(57)【要約】本発明は、甲状腺機能の評価のための遊離甲状腺ホルモン定量用のバイオセンサーおよびその応用に関する。甲状腺関連疾患の診断のための方法およびツールも本明細書で開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺ホルモンの定量化のためのセンサーであって、
ａ．基材、
ｂ．ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼ、および
ｃ．任意選択で、抗ｒＴ３抗体、を含み、
少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼおよび抗ｒＴ３抗体は、基材表面上に固定されるセンサー。
【請求項２】
前記基材が、前記少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼの固定化用の、前記基材の第１の表面および前記基材の第２の表面などの複数の表面を含む、請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
前記少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼが、前記基材の第１表面上に固定されたＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードチロイジンデヨーデナーゼ、および前記基材の第２の表面上に固定されたＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される第２のヨードチロイジンデヨーデナーゼを含む、請求項１または２に記載のセンサー。
【請求項４】
前記第１のヨードサイロニンデヨージナーゼが、ＥＣ１．２１．９９．４から選択され、前記第２のヨードサイロニンデヨージナーゼは、ＥＣ１．２１．９９．３から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項５】
前記第１のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび前記第２のヨードサイロニンデヨージナーゼが両方とも、ＥＣ１．２１．９９．４から独立に選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項６】
前記第１のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび前記第２のヨードサイロニンデヨージナーゼが、ＥＣ１．２１．９９．４から選択される異なる酵素である、請求項１〜５のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項７】
前記抗ｒＴ３抗体が基材の第３の表面上に固定されている、請求項１〜６のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項８】
前記第１のヨードサイロニンデヨージナーゼが１型ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または２型ヨードサイロニンデヨージナーゼである、請求項１〜７のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項９】
前記第２のヨードサイロニンデヨージナーゼが１型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または３型ヨードサイロニンデヨージナーゼである、請求項１〜８のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１０】
前記第１のヨードサイロニンデヨージナーゼが１型ヨードサイロニンデヨージナーゼであり、前記第２のヨードサイロニンデヨージナーゼが２型ヨードサイロニンデヨージナーゼである、請求項１〜９のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１１】
前記第１のヨードサイロニンデヨージナーゼが１型ヨードサイロニンデヨージナーゼであり、前記第２のヨードサイロニンデヨージナーゼが３型ヨードサイロニンデヨージナーゼである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１２】
前記第１のヨードサイロニンデヨージナーゼが２型ヨードサイロニンデヨージナーゼであり、前記第２のヨードサイロニンデヨージナーゼが３型ヨードサイロニンデヨージナーゼである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１３】
前記甲状腺ホルモンが、遊離Ｔ４、遊離Ｔ３および逆位Ｔ３（ｒＴ３）、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１４】
前記基材が１個または複数の電極および／またはチップである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１５】
前記基材が、少なくとも２個の電極など、少なくとも３個の電極などの、少なくとも１個の電極を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１６】
前記基材が、少なくとも２個のチップなど、少なくとも３個のチップなどの、少なくとも１個のチップを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１７】
前記基材が、３個の電極を含むかまたはこれからなり、前記第１の表面が第１の電極の表面であり、前記第２の表面が第２の電極の表面であり、および第３の表面が第３の電極の表面である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１８】
前記基材が、３個のチップを含むかまたはこれからなり、前記第１の表面が第１のチップの表面であり、前記第２の表面が第２のチップの表面であり、および前記第３の表面が第３の電極の表面である、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１９】
前記電極が、炭素、金または白金から作製される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２０】
前記電極が、スクリーン印刷電極である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２１】
前記チップがガラスチップである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２２】
前記基材の第１、第２および／または第３の表面が、改質表面である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２３】
前記改質表面が、ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴を含む表面である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２４】
前記ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴が、微粒子、ナノ粒子、マイクロワイヤー、ナノワイヤー、マイクロチューブ、ナノチューブ、マイクロロッド、ナノロッド、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２５】
前記ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴が、前記表面を焼結により組み合わせることにより、基材の表面上に生成された、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２６】
前記ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴が、表面エッチングにより前記基材の表面上に生成された、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２７】
前記ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴が、粒子沈着により前記基材の表面上に生成された、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２８】
前記改質表面が、金の層でコートされた表面である、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２９】
前記改質表面が、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるナノ粒子で改質された表面である、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３０】
前記改質表面が金の層で表面コートされ、前記表面が、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるナノ粒子でさらに改質される、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３１】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼが、ナノ粒子を含むリンカーを介して表面上に固定されている、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３２】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、ニッケル−ヒスチジン（Ｎｉ−Ｈｉｓ）共有配位結合を含むリンカーを介して前記基材上に固定されている、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３３】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、次記を含むリンカーを介して前記基材上に固定されている、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のセンサー：
ａ．前記基材に結合したシステアミン、および
ｂ．前記システアミンおよび前記ヨードサイロニンデヨージナーゼに、任意選択で、１個または複数の追加のシステアミンを介して、結合したナノ粒子。
【請求項３４】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、哺乳動物由来である、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３５】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、ヒト由来である、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３６】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、無細胞発現によるなどの組換えにより生成される、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３７】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、それぞれ個別に追加の部分に結合されている、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３８】
前記追加の部分が、ヒスチジンタグなどのペプチドタグなどのペプチドである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３９】
前記追加の部分が標識である、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項４０】
前記センサーが、それぞれ１０〜１００ＩＵの少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼを含む、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項４１】
前記センサーが、１０〜１００ＩＵの１型および２型のヨードサイロニンデヨージナーゼを含む、請求項１〜４０のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項４２】
前記センサーが、１０〜１００ＩＵの２型および３型のヨードサイロニンデヨージナーゼを含む、請求項１〜４１のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項４３】
前記センサーが、１０〜１００ＩＵの１型および３型のヨードサイロニンデヨージナーゼを含む、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項４４】
前記基材が、卓上型手持ち式の電気化学ワークステーション、表面プラズモン共鳴検出器または測定回路に接続できるように構成されている、請求項１〜４３のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項４５】
前記基材が、少なくとも３個の電極を含み、前記電極が、電気化学ワークステーションに接続できるように構成されている、請求項１〜４４のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項４６】
前記基材が、少なくとも３個のチップを含み、前記チップが、表面プラズモン共鳴検出器に接続できるように構成されている、請求項１〜４５のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項４７】
前記センサーが、甲状腺ホルモンの定量用として構成されている、請求項１〜４６のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項４８】
次のステップを含む、試料中の甲状腺ホルモンの検出方法：
ａ．甲状腺ホルモンを含むまたは含むと疑われる試料を用意するステップ、
ｂ．項目１〜４７のいずれか１項に記載のセンサーを前記試料と接触させるステップ、
ｃ．前記センサーからのシグナルを測定するステップ、および
ｄ．前記シグナルを用いて、試料中の前記１種または複数の甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、前記甲状腺ホルモンを検出するステップ。
【請求項４９】
次のステップを含む対象の甲状腺関連障害の診断方法：
ａ．前記対象から得られる試料を用意するステップ、
ｂ．請求項４８に記載の方法を用いて、前記試料中の甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、１種または複数の甲状腺関連障害を診断するステップ。
【請求項５０】
次のステップを含む対象の甲状腺関連障害の監視方法：
ａ．甲状腺刺激化合物を前記対象に投与するステップ、
ｂ．ステップａ．の実施後に前記対象から試料を収集するステップ、
ｃ．請求項４８に記載の方法を用いて、前記試料中の甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、前記甲状腺関連障害を監視するステップ。
【請求項５１】
前記ステップa．〜c．が２回以上実施される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
甲状腺ホルモンの定量化のために、請求項１〜４７のいずれか１項に記載のセンサーの使用。
【請求項５３】
甲状腺ホルモンの定量化が、請求項４８に記載の方法により実施される、請求項５２に記載の使用。
【請求項５４】
前記試料中の甲状腺ホルモンの濃度を用いて前記甲状腺ホルモンのインビボ濃度を計算するステップをさらに含む、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記試料中の甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度が、前記甲状腺ホルモンと前記ヨードサイロニンデヨージナーゼとの間の反応動力学から決定される、請求項４８〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記甲状腺ホルモンの濃度が、前記対象が甲状腺刺激化合物を含む薬物を受けた後で決定される、請求項４８〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記対象が薬物を受けた後の時間が５分〜４８時間である、請求項５０〜５６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５８】
前記試料中の甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度をカットオフ間隔と比較し、甲状腺関連障害の対象を診断するステップをさらに含み、前記カットオフ間隔は、前記甲状腺関連障害を罹患していないヒト個体などの健康なヒト個体の甲状腺ホルモンの濃度範囲から決定され、前記カットオフ間隔の外側のレベルおよび／または濃度が、前記甲状腺関連障害の存在を示す、請求項４９〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
遊離Ｔ３の前記カットオフ間隔が、２．８〜４．４ｐｇ／ｍＬである、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
遊離Ｔ４の前記カットオフ間隔が、０．８〜２．０ｎｇ／ｍＬである、請求項５８および５９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６１】
ｒＴ３の前記カットオフ間隔が、１０〜２４ｎｇ／ｍＬである、請求項５８〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記カットオフ間隔未満の濃度は低いと見なされ、前記カットオフ間隔内の濃度は正常と見なされ、および前記カットオフ間隔を超える濃度は高いと見なされる、請求項５８〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記甲状腺関連障害を治療するステップをさらに含む、請求項４９〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記治療が、治療有効量での薬物の投与を含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記薬物が甲状腺刺激化合物である、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記甲状腺刺激化合物が、Ｔ３、Ｔ４、ＴＳＨ、甲状腺自己抗体（ＴＲＡｂ、ＴＰＯＡｂおよびＴｇＡｂ）およびチログロブリンからなる群から選択される、請求項５０〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
前記対象がヒト対象である、請求項４９〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ヒト対象が子供または成人である、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記対象が、ウマ、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ネコまたはイヌである、請求項４９〜６８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７０】
前記試料が、血液試料、血清試料または血漿試料であり、任意選択で、前記試料が分析の前に処理されている、請求項４８〜６９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７１】
分析の前の前記処理が、濾過、ｒＴ３の除去、および／またはｐＨの調節を含む、請求項４８〜７０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７２】
前記甲状腺ホルモンが、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いて検出される、請求項４８〜７１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７３】
前記ＳＰＲ測定値を用いて１種または複数の前記甲状腺ホルモンの濃度が決定される、請求項４８〜７２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７４】
前記甲状腺ホルモンが、電気化学的変換により定量または監視される、請求項４８〜７３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７５】
甲状腺関連障害が、リスト：甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、臨床的うつ病、甲状腺腫、グレーブス・バセドウ病、橋本甲状腺炎、甲状腺機能正常性症および極性Ｔ３症候群から選択される、請求項４９〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記甲状腺機能亢進症が、高遊離Ｔ４、高遊離Ｔ３および低ＴＳＨを特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
前記甲状腺機能正常性症が、低遊離Ｔ３および高ｒＴ３を特徴とする、請求項７５に記載の方法。
【請求項７８】
前記甲状腺機能低下症が、一次性または二次性である、請求項７５に記載の方法。
【請求項７９】
前記一次性甲状腺機能低下症が、低遊離Ｔ４、正常または低遊離Ｔ３および高ＴＳＨを特徴とする、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記二次性甲状腺機能低下症が、低遊離Ｔ４、正常または低遊離Ｔ３および正常または低ＴＳＨを特徴とする、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
次記を含む、ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーの製造方法：
ａ．基材を用意するステップ、
ｂ．ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および任意選択で、抗ｒＴ３抗体を用意するステップ、
ｃ．前記ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび前記抗ｒＴ３抗体を前記基材表面上に固定し、それにより、ＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーを製造するステップ。
【請求項８２】
前記基材が、請求項１〜８１のいずれか１項で定義の通りである、請求項８１に記載の方法
【請求項８３】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼが、請求項１〜８２のいずれか１項で定義の通りである、請求項８１または８２に記載の方法。
【請求項８４】
次記を含む、甲状腺ホルモンの定量および／または監視のための手持ち型装置：
ａ．試料の入口；
ｂ．センサーであって、
ｉ．基材、
ｉｉ．ＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ、
ｉｉｉ．ＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．４から選択される第２のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および
ｉｖ．任意選択で、抗ｒＴ３抗体、を含むセンサー、
ｃ．前記センサーからシグナルを受け、それを使用者により読み取り可能なフォーマットに変換するように構成された検出器；
ｄ．任意選択で、前記試料から細胞成分を分離する手段。
【請求項８５】
前記センサーが、請求項１〜８４のいずれか１項で定義の通りである、請求項８４に記載の手持ち型装置。
【請求項８６】
前記第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ、前記第２のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび前記抗ｒＴ３抗体が、請求項８４〜８５のいずれか１項で定義の通りである、請求項８４および８５のいずれか１項に記載の手持ち型装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、甲状腺機能の評価のための遊離甲状腺ホルモン定量用のバイオセンサーおよびその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
甲状腺は、首の前面の喉仏の後ろに位置する二葉の内分泌腺である。これは、ヨウ素含有甲状腺ホルモン−トリヨードサイロニン（Ｔ３）およびチロキシン（Ｔ４）の合成および分泌に関与し、これらは、全体代謝率およびタンパク質合成に影響を与える。甲状腺ホルモンの分泌は、視床下部−下垂体−甲状腺系（ＨＰＴ  ａｘｉｓ）により制御され、視床下部および脳下垂体は、チロトロピン放出ホルモン（ＴＲＨ）および甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）を放出することにより甲状腺を刺激する。
【０００３】
トリヨードサイロニンまたは［ｏ−（４−ヒドロキシ−３，５−ヨードフェニル）３，５−ジヨードフェニルチロシン］としても知られるＴ３は、基礎代謝率、タンパク質代謝回転、脂肪分解、心拍出量、および胎児発生および乳幼児発達に対し影響を与え、チロキシンまたは［ｏ−（４−ヒドロキシ−３，５−ジヨードフェニル）３，５−ジヨードフェニルチロシン］としても知られるＴ４は、肝臓および腎臓に移動し、Ｔ３の部位特異的合成のための基質としての役割をするプロホルモンである。
【０００４】
甲状腺ホルモンは、身体中のほぼすべての細胞に対し作用する。それらは、基礎代謝率を高めるように作用し、タンパク質合成に影響を与え、長骨成長の調節を支援し（成長ホルモンと相乗作用）、寛容性により身体のカテコールアミン（アドレナリンなど）に対する感度を高める。甲状腺ホルモンは、人体の全ての細胞の適切な発生と分化に不可欠である。これらのホルモンはまた、タンパク質、脂肪、および糖代謝を調節し、人の細胞のエネルギー過剰化合物の使い方に影響を及ぼす。それらは、ビタミン代謝を刺激する。多数の生理学的および病理学的刺激物質が甲状腺ホルモン合成に影響を与える。
【０００５】
チロキシンの過剰および欠損の両方が障害を引き起こし得る。
・  グレーブス病が原因であることが多い甲状腺機能亢進症は、過剰の循環遊離チロキシン（ｆＴ４）、遊離トリヨードサイロニン（ｆＴ３）、または両方および減少したＴＳＨを特徴とする臨床症候群である。これは、約２％の女性および０．２％の男性で発生する共通の障害である。甲状腺中毒症は、甲状腺機能亢進症と同義に使用されることが多いが、わずかな差異が存在する。甲状腺中毒症は、循環甲状腺ホルモンの増大も意味するが、これは、チロキシン錠剤の摂取または過活動性甲状腺により引き起こされ、一方、甲状腺機能亢進症は、過活動性甲状腺のみを意味する。
・  橋本甲状腺炎が原因である場合が多い甲状腺機能低下症は、チロキシン、トリヨードサイロニン、または両方の欠損がある場合の症例である。
・  臨床的うつ病は、甲状腺機能低下症が原因の場合もある。Ｔ３は、シナプス接合部で認められ、脳中のセロトニン、ノルエピネフィリン、およびγ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）の量と活性を調節する（Ｄｒａｔｍａｎ  Ｍ，Ｇｏｒｄｏｎ  Ｊ（１９９６）．”Ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅｓ  ａｓ  ｎｅｕｒｏｔｒａｎｓｍｉｔｔｅｒｓ”．Ｔｈｙｒｏｉｄ．６（６）：６３９−４７）。
・  脱毛症は、Ｔ３およびＴ４の機能不全が原因の場合もある。正常な育毛サイクルが影響を受け、毛髪の成長が破壊され得る。
・  早産は、自身の甲状腺が生後の必要性を満たすことができないときには、母体甲状腺ホルモンの不足に起因する神経発達障害になる場合がある。また、正常の妊娠では、胎児およびその発生中の脳が甲状腺ホルモン利用能を保証するために、適切なレベルの母体甲状腺ホルモンは重要である。先天性甲状腺機能低下症は、１６００〜３４００人の新生児の内の１人で発症し、大抵は、無症候性で生まれ、関連症状を誕生の数週間後に発生する。
【０００６】
従って、ヒトのＴ３およびＴ４の量を定量できることは、甲状腺疾患の診断に重要である。甲状腺機能障害の従来の診断は、甲状腺ホルモンおよびＴＳＨに対するイムノアッセイにより実施される。現在のｆＴ３およびｆＴ４試験は、遊離ホルモンを競合的に測定する、または結合ホルモンの物理的分離後に測定する、または不正確なことも多い間接的推定により求めることを試みている。従って、遊離甲状腺ホルモンを定量するための新規および代替方法の発見に向けた契機が存在する。
【０００７】
バイオセンサーは、生体物質、例えば、微生物、酵素、抗体、ＤＮＡ、およびＲＮＡなどの分子特定機能を利用し、このような生体物質を分子特定素子として適用する。換言すれば、バイオセンサーは、固定化生体物質が標的基質、微生物の呼吸により消費される酸素、酵素反応、発光、などを特定する場合に起こる反応を利用する。バイオセンサーの中で、酵素センサーの実用化に関する開発が行われている。例えば、グルコース、乳酸、尿酸、およびアミノ酸のための酵素センサーは、医療機器および食品加工産業に応用されている。
【０００８】
酵素センサーでは、例えば、試料液体、すなわち分析物中に含まれる基質と酵素などとの反応により生成される電子が、電子受容体を還元し、測定装置が還元された電子受容体の量を電気化学的に測定する。従って、分析物の定量的分析が実施される。このようなバイオセンサーの例は、国際出願第ＰＣＴ／ＪＰ００／０８０１２号で提案されている。
【０００９】
異なる技術を使って、例えば、電極に結合した酵素と標的基質との間の反応を追跡し得る。このような技術の１つは、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）に依存する。ＳＰＲでは、タンパク質などの分子のパートナーの片方は、金属（チップ）上に固定される。光が金属中で表面プラズモンを励起し、結合パートナーが固定化分子に結合する場合、これは、表面プラズモンシグナルの検出可能な変化を生じさせる。別のこのような技術は、生体試料の含量は生物学的イベントの電子シグナルへの直接的変換により分析し得る、電気化学的変換に依存する。電気化学的バイオセンシングで最もよくある技術は、ナノワイヤーまたは磁気ナノ粒子ベースバイオセンシングに加えて、サイクリックボルタメトリー、クロノアンペロメトリー、クロノポテンシオメトリー、インピーダンス分光法、および電界効果トランジスタベース方法を含む。
【発明の概要】
【００１０】
本発明者らは、甲状腺ホルモンの変換に関与する酵素を電極上に固定することにより、遊離Ｔ３および遊離Ｔ４の直接定量化方法に採用し得るということを見出した。以前の方法は、複数のステップ、間接的測定または推定による遊離Ｔ３および遊離Ｔ４を定量するので、前述の知見は、甲状腺ホルモンのより正確で特異的な定量化を可能とする。従って、本開示は、甲状腺関連疾患のための高められた診断システムを提供する。
【００１１】
本発明者らは、ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼ（ｉｏｄｏｔｈｙｒｏｉｄｉｎｅ  ｄｅｉｏｄｅｎａｓｅ）の、別の基材表面上などのセンサー上の存在がｆＴ３および／またはｆＴ４の定量には必要であることを見出した。実際に、１方のホルモンを定量するときには、必ず他方のホルモンも定量される。理由は、図２で分かるように、定量に使用される酵素反応は、いくつかのオーバーラップがあるためである。さらに、第３の甲状腺ホルモン、逆位トリヨードサイロニン（ｒＴ３）は、定量化で重要な役割を果たす。理由は、ｒＴ３の脱ヨウ素は、ＥＣ１．２１．９９．４のヨードサイロニンデヨージナーゼ（ｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ  ｄｅｉｏｄｉｎａｓｅ）により同様に触媒されるためである。従って、ｒＴ３は好都合にも、本発明のセンサーによるｆＴ３およびｆＴ４の定量の前に除去されるか、または別々に定量され得る。あるいは、いくつかの実施形態では、本発明のセンサーは、抗ｒＴ３抗体も含み、これは、ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼと共に、１つの単一のステップでｒＴ３、ｆＴ３およびｆＴ４の特異的定量化を可能にする。
【００１２】
甲状腺ホルモンの定量のためのセンサーを提供することは本開示の一態様であり、該センサーは、
ａ．基材、
ｂ．ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼ、を含み、
少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼは、基材表面上に固定される。
【００１３】
甲状腺ホルモンの定量のためのセンサーを提供することは本開示の一態様であり、該センサーは、
ａ．基材、
ｂ．ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼ、および
ｃ．抗ｒＴ３抗体、を含み、
少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼおよび抗ｒＴ３抗体は、基材表面上に固定される。
【００１４】
甲状腺ホルモンの定量のためのセンサーを提供することは本開示の一態様であり、該センサーは、ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含み、ヨードサイロニンデヨージナーゼはセンサー上に固定される。
【００１５】
甲状腺ホルモンの検出のためのセンサーを提供することは本開示の別の態様であり、該センサーは、ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含み、ヨードサイロニンデヨージナーゼはセンサー上に固定される。
【００１６】
本開示のさらなる態様は、試料中の甲状腺ホルモンの定量化方法を提供することであり、該方法は、下記のステップを含む：
ａ．甲状腺ホルモンを含むまたは含むと疑われる試料を用意するステップ、
ｂ．本開示のセンサーと接触させるステップ、
ｃ．センサーからのシグナルを測定するステップ、および
ｄ．シグナルを用いて、試料中の１種または複数の甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、甲状腺ホルモンを検出するステップ。
【００１７】
本開示のさらなる態様は、対象の甲状腺関連障害の診断方法を提供することであり、該方法は、下記のステップを含む：
ａ．対象から得られる試料を用意するステップ、
ｂ．本開示の方法を用いて、試料中の前記甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、１種または複数の甲状腺関連障害を診断するステップ。
【００１８】
本開示のさらなる態様は、対象の甲状腺関連障害の診断方法を提供することであり、該方法は、下記のステップを含む：
ａ．対象から得られる試料を用意するステップ、
ｂ．前記試料と本開示によるセンサーとを接触させるステップ、
ｃ．試料中の１種または複数の甲状腺ホルモンを検出するステップ、
ｄ．試料中の前記甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、１種または複数の甲状腺関連障害を診断するステップ。
【００１９】
本開示のさらなる態様は、対象の甲状腺関連障害の監視方法を提供することであり、該方法は、下記のステップを含む：
ａ．甲状腺刺激化合物を対象に投与するステップ、
ｂ．ステップａ．の実施後に対象から試料を収集するステップ、
ｃ．本明細書で開示の方法を用いて、試料中の前記甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、甲状腺関連障害を監視するステップ。
【００２０】
本開示のさらなる態様は、対象の甲状腺関連障害の監視方法を提供することであり、該方法は、下記のステップを含む：
ａ．甲状腺刺激化合物を対象に投与するステップ、
ｂ．ステップａ．の実施後に対象から試料を収集するステップ、
ｃ．前記試料と本開示によるセンサーとを接触させるステップ、
ｄ．シグナルを測定するステップ、および
ｅ．シグナルを用いて、試料中の甲状腺ホルモンの濃度を決定し、それにより、甲状腺関連障害を監視するステップ。
【００２１】
本開示のまたさらなる態様は、甲状腺ホルモンの定量のために、本開示のセンサーの使用を提供することである。
【００２２】
本開示の態様は、試料中の甲状腺ホルモンの検出方法を提供することも、本開示の一態様であり、該方法は、下記のステップを含む：
ａ．甲状腺ホルモンを含むまたは含むと疑われる試料を用意するステップ、
ｂ．前記試料と本開示によるセンサーとを接触させるステップ、
ｃ．センサーからのシグナルを測定し、それにより、甲状腺ホルモンを検出するステップ。
【００２３】
ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーの製造方法を提供することは、本開示のさらなる態様であり、該方法は、下記を含む：
ａ．基材を用意するステップ、
ｂ．ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および任意選択で、抗ｒＴ３抗体を用意するステップ、
ｃ．ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび抗ｒＴ３抗体を基材表面上に固定し、それにより、ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．３から選択される少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーを製造するステップ。
【００２４】
ヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーの製造方法を提供することは、本開示のさらなる態様であり、該方法は、下記を含む：
ａ．電極を用意するステップ、
ｂ．少なくとも１種のヨードサイロニンデヨージナーゼを用意するステップ、
ｃ．電極上にヨードサイロニンデヨージナーゼを固定し、それにより、ヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーを製造するステップ。
【００２５】
本開示の別の態様は、甲状腺ホルモンの定量および／または監視のための手持ち型装置を提供することであり、該装置は下記を含む：
ａ．試料の入口；
ｂ．センサーであって、
ｉ．基材、
ｉｉ．ＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ、
ｉｉｉ．ＥＣ１．２１．９９．４から選択された第２のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および
ｉｖ．任意選択で、抗ｒＴ３抗体、を含むセンサー、
ｃ．センサーからシグナルを受け、それを使用者により読み取り可能なフォーマットに変換するように構成された検出器、
ｄ．任意選択で、試料から細胞成分を分離する手段。
【００２６】
本開示の別の態様は、甲状腺ホルモンの検出、定量および／または監視のための手持ち型装置を提供することであり、該装置は下記を含む：
ａ．試料の入口；
ｂ．ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含むセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼがセンサー上に固定され、入口が試料とセンサーとを接触させて配置するように構成された、センサー、
ｃ．センサーからシグナルを受け、それを使用者により読み取り可能なフォーマットに変換するように構成された検出器；
ｄ．任意選択で、試料から細胞成分を分離する手段。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】視床下部−下垂体−甲状腺系。
【図２】ヨードサイロニンデヨージナーゼの３種のアイソフォームによる甲状腺ホルモンの触媒。
【図３】Ｔ４の漸増濃度によるＩＤＩＩ電流測定バイオセンサーの電流応答。
【図４】Ｔ４の漸増濃度によるＩＤＩＩボルタメトリーバイオセンサーの電流応答。
【図５】Ｔ４の検出に及ぼすチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）濃度の影響。Ｔ４の濃度は一定である。
【図６】漸増Ｔ４濃度によるウシ胎仔血清のサイクリックボルタメトリー測定。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
甲状腺機能の評価のための遊離甲状腺ホルモンｆＴ３およびｆＴ４の定量用のバイオセンサーおよびその応用が本明細書で開示される。さらに、本開示は、対象の甲状腺関連障害の診断または監視方法に関し、該方法は、前記対象から得た試料中の甲状腺ホルモンの濃度を決定することを含む。
【００２９】
甲状腺ホルモン
本開示は、遊離甲状腺ホルモンｆＴ３およびｆＴ４の検出および／または定量のための、および従って、甲状腺機能の評価のための、装置および方法に関する。
【００３０】
甲状腺ホルモンは、甲状腺により産生および放出されるホルモンである。それらは、主として、代謝の調節に関与するチロシン系ホルモンである。
【００３１】
甲状腺ホルモンチロキシン（Ｔ４）およびトリヨードサイロニン（Ｔ３）は、遊離チロキシン（ｆＴ４）および遊離トリヨードサイロニン（ｆＴ３）として測定でき、これらは、身体中のチロキシンおよびトリヨードサイロニン活性の指標である。それらはまた、総チロキシンおよび総トリヨードサイロニンとしても測定でき、チロキシン結合グロブリンに結合しているチロキシンおよびトリヨードサイロニンの量に依存する。関連パラメーターは、遊離チロキシン指数であり、これは、総チロキシンに甲状腺ホルモン取り込みを乗じたものであり、これは、さらには、非結合チロキシン結合グロブリンの尺度である。さらに、甲状腺疾患は、先進画像処理技術を用い、胎生期のホルモンレベルを検査して、出生前に検出できる。
【００３２】
逆位トリヨードサイロニン（３，３’，５’−トリヨードサイロニン、逆位Ｔ３、またはｒＴ３）は、トリヨードサイロニン（３，５，３’−トリヨードサイロニン、Ｔ３）の異性体である。
【００３３】
逆位Ｔ３は、甲状腺が血流中へ放出する第３のヨードサイロニンの内で最も多いものであり、血流中に放出されるヨードサイロニンの内で、０．９％がｒＴ３であり、テトラヨードサイロニン（レボチロキシン、Ｔ４）が９０％を構成し、Ｔ３が９％である。しかし、ヒト血液中のｒＴ３の９５％は、身体中の他の場所で産生される。甲状腺によるホルモンの産生は、視床下部および脳下垂体により制御される。甲状腺ホルモンの生理学的活性は、プロホルモンＴ４を活性化する、不活化する、または単純に廃棄する、およびさらにはＴ３およびｒＴ３を機能的に調節する、酵素系により調節される。これらの酵素は、神経伝達物質、ホルモン、代謝マーカーおよび免疫学的シグナルを含むシステムの複雑な指示により機能する。ｒＴ３レベルは、甲状腺機能正常症候群などの状態下で増大する。理由は、その排出が減少し、一方で、その産生が同じにとどまるためである。
【００３４】
健康な対象とも呼ばれる、成人健常者では、甲状腺ホルモンの基準範囲は：
・ｆＴ３：２．８〜４．４ｐｇ／ｍＬ（≧１歳、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃから取得）、
・ｆＴ４：０．８〜２．０ｎｇ／ｄＬ（全年代、Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃから取得）、
・ｒＴ３：１０〜２４ｎｇ／ｄＬ（Ｍａｙｏ  Ｃｌｉｎｉｃから取得）、
これらの値は次の文献による：Ｄｅｍｅｒｓ  ＬＭ，Ｓｐｅｎｃｅｒ  Ｃｌ：Ｔｈｅ  ｔｈｙｒｏｉｄ：ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｔｅｓｔｉｎｇ．Ｉｎ  Ｔｉｅｔｚ  Ｔｅｘｔｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ．Ｆｏｕｒｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  ＣＡ  Ｂｕｒｔｉｓ，ＥＲ  Ａｓｈｗｏｏｄ，ＤＥ  Ｂｒｕｎｓ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ  Ｓａｕｎｄｅｒｓ  Ｃｏｍｐａｎｙ．２００６，ｐｐ  ２０５３−２０８７；Ｓｔｏｃｋｉｇｔ  ＪＲ：Ｆｒｅｅ  ｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ．Ａ  ｃｒｉｔｉｃａｌ  ａｐｐｒａｉｓａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ  ２００１  Ｊｕｎ；３０：２６５−２８９；ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ＷＴ，Ｅａｓｔｍａｎ  ＲＣ：Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ．Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏｓｂｙ，１９９０，ｐｐ  １８２−１８３．
【００３５】
異なる基準範囲を乳幼児および子ども対し使用し得る。さらに、異なる検査室では、±０．４単位で基準範囲を調節し得る。
【００３６】
従って、上記範囲内の甲状腺ホルモン濃度および／またはレベルは、正常と認識され、一方、その範囲未満の濃度および／またはレベルは低いと見なされ、その範囲を超える濃度および／またはレベルは、高いと見なされる。
【００３７】
ヨードサイロニンデヨージナーゼ
本開示は、甲状腺ホルモンの定量のためのセンサーに関し、該センサーは、基材、ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼ、および任意選択で、抗ｒＴ３抗体を含み、少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼおよび抗ｒＴ３抗体は、基材の表面上に固定される。
【００３８】
本開示は、ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含むセンサーに関し、甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために、ヨードサイロニンデヨージナーゼはセンサー上に固定される。
【００３９】
ヨードサイロニンデヨージナーゼ（ＥＣ１．２１．９９．４およびＥＣ１．２１．９９．３）は、甲状腺ホルモンの活性化および非活性化に重要なデヨージナーゼ酵素のサブファミリーである。チロキシン（Ｔ４）、３，５，３’−トリヨードサイロニン（Ｔ３）の前駆体は、デヨージナーゼ活性によりＴ３に変換される。Ｔ３は、核甲状腺ホルモン受容体への結合を介して、実質的に全ての脊椎動物細胞中の遺伝子の発現に影響を与える。ヨードサイロニンデヨージナーゼは、これらの酵素は、他の場合には希なアミノ酸セレノシステインの形でセレンを含むという点で珍しい。
【００４０】
本明細書で言及されるＥＣ１．２１．９９．４ヨードサイロニンデヨージナーゼは、下記の反応を触媒できる：
３，５，３’−トリヨード−Ｌ−サイロニン＋ヨウ化物＋Ａ＋Ｈ（＋）  ＜＝＞  Ｌ−チロキシン＋ＡＨ（２）
ＥＣ１．２１．９９．４ヨードサイロニンデヨージナーゼは、甲状腺ホルモンをより活性にする５’−脱ヨウ素化の方向にのみ酵素活性を示した。
【００４１】
ＥＣ１．２１．９９．４ヨードサイロニンデヨージナーゼは、Ｉ型およびＩＩ型からなり、両方がセレノシステインを含むが、異なる動力学を有する。Ｉ型酵素では、最初の反応は還元的脱ヨウ素であり、酵素の−Ｓｅ−Ｈ基を−Ｓｅ−Ｉ基に変換し、還元剤はその後、これを−Ｓｅ−Ｈに再変換し、ヨウ化物を放出する。次の酵素がＥＣ１．２１．９９．４グループに包含される：
ジヨードサイロニン５’−デヨージナーゼ；
ジヨードサイロニン５’−デヨージナーゼ；
ヨードサイロニン外輪モノデヨージナーゼ；
Ｌ−チロキシンヨードヒドロラーゼ（還元性）；
チロキシン５−デヨージナーゼ；
Ｉ型ヨードサイロニンデヨージナーゼ；
ＩＩ型ヨードサイロニンデヨージナーゼ；
【００４２】
本明細書で言及されるＥＣ１．２１．９９．３ヨードサイロニンデヨージナーゼは、下記の反応を触媒できる：
３，３‘，３’−トリヨード−Ｌ−サイロニン＋ヨウ化物＋受容体＋Ｈ（＋）  ＜＝＞  Ｌ−チロキシン＋還元受容体
【００４３】
ＥＣ１．２１．９９．３ヨードサイロニンデヨージナーゼは、５’−脱ヨウ素化の方向に酵素活性を示した。この５−ヨウ素の除去、すなわち、内輪からの除去は、ホルモンチロキシンを大きく不活性化する。次の酵素がＥＣ１．２１．９９．４グループに包含される：
ジヨードサイロニン５’−デヨージナーゼ；
ヨードサイロニン５−デヨージナーゼ；
ヨードサイロニン内輪モノデヨージナーゼ；
ＩＩＩ型ヨードサイロニンデヨージナーゼ；
【００４４】
デヨージナーゼＩ型とも呼ばれるＩ型デヨージナーゼ（ＤＩまたはＤ１）は、肝臓および腎臓中でよく検出され、甲状腺ホルモンの内輪および外輪の両方を脱ヨウ素化できる。用語の「内輪」および「外輪」は、図２に可視化され、甲状腺ホルモン中に存在する異なるベンゼン環を指す。
【００４５】
デヨージナーゼＩＩ型とも呼ばれるＩＩ型デヨージナーゼ（ＤＩＩまたはＤ２）は、心臓、骨格筋、中枢神経系、脂肪、甲状腺、および下垂体でよく検出される。プロホルモンチロキシンの外輪を脱ヨウ素化することのみが知られており、主要な活性化酵素である（既に不活性の逆位トリヨードサイロニンはまた、ＤＩＩによりさらに分解される）。
【００４６】
デヨージナーゼＩＩＩ型とも呼ばれるＩＩＩ型デヨージナーゼ（ＤＩＩＩまたはＤ３）は、胎生期組織および胎盤でよく検出され、下垂体中を除いて、脳全体にも存在する。これは、チロキシンまたはトリヨードサイロニンの内輪を脱ヨウ素化することのみが知られている。
【００４７】
組織中では、デヨージナーゼは、甲状腺ホルモンを活性化または不活性化できる。活性化は、外輪上のヨウ素原子の除去を介したプロホルモンチロキシン（Ｔ４）の活性ホルモントリヨードサイロニン（Ｔ３）への変換により起こる。
【００４８】
甲状腺ホルモンの不活性化は、内輪上のヨウ素原子の除去により起こり、これは、チロキシンを不活性逆位トリヨードサイロニン（ｒＴ３）、または活性トリヨードサイロニンをジヨードサイロニン（Ｔ２）に変換する。
【００４９】
チロキシン脱ヨウ素の主要な部分は、細胞内で行われる。
【００５０】
ＤＩＩ活性は、ユビキチン化により調節できる：ユビキチンの共有結合は、ダイマー化を破壊し、それをプロテオソームの分解を標的にすることにより、ＤＩＩを不活性化する。ＤＩＩからのユビキチンを除去する脱ユビキチン化は、その活性を回復し、プロテアソーム分解を防止する。
【００５１】
ＤＩは、Ｔ４を活性化してＴ３の産生およびＴ４の不活化の両方を行う。甲状腺機能亢進症の患者の余分の甲状腺Ｔ３の産生におけるその増大した機能を除いて、その機能は、ＤＩＩまたはＤＩＩＩに比べて十分には理解されていない。ＤＩＩは、Ｔ４をＴ３に変換し、細胞質のＴ３プールの主要な発生源である。ＤＩＩＩは、Ｔ４の活性化を防止し、Ｔ３を不活化する。ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｉｏｄｏｔｈｙｒｏｎｉｎｅ＿ｄｅｉｏｄｉｎａｓｅ−ｃｉｔｅ＿ｎｏｔｅ−ｕｒｌ＿Ｂｉａｎｃｏ＿Ｌａｂ−９ＤＩＩおよびＤ３は、血漿および細胞のレベルでのＴ３レベルの維持の恒常的調節に重要である。甲状腺機能亢進症では、Ｄ２は、下方制御され、Ｄ３は、上方制御されて余分のＴ３を除去し、同時に、甲状腺機能低下症Ｄ２は、上方制御され、細胞質Ｔ３を増大させるために、Ｄ３は下方制御されている。血清Ｔ３レベルは、健常者では全く一定であるが、Ｔ３およびＴ４レベルは臓器によって変動し得るので、Ｄ２およびＤ３は、組織特異的細胞内Ｔ３レベルを調節して、恒常性を維持できる。デヨージナーゼはまた、甲状腺ホルモンレベルの空間的および時間的発生制御を提供する。Ｄ３レベルは、発生の早期に最高であり、時間と共に低下するが、一方、Ｄ２レベルは、組織の顕著な変形の瞬間で高い。従って、Ｄ２は、必要な時点で十分なＴ３の産生を可能とするが、一方、Ｄ３は、Ｔ３への過剰暴露から組織を遮蔽する。
【００５２】
ＤＩＩはまた、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）中の熱産生において重要な役割を果たす。交感神経刺激、温度低下、またはＢＡＴの過剰供給に応答して、ＤＩＩは、脂肪酸の酸化を高め、タンパク質の脱共役により酸化的リン酸化を脱共益させ、ミトコンドリア熱発生を生じさせる。ＤＩＩは、ＢＡＴの寒冷ストレス中に減少し、細胞内のＴ３レベルを増大させる。ＤＩＩ欠損モデルでは、悪寒戦慄は、低温に対する行動適応である。しかし、熱発生は、脂質酸化の脱共益よりも遙かに効率が低い。
【００５３】
甲状腺ホルモンの検出のためのセンサーを提供することは本開示の一態様であり、該センサーは、ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含み、ヨードサイロニンデヨージナーゼはセンサー上に固定される。
【００５４】
一実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、１型ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．４］、またはそのフラグメントである。
【００５５】
一実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．４］、またはそのフラグメントである。
【００５６】
一実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、３型ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３］、またはそのフラグメントである。
【００５７】
一実施形態では、ＥＣ１．２１．９９．４ヨードサイロニンデヨージナーゼは、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、または１型ヨードサイロニンデヨージナーゼである。
【００５８】
一実施形態では、ＥＣ１．２１．９９．４ヨードサイロニンデヨージナーゼは、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼである。
【００５９】
一実施形態では、ＥＣ１．２１．９９．３ヨードサイロニンデヨージナーゼは、３型ヨードサイロニンデヨージナーゼである。
【００６０】
本開示のいくつかの実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、哺乳動物由来である。本開示のいくつかの実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、ヒト由来である。
【００６１】
本開示のいくつかの実施形態では、ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および／または抗ｒＴ３抗体は、哺乳動物由来である。
【００６２】
本開示のいくつかの実施形態では、ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および／または抗ｒＴ３抗体は、ヒト由来である。
【００６３】
本開示のいくつかの実施形態では、ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および／または抗ｒＴ３抗体は、追加の部分に結合される。
【００６４】
本開示のいくつかの実施形態では、ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および／または抗ｒＴ３抗体は、追加の部分にそれぞれ個別に結合される。例えば、追加の部分は、ヨードサイロニンデヨージナーゼのセンサー上への固定化、または甲状腺ホルモンの検出を容易にし得る。
【００６５】
本開示のいくつかの実施形態では、基材は、少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼの固定化用の、基材の第１の表面および基材の第２の表面などの複数の表面を含む。
【００６６】
本開示のいくつかの実施形態では、第１の表面、第２の表面および任意選択で、第３の表面は、同じ基材上に存在する。
【００６７】
本開示のいくつかの実施形態では、第１の表面、第２の表面および任意選択で、第３の表面は、異なる基材上に存在する。
【００６８】
本開示のいくつかの実施形態では、少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼは、基材の第１表面上に固定されたＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードチロイジンデヨーデナーゼ、および基材の第２の表面上に固定されたＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される第２のヨードチロイジンデヨーデナーゼを含む。
【００６９】
本開示のいくつかの実施形態では、第１のヨードサイロニンデヨージナーゼは、ＥＣ１．２１．９９．４から選択され、第２のヨードサイロニンデヨージナーゼは、ＥＣ１．２１．９９．３から選択される。
【００７０】
本開示のいくつかの実施形態では、第１のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび第２のヨードサイロニンデヨージナーゼは、両方ともＥＣ１．２１．９９．４から独立に選択される。
【００７１】
本開示のいくつかの実施形態では、第１のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび第２のヨードサイロニンデヨージナーゼは、ＥＣ１．２１．９９．４から選択される異なる酵素である。
【００７２】
本開示のいくつかの実施形態では、第１のヨードサイロニンデヨージナーゼは、１型ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または２型ヨードサイロニンデヨージナーゼである。
【００７３】
本開示のいくつかの実施形態では、第２のヨードサイロニンデヨージナーゼは、１型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または３型ヨードサイロニンデヨージナーゼである。
【００７４】
本開示のいくつかの実施形態では、第１のヨードサイロニンデヨージナーゼは、１型ヨードサイロニンデヨージナーゼであり、第２のヨードサイロニンデヨージナーゼは、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼである。
【００７５】
本開示のいくつかの実施形態では、第１のヨードサイロニンデヨージナーゼは、１型ヨードサイロニンデヨージナーゼであり、第２のヨードサイロニンデヨージナーゼは、３型ヨードサイロニンデヨージナーゼである。
【００７６】
本開示のいくつかの実施形態では、第１のヨードサイロニンデヨージナーゼは、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼであり、第２のヨードサイロニンデヨージナーゼは、３型ヨードサイロニンデヨージナーゼである。
【００７７】
本開示のいくつかの実施形態では、ｔ
本開示のいくつかの実施形態では、ｔ
本開示のいくつかの実施形態では、ｔ
本開示のいくつかの実施形態では、ｔ
【００７８】
いくつかの実施形態では、追加の部分はペプチド、例えば、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓタグ）である。
【００７９】
いくつかの実施形態では、追加の部分は、蛍光タグまたはプローブとも呼ばれる標識である。
【００８０】
ポリヒスチジンタグは、タンパク質の、金属表面、例えば、ニッケルまたはコバルトコートマイクロタイタープレートまたはタンパク質アレイ上の表面などの表面上への固定のためにうまく使用できる。
【００８１】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび３型ヨードサイロニンデヨージナーゼの両方、またはそれらのフラグメントを含む。ＤＩＩおよびＤＩＩＩの両方の存在は、甲状腺疾患のより正確な診断をもたらし得る。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、１型ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび２型ヨードサイロニンデヨージナーゼの両方、またはそれらのフラグメントを含む。ＤＩおよびＤＩＩの両方の存在は、甲状腺疾患のより正確な診断をもたらし得る。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、１型ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび３型ヨードサイロニンデヨージナーゼの両方、またはそれらのフラグメントを含む。ＤＩおよびＤＩＩＩの両方の存在は、甲状腺疾患のより正確な診断をもたらし得る。
【００８４】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、第１のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび第２のヨードサイロニンデヨージナーゼを含み、両方はＥＣ１．２１．９９．４から独立に選択される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、第１のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび第２のヨードサイロニンデヨージナーゼを含み、両方はＥＣ１．２１．９９．３から独立に選択される。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、第１および第２のヨードサイロニンデヨージナーゼを含み、両方はＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．４から独立に選択される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、ＥＣ１．２１．９９．４から独立に選択される第１のヨードサイロニンデヨージナーゼおよびＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．４から独立に選択される第２のヨードサイロニンデヨージナーゼを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、基材の第１の表面上に固定された第１のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび基材の第２の表面上に固定された第２のヨードサイロニンデヨージナーゼを含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、１型ヨードサイロニンデヨージナーゼは、配列番号１に対し、少なくとも９５％配列同一性、例えば、少なくとも９６％配列同一性、例えば、少なくとも９７％配列同一性、例えば、少なくとも９８％配列同一性、例えば、少なくとも９９％配列同一性、例えば、約１００％配列同一性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを含むまたはそれからなる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼは、配列番号２に対し、少なくとも９５％配列同一性、例えば、少なくとも９６％配列同一性、例えば、少なくとも９７％配列同一性、例えば、少なくとも９８％配列同一性、例えば、少なくとも９９％配列同一性、例えば、約１００％配列同一性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを含むまたはそれからなる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、３型ヨードサイロニンデヨージナーゼは、配列番号３に対し、少なくとも９５％配列同一性、例えば、少なくとも９６％配列同一性、例えば、少なくとも９７％配列同一性、例えば、少なくとも９８％配列同一性、例えば、少なくとも９９％配列同一性、例えば、約１００％配列同一性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを含むまたはそれからなる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、無細胞発現によるなどの組換えによりで作製される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ＥＣ１．２１．９９．３ヨードサイロニンデヨージナーゼ、ＥＣ１．２１．９９．４ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または抗ｒＴ３抗体は、無細胞発現によるなどの組換えにより作製される。
【００９４】
無細胞発現は、無細胞タンパク質合成またはＣＦＰＳとも呼ばれる、無細胞系で、すなわち、生細胞を使用することなく、生物学的機械を用いたタンパク質の作製である。インビトロタンパク質合成環境は、細胞生存率を維持するために必要な細胞壁または恒常性条件により束縛されない。従って、ＣＦＰＳは、翻訳環境の直接アクセスおよび制御を可能とし、これは、膜タンパク質の同時翻訳可溶化、タンパク質作製の最適化、非天然アミノ酸の組み込み、選択的および部位特異的標識化を含む多くの用途にとって好都合である。
【００９５】
配列同一性に関して：高レベルの配列同一性は、第１の配列が第２の配列から誘導されているという可能性を示す。アミノ酸配列同一性は、２つの整列配列の間の同一のアミノ酸配列を必要とする。従って、参照配列と少なくとも９５％アミノ酸同一性を共有する候補配列は、整列後に、候補配列中の少なくとも９５％のアミノ酸が参照配列中の対応するアミノ酸に同一であることが必要である。同一性は、限定されないが、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗコンピューター整列プログラム（Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．，Ｇｉｂｓｏｎ  Ｔ．，Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  Ｊ．Ｄ．，Ｈｉｇｇｉｎｓ  Ｄ．Ｇ．，Ｇｉｂｓｏｎ  Ｔ．Ｊ．，１９９４．ＣＬＵＳＴＡＬ  Ｗ：ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｖｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｗｅｉｇｈｔｉｎｇ，ｐｏｓｉｔｉｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇａｐ  ｐｅｎａｌｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｗｅｉｇｈｔ  ｍａｔｒｉｘ  ｃｈｏｉｃｅ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：４６７３−４６８０）などのコンピューター解析、およびその中で提案されているデフォルトパラメーターを使用して決定し得る。
【００９６】
バイオセンサー概念
本開示は、基材、ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および抗ｒＴ３抗体を含むセンサーであるバイオセンサーに関し、少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび抗ｒＴ３抗体は、基材の表面上に固定されている。
【００９７】
本開示はバイオセンサーに関し、該バイオセンサーは、その１つの表面上に固定されたヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］を含む。
【００９８】
リガンド／受容体相互作用を検出するための種々の装置が知られている。これらの内で最も基本的なものは、分析物の存在または量が検出可能な反応生成物を測定または定量することにより検出される、純粋に化学的／酵素的なアッセイである。リガンド／受容体相互作用はまた、放射標識アッセイによっても検出および定量できる。
【００９９】
このタイプの定量的結合アッセイは、２種の別々の要素：反応基材、例えば、固相検査片、チップまたは電極、および別の読み取りまたは検出装置、例えば、シンチレーションカウンターまたは分光光度計、を必要とする。基材は通常、少量の体液試料由来の複数の分析物アッセイを取り扱うための多重アッセイ、または小型化に適合しない。
【０１００】
バイオセンサーでは、対照的に、アッセイ基材および検出器表面は、単一装置に統合されている。ある種の汎用型バイオセンサーは、リガンド−受容体結合イベントの存在に応答した電流またはインピーダンスの変化を検出するための電流またはインピーダンス測定素子と組み合わせた電極表面を採用する。別のタイプのバイオセンサーは、光学的検出器と組み合わせて、例えば、表面プラズモン共鳴法と組み合わせて、チップ、例えば、ガラスチップを採用し得る。
【０１０１】
本明細書では「センサー」と呼ばれることもある「バイオセンサー」は、センサーおよび生物学的素子を含むシステムを意味する。バイオセンサーは、長時間を要し、高価、複雑で、インサイツ管理に好適しない従来の分析技術の実用的代用品である。バイオセンサーは、生物学的素子と変換器とを大まかに統合する化学的分析装置である。それは、生物学的素子を、単一分析物に比例した、検出器に対しさらに変換される電子シグナルを生じる変換器内に、またはそれと密接に接触して固定する。
【０１０２】
バイオセンサーは、３つの基本的な要素：バイオレセプター（生物学的素子）、変換器および電子回路、を包含する。バイオレセプターまたは生物学的素子は、変換器に埋め込まれた、酵素、ＤＮＡ、タンパク質、ホールセル、抗体、などの生体分子である。本出願では、バイオレセプターは、ヨードサイロニンデヨージナーゼである。変換器は、１つの形のエネルギーを別のエネルギーに、例えば、化学エネルギーを電気エネルギーに、再活性化する装置である。例えば、変換器は、検出器である。本開示の方法により包含される検出器は、表面プラズモン共鳴検出器などの光学的検出器、電気化学検出器、および測定回路である。電子回路は、電気シグナルを処理可能シグナルに変換するシグナル処理システムを含む。
【０１０３】
表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）に基づくバイオセンサーは、ＳＰＲ境界での変動、例えば、結合イベントにより発生するＳＰＲ表面反射角度のシフトを利用する。最終的に、バイオセンサーはまた、バイオセンサー表面での光学特性の変化を利用し得る。
【０１０４】
電気化学のバイオセンサーは通常、電子を生成または消費する反応の酵素触媒作用（レドックス酵素）に基づく。センサー基材は通常、３個の電極：参照電極、作用電極および対極、を含む。標的分析物は、活性電極表面上に起こる反応に関与し、反応は、二重層を横切る電子移動を引き起こし得る（電流を生成）、または二重層電位に寄与できる（電圧を生成）。電流が測定でき、一定の電位で電子の流れの速度が分析物濃度に比例する、またはゼロ電流で電位が測定でき、これは対数応答を与える。さらに、小さいペプチドおよびタンパク質の無標識、直接電気的検出が、バイオ機能化イオン感応性電界効果トランジスタを用いて、それらの固有電荷により可能である。
【０１０５】
電位差測定バイオセンサーは、ゼロ電流で電位が生成され、高いダイナミックレンジを備えた対数応答を与える。このようなバイオセンサーは多くの場合、プラスチック基材上で電極パターンをスクリーン印刷し、導電性ポリマーでコートした後、いくつかのタンパク質（酵素または抗体）が付着される。それらは２つのみの電極を有し、極めて高感度で頑丈である。それらは、従来はＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳでのみ達成可能なレベルで、さらに厳密な試料調製の必要なしに、分析物の検出を可能とする。生物学的検知要素は当該分析物に対し高度に選択的であるので、全てのバイオセンサーは通常、最小限の試料調製しか必要としない。シグナルは、センサー表面で起こる変化に起因する導電性ポリマー中の電気化学的および物理的変化により生成される。このような変化は、イオン強度、ｐＨ、水和およびレドックス反応に起因し得る。ＦＥＴのゲート領域への分析物の結合がドレイン発信源電流の変化を生ずるので、ゲート領域が酵素または抗体により改質されている電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）は、同様に非常に少ない濃度の種々の分析物を検出できる。
【０１０６】
バイオセンサーは、分離した反応基材および読み取り装置を有する結合アッセイシステムと比べて、多くの潜在的利点を有する。１つの重要な利点は、マイクロチップ製造方法を用いて、小規模であるが高度に再現可能なバイオセンサー装置を製造する能力である。
【０１０７】
種々のタイプのバイオセンサーの多くの潜在的用途が存在する。研究および商業的用途の観点で有用なバイオセンサーによる手法に対する主要件は、いくつかの状況下での高感度検査室ベース技術にとって好ましい、標的分子の特定、好適な生物学的認識素子の利用能、および使い捨て型の持ち運び可能検出システムに対する潜在能力である。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本開示は、甲状腺ホルモンの検出および／または定量のためのバイオセンサーに関し、甲状腺ホルモンは、遊離Ｔ４、遊離Ｔ３および逆位Ｔ３（ｒＴ３）から選択される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、本開示は、甲状腺ホルモンの定量のためのバイオセンサーに関し、甲状腺ホルモンは、遊離Ｔ４、遊離Ｔ３および逆位Ｔ３（ｒＴ３）から選択される。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本開示はバイオセンサーに関し、前記バイオセンサーは、センサーを含み、前記センサーは、基材、ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、またはそのフラグメント、および抗ｒＴ３抗体、またはそのフラグメントを含み、少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび抗ｒＴ３抗体は、基材の表面上に固定される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本開示はバイオセンサーに関し、前記バイオセンサーは、センサーを含み、前記センサーは、電極および電極に固定されたヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含む。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、１０〜１５ＩＵなどの、１５〜２０ＩＵなどの、２０〜２５ＩＵなどの、２５〜３０ＩＵなどの、３０〜３５ＩＵなどの，３５〜４０ＩＵなどの、４０〜４５ＩＵなどの、４５〜５０ＩＵなどの、５０〜５５ＩＵなどの、５５〜６０ＩＵなどの、６０〜６５ＩＵなどの、６５〜７０ＩＵなどの、７０〜７５ＩＵなどの、７５〜８０ＩＵなどの、８０〜８５ＩＵなどの、８５〜９０ＩＵなどの、９０〜９５ＩＵなどの、９５〜１００ＩＵなどの、１０〜１００ＩＵのヨードサイロニンデヨージナーゼを含む。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、１０〜１５ＩＵなどの、１５〜２０ＩＵなどの、２０〜２５ＩＵなどの、２５〜３０ＩＵなどの、３０〜３５ＩＵなどの，３５〜４０ＩＵなどの、４０〜４５ＩＵなどの、４５〜５０ＩＵなどの、５０〜５５ＩＵなどの、５５〜６０ＩＵなどの、６０〜６５ＩＵなどの、６５〜７０ＩＵなどの、７０〜７５ＩＵなどの、７５〜８０ＩＵなどの、８０〜８５ＩＵなどの、８５〜９０ＩＵなどの、９０〜９５ＩＵなどの、９５〜１００ＩＵなどの、１０〜１００ＩＵのＥＣ１．２１．９９．３ヨードサイロニンデヨージナーゼおよびＥＣ１．２１．９９．４ヨードサイロニンデヨージナーゼを含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、１０〜１５ＩＵなどの、１５〜２０ＩＵなどの、２０〜２５ＩＵなどの、２５〜３０ＩＵなどの、３０〜３５ＩＵなどの，３５〜４０ＩＵなどの、４０〜４５ＩＵなどの、４５〜５０ＩＵなどの、５０〜５５ＩＵなどの、５５〜６０ＩＵなどの、６０〜６５ＩＵなどの、６５〜７０ＩＵなどの、７０〜７５ＩＵなどの、７５〜８０ＩＵなどの、８０〜８５ＩＵなどの、８５〜９０ＩＵなどの、９０〜９５ＩＵなどの、９５〜１００ＩＵなどの、１０〜１００ＩＵの２型および３型ヨードサイロニンデヨージナーゼを含む。
【０１１５】
ＩＵは、国際単位を意味し、物質の量の測定値の単位であり、物質間でより容易に比較するために、１つの国際単位を構成する質量または体積は、測定される物質を基準にして変化し、変動は、生物活性または効果を基準にする。
【０１１６】
本開示のいくつかの実施形態では、下記を含む甲状腺ホルモンの定量のためのセンサーが開示される：
・第１表面を含む第１の電極；
・第２の表面を含む第２の電極；
・第１の電極の第１の表面上に固定されたＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ；
・第２の電極の第２の表面上に固定されたＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．３から選択される第２のヨードサイロニンデヨージナーゼ。
【０１１７】
本開示のいくつかの実施形態では、下記を含む甲状腺ホルモンの定量のためのセンサーが開示される：
・第１表面を含む第１の電極；
・第２の表面を含む第２の電極；
・第３の表面を含む第３の電極；
・第１の電極の第１の表面上に固定されたＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ；
・第２の電極の第２の表面上に固定されたＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．３から選択される第２のヨードサイロニンデヨージナーゼ；および
・第３の電極の第３の表面上に固定された抗ｒＴ３抗体。
【０１１８】
ヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーの製造方法を提供することは、本開示の一態様であり、該方法は、下記を含む：
ａ）電極を用意するステップ、
ｂ）少なくとも１種のヨードサイロニンデヨージナーゼを用意するステップ、
ｃ）電極上にヨードサイロニンデヨージナーゼを固定し、それにより、ヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーを製造するステップ。
【０１１９】
本発明の特定の実施形態では、電極は、本開示の実施形態により定義された通りである。本発明の特定の実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、本開示の実施形態により定義された通りである。
【０１２０】
上記ステップｃ）は、ヨードサイロニンデヨージナーゼの、センサー上などの電極上への固定を含む。このステップは、電極を機能化し、続けて、ヨードサイロニンデヨージナーゼを機能化電極上に固定するステップを含むと見られ得る。ヨードサイロニンデヨージナーゼを電極上に固定するために使用し得る手順の例は、本開示の本明細書で詳細に記述される。
【０１２１】
酵素固定化
目的の酵素などの生物学的素子のセンサー（金属、高分子またはガラスであっても）上への固定化は必要であり、バイオセンサーの設計で重要なステップである。用いられる基材に応じて、異なる固定化技術が存在し、これらの技術は当業者に既知である。
【０１２２】
甲状腺ホルモンの検出のためのセンサーを提供することは本開示の一態様であり、該センサーは、基材、
ａ．ＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ、
ｂ．ＥＣ１．２１．９９．３またはＥＣ１．２１．９９．４から選択される第２のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および
ｃ．任意選択で、抗ｒＴ３抗体、を含み、
第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ、第２のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび抗ｒＴ３抗体は、基材表面上に固定される。
【０１２３】
第１の態様では、甲状腺ホルモンの定量のためのセンサーが提供され、該センサーは、ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含み、ヨードサイロニンデヨージナーゼはセンサー上に固定される。
【０１２４】
甲状腺ホルモンの検出のためのセンサーを提供することは本開示の一態様であり、該センサーは、ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含み、ヨードサイロニンデヨージナーゼはセンサー上に固定される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本開示による基材は、１個または複数の電極および／またはチップを含む。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、本開示による基材は、少なくとも２個の電極など、少なくとも３個の電極などの、少なくとも１個の電極を含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、本開示による基材は、少なくとも２個のチップなど、少なくとも３個のチップなどの、少なくとも１個のチップを含む。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、本開示による基材は、３個の電極を含むかまたはこれからなり、第１の表面は第１の電極の表面であり、第２の表面は第２の電極の表面であり、および第３の表面は第３の電極の表面である。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、本開示による基材は、３個のチップを含むかまたはこれからなり、第１の表面は第１のチップの表面であり、第２の表面は第２のチップの表面であり、および第３の表面は第３のチップの表面である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、改質表面を有する基材を含む。前記基材は、ヨードサイロニンデヨージナーゼがその表面に固定され得るように改質される。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本開示による基材は、電極またはチップである。さらなる実施形態では、前記チップはガラスチップである。本明細書で使用される場合、用語の「ガラス」は、石英またはシリカと同等であり、連続的なフレームワーク中にケイ素および酸素原子を含み、全体としてＳｉＯ２の化学式を有する。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、２個の電極などの、３個の電極などの、１個の電極を含み、第１の電極の第１の表面は改質表面であり、第２の電極の第２の表面は改質表面であり、および／または第３の電極の第３の表面は改質表面である。
【０１３３】
本開示の本明細書で「電極」に言及する場合、それは、センサーの生物学的要素、すなわち、ＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ、ＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．４から選択される第２のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および任意選択で、抗ｒＴ３抗体がその上に固定されている、第１の電極、第２の電極、第３の電極および／またはさらなる電極と呼ばれる。
【０１３４】
本開示の本明細書で「表面」に言及する場合、それは、センサーの生物学的要素、すなわち、ＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ、ＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．４から選択される第２のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および任意選択で、抗ｒＴ３抗体がその上に固定されている、基材の（すなわち、電極および／またはチップの）第１の表面、第２の表面、第３の表面および／またはさらなる表面と呼ばれる。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、電極は、炭素、金または白金で作製される。
【０１３６】
さらなる実施形態では、電極は、スクリーン印刷電極である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、チップまたは金層または金単層でコートしたチップまたは電極の少なくとも表面を含む。さらなる実施形態では、チップまたは電極の表面は、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択される材料でコートされる。
【０１３８】
本開示によるいくつかの実施形態では、センサーの基材の第１、第２および／または第３の表面は、改質表面である。
【０１３９】
センサー表面は、例えば、電極の表面および／またはチップの表面は、使用前に、任意のタイプの処理に供され得る。処理としては、コーティング、ディップコーティング、スピンコーティング、ラングミュア−ブロジェット自己集合、溶媒蒸発、ドクターブレードコーティング、化学蒸着法、転写印刷、直接沈着、沈着沈殿法、電極表面と高分子電解質含有ナノ粒子との間の接着層の使用、アミド結合アミド結合によるなどの共有結合固定化、静電気的固定化、高分子ブラシ固定化、ゾルゲル／高分子ネットワーク固定化、ファンデルワールス固定化、疎水性／親水性固定化、蒸発および／またはディウェッティングによる沈着、光学的誘導電着などの電着、Ｔｕｒｋｅｖｉｃｈ−Ｆｒｅｎｓ法、Ｂｒｕｓｔ−Ｓｃｈｉｆｆｒｉｎ法、交互吸着法、連続的イオン性層沈着、化学的手法、光化学的方法、音波照射法またはこれらの組み合わせなどの方法により実施され得るナノ粒子の沈着が挙げられる。
【０１４０】
センサーの表面は、少なくともナノ粒子の一部が特定のパターンでセンサーの表面上に固定化されるように、ナノ粒子の沈着の前に、微細加工技術などにより、さらにパターニングされ得る。
【０１４１】
センサーの表面は、例えば、アミン機能化、チオール機能化、ヒドロキシル化、シリル化、酸化および／またはプラズマ活性化またはこれらの組み合わせにより、機能化または活性化などの化学変化を誘導するようにさらに処理され得る、表面改質は、ナノ粒子の沈着の前などの表面処理の任意の時点で実施し得る。
【０１４２】
センサーは、焼結、３Ｄプリンティングなどの印刷、スクリーン印刷および／またはインクジェット印刷、キャスティング、電着、薄膜技術、ネットワーク形成、脱合金、光学的リソグラフィーおよび／またはインプリントリソグラフィーなどのリソグラフィー、スパッタリング、スタンピング、熱アニーリング、電解、陽極酸化、電気化学エッチングなどのエッチング、ウェットエッチングおよびドライエッチングまたはこれらの組み合わせなどのセンサーの組み立てに利用できる任意の方法によりさらに組み立てまたは処理され得る。
【０１４３】
本開示によるいくつかの実施形態では、改質表面は、ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴を含む。ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴を含むこのような改質表面は、粗面（ｒｏｕｇｈｅｎｅｄ  ｓｕｒｆａｃｅ）、または粗面（ｒｏｕｇｈ  ｓｕｒｆａｃｅ）とも呼ばれる。粗面は、酵素の固定化に有益である。理由は、それにより、他の方法では固定化酵素を崩壊させる可能性があるファンデルワールス力が最小化されるためである。
【０１４４】
本開示によるいくつかの実施形態では、ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴は、微粒子、ナノ粒子、マイクロワイヤー、ナノワイヤー、マイクロチューブ、ナノチューブ、マイクロロッド、ナノロッド、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１４５】
本開示によるいくつかの実施形態では、ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴は、前記表面を焼結により組み合わせることにより、基材の表面上に生成された。
【０１４６】
本開示によるいくつかの実施形態では、ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴は、表面エッチングにより、基材の表面上に生成された。例えば、表面エッチングは、ウェットエッチングまたはドライエッチングであり得る。
【０１４７】
本開示によるいくつかの実施形態では、ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴は、粒子沈着により、基材の表面上に生成された。例えば、ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴は、電気泳動析出により、基材の表面上に生成された。
【０１４８】
本開示によるいくつかの実施形態では、改質表面は、金の層でコートされた表面である。
【０１４９】
本開示によるいくつかの実施形態では、改質表面は、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるナノ粒子でコートされた表面である。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、少なくとも金の層または単層でコートされた基材（チップまたは電極）表面を含み、前記表面は、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるナノ粒子でさらに改質される。
【０１５１】
換言すれば、基材（電極またはチップ）は、金の層または単層でコートされ、前記金の層または単層上には、ナノ粒子、例えば、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるナノ粒子が存在し、ヨードサイロニンデヨージナーゼ分子は、前記ナノ粒子上に固定される。
【０１５２】
一実施形態では、チップまたは電極の少なくとも１つの表面は、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるナノ粒子で改質される。
【０１５３】
本開示によるいくつかの実施形態では、改質表面は、金の層でコートされた表面であり、前記表面は、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるナノ粒子でさらに改質される。
【０１５４】
本明細書で開示のナノ粒子は、キャッピング剤でキャッピングされ得る。キャッピング剤は、シトレートなどの有機分子であり得、ナノ粒子の成長を停止させてそのサイズを制御するために使用され得る。いくつかの実施形態では、ナノ粒子はクエン酸キャップ、アミノ酸キャップ、またはクエン酸キャップおよびアミノキャップの両方のキャップが実施されている。
【０１５５】
一実施形態では、センサーは、改質表面を有するチップを含み、前記チップは、化学的に改質されたガラス基材であり、前記チップは、甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために表面プラズモン共鳴と組み合わせて使用される。
【０１５６】
一実施形態では、センサーは、改質表面を有するチップを含み、前記チップは、ナノ粒子で改質されたガラス基材であり、前記ナノ粒子は、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択され得、前記チップは、甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために表面プラズモン共鳴と組み合わせて使用される。
【０１５７】
一実施形態では、センサーは、改質表面を有するチップを含み、前記チップは、層または単層で改質されたガラス基材であり、前記層または単層は、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択される材料から作製され、前記チップは、甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために表面プラズモン共鳴と組み合わせて使用される。
【０１５８】
一実施形態では、センサーは、改質表面を有するチップを含み、前記チップは、金ナノ粒子で改質されたガラス基材であり、前記チップは、甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために表面プラズモン共鳴と組み合わせて使用される。
【０１５９】
一実施形態では、センサーは、改質表面を有するチップを含み、前記チップは、金の層または単相で改質されたガラス基材であり、前記チップは、甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために表面プラズモン共鳴と組み合わせて使用される。
【０１６０】
一実施形態では、センサーは、改質表面を有する電極を含み、前記電極は、金から作製された層または単相表面を含み、前記電極は、甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために電気化学的変換と組み合わせて使用される。
【０１６１】
別の実施形態では、電極は、銀から作製された層または単相表面を含み、前記電極は、本開示による甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために電気化学的変換と組み合わせて使用される。
【０１６２】
別の実施形態では、電極は、酸化銅から作製された層または単相表面を含み、前記電極は、本開示による甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために電気化学的変換と組み合わせて使用される。
【０１６３】
別の実施形態では、電極は、グラフェンから作製された層または単相表面を含み、前記電極は、本開示による甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために電気化学的変換と組み合わせて使用される。
【０１６４】
別の実施形態では、電極は、酸化鉄から作製された層または単相表面を含み、前記電極は、本開示による甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために電気化学的変換と組み合わせて使用される。
【０１６５】
別の実施形態では、電極は、金および銀などの金属の組み合わせから作製された層または単相表面を含み、前記電極は、本開示による甲状腺ホルモンの検出および／または定量のために電気化学的変換と組み合わせて使用される。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、本開示によるヨードサイロニンデヨージナーゼは、基材上に固定される。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、本開示によるヨードサイロニンデヨージナーゼは、ナノ粒子を含むリンカーを介してセンサーの表面上に固定される。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、本開示によるヨードサイロニンデヨージナーゼは、ニッケルヒスチジン（Ｎｉ−Ｈｉｓ）共有配位結合を含むリンカーを介してセンサーの表面上に固定される。これは、ヨードサイロニンデヨージナーゼがヒスチジンタグを含む場合に特に好適し得る。
【０１６９】
本開示によるいくつかの実施形態では、ナノ粒子は、１ｎｍ〜５０ｎｍのサイズ、好ましくは５ｎｍ〜４５ｎｍのサイズ、好ましくは１０ｎｍ〜４０ｎｍのサイズ、好ましくは１０ｎｍ〜３５ｎｍのサイズ、好ましくは１０ｎｍ〜３０ｎｍのサイズを有する。ナノ粒子のサイズは、ＴＥＭ顕微鏡で測定し得る。このサイズ範囲のナノ粒子の、基材表面とヨードサイロニンデヨージナーゼとの間のリンカーとしての使用は、基材表面にヨードサイロニンデヨージナーゼの固定に好ましい湾曲を与え得る。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本開示によるヨードサイロニンデヨージナーゼは、イオン相互作用を介して基材上に固定される。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本開示によるヨードサイロニンデヨージナーゼは、非共有結合相互作用を介して、基材上に固定される。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、本開示によるヨードサイロニンデヨージナーゼは、基材上に共有結合固定される。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、１個または複数のナノ粒子を含むリンカーを介して、基材上に固定される。基材とヨードサイロニンデヨージナーゼとの間の少なくとも１個のナノ粒子の存在は、タンパク質のアンフォールドを防止する。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、
電極に結合したシステアミン、および
システアミンおよびヨードサイロニンデヨージナーゼに、任意選択で、１個または複数の追加のシステアミンを介して、結合したナノ粒子、を含むリンカーを介して基材上に固定される。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および／または抗ｒＴ３抗体は、
電極に結合したシステアミン、および
システアミンおよびヨードサイロニンデヨージナーゼに、任意選択で、１個または複数の追加のシステアミンを介して、結合したナノ粒子、を含むリンカーを介して基材上に固定される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、本開示のセンサーは、センサーの表面上に固定された、特に電極の表面上に（例えば、第３の電極の第３の表面上に）またはチップの表面上に（例えば、第３のチップの第３の表面上に）固定された、抗ｒＴ３抗体をさらに含む。
【０１７７】
電極の表面上、またはチップの表面上の抗体の固定化に有用な各種技術は、当業者に既知である。
【０１７８】
本開示のいくつかの実施形態では、抗ｒＴ３抗体は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）化学を介して、基材の表面上に固定される。
【０１７９】
本開示のいくつかの実施形態では、抗ｒＴ３抗体は、アジド修飾抗体であり得、これは、アルキンまたは重鎖結合グリカンに対するクリックケミストリーを介して基材の表面上に固定され得る。
【０１８０】
本開示のいくつかの実施形態では、抗ｒＴ３抗体は、基材の表面上に直接固定され、基材の表面は、正に帯電しているアミン改質表面である。
【０１８１】
本開示のいくつかの実施形態では、抗ｒＴ３抗体がビオチン化されている場合には、抗ｒＴ３抗体は、ビオチン−アビジン結合を介して基材の表面上に固定される。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、Ｃ末端またはＮ末端経由でリンカーに結合される。いくつかの実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、Ｎ末端経由でシステアミンによるアミド結合によりリンカーに結合される。
【０１８３】
例えば、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、次記のいずれかの手順を採用することにより基材の表面上に固定され得る：
・炭素電極：電極を、Ｈ２ＳＯ４／ＨＮＯ３（水溶液）を用いて酸化し、ヒドロキシル基を導入；洗浄；暗所でシステアミン塩酸塩（水溶液）との反応を介して遊離チオール基を導入；洗浄；チオール／金結合を用いてクエン酸キャップナノ粒子の共有結合固定化；洗浄；システアミンジ塩酸塩（水溶液）を用いてアミン基の導入；洗浄；カルボキシレート残基を介してアミド結合形成経由ヨードサイロニンデヨージナーゼまたはそのフラグメントの固定化；ウシ血清アルブミンでブロッキング。Ｓｈａｒｍａ  Ｓ，Ｚａｐａｔｅｒｏ−Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｊ，Ｓａｘｅｎａ  Ｒ，Ｏ’Ｋｅｎｎｅｄｙ  Ｒ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｓ  ２０１８．Ｕｌｔｒａｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｄｉｒｅｃｔ  ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｅｒｕｍ  ＨＥＲ２．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １０６：７８−８５も参照されたい。
・金電極：Ａｕ／ＳＨ結合を利用するシステアミン塩酸塩（水溶液）との反応によりアミノ基の導入；洗浄；アミド結合の形成によるクエン酸キャップナノ粒子の共有結合；洗浄；ヨードサイロニンデヨージナーゼまたはそのフラグメントの、それらの一級アミンと遊離カルボキシレートとの間の共有結合によるナノ粒子での固定化。Ｒａｇｈａｖ  Ｒ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｓ，２０１６．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ：Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ＡｕＮＰｓ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｏｆ  ＥＤＣ−ＮＨＳ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｉｔｒａｔｅ−ＡｕＮＰｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １５；７８：３９６−４０３も参照されたい。
・金電極：Ａｕ／ＳＨ結合を利用するシステアミン塩酸塩（水溶液）との反応によりアミノ基の導入；洗浄；アミド結合の形成によるクエン酸キャップナノ粒子の共有結合；洗浄；ＥＤＣ架橋剤（１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩）およびスルホ−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド）の水溶液の添加；ヨードサイロニンデヨージナーゼまたはそのフラグメントの、それらの一級アミンとＮＨＳエステル中間体との間の共有結合による固定化。Ｒａｇｈａｖ  Ｒ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｓ，２０１６．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ：Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ＡｕＮＰｓ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｏｆ  ＥＤＣ−ＮＨＳ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｉｔｒａｔｅ−ＡｕＮＰｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １５；７８：３９６−４０３も参照されたい。
・金電極：Ａｕ／ＳＨ結合を利用するシステアミン塩酸塩（水溶液）との反応によりアミノ基の導入；洗浄；アミド結合の形成によるアミノおよびクエン酸キャップナノ粒子の共有結合；洗浄；アミド結合形成による共有結合によるヨードサイロニンデヨージナーゼまたはそのフラグメントの固定化。Ｒａｇｈａｖ  Ｒ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｓ，２０１６．Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒｓ：Ｌ−Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ−ＡｕＮＰｓ  ａｓ  ａ  ｐｒｏｍｉｓｉｎｇ  ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ  ｏｆ  ＥＤＣ−ＮＨＳ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｃｉｔｒａｔｅ−ＡｕＮＰｓ  ｆｏｒ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ  ＆  Ｂｉｏｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ  １５；７８：３９６−４０３も参照されたい。
・金電極：Ａｕ／ＳＨ結合を利用するシステアミン塩酸塩（水溶液）との反応によりアミノ基の導入；洗浄；アミド結合の形成によるクエン酸キャップナノ粒子の共有結合；洗浄；アミド結合形成による共有結合によるタンパク質または抗体の固定化。Ｒａｇｈａｖ  Ｒ，Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  Ｓ，２０１５．Ｃｏｒｅ−ｓｈｅｌｌ  ｇｏｌｄ−ｓｉｌｖｅｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｉｍｐｅｄｉｍｅｔｒｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｓｅｎｓｏｒ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｔｉｇｅｎ  ＣＡ１２５．Ｓｅｎｓｏｒｓ  ａｎｄ  Ａｃｔｕａｔｏｒｓ  Ｂ：Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ２２０：５５７−５６４も参照されたい。
【０１８４】
上記手順は、炭素および金電極を対象としているが、他のタイプの電極も類似の手順で使用し得る。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは、電極が卓上型手持ち式の電気化学ワークステーション、表面プラズモン共鳴検出器または測定回路に接続できるように構成される。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは基材を含み、該基材は、少なくとも３個の電極を含み、前記電極は、電気化学ワークステーションに接続できるように構成される。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本開示によるセンサーは基材を含み、該基材は、少なくとも３個のチップを含み、前記チップは、表面プラズモン共鳴検出器に接続できるように構成される。
【０１８８】
一実施形態では、センサーは、甲状腺ホルモンの検出および／または定量用として構成される。
【０１８９】
方法
本開示は、甲状腺ホルモンの検出および／または定量のためのセンサーに関し、該センサーは、ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含み、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、センサー上に固定され、前記センサーの使用は、甲状腺関連障害の診断および／または監視のためである。
【０１９０】
本開示は、甲状腺ホルモンの検出および／または定量のためのセンサーに関し、該センサーは、基材、ＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ、ＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．４から選択される第２のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび任意選択で、抗ｒＴ３抗体を含み、ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび抗ｒＴ３抗体は、基材の表面上に固定され、前記センサーの使用は、甲状腺関連障害の診断および／または監視のためである。
【０１９１】
対象の甲状腺関連障害の診断方法を提供することは、本開示の一態様であり、該方法は、次のステップを含む：
ａ）対象から得られる試料を用意するステップ、
ｂ）本明細書で開示のものを前記試料と接触させるステップ、
ｃ）試料中の１種または複数の甲状腺ホルモンを検出するステップ、
ｄ）試料中の前記甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、１種または複数の甲状腺関連障害を診断するステップ。
【０１９２】
対象の甲状腺関連障害の監視方法を提供することは、本開示のさらなる態様であり、該方法は、次記のステップを含む：
ａ）甲状腺刺激化合物を対象に投与するステップ、
ｂ）ステップａ）の実施後に対象から試料を収集するステップ、
ｃ）前記試料と本開示によるセンサーとを接触させるステップ、
ｄ）シグナルを測定するステップ、
ｅ）シグナルを用いて、試料中の甲状腺ホルモンの濃度を決定し、それにより、甲状腺関連障害を監視するステップ。
本開示による方法の特定の実施形態では、ステップｂ）〜ｅ）は、２回以上実施される。
【０１９３】
試料中の甲状腺ホルモンの検出方法を提供することも、本開示の一態様であり、該方法は、次記のステップを含む：
ａ）甲状腺ホルモンを含むまたは含むと疑われる試料を用意するステップ、
ｂ）本明細書で開示のセンサーを前記試料と接触させるステップ、
ｃ）センサーからのシグナルを測定し、それにより、甲状腺ホルモンを検出するステップ。
【０１９４】
試料中の甲状腺ホルモンの定量方法を提供することも、本開示の一態様であり、該方法は、次記のステップを含む：
ａ．甲状腺ホルモンを含むまたは含むと疑われる試料を用意するステップ、
ｂ．本明細書で開示のセンサーを前記試料と接触させるステップ、
ｃ．センサーからのシグナルを測定するステップ、および
ｄ．シグナルを用いて、試料中の１種または複数の甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、甲状腺ホルモンを検出するステップ。
【０１９５】
特定の実施形態では、本開示による試料中の甲状腺ホルモンの検出方法は、ステップｄ）シグナルを用いて、試料中の１種または複数の甲状腺ホルモンの濃度を決定するステップ、をさらに含む。
【０１９６】
特定の実施形態では、本開示による方法は、試料中の甲状腺ホルモンの濃度を用いて甲状腺ホルモンのインビボ濃度を計算するステップをさらに含む。
【０１９７】
本開示による方法のいくつかの実施形態では、試料中の甲状腺ホルモンの濃度は、前記甲状腺ホルモンとヨードサイロニンデヨージナーゼとの間の反応動力学から決定される。
【０１９８】
特定の実施形態では、甲状腺ホルモンの濃度は、対象が、甲状腺刺激化合物を含む薬物を受けた後で決定される。
【０１９９】
特定の実施形態では、対象が薬物を受けた後の時間は、５分〜４５時間などの、５分〜４０時間などの、５分〜３６時間などの、５分〜３２時間などの、５分〜３０時間などの、５分〜２８時間などの、５分〜２４時間などの、５分〜２０時間などの、５分〜１８時間などの、５分〜１６時間などの、５分〜１４時間などの、５分〜１２時間などの、５分〜１１時間などの、５分〜１０時間などの、５分〜９時間などの、５分〜８時間などの、５分〜７時間などの、５分〜６時間などの、５分〜５時間などの、５分〜４時間などの、５分〜３時間などの、５分〜２時間などの、５分〜１時間などの、５分〜４５分などの、５分〜３０分などの、５分〜４８時間である。
【０２００】
特定の実施形態では、対象が薬物を受けた後の時間は、１５分〜４８時間などの、３０分〜４８時間などの、４５分〜４８時間などの、６０分〜４８時間などの、１〜４８時間などの、２〜４８時間などの、３〜４８時間などの、４〜４８時間などの、５〜４８時間などの、６〜４８時間などの、６〜４８時間などの、７〜４８時間などの、８〜４８時間などの、９〜４８時間などの、１０〜４８時間などの、１１〜４８時間などの、１２〜４８時間などの、１４〜４８時間などの、１６〜４８時間などの、１８〜４８時間などの、２０〜４８時間などの、２４〜４８時間などの、２８〜４８時間などの、３２〜４８時間などの、３６〜４８時間などの、４０〜４８時間などの、４４〜４８時間などの、５分〜４８時間である。
【０２０１】
本開示によるに方法の一実施形態では、対象は、甲状腺ホルモンの濃度の測定前に、甲状腺刺激化合物を含む薬物を受けなかった。
【０２０２】
特定の実施形態では、本開示による方法は、試料中の前記甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度をカットオフ間隔と比較し、甲状腺関連障害の対象を診断するステップをさらに含み、前記カットオフ間隔は、甲状腺関連障害を罹患していないヒト個体などの健康なヒト個体の甲状腺ホルモンの濃度範囲から決定され、カットオフ間隔の外側のレベルおよび／または濃度は、前記甲状腺関連障害の存在を示す。
【０２０３】
本開示による方法のいくつかの実施形態では、遊離Ｔ３のカットオフ間隔は２．８〜４．４ｐｇ／ｍＬ、遊離Ｔ４のカットオフ間隔は０．８〜２．０ｎｇ／ｍＬ、およびｒＴ３のカットオフ間隔は１０〜２４ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、カットオフ間隔未満の濃度は低いと見なされ、カットオフ間隔内の濃度は正常と見なされ、およびカットオフ間隔を超える濃度は高いと見なされる。
【０２０４】
本開示による方法のいくつかの実施形態では、遊離Ｔ３のカットオフ間隔は２．４〜４．２ｐｇ／ｍＬ、遊離Ｔ４のカットオフ間隔は０．８〜１．８ｎｇ／ｍＬ、およびｒＴ３のカットオフ間隔は１０〜２４ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、カットオフ間隔未満の濃度は低いと見なされ、カットオフ間隔内の濃度は正常と見なされ、およびカットオフ間隔を超える濃度は高いと見なされる。
【０２０５】
本開示による方法のいくつかの実施形態では、遊離Ｔ３のカットオフ間隔は２．８〜４．０ｐｇ／ｍＬ、遊離Ｔ４のカットオフ間隔は０．８〜２．２ｎｇ／ｍＬ、およびｒＴ３のカットオフ間隔は１０〜２４ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、カットオフ間隔未満の濃度は低いと見なされ、カットオフ間隔内の濃度は正常と見なされ、およびカットオフ間隔を超える濃度は高いと見なされる。
【０２０６】
一実施形態では、本開示による方法は、前記甲状腺関連障害を治療するステップをさらに含む。特定の実施形態では、治療は、治療有効量での薬物の投与を含む。さらなる実施形態では、前記薬物は、甲状腺刺激化合物である。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、甲状腺刺激化合物は、Ｔ３、Ｔ４、ＴＳＨ、甲状腺自己抗体（ＴＲＡｂ、ＴＰＯＡｂおよびＴｇＡｂ）およびチログロブリンからなる群から選択される。
【０２０８】
対象
本開示による方法を提供することは、本開示の一態様であり、対象はヒト対象である。特定の実施形態では、ヒト対象は、子どもまたは成人である。
【０２０９】
本開示による方法のさらなる実施形態では、対象は、ウマ、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ネコまたはイヌである。
【０２１０】
試料
本開示による方法の特定の実施形態では、試料は、血液試料、血清試料または血漿試料であり、任意選択で、試料は分析の前に処理されている。
【０２１１】
特定の実施形態では、分析の前の処理は、濾過、ｒＴ３の除去、および／またはｐＨの調節を含む。血液試料などの試料の濾過は、血液細胞を除去する手段を提供し得ることは当業者には理解されよう。ｐＨの調節は、試料への好適な酸または塩基の所望ｐＨが得られるまでの添加により実施し得る。ｐＨの調節に好適な酸および塩基は、当業者に既知である。
【０２１２】
検出技術
本開示による方法のいくつかの実施形態では、前記甲状腺ホルモンは、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いて検出される。特定の実施形態では、表面プラズモン共鳴法の測定値を用いて１種または複数の甲状腺ホルモンの濃度が決定される。
【０２１３】
表面プラズモン共鳴法は、入射光により刺激された負および正誘電率材料間の界面での伝導電子の共振振動である。ＳＰＲは、平板金属（金または銀などの）表面上へのまたは金属ナノ粒子上への物質の吸収を測定する多くの標準的ツールの共通基盤である。これは、多くの色ベースのバイオセンサー適用、種々のセンサーおよび珪藻光合成の背後にある基本的原理である。ＳＰＲを用いて、生体分子結合相互作用を検出し得る。ＳＰＲでは、タンパク質などの分子パートナーの片方は、金属フィルム上に固定される。光が金属中で表面プラズモンを励起し、結合パートナーが固定化分子に結合する場合、これは、表面プラズモンシグナルの検出可能な変化を生じさせる。
【０２１４】
本開示による方法のいくつかの実施形態では、ヨードサイロニンデヨージナーゼは、基材上の金属表面またはナノ粒子層上に固定される。いくつかの実施形態では、前記基材はガラスチップである。
【０２１５】
本開示による方法のいくつかの実施形態では、甲状腺ホルモンは、電気化学的変換により検出または監視される。
【０２１６】
電気化学的変換を利用するバイオセンサーとも呼ばれる電気化学的バイオセンサーは、生物学的イベントの電子シグナルへの直接変換により生体試料の含量を分析する魅力的手段を提供する。電気化学的バイオセンシングで最もよくある技術は、ナノワイヤーまたは磁気ナノ粒子ベースバイオセンシングに加えて、サイクリックボルタメトリー、クロノアンペロメトリー、クロノポテンシオメトリー、インピーダンス分光法、および電界効果トランジスタベース方法を含む。電気化学検出と組み合わせて有用な追加の測定方法は、電気化学的バージョンの表面プラズモン共鳴法、光導波路光モード分光法、偏光解析法、水晶振動子マイクロバランス、および走査型プローブ顕微鏡をさらに含み得る。
【０２１７】
電気化学的変換および電気化学センサーの一般的能力は、多くの場合、ナノメートルスケールで電極を生体試料に接続する表面構造により決定される。電極表面改質、種々の電気化学的変換機序、および電極に結合する生物学的素子の選択は全て、最終的なセンサー感度に影響を与える。
【０２１８】
甲状腺関連障害
いくつかの実施形態では、甲状腺関連障害は、リスト：甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、臨床的うつ病、甲状腺腫、グレーブス・バセドウ病、橋本甲状腺炎、甲状腺機能正常性症および極性Ｔ３症候群から選択される。
【０２１９】
特定の実施形態では、甲状腺機能亢進症は、高遊離Ｔ４、高遊離Ｔ３および低ＴＳＨを特徴とする。一実施形態では、甲状腺機能正常性症は、低遊離Ｔ３および高ｒＴ３を特徴とする。さらなる実施形態では、甲状腺機能低下症は一次性または二次性である。一実施形態では、一次性甲状腺機能低下症は、低遊離Ｔ４、正常または低遊離Ｔ３および高ＴＳＨを特徴とする。一実施形態では、二次性甲状腺機能低下症は、低遊離Ｔ４、正常または低遊離Ｔ３および正常または低ＴＳＨを特徴とする。
【０２２０】
家庭用装置
甲状腺ホルモンの検出、定量および／または監視のための手持ち型装置を提供することは、本開示のさらなる態様であり、該甲状腺ホルモンは、ｆＴ３、ｆＴ４およびｒＴ３からなる群より選択され、該装置は、次記を含む：
ａ．試料の入口；
ｂ．センサーであって、
ｉ．基材、
ｉｉ．ＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および
ｉｉｉ．ＥＣ１．２１．９９．４から選択される第２のヨードサイロニンデヨージナーゼ、を含むセンサー、
ｃ．センサーからシグナルを受け、それを使用者により読み取り可能なフォーマットに変換するように構成された検出器；
ｄ．任意選択で、試料から細胞成分を分離する手段。
【０２２１】
甲状腺ホルモンの検出、定量および／または監視のための手持ち型装置を提供することは、本開示のさらなる態様であり、該甲状腺ホルモンは、ｆＴ３、ｆＴ４およびｒＴ３からなる群より選択され、該装置は、次記を含む：
ｅ．試料の入口；
ｆ．センサーであって、
ｉ．基材、
ｉｉ．ＥＣ１．２１．９９．３およびＥＣ１．２１．９９．４から選択される第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ、
ｉｉｉ．ＥＣ１．２１．９９．４から選択される第２のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および
ｉｖ．抗ｒＴ３抗体、を含むセンサー、
ｇ．センサーからシグナルを受け、それを使用者により読み取り可能なフォーマットに変換するように構成された検出器；
ｈ．任意選択で、試料から細胞成分を分離する手段。
【０２２２】
甲状腺ホルモンの検出、定量および／または監視のための手持ち型装置を提供することは、本開示のさらなる態様であり、該甲状腺ホルモンは、ｆＴ３、ｆＴ４およびｒＴ３からなる群より選択され、該装置は、次記を含む：
ａ）試料の入口；
ｂ）ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含むセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼがセンサー上に固定され、入口が試料とセンサーとを接触させて配置するように構成された、センサー、
ｃ）センサーからシグナルを受け、それを使用者により読み取り可能なフォーマットに変換するように構成された検出器；
ｄ）任意選択で、試料から細胞成分を分離する手段。
【０２２３】
特定の実施形態では、本開示による手持ち型装置は、本開示の実施形態のいずれか１つで定義されたセンサーを含む。
【０２２４】
項目
１．甲状腺ホルモンの定量のためのセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含み、ヨードサイロニンデヨージナーゼがセンサー上に固定される、センサー。
２．甲状腺ホルモンの検出のためのセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含み、ヨードサイロニンデヨージナーゼがセンサー上に固定される、センサー。
３．項目１または２に記載のセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼが哺乳動物由来である、センサー。
４．項目１〜３のいずれか１項に記載のセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼがヒト由来である、センサー。
５．項目１〜４のいずれか１項に記載のセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼが追加の部分に結合されている、センサー。
６．項目１〜５のいずれか１項に記載のセンサーであって、追加の部分がペプチドである、センサー。
７．項目１〜６のいずれか１項に記載のセンサーであって、追加の部分が標識である、センサー。
８．項目１〜７のいずれか１項に記載のセンサーであって、１０〜１００ＩＵのヨードサイロニンデヨージナーゼを含む、センサー。
９．項目１〜８のいずれか１項に記載のセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼが２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３］である、センサー。
１０．項目１〜９のいずれか１項に記載のセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼが３型ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．４］である、センサー。
１１．項目１〜１０のいずれか１項に記載のセンサーであって、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび３型ヨードサイロニンデヨージナーゼの両方を含む、センサー。
１２．項目１〜１１のいずれか１項に記載のセンサーであって、１型ヨードサイロニンデヨージナーゼが、配列番号１に対し、少なくとも９５％配列同一性、例えば、少なくとも９６％配列同一性、例えば、少なくとも９７％配列同一性、例えば、少なくとも９８％配列同一性、例えば、少なくとも９９％配列同一性、例えば、約１００％配列同一性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを含むまたはそれからなる、センサー。
１３．項目１〜１２のいずれか１項に記載のセンサーであって、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼが、配列番号２に対し、少なくとも９５％配列同一性、例えば、少なくとも９６％配列同一性、例えば、少なくとも９７％配列同一性、例えば、少なくとも９８％配列同一性、例えば、少なくとも９９％配列同一性、例えば、約１００％配列同一性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを含むまたはそれからなる、センサー。
１４．項目１〜１３のいずれか１項に記載のセンサーであって、３型ヨードサイロニンデヨージナーゼが、配列番号３に対し、少なくとも９５％配列同一性、例えば、少なくとも９６％配列同一性、例えば、少なくとも９７％配列同一性、例えば、少なくとも９８％配列同一性、例えば、少なくとも９９％配列同一性、例えば、約１００％配列同一性を有するポリペプチドまたはそのフラグメントを含むまたはそれからなる、センサー。
１５．項目１〜１４のいずれか１項に記載のセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼが、無細胞発現によるなどの組換えにより作製される、センサー。
１６．項目１〜１５のいずれか１項に記載のセンサーであって、甲状腺ホルモンが遊離Ｔ４、遊離Ｔ３および逆位Ｔ３（ｒＴ３）から選択される、センサー。
１７．項目１〜１６のいずれか１項に記載のセンサーであって、基材を含み、基材が電極またはチップである、センサー。
１８．項目１〜１７のいずれか１項に記載のセンサーであって、チップがガラスチップである、センサー。
１９．項目１〜１８のいずれか１項に記載のセンサーであって、基材が改質表面を有する、センサー。
２０．項目１〜１９のいずれか１項に記載のセンサーであって、電極が炭素、金または白金から作製される、センサー。
２１．項目１〜２０のいずれか１項に記載のセンサーであって、電極がスクリーン印刷電極である、センサー。
２２．項目１〜２１のいずれか１項に記載のセンサーであって、少なくとも基材の表面が金の層でコートされている、センサー。
２３．項目１〜２２のいずれか１項に記載のセンサーであって、基材の少なくとも１つの表面が、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるナノ粒子で改質されている、センサー。
２４．項目１〜２３のいずれか１項に記載のセンサーであって、基材の少なくとも表面が金の層でコートされ、前記表面が、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるナノ粒子でさらに改質されている、センサー。
２５．項目１〜２４のいずれか１項に記載のセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼが基材上に固定されている、センサー。
２６．項目１〜２５のいずれか１項に記載のセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼが、ナノ粒子を含むリンカーを介して基材上に固定されている、センサー。
２７．項目１〜２６のいずれか１項に記載のセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼが、次記を含むリンカーを介して基材上に固定されている、センサー：
ａ．基材に結合したシステアミン、および
ｂ．システアミンおよびヨードサイロニンデヨージナーゼに、任意選択で、１個または複数の追加のシステアミンを介して、結合したナノ粒子。
２８．項目１〜２７のいずれか１項に記載のセンサーであって、基材が卓上型手持ち式の電気化学ワークステーション、表面プラズモン共鳴検出器または測定回路に接続できるように構成されている、センサー。
２９．項目１〜２８のいずれか１項に記載のセンサーであって、基材が電極であり、前記電極が電気化学ワークステーションに接続できるように構成されている、センサー。
３０．項目１〜２９のいずれか１項に記載のセンサーであって、基材がチップであり、前記チップが表面プラズモン共鳴検出器に接続できるように構成されている、センサー。
３１．項目１〜３０のいずれか１項に記載のセンサーであって、甲状腺ホルモンの検出および／または定量用として構成される、センサー。
３２．次のステップを含む対象の甲状腺関連障害の診断方法：
ａ．対象から得られる試料を用意するステップ、
ｂ．項目１〜３１のいずれか１項に記載のセンサーを前記試料と接触させるステップ、
ｃ．試料中の１種または複数の甲状腺ホルモンを検出するステップ、
ｄ．試料中の前記甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、１種または複数の甲状腺関連障害を診断するステップ。
３３．次のステップを含む対象の甲状腺関連障害の監視方法：
ａ．甲状腺刺激化合物を対象に投与するステップ、
ｂ．ステップａ．の実施後に対象から試料を収集するステップ、
ｃ．項目１〜３２のいずれか１項に記載のセンサーを前記試料と接触させるステップ、
ｄ．シグナルを測定するステップ、
ｅ．シグナルを用いて、試料中の甲状腺ホルモンの濃度を決定し、それにより、甲状腺関連障害を監視するステップ。
３４．項目３２に記載の方法であって、ステップｂ．〜ｅ．が２回以上実施される方法。
３５．次のステップを含む、試料中の甲状腺ホルモンの検出方法：
ａ．甲状腺ホルモンを含むまたは含むと疑われる試料を用意するステップ、
ｂ．項目１〜３４のいずれか１項に記載のセンサーを前記試料と接触させるステップ、
ｃ．センサーからのシグナルを測定し、それにより、甲状腺ホルモンを検出するステップ。
３６．項目３４に記載の方法であって、ステップｄ．シグナルを用いて、試料中の１種または複数の甲状腺ホルモンの濃度を決定するステップ、をさらに含む、方法。
３７．項目３５に記載の方法であって、試料中の甲状腺ホルモンの濃度を用いて甲状腺ホルモンのインビボ濃度を計算するステップをさらに含む、方法。
３８．項目３１〜３６のいずれか１項に記載の方法であって、試料中の甲状腺ホルモンの濃度が、前記甲状腺ホルモンとヨードサイロニンデヨージナーゼとの間の反応動力学から決定される、方法。
３９．項目３１〜３７のいずれか１項に記載の方法であって、甲状腺ホルモンの濃度が、対象が甲状腺刺激化合物を含む薬物を受けた後で決定される、方法。
４０．項目３１〜３８のいずれか１項に記載の方法であって、対象が薬物を受けた後の時間が５分〜４８時間である、方法。
４１．項目３１〜３９のいずれか１項に記載の方法であって、試料中の前記甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度をカットオフ間隔と比較し、甲状腺関連障害の対象を診断するステップをさらに含み、前記カットオフ間隔は、甲状腺関連障害を罹患していないヒト個体などの健康なヒト個体の甲状腺ホルモンの濃度範囲から決定され、カットオフ間隔の外側のレベルおよび／または濃度は、前記甲状腺関連障害の存在を示す。
４２．項目３１〜４０のいずれか１項に記載の方法であって、遊離Ｔ３のカットオフ間隔が２．８〜４．４ｐｇ／ｍＬである、方法。
４３．項目３１〜４０のいずれか１項に記載の方法であって、遊離Ｔ４のカットオフ間隔が０．８〜２．０ｎｇ／ｍＬである、方法。
４４．項目３１〜４０のいずれか１項に記載の方法であって、ｒＴ３のカットオフ間隔が１０〜２４ｎｇ／ｍＬである、方法。
４５．項目３１〜４３のいずれか１項に記載の方法であって、カットオフ間隔未満の濃度は低いと見なされ、カットオフ間隔内の濃度は正常と見なされ、およびカットオフ間隔を超える濃度は高いと見なされる、方法。
４６．項目３１〜４４のいずれか１項に記載の方法であって、前記甲状腺関連障害を治療するステップをさらに含む、方法。
４７．項目４５に記載方法であって、治療が、治療有効量での薬物の投与を含む、方法。
４８．項目４６に記載の方法であって、薬物が甲状腺刺激化合物である、方法。
４９．項目３１〜４７のいずれか１項に記載の方法であって、甲状腺刺激化合物が、Ｔ３、Ｔ４、ＴＳＨ、甲状腺自己抗体（ＴＲＡｂ、ＴＰＯＡｂおよびＴｇＡｂ）およびチログロブリンからなる群から選択される、方法。
５０．項目３１〜４８のいずれか１項に記載の方法であって、対象がヒト対象である、方法。
５１．項目３１〜４９のいずれか１項に記載の方法であって、ヒト対象が子どもまたは成人である、方法。
５２．項目３１〜５０のいずれか１項に記載の方法であって、対象が、ウマ、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ネコまたはイヌである、方法。
５３．項目３１〜５１のいずれか１項に記載の方法であって、試料が、血液試料、血清試料または血漿試料であり、任意選択で、試料は分析の前に処理されている、方法。
５４．項目３１〜５２のいずれか１項に記載の方法であって、分析の前の処理が、濾過、ｒＴ３の除去、および／またはｐＨの調節を含む、方法。
５５．項目３１〜５３のいずれか１項に記載の方法であって、甲状腺ホルモンが表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いて検出される、方法。
５６．項目３１〜５４のいずれか１項に記載の方法であって、ＳＰＲ測定値を用いて１種または複数の甲状腺ホルモンの濃度が決定される、方法。
５７．項目３１〜５５のいずれか１項に記載の方法であって、ヨードサイロニンデヨージナーゼが、チップ上または電極上に固定される、方法。
５８．項目３１〜５６のいずれか１項に記載の方法であって、甲状腺ホルモンが、電気化学的変換により検出または監視される、方法。
５９．項目３１〜５７のいずれか１項に記載の方法であって、甲状腺関連障害が、リスト：甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、臨床的うつ病、甲状腺腫、グレーブス・バセドウ病、橋本甲状腺炎、甲状腺機能正常性症および極性Ｔ３症候群から選択される、方法。
６０．項目５８に記載の方法であって、甲状腺機能亢進症が、高遊離Ｔ４、高遊離Ｔ３および低ＴＳＨを特徴とする、方法。
６１．項目５８に記載の方法であって、甲状腺機能正常性症が、低遊離Ｔ３および高ｒＴ３を特徴とする、方法。
６２．項目５８に記載の方法であって、甲状腺機能低下症が一次性または二次性である、方法。
６３．項目６１に記載の方法であって、一次性甲状腺機能低下症が、低遊離Ｔ４、正常または低遊離Ｔ３および高ＴＳＨを特徴とする、方法。
６４．項目６１に記載の方法であって、二次性甲状腺機能低下症が、低遊離Ｔ４、正常または低遊離Ｔ３および正常または低ＴＳＨを特徴とする、方法。
６５．ヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーの製造方法であって、次記を含む方法：
ａ．基材を用意するステップ、
ｂ．少なくとも１種のヨードサイロニンデヨージナーゼを用意するステップ、
ｃ．基材上にヨードサイロニンデヨージナーゼを固定し、それにより、ヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーを製造するステップ。
６６．項目６４に記載の方法であって、基材が、項目１〜６５のいずれか１項で定義の通りである、方法。
６７．項目６４または６５に記載の方法であって、ヨードサイロニンデヨージナーゼが、項目１〜６６のいずれか１項で定義の通りである、方法。
６８．甲状腺ホルモンの検出、定量および／または監視のための手持ち型装置であって、次記を含む装置：
ａ．試料の入口；
ｂ．ヨードサイロニンデヨージナーゼ［ＥＣ１．２１．９９．３および／またはＥＣ１．２１．９９．４］またはそのフラグメントを含むセンサーであって、ヨードサイロニンデヨージナーゼがセンサー上に固定され、入口が試料とセンサーとを接触させて配置するように構成された、センサー、
ｃ．センサーからシグナルを受け、それを使用者により読み取り可能なフォーマットに変換するように構成された検出器；
ｄ．任意選択で、試料から細胞成分を分離する手段。
６９．項目６７に記載の手持ち型装置であって、センサーが、項目１〜６８のいずれか１項で定義の通りである、装置。
７０．項目６７および６８のいずれか１項に記載の手持ち型装置であって、ヨードサイロニンデヨージナーゼが、項目１〜６９のいずれか１項で定義の通りである、装置。
【０２２５】
実施例
実施例１．ＩＤＩＩ電流測定バイオセンサーを用いたＴ４の推定
ＩＤＩＩをラット脳を粗マイクロソーム画分として抽出し、電流測定バイオセンサーの作製に用いた。
ＣＨ６０４Ｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ／Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＣＨ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて電気化学バイオセンサーを作製した。１０μＬの（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（５ｍＭ、ＡＰＴＥＳ）で炭素電極をアミノ機能化し、暗所で２時間インキュベートした。電極を再蒸留水ですすいで非結合３−ＡＰＴＥＳを除去し、続けて、０．５μｇのクエン酸キャップＡｕＮＰを加えた。２ｍｇ／ｍＬのシステアミン塩酸塩２０μｇを用いてＮＰ表面をアミノキャップし、２時間のインキュベーションおよび洗浄に続けて、１０μＬの架橋剤（グルタルアルデヒドの１０％（ｖ／ｖ）水溶液）を加えた後、空気乾燥した。最終的に、ラット脳粗抽出物（マイクロソーム画分）を電極上に加え、周囲温度で２時間乾燥させた。図３は、電流応答に与えるＴ４濃度の影響を示す。
結果：Ｔ４の漸増濃度に伴う電流の直線状変化が観察された。
【０２２６】
実施例２．ＩＤＩＩボルタメトリーバイオセンサーを用いたＴ４の推定
Ｔ４の定量化のためのサイクリックボルタメトリー測定を図４に示した。
結果：Ｔ４濃度が増大するに伴い、酸化のピーク電流は減少する。
【０２２７】
実施例３．遊離対結合Ｔ４
さらに、Ｔ４の検出に対するチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）の干渉を調査した。図５は、ＴＢＧ濃度の増大に伴い、電流応答が低下することを示す。
結果：このデータは、酵素がｆＴ４のみの脱ヨウ素を触媒し、結合型（ｔＴ４）を触媒しないことを示す。従って、この戦略は、ｆＴ４の直接推定を可能にする。
【０２２８】
実施例４．血清タンパク質の干渉
ウシ胎仔血清の存在下でサイクリックボルタメトリー測定を実施し、定量化における血清タンパク質の干渉を調査した。図６は、Ｔ４濃度の増大に伴うウシ胎仔血清のこれらの測定値を示す。
結果：このデータは、酸化ピーク電流がこの場合でも一貫した傾向に従い、それにより、測定値に対する血清タンパク質の影響を克服することを示す。
【０２２９】
実施例５．ＩＤＩＩ−ＩＤＩＩＩ−抗ｒＴ３ボルタメトリーバイオセンサーを用いたｆＴ３およびｆＴ４の推定
ＩＤＩＩおよびＩＤＩＩＩをラット脳を粗マイクロソーム画分として抽出し、電流測定バイオセンサーの作製に用いる。
ＩＤＩＩは、電極１の表面に直接接続され、電極１の前記表面は、ナノ粒子で改質される、または電極の前記表面は、金の層で改質される、または電極の前記表面は、当業者に既知の他の手段により粗面化される。
ＩＤＩＩＩは、電極２の表面に直接接続され、電極２の前記表面は、ナノ粒子で改質される、または電極の前記表面は、金の層で改質される、または電極の前記表面は、当業者に既知の他の手段により粗面化される。
【０２３０】
抗ｒＴ３抗体は、電極３の表面に直接接続され、電極３の前記表面は、ナノ粒子で改質される、または電極の前記表面は、金の層で改質される、または電極の前記表面は、当業者に既知の他の手段により粗面化される。商業的に入手できる抗ｒＴ３抗体が使用される（例えば：モノクローナル抗ｒＴ３抗体，ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（ＵＳ）；ｒＴ３／逆位トリヨードサイロニンポリクローナル抗体，ＬｉｆｅＳｐａｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（ＵＳ）；抗逆位トリヨードサイロニン抗体，ＭｙＢｉｏＳｏｕｒｃｅ．ｃｏｍ（ＵＳ）；逆位トリヨードサイロニン（ｒＴ３）モノクローナル抗体，Ｂｉｏｍａｔｉｋ（ＵＳ）；逆位トリヨードサイロニン（ｒＴ３）ポリクローナル抗体、Ｂｉｏｍａｔｉｋ（ＵＳ））。
【０２３１】
ＣＨ６０４Ｅ  Ｅｌｅｃｔｒｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｚｅｒ／Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎ（ＣＨ  ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いて電気化学バイオセンサーを作製する。
【０２３２】
ＤＩＯ２は、試料中のＴ４およびｒＴ３を電極１上で脱ヨード化し、従って、［Ｔ４＋ｒＴ３］の合計を測定する。
ＤＩＯ３は、試料中のＴ４およびＴ３を電極２上で脱ヨード化し、従って、［Ｔ４＋Ｔ３］の合計を測定する。
抗ｒＴ３はｒＴ３に結合し、従って、［ｒＴ３］を測定する。
得られた［Ｔ４＋ｒＴ３］、［Ｔ４＋Ｔ３］および［ｒＴ３］に基づいて、［Ｔ４］および［Ｔ３］を計算により決定できる。
【図１】
2021531478.tif 000002
【図２】
2021531478.tif 000003
【図３】
2021531478.tif 000004
【図４】
2021531478.tif 000005
【図５】
2021531478.tif 000006
【図６】
2021531478.tif 000007
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月18日(2020.6.18)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺ホルモンの定量化のためのセンサーであって、
ａ．基材、および
ｂ．前記基材の表面上に固定される、少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および任意選択で、抗ｒＴ３抗体の組み合わせを含み、前記組み合わせが、
・１型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、および抗ｒＴ３抗体、
・２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、３型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、および抗ｒＴ３抗体、または
・１型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、および３型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、
を含む、センサー。
【請求項２】
前記基材が、前記少なくとも２種のヨードチロイジンデヨーデナーゼの固定化用の、前記基材の第１の表面および前記基材の第２の表面などの複数の表面を含む、請求項１に記載のセンサー。
【請求項３】
前記第１のヨードサイロニンデヨージナーゼが前記基剤の第１の表面上に固定され、前記第２のヨードサイロニンデヨージナーゼが前記基材の第２の表面上に固定される、請求項１または２に記載のセンサー。
【請求項４】
前記抗ｒＴ３抗体が前記基材の第３の表面上に固定される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項５】
前記甲状腺ホルモンが、遊離Ｔ４、遊離Ｔ３および逆位Ｔ３（ｒＴ３）、およびこれらの組み合わせから選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項６】
前記基材が１個または複数の電極および／またはチップである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項７】
前記基材が、少なくとも２個の電極など、少なくとも３個の電極などの、少なくとも１個の電極を含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項８】
前記基材が、少なくとも２個のチップなど、少なくとも３個のチップなどの、少なくとも１個のチップを含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項９】
前記基材が、３個の電極を含むかまたはこれらからなり、前記第１の表面が第１の電極の表面であり、前記第２の表面が第２の電極の表面であり、および前記第３の表面が第３の電極の表面である、請求項１〜８のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１０】
前記基材が、３個のチップを含むかまたはこれらからなり、前記第１の表面が第１のチップの表面であり、前記第２の表面が第２のチップの表面であり、および前記第３の表面が第３のチップの表面である、請求項１〜９のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１１】
前記電極が、炭素、金または白金から作製される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１２】
前記電極が、スクリーン印刷電極である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１３】
前記チップがガラスチップである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１４】
前記基材の第１、第２および／または第３の表面が、改質表面である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１５】
前記改質表面が、ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴を含む表面である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１６】
前記ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴が、微粒子、ナノ粒子、マイクロワイヤー、ナノワイヤー、マイクロチューブ、ナノチューブ、マイクロロッド、ナノロッド、およびこれらの組み合わせからなる群より選択される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１７】
前記ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴が、前記表面を焼結により組み合わせることにより、前記基材の表面上に生成される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１８】
前記ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴が、表面エッチングにより前記基材の表面上に生成される、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項１９】
前記ナノメートルおよび／またはマイクロメートルサイズの複数の局所的特徴が、粒子沈着により前記基材の表面上に生成される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２０】
前記改質表面が、金の層でコートされた表面である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２１】
前記改質表面が、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるナノ粒子で改質された表面である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２２】
前記改質表面が金の層で表面コートされ、前記表面が、金、銀、酸化銅、グラフェン、酸化鉄およびこれらの組み合わせからなる群より選択されるナノ粒子でさらに改質されている、請求項１〜２１のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２３】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼが、ナノ粒子を含むリンカーを介して前記表面上に固定されている、請求項１〜２２のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２４】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、ニッケル−ヒスチジン（Ｎｉ−Ｈｉｓ）共有配位結合を含むリンカーを介して前記基材上に固定されている、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２５】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、次記を含むリンカーを介して前記基材上に固定されている、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のセンサー：
ａ．前記基材に結合したシステアミン、および
ｂ．前記システアミンおよび前記ヨードサイロニンデヨージナーゼに、任意選択で、１個または複数の追加のシステアミンを介して、結合したナノ粒子。
【請求項２６】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、哺乳動物由来である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２７】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、ヒト由来である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２８】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、無細胞発現によるなどの組換えにより生成される、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項２９】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび／または前記抗ｒＴ３抗体が、それぞれ個別に追加の部分に結合されている、請求項１〜２８のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３０】
前記追加の部分が、ヒスチジンタグなどのペプチドタグなどのペプチドである、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３１】
前記追加の部分が標識である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３２】
前記センサーが、それぞれ１０〜１００ＩＵの少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼを含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３３】
前記センサーが、１０〜１００ＩＵの１型および２型のヨードサイロニンデヨージナーゼを含む、請求項１〜３２のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３４】
前記センサーが、１０〜１００ＩＵの２型および３型のヨードサイロニンデヨージナーゼを含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３５】
前記センサーが、１０〜１００ＩＵの１型および３型のヨードサイロニンデヨージナーゼを含む、請求項１〜３４のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３６】
前記基材が、卓上型手持ち式の電気化学ワークステーション、表面プラズモン共鳴検出器または測定回路に接続できるように構成されている、請求項１〜３５のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３７】
前記基材が、少なくとも３個の電極を含み、前記電極が、電気化学ワークステーションに接続できるように構成されている、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３８】
前記基材が、少なくとも３個のチップを含み、前記チップが、表面プラズモン共鳴検出器に接続できるように構成されている、請求項１〜３７のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項３９】
前記センサーが、甲状腺ホルモンの定量用として構成されている、請求項１〜３８のいずれか１項に記載のセンサー。
【請求項４０】
次のステップを含む、試料中の甲状腺ホルモンの定量化方法：
ａ．甲状腺ホルモンを含むまたは含むと思われる試料を用意するステップ、
ｂ．項目１〜３９のいずれか１項に記載のセンサーを前記試料と接触させるステップ、
ｃ．前記センサーからのシグナルを測定するステップ、および
ｄ．前記シグナルを用いて、前記試料中の前記１種または複数の甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、前記甲状腺ホルモンを検出するステップ。
【請求項４１】
次のステップを含む、対象の甲状腺関連障害の診断方法：
ａ．前記対象から得られる試料を用意するステップ、
ｂ．請求項４０に記載の方法を用いて、前記試料中の甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、１種または複数の甲状腺関連障害を診断するステップ。
【請求項４２】
次のステップを含む、対象の甲状腺関連障害の監視方法：
ａ．甲状腺刺激化合物を前記対象に投与するステップ、
ｂ．ステップａ．の実施後に前記対象から試料を収集するステップ、
ｃ．請求項４０に記載の方法を用いて、前記試料中の前記甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度を決定し、それにより、前記甲状腺関連障害を監視するステップ。
【請求項４３】
前記ステップａ．〜ｃ．が２回以上実施される、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
甲状腺ホルモンの定量化のために、請求項１〜３９のいずれか１項に記載のセンサーの使用。
【請求項４５】
甲状腺ホルモンの定量化が、請求項４０に記載の方法により実施される、請求項４４に記載の使用。
【請求項４６】
前記試料中の甲状腺ホルモンの前記濃度を用いて前記甲状腺ホルモンのインビボ濃度を計算するステップをさらに含む、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料中の甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度が、前記甲状腺ホルモンと前記ヨードサイロニンデヨージナーゼとの間の反応動力学から決定される、請求項４０〜４６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
前記甲状腺ホルモンの濃度が、前記対象が甲状腺刺激化合物を含む薬物を受けた後で決定される、請求項４０〜４７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４９】
前記対象が前記薬物を受けた後の時間が５分〜４８時間である、請求項４２〜４８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料中の前記甲状腺ホルモンのレベルおよび／または濃度をカットオフ間隔と比較し、甲状腺関連障害の対象を診断するステップをさらに含み、前記カットオフ間隔が、前記甲状腺関連障害を罹患していないヒト個体などの健康なヒト個体の甲状腺ホルモンの濃度範囲から決定され、
前記カットオフ間隔の外側のレベルおよび／または濃度が、前記甲状腺関連障害の存在を示す、請求項４１〜４９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５１】
遊離Ｔ３の前記カットオフ間隔が、２．８〜４．４ｐｇ／ｍＬである、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
遊離Ｔ４の前記カットオフ間隔が、０．８〜２．０ｎｇ／ｍＬである、請求項５０または５１に記載の方法。
【請求項５３】
ｒＴ３の前記カットオフ間隔が、１０〜２４ｎｇ／ｍＬである、請求項５０〜５２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５４】
前記カットオフ間隔未満の濃度は低いと見なされ、前記カットオフ間隔内の濃度は正常と見なされ、および前記カットオフ間隔を超える濃度は高いと見なされる、請求項５０〜５３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５５】
前記甲状腺関連障害を治療するステップをさらに含む、請求項４１〜５４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５６】
前記治療が、治療有効量での薬物の投与を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記薬物が甲状腺刺激化合物である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記甲状腺刺激化合物が、Ｔ３、Ｔ４、ＴＳＨ、甲状腺自己抗体（ＴＲＡｂ、ＴＰＯＡｂおよびＴｇＡｂ）およびチログロブリンからなる群から選択される、請求項４２〜５７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５９】
前記対象がヒト対象である、請求項４１〜５８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ヒト対象が子どもまたは成人である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記対象が、ウマ、雌ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ネコまたはイヌである、請求項４１〜６０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６２】
前記試料が、血液試料、血清試料または血漿試料であり、任意選択で、前記試料が分析の前に処理されている、請求項４０〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
分析の前の前記処理が、濾過、ｒＴ３の除去、および／またはｐＨの調節を含む、請求項４０〜６２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記甲状腺ホルモンが、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を用いて検出される、請求項４０〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＳＰＲ測定値を用いて１種または複数の前記甲状腺ホルモンの濃度が決定される、請求項４０〜６４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６６】
前記甲状腺ホルモンが、電気化学的変換により定量または監視される、請求項４０〜６５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６７】
甲状腺関連障害が、リスト：甲状腺機能低下症、甲状腺機能亢進症、臨床的うつ病、甲状腺腫、グレーブス・バセドウ病、橋本甲状腺炎、甲状腺機能正常性症および極性Ｔ３症候群から選択される、請求項４１〜６６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６８】
前記甲状腺機能亢進症が、高遊離Ｔ４、高遊離Ｔ３および低ＴＳＨを特徴とする、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記甲状腺機能正常性症が、低遊離Ｔ３および高ｒＴ３を特徴とする、請求項６７に記載の方法。
【請求項７０】
前記甲状腺機能低下症が、一次性または二次性である、請求項６７に記載の方法。
【請求項７１】
前記一次性甲状腺機能低下症が、低遊離Ｔ４、正常または低遊離Ｔ３および高ＴＳＨを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記二次性甲状腺機能低下症が、低遊離Ｔ４、正常または低遊離Ｔ３および正常または低ＴＳＨを特徴とする、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
次記を含む、少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーの製造方法：
ａ．基材を用意するステップ、
ｂ．少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および任意選択で、抗ｒＴ３抗体の組み合わせを用意するステップ、
ｃ．前記ヨードサイロニンデヨージナーゼおよび前記抗ｒＴ３抗体を前記基材表面上に固定し、それにより、少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼを含むセンサーを製造するステップであって、前記組み合わせが、
・１型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、および抗ｒＴ３抗体、
・２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、３型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、および抗ｒＴ３抗体、または
・１型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、および３型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、
を含むステップ。
【請求項７４】
前記基材が、請求項１〜７３のいずれか１項で定義の通りである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼが、請求項１〜７４のいずれか１項で定義の通りである、請求項７３または７４に記載の方法。
【請求項７６】
次記を含む、甲状腺ホルモンの定量および／または監視のための手持ち型装置：
ａ．試料の入口；
ｂ．センサーであって、
ｉ．基材、および
ｉｉ．少なくとも２種のヨードサイロニンデヨージナーゼ、および任意選択で、抗ｒＴ３抗体の組み合わせを含み、前記組み合わせが、
・１型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、および抗ｒＴ３抗体、
・２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、３型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、および抗ｒＴ３抗体、または
・１型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、２型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、および３型ヨードサイロニンデヨージナーゼ、
を含む、センサー、
ｃ．前記センサーからシグナルを受け、それを使用者により読み取り可能なフォーマットに変換するように構成された検出器、
ｄ．任意選択で、前記試料から細胞成分を分離する手段。
【請求項７７】
前記センサーが、請求項１〜７６のいずれか１項で定義の通りである、請求項７６に記載の手持ち型装置。
【請求項７８】
前記第１のヨードサイロニンデヨージナーゼ、前記第２のヨードサイロニンデヨージナーゼおよび前記抗ｒＴ３抗体が、請求項１〜７７のいずれか１項で定義の通りである、請求項７６または７７に記載の手持ち型装置。
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月9日(2021.4.9)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021531478000001.app
【国際調査報告】
2021531478.tif 000008
2021531478.tif 000009