデリングによって明らかにすることができる。したがって、所与の抗体配列は、とりわけ、（例えば、種々のカノニカル構造をライブラリーに含めるという要求に基づいて）適切なシャーシ配列の同定が可能であるカノニカルクラスに分類され得る。抗体のアミノ酸配列のＫａｂａｔ付番法及びＣｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，（前掲）に記載される構造の検討並びに抗体構造のカノニカルな側面の解釈に対するそれらの意義については、文献に記載されている。様々なクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び三次元配置は、当技術分野でよく知られている。抗体構造の概説については、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｅｄｓ．Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８を参照されたい。
【０１１２】
軽鎖のＣＤＲ３及び特に重鎖のＣＤＲ３は、軽鎖及び重鎖可変領域内での抗原結合において最も重要な決定因子となる場合がある。いくつかの抗体コンストラクトでは、重鎖ＣＤＲ３が抗原と抗体との間の主要な接触領域になると思われる。ＣＤＲ３のみを変化させるインビトロ選択スキームを使用して、抗体の結合特性を変化させることができるか、又はいずれの残基が抗原の結合に寄与するかを決定することができる。したがって、ＣＤＲ３は、典型的には抗体結合部位内における分子多様性の最大の供給源である。例えば、Ｈ３は、２つのアミノ酸残基ほど短いもの又は２６つ超のアミノ酸であり得る。
【０１１３】
古典的完全長抗体又は免疫グロブリンでは、各軽（Ｌ）鎖は、１つの共有結合性ジスルフィド結合によって重（Ｈ）鎖に連結される一方、２つのＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じた１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結される。ＶＨに最も近接するＣＨドメインは、通常、ＣＨ１と称される。定常（「Ｃ」）ドメインは、抗原結合に直接関与しないが、抗体依存性、細胞介在性の細胞傷害性及び補体活性化などの種々のエフェクター機能を示す。抗体のＦｃ領域は、重鎖定常ドメイン内に含まれ、例えば細胞表面に位置するＦｃ受容体と相互作用することができる。
【０１１４】
構築及び体細胞変異後の抗体遺伝子の配列は、極めて多様であり、これらの多様化した遺伝子は、１０１０の異なる抗体分子をコードすると推定される（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，２ｎｄ  ｅｄ．，ｅｄｓ．Ｊｏｎｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，１９９５）。したがって、免疫系は、免疫グロブリンのレパートリーを提供する。用語「レパートリー」は、少なくとも１つの免疫グロブリンをコードする少なくとも１つの配列に全体又は一部が由来する少なくとも１つのヌクレオチド配列を指す。この配列は、重鎖のＶ、Ｄ及びＪセグメント並びに軽鎖のＶ及びＪセグメントのインビボでの再編成によって生成され得る。代わりに、この配列は、再編成を生じさせる、例えばインビトロ刺激に応答して細胞から生成され得る。代わりに、この配列の一部又は全ては、ＤＮＡスプライシング、ヌクレオチド合成、変異誘発及び他の方法によって得られる場合がある（例えば、米国特許第５，５６５，３３２号明細書を参照されたい）。レパートリーは、１つの配列のみを含むか、又は遺伝的に多様なコレクション内のものを含む複数の配列を含み得る。
【０１１５】
本明細書で使用する場合、用語「二重特異性」は、「少なくとも二重特異性」であるコンストラクトを指し、すなわち、それは、少なくとも第１の結合ドメイン及び第２の結合ドメインを含み、ここで、第１の結合ドメインは、１つの抗原又は標的に結合し、第２の結合ドメインは、別の抗原又は標的（本明細書ではＣＤ３）に結合する。したがって、本発明による二重特異性抗体コンストラクトは、少なくとも２つの異なる抗原又は標的に対する特異性を含む。本発明の用語「二重特異性抗体コンストラクト」は、多重特異性コンストラクト、例えば３つの結合ドメインを含む三重特異性コンストラクト又は４つ以上（例えば、４つ、５つ．．．）の特異性を有するコンストラクトも包含する。本発明との関係で使用されるコンストラクトが抗体コンストラクトである場合、これらを包含する対応するコンストラクトは、多重特異性抗体コンストラクト、例えば３つの結合ドメインを含む三重特異性抗体コンストラクト又は４つ以上（例えば、４つ、５つ．．．）の特異性を有するコンストラクトである。
【０１１６】
本発明による抗体コンストラクトが（少なくとも）二重特異性である場合、それらは、天然に存在せず、且つそれらは、天然に存在する産物と顕著に異なる。したがって、「二重特異性」抗体コンストラクト又は免疫グロブリンは、異なる特異性を有する少なくとも２つの異なる結合部位を有する人工ハイブリッド抗体又は免疫グロブリンである。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合又はＦａｂ’フラグメントの連結を含む様々な方法によって生成することができる。例えば、Ｓｏｎｇｓｉｖｉｌａｉ＆Ｌａｃｈｍａｎｎ，Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．７９：３１５−３２１（１９９０）を参照されたい。
【０１１７】
本発明の抗体コンストラクトの少なくとも２つの結合ドメイン及び可変ドメインは、ペプチドリンカー（スペーサーペプチド）を含んでも又は含まなくてもよい。用語「ペプチドリンカー」は、本発明によれば、本発明の抗体コンストラクトの一方の（可変及び／又は結合）ドメイン及びもう一方の（可変及び／又は結合）ドメインのアミノ酸配列を相互に連結するアミノ酸配列を定義する。そのようなペプチドリンカーの必須の技術的特徴は、前記ペプチドリンカーがいかなる重合活性も含まないことである。好適なペプチドリンカーには、米国特許第４，７５１，１８０号明細書及び同第４，９３５，２３３号明細書又は国際公開第８８／０９３４４号パンフレットに記載されるものがある。ペプチドリンカーは、他のドメイン又はモジュール又は領域（半減期延長ドメインなど）を本発明の抗体コンストラクトに結合するためにも使用され得る。
【０１１８】
リンカーが使用される場合、このリンカーは、第１及び第２のドメインのそれぞれが互いに独立してその異なる結合特異性を確実に保持できる十分な長さ及び配列からなることが好ましい。本発明の抗体コンストラクト内の少なくとも２つの結合ドメイン（又は２つの可変ドメイン）を接続するペプチドリンカーの場合、それらのペプチドリンカーは、数個のアミノ酸残基のみを含むもの、例えば１２アミノ酸残基以下を含むものが好ましい。したがって、１２、１１、１０、９、８、７、６又は５アミノ酸残基のペプチドリンカーが好ましい。５アミノ酸未満の想定されるペプチドリンカーは、４、３、２又は１アミノ酸を含み、ここでは、Ｇｌｙリッチリンカーが好ましい。前記「ペプチドリンカー」に関連して特に好ましい「単一」のアミノ酸は、Ｇｌｙである。したがって、前記ペプチドリンカーは、単一のアミノ酸Ｇｌｙからなり得る。ペプチドリンカーの別の好ましい実施形態は、アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ、すなわちＧｌｙ４Ｓｅｒ又はそのポリマー、すなわち（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｘを特徴とし、ここで、ｘは、１以上の整数である。二次構造を促進しないことを含む前記ペプチドリンカーの特徴は、当技術分野で知られており、例えばＤａｌｌ’Ａｃｑｕａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９９８）３７，９２６６−９２７３）、Ｃｈｅａｄｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（１９９２）２９，２１−３０）及びＲａａｇ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｌｏｗ（ＦＡＳＥＢ（１９９５）９（１），７３−８０）に記載されている。いかなる二次構造も促進しないペプチドリンカーが好ましい。前記ドメインの相互の連結は、例えば、実施例に記載される遺伝子操作によって提供することができる。融合され、作動可能に連結された二重特異性一本鎖コンストラクトを調製し、それらを哺乳動物細胞又は細菌において発現させる方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット又はＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，２００１）。
【０１１９】
二重特異性一本鎖分子は、当技術分野で知られており、国際公開第９９／５４４４０号パンフレット、Ｍａｃｋ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９７），１５８，３９６５−３９７０、Ｍａｃｋ，ＰＮＡＳ，（１９９５），９２，７０２１−７０２５、Ｋｕｆｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．，（１９９７），４５，１９３−１９７、Ｌｏｅｆｆｌｅｒ，Ｂｌｏｏｄ，（２０００），９５，６，２０９８−２１０３、Ｂｒｕｅｈｌ，Ｉｍｍｕｎｏｌ．，（２００１），１６６，２４２０−２４２６、Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，（１９９９），２９３，４１−５６に記載されている。一本鎖抗体の作製に関して記載された技術（とりわけ米国特許第４，９４６，７７８号明細書、Ｋｏｎｔｅｒｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｄｕｅｂｅｌ（２０１０），前掲及びＬｉｔｔｌｅ（２００９），前掲を参照されたい）は、選出された標的を特異的に認識する一本鎖抗体コンストラクトを作製するために適合させることができる。
【０１２０】
二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）（二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）とも呼ばれる）又は二重特異性一本鎖可変フラグメント（形式（ｓｃＦｖ）２を有するｂｉ−ｓｃＦｖ又はｄｉ−ｓｃＦｖ）は、２つのｓｃＦｖ分子を連結することにより作り出すことができる。これらの２つのｓｃＦｖ分子が同じ結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二価と呼ぶことが好ましい（すなわち、それは、同じ標的エピトープに対して２の価数を有する）。これらの２つのｓｃＦｖ分子が異なる結合特異性を有する場合、得られる（ｓｃＦｖ）２分子を二重特異性と呼ぶことが好ましい。連結は、２つのＶＨ領域及び２つのＶＬ領域を有する単一のペプチド鎖を作製して、タンデムｓｃＦｖを生成することによってなされ得る（例えば、Ｋｕｆｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２２（５）：２３８−２４４を参照されたい）。別の可能性は、２つの可変領域を一体に折り畳むには短すぎる（例えば、約５アミノ酸の）リンカーペプチドを用いてｓｃＦｖ分子を作製し、ｓｃＦｖを二量体化させることである。この型は、ダイアボディとして知られている（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ，Ｐｈｉｌｉｐｐ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｊｕｌｙ  １９９３）Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｓｔａｔｅｓ  ｏｆ  Ａｍｅｒｉｃａ  ９０（１４）：６４４４−８を参照されたい）。
【０１２１】
単一ドメイン抗体は、他のＶ領域又はドメインに非依存的に特異抗原に選択的に結合することができる１つのみの（単量体の）抗体可変ドメインを含む。最初の単一ドメイン抗体は、ラクダにおいて見出される重鎖抗体から作り出され、これらは、ＶＨＨフラグメントと呼ばれる。軟骨魚類も重鎖抗体（ＩｇＮＡＲ）を有し、それから、ＶＮＡＲフラグメントと呼ばれる単一ドメイン抗体を得ることができる。代替的な手法は、例えば、ヒト又は齧歯類由来の一般的な免疫グロブリン由来の二量体可変ドメインを単量体に分割し、それによって単一ドメインＡｂとしてＶＨ又はＶＬを得ることである。単一ドメイン抗体に関する大部分の研究は、現時点で重鎖可変ドメインに基づいているが、軽鎖由来のナノボディも標的エピトープに特異的に結合することが示されている。単一ドメイン抗体の例は、ｓｄＡｂ、ナノボディ又は単一可変ドメイン抗体と呼ばれる。
【０１２２】
したがって、（単一ドメインｍＡｂ）２は、ＶＨ、ＶＬ、ＶＨＨ及びＶＮＡＲを含む群から個別に選択される（少なくとも）２つの単一ドメインモノクローナル抗体から構成されるモノクローナル抗体コンストラクトである。リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。同様に、「ｓｃＦｖシングルドメインｍＡｂ」は、上記に記載したとおりの少なくとも１つのシングルドメイン抗体と、上記に記載したとおりの１つのｓｃＦｖ分子とで構成されたモノクローナル抗体コンストラクトである。この場合もやはり、リンカーは、好ましくは、ペプチドリンカーの形態である。
【０１２３】
また、本発明の抗体コンストラクトは、標的抗原ＣＤ３３及びＣＤ３に結合するその機能に加えてさらなる機能を有することも想定される。この形式において、抗体コンストラクトは、標的抗原への結合を介して標的細胞を標的化すること、ＣＤ３結合を介して細胞障害性Ｔ細胞活性を媒介すること及び標識（蛍光など）などのさらなる機能、毒素などの治療薬又は放射性核種などをもたらすことによる三機能性又は多機能性抗体コンストラクトである。
【０１２４】
抗体コンストラクトの共有結合修飾も本発明の範囲内に含まれ、これは、必ずしもというわけではないが、概して翻訳後に行われる。例えば、抗体コンストラクトのいくつかの種類の共有結合的修飾は、抗体コンストラクトの特定のアミノ酸残基を、選択された側鎖又はＮ末端若しくはＣ末端残基と反応することができる有機誘導体化剤と反応させることによって分子内に導入される。
【０１２５】
システイニル残基は、最も一般的には、α−ハロアセテート（及び対応するアミン）、例えばクロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応して、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイニル残基は、ブロモトリフルオロアセトン、α−ブロモ−β−（５−イミドゾイル）プロピオン酸、リン酸クロロアセチル、Ｎ−アルキルマレイミド、３−ニトロ−２−ピリジルジスルフィド、メチル２−ピリジルジスルフィド、ｐ−クロロメルクリ安息香酸、２−クロロメルクリ−４−ニトロフェノール又はクロロ−７−ニトロベンゾ−２−オキサ−１，３−ジアゾールとの反応によっても誘導体化される。
【０１２６】
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５〜７．０でのジエチルピロカーボネートとの反応によって誘導体化され、なぜなら、この薬剤は、ヒスチジル側鎖に対して比較的特異的であるためである。パラ−ブロモフェナシルブロミドも有用であり、この反応は、好ましくは、ｐＨ６．０の０．１Ｍカコジル酸ナトリウム中で行われる。リシニル及びアミノ末端残基は、コハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応する。これらの薬剤による誘導体化は、リシニル残基の電荷を反転させる効果を有する。アルファ−アミノ含有残基を誘導体化するための他の好適な試薬としては、ピコリンイミド酸メチルなどのイミドエステル；リン酸ピリドキサール；ピリドキサール；クロロボロヒドリド；トリニトロベンゼンスルホン酸；Ｏ−メチルイソ尿素；２，４−ペンタンジオン；及びグリオキシレートとのトランスアミナーゼ触媒反応が挙げられる。
【０１２７】
アルギニル残基は、１つ又は複数の従来型の試薬、とりわけフェニルグリオキサール、２，３−ブタンジオン、１，２−シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンとの反応により修飾される。グアニジン官能基のｐＫａが高いため、アルギニン残基の誘導体化は、反応をアルカリ条件下で実施する必要がある。さらに、これらの試薬は、リジンの基及びアルギニンイプシロン−アミノ基と反応し得る。
【０１２８】
チロシル残基の特異的修飾は、特に芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基へのスペクトル標識の導入を目的として行われる場合がある。最も一般的には、Ｎ−アセチルイミジゾール及びテトラニトロメタンを使用して、それぞれＯ−アセチルチロシル種及び３−ニトロ誘導体を形成する。１２５Ｉ又は１３１Ｉを用いてチロシル残基をヨウ素化して、ラジオイムノアッセイに使用される標識タンパク質を調製し、上記のクロラミンＴ法が好適である。
【０１２９】
カルボキシル側基（アスパルチル又はグルタミル）は、カルボジイミド（Ｒ’−Ｎ＝Ｃ＝Ｎ−Ｒ’）との反応によって選択的に修飾され、ここで、Ｒ及びＲ’は、任意選択的に異なるアルキル基、例えば１−シクロヘキシル−３−（２−モルホリニル−４−エチル）カルボジイミド又は１−エチル−３−（４−アゾニア−４，４−ジメチルペンチル）カルボジイミドである。さらに、アスパルチル残基及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル残基及びグルタミニル残基に変換される。
【０１３０】
二官能性物質による誘導体化は、本発明の抗体コンストラクトを、様々な方法に使用するための非水溶性の支持マトリックス又は支持表面に架橋するのに有用である。一般的に使用される架橋剤として、例えば、１，１−ビス（ジアゾアセチル）−２−フェニルエタン、グルタルアルデヒド、例えば４−アジドサリチル酸とのエステルなどのＮ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、３，３’−ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）などのジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル及びビス−Ｎ−マレイミド−１，８−オクタンなどの二官能性マレイミドが挙げられる。メチル−３−［（ｐ−アジドフェニル）ジチオ］プロピオイミデートなどの誘導体化剤により、光の存在下で架橋を形成することができる光活性化され得る中間体が得られる。代わりに、臭化シアン活性化炭水化物などの反応性非水溶性マトリックス並びに米国特許第３，９６９，２８７号明細書；同第３，６９１，０１６号明細書；同第４，１９５，１２８号明細書；同第４，２４７，６４２号明細書；同第４，２２９，５３７号明細書；及び同第４，３３０，４４０号明細書に記載されている反応性基材がタンパク質の固定化に使用される。
【０１３１】
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、多くの場合、脱アミド化されて、それぞれ対応するグルタミル残基及びアスパルチル残基になる。代わりに、これらの残基は、弱酸性条件下で脱アミド化される。これらの残基のいずれの形態も本発明の範囲内に含まれる。
【０１３２】
他の修飾としては、プロリン及びリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン及びヒスチジン側鎖のα−アミノ基のメチル化（Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８３，ｐｐ．７９−８６）、Ｎ末端アミンのアセチル化及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が挙げられる。
【０１３３】
本発明の範囲内に含まれる抗体コンストラクトの別のタイプの共有結合修飾は、タンパク質のグリコシル化パターンの改変を含む。当技術分野で知られるとおり、グリコシル化パターンは、タンパク質の配列（例えば、以下で論じる特定のグリコシル化アミノ酸残基の存在又は非存在）又はそのタンパク質を産生する宿主細胞若しくは生物体の両方に依存し得る。特定の発現系について以下で論じる。
【０１３４】
ポリペプチドのグリコシル化は、通常、Ｎ結合又はＯ結合のいずれかである。Ｎ結合は、糖鎖のアスパラギン残基側鎖への結合を指す。トリペプチド配列のアスパラギン−Ｘ−セリン及びアスパラギン−Ｘ−トレオニン（ここで、Ｘは、プロリン以外の任意のアミノ酸である）は、アスパラギン側鎖への糖鎖の酵素的結合のための認識配列である。したがって、ポリペプチド中のこれらのトリペプチド配列のいずれかの存在は、潜在的なグリコシル化部位を生成する。Ｏ結合型グリコシル化は、ヒドロキシアミノ酸、５−ヒドロキシプロリン又は５−ヒドロキシリジンも使用し得るが、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの糖類Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトース又はキシロースの１つの付加を指す。
【０１３５】
抗体コンストラクトへのグリコシル化部位の付加は、好都合には、上述のトリペプチド配列の１つ以上が含まれるようにアミノ酸配列を改変することにより達成される（Ｎ結合型グリコシル化部位について）。この改変は、出発配列に対する１つ以上のセリン又はスレオニン残基の付加又はそれによる置換によっても行われ得る（Ｏ結合型グリコシル化部位について）。簡潔には、抗体コンストラクトのアミノ酸配列を、ＤＮＡレベルにおける変更、特に所望のアミノ酸に翻訳されることになるコドンが生じるようにポリペプチドをコードするＤＮＡを、事前に選択した塩基で変異させることによって改変することが好ましい。
【０１３６】
抗体コンストラクト上の糖鎖の数を増加させる別の手段は、そのタンパク質へのグリコシドの化学的又は酵素的結合による。これらの手順は、Ｎ結合型及びＯ結合型グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞におけるタンパク質の産生を必要としない点で有利である。使用される結合様式に応じて、糖は、（ａ）アルギニン及びヒスチジン、（ｂ）遊離カルボキシル基、（ｃ）システインのものなどの遊離スルフヒドリル基、（ｄ）セリン、スレオニン若しくはヒドロキシプロリンのものなどの遊離ヒドロキシル基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファンのものなどの芳香族残基、又は（ｆ）グルタミンのアミド基に付加され得る。これらの方法は、国際公開第８７／０５３３０号パンフレット及びＡｐｌｉｎ  ａｎｄ  Ｗｒｉｓｔｏｎ，１９８１，ＣＲＣ  Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，ｐｐ．２５９−３０６に記載されている。
【０１３７】
出発抗体コンストラクト上に存在する糖鎖の除去は、化学的又は酵素的に行われ得る。化学的脱グリコシル化は、化合物トリフルオロメタンスルホン酸又は均等な化合物へのタンパク質の曝露が必要となる。この処理により、ポリペプチドは、無傷な状態のままで、結合している糖（Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン）を除くほとんど又は全ての糖が切断される。化学的脱グリコシル化については、Ｈａｋｉｍｕｄｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２５９：５２及びＥｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１１８：１３１によって記載される。ポリペプチド上の糖鎖の酵素的切断は、Ｔｈｏｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８７，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３８：３５０によって記載される様々なエンド−及びエキソ−グリコシダーゼの使用によって達成され得る。潜在的なグリコシル化部位でのグリコシル化は、Ｄｕｓｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：３１０５によって記載されるとおりの化合物ツニカマイシンの使用により妨げられ得る。ツニカマイシンは、タンパク質−Ｎ−グリコシド結合の形成を阻止する。
【０１３８】
抗体コンストラクトの他の修飾は、本明細書において企図される。例えば、抗体コンストラクトの別の種類の共有結合的修飾は、米国特許第４，６４０，８３５号明細書；同第４，４９６，６８９号明細書；同第４，３０１，１４４号明細書；同第４，６７０，４１７号明細書；同第４，７９１，１９２号明細書又は同第４，１７９，３３７号明細書に示される様式の様々なポリオール、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン又はポリエチレングリコールとポリプロピレングリコールとのコポリマーを含むが、これらに限定されない、様々な非タンパク質性ポリマーへの抗体コンストラクトの連結を含む。加えて、当技術分野で知られるとおり、例えばＰＥＧなどのポリマーの付加を容易にするために抗体コンストラクト内の様々な位置でアミノ酸置換がなされ得る。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、本発明の抗体コンストラクトの共有結合的修飾は、１つ以上の標識の付加を含む。潜在的な立体障害を低減するために、様々な長さのスペーサーアームを介して標識基が抗体コンストラクトに結合され得る。タンパク質を標識するための様々な方法が当技術分野で知られており、本発明を実施する際に使用することができる。用語「標識」又は「標識基」は、任意の検出可能な標識を指す。一般に、標識は、標識を検出しようとするアッセイに応じて様々なクラスに分類され、以下の例が挙げられるが、これらに限定されない：
ａ）放射性同位体又は放射性核種（例えば、３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、８９Ｚｒ、９０Ｙ、９９Ｔｃ、１１１Ｉｎ、１２５Ｉ、１３１Ｉ）などの放射性同位体又は重同位体であり得る同位体標識
ｂ）磁気標識（例えば、磁気粒子）
ｃ）酸化還元活性部分
ｄ）蛍光基（例えば、ＦＩＴＣ、ローダミン、ランタニド蛍光体）、化学発光基及び「低分子」蛍光体又はタンパク質性蛍光体のいずれかであり得るフルオロフォアなどの光学色素（発色団、蛍光体及びフルオロフォアを含むが、これらに限定されない）
ｅ）酵素群（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ）
ｆ）ビオチン化基
ｇ）二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパー対配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグなど）。
【０１４０】
「蛍光標識」は、その固有の蛍光特性によって検出され得る任意の分子を意味する。好適な蛍光標識としては、限定されないが、フルオレセイン、ローダミン、テトラメチルローダミン、エオシン、エリスロシン、クマリン、メチルクマリン類、ピレン、マラカイトグリーン、スチルベン、ルシファーイエロー、Ｃａｓｃａｄｅ  ＢｌｕｅＪ、テキサスレッド、ＩＡＥＤＡＮＳ、ＥＤＡＮＳ、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、ＬＣ  Ｒｅｄ  ６４０、Ｃｙ  ５、Ｃｙ  ５．５、ＬＣ  Ｒｅｄ  ７０５、オレゴングリーン、Ａｌｅｘａ−Ｆｌｕｏｒ色素（Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６８０）、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｂｌｕｅ、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗ及びＲ−フィコエリトリン（ＰＥ）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ＦＩＴＣ、ローダミン及びテキサスレッド（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ、ＰＡ）が挙げられる。フルオロフォアを含めた好適な光学色素がＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｂｙ  Ｒｉｃｈａｒｄ  Ｐ．Ｈａｕｇｌａｎｄに記載されている。
【０１４１】
好適なタンパク質性蛍光標識としては、Ｒｅｎｉｌｌａ、Ｐｔｉｌｏｓａｒｃｕｓ又はＡｅｑｕｏｒｅａ種のＧＦＰ（Ｃｈａｌｆｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６３：８０２−８０５）、ＥＧＦＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｕ５５７６２）を含む緑色蛍光タンパク質、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ，Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．１８０１  ｄｅ  Ｍａｉｓｏｎｎｅｕｖｅ  Ｂｌｖｄ．Ｗｅｓｔ，８ｔｈ  Ｆｌｏｏｒ，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｑｕｅｂｅｃ，Ｃａｎａｄａ  Ｈ３Ｈ  １Ｊ９；Ｓｔａｕｂｅｒ，１９９８，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２４：４６２−４７１；Ｈｅｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．６：１７８−１８２）、強化型黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、ルシフェラーゼ（Ｉｃｈｉｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５０：５４０８−５４１７）、βガラクトシダーゼ（Ｎｏｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２６０３−２６０７）及びＲｅｎｉｌｌａ（国際公開第９２／１５６７３号パンフレット、国際公開第９５／０７４６３号パンフレット、国際公開第９８／１４６０５号パンフレット、国際公開第９８／２６２７７号パンフレット、国際公開第９９／４９０１９号パンフレット、米国特許第５，２９２，６５８号明細書、同第５，４１８，１５５号明細書、同第５，６８３，８８８号明細書、同第５，７４１，６６８号明細書、同第５，７７７，０７９号明細書、同第５，８０４，３８７号明細書、同第５，８７４，３０４号明細書、同第５，８７６，９９５号明細書、同第５，９２５，５５８号明細書）も挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４２】
ロイシンジッパードメインは、それが存在するタンパク質のオリゴマー形成を促進するペプチドである。ロイシンジッパーは、当初、いくつかのＤＮＡ結合タンパク質において同定されたものであり（Ｌａｎｄｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４０：１７５９）、それ以来、種々の異なるタンパク質において見出されてきた。公知のロイシンジッパーの中には、天然に存在するペプチド及び二量化又は三量化するその誘導体がある。可溶性オリゴマータンパク質の作製に好適なロイシンジッパードメインの例がＰＣＴ出願の国際公開第９４／１０３０８号パンフレットに記載されており、且つ肺サーファクタントタンパク質Ｄ（ＳＰＤ）に由来するロイシンジッパーがＨｏｐｐｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３４４：１９１に記載されている。それに融合した異種タンパク質の安定三量化を可能にする修飾ロイシンジッパーの使用は、Ｆａｎｓｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｓｅｍｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：２６７−７８に記載されている。ある手法において、ロイシンジッパーペプチドに融合された標的抗原抗体フラグメント又はその誘導体を含む組換え融合タンパク質は、好適な宿主細胞において発現され、形成する可溶性オリゴマーの標的抗原抗体フラグメント又は誘導体は、培養上清から回収される。
【０１４３】
本発明の抗体コンストラクトは、例えば、その分子の単離に役立つか、又はその分子の薬物動態プロファイルの適合に関連する追加ドメインも含み得る。抗体コンストラクトの単離に役立つドメインは、単離方法、例えば単離用カラムで捕捉できるペプチドモチーフ又は二次的に導入される部分から選択され得る。このような追加ドメインの非限定的な実施形態は、Ｍｙｃタグ、ＨＡＴタグ、ＨＡタグ、ＴＡＰタグ、ＧＳＴタグ、キチン結合ドメイン（ＣＢＤタグ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰタグ）、Ｆｌａｇタグ、Ｓｔｒｅｐタグ及びその変種（例えば、ＳｔｒｅｐＩＩタグ）並びにＨｉｓタグとして知られるペプチドモチーフを含む。同定されたＣＤＲによって特徴付けられる本明細書で開示される抗体コンストラクトの全ては、分子のアミノ酸配列中の連続するＨｉｓ残基、好ましくは６つのＨｉｓ残基のリピートとして一般に知られるＨｉｓタグドメインを含むことが好ましい。
【０１４４】
Ｔ細胞又はＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的な役割を果たすリンパ球の一種（それ自体白血球細胞の一種）である。Ｔ細胞のサブセットがいくつかあり、各々が異なる機能を有する。Ｔ細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によってＢ細胞及びＮＫ細胞などの他のリンパ球と区別することができる。ＴＣＲは、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原の認識に関与し、２つの異なるタンパク質鎖で構成される。Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲは、アルファ（α）鎖とベータ（β）鎖とからなる。ＴＣＲが抗原ペプチド及びＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ複合体）と会合すると、関連する酵素、共受容体、特殊化したアダプター分子及び活性化した又は放出された転写因子によって媒介される一連の生化学的事象を通じてＴリンパ球が活性化される。
【０１４５】
ＣＤ３受容体複合体は、タンパク質複合体であり、４つの鎖から構成される。哺乳動物において、この複合体は、ＣＤ３γ（ガンマ）鎖、ＣＤ３δ（デルタ）鎖及び２つのＣＤ３ε（イプシロン）鎖を含有する。これらの鎖は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）及びいわゆるζ（ゼータ）鎖と会合してＴ細胞受容体ＣＤ３複合体を形成し、Ｔリンパ球において活性化シグナルを生成する。ＣＤ３γ（ガンマ）、ＣＤ３δ（デルタ）及びＣＤ３ε（イプシロン）鎖は、単一の細胞外免疫グロブリンドメインを含有する、関連性の高い免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面タンパク質である。ＣＤ３分子の細胞内尾部は、ＴＣＲのシグナル伝達能に必須である免疫受容活性化チロシンモチーフ、すなわち略称ＩＴＡＭとして知られる単一の保存的モチーフを含有する。ＣＤ３イプシロン分子は、ヒトの第１１染色体に存在するＣＤ３Ｅ遺伝子によってコードされるポリペプチドである。好ましいヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインの配列は、配列番号１に示され、ヒトＣＤ３イプシロン細胞外ドメインのアミノ酸残基１〜２７に対応する最も好ましいＣＤ３結合エピトープは、配列番号２において表される。
【０１４６】
多重特異性、少なくとも二重特異性抗体コンストラクトによるＴ細胞の動員を介するリダイレクトされた標的細胞の溶解は、細胞溶解性シナプスの形成並びにパーフォリン及びグランザイムの送達を伴う。結合したＴ細胞は、連続的な標的細胞の溶解が可能であり、ペプチド抗原のプロセシング及び提示又はクローナルなＴ細胞分化を妨げる免疫回避機構による影響を受けない（例えば、国際公開第２００７／０４２２６１号パンフレットを参照されたい）。
【０１４７】
二重特異性抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害性は、様々な方法で測定することができる。エフェクター細胞は、例えば、刺激された濃縮（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞又は未刺激の（ヒト）末梢血単核球（ＰＢＭＣ）であり得る。標的細胞がマカク由来であるか、又はマカク標的細胞抗原を発現するか若しくはそれによりトランスフェクトされている場合、エフェクター細胞もマカクＴ細胞株、例えば４１１９ＬｎＰｘなど、マカク由来でなければならない。標的細胞は、標的細胞の抗原、例えばヒト又はマカク標的細胞の抗原（の少なくとも細胞外ドメイン）を発現するはずである。標的細胞は、標的細胞の抗原、例えばヒト又はマカク標的細胞の抗原で安定的に又は一過的にトランスフェクトされている細胞株（ＣＨＯなど）であり得る。代わりに、標的細胞は、ヒト癌細胞株などの標的細胞抗原陽性の天然発現体細胞株であり得る。通常、ＥＣ５０値は、細胞表面に高レベルの標的細胞抗原を発現する標的細胞株で低くなると予想される。エフェクター対標的細胞（Ｅ：Ｔ）比は、通常、約１０：１であるが、これは、変動し得る。二重特異性抗体コンストラクトの細胞傷害活性は、５１クロム放出アッセイ（約１８時間のインキュベーション時間）又はＦＡＣＳを用いた細胞傷害性アッセイ（約４８時間インキュベーション時間）において測定することができる。アッセイのインキュベーション時間（細胞傷害性反応）の変更も可能である。細胞傷害性を測定する他の方法は、当業者によく知られており、ＭＴＴ又はＭＴＳアッセイ、生物発光アッセイを含むＡＴＰ系アッセイ、スルホローダミンＢ（ＳＲＢ）アッセイ、ＷＳＴアッセイ、クローン原性アッセイ及びＥＣＩＳ技術を含む。
【０１４８】
本発明の二重特異性抗体コンストラクトによって媒介される細胞傷害活性は、好ましくは、細胞を用いた細胞傷害性アッセイで測定される。細胞傷害活性は、ＥＣ５０値によって表され、これは、半数効果濃度（ベースラインと最大値との中間の細胞傷害性反応を誘導する抗体コンストラクトの濃度）に対応する。好ましくは、二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、≦２０．０００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは≦５０００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１０００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦５００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦３５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦２５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１０ｐｇ／ｍｌ及び最も好ましくは≦５ｐｇ／ｍｌである。
【０１４９】
上記の所与のＥＣ５０値のいずれかは、細胞を用いた細胞障害アッセイの示されるシナリオのいずれか１つと、例えば添付の実施例において記載される方法に一致して組み合わされ得る。例えば、（ヒト）ＣＤ８陽性Ｔ細胞又はマカクＴ細胞株がエフェクター細胞として使用されるとき、本発明の二重特異性抗体コンストラクト（例えば、標的細胞抗原／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクト）のＥＣ５０値は、好ましくは、≦１０００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは≦５００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦２５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１０ｐｇ／ｍｌ及び最も好ましくは≦５ｐｇ／ｍｌである。このアッセイにおいて、標的細胞が、ＣＨＯ細胞などの標的抗原（例えば、標的細胞抗原ＣＤ３３）でトランスフェクトされた（ヒト又はマカク）細胞である場合、二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、好ましくは、≦１５０ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦３０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１０ｐｇ／ｍｌ及び最も好ましくは≦５ｐｇ／ｍｌである。標的細胞が（例えば、標的細胞抗原の）陽性の天然発現体細胞株である場合、ＥＣ５０値は、好ましくは、≦３５０ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは≦２５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦２００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ及び最も好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ以下である。（ヒト）ＰＢＭＣがエフェクター細胞として使用されるとき、二重特異性抗体コンストラクトのＥＣ５０値は、好ましくは、≦１０００ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは≦７５０ｐｇ／ｍｌ、より好ましくは≦５００ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦３５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦２５０ｐｇ／ｍｌ、さらにより好ましくは≦１００ｐｇ／ｍｌ及び最も好ましくは≦５０ｐｇ／ｍｌ以下である。
【０１５０】
好ましくは、本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、ＣＨＯ細胞などの標的細胞抗原陰性細胞の溶解を誘導／媒介しないか、又は溶解を本質的に誘導／媒介しない。用語「溶解を誘導しない」、「溶解を本質的に誘導しない」、「溶解を媒介しない」又は「溶解を本質的に媒介しない」は、標的細胞抗原陽性細胞株の溶解を１００％とした場合、本発明の抗体コンストラクトが標的細胞抗原陰性細胞の３０％超、好ましくは２０％超、より好ましくは１０％超、特に好ましくは９％、８％、７％、６％又は５％超の溶解を誘導又は媒介しないことを意味する。これは、通常、最高５００ｎＭまでの抗体コンストラクトの濃度に適用される。当業者は、さらなる労力を伴わずに細胞溶解を測定する方法を知っている。さらに、本明細書では、細胞溶解の測定方法の具体的な指示を教示する。
【０１５１】
好ましくは、本発明による使用のための二重特異性抗体コンストラクトは、以下の工程：
（ａ）二重特異性抗体コンストラクトの第１の用量の投与、続いて
（ｂ）二重特異性抗体コンストラクトの第２の用量の投与であって、前記第２の用量は、前記第１の用量を超える、投与、続いて
（ｃ）二重特異性抗体コンストラクトの第３の用量の投与であって、前記第３の用量は、前記第２の用量を超える、投与、任意選択により、続いて
（ｄ）二重特異性抗体コンストラクトの第４の用量の投与だって、前記任意選択による第４の用量は、前記第３の用量を超える、投与
を含むスケジュールに従って投与される。
【０１５２】
上記に一致して、第１の用量の投与の期間は、最大７日であることがさらに好ましい。この期間の第１の用量の投与を二重特異性抗体コンストラクトの投与の初期／第１のサイクル中に使用して、例えば患者における腫瘍量を減少させ得るが（腫瘍減量）、比較的高い用量が第１の用量の投与の期間中に使用される場合に予想され得るサイトカインストーム及び／又はサイトカイン放出症候群などの状態を回避する。
【０１５３】
本発明の一実施形態において、第１の用量の投与の期間は、最大７日であるが、この第１の用量が６日、５日、４日、３日、２日又は１日間投与されることもこの好ましい実施形態の範囲内である。個々の患者の腫瘍量又は一般的な状態が、第１の限定された用量段階において、限定された用量の二重特異性抗体コンストラクトの投与を必要とする場合、この第１の用量段階は、患者の二重特異性抗体コンストラクトとの最初の接触から生じる副作用を回避又は制限するべき導入期／適応期として理解される。そのような導入期／適応期における用量に関する好ましい範囲は、５４ｋＤａの一本鎖ポリペプチドであるＣＤ３３ＸＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトなどの標準的なＢｉＴＥ（登録商標）に関して、１〜５０μｇ／ｄの範囲、好ましくは３〜３０μｇ／ｄの範囲、さらに好ましくは４〜２０μｇ／ｄの範囲及びさらにより好ましくは５〜１５μｇ／ｄの範囲であり得る。非常に好ましい実施形態において、本発明による二重特異性抗体コンストラクトは、１０μｇ／ｄの用量で投与される。
【０１５４】
二重特異性抗体コンストラクトの第２の用量に関する好ましい範囲は、例えば、１０μｇ／ｄ〜１０ｍｇ／ｄの範囲、より好ましくは２５μｇ／ｄ〜１ｍｇ／ｄの範囲及びさらにより好ましくは３０μｇ／ｄ〜５００μｇ／ｄの範囲のＣＤ３３ＸＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトなどの標準的なＢｉＴＥ（登録商標）のためのものである。非常に好ましい実施形態において、第２の用量は、３０μｇ／ｄ又は６０μｇ／ｄである。上記に一致して、二重特異性抗体コンストラクトの第３の用量の好ましい範囲は、第２の用量の対応する用量を超える。第３の用量は、通常、６０μｇ／ｄ〜５００μｇ／ｄの範囲であり、好ましくは本発明による第２の用量と均等な治療を回避した可能性のある残留している標的細胞を根絶する。
【０１５５】
驚くべきことに、少なくとも２つの投与段階を含む段階的な投与が本発明に従って適用されるとき、望まれないサイトカイン放出、例えばサイトカイン放出症候群などの免疫性の副作用が効率的に予防され得ることが見出された。対照的に、第２の投与量と均等な用量が、本発明の第１の用量と同等な前のより少ない用量を伴わずに与えられる場合、望まれないサイトカイン放出、例えばサイトカイン放出症候群などの副作用が生じ得る。同じことが第２の投与量に対する第３の投与量に適用される。
【０１５６】
また、第１及び第２の用量の投与の期間は、可能な限り早く白血病幹細胞に対処する標的用量に到達するように可能な限り短いことが本発明のために好ましい。これは、ＡＭＬなどの活動性及び進行性疾患に関する治療の成功にとって決定的に重要である。したがって、２又は３日間のみ、好ましくは２日間の第１の投与量及び第２の投与量に関して２〜４日の投与の期間を有する投与スキームを提供することが本発明による主な成果である。さらに、第３の投与量又は任意選択による第４の投与量、すなわち標的投与量は、好ましくは、少なくとも数日の長期間の投与を含む。
【０１５７】
また、本発明に一致して、二重特異性抗体コンストラクトの第１の結合ドメインが、配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含むことは、骨髄性白血病の治療において使用される二重特異性抗体コンストラクトに好ましい。
【０１５８】
さらに、本発明に一致して、二重特異性抗体コンストラクトの第２の結合ドメインが、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号９〜１４、２７〜３２、４５〜５０、６３〜６８、８１〜８６、９９〜１０４、１１７〜１２２、１３５〜１４０、１５３〜１５８及び１７１〜１７６からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含むことは、骨髄性白血病の治療において使用される二重特異性抗体コンストラクトに好ましい。
【０１５９】
第２の結合ドメインだけでなく、本発明の抗体コンストラクトの第１の（又は任意のさらなる）結合ドメインは、好ましくは、霊長類の哺乳動物目のメンバーにおいて異種間特異的である。異種間特異的ＣＤ３結合ドメインについては、例えば、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットに記載されている。一実施形態によれば、第１及び第２の結合ドメインは、ヒトＣＤ３３標的細胞抗原及びヒトＣＤ３への結合に加えて、新世界霊長類（マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）、ワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  Ｏｅｄｉｐｕｓ）又はリスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）など）、旧世界霊長類（ヒヒ及びマカクなど）、テナガザル及び非ヒトのヒト亜科動物を含む（ただし、これらに限定されない）霊長類のＣＤ３３標的細胞抗原／ＣＤ３にもそれぞれ結合することになる。マーモセット（Ｃａｌｌｉｔｈｒｉｘ  ｊａｃｃｈｕｓ）及びワタボウシタマリン（Ｓａｇｕｉｎｕｓ  ｏｅｄｉｐｕｓ）は、両方ともマーモセット（Ｃａｌｌｉｔｒｉｃｈｉｄａｅ）科に属する新世界霊長類であるが、リスザル（Ｓａｉｍｉｒｉ  ｓｃｉｕｒｅｕｓ）は、オマキザル（Ｃｅｂｉｄａｅ）科に属する新世界霊長類である。
【０１６０】
本発明の好ましい実施形態では、二重特異性抗体コンストラクトは、ある二重特異性抗体コンストラクトである。本明細書で上に提供される定義に一致して、この実施形態は、抗体コンストラクトである二重特異性抗体コンストラクトに関する。本発明の好ましい実施形態では、二重特異性抗体コンストラクトは、一本鎖コンストラクトである。そのような二重特異性一本鎖抗体コンストラクトは、本発明に一致して、配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【０１６１】
本明細書に記載される二重特異性抗体コンストラクトのアミノ酸配列修飾も企図される。例えば、二重特異抗体コンストラクトの結合親和性及び／又は他の生物学的特性を向上させることが望ましい場合もある。二重特異性抗体コンストラクトのアミノ酸配列バリアントは、二重特異性抗体コンストラクトの核酸に適切なヌクレオチド変化を導入することによって又はペプチド合成によって作製される。以下に記載されるアミノ酸配列改変の全ては、未改変の親分子の所望の生物活性（標的細胞抗原及びＣＤ３への結合）を引き続き保持する二重特異性抗体コンストラクトをもたらすはずである。
【０１６２】
用語「アミノ酸」又は「アミノ酸残基」は、通常、アラニン（Ａｌａ又はＡ）；アルギニン（Ａｒｇ又はＲ）；アスパラギン（Ａｓｎ又はＮ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ又はＤ）；システイン（Ｃｙｓ又はＣ）；グルタミン（Ｇｌｎ又はＱ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ又はＥ）；グリシン（Ｇｌｙ又はＧ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ又はＨ）；イソロイシン（Ｉｌｅ又はＩ）；ロイシン（Ｌｅｕ又はＬ）；リジン（Ｌｙｓ又はＫ）；メチオニン（Ｍｅｔ又はＭ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ又はＦ）；プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）；セリン（Ｓｅｒ又はＳ）；スレオニン（Ｔｈｒ又はＴ）；トリプトファン（Ｔｒｐ又はＷ）；チロシン（Ｔｙｒ又はＹ）；及びバリン（Ｖａｌ又はＶ）からなる群から選択されるアミノ酸など、当技術分野で認められる定義を有するアミノ酸を指すが、修飾、合成又は希少アミノ酸が必要に応じて使用され得る。一般に、アミノ酸は、非極性側鎖（例えば、Ａｌａ、Ｃｙｓ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｖａｌ）；負電荷側鎖（例えば、Ａｓｐ、Ｇｌｕ）；正電荷側鎖（例えば、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ）；又は無電荷極性側鎖（例えば、Ａｓｎ、Ｃｙｓ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ及びＴｙｒ）の存在によって分類することができる。
【０１６３】
アミノ酸改変は、例えば、二重特異性抗体コンストラクトのアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又は残基への挿入、及び／又は残基の置換を含む。欠失、挿入及び置換のいずれかの組合せは、最終コンストラクトが所望の特徴を有するのであれば、その最終コンストラクトに到達するようになされる。アミノ酸の変化は、グリコシル化部位の数又は位置の変化などの二重特異性抗体コンストラクトの翻訳後プロセスも変え得る。
【０１６４】
例えば、１、２、３、４、５又は６つのアミノ酸がＣＤＲの各々において（当然のことながら、それらの長さに依存する）挿入又は欠失され得る一方、ＦＲの各々において１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５のアミノ酸が挿入又は欠失され得る。好ましくは、アミノ酸配列の挿入は、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０残基から、１００以上の残基を含有するポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ末端融合及び／又はカルボキシル末端融合並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。本発明の二重特異性抗体コンストラクトの挿入バリアントは、酵素に対して二重特異性抗体コンストラクトのＮ末端若しくはＣ末端への融合又は二重特異性抗体コンストラクトの血清半減期を増大させるポリペプチドへの融合を含む。
【０１６５】
長い半減期は、一般に、免疫グロブリン、特に抗体、また最も特定すると小サイズの抗体フラグメントのインビボ適用において有用である。抗体フラグメント（Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）に基づくそのような抗体コンストラクトは、体の大部分に迅速に到達できるが、それらの抗体コンストラクトは、体からの迅速なクリアランスを受ける可能性がある。一本鎖ダイアボディなどの抗体コンストラクトの半減期を延長するための、当技術分野で記載される戦略は、ポリエチレングリコール鎖のコンジュゲーション（ペグ化）、ＩｇＧ  Ｆｃ領域又はアルブミン若しくはアルブミン結合ドメインへの融合を含む。
【０１６６】
血清アルブミンは、肝臓によって生理的に産生されるタンパク質であり；血漿中で溶解されて存在し、且つ哺乳動物において最も豊富な血液タンパク質である。アルブミンは、血管と体組織との間の体液の適切な分布に必要とされる膠質浸透圧を維持するのに必須である。また、それは、いくつかの疎水性ステロイドホルモンに非特異的に結合することによって血漿担体として且つヘミン及び脂肪酸のための輸送タンパク質として作用する。用語「血清アルブミン」、それぞれそのヒトバリアント（「ヒトアルブミン」）は、発明されたタンパク質に関連して、親ヒト血清アルブミンタンパク質（配列番号１０９に記載されるとおりの配列）、又はその任意のバリアント（例えば、配列番号１１０〜１３８に示されるとおりのアルブミンタンパク質など）、又はそのフラグメントを定義し、好ましくは遺伝的融合タンパク質として且つ少なくとも１つの治療用タンパク質との化学的架橋などによって発現される。アルブミンの単一若しくは複数変異又はフラグメントを含むバリアントは、ＦｃＲｎ受容体に対する親和性などの特性の向上及びその親又は基準と比較した血漿半減期の延長をもたらす。ヒトアルブミンのバリアントは、例えば、国際公開第２０１４／０７２４８１号パンフレットにおいて記載される。本発明に一致して、血清アルブミンは、ペプチドリンカーを介して抗体コンストラクトに連結され得る。ペプチドリンカーは、アミノ酸配列（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号１３）ｎを有することが好ましく、ここで、「ｎ」は、１〜５の範囲の整数である。「ｎ」は、１〜３の範囲の整数であることがさらに好ましく、最も好ましくは、「ｎ」は、１又は２である。
【０１６７】
置換変異誘発にとって最も重要な部位としては、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲ、特に超可変領域が挙げられるが、重鎖及び／又は軽鎖におけるＦＲの改変も企図される。置換は、本明細書に記載される保存的置換であることが好ましい。好ましくは、ＣＤＲ又はＦＲの長さに応じて、ＣＤＲでは１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸を置換し得る一方、フレームワーク領域（ＦＲ）では１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０又は２５のアミノ酸を置換し得る。例えば、ＣＤＲ配列が６つのアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸の１、２又は３つが置換されることが想定される。同様に、ＣＤＲ配列が１５のアミノ酸を包含する場合、これらのアミノ酸の１、２、３、４、５又は６つが置換されることが想定される。
【０１６８】
変異誘発について好ましい位置である二重特異性抗体コンストラクトの特定の残基又は領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１：１０８５（１９８９）によって記載されるとおりの「アラニンスキャニング変異導入法」と呼ばれるものである。この方法では、二重特異性抗体コンストラクト内の残基又は標的残基群を同定し（例えば、ａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ及びｇｌｕなどの荷電残基）、アミノ酸とエピトープとの相互作用に影響を与える中性又は負電荷アミノ酸（最も好ましくはアラニン又はポリアラニン）で置き換えられる。
【０１６９】
次に、さらなるバリアント又は他のバリアントを置換部位に、すなわち置換部位の代わりに導入することにより、置換に対して機能的感受性を示すそれらのアミノ酸位置を厳選する。このように、アミノ酸配列変種を導入する部位又は領域は、予め決定されるが、変異の性質自体を予め決定する必要はない。例えば、所与の部位における変異の性能を分析又は最適化するため、標的コドン又は領域においてアラニンスキャニング又はランダム変異誘発を実施し得、発現された二重特異性抗体コンストラクト変異体が所望の活性の最適な組合せに関してスクリーニングされる。既知の配列を有するＤＮＡの所定の部位における置換変異を作製するための手法、例えばＭ１３プライマー変異誘発及びＰＣＲ変異誘発は、よく知られている。変異体のスクリーニングは、標的抗原結合活性のアッセイを使用してなされる。
【０１７０】
一般に、重鎖及び／又は軽鎖のＣＤＲの１つ以上又は全てにおいてアミノ酸が置換される場合、それによって得られる「置換された」配列は、「当初の」ＣＤＲ配列と少なくとも６０％、より好ましくは６５％、さらにより好ましくは７０％、特に好ましくは７５％、特により好ましくは８０％同一である。これは、それが「置換された」配列とどの程度同一であるかがＣＤＲの長さに依存することを意味する。例えば、５つのアミノ酸を有するＣＤＲは、少なくとも１つの置換されたアミノ酸を有するために、その置換された配列と８０％同一であることが好ましい。したがって、二重特異性抗体コンストラクトのＣＤＲは、それらの置換配列に対して異なる程度の同一性を有する場合があり、例えばＣＤＲＬ１が８０％を有する場合がある一方、ＣＤＲＬ３が９０％を有する場合がある。
【０１７１】
好ましい置換（又は置き換え）は、保存的置換である。しかしながら、二重特異性抗体コンストラクトが第１の結合ドメインを介して標的細胞抗原に結合し、第２の結合ドメインを介してＣＤ３イプシロンに結合する能力を保持する限り、且つ／又はそのＣＤＲが置換後の配列に対して同一性を有している（「当初の」ＣＤＲ配列に対して少なくとも６０％、より好ましくは６５％、さらにより好ましくは７０％、特に好ましくは７５％、特により好ましくは８０％同一である）限り、（非保存的置換又は以下の表１に列挙される「例示的な置換」の１つ以上を含む）任意の置換が想定される。
【０１７２】
保存的置換を表１の「好ましい置換」の見出しの下に示す。このような置換が生物活性を変化させる場合、表１において「例示的な置換」と称されるか、又はアミノ酸クラスに関連して以下でさらに記載する、より実質的な変更を導入し、所望の特徴について産物をスクリーニングし得る。
【０１７３】
【表１】
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【０１７４】
本発明の二重特異性抗体コンストラクトの生物学的特性の実質的な修飾は、（ａ）例えばシート又はヘリックスコンホメーションなど、置換範囲におけるポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷又は疎水性、又は（ｃ）側鎖のバルク性の維持に対するその効果が有意に異なる置換を選択することにより達成される。天然に存在する残基は、共通の側鎖特性に基づいて以下の群に分類される：（１）疎水性：ノルロイシン、ｍｅｔ、ａｌａ、ｖａｌ、ｌｅｕ、ｉｌｅ；（２）中性疎水性：ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、ａｓｎ、ｇｌｎ；（３）酸性：ａｓｐ、ｇｌｕ；（４）塩基性：ｈｉｓ、ｌｙｓ、ａｒｇ；（５）鎖の配向に影響する残基：ｇｌｙ、ｐｒｏ；及び（６）芳香族：ｔｒｐ、ｔｙｒ、ｐｈｅ。
【０１７５】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うことになる。二重特異性抗体コンストラクトの適切な立体構造の維持に関与しない任意のシステイン残基を一般的にセリンで置換することで分子の酸化安定性を向上させ、異常な架橋を回避し得る。逆に、抗体にシステイン結合を付加することで、（特に抗体がＦｖフラグメントなどの抗体フラグメントである場合）その安定性を向上させ得る。
【０１７６】
アミノ酸配列に関して、配列同一性及び／又は類似性は、当技術分野で知られる標準的な技術、例えば、限定されないが、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所的配列同一性アルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の配列同一性アラインメントアルゴリズム、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷｉｓのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ）、Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：３８７−３９５により記載されている、好ましくはデフォルト設定を用いたＢｅｓｔ  Ｆｉｔ配列プログラムを使用することにより又は目視により決定される。好ましくは、同一性パーセントは、以下のパラメーターに基づいてＦａｓｔＤＢによって計算される：ミスマッチペナルティが１；ギャップペナルティが１；ギャップサイズペナルティが０．３３；及び結合ペナルティが３０、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ａｎｄ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｓｅｌｅｃｔｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐｐ  １２７−１４９（１９８８），Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ。
【０１７７】
有用なアルゴリズムの例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、関連配列の群から累進的ペアワイズアラインメントを用いて多重配列アラインメントを生成する。これは、アラインメントの生成に用いられるクラスタリング関係を示すツリーもプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ＆Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１−３６０のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用する。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，１９８９，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−１５３により記載されたものと同様である。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、３．００のデフォルトのギャップ加重、０．１０のデフォルトのギャップ長加重及び加重エンドギャップを含む。
【０１７８】
有用なアルゴリズムの別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２；及びＫａｒｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３−５７８７において記載されるＢＬＡＳＴアルゴリズムである。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２６６：４６０−４８０から入手したＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、いくつかの検索パラメーターを使用しており、その大部分がデフォルト値に設定される。調節可能なパラメーターは、以下の値で設定される：重複範囲＝１、重複割合＝０．１２５、ワード閾値（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ  Ｓ及びＨＳＰ  Ｓ２パラメーターは、動的な値であり、特定の配列の組成及び目的の配列が検索される特定のデータベースの組成に依存してプログラム自体によって確立される。しかしながら、感度を増加させるために値が調整され得る。
【０１７９】
追加の有用なアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２において報告されるギャップ付きＢＬＡＳＴである。ギャップ付きＢＬＡＳＴはＢＬＯＳＵＭ−６２置換スコアを使用し、閾値Ｔパラメーターは、９に設定され、ギャップなし伸長をもたらすｔｗｏ−ｈｉｔ法は、ギャップ長ｋのコストを１０＋ｋとし、Ｘｕは、１６に設定され、Ｘｇは、データベース検索段階では４０に、アルゴリズムの出力段階では６７に設定される。ギャップ付きアラインメントは、約２２ビットに相当するスコアによって引き起こされる。
【０１８０】
一般に、個々のバリアントＣＤＲ間のアミノ酸相同性、類似性又は同一性は、本明細書に示される配列に対して少なくとも６０％であり、より典型的には相同性又は同一性が少なくとも６５％又は７０％、より好ましくは少なくとも７５％又は８０％、さらにより好ましくは少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％及びほぼ１００％に増加することが好ましい。同様に、本明細書で特定される結合タンパク質の核酸配列に関する「核酸配列同一性パーセント（％）」は、二重特異性抗体コンストラクトのコード配列内のヌクレオチド残基と同一である候補配列内のヌクレオチド残基の割合と定義される。具体的な方法では、重複範囲及び重複割合がそれぞれ１及び０．１２５を有するデフォルトパラメーターに設定されたＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２のＢＬＡＳＴＮモジュールを利用する。
【０１８１】
一般に、個々のバリアントＣＤＲをコードするヌクレオチド配列と本明細書に示されるヌクレオチド配列との間の核酸配列相同性、類似性又は同一性は、少なくとも６０％であり、より典型的には相同性又は同一性が少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％及びほぼ１００％に増加することが好ましい。したがって、「バリアントＣＤＲ」は、本発明の親ＣＤＲに対して特定の相同性、類似性又は同一性を有するものであり、且つ親ＣＤＲの特異性及び／又は活性の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％を含むが、これらに限定されない生物学的機能を共有している。
【０１８２】
一実施形態では、本発明による使用のための二重特異性抗体コンストラクトは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシ尿素、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストンデメチラーゼ阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランス型レチノイン酸）からなる群から選択される１つ以上のエピジェネティック因子と組み合わせて投与され、
（ａ）１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与前に投与されるか；
（ｂ）１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与後に投与されるか；又は
（ｃ）１つ以上のエピジェネティック因子及び二重特異性抗体コンストラクトは、同時に投与される。
【０１８３】
本発明と関連する用語「エピジェネティック因子」は、投与時の細胞集団の遺伝子発現又は細胞表現型を変化させることができる化合物を定義する。そのような変化は、核酸配列における変化を伴わずにゲノムに対して１つ以上の機能に関連する修飾を指すことが理解される。そのような修飾の例は、ＤＮＡメチル化及びヒストン修飾であり、これらは、両方とも根底にあるＤＮＡ配列の改変を伴わない遺伝子発現の調節に重要である。
【０１８４】
上記のエピジェネティック因子の１つ以上と組み合わせた二重特異性抗体コンストラクトの投与を含む骨髄性白血病の治療についての詳細は、ＰＣＴ／欧州特許出願公開第２０１４／０６９５７５号明細書において提供されている。
【０１８５】
本発明の一実施形態では、１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与の７日前まで投与されることが好ましい。
【０１８６】
また、本発明の一実施形態では、エピジェネティック因子は、ヒドロキシ尿素であることが好ましい。
【０１８７】
骨髄性白血病は、急性骨髄芽球性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤白血病、真性多血症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄肉腫及び急性混合型白血病からなる群から選択されることが本発明のために好ましい。より好ましくは、骨髄性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。ＡＭＬの定義は、とりわけ、急性骨髄芽球性白血病、急性骨髄性樹状細胞白血病、急性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、急性赤白血病及び急性汎骨髄性白血病を含む。
【０１８８】
本発明と関連して記載される二重特異性抗体コンストラクトは、医薬組成物の形態において、それを必要とする対象への適切な投与のために製剤化され得る。
【０１８９】
本明細書に記載される製剤は、それを必要とする患者において、本明細書に記載される病的な医学的状態を治療、改善及び／又は予防する医薬組成物として有用である。用語「治療」は、療法的治療及び予防的又は防御的手段の両方を指す。治療は、疾患、疾患の症状又は疾患素因を治癒するか、治すか、軽減するか、緩和するか、変化させるか、矯正するか、改善するか、好転させるか又は影響を与えることを目的とした、疾患／障害、疾患／障害の症状又は疾患／障害の素因を有する患者の身体、単離された組織又は細胞に対する製剤の適用又は投与を含む。
【０１９０】
用語「疾患」は、本明細書に記載される二重特異性抗体コンストラクト又は医薬組成物による治療から利益を受け得る任意の状態を指す。これには、哺乳類において問題の疾患の素因になる病理学的状態を含めた慢性及び急性障害又は疾患が含まれる。
【０１９１】
用語「必要とする対象」又は「治療を必要とする」対象は、既にその障害を有する対象及びその障害を予防しようとする対象を含む。必要とする対象又は「患者」は、予防的治療又は治療的治療のいずれかを受けるヒト及び他の哺乳動物対象を含む。
【０１９２】
本発明の二重特異性抗体コンストラクトは、一般に、とりわけバイオアベイラビリティ及び持続性の範囲において、特定の投与経路及び投与方法、特定の投与量及び投与頻度、特定の疾患の特定の治療に合わせて設計されることになる。組成物の材料は、好ましくは、投与部位に許容可能な濃度で製剤化される。
【０１９３】
したがって、製剤及び組成物は、本発明に従って任意の好適な投与経路による送達のために設計され得る。本発明に関連して、投与経路は、
・局所経路（例えば、皮膚上、吸入、鼻、眼、耳介／耳、膣、粘膜）；
・腸経路（例えば、経口、胃腸、舌下、唇下、頬側、直腸）；及び
・非経口経路（例えば、静脈内、動脈内、骨内、筋肉内、脳内、脳室内、硬膜外、髄腔内、皮下、腹腔内、羊膜外、関節内、心臓内、皮内、病巣内、子宮内、膀胱内、硝子体内、経皮、鼻腔内、経粘膜、滑液嚢内、管腔内）
を含むが、これらに限定されない。
【０１９４】
本発明と関連して記載される医薬組成物及び二重特異性抗体コンストラクトは、例えば、ボーラス注射などの注射による又は持続注入などの注入による非経口投与、例えば皮下又は静脈内送達に特に有用である。医薬組成物は、医療機器を使用して投与され得る。医薬組成物を投与するための医療機器の例については、米国特許第４，４７５，１９６号明細書；同第４，４３９，１９６号明細書；同第４，４４７，２２４号明細書；同第４，４４７，２３３号明細書；同第４，４８６，１９４号明細書；同第４，４８７，６０３号明細書；同第４，５９６，５５６号明細書；同第４，７９０，８２４号明細書；同第４，９４１，８８０号明細書；同第５，０６４，４１３号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３１２，３３５号明細書；同第５，３８３，８５１号明細書；及び同第５，３９９，１６３号明細書に記載されている。
【０１９５】
特に、本発明は、好適な組成物の中断のない投与を実現する。非限定的な例として、中断のない又は実質的に中断のない、すなわち連続的な投与は、患者体内への治療薬の流入を調整するための、患者が装着した小型ポンプシステムによって実現され得る。本発明と関連して記載される二重特異性抗体コンストラクトを含む医薬組成物は、前記ポンプシステムを使用することによって投与され得る。そのようなポンプシステムは、一般に当技術分野で知られており、通常、注入する治療薬を含有するカートリッジの定期交換に依拠する。そのようなポンプシステムでカートリッジを交換する際、交換時以外に中断しない患者体内への治療薬の流入に一時的な中断が結果として生じる場合がある。そのような場合でも、カートリッジ交換前の投与段階及びカートリッジ交換後の投与段階は、依然として、ともにこのような治療薬の「中断のない投与」を構成する本発明の医薬的手段及び方法の意味の範囲内と見なされるであろう。
【０１９６】
本発明と関連して記載される二重特異性抗体コンストラクトの連続投与又は中断のない投与は、流体をレザバーから送り出すための流体送出機構及び送出機構を駆動するための駆動機構を含む、流体送達デバイス又は小型ポンプシステムによる静脈内又は皮下投与であり得る。皮下投与のためのポンプシステムは、患者の皮膚に穿通し、好適な組成物を患者体内に送達するための針又はカニューレを含み得る。前記ポンプシステムを、静脈、動脈又は血管を問わず、患者の皮膚に直接固定又は装着することでポンプシステムと患者の皮膚とを直接接触させることが可能になる。このポンプシステムは、患者の皮膚に２４時間〜数日間装着することができる。レザバーの容積が小さい小型のポンプシステムの場合もある。非限定的な例として、投与される好適な医薬組成物のためのレザバーの容積は、０．１〜５０ｍｌであり得る。
【０１９７】
連続投与は、皮膚に装着され時折交換されるパッチによって経皮的でもあり得る。当業者は、この目的に好適な薬物送達のためのパッチシステムを認識している。経皮投与は、例えば、第１の使用済みパッチの直接隣の皮膚表面に、第１の使用済みパッチを除去する直前に、新しい第２のパッチを装着すると同時に、第１の使用済みパッチの交換を完了できる有利さがあることから、中断のない投与に特に適していることに注目されたい。流入の中断又は電池故障の問題は生じない。
【０１９８】
医薬組成物が凍結乾燥されている場合、まず凍結乾燥材料を投与前に適切な液体で再構成する。凍結乾燥材料を、例えば注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又は凍結乾燥前にタンパク質が存在した同じ製剤で再構成し得る。
【０１９９】
本発明の組成物は、例えば、本明細書に記載される異種間特異性を示す、本発明と関連して記載される二重特異性抗体コンストラクトを、チンパンジーではない霊長類、例えばマカクに用量を増加させながら投与することによる用量漸増試験によって決定できる好適な用量で対象に投与することができる。上述のとおり、本明細書に記載される異種間特異性を示す本発明と関連して記載される二重特異性抗体コンストラクトは、チンパンジーではない霊長類の前臨床試験において同一の形態で使用でき、且つヒトにおける薬物として使用できるという利点がある。投与計画は、主治医及び臨床学的因子によって決定されることになる。医学分野でよく知られるとおり、ある１人の患者に対する投与量は、その患者の体格、体表面積、年齢、投与される個々の化合物、性別、投与時間及び投与経路、全身健康状態並びに同時に投与されている他の薬物を含む多くの要因に依存する。
【０２００】
用語「有効用量」又は「有効投与量」は、所望の効果を達成するか又は少なくとも部分的に達成するのに十分な量と定義される。用語「治療有効用量」は、疾患に既に罹患している患者の疾患及びその合併症を治癒するか又は少なくとも部分的に抑止するのに十分な量と定義される。この用途に効果的な量又は用量は、治療される状態（適応症）、送達される二重特異性抗体コンストラクト、治療の内容及び目的、疾患の重症度、前治療、患者の病歴及び治療薬に対する反応性、投与経路、体格（体重、体表面積又は臓器サイズ）及び／又は患者の状態（年齢及び全身健康状態）並びに患者自身の免疫系の全身状態に依存することになる。適当な用量は、１回又は一連の投与にわたって患者に投与できるように、また最適な治療効果を得るために主治医の判断に従って調整することができる。
【０２０１】
治療有効量の本発明と関連して記載される二重特異性抗体コンストラクトは、好ましくは、疾患症状の重症度を低下させるか、疾患症状がない期間の頻度若しくは期間を増加させるか、又は疾患の苦痛に起因する機能障害若しくは能力障害を予防する。標的細胞の抗原発現腫瘍の治療に関して、治療有効量の本発明と関連して記載される二重特異性抗体コンストラクト、例えば抗標的細胞抗原／抗ＣＤ３抗体コンストラクトは、好ましくは、細胞増殖又は腫瘍増殖を未治療の患者と比較して少なくとも約２０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％又は少なくとも約９０％阻害する。化合物が腫瘍増殖を阻害する能力は、ヒト腫瘍における有効性の予測指標となる動物モデルにおいて評価され得る。
【０２０２】
医薬組成物は、単一の治療で投与するか、又は必要に応じて抗癌療法などの追加の療法、例えば他のタンパク質性及び非タンパク質性薬物と併用して投与することができる。これらの薬物は、本明細書で定義される本発明と関連して記載される二重特異性抗体コンストラクトを含む組成物と同時に投与され得るか、又は前記二重特異性抗体コンストラクトの投与前若しくは投与後に既定の時間間隔及び用量で別々に投与され得る。
【０２０３】
さらに、本発明者らは、免疫性の副作用などの希少な副作用がグルココルチコイド（前）及び／又は（同時）療法の手段によって予防又は軽減され得ることを観察した。
【０２０４】
したがって、本発明は、デキサメタゾンなどのグルココルチコイドが、本発明によるＣＤ３３／ＣＤ３特異的二重特異性抗体コンストラクトによる治療期間に生じる可能性がある有害作用を軽減又はさらに予防することを確立している。
【０２０５】
グルココルチコイド（ＧＣ）は、依然として、炎症性障害及び自己免疫疾患の治療のために最も広範に使用される免疫抑制剤である。グルココルチコイド（ＧＣ）は、ヒトを含むほぼ全ての脊椎動物細胞において存在するグルココルチコイド受容体（ＧＲ）に結合するステロイドホルモンのクラスである。これらの化合物は、炎症の原因にかかわらず、強力な抗炎症剤である。グルココルチコイドは、とりわけ、サイトカインＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８及びＩＦＮ−γをコードする遺伝子を阻害することによって細胞性免疫を抑制する。
【０２０６】
ＧＣの群に属するコルチゾンは、アジソン病から関節リウマチまでの範囲の多くの病気に対処するために使用される重要な治療薬である。抗リウマチ特性が発見され、特効薬としてその称賛がもたらされて以来、特定の病気により適切に対処するための特性を強化したコルチゾンの誘導体が多く作製されている。コルチゾンは、コルチコステロイドとして知られるステロイドの群に属する。これらのステロイドは、腎臓の近くにある副腎の外部である副腎皮質によって産生される。コルチコステロイドは、２つの主要な群：脂肪、タンパク質、カルシウム及び炭水化物代謝を制御するグルココルチコイド（ＧＣ）並びにナトリウム及びカリウムレベルを制御する鉱質コルチコイドに分類される。コルチゾンは、前者の群、すなわちＧＣに属する。コルチゾン及びその多くの誘導体は、様々な疾患のために使用される。コルチゾンは、移植された臓器に存在する外来タンパク質に対する体の防御反応を最小化し、したがって移植された臓器の機能に悪影響を及ぼすことができるその能力に起因して、臓器移植を現実のものにするのにも役立った。しかしながら、５０年を超える期間の臨床的使用にもかかわらず、免疫系の異なる細胞区画に対するＧＣの特異的な抗炎症効果は、依然として不明である。ＧＣは、ほぼ全ての免疫系の細胞に影響を及ぼし、細胞型特異的機構に関するエビデンスが増えている。
【０２０７】
特定の一実施形態では、本発明は、ＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトによって引き起こされる有害作用の寛解、治療又は予防における使用のためのグルココルチコイド（ＧＣ）に関する。上で概説されるとおり、これらの望まれない有害作用は、本明細書に記載されるとおりの段階的な投与によって予防され得る。しかし、単なる予防のために、患者における（免疫学的）有害作用の寛解、治療又は予防における使用のためのグルココルチコイドが提供され得、前記患者は、ＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトによる療法に対する対象である。したがって、１つのさらなる態様において、本発明は、本発明によるＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトによって引き起こされる免疫学的有害作用の寛解、治療又は予防における方法における使用のためのグルココルチコイド（ＧＣ）に関する。
【０２０８】
また、本発明は、ＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトによって引き起こされる免疫学的有害作用の寛解、治療又は予防の方法であって、それを必要とする患者にＩＬ−６Ｒ遮断抗体トシリズマブ又はグルココルチコイド（ＧＣ）を投与することを含む方法に関する。ＧＣは、好ましくは、ＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトによって引き起こされる前記免疫学的有害作用を寛解させるか、治療するか又は予防するのに十分な量で投与される。
【０２０９】
用語「グルココルチコイド」は、グルココルチコイド受容体に好ましくは特異的に結合する化合物を意味する。前記用語は、コルチゾン、コルチゾール（ヒドロコルチゾン）、クロプレドノール、プレドニゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、デフラザコート、フルオコルトロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベタメタゾン、コルチバゾール、パラメタゾン及び／又はフルチカゾンからなる群から選択される化合物、その薬学的に許容される誘導体を含む。本発明の実施形態に関連して、言及される化合物は、単独で又は組み合わせて使用され得る。デキサメタゾンが好ましい。しかしながら、本発明は、上記の特定のＧＣに限定されない。既に「グルココルチコイド」として分類されているか又は分類されることになる全ての物質は、本発明に関連しても利用され得ることが想定される。そのような将来のグルココルチコイドは、グルココルチコイド受容体に特異的に結合し、且つ活性化する化合物を含む。用語「ＧＣ受容体に特異的に結合する」は、本発明に一致して、ＧＣ（又はＧＣのように作用すると想定される化合物）が、ＧＣ受容体（ＮＲ３Ｃ１としても知られる）と、一般にタンパク質／受容体との会合と比較して（すなわち非特異的結合）、統計的に有意な程度まで会合する（例えば、相互作用する）ことを意味する。ＧＣ受容体がグルココルチコイドに結合するとき、その主要な作用機序は、遺伝子転写の調節である。ＧＣの非存在下において、グルココルチコイド受容体（ＧＲ）は、熱ショックタンパク質９０（ｈｓｐ９０）、熱ショックタンパク質７０（ｈｓｐ７０）及びタンパク質ＦＫＢＰ５２（ＦＫ５０６結合タンパク質５２）を含む様々なタンパク質と複合体を形成したサイトゾル中に存在する。グルココルチコイド受容体（ＧＲ）に対するＧＣの結合は、熱ショックタンパク質の放出をもたらす。したがって、将来のＧＣ又はＧＣの薬学的に許容される誘導体若しくは塩は、好ましくは、ＧＣ受容体に結合し、且つ上記の熱ショックタンパク質を放出させることができると想定される。活性化ＧＲ複合体は、核内での抗炎症性タンパク質の発現を上方制御するか、又はサイトゾル中の炎症促進性タンパク質の発現を抑制する（サイトゾルから核への他の転写因子の移行を防ぐことにより）。
【０２１０】
好ましい実施形態では、前記ＧＣは、デキサメタゾン、プロピオン酸フルチカゾン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、ベタメタゾン、トリアムシノロンアセトニド又はこれらの組合せのような最も臨床的に使用され、且つ適切なＧＣから選択される。
【０２１１】
さらにより好ましい実施形態では、前記ＧＣは、デキサメタゾンである。
【０２１２】
デキサメタゾンは、最も一般的に使用されるステロイドの中で最も高いグルココルチコイド効力を有し、また最長の半減期を有する（下の表２を参照されたい）。しかし、当業者は、いくつかが本明細書で開示される他の既知のグルココルチコイドの１つを選択することができ、且つそれを必要とする患者の治療に起因する場合がある免疫学的有害事象を寛解させるか又は予防する適切な有効用量を選択することができる。
【０２１３】
【表２】
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【０２１４】
デキサメタゾンは、場合によりＣＮＳへの特異的な浸透に起因して、悪性中枢神経系（ＣＮＳ）疾患（例えば、ＣＮＳリンパ腫又は脳腫瘍転移）における有益な効果も有する。それは、脳浮腫を治療するためにも優先的に（他のステロイドより）使用される。コルチコステロイドは、腫瘍自体における毛細血管透過性を低減するが、デキサメタゾンは、異なって作用し、且つ腫瘍から離れた総体流に対する作用によって浮腫を減少させ得ることが動物モデルにおいて見出されている（Ｍｏｌｎａｒ，Ｌａｐｉｎ，＆Ｇｏｏｔｈｕｉｓ，１９９５，Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ．１９９５；２５（１）：１９−２８）。
【０２１５】
ＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの適用と関連する臨床試験のために、本発明者らは、効率的且つ患者の大部分によって良好な耐容性が示されることになる治療レジメンを開発しなければならなかった。この目的のため、本発明者らは、本明細書で概説されるとおりのＣＤ３３／ＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの段階的な適用を適用した。それにより、有害作用は、数が減少され、寛解され、且つさらに予防できた。
【０２１６】
本発明の実施形態に従って使用されることになるＧＣの用量は、制限されず、すなわち、それは、個々の患者の状況に依存することになる。ＧＣは、静脈内又は経口投与され得る。しかしながら、ＧＣの好ましい投与量としては、４０ｍｇ（デキサメタゾン換算）までの投与のより低い方の端での１〜６ｍｇ（デキサメタゾン換算）が挙げられる。前記投与量は、全て直ちに投与され得るか、又はより少ない投与量に細分され得る。細分された用量が好ましく、ＧＣの用量は、本明細書に記載されるとおりの段階的な投与に従って第１及び／又は第２の用量の注入前に与えられ、且つＧＣの他の用量は、本明細書に記載されるとおりの段階的な投与に従って第２又は第３の用量の投与前に与えられる。したがって、ＧＣは、好ましくは、１つの治療サイクル当たり２回投与される。さらにより好ましくは、ＧＣは、治療サイクルの開始又は前記治療サイクル内で次に高い用量の投与の開始の２４、若しくは８時間、若しくは４時間、若しくは１時間前に投与される。この点に関して、１時間が最も好ましい。用量は、それぞれ１〜４０ｍｇ、好ましくは５〜２０ｍｇ、最も好ましくはそれぞれ８ｍｇである。「ｄ」は、１日を意味する。さらなる投与計画は、添付の実施例から導き出すことができる。本段落において与えられる全ての投与量は、デキサメタゾン換算を指す。
【０２１７】
本明細書で使用する場合、用語「有効且つ非毒性用量」は、重大な毒性作用を生じさせずに又は本質的に生じさせずに、病的細胞の激減、腫瘍の除去、腫瘍の縮退又は疾患の安定化をもたらすのに十分高い、二重特異性抗体コンストラクトの許容用量を指す。そのような有効且つ非毒性用量は、例えば、当技術分野で記載されている用量漸増試験によって決定され得、その用量は、重篤な有害副事象を誘発する用量未満であるべきである（用量制限毒性、ＤＬＴ）。
【０２１８】
代わりに、トシリズマブは、前投薬において使用され得る。
【０２１９】
本明細書で使用する場合、用語「毒性」は、有害事象又は重篤な有害事象として現れる薬物の毒性作用を指す。これらの副事象は、全身的な薬物忍容性の欠如及び／又は投与後の局所的な忍容性の欠如を指す場合がある。毒性は、その薬物によって引き起こされる催奇性作用又は発癌性作用も含み得る。
【０２２０】
本明細書で使用する場合、用語「安全性」、「インビボ安全性」又は「忍容性」は、投与直後（局所忍容性）及びより長期の薬物適用期間中に重篤な有害事象を誘発しない薬物の投与と定義される。「安全性」、「インビボ安全性」又は「忍容性」は、例えば、治療中及び経過観察期間中に定期的に評価することができる。測定値は、臨床評価、例えば臓器の所見及び臨床検査値異常のスクリーニングを含む。臨床評価が実施され、ＮＣＩ−ＣＴＣ及び／又はＭｅｄＤＲＡ標準に従って正常所見からの逸脱が記録／コード化され得る。臓器の所見は、例えば、Ｃｏｍｍｏｎ  Ｔｅｒｍｉｎｏｌｏｇｙ  Ｃｒｉｔｅｒｉａ  ｆｏｒ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔｓ  ｖ４（ＣＴＣＡＥ）に示される、アレルギー／免疫学、血液／骨髄、心不整脈、凝固などの基準を含み得る。試験され得る検査パラメーターは、例えば、血液学、臨床化学、凝固プロファイル及び尿検査並びに他の体液、例えば血清、血漿、リンパ液又は脊髄液、髄液などの検査を含む。したがって、安全性は、例えば、身体検査、画像化技術（すなわち超音波、ｘ線、ＣＴスキャン、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、技術的デバイスを用いた他の計測（すなわち心電図）、バイタルサインにより、検査パラメーターを測定し、有害事象を記録することにより評価することができる。例えば、本発明による使用及び方法において、チンパンジーではない霊長類における有害事象は、組織病理学的方法及び／又は組織化学的方法により試験され得る。
【０２２１】
上記の用語は、例えば、１９９７年７月１６日のＰｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓａｆｅｔｙ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｓ６；ＩＣＨ  Ｈａｒｍｏｎｉｓｅｄ  Ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ  Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ；ＩＣＨ  Ｓｔｅｅｒｉｎｇ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｍｅｅｔｉｎｇでも参照されている。
【０２２２】
本発明の方法の好ましい実施形態では、治療の第１のサイクルのみは、工程（ａ）による投与を含む一方、その後のサイクルは、工程（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）による用量で開始する。
【０２２３】
二重特異性抗体コンストラクトの第１の結合ドメインは、配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含むことが本発明の方法のために好ましい。
【０２２４】
また、本発明の方法の好ましい実施形態に一致して、二重特異性抗体コンストラクトの第２の結合ドメインは、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号９〜１４、２７〜３２、４５〜５０、６３〜６８、８１〜８６、９９〜１０４、１１７〜１２２、１３５〜１４０、１５３〜１５８及び１７１〜１７６からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含む。
【０２２５】
本発明の方法の好ましい実施形態では、二重特異性抗体コンストラクトは、ある二重特異性抗体コンストラクトである。
【０２２６】
さらに、二重特異性抗体コンストラクトは、配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む一本鎖コンストラクトであることが本発明の方法のために好ましい。
【０２２７】
本発明の方法の一実施形態では、二重特異性抗体コンストラクトは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシ尿素、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストンデメチラーゼ阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランス型レチノイン酸）からなる群から選択される１つ以上のエピジェネティック因子と組み合わせて投与され、
（ａ）１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与前に投与されるか；
（ｂ）１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与後に投与されるか；又は
（ｃ）１つ以上のエピジェネティック因子及び二重特異性抗体コンストラクトは、同時に投与される。
【０２２８】
１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与の７日前まで投与されることが本発明の方法のために好ましい。
【０２２９】
本発明の方法の一実施形態のために、エピジェネティック因子は、ヒドロキシ尿素であることが好ましい。
【０２３０】
上記のとおり、本発明に一致して、骨髄性白血病は、急性骨髄芽球性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤白血病、真性多血症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄肉腫及び急性混合型白血病からなる群から選択される。骨髄性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であることが好ましい。
【０２３１】
また、一実施形態では、本発明は、好ましくは骨髄性白血病の治療のための医薬組成物の調製のための、ＣＤ３３に特異的に結合する第１の結合ドメイン及びＣＤ３に特異的に結合する第２の結合ドメインを含む二重特異性抗体コンストラクトの使用を提供し、二重特異性抗体コンストラクトは、１４日間を超えて投与された後、コンストラクトの投与を伴わない少なくとも１４日の期間が続くことになる。
【０２３２】
二重特異性抗体コンストラクトは、以下の工程：
（ａ）二重特異性抗体コンストラクトの第１の用量の投与、続いて
（ｂ）二重特異性抗体コンストラクトの第２の用量の投与であって、前記第２の用量は、前記第１の用量を超える、投与、続いて
（ｃ）二重特異性抗体コンストラクトの第３の用量の投与であって、前記任意選択による第３の用量は、前記第２の用量を超える、投与、任意選択により、続いて
（ｄ）二重特異性抗体コンストラクトの第４の用量の投与であって、前記任意選択による第３の用量は、前記第３の用量を超える、投与
を含むスケジュールに従って投与されることになることが本発明の使用に好ましい。
【０２３３】
本発明の使用の好ましい実施形態では、治療の第１のサイクルのみは、工程（ａ）による投与を含む一方、その後のサイクルは、工程（ｂ）、（ｃ）又は（ｄ）による用量で開始する。
【０２３４】
二重特異性抗体コンストラクトの第１の結合ドメインは、配列番号１０〜１２及び１４〜１６、２２〜２４及び２６〜２８、３４〜３６及び３８〜４０、４６〜４８及び５０〜５２、５８〜６０及び６２〜６４、７０〜７２及び７４〜７６、８２〜８４及び８６〜８８、９４〜９６及び９８〜１００からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含むことが本発明の使用のために好ましい。
【０２３５】
また、本発明の使用の好ましい実施形態に一致して、二重特異性抗体コンストラクトの第２の結合ドメインは、国際公開第２００８／１１９５６７号パンフレットの配列番号９〜１４、２７〜３２、４５〜５０、６３〜６８、８１〜８６、９９〜１０４、１１７〜１２２、１３５〜１４０、１５３〜１５８及び１７１〜１７６からなる群から選択される６つのＣＤＲの群を含む。
【０２３６】
本発明の使用の好ましい実施形態では、二重特異性抗体コンストラクトは、ある二重特異性抗体コンストラクトである。
【０２３７】
さらに、二重特異性抗体コンストラクトは、配列番号１８、１９、２０、３０、３１、３２、４２、４３、４４、５４、５５、５６、６６、６７、６８、７８、７９、８０、９０、９１、９２、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７及び１０８からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む一本鎖コンストラクトであることが本発明の使用のために好ましい。
【０２３８】
本発明の使用の一実施形態では、二重特異性抗体コンストラクトは、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ（ＤＮＭＴ）Ｉ阻害剤、ヒドロキシ尿素、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、ヒストンデメチラーゼ阻害剤及びＡＴＲＡ（全トランス型レチノイン酸）からなる群から選択される１つ以上のエピジェネティック因子と組み合わせて投与され、
（ａ）１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与前に投与されるか；
（ｂ）１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与後に投与されるか；又は
（ｃ）１つ以上のエピジェネティック因子及び二重特異性抗体コンストラクトは、同時に投与される。
【０２３９】
１つ以上のエピジェネティック因子は、二重特異性抗体コンストラクトの投与の７日前まで投与されることが本発明の使用のために好ましい。
【０２４０】
本発明の使用の一実施形態のために、エピジェネティック因子は、ヒドロキシ尿素であることが好ましい。
【０２４１】
上記のとおり、本発明に一致して、骨髄性白血病は、急性骨髄芽球性白血病、慢性好中球性白血病、骨髄性樹状細胞白血病、移行期慢性骨髄性白血病、急性骨髄単球性白血病、若年性骨髄単球性白血病、慢性骨髄単球性白血病、急性好塩基球性白血病、急性好酸球性白血病、慢性好酸球性白血病、急性巨核芽球性白血病、本態性血小板増加症、急性赤白血病、真性多血症、骨髄異形成症候群、急性汎骨髄性白血病、骨髄肉腫及び急性混合型白血病からなる群から選択される。骨髄性白血病は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）であることが好ましい。
【０２４２】
本発明の方法に感受性があると考えられる患者集団は、前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）を除く１つ以上の治療過程後に持続するか又は再発するＷＨＯ分類によって定義されるとおりのＡＭＬである。患者集団は、前の骨髄異形成症候群に続いて起こるＡＭＬを含み得る。好ましくは、患者集団は、前骨髄球性白血病（ＡＰＭＬ）及び前の骨髄異形成症候群に続いて起こるＡＭＬを除く、少なくとも１つの一次の誘導過程後に持続する／難治性（すなわち少なくとも１つの前の化学療法サイクル後に応答しない）又は化学療法に対する最初の応答を達成した後に再発するＷＨＯ分類によって定義されるとおりのＡＭＬを含む。さらに、好ましい患者集団は、骨髄中に１％を超える芽球、好ましくは５％を超える芽球を有することによって特徴付けられる。通常、患者集団のＥＣＯＧパフォーマンスステータスは、２未満である。
【０２４３】
一般的な定義
本明細書で使用する場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」及び「その」は、文脈により別段の明確な指示がない限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。したがって、例えば、「試薬」に対する参照は、１つ以上のこのような種々の試薬を含み、「方法」に対する参照は、本明細書に記載される方法のために改変され得るか、又は本明細書に記載される方法と置換され得る、当業者に知られる均等な工程及び方法に対する参照を含む。
【０２４４】
当業者であれば、単なる通例的な実験により、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識することになるか又は確認することができるであろう。このような均等物は、本発明に包含されるものとする。
【０２４５】
用語「及び／又は」は、本明細書のいずれの箇所で使用される場合でも、「及び」、「又は」及び「前記用語によって接続される要素の全て又は任意の他の組合わせ」の意味を含む。
【０２４６】
用語「約」又は「近似的に」は、本明細書で使用されるとき、所与の値又は範囲の±２０％以内、好ましくは±１５％以内、より好ましくは±１０％以内及び最も好ましくは±５％以内を意味する。
【０２４７】
本明細書及びそれに続く特許請求の範囲の全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語並びに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含んでいる」などのバリエーションは、述べられる整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を含むことを意味するが、任意の他の整数若しくは工程又は整数若しくは工程の群を除外することを意味するものではないことを理解されたい。本明細書で使用する場合、用語「含む」は、用語「含有する」若しくは「包含する」又は本明細書で使用する場合にときに用語「有する」とも置き換えることができる。
【０２４８】
本明細書で使用する場合、「〜からなる」は、請求項の要素で特定されていない任意の要素、工程又は成分を除外する。本明細書で使用する場合、「〜から本質的になる」は、請求項の基本的及び新規の特徴に実質的に影響を及ぼさない材料又は工程を除外しない。
【０２４９】
本明細書では、各場合において、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という用語のいずれかを他の２つの用語のいずれかに置き換え得る。
【０２５０】
本明細書の本発明は、特定の方法論、プロトコル又は試薬に限定されず、そのため、変動し得ることが理解されるべきである。本明細書で提供される議論及び実施例は、特定の実施形態を説明することを目的として示されているに過ぎず、特許請求の範囲によってのみ定義される本発明の範囲を限定することを意図されない。
【０２５１】
本明細書の本文全体において引用されている全ての刊行物及び特許（全ての特許、特許出願、科学刊行物、製造業者の仕様書、説明書などを含む）は、上記であっても下記であっても、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。本明細書のいかなる内容も、本発明が、先発明によってこのような開示に先行する権利を有しないことを承認するものとして解釈すべきではない。参照により組み込まれる資料が本明細書と矛盾又は一致しない限り、本明細書は、いかなるこのような資料よりも優先される。
【実施例】
【０２５２】
以下の実施例は、本発明の具体的な実施形態又は特徴を例示する目的で提供されるものである。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例は、例示のために含まれ、本発明は、特許請求によってのみ限定される。
【０２５３】
実施例１：
この試験の目的は、ｒ／ｒ  ＡＭＬを呈している患者の予後を評価することであった。
【０２５４】
方法
データは、白血病を有する患者の経験を反映する臨床データの包括的な収集物であるＭＤアンダーソン癌センター（Ａｎｄｅｒｓｏｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ）白血病中央データリポジトリに由来する。含まれる患者は、２００２年〜２０１６年にＭＤＡＣＣでの少なくとも１つの治療過程にわたってｒ／ｒ  ＡＭＬについて治療された。この試験に含まれるとき、患者は、前に少なくとも１つの治療の失敗を有し、ＡＭＬ診断時の年齢が１８歳以上であり、精巣又はＣＮＳ髄外疾患がなかった。急性前骨髄球性白血病の診断は、除外された。
【０２５５】
患者の記述的な特徴は、平均及び標準偏差並びに／又は中央値及び四分位間範囲とともに要約された。完全寛解（ＣＲ）率及び不完全な血液学的回復を伴う完全寛解（ＣＲｉ）率は、Ｗａｌｄ  ９５％信頼区間を伴う比率として記載された。特定の時間間隔３／６／９／１２ヶ月におけるカプラン−マイヤーの中央値及び確率を使用して、Ｗａｌｄ  ９５％信頼区間により事象分析までの時間を推定した。部分群分析は、Ｗａｌｄカイ二乗試験を使用した。
【０２５６】
結果
合計で１０２１名の患者が含まれた。含まれる患者の年齢中位数は、６０歳であり、最初の再発性／難治性ＡＭＬは、患者の４３％（ｎ＝４３９）に関して２０１１〜２０１６年に発生した。少なくとも１つの染色体異常は、集団の５３．３％（ｎ＝５４６）に存在し、３４．５％（ｎ＝３５２）は、先行している血液疾患の履歴を有し、且つ１０．５％（ｎ＝１０７）は、療法に誘導されるＡＭＬであった。利用可能な誘導記録を有する患者に関して、およそ４６％（２９５／６３５）は、難治性であった。誘導までＣＲを達成した患者の中で、４５％（１１８／２６４）は、６ヶ月未満のＣＲ期間を有した。
【０２５７】
全体的に、全てのｒ／ｒ  ＡＭＬ患者のわずかな比率が第２の完全寛解（ＣＲ２）を達成できる。ＣＲ率は、その後のサルベージの試行毎に低下する（表１）。比率は、６０歳未満の患者の中でより低い。様々な型のサルベージレジメンの中で、ＣＲの範囲は、０〜３６％であった。高用量のシタラビンに基づくレジメンは、最も一般的であった（ｎ＝２９９）。試料サイズは、中程度であったが、ＦＬＴ３阻害剤を含有するレジメンは、最も高いＣＲ及びＣＲ／ＣＲｉ率（３６％  ＣＲ２、３３％  ＣＲ３）を誘導した（表２）。年齢、細胞遺伝学、先行している疾患、第１の寛解の期間及び再発の年は、ＣＲ率と関連した。
【０２５８】
全生存期間及び無再発生存期間は、中程度であり、その後のサルベージとともに減少した（表３）。年齢、細胞遺伝学、前駆疾患、初発／療法に誘発されたＡＭＬ、最初の寛解の期間及び血小板数は、生存期間と関連した。
【０２５９】
結論
全体的に、大部分の患者は、第２の又はさらなるＣＲ２を達成できなかった。第２の治療の失敗又は再発後に引き続くＣＲを達成できる患者は、少なかった。ＥＦＳは、ＣＲを達成できない大部分の患者のために短い。第１のサルベージ時でさえ、ＯＳは、１年未満である。これらのデータは、再発性又は難治性ＡＭＬ患者が芳しくない全体的な予後及び患者のための追加の選択肢の必要性を有することを実証している。これらのデータは、様々な異なるエンドポイントのためのＡＭＬにおける新しいプロトコル及び治療選択肢の開発を導く一助として使用され得る。
【０２６０】
実施例２
この試験の目的は、Ｒ／Ｒ  ＡＭＬにおけるＣＤ３３ＸＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの安全性、薬物動態及び薬物動力学を評価すること並びに最大耐用量を推定することであった。
【０２６１】
方法（図１を参照されたい）：これは、Ｒ／Ｒ  ＡＭＬを有する患者において、最初の３用量に関して単一患者コホート、その後、１コホート当たり３〜６名の患者により、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトを持続ＩＶ注入として評価する第１相用量漸増試験であった（ＮＣＴ０２５２０４２７）。応答は改訂されたＩＷＧ基準に基づき、部分的な血液学的回復を伴う完全奏効（ＣＲ）の追加を有した。用量制限毒性（ＤＬＴ）を伴わない第１のサイクルを完了した後、最大５つの追加のサイクルが臨床的有用性のために与えられ得る。３０μｇ／日（ｄ）コホート後、段階的な投与及びコルチコステロイドの単回投与による前治療を含むサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）のためのリスク軽減対策が行われた。改変された治療レジメンは、１０μｇ／ｄ×４ｄの最初の導入用量に続く標的用量からなった。次に、２工程のレジメン、すなわち１４ｄ又は２８ｄの治療期間に１０μｇ／ｄ、６０μｇ／ｄ、続いて標的用量、続いて１〜４週の無治療が試験された。
【０２６２】
結果（表１〜３、図２〜４を参照されたい）：３５名の患者は、この進行中の試験において０．５〜４８０μｇ／ｄの標的用量範囲を有する１２の用量コホートに登録した。患者の半数超（２０／３５、５７％）は、男性であり、年齢中位数は、５８歳（範囲：１８〜８０歳）であり；１４／３５（４０％）は、以前に幹細胞移植を受けたことがある。ベースライン時のＡＭＬ疾患期間の中央値は、１．３（範囲：０．３〜９．６）年であり、ベースライン時の芽球の割合の中央値は、３７％（範囲：３％〜９５％）であり、且つ前治療の中央値＃は、４回（範囲：１〜１５）であった。ベースラインＡＮＣの中央値は、０．２（範囲：０〜８．６）×１０９／Ｌであった。
【０２６３】
患者は、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトによる１（範囲：１〜６）サイクルの中央値を受け；３１／３５（８９％）患者は、疾患進行（ｎ＝２４）、有害事象（ＡＥ；ｎ＝５、２つの治療関連）及び患者の要求（ｎ＝２）のために治療を中断した。１名の患者は、許容される最大の６サイクルを完了し、３名の患者は、依然として試験薬物を受容している。重篤なＡＥ（ＳＡＥ）は、２３／３５（６６％）の患者に認められた（１５名の患者では治療関連）；１名を超える患者に認められたＳＡＥとしては、ＣＲＳ（ｎ＝１１）、発熱性好中球減少症（ｎ＝６）、肺炎（ｎ＝４）、白血球減少症（ｎ＝３）、血小板減少症（ｎ＝２）及び硬膜下血腫（ｎ＝２）が挙げられ；１名の患者は、ＡＭＬ進行により試験中に死亡した（治療関連ではない）。１０μｇ／ｄ及び３０μｇ／ｄコホート（導入期なし）で各１名の患者が重篤なＣＲＳを経験し；ＣＲＳの徴候及び症状は、コルチコステロイド、昇圧剤及びＩＶ液並びにＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの中断により、１ｄで回復した。４８０μｇ／ｄの標的用量によりグレード２ＣＲＳ及びグレード４心室細動のＤＬＴがあり；次に標的用量を２４０μｇ／ｄに減少させた。
【０２６４】
２名の患者は、２４０μｇ／ｄの標的用量（１０μｇ／ｄ→６０μｇ／ｄの導入）でＣＲを有し；１２０μｇ／ｄ及び２４０μｇ／ｄの各標的用量で１名の患者は、ＣＲｉを有し、且つ１．５μｇ／ｄを受容した１名の患者は、形態学的無白血病状態（ＭＬＦＳ、＜５％芽球、非血液学的回復）を有した。ＣＲを有する１名の患者は、フローサイトメトリーによって２９日目までに約５％〜１０％から（斑状疾患と推定される）２．５％までの骨髄芽球の減少を有し、残存ＡＭＬ及び正常〜富細胞性骨髄の形態学的エビデンス並びに末梢血数の回復を伴わなかった。第２のＣＲ患者は、１サイクルのＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトを受容した後、４２日目までに抹消血数の回復を伴って４０％から３％の芽球の減少を有した。相関的なデータが示されることになる。
【０２６５】
結論：４８０μｇ／ｄまで投与されたＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの予備的なデータは、高度に前治療されたＲ／Ｒ  ＡＭＬを有する患者において忍容性及び抗白血病活性の初期の有望なエビデンスを提供する。予想されるＣＲＳは、必要に応じて漸増的投与、コルチコステロイド前治療、ＩＶ液、トシリズマブ及び薬物中断により軽減され；大部分の患者は、治療に対して十分に応答した短い期間のＣＲＳを有した。２段階の手法は、標的用量を迅速に達成し、且つ臨床応答を最適化するために将来的に使用されることになる。現在まで、２名のＣＲ及び２名のＣＲｉが１２０及び２４０μｇ／ｄの標的用量で観察されている。ほぼ全ての患者は、ベースラインで実質的に血球減少症であったため、血球減少症に対するＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトの影響を評価することが課題である。注目すべきことに、両方のＣＲ患者は、１サイクルの治療後に血球数の完全な回復を有した。これらの有望なデータは、ＣＤ３３を標的化するＢｉＴＥ（登録商標）プラットフォームの使用を確証する。
【０２６６】
実施例３
この試験の目的は、ＣＤ３３ｘＣＤ３二重特異性抗体コンストラクトに関する用量制限毒性（ＤＬＴ）期間を短縮することであった。他の実施例において適用されるＤＬＴ期間は、治療サイクル（例えば、４週間）及び例えばサイクルの終了後の２週間の追加の無治療期間を含んだ。この試験は、実際の治療期間に焦点を合わせ、ＤＬＴ期間からのサイクル期間後の２週間は、第１のサイクル後に除かれた。
【０２６７】
結論：これらの変化は、登録された将来の対象に関する配列番号１０４のベネフィット：リスクプロファイルを改善した。試験２０１２０２５２は、再発性又は難治性急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する対象における配列番号１０４の安全性、忍容性、薬物動態、薬物動力学及び有効性を評価するために設計され、現在、ドイツ、オランダ及びアメリカ合衆国（ＵＳ）において実施されている。
【０２６８】
ＤＬＴ期間の更新のための根拠：２週間の無薬物期間は、以前に、完全奏功（ＣＲ）を達成している患者における末梢血液細胞の回復の動態をモニターするためにＤＬＴ期間に加えられた。成熟骨髄細胞及び骨髄前駆細胞は、ＣＤ３３を発現するため、配列番号１０４による治療が、持続的な骨髄抑制によって反映される骨髄系列の阻害をもたらし得ることが懸念であった。骨髄系列に対する配列番号１０４の効果を調査するために、絶対好中球数（ＡＮＣ）が全ての治療対象において分析された。コホート１１、１２及び１３に登録された対象は、２つの用量段階のスケジュール（すなわちスケジュール３：１０μｇ／日の第１の用量段階後に６０μｇ／日の第２の用量段階、続いて標的用量）により治療された。個々の対象の結果の概説は、コホート１１〜１３において治療された大部分の対象がベースラインでグレード３〜４の好中球減少症（根底にある疾患の性質の反映）を有することを示した（図６）。同様の結果は、スケジュール１（コホート１〜５、用量段階を伴わない標的用量漸増）及びスケジュール２（コホート６〜１０、１０μｇ／日の１つの用量段階後に標的用量）において治療された対象に関して得られた（データは示さず）。
【０２６９】
大部分の対象は、好中球減少性のままであったが、一部の対象は、配列番号１０４による治療中に好中球数の改善を示した。各コホートからのデータの概説は、ベースラインとサイクル治療の終わりとの間で好中球数の臨床的に意味のある変化を示さなかった。さらに、コホート１１〜１３で治療された対象の大部分は、疾患進行によりＤＬＴ期間（すなわち無薬物期間）の最後の２週を完了しなかった。しかしながら、コホート１１及び１２で治療された２名の対象は、完全な血液学的回復を有するＣＲを達成したが、これは、配列番号１０４が正常な造血発生に支障をきたさない場合があることを示唆している。
【０２７０】
ＤＬＴ期間にコホート１１（２４０μｇ）、１２（２４０μｇ）及び１３（３６０μｇ）において治療された患者の末梢血中の絶対好中球数が示される（図６）。平均±ＳＥが示される。Ｇ４線（下方の線）及びＧ３ライン（上方の線）は、ＣＴＣＡＥによってグレード４及び３の好中球減少症を示す。
【０２７１】
ＦＩＨ試験における臨床データの分析に加えて、循環単球及び好中球に対する持続静脈内（ＣＩＶ）又は皮下（ＳＣ）投与による配列番号１０４の潜在的な効果は、カニクイザルにおける優良試験所基準（ＧＬＰ）を遵守した２８日の繰り返し投与毒性試験において評価された（試験１１９４２２、配列番号１０４：カニクイザルにおける２８日持続静注又は皮下毒性試験）。血液学評価は、事前試験（２回）及び１日目（４時間）、２日目、１０日目及び２９日目に実施された。３、１０及び３０μｇ／ｋｇ／日  ＣＩＶ及び２５ｕｇ／ｋｇ／日  ＳＣ用量群における単球の減少並びに／又は１０及び３０μｇ／ｋｇ／日  ＣＩＶ及び２５μｇ／ｋｇ／日  ＳＣ用量群における好中球の減少は、１又は２日目に検出された。減少は、５段階尺度（最小、軽度、中程度、顕著、重度）に対して「軽度〜顕著」として類別された。循環単球の数は、２９日目までに投与前値まで有利に回復し、循環好中球の数は、２９日目までに投与前値まで回復した。したがって、配列番号１０４に誘導される循環骨髄細胞の減少は、２８日目まで薬物曝露を維持した３、１０及び３０μｇ／ｋｇ／日  ＣＩＶ群における動物のように単に一過的であった。
【０２７２】
血小板は、ＣＤ３３陰性であり、且つ配列番号１０４によって直接的に標的化されないが、それらは、ＣＤ３３を発現する骨髄前駆細胞に起源を有する。したがって、末梢血中の血小板数を査定して、一般的な骨髄前駆細胞に対する配列番号１０４の潜在的な阻害効果を評価した。コホート１１〜１３において治療された対象における血小板数の分析は、対象の大部分がベースライン時に血小板減少性であることを示した。配列番号１０４による治療中の血小板動態の概説は、ベースラインと比較して血小板数における臨床的に意味のある変化を示さなかった（図７）。この知見は、ＣＩＶ経路による≧１０μｇ／ｋｇ／日の配列番号１０４の投与が単にカニクイザルの血小板数の一過的且つ最小の減少をもたらしたことを示す毒性試験の結果と一致する。
【０２７３】
ＤＬＴ期間にコホート１１（２４０μｇ）、１２（２４０μｇ）及び１３（３６０μｇ）において治療された患者の末梢血中の血小板数が示される。平均±ＳＥが示される。Ｇ４線（下方の線）及びＧ３ライン（上方の線）は、ＣＴＣＡＥによってグレード４及び３の好中球減少症を示す。
【０２７４】
ＣＲＳは、試験２０１２０２５２においてオンターゲット毒性として定義された。ＣＲＳの発症及び回復の動態を理解するため、既存のスケジュールで治療されたコホート１１、１２及び１３における対象に関して利用可能なデータが分析された。全てのＣＲＳ事象の発症は、配列番号１０４投与の最初の１０日以内、すなわち用量段階及び／又は標的用量若しくはその直後に発生した。同様の動態は、コホート１〜１０において治療された対象において観察された（データは示さず）。この知見は、ＣＲＳが、用量投与又は用量増加後、早急に観察される急性毒性であるという既存の知識と一致する。これまでの対象において、ＣＲＳの遅延は、観察されていない。したがって、提案されたＤＬＴ期間（標的用量に対して少なくとも１４日を伴う合計で４週間）は、ＣＲＳが回復するのに十分な時間を提供する。さらに、グレード２〜３  ＣＲＳが７日以内に回復しない状況下では、プロトコルによりＤＬＴとして分類される。
【０２７５】
ＤＬＴ期間中にコホート１１（２４０μｇ）、１２（２４０μｇ）及び１３（３６０μｇ）において治療された患者におけるＣＲＳの発症及び回復が示される。左のデータは、初期用量及びＤＬＴ期間の再開をもたらす用量の再開を示す。右のデータは、最終ＤＬＴ期間の開始に標準化される。
【０２７６】
要約すると、試験２０１２０２５２の例示的なコホート１１〜１３における絶対好中球数は、対象がベースラインで骨髄抑制され、好中球数における減少が配列番号１０４による治療後に観察されないことを示した。これは、骨髄系列に対する配列番号１０４の効果が薬物曝露の早い段階で生じ、実際には一過性であったカニクイザルにおける試験と一致する。さらに、試験２０１２０２５２のコホート１１〜１３におけるＣＲＳの発症は、毒性の遅延のいずれのエビデンスも伴わずに、配列番号１０４の所与の用量段階及び標的用量の最初の１０日以内に生じた。これらの知見に基づいて、ＤＬＴ期間を標準の４週まで短縮することができ（標的用量に対して少なくとも１４日）、ＣＲＳの発症及びその回復、効率的な患者内増加並びに全体的な患者の安全性をモニタリングすることを可能にする。
【０２７７】
実施例４
副作用（ＣＲＳ事象）の回避又は減弱の評価
例示的なコホート１〜１４（標的用量０．５〜４８０μｇ）において治療された４６名の対象のうち、治療された４６名の対象のうちの２９名（６３％）がいくらかのＣＲＳの事象を経験した。２９名の対象は、ＣＲＳの５６の事象を経験し、その重症度は、２９／５６（５２％）グレード１、２１／５６（３７．５％）グレード２、４／５６（７％）グレード３及び２／５６（３．５％）グレード４であった。ＣＲＳのグレード５の事象はなかった。薬物は、１９／５６（３４％）に関して中断され、１／５６（２％）のみが中止された。対象のうちの３６／５６（６４％）に関して、配列番号１０４による処置は行われなかった。したがって、最高グレードの副作用ＣＲＳは、完全に回避することができ、比較的高いグレード３及び４は、希発の一桁の発生率まで減弱できた。治療の中断は、治療された患者の大部分で回避することができ、高度に進行したｒ／ｒ  ＡＭＬに罹患している高位の患者を治療するための継続的な有効用量投与を確保できた。
【０２７８】
【表３】
2021532140.tif 000005
【０２７９】
【表４】
2021532140.tif 000006
【０２８０】
【表５】
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【０２８１】
【表６】
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【０２８２】
【表７】
2021532140.tif 000009
【０２８３】
【表８】
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【０２８４】
【表９】
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【０２８５】
【表１０】
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【０２８６】
【表１１】
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【０２８７】
【表１２】
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【０２８８】
【表１３】
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【０２８９】
【表１４】
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【０２９０】
【表１５】
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【０２９１】
【表１６】
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【０２９２】
【表１７】
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【０２９３】
【表１８】
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【０２９４】
【表１９】
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【０２９５】
【表２０】
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【０２９６】
【表２１】
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【０２９７】
【表２２】
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【０２９８】
【表２３】
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【図１】
2021532140.tif 000026
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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