(57)【要約】本発明は、Maackia amurensisレクチンII(MAH-II)、Euonymus europaeusレクチン(EEL)、Psophocarpus tetragonolobusレクチンI(PTL-I)及びGrijfonia SimplicifoliaレクチンII(GSL-II)から選択される少なくとも１つのレクチン、具体的にはHAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIから選択される少なくとも２つのレクチン、具体的にはHAM-II及びEELの２つのレクチンの、生体試料においてホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を標識してホルモン依存性癌標的器官の標識癌幹細胞を取得するためのインビトロ方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Maackia amurensisレクチンII(MAH-II)、Euonymus europaeusレクチン(EEL)、Psophocarpus tetragonolobusレクチンI(PTL-I)及びGrijfonia SimplicifoliaレクチンII(GSL-II)から選択される少なくとも１つのレクチン、具体的にはHAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIから選択される少なくとも２つのレクチン、具体的にはMAH−II及びEELの２つのレクチンの、生体試料においてホルモン依存性癌の標的器官の癌幹細胞を標識してホルモン依存性癌標的器官の標識癌幹細胞を取得するためのインビトロ使用。
【請求項２】
少なくとも２つのレクチンを、等量又は不等量で、具体的には重量比2：1の不等量で使用し、好ましくは両レクチンが重量比2：1の不等量のMAH-II/EELである、請求項１に記載のインビトロ使用。
【請求項３】
MAH-IIレクチンはＯ結合グリカン、具体的にはジシアリル-Ｔ基(NeuAc α2-3Gal α1-3 (NeuAc α2-6) GalNAc)を認識し、PTC-IレクチンはＯ結合グリカン、具体的にはＢ及びＡ抗原のGal α1-3 (Fuc α 1-2) Gal及びGalNAc α 1-3 (Fuc α 1-2)基を認識し、EELレクチンはガラクトシル化グリカン、具体的にはＢ抗原のGal α1-3 (Fuc α1-2) Gal基及びＨ抗原のFuc α1-2Galβ1-3GlcNAc基を認識し、GSL-IIはＮ結合グリカン、具体的には非ガラクトシル化トリ又はテトラアンテナＮ結合グリカンを認識する、請求項１又は２に記載のインビトロ使用。
【請求項４】
癌が乳癌、子宮癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌又は副腎癌である、請求項１〜３のいずれか１項に記載のインビトロ使用。
【請求項５】
ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の標識化が
− フルオロフォア、特にローダミン、FITC又はAlexa Fluorから選択されるフルオロフォア、
− 放射性同位体、特にヨウ素125、トリチウム又はテクネチウムから選択される放射性同位体、
− 発色性又は発光性基質を利用する酵素、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ又はβ-ガラクトシダーゼから選択される酵素、
− 金ビーズ、又は
− ビオチン
から選択されるマーカーに接合されたレクチンにより行われる、請求項１に記載のインビトロ使用。
【請求項６】
ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞が接合レクチンで標識された後、接合レクチンの検出によりホルモン依存性癌標的器官の標識癌幹細胞が検出される、請求項１又は５に記載のインビトロ使用。
【請求項７】
マーカーに接合されたレクチンでホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞が標識された後に、ホルモン依存性癌の標識癌幹細胞が単離され、ここで、マーカーがビオチンであり、単離が磁場の存在下、磁気ビーズからなる、ストレプトアビジン又はアビジンで官能化された支持体を用いて行われ、又はマーカーがフルオロフォアであり、単離はフローサイトメトリーにより行われる、請求項１又は５に記載のインビトロ使用。
【請求項８】
生体試料がホルモン依存性癌標的器官の試料である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のインビトロ使用。
【請求項９】
(a) HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンであって、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ又はビオチンから選択されるマーカーに接合されたレクチンでホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を標識して、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞が少なくとも１つのレクチンで標識された生体試料を取得するステップ、その後
(b) 少なくとも１つのレクチンで標識された、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を検出するステップ
を含んでなる、生体試料中のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を検出するインビトロ方法。
【請求項１０】
(a) HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンであって、ビオチン又はフルオロフォアに接合されたレクチンでホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を標識して、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞が少なくとも１つのレクチンで標識された生体試料を取得するステップ、その後
(b) 少なくとも１つのレクチンで標識されたホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を単離するステップであって、レクチンがビオチンに接合されている場合、単離ステップは磁場の存在下、磁気ビーズからなる、ストレプトアビジン又はアビジンで官能化された支持体を用いて行われ、レクチンがフルオロフォアに接合されている場合、単離ステップはフローサイトメトリーでの細胞選別により行われる、ステップ
を含んでなる、生体試料中のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を単離するインビトロ方法。
【請求項１１】
(a) 生体試料のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンであって、フルオロフォア又はビオチンから選択されるマーカーに接合されたレクチンで標識して、生体試料中に少なくとも１つのレクチンで標識されたホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を取得するステップ、
(b) 少なくとも１つのレクチンで標識されたホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を単離するステップであって、ビオチンに接合されたレクチンで標識された場合、単離はストレプトアビジン又はアビジンで官能化された支持体を用いて行われ、具体的には、官能化された支持体はストレプトアビジン又はアビジンで官能化された磁気ビーズからなり、単離は磁場の存在下で磁気細胞選別により行われ、フルオロフォアに接合されたレクチンで標識された場合、単離はフローサイトメトリーによる細胞選別により行われる、ステップ、
(c) 単離されたホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンであってフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ又はビオチンから選択されるマーカーに接合されたレクチンで新たに標識して、単離され新たな標識により標識されたホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を取得するステップ、
(d) 単離され新たな標識により標識されたホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を、
− レクチンがフルオロフォアに接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合されたフルオロフォアにより検出される場合、蛍光顕微鏡観察又は蛍光リーダー、
− レクチンが化学発光性基質を利用する酵素に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された化学発光性基質を利用する酵素により検出される場合、発光顕微鏡観察又は発光リーダー、
− レクチンが放射性同位体に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された放射性同位体により検出される場合、ガンマカメラ
− レクチンが発色性基質を利用する酵素に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された発色性基質を利用する酵素により検出される場合、UV/可視光顕微鏡観察又は吸光リーダー、或いは
− レクチンが金ビーズに接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された金ビーズにより検出される場合、電子顕微鏡観察
により検出するステップ、
(e) 場合により、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を定量するステップ、
(f) 生体試料中のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の検出強度を、生体試料に隣接する健常試料中のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の検出強度と比較し、任意に、生体試料中のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の量を、生体試料に隣接する健常試料中のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の量と比較するステップ、及び
(g) ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の存在及び場合により量に基いて、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性を推論するステップ
を含んでなる、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性のインビトロ診断方法。
【請求項１２】
(a) 生体試料のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンであって、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ又はビオチンから選択されるマーカーに接合されたレクチンで標識して、生体試料中に少なくとも１つのレクチンで標識されたホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を得るステップ、
(b) ホルモン依存性癌標的器官の標識癌幹細胞を
− レクチンがフルオロフォアに接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合されたフルオロフォアにより検出される場合、蛍光顕微鏡観察又は蛍光リーダー
− レクチンが化学発光性基質を利用する酵素に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された化学発光性基質を利用する酵素により検出される場合、発光顕微鏡観察又は発光リーダー
− レクチンが放射性同位体に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された放射性同位体により検出される場合、ガンマカメラ
− レクチンが発色性基質を利用する酵素に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された発色性基質を利用する酵素により検出される場合、UV/可視光顕微鏡観察又は吸光リーダー、或いは
− レクチンが金ビーズに接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された金ビーズにより検出される場合、電子顕微鏡観察
により検出するステップ、
(c) 場合により、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を定量するステップ、
(d) 生体試料中のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の検出強度を、生体試料に隣接する健常試料中のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の検出強度と比較し、任意に、生体試料中のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の量を、生体試料に隣接する健常試料中のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の量と比較するステップ、及び
(e) ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の存在及び場合により量に基いて、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性を推論するステップ
を含んでなる、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性のインビトロ診断方法。
【請求項１３】
MAH-IIレクチンとEELレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物であって、レクチンがビオチンに接合された混合物、及びストレプトアビジンで官能化された磁気ビーズを含み、
任意に、MAH-IIレクチンとEELレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物であって、レクチンがフルオロフォア、放射性同位体、酵素又は金ビーズ接合された混合物を含むか、或いは、
MAH-IIレクチンとEELレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物であって、レクチンがフルオロフォアに接合された混合物を含み、
任意に、MAH-IIレクチンとEELレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIレクチンとEELレクチンとPTL-IレクチンとGSL-IIレクチンとの混合物であって、レクチンがビオチン、放射性同位体、酵素又は金ビーズに接合された混合物を含む、
ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性のインビトロ診断キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はホルモン依存性癌標的器官に関する癌幹細胞(CSC)の単離及び検出の方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
特にホルモン依存性癌標的器官としては乳房、子宮、前立腺、卵巣、甲状腺、副腎などがある。
乳癌はフランスでは女性の癌による死亡原因の第1位である。この病気は年間に48,000人に影響を及ぼす。また、この病理による死亡数は年間、約12,000人であり、女性の生涯で10人のうち1人に影響を及ぼす。転移性乳癌の場合には5年生存率が非常に低いので、本発明の当該病理に関連する早期診断の概念は十分に意味をもっている(Velasco-Velazquez et al., 2011)。
【０００３】
フランスでは2008年に推計される子宮頸癌の新たな症例は約3,000件であり、女性の癌による死亡原因の第11位である。発症のピーク年齢は40歳である。子宮頸癌では年間、約1,000人が死亡している。死亡率のピークは50歳である。子宮頸癌の多くは癌腫である。ほとんどの場合、子宮頸癌は進行の遅い感染源の疾患である(HPVパピローマウイルス)。2011年にフランスで推計される新たな症例は約54,000件であり、前立腺癌は男性と一般の集団の両方において最も一般的な癌である。この発症は50歳前では非常に稀でも、年齢とともに増加する。平均の診断時年齢は約70歳である。
卵巣癌は2008年に推計される新たな症例では4,430件であり、女性の癌による死亡原因の第7位である。診断時における年齢の中央値は65歳である。卵巣癌における最も重要なリスク因子は遺伝である。
【０００４】
子宮内膜癌は女性に発症し、2010年に推計される新たな症例は6,560件の第5位であり、フランスで最も多い婦人科癌である。通常、この癌は閉経後に発症する。平均の診断時年齢は68歳である。子宮内膜癌の主なリスク因子は肥満、糖尿病、タモキシフェンによる治療である。甲状腺癌は希であり、フランスで診断される全ての癌の2％、又は年間の新たな症例として8,000件を少し超える数である。しかし着実に増加している疾患であり、甲状腺癌の疾患頻度は1980年から2012年中において3〜5％増加している。しかし疾患は良好な予後を示しており、2012年の死亡数は375人で、過去30年間は着実に減少している。
【０００５】
副腎の癌は年間で100万人のうち1〜2件の発症である。ほとんどの場合、40〜50歳の成人であるが15歳未満の子供にも発症する。この腫瘍は男性よりも女性に多くみられるが、その理由は定かではない。
別のホルモン依存性癌標的器官と同じように乳癌は当該集団内で死亡率が高く、特に診断の遅れを含む他の因子が挙げられ、転移性であり、更に再発症率の高く、進行の伴った癌である。確かに、この比率は癌が検出されるステージに直接的に依存している。しかし一定のパラメータは当面は考慮されないので検出ステージが早期でも、再発率は高い状態である。
【０００６】
確かに、再発での現象は腫瘍進行と、現時点で検討されていない癌幹細胞又は腫瘍開始細胞又は前癌細胞の存在に基づく耐性機構により一部が説明できる。放射線治療及び化学療法治療から腫瘍の治療的回避(escape)は腫瘍内の、これらの細胞の存在に依存する。よって、腫瘍組織内での、かかる細胞の検出は腫瘍の攻撃性レベルを定義する1つの方法である。従って癌幹細胞の特異的バイオマーカーの特徴決定は癌治療で診断的にも、予後的にも重要である。しかし現時点では確実に別の幹細胞から区別が可能な、癌幹細胞(CSC)の特異的マーカーは存在しない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
CSCの単離及び特徴決定が困難な主たる原因は、その集団サイズが小さい(腫瘍集団の３〜４％)こと及び特異的マーカーが存在しないことにある。したがって、早期診断並びに癌幹細胞を検出及び/又は単離する新たな方法の開発に対する重要な必要性が存在する(Bomken et al., 2010)。
癌幹細胞の存在の早期同定は医師に当該疾患の予測因子を提供する。
加えて、このことは癌の危険性診断に新たな展望を提供する。
事実、臨床医による追加的情報の取得により、治療の調節で再発リスク及び疾患の悪化を限定できる。
よって、新しいマーカーの確立は上記の病理の標的治療において最も重要と思われる(Tao et al., 2008)。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞のみを認識し、したがって従来の方法より効率的である特異的な検出方法に関する。加えて、本発明の方法は、非再現性により一般化できず且つ癌幹細胞と非癌幹細胞とを混同する従来方法に比べ、より迅速に行われる。ホルモン依存性癌は性ホルモンに感受性である癌である。ホルモン依存性腫瘍は、その機能が通常ホルモンにより調節される組織に主に形成する。腫瘍の増殖は、ホルモン、例えば前立腺癌の場合には男性ホルモンであるテストステロン、乳癌の場合には卵巣が分泌する女性ホルモンホルモンであるエストロゲンなどにより刺激される。
【０００９】
表現「ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞」とは、発癌性の進展がホルモン依存性癌標的器官に存在するホルモンによる影響を受ける当該器官に由来する癌幹細胞だけでなく、発癌性の進展がホルモンによる影響を受けなる場合のホルモン依存性癌標的器官由来の癌幹細胞も意味する。
言い換えれば、これは、ホルモン依存性癌の標的器官に由来する癌幹細胞だけでなく、罹患している癌が非ホルモン依存性である(非ホルモン依存性癌)である場合のホルモン依存性癌標的器官由来癌幹細胞にも対応する。ホルモン依存性癌の標的器官はホルモンの影響下の器官である。
【００１０】
ARC癌研究会(ARC Foundation for Cancer Research)及び米国国立癌研究所(NCI)は乳房、子宮、前立腺、卵巣、子宮内膜、甲状腺、副腎におけるホルモン依存性癌を例示している。乳癌(breast cancer)が乳房癌(mammary cancer)とも言われることに留意する。
よって、ホルモン依存性癌の標的器官は、具体的には、乳房、子宮、前立腺、卵巣、子宮内膜、甲状腺及び副腎である。
多くの場合、これら器官に罹患する癌はホルモン依存性、すなわち、ホルモンが癌細胞の増殖において或る役割を演じている癌である。しかし、幾つかの場合、これら器官に罹患する癌は、非ホルモン依存性、すなわち、ホルモンが癌細胞に影響しない癌である。
【００１１】
よって、本発明により単離及び検出されたホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞は、器官がホルモン依存性癌に罹患している場合のみならず非ホルモン依存性癌に罹患しているという特別な場合にも、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞に対応する。
特定の実施形態において、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞は、器官がホルモン依存性癌又は非ホルモン依存性癌に罹患しているか否かにかかわらず、乳房、子宮、前立腺、卵巣、子宮内膜、甲状腺又は副腎の癌幹細胞に対応する。
【００１２】
本出願において、表現「ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞」は表現「ホルモン依存性癌の癌幹細胞」と等しく、これら表現は互換可能に用いられる。
よって、乳癌はホルモン依存性癌の代表例である。しかし、乳癌は非ホルモン依存性癌の１つの型でもある。例えば、限定されないが、３重陰性乳癌は非ホルモン依存性癌の１つの型である。
【００１３】
第１の態様において、本発明は、ホルモン依存性癌の癌幹細胞の検出及び/又は単離のための、レクチンの標識手段としての使用に関する。
第２の態様において、本発明は、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を少なくとも１種のレクチンで標識することを含んでなる、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離及び検出する方法に関する。
第３の態様において、本発明は、ホルモン依存性癌の癌幹細胞の単離及び/又は検出ステップを含んでなる、ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性癌の攻撃性及び/又は再発リスクの診断方法に関する。
第４の態様において、本発明は、レクチンを含む、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を検出又は単離するためのキットに関する。
【００１４】
本発明の目的において、用語「ホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識する手段」とは、ホルモン依存性癌の癌幹細胞の表面に発現するマーカーに特異的に結合可能な物質を意味すると理解される。
一般的な態様によれば、本発明は、Maackia amurensisレクチンII(MAH-II)、Euonymus europaeusレクチン(EEL)、Psophocarpus tetragonolobusレクチンI(PTL-I)及びGrijfonia SimplicifoliaレクチンII(GSL-II)から選択される少なくとも１種のレクチンの、生体試料においてホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を標識してホルモン依存性癌の標識癌幹細胞を取得するためのインビトロ使用に関する。
【００１５】
これらのレクチンは当業者に周知であり、市販されている(特にVector Laboratories及びEmelca Biosciencesから購入できる)。これらの構造はレビューに記載(Lectin Structure, Rini JM, Annu Rev Biophys Biomol Struct, 1995; 24: 551-77)され、最近の別のレビューでは全履歴((Insight of Lectins-A review, Singh et al., International Journal of Scientific and Engineering Research, volume 3, issue 4, April 2012)が記載され、特に免疫組織化学における使用についても記載されている(Lectin Histochemistry: Historical Perspectives, State of the Art, and the Future, Brooks SA, Methods Mol Biol, 2017, 1560: 93-107)。
【００１６】
MAH-II及びPTC-Iレクチンは、細胞表面に存在するＯ結合グリカンを認識する。より具体的には、MAH-IIレクチンは、ジシアリル‐Ｔ基(NeuAc α2-3Gal α1-3 (NeuAc α2-6) GalNAc)を特異的に認識し、PTL-Iレクチンは、Ｂ及びＡ抗原のGal α1-3 (Fuc α 1-2) Gal及びGalNAc α 1-3 (Fuc α 1-2)基を特異的に認識する。
EELレクチンは、細胞表面に存在するガラクトシル化グリカンを認識する。より具体的には、EELレクチンは、Ｂ抗原のGal α 1-3 (Fuc α 1-2) Gal基及びＨ抗原のFuc α1-2Galβ1-3GlcNAc基を認識する。
GSL-IIレクチンは、Ｎ結合グリカン、具体的にはトリ又はテトラアンテナ非ガラクトシル化Ｎ結合グリカン(すなわち、ガラクトースを有しないＮ結合グリカン)を認識する。
【００１７】
特定の実施形態において、本発明は、生体試料において標識化ホルモン依存性癌幹細胞を取得するための、MAH-IIレクチン及び/又はEELレクチンのインビトロ使用に関する。
本発明の目的において、生体試料は、ホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の患者又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌を有する可能性のある患者から採取した試料である。
本発明の目的において、試料は、ホルモン依存性癌標的器官の固体又は液体の生検、塗抹/スメア、即時生検(extemporaneous biopsy)であり得る。
【００１８】
よって、生体試料は、ホルモン依存性癌に罹患しているか若しくは罹患する可能性がある場合のみならず、非ホルモン依存性癌を有するか若しくは有する可能性がある場合にもホルモン依存性癌の標的器官の試料に対応する。
よって、生体試料は、乳房、子宮、前立腺、卵巣、子宮内膜、甲状腺又は副腎からの試料に対応し得る。
この試料は、癌幹細胞を含む可能性がある。
解剖病理学における通常の分析とは異なるか又は当該分析に加えて、本発明によるレクチンの使用は、最終的には、早期ステージの試料を前腫瘍又は腫瘍であると特徴づけることを可能にする。用語「前腫瘍」とは、腫瘍という特徴づけに至るか又は至らない可能性のある腫瘍上流という意味である。
【００１９】
事実、塗抹又は即時の生検により、病気又は死亡した生体の生検から採取された組織の巨視的及び徴視的病変を解剖病理学的に研究する。従って、この医学分野は癌幹細胞の探索ではなく、細胞の自己複製能力ではない、採取された生物組織及び病的細胞における巨視的及び徴視的異常の形態学的研究に焦点を当てる。
解剖病理学は観察された異常が癌細胞の自己複製的な性質が既に発現されたステージで起こるので、形態学的研究に基づく、試料の初期特徴決定の確立ができない。
逆に、本発明は癌幹細胞の存在に検出に直接的に付いており、解剖病理学に比べてより早期のステージで、つまり癌幹細胞が細胞における形態学的異常に繋がる自己複製的な性質の発現前でも試料を特徴決定できる。
【００２０】
本発明の方法は解剖病理学な分析の終了段階で実施できる。この場合には、試料は解剖病理学研究後に腫瘍性か、腫瘍になりうる可能性か、又は腫瘍が疑われないかに特徴付けられる。本発明の方法は癌幹細胞に特異的に関係があり、この場合には解剖病理学で得られた診断の確認、又は診断を無効にできる。
確かに、解剖病理学にて試料が腫瘍の疑いがない場合には、本発明は解剖病理学以外のパラメータに基づくので、癌幹細胞の存在と、場合により定量化で試料の前腫瘍(pre-tumoral)特性を明らかにすることで診断を無効にできる。
【００２１】
よって、一実施形態によれば、本発明は、Maackia amurensisレクチンII(MAH-II)、Euonymus europaeusレクチン(EEL)、Psophocarpus tetragonolobusレクチンI(PTL-I)及びGrijfonia SimplicifoliaレクチンII(GSL-II)から選択される少なくとも１つのレクチンの、生体試料においてホルモン依存性癌の標的器官の癌幹細胞を標識してホルモン依存性癌標的器官の標識癌幹細胞を取得するためのインビトロ使用に関する。
具体的には、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIから選択される少なくとも２種のレクチンであり、具体的にはHAM-II及びEELの２つのレクチンである。
特定の実施形態によれば、本発明は、MAH-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIから選択される少なくとも２種のレクチンのインビトロ使用に関する。
【００２２】
一実施形態によれば、本発明は、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIから選択される２種のレクチンのインビトロ使用に関する。
よって、一実施形態では、本発明は、次の混合物(MAH-II、EEL)、(MAH-II、PTL-I)、(MAH-II、GSL-II)、(EEL、PTL-I)、(EEL、GSL-II)、(PTL-I、GSL-II)から選択される２種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
特定の実施形態において、本発明は、２種のレクチンHAM-II及びEEL(MAH-II/EELとも表記)の混合物のインビトロ使用に関する。
本出願全体を通して、例えば、(MAH-II/EEL)として示すレクチン混合物は、(MAH-II、EEL)として示すレクチン混合物と等価である。
【００２３】
一実施形態によれば、本発明は、等量である少なくとも２種のレクチンのインビトロ使用に関する。
一実施形態によれば、本発明は、少なくとも２種のレクチンが等量である、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIのレクチンから選択される少なくとも２種のレクチンのインビトロ使用に関する。
【００２４】
一実施形態によれば、本発明は、２種のレクチンが混合物中で等量であるHAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される２種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
等量とは、２種のレクチンの各々が他方と同量で用いられるという意味である。これは、２種のレクチンの重量比１：１である。
よって、一実施形態では、本発明は、２種のレクチンが混合物中で等量である次の混合物(MAH-II、EEL)、(MAH-II、PTL-I)、(MAH-II、GSL-II)、(EEL、PTL-I)、(EEL、GSL-II)、(PTL-I、GSL-II)から選択される２種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。一実施形態によれば、本発明は、レクチンのそれぞれが等量であり、２つのレクチンがMAH-II/EELの混合物である、２種のレクチンのインビトロ使用に関する。
【００２５】
一実施形態によれば、本発明は、少なくとも２種のレクチンが不等量である上記インビトロ使用に関する。
一実施形態によれば、本発明は、少なくとも２種のレクチンが不等量である、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIのレクチンから選択される少なくとも２種のレクチンのインビトロ使用に関する。
一実施形態によれば、本発明は、２種のレクチンが混合物中で不等量である、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIから選択される２種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
【００２６】
不等量とは、レクチンの各々がその他と異なる量で存在するという意味である。具体的には、これは２種のレクチン間の重量比２：１である。
よって、一実施形態では、本発明は、２種のレクチンが混合物中において不等量であり、具体的には重量比２：１である次の混合物(MAH-II、EEL)、(EEL、MAH-II)、(MAH-II、PTL-I)、(PTL-I、MAH-II)、(MAH-II、GSL-II)、(GSL-II、MAH-II)、(EEL、PTL-I)、(PTL-I、EEL)、(GSL-II、EEL)、(EEL、GSL-II)、(PTL-I、GSL-II)、(GSL-II、PTL-I)から選択される少なくとも２種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
特定の実施形態によれば、本発明は、２種のレクチンが重量比２：１の不等量、すなわちEEL １に対してMAH-II ２で存在する混合物(MAH-II及びEEL)である、２種のレクチンのインビトロ使用に関する。
【００２７】
よって、一実施形態によれば、本発明は、２つのレクチンが重量比２：１の不等量である上記のインビトロ使用、具体的には、重量比２：１の２種のレクチンMAH-II/EELの上記インビトロ使用に関する。
よって、一実施形態によれば、本発明は、少なくとも２種のレクチンを等量又は不等量で、具体的には重量比２：１の不等量で用い、好ましくは両レクチンが重量比２：１の不等量のMAH-II/EELである上記のインビトロ使用に関する。
【００２８】
特定の実施形態によれば、本発明は、MAH-II、EEL、PTL-1及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも３種のレクチンのインビトロ使用に関する。
一実施形態によれば、本発明は、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIから選択される３種のレクチンのインビトロ使用に関する。
よって、一実施形態では、本発明は、次の混合物(MAH-II、EEL、PTL-I)、(MAH-II、EEL、GSL-II)、(EEL、PTL-1、GSL-II)、(MAH-II、PTL-I、GSL-II)から選択される３種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
一実施形態によれば、本発明は、少なくとも３種のレクチンが等量である、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIから選択される少なくとも３種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。一実施形態によれば、本発明は、３種のレクチンが混合物中で等量である、HAM-II、EEL、PTL-I、GSL-IIのレクチンから選択される３種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
【００２９】
等量とは、３種のレクチンの各々がその他と同量で用いられるという意味である。同量とは、３種のレクチンの重量比１：１：１である。よって、一実施形態によれば、本発明は、３種のレクチンが混合物中で等量である次の混合物(MAH-II、EEL、PTL-I)、(MAH-II、EEL、GSL-II)、(EEL、PTL-1、GSL-II)、(MAH-II、PTL-I、GSL-II)から選択される３種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
一実施形態によれば、本発明は、少なくとも３種のレクチンが不等量である、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIのレクチンから選択される少なくとも３種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
【００３０】
一実施形態によれば、本発明は、３種のレクチンが混合物中で不等量である、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIのレクチンから選択される少なくとも３種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。３種のレクチンを用いる場合、不等量とは、３種のレクチンが互い等量で用いられず、３種のレクチンのうち少なくとも２つが異なる量で用いられるという意味である。具体的には、これは、３種のレクチン間の重量比２：１：１である。
よって、特定の実施形態によれば、本発明は、３種のレクチンが混合物中で不等量であり、具体的には重量比２：１：１である次の混合物(MAH-II、EEL、PTL-I)、(EEL、MAH-II、PTL-I)、(PTL-I、MAH-II、EEL)、(MAH-II、EEL、GSL-II)、(EEL、MAH-II、GSL-II)、(GSL-II、MAH-II、EEL)、(EEL、GSL-II、PTL-I)、(PTL-I、EEL、GSL-II)、(GSL-II、EEL、PTL-I)から選択される３種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
【００３１】
特定の実施形態によれば、本発明は、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIの４種のレクチンのインビトロ使用に関する。
特定の実施形態によれば、本発明は、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIの４種のレクチンのインビトロ使用に関する。
一実施形態によれば、本発明は、４種のレクチンが等量であるHAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIの４種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
一実施形態によれば、本発明は、４種のレクチンが混合物中で等量であるAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIの４種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
【００３２】
等量とは、４種のレクチンの各々がその他と同量で用いられるという意味である。同量とは４種のレクチンの重量比１：１：１：１である。
一実施形態によれば、本発明は、４種のレクチンが不等量であるHAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIの４種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
一実施形態によれば、本発明は、４種のレクチンが混合物中で不等量である、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIの４種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
【００３３】
４種のレクチンを用いる場合、不等量とは当該４つのレクチンが互いに等量で用いられず、４種のレクチンのうち少なくとも２種が異なる量で用いられるという意味である。具体的には、これは４種のレクチンの重量比２：１：１：１である。よって、特定の実施形態によれば、本発明は、４種のレクチンが混合物中で不等量であり、具体的には重量比が２：１：１：１である次の混合物：(MAH-II、EEL、PTL-I、GSL-II)、(MAH-II、EEL、GSL-II、PTL-I)、(MAH-II、PTL-I、EEL、GSL-II)、(MAH-II、PTL-I、GSL-II、EEL)、(MAH-II、GSL-II、PTL-I、EEL)、(MAH-II、GSL-II、EEL、PTL-I)、(EEL、MAH-II、PTL-I、GSL-II)、(EEL、MAH-II、GSL-II、PTL-I)、(EEL、PTL-I、MAH-II、GSL-II)、(EEL、PTL-I、GSL-II、MAH-II)、(EEL、GSL-II、MAH-II、PTL-I)、(EEL、GSL-II、PTL-I、MAH-II)、(GSL-II、EEL、PTL-I、MAH-II)、(GSL-II、EEL、MAH-II、PTL-I)、(GSL-II、PTL-I、EEL、MAH-II)、(GSL-II、PTL-I、MAH-II、EEL)、(GSL-II、MAH-II、EEL、PTL-I)、(GSL-II、MAH-II、PTL-I、EEL)、(PTL-I、GSL-II、MAH-II、EEL)、(PTL-I、GSL-II、EEL、MAH-II)、(PTL-I、EEL、GSL-II、MAH-II)、(PTL-I、EEL、MAH-II、GSL-II)、(PTL-I、MAH-II、EEL、GSL-II)、(PTL-I、MAH-II、GSL-II、EEL)から選択される４種のレクチンの混合物のインビトロ使用に関する。
幾つかの場合、２種、３種又は４種のレクチンの使用により、癌幹細胞の標識化のより良好な特異性を可能にする。
【００３４】
一実施形態によれば、本発明は、MAH-IIレクチンがＯ結合グリカン、具体的にはジシアリル‐Ｔ基(NeuAc α2-3Gal α1-3 (NeuAc α2-6) GalNAc)を認識し、PTC-IレクチンがＯ結合グリカン、具体的にはＢ及びＡ抗原のGal α1-3 (Fuc α 1-2) Gal及びGalNAc α 1-3 (Fuc α 1-2)基を認識し、EELレクチンがガラクトシル化グリカン、具体的にはＢ抗原のGal α1-3 (Fuc α1-2) Gal基及びＨ抗原のFuc α1-2Galβ1-3GlcNAc基を認識し、GSL-IIがＮ結合グリカン、具体的には非ガラクトシル化トリ又はテトラアンテナＮ結合グリカンを認識する、上記インビトロ使用に関する。
一実施形態によれば、本発明は、癌が乳癌、子宮癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮内膜癌、甲状腺癌又は副腎癌である、上記インビトロ使用に関する。
等量の２種のレクチンMAH-II/EELの混合物は、癌がホルモン依存性又は非ホルモン依存性の乳癌であるとき、ホルモン依存性癌からのCSCの検出及び単離に有利な実施形態である。
【００３５】
本発明に関して用いられるレクチンは接合可能である。
本発明の目的において、用語「接合」とは、レクチンが別の分子に共有結合していることを意味する。
一実施形態によれば、本発明は、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンの、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識するためのインビトロ使用であって、ホルモン依存性癌の癌幹細胞の標識化がフルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ又はビオチンから選択されるマーカーに接合されたレクチンにより行われる使用に関する。
【００３６】
よって、特定の実施形態において、レクチンはフルオロフォアに接合される。特定の実施形態において、フルオロフォアはフローサイトメトリーに使用可能ないずれのフルオロフォアでよい。フルオロフォアは市販されている。フルオロフォアは、例えばAlexa fluor(具体的には、Alexa fluor350、405、430、488、500、514、532、546、555、568、594、610、633、647、660、680、700、750、790)、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、ローダミン、アロフィコシアニン(APC)及びフィコエリトリン(PE)である。有利には、フルオロフォアは、ローダミン、FITC又はAlexa fluor(具体的にはAlexa fluor594又はAlexa fluor633)から選択される。
本発明の意味でのフルオロフォアのこの特徴は、フルオロフォアを用いる本発明の任意の実施形態に適用できる。
【００３７】
別の特定の実施形態において、レクチンは放射性同位体に接合される。発明の目的において、放射性同位体はヨウ素125、トリチウム又はテクネチウムから選択される。
別の特定の実施形態において、レクチンは、酵素に接合される。
本発明の意味において、酵素は着色生成物の生成を触媒する酵素、すなわち発色性基質を利用する酵素、又は発光生成物の生成を触媒する酵素、すなわち化学発光性基質を利用する酵素である。
発明の目的において、「発色性基質」は、酵素による変換後に着色生成物を生じる基質を意味する。本発明の目的において、「化学発光性基質」は、酵素による変換後に化学発光生成物を生じる基質を意味する。
【００３８】
本発明の特定の場合には、着色生成物の生成を触媒する酵素は、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ又はβ-ガラクトシダーゼから選択される。
HRPの特定の場合は、発色性基質は、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)、5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)又は2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)から選択される。
アルカリ性ホスファターゼの特定の場合には、発色性基質は、NBT(ニトロブルーテトラゾリウム)及びBCIP(ブロモクロロインドリルホスフェート)である。
本発明の特定の場合には、発光生成物の生成を触媒する酵素はHRPであり、発光基質はルミノールである。
【００３９】
別の特定の実施形態において、レクチンは金ビーズに接合される。
別の特定の実施形態において、レクチンはビオチンに接合される。よって、一実施形態によれば、本発明は、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞の標識化が
− フルオロフォア、特にローダミン、FITC又はAlexa Fluorから選択されるフルオロフォア、
− 放射性同位体、特にヨウ素125、トリチウム又はテクネチウムから選択される放射性同位体、
− 発色性又は発光性基質を利用する酵素、特に西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ又はβ-ガラクトシダーゼから選択される酵素、
− 金ビーズ、又は
− ビオチン
から選択されるマーカーに接合されたレクチンにより行われる、上記インビトロ使用に関する
【００４０】
発明者らはまた、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択されるレクチンをホルモン依存性癌の癌幹細胞に標識に用いることにより、ホルモン依存性癌の癌幹細胞が検出されることを示した。本発明の目的において、用語「検出」は、生体試料におけるホルモン依存性癌の癌幹細胞の存在をUV/可視光、発光、蛍光、放射性及び酵素学的方法により同定する事実を意味する。
よって、本発明はまた、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識した後に、前記接合されたレクチンの検出により生体試料中の癌幹細胞を検出するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンの使用に関する。
【００４１】
一実施形態では、レクチンはフルオロフォアに共有結合できる。
よって、一実施形態によれば、本発明は、フルオロフォアに接合されたレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞が標識された後に、蛍光顕微鏡観察又は蛍光リーダーによりホルモン依存性癌の癌幹細胞を検出するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンのインビトロ使用に関する。
一実施形態では、レクチンは放射性同位体に接合できる。
よって、一実施形態によれば、本発明は、放射性同位体に接合されたレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞が標識された後に、ガンマカメラによりホルモン依存性癌の標識癌幹細胞を検出するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンのインビトロ使用に関する。
【００４２】
一実施形態では、レクチンは発色性基質又は化学発光性基質を利用する酵素に接合できる。
よって、一実施形態によれば、本発明は、西洋ワサビペルオキシダーゼに接合されたレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞が標識された後に、ルミノールなどの化学発光性基質を添加して発光顕微鏡観察又は発光リーダーによりホルモン依存性癌の標識癌幹細胞の検出のための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンのインビトロ使用に関する。
【００４３】
別の実施形態では、本発明は、西洋ワサビペルオキシダーゼに接合されたレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞が標識された後に、3,3'-ジアミノベンジジン(DAB)、5,5'-テトラメチルベンジジン(TMB)、2,2'-アジノ-ビス(3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸)(ABTS)から選択される発色性基質を添加してUV/可視光顕微鏡観察又は吸光リーダーによりホルモン依存性癌の標識癌幹細胞を検出するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンのインビトロ使用に関する。
一実施形態では、レクチンは金ビーズに接合できる。
よって、一実施形態によれば、本発明は、金ビーズに接合されたレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識した後に、電子顕微鏡観察によりホルモン依存性癌の標識癌幹細胞を検出するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンのインビトロ使用に関する。
【００４４】
一実施形態では、レクチンはビオチンに接合でき、ビオチン化レクチンを得る。
よって、一実施形態によれば、本発明は、ビオチン接合レクチンでホルモン依存性癌の幹細胞を標識した後に、上記載の方法の１つ(ここで、前記マーカー(フルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ)自体はストレプトアビジン又はアビジンと接合される)により、ビオチン接合レクチンで標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を検出するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンのインビトロ使用に関する。
【００４５】
ホルモン依存性癌の癌幹細胞の標識化が、ビオチンに接合されたレクチンを用いて行われ、その後、ビオチンに接合されたレクチンで標識された、ホルモン依存性癌の癌幹細胞の検出が行われる場合、検出は
・ ストレプトアビジン又はアビジンに接合されたフルオロフォアを用いる場合、蛍光顕微鏡観察
・ ストレプトアビジン又はアビジンに接合された化学発光基を利用する酵素を用いる場合、発光リーダー
・ ストレプトアビジン又はアビジンに接合された放射性同位体を用いる場合、ガンマカメラ
・ ストレプトアビジン又はアビジンに接合された金ビーズを用いる場合、電子顕微鏡観察
・ ストレプトアビジン又はアビジンに接合された発色性基質を利用する酵素を用いる場合、UV/可視光顕微鏡観察
によりなされる。
【００４６】
発明者らはまた、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択されるレクチンのホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識するための使用により、ホルモン依存性癌の癌幹細胞が単離できることを示した。
用語「ホルモン依存性癌の癌幹細胞の単離」は、生体試料からのホルモン依存性癌の癌幹細胞の抽出(他の細胞タイプを含まない)を意味する。
よって、本発明はまた、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を標識した後に、生体試料から癌幹細胞を単離するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンの使用であって、レクチンが接合されている使用に関する。
この単離により、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を有する試料を富化できる。用語「富化」は、非癌幹細胞の枯渇によって、試料に含まれる全細胞に対するホルモン依存性癌の癌幹細胞の比率が増加することを意味する。
これはホルモン依存性癌の癌幹細胞が富化された試料と呼ばれる。
【００４７】
よって、本発明に関して、表現「ホルモン依存性癌の癌幹細胞の単離」は、「ホルモン依存性癌の癌幹細胞を有する試料の富化」を意味する。
よって、本発明の意味において、用語「単離」また、生体試料からホルモン依存性癌の癌幹細胞が富化された細胞の集団を取得する事実を意味する。本発明の目的において、用語「富化された」は、癌幹細胞数/全細胞数の比が、フローサイトメトリーによるEpcam high+細胞/Epcam high-細胞の比により決定される場合の少なくとも４である細胞集団をいう。
癌幹細胞を有する試料の富化は、所望の細胞集団が試料中により高い比率で存在するので、癌幹細胞の検出及び定量を確実に、かつ簡単にする。
【００４８】
よって、発明者ら、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択されるレクチンを用いることにより、生体試料を、特に効率的に癌幹細胞で富化できることを示した。
特定の実施形態において、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンで標識された癌幹細胞の単離の後に、細胞増幅ステップを行うことができる。よって、細胞の単離後、細胞は、ホルモン依存性癌の癌幹細胞の量を増加する培地で培養できる。
一実施形態では、本発明は、接合されたレクチンでホルモン依存性癌を標識した後に、標識化ホルモン依存性癌幹細胞を単離するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンのインビトロ使用に関する。
【００４９】
特定の実施形態において、レクチンはビオチンに接合され、ホルモン依存性癌の標識癌幹細胞の単離は、ストレプトアビジン又はアビジンで官能化された支持体により行われる。
この実施形態において、ビオチンに接合されたレクチンにより標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞は、ビオチン‐ストレプトアビジン又はビオチン-アビジン親和性により、ストレプトアビジン又はアビジンで官能化された支持体に固定される。
支持体はまた、ガラス、ポリジメチルシロキサン(PDMS)、シリコーン、又はポリメタクリル酸メチル(PMMA)、ポリスチレン(PS)若しくは環状オレフィン共重合体(COC)などのプラスチックであり得る。
【００５０】
好適な支持体の施例は、Kimらのレビューに掲載されている(Protein immobilization techniques for microfluidics assays, Kim et al., Biomicrofluidics, 7, 041501, 2013)。用語「官能化」は、支持体が、固定されたストレプトアビジン又はアビジンで被膜されるように化学的に改変されていることを意味する。
上に記載したKimらのレビューは支持体の官能化の例を挙げている。
更に特定の実施形態において、支持体は磁気ビーズからなる。よって、本発明の特定の実施形態によれば、支持体は磁気ビーズからなり、ホルモン依存性癌の標識癌幹細胞の単離は磁場の存在で磁気選別により行われる。
【００５１】
この実施形態において、ビオチンに接合されたレクチンで標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞は、ビオチン-ストレプトアビジン又はビオチン-アビジン親和性により、ストレプトアビジン又はアビジンで官能化された磁気ビーズに付着する。
磁場の影響下において、磁気ビーズに付着しホルモン依存性癌の癌幹細胞は、試料内で単離される。この単離の後、上清の除去に続いて支持体に結合した癌幹細胞の溶出により、癌幹細胞が富化された試料を回収することができる。
溶出は、ストレプトアビジン-ビオチン又はアビジン-ビオチン結合を切断する酸性条件下で行うことができる。
【００５２】
支持体が磁気ビーズからなり、ストレプトアビジン又はアビジンがDNA結合により磁気ビーズに結合しているという特定の場合に、溶出はDNAseを用いた処理で行われる。
別の実施形態によれば、標識に用いられるレクチンは、フルオロフォアに接合されたレクチンであり、単離がフローサイトメトリーによる細胞選別により行われる。
フローサイトメトリーによる細胞選別により、ホルモン依存性癌の癌幹細胞が富化された試料の画分が得られる。
フローサイトメトリーは、細胞を蛍光標識により異なる画分に選別可能である当業者に周知の技術である。
よって、本発明に関して、フローサイトメトリーによる細胞選別により、下記のものが取得できる：
− 一方で、フルオロフォアに接合されたレクチンにより標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を含む試料画分、及び
− 他方で、出発試料に含まれる他の細胞タイプを含有する試料画分。
【００５３】
本発明はまた、少なくとも１つの接合レクチンを用いるホルモン依存性癌の癌幹細胞の標識、単離及び検出ができる。
別の実施形態では、本発明は、接合されたレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識した後に、ホルモン依存性癌の標識癌幹細胞を単離し、続いて、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ又はビオチンから選択されるマーカーでホルモン依存性癌の単離された癌幹細胞を新たに標識することによってホルモン依存性癌の癌幹細胞を検出するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンのインビトロ使用に関する。
【００５４】
よって、別の実施形態では、本発明は、ビオチン又はフルオロフォアに接合されたレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識した後に、
−  本明細書に記載されたような、ビオチンに接合されたレクチンの場合、ストレプトアビジン又はアビジンで官能化された支持体により、又は
本明細書に記載されたような、フルオロフォアに接合されたレクチンの場合、サイトメトリーにより
ホルモン依存性癌の標識癌幹細胞を単離して、ホルモン依存性癌の標識され単離された癌幹細胞を取得し、
− 次いで、ホルモン依存性癌の標識され単離された癌幹細胞を、本明細書に記載されたような接合レクチンで新たに標識し、続いて、本明細書に記載された検出方法により細胞を検出するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンのインビトロ使用に関する。
【００５５】
よって、一実施形態によれば、本発明は、接合レクチンでホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を標識した後に、接合レクチンの検出によりホルモン依存性癌の標識癌幹細胞を検出する、上記インビトロ使用に関する。
よって、一実施形態によれば、本発明は、マーカーに接合されたレクチンでホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を標識した後に、ホルモン依存性癌の標識癌幹細胞を単離する、上記インビトロ使用であって、マーカーがビオチンであり、単離が磁場の存在下で磁気ビーズからなる、ストレプトアビジン又はアビジンで官能化された支持体により行われるか、又はマーカーがフルオロフォアであり、単離がフローサイトメトリーにより行われる、使用に関する。
【００５６】
本発明によれば、癌幹細胞が単離又は検出される生体試料は、ホルモン依存性若しくはは非ホルモン依存性癌の患者から採取されたホルモン依存性癌標的器官(例えば、乳房、子宮、前立腺、卵巣、子宮内膜、甲状腺及び副腎)の生体試料又は当該癌を有すると疑われる患者から採取された生検である。
よって、一実施形態によれば、本発明は、生体試料がホルモン依存性癌標的器官の試料である上記インビトロ使用に関する。
生体試料は、固体又は液体生検、塗抹又は即時生検に対応する。
【００５７】
ホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の生体試料はまた、ホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の癌細胞株、又は癌細胞株の注入により動物(例えばマウス又はラット)に誘発された腫瘍である。細胞株は、ホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の癌細胞株であることが好ましい。この実施形態によれば、誘発された腫瘍は、ホルモン依存性癌の癌幹細胞、有利には、研究のために腫瘍のその他の細胞から単離された癌幹細胞を含む。
一実施形態によれば、本発明は、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識して生体試料において標識ホルモン依存性癌幹細胞を取得するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンのインビトロ使用であって、生体試料が懸濁状態の細胞からなる使用に関する。
別の実施形態によれば、本発明はホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識して生体試料において標識ホルモン依存性癌幹細胞を取得するための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGS-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンのインビトロ使用であって、生体試料が細胞組織からなる、使用に関する。
【００５８】
本発明は、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識して、生体試料においてホルモン依存性癌標的器官の標識癌幹細胞を取得するステップを含んでなる、ホルモン依存性癌の癌幹細胞をインビトロで標識する方法に関する。
この標識法は、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、ビオチン又は金ビーズから選択されるマーカーに接合されたレクチンを用いるホルモン依存性癌の癌幹細胞を検出する方法に組み込むことができる。
【００５９】
本発明はまた、生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞を検出するインビトロ方法であって、
(a) HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ又はビオチンから選択されるマーカーに接合されたレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識して、ホルモン依存性癌の癌幹細胞が少なくとも１種のレクチンで標識された生体試料を取得するステップ、
続いて
(b) 少なくとも１種のレクチンで標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を検出するステップ
を含んでなる方法に関する。
【００６０】
レクチンがフルオロフォアに接合される方法の一実施形態では、標識ホルモン依存性癌幹細胞は、蛍光顕微鏡観察又は蛍光リーダーにより検出される。レクチンが放射性同位体に接合される方法の一実施形態では、ホルモン依存性癌の標識癌幹細胞はガンマカメラにより検出される。
レクチンが着色生成物の生成を触媒する酵素(例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、アルカリ性ホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ又はβ-ガラクトシダーゼ)に接合される方法の一実施形態では、ホルモン依存性癌の標識癌幹細胞は、発色性基質を添加してUV/可視光顕微鏡観察又は吸光リーダーにより検出される。
レクチンが発光生成物の生成を触媒する酵素(例えばHRP)に接合される方法の一実施形態では、ホルモン依存性癌の標識癌幹細胞は、化学発光性基質(ルミノール)を添加して発光顕微鏡観察又は発光リーダーにより検出される。
【００６１】
レクチンが金ビーズに接合される方法の一実施形態では、ホルモン依存性癌の標識癌幹細胞は、電子顕微鏡観察により検出される。
レクチンがビオチンに接合された一実施形態では、ホルモン依存性癌の癌幹細胞は、上記の検出方法の１つ(ここで、マーカーはストレプトアビジン又はアビジンに接合される)により検出される。この標識法は、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、ビオチン又は金ビーズから選択されるマーカーに接合されたレクチンを用いるホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離する方法に組み込むことができる。
【００６２】
一実施形態では、本発明の方法は、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離する。特に、この単離ステップにより、ホルモン依存性癌試料中に検出されたホルモン依存性癌の癌幹細胞の研究、例えばしばしば再発及び転移の原因となる癌幹細胞を除去可能な新たな治療の発見のための研究が可能となる。
用語「インビトロ単離法」は、ホルモン依存性癌からの非癌幹細胞(CNC)の枯渇により、生体試料が、ホルモン依存性癌の癌幹細胞(CSC)で富化されることを意味する。
ホルモン依存性癌の癌幹細胞は、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンを用いて、試料中に存在するその他の細胞タイプ(例えば、ホルモン依存性癌の非癌幹細胞(CNC))から特異的に分離される。
試料をCSCで富化することにより、ホルモン依存性癌の癌幹細胞が主である生体試料、すなわちホルモン依存性癌の癌幹細胞がその他の細胞タイプ(特にCNC)と比較して多くの量で存在する生体試料の取得を可能にする。
【００６３】
よって、本発明はまた、
(a) HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンであって、ビオチン又はフルオロフォアに接合されたレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識して、ホルモン依存性癌の癌幹細胞が少なくとも１種のレクチンで標識された生体試料を取得するステップ、
続いて
(b) 少なくとも１種のレクチンで標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離するステップ
を含んでなる、生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離するインビトロ方法に関する。
特定の実施形態において、本発明は、
(a) HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、ビオチンに接合されたレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識して、ホルモン依存性癌の癌幹細胞が少なくとも１種のレクチンで標識された生体試料を取得するステップ、
続いて
(b) ストレプトアビジン又はアビジンで官能化された支持体により、少なくとも１種のレクチンで標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離するステップ
を含んでなる、生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離するインビトロ方法に関する。
【００６４】
この単離の後、上清の除去に続いて支持体に結合した癌幹細胞の溶出により、癌幹細胞が富化された試料を回収することができる。
この溶出は、ストレプトアビジン-ビオチン/アビジン-ビオチン結合を切断する酸性条件下で行うことができる
一実施形態によれば、支持体は、ストレプトアビジン又はアビジンで官能化された磁気ビーズからなり、単離ステップは磁場の存在で磁気選別により行われる。
支持体が磁気ビーズからなり、ストレプトアビジン又はアビジンがDNA結合により磁気ビーズに結合しているという特定の場合に、溶出はDNAseを用いた処理で行われる。
【００６５】
特定の実施形態において、本発明は、
(a) HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンであって、フルオロフォアに接合されたレクチンでホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識して、ホルモン依存性癌の癌幹細胞が少なくとも１つのレクチンで標識された生体試料を取得するステップ、
続いて
(b) フローサイトメトリーによる細胞選別により、少なくとも１つのレクチンで標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離するステップ
を含んでなる、生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離するインビトロ方法に関する。よって、フローサイトメトリーによる細胞選別は、癌幹細胞が富化された試料画分を取得できる。
【００６６】
ステップ(a)においてホルモン依存性癌の癌幹細胞を標識する前に、試料中の細胞は、有利には、互いに解離されている。細胞の解離は、従来の手順に従って、例えば、細胞表面に発現されたグリカン、特にフコース α 1-2 ガラクトース基を変化させることなく、細胞を互いに分離することができる１種又は２種以上の酵素を用いることにより行うことができる。例えば、細胞の解離は、Roche Diagnostic社が販売しているLiberase(登録商標)混合物を用いて行うことができる。
よって、本発明はまた、標識ステップの前に、試料中の細胞を互いに解離させる予備ステップを含む、本発明の方法に関する。
【００６７】
よって、本発明はまた、
(a) HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンであって、ビオチン又はフルオロフォアに接合されたレクチンでホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を標識して、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞が少なくとも１つのレクチンで標識された生体試料を取得するステップ、
続いて
(b) 少なくとも１つのレクチンで標識されたホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を単離するステップであって、レクチンがビオチンに接合されている場合、単離ステップは磁場の存在下、磁気ビーズからなる、ストレプトアビジン又はアビジンで官能化された支持体を用いて行われ、レクチンがフルオロフォアに接合されている場合、単離ステップはフローサイトメトリーでの細胞選別により行われる、ステップ
を含んでなる、生体試料中のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を単離するインビトロ方法に関する。
【００６８】
特に癌幹細胞に作用可能な新たな物質を明らかにするために、癌幹細胞に関する調査及び診断目的の研究は欠かすことができない。また、癌幹細胞の研究は個別化医薬に特に有益である。
ホルモン依存性癌の癌幹細胞は、化学療法治療への耐性に起因して腫瘍再形成及び腫瘍再発を導く特定の細胞集団である。よって、本発明は、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を検出又は単離することで、ホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク評価を可能にする。
ホルモン依存性癌の癌幹細胞の検出と、場合により、その後に定量により、腫瘍進行のリスク評価が可能である。
よって、本発明はまた、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又は攻撃性のインビトロ診断のための、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンの使用に関する。
【００６９】
よって、実施形態によれば、本発明は、
(a) 生体試料のホルモン依存性癌の癌幹細胞を、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ又はビオチンから選択されるマーカーに接合されたレクチンで標識して、生体試料中に少なくとも１種のレクチンで標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を取得するステップ、
(b) 
− レクチンがフルオロフォアに接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合されたフルオロフォアにより検出される場合、蛍光顕微鏡観察又は蛍光リーダー、
− レクチンが化学発光性基質を利用する酵素に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された化学発光性基質を利用する酵素により検出される場合、発光顕微鏡観察又は発光リーダー
− レクチンが放射性同位体に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された放射性同位体により検出される場合、ガンマカメラ
− レクチンが発色性基質を利用する酵素に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された発色性基質を利用する酵素により検出される場合、UV/可視光顕微鏡観察又は吸光リーダー、或いは
− レクチンが金ビーズに接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された金ビーズにより検出される場合、電子顕微鏡観察
を用いてホルモン依存性癌の標識癌幹細胞を検出するステップ、
(c) 任意に、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を定量するステップ、
(d) 生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の検出強度を、生体試料に隣接する健常試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の検出強度と比較し、任意に、生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の量を、生体試料に隣接する健常試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の量と比較するステップ、
(e) ホルモン依存性癌の癌幹細胞の存在及び場合により量に基いて、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性を推論するステップ
を含んでなる、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性のインビトロ診断方法に関する。
【００７０】
別の特定の実施形態によれば、本発明は、
(a) 生体試料のホルモン依存性癌の癌幹細胞を、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、フルオロフォア又はビオチンから選択されるマーカーに接合されたレクチンで標識して、生体試料中に少なくとも１種のレクチンで標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を取得するステップ、
(b) 少なくとも１種のレクチンで標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離するステップであって、ビオチンに接合されたレクチンで標識された場合、単離はストレプトアビジン又はアビジンで官能化された支持体を用いて行われ、具体的には、官能化された支持体はストレプトアビジン又はアビジンで官能化された磁気ビーズからなり、単離は磁場の存在下で磁気細胞選別により行われ、フルオロフォアに接合されたレクチンで標識された場合、単離はフローサイトメトリーによる細胞選別により行われる、ステップ、
(c) 単離されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ又はビオチンから選択されるマーカーに接合されたレクチンで新たに標識して、単離され新たな標識により標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を取得するステップ、
(d) 単離され新たな標識により標識されたホルモン依存性癌の癌幹細胞を、
− レクチンがフルオロフォアに接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合されたフルオロフォアにより検出される場合、蛍光顕微鏡観察又は蛍光リーダー、
− レクチンが化学発光性基質を利用する酵素に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された化学発光性基質を利用する酵素により検出される場合、発光顕微鏡観察又は発光リーダー、
− レクチンが放射性同位体に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された放射性同位体により検出される場合、ガンマカメラ
− レクチンが発色性基質を利用する酵素に接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された発色性基質を利用する酵素により検出される場合、UV/可視光顕微鏡観察又は吸光リーダー、
− レクチンが金ビーズに接合されている場合又はレクチンがビオチンに接合され、ストレプトアビジン若しくはアビジンに接合された金ビーズにより検出される場合、電子顕微鏡観察
により検出するステップ、
(e) 任意に、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を定量するステップ、
(f) 生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の検出強度を、生体試料に隣接する健常試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の検出強度と比較し、任意に、生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の量を、生体試料に隣接する健常試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の量と比較するステップ、
(g) ホルモン依存性癌の癌幹細胞の存在及び場合により量に基いて、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性を推論するステップ
を含んでなる、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性のインビトロ診断方法に関する。ホルモン依存性癌の癌幹細胞の検出強度及び場合によりその量は、生体試料に隣接する健常試料に対して比較される。
【００７１】
生体試料に隣接する健常試料は対照として用いられる。
用語「生体試料に隣接する健常試料」は、生体試料と同じ個体から採取されたが、生体試料が採取された組織に近い組織であって、解剖病理学分析において癌細胞を表さず、本発明の方法により癌幹細胞を表さない組織から採取された試料を意味する。
よって、健常試料とは、病理学的分析により腫瘍細胞の不存在が特徴づけられ、本発明の方法により癌幹細胞の不存在が特徴づけられた試料である。
【００７２】
生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の定量により、ホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性を測定できる。この定量は、フローサイトメトリー、ウエスタンブロット、遺伝子マーカー(例えば、Oct-4、c-Myc1、Gli-1又はEpCam)を用いる定量的PCR又はクローン形成能試験などの種々の方法で行うことができる。
これらの方法の幾つかは、並行して用いてCSCの存在を複数で証明できるので、定量の信頼性が増加する。
特定の実施形態において、ホルモン依存性癌の癌幹細胞の定量はクローン形成能試験により行われる。
【００７３】
クローン形成能試験は、生体試料を培養して、腫瘍球を再形成する細胞の能力を観察することを含む。自己再生及び自己複製の性質は、癌幹細胞に特異的である；よって、単一の癌幹細胞は、形成された腫瘍球の原因である。よって、形成された腫瘍球を計数することで試料中の癌幹細胞の定量が可能である。
これら方法、有利には遺伝子マーカー(例えば、Oct-4、cMyc、Gli-1又はEpCam)を用いる定量的PCR及びクローン形成能試験はまた、癌幹細胞の単離ステップ後に、これら細胞の有無を決定するための癌幹細胞の検出ができる。よって、これらの方法は、単離されたホルモン依存性癌の癌幹細胞の新たな標識及び検出にそれぞれ対応する上記のステップ(c)及び(d)の代替方法として提示される。
【００７４】
この検出は、試料を癌幹細胞で富化することにより容易になり、より信頼性が上がる。
これら方法での検出により、本発明の方法によるホルモン依存性癌の癌幹細胞を有する試料の富化の効率、すなわち、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離する効率の検証も可能になる。
【００７５】
本発明の診断方法では、生体試料中の検出の強度が生体試料に隣接する健常試料と比べて高いほど、ホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスクが高く、癌はより攻撃性である。
同様に、生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の量が生体試料に隣接する健常試料と比べて高いほど、ホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスクが高く、癌はより攻撃性である。
生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の検出及び定量により、ホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性及び進展能力の測定ができる。
【００７６】
生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の検出及び定量はまた、個別化医薬アプローチの一部である。よって、事実、生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞の検出により、治療の予後値の評価が可能となり、したがって治療を適応させることができる。
MAH-II、PTL-I、GSL-II及びEELレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンの使用を含む、上記した全ての検出及び単離方法並びに全ての診断法はまた、MAH-II、PTL-I、GSL-II及びEELレクチンから選択される少なくとも２種のレクチン若しくは少なくとも３種のレクチンの使用又はMAH-II、PTL-I、GSL-II及びEELの４種のレクチンの使用により行うことができる。よって、本明細書に記載されたレクチンの種々の混合物並びにこれら混合物中のレクチンの種々の比率は、本明細書に記載された全ての検出及び単離方法並びに全ての診断方法の実行に適用可能である。
【００７７】
本発明はまた、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、金ビーズ又はビオチンから選択されるマーカーに接合されたレクチンを含む、生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞のインビトロ検出用キットに関する。
本発明はまた、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、ビオチンに接合されたレクチンと、ストレプトアビジンで官能化された磁気ビーズとを含み、生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞のインビトロ単離用キットに関する。
本発明はまた、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、フルオロフォアに接合されたレクチンを含む、生体試料中のホルモン依存性癌の癌幹細胞のインビトロ単離用キットに関する。
【００７８】
本発明はまた、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性のインビトロ診断キットであって、
− HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、ビオチンに接合されたレクチンと、ストレプトアビジンで官能化された磁気ビーズと、
− 任意に、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、フルオロフォア、放射性同位体、酵素又は金ビーズに接合されたレクチン
を含んでなるキットに関する。本発明はまた、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性のインビトロ診断キットであって、
− HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、フルオロフォアに接合されたレクチンと、
− 任意に、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、ビオチン、放射性同位体、酵素、又は金ビーズに接合されたレクチン
を含んでなるキットに関する
【００７９】
本発明はまた、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、ビオチンに接合されたレクチンと、ストレプトアビジンで官能化された磁気ビーズとを含み、任意に、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、フルオロフォア、放射性同位体、酵素、又は金ビーズに接合されたレクチンを含んでなり、或いは
HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１種のレクチンであって、フルオロフォアに接合されたレクチンと、任意に、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも１つのレクチンであって、ビオチン、放射性同位体、酵素又は金ビーズに接合されたレクチンとを含んでなる、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性のインビトロ診断キットに関する。
【００８０】
上記の本発明のキットは、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも２種の接合レクチンを等量で含むことができる。
上記の本発明のキットは、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも２種の接合レクチンを不等量で含むことができる。
よって、一実施形態では、本発明のキットは、(MAH-II、EEL)、(EEL、MAH-II)、(MAH-II、PTL-I)、(PTL-I、MAH-II)、(MAH-II、GSL-II)、(GSL-II、MAH-II)、(EEL、PTL-I)、(PTL-I、EEL)、(GSL-II、EEL)、(EEL、GSL-II)、(PTL-I、GSL-II)、(GSL-II、PTL-I)から選択される２種の接合レクチンを不等量で、具体的には重量比２：１で含むことができる。
【００８１】
上記の本発明のキットは、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも３種の接合レクチンを等量で含むことができる。
上記の本発明のキットは、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される少なくとも３種の接合レクチンを不等量で含むことができる。
よって、特定の実施形態によれば、本発明のキットは、(MAH-II、EEL、PTL-I)、(EEL、MAH-II、PTL-I)、(PTL-I、MAH-II、EEL)、(MAH-II、EEL、GSL-II)、(EEL、MAH-II、GSL-II)、(GSL-II、MAH-II、EEL)、(EEL、GSL-II、PTL-I)、(PTL-I、EEL、GSL-II)、(GSL-II、EEL、PTL-I)の混合物から選択される３種の接合レクチンを不等量で、具体的には重量比２：１：１で含むことができる。
【００８２】
上記の本発明のキットは、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される４種の接合レクチンを等量で含むことができる。
上記の本発明のキットは、HAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択される４種の接合レクチンを不等量で含むことができる。
よって、特定の実施形態によれば、本発明のキットは、(MAH-II、EEL、PTL-I、GSL-II)、(MAH-II、EEL、GSL-II、PTL-I)、(MAH-II、PTL-I、EEL、GSL-II)、(MAH-II、PTL-I、GSL-II、EEL)、(MAH-II、GSL-II、PTL-I、EEL)、(MAH-II、GSL-II、EEL、PTL-I)、(EEL、MAH-II、PTL-I、GSL-II)、(EEL、MAH-II、GSL-II、PTL-I)、(EEL、PTL-I、MAH-II、GSL-II)、(EEL、PTL-I、GSL-II、MAH-II)、(EEL、GSL-II、MAH-II、PTL-I)、(EEL、GSL-II、PTL-I、MAH-II)、(GSL-II、EEL、PTL-I、MAH-II)、(GSL-II、EEL、MAH-II、PTL-I)、(GSL-II、PTL-I、EEL、MAH-II)、(GSL-II、PTL-I、MAH-II、EEL)、(GSL-II、MAH-II、EEL、PTL-I)、(GSL-II、MAH-II、PTL-I、EEL)、(PTL-I、GSL-II、MAH-II、EEL)、(PTL-I、GSL-II、EEL、MAH-II)、(PTL-I、EEL、GSL-II、MAH-II)、(PTL-I、EEL、MAH-II、GSL-II)、(PTL-I、MAH-II、EEL、GSL-II)、(PTL-I、MAH-II、GSL-II、EEL)から選択される４種の接合レクチンを不等量で、具体的には重量比２：１：１：１で含むことができる。
【００８３】
別の実施形態によれば、本発明はまた、ホルモン依存性又は非ホルモン依存性癌の治療適応性に関する予後値を規定するホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の再発リスク及び/又はホルモン依存性若しくは非ホルモン依存性癌の攻撃性のインビトロ診断キットであって、
レクチンがビオチンに接合された、MAH-IIとEELレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はEELとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELとPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物と、ストレプトアビジンで官能化された磁気ビーズとを含み、レクチンがフルオロフォア、放射性同位体、酵素又は金ビーズ接合された、MAH-IIとEELレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はEELとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELとPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物を任意に含み、或いは
レクチンがフルオロフォアに接合された、MAH-IIとEELレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はEELとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELとPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとPTL-IとGSL-IIクチンの混合物を含み、レクチンがビオチン、放射性同位体、酵素、又は金ビーズに接合された、MAH-IIとEELレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はEELとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとPTL-Iレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はEELとPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物及び/又はMAH-IIとEELとPTL-IとGSL-IIレクチンとの混合物を任意に含むキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００８４】
【図１】図１は、乳房起源の癌細胞株であるMCF-7株からの細胞試料におけるホルモン依存性癌の癌幹細胞の分離の結果を示す。MCF-7株からストレプトアビジンをグラフトした磁気ビーズ及び次のビオチン化レクチン：ビオチン化MAH-II(レクチンMAH-II)、ビオチン化EEL(レクチンEEL)、ビオチン化PTL-I(レクチンPTL-I)、ビオチン化GSL-II(レクチンGSL-II)、ビオチン化レクチンMAH-II/EELの等量(重量比１:１)混合物(混合物１)又はビオチン化レクチンMAH-II/EELの不等量(重量比２:１)混合物(混合物２)を用いて選別した癌幹細胞を、Epcam high+/Epcam high-細胞比を用いて試験した。
【図２】図２は、健常個体(図2A)又は乳癌患者(図２B)の生検から採取された乳房組織試料の切片を示す。図2A：２種のレクチンMAH-II/EELの等量(1：1)混合物による健常組織の処理は、癌幹細胞の標識の非存在を示し、健常組織における乳癌幹細胞の非存在を示す。図2B：２種のレクチンMAH-II/EELの等量(1：1)混合物による腫瘍組織の処理は、このレクチン混合物のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を選択的に標識する能力(この例では、乳癌幹細胞を選択的に標識する能力(色の濃い領域))を示す。
【図３】図３は、健常個体(図3A)又は卵巣癌患者(図3B)の生検から採取された卵巣組織の切片を示す。図3A：２種のレクチンMAH-II/EELの等量(1：1)混合物による健常組織の処理は、癌幹細胞の標識の非存在を示し、健常組織における卵巣癌幹細胞の非存在を示す。図3B：２種のレクチンMAH-II/EELの等量(1：1)混合物による腫瘍組織の処理は、このレクチン混合物のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を選択的に標識する能力(この例では、卵巣癌幹細胞を選択的に標識する能力(色の濃い領域))を示す。
【図４】図４は、健常個体(図4A)又は子宮癌患者(図4B)の生検から採取された子宮組織の切片を示す。図4A：２種のレクチンMAH-II/EELの等量(1：1)混合物による健常組織の処理は、癌幹細胞の標識の非存在を示し、健常組織における子宮癌幹細胞の非存在を示す。図4B：２種のレクチンMAH-II/EELの等量(1：1)混合物による腫瘍組織の処理は、このレクチン混合物のホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞を選択的に標識する能力(この例では、子宮癌幹細胞を選択的に標識する能力(色の濃い領域))を示す。
【実施例】
【００８５】
実施例
実施例１：乳癌からの癌幹細胞の単離プロトコール
I. 必要な材料
試薬及び材料
− ホルモン依存性癌(本実施例において、乳癌である)の癌幹細胞を特異的に標識する個別のビオチン化レクチン又はビオチン化レクチンの混合物(Vector Laboratories及びEmelca Biosciencesの個別のレクチンから調製)
− DNA結合によりストレプトアビジンが連結された磁気ビーズを含むCELLection Biotin Binderキット(Invitrogen)
− 磁石
【００８６】
緩衝液
− リン酸緩衝化生理食塩水(PBS)及びEDTAを含むVersene(Invitrogen)
− 緩衝液１：0.1％BSA(ウシ血清アルブミン)を含むPBS(Ca2+及びMg2+を含まないリン酸緩衝化生理食塩水)、pH7.4
− 緩衝液２：0.1％BSA(ウシ血清アルブミン)を含むPBS(Ca2+及びMg2+を含まないリン酸緩衝化生理食塩水)及び４％クエン酸ナトリウム
− 緩衝液３：１％FCS(ウシ胎仔血清)、１mMのCaCl2及び５mMのMgCl2を含むRPMI、pH7.0〜7.4。
【００８７】
II. 実験時間
− 細胞の調製に20分間
− 細胞の標識に20分間
− 標識細胞をビーズとインキュベートするために20分間
− CSCが富化されていない懸濁液の回収に10分間
− CSC/ビーズ結合の切断に15分間
− 目的のCSCが富化された懸濁液の回収に５分間
− 合計：１時間30分間
【００８８】
III. 磁気選別手順
1. 細胞の調製。MCF-7株の細胞(乳房癌細胞株)を、Verseneを37℃にて10分間用いて支持体から脱離させる。
2. 細胞を計数して試料中の細胞数を1.107に調整する。
3. 細胞懸濁液を300gにて10分間遠心分離して、上清を除去する。
4. 非特異部位のブロッキング。１mLの緩衝液２を添加する。
5. 細胞の標識。計10pgのレクチンを添加する。レクチンが複数である場合は、各々の量を同一とする。
これにより
− レクチンMAH-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIから選択される10pgの個別のビオチン化レクチン、又は
− 混合物１(MAH-II/GSL-II)については各レクチン５pg
− 混合物２についてはMAH-IIレクチン6.66pg及びGSL-IIレクチン3.33pg
を添加する。得られた混合物を４℃で10分間インキュベートする。
【００８９】
6. 500pLの緩衝液２を添加して細胞を洗浄し、懸濁液を300gで10分間遠心分離して上清を除去する。
7. ビーズの添加。細胞を１mLの緩衝液２で再懸濁し、予め洗浄したストレプトアビジンを連結した25μLの磁気ビーズを添加し、緩衝液１を用いて再懸濁する。混合物を緩徐に攪拌しながら４℃で20分間インキュベートする。
8. CSCが富化されていない懸濁液の回収。次いで、試験管を磁石の上に２分間置く。ビオチン化レクチンで標識され、ストレプトアビジンが連結した磁気ビーズに結合した細胞は、磁石方向に析出し(磁気細胞選別)、非標識細胞から分離される。試験管を磁石上に置いたまま、非標識細胞を含む上清を取り出し、Falconチューブに保管する。
9. 次に、標識された癌幹細胞を含む試験管を磁石から取り外す。１mLの緩衝液１を添加する。試験管をボルテックスし、２分間磁石上に再び置き、再度上清を除去し、ステップ８と同じFalconチューブに保管する。このステップを２回繰り返す。
10. 磁気ビーズに結合したままの標識癌幹細胞を、37℃に予め加温した200mLの緩衝液３を用いて再懸濁する。DNaselからなる細胞/ビーズ結合切断緩衝液４μlを添加する。この混合物を緩徐に攪拌しながら室温で15分間インキュベートする。
11. 細胞の脱離を促進するために、懸濁液をピペットで５〜10回激しく攪拌する。
12. CSCが富化された懸濁液の回収。試験管を磁石上に２分間置く。次に、磁気ビーズを標識癌幹細胞から分離し、標識癌幹細胞を含む上清を、37℃に予め加温した200μLの緩衝液３を含む試験管に移す。ステップ11及び12は収量を増加させるために再度繰り返すことができる。
【００９０】
これら実験は、レクチンの各々(MAH-II、EEL、PTL-I、GSL-II)を個々に、２種のレクチンの等量(重量比1:1)混合物(混合物１：MAH-II/EEL)又は２種のレクチンの不等量(重量比2:1)混合物(混合物２：2 MAH-II/EEL)を用い類似条件下で行った。
これら異なる実験の結果を図１に示す。
これら試験の結果が示すように、混合物１(すなわち、MAH-II及びEELの等量混合物)の使用は、ホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞(この場合、乳癌)の単離を可能とした。癌幹細胞は、並行して行ったその他の実験と比較して優勢であった。
これら結果により、乳癌の癌幹細胞が、表面に、主にＯ結合グリカン、特にジシアリル-Ｔ基(NeuAc α2-3Gal α1-3 (NeuAc α2-6) GalNAc)及びガラクトシル化グリカン、具体的にはＨ抗原のFuc α1 -2Galβ 1 -3GlcNAc基を有することが示される。
事実、MAH-II及びEELレクチンは、このタイプの癌幹細胞の単離及び検出において特に効率的である。
【００９１】
実施例２：クローン形成能試験
クローン形成能試験の目的は、(患者において腫瘍塊を再形成する能力に対応する)腫瘍球を再形成する細胞の能力、したがって増殖能を観察することである。
本実施例において、クローン形成能試験は、本明細書に記載された単離方法によりホルモン依存性癌の癌幹細胞を単離した後に、ホルモン依存性癌の癌幹細胞の存在を確認するため及び試料中の該細胞を定量するために用いられる。よって、クローン形成能試験により、本発明の単離方法の有効性を、本発明の方法に供されていない対照試料(未選別細胞)と比較して示すことができる。
【００９２】
クローン形成能試験は、50単位/mlのペニシリン、50単位/mlのストレプトマイシン(Gibco)及び2.4g/Lの重炭酸ナトリウム、１MのHEPES緩衝液(Sigma Aldrich、Saint-Quentin-Fallavier、France)、１×プロゲステロン(Sigma Aldrich)、１×プトレッシン(Sigma)、0.025g/mlのヘパリン(Sigma Aldrich)、30％(m/v)グルコース(Sigma Aldrich)、１×増殖サプリメントB27(Invitrogen, Carlsbad, CA)、20ng/mL EGL(Sigma Aldrich)、20ng/mLヒト塩基性LGL(Sigma Aldrich)、１×インスリン-トランスフェリン-亜セレン酸ナトリウムサプリメント(Roche diagnostics、Meylan, France)を補充したRPMI組成物の培地(Gibco)中で500細胞/cm2の密度にて６ウェルプレートにおいて行った。
コロニーの発生がCO2雰囲気下37℃にて３週間のインキュベーション後に観察され、ImageJ(登録商標)ソフトウエアで定量した。
【００９３】
本明細書に記載の単離方法を用いて単離したホルモン依存性癌標的器官の癌幹細胞は、対照とは異なり、腫瘍球の形成に至る。これは、ビオチン化MAH-II(レクチンMAH-II)、ビオチン化EEL(レクチンEEL)、ビオチン化PTL-I(レクチンPTL-I)、ビオチン化GSL-II(レクチンGSL-II)、ビオチン化レクチンMAH-II/EELの等量(重量比1:1)混合物(混合物１)、ビオチン化レクチン2 MAH-II/EELの不等量(重量比2:1)混合物(混合物２)により積極的に選別された細胞に対して、未選別の細胞(T-)を対照とするクローン形成能試験である。よって、本発明の方法は、腫瘍を再形成可能な幹細胞を取得できる(結果は示さず)。
【００９４】
実施例３：パラフィン処理した組織切片でのレクチンの可視標識(図２：乳房)
用いる器具：パラフィンブロック、氷、ミクロトーム、Superfrost(登録商標)スライド、コンピュータを備えたBond Maxオートメーション(Leica Microsystems)、Leica消耗品(アルコール、洗浄緩衝液、ER1緩衝液、脱ロウ緩衝液、ラベル、カバースリップ、試験管)、PBS緩衝液５％BSA、ビオチン化レクチンMAH-II及びGSL-II(Vector Lab)、EEL及びPTL-1(Emelca Biosciences))、Bond Intense R検出キット(Leica)、Leica封入剤、カバースリップ及び顕微鏡。
(病理解剖学部門が付した)番号で同定される各患者からの乳癌試料を含むパラフィンブロックを氷中に約１時間置いて冷却して、ミクロトームによる厚さ４μmへのスライスを容易にした。
【００９５】
切断組織の最大接着のために用いた、いわゆる「スーパーフロスト」スライドを、ブロックの番号と同じ番号により同定した。一滴の水を、これらスライドの各々の中心に置いた。
切片をミクロトームで作製し、予め配置した水滴上に置いた。次に、スライドを、37℃に加温したホットプレートに置いて接着を促進し、過剰の水を除いた。作製した全てのスライドを37℃のオーブンに置いて乾燥させた。
残りの操作には、制御用ソフトウエアを備えたコンピュータに接続されたLeica製Bond Maxオートメーションを用いた。スライドがオーブンの中にある間に、全ての免疫組織化学的標識操作を準備し、操作の実行に必要な物の自動装置で用いる量のチェックから開始して、その後、PLCを制御するソフトウエアにおいてスライドを同じ番号で同定した。標準化されたプロトコールを可能にする標識を作製した。レクチンの希釈率及び量を計算し、必要なキットを準備した。各実験を行う前に、用いる物の各々をスキャンし、レベルをゼロにリセットしなければならないことに留意する。
【００９６】
次に、ラベルを、オーブンの出口で、対応するスライドに張り付け、取り扱い中に接触特性によりスライド全面にわたって生成物を均一に分布させることができる、切片上に配置されるプラスチック要素であるカバースリップを各スライドに配置した。
スライドラックを装置内に配置し、ラベル上に存在するバーコードにより同定されるエレメント及びスライドの各々をリーダーにより認識した後、操作を開始した。Leica製の脱ロウ剤を用いて加温脱ロウを開始した。これにより、抗体の接近が可能となった。このステップ及びその他の全てのステップの後、予め希釈した10×Bond Washで３回洗浄した。
このステップの後、抗原の露出を可能とする、すなわち抗原を接近可能とするpH６のクエン酸緩衝液に相当するLeica製のER1緩衝液で５分間前処理した。
【００９７】
(飽和力により非特異付着を防止する)５％BSAを有するPBS溶液に希釈したHAM-II、EEL、PTL-I及びGSL-IIレクチンから選択されるビオチン化レクチン又は２種のビオチン化レクチンの混合物を、切片上に20分間置いた。二次抗体の役割を果たすストレプトアビジン-HRPを用いるBond Intense R検出キット(Leica)は、その特性から、ビオチン化レクチンを、(HRP(西洋ワサビペルオキシダーゼ)酵素の基質である)DABの性質に起因して褐色に発色させることができ、ビオチン/ストレプトアビジン-HRP複合体の存在を明らかにする。次に、ヘマトキシリンの存在を利用する青色対比染色を７分間行って、試料全体を同定可能にした。
スライドを装置から取り外した。次に、スライドを手操作でアルコール浴中に５分間２回浸漬することにより切片を再水和させた。この再水和ステップは、トルエン浴でも５分間行った。１滴の封入剤(Leica)を添加して、スライドをマウントした。
最後に、スライドを顕微鏡下で観察した。
【００９８】
２種のレクチンMAH−II/EELの等量(比1：1)混合物による乳房生検からの健常組織の標識は、細胞が標識されないことを示した。よって、この組織には乳癌幹細胞が存在しないと推定できる(図2A)。
腫瘍組織には、幾つかの細胞タイプが共存する；腫瘍非幹細胞、非腫瘍幹細胞、腫瘍幹細胞及び非腫瘍非幹細胞。MAH−II/EELの等量(比1：1)混合物による腫瘍細胞の標識は、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を選択的に標識するこのレクチン混合物の能力(ここでは、乳癌幹細胞を選択的に標識する能力)を示す(図2B)。
【００９９】
実施例４：パラフィン処理した組織切片でのレクチンの可視標識(図３：卵巣)
本実施例の操作プロトコールは、上記実施例３のものと同一である。しかし、本実施例を行うに必要なパラフィンブロックに含まれる試料は、患者由来の卵巣癌から得られる。２種のレクチンMAH−II/EELの等量(比1：1)混合物による卵巣生検からの健常組織の標識は、細胞が標識されないことを示した。よって、この組織には卵巣癌幹細胞が存在しないと推定できる(図3A)。
腫瘍組織には、幾つかの細胞タイプが共存する：腫瘍非幹細胞、非腫瘍幹細胞、腫瘍幹細胞及び非腫瘍非幹細胞。MAH−II/EELの等量(比1：1)混合物による腫瘍細胞の標識は、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を選択的に標識するこのレクチン混合物の能力(ここでは、卵巣幹細胞を選択的に標識する能力)を示す(図3B)。
【０１００】
実施例５：パラフィン処理した組織切片でのレクチンの可視標識(図４：子宮)
本実施例の操作プロトコールは、上記実施例３及び実施例４のものと同一である。しかし、本実施例を行うに必要なパラフィンブロックに含まれる試料は、患者由来の子宮癌から得られる。
２種のレクチンMAH−II/EELの等量(比1：1)混合物による子宮生検からの健常組織の標識は、細胞が標識されないことを示した。よって、この組織には子宮癌幹細胞が存在しないと推定できる(図4A)。
腫瘍組織には、幾つかの細胞タイプが共存する：腫瘍非幹細胞、非腫瘍幹細胞、腫瘍幹細胞及び非腫瘍非幹細胞。MAH−II/EELの等量(比1：1)混合物による腫瘍細胞の標識は、ホルモン依存性癌の癌幹細胞を選択的に標識するこのレクチン混合物の能力(ここでは、子宮幹細胞を選択的に標識する能力)を示す(図4B)。
【図１】
2021516342.tif 000002
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
2021516342.tif 000008
【国際調査報告】
2021516342.tif 000009
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