(57)【要約】本願発明は、癌の処置において可溶性ヒトＣＤ３９の酵素活性を阻害する化合物を使用して、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する及び／又は腫瘍細胞の死を誘導する薬剤又は処置の活性を強力化する方法に関する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト個体における腫瘍の処置に使用するための、ヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤアーゼ１）タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体であって、該処置が、（ａ）ＡＴＰの存在下でＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体、及び（ｂ）腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置のそれぞれの有効量を個体に投与することを含む、抗体。
【請求項２】
可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができ、任意選択により、溶液中のヒト細胞外ドメインＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の減少を、５０％を超えて、任意選択により６０％、７０％、７５％又は８０％を超えて引き起こすことができる、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
外因的に添加されたＡＴＰ、任意選択により２０μＭの濃度で添加されたＡＴＰの存在下で可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害する、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒト個体における腫瘍の処置に使用するための、可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体であって、該処置が、（ａ）可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体、及び（ｂ）腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置のそれぞれの有効量を個体に投与することを含む、抗体。
【請求項５】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置での処置への個体の感受性化に使用するための、外因的に添加されたＡＴＰの存在下でＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体。
【請求項６】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置が、腫瘍細胞の死を誘導する薬剤である、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
個体が、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤での処置の事前の経過（ｃｏｕｒｓｅ）に続いて再発又は進行した癌を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
個体が、白金薬剤、タキサン又はＰＡＲＰインヒビターでの処置の事前の経過に続いて再発又は進行した癌を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
方法又は処置が、（ａ）ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する薬剤、任意選択により抗体及び／又は（ｂ）ヒトＣＤ７３タンパク質の阻害活性を中和する薬剤、任意選択により抗体又は小分子薬剤を個体に投与することをさらに含む、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１０】
個体が、ヒトＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性に結合して中和することができる抗体との併用処置の非存在下で、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤での処置への悪い反応又はそれへの反応として悪い予後を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
外因的に添加されたＡＴＰ抗体の存在下でＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体が、単球由来の樹状細胞（ｍｏＤＣ）が抗体及びＡＴＰと共にインビトロでインキュベートされると、単球由来の樹状細胞において活性化の細胞表面マーカーの発現の増加を引き起こすことができる抗体であり、任意選択により、外因的に添加されたＡＴＰが０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭで提供される、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
細胞の表面でヒトＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性に結合して中和することができる、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
ＡＴＰの存在下で樹状細胞の活性化を増加させることができる、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
ｍｏＤＣが抗体及びＡＴＰと共にインビトロでインキュベートされると、単球由来の樹状細胞において活性化の細胞表面マーカーの発現の増加を引き起こすことができる、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
外因的に添加されたＡＴＰが０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭで提供される、請求項１１−１４に記載の抗体。
【請求項１６】
活性化の細胞表面マーカーの発現の増加が、ｍｏＤＣをＡＴＰの存在下で２４時間インキュベートすること、及びｍｏＤＣ上のＣＤ８０、ＣＤ８３及び／又はＨＬＡ−ＤＲの細胞表面発現をフローサイトメトリーにより分析することにより評価される、請求項１１−１５に記載の抗体。
【請求項１７】
細胞表面マーカーの発現の増加が、陰性対照と比較して、少なくとも４０％、５０％、７５％又は８０％である、請求項１１−１６に記載の抗体。
【請求項１８】
ＡＴＰの存在下で、Ｔ細胞がＣＤ３９発現ＤＣ細胞とインビトロで共培養されると、Ｔ細胞の増殖を増加させることができる、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１９】
外因的に添加されたＡＴＰの存在下で可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２０】
外因的に添加されたＡＴＰが２０μＭの濃度で提供される、請求項１９に記載の抗体。
【請求項２１】
細胞表面ＣＤ３９の内在化を実質的に誘導又は増加させない、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２２】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置が、放射線療法又は化学治療剤を含む組成物である、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２３】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置が、ＰＡＲＰインヒビターである、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２４】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する及び／又は腫瘍細胞の死を誘導する薬剤又は処置が、タキサンである、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２５】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置が、白金薬剤である、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２６】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置が、放射線療法である、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２７】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤が、腫瘍組織中に存在する細胞、任意選択により腫瘍細胞の表面に存在するタンパク質に結合する枯渇抗体を含む組成物である、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２８】
ヒトＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を中和する抗体、及び腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤が、別々の投与のために処方され、同時又は順次投与される、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項２９】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤が、ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体の投与の１から４８時間後に投与される、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３０】
個体が固形腫瘍を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３１】
個体が卵巣癌を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３２】
個体が胃癌を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３３】
個体が肺癌を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体
【請求項３４】
個体が結腸癌を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３５】
個体が、食道癌を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３６】
個体が白金感受性癌を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３７】
個体が白金耐性癌を有する、請求項１−３５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３８】
個体がタキサン感受性癌を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項３９】
個体がタキサン耐性癌を有する、請求項１−３７のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４０】
個体がＰＡＲＰインヒビター感受性癌を有する、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４１】
個体がＰＡＲＰインヒビター耐性癌を有する、請求項１−３９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４２】
個体が血液腫瘍を有する、請求項１−２９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４３】
ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を中和する抗体が、ヒトＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ及び／又はＣＤ６４ポリペプチドへの結合を実質的に欠く、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４４】
前記抗体がキメラ、ヒト又はヒト化抗体である、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４５】
ＣＤ３９の活性を中和する前記抗体が非枯渇（ｎｏｎ−ｄｅｐｌｅｔｉｎｇ）抗体である、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４６】
前記抗体が抗体フラグメントである、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項４７】
前記抗体フラグメントが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、二重特異性抗体、一本鎖抗体フラグメント、又は多重の様々な抗体フラグメントを含む多重特異性抗体から選択される、請求項４６に記載の抗体。
【請求項４８】
可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体、及び腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤を含む医薬組成物。
【請求項４９】
（ａ）可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体の用量、及び（ｂ）腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤の用量を含むキット。
【請求項５０】
（ａ）可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体の有効量を含有する単回投与医薬組成物の多重パッケージ、及び（ｂ）腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤を含有する単回投与医薬組成物の多重パッケージを含むキット。
【請求項５１】
個体における適応抗腫瘍応答の増強に使用するため、さらに任意選択により、個体における樹状細胞活性化及び／又は樹状細胞により媒介されるＴ細胞増殖の増強に使用するための、可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体であって、該方法が、ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を中和することができる抗体、及び腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤の有効量を前記個体に投与することを含む、抗体。
【請求項５２】
個体が、免疫抑制及び／又は疲弊の１以上のマーカーを特徴とする腫瘍組織及び／又は腫瘍隣接組織を含む、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５３】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤での処置に続いて癌が再発又は進行した個体における癌の処置又は予防に使用するための、可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体。
【請求項５４】
処置が、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤を個体に投与することをさらに含む、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５５】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤が、白金薬剤、タキサン又はＰＡＲＰインヒビターである、請求項５３に記載の抗体。
【請求項５６】
それぞれの場合において、抗体と配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間の結合と比較して、
−（ａ）突然変異Ｑ９６Ａ、Ｎ９９Ａ、Ｅ１４３Ａ及びＲ１４７Ｅ（配列番号１を基準とする）を含む突然変異体ＣＤ３９ポリペプチド；
−（ｂ）突然変異Ｒ１３８Ａ、Ｍ１３９Ａ及びＥ１４２Ｋ（配列番号１を基準とする）を含む突然変異体ＣＤ３９ポリペプチド；
−（ｃ）突然変異Ｋ８７Ａ、Ｅ１００Ａ及びＤ１０７Ａ（配列番号１を基準とする）を含む突然変異体ＣＤ３９ポリペプチド；及び／又は
−（ｄ）突然変異Ｎ３７１Ｋ、Ｌ３７２Ｋ、Ｅ３７５Ａ、Ｋ３７６Ｇ及びＶ３７７Ｓ、及び残基３７６と３７７（配列番号１を基準とする）との間のバリンの挿入を含む突然変異体ＣＤ３９ポリペプチド
への結合が減少した、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体又は使用。
【請求項５７】
抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９の重鎖可変領域の機能保存的変異体である重鎖可変領域、及びそれぞれのＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９抗体の軽鎖可変領域の機能保存的変異体である軽鎖可変領域を含む、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体又は使用。
【請求項５８】
配列番号４４−４７のいずれかのヒト重鎖定常領域に融合した抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９の重鎖可変領域の機能保存型変異体である重鎖、及びヒトＣカッパ軽鎖定常領域に融合したそれぞれのＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９抗体の軽鎖可変領域の機能保存的変異体である軽鎖を含む、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体又は使用。
【請求項５９】
アミノ酸配列ＤＹＮＭＨ（配列番号５）を含むＨＣＤＲ１；アミノ酸配列ＹＩＶＰＬＮＧＧＳＴＦＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）を含むＨＣＤＲ２；アミノ酸配列ＧＧＴＲＦＡＹ（配列番号７）を含むＨＣＤＲ３；アミノ酸配列ＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＶＳＦＭＹ（配列番号８）を含むＬＣＤＲ１；アミノ酸配列ＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号９）を含むＬＣＤＲ２領域；及びアミノ酸配列ＱＱＴＫＥＶＰＹＴ（配列番号１０）を含むＬＣＤＲ３領域を含む、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体又は使用。
【請求項６０】
抗体が、Ｋａｂａｔ残基Ｎ２９７にＮ結合型グリコシル化を含み、Ｋａｂａｔ残基２３４及び２３５、任意選択によりさらにＫａｂａｔ残基３３１、任意選択によりＫａｂａｔ残基２３４、２３５、２３７及びＫａｂａｔ残基３３０及び／又は３３１にアミノ酸置換を含む改変されたヒトＩｇＧ１Ｆｃドメインを含み、任意選択によりＦｃドメインが、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ｆ／Ｌ２３５Ｅ／Ｐ３３１Ｓ置換、Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ｐ３３１Ｓ置換、又はＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換を含む、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体又は使用。
【請求項６１】
抗体が、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与の少なくとも１時間前、１２時間前、２４時間前、又は４８時間前に投与される、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体又は使用。
【請求項６２】
ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置が、抗体の投与に続く２週間以内に少なくとも２回投与される、上記の請求項のいずれか一項に記載の抗体又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、任意の図面、全てがその全体において参照により本明細書中に組み込まれる２０１７年１１月１５日提出の米国仮特許出願第６２／５８６，２２４号明細書、２０１８年６月１８日提出のＵＳ６２／６８６，１４９及び９月１９日提出のＵＳ６２／７３３，１７５の利益を主張する。
【０００２】
配列表の参照
本願は、電子方式の配列リストと共に提出されている。本配列リストは、２０１８年１１月１４日作成の「ＣＤ３９−８＿ＳＴ２５」という名称で提供されており、サイズは、６４ｋＢである。本配列リストの電子方式の情報は、その全体において参照により本明細書中に組み込まれる。
【０００３】
発明の分野
この発明は、癌の処置のためのＣＤ３９中和剤の使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
ＣＤ３９／ＥＮＴＰＤ１又は血管ＣＤ３９としても既知であるＮＴＰＤアーゼ１（エクトヌクレオシド三リン酸ジホスホヒドロラーゼ１）は、別の酵素ＣＤ７３（エクト−５’−ヌクレオチダーゼ）と一緒に機能して、細胞外アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）及び細胞外アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）を加水分解して、アデノシン受容体に結合してＴ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の応答を阻害し、それにより免疫系を抑制するアデノシンを生成する。ＣＤ７３／ＣＤ３９経路を介したアデノシンの生成は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の免疫抑制機能の主要な機構として認識される。Ｃ３９は、Ｎ末端及びＣ末端の近くの２個の膜貫通ドメイン、短い細胞質Ｎ末端セグメント及び細胞質Ｃ末端セグメント、及び活性部位を含有する大きい細胞外ドメインを有する。しかしながら、ＣＤ３９は、一般的には、該分子の２個の末端での２個の膜貫通ドメインにより膜に固定されているが、ＣＤ３９の可溶性触媒活性形態がヒト及びマウスの循環中でも見られ得ることも最近報告されている(Yegutkin et al., (2012) FASEB J. 26(9): 3875-3883)。
【０００５】
放射線療法及びいくつかの化学治療剤は、免疫原性癌細胞死をもたらす特異的な免疫反応を誘導することが示されている(Martins et al. 2009 Cell Cycle 8(22):3723-3728)。そのような処置により誘導される抗腫瘍免疫反応は、死にかけている癌細胞からの抗原を提示し、腫瘍特異的な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）をプライムする樹状細胞（ＤＣ）の能力に依存する。ＣＴＬ反応を開始するために、ＤＣは、ストレスを受けたか又は死にかけている細胞からの抗原を組み込み、成熟ステップにおいて抗原処理の競合を得て、特異的なＣＴＬの分化／活性化を刺激する共刺激シグナル及びサイトカインに関連してＭＨＣ分子に結合した抗原性ペプチドを提示する必要がある。
【０００６】
しかしながら、放射線療法及び化学治療剤を包含する、癌細胞を除去するように設計された現在の療法の有効性を改善する必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００７】
本願発明は、とりわけ、有意な濃度のＡＴＰの存在下でＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を中和する抗体が、外因的に添加されたＡＴＰの存在下で樹状細胞（ＤＣ）におけるＣＤ３９の免疫抑制効果を逆転させることができるという発見から生じる。さらに、該抗体は、ＤＣと共培養されたＴ細胞の増殖を誘導又は増加させることができる。ＤＣ活性化のＣＤ３９により媒介される阻害を減少させる能力は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置、特に免疫原性癌細胞死を誘導する薬剤又は処置、例えば、腫瘍細胞の死を誘導する薬剤又は処置（とりわけ、化学治療剤、放射線療法）と組み合わせた抗体の有利な使用を提供する。ＡＴＰ放出は、免疫原性であり、ＤＣの活性化を促進する能力を有するが、ＣＤ３９による異化にさらされ、次いで細胞外ＡＴＰの免疫原性効果を抑制し得る。さらに、化学療法中に、ＡＴＰの増加したレベルは、ＤＣでのＣＤ３９のより高い発現と関連する。ＡＴＰが豊富な腫瘍微小環境内では、浸潤ＤＣは、ＣＤ３９発現を調節することによりＡＴＰ分解に寄与し、次いで化学療法により誘導性される免疫原性腫瘍細胞死を減少させ得る。したがって、抗ＣＤ３９抗体との併用は、腫瘍細胞の死（例えば、アポトーシス又は壊死）を誘導する薬剤又は処置の免疫原性効果の強力化を可能にする。
【０００８】
よって、ある態様において、本願発明は、腫瘍細胞の死を誘導する薬剤又は処置、例えば腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤又は処置、免疫原性癌細胞死を誘導する薬剤又は処置と組み合わせて、ＡＴＰの存在下でＣＤ３９に結合して中和する抗体の使用を介した抗腫瘍免疫反応を増強する改善された方法を提供する。ある態様において、本願発明は、腫瘍細胞の死を誘導するための手段、例えば、アポトーシス及び／又は腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導するための手段と組み合わせて、ＡＴＰの存在下でＣＤ３９に結合して中和することができる抗体の使用を介した抗腫瘍免疫反応を増強する改良された方法を提供する。ある実施形態において、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤又は処置（又は手段）は、アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチン、Ｘ線、ＰＡＲＰインヒビター、タキサン、アントラサイクリン、ＤＮＡ損傷薬剤、カンプトテシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、ビンカアルカロイド、ナイトロジェンマスタード、マイタンシノイド、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、ツブリシン、ドラスタチン、オーリスタチン、エンジイン、アマトキシン、ピロロベンゾジアゼピン、エチレンイミン、ラジオアイソトープ、治療用タンパク質又はペプチド毒素、又は腫瘍細胞により発現された抗原に結合し、ＡＤＣＣを媒介する抗体を含む。ある実施形態において、ＣＤ３９に結合して中和することができる抗体は、可溶性細胞外ドメインＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９）及び膜結合型ＣＤ３９タンパク質（ｍｅｍＣＤ３９）の両方の活性を中和することができる。本明細書中で示されるように、外因的に添加されたＡＴＰの存在下で樹状細胞（ＤＣ）におけるＣＤ３９の免疫抑制効果を逆転させることができる抗体は、可溶性細胞外ドメインＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９）及び膜結合型ＣＤ３９タンパク質（ｍｅｍＣＤ３９）の両方の活性を中和できることも特徴とする。特に、外因的なＡＴＰの存在下で樹状細胞（ＤＣ）におけるＣＤ３９の免疫抑制効果を逆転させることができない抗体ＢＹ４０は、可溶性細胞外ドメインＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９）のＡＴＰアーゼ活性を中和することもできず、膜結合型ＣＤ３９タンパク質（ｍｅｍＣＤ３９）ＡＴＰアーゼ活性のより低い最大阻害を有する。
【０００９】
理論に拘束されることを望まないが、細胞表面で膜結合型ＣＤ３９を中和する抗体は、膜結合型ＣＤ３９（ｍｅｍＣＤ３９）のドメイン運動を阻害することにより働くが、可溶性ＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９）の活性に類似の影響を及ぼさないと考えられる。ｍｅｍＣＤ３９は、ホモ多量体(例えば、単量体形態に加えて四量体及び/又は他の多量体)として生じるが、ｓＣＤ３９は単量体であることが報告されており、加えて、ｍｅｍＣＤ３９中の膜貫通ドメインは、活性部位との機能的関係の基礎をなす動的運動を受けることも報告されている(Schulte am Esch et al. 1999 Biochem. 38(8):2248-58)。ｍｅｍＣＤ３９のみをブロックする抗体は、酵素活性部位の外側でＣＤ３９を認識し、ＣＤ３９の単量体形態をブロックせずに多量体化を防止し得る。多量体化の遮断は酵素活性を低下させ得、ＣＤ３９多量体化がＡＴＰアーゼ活性を実質的に増強すると報告されている。対照的に、ｓＣＤ３９もブロックする抗体は、ＣＤ３９基質を妨害し、酵素の単量体形態を阻害し得る。ＡＴＰが存在する場合（例えば腫瘍環境において）、ｓＣＤ３９の遮断の無い多量体化の防止によるＣＤ３９の部分的な阻害は、ＤＣの活性化に対する何れの検出可能な相加効果をも防止するのに十分な残留ＡＭＰをもたらし得る。その結果、単量体及び／又は可溶性ＣＤ３９（例えば、単量体ｓＣＤ３９）のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害する抗体は有利に使用されて、膜結合型及び可溶性ＣＤ３９タンパク質（溶液中の細胞外ドメインタンパク質）両方を中和することにより個体においてＣＤ３９活性のより大きな中和を達成し得る。
【００１０】
ある態様において、癌の処置で使用するための、ＣＤ３９に結合してヒトＣＤ３９タンパク質の酵素（ＡＴＰアーゼ活性）活性を阻害する薬剤が本明細書中で提供され、ここでＣＤ３９に結合する薬剤は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤、任意選択により腫瘍細胞の死を誘導する、任意選択によりアポトーシス及び／又は壊死を誘導する薬剤と組み合わせて投与される。別の態様において、癌の処置に使用するための、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤、任意選択により腫瘍細胞の死を誘導する、任意選択によりアポトーシス及び／又は壊死を誘導する薬剤が本明細書中で提供され、ここで腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤は、ＣＤ３９に結合してヒトＣＤ３９タンパク質の酵素（ＡＴＰアーゼ活性）活性を阻害する薬剤と組み合わせて投与される。
【００１１】
ある実施形態において、個体における癌を処置又は予防するための方法であって、（ａ）ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害する薬剤、及び（ｂ）腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤を個体に投与することを含む方法が提供される。
【００１２】
ある実施形態において、外因的に添加されたＡＴＰの存在下でＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体の抗腫瘍効果を強力化する方法であって、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する及び／又は腫瘍細胞の死を誘導する薬剤又は処置を個体に投与することを含む方法が提供される。
【００１３】
ある実施形態において、（抗ＣＤ３９抗体との併用処置の非存在下で）腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する及び／又は腫瘍細胞の死を誘導する処置又は薬剤での処置への悪い反応又はそれへの反応として悪い予後を有する個体における癌を処置する方法であって、外因的に添加されたＡＴＰの存在下でＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体を個体に投与することを含む方法が提供される。
【００１４】
ある実施形態において、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤は、腫瘍細胞のアポトーシスを直接誘導する。ある実施形態において、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤は、腫瘍細胞の壊死を直接誘導する。ある実施形態において、薬剤は、腫瘍細胞の死を直接引き起こす細胞毒性薬剤、任意選択により癌の処置に使用される化学治療剤を含む。ある実施形態において、薬剤は、枯渇抗体を含む。ある実施形態において、薬剤は、腫瘍細胞により発現されるタンパク質に特異的に結合する抗体及び細胞毒性薬剤を含む免疫コンジュゲートを含む。ある実施形態において、薬剤は、腫瘍細胞により発現されるタンパク質に特異的に結合し、細胞毒性薬剤にコンジュゲートされていない抗体（例えば、ネイクド抗体）を含む。任意選択により、抗体は腫瘍細胞のアポトーシスを直接誘導することができる。
【００１５】
ある実施形態において、ＣＤ３９に結合してヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害する薬剤は、外因的に添加されたＡＴＰの存在下でＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を中和することができる。
【００１６】
ある実施形態において、ＣＤ３９に結合してヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害する薬剤は、可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を中和することができる。任意選択により、薬剤は、外因的に添加されたＡＴＰ、任意選択により２０μＭの濃度で添加されたＡＴＰの存在下で、可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を中和することができる。アッセイは、例えば本明細書中の実施例に示すように、例えば、抗ＣＤ３９抗体が可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質と共にプレート中で１時間３７°Ｃでインキュベートされ、２０μＭ  ＡＴＰが、ＣＴＧ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ）試薬を添加する前に３７°Ｃでさらに３０分間プレートに添加され、放出された光が、暗所での５分間の短いインキュベーション後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）ルミノメーターを使用して定量化される。
【００１７】
任意選択により、抗体は、溶液中のヒト細胞外ドメインＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の５０％を超える、任意選択により６０％、７０％、７５％又は８０％を超える減少を引き起こすことができる。
【００１８】
ある実施形態において、ＣＤ３９に結合する薬剤は、任意選択により、さらにヒトへの抗体の投与に適合する濃度で、（例えば、本明細書で開示された方法により評価されるような）可溶性ヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％又は９０％の減少を提供するであろう。
【００１９】
ある実施形態において、ＣＤ３９に結合してヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害する薬剤は、単球由来の樹状細胞（ｍｏＤＣ）が抗体及びＡＴＰと共にインビトロでインキュベートされると、単球由来の樹状細胞における活性化の細胞表面マーカーの発現の増加を引き起こすことができ、任意選択により、外因的に添加されたＡＴＰは０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭで提供される。
【００２０】
ある実施形態において、ＣＤ３９に結合してヒトＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害する薬剤は、細胞表面でヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して中和することができる。ある実施形態において、薬剤はＡＴＰの存在下で樹状細胞の活性化を増加させることができる。ある実施形態において、薬剤は、単球由来の樹状細胞が抗体及びＡＴＰと共にインビトロでインキュベートされると、単球由来の樹状細胞における活性化の細胞表面マーカーの発現の増加を引き起こすことができる。任意選択により、ＡＴＰは、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭで提供される外因的に添加されたＡＴＰである。任意選択により、活性化の細胞表面マーカーの発現の増加は、ｍｏＤＣをＡＴＰ存在下で２４時間インキュベートし、ｍｏＤＣ上のＣＤ８０、ＣＤ８３及び／又はＨＬＡ−ＤＲをフローサイトメトリーで分析することにより評価される。任意選択により、細胞表面マーカーの発現の増加は、陰性対照（例えば、培地）と比較して、少なくとも４０％、５０％、７５％又は８０％である。
【００２１】
本明細書中のいずれかの実施形態のある態様において、ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害又は中和する薬剤は、ＣＤ３９タンパク質に結合する抗体又は抗体フラグメント（例えば、単一特異性抗体、二重特異性抗体又は多重特異性抗体）であるか又はそれを含む。
【００２２】
薬剤の併用は、腫瘍微小環境における利用可能なＡＴＰのプールを増加させることにより、腫瘍に対する適応免疫反応を促進するのに有用になるだろう。これらの抗体は、ＤＣ及び／又はＴ細胞の活性に対するＣＤ３９の免疫抑制効果を逆転させるのに役立つだろう。ある実施形態において、本開示の方法は、個体における抗腫瘍免疫を増加又は増強するため、免疫抑制を減少させるため、適応抗腫瘍免疫反応を増強するため、又はＤＣ、Ｔ細胞、腫瘍浸潤性及び／又は腫瘍特異的なＴ細胞を活性化する及び／又はそれらの活性を強力化するために有用である。
【００２３】
本明細書中のいずれかの実施形態のある態様において、ｓＣＤ３９タンパク質は、膜結合型ＣＤ３９中で見出される２個の膜貫通ドメイン（つまり、Ｎ末端及びＣ末端の付近の膜貫通ドメイン）を欠くことを特徴とし得る。ある実施形態において、ｓＣＤ３９は、例えばヒト個体における、循環において見出される非膜結合型ｓＣＤ３９タンパク質である。ある実施形態において、ｓＣＤ３９は配列番号２のアミノ酸配列、例えば本明細書中の実施例において製造されたｓＣＤ３９タンパク質を含むか又はこの配列からなる（任意選択により、Ｃ末端タグ又は別の非ＣＤ３９由来アミノ酸配列をさらに含む）。ある実施形態において、タンパク質、抗体又は抗体フラグメントは、例えば、本明細書中で開示される方法に従って、溶液中でｓＣＤ３９と共にインキュベートすると、ｓＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害するか又は中和する。ある実施形態において、タンパク質、抗体又は抗体フラグメントは、可溶性（細胞外ドメインタンパク質）及び膜結合形態の両方でヒトＣＤ３９タンパク質に特異的に結合する。
【００２４】
本明細書中のいずれかの実施形態のある態様において、個体はヒトであると特定し得る。
【００２５】
ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は治療有効量で投与される。
【００２６】
ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、末梢において及び／又は腫瘍微小環境において、ＣＤ３９（ｓＣＤ３９及び／又はｍｅｍＣＤ３９）の活性を中和するのに十分な量及び頻度で癌を有する個体に投与される。ある実施形態において、抗体は、腫瘍微小環境においてＡＴＰの異化を減少させるのに十分な量及び頻度で投与される。任意選択により、抗体は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤の２回の連続投与の間の期間、末梢において及び／又は腫瘍微小環境においてＣＤ３９（ｓＣＤ３９及び／又はｍｅｍＣＤ３９）の活性の継続した阻害、及び／又は腫瘍微小環境においてＡＴＰの異化の継続した減少を提供するのに十分な量及び頻度で投与される。
【００２７】
ある実施形態において、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤は、治療有効量で投与される。ある実施形態において、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤は、アポトーシス及び／又は腫瘍細胞の壊死を誘導するのに十分な量及び頻度で癌を有する個体に投与される。ある実施形態において、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤は、腫瘍微小環境においてＡＴＰの細胞外放出を誘導するのに十分な量及び頻度で癌を有する個体に投与される。
【００２８】
ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体及び腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤は、それぞれ少なくとも１回の投与サイクルで投与され、該投与サイクルは、少なくとも１回目の及び２回目の（並びに任意選択により、３回目、４回目、５回目、６回目、７回目及び／若しくは８回目の又はさらなる）抗ＣＤ３９抗体及び腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤の投与を含む。
【００２９】
ある実施形態において、癌は白血病、神経膠腫又は神経膠芽腫、又は膀胱、乳房、結腸、食道、腎臓、肝臓、肺、卵巣、子宮、前立腺、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺、頭及び首（頭頸部扁平上皮癌、及び皮膚（例えば、メラノーマ）の癌である。ある実施形態において、癌は進行した及び／又は難治性固形腫瘍である。ある実施形態において、癌は進行した及び／又は難治性固形腫瘍である。非限定的な一実施形態において、癌（例えば、進行した難治性固形腫瘍）は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、腎臓癌、膵臓又は食道腺癌、乳癌、腎細胞癌（ＲＣＣ）、黒色腫、結腸直腸癌、及び卵巣癌（及び任意選択により、本明細書中で説明されるさらなる癌のタイプ）からなる群から選択される。
【００３０】
特定の任意選択の態様において、抗ＣＤ３９薬剤は、任意選択により腫瘍における免疫浸潤を欠くか又はそれが不十分であり、任意選択により抗腫瘍免疫を欠くか又はそれが不十分である、免疫抑制を特徴とする癌又は腫瘍を有する個体における癌を処置するために使用され得る。
【００３１】
特定の任意選択の態様において、本明細書中で開示された処置は、悪い疾患予後、特に抗癌剤、例えば、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤、細胞毒性薬剤、化学治療剤、又はＣＤ３９の酵素活性を阻害する薬剤を用いた処置への反応として悪い予後を有する個体における癌を処置するために使用し得る。悪い疾患予後を有する個体は、例えば、進行のより高いリスクで、１個又は複数の予測要因に基づく。ある実施形態において、予測要因は、１個又は複数の遺伝子における変異の存在又は非存在を含む。ある実施形態において、予測要因は、１個又は複数の遺伝子又はタンパク質、例えば、免疫エフェクター細胞上の抑制又は活性化受容体の発現のレベルを含む。ある実施形態において、予測要因は、ＣＤ３９を発現する循環又は腫瘍環境における細胞の存在（例えば数）、及び／又は循環又は腫瘍環境における細胞表面でのＣＤ３９の発現レベルを含み；ある実施形態において、細胞は腫瘍細胞であり；ある実施形態において、細胞は白血球、例えばＢ細胞、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）であり；ある実施形態において細胞は樹状細胞である。ＣＤ３９の増加した発現、及び／又はＣＤ３９発現細胞の増加した数の存在は、個体がＣＤ３９を中和する抗体での処置への反応として悪い予後を有することを示し得る。
【００３２】
本明細書中のいずれの態様においても、個体は、非応答者であるか、又は腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤での処置への部分的又は不完全な反応を経験したか、又は腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤での処置に続いてその疾患が再発又は進行した個体であり得る。
【００３３】
ある態様において、非応答者であるか、又は腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤での処置に対し部分的又は不完全な反応を経験したか、又は腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤での処置に続いてその疾患が再発又は進行した個体における癌の処置に使用するための抗ＣＤ３９薬剤が提供される。ある実施形態において、抗ＣＤ３９薬剤は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる処置（例えば、薬剤）と組み合わせて投与される。任意選択により、抗ＣＤ３９薬剤は、ＡＴＰの存在下でＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる及び／又は可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる。
【００３４】
ある実施形態において、抗ＣＤ３９薬剤は、抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９と、ＣＤ３９上のエピトープ又は決定基への結合について競合する。ある実施形態において、抗ＣＤ３９薬剤は、それぞれ配列番号３７及び３８の重鎖及び軽鎖を有する抗体と、ＣＤ３９への結合について競合する。薬剤は、例えば、ヒト又はヒト化抗ＣＤ３９抗体であり得る。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、配列番号３７の重鎖の重鎖ＣＤＲ及び配列番号３７の軽鎖の軽鎖ＣＤＲをそれぞれ含む抗体である。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、配列番号３７の重鎖アミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％同一のアミノ酸配列を含む重鎖及び配列番号３８の軽鎖アミノ酸配列と少なくとも６０％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖をそれぞれ含む。
【００３５】
特定の任意選択の態様において、個体は、患者が抗癌剤（例えば、細胞毒性化合物、化学治療剤、枯渇抗体を含む組成物）について悪い応答者である（反応として悪い予後を有する）かどうか評価することにより、ＣＤ３９中和剤及び腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤での処置について特定され得る。悪い応答者は、ＣＤ３９中和剤及び腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤の組み合わせで処置し得る。
【００３６】
特定の任意選択の態様において、患者は、腫瘍サンプル（例えば、腫瘍組織及び／又は腫瘍隣接組織）中の細胞外ＡＴＰの存在を評価することにより、ＣＤ３９中和剤での処置について特定され得、任意選択により、ＡＴＰの所定の濃度は、個体が抗ＣＤ３９での処置について適切であり、任意選択により細胞外ＡＴＰの濃度が少なくとも０．０１ｍＭ、０．０２ｍＭ、０．０５ｍＭ、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭであることを示す。
【００３７】
他の実施形態において、本明細書中で説明される処置方法は、いずれの他の適切な処置とも組み合わせて使用され得る。ある実施形態において、本明細書中で記載される処置方法は、ヒトＰＤ−１の阻害活性を中和する薬剤、任意選択により抗体を個体に投与することをさらに含む。ある実施形態において、本明細書中で説明される処置方法は、ヒトＣＤ７３タンパク質の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を中和する薬剤、任意選択により抗体を個体に投与することをさらに含む。
【００３８】
他の実施形態において、医薬組成物及びキット、ならびにそれらの使用方法が提供される。ある実施形態において、ヒトＣＤ３９ポリペプチドのＡＴＰアーゼ活性を中和する化合物及び腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤を含む医薬組成物が提供される。ある実施形態において、ヒトＣＤ３９ポリペプチドの阻害活性を中和する化合物及び腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導することができる薬剤を含むキットが提供される。
【００３９】
他の実施形態において、可溶性細胞外ドメインのヒトＴＰ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体と併用するための抗癌薬剤の有効性又は適合性を予測又は評価する方法が提供され、該方法は、抗癌薬剤が細胞（例えば腫瘍細胞）からのＡＴＰの細胞外放出を誘導するかどうかを（例えばインビトロで）決定又は評価することを含み、ここで抗癌薬剤が細胞（腫瘍細胞など）からのＡＴＰの細胞外放出を誘導するとの決定は、該薬剤が、可溶性細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる前記抗体と組み合わせて癌の処置に使用し得ることを示す。抗癌薬剤が腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導するかどうかを決定又は評価することは、例えば、細胞（例えば、腫瘍細胞）を薬剤とインビトロで接触させ、ＡＴＰの細胞外放出を評価することを含み得る。
【００４０】
これらの態様は、本明細書に記載された説明でより詳細に説明されており、追加の態様、特徴及び利点は、本明細書に記載された説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】代表的なスクリーニング結果を示し、陽性対照Ｉ−３９４抗体と比較した抗体Ｉ−３９７、Ｉ−３９８及びＩ−３９９を示す。
【００４２】
【図２】図２Ａは、抗体ＢＹ４０、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５及びＩ−３９６が細胞膜結合型ＣＤ３９を阻害し、Ｉ−３９４及びＩ−３９５の両方が全ての濃度でより高い効力を示すだけでなく、ＢＹ４０と比較して細胞性ＣＤ３９のより大きい最大阻害も示すことを示す。図２Ｂは、抗体Ｉ−３９５及びＩ−３９６は、両方とも陰性対照抗体（ＢＹ４０）及び陽性対照抗体（Ｉ−３９４）と比較して可溶性ＣＤ３９を阻害することを示す。
【００４３】
【図３Ａ】ＣＤ３９タンパク質の表面上の突然変異体５（Ｍ５）、１５（Ｍ１５）及び１９（Ｍ１９）で突然変異した残基の位置を示す。
【００４４】
【図３Ｂ】様々な抗体に関する突然変異体５、１５及び１９への結合の結果を示す。
【００４５】
【図４】フローサイトメトリーにより評価した場合の、ヒトＣＤ３９を発現する細胞への抗体Ｉ−３９４の結合を示す。Ｉ−３９４は、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｈｕＣＤ３９）、カニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｃｙＣＤ３９）及びＲａｍｏｓリンパ腫細胞に結合するが、マウスＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｍｏＣＤ３９）に結合しない。
【００４６】
【図５】抗体Ｉ−３９４は、存在するＡＴＰの量に比例する発光単位を定量することにより評価した場合、腫瘍（Ｒａｍｏｓ）細胞、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｈｕＣＤ３９）及びカニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｃｙＣＤ３９）中でのＣＤ３９酵素活性のブロッキングで非常に強力であることを示す。
【００４７】
【図６】抗体Ｉ−３９４は、存在するＡＴＰの量に比例する発光単位を定量することにより評価した場合、可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質の酵素活性のブロッキングで非常に強力であることを示す。
【００４８】
【図７】ＥＬＩＳＡアッセイで評価した場合、抗体Ｉ−３９４は、ヒトＣＤ３９に結合するが、ヒトアイソフォームＣＤ３９−Ｌ１、ＣＤ３９−Ｌ２、ＣＤ３９−Ｌ３又はＣＤ３９−Ｌ４の何れにも結合しないことを示す。
【００４９】
【図８】ＣＤ４Ｔ細胞活性化へのＡＴＰにより媒介されるＤＣ活性化の効果を評価するための実験手順を示し、ＡＴＰ活性化ＤＣを洗浄し、次いで５日間の混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のために同種のＣＤ４Ｔ細胞と共に（比１  ＭｏＤＣ／４  Ｔ細胞）インキュベートした。Ｔ細胞の活性化及び増殖をフローサイトメトリーによるＣＤ２５発現及びＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ希釈により分析した。
【００５０】
【図９】図９は、ｍｏＤＣによるＨＬＡ−ＤＲ発現を示し、図１０は、ｍｏＤＣによるＣＤ８３発現を示す。これらの図は、抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ−３９４及びＣＤ３９の化学的阻害剤が０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭのそれぞれでｍｏＤＣ活性化をもたらしたことを示す。しかしながら、抗ＣＤ３９抗体ＢＹ４０又は抗ＣＤ７３抗体は、樹状細胞（ＤＣ）のＡＴＰにより誘導される活性化を促進することができず、これは、抗体が、ＡＴＰの異化を回避するのに十分に酵素活性をブロックできないことを示唆する。凡例（上から下へ）は、グラフ中のバー（左から右へ）に対応する。
【００５１】
【図１０】図９は、ｍｏＤＣによるＨＬＡ−ＤＲ発現を示し、図１０は、ｍｏＤＣによるＣＤ８３発現を示す。この図は、抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ−３９４及びＣＤ３９の化学的阻害剤が０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭのそれぞれでｍｏＤＣ活性化をもたらしたことを示す。しかしながら、抗ＣＤ３９抗体ＢＹ４０又は抗ＣＤ７３抗体は、樹状細胞（ＤＣ）のＡＴＰにより誘導される活性化を促進することができず、これは、抗体が、ＡＴＰの異化を回避するのに十分に酵素活性をブロックできないことを示唆する。凡例（上から下へ）は、グラフ中のバー（左から右へ）に対応する。
【００５２】
【図１１】ＣＤ２５発現を示し、ＡＴＰの存在下で活性化されたＭｏＤＣがＭＬＲアッセイにおいてＴ細胞活性化及び増殖を誘導でき；抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ−３９４によるＡＴＰにより媒介されたＭｏＤＣ活性化の増強は、より高いＴ細胞増殖及び活性化をもたらしたことを示す。凡例（上から下へ）は、グラフ中のバー（左から右へ）に対応する。
【００５３】
【図１２】対照（１群）ＰＢＳ又はオキサリプラチン化学療法（２群）のいずれかで腫瘍細胞生着後５日目に処置されたマウスにおける腫瘍増殖及び生存を示す。並行して、オキサリプラチンで処置されたマウスの１つの群に抗ＣＤ３９抗体を週２回注入し、抗ＣＤ３９抗体処置はオキサリプラチン処置のちょうど１日前（４日目）に開始した。このことは、ＣＤ３９が既に完全に阻害された腫瘍環境でオキサリプラチンがＡＴＰ放出を誘導し、したがって腫瘍内ＣＤ３９によるＡＴＰ分解の最適な防止が提供されることを確実にする。
【００５４】
【図１３】対照（１群）ＰＢＳ、抗ＣＤ３９抗体、オキサリプラチン、又はオキサリプラチン及び抗ＣＤ３９抗体の組み合わせのいずれかで腫瘍細胞生着後５日目に処置されたマウスにおける腫瘍増殖及び生存を示す。オキサリプラチン注入は、１回目のオキサリプラチン注入から１週間後、Ｉ−３９４抗体での処置のちょうど１日後に再び反復され、ＡＴＰ分解の最適な阻害を提供した。
【００５５】
詳細な記載
定義
明細書で使用される「ａ」又は「ａｎ」は、１又は複数を意味し得る。請求項において使用されるように、「含む」という単語と組み合わせて使用される場合、「ａ」又は「ａｎ」という単語は１又は複数を意味し得る。ここで使用されるとき、「別の」は、少なくとも第二以上を意味し得る。
【００５６】
「含む」が使用される場合、これは、「から基本的になる」又は「からなる」に任意選択により置き換えられ得る。
【００５７】
ヒトＣＤ３９（ＮＴＰｄアーゼ１、ＥＮＴＰＤ１、ＡＴＰＤアーゼ及び血管ＡＴＰジホスホヒドロラーゼとしても既知である）は、ＡＴＰアーゼ活性を示す。ＣＤ３９は、細胞外ＡＴＰ及び細胞外ＡＤＰをＡＭＰに加水分解する膜結合タンパク質であり、このＡＭＰは、別の酵素５−プライムヌクレオチダーゼによりアデノシンにさらに変換される。ヒトＣＤ３９成熟ポリペプチド鎖のアミノ酸配列は、受入番号Ｐ４９９６１においてＧｅｎｂａｎｋで示されており（この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）、且つ下記のとおりである。
【化１】
2021502980.tif 000003
【００５８】
本明細書に関連して、「阻害する」、「阻害すること」、「中和する」又は「中和すること」は、ＣＤ３９ポリペプチドを指す場合（例えば、「ＣＤ３９を中和する」、「ＣＤ３９の活性を中和する」又は「ＣＤ３９の酵素活性を中和する」など）、ＣＤ３９のＡＴＰ加水分解（ＡＴＰアーゼ）活性が阻害されるプロセスを指す。これは、特にＡＭＰ及び／又はＡＤＰのＣＤ３９により媒介される生成の阻害を含み、すなわちＡＴＰからＡＭＰ及び／又はＡＤＰへのＣＤ３９により媒介される異化の阻害を含む。これを、例えばＡＴＰからＡＭＰ及び／又はＡＤＰへの変換を阻害する試験化合物の能力を測定する細胞アッセイにおいて直接的又は間接的に測定し得る。例えば、本明細書で説明されているように、ＡＴＰの消失及び／又はＡＭＰの生成を評価し得る。ある実施形態において、例えば本明細書で説明されたアッセイ（例えば、ＡＴＰの消失及び／又はＡＭＰの生成）を参照すると、抗体調製物は、ＡＴＰからＡＭＰへの変換の少なくとも６０％の減少を生じさせるか、ＡＴＰからＡＭＰへの変換の少なくとも７０％の減少を生じさせるか、又はＡＴＰからＡＭＰへの変換の少なくとも８０％又は９０％の減少を生じさせる。
【００５９】
「ＥＣ５０」に関して、薬剤及び特定の活性（例えば、細胞への結合、酵素活性の阻害、免疫細胞の活性化又は阻害）は、そのような活性に関する最大反応又は効果の５０％を製造する薬剤の効果的な濃度を指す。「ＥＣ１００」に関して、薬剤及び特定の活性は、そのような活性に関して実質的に最大反応を製造する薬剤の効果的な濃度を指す。
【００６０】
用語「抗体」は、本明細書で使用される場合、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体を指す。重鎖中の定常ドメインのタイプに応じて、抗体は、下記の５種の主要なクラスの１つに割り当てられる：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ。これらのいくつかは、サブクラス又はアイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４及び同類のもの）にさらに分類される。代表的な免疫グロブリン（抗体）構造単位は、四量体を含む。各四量体は、ポリペプチド鎖の２つの同一の対から構成され、各対は１本の「軽」鎖（約２５ｋＤａ）及び１本の「重」鎖（約５０〜７０ｋＤａ）を有する。各鎖のＮ末端は、抗原認識に主に関与する約１００〜１１０又はそれを超えるアミノ酸の可変領域を定める。可変軽鎖（ＶＬ）及び可変重鎖（ＶＨ）という用語は、これらの軽鎖及び重鎖をそれぞれ指す。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、「アルファ」、「デルタ」、「イプシロン」、「ガンマ」及び「ミュー」とそれぞれ呼ばれる。免疫グロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配置は周知である。ＩｇＧは、生理学的状況において最も共通する抗体であるため、及び実験室で最も容易に製造されるため、本明細書中で使用される抗体の代表的なクラスである。任意選択により、本抗体はモノクローナル抗体である。抗体の特定の例は、ヒト化、キメラ、ヒト又はそうでなければヒトに適切な抗体である。「抗体」は、本明細書中に記載の抗体の何れかの何らかの断片又は誘導体も含む。
【００６１】
「特異的に結合する」という語は、単離標的細胞の表面上に存在するタンパク質、その中のエピトープ又はネイティブタンパク質の何れかの組換え形態を用いて評価した場合、抗体が好ましくは競合的結合アッセイにおいて結合パートナー、例えばＣＤ３９に結合し得ることを意味する。競合的結合アッセイ及び特異的な結合を決定するための他の方法は、当該義技術分野で周知である。例えば結合は、放射性標識、質量分析などの物理的方法、又は例えば細胞蛍光測定分析（例えば、ＦＡＣＳｃａｎ）を使用して検出される直接又は間接蛍光標識を介して検出し得る。対照的な非特異的な薬剤で見られる量を超える結合は、該薬剤が標的に結合することを示す。
【００６２】
抗体が特定のモノクローナル抗体と「競合する」と言われる場合、これは、本抗体が、組換え分子（例えば、ＣＤ３９）又は表面発現分子（例えば、ＣＤ３９）の何れかを用いた結合アッセイにおいて、モノクローナル抗体と競合することを意味する。例えば、試験抗体が結合アッセイにおいて配列番号３の重鎖及び配列番号４の軽鎖を有する抗体のＣＤ３９ポリペプチド又はＣＤ３９発現細胞への結合を減少させる場合、本抗体は、そのような抗体とそれぞれ「競合する」と言われる。
【００６３】
「親和性」という用語は、本明細書中で使用される場合、エピトープへの抗体の結合の強度を意味する。抗体の親和性は、［Ａｂ］ｘ［Ａｇ］／［Ａｂ−Ａｇ］（式中、［Ａｂ−Ａｇ］は、抗体−抗原複合体のモル濃度であり、［Ａｂ］は未結合抗体のモル濃度であり、［Ａｇ］は未結合抗原のモル濃度である）として定められる解離定数Ｋｄにより与えられる。親和性定数Ｋａは、１／Ｋｄにより定義される。ｍＡｂの親和性を決定するための方法は、Harlow,et al.,Antibody:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1988),Coligan et al.,eds,Current Protocols in Immunology,Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience,N.Y.,(1992,1993)及びMuller,Meth.Enzymol.92:589-601(1983)で見出すことができ、この参考文献は、全体的に参照により本明細書中に組み込まれる。ｍＡｂの親和性を決定するための当技術分野で周知のある標準的な方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニング（ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置による分析など）の使用である。
【００６４】
本明細書に関連して、「決定基」はポリペプチド上の相互作用又は結合の部位を指す。
【００６５】
「エピトープ」という用語は、抗原性決定基を指し、抗体が結合する抗原上のエリア又は領域である。タンパク質エピトープは、直接結合に関与するアミノ酸残基並びに特異的な抗原結合抗体又はペプチドにより効果的に阻止されるアミノ酸残基、すなわち抗体の「フットプリント」内のアミノ酸残基を含み得る。これは、例えば、抗体又は受容体と組み合わせ得る複合抗原分子上の最も単純な形態又は最小構造領域である。エピトープは、直鎖状又は立体構造／構造であり得る。「直鎖状エピトープ」という用語は、アミノ酸の直鎖状配列（一次構造）上で隣接するアミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。「立体構造又は構造エピトープ」という用語は、全てが隣接しておらず、従って分子の折り畳みにより互いに対して近接するようになるアミノ酸の直鎖状配列の分離部分を表す（二次、三次及び／又は四次構造）アミノ酸残基から構成されるエピトープとして定義される。立体構造エピトープは三次元構造に依存する。従って、「立体構造」という用語は、「構造」と交換可能に使用されることが多い。
【００６６】
「枯渇する」又は「枯渇」という用語は、腫瘍細胞に関して、殺傷、除去、溶解又はそのような殺傷、除去又は溶解の誘導をもたらし、サンプル又は対象中に存在するそのような腫瘍細胞の数に悪影響を与えるプロセス、方法、又は化合物を意味する。
【００６７】
用語「内在化」（「細胞内内在化」と交換可能に使用される）は、細胞の細胞外表面から細胞の細胞内表面に分子を移行させるプロセスに関連する分子的な、生化学的な、及び細胞の事象を指す。分子の細胞内内在化の原因となるプロセスは、周知であり、特に細胞外分子（例えば、ホルモン、抗体及び小さい有機分子）、膜関連分子（例えば、細胞表面受容体）並びに細胞外分子に結合した膜関連分子の複合体（例えば、膜貫通受容体に結合したリガンド又は膜関連分子に結合した抗体）の内在化を伴い得る。そのため、「内在化の誘導及び／又は増加」は、細胞内内在化が開始される事象並びに／又は細胞内内在化の速度及び／若しくは程度が増加する事象を含む。
【００６８】
「薬剤」という用語は、本明細書中で、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生体高分子又は生体物質から製造される抽出物を指すために使用される。「治療剤」という用語は、生物学的活性を有する薬剤を指す。
【００６９】
本明細書中での目的のために、「ヒト化」又は「ヒト」抗体は、１個又は複数のヒト免疫グロブリンの定常及び可変フレームワーク領域が動物免疫グロブリンの結合領域、例えばＣＤＲと融合される抗体を指す。このような抗体は、結合領域が由来する非ヒト抗体の結合特異性を維持するが、非ヒト抗体に対する免疫反応を回避するために設計される。このような抗体は、抗原負荷に反応して特異的なヒト抗体を製造させるために「操作」されている、トランスジェニックマウス又は他の動物から入手し得る（例えば、全体的な教示が参照により本明細書中に組み込まれる、Green et al.(1994)Nature Genet 7:13;Lonberg et al.(1994)Nature 368:856;Taylor et al.(1994)Int Immun 6:579を参照されたい）。全て当技術分野で周知である、遺伝学的又は染色体導入法並びにファージディスプレイ技術により完全ヒト抗体も構築し得る（例えば、McCafferty et al.(1990)Nature 348:552-553を参照されたい）。ヒト抗体は、インビトロ活性化Ｂ細胞によっても製造し得る（例えば、参照によりそれらの全体において組み込まれる米国特許第５，５６７，６１０号明細書及び同第５，２２９，２７５号明細書を参照されたい）。
【００７０】
「キメラ抗体」は、（ａ）抗原結合部位（可変領域）が、異なるか若しくは改変されているクラス、エフェクター機能及び／若しくは種の定常領域又はキメラ抗体に新しい特性を付与する完全に異なる分子、例えば酵素、毒素、ホルモン、成長因子、薬物などに連結されるように、定常領域又はそれらの一部が改変されるか、置き換えられるか、又は交換されているか、又は（ｂ）可変領域又はそれらの一部が改変されるか、置き換えられるか、又は異なるか若しくは改変されている抗原特異性を有する可変領域と交換されている、抗体分子である。
【００７１】
「超可変領域」という用語は、本明細書中で使用される場合、抗原結合に関与する抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）及び８９〜９７（Ｌ３）及び重鎖可変ドメイン中の３１〜３５（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）及び９５〜１０２（Ｈ３）；Kabat et al.1991）及び／又は「超可変ループ」からの残基（例えば、軽鎖可変ドメイン中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）及び９１〜９６（Ｌ３）及び重鎖可変ドメイン中の２６〜３２（Ｈ１）、５３〜５５（Ｈ２）及び９６〜１０１（Ｈ３）；Chothia and Lesk,J.Mol.Biol1987;196:901-917）又は抗原結合に関与する必須アミノ酸を決定するための同様の系からのアミノ酸残基を含む。一般的には、この領域中のアミノ酸残基の付番は、Kabat et al.、前出に記載の方法により行われる。「Ｋａｂａｔ位置」、「Ｋａｂａｔにおけるような可変ドメイン残基付番」及び「Ｋａｂａｔによる」などの句は、本明細書中で、重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインに対するこの付番系を指す。Ｋａｂａｔ付番系を用いて、ペプチドの実際の直鎖状アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ若しくはＣＤＲの短縮又はそれへの挿入に対応する少数の又はさらなるアミノ酸を含有し得る。例えば、重鎖可変ドメインは、ＣＤＲ  Ｈ２の残基５２の後に１つのアミノ酸挿入（Ｋａｂａｔによる残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後に残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ付番は、「標準的な」Ｋａｂａｔ付番配列での抗体の配列の相動性の領域でのアライメントにより、特定の抗体に対して決定され得る。
【００７２】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、本明細書中で使用される場合、ＣＤＲとして定められる領域を除く、抗体可変ドメインの領域を意味する。各抗体可変ドメインフレームワークは、ＣＤＲにより分離される近接領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）にさらに分けられ得る。
【００７３】
「Ｆｃドメイン」、「Ｆｃ部分」及び「Ｆｃ領域」という用語は、例えば、ヒトγ（ガンマ）重鎖の約アミノ酸（ａａ）２３０〜約ａａ４５０からの、抗体重鎖のＣ末端断片又は他のタイプの抗体重鎖（例えば、ヒト抗体の場合、α、δ、ε及びμ）におけるその対応配列又はその天然のアロタイプを指す。別段の指定がない限り、免疫グロブリンに対する一般的に受容されるＫａｂａｔアミノ酸付番は、この開示を通じて使用される(Kabat et. al.(1991)Sequences of Protein of Immunological Interest,5th ed.,United States Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,ＭＤを参照されたい）。
【００７４】
「単離」、「精製」又は「生物学的に純粋」という用語は、実質的に又は基本的に、そのネイティブ状態で見られるような通常それに付随する成分を含まない物質を指す。純度及び均一性は、一般的にはポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析学的化学技術を用いて決定される。標品中に存在する主要な種であるタンパク質は実質的に精製されている。
【００７５】
「ポリペプチド」、「ペプチド」及び「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーを指すために本明細書中で交換可能に使用される。この用語は、１個又は複数のアミノ酸残基が対応する天然のアミノ酸の人工的な化学模倣物であるアミノ酸ポリマー並びに天然のアミノポリマー及び非天然のアミノポリマーに適用される。
【００７６】
「組換え」という用語は、例えば、細胞又は核酸、タンパク質又はベクターに関して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質又はベクターが異種核酸若しくはタンパク質の導入又はネイティブ核酸若しくはタンパク質の改変により修飾されているか、又は細胞が、そのように修飾された細胞に由来することを示す。従って、例えば、組換え細胞は、細胞のネイティブ（非組換え）形態内では見出されない遺伝子を発現するか、又はそうでなければ異常に発現されるか、発現が少ないか又は全く発現されないネイティブ遺伝子を発現する。
【００７７】
本明細書に関連して、ポリペプチド又はエピトープに「結合」する抗体という用語は、特異性及び／又は親和性をもって前記決定基に結合する抗体を指す。
【００７８】
「同一性」又は「同一である」という用語は、２つ以上のポリペプチドの配列間の関係において使用される場合、２つ以上の一連のアミノ酸残基間の一致数により決定される場合のポリペプチド間の配列関連性の度合いを指す。「同一性」は、特定の数学的モデル又はコンピュータープログラム（すなわち「アルゴリズム」）により扱われるギャップアライメント（存在する場合）を用いた２つ以上の配列のより小さいものの間の完全な一致のパーセントを評価する。関連ポリペプチドの同一性は、周知の方法により容易に計算され得る。このような方法としては、Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,ed.,Oxford University Press,New York,1988;Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,ed.,Academic Press,New York,1993;Computer Analysis of Sequence Data,Part 1,Griffin,A.M.and Griffin,H.G.,eds.,ヒトa Press,New Jersey,1994;Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987;Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.and DevereuX,J.,eds.,M.Stockton Press,New York,1991;及びCarillo et al.,SIAM J.Applied Math.48,1073(1988)に記載のものが挙げられるが限定されない。
【００７９】
同一性を決定するための方法は、試験される配列間の一致が最大となるように設計される。同一性を決定する方法は、公開されているコンピュータープログラムに記載されている。２つの配列間の同一性を決定するためのコンピュータープログラム法としては、ＧＡＰ(Devereux et al.,Nucl.Acid.Res.12,387(1984);Genetics Computer Group, University of Wisconsin,Madison,Wis.)、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮ及びＦＡＳＴＡ(Altschul et al.,J.Mol.Biol.215,403-410(1990))を含む、ＧＣＧプログラムパッケージが挙げられる。ＢＬＡＳＴＸプログラムは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）及び他のソース(BLAST Manual,Altschul et al.NCB/NLM/NIH Bethesda,Md.20894;Altschul et al.、前出)から公開されている。周知のＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムも同一性を決定するために使用し得る。
【００８０】
ＣＤ３９を阻害する薬剤
本明細書に従って使用するためのＣＤ３９に結合して阻害する薬剤は、ＣＤ３９タンパク質、例えば細胞の表面で発現する可溶性ＣＤ３９タンパク質（ｓＣＤ３９）、単量体ＣＤ３９タンパク質、膜結合型ＣＤ３９タンパク質（ｍｅｍＣＤ３９）のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害するか又は中和する抗原結合ドメイン又はそれを含むタンパク質、任意選択により抗体又は抗体フラグメントであり得る。
【００８１】
ある実施形態においてｓＣＤ３９タンパク質は、膜結合型ＣＤ３９中で見出される２個の膜貫通ドメイン（つまり、Ｎ末端及びＣ末端の付近の膜貫通ドメイン）を欠くＣＤ３９タンパク質である。ある実施形態において、ｓＣＤ３９は、例えばヒト個体における、循環において見出される非膜結合型ｓＣＤ３９タンパク質である。ある実施形態において、ｓＣＤ３９は配列番号２のアミノ酸配列を含むか又はこの配列からなる（任意選択によりＣ末端タグ又は別の非ＣＤ３９由来アミノ酸配列をさらに含む）。ある実施形態において、タンパク質、抗体又は抗体フラグメントは、溶液中でｓＣＤ３９とインキュベートすると、例えば、本明細書中で開示される方法に従って、ｓＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害する。ある実施形態において、タンパク質、抗体又は抗体フラグメントは、可溶性（細胞外ドメインタンパク質）及び膜結合形態の両方でヒトＣＤ３９タンパク質に特異的に結合する。
【００８２】
ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、細胞表面発現ＣＤ３９の細胞内内在化、又はより一般にはダウンモジュレーション（down-modulation）を増加又は誘導しない及び／又はそのＣＤ３９阻害活性についてそれに依存しない。
【００８３】
ある態様において、抗ＣＤ３９抗体は、（ａ）細胞の表面で発現する膜結合型ＣＤ３９タンパク質（例えば、配列番号１のアミノ酸配列を含む）の酵素活性を阻害する、及び（ｂ）可溶性ＣＤ３９タンパク質（例えば、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤ３９タンパク質、その膜貫通ドメインを欠くＣＤ３９タンパク質）の酵素活性を阻害することができる。
【００８４】
ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ヒトＦｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６、ＣＤ３２ａ、ＣＤ３２ｂ、ＣＤ６４）及び／又はＣ１ｑに、（例えば、そのＦｃドメインを介して）実質的に結合しない、及び／又はＡＤＣＣ及び／又はＣＤＣをＣＤ３９発現細胞に実質的に向けない。任意選択により、該抗体は、（例えば、ヒトＩｇＧアイソタイプの）Ｆｃドメインを保持し、ヒトＦｃＲｎへの結合を保持する。
【００８５】
ある実施形態において、ＣＤ３９中和抗体は、ｓＣＤ３９ポリペプチドの及び／又は単量体ＣＤ３９ポリペプチドのＡＴＰアーゼ活性の低下を引き起こすことができることを特徴とし得、任意選択により可溶性単量体ヒトＣＤ３９タンパク質、例えば配列番号２のアミノ酸配列からなるＣＤ３９タンパク質によるＡＭＰ生成の低下を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％引き起こすことができることを特徴とし得る。
【００８６】
ある実施形態において、ＣＤ３９中和抗体は、ＣＤ３９の細胞のＡＴＰアーゼ活性の低下を引き起こすことができることを特徴とし得、任意選択により、ＣＤ３９発現細胞によるＡＭＰ生成の低下を少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％引き起こすことができることを特徴とし得る。ある実施形態において、ＣＤ３９中和抗体は、１μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．５μｇ／ｍｌ以下、任意選択により０．２μｇ／ｍｌ以下の細胞により発現されるＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性の阻害に対するＥＣ５０（例えば、ＣＤ３９発現細胞によるＡＭＰ生成の阻害に対するＥＣ５０）を特徴とし得る。
【００８７】
ある実施形態において、ＣＤ３９中和抗体は、ヒト単球由来の樹状細胞が抗体及びＡＴＰと共にインビトロでインキュベートされると、ヒト単球由来の樹状細胞（ｍｏＤＣ）における活性化の細胞表面マーカーの発現の増加を引き起こすことができることを特徴とし得、任意選択により、ＡＴＰは外因的に添加されたＡＴＰであり、任意選択によりさらに、添加されたＡＴＰは０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭで提供される。
【００８８】
抗原結合化合物は、本明細書でさらに説明されるように製造され得、任意の所望の段階において、ＣＤ３９の酵素活性を阻害する、特にｓＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性をブロックし、可溶性ＣＤ３９タンパク質による、及び任意選択によりさらにＣＤ３９発現細胞によるＡＤＰ及びＡＭＰ（及びＣＤ７３、アデノシンと一緒に）の産生を減少させ、次いでＡＴＰにより媒介される樹状細胞活性の活性化及び／又はＴ細胞増殖を回復させる能力について評価され得る。
【００８９】
抗体の阻害活性（例えば、免疫増強能力）も、例えばＡＴＰの消失（加水分解）及び／又はＡＭＰの生成を検出するためのアッセイで評価し得る。
【００９０】
可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質を阻害する抗体の能力を、可溶性ＣＤ３９タンパク質（例えば、実施例１で産生される、配列番号２のアミノ酸配列を有するＣＤ３９タンパク質、任意選択により、精製タグ又は他の機能する若しくは機能しない非ＣＤ３９由来のアミノ酸配列をさらに含む）と共に試験抗体をインキュベートした後にＡＴＰを検出することにより試験し得る。例えば、実施例を参照されたい。簡潔に説明すると、試験抗体の用量範囲を３７℃で１時間にわたり実施例で説明する可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質と共にインキュベートするアッセイにおいて、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＴＰを定量し得る。３７℃でさらに３０分にわたりプレートに２０μＭのＡＴＰを添加した後、ＣＴＧ試薬を添加する。暗所での５分間の短いインキュベーション後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）ルミノメーターを使用して放射光を定量する。
【００９１】
ＣＤ３９タンパク質を発現する細胞を阻害する抗体の能力を、細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞、ＣＤ３９が遺伝子移入された細胞等）と共に試験抗体をインキュベートした後にＡＴＰを検出することにより試験し得る。例えば、実施例を参照されたい。細胞を試験抗体と共に３７℃で１時間にわたりインキュベートし得る。次いで、細胞を３７℃でさらに１時間にわたり２０μＭのＡＴＰと共にインキュベートする。プレートを４００ｇで２分にわたり遠心分離し、細胞上清を発光マイクロプレート（白色ウェル）に移す。この上清にＣＴＧを添加し、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）ルミノメーターを使用して、暗所での５分間のインキュベーション後に放射光を定量する。抗ＣＤ３９抗体の有効性を、抗体の存在下での放射光と、ＡＴＰのみ（最大光放射）並びにＡＴＰ及び細胞（最小光放射）とを比較することにより決定する。
【００９２】
抗体の存在下でのＡＭＰへのＡＴＰの加水分解の減少、及び／又はＡＴＰの増加、及び／又はＡＭＰの生成の減少は、この抗体がＣＤ３９を阻害することを示す。ある実施形態において、例えば実施例１のように、試験抗体と共に、ＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞（例えば、Ｒａｍｏｓ細胞）をインキュベートした後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＴＰを検出することにより評価した場合、抗体調製物は、細胞により発現されるＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも６０％の低下を生じさせることができ、好ましくは、この抗体は、細胞中においてＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも７０％、８０％又は９０％の低下を生じさせる。
【００９３】
ある実施形態において、例えば実施例１のように、試験抗体と共に可溶性組換えＣＤ３９ポリペプチドをインキュベートした後、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用してＡＴＰを検出することにより評価した場合、抗体調製物は、可溶性組換えＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも６０％の低下を生じさせることができ、好ましくは、可溶性組換えＣＤ３９ポリペプチドの酵素活性の少なくとも７０％、８０％又は９０％の低下を生じさせることができる。
【００９４】
ある実施例において、本開示の方法で使用可能な抗ＣＤ３９抗体又は抗原結合ドメインを生成又は特定するためのインビトロ方法（例えば、腫瘍細胞からのＡＴＰの放出を誘導する薬剤と組み合わせての使用のための）が提供され、該方法は、以下のステップ：
（ａ）ヒトＣＤ３９ポリペプチドに結合する複数の抗体を提供すること、
（ｂ）それぞれの抗体を、ＡＴＰの存在下でヒト単球由来の樹状細胞（ｍｏＤＣ）と接触させること、任意選択によりＡＴＰは外因的に添加されたＡＴＰである、及び
（ｃ）ｍｏＤＣにおける活性化の細胞表面マーカーの発現の増加をもたらすステップ（ｂ）の抗体を選択すること
を含む。
【００９５】
任意選択により、本明細書中のいずれの実施形態においても、中和抗ＣＤ３９抗体は、細胞表面で発現されるｓＣＤ３９及びＣＤ３９（ｍｅｍＣＤ３９）の両方に存在する抗原性決定基に結合する。
【００９６】
任意選択により、本明細書中のいずれかの実施形態においても、中和抗ＣＤ３９抗体は、抗体Ｉ−３９４が結合するＣＤ３９上のエピトープへの結合について競合する（例えば、ＣＤ３９ポリペプチド上のエピトープへの結合について、Ｉ−３９４のいずれかの重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域を有する抗体と競合する）。
【００９７】
任意選択により、本明細書中のいずれかの実施形態においても、中和抗ＣＤ３９抗体は、モノクローナル抗体Ｉ−３９４と同じエピトープへ結合する及び／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合について競合する（例えば、Ｉ−３９４の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ又は可変領域を有する抗体とＣＤ３９ポリペプチドへの結合について競合する）。ある実施形態において、中和抗ＣＤ３９抗体は、配列番号３及び４のＶＨ及びＶＬ領域をそれぞれ有する抗体と同じエピトープに結合する及び／又はＣＤ３９ポリペプチドへの結合について競合する。
【００９８】
任意選択により、本明細書中のいずれかの実施形態においても、抗ＣＤ３９抗体は、Ｉ−３９４が結合するＣＤ３９上のアミノ酸残基からなる群から選択される１つ、２つ、又は３つのアミノ酸残基を含むエピトープに結合する。
【００９９】
任意選択により、本明細書中の何れの実施形態においても、結合分子（例えば、抗ＣＤ３９抗体）は、本明細書で説明される軽鎖ＣＤＲ１、２及び３を含む可変重鎖ドメイン（ＶＨ）、及び本明細書で説明される重鎖ＣＤＲ１、２及び３を含む可変軽鎖ドメイン（ＶＬ）、又はＣＤＲが上記ＣＤＲ（又は上記の重及び／又は軽鎖ＣＤＲのセット）に少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％アミノ酸同一性を有するアミノ酸を含む。本明細書中の実施形態のいずれの態様においても、抗体は、抗体Ｉ−３９４の重鎖可変領域（ＶＨ）の３つのＣＤＲを含む重鎖及び抗体Ｉ−３９４の軽鎖可変領域（ＶＬ）の３つのＣＤＲを含む軽鎖を含み得る。
【０１００】
任意選択により、本明細書中の何れの実施形態においても、抗ＣＤ３９抗体は、ＦｃドメインとヒトＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及び／又はＣＤ６４ポリペプチドとの間の結合を（同一のアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）減少させるように改変されるＦｃドメインを含み、任意選択により抗体は、（ｉ）配列番号３の重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む重鎖と、（ｉｉ）配列番号４の軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む軽鎖とを含む、抗体である。ある態様において、Ｆｃドメインは、ＦｃドメインとヒトＣ１ｑポリペプチドとの間の結合を（同一のアイソタイプの野生型Ｆｃドメインと比較して）減少させるように改変される。ある実施形態において、抗体は、２２０、２２６、２２９、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２４３、２６４、２６８、２９７、２９８、２９９、３０９、３１０、３１８、３２０、３２２、３２７、３３０及び３３１（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）からなる群から選択される残基のいずれか１つ、２つ、３つ、４つ、５つ又はより多くで重鎖定常領域中にアミノ酸置換を含む。ある実施形態において、抗体は、２３４、２３５、２３７、３２２、３３０及び３３１からなる群から選択される残基のいずれか３つ、４つ、５つ又はより多くで重鎖定常領域中にアミノ酸置換を有する。ある実施形態において、抗体は下記に示されるアミノ酸配列を含むＦｃドメインを含む。
【０１０１】
ある実施形態において、抗体は、下記のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％、９５％又は９９％同一であるが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１（下線付き）にアミノ酸残基を保持するアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はＦｃドメインを含む。
【化２】
2021502980.tif 000004
【０１０２】
ある実施形態において、抗体は、下記のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％、９５％又は９９％同一であるが、アミノ酸残基をＫａｂａｔ位置２３４、２３５及び３３１（下線付き）に保持するアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はＦｃドメインを含む。
【化３】
2021502980.tif 000005
【０１０３】
ある実施形態において、抗体は、下記のアミノ酸配列、又はそれと少なくとも９０％、９５％又は９９％同一であるが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７、３３０及び３３１（下線付き）にアミノ酸残基を保持するアミノ酸配列を含む重鎖定常領域又はＦｃドメインを含む。
【化４】
2021502980.tif 000006
【０１０４】
ある実施形態において、抗体は、下記のアミノ酸配列、又はそれと９０％、９５％又は９９％同一であるが、Ｋａｂａｔ位置２３４、２３５、２３７及び３３１（下線付き）にアミノ酸残基を保持する配列を含む重鎖定常領域又はＦｃドメインを含む。
【化５】
2021502980.tif 000007
【０１０５】
ある態様において、抗ＣＤ３９抗体は、抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９と同じエピトープに結合する。ある実施形態において、この抗体は、抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９が結合するエピトープと少なくとも部分的に重複するか、又はこのエピトープ中の少なくとも１個の残基を含むＣＤ３９のエピトープに結合する。この抗体が結合する残基は、ＣＤ３９ポリペプチドの表面上（例えば、細胞の表面上で発現されるＣＤ３９ポリペプチド中）に存在すると特定され得る。
【０１０６】
ＣＤ３９突然変異体が遺伝子移入された細胞への抗ＣＤ３９抗体の結合を測定し得、且つ抗ＣＤ３９抗体の、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、配列番号１）に結合する能力と比較し得る。抗ＣＤ３９抗体と突然変異体ＣＤ３９ポリペプチド（例えば、表１の突然変異体）との間の結合の減少は、（例えば、特定の突然変異体を発現する細胞のＦＡＣＳ試験のような既知の方法により測定した場合若しくは突然変異体ポリペプチドへの結合のＢｉａｃｏｒｅ試験により測定した場合に）結合親和性の減少が存在すること、及び／又は（例えば、抗ＣＤ抗体濃度対ポリペプチド濃度のプロットにおいてＢｍａｘの減少により実証される場合に）抗ＣＤ３９抗体の総結合能力の減少が存在することを意味する。結合の有意な減少は、抗ＣＤ３９抗体がＣＤ３９に結合している場合、突然変異した残基が抗ＣＤ３９抗体への結合に直接関与していること、又はこの結合タンパク質に近接していることを示す。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、結合の有意な減少は、抗ＣＤ３９抗体と突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドとの間の結合親和性及び／又は結合能力が、この抗体と野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間の結合と比較して４０％超、５０％超、５５％超、６０％超、６５％超、７０％超、７５％超、８０％超、８５％超、９０％超又は９５％超減少していることを意味する。特定の実施形態において、結合は、検出可能な限界未満まで減少する。いくつかの実施形態において、結合の有意な減少は、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドへの抗ＣＤ３９抗体の結合が、この抗ＣＤ３９抗体と野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの間で観測されているものの、５０％未満（例えば、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％又は１０％未満）である場合に証明される。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９が結合するアミノ酸残基を含むセグメント中の残基が異なるアミノ酸に置換されている突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドについての有意に低い結合を示す。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９が結合するＣＤ３９上のエピトープに結合する抗ＣＤ３９抗体（例えば、Ｉ−３９４以外）が提供される。
【０１１０】
ある態様において、抗体は、Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２（配列番号１を基準とする）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、該残基の１つ、２つ又は３つ）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
【０１１１】
ある態様において、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号１のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ又は３つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少（例えば、実質的に完全な結合の喪失）を示し；任意選択により、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｒ１３８Ａ、Ｍ１３９Ａ及びＥ１４２Ｋを有する。任意選択のある態様において、該抗体は、突然変異体１９以外の表１の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドの何れかへの結合を喪失していない。別の任意選択の態様において、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号１のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ、３つ又は４つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少を（任意選択により減少しているが、実質的に完全ではない結合の喪失；又は任意選択により、実質的に完全な結合の喪失）示し、任意選択により、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｑ９６Ａ、Ｎ９９Ａ、Ｅ１４３Ａ及びＲ１４７Ｅを有する。
【０１１２】
ある態様において、抗体は、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、該残基の１つ、２つ、３つ又は４つ）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。ある態様において、抗体は、抗体と、配列番号１のアミノ酸配列を含む野生型ＣＤ３９ポリペプチドとの結合と比較して、それぞれの場合にＱ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される１つ、２つ、３つ、又は４つの残基で突然変異を含む突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドへの結合が減少している（例えば、実質的に完全な結合の喪失）。
【０１１３】
ある態様において、抗体は、（ａ）Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２（配列番号１を基準とする）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば該残基の１つ、２つ又は３つ）、及び（ｂ）Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、該残基の１つ、２つ、３つ又は４つ）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
【０１１４】
ある態様において、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号１のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、それぞれの場合に（ａ）Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ、３つ又は４つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチド、及び（ｂ）Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ、又は３つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドの両方への結合の減少（例えば、実質的に完全な喪失）を示す。任意選択により、（ａ）の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｑ９６Ａ、Ｎ９９Ａ、Ｅ１４３Ａ及びＲ１４７Ｅを有する。任意選択により、（ｂ）の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｒ１３８Ａ、Ｍ１３９Ａ及びＥ１４２Ｋを有する。任意選択により、抗体は、突然変異体５及び１９以外の表１の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドの何れかへの結合を喪失していない。
【０１１５】
ある態様において、抗体は、Ｋ８７、Ｅ１００及びＤ１０７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、該残基の１つ、２つ、３つ又は４つ）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
【０１１６】
ある態様において、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号１のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｋ８７、Ｅ１００及びＤ１０７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ、３つ又は４つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少（例えば、実質的に完全な結合の喪失）を示す。任意選択により、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｋ８７Ａ、Ｅ１００Ａ及びＤ１０７Ａを有する。任意選択により、抗体は、突然変異体１５以外の表１の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドの何れかへの結合を喪失していない。
【０１１７】
ある態様において、抗体は、Ｎ３７１、Ｌ３７２、Ｅ３７５、Ｋ３７６及びＶ３７７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択されるアミノ酸残基（例えば、該残基の１つ、２つ、３つ又は４つ）を含むＣＤ３９上のエピトープに結合する。
【０１１８】
ある態様において、抗ＣＤ３９抗体は、野生型ＣＤ３９ポリペプチド（配列番号１のＣＤ３９ポリペプチド）と比較して、Ｎ３７１、Ｌ３７２、Ｅ３７５、Ｋ３７６及びＶ３７７（配列番号１を基準とする）からなる群から選択される残基の１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つで突然変異を有するＣＤ３９ポリペプチドへの結合の減少（例えば、実質的に完全な喪失）を示し；任意選択により、突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドは、突然変異Ｎ３７１Ｋ、Ｌ３７２Ｋ、Ｅ３７５Ａ、Ｋ３７６Ｇ及びＶ３７７Ｓ、及び残基３７６と３７７との間のバリンの挿入を有する。任意選択により、該抗体は、突然変異体１１以外の表１の突然変異体ＣＤ３９ポリペプチドの何れかへの結合を喪失していない。
【０１１９】
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、下記を含み得る：アミノ酸配列：ＤＹＮＭＨ（配列番号５）若しくはその少なくとも４個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＹＩＶＰＬＮＧＧＳＴＦＮＱＫＦＫＧ（配列番号６）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ２であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＧＴＲＦＡＹ（配列番号７）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ３であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＥＳＶＤＮＦＧＶＳＦＭＹ（配列番号８）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＧＡＳＮＱＧＳ（配列番号９）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸配列：ＱＱＴＫＥＶＰＹＴ（配列番号１０）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個若しくは８個の連続したアミノ酸の配列を含む、Ｉ−３９４のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、欠失され得るか若しくは異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ３領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ付番に従い得る。
【０１２０】
ヒトｓＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害する抗体の代表的な抗ＣＤ３９  ＶＨ及びＶＬペアは、抗体Ｉ−３９４のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は下記に列挙されており（配列番号３）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は下記に列挙されている（配列番号４）。Ｋａｂａｔ付番によるＣＤＲは、配列番号３及び４中に下線を引いている。任意選択により、ＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、このフレームワークを組み入れるように改変されている）。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号３のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番に従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号４のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番に従う）を含む。
Ｉ−３９４ＶＨ：
【化６】
2021502980.tif 000008
Ｉ−３９４ＶＬ：
【化７】
2021502980.tif 000009
【０１２１】
本開示に係る別の代表的な抗ＣＤ３９  ＶＨ及びＶＬのペアは、抗体Ｉ−３９５のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されており（配列番号１１）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されている（配列番号１２）。配列番号１１及び配列番号１２において、Ｋａｂａｔ付番に従うＣＤＲに下線を引いている。任意選択により、このＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、このフレームワークを組み入れるように改変されている）。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番に従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１２のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番に従う）を含む。
Ｉ−３９５ＶＨ：
【化８】
2021502980.tif 000010
Ｉ−３９５ＶＬ：
【化９】
2021502980.tif 000011
【０１２２】
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、下記を含み得る：アミノ酸配列：ＤＹＮＭＨ（配列番号１３）若しくはその少なくとも４個の連続したアミノ酸の配列を含むＩ−３９５のＨＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＹＩＮＰＮＮＧＧＴＴＹＮＱＫＦＫＧ（配列番号１４）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＩ−３９５のＨＣＤＲ２であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＧＴＲＦＡＳ（配列番号１５）又はその少なくとも４個、５個、６個の連続したアミノ酸の配列を含むＩ−３９５のＨＣＤＲ３であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＹ（配列番号１６）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＩ−３９５のＬＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＡＡＳＴＱＧＳ（配列番号１７）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＩ−３９５のＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸配列：ＱＱＳＫＥＶＰＦＴ（配列番号１８）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個若しくは８個の連続したアミノ酸の配列を含む、Ｉ−３９６のＩ−３９５のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、欠失され得るか若しくは異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ３領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ付番に従い得る。
【０１２３】
本開示に係る別の代表的な抗ＣＤ３９  ＶＨ及びＶＬのペアは、抗体Ｉ−３９６のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されており（配列番号１９）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されている（配列番号２０）。配列番号１９及び配列番号２０において、Ｋａｂａｔ付番に従うＣＤＲに下線を引いている。任意選択により、このＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、このフレームワークを組み入れるように改変されている）。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番に従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番に従う）を含む。
Ｉ−３９６ＶＨ：
【化１０】
2021502980.tif 000012
Ｉ−３９６ＶＬ：
【化１１】
2021502980.tif 000013
【０１２４】
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、下記を含み得る：アミノ酸配列：ＤＴＹＩＮ（配列番号２１）若しくはその少なくとも４個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＲＩＤＰＡＮＧＮＴＫＹＤＰＫＦＱＧ（配列番号２２）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ２であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＷＧＹＤＤＥＥＡＤＹＦＤＳ（配列番号２３）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ３であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＲＡＳＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦＭＮ（配列番号２４）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＡＡＳＮＱＧＳ（配列番号２５）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸配列：ＨＱＳＫＥＶＰＷＴ（配列番号２６）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個若しくは８個の連続したアミノ酸の配列を含む、Ｉ−３９６のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、欠失され得るか若しくは異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ３領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ付番に従い得る。
【０１２５】
本開示に係る別の代表的な抗ＣＤ３９  ＶＨ及びＶＬのペアは、抗体Ｉ−３９９のものであり、その重鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されており（配列番号２７）、その軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記で列挙されている（配列番号２８）。配列番号２７及び配列番号２８において、Ｋａｂａｔ付番に従うＣＤＲに下線を引いている。任意選択により、このＶＨ及びＶＬは、ヒトアクセプターフレームワークを含む（例えば、このフレームワークを組み入れるように改変されている）。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域のＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番に従う）を含む。ある実施形態において、本開示の抗ＣＤ３９抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域のＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３（例えば、Ｋａｂａｔ付番に従う）を含む。
Ｉ−３９９ＶＨ：
【化１２】
2021502980.tif 000014
Ｉ−３９９ＶＬ：
【化１３】
2021502980.tif 000015
【０１２６】
抗ＣＤ３９抗体は、例えば、下記を含み得る：アミノ酸配列：ＳＦＷＭＮ（配列番号２９）若しくはその少なくとも４個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＥＩＤＰＳＤＦＹＴＮＳＮＱＲＦＫＧ（配列番号３０）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ２であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ２；アミノ酸配列：ＧＤＦＧＷＹＦＤＶ（配列番号３１）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＨＣＤＲ３であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＨＣＤＲ３；アミノ酸配列：ＳＡＳＳＳＩＮＳＮＹＬＨ（配列番号３２）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個、８個、９個若しくは１０個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ１であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ１；アミノ酸配列：ＲＴＳＮＬＡＳ（配列番号３３）又はその少なくとも４個、５個若しくは６個の連続したアミノ酸の配列を含むＬＣＤＲ２領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ２領域；及び／又はアミノ酸配列：ＱＱＧＳＳＬＰＲＴ（配列番号３４）又はその少なくとも４個、５個、６個、７個若しくは８個の連続したアミノ酸の配列を含む、Ｉ−３９９のＬＣＤＲ３領域であって、任意選択により、これらのアミノ酸の１個若しくは複数は、欠失され得るか若しくは異なるアミノ酸に置換され得る、ＬＣＤＲ３領域。ＣＤＲの位置は、Ｋａｂａｔ付番に従い得る。
【０１２７】
Ｉ−３９４抗体、Ｉ−３９５抗体、Ｉ−３９６抗体及びＩ−３９９抗体の何れかにおいて、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２、ＨＣＤＲ３及びＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２、ＬＣＤＲ３の配列（別々に各ＣＤＲ又は全てのＣＤＲ）は、Ｋａｂａｔ付番システムのもの（下線を引くことにより、ＶＨ及びＶＬの配列中に示す）、Ｃｈｏｔｈｉａ付番システムのもの若しくはＩＭＧＴ付番システムのもの又は任意の他の適切な付番システムであると指定され得る。
【０１２８】
いずれの態様においても、指定した可変領域、ＦＲ及び／又はＣＤＲの配列は、１個又は複数の配列改変を含み得、例えば置換（１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個又はより多くの配列改変）を含み得る。ある実施形態において、この置換は、保存的改変である。
【０１２９】
別の態様において、本抗ＣＤ３９化合物は、本明細書中で開示される抗体のＶＨドメインに対して少なくとも約６０％、７０％又は８０％の配列同一性、任意選択により少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＨドメインを含む。別の態様において、本抗ＣＤ３９抗体は、本明細書中で開示される抗体のＶＬドメインに対して少なくとも約６０％、７０％又は８０％の配列同一性、任意選択により少なくとも約８５％、９０％、９５％、９７％、９８％又は９９％の同一性を有するＶＬドメインを含む。
【０１３０】
任意選択により、本明細書中の何れの実施形態においても、抗ＣＤ３９抗体は、本明細書で説明される抗体、その重鎖及び／又は軽鎖、ＣＤＲ又は可変領域のいずれかの機能保存的変異体であることを特徴し得る。「機能保存的変異体」は、タンパク質又は酵素の特定のアミノ酸残基が、ポリペプチドの全体的なコンフォメーション及び機能を変えることなく変更されたものであり、同様の特性（例えば、極性、水素結合能力、酸性、塩基性、疎水性、芳香族など）を有するものとのアミノ酸の置換を包含するがこれに限定されない。保存されていると示されているもの以外のアミノ酸はタンパク質で異なり得るため、同様の機能の任意の２つのタンパク質間のパーセントタンパク質又はアミノ酸配列同一性は異なり得、たとえば、Ｃｌｕｓｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄなどによるアラインメントスキームに従って決定される７０％から９９％であり得、ここで同一性はＭＥＧＡＬＩＧＮアルゴリズムに基づく。「機能保存的変異体」は、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡアルゴリズムにより決定される少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８５％、さらに好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％のアミノ酸同一性を有し、比較されるネイティブ又は親タンパク質（たとえば、その重鎖又は軽鎖、又はＣＤＲ又は可変領域）と同じ又は実質的に同様の特性又は機能を有するポリペプチドを含む。ある実施形態において、抗体は、抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９の重鎖可変領域の機能保存的変異体である重鎖可変領域、及びそれぞれのＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９抗体の軽鎖可変領域の機能保存的変異体である軽鎖可変領域を含む。ある実施形態において、抗体は、本明細書中で開示されたヒト重鎖定常領域と融合した抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９の重鎖可変領域の機能保存的変異体である重鎖、任意選択により配列番号４４−４７のいずれかの定常領域、及びヒトＣカッパ軽鎖定常領域に融合したそれぞれのＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６、Ｉ−３９７、Ｉ−３９８又はＩ−３９９抗体の軽鎖可変領域の機能保存的変異体である軽鎖を含む。
【０１３１】
抗体の産生
抗ＣＤ３９抗体は、当技術分野で既知の様々な技術のいずれかにより製造し得る。一般的には、それらは、それぞれＣＤ３９ポリペプチドを含む免疫原で非ヒト動物、例えばマウスの免疫付与により、又はＣＤ３９ポリペプチドで候補結合ドメインのライブラリーをスクリーニングすることにより製造される。ＣＤ３９ポリペプチドは、それぞれヒトＣＤ３９ポリペプチドの完全長配列、又はその断片又は誘導体、一般的には免疫原性断片、すなわちＣＤ３９ポリペプチドを発現する細胞の表面上に露出したエピトープを含むポリペプチドの一部を含み得る。そのような断フラグメントは一般的には、成熟ポリペプチド配列の少なくとも約７個の連続したアミノ酸、さらにより好ましくは、その少なくとも約１０個の連続したアミノ酸を含有する。フラグメントは、一般的には、受容体の細胞外ドメインに基本的に由来する。ある実施形態において、免疫原は、一般的には細胞表面の脂質膜中に野生型ヒトＣＤ３９ポリペプチドを含む。特定の実施形態において、免疫原は、任意選択により処理されているか又は溶解している無傷の細胞、特に無傷のヒト細胞を含む。別の実施形態において、ポリペプチドは組換えＣＤ３９ポリペプチドである。
【０１３２】
非ヒト哺乳動物を抗原で免疫付与するステップを、マウス中で抗体の産生を刺激するための当技術分野で周知のあらゆる方法で実行し得る（例えば、その開示全体が参照により本明細書中に組み込まれるE. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)を参照されたい）。免疫原は、任意選択により完全又は不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントとともに、緩衝液中で懸濁又は溶解される。免疫原の量、緩衝液のタイプ、及びアジュバントの量を決定するための方法は、当業者に周知であり、決して限定的ではない。これらのパラメータは、様々な免疫原について様々であり得るが、簡単に解明される。
【０１３３】
同様に、抗体の産生を刺激するのに十分な免疫付与の位置及び頻度もまた、当該技術分野で周知である。典型的な免疫付与プロトコルにおいて、非ヒト動物は１日目に抗原を腹腔内に注入され、約１週間後に再び注入される。任意選択により、不完全フロイントアジュバントなどのアジュバントでの２０日目頃の抗原のリコール注入が、これに続く。リコール注入は、静脈内で行われ、数日間連続して反復され得る。静脈内又は腹腔内のいずれかでの、一般的にはアジュバントなしでの４０日目のブースター注入が、これに続く。このプロトコルは、約４０日後に抗原特異的な抗体産生Ｂ細胞の産生をもたらす。免疫付与において使用される抗原に向けられる抗体を発現するＢ細胞の産生をもたらす限り、他のプロトコルも使用し得る。
【０１３４】
モノクローナル抗体について、脾細胞が、免疫付与された非ヒト哺乳動物から単離され、それらの脾細胞と不死化細胞とがその後融合され、抗体産生ハイブリドーマが形成される。非ヒト哺乳動物からの脾細胞の単離は当技術分野で周知であり、一般的には麻酔された非ヒト哺乳動物から脾臓を摘出し、それを小片に切断し、細胞ストレーナーのナイロンメッシュにより脾細胞を脾膜から適当な緩衝液中に絞り、単一細胞懸濁液を製造することを含む。細胞は、いかなる赤血球をも溶解する緩衝液中で、洗浄、遠心分離、及び再懸濁される。溶液は、再度遠心分離され、ペレット中に残っているリンパ球は、最終的に新鮮な緩衝液中に再懸濁される。
【０１３５】
リンパ球を分離して単一の細胞懸濁液に入れると、リンパ球は、不死細胞系に融合され得る。これは一般的には、マウス骨髄腫細胞系だが、ハイブリドーマを作成するのに役立つ他の多くの不死細胞系が、当技術分野では既知である。マウス骨髄腫株は、Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, U. S. A.から利用可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍、American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U. S. A.から利用可能なＸ６３  Ａｇ８６５３及びＳＰ−２細胞に由来するものを含むが、これらに限定されない。融合は、ポリエチレングリコールなどを使用して行われる。次に、得られたハイブリドーマは、融合していない親骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する１個又は複数の物質を含有する選択培地中で増殖される。例えば、親骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマのための培養培地は、一般的には、ＨＧＰＲＴ欠乏細胞の増殖を妨げる物質ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）を含むだろう。
【０１３６】
ハイブリドーマは一般的には、マクロファージの支持細胞層で増殖する。マクロファージは、好ましくは、脾細胞を単離するために使用される非ヒト哺乳動物の同腹子からのものであり、一般的にはハイブリドーマを播種する数日前に、不完全フロイントアジュバントなどでプライムされる。融合方法は、その開示が参照により本明細書中に組み込まれるGoding, ”Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,” pp. 59-103 (Academic Press, 1986)に説明される。
【０１３７】
細胞は、コロニー形成及び抗体産生のために十分な時間、選択培地中で増殖される。これは通常、約７から１４日である。
【０１３８】
次いで、ハイブリドーマコロニーは、ＣＤ３９ポリペプチド遺伝子産物に特異的に結合する抗体の産生についてアッセイされる。アッセイは、一般的には比色ＥＬＩＳＡタイプアッセイだが、ハイブリドーマが増殖するウェルに適合し得る任意のアッセイが使用し得る。他のアッセイは、ラジオイムノアッセイ又は蛍光活性化細胞ソーティングを含む。所望の抗体産生について陽性であるウェルが調べられ、１個又は複数の異なるコロニーが存在するかどうかが決定される。複数のコロニーが存在する場合、単一の細胞のみが所望の抗体を産生するコロニーを生じさせたことを確実にするために、細胞は再クローニング及び増殖され得る。一般的には、抗体は、ＣＤ３９ポリペプチド、例えばＣＤ３９発現細胞に結合する能力についても試験されるだろう。
【０１３９】
モノクローナル抗体を製造することが確認されたハイブリドーマは、ＤＭＥＭ又はＲＰＭＩ−１６４０などの適切な培地中で大量に増殖され得る。代替的に、ハイブリドーマ細胞は、動物における腹水腫瘍としてもインビボで増殖され得る。
【０１４０】
所望のモノクローナル抗体を製造するのに十分な増殖後、モノクローナル抗体（又は腹水液）を含有する成長培地を細胞から分離し、その中に存在するモノクローナル抗体を精製する。精製は一般的には、ゲル電気泳動、透析、タンパク質Ａ又はタンパク質Ｇ−セファロース、又はアガロース又はセファロースビーズなどの固体支持体に連結された抗マウスＩｇを使用したクロマトグラフィーにより達成される（例えば、その開示が参照により本明細書に組み込まれるAntibody Purification Handbook, Biosciences, publication No. 18-1037-46, Edition ACで全て説明される）。結合した抗体は、一般的には低ｐＨ緩衝液（ｐＨ３．０以下のグリシン又は酢酸緩衝液）を使用することにより、抗体含有画分の即座の中和で、抗体Ａ／タンパク質Ｇカラムから溶出される。これらの画分は、必要に応じてプールされ、透析され、濃縮される。
【０１４１】
単一の見かけのコロニーを有する陽性ウェルは、一般的には１つのモノクローナル抗体のみが検出及び製造されていることを保証するために、再クローニング及び再アッセイされる。
【０１４２】
例えば、(Ward et al.Nature,341(1989)p.544、この開示全体が参照により本明細書に組み込まれる）で開示されているように、免疫グロブリンのコンビナトリアルライブラリの選択によっても抗体を製造し得る。
【０１４３】
目的の抗原、すなわちＣＤ３９、特に又は基本的にモノクローナル抗体Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６又はＩ−３９９と同じ領域、決定基又はエピトープに結合する１個又は複数の抗体の特定は、抗体競合を評価し得る様々な免疫学的スクリーニングアッセイのいずれか１つを使用して簡単に決定し得る。多くのそのようなアッセイは日常的に実施され、当技術分野で周知である（例えば、参照により本明細書中に具体的に組み込まれる１９９７年８月２６日発行の米国特許第５，６６０，８２７号明細書を参照されたい）。
【０１４４】
例えば、検査する試験抗体が異なる供給源動物から得られる場合又は異なるＩｇアイソタイプ由来である場合、対照（例えば、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６又はＩ−３９９）と試験抗体とを混合し（又はプレ吸着させ）、ＣＤ３９ポリペプチドを含有する試料に適用させる簡単な競合アッセイを利用し得る。ウエスタンブロッティングに基づくプロトコル及びＢＩＡＣＯＲＥ分析の使用は、そのような競合研究での使用に適している。
【０１４５】
特定の実施形態において、ＣＤ３９抗原試料への適用前に一定の期間にわたって対照抗体（例えば、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６又はＩ−３９９）と様々な量の試験抗体とをプレミックスする（例えば、約１：１０又は約１：１００）。他の実施形態において、対照及び様々な量の試験抗体をＣＤ３９抗原試料への曝露中に簡単に混合し得る。（例えば、分離技術又は洗浄技術を使用して非結合抗体を排除することにより）遊離抗体から結合を区別し得る限り、且つ（例えば、種特異的な若しくはアイソタイプ特異的な二次抗体を使用することにより、又は検出可能な標識でＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６又はＩ−３９９を特異的に標識することにより）試験抗体からＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６又はＩ−３９９を区別し得る限り、この試験抗体がそれぞれのＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６又はＩ−３９９の抗原への結合を減少させるかどうかを決定し得る。完全に無関係な抗体の非存在下での（標識された）対照抗体の結合は、対照高値として役立ち得る。対照低値を、標識（Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６又はＩ−３９９）抗体を完全に同一のタイプ（Ｉ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６又はＩ−３９９）の非標識抗体と共にインキュベートすることにより得ることができ、競合が生じて標識抗体の結合が減少するであろう。試験アッセイでは、試験抗体の存在下での標識抗体の反応性の有意な低下は、ＣＤ３９上の同一の領域又はエピトープを認識し得る試験抗体の指標である。約１：１０〜約１：１００のＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６又はＩ−３９９：試験抗体の任意の比において、ＣＤ３９抗原へのＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６又はＩ−３９９の結合を少なくとも約５０％、例えば少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約８０％又は９０％（例えば、約６５〜１００％）減少させる試験抗体を選択し得る。好ましくは、そのような試験抗体は、ＣＤ３９抗原へのＩ−３９４、Ｉ−３９５、Ｉ−３９６又はＩ−３９９の結合を少なくとも約９０％（例えば、約９５％）減少させるであろう。
【０１４６】
例えば、フローサイトメトリー試験により競合を評価することもできる。このような試験において、ある種のＣＤ３９ポリペプチドを保有する細胞を最初に例えばＩ−３９４とインキュベートし、次いで蛍光色素又はビオチンで標識される試験抗体とインキュベートし得る。本抗体は、飽和量のそれぞれのＩ−３９４との予備インキュベーション時に得られる結合が、Ｉ−３９４とのプレインキュベーションを行わずに抗体により得られる結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％以下（例えば、約３０％、２０％又は１０％）（蛍光手段により測定される場合）である場合、Ｉ−３９４と競合すると言われる。代替的に、抗体は、飽和量の試験抗体とプレインキュベートされる細胞上で（蛍光色素又はビオチンにより）標識化Ｉ−３９４抗体と共に得られる結合が、試験抗体とのプレインキュベーションなしに得られる結合の約８０％、好ましくは約５０％、約４０％又はそれ未満（例えば、約３０％、２０％又は１０％）である場合、Ｉ−３９４と競合すると言われる。
【０１４７】
抗体がエピトープ領域内で結合するか否かの判定は、当業者にとって周知のように行い得る。このようなマッピング／特徴評価方法の一例として、抗ＣＤ３９抗体に対するエピトープ領域は、それぞれのＣＤ３９タンパク質における露出アミン／カルボキシルの化学修飾を用いて、エピトープ「フットプリンティング」により決定され得る。このようなフットプリンティング技術のある具体例は、ＨＸＭＳ（質量分析により検出される水素−重水素交換）の使用であり、ここで受容体及びリガンドタンパク質アミドプロトンの水素／重水素交換、結合及び逆交換が起こり、タンパク質結合に加わる骨格アミド基は、逆交換から保護され、従って重水素化されたままとなる。関連領域は、この点でペプシンのタンパク質分解、ファストマイクロボア高速液体クロマトグラフィー分離及び／又はエレクトロスプレーイオン化質量分析により同定され得る。例えば、Ehring H,Analytical Biochemistry,Vol.267(2)pp.252-259(1999)Engen,J.R.and Smith,D.L.(2001)Anal.Chem.73,256A-265Aを参照されたい。適切なエピトープ同定技術の別の例は核磁気共鳴エピトープマッピング（ＮＭＲ）であり、一般的には遊離抗原及び抗体などの抗原結合ペプチドと複合体形成する抗原の二次元ＮＭＲスペクトルにおけるシグナルの位置を比較する。抗原は、一般的には、１５Ｎで選択的に同位体標識され、抗原に対応するシグナルのみがＮＭＲ−スペクトルで見られ、抗原結合ペプチドからのシグナルが見られないようになる。抗原結合ペプチドとの相互作用に関与するアミノ酸由来の抗原シグナルは、一般に、遊離抗原のスペクトルと比較して、複合体のスペクトルにおいて位置をシフトさせ、結合に関与するアミノ酸はそのように同定され得る。例えば、Ernst Schering Res Found Workshop.2004;(44):149-67;Huang et al.,Journal of Molecular Biology,Vol.281(1)pp.61-67(1998);及びSaito and Patterson,Methods.1996 Jun;9(3):516-24を参照されたい。
【０１４８】
エピトープマッピング／特徴評価は質量分析方法を用いて行うこともできる。例えば、Downard,J Mass Spectrom.2000 Apr;35(4):493-503及びKiselar and Downard,Anal Chem.1999 May 1;71(9):1792-1801を参照されたい。プロテアーゼ消化技術もエピトープマッピング及び同定との関連で有用であり得る。抗原性決定基関連領域／配列は、プロテアーゼ消化により、例えばＣＤ３９に対して約１：５０の比率でトリプシンを使用することによりｐＨ７〜８でｏ／ｎ消化を使用することにより、続いてペプチド同定のために質量分析（ＭＳ）を行うことにより決定し得る。続いて、抗ＣＤ３９結合物によりトリプシン切断から保護されるペプチドは、トリプシン消化に供した試料及び抗体とインキュベートし、続いて例えばトリプシン（それにより結合物に対するフットプリントが明らかになる）による消化に供した試料の比較により同定し得る。キモトリプシン、ペプシンなどの他の酵素も又は代替的に同様のエピトープ特徴評価方法で使用し得る。さらに、酵素性消化により、可能性のある抗原性決定基配列が表面に露出していない、従っておそらく免疫原性／抗原性について関連がないと思われるＣＤ３９ポリペプチドの領域内にあるか否かを分析するための迅速な方法が提供され得る。
【０１４９】
部位特異的突然変異誘発は、結合エピトープを明らかにするのに有用な別の技術である。例えば、「アラニンスキャニング」において、タンパク質セグメント内の各残基をアラニン残基で置き換え、結合親和性に対する結果を測定する。突然変異が結合親和性の顕著な低下につながる場合、結合に関与する可能性が高い。構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体（すなわち折り畳まれていないタンパク質に結合しない抗体）を使用して、アラニン置換がタンパク質の全体的な折り畳みに影響しないことを確認し得る。例えば、Clackson and Wells,Science 1995;267:383-386;及びWells,Proc Natl Acad Sci USA 1996;93:1-6を参照されたい。
【０１５０】
エピトープ「フットプリンティング」のために電子顕微鏡も使用し得る。例えば、Wang et al.,Nature 1992;355:275-278は、低温電子顕微鏡、三次元画像再構成及びＸ結晶学の同時適用を使用して、ネイティブササゲモザイクウイルスのキャプシド表面上のＦａｂ断片の物理学的フットプリントを決定した。
【０１５１】
エピトープ評価のための「標識不含」アッセイの他の形態としては、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ、ＢＩＡＣＯＲＥ）及び反射型干渉分光法（ＲｉｆＳ）が挙げられる。例えば、Faegerstam et al.,Journal Of Molecular Recognition 1990;3:208-14;Nice et al.,J.Chromatogr.1993;646:159-168;Leipert et al.,Angew.Chem.Int.Ed.1998;37:3308-3311;Kroeger et al.,Biosensors and Bioelectronics 2002;17:937-944を参照されたい。
【０１５２】
抗体と同じであるか又は実質的に同じであるエピトープに結合する抗体は、本明細書中に記載の代表的な競合アッセイの１個又は複数で同定され得ることも注意すべきである。
【０１５３】
一般的には、本明細書で提供される抗ＣＤ３９抗体は、約１０４〜約１０１１Ｍ−１（例えば、約１０８〜約１０１０Ｍ−１）の範囲において、それぞれのＣＤ３９ポリペプチドに対する親和性を有する。例えば、特定の態様において、抗ＣＤ３９抗体は、例えば、（例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）ＳＰＲ分析装置での分析による）表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）スクリーニングにより決定される場合、ＣＤ３９に関してそれぞれ１×１０−９Ｍ未満の平均解離定数（ＫＤ）を有する。より特定の代表的な態様において、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ３９に関してそれぞれ約１×１０−８Ｍ〜約１×１０−１０Ｍ又は１×１０−９Ｍ〜約１×１０−１１ＭのＫＤを有する。ある実施形態において、結合は一価の結合である。ある実施形態において、結合は二価の結合である。
【０１５４】
抗体は、例えば、約１００、６０、１０、５又は１ナノモル以下の（すなわちより親和性の）平均ＫＤ、好ましくはサブナノモルの平均ＫＤ、又は任意選択により約５００、２００、１００又は１０ピコモル以下の平均ＫＤにより特徴付けられ得る。例えば、チップ表面上において、組換えにより産生されたヒトＣＤ３９タンパク質を固定し、その後、溶液中で試験する抗体を適用することにより、ＫＤを決定し得る。ある実施形態において、この方法は、ＣＤ３９への結合に関して抗体Ｉ−３９４と競合することができる（ｂ）からの抗体を選択するステップをさらに含む。
【０１５５】
実施形態の何れかのある態様において、本方法に従って調製された抗体は、モノクローナル抗体である。別の態様において、本明細書の方法に従って抗体を製造するために使用される非ヒト動物は、哺乳動物、例えば齧歯動物、ウシ、ブタ、家禽、ウマ、ウサギ、ヤギ又はヒツジである。
【０１５６】
ＣＤ３９ポリペプチド上に存在するエピトープに結合する抗体をコードするＤＮＡをハイブリドーマから単離し、適切な宿主へのトランスフェクションのために適切な発現ベクター中に入れる。次いで、この宿主を抗体又はそのバリアント（例えば、このモノクローナル抗体のヒト化バージョン、この抗体の活性フラグメント、この抗体の抗原認識部位を含むキメラ抗体又は検出可能な部分を含むバージョン）の組換え産生に使用する。
【０１５７】
本開示のモノクローナル抗体（例えば、抗体Ｉ−３９４）をコードするＤＮＡを、（例えば、マウス抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）従来の手順を使用して容易に単離して配列決定し得る。ある態様において、提供されるのは、本明細書の何れかの実施形態の抗ＣＤ３９抗体の重鎖又は軽鎖をコードする核酸である。単離すると、このＤＮＡを発現ベクターに入れることができ、次いでこの発現ベクターを宿主細胞（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は通常は免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞）に遺伝子移入して、この組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を得る。本明細書の他の箇所で説明されているように、そのようなＤＮＡ配列は、多数の目的の何れかのために改変され得、例えば抗体をヒト化するために、フラグメント又は誘導体を製造するために、又は例えば抗体の結合特異性を最適化するために抗原結合部位中で抗体の配列を改変するために改変され得る。ある実施形態において、提供されるのは、抗体の軽鎖及び／又は重鎖をコードする単離核酸配列並びにそのような核酸を（例えば、ゲノム中に）含む組換え宿主細胞である。抗体をコードするＤＮＡの細菌中での組換え発現は、当技術分野で周知である（例えば、Skerra et al.,Curr.Opinion in Immunol.,5,pp.256(1993);及びPluckthun,Immunol.130,p.151(1992)を参照されたい）。
【０１５８】
抗体のフラグメント及び誘導体（別途明記しない限り又は文脈により明らかに矛盾しない限り、本願で使用される用語１つ又は複数の「抗体」に包含される）を当技術分野で既知の技術により製造し得る。「フラグメント」は、無傷の抗体の一部を含み、一般には抗原結合部位又は可変領域を含む。抗体フラグメントの例として下記が挙げられる：Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント及びＦｖフラグメント；ダイアボディ；連続したアミノ酸残基の１つの連続した配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体フラグメント（本明細書では、「一本鎖抗体フラグメント」又は「一本鎖ポリペプチド」と称される）、例えば、限定されないが、（１）一本鎖Ｆｖ分子、（２）会合した重鎖部分を有しない、１個のみの軽鎖可変ドメインを含む一本鎖ポリペプチド又はこの軽鎖可変ドメインの３個のＣＤＲを含む、この一本鎖ポリペプチドのフラグメント、及び（３）会合した軽鎖部分を有しない、１個のみの重鎖可変領域を含む一本鎖ポリペプチド又はこの重鎖可変領域の３個のＣＤＲを含む、この一本鎖ポリペプチドのフラグメント；並びに抗体フラグメントから形成された多重特異性（例えば、二重特異性）抗体。含まれるのは、特にナノボディ、ドメイン抗体、単一ドメイン抗体又は「ｄＡｂ」である。
【０１５９】
ある態様において、薬剤は、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、及びキメラ抗体から選択される抗体である。
【０１６０】
ある態様において、薬剤は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４から選択される定常ドメインを含む抗体のフラグメントである。ある態様において、この薬剤は、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、Ｆａｂ’−ＳＨフラグメント、Ｆ（ａｂ）２フラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆｖフラグメント、重鎖Ｉｇ（ラマＩｇ又はラクダＩｇ）、ＶＨＨフラグメント、単一ドメインＦＶ及び一本鎖抗体フラグメントから選択される抗体フラグメントである。ある態様において、この薬剤は、合成又は半合成の抗体由来分子であって、ｓｃＦｖ、ｄｓＦＶ、ミニボディ、ダイアボディ、トリアボディ、カッパボディ、ＩｇＮＡＲ及び多重特異性（例えば、二重特異性）抗体から選択される合成又は半合成の抗体由来分子である。ある態様において、抗体は少なくとも部分的に精製された形態である。ある態様において、抗体は基本的に単離された形態である。
【０１６１】
医薬製剤中に１ｍｇ／ｍＬ〜５００ｍｇ／ｍＬの濃度で含む抗体などの抗ＣＤ３９が組み込まれ得、前記製剤のｐＨは２．０〜１０．０である。本製剤は、緩衝液系、保存剤、等張化剤、キレート剤、安定化剤及び界面活性剤をさらに含み得る。ある実施形態において、医薬製剤は、水性製剤、すなわち水を含む製剤である。このような製剤は、一般に溶液又は懸濁液である。さらなる実施形態において、本医薬製剤は水性溶液である。「水性製剤」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む製剤として定義される。同様に「水溶液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む溶液として定義され、「水性懸濁液」という用語は、少なくとも５０％ｗ／ｗの水を含む懸濁液として定義される。
【０１６２】
別の実施形態において、本医薬製剤は、凍結乾燥製剤であり、医師又は患者が使用前にそれに溶媒及び／又は希釈剤を添加する。
【０１６３】
別の実施形態において、本医薬製剤は、事前に溶解する必要がない使用準備済みの乾燥製剤（例えば、凍結乾燥又は噴霧乾燥）である。
【０１６４】
さらなる態様において、本医薬製剤は、このような抗体の水溶液及び緩衝液を含み、この抗体は１ｍｇ／ｍＬ又はそれを超える濃度で存在し、前記製剤のｐＨは約２．０〜約１０．０である。
【０１６５】
別の実施形態において、本製剤のｐＨは、約２．０〜約１０．０、約３．０〜約９．０、約４．０〜約８．５、約５．０〜約８．０及び約５．５〜約７．５からなる一覧から選択される範囲である。
【０１６６】
さらなる実施形態において、緩衝液は、酢酸ナトリウム、炭酸ナトリウム、クエン酸塩、グリシルグリシン、ヒスチジン、グリシン、リジン、アルギニン、リン酸二水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、リン酸ナトリウム及びトリス（ヒドロキシメチル）−アミノメタン、ビシン、トリシン、リンゴ酸、コハク酸塩、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、アスパラギン酸又はこれらの混合物からなる群から選択される。これらの具体的な各緩衝液は、発明の代替的な実施形態を構成する。
【０１６７】
発明のさらなる実施形態において、本製剤は、薬学的に許容可能な保存剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本製剤は等張剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本製剤はキレート剤も含む。さらなる実施形態において、本製剤は安定化剤をさらに含む。さらなる実施形態において、本製剤は界面活性剤をさらに含む。便宜上、Remington:The Science and 実施 of Pharmacy,19th edition,1995を参照する。
【０１６８】
本願発明のペプチド医薬製剤中に他の成分が存在し得る可能性がある。このようなさらなる成分としては、湿潤剤、乳化剤、抗酸化剤、充填剤、等張性調節剤、キレート剤、金属イオン、油性ビヒクル、タンパク質（例えば、ヒト血清アルブミン、ゼラチン又はタンパク質）及び双性イオン（例えば、ベタイン、タウリン、アルギニン、グリシン、リジン及びヒスチジンなどのアミノ酸）が挙げられ得る。このようなさらなる成分は、当然のことながら、本願発明の医薬製剤の全体的な安定性に悪影響を与えるべきではない。
【０１６９】
発明による医薬組成物の投与は、例えば静脈内であるいくつかの投与経路を介し得る。適切な抗体製剤は、他の既に開発されている治療用モノクローナル抗体での経験を調べることによっても決定し得る。いくつかのモノクローナル抗体は、リツキサン（リツキシマブ）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、ゾーレア（オマリズマブ）、ベクザー（トシツモマブ）、キャンパス（アレムツズマブ）、ゼバリン、オンコリム（Ｏｎｃｏｌｙｍ）など、臨床的状況で有効であることが示されており、この発明の抗体と共に同様の製剤を使用し得る。
【０１７０】
前の方法に使用するために適合された治療有効量で、抗ＣＤ３９抗体を含有する医薬組成物、及び腫瘍細胞からのＡＴＰ放出を誘導する薬剤、及び薬学的に許容可能な担体を含むキットも提供される。キットは、任意選択により、癌（例えば、固形腫瘍）を有する患者に組成物を投与するために、施術者（例えば、医師、看護師、又は患者）がその中に含有される組成物を投与することを可能にするための、例えば、投与スケジュールを含む指示書をも含み得る。キットはまた、シリンジを含み得る。
【０１７１】
任意選択により、キットは、上記で提供される方法に従って単一投与のために腫瘍細胞からのＡＴＰ放出を誘導する抗ＣＤ３９又は薬剤の有効量をそれぞれ含有する単回投与医薬組成物の多重パッケージを含む。医薬組成物を投与するために必要な器具又は装置も、キットに含まれ得る。例えば、キットは、腫瘍細胞からのＡＴＰ放出を誘導する抗ＣＤ３９及び薬剤の量を含有する１個又は複数のプレ充填（pre-filled）シリンジを提供し得る。
【０１７２】
ある実施形態において、本願発明は、ヒト患者における癌を処置するためのキットを提供し、該キットは、
（ａ）ｓＣＤ３９の活性を中和する抗ＣＤ３９抗体の用量、任意選択により、抗体は抗体Ｉ−３９４の重鎖可変領域の超可変領域（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン）及び抗体Ｉ−３９４の軽鎖可変領域の超可変領域（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３ドメイン）を含む；
（ｂ）腫瘍細胞からのＡＴＰ放出を誘導する薬剤の用量；及び
（ｃ）任意選択により、本明細書で説明される方法のいずれかにおいて抗ＣＤ３９抗体及び腫瘍細胞からのＡＴＰ放出を誘導する薬剤を使用するための指示書
を含む。
【０１７３】
悪性腫瘍の診断、予後、及び処置
抗ＣＤ３９抗体を使用して腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤の活性を強力化することによる個体における癌の診断、予後、モニタリング、処置及び予防に有用な方法が、本明細書で説明される。
【０１７４】
ストレス（機械的、低張性又は低酸素性）の場合、又は細胞死の場合、細胞外ＡＴＰは腫瘍細胞から放出される。壊死は、全細胞内容物の放出によるＡＴＰの受動的放出を促進するが、アポトーシスは、Ｐａｎｅｘｉｎ１（ＡＴＰトランスポーター）を開裂及び活性化するカスパーゼ３及び９の活性化によるＡＴＰの放出を促進する。腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤の例は、化学療法、放射線療法、及びさらに一般的には、アポトーシスを誘導し、それによりＡＴＰ放出を促進する薬剤を含み得る。ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤は、免疫原性細胞死を誘導することが示される。例えば、実質的なＡＴＰ放出は、アントラサイクリン、オキサリプラチン、シスプラチン及びＸ線、ＰＡＲＰインヒビター、タキサン、アントラサイクリン、ＤＮＡ損傷薬剤、カンプトテシン、エポチロン、マイトマイシン、コンブレタスタチン、ビンカアルカロイド、ナイトロジェンマスタード、メイタンシノイド、カリケアマイシン、デュオカルマイシン、チューブリシン、ドラスタチン及びオーリスタチン、エンジイン、アマトキシン、ピロロベンゾジアゼピン、エチレンイミン、放射性同位元素、治療用タンパク質及びペプチド、ならびにそれらの毒素又は断片により誘導され得る。
【０１７５】
ＡＴＰはまた、癌細胞の表面で発現される抗原（例えば、腫瘍抗原）に結合する枯渇性抗体、例えば、ＡＴＰ放出を誘導する化学治療剤に結合される抗体、アポトーシスを媒介することができる抗体又は抗体依存性細胞媒介毒性（ＡＤＣＣ）を癌細胞に向ける抗体（例えばここで該抗体は、ＡＤＣＣを媒介するようにヒトＩｇＧ１アイソタイプのＦｃドメインを有する）での投与によっても放出され得る。
【０１７６】
アントラサイクリンは、例えばダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン又はイダルビシン、任意選択により、そのリポソーム製剤、例えばＤａｕｎｏＸｏｍｅ（商標）又はＶｙｘｅｏｓ（商標）又はＣＰＸ−３５１（シタラビン及びダウノルビシンの組み合わせ）などのリポソームダウノルビシンを含む。アントラサイクリンは、例えば急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、及びカポジ肉腫を包含する固形及び血液悪性腫瘍の処置に広く使用される。ドキソルビシン及びその誘導体であるエピルビシンは、乳癌、小児期の固形腫瘍、軟組織肉腫及び侵攻性リンパ腫に使用される。ダウノルビシンは、急性リンパ芽球性又は骨髄芽球性白血病の処置に使用され、その誘導体であるイダルビシンは、多発性骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、及び乳癌に使用される。ネモルビシンは、肝細胞癌の処置に使用され、ピクサントロンは、非ホジキンリンパ腫の第二処置として使用される。サバルビシンは、非小細胞肺癌、ホルモン難治性転移性前立腺癌、及び白金又はタキサン耐性卵巣癌に使用される。バルルビシンは、膀胱癌の局所処置に使用される。
【０１７７】
白金薬剤は、例えばオキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、フェナントリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチンを含む。
【０１７８】
タキサンは、例えばパクリタキセル（Ｔａｘｏｌ）及びドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒｅ）を含む。
【０１７９】
ＤＮＡ損傷薬剤は、例えばＤＮＡ挿入薬剤、例えば自身を細胞のＤＮＡ構造中に挿入してＤＮＡに結合し、次にＤＮＡ損傷を引き起こす薬剤（例えば、ダウノルビシン）を含む。化合物は、トポイソメラーゼインヒビター、トポイソメラーゼ（トポイソメラーゼＩ及びＩＩ）の作用をブロックする化学的化合物を含む。そのような化合物は、広範囲の固形腫瘍及び血液悪性腫瘍、特にリンパ腫に使用される。トポイソメラーゼＩインヒビターは、カンプトテシン、例えばイリノテカン（結腸癌の処置について承認）、トポテカン（卵巣及び肺癌の処置について承認）、カンプトテシン、ラメラリンＤ、インデノイソキノリン、インジミテカンを含む。さらに、カンプトテシンは、シラテカン、コサイトカン、エキサテカン、ルルトテカン、ギマテカン、ベロテカン、及びルビテカンを含む。トポイソメラーゼＩＩインヒビターは、例えばエトポシド（ＶＰ−１６）、テニポシド、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ミトキサントロン、アムサクリン、エリプチシン、オーリントリカルボン酸、及びカンナビジオールから合成されたキノロンであるＨＵ−３３１を含む。
【０１８０】
ＰＡＲＰインヒビターは、癌細胞において細胞死を壊死からカスパーゼ非依存性アポトーシスに傾けることが報告されている。ＰＡＲＰの阻害は、細胞内ＡＴＰの増加をもたらし、これは、次に、アポトーシス時のＡＴＰの細胞外放出をもたらすと考えられる。ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）ファミリーの酵素は、ＮＡＤ＋をニコチンアミド及びＡＤＰ−リボースに変換し、通常クロマチンと会合した多数のアクセプタータンパク質のグルタミン酸残基上に長い分岐（ＡＤＰ−リボース）ポリマーを形成する。最も豊富なＰＡＲＰであるＰＡＲＰ−１は、ＮＡＤ＋を基質として使用して、標的タンパク質上でのポリ（ＡＤＰ−リボース）の形成を触媒する核酵素である。ＰＡＲＰインヒビターは、一般的に重要なファーマコフォアとしてベンゾオキサゾール又はベンズアミド部分を含み、様々なベンズアミド誘導体が報告されている。開示に従って使用し得る承認されたＰＡＲＰインヒビターの例は、オラパリブ（ＡＺＤ−２２８１、Ａｓｔｒａ  ＺｅｎｅｃａによるＬｙｎｐａｒｚａ（登録商標）、卵巣癌で承認され、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌の処置にも有効）、ルカパリブ（ＰＦ−０１３６７３３８、Ｃｌｏｖｉｓ  ＯｎｃｏｌｏｇｙによるＲｕｖｉｓａ（登録商標）、卵巣癌で承認）、ニラパリブ（ＭＫ−４８２７、ＴｅｓａｒｏによるＺｅｊｕｌａ（登録商標）、上皮、卵巣、卵管、及び原発性腹膜癌で承認）を含む。開示に従って使用し得るＰＡＲＰインヒビターのさらなる例は、血液学的及び進行した又は再発性の固形腫瘍のためのタラゾパリブ（ＢＭＮ−６７３、ＢｉｏＭａｒｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｃ．、Ｐｆｉｚｅｒ）、卵巣癌、三重陰性乳癌及び非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、黒色腫のためのヴェリパリブ（ＡＢＴ−８８８、ＡｂｂＶｉｅが開発）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）のためのＣＥＰ  ９７２２、黒色腫のためのＥ７０１６（エーザイが開発）、及び様々な固形腫瘍悪性腫瘍のためのＢｅｉｇｅｎｅが開発したパミパリブ（ＢＧＢ−２９０）を含む。
【０１８１】
エポチロンは、例えば、エポチロンＢ及びその様々な類似体、例えば乳癌の処置に承認されたイクサベピロン（ＢＭＳ−２４７５５０）を含む。ビンカアルカロイドは、例えば、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、及びビノレルビンを含む。ナイトロジェンマスタードは、例えば、シクロホスファミド、クロラムブシル、ウラムスチン、イホスファミド、メルファラン、及びベンダムスチンを含む。メイタンシノイドは、例えば、Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎ  Ｉｎｃ.が開発したアンサマイトシン、メルタンシン（ＤＭ１）又はＤＭ４を含む。
【０１８２】
薬剤は、例えば、それぞれの場合において任意選択によりさらなる薬学的に活性な薬剤とさらに組み合わせた、カプセル化された（例えば、リポソーム中に）、遊離化合物として又はコンジュゲートの一部として、ナノ粒子製剤を包含する、任意の適切な立体配置又は製剤であり得る。薬剤は、免疫コンジュゲートにおけるなどの標的化部分に便利にコンジュゲートされ得る。「免疫コンジュゲート」及び「抗体コンジュゲート」という用語は、交換可能に使用され、抗原結合薬剤、例えば、抗体結合タンパク質又は別の部分（例えば、細胞毒性薬剤、本明細書で説明されるＡＴＰ放出を誘導する化学治療剤）にコンジュゲートされた抗体を指す。細胞毒性薬剤にコンジュゲートした抗原結合薬剤を含む免疫コンジュゲートは、「抗体薬物コンジュゲート」又は「ＡＤＣ」とも称され得る。
【０１８３】
本明細書で説明される処置レジメン及び方法は、固形腫瘍の処置に特に有用であるが、本明細書で説明される処置レジメン及び方法は、様々な血液癌にも使用し得る。本願発明の方法及び組成物は、例えば、以下を包含するがこれらに限定されない様々な癌及び他の増殖性疾患の処置に利用される：膀胱、乳房、結腸、腎臓、肝臓、肺、卵巣、子宮、前立腺、膵臓、胃、子宮頸部、甲状腺、頭及び首（頭頸部扁平上皮癌、及び皮膚（例えば、黒色腫）を包含する癌腫；白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、ホジキンスリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫及びバーケットリンパ腫、及び多発性骨髄腫を包含するリンパ系の造血器腫瘍；急性及び慢性骨髄性白血病、前骨髄球性白血病、及び骨髄異形成症候群を包含する骨髄系の造血器腫瘍；線維肉腫及び横紋筋肉腫の腫瘍を包含する間葉起源の腫瘍；黒色腫、セミノーマ、奇形癌、神経芽細胞腫及び神経膠腫を包含する他の腫瘍；星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、及び神経鞘腫を包含する中枢及び末梢神経系の腫瘍；線維肉腫、横紋筋肉腫、及び骨肉腫を包含する間葉起源の腫瘍；及び黒色腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、セミノーマ、及び甲状腺濾胞癌を包含する他の腫瘍。
【０１８４】
本明細書中で提供される癌の処置のための組み合わせ療法は、癌に苦しむ対象を処置するために、中和抗ＣＤ３９薬剤（例えば抗体）及びＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤の投与を含む。ある実施形態において、本発明は、固形腫瘍（例えば、固形腫瘍、進行した難治性固形腫瘍）を有する対象又は血液腫瘍を有する対象を処置するために、組み合わせて使用するための抗ＣＤ３９抗体及びＡＴＰの細胞外放出を誘導する処置（例えば、薬剤）を提供する。ある実施形態において、癌を有する個体の処置に使用するための抗ＣＤ３９抗体が提供され（例えば、さらなる特徴を有する本明細書で説明される）、該処置は、（例えば、癌性細胞におけるＡＴＰの細胞外放出を誘導するために）癌性細胞における誘導アポトーシスの手段と組み合わせた抗ＣＤ３９抗体の個体への投与を含む。ある実施形態において、癌を有する個体の処置に使用するための、（例えば、本明細書で説明されるさらなる特徴を有する）抗ＣＤ３９抗体が提供され、該処置は、（ａ）癌細胞のアポトーシスを誘導するための手段（例えば、薬剤又は処置）及び（ｂ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物と組み合わせた抗ＣＤ３９抗体の個体への投与を含む。ある実施形態において、癌を有する個体の処置に使用するための、（例えば、本明細書で説明されるさらなる特徴を有する）抗ＣＤ３９抗体が提供され、該処置は、（ａ）癌細胞におけるＡＴＰの細胞外放出を誘導するための手段（例えば、及び薬剤又は処置）及び（ｂ）薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物と組み合わせた抗ＣＤ３９抗体の個体への投与を含む。
【０１８５】
ある実施形態において、本発明は、固形腫瘍を有する個体を処置するために、白金薬剤（例えば、オキサリプラチン、シスプラチン、カルボプラチン、ネダプラチン、フェナントリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、又は白金薬剤を含む組み合わせレジメン）と組み合わせて使用するための抗ＣＤ３９抗体を提供する。ある実施形態において、固形腫瘍は、肺癌、扁平上皮肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、卵巣癌、癌、頭頸部扁平上皮癌（ＨＮＳＣＣ）、結腸直腸癌、尿路上皮癌、膀胱癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌又は乳癌である。ある実施形態において、白金薬剤を含む組み合わせレジメンはＦＯＬＦＯＸ（フォリン酸、５−Ｆｕ及びオキサリプラチン）である。ある実施形態において、白金薬剤を含む組み合わせレジメンは、カルボプラチン及びタキサン（例えば、パクリタキセル）を含む。
【０１８６】
ある実施形態において、本発明は、固形腫瘍、例えば卵巣癌、乳癌を有する個体を処置するために、タキサン薬剤（例えば、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））又はドセタキセル（Ｔａｘｏｔｅｒ（商標）））と組み合わせて使用するための抗ＣＤ３９抗体を提供する。
【０１８７】
ある実施形態において、本発明は、固形腫瘍、例えば卵巣癌を有する個体を処置するためにゲムシタビンと組み合わせて使用するための抗ＣＤ３９抗体を提供する。
【０１８８】
ある実施形態において、固形腫瘍、例えば、卵巣癌、乳癌、非小細胞肺癌、結腸直腸癌、前立腺癌、軟組織肉腫又は膀胱癌を有する個体を処置するために、アントラサイクリン薬剤（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン又はイダルビシン）と組み合わせて使用するための抗ＣＤ３９抗体が提供される。ある実施形態において、本発明は、血液腫瘍、例えばＡＭＬ、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、リンパ腫、急性リンパ芽球性、骨髄芽球性白血病、多発性骨髄腫又は非ホジキンリンパ腫を有する個体を処置するために、アントラサイクリン薬剤（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン又はイダルビシン）と組み合わせて使用するための抗ＣＤ３９抗体を提供する。
【０１８９】
ある実施形態において、本発明は、固形腫瘍、例えば上皮癌、卵巣癌、乳癌、前立腺癌、結腸直腸癌、卵管癌、腹膜癌、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）又は黒色腫を有する個体を処置するために、ＰＡＲＰインヒビター薬剤（例えば、ＰＡＲＰ−１インヒビター、オラパリブ、ルカパリブ、ニラパリブ、タラゾパリブ、ヴェリパリブ、ＣＥＰ  ９７２２、Ｅ７０１６又はパミパリブ）と組み合わせて使用するための抗ＣＤ３９抗体を提供する。
【０１９０】
本明細書で説明される組み合わせ処置は、（個体におけるＣＤ３９の発現又はレベルを評価する事前ステップの有無にかかわらず）ＣＤ３９の高発現を特徴とする、特に卵巣癌、胃癌及び食道癌を包含する癌の処置に特に効果的であり得る。
【０１９１】
ある実施形態において、卵巣癌を有する個体を処置するために、白金薬剤（例えば、カルボプラチン）と組み合わせて、及び任意選択によりさらにゲムシタビンと組み合わせて使用するための抗ＣＤ３９抗体が提供される。
【０１９２】
ある実施形態において、胃癌又は食道癌を有する個体を処置するために、任意選択によりＦＯＬＦＯＸレジメン（葉酸、５−Ｆｕ及びオキサリプラチン）と組み合わせて使用される、白金薬剤（例えば、オキサリプラチン）と組み合わせて使用するための抗ＣＤ３９抗体が提供される。
【０１９３】
ある実施形態において、ＮＳＣＬＣを有する個体を処置するために、白金薬剤（例えば、カルボプラチン）と組み合わせて、及び任意選択によりさらにタキサン（例えば、パクリタキセル）と組み合わせて使用するための抗ＣＤ３９抗体が提供され、任意選択によりＮＳＣＬＣは扁平上皮細胞肺癌である。
【０１９４】
ある実施形態において、ＦＯＬＦＯＸと組み合わせて使用するための抗ＣＤ３９抗体が提供される。
【０１９５】
ある実施形態において、固形腫瘍は卵巣癌であり、個体はオキサリプラチン又はカルボプラチンと組み合わせた、任意選択によりさらにゲムシタビンと組み合わせた抗ＣＤ３９抗体で処置される。任意選択により、本明細書中の何れの実施形態においても、卵巣癌は白金耐性卵巣癌である。白金耐性卵巣癌を有する個体は、例えば、抗ＣＤ３９抗体を含まない白金薬剤含有治療用レジメンでの事前の処置に対して進行した、再発した、又は反応しなかった癌を有することを特徴とし得る。別の実施形態において、卵巣癌は、白金感受性卵巣癌として特徴付け得る。
【０１９６】
抗ＣＤ３９抗体を含む組み合わせ療法は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する及び／又は腫瘍細胞の死を誘導する薬剤又は処置の効果を増強するために有利に使用し得る。これは、例えば、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する及び／又は腫瘍細胞の死を誘導する薬剤又は処置に対して耐性である癌（例えば、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌）を有する個体において有用であり得る。薬剤又は処置に対して耐性である癌を有する個体は、例えば、そのような薬剤又は処置（又はそのような薬剤又は処置を含む治療用レジメン、ここで該レジメンは抗ＣＤ３９抗体を含まない）での事前の処置に対して進行した、再発した又は反応しなかった癌を有することを特徴とし得る。
【０１９７】
例えば、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の特定のクラスのメンバー（例えばタキサン、白金薬剤、ＰＡＲＰインヒビター、又はそれを含む組み合わせレジメン）に耐性である癌（例えば、乳癌、卵巣癌、大腸癌、胃癌、食道癌）を有する個体は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の当該クラスの薬剤と組み合わせた抗ＣＤ３９抗体で処置し得る。例えば、ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、タキサン耐性癌を有する個体を処置するために、タキサンと組み合わせて使用し得る。別の例において、抗ＣＤ３９抗体は、白金薬剤耐性癌を有する個体を処置するために、白金薬剤と組み合わせて使用し得る。別の例において、抗ＣＤ３９抗体は、ＰＡＲＰインヒビター耐性癌を有する個体を処置するために、ＰＡＲＰインヒビターと組み合わせて使用し得る。
【０１９８】
別の実施形態において、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の特定のクラスのメンバー（例えばタキサン、白金薬剤、ＰＡＲＰインヒビター、又はそのようなものを含む組み合わせレジメン）に対して耐性である癌を有する個体は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の様々なクラスの薬剤と組み合わせた抗ＣＤ３９抗体で処置し得る。例えば、ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、白金耐性癌を有する個体を処置するために、タキサンと組み合わせて使用し得る。別の実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、タキサン耐性癌を有する個体を処置するために、白金薬剤と組み合わせて使用し得る。別の実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、タキサン耐性／又は白金耐性癌を有する個体を処置するために、ＰＡＲＰインヒビターと組み合わせて使用し得る。
【０１９９】
ある実施形態において、個体における癌の処置又は予防に使用するための可溶性の細胞外ドメインヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体が提供され、該処置は、
−ａ）個体が腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤での処置への反応として悪い予後を有するかどうかを決定すること、及び
−ｂ）個体が腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤での処置への反応として悪い予後を有するとの決定に際し、外因的に添加されたＡＴＰの存在下でヒトＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体を個体に投与することを含む。任意選択により、個体は、白金耐性癌、タキサン耐性癌、又はＰＡＲＰインヒビター耐性癌を有する。任意選択により、個体が、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤による処置への反応について悪い予後を有すると決定するステップは、個体からの生物学的サンプル中の免疫エフェクター細胞が免疫抑制及び／又は疲弊の１個又は複数のマーカーを特徴とするかどうかを評価することを含み、ここで免疫抑制及び／又は疲弊の１個又は複数のマーカーを特徴とする免疫エフェクター細胞の存在又は及び／又は上昇したレベルは、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤での処置への反応としての悪い予後を示す。
【０２００】
腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する及び／又は腫瘍細胞の死を誘導する薬剤又は処置の効果を増強するために抗ＣＤ３９抗体を使用することの利点は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する及び／又は腫瘍細胞の死を誘導する薬剤又は処置に対して感受性（例えば、感受性であると予測されるか又は決定される）である癌（例えば、肺癌、卵巣癌、結腸直腸癌、胃癌、食道癌）を有する個体における改善された結果を達成するためにも採用し得る。例えば、ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、タキサン感受性癌を有する個体を処置するために、タキサンと組み合わせて使用し得る。別の例において、抗ＣＤ３９抗体は、白金薬剤感受性癌を有する個体を処置するために、白金薬剤と組み合わせて使用し得る。別の例において、抗ＣＤ３９抗体は、ＰＡＲＰインヒビター感受性癌を有する個体を処置するために、ＰＡＲＰインヒビターと組み合わせて使用し得る。
【０２０１】
本明細書中で使用される場合、補助的投与又は併用投与（共投与）は、同じ又は様々な剤形の化合物の同時投与、又は該化合物の別々の投与（例えば、逐次投与）を含む。従って、抗ＣＤ３９及びＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤は、単一製剤中で同時に投与し得る。代替的に、抗ＣＤ３９及びＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤は、別々の投与のために処方され、同時又は順次投与され得る。
【０２０２】
癌を有する患者は、腫瘍ＡＴＰアーゼ活性、腫瘍ＡＴＰ（例えば、腫瘍内ＡＴＰ濃度）、及び／又は細胞上のＣＤ３９発現を評価する事前検出ステップの有無にかかわらず、抗ＣＤ３９薬剤及びＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤で処置し得る。任意選択により、処置方法は、個体からの腫瘍の（例えば、腫瘍又は腫瘍浸潤細胞上の）生物学的サンプル中のＣＤ３９核酸又はポリペプチドを検出するステップを含み得る。
【０２０３】
任意選択により、処置方法は、個体からの生物学的サンプル中のＣＤ３９核酸又はポリペプチドを検出するステップを含み得る。生物学的サンプルの例は、いずれの適切な生体液（例えば、血清、リンパ液、血液）、細胞サンプル、又は組織サンプルも含む。参照と比較して、生物学的サンプル中の細胞（例えば、癌細胞、リンパ球、例えば、ＴＲｅｇ細胞、Ｂ細胞、Ｔ細胞）がＣＤ３９を高レベルで発現する、又はサンプル中の多数の細胞がＣＤ３９陽性であるか、抗ＣＤ３９抗体での染色の高い強度を示すとのいずれの決定も、個体が、腫瘍細胞からのＡＴＰ放出を誘導する薬剤と組み合わせたＣＤ３９を阻害する薬剤での処置からの強い利益を有し得る癌を有することを示し得る。ある実施形態において、処置方法は、個体からの腫瘍の（例えば、腫瘍浸潤細胞上の）生物学的サンプル中のＣＤ３９核酸又はポリペプチドを検出するステップを含み得る。
【０２０４】
処置法において、抗ＣＤ３９抗体及びＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置は、個別に、一緒に、又は順次、又はカクテルで（必要に応じて）投与し得る。いくつかの実施形態において、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置は、抗ＣＤ３９抗体の投与前に投与される。好ましい実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与の前又は同時に投与される。１つの有利な実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤の経過又はサイクルとともに、又はその０から１５日前に投与される。例えば、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤または処置の投与のおよそ０から１５日前に投与し得る。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与の少なくとも１時間前、１２時間前、２４時間前又は４８時間前に投与される。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与の少なくとも１時間前、１２時間前、２４時間前又は４８時間前だが、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与の１週間以下までに投与される。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与の０から４８時間前、又は１から４８時間前に投与される。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与の約３０分から約２週前、約３０分から約１週前、約１時間から約２週前、約１時間から約１週前、約１時間から約２時間前、約２時間から約４時間前、約４時間から約６時間前、約６時間から約８時間前、約８時間から１日前、約２４又は４８時間から約５、６又は７日前、約１時間から約５、６又は７日前、約１時間から約１５日前、約２４又は４８時間から約１５日前、約３日から７日前、又は約１日から５日前に投与される。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与と同時に投与される。いくつかの有利な実施形態において、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置は、抗ＣＤ３９抗体の投与に続く１５日以内又は約２週間以内に少なくとも２回投与する。他の実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与後に投与される。いくつかの実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与の約３０分から約２週間後、約３０分から約１週間後、約１時間から約２４、３６又は４８時間後、約１時間から２時間後、約２時間から約４時間後、約４時間から約６時間後、約６時間から約８時間後、約８時間から１日後、又は約１日から約２、３、４又は５日後に投与される。
【０２０５】
ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置は、処置されているる特定の疾患又は状態の単剤療法でその薬剤又は処置のために一般的に使用される量及び処置レジメンで投与し得る。
【０２０６】
ＣＤ３９抗体の適切な量の例は、１から２０ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。ある実施形態において、その量は、毎週、２週間ごと、１か月ごと又は２か月ごとに個体に投与される。
【０２０７】
ある実施形態において、癌を有するヒト個体を処置する方法であって、本開示の抗ＣＤ３９抗体の有効量及びＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の有効量を含む１回の投与サイクルを個体に投与することを含む方法が提供される。ある実施形態において、サイクルは８週間以下（２週間、４週間、８週間など）の期間である。ある実施形態において、少なくとも１回のサイクルのそれぞれに関して、抗ＣＤ３９抗体の１回、２回、３回、又は４回の用量は、１−２０ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与される。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体を静脈内注入により投与する。ある実施形態において、少なくとも１回のサイクルのそれぞれについて、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の１回、２回、３回又は４回の用量が投与される。
【０２０８】
本明細書中で示されるように、抗ＣＤ３９抗体の飽和濃度の存在下での化学治療剤の反復投与がＡＴＰ蓄積及びアデノシン（Ａｄｏ）抑制が効果的な抗腫瘍免疫反応を開始するために必要な古典的な２週間の間に起こることを可能にすると、最も強い抗腫瘍反応が観察された。よって、有利な一実施形態において、本開示による処置は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の連続２回の投与を含む。ある実施形態において、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置は、抗ＣＤ３９抗体の投与に続く１５日間又は約２週間の期間内に少なくとも２回投与される。抗ＣＤ３９抗体は、目的の循環及び／又は組織（例えば、腫瘍組織）中の抗ＣＤ３９抗体の濃度がＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の２回の連続投与のそれぞれで（例えば、飽和する濃度で）ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害するような量及び/又は濃度で投与され得る。例えば、１つの有利な治療用レジメンにおいて、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰ放出を誘導する化学治療剤の投与と同時に、又は少なくとも１−４８時間前に投与される。ある有利な治療用レジメンにおいて、抗ＣＤ３９抗体は、ＡＴＰ放出を誘導する化学治療剤の投与の少なくとも１、２、３、４、５、６又は７日前に投与される。
【０２０９】
ある実施形態において、ヒト個体における腫瘍の処置のための、ヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤアーゼ１）タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害できる抗体が提供され、該処置は、抗ＣＤ３９抗体及び腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置のそれぞれの有効量を個体に投与することを含み、該腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置は、少なくとも２回投与され（例えば、第一及び第二の連続投与）、ここで該抗ＣＤ３９抗体は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の前記２回の投与の間に抗ＣＤ３９抗体の飽和濃度を達成するため及び／又は維持するために効果的な量及び／又はスケジュールで投与される。抗ＣＤ３９抗体は、例えば１回又は２回投与し得る。ある実施形態において、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の２回の投与は、２週以下に分離された（例えば、毎日、毎週、２週間に１回）。ある実施形態において、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置は、２週間の間に少なくとも２、３、又は４回投与される。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、少なくとも実質的に完全に（例えば９０％、９５％）ＣＤ３９タンパク質を占める（飽和する）ために必要な最低濃度である濃度をもたらす量で投与し得る。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、少なくとも腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の前記２回の投与の間に実質的に完全に（例えば９０％、９５％）ＣＤ３９タンパク質抗体を占める（飽和する）ために必要な最低濃度である濃度をもたらす量で投与し得る。
【０２１０】
抗ＣＤ３９抗体でヒトを処置するための代表的な処置プロトコルは、例えば、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する抗ＣＤ３９抗体及び薬剤又は処置のそれぞれの有効量を患者に投与することを含み、該方法は、少なくとも１回の用量の抗ＣＤ３９抗体、及び２回の用量の腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置が投与される少なくとも１回の投与サイクルを含み、ここで該２回の用量のＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置は２週間以下の間隔で投与される。ある実施形態において、投与サイクルは２週間から８週間である。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、目的の循環及び／又は組織（例えば腫瘍組織）中の抗ＣＤ３９抗体の濃度がＣＤ３９のＡ３９アーゼ活性を阻害する量となるような量及び／又はスケジュールで投与し得る。任意選択により、抗ＣＤ３９抗体は、ＣＤ３９の実質的に完全な（例えば、９０％、９５％）占有（飽和）を提供する濃度を提供する量で投与される。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与と同時に、又は１−４８時間前に投与される。
【０２１１】
ある実施形態において、ヒト個体における腫瘍の処置に使用するためのヒトＣＤ３９（ＮＴＰＤアーゼ１）タンパク質のＡＴＰアーゼ活性に結合して阻害することができる抗体が提供され、該処置は、（ａ）少なくとも１週間、任意選択により少なくとも２週間（例えば、２週間、３週間、４週間以上）抗ＣＤ３９抗体の飽和濃度を達成する及び/又は維持するのに有効な量及びスケジュールでの抗ＣＤ３９抗体、及び（ｂ）腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置を個体に投与することを含み、ここで抗ＣＤ３９抗体は、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置の投与と同時に又は１−４８時間前に投与される。任意選択により、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置は、抗ＣＤ３９抗体の投与に続く２週間以内に少なくとも２回投与され、例えば、腫瘍細胞からのＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置は、少なくとも週に１回投与され得る。
【０２１２】
いずれの実施形態においても、抗ＣＤ３９抗体は、少なくとも実質的に完全に（例えば９０％、９５％）ＣＤ３９タンパク質抗体を１週間占める（飽和する）ために必要な最低濃度である濃度をもたらす量で投与され得る。ある実施形態において、抗ＣＤ３９抗体は、少なくとも実質的に完全に（例えば９０％、９５％）ＣＤ３９タンパク質抗体を２週間占める（飽和する）ために必要な最低濃度である濃度をもたらす量で投与され得る。
【０２１３】
抗ＣＤ３９抗体組成物は、ＡＴＰの細胞外放出を誘導する薬剤又は処置と組み合わせて、任意選択により、抗体が投与されている特定の治療用目的のために通常は利用される薬剤を包含する１個又は複数のその他の処置又は治療剤との併用（さらなる併用）処置であり得る。さらなる治療剤は通常、処置されている特定の疾患又は状態について単剤療法におけるその薬剤について一般的に使用される量及び処置レジメンで投与されるだろう。ある実施形態において、さらなる治療剤は、ＣＴＬＡ−４又はＰＤ−１軸を阻害する（すなわち、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１を阻害する）薬剤（例えば、抗体）である。ＣＴＬＡ−４、ＰＤ１、又はＰＤ−Ｌ１に結合する抗体は、例えば、そのような薬剤が、例えば下記に記載されるような、単剤療法として使用される代表的な用量及び／又は頻度で使用し得る。ある実施形態において、さらなる治療剤は、ヒトＣＤ７３タンパク質（例えば、細胞により発現されるＣＤ７３タンパク質である可溶性ＣＤ７３タンパク質）の５’−エクトヌクレオチダーゼ活性に結合して中和する薬剤（例えば、抗体）である。ＮＴ５Ｅ遺伝子によりコードされるエクト−５’−ヌクレオチダーゼとして及び５−プライム−リボヌクレオチドホスホヒドロラーゼ、ＥＣ３．１．３．５としても既知であるヒトＣＤ７３は、５’−ヌクレオチダーゼ、特にＡＭＰ−、ＮＡＤ−、及びＮＭＮ−ヌクレオシダーゼ活性を示す。ＣＤ７３は、プリン５プライムモノヌクレオチドの中性ｐＨでのヌクレオシドへの変換を触媒し、好ましい基質は、ＡＭＰである。酵素は、グリコシルホスファチジルイノシトール結合により細胞膜の外面に結合した２つの同一の７０ｋＤサブユニットの二量体からなる。アミノ酸１−２６でのシグナル配列を包含するヒトＣＤ７３プレタンパク質（単量体）のアミノ酸配列は、受入番号ＮＰ＿００２５１７においてＧｅｎｂａｎｋで示され、その開示全体は参照により本明細書中で組み込まれ、以下のとおりである。
【化１４】
2021502980.tif 000016
【０２１４】
本明細書に関連して、「阻害する」、「阻害すること」、「中和する」、又は「中和すること」は、ＣＤ７３ポリペプチドを指す場合（例えば、「ＣＤ７３を中和する」、「ＣＤ７３の活性を中和する」又は「ＣＤ７３の酵素活性を中和する」など）、ＣＤ７３の５’−ヌクレオチダーゼ（５’−エクトヌクレオチダーゼ）活性が阻害されるプロセスを指す。これは、特にＣＤ７３により媒介されるアデノシンの生成の阻害を含み、すなわち、ＡＭＰのアデノシンへのＣＤ７３により媒介される異化を含む。これは、例えば試験化合物がＡＭＰからアデノシンへの変換を阻害する能力を測定する細胞遊離アッセイにおいて直接又は間接的に測定し得る。ある実施形態において、例えば本明細書で説明されたアッセイを参照すると、抗体調製物は、ＡＭＰからアデノシンへの変換の少なくとも５０％の減少を生じさせるか、ＡＭＰからアデノシンへの変換の最大で７０％の減少を生じさせるか、又はＡＭＰからアデノシンへの変換の最大８０％の減少を生じさせる。
【実施例】
【０２１５】
方法
ＣＤ３９突然変異体の生成
ＣＤ３９突然変異体をＰＣＲにより生成した。増幅した配列をアガロースゲル上で泳動させ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ  Ｎａｇｅｌ  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−Ｕｐ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（リファレンス７４０６０９）を使用して精製した。次いで、各突然変異体に関して生成した精製済ＰＣＲ産物をＣｌｏｎＴｅｃｈ  ＩｎＦｕｓｉｏｎシステムにより発現ベクターに連結した。突然変異した配列を含むベクターをＭｉｎｉｐｒｅｐとして調製し、次いで配列決定した。配列決定後、Ｐｒｏｍｅｇａ  ＰｕｒｅＹｉｅｌｄ（商標）Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｄｉｐｒｅｐ  Ｓｙｓｔｅｍを使用して、突然変異した配列を含むベクターをＭｉｄｉｐｒｅｐとして調製した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をＤＭＥＭ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中で増殖させ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用してベクターを遺伝子移入し、４８時間にわたりＣＯ２インキュベータ中で３７℃においてインキュベートした後、導入遺伝子の発現に関して試験した。下記の表に示すように、突然変異体をＨｅｋ−２９３Ｔ細胞に遺伝子移入した。下記の表１において標的となるアミノ酸突然変異を、配列番号１の付番を使用して示す。
【０２１６】
【表１】
2021502980.tif 000017
【０２１７】
可溶性ｈｕＣＤ３９のクローニング、産生及び精製
分子生物学
下記のプライマー：
【化１５】
2021502980.tif 000018
（フォワード）、及び
【化１６】
2021502980.tif 000019
（リバース）を使用して、ヒトＰＢＭＣ  ｃＤＮＡからｈｕＣＤ３９タンパク質をクローニングした。次いで、精製済ＰＣＲ産物を、ＩｎＦｕｓｉｏｎクローニングシステムを使用して発現ベクター中にクローニングした。精製ステップのためにタンパク質のＣ末端部分中にＭ２タグ（ＦＬＡＧタグ、配列番号３９において下線を引いた）を追加しており、（例えば、配列番号３９の）ＣＤ３９細胞外ドメインタンパク質は、何れの実施形態においても、Ｍ２タグを欠くように任意選択により指定され得ることが認識されるであろう。
【０２１８】
ｈｕＣＤ３９タンパク質の発現及び精製
クローニングした配列の検証後、ＣＨＯ細胞をヌクレオフェクト（ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔ）し、次いで産生プールをサブクローニングして、ｈｕＣＤ３９タンパク質を産生する細胞クローンを得た。ローラー中で増殖したｈｕＣＤ３９クローンから上清を回収し、Ｍ２クロマトグラフィーカラムを使用して精製し、Ｍ２ペプチドを使用して溶出させた。次いで、精製済タンパク質をＳ２００サイズ排除クロマトグラフィーカラム上にロードした。単量体に相当する精製済タンパク質をＴＢＳ  ＰＨ７．５緩衝液で製剤化した。Ｍ２タグを有しないＣＤ３９−Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質のアミノ酸配列は、下記のとおりであった。
【化１７】
2021502980.tif 000020
【０２１９】
Ｍ２タグを有するＣＤ３９−Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質の最終アミノ酸配列は、下記のとおりであった。
【化１８】
2021502980.tif 000021
【０２２０】
可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害
産生された可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を、存在するＡＴＰの量に比例して発光シグナルを生じる試薬の使用によりＡＴＰ加水分解の評価を可能にするＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、リファレンスＧ７５７１）を使用して評価した。この方法では、可溶性ＣＤ３９により媒介されるＡＴＰ加水分解の阻害を評価し得る。簡潔に説明すると、１００μｇ／ｍｌ〜６×１０−３μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３９抗体の用量範囲を３７℃で１時間にわたり、方法セクションで説明したアミノ酸配列（配列番号３９）を有する４００ｎｇ／ｍｌの可溶性組換えヒトＣＤ３９タンパク質と共にインキュベートした。このプレートに３７℃でさらに３０分にわたり２０μＭのＡＴＰを添加した後、ＣＴＧ（Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ）試薬を添加した。暗所での５分間の短いインキュベーション期間後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）ルミノメーターを使用して放射光を定量した。抗体の存在下での放射光と、ＡＴＰのみ（最大光放射）並びにＡＴＰ及び可溶性ＣＤ３９タンパク質（最小光放射）との比較により、抗ＣＤ３９抗体の効力を決定した。
【０２２１】
細胞性ＣＤ３９の酵素活性の阻害
抗体による、ＣＤ３９を発現する細胞におけるＣＤ３９酵素活性の阻害を、存在するＡＴＰの量に比例して発光シグナルを生じる試薬の使用によりＡＴＰ加水分解の評価を可能にするＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、リファレンスＧ７５７１）を使用して評価した。そのため、このアッセイを、細胞培養上清中においてＣＤ３９により加水分解されるＡＴＰの阻害の評価を可能にするように設計した。簡潔に説明すると、５×１０４個のＲａｍｏｓヒトリンパ腫細胞、５×１０３個の、ヒトＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞、カニクイザルＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞及びマウスＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞を、３０μｇ／ｍｌ〜５×１０−４μｇ／ｍｌの抗ＣＤ３９抗体と共に３７℃で１時間インキュベートした。次いで、細胞を３７℃でさらに１時間にわたり２０μＭのＡＴＰと共にインキュベートした。プレートを４００ｇで２分にわたり遠心分離し、細胞上清５０μｌを発光マイクロプレート（白色ウェル）に移す。この上清にＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ＣＴＧ）５０μｌを添加し、暗所での５分間のインキュベーション後、Ｅｎｓｐｉｒｅ（商標）ルミノメーターを使用して放射光を定量した。抗体の存在下での放射光と、ＡＴＰのみ（最大光放射）並びにＡＴＰ及び細胞（最小光放射）との比較により、抗ＣＤ３９抗体の効力を決定した。
【０２２２】
抗体の生成：マウスにおける免疫付与及びスクリーニング
抗ヒトＣＤ３９抗体を得るために、上記で説明した組換えヒトＣＤ３９−Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質によりＢａｌｂ／ｃマウスに免疫付与した。マウスに、腹腔内で、ＣＤ３９タンパク質５０μｇ及びＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔの乳濁液による１回の１回目の免疫付与を行い、腹腔内でＣＤ３９タンパク質５０μｇ及びＩｎｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔの乳濁液による２回目の免疫付与を行い、最後に静脈内でＣＤ３９タンパク質１０μｇによる追加免疫を行った。免疫脾臓細胞を追加免疫の３日後にＸ６３．Ａｇ８．６５３不死化Ｂ細胞と融合させ、放射線照射した脾臓細胞の存在下で培養した。ハイブリドーマを半固体メチルセルロース含有培地に播種し、増殖中のクローンを、ｃｌｏｎｅｐｉｘ  ２装置（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）を使用して採取した。
【０２２３】
実施例１：既知の中和ＣＤ３９  ｍＡｂのエピトープマッピング
抗体がどのように細胞性ＣＤ３９の酵素（ＡＴＰアーゼ）活性を阻害することができるかについての洞察を得るために、本発明者らは、細胞アッセイにおいてＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害することが報告されている抗体（国際公開第２００９／０９５４７８号パンフレットで開示されたＢＹ４０）が結合するエピトープを調べた。
【０２２４】
抗ＣＤ３９抗体のエピトープを定義するために、本発明者らは、ＣＤ３９の表面上に分子表面で露出したアミノ酸の置換により定義されるＣＤ３９突然変異体を設計した。配列番号１の付番を使用して表１に示す突然変異体をＨｅｋ−２９３Ｔ細胞に遺伝子移入した。
【０２２５】
Ｉ−３９４の用量範囲（１０〜２．５〜０．６２５〜０．１５６３〜０．０３９１〜０．００９８〜０．００２４〜０．０００６μｇ／ｍｌ）を、フローサイトメトリーにより、２０種の生成した突然変異体で試験する。ＢＹ４０抗体は、両方ともＣＤ３９の突然変異体５を発現する細胞への結合が完全に喪失していたが、あらゆる他の突然変異体への結合を喪失していなかった。突然変異体５は、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７でアミノ酸置換を含む。ＣＤ３９の表面上での突然変異体５の位置を図３Ａに示す。
【０２２６】
実施例２：既知の中和ＣＤ３９  ｍＡｂは、組換え可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害することができない
細胞アッセイにおいてＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害することが報告されている２種の抗体（ＢＹ４０及びＢＹ１２）を、組換え可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害することができるかどうかを決定するために評価した。上記で説明したように産生された可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を、Ｃｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  Ｇｌｏ（商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、リファレンスＧ７５７１）を使用して評価した。細胞性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性の抗体による阻害を上記で示したように評価した。
【０２２７】
予想したように、ＢＹ４０は、細胞中においてＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を阻害した。しかしながら、ＢＹ４０は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害することができなかった。図２Ｂは、ＢＹ４０と、本明細書で特定された新規の抗体との比較を示す。
【０２２８】
実施例３：ｓＣＤ３９の活性をブロックするための新規のｍＡｂのスクリーニング
ｓＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を中和する抗体を探すために一連の免疫付与を実行した。抗ヒトＣＤ３９抗体を得るために、上記で説明した組換えヒトＣＤ３９−Ｍ２細胞外ドメイン組換えタンパク質で動物に免疫付与した。様々なプロトコルを使用して及び様々な動物において、合計で１５の系列の免疫付与を実行した。含まれているのは、様々なマウス株、ラット及びウサギであった。
【０２２９】
最初の免疫付与プロトコルでは、一次スクリーニングは、野生型ＣＨＯ細胞系及びｈｕＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞系を使用するフローサイトメトリーによる増殖中のクローンの上清（ＳＮ）の試験を含んだ。細胞をそれぞれ０．１μＭ及び０．００５μＭのＣＦＳＥで染色した。フリーサイトメトリースクリーニングのために、全ての細胞を同程度に混合し、ＡＰＣで標識されたヤギ抗マウスポリクローナル抗体（ｐＡｂ）により、上清中における反応性抗体の存在が明らかになった。次いで、ｈｕＣＤ３９に結合した抗体に関して、開発して上記（方法）で説明したスクリーニングアッセイを使用して、可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害に関して上清をスクリーニングした。
【０２３０】
結果は、多数の特異的ＣＤ３９結合抗体を得ることができるが、これらの免疫付与の何れからの抗体も可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害を全く示さないことを示した。１つの可能性は、ＣＤ３９上の優性エピトープが、ＣＤ３９の触媒部位に又はこの触媒部位の付近に適切に配置されたいずれのエピトープも含まないことである。細胞性ＣＤ３９を阻害する利用可能な抗体の少なさと、抗体を使用した酵素の触媒部位の阻害における既知の困難さとを考慮すると、ｓＣＤ３９を中和する抗体の非存在は、可溶性（細胞外ドメイン）ＣＤ３９を阻害する抗体を得ることができないことを示す可能性がある。他の可能性は、機能しないスクリーニングアッセイ及び／又は不適切に折りたたまれた若しくは機能する可溶性ＣＤ３９タンパク質に関し、なぜなら、特に可溶性ＣＤ３９を阻害し得る抗体の欠如により、ｓＣＤ３９遮断アッセイの検証が妨げられるからである。
【０２３１】
可溶性ＣＤ３９を阻害し得る抗体の非存在を考慮して、抗体ＢＹ４０のエピトープにより特定されるようにＣＤ３９の活性部位に結合する抗体の生成を促進するように設計されたスクリーニングプロトコルにより、さらなる免疫付与を実行した。簡潔に説明すると、一次スクリーニングは、上述の免疫付与と同様に野生型ＣＨＯ細胞系及びｈｕＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞系を使用するフローサイトメトリーによる増殖中のクローンの上清（ＳＮ）の試験、これに続く、野生型ＣＤ３９と比較して表１に示すＣＤ３９突然変異体５を発現するＨｅｋ−２９３Ｔ細胞への結合の喪失に関するスクリーニングを含んだ。突然変異体５は、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７で置換を有する。しかしながら、再び結果は、突然変異体５への結合の喪失を示す多数の特異的ＣＤ３９結合抗体を得ることができるが、最初の免疫付与の何れからの抗体も可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害を全く示さないことを示した。
【０２３２】
実施例４：エピトープ特異的スクリーニングの一部としての、ｓＣＤ３９活性を阻害する一次抗体の特定
本発明者らは、ＢＹ４０様抗体と競合しない抗体を有するために、Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７領域（突然変異体５により定義される）に結合しない抗ＣＤ３９抗体を特定しようとした。ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性をブロックする能力を必要としないそのような抗体は、例えば、細胞性ＣＤ３９を阻害するＢＹ４０抗体又はＢＹ４０様抗体の存在下で細胞上の遊離ＣＤ３９タンパク質を検出して定量するための、ＢＹ４０結合部位に結合する細胞性ＣＤ３９を阻害する抗体の薬理学的研究に有用であり得る。
【０２３３】
ＣＤ３９突然変異体５への結合の喪失に関してハイブリドーマをスクリーニングした実施例３の免疫付与の結果から出発して、ＣＤ３９突然変異体５への結合の喪失を示すものの中の１つではないハイブリドーマを選択した。このハイブリドーマ（Ｉ−３９４）は、突然変異体５への結合の可能性のある部分的減少を示す決定的ではないデータに起因するより広いプールの中の１つであったが、突然変異体５への結合を喪失せず、従って最初に保持されなかった。
【０２３４】
可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害のためのさらなる免疫付与からの上清の継続的なスクリーニングに関連して、クローン化して産生した抗体Ｉ−３９４を対照として含めた。驚くべきことに、抗体Ｉ−３９４は、エピトープ特異的スクリーニングで保持されるクローンの中の１つでないにもかかわらず、この抗体は、上記（方法）で説明したアッセイにおいて可溶性ＣＤ３９の酵素活性の強い阻害を示した。
【０２３５】
ヒトＦｃγ受容体ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ６４への結合の欠如をもたらす突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）を有する改変されたＦｃドメインを有するＩｇＧ１アイソタイプのヒト定常領域でＩ−３９４を産生させた。簡潔に説明すると、Ｉ−３９４抗体のＶＨ配列及びＶｋ配列（それぞれ配列番号３及び配列番号４に示すＶＨ可変領域及びＶｋ可変領域）を、上述の突然変異及びｈｕＣｋ定常ドメインをそれぞれ有するｈｕＩｇＧ１定常ドメインを含む発現ベクターにクローニングした。これら２種の得られたベクターをＣＨＯ細胞系に共遺伝子移入した。細胞の確立されたプールを使用して、ＣＨＯ培地中で抗体を産生させた。次いで、この抗体を、プロテインＡを使用して精製した。Ｉ−３９４のぞれぞれの重鎖可変ドメイン及び軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列を下記に示す（Ｋａｂａｔ  ＣＤＲに下線を引いている）。
Ｉ−３９４重鎖可変ドメイン配列：
【化１９】
2021502980.tif 000022
Ｉ−３９４軽鎖可変ドメイン配列：
【化２０】
2021502980.tif 000023
【０２３６】
Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ置換（Ｎ２９７結合グリコシル化を保持する）を有するヒトＩｇＧ１定常領域を有するヒトＩ−３９４の重鎖及び軽鎖配列を下記に示す。
Ｉ−３９４重鎖配列：
【化２１】
2021502980.tif 000024
Ｉ−３９４重鎖配列：
【化２２】
2021502980.tif 000025
【０２３７】
次いで、抗体Ｉ−３９４を、ＣＤ３９の表面上に分子表面で露出したアミノ酸の置換により定義されるＣＤ３９突然変異体への結合の喪失に関して試験した。配列番号１の付番を使用して表１に示す突然変異体をＨｅｋ−２９３Ｔ細胞に遺伝子移入した。抗体Ｉ−３９４の用量範囲をフローサイトメトリーにより２０種の突然変異体で試験した。図３Ｂに示すように、Ｉ−３９４は、ＣＤ３９の突然変異体１９を発現する細胞への結合の完全な喪失を示した。突然変異体１９は、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２で置換を含む。そのため、Ｉ−３９４のコアエピトープは、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２の１つ又は複数（又は全て）を含む。
【０２３８】
突然変異体５への結合を喪失し、且つ細胞性ＣＤ３９を阻害する能力を有するが可溶性ＣＤ３９を阻害する能力を有しない先行の抗体ＢＹ４０と異なり、抗体Ｉ−３９４は、隣接する突然変異体１９への結合を喪失し、突然変異体５への結合が強く減少する（しかし、いくつかの残基は、突然変異体５に結合する）。興味深いことに、突然変異体１９の残基は、残基５のものに近接しているか又は隣接しており、その結果、Ｉ−３９４は、ＢＹ４０と比較してエピトープのシフトを表す可能性がある。そのため、抗体Ｉ−３９４は、可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の阻害を可能にする抗ＣＤ３９抗体に関する有用な新規のエピトープを提示する。同様に、可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性を中和するさらなる抗体を検出するためのスクリーニングアッセイの検証及び試験を可能とする特異的陽性対照も提供される。
【０２３９】
実施例５：ｓＣＤ３９中和ｍＡｂに関する非エピトープ特異的スクリーニング
可溶性ＣＤ３９の抗体により媒介される阻害が可能であることを示す実施例４の結果に基づいて、ｓＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を中和する抗体を探すために、実施例３と異なるプロトコルを使用する異なる免疫付与からの融合を再検討した。
【０２４０】
次いで、ＡＴＰアーゼ阻害に関するスクリーニングのための様々なアプローチを評価した。一実験では、Ｉ−３９４抗体を使用して、可溶性ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害する能力が陰性であることが分かった実施例３の免疫付与のハイブリドーマから上清をスパイクした。上清へのＩ−３９４のこの添加により、ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害する陰性上清の能力は、回復しなかった。次いで、抗体Ｉ−３９４を、プロテインＡ被覆ビーズを使用して陰性上清から精製し、本発明者らは、精製されたＩ−３９４が再びＡＴＰ活性を阻害し得ることを観察した。
【０２４１】
上述の結果を考慮して、可溶性ＣＤ３９又は細胞性ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性の阻害を評価することなく、且つエピトープに関するスクリーニングバイアスなしに、野生型ＣＨＯ細胞系及びｈｕＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞系を使用するフローサイトメトリーにより、新たな免疫付与及び過去の免疫付与からの増殖クローンをスクリーニングする新たな免疫付与及びスクリーニングのプロトコルを開発した。突然変異体５又は突然変異体１９への結合の喪失に関するデータが一部のハイブリドーマに関して利用可能であったが、そのようなデータをクローン選択に使用せず、ＡＴＰアーゼブロッキングアッセイにおいて陰性結果の場合にクローニングのためにハイブリドーマを救出する目的で保持するのみであった。ＣＤ３９に結合するハイブリドーマを選択してクローニングし、次いで下記のプロトコルに従ってプロテインＡを使用して精製した：
−  ハイブリドーマ上清３００μｌにプロテインＡビーズ１０μｌを添加する
−  最終濃度が１，５μＭとなるようにＮａＣｌを添加する
−  ４℃で３〜４時間にわたりチューブを回転させる
−  １５００ｒｐｍで１分間遠心分離する
−  上清を除去し、ＴＢＳ  １ｍｌによる３回の洗浄を実施する
−  ３回目の洗浄後にＴＢＳを全て除去する
−  クエン酸塩０，１Ｍ  ｐＨ３  ５０μｌを添加し、ホモジナイズし、次いで５分にわたりＲＴでインキュベートする
−  １５００ｒｐｍで１分にわたりビーズを遠心分離する
−  溶出液５０μｌを回収し、ＴＢＳ  ４５０μｌを速やかに添加し、次いで４℃で貯蔵する。
【０２４２】
次いで、得られた抗体を、Ｉ−３９４と同程度までＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を阻害する能力に関して比較アッセイでスクリーニングした。可溶性ＣＤ３９及び細胞性ＣＤ３９の酵素活性の阻害に使用するアッセイは、上記（方法）で説明したとおりであった。驚くべきことに、この方法で製造した例示的抗体のいくつかは、可溶性ＣＤ３９の阻害（及び細胞性ＣＤ３９の阻害）を示した。図１は、代表的なスクリーニング結果を示し、陽性対照Ｉ−３９４抗体と比較して抗体Ｉ−３９７、Ｉ−３９８及びＩ−３９９を示す。同様に、異なる免疫付与からの抗体Ｉ−３９５及びＩ−３９６は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害した。図２Ａ及び図２Ｂは、抗体Ｉ−３９５及びＩ−３９６の結果を示しており、より多くの抗体が可溶性ＣＤ３９中和及び細胞性ＣＤ３９中和の両方の追加実験に利用可能であった。図２Ａは、抗体Ｉ−３９５及びＩ−３９６が、両方ともＢＹ４０抗体及びＩ−３９４抗体と比較して細胞膜結合型ＣＤ３９を阻害し、Ｉ−３９４及びＩ−３９５が、両方ともＢＹ４０と比較して大きい効力及び細胞性ＣＤ３９の最大阻害を示すことを示す。図２Ｂは、抗体Ｉ−３９５及びＩ−３９６が、両方ともＢＹ４０抗体及びＩ−３９４抗体と比較して可溶性ＣＤ３９を阻害することを示す。ＢＹ４０は、いかなる濃度でも可溶性ＣＤ３９を阻害しないが、Ｉ−３９４、Ｉ−３９５及びＩ−３９６は、全て可溶性ＣＤ３９を阻害し、Ｉ−３９４が最大の効力を示し、続いてＩ−３９５がより低い効力を示し、次いでＩ−３９６がより低い効力を示す。
【０２４３】
得られた結果は、ハイブリドーマ上清中の因子が、細胞培養と可溶性ＣＤ３９アッセイとの両方でＡＴＰを迅速に加水分解する可能性を高め、その結果、従来の方法を使用した抗体のスクリーニングではＡＴＰに関するシグナルが検出されない。可溶性因子は、ＣＤ３９又は例えば融合パートナーにより産生されるいくつかの他の酵素であり得る。
【０２４４】
次いで、Ｉ−３９４に関して本明細書で示したのと同一の方法において、ヒトＦｃγ受容体ＣＤ１６Ａ、ＣＤ１６Ｂ、ＣＤ３２Ａ、ＣＤ３２Ｂ及びＣＤ６４への結合の欠如をもたらす突然変異Ｌ２３４Ａ／Ｌ２３５Ｅ／Ｇ２３７Ａ／Ａ３３０Ｓ／Ｐ３３１Ｓ（Ｋａｂａｔ  ＥＵ付番）を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメインを有するヒト定常領域を有するように改変された抗体をクローニングした。次に、得られた抗体を滴定にかけ、次いで効力に従って抗体をランク付けするためにＥＣ５０及びＩＣ５０の決定を評価するために、実施例７〜９（滴定、ＡＴＰアーゼ活性の阻害）に示すようにより詳細な活性評価にかけることができる。
【０２４５】
実施例６：ｓＣＤ３９中和ｍＡｂのエピトープマッピング
実施例４で示すように、Ｉ−３９４は、ＣＤ３９の突然変異体１９を発現する細胞への結合の完全な喪失を示したが、突然変異体５への結合を喪失していなかった。実施例５のさらなる抗ＣＤ３９抗体のエピトープを定義するために、これらを、実施例１及び表１で説明されているＣＤ３９突然変異体のパネルへの結合の喪失に関して試験した。配列番号１の付番を使用して表１に示す突然変異体をＨｅｋ−２９３Ｔ細胞に遺伝子移入した。試験抗体の用量範囲（１０〜２．５〜０．６２５〜０．１５６３〜０．０３９１〜０．００９８〜０．００２４〜０．０００６μｇ／ｍｌ）を、フローサイトメトリーにより、２０種の生成された突然変異体で試験する。
【０２４６】
結果は、可溶性ＣＤ３９を阻害する能力に関して実施例５で選択された抗体がいくつかの異なるエピトープを表すことを示した。実施例５において可溶性細胞外ＣＤ３９の阻害を示した抗体のうち、抗体Ｉ−３９５は、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７で置換を有する突然変異体５への結合の喪失を示し、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２で置換を有する突然変異体１９への結合の装置も示した抗体の一例である。突然変異体１９は、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２で置換を含む。そのため、Ｉ−３９５のＣＤ３９上のコアエピトープは、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７の１つ、２つ、３つ又は４つと、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２の１つ、２つ又は３つとを含む。
【０２４７】
一方、抗体Ｉ−３９８は、残基Ｒ１３８、Ｍ１３９及びＥ１４２で置換を有する突然変異体１９への結合の喪失を示したが、残基Ｑ９６、Ｎ９９、Ｅ１４３及びＲ１４７で置換を有する突然変異体５への結合が減少していないか又は喪失していない抗体の一例である。
【０２４８】
実施例５において可溶性細胞外ＣＤ３９の阻害を示した他の抗体は、非常に異なるエピトープを有し、且つ突然変異体５又は突然変異体１９の何れかへの結合の喪失を示さず、これは、可溶性ＣＤ３９がｓＣＤ３９上の他の部位への結合によっても阻害され得ることを示唆する。一部の抗体の場合、表１の２０種の突然変異体の１つへの結合の喪失により、ＣＤ３９上の結合部位の位置特定が可能となり、他の場合、結合部位は、依然として決定されておらず、なぜなら、２０種の突然変異体の何れに対しても結合が喪失されなかったからである。実施例５において可溶性ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性の阻害を示す抗体のうち、抗体Ｉ−３９６は、他の２０種の突然変異体の何れに対しても結合を喪失することなく、置換Ｋ８７Ａ、Ｅ１００Ａ及びＤ１０７Ａを有する突然変異体１５への結合の喪失を示した。そのため、この抗体のＣＤ３９上のコアエピトープは、残基Ｋ８７、Ｅ１００及びＤ１０７の１つ又は複数（又は全て）を含む。抗体Ｉ−３９９は、他の２０種の突然変異抗体の何れに対しても結合を喪失することなく、置換Ｎ３７１Ｋ、Ｌ３７２Ｋ、Ｅ３７５Ａ、Ｋ３７６Ｇ、Ｖ３７７Ａを有し、且つＫ３７６とＶ３７７との間にバリンの挿入（表１では「挿入３７７Ｖ」と称される）を有する突然変異体１１への結合の喪失を示した。そのため、この抗体のＣＤ３９上のコアエピトープは、残基Ｎ３７１、Ｌ３７２、Ｅ３７５、Ｋ３７６及びＶ３７７の１つ又は複数（又は全て）を含む。図３Ａは、ＣＤ３９タンパク質の表面上の突然変異体５（Ｍ５）、突然変異体１５（Ｍ１５）及び突然変異体１９（Ｍ１９）中で突然変異した残基の位置を示す。図３Ｂは、様々な抗体に関する突然変異体５、突然変異体１５及び突然変異体１９への結合の結果を示す。
【０２４９】
そのため、この結果は、可溶性ＣＤ３９を阻害する抗体を様々なエピトープに対して得ることができることを示す。これらのエピトープとして下記が挙げられる：細胞性ＣＤ３９のみを阻害し可溶性ＣＤ３９を阻害しない（突然変異体５への結合を喪失している）ＢＹ４０抗体又はＢＹ４０様抗体の結合部位に隣接して位置する突然変異体１９の１個又は複数の残基により定義されるエピトープ、突然変異体１９の１個又は複数の残基により定義されるが、突然変異体５によっても部分的に定義されるエピトープ（ＢＹ４０抗体又はＢＹ４０様抗体と比較して小さいシフトを示す可能性がある）、突然変異体１９の１個又は複数の残基により定義され、且つ突然変異体５の残基により定義されないエピトープ並びに他のエピトープ、例えば突然変異体１１の１個若しくは複数の残基又は突然変異体１５の１個若しくは複数の残基により定義されるか、又は突然変異体５、突然変異体１５若しくは当然変異体１９の何れかへの結合が全く減少していない他の抗体によりさらに定義されるもの（エピトープの位置特定が依然として決定されていない）。
【０２５０】
実施例７：フローサイトメトリーによる、ＣＤ３９発現細胞に対する抗体滴定
抗体Ｉ−３９４を、ヒトＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞、カニクイザル（マカカ・ファスキクラリス（ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ））ＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞、マウスＣＤ３９を発現するＣＨＯ細胞及びヒトＲａｍｏｓリンパ腫細胞（ＡＴＣＣ（商標）、リファレンスＣＲＬ−１５９６）への結合に関して２回の反復実験で試験した。細胞を４℃で３０分にわたり３０μｇ／ｍｌ〜５×１０−４μｇ／ｍｌの様々な濃度の非標識抗ＣＤ３９と共にインキュベートした。洗浄後、４℃で３０分にわたり細胞をヤギ抗マウスＨ＋Ｌ標識二次抗体と共にインキュベートした。
【０２５１】
結果を図４に示す。抗体Ｉ−３９４は、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｈｕＣＤ３９）、カニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｃｙＣＤ３９）及びＲａｍｏｓリンパ腫細胞に結合したが、マウスＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｍｏＣＤ３９）に結合しなかった。Ｉ−３９４は、実験の第１のセット及び第２のセットそれぞれにおいて０．１６μｇ／ｍｌ及び０．１９μｇ／ｍｌのＥＣ５０値でＲａｍｏｓ細胞に結合した。いくつかの他の抗ＣＤ３９抗体は、Ｒａｍｏｓ細胞への結合に関して同等のＥＣ５０値を示した。
【０２５２】
実施例８：細胞性ＡＴＰアーゼ活性の阻害に関するＩＣ５０の決定
上記（方法）で説明した細胞性ＣＤ３９の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイを使用して、ＣＤ３９発現細胞中におけるＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性の抗体Ｉ−３９４による阻害を評価した。
【０２５３】
結果を図５に示す。Ｉ−３９４は、腫瘍（Ｒａｍｏｓ）細胞中におけるＣＤ３９酵素活性のブロックで非常に強力であり、試験した全ての他の抗体と比較して効力が高い。Ｉ−３９４は、ヒトＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｈｕＣＤ３９）中及びカニクイザルＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｃｙＣＤ３９）中においてＣＤ３９酵素活性もブロックする。マウスＣＤ３９を発現する細胞（ＣＨＯ−ｍｏＣＤ３９）を陰性対照として示す。算出したＩＣ５０（５０，０００個のＲａｍｏｓ細胞により発現されたＣＤ３９の酵素活性の５０％の阻害）は、０．０５μｇ／ｍｌである。達成された最大阻害は、８１．６％である。アイソタイプ対照は、効果がなかった。
【０２５４】
実施例９：組換え可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の阻害に関するＩＣ５０の決定
上記（方法）で説明した可溶性ＣＤ３９の酵素活性の阻害に関して使用したアッセイを使用して、可溶性ＣＤ３９タンパク質のＡＴＰアーゼ活性の抗体Ｉ−３９４による阻害を評価した。結果を図６に示す。Ｉ−３９４は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害する。比較すると、抗体ＢＹ４０は、可溶性ＣＤ３９タンパク質の酵素活性を阻害しなかった。算出したＩＣ５０は、０．００３μｇ／ｍｌである。達成された最大阻害は、７４．９％である。
【０２５５】
実施例１０：ＣＤ３９−Ｌ１アイソフォーム、ＣＤ３９−Ｌ２アイソフォーム、ＣＤ３９−Ｌ３アイソフォーム、ＣＤ３９−Ｌ４アイソフォームに対するＥＬＩＳＡ滴定
抗体Ｉ−３９４を、一晩４℃で５００ｎｇ／ｍｌ又は１μｇ／ｍｌにおいてＰＢＳ  １Ｘで９６ウェルプレートにコーティングした、下記に示すアミノ酸配列を有する組換えヒトＣＤ３９アイソフォーム（Ｒｅｃ−ｈｕＣＤ３９アイソフォーム）への結合に関して試験した。ウェルをＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、ＴＢＳブロッキング緩衝液でＲＴにおいてさらに２時間飽和させた。一次抗体の用量範囲濃度をＲＴで２時間にわたりＴＢＳブロッキング緩衝液中でインキュベートした。ウェルをＴＢＳ  Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄した。二次抗体（ＴＢＳブロッキング緩衝液中のＧＡＭ−ＨＲＰ又はＧＡＨ−ＨＲＰ）をＲＴで１時間にわたりインキュベートし、ＴＭＢで明らかにした。光学密度をＯＤ＝４５０でＥｎｓｐｉｒｅ（商標）により測定した。
【０２５６】
クローニングしたｈｕＣＤ３９（血管アイソフォーム）のアミノ酸配列：
ヒトＣＤ３９−Ｌ１（ＮＴＰＤアーゼ２又はＥＮＴＰＤ２としても既知である）：
【化２３】
2021502980.tif 000026
ヒトＣＤ３９−Ｌ４（ＮＴＰＤアーゼ５又はＥＮＴＰＤ５としても既知である）：
【化２４】
2021502980.tif 000027
ヒトＣＤ３９−Ｌ３（ＮＴＰＤアーゼ３又はＥＮＴＰＤ３としても既知である）：
【化２５】
2021502980.tif 000028
ヒトＣＤ３９−Ｌ４（ＮＴＰＤアーゼ５又はＥＮＴＰＤ５としても既知である）：
【化２６】
2021502980.tif 000029
【０２５７】
Ｉ−３９４は、ＣＤ３９に結合したが、アイソフォームＣＤ３９−Ｌ１、ＣＤ３９−Ｌ２、ＣＤ３９−Ｌ３又はＣＤ３９−Ｌ４の何れにも結合しなかった。アイソタイプ対照抗体（ＩＣ）は、何れのＣＤ３９分子又はＣＤ３９−Ｌ分子にも結合しなかった。結果を図７に示す。
【０２５８】
実施例１１：樹状細胞の活性化
ＡＴＰは、炎症誘導性活性を有するが、ＡＴＰのＣＤ３９により媒介される異化により、樹状細胞（ＤＣ）活性化を損ない、次いで腫瘍抗原に対するより広い適応免疫反応を変化させることができると考えられる。抗ＣＤ３９抗体を使用するＣＤ３９遮断が、ＡＴＰの存在下での樹状細胞（ＤＣ）活性化のＣＤ３９により媒介される変化を克服し得るかどうかを評価するために、ＡＴＰの存在下で抗ＣＤ３９抗体と共に単球由来のＤＣ（ｍｏＤＣ）をインキュベートした。
【０２５９】
簡潔に説明すると、ヒト単球をヒトの健康な血液から精製し、６日にわたりＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下でＭｏＤＣに分化させた。次いで、ＭｏＤＣを２４時間にわたりＡＴＰ（Ｓｉｇｍａ、０．２５〜１ｍＭ）の存在下で活性化させ、フローサイトメトリーにより、ＣＤ８０、ＣＤ８３及びＨＬＡ−ＤＲ発現を分析することによりＤＣ活性化を評価した。任意選択により、ＣＤ３９阻害剤：ＡＲＬ６７１６（Ｔｏｃｒｉｓ、２５０μＭ）、ＣＤ７３阻害剤：ＡＰＣＰ（Ｔｏｃｒｉｓ  ５０μＭ）、抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ−３９４若しくはＢＹ４０（ＢＹ４０に関して、国際公開第２００９／０９５４７８号パンフレットを参照されたい）又は抗ＣＤ７３ブロッキング抗体の存在下で１時間にわたりＭｏＤＣをプレインキュベートした。ＬＰＳ（インビボｇｅｎ、１０ｎｇ／ｍｌ）を陽性対照として使用した。ＣＤ４Ｔ細胞活性化へのＡＴＰにより媒介されるＤＣ活性化の生じた効果を評価するために、ＡＴＰにより活性化されたＤＣを洗浄し、次いで５日にわたる混合リンパ球反応（ＭＬＲ）のために同種ＣＤ４Ｔ細胞と共にインキュベートした（比１  ＭｏＤＣ／４  Ｔ細胞）。Ｔ細胞の活性化及び増殖をフローサイトメトリーによるＣＤ２５発現及びＣｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ希釈により分析した（図８）。
【０２６０】
結果を図９、図１０及び図１１に示す。陰性対照（培地）の存在下では、１ｍＭのＡＴＰの存在下でｍｏＤＣの活性化を観察したが、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭでのＡＴＰではｍｏＤＣの活性化は可能でなかった。活性部位への結合によりＣＤ３９酵素活性を完全にブロックすると考えられるＣＤ３９の化学阻害剤の添加により、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭのそれぞれでｍｏＤＣ活性化がもたらされる。しかしながら、抗ＣＤ３９抗体（例えば、ＢＹ４０抗体又は抗ＣＤ７３抗体）は、樹状細胞（ＤＣ）のＡＴＰにより誘導される活性化を促進することができず、これは、抗体が、ＡＴＰの異化を回避するのに十分に酵素活性をブロックできないことを示唆する。驚くべきことに、ＣＤ３９のＡＴＰアーゼ活性を実質的に完全にブロックし、従ってＡＴＰの蓄積を可能にし得る抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ−３９４（図面では、濃度１０μｇ／ｍｌで示す）は、０．１２５ｍＭ、０．２５ｍＭ又は０．５ｍＭのそれぞれでＨＬＡ−ＤＲ又はＣＤ８３の発現により評価した場合、ｍｏＤＣ活性化を可能にした（図９及び図１０）。興味深いことに、ＡＴＰの存在下で活性化されたＭｏＤＣは、ＭＬＲアッセイにおいてより良好なＴ細胞の活性化及び増殖を誘導し得た。さらに、抗ＣＤ３９ブロッキング抗体Ｉ−３９４による、ＡＴＰにより媒介されるＭｏＤＣの活性化の増強により、より高いＴ細胞の増殖及び活性化がもたらされた（図１１）。
【０２６１】
ＡＴＰの存在下でＣＤ３９阻害剤がＤＣを活性化する能力の評価により、ＣＤ３９の高度な阻害を達成し得る抗ＣＤ３９抗体を特定して評価するための方法が提供される。
【０２６２】
さらに、ＤＣへのＣＤ３９によってもたらされる免疫抑制効果を緩和するための抗ＣＤ３９抗体の使用の可能性により、（特に腫瘍細胞上の）抗原に対する適応免疫反応の増強がもたらされ得る。さらに、そのような抗ＣＤ３９抗体は、化学療法剤の免疫原性効果を増強するために使用される場合、特に興味深い場合がある。腫瘍細胞の壊死を生じさせる多くの化学療法剤は、ＡＴＰを誘導することができ、抗ＣＤ３９抗体との併用は、この設定で抗腫瘍反応を増強するのに特に有用であり得る。
【０２６３】
実施例１２：ＡＴＰ放出を誘導する薬剤の抗ＣＤ３９抗体でのインビボ組み合わせ処置
１ｘ１０６個のＭＣＡ２０５マウス腫瘍細胞（肉腫）を、ヒトＣＤ３９（ＣＤ３９ＫＩマウス）を発現するように遺伝的に改変されたマウスの右腹部に皮下移植した。マウス（ｎ＝９から１３）を、対照、オキサリプラチン（１０ｍｇ／ｋｇ、腹腔内、５日目及び１２日目又は１４日目）、マウス抗ヒトＣＤ３９抗体Ｉ−３９４（一回目の注入は２０ｍｇ／ｋｇ、次いで１０ｍｇ／ｋｇ、静脈内、４日目から３週間又は４週間週２回）、又は両方の組み合わせのいずれかで処置した。腫瘍をキャリパー（Ｌ：長さ及びｗ：幅）で週２回測定し、腫瘍体積を式（Ｌｘｗ２）／２で計算した。腫瘍体積が１８００ｍｍ３を超えると、又は腫瘍が非常に壊死すると、マウスを犠牲にした。ヒトＣＤ３９  ＫＩマウスに、０日目にＭＣＡ２０５腫瘍細胞を移植した。使用したマウスＩ−３９４を、マウスＦｃＲ及び補体結合を防ぐために、観察される唯一の効果が抗体のブロッキング特性に関連し、ＣＤ３９＋免疫抑制細胞又はＣＤ３９＋内皮細胞のＡＤＣＣ又はＣＤＣ溶解には関連しないように、非グリコシル化マウスＩｇＧ１アイソタイプ（Ｋａｂａｔ重鎖残基Ｎ２９７で置換）で操作した。
【０２６４】
第一の実験系列において、マウスを、腫瘍細胞生着後５日目に対照（１群）ＰＢＳ又はオキサリプラチン化学療法（２群）のいずれかで処置した。並行して、オキサリプラチンで処置したマウスの１つの群に週２回抗ＣＤ３９抗体を注入し、抗ＣＤ３９抗体処置をオキサリプラチン処置のちょうど１日前（４日目）に開始した。このことは、ＣＤ３９が既に完全に阻害された腫瘍環境でオキサリプラチンがＡＴＰ放出を誘導し、従って腫瘍内ＣＤ３９によるＡＴＰ分解の最適な防止が提供されることを確実にした。この実験において、オキサリプラチン及びＩ−３９４抗体群の組み合わせにおける腫瘍の増殖及びマウス生存の遅延を観察し得たが、この群において１つの完全な反応（ＣＲ）を得ても、対照又はオキサリプラチン単一薬剤群においてＣＲを観察せず、該遅延を比較的穏やかであると見なした。対照の生存中央値は２０日、オキサリプラチンは２５日、オキサリプラチンと組み合わせたＩ−３９４抗体は３１日であった。結果を図１２に示す。
【０２６５】
第二の実験系列（２つのうち１つの代表的な実験を示す）において、最初のオキサリプラチン注入の１週間後、Ｉ−３９４抗体での処置のちょうど１日後に再びオキサリプラチン注入を反復し、ＡＴＰ分解の最適な阻害を提供した。単独で投与されたＩ−３９４  Ａｂは、腫瘍増殖及びマウスの生存にわずかな影響しか有さなかった。反復（２回）注入での単一薬剤としてのオキサリプラチンは、腫瘍体積のいくらかの退縮を誘導し、マウスの生存を増加させた。しかしながら、オキサリプラチンの前に投与された抗体Ｉ−３９４と組み合わされたオキサリプラチンの反復注入の組み合わせは、オキサリプラチン単独での２と比較した３のＣＲ、及び６の部分的反応（ＰＲ）対オキサリプラチン単独での３のＰＲで、全てのマウスにおいて腫瘍体積退縮を誘導した。該組み合わせはまた、４／１３腫瘍の無いマウス対オキサリプラチン単独群での２／１２で、腫瘍生着後の４０日、マウスの生存を改善した。結果を図１３に示す。
【０２６６】
この設定でのオキサリプラチンの２回目の反復注入は、ブロッキング抗ＣＤ３９抗体の存在下でのＡＴＰ蓄積及びアデノシン（Ａｄｏ）抑制が、効果的な抗腫瘍免疫反応を開始するために必要な古典的な２週間の間に起こるのを可能にすると考えられる。その結果、ヒトでは、改善された処置レジメンは、抗ＣＤ３９ブロッキング抗体との最も強い組み合わせ効果を確認するために、化学療法投与を少なくとも２回反復することを含み得る。さらに、抗ＣＤ３９  Ａｂは、化学治療剤がＡＴＰ放出を誘導する時に、腫瘍内ＣＤ３９の完全阻害及びアデノシンへのＡＴＰ分解の完全阻害を確実にするため、理想的にはＡＴＰ放出を誘導する化学療法剤誘導の少なくとも１−４８時間前に投与され得る。
【０２６７】
本明細書中で引用される刊行物、特許出願及び特許を含む全ての参考文献は、本明細書中の他の箇所でなされる特定の文献の何れかの個別に提供される組み込みにかかわらず、（法律により許される最大の限度で）各参考文献が個々に及び具体的に参照により組み込まれることが示され、本明細書中でその全体において記載されているかのように、同定度に参照により全体的に本明細書に組み込まれる。
【０２６８】
別段の指定がない限り、本明細書中で提供される全ての厳密値は、対応する近似値の代表である（例えば、特定の要因に関して提供される全ての代表的厳密値又は測定値は、必要に応じて、「約」により修飾される対応する近似測定値も提供するとみなされ得る）。「約」が数に関連して使用される場合、これは、特定される数の＋／−１０％に対応する値を包含するとして特定され得る。
【０２６９】
１つ又は複数の要素に関する「含む」、「有する」、「包含する」又は「含有する」などの語を使用した本明細書における何らかの態様又は実施形態の本明細書中の記述は、別段の指定がない限り又は内容に明らかに矛盾しない限り、その特定の１つ又は複数の要素「からなる」、「から基本的になる」又はそれを「実質的に含む」、本明細書における同様の態様又は実施形態に対する支持を提供するものとする（例えば、特定の要素を含む場合の本明細書中に記載の組成物は、別段の指定がない限り又は内容に明らかに矛盾しない限り、その要素からなる組成物も記載するものとしても理解されるべきである）。
【０２７０】
本明細書中で提供されるあらゆる実施例又は代表的な語（例えば、「など」）の使用は、本発明を単により良好に明らかにするものとして意図され、別段の主張がない限り、本発明の範囲において限定を提起しない。本明細書中のいかなる語も、何らかの請求項に記載されていない要素を本発明の実施に必須であるものとして示すものと解釈すべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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