(57)【要約】  本発明は、異味を低減するようにグリコシルトランスフェラーゼを使用して変性された高甘味度甘味料グリコシドに関する。本発明は、この変性高甘味度甘味料グリコシドの使用及びその製造方法にも関する。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
グリコシルトランスフェラーゼを使用して変性された高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項２】
前記グリコシルトランスフェラーゼがシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を含む請求項１に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項３】
前記高甘味度甘味料グリコシドが、以下の、ステビオールグリコシド、モグロシド、又はこれらの誘導体のうちの１以上から選択される請求項１又は請求項２に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項４】
前記ステビオールグリコシドがレバウディオサイドＡを含むか、又は前記モグロシドがモグロシドＶを含む請求項３に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項５】
前記ＣＧＴａｓｅが細菌に由来する請求項２から請求項４のいずれか一項に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項６】
前記細菌が、以下の、パエニバシラス属、サーモアナエロバクター属、及びゲオバチルス属のうちの１以上を含む請求項５に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項７】
前記グリコシドがステビオールグリコシドであり、前記ＣＧＴａｓｅがゲオバチルス属細菌に由来する請求項６に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項８】
前記グリコシドがレバウディオサイドＡであり、前記ＣＧＴａｓｅがゲオバチルス属細菌に由来する請求項６に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項９】
前記グリコシドがモグロシドＶであり、前記ＣＧＴａｓｅがサーモアナエロバクター属細菌に由来する請求項６に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項１０】
前記変性高甘味度甘味料グリコシドが、未変性高甘味度甘味料グリコシドと比べて低減された苦味及び／又はリコリス味を有する請求項１から請求項９のいずれか一項に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項１１】
低カロリー甘味料又はカロリーを減らした甘味料としての、請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の高甘味度甘味料グリコシドの使用。
【請求項１２】
スクロース代用品としての、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記高甘味度甘味料グリコシドが、食料品、フードサプリメント又はカロリー制限の惣菜製品に組み込まれているか、又はそれらに組み込むためのものである請求項９又は請求項１０に記載の使用。
【請求項１４】
プレバイオティックと組み合わせた請求項１から請求項１０のいずれか一項に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項１５】
前記プレバイオティックが、以下の、イヌリン、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、α−グルコオリゴ糖、キシロオリゴ糖（ＸＯＳ）、セロビオース、α−ガラクトオリゴ糖、β−グルカン及びこれらの組み合わせから選択される１以上を含む請求項１４に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項１６】
前記高甘味度甘味料グリコシドが、前記プレバイオティックの存在下でグリコシルトランスフェラーゼを使用して変性されたものである請求項１４又は請求項１５に記載の高甘味度甘味料グリコシド。
【請求項１７】
高甘味度甘味料グリコシドを、１以上の異味を低減するように変性する方法であって、
ａ）変性高甘味度甘味料グリコシド又は部分変性高甘味度甘味料グリコシドの混合物を形成するように、
（ｉ）前記高甘味度甘味料グリコシドのグリコシド鎖の少なくとも部分的な増加、及び／又は
（ｉｉ）前記高甘味度甘味料グリコシドの部分のグリコシド鎖の少なくとも部分的な増加
を生じるのに有効な条件下で、前記高甘味度甘味料グリコシドをグリコシルトランスフェラーゼと接触させる工程
を備える方法。
【請求項１８】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を含む請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記高甘味度甘味料グリコシドが、以下の、ステビオールグリコシド、モグロシド、又はこれらの誘導体のうちの１以上から選択される請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ステビオールグリコシドがレバウディオサイドＡを含むか、又は前記モグロシドがモグロシドＶを含む請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＣＧＴａｓｅが細菌に由来する請求項１８から請求項２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記細菌が、パエニバシラス属、サーモアナエロバクター属、及びゲオバチルス属から選択される請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記グリコシドがステビオールグリコシドであり、前記ＣＧＴａｓｅがゲオバチルス属細菌に由来する請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記グリコシドがレバウディオサイドＡであり、前記ＣＧＴａｓｅがゲオバチルス属細菌に由来する請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記グリコシドがモグロシドＶであり、前記ＣＧＴａｓｅがサーモアナエロバクター属細菌に由来する請求項２２に記載の方法。
【請求項２６】
前記１以上の異味が、以下の風味：苦み、リコリス味若しくは金属味、のうちの１以上、又はそれらのうちの１以上の組み合わせを含む請求項１７から請求項２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記高甘味度甘味料グリコシドが、マルトデキストリンの存在下でシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）と接触させられる請求項１７から請求項２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、異味を低減するようにグリコシルトランスフェラーゼ（シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）等）を使用して変性された高甘味度甘味料グリコシドに関する。このような変性高甘味度甘味料グリコシドは、プレバイオティクスと組み合わせて使用することができる低カロリーの甘味料としての使用に特に適している。
【背景技術】
【０００２】
全世界の甘味料市場は、現在、砂糖が主役であり、２０２２年までに１１２０憶ドルに達すると予想されている。スクロースの過剰消費に伴ういくつかの健康への懸念事項に起因して、低カロリー又はノンカロリーの甘味料への動きが大きくなっている。モグロシドＶ及びステビオールグリコシド等のいくつかの甘味料は、高甘味度甘味料（ＨＩＳ）に分類され、報告によれば、それぞれスクロースに対しておよそ１５０倍、２５０倍及び４００倍の甘味度を有する。しかしながら、いくつかのＨＩＳは、苦み又は他の「異」味（リコリス味等）を伴い、このことが消費者にとってのＨＩＳの魅力を減じている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
高甘味度甘味料に関連する課題のうちの１以上に対処することが本発明の目的である。特に、苦味又は異味を低減した高甘味度甘味料を提供することが本発明の目的である。高甘味度甘味料が、その甘さの効力を実質的に保持しながら苦味又は異味を低減するように変性されることが望ましいであろう。高甘味度甘味料をその甘さの効力を実質的に保持しながらその苦味又は異味を低減するように変性するために使用することができる方法が提供されることも望ましいであろう。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本発明の第１の態様によれば、グリコシルトランスフェラーゼを使用して変性された高甘味度甘味料グリコシドが提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】図１は、甘味について実施例１の試料の間で有意に異なると判明した重要な特性を示す棒グラフである（棒は平均値を表し、エラーバーは±半ＬＳＤに広がる）。
【図２】図２は、苦味について実施例１の試料の間で有意に異なると判明した重要な特性を示す棒グラフである（棒は平均値を表し、エラーバーは±半ＬＳＤに広がる）。
【図３】図３は、リコリス味について実施例１の試料の間で有意に異なると判明した重要な特性を示す棒グラフである（棒は平均値を表し、エラーバーは±半ＬＳＤに広がる）。
【図４Ａ】図４Ａは、目的甘味料（ステビオールグリコシド）についてのプロファイルをＣＧＴａｓｅ酵素による合成の前後の対応する化合物に関して示すグラフである。
【図４Ｂ】図４Ｂは、目的甘味料（レバウディオサイドＡ）についてのプロファイルをＣＧＴａｓｅ酵素による合成の前後の対応する化合物に関して示すグラフである。
【図４Ｃ】図Ｃは、目的甘味料（モグロシドＶ）についてのプロファイルをＣＧＴａｓｅ酵素による合成の前後の対応する化合物に関して示すグラフである。
【図５Ａ】図５Ａは、ＣＧＴａｓｅ酵素による合成の前後の対応する化合物に関する、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦから得られた質量スペクトルのグラフである（ステビオールグリコシド）。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＣＧＴａｓｅ酵素による合成の前後の対応する化合物に関する、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦから得られた質量スペクトルのグラフである（レバウディオサイドＡ）。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ＣＧＴａｓｅ酵素による合成の前後の対応する化合物に関する、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦから得られた質量スペクトルのグラフである（モグロシドＶ）。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
好ましくは、上記グリコシルトランスフェラーゼは、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ、ＥＣ  ２．４．１．１９）を含む。ＣＧＴａｓｅは、デンプンのカップリング、環化及び加水分解を触媒する酵素である。本発明者らは、有利なことに、ＣＧＴａｓｅの使用は、いくつかの高甘味度甘味料グリコシドにおいて同様の甘味プロファイルを保持しながら望ましくない苦味及び異味を実質的に低減することができるということを見出した。それゆえ、得られたオリゴ糖は、良好な風味プロファイルを示し、等価の濃度でスクロースの１４０倍〜２２３倍の甘味を示す。
【０００７】
好ましくは、上記高甘味度甘味料グリコシドは、以下のもののうちの１以上（又は組み合わせ）から選択される：ステビオールグリコシド（レバウディオサイドＡ等）、モグロシド（モグロシドＶ等）、又はこれらの誘導体。使用されるＣＧＴａｓｅは、一般に、変性される高甘味度甘味料グリコシドに対して特定的であろう。例えば、ステビアＣＧＴａｓｅが、ステビオールグリコシドを変性するために使用され、ＲｅｂＣＧＴａｓｅ及びＭｏｇＣＧＴａｓｅが、それぞれレバウディオサイド及びモグロシドを変性するために使用されることになろう。
【０００８】
変性される高甘味度甘味料グリコシドがステビオールグリコシドである場合、好ましくは、１３以下、１２以下、又は１１以下のグリコシル残基がステビオールアグリコンに結合して残される。変性される高甘味度甘味料グリコシドがモグロシドＶである場合、好ましくは、２０以下、１９以下又は１８以下のグリコシル残基がアグリコンに結合して残される。変性される高甘味度甘味料グリコシドがレバウディオサイドＡである場合、好ましくは、１５以下、１４以下、又は１３以下のグリコシル残基がステビオールアグリコンに結合して残される。
【０００９】
好ましくは、上記ＣＧＴａｓｅは細菌に由来する。この細菌は、以下の細菌のうちの１以上から選択されてもよい：パエニバシラス属（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、及びゲオバチルス属（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ）。ＣＧＴａｓｅがパエニバシラス属に由来する場合、それがパエニバシラス・マセランス（Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍａｃｅｒａｎｓ）種であることが好ましい。好ましくは、グリコシドがステビオールグリコシドである場合、ＣＧＴａｓｅはゲオバチルス属細菌に由来し、又はグリコシドがモグロシドＶである場合、ＣＧＴａｓｅはサーモアナエロバクター属細菌に由来する。
【００１０】
グリコシル供与体はマルトデキストリンを含んでもよい。あるいは、グリコシル供与体は、糊化デンプン又は可溶性デンプンを含んでもよい。
【００１１】
当該変性高甘味度甘味料グリコシドは、好ましくは、未変性高甘味度甘味料グリコシドと比べて低減された苦味及び／又はリコリス味を有する。好ましくは、変性高甘味度甘味料の風味プロファイルは、以下の風味プロファイルを有する。
ステビオールグリコシド：
・苦味：低減比／％＝１．６／３９％
・リコリス味：低減比／％＝０／０％
・金属味：低減比／％＝２．７／６３％
モグロシドＶ：
・苦味：低減比／％＝０
・リコリス味：低減比／％＝１．７／４１％
・金属味：低減比／％＝３／６７％
【００１２】
本発明の別の態様によれば、低カロリー甘味料又はカロリーを減らした甘味料としての、本明細書中にこれまで記載された変性高甘味度甘味料グリコシドの使用が提供される。当該変性高甘味度甘味料グリコシドはスクロース代用品として使用されてもよく、つまり、当該変性高甘味度甘味料グリコシドは、製品中のスクロースの一部分、又は実質的にすべてを取り除いて置き換えるために使用される。当該変性高甘味度甘味料グリコシドは、所望に応じて、食料品、フードサプリメント又はカロリー制限の惣菜製品に組み込まれてもよいし、それらに組み込むためのものであってもよい。
【００１３】
用語「食料品」は、ヒト又は動物によって安全に摂取されることが可能なあらゆる材料を意味することが意図されており、例としては、食品、飲料、シリアル、ベーカリー製品、パン粉をまぶし衣付きの製品（揚げ物）、乳製品、菓子類、スナック菓子、及び粗粉が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、調理又は摂食される前に再構成を必要とする製品を包含する。この用語は、任意のフードサプリメント又は医薬（ビタミン錠剤又は抗生物質液等）も包含する。
【００１４】
当該変性高甘味度甘味料グリコシドが、そのグリコシドを他の原料とブレンド又は混合することにより製品に組み込まれてもよいことは当業者には明らかであろう。あるいは、変性高甘味度甘味料グリコシドが、製品をコーティングするために使用されてもよい。
【００１５】
本発明の別の態様では、上記変性高甘味度甘味料グリコシドは、プレバイオティックと共に使用されてもよいし、又はプレバイオティックと組み合わせて処方されてもよい。
【００１６】
用語「プレバイオティック」は、宿主に対して健康状態及び健康上の利益をもたらす胃腸内細菌叢の組成及び／又は活性の両方において特定の変化を可能にする選択的に発酵される原料を意味することが意図されている。
【００１７】
好ましくは、このプレバイオティックは、イヌリン、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、α−グルコオリゴ糖、β−グルカンセロビオース、キシロオリゴ糖及びこれらの組み合わせから選択される１以上（又は１以上の組み合わせ）を含む。より好ましくは、このプレバイオティックはフラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）及びイヌリン並びにフラクトオリゴ糖及びイヌリンの組み合わせを含めたフルクタンを含む。
【００１８】
グリコシルトランスフェラーゼ（シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）等）を使用して変性された高甘味度甘味料グリコシドは、プレバイオティックの存在下で変性されたものであってもよい。
【００１９】
本発明のなおさらなる態様によれば、高甘味度甘味料グリコシドを、１以上の異味を低減するように変性する方法であって、
ａ）変性高甘味度甘味料グリコシド又は部分変性高甘味度甘味料グリコシドの混合物を形成するように、
（ｉ）上記高甘味度甘味料グリコシドのグリコシド鎖の少なくとも部分的な増加、及び／又は
（ｉｉ）上記高甘味度甘味料グリコシドの割合のグリコシド鎖の少なくとも部分的な増加
を生じるのに有効な条件下で、上記高甘味度甘味料グリコシドをグリコシルトランスフェラーゼと接触させる工程
を備える方法が提供される。
【００２０】
好ましくは、上記グリコシルトランスフェラーゼは、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を含む。当該方法では、この好ましいＣＧＴａｓｅを使用することで、アグリコン単位に結合されたグリコシド鎖が増加する。
【００２１】
当該方法では、高甘味度甘味料グリコシドは、以下のもののうちの１以上から選択されてもよい：ステビオールグリコシド、レバウディオサイドＡ、モグロシドＶ、又はこれらの誘導体。
【００２２】
当該方法では、ＣＧＴａｓｅは、以下の細菌のうちの１以上に由来してもよい：パエニバシラス属、サーモアナエロバクター属、及びゲオバチルス属。グリコシドがステビオールグリコシドである場合、ＣＧＴａｓｅはパエニバシラス属細菌に由来してもよい。グリコシドがレバウディオサイドＡである場合、ＣＧＴａｓｅはゲオバチルス属細菌に由来してもよい。グリコシドがモグロシドＶである場合、ＣＧＴａｓｅはサーモアナエロバクター属細菌に由来してもよい。
【００２３】
当該方法における１以上の異味は、以下の風味のうちの１以上、又は１以上の組み合わせを含んでもよい：苦味、リコリス味又は金属味。
【００２４】
好ましくは、高甘味度甘味料グリコシドは、マルトデキストリンの存在下でシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）と接触させられる。
【００２５】
本発明のいくつかの態様に関して列挙された組成物のいくつかの特徴は、本発明において投与される組成物に関して互換的であろうということは当業者には明らかであろう。
【００２６】
本発明の実施形態は、例としてのみ、これより記載される。
【実施例】
【００２７】
実施例１  −  高甘味度甘味料から製造したオリゴ糖の官能プロファイリング
これらの実験の目的は、酵素により変性されたグリコシドがそのグリコシド対照物と同程度に甘いか、及び酵素による変性が苦味及びリコリス風味等の望ましくない異味を低減するかを判定することであった。試料を、食品等級のマルトデキストリン及び食品等級のステビオールグリコシド又はレバウディオサイドＡ又はモグロシドＶから製造した。これらの試料は、市販の食品等級のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）酵素を使用して生成した。
【００２８】
初期スクリーニング
上述のように、ステビオールグリコシド、レバウディオサイドＡ及びモグロシドＶは、スクロースに対してそれぞれおよそ１５０倍、２５０倍及び４００倍の甘さの効力を有すると報告されている高甘味度甘味料（ＨＩＳ）である。甘味料は、８％スクロース当量のスクロースと比べられることが多い（Ｐｒａｋａｓｈ，Ｇ．Ｅ．ＤｕＢｏｉｓ，  Ｊ．Ｆ．Ｃｌｏｓ，  Ｋ．Ｌ．Ｗｉｌｋｅｎｓ，  Ｌ．Ｅ．Ｆｏｓｄｉｃｋ．（２００８）．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｒｅｂｉａｎａ，  ａ  ｎａｔｕｒａｌ，  ｎｏｎ−ｃａｌｏｒｉｃ  ｓｗｅｅｔｅｎｅｒ．  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ．  第４６巻、第７号、Ｓ７５−Ｓ８２頁）。これまでの文献（Ｃａｒｏｌｉｎｅ  Ｈｅｌｌｆｒｉｔｓｃｈ，  Ａｎｎｅ  Ｂｒｏｃｋｈｏｆｆ，  Ｆｒａｕｋｅ  Ｓｔａｅｈｌｅｒ，  Ｗｏｌｆｇａｎｇ  Ｍｅｙｅｒｈｏｆ及びＴｈｏｍａｓ  Ｈｏｆｍａｎｎ（２０１２）．  Ｈｕｍａｎ  Ｐｓｙｃｈｏｍｅｔｒｉｃ  ａｎｄ  Ｔａｓｔｅ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ．  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  ａｎｄ  Ｆｏｏｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１２  ６０（２７），６７８２−６７９３）は、ステビオールグリコシドの苦味は約１０００μＭで最も顕著であり、レバウディオサイドＡについては、これは２４％スクロースに等価の０．９７ｇ／Ｌとなるということを示した。しかしながら、１００μＭの溶液は苦くもあり、レバウディオサイドＡについては、これは２．４％スクロースに等価の０．０９７ｇ／Ｌになる。それゆえ、２％スクロースを超える等価な甘味レベルの溶液を試験して、甘味及び苦味の両方が最終用途に応用できるレベルで評価できることを確認した。
【００２９】
初期試食のために、スクロース標品を４％、６％、８％及び１０％（ｗ／ｖ）スクロースで調製した。８％スクロース等価性を目指して、すべてのＨＩＳ及び酵素変性試料も０．３２ｇ／Ｌで調製した。初期試食から、１０％試料は極端すぎるため、上記スクロース標品の範囲が２％、４％、６％及び８％に低下される必要があると結論した。レバウディオサイドＡ及びモグロシドＶ、及びそれらのそれぞれの酵素変性試料は、ステビオールグリコシドよりも甘く、スクロース標品に対して強すぎる（ｔｏｏ  ｉｎｔｅｎｓｅ）可能性があると考え、それゆえそれらの濃度を０．２４ｇ／Ｌに下げた。
【００３０】
試料の調製
以下の市販の製品は、Ｏｐｔｉｂｉｏｔｉｘ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｌｔｄ（オプティバイオティックス・ヘルス）、ヨーク、英国によって、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｅａｄｉｎｇ（レディング大学）、Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（食料・栄養科学科）のＳｅｎｓｏｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ（感覚科学センター）に供給された：レバウディオサイドＡ；ステビオールグリコシド；モグロシドＶ（５０％）；ＣＧＴａｓｅで変性したレバウディオサイドＡ；ＣＧＴａｓｅで変性したステビオールグリコシド；及びＣＧＴａｓｅで変性したモグロシドＶ（５０％）。
【００３１】
すべての試料は、微生物学的クリアランス試験、及びエタノールを使用する精製工程から１０００ｐｐｍ未満であることを確認するための揮発分分析を受けた。
【００３２】
すべての材料を常温で保存した。スクロースは白グラニュー糖（Ｓａｉｎｓｂｕｒｙｓ  Ｐｌｃ（セインズベリー）、ロンドン、英国）として購入した。水は、Ｈａｒｒｏｇａｔｅ  Ｓｐａミネラルウォーター（Ｈａｒｒｏｇａｔｅ  Ｗａｔｅｒ  Ｂｒａｎｄｓ（ハロゲイト・ウォーター・ブランド）、ハロゲイト（Ｈａｒｒｏｇａｔｅ）、英国）であった。
【００３３】
ステビオールグリコシド及びＣＧＴａｓｅで変性したステビオールグリコシド（ＳｔｅｖｉａＣＧＴａｓｅ）を０．３２ｇ／Ｌ水で調製した。レバウディオサイドＡ（ＲｅｂＡ）、モグロシドＶ及びそれらのそれぞれの酵素変性等価物（ＲｅｂＣＧＴａｓｅ及びＭｏｇＣＧＴａｓｅ）を０．２４ｇ／Ｌ水で調製した。スクロース試料を２．０％、４．０％、６．０％及び８．０％ｗ／ｖで調製した。重量は小数点以下３桁まで正確であり、試料はメスフラスコの中で調製した。すべての試料は、水によく分散し容易に可溶化された。
【００３４】
官能プロファイリング方法
Ｒｅａｄｉｎｇ（レディング）のＳｅｎｓｏｒｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｃｅｎｔｒｅ（英国）の訓練を受けた官能パネルを、上記試料の官能プロファイリングのために採用した。１年〜９年の経験を持つ１０人のパネリストが存在した。ＱＤＡ（定量的記述分析）プロファイリングアプローチを採用した。このパネルは、試食会のための合意事項として開発した同じ語彙を使用した。そのような語彙は、ステビオールグリコシドの特徴的な味わいである用語「リコリス味」を含んでいた。このパネルは、試料セットの開始時に３回の別々の試食会にわたって再訓練を受けた。この再訓練は、スクロース標品位置の新しい濃度に対して甘味をパネリストが信頼性高くスコア付けすることができることを確保することに絞り込んだ。
【００３５】
評点付けは、隔離された官能評価ブースで、不定式の線尺度（０〜１００のスケール）を使用して、二重に独立に実施した。しかしながら、甘味についての区別を向上させるために、４つのスクロース試料を標品として使用した。パネルが合意したところによる、これらの試料の各々についての平均値を下記表１に示す。
【００３６】
【表１】
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【００３７】
各スコア付け会議の開始時に、パネルは強さが大きくなる順に上記４つの基準試料を味わい、線尺度上のこれらのレベルの甘味の位置決めに自身を再び慣れさせた。基準試料（１０ｍＬ）は、透明なポリスチレンカップ（３０ｍＬ）に入れて出された。次いでパネルは、暖かい濾過した水道水及び低塩のクラッカー（Ｃａｒｒ’ｓ  ｗａｔｅｒ  ｃｒａｃｋｅｒｓ）で口直しをし、その後で試料試食会を開始し、各試料スコア付け会議の間に再び同様に口直しをした。
【００３８】
無作為の３文字コードで標識した試料を、１日あたり最大６試料で、偏りのない提示順序で継続単一製品式に（シークエンシャルモナディック法により）提示した。部屋の空調を２３℃に設定して、試料を２３〜２４℃（室温）で出した。
【００３９】
パネルは、下記表２に示すように、オリゴ糖試料を規定するために１６個の特性を使用した。
【００４０】
【表２】
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【００４１】
パネリストに、５ｍＬの各試料を試食のために与えた。その５ｍＬを、プラスチックのシリンジによって透明の試食用カップ（３０ｍＬ）へと計り取った。パネリストは、試料を慎重に少しずつ飲み、舌の上へと試料を流してから飲み込むことを確実に行った。パネリストは試料の半分を自分の口へと少しずつ運び、最初の６つの特性をスコア付けし、後半の半分は、以下の６つの特性をスコア付けするためのものであった。後作用は３０秒の時間遅延後にスコア付けした。
【００４２】
データ解析
パネリストをランダム効果として扱い、試料を固定効果として扱い、主効果を評価者相互作用（ａｓｓｅｓｓｏｒ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）によって試料に対して検定する混合モデルＡＮＯＶＡを使用してデータを解析した。フィッシャーのＬＳＤを使用して多重対比較を実施し、有意差を５％のαリスク（ｐ≦０．０５）で宣言した。データ解析は、Ｓｅｎｐａｑソフトウェア（Ｑｉ  Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ（キューアイ・スタティクス）、レディング、英国）を使用して実施した。
【００４３】
官能プロファイリング結果
ランク付けした１６個の特性のうちで、９つは、（上記の表２に示すとおり）試料間で有意に異なった。
【００４４】
レバウディオサイドＡ（０．２４ｇ／Ｌ）は、ステビオールグリコシド（０．３２ｇ／Ｌ）及びモグロシドＶ（０．２４ｇ／Ｌ）よりも有意に甘かった。酵素変性によりレバウディオサイドＡ及びモグロシドＶの甘味は低下したが、ステビオールグリコシドの甘味は低下しなかった。苦味は、ステビオールグリコシドについては、Ｒｅｂ  Ａ又はモグロシドＶよりも有意に高かった。しかしながら、酵素による変性により、ステビオールグリコシドの苦味は低減した。ステビオールグリコシド、Ｒｅｂ  Ａ及びモグロシドＶは、リコリス味ではすべて同等であったが、これは、モグロシドＶだけではあるが、酵素による変性によって有意に低減された。すべての他の風味及び香味の特性は、低レベルで評点付けされた。
【００４５】
図１〜図３は、甘味、苦味及びリコリス味について試料間で有意に異なると判明した重要な特性を示す。スクロース標品は盲検的には評点付けしなかったが、平均の甘味値試料を４つのスクロース標品の甘味値と比較することは有用である。スクロース標品の甘味についての用量反応曲線を準備し、使用した濃度の範囲内で、関係は線形であり、一次回帰式は以下のとおりであった：甘味＝１５．５（スクロース）−２２．５（Ｒ２＝０．９９）。この回帰式を使用して、試料の甘味値を等価スクロース（ＥＳ）濃度に変換した。これは、平均の甘味評点から行った。ＥＳの値及び効力値を下記表３に示す。
【００４６】
【表３】
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【００４７】
０．０３２ｇ／／Ｌ又は０．０２４ｇ／／Ｌのいずれかで水の中で調製した高甘味度甘味料は、（平均で）３．７％〜５．３％スクロース当量と同じ甘味を提供するという範囲にわたり、これは１４０倍〜２２３倍スクロースの効力値を導いた。
【００４８】
実施例２  −  ステビア・レバウディアナ（Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ）からのステビオールグリコシド及びレバウディオサイドＡ並びに羅漢果（シライチア・グロスベノリイ、Ｓｉｒａｉｔｉａ  ｇｒｏｓｖｅｎｏｒｉｉ）からのモグロシドＶの酵素による変性の比較
この実験の目的は、ステビア・レバウディアナからのステビオールグリコシド及びレバウディオサイドＡ並びに羅漢果からのモグロシドＶの酵素による変性の収率を評価することであった。
【００４９】
酵素による合成
マルトデキストリン、３つの異なる目的甘味料（ステビオールグリコシド、レバウディオサイドＡ及びモグロシドＶ）、並びにパエニバシラス・マセランス、サーモアナエロバクター属種及びゲオバチルス属種由来の３つの異なる市販のシクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴａｓｅ）を使用して合成を実施した。
【００５０】
より高い生産性をもたらすように最良の合成条件を決定するために、実験計画（ＤｏＥ）（要因配置実験及び中心複合計画（ＣＣＤ）も実施した。
【００５１】
３つの異なる微生物に由来する３つのＣＧＴａｓｅを、新しいグリコシル化されたステビオールグリコシド及びモグロシドＶの合成について比較した。現在利用できる市販の甘味料に関する主な課題の１つは後味である。
【００５２】
表４は、上記新しい生成物の収率を示す。値は、すべてのＣＣＤ計画最適化から得られる。
【００５３】
【表４】
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【００５４】
精製
合成後、構造分析及び官能分析のための試料を、Ｄｉａｉｏｎ（登録商標）ＨＰ−２０樹脂を使用して精製し、あらゆる遊離の炭水化物を混合物から除去した。樹脂及び対応する溶離液（エタノール／水）は食品等級であった。
【００５５】
この工程の目的は、官能分析及び構造分析を妨げる可能性があるオリゴ糖を含まない生成物を得ることであった。この精製の後、酵素による合成の後に得られた新しい化合物の純度は、すべての処理について９０〜９５％であった。
【００５６】
構造分析
ＬＣ−ＤＡＤ（Ｃ１８カラム）を使用して定量化を実施した。酵素反応後に結合している単量体単位の数を決定するために、ＭＡＬＤＩ−ＴｏＦを使用して構造的特性解析を実施した。
【００５７】
上記の表４は、各ＣＧＴａｓｅを用いた各目的甘味料の収率の相対的定量化の概要を示す。図４Ａ〜図４Ｃは、酵素による合成の前後の対応する化合物を用いた各処理についての異なるＬＣ−ＤＡＤプロファイルを示す。
【００５８】
図４Ａ〜図４Ｃによれば、すべての処理が、より短い保持時間を有する新しい化合物を生成した。使用したカラムはＣ１８（逆相）であるので、見つかった新しい化合物はより親水性であると思われる。この場合、親水性は、グルコース単位がステビオールグリコシド及びモグロシドＶに付加されたことによって発生している。
【００５９】
図５Ａ〜図５Ｃによれば、ステビオールグリコシド及びレバウディオサイドＡでは、１３以下及び１９のグルコシル残基がステビオールアグリコンに結合していることが質量分析による構造的特性解析により判明したのに対し、モグロシドＶについては、２０以下のグルコシル残基がアグリコンに結合していることが判明した。
【００６０】
上記の実施形態は、特許請求の範囲によって与えられる保護範囲を限定することを意図しておらず、本発明が実施されてもよい方法の例を記載することを意図している。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【国際調査報告】
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