(57)【要約】  本開示は、不妊の魚、甲殻類、または軟体類の生成方法を提示している。この方法には、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するための、(i)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類と(ii) 繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖、遺伝子選択によるホモ接合型である雌原始の選択、およびホモ接合体雌原始の繁殖が含まれている。この変異は、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を阻害するが、ホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。また本開示は、種親そのものだけでなく、不妊の真水および海水生物の産出における、真水および海水生物の種親の生成方法も提示している。
2021531827.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次のステップを含む、不妊の魚、甲殻類、または軟体類の生成方法:
(i)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類と(ii)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類を繁殖する
遺伝子型選択によりホモ接合型である雌原始を選択する、および
不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するためホモ接合体雌原始を繁殖する；
変異が、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を破壊する、および
PGC発生遺伝子の母性効果を阻害する変異が、ホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。
【請求項２】
この変異が次を含む、請求項１記載の方法:
PGC発生遺伝子のシス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異；
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異；
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異；
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子における変異；または
これらの組み合わせ。
【請求項３】
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子が次である、請求項2記載の方法：Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9。
【請求項４】
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子が、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化する、請求項2記載の方法。
【請求項５】
このマルチチューダードメインコンテイニングタンパク質がTdrd6aである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
このアダプタータンパク質がhook2である、請求項4記載の方法。
【請求項７】
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子がノンコーディング RNAを発現する遺伝子である、請求項2記載の方法。
【請求項８】
ノンコーディング RNAがmiR202-5pである、請求項7記載の方法。
【請求項９】
シス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列がPGC発生遺伝子の母性活性を阻害するが、発生後期においてPGC発生遺伝子の機能は破壊しない、請求項2記載の方法。
【請求項１０】
PGC発生遺伝子がnanos3、dnd1、ElavI2、またはpiwi様遺伝子である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
この変異がPGC発生遺伝子の母性効果を低下させるため、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の翻訳後調節を阻害する、およびPGC発生遺伝子の翻訳後調節を阻害する変異がその遺伝子の体性機能は損なわない、繁殖不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するための、能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項１２】
この変異が次を含む、請求項11記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類：
PGC発生遺伝子のシス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異；
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異；
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異；
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子における変異；またはこれらの組み合わせ。
【請求項１３】
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子が、Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9である、請求項12記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項１４】
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子が、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化する、 請求項12記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項１５】
このマルチチューダードメインコンテイニングタンパク質がTdrd6aである、請求項14記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項１６】
このアダプタータンパク質がhook2である、請求項14記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項１７】
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子が、ノンコーディング RNAを発現する遺伝子である、請求項12記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項１８】
このノンコーディング RNAがmiR202-5pである、請求項17記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項１９】
シス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異がPGC発生遺伝子の母性活性を阻害するが、発生後期においてPGC発生遺伝子の機能は阻害しない、請求項12記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項２０】
このPGC発生遺伝子がnanos3、dnd1、ElavI2、またはpiwi様遺伝子である、請求項19記載の繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類。
【請求項２１】
不妊の魚、甲殻類、または軟体類を生成するため、次のステップを含む、繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を繁殖する方法:
不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出するため、繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を、野生型雄の魚、甲殻類、または軟体類、ヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類、またはホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖する、
この変異が始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を阻害する、および
PGC発生遺伝子の母性効果を阻害する変異が、ホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。
【請求項２２】
この変異が次を含む、請求項21記載の方法:
PGC発生遺伝子のシス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異；
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異；
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異；
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子における変異；または
これらの組み合わせ。
【請求項２３】
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子が次である、請求項22記載の方法：Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9。
【請求項２４】
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子が、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化する、請求項22記載の方法。
【請求項２５】
このマルチチューダードメインコンテイニングタンパク質がTdrd6aである、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
このアダプタータンパク質がhook2である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子が、ノンコーディング RNAを発現する遺伝子である、請求項22記載の方法。
【請求項２８】
このノンコーディング RNAがmiR202-5pである、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
シス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異がPGC発生遺伝子の母性活性を阻害するが、発生後期においてPGC発生遺伝子の機能は阻害しない、請求項22記載の方法。
【請求項３０】
このPGC発生遺伝子がnanos3、dnd1、またはpiwi様遺伝子である、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
A次のステップを含む、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出する繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類の生成方法:
(i)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類と(ii)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類またはホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類を繁殖する、および
遺伝子型選択によりホモ接合型である雌原始を選択する、
変異が、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を阻害する、および
PGC発生遺伝子の母性効果を阻害する変異が、ホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。
【請求項３２】
この変異が次を含む、請求項31記載の方法:
PGC発生遺伝子のシス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異；
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異；
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異；
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子における変異；または
これらの組み合わせ。
【請求項３３】
PGC発生遺伝子の翻訳後調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子が次である、請求項32記載の方法：Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9。
【請求項３４】
生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子が、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化する、請求項32記載の方法。
【請求項３５】
このマルチチューダードメインコンテイニングタンパク質がTdrd6aである、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
このアダプタータンパク質がhook2である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
生殖細胞の形成、維持、または移動に関与する遺伝子が、ノンコーディング RNAを発現する遺伝子である、請求項32記載の方法。
【請求項３８】
このノンコーディング RNAがmiR202-5pである、請求項37記載の方法。
【請求項３９】
シス作用5’または3’ 非翻訳領域制御配列における変異がPGC発生遺伝子の母性活性を阻害するが、発生後期においてPGC発生遺伝子の機能は阻害しない、請求項32記載の方法。
【請求項４０】
このPGC発生遺伝子がnanos3、dnd1、Elavl2またはpiwi様遺伝子である、請求項39記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府の権利に関する声明
ここに記述された作業の態様は、アメリカ合衆国農務省および国立食糧・農業研究所からの補助金2019-67030-29002支援によるものである。米国政府は、これらの発明に関し特定の権利を有する。
【０００２】
分野
本開示は、真水および海水生物の不妊化方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
次項は、これらにおいて議論された内容は、先行技術または当業者の知識の一部であるということを認めているものではない。
【０００４】
野生魚の漁業生産量は減少の一途をたどり、海産食品に対し増え続ける需要を満たすため、世界の食糧需給は、食品農業に今まで以上に大きく依存しなければならなくなる。工場畜産の形態とは対照的に、水産養殖においては、多くの種が生産中に性的に成熟し、その結果、数十億ドルもの生産性の損失および製品品質の低下に繋がっている。さらに、養殖魚は逃げ出し、水界生態系へ悪影響を与え得る。従って、養殖業における養殖水生種の不妊化が推奨される。
【０００５】
方法の一つに、三倍体の誘発による魚の不妊化がある。三倍体の誘発は、不妊の魚を生成する方法としては最もよく使われ、またよく研究されている方法である。三倍体魚は通常、温度または圧力による衝撃を受精卵へ与え、強制的に第二極体を組み込み、3対の染色体組(3N)を持つ細胞を産出し生成される。三倍体魚は、染色体が1組多いため減数分裂が阻止され、生殖腺が正常に発達しない。産業規模では、卵塊へ確実に、圧力または温度による衝撃を与えることは複雑であり、多大な費用がかかる。物理的処理により誘発した三倍体の他に、遺伝学により誘発した三倍体があり、これは四倍体を二倍体魚と交配したことによるものである。しかし四倍体魚は、胚の生存率が低く、成長も遅いため、生成することが困難である。三倍体の雄は正常な単相の精子細胞を産出するため、雄が卵子を受精させることが可能となるが、効率性は低下するという例がいくつかある。さらにある種では、成長の遅滞や病気になりやすいなど、三倍体の表現型に関連し、性能が低いといった特徴を持ったものもあった。
【０００６】
ホルモン処理により魚を不妊化するという方法もある。しかし長期間集中的に刺激を与えるなど、多くの場合、このようなプロセスは不妊化において望ましい有効性はなく、さらに／または魚の成長機能の低下に関連している。その上、合成ステロイドを使用した処理では、より高い死亡率に繋がることがある。
【０００７】
魚の不妊化には、一時的な遺伝子サイレンシングにより、生殖系列の発達を抑制するという方法もある。これには、始原生殖細胞を除去するため、アンチセンスオリゴヌクレオチドを単一卵子へ顕微注入するという手順が含まれる。しかし、個々の卵子への顕微注入は、商業規模では実行不可能である。
【０００８】
トランスジェニック技法を使用し、魚を不妊化する方法もあり、これには、細胞死を誘発、または移動パターンを阻止することで、成長過程にある胚を除去する、導入遺伝子を挿入する手順が含まれる。しかし、導入遺伝子は、サイレンシングおよび位置効果に依存する。従って、このような方法が、商業用途として許容されるためには、広範囲におよぶ規制レビュープロセスの対象となる。
【０００９】
膜を透過するアンチセンスオリゴヌクレオチドまたは低分子阻害剤に卵子を浸し、魚を不妊化する方法もあり、これには試験管内受精が必要とされる。しかし、水による硬化プロセス中、または初期胚発生中の卵子を処理することで、機械、温度および／または化学ストレスを与えることがあり、その結果、卵子および／または胚の生存能力に悪影響を与え得る。従って、卵子を浸すための設備のない孵化場では、生産コストが増加する。
【００１０】
不妊の魚、甲殻類、または軟体類の生成における改良が望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
導入
この導入の目的は、読者へ対し本明細書を示すことであり、いかなる発明をも定義することではない。以下または本文書の他の部分で記述されている、器具等または方法過程の組み合わせまたは部分的組み合わせにおいて、1つ以上の発明について記載されていることがある。発明者は、他のいかなる発明者または本明細書において公開されたいかなる発明へ対しても、そのような発明または発明者について、本特許請求内に記述しないことにより、その権利を放棄または拒否しない。
【００１２】
真水および海水生物の不妊化に用いられる前述の方法の1つ以上は、次のような結果となることがある：(1)例えば、卵子および／または成長過程にある胚へ機械、温度および／または化学ストレスを与えることにより生じる不妊化の不十分な有効性；(2) 例えば、畜産における慣行の大幅な変更、複数の種において転送が不可能、生産時間の増加、不妊の生物の割合の増加またはこれらの組み合わせにより生じる運営コストの増加；(3)野生の個体群への遺伝子流入および養殖、外来種による新しい生息場所でのコロニー形成；(4)例えば、顕微注入のよる始原生殖細胞の非効率的な除去による不妊化の不十分な有効性；または(5)これらの組み合わせ。
【００１３】
本開示は、成熟期へ到達する能力を損なうことなく、原子生殖細胞の発生を阻止することで、不妊化した真水および海水生物の生成する方法を示している。本開示における1つ以上の例は、真水および海水生物の不妊化に用いられる前述の1つ以上の提案方法と比較し、次のような結果へ繋がる：(1)例えば、試験管内受精ではなく、自然交配プロセスの活用により不妊化の効果を高める；(2)例えば、コストのかかる機材数または処理の削減、商業的にスケーラブルであること、複数の種において転送可能であること、飼料の削減、生産時間の短縮、成熟期へ到達する生物の割合増加、成熟期を迎えた生物の物理的サイズの拡大、またはこれらの組み合わせによる運営コストの削減；(3)野生の個体群への遺伝子流入および養殖、外来種による新しい生息場所でのコロニー形成の減少；(4) 例えば、生殖腺発育へ対するエネルギーの損失低下による養殖能力の向上；(5)例えば：a)位置効果およびサイレンシングの発生率の低下または発生阻止、および／またはb)不妊子孫の生成を引き起こすことによる不妊化効率の向上；または(6)これらの組み合わせ。  
【００１４】
また本開示では、種親そのものだけでなく、不妊の真水および海水生物の生成に用いる、真水および海水生物の種親の生成方法についても議論している。
【００１５】
本開示は、不妊の魚、甲殻類、または軟体類の生成方法を示している。この方法には、(i)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を (ii) 繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させる、遺伝子型選択により始原となるホモ接合体雌を選択する、および不妊の魚、甲殻類、または軟体類を生成するための始原となるホモ接合体雌を繁殖する方法が含まれる。この変異は、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を阻害することがあるが、ホモ接合体始原の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。  
【００１６】
この変異には：PGC発生遺伝子のシス作用性5’または3’非翻訳領域制御配列における変異；PGC発生遺伝子転写後の調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異；生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異；生殖細胞の形成、維持、または流動に関与する遺伝子における変異；またはそれらの組み合わせが含まれることがある。
【００１７】
PGC発生遺伝子転写後の調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子は：Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9であり得る。生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子は、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化し得る。マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質は、Tdrd6であり得る。アダプタータンパク質は、hook2であり得る。生殖細胞の形成、維持、または流動に関与する遺伝子は、ノンコーディングRNAを伝達する遺伝子であり得る。ノンコーディングRNAは、miR202-5pであり得る。
【００１８】
PGC発生遺伝子のシス作用性5’または3’非翻訳領域制御配列における変異は、PGC発生遺伝子の母性活性を阻害することがあるが、発生後期において、PGC発生遺伝子の機能を阻害しない。PGC発生遺伝子は、nanos3、dnd1、またはpiwi様遺伝子であり得る。
【００１９】
本開示では、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を生成するための、繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類についても示している。この変異は、PGC発生遺伝子の母性効果を減少させるための始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子転写後の調節を阻害するが、この遺伝子の体性機能は損なわない。
【００２０】
この変異には：PGC発生遺伝子のシス作用性5’または3’非翻訳領域制御配列における変異；PGC発生遺伝子転写後の調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異；生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異；生殖細胞の形成、維持、または流動に関与する遺伝子における変異；またはそれらの組み合わせが含まれることがある。PGC発生遺伝子転写後の調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子は：Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9であり得る。生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子は、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化し得る。マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質は、Tdrd6であり得る。アダプタータンパク質は、hook2であり得る。生殖細胞の形成、維持、または流動に関与する遺伝子は、ノンコーディングRNAを伝達する遺伝子であり得る。ノンコーディングRNAは、miR202-5pであり得る。PGC発生遺伝子のシス作用性5’または3’非翻訳領域制御配列における変異は、PGC発生遺伝子の母性活性を阻害する恐れがあるが、発生後期において、PGC発生遺伝子の機能を阻害しない。PGC発生遺伝子は、nanos3、dnd1、またはpiwi様遺伝子であり得る。
【００２１】
本開示では、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を生成するための、繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖方法についても示している。この方法には、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を生成するため：繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を、野生型の雄の魚、甲殻類、または軟体類、ヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類、またはホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖する方法が含まれる。この変異は、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を阻害する恐れがあるが、ホモ接合型始原の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。
【００２２】
この変異には：PGC発生遺伝子のシス作用性5’または3’非翻訳領域制御配列における変異；PGC発生遺伝子転写後の調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異；生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異；生殖細胞の形成、維持、または流動に関与する遺伝子における変異；またはそれらの組み合わせが含まれることがある。PGC発生遺伝子転写後の調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子は：Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9であり得る。生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子は、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化し得る。マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質は、Tdrd6であり得る。アダプタータンパク質は、hook2であり得る。生殖細胞の形成、維持、または流動に関与する遺伝子は、ノンコーディングRNAを伝達する遺伝子であり得る。ノンコーディングRNAは、miR202-5pであり得る。
【００２３】
PGC発生遺伝子のシス作用性5’または3’非翻訳領域制御配列における変異は、PGC発生遺伝子の母性活性を阻害する恐れがあるが、発生後期において、PGC発生遺伝子の機能を阻害しない。PGC発生遺伝子は、nanos3、dnd1、またはpiwi様遺伝子であり得る。
【００２４】
本開示では、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を生成する、繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類の生成方法についても示している。この方法には：(i)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を (ii) 繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類、またはホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させる、および遺伝子型選択により始原となるホモ接合体雌を選択する方法が含まれる。この変異は、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を阻害する恐れがあるが、ホモ接合型始原の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。
【００２５】
この変異には：PGC発生遺伝子のシス作用性5’または3’非翻訳領域制御配列における変異；PGC発生遺伝子転写後の調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異；生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子における変異；生殖細胞の形成、維持、または流動に関与する遺伝子における変異；またはそれらの組み合わせが含まれることがある。PGC発生遺伝子転写後の調節に関与するRNA結合タンパク質をコード化する遺伝子は：Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpms42、Rbpms24、KHSRP、またはDHX9であり得る。生殖質の輸送または形成に関与する遺伝子は、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化し得る。マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質は、Tdrd6であり得る。アダプタータンパク質は、hook2であり得る。生殖細胞の形成、維持、または流動に関与する遺伝子は、ノンコーディングRNAを伝達する遺伝子であり得る。ノンコーディングRNAは、miR202-5pであり得る。
【００２６】
PGC発生遺伝子のシス作用性5’または3’非翻訳領域制御配列における変異は、PGC発生遺伝子の母性活性を阻害する恐れがあるが、発生後期において、PGC発生遺伝子の機能を阻害しない。PGC発生遺伝子は、nanos3、dnd1、またはpiwi様遺伝子であり得る。
【００２７】
本開示におけるその他の実施例および機能は、添付図と併せ、具体例に関する以下の記述をレビューすることで、当業者へ対し明らかになる。
現在開示されている方法および生物は、添付図を参照とし、例を通してのみ記述される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図1は、不妊の魚、甲殻類、または軟体類の生成方法および変異系統の繁殖方法の例について説明しているフローチャートである。
【図２】図2AおよびBは、ここに記述されているPGC発生に作用する母性効果変異体を特定するための、突然変異導入ストラテジーの概要および選択した変異アレルのさらなる繁殖について説明しているフローチャートである。
【図３】図3パネルAからDは、両アレルノックアウトと比較した、ティラピアF0ジェネレーションの成長過程の写真である。
【図４】図4パネルAおよびBは、マルチ遺伝子ターゲッティング後のティラピアの写真である。
【図５】図5パネルAからCは、始原生殖細胞内に緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現しているティラピアの安定した遺伝子導入系の表現および写真である。Zpc5:eGFP:tnosの3’非翻訳領域構築物：ティラピアのZpc5プロモーターは、卵母細胞特異的プロモーターであり、第一減数分裂に先立ち、卵形成の間に活性化する。そのため、ヘテロ接合トランスジェニック雌からの胚は全て、eGFP:tnosの3’非翻訳領域mRNAを受け継いでおり、これは3’非翻訳領域(ティラピアnanos 3’非翻訳領域)におけるシス作用性のRNAエレメントの作用により、PCG内のみに限定され、発現する。(図5パネルC)
【図６】図6は、DNA配列へカスタムヌクレオチドの変化を導入するためのプロセスを説明している。mHDR =マイクロホモロジー組み換え修復；HA =ホモロジーアーム。はさみの絵は、開裂されるターゲットを表している。この方法は、図35で示されているdnd1 3’非翻訳領域における保存モチーフの編集に用いられていた。
【図７】図7は、F0モザイクファウンダー変異の同定および選択ストラテジーについて説明し、グラフに表したものである。変異アレルは、ターゲットとなる遺伝子座の周辺領域を増幅させるため、遺伝子特異的プライマーを用いた蛍光PCRにより同定された(120-300 bp)。蛍光PCRについては、遺伝子特異的プライマーおよび蛍光色素6-FAMまたはNED が取り付けられた2つの増幅するオリゴ両方の組み合わせが、反応に追加された。野生型DNAを用いた制御反応は、個々の遺伝子座において、単一ピークの増幅の存在を確認するために使用される。結果として生じるアンプリコンは、塩基対の解像度に的確なアンプリコンのサイズを決定するためのLIZ標識サイズ基準を追加したキャピラリー電気泳動(CE)により分解された(Retrogen)。Rawトレースファイルは、Peak Scannerソフトウェアで分析された(サーモフィッシャー)。野生型のピーク対照と比較したピークのサイズにより、変異の本質(挿入または欠失)および長さを決定する。ピークの回数は、モザイクのレベルを示している。本発明者らは、最少の変異アレルを持つF0モザイクファウンダーを選択した(選択的に2〜4ピーク)。
【図８】図8は、融解曲線プロットにより、ヘテロ接合の遺伝子型、ホモ接合型変異および野生型サンプルを可視化したグラフである。温度(-dF/dT)に対し、蛍光性がマイナスに変化していることがわかる。それぞれのトレースは、サンプルを表している。この例の野生型アレルの融解温度は、〜81℃(野生型ピーク)であり、ホモ接合変異体産物(ホモ接合欠失ピーク)の融解温度は、〜79℃である。それ以外のトレースは、ヘテロ接合型を表している。
【図９】図9パネルAおよびBは、nanos3 3’非翻訳領域遺伝子座での突然変異を表している。図9パネルAは、nanos3遺伝子の図式である。エクソン1は影付きのボックスで示されている；翻訳開始部位および停止部位はそれぞれ、ATGおよびTAAである。図9パネルBは、野生型の参照配列およびnanos3 3’非翻訳領域の変異ティラピアの異なる子孫の7つの生殖細胞系変異アレルの塩基配列である。欠失および挿入はそれぞれ、ダッシュおよびハイライト表示された大文字で示されている。
【図１０】図10は、F3ホモ接合KIF5B△1/△1変異体の頭蓋顔面および尾の変形の写真である。
【図１１】図11パネルAからDは、変異したF0雌のTIAR、KSHRP、TIA1、DHX9、Igf2bp3、Elavl1、Elavl2、Cxcr4a、Ptbp1a、Hnrnpab、Rbm24、Rbm42、TDRD6、Hook2、miR-202-5pの母性効果不妊の表現型を表しているグラフおよび写真である。図11パネルAおよびBは、F0変異体雌の4日目の胚(≧12個)でのPGC平均数を表している。野生型の対照雌の胚と比較し、著しい違いがある。垂直の棒は、標準偏差を示す。図11パネルCは、正常なPGC数を示している雌の遺伝子導入系Tg(Zpc5: EGFP: nos 3’非翻訳領域)の4 dpfティラピアの胚を表す。GFP (+)生殖細胞(n=40)は、消化管の前部周辺に縦方向に群がる。図11パネルDは、ターゲットとなる遺伝子変異を持ち、4 dpf (from n=1 to 15)で異なるPCG数を示しているF0 Tg(Zpc5: EGFP: nos3 3’非翻訳領域)雌系の子孫の体幹領域を表す。矢印は、GFP (+)細胞を示す(緑色)。
【図１２】図12パネルAからHは、F0変異体雌の子孫における、母性効果不妊の表現型を示した写真およびグラフである。図12のパネルAは、nos3 3’非翻訳領域(右側)を持つF0雌からの4ヶ月のティラピア雄の子孫の腹腔および同齢の対照精巣と比較した精巣萎縮(矢印で指示)を示す。図12パネルBおよびCは、F0 nos3 3’非翻訳領域変異体雌のF1雄子孫における平均的な生殖腺重量指数を示す(n=15/グループ)。Mean ± SDはこの通りである。図12のパネルDは、F0 nos3 3’非翻訳領域変異体雌の6ヶ月F1子孫の半透明の精巣を解剖したものである。図12パネルEは、TIA1に変異を持つF0雌からのF1子孫の生殖腺を解剖したものである。PGC数の多いF1子孫(<15PGC/胚)の生殖腺は成熟している一方で、PGC数の少ない子孫(<5PGC/胚)は6ヶ月時点において、精巣は半透明であり、卵巣は萎縮していた。図12パネルFは、PGC数が多いまたは少ないF1子孫における平均的な生殖腺重量指数を示す。図12パネルGは、RBMS42に変異を持つF0雌(右)または雄(左)からのF1雌の子孫の腹腔である。矢印は卵巣を指しており、白い矢印は、萎縮した紐のような卵巣を指している。図12パネルHは、Ptbp1aに変異を持つF0雌(下)またはF0雄(上)からのティラピア雌の子孫の腹腔である。
【図１３】図13パネルAからCは、KIF5Ba遺伝子座で選択したヌクレアーゼにより誘発した欠失を示す。図13パネルAは、KIF5Ba遺伝子の図である。エクソン(E1-25)は、影付きボックスで示されている；5’および3’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている。図13パネルBは、1nt欠失(塩基配列ではダッシュ1つ)を示しているKIF5B F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 89)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 88)である。このフレームシフトは、位置962ではなく、アミノ酸110で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図13パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 90)および最初の110のアミノ酸が、野生型TIARタンパク質のそれと一致している、変異KIF5Bアレル(SEQ ID NO: 91)である。
【図１４】図14パネルAからCは、TIAR遺伝子座での選択的な変異アレルの説明である。図14パネルAは、TIAR遺伝子の図である。エクソン(E1-12)は、影付きボックスで示されている；5’および3’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている；翻訳開始部位および停止部位はそれぞれ、ATGおよびTAAである。図14パネルBは、TIAR F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレル(SEQ ID NO: 93)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 92)である。この11nt挿入は、位置382ではなく、アミノ酸119で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図14パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 94)および最初の118のアミノ酸が、誤ったコードを与えられたアミノ酸が1つ後に続く野生型TIARタンパク質のそれと一致している、変異TIARアレル(SEQ ID NO: 95)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図１５】図15パネルAからCは、KHSRP遺伝子座で選択した変異アレルの説明である。図15パネルAは、KHSRP遺伝子の図である。エクソン(E1-22)は、影付きボックスで示されている；翻訳開始部位および停止部位はそれぞれ、ATGおよびTGAである。矢印は、ターゲットとなるエクソンを指している。図15パネルBは、野生型参照配列(SEQ ID NO: 96)およびKHSRP F0変異ティラピアの子から選択した変異アレル(SEQ ID NO: 97)である。欠失は、ダッシュで示されている。これらの連続欠失は、位置695ではなく、アミノ酸410で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図15パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 98)および最初の387のアミノ酸が、野生型KHSRPタンパク質のそれと一致しており、それに続く23のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異KHSRPタンパク質(SEQ ID NO: 99)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図１６】図16パネルAからCは、DHX9遺伝子座で選択した変異の説明である。図16パネルAは、ティラピアのDHX9遺伝子の図である。エクソン(E1-26)は、影付きボックスで示されている；5’および3’非翻訳領域は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなるエクソンを指している。図16パネルBは、DHX9 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 101)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 100)である。7ヶ所あるヌクレオチド欠失は、ダッシュで示されている。このフレームシフト変異は、位置1286ではなく、アミノ酸82で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図16パネルCは、WTの塩基配列(SEQ ID NO: 102)および最初の81のアミノ酸が、野生型DHX9タンパク質のそれと一致しており、それに続くアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異DHX9タンパク質(SEQ ID NO: 103)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図１７】図17パネルAからCは、TIA1遺伝子座で選択した変異の説明である。図17パネルAは、ティラピアのTia1遺伝子の図である。エクソン(E1-12)は、影付きボックスで示されている；5’および3’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている。翻訳開始部位および停止部位はそれぞれ、ATGおよびTAAである。図17パネルBは、野生型参照配列(SEQ ID NO: 104)およびTia1 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 105)である。塩基配列内に10ヶ所あるヌクレオチド欠失は、ダッシュで示されている。塩基配列内のこのフレームシフトは、位置387ではなく、アミノ酸27で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図17パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 106)および最初の15のアミノ酸が、野生型TIA1タンパク質のそれと一致しており、それに続く12のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異TIA1タンパク質(SEQ ID NO: 107)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図１８】図18パネルAからCは、Igf2pb3遺伝子座で選択した変異の説明である。図18パネルAは、ティラピアのIgf2pb3遺伝子の図である。エクソン(E1-15)は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなるエクソンを指している。図18パネルBは、Igf2pb3 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 109)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 108)である。挿入したヌクレオチドは、太字および下線で示されている。このフレームシフトは、位置589ではなく、アミノ酸206で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図18パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 110)および最初の173のアミノ酸が、野生型Igf2pb3タンパク質のそれと一致しており、それに続く33のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 111)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図１９】図19パネルAからCは、Elavl1遺伝子座で選択した変異の説明である。図19パネルAは、ティラピアのElavl1遺伝子の図である。エクソン(E1-7)は、影付きボックスで示されている；5’および3’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなるエクソンを指している。図19パネルBは、Elavl1 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 113)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 112)である。3kb欠失は、ダッシュで示されている。このフレームシフトは、位置359ではなく、アミノ酸105で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図19パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 114)および最初の45のアミノ酸が、野生型Elavl1タンパク質のそれと一致しており、それに続く60のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 115)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２０】図20パネルAからCは、Elavl2遺伝子座で選択した変異の説明である。図20パネルAは、ティラピアのElavl2遺伝子の図である。エクソン(E1-7)は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなるエクソンを指している。図20パネルBは、Elavl2 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 117)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 116)である。8ヶ所あるヌクレオチド欠失は、ダッシュで示されている。このフレームシフトは、位置372ではなく、アミノ酸40で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図20パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 118)および最初の12のアミノ酸が、野生型Elavl2タンパク質のそれと一致しており、それに続く28のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 119)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２１】図21パネルAからCは、Cxcr4a遺伝子座で選択した変異の説明である。図21パネルAは、ティラピアのCxcr4a遺伝子の図である。エクソン(E1-2)は、影付きボックスで示されている；5’および3’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなるエクソンを指している。図21パネルBは、Cxcr4a F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 121)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 120)である。8ヶ所あるヌクレオチド欠失は、ダッシュで示されている。このフレームシフトは、位置372ではなく、アミノ酸26で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図21パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 122)および最初の169のアミノ酸が、野生型CXCR4aタンパク質のそれと一致しており、それに続く8のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 123)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２２】図22パネルAからCは、Ptbp1遺伝子座で選択した変異の説明である。図22パネルAは、ティラピアのPtbp1遺伝子の図である。エクソン(E1-16)は、影付きボックスで示されている。5’および3’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなるエクソンを指している。図22パネルBは、Ptbp1 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 125および126)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 124)である。13ヶ所および1.5kbのヌクレオチド欠失は、ダッシュで示されている。このフレームシフト変異は、位置538ではなく、アミノ酸80および346で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図22パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 127)および最初の71および72のアミノ酸が、野生型Ptbp1タンパク質のそれと一致しており、それに続く9および274のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 128および129)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２３】図23パネルAからCは、nos3遺伝子座で選択した変異の説明である。図23パネルAは、ティラピアのnos3遺伝子の図である。エクソン(E1)は、影付きボックスで示されている。矢印は、エクソン1のターゲットとなる遺伝子座を指している。図23パネルBは、nos3 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 131)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 130)である。ダッシュで示されている5ヶ所のヌクレオチド欠失は、位置219ではなく、アミノ酸145で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図23パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 132)および最初の140のアミノ酸が、野生型NANOS3タンパク質のそれと一致しており、それに続く5のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 133)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２４】図24パネルAからCは、dnd1遺伝子座で選択した変異の説明である。図24パネルAは、ティラピアのdnd1遺伝子の図である。エクソン(E1-E6)は、影付きボックスで示されている。5’および3’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている。矢印は、エクソン6のターゲットとなる遺伝子座を指している。図24パネルBは、dnd1 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 135)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 134)である。ダッシュで示されている5ヶ所のヌクレオチド欠失は、位置320ではなく、アミノ酸324で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図24パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 136)および最初の316のアミノ酸が、野生型DND1タンパク質のそれと一致しており、それに続く8のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 137)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２５】図25パネルAからCは、Hnrnpabのコーディング領域で選択した変異の説明である。図25パネルAは、ティラピアのHnrnpab遺伝子の図である。エクソン(E1-E7)は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなる遺伝子座を指している。図25パネルBは、Hnrnpab F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 139)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 138)である。ダッシュで示されている8ヶ所のヌクレオチド欠失は、位置332ではなく、アミノ酸29で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図25パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 140)および最初の27のアミノ酸が、野生型Hnrnpabタンパク質のそれと一致しており、それに続く2のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 141)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２６】図26パネルAからCは、Hermes (Rbms)遺伝子座で選択した変異の説明である。図26パネルAは、ティラピアのHermes遺伝子の図である。エクソン(E1-E6)は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなる遺伝子座を指している。図26パネルBは、Hermes F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 143)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 142)である。太字およびアンダーラインで示されている16ヶ所のヌクレオチド挿入は、位置174ではなく、アミノ酸61で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図26パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 144)および最初の52のアミノ酸が、野生型Hermesタンパク質のそれと一致しており、それに続く9のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 145)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２７】図27パネルAからCは、RBM24遺伝子座で選択した変異の説明である。図27パネルAは、ティラピアのRBM24遺伝子の図である。エクソン(E1-E4)は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなる遺伝子座を指している。図27パネルBは、RBM24 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 147)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 146)である。ダッシュで示されている7ヶ所のヌクレオチド欠失は、位置235ではなく、アミノ酸54で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図27パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 148)および最初の42のアミノ酸が、野生型RBM24タンパク質のそれと一致しており、それに続く12のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 149)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２８】図28パネルAからCは、RBM42遺伝子座で選択した変異の説明である。図28パネルAは、ティラピアのRBM42遺伝子の図である。エクソン(E1-E11)は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなる遺伝子座を指している。図28パネルBは、RBM42 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 151)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 150)である。ダッシュで示されている7ヶ所のヌクレオチド欠失は、位置408ではなく、アミノ酸178で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図28パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 152)および最初の158のアミノ酸が、野生型RBM42タンパク質のそれと一致しており、それに続く20のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 153)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図２９】図29パネルAからCは、TDRD6遺伝子座で選択した変異の説明である。図29パネルAは、ティラピアのTDRD6遺伝子の図である。エクソン(E1-E2)は、影付きボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなる遺伝子座を指している。図29パネルBは、TDRD6 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 155)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 154)である。ダッシュで示されている10ヶ所のヌクレオチド欠失は、位置1630ではなく、アミノ酸43で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図29パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 156)および最初の31のアミノ酸が、野生型TDRD6タンパク質のそれと一致しており、それに続く12のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 157)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図３０】図30パネルAからCは、Hook2遺伝子座で選択した変異の説明である。図30パネルAは、ティラピアのHook2遺伝子の図である。エクソン(E1-E22)は、影付きボックスで示されている。5’および3’非翻訳領域は、オープンボックスで示されている。矢印は、ターゲットとなる遺伝子座を指している。図30パネルBは、Hook2 F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(SEQ ID NO: 159)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 158)である。ダッシュで示されている2ヶ所のヌクレオチド欠失は、位置708ではなく、アミノ酸158で切断する短縮型タンパク質を生成すると予測される。図30パネルCは、予測されるWTのタンパク質配列(SEQ ID NO: 160)および最初の102のアミノ酸が、野生型Hook2タンパク質のそれと一致しており、それに続く56のアミノ酸が誤ってコード化されている短縮型変異タンパク質配列(SEQ ID NO: 161)である。変性したアミノ酸は、ハイライト表示されている。
【図３１】図31パネルAからCは、miR-202遺伝子座で選択した変異の説明である。図31パネルAは、Forna(RNAグラフ描写)RNA視覚化ツール(Kerpedjiev, Hammer et al. 2015)で表示されている通り、ティラピア(ナイルティラピア)pre miR-202の二次構造を表している。矢印は、2つの成熟したmiR-202の最初および最後のヌクレオチドの位置を指している。図31パネルBは、野生型のヌクレオチド配列アライメント(SEQ ID NO: 162)およびダッシュにより示しているmiR-202-5p領域を覆う欠失を持つ選択した変異体(SEQ ID NOs: 163から165)を表している。miR-202-5pの配列は1本の下線、miR-202-3pの配列には2本の下線が引いてある。miR-202-5pのSeed配列は、破線枠で示している。図31パネルCは、Forna RNA可視化ツールを使い、 pre miR-202変異アレルの二次構造を表したものである(miR-202 △7/+, miR-202 △8/+)。矢印は、2つの成熟したmiR-202の最初および最後のヌクレオチドを指している。
【図３２】図32パネルAからCは、様々な硬骨魚類nos3 3’非翻訳領域のMEME分析の結果である。図32パネルAは、様々な硬骨魚類(ヒラメ(Paralichthys olivaceus) (SEQ ID NO: 166)、アメリカナマズ(Ictalurus punctatus) (SEQ ID NO: 170)、ニジマス(Oncorhynchus mykiss) (SEQ ID NO: 171)、ゼブラフィッシュ(Danio rerio) (SEQ ID NO: 168)、ナイルティラピア(Oreochromis niloticus) (SEQ ID NO: 169)、メダカ(Oryzias latipes) (SEQ ID NO: 172)、真鯉(Cyprinus carpio) (SEQ ID NO: 167)、フグ(tetraodon) (SEQ ID NO: 173))のnos3遺伝子の3’非翻訳領域に保存されたモチーフの分布を示すMEMEブロック図である。3’非翻訳領域は、縮尺である。保存モチーフ1(長さ17nt)および2(長さ40nt)はそれぞれ、黒およびグレーのボックスで示している。図32パネルBは、MEMEツールにより同定した上部保存モチーフを表している長さ17ntロゴの配列である。文字の高さは、モチーフ内の位置で出現する確率を明確にしている。ブロック内の最初の配列アライメントは、配列名、鎖(+)、SEQ ID#、ヌクレオチドの開始位置およびP-valueサイト(p-valueの位置により分類したサイト)を表している。図32パネルCは、MEMEツールにより同定した上部保存モチーフを表している長さ40ntロゴの配列である。文字の高さは、モチーフ内の位置で出現する確率を明確にしている。ブロック内の最初の配列アライメントは、配列名、鎖(+)、SEQ ID#、ヌクレオチドの開始位置およびP-valueサイト(p-valueの位置により分類したサイト)を表している。
【図３３】図33パネルAおよびBは、ティラピアnos3 3’非翻訳領域の保存19ntモチーフ1内のヌクレアーゼにより誘発した欠失を表している。図33パネルAは、nos3 3’非翻訳領域F0変異ティラピアの子から選択した生殖細胞系変異アレルの塩基配列(長さ8ntおよび32nt欠失、それぞれSEQ ID NOs: 188および189)を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 169)である。ダッシュで示されている欠失は、MEMEにより同定された長さ17nt保存モチーフを部分的または全体的に取り除くと予測される(図32参照)。miR-430推定標的配列GCACUU (Giraldez, Mishima et al. 2006)は、破線枠で示している。図33パネルBは、Forna RNA可視化ツール(Kerpedjiev, Hammer et al. 2015)による保存モチーフ1の予測される二次構造である。矢印は、モチーフ1の最初および最後のヌクレオチドを指している。
【図３４】図34パネルAからCは、様々な硬骨魚類dnd1 3’非翻訳領域のMEME分析の結果である。図34パネルAは、魚から蛙まで様々な種(タイセイヨウサケ(Salmo salar) (SEQ ID NO: 174)、タイセイヨウダラ(Gadus morhua) (SEQ ID NO: 175)、ニジマス(Oncorhynchus mykiss) (SEQ ID NO: 176)、ナイルティラピア(Oreochromis niloticus) (SEQ ID NO: 177)、フグ(takifugu rubripes) (SEQ ID NO: 178) 、ゼブラフィッシュ (Danio rerio) (SEQ ID NO: 179)、アメリカナマズ(Ictalurus punctatus) (SEQ ID NO: 180)、ネッタイツメガエル(Xenopus tropicalis) (SEQ ID NO: 181))のdnd1遺伝子の3’非翻訳領域に保存されたモチーフの分布を示すMEMEブロック図である。3’非翻訳領域は、縮尺である。保存モチーフ1および2はそれぞれ、黒およびグレーのボックスで示している。図34パネルBおよびCは、MEMEツールにより同定した2つの上部保存モチーフに対応する、長さ19ntおよび46ntロゴの配列である。文字の高さは、モチーフ内の位置で出現する確率を明確にしている。ブロック内の最初の配列アライメントは、配列名、鎖(+)、ヌクレオチドの開始位置およびP-valueサイト(p-valueの位置により分類したサイト)を表している。
【図３５】図35パネルAおよびBは、ティラピアdnd1 3’非翻訳領域の保存19ntモチーフ1内のヌクレアーゼにより誘発したヌクレオチドの置き換えを表している。図35パネルAは、黒い枠内で協調されている、保存dnd1 19ntモチーフ1配列を持つ野生型参照配列(SEQ ID NO: 177)および、Forna RNA可視化ツール(Kerpedjiev, Hammer et al. 2015)のより予測される最小自由エネルギー(MFE)二次構造である。miR-23d推定標的配列(MIMAT0043480) (Eshel, Shirak et al. 2014)は、破線枠で示している。図35パネルBは、対立遺伝子性を、最も保存されたモチーフ1-ヌクレオチドの塩基置換(SEQ ID NO: 190)に置き換えた後(方法は図6にて記述)、編集された塩基配列である。RNAfoldウェブサーバーは、編集したdnd1モチーフ1(Forna RNA可視化ツール(Kerpedjiev, Hammer et al. 2015))での二次構造を予測しない。
【図３６】図36パネルAからCは、様々な硬骨魚類Elavl2 3’非翻訳領域のMEME分析の結果である。図36パネルAは、魚から蛙まで様々な種(ゼブラフィッシュ(Danio rerio) (SEQ ID NO: 184)、ナマズ(Ictalurus punctatus) (SEQ ID NO: 185)、ナイルティラピア(Oreochromis niloticus) (SEQ ID NO: 183)、メダカ(Oryzias latipes) (SEQ ID NO: 186)、タイセイヨウサケ(Salmo salar) (SEQ ID NO: 182)、ネッタイツメガエル(Xenopus tropicalis) (SEQ ID NO: 187))のElavl2遺伝子の3’非翻訳領域に保存されたモチーフの分布を示すMEMEブロック図である。3’非翻訳領域は正確な比率である。保存モチーフ1および2はそれぞれ、黒およびグレーのボックスで示している。図36パネルBおよびCは、MEMEツールにより同定した保存モチーフ1および2の長さ30ntロゴの配列である。文字の高さは、モチーフ内の位置で出現する確率を明確にしている。ブロック内の最初の配列アライメントは、配列名、鎖(+)、SEQ ID#、ヌクレオチドの開始位置およびP-valueサイト(p-valueの位置により分類したサイト)を表している。
【図３７】図37パネルAおよびBは、TIAR、KSHRP、TIA1、DHX9、Igf2bp3、Elavl1、Elavl2、Cxcr4a、Ptbp1a、Hnrnpab、Rbm24、Rbm42、TDRD6、Hook2、miR-202-5p変異F1雌の子孫のPGC数のを統計分析したグラフである。棒グラフは、それぞれのF0変異雌の4日の胚(≧12個)でのPGC平均数を表している。KHSRPおよびElavl1を除く、分析を実施した全てのグループに対する野生型の対照雌の子孫と比較し、著しい違い(p ≦ 0.01)がある。垂直の棒は、標準偏差を示す。
【図３８】図38パネルAおよびBは、選択したティラピアdnd1変異体のジェネレーション、遺伝子型および関連する表現型を示した図および写真である。図38パネルA：Dnd変異体は、細胞卵割期前に、dnd1コード配列をターゲットとした人工ヌクレアーゼを、ティラピアの胚の胚盤へ顕微注入し生成された。結果として生じたファウンダーの雄の1匹が、野生型雌と交配し、F1ジェネレーションでヘテロ接合変異体を生み出した。F1変異体Dnd△5/+と交配することで、卵の約25％がホモ接合変異体(dndによりノックアウトされたDnd△5/△5)雄、および生殖細胞の欠如している(生殖腺の解剖分析により確認)F2ジェネレーションを生み出した。図38パネルB：正常な大きさの精巣で、半透明の精巣構造を示す1歳(411gr) dndによりノックアウトされたDnd△5/△5雄の生殖腺の形態。
【図３９】図39パネルAおよびBは、選択したティラピアnos3変異体のジェネレーション、遺伝子型および関連する表現型を示した図および写真である。図39パネルA：Nos3変異体は、細胞卵割期前に、nos3コード配列をターゲットとした人工ヌクレアーゼを、ティラピアの胚の胚盤へ顕微注入し生成された。結果として生じたファウンダーの雄の1匹が、野生型雌と交配し、F1ジェネレーションでヘテロ接合変異体を生み出した。F1変異体nos3△5/+と交配することで、卵の約25％が、生殖細胞の欠如している雌がいる(生殖腺の解剖分析により確認)、両性別のホモ接合変異体(nos3によりノックアウトされたnos3 △5/△5)のF2ジェネレーションを生み出した。図39パネルB：ヘミ接合シブリングnos3△5/+と比較した際、卵巣のような紐を示すnos3によりノックアウトされたnos3 △5/△5雄の生殖腺の形態。
【図４０】図40パネルAおよびBは、選択したティラピアElavl2変異型のジェネレーション、遺伝子型および関連する表現型を示した図および写真である。図40パネルA：Elavl2変異型は、細胞卵割期前に、Elavl2コード配列をターゲットとした人工ヌクレアーゼを、ティラピアの胚の胚盤へ顕微注入し生成された。結果として生じたファウンダーの雄の1匹が、野生型雌と交配し、F1ジェネレーションでヘテロ接合変異体を生み出した。F1変異体Elavl2△8/+と交配することで、卵の約25％が、生殖細胞の欠如している雌がいる(生殖腺の解剖分析により確認)、両性別のホモ接合変異体(Elavl2によりノックアウトされたElavl2△8/△8)のF2ジェネレーションを生み出した。図40パネルB：ヘミ接合シブリングElavl2△8/+と比較した際、卵巣のような紐を示すElavl2によりノックアウトされたElavl2△8/△8雄の生殖腺の形態。
【図４１】図41パネルAからDは、dnd1をβ-globin 3'非翻訳領域へスワップする実験に関する図および写真である。図41パネルAは、dnd1をターゲットとなるβ-globin 3'非翻訳領域へ組み込んだ後の、ティラピアdnd1遺伝子の図である。ティラピアのゲノムへのβ-globin 3'非翻訳領域カセット組み込みを確認するため、プライマー(矢印)を使用した。図41パネルBは、処理をした他の魚からのgDNA PCR産物のゲル電気泳動である。1、3-5、7および9-14レーンの497bp特異的PCRアンプリコンは、dnd1 (dead end1) オープンリーディングフレームのβ-globin 3'非翻訳領域下流の組み込みが成功したことを示している。図41パネルCは、この組み込み(DND1bglo 3’UTR/bglo3’UTR)に対する、ティラピアホモ接合体の腹腔内の半透明の精巣である。図41パネルDは、DND1bglo 3’UTR/bglo3’UTR ティラピアの精巣内に、vasa特異的RT PCRアンプリコンが欠損していることを示すゲルである。
【図４２】図42パネルAおよびBは、nos3 3’非翻訳領域ホモ接合型雌(nos3 3’UTR△32/△32)の子孫に見られる母性効果不妊表現型に関する写真およびグラフである。図42パネルAは、雄および雌において、完全(半透明の精巣および卵巣のような紐)または一部不妊表現型を持つ6ヶ月の子孫の生殖腺を解剖したものである。図42パネルB：nos3 3’非翻訳領域△32/△32 雌の4日目の胚におけるPGC数の統計分析である。PCG数(≧12個/棒)の平均は、対照よりも93％減少した。
【図４３】図43パネルAおよびBは、TIARホモ接合変異体雌(TIAR-/-)の子孫に見られる母性効果不妊表現型に関する写真およびグラフである。図43パネルAは、雄(左、腹腔の画像)および雌(右、腹腔の画像)において、重度の不妊表現型を持つ6ヶ月の子孫の生殖腺を解剖したものである。図43パネルB：TIAR 変異体雌が生んだ6ヶ月子孫生殖腺重量指数の統計分析である。PCG数(≧12個/棒)の平均は、対照よりも93％減少した。
【図４４】図44パネルAからCは、2つの成分システムにおける、母性効果変異型の相互作用の性質に関するグラフである(エピスタシス)。相加的と仮定したエピスタシスを用いることで、2本のKOラインにおけるエピスタシスの欠如は、単一KOの効果の合計であると予測される。本発明者らは、公式：TPA=LA1+ (1-LA1) x LA2を用い、単一KOの合計予測を測定した。LA1はKO#1 からのPGCアブレーションのレベル、およびLA2はKO#2により発生したPGCアブレーションのレベルである。PGCアブレーションレベルが、測定したアブレーションレベルから、数パーセント点以内となるよう計算し、エピスタシスがないことが示された。計算済みLA対測定済みLAは、それぞれのグラフ下の括弧内に示されている。
【図４５】図45は、TIAR、KSHRP、TIA1、DHX9、Elavl1、Cxcr4a およびnos3 3’非翻訳領域ホモ接合変異体F2雌の子孫におけるPGC数の統計分析を表したグラフである。グラフの縦棒は、個々のF0変異体雌の4日目の胚(≧12個)におけるPGC平均数を示している。検証を実施した全てのグループにおいて、野生型の対照雌の子孫と比較し、著しい違いがある(p ≦ 0.01)。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
全体として本開示は、不妊の魚、甲殻類、または軟体類の生成方法を示している。この方法には、(i)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を (ii) 繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させる、遺伝子型選択により始原となるホモ接合体雌を選択する、および不妊の魚、甲殻類、または軟体類を生成するための始原となるホモ接合体雌を繁殖する方法が含まれる。変異は、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を阻害するが、ホモ接合体始原の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。  
【００３０】
本開示では、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を生成する目的における繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類の繁殖方法についても示している。この方法には、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を生成するため、繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を、野生型の雄の魚、甲殻類、または軟体類、ヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類、またはホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖する方法が含まれる。この変異は、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を阻害するが、ホモ接合体始原の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。
【００３１】
本開示では、不妊の魚、甲殻類、または軟体類を産出する繁殖能力のあるホモ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類の生成方法についてさらに示している。この方法には、(i)繁殖能力のあるヘミ接合変異体雌の魚、甲殻類、または軟体類を、(ii) 繁殖能力のあるヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類、またはホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類と繁殖させる、および遺伝子型選択により始原となるホモ接合体雌を選択する方法が含まれる。この変異は、始原生殖細胞(PGC)発生遺伝子の母性効果を阻害するが、ホモ接合体始原の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない。
【００３２】
本開示の文脈において、魚とは、指のある手足のない、鰓を持つあらゆる有頭動物のことである。魚の例としては、コイ、ティラピア、サケ、マスおよびナマズが挙げられる。本開示の文脈において、甲殻類とは、あらゆる節足動物分類群のことである。甲殻類の例としては、カニ、ロブスター、ザリガニおよびエビが挙げられる。本開示の文脈において、軟体類とは、柔らかく未分節の体を持ち、通常、石灰質の殻に覆われているあらゆる無脊椎動物のことである。軟体類の例としては、二枚貝、ホタテガイ、カキ、タコ、イカおよびヒザラガイが挙げられる。ヘミ接合体の魚、甲殻類、または軟体類とは、突然変異を含む1コピーの染色体を持つが、両方の染色体には変異がないあらゆる二倍体の魚、甲殻類、または軟体類のことである。ホモ接合体の魚、甲殻類、または軟体類とは、突然変異を含む2コピーの染色体を持つあらゆる二倍体の魚、甲殻類、または軟体類のことである。
【００３３】
不妊の魚、甲殻類、または軟体類とは、野生型の対照と比較し、繁殖または交配により子孫を生む能力が低下しているあらゆる魚、甲殻類、または軟体類のことである；例えば、不妊の魚、甲殻類、または軟体類は、子孫を産出する可能性が約50%、約75%、約90%、約95%、または100%低下している。これに対し、繁殖能力のある魚、甲殻類、または軟体類とは、繁殖または交配により子孫を産出する能力を有するあらゆる魚、甲殻類、または軟体類のことである。繁殖および交配とは、子孫または子を生み出すための雄の種および雌の種の交尾における、あらゆるプロセスのことである。
【００３４】
母性効果とは、母体がRNA、タンパク質、またはこれらの組み合わせを卵母細胞へ供給するため、生物の表現型が、母体の表現型から期待される状況のことである。PGC発生遺伝子の母性効果を阻害するとは、卵母細胞において母方で発現する1つまたは遺伝子の組み合わせ、およびPGCの発生、維持、移動、またはこれらを組み合わせた機能を低下させるまたは阻害することである。卵母細胞において母方で発現する1つまたは遺伝子の組み合わせ、およびPGCの発生、維持、移動、またはこれらを組み合わせた機能の阻害は、前述の障害または破壊遺伝子機能を有するホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせに関与する1つまたは遺伝子の組み合わせの接合体機能を損なわない、または阻害しない。注目すべきことに、卵母細胞において母方で発現する1つまたは遺伝子の組み合わせおよびPGCの発生、維持、移動、またはこれらを組み合わせた機能の阻害は、ホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせに関与しない1つまたは遺伝子の組み合わせの接合体機能を損なう、または阻害する恐れがあり、これらは例えば、免疫、代謝、ストレスまたは病気への反応に関与するものである。卵母細胞において母方で発現する1つまたは遺伝子の組み合わせおよびPGCの発生、維持、移動、またはこれらを組み合わせた機能を阻害することは、配偶子の形成を阻害し、結果として生物の不妊および性的な未熟さに繋がることがある。
【００３５】
生殖質遺伝子は、不活性化が生じるノックアウト実験の対象となっていた。しかし、いくつかの生殖質遺伝子では、ノックアウトされた後に期待された表現型が認められず、さらに／または多面的に発現する表現型が認められ、次の結果が生じた：1)不妊の子孫を産出するために繁殖することができない欠損のある魚へ発育；または2)生存不能な子孫を生む魚へ発育。また、他の生殖質遺伝子はノックアウトされ、卵巣、精巣、または両方の発育に障害のあるホモ接合変異体となるため、不妊の子孫の繁殖が不可能である。この発明者は、変異した生物が、性的に成熟した成体へと成育するための機能を低下させる、または阻害することなく、PGC機能に作用する特異的変異を1つ以上引き起こすことで、例えば、生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない、不妊の子孫を産出するために利用することが可能な種親の生成が可能となる、ということを発見した。1つ以上の特異的変異は、ホモ接合変異体雌の子孫は正常であるが、生殖細胞が欠失しているなど、PGC形成の母性機能を阻害するということが重要である。
【００３６】
PGC発生遺伝子の母性効果機能を阻害する変異とは、PGC発生遺伝子の母性効果機能を直接的または間接的に低下させる、または阻害する、あらゆる遺伝子変異のことである。直接的または間接的な遺伝子機能に作用するとは、次を指す：(1)1つ以上のPGC発生遺伝子のコード配列を変異させる；(2) 1つ以上のPGC発生遺伝子の転写または転写後調節をある程度制御する、非コード配列を変異させる；(3) 1つ以上のPGC発生遺伝子の転写後調節に作用する他の遺伝子のコード配列を変異させる；(4)生殖質、例えば、1つ以上のPGC発生遺伝子の遺伝子産物の輸送、形成、またはこれらの組み合わせに関与する他の遺伝子のコード配列を変異させる；(5) 生殖細胞の形成、維持、移動、またはこれらの組み合わせに関与する他の遺伝子のコード配列を変異させる；(6) 1つ以上のPGC発生遺伝子のエピジェネティック調節に関与する他の遺伝子のコード配列を変異させる；または(7)PGC発生遺伝子の機能を低下させる、または阻害するための、これらの組み合わせ。遺伝子機能とは、遺伝子そのものの直接的な機能および遺伝子の発現中に産出された分子の機能、例えば、RNAおよびタンパク質の機能のことである。遺伝子機能を低下させるとは、遺伝子の野生型対照の機能と比較し、遺伝子機能を、例えば、約10%、約25%、約50%、約75%、約90%、または約95%低下させることである。遺伝子機能を阻害する、または機能の喪失とは、遺伝子の野生型対照の機能と比較し、遺伝子機能を100%低下させることである。本明細書で使用するときは、「野生型」とは通常、母性効果機能が阻害されていない生物のことである。「野生型対照」とは通常、同じ年齢、種などの正常な生物のことである。  
【００３７】
変異とは、対象となるヌクレオチド配列に対する、あらゆる種類の変化であり、例えば、ヌクレオチド挿入、ヌクレオチド欠失、ヌクレオチド置換のことである。1つ以上のPGC発生遺伝子のコード配列で推奨される変異は、フレームシフト変異を引き起こすヌクレオチド挿入またはヌクレオチド欠失であり、これは非機能的なタンパク質の産出に繋がることがある。
【００３８】
1つ以上のPGC発生遺伝子のコード配列の変異とは、コード配列に対するあらゆる種類の変異のことであり、このコード配列は：(1)PGCの発生、維持、移動、またはこれらの組み合わせに関与する、PGC発生遺伝子の母性効果機能を低下させる、または阻害する；および(2)前述の変異を持つホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない、または阻害しない。始原生殖細胞発生遺伝子のコード配列へ対する変異の例としては、Tia1、TIAR、KHSRP、DHX9、Elavl1、Igf2bp3、Ptbp1a、TDRD6、Hook2およびHnrnpabのコード配列における変異が挙げられる。この発明者は、PGCの発生、維持、移動、またはこれらの組み合わせに関与する、PGC発生遺伝子の母性効果機能を低下させる、または阻害する特定のPGC遺伝子のコード配列を変異させることは、前述の変異、例えば、Hnrnph1、Hermes、Elavl2、KIF5Bを持つホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせも低下させる、または阻害するということを発見した。
【００３９】
驚くことに、この発明者は、(1)1つ以上のPGC発生遺伝子の転写または転写後調節をある程度制御する非コード配列を変異させる； (2) PGC発生遺伝子の転写後調節に関与する他の遺伝子のコード配列を変異させる；(3)生殖質の輸送、形成、またはこれらの組み合わせに関与する他の遺伝子のコード配列を変異させる；(4) 生殖細胞の形成、維持、移動、またはこれらの組み合わせに関与する他の遺伝子のコード配列を変異させる；または(5)これらの組み合わせは、前述の変異を持つホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせの低下または阻害を阻止することがある、ということを発見した。
【００４０】
1つ以上のPGC発生遺伝子の転写または転写後調節をある程度制御する非コード配列を変異させるとは、非コード配列のあらゆる変異のことであり、このコード配列は：(1)PGCの発生、維持、移動、またはこれらの組み合わせに関与する、PGC発生遺伝子の母性効果機能を低下させる、または阻害する；および(2)前述の変異を持つホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない、または阻害しない。1つ以上のPGC発生遺伝子の非コード配列の変異の例としては：(1) 1つ以上のPGC発生遺伝子の1つ以上のシス作用性5’非翻訳領域制御配列；(2) 1つ以上のPGC発生遺伝子の1つ以上のシス作用性3’非翻訳領域制御配列；(3) 1つ以上のPGC発生遺伝子のプロモーター；または(4)これらの組み合わせにおける変異が挙げられる。シス作用性5’非翻訳領域制御配列の例としては、nanos3、dnd1、およびPiwi様遺伝子、例えば、ziwiの5’非翻訳領域制御配列が挙げられる。シス作用性3’非翻訳領域制御配列の例としては、nanos3、dnd1、およびPiwi様遺伝子の3’非翻訳領域制御配列が挙げられる。
【００４１】
1つ以上のPGC発生遺伝子の転写後調節に関与する他の遺伝子のコード配列を変異させるとは、(1) PGCの発生、維持、移動、またはこれらの組み合わせに関与する、PGC発生遺伝子の母性効果機能を低下させる、または阻害する；および(2)前述の変異を持つホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない、または阻害しない、1つ以上のPGC発生遺伝子以外の、あらゆる種類の遺伝子の変異のことである。1つ以上のPGC発生遺伝子の転写後調節に関与する、他の遺伝子のコード配列の変異の例としては、1つ以上のPGC発生遺伝子の転写後調節において、RNA結合タンパク質をコード化する遺伝子における変異および1つ以上のPGC発生遺伝子の転写後調節において、マイクロRNAをコード化する遺伝子における変異が挙げられる。1つ以上のPGC発生遺伝子の転写後調節におけるRNA結合タンパク質の例としては、Hnrnpab、Elavl1、Ptbp1a、Igf2bp3、Tia1、TIAR、Rbpm42、Rbpm24、KHSRPおよびDHX9が挙げられる。
【００４２】
生殖質の輸送、形成、またはこれらの組み合わせに関与する、他の遺伝子のコード配列を変異させるとは、(1) PGCの発生、維持、移動、またはこれらの組み合わせに関与する、PGC発生遺伝子の母性効果機能を低下させる、または阻害する；および(2)前述の変異を持つホモ接合体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない、または阻害しない、1つ以上のPGC発生遺伝子以外の、あらゆる種類の遺伝子の変異のことである。生殖質の輸送、形成、またはこれらの組み合わせに関与する、他の遺伝子のコード配列の変異の例としては、マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質、キネシン様タンパク質、またはアダプタータンパク質をコード化する1つ以上の遺伝子が挙げられる。マルチチューダードメインコンテイニングタンパク質の例は、Tdrd6である。アダプタータンパク質の例は、hook2である。
【００４３】
生殖細胞の形成、維持、移動、またはこれらの組み合わせに関与する、他の遺伝子のコード配列を変異させるとは、(1) PGCの発生、維持、移動、またはこれらの組み合わせに関与する、PGC発生遺伝子の母性効果機能を低下させる、または阻害する；および(2)前述の変異を持つホモ接合型体原始の生存能力、性決定、繁殖能力、またはこれらの組み合わせを損なわない、または阻害しない、1つ以上のPGC発生遺伝子以外の、あらゆる種類の遺伝子の変異のことである。生殖細胞の形成、維持、移動、またはこれらの組み合わせに関与する、他の遺伝子のコード配列の変異の例としては、非コードRNAを発現する遺伝子の変異が挙げられる。非コードRNAの例は、miR202-5pである。
【００４４】
図1は、どのように種親を維持することができるのか、または不妊の魚、甲殻類、または軟体類を生み出すために利用することができるのか、本開示に基づいた例を示している。ステップ1では、図1において「pgcDGsm1-n」と表されているF0モザイクファウンダーを生成するため、1つ以上のPGC発生遺伝子の母性機能を阻害する、1つ以上の遺伝子変異が、野生型の魚、甲殻類、または軟体類の胚へ提供されている。当業者にとって周知である、生物の1つ以上の遺伝子を直接操作するあらゆるバイオテクノロジー技術は、F0モザイクファウンダーの生成に利用することが可能である。PGCの産出に必要な生体物質が、1つ以上の変異を持たないゲノムを持つ母により供給されたとすると、F0モザイクファウンダーは、繁殖能力がある場合がある。
【００４５】
ステップ2では、F1子孫を産出するため、雄のF0モザイクファウンダーを野生型雌と交配する。1つ以上のPGC発生遺伝子が、野生型の母により供給されたとすると、この子孫は、繁殖能力がある場合がある。雄のF0モザイクファウンダーが、異なる細胞内に、異なる種類の変異アレルを持っているとすると、その子孫は、望ましい変異体を持つ子孫を  見つけ出すために選別される。これは図1において「m1」と指定されている。当業者にとって周知である、生物の1つ以上の遺伝子変異を同定するあらゆるバイオテクノロジー技術は、この子孫、例えば、遺伝子型選択に利用することが可能である。F0モザイクファウンダーの雄は、あらゆる母体効果遺伝子または母性効果遺伝子の組み合わせに対し、変異アレルを1つ以上持たない雌と交配させることも可能である。このような交配は、例えば、ダブルノックアウト系統の生成をスピードアップするために利用することができる。
【００４６】
ステップ3では、ステップ2のヘミ接合変異体雄F1およびヘミ接合変異体雌F1は、同じ対象となる変異を持つと同定され、F2子孫を産出するために交配される。ヘミ接合変異体雌F1が、変異した遺伝子の1野生型コピーを持つとすると、この子孫は、繁殖能力がある場合がある。F2ホモ接合変異体雌は、ホモ接合体の種親として同定および利用することができ、これは図1において、破線で指定されている。
【００４７】
ステップ4では、F2ホモ接合変異体雌の種親は、不妊のF3子孫を産出するため、野生型雌の魚、甲殻類、または軟体類と交配され、これは、不妊の種親とみなすことができる。あるいは、F2ホモ接合変異体雌の種親は、不妊のF3子孫を産出するため、ヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類、またはホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類、または野生型雄の魚、甲殻類、または軟体類と交配される。この子孫の不妊化は、F2母におけるホモ接合変異体から生じ、これは、変異した遺伝子の野生型コピーを持たない。できれば、F2ホモ接合変異体雌の種親と、ヘミ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類、またはホモ接合変異体雄の魚、甲殻類、または軟体類との交配は、変異に対しホモ接合体のF3子孫を50%または100%生み出すことがあるため、F2ホモ接合変異体雌の種親は、不妊のF3子孫を産出するため、野生型雄の魚、甲殻類、または軟体類と交配するのが望ましい。この変異遺伝子が、PGC発生における役割を超え、多面的に発現する機能を持つ場合、F3子孫は、例えば、代謝および免疫といった代替機能を損なうことがある。
【００４８】
ステップ5では、F3子孫を産出するため、図1において実線で指定されているF2ホモ接合変異体雄は同定され、同定されたF2ヘミ接合変異体雌と交配される。ヘミ接合変異体雌F2が、変異した遺伝子の1野生型コピーを持つとすると、このF3子孫は、繁殖能力がある場合がある。ホモ接合変異体雌は、ステップ4で種親として同定および利用することができる。F3ヘミ接合体雄およびF3ヘミ接合体雌は、ステップ3で交配可能なヘミ接合体の種親として同定することができる。
【００４９】
図2AおよびBは、ここで記述している、PGC発生および母性効果変異および選択した変異アレルの伝播を同定するための突然変異導入方法の概要を示すフローチャートである。図2Aは、選択した遺伝子内の所望の場所でインデルを誘発するため、ここで用いた遺伝子編集方法を示すフローチャートである。処理した胚は、卵母細胞に特異的なプロモーターから、GFP:nos3 3’非翻訳領域を発現している遺伝子導入系から誘導された。「m」とは、あらゆる生殖細胞系変異のことであり、数字は、モザイクF0における様々なインデルの可能性を示している。WT雄と交配したF0雌および遺伝子導入GFP雌と交配したF0雄の子孫は、4dpfで蛍光顕微鏡検査法により分析し、GFP-PGCを数え、記録した。それぞれのF0交配から、少なくとも12の子孫から採取したPGCの平均数を比較した。F0雌の子孫で少ないPGC数を引き起こしている変異およびF0雄の子孫で正常なPGC数を引き起こしている変異を選択し、伝播した。図2Bは、体細胞および生殖細胞系列両方の発生に対し、ハプロが十分な変異の伝播を示すフローチャートである。F2の魚を生み出すため、同じ遺伝子変異アレルを持つF1の魚を交雑した。F2の4分の1の遺伝子変異アレルは、ホモ接合体であると予測される。変異は、発生、性決定および繁殖能力には作用せず、ホモ接合変異体で繁殖能力のある雌を生み出す。この変異が、PGC形成の母性機能のみを損なう場合、あらゆる遺伝子的背景を持つ雄と交配した、これらのF2ホモ接合型雌の子孫は、全てのPGCアブレーション表現型を表すべきである。
【実施例】
【００５０】
実施例1 - ティラピアF0ジェネレーションにおける両アレルノックアウト誘発のための遺伝子編集ツールの利用
本発明者らは、色素形成に関与する2つの遺伝子、すなわち、チロシナーゼ(tyr)コード化する遺伝子[1]およびミトコンドリア内膜タンパク質MpV17 (mpv17) [2] を別々にターゲットとした。Tyrおよびmpv17それぞれの遺伝子座において、注入された胚全体の50%および46%が、高変異性を示したということを見い出した(図3)。機能欠損アレルは、胚体(図3パネルB)および網膜色素上皮(図3パネルC)において、細胞自律的に無色素の黒色素胞となり、野生型表現型と比較し同定が容易な、メラニンおよび虹色素胞色素の完全欠損から部分欠損におよぶ胚の表現型を生み出した(図3パネルA)。色素の完全欠損を示している胚(処理した魚のうち10〜30%)を、3ヶ月まで育てたが、全てにおいて野生型tyrおよびmpv17配列が欠損していた。これらの魚は、半透明およびアルビノ表現型を表し(図3パネルD)、F0ティラピアにおいて、機能的研究の実施が可能であることを示唆している。
【００５１】
実施例2 - ティラピアにおける多重遺伝子ターゲッティング
本発明者らは、多重ゲノムの遺伝子座は、同時にターゲットとすることができるのか、およびティラピアのゲノムにおいて、1つの遺伝子座で測定した変異原性効率は、もう1つの遺伝子座での変異を予測することが可能であるのかを検証した。本発明の仮説を検証するため、本発明者らは、tyrおよびDead-end1 (dnd1)を共同ターゲットとした。Dnd1は、生殖細胞運命および移動能力を維持する、PGC特異的なRNA結合タンパク質(RBP)である[3]。プログラムしたヌクレアーゼの注入後、本発明者らは、tyrおよびdnd1両方の遺伝子ターゲットにおける変異は、相関性が高いといことを見い出した。約95%のアルビノ(tyr；図4パネルAの成体表現型を参照)変異体も、dnd1遺伝子座における変異を持ち、選択マーカーとして、色素欠乏の適合性を証明していた(図4)。アルビノの魚10匹の生殖腺をさらに分析したところ、6匹の精巣が、生殖細胞のない半透明のものであった(図4パネルB)。野生型の精巣に強く発現している生殖細胞固有マーカー、vasaの発現は、dnd1変異体の精巣では、全く検知されなかった。この結果は、接合性のdnd1の発現は、生殖細胞の維持に必要であり、その上、母から寄与されたdnd1 mRNAおよび／またはタンパク質は、接合性の消失をレスキューすることはできないということを示唆している。
【００５２】
実施例3 - F0 変異体の生成
ティラピアの選択した遺伝子のオルソログおよびnos-3およびdnd1 3’非翻訳領域におけるシスエレメントは、ゲノムデータベースおよびアルゴリズムにより検索するモチーフ発見ソフトウェアから、イン・シリコで同定されている[4-7]。ヌル突然変異の生成頻度を高めるため、本発明者らは、2つの異なるエクソンを同時にターゲットとした。対象となる遺伝子と並行し、突然変異誘発選択マーカーの役割として、色素形成遺伝子も共同ターゲットとした。nos3 3’非翻訳領域をターゲットとしたものを除いた全ての変異体が、ZPC5:eGFP:nos 3’非翻訳領域構成を持つティラピア系で作り出された。本発明の先の研究に基づき、本発明者らは、胚200個へ注入することで、完全に色素が欠乏した胚を、20〜60個産出することができると予想した。これらの胚のうちの5個で、PCRフラグメント分析により、ゲノム修飾を定量的に分析した。さらに、例えば、ターゲットとなる遺伝子座2または4つの変異アレルを、フラグメント分析により検知するなど、1または2細胞期で、変異体が作られた胚のみを育てた。
【００５３】
実施例4 - 実施例3におけるそれぞれの変異体グループの表現型分析 
選択したF0変異体を、形態異常、発育遅延および性分化の目的において選別した。変異した魚が正常に発育した場合、雄3匹および雌3匹をZPC5:eGFP:tnos 3’非翻訳領域ティラピアと交配し、それぞれ4ヶ月および6ヶ月時の繁殖能力を判定した。それぞれの交配に関し、F1子孫30匹の表現型が同定され、さらに20匹を蛍光顕微鏡検査法により分析した。これらの系統は、選択的にPGCでGFPを発現しているため、全てのPGCが、生殖隆起への移動を完了したとき、4 dpfで標識されたPGCを数えることが可能である。PGC総数の平均を、独立したサンプルのt検定を用い、F1子孫全体で統計的に比較した。人工的な変異体が仮説通りに機能する場合、本発明者らは、F0雌が生成したF1の胚のGFP-PGCの数が減少またはGFP-PGCが欠損していると予想した。同様に、変異体が確実に母性効果固有である場合、本発明者らは、F0雄は、PGCの数が正常(PGC ~35+/- 5個/胚)なF1子孫を産出すると予想した (図2A参照)。
【００５４】
実施例5 - 実施例4からのF1およびF2系の生成
(異なる遺伝子背景を持つWTの魚と異系交配した) F1ヘミ接合およびF2ホモ接合系を選択するため、本発明者らは、ターゲットとなる領域におよびアンプリコンについてのQPCR融解分析(MA)を用いた(図8)。ヘテロ接合性障害はそれぞれ、特徴的な融解曲線となるため、同じインデルを持つF1子孫を再グループ化し、繁殖することが可能である。このインデルを完全に特性化するため、本発明者らは、F1の固体からPCR産物を配列した。この変異体リードは、WT配列を取り出すことで、ヘテロ接合性解読から抽出可能である。
【００５５】
実施例6 - 実施例5からの分子、細胞および形態レベルにおける不妊の確認
それぞれのRBPおよび3’非翻訳領域ターゲットに関し、WT種親と交配したF2ホモ接合変異体雄および雌のF3胚(n=30/グループ)を産出し、2〜3ヶ月目まで育てた。稚魚10匹の生殖腺を解剖し、生殖細胞固有遺伝子、vasaを用い、QPCR によりRNA/cDNAを選別した[9]。それぞれのサンプルに対し、Q-PCRを3回実施し、vasaの発現レベルは、ホストハウスキーピング遺伝子1組まで正常化した[57] (β-actinおよびef1α)。本発明者らは、不妊の魚においてvasaの発現はないと予想した。本発明者らは、5ヶ月時点で、不妊の雄は半透明の精巣を持ち、不妊の雌は紐のような卵巣を産出すると予想した。解剖した生殖腺のサブセット(n=10/グループ)をさらに、ブアン液内で固定し、薄片を作成するため、乾燥させ、パラフィンを浸透させた。生殖細胞が完全に欠損していることから、不妊であることは明確であった。
【００５６】
実施例7 - 生産形質の定量化および不妊個体群の成長率
これらの検証に向け、半同胞のグループを3つ作成するため、F2ホモ接合変異体雌3匹(不妊グループ)およびWT雌3匹(繁殖能力のあるグループ)と交配したWT雄3匹を、孵化場で決められた手順に従い、別々に飼育するする。1ヶ月目までに、ティラピアの子孫(n=100/グループ)の計量、PITタグ付けを行い、27℃に保たれた、再循環式の養殖システムの3x300リットルの水槽内で一緒に育てる。全ての魚には、1日2回、市販の養殖用の餌が飽食量与えられる。それぞれの魚は、24週かけ、4週間ごとに個別に計量および測定される。これらの魚は実験の終わりに、殺処分され、性別判定を行い、体長、重量の平均、フィレットの収量、成長曲線は、独立したサンプルのt検定により、統計的に比較される。
【００５７】
実施例8 -材料および方法
ヌクレアーゼの生成および方法：DNA二本鎖切断(DSB)を特異的ゲノム部位で作成するため、本発明者らは、人工ヌクレアーゼを使用した。ほとんどの応用で、修復テンプレートがない場合、単一DSBが産出され、非相同末端再結合(NHEJ)修復経路の活性化に繋がる。NHEJは、ある割合において、ターゲットとなる部位で挿入または欠失を生成(インデル)し、不完全な修復プロセスとなり得る。インデルの誘導は、遺伝子のコード領域内にフレームシフトを起こす、または制御領域内を変化させることができ、遺伝子翻訳またはその時空的制御を個別に妨害する。対象となる遺伝子におけるヌル突然変異の生成頻度を高めるため、本発明者らは、nos 3’非翻訳領域およびmiR202をターゲットとしたものを除いた、2つの異なるエクソンを同時にターゲットとした。対象となる遺伝子と並行し、突然変異誘発選択マーカーの役割として、色素形成遺伝子も共同ターゲットとした。
【００５８】
いくつかの実施形態において、カスタムヌクレオチド変化を、DNA配列へ誘導するため、ターゲットとなる部位を2箇所用い、操作する領域を切り離した。この方法では、この2箇所のターゲット部位の外にあるDNAの領域をターゲットとした、ホモロジーアームの間にある所望の変異体を持つdsDNAドナーベクトルが必要となる。この方法は、マイクロホモロジー指向修復(mHDR)を活性化する。そして最終的には、ドナーベクトルに含まれるDNA配列は、ネイティブな遺伝子座へ導入される(図6)。
【００５９】
人工ヌクレアーゼへのテンプレートDNAは線形化され、DNA Clean &. Concentrator-5TM(Zymo Resarch)を使用し、精製された。mMESSAGE mMACHINE T3 kit (Invitrogen)を使用し、Qiaquick columns (Qiagen)を使用し精製したキャップRNAを合成するため、線形化したテンプレートを1マイクログラム用い、終濃度800 ng/μlのRNaseフリー水内、-80℃で保管した。
【００６０】
胚への注入：畜産全般において、動物実験委員会により認可されている、動物に関するプロトコルCAT-003に従い、手順が実行される。ZPC5:eGFP:tnos 3’非翻訳領域構成または野生型株を持つティラピア系へ対し、全ての注入が実施された。プログラムしたヌクレアーゼを含有する薬液を約10 nL、1細胞分裂期の胚の細胞質へ注入した。200個の胚へ注入することで、通常、完全に色素が欠乏した胚(アルビノ表現型)が10〜60個産出される。注入から10〜12日間にわたり、胚／幼生の生存を監視した。
【００６１】
ファウンダーの選択：アルビノF0変異体を、形態異常、発育遅延および性分化の目的において選別した。変異した魚が正常に発育した場合、雄3匹および雌3匹をZPC5:eGFP:tnos 3’非翻訳領域ティラピアと交配し、それぞれ4ヶ月および6ヶ月時の繁殖能力を判定した。それぞれの交配に関し、F1子孫20匹を蛍光顕微鏡検査法により分析した。これらの系統は、選択的にPGCでGFPを発現しているため、全てのPGCが、生殖隆起への移動を完了したとき、4 dpfで標識されたPGCを数えた(実施例9参照)。PGC総数の平均を、独立したサンプルのt検定を用い、F1子孫全体で統計的に比較した。人工的な変異体が仮説通りに機能する場合、本発明者らは、F0雌が生成したF1の胚のGFP-PGCの数が減少またはGFP-PGCが欠損していたと予想する。同様に、変異体が確実に母性効果固有である場合、本発明者らは、F0雄は、PGCの数が正常(PGC ~35+/- 5個/胚)なF1子孫を産出すると予想する 。
【００６２】
母性効果特異的なPGC減少を与える変異体系に関し、F0雄3〜5匹を、蛍光PCRフラグメント分析により、ゲノム修飾を定量的に分析した(遺伝子特異的な遺伝子型決定プライマーについては、表1および表2参照)。本発明者らは、1または2細胞分裂期で変異体が産出された雄を選択した(フラグメント分析により、ターゲットとなる遺伝子座で2または4匹の変異アレルを検出)(図7)。
【００６３】
【表１】
2021531827.tif 000003
【００６４】
【表２】
2021531827.tif 000004
【００６５】
実施例9 - 初期胚におけるPGC数の定量
遺伝子導入系において、ティラピアZpc5プロモーターであるTg(Zpc5:eGFP:tnos 3’非翻訳領域)は、卵母細胞特異的プロモーターであり、第一減数分裂に先立ち、卵形成の間に活性化する。そのため、ヘテロ接合またはホモ接合トランスジェニックの雌からの胚は全て、eGFP:tnos 3’非翻訳領域mRNAを受け継いでおり、これは3’非翻訳領域(ティラピアnanos3 3’非翻訳領域)におけるシス作用性のRNAエレメントの作用により、PCG内のみに限定され、発現する。胚(受精後4日)を、トリカインメタンスルホネート(MS-222, 200-300mg/l)に最低10分間浸すことで、過量摂取により安楽死させた。ストックは、重炭酸ナトリウムでpH 7まで緩衝し、4g/Lに調整する(重炭酸塩とMS-222を2:1の割合)。この胚をガラス表面のPBSへ浸し、卵黄を取り除いた。卵黄を取り除いた胚を、顕微鏡スライドおよびカバーガラスの間で押し潰し、画像用のカメラを搭載した蛍光顕微鏡で分析した。
【００６６】
F1遺伝子型決定：選択した雄のファウンダーを、ZPC5:eGFP:tnos 3’非翻訳領域構成を持つティラピア雌と交配した。これらのF1子孫を2ヶ月まで育て、200mg/LのMS-222 (トリカイン)へ浸し麻酔をかけ、プラスチックスプーンを使い、清潔な表面へ移した。これらのヒレをかみそりの刃で切り取り、ウェル(キャップ付き96ウェルプレート)の上へ設置した。その後、蛍光PCRでヒレのDNAを分析し、ヒレを切り取った魚は、個別に容器へ入れた。簡単に説明すると、組織を消化し、gDNAを抽出するため、キレックス9.4％およびプロテイナーゼKを0.625mg/ml含有した薬液60μlを、55℃のインキュベーター内のそれぞれのウェルへ追加した。その後、このプレートを撹拌し、遠心分離した。それから、混合液内のPCR阻害物質を全て除去するため、gDNAの抽出液を、超清浄水により10倍に希釈した。本発明者らは、同一サイズの変異体を持つ稚魚約20匹を選択し、育てるため、主に稚魚／ファウンダー80匹を分析した。
【００６７】
蛍光PCR(図7参照)：PCR反応には、水3.8 μL、フィンDNA0.2 μLおよび、蛍光タグで標識したテイルドプライマー(6-FAM、NED)、フォワードテイルによるアンプリコン特異的フォワードプライマー(5′ -TGTAAAACGACGGCCAGT-3′および5′ -TAGGAGTGCAGCAAGCAT-3′)、アンプリコン特異的リバースプライマー(遺伝子特異的プライマーは表1および2に記載)の3つのプライマーを含有するプライマーミックス1 ul のPCRのマスターミックス(Quiagen Multiplex PCR) 5 μLを用いた。PCR条件は次の通りである：95°Cで15分変性ののち、増幅30サイクル(94°Cで30秒、57°Cで45秒、および72°Cで45秒) 、その後増幅8サイクル(94°Cで30秒、53°Cで45秒、および72°Cで45秒)および最後の伸長反応72°Cで10分、および4°Cで無期限に保持。
【００６８】
結果として生じるアンプリコンの1:10希釈液1〜2マイクロミリリットルは、塩基対の解像度に的確なアンプリコンのサイズを決定するためのLIZ標識サイズ基準を追加したキャピラリー電気泳動(CE)により分解された(Retrogen Inc.、サンディエゴ)。Rawトレースファイルは、Peak Scannerソフトウェアにより分析された(サーモフィッシャー)。野生型のピーク対照と比較したピークのサイズにより、変異の本質(挿入または欠失)および長さを決定する。ピークの回数は、モザイクのレベルを示している。本発明者らは、最少の変異アレルを持つF0モザイクファウンダーを選択した(選択的に2〜4ピーク)。
【００６９】
このアレルのサイズは、観察中のインデル変異を研鑽するために使用された。配列決定によりさらに確認するため、ターゲットとなる遺伝子の非コード配列における変異を除き、3 bpの倍数ではないため、フレームシフト変異となると予想される変異体が選択された。次世代のためのQPCR融解分析による遺伝子型決定を容易にするため、8bpよりも大きいが、30bpよりもサイズの小さい変異が優先的に選択された。配列確認に関し、この選択したインデルのPCR産物はさらに、遺伝子配列へ送信される。同時に2つのリードが存在するPCRの配列決定クロマトグラフィーは、インデルの存在を示している。欠失または挿入の開始は通常、配列リードが分岐したときに始まる。二重配列はその後、一意のヌクレオチドリードを検知するため、慎重に分析される。野生型配列そのものを徐々にシフトすることにょり生成された一連の人工的な単一のリードパターンに対し、一意のヌクレオチドリードのパターンが分析される。
【００７０】
実施例10 - 胚の生存能力、発達異常および、成体における両性の存在に対する変異体の魚の分析
単一遺伝子ヘテロ接合変異体の魚の相互交配により生成された胚は、目に見える全体的な異常について、実体顕微鏡を使い分析された(明るい照明および蛍光灯照明の両方)。子孫となる卵は、成体期まで育てられた(3〜6ヶ月間)。魚の成体から切り取られたヒレは、DNAを抽出するため、キレックスレジンを使用し処理され、融解分析による遺伝子型決定に使用された：実施例10−融解分析によるF2および次世代遺伝子型決定(下記参照)。
【００７１】
リアルタイムqPCRは、ROTOR-GENE RG-3000リアルタイムPCRシステム(Corbett Research)により実施した。1-μL遺伝子DNA(gDNA)テンプレート(5-20ng/μlで希釈)を、フォワードおよびリバースプライマーそれぞれの濃縮液0.15 μMおよびQPCR 2x Master Mix (Apex Bio社製品) 5 μLを含有する合計10μL使用した。使用したqPCRプライマーは、表1および2(表2では遺伝子型決定RT-PCRプライマー)に記載されている。このqPCRは、95°Cで15秒、60°Cで60秒の40サイクルの後、アッセイの特異性(67°Cから97°C)を確認するため、融解曲線分析により実施された。この方法において、対象となる領域を含む、短いPCRアンプリコン(約120〜200 bp)がgDNAサンプルから生成され、これは温度依存性解離(融解曲線)に依存する。ヘミ接合型gDNA内でインデルの誘発が起こると、ヘテロ接合型分子および異なる二本鎖分子が形成される。二本鎖分子の複数形成は、融解プロファイルにより検知され、二重溶解が、単一種として機能しているのか、または1つ以上の種として機能しているのかを表す。概して、融解曲線および融解温度の対称性は、dsDNA配列および長さの均一性を暗示している。従って、ホモ接合型および野生型(WT)は、異なる融解温度により区別可能な、対称的な融解曲線を表す。この融解分析は、同じマスターミクス反応と同時に増幅した(対照野生型DNAからの)参照DNAサンプルと比較し、実施された。要するに、融解プロファイルにおける変化は  ホモ接合型、ヘミ接合型およびWT gDNAから生成したアンプリコンにより異なる(図8参照)。
【００７２】
ホモ接合WTおよびヘテロ接合型の魚と比較した、残存するホモ接合体ノックアウトの魚のメンデル比率を分析するため、遺伝子型決定データを使用した。この細胞生存の選択なしという帰無仮説に基づき、子孫の遺伝子型は、予想したメンデル比率1:2:1に一致するべきである。予想されるホモ接合体キックアウト数(25％)からの偏位は、カイ二乗適合度統計分析により検証した。
【００７３】
性比の決定：3〜4ヶ月時点で、子孫(n=40/グループ)の性別判定を行った。性別特有の泌尿生殖突起に基づき、視覚的に雄および雌を同定した。
【００７４】
生殖腺の形態および細胞分析：生殖腺の形態を全体的に比較し、不妊を評価した。ホモ接合型母系子孫の生殖腺の構造を、年齢が同じ(3ヶ月)父系子孫(繁殖能力を制御)と比較した。生殖腺の細胞構造を分析するため、本発明者らは、この生殖腺をブアン液内で48時間固定した。エタノールで乾燥させ、トルエンで洗浄した後、パラフィンを浸透させ、埋め込み、薄片を作成した。2人のレビュアーが予備知識なしで、それぞれの薄片を読み取った。生殖腺が、紐のような構造へと縮小し、卵母細胞がない  ことを表す組織切片から、雌が不妊であることは明確である。
【００７５】
分子レベルにおける不妊の確認：解剖した生殖腺(それぞれの父系および母系グループ／系統)から全RNAを抽出し、生殖細胞特異的遺伝子(tilapia vasa accession #AB03246766)および生殖腺を個別にサポートする体細胞(雄および雌の生殖腺に対し、それぞれtilapia Sox 9aおよびtilapia cyp19a1a)の発現を定量化するため、対応するcDNAを選別した。Q-PCRを3回実施し、ホストハウスキーピング遺伝子(tilapia b-actin)の発現レベルは正常化した。決められた手順により、相対的なコピー数を予測した。本発明者らは、不妊の魚におけるvasaの発現はないが、野生型の精巣に関してはsox9aが正常に発現すると予想した。
【００７６】
実施例11 - 選択した遺伝子および制御配列での変異に関連するF0表現型
選択した遺伝子のコード配列または制御配列が、PGC発生にとって不可欠であるかどうかを検証するため、本発明者らは、ドナーDNAの有無に関わらずプログラム可能なヌクレアーゼを使用し、ティラピア変異体を生成した。Nanos3 (nos3)、Dead end-1 (dnd1)、TIAR、Tia1、KHSRP、DHX9、Elavl1、Elavl2、Igf2bp3、Rbm42、Rbms (Hermes) 、Rbm24、Hnrnph1、Hnrmpab、Tdrd6、Hook2、Ptbp1a、KIF5B、Cxcr4a遺伝子におけるヌル突然変異の生成頻度を高めるため、本発明者らは、それぞれの遺伝子の2つの異なるエクソンを同時にターゲットとした。機能欠損変異が生成される可能性を最大化するため、本発明者らは、コード領域の前半でターゲットとなる部位を優先的に選択した。対象となる遺伝子と並行し、突然変異誘発選択マーカーの役割として、色素形成遺伝子も共同ターゲットとした(図3)。さらに、dnd の3’非翻訳領域が、その接合機能に必要であるかを検証するため、本発明者らは、dnd1コード配列のβ-globin 3'非翻訳領域下流へ、ターゲットとなる組み込みを実施した。さらに本発明者らは、nos3 3’非翻訳領域における進化的保存モチーフをターゲットとし、本発明者らが仮定したdnd1 3’非翻訳領域は、卵母細胞および初期胚の対応するmRNAの時空的制御に関与している(図9)。これらのモチーフは、i) オルソログmRNAs の3'非翻訳領域上での同時存在、ii) miRNA結合配列を推定するための並置およびiii)二次構造分析(実施例17の説明参照)に基づき、同定および優先的に選択された。また本発明者らは、発達中の胚のPGCに限定されたmiRNA(miRNA202-5p) (Zhang, Liu et al. 2017)もターゲットとした。
【００７７】
F0処理済みの胚の生存および変形を分析し、注入されていない対照と比較した。本発明者らは、RbmsおよびHnrnph1 F0処理済みの胚の生存率は低く、アルビノの魚は回収されなかったということを見い出し、これは、これらの遺伝子が、胚の形態形成において必要不可欠な役割を果たしていることを示唆している。同様に、KIF5Bにより処理した胚の生存率も低かった。それでもなお、本発明者らは、重度の形態学的異常を示す、生存能力のあるF0 KIF5B変異体の回収および伝播に成功した。
【００７８】
本発明者らは、処理グループおよび残り17個のターゲットとなる遺伝子に対する、その他あらゆる遺伝子変異型の魚の対照グループ間で、生存能力または目に見える全体的な異常における大きな違いを認めなかった。それぞれの処理グループに関し、最低20匹のアルビノを選択し、伝播した。全てのF0変異体処理グループは、nos3 (88%雄、n=42)、dnd1 (83%雄、n=41)、Tia1 (80%雄、n=20)およびElavl1 (90%雄、n=20)を除いては、 5ヶ月時点において、正常な性比となった(表3参照)。さらに、本発明者らは、nos3およびdnd1のコード配列の破壊により、nos3 F0 雌の30% (n=3/10) およびdnd1 F0 雄の60% (n= 4/10)が非配偶体の成体となることを見い出した。これらの魚において、成熟期に抜去処理をすることにより、配偶子が産出されなかった。これらの生殖腺をさらに分析し、本発明者らは、F0 nos3変異体雌では紐のような卵母細胞のない卵巣および、F0 dnd  変異体雄では精子のない半透明の精巣であることを見い出した(図4)。野生型の精巣および卵巣内に強く発現した生殖細胞特異的マーカー、Vasaの出現は、驚くことにこれらの魚の生殖腺(nos3およびdnd1 F0生殖腺)からは検知されなかった。興味深いことに、dnd1コード配列のβ-globin 3'非翻訳領域下流へ、両アレルを正常に組み込むことで、雄が不妊化した。
【表３−１】
2021531827.tif 000005
【表３−２】
2021531827.tif 000006
【００７９】
次に、本発明者らは、変異体の母性効果が、PGC発生経路を変化させたかどうかを決定するため、変異体の母性効果を調査した。これに関し、それぞれの処理グループから、F0雌ティラピアシブリング2〜4匹を、野生型雄と繁殖し、PGC数を数えるため、その胚子孫を蛍光顕微鏡検査法により分析した。PGCアブレーションレベルの平均は、ターゲットとなった遺伝子により、20％から85％に及んだ(図11および表3)。それぞれの処理グループの異なるF0雌は、ターゲットとなる位置での、配列結果のモザイク化による可能性が高いことにより、異なるPGCアブレーションレベルの胚を産出した。これに対し、雌Tg(Zpc5:eGFP:nanos 3’非翻訳領域)と交配した全てのF0変異体雄は、正常なPGC数の胚(PGC平均35〜42個/胚)を産出した。
【００８０】
nos3 3’非翻訳領域に変異を持つF0雌が、PGC数の少ない胚を産出するかどうかを決定するため、本発明者らは、これら子孫の4ヶ月および6ヶ月時点での生殖腺を分析した(この処理グループのF0雌はGFP導入遺伝子を持っていないため、PGC数を数えることは不可能である)。驚くことに、本発明者らは、半透明の精巣および紐のような卵巣を持ち、生殖腺重量指数が低いという特徴のある、母性効果の不妊化を認めた(図12パネルAからD)。従って、nos3コード配列における変異が、雌の不妊化を引き起こす一方で、nos3 3’非翻訳領域保存モチーフにおける不連続な変異は、卵母細胞の発生を阻害しなかった。その代わり、このような変異は、変異体雌の胚子孫におけるnos3 mRNAの翻訳後調節のみを阻害すると思われる。PGC発生における変異の母性効果は、次世代で確認され、下記の実施例16においてさらに議論された。
【００８１】
本発明者らは、TIA1、Rbms42およびPtbp1aにおける変異を持つ、 F0雌子孫のPGCが激減した生殖腺の発達をさらに分析した。本発明者らは、PGC数の少ない個体およびPGC数の多い個体を比較し、PGC減少レベルおよび生殖腺のサイズ縮小の間に、強い相関関係を見い出した(図12パネルEからF)。本発明者らは、PGC数が激減した個体における半透明な精巣および萎縮性の紐のような卵巣を含む、母性効果の不妊表現型を観察した(図12パネルEからH)。
【００８２】
本発明の結果全体として、遺伝子の機能の欠損または誤発現が、母性効果PGCの激減および、関連する不妊表現型を与える、いくつかの遺伝子を同定した。
【００８３】
実施例12 - F1およびF2ジェネレーションにおける表現型の検証
F0変異体ティラピアは、ターゲットとなるDNA二重鎖切断の位置で、予想不可能な複数の配列結果を持ち、残りの野生型またはインフレームインデル配列が、どのくらい表現型を覆い隠すことができるかは未知であるため、表現型の特徴分析を追加で実施した。さらに、オフターゲットのヌクレアーゼ活性は、表現型に寄与しているようであった。従って、本発明者らは、必ず複数のオフターゲット変異が分離され、次世代の子から消失するよう、この対象となる変異を選択的に伝播した。最終的には、F2ホモ接合体ジェネレーションにおける動物の全ての細胞内で、同一の変異が発見されたとき、完全な表現型を測定することが可能である。それにより、それぞれの処理済みグループに関し、本発明者らは、フレームシフト変異、ターゲットとなる遺伝子への挿入または正確な編集のいずれかに対し、ヘテロ接合体F1魚を生成するため、選択した生殖細胞系の遺伝変異を持つファウンダー雄を、雌Tg(Zpc5:eGFP:nanos 3’非翻訳領域)と異系交配した。
【００８４】
インデルのサイズおよび予測cDNAおよびタンパク質など、選択した変異アレルの詳細は表3に要約され、図13〜31、33および35に示されている。nos3(図33)およびdnd1 (図35)の3’非翻訳領域における変異は、選択的に取り除かれた(欠失)、または推定制御モチーフと置き換えられた(遺伝子の置換)。最後に、miR-202-5pのseed配列を完全にまたは部分的に取り除くため、 miRNA-202における変異を選択した(図31)。
【００８５】
これらの変異を持つヘテロ接合体ティラピアは健康であり、繁殖能力のある両性別の成体へ分化しているようである。選択した変異体の全ての細胞内の、それぞれのターゲット遺伝子の野生型変異アレルの存在を考慮すると、これらの性的に成熟したF1ジェネレーションにおける、この生殖表現型の欠如は、予想外なことではない。
【００８６】
PGC発生において、ターゲットとなる遺伝子の明らかに重要な役割を考慮し、本発明者らは、これらが量依存性メカニズムを表しているかどうかについて、さらに検証した。この目的を達成するため、本発明者らは、母の機能mRNA/タンパク質の量を減らすことで、PGCの数が減少するのかを調査した。実際に、ヘミ接合変異体雌の卵母細胞内に、両アレルが発現するが、機能タンパク質のコードに対してのみである。従って、ターゲットとなる遺伝子が、量に依存する方法により機能する場合、本発明者らは、野生型雄と交配したヘミ接合型雌の子孫のPGC数は減少するものと予想するべきである。本発明者らは、KHSRP (KSHRP △17/＋)およびElavL1 (ElavL1△3k/＋)に対するヘミ接合変異体は、正常な数のPGCを持つ胚子孫を産出したということを見い出した(図36)。これに対し、本発明者らは、nos3 3’非翻訳領域モチーフ1△32/+およびnos3 3’非翻訳領域モチーフ1△8/+だけでなく、TIARi11/+、TIA1△10/+、DHX9 △7/+、Igf2pb3△2/+、Elavl2△8/+、Ptpb1a △1.5k/+、Hnrnpab △8/+、Rbm24△7/+、TDRD6△10/+およびmiR202-5p△7/+miR202-5p△8/+の子孫における、PGCの著しい減少も測定し(40〜50%減少)、遺伝子量に非常に敏感であることを明らかにした(図37)。
【００８７】
初期発生過程における変異の接合効果の可能性をさらに調査するため、本発明者らは、ヘミ接合変異体雄と交配したヘミ接合変異体雌の胚子孫の生存率を記録した。本発明者らは、胚子孫の約25％が、変異アレルに対し、ホモ接合型体であると予想した。
【００８８】
白色実体顕微鏡を使い、本発明者らは、KIF5Bファミリーの幼生の〜25％が、重度の頭蓋顔面奇形を発症し、曲がった尾を持つ湾曲した体となることを測定した(図10)。これらの変形した幼生は、遺伝子型が同定され、KIF5B△1/△1アレルを持つということを見い出した。F2ホモ接合KIF5B△1/△1変異体の受精後7日目の死亡率は、95％に達し、ホモ接合変異体KIF5Bは全て、30日で死亡した。本発明者らは、その他全てのターゲットとなる遺伝子に対し、明確な形態的な体細胞異常を確認せず、残存している、および解剖学的に区別がつかないシブリング子孫の中で、ホモ接合変異体の約25％が同定された。
【００８９】
発生段階の後期において、ターゲットとなる遺伝子の考えられる機能を詳しく確認するため、本発明者らは、それぞれの胚を成体期まで育て、ホモ接合型、ヘミ接合型およびWTシブリング子孫の性比、繁殖能力および生殖腺の形態を分析した。
【００９０】
F0ジェネレーションに見られた表現型と一致し、接合nos3およびdnd1 mRNAの欠損は、不妊表現型となった。本発明者らは、nos3ノックアウト(nos3 △5/△5)は、両性の魚となることを見い出した。本発明者らは、nos3△5/△5雌は、紐のような卵巣を持つ非配偶体となることを見い出した(図39)。さらに、nos3が不十分な雄の精巣は、WTおよびヘミ接合変異体のピンク色の不透明な精巣と比較し、部分的に半透明であった。6ヶ月時点で、nos3 △5/△5雄の精子濃度は激減した；しかし、本発明者らは、精子の形態、運動性または機能に異常はないことを見い出した。従って、nos3 △5/△5雄には、成熟遅延が見られるが、繁殖能力に変わりはない。
【００９１】
本発明者らは、dnd1 KOティラピア(dnd1)のみを育てたところ、全てが雄となった(n=17)。これらの雄は、半透明な精巣を持ち、これらの精巣を細胞および分子分析し、非配偶体であることを確認した(図38)。
【００９２】
さらに本発明者らは、生殖腺の形態および分子分析が示す通り、機能を欠損した変異体は、両性別において配偶子を完全に抑制するため、RNA結合タンパク質Elavl2は、雄および雌の両方において、配偶子形成の基盤となるということを示している(図40)。
【００９３】
実施例13 - 母性効果不妊表現型を持つ単一ホモ接合KO遺伝子
その他全てのターゲットとなる遺伝子に関し、本発明者らは、所望するメンデルの法則に基づく頻度で、予想していた成体期を通して明らかな表現型のない遺伝子型を全て回収した。母性効果不妊表現型を全て測定するため、本発明者らは、ホモ接合変異体雌を、WT雄と交配し、胚子孫を分析した。本発明者らは、TIAR、KHSRP、TIA1、DHX9、Elavl1、Cxcr4のアレルに対し、ホモ接合体雌の子孫において、 PGCが著しく減少していることを認めた(図45)。変異体雌のPGCが激減した子孫を成体期まで育て、その生殖腺のサイズおよび変化を分析した。本発明者らは、胚における重度のPGC欠損と一致する、生殖細胞が激減した半透明の精巣だけでなく、紐のような構造の萎縮性卵巣も見い出した。これに対し、F2変異体雄の子孫では、正常なサイズの生殖腺に発達した。例えば、本発明者らは、TIAR1ホモ接合変異体雌は、生殖腺重量指数の平均が、対照(ホモ接合変異体雄の子孫)よりも10〜20倍少ない子孫を産出したことを測定した(図43)。nos3コード配列におけるヌル突然変異と比較し、nos3 3’非翻訳領域に存在するモチーフ1配列の欠失は、雌の不妊化には繋がらず、これはこのモチーフが、卵原幹細胞の維持に必要ではないことを示唆している。ただし重要なのは、これらの雌は、重度のPGCアブレーションを持つ胚を産出するということである(図41および44)。残りの遺伝子に対するこの母性効果表現型については、現在調査中である。単一遺伝子不活性化から生じた不完全なPGCアブレーション表現型は、これらの遺伝子は、かなりの遺伝的重複を持つ複合経路に関与していることを示唆している。
【００９４】
実施例14 - PGC形成の遺伝的構造の解剖
PGC発生の遺伝的構造をより理解し、これらのプロセスに関与する遺伝子の作用の機能的順序を決定するため、本発明者らは、二重変異体系統を確立し、単一遺伝子または二重遺伝子機能損失表現型の子孫におけるPGCの数を比較した。さらに、存在する変異が、nos3の翻訳後調節を支配しているかを決定するため、本発明者らは、卵母細胞特異的プロモーター(MSC遺伝子導入系)の制御のもと、baxを nos3 3’非翻訳領域へ融合したプロアポトティック遺伝子を発現したティラピアの遺伝子導入系での単一変異の効果を詳しく調べる。本発明者らは、MSC雌は、これらの細胞内のBAXの異所性母性発現から、PGCが不足している胚を産出するということを、すでに確立している(Lauth and BUCHANAN 2016)。
【００９５】
本発明者らは、MSC-khrsp△16/△16、MSC-DHX9△7/△7、MSC-TIARι11/ι11を持つティラピア系において、相加的PGC効果のみを発見したが、これはこれらの遺伝子が、nos3’非翻訳領域とインタラクトしないことを示唆している(図44)。実際、このMSCは、bax:nos3 3’非翻訳領域の発現を、胚子孫のPGCへ移動させるための卵母細胞そのものの細胞機構を、利己的に利用するために設計されていた。ターゲットとなる遺伝子が、nos3 3’非翻訳領域の翻訳後調節に関与していた場合、アポトーシス促進タンパク質Baxの発現は、PGCに制限されず、MSC-PGCアブレーション能力を制限している。本発明者らは、DHX9、TIALおよびKHSRPは、nos3の局在化には、直接的または間接的にも関与していないと結論づけた。
【００９６】
実施例15 - PGC発生に制限されない多面的表現型を持つティラピア生殖質遺伝子
本発明の突然変異誘発スクリーニングにより、ティラピアにおけるこの遺伝子の不活性化が繁殖能力のある雌の発達を妨げる、新たな生殖質遺伝子が明らかとなった。本発明者らは、Hnrnph1およびRbmsの不活性化が、胚性致死に繋がるということを見い出した。本発明の結果はさらに、Kif5Baが不足している胚は、中等度から重度が入り混じった腹側化表現型(Campbell, Heim et al. 2015)を示すという前述の結果に合致している。
【００９７】
本発明の結果は、ティラピアにおけるnos3の接合機能は、成熟期に紐のような萎縮性卵巣を持つnos3△5/△5変異体雌では、卵原幹細胞の維持に必要であるが、一方で、変異体雄の繁殖能力に変わりはないことを示している(図39)。興味深いことに、本発明のnos3変異体ティラピア雌は、雄表現型へ性別が逆には戻ることはなかった。この点について、本発明の結果は、Li et al (Li, Yang et al. 2014)の結果には合致せず、ティラピアにおける生殖細胞に依存しない性決定方法を示している。
【００９８】
本発明の結果は、接合型dnd1発現が、生殖細胞の継続的な維持に必要であり、その上、母から供給されたdnd1 mRNAおよび／またはタンパク質は、この遺伝子の接合機能を回復することはできないということを示した、タイセイヨウサケにおける過去の研究結果(Wargelius, Leininger et al. 2016) を確証する。
【００９９】
本発明者らは、ショウジョウバエelav遺伝子産物に非常に類似している(胚性致死、異常な視覚系)、タンパク質をコード化するElavL2内に機能欠損変異体を生成した。この欠損は、複数の構造上の欠損および胚性致死を引き起こす。Elavl2は、初期胚発生中、PGC内だけでなく、ゼブラフィッシュの脳内に多量に発現することがわかった(Thisse and Thisse 2004, Mickoleit, Banisch et al. 2011)。このため、本発明者らは、ティラピアElavL2△8/△8ホモ接合変異体が生存可能であり、不妊の雄および雌に成育するということに驚いた(図40)。従って、nos3、dnd1、vasaおよびpiwi様遺伝子同様、Elavl2も、成体の生殖細胞を確実に維持する重要な接合機能を表している。
【０１００】
実施例16 - PGC形成に関与する新規RNA結合タンパク質
意外なことに、本発明者らは、機能欠損変異体が、成体期まで他に明らかな表現型のない、重度の欠損をPGC発生において産出する遺伝子を同定することに成功し、これは、これらが生存能力または繁殖能力には必要ではないことを示している。ここで、本発明者らは、生殖細胞が、母性遺伝により指定されるあらゆる動物種において、TIA1, TIAR, KHSRP, Rbm24, Rbm42, DHX9, Igf2pb3, Hnrnph1およびElavL1機能欠損変異により生じる欠損を初めて記述した(例、全ての魚、多くの昆虫種およびカエルの種)。これらの遺伝子に対し、変異体母に由来する胚は、平均で、PGC数が60％から最大88％減少した。一部だが全てではない母体変異体表現型では、この減少は、この量的形質の分散における増大と相関関係があった。分散の増大は、生殖細胞の数をコントロールする遺伝子制御ネットワークを安定させるための、緩衝剤の役割を示唆している。TIAL1が欠如しているネズミは、部分的な胚性致死および欠損のある生殖細胞変異を示し(Beck et al., 1998)、これには、脊椎動物発生の本質的側面の制御におけるTIAL1タンパク質が関係している。また本発明者らは、ティラピア内のHook2、Tdrd6、dnd1およびKIF5Bの不活性化により生じる最初の欠損についても記述する。
【０１０１】
実施例17 - 3’非翻訳領域制御モチーフの同定および機能分析
生殖細胞の維持に必要な重要なタンパク質の多面的な機能に関連する問題を解決するため、本発明者らは、接合作用に影響を与えることなく、選択的に母性遺伝子機能を不活性化する可能性を調査した。本発明者らは、生殖細胞系の形成および継続的な維持のため、胚および成体内でそれぞれ必要なティラピアnos3およびdnd1の3’非翻訳領域機能を特別に調査した。PGC形成におけるElavl2の関与の可能性(Mickoleit, Banisch et al. 2011)、および成体内の生殖細胞系維持におけるその必要条件(本発明の研究)を考慮し、本発明者らは、さらにElavl2 3’非翻訳領域も分析に含めた。
【０１０２】
成熟した生殖細胞維持におけるティラピアdnd1 3’非翻訳領域の寄与を照合するため、本発明者らは、3’非翻訳領域とティラピアβ-globin遺伝子の 3’非翻訳領域との交換実験を実施した。細胞質β-globin遺伝子の発現は概ね、全ての細胞型において構成的および遍在的であるとされ、PGCの発現に必要なシス作用性モチーフに欠けていると予想される(Herpin, Nakamura et al. 2009)。本発明者らは、β-globin 3’非翻訳領域は、dnd1の接合機能を維持するため、代替3’非翻訳領域として使用することはできないということを見い出し、これは、特定の翻訳後調節が、接合体におけるDND1作用に必要であることを示唆している。
【０１０３】
生殖質へのRNA分布は、接合機能へ対する必要条件は未検証のままである、3’非翻訳領域特異的シス作用性エレメントにより媒介される。まず、候補となる制御エレメントをマッピングするため、本発明者らは、様々な種で異なるnos3, dnd1およびElavl2転写物の 3’非翻訳領域配列を、ウェブベースのモチーフ発見アルゴリズムソフトウェアへ代入した。複数の配列アライメントにおいて、配列の類似性が低く、長さには3〜9倍の違いがあるにも関わらず、本発明者らは、これらオーソロガス遺伝子に対する3’非翻訳領域における異なる保存モチーフの同定に成功した。nos3 3’非翻訳領域配列の分析結果は、2つの保存モチーフを明らかにし、このうち1つは分析したnos3 3’非翻訳領域配列全てに存在している(図32)。dnd1 3’非翻訳領域の分析結果は、ネッタイツメガエル内だけでなく、検証した様々な硬骨魚類全体の異なる位置で発見される、予測した2つ結合モチーフ1組である(図34)。最後に、Elavl2 3’非翻訳領域で同定される2つのモチーフを分析し、このうちの1つは、検証した全ての種における3’非翻訳領域内の同じ位置に存在していた(図35AおよびB)。2つ目のElavl2モチーフ(Elavl2モチーフ2)は、タイセイヨウサケ、メダカおよびナイルティラピア内に完全に保存されている(図36パネルC)。RNA制御エレメントは通常、二次構造の一環の中で大まかに定義された一次配列の組み合わせを伴うため(Keene and Tenenbaum 2002)、本発明者らは、RNAフォールディングアルゴリズム(Kerpedjiev, Hammer et al. 2015)を用い、これらの領域の計算検証を実施した。異なるモチーフの中で、nos3-モチーフ1およびdnd1-モチーフ1は、RNA配列およびフォールディング予測における類似性を分析するいくつかのプログラムにより、共に識別された。この配列アライメント、モチーフロゴ(それぞれの位置でのヌクレオチド相対度数の図示)およびこれらのモチーフに対する予想二次構造は、図32および33で示されている。
【０１０４】
これらの領域の尤度をさらに評価するため、本発明者らは、miR-430、miR-23およびmiR-101へ対するSeedターゲットの結果対合のスキャンを実施した。miR430は、ゼブラフィッシュの初期胚内に、最も豊富にあるmiRであり、体細胞内のnos3およびtdrd7 mRNAsを抑制することがある(Mishima, Giraldez et al. 2006)。これらの保存miRNAファミリーは、多くの硬骨魚類種において、未受精卵および初期胚内で検知され(Ramachandra, Salem et al. 2008)、これは、おそらく生殖質RNAを制御しているであろう、重要な保存された役割を示唆している。本発明者らは、ティラピアdnd1 3’非翻訳領域内に、oni-miR-23推定位置を2箇所、ティラピアnos3およびdnd1 3’非翻訳領域の予想した保存結合モチーフ1および2のすぐそばに位置する、ティラピアnos3 3’非翻訳領域内にmiR-430を1箇所およびmiR-101を1箇所発見した。いかなる理論にも拘束されることを望むものではないが、本発明の分析は、mRNA-タンパク質複合体(mRNPs)のシス作用モチーフおよびトランス作用RNA結合因子内に保存されているメカニズムを示唆している。これらのインタラクションは、生殖質に特異的な方法におけるmiRNAの分解を防ぐことがある。
【０１０５】
最初に仮定した通り、nos3機能欠損変異体とは対照的に、本発明者らは、nos3-3’非翻訳領域モチーフ-1の破壊は、遺伝子の接合機能を損なわないということを見い出した。本発明者らは、モチーフ-1が不足している雌では、機能性卵巣が発達することを認めた。重要なことに、本発明者らは、このモチーフは、遺伝子の母性機能にとって必要であるということを確証した。本発明者らは、モチーフ-1が不足している雌は、性的な成熟遅延および／または非配偶体成体となるPGCが激減した胚を産出するということを認めた(図41BおよびA)。この18-merおよび広範囲の生物に及ぶオーソロガス遺伝子の3’-非翻訳領域内の他のモチーフの発生は、魚からカエルまで、下等脊椎動物全体における3’非翻訳領域の機能的互換性を説明することができる。
【０１０６】
本発明者らは、RNA結合タンパク質の結合モチーフターゲットの予想へ対し、同様の方法を用いることが可能であり、このような系統的な同定は、PGC形成を支配する付加的な母性遺伝子の脱制御を達成するため、組み換えのための貴重なターゲットを同定するということを提案する。
【０１０７】
本発明者らは、その他の保存3’非翻訳領域制御配列は、ホモ接合変異体雌の生存、性決定または繁殖能力へ対し有害な、多面的に発現する表現型とはならないと推測する。このシス作用性エレメントの保存性質は、魚の異なる養殖種で、同じ母性効果表現型を達成するため、特にこれらの配列をターゲットとして魅力的にする。  
【０１０８】
例18-miR-202-5pを対象とした修飾の分析
本発明者らは、PGC発生に関し、miR-202-5pの不活性化により生じる効果を初めて記述する。このmiR202は、進化的に保存され、成熟した転写物を2つ、miR-202-5p およびゼブラフィッシュ(Juanchich, Le Cam et al. 2013)、インドメダカ(Presslauer, Bizuayehu et al. 2017)、ニジマス(Juanchich, Le Cam et al. 2013)、ティラピア(Xiao, Zhong et al. 2014)、大西洋オヒョウ(Bizuayehu, Babiak et al. 2012)およびネッタイツメガエル(Armisen, Gilchrist et al. 2009)の後期卵黄形成期間中、卵巣内で優性なアームを示すmiR-202-5pを持つmiR-202-3pを持っている。メダカにおけるmiR-202 (combined loss of miR202-3pおよびmiR202-5pの複合欠失)の不活性化は、異常および生存能力のない、少ない数の卵を生む、卵子が不足している不妊の雌または低受精率の雌に繋がるということが、最近報告された。この生殖表現型は、卵胞形成に障害を及ぼす(Gay, Bugeon et al. 2018)。興味深いことに、本発明のF0およびF1 miR-202変異体雌は、生存能力のあるPGCが激減した子孫を産出した。
【０１０９】
参照
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【０１１０】
配列一覧
【０１１１】
SEQ ID NO 1
長さ: 40
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー (NED)
配列: 1 
TAGGAGTGCAGCAAGCATGTGAATTTCCATTCGTGAACCG
【０１１２】
SEQ ID NO 2
長さ: 21
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 2 
gaagacaTAGCGCGTTATATG
【０１１３】
SEQ ID NO 3
長さ: 38
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 3 
TGTAAAACGACGGCCAGTTTTGCATATGGGCAGACATC
【０１１４】
SEQ ID NO 4
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 4 
agtctcagatcttaaccatata
【０１１５】
SEQ ID NO 5
長さ: 42
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 5 
TAGGAGTGCAGCAAGCATtataattcattgttgtgggttgta
【０１１６】
SEQ ID NO 6
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 6
Tgacacattggctgagactttc
【０１１７】
SEQ ID NO 7
長さ: 39
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 7 
TGTAAAACGACGGCCAGTCCATTCTGAAGTTATCCTTTT
【０１１８】
SEQ ID NO 8
長さ: 20
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 8
TCATAGCTCCCTCCTGTGGC
【０１１９】
SEQ ID NO 9
長さ: 37
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 9 
TAGGAGTGCAGCAAGCATtctttcacagGGTCCACCG
【０１２０】
SEQ ID NO 10
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 10
TGACGAGATATCTCCACAAATGC
【０１２１】
SEQ ID NO 11
長さ: 40
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 11 
TGTAAAACGACGGCCAGTTGATTTGAATCCAGAGATTACT
【０１２２】
SEQ ID NO 12
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 12
tggttggactgaaacatattgt
【０１２３】
SEQ ID NO 13
長さ: 39
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 13 
TAGGAGTGCAGCAAGCATtgtccttcagGTTGATTACAG
【０１２４】
SEQ ID NO 14
長さ: 21
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 14
gtcaaactcacTCTACTCCAA
【０１２５】
SEQ ID NO 15
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 15 
TAGGAGTGCAGCAAGCATGGCTTCAACTACATTGGGATGGG
【０１２６】
SEQ ID NO 16
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 16
GGGAGGTTTCCAAAGCCAGCAT
【０１２７】
SEQ ID NO 17
長さ: 37
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 17 
TGTAAAACGACGGCCAGTttctcagGGGACGGCAGCG
【０１２８】
SEQ ID NO 18
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー 
配列: 18
GTCTCTCTTGGCGTAATACTCC
【０１２９】
SEQ ID NO 19
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 19 
TAGGAGTGCAGCAAGCATGGCAATGGAGAAGCTGAATGGAT
【０１３０】
SEQ ID NO 20
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 20
GAACCAGCATGCGTAGCGGGAT
【０１３１】
SEQ ID NO 21
長さ: 40
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 21 
TGTAAAACGACGGCCAGTagaagttctaatgcacctccaa
【０１３２】
SEQ ID NO 22
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 22
GTTCATAGCAGCCATGTCACTCT
【０１３３】
SEQ ID NO 23
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 23
TAGGAGTGCAGCAAGCATCGCTAAAGGAGCTGCTGGAAATg
【０１３４】
SEQ ID NO 24
長さ: 21
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細:プライマー
配列: 24
ACTGCTGAAGAGGCTGCGTAG
【０１３５】
SEQ ID NO 25
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 25 
TGTAAAACGACGGCCAGTGGGAGCTCATCCTCTGGTTGGTG
【０１３６】
SEQ ID NO 26
長さ: 21
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 26
TGCCCCTTGCTGGTCTTGAAT
【０１３７】
SEQ ID NO 27
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 27 
TGTAAAACGACGGCCAGTttttctttgtctctttagCAGGT
【０１３８】
SEQ ID NO 28
長さ: 19
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 28
GTTTTACTGTCCTCTACGC
【０１３９】
SEQ ID NO 29
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 29
TAGGAGTGCAGCAAGCATttgtgttttaacagCAGGTTCTC
【０１４０】
SEQ ID NO 30
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 30
CACTTGTTTGTGTTAAAGTCGC
【０１４１】
SEQ ID NO 31
長さ: 39
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 31 
TGTAAAACGACGGCCAGTTGGGATAGTTGGTAATGGATT
【０１４２】
SEQ ID NO 32
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 32
TTGATGGTGTAGATCATGTGCA
【０１４３】
SEQ ID NO 33
長さ: 41
タイプ: DNA 
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 33
TAGGAGTGCAGCAAGCATGTCTGTGCACATGATCTACACCA
【０１４４】
SEQ ID NO 34
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 34
ACTGTCCATATGACGTTACTTTC
【０１４５】
SEQ ID NO 35
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 35
TAGGAGTGCAGCAAGCATCCAATGGCAACGACAGCAAAAAG
【０１４６】
SEQ ID NO 36
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 36
tgtgtacagtgtgtgtacCTGGT
【０１４７】
SEQ ID NO 37
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 37 
TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCTGGACGGTCAGAACATCTA
【０１４８】
SEQ ID NO 38
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 38
ctgcatcacagtttttgagcaca
【０１４９】
SEQ ID NO 39
長さ: 36
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 39
TAGGAGTGCAGCAAGCATATGAACGGAATGGTTTGG
【０１５０】
SEQ ID NO 40
長さ: 20
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 40
TAGCTCGGCTCATGTCACAC
【０１５１】
SEQ ID NO 41
長さ: 40
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 41 
TGTAAAACGACGGCCAGTCCCGCGAATGTGCACTAACGAG
【０１５２】
SEQ ID NO 42
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 42
TCTTGGTTCTTCAGCCAGTGGGA
【０１５３】
SEQ ID NO 43
長さ: 40
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 43
TAGGAGTGCAGCAAGCATTTTCCCAATTCCTCCACCCAAG
【０１５４】
SEQ ID NO 44
長さ: 21
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 44
GTGAAACAGAACTGCAGGACG
【０１５５】
SEQ ID NO 45
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 45
TAGGAGTGCAGCAAGCATATGTCTGAGTCAGAGCAACAGTA
【０１５６】
SEQ ID NO 46
長さ: 20
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 46
TCCCTCCGTGCCGCCGTTTT
【０１５７】
SEQ ID NO 47
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 47
TGTAAAACGACGGCCAGTGAAGAAGGATCCAGTAAAGAAAA
【０１５８】
SEQ ID NO 48
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 48
TGGAAGCTCTATGGTCTCAATct
【０１５９】
SEQ ID NO 49
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 49
TAGGAGTGCAGCAAGCATtttgttctgtctccttgtctccc
【０１６０】
SEQ ID NO 50
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 50
acaacgagggcatgacacttacG
【０１６１】
SEQ ID NO 51
長さ: 39
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 51
TGTAAAACGACGGCCAGTCCAAGATGGCCAAAAACAAGC
【０１６２】
SEQ ID NO 52
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 52
ggaagtagcaatgcagacggaca
【０１６３】
SEQ ID NO 53
長さ: 36
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 53
TAGGAGTGCAGCAAGCATCACACAACCGACTCAAGT
【０１６４】
SEQ ID NO 54
長さ: 21
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 54
Tttactcgtccagctgaccgg
【０１６５】
SEQ ID NO 55
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 55
TGTAAAACGACGGCCAGTTTCCCCATACCTTGACTATACTG
【０１６６】
SEQ ID NO 56
長さ: 17
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 56
GCGGTGGCGAGCGGCTG
【０１６７】
SEQ ID NO 57
長さ: 39
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 57
TAGGAGTGCAGCAAGCATACCTCCACCCATGATGCTCCC
【０１６８】
SEQ ID NO 58
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 58
CATTGAAACCATATCACCAACct
【０１６９】
SEQ ID NO 59
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 59
TGTAAAACGACGGCCAGTtgccaaaATGTCATCAATCTTAG
【０１７０】
SEQ ID NO 60
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 60
CCCAGGGGACTGAATGTCTTTAG
【０１７１】
SEQ ID NO 61
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 61
TAGGAGTGCAGCAAGCATAATTGTCTGCACTTATAGATGTC
【０１７２】
SEQ ID NO 62
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 62
tccgttatgaaGCTCTTCCACC
【０１７３】
SEQ ID NO 63
長さ: 39
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 63
TGTAAAACGACGGCCAGTCTCGGTCACCAGGTGTCTGAT
【０１７４】
SEQ ID NO 64
長さ: 21
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 64
TCTTCTCGCAGCTGACTGCAC
【０１７５】
SEQ ID NO 65
長さ: 41
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (NED)
配列: 65
TAGGAGTGCAGCAAGCATAAGCTCAGCCTCAGCGAATCTCT
【０１７６】
SEQ ID NO 66
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 66
ttttcctaagtacttatgtacca
【０１７７】
SEQ ID NO 67
長さ: 39
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 67
TGTAAAACGACGGCCAGTgttccagtgtccagaatcggg
【０１７８】
SEQ ID NO 68
長さ: 18
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 68
ctGGTGGAATACCTCTGC
【０１７９】
SEQ ID NO 69
長さ: 40
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: フォワードテイルドプライマー  (FAM)
配列: 69
TGTAAAACGACGGCCAGTCTCCGTGTACGCCAAGTCCAGA
【０１８０】
SEQ ID NO 70
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 70
Gacagtgttataatccttcaatg
【０１８１】
SEQ ID NO 71
長さ: 21
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 71
ctccttttgcagGTATGTGGG
【０１８２】
SEQ ID NO 72
長さ: 21
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 72
TGTGAAGACCTGCAGAATGAG
【０１８３】
SEQ ID NO 73
長さ: 20
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 73
GGTAGAGGCCAAGGGAACTG
【０１８４】
SEQ ID NO 74
長さ: 19
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 74
GCAGGGATGGAGAAAGTCA
【０１８５】
SEQ ID NO 75
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 75
CGCGACTTTGTCAACTATCTGGT
【０１８６】
SEQ ID NO 76
長さ: 18
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 76
Caggaacagcttcctgac
【０１８７】
SEQ ID NO 77
長さ: 15
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 77
cccctgctggatACC
【０１８８】
SEQ ID NO 78
長さ: 19
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 78
ACGCGCGCACGAACCTGAT
【０１８９】
SEQ ID NO 80
長さ: 19
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 80
AAGCTTCCCAGCGACATCA
【０１９０】
SEQ ID NO 81
長さ: 23
タイプ: DNA
生物: Artificial Sequence
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 81
tgtgtacagtgtgtgtacCTGGT
【０１９１】
SEQ ID NO 82
長さ: 19
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 82
AAGACGAGTCGTTTCAAAA
【０１９２】
SEQ ID NO 83
長さ: 18
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー
配列: 83
CAGAACATGCGGTCAGGA
【０１９３】
SEQ ID NO 84
長さ: 19
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 84
GATCCGCGGGATCACTGCC
【０１９４】
SEQ ID NO 85
長さ: 20
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 85
CTGGGCTACAGCCTTCTGAG
【０１９５】
SEQ ID NO 86
長さ: 22
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 86
tgccagcctaaaatacctcagc
【０１９６】
SEQ ID NO 87
長さ: 27
タイプ: DNA
生物: 人工配列
その他情報: 人工配列の詳細: プライマー 
配列: 87
Gaaacatacaataattttttgaaacat
【０１９７】
SEQ ID NOs 88および90 (野生型KIF5B)
長さ: 6289bpおよび962aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 88)およびタンパク質(SEQ ID NO: 90)
生物: ナイルティラピア
【化１−１】
2021531827.tif 000007
【化１−２】
2021531827.tif 000008
【化１−３】
2021531827.tif 000009
【化１−４】
2021531827.tif 000010
【化１−５】
2021531827.tif 000011
【化１−６】
2021531827.tif 000012
【０１９８】
SEQ ID NOs 89および91 (KIF5B変異体アレル- 1nt 欠失)
長さ: 6289bp(-1bp)および110aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 89)およびタンパク質(SEQ ID NO: 91)
生物: ナイルティラピア
【化２】
2021531827.tif 000013
【０１９９】
SEQ ID NOs 92および94 (野生型TIAR)
長さ: 2520bpおよび382aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 92)およびタンパク質(SEQ ID NO: 94)
生物: ナイルティラピア
【化３−１】
2021531827.tif 000014
【化３−２】
2021531827.tif 000015
【０２００】
SEQ ID NOs 93および 95 (TIAR変異アレル- 11nt 挿入)
長さ: 2520bp(-11bp)および119aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 93)およびタンパク質 (SEQ ID NO: 95)
生物: ナイルティラピア
【化４】
2021531827.tif 000016
【０２０１】
SEQ ID NOs 96および98 (野生型KHSRP)
長さ: 2085bpおよび695aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 96)およびタンパク質(SEQ ID NO: 98)
生物: ナイルティラピア
【化５−１】
2021531827.tif 000017
【化５−２】
2021531827.tif 000018
【０２０２】
SEQ ID NOs 97および 99 (KHSRP変異アレル - 17nt 欠失)
長さ: 2085bp(-17bp)および410aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 97)およびタンパク質 (SEQ ID NO: 99)
生物: ナイルティラピア
【化６−１】
2021531827.tif 000019
【化６−２】
2021531827.tif 000020
【０２０３】
SEQ ID NOs 100および102 (野生型DHX9)
長さ: 4280bpおよび1286aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 100)およびタンパク質(SEQ ID NO: 102)
生物: ナイルティラピア
【化７−１】
2021531827.tif 000021
【化７−２】
2021531827.tif 000022
【化７−３】
2021531827.tif 000023
【化７−４】
2021531827.tif 000024
【０２０４】
SEQ ID NOs 101および103 (DHX9変異アレル - 7nt 欠失)
長さ: 4280bp(-7bp)および82aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 101)およびタンパク質(SEQ ID NO: 103)
生物: ナイルティラピア
【化８】
2021531827.tif 000025
【０２０５】
SEQ ID NOs 104および106 (野生型TIA1)
長さ: 3664bpおよび387aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 104)およびタンパク質(SEQ ID NO: 106)
生物: ナイルティラピア
【化９−１】
2021531827.tif 000026
【化９−２】
2021531827.tif 000027
【化９−３】
2021531827.tif 000028
【０２０６】
SEQ ID NOs 105および107 (TIA1変異型- 10nt 欠失)
長さ: 3664bp(-10bp)および27aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 105)およびタンパク質(SEQ ID NO: 107)
生物: ナイルティラピア
【化１０】
2021531827.tif 000029
【０２０７】
SEQ ID NOs 108および110 (野生型Igf2bp3)
長さ: 2288bpおよび589aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 108)およびタンパク質(SEQ ID NO: 110)
生物: ナイルティラピア
【化１１−１】
2021531827.tif 000030
【化１１−２】
2021531827.tif 000031
【０２０８】
SEQ ID NOs 109および111 (Igf2bp3変異アレル- 2nt 挿入)
長さ: 2288bp(-2bp)および206aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 109)およびタンパク質(SEQ ID NO: 111)
生物: ナイルティラピア
【化１２】
2021531827.tif 000032
【０２０９】
SEQ ID NOs 112および114 (野生型Elavl1)
長さ: 1894bpおよび359aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 112)およびタンパク質(SEQ ID NO: 114)
生物: ナイルティラピア
【化１３−１】
2021531827.tif 000033
【化１３−２】
2021531827.tif 000034
【０２１０】
SEQ ID NOs 113および115 (Elavl1変異アレル- 3Knt 欠失)
長さ: 1894bp(-3kb)および105aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 113)およびタンパク質(SEQ ID NO: 115)
生物: ナイルティラピア
【化１４】
2021531827.tif 000035
【０２１１】
SEQ ID NOs 116および118 (野生型Elavl2)
長さ: 1119bpおよび372aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 116)およびタンパク質(SEQ ID NO: 118)
生物: ナイルティラピア
【化１５】
2021531827.tif 000036
【０２１２】
SEQ ID NOs 117および119 (Elavl2変異アレル- 8nt 欠失)
長さ: 1119bp(-8bp)および40aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 117)およびタンパク質(SEQ ID NO: 119)
生物: ナイルティラピア
【化１６】
2021531827.tif 000037
【０２１３】
SEQ ID NOs 120および122 (野生型Cxcr4a)
長さ: 1996bpおよび382aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 120)およびタンパク質(SEQ ID NO: 122)
生物: ナイルティラピア
【化１７−１】
2021531827.tif 000038
【化１７−２】
2021531827.tif 000039
【０２１４】
SEQ ID NOs 121および123 (Cxcr4a変異アレル- 8nt 欠失)
長さ: 1996bp(-8bp)および177aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 121)およびタンパク質(SEQ ID NO: 123)
生物: ナイルティラピア
【化１８】
2021531827.tif 000040
【０２１５】
SEQ ID NOs 124および127 (野生型Ptbp1a)
長さ: 6015bpおよび538aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 124)およびタンパク質(SEQ ID NO: 127)
生物: ナイルティラピア
【化１９−１】
2021531827.tif 000041
【化１９−２】
2021531827.tif 000042
【化１９−３】
2021531827.tif 000043
【化１９−４】
2021531827.tif 000044
【化１９−５】
2021531827.tif 000045
【０２１６】
SEQ ID NOs 125および128 (Ptbp1a変異アレル- 13nt 欠失)
長さ: 6015bp (-13bp)および80aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 125)およびタンパク質(SEQ ID NO: 128)
生物: ナイルティラピア
【化２０】
2021531827.tif 000046
【０２１７】
SEQ ID NOs 126および129 (Ptbp1a変異アレル- 1.5knt d欠失)
長さ: 6015bp(-1.5kb)および346aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 126)およびタンパク質(SEQ ID NO: 129)
生物: ナイルティラピア
【化２１】
2021531827.tif 000047
【０２１８】
SEQ ID NOs 130および 132 (野生型Nos3)
長さ: 660bpおよび219aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 130)およびタンパク質(SEQ ID NO: 132)
生物: ナイルティラピア
【化２２】
2021531827.tif 000048
【０２１９】
SEQ ID NOs 131および133 (Nos3変異アレル - 5nt 欠失)
長さ: 660bp(-5pb)および145aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 131)およびタンパク質(SEQ ID NO: 133)
生物: ナイルティラピア
【化２３】
2021531827.tif 000049
【０２２０】
SEQ ID NOs 134および136 (野生型dnd1)
長さ: 1653bpおよび320aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 134)およびタンパク質(SEQ ID NO: 136)
生物: ナイルティラピア
【化２４−１】
2021531827.tif 000050
【化２４−２】
2021531827.tif 000051
【０２２１】
SEQ ID NOs 135および137 (dnd変異アレル- 5nt 欠失)
長さ: 1653bp (-5pb)および324aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 135)およびタンパク質(SEQ ID NO: 137)
生物: ナイルティラピア
【化２５】
2021531827.tif 000052
【０２２２】
SEQ ID NOs 138および140 (野生型Hnrnpab)
長さ: 999bpおよび332aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 138)およびタンパク質(SEQ ID NO: 140)
生物: ナイルティラピア
【化２６】
2021531827.tif 000053
【０２２３】
SEQ ID NOs 139および141 (Hnrnpab変異アレル- 8nt 欠失)
長さ: 999bp (-8bp)および29aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 139)およびタンパク質(SEQ ID NO: 141)
生物: ナイルティラピア
【化２７】
2021531827.tif 000054
【０２２４】
SEQ ID NOs 142および144 (野生型Hermes)
長さ: 525bpおよび174aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 142)およびタンパク質(SEQ ID NO: 144)
生物: ナイルティラピア
【化２８】
2021531827.tif 000055
【０２２５】
SEQ ID NOs 143および145 (Hermes変異アレル- 16nt挿入)
長さ: 525bp(+16bp)および61aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 143)およびタンパク質(SEQ ID NO: 145)
生物: ナイルティラピア
【化２９】
2021531827.tif 000056
【０２２６】
SEQ ID NOs 146および148 (野生型RBM24)
長さ: 708bpおよび235aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 146)およびタンパク質(SEQ ID NO: 148)
生物: ナイルティラピア
【化３０】
2021531827.tif 000057
【０２２７】
SEQ ID NOs 147および149 (RBM24変異アレル- 7nt 欠失)
長さ: 708 bp (-7bp)および54aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 147)およびタンパク質(SEQ ID NO: 149)
生物: ナイルティラピア
【化３１】
2021531827.tif 000058
【０２２８】
SEQ ID NOs 150および152 (野生型RBM42)
長さ: 1227bpおよび 408aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 150)およびタンパク質(SEQ ID NO: 152)
生物: ナイルティラピア
【化３２−１】
2021531827.tif 000059
【化３２−２】
2021531827.tif 000060
【０２２９】
SEQ ID NOs 151および153 (RBM42変異アレル- 7nt 欠失)
長さ: 1227bp (-7pb)および178aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 151)およびタンパク質(SEQ ID NO: 153)
生物: ナイルティラピア
【化３３】
2021531827.tif 000061
【０２３０】
SEQ ID NOs 154および156 (野生型TDRD6)
長さ: 4890bpおよび1630aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 154)および(SEQ ID NO: 156)
生物: ナイルティラピア
【化３４−１】
2021531827.tif 000062
【化３４−２】
2021531827.tif 000063
【化３４−３】
2021531827.tif 000064
【化３４−４】
2021531827.tif 000065
【化３４−５】
2021531827.tif 000066
【０２３１】
SEQ ID NOs 155および157 (TDRD6変異アレル- 10nt 欠失)
長さ: 4890bp (-10bp)および43aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 154)およびタンパク質(SEQ ID NO: 156)
生物: ナイルティラピア
【化３５】
2021531827.tif 000067
【０２３２】
SEQ ID NOs 158および160 (野生型Hook2)
長さ: 4002bpおよび708aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 158)およびタンパク質 (SEQ ID NO: 160)
生物: ナイルティラピア
【化３６−１】
2021531827.tif 000068
【化３６−２】
2021531827.tif 000069
【化３６−３】
2021531827.tif 000070
【０２３３】
SEQ ID NOs 159および161 (Hook2変異アレル- 2nt 欠失)
長さ: 4002bp (-2pb)および158aa
タイプ: cDNA (SEQ ID NO: 159)およびタンパク質(SEQ ID NO: 161)
生物: ナイルティラピア
【化３７】
2021531827.tif 000071
【０２３４】
SEQ ID NO 166 (nanos3 3’非翻訳領域) 
長さ: 703bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: ヒラメ(Paralichthys olivaceus)
【化３８】
2021531827.tif 000072
【０２３５】
SEQ ID NO 167 (nanos3 3’非翻訳領域) 
長さ: 567bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: 真鯉(Cyprinus Carpio)
【化３９】
2021531827.tif 000073
【０２３６】
SEQ ID NO 168 (nanos3 3’非翻訳領域) 
長さ: 618bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: ゼブラフィッシュ(Danio Rerio)
【化４０】
2021531827.tif 000074
【０２３７】
SEQ ID NO 169 (nanos3 3’非翻訳領域) 
長さ: 801bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: ナイルティラピア(Oreochromis Niloticus)
【化４１】
2021531827.tif 000075
【０２３８】
SEQ ID NO 170 (nanos3 3’非翻訳領域) 
長さ: 903bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: アメリカナマズ(Ictalurus punctatus)
【化４２】
2021531827.tif 000076
【０２３９】
SEQ ID NO 171 (nanos3 3’非翻訳領域) 
長さ: 1000bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: ニジマス(Oncorhynchus mykiss)
【化４３】
2021531827.tif 000077
【０２４０】
SEQ ID NO 172 (nanos3 3’非翻訳領域) 
長さ: 124bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: ニホンメダカ(Oryzias latipes) 
【化４４】
2021531827.tif 000078
【０２４１】
SEQ ID NO 173 (nanos3 3’非翻訳領域) 
長さ:400 bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物:  ミドリフグ
【化４５】
2021531827.tif 000079
【０２４２】
SEQ ID NO 174 (dnd1 3’非翻訳領域) 
長さ: 173bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: タイセイヨウサケ(Salmo salar)
【化４６】
2021531827.tif 000080
【０２４３】
SEQ ID NO 175 (dnd1 3’非翻訳領域) 
長さ: 500bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: タイセイヨウダラ(Gadus morhua)
【化４７】
2021531827.tif 000081
【０２４４】
SEQ ID NO 176 (dnd1 3’非翻訳領域) 
長さ: 190bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: ニジマス(Onchrorincus myskiss)
【化４８】
2021531827.tif 000082
【０２４５】
SEQ ID NO 177 (dnd1 3’非翻訳領域) 
長さ: 465bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: ナイルティラピア(Oreochromis Niloticus)
【化４９】
2021531827.tif 000083
【０２４６】
SEQ ID NO 178 (dnd1 3’非翻訳領域) 
長さ: 273bp 
タイプ: cDNAノンコーディング
生物: フグ(Takifugu rubripes)
【化５０】
2021531827.tif 000084
【０２４７】
SEQ ID NO 179 (dnd1 3’非翻訳領域) 
長さ: 527bp 
タイプ: cDNA non-coding
生物: ゼブラフィッシュ(Danio rerio)
【化５１】
2021531827.tif 000085
【０２４８】
SEQ ID NO 180 (dnd1 3’非翻訳領域) 
長さ: 552bp 
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: アメリカナマズ(Ictalurus punctatus)
【化５２】
2021531827.tif 000086
【０２４９】
SEQ ID NO 181 (dnd1 3’非翻訳領域) 
長さ: 585bp 
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物:アフリカツメガエル(Xenopus tropicalis)
【化５３】
2021531827.tif 000087
【０２５０】
SEQ ID NO 182 (Elavl2 3’非翻訳領域) 
長さ: 2235bp 
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: タイセイヨウサケ(Salmo salar)
【化５４】
2021531827.tif 000088
【０２５１】
SEQ ID NO 183 (Elavl2 3’非翻訳領域) 
長さ: bp 
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物:  ナイルティラピア(O.Niloticus)
【化５５】
2021531827.tif 000089
【０２５２】
SEQ ID NO 184 (Elavl2 3’非翻訳領域) 
長さ: 465bp 
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: ゼブラフィッシュ(Danio rerio)
【化５６】
2021531827.tif 000090
【０２５３】
SEQ ID NO 185 (Elavl2 3’非翻訳領域) 
長さ: 1264bp 
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: ナマズ(Ictalurus punctatus)
【化５７】
2021531827.tif 000091
【０２５４】
SEQ ID NO 186 (Elavl2 3’非翻訳領域) 
長さ: 2176bp 
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: メダカ(Oryzias latipes)
【化５８】
2021531827.tif 000092
【０２５５】
SEQ ID NO 187 (Elavl2 3’非翻訳領域) 
長さ: 485bp 
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: アフリカツメガエル(X.tropicalis)
【化５９】
2021531827.tif 000093
【０２５６】
SEQ ID NO 188 (nanos3 3’非翻訳領域-Del 8nt) 
長さ: 793bp 
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: ナイルティラピア(Oreochromis Niloticus)
【化６０】
2021531827.tif 000094
【０２５７】
SEQ ID NO 189 (nanos3 3’非翻訳領域-Del 32nt) 
長さ: 769bp 
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: ナイルティラピア(Oreochromis Niloticus)
【化６１】
2021531827.tif 000095
【０２５８】
SEQ ID NO 190 (dnd1 3’非翻訳領域-編集モチーフ1)
長さ: 465bp 
タイプ: cDNA ノンコーディング
生物: ナイルティラピア(Oreochromis Niloticus)
【化６２】
2021531827.tif 000096
【０２５９】
前述の説明において、説明の目的で、実施例の徹底的な理解を提供するため、多数の詳細事項が提示されている。しかし、これらの具体的な詳細事項は義務ではないということは当業者において明らかであろう。
【０２６０】
上記の実施例は、例を示すことが目的である。特定の実施例に対する変更、修正および変形は、当業者により可能である。特許請求の範囲は、ここに示した特定の実施例に制限されるべきではないが、明細書全体に合致する方法で解釈されなければならない。
【図１】
2021531827.tif 000097
【図２Ａ】
2021531827.tif 000098
【図２Ｂ】
2021531827.tif 000099
【図３】
2021531827.tif 000100
【図４】
2021531827.tif 000101
【図５】
2021531827.tif 000102
【図６】
2021531827.tif 000103
【図７】
2021531827.tif 000104
【図８】
2021531827.tif 000105
【図９】
2021531827.tif 000106
【図１０】
2021531827.tif 000107
【図１１】
2021531827.tif 000108
【図１２】
2021531827.tif 000109
【図１３】
2021531827.tif 000110
【図１４】
2021531827.tif 000111
【図１５】
2021531827.tif 000112
【図１６】
2021531827.tif 000113
【図１７】
2021531827.tif 000114
【図１８】
2021531827.tif 000115
【図１９】
2021531827.tif 000116
【図２０】
2021531827.tif 000117
【図２１】
2021531827.tif 000118
【図２２】
2021531827.tif 000119
【図２３】
2021531827.tif 000120
【図２４】
2021531827.tif 000121
【図２５】
2021531827.tif 000122
【図２６】
2021531827.tif 000123
【図２７】
2021531827.tif 000124
【図２８】
2021531827.tif 000125
【図２９】
2021531827.tif 000126
【図３０】
2021531827.tif 000127
【図３１】
2021531827.tif 000128
【図３２】
2021531827.tif 000129
【図３３】
2021531827.tif 000130
【図３４】
2021531827.tif 000131
【図３５】
2021531827.tif 000132
【図３６】
2021531827.tif 000133
【図３７】
2021531827.tif 000134
【図３８】
2021531827.tif 000135
【図３９】
2021531827.tif 000136
【図４０】
2021531827.tif 000137
【図４１】
2021531827.tif 000138
【図４２】
2021531827.tif 000139
【図４３】
2021531827.tif 000140
【図４４】
2021531827.tif 000141
【図４５】
2021531827.tif 000142
【配列表】
2021531827000001.app
【国際調査報告】
2021531827.tif 000143
2021531827.tif 000144