(57)【要約】  ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質が提供される。ＣＤ８０フラグメント、免疫グロブリンＦｃおよびＩＬ−２変種を含む融合タンパク質は、ナチュラルキラー細胞などの免疫細胞を活性化することができ、同時に制御性Ｔ細胞の免疫細胞調節活性を制御しうる。従って、活性成分として融合タンパク質を含む医薬組成物は、かかる医薬組成物が体内にて免疫活性を増大させ、かくして炎症疾患ならびにがんに対して効果的に使用され得るという点において工業的に極めて有用である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む、融合タンパク質。
【請求項２】
ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質が相互にリンカーを介して結合する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
ＩＬ−２タンパク質が配列番号：１０のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
ＩＬ−２タンパク質がＩＬ−２変種である、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
ＩＬ−２変種が、配列番号：１０のアミノ酸配列において３８番、４２番、４５番、６１番および７２番目のアミノ酸より選択される少なくとも１つの置換によって得られる、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
ＩＬ−２変種が、配列番号：１０のアミノ酸配列においてＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、およびＬ７２Ｇからなる群より選択される少なくとも１つの置換によって得られる、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
ＩＬ−２変種が、配列番号：１０のアミノ酸配列において次の置換の組み合わせ：
（ａ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ
（ｂ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ
（ｃ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｅ６１Ｒ
（ｄ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｌ７２Ｇ
より選択される、いずれか１つを含有する、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
ＩＬ−２変種が、配列番号：６、２２、２３、または２４のアミノ酸配列を有する、請求項４に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＣＤ８０タンパク質が配列番号：１１のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
ＣＤ８０タンパク質がＣＤ８０フラグメントである、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
ＣＤ８０フラグメントが、配列番号：１１のアミノ酸配列において３５番目のアミノ酸〜２４２番目のアミノ酸からなる、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
リンカーが、アルブミンまたは免疫グロブリンのＦｃドメインである、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
Ｆｃドメインが野生型または変種である、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
Ｆｃドメインが配列番号：４のアミノ酸配列を有する、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
Ｆｃドメインの変種が配列番号：１２のアミノ酸配列を有する、請求項１３に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
次の構造式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化１】
2021511081.tif 000010
［構造式（Ｉ）および（ＩＩ）中：
Ｎ’が融合タンパク質のＮ−末端であり、
Ｃ’が融合タンパク質のＣ−末端であり、
ＸがＣＤ８０タンパク質であり、
ＹがＩＬ−２タンパク質であり、
リンカー（１）および（２）がペプチドリンカーであり、および
ｎおよびｍが、各々独立して、０または１である］
で示される融合タンパク質からなる、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
リンカー（１）が配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
リンカー（２）が配列番号：５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーである、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
融合タンパク質が構造式（Ｉ）からなる、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
融合タンパク質が、配列番号：９、２６、２８、または３０のアミノ酸配列と８５％以上の配列同一性を有する、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の２つの融合タンパク質が相互に結合している、融合タンパク質二量体。
【請求項２２】
融合タンパク質二量体がホモ二量体である、請求項２１に記載の融合タンパク質二量体。
【請求項２３】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２４】
ポリヌクレオチドが、配列番号：８、２５、２７または２９のヌクレオチド配列と８５％以上の配列同一性を有する、請求項２３に記載のポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２３に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項２６】
請求項２５に記載のベクターが導入されている形質転換細胞。
【請求項２７】
活性成分として：
請求項１〜２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質；または
請求項２１または２２に記載の融合タンパク質二量体
を含む、がんまたは感染症を予防または治療するための医薬組成物。
【請求項２８】
医薬的に許容される担体をさらに含む、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
がんが、胃がん、肝臓がん、肺がん、大腸がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がん、子宮頸がん、甲状腺がん、咽頭がん、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽腫、頭頚部がん、唾液腺がん、およびリンパ腫からなる群より選択されるいずれかである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
感染症が、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト・パピローマウイルス感染、サイトメガロウイルス感染、ウイルス性呼吸器疾患、およびインフルエンザからなる群より選択されるいずれかである、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
がんまたは感染症を治療するための、請求項１に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３２】
がんまたは感染症を治療するための医薬の製造のための、請求項１に記載の融合タンパク質の使用。
【請求項３３】
がんまたは感染症を治療するための方法であって、
対象に、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質を、または請求項２１もしくは２２に記載の融合タンパク質二量体を投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質およびその使用に関する。具体的には、本発明は、がん治療効果および免疫増強効果を有する新規な融合タンパク質に関する。
【背景技術】
【０００２】
インターロイキン２（ＩＬ−２）（Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）とも称される）は、リンパ球の産生、生存およびホメオスタシスにおいて中心的役割を果たす、グロブラー糖タンパク質である。ＩＬ−２はタンパク質の大きさが１５.５ｋＤａ〜１６ｋＤａであって、１３３個のアミノ酸からなる。ＩＬ−２は３つの異なるサブユニットからなるＩＬ−２受容体と結合することにより様々な免疫作用を媒介する。
【０００３】
加えて、ＩＬ−２は、活性化Ｔ細胞によって、特にＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞によって主に合成される。ＩＬ−２は、Ｔ細胞の増殖および分化を刺激し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の産生、および末梢血液リンパ球の細胞傷害性細胞およびリンホカイン活性化キラー細胞（ＬＡＫ細胞）への分化を誘発する。
【０００４】
さらには、ＩＬ−２はＢ細胞の増殖および分化とも関係しており、Ｂ細胞による免疫グロブリン合成を促進し、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）の産生、増殖および活性化を刺激する。したがって、ＩＬ−２は、リンパ球集団を大きくし、生体での免疫細胞の機能を亢進させることができるため、抗がん剤として使用される。現在、ＩＬ−２を用いる療法が承認されており、代謝性腎細胞腫瘍および悪性メラノーマの患者に使用されている。
【０００５】
しかしながら、ＩＬ−２は、それが免疫細胞の数を増やし、その活性を増大させるのに介在するだけでなく、免疫耐性を維持するのにも重要であるという点で、二元的な免疫応答の機能を有する。加えて、ＩＬ−２は腫瘍増殖を阻害するのに最適ではない可能性があると報告されている。その理由は、ＩＬ−２の存在下で、活性化誘発の細胞死（ＡＩＣＤ）がその得られた細胞傷害性Ｔリンパ球で生じている可能性があり、免疫応答がＩＬ−２依存の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）によって阻害されるかもしれないというものである（Imaiら、Cancer Sci 98, 416-423, 2007）。
【０００６】
加えて、重度の心血管性、肺性、腎臓性、肝臓性、胃腸性、神経性、皮膚性、血液性、および全身性副作用が、ＩＬ−２を用いる免疫療法を受けた患者で発生している。したがって、ＩＬ−２の治療効能を改善し、その副作用を最小限とするために種々のＩＬ−２変異が研究されてきた（ＵＳ５,２２９,１０９Ｂ）。しかしながら、ＩＬ−２を薬理目的に利用するためには今なお解決すべき多くの課題がある。
【０００７】
一方で、ＣＤ８０（Ｂ７−１としても知られる）は、共刺激応答および共阻害応答を送達する方法でそのリガンドと結合することにより免疫制御に関与する、膜結合タンパク質のＢ７ファミリーの一の構成員である。ＣＤ８０は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および単球の表面上で発現される膜貫通タンパク質である。ＣＤ８０は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４（ＣＤ１５２）、およびＰＤ−Ｌ１と結合することが知られている。ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＴＬＡ４、およびＣＤ２８は、共刺激−共阻害システムにおいて関連付けられる。例えば、それらはＴ細胞の活性を制御し、その増殖、分化および生存にて関連付けられる。
【０００８】
例えば、ＣＤ８０およびＣＤ８６がＣＤ２８と相互作用すると、共刺激シグナルが発せられ、Ｔ細胞を活性化する。最終的には、ＣＤ８０はＣＴＬＡ４と結合し、ＣＴＬＡ４を刺激してアップレギュレートされるようにする。結果として、ＣＤ８０は、ＣＤ８０／ＣＤ２８の相互作用によって惹起される免疫応答の活性化の前に、Ｔ細胞応答を阻害する。このフィードバックループにより免疫応答の微調整が可能となる。
【０００９】
加えて、ＣＤ８０は、Ｂ７ファミリーのもう一つ別の構成員である、ＰＤ−Ｌ１と、ＣＤ２８がＰＤ−Ｌ１と結合する親和性と同様の力で、結合することが知られている。ＰＤ−Ｌ１は、プログラムされた細胞死−１（ＰＤ−１）タンパク質を標的とする２つのリガンドのうちの１つとして公知であり、ＰＤ−Ｌ１はＴ細胞制御に関与することが知られている。ＣＤ８０のＰＤ−Ｌ１との結合は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の相互作用を遮断し得るもう一つ別の作用機構であり、そのことは腫瘍におけるＴ細胞応答の阻害を妨げるかもしれない。しかしながら、同時に、ＣＤ８０レベルの増加は、ＣＴＬＡ４が誘発されるようにＣＤ８０をＣＤ２８と結合させものであり、それによってＴ細胞応答を誘発または阻害することとなる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明は安全で効果的なＩＬ−２を開発することを研究してきた。その結果、本発明者らは、１つの分子にて、ＩＬ−２タンパク質とＣＤ８０タンパク質とを含む新規な融合タンパク質が免疫細胞を活性化し、Ｔｒｅｇ細胞を効果的に制御し得ることを見出し、それによって本発明を完成した。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
上記した目的を達成するために、本発明の態様において、ＩＬ−２タンパク質とＣＤ８０タンパク質とを含む融合タンパク質が提供される。
本発明のもう一つ別の態様において、２つの融合タンパク質を相互に結合させることによって得られる融合タンパク質二量体が提供される。
【００１２】
本発明のさらにもう一つ別の態様において、該融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、該ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、該ベクターがその中に導入されている形質転換細胞が提供される。
【００１３】
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、活性成分として、該融合タンパク質または該融合タンパク質二量体を含む、がんまたは感染症を予防または治療するための医薬組成物が提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症を治療するための該融合タンパク質の使用が提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症の治療用の医薬を製造するための該融合タンパク質の使用が提供される。
【発明の効果】
【００１４】
ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質は、ＩＬ−２によって免疫細胞を活性化するだけでなく、ＣＤ８０によってＴｒｅｇ細胞を効果的に制御することができる。従って、該融合タンパク質はがん細胞を効率的な方法で攻撃することができ、かくしてがんまたは感染症の治療に役立つように利用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】融合タンパク質の図解による実施態様を示す。
【図２】融合タンパク質が異なる２種の免疫細胞を制御する機構を示す。しかしながら、融合タンパク質の作用を表す機構がそれに限定されないことを理解すべきである。
【図３】融合タンパク質が抗がん作用を示す機構を示す。
【図４】融合タンパク質の構造を斜視図で示す。ここで、ＧＩ１０１およびｍＧＩ１０１の各々は、本明細書に記載の融合タンパク質の実施態様であり、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、およびｍＧＩ１０１Ｃ１は該融合タンパク質の活性と比べるための比較例である。
【図５】本明細書に記載の融合タンパク質の種々の実施態様を示す。ヒトおよびマウス由来のタンパク質を合わせて融合タンパク質を製造することができる。ＣＤ８０タンパク質とＩＬ−２タンパク質とを、Ｆｃ以外の種々のリンカーを介して相互に結合させてもよい。
【図６】得られた融合タンパク質（ＧＩ１０１）をＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定することで得られた結果を示す。
【図７】融合タンパク質（ＧＩ１０１）の量が吸光度に依存することを示す。
【図８】得られた融合タンパク質（ＧＩ１０１）をサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で分析することによって得られた結果を示す。
【図９】得られたｍＧＩ１０１の融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定することによって得られた結果を示す。
【図１０】得られたＧＩ１０１Ｃ１の融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定することで得られた結果を示す。
【図１１】得られたＧＩ１０１Ｃ２の融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定することで得られた結果を示す。
【図１２】得られたｍＧＩ１０１Ｃ１の融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定することで得られた結果を示す。
【図１３】得られたＧＩ１０２−Ｍ４５の融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定することで得られた結果を示す。
【図１４】得られたＧＩ１０２−Ｍ６１の融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定することで得られた結果を示す。
【図１５】得られたＧＩ１０２−Ｍ７２の融合タンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで同定することで得られた結果を示す。
【図１６】ｈＣＴＬＡ４とＧＩ１０１との間の結合親和性を示す。
【図１７】ｈＰＤ−Ｌ１とＧＩ１０１との間の結合親和性を示す。
【図１８】ｈＰＤ−Ｌ１とｈＰＤ−１との間の結合親和性を示す。
【図１９】ｍＣＴＬＡ４とｍＧＩ１０１との間の結合親和性を示す。
【図２０】ｍＰＤ−Ｌ１とｍＧＩ１０１との間の結合親和性を示す。
【図２１】ＧＩ−１０１（ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ｈＩＬ−２ｖ）とＣＴＬＡ−４との間、およびＧＩ−１０１（ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ｈＩＬ−２ｖ）とＰＤ−Ｌ１との間の結合親和性を同定することによって得られた結果を示す。ＧＩ−１０１（ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ｈＩＬ−２ｖ）がＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１に対して高い結合能を有することが同定された。
【図２２】ＧＩ−１０１（ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ｈＩＬ−２ｖ）とＣＴＬＡ−４との間、およびＧＩ−１０１（ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ｈＩＬ−２ｖ）とＰＤ−Ｌ１との間の結合親和性を同定することによって得られた結果を示す。ＧＩ−１０１（ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ｈＩＬ−２ｖ）がＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１に対して高い結合能を有することが同定された。
【図２３】ＧＩ１０１のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合についての効果を示す。ＧＩ１０１はＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合を効果的に阻害した。
【図２４】ＧＩ１０１とＩＬ−２ＲαまたはＩＬ−２Ｒβとの間の結合親和性を同定することによって得られた結果を示す。
【図２５】ＧＩ１０１とＩＬ−２Ｒαとの間の結合親和性を同定することによって得られた結果を示す。
【図２６】ＧＩ１０１とＩＬ−２Ｒβとの間の結合親和性を同定することによって得られた結果を示す。
【図２７】ＩＬ−２ＲαとＧＩ１０２−Ｍ４５との間の結合親和性を同定することによって得られた結果を示す。
【図２８】ＩＬ−２ＲαとＧＩ１０２−Ｍ６１との間の結合親和性を同定することによって得られた結果を示す。
【図２９】ＩＬ−２ＲαとＧＩ１０２−Ｍ７２との間の結合親和性を同定することによって得られた結果を示す。
【図３０】ＩＬ−２ＲβとＧＩ１０２−Ｍ４５との間の結合親和性を同定することによって得られた結果を示す。
【図３１】ＩＬ−２ＲβとＧＩ１０２−Ｍ６１との間の結合親和性を同定することによって得られた結果を示す。
【図３２】ＩＬ−２ＲβとＧＩ１０２−Ｍ７２との間の結合親和性を同定することによって得られた結果を示す。
【図３３】細胞をＧＩ１０１、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、またはＩＬ−２の各濃度での処理に付し、インキュベーションを行う場合に、細胞より分泌されるＩＦＮ−γの量を測定することによって得られた結果を示す。
【図３４】細胞をＧＩ１０１、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、またはＩＬ−２の各濃度での処理に付し、インキュベーションを行う場合に、細胞より分泌されるＩＦＮ−γの量を測定することによって得られた結果を示す。
【図３５】ＧＩ１０１、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、およびＩＬ−２（プロロイキン（Proleukin））のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖についての効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図３６】ＧＩ１０１、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、およびＩＬ−２（プロロイキン（Proleukin））のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖についての効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図３７】ＧＩ１０１およびＧＩ１０２のＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の増殖についての効果を同定することによって得られた結果を示す。ここで、図３７ＡはＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞の割合を示し、図３７ＢはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖能を示し、図３７ＣはＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の割合を示す。
【図３８】ＧＩ１０１およびＧＩ１０１ｗのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞についての効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図３９】ＧＩ１０１およびＧＩ１０１ｗのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞についての効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図４０】ＧＩ１０１のエフェクターＴ細胞についての効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図４１】ＧＩ１０１のエフェクターＴ細胞についての効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図４２】ｍＧＩ１０１およびｍＧＩ１０２−Ｍ６１のマウス免疫細胞についての効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図４３】ＧＩ１０１のＰＤ−Ｌ１を過剰発現するがん細胞についての効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図４４】ＧＩ１０１のＰＤ−Ｌ１を過剰発現するがん細胞についての効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図４５】ＧＩ１０１の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける腫瘍阻害効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図４６】ＧＩ１０１の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける腫瘍阻害効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図４７】ｍＧＩ１０１のマウス由来の黒色腫を移植したマウスにおける腫瘍阻害効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図４８】ｍＧＩ１０１のマウス由来の黒色腫を移植したマウスにおける腫瘍阻害を示す。
【図４９】ｍＧＩ１０１の、その用量に依存した、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける腫瘍阻害効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図５０】ｍＧＩ１０１を受容したマウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスの生存率を分析することによって得られた結果を示す。
【図５１】ＧＩ１０１のマウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける腫瘍阻害効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図５２】マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスをｈＩｇＧ４、抗ＰＤ−１抗体、またはＧＩ１０１での処理に付し、次にＦＡＣＳで、腫瘍組織中のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＩＦＮ−γＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＴｒｅｇ細胞を分析することによって得られる結果を示す。
【図５３】マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスをｈＩｇＧ４、抗−ＰＤ−１抗体、またはＧＩ１０１での処理に付し、次にＦＡＣＳで、がん組織中のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＩＦＮ−γＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＴｒｅｇ細胞を分析することによって得られる結果を示す。
【図５４】マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスをｈＩｇＧ４、抗−ＰＤ−１抗体、またはＧＩ１０１での処理に付し、次にＦＡＣＳで、がん組織中のマクロファージを分析することによって得られる結果を示す。
【図５５】マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスをｈＩｇＧ４、抗−ＰＤ−１抗体、またはＧＩ１０１での処理に付し、次にＦＡＣＳで、がん組織中のマクロファージを分析することによって得られる結果をグラフで示す。
【図５６】マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスをｈＩｇＧ４、抗−ＰＤ−１抗体、またはＧＩ１０１での処理に付し、次にＦＡＣＳで、がん組織中の樹状細胞を分析することによって得られる結果を示す。
【図５７】マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスをｈＩｇＧ４、抗−ＰＤ−１抗体、またはＧＩ１０１での処理に付し、次にＦＡＣＳで、がん組織中の樹状細胞を分析することによって得られる結果をグラフで示す。
【図５８】マウス由来の肺がん細胞を移植したマウスにおいてＧＩ１０１の腫瘍阻害効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図５９】マウス由来の肺がん細胞を移植したマウスをｈＩｇＧ４、抗−ＰＤ−１抗体、またはＧＩ１０１での処理に付し、次にＦＡＣＳで、がん組織中のＣＤ８＋Ｔ細胞、ＩＦＮ−γＴ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＴｒｅｇ細胞を分析することによって得られる結果をグラフで示す。
【図６０】マウス由来の肺がん細胞を移植したマウスをｈＩｇＧ４、抗−ＰＤ−１抗体、またはＧＩ１０１での処理に付し、次にＦＡＣＳで、がん組織中のマクロファージを分析することによって得られる結果をグラフで示す。
【図６１】マウス由来の肺がん細胞を移植したマウスをｈＩｇＧ４、抗−ＰＤ−１抗体、またはＧＩ１０１での処理に付し、次にＦＡＣＳで、がん組織中の樹状細胞を分析することによって得られる結果をグラフで示す。
【図６２】ｍＧＩ１０２−Ｍ６１の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける腫瘍阻害効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図６３】ｍＧＩ１０２−Ｍ６１を受容したマウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスの生存率を分析することによって得られる結果を示す。
【図６４】ｍＧＩ１０１の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける腫瘍阻害効果を同定することによって得られた結果を示す。
【図６５】ｍＧＩ１０１の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける腫瘍阻害を示す。
【図６６】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて１５日間の臨床観察を行うことによって得られた結果を示す。
【図６７】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に体重を測定することによって得られる結果を示す。
【図６８】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に体重を測定することによって得られる結果を示す。
【図６９】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについての１５日間の摂餌費を示す。
【図７０】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に血液を分析することによって得られる結果を示す。
【図７１】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に血液を分析することによって得られる結果を示す。
【図７２】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に血液を分析することによって得られる結果を示す。
【図７３】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に臨床および化学分析を行うことによって得られる結果を示す。
【図７４】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に臨床および化学分析を行うことによって得られる結果を示す。
【図７５】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に臨床および化学分析を行うことによって得られる結果を示す。
【図７６】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に臨床および化学分析を行うことによって得られる結果を示す。
【図７７】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に臨床および化学分析を行うことによって得られる結果を示す。
【図７８】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に臨床および化学分析を行うことによって得られる結果を示す。
【図７９】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に臨床および化学分析を行うことによって得られる結果を示す。
【図８０】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目にサイトカインを分析することによって得られる結果を示す。
【図８１】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目にサイトカインを分析することによって得られる結果を示す。
【図８２】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に免疫細胞を分析することによって得られる結果を示す。
【図８３】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に免疫細胞を分析することによって得られる結果を示す。
【図８４】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に免疫細胞を分析することによって得られる結果を示す。
【図８５】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に免疫細胞を分析することによって得られる結果を示す。
【図８６】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に免疫細胞を分析することによって得られる結果を示す。
【図８７】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルについて、−１、１、８、および１５日目に免疫細胞を分析することによって得られる結果を示す。
【図８８】ＰＢＳまたはＧＩ１０１を受容したサルを１６日目に殺し、脾臓細胞を摘出し、その脾臓細胞を病理学的に分析することによって得られる結果を示す。
【図８９】ＣＤ８０タンパク質およびＩＬ−２タンパク質の各々がキャリアタンパク質に結合している融合タンパク質を示す。具体的には、図８９ＡはＣＤ８０タンパク質およびＩＬ−２タンパク質が、各々、キャリアタンパク質のＮ−末端およびＣ−末端に結合している、融合タンパク質を示す。加えて、図８９ＢはＣＤ８０タンパク質およびＩＬ−２タンパク質が、各々、キャリアタンパク質のＣ−末端およびＮ−末端に結合している、融合タンパク質を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質
本発明の態様において、ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質が提供される。
本明細書において使用される場合の、「ＩＬ−２」または「インターロイキン−２」なる語は、特記されない限り、哺乳類、例えば霊長類（ヒトなど）およびげっ歯類（マウスおよびラットなど）を含む、任意の脊椎動物源より得られる任意の野生型ＩＬ−２をいう。ＩＬ−２は動物細胞より得られてもよく、ＩＬ−２の産生能を有する組換え細胞より得られるものをも包含する。加えて、ＩＬ−２は野生型ＩＬ−２またはその変種であってもよい。
【００１７】
本明細書において、ＩＬ−２またはその変種は、「ＩＬ−２タンパク質」または「ＩＬ−２ポリペプチド」なる語によって包括的に表されてもよい。ＩＬ−２、ＩＬ−２タンパク質、ＩＬ−２ポリペプチド、およびＩＬ−２変種は、例えば、ＩＬ−２受容体と特異的に結合する。この特異的結合は当業者に知られている方法により同定され得る。
【００１８】
ＩＬ−２の実施態様は配列番号：３５または配列番号：３６のアミノ酸配列を有してもよい。ここで、ＩＬ−２はまた、成熟した形態であってもよい。具体的には、該成熟ＩＬ−２はシグナル配列を含有しなくてもよく、配列番号：１０のアミノ酸配列を有してもよい。ここで、ＩＬ−２は、その野生型ＩＬ−２のＮ−末端またはＣ−末端部分が切断されているところの野生型ＩＬ−２のフラグメントを包含する概念の下で使用され得る。
【００１９】
加えて、ＩＬ−２のフラグメントは、配列番号：３５または配列番号：３６のアミノ酸配列のタンパク質のＮ−末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したアミノ酸が切断されているところの形態であってもよい。加えて、ＩＬ−２のフラグメントは、配列番号：３５または配列番号：３６のアミノ酸配列のタンパク質のＣ−末端から１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５個の連続したアミノ酸が切断されているところの形態であってもよい。
【００２０】
本明細書にて使用される場合の「ＩＬ−２変種」なる語は、全長ＩＬ−２でのアミノ酸の一部が、またはＩＬ−２の上記したフラグメントが置換されている、形態をいう。すなわち、ＩＬ−２変種は野生型ＩＬ−２またはそのフラグメントと異なるアミノ酸配列を有してもよい。しかしながら、ＩＬ−２変種は野生型ＩＬ−２と等価または類似する活性を有する。ここで、「ＩＬ−２活性」は、例えば、ＩＬ−２受容体との特異結合をいい、その特異結合は当業者に公知の方法により測定され得る。
【００２１】
具体的には、ＩＬ−２変種は、野生型ＩＬ−２におけるアミノ酸の一部を置換することにより得られてもよい。アミノ酸置換によって得られるＩＬ−２変種の実施態様は、配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４２番、４５番、６１番、および７２番目にあるアミノ酸の少なくとも１つの置換によって得られてもよい。
【００２２】
具体的には、ＩＬ−２変種は、配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４２番、４５番、６１番、または７２番目にあるアミノ酸の少なくとも１つがもう一つ別のアミノ酸で置換されることで得られてもよい。加えて、ＩＬ−２が、配列番号：３５のアミノ酸配列のＮ−末端の部分が切断されている形態である場合、配列番号：１０のアミノ酸配列のその部分に相当する補完性の位置にあるアミノ酸がもう一つ別のアミノ酸で置換されていてもよい。例えば、ＩＬ−２が配列番号：３５のアミノ酸配列である場合、そのＩＬ−２変種は配列番号：３５のアミノ酸配列の５８番、６２番、６５番、８１番、または９２番目にあるアミノ酸の少なくとも１つがもう一つ別のアミノ酸で置換されることで得られてもよい。これらのアミノ酸残基は、各々、配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４２番、４５番、６１番、および７２番目のアミノ酸残基に相当する。実施態様によれば、かかるＩＬ−２変種がＩＬ−２活性を維持する限り、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のアミノ酸が置換されてもよい。もう一つ別の実施態様によれば、１〜５個のアミノ酸が置換されてもよい。
【００２３】
実施態様において、ＩＬ−２変種はその中の２個のアミノ酸が置換されている形態であってもよい。具体的には、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番および４２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番および４５番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番および６１番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の４２番および４５番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の４２番および６１番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の４２番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の４５番および６１番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の４５番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の６１番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。
【００２４】
さらには、ＩＬ−２変種は、その中の３個のアミノ酸が置換される形態であってもよい。具体的には、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４２番および４５番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４２番および６１番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４２番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４５番および６１番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４５番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、６１番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の４２番、４５番および６１番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の４２番、４５番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の４５番、６１番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。
【００２５】
加えて、ＩＬ−２変種は、その中の４個のアミノ酸が置換される形態であってもよい。具体的には、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４２番、４５番および６１番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４２番、４５番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４５番、６１番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４２番、６１番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の４２番、４５番、６１番および７２番目のアミノ酸が置換されることで得られてもよい。
【００２６】
さらには、ＩＬ−２変種は、その中の５個のアミノ酸が置換される形態であってもよい。具体的には、ＩＬ−２変種は配列番号：１０のアミノ酸配列の３８番、４２番、４５番、６１番、および７２番目のアミノ酸がもう一つ別のアミノ酸で置換されることで得られてもよい。
【００２７】
ここで、置換で導入される「もう一つ別のアミノ酸」は、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、スレオニン、トリプトファン、チロシン、およびバリンからなる群より選択されるいずれのアミノ酸であってもよい。ただし、配列番号：１０のアミノ酸配列における、ＩＬ−２変種のアミノ酸置換に関して、３８番目のアミノ酸はアルギニンと置換できず、４２番目のアミノ酸はフェニルアラニンと置換できず、４５番目のアミノ酸はチロシンと置換できず、６１番目のアミノ酸はグルタミン酸と置換できず、７２番目のアミノ酸はロイシンと置換できない。
【００２８】
配列番号：１０のアミノ酸配列における、ＩＬ−２変種のアミノ酸置換に関して、３８番目のアミノ酸のアルギニンは、アルギニン以外のアミノ酸と置換されてもよい。好ましくは、配列番号：１０のアミノ酸配列における、ＩＬ−２変種のアミノ酸置換に関して、３８番目のアミノ酸のアルギニンは、アラニンと置換されてもよい（Ｒ３８Ａ）。
【００２９】
配列番号：１０のアミノ酸配列における、ＩＬ−２変種のアミノ酸置換に関して、４２番目のアミノ酸のフェニルアラニンは、フェニルアラニン以外のアミノ酸と置換されてもよい。好ましくは、配列番号：１０のアミノ酸配列における、ＩＬ−２変種のアミノ酸置換に関して、４２番目のアミノ酸のフェニルアラニンは、アラニンと置換されてもよい（Ｆ４２Ａ）。
【００３０】
配列番号：１０のアミノ酸配列における、ＩＬ−２変種のアミノ酸置換に関して、４５番目のアミノ酸のチロシンは、チロシン以外のアミノ酸と置換されてもよい。好ましくは、配列番号：１０のアミノ酸配列における、ＩＬ−２変種のアミノ酸置換に関して、４５番目のアミノ酸のチロシンは、アラニンと置換されてもよい（Ｙ４５Ａ）。
【００３１】
配列番号：１０のアミノ酸配列における、ＩＬ−２変種のアミノ酸置換に関して、６１番目のアミノ酸のグルタミン酸は、グルタミン酸以外のアミノ酸と置換されてもよい。好ましくは、配列番号：１０のアミノ酸配列における、ＩＬ−２変種のアミノ酸置換に関して、６１番目のアミノ酸のグルタミン酸は、アルギニンと置換されてもよい（Ｅ６１Ｒ）。
【００３２】
配列番号：１０のアミノ酸配列における、ＩＬ−２変種のアミノ酸置換に関して、７２番目のアミノ酸のロイシンは、ロイシン以外のアミノ酸と置換されてもよい。好ましくは、配列番号：１０のアミノ酸配列における、ＩＬ−２変種のアミノ酸置換に関して、７２番目のアミノ酸のロイシンは、グリシンと置換されてもよい（Ｌ７２Ｇ）。
【００３３】
具体的には、ＩＬ−２変種は、配列番号：１０のアミノ酸配列における、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、およびＬ７２Ｇからなる群より選択される、少なくとも１つの置換によって得られてもよい。
具体的には、ＩＬ−２変種は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、およびＬ７２Ｇからなる群より選択される位置の中から２、３、４または５箇所でアミノ酸置換されることで得られてもよい。
【００３４】
加えて、ＩＬ−２変種は２個のアミノ酸が置換されている形態であってもよい。具体的には、ＩＬ−２変種は、Ｒ３８ＡおよびＦ４２Ａの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種は、Ｒ３８ＡおよびＹ４５Ａの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＲ３８ＡおよびＥ６１Ｒの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＲ３８ＡおよびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＦ４２ＡおよびＹ４５Ａの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＦ４２ＡおよびＥ６１Ｒの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＦ４２ＡおよびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＥ６１ＲおよびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。
【００３５】
さらには、ＩＬ−２変種は３個のアミノ酸が置換されている形態であってもよい。具体的には、ＩＬ−２変種はＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、およびＹ４５Ａの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、およびＥ６１Ｒの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、およびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＲ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６１Ｒの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＲ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６１Ｒの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＦ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ、およびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＹ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、およびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。
【００３６】
さらには、ＩＬ−２変種は４個のアミノ酸が置換されている形態であってもよい。具体的には、ＩＬ−２変種はＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＥ６１Ｒの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、およびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＲ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ、およびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＲ３８Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、およびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。加えて、実施態様において、ＩＬ−２変種はＦ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、およびＬ７２Ｇの置換で得られてもよい。
【００３７】
さらには、ＩＬ−２変種は、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、およびＬ７２Ｇの置換によって得られてもよい。
好ましくは、ＩＬ−２変種の実施態様は、配列番号：１０のアミノ酸配列において以下の（ａ）〜（ｄ）の組み合わせから選択されるいずれのものを含有してもよい。
（ａ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ
（ｂ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｙ４５Ａ
（ｃ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｅ６１Ｒ
（ｄ）Ｒ３８Ａ／Ｆ４２Ａ／Ｌ７２Ｇ
【００３８】
ここで、ＩＬ−２が配列番号：３５のアミノ酸配列を有する場合、配列番号：１０のアミノ酸配列の位置に相補的に対応するところにアミノ酸置換があってもよい。加えて、ＩＬ−２が配列番号：３５のアミノ酸配列のフラグメントである場合であっても、配列番号：１０のアミノ酸配列の位置に相補的に対応するところにアミノ酸置換があってもよい。
具体的には、ＩＬ−２変種は、配列番号：６、２２、２３、または２４のアミノ酸配列を有してもよい。
【００３９】
加えて、ＩＬ−２変種はインビボにおける毒性が低いことで特徴付けられ得る。ここで、インビボにおける毒性の低さは、ＩＬ−２がＩＬ−２受容体アルファ鎖（ＩＬ−２Ｒα）と結合することによって惹起される副作用とすることができる。ＩＬ−２のＩＬ−２Ｒαとの結合によって惹起される副作用を改善するために、種々のＩＬ−２変種が開発されており、かかるＩＬ−２変種が米国特許第５,２２９,１０９号および韓国特許第１６６７０９６号に開示されている変種である。特に、本願において開示されるＩＬ−２変種はＩＬ−２受容体アルファ鎖（ＩＬ−２Ｒα）に対する結合能が低く、かくして野生型ＩＬ−２よりもインビボにおける毒性が低い。
【００４０】
本明細書にて使用される時の「ＣＤ８０」なる語（「Ｂ７−１」とも称される）は、樹状細胞、活性化Ｂ細胞、および単球細胞において存在する膜タンパク質である。ＣＤ８０はＴ細胞の活性化および生存に不可欠な共刺激シグナルを提供する。ＣＤ８０は、Ｔ細胞の表面に存在する、２種類の異なるタンパク質、ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４を標的とするリガンドとして知られている。ＣＤ８０は２８８個のアミノ酸で構成され、具体的には配列番号：１１のアミノ酸配列を有してもよい。加えて、本明細書にて使用場合の「ＣＤ８０タンパク質」なる語は、全長ＣＤ８０またはＣＤ８０フラグメントをいう。
【００４１】
本明細書にて使用される時の「ＣＤ８０フラグメント」なる語は、ＣＤ８０の切断された形態をいう。加えて、ＣＤ８０フラグメントはＣＤ８０の細胞外ドメインであってもよい。ＣＤ８０フラグメントの実施態様は、ＣＤ８０のシグナル配列である、Ｎ末端から１番〜３４番目のアミノ酸を除去することによって得られてもよい。具体的には、ＣＤ８０フラグメントの実施態様は、配列番号：１１の３５番〜２８８番目のアミノ酸で構成されるタンパク質であってもよい。加えて、ＣＤ８０フラグメントの実施態様は、配列番号：１１の３５番〜２４２番目のアミノ酸で構成されるタンパク質であってもよい。加えて、ＣＤ８０フラグメントの実施態様は、配列番号：１１の３５番〜２３２番目のアミノ酸で構成されるタンパク質であってもよい。加えて、ＣＤ８０フラグメントの実施態様は、配列番号：１１の３５番〜１３９番目のアミノ酸で構成されるタンパク質であってもよい。加えて、ＣＤ８０フラグメントの実施態様は、配列番号：１１の１４２番〜２４２番目のアミノ酸で構成されるタンパク質であってもよい。加えて、ＣＤ８０フラグメントの実施態様は、配列番号：２のアミノ酸配列を有してもよい。
【００４２】
加えて、ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質は、リンカーまたは担体を通して相互に結合してもよい。具体的には、ＩＬ−２またはその変種と、ＣＤ８０（Ｂ７−１）またはそのフラグメントとは、リンカーまたは担体を通して相互に結合してもよい。本記載において、リンカーと担体とは互換的に使用され得る。
【００４３】
リンカーは２つのタンパク質を連結する。リンカーの実施態様として、１〜５０個のアミノ酸、アルブミンまたはそのフラグメント、免疫グロブリンのＦｃドメイン等が挙げられてもよい。ここで、免疫グロブリンのＦｃドメインは、免疫グロブリンの重鎖定常領域２（ＣＨ２）および重鎖定常領域３（ＣＨ３）を含有し、免疫グロブリンの重鎖および軽鎖可変領域および軽鎖定常領域１（ＣＨ１）を含有しない、タンパク質をいう
。免疫グロブリンはＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、またはＩｇＭであってもよく、好ましくはＩｇＧ４であってもよい。ここで、野生型免疫グロブリンＧ４のＦｃドメインは配列番号：４のアミノ酸配列を有してもよい。
【００４４】
加えて、免疫グロブリンのＦｃドメインは、Ｆｃドメイン変種ならびに野生型Ｆｃドメインであり得る。加えて、本明細書にて使用される場合の「Ｆｃドメイン変種」なる語は、グリコシル化パターンに関して野生型Ｆｃドメインと異なり、野生型Ｆｃドメインと比べてグリコシル化が高いか、野生型Ｆｃドメインと比べてグリコシル化が低い形態をいうか、あるいは脱グリコシル化された形態をいう。加えて、非グリコシル化Ｆｃドメインは本明細書にて包含される。Ｆｃドメインまたはその変種は、宿主の培養条件または遺伝的操作を介して、調整数のシアル酸、フコシル化、またはグリコシル化を有するように適合されてもよい。
【００４５】
加えて、免疫グロブリンのＦｃドメインのグリコシル化は、化学的方法、酵素的方法、および微生物を用いる遺伝子工学的方法などの慣用的方法によって修飾されてもよい。加えて、Ｆｃドメイン変種は、イムノグロブリン、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤ、およびＩｇＭの個々のＦｃドメインの混合した形態であってもよい。加えて、Ｆｃドメイン変種はＦｃドメインの数個のアミノ酸が他のアミノ酸で置換されている形態であってもよい。Ｆｃドメインのドメイン変種の実施態様は、配列番号：１２のアミノ酸配列を有してもよい。
【００４６】
融合タンパク質は、リンカー（または担体）としてＦｃドメインを用い、ＣＤ８０タンパク質とＩＬ−２タンパク質とを、またはＩＬ−２タンパク質とＣＤ８０タンパク質とを、各々、リンカーまたは担体のＮ−末端およびＣ−末端に連結する、構造を有する（図８９）。ＦｃドメインのＮ−末端またはＣ−末端と、ＣＤ−８０またはＩＬ−２との連結は、所望により、リンカーペプチドによってなされてもよい。
【００４７】
具体的には、融合タンパク質は、次の構造式（Ｉ）または（ＩＩ）：
【化１】
2021511081.tif 000003
［ここで、構造式（Ｉ）および（ＩＩ）中、
Ｎ’は融合タンパク質のＮ−末端であり、
ＸはＣＤ８０タンパク質であり、
ＹはＩＬ−２タンパク質であり、
リンカー（１）および（２）はペプチドリンカーであり、および
ｎおよびｍは、各々独立して、０または１である］
で構成されてもよい。
【００４８】
好ましくは、該融合タンパク質は構造式（Ｉ）からなってもよい。ＩＬ−２タンパク質は上記されるとおりである。加えて、ＣＤ８０タンパク質は上記されるとおりである。実施態様によれば、ＩＬ−２タンパク質は、野生型ＩＬ−２と比べた時に、１〜５個のアミノ酸置換のあるＩＬ−２変種であってもよい。ＣＤ８０タンパク質は、野生型ＣＤ８０のＮ−末端またはＣ−末端から約３４個までの連続したアミノ酸残基を切断することで得られるフラグメントであってもよい。あるいはまた、ＣＤタンパク質は、Ｔ細胞表面の受容体、ＣＴＬＡ−４およびＣＤ２８との結合能を有する、細胞外イムノグロブリン様ドメインであってもよい。
【００４９】
具体的には、融合タンパク質は、配列番号：９、２６、２８、または３０のアミノ酸配列を有してもよい。もう一つ別の実施態様によれば、融合タンパク質は、配列番号：９、２６、２８、または３０のアミノ酸配列に対して８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列同一性を有するポリペプチドを包含する。ここで、同一性は、例えば、パーセント相同性であり、アメリカ国立生物工学情報センター（National Center of Biotechnology Information、ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＮソフトウェアなどの相同性比較ソフトウェアを用いて決定されてもよい。
【００５０】
ペプチドリンカー（１）はＣＤ８０タンパク質とＦｃドメインとの間に含まれてもよい。ペプチドリンカー（１）は、５〜８０個の連続したアミノ酸、２０〜６０個の連続したアミノ酸、２５〜５０個の連続したアミノ酸、または３０〜４０個の連続したアミノ酸からなってもよい。１の実施態様において、ペプチドリンカー（１）は３０個のアミノ酸からなってもよい。加えて、該ペプチドリンカー（１）は少なくとも１個のシステインを含有してもよい。具体的には、該ペプチドリンカー（１）は１個、２個、または３個のシステインを含有してもよい。加えて、該ペプチドリンカー（１）は免疫グロブリンのヒンジより誘導されてもよい。１の実施態様において、該ペプチドリンカー（１）は配列番号：３のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。
【００５１】
ペプチドリンカー（２）は１〜５０個の連続したアミノ酸、３〜３０個の連続したアミノ酸、または５〜１５個の連続したアミノ酸からなってもよい。１の実施態様において、該ペプチドリンカー（２）は（Ｇ４Ｓ）ｎ（ここで、ｎは１〜１０の整数である）であってもよい。ここで、（Ｇ４Ｓ）ｎにおいて、ｎは１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。１の実施態様において、該ペプチドリンカー（２）は配列番号：５のアミノ酸配列からなるペプチドリンカーであってもよい。
【００５２】
本発明のもう一つ別の態様において、２個の融合タンパク質の結合によって得られる二量体であって、その各々がＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む、二量体が提供される。ＩＬ−２またはその変種およびＣＤ８０またはそのフラグメントを含む融合タンパク質は上記されるとおりである。
【００５３】
ここで、二量体を構成する融合タンパク質の間の結合は、限定されないが、リンカーにあるシステインによって形成されるジスルフィド結合によって達成される。二量体を構成する融合タンパク質は、相互に同じであっても異なる融合タンパク質であってもよい。好ましくは、二量体はホモ二量体である。二量体を構成する融合タンパク質の実施態様は配列番号：９のアミノ酸配列を有するタンパク質であってもよい。
【００５４】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド
本発明のさらにもう一つ別の態様において、ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提供される。具体的には、該ポリヌクレオチドは、配列番号：８、２５、２７、または２９のヌクレオチド配列を含有してもよい。ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質は上記されるとおりである。ポリヌクレオチドにおいて、１または複数のヌクレオチドが、置換、欠失、挿入またはその組み合わせにより改変されてもよい。ヌクレオチド配列が化学合成によって製造される場合、EngelsおよびUhlmann（Angew Chem IntEd Eng.、37：73-127, 1988）に記載される方法などの当該分野にて周知の合成方法が使用され得る。かかる方法はトリエステル、ホスファイト、ホスホルアミダイトおよびＨ−ホスフェート方法、ＰＣＲおよび他のオートプライマー方法、固体支持体でのオリゴヌクレオチド合成等を含んでもよい。
【００５５】
実施態様によれば、該ポリペプチドは、配列番号：８、２５、２７、または２９に対して、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％の同一性を有する、核酸配列を含有し得る。
【００５６】
ポリヌクレオチドは、シグナル配列またはリーダー配列をコードする、核酸をさらに含有してもよい。本明細書にて使用される場合の「シグナル配列」なる語は、標的タンパク質の分泌を方向付けるシグナルペプチドをいう。シグナルペプチドは宿主細胞中で翻訳され、次に切断される。具体的には、シグナル配列はタンパク質の小胞体（ＥＲ）膜を横切る移動を生じさせるアミノ酸配列である。１の実施態様において、該シグナル配列は配列番号：１のアミノ酸配列を有してもよい。
【００５７】
シグナル配列はその特徴について当該分野にて周知である。かかるシグナル配列は、典型的には、１６〜３０個のアミノ酸残基を含有し、かかるアミノ酸残基よりも多くのまたは少ないアミノ酸残基を含有してもよい。典型的なシグナルペプチドは、３つの領域、すなわち、塩基性Ｎ−末端領域、中央の疎水性領域、およびより極性のＣ−末端領域からなる。中央の疎水性領域は、未成熟なポリペプチドが脂質二重層膜を介して移動する間にシグナル配列が固定化されるようにする、４〜１２個の疎水性残基を含有する。
【００５８】
移動が起こった後、シグナル配列は、シグナルペプチダーゼとして周知の細胞酵素によってＥＲの内腔中で切断される。ここで、シグナル配列は、ｔＰａ（組織プラスミノーゲンアクチベーター）、ＨＳＶｇＤｓ（単純ヘルペスウイルスの糖タンパク質Ｄのシグナル配列）、または成長ホルモンの分泌性シグナル配列とすることができる。哺乳類等を含む高等真核生物の細胞にて使用される分泌性シグナル配列が使用されるのが好ましい。加えて、野生型ＩＬ−２および／またはＣＤ−８０に含まれるシグナル配列が使用されてもよく、あるいは宿主細胞にて高い頻度で発現されるコドンで置換されているシグナル配列が用いられてもよい。
【００５９】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを有するベクター
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、該ポリヌクレオチドを含むベクターが提供される。
【００６０】
該ベクターは、宿主細胞のゲノムと組換えられ、その中に挿入されるようにその宿主細胞に導入され得る。あるいは、該ベクターは、エピソームとして自立的に複製可能である、ポリヌクレオチド配列を含有する核酸手段として理解される。該ベクターは、線状核酸、プラスミド、ファージミド、コスミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクター、およびそのアナログを包含する。ウイルスベクターの例として、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ関連ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
具体的には、該ベクターは、プラスミドＤＮＡ、ファージＤＮＡ等；商業的に開発されたプラスミド（ｐＵＣ１８、ｐＢＡＤ、ｐＩＤＴＳＡＭＲＴ−ＡＭＰ等）、イー・コリ（E. coli）由来のプラスミド（ｐＹＧ６０１ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１１９等）、バシラス・サチリス（Bacillus subtilis）由来のプラスミド（ｐＵＢ１１０、ｐＴＰ５等）、酵母由来のプラスミド（ＹＥｐ１３、ＹＥｐ２４、ＹＣｐ５０等）、ファージＤＮＡ（カロン（Charon）４Ａ、カロン２１Ａ、ＥＭＢＬ３、ＥＭＢＬ４、λｇｔ１０、λｇｔ１１、λＺＡＰ等）、動物ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノウイルス、ワクシニアウイルス等）、昆虫ウイルスベクター（バキュロウイルス等）を包含しうる。ベクターは、宿主細胞に応じて、異なる発現レベルおよびタンパク質の修飾を示すため、その目的に最適な宿主細胞を選択し、使用するのが好ましい。
【００６２】
本明細書にて使用される時の標的タンパク質の「遺伝子発現」または「発現」なる語は、ＤＮＡ配列の転写、ｍＲＮＡ転写物の翻訳、および融合タンパク質の産生物またはそのフラグメントの分泌を意味するものと理解される。有用な発現ベクターはＲｃＣＭＶ（Invitrogen、Carlsbad）またはその変種であってもよい。発現ベクターは、さらに、哺乳類細胞にて標的遺伝子の連続的転写を促進するためのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、および転写後にＲＮＡの安定性レベルを増大させるためのウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル配列を含有してもよい。
【００６３】
融合タンパク質を発現する形質転換細胞
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、ベクターが導入されている形質転換細胞が提供される。
【００６４】
細胞を形質転換させるための宿主細胞として、原核細胞、真核細胞、および哺乳類、植物、昆虫、真菌または細菌起源の細胞を挙げることができるが、これらに限定されない。原核細胞の例として、イー・コリが使用されてもよい。加えて、真核生物の例として、酵母が使用されてもよい。加えて、哺乳類細胞では、ＣＨＯ細胞、Ｆ２Ｎ細胞、ＣＳＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ボウズ（Bowes）メラノーマ細胞、ＨｅＬａ細胞、９１１細胞、ＡＴ１０８０細胞、Ａ５４９細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞等が使用されてもよい。しかしながら、哺乳類細胞はこれらに限定されず、哺乳類細胞として使用可能であると当業者に公知のいずれの細胞も使用されてもよい。
【００６５】
加えて、発現ベクターを宿主細胞に導入するために、ＣａＣｌ２沈降、ＣａＣｌ２の沈降においてジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）などの還元剤を用いることによってその効率を増大させるハナハン（Hanahan）方法、電気穿孔、リン酸カルシウム沈降、原形質融合、炭化ケイ素ファイバーを用いる撹拌、アグロバクテリウム介在性形質転換、ＰＥＧを用いる形質転換、デキストラン硫酸塩−、リポフェクタミン−、または乾燥／阻害−介在性形質転換等を用いてもよい。
【００６６】
上記されるように、融合タンパク質の治療剤としての特性を最適化するために、あるいは他の目的として、融合タンパク質のグリコシル化パターン（例えば、シアル酸、フコシル化、グリコシル化）は、当業者に既知の方法を介して、宿主細胞が有するグリコシル化関連遺伝子を操作することにより調整されてもよい。
【００６７】
融合タンパク質の産生方法
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質を産生する方法であって、形質転換細胞の培養を含む、方法が提供される。具体的には、該産生方法は、ｉ）該形質転換細胞を培養して培養体を得；ｉｉ）融合タンパク質を該培養体より集める、ことを含んでもよい。
【００６８】
形質転換細胞の培養は、当該分野にて周知の方法を用いて実施されてもよい。具体的には、該培養はバッチ工程で実施されてもよく、あるいはフェドバッチまたは反復フェドバッチ工程にて連続的に行われてもよい。
【００６９】
融合タンパク質またはその二量体の使用
本発明のさらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症を治療または予防するための、および／またはがんまたは感染症を治療するのに効能を増大させるための医薬組成物であって、活性成分として、ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質、あるいは２個の融合タンパク質が結合している融合タンパク質二量体を含む、組成物が提供される。
ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質、または２個の融合タンパク質が結合している融合タンパク質二量体は上記されるとおりである。
【００７０】
がんは、胃がん、肝臓がん、肺がん、大腸がん、乳がん、前立腺がん、卵巣がん、膵臓がん、子宮頸がん、甲状腺がん、咽頭がん、急性骨髄性白血病、脳腫瘍、神経芽細胞腫、網膜芽腫、頭頚部がん、唾液腺がん、およびリンパ腫からなる群より選択されてもよい。加えて、感染症は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒト・パピローマウイルス（ＨＰＶ）感染、サイトメガロウイルス感染、ウイルス性呼吸器疾患、およびインフルエンザからなる群より選択されるいずれの疾患であってもよい。
【００７１】
医薬組成物の好ましい用量は、患者の状態および体重、疾患の重度、薬物の形態、投与の経路および期間に応じて変化し、当業者が適宜選択することができる。がんまたは感染症を治療または予防するための本発明の医薬組成物において、活性成分は、用途、剤形、ブレンドの目的等に応じて、活性成分が抗がん活性または感染症に対して治療効果を示し得る限り、どのような量（有効量）で含まれてもよい。その通常の有効量は、組成物の全量に基づいて、０.００１重量％〜２０.０重量％の範囲内で決定されるであろう。ここで、「有効量」なる語は、抗がん作用または感染症の治療効果の誘発能を有する活性成分の量をいう。かかる有効量は当業者の一般常識の範囲内で実験で決定され得る。
【００７２】
本明細書にて使用される時の「治療」なる語は、療法的または予防的治療の両方を意味するのに使用されてもよい。ここで、予防は、個体の病的状態または疾患が緩和または軽減されることを意味するのに使用され得る。実施態様において、「治療」なる語は、ヒトを含む哺乳類において疾患を治療するための両方の用途またはいずれの投与形態も包含する。加えて、該用語は疾患または疾患の進行を阻害すること、または遅らせることを包含し；疾患が部分的または完全に緩和されるように、損傷または喪失した機能を回復または修復する手段；非効率な工程を刺激する手段；または重篤な疾患を緩和する手段を包含する。
【００７３】
本明細書にて使用される時の「効能」なる語は、１または複数のパラメータ、例えば、１年、５年または１０年などの特定の期間にわたる生存率または無病生存率によって決定され得る能力をいう。加えて、該パラメータとして、個体において少なくとも１つの腫瘍の大きさを抑制することが挙げられてもよい。
【００７４】
生物学的利用能などの薬物動態パラメータおよびクリアランス速度などの基本的なパラメータもまた効能に影響を及ぼすかもしれない。かくして、「効能の強化」（例えば、効能における改善）は薬物動態パラメータの強化および効能の改善によるものであってもよく、それは試験動物またはヒト対象におけるクリアランス速度および腫瘍の成長と比べることで、あるいは生存率、再発率、または無病生存率などのパラメータと比べることで測定することができる。
【００７５】
本明細書にて使用される時の「治療的に効果的な量」または「医薬的に効果的な量」は、問題となる疾患を予防または治療するのに効果的な化合物または組成物の量をいい、医療に適用可能な合理的な利益／危険の割合で該疾患を治療するのに十分であり、副作用を生じさせない量をいう。効果的な量のレベルは、患者の健康状態、疾患の型および重篤度、薬物の活性、患者の薬物に対する感受性、投与方法、投与期間、投与経路および排出率、治療期間、処方または同時に使用される薬物を含む因子、および医薬の分野において周知の他の因子に応じて決定され得る。実施態様において、治療的に効果的な量はがんを治療するのに効果的な薬物の量を意味する。
【００７６】
ここで、該医薬組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含んでもよい。該医薬的に許容される担体は、該担体が患者に送達するのに適する非毒性の物質である限り、いずれの担体であってもよい。蒸留水、アルコール、脂肪、ワックス、および不活性固体が担体として含有されてもよい。医薬的に許容されるアジュバント（緩衝剤、分散剤）も医薬組成物中に配合されてもよい。
【００７７】
具体的には、活性成分に加えて医薬的に許容される担体を含めることにより、医薬組成物は、その投与経路に応じて、当該分野にて既知の通常の方法を用いて非経口製剤に製造され得る。ここで、「医薬的に許容される」なる語は、該担体が活性成分の活性を阻害しないと同時に、適用される（処方される）対象が適応し得る毒性よりも毒性が低いことを意味する。
【００７８】
医薬組成物が非経口用処方に調製される場合、該組成物は、当該分野にて公知の方法に従って、適切な担体を用いた、注射液、経皮パッチ、鼻腔用吸入剤または坐剤の形態の製剤に製造され得る。注射液が製造される場合には、滅菌水、エタノール、グリセロールまたはプロピレングリコールなどのポリオール、またはその混合液が適切な担体として使用されてもよく；リンガー溶液、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（トリエタノールアミンまたは注射用滅菌水、および５％デキストロースを含有する）等などの等張溶液が用いられるのが好ましい。医薬組成物の製剤は当該分野にて知られており、具体的にはRemington Pharmaceutical Sciences（第19版、1995）等に言及し得る。この刊行物は本明細書の記載の一部であると考えられる。
【００７９】
医薬組成物の好ましい用量は、患者の状態、体重、性別、年齢、患者の重篤度、および投与経路に応じて、一日当たり０.０１μｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇ、または０.０１ｍｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇの範囲であってもよい。該用量は一日１回で投与されてもよく、あるいは一日数回に分けてもよい。かかる用量はどの態様であっても本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【００８０】
医薬組成物が適用（処方）され得る対象は哺乳類およびヒトであり、特にヒトが好ましい。活性成分に加えて、本願の医薬組成物は、安全性について既に認証されており、抗がん活性のあることが知られており、抗がん活性を促進または強化するために、感染症に対して治療効果のあることが分かっている、いずれの化合物または天然抽出剤をさらに含有してもよい。
【００８１】
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症を治療するためにＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質の使用が提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症に対する治療効果を高めるためにＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質の使用が提供される。
【００８２】
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症の治療用の医薬を製造するためにＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質の使用が提供される。
本発明のその上さらにもう一つ別の態様において、がんまたは感染症を治療する方法、および／またはがんまたは感染症に対する治療効果を強化する方法であって、対象に、ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質、または２つの融合タンパク質が結合している融合タンパク質二量体を投与することを含む、方法が提供される。
【００８３】
対象はがんまたは感染症を患っている個体であってもよい。加えて、対象は哺乳類、好ましくはヒトであってもよい。ＩＬ−２タンパク質およびＣＤ８０タンパク質を含む融合タンパク質、または２つの融合タンパク質が結合している融合タンパク質二量体は上記されるとおりである。
【００８４】
融合タンパク質または融合タンパク質二量体の投与経路、用量、および投与頻度は、患者の状態、および副作用の有無に応じて変化してもよく、かくして該融合タンパク質または融合タンパク質二量体は様々な方法および量で対象に投与されてもよい。最適な投与方法、用量、および投与頻度は、適切な範囲にて、当業者によって選択され得る。
【００８５】
加えて、融合タンパク質または融合タンパク質の二量体は、治療されるべき疾患に関してその治療効果が知られている、他の薬物または生理的に活性な物質と組み合わせて投与されてもよく、あるいは他の薬物との併用製剤の形態にて処方されてもよい。
【００８６】
ＩＬ−２活性に起因して、該融合タンパク質は、本発明の実施態様において、ナチュラルキラー細胞などの免疫細胞を活性化しうる。かくして、該融合タンパク質はがんおよび感染症に効果的に使用され得る。特に、野生型と比べて、２ないし５個のアミノ酸置換があるＩＬ−２変種は、とりわけ、Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ、Ｅ６１Ｒ、およびＬ７２Ｇからなる群より選択される位置のうちで、２、３、４または５個の位置でアミノ酸置換を有するＩＬ−２変種が、ＩＬ−２受容体アルファ鎖に対して結合能が小さく、かくして従来のＩＬ−２の薬理的副作用に関して改善された特性を示すことが確認された。かくして、かかるＩＬ−２変種は、単独で、または融合タンパク質の形態にて使用される場合、血管（または毛細管）漏出症候群（ＶＬＳ、vascular leakage syndrome）、通常知られているＩＬ−２での問題の発生率を下げることができる。
【００８７】
発明の形態
本発明を次の実施例を用いてさらに詳細に記載する。しかしながら、次の実施例は本発明を説明するに過ぎず、本発明の範囲がそれに限定されるものではない。
【００８８】
Ｉ．  融合タンパク質の製造
製造例１．  ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ＩＬ−２変種（２Ｍ）：ＧＩ１０１の製造
ヒトＣＤ８０フラグメント、Ｆｃドメイン、およびＩＬ−２変種を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社（Thermo Fisher Scientific）のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシス（Invitrogen GeneArt Gene Synthesis）サービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号：１）、ＣＤ８０フラグメント（配列番号：２）、Ｉｇヒンジ（配列番号：３）、Ｆｃドメイン（配列番号：４）、リンカー（配列番号：５）、および２個のアミノ酸置換を有するＩＬ−２変種（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号：６）を、Ｎ−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：８）を含有する。該ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３_４ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ−ＣＨＯＴＭ）に導入し、配列番号：９の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、および８％ＣＯ２濃度の環境下で７日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「ＧＩ１０１」と称した。
【００８９】
マブセレクト・スレ（MabSelect SuRe）タンパク質Ａ樹脂を含むクロマトグラフィーを用いて精製を行った。該融合タンパク質を２５ｍＭトリス（Tris）、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７.４の条件下でそれと結合させた。次に、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭ酢酸、ｐＨ３で溶出を行った。２０％  １Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）を捕集管に入れ、ついで該融合タンパク質を集めた。融合タンパク質を集めるのに、緩衝液を１６時間にわたって透析してＰＢＳ緩衝液と交換した。
【００９０】
その後で、ＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷＸＬカラム（TOSOH Bioscience）を用いてサイズ排除クロマトグラフィーに付し、２８０ｎｍ波長での吸光度を経時的に測定し、高度に濃縮された融合タンパク質を得た。ここで、単離かつ精製された融合タンパク質を還元（Ｒ）または非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルー（Coomassie Blue）で染色し、その純度をチェックした（図６）。ナノドロップ（NanoDrop）で検出すると、該融合タンパク質が２.７８ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれていることが同定された（図７）。加えて、サイズ排除クロマトグラフィーを用いて分析することによって得られた結果を図８にて提供する。
【００９１】
製造例２．  ｍＣＤ８０−Ｆｃ−ＩＬ−２変種（２Ｍ）：ｍＧＩ１０１の製造
マウスＣＤ８０、Ｆｃドメイン、およびＩＬ−２変種を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号：１）、ｍＣＤ８０（配列番号：１３）、Ｉｇヒンジ（配列番号：３）、Ｆｃドメイン（配列番号：４）、リンカー（配列番号：５）、および２個のアミノ酸置換を有するＩＬ−２変種（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号：６）を、Ｎ−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：１４）を含有する。該ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３_４ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ−ＣＨＯＴＭ）に導入し、配列番号：１５の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、および８％ＣＯ２濃度の環境下で７日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「ｍＧＩ１０１」と称した。
【００９２】
融合タンパク質の精製および収集は、製造例１での操作と同じ操作で実施された。単離かつ精製された融合タンパク質を還元（Ｒ）または非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルーで染色し、その純度をチェックした（図９）。ナノドロップを用い、２８０ｎｍでの吸光度で検出すると、該融合タンパク質が１.９５ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれていることが判明した。
【００９３】
製造例３．  ｈＣＤ８０−Ｆｃ：ＧＩ１０１Ｃ１の製造
ヒトＣＤ８０フラグメント、およびＦｃドメインを含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号：１）、ＣＤ８０フラグメント（配列番号：２）、Ｉｇヒンジ（配列番号：３）、およびＦｃドメイン（配列番号：４）を含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：１６）を含有する。該ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３_４ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ−ＣＨＯＴＭ）に導入し、配列番号：１７の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、および８％ＣＯ２濃度の環境下で７日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「ＧＩ１０１Ｃ１」と称した。
【００９４】
融合タンパク質の精製および収集は、製造例１での操作と同じ操作で実施された。単離かつ精製された融合タンパク質を還元（Ｒ）または非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルーで染色し、その純度をチェックした（図１０）。ナノドロップを用い、２８０ｎｍでの吸光度で検出すると、該融合タンパク質が３.６１ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれていることが観察された。
【００９５】
製造例４．  Ｆｃ−ＩＬ−２変種（２Ｍ）：ＧＩ１０１Ｃ２の製造
ＦｃドメインおよびＩＬ−２変種を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号：１）、Ｆｃドメイン（配列番号：４）、リンカー（配列番号：５）、および２個のアミノ酸置換を有するＩＬ−２変種（２Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ）（配列番号：６）を、Ｎ−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：１８）を含有する。該ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３_４ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ−ＣＨＯＴＭ）に導入し、配列番号：１９の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、および８％ＣＯ２濃度の環境下で７日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「ＧＩ１０１Ｃ２」と称した。
【００９６】
融合タンパク質の精製および収集は、製造例１での操作と同じ操作で実施された。単離かつ精製された融合タンパク質を還元（Ｒ）または非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルーで染色し、その純度をチェックした（図１１）。ナノドロップを用い、２８０ｎｍでの吸光度で検出すると、該融合タンパク質が４.７９ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれていることが判明した。
【００９７】
製造例５．  ｍＣＤ８０−Ｆｃ：ｍＧＩ１０１Ｃ１の製造
マウスＣＤ８０およびＦｃドメインを含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号：１）、ｍＣＤ８０（配列番号：１３）、Ｉｇヒンジ（配列番号：３）、およびＦｃドメイン（配列番号：４）を、Ｎ−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２０）を含有する。該ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３_４ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ−ＣＨＯＴＭ）に導入し、配列番号：２１の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、および８％ＣＯ２濃度の環境下で７日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「ｍＧＩ１０１Ｃ１」と称した。
【００９８】
融合タンパク質の精製および収集は、製造例１での操作と同じ操作で実施された。単離かつ精製された融合タンパク質を還元（Ｒ）または非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルーで染色し、その純度をチェックした（図１２）。ナノドロップを用い、２８０ｎｍでの吸光度で検出すると、該融合タンパク質が２.４９ｍｇ／ｍｌの濃度で含まれていることが観察された。
【００９９】
製造例１〜５において製造される融合タンパク質を以下の表１において要約する。
表１
【表１】
2021511081.tif 000004
【０１００】
製造例６．  ＣＤ８０−Ｆｃ−ＩＬ−２：ＧＩ１０１ｗの製造
ヒトＣＤ８０フラグメント、Ｆｃドメイン、およびヒトＩＬ−２を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号：１）、ＣＤ８０フラグメント（配列番号：２）、Ｉｇヒンジ（配列番号：３）、Ｆｃドメイン（配列番号：４）、リンカー（配列番号：５）、および成熟ヒトＩＬ−２（配列番号：１０）を、Ｎ−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：３１）を含有する。該ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３_４ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ−ＣＨＯＴＭ）に導入し、配列番号：３２の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、および８％ＣＯ２濃度の環境下で７日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「ＧＩ１０１ｗ」と称した。融合タンパク質の精製および収集は製造例１での操作と同じ操作で実施された。
【０１０１】
製造例７．  ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ＩＬ−２変種（３Ｍ）：ＧＩ１０２−Ｍ４５の製造
ヒトＣＤ８０フラグメント、Ｆｃドメイン、および３個のアミノ酸置換を有するＩＬ−２変種（３Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｙ４５Ａ）（ＧＩ１０２−Ｍ４５）を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号：１）、ＣＤ８０フラグメント（配列番号：２）、Ｉｇヒンジ（配列番号：３）、Ｆｃドメイン（配列番号：４）、リンカー（配列番号：５）、およびＩＬ−２変種（配列番号：２２）を、Ｎ−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２５）を含有する。該ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３_４ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ−ＣＨＯＴＭ）に導入し、配列番号：２６の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、および８％ＣＯ２濃度の環境下で７日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「ＧＩ１０２−Ｍ４５」と称した。
【０１０２】
融合タンパク質の精製および収集は製造例１での操作と同じ操作で実施された。単離かつ精製された融合タンパク質を還元（Ｒ）または非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルーで染色し、その純度をチェックした（図１３）。
【０１０３】
製造例８．  ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ＩＬ−２変種（３Ｍ）：ＧＩ１０２−Ｍ６１の製造
ヒトＣＤ８０フラグメント、Ｆｃドメイン、および３個のアミノ酸置換を有するＩＬ−２変種（３Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ）（ＧＩ１０２−Ｍ６１）を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号：１）、ＣＤ８０フラグメント（配列番号：２）、Ｉｇヒンジ（配列番号：３）、Ｆｃドメイン（配列番号：４）、リンカー（配列番号：５）、およびＩＬ−２変種（配列番号：２３）を、Ｎ−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２７）を含有する。該ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３_４ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ−ＣＨＯＴＭ）に導入し、配列番号：２８の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、および８％ＣＯ２濃度の環境下で７日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「ＧＩ１０２−Ｍ６１」と称した。
【０１０４】
融合タンパク質の精製および収集は製造例１での操作と同じ操作で実施された。単離かつ精製された融合タンパク質を還元（Ｒ）または非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルーで染色し、その純度をチェックした（図１４）。
【０１０５】
製造例９．  ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ＩＬ−３Ｍ：ＧＩ１０２−Ｍ７２の製造
ヒトＣＤ８０フラグメント、Ｆｃドメイン、および３個のアミノ酸置換を有するＩＬ−２変種（３Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｌ７２Ｇ）（ＧＩ１０２−Ｍ７２）を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号：１）、ＣＤ８０フラグメント（配列番号：２）、Ｉｇヒンジ（配列番号：３）、Ｆｃドメイン（配列番号：４）、リンカー（配列番号：５）、およびＩＬ−２変種（配列番号：２４）を、Ｎ−末端からこの順序で含有する、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：２９）を含有を含有する。該ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３_４ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ−ＣＨＯＴＭ）に導入し、配列番号：３０の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、および８％ＣＯ２濃度の環境下で７日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「ＧＩ１０２−Ｍ７２」と称した。
【０１０６】
融合タンパク質の精製および収集は製造例１での操作と同じ操作で実施された。単離かつ精製された融合タンパク質を還元（Ｒ）または非還元（ＮＲ）条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、クマシーブルーで染色し、その純度をチェックした（図１５）。
【０１０７】
製造例１０．  ｍＣＤ８０−Ｆｃ−ＩＬ−３Ｍ：ｍＧＩ１０２−Ｍ６１の製造
マウスＣＤ８０フラグメント、Ｆｃドメイン、および３個のアミノ酸置換を有するＩＬ−２変種（３Ｍ）（Ｒ３８Ａ、Ｆ４２Ａ、Ｅ６１Ｒ）（ＧＩ１０２−Ｍ６１）を含む融合タンパク質を産生するために、サーモフィッシャーサイエンティフィック社のインビトロゲン・ジンアート・ジン・シンセシスサービスを通してポリヌクレオチドを合成した。具体的には、該ポリヌクレオチドは、シグナルペプチド（配列番号：１）、ｍＣＤ８０フラグメント（配列番号：１３）、Ｉｇヒンジ（配列番号：３）、Ｆｃドメイン（配列番号：４）、リンカー（配列番号：５）、およびＩＬ−２変種（配列番号：２３）を、Ｎ−末端からこの順序で含有する融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列（配列番号：３３）を含有する。該ポリヌクレオチドをｐｃＤＮＡ３_４ベクターに挿入した。加えて、該ベクターをＣＨＯ細胞（Ｅｘｐｉ−ＣＨＯＴＭ）に導入し、配列番号：３４の融合タンパク質を発現させた。該ベクターを導入した後、３７℃、１２５ＲＰＭ、および８％ＣＯ２濃度の環境下で７日間にわたって培養を行った。次に、該培養物を収穫し、そこから融合タンパク質を精製した。その精製した融合タンパク質を「ｍＧＩ１０２−Ｍ６１」と称した。
融合タンパク質の精製および収集は製造例１での操作と同じ操作で実施された。
【０１０８】
ＩＩ．  融合タンパク質と、そのリガンドとの間の結合親和性の同定
融合タンパク質と、そのリガンドとの間の結合親和性を同定するために、その結合親和性をＯｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ３８４を用いて測定した。
【０１０９】
実験例１．  ｈＣＴＬＡ−４と、ＧＩ１０１との間の結合親和性の同定
ＡＲ２Ｇ（Amine Reactive 2nd gen）バイオセンサー（ForteBio、カタログ番号：１８−５０９２）を、９６ウェルのマイクロプレート（Greiner Bio-one、カタログ番号：６５５２０９）において、２００μｌの蒸留水で予め水和させた。該ＡＲ２Ｇバイオセンサーと結合させるリガンド（ＣＴＬＡ−４、ヒトＣＴＬＡ−４／ＣＤ１５２、Ｈｉｓタグ、Sino Biological、カタログ番号：１１１５９−Ｈ０８Ｈ）を１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５、ＡＲ２Ｇ試薬キット（AR2G reagent Kit）、ForteBio、カタログ番号：１８−５０９５）で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。加えて、該リガンドと結合させるＧＩ１０１を１ｘＡＲ２Ｇ  カイネティック緩衝液（ＡＲ２Ｇ試薬キット、ForteBio、カタログ番号：１８−５０９５）で１,０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、または６２.５ｎＭの濃度に希釈した。２０ｍＭ  ＥＤＣと１０ｍＭ  ｓ−ＮＨＳ（ＡＲ２Ｇ試薬キット、ForteBio、カタログ番号：１８−５０９５）とを蒸留水中で混合することによって活性化緩衝液を製造した。８０μｌの各試薬を３８４ウェルのマイクロプレート（Greiner Bio-one、カタログ番号：７８１２０９）に置き、プログラムをセットアップした。
【０１１０】
その結果、ｈＣＴＬＡ−４およびＧＩ１０１の間の結合親和性が、図１６に示されるように、測定された。
【０１１１】
実験例２．  ｈＰＤ−Ｌ１／ＧＩ１０１と、ｈＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１との間の結合親和性の同定
Ｎｉ−ＮＴＡ（ニッケルをチャージしたトリス−ＮＴＡ、Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサー、ForteBio、１８−５１０１）を、９６ウェルのマイクロプレート（Greiner Bio-one、カタログ番号：６５５２０９）において、２００μｌの１ｘＮｉ−ＮＴＡカイネティック緩衝液（１０ｘカイネティック緩衝液、ForteBio、カタログ番号：１８−１０４２）で予め水和させた。Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサーと結合させるリガンド（ヒトＰＤ−Ｌ１／Ｂ７−Ｈ１タンパク質、Ｈｉｓ−タグ、Sino biological、カタログ番号：１００８４−Ｈ０８Ｈ）を１ｘＮｉ−ＮＴＡカイネティック緩衝液で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。該リガンドと結合させるＧＩ１０１を１ｘＮｉ−ＮＴＡカイネティック緩衝液で１,０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、または６２.５ｎＭに希釈した。加えて、該リガンドと結合させるヒトＰＤ−１／ＰＤＣＤ１（ヒトＰＤ−１／ＰＤＣＤ１、Ｆｃ  Ｔａｇ、Sino Biological、カタログ番号：１０３７７−Ｈ０２Ｈ）を、１ｘＮｉ−ＮＴＡカイネティック緩衝液で２,０００ｎＭ、１,０００ｎＭ、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、または１２５ｎＭの濃度に希釈した。ついで、８０μｌの各試薬を３８４ウェルのマイクロプレートに置き、プログラムをセットアップした。
【０１１２】
結果として、ｈＰＤ−Ｌ１とＧＩ１０１との間の結合親和性が、図１７に示されるように、測定された。加えて、ｈＰＤ−Ｌ１とｈＰＤ−１との間の結合親和性が、図１８に示されるように、測定された。
【０１１３】
実験例３．  ｍＣＴＬＡ−４とｍＧＩ１０１との間の結合親和性の同定
ｍＣＴＬＡ−４とｍＧＩ１０１との間の結合親和性を実験例１と同様にして試験した。ここで、使用される用品は次のとおりである：バイオセンサー：ＡＲ２Ｇ、リガンド：ｍＣＴＬＡ−４（組換えマウスＣＴＬＡ−４  Ｆｃキメラ、R&D Systems、カタログ番号：４３４−ＣＴ−２００）、分析物：ｍＧＩ１０１（５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２.５ｎＭ、３１.３ｎＭ）
【０１１４】
結果として、ｍＣＴＬＡ−４とｍＧＩ１０１との間の結合親和性が、図１９に示されるように、測定された。
【０１１５】
実験例４．  ｍＰＤ−Ｌ１とｍＧＩ１０１との間の結合親和性の同定
ｍＰＤ−Ｌ１とｍＧＩ１０１との間の結合親和性を実験例１と同様にして同定した。ここで、使用の用品は次のとおりである。バイオセンサー：ＡＲ２Ｇ、リガンド：ｍＰＤ−Ｌ１（組換えマウスＢ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１  Ｆｃキメラ、R&D Systems、カタログ番号：４３４−ＣＴ−２００）、分析物：ｍＧＩ１０１（５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、６２.５ｎＭ、３１.３ｎＭ）
【０１１６】
結果として、ｍＰＤ−Ｌ１とｍＧＩ１０１との間の結合親和性が、図２０に示されるように、測定された。
【０１１７】
実験例５．  ＧＩ−１０１（ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ｈＩＬ−２ｖ）のＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１に対する結合親和性の同定
結合キネティクスの測定は、オクテットＲＥＤ３８４装置（ForteBio、Pall Life Science）を用い、３０℃および１,０００ｒｐｍでかき混ぜることでなされた。ＣＴＬＡ−４に対する結合能はアミン反応性第２世代（ＡＲ２Ｇ）バイオセンサーチップを用いて測定され、ＰＤ−Ｌ１に対する結合能はニッケルチャージのトリス−ＮＴＡ（Ｎｉ−ＮＴＡ）バイオセンサーチップを用いて測定された。ＡＲ２Ｇバイオセンサーチップは４００ｍＭのＥＤＣを１００ｍＭのスルホ−ＮＨＳと合わせることで活性化された。次に、ヒトＣＴＬＡ−４−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（Sino Biological、カタログ番号：１１１５９−Ｈ０８Ｈ）を１０ｍＭ  酢酸緩衝液（ｐＨ５）で５μｇ／ｍｌに希釈し、ＡＲ２Ｇバイオセンサーチップ上に３００秒間ローディングさせて固定した。
【０１１８】
次に、ＣＴＬＡ−４の、種々の濃度でのＧＩ−１０１（ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ｈＩＬ−２ｖ）、ＧＩ−１０１Ｃ１（ｈＣＤ８０−Ｆｃ）、イピリムマブ（Ipilimumab）（Bristol-Myers Squibb）、およびＧＩ−１０１Ｃ２（Ｆｃ−ｈＩＬ−２ｖ）に対する結合を３００秒間測定し、その解離も３００秒間測定した。他方で、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（Sino biological、カタログ番号：１００８４−Ｈ０８Ｈ）を１ｘＮｉ−ＮＴＡカイネティック緩衝液で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサーチップ上に６００秒間ローディングさせて固定した。次に、ＰＤ−Ｌ１の、種々の濃度でのＧＩ−１０１、ＧＩ−１０１Ｃ１、ｈＰＤ−１−Ｆｃ（Sino biological、カタログ番号：１０３７７−Ｈ０２Ｈ）、およびＧＩ１０１Ｃ２に対する結合を３００秒間測定し、その解離も３００秒間測定した。結合キネティクス分析は、Pall Corporationより提供されるオクテットデータアナライシスＨＴソフトウェア  バージョン１０を用いてなされた。結果を図２１および２２において示す。
【０１１９】
実験例６．  ＧＩ−１０１（ｈＣＤ８０−Ｆｃ−ｈＩＬ−２ｖ）のＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１結合に対する作用の同定
遮断実験は、オクテットＲＥＤ３８４装置（ForteBio、Pall Life Science）を用い、３０℃および１,０００ｒｐｍでかき混ぜて行われた。ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｈｉｓ  Ｔａｇ（Sino biological、カタログ番号：１００８４−Ｈ０８Ｈ）を１ｘＮｉ−ＮＴＡカイネティック緩衝液で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈し、Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサーチップ上に６００秒間ローディングさせて固定した。遮断実験を進行させるために、バイオセンサーチップに固定したｈＰＤ−Ｌ１を種々の濃度（３００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２.５ｎＭ、および０ｎＭ）のＧＩ−１０１と６００秒間にわたって結合させ、次にさらなるｈＰＤ−１がそれとどの程度結合し得るかを測定するために、コンペチタ−のヒトＰＤ−１（１００ｎＭ）と６００秒間にわたって再び結合させた。対照的に、ｈＰＤ−Ｌ１はｈＰＤ−１と種々の濃度（３００ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、１２.５ｎＭ、および０ｎＭ）で６００秒間にわたって結合させ、次にさらなるＧＩ−１０１がそれとどの程度結合し得るかを測定するために、コンペチタ−のＧＩ−１０１（１００ｎＭ）と６００秒間にわたって再び結合させた。遮断実験は、Pall Corporationより提供されるオクテットデータアナライシスＨＴソフトウェア  バージョン１０のエピトープビニングメニュー（epitope bining menu）を用いて分析された。結果を図２３において示す。
【０１２０】
実験例７．  ＩＬ−２ＲαまたはＩＬ−２ＲβとＧＩ１０１との間の結合親和性の同定
ＩＬ−２Ｒαを標的とする結合親和性は、ＡＲ２Ｇバイオセンサーを用いて測定され、ＩＬ−２Ｒβを標的とする結合親和性はＮｉ−ＮＴＡバイオセンサー（ニッケルをチャージしたトリス−ＮＴＡ、Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサー、ForteBio、１８−５１０１）を用いて測定された。
【０１２１】
ＡＲ２Ｇバイオセンサーと結合させるリガンド（ＩＬ−２Ｒα−Ｈｉｓ  Ｔａｇ、Acro、カタログ番号：ＩＬＡ−Ｈ５２Ｈ９）を１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５、ＡＲ２Ｇ試薬キット、ForteBio、カタログ番号：１８−５０９５）で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。該ＡＲ２Ｇバイオセンサーを、４００ｍＭ  ＥＤＣと１００ｍＭ  スルホ−ＮＨＳとを混合することによって製造された緩衝液で活性化させ、次にその希釈したリガンドをＡＲ２Ｇバイオセンサー上に３００秒間にわたってローディングさせて固定した。
【０１２２】
一方で、Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサーと結合させるリガンド（ＩＬ−２Ｒβ−Ｈｉｓ  Ｔａｇ、Acro、カタログ番号：ＣＤ２−H５２２１）を１ｘＮｉ−ＮＴＡカイネティック緩衝液で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。その希釈したリガンドをＮｉ−ＮＴＡバイオセンサー上に６００秒間にわたってローディングさせて固定した。
【０１２３】
その後で、種々の濃度でリガンドと結合させるＧＩ１０１、ＧＩ１０１ｗ、またはプロロイキン（Proleukin）（Novartis、ｈＩＬ−２）を３００秒間にわたってその上にローディングさせた。次にその結合を測定し、その解離も３００秒間測定した。結合キネティクス分析は、Pall Corporationより提供されるオクテットデータアナライシスＨＴソフトウェア  バージョン１０を用いてなされた。結果を図２４〜２６において示す。
【０１２４】
その結果、ＧＩ１０１ｗおよびプロロイキンと比較した場合、ＧＩ１０１は、ＩＬ−２受容体アルファ鎖、ＩＬ−２Ｒαを標的とする結合親和性は低く、ＩＬ−２Ｒβを標的とする結合親和性は高いことが同定された。
【０１２５】
実験例８．  融合タンパク質とリガンドとの間の結合親和性の測定
融合タンパク質とそのリガンドとの間の結合親和性を同定するために、オクテットＲＥＤ３８４を用いて結合親和性を測定した。
【０１２６】
実験例８.１．  ＩＬ２アルファ受容体と、ＧＩ１０１−Ｍ４５、ＧＩ１０１−Ｍ６１、またはＧＩ１０１−Ｍ７２との間の結合親和性の同定
ＡＲ２Ｇバイオセンサー（アミン反応性第２世代、ForteBio、カタログ番号：１８−５０９２）を２００μｌの蒸留水（ＤＷ）を用いて９６ウェルマイクロプレート（GreinerBio-one、カタログ番号：６５５２０９）において予め水和させた。該バイオセンサーと結合させるリガンド（ヒトＩＬ−２Ｒアルファタンパク質、Ｈｉｓ  Ｔａｇ、Acro、ＩＬＡ−Ｈ５２Ｈ９）を１０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ５）（ＡＲ２Ｇ試薬キット、ForteBio、カタログ番号：１８−５０９５）で５μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。該リガンドと結合させる分析物（ＧＩ１０１−Ｍ４５、ＧＩ１０１−Ｍ６１、ＧＩ１０１−Ｍ７２）を１ｘＡＲ２Ｇカイネティック緩衝液（ＡＲ２Ｇ試薬キット、ForteBio、カタログ番号：１８−５０９５）で、各々、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、および６２.５ｎＭに希釈した。２０ｍＭ  ＥＤＣおよび１０ｍＭ  ｓ−ＮＨＳ（ＡＲ２Ｇ試薬キット、ForteBio、カタログ番号：１８−５０９５）をＤＷ中で混合することによって活性化緩衝液を製造した。８０μｌの各試薬を３８４ウェルのマイクロプレート（Greiner Bio-one、カタログ番号：７８１２０９）に配置し、プログラムをセットアップした。
【０１２７】
結果として、ＩＬ２アルファ受容体とＧＩ１０１−Ｍ４５との間の結合親和性を図２７にて示す。加えて、ＩＬ２アルファ受容体とＧＩ１０１−Ｍ６１との間の結合親和性を図２８にて示し、ＩＬ２アルファ受容体とＧＩ１０１−Ｍ７２との間の結合親和性を図２９にて示す。
【０１２８】
実験例８.２．  ＧＩ１０２−Ｍ４５、ＧＩ１０２−Ｍ６１、およびＧＩ１０２−Ｍ７２のＩＬ−２Ｒβに対する結合親和性の同定
Ｎｉ−ＮＴＡバイオセンサーを、２００μｌの１ｘＮｉ−ＮＴＡカイネティック緩衝液（１０ｘカイネティック緩衝液、ForteBio、１８−１０４２）で９６ウェルのマイクロプレートにおいて予め水和させた。該バイオセンサーと結合させるリガンド（ヒトＩＬ−２Ｒベータタンパク質、Ｈｉｓ−Ｔａｇ、Acro、ＣＤ２−Ｈ５２２１）を１ｘＮｉ−ＮＴＡカイネティック緩衝液で２μｇ／ｍｌの濃度に希釈した。該リガンドと結合させるＧＩ１０２−Ｍ４５、ＧＩ１０２−Ｍ６１、またはＧＩ１０２−Ｍ７２を１ｘＮｉ−ＮＴＡカイネティック緩衝液で５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１２５ｎＭ、または６２.５ｎＭの濃度に希釈した。８０μｌの各試薬を３８４ウェルのマイクロプレートに配置し、プログラムをセットアップした。
【０１２９】
結果として、ＩＬ−２ＲβおよびＧＩ１０２−Ｍ４５の間の結合親和性を測定し、図３０にて示し、ＩＬ−２ＲβおよびＧＩ１０２−Ｍ６１の間の結合親和性を測定し、図３１にて示す。加えて、ＩＬ−２ＲβおよびＧＩ１０２−Ｍ７２の間の結合親和性を測定し、図３２にて示す。
【０１３０】
ＩＩＩ．  融合タンパク質の免疫活性の同定
実験例９．  融合タンパク質によって惹起されるＩＦＮ−γ産生の同定
実験例９.１．  ＣＦＳＥ標識を付したＰＢＭＣの培養
ヒトから単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１μＭセルトレース（CellTrace）ＣＦＳＥ色素と３７℃で２０分間にわたって反応させることにより、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）での標識に付した。細胞と結合していないＣＦＳＥは、５倍容量の染色反応溶液を含む培地で５分間反応させ、ついで１,３００ｒｐｍで５分間遠心分離に付すことによって除去された。ＣＦＢ標識を付したＰＢＭＣを培地（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５５μＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭの非必須アミノ酸、および２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地）に再び懸濁させ、次にウェルに付き１ｘ１０５個の細胞で９６ウェルのプレートに加えた。５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（インゲンマメ、アカインゲンマメから由来のラクチン、Sigma-Aldrich、St. Louis、ＭＯ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｌ１６６８−５ＭＧ）、およびＧＩ１０１、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、またはＩＬ−２（アルデスロイキン；ヒト組換えＩＬ−２、Novartis）を用いる処理を行い、インキュベーションを５％ＣＯ２のインキュベーター中、３７℃で６日間にわたって行った。
【０１３１】
ここで、ＧＩ１０１、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、およびＩＬ−２での処理を１ｎＭ、１０ｎＭ、または１００ｎＭの濃度で行った。細胞をＦＡＣＳで分析し、培地中に含まれるヒトＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡキット（Biolegend、San Diego、ＣＡ、ＵＳＡ、カタログ番号４３０１０３）を用いて測定した。
【０１３２】
実験例９.２．  ＦＡＣＳ分析
上澄みを除去することによって得られた細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液（３％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１Ｍ  ＨＥＰＥＳ、１００単位／ｍＬのペニシリン  ストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌ、１ｍＭピルビン酸ナトリウム）で洗浄し、次にＦｃブロッカー（Biolegend、カタログ番号４２２３０２）と４℃で５分間反応させた。次に、ＡＰＣ抗−ＣＤ３Ａｂ（Biolegend、カタログ番号３００４１２）およびＰＥ抗−ＣＤ８ａＡｂ（Biolegend、カタログ番号３００９０８）での処理を行い、反応を４℃で２０分間にわたって進行させた。ついで、得られた反応物をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄した。細胞ペレットをＦＡＣＳ緩衝液に再び懸濁させ、次にBD LSR Fortessa（BD Biosciences、San Diego、ＣＡ、ＵＳＡ）およびFlowJoソフトウェアを用いて分析した。
【０１３３】
実験例９.３．  ヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡ
細胞を培養した、各サンプルの上澄みに分泌されるヒトＩＦＮ−γの量を、ヒトＩＦＮ−γＥＬＩＳＡキット（Biolegend、カタログ番号４３０１０３）を用いて測定した。簡単に言えば、抗−ヒト−ＩＦＮ−γ抗体をＥＬＩＳＡプレートに加え、これらの抗体がその上で被覆されるように、反応を４℃で一夜進行させた。次に、１％ＢＳＡを添加したＰＢＳ溶液を用いて遮断を室温で１時間行った。洗浄緩衝液（ＰＢＳ中０.０５％ツィーン２０）での洗浄を行い、次に標準溶液および各サンプルを適切に希釈し、そこに添加した。ついで、室温で２時間にわたって反応を進行させた。
【０１３４】
反応の終了した後、該プレートを洗浄し、第２抗体（検出抗体）をそこに加えた。室温で１時間にわたって反応を進行させた。洗浄緩衝液での洗浄を行い、次にアビジン−ＨＲＰ溶液をそこに加えた。室温で３０分間にわたって反応を進行させた。そこに基質溶液を添加し、発色現像反応を暗所にて室温で２０分間にわたって誘発させた。最後に、Ｈ２ＳＯ４をそこに添加し、発色現像反応を停止させ、４５０ｎｍでの吸光度をエポック・マイクロプレート・スペクトロフォトメータ（Epoch Microplate Spectrophotometer）（BioTek Instruments, Inc.、Winooski、ＶＴ、ＵＳＡ）を用いて測定した。
【０１３５】
結果として、ＧＩ１０１で処理した細胞が、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、またはＩＬ−２で処理した細胞と比べて、ＩＦＮ−γの分泌において著しい増加を示すことが判明した（図３３および３４）。
【０１３６】
実験例１０．  ＧＩ１０１のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖についての効果の同定
ヒトから単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、１μＭセルトレースＣＦＳＥ色素と３７℃で２０分間にわたって反応させることにより、ＣＦＳＥでの標識に付した。細胞と結合していないＣＦＳＥは、５倍容量の染色反応溶液を含む培地で５分間反応させ、ついで１,３００ｒｐｍで５分間遠心分離に付すことによって除去された。ＣＦＢ標識を付したＰＢＭＣを培地（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５５μＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭの非必須アミノ酸、および２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地）に再び懸濁させ、次にウェルに付き１ｘ１０５個の細胞で９６ウェルのプレートに加えた。
【０１３７】
その後で、１μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３ε抗体（Biolegend、カタログ番号Ｌ１６６８−５ＭＧ）、およびＧＩ１０１、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、またはプロロイキン（Novartis）での処理を行い、５％ＣＯ２のインキュベーター中、３７℃で６日間にわたってインキュベーションを行った。ここで、該細胞をＧＩ１０１、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、およびＩＬ−２と１００ｎＭの濃度で処理した。インキュベートした細胞を、ＡＰＣ−ＴＣＲαβおよびＰＥ−ＣＤ８α抗体を用いるＦＡＣＳ分析で、ＣＦＳＥで標識されていないＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を測定することにより、その増殖の程度について試験した。
【０１３８】
結果として、ＧＩ１０１は、ＣＤ８＋Ｔ細胞のインビトロにおける増殖を野生型ＩＬ−２プロロイキンと同様の程度まで活性化させることが判明した（図３５および３６）。
【０１３９】
実験例１１．  ＧＩ１０１およびＧＩ１０２のＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖についての効果の同定
ヒトＰＢＭＣをAllcells（ロット番号３０１４９２８、ＵＳＡ）より購入した。１ＭのセルトレースのＣＦＳＥ色素を用い、それをヒトＰＢＭＣと光遮断条件下にて室温で２０分間反応させた。１ＭセルトレースのＣＦＳＥ色素と３７℃で２０分間反応させることにより該細胞をＣＦＳＥでの標識に付した。細胞と結合していないＣＦＳＥは、５倍容量の染色反応溶液を含む培地で５分間反応させ、ついで１,３００ｒｐｍで５分間遠心分離に付すことによって除去された。ＣＦＢ標識を付したＰＢＭＣを培地（１０％ＦＢＳ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン／ストレプトマイシン、１ｍＭピルビン酸ナトリウム、５５μＭの２−メルカプトエタノール、１ｍＭの非必須アミノ酸、および２ｍＭのＬ−グルタミンを含有するＲＰＭＩ１６４０培地）に再び懸濁させ、次にウェルに付き１ｘ１０５個の細胞で９６ウェルのプレートに加えた。
【０１４０】
その後で、ＣＦＢ標識を付したＰＢＭＣを、１μｇ／ｍｌの抗−ＣＤ３ε抗体（ＯＫＴ３、eBioscience、ＵＳＡ）で、およびＧＩ１０１、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、またはプロロイキン（Novartis）で処理し、５％ＣＯ２のインキュベーター中、３７℃で７日間にわたってインキュベーションを行った。ここで、該細胞をＧＩ１０１、ＧＩ１０１Ｃ１、ＧＩ１０１Ｃ２、およびＩＬ−２と１０μＭの濃度での処理に供された。
【０１４１】
インキュベートした細胞を、抗−ヒトＣＤ４−ＰＥ抗体（BioLegend、ＵＳＡ）、抗−ヒトＣＤ８−ＰＥ／Ｃｙ７抗体（BioLegend、ＵＳＡ）、および抗−ヒトＦｏｘＰ３−ＡＰＣ抗体（BioLegend、ＵＳＡ）を用いるＦＡＣＳ分析で、ＣＦＳＥで標識されていないＣＤ８＋Ｔ細胞の割合を測定することにより、その増殖の程度について試験した。
【０１４２】
結果として、ＧＩ１０１、ＧＩ１０２_Ｍ６１、ＧＩ１０１Ｃ２、およびプロロイキンの処理群は、対照群（刺激なし）、抗−ＣＤ３抗体単独の処理群、およびＧＩ１０１Ｃ１の処理群と比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合において有意な増加を示した。加えて、負対照群（刺激なし）および抗−ＣＤ３単独の処理群と比べて、ＧＩ１０１、ＧＩ１０１Ｃ２、およびプロロイキンの処理群はＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増殖にて有意な増加を示すのに対して、ＧＩ１０２およびＧＩ１０１Ｃ１の処理群はＣＤ４＋／ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞の増殖にて有意な増加を示さなかった（図３７）。
【０１４３】
実験例１２．  ＧＩ１０１またはＧＩ１０１ｗのＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の増殖についての効果の同定
Orient Bio（Busan、Korea）より購入した７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、一群に付き３匹のマウスを有する３群に分け、それらにＰＢＳ、ＧＩ１０１、またはＧＩ１０１ｗを腹腔内に注射した。ここで、ＧＩ１０１およびＧＩ１０１ｗは、各々、２００μｌのＰＢＳ中に４０.５μｇを含むように製造され、それらの腹腔内に注射された。注射して５日経過した後、各群のマウスから脾臓を摘出した。そこから細胞を単離し、血球計数器を用いて細胞の全数を測定した。脾細胞を、ＡＰＣ−ＣＤ３ε抗体（Biolegend；１４５−２Ｃ１１）、ＰＥ−ＮＫ１.１抗体（Biolegend；ＰＫ１３６）、およびパシフィック・ブルー（Pacific blue）−ＣＤ８α抗体（BD；５３−６.７）を用いるＦＡＣＳで、その中のＣＤ８＋Ｔ細胞とＮＫ細胞の割合について試験した。それで、脾臓にあるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数を算定した。
【０１４４】
結果として、ＧＩ１０１は、ＧＩ１０１ｗと比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のインビボでの増殖を活性化することが同定された（図３８および３９）。
【０１４５】
実験例１３．  ＧＩ１０１の、Ｔ細胞の機能に関する効果の同定
実験は、ＣＴＬＡ−４遮断バイオアッセイキット（Promega、カタログ番号ＪＡ４００５）を用いて行われた。該実験は、簡単には、次のように記載される。液体窒素中に保持されたＣＴＬＡ−４エフェクター細胞を３７℃の恒温水浴にて３分間にわたって解凍し、０.８ｍｌのＣＴＬＡ−４エフェクター細胞を３.２ｍｌの予め加温に供したアッセイ緩衝液（９０％ＲＰＭI＋１０％ＦＢＳ）とよく混合した。次に、該混合物を９６ウェルの白色の細胞培養プレート（SPL、カタログ番号３０１９６）にウェル当たり２５μｌで添加した。次に、２５μｌのＧＩ１０１を種々の濃度でそれに添加した。負の対照として、２５μｌのアッセイ緩衝液をそこに添加した。次に、該白色プレートの細胞培養プレート（white plat cell culture plate）にカバーをかけ、ａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞が製造されるまで、室温に置いた。
【０１４６】
液体窒素中に保持されたａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞を３７℃の恒温水浴にて３分間にわたって解凍し、０.８ｍｌのａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞を３.２ｍｌの予め加温に供したアッセイ緩衝液とよく混合した。次に、ウェル当たり２５μｌの該混合物を該プレートに添加し、５％ＣＯ２のインキュベーター中、３７℃で１６時間にわたって反応を進行させた。反応の終了した後、得られた反応物を室温で１５分間にわたって放置し、次に気泡の発生を回避することに注意しながらＢｉｏ−Ｇｌｏ試薬をそこに添加した。一番外側の３つのウェルにもＢｉｏ−Ｇｌｏ試薬を添加し、該ウェルをブランクとして用い、バックグラウンドシグナルを修正した。室温で１０分間にわたって反応を進行させ、次にサイテーション（Cytation）（登録商標）３（BioTek Instruments, Inc.、Winooski、ＶＴ、ＵＳＡ）で発光を測定した。最終のデータ分析はＲＬＵ（ＧＩ１０１−バックグラウンド）／ＲＬＵ（未処理−バックグラウンド）を算定することによりなされた。
【０１４７】
結果として、ＣＴＬＡ−４と結合したＧＩ１０１はエフェクターＴ細胞上で発現され、Ｔ細胞の機能を阻害するよりもむしろそれを活性化することが判明した（図４０および４１）。
【０１４８】
実験例１４．  ｍＧＩ１０１およびｍＧＩ１０２の免疫細胞を標的とする効果の同定
Orient Bio（Korea）より購入した７週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスを、一群に付き３匹のマウスを有する３群に分け、それらにＰＢＳを、３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、または１２ｍｇ／ｋｇのＧＩ１０１を、あるいは３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、または１２ｍｇ／ｋｇのｍＧＩ１０２（ｍＧＩ１０２−Ｍ６１）を静脈内に投与した。注射後の１、３、５、７、および１４日目に、各群のマウスから脾臓を摘出した。その後で、脾臓組織について、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞、ＮＫ細胞、およびＴｒｅｇ細胞の数を個々の抗体を用いるＦＡＣＳ分析で算定し、エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞のＴｒｅｇ細胞に対する割合を個々に算定した。各細胞アッセイにおいて使用された抗体の情報は次のとおりである：
【０１４９】
エフェクターＣＤ８＋Ｔ細胞：ＰＢ抗−マウスＣＤ３ε抗体（Biolegend、＃１５５６１２；ＫＴ３.１.１）、ＦＩＴＣ抗−マウスＣＤ８α抗体（BD、＃５５３０３１、５３−６.７）、ＰＥ／Ｃｙ７抗−マウスＣＤ４４抗体（Biolegend、＃１０３０３０；ＩＭ７）、ＡＰＣ抗−マウスＣＤ１２２抗体（Biolegend、＃１２３２１４；ＴＭ−β１）
ＮＫ細胞：ＰＢ抗−マウスＣＤ３ε抗体（Biolegend、＃１５５６１２；ＫＴ３.１.１）、ＰＥ抗−マウスＮＫ−１.１（Biolegend、＃１０８７０８；ＰＫ１３６）
Ｔｒｅｇ細胞：ＦＩＴＣ抗−マウスＣＤ３抗体（Biolegend、＃１００２０４；１７Ａ２）、ＰＢ抗−マウスＣＤ４抗体（Biolegend、＃１００５３１；ＲＭ４−５）、ＰＥ抗−マウスＣＤ２５抗体（Biolegend、＃１０２００８；ＰＣ６１）、ＡＰＣ抗−マウスＦｏｘｐ３抗体（Invitrogen、＃ＦＪＫ−１６ｓ、１７−５７７３−８２）
【０１５０】
結果として、ｍＧＩ１０１またはｍＧＩ１０２（ｍＧＩ１０２−Ｍ６１）を投与された群は、ＰＢＳの投与群と比べて、投与から３日目ないし１４日目の時点で、ＣＤ８＋Ｔ細胞およびＮＫ細胞の数において有意な増加を示した。加えて、ｍＧＩ１０２を投与された群は、ＰＢＳの投与群と比べて、投与から３日目ないし１４日目の時点で、活性化ＣＤ８＋Ｔ細胞／Ｔｒｅｇ細胞、およびＮＫ細胞／Ｔｒｅｇ細胞の割合において有意な増加を示すことが判明した（図４２）。
【０１５１】
ＩＶ．  融合タンパク質の抗がん効果の同定
実験例１５．  ＧＩ１０１の、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するがん細胞に対する効果の同定
ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＮＣｌ−Ｈ２９２がん細胞株を、１０μｇ／ｍｌのミトマイシン（Mitomycin）Ｃ（Sigma）を含有する培地中で３時間にわたって培養し、次にミトマイシンＣを該培地で洗浄することで除去した。その後で、ミトマイシンＣ処理のＮＣｌ−Ｈ２９２がん細胞の５ｘ１０４個の細胞を９６ウェルプレートにて１ｘ１０５個のヒトＰＢＭＣの細胞と一緒にインキュベートした。ここで、５μｇ／ｍｌのＰＨＡ（Sigma）での処理をＴ細胞の活性のために行った。加えて、ＧＩ１０１Ｃ１およびＧＩ１０１を５０ｎＭの濃度でＩｇＧ１−Ｆｃ（Biolegend）またはアバタセプト（abatacept）（＝オレンシア（Orencia）；Bristol-Myers Squibb）と５０ｎＭの濃度で４℃にて３０分間反応させ、ついで得られた反応物を用いてＮＣｌ−Ｈ２９２がん細胞を処理した。３日後、細胞培養物の上澄みを集め、ＩＦＮ−γの数をＥＬＩＳＡキット（Biolegend）を用いて定量した。
【０１５２】
ミトマイシンＣ処理のＮＣｌ−Ｈ２９２がん細胞株の不在下で、ＰＨＡで刺激したヒトＰＢＭＣを正の対照として用い、ミトマイシンＣ処理のＮＣｌ−Ｈ２９２がん細胞株の存在下で、ＰＨＡで刺激したヒトＰＢＭＣを負の対照として用いた。ＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡキットを用いる実験方法を実験例９.３における操作と同様の操作にて実施した。
【０１５３】
結果として、ＧＩ１０１は、ＰＤ−Ｌ１を過剰発現するがん細胞株によって阻害された免疫応答を効率的に活性化した。加えて、ＧＩ１０１はエフェクターＴ細胞上で発現されるＣＴＬＡ−４のシグナル伝達を阻害することも見いだされた（図４３および４４）。
【０１５４】
実験例１６．  ＧＩ１０１のマウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
５ｘ１０６個の細胞／０.０５ｍｌのマウス由来のＣＴ−２６がん細胞株を、０.０５ｍｌのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー（Matrigel matrix phenol red-free）（ＢＤ）と混合し、該混合物（０.１ｍｌ）の移植は６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Orient Bio）の右背部に皮下投与されることでなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約８０ｍｍ３〜１２０ｍｍ３に達した対象を分離した。次に、対象に、ＧＩ１０１（０.１ｍｌ）を静脈内投与した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行い、負の対照群にはＰＢＳを投与した。腫瘍の大きさを毎日測定し、抗がん効果を同定した。
【０１５５】
その結果、ＧＩ１０１で処理したＣＴ−２６がん細胞株移植のマウスが、負の対照群と比べて、腫瘍の大きさにて著しい減少を示すことが観察された（図４５および４６）。
【０１５６】
実験例１７．  ｍＧＩ１０１の、マウス由来のメラノーマ移植したマウスにおける抗がん作用の同定
Orient Bioより購入したＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢）を７日間の順化期間に供した。次に、Ｂ１６Ｆ１０がん細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）の５ｘ１０６個の細胞を、０.０５ｍｌのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー（ＢＤ）と混合し、該混合物の同種間移植はマウスの右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約５０ｍｍ３〜１２０ｍｍ３に達した対象を選択し、選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が１０匹のマウスを有するようにグループ分した。
【０１５７】
その後で、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、１ｍＬ）を用い、ｈＩｇＧ４を４ｍｇ／ｋｇの用量で負の対照群に投与し、抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で正の対照群に投与した。実験群には、ｍＧＩ１０１を１ｍｇ／ｋｇまたは４ｍｇ／ｋｇの用量でそれらに静脈内投与した。さらには、ｍＧＩ１０１を４ｍｇ／ｋｇの用量で、抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で受容している群も実験群として設定した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。
【０１５８】
結果として、すべての群で腫瘍の最初の体積は９０ｍｍ３であり、各群の標準偏差（Ｓ.Ｅ.）は５ｍｍ３〜６ｍｍ３であった。負の対照群において、腫瘍の体積の変化が実験期間の間に観察され、その間に腫瘍の体積は投与から１５日経過するまでに９０ｍｍ３から１,４３４ｍｍ３まで増大した。
【０１５９】
ｍＧＩ１０１を１ｍｇ／ｋｇの用量で受容した群において、腫瘍の体積は、負の対照群と同じ期間である、実験期間の間に９０ｍｍ３から８８５ｍｍ３まで増加するのが観察され、腫瘍増殖の統計学的に有意な阻害が測定したいくつかの時点で観察された（１１日目でｐ−値：０.５、７日目でｐ−値＜０.０１、３日目でｐ−値＜０.００１）。ｍＧＩ１０１を４ｍｇ／ｋｇの用量で受容した群において、腫瘍の体積は、負の対照群と同じ期間である、実験期間の間に９０ｍｍ３から７４８ｍｍ３まで増加するのが観察され、腫瘍増殖の統計学的に有意な阻害が測定したいくつかの時点で観察された（９日目でｐ−値：０.５、７日および１１日目でｐ−値＜０.０１）。
【０１６０】
加えて、腫瘍増殖阻害率は、ｍＩｇＧを４ｍｇ／ｋｇで受容している群を標準として用い、この群を他の各々の群と比較することにより分析された。ｍＧＩ１０１を１ｍｇ／ｋｇの用量で受容した群において、３６.５％の増殖阻害率が負の対照群と比較した場合に観察され、統計的に有意な差（ｐ−値：０.５）は観察されなかった。ｍＧＩ１０１を４ｍｇ／ｋｇの用量で受容した群において、負の対照群と比べて統計学的に有意な腫瘍増殖阻害率（ｐ−値：０.５）が観察された。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて２回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。
【０１６１】
この測定を通して、Ｂ１６Ｆ１０についての腫瘍増殖阻害効能試験において、メラノーマをＣ５７ＢＬ／６マウスに同種間移植に付し、ｍＧＩ１０１が用量依存的に腫瘍増殖の阻害において効果のあることが判明した（図４７および４８）。
【０１６２】
実験例１８．  ｍＧＩ１０１の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
Orient Bioより購入したＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢）を７日間の順化期間に供した。次に、ＣＴ−２６がん細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）の５ｘ１０６個の細胞を０.０５ｍｌのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー（ＢＤ）と混合し、該混合物の同種間移植はマウスの右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約２８ｍｍ３に到達した対象を選択し、次に選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が１０匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、１ｍＬ）を用い、ｈＩｇＧ４を６ｍｇ／ｋｇの用量で負の対照群に投与した。実験群には、ｍＧＩ１０１を３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、または１２ｍｇ／ｋｇの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。
【０１６３】
結果として、ｍＧＩ１０１を６ｍｇ／ｋｇまたは１２ｍｇ／ｋｇ  ｍＧＩ１０１の用量で受容した実験群は、負の対照群と比較して、試験の測定したいくつかの時点および最終点で有意な腫瘍増殖の阻害を示すことが判明した（図４９）。加えて、生存率を測定した結果として、ｍＧＩ１０１を６ｍｇ／ｋｇの用量で受容した実験群は、負の対照群と比較して、試験の測定したいくつかの時点および最終点で有意な改善を示すことが判明した（図５０）。
【０１６４】
実験例１９．  ＧＩ１０１の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
実験例１９.１．  腫瘍阻害作用の同定
Orient Bioより購入したＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢）を７日間の順化期間に供した。次に、ＣＴ−２６がん細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）の５ｘ１０６個の細胞を０.１ｍｌのＰＢＳに懸濁させ、該懸濁液の同種間移植はマウスの右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約５０ｍｍ３ないし２００ｍｍ３に到達した対象を選択し、次に選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が１０匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、１ｍＬ）を用い、負の対照群には薬物を投与せず、正の対照群には抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で、または抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で、および抗−ＣＴＬＡ−４抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に投与した。実験群には、ＧＩ１０１を０.１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。
【０１６５】
結果として、ＣＴ−２６がん細胞株を移植したマウスにおいて、抗−ＰＤ−１抗体、抗−ＰＤ−１抗体および抗−ＣＴＬＡ−４抗体、あるいはＧＩ１０１を０.１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの用量で受容した群は、すべて、負の対照と比較して、腫瘍増殖の有意な阻害を示した。特に、ＧＩ１０１を０.１ｍｇ／ｋｇの用量で受容した実験群は、抗−ＰＤ−１抗体処理群と比べて、有意な腫瘍阻害作用を示した（＊  ｐ＜０.０５）（図５１）。
【０１６６】
実験例１９.２．  がん組織における免疫細胞分析
実験例１９.１における各群のマウスにて、腫瘍の体積が平均２００ｍｍ３に達したならば、それらのマウスを殺し、がん組織を集めた。その後で、該がん組織を単一細胞レベルに分離し、その中の免疫細胞を分析し、次に以下の抗体を用いてがん組織における免疫細胞についてＦＡＣＳ分析を行った：抗−マウス−ＣＤ３（Biolegend、カタログ番号１００３２０）、抗−マウス−ＣＤ４（Biolegend、カタログ番号１００５２６）、抗−マウス−ＣＤ８（Biolegend、カタログ番号１００７５０）、抗−マウス−ＦｏｘＰ３（eBioscience、カタログ番号１２−５７７３−８２）、抗−マウス−ＣＤ２５（Biolegend、カタログ番号１０２０４９）、抗−マウス−ＣＤ４４（eBioscience、カタログ番号６１−０４４１−８２）、抗−マウス−ＰＤ−１（Biolegend、カタログ番号１３５２１８）、抗−マウス−ＩＦＮ−ガンマ（Biolegend、カタログ番号５０５８３２）、抗−マウス−ＣＤ４９ｂ（Biolegend、カタログ番号１０８９０６）、抗−マウス−Ｈ２（Invitrogen、カタログ番号Ａ１５４４３）、抗−マウス−ＣＤ１１ｃ（Biolegend、カタログ番号１１７３４３）、抗−マウス−ＣＤ８０（eBioscience、カタログ番号４７−４８０１−８２）、抗−マウス−ＣＤ８６（Biolegend、カタログ番号１０４７２９）、抗−マウス−Ｆ４／８０（eBioscience、カタログ番号４７−４８０１−８２）、および抗−マウス−ＣＤ２０６（eBioscience、カタログ番号１７−２０６１−８０）。
【０１６７】
結果として、ＧＩ１０１を０.１ｍｇ／ｋｇの用量で受容した実験群は、抗−ＰＤ−１抗体を単独で５ｍｇ／ｋｇの用量にて受容した正の対照群と比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意な増加を示した（＊  ｐ＜０.０５、図５２および５３）。さらには、ＧＩ１０１を受容した実験群はすべて、負の対照群と比較して、Ｔ細胞においてＩＦＮ−γの有意に増加した発現レベルを示した（＊  ｐ＜０.０５、図５２および５３）。加えて、ＧＩ１０１を０.１ｍｇ／ｋｇの用量で受容した実験群は、負の対照群と、および抗−ＰＤ−１抗体を単独で受容した正の対照群と比べて、Ｍ１マクロファージの増加を示した（図５４および５５）。加えて、ＧＩ１０１を受容したすべての実験群は、ＣＤ８６の発現がマクロファージおよび樹状細胞において高レベルにあることを示した（＊  ｐ＜０.０５、図５４ないし５７）。
【０１６８】
実験例２０．  ＧＩ１０１の、マウス由来の肺がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
実験例２０.１．  腫瘍阻害作用の同定
Orient Bioより購入したＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢）を７日間の順化期間に供した。次に、ＬＬＣ２がん細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）の５ｘ１０６個の細胞を０.１ｍｌ  ＰＢＳに懸濁させ、該懸濁液の同種間移植はマウスの右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約５０ｍｍ３ないし２００ｍｍ３に到達した対象を選択し、次に選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が１０匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、１ｍＬ）を用い、負の対照群には薬物を投与せず、正の対照群には抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で、または抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で、および抗−ＣＴＬＡ−４抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に投与した。実験群には、ＧＩ１０１を０.１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。
【０１６９】
結果として、全ての実験群は、負の対照群と比べて、有意な腫瘍阻害作用を示した（＊  ｐ＜０.０５）（図５８）。
【０１７０】
実験例２０.２．  がん組織における免疫細胞分析
実験例２０.１における各群のマウスは、腫瘍の体積が平均で２００ｍｍ３に達した時に殺され、がん組織を集めた。その後で、実験例１９.２と同じ方法にてＦＡＣＳ分析を行い、がん組織中の免疫細胞を分析した。
【０１７１】
結果として、ＧＩ１０１を０.１ｍｇ／ｋｇの用量で受容した実験群は、抗−ＰＤ−１抗体を単独で受容した正の対照群と比べて、ＣＤ８＋Ｔ細胞における有意な増加を示した（＊  ｐ＜０.０５、図５９）。さらには、ＧＩ１０１を受容した実験群はすべて、負の対照群と比較して、ＩＦＮ−γの有意に増加した発現レベルを示した（＊  ｐ＜０.０５、図５９）。加えて、ＧＩ１０１を受容したすべての実験群は、ＣＤ８６の発現がマクロファージおよび樹状細胞において高レベルにあることを示した（＊  ｐ＜０.０５、図５９ないし６１）。
【０１７２】
実験例２１．  ｍＧＩ１０２−Ｍ６１の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
Orient Bioより購入したＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢）を７日間の順化期間に供した。次に、ＣＴ−２６がん細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）の５ｘ１０６個の細胞を、０.０５ｍｌのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー（ＢＤ）と混合し、該混合物の同種間移植はマウスの右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約２８ｍｍ３に到達した対象を選択し、次に該選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が１０匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、１ｍＬ）を用い、ｈＩｇＧ４を６ｍｇ／ｋｇの用量で負の対照群に投与した。実験群には、ｍＧＩ１０２−Ｍ６１を３ｍｇ／ｋｇ、６ｍｇ／ｋｇ、または１２ｍｇ／ｋｇの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。
【０１７３】
結果として、ｍＧＩ１０２−Ｍ６１を１２ｍｇ／ｋｇの用量で受容した実験群は、負の対照群と比較して、試験の測定したいくつかの時点および最終点で有意な腫瘍増殖の阻害を示すことが判明した（図６２）。加えて、生存率を測定した結果として、ｍＧＩ１０２−Ｍ６１を１２ｍｇ／ｋｇの用量で受容した実験群は、負の対照群と比較して、試験の測定したいくつかの時点および最終点で有意な改善を示すことが同定された（図６３）。
【０１７４】
実験例２２．  ｍＧＩ１０１の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
Orient Bioより購入したＢＡＬＢ／ｃマウス（雌、７週齢）を７日間の順化期間に供した。次に、ＣＴ−２６がん細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）の５ｘ１０６個の細胞を、０.０５ｍｌのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー（ＢＤ）と混合し、該混合物の同種間移植はマウスの右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約２００ｍｍ３〜２５０ｍｍ３に到達した対象を選択し、ついで選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が１０匹のマウスを有するようにグループ分けした。
【０１７５】
その後で、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、１ｍＬ）を用い、ｈＩｇＧ４を４ｍｇ／ｋｇの用量で負の対照群に投与した。実験群には、ｍＧＩ１０１を１ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、または６ｍｇ／ｋｇの用量でそれらに静脈内投与した。さらには、ｍＣＤ８０を４.９ｍｇ／ｋｇで、またはＦｃ−ＩＬ−２ｖ（ＧＩ１０１Ｃ２）を２.８ｍｇ／ｋｇで受容した群を対照群として設定した。加えて、ｍＣＤ８０を４.９ｍｇ／ｋｇで、そしてＦｃ−ＩＬ−２ｖ（ＧＩ１０１Ｃ２）を２.８ｍｇ／ｋｇで同時に受容した群を対照群として設定した。
【０１７６】
腫瘍体積を測定するにおいて、ｍＧＩ１０１を６ｍｇ／ｋｇの用量で受容した群は、負の対照群と比較して、試験の測定したいくつかの時点および最終点で有意な阻害を示すことが同定された。ｍＣＤ８０およびＦｃ−ＩＬ−２ｖ（ＧＩ１０１Ｃ２）の組み合わせを受容した群と比べて、極めて高い腫瘍増殖阻害率が観察された（図６４および６５）。
【０１７７】
結論として、ＣＴ−２６、ＢＡＬＢ／ｃマウス由来の大腸がん細胞株を同種間移植したＢＡＬＢ／ｃマウスでの腫瘍増殖阻害能試験において、試験物質のｍＧＩ１０１が、ｍＣＤ８０およびＩＬ−２ｖの単一製剤と比べて、この試験条件下で腫瘍阻害効能のあることが証明され；ｍＧＩ１０１が、ｍＣＤ８０およびＩＬ−２ｖの組み合わせを受容した群と比較して、極めて高い抗がん効能を示すことが同定された（図６４および６５）。特に、ｍＧＩ１０１を６ｍｇ／ｋｇの用量で受容した群は、負の対照群およびＣＤ８０とＦｃ−ＩＬ２ｖの組み合わせ（ＧＩ１０１Ｃ２）を受容した群と比べて、腫瘍の大きさについて有意な阻害を示した。
【０１７８】
Ｖ．  融合タンパク質の毒性評価
実験例２３．  サルを用いてのＧＩ１０１の毒性評価
実験例２３.１．  サルの飼育および薬物投与
この実験において、２ないし３歳の９匹の雄フィリピンザル（Philippine monkeys）（カニクイザル（Cynomolgus monkeys））を用いた。該実験は、日本における「動物の愛護および管理に関する法律（Act on Welfare and Management of Animals）」およびIna Research Incの「動物の管理と使用に関する指針（Guidance for Animal Care and Use）」に従って実施された。該実験プロトコルは、Ina Research IncのＩＡＣＵＣ（Institutional Animal Care and Use Committee）によってチェックされ、ＡＡＡＬＡＣインターナショナルによって認証された（認証ユニット第００１１０７号）。
【０１７９】
実験は薬物投与の１日前から薬物投与の１５日後まで行われた。各サルはケージの周囲を回るのが観察され、ついでに便の状態もチェックした。薬物投与の１日前に、薬物投与の１日、８日および１５日後に、デジタル式体重計（ＬＤＳ−１５０Ｈ、Shimadzu Corporation）を用いて体重を測定した。加えて、残した食べ物の量を薬物投与の１日前からサルを殺すまで測定した。
【０１８０】
ここで、使い捨てシリンジ（２４Ｇ）を薬物ＧＩ１０１で満たし、静脈内経路を介して合計２回投与を行い、各投与は０.１７ｍｌ／秒の速度でなされた。ＧＩ１０１を１週間の間隔で、５ｍｇ／ｋｇ／日または１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で２回投与された。対照群にはＰＢＳ（ｐＨ７.４）を同じ方法で投与した。
【０１８１】
実験例２３.２．  臨床観察、体重および食物摂取の変化の同定
臨床観察、および体重および食物摂取の変化の測定は、薬物投与の１日前に、薬物投与の１日、８日および１５日後に行われた。結果として、毒性はＧＩ１０１によって生じなかった（図６６ないし６９）。
【０１８２】
実験例２３.３．  血液分析
薬物を投与する１日前に、そして薬物を投与した後の１日、８日および１５日目に、実験例２３.１のサルから採血を行った。ここで、血液は使い捨てシリンジ（２２Ｇ）を用いて大腿静脈を通して集められた。採取血液を自動血球計数システム（Automated Hematology System）ＸＮ−２０００（Sysmex Corporation）および自動血液凝固分析装置（Automated Blood Coagulation Analyzer）ＣＡ−５１０（Sysmex Corporation） を用いて以下の表２に列挙される項目について血液分析に供した。
【０１８３】
表２
【表２】
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【０１８４】
結果として、ＧＩ１０１を５ｍｇ／ｋｇ／日または１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で受容した群は、１５日目に、網状白血球、白血球およびリンパ球の数の増加を示した（図７０ないし７２）。
【０１８５】
実験例２３.４．  臨床および化学分析
薬物を投与する１日前に、そして薬物を投与した後の１日、８日および１５日目に、実験例２３.１のサルから採血を行った。ここで、血液は実験例２３.３における方法と同じ方法で集められた。採取血液を臨床分析装置モデル７１８０（Hitachi High-Technologies Corporation）を用いて以下の表３に列挙される項目について臨床および化学分析に供した。
【０１８６】
表３
【表３】
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【０１８７】
結果として、ＧＩ１０１により惹起される毒性は臨床および化学分析にて検出されなかった（図７３ないし７９）。
【０１８８】
実験例２３.５．  サイトカイン分析
薬物を投与する１日前に、そして薬物を投与した後の１日、８日および１５日目に、実験例２３.１のサルから採血を行った。ここで、血液は実験例２３.３における方法と同じ方法で集められた。バイオ−プレックス（Bio-Plex）２００（Bio-Rad Laboratories, Inc.）装置およびヒト以外の霊長類サイトカイン磁性ビーズパネル（Non-Human Primate Cytokine Magnetic Bead Panel）（EMD Millipore）アッセイキット（Assay Kit）を用い、採取血液をＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１０、およびＩＬ−１２について分析した。結果として、ＧＩ１０１によって惹起される毒性はサイトカイン分析に関して検出されなかった（図８０および８１）。
【０１８９】
実験例２３.６．  免疫細胞分析
薬物を投与する１日前に、そして薬物を投与した後の１日、８日および１５日目に、実験例２３.１のサルから採血を行った。ここで、血液は実験例２３.３における方法と同じ方法で集められた。フローサイトメーター（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ  Ｘ−２０、Becton、Dickinson and Company）を用い、採取血液を以下の項目について分析した：
１）Ｋｉ６７＋ＣＤ４：ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ４＋／Ｋｉ６７＋
２）Ｋｉ６７＋ＣＤ８：ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＣＤ８＋／Ｋｉ６７＋
３）Ｋｉ６７＋Ｔｒｅｇ：ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＦｏｘＰ３＋／Ｋｉ６７＋
４）Ｋｉ６７＋ＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇ：ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＦｏｘＰ３＋／Ｋｉ６７＋／ＣＤ２７８＋
５）ＩＣＯＳ＋Ｔｒｅｇ：ＣＤ４５＋／ＣＤ３＋／ＦｏｘＰ３＋／ＣＤ２７８＋
６）Ｋｉ６７＋ＮＫ細胞：ＣＤ４５＋／ＣＤ１６＋およびＣＤ５６＋／Ｋｉ６７＋
【０１９０】
結果として、免疫細胞分析において、ＧＩ１０１を受容したすべての群は、１５日目に、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＫｉ６７＋Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋制御性Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋ＮＫ細胞、ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞の数の増加を示した。
【０１９１】
具体的には、リンパ球中で、Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞の割合は増加し、ＮＫ細胞の割合は減少したが、ＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は変化しなかった。制御性Ｔ細胞の割合は３日目で増加し、８日および１５日目で減少した。それでも、その割合は対照群よりもまだ高かった。
【０１９２】
加えて、個々の免疫細胞中の、Ｋｉ６７＋である免疫細胞の割合について、Ｋｉ６７＋Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋制御性Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋ＮＫ細胞、およびＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞の割合が増加した。
【０１９３】
さらには、Ｋｉ６７＋Ｔ細胞、Ｋｉ６７＋ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＫｉ６７＋ＮＫ細胞の割合は、３日、８日、および１５日目に増加し；Ｋｉ６７＋ＣＤ４＋Ｔ細胞、およびＫｉ６７＋制御性Ｔ細胞の割合は、３日および８日目に増加し；ならびにＫｉ６７＋ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞、およびＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞の割合は、８日目だけが増加した（図８２ないし８７）。
【０１９４】
実験例２３.７．  病理学的分析
１６日目に、実験例２３.１にあるサルを殺し、すべての器官および組織を１０％ホルマリンを用いて固定した。しかしながら、睾丸はホルマリン−シュークロース−酢酸（ＦＳＡ）溶液を用いて固定し、眼および視神経はリン酸緩衝液中の１％ホルムアルデヒド−２.５％グルタルアルデヒドを用いて固定した。以下の表４にて列挙される項目にある器官および組織に対してはヘマトキシリン−エオシン染色を行い、観察を光学顕微鏡の下で行った。
【０１９５】
表４
【表４】
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【表５】
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【表６】
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【０１９６】
結果として、ＧＩ１０１を５ｍｇ／ｋｇ／日または１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量で用いて処理した群は脾臓の重量の増加を示した（図８８）。他の組織では有意な変化は観察されなかった。結論として、ＧＩ１０１を受容した群では、何らかの変化は観察されたが、毒性は観察されなかった。
【０１９７】
ＶＩ．  ＧＩ１０２の抗がん作用の同定
実験例２４．  ＧＩ１０２−Ｍ４５の抗がん作用の同定
実験例２４.１．  ＧＩ１０２−Ｍ４５の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
マウス由来のＣＴ−２６がん細胞株（０.０５ｍｌ）中の５ｘ１０６個の細胞を０.０５ｍｌのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー（ＢＤ）と混合し、該混合物の移植は６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Orient Bio）の右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約８０ｍｍ３ないし１２０ｍｍ３に到達した対象を分離した。次に該対象に０.１ｍｌのＧＩ１０２−Ｍ４５を静脈内投与した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行い、負の対照にはＰＢＳを投与した。腫瘍の大きさを毎日測定し、抗がん作用を同定した。ＧＩ１０２−Ｍ４５の活性を実験例１６にあるのと同じ方法で同定した。
【０１９８】
実験例２４.２．  ＧＩ１０２−Ｍ４５の、マウス由来の肺がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用を同定
Orient Bioより購入したＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢）を７日間の順化期間に供した。次に、ＬＬＣ２がん細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）の５ｘ１０６個の細胞を０.１ｍｌ  ＰＢＳに懸濁させ、該懸濁液の同種間移植はマウスの右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約５０ｍｍ３ないし２００ｍｍ３に到達した対象を選択し、次にその選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が１０匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、１ｍＬ）を用い、負の対照群には薬物を投与せず、正の対照群には抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で、または抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で、および抗−ＣＴＬＡ−４抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に投与した。実験群には、ＧＩ１０２−Ｍ４５を０.１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。ＧＩ１０２−Ｍ４５の活性を実験例２０.１と同じ方法にて同定した。
【０１９９】
実験例２５．  ＧＩ１０２−Ｍ６１の抗がん作用の同定
実験例２５.１．  ＧＩ１０２−Ｍ６１の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
マウス由来のＣＴ−２６がん細胞株（０.０５ｍｌ）中の５ｘ１０６個の細胞を、０.０５ｍｌのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー（ＢＤ）と混合し、該混合物の移植は６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Orient Bio）の右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約８０ｍｍ３ないし１２０ｍｍ３に到達した対象を分離した。次に、該対象に０.１ｍｌのＧＩ１０２−Ｍ６１を静脈内に投与した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行い、負の対照にＰＢＳを投与した。腫瘍の大きさを毎日測定し、抗がん作用を同定した。ＧＩ１０２−Ｍ６１の活性を実験例１６と同じ方法にて同定した。
【０２００】
実験例２５.２．  ＧＩ１０２−Ｍ６１の、マウス由来の肺がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
Orient Bioより購入したＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢）を７日間の順化期間に供した。次に、ＬＬＣ２がん細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）の５ｘ１０６個の細胞を０.１ｍｌ  ＰＢＳに懸濁させ、該懸濁液の同種間移植はマウスの右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約５０ｍｍ３ないし２００ｍｍ３に到達した対象を選択し、次にその選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が１０匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、１ｍＬ）を用い、負の対照群には薬物を投与せず、正の対照群には抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で、または抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で、および抗−ＣＴＬＡ−４抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に投与した。実験群には、ＧＩ１０２−Ｍ６１を０.１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇでそれらに静脈内投与した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。ＧＩ１０２−Ｍ６１の活性を実験例２０.１と同じ方法にて同定した。
【０２０１】
実験例２６．  ＧＩ１０２−Ｍ７２の抗がん作用の同定
実験例２６.１．  ＧＩ１０２−Ｍ７２の、マウス由来の大腸がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
マウス由来のＣＴ−２６がん細胞株（０.０５ｍｌ）中の５ｘ１０６個の細胞を０.０５ｍｌのマトリゲルマトリックスフェノールレッドフリー（ＢＤ）と混合し、該混合物の移植は６週齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Orient Bio）の右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約８０ｍｍ３ないし１２０ｍｍ３に到達した対象を分離した。ついで、該対象に０.１ｍｌのＧＩ１０２−Ｍ７２を静脈内に投与した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行い、負の対照にＰＢＳを投与した。腫瘍の大きさを毎日測定し、抗がん作用を同定した。ＧＩ１０２−Ｍ７２の活性を実験例１６と同じ方法にて同定した。
【０２０２】
実験例２６.２．  ＧＩ１０２−Ｍ７２の、マウス由来の肺がん細胞を移植したマウスにおける抗がん作用の同定
Orient Bioより購入したＣ５７ＢＬ／６マウス（雌、７週齢）を７日間の順化期間に供した。次に、ＬＬＣ２がん細胞株（ＡＴＣＣ、ＵＳＡ）の５ｘ１０６個の細胞を０.１ｍｌ  ＰＢＳに懸濁させ、該懸濁液の同種間移植はマウスの右背部に０.１ｍｌを皮下投与することによってなされた。がん細胞を移植して特定期間経過した後に、腫瘍体積を測定し、約５０ｍｍ３ないし２００ｍｍ３に到達した対象を選択し、次にその選択したマウスを腫瘍の大きさおよび体重に基づいて均等に、各群が１０匹のマウスを有するようにグループ分けした。その後で、使い捨てシリンジ（３１Ｇ、１ｍＬ）を用い、負の対照群には薬物を投与せず、正の対照群には抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で、または抗−ＰＤ−１抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で、および抗−ＣＴＬＡ−４抗体を５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に投与した。実験群には、ＧＩ１０２−Ｍ７２を０.１ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇの用量でそれらに静脈内投与した。最初の投与から３日毎に１回の割合で合計にて３回の投与を行った。腫瘍の大きさを毎日測定した。ＧＩ１０２−Ｍ７２の活性を実験例２０.１と同じ方法にて同定した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【図８１】
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【図８２】
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【図８３】
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【図８４】
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【図８５】
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【図８６】
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【図８７】
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【図８８】
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【図８９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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