(57)【要約】  本発明は、ＤＬＫ１（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））に対する抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、これを含む抗体−薬物接合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）、癌治療用薬学組成物、癌診断用組成物、これを含むキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）及びＴ細胞エンゲージャ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）に関する。【選択図】  図２３
2021502797.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むＤＬＫ１（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片：
配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２及び８６からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＣＤＲ１、
配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４及び８８からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＣＤＲ２、
配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６及び９０からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び
配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１１５及び１２１からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＣＤＲ１、
配列番号１１、２５、３９、５３、６７、８１及び９５からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＣＤＲ２、及び
配列番号１３、２７、４１、５５、６９、８３、９７、１１６及び１２５からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
【請求項２】
配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５及び１１９からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＦＲ１、
配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３及び８７からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＦＲ２、
配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５及び８９からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＦＲ３、
配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７及び９１からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＦＲ４、
配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１１７及び１２０からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＦＲ１、
配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４及び１２２からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＦＲ２、
配列番号１２、２６、４０、５４、６８、８２、９６、１１８及び１２３からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＦＲ３、又は
配列番号１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８及び１２５からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＦＲ４を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
配列番号９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１及び１２７からなる群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６及び１２８からなる群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸を含む発現ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載の発現ベクターで形質転換された細胞。
【請求項８】
次の段階を含むＤＬＫ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の製造方法：
（ａ）請求項７に記載の細胞を培養する段階；及び
（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
【請求項９】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片及び薬物を含む抗体−薬物接合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ，ＡＤＣ）。
【請求項１０】
前記薬物は、細胞毒素（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）、放射性同位元素、抗増殖剤、アポトーシス促進剤（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、化学療法剤及び治療用核酸からなる群から選ばれることを特徴とする、請求項９に記載の抗体−薬物接合体。
【請求項１１】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異的抗体。
【請求項１２】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片、請求項９に記載の抗体−薬物接合体又は請求項１１に記載の二重特異的抗体を有効成分として含む、癌の予防又は治療用医薬組成物。
【請求項１３】
前記癌は、皮膚癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、腎臓癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、肉腫、神経芽細胞腫及び再発癌からなる群から選ばれるいずれか一つ以上の癌であることを特徴とする、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む癌診断用組成物。
【請求項１５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を抗原結合ドメインとして含むキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）。
【請求項１６】
腫瘍細胞で発現するＤＬＫ１に特異的に結合する請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体又はその抗原結合断片を含むＴ細胞エンゲージャ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＤＬＫ１（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））に対する抗体又はその抗原結合断片、これをコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターで形質転換された細胞、前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法、これを含む抗体−薬物接合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）、癌治療用薬学組成物、癌診断用組成物、これを含むキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）及びＴ細胞エンゲージャ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト由来ＤＬＫ１（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））は、全長３８３個のアミノ酸からなる１回膜貫通型の膜タンパク質であり、該タンパク質は細胞外領域に６個のＥＧＦ様反復（ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−ｌｉｋｅ  ｒｅｐｅａｔ）ドメインを有している。ＤＬＫ１は、細胞分化制御因子であるノッチ（Ｎｏｔｃｈ）レセプターのリガンドであるデルタ（Ｄｅｌｔａ）とのアミノ酸配列の相同性から、ＤＬＫ１という遺伝子で呼ばれるのが一般的であり、その他にＰｒｅｆ−１、ｐＧ２、ＳＣＰ−１及びＺＯＧとも呼ばれる。ＤＬＫ１は膜タンパク質でもあるが、腫瘍壊死因子アルファ転換酵素（Ｔｕｍｏｒ  ｎｅｃｒｏｓｉｓ  ｆａｃｔｏｒ  ａｌｐｈａ  ｃｏｎｖｅｒｔｉｎｇ  ｅｎｚｙｍｅ，ＴＡＣＥ）によって細胞外領域が細胞膜から落ちて（ｓｈｅｄｄｉｎｇ）別に機能を有するタンパク質でもあるとよく知られている。
【０００３】
ＤＬＫ１は、未分化のため増殖能の高い胎児細胞において高い発現を示す。特に、胎児の肝、腎臓、骨格筋、脳などで高い発現を示すが、出生後は大部分の組織で発現が確認されず、脂肪分化前細胞（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ）、膵臓島細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｉｓｌｅｔ  ｃｅｌｌ）、胸腺ストロマ細胞（ｔｈｙｍｉｃ  ｓｔｒｏｍａｌ  ｃｅｌｌ）、副腎細胞（ａｄｒｅｎａｌ  ｇｌａｎｄ  ｃｅｌｌ）などの特定細胞でのみ発現する。
【０００４】
ＤＬＫ１の機能研究は、脂肪細胞分化を抑制する因子Ｐｒｅｆ−１（ｐｒｅａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｆａｃｔｏｒ−１）として知られ、最も多く研究されている。脂肪細胞分化抑制能力の他に、ＤＬＫ１は造血幹細胞（ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）の分化を抑制し、リンパ腺前駆細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）の分化を調節する役割及び傷治癒（ｗｏｕｎｄ  ｈｅａｌｉｎｇ）にも関係するものと知られている。
【０００５】
また、ＤＬＫ１は色々な癌や腫瘍でも高頻度で発現していることが報告されている。現在まで、その発現が確認されている癌の種類としては、固形癌では神経内分泌腫瘍、神経芽細胞腫、神経膠腫、１型神経線維腫症、小細胞肺癌、肝癌、腎臓癌、卵巣癌、大腸癌、乳癌及び膵癌が知られており、血液癌では骨髄異形成症候群及び急性骨髄性白血病が知られている。ＤＬＫ１と癌との関連性に対する研究としては、脳癌細胞（ｇｌｉｏｍａ）においてＤＬＫ１の発現が過発現となっており、ＤＬＫ１のｃＤＮＡを脳癌細胞に過発現させると、脳癌細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）が増加して転移（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ）が増加するという報告もあり、肝癌においてＤＬＫ１の発現が正常肝細胞に比べて上昇しており、ｓｉＲＮＡ実験によってＤＬＫ１の発現を減少させた時、腫瘍の大きさが減少するという報告もあった。
【０００６】
一方、癌は、死亡原因の上位を占める重要な疾患ではあるが、その治療に対する要求はまだ満たされずにいる。最近では、既存の化学療法が正常細胞にも損傷を与える問題点を解決するために、癌細胞に特異的に発現する特定分子を標的にして薬物を設計し治療する分子標的医薬（ｍｏｌｅｃｕｌａｒｌｙ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｄｒｕｇ）による癌治療が活発に研究されている。
【０００７】
特定抗原を標的にした分子標的医薬は、抗体医薬として既に多く市販されており、その大部分は抗体依存性細胞毒性活性（ＡＤＣＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）を主要作用機作としている。しかし、その薬効が十分であるとはいえず、より強力な抗癌作用を目標とする技術開発も同時に行われている。
【０００８】
抗体の抗癌作用を強化する効果的な手段の一つとして、抗体と強力な毒性を有する物質（毒素）との連結を挙げることができる。毒素は、それを単独で患者に投与すると、正常組織にも損傷を与え、効果的な治療手段になり得ない。しかし、癌細胞特異的な抗原に結合する抗体と毒素を連結することによって、正常組織に悪影響を及ぼすことなく癌細胞だけを殺傷できる能力を有することができる。このような薬剤を抗体薬物接合体（ＡＤＣ，ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）と呼ぶ。癌細胞の表面に存在する特定ターゲットレセプターに結合するＡＤＣは、エンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）によって細胞内に取り込まれた後、抗体はリソソームにおいて分解され、毒素はリソソーム外に放出されて特定細胞内部でのみ毒性が発現し、その効果によって細胞が殺傷される。
【０００９】
ＡＤＣ用抗体としては、今まで制限された数の抗体しか開発されておらず、その代表例には、ａｎｔｉ−Ｈｅｒ２抗体であるハーセプチン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ社）があり、その他にも、海外の多国籍製薬会社のＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ１３８、ＰＭＳＡ、ＥｐｈＡ２などに対するそれぞれの抗体が臨床試験段階又は新薬開発初期段階にある。今のところ、韓国におけるＡＤＣ用新規抗体の開発は微々たる実情である。
【００１０】
このような技術的背景下で、本出願の発明者らはＤＬＫ１に特異的に結合する抗体を開発するために努力した。その結果、本発明者らは、ＤＬＫ１に対して優れた結合力を示す抗−ＤＬＫ１抗体を開発することによって、目的とする癌の治療又は診断が可能であることを確認し、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１１】
本発明の目的は、ＤＬＫ１に対する新規抗体又はその抗原結合断片を提供することにある。
【００１２】
本発明の他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供することにある。
【００１３】
本発明の他の目的は、前記核酸を含むベクター、前記ベクターで形質転換された細胞及びその製造方法を提供することにある。
【００１４】
本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む抗体−薬物接合体を提供することにある。
【００１５】
本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む癌の予防又は治療用薬学組成物を提供することにある。
【００１６】
本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含む癌診断用組成物を提供することにある。
【００１７】
本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含むキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）を提供することにある。
【００１８】
本発明の更に他の目的は、前記抗体又はその抗原結合断片を含むＴ細胞エンゲージャ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
上記目的を達成するために、本発明は、次の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むヒトＤＬＫ１（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を提供する：配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２及び８６からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４及び８８からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６及び９０からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１１５及び１２１からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１、２５、３９、５３、６７、８１及び９５からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３、２７、４１、５５、６９、８３、９７、１１６及び１２５からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
【００２０】
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を提供する。
【００２１】
本発明はまた、前記核酸を含むベクターを提供する。
【００２２】
本発明はまた、前記ベクターで形質転換された細胞を提供する。
【００２３】
本発明はまた、次の段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法を提供する：（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階。
【００２４】
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片及び薬物を含む抗体−薬物接合体（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｄｒｕｇ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅ：ＡＤＣ）を提供する。
【００２５】
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異的抗体を提供する。
【００２６】
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片、前記抗体−薬物接合体又は二重特異的抗体を有効成分として含む癌の予防又は治療用薬学組成物を提供する。
【００２７】
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片を含む癌診断用組成物を提供する。
【００２８】
本発明はまた、前記抗体又はその抗原結合断片を抗原結合ドメインとして含むキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）を提供する。
【００２９】
本発明はまた、腫瘍細胞で発現するヒトＤＬＫ１に特異的に結合する前記抗体又はその抗原結合断片を含むＴ細胞エンゲージャ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】本発明において抗原として使用するために作製された６個のＥＧＦ様反復（ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｒｅｐｅａｔ）ドメインを含むヒトＤＬＫ１タンパク質の細胞外領域及びヒト抗体Ｆｃ（ｈＦｃ）領域が接合されたＤＬＫ１−ｈＦｃ融合タンパク質の模式図（Ａ）、及び前記ＤＬＫ１−ｈＦｃ融合タンパク質の精製結果（Ｂ）である。Ａ：１〜６、ＥＧＦ様反復（ＥＧＦ−ｌｉｋｅ  ｒｅｐｅａｔ）ドメイン１〜６；ＪＭ、膜近接ドメイン（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ  ｄｏｍａｉｎ）。Ｂ：Ｒｅｄｕｃｉｎｇ、還元条件；Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ、非還元条件。
【図２】ＤＬＫ１に対する多クローンファージ抗体に対するＥＬＩＳＡを行った結果を示すグラフである。＃３８、抗体対照群。
【図３】ＤＬＫ１に対する単一ｓｃＦｖを発現するクローンに対するＥＬＩＳＡを行った結果である。
【図４】７種の単一クローンファージ抗体（１７Ｂ１１、１８Ａ５、２０Ｄ３、２１Ｄ８、２１Ｆ９、２７Ｆ７、３５Ｅ２）をｓｃＦｖ形態からＩｇＧ形態に転換するための発現ベクターのベクターマップ（Ａ）、及びＩｇＧ形態に転換された抗体の精製後、純度を確認するためのＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果（Ｂ）である。
【図５】ＤＬＫ１抗原に対する７種のＤＬＫ１単一クローンヒト抗体（１７Ｂ１１、１８Ａ５、２０Ｄ３、２１Ｄ８、２１Ｆ９、２７Ｆ７、３５Ｅ２）の結合力をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図６】ｈＦｃタンパク質（陰性対照群）、全長又は一部のＥＧＦ様反復ドメインを含むＤＬＫ１−ｈＦｃ融合タンパク質（Ａ及びＢ）に対する７種のＤＬＫ１単一ヒト抗体（１７Ｂ１１、１８Ａ５、２０Ｄ３、２１Ｄ８、２１Ｆ９、２７Ｆ７、３５Ｅ２）の結合特異性をＥＬＩＳＡで確認した結果（Ｃ）である。
【図７】ｈＦｃタンパク質（陰性対照群）、ヒトＤＬＫ１（ｈＤＬＫ１）、マウスＤＬＫ１（ｍＤＬＫ１）又はサルＤＬＫ１（ＭＤＬＫ１）のｈＦｃ融合タンパク質（Ａ及びＢ）に対する７種のＤＬＫ１単一ヒト抗体（１７Ｂ１１、１８Ａ５、２０Ｄ３、２１Ｄ８、２１Ｆ９、２７Ｆ７、３５Ｅ２）の結合特異性をＥＬＩＳＡで確認した結果（Ｃ）である。
【図８】ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞で発現するＤＬＫ１タンパク質とｓｉＲＮＡ処理によるＤＬＫ１タンパク質発現の減少を確認した結果（Ａ）、及びＤＬＫ１単一クローンヒト抗体（１７Ｂ１１、１８Ａ５、２１Ｄ８、２７Ｆ７）の細胞表面に存在するＤＬＫ１に対する結合力を蛍光利用細胞分流器（ＦＡＣＳ）を用いて確認した結果（Ｂ）である。ｓｃＲＮＡ；ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）。ｓｉＤＬＫ１；ＤＬＫ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉＲＮＡ。
【図９】ＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞で内生的に（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）発現するＤＬＫ１タンパク質とｓｉＲＮＡ処理によるＤＬＫ１タンパク質発現の減少を確認した結果（Ａ）、及びＤＬＫ１単一クローンヒト抗体（１７Ｂ１１、１８Ａ５、２１Ｄ８、２７Ｆ７）の細胞表面に存在するＤＬＫ１に対する結合力を蛍光利用細胞分流器（ＦＡＣＳ）を用いて確認した結果（Ｂ）である。
【図１０】ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞においてＤＬＫ１単一クローンヒト抗体（１８Ａ５，２７Ｆ７）の細胞表面特異的結合を免疫蛍光染色法（Ｉｍｍｕｎｏｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ）を用いて確認した結果である。
【図１１】ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞においてＤＬＫ１単一クローンヒト抗体（１８Ａ５）が時間別に細胞内の個別のエンドソームマーカーと共位置することを蛍光染色法を用いて確認した結果である。ＥＥＡ：初期エンドソームマーカー、ＴｆＲ：初期／リサイクルエンドソームマーカー、ＬＡＭＰ１：末期エンドソームマーカー。
【図１２】ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞においてＤＬＫ１単一クローンヒト抗体（２７Ｆ７）が時間別に細胞内の個別のエンドソームマーカーと共位置することをグラフから確認した結果である。
【図１３】ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞において単一クローンヒト抗体（１８Ａ５、２７Ｆ７）の細胞内流入後、時間別に、細胞膜に残っている抗体の量を蛍光利用細胞分流器（ＦＡＣＳ）を用いて平均蛍光強度（ＭＦＩ：Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）によって定量化した結果である。
【図１４】ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞において単一クローンヒト抗体（１８Ａ５、２７Ｆ７）のトキシンによる細胞死滅効果を確認した結果（Ａ及びＢ）である。
【図１５】ヒトＤＬＫ１に対する１８Ａ５抗体変異体として単一ｓｃＦｖを発現するファージクローンが抗原と結合するかどうか確認するためにＥＬＩＳＡを行った結果である。
【図１６】１８Ａ５抗体変異体から選別された２つの抗体のｓｃＦｖをＩｇＧ形態に転換して発現精製後、還元的或いは非還元的条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分析した純度を示す結果である。
【図１７】ＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２のヒトＤＬＫ１（ｈＤＬＫ１）、マウスＤＬＫ１（ｍＤＬＫ１）又はサルＤＬＫ１（ＭＤＬＫ１）のｈＦｃ融合タンパク質に対する交差反応性をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図１８】ｈＦｃタンパク質（陰性対照群）、全長又は一部のＥＧＦ様反復ドメインを含むＤＬＫ１−ｈＦｃ融合タンパク質に対する２種のＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２の結合特異性をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図１９】ＤＬＫ１抗原に対するＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２の結合親和性とキネティック定数をＥＬＩＳＡで確認した結果である。
【図２０】ＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２が、ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に濃度依存的に結合力を有するかどうかを蛍光利用細胞分流器（ＦＡＣＳ）を用いて確認した結果である。
【図２１】ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞にｓｉＲＮＡを処理（Ａ）しりた、或いは内生的に（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｌｙ）ＤＬＫ１を発現するＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞にｓｈＲＮＡを処理（Ｂ）して、ＤＬＫ１タンパク質発現の減少を確認し、ＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２の抗原結合特異性を蛍光利用細胞分流器（ＦＡＣＳ）を用いて確認した結果である。ｓｃＲＮＡ，ｓｃｒａｍｂｌｅｄ  ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）；ｓｉＤＬＫ１，ＤＬＫ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｉＲＮＡ；ｓｈＣｏｎ，ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）；ｓｈＤＬＫ１，ＤＬＫ１−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｓｈＲＮＡ。
【図２２】ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞、内生的に発現するＳＫ−Ｎ−Ｆ１又はＨｅｐＧ２細胞に、ＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２を処理した後、時間による細胞内抗体の流入量（Ａ）と２４時間で細胞内に蓄積された程度（Ｂ）をＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ  ＨＤ／２ＣＬＲシステムを用いて確認した結果である。
【図２３】ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞においてＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２のトキシンによる細胞死滅効果を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
特に定義されない限り、本明細書で使う技術的及び科学的用語はいずれも、本発明の属する技術分野における熟練した専門家によって通常理解されるのと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使う命名法は、当該技術分野によく知られており、通常使用されるものである。
【００３２】
本発明は、一観点において、次の重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含むＤＬＫ１（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ  １  ｈｏｍｏｌｏｇ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片に関する：
配列番号２、１６、３０、４４、５８、７２及び８６からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＣＤＲ１、配列番号４、１８、３２、４６、６０、７４及び８８からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＣＤＲ２、配列番号６、２０、３４、４８、６２、７６及び９０からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域；及び
配列番号９、２３、３７、５１、６５、７９、９３、１１５及び１２１からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＣＤＲ１、配列番号１１、２５、３９、５３、６７、８１及び９５からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＣＤＲ２、及び配列番号１３、２７、４１、５５、６９、８３、９７、１１６及び１２５からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域。
【００３３】
本発明に係る抗体は、例えば、ヒトＤＬＫ１の細胞外ドメインに特異的に結合し得る。
【００３４】
本出願の発明者らは、ファージディスプレイ方法を用いて、ヒトＤＬＫ１タンパク質の細胞外ドメインに高い親和力を有する７種の新規ＤＬＫ１単一クローンヒト抗体をスクリーニングし、親和力、結合部位決定、種間の抗原に対する交差結合、細胞表面のＤＬＫ１への特異的結合などのような抗体特性分析によって２種のＤＬＫ１抗体（１８Ａ５、２７Ｆ７）を選別し、両抗体とも抗原と結合後に細胞内に流入し、Ｆａｂ  ＺＡＰアッセイを用いて細胞死滅効果を確認した。
【００３５】
また、親和度成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）と上述の抗体の特性分析によって１８Ａ５抗体変異体２種（１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２）をさらに選別した。
【００３６】
前記選別されたＤＬＫ１単一クローンヒト抗体が抗体−薬物接合体（ＡＤＣ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）として使用可能であるということを確認することによって、本発明を完成した。
【００３７】
本明細書で使う用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、ＤＬＫ１、特にヒトＤＬＫ１タンパク質の細胞外ドメインに特異的に結合する抗−ＤＬＫ１抗体を意味する。本発明の範囲には、ＤＬＫ１に特異的に結合する完全な抗体形態だけでなく、前記抗体分子の抗原結合断片も含まれる。
【００３８】
完全な抗体は、２個の全長の軽鎖及び２個の全長の重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖とジスルフィド結合で連結されている。重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）及びエプシロン（ε）タイプを有し、サブクラスとしてガンマ１（γ１）、ガンマ２（γ２）、ガンマ３（γ３）、ガンマ４（γ４）、アルファ１（α１）及びアルファ２（α２）を有する。軽鎖の不変領域はカッパ（κ）及びラムダ（λ）タイプを有する。
【００３９】
抗体の抗原結合断片又は抗体断片は、抗原結合機能を保有している断片を意味し、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖなどを含む。抗体断片のうちＦａｂは、軽鎖及び重鎖の可変領域、軽鎖の不変領域及び重鎖の最初の不変領域（ＣＨ１）を有する構造であり、１個の抗原結合部位を有する。Ｆａｂ’は、重鎖ＣＨ１ドメインのＣ−末端に一つ以上のシステイン残基を含むヒンジ領域（ｈｉｎｇｅ  ｒｅｇｉｏｎ）を有するという点でＦａｂと異なる。
【００４０】
Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合をなしながら生成される。Ｆｖは、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域だけを有している最小の抗体断片であり、Ｆｖ断片を生成する組換え技術は、ＰＣＴ国際公開特許出願ＷＯ８８／１０６４９、ＷＯ８８／１０６６３０、ＷＯ８８／０７０８５、ＷＯ８８／０７０８６及びＷＯ８８／０９３４４に開示されている。二重鎖Ｆｖ（ｔｗｏ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ）は非共有結合で重鎖可変領域と軽鎖可変領域が連結されており、単鎖Ｆｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  Ｆｖ，ｓｃＦｖ）は一般に、ペプチドリンカーによって重鎖の可変領域と軽鎖の可変領域が共有結合で連結されたり、又はＣ−末端で直接連結されているので、二重鎖Ｆｖと同様にダイマーのような構造をなすことができる。このような抗体断片は、タンパク質加水分解酵素を用いて得ることができ（例えば、全抗体をパパインで制限切断すればＦａｂが得られ、ペブシンで切断すればＦ（ａｂ’）２断片が得られる。）、遺伝子組換え技術を用いて作製することもできる。
【００４１】
一実施例において、本発明に係る抗体は、Ｆｖ形態（例えば、ｓｃＦｖ）であるか、完全な抗体形態である。また、重鎖不変領域は、ガンマ（γ）、ミュー（μ）、アルファ（α）、デルタ（δ）又はエプシロン（ε）のいずれか一つのイソタイプから選択され得る。例えば、不変領域は、ガンマ１（ＩｇＧ１）、ガンマ３（ＩｇＧ３）又はガンマ４（ＩｇＧ４）である。軽鎖不変領域はカッパ又はラムダ型であり得る。
【００４２】
本明細書で使われる用語「重鎖」は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＨ及び３個の不変領域ドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３を含む全長重鎖及びその断片のいずれをも意味する。また、本明細書で使われる用語「軽鎖」は、抗原に特異性を付与するに十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインＶＬ及び不変領域ドメインＣＬを含む全長軽鎖及びその断片のいずれをも意味する。
【００４３】
本発明の抗体は、単一クローン抗体、多特異的抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖Ｆｖｓ（ｓｃＦＶ）、単鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）断片、ジスルフィド−結合Ｆｖｓ（ｓｄＦＶ）及び抗−イディオタイプ（抗−Ｉｄ）抗体、又はこれら抗体のエピトープ−結合断片などを含むが、これに限定されるものではない。
【００４４】
前記単一クローン抗体は、実質的に同質的抗体集団から得た抗体、すなわち集団を占めている個々の抗体が微量で存在し得る、できるだけ天然発生的な突然変異以外は、同一のものを指す。単一クローン抗体は高度に特異的であるため、単一抗原部位に対抗して誘導される。典型的に個別の決定因子（エピトープ）に対する個別の抗体を含む通常の（ポリクロナール）抗体製剤とは違い、それぞれの単一クローン抗体は抗原上の単一決定因子に対して指示される。
【００４５】
例えば、本発明で有用な単一クローン抗体は、ハイブリドーマ方法によって製造できるか、或いはバクテリア、真核動物又は植物細胞において組換えＤＮＡ方法で製造することができる（米国特許４，８１６，５６７号参照）。また、単一クローン抗体はファージ抗体ライブラリーから単離することができる。
【００４６】
本発明の一実施例では、ファージディスプレイ方法で天然ヒトｓｃＦｖライブラリー（ｎａｔｉｖｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  Ｆｖ  ｌｉｂｒａｒｙ）をパンニングして、ＤＬＫ１に特異的に結合する７種の単一クローンヒト抗体を製造した。
【００４７】
「ファージディスプレイ」は、変異体ポリペプチドをファージ、例えば繊維状ファージ粒子の表面上に、外皮タンパク質の少なくとも一部との融合タンパク質としてディスプレイする技術である。ファージディスプレイの有用性は、無作為化タンパク質変異体の大きいライブラリーを対象にして、標的抗原と高親和度で結合する配列を迅速且つ効率的に分類できるという事実にある。ペプチド及びタンパク質ライブラリーをファージ上にディスプレイすることは、特異的結合特性を持つポリペプチドを調べるために数百万個のポリペプチドをスクリーニングするのに用いられてきた。
【００４８】
ファージディスプレイ技術は、特定リガンド（例：抗原）と結合する新規タンパク質を生成及び選別するための強力な道具を提供した。ファージディスプレイ技術を用いて、タンパク質変異体の大きいライブラリーを生成させ、標的抗原と高親和性で結合する配列を迅速に分類することができる。変異体ポリペプチドを暗号化する核酸をウイルス性外皮タンパク質、例えば遺伝子ＩＩＩタンパク質又は遺伝子ＶＩＩＩタンパク質を暗号化する核酸配列と融合させる。タンパク質又はポリペプチドを暗号化する核酸配列を、遺伝子ＩＩＩタンパク質の一部を暗号化する核酸配列と融合させた１価ファージディスプレイシステムが開発された。１価ファージディスプレイシステムでは、遺伝子融合物が低レベルで発現し、野生型遺伝子ＩＩＩタンパク質も発現して、粒子感染性が維持される。
【００４９】
繊維状ファージ表面上におけるペプチドの発現とＥ．ｃｏｌｉの周辺細胞質における機能性抗体断片の発現を立証することが、抗体ファージディスプレイライブラリーを開発する上で重要である。抗体又は抗原結合性ポリペプチドのライブラリーは数多くの方式、例えば、無作為ＤＮＡ配列を挿入することによって単一遺伝子を変更させる方法又は関連遺伝子系列をクローニングする方法で製造した。ライブラリーを対象にして、目的とする特徴を伴う抗体又は抗原結合性タンパク質の発現に関してスクリーニングすることができる。
【００５０】
ファージディスプレイ技術は、目的とする特徴を持つ抗体を製造するための通常のハイブリドーマ及び組換え方法に比べて、いくつかの利点を有する。このような技術は、動物を使用しないで短時間で様々な配列を持つ大きい抗体ライブラリーを生成可能にする。ハイブリドーマの製造やヒト化抗体の製造には数ヵ月の製造期間がかかることがある。また、免疫が全く要求されないので、ファージ抗体ライブラリーは、毒性であるか又は抗原性の低い抗原に対しても抗体を生成させることができる。さらに、ファージ抗体ライブラリーを用いて新規な治療的抗体を生成及び確認することができる。
【００５１】
ファージディスプレイライブラリーを用いて免疫させた、非−免疫させたヒト、生殖細胞系配列、又は未感作Ｂ細胞Ｉｇレパートリー（ｒｅｐｅｒｔｏｒｙ）からヒト抗体を生成させる技術を用いることができる。各種リンパ系組織を用いて、未感作又は非免疫抗原結合性ライブラリーを製造することができる。
【００５２】
ファージディスプレイライブラリーから高親和性抗体を確認及び分離できる技術は、治療用新規抗体分離に重要である。ライブラリーから高親和性抗体を分離することは、ライブラリーの大きさ、細菌性細胞中における生産効率及びライブラリーの多様性に左右され得る。ライブラリーの大きさは、抗体又は抗原結合性タンパク質の不適切なフォールディングと停止コードンの存在による非効率的生産によって減少する。細菌性細胞における発現は、抗体又は抗原結合性ドメインが適切にフォールディングされない場合には抑制され得る。発現は、可変／不変の界面の表面や選別されたＣＤＲ残基における残基を交互に突然変異させることによって改善させることができる。骨格領域の配列は、細菌性細胞で抗体ファージライブラリーを生成させる場合に適切なフォールディングを提供するための一要素である。
【００５３】
高親和性抗体分離において、抗体又は抗原結合性タンパク質の様々なライブラリーを生成させることが重要である。ＣＤＲ３領域はこれらがしばしば抗原結合に参加することが明らかになった。重鎖上のＣＤＲ３領域は、大きさ、配列及び構造的立体形態面において非常に多様なので、これを用いて様々なライブラリーを製造することができる。
【００５４】
また、各位置で２０個アミノ酸を全て用いて可変重鎖及び軽鎖のＣＤＲ領域を無作為化することによって多様性を発生することができる。２０個の全てのアミノ酸を使用すれば多様性の大きい変異体抗体配列が生成され、新規な抗体を確認する機会が増加し得る。
【００５５】
「エピトープ」は、抗体が特異的に結合し得るタンパク質決定部位（ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）を意味する。エピトープは通常、化学的に活性である表面分子群、例えばアミノ酸又は糖側鎖で構成され、一般に、特定の３次元の構造的特徴の他に、特定の電荷特性も有する。立体的エピトープ及び非立体的エピトープは、変性溶媒の存在下で前者に対する結合は消失されるが、後者に対しては消失されないという点で区別される。
【００５６】
前記「ヒト化」形態の非−ヒト（例：ムリン）抗体は、非−ヒト免疫グロブリンから由来した最小配列を含有するキメラ抗体である。大部分の場合、ヒト化抗体は受容者の超可変領域からの残基を、目的とする特異性、親和性及び能力を保有している非−ヒト種（供与者抗体）、例えばマウス、ラット、ウサギ又は非−ヒト霊長類の超可変領域からの残基に置き換えたヒト免疫グロブリン（受容者抗体）である。
【００５７】
前記「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンから由来する分子であり、相補性決定領域、構造領域を含む抗体を構成する全てのアミノ酸配列全体がヒトの免疫グロブリンで構成されているものを意味する。
【００５８】
重鎖及び／又は軽鎖の一部が特別な種から由来するか、特別な抗体分類又は亜分類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか、これと相同性であるのに対し、残りの鎖は、別の種から由来するか、別の抗体分類又は亜分類に属する抗体内の相応する配列と同一であるか、これと相同性である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）だけでなく、目的とする生物学的活性を示す前記抗体の断片も含まれる。
【００５９】
本願で使うような「抗体可変ドメイン」とは、相補性決定領域（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）、及び骨格領域（ＦＲ）のアミノ酸配列を含む抗体分子の軽鎖及び重鎖部分を指す。ＶＨは重鎖の可変ドメインを指す。ＶＬは軽鎖の可変ドメインを指す。
【００６０】
「相補性決定領域」（ＣＤＲ；すなわち、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３）は、抗原結合のために必要な存在である抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指す。各可変ドメインは典型的にＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３として確認された３個のＣＤＲ領域を有する。
【００６１】
本発明において、前記ＤＬＫ１に結合する抗体又はその抗原結合断片は具体的に、次の表１に示すＣＤＲ配列を含むことができる。このうち、２種（１８Ａ５、２７Ｆ７）と他の２種の１８Ａ５変異抗体（１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２）の抗−ＤＬＫ１抗体は、ＤＬＫ１が過発現した細胞に結合可能であり、癌細胞表面に発現するＤＬＫ１をターゲットにして癌細胞を死滅させ得る抗−ＤＬＫ１抗体−薬物接合体として開発可能であることを確認した（実施例３、４、８及び９）。
【００６２】
【表１】
2021502797.tif 000003
2021502797.tif 000004
2021502797.tif 000005
【００６３】
「骨格領域」（ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメイン残基である。各可変ドメインは典型的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４として確認された４個のＦＲを有する。
【００６４】
本発明の一実施例によれば、配列番号１、１５、２９、４３、５７、７１、８５及び１１９からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＦＲ１、配列番号３、１７、３１、４５、５９、７３及び８７からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＦＲ２、配列番号５、１９、３３、４７、６１、７５及び８９からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＦＲ３、配列番号７、２１、３５、４９、６３、７７及び９１からなる群から選ばれる一つ以上の重鎖ＦＲ４、配列番号８、２２、３６、５０、６４、７８、９２、１１７及び１２０からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＦＲ１、配列番号１０、２４、３８、５２、６６、８０、９４及び１２２からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＦＲ２、配列番号１２、２６、４０、５４、６８、８２、９６、１１８及び１２３からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＦＲ３、又は配列番号１４、２８、４２、５６、７０、８４、９８及び１２５からなる群から選ばれる一つ以上の軽鎖ＦＲ４を含むことができる。
【００６５】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗体認識及び結合部位を含有する抗体断片である。このような領域は、１個の重鎖可変ドメインと１個の軽鎖可変ドメインが、例えばｓｃＦｖとして堅固に事実上共有的に連合した二量体からなる。
【００６６】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変及び不変ドメインと、重鎖の可変及び第１不変ドメイン（ＣＨ１）を含有する。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は一般に、それらの間にヒンジシステインによってそれらのカルボキシ末端近くに共有的に連結される一対のＦａｂ断片を含む。
【００６７】
「単一鎖Ｆｖ」又は「ｓｃＦｖ」抗体断片は、抗体のＶＨ及びＶＬドメインを含むが、これらのドメインは単一ポリペプチド鎖内に存在する。Ｆｖポリペプチドは、ｓｃＦｖが抗原結合のために目的とする構造を形成可能にするＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーをさらに含むことができる。
【００６８】
本発明に係る抗体は１価又は２価であり、単鎖又は二重鎖を含む。機能的に、抗体のＤＬＫ１の細胞外ドメインに対する結合親和度は、１０−５Ｍ〜１０−１２Ｍ範囲内にある。例えば、結合親和性は、１０−６Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１２Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−１０Ｍ〜１０−１１Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−９Ｍ〜１０−１０Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−８Ｍ〜１０−９Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−７Ｍ〜１０−８Ｍ、１０−５Ｍ〜１０−７Ｍ、１０−６Ｍ〜１０−７Ｍ又は１０−５Ｍ〜１０−６Ｍである。
【００６９】
また、本発明に係る抗体は、抗原に対する親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）が増加した抗体である。用語「親和度」とは、抗原の特定部位を特異的に認識し結合する能力であり、抗体の抗原に対する特異性と共に高度の親和度は免疫反応において重要な要素である。当業界に公知された任意の様々な分析、例えば放射免疫分析法（ＲＩＡ）及びＥＬＩＳＡを用いて親和度を決定することができ、様々な定量的な値で表現することができる。抗体の抗原に対する親和度は、一般的に特定抗体−抗原相互作用の解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｏｎｓｔａｎｔ，Ｋｄ）によって示すことができる。Ｋｄ値が低ければ低いほど抗体の抗原に対する親和力が高いことを意味する。例えば、本発明の抗体のＫｄ値は、１８Ａ５抗体が０．５２で、２７Ｆ７抗体が０．２２であることから、ヒトＤＬＫ１に特異的に結合する高親和度抗体であることが分かる。
【００７０】
前記ＤＬＫ１の細胞外ドメインに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１及び１２７からなる群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む重鎖可変領域を含むことができる。前記ＤＬＫ１の細胞外ドメインに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１及び１２７からなる群から選ばれる重鎖可変領域を含むことができる。
【００７１】
また、前記ＤＬＫ１の細胞外ドメインに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６及び１２８からなる群から選ばれる配列と９０％以上の配列相同性を有する配列を含む軽鎖可変領域を含むことができる。前記ＤＬＫ１の細胞外ドメインに結合する抗体又はその抗原結合断片は、配列番号１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１２６及び１２８からなる群から選ばれる軽鎖可変領域を含むことができる。
【００７２】
本発明の抗体又は抗体断片は、ＤＬＫ１の細胞外ドメインを特異的に認識できる範囲内で、本明細書に記載された本発明の抗−ＤＬＫ１抗体の配列だけでなく、その生物学的均等物も含むことができる。例えば、抗体の結合親和度及び／又はその他生物学的特性をより一層改善させるために抗体のアミノ酸配列に更なる変化を与えることができる。このような変形は、例えば、抗体のアミノ酸配列残基の欠失、挿入及び／又は置換を含む。このようなアミノ酸変異は、アミノ酸側鎖置換体の相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、大きさなどに基づいてなされる。アミノ酸側鎖置換体の大きさ、形状及び種類に対する分析によって、アルギニン、リシンとヒスチジンはいずれも正電荷を帯びた残基であり；アラニン、グリシンとセリンは、類似の大きさを有し；フェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは、類似の形状を有するということがわかる。したがって、このような考慮事項に基づいて、アルギニン、リシンとヒスチジン；アラニン、グリシンとセリン；そしてフェニルアラニン、トリプトファンとチロシンは生物学的に機能均等物であるといえる。
【００７３】
上述した生物学的均等活性を有する変異を考慮すれば、本発明の抗体又はこれをコードする核酸分子は、配列番号に記載された配列と実質的な同一性（ｓｕｂｓｔａｎｔｉａｌ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）を示す配列も含むものと解釈される。前記の実質的な同一性は、上述した本発明の配列と任意の他の配列を最大限に対応するようにアラインし、当業界で通常利用されるアルゴリズムを用いてアラインされた配列を分析した場合に、少なくとも９０％の相同性、最も好ましくは少なくとも９５％の相同性、９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上の相同性を示す配列を意味する。配列比較のためのアラインメント方法は当業界に公知されている。ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ）はＮＣＢＩなどで接近可能であり、インターネット上でｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘのような配列分析プログラムと連動して利用することができる。ＢＬＡＳＴは、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／で接続可能である。このプログラムを用いた配列相同性比較方法は、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／ｂｌａｓｔ＿ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌから確認することができる。
【００７４】
これに基づいて、本発明の抗体又はその抗原結合断片は、明細書に記載された明示された配列又は全体と比較して９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又はそれ以上の相同性を有することができる。このような相同性は、当業界に公知された方法による配列比較及び／又は整列によって決定され得る。例えば、配列比較アルゴリズム（すなわち、ＢＬＡＳＴ又はＢＬＡＳＴ２．０）、手動整列、肉眼検査を用いて本発明の核酸又はタンパク質のパーセント配列相同性を決定することができる。
【００７５】
本発明は、他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸に関する。
【００７６】
本発明の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸を分離して抗体又はその抗原結合断片を組換え的に生産することができる。核酸を分離し、これを複製可能なベクター内に挿入してさらにクローニング（ＤＮＡの増幅）したり、或いはさらに発現させる。これに基づいて、本発明はさらに他の観点において、前記核酸を含むベクターに関するものである。
【００７７】
「核酸」は、ＤＮＡ（ｇＤＮＡ及びｃＤＮＡ）及びＲＮＡ分子を包括的に含む意味を有し、核酸において基本構成単位であるヌクレオチドは、自然のヌクレオチドの他に、糖又は塩基部位が変形された類似体（ａｎａｌｏｇｕｅ）も含む。本発明の重鎖及び軽鎖可変領域をコードする核酸の配列は変形可能である。前記変形は、ヌクレオチドの追加、欠失、又は非保存的置換又は保存的置換を含む。
【００７８】
前記抗体を暗号化するＤＮＡは通常の過程を使用し（例えば、抗体の重鎖と軽鎖を暗号化するＤＮＡと特異的に結合し得るオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に分離又は合成する。多くのベクターが入手可能である。ベクター成分には一般に、次のいずれか一つ以上が含まれるが、これに制限されない：信号配列、複製起点、一つ以上のマーカー遺伝子、増強因子要素、プロモーター、及び転写終結配列。
【００７９】
本明細書で使う用語「ベクター」は、宿主細胞で目的遺伝子を発現させるための手段であり、プラスミドベクター；コズミドベクター；バクテリオファージベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター及びアデノ−関連ウイルスベクターのようなウイルスベクターなどを含む。前記ベクターにおいて抗体をコードする核酸はプロモーターと作動的に連結されている。
【００８０】
「作動的に連結」は、核酸発現調節配列（例えば、プロモーター、シグナル配列、又は転写調節因子結合位置のアレイ）と他の核酸配列との機能的な結合を意味し、これによって前記調節配列は前記他の核酸配列の転写及び／又は解読を調節するようになる。
【００８１】
原核細胞を宿主とする場合には、転写を進行させ得る強力なプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｌａｃＵＶ５プロモーター、ｌｐｐプロモーター、ｐＬλプロモーター、ｐＲλプロモーター、ｒａｃ５プロモーター、ａｍｐプロモーター、ｒｅｃＡプロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｔｒｐプロモーター及びＴ７プロモーターなど）、解読の開始のためのリボソーム結合位及び転写／解読終結配列を含むことが一般的である。また、例えば、真核細胞を宿主とする場合には、哺乳動物細胞のゲノムから由来したプロモーター（例：メタロチオニンプロモーター、β−アクチンプロモーター、ヒトヘモグロビンプロモーター及びヒト筋肉クレアチンプロモーター）、又は哺乳動物ウイルスから由来したプロモーター（例えば、アデノウイルス後期プロモーター、ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ＨＳＶのｔｋプロモーター、マウス乳房腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＩＶのＬＴＲプロモーター、モロニーウイルスのプロモーター、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）のプロモーター及びラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）のプロモーター）を用いることができ、転写終結配列としてポリアデニル化配列を一般的に有する。
【００８２】
場合によって、ベクターはそれから発現する抗体の精製を容易にするために他の配列と融合されてもよい。融合される配列は、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，ＵＳＡ）、マルトース結合タンパク質（ＮＥＢ，ＵＳＡ）、ＦＬＡＧ（ＩＢＩ，ＵＳＡ）及び６ｘＨｉｓ（ｈｅｘａｈｉｓｔｉｄｉｎｅ；Ｑｉａｇｅｎ，ＵＳＡ）などがある。
【００８３】
前記ベクターは、選択標識として当業界で通常利用される抗生剤耐性遺伝子を含み、例えば、アンピシリン、ゲンタマイシン、カベニシリン、クロラムフェニコール、ストレプトマイシン、カナマイシン、ジェネティシン、ネオマイシン及びテトラサイクリンに対する耐性遺伝子がある。
【００８４】
本発明は更に他の観点において、上に言及されたベクターで形質転換された細胞に関する。本発明の抗体を生成させるために使用した細胞は、原核生物、酵母又は高等真核生物細胞であり得るが、これに制限されるものではない。
【００８５】
エスケリチアコリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、バチルスサブチリス及びバチルスチューリンゲンシスのようなバチルス属菌株、ストレプトマイセス（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、シュードモナス（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）（例えば、シュードモナスプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｐｕｔｉｄａ））、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ  ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）及びスタフィロコカス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）（例えば、スタフィロコカスカルノサス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｕｓ  ｃａｒｎｏｓｕｓ））のような原核宿主細胞を用いることができる。
【００８６】
ただし、動物細胞に対する関心が最も大きく、有用な宿主細胞株の例は、ＣＯＳ−７、ＢＨＫ、ＣＨＯ、ＣＨＯＫ１、ＤＸＢ−１１、ＤＧ−４４、ＣＨＯ／−ＤＨＦＲ、ＣＶ１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ、ＴＭ４、ＶＥＲＯ、ＨＥＬＡ、ＭＤＣＫ、ＢＲＬ  ３Ａ、Ｗ１３８、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＳＫ−Ｈｅｐ、ＭＭＴ、ＴＲＩ、ＭＲＣ５、ＦＳ４、３Ｔ３、ＲＩＮ、Ａ５４９、ＰＣ１２、Ｋ５６２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、Ｕ２０Ｓ、又はＨＴ１０８０であり得るが、これに制限されるものではない。
【００８７】
本発明はさらに他の観点において、（ａ）前記細胞を培養する段階；及び（ｂ）前記培養された細胞から抗体又はその抗原結合断片を回収する段階を含む前記抗体又はその抗原結合断片の製造方法に関する。
【００８８】
前記細胞は各種培地で培養することができる。市販用培地のいずれも培養培地として用いることができる。当業者に公知されているその他全ての必須補充物が適度の濃度で含まれてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどが発現のために選別された宿主細胞と共に既に使用されており、これは当業者には明らかであろう。
【００８９】
前記抗体又はその抗原結合断片の回収は、例えば遠心分離又は限外濾過によって不純物を除去し、その結果物を、例えば親和クロマトグラフィーなどを用いて精製することができる。更なるその他精製技術、例えば陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーなどが用いられてもよい。
【００９０】
本発明は更に他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片及び薬物を含む抗体−薬物接合体に関する。
【００９１】
抗体−薬物接合体は、ターゲット癌細胞に抗癌薬物を伝達するまでに抗癌薬物が抗体に安定的に結合していなければならない。ターゲットに伝達された薬物は抗体から遊離し、ターゲット細胞の死滅を誘導する必要がある。そのためには、薬物が抗体に安定的に結合すると同時に、ターゲット細胞から遊離する時は、ターゲット細胞の死滅を誘導するに十分な細胞毒性を持つ必要がある。本発明によれば、前記抗体又はその抗原結合断片と薬物を接合させた場合、ヒトＤＬＫ１発現細胞に特異的に結合することによって薬物を効果的に、且つ特異的及び選択的に伝達することができる。
【００９２】
前記薬物は、薬理学的効果を示す製剤であり、本発明のＤＬＫ１に特異的な抗体又はその切片に結合可能であり、酸性条件によって前記抗体又はその切片から分離可能であり、標的細胞に対する治療効果を示す化合物を意味する。該薬物は特にこれに制限されないが、細胞毒素（ｃｙｔｏｔｏｘｉｎ）、放射性同位元素、抗増殖剤、アポトーシス促進剤（ｐｒｏ−ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、化学療法剤及び治療用核酸であり得る。
【００９３】
前記抗体−薬物接合体は、ＤＬＫ１発現細胞に内在化可能であり、抗体依存性細胞毒性を媒介することができる。
【００９４】
用語「細胞毒性活性」は、抗体−薬物接合体又は抗体−薬物接合体の細胞内代謝物質の細胞−死滅、細胞増殖抑制又は成長抑制効果を意味する。細胞毒性活性は、１／２の細胞が生存する単位体積当たり濃度（モル又は質量）であるＩＣ５Ｏ値として表現され得る。
【００９５】
細胞毒素という用語は一般に、細胞の機能を抑制又は防止し／するか、細胞を破壊する製剤を指す。細胞毒素の代表には、抗生剤、チューブリン重合抑制剤、ＤＮＡに結合してこれを破壊するアルキル化剤、及びタンパク質キナーゼ、フォスファターゼ、トポイソメラーゼ、酵素及びサイクリンのような必須の細胞タンパク質の機能又はタンパク質合成を破壊する製剤が含まれる。細胞毒素の例は、タキソール、サイトカラシンＢ（ｃｙｔｏｃｈａｌａｓｉｎ  Ｂ）、グラミシジンＤ（ｇｒａｍｉｃｉｄｉｎ  Ｄ）、エチジウムブロマイド（ｅｔｈｉｄｉｕｍ  ｂｒｏｍｉｄｅ）、エメチン（ｅｍｅｔｉｎｅ）、マイトマイシン（ｍｉｔｏｍｙｃｉｎ）、エトポシド（ｅｔｏｐｏｓｉｄｅ）、テノポシド（ｔｅｎｏｐｏｓｉｄｅ）、ビンクリスチン（ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）、ビンブラスチン（ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、コルヒチン（ｃｏｌｃｈｉｃｉｎｅ）、ドキソルビシン（ｄｏｘｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ダウノルビシン（ｄａｕｎｏｒｕｂｉｃｉｎ）、ジヒドロキシアントラシンジオン（ｄｉｈｙｄｒｏｘｙ  ａｎｔｈｒａｃｅｎｅ  ｄｉｏｎｅ）、ミトキサントロン（ｍｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ）、ミトラマイシン（ｍｉｔｈｒａｍｙｃｉｎ）、アクチノマイシンＤ（ａｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ  Ｄ）、１−デヒドロテストステロン（１−ｄｅｈｙｄｒｏｔｅｓｔｏｓｔｅｒｏｎｅ）、グルココルチコイド（ｇｌｕｃｏｃｏｒｔｉｃｏｉｄｓ）、プロカイン（ｐｒｏｃａｉｎｅ）、テトラカイン（ｔｅｔｒａｃａｉｎｅ）、リドカイン（ｌｉｄｏｃａｉｎｅ）、プロプラノロール（ｐｒｏｐｒａｎｏｌｏｌ）、及びピューロマイシン（ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ）及びそれらの類似体又は同族体が含まれるが、これに制限されない。
【００９６】
放射線療法の適用のために、本発明の抗−ＤＬＫ１抗体は、高エネルギー放射性同位元素を含むことができる。当該同位元素は、例えば、抗体内に存在するシステイン残基で抗体に直接結合してもよく、或いはキレートを用いて抗体と放射性同位元素の結合を媒介してもよい。放射線療法に適した放射性同位元素には、α−放出基、β−放出基及びオージェ電子（ａｕｇｅｒ  ｅｌｅｃｔｒｏｎ）が含まれるが、これに制限されない。診断上適用に有用な放射性同位元素には陽電子放出基及びγ−放出基が含まれる。
【００９７】
抗増殖剤及びアポトーシス促進剤には、ＰＰＡＲ−ガンマ（例えば、シクロペンテノンプロスタグランジン（ｃｙＰＧｓ））、レチノイド、トリテルピノイド（例えば、シクロアルタン、ルパン、ウルサン、オレアナン、フリエデラン、ダマラン、ククルビタシン、及びリモノイドトリテルペノイド）、ＥＧＦ受容体の抑制剤（例えば、ＨＥＲ４）、ラパマイシン、ＣＡＬＣＩＴＲＩＯＬＲ（１，２５−ジヒドロドロキシコレカルシフェロール（ビタミンＤ））、アロマターゼ抑制剤（ＦＥＭＡＲＡ(登録商標)（レトロゾン））、テロメラーゼ抑制剤、鉄キレート剤（例えば、３−アミノピリジン−２−カルボキサルデヒドチオセミカルバゾン（Ｔｒｉａｐｉｎｅ））、アポプチン（ウイルスタンパク質３ニワトリ貧血ウイルスからのＶＰ３）、Ｂｃｌ−２及びＢｃｌ−Ｘ（Ｌ）の抑制剤、ＴＮＦ−アルファ、ＦＡＳリガンド、ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）、ＴＮＦ−アルファ／ＦＡＳリガンド／ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２Ｌ）信号伝達の活性化剤、及びＰＩ３Ｋ−Ａｋｔ生存経路信号伝達の抑制剤（例えば、ＵＣＮ−０１及びゲルダナマイシン）が含まれる。
【００９８】
「化学療法剤」は、作用のメカニズムとは関係なく、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の部類は、アルキル化剤、代謝拮抗物質、紡錘体毒性植物アルカロイド、細胞毒性／抗腫瘍抗生剤、局所異性化酵素抑制物質、抗体、感光剤、そしてキナーゼ抑制物質を含むが、これらに制限されない。化学療法剤は「標的化された療法」及び伝統的な化学療法に利用される化合物を含む。
【００９９】
抗−ＤＬＫ１抗体を用いた診断方法のために、薬物は試験管内又は生体内でＤＬＫ１−発現細胞の存在を検出するのに使用される検出可能な標識を含むことができる。閃光造影術、磁気共鳴映像又は超音波を用いて検出できる標識のように、生体内で検出可能な放射性同位元素を臨床診断適用のために使用することができる。有用なシンチグラフィ標識には陽電子放出基及びγ−放出基が含まれる。マグネチック供給源映像化用として代表的な造影剤には、常磁性又は超常磁性イオン（例えば、鉄、銅、マンガン、クロム、エルビウム、ユウロピウム、ジスプロシウム、ホルミウム及びガドリニウム）、酸化鉄粒子及び水溶性造影剤がある。超音波検出のために、ガス又は液体を、マイクロバブル（ｍｉｃｒｏｂｕｂｂｌｅ）造影剤として放出される多孔性無機粒子中に捕獲させることができる。試験管内検出に有用な検出可能な標識には、蛍光発色団、検出可能なエピトープ又は結合剤及び放射性標識が含まれる。
【０１００】
前記接合体は、薬物を抗体又は機能的均等物を結合して公知の方法で作製することができる。抗体と薬物はそれら自身の連結基などで直接に結合してもよく、或いはリンカーや他の物質で間接に結合してもよい。薬物を抗体から切断させる主要機転には、リソソーム（ヒドラゾーン、アセタル及びシス−アコニット酸−類似アミド）の酸性ｐＨにおける加水分解、リソソーム酵素（カテプシン及びその他リソソーム酵素）によるペプチド切断及びジスルフィドの還元が含まれる。このような様々な切断機転の結果として、薬物を抗体に連結させる機転は非常に多様であり、いかなる適合なリンカーも使用可能である。
【０１０１】
抗体と薬物が結合するための適切な連結基は、当該分野に公知であり、例えば、二硫化基、チオエーテル基、酸分解性基、光分解性基、ペプチダーゼ分解性基及びエステラーゼ分解性基を含む。
【０１０２】
薬物が直接結合する場合、連結基（ｌｉｎｋｉｎｇ  ｇｒｏｕｐ）は、例えば、ＳＨ基を用いた二硫化結合やマレイミドを媒介とする結合を挙げることができる。例えば、抗体Ｆｃ領域の分子内二硫化結合と薬物の二硫化結合を還元して、両者を二硫化結合で連結する。また、マレイミドを用いる方法及び抗体内にシステインを遺伝工学的に導入する方法もある。
【０１０３】
抗体と薬物を他の物質（リンカー）を用いて間接に結合させることもできる。リンカーとしては、抗体、薬物又はこれら全部と反応する官能基を１種又は２種以上有するものが好ましい。官能基の例としては、アミノ基、カルボキシル基、メルカプト基、マレイミド基、ピリジニル基などを挙げることができる。
【０１０４】
本発明は他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異的抗体に関する。二重特異的抗体は、異なる２種類の抗原（標的タンパク質）に結合し得る抗体を意味し、遺伝工学又は任意の方法によって製造された形態である。
【０１０５】
本発明はさらに他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体−薬物接合体を有効成分として含む癌の予防又は治療用医薬組成物に関する。
【０１０６】
本発明は、例えば、（ａ）本発明に係るＤＬＫ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片の薬剤学的有効量；及び（ｂ）薬剤学的に許容される担体を含む癌の予防又は治療用薬剤学的組成物であり得る。本発明はまた、患者に必要な有効量で本発明に係るＤＬＫ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を投与する段階を含む癌の予防又は治療方法に関する。
【０１０７】
前記組成物は、上述した本発明の抗−ＤＬＫ１抗体又はその抗原結合断片を有効成分として用いるので、この両者間に共通する内容説明は省略する。
【０１０８】
「予防」は、本発明に係る組成物の投与によって癌又は感染疾患を抑制させるか進行を遅延させる全ての行為を意味し、「治療」は、癌の進展の抑制、癌の軽減又は癌の除去、若しくは感染疾患の抑制、感染疾患の軽減又は感染疾患の除去を意味する。
【０１０９】
用語「癌」及び「癌性（ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）」は、細胞の集団が調節されない細胞成長と特徴づけられる哺乳類における生理学的条件を意味又は記述する。
【０１１０】
「腫瘍」は、前−癌性（ｐｒｅ−ｃａｎｃｅｒｏｕｓ）病変をはじめとして陽性（非−癌性）又は悪性（癌性）である過度な細胞成長又は増殖によって引き起こされた任意の組織塊のことを指す。
【０１１１】
用語「癌細胞」、「腫瘍細胞」及び文法的等価語は、腫瘍細胞集団の大部分（ｂｕｌｋ）を含む非−腫瘍原性細胞、そして腫瘍原性幹細胞（癌幹細胞）のいずれをも含む、腫瘍又は前−癌性病変から由来した細胞の総集団を指す。
【０１１２】
本発明の抗体は、ＤＬＫ１−発現細胞に関連した適用の場合に、試験管内及び生体内のいずれにおいても有用に利用することができる。前記単一クローン抗体又はその切片；又は抗体−薬物接合体については、前述した通りである。
【０１１３】
本発明において「癌」は、ＤＬＫ１が発現する癌であればいかなる種類も含む。前記ＤＬＫ１が発現する癌は、皮膚癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、腎臓癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、肉腫、神経芽細胞腫及び再発癌からなる群から選ばれるものが好ましいか、これに限定されない。
【０１１４】
本発明の医薬的組成物は、前記ＤＬＫ１に特異的な単一クローン抗体又はその切片；又は前記抗体−薬物接合体を含有することができ、前記成分に本発明の医薬的組成物の投与のためにさらに薬学的に許容可能な担体を含むことができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激しなく、投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体又は希釈剤のことを指す。液相溶液として製剤化する組成物において薬学的に許容可能な担体は、滅菌及び生体に適したものとして、食塩水、滅菌水、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、及びそれらの成分のいずれか１成分以上を混合して使用することができ、必要によって、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤をさらに添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒又は錠剤に製剤化することができる。
【０１１５】
本発明の前記医薬的組成物は、経口又は非経口の様々な剤形であり得る。製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を用いて調製する。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、一つ以上の化合物に少なくとも一つの賦形剤、例えば、澱粉、炭酸カルシウム、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）又はラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチンなどを混ぜて調製する。また、単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルクなどのような潤滑剤も使用される。経口投与のための液状製剤には懸濁剤、耐溶液剤、乳剤、シロップ剤などが該当するが、通常使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィンの他に、様々な賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれてもよい。非経口投与のための製剤には、滅菌した水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁溶剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどを使用することができる。坐剤の基剤としては、ウィテップゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオジ、ラウリンジ、グリセロゼラチンなどを使用することができる。
【０１１６】
また、本発明は他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片又は前記抗体−薬物接合体を接触させることを含む、ＤＬＫ１−発現腫瘍細胞の成長を抑制する方法を提供する。
【０１１７】
前記腫瘍細胞としては、ＤＬＫ１を発現する腫瘍細胞であればいかなる種類も可能である。好ましくは、前記ＤＬＫ１が発現する腫瘍細胞は、皮膚癌、乳癌、子宮癌、大腸癌、腎臓癌、肝癌、肺癌、卵巣癌、膵癌、胃癌、肉腫、神経芽細胞腫又は再発癌細胞であり得るが、これに限定しない。
【０１１８】
腫瘍細胞成長を抑制する方法の一具体例において、抗体又はその抗原結合断片は、薬物、例えば、細胞毒素、放射能同位元素又は化学療法剤のような、治療剤に接合される。他の具体例において、抗体又はその抗原結合断片は、一つ以上の更なる抗−腫瘍剤と組み合わせて投与される。抗体は、手術及び／又は放射線のような他の癌治療法、及び／又は上記で論議し説明した他の抗−新生物製剤と一緒に使用することができるが、これに限定されない。
【０１１９】
本発明は、薬学的に有効な量の抗体又はその抗原結合断片若しくは前記抗体−薬物接合体を個体に投与する段階を含む癌治療方法を提供する。
【０１２０】
本発明の抗体又はその抗原結合断片；若しくは抗体−薬物接合体を用いた治療方法は、前記抗体又はその抗原結合断片；若しくは抗体−薬物接合体を薬学的有効量で投与することを含む。適度の総１日使用量は、正しい医学的判断範囲内で処置医によって決定され得ることは、当業者に明らかである。また、１回又は数回に分けて投与することができる。しかし、本発明の目的上、特定患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が使用されるか否かをはじめとする具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び治療期間、具体的組成物と共に使用されたり又は同時使用される薬物をはじめとする様々な因子と医薬分野によく知られた類似因子によって個別に適用することが好ましい。
【０１２１】
本発明の前記組成物を投与する個体は、ヒトを含めていかなる哺乳動物も可能である。
【０１２２】
本発明の用語「投与」は、いずれか適切な方法で患者に本発明の医薬的組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達できるものであれば、経口又は非経口の様々な経路で投与され得る。
【０１２３】
本発明は他の観点において、前記抗体又はその抗原結合断片を含む癌診断用組成物を提供する。本発明のＤＬＫ１に特異的な抗体又はその抗原結合断片を含む診断用組成物を用いて、ＤＬＫ１発現の有無と発現程度に関連した疾患、例えば癌を診断することができる。
【０１２４】
また、本発明は、前記癌診断用組成物を含む癌診断用キットを提供する。
【０１２５】
前記組成物及び癌については、上述した通りである。また、前記癌診断用キットは分析方法に適した１つ又はそれ以上の異なる構成成分を持つ組成物、溶液又は装置をさらに含んで構成され得る。
【０１２６】
一実施例において、前記キットは、瓶、バイアル、バッグ、注射器又はシリンジを含むことができる。容器は、様々な物質、例えばガラス、プラスチック、又は金属から形成され得る。前記容器に含まれたラベルは、使用指針を示すことができる。さらに、商業的及び使用者観点から好ましい他の物質、例えば、その他緩衝剤、希釈剤、フィルター、針、シリンジなどを含むことができる。
【０１２７】
本発明はさらに他の観点において、前記ＤＬＫ１に特異的に結合する抗体又はその抗原結合断片を抗原結合ドメインとして含むキメラ抗原受容体（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＡＲ）に関する。
【０１２８】
ＣＡＲは、抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞内信号化ドメインを含む細胞外ドメインを含むことができる。細胞外ドメインは、リンカーによって膜貫通ドメインに連結され得る。細胞外ドメインはさらに信号ペプチドを含むことができる。
【０１２９】
ＣＡＲは、Ｔ−細胞信号化分子の細胞質ドメインにヒンジ及び膜貫通領域を介してカップリングされる腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体の単鎖断片可変部（ｓｃＦｖ）を含む。大部分の通常のリンパ球活性化モイエティは、Ｔ−細胞触発（例えば、ＣＤ３ζ）モイエティを有するタンデム（ｔａｎｄｅｍ）においてＴ−細胞共刺激（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、及びＣＤ２７）ドメインを含む。ＣＡＲ−媒介養子免疫療法は、ＣＡＲ−移植された細胞が非−ＨＬＡ−制限方式で標的腫瘍細胞上のＴＡＡを直接認識するようにする。
【０１３０】
本発明は、前記ＣＡＲを発現するように遺伝的に変形された細胞を含む。前記細胞は、免疫細胞、好ましくはＴ細胞又はＮＫ細胞であり得る。
【０１３１】
本発明はさらに他の観点において、腫瘍細胞で発現するＤＬＫ１に特異的に結合する前記抗体又はその抗原結合断片を含むＴ細胞エンゲージャ（Ｔ−ｃｅｌｌ  ｅｎｇａｇｅｒ）に関する。
【０１３２】
前記Ｔ細胞エンゲージャは、例えば、二重−特異的Ｔ−細胞エンゲージャ（ＢｉＴＥ（登録商標））であり得る。前記ＢｉＴＥは、人工二重特異的モノクローナル抗体の部類であり、約５５キロダルトンの単一ペプチド鎖上に４個の異なる遺伝子からアミノ酸配列又は異なる抗体の２個の単鎖可変部断片（ｓｃＦｖ）で構成される融合タンパク質である。ｓｃＦｖのいずれか一つはＣＤ３受容体を介してＴ細胞に結合し、もう一つは腫瘍特異的な分子を介して腫瘍細胞に結合する。他の二重特異的抗体と類似に、そして普通のモノクローナル抗体とは違い、ＢｉＴＥ（登録商標）は、Ｔ細胞と腫瘍細胞との間で連結を形成する。これは、パーフォリン及びグランザイムのようなタンパク質を生産することによって、ＭＨＣ  Ｉ又は共刺激分子の存在とは独立して、Ｔ細胞が腫瘍細胞上で細胞毒性活性を発揮するようにする。これらのタンパク質は腫瘍細胞に進入し、細胞の細胞死滅を開始する。
【０１３３】
実施例
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は単に本発明を例示するためのもので、本発明の範囲がこれら実施例によって制限されるものと解釈されないことは、当業界で通常の知識を有する者にとって自明であろう。
【０１３４】
実施例１．抗原（ＤＬＫ１）の作製と精製
ＤＬＫ１のクローニングは、ヒト胎盤から作られたｃＤＮＡライブラリーを用いてＤＬＫ１の細胞外領域を得るために、５’と３’に制限酵素ＳｆｉＩサイトが含まれたプライマー（表２）を用いてＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ）で増幅させ、増幅したＰＣＲ産物は、ｐＹＫ−６０２ベクターを用いてカルボキシ−末端にヒトＦｃを融合させて作製した（図１Ａ）。
【０１３５】
【表２】
2021502797.tif 000006
【０１３６】
ｐＹＫ６０２ベクターにクローニングされたＤＬＫ１プラスミドは、ＰＥＩ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ）を用いてＨＥＫ２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）に形質感染（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）させた後、無血清培地（ｓｅｒｕｍ−ｆｒｅｅ  ｍｅｄｉｕｍ）で培養した。培養７日目に、細胞培養培地を回収し、遠心分離（６，０００ｒｐｍ、３０分、４４℃）及び０．２２μｍ  Ｔｏｐ−フィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、米国）を用いて細胞と浮遊物質を除去した後、上澄液を集めてタンパク質Ａビーズ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｂｅａｄ）（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｅｃａｒｅ、英国）で精製した。得られたタンパク質の純度は、非還元（Ｎｏｎ−ｒｅｄｕｃｉｎｇ）及び還元（Ｒｅｄｕｃｉｎｇ）条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｇｅｌを用いて分析した（図１Ｂ）。
【０１３７】
実施例２．ＤＬＫ１単一ヒト抗体のスクリーニング及び製造
実施例２−１．ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ）を用いたパンニング
ヒト抗体ライブラリーファージは、２．７×１０１０の多様性を持つヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリー（ｈｕｍａｎ  ｓｃＦｖ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｌｉｂｒａｒｙ）をバクテリアに感染させた後、バクテリアを３０℃で１６時間培養した後、遠心分離（５，０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して上澄液をＰＥＧ（Ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）で濃縮し、これをＰＢＳ緩衝溶液に溶かしてヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーを準備した。
【０１３８】
コーティングバッファ（１５ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、３５ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、３ｍＭ  Ｓｏｄｉｕｍ  ａｚｉｄｅ、ｐＨ９．６）に入っているＤＬＫ１−ｈＦｃ（１００μｇ／３ｍｌ）を一晩中４℃で免疫吸着チューブ（ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂ  ｔｕｂｅ、Ｎｕｎｃ、米国）の表面に固定させた後、ＰＢＳに４％に溶解された脱脂粉乳（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）で室温で２時間ブロッキングした。一方、２．７×１０１０の多様性を持つヒトｓｃＦｖファージディスプレイライブラリーをファージに感染させた後、ライブラリーファージを免疫吸着チューブに入れて常温で２時間反応させた後、ＰＢＳ−Ｔ（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０ｉｎ  ＰＢＳ）５ｍｌで２０回洗浄し、抗原に特異的に結合したｓｃＦｖファージだけを１００ｍＭトリエチルアミン（ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）で溶出した。溶出されたファージはさらに大腸菌に感染させて増幅した後、同様の方法で２〜３次パンニングを行い、３次パンニング後、抗原に対するファージのコロニー数は、表３のように、１、２次パンニング結果と比較して１００倍以上増幅（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）し、抗原に対する結合能も増加した（図２）。
【０１３９】
【表３】
2021502797.tif 000007
【０１４０】
実施例２−２．単一クローン選別
結合能の大きい３次パンニングから得られたファージを大腸菌に感染させた後、それぞれの単一クローンを９６−ディープウェルプレート（９６−ｄｅｅｐ  ｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ、バイオニア）に培養した後、上澄液に存在する単一ｓｃＦｖファージに対してファージ−ＥＬＩＳＡを行って選別した。まず、コーティングバッファを用いて１ウェル当たり１００ｎｇのＤＬＫ１タンパク質を免疫−９６マイクロウェルプレート（ｉｍｍｕｎｏ−９６  ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に分注し、４℃で一晩中表面固定させた後、２００μｌの４％脱脂粉乳が含まれたＰＢＳ−Ｔを全てのウェルに入れて３７℃で１時間反応させることによって、非特異的なタンパク質結合を遮断した。その後、それぞれの培養された２００μｌの単一ｓｃＦｖファージを入れて３７℃で２時間反応させた後、２００μｌのＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）が結合しているマウス抗Ｍ１３抗体（ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｍ１３−ＨＰＲ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、英国）を１：２，０００に希釈して３７℃で１時間反応させた。ＰＢＳ−Ｔでさらに３回洗浄後、１０ｍｌのＰＣ緩衝溶液（０．１Ｍ  Ｎａ２ＨＰＯ４、０．００５Ｍ  Ｎａ−Ｃｉｔｒａｔｅ、ｐＨ５．０）に４ｍｇ  ＯＰＤ（ｏ−ｐｈｅｎｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅ  ｄｉｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ、Ｓｉｇｍａ、米国）１錠、３０％過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）１０μｌを入れて、光のない条件で１０分間反応させた後、５０μｌの２．５Ｍ硫酸（Ｈ２ＳＯ４）で反応を中断させた後、分光光度計（ｓｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ５  ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、米国）を用いて４９０ｎｍで吸光度を測定した。
【０１４１】
その結果、ＤＬＫ１タンパク質に対して結合能の強い数十種の単一ファージクローンを選別した。図３は、様々な単一ファージクローンのうち、代表クローンを図式化したものである。
【０１４２】
前記選別された単一クローンに対してＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いてファージミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ＤＮＡを分離してＤＮＡ塩基配列分析し、重鎖と軽鎖のＣＤＲ３部位配列をＮＣＢＩのウェブページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔのＩｇ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて分析した結果、７種（１７Ｂ１１、１８Ａ５、２０Ｄ３、２１Ｄ８、２１Ｆ９、２７Ｆ７、３５Ｅ２）の異なるクローンとして確認された（表４）。７種のクローンに対する配列は、表５に記載する通りである。
【０１４３】
【表４】
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【０１４４】
【表５】
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2021502797.tif 000010
2021502797.tif 000011
【０１４５】
実施例２−３．ｓｃＦｖ形態をＩｇＧ形態に転換（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ）
選別された７種の単一クローンファージ抗体をｓｃＦｖ形態からＩｇＧ形態に転換するために、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域の塩基配列をそれぞれ制限酵素ＳｆｉＩ／ＮｈｅＩサイトを用いてｐＮＡＴＶＨにクローニングし、制限酵素ＳｆｉＩ／ＢｇｌIIサイトを用いてｐＮＡＴＶＬにクローニングした（図４Ａ）。
【０１４６】
クローニングされたｐＮＡＴＶＨとｐＮＡＴＶＬベクターは６：４の割合でＨＥＫ２９３Ｅ細胞に同時形質感染（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）して７日目に上澄液を回収し、遠心分離及び０．２２μｍＴｏｐ−フィルターを用いて細胞及び浮遊物質を除去した後、上澄液を集めてタンパク質Ａビーズ（ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｂｅａｄ）で精製し、精製された抗体の純度は、非還元及び還元条件のＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いて分析した（図４Ｂ）。
【０１４７】
実施例３．ＤＬＫ１単一クローン抗体の特性
実施例３−１．ＤＬＫ１抗原に対する親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）決定
７種のＤＬＫ１単一ヒト抗体の抗原に対する結合力をＥＬＩＳＡ方法で測定した。前記実施例２−２で記述したファージ−ＥＬＩＳＡ方法と同一であり、ファージの代わりに７種のＤＬＫ１単一ヒト抗体を１００ｎＭから０．０４６ｎＭまで１／３ずつ段階希釈（ｓｅｒｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）し、各ウェルのカラムに順次に１００μｌずつ入れて行った。測定した結果はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｉｓｍ／）を用いて分析した。ＤＬＫ１単一ヒト抗体１７Ｂ１１、１８Ａ５、２０Ｄ３、２１Ｄ８、２１Ｆ１９、２７Ｆ７及び３５Ｅ２の抗原に対する親和度解離定数（Ｋｄ）はそれぞれ、７．１９、０．５２、５３．９５、８．４０、０．５３、０．２２及び０．３３ｎＭだった（図５）。
【０１４８】
実施例３−２．ＤＬＫ１抗原に対する結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）決定
ＤＬＫ１単一ヒト抗体の抗原に対する結合部位を調べるために、図６Ａのように、４種のヒト由来ＤＬＫ１組換えタンパク質及びｈＦｃ組換えタンパク質を、前記実施例１で述べた一方法と同一の方法で作製、生産、精製した（図６Ｂ）。このとき、精製されたＤＬＫ１組換えタンパク質の純度はいずれも９５％以上だったし、７種のＤＬＫ１ヒト抗体に対してＥＬＩＳＡを行った（図６Ｃ）。
【０１４９】
その結果、抗−ＤＬＫ１抗体１７Ｂ１１、２０Ｄ３、２１Ｄ８、２７Ｆ７は、ヒト由来ＥＧＦ様反復ドメイン１及びＥＧＦ様反復ドメイン２に、抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５、２１Ｆ９、３５Ｅ２はＥＧＦ様反復ドメイン６及び膜近接ドメインに結合部位を有するということを確認した（図６Ｃ）。
【０１５０】
実施例３−３．他の種のＤＬＫに対する交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）決定
ＤＬＫ１単一ヒト抗体の他の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）から発見されるＤＬＫ１オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）に対する交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を調べるために、図７Ａのように、マウスＤＬＫ１及びサルＤＬＫ１を、前記実施例１で述べたのと同じ方法で作製、生産、精製した（図７Ｂ）。この時、精製されたＤＬＫ１組換えタンパク質の純度は、図７Ｂのようにいずれも９５％以上だった。これらのタンパク質を用いて７種のＤＬＫ１ヒト抗体の結合力をＥＬＩＳＡ方法で調べた（図７Ｃ）。
【０１５１】
その結果、抗−ＤＬＫ１抗体２１Ｆ９はヒトＤＬＫ１にのみ結合し、抗−ＤＬＫ１抗体１７Ｂ１１、２０Ｄ３、２１Ｄ８、２７Ｆ７は、ヒトＤＬＫ１及びサルＤＬＫ１に結合し、抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５、３５Ｅ２は、ヒトＤＬＫ１、マウスＤＬＫ１及びサルＤＬＫ１に結合することを確認した（図７Ｃ）。
【０１５２】
したがって、前記実施例３−１及び３−３の結果に基づいて、ＤＬＫ１単一ヒト抗体のヒトＤＬＫ１に対する結合力が低い２０Ｄ３と、サルＤＬＫ１に結合力が低い２１Ｆ９及び３５Ｅ２は、特性分析によるＤＬＫ１ヒト抗体選別過程から除外した。
【０１５３】
実施例３−４．ＦＡＣＳ分析を用いた細胞表面に存在するＤＬＫ１に対する結合力の確認
本発明のヒト抗体の細胞表面に存在するＤＬＫ１に対する特異的結合力は、抗原を持続して発現できるように形質転換された（ＤＬＫ１が過発現した）ヒト膵癌細胞株であるＭＩＡ  ＰａＣａ−２と、ＤＬＫ１を内生的に発現している神経芽腫細胞株であるＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞を使用し、ＤＬＫ１に対するｓｉＲＮＡ（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国）を２０ｎＭ処理してＤＬＫ１の発現を減少させることによって、細胞表面の抗原発現程度による抗体の抗原結合力をＦＡＣＳ分析した。それぞれの細胞を５×１０５細胞で準備し、１次抗体として２μｇ／ｍｌ濃度のＤＬＫ１単一ヒト抗体である１７Ｂ１１、１８Ａ５、２１Ｄ８、２７Ｆ７を４℃で１時間反応させた。その後、細胞は、冷たいＰＢＳで水洗した後、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；Ｖｅｃｔｏｒ、米国）蛍光が結合した抗−ヒトＩｇＧ  ２次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ、米国）を用いて４℃で１時間暗培養した。蛍光染色された細胞は、２％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が含まれた５００μｌのＰＢＳで懸濁させた後、流細胞分析機であるＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭＩＩ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて分析した。
【０１５４】
ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に対するＤＬＫ１  ｓｉＲＮＡによるＤＬＫ１発現率の減少は、ウェスタンブロットによって確認した（図８Ａ）。１７Ｂ１１、１８Ａ５、２７Ｆ７のＤＬＫ１単一ヒト抗体は、ＤＬＫ１の過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に結合し、ＤＬＫ１ｓｉＲＮＡによってＤＬＫ１の発現量が減少した場合にその結合力はなくなることが確認された（図８Ｂ）。しかし、ＤＬＫ１単一ヒト抗体２１Ｄ８は、ＤＬＫ１の過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞ですら結合することができなかった。
【０１５５】
また、ＤＬＫ１を内生的に発現させているＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞と、この細胞にＤＬＫ１  ｓｉＲＮＡを用いてＤＬＫ１発現を減少させた細胞において（図９Ａ）、１８Ａ５、２７Ｆ７のＤＬＫ１単一ヒト抗体は、ＤＬＫ１が内生的に発現するＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞に結合しており、ＤＬＫ１  ｓｉＲＮＡによってＤＬＫ１の発現量が減少した場合にその結合力はなくなることが確認された（図９Ｂ）。しかし、１７Ｂ１１、２１Ｄ８のＤＬＫ１単一ヒト抗体は、ＤＬＫ１を内生的に発現するＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞ですら結合することができなかった。
【０１５６】
したがって、前記実施例３−４から、ＤＬＫ１単一ヒト抗体１７Ｂ１１と２１Ｄ８は特性分析によるＤＬＫ１ヒト抗体選別過程から除外した。
【０１５７】
実施例３−５．免疫細胞化学（Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）分析による細胞表面特異的結合力の確認
８−ウェルチャンバースライド（８−ｗｅｌｌ  ｃｈａｍｂｅｒ  ｓｌｉｄｅ；Ｎｕｎｃ、米国）に、ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞をウェル当たり２×１０４細胞でシード（ｓｅｅｄｉｎｇ）し、１０％  ＦＢＳが含まれたＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ；ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国）完全培地で二日間育てた。次の日、培地を除去し、１０μｇ／ｍｌの陰性対照群抗−ヒトＩｇＧ、抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５又は抗−ＤＬＫ１抗体２７Ｆ７が含まれた冷たいＤＭＥＭ培地を添加し、抗体が細胞表面に結合するように４℃で１時間反応させた。細胞に結合しない抗体はＰＢＳで３回水洗して除去した後、細胞に、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）が含まれたＰＢＳを添加し、常温で１０分間反応させることによって細胞を固定させた。固定された細胞は、１０％  ＦＢＳが含まれたＰＢＳで水洗した後、ＦＩＴＣ−抗−ヒトＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ、米国）２次抗体が１：２００で含まれたＰＢＳを添加し、常温で１時間暗培養した。蛍光染色された細胞はＰＢＳＴで３分間隔で３回水洗した後、ＤＡＰＩ（４’，６−ｄｉａｍｉｄｉｎｏ−２−ｐｈｅｎｙｌｉｎｄｏｌｅ；Ｖｅｃｔｏｒ、米国）が含まれたマウンティング（ｍｏｕｎｔｉｎｇ）溶液（Ｖｅｃｔｏｒ、米国）をスライドに落とし、気泡ができないようにカバーガラスで覆って封鎖した後、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ、ＺＥＩＳＳ、ドイツ）を用いてイメージングした。
【０１５８】
その結果、図１０のように、２種（１８Ａ５、２７Ｆ７）のＤＬＫ１単一ヒト抗体とも、ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２の細胞膜に結合することを確認した。一方、陰性対照群として使用した抗−ヒトＩｇＧは細胞膜に結合しなかった。
【０１５９】
実施例３−６．ヒト膵癌細胞において抗−ＤＬＫ１抗体の細胞内流入の検証
抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５及び２７Ｆ７が細胞表面に存在する抗原と結合した後、細胞内に取り込まれ得るかを確認するために、ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞においてエンドサイトーシス（ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ）試験法を行い、また、抗体の細胞内位置を確認するために、免疫細胞化学的染色を行った。８−ウェルチャンバースライドにウェル当たり２×１０４でシードされた細胞に、１０μｇ／ｍｌの抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５及び２７Ｆ７をそれぞれ処理し、４℃で１時間、細胞表面に存在する抗原に抗体が結合するように反応させた。その後、細胞を冷たいＰＢＳで水洗し、抗体の細胞内流入を誘導するために、３７℃にあらかじめ温めておいた完全培地に入れ換え、３７℃、５％  ＣＯ２条件で、０．１、０．５、１、２又は４時間培養した。計画した培養時間が終わった後、細胞をＰＢＳで３回水洗して培地を除去し、４％パラホルムアルデヒドで固定した。固定された細胞は、ＰＢＳで３回水洗した後、０．２％サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）及び１０％  ＦＢＳが含まれたＰＢＳに希釈したそれぞれのエンドソーム（ｅｎｄｏｓｏｍｅ）標識抗体と共に常温で１時間反応させた。エンドソーム標識は、後期エンドソーム（ｌａｔｅ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ）／リソソーム（ｌｙｓｏｓｏｍｅ）標識抗体として抗−ウサギＬＡＭＰ１（Ａｂｃａｍ、米国）を、初期エンドソーム（ｅａｒｌｙ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ）標識抗体として抗−マウスＥＥＡ１（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を、初期／リサイクリングエンドソーム（ｅａｒｌｙ／ｒｅｃｙｃｌｉｎｇ  ｅｎｄｏｓｏｍｅ）標識抗体として抗−マウストランスフェリン受容体（ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ（ＴｆＲ）；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を使用した。標識抗体結合後、細胞は、１０％  ＦＢＳが含まれたＰＢＳで３分間隔で３回水洗した後、抗−ＤＬＫ１抗体に対する２次抗体であるＦＩＴＣが結合した抗−ヒトＩｇＧ（Ｖｅｃｔｏｒ、米国）、抗−ウサギＬＡＭＰ１に対する２次抗体であるＣｙ３が結合した抗−ウサギＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、米国）、そして抗−マウスＥＥＡ１又は抗−マウスＴｆＲに対する２次抗体であるＣｙ３が結合した抗−マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、米国）を、０．２％サポニン（ｓａｐｏｎｉｎ）及び１０％  ＦＢＳが含まれたＰＢＳにそれぞれ１：２００に希釈して常温で１時間暗培養した。蛍光染色された細胞は、ＰＢＳで３分間隔で３回水洗した後、ＤＡＰＩが含まれたマウンティング溶液（Ｖｅｃｔｏｒ、米国）をスライドに落とし、気泡ができないようにカバーガラスで覆って封鎖した後、共焦点レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ  ｌａｓｅｒ  ｓｃａｎｎｉｎｇ  ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＬＳＭ５１０ＭＥＴＡ、ＺＥＩＳＳ、ドイツ）を用いてイメージングした。
【０１６０】
その結果、２種のＤＬＫ１単一ヒト抗体は、エンドサイトーシス誘導後０．１時間から既に細胞内に流入することを確認した（図１１及び図１２）。一方、流入した抗−ＤＬＫ１抗体は、初期には初期エンドソーム及びリサイクリングエンドソーム標識抗体である抗−ＥＥＡ１抗体又は抗−ＴｆＲ抗体と共−位置（ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）する頻度が高かったが、この頻度は、時間が経つほど低くなり、後期エンドソーム／リソソーム標識抗体である抗−ＬＡＭＰ１抗体と共−位置する頻度が高くなることから、抗−ＤＬＫ１抗体がリソソームに伝達されることを確認することができた。したがって、ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞においてＤＬＫ１単一ヒト抗体１８Ａ５及び２７Ｆ７とも、細胞毒性物質を細胞内に伝達するためのＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、抗体−薬物接合体）用に適した抗体であることを確認した。
【０１６１】
実施例３−７．ＦＡＣｓ分析による抗−ＤＬＫ１抗体の細胞内流入の定量化
抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５及び２７Ｆ７を、ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞表面に結合及び細胞流入を誘導した後、時間別に細胞表面に残っている抗体の量を測定するために、蛍光利用細胞分流器を用いて定量化を行った。６−ウェルプレートにウェル当たり５×１０５細胞でシード（ｓｅｅｄｉｎｇ）された細胞に、１０μｇ／ｍｌの抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５及び２７Ｆ７をそれぞれ処理し、４℃で１時間、細胞表面に存在する抗原に抗体が結合するように反応させた。その後、細胞を冷たいＰＢＳで水洗し、抗体の細胞内流入を誘導するために、３７℃にあらかじめ温めておいた完全培地に入れ換え、３７℃、５％  ＣＯ２条件で０、０．５、２又は４時間培養した。各時間別に細胞は、冷たい１０％  ＦＢＳ（Ｆｅｔａｌ  Ｂｏｖｉｎｅ  Ｓｅｒｕｍ）が含まれたＰＢＳで水洗し、細胞をスクラッパー（ｓｃｒａｐｐｅｒ）でかき集めて遠心分離した後、ＦＩＴＣ蛍光が結合した抗−ヒトＩｇＧ  ２次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ、米国）を用いて４℃で０．５時間暗培養した。蛍光染色された細胞は、１０％  ＦＢＳが含まれた５００μｌのＰＢＳで懸濁させた後、流細胞分析機であるＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭＩＩ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）を用いて分析した。抗体の内在化の動力学比較は、細胞表面に残っている抗−ＤＬＫ１抗体を平均蛍光強度（Ｍｅａｎ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ，ＭＦＩ）によって定量化した。細胞内流入比率は、下記のように計算した。
細胞内流入（％）＝（１−ＭＦＩ３７℃／ＭＩＦ４℃）Ｘ１００
【０１６２】
その結果、２種の抗−ＤＬＫ１単一ヒト抗体は、時間依存的に速く細胞内に流入することを確認した（図１３）。細胞内流入を誘導して０．５時間で既に、１８Ａ５は３３．２％、２７Ｆ７は４５．８％が細胞内に流入し、４時間後、１８Ａ５は７７．１％、２７Ｆ７は８８．２％と高い比率で速く細胞内に流入した。したがって、前記開示された共焦点顕微鏡検査によって評価されるように、ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞においてＤＬＫ１単一ヒト抗体１８Ａ５及び２７Ｆ７とも、細胞毒性物質を細胞内に伝達するためのＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅ、抗体−薬物接合体）用に適した抗体であることを確認した。
【０１６３】
実施例４．ＤＬＫ１発現癌細胞における効能試験
抗−ＤＬＫ１抗体に対する抗−ＤＬＫ１抗体−薬物接合体（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）としての開発可能性を確認するために、ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞に、ＺＡＰ抗体内在化キット（ＺＡＰ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｋｉｔ）（Ａｄｖａｎｃｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、ＵＳＡ）を用いて、ＤＬＫ１単一ヒト抗体１８Ａ５及び２７Ｆ７に対する細胞毒性実験を行った。９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、ＵＳＡ）にウェル当たり細胞を２．５×１０３で分注し、２４時間付着させた後、１８Ａ５、１８Ａ５−Ｆａｂ  ＺＡＰ或いは２７Ｆ７、２７Ｆ７−Ｆａｂ  ＺＡＰを、１ｆＭ〜１０ｎＭの範囲内で、図１４のように、異なる濃度別に調製して細胞培養液に処理し、陽性対照薬物であるサポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）は１ｆＭ〜１μＭの範囲内で、ＩｇＧ−ＳＡＰは１ｆＭ〜１００ｎＭの範囲内で細胞培養液に処理した。その後、ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞は、３７℃、５％  ＣＯ２インキュベーターで７２時間培養した後、５０μｌ  ＸＴＴ／ＰＭＳ溶液を加え、２時間さらに培養し、これを、ＥＬＩＳＡリーダー（Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｍａｘ５；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅ、ＵＳＡ）を用いて４５０ｎｍで吸光度を測定した。各試料の細胞毒性を比較検討するために、最大効果の５０％に至らせるために必要な試料の量（ＥＣ５０）を測定した。
【０１６４】
その結果、１８Ａ５或いは２７Ｆ７を処理したり、或いは陰性対照薬物ＩｇＧ−ＳＡＰを処理したとき、いかなる濃度でも、ＤＬＫ１の過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞において癌細胞の死滅が起きなかったが、１８Ａ５−或いは２７Ｆ７−Ｆａｂ  ＺＡＰの癌細胞に対する毒性は、抗体の濃度が増加するにつれて増加し、１０ｐＭの濃度で約８０％の細胞毒性効果を示した（図１４）。このとき、ＥＣ５０値はそれぞれ、２．５、３０．１ｆＭだった。一方、陽性対照薬物であるサポリンは、１００ｎＭ以上の高い濃度で非特異的な細胞流入による細胞毒性を起こした。
【０１６５】
前記実施例４の結果は、２種（１８Ａ５、２７Ｆ７）の抗−ＤＬＫ１単一ヒト抗体は、癌細胞表面に発現するＤＬＫ１をターゲットとして癌細胞を死滅させ得る抗−ＤＬＫ１抗体−薬物接合体として開発可能であるということを示唆する。
【０１６６】
実施例５．ＤＬＫ１抗体１８Ａ５に対する抗体最適化
実施例５−１．ＤＬＫ１−１８Ａ５抗体の最適化のためのライブラリー作製
抗体最適化は、重鎖は固定し、ワイバイオロジックスで保有している１０５〜１０６軽鎖（ＬＣ）プールを入れて新しいＬＣシャフリングライブラリー（ＬＣ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｙ）を作製するＬＣシャフリング、重鎖の疎水性コア（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｃｏｒｅ）、露出残基（ｅｘｐｏｓｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）、電荷クラスター（ｃｈａｒｇｅ  ｃｌｕｓｔｅｒ）、塩ブリッジ（ｓａｌｔ  ｂｒｉｄｇｅ）などのように構造的に重要な部位の残基と比較分析をして保存された残基（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  ｒｅｓｉｄｕｅ）に変異させた後にＬＣシャフリングを進行するコアパッキング（ｃｏｒｅ  ｐａｃｋｉｎｇ）＋ＬＣシャフリング、抗体可変領域（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎ）のＤＮＡはｉｎ  ｖｉｖｏ親和度成熟（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ）過程で頻繁に変異（ｍｕｔａｔｉｏｎ）され得る変異ホットスポット（ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｈｏｔ  ｓｐｏｔ）をランダムに変異させた後にＬＣシャフリングを進行するＣＤＲホットスポット＋ＬＣシャフリング（ＡＭ）などの３つの方法で進行した。
【０１６７】
ＬＣシャフリングライブラリー作製のために１８Ａ５抗体のＬＣ遺伝子をＢｓｔＸＩで切断した後にベクターとして使用し、同社で保有しているライブラリープール（ｌｉｂｒａｒｙ  ｐｏｏｌ）をＢｓｔＸＩで切断してインサートとして使用した。リガーゼでライゲーション後に、電気穿孔形質転換用細胞を用いて形質転換を行った。方形皿（ｓｑｕａｒｅ  ｐｌａｔｅ）に形質転換された細胞を集めて抗体ライブラリーを製造した結果、約１．５×１０７の様々なライブラリーを得た。塩基配列分析の結果、ＨＣの配列はいずれも同じであり、また、ＬＣの配列が互いに異なることを確認した。
【０１６８】
コアパッキング＋ＬＣシャフリングライブラリーを作製するために、１８Ａ５抗体の骨格（ＦＲ）部分を、保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換した後に、ＬＣ遺伝子をＢｓｔＸＩで切断してベクターとして使用し、同社で保有しているライブラリープールをＢｓｔＸ Ｉで切断してインサートとして使用した。リガーゼでライゲーション後に、電気穿孔形質転換用細胞を用いて形質転換を行った。方形皿（ｓｑｕａｒｅ ｐｌａｔｅ）に形質転換された細胞を集めて抗体ライブラリーを製造した結果、約８．４×１０６の様々なライブラリーを得た。塩基配列分析の結果、ＨＣのＦＲ部位が、保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換され、また、ＬＣの配列が互いに異なることを確認した。 
【０１６９】
ＣＤＲホットスポット＋ＬＣシャフリングライブラリーを作製するために、１８Ａ５抗体の骨格（ＦＲ）部分を、保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換した後に、ＣＤＲのホットスポットライブラリーをＳｆｉＩで切断してインサートとして使用し、同社で保有しているライブラリープールをＳｆｉＩで切断してベクターとして使用した。リガーゼでライゲーション後に、電気穿孔形質転換用細胞を用いて形質転換を行った。方形皿（ｓｑｕａｒｅ ｐｌａｔｅ）に形質転換された細胞を集めて抗体ライブラリーを製造した結果、約５．６×１０６の様々なライブラリーを得た。塩基配列分析の結果、ＨＣのＦＲ部位が、保存された（ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ）アミノ酸配列に置換され、ＣＤＲのホットスポット配列のアミノ酸がランダムに変異され、また、ＬＣの配列が互いに異なることを確認した。
【０１７０】
実施例６．ＤＬＫ１ヒト抗体変異体の選別
実施例６−１．バイオパンニング（Ｂｉｏ−ｐａｎｎｉｎｇ）
ＤＬＫ１−１８Ａ５抗体の最適化のために作製したライブラリーファージをバクテリアに感染させた後、バクテリアを３０℃に１６時間培養した。培養後に遠心分離して上澄液をＰＥＧで濃縮した後、これをＰＢＳ緩衝溶液に溶かしてヒト抗体ライブラリーを準備した。ヒトＤＬＫ１−ｈＦｃタンパク質抗原がコートされた免疫チューブにライブラリーファージを入れ、室温で２時間反応させた後、１ＸＰＢＳ／Ｔと１ＸＰＢＳで水洗し、抗原に特異的に結合したｓｃＦｖ−ファージだけを抽出した。
【０１７１】
抽出されたファージをさらに大腸菌に感染させて増幅させるパンニング過程を行って陽性ファージのプールを得、抗体最適化のためのパンニングは最初ラウンドだけ行った。その結果、表６に示すように、２ラウンドパンニングにおいて抗原に結合したファージ数が、流入（ｉｎｐｕｔ）対結合（ｏｕｔｐｕｔ）が多少増加したことを確認した。
【０１７２】
【表６】
2021502797.tif 000012
【０１７３】
実施例６−２．陽性ファージの選別
パンニングから得たコロニーは、２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地に１ｍｌ  ９６−ディープウェルプレートを用いて３７℃で１６時間培養した。培養細胞は、ＯＤ６００で値が０．１となるように１００〜２００μｌを取って１ｍｌの２ｘＹＴＣＭ、２％グルコース、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２培地に入れた後、９６−ディープウェルプレートに３７℃でＯＤ６００値が０．５〜０．７となるように２〜３時間培養した。Ｍ１ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ  ｐｈａｇｅ）をＭＯＩ値が１：２０となるように感染させ、２ｘＹＴＣＭＫ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２１ｍＭ  ＩＰＴＧ培地に３０℃で１６時間培養した。
【０１７４】
免疫−９６マイクロウェルプレート（ｉｍｍｕｎｏ−９６  ｍｉｃｒｏｗｅｌｌ  ｐｌａｔｅ）に抗原ＤＬＫ１を、ウェル当たり１００ｎｇずつを４℃で１６時間コートした後、ＰＢＳに溶かした４％脱脂粉乳を用いて各ウェルをブロッキングし、ＰＢＳ／Ｔで水洗後に、１６時間培養した単一クローンｓｃＦｖ−ファージ（それぞれ１００ｓｃＦｖ−ファージ）を各ウェルに１μｌずつ入れて常温で２時間反応させた。反応後、各ウェルをＰＢＳ／Ｔで４回水洗した後、２次抗体であるマウス抗−Ｍ１３抗体（ｍｏｕｓｅ  ａｎｔｉ−Ｍ１３−ＨＲＰ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、英国）を１／２０００に希釈して室温で１時間反応させ、ＰＢＳ／Ｔ水洗後に発色して吸光度４９０ｎｍで測定した。
【０１７５】
上記のようにＤＬＫ１抗原に結合する単一ファージクローンを選別するために約５００個の抗体クローンを分析し、その結果、親抗体（ｐａｒｅｎｔ）であるＤＬＫ１−１８Ａ５に比べて、結合能が強い又は類似の単一ファージクローンが確認できた。例として３８種の単一ファージクローン分析結果を図１５に示す。
【０１７６】
実施例６−３．陽性ファージ抗体の塩基配列の分析
選別された単一クローンに対してＤＮＡ精製キット（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）を用いてＤＮＡ−ｐｒｅｐを行ってＤＮＡを得、配列分析を依頼した（ソルジェント）。配列分析結果から、選別された抗体のＶＨとＶＬのＣＤＲ領域を確認し、それら抗体とジャームライン（ｇｅｒｍ  ｌｉｎｅ）抗体群の類似性を、ＮＣＢＩのウェブページｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｉｇｂｌａｓｔ／のＩｇ  ＢＬＡＳＴプログラムを用いて調べた。その結果、親抗体（ＤＬＫ１−１８Ａ５）に比べて抗原結合力が高い又は類似の４４種（ＬＳ：１９種、ＦＲ：８種、ＡＭ：１７種）の特異的なファージ抗体を得、下記する実施例のように、異なる種間の交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）、抗原結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）、親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）、細胞結合能、細胞内流入力、癌細胞死滅効能などの分析によって１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０及び１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２抗体の２種を選別した。選別した２種の単一クローン特性は、表７に整理して提示した。
【０１７７】
【表７】
2021502797.tif 000013
【０１７８】
選別された２種抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ、ＦＲ配列及びこれを含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む抗体は、次の表８の通りである。
【０１７９】
【表８】
2021502797.tif 000014
【０１８０】
実施例７．ＤＬＫ１ヒト抗体変異体の生産
選別された１８Ａ５抗体変異体２種の抗体生産は、実施例２−３に述べたのと同じ過程で行われた。クローニングされた重鎖と軽鎖を含むそれぞれのベクターは、動物臨時発現細胞ＨＥＫ−２９３Ｅに同時形質感染して発現させた後、タンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーで精製して生産量を確認し、還元、非−還元条件でＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によってタンパク質純度及び移動度状態を確認した。
【０１８１】
その結果、図１６に示すように、ＤＬＫ１−１８Ａ５ヒト抗体変異体ＬＳ＿１Ａ１０とＡＭ＿１Ａ１２は、非還元条件では両方とも１５０ｋＤａ以上の大きさにおいて検出され、純度は９５％以上、生産量はそれぞれ１２７．４ｍｇ／Ｌ、１６８．５ｍｇ／Ｌと確認された。
【０１８２】
実施例８．ＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体の特性
実施例８−１．選別されたＤＬＫ１ヒト単一抗体変異体の交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）の決定
ＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体の他の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）から発見されるＤＬＫ１オルソログ（ｏｒｔｈｏｌｏｇｕｅ）に対する交差反応性（ｃｒｏｓｓ−ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ）を調べるために、図７で使用したのと同じマウスＤＬＫ１及びサルＤＬＫ１タンパク質を用いて、ＤＬＫ１ヒト抗体の結合力をＥＬＩＳＡ方法で調べてみた。
【０１８３】
その結果、抗−ＤＬＫ１抗体変異体１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０及び１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２は、親抗体１８Ａ５と同じヒトＤＬＫ１、マウスＤＬＫ１及びサルＤＬＫ１に結合することを確認した（図１７）。
【０１８４】
実施例８−２．選別されたＤＬＫ１ヒト単一抗体変異体のＤＬＫ１抗原に対する結合部位（ｅｐｉｔｏｐｅ）の決定
ＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体の抗原に対する結合部位を調べるために、図６におけると同じ４種のヒト由来ＤＬＫ１組換えタンパク質及びｈＦｃ組換えタンパク質を用いて、ＤＬＫ１ヒト抗体変異体に対してＥＬＩＳＡを行った。
【０１８５】
その結果、抗−ＤＬＫ１抗体変異体１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０及び１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２は、親抗体１８Ａ５と同じＥＧＦ様反復ドメイン６及び膜近接ドメインに結合部位を有するということを確認した（図１８）。
【０１８６】
実施例８−３．選別されたＤＬＫ１ヒト単一抗体変異体の抗原に対する親和度（ａｆｆｉｎｉｔｙ）の決定
選別されたＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体の抗原に対する結合力をＥＬＩＳＡ方法で測定した。前記実施例２−２で述べたファージ−ＥＬＩＳＡ方法と同一であり、ファージの代わりに選別されたＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体を１００ｎＭで０．０４６ｎＭまで１／３ずつ段階希釈（ｓｅｒｉａｌ  ｄｉｌｕｔｉｏｎ）して各ウェルのカラムに順次に１００μｌずつ入れて行った。測定した結果は、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６  ｓｏｆｔｗａｒｅ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｇｒａｐｈｐａｄ．ｃｏｍ／ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ−ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｐｒｉｓｍ／）を用いて分析した。ＤＬＫ１単一ヒト抗体１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２の抗原に対する親和度の解離定数（Ｋｄ）はそれぞれ、０．０４７、０．０１３ｎＭだった（図１９）。
【０１８７】
実施例８−４．ＦＡＣｓ分析による細胞表面に存在するＤＬＫ１に対する結合力確認
抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５とＤＬＫ１ヒト抗体変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２の、ＤＬＫ１が過発現したヒト膵癌細胞株であるＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞表面への結合力を比較するためにＦＡＣＳ分析を行った。細胞を５×１０５細胞として準備し、１次抗体として抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５とＤＬＫ１ヒト抗体変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２を１０μｇ／ｍｌ濃度から初めて１／３階段希釈して４℃で１時間細胞結合させた。その後、細胞を冷たいＰＢＳで水洗した後、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；Ｖｅｃｔｏｒ、米国）蛍光が結合した抗−ヒトＩｇＧ  ２次抗体（Ｖｅｃｔｏｒ、米国）を用いて４℃で１時間暗培養した。蛍光染色された細胞は、２％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が含まれた５００μｌのＰＢＳで懸濁させた後、流細胞分析機であるＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭＩＩ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて分析した。最大効果の５０％に至らせるのに必要な抗体の量（ＥＣ５０）を測定した。
【０１８８】
その結果、ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２に抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５とＤＬＫ１ヒト抗体変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２が結合するＥＣ５０抗体の量は、１８Ａ５が１３０．７ｎｇ／ｍｌ、１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０は１２０ｎｇ／ｍｌ、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２は９０．３ｎｇ／ｍｌであり、いずれも類似の結合力を示した（図２０）。
【０１８９】
実施例８−５．選別されたＤＬＫ１ヒト単一抗体変異体の細胞表面に存在するＤＬＫ１抗原に対する特異的結合力の確認
ＤＬＫ１−１８Ａ５単一ヒト抗体変異体の抗原に対する結合特異性は、細胞表面にＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞と、内生的にＤＬＫ１を発現させているＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞にそれぞれ、２０ｎＭのＤＬＫ１  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＤＬＫ１、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ、米国）又はｓｈＲＮＡ（ｓｈＤＬＫ１、Ｓｉｇｍａ、米国）を処理してＤＬＫ１の発現を減少させた後、抗体の細胞結合力差から確認した。抗体の細胞結合力はＦＡＣＳ分析から確認した。それぞれの細胞を５×１０５細胞として準備し、ＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０と１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２を２μｇ／ｍｌ濃度で４℃で１時間反応させた。その後、細胞は、冷たいＰＢＳで水洗した後、ＦＩＴＣ（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；Ｖｅｃｔｏｒ、米国）蛍光が結合した抗−ヒトＩｇＧ抗体（Ｖｅｃｔｏｒ、米国）を４℃で１時間暗培養した。蛍光染色された細胞は２％  ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）が含まれた５００μｌのＰＢＳで懸濁させた後、流細胞分析機であるＦＡＣＳＣａｎｔｏＴＭＩＩ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて分析した。
【０１９０】
その結果、ＤＬＫ１  ｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡを、ＤＬＫ１が過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞（図２１Ａ）、及び内生的にＤＬＫ１を発現させているＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞（図２１Ｂ）に処理したとき、ウェスタンブロット上でそれぞれ対照群（ｓｃＲＮＡ又はｓｈＣｏｎ）に比べて、いずれも９５％以上ＤＬＫ１発現が減少し、この時、ＤＬＫ１単一ヒト抗体変異体１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０と１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２の細胞結合力も、ＦＡＣＳ分析結果から減少することを確認した。この結果は、１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０及び１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２抗体がＤＬＫ１抗原に特異的に結合することを示唆する。
【０１９１】
実施例９．選別されたＤＬＫ１ヒト抗体変異体の活性評価
実施例９−１．ＩｎｃｕＣｙｔｅ分析による選別されたＤＬＫ１ヒト抗体変異体の細胞内流入の確認
抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５とその変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０及び１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２の細胞内流入力は、それぞれ、抗体をＩｎｃｕｃｙｔｅ(R)  ＦａｂＦｌｕｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｒｅｄ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、米国）と接合させた後、ＤＬＫ１の発現率が高いＤＬＫ１過発現ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞、発現率が普通であるＳＫ−Ｎ−Ｆ１細胞、そして発現率が低いＨｅｐＧ２細胞に処理し、時間によって細胞内に流入する抗体の量をモニタリングして確認した。９６−ウェルプレート（Ｎｕｎｃ、米国）にウェル当たり１×１０４個のＤＬＫ１過発現ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞と４×１０４個のＳＫ−Ｎ−Ｆ１又はＨｅｐＧ２細胞を分注して２４時間付着させ、それぞれ４μｇ／ｍｌの抗体を同量のＩｎｃｕｃｙｔｅ(R)  ＦａｂＦｌｕｏｒ  ｒｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｌａｂｅｌｉｎｇ  ｒｅａｇｅｎｔと混合して３７℃で１５分間暗反応させた後、細胞に処理した。抗体の細胞内流入量は、時間によって細胞のリソソームに蓄積される抗体の量をＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ  ＨＤ／２ＣＬＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｅｓｓｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国）を用いて１５分間隔で２４時間確認し、定量化を行った。
【０１９２】
その結果、細胞表面に結合した抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５とＤＬＫ１ヒト抗体変異体抗体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０、１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２は、ＤＬＫ１過発現ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞では１時間以内、ＳＫ−Ｎ−Ｆ１とＨｅｐＧ２細胞では３時間以内に、抗体の５０％が細胞内に流入することを確認した（図２２Ａ）。抗体は、細胞表面のＤＬＫ１発現量によって細胞内流入程度に差があった。また、２４時間後に細胞内流入した抗体の蓄積量は、同一細胞に対してはいずれも類似だった（図２２Ｂ）。
【０１９３】
上記の結果は、抗−ＤＬＫ１抗体１８Ａ５と同様に、１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０及び１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１２抗体両方とも、細胞内に薬物を伝達できる抗体と評価され、抗−ＤＬＫ１抗体−薬物接合体として開発可能であるということを示唆する。
【０１９４】
実施例９−２．選別されたＤＬＫ１ヒト抗体変異体の癌細胞死滅効能試験
ＤＬＫ１−１８Ａ５単一ヒト抗体変異体である１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０と１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２抗体のＡＤＣ（Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ｄｒｕｇ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）開発可能性の確認は、実施例４のように、ＤＬＫ１過発現ＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞とＺＡＰ抗体内在化キット（Ａｄｖａｎｃｅ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ、米国）を用いて同じ方法で細胞毒性実験を行い、１８Ａ５抗体と比較確認した。
【０１９５】
その結果、１８Ａ５、１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０或いは１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２抗体を処理したり、或いは陰性対照薬物ＩｇＧ−ＳＡＰを処理したとき、いずれの濃度でも、ＤＬＫ１の過発現したＭＩＡ  ＰａＣａ−２細胞で癌細胞の死滅が起きなかったのに対し、１８Ａ５−、１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０−或いは１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２−Ｆａｂ  ＺＡＰの癌細胞に対する毒性は、抗体の濃度が増加することによって濃度依存的に細胞毒性効果を示した（図２３）。この時、ＥＣ５０値はそれぞれ、２．０、１．１、２．６ｆＭであり、このうち、１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０−Ｆａｂ  ＺＡＰが多少優れた効能を示した。陽性対照薬物であるサポリン（Ｓａｐｏｒｉｎ）は、１００ｎＭ以上の高い濃度で非特異的な細胞流入による細胞毒性を起こした。
【０１９６】
上記実施例における図２３の結果は、抗−ＤＬＫ１単一ヒト抗体１８Ａ５を含めて１８Ａ５＿ＬＳ＿１Ａ１０及び１８Ａ５＿ＡＭ＿１Ａ１２抗体とも、癌細胞表面に発現するＤＬＫ１をターゲットとして癌細胞を死滅させ得る抗−ＤＬＫ１抗体−薬物接合体として開発可能であるということを示唆する。
【産業上の利用可能性】
【０１９７】
本発明の抗−ＤＬＫ１抗体又はその抗原結合断片は、ＤＬＫ１に対する優れた結合力を示し、癌の予防又は治療に有用に利用可能である。また、これを含む抗体−薬物接合体は、ＤＬＫ１を発現する癌細胞に対して強力な細胞毒性活性を示し、本発明による抗−ＤＬＫ１抗体又はその抗原結合断片はＡＤＣ用抗体として有用に利用可能であると期待される。
【０１９８】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳細に述べてきたが、当業界における通常の知識を有する者にとって、このような具体的な記述は単なる好ましい実施の形態であり、これによって本発明の範囲が制限されないことは明らかであろう。したがって、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とそれらの等価物によって定義されるべきであろう。
【図１Ａ】
2021502797.tif 000015
【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６Ａ】
2021502797.tif 000022
【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３】
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【配列表】
2021502797000001.app
【国際調査報告】
2021502797.tif 000050
2021502797.tif 000051
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