(57)【要約】本開示の実施形態には、第２のヒトサイトカインのＮ末端に融合した第１のヒトサイトカインを含むサイトカイン融合タンパク質が含まれる。第２のサイトカインに融合した第１のサイトカイン、例えば、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のＮ末端に融合したインターロイキン−２（ＩＬ−２）またはインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、を含むサイトカイン融合タンパク質、及び関連組成物、ならびにそれを単剤としてまたは自家腫瘍ワクチン及び／もしくは免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて癌の治療に使用する方法が提供されている。【選択図】図３
2021511348.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第２のヒトサイトカインのＮ末端に融合した第１のヒトサイトカインを含むサイトカイン融合タンパク質であって、前記第１のサイトカインが前記第２のサイトカインと異なり、前記第１のサイトカイン及び前記第２のサイトカインが、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α（任意選択的に、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１から選択される）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−２３、及びＩＬ−２７から選択され、任意選択的に前記第１のサイトカインと前記第２のサイトカインとがペプチドリンカーで隔てられている、サイトカイン融合タンパク質。
【請求項２】
ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−２３、及び／またはＩＬ−２７のアミノ酸配列が、表Ｃ１、ならびにサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有するそれらの断片及び変異体から選択される、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記第１のサイトカインがＩＬ−２またはＩＦＮ−βであり、前記第２のサイトカインがＴＮＦ−αである、請求項１または請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記ＩＬ−２が、配列番号１もしくは配列番号２と、または配列番号１もしくは配列番号２の残基２１〜１５３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記ＩＬ−２がＣ１２５Ｓ変異またはＣ１２５Ａ変異を含む、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記ＩＦＮ−βが、配列番号１５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、請求項３に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＴＮＦ−αが、配列番号３〜配列番号６のいずれかと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、請求項３から請求項６のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ＴＮＦ−αが、ＴＮＦ−αの比活性を約もしくは少なくとも約１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１１、もしくは１／１２に低減させる、及び／またはＴＮＦＲ２と比べてＴＮＦＲ１への選択的結合を増加させる、少なくとも１つの変異であって、任意選択的にＳ８６Ｔ、Ｒ３１Ｅ、及びＲ３２Ｗ、ならびにそれらの組み合わせから選択される、前記少なくとも１つの変異を含む、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記融合タンパク質がペプチドリンカー、任意選択的に生理学的に安定なリンカーまたは遊離可能なリンカー、任意選択的に可撓性リンカーまたは剛性リンカーを含む、請求項１から請求項８のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ペプチドリンカーが、長さが約１個〜１００個のアミノ酸、約１個〜９０個のアミノ酸、約１個〜８０個のアミノ酸、約１個〜７０個のアミノ酸、約１個〜８０個のアミノ酸、約１個〜５０個のアミノ酸、約１個〜４０個のアミノ酸、約１個〜３０個のアミノ酸、約１個〜２０個のアミノ酸、約１個〜１０個のアミノ酸、もしくは約１個〜５個のアミノ酸であるか、または、長さが約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、もしくは１００個のアミノ酸である、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ペプチドリンカーが表Ｌ１から選択される、請求項９または請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
以下の構造で示される、
−ＩＬ−２（Ｃ１２５Ｓ）−（ＧＧＧＧＳ）３−ＴＮＦ−α−（Ｓ８６Ｔ）（配列番号１９）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−（ＧＧＧＧＳ）２−ＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２０）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−（ＧＧＧＧＳ）２−ＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２１）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＰＡＰ−ＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２２）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＰＡＰ−ＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２３）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ−ＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２４）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ−ＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２５）、
−ＩＬ−２（Ｃ１２５Ｓ）−（ＧＧＧＧＳ）３−ＴＮＦ−α（Ｒ３１Ｅ、Ｓ８６Ｔ）、または
−ＩＦＮ−β−（ＧＧＧＧＳ）２−ＴＮＦ−α（配列番号２６）
を含む、請求項１から請求項１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
表Ｆ１から選択される配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる、請求項１から請求項１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、前記単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、または前記単離されたポリヌクレオチドもしくは前記発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１５】
請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質と薬剤的に許容できる担体とを含む、治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項１６】
長期徐放性製剤を含む、請求項１５に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項１７】
前記長期徐放性製剤が、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、微粒子／マイクロスフェア、ナノ粒子／ナノスフェア、及び／またはリポソーム、ならびにそれらの任意の組み合わせ、のうちのいずれか１つまたは複数を含む、請求項１６に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項１８】
前記長期徐放性製剤がＰＬＧＡナノ粒子及び／またはＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子を含む、請求項１６または請求項１７に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項１９】
対象由来の自家腫瘍細胞ワクチンを含む、請求項１５から請求項１８のいずれか１項に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項２０】
前記自家腫瘍細胞ワクチンが全腫瘍細胞ワクチン及び／またはその細胞溶解物を含む、請求項１９に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項２１】
前記腫瘍細胞が、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、膵癌、骨癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（例えば、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、再発急性骨髄性白血病）、リンパ腫、肝腫（肝細胞癌）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳癌、卵巣癌、大腸癌、神経膠腫、多形グリア芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、腎癌（例えば、腎細胞腫）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、甲状腺癌、及び胃癌のうちの１つまたは複数から選択される癌由来である、請求項１９または請求項２０に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項２２】
前記自家腫瘍細胞ワクチンが、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＭＡＧＥ−３、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、グアニリルシクラーゼＣ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、サバイビン、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸受容体１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７  （ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌（pancarcinoma）抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来増殖因子受容体、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝ホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、ルイスＹ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉由来の腫瘍に発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、及びメゾテリンのうちの１つまたは複数から選択される癌抗原を含む、請求項１９から請求項２１のいずれか１項に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項２３】
（ａ）阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニスト及び（ｂ）刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニストから選択される、少なくとも１つの免疫チェックポイント調節剤を含む、請求項１５から請求項２２のいずれか１項に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項２４】
前記免疫チェックポイント調節剤が、前記免疫チェックポイント分子に特異的に結合するものであり、任意選択的に、抗体もしくはその抗原結合断片、またはリガンド、または少分子を含む、ポリペプチドである、請求項２３に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項２５】
前記阻害性免疫チェックポイント分子が、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死１（ＰＤ−１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（B  and  T  Lymphocyte  Attenuator：ＢＴＬＡ）、ＣＤ１６０、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）、ならびにＩｇドメイン及びＩＴＩＭドメインを持つＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）のうちの１つまたは複数から選択される、請求項２３または請求項２４に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項２６】
前記（ａ）のアンタゴニストが、
ＰＤ−Ｌ１及び／またはＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、及びデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択される、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト及び／またはＰＤ−Ｌ２アンタゴニスト、
ＰＤ−１に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＰＤＲ００１、及びピディリズマブのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＰＤ−１アンタゴニスト、
ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、イピリムマブ、及びトレメリムマブのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、
ＩＤＯに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、インドキシモド（ＮＬＧ−８１８９）、１−メチル−トリプトファン（１ＭＴ）、β−カルボリン（ノルハルマン、９Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール）、ロスマリン酸、及びエパカドスタットのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＩＤＯアンタゴニスト、
ＴＤＯに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、６８０Ｃ９１、及びＬＭ１０のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＴＤＯアンタゴニスト、
ＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＴＩＭ−３アンタゴニスト、
ＬＡＧ−３に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、及びＢＭＳ−９８６０１６のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＬＡＧ−３アンタゴニスト、
ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＶＩＳＴＡアンタゴニスト、
ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、及び／またはＨＶＥＭに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、及び／またはＨＶＥＭのアンタゴニスト、
ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＴＩＧＩＴアンタゴニスト、
のうちの１つまたは複数から選択される、請求項２５に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項２７】
前記刺激性免疫チェックポイント分子が、ＯＸ４０、ＣＤ４０、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２２６、及びヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）のうちの１つまたは複数から選択される、請求項２３または請求項２４に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項２８】
前記（ｂ）のアゴニストが、
ＯＸ４０に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、ＯＸ８６、Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、及びＧＳＫ３１７４９９８のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＯＸ４０アゴニスト、
ＣＤ４０に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、ＣＰ−８７０８９３、ダセツズマブ、Ｃｈｉ  Ｌｏｂ７／４、ＡＤＣ−１０１３、及びｒｈＣＤ４０Ｌのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＣＤ４０アゴニスト、
ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、ＩＮＣＡＧＮ０１８７６、ＤＴＡ−１、及びＭＥＤＩ１８７３のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＧＩＴＲアゴニスト、
ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、ウトミルマブ、及び４−１ＢＢリガンドのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＣＤ１３７アゴニスト、
ＣＤ２７に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、バルリルマブ、及びＣＤＸ−１１２７（１Ｆ５）のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＣＤ２７アゴニスト、
ＣＤ２８に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、及びＴＡＢ０８のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＣＤ２８アゴニスト、
ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンドのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＨＶＥＭアゴニスト、
のうちの１つまたは複数から選択される、請求項２７に記載の治療用組成物またはワクチン組成物。
【請求項２９】
癌の治療を必要とする対象において、癌の治療に使用するための、請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質、または請求項１３から請求項２６のいずれか１項に記載の治療用組成物もしくはワクチン組成物。
【請求項３０】
請求項１から請求項１３のいずれか１項に記載の融合タンパク質を、任意選択的に請求項１５から請求項２８のいずれか１項に記載の治療用組成物またはワクチン組成物として、癌の治療を必要とする対象に投与することを含む、前記対象における癌の治療方法。
【請求項３１】
前記融合タンパク質を、前記対象由来の自家腫瘍細胞ワクチンと組み合わせて前記対象に投与することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
任意選択的に請求項１７から請求項２４のいずれか１項によって定義されている、同一の治療用組成物またはワクチン組成物で、前記融合タンパク質と前記自家腫瘍ワクチンとを合わせて投与することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記融合タンパク質を免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて前記対象に投与することを含む、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
任意選択的に請求項２３から請求項２８のいずれか１項によって定義されている、同一の治療用組成物またはワクチン組成物で、前記融合タンパク質と前記免疫チェックポイント調節剤とを合わせて投与することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記融合タンパク質を自家腫瘍ワクチン及び免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて前記対象に投与することを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
任意選択的に請求項１５から請求項２８のいずれか１項によって定義されている、同一の治療用組成物またはワクチン組成物で、前記融合タンパク質と、前記自家腫瘍ワクチンと、前記免疫チェックポイント調節剤とを合わせて投与することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記癌が原発癌である、請求項３０から請求項３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記癌が転移癌である、請求項３０から請求項３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記癌が、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、膵癌、骨癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（例えば、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、再発急性骨髄性白血病）、リンパ腫、肝腫（肝細胞癌）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳癌、卵巣癌、大腸癌、神経膠腫、多形グリア芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、腎癌（例えば、腎細胞腫）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、甲状腺癌、及び胃癌のうちの１つまたは複数から選択される、請求項３０から請求項３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記転移性癌が、
（ａ）骨、肝臓、及び／または肺に転移した膀胱癌、
（ｂ）骨、脳、肝臓、及び／または肺に転移した乳癌、
（ｃ）肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した大腸癌、
（ｄ）副腎、骨、脳、肝臓、及び／または肺に転移した腎癌、
（ｅ）副腎、骨、脳、肝臓、及び／または他の肺部位に転移した肺癌、
（ｆ）骨、脳、肝臓、肺、及び／または皮膚／筋肉に転移した黒色腫、
（ｇ）肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した卵巣癌、
（ｈ）肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した膵癌、
（ｉ）副腎、骨、肝臓、及び／または肺に転移した前立腺癌、
（ｊ）肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した胃癌、
（ｌ）骨、肝臓、及び／または肺に転移した甲状腺癌、ならびに
（ｍ）骨、肝臓、肺、腹膜、及び／または腟に転移した子宮癌、
のうちの１つまたは複数から選択される、請求項３８または請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記融合タンパク質または治療用組成物もしくはワクチン組成物を、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、腫瘍内注射、腫瘍周囲注射、もしくはリンパ節内注射で、またはそれらの任意の組み合わせで投与することを含む、請求項３０から請求項４０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１２月４日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／１１９０７１号及び２０１８年１月２４日に出願された国際出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７３９４０号の利益を主張するものであり、これらの出願の各々はその全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表の記述
本出願に付随する配列表は、紙の写しの代わりにテキスト形式で提供され、参照により本出願に援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＢＥＰＥ＿００４＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは、サイズが５８ｋＢであり、２０１９年１月２３日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に提出されている。
【０００３】
本開示は、１つには、第２のサイトカインに融合した第１のサイトカイン、例えば、ヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）のＮ末端に融合したヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）またはヒトインターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、を含むサイトカイン融合タンパク質、及び関連組成物、ならびにそれを単剤としてまたは自家腫瘍ワクチン及び／もしくは免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて癌の治療に使用する方法に関するものである。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示の実施形態には、第２のヒトサイトカインのＮ末端に融合した第１のヒトサイトカインを含むサイトカイン融合タンパク質であって、第１のサイトカインが第２のサイトカインと異なり、第１のサイトカイン及び第２のサイトカインが、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α（例えば、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−２３、及びＩＬ−２７から選択され、任意選択的に第１のサイトカインと第２のサイトカインとがペプチドリンカーで隔てられている、サイトカイン融合タンパク質が含まれる。一部の実施形態では、ＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−２３、及び／またはＩＬ−２７のアミノ酸配列が、表Ｃ１、ならびにサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有するそれらの断片及び変異体から選択される。
【０００５】
特定の実施形態では、第１のサイトカインはＩＬ−２またはＩＦＮ−βであり、第２のサイトカインはＴＮＦ−αである。一部の実施形態では、ＩＬ−２は、配列番号１もしくは配列番号２と、または配列番号１もしくは配列番号２の残基２１〜１５３と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＩＬ−２はＣ１２５Ｓ変異またはＣ１２５Ａ変異を含む。一部の実施形態では、ＩＦＮ−βは、配列番号１５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
【０００６】
一部の実施形態では、ＴＮＦ−αは、配列番号３〜配列番号６のいずれかと少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＴＮＦ−αは、ＴＮＦ−αの比活性を約もしくは少なくとも約１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１１、もしくは１／１２に低減させる、及び／またはＴＮＦＲ２よりもＴＮＦＲ１への選択的結合を増加させる、少なくとも１つの変異であって、任意選択的にＳ８６Ｔ、Ｒ３１Ｅ、及びＲ３２Ｗ、ならびにそれらの組み合わせから選択される、少なくとも１つの変異を含む。
【０００７】
一部の実施形態では、融合タンパク質はペプチドリンカーを含み、任意選択的に生理学的に安定なリンカーまたは遊離可能なリンカー、任意選択的に可撓性リンカーまたは剛性リンカーを含む。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは、長さが約１個〜１００個のアミノ酸、約１個〜９０個のアミノ酸、約１個〜８０個のアミノ酸、約１個〜７０個のアミノ酸、約１個〜８０個のアミノ酸、約１個〜５０個のアミノ酸、約１個〜４０個のアミノ酸、約１個〜３０個のアミノ酸、約１個〜２０個のアミノ酸、約１個〜１０個のアミノ酸、もしくは約１個〜５個のアミノ酸であるか、または、長さが約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、もしくは１００個のアミノ酸である。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは表Ｌ１から選択される。
【０００８】
特定の融合タンパク質には、以下の構造で示される、
−ＩＬ−２（Ｃ１２５Ｓ）−（ＧＧＧＧＳ）３−ＴＮＦ−（Ｓ８６Ｔ）（配列番号１９）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−（ＧＧＧＧＳ）２−ＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２０）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−（ＧＧＧＧＳ）２−ＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２１）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＰＡＰ−ＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２２）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＰＡＰ−ＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２３）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ−ＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２４）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ−ＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２５）、
−ＩＬ−２（Ｃ１２５Ｓ）−（ＧＧＧＧＳ）３−ＴＮＦ−α（Ｒ３１Ｅ、Ｓ８６Ｔ）、
−ＩＦＮ−β−（ＧＧＧＧＳ）２−ＴＮＦ−α（配列番号２６）
が含まれる。
【０００９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、表Ｆ１から選択される配列と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
【００１０】
本明細書に記載の融合タンパク質をコードする単離されたポリヌクレオチド、該単離されたポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び／または該単離されたポリヌクレオチドもしくは該発現ベクターを含む宿主細胞も含まれる。
【００１１】
特定の実施形態には、本明細書に記載の融合タンパク質と薬剤的に許容できる担体とを含む、治療用組成物またはワクチン組成物が含まれる。特定の実施形態には、長期徐放性製剤が含まれる。一部の実施形態では、長期徐放性製剤は、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、微粒子／マイクロスフェア、ナノ粒子／ナノスフェア、及び／またはリポソーム、ならびにそれらの任意の組み合わせ、のうちのいずれか１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、長期徐放性製剤はＰＬＧＡナノ粒子及び／またはＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子を含む。
【００１２】
一部の実施形態には、対象由来の自家腫瘍細胞ワクチンが含まれる。一部の実施形態では、自家腫瘍細胞ワクチンは、全腫瘍細胞ワクチン及び／またはその細胞溶解物を含む。一部の実施形態では、腫瘍細胞は、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、膵癌、骨癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（例えば、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、再発急性骨髄性白血病）、リンパ腫、肝腫（肝細胞癌）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳癌、卵巣癌、大腸癌、神経膠腫、多形グリア芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、腎癌（例えば、腎細胞腫）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、甲状腺癌、及び胃癌のうちの１つまたは複数から選択される癌由来である。一部の実施形態では、自家腫瘍細胞ワクチンは、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＭＡＧＥ−３、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、グアニリルシクラーゼＣ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、サバイビン、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸受容体１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７（ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌（pancarcinoma）抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来増殖因子受容体、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝ホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、ルイスＹ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉由来の腫瘍に発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、及びメゾテリンのうちの１つまたは複数から選択される癌抗原を含む。
【００１３】
特定の実施形態には、（ａ）阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニスト及び（ｂ）刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニストから選択される、少なくとも１つの免疫チェックポイント調節剤が含まれる。一部の実施形態では、免疫チェックポイント調節剤は、免疫チェックポイント分子に特異的に結合するものであり、任意選択的に、抗体もしくはその抗原結合断片、またはリガンド、または少分子を含む、ポリペプチドである。
【００１４】
一部の実施形態では、阻害性免疫チェックポイント分子が、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死１（ＰＤ−１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（B  and  T  Lymphocyte  Attenuator：ＢＴＬＡ）、ＣＤ１６０、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）、ならびにＩｇドメイン及びＩＴＩＭドメインを持つＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）のうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、（ａ）のアンタゴニストは、以下に挙げる、
ＰＤ−Ｌ１及び／またはＰＤ−Ｌ２に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、アテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、及びデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択される、ＰＤ−Ｌ１アンタゴニスト及び／またはＰＤ−Ｌ２アンタゴニスト、
ＰＤ−１に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、ニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＭＫ−３４７５、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＰＤＲ００１、及びピディリズマブのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＰＤ−１アンタゴニスト、
ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、イピリムマブ、及びトレメリムマブのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、
ＩＤＯに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、インドキシモド（ＮＬＧ−８１８９）、１−メチル−トリプトファン（１ＭＴ）、β−カルボリン（ノルハルマン、９Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール）、ロスマリン酸、及びエパカドスタットのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＩＤＯアンタゴニスト、
ＴＤＯに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、６８０Ｃ９１、及びＬＭ１０のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＴＤＯアンタゴニスト、
ＴＩＭ−３に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＴＩＭ−３アンタゴニスト、
ＬＡＧ−３に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子、及びＢＭＳ−９８６０１６のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＬＡＧ−３アンタゴニスト、
ＶＩＳＴＡに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＶＩＳＴＡアンタゴニスト、
ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、及び／またはＨＶＥＭに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、及び／またはＨＶＥＭのアンタゴニスト、
ＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＴＩＧＩＴアンタゴニスト、
のうちの１つまたは複数から選択される。
【００１５】
一部の実施形態では、刺激性免疫チェックポイント分子は、ＯＸ４０、ＣＤ４０、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２２６、及びヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）のうちの１つまたは複数から選択される。一部の実施形態では、（ｂ）のアゴニストは、以下に挙げる、
ＯＸ４０に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、ＯＸ８６、Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、及びＧＳＫ３１７４９９８のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＯＸ４０アゴニスト、
ＣＤ４０に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、ＣＰ−８７０８９３、ダセツズマブ、Ｃｈｉ  Ｌｏｂ７／４、ＡＤＣ−１０１３、及びｒｈＣＤ４０Ｌのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＣＤ４０アゴニスト、
ＧＩＴＲに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、ＩＮＣＡＧＮ０１８７６、ＤＴＡ−１、及びＭＥＤＩ１８７３のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＧＩＴＲアゴニスト、
ＣＤ１３７に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、ウトミルマブ、及び４−１ＢＢリガンドのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＣＤ１３７アゴニスト、
ＣＤ２７に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、バルリルマブ、及びＣＤＸ−１１２７（１Ｆ５）のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＣＤ２７アゴニスト、
ＣＤ２８に特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンド、及びＴＡＢ０８のうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＣＤ２８アゴニスト、
ＨＶＥＭに特異的に結合する抗体または抗原結合断片または少分子またはリガンドのうちの１つまたは複数から任意選択的に選択されるＨＶＥＭアゴニスト、
のうちの１つまたは複数から選択される。
【００１６】
一部の実施形態では、本明細書に記載の治療用組成物またはワクチン組成物を、癌の治療を必要とする対象の癌の治療に使用する。
【００１７】
癌の治療を必要とする対象の癌の治療方法も含まれており、該方法には、本明細書に記載の融合タンパク質を、例えば、本明細書に記載の治療用組成物またはワクチン組成物の一部として対象に投与することも含まれる。
【００１８】
一部の実施形態には、融合タンパク質を対象に併用投与することが含まれ、一部の実施形態には、任意選択的に本明細書に記載されている、同一の治療用組成物またはワクチン組成物で、融合タンパク質と自家腫瘍ワクチンとを合わせて投与することが含まれる。
【００１９】
一部の実施形態には、融合タンパク質を免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて対象に投与することが含まれる。一部の実施形態には、任意選択的に本明細書に記載されている、同一の治療用組成物またはワクチン組成物で、融合タンパク質と免疫チェックポイント調節剤とを合わせて投与することが含まれる。
【００２０】
一部の実施形態には、融合タンパク質を、自家腫瘍ワクチン及び免疫チェックポイント調節剤と組み合わせて対象に投与することが含まれる。
【００２１】
一部の実施形態には、任意選択的に本明細書に記載されている、同一の治療用組成物またはワクチン組成物で、融合タンパク質と、自家腫瘍ワクチンと、免疫チェックポイント調節剤とを合わせて投与することが含まれる。
【００２２】
一部の実施形態では、癌は原発癌である。一部の実施形態では、癌は転移癌である。一部の実施形態では、癌は、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、膵癌、骨癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（例えば、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、再発急性骨髄性白血病）、リンパ腫、肝腫（肝細胞癌）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳癌、卵巣癌、大腸癌、神経膠腫、多形グリア芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、腎癌（例えば、腎細胞腫）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、甲状腺癌、及び胃癌のうちの１つまたは複数から選択される。
【００２３】
一部の実施形態では、転移癌は、以下のうちの１つまたは複数から選択される。
（ａ）骨、肝臓、及び／または肺に転移した膀胱癌、
（ｂ）骨、脳、肝臓、及び／または肺に転移した乳癌、
（ｃ）肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した大腸癌、
（ｄ）副腎、骨、脳、肝臓、及び／または肺に転移した腎癌、
（ｅ）副腎、骨、脳、肝臓、及び／または他の肺部位に転移した肺癌、
（ｆ）骨、脳、肝臓、肺、及び／または皮膚／筋肉に転移した黒色腫、
（ｇ）肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した卵巣癌、
（ｈ）肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した膵癌、
（ｉ）副腎、骨、肝臓、及び／または肺に転移した前立腺癌、
（ｊ）肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した胃癌、
（ｌ）骨、肝臓、及び／または肺に転移した甲状腺癌、ならびに
（ｍ）骨、肝臓、肺、腹膜、及び／または腟に転移した子宮癌。
【００２４】
一部の実施形態には、融合タンパク質または治療用組成物もしくはワクチン組成物を、皮下注射、静脈内注射、皮内注射、腫瘍内注射、腫瘍周囲注射、もしくはリンパ節内注射で、またはそれらの任意の組み合わせで投与することが含まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】図１は、融合タンパク質ＺＫＢＹ０４ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイ結果を示す図である。
【図２】図２Ａ〜図２Ｂは、Ｌ９２９細胞においてＣＣＫ−８法を用いてアッセイした試験物質のＴＮＦ−α活性を示す図である。図２ＡはＺＫＢＹ０４Ａ融合タンパク質の結果を示し、図２Ｂは市販のＴＮＦ−α単体の結果を示す。
【図３】図３は、ＺＫＢＹ０４Ａが、ＷＥＨＩ−１６４マウス腫瘍モデルにおいて、ＩＴ注射した場合には抗腫瘍効果が強く、ＩＰ注射した場合には腫瘍増殖の阻害効果が若干弱くなっていることを示す図である。
【図４】図４は、ＩＬ−２とＴＮＦ−αとの組み合わせが、ＷＥＨＩ−１６４マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を阻害したことを示す図である。ＩＬ−２とＴＮＦ−αとを、ＰＤ−１抗体と組み合わせて使用した場合に、腫瘍阻害効果がより顕著になった。
【図５】図５は、予め腫瘍増殖を停止させたマウスは、ＷＥＨＩ−１６４細胞を再移植した後でも腫瘍を発生させなかったことを示す図である。
【図６】図６Ａ〜図６Ｃは、ＩＬ−２＋ＴＮＦ−α＋ＰＤ−１群に薬剤注射をした後の腫瘍の画像を示す図である。初回注射の数日後、腫瘍に潰瘍が見られた後、その潰瘍部位に瘢痕組織が形成された。
【図７】図７は、潰瘍も瘢痕も形成されずに腫瘍が標準的に増殖した対照群の画像を示す図である。
【図８】図８Ａ〜図８Ｂは、ＣＴ２６マウス癌モデル（図８Ａ）及びＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫モデル（図８Ｂ）におけるＩＬ−２とＴＮＦ−αとの組み合わせのインビボ抗腫瘍効果を示す図である。
【図９】図９は、ＩＦＮ−βとＴＮＦ−αとの組み合わせが、ＷＥＨＩ−１６４マウス腫瘍モデルにおいて腫瘍増殖を阻害したことを示す図である。
【図１０】図１０Ａ〜図１０Ｂは、同系Ｒｅｎｃａマウス腎癌モデル（図１０Ａ）及びＣＴ２６マウス結腸癌モデル（図１０Ｂ）において、ＩＦＮ−βとＴＮＦ−αとの組み合わせが腫瘍増殖を阻害したことを示す図である。
【図１１】図１１Ａ〜図１１Ｄは、ＩＦＮ−β−ＴＮＦ−α融合タンパク質が、ＨＥＫ２９３細胞から分泌融合タンパク質として発現されたものか（図１１Ａ）、またはＬ９２９細胞に直接トランスフェクトされたものか（図１１Ｂ）にかかわらず、ＣＣＫ８アッセイにおいてＴＮＦ−α活性を有することを示す図である。ＴＮＦ−α標準（図１１Ｃ）及び対照トランスフェクション（図１１Ｄ）を参照として示している。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
定義
別段の定めがない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本開示が属する技術分野の当業者が一般的に理解するものと同一の意味を有する。本明細書に記載の方法、材料、組成物、試薬、細胞と同様または均等の任意の方法、材料、組成物、試薬、細胞を、本開示の主題の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法及び材料が説明されている。本明細書で引用された特許及び特許出願を含むがこれらに限定されない全ての刊行物及び参考文献は、各刊行物または各参考文献が、全て記載の通りに参照により本明細書に組み込まれていると具体的かつ個別に示されているかのように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。また、本出願が優先権を主張する対象の任意の特許出願は、刊行物や参考文献について上述したように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本開示の実施では、特に別段の指定がなされない限り、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、及び組み換えＤＮＡ技術で使用される従来の方法が当該技術分野の範囲内で使用される。それらの方法の多くは以下に例として記載されている。また、こうした技術は文献で十分に説明されている。例えば、Current  Protocols  in  Protein  Science,  Current  Protocols  in  Molecular  Biology  or  Current  Protocols  in  Immunology,  John  Wiley  &  Sons,  New  York,  N.Y.  (2009)、Ausubel  et  al.,  Short  Protocols  in  Molecular  Biology,  3rd  ed.,  Wiley  &  Sons,  1995、Sambrook  and  Russell,  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  (3rd  Edition,  2001)、Maniatis  et  al.  Molecular  Cloning:  A  Laboratory  Manual  (1982)、DNA  Cloning:  A  Practical  Approach,  vol.  I  &  II  (D.  Glover,  ed.);  Oligonucleotide  Synthesis  (N.  Gait,  ed.,  1984)、Nucleic  Acid  Hybridization  (B.  Hames  &  S.  Higgins,  eds.,  1985)、Transcription  and  Translation  (B.  Hames  &  S.  Higgins,  eds.,  1984)、Animal  Cell  Culture  (R.  Freshney,  ed.,  1986)、Perbal,  A  Practical  Guide  to  Molecular  Cloning  (1984)、及び他の同様な参考文献を参照されたい。
【００２８】
組み換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、及び組織培養、ならびにトランスフォーメーション（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）には、標準的な技術を用いることができる。酵素反応及び精製手法は、製造業者の説明書に従って、または当該技術分野において一般に実施される通りに、または本明細書に記載の通りに、実施することができる。これらの技法及び手順ならびに関連する技法及び手順は、概して、当該技術分野において周知の従来の方法に従って、また本明細書全体において引用し論じる種々の一般的かつより具体的な参考文献に記載の通りに、実施することができる。別途具体的な定義が記載されている場合を除き、本明細書に記載の分子生物学、分析化学、有機合成化学、医薬品化学、及び製薬化学に関連して使用される用語、ならびにそれらの検査手順及び技法は、当該技術分野において周知であり、一般的に使用されるものである。組み換え技術、分子生物学的合成、微生物学的合成、化学合成、化学分析、薬剤調製、製剤化、及び送達、ならびに患者の処置には、標準的な技術を用いることができる。
【００２９】
本開示では、以下に示す用語を下記のように定義する。
【００３０】
冠詞の「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書で使用する場合、その冠詞の文法上の対象が１つであるかまたは２以上（すなわち、少なくとも１つ）であることを意味する。一例として、「ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ」は、「１つの要素」、「２つ以上の要素」、及び「少なくとも１つの要素」を含んでいる。
【００３１】
「約」は、分量、レベル、値、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、または長さが、参照する分量、レベル、値、数、頻度、パーセント、寸法、サイズ、量、重量、または長さに比べて３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％程度変動していることを意味する。
【００３２】
「アンタゴニスト」は、他の作用剤または分子の生理学的作用を阻害するかまたは減じる生物学的構造体または化学剤を意味する。一部の例では、アンタゴニストは他の作用剤または分子に特異的に結合する。完全アンタゴニスト及び部分アンタゴニストも含まれる。
【００３３】
「アゴニスト」は、他の作用剤または分子の生理学的作用を増加させるかまたは強める生物学的構造体または化学剤を意味する。一部の例では、アゴニストは他の作用剤または分子に特異的に結合する。完全アゴニスト及び部分アゴニストも含まれる。
【００３４】
用語「アミノ酸」は、本明細書で使用する場合、天然のアミノ酸及び非天然のアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物を意味することが意図される。天然のアミノ酸には、タンパク質の生合成の間に用いられる２０個のＬ−アミノ酸と、例えば４−ヒドロキシプロリン、ヒドロキシリジン、デスモシン、イソデスモシン、ホモシステイン、シトルリン、及びオルニチンなどの他のアミノ酸とが含まれる。非天然のアミノ酸には、例えば、Ｄ−アミノ酸、ノルロイシン、ノルバリン、ｐ−フルオロフェニルアラニン、エチオニンなどが含まれており、これらは当業者に公知である。アミノ酸類似体には、天然のアミノ酸及び非天然のアミノ酸の修飾型が含まれる。こうした修飾には、例えば、アミノ酸の化学基及び部分の置換もしくは置き換え、またはアミノ酸の誘導体化が含まれ得る。アミノ酸模倣物には、例えば、参照アミノ酸の電荷特性及び電荷空間配置特性などの特性が機能的に同様である有機構造が含まれる。例えば、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）を模倣した有機構造には、天然Ａｒｇアミノ酸の側鎖のｅアミノ基と同様な分子空間配置を持ち、かつ同程度の可動度を有する正電荷部分を持つものがある。模倣物にはまた、アミノ酸またはアミノ酸官能基の最適な空間配置及び電荷相互作用を維持するように制限された構造も含まれる。当業者は、どの構造が機能的に同等のアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣物となるのかを知っているか、または算出ことができる。
【００３５】
「生体適合性」は、生物学的機能を概して損なうことがなく、かつ、いかなる程度の許容不可能な毒性、例えばアレルギーや疾患なども引き起こさない、材料または化合物を意味する。
【００３６】
「コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のコードを与える任意の核酸配列を意味する。一方で、「非コード配列」は、遺伝子のポリペプチド産物のコードを直接与えることはない任意の核酸配列を意味する。
【００３７】
本開示では、別途明記しない限り、「含む（comprise）」、「含む（comprises）」、及び「含んでいる（comprising）」という語は、記載されている工程もしくは要素または工程群もしくは要素群を含めるが、任意の他の工程もしくは要素または工程群もしくは要素群を除外するものではないことを意味すると理解されている。
【００３８】
「からなる（consisting  of）」は、この語句に続くもの全てを含み、それらに限定されることを意味する。したがって、語句「からなる（consisting  of）」は、列挙した要素が必要または必須であり、他のいかなる要素も存在し得ないことを示すものである。「本質的になる（consisting  essentially  of）」は、その語句に続いて列挙した任意の要素、及び列挙した要素に対して本開示で詳述する活性または作用を阻害したり与えたりすることがない他の要素に限定される任意の要素を含むことを意味する。したがって、語句「本質的になる（consisting  essentially  of）」は、リストした要素は必要または必須であるが、他の要素は、任意選択的であり、リストした要素の活性または作用に実質的に影響を与えるか否かによって存在する場合もしない場合もあることを示している。
【００３９】
用語「融合タンパク質」及び「融合ポリペプチド」は交換可能に用いられ、別々のポリペプチドに元々または天然にコードされた２つ以上のコード配列を連結することによって生成されるポリペプチドを意味する。連結したコード配列を翻訳した結果、単一の融合ポリペプチドが得られ、構造機能特性は一般的に、別々のポリペプチドの各々に由来する。
【００４０】
用語「エンドトキシンのない」または「実質的にエンドトキシンのない」は通例、多くても検出可能な量（例えば、対象に対して臨床的に有害生理作用を与えない量）のエンドトキシン、好ましくは検出限界下の量のエンドトキシンを含む組成物、溶媒、及び／または容器に関するものである。エンドトキシンは、特定の微生物、例えば、細菌、通例グラム陰性菌に由来する毒素であるが、エンドトキシンがリステリア・モノサイトゲネスなどのグラム陽性菌に見られる場合もある。最もよく見られるエンドトキシンは、様々なグラム陰性菌の外膜にあるリポ多糖類（ＬＰＳ）またはリポオリゴ糖類（ＬＯＳ）であり、これは、グラム陰性菌が疾患をもたらす性質における主な病原性を示すものである。ヒトにおいては、少量のエンドトキシンにより、有害生理作用の中でも熱、血圧低下、炎症活性化及び凝固活性化を伴う場合がある。
【００４１】
したがって、薬剤を生産するにあたり、薬剤及び／または薬剤容器から検出可能なエンドトキシンのほとんどまたは全てを除去することが好ましいことが多い。少量でもヒトに有害作用を及ぼす場合があるからである。デパイロジェネーションオーブンは、この目的で使用できるものであり、エンドトキシンの大半を破壊するためには通例、温度を３００℃超にする必要がある。例えば、シリンジまたはバイアルなどの一次パッケージ材料を用いる場合には、ガラス温度を２５０℃で３０分間保てば、エンドトキシンレベルを３桁低減するのに十分である場合が多い。エンドトキシンを除去する他の方法も考慮されており、例えば、本明細書に記載され、当該技術分野で公知のクロマトグラフィ法やろ過法などがある。
【００４２】
エンドトキシンは、当該技術分野で公知の常套的な技法を用いて検出することができる。例えば、リムルスアメーバ様細胞溶解物アッセイは、カブトガニの血液を利用するものであり、エンドトキシンの存在を検出するのに感度の高いアッセイである。検出試験では、ＬＰＳのレベルが極めて低い場合でも、反応を増強させる強力な酵素カスケードによってカブトガニ細胞分解産物の凝固を検出することができる。酵素結合免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）を用いてエンドトキシンを定量することもできる。実質的にエンドトキシンのない状態にするために、エンドトキシンレベルは、活性化合物の約０．００１ＥＵ／ｍｇ未満、０．００５ＥＵ／ｍｇ未満、０．０１ＥＵ／ｍｇ未満、０．０２ＥＵ／ｍｇ未満、０．０３ＥＵ／ｍｇ未満、０．０４ＥＵ／ｍｇ未満、０．０５ＥＵ／ｍｇ未満、０．０６ＥＵ／ｍｇ未満、０．０８ＥＵ／ｍｇ未満、０．０９ＥＵ／ｍｇ未満、０．１ＥＵ／ｍｇ未満、０．５ＥＵ／ｍｇ未満、１．０ＥＵ／ｍｇ未満、１．５ＥＵ／ｍｇ未満、２ＥＵ／ｍｇ未満、２．５ＥＵ／ｍｇ未満、３ＥＵ／ｍｇ未満、４ＥＵ／ｍｇ未満、５ＥＵ／ｍｇ未満、６ＥＵ／ｍｇ未満、７ＥＵ／ｍｇ未満、８ＥＵ／ｍｇ未満、９ＥＵ／ｍｇ未満、または１０ＥＵ／ｍｇ未満であるのがよい。一般的には、１ｎｇの（ＬＰＳ）リポ多糖は約１ＥＵ〜約１０ＥＵに相当する。
【００４３】
ポリペプチドの「半減期」は、ポリペプチドの薬理学的活性、生理学的活性、または他の活性が、生物体の血清もしくは組織に投与した時点での活性に対して、または他の定義した任意の時点の活性に対して、半分に減少するのに要する時間を意味し得る。「半減期」はまた、ポリペプチドの量または濃度が、生物体の血清もしくは組織に投与した初期量、つまり生物体の血清もしくは組織に投与した時点の量もしくは濃度に対して、または他の定義した任意の時点に対して、半分に減少するのに要する時間を意味し得る。半減期は、血清中で及び／または任意の１つもしくは複数の選択した組織内で測定することができる。
【００４４】
用語「調節」及び「変化」は、対照と比べて、一般的には統計学的に有意な量もしくは程度で、または生理学的に有意な量もしくは程度で「増加」、「増強」、または「刺激」すること、及び「低下」または「低減」することを含む。「増加」、「刺激」、または「増強」した量は通例、「統計学的に有意な」量であり、組成物がなかった場合（例えば作用剤を入れない場合）に産生する量、または対照の組成物によって産生する量の１．１倍、１．２倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、またはそれ以上の倍数（例えば、５００倍、１０００倍）（これらの数値間の全ての整数及び範囲、例えば１．５、１．６、１．７、１．８などを含めた倍数）増加した量を含んでいてもよい。「減少」または「低減」した量は通例、「統計学的に有意な」量であり、組成物がなかった場合（例えば作用剤を入れない場合）に産生する量、または対照の組成物によって産生する量の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％減少した量（これらの数値間の全ての整数及び範囲を含めた量）を含んでいてもよい。比較値及び「統計学的に有意な」量の例は、本明細書に記載されている。
【００４５】
用語「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」は交換可能に用いることができ、任意の特定の長さに限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。用語「酵素」はポリペプチド触媒またはタンパク質触媒を含み、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドと交換可能に用いられている。これらの用語は、ミリストイル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、及びシグナル配列の付加または欠失などの修飾型を含んでいる。用語「ポリペプチド」または「タンパク質」は１つまたは複数のアミノ酸鎖を意味し、各鎖はペプチド結合で共有結合したアミノ酸を含むものである。該ポリペプチドまたはタンパク質が、ペプチド結合により互いに非共有結合的及び／または共有結合的に結合している複数の鎖を含む場合もあるが、これらの鎖は天然タンパク質、つまり天然で特定の非組み換え型の細胞または遺伝子操作細胞もしくは組み換え細胞により産生されたタンパク質の配列を有している。また、該ポリペプチドまたはタンパク質が、天然タンパク質のアミノ酸配列を持つ分子、または天然配列の１つもしくは複数のアミノ酸の欠失、付加、及び／もしくは置換を持つ分子を含む場合もある。用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」は、特に、本明細書に記載の酵素／タンパク質を含み、または該タンパク質の１つもしくは複数のアミノ酸の欠失、付加、及び／もしくは置換を持つ配列を含む。特定の実施形態では、ポリペプチドは、１つまたは複数の組み換えＤＮＡ分子を含む組み換え細胞により産生された「組み換え型」ポリペプチドであり、該組み換えＤＮＡ分子は一般的には異種ポリヌクレオチド配列か、または細胞には見られないポリヌクレオチド配列の組み合わせから構成されている。
【００４６】
本明細書で言及する用語「単離された」ポリペプチドまたはタンパク質は、対象のタンパク質が（１）該タンパク質と一般的に天然に共存する少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないか、（２）同一の供給源由来、例えば同じ種由来の他のタンパク質を本質的に含まないか、（３）異なる種由来の細胞により発現されているか、（４）該タンパク質と天然に共存するポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは他の物質の少なくとも約５０％から分離されているか、（５）該「単離タンパク質」と天然に会合するタンパク質の一部と（共有結合的な相互作用でも非共有結合的な相互作用でも）会合していないか、（６）該タンパク質と天然には会合しないポリペプチドと作用可能に（共有結合的な相互作用もしくは非共有結合的な相互作用で）会合しているか、または（７）天然には生じないものであることを意味する。こうした単離されたタンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくは他のＲＮＡを用いてコードされていても、合成されていてもよく、またはこれらの任意の組み合わせであってもよい。特定の実施形態では、単離されたタンパク質は、使用時（治療時、診断時、予防時、研究時など）に阻害要因となる天然環境に見られるタンパク質またはポリペプチドまたは他の汚染物質を実質的に含まない。
【００４７】
特定の実施形態では、組成物における所定の作用剤（例えば、融合タンパク質）の「純度」は、詳細に定義することができる。例えば、特定の組成物は、純度が少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％、またはこれらの数値間の少数及び範囲を含めた割合の作用剤を含むことができる。その測定方法としては、限定されるものではないが、例えば、高速液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）、生化学や分析化学で化合物の分離、同定、定量によく用いられる周知の形態のカラムクロマトグラフィなどがある。一部の例では、組成物の純度は凝集の程度によって測定される。例えば、作用剤（例えば、融合タンパク質）の凝集の程度は、サイズに応じて粒子を分離するサイズ排除クロマトグラフィ（ＳＥＣ）で測定することができる。これは、精製されたタンパク質の三次構造及び四次構造を測定する方法として一般的に認められている。ＳＥＣはタンパク質やポリマーなどの大きな分子の分析に主に用いられる。ＳＥＣは小さい分子を粒子の孔にトラップすることにより作用する。大きい分子は孔に入るには大きすぎるため、孔には入らずに通過することになる。したがって、大きい分子は、小さい分子よりも速くカラムを通って流れ、つまり、分子が小さいほど保持時間が長くなる。また、特定の組成物は凝集物を実質的に含まない（ＳＥＣ−ＨＰＬＣの単一ピークが約９５％超になる）。特定の実施形態では凝集物を含まず、ＳＥＣ−ＨＰＬＣの単一ピークが約９６％、約９７％、約９８％、または約９９％超になる。
【００４８】
用語「参照配列」は通例、他の配列と比較される核酸コード配列またはアミノ酸配列を意味する。本明細書に記載の全てのポリペプチド配列及びポリヌクレオチド配列は、名称で示されている配列ならびに表及び配列表に示されている配列を含めて、参照配列として包含されている。
【００４９】
「５０％同一の配列」などを含めた用語「配列同一性」は、本明細書で使用する場合、比較領域にわたって配列がヌクレオチド毎またはアミノ酸毎に同一である程度を意味する。したがって、「配列同一性パーセント」は、比較領域で最適にアライメントされた２つの配列を比較し、両方の配列において同一性の核酸基（例えば、Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ、Ｉ）または同一のアミノ酸残基（例えば、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｙ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｃｙｓ、及びＭｅｔ）となる位置の数を算出して、一致した位置の数を求め、その一致した位置の数を比較領域（すなわちウィンドウサイズ）の全位置の数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性の百分率を得ることによって算出することができる。比較領域をアライメントするための配列の至適アライメントは、アルゴリズムのコンピュータ処理（Genetics  Computer  Group（米国ウィスコンシン州マディソン、575  Science  Drive）製のWisconsin  Geneticsソフトウェアパッケージリリース７．０におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡ）により、または選択した種々の方法のいずれかを用いた検証及び最適アライメント（すなわち、比較領域で最高割合の相同性が得られるもの）により行うことができる。また、例えば、Altschul  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.  25:3389,  1997に開示されているように、ＢＬＡＳＴファミリーのプログラムを参照することができる。
【００５０】
用語「溶解度」は、本明細書に記載の作用剤（例えば、融合タンパク質）が液体溶媒に溶解し、均質な溶液になる性質を表す。溶解度は通例、濃度で表されており、溶媒の単位体積当たりの溶質の質量（溶媒１ｋｇ当たりの溶質のｇ数、１ｄＬ（１００ｍＬ）当たりのｇ数、ｍｇ／ｍＬなど）、モル濃度、重量モル濃度、モル分率、または他の類似した濃度の記述などで表されている。溶媒の単位量当たりに溶解することができる溶質の最大平衡量が、温度、圧力、ｐＨ、溶媒の性質といった特定の条件下において、溶媒に溶ける溶質の溶解度となる。特定の実施形態では、溶解度は、生理学的ｐＨまたは他のｐＨ、例えば、ｐＨ５．０、ｐＨ６．０、ｐＨ７．０、ｐＨ７．４、ｐＨ７．６、ｐＨ７．８、またはｐＨ８．０（例えば、約ｐＨ５〜ｐＨ８）で測定される。特定の実施形態では、溶解度は、水、またはＰＢＳまたはＮａＣｌなどの生理学的緩衝液（ＮａＰ含有または非含有）に溶かした状態で測定される。特定の実施形態では、溶解度は、比較的低いｐＨ（例えばｐＨ６．０）かつ比較的高い塩濃度（例えば、５００ｍＭのＮａＣｌ及び１０ｍＭのＮａＰなど）で測定される。特定の実施形態では、溶解度は、血液や血清などの生体液（溶媒）に溶けた状態で測定される。特定の実施形態では、温度は約室温（例えば、約２０℃、２１℃、２２℃、２３℃、２４℃、２５℃）または約体温（３７℃）である場合がある。特定の実施形態では、作用剤の溶解度は、室温または３７℃で少なくとも約０．１ｍｇ／ｍＬ、０．２ｍｇ／ｍＬ、０．３ｍｇ／ｍＬ、０．４ｍｇ／ｍＬ、０．５ｍｇ／ｍＬ、０．６ｍｇ／ｍＬ、０．７ｍｇ／ｍＬ、０．８ｍｇ／ｍＬ、０．９ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ、５ｍｇ／ｍＬ、６ｍｇ／ｍＬ、７ｍｇ／ｍＬ、８ｍｇ／ｍＬ、９ｍｇ／ｍＬ、１０ｍｇ／ｍＬ、１１ｍｇ／ｍＬ、１２ｍｇ／ｍＬ、１３ｍｇ／ｍＬ、１４ｍｇ／ｍＬ、１５ｍｇ／ｍＬ、１６ｍｇ／ｍＬ、１７ｍｇ／ｍＬ、１８ｍｇ／ｍＬ、１９ｍｇ／ｍＬ、２０ｍｇ／ｍＬ、２５ｍｇ／ｍＬ、３０ｍｇ／ｍＬ、４０ｍｇ／ｍＬ、５０ｍｇ／ｍＬ、６０ｍｇ／ｍＬ、７０ｍｇ／ｍＬ、８０ｍｇ／ｍＬ、９０ｍｇ／ｍＬ、または１００ｍｇ／ｍＬである。
【００５１】
「対象」もしくは「それを必要とする対象」または「患者」もしくは「それを必要とする患者」は、ヒト対象などの哺乳動物の対象を含める。
【００５２】
「実質的」または「本質的」は、ほぼ全体的またはほぼ完全を意味し、例えば、特定の量の９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上を意味する。
【００５３】
「統計学的に有意」は、結果が偶然に起こったとは考え難いことを意味する。統計学的な有意性は、当該技術分野で公知の任意の方法により求めることができる。有意性を表すのに一般的に用いられる尺度としてｐ値が挙げられ、これは帰無仮説が真である場合に、観察事象が起こる周期または確率のことである。得られたｐ値が有意レベルよりも小さい場合には、帰無仮説を却下する。簡単な例では、有意レベルはｐ値が０．０５以下であると定義されている。
【００５４】
「治療応答」は、１つまたは複数の治療剤、例えば、融合タンパク質の投与による症状の改善（持続するかしないかにかかわらず）を意味する。
【００５５】
対象（例えば、ヒトなどの哺乳動物）または細胞の「治療」は、本明細書で用いる場合、個体または細胞の自然経過を変化させようとする場合に用いる任意の種類の介入のことである。治療には、組成物の投与が含まれるがこれに限定されるものではなく、予防的に、または病理的な事象が生じた後もしくは病原体に接触した後に治療を行うことができる。「予防的」な治療も含まれ、これは、治療される疾患もしくは症状の進行速度を減じるか、疾患もしくは症状の発症を遅らせるか、または発症の重症度を減じるように誘導することができるものである。「治療」または「予防」は、疾患または症状またはその関連症候の完全な根絶、治癒、または予防を必ずしも意味するものではない。
【００５６】
用語「野生型」は、ある集団おいて最も多く観察され、したがって適宜、遺伝子の「正常型」または「野生型」と称される遺伝子または遺伝子産物（例えばポリペプチド）を意味する。
【００５７】
本明細書の各実施形態は、別段の明確な記載がない限り、他のあらゆる実施形態に準用される。
【００５８】
サイトカイン融合タンパク質
本開示の実施形態は、１つには、少なくとも１つのサイトカインと別のサイトカインとの融合、例えばインターロイキン−２（ＩＬ−２）と腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）との融合によって、各サイトカイン単体に比べて、融合タンパク質の薬物動態及び／または生物活性が改善するという驚くべき発見に関わるものである。また、サイトカイン融合タンパク質が自家腫瘍ワクチンに対する免疫応答を向上させ、また免疫チェックポイント阻害剤などの免疫チェックポイント調節剤の抗腫瘍活性を向上させることができるという発見に関わるものである。
【００５９】
したがって、特定の実施形態は、第２のヒトサイトカインのＮ末端に融合された第１のヒトサイトカインを含む融合タンパク質であって、該第１のサイトカインが該第２のサイトカインと異なる融合タンパク質に関するものである。特定の実施形態では、第１及び第２のサイトカインは、ヒトＩＬ−２、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−β（ＩＦＮＢ１）、ＩＦＮ−α（例えば、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１）、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−７、ＩＬ−２３、及びＩＬ−２７、ならびに「サイトカインシグナル伝達活性」及び／または抗腫瘍活性を有するそれらの変異体及び／または断片から選択される。「サイトカインシグナル伝達活性」の例を、各サイトカインについて以下に示している。一部の実施形態では、第１及び第２のサイトカインはペプチドリンカーで隔てられている。
【００６０】
一部の実施形態では、第１または第２のサイトカインは、ヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）、またはサイトカインシグナル伝達活性及び／もしくは抗腫瘍活性を有するその変異体及び／もしくは断片である。ＩＬ−２は、抗原刺激または分裂刺激があるとＴ細胞により産生され、Ｔ細胞増殖に必要であり、また免疫応答の制御に必須となる他の活性に必要である。ＩＬ−２はまた、Ｂ細胞、単球、リンホカイン活性化キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、及びグリオーマ細胞を刺激することができる。ＩＬ−２は、ＩＬ−２受容体というアルファ鎖、ベータ鎖、及びガンマ鎖と呼ばれる３つの鎖からなる複合体を介してシグナル伝達する。
【００６１】
一部の実施形態では、第１または第２のサイトカインは、ヒト腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）、またはサイトカインシグナル伝達活性及び／もしくは抗腫瘍活性を有するその変異体及び／もしくは断片である。ＴＮＦ−αは、ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＴＮＦＲ１及びＴＮＦＲＳＦ１Ｂ／ＴＮＦＢＲに結合するサイトカインである。ＴＮＦ−αは、主にマクロファージによって分泌され、特定の腫瘍細胞株の細胞死を誘発することができる。例えば、膜形態及び溶解形態で存在している。溶解形態は、タンパク質分解処理により膜形態から得られる。膜結合形態は、ＳＰＰＬ２ＡまたはＳＰＰＬ２Ｂにより、制御的膜内切断を介してさらにタンパク質分解処理され、サイトゾルに放出されるＴＮＦの細胞内ドメイン（ＩＣＤ１及びＩＣＤ２）と、細胞外空間に分泌されるＴＮＦのＣドメイン１及びＣドメイン２とが産生される。膜形態はセリン残基でリン酸化されるが、溶解度形態ではリン酸化されない。膜形態の脱リン酸化は、溶解性ＴＮＦＲＳＦ１Ａ／ＴＮＦＲ１に結合することによって起こる。
【００６２】
一部の実施形態では、第１または第２のサイトカインは、ヒトインターフェロン、またはサイトカインシグナル伝達活性及び／もしくは抗腫瘍活性を有するその変異体及び／もしくは断片である。インターフェロン（ＩＦＮ）は、腫瘍細胞または病原体の存在に応じて宿主細胞によって放出されるサイトカインシグナル伝達タンパク質群である。一部の実施形態では、ヒトインターフェロンは、ＩＦＮ−α、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ε、ＩＦＮ−κ、またはＩＦＮ−ωなどのＩ型インターフェロンである。ＩＦＮ−αインターフェロンの具体的な例として、ＩＦＮＡ１、ＩＦＮＡ２、ＩＦＮＡ４、ＩＦＮＡ５、ＩＦＮＡ６、ＩＦＮＡ７、ＩＦＮＡ８、ＩＦＮＡ１０、ＩＦＮＡ１３、ＩＦＮＡ１４、ＩＦＮＡ１６、ＩＦＮＡ１７、ＩＦＮＡ２１が挙げられる。一部の実施形態では、ヒトインターフェロンはＩＩ型インターフェロンであり、ヒトにおいてはＩＦＮ−γとしても知られている。
【００６３】
一部の実施形態では、第１または第２のサイトカインは、ヒトインターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、またはサイトカインシグナル伝達活性及び／もしくは抗腫瘍活性を有するその変異体及び／もしくは断片である。ＩＬ−１２は、活性化されたＴ細胞及びＮＫ細胞の増殖因子として作用し、ＮＫ細胞またはリンホカイン活性化キラー細胞の溶解活性を向上させ、ＰＢＭＣの存在下でＩＦＮ−ガンマの産生を刺激することができるサイトカインである。ＩＬ−１２は、ジスルフィド結合のヘテロ二量体であり、ＩＬ−１２サブユニットアルファ及びＩＬ−１２サブユニットベータで構成されている。特定の融合タンパク質は、サブユニットアルファ、サブユニットベータ、またはその両方を含んでいる。
【００６４】
一部の実施形態では、第１または第２のサイトカインは、ヒト顆粒状マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、またはサイトカインシグナル伝達活性及び／もしくは抗腫瘍活性を有するその変異体及び／もしくは断片である。ＧＭ−ＣＳＦは、種々の系統、例えば、顆粒球、マクロファージ、好酸球、及び赤血球に由来する造血前駆細胞の増殖及び分化を刺激するモノマーサイトカインである。
【００６５】
特定の実施形態では、第１または第２のサイトカインは、ヒトインターロイキン−７（ＩＬ−７）、またはサイトカインシグナル伝達活性及び／もしくは抗腫瘍活性を有するその変異体及び／もしくは断片である。ＩＬ−７は、リンパ球前駆細胞の増殖を刺激することができる造血増殖因子である。例えば、ＩＬ−７は、Ｂ細胞が成熟する特定段階における増殖に重要なものである。
【００６６】
特定の実施形態では、第１または第２のサイトカインは、ヒトインターロイキン−２３（ＩＬ−２３）、またはサイトカインシグナル伝達活性及び／もしくは抗腫瘍活性を有するその変異体及び／もしくは断片である。ＩＬ−２３は、自然免疫及び適応免疫のサイトカインとして機能し、ＩＬ−２３サブユニットアルファとＩＬ−１２サブユニットベータで構成されるヘテロ二量体のサイトカインである。ＩＬ−２３は、ＩＬ−１２ＲＢ１及びＩＬ−２３Ｒで構成されるヘテロ二量体受容体複合体に結合し、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達カスケードを活性化し、ナイーブＴ細胞ではなくメモリーＴ細胞を刺激し、炎症誘発性サイトカインの産生を促すものである。ＩＬ−２３系融合タンパク質がＩＬ−２３のサブユニットアルファのみを含む場合もあり、融合タンパク質がＩＬ−２３のサブユニットアルファとＩＬ−１２のサブユニットベータの両方を含む場合もある。
【００６７】
一部の実施形態では、第１または第２のサイトカインはヒトインターロイキン−２７（ＩＬ−２７）である。ＩＬ−２７は、自然免疫サイトカインとして機能し、ＩＬ−２７サブユニットアルファとＩＬ−２７サブユニットベータで構成されるヘテロ二量体のサイトカインである。ＩＬ−２７は、ヘルパーＴ細胞の成長を制御し、Ｔ細胞の増殖を抑制し、細胞傷害性Ｔ細胞活性を刺激し、Ｂ細胞のアイソタイプスイッチを誘導することが可能な炎症性特性及び抗炎症性特性を持つ。またＩＬ−２７は、自然免疫細胞に様々な作用を持つ。この標的細胞の中にはＣＤ４ヘルパーＴ細胞があり、この細胞は１型エフェクター細胞（Ｔｈ１）、２型エフェクター細胞（Ｔｈ２）、及びＩＬ１７産生ヘルパーＴ細胞（Ｔｈ１７）に分化することができる。ＩＬ−２７は、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞の高速クローン増殖を駆動させるが、メモリーＣＤ４Ｔ細胞では駆動させない。また、ＩＬ−１２との相乗作用で、ナイーブＣＤ４Ｔ細胞のインターフェロン−ガンマ／ＩＦＮ−ガンマの産生を誘発し、サイトカイン受容体ＷＳＸ−１／ＴＣＣＲに結合する。ＩＬ−２７は、Ｔｈ１応答の初期段階を促進させ、Ｔｈ２及びＴｈ１７の分化を抑制する。さらに、２つの別々の経路である、ｐ３８ＭＡＰＫ／ＴＢＸ２１依存経路及びＩＣＡＭ１／ＩＴＧＡＬ／ＥＲＫ依存経路を介してＴｈ１細胞の分化を誘導する。加えて、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、及びＳＴＡＴ５のリン酸化を誘導し、ＳＴＡＴ１を介してＴＢＸ２１／Ｔ−Ｂｅｔを活性化して、ＩＬ１２ＲＢ２の発現を増加させる。これは、Ｔｈ１細胞コミットメントに極めて重要な事象である。また、Ｔｈ１細胞産生の阻害剤であるＧＡＴＡ３の発現を抑制する。ＣＤ８Ｔ細胞では、ＩＬ−２７はＳＴＡＴとＧＺＭＢとを活性化する。ＩＬ−２７は、サイトカイン産生にも作用し、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−６などの炎症誘発性サイトカインの産生を抑制する一方、ＳＯＣＳ１及びＳＯＣＳ３などのサイトカインシグナル伝達のサプレッサーを活性化する。さらに、ＩＬ−２７は、Ｔ細胞に直接作用することによりＩＬ−６などのいくつかのサイトカインの作用を弱める。また、ＩＬ−２７は抗腫瘍活性も持つ。ＩＬ−２７系の融合タンパク質が、ＩＬ−２７のサブユニットアルファのみを含む場合もあり、ＩＬ−２７のサブユニットベータのみを含む場合もあり、両方のサブユニットを含む場合もある。
【００６８】
前述したサイトカインのアミノ酸配列及びその特定の変異体を以下の表Ｃ１に示す。一般的に、融合タンパク質のＣ末端部におけるサイトカイン配列にはＮ末端メチオニン残基が含まれていないことを、当業者は認識しているであろう（表Ｃ１を参照）。
【表１−１】
2021511348.tif 000003
【表１−２】
2021511348.tif 000004
【表１−３】
2021511348.tif 000005
【００６９】
一部の実施形態では、融合タンパク質の各サイトカイン成分は、表Ｃ１から選択されるアミノ酸配列またはその活性変異体及び／もしくは断片を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。活性変異体及び断片の具体的な例として、表Ｃ１から選択される配列と少なくとも８０％、９５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。ポリペプチド「変異体」及び「断片」のさらなる例は本明細書のいずれかに記載されている。
【００７０】
特定の実施形態では、第１のサイトカインはＩＬ−２であり、第２のサイトカインはＴＮＦ−αである。詳細には、ＩＬ−２はＴＮＦ−αのＮ末端に融合されており、一部の例では、ペプチドリンカー（例えば、−（ＧＧＧＧＳ）２−リンカー、または−（ＧＧＧＧＳ）３−リンカー）で隔てられている（表Ｌ１も参照）。一部の実施形態では、ＩＬ−２は、配列番号１もしくは配列番号２（シグナルペプチド有）と、または配列番号１もしくは配列番号２の残基２１〜１５３（シグナルペプチド無）と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。特定の実施形態では、ＩＬ−２はＣ１２５Ｓ変異またはＣ１２５Ａ変異を含む（例えば、配列番号２を参照）。一部の実施形態では、ＴＮＦ−αは、配列番号３〜配列番号６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。特定の実施形態では、ＴＮＦ−αは、少なくとも１つの変異（野生型との比較）を含むが、該変異は、ＴＮＦ−αの比活性を、例えば、ＩＬ−２の比活性に対する相対モル当量に相当する比活性に対して、約または少なくとも約１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１１、もしくは１／１２に減じるものである。一部の実施形態では、ＴＮＦ−αは、少なくとも１つの変異（野生型との比較）を含むが、該変異は、ＴＮＦＲ２と比べてＴＮＦＲ１に対するＴＮＦ−αの選択的結合を、例えば、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍増加させるものである。特定の実施形態では、ＴＮＦ−αは、Ｓ８６Ｔ（例えば、配列番号６を参照）、Ｒ３１Ｅ（例えば、配列番号５を参照）、及びＲ３２Ｗ、ならびにそれらの組み合わせ、例としてＳ８６Ｔ／Ｒ３１Ｅ（例えば、配列番号７を参照）及びＳ８６Ｔ／Ｒ３２Ｗなどから選択される少なくとも１つの変異を含む。
【００７１】
一部の実施形態では、第１のサイトカインはＩＦＮ−βであり、第２のサイトカインはＴＮＦ−αである。詳細には、ＩＦＮ−βはＴＮＦ−αのＮ末端に融合されており、一部の例では、ペプチドリンカー（例えば、−（ＧＧＧＧＳ）２−リンカー、または−（ＧＧＧＧＳ）３−リンカー）で隔てられている（表Ｌ１も参照）。一部の例では、ＩＦＮ−βは、配列番号１５と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。一部の実施形態では、ＴＮＦ−αは、配列番号３〜配列番号６と少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり、かつサイトカインシグナル伝達活性及び／または抗腫瘍活性を有する、アミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。特定の実施形態では、ＴＮＦ−αは、少なくとも１つの変異（野生型との比較）を含むが、該変異は、ＴＮＦ−αの比活性を、例えば、ＩＦＮ−βの比活性に対する相対モル当量に相当する比活性に対して、約または少なくとも約１／２、１／３、１／４、１／５、１／６、１／７、１／８、１／９、１／１０、１／１１、もしくは１／１２に減じるものである。一部の実施形態では、ＴＮＦ−αは、少なくとも１つの変異（野生型との比較）を含むが、該変異は、ＴＮＦＲ２と比べてＴＮＦＲ１に対するＴＮＦ−αの選択的結合を、例えば、約１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍増加させるものである。特定の実施形態では、ＴＮＦ−αは、Ｓ８６Ｔ（例えば、配列番号６を参照）、Ｒ３１Ｅ（例えば、配列番号５を参照）、及びＲ３２Ｗ、ならびにそれらの組み合わせ、例としてＳ８６Ｔ／Ｒ３１Ｅ（例えば、配列番号７を参照）及びＳ８６Ｔ／Ｒ３２Ｗなどから選択される少なくとも１つの変異を含む。
【００７２】
特定の実施形態では、融合タンパク質は以下の構造で示される、
−ＩＬ−２（Ｃ１２５Ｓ）−（ＧＧＧＧＳ）３−ＴＮＦ−（Ｓ８６Ｔ）（配列番号１９）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−（ＧＧＧＧＳ）２−ＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２０）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−（ＧＧＧＧＳ）２−ＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２１）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＰＡＰ−ＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２２）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＰＡＰ−ＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２３）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ−ＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２４）、
−ＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ−ＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２５）、
−ＩＬ−２（Ｃ１２５Ｓ）−（ＧＧＧＧＳ）３−ＴＮＦ−α（Ｒ３１Ｅ、Ｓ８６Ｔ）、もしくは
−ＩＦＮ−β−（ＧＧＧＧＳ）２−ＴＮＦ−α（配列番号２６）、
またはその活性変異体／断片を含む。
【００７３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、以下の表Ｆ１から選択されるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。
【表２−１】
2021511348.tif 000006
【表２−２】
2021511348.tif 000007
【００７４】
したがって、一部の実施形態では、融合タンパク質は、表Ｆ１から選択されるアミノ酸配列またはその活性変異体及び／もしくは断片を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。活性変異体及び断片の具体的な例として、表Ｆ１から選択される配列と少なくとも８０％、９５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になる。ポリペプチド「変異体」及び「断片」のさらなる例は本明細書のいずれかに記載されている。
【００７５】
リンカー：特定の融合タンパク質は１つまたは複数のリンカーペプチドを含む。用語「連結部」、「リンカー」、「リンカー部」、または「Ｌ」は、本明細書で使用する場合、融合タンパク質の１つのポリペプチド成分を別のポリペプチド成分から隔てるために、例として、第１のサイトカイン（例えばＩＬ−２）を第２のサイトカイン（例えばＴＮＦ−α）から隔てるために使用することができるリンカーを意味する。ペプチドリンカーは、生理学的に安定であってもよく、または反応活性リンカーまたは酵素分解性リンカー（例えば、タンパク質分解開裂性リンカー）などの遊離可能なリンカーを含んでいてもよい。ペプチドリンカー配列は、当該技術分野の標準的な技術を用いて融合タンパク質に組み込むことができる。
【００７６】
特定のペプチドリンカー配列は、以下の典型的な因子に基づいて選択することができ、それらの因子は、（１）可撓性の伸長構造が取れること、（２）第１及び第２のポリペプチドの機能的エピトープと相互作用し得る二次構造が取れないこと、（３）生理学的安定性があること、（４）ポリペプチドの機能的エピトープまたは他の特徴部分と反応し得る疎水性残基または荷電残基を持たないことである。例えば、George  and  Heringa,  J  Protein  Eng.  15:871-879,  2002を参照されたい。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは剛性リンカーである。一部の実施形態では、ペプチドリンカーは可撓性リンカーである。特定の実施形態では、可撓性リンカーは、ペプチドそのものを設計可能なコンピュータプログラムを用いるか（Desjarlais  &  Berg,  PNAS.  90:2256-2260,  1993及びPNAS.  91:11099-11103,  1994）、またはファージディスプレイ法を用いて合理的に設計することができる。
【００７７】
一部の実施形態では、ペプチドリンカー配列は長さが１個〜約２００個のアミノ酸である。リンカーの例は、アミノ酸の全長が、約１個〜２００個のアミノ酸、１個〜１５０個のアミノ酸、１個〜１００個のアミノ酸、１個〜９０個のアミノ酸、１個〜８０個のアミノ酸、１個〜７０個のアミノ酸、１個〜６０個のアミノ酸、１個〜５０個のアミノ酸、１個〜４０個のアミノ酸、１個〜３０個のアミノ酸、１個〜２０個のアミノ酸、１個〜１０個のアミノ酸、１個〜５個のアミノ酸、１個〜４個のアミノ酸、１個〜３個のアミノ酸であるか、または約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、もしくは２００個、もしくはそれ以上のアミノ酸であり得る。
【００７８】
ペプチドリンカーには、本明細書のいずれかに記載され、かつ当該技術分野で公知であるように、任意の１つまたは複数の天然アミノ酸、非天然アミノ酸、アミノ酸類似体、及び／またはアミノ酸模倣物を用いることができる。リンカーとして有用に使用可能な特定のアミノ酸配列には、Maratea  et  al.,  Gene  40:39-46,  1985、Murphy  et  al.,  PNAS  USA.  83:8258-8262,  1986、米国特許第４，９３５，２３３号、及び米国特許第４，７５１，１８０号に開示されている配列が含まれる。特定のペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ残基、Ｓｅｒ残基、及び／またはＡｓｎ残基を含む。必要に応じて、ペプチドリンカー配列にＴｈｒ及びＡｌａなどの中性付近の他のアミノ酸を用いることもできる。
【００７９】
特定のペプチドリンカーの例を以下の表Ｌ１に示す。
【表３】
2021511348.tif 000008
【００８０】
したがって、特定の実施形態では、融合タンパク質は、表Ｐ１から選択される１つまたは複数のペプチドリンカーを含む。特定の実施形態では、前述のリンカーは任意である。
【００８１】
ポリペプチド変異体：特定の実施形態には、本明細書に記載の参照配列の「変異体」及び「断片」が含まれており、名称で記載されているか、または表もしくは配列の識別子を参照できる。例として、本明細書に記載のサイトカイン、融合タンパク質、及び抗体のいずれかが挙げられる。「変異体」配列は、１つまたは複数の置換、欠失（例えばトランケーション）、付加、及び／または挿入のために参照配列とは異なるポリペプチド配列またはポリヌクレオチド配列のことである。変異体ポリペプチドは生物活性があり、つまり、参照ポリペプチドの酵素活性または結合活性を変わらず保っている。こうした変異体は、例えば遺伝的多型から得られるか、及び／または人為的な操作によって得られる。
【００８２】
多くの例では、生物活性変異体は１つまたは複数の保存的置換を含んでいる。「保存的置換」は、アミノ酸が、同様な特性を有する別のアミノ酸と置換されていることを表し、ペプチド化学分野の当業者であれば、ポリペプチドの二次構造及び疎水親水特性が実質的に変化しないことを予測できるはずである。上述の通り、本開示のポリヌクレオチド及びポリペプチドの構造に修飾を加えることができ、その修飾によって、所望の特性を持つ変異体ポリペプチドまたは誘導体ポリペプチドをコードする機能的分子が得られる。ポリペプチドのアミノ酸配列を変えて、同等のあるいは改良された本明細書に記載のポリペプチドの変異体または一部を作製するのが好ましい場合、当業者は通例、ＤＮＡ配列をコードするコドンの１つまたは複数を変える。
【００８３】
例えば、タンパク質構造において、相互作用結合能を大きく損なうことなく、特定のアミノ酸を他のアミノ酸の代わりに用いることができる。この結合能はタンパク質の生物学的な機能活性を定めるタンパク質の相互作用能及び性質であるため、タンパク質配列、また当然その基となるＤＮＡコード配列において、特定のアミノ酸配列を置換したとしても、同様の特性を持つタンパク質が得られることになる。したがって、開示した組成物のペプチド配列において、またはその作用を大きく損なうことなく該ペプチドをコードするＤＮＡ配列において、様々な改変を加えることができると考えられる。
【００８４】
こうした改変を加える際には、アミノ酸の疎水性親水性指標を考慮することができる。タンパク質における相互作用の生物学的機能を示すのに疎水性親水性アミノ酸指標が重要であることは、当該技術分野で一般的に理解されていることである（本明細書に参照により援用されるKyte  &  Doolittle,  1982）。アミノ酸の相対的な疎水性親水性性質は得られるタンパク質の二次構造を決める要因となっており、この二次構造がタンパク質と他の分子、例えば、酵素、基質、受容体、ＤＮＡ、抗体、抗原などとの相互作用を定めることは知られている。各アミノ酸には、その疎水性及び帯電特性を基に疎水性親水性指標が与えられている（Kyte  &  Doolittle,  1982）。その値は、イソロイシン（＋４．５）、バリン（＋４．２）、ロイシン（＋３．８）、フェニルアラニン（＋２．８）、システイン（＋２．５）、メチオニン（＋１．９）、アラニン（＋１．８）、グリシン（−０．４）、スレオニン（−０．７）、セリン（−０．８）、トリプトファン（−０．９）、チロシン（−１．３）、プロリン（−１．６）、ヒスチジン（−３．２）、グルタミン酸（−３．５）、グルタミン（−３．５）、アスパラギン酸（−３．５）、アスパラギン（−３．５）、リジン（−３．９）、及びアルギニン（−４．５）である。当該技術分野では、特定のアミノ酸が、同様の疎水性親水性指標またはスコアを持つ他のアミノ酸によって置換され、その結果、同様の生物活性を持つタンパク質が得られる、すなわち機能的に同等の生体タンパク質が得られることが知られている。こうした改変では疎水性親水性指標が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、±０．５以内がさらにより一層好ましい。
【００８５】
類似したアミノ酸を親水性に基づいて効果的に置換することができることも当該技術分野で理解されている。米国特許第４，５５４，１０１号（その全体が参照により本明細書に具体的に援用されている）によると、タンパク質の最大局所平均親水性は、隣接するアミノ酸の親水性によって決定され、そのタンパク質の生物学的特性と相関することが報告されている。米国特許第４，５５４，１０１号に詳述される通り、以下の親水性値がアミノ酸残基に与えられており、アルギニン（＋３．０）、リジン（＋３．０）、アスパラギン酸（＋３．０±１）、グルタミン酸（＋３．０±１）、セリン（＋０．３）、アスパラギン（＋０．２）、グルタミン（＋０．２）、グリシン（０）、スレオニン（−０．４）、プロリン（−０．５±１）、アラニン（−０．５）、ヒスチジン（−０．５）、システイン（−１．０）、メチオニン（−１．３）、バリン（−１．５）、ロイシン（−１．８）、イソロイシン（−１．８）、チロシン（−２．３）、フェニルアラニン（−２．５）、及びトリプトファン（−３．４）となっている。アミノ酸が、同様の親水性値を有する他のアミノ酸と置換されても、生物学的に同等、特に免疫学的に同等のタンパク質が得られることが理解されている。こうした改変では親水性値が±２以内であるアミノ酸の置換が好ましく、±１以内が特に好ましく、±０．５以内がさらにより一層好ましい。
【００８６】
上記に概説したように、アミノ酸の置換は通例、アミノ酸側鎖の置換基の持つ相対的類似性、例えば、疎水性、親水性、電荷、サイズなどに基づいて行う。様々な上述の特徴を考慮に入れた置換の例が当業者に周知であり、その例として、アルギニンとリジン、グルタミン酸とアスパラギン酸、セリンとスレオニン、グルタミンとアスパラギン、及びバリン、ロイシンとイソロイシンが挙げられる。
【００８７】
アミノ酸はさらに、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性の類似性に基づいて置換することができる。例えば、負に帯電したアミノ酸にはアスパラギン酸とグルタミン酸があり、正に帯電したアミノ酸にはリジンとアルギニンがあり、同様の親水性値を持つ非荷電極性頭部基を備えたアミノ酸には、ロイシン、イソロイシン、及びバリンと、グリシン及びアラニンと、アスパラギン及びグルタミンと、セリン、スレオニン、フェニルアラニン、及びチロシンとが含まれる。保存的改変を示し得るアミノ酸の他の群には、（１）ａｌａ、ｐｒｏ、ｇｌｙ、ｇｌｕ、ａｓｐ、ｇｌｎ、ａｓｎ、ｓｅｒ、ｔｈｒ、（２）ｃｙｓ、ｓｅｒ、ｔｙｒ、ｔｈｒ、（３）ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ、ｍｅｔ、ａｌａ、ｐｈｅ、（４）ｌｙｓ、ａｒｇ、ｈｉｓ、及び（５）ｐｈｅ、ｔｙｒ、ｔｒｐ、ｈｉｓが含まれる。
【００８８】
加えて、または代わりに、変異体が非保存的改変を含む場合がある。好ましい実施形態では、変異体ポリペプチドは、約１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個のアミノ酸未満のアミノ酸、または１個のみのアミノ酸の置換、欠失、または付加のために、天然配列または参照配列とは異なっている。変異体は、加えて（または代わりに）、例えば、ポリペプチドの免疫原性、二次構造、酵素活性、及び／または疎水親水特性への影響が最小限となるアミノ酸の欠失または付加により修飾することができる。
【００８９】
特定の実施形態では、ポリペプチド配列は、長さが、約、少なくとも約、または最大約５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３１０個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４１０個、４２０個、４３０個、４４０個、４５０個、４６０個、４７０個、４８０個、４９０個、５００個、５１０個、５２０個、５３０個、５４０個、５５０個、５６０個、５７０個、５８０個、５９０個、６００個、６１０個、６２０個、６３０個、６４０個、６５０個、６６０個、６７０個、６８０個、６９０個、７００個、７１０個、７２０個、７３０個、７４０個、７５０個、７６０個、７７０個、７８０個、７９０個、８００個、８００個、８１０個、８２０個、８３０個、８４０個、８５０個、８６０個、８７０個、８８０個、８９０個、９００個、９００個、９１０個、９２０個、９３０個、９４０個、９５０個、９６０個、９７０個、９８０個、９９０個、１０００個、もしくはそれを超える、またはこれらの数値間の全整数個の連続したアミノ酸であり、参照配列の全てまたは一部を含み得る（例えば、表または配列表を参照）。
【００９０】
一部の実施形態では、ポリペプチド配列は、約または多くても約５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２１０個、２２０個、２３０個、２４０個、２５０個、２６０個、２７０個、２８０個、２９０個、３００個、３１０個、３２０個、３３０個、３４０個、３５０個、３６０個、３７０個、３８０個、３９０個、４００個、４１０個、４２０個、４３０個、４４０個、４５０個、４６０個、４７０個、４８０個、４９０個、５００個、５１０個、５２０個、５３０個、５４０個、５５０個、５６０個、５７０個、５８０個、５９０個、６００個、６１０個、６２０個、６３０個、６４０個、６５０個、６６０個、６７０個、６８０個、６９０個、７００個、７１０個、７２０個、７３０個、７４０個、７５０個、７６０個、７７０個、７８０個、７９０個、８００個、８００個、８１０個、８２０個、８３０個、８４０個、８５０個、８６０個、８７０個、８８０個、８９０個、９００個、９００個、９１０個、９２０個、９３０個、９４０個、９５０個、９６０個、９７０個、９８０個、９９０個、１０００個、もしくはそれを超える、またはこれらの数値間の全整数個の連続したアミノ酸からなり、参照配列の全てまたは一部を含み得る（例えば、表または配列表を参照）。
【００９１】
特定の実施形態では、ポリペプチド配列は約１０個〜１０００個、１０個〜９００個、１０個〜８００個、１０個〜７００個、１０個〜６００個、１０個〜５００個、１０個〜４００個、１０個〜３００個、１０個〜２００個、１０個〜１００個、１０個〜５０個、１０個〜４０個、１０個〜３０個、１０個〜２０個、２０個〜１０００個、２０個〜９００個、２０個〜８００個、２０個〜７００個、２０個〜６００個、２０個〜５００個、２０個〜４００個、２０個〜３００個、２０個〜２００個、２０個〜１００個、２０個〜５０個、２０個〜４０個、２０個〜３０個、５０個〜１０００個、５０個〜９００個、５０個〜８００個、５０個〜７００個、５０個〜６００個、５０個〜５００個、５０個〜４００個、５０個〜３００個、５０個〜２００個、５０個〜１００個、１００個〜１０００個、１００個〜９００個、１００個〜８００個、１００個〜７００個、１００個〜６００個、１００個〜５００個、１００個〜４００個、１００個〜３００個、１００個〜２００個、２００個〜１０００個、２００個〜９００個、２００個〜８００個、２００個〜７００個、２００個〜６００個、２００個〜５００個、２００個〜４００個、もしくは２００個〜３００個、またはこれらの数値間の全範囲の連続したアミノ酸であり、参照配列の全てまたは一部を含む。特定の実施形態では、任意の参照ポリペプチドのＣ末端領域またはＮ末端領域は、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個、１００個、１１０個、１２０個、１３０個、１４０個、１５０個、１６０個、１７０個、１８０個、１９０個、２００個、２５０個、３００個、３５０個、４００個、４５０個、５００個、５５０個、６００個、６５０個、７００個、７５０個、もしくは８００個、もしくはそれを超えるアミノ酸、または約１０個〜５０個、２０個〜５０個、５０個〜１００個、１００個〜１５０個、１５０個〜２００個、２００個〜２５０個、２５０個〜３００個、３００個〜３５０個、３５０個〜４００個、４００個〜４５０個、４５０個〜５００個、５００個〜５５０個、５５０個〜６００個、６００個〜６５０個、６５０個〜７００個、７００個〜７５０個、７５０個〜８００個、もしくはそれを超えるアミノ酸、またはこれらの数値間の全整数個及び範囲（例えば、１０１個、１０２個、１０３個、１０４個、１０５個）のアミノ酸によりトランケートされ得るが、トランケートされたポリペプチドが参照ポリペプチドの結合特性及び／または活性を保持している場合に限る。典型的には、生物活性断片は、それが由来する生物活性参照ポリペプチドの活性の約１％以上、約５％以上、約１０％以上、約２５％以上、または約５０％以上を有する。
【００９２】
特定の例では、変異体は、参照ポリペプチド配列に対して、少なくとも約３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性または配列同一性または配列相同性を示す。さらに、約１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個、３６個、３７個、３８個、３９個、４０個、４１個、４２個、４３個、４４個、４５個、４６個、４７個、４８個、４９個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、または１００個（これらの数値間の全整数個及び範囲を含む）のアミノ酸の付加（例えば、Ｃ末端付加、Ｎ末端付加、これらの両方）、欠失、トランケーション、挿入、または置換（例えば、保存的置換）によって、天然配列または親配列とは異なるが、親ポリペプチド配列または参照ポリペプチド配列の特性または活性を保持している配列が考慮される。
【００９３】
一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照配列とは少なくとも１個のアミノ酸残基が異なるが、５０個未満、４０個未満、３０個未満、２０個未満、１５個未満、１０個未満、８個未満、６個未満、５個未満、４個未満、３個未満、または２個未満のアミノ酸残基が異なっている。特定の実施形態では、変異体ポリペプチドは参照配列とは残基の少なくとも１％が異なるが、残基の２０％未満、１５％未満、１０％未満、または５％未満が異なっている。（この比較にアライメントが必要である場合、配列の類似性が最大になるようにアライメントすべきである。欠失または挿入またはミスマッチにより「ループアウト」した配列は異なるものとみなす。）
【００９４】
配列間の配列類似性または配列同一性（これらの用語は本明細書では交換可能に用いられる）を以下のように計算する。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を求めるために、これらの配列を至適比較するようにアライメントする（例えば、至適アライメントをするためにギャップを第１のアミノ配列もしくは核酸配列と第２のアミノ酸配列もしくは核酸配列の一方または両方に導入することができ、また比較のために非相同配列を無視することができる）。特定の実施形態では、比較のためにアライメントする参照配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも５０％、６０％、及びさらにより好ましくは少なくとも７０％、８０％、９０％、１００％である。次に、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置でのアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第１の配列におけるある位置が、第２の配列における対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占有されている場合には、分子はその位置で同一となる。
【００９５】
２つの配列間のパーセント同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数であり、２つの配列の至適アライメントのために導入されるべきギャップの数及び各ギャップの長さも考慮に入れる。
【００９６】
配列の比較及び２つの配列間のパーセント同一性の算出は、数学的アルゴリズムを用いて行うことができる。好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性を、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman及びWunsch（J.  Mol.  Biol.  48:  444-453,  1970）のアルゴリズムを用いて算出しており、Ｂｌｏｓｓｕｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスと、ギャップの重み１６、１４、１２，１０、８、６、または４と、長さの重み１、２、３、４、５、または６とを使用している。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性を、ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを用いて算出しており、ＮＷＳｇａｐｄｎ  ＣＭＰマトリックスと、ギャップの重み４０、５０、６０、７０、または８０と、長さの重み１、２、３、４、５、または６とを使用している。特に好ましいパラメータセット（及び別段の指定がない限り使用されるべきもの）は、ギャップペナルティ１２、ギャップ伸長ペナルティ４、及びフレームシフトギャップペナルティ５のＢｌｏｓｓｕｍ６２スコアマトリックスである。
【００９７】
２つのアミノ酸配列間またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれたE.  Meyers及びW.  Millerのアルゴリズム（Cabios.  4:11-17,  1989）を用いて、ＰＡＭ１２０重み付け残基表、ギャップ長ペナルティ１２、及びギャップペナルティ４を使用して算出することができる。
【００９８】
本明細書に記載の核酸配列及びタンパク質配列を「クエリー配列」として用いて、公開データベースに対して検索を行うことができ、例えば、他のファミリーメンバーまたは関連配列を特定することができる。こうした検索を、AltschulらのＮＢＬＡＳＴプログラム及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）を用いて行うことができる（1990,  J.  Mol.  Biol,  215:  403-10）。ＢＬＡＳＴヌクレオチドの検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラムを用いて、スコア１００、ワード長１２で行うことで、本明細書に記載の核酸分子に相同性を持つヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質の検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラムを用いて、スコア５０、ワード長３で行うことで、本明細書に記載のタンパク質分子に相同性を持つアミノ酸配列を得ることができる。比較用のギャップを付加したアライメントを得るために、Altschulらの記載のように（Nucleic  Acids  Res.  25:  3389-3402,  1997）ギャップ付加（Gapped）ＢＬＡＳＴを用いることができる。ＢＬＡＳＴプログラム及びギャップ付加ＢＬＡＳＴプログラムを使用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを用いることができる。
【００９９】
一部の実施形態では、上述したように、ポリヌクレオチド及び／またはポリペプチドをＢＬＡＳＴアライメントツールを用いて評価することができる。局所アライメントは、比較する配列の各々から得た配列セグメント対のみを考慮する。Smith-WatermanアルゴリズムまたはSellersアルゴリズムの改良法により、伸長またはトリミングによってスコアが改善されない全てのセグメント対がわかる。この対は高スコアリングセグメント対（ＨＳＰ）と称されている。ＢＬＡＳＴアライメントの結果は、ＢＬＡＳＴスコアが単に偶然による期待値となる可能性を示す統計的尺度を含んでいる。
【０１００】
粗スコアＳは、アライメントする各配列に関連付けられるギャップ及び置換の数から計算され、類似性スコアが高いほど有意なアライメントであることを示す。置換スコアはテーブル索引から得られる（ＰＡＭ、ＢＬＯＳＵＭを参照）。
【０１０１】
ギャップスコアは通例、ギャップ開始ペナルティＧ及びギャップ伸長ペナルティＬの合計として計算される。長さｎのギャップについては、ギャップコストはＧ＋Ｌｎである。ギャップコスト、Ｇ、及びＬの選択は経験的なものであるが、Ｇについては高い値（１０〜１５）、例えば１１であり、Ｌについては低い値（１〜２）、例えば１を選択することが多い。
【０１０２】
ビットスコアＳ’は、粗アライメントスコアＳから得られ、その中では使用したスコアリングシステムの統計的特性が考慮される。ビットスコアはスコアリングシステムに対して正規化されるため、ビットスコアを種々検索から得たアライメントスコアの比較に使用することができる。用語「ビットスコア」及び「類似性スコア」は、交換可能に使用されている。ビットスコアは、アライメントがどの程度良好かを表す指標であり、スコアが高いほどアライメントは良好である。
【０１０３】
Ｅ値または期待値は、類似のスコアを持つ配列がデータベースに偶然存在する可能性を示すものである。Ｅ値は、データベース検索で偶然存在すると期待されるＳと同等のまたはＳより良好なスコアを持つ種々のアライメント数の予測値である。Ｅ値が小さいほど、アライメントは有意である。例えば、ｅ−１１７のＥ値を有するアライメントは、類似のスコアを持つ配列が単に偶然生じる可能性が極めて低いことを意味する。さらに、ランダムな一対のアミノ酸をアライメントする場合の予測スコアは負である必要がある。さもなければ、アライメント配列が長い場合に、アライメントされたセグメントが類似しているか否かにかかわらず高いスコアを有しやすくなる。加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、適切な置換マトリックス、ヌクレオチド、またはアミノ酸を使用し、ギャップ付きアライメントに対しては、ギャップ挿入ペナルティ及び伸長ペナルティを使用する。例えば、ポリペプチド配列のＢＬＡＳＴアライメントや比較は通例、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ存在ペナルティ１１、及びギャップ伸長ペナルティ１を用いて行う。
【０１０４】
一部の実施形態では、配列類似性スコアは、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ存在ペナルティ１１、及びギャップ伸長ペナルティ１を用いて行うＢＬＡＳＴ分析から得られる。
【０１０５】
特定の実施形態では、本明細書の配列同一性／類似性スコアは、ＧＡＰバージョン１０（Accelrys社GCG、カリフォルニア州サンディエゴ）を用いて得られる値を意味し、そこでは以下のパラメータを用いている。ヌクレオチド配列のパーセント同一性及びパーセント類似性に関しては、ギャップの重み５０及び長さの重み３、ならびにｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを用いる。アミノ酸配列のパーセント同一性及びパーセント類似性に関しては、ギャップの重み８及び長さの重み２、ならびにＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを用いる（Henikoff  and  Henikoff,  PNAS  USA.  89:10915-10919,  1992）。ＧＡＰは、Needleman-Wunschのアルゴリズム（J  Mol  Biol.  48:443-453,  1970）を使用して、マッチング数を最大化しかつギャップ数を最小化する２つの完全な配列のアライメントを探すものである。
【０１０６】
特定の実施形態において、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチド配列（例えば、配列表を参照）との至適アライメントをなし得るアミノ酸配列を含み、少なくとも約５０、６０、７０、８０、９０、１００、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００、８１０、８２０、８３０、８４０、８５０、８６０、８７０、８８０、８９０、９００、９１０、９２０、９３０、９４０、９５０、９６０、９７０、９８０、９９０、１０００、もしくはそれ以上、またはこれらの数値間の全ての整数及び範囲のＢＬＡＳＴビットスコアまたは配列類似性スコアをもたらすものである。このＢＬＡＳＴアライメントには、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス、ギャップ存在（existence）ペナルティ１１、ギャップ伸長ペナルティ１を用いた。
【０１０７】
上述されるように、参照ポリペプチドは、アミノ酸置換、欠失、トランケーション、付加、及び挿入を含めた様々な方法で改変され得る。こうした操作の方法は、当該技術分野において一般的に公知である。例えば、参照ポリペプチドのアミノ酸配列の変異体を、ＤＮＡの変異により調製することができる。変異誘発及びヌクレオチド配列改変のための方法は、当分野において周知である。例えば、KunkelのPNAS  USA.  82:  488-492,  1985、KunkelらのMethods  in  Enzymol.  154:  367-382,  1987、米国特許  第４，８７３，１９２号、Watson,  J.  Dらの“Molecular  Biology  of  the  Gene,”  Fourth  Edition,  Benjamin/Cummings,  Menlo  Park,  Calif.,  1987、及びそこに引用されている参考文献を参照されたい。対象となるタンパク質の生物活性に影響を及ぼすことのない適切なアミノ酸置換に関する指針については、Dayhoff  et  al.,  (1978)  Atlas  of  Protein  Sequence  and  Structure（Natl.  Biomed.  Res.  Found.,  Washington,  D.C.）のモデルに記載されている。
【０１０８】
こうした改変によって作製されるコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングする方法、及び選択された特性を有する遺伝子産物のｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする方法については、当該技術分野で公知である。これらの方法は、参照ポリペプチドのコンビナトリアル変異誘発によって生成される遺伝子ライブラリーを迅速にスクリーニングするのに適応している。一例として、再帰的アンサンブル変異誘発（ＲＥＭ）、すなわちライブラリー内の機能的変異体の頻度を増やす手法が、ポリペプチド変異型を特定するためにスクリーニングアッセイと共に使用され得る（Arkin  and  Yourvan,  PNAS  USA  89:  7811-7815,  1992、Delgrave  et  al.,  Protein  Engineering.  6:  327-331,  1993）。
【０１０９】
ポリヌクレオチド、発現ベクター、及び宿主細胞：特定の実施形態は、本明細書で記載するように、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドに関連する。よって、特定の実施形態には、表Ｃ１に記載されている個々のサイトカイン（それらの変異体及び／または断片を含む）の任意の組み合わせを含む融合タンパク質、及び表Ｌ１に記載されているリンカーのいずれかを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが含まれる。特定の実施形態には、表Ｆ１から選択される融合タンパク質（それらの変異体及び／または断片を含む）をコードするポリヌクレオチド、及び表Ｅ１に記載されている例示的なコード配列を含むか、それからなるか、またはそれから本質的になるポリヌクレオチドが含まれる。
【０１１０】
他の用途では、これらの実施形態及び関連する実施形態を用いて、融合ポリペプチドを、宿主細胞において組み換え技術により産生することができる。遺伝コードの縮重のために、本明細書に記載のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が数多く存在することは、当業者に認識されている。これらのポリヌクレオチドのうち、任意の天然遺伝子のヌクレオチド配列に対して相同性が最小になるものがある。しかしながら、コドン使用頻度が異なるために多様になるポリヌクレオチド、例えば、ヒト、酵母、または細菌のコドン選択に至適化されたポリヌクレオチドが特に考慮される。
【０１１１】
当業者に認識されるように、ポリヌクレオチドは一本鎖（コーディングまたはアンチセンス）であっても二本鎖であってもよく、ＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）であってもＲＮＡ分子であってもよい。さらなるコード配列または非コード配列が本開示のポリヌクレオチド内に存在してもよいが、その必要があるわけではなく、またポリヌクレオチドが他の分子及び／または支持材料に連結されていてもよいが、その必要があるわけではない。
【０１１２】
ポリヌクレオチドは天然配列（すなわち、融合ポリペプチドまたはその成分をコードする内因性配列）を含んでいてもよく、またはこうした配列の変異体もしくは生物学的機能等価物を含んでいてもよい。ポリヌクレオチド変異体は、本明細書に記載の１つ以上の置換、付加、欠失、及び／または挿入を含んでいてもよく、好ましくは、その結果、そのポリペプチド変異体の活性が、未改変ポリペプチドに比べて実質的に減少しないようにする。
【０１１３】
さらなるコード配列または非コード配列がポリヌクレオチド内に存在してもよいが、その必要があるわけではなく、またポリヌクレオチドが他の分子及び／または支持材料に連結されていてもよいが、その必要があるわけではない。したがって、ポリヌクレオチドは、それ自体のコード配列の長さを問わず、他のＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列、例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、付加的制限酵素部位、多重クローニング部位、他のコードセグメントなどと結合していてもよく、その結果、その全体の長さにかなりばらつきがあってもよい。
【０１１４】
ポリヌクレオチド配列は、混合ゲノム、すなわちｃＤＮＡ、ＲＮＡ、及び合成した配列の混合であってもよい。例えば、リーダーペプチドをコードするゲノム配列またはｃＤＮＡ配列は、ポリペプチドをコードするゲノム配列またはｃＤＮＡ配列に接続されていてもよく、それに続いて、そのＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列が、周知の手順に従って、相同組み換えに望ましいアミノ酸配列をコードする合成オリゴヌクレオチドを挿入することによって、または好ましくは所望の配列を適正なオリゴヌクレオチドを用いてＰＣＲで作製することによって、ある部位で改変されていてもよい。一部の実施形態では、シグナル配列をコード配列の前に含めることができる。シグナル配列は、宿主細胞と信号伝達して、ポリペプチドを細胞表面に誘導するかまたはポリペプチドを培養液に分泌させる、コード配列のシグナルペプチドＮ末端をコードする。典型的には、タンパク質が細胞を離れる前に、シグナルペプチドは宿主細胞により切断される。シグナルペプチドは、原核生物及び真核生物の種々のタンパク質に見られるものである。
【０１１５】
１つまたは複数のポリヌクレオチドが本明細書に記載の融合タンパク質をコードすることができる。さらに、ポリヌクレオチド配列は様々な理由で操作することができる。例として、以下に限定されないが、好ましいコドンを組み込んで、種々の生物体におけるポリヌクレオチドの発現を増強することが挙げられる（概してNakamura  et  al.,  Nuc.  Acid.  Res.  28:292,  2000を参照）。さらに、サイレント変異を組み込んで、制限部位を導入するかもしくは除去するか、ＣｐＧジヌクレオチドモチーフの密度を減少させるか（例えば、Kameda  et  al.,  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun.  349:1269-1277,  2006を参照）、または一本鎖配列がステムループ構造になり難くなるようにする（例えば、Zuker  M.,  Nucl.  Acid  Res.  31:3406-3415,  2003を参照）ことができる。加えて、哺乳動物の発現を、開始コドンにコザックコンセンサス配列（例えば、（ａ／ｇ）ｃｃ（ａ／ｇ）ｃｃＡＴＧｇ（配列番号５１））を含めることによってさらに最適化することができる。この目的に有用なコザックコンセンサス配列は当該技術分野で公知である（Mantyh  et  al.,  PNAS  92:  2662-2666,  1995、Mantyh  et  al,.  Prot.  Exp.  &  Purif.  6:124,  1995）。
【０１１６】
ポリヌクレオチドを含む発現ベクターと、ポリヌクレオチド及び／または発現ベクターを含む宿主細胞とがさらに含まれる。適切な宿主細胞において周知の方法を用いてポリペプチドをコードするＤＮＡ配列またはＲＮＡ配列を発現させることによって、ポリペプチド及び融合タンパク質を産生することができる。用語「宿主細胞」は、本明細書に記載のポリペプチドのうちの１つまたは複数をコードする核酸配列を導入したか、または該細胞に導入可能である細胞、またさらに、目的のポリペプチド、例えば、本明細書に記載の任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドなどを発現するか、または発現可能である細胞を意味するのに用いられている。この用語は、親細胞の後代を含むが、後代が形態または遺伝子構造において親細胞と同一であるか否かにかかわらず、選択した遺伝子が存在する限り該後代を含むものとする。宿主細胞は、特定の特性に応じて選択され、例えば特性には、ホルミルグリシン生成酵素（ＦＧＥ）を発現させてスルファターゼモチーフ内のシステイン残基またはセリン残基をホルミルグリシン（ＦＧｌｙ）残基に変換する特性、または非天然のアミノ酸、例えばアジド側鎖、アルキン側鎖、または他の所望の側鎖を持つ非天然のアミノ酸をポリペプチドに組み込むことができるアミノアシルｔＲＮＡシンテターゼを発現させて、化学的結合または修飾を容易にする特性などがある。
【０１１７】
一部の例では、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターは付加的な非コード配列を含む。例えば、発現ベクターに含まれる「調節エレメント」または「制御配列」はベクターの非翻訳領域にあり、これらには、転写及び翻訳を行うように宿主細胞のタンパク質と相互作用するエンハンサー、プロモーター、５’及び３’非翻訳領域などがある。こうしたエレメントは、その強度及び特異性が様々になり得る。使用するベクター系及び宿主によって、任意の数の適切な転写エレメント及び翻訳エレメント、例えば、構成プロモーター及び誘導プロモーターなどを使用することができる。例として、細菌系のクローニングの際には、ＰＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴファージミド（Stratagene社、カリフォルニア州ラ・ホーヤ）またはＰＳＰＯＲＴ１プラスミド（Gibco  BRL社、メリーランド州ゲイザースバーグ）などのハイブリッドｌａｃＺプロモーターといった誘導プロモーターを使用することができる。哺乳動物細胞系では、哺乳動物遺伝子由来または哺乳動物ウイルス由来のプロモーターが一般的に好まれる。ポリペプチドをコードする配列の複数のコピーを含む細胞株を作製することが必要な場合には、ＳＶ４０またはＥＢＶベースのベクターを適切な選択マーカーと共に使用することが有利な場合がある。
【０１１８】
種々の発現ベクター／宿主系が知られており、それらを使用してポリヌクレオチド配列を入れかつ発現することができる。これらの例として、以下に限定されないが、発現ベクター、例えば、組み換えバクテリオファージ発現ベクター、プラスミド発現ベクター、もしくはコスミドＤＮＡ発現ベクターなどで形質転換された細菌などの微生物；酵母発現ベクターで形質転換された酵母；ウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；ウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣａＭＶ）、タバコモザイクウイルス（ＴＭＶ））もしくは細菌発現ベクター（例えば、ＴｉプラスミドまたはｐＢＲ３２２プラスミド）で形質転換された植物細胞系；または、ウイルス発現ベクター、プラスミド発現ベクター、エピソーム発現ベクター、組み込み発現ベクター、もしくは他の発現ベクターで形質転換された哺乳動物細胞系、より詳細にはヒト細胞系などの動物細胞系が挙げられる。したがって、特定の実施形態には、本明細書に記載のポリペプチド、例えば、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターが含まれる。ポリヌクレオチド及び／または発現ベクターを含む宿主細胞も包含される。
【０１１９】
特定の実施形態は、大腸菌系発現システムを利用することができる（例えば、Structural  Genomics  Consortium  et  al.,  Nature  Methods.  5:135-146,  2008を参照）。これらの実施形態及び関連実施形態では、部分的にまたは全体的に、ライゲーション非依存クローニング（ＬＩＣ）により、適切な発現ベクターを産生することができる。特定の実施形態では、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐＥＴ系列）により、または、代替プロモーター、例えばＴＡＣプロモーターを含む改変ｐＥＴベクターにより、タンパク質発現を制御することができる。これらの実施形態及び関連実施形態は、発現宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）、すなわちＴ７媒介発現を働かせ、かつｌｏｎプロテアーゼ及びｏｍｐＴプロテアーゼの欠損により標的タンパク質の安定性を向上させる、ＢＬ２１のＤＥ３溶原菌を使用することができる。大腸菌でほとんど使用されないｔＲＮＡをコードするプラスミドを持つ発現宿主株、例えばROSETTA（商標）（ＤＥ３）株及びRosetta  2（ＤＥ３）株も含まれる。一部の実施形態では、他の大腸菌株、例えば、Ｗ３１１０（Ｆ−ラムダ−ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）１ｒｐｈ−１）、ＵＴ５６００（Ｆ、ａｒａＣ１４、ｌｅｕＢ６（Ａｍ）、ｓｅｃＡ２０６（ａｚｉＲ）、ｌａｃＹ１、ｐｒｏＣ１４、ｔｓｘ６７、Δ（ｏｍｐＴｆｅｐＣ）２６６、ｅｎｔＡ４０３、ｇｌｎＸ４４（ＡＳ）、λ−、ｔｒｐＥ３８、ｒｆｂＣ１、ｒｐｓＬ１０９（ｓｔｒＲ）、ｘｙｌＡ５、ｍｔｌ−１、ｔｈｉＥ１）などの他の大腸菌Ｋ−１２株を用いることができ、その結果、発酵中の翻訳後修飾レベルを低減することができる。市販の試薬であるBENZONASE（登録商標）ヌクレアーゼ及びBUGBUSTER（登録商標）タンパク質抽出試薬を用いることで、細胞の溶解及び試料ハンドリングを改善することもできる。細胞の培養については、自己誘導性培地により、多くの発現系、例えば高スループット発現系の効率が改善され得る。この系の培地（例えば、OVERNIGHT  EXPRESS（商標）自己誘導系）は、ＩＰＴＧなどの人工的な誘導剤を添加することなしに、代謝シフトによってタンパク質発現を徐々に誘発するものである。
【０１２０】
特定の実施形態では、ヘキサヒスチジンタグ（例えば、市販されている商標名ＨＩＳ・ＴＡＧ（登録商標）融合物のタグ）を用いてから、固定化金属アフィニティクロマトグラフィ（ＩＭＡＣ）精製または関連手法が利用される。一方、特定の態様では、臨床グレードのタンパク質を、アフィニティタグを用いるか用いないかにかかわらず、大腸菌封入体から単離することができる（例えば、Shimp  et  al.,  Protein  Expr  Purif.  50:58-67,  2006を参照）。さらなる例として、特定の実施形態は、低温ショック誘導大腸菌高収率産生系を利用することができるが、これは、低温での大腸菌内のタンパク質過剰発現が、溶解度及び安定度を向上させるからである（例えば、Qing  et  al.,  Nature  Biotechnology.  22:877-882,  2004を参照）。
【０１２１】
高密度細菌発酵系もまた含まれる。例えば、ラルストニア・ユートロファ（Ralstonia  eutropha）の高細胞密度培養により、１５０ｇ／Ｌを上回る細胞密度でのタンパク質産生と、１０ｇ／Ｌを上回る力価での組み換えタンパク質の発現とが可能になる。酵母のサッカロマイセス・セレヴィシエ（Saccharomyces  cerevisiae）では、アルファ因子、アルコールオキシダーゼ、及びＰＧＨなどの構成プロモーターまたは誘導プロモーターを含む複数のベクターを使用することができる。総説として、Ausubelら（上掲）とGrantらのMethods  Enzymol.,  153:516-544,  1987を参照されたい。また、ピキア・パンドリス（Pichia  pandoris）発現系も含まれる（例えば、Li  et  al.,  Nature  Biotechnology.  24,  210-215,  2006及びHamilton  et  al.,  Science,  301:1244,  2003を参照）。特定の実施形態には、特に、ヒト化Ｎ−グリコシル化経路を有する酵母を含めた、選択的にタンパク質をグリコシル化するように操作された酵母系が含まれる（例えば、Hamilton  et  al.,  Science.  313:1441-1443,  2006、Wildt  et  al.,  Nature  Reviews  Microbiol.  3:119-28,  2005、及びGerngross  et  al.,  Nature-Biotechnology.  22:1409  -1414,  2004、ならびに米国特許第７，６２９，１６３号、同第７，３２６，６８１号、及び同第７，０２９，８７２号を参照）。単なる例に過ぎないが、例えば、フェルンバッハフラスコまたは１５Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、及び２００Ｌの発酵槽で組み換え酵母培養物を増殖させることができる。
【０１２２】
植物発現ベクターを使用する場合、複数のプロモーターのいずれかを用いて、ポリペプチドをコードする配列の発現を駆動することができる。例えば、ＣａＭＶの３５Ｓプロモーター及び１９Ｓプロモーターなどのウイルスプロモーターを単独で、またはＴＭＶ由来のオメガリーダー配列と組み合わせて使用することができる（Takamatsu,  EMBO  J.  6:307-311,1987）。あるいは、ＲＵＢＩＳＣＯの小サブユニットなどの植物プロモーターまたは熱ショックプロモーターを使用することができる（Coruzzi  et  al.,  EMBO  J.  3:1671-1680,  1984、Broglie  et  al.,  Science.  224:838-843,  1984、及びWinter  et  al.,  Results  Probl.  Cell  Differ.  17:85-105,  1991）。これらの構築物を、直接的ＤＮＡ形質転換または病原体媒介トランスフェクションにより植物細胞内に導入することができる。このような技術は一般にアクセスできる複数の総説に記載されている（例えば、Hobbs  in  McGraw  Hill,  Yearbook  of  Science  and  Technology,  pp.  191-196,  1992を参照）。
【０１２３】
また、昆虫系を用いて目的の融合タンパク質を発現させることもできる。例えば、このような系の一例では、オートグラファ・カリフォルニカ（Autographa  californica）核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）をベクターとして使用し、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodoptera  frugiperda）細胞またはトリコプラシア（Trichoplusia）細胞内で外来遺伝子を発現させるものがある。ポリペプチドをコードする配列をポリヘドリン遺伝子などのウイルスの非必須領域内にクローニングして、ポリヘドリンプロモーターの制御下に入れることができる。ポリペプチドコード配列が上手く挿入できれば、ポリヘドリン遺伝子が不活性化されて、コートタンパク質のない組み換えウイルスが産生されることになる。次いで、この組み換えウイルスを用いて、例えばスポドプテラ・フルギペルダ（S.  frugiperda）細胞またはトリコプラシア（Trichoplusia）細胞を感染させ、そこで目的のポリペプチドを発現させることができる（Engelhard  et  al.,  PNAS  USA.  91:3224-3227,  1994）。さらに、ＳＦ９、ＳＦ２１、及びＴｎｉ細胞を用いる系を含めたバキュロウイルス発現系も含まれる（例えば、Murphy  and  Piwnica‐Worms,  Curr  Protoc  Protein  Sci.  Chapter  5:Unit5.4,  2001を参照）。昆虫系では、哺乳動物系と同様の翻訳後修飾が得られる。
【０１２４】
哺乳動物宿主細胞では、複数の発現系が当該技術分野で周知であり、市販されている。哺乳動物ベクター系の例には、例えば、Invitrogen製のｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ４、及びｐＲＥＰ７、Crucell製のＰｅｒＣ６系、Invitrogen製のｐＬＰ１などのレンチウイルスベース系などが含まれる。例えば、アデノウイルスを発現ベクターとして用いる場合には、目的のポリペプチドをコードする配列は、後期プロモーター及び三部分リーダー配列からなるアデノウイルス転写／翻訳複合体にライゲーションされ得る。ウイルス遺伝子の非必須Ｅ１領域またはＥ３領域に挿入することで、感染宿主細胞でポリペプチドを発現できる生存ウイルスを得ることができる（Logan  &  Shenk,  PNAS  USA.  81:3655-3659,  1984）。さらに、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）エンハンサーなどの転写エンハンサーを用いて、哺乳動物宿主細胞での発現を増加させることができる。
【０１２５】
有益な哺乳動物宿主細胞株の例として、ＳＶ４０（ＣＯＳ−７、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６５１）により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株、ヒト胚腎臓株（２９３細胞、または懸濁培養液で増殖用にサブクローニングされた２９３細胞、Graham  et  al.,  J.  Gen  Virol.  36:59,  1977）、乳児ハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ１０）、マウス・セルトリ細胞（ＴＭ４、Mather,  Biol.  Reprod.  23:243-251,  1980）、サル腎臓細胞（ＣＶ１ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ２）、イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４）、バッファロー・ラット肝臓細胞（ＢＲＬ３Ａ、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１４４２）、ヒト肺細胞（Ｗ１３８、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ７５）、ヒト肝臓細胞（ＨｅｐＧ２、ＨＢ８０６５）、マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ０６０５６２、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）、ＴＲ１細胞（Mather  et  al.,  Annals  N.Y.  Acad.  Sci.  383:44-68,  1982）、ＭＲＣ５細胞、ＦＳ４細胞、及びヒト肝癌株（ＨｅｐＧ２）が挙げられる。他の有益な哺乳動物宿主細胞株の例として、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、例えば、ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞（Urlaub  et  al.,  PNAS  USA.  77:4216,  1980）と、ＮＳＯ及びＳｐ２／０などの骨髄腫細胞株とが挙げられる。タンパク質の産生に適した特定の哺乳動物宿主細胞株の総説に関しては、例えば、Yazaki  and  Wu,  Methods  in  Molecular  Biology,  Vol.  248  (B.  K.C  Lo,  ed.,  Humana  Press,  Totowa,  N.J.,  2003),  pp.255-268を参照されたい。特定の好ましい哺乳動物細胞発現系として、ＣＨＯ細胞及びＨＥＫ２９３細胞ベースの発現系が挙げられる。哺乳動物発現系では、当該技術分野で公知のものの中で、例えば、Ｔ型フラスコ、ローラーボトル、またはセルファクトリー、または懸濁培養液内、例えば、１Ｌ及び５Ｌのスピナ、５Ｌ、１４Ｌ、４０Ｌ、１００Ｌ、及び２００Ｌの撹拌槽バイオリアクター、もしくは２０／５０Ｌ及び１００／２００ＬのＷＡＶＥバイオリアクターの付着細胞株を用いることができる。
【０１２６】
さらに、挿入配列の発現を調節する性能により、または好ましい方法で発現タンパク質を処理する性能により、宿主細胞株を選択することができる。こうしたポリペプチドの改変の例として、以下に限定されないが、翻訳後修飾、例えば、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化、及びアシル化、または非天然アミノ酸の挿入が挙げられる（概して、米国特許第７，９３９，４９６号、同第７，８１６，３２０号、同第７，９４７，４７３号、同第７，８８３，８６６号、同第７，８３８，２６５号、同第７，８２９，３１０号、同第７，８２０，７６６号、同第７，８２０，７６６号、同第７，７７３７，２２６号、同第７，７３６，８７２号、同第７，６３８，２９９号、同第７，６３２，９２４号、及び同第７，２３０，０６８号を参照）。タンパク質の「プレプロ」型を切断する翻訳後処理を行って、適正な挿入、フォールディング、及び／または作用を促すことができる。細菌細胞の他に、こうした翻訳後活性の特異的な細胞機構及び特性機序を有するか、または逆にこれらを欠く酵母、ＣＨＯ、ＨｅＬａ、ＭＤＣＫ、ＨＥＫ２９３、及びＷ１３８などの様々な宿主細胞を選択して、確実に異種タンパク質を適正に修飾及び処理することができる。
【０１２７】
本明細書に記載の様々なサイトカイン融合タンパク質を、本明細書に記載の様々な自家腫瘍細胞ワクチン及び／または免疫チェックポイント調節剤のうちの任意の１つまたは複数と組み合わせて、本明細書に記載の方法または組成物のうちの任意の１つまたは複数に応じて使用することができることを、当業者は認識しているであろう。
【０１２８】
自家腫瘍細胞ワクチン
特定の実施形態は自家腫瘍細胞ワクチンを利用する。自家腫瘍細胞ワクチンには、治療を受けている対象由来の腫瘍細胞が含まれる（例えば、参照により援用されるZhang  et  al.,  Mol  Immunol.  2013  Oct;55(3-4):264-74、Fishman  et  al.,  J  Immunother.  2008  Jan;31(1):72-80、Berger  et  al.,  J  Pharm  Sci.  2007;10(2):144-52、Schirrmacher  V.,  Cancer  Immunol  Immunother.  2005  Jun;54(6):587-98を参照）。一部の例では、こうしたワクチンは、対象由来の腫瘍細胞を単離し、この腫瘍細胞をインビトロまたはエクスビボで処理または処置してワクチン製剤にすることにより調製する。次に、単離した腫瘍細胞を提供した対象に、調製したワクチンを投与する。
【０１２９】
一般的な例として、自家全細胞腫瘍細胞ワクチン及び自家腫瘍細胞溶解物ワクチンが挙げられる。一部の例では、腫瘍細胞を形質導入し（例えば、目的の遺伝子を発現するレトロウイルスを用いて）、続いて、単離した腫瘍細胞を提供した対象にそれを投与する。一部の例では、腫瘍細胞に放射線を照射した後に、単離した腫瘍細胞を提供した対象にそれを投与する。樹状細胞（ＤＣ）系自家腫瘍細胞ワクチンも含まれ、例として、ＤＣを対象から単離し、該対象由来の腫瘍細胞溶解物に曝露した後に、該対象に投与するものが挙げられる（例えば、Gonzales  et  al.,  Hum  Vaccin  Immunother.  2014;10(11):3261-9を参照）。したがって、特定の実施形態には、自家腫瘍溶解物負荷ＤＣワクチンが含まれる。
【０１３０】
一部の実施形態では、自家腫瘍細胞ワクチンの腫瘍は、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、膵癌、骨癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（例えば、リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、再発急性骨髄性白血病）、リンパ腫、肝腫（肝細胞癌）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳癌、卵巣癌、大腸癌、神経膠腫、多形グリア芽腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、腎癌（例えば、腎細胞腫）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、甲状腺癌、及び胃癌のうちの１つまたは複数から選択される癌から単離されている。
【０１３１】
一部の実施形態では、自家腫瘍細胞ワクチンは、ヒトＨｅｒ２／ｎｅｕ、Ｈｅｒ１／ＥＧＦ受容体（ＥＧＦＲ）、Ｈｅｒ３、Ａ３３抗原、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ５、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＭＡＧＥ−３、Ｃ２４２抗原、５Ｔ４、ＩＬ−６、ＩＬ−１３、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）（例えば、ＶＥＧＦ−Ａ）ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ４０、ＣＤ４４、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＤ１５２、ＣＤ２００、ＣＤ２２１、ＣＣＲ４、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＴＬＡ−４、ＮＰＣ−１Ｃ、テネイシン、ビメンチン、インスリン様増殖因子１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）、アルファ−フェトプロテイン、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、グアニリルシクラーゼＣ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ｐ５３、サバイビン、インテグリンαｖβ３、インテグリンα５β１、葉酸受容体１、膜貫通糖タンパク質ＮＭＢ、線維芽細胞活性化タンパク質アルファ（ＦＡＰ）、糖タンパク質７５、ＴＡＧ−７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６（またはＣＡ−１２５）、ホスファチジルセリン、前立腺特異的膜抗原（ＰＭＳＡ）、ＮＲ−ＬＵ−１３抗原、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０ＢまたはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＳＬＡＭファミリーメンバー７  （ＳＬＡＭＦ７）、ＥＧＰ４０汎癌（pancarcinoma）抗原、Ｂ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）、血小板由来増殖因子受容体、糖タンパク質ＥｐＣＡＭ（１７−１Ａ）、プログラム死−１、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）、再生肝ホスファターゼ３（ＰＲＬ−３）、前立腺酸性ホスファターゼ、ルイスＹ抗原、ＧＤ２（神経外胚葉由来の腫瘍に発現するジシアロガングリオシド）、グリピカン３（ＧＰＣ３）、及びメゾテリンのうちの１つまたは複数から選択される癌抗原を含む。
【０１３２】
本明細書に記載の様々な自家腫瘍細胞ワクチンを、本明細書に記載の様々な融合タンパク質及び／または免疫チェックポイント調節剤のうちの任意の１つまたは複数と組み合わせて、本明細書に記載の方法または組成物のうちの任意の１つまたは複数に応じて使用することができることを、当業者は認識しているであろう。
【０１３３】
免疫チェックポイント調節剤
特定の実施形態は、１つまたは複数の免疫チェックポイント調節剤を利用する。特定の例には、１つまたは複数の阻害性免疫チェックポイント分子の「アンタゴニスト」、及び１つまたは複数の刺激性免疫チェックポイント分子の「アゴニスト」が含まれる。一般的に、免疫チェックポイント分子は、シグナルを強める（共刺激性分子）か、またはシグナルを弱める免疫系の成分である。癌細胞は免疫チェックポイント分子の本来の機能を乱すことができるため、この分子のターゲティングは癌治療の可能性を持つものである（例えば、Sharma  and  Allison,  Science.  348:56-61,  2015、Topalian  et  al.,  Cancer  Cell.  27:450-461,  2015、Pardoll,  Nature  Reviews  Cancer.  12:252-264,  2012を参照）。一部の実施形態では、免疫チェックポイント調節剤（例えば、アンタゴニスト、アゴニスト）は、本明細書に記載するように、１つまたは複数の免疫チェックポイント分子に「結合」するかまたは「特異的に結合」する。
【０１３４】
特定の実施形態では、免疫チェックポイント調節剤はポリペプチドまたはペプチドである。用語「ペプチド」及び「ポリペプチド」を本明細書では交換可能に使用するが、特定の例では、用語「ペプチド」は短いポリペプチド、例えば、約２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、もしくは５０個のアミノ酸、またはこれらの数値間の全整数個及び範囲（例えば、５個〜１０個、８個〜１２個、１０個〜１５個）のアミノ酸からなるポリペプチドを意味する場合がある。ポリペプチド及びペプチドは、本明細書に記載するように、天然のアミノ酸及び／または非天然のアミノ酸から構成され得る。
【０１３５】
また、抗体もポリペプチドとして含まれる。したがって、一部の実施形態では、免疫チェックポイント調節ポリペプチド剤は「抗体」または「その抗原結合断片」である。用語「抗体」は、本明細書で使用する場合、インタクトなポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけではなく、その断片（ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、その合成変異体、天然変異体、抗体部分と所定の特異性を持つ抗原結合断片とを含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体を包含し、また所定の特異性を持つ抗原結合部位または断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾形態を包含するものである。抗体（及びその抗原結合断片）の特定の特性及び特徴について本明細書でさらに詳細に述べている。
【０１３６】
抗体または抗原結合断片は、本質的に任意の種類のものであり得る。当該技術分野で周知のように、抗体は、免疫グロブリン分子の可変領域にある少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して、免疫チェックポイント分子などの標的に特異的に結合することができる免疫グロブリン分子である。
【０１３７】
用語「抗原結合断片」は、本明細書で使用する場合、目的の抗原に結合する免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含むポリペプチド断片を意味する。この点に関して、本明細書に記載の抗体の抗原結合断片は、標的分子に結合する抗体由来のＶＨ配列及びＶＬ配列のうちの１個、２個、３個、４個、５個、または全６個のＣＤＲを含んでいてもよい。
【０１３８】
抗体及びその抗原結合断片の結合特性は、当該技術分野で周知の方法を用いて定量することができる（Davies  et  al.,  Annual  Rev.  Biochem.  59:439-473,  1990を参照）。一部の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片は、標的分子、例えば免疫チェックポイント分子またはエピトープまたはその複合体に特異的に結合し、その平衡解離定数は、約１０−７Ｍ以下〜約１０−８Ｍであるか、またはその範囲である。一部の実施形態では、平衡解離定数は、約１０−９Ｍ以下〜約１０−１０Ｍ以下であるか、またはその範囲である。特定の実施形態の例では、抗体またはその抗原結合断片の標的分子（特異的に結合する対象）に対する親和性（Ｋｄ）は、約もしくは少なくとも約０．０１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．３ｎＭ、０．４ｎＭ、０．５ｎＭ、０．６ｎＭ、０．７ｎＭ、０．８ｎＭ、０．９ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１１ｎＭ、１２ｎＭ、１３ｎＭ、１４ｎＭ、１５ｎＭ、１６ｎＭ、１７ｎＭ、１８ｎＭ、１９ｎＭ、２０ｎＭ、２１ｎＭ、２２ｎＭ、２３ｎＭ、２４ｎＭ、２５ｎＭ、２６ｎＭ、２７ｎＭ、２８ｎＭ、２９ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、もしくは５０ｎＭであるか、または約０．０１ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、１ｎＭ未満、２ｎＭ未満、３ｎＭ未満、４ｎＭ未満、５ｎＭ未満、６ｎＭ未満、７ｎＭ未満、８ｎＭ未満、９ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１１ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１３ｎＭ未満、１４ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１６ｎＭ未満、１７ｎＭ未満、１８ｎＭ未満、１９ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、２１ｎＭ未満、２２ｎＭ未満、２３ｎＭ未満、２４ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２６ｎＭ未満、２７ｎＭ未満、２８ｎＭ未満、２９ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、もしくは５０ｎＭ未満である。
【０１３９】
ポリペプチドまたは抗体などの分子は、この分子が、特定の細胞、基質、または特定のエピトープと、他の細胞、基質、またはエピトープと結合するよりも高頻度に、高速に、長い間、及び／または高い親和性を持って反応するかまたは結合する場合には、「特異的結合」または「選択的結合」を示すと称される。抗体は、標的の分子またはエピトープに、他の基質またはエピトープに対して結合するよりも、例えば統計学的に有意な量だけ、高い親和性で、高い結合活性で、容易に、及び／または長い間結合している場合には、「特異的に結合」または「選択的に結合」している。典型的には、特異的結合を示す一対の分子の一方の部分は、その対分子の他方の部分が持つ特有の空間構成及び／または極性構成に対して特異的に結合して相補的になる表面上領域または凹みを持つ。したがって、その対の部分は、互いに特異的に結合する特性を持つことになる。例えば、特定のエピトープに特異的または選択的に結合する抗体は、その特定のエピトープを、他のエピトープに結合するよりも高い親和性で、高い結合活性で、容易に、及び／または長い間結合させる抗体である。また、例えば、第１の標的に特異的または選択的に結合する抗体（部分またはエピトープ）が、第２の標的に特異的または選択的に結合してもしなくてもよいことは、この定義を読むことにより理解されることである。この用語は以下の場合にも適用可能であり、例えば、抗体が、複数の抗原に備わる特定のエピトープに特異的である場合、すなわち、抗原結合断片またはドメインを持つ特異的結合部分が、そのエピトープを持つ様々な抗原に結合できる場合や、例えば、共通のエピトープを共有する多種由来標的抗原の多様な形態に対して抗体が交差反応性を持つ場合にも適用可能である。
【０１４０】
免疫学的結合は通例、免疫グロブリン分子と、その免疫グロブリンに特異的となる抗原との間で生じる種の非共有相互作用を意味し、その相互作用は、例えば単なる例として以下に限定されるものではないが、静電的、イオン的、親水性及び／もしくは疎水性の親和力または反発力、立体的な力、水素結合、ファンデルワールス力、ならびに他の相互作用の結果生じるものである。免疫学的結合相互作用の強さまたは親和性は、その相互作用の解離定数（Ｋｄ）で表すことができ、Ｋｄが小さい場合には親和性が高いことになる。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性について、当該技術分野で周知の方法を用いて定量することができる。こうした方法の一例は、抗原結合部位／抗原複合体の形成速度と解離速度とを測定するものであり、これらの速度は、複合体を構成する双方の濃度、相互作用の親和性、及び両方向の速度に均等に影響を及ぼす幾何学的パラメータにより変動する。したがって、オン速度定数（Ｋｏｎ）と「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）とを、濃度及び結合と解離の実速度を計算することで算出することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比を求めると、親和性に関係のない全てのパラメータを相殺することができ、したがって、解離定数Ｋｄに等しくなる。用語「親和性」は、本明細書で使用する場合、２つの作用剤の可逆的結合の平衡定数を含めるものであり、Ｋｄと表される。結合タンパク質のリガンドに対する親和性、例えば、抗体のエピトープに対する親和性は、例えば約０．１ナノモル濃度（ｎＭ）〜約１００ｎＭ、約１ピコモル濃度（ｐＭ）〜約１００ｎＭ、または約１フェムトモル濃度（ｆＭ）〜約１００ｎＭの範囲であり得る。用語「結合活性」は、本明細書で使用する場合、２つ以上の作用剤の複合体が持つ希釈後の解離に対する抵抗性を意味する。
【０１４１】
抗体は、当業者に知られている様々な手法のいずれかにより調製することができる。例えば、Harlow  and  Lane,  Antibodies:  A  Laboratory  Manual,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory,  1988を参照されたい。対象となるポリペプチドに特異的なモノクローナル抗体は、例えば、Kohler  and  Milstein,  Eur.  J.  Immunol.  6:511-519,  1976の手法及びそれに改良を加えた手法を用いて調製することができる。マウスなどのトランスジェニック動物を用いてヒト抗体を発現する方法も含まれる。例えば、Neuberger  et  al.,  Nature  Biotechnology  14:826,  1996、Lonberg  et  al.,  Handbook  of  Experimental  Pharmacology  113:49-101,  1994、及びLonberg  et  al.,  Internal  Review  of  Immunology  13:65-93,  1995を参照されたい。具体的な例として、REGENEREX（登録商標）のVELOCIMMUNE（登録商標）プラットフォーム（例えば米国特許第６，５９６，５４１号）が挙げられる。
【０１４２】
ファージディスプレイまたは酵母ディスプレイのライブラリーを用いて抗体を作製または特定することもできる（例えば、米国特許第７，２４４，５９２号、Chao  et  al.,  Nature  Protocols.  1:755-768,  2006を参照）。使用可能なライブラリーの非限定的な例として、クローン化ライブラリーまたは合成ライブラリー、例えば、ＨｕＣＡＬ（Human  Combinatorial  Antibody  Library）などが挙げられ、これはヒト抗体レパートリーの構造的な多様性を７つの重鎖と７つの軽鎖の可変領域遺伝子で表したものである。これらの遺伝子の組み合わせによって、マスターライブラリーの４９個のフレームワークが生じる。これらのフレームワークに高可変遺伝子カセット（ＣＤＲ：相補性決定領域）を導入することによって、膨大なヒト抗体レパートリーを再現することができる。また、軽鎖可変領域と、重鎖ＣＤＲ−３をコードするヒトドナー由来の断片と、重鎖ＣＤＲ−１の多様性をコードする合成ＤＮＡと、重鎖ＣＤＲ−２の多様性をコードする合成ＤＮＡとを用いてデザインしたヒトライブラリーも含まれる。使用に適した他のライブラリーについては当業者に明らかであろう。
【０１４３】
特定の実施形態では、本明細書に記載の抗体及びその抗原結合断片には、重鎖及び軽鎖のＣＤＲセットが含まれる。ＣＤＲセットは、重鎖と軽鎖のフレームワーク領域（ＦＲ）セット間にそれぞれ挿入されており、このＦＲセットはＣＤＲを支持しかつＣＤＲ同士の空間的関係を画定している。用語「ＣＤＲセット」は、本明細書で使用する場合、重鎖または軽鎖のＶ領域の３つの超可変領域を意味する。これらの領域は、重鎖または軽鎖のＮ末端から順に、「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、「ＣＤＲ３」とそれぞれ称される。したがって、抗原結合部位には６つのＣＤＲが含まれ、これらには重鎖及び軽鎖のＶ領域のそれぞれに由来するＣＤＲセットが含まれる。単鎖ＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドを本明細書では「分子認識ユニット」と称する。複数の抗原抗体複合体の結晶解析により、ＣＤＲのアミノ酸残基が結合抗原と広く接触しており、抗原は重鎖ＣＤＲ３と最も広範に接触していることがわかっている。したがって、分子認識ユニットは主に、抗原結合部位の特異性を定めるものである。
【０１４４】
用語「ＦＲセット」は、本明細書で使用する場合、重鎖または軽鎖のＶ領域にあるＣＤＲセットのＣＤＲを画定する４つの隣接するアミノ酸配列を意味する。一部のＦＲ残基は結合抗原と接してもよいが、ＦＲ、特にＣＤＲに直接隣接したＦＲ残基は主に、Ｖ領域の抗原結合部位へのフォールディングを定めるものである。ＦＲ内で、特定のアミノ残基及び特定の構造特性が極めて高度に保存される。この点に関して、全てのＶ領域配列には約９０個のアミノ酸残基の分子内ジスルフィドループがある。Ｖ領域が結合部位にフォールディングした際に、ＣＤＲは抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして提示される。ＣＤＲのアミノ酸配列そのものにかかわらず、ある種の「カノニカル」構造にフォールディングしたＣＤＲループ形状に影響を与えるＦＲの保存構造領域があることは、一般的に認識されている。さらに、特定のＦＲ残基は、抗体の重鎖と軽鎖の相互作用を安定化させる非共有結合性のドメイン間接触に関わることが知られている。
【０１４５】
免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、Kabat,  E.  A.  et  al.,  Sequences  of  Proteins  of  Immunological  Interest.  4th  Edition  US  Department  of  Health  and  Human  Services.  1987とその最新情報とを参照して求めることができる。
【０１４６】
均一な抗体の集団を意味する「モノクローナル」抗体も含まれ、モノクローナル抗体は、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（天然及び非天然）で構成されている。モノクローナル抗体は特異的が高く、単一のエピトープに対して作用するものである。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトなモノクローナル抗体及び完全長モノクローナル抗体だけではなく、その断片（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）、それらの変異体、抗体結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体を包含し、ならびにエピトープへの所定の特異性及び結合性能を持つ抗原結合断片（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の任意の他の修飾形態を包含するものである。抗体の供給源または抗体が作製される方法（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組み換え発現、トランスジェニック動物）については限定することを意図していない。この用語は、全免疫グロブリン、及び「抗体」の定義に準ずる上述した断片などを含む。
【０１４７】
タンパク質分解酵素パパインはＩｇＧ分子を優先的に切断して複数の断片を形成し、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）断片）の各々が、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合性のヘテロ二量体から構成されている。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、複数の断片、例えば、２つの抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２断片などを形成することができる。本発明の特定の実施形態に従って使用するＦｖ断片を、ＩｇＭ、稀にＩｇＧまたはＩｇＡといった免疫グロブリン分子の選択的タンパク質切断によって作製することができる。しかしながら、Ｆｖ断片は、当該技術分野で公知の組み換え技術を用いて得るのがより一般的である。Ｆｖ断片として、抗原結合部位を含む非共有結合性ＶＨ−ＶＬヘテロ二量体が挙げられ、これは天然抗体分子の抗原認識性能と抗原結合性能の多くを保持するものである。Inbar  et  al.,  PNAS  USA.  69:2659-2662,  1972、Hochman  et  al.,  Biochem.  15:2706-2710,  1976、及びEhrlich  et  al.,  Biochem.  19:4091-4096,  1980を参照されたい。
【０１４８】
特定の実施形態では、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体を対象にしている。例えば、カッパボディ（Ill  et  al.,  Prot.  Eng.  10:949-57,  1997）、ミニボディ（Martin  et  al.,  EMBO  J  13:5305-9,  1994）、ダイアボディ（Holliger  et  al.,  PNAS  90:  6444-8,  1993）、またはジャヌシン（Janusins）（Traunecker  et  al.,  EMBO  J  10:  3655-59,  1991及びTraunecker  et  al.,  Int.  J.  Cancer  Suppl.  7:51-52,  1992）を、所望の特異性を持つ抗体の選択に関する本出願の教示に従って、標準的な分子生物学的技術を用いて調製することができる。
【０１４９】
一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、共有結合性のＶＨ−ＶＬヘテロ二量体であり、この二量体は、ペプチドコードリンカーによって連結したＶＨコード遺伝子とＶＬコード遺伝子とを含む遺伝子融合体から発現されたものである。HustonらのPNAS  USA.  85(16):5879-5883,  1988を参照されたい。自然に凝集するが化学的には分離している抗体Ｖ領域の軽ポリペプチド鎖と重ポリペプチド鎖とをｓｃＦｖ分子に変換し、それを抗原結合部位の構造と実質的に同様な三次元構造にフォールディングさせる、化学構造の識別方法が複数報告されている。例えば、Hustonらの米国特許第５，０９１，５１３号及び第５，１３２，４０５号、ならびにLadnerらの米国特許第４，９４６，７７８号を参照されたい。
【０１５０】
特定の実施形態では、抗体またはその抗原結合断片がヒト化されている。これらの実施形態では、通例組み換え技術を用いて調製したキメラ分子について述べており、この分子は、非ヒト種の免疫グロブリン由来の抗原結合部位と、残りの部分のヒト免疫グロブリン構造及び／または配列に準じた分子の免疫グロブリン構造とを有するものである。抗原結合部位は、定常ドメインに融合された完全可変ドメインを含んでいても、可変ドメインの適正なフレームワーク領域に移植したＣＤＲのみを含んでいてもよい。エピトープ結合部位は、野生型であっても、１つまたは複数のアミノ酸置換により改変されていてもよい。これにより、ヒト個体の免疫原としての定常領域が除かれるが、異種可変領域に対して免疫応答する可能性を残している（LoBuglio  et  al.,  PNAS  USA  86:4220-4224,  1989、  Queen  et  al.,  PNAS  USA.  86:10029-10033,  1988、Riechmann  et  al.,  Nature.  332:323-327,  1988）。抗体をヒト化する方法の例には、米国特許第７，４６２，６９７号に記載の方法が含まれる。
【０１５１】
他の方法は、ヒト型にできるだけ近い形態で再構築できるように、ヒト由来の定常領域を備えるだけでなく、可変領域を改変することにも焦点を当てている。重鎖と軽鎖の両方の可変領域は、目的のエピトープに応じて変わり、かつ結合性能を決定する３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含んでおり、このＣＤＲは、種毎に比較的保存されており、かつＣＤＲに足場を提供すると言われている４つのフレームワーク領域（ＦＲ）に隣接していることが知られている。特定のエピトープに対して非ヒト抗体を調製する際には、改変するヒト抗体のＦＲに非ヒト抗体由来のＣＤＲを移植することにより、可変領域を「再構築」することも「ヒト化」することもできる。種々の抗体に対するこの方法の応用については、Sato  et  al.,  Cancer  Res.  53:851-856,  1993、Riechmann  et  al.,  Nature  332:323-327,  1988、Verhoeyen  et  al.,  Science  239:1534-1536,  1988、Kettleborough  et  al.,  Protein  Engineering.  4:773-3783,  1991、Maeda  et  al.,  Human  Antibodies  Hybridoma  2:124-134,  1991、Gorman  et  al.,  PNAS  USA.  88:4181-4185,  1991、Tempest  et  al.,  Bio/Technology  9:266-271,  1991、Co  et  al.,  PNAS  USA.  88:2869-2873,  1991、Carter  et  al.,  PNAS  USA.  89:4285-4289,  1992、及びCo  et  al.,  J  Immunol.  148:1149-1154,  1992で報告されている。一部の実施形態では、ヒト化抗体は全ＣＤＲ配列（例えば、マウス抗体由来の全６つのＣＤＲを含むヒト化マウス抗体）を保存している。他の実施形態では、ヒト化抗体は、１つまたは複数（１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または６つ）のＣＤＲを有し、これらは元の抗体に対して改変されており、元の抗体の１つまたは複数のＣＤＲに「由来」する１つまたは複数のＣＤＲとも称されている。
【０１５２】
一部の実施形態では、作用剤は「リガンド」、例えば、免疫チェックポイント分子の天然のリガンドであるか、またはそれを含む。「リガンド」は一般に、生物学的な目的に沿うように標的分子（例えば、生体分子）と複合体を形成する物質または分子を意味し、「タンパク質リガンド」を含んでおり、タンパク質リガンドは一般的に標的分子または標的タンパク質の部位に結合することによってシグナルを生成するものである。したがって、特定の作用剤が、自然界において免疫チェックポイント分子に結合しシグナルを生成するタンパク質リガンドとなる。また、「修飾リガンド」、例えば、免疫グロブリン由来のＦｃ領域などの薬物動態修飾因子に融合するタンパク質リガンドが含まれる。
【０１５３】
リガンドの結合特性は、当該技術分野で周知の方法を用いて定量することができる（Davies  et  al.,  Annual  Rev.  Biochem.  59:439-473,  1990を参照）。一部の実施形態では、リガンドは、標的分子、例えば免疫チェックポイント分子またはそのエピトープに特異的に結合し、その平衡解離定数は、約１０−７Ｍ以下〜約１０−８Ｍであるか、またはその範囲である。一部の実施形態では、平衡解離定数は、約１０−９Ｍ以下〜約１０−１０Ｍ以下であるか、またはその範囲である。特定の実施形態の例では、本明細書に記載の標的（特異的に結合する対象）に対するリガンドの親和性（Ｋｄ）は、約もしくは少なくとも約０．０１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．３ｎＭ、０．４ｎＭ、０．５ｎＭ、０．６ｎＭ、０．７ｎＭ、０．８ｎＭ、０．９ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１１ｎＭ、１２ｎＭ、１３ｎＭ、１４ｎＭ、１５ｎＭ、１６ｎＭ、１７ｎＭ、１８ｎＭ、１９ｎＭ、２０ｎＭ、２１ｎＭ、２２ｎＭ、２３ｎＭ、２４ｎＭ、２５ｎＭ、２６ｎＭ、２７ｎＭ、２８ｎＭ、２９ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、もしくは５０ｎＭであるか、または約０．０１ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、１ｎＭ未満、２ｎＭ未満、３ｎＭ未満、４ｎＭ未満、５ｎＭ未満、６ｎＭ未満、７ｎＭ未満、８ｎＭ未満、９ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１１ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１３ｎＭ未満、１４ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１６ｎＭ未満、１７ｎＭ未満、１８ｎＭ未満、１９ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、２１ｎＭ未満、２２ｎＭ未満、２３ｎＭ未満、２４ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２６ｎＭ未満、２７ｎＭ未満、２８ｎＭ未満、２９ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、もしくは５０ｎＭ未満である。
【０１５４】
一部の実施形態では、作用剤は「少分子」であり、これは、合成由来または生物由来（生体分子）であるが一般的にポリマーではない有機化合物を意味する。有機化合物は、化合物の分子が炭素を含んでおり、一般に、炭酸塩、炭素の単純酸化物、またはシアン化物のみを含むものを除いた化合物の大分類を表す。「生体分子」は、一般に、生体で産生する有機分子を表し、例えば、ペプチド、多糖類、及び核酸などの大きなポリマー分子（生体高分子）、ならびに一次・二次代謝産物、脂質類、リン脂質類、糖脂質類、ステロール類、グリセロ脂質類、ビタミン類、及びホルモン類などの少分子が挙げられる。「ポリマー」は一般的に、共有化学結合により連結された反復構造単位から構成される大きい分子または巨大分子を意味する。
【０１５５】
特定の実施形態では、少分子の分子量は、約１０００ダルトン〜２０００ダルトンまたは約１０００ダルトン〜２０００ダルトン未満であり、典型的には約３００ダルトン〜７００ダルトンであり、例えば、約５０ダルトン、１００ダルトン、１５０ダルトン、２００ダルトン、２５０ダルトン、３００ダルトン、３５０ダルトン、４００ダルトン、４５０ダルトン、５００ダルトン、５５０ダルトン、５００ダルトン、６５０ダルトン、６００ダルトン、７５０ダルトン、７００ダルトン、８５０ダルトン、８００ダルトン、９５０ダルトン、１０００ダルトン、もしくは２０００ダルトンであるか、または約５０ダルトン未満、１００ダルトン未満、１５０ダルトン未満、２００ダルトン未満、２５０ダルトン未満、３００ダルトン未満、３５０ダルトン未満、４００ダルトン未満、４５０ダルトン未満、５００ダルトン未満、５５０ダルトン未満、５００ダルトン未満、６５０ダルトン未満、６００ダルトン未満、７５０ダルトン未満、７００ダルトン未満、８５０ダルトン未満、８００ダルトン未満、９５０ダルトン未満、１０００ダルトン未満、もしくは２０００ダルトン未満である。
【０１５６】
特定の少分子は、抗体などの本明細書のポリペプチドについて記載した「特異的結合」特性を持つ場合がある。例えば、一部の実施形態では、少分子は、標的、例えば免疫チェックポイント分子に特異的に結合し、その結合親和性（Ｋｄ）は、約もしくは少なくとも約０．０１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．２ｎＭ、０．３ｎＭ、０．４ｎＭ、０．５ｎＭ、０．６ｎＭ、０．７ｎＭ、０．８ｎＭ、０．９ｎＭ、１、２ｎＭ、３ｎＭ、４ｎＭ、５ｎＭ、６ｎＭ、７ｎＭ、８ｎＭ、９ｎＭ、１０ｎＭ、１１ｎＭ、１２ｎＭ、１３ｎＭ、１４ｎＭ、１５ｎＭ、１６ｎＭ、１７ｎＭ、１８ｎＭ、１９ｎＭ、２０ｎＭ、２１ｎＭ、２２ｎＭ、２３ｎＭ、２４ｎＭ、２５ｎＭ、２６ｎＭ、２７ｎＭ、２８ｎＭ、２９ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、もしくは５０ｎＭであるか、または約０．０１ｎＭ未満、０．０５ｎＭ未満、０．１ｎＭ未満、０．２ｎＭ未満、０．３ｎＭ未満、０．４ｎＭ未満、０．５ｎＭ未満、０．６ｎＭ未満、０．７ｎＭ未満、０．８ｎＭ未満、０．９ｎＭ未満、１ｎＭ未満、２ｎＭ未満、３ｎＭ未満、４ｎＭ未満、５ｎＭ未満、６ｎＭ未満、７ｎＭ未満、８ｎＭ未満、９ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、１１ｎＭ未満、１２ｎＭ未満、１３ｎＭ未満、１４ｎＭ未満、１５ｎＭ未満、１６ｎＭ未満、１７ｎＭ未満、１８ｎＭ未満、１９ｎＭ未満、２０ｎＭ未満、２１ｎＭ未満、２２ｎＭ未満、２３ｎＭ未満、２４ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、２６ｎＭ未満、２７ｎＭ未満、２８ｎＭ未満、２９ｎＭ未満、３０ｎＭ未満、４０ｎＭ未満、もしくは５０ｎＭ未満である。
【０１５７】
一部の実施形態では、免疫チェックポイント調節剤は、１つまたは複数の阻害性免疫チェックポイント分子のアンタゴニストまたは阻害剤である。阻害性免疫チェックポイント分子の例として、プログラム死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）、プログラム死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）、プログラム死１（ＰＤ−１）、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、トリプトファン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＴＤＯ）、Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ−３）、Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）、ＣＤ１６０、ならびにＩｇドメイン及びＩＴＩＭドメインを持つＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）が挙げられる。
【０１５８】
特定の実施形態では、作用剤はＰＤ−１（受容体）アンタゴニストまたは阻害剤であり、そのターゲティングは腫瘍環境における免疫機能を回復することであると報告されている（例えば、Phillips  et  al.,  Int  Immunol.  27:39-46,  2015を参照）。ＰＤ−１は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、Ｔ細胞及びプロＢ細胞で発現する細胞表面受容体である。ＰＤ−１は、２つのリガンドであるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２と相互作用する。ＰＤ−１は、例えば、Ｔ細胞の活性化を減じるかまたは妨げることによって阻害性免疫チェックポイント分子として機能し、その結果、自己免疫を低減させ、自己寛容を促すものである。ＰＤ−１の阻害作用は、少なくとも１つには、リンパ節における抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシスを促すしつつ、制御性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞）におけるアポトーシスを減じるという２つの機序によって生じる。ＰＤ−１のアンタゴニストまたは阻害剤の例として、ＰＤ−１に特異的に結合し、かつＰＤ−１の１つまたは複数の免疫抑制活性、例えばＰＤ−１の下流シグナル伝達またはＰＤ−Ｌ１との相互作用を減じる、抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる。ＰＤ−１のアンタゴニストまたは阻害剤の具体例として、抗体のニボルマブ、ペムブロリズマブ、ＰＤＲ００１、ＭＫ−３４７５、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、及びピディリズマブ、ならびにそれらの抗原結合断片が挙げられる（例えば、米国特許第８，００８，４４９号、同第８，９９３，７３１号、同第９，０７３，９９４号、同第９，０８４，７７６号、同第９，１０２，７２７号、同第９，１０２，７２８号、同第９，１８１，３４２号、同第９，２１７，０３４号、同第９，３８７，２４７号、同第９，４９２，５３９号、同第９，４９２，５４０号、及び米国特許出願公開第２０１２／００３９９０６号、同第２０１５／０２０３５７９号を参照）。
【０１５９】
一部の実施形態では、作用剤はＰＤ−Ｌ１のアンタゴニストまたは阻害剤である。上述したように、ＰＤ−Ｌ１はＰＤ−１受容体の天然リガンドのうちの１つである。ＰＤ−Ｌ１のアンタゴニストまたは阻害剤の典型例として、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、かつＰＤ−Ｌ１の１つまたは複数の免疫抑制活性、例えばＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１受容体への結合を減じる、抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる。ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストの具体的な例として、抗体のアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、及びデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、ならびにそれらの抗原結合断片が挙げられる（例えば、米国特許第９，１０２，７２５号、同第９，３９３，３０１号、同第９，４０２，８９９号、同第９，４３９，９６２号を参照）。
【０１６０】
一部の実施形態では、作用剤はＰＤ−Ｌ２のアンタゴニストまたは阻害剤である。上述したように、ＰＤ−Ｌ２はＰＤ−１受容体の天然リガンドのうちの１つである。ＰＤ−Ｌ２のアンタゴニストまたは阻害剤の典型例として、ＰＤ−Ｌ２に特異的に結合し、かつＰＤ−Ｌ２の１つまたは複数の免疫抑制活性、例えばＰＤ−Ｌ２のＰＤ−１受容体への結合を減じる、抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる。
【０１６１】
一部の実施形態では、作用剤はＣＴＬＡ−４のアンタゴニストまたは阻害剤である。ＣＴＬＡ４またはＣＴＬＡ−４（細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４）は、ＣＤ１５２（分化クラスタ１５２）としても知られており、例えば、ＣＴＬＡ−４が抗原提示細胞表面でＣＤ８０またはＣＤ８６に結合した際にＴ細胞に阻害性シグナルを伝達することによって、阻害性免疫チェックポイント分子として機能するタンパク質受容体である。ＣＴＬＡ−４のアンタゴニストまたは阻害剤の典型例として、ＣＴＬＡ−４に特異的に結合する抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる。特定の例には、抗体のイピリムマブ及びトレメリムマブ、ならびにそれらの抗原結合断片が含まれる。イピリムマブの活性のうちの少なくともいくつかは、ＣＴＬＡ−４を発現するサプレッサーＴｒｅｇの抗体依存性細胞媒介細胞傷害性（ＡＤＣＣ）致死によって影響を受けると考えられている。
【０１６２】
一部の実施形態では、作用剤はＩＤＯのアンタゴニストもしくは阻害剤、またはＴＤＯのアンタゴニストもしくは阻害剤である。ＩＤＯ及びＴＤＯは、免疫阻害特性を持つトリプトファン分解酵素である。例えば、ＩＤＯは、Ｔ細胞及びＮＫ細胞を抑制し、Ｔｒｅｇ及び骨髄由来サプレッサー細胞を活性化し、腫瘍血管新生を促すものであると知られている。ＩＤＯ及びＴＤＯのアンタゴニストまたは阻害剤の典型例として、ＩＤＯまたはＴＤＯに特異的に結合し（例えば、Platten  et  al.,  Front  Immunol.  5:  673,  2014を参照）、かつ１つまたは複数の免疫抑制活性を低減させるか阻害する、抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる。ＩＤＯのアンタゴニストまたは阻害剤の具体的な例として、インドキシモド（ＮＬＧ−８１８９）、１−メチル−トリプトファン（１ＭＴ）、β−カルボリン（ノルハルマン、９Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール）、ロスマリン酸、及びエパカドスタットが挙げられる（例えば、Sheridan,  Nature  Biotechnology.  33:321-322,  2015を参照）。ＴＤＯアンタゴニストまたは阻害剤の具体的な例として、６８０Ｃ９１及びＬＭ１０が挙げられる（例えば、Pilotte  et  al.,  PNAS  USA.  109:2497-2502,  2012を参照）。
【０１６３】
一部の実施形態では、作用剤はＴＩＭ−３のアンタゴニストまたは阻害剤である。Ｔ細胞免疫グロブリンドメイン及びムチンドメイン３（ＴＩＭ−３）は、活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞で発現し、Ｔｈ１サイトカイン及びＴｈ１７サイトカインを制御する。また、ＴＩＭ−３は、リガンドであるガレクチン−９と相互作用することにより細胞死を誘発することで、Ｔｈ１／Ｔｃ１機能の負の調節因子として作用する。ＴＩＭ−３は抑制的な腫瘍微小環境を与えるものであり、その過剰発現は様々な癌で予後不良を伴う（例えば、Li  et  al.,  Acta  Oncol.  54:1706-13,  2015を参照）。ＴＩＭ−３のアンタゴニストまたは阻害剤の典型例として、ＴＩＭ−３に特異的に結合し、かつＴＩＭ−３の１つまたは複数の免疫抑制活性を減じるかまたは阻害する、抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる。
【０１６４】
一部の実施形態では、作用剤はＬＡＧ−３のアンタゴニストまたは阻害剤である。リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３）は、活性Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、Ｂ細胞、及び形質細胞様樹状細胞で発現する。ＬＡＧ−３は、ＣＴＬＡ−４及びＰＤ−１と同様に、Ｔ細胞の細胞増殖、活性化、及びホメオスタシスを負方向に制御するものであり（例えば、Workman  and  Vignali.  European  Journal  of  Immun.  33:  970-9,  2003、及びWorkman  et  al.,  Journal  of  Immun.  172:  5450-5,  2004を参照）、Ｔｒｅｇ抑制機能に関与していると報告されている（例えば、Huang  et  al.,  Immunity.  21:  503-13,  2004を参照）。ＬＡＧ−３はまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞を寛容原性状態で維持し、ＰＤ−１と併せてＣＤ８Ｔ細胞の疲弊化を保持する。ＬＡＧ−３のアンタゴニストまたは阻害剤の典型例として、ＬＡＧ−３に特異的に結合し、かつＬＡＧ−３の１つまたは複数の免疫抑制活性を阻害する、抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる。具体的な例には、抗体ＢＭＳ−９８６０１６及びその抗原結合断片が含まれる。
【０１６５】
一部の実施形態では、作用剤はＶＩＳＴＡのアンタゴニストまたは阻害剤である。Ｔ細胞活性化のＶドメインＩｇサプレッサー（ＶＩＳＴＡ）は、主に造血細胞で発現するものであり、Ｔ細胞の活性化を抑制し、Ｆｏｘｐ３発現を誘発し、かつ抗腫瘍Ｔ細胞応答を抑制する腫瘍微小環境で高発現する、阻害性免疫チェックポイント調節因子である（例えば、Lines  et  al.,  Cancer  Res.  74:1924-32,  2014を参照）。ＶＩＳＴＡのアンタゴニストまたは阻害剤の典型例として、ＶＩＳＴＡに特異的に結合し、かつＶＩＳＴＡの１つまたは複数の免疫抑制活性を減じる、抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる。
【０１６６】
一部の実施形態では、作用剤はＢＴＬＡのアンタゴニストまたは阻害剤である。Ｔ細胞を活性化する間に、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ、ＣＤ２７２）の発現が誘導され、これにより、腫瘍壊死ファミリー受容体（ＴＮＦ−Ｒ）と細胞表面受容体のＢ７ファミリーとの相互作用を介してＴ細胞が阻害される。ＢＴＬＡは、腫瘍壊死因子（受容体）スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）のリガンドであり、ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）としても知られている。ＢＴＬＡ−ＨＶＥＭ複合体は、例えば、ヒトＣＤ８＋癌特異的Ｔ細胞の機能を阻害することにより、Ｔ細胞の免疫応答を負方向に制御する（例えば、Derre  et  al.,  J  Clin  Invest  120:157-67,  2009を参照）。ＢＴＬＡのアンタゴニストまたは阻害剤の典型例として、ＢＴＬＡ−４に特異的に結合し、かつＢＴＬＡ−４の１つまたは複数の免疫抑制活性を減じる、抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる。
【０１６７】
一部の実施形態では、作用剤は、ＨＶＥＭのアンタゴニストまたは阻害剤であり、例えば、ＨＶＥＭに特異的に結合し、かつＢＴＬＡまたはＣＤ１６０との相互作用を妨害するアンタゴニストまたは阻害剤である。ＨＶＥＭのアンタゴニストまたは阻害剤の典型例として、ＨＶＥＭに特異的に結合し、任意選択的にＨＶＥＭ／ＢＴＬＡ及び／またはＨＶＥＭ／ＣＤ１６０の相互作用を低減することで、ＨＶＥＭの１つまたは複数の免疫抑制活性を減じる、抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる。
【０１６８】
一部の実施形態では、作用剤は、ＣＤ１６０のアンタゴニストまたは阻害剤であり、例えば、ＣＤ１６０に特異的に結合し、かつＨＶＥＭとの相互作用を妨害するアンタゴニストまたは阻害剤である。ＣＤ１６０のアンタゴニストまたは阻害剤の典型例として、ＣＤ１６０に特異的に結合し、任意選択的にＣＤ１６０／ＨＶＥＭの相互作用を低減することで、ＣＤ１６０の１つまたは複数の免疫抑制活性を減じるかまたは阻害する、抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる。
【０１６９】
一部の実施形態では、作用剤はＴＩＧＩＴのアンタゴニストまたは阻害剤である。Ｔ細胞Ｉｇ及びＩＴＩＭドメイン（ＴＩＧＩＴ）は、種々のリンパ系細胞の表面に見られる共抑制受容体であり、抗腫瘍免疫を例えばＴｒｅｇを介して抑制するものである（Kurtulus  et  al.,  J  Clin  Invest.  125:4053-4062,  2015）。ＴＩＧＩＴのアンタゴニストまたは阻害剤の典型例として、ＴＩＧＩＴに特異的に結合し、かつＴＩＧＩＴの１つまたは複数の免疫抑制活性を減じる、抗体、または抗原結合断片、または少分子が挙げられる（例えば、Johnston  et  al.,  Cancer  Cell.  26:923-37,  2014を参照）。
【０１７０】
特定の実施形態では、免疫チェックポイント調節剤は、１つまたは複数の刺激性免疫チェックポイント分子のアゴニストである。刺激性免疫チェックポイント分子の例として、ＯＸ４０、ＣＤ４０、グルココルチコイド誘導ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２２６、及びヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）が挙げられる。
【０１７１】
一部の実施形態では、作用剤はＯＸ４０のアゴニストである。ＯＸ４０（ＣＤ１３４）は、エフェクターＴ細胞及びメモリーＴ細胞の増殖を促し、Ｔ制御性細胞の分化及び活性を抑制するものである（例えば、Croft  et  al.,  Immunol  Rev.  229:173-91,  2009を参照）。ＯＸ４０のリガンドはＯＸ４０Ｌ（ＣＤ２５２）である。ＯＸ４０のシグナル伝達はＴ細胞活性化と生存の両方に影響し、リンパ節における抗腫瘍免疫応答の惹起と、腫瘍微小環境における抗腫瘍免疫応答の維持とに重要な役割を果たしている。ＯＸ４０のアゴニストの典型例として、ＯＸ４０に特異的に結合し、かつＯＸ４０の１つまたは複数の免疫促進活性を増加させる、抗体、または抗原結合断片、または少分子、またはリガンドが挙げられる。具体的な例として、ＯＸ８６、ＯＸ−４０Ｌ、Ｆｃ−ＯＸ４０Ｌ、ＧＳＫ３１７４９９８、ＭＥＤＩ０５６２（ヒト化ＯＸ４０アゴニスト）、ＭＥＤＩ６４６９（マウスＯＸ４アゴニスト）、及びＭＥＤＩ６３８３（ＯＸ４０アゴニスト）、ならびにそれらの抗原結合断片が挙げられる。
【０１７２】
一部の実施形態では、作用剤はＣＤ４０のアゴニストである。ＣＤ４０は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び一部の悪性腫瘍で発現する。ＣＤ４０のリガンドはＣＤ４０Ｌ（ＣＤ１５４）である。ＡＰＣでは、ライゲーションすると、共刺激分子が上方制御され、抗腫瘍免疫応答においてＴ細胞の補助を必要としなくなる可能性がある。ＣＤ４０アゴニスト療法は、ＡＰＣの成熟化及び腫瘍からリンパ節への遊走に重要な役割を果たし、その結果、抗原提示及びＴ細胞活性化を加速させる。抗ＣＤ４０アゴニスト抗体は、動物モデルにおいて実質的な応答と持続的な抗癌免疫をもたらすが、これは少なくとも１つには細胞傷害性Ｔ細胞によって媒介される作用である（例えば、Johnson  et  al.  Clin  Cancer  Res.  21:  1321-1328,  2015、及びVonderheide  and  Glennie,  Clin  Cancer  Res.  19:1035-43,  2013を参照）。ＣＤ４０のアゴニストの典型例として、ＣＤ４０に特異的に結合し、かつＣＤ４０の１つまたは複数の免疫促進活性を増加させる、抗体、または抗原結合断片、または少分子、またはリガンドが挙げられる。具体的な例として、ＣＰ−８７０８９３、ダセツズマブ、Ｃｈｉ  Ｌｏｂ  ７／４、ＡＤＣ−１０１３、ＣＤ４０Ｌ、ｒｈＣＤ４０Ｌ、及びそれらの抗原結合断片が挙げられる。
【０１７３】
一部の実施形態では、作用剤はＧＩＴＲのアゴニストである。グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲファミリー関連遺伝子（ＧＩＴＲ）は、Ｔ細胞の増殖を増加させ、Ｔｒｅｇの抑制活性を阻害し、Ｔエフェクター細胞の生存期間を延ばすものである。ＧＩＴＲアゴニストは、Ｔｒｅｇ系統の不安定化により抗腫瘍応答を促進することがわかっている（例えば、Schaer  et  al.,  Cancer  Immunol  Res.  1:320-31,  2013を参照）。これらの多様な機序は、ＧＩＴＲが、リンパ節における免疫応答の惹起と、腫瘍組織における免疫応答の保持とに重要な役割を果たすことを示している。ＧＩＴＲのリガンドはＧＩＴＲＬである。ＧＩＴＲのアゴニストの典型例として、ＧＩＴＲに特異的に結合し、かつＧＩＴＲの１つまたは複数の免疫促進活性を増加させる、抗体、または抗原結合断片、または少分子、またはリガンドが挙げられる。具体的な例として、ＧＩＴＲＬ、ＩＮＣＡＧＮ０１８７６、ＤＴＡ−１、ＭＥＤＩ１８７３、及びそれらの抗原結合断片が挙げられる。
【０１７４】
一部の実施形態では、作用剤はＣＤ１３７のアゴニストである。ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）受容体ファミリーのメンバーであり、ＣＤ１３７の架橋により、Ｔ細胞の増殖、ＩＬ−２分泌、生存期間、細胞溶解活性が増える。また、ＣＤ１３７媒介シグナル伝達は、ＣＤ８＋Ｔ細胞などのＴ細胞を活性化誘導細胞死から保護するものである。ＣＤ１３７のアゴニストの典型例として、ＣＤ１３７に特異的に結合し、かつＣＤ１３７の１つまたは複数の免疫促進活性を増加させる、抗体、または抗原結合断片、または少分子、またはリガンドが挙げられる。具体的な例として、ＣＤ１３７（または４−１ＢＢ）リガンド（例えば、Shao  and  Schwarz,  J  Leukoc  Biol.  89:21-9,  2011を参照）、ならびに抗体ウトミルマブ及びその抗原結合断片が挙げられる。
【０１７５】
一部の実施形態では、作用剤はＣＤ２７のアゴニストである。ＣＤ２７を刺激すると、ナイーブＴ細胞の抗原特異的増殖が増え、Ｔ細胞メモリー、及びＴ細胞免疫の長期持続性に影響を与える。ＣＤ２７のリガンドはＣＤ７０である。ヒトＣＤ２７とアゴニスト抗体とを組み合わせたターゲティングは、Ｔ細胞活性化及び抗腫瘍免疫を刺激することである（例えば、Thomas  et  al.,  Oncoimmunology.  2014;3:e27255.  doi:10.4161/onci.27255、及びHe  et  al  .,  J  Immunol.  191:4174-83,  2013を参照）。ＣＤ２７のアゴニストの典型例として、ＣＤ２７に特異的に結合し、かつＣＤ２７の１つまたは複数の免疫促進活性を増加させる、抗体、または抗原結合断片、または少分子、またはリガンドが挙げられる。具体的な例には、ＣＤ７０と、抗体のバルリルマブ及びＣＤＸ−１１２７（１Ｆ５）ならびにそれらの抗原結合断片とが含まれる。
【０１７６】
一部の実施形態では、作用剤はＣＤ２８のアゴニストである。ＣＤ２８は、恒常的にＣＤ４＋Ｔ細胞、また一部のＣＤ８＋細胞で発現する。ＣＤ２８のリガンドにはＣＤ８０及びＣＤ８６が含まれ、ＣＤ２８を刺激するとＴ細胞の増殖が増える。ＣＤ２８のアゴニストの典型例として、ＣＤ２８に特異的に結合し、かつＣＤ２８の１つまたは複数の免疫促進活性を増加させる、抗体、または抗原結合断片、または少分子、またはリガンドが挙げられる。具体的な例には、ＣＤ８０、ＣＤ８６、抗体ＴＡＢ０８、及びそれらの抗原結合断片が含まれる。
【０１７７】
一部の実施形態では、作用剤はＣＤ２２６のアゴニストである。ＣＤ２２６は、リガンドをＴＩＧＩＴと共有する刺激性受容体である。ＴＩＧＩＴとは異なり、ＣＤ２２６が結合するとＴ細胞活性化が増強する（例えば、Kurtulus  et  al.,  J  Clin  Invest.  125:4053-4062,  2015、Bottino  et  al.,  J  Exp  Med.  1984:557-567,  2003、及びTahara-Hanaoka  et  al.,  Int  Immunol.  16:533-538,  2004を参照）。ＣＤ２２６のアゴニストの典型例として、ＣＤ２２６に特異的に結合し、かつＣＤ２２６の１つまたは複数の免疫促進活性を増加させる、抗体、または抗原結合断片、または少分子、またはリガンド（例えば、ＣＤ１１２、ＣＤ１５５）が挙げられる。
【０１７８】
一部の実施形態では、作用剤はＨＶＥＭのアゴニストである。ヘルペスウイルスエントリーメディエーター（ＨＶＥＭ）は、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１４（ＴＮＦＲＳＦ１４）としても知られ、ＴＮＦ−受容体スーパーファミリーのヒト細胞表面受容体である。ＨＶＥＭは、Ｔ細胞、ＡＰＣ、及び他の免疫細胞を含めた種々の細胞に見られるものである。ＨＶＥＭは他の受容体とは異なり、休止Ｔ細胞で高レベルで発現し、活性化の際には下方制御される。ＨＶＥＭシグナル伝達は、Ｔ細胞活性化の初期段階において、及びリンパ節において腫瘍特異的リンパ球集団が増殖している間に、重要な役割を果たすことがわかっている。ＨＶＥＭのアゴニストの典型例として、ＨＶＥＭに特異的に結合し、かつＨＶＥＭの１つまたは複数の免疫促進活性を増加させる、抗体、または抗原結合断片、または少分子、またはリガンドが挙げられる。
【０１７９】
本明細書に記載の様々な免疫チェックポイント調節剤を、本明細書に記載の様々な融合タンパク質及び／または自家腫瘍細胞ワクチンのうちの任意の１つまたは複数と組み合わせて、本明細書に記載の方法または組成物のうちの任意の１つまたは複数に応じて使用することができることを、当業者は認識しているであろう。
【０１８０】
使用方法及び組成物／製剤
本明細書に記載のサイトカイン融合タンパク質を、それを必要とする対象を治療するために使用する方法、及びその融合タンパク質を含む組成物も包含されている。例えば、特定の実施形態には、対象の癌を治療する方法、癌の症状を寛解する方法、または癌の進行を阻害する方法が含まれ、該方法には、本明細書に記載のサイトカイン融合タンパク質または該融合タンパク質を含む組成物を対象に投与することが含まれる。特定の実施形態には、対象の癌、例えば、転移癌の再発を減じるかまたは防ぐことが含まれ、その中で治療用組成物の投与により癌に対する免疫記憶が形成される。
【０１８１】
対象の癌を治療する方法、癌の症状を寛解する方法、または癌の進行を阻害する方法を含む、癌を治療する併用療法も包含され、該療法には、少なくとも１つのサイトカイン融合タンパク質を少なくとも１つの自家腫瘍細胞ワクチン（それを必要とする対象から得られたもの）と組み合わせて対象に投与することが含まれる。一部の併用療法には、対象の癌を治療する方法、癌の症状を寛解する方法、または癌の進行を阻害する方法が含まれ、該療法には、少なくとも１つのサイトカイン融合タンパク質を少なくとも１つのチェックポイント調節剤と組み合わせて投与することが含まれる。具体的な併用療法には、対象の癌を治療する方法、癌の症状を寛解する方法、または癌の進行を阻害する方法も含まれ、該療法には、少なくとも１つのサイトカイン融合タンパク質を、少なくとも１つの自家腫瘍細胞ワクチン（それを必要とする対象から得られたもの）及び少なくとも１つのチェックポイント調節剤と組み合わせて対象に投与することが含まれる。サイトカイン融合タンパク質、自家腫瘍細胞ワクチン、免疫チェックポイント調節剤、及びこれらを含む治療用組成物またはワクチン組成物は、本明細書のいずれかに記載されている。
【０１８２】
一部の例では、サイトカイン融合タンパク質及び自家腫瘍細胞ワクチンは、同一の治療用組成物またはワクチン組成物の一部として投与される。一部の例では、サイトカイン融合タンパク質及び免疫チェックポイント調節剤は、同一の治療用組成物またはワクチン組成物の一部として投与される。特定の例だが、一部の例では、サイトカイン融合タンパク質、自家腫瘍細胞ワクチン、及び免疫チェックポイント調節剤が、同一の治療用組成物またはワクチン組成物の一部として投与される。ある例では、併用療法剤（すなわち、サイトカイン融合タンパク質、自家腫瘍ワクチン、及び／または免疫チェックポイント調節剤）のうちの１つまたは複数を、別々の治療用組成物またはワクチン組成物として別々に投与する。
【０１８３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、患者の生存時間中央値を４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、１５週、２０週、２５週、３０週、４０週、またはそれ以上増加させる。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法または組成物は、患者の生存時間中央値を１年、２年、３年、またはそれ以上増加させる。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法及び組成物は、無増悪生存期間を２週、３週、４週、５週、６週、７週、８週、９週、１０週、またはそれ以上増加させる。特定の実施形態では、本明細書に記載の方法または組成物は、無増悪生存期間を１年、２年、３年、またはそれ以上増加させる。
【０１８４】
特定の実施形態では、投与される組成物は、生存腫瘍の量に統計学的に有意な減少が見られる、例えば、腫瘍量に少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％もしくはそれ以上の減少が見られるか、または走査寸法の変化（例えば、統計学的に有意な減少）が見られるような腫瘍退縮を得るのに十分なものである。特定の実施形態では、投与される組成物は安定病態をもたらすのに十分なものである。特定の実施形態では、投与される組成物は、熟練臨床医に知られている特定の疾患の症状が安定化する、または臨床的に適宜緩和されるのに十分なものである。
【０１８５】
癌を治療する方法及び組成物は、他の治療法と組み合わせることができる。例えば、本明細書に記載の１つまたは複数の作用剤または組成物は、他の治療的介入の前か、介入の間か、または介入の後に対象に投与することができ、例えば、治療的介入には、症候性治療、化学療法、放射線療法、外科的手術、移植、ホルモン療法、光線力学的療法、抗生物質療法、または任意のこれらの組み合わせがある。症候性治療には、脳浮腫、頭痛、認知障害、及び嘔吐を緩和させるためにコルチコステロイドを投与すること、ならびにてんかん発作を緩和するために抗痙攣薬を投与することが含まれる。放射線療法には、全脳照射、分割放射線療法、及び定位的放射線手術などの放射線手術が含まれ、これらは従来の外科的手術とさらに組み合わせることができる。
【０１８６】
本明細書に記載の方法及び組成物を、いかなる種類の癌の治療にも使用することができる。一部の実施形態では、癌は原発癌、すなわち腫瘍増殖が開始し癌量が生じた解剖学的部位で増殖する癌である。一部の実施形態では、癌は二次癌または転移癌、すなわち元の原発部位または組織から１つまたは複数の異なる部位または組織に拡がった癌である。一部の実施形態では、対象または患者は、黒色腫（例えば、転移性黒色腫）、膵癌、骨癌、前立腺癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、白血病（例えば、リンパ球白血病、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、再発性急性骨髄性白血病）、リンパ腫、肝細胞腫（肝細胞癌またはＨＣＣ）、肉腫、Ｂ細胞悪性腫瘍、乳癌（例えば、エストロゲン受容体陽性（ＥＲ＋）、エストロゲン受容体陰性（ＥＲ−）、Ｈｅｒ２陽性（Ｈｅｒ２＋）、Ｈｅｒ２陰性（Ｈｅｒ２−）、またはこれらの組み合わせ（例えば、ＥＲ＋／Ｈｅｒ２＋、ＥＲ＋／Ｈｅｒ２−、ＥＲ−／Ｈｅｒ２＋、もしくはＥＲ−／Ｈｅｒ２−、またはエストロゲン受容体陰性、プロゲステロン受容体陰性、及びＨｅｒ２陰性である「トリプルネガティブ」乳癌））、卵巣癌、大腸癌、神経膠腫（例えば、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、または脈絡叢乳頭腫）、多形神経膠芽腫（例えば、巨細胞膠芽腫または膠肉腫）、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、原始神経外胚葉性腫瘍（髄芽腫）、腎癌（例えば、腎細胞癌）、膀胱癌、子宮癌、食道癌、脳癌、頭頸部癌、子宮頸癌、精巣癌、甲状腺癌、胃癌、パピローマウイルス誘発癌腫などのウイルス誘発腫瘍（例えば、子宮頸部腫瘍、子宮頸癌）、腺癌、ヘルペスウイルス誘発腫瘍（例えば、バーキットリンパ腫、ＥＢＶ誘発Ｂ細胞リンパ腫）、Ｂ型肝炎誘発腫瘍（肝細胞癌）、ＨＴＬＶ−１誘発リンパ腫及びＨＴＬＶ−２誘発リンパ腫、聴神経腫、肺癌（例えば、肺癌腫、気管支癌）、小細胞肺癌、咽頭癌、肛門癌、グリア芽腫、直腸癌、星状細胞腫、脳腫瘍、網膜芽細胞腫、基底細胞腫、脳転移、髄芽腫、腟癌、膵癌、精巣癌、ホジキン症候群、髄膜腫、シュネーベルガー疾患、脳下垂体腫瘍、菌状息肉腫、カルチノイド、神経鞘腫、棘細胞癌、バーキットリンパ腫、喉頭癌、腎癌、胸腺腫、子宮体部癌、骨癌、非ホジキンリンパ腫、尿道癌、ＣＵＰ症候群、頭部／頸部腫瘍、乏突起膠腫、外陰部癌、腸癌、結腸癌、食道癌（例えば、食道癌腫）、疣病変、小腸の腫瘍、頭蓋咽頭腫、卵巣癌、生殖器腫瘍、卵巣癌（例えば、卵巣癌腫）、膵癌（例えば、膵臓癌腫）、子宮内膜癌、肝臓転移、陰茎癌、舌癌、胆嚢癌、白血病、形質細胞腫、ならびに眼瞼腫瘍のうちの１つまたは複数から選択される癌を持つ。
【０１８７】
一部の実施形態では、上述したように、癌または腫瘍は転移癌である。上記の癌に加え、転移癌の例として、以下に限定されないが、特に、骨、肝臓、及び／または肺に転移した膀胱癌；骨、脳、肝臓、及び／または肺に転移した乳癌；肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した大腸癌；副腎、骨、脳、肝臓、及び／または肺に転移した腎癌；副腎、骨、脳、肝臓、及び／または他の肺部位に転移した肺癌；骨、脳、肝臓、肺、及び／または皮膚／筋肉に転移した黒色腫；肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した卵巣癌；肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した膵癌；副腎、骨、肝臓、及び／または肺に転移した前立腺癌；肝臓、肺、及び／または腹膜に転移した胃癌；骨、肝臓、及び／または肺に転移した甲状腺癌；ならびに骨、肝臓、肺、腹膜、及び／または腟に転移した子宮癌が挙げられる。
【０１８８】
例えば、癌免疫療法剤がＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のアンタゴニストまたは阻害剤である一部の実施形態では、対象は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤療法に適した１つまたは複数のバイオマーカー（例えば、癌細胞または癌特異的ＣＴＬ細胞内のＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１レベルの上昇）を有している。例えば、一部の実施形態では、対象の腫瘍浸潤性ＣＤ８＋Ｔ細胞サブセット内におけるプログラム細胞死１高発現／細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４高発現（例えば、ＰＤ−１ｈｉＣＴＬＡ−４ｈｉ）の割合が増加している（例えば、Daud  et  al.,  J  Clin  Invest.  126:3447-3452,  2016を参照）。別の例として、一部の実施形態では、対象の循環腫瘍反応性（例えば、ＰＤ−１＋ＣＤ１１ａｈｉＣＤ８＋）Ｔ細胞においてＢｉｍ（Ｂ細胞リンパ腫２相互作用（Ｂｃｌ２相互作用）メディエーター）レベルが増加し、任意選択的に対象は転移性黒色腫を有する（例えば、Dronca  et  al.,  JCI  Insight.  May  5;  1(6):  e86014,  2016を参照）。
【０１８９】
特定の組み合わせには、大腸癌、黒色腫、乳癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、及び腎細胞癌のうちの１つまたは複数から選択される癌の治療用として、サイトカイン融合タンパク質と、例えばアテゾリズマブ（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、アベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）、及びデュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）などのＰＤ−Ｌ１アンタゴニストまたは阻害剤とが含まれる。
【０１９０】
一部の特定の組み合わせには、ホジキンリンパ腫、黒色腫、非小細胞肺癌、肝細胞癌、腎細胞癌、及び卵巣癌のうちの１つまたは複数から選択される癌の治療用として、サイトカイン融合タンパク質と、例えばニボルマブなどのＰＤ−１アンタゴニストとが含まれる。
【０１９１】
別の特定の組み合わせには、黒色腫、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、頭頸部癌、及び尿路上皮癌のうちの１つまたは複数から選択される癌の治療用として、サイトカイン融合タンパク質と、例えばペムブロリズマブなどのＰＤ−１アンタゴニストとが含まれる。
【０１９２】
また、特定の組み合わせには、黒色腫、前立腺癌、肺癌、及び膀胱癌のうちの１つまたは複数から選択される癌の治療用として、サイトカイン融合タンパク質と、例えばイピリムマブ及びトレメリムマブなどのＣＴＬＡ−４アンタゴニストとが含まれる。
【０１９３】
さらに、一部の特定の組み合わせには、転移性乳癌、及び脳癌、任意選択的に多形神経膠芽腫、神経膠腫、膠肉腫、または悪性脳腫瘍のうちの１つまたは複数から選択される癌の治療用として、サイトカイン融合タンパク質と、例えばインドキシモド（ＮＬＧ−８１８９）、１−メチル−トリプトファン（１ＭＴ）、β−カルボリン（ノルハルマン、９Ｈ−ピリド［３，４−ｂ］インドール）、ロスマリン酸、またはエパカドスタットなどのＩＤＯアンタゴニストとが含まれる。
【０１９４】
本明細書に記載の疾患または症状のうちの１つまたは複数を持つ対象を特定する方法は、当該技術分野で知られている。
【０１９５】
インビボ使用において、例えば、ヒト疾患の治療または検査において、本明細書に記載の融合タンパク質は、投与前に１つまたは複数の組成物、例えば、医薬組成物、治療用組成物、及び／またはワクチン組成物に組み込まれるのが一般的である。一部の例では、組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つのサイトカイン融合タンパク質と、生理学的に許容できる担体または賦形剤とを合わせて含む。一部の例では、少なくとも１つのサイトカイン融合タンパク質を含む組成物は、自家腫瘍細胞ワクチンをさらに含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのサイトカイン融合タンパク質を含む組成物は、少なくとも１つの免疫チェックポイント調節剤をさらに含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのサイトカイン融合タンパク質を含む組成物は、自家腫瘍細胞ワクチンと免疫チェックポイント調節剤とをさらに含む。
【０１９６】
一部の組成物には１つのサイトカイン融合タンパク質のみが含まれ、特定の方法には１つのサイトカイン融合タンパク質のみが用いられる。特定の組成物には、少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つの異なるサイトカイン融合タンパク質の混合物が含まれ、特定の方法には少なくとも２つ、３つ、４つ、または５つの異なるサイトカイン融合タンパク質の混合物が用いられる。
【０１９７】
特定の実施形態では、サイトカイン融合タンパク質、抗体、及び／または他のポリペプチド剤などの作用剤を含む組成物は、タンパク質基準または重量−重量基準で実質的に純粋であり、例えば、組成物の純度は、タンパク質基準または重量−重量基準で少なくとも約８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％である。
【０１９８】
一部の実施形態では、本明細書に記載のサイトカイン融合タンパク質または他のポリペプチド剤は、本明細書に記載されかつ当該技術分野で知られているように、凝集物を形成せず、所望の溶解度を有し、及び／またはヒトへの使用に適した免疫原性プロファイルを持つ。したがって、一部の実施形態では、ポリペプチド剤（例えば、サイトカイン融合タンパク質及び任意選択的に抗体）を含む治療用組成物は実質的に凝集していない。例えば、特定の組成物は、約１０％未満（タンパク質基準）の高分子量の凝集タンパク質、または約５％未満の高分子量の凝集タンパク質、または約４％未満の高分子量の凝集タンパク質、または約３％未満の高分子量の凝集タンパク質、または約２％未満の高分子量の凝集タンパク質、または約１％未満の高分子量の凝集タンパク質を含む。一部の組成物は、その見掛けの分子質量に対して少なくとも約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、または約９５％の単分散であるポリペプチド剤（例えば、サイトカイン融合タンパク質、及び任意選択的に抗体）を含む。
【０１９９】
一部の実施形態では、ポリペプチド剤は、約または少なくとも約０．１ｍｇ／ｍｌ、０．２ｍｇ／ｍｌ、０．３ｍｇ／ｍｌ、０．４ｍｇ／ｍｌ、０．５ｍｇ／ｍｌ、０．６ｍｇ／ｍｌ、０．７ｍｇ／ｍｌ、０．８ｍｇ／ｍｌ、０．９ｍｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ、１１ｍｇ／ｍｌ、１２ｍｇ／ｍｌ、１３ｍｇ／ｍｌ、１４ｍｇ／ｍｌ、または１５ｍｇ／ｍｌに濃縮されており、生物学的用途向けに製剤化されている。
【０２００】
組成物（例えば、医薬組成物、治療用組成物、及び／またはワクチン組成物）を調製するために、有効量または所望量の１つまたは複数の作用剤を、特定の作用剤及び／または投与方法に適切であると当業者に知られている任意の薬物担体または賦形剤と混合する。薬物担体は液体状でも、半液体状でも、固体状でもよい。非経口用途、皮内用途、皮下用途、または局所用途に使用する溶液または懸濁液には、例えば、無菌希釈剤（水など）、生理食塩水（例えば、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ））、不揮発性油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたは他の合成溶媒；抗菌剤（ベンジルアルコール及びメチルパラベンなど）；抗酸化剤（アスコルビン酸及び亜硫酸水素ナトリウムなど）及びキレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；緩衝液（酢酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩など）が含まれ得る。静脈内に投与される（すなわちＩＶ注入の）場合、適切な担体には、生理食塩水またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、また、グルコース、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、及びそれらの混合物などの増粘剤及び可溶化剤を含む溶液も含まれる。
【０２０１】
本明細書に記載の作用剤を純粋な形態でまたは適正な組成物で、同様の効果をもたらす容認された任意の作用剤投与方法で投与することができる。作用剤含有組成物と、生理学的に許容できる適切な担体、希釈剤または賦形剤とを組み合わせることにより組成物を調製することができ、固体形態、半固体形態、液体形態、または気体形態に製剤化、例えば錠剤、カプセル剤、粉末、顆粒剤、軟膏剤、溶液、座薬、注射液、吸入剤、ゲル、マイクロスフェア、及びエアロゾルに製剤化することができる。さらに、他の薬剤的に活性な成分（本明細書のいずれかに記載の他の少分子など）、及び／または塩、緩衝液、及び安定剤などの適正な賦形剤が、その必要があるわけではないが、組成物に含まれていてもよい。
【０２０２】
担体には、例えば、使用する用量及び濃度で、それに曝露される細胞または哺乳動物に対して無毒である薬剤的または生理学的に許容できる担体、賦形剤、または安定剤が含まれ得る。生理学的に許容できる担体は水性ｐＨ緩衝溶液であることが多い。生理学的に許容できる担体の例として、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸などの抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド：血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含めた単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤、マンニトール、もしくはソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；ならびに／またはポリソルベート２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標））、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びポロクサマー（ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標））などの非イオン性界面活性剤が挙げられる。
【０２０３】
一部の実施形態では、コロイド状の薬剤送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、及びナノカプセル）またはマクロエマルションにおいて、例えば、コアセルベーション技術または界面重合（例えばそれぞれ、ヒドロキシエチルセルロース、またはゼラチンマイクロカプセル及びポリ（メチルメタクリル酸）マイクロカプセル）により調製したマイクロカプセルに、１つまたは複数の作用剤を封入することができる。こうした技術は、Remington's  Pharmaceutical  Sciences,  16th  edition,  Oslo,  A.,  Ed.,  (1980)に開示されている。粒子またはリポソームは、他の治療剤または診断剤をさらに含んでいてもよい。
【０２０４】
本明細書に記載の組成物は、作用剤が体内から急速に除去されないように保護する担体、例えば徐放製剤またはコーティングなどを用いて調製することができる。こうした担体として、放出制御製剤、例えば以下に限定されないが、植込錠、マイクロカプセル化した送達システム、ならびに生分解性ポリマー及び生体適合性ポリマー（エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物類、ポリグリコール酸、ポリオルトエステル類、ポリ乳酸、及び当業者に公知の他のポリマーなど）が挙げられる。したがって、特定の実施形態には、長期徐放性製剤を含む組成物が含まれる。例として、ポリ乳酸グリコール酸共重合体（ＰＬＧＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、微粒子／マイクロスフェア、ナノ粒子／ナノスフェア、及び／またはリポソーム、ならびにそれらの任意の組み合わせ、のうちのいずれか１つまたは複数を含む組成物が挙げられる。特定の実施形態では、組成物にはＰＬＧＡナノ粒子及び／またはＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子を含む長期徐放性製剤が含まれる。
【０２０５】
組成物は、固体形態または液体形態であってもよい。一実施形態では、担体は粒状であり、組成物は例えば錠剤または粉末の形態である。担体は液体であってもよく、組成物は例えば、経口油、注射液、または、例えば吸入投与に有用であるエアロゾルである。経口投与をする場合には、組成物は好ましくは、固体形態または液体形態であり、本明細書で固体形態または液体形態として考慮される形態の中には、半固体形態、半液体形態、懸濁形態、及びゲル形態も含まれる。特定の実施形態には無菌注射溶液も含まれる。
【０２０６】
経口投与用の固体組成物として、医薬組成物は粉末、顆粒剤、圧縮錠剤、丸剤、カプセル剤、ガム剤、または水などに製剤化されていてもよい。こうした固体組成物は通例、１つまたは複数の不活性希釈剤または食用担体を含むことになる。さらに、以下に挙げるものうちの１つまたは複数が含まれていてもよく、それらは、カルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、トラガカント、またはゼラチンなどの結合剤；デンプン、ラクトース、またはデキストリンなどの賦形剤；アルギン酸、アルギン酸ナトリウム、プリモゲル（Primogel）、コーンスターチなどの崩壊剤；ステアリン酸マグネシウムまたはステロテックス（Sterotex）などの潤滑剤；コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤；スクロースまたはサッカリンなどの甘味剤；ペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香味料などの香味剤；及び着色剤などである。医薬組成物がカプセル形態、例えばゼラチンカプセル剤の形態である場合、上述の種類の材料に加えて、ポリエチレングリコールまたは油などの液体担体を含んでもよい。
【０２０７】
組成物が、液体の形態、例えば、エリキシル剤、シロップ剤、溶液、エマルション、または懸濁液であってもよい。液体は、２つの例を挙げると、経口投与用であっても注射送達用であってもよい。経口投与をする場合には、好ましい組成物には、本化合物に加えて、甘味剤、保存剤、染料／着色剤、及び風味相乗剤のうちの１つまたは複数が含まれる。注射投与用の組成物には、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝液、安定剤、及び等張剤のうちの１つまたは複数が含まれていてもよい。
【０２０８】
液体組成物は、溶液であるか、懸濁液であるか、または他の形態であるかにかかわらず、以下の補助剤のうちの１つまたは複数を含んでいてもよく、それらの補助剤は、注射用の水、食塩水（好ましくは生理食塩水、リンゲル溶液、等張食塩水）、固定油（溶媒または懸濁媒体として機能し得る合成モノグリセリドまたはジグリセリドなど）、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の溶媒などの無菌希釈剤；ベンジルアルコールまたはメチルメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または亜硫酸水素ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；酢酸塩、クエン酸塩、またはリン酸塩などの緩衝液、及び塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの浸透圧の調整剤などである。非経口製剤は、ガラス製またはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジ、または多人数用バイアルに封入され得る。生理食塩水は好ましい補助剤である。注射用医薬組成物は好ましくは無菌である。
【０２０９】
非経口投与または経口投与に用いる液体組成物は、適切な用量が得られる量の作用剤を含むべきである。通例、組成物に含まれる対象作用剤の量は少なくとも０．０１％である。経口投与をする場合には、この量は組成物の重量の０．１％〜７０％と変動し得る。特定の経口治療用組成物または医薬組成物は、対象作用剤を約４％〜約７５％含む。特定の実施形態では、本発明の治療用組成物及び製剤または医薬組成物及び製剤を、希釈前に非経口投与単位が０．０１重量％〜１０重量％の対象作用剤を含むように調製する。
【０２１０】
組成物は局所投与に用いられる場合があり、この場合には、担体は適宜、溶液、エマルション、軟膏剤、またはゲルのベースを含んでいてもよい。ベースは、例えば、ペトロラタム、ラノリン、ポリエチレングリコール、ミツロウ、鉱油、希釈剤（水及びアルコール）、ならびに乳化剤及び安定剤のうちの１つまたは複数を含んでいてもよい。増粘剤が、局所投与用の治療用組成物または医薬組成物に含まれていてもよい。経皮投与の場合には、組成物は経皮パッチまたはイオン導入デバイスを含んでいてもよい。
【０２１１】
組成物は、直腸投与に、例えば直腸で溶解し薬剤を放出する座薬の形態で用いられる場合がある。直腸投与用の組成物には、適切な非刺激性賦形剤として油性のベースが含まれていてもよい。こうしたベースには、以下に限定されないが、ラノリン、カカオ脂、及びポリエチレングリコールが含まれる。
【０２１２】
組成物には、固体または液体の投与単位の物理的形態を変化させる様々な材料が含まれていてもよい。例えば、組成物には、活性成分を囲う被覆シェルを形成する材料が含まれていてもよい。被覆シェルを形成する材料は一般的に不活性であり、例えば、糖、シェラック、及び他の腸溶コーティング剤から選択されてもよい。あるいは、活性成分はゼラチンカプセル剤に封入されていてもよい。固体形態または液体形態の治療用組成物または医薬組成物には、作用剤と結合することにより、化合物の送達を補助する成分が含まれていてもよい。この性能を働かせることができる適切な成分には、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、１つまたは複数のタンパク質、またはリポソームが含まれる。
【０２１３】
組成物は、エアロゾルとして投与することができる投与単位から本質的になっていてもよい。エアロゾルという用語は、コロイドの性質を持つシステムから加圧パッケージで構成されるシステムまで種々のシステムを意味するのに用いられる。送達は、液化ガスまたは圧縮ガスにより、または活性成分を投与する適切なポンプシステムにより行われてもよい。エアロゾルは、活性成分を送達するために、単相、二相、または三相のシステムで送達されてもよい。エアロゾルの送達には、必要な容器、活性化剤、バルブ、及びサブ容器などが含まれ、これらが合わさってキットを形成していてもよい。当業者は、必要以上に実験を行うことなく、好ましいエアロゾルを決めることができる。
【０２１４】
組成物は、薬剤分野で周知の方法を用いて調製することができる。例えば、注射により投与される組成物は、溶液を得るために、無菌の蒸留水と、塩、緩衝液、及び／または安定剤のうちの１つまたは複数とを含んでいてもよい。界面活性剤を加えて、均質な溶液または懸濁液を形成しやすくすることもできる。界面活性剤は、水性送達システムで作用剤を溶解しやすくまたは均質に懸濁しやすくするために、作用剤と非共有結合的に相互作用する化合物である。
【０２１５】
治療の正確な投与量及び期間は、治療する疾患によって異なるが、既知の試験プロトコルを用いるか、または組成物を当該技術分野で公知のモデルシステムで試験し、その結果から外挿することにより、実験的に算出することができる。また、比較臨床試験を行うこともできる。また、投与量は緩和すべき症状の重症度により変動し得る。一般的に、医薬組成物は、治療上有用な影響を及ぼしつつ望ましくない副作用を最低限に抑えるように製剤化され、投与される。組成物は一度に投与されても、少ない用量を複数回に分けて投与されてもよい。任意の特定の対象には、個々の必要性に鑑みて、固有の投与レジメンを経時的に調整してもよい。
【０２１６】
様々な経路、例えば、経口、非経口、経鼻、静脈内、皮内、筋肉内、皮下、または局所経路で投与を行うことができる。投与の好ましい方法は、治療または予防する症状の性質により異なる。特定の実施形態には、皮下注射、静脈内（ＩＶ）注入、皮内注射、腫瘍内注射、腫瘍周囲注射、またはリンパ節内注射、及びこれらの任意の組み合わせによる投与が含まれる。
【０２１７】
したがって、本組成物及び関連治療用組成物またはワクチン組成物を投与する一般的な経路には、以下に限定されないが、経口、局所、経皮、吸入、非経口、舌下、頬側、直腸、腟、及び鼻腔内経路が挙げられる。非経口という用語は、本明細書で用いる場合、皮下注射、静脈内注射または注入、筋肉内注射または注入、胸骨内注射または注入の手法を含む。特定の実施形態による治療用組成物またはワクチン組成物は、そこに含まれる活性成分が、組成物を対象または患者に投与した際に生体利用できるように製剤化される。対象または患者に投与される組成物は、１つまたは複数の投与単位の形態を取っていてもよいが、例えば、錠剤が単一の投与単位であってもよく、またエアロゾル形態の本明細書に記載の作用剤の容器が複数の投与単位を含んでいてもよい。こうした投与形態を調製する実際の方法は知られており、当業者には明らかであるだろう。例えば、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy,  20th  Edition  (Philadelphia  College  of  Pharmacy  and  Science,  2000)を参照されたい。投与される組成物は通例、対象となる疾患または症状の治療用に、本明細書に記載されている作用剤の治療有効量を含んでいる。
【０２１８】
本明細書に記載の併用療法には、サイトカイン融合タンパク質と自家腫瘍細胞ワクチン及び／または免疫チェックポイント調節剤（任意選択的に１つまたは複数のさらなる活性作用剤を含む）とを含む単回投与製剤の投与、ならびにサイトカイン融合タンパク質と自家腫瘍細胞ワクチン及び／または免疫チェックポイント調節剤とを含む組成物であって、それぞれが異なる投与製剤である組成物の投与を含んでいてもよい。例えば、サイトカイン融合タンパク質と自家腫瘍細胞ワクチン及び／または免疫チェックポイント調節剤とが、単回の静脈投与か、非経口投与か、腫瘍内投与か、腫瘍周囲投与か、または生理食塩水もしくは他の生理学的に許容できる溶液に溶かした状態などの他の投与の組成物で合わせて対象に投与され得るか、あるいはそれぞれの作用剤が異なる投与製剤で投与され得る。別の例として、細胞ベース療法用に、サイトカイン融合タンパク質を投与に先立ち自家腫瘍細胞ワクチンの細胞に混合することができ、別々の組成物の一部としてまたは一緒に投与することができる。別々の投与製剤を用いる場合、組成物は、実質的に一緒にすなわち同時に、または別々に時間をずらしてすなわち逐次的かつ任意の順番で投与することができる。したがって、併用療法はこれら全てのレジメンを含むと理解されるものである。
【０２１９】
また、患者ケアキットも含まれており、該キットには１つまたは複数の融合タンパク質、自家腫瘍細胞ワクチン、免疫チェックポイント調節剤、及び／または本明細書に記載の組成物が含まれる。さらに、特定にキットには１つまたは複数の薬剤的に許容できる希釈剤または溶媒、例えば水（例として滅菌水）が含まれる。一部の実施形態では、該キットの成分が、バイアル、カートリッジ、デュアルチャンバーシリンジ、及び／またはプレフィルドミックスシステムに貯蔵されている。
【０２２０】
本明細書のキットには、治療する症状または所望の診断用途に適切であるかまたは望ましい１つまたは複数のさらなる治療剤または他の成分が含まれていてもよい。さらに、本明細書のキットには、用いる送達方法を容易にするのに必須または所望の１つまたは複数のシリンジまたは他の構成要素（例えば、ステント、埋め込み型デポーなど）が含まれていてもよい。
【０２２１】
一部の実施形態では、患者ケアキットには、組成物及び情報材料のための個別の容器、デバイダ、またはコンパートメントが含まれている。例えば、組成物を、瓶、バイアル、またはシリンジに入れることができ、また情報材料を容器と連結して含めることができる。一部の実施形態では、キットの個別の要素は、単一の仕切られていない容器に入れられている。例えば、組成物は、表示された情報材料と連結している瓶、バイアル、またはシリンジに入れられている。一部の実施形態では、キットには複数（例えば多数）の個別の容器が含まれ、各々がサイトカイン融合タンパク質及び任意選択的に免疫チェックポイント調節剤の１つまたは複数の単位投与形態（例えば、本明細書に記載の投与形態）を含んでいる。例えば、一部のキットには、複数のシリンジ、アンプル、箔包、またはブリスター包装が含まれ、各々がサイトカイン融合タンパク質及び任意選択的に免疫チェックポイント調節剤の単回単位投与量を含んでいる。キットの容器は、気密状態で、防水性があり（例えば、湿気または蒸発の変化に対して不浸透性であり）、及び／または光を通さない。
【０２２２】
患者ケアキットには、任意選択的に、組成物の投与に適切なデバイス、例えば、シリンジ、吸入器、ドロッパー（例えば、点眼器）、スワブ（例えば、綿棒または木製綿棒）、またはこれらの種の任意送達デバイスが含まれる。一部の実施形態では、デバイスは、計量した作用剤の用量を供給する埋め込み型デバイスである。また例えば、本明細書に記載の成分を組み合わせることによって、キットを提供する方法も含まれる。
【０２２３】
本明細書において引用された全ての刊行物、特許出願、及び発行された特許は、各個別の刊行物、特許出願及び発行された特許が具体的かつ個別に参照により組み込まれると明記されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２４】
上記では、理解を明確化にするために説明及び例により詳細に記載しているが、本開示の教示を考慮すれば、添付の特許請求の範囲の趣旨または範囲を逸脱することなく、それに一定の変更及び修飾を加えることができることは当業者には容易にわかるであろう。以下の実施例は限定のためではなく、例示のためだけに提供されるものである。当業者は、変更または修飾することにより実質的に同様の結果を与え得る種々の非重要パラメータを容易に認識するであろう。
【実施例】
【０２２５】
実施例１
ＩＬ−２とＴＮＦ−αとの組み合わせの抗腫瘍効果
組み換えＩＬ−２−ＴＮＦ−α融合タンパク質を生成し、その抗腫瘍機能を、単体で、ならびに（ａ）自家腫瘍細胞溶解物、（ｂ）ＰＤ−１抗体、及び（ａ）と（ｂ）の両方と組み合わせて評価した。
【０２２６】
ＩＬ−２−ＴＮＦ−α融合タンパク質を標準的なクローニング技術を用いて調製した。変異を天然配列に導入したが、ヒトＩＬ−２（シグナルペプチド無）に対しては、Ｃ１２５Ｓ変異またはＣ１２５Ａ変異を導入して、不適当なジスルフィド結合の形成を抑え、溶解性ヒトＴＮＦ−αに対しては、Ｓ８６Ｔ変異、Ｒ３１Ｅ変異、及び／またはＲ３２Ｗ変異を導入して、ＴＮＦＲ２に対する特異的活性及び親和性を減少させた。構築物の例は、
［ＺＫＢＹ０３］ｈＩＬ−２（Ｃ１２５Ｓ）−（ＧＧＧＧＳ）３−ｈＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号１９）、
［ＺＫＢＹ０４Ａ］ｈＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−（ＧＧＧＧＳ）２−ｈＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２０）、
［ＺＫＢＹ０４Ｂ］ｈＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−（ＧＧＧＧＳ）２−ｈＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２１）、
［ＺＫＢＹ０５Ａ］ｈＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＰＡＰ−ｈＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２２）、
［ＺＫＢＹ０５Ｂ］ｈＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＰＡＰ−ｈＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２３）、
［ＺＫＢＹ０６］ｈＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ−ｈＴＮＦ−α（Ｓ８６Ｔ）（配列番号２４）、
［ＺＫＢＹ０６Ｂ］ｈＩＬ２（Ｃ１２５Ａ）−ＰＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＡ−ｈＴＮＦ−α（Ｒ３２Ｗ）（配列番号２５）、及び
ｈＩＬ−２（Ｃ１２５Ｓ）−（ＧＧＧＧＳ）３−ｈＴＮＦ−α（Ｒ３１Ｅ、Ｓ８６Ｔ）である。
【０２２７】
ＩＬ２−ＴＮＦ−α融合タンパク質配列を設計し、ＤＮＡを合成した。ＤＮＡを大腸菌発現ベクターｐＥＴ−３２ａにサブクローニングした。コードタンパク質をＮ末端Ｈｉｓタグでクローニングした後に、該Ｈｉｓタグを精製プロセスの間に除去した。タンパク質を発現させ、精製した。１つの構築物（ＺＫＢＹ０４Ａ、図中にはＺＫＢＹ０４と示されている）を、インビトロ活性アッセイ結果に基づいて、さらなる検討用に選択した。
【０２２８】
融合タンパク質（ＺＫＢＹ０４Ａ）を大腸菌内で封入体として発現させた。封入体を尿素で溶解し、タンパク質を変性条件下でＮｉカラムを用いて精製した。次にタンパク質を、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、１０％グリセロール、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．５ＭのＬ−アルギニンを含むリフォールディング緩衝液でリフォールディングした。タグ領域を除去した後、タンパク質を変性条件下でＮｉカラムに再びかけた。タンパク質をリフォールディングし、ろ過により滅菌した。タンパク質調製物に含まれるエンテロトキシンレベルを測定し、タンパク質純度及び収率をそれぞれＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びブラッドフォード法により調べた。最終生成物を分割し、−８０℃で保管した。融合タンパク質ＺＫＢＹ０４ＡのＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイ結果を図１に示す。
【０２２９】
ＩＬ−２−ＴＮＦ−α融合タンパク質の活性を測定し、その中で単剤のＩＬ−２及びＴＮＦ−αとの比較も行っている。ＩＬ−２の活性をＣＴＬＬ−２細胞増殖を測定することにより評価している。
【０２３０】
融合タンパク質（ＺＫＢＹ０４Ａ）のＴＮＦ−α活性をＬ９２９細胞においてＣＣＫ−８法を用いて評価した。ＺＫＢＹ０４Ａ融合タンパク質をＬ９２９細胞に段階希釈し、ＣＣＫ−８アッセイを行った。データをプロットすると、タンパク質ＺＫＢＹ０４Ａは、ＴＮＦ−α単体のＳ字型曲線よりも複雑な応答を示すことがわかった。図２ＡはＺＫＢＹ０４Ａ融合タンパク質の結果を示し、図２Ｂは市販のＴＮＦ−α単体の結果を示す。
【０２３１】
同系マウスモデルｃｔ−２６及びｐａｎ−０２を用いて、ＰＤ−１抗体とＩＶ注射したＩＬ−２−ＴＮＦ−α融合タンパク質とによる腫瘍増殖阻害の併用効果を評価した。
【０２３２】
ＩＬ−２−ＴＮＦ融合タンパク質ＺＫＢＹ０４Ａのインビボ抗腫瘍効果をＷＥＨＩ−１６４マウス腫瘍モデルで評価した。軟部組織肉腫モデルを、ＷＥＨＩ−１６４細胞をマウス（継代０と称する）に移植することにより作製した。腫瘍サイズが１５０ｍｍ３に達した時に、マウスを無作為にグループに分けて薬剤を腫瘍内（ＩＴ）注射または腹腔内（ＩＰ）注射した。薬剤を３日毎に全３回注射した。腫瘍サイズを３日毎に測定した。図３に示すように、ＺＫＢＹ０４Ａは、ＩＴ注射した場合には抗腫瘍効果が強く、ＩＰ注射した場合には腫瘍増殖の阻害効果が若干弱くなることがわかった。
【０２３３】
また、ＩＬ−２及びＴＮＦ−αのインビボ抗腫瘍効果を、マウス腫瘍モデルＷＥＨＩ−１６４においてＰＤ−１抗体と組み合わせて評価した。上述と同様に、ＷＥＨＩ−１６４マウスに、ＰＤ−１抗体、またはＩＬ−２とＴＮＦ−αの組み合わせ、またはＰＤ−１抗体＋ＩＬ−２＋ＴＮＦ−αを注射した。ＳＴＩＮＧアゴニストＡＤＵ−Ｓ１００を比較のために用いた。図４に示すように、ＩＬ−２とＴＮＦ−αの組み合わせは腫瘍増殖を良好に阻害した。ＩＬ−２とＴＮＦ−αとをＰＤ−１抗体と組み合わせて使用した場合に、阻害効果がより顕著になった。ＩＬ−２＋ＴＮＦ−α＋ＰＤ−１抗体で処置した群の全３匹のマウスにおいて、初回の薬剤処置の２１日後に腫瘍が消失した。ＩＬ−２＋ＴＮＦ−αで処置した群では、３１日後に１匹のマウスで腫瘍が消失した。
【０２３４】
次に、腫瘍増殖を停止させた４匹のマウスにＷＥＨＩ−１６４細胞を再移植し、３週間超保持した。図５に示すように、いずれもマウスも腫瘍を発生させなかったが、これは、完全治癒、及びＷＥＨＩ−１６４腫瘍への再度の曝露に対する免疫または保護の獲得を示している。
【０２３５】
図６Ａ〜図６ＣはＩＬ−２＋ＴＮＦ−α＋ＰＤ−１群に薬剤注射をした後の腫瘍の画像を示している。最初の注射をした数日後、腫瘍に潰瘍が見られた後、その潰瘍部位に瘢痕組織が形成された。しかしながら、最終的に瘢痕がなくなり、マウスには検出可能な腫瘍が見つからなかった。図７は、潰瘍も瘢痕も形成されずに腫瘍が標準的に増殖した対照群の画像を示している。
【０２３６】
ＩＬ−２とＴＮＦ−αの組み合わせのインビボ抗腫瘍効果を、ＣＴ２６マウス癌モデル及びＢ１６−Ｆ１０マウス黒色腫モデルにおいて評価した。図８ＡはＣＴ２６モデルにおける腫瘍増殖阻害を示し、図８ＢはＢ１６−Ｆ１０モデルにおける同様の腫瘍増殖阻害を示している。
【０２３７】
ＰＬＧＡナノ粒子またはＰＬＧＡ−ＰＥＧナノ粒子を用いた薬剤送達も評価している。ＩＬ−２−ＴＮＦ−α融合タンパク質を二重エマルションに第１の水相として溶解する。また、全自家腫瘍細胞溶解物＋ＩＬ−２−ＴＮＦ−α融合物を二重エマルションに第１の水相として溶解する。タンパク質レベル（全体及びＩＬ−２−ＴＮＦ−α）を、ＰＬＧＡタンパク質複合体において、ブラッドフォード法及びＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロット法を用いて測定している。
【０２３８】
さらに、自家腫瘍抗原及び腫瘍ワクチン製剤としての腫瘍全細胞溶解物を、融合タンパク質と組み合わせて評価する。腫瘍細胞または腫瘍組織由来の全細胞溶解物を、例えば、ＰＬＧＡを用いて該溶解物をＩＬ−２−ＴＮＦ−α融合タンパク質と一緒に封入して、個別の腫瘍ワクチンを作製することにより調製する。調製物を凍結乾燥し、全タンパク質レベルを測定する。
【０２３９】
ＩＬ−２−ＴＮＦ−α融合タンパク質、自家腫瘍細胞溶解物、及びＰＤ−１抗体の個別の効果及び組み合わせ効果を、同系マウスモデル、例えばｃｔ−２６、Ｐａｎ−０２、及び食道腫瘍モデルにおいて評価する。マウスに、静脈内注射、腫瘍内注射、及び／または腫瘍周囲注射する。投与量及びスケジュールを変化させて至適効果を特定し、例えばＩＨＣ分析及びサイトカイン放出分析により機序及び機能の検討を行う。
【０２４０】
実施例２
ＩＦＮ−βとＴＮＦ−αとの組み合わせの抗腫瘍効果
インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）とＴＮＦ−αとを組み合わせた場合のインビボ抗腫瘍効果を、まずＷＥＨＩ−１６４マウス腫瘍モデル、同系Ｒｅｎｃａマウス腎癌モデル、及びＣＴ２６マウス結腸癌モデルで評価した。図９はＷＥＨＩ−１６４モデルにおける腫瘍増殖阻害を示し、図１０ＡはＲｅｎｃａモデルにおける腫瘍増殖阻害を示し、図１０ＢはＣＴ２６モデルにおける腫瘍増殖阻害を示す。
【０２４１】
ＩＦＮ−β−ＴＮＦ−α融合タンパク質のインビトロ活性を評価した。ここでは、ｍＲＮＡを用いた方法を使用して、融合タンパク質構築物（ＩＦＮ−β−ＧＧＧＧＳ２−ＴＮＦ−α）を作製した。全長ヒトＩＦＮ−βと、リンカー領域と、ヒトＴＮＦ−αとを含み、シグナルペプチドを含まないＤＮＡ配列を設計して合成し、真核生物プラスミドベクターにクローニングした。この構築物の配列を以下の表Ｅ１に記載している。
【表４】
2021511348.tif 000009
【０２４２】
次に、３’ポリＡテールを付加した一対のプライマーを用いてＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をインビトロ転写のテンプレートとして用いて、ｍＲＮＡを作製し、修飾５’キャップ、シュードＵＴＰ、及びメチル化ＣＴＰを組み込んでｍＲＮＡを最適化した。ｍＲＮＡ調製物をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションした。
【０２４３】
２４時間インキュベーションした後に、培養液を回収し、分泌融合タンパク質ＩＦＮβ−ＴＮＦαの産生の指標となるＬ９２９細胞でのＣＣＫ８アッセイにより、ＴＮＦ−α活性を評価した。また、ＩＦＮβ−ＴＮＦαを含むプラスミドをトランスフェクションし、ＴＮＦ−αタンパク質をＣＣＫ８アッセイで陽性対照として用いた。図１１Ａ〜図１１Ｄは、ＩＦＮ−β−ＴＮＦ−α融合タンパク質が、ＨＥＫ２９３細胞から分泌融合タンパク質として発現されたものか、またはＬ９２９細胞に直接トランスフェクトされたものかにかかわらず、ＣＣＫ８アッセイにおいてＴＮＦ−α活性を有することを示している。
【図１】
2021511348.tif 000010
【図２】
2021511348.tif 000011
【図３】
2021511348.tif 000012
【図４】
2021511348.tif 000013
【図５】
2021511348.tif 000014
【図６】
2021511348.tif 000015
【図７】
2021511348.tif 000016
【図８】
2021511348.tif 000017
【図９】
2021511348.tif 000018
【図１０】
2021511348.tif 000019
【図１１】
2021511348.tif 000020
【配列表】
2021511348000001.app
【国際調査報告】
2021511348.tif 000021
2021511348.tif 000022
2021511348.tif 000023
2021511348.tif 000024