(57)【要約】  本開示は、リンパ球、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞を、以前よりも短い時間で、および／または全血もしくはその成分において遺伝子改変するための方法および組成物を提供する。いくつかの実施形態では、リンパ球枯渇フィルタアセンブリが反応混合物を形成する前または後に使用され、リンパ球が閉鎖システムにおいて組み換えレトロウイルス粒子と接触されてリンパ球が遺伝子改変される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象のＴ細胞またはＮＫ細胞を遺伝子改変するためのキットの製造における複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の使用であって、前記キットの前記使用が、
前記Ｔ細胞および／または前記ＮＫ細胞を含む血液細胞を、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と反応混合物中でエクスビボで接触させることを含み、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が、それらの表面上にシュードタイピング要素を含み、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の転写単位が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第１のポリペプチド、リンパ増殖性要素（ＬＥ）を含む第１のポリペプチド、またはＬＥを含む第１のポリペプチドとＣＡＲを含む第２のポリペプチドをコードし、前記接触が、１５分間未満実施されて、前記Ｔ細胞および／または前記ＮＫ細胞の、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子への膜融合を促進し、それによって前記遺伝子改変Ｔ細胞および／または前記遺伝子改変ＮＫ細胞を産生する、使用。
【請求項２】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む血液細胞を、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と反応混合物中でエクスビボで接触させることを含む方法に従って、前記Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変することによって作製される遺伝子改変Ｔ細胞またはＮＫ細胞であって、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が、それらの表面上にシュードタイピング要素を含み、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の転写単位が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第１のポリペプチド、リンパ増殖性要素（ＬＥ）を含む第１のポリペプチド、またはＬＥを含む第１のポリペプチドとＣＡＲを含む第２のポリペプチドをコードし、前記接触が、１５分間未満実施されて、前記Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子への膜融合を促進し、それによって前記遺伝子改変Ｔ細胞または前記遺伝子改変ＮＫ細胞を産生する、遺伝子改変Ｔ細胞またはＮＫ細胞。
【請求項３】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞を遺伝子改変する方法であって、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含む血液細胞を、それらの表面上にシュードタイピング要素を含む複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と反応混合物中でエクスビボで接触させることを含み、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の転写単位が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第１のポリペプチド、リンパ増殖性要素（ＬＥ）を含む第１のポリペプチド、またはＬＥを含む第１のポリペプチドとＣＡＲを含む第２のポリペプチドをコードし、前記接触させることが、１５分間未満実施されて、前記Ｔ細胞および／または前記ＮＫ細胞の、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子への膜融合を促進し、それによって前記遺伝子改変Ｔ細胞または前記遺伝子改変ＮＫ細胞を産生する、方法。
【請求項４】
前記反応混合物が、少なくとも２５％の全血を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変および／もしくは形質導入するための方法。
【請求項５】
反応混合物であって、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子、Ｔ細胞活性化要素、および血液細胞を含み、前記組み換えレトロウイルス粒子が、それらの表面上にシュードタイピング要素を含み、前記血液細胞が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含み、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、前記１つ以上の転写単位が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第１のポリペプチド、リンパ増殖性要素（ＬＥ）を含む第１のポリペプチド、またはＬＥを含む第１のポリペプチドとＣＡＲを含む第２のポリペプチドとをコードし、前記反応混合物が、少なくとも２５％の全血を含む、反応混合物。
【請求項６】
血液またはその成分中のＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変する方法であって、前記Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含む血液細胞を、Ｔ細胞活性化要素を含む反応混合物中の複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子とエクスビボで接触させることを含み、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が、それらの表面上にシュードタイピング要素を含み、前記接触が、前記Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞と、前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子との会合を促進し、前記組み換えレトロウイルス粒子が、前記Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変および／または形質導入し、前記反応混合物が、少なくとも２５％の全血を含む、方法。
【請求項７】
前記複製能力のないレトロウイルス粒子と組み合わされて前記反応混合物を形成する場合、前記Ｔ細胞のほとんどが休止Ｔ細胞であるか、または前記ＮＫ細胞が休止ＮＫ細胞である、請求項１〜６のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項８】
前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が、それらの表面上に膜結合Ｔ細胞活性化要素を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項９】
前記１つ以上の転写単位が、前記ＣＡＲを含む前記第１のポリペプチドをコードし、前記遺伝子改変Ｔ細胞またはＮＫ細胞が、前記遺伝子改変Ｔ細胞であり、任意選択で、前記ＣＡＲが、微小環境が制限された生物学的ＣＡＲである、請求項１〜８のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の転写単位が、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、ＳＯＣＳ１、ｍｉＲ１５５標的、ＩＦＮガンマ、ｃＣＢＬ、ＴＲＡＩＬ２、ＰＰ２Ａ、ＡＢＣＧ１、ＣＤ３ｚ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＳＭＡＤ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳ）、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、Ａ２ＡＲ、ＡＨＲ、ＥＯＭＥＳ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＴＧＦＢＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＴＮＦＳＦ６（ＦＡＳＬ）、ＣＡＳＰ３、ＳＯＣＳ２、ＴＩＥＧ１、ＪｕｎＢ、Ｃｂｘ３、Ｔｅｔ２、またはＨＫ２を標的とする阻害性ＲＮＡ分子をさらにコードする、請求項１〜９のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の転写単位が、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳ）、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩ、Ａ２ＡＲ、ＡＨＲ、ＥＯＭＥＳ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＴＮＦＳＦ６（ＦＡＳＬ）、ＣＡＳＰ３、ＳＯＣＳ２、ＴＩＥＧ１、ＪｕｎＢ、Ｃｂｘ３、Ｔｅｔ２、およびＨＫ２を標的とする阻害性ＲＮＡ分子をさらにコードする、請求項１〜１０のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の転写単位が、ＦＡＳ、ＡＨＲ、ＣＤ３ｚ、ｃＣＢＬ、Ｃｂｘ、ＨＫ２、ＦＡＳＬ、ＳＭＡＤ４、またはＥＯＭＥＳを標的とする阻害性ＲＮＡ分子をさらにコードする、請求項１〜１１のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項１３】
前記１つ以上の転写単位が、ＦＡＳ、ＡＨＲ、Ｃｂｘ３、ＨＫ２、ＦＡＳＬ、ＳＭＡＤ４、またはＥＯＭＥＳを標的とする阻害性ＲＮＡ分子をさらにコードする、請求項１〜１２のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の転写単位が、ＡＨＲ、Ｃｂｘ３、ＨＫ２、ＳＭＡＤ４、またはＥＯＭＥＳをコードするｍＲＮＡを標的とする少なくとも１つの阻害性ＲＮＡ分子をさらにコードする、請求項１〜１３のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項１５】
前記血液細胞が、前記接触の前にＰＢＭＣ濃縮手順に供されない、請求項１〜１４のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項１６】
前記反応混合物が、少なくとも５０％の全血を含む、請求項１〜１５のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項１７】
前記反応混合物が、前記組み換えレトロウイルス粒子を全血に添加することによって形成される、請求項１〜１６のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項１８】
前記反応混合物が、前記組み換えレトロウイルス粒子を、有効量の抗凝固剤を含む実質的な全血に添加することによって形成される、請求項１〜１７のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項１９】
前記反応混合物が、閉鎖型細胞処理システム内にある、請求項１〜１８のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項２０】
前記反応混合物が、前記閉鎖型細胞処理システム内で白血球除去フィルタアセンブリと接触している、請求項１８に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項２１】
前記反応混合物が、抗凝固剤を含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項２２】
前記抗凝固剤が、酸性クエン酸デキストロース、ＥＤＴＡ、またはヘパリンからなる群から選択される、請求項２１に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項２３】
前記抗凝固剤が、酸性クエン酸デキストロース以外である、請求項２１に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項２４】
前記抗凝固剤が、有効量のヘパリンを含む、請求項２１に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項２５】
前記方法が、前記遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に投与することをさらに含み、前記対象が、前記血液細胞の供給源である、請求項１、３、４、または６〜２４のいずれか一項に記載のＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変するための使用または方法。
【請求項２６】
前記Ｔ細胞活性化要素が、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ８２に結合することができる１つ以上のポリペプチドである、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項２７】
前記Ｔ細胞活性化要素が、抗ＣＤ３抗体であり、前記抗ＣＤ３抗体は、前記組み換えレトロウイルス粒子の膜に結合し、任意選択で、前記膜結合抗ＣＤ３が抗ＣＤ３ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃであり、任意選択で、前記抗ＣＤ３がＧＰＩアンカーによって前記膜に結合し、および任意選択で、前記抗ＣＤ３がウイルスエンベロープタンパク質との組み換え融合タンパク質であり、任意選択で、前記抗ＣＤ３がＭｕＬＶからの前記ウイルスエンベロープタンパク質との組み換え融合タンパク質であり、任意選択で、前記抗ＣＤ３がフューリン開裂部位で変異しているＭｕＬＶのウイルスエンベロープタンパク質との組み換え融合タンパク質である、請求項２６に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項２８】
ＡＢＣトランスポーター阻害剤および／または基質、任意選択で外因性ＡＢＣトランスポーター阻害剤および／または基質が、遺伝子改変および／または形質導入の前、最中、または前および最中の両方に存在しない、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項２９】
前記組み換えレトロウイルス粒子が、少なくとも１のＭＯＩで前記反応混合物中に存在する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項３０】
前記Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の少なくとも５％が遺伝子改変されている、請求項１〜４または６〜２９のいずれか一項に記載の使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項３１】
前記細胞または複数の細胞が、少なくとも３０分間少なくとも８００ｇのスピノキュレーションに供されない、請求項１〜４または６〜３０のいずれか一項に記載の使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項３２】
前記反応混合物が、前記接触中に血液バッグ内にある、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項３３】
前記反応混合物が、前記接触前、前記組み換えレトロウイルス粒子と前記血液細胞との接触時、前記反応混合物中での任意のインキュベーションを含む接触中、および／または前記反応混合物中での任意のインキュベーションを含む接触後に、閉鎖型細胞処理システムにおける白血球除去フィルタアセンブリと接触しており、前記Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞、または前記遺伝子改変Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞は、前記接触後にさらにＰＢＭＣ濃縮手順に供される、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項３４】
前記反応混合物が、前記接触前に前記閉鎖型細胞処理システムにおけるＴリンパ球および／またはＮＫ細胞濃縮フィルタと接触しており、前記反応混合物が顆粒球を含み、前記顆粒球が前記反応混合物中の白血球の少なくとも１０％を含むか、または前記反応混合物がＴ細胞の少なくとも１０％の数の顆粒球を含む、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項３５】
前記反応混合物が、前記反応混合物中での任意のインキュベーションを含む前記接触後、前記閉鎖型細胞処理システムにおける白血球除去フィルタアセンブリと接触している、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項３６】
前記全血が、臍帯血以外である、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項３７】
前記１つ以上の転写単位が、リンパ増殖性要素を含む第１のポリペプチドをコードする、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項３８】
前記リンパ増殖性要素が、ボックス１およびボックス２ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合モチーフ、ならびにチロシン残基を含むシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）結合モチーフを含む、請求項３７に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項３９】
前記ＬＥが、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２７、変異型Ｄｅｌｔａ  Ｌｃｋ  ＣＤ２８、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＣＧＲＡ２、ＧＨＲ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ１７ＲＥ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦＲ、ＬＭＰ１、ＭＰＬ、ＭＹＤ８８、ＯＳＭＲ、ＰＲＬＲ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１４もしくはＴＮＦＲＳＦ１８、または機能的突然変異体および／もしくはその断片からの細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項３８に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項４０】
前記複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子がレンチウイルス粒子であり、前記遺伝子改変された細胞が、遺伝子改変されたＴ細胞または遺伝子改変されたＮＫＴ細胞である、請求項１〜４または６〜３９のいずれか一項に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項４１】
前記血液細胞がＰＢＭＣである、請求項１〜３、または６〜１４、または１９〜２０、または２５〜３３、または３５、または３７〜４０のいずれか一項に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【請求項４２】
前記阻害性ＲＮＡ分子が、配列番号３９４〜４０１、４０６〜４０９、４３８〜４４１、または４４６〜４４９の配列の少なくとも１つを含む、請求項１４に記載の反応混合物、使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月１７日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５１３９２の一部継続出願であり；２０１８年９月２日に出願された米国仮特許出願第６２／７２６，２９３号；２０１８年９月２日に出願された米国仮特許出願第６２／７２６，２９４号；２０１８年９月６日に出願された米国仮特許出願第６２／７２８，０５６号；２０１８年９月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／７３２，５２８号；２０１９年３月２０日に出願された米国仮特許出願第６２／８２１，４３４号；および２０１９年９月１日に出願された米国仮特許出願第６２／８９４，８５３号の利益を主張し；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０５１３９２は、２０１８年３月３日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０８１８の一部継続出願であり；２０１７年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５６０，１７６号；２０１７年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／５６４，２５３号；２０１７年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／５６４，９９１号；および２０１８年９月６日に出願された米国仮特許出願第６２／７２８，０５６号の利益を主張し；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０２０８１８は、２０１７年３月１９日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２３１１２の一部継続出願；２０１７年７月８日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４１２７７の一部継続出願；２０１７年３月１９日に出願された米国特許出願第１５／４６２，８５５の一部継続出願；２０１７年７月８日に出願された米国特許出願第１５／６４４，７７８号の一部継続出願であり；２０１７年３月３日に提出された米国仮特許出願第６２／４６７，０３９号；２０１７年９月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／５６０，１７６号；２０１７年９月２７日に出願された米国仮特許出願第６２／５６４，２５３号；および２０１７年９月２８日に出願された米国仮特許出願第６２／５６４，９９１号の利益を主張し；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２３１１２は、２０１６年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３９０，０９３号；２０１６年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６０，０４１号；および２０１７年３月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４６７，０３９号の利益を主張し；国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０４１２７７は、２０１７年３月１９日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２３１１２；２０１７年３月１９日に出願された米国特許出願第１５／４６２，８５５号；２０１６年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６０，０４１号；および２０１７年３月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４６７，０３９号の利益を主張し；米国特許出願第１５／４６２，８５５号は、２０１６年３月１９日に出願された米国仮特許出願第６２／３９０，０９３号；２０１６年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６０，０４１号；および２０１７年３月３日に出願された米国仮特許出願第６２／４６７，０３９号の利益を主張し；米国特許出願第１５／６４４，７７８号は、２０１７年３月１９日に出願された国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２３１１２の一部継続出願であり；２０１７年３月１９日に出願された米国特許出願第１５／４６２，８５５号の一部継続出願であり；２０１６年７月８日に出願された米国仮特許出願第６２／３６０，０４１号および２０１７年３月３日に提出された米国仮特許出願第６２／４６７，０３９号の利益を主張する。これらの出願は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、本出願と同時に提出される電子配列表の資料を参照により本明細書に組み込む。電子配列表の資料は、２０１９年９月２日に作成された「Ｆ１＿００１＿ＷＯ＿０５＿Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ＿０２＿２０１９．ｔｘｔ」という表題のテキスト（．ｔｘｔ）ファイルとして提出され、ファイルサイズは４５０ＫＢであり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本開示は、免疫学の分野、またはより具体的には、Ｔリンパ球もしくは他の免疫細胞の遺伝子改変、およびそのような細胞の増殖を制御する方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
対象（例えば、患者）から単離されたリンパ球は、インビトロで活性化され、遺伝子改変されて、組み込まれた遺伝子プログラムに基づいて他の細胞および環境とのリダイレクトされた関与を可能にする合成タンパク質を発現することができる。そのような合成タンパク質の例としては、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）およびキメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）が挙げられる。現在使用されている１つのＣＡＲは、細胞外認識ドメイン（例えば、抗原結合ドメイン）、膜貫通ドメイン、および複製能力のない組み換えレトロウイルスによってコードされる１つ以上の細胞内シグナル伝達ドメインの融合である。
【０００５】
組み換えレトロウイルスは非分裂細胞に感染する上で効力を示しているが、休止状態のＣＤ４およびＣＤ８リンパ球はこれらのベクターによる遺伝子導入に抵抗性がある。この困難を克服するために、これらの細胞は、典型的には、ＣＡＲ遺伝子ベクターによる遺伝子改変が起こり得る前に、刺激試薬を使用してインビトロで活性化される。刺激および形質導入に続いて、遺伝子改変された細胞はインビトロで拡張され、その後リンパ球枯渇患者に再導入される。インビボでの抗原の関与により、ＣＡＲの細胞内シグナル伝達部分は、免疫細胞における活性化関連応答および細胞溶解性分子の放出を開始して、標的細胞死を誘導することができる。
【０００６】
そのような現在の方法は、患者への再注入の前に体外で増殖するＴ細胞の広範な操作および製造、ならびにサイトカインを遊離し、競合する受容体を枯渇させてＴ細胞の生着を促進するリンパ球枯渇化学療法を必要とする。そのようなＣＡＲ療法は、体内に導入された後のインビボでの増殖速度を制御することも、腫瘍の外側にも発現する標的に安全に誘導することもできない。結果として、ＣＡＲ療法は今日、典型的には、１×１０５〜１×１０８細胞／ｋｇでの用量を用いて１２〜２８日間エクスビボで拡張された細胞から注入され、標的、例えば腫瘍標的に誘導され、その腫瘍外標的毒性（ｏｆｆ  ｔｕｍｏｒ  ｏｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｔｏｘｉｃｉｔｙ）は一般的に許容される。これらの比較的長いエクスビボ拡張時間は、スケーラビリティの課題に加えて、細胞生存率および無菌性、ならびに試料の同一性の問題を引き起こす。したがって、より安全でより効果的なスケーラブルなＴ細胞またはＮＫ細胞治療が強く求められている。
【０００７】
リンパ球の形質導入、増殖および生存を促進するプロセスの理解は、免疫学的プロセスを含む様々な潜在的商業的用途の中心であるため、リンパ球を研究するための改善された方法および組成物が必要である。例えば、リンパ球が遺伝子改変され得る様式、ならびにリンパ球の生存および増殖に影響を与える要因をより良く特徴付けて理解するために使用され得る方法および組成を特定することが有用である。さらに、リンパ球の増殖および生存を促進する組成物を特定することが有用である。そのような組成物は、そのようなプロセスの調節を研究するために使用することができる。リンパ球を研究するための方法および組成物に加えて、改良されたウイルスパッケージング細胞株ならびにそれらを作製および使用する方法が必要である。例えば、そのような細胞株および方法は、組み換えレトロウイルス粒子等の組み換えウイルスの異なる成分を分析する上で、および組み換えレトロウイルス粒子の産生のためにパッケージング細胞株を使用する方法に有用である。
【０００８】
事前活性化およびエクスビボ拡張なしで実行され得るより最近の方法が開発されている。しかしながら、特にそのような方法が例えば注入センター内で対象の血液を採取させ、次いでその同じ日に対象に再導入させる合、そのような方法に必要な複雑さおよび時間をさらに減らすことが非常に望ましいであろう。さらに、より単純で迅速な方法単独、またはより少ない専門機器を必要とする方法は、現在高度に専門化された医療センターでのみ定期的に行われているこれらの細胞治療プロセスを一般化する可能性がある。
【０００９】
一部のグループは、インビボで細胞を形質導入するために、ウイルス粒子を静脈内注入することにより、エクスビボ形質導入の拡張を排除することによって細胞療法のエクスビボ処理を簡素化しようと試みた。しかしながら、そのような方法は大量のベクターを必要とし、またその方法は、凝固因子、および／またはインビボで存在する他の酵素によるレトロウイルス粒子の不活化のリスクを有する。最後に、そのような方法は、非標的細胞／臓器の高レベルの形質導入の危険がある。
【発明の概要】
【００１０】
本明細書で提供されるのは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞等のリンパ球を形質導入および／または遺伝子改変するための方法の有効性および安全性に関連する問題を克服するのに役立つ方法、組成物、およびキットである。そのような方法の特定の実施形態は、これらの細胞を用いて養子細胞療法を実施するために有用である。したがって、いくつかの態様では、リンパ球、特にＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための、および／または形質導入および／もしくは遺伝子改変されたＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞の活性を調節するための方法、組成物、およびキットが本明細書で提供される。そのような方法、組成物、およびキットは、特に組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲｓ）、および例示的な実施形態では微小環境が制限された生物学的（「ＭＲＢ」）ＣＡＲｓを発現するＴ細胞および／またはＮＫ細胞に関して、現在の技術よりも改善された効力および安全性を提供する。本明細書で提供される方法によって産生および／または使用される形質導入および／または遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）粒子を介してレトロウイルス（例えばレンチウイルス）ゲノムから送達される例示的な実施形態では、機能性および機能性の組み合わせを含み、これはそのような細胞およびそのような細胞を利用する方法、例えば研究方法、商業生産方法、および養子細胞療法等に改善された機能を提供する。例えば、そのような細胞は、エクスビボでより短い時間で生成され得、より良く調節することができる改善された増殖特性を有する。
【００１１】
いくつかの態様では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞等のリンパ球を形質導入および／または遺伝子改変するための方法が提供され、例示的な実施形態では、休止Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を形質導入および／または遺伝子改変するためのエクスビボ方法が提供される。これらの態様のいくつかは、以前の方法よりもはるかに迅速に実行でき、より効率的な研究、より効果的な商業生産、および患者ケアの改善された方法を容易化することができる。本明細書で提供される方法、組成物、およびキットは、研究ツールとして、商業生産において、およびＴＣＲまたはＣＡＲを発現する形質導入および／または遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞による養子細胞療法において使用することができる。
【００１２】
Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞等のリンパ球の形質導入に関連する本明細書で提供される方法、使用および組成物に関して、濃縮されたＰＢＭＣの形質導入反応または全血中等での事前のＰＢＭＣ濃縮なしの形質導入反応を含む方法、ならびに関連する使用および組成物が本明細書で提供され、これは、例えばＣＡＲ−Ｔ療法等、エクスビボ細胞処理を実行するための簡素化された迅速な方法である。そのような方法は、より専門性の低い計測およびトレーニングを必要とする。さらに、そのような方法は、インビボ形質導入法と比較して、非標的細胞形質導入のリスクを低減する。さらに、本明細書で提供されるのは、本明細書において提供される他の任意の態様と任意選択で組み合わせて、リンパ球、特にＴ細胞および／またはＮＫ細胞のインビトロ、エクスビボおよびインビボでの拡張を促進するための強力な方法、使用、および組成物を提供することができる特定の標的阻害性ＲＮＡ、ポリペプチドリンパ増殖性要素、およびシュードタイピング要素を含む、上記の方法の実施形態を含む方法、使用、および組成物である。
【００１３】
本開示の態様および実施形態に関するさらなる詳細は、この特許出願全体を通して提供される。セクションおよびセクション見出しは、読みやすくするためのものであり、方法、組成物、およびキットまたはセクション全体にわたるその中の機能要素等の開示の組み合わせを制限することを意図するものではない。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１Ａ】限定されない例示的な細胞処理ワークフローのフローチャートである。図１Ａは、ＰＢＭＣ中のＴ細胞およびＮＫ細胞がレトロウイルス粒子と接触する前に、ＰＢＭＣ濃縮を用いたシステムを使用するプロセスのフローチャートである。図１Ｂは、全血中のＴ細胞およびＮＫ細胞がレトロウイルス粒子と接触する前に血液細胞の分画または濃縮が行われず、形質導入後にＰＢＭＣ濃縮が行われるプロセスのフローチャートである。
【図１Ｂ】（同上）
【図２】関連する血液処理バッグ、チューブ、バルブ、および白血球除去フィルタセットを含むフィルタエンクロージャ（２１０）を備えた限定されない例示的な白血球除去フィルタアセンブリ（２００）の図である。
【図３Ａ】異なるシュードタイピング要素を用いた実験結果のヒストグラムを示す図である。図３Ａは、形質導入後６日目のウェルあたりの生細胞の総数のヒストグラムを示す。図３Ｂは、ｅＴＡＧ発現によって測定された、形質導入されたＣＤ３＋細胞のパーセントのヒストグラムを示す。
【図３Ｂ】（同上）
【図４Ａ】反応混合物が形成される前にＰＢＭＣ濃縮しなかった、全血、レンチウイルス粒子、抗凝固剤ＥＤＴＡまたはヘパリンを含む形質導入反応混合物を用いた実験結果のヒストグラムを示す。このプロセスは、全血を示されたレンチウイルス粒子Ｆ１−３−２３ＧまたはＦ１−３−２３ＧＵと４時間接触させた後、密度勾配遠心分離ベースのＰＢＭＣ濃縮手順を行うことによって実行された。図４Ａは、生きたリンパ球集団のｕＬあたりの絶対細胞数のヒストグラムを示す。図４Ｂは、形質導入後６日目の生きたリンパ球集団におけるＣＤ３＋ｅＴａｇ＋細胞のパーセンテージ（％）のヒストグラムを示す。
【図４Ｂ】（同上）
【図５】示された期間のＭＯＩ  １での異なる組み換えレンチウイルス粒子による非刺激ＰＢＭＣの形質導入後６日目の、培養液１μｌあたりのＣＤ３＋ＦＬＡＧ＋細胞数を示すヒストグラムである。同じＣＡＲに加えて、Ｆ１−３−２５３は抗ＣＤ１９  ＣＡＲをエンコードし、Ｆ１−３−４５１はＣＬＥをエンコードした。レンチウイルス粒子はＶＳＶ−Ｇ［ＶＳＶ−Ｇ］でシュードタイピングされ、任意選択でＵＣＨＴ１ＳｃＦｖＦｃ−ＧＰＩ［ＶＳＶ−Ｇ＋Ｕ］が示されている。示されるように、試料を逆転写阻害剤（ＲＴ  ｉｎｂ）であるダピビリンまたは組み込み阻害剤（ＩＮＴ  Ｉｎｂ）であるドルテグラビルで処理した。
【図６】実施例６で分析されたＣＡＲおよびライブラリの候補ＣＬＥをコードするポリヌクレオチド配列を含む限定されない例示的な導入遺伝子発現カセットの概略図である。
【００１５】
定義
本明細書で使用される場合、「キメラ抗原受容体」または「ＣＡＲ」または「ＣＡＲｓ」という用語は、細胞、例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、および幹細胞に抗原特異性を移植する操作された受容体を指す。本発明のＣＡＲｓは、少なくとも１つの抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン（ＴＭ）、および細胞内活性化ドメイン（ＩＡＤ）を含み、ストーク、および１つ以上の共刺激ドメイン（ＣＳＤ）を含むことができる。別の実施形態では、ＣＡＲは、２つの異なる抗原またはエピトープに特異的な二重特異性ＣＡＲである。ＡＳＴＲが標的抗原に特異的に結合した後、ＩＡＤは細胞内シグナル伝達を活性化する。例えば、ＩＡＤは、抗体の抗原結合特性を利用して、ＭＨＣに制限されない様式で、選択された標的に向けてＴ細胞の特異性および反応性をリダイレクトすることができる。ＭＨＣに制限されていない抗原認識により、ＣＡＲを発現するＴ細胞は、抗原プロセシングとは無関係に抗原を認識することができるため、腫瘍の脱出の主要なメカニズムが回避される。さらに、Ｔ細胞で発現される場合、ＣＡＲｓは、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）アルファおよびベータ鎖と有利に二量体化しない。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「微小環境」という用語は、組織の他の領域または体の領域との一定もしくは一時的、物理的、または化学的差異を有する組織または体の任意の部分または領域を意味する。例えば、本明細書で使用される「腫瘍微小環境」は、腫瘍が存在する環境を指し、これは、腫瘍内の非細胞領域および腫瘍組織のすぐ外側の領域であるが、癌細胞自体の細胞内区画には関係しない。腫瘍微小環境は、悪性プロセスが生き残るおよび／または拡張するおよび／または広がるための構造的および／または機能的環境を作り出す条件を含む、腫瘍環境のありとあらゆる条件を指し得る。例えば、腫瘍微小環境は、これらに限定されないが、圧力、温度、ｐＨ、イオン強度、浸透圧、オスモル濃度、酸化ストレス、１つ以上の溶質の濃度、電解質の濃度、グルコースの濃度、ヒアルロナンの濃度、乳酸もしくは乳酸塩の濃度、アルブミンの濃度、アデノシンのレベル、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸塩のレベル、ピルビン酸塩の濃度、酸素の濃度、および／または酸化剤、還元剤、もしくは共因子の存在、ならびに当業者が理解する他の条件等の条件の変化を含み得る。
【００１７】
本明細書で交換可能に使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドのいずれかの任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語には、一本鎖、二本鎖、もしくは複数鎖のＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリンおよびピリミジン塩基、あるいは他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「抗体」という用語は、無傷の抗体および抗原への特異的結合を保持する抗体の断片を含む、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。抗体断片は、これらに限定されないが、断片抗原結合（Ｆａｂ）断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、Ｆａｂ’−ＳＨ断片、（Ｆａｂ’）２Ｆｖ断片、Ｆｄ断片、組み換えＩｇＧ（ｒＩｇＧ）断片、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む一本鎖抗体断片、二価ｓｃＦｖ、三価ｓｃＦｖ、および単一ドメイン抗体断片（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｄＦｖ、ナノボディ）であってもよい。この用語は、遺伝子操作された、および／または別様に改変された形態の免疫グロブリン、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、一本鎖抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、抗体および非抗体タンパク質の抗原特異的標的化領域を含む融合タンパク質、ヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性抗体、ジアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムジ−ｓｃＦｖ、およびタンデムトリ−ｓｃＦｖを含む。特に明記しない限り、「抗体」という用語は、その機能的抗体断片を含むと理解されるべきである。この用語はまた、ＩｇＧおよびそのサブクラス、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、およびＩｇＤを含む任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、無傷または全長の抗体を含む。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「抗体断片」という用語は、無傷の抗体の一部、例えば、無傷の抗体の抗原結合または可変領域を含む。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ジアボディ；線状抗体（Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５））；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれる。抗体のパパイン消化により、「Ｆａｂ」断片（各断片には単一の抗原結合部位がある）および残留「Ｆｅ」断片（容易に結晶化する能力を反映した名称）と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が生成される。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位を有し、抗原を架橋できるＦ（ａｂ’）２断片が生成される。
【００２０】
本明細書で互換的に使用される場合、「一本鎖Ｆｖ」、「ｓｃＦｖ」、または「ｓＦｖ」抗体断片という用語は、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、これらのドメインは、単一のポリペプチド鎖に存在する。いくつかの実施形態では、Ｆｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間にポリペプチドリンカーまたはスペーサーをさらに含み、これにより、ｓＦｖが抗原結合のための所望の構造を形成することが可能になる。ｓＦｖのレビューについては、ＰｌｕｃｋｔｈｕｎによるＴｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「自然発生」ＶＨおよびＶＬドメインは、米国特許第８７０９７５５Ｂ２号および出願ＷＯ／２０１６／０３３３３１Ａ１に開示されているような特定の条件下でｓｃＦｖ形式で生成されたときにそれらの親和性を変化させるためのさらなる分子進化なしに宿主から単離されたＶＨおよびＶＬドメインを指す。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「親和性」という用語は、２つの薬剤の可逆的結合の平衡定数を指し、解離定数（Ｋｄ）として表される。親和性は、無関係なアミノ酸配列に対する抗体の親和性より少なくとも１倍大きい、少なくとも２倍大きい、少なくとも３倍大きい、少なくとも４倍大きい、少なくとも５倍大きい、少なくとも６倍大きい、少なくとも７倍大きい、少なくとも８倍大きい、少なくとも９倍大きい、少なくとも１０倍大きい、少なくとも２０倍大きい、少なくとも３０倍大きい、少なくとも４０倍大きい、少なくとも５０倍大きい、少なくとも６０倍大きい、少なくとも７０倍大きい、少なくとも８０倍大きい、少なくとも９０倍大きい、少なくとも１００倍大きい、または少なくとも１０００倍大きい、またはそれ以上であってもよい。標的タンパク質に対する抗体の親和性は、例えば、約１００ナノモル（ｎＭ）から約０．１ｎＭ、約１００ｎＭから約１ピコモル（ｐＭ）、または約１００ｎＭから約１フェムトモル（ｆＭ）、またはそれ以上であってもよい。本明細書で使用される場合、「アビディティ」という用語は、希釈後の解離に対する２つ以上の薬剤の複合体の耐性を指す。「免疫反応性」および「優先的に結合する」という用語は、抗体および／または抗原結合断片に関して本明細書で交換可能に使用される。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「結合」という用語は、例えば、塩橋および水橋等の相互作用を含む、共有結合、静電相互作用、疎水性相互作用、ならびにイオン結合および／または水素結合相互作用による２つの分子間の直接会合を指す。非特異的結合とは、約１０−７Ｍ未満の親和性での結合、例えば１０−６Ｍ、１０−５Ｍ、１０−４Ｍ等の親和性での結合を指す。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「細胞表面発現システム」または「細胞表面表示システム」への言及は、細胞の表面上のタンパク質またはその一部の表示または発現を指す。典型的には、細胞表面タンパク質に融合した目的のタンパク質を発現する細胞が生成される。例えば、タンパク質は膜貫通ドメインとの融合タンパク質として発現される。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「要素」という用語は、ポリペプチド、ポリペプチドの領域、およびそれらの機能的突然変異体または断片の融合を含むポリペプチド、ならびにｍｉｃｒｏＲＮＡおよびｓｈＲＮＡを含むポリヌクレオチド、ならびにそれらの機能的突然変異体または断片を含む。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「領域」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの任意のセグメントである。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ドメイン」は、機能的および／または構造的特性を有するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの領域である。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ストーク」または「ストークドメイン」という用語は、隣接するポリペプチド領域に構造的柔軟性および間隔を提供する柔軟なポリペプチドコネクタ領域を指し、天然または合成ポリペプチドからなり得る。ストークは、免疫グロブリン（例えば、ＩｇＧ１）のヒンジまたはヒンジ領域に由来し得、これは、一般に、ヒトＩｇＧ１のＧｌｕ２１６からＰｒｏ２３０に伸びていると定義される（Ｂｕｒｔｏｎ（１９８５）Ｍｏｌｅｃ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：１６１−２０６）。他のＩｇＧアイソタイプのヒンジ領域は、重鎖間ジスルフィド（Ｓ−Ｓ）結合を形成する最初と最後のシステイン残基を同じ位置に配置することにより、ＩｇＧ１配列と整列させることができる。ストークは、米国特許第５，６７７，４２５号に開示されているように、変更されたヒンジ領域を含むがこれに限定されない、自然発生または非自然発生であってもよい。ストークは、任意のクラスまたはサブクラスの抗体に由来する完全なヒンジ領域を含むことができる。ストークはまた、ＣＤ８、ＣＤ２８、または隣接領域に柔軟性および間隔を提供するのと同様の機能を提供する他の受容体に由来する領域を含むことができる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、材料がその元の環境（例えば、それが自然発生の場合は自然環境）から除去されることを意味する。例えば、生きた動物に存在する自然発生ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離されないが、天然系に共存する材料のいくつかまたは全てから分離された同じポリヌクレオチドまたはポリペプチドは単離される。そのようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部であってもよく、および／またはそのようなポリヌクレオチドもしくはポリペプチドは、組成物の一部であってもよく、そのようなベクターまたは組成物がその自然環境の一部ではないという点で依然として単離され得る。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基の一本鎖である。ポリペプチドは固定構造に折りたたまれず、またいかなる翻訳後修飾も有しない。「タンパク質」は、固定構造に折りたたまれるポリペプチドである。「ポリペプチド」および「タンパク質」は、本明細書では交換可能に使用される。
【００３１】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドは、ポリペプチドの自然環境の汚染成分、例えば、酵素、ホルモン、および他のタンパク質性または非タンパク質性溶質等のポリペプチドの診断的または治療的使用を妨げる材料を除去するために「精製」され得る。ポリペプチドは、（１）ローリー法によって決定される抗体の９０重量％超、９５重量％超、もしくは９８重量％超、例えば９９重量％超まで、（２）スピニングカップシークエネーターの使用によってＮ末端もしくは内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーもしくは銀染色を使用して還元もしくは非還元条件下でドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により均一になるまで精製することができる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「免疫細胞」という用語は、一般に、骨髄で産生される造血幹細胞（ＨＳＣ）に由来する白血球（ロイコサイト）を含む。「免疫細胞」には、例えば、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）および骨髄由来細胞（好中球、好酸球、好塩基球、単球、マクロファージ、樹状細胞）が含まれる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「Ｔ細胞」は、Ｔヘルパー細胞（ＣＤ４＋細胞）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＤ８＋細胞）、Ｔ制御性細胞（Ｔｒｅｇ）およびガンマ−デルタＴ細胞を含む、ＣＤ３を発現する全てのタイプの免疫細胞を含む。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「細胞傷害性細胞」には、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、γδＴ細胞、ＣＤ４＋細胞の亜集団、および細胞傷害性応答を媒介することができる細胞である好中球が含まれる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、一般に、多能性または多分化能性の幹細胞を含む。「幹細胞」には、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ）；間葉系幹細胞（ＭＳＣ）；人工多能性幹細胞（ｉＰＳ）；コミットされた前駆細胞（造血幹細胞（ＨＳＣ）；骨髄由来細胞等）が含まれる。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置する」等の用語は、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを指す。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であってもよく、ならびに／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒の点で治療的であってもよい。本明細書で使用される「処置」は、哺乳動物、例えばヒトにおける疾患の任意の処置をカバーし、以下を含む：（ａ）疾患の素因があるかもしれないが、まだそれを有すると診断されていない対象において疾患が発生するのを防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害する、すなわちその発症を阻止すること；および（ｃ）疾患を和らげる、すなわち疾患の退行をもたらすこと。
【００３７】
本明細書で互換的に使用される場合、「個体」、「対象」、「宿主」、および「患者」という用語は、これらに限定されないが、ヒト、ネズミ（例えばラット、マウス）、ウサギ目（例えばウサギ）、非ヒト霊長類、ヒト、イヌ、ネコ、有蹄動物（例えば、ウマ、ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ）を含む哺乳動物を指す。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」または「効力のある量」という用語は、疾患を処置するための哺乳動物または他の対象に投与された場合に、疾患に対するそのような処置に影響を与えるのに十分である薬剤の量、または２つの薬剤の合計量を指す。「治療有効量」は、薬剤、疾患およびその重症度、ならびに処置対象の年齢、体重等によって異なる。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「進化」または「進化する」という用語は、突然変異誘発の１つ以上の方法を使用して、それ自体が改良された生体分子である、および／または別の改良された生体分子の生成に寄与する、異なるポリペプチドをコードする異なるポリヌクレオチドを生成することを指す。「生理学的」または「正常」または「正常な生理学的」条件は、これらに限定されないが、圧力、温度、ｐＨ、イオン強度、浸透圧、オスモル濃度、酸化ストレス、１つ以上の溶質の濃度、電解質の濃度、グルコースの濃度、ヒアルロナンの濃度、乳酸または乳酸塩の濃度、アルブミンの濃度、アデノシンのレベル、Ｒ−２−ヒドロキシグルタル酸塩のレベル、ピルビン酸塩の濃度、酸素の濃度、および／または酸化剤、還元剤、もしくは共因子の存在、ならびに、対象への投与部位、または作用部位の組織もしくは器官で正常範囲内であると考えられる他の条件等の条件である。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子改変された細胞」は、外因性核酸が細胞のゲノムに組み込まれているかどうかに関係なく、外因性核酸を含む細胞である。本明細書で使用される場合、「形質導入された細胞」は、細胞のゲノムに組み込まれる外因性核酸を含む細胞である。
【００４１】
本明細書で使用される「ポリペプチド」は、タンパク質分子の一部または全体、ならびに翻訳後または他の修飾を含み得る。
【００４２】
本明細書で使用されるシュードタイピング要素は、標的宿主細胞を特定および結合する、典型的には糖タンパク質である１つ以上のポリペプチドを含む「結合ポリペプチド」、およびレトロウイルスと標的宿主細胞膜の融合を媒介し、それによりレトロウイルスゲノムが標的宿主細胞に入ることを可能にする１つ以上の「融合性ポリペプチド」を含み得る。本明細書で使用される「結合ポリペプチド」はまた、「Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞結合ポリペプチド」または「標的関与要素」と呼ばれることもあり、「融合性ポリペプチド」は、「融合性要素」と呼ばれることもある。
【００４３】
例えば休止Ｔ細胞等の「休止」リンパ球は、Ｋｉ−６７等の活性化マーカーを発現しない細胞周期のＧ０期のリンパ球である。休止リンパ球には、特定の抗原に遭遇したことのないナイーブＴ細胞や、以前に抗原に遭遇したことによって変化したメモリーＴ細胞が含まれる。「休止」リンパ球はまた、「静止」リンパ球と呼ばれることもある。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「リンパ球枯渇」は、例えば、リンパ球枯渇剤の投与によって、対象におけるリンパ球の数を減少させる方法を含む。リンパ球枯渇はまた、部分的または全身の分割放射線療法によっても達成され得る。リンパ球枯渇剤は、哺乳動物に投与されたときに哺乳動物の機能的リンパ球の数を減少させることができる化合物または組成物であってもよい。そのような薬剤の一例は、１種以上の化学療法剤である。そのような薬剤および投薬量は既知であり、治療される対象に応じて治療する医師によって選択され得る。リンパ球枯渇剤の例には、これらに限定されないが、フルダラビン、シクロホスファミド、クラドリビン、デニロイキン・ディフチトックス、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００４５】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＲＮＡ分子が標的ＲＮＡ分子を中和することによって遺伝子発現または翻訳を阻害する生物学的プロセスである。ＲＮＡ標的は、ｍＲＮＡであってもよく、またはＲＮＡｉによる機能阻害を受けやすい他のＲＮＡであってもよい。本明細書で使用される場合、「阻害性ＲＮＡ分子」は、細胞内に存在することによりＲＮＡｉをもたらし、阻害性ＲＮＡ分子が標的とされる転写物の発現の低下をもたらすＲＮＡ分子を指す。本明細書で使用される阻害性ＲＮＡ分子は、ＲＮＡ二重鎖を形成することができる５’ステムおよび３’ステムを有する。阻害性ＲＮＡ分子は、例えば、ｍｉＲＮＡ（内因性もしくは人工のいずれか）またはｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡの前駆体（すなわちＰｒｉ−ｍｉＲＮＡもしくはＰｒｅ−ｍｉＲＮＡ）またはｓｈＲＮＡ、あるいは、細胞または対象に単離された核酸として直接転写または導入されるｄｓＲＮＡであってもよい。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「二本鎖ＲＮＡ」または「ｄｓＲＮＡ」または「ＲＮＡ二本鎖」は、２本の鎖で構成されるＲＮＡ分子を指す。二本鎖分子には、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ構造を形成する２本のＲＮＡ鎖、またはそれ自体が二重になって二本鎖構造を形成する一本鎖ＲＮＡ鎖で構成される分子が含まれる。必ずしも全てではないが、ほとんどの二本鎖領域の塩基は塩基対である。二本鎖領域は、標的ＲＮＡに相補的な配列を含む。標的ＲＮＡに相補的な配列はアンチセンス配列であり、しばしば１８〜２９、１９〜２９、１９〜２１、または２５〜２８ヌクレオチド長、またはいくつかの実施形態では下端の１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５と、上端の２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０との間であり、特定の範囲の下端は常に上端よりも低い。そのような構造は、典型的には、５’ステム、ループ、および各ステムに隣接し、二本鎖の一部ではないループによって接続された３’ステムを含む。特定の実施形態では、ループは、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、または１０ヌクレオチドを含む。他の実施形態では、ループは、２〜４０、３〜４０、３〜２１、または１９〜２１ヌクレオチド、またはいくつかの実施形態では下端の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０と、上端の１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、または４０との間を含み、特定の範囲の下端は常に上端よりも低い。
【００４７】
本明細書で使用される「ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列」という用語は、ｍｉｃｒｏＲＮＡプロセシング要素を含むヌクレオチド配列を指す。ｍｉｃｒｏＲＮＡプロセシング要素は、前駆体ｍｉｃｒｏＲＮＡからの成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの生成に寄与する最小限の核酸配列である。多くの場合、これらの要素は、ｍｉｃｒｏＲＮＡステムループ構造に隣接する４０ヌクレオチド配列内にある。いくつかの場合において、ｍｉｃｒｏＲＮＡプロセシング要素は、ｍｉｃｒｏＲＮＡステムループ構造に隣接する長さ５〜４，０００ヌクレオチドのヌクレオチド配列のストレッチ内に見られる。
【００４８】
多重阻害性ＲＮＡ分子に関して使用される場合の「リンカー」という用語は、２つの阻害性ＲＮＡ分子を結合する接続手段を指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「組み換えレトロウイルス」は、複製可能なレトロウイルスとして明示的に記載されていない限り、複製不可能な、または「複製能力のない」レトロウイルスを指す。「組み換えレトロウイルス」および「組み換えレトロウイルス粒子」という用語は、本明細書では互換的に使用される。そのようなレトロウイルス／レトロウイルス粒子は、例えば、ガンマレトロウイルス、および例示的な実施形態ではレンチウイルスを含む、任意のタイプのレトロウイルス粒子であり得る。知られているように、そのようなレトロウイルス粒子、例えばレンチウイルス粒子は、典型的には、Ｇａｇ、ＰｏｌおよびＲｅｖ等のパッケージング成分を含むプラスミド、シュードタイピング要素をコードするエンベロープまたはシュードタイピングプラスミド、およびトランスファー、ゲノム、またはレトロウイルス（エグレンチウイルス）発現ベクター（これは典型的には、目的の遺伝子または他のコーディング配列がコードされているプラスミドである）でパッキング細胞をトランスフェクトすることにより、パッキング細胞において形成される。したがって、レトロウイルス（例えばレンチウイルス）発現ベクターは、細胞へのトランスフェクション後の発現およびパッケージングを促進する配列（例えば、プサイパッケージング要素および標的異種コード配列等に隣接する５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ）を含む。「レンチウイルス」および「レンチウイルス粒子」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【００５０】
ｍｉＲＮＡの「フレームワーク」は、ｍｉＲＮＡを取り囲む「５’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列」および／または「３’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列」と、いくつかの場合ではｍｉＲＮＡ内のステム−ループ構造のステムを分離するループ配列とで構成される。いくつかの例では、「フレームワーク」は、例えば、ｍｉＲ−１５５等の自然発生ｍｉＲＮＡに由来する。「５’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列」および「５’アーム」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。「３’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列」および「３’アーム」という用語は、本明細書では交換可能に使用される。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ前駆体」という用語は、一次ＲＮＡ転写物、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、またはｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ等のｍｉＲＮＡに酵素的に処理され得る任意の長さのＲＮＡ分子を指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「構築物」という用語は、単離されたポリペプチドまたはポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチド構築物は、ポリペプチド、例えば、リンパ増殖性要素をコードすることができる。当業者は、状況に応じて、構築物が単離されたポリヌクレオチドを指すのか、または単離されたポリペプチドを指すのかを理解するであろう。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「ＭＯＩ」は、感染多重度比を指し、ここで、ＭＯＩは、細胞数あたりの感染に使用されるウイルス粒子の数の比に等しい。ウイルス粒子数の機能的力価測定は、ＦＡＣＳおよびレポーター発現を使用して実行され得る。
【００５４】
「末梢血単核細胞」（ＰＢＭＣ）は、丸い核を有する末梢血細胞を含み、リンパ球（例えば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞およびＢ細胞）ならびに単球を含む。ＰＢＭＣではないいくつかの血液細胞タイプには、赤血球、血小板、および顆粒球（すなわち、好中球、好酸球、および好塩基球）が含まれる。
【００５５】
本開示、ならびに本明細書で提供される態様および実施形態は、開示された特定の例に限定されず、したがって当然ながら変動し得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の例および実施形態を開示することのみを目的としており、本開示の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定することを意図しないことも理解されたい。
【００５６】
値の範囲が提供される場合、文脈により明確に別段に指定されない限り、下限の単位の１０分の１まで、その範囲の上限と下限との間の各介在値、およびその記載された範囲内の任意の他の記載されたまたは介在する値が本開示に含まれることが理解される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立してより小さな範囲に含まれ得、同じく本発明に包含され、記載された範囲内の特に除外された限界に従う。記載された範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外する範囲も本発明に含まれる。重複する範囲に複数の低い値および複数の高い値が与えられる場合、当業者は、選択された範囲が高い値よりも小さい低い値を含むことを認識するであろう。本出願の全ての見出しは、読者の便宜のためのものであり、限定するものではない。
【００５７】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料もまた、本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をここで説明する。本明細書で言及される全ての刊行物は、それに関して刊行物が引用されている方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈により明確に別段に指定されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「キメラ抗原受容体」への言及は、複数のそのようなキメラ抗原受容体および当業者に知られているそれらの同等物等を含む。特許請求の範囲は、任意選択の要素を除外するように起草される場合があることがさらに留意される。したがって、この記述は、請求要素の列挙に関連して「単独」、「のみ」等の排他的用語を使用する、または「否定的な」制限を使用するための先行する基礎として機能することを意図しいる。
【００５９】
明確にするために、別個の実施形態の文脈で説明されている本発明の特定の特徴はまた、単一の実施形態で組み合わせて提供され得ることが理解される。逆に、簡潔にするために、単一の実施形態の文脈で説明される本発明の様々な特徴はまた、別個に、または任意の適切なサブコンビネーションで提供され得る。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって具体的に包含され、あたかも全ての組み合わせが個別に明示的に開示されたかのように、本明細書に開示される。さらに、様々な実施形態およびその要素の全てのサブコンビネーションもまた、本発明によって具体的に包含され、あたかもそのようなサブコンビネーションのそれぞれが個別にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように、本明細書に開示される。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
本開示は、リンパ球、例えばＮＫ細胞、および例示的な実施形態ではＴ細胞を遺伝子改変するための改善された方法および組成物を提供することにより、従来技術の課題を克服する。本明細書の方法および組成物のいくつかは、リンパ球を形質導入するための単純化されたより迅速なプロセスを提供し、特殊なデバイスを必要とするいくつかのステップを回避する。さらに、任意のそのような処理はエクスビボで行われ、したがって様々な不要な細胞を除去するオプションを可能にするため、この方法は、形質導入後の処理のより良い制御を提供する。したがって、方法は、細胞治療法の一般化に向けた重要なステップを提供する。
【００６１】
リンパ球、例えばＮＫ細胞および例示的な実施形態ではＴ細胞を遺伝子改変するための例示的な方法および組成物は、以前の方法よりも短い時間で実行される。さらに、これらの改良された方法での使用を含む、多くの用途を有する組成物が提供される。これらの組成物のいくつかは、例えば成長因子の非存在下でのインビトロ培養を含む、増殖および生存の質が改善された遺伝子改変されたリンパ球である。そのような遺伝子改変されたリンパ球は、例えば、Ｔ細胞の増殖および生存に影響を与える要因をよりよく理解するための研究ツールとして、また、例えば、採集および試験される、または商用製品に使用され得る成長因子および免疫調節剤等の特定の要因の生成のための商業生産に実用性を有する。
【００６２】
リンパ球を形質導入および／または遺伝子改変するための方法
特定の態様において、リンパ球、例えば末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、典型的にはＴ細胞および／またはＮＫ細胞、特定の例示的な実施形態では休止Ｔ細胞および／または休止ＮＫ細胞（典型的にはその集団）を形質導入および／または遺伝子改変する方法であって、リンパ球を複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子（典型的にはその集団）と接触させることを含む方法が本明細書で提供され、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、典型的には、その表面上にシュードタイピング要素を含み、前記接触（および接触条件下でのインキュベーション）は、膜結合、膜融合、ならびに任意選択で複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子による休止Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入を促進し、それによって遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を産生する。例示的な実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の事前活性化は必要ではなく、本明細書で提供される任意の活性化要素であり得る活性化要素は、接触が行われる反応混合物中に存在する。さらなる例示的な実施形態では、活性化要素は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面上に存在する。例示的な実施形態では、活性化要素は、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ３  ｓｃＦｖＦｃ等の抗ＣＤ３である。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣまたはリンパ球、典型的にはＴ細胞および／またはＮＫ細胞を形質導入および／または遺伝子改変する、本明細書で提供される方法において、細胞に関連しないレトロウイルス粒子を除去するステップを含む、接触ステップおよびその後の任意選択のインキュベーションは、７２時間、４８時間、もしくは２４時間以内、または本明細書で提供される接触時間範囲のいずれかで実行することができる（または発生することができる）。しかしながら、例示的な実施形態では、接触は、２時間未満、１時間未満、３０分未満、または１５分未満で行われるが、いずれの場合も、レトロウイルス粒子および細胞が形質導入反応混合物中での懸濁状態で接触される、少なくとも最初の接触ステップが存在する。この接触は、典型的には、反応混合物の細胞に関連しないレトロウイルス粒子が細胞から分離され、その後さらに処理される最初のステップを含む。そのような懸濁液は、本明細書でさらに詳細に論じられるように、細胞およびレトロウイルス粒子を沈降させること、または遠心力等の力を容器またはチャンバの底に印加することによってそのような沈降を引き起こすことを含み得る。例示的な実施形態では、そのようなｇ力は、スピノキュレーション手順で首尾よく使用されるｇ力よりも低い。さらなる接触時間、ならびに接触および任意のインキュベーションに関する議論は、本明細書でさらに議論される。さらなる例示的な実施形態では、接触は、反応混合物中でのさらなるインキュベーションなしに最初の接触ステップのみ（懸濁液中の遊離レトロウイルス粒子および懸濁液中の細胞を含む反応混合物中でのさらなるインキュベーションなし）の間、または５分、１０分、１５分、３０分、もしくは１時間の反応混合物中でのインキュベーションとともに実施され、これは、反応混合物中の遊離レトロウイルス粒子を細胞に関連する粒子から分離するステップであってもよい。
【００６４】
この方法の様々な実施形態、ならびにそのような方法によって作製されたＮＫ細胞およびＴ細胞等の他の態様は、本明細書に詳細に開示されている。さらに、ＰＢＭＣ、リンパ球、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を形質導入および／または遺伝子改変するためのそのような方法の態様の様々な要素またはステップが、本明細書、例えばこのセクションおよび例示的な実施形態のセクションで提供され、そのような方法は、本明細書においてさらに議論されるような本明細書全体にわたり提供される実施形態を含む。例えば、このセクションおよび例示的な実施形態のセクション等で提供されるＰＢＭＣまたはリンパ球、例えばＮＫ細胞または例示的な実施形態ではＴ細胞を形質導入および／または遺伝子改変するための態様のいずれかの実施形態は、１つ以上のリンパ球増殖性要素、ＣＡＲ、シュードタイピング要素、リボスイッチ、活性化要素、膜結合サイトカイン、ｍｉＲＮＡ、コザック型配列、ＷＰＲＥ要素、三重終止コドン、および／または本明細書に開示される他の要素を含む本明細書で提供される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の実施形態のいずれかを含むことができ、パッケージングセルを使用してレトロウイルス粒子を生成するための本明細書の方法と組み合わされ得る。特定の例示的な実施形態では、レトロウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞等のＰＢＭＣまたはリンパ球を遺伝子改変および／または形質導入するためのそのような方法は、インビトロまたはエクスビボで実行することができる。当業者は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞等のＰＢＭＣまたはリンパ球を形質導入および／または遺伝子改変するための本明細書で提供される詳細が、そのようなステップを含む任意の態様に適用され得ることを認識するであろう。
【００６５】
特定の例示的な実施形態では、細胞は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボのいずれであれ、事前の活性化または刺激を必要とせずに遺伝子改変および／または形質導入される。特定の例示的な実施形態では、細胞は、接触中に活性化され、接触の前に全く、または１５分、３０分、１、２、４、もしくは８時間を超えて活性化されない。特定の例示的な実施形態では、レトロウイルス粒子表面に存在しない要素による活性化は、細胞を遺伝子改変および／または形質導入するために必要とされない。したがって、そのような活性化または刺激要素は、接触前、接触中、または接触後のレトロウイルス粒子以外には必要とされない。したがって、本明細書でより詳細に考察されるように、事前活性化または刺激を必要としないこれらの例示的な実施形態は、Ｔ細胞およびその中の生物学的メカニズムをよりよく理解することを目的としたインビトロ実験を迅速に実施する能力を提供する。さらに、そのような方法は、ＰＢＭＣ、リンパ球、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞を使用して生産される生物学的製品のはるかに効率的な商業生産、およびそのような商業生産方法の開発を提供する。最後に、そのような方法は、養子細胞療法のためのＰＢＭＣのより迅速なエクスビボ処理を提供し、例えば、ポイントオブケア法を提供することによって、そのような療法の提供を根本的に単純化する。
【００６６】
全血中の全血リンパ球におけるリンパ球の軽質導入のための組成および方法
特定の態様では、血液またはその成分、および／または抗凝固剤を含む反応混合物において、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）またはリンパ球、典型的にはＴ細胞および／またはＮＫ細胞、特定の例示的な実施形態では休止Ｔ細胞および／または休止ＮＫ細胞を形質導入および／または遺伝子改変する方法が本明細書で提供され、方法は、リンパ球を、本明細書で提供される別個の態様を表す反応混合物中の複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と接触させることを含む。例示的な実施形態における反応混合物は、リンパ球および複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子、Ｔ細胞活性化要素、ならびに例示的な実施形態において、反応混合物が少なくとも１０％の全血を含むために存在する以下に示す１つ以上の追加の血液成分を含み、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、典型的には、その表面にシュードタイピング要素を含む。そのような方法において、接触（および接触条件下でのインキュベーション）は、リンパ球と複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子との会合を促進し、組み換えレトロウイルス粒子は、リンパ球を遺伝子改変および／または形質導入する。この態様の反応混合物は、少なくとも１０％の全血（例えば、少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の全血）および任意選択で、有効量の抗凝固剤を含み、または、反応混合物は、ＰＢＭＣではない少なくとも１つの追加の血液もしくは血液調製成分をさらに含み、例えば、反応混合物は、有効量の抗凝固剤およびＰＢＭＣではない１つ以上の血液調製成分を含む。例示的な実施形態では、ＰＢＭＣではないそのような血液または血液調製成分は、以下の追加の成分うちの１つ以上（例えば、少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、または５つ）または全てである。
ａ）赤血球（ここで、赤血球は、反応混合物の体積の１〜６０％を占める）、
ｂ）好中球（ここで、好中球は、反応混合物中の白血球の少なくとも１０％を占めるか、または反応混合物は、Ｔ細胞と同数の好中球を少なくとも１０％含む）、
ｃ）好塩基球（ここで、好塩基球は、反応混合物中の白血球の少なくとも０．０５％を占める）、
ｄ）好酸球（ここで、反応混合物は、反応混合物中の白血球の少なくとも０．１％を含む）、
ｅ）血漿（ここで、血漿は、反応混合物の体積の少なくとも１％を占める）、および
ｆ）抗凝固剤
（上記のそのような血液または血液調製成分ａ〜ｆは、本明細書において（「注目すべき非ＰＢＭＣ血液または血液調製成分」）と称される））。
【００６７】
１つ以上の追加の血液成分は、反応混合物の特定の例示的な実施形態（関連する使用、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞、または本明細書で提供されるＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞の態様を遺伝子改変するための方法を含む）に存在するが、これは、これらの例示的な実施形態では、反応混合物が少なくとも１０％の全血、および特定の例示的な実施形態では少なくとも２５％、５０％、７５％、９０％、もしくは９５％の全血、または例えば２５％〜９５％の全血を含むためである。これらの例示的な実施形態では、そのような反応混合物は、全血を抗凝固剤と組み合わせ（例えば、全血を抗凝固剤を含む採血管に採取し）、組み換えレトロウイルスの溶液を抗凝固剤とともに血液に加えることによって形成される。したがって、例示的な実施形態では、反応混合物は、本明細書でより詳細に説明されるような抗凝固剤を含む。いくつかの実施形態では、全血は臍帯血ではないか、または臍帯血を含まない。
【００６８】
これらの態様での反応混合物は、通常、形質導入反応混合物が形成される前のＰＢＭＣ濃縮手順を含まない。したがって、典型的には、そのような反応混合物は、ＰＢＭＣではない、上記のａ）〜ｆ）に列挙された追加の成分を含む。さらに、例示的な実施形態では、反応混合物は、実質的に全血または全血を含むため、反応混合物は、上記のａ）〜ｅ）に列挙された追加の成分の全てを含む。「実質的に全血」とは、個人から分離され、ＰＢＭＣ濃縮手順に供されておらず、他の溶液で５０％未満だけ希釈された血液である。例えば、この希釈は、抗凝固剤の添加、ならびにレトロウイルス粒子を含むある量の液体の添加によるものであり得る。全血中のリンパ球の形質導入に関連する方法および組成物のためのさらなる反応混合物の実施形態が、本明細書で提供される。
【００６９】
別の態様では、全血中のリンパ球を形質導入および／または遺伝子改変する上記の方法によって作製された遺伝子改変リンパ球、例示的な実施形態では遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が本明細書で提供される。さらに別の態様では、対象のリンパ球、例示的な実施形態ではＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変するためのキットの製造における複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の使用が本明細書で提供され、キットの使用は、全血中のリンパ球を形質導入および／または遺伝子改変する上記の方法を含む。別の態様では、遺伝子改変リンパ球を対象に投与するための方法が本明細書で提供され、遺伝子改変リンパ球は、全血中のリンパ球を形質導入および／または遺伝子改変する上記の方法によって生成される。全血中のリンパ球を形質導入および／または遺伝子改変するそのような方法、キットの製造におけるそのような方法の使用、そのような方法で形成される反応混合物、そのような方法によって作製される遺伝子改変リンパ球、ならびにそのような方法によって作製された遺伝子改変リンパ球を投与するための方法を含む本明細書で提供される態様は、本明細書では「全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法の態様」と呼ばれる。そのような態様の例示的な実施形態は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を全血中のレトロウイルス粒子と接触させることを含むが、そのような態様はまた、上記追加の成分ａ〜ｆの１つ以上がＰＢＭＣ濃縮手順後の典型的な濃度よりも高い濃度で形質導入反応混合物中に存在する他の実施形態も含むことに留意されたい。
【００７０】
全血中のリンパ球を形質導入するためのそのような方法の態様の様々な要素またはステップが、本明細書、例えばこのセクションおよび例示的な実施形態のセクションで提供され、そのような方法は、本明細書でさらに論じられるように、本明細書全体で提供される実施形態を含む。当業者は、本明細書のどこかに提供される多くの実施形態が、全血中のリンパ球を形質導入するための組成物の態様および方法の態様のいずれかに適用され得ることを認識するであろう。例えば、このセクションおよび／または例示的な実施形態のセクション等で提供される全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法の態様のいずれかの実施形態は、１つ以上のポリペプチドリンパ増殖性要素、阻害性ＲＮＡ、ＣＡＲ、シュードタイピング要素、リボスイッチ、活性化要素、膜結合サイトカイン、ｍｉＲＮＡ、コザック型配列、ＷＰＲＥ要素、三重終止コドン、および／または本明細書に開示される他の要素を含むものを含む、本明細書で提供される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の実施形態のいずれかを含むことができ、パッケージングセルを使用してレトロウイルス粒子を生成するための本明細書の方法と組み合わせることができる。
【００７１】
本明細書の多くの態様で使用され得る実施形態の限定されない例として、本明細書でより詳細に論じられるように、シュードタイピング要素は、典型的には、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）、例示的な実施形態では休止Ｔ細胞および／または休止ＮＫ細胞と結合し、単独で、または複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の他のタンパク質と組み合わせて膜融合を促進することができる。特定の例示的な実施形態では、レトロウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。全血中のＴ細胞および／またはＮＫ細胞等のリンパ球を遺伝子改変するためのそのような方法は、インビトロまたはエクスビボで実施することができる。
【００７２】
抗凝固剤は、本明細書で提供される全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法の態様の特定の実施形態のための反応混合物に含まれる。いくつかの例示的な実施形態では、血液は、例えば当該技術分野で知られている標準的な採血プロトコルを使用して、抗凝固剤が採取容器（例えば、チューブまたはバッグ）内に存在する状態で採取される。本明細書で提供される全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法の態様で使用され得る抗凝固剤は、トロンビン血液凝固カスケードを遮断または制限する化合物または生物学的製剤を含む。抗凝固剤は、金属キレート剤、好ましくはクエン酸塩（例えば、遊離クエン酸イオンを含む）等のカルシウムイオンキレート剤を含み、これは、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、アデニンおよびモノまたはモノ多糖類、例えばデキストロース、シュウ酸塩、およびＥＤＴＡ；ヘパリンおよびヘパリン類似体、例えば未分画ヘパリン、低分子量ヘパリン、および他の合成糖類；ならびにビタミンＫ拮抗剤、例えばクマリン等の１つ以上の成分を含むクエン酸塩の溶液を含む。例示的なクエン酸塩組成物は、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）（抗凝固剤クエン酸デキストロース溶液Ａおよび溶液Ｂとも呼ばれる（米国薬局方２６、２００２、１５８ページ））；ならびにクエン酸リン酸デキストロース（ＣＰＤ）溶液（これは、当該技術分野で知られているように、ＣＰＤ−Ａ１としても調製することができる）を含む。したがって、抗凝固剤組成物はまた、リン酸イオンまたは一塩基性リン酸イオン、アデニン、および単糖または多糖を含み得る。
【００７３】
そのような抗凝固剤は、当該技術分野で知られているように血液の凝固を防止するのに有効な濃度（すなわち有効量）で、または、例えば有効濃度の２倍、１．５倍、１．２５倍、１．２倍、１．１倍、または９／１０、４／５、７／１０、３／５、１／２、２／５、３／１０、１／５、もしくは１／１０の濃度で反応混合物中に存在し得る。多くの異なる抗凝固剤の有効濃度は既知であり、物理的に観察さえ得る血液凝固を防止する能力について異なる濃度を分析することにより、経験的に容易に決定することができる。凝固を測定する多数の凝固計が市販されており、ＱＣＭセンサ等の様々なセンサ技術が使用され得る（例えば、Ｙａｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｂｌｏｏｄ  Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ  Ｔｅｓｔｉｎｇ  Ｓｍａｒｔｐｈｏｎｅ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ  Ｕｓｉｎｇ  Ｑｕａｒｔｚ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｍｉｃｒｏｂａｌａｎｃｅ  Ｄｉｓｓｉｐａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄ，”Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１８  Ｓｅｐ；１８（９）：３０７３を参照されたい）。有効濃度は、抗凝固剤がチューブまたはバッグ用の血液量で希釈された後の、市販のチューブまたはバッグ内の任意の市販の抗凝固剤の濃度を含む。例えば、本明細書で提供される全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法の態様の特定の実施形態における反応混合物中の酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）の濃度は、市販のＡＣＤ採血管またはバッグ内のＡＣＤの濃度の０．１〜５倍の間、または０．２５〜２．５倍の間、０．５〜２倍の間、０．７５〜１．５倍の間、０．８〜１．２倍の間、０．９〜１．１倍の間、約１倍、または１倍であってもよい。例えば、標準的なプロセスでは、血液は、９部の血液および１部の抗凝固剤の比率で３．２％（１０９ｍＭ）のクエン酸ナトリウム（１０９ｍＭ）を含むチューブまたはバッグ内に採取され得る。したがって、１部の抗凝固剤対９部の血液のこの混合物に１〜２部のレトロウイルス粒子溶液を添加することによって作製された反応混合物を用いた特定の例示的な実施形態では、クエン酸塩濃度は、例えば、０．２５％から０．４％、または０．３０％〜０．３５％の間であってもよい。例示的な標準的採血の実施形態では、１５ｍｌのＡＣＤ溶液Ａが、１００ｍＬの血液を採取するための血液バッグ内に存在する。血液添加前のＡＣＤは、クエン酸（無水）７．３ｇ／Ｌ（０．７３％）、クエン酸ナトリウム（二水和物）２２．０ｇ／Ｌ（２．２％）、およびデキストロース（一水和物）２４．５ｇ／Ｌ［ＵＳＰ］（２．４％）を含む。ＡＣＤが入っているバッグに１００ｍｌの血液を加えた後、例えば５〜２０ｍｌの量の遺伝子改変されたレトロウイルス粒子が加えられる。したがって、いくつかの実施形態では、反応混合物中のＡＣＤ成分の濃度は、０．０５〜０．１％、または０．０６〜０．０８％のクエン酸（無水）、０．１７〜０．２７、または０．２０〜０．２４のクエン酸ナトリウム（二水和物）、０．２〜０．３、または０．２０〜０．２８、または０．２２および０．２６％デキストロース（一水和物）であってもよい。特定の実施形態では、クエン酸ナトリウムは、反応混合物中に０．００１〜０．０２Ｍの濃度で使用される。
【００７４】
いくつかの実施形態では、ヘパリンは、例えば、市販のヘパリン採血管におけるヘパリンの濃度の０．１〜５倍の間、または０．２５〜２．５倍の間、０．５〜２倍の間、０．７５〜１．５倍の間、０．８〜１．２倍の間、０．９〜１．１倍の間、約１倍、または１倍の濃度で反応混合物中に存在する。ヘパリンは、５，０００〜３０，０００ダルトンの範囲の分子量を有するグリコサミノグリカン抗凝固剤である。いくつかの実施形態では、ヘパリンは、約１．５〜４５、５〜３０、１０〜２０、または１５ＵＳＰ単位／反応混合物のｍｌの濃度で使用される。いくつかの実施形態では、本明細書の反応混合物中の、例えばＫ２ＥＤＴＡとしてのＥＤＴＡの有効濃度は、０．１５〜５ｍｇ／ｍｌの間、１〜３ｍｇ／ｍｌの間、１．５〜２．２ｍｇ／ｍｌの間、または１〜２ｍｇ／ｍｌの間、または約１．５ｍｇ／ｍｌであってもよい。本明細書で提供される全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法の態様における反応混合物は、その組み合わせた有効用量が反応混合物の形成前の血液、および／または反応混合物自体の凝固を防止する２つ以上の抗凝固剤を含んでもよい。
【００７５】
いくつかの実施形態では、抗凝固剤は、エクスビボ形質導入のために対象から血液が採取される前に対象に投与されてもよく、その結果、血液が採取されたときの血液の凝固は、少なくとも部分的かつ少なくとも接触工程およびその後の任意選択のインキュベーション期間を通して阻害される。そのような実施形態では、例えば、酸性クエン酸デキストロースは、８０ｍｇ／ｋｇ／日〜５ｍｇ／ｋｇ／日の間で対象に投与され得る（ｍｇはクエン酸のｍｇを指し、ｋｇは治療される哺乳動物に適用される）。ヘパリンは、例えば、５単位／ｋｇ／時から３０単位／ｋｇ／時の間の用量で送達され得る。
【００７６】
抗凝固剤に加えて、またはその代わりに、本明細書で提供される全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法の態様は、以下の成分のうちの１つ以上から選択される、少なくとも１つの追加の成分を含むことができる：
ａ）赤血球（ここで、赤血球は、反応混合物の体積の０．１〜７５％を占める）、
ｂ）好中球（ここで、好中球は、反応混合物中の白血球の少なくとも１０％を占めるか、または反応混合物は、Ｔ細胞と同数の好中球を少なくとも１０％含む）、
ｃ）好塩基球（ここで、好塩基球は、反応混合物中の白血球の少なくとも０．０５％を占める）、
ｄ）好酸球（ここで、反応混合物は、反応混合物中の白血球の少なくとも０．１％を含む）、
ｅ）血漿（ここで、血漿は、反応混合物の体積の少なくとも１％を占める）、および
ｆ）血小板（ここで、血小板は、１リットルの反応混合物当たり少なくとも１×１０６個の血小板を含む）。
【００７７】
赤血球に関して、いくつかの実施形態では、赤血球は、範囲の下限の反応混合物の体積の０．１、０．５、１、５、１０、２５、３５または４０％から、範囲の上限の反応混合物の体積の２５、５０、６０、または７５％の間を占めてもよい。例示的な実施形態では、赤血球は、１〜６０％の間、１０〜６０％の間、２０〜６０％の間、３０〜６０％の間、４０〜６０％の間、４０〜５０％の間、４２〜４８％の間、４４〜４６％の間、約４５％または４５％を占める。
【００７８】
好中球に関して、いくつかの実施形態では、好中球は、範囲の下限の反応混合物の白血球の０．１、０．５、１、５、１０、２０、２５、３５または４０％から、範囲の上限の反応混合物の白血球の２５、５０、６０、７０、７５および８０％の間、例えば、反応混合物の白血球の２５％〜７０％の間、または３０％〜６０％の間、または４０％〜６０％の間を占めてもよい。いくつかの実施形態では、本明細書の反応混合物中に、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞よりも多くの好中球が存在する。
【００７９】
好酸球に関して、いくつかの実施形態では、好酸球は、範囲の下限の反応混合物の白血球の０．０５、０．１、０．２、０．４、０．６、０．８、１．０、１．２、１．４、１．６、および１．８％から、範囲の上限の反応混合物の白血球の２．０、２．２、２．４、２．６、２．８、３．０、３．５、４、５、６、８および１０％の間を占めてもよい。例示的な実施形態では、好酸球は、反応混合物の白血球の０．０５〜１０．０％の間、０．１〜９％の間、０．２〜８％の間、０．２〜６％の間、０．５〜４％の間、０．８〜４％の間、または１〜４％の間を占める。
【００８０】
好塩基球に関して、いくつかの実施形態では、好塩基球は、範囲の下限の反応混合物の白血球の０．０５、０．１、０．２、０．４、０．４５および０．５％から、範囲の上限の反応混合物の白血球の０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．５、および２．０％の間を占めてもよい。例示的な実施形態では、好塩基球は、反応混合物の白血球の０．０５〜１．４％の間、０．１〜１．４％の間、０．２〜１．４％の間、０．３〜１．４％の間、０．４〜１．４％の間、０．５〜１．４％の間、０．５〜１．２％の間、０．５〜１．１％の間、または０．５〜１．０％の間を占める。
【００８１】
血漿に関して、いくつかの実施形態では、血漿は、範囲の下限の反応混合物の体積の０．１、０．５、１、５、１０、２５、３５または４５％から、範囲の上限の反応混合物の体積の２５、５０、６０、７０、および８０％の間を占めてもよい。例示的な実施形態では、血漿は、反応混合物の０．１〜８０％の間、１〜８０％の間、５〜８０％の間、１０〜８０％の間、３０〜８０％の間、４０〜８０％の間、４５〜７０％の間、５０〜６０％の間、５２〜５８％の間、５４〜５６％の間、約５５％または５５％を占める。
【００８２】
血小板に関して、いくつかの実施形態では、血小板は、範囲の下限の１ｍＬの反応混合物当たり１×１０５、１×１０６、１×１０７、または１×１０８個の血小板から、範囲の上限の１ｍＬの反応混合物当たり１×１０９、１×１０１０、１×１０１１、１×１０１２、２×１０１３、または２×１０１４個の血小板を含んでもよい。例示的な実施形態では、血小板は、１ｍｌの反応混合物当たり１×１０５〜１×１０１２個の間の血小板、１×１０６〜１×１０１１個の間の血小板、１×１０７〜１×１０１０個の間の血小板、１ｍＬ当たり１×１０８〜１×１０９個の間の血小板、または１×１０８〜５×１０８個の間の血小板を含む。
【００８３】
血液またはその成分の存在下でＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変するための例示的な細胞処理方法
本明細書で提供される遺伝子改変のための方法のいくつかの実施形態が、対象から血液を採取するステップを含まないことは注目に値する。しかしながら、図１に示されるように、本明細書で提供されるいくつかの方法は、対象から血液が採取されるステップ（１１０）を含む。本明細書でより詳細に論じられるように、当該技術分野で知られている任意の適切な方法によって、対象から血液を採取または獲得することができる。例えば、血液は、静脈穿刺または血液の試料が採取される任意の他の採血方法によって採取することができる。いくつかの実施形態では、採取される血液の量は、２５ｍｌ〜２５０ｍｌ、例えば、２５ｍｌ〜６０ｍｌ、５０ｍｌ〜９０ｍｌ、７５ｍｌ〜１２５ｍｌ、または９０ｍｌ〜１２０ｍｌ、または９５〜１１０ｍｌである。
【００８４】
血液が対象から採取されるかどうかに関係なく、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を遺伝子改変するために本明細書で提供される方法の態様のいずれかにおいて、リンパ球は、反応混合物中の複製能力のないレトロウイルス粒子と接触される。例示的な実施形態では、この接触、および接触が起こる反応混合物は、本明細書でより詳細に考察されるように、閉鎖型細胞処理システム内で行われる。エクスビボでのリンパ球の遺伝子改変および／または形質導入を含む従来の閉鎖型細胞処理法、特に自己細胞療法の方法では、ＰＢＭＣ濃縮、洗浄、細胞活性化、形質導入、拡張、採取、および任意選択で再導入等の多くのステップが数日にわたって行われる。より最近の方法（図１Ａを参照されたい）では、このエクスビボ細胞処理に含まれるステップおよび時間のいくつかが短縮された（例えば、ＷＯ２０１９／０５５９４６を参照されたい）。これらのより最近の方法（および本明細書で提供されるさらに改善された細胞処理方法）は、事前活性化（例えば、レトロウイルス粒子と接触する前にリンパ球、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞を活性化剤と３０、１５、１０、または５分未満接触させること）を含まない、または最小限で含む、迅速なエクスビボ形質導入プロセスをさらに使用する。そのような方法の特定の実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞活性化要素は、接触ステップが起こる反応混合物中に存在する。例示的な実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞活性化要素は、反応混合物中に存在するレトロウイルス粒子の表面と会合している。例示的な実施形態では、そのような方法は、ポイントオブケア自家細胞療法で使用される。しかしながら、そのようなより最近の方法は、依然として、ＰＢＭＣ濃縮ステップ／手順（１２０）を含み、これは典型的には閉鎖システム内で少なくとも約１時間かかり、続いて、細胞のカウント、移送、および培地の添加が行われ、これは、リンパ球がレトロウイルス粒子と接触して形質導入反応混合物を形成する（１３０Ａ）前に少なくとも約４５分かかる。本明細書で詳細に論じられるように、典型的にはインキュベーションを伴う接触ステップである「ウイルス形質導入」ステップに続いて、リンパ球は、典型的には、例えばＳｅｐａｘを使用して懸濁液中に残留するレトロウイルス粒子から洗い流され（１４０Ａ）、収集され（１５０Ａ）、最終生成物は、典型的には、再注入用の注入バッグまたは保管用の凍結保存バイアル（１６０Ａ）に入れられる。本明細書でさらに詳細に論じられるように、従来のＰＢＭＣ濃縮手順は、典型的には、フィコール密度勾配および遠心力（例えば遠心分離）もしくは求心力（例えばＳｅｐａｘ）を含むか、または白血球泳動を使用してＰＢＭＣを濃縮する。
【００８５】
本明細書で提供される実施例に示されるように、驚くべきことに、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）は、抗凝固剤を含む全血の反応混合物中の複製能力のないレトロウイルス粒子と接触し得、リンパ球のかなりの割合が遺伝子改変され、形質導入され得ることが見出された。したがって、組み換えレトロウイルス粒子によるリンパ球の効果的な遺伝子改変は、ＰＢＭＣに加えて血液成分および血液細胞の存在下で実行され得ることが発見された。さらに、レトロウイルス粒子によるＴ細胞および任意選択でＮＫ細胞の効果的な遺伝子改変に関して上記で論じた驚くべき発見に基づいて、接触が全血で行われる場合でも、本明細書の例示的な実施形態では、複製能力のないレトロウイルス粒子を全血に直接添加して反応混合物を形成する（１３０Ｂ）ことによりリンパ球が遺伝子改変および／または形質導入され、全血中の細胞が、本明細書で提供される任意選択インキュベーションとともに複製能力のないレトロウイルス粒子と接触するさらに単純化された方法が提供される。したがって、この例示的な実施形態におけるそのようなさらに改善された方法は、典型的には抗凝固剤を含む全血中のリンパ球がレトロウイルス粒子と接触する前にリンパ球濃縮ステップを含まない。このさらに改善された方法は、本明細書の他の細胞処理方法と同様に、典型的には、閉鎖型細胞処理システム内で実行され、リンパ球がレトロウイルス粒子と接触する前の事前活性化を含まないか、最小限に含み得る。これらのさらに単純化された方法では、全血中のリンパ球を血液バッグ内で直接レトロウイルス粒子と接触させることができる。そのような方法での接触ステップ（１３０Ｂ）の後、レトロウイルス粒子と接触したリンパ球は洗浄され、ＰＢＭＣ濃縮手順（１３５Ｂ）を使用して高濃度化され、これにより、好中球が減少し、対象への再導入が容易になる。したがって、そのような実施形態では、典型的には抗凝固剤を含む全血中の細胞が組み換えレトロウイルス粒子と接触する前に、ＰＢＭＣ濃縮手順およびリンパ球濃縮濾過は行われない。しかしながら、図１Ｂの実施形態では、そのようなＰＢＭＣ濃縮方法は、例えば、任意のインキュベーションとともに接触（１３０Ｂ）が行われた後、フィコール勾配を有するＳｅｐａｘを使用して行われる（１３５Ｂ）。ＰＢＭＣ濃縮後、リンパ球は、任意選択で、例えばＳｅｐａｘを使用して残留するレトロウイルス粒子からさらに洗い流され（１４０Ｂ）、収集され（１５０Ｂ）、最終生成物は、典型的には、再注入用の注入バッグまたは保管用の凍結保存バイアルに入れられる（１６０Ｂ）。
【００８６】
図２は、図１の方法において白血球除去フィルタとして使用することができる有核細胞を濃縮する細胞処理白血球除去濾過アセンブリ（２００）の限定されない例示的な例を提供する。例示的な実施形態では単回使用濾過アセンブリである例示的な白血球除去濾過アセンブリ（２００）は、入口（２２５）および出口（２２６）を有するフィルタエンクロージャ（２１０）内の白血球除去媒体（例えばフィルタセット）、ならびに、灌流および逆灌流を使用して、保持された白血球または有核赤血球を高濃度化、濃縮、洗浄、および収集する能力を提供するバッグ、バルブ、および／またはチャネル／チューブの構成を備える（例えば、参照により全体が本明細書に組み込まれるＥＰ２６０２３１５Ａ１を参照されたい）。例示的な実施形態では、白血球除去濾過アセンブリ（２００）は、市販のＨｅｍａＴｒａｔｅフィルタ（Ｃｏｏｋ  Ｒｅｇｅｎｅｔｅｃ、インディアナポリス、ＩＮ）である。白血球除去濾過アセンブリを使用して、顆粒球を含む全有核細胞（ＴＮＣ）を高濃度化することができ、これは、閉鎖型細胞処理システムのＰＢＭＣ濃縮手順で除去される。ＨｅｍａＴｒａｔｅフィルタ等のＥＰ２６０２３１５Ａ１の白血球除去培地を備えるフィルタアセンブリおよび図２の例示的な白血球除去フィルタアセンブリは顆粒球を除去しないため、それらは本明細書ではＰＢＭＣ濃縮アセンブリまたはフィルタとは見なされず、それらを組み込む方法は、本明細書ではＰＢＭＣ濃縮手順またはステップとは見なされない。
【００８７】
図２の白血球除去フィルタアセンブリ（２００）は、全血および白血球を含む血液細胞調製物からの白血球の単離、ならびに白血球の迅速な洗浄および高濃度化を可能にする様々なチューブおよびバルブ、典型的には無針バルブを含む単回使用滅菌アセンブリである。この例示的なアセンブリでは、本明細書に詳細に開示されるように反応混合物が任意選択のインキュベーションを伴う接触工程に供された後、血液バッグ（２１５）、例えば、全血、抗凝固剤、およびレトロウイルス粒子を含む約１２０ｍｌの形質導入／接触反応混合物を含む５００ｍｌのＰＶＣバッグが、入口チューブ（２５５）の第１のアセンブリ開口部（２１７）においてアセンブリ（２００）に接続されている。関連するレトロウイルス粒子を伴ういくつかのＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含むリンパ球、ならびにこの時点で遺伝子改変される可能性のあるいくつかのリンパ球、ならびに全血反応混合物中の他の血液細胞および成分、ならびに抗凝固剤が、第１の入口チューブ（２５５）のクランプが解放されたときの重力により第１のアセンブリ開口部（２１７）を通って入口チューブ（２５５）に入る。遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞は、入口バルブ（２４７）および収集バルブ（２４５）を通過し、フィルタエンクロージャ入口（２２５）を通ってフィルタエンクロージャ（２１０）に入り、フィルタエンクロージャ（２１０）内の白血球除去ＩＶフィルタセット（例えば、ＳＫＵ  Ｊ１４７２Ａ  Ｊｏｒｇｅｎｓｅｎ  Ｌａｂｓ）と接触する。白血球を含む有核赤血球はフィルタによって保持されるが、他の血液成分はフィルタを通過し、フィルタエンクロージャ出口（２２６）から出口チューブ（２５６）に入り、次いで出口バルブ（２４７）を通り、例えば２Ｌ  ＰＶＣ廃棄物収集バッグであってもよい廃棄物収集バッグ（２１６）に収集される。
【００８８】
任意選択の緩衝液洗浄ステップは、入口バルブ（２４７）を洗浄位置に切り替えることで実行され得る。この任意の洗浄ステップでは、緩衝液バッグ（２１９）、例えば５００ｍｌの生理食塩水洗浄バッグが、入口チューブ（２５５）の第２のアセンブリ開口部（２１８）に接続される。緩衝液は、入口チューブ（２５５）のクランプが解放されると、重力によって２番目のアセンブリ開口部（２１８）を通って入口チューブ（２５５）に移動する。緩衝液は、入口バルブ（２４７）および収集バルブ（２４５）を通過し、フィルタ囲い入口（２２５）を通ってフィルタ囲い（２１０）に入り、フィルタ囲い（２１０）内に設定された白血球除去フィルタを通過して、保持されたリンパ球をすすぐ。フィルタに。緩衝液は、フィルタエンクロージャ出口（２２６）から出口チューブ（２５６）に移動し、次いで出口バルブ（２４７）を通過して、前のステップでフィルタを通過した反応混合物成分を収集するために使用されたものと同じ廃棄物収集バッグ、または第１の廃棄物収集バッグの代わりに交換された新しい廃棄物収集バッグであってもよい廃棄物収集バッグ（２１６）に収集されてから、緩衝液が第２のアセンブリ開口部（２１８）に入る。任意選択の洗浄ステップは、追加の緩衝液を用いて上記のプロセスを繰り返すことにより、任意選択で複数回実行され得る。
【００８９】
血液バッグ（２１５）内の反応混合物の全量または実質的に全量がフィルタ（２１０）を通過し、任意選択の洗浄ステップが任意選択で実行されると、逆灌流プロセスが開始されて、フィルタエンクロージャ（２１０）内のフィルタセットに保持されたリンパ球を収集するためのアセンブリ（２００）の反対方向に流体を移動させる。本明細書における白血球除去フィルタアセンブリの例示的な実施形態は、再灌流に適応可能である。例示的なアセンブリ（２００）において逆灌流プロセスを開始する前に、出口バルブ（２４７）は再灌流位置に切り替えられ、収集バルブ（２４５）は収集位置に切り替えられる。再灌流を開始するために、注射器（２６６）内の緩衝液（例えば、ＰＢＳ）（例えば、２５ｍｌの注射器であってもよい）が、注射器（２６６）を用いた注入によって出口チューブ（２５６）に通される。次いで、緩衝液は、フィルタエンクロージャ出口（２２６）を通ってフィルタエンクロージャ（２１０）に入り、フィルタセットに保持されたリンパ球を、フィルタエンクロージャ（２１０）からフィルタエンクロージャ入口（２２５）を通って入口チューブ（２５５）に移動させる。次いで、関連するレトロウイルス粒子を伴ういくつかのＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含むリンパ球（そのいくつかはこの時点では遺伝子改質および／または形質導入されいてもよい）は、収集バルブ（２４５）を通過した後２５ｍｌ凍結保存バッグであってもよい細胞試料収集バッグ（２６５）に収集される。
【００９０】
いくつかの態様では、ＮＫ細胞および／または例示的な実施形態ではＴ細胞を遺伝子改変するためのキットが、本明細書で提供される。キットは、白血球除去フィルタアセンブリ、および典型的にはチューブまたはバイアルに含まれる本明細書に開示される複製能力のないレトロウイルスベクターの実施形態のいずれかを含む。そのようなキットの白血球除去濾過アセンブリは、典型的には、図２の例示的なアセンブリによって例示されるように、典型的にはフィルタエンクロージャ内の白血球除去フィルタまたは白血球除去フィルタセット、ならびに、単回使用閉鎖型血液処理システムでの使用に適合した、複数の接続された滅菌チューブおよびそれに接続された複数のバルブを含む。そのようなキットは、抗凝固剤、血液処理緩衝液バッグ、血液処理廃棄物収集バッグ、血液処理細胞試料収集バッグ、および滅菌注射器を含む例示的な実施形態では、任意選択で採血バッグを含む。例示的な実施形態では、キットは、本明細書で詳細に開示されるようなＴ細胞活性化要素、例えば抗ＣＤ３を含む。そのような活性化要素は、レトロウイルス粒子を含むチューブまたはバイアル内の溶液中に、または別個のチューブまたはバイアル内に提供することができる。例示的な実施形態では、活性化要素は、複製能力のないレトロウイルス粒子の表面に会合する抗ＣＤ３である。例示的な実施形態では、キット内の複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、１つ以上の転写単位は、本明細書で提供される実施形態のいずれかによる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および任意選択でリンパ増殖性要素を含む第１のポリペプチドをコードする。
【００９１】
リンパ球を遺伝子改変するための方法のためのステップおよび反応混合物
典型的にはリンパ球、ＰＢＭＣ、および例示的な実施形態ではＮＫ細胞および／またはさらなる例示的な実施形態ではＴ細胞を遺伝子改変するための方法である、本明細書で提供される任意の態様で使用される任意の方法のいくつかの実施形態は、対象から血液を採取するステップを含み得る。血液は、本明細書で提供される方法および組成物で使用され得るリンパ球（例えばＴ細胞およびＮＫ細胞）等の血液細胞を含む血液成分を含む。特定の例示的な実施形態では、対象は、癌に罹患しているヒト対象（すなわちヒト癌対象）である。特定の実施形態はそのようなステップを含まないことが注目に値する。しかしながら、対象から血液を採取することを含む実施形態では、血液は、本明細書でより詳細に論じられるように、当該技術分野で知られている任意の適切な方法によって対象から採取または獲得することができる。例えば、血液は、静脈穿刺または血液の試料が採取される任意の他の採血方法によって採取することができる。いくつかの実施形態では、採取される血液の量は、５０ｍｌ〜２５０ｍｌ、例えば、７５ｍｌ〜１２５ｍｌ、または９０ｍｌ〜１２０ｍｌ、または９５〜１１０ｍｌである。いくつかの実施形態では、採取される血液の量は、範囲の下限の２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、または９００ｍｌから、範囲の上限の３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、または９００ｍｌ、または１Ｌまでであり得る。いくつかの実施形態では、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）は、アフェレーシスによって得ることができる。いくつかの実施形態では、アフェレーシス中に採取および処理される血液の量は、範囲の下限のある対象の総血液量の０．５、０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、または１．５倍から、範囲の上限のある対象の総血液量の０．６、０．７、０．７５、０．８、０．９、１、１．２５、１．５、１．７５、２、２．２５、または２．５倍の間であってもよい。ヒトの総血液量は、典型的には、４．５〜６Ｌの範囲であり、したがって、本明細書の例示的な実施形態のように、血液が採取され、次いでその中のリンパ球が遺伝子改変および／または形質導入される場合よりも、アフェレーシス中にはるかに多くの血液が採取および処理される。
【００９２】
対照から血が採取されるかどうかに関係なく、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を遺伝子改変するための本明細書で提供される方法の態様のいずれかにおいて、リンパ球は、反応混合物中の複製能力のないレトロウイルス粒子と接触される。本明細書で提供される任意の実施形態での接触は、本明細書でより詳細に論じられるように、例えば血液バッグ内で、血液細胞の処理に適合された閉鎖システムのチャンバ内で実行され得る。形質導入反応混合物は、１つ以上の緩衝液、イオン、および培地を含み得る。レトロウイルス粒子に関して、また例示的な実施形態ではレンチウイルス粒子に関して、本明細書で提供される特定の例示的な反応混合物中、０．１〜５０、０．５〜５０、０．５〜２０、０．５〜１０、１〜２５、１〜１５、１〜１０、１〜５、２〜１５、２〜１０、２〜７、２〜３、３〜１０、３〜１５、もしくは５〜１５の間の感染多重度（ＭＯＩ）；または、少なくとも１および６、１１、もしくは５１未満のＭＯＩ；またはいくつかの実施形態では、５〜１０の間のＭＯＩ単位の複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が存在する。いくつかの実施形態では、ＭＯＩは、少なくとも０．１、０．５、１、２、２．５、３、５、１０、または１５であり得る。血液中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法に関して、特定の実施形態では、ＰＢＭＣが単離されて反応混合物で使用される方法よりも高いＭＯＩを使用することができる。例えば、全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法の例示的な実施形態は、１×１０６ＰＢＭＣ／血液のｍｌを想定して、１〜５０、２〜２５、２．５〜２０、２．５〜１０、４〜６、または約５、およびいくつかの実施形態では５〜２０、５〜１５、１０〜２０、または１０〜１５の間のＭＯＩを有するレトロウイルス粒子を使用することができる。
【００９３】
例示的な実施形態では、この接触、および接触が起こる反応混合物は、本明細書でより詳細に考察されるように、閉鎖型細胞処理システム内で行われる。パッケージング細胞、および例示的な実施形態ではパッケージング細胞株、特に例示的な実施形態では本明細書の特定の態様で提供されるパッケージング細胞を使用して、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を生成することができる。反応混合物中のリンパ球は、ＰＢＭＣであってもよく、または全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法を提供する本明細書の態様では、本命支所で論じられるように、抗凝固剤および／もしくはＰＢＭＣではない追加のタイプの血液細胞を含む追加の血液成分であってもよい。実際、全血中のリンパ球を形質導入するためのこれらの組成物および方法の態様の例示的な実施形態では、反応混合物は、本質的に全血、および典型的には抗凝固剤、レトロウイルス粒子、およびレトロウイルス粒子が全血に送達された少量の溶液であってもよい。
【００９４】
本明細書で提供されるいくつかの反応混合物において、Ｔ細胞は、例えば、範囲の下限の反応混合物のリンパ球の１０、２０、３０、または４０％から、範囲の上限の反応混合物のリンパ球の４０、５０、６０、７０、８０、または９０％の間で存在し得る。例示的な実施形態では、Ｔ細胞は、リンパ球の１０〜９０％の間、２０〜９０％の間、３０〜９０％の間、４０〜９０％の間、４０〜８０％の間、４５％〜７５％の間を占める。そのような実施形態では、例えば、ＮＫ細胞は、範囲の下限の反応混合物のリンパ球の１、２、３、４、または５％から、範囲の上限の反応混合物のリンパ球の５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４％の間で存在し得る。例示的な実施形態では、Ｔ細胞は、反応混合物のリンパ球の１〜１４％の間、２〜１４％の間、３〜１４％の間、４〜１４％の間、５〜１４％の間、５〜１３％の間、５〜１２％の間、５〜１１％の間、または５〜１０％の間を占める。
【００９５】
本明細書で提供される全血中のリンパ球を遺伝子改変するための組成物および方法の態様に関連する反応混合物において、ＮＫ細胞およびＴ細胞を含むリンパ球は、反応混合物を形成する前にＰＢＭＣ濃縮手順を含む方法よりも、反応混合物においてより低いパーセントの血液細胞およびより低いパーセンテージの白血球で存在し得る。例えば、これらの態様のいくつかの実施形態では、ＮＫ細胞またはさらにはＴ細胞よりも多くの顆粒球または好中球が反応混合物中に存在する。全血中のリンパ球を遺伝子改変するための態様の反応混合物中に存在する抗凝固剤および１つ以上の追加の血液成分の組成に関する詳細は、本明細書の他のセクションで詳細に提供される。
【００９６】
本明細書に開示されるように、全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法の態様は、典型的には、血液試料からのリンパ球がそれらの態様について本明細書に開示される反応混合物中のレトロウイルス粒子と接触する前に、血液試料のＰＢＭＣ濃縮ステップを含まない。しかしながら、いくつかの実施形態では、好中球／顆粒球は、細胞が複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と接触される前に、他の血液細胞から分離される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞等の末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を含む末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、反応混合物中でレトロウイルス粒子と組み合われる前に、例えばＰＢＭＣ濃縮手順を使用して、血液試料の他の成分から単離される。
【００９７】
ＰＢＭＣ濃縮手順は、ＰＢＭＣが他の血液細胞タイプから少なくとも２５倍、典型的には少なくとも５０倍濃縮される手順である。例えば、ＰＢＭＣは全血中の血液細胞の１％未満を構成すると考えられている。ＰＢＭＣ濃縮手順の後、ＰＢＭＣ画分で単離された細胞の少なくとも３０％、いくつかの例では実に７０％がＰＢＭＣである。いくつかのＰＢＭＣ濃縮手順を使用して、ＰＢＭＣのさらに高い濃縮が達成される可能性がある。様々な異なるＰＢＭＣ濃縮手順が当該技術分野で知られている。例えば、ＰＢＭＣ濃縮手順は、リンパ球、単球、顆粒球、赤血球等の主要な細胞集団を密度勾配培地全体で分離するフィコール密度勾配遠心分離プロセスである。そのような方法では、水性媒体は、高密度溶液を形成する親水性多糖類であるフィコールを含む。２つの層を混合せずに密度培地の上または下に全血を重ねた後、遠心分離すると、細胞が密度に応じて分散し、ＰＢＭＣ画分が血漿と密度勾配培地との界面に薄い白い層を形成する（例えば、Ｐａｎｄａ  ａｎｄ  Ｒａｖｉｎｄｒａｎ（２０１３）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＰＢＭＣｓ．ＢｉｏＰｒｏｔｏｃ．Ｖｏｌ．３（３）を参照されたい）。さらに、Ｓｅｐａｘ細胞処理システムの回転力を使用して、フィコールでＰＢＭＣを他の血液成分から分離するために、求心力を使用することができる。
【００９８】
別のＰＢＭＣ濃縮法では、自動白血球アフェレーシス採取システム（ＴＥＲＵＭＯ  ＢＣＴ，ＩＮＣ．  Ｌａｋｅｗｏｏｄ  ＣＯ  ８０２１５、ＵＳＡからのＳＰＥＣＴＲＡ  ＯＰＴＩＡ（登録商標）ＡＰＨＥＲＥＳＩＳ  ＳＹＳＴＥＭ）を使用して、典型的には血漿、赤血球、および顆粒球等の流出物質をドナーに戻しながら高速遠心分離を用いて標的ＰＢＭＣ画分から全血の流入を分離するが、本明細書で提供される方法では、戻すことは任意選択的である。残留赤血球および顆粒球を除去するには、さらに処理が必要となり得る。どちらの方法も、ＰＢＭＣの時間のかかる精製を含み、白血球アフェレーシス法では、ＰＢＭＣ濃縮ステップ中に患者の存在と参加が必要である。
【００９９】
ＰＢＭＣ濃縮手順のさらなる限定されない例として、本明細書における形質導入または遺伝子改変する方法のいくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、ＳｅｐａｘまたはＳｅｐａｘ  ２細胞処理システム（ＢｉｏＳａｆｅ）を使用して単離される。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙセルプロセッサ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して単離される。いくつかの実施形態では、対象から血液を採取し、特定の細胞タイプ（例えばＰＢＭＣ等）を選別する装置に血液を通過させ、残りを対象に戻す自動アフェレーシス分離器が使用される。密度勾配遠心分離は、アフェレーシス後に実行され得る。いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣは、白血球除去フィルタアセンブリを使用して単離される。いくつかの実施形態では、次いで磁気ビーズ活性化細胞選別を使用して、細胞表現型（すなわちポジティブ選択）に従って、ＰＢＭＣ、例えば、ＰＢＬまたはそのサブセットから特定の細胞集団を精製してから、それらを本明細書の反応混合物中に使用する。
【０１００】
他の精製方法、例えば、反応混合物に添加する前にＴ細胞を精製するために、Ｔ細胞が動員中に遭遇する環境を模倣する基質を利用する基質接着もまた使用され得、または、接触ステップの反応混合物が形成される前に、不要な細胞を除去の標的とする抗体複合体を用いて、不要な細胞が除去の標的とされるネガティブ選択が使用され得る。いくつかの実施形態では、赤血球ロゼットを使用して、反応混合物を形成する前に赤血球を除去することができる。他の実施形態では、造血幹細胞が接触ステップの前に除去され得、したがってこれらの実施形態では造血幹細胞は接触ステップ中に存在しない。本明細書のいくつかの実施形態では、特に全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法について、ＡＢＣトランスポーター阻害剤および／または基質は、任意選択のインキュベーションを伴う、もしくは伴わない接触前、接触中、もしくは接触前および接触中の両方に存在せず（すなわち、接触が生じる反応混合物中に存在しない）、または方法の任意のステップにおいて存在しない。
【０１０１】
本明細書で提供される任意の態様の特定の例示的な実施形態では、リンパ球は、インビボ、インビトロ、またはエクスビボのいずれであれ、事前の活性化もしくは刺激なしに、および／または事前の活性化もしくは刺激を必要とせずに；ならびに／あるいはさらに、いくつかの実施形態では、任意選択のインキュベーションを伴うもしくは伴わない最初の接触後のエクスビボもしくはインビトロの活性化もしくは刺激なしに、または任意選択のインキュベーションを伴うもしくは伴わない最初の接触後のエクスビボもしくはインビトロの活性化または刺激を必要とせずに、遺伝子改変および／または形質導入される。したがって、例示的な実施形態では、リンパ球のいくつか、ほとんど、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または全てが、それらがレトロウイルス粒子と組み合わされて反応混合物を形成する際には休止しており、典型的には、それらが反応混合物中のレトロウイルスウイルス粒子と接触する際には休止している。血液またはその成分中のＴ細胞および／またはＮＫ細胞等のリンパ球を遺伝子改変するための方法では、リンパ球は、採取直前にインビボで採取された血液中に存在する際の典型的な休止状態で接触することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、９５〜１００％の休止細胞（ＫＩ−６７−）からなる。いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が接触するＴ細胞および／またはＮＫ細胞は、範囲の下限の９０、９１、９２、９３、９４、および９５％の休止細胞から範囲の上限の９６、９７、９８、９９、または１００％の休止細胞を含む。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、ナイーブ細胞を含む。いくつかの例示的な実施形態では、この段落の下位実施形態は、全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法の態様に含まれる。
【０１０２】
Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞と複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子との間の接触は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子によるＴ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入を促進することができる。理論によって制限されないが、接触の期間中に、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、レトロウイルスおよび宿主細胞膜が融合し始める時点で、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を識別して結合する。次いで、形質導入のプロセスの次のステップとして、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子からの遺伝物質がＴ細胞および／またはＮＫ細胞に入り、その時点でＴ細胞および／またはＮＫ細胞は「遺伝子改変」され、この語句は本明細書で使用される通りである。そのようなプロセスは、接触が開始されてから数時間または数日後、さらには関連のないレトロウイルス粒子が洗い流された後でも発生し得ることは注目に値する。次いで、遺伝物質は、典型的には、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のゲノムＤＮＡに組み込まれ、その時点で、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は「形質導入」され、この語句は本明細書で使用される通りである。したがって、例示的な実施形態では、本明細書のリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を遺伝子改変するための任意の方法は、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を形質導入するための方法である。インビボまたはエクスビボでの６日目までに、接触が開始された後、遺伝子改変された細胞の大部分が形質導入されていると考えられている。レンチウイルスを形質導入する方法は既知である。例示的な方法は、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．３５（９）：６８９−７０１；Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ．１０１：１６３７−１６４４；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．５０６：９７−１１４；およびＣａｖａｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ．１０２（２）：４９７−５０５に記載されている。本開示を通して、形質導入されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞は、エクスビボ形質導入中に細胞のゲノムに組み込まれる核酸またはポリヌクレオチドの少なくともいくつかを保持するエクスビボ形質導入細胞の子孫を含む。形質導入された細胞を「再導入する」ことを列挙している本明細書の方法では、そのような細胞は、対象の血液から採取されたとき、典型的には変換された状態ではないことが理解される。
【０１０３】
本明細書で提供される方法の多くは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の遺伝子改変および形質導入を含む。複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子、例えば複製能力のない組み換えレンチウイルス粒子等を用いた、エクスビボでＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変および形質導入するための方法が当該技術分野で知られている。本明細書で提供される方法は、例示的な実施形態では、エクスビボ刺激または活性化を必要としない。したがって、以前の方法におけるこの一般的なステップは、本方法では回避することができるが、抗ＣＤ３および／または抗ＣＤ２８ビーズ等のエクスビボ刺激分子は、その後の接触および任意選択のインキュベーション中に存在し得る。しかしながら、本明細書で提供される例示的な方法では、エクスビボ刺激は必要とされない。
【０１０４】
本明細書の任意の態様の特定の例示的な実施形態では、リンパ球等の血液細胞、特にＴ細胞および／またはＮＫ細胞は、接触またはその後の任意選択のインキュベーション中に活性化され、接触前には全く、または１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、もしくは８時間を超える期間活性化されない。特定の例示的な実施形態では、レトロウイルス粒子表面に存在しない要素による活性化は、リンパ球を遺伝子改変するために必要とされない。したがって、そのような活性化または刺激要素は、接触前、接触中、または接触後のレトロウイルス粒子以外には必要とされない。したがって、本明細書でより詳細に考察されるように、事前活性化または刺激を必要としないこれらの例示的な実施形態は、Ｔ細胞およびその中の生物学的メカニズムをよりよく理解することを目的としたインビトロ実験を迅速に実施する能力を提供する。さらに、そのような方法は、ＰＢＭＣ、リンパ球、Ｔ細胞、またはＮＫ細胞を使用して生産される生物学的製品のはるかに効率的な商業生産、およびそのような商業生産方法の開発を提供する。最後に、そのような方法は、養子細胞療法のためのリンパ球（例えばＮＫ細胞および特にＴ細胞）のより迅速なエクスビボ処理を提供し、例えば、ポイントオブケア法を提供することによって、そのような療法の提供を根本的に単純化する。
【０１０５】
例示的な実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、本明細書の方法において組み換えレトロウイルスと接触する前に活性化されないが、例示的な実施形態におけるＴ細胞活性化要素は、組み換えレトロウイルスおよびリンパ球の最初の接触が生じる反応混合物中に存在する。例えば、そのようなＴ細胞活性化要素は、反応混合物中の溶液中にあってもよい。例えば、可溶性抗ＣＤ３抗体は、接触中およびその後の任意のインキュベーション中に、２５〜２００、５０〜１５０、７５〜１２５、または１００ｎｇ／ｍｌで反応混合物中に存在することができる。例示的な実施形態では、Ｔ細胞活性化要素は、レトロウイルス表面に会合している。Ｔ細胞活性化要素は、本明細書で提供される任意のＴ細胞活性化要素であってもよい。例示的な実施形態では、Ｔ細胞活性化要素は、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ３  ｓｃＦｖＦｃ等の抗ＣＤ３であってもよい。したがって、いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞活性化要素をさらに含むことができ、これは、さらなる例示的な例では、レトロウイルスの表面の外側に会合している。
【０１０６】
本明細書で提供される、全血中のリンパ球を形質導入するための方法および／または遺伝子改変するための方法の接触ステップは、典型的には、液体緩衝液および／または培地に懸濁して形質導入反応混合物を形成している間、レトロウイルス粒子、典型的にはレトロウイルス粒子の集団が、血液細胞、典型的には、抗凝固剤および／またはＰＢＭＣ濃縮手順後に存在しないＰＢＭＣ以外の追加の血液成分を含む血液細胞の集団と接触させられる初期段階を含む。この接触に続いて、本明細書で提供される他の態様と同様に、懸濁液中にレトロウイルス粒子およびリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を含む血液細胞を含むこの反応混合物における任意選択のインキュベーション期間が伴ってもよい。血液またはその成分中のＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変する方法において、反応混合物は、本明細書に開示される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、または全ての追加の血液成分を含んでもよく、例示的な実施形態では、１種以上の抗凝固剤を含む。
【０１０７】
本明細書で提供される態様のいずれかにおける形質導入反応混合物は、レトロウイルス粒子およびリンパ球の最初の接触後の任意のインキュベーションステップにおいて、２３〜３９℃で、いくつかの例示的な実施形態では３７℃でインキュベートされ得る。特定の実施形態では、形質導入反応は、より速い融合／形質導入のために３７〜３９℃で実行され得る。形質導入反応混合物中で接触させられた際の細胞およびレトロウイルス粒子を直ちに処理して、懸濁液中に遊離状態のままであり細胞と会合していないレトロウイルス粒子を細胞から除去することができる。任意選択で、懸濁液中の細胞、および懸濁液中で遊離しているかまたは懸濁液中の細胞と会合しているレトロウイルス粒子は、本明細書で提供される方法の接触ステップのために本明細書で提供されるように、様々な長さの時間インキュベートされ得る。さらなるステップの前に、そのような細胞がインビトロで研究される、エクスビボで研究される、または対象に導入されるかどうかに関係なく、洗浄を行うことができる。
【０１０８】
リンパ球、特にＮＫ細胞、および例示的な実施形態ではＴ細胞を遺伝子改変するための、以前の方法よりもはるかに短く単純な例示的な方法が、本明細書で開示される。したがって、いくつかの実施形態では、ＰＢＭＣまたはリンパ球、典型的にはＴ細胞および／またはＮＫ細胞を形質導入および／または遺伝子改変する本明細書で提供される任意の方法における接触ステップは、例示的な実施形態のセクションで提供される期間を含むがこれに限定されない本明細書で提供される期間のいずれかの間実行され得る（または生じ得る）。例えば、前記接触は、２４時間未満、例えば１２時間未満、８時間未満、４時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分未満、または１５分未満であってもよいが、いずれの場合も、本明細書でさらに詳細に論じられるように、レトロウイルス粒子および細胞が形質導入反応混合物中の懸濁液中で接触する少なくとも最初の接触ステップがあり、その後細胞に会合しない懸濁液中に残留するレトロウイルス粒子が細胞から分離され、典型的には廃棄される。理論によって限定されることを意図するものではないが、接触は、典型的には、レトロウイルス粒子を含む溶液をリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を含む溶液に添加することにより、レトロウイルス粒子およびリンパ球が一緒に組み合わされた時点で開始すると考えられることに留意されたい。
【０１０９】
そのような最初の接触の後、いくつかの実施形態では、溶液中で遊離状態のままであり、細胞と会合しないレトロウイルス粒子を除去することなく、指定された期間、懸濁液中の細胞およびレトロウイルス粒子を含む反応混合物のインキュベーションが行われる。このインキュベーションは、本明細書では任意選択のインキュベーションと呼ばれることがある。したがって、例示的な実施形態では、範囲の下限の３０秒、または１、２、５、１０、１５、３０もしくは４５分、または１、２、３、４、５、６、７もしくは８時間から、範囲の上限の１０分、１５分、３０分、または１、２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３６、４８、および７２時間まで、接触（最初の接触および任意選択のインキュベーションを含む）を実行することができる（または発生することができる）（本明細書で一般に示されるように、選択された範囲の下限は、選択された範囲の上限よりも小さい）。特定の例示的な実施形態では、接触ステップは、範囲の下限の３０秒間、１分間、５分間、１０分間、１５分間、または３０分間から、範囲の上限の１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、または１２時間まで実行され得る。いくつかの実施形態では、接触ステップは、範囲の下限の３０秒、１分、および５分から、範囲の上限の１０分、１５分、３０分、１時間、２時間、４時間、または８時間まで実行される。したがって、いくつかの実施形態では、レトロウイルス粒子をリンパ球に添加することによって反応混合物が形成された後、反応混合物は、５分〜１２時間の間、５分〜１０時間の間、５分〜８時間の間、５分〜６時間の間、５分〜４時間の間、５分〜２時間の間、５分〜１時間の間、５分〜３０分の間、または５分〜１５分の間インキュベートされ得る。他の実施形態では、反応混合物は、１５分〜１２時間の間、１５分〜１０時間の間、１５分〜８時間の間、１５分〜６時間の間、１５分〜４時間の間、１５分〜２時間の間、１５分〜１時間の間、１５分〜４５分の間、または１５分〜３０分の間インキュベートされ得る。他の実施形態では、反応混合物は、３０分〜１２時間の間、３０分〜１０時間の間、３０分〜８時間の間、３０分〜６時間の間、３０分〜４時間の間、３０分〜２時間の間、３０分〜１時間の間、３０分〜４５分の間インキュベートされ得る。他の実施形態では、反応混合物は、１時間から１２時間の間、１時間〜８時間の間、１時間〜４時間の間、または１時間〜２時間の間インキュベートされ得る。別の例示的な実施形態では、接触は、反応混合物中でのさらなるインキュベーションなしでの最初の接触ステップのみ（懸濁液中の遊離レトロウイルス粒子および懸濁液中の細胞を含む反応混合物中でのさらなるインキュベーションなし）の間、または反応混合物中での５分、１０分、１５分、３０分もしくは１時間のインキュベーションとともに実行される。
【０１１０】
最初の接触および接触ステップの一部となり得る任意選択のインキュベーションのための示された期間の後、反応混合物中の血液細胞またはそのＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞含有画分は、そのような細胞と会合しないレトロウイルス粒子から分離される。例えば、これは、ＰＢＭＣ濃縮手順（例えば、Ｓｅｐａｘユニットにおけるフィコール勾配）を使用して、または本明細書で提供される特定の例示的な実施形態では、反応混合物を白血球除去フィルタセットアセンブリ上で濾過し、次いでＴ細胞およびＮＫ細胞を含む白血球を採取することによって実行され得る。別の実施形態では、これは、５００ｇ未満、例えば４００ｇ、または３００〜４９０ｇの間、または３５０〜４５０ｇの間の相対遠心力で反応混合物を遠心分離することによって実行され得る。レトロウイルス粒子を細胞から分離するためのそのような遠心分離は、例えば、５分〜１５分の間、または５分〜１０分の間実行され得る。遠心力を使用して、細胞に会合しないレトロウイルス粒子から細胞を分離する例示的な実施形態では、そのようなｇ力は、典型的には、スピノキュレーション手順で首尾よく使用されるｇ力よりも低い。
【０１１１】
いくつかの例示的な実施形態では、任意の態様で本明細書で提供される方法は、スピノキュレーションを実行することを含まない。いくつかの実施形態では、スピノキュレーションは、接触ステップの一部として含まれる。例示的な実施形態では、スピノキュレーションが行われる場合、スピノキュレーションの時間が上記の任意選択のインキュベーションのインキュベーション時間を提供するため、接触の一部として追加のインキュベーションはない。他の実施形態では、１５分〜４時間の間、または１５分〜２時間の間、または１５分〜１時間の間のスピノキュレーション後に追加のインキュベーションがある。スピノキュレーションは、例えば、３０分〜１２０分間、典型的には少なくとも６０分間、例えば６０分〜１８０分間、または６０分〜９０分間実行され得る。スピノキュレーションは、典型的には、遠心分離機において少なくとも８００ｇ、より典型的には少なくとも１，２００ｇ、例えば８００ｇ〜２４００ｇの間、または８００ｇ〜１８００ｇの間、または１２００ｇ〜２４００ｇの間、または１２００ｇ〜１８００ｇの間の相対遠心力で実行される。スピノキュレーション後、そのような方法は、典型的には、ペレット化された細胞およびレトロウイルス粒子を再懸濁し、次いでスピノキュレーションが行われない場合に上記のステップに従って細胞に会合しないレトロウイルス粒子を除去する追加のステップを含む。
【０１１２】
任意選択のインキュベーションを含む接触ステップ、およびスピノキュレーションを含む実施形態におけるスピノキュレーションは、４℃〜４２℃の間、または２０℃〜３７℃の間で実行され得る。特定の例示的な実施形態では、スピノキュレーションは行われず、接触および関連する任意選択のインキュベーションは、２０〜２５℃で４時間以下、２時間以下、１時間以下、３０分以下、１５分以下、または１５分〜２時間、１５分〜１時間もしくは１５分〜３０分の間行われる。
【０１１３】
本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態では、血液から採取された全リンパ球の５％〜８５％の間が遺伝子改変されている。いくつかの実施形態では、遺伝子改変および／または形質導入されたリンパ球のパーセントは、範囲の下限の１、５、および１０％から、範囲の上限の１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、および８５％の間である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変および／または形質導入されたＴ細胞およびＮＫ細胞のパーセントは、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、または少なくとも２０％である。本明細書の実施例に示されるように、全血中のリンパ球を形質導入するために本明細書で提供される例示的な方法において、リンパ球の１％〜２０％の間、または１％〜１５％の間、または５％〜１５％の間、または７％〜１２％の間、または約１０％が遺伝子改変および／または形質導入されている。
【０１１４】
本明細書の任意の方法に従って提供されるリンパ球を遺伝子改変する方法は、典型的には、本明細書で提供されるＣＡＲおよびリンパ増殖性要素の実施形態のいずれかに従う、ＣＡＲまたはリンパ増殖性要素をコードする、または例示的な実施形態では、ＣＡＲおよびリンパ増殖性要素の両方をコードする１つ以上の転写単位を含むポリヌクレオチドの細胞への挿入を含む。そのようなＣＡＲおよびリンパ増殖性要素は、接触および任意のインキュベーション後の遺伝子改変および／または形質導入されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞の拡張をサポートすることができる、本明細書で提供されるより短くより単純化された方法をサポートするために提供され得る。したがって、本明細書で提供される任意の方法の例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、遺伝子改変および／または形質導入されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞内のレトロウイルス粒子のゲノムから送達され得、その結果、それらの細胞は、本明細書のリンパ増殖性要素のセクションに開示されている増加した増殖および／または生存の特徴を有する。本明細書で提供される任意の方法の例示的な実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞またはＮＫ細胞は、マウスにおいてインビボで生着および／またはマウスにおいてインビボで少なくとも７、１４、または２８日間濃縮することができる。当業者は、遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞間の任意の免疫学的差異が、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子により形質導入されたリンパ球の任意の成分に対してマウスにおいて誘発される免疫応答をもたらさないように、そのようなマウスが処置または別様に遺伝子改変され得ることを認識するであろう。
【０１１５】
接触ステップにおいて、例えば細胞およびレトロウイルス粒子が最初に接触する際に、もしくは本明細書で提供される任意の態様においてレトロウイルス粒子および細胞を培地中の懸濁状態で含む反応混合物とのその後の任意選択のインキュベーション期間中に含めることができる培地、または本明細書で提供される任意の態様における細胞培養中および／もしくは様々な洗浄ステップ中に使用され得る培地は、エクスビボＴ細胞および／またはＮＫ細胞培養用の市販の培地等の基本培地を含み得る。そのような培地の限定されない例には、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）１５既知組成無血清造血細胞培地（Ｌｏｎｚａ）（２０１８年カタログ番号ＢＥ０２−０６０Ｆ、ＢＥ０２−００Ｑ、ＢＥ−０２−０６１Ｑ、０４−７４４Ｑ、または０４−４１８Ｑ）、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ  Ｔ細胞拡張培地（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（２０１８年カタログ番号１０９８１）、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ（登録商標）Ｔ細胞拡張ＸＳＦＭ（Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）（２０１８年カタログ番号９１１４１）、ＡＩＭ  Ｖ（登録商標）培地ＣＴＳ（商標）（治療グレード）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ここでは「ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ」と呼ばれる）、またはＣＴＳ（商標）Ｏｐｔｉｍｉｚｅｒ（商標）メディア（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）（２０１８年カタログ番号Ａ１０２２１−０１（基本培地（ボトル））、およびＡ１０４８４−０２（添加物）、Ａ１０２２１−０３（基本培地（バッグ））、Ａ１０４８５０１（基本培地および添加物キット（ボトル））、およびＡ１０４８５０３（基本培地および添加物キット（バッグ））が含まれる。そのような培地は、ｃＧＭＰに準拠して製造された既知組成無血清製剤であってもよい。培地は、異種不含で完全であってもよい。いくつかの実施形態では、基本培地は、ＦＤＡ  ５１０（ｋ）をクリアしたデバイス等、エクスビボ細胞処理で使用するために規制当局によってクリアされている。いくつかの実施形態では、培地は、両方ともＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から入手可能な２０１８年カタログ番号Ａ１０４８５０１（ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞拡張ＳＦＭ、ボトル形式）またはＡ１０４８５０３（ＣＴＳ（商標）ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）Ｔ細胞拡張ＳＦＭ、バッグ形式）の付属のＴ細胞増殖添加物を含む、または含まない基本培地である。ヒト血清アルブミン、ヒトＡＢ＋血清、および／または対象に由来する血清等の添加剤が、形質導入反応混合物に添加されてもよい。ＩＬ２、ＩＬ７、もしくはＩＬ１５等の形質導入反応混合物、またはヒト血清に見られるものに、補助的なサイトカインが添加されてもよい。特定の実施形態では、ｄＧＴＰが形質導入反応物に添加されてもよい。
【０１１６】
リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を遺伝子改変するステップを含む本明細書の任意の方法のいくつかの実施形態では、細胞は、事前の活性化なしにレトロウイルス粒子と接触させることができる。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変するステップを含む本明細書の任意の方法のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、一実施形態では形質導入の前に４時間超、または別の実施形態では６時間超、または別の実施形態では８時間超単球に付着する基質上でインキュベートされていない。１つの例示的な実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、形質導入の前に単球を除去するために付着性基質上で一晩インキュベートされている。別の実施形態では、この方法は、形質導入の前に３０分、１時間、または２時間以内単球に結合する付着性基質上でＴ細胞および／またはＮＫ細胞をインキュベートすることを含み得る。別の実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、前記形質導入ステップの前に、付着性基質上でのインキュベーションによって単球を除去するステップに供されない。別の実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、接触ステップ、ならびに／または遺伝子改変および／もしくは形質導入ステップの前または最中に、ウシ血清、例えば細胞培養ウシ血清、例えばウシ胎児血清とインキュベートまたはそれに曝露されない。
【０１１７】
本明細書で提供される遺伝子改変のための方法のいくつかまたは全てのステップ、またはそのような方法の使用は、閉鎖システムで実行される。したがって、そのような方法で形成された反応混合物、ならびにそのような方法によって作製された遺伝子改変および／または形質導入されたリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）は、そのような閉鎖システム内に含まれ得る。閉鎖システムは、部屋内の環境、またはさらにはドラフト内、細胞が処理および／または輸送されるシステムのチューブおよびチャンバ等の導管の外側の環境等の環境に対して概して閉鎖または完全に閉鎖されている細胞処理システムである。細胞処理手順における安全性および規制管理に対する最大のリスクの１つは、従来の開放型細胞培養システムに見られるような環境への頻繁な曝露による汚染のリスクである。特に抗生物質がない場合にこのリスクを軽減するために、使い捨て（単回使用）機器の使用に焦点を当てたいくつかの商業的プロセスが開発された。しかしながら、無菌状態で使用した場合でも、フラスコを開いて試料を採取する、または追加の成長培地を加えることにより、常に汚染のリスクがある。この問題を克服するために、本明細書で提供される方法は、典型的にはエクスビボ法であり、典型的には閉鎖システム内で実行される。そのようなプロセスは、製品が外部環境にさらされないように設計および操作され得る。材料の移動は、滅菌チューブおよび滅菌溶接接続等の滅菌接続を介して行われる。ガス交換用の空気は、ガス透過膜を介して、環境への暴露を防ぐために０．２μｍフィルタを介して発生し得る。いくつかの例示的な実施形態では、方法は、例えば、遺伝子改変されたＴ細胞を提供するために、Ｔ細胞に対して実行される。
【０１１８】
そのような閉鎖システムの方法は、市販のデバイスを使用して実行され得る。方法内の様々なステップで様々な閉鎖システムデバイスが使用され得、細胞または培地が環境にさらされるのを防ぐために、溶接、ルアー、スパイク、またはクレーブポート等の配管および接続を使用して細胞をこれらのデバイス間で移動させることができる。例えば、任意選択で抗凝固剤を含むＩＶバッグまたはシリンジに血液を採取し、ＰＢＭＣ濃縮および単離のためにＳｅｐａｘ  ２デバイス（Ｂｉｏｓａｆｅ）に移すことができる。他の実施形態では、全血を濾過して、白血球除去フィルタアセンブリを使用して白血球を採取することができる。単離されたＰＢＭＣまたは単離された白血球は、任意選択の活性化、形質導入、および任意選択の拡張のために、Ｇ−Ｒｅｘデバイスのチャンバに移すことができる。代替として、採取された血液は、血液バッグ、例えばそれが採取されたバッグに変換され得る。最後に、Ｓｅｐａｘ  ２デバイスを使用して、細胞を回収し、別のバッグに収集することができる。この方法は、閉鎖システムＴ細胞および／またはＮＫ細胞生成に適合した任意のデバイスまたはデバイスの組み合わせで実行することができる。そのようなデバイスの限定されない例には、Ｇ−Ｒｅｘデバイス（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）、ＧａｔｈｅＲｅｘ（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆ）、Ｓｅｐａｘ  ２（Ｂｉｏｓａｆｅ）、ＷＡＶＥ  Ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒｓ（Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ）、ＣｕｌｔｉＬｉｆｅ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅバッグ（Ｔａｋａｒａ）、ＰｅｒｍａＬｉｆｅバッグ（ＯｒｉＧｅｎ）、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）、およびＶｕｅＬｉｆｅバッグ（Ｓａｉｎｔ−Ｇｏｂａｉｎ）が含まれる。例示的な実施形態では、任意選択の活性化、形質導入、および任意選択の拡張は、閉鎖システムの同じチャンバまたは容器内で実行され得る。例えば、例示的な実施形態では、チャンバは、Ｇ−Ｒｅｘデバイスのチャンバであってもよく、ＰＢＭＣまたは白血球は、それらが濃縮および単離された後、Ｇ−Ｒｅｘデバイスのチャンバに移されてもよく、回収されるまでＧ−Ｒｅｘデバイスの同じチャンバ内に留まってもよい。
【０１１９】
本明細書で提供される方法は、血液およびその中の細胞ならびに／またはその画分、ならびにそれらがレトロウイルス粒子と接触する前または後のリンパ球を、閉鎖システム内の容器間で、したがって環境曝露なしで移すことを含み得る。閉鎖システムで使用される容器は、例えば、チューブ、バッグ、注射器、または他のコンテナであってもよい。いくつかの実施形態では、容器は、研究施設で使用される容器である。いくつかの実施形態では、容器は、商業生産で使用される容器である。他の実施形態では、容器は、採血プロセスで使用される収集容器であってもよい。本明細書の遺伝子改変するための方法は、典型的には、リンパ球が複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と接触される接触ステップを含む。いくつかの実施形態における接触は、容器内、例えば、血液バッグ内で実行され得る。血液およびその様々なリンパ球含有画分は、接触のために閉鎖システム内で容器から別の容器に（例えば第１の容器から第２の容器に）移されてもよい。第２の容器は、Ｇ−Ｒｅｘデバイス等の閉鎖デバイスの細胞処理区画であってもよい。いくつかの実施形態では、接触した後、遺伝子改変された（例えば形質導入された）細胞は、閉鎖システム内で（すなわち、環境への曝露なしに）異なる容器に移されてもよい。この移動の前または後のいずれかにおいて、細胞は、典型的には、閉鎖システム内で洗浄されて、レトロウイルス粒子の実質的に全てまたは全てが除去される。いくつかの実施形態では、採血から接触（例えば形質導入）、任意選択のインキュベーションおよびインキュベーション後の単離、ならびに任意選択の洗浄までの、本明細書に開示されるプロセスは、範囲の下限の１５分、３０分、または１、２、３、もしくは４時間から、範囲の上限の４、８、１０、または１２時間まで実行される。
【０１２０】
理論に限定されないが、限定されない例示的方法において、リンパ増殖性要素をコードするポリヌクレオチドの、エクスビボでの休止Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞への送達（これはＴ細胞またはＮＫ細胞のゲノムに組み込まれ得る）は、宿主をリンパ球枯渇させる必要なく、その細胞にインビボ拡張の推進力を提供する。したがって、例示的な実施形態では、対象は、接触から１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、もしくは２８日以内、または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月もしくは６ヶ月以内、接触中、ならびに／あるいは、改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞が対象に再導入されてから１、２、３、４、５、６、７、１０、１４、２１、もしくは２８日以内、または１か月、２か月、３か月もしくは６ヶ月以内にリンパ球枯渇剤に曝露されない。さらに、限定されない例示的な実施形態では、本明細書で提供される方法は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が対象の休止Ｔ細胞および／もしくは休止ＮＫ細胞と接触しているステップ中に、ならびに／またはエクスビボ法全体の間、対象をリンパ球枯渇剤に曝露することなく実行され得る。したがって、インビボで対象において遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞を拡張する方法は、本開示のいくつかの実施形態の特徴である。例示的な実施形態では、そのような方法は、エクスビボでの増殖がないか、または実質的に増殖がない。
【０１２１】
本明細書で提供される任意の態様の限定されない例示的な実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のエクスビボ形質導入後の対象からの採血から対象への血液の再導入までのこの方法／プロセス全体は、４８時間未満、３６時間未満、２４時間未満、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、２時間、または２時間未満の期間にわたって行われ得る。他の実施形態では、対象からの採血／血液採取からＴ細胞および／またはＮＫ細胞のエクスビボ形質導入後の対象への血液の再導入までの方法／プロセス全体は、本明細書の限定されない例示的な実施形態において、１時間〜１２時間の間、もしくは２時間〜８時間の間、もしくは１時間〜３時間の間、もしくは２時間〜４時間の間、もしくは２時間〜６時間の間、もしくは４時間〜１２時間の間、もしくは４時間〜２４時間の間、もしくは８時間〜２４時間の間、もしくは８時間〜３６時間の間、もしくは８時間〜４８時間の間、もしくは１２時間〜２４時間の間、もしくは１２時間〜３６時間の間、もしくは１２時間〜４８時間の間の期間にわたり、または範囲の下限の１５、３０、６０、９０、１２０、１８０、および２４０分から、範囲の上限の１２０、１８０、および２４０、３００、３６０、４２０、および４８０分までの期間にわたって行われる。他の実施形態では、対象からの採血／血液採取からＴ細胞および／またはＮＫ細胞のエクスビボ形質導入後の対象への血液の再導入までの方法／プロセス全体は、範囲の下限の１、２、３、４、６、８、１０、および１２時間から、範囲の上限の８、９、１０、１１、１２、１８、２４、３６、または４８時間まで期間にわたって行われる。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞は、接触が生じる期間の後に、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子から分離される。
【０１２２】
リンパ球を遺伝子改変するための本明細書で提供される方法、および養子細胞療法を実行するための関連する方法は、以前の方法よりも大幅に短い時間で実行され得るため、患者のケアおよび安全性ならびに製品の製造可能性の根本的な改善が可能になる。したがって、そのようなプロセスは、治療目的でインビボで実行される場合、そのようなプロセスを承認する責任がある規制機関の観点から有利であると予想される。例えば、対象を含む本明細書で提供される任意の態様の限定されない例における対象は、改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞が患者に再導入される前に試料が処理されている間ずっと、血液または試料を処理する機器と同じ建物（例えば注入クリニック）または部屋に留まることができる。限定されない例示的な実施形態では、対象は、対象からの採血／血液採取からＴ細胞および／またはＮＫ細胞のエクスビボ形質導入後の対象への血液の再導入までの方法／プロセス全体において、サイトのライン内および／または処理されている血液もしくは細胞から１００、５０、２５、もしくは１２フィートまたは腕の距離内に留まる。他の限定されない例示的な実施形態では、対象は覚醒したままであり、および／または少なくとも１人は、採血／血液採取からＴ細胞および／またはＮＫ細胞のエクスビボ形質導入後の対象への血液の再導入までの方法／プロセス全体にわたって、および／または継続的に、処理されている対象の血液または細胞を監視し続けることができる。本明細書で提供される改善のために、養子細胞療法、ならびに／または休止Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞を、対象からの採血／血液採取からＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞のエクスビボ形質導入後の対象への血液の再導入まで形質導入するための方法／プロセス全体が、人間による継続的な監視とともに実行することができる。他の限定されない例示的な実施形態では、対象からの採血／血液採取からＴ細胞および／またはＮＫ細胞のエクスビボ形質導入後の対象への血液の再導入までの方法／プロセス全体のどの点でも、人がいない部屋で血液細胞がインキュベートされない。他の限定されない例示的な実施形態では、対象からの採血／血液採取からＴ細胞および／またはＮＫ細胞のエクスビボ形質導入後の対象への血液の再導入までの方法／プロセス全体が、対象の隣で、および／または対象と同じ部屋で、および／または対象のベッドもしくは椅子の隣で行われる。したがって、試料ＩＤの取り違えや、数日または数週間にわたる長くて費用のかかるインキュベーションが回避され得る。これは、本明細書で提供される方法が、対象に再導入される血液試料およびその成分が使い捨ての単回使用構成要素とのみ接触する、閉鎖型および自動血液処理システムに容易に適応可能であるという事実によってさらに提供される。
【０１２３】
本明細書で提供されるＴ細胞および／またはＮＫ細胞等のリンパ球を遺伝子改変および／または形質導入するための方法は、養子細胞療法を実施するための方法の一部であってもよい。典型的には、養子細胞療法を実行するための方法は、対象から血液を採取するステップ、ならびに遺伝子改変および／または形質導入されたリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を対象に戻すステップを含む。本開示は、ＣＡＲを使用する様々な処置方法を提供する。本開示のＣＡＲは、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞に存在する場合、標的細胞に対する細胞毒性を媒介することができる。本開示のＣＡＲは、標的細胞上に存在する抗原に結合し、それにより、ＣＡＲを産生するように遺伝子改変されたＴリンパ球またはＮＫ細胞による標的細胞の死滅を媒介する。ＣＡＲのＡＳＴＲは、標的細胞の表面に存在する抗原に結合する。本開示は、標的細胞を殺す、またはその成長を阻害する方法を提供し、方法は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞が標的細胞の表面に存在する抗原を認識し、標的細胞の死滅を媒介するように、対象のＣＡＲを産生するように遺伝子改変された細胞傷害性免疫エフェクター細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球またはＮＫ細胞）を接触させることを含む。標的細胞は、例えば癌細胞であってもよく、本明細書の自家細胞療法は、いくつかの例示的な実施形態では癌を処置するための方法であってもよい。これらの実施形態では、対象は、癌を有することが疑われる動物もしくはヒト、またはより典型的には、癌を有することが知られている対象であってもよい。
【０１２４】
リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を遺伝子改変するための本明細書で提供される方法のいずれかのいくつかの実施形態、ならびに対象のＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変するためのキットの製造における複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の使用に関する態様では、遺伝子改変および／または形質導入されたリンパ球（例えばＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞）またはその集団は、対象に導入または再導入される。対象への遺伝子改変されたリンパ球の導入または再導入は、当該技術分野で知られている任意の経路を介することができる。例えば、導入または再導入は、対象の血管への注入を介した送達であってもよい。いくつかの実施形態では、遺伝子改変および／または形質導入されたリンパ球（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞）またはその集団は、対象に導入または再導入される前に、エクスビボで４つ以下の細胞分裂を受ける。いくつかの実施形態では、そのような方法で使用されるリンパ球は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と１時間〜１２時間の間接触している休止Ｔ細胞および／または休止ＮＫ細胞である。いくつかの実施形態では、対象から血液が採取される時点から遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞が対象に再導入される時点の間に、１２時間以内、１０時間以内、８時間以内、６時間以内、４時間以内、２時間以内、または１時間以内の時間が経過する。いくつかの実施形態では、血液が採取された後および血液が再導入される前の全てのステップは、人が処理全体を通して閉鎖システムを監視する閉鎖システムで実行される。
【０１２５】
本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態では、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫの刺激および／または活性化等の追加のエクスビボ操作なしに、対象に戻される、再導入される、再注入される、または別様に送達される。従来の方法では、エクスビボ操作は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の刺激／活性化、ならびに遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入する前の遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の拡張のために使用される。従来技術の方法では、これは一般に数日または数週間かかり、対象は最初の採血後数日または数週間輸血のために診療所に戻る必要がある。本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と接触させる前に、例えば抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８でコーティングされたビーズ等の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８固体支持体への曝露によってエクスビボで刺激されない。したがって、本明細書で提供されるのは、エクスビボ増殖のない方法である。他の実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞は、エクスビボで拡張されないか、または少数の細胞分裂（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０ラウンドの細胞分裂）についてのみ拡張されるが、インビボ、すなわち対象内でむしろ拡張されるか、または優位に拡張される。いくつかの実施形態では、細胞のさらなる拡張を可能にするために追加の培地は添加されない。いくつかの実施形態では、一次血液リンパ球（ＰＢＬ）の細胞生産は、ＰＢＬが複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と接触されている間は生じない。例示的な実施形態では、ＰＢＬがエクスビボである間、ＰＢＬの細胞生産は生じない。養子細胞療法の従来の方法では、対象は、遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞を再注入する前にリンパ球が枯渇する。いくつかの実施形態では、患者または対象は、採血される前にリンパ球が枯渇しない。いくつかの実施形態では、患者または対象は、遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞の再注入の前にリンパ球が枯渇しない。しかしながら、本明細書に開示される方法および組成物の実施形態は、事前に活性化または事前に刺激されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞にも使用することができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と接触させる前に、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８固体支持体への曝露によってエクスビボで刺激され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と接触する前の１、２、３、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、または２４時間未満の間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８固体支持体に曝露され得る（曝露なしを含む）。例示的な実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞が複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と接触する前の１、２、３、４、６、または８時間未満の間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８固体支持体に曝露され得る。
【０１２６】
いくつかの例示的な実施形態では、細胞は、静脈または動脈への注入によって対象に導入または再導入される。本明細書で開示される実施形態のいずれかにおいて、対象に再注入されるＴ細胞および／またはＮＫ細胞の数は、範囲の下限の１×１０３、２．５×１０３、５×１０３、１×１０４、２．５×１０４、５×１０４、１×１０５、２．５×１０５、５×１０５、１×１０６、２．５×１０６、５×１０６、および１×１０７細胞／ｋｇから、範囲の上限の５×１０４、１×１０５、２．５×１０５、５×１０５、１×１０６、２．５×１０６、５×１０６、１×１０７、２．５×１０７、５×１０７、および１×１０８細胞／ｋｇの間であってもよい。例示的な実施形態では、対象に再注入または別様に送達されるＴ細胞および／またはＮＫ細胞の数は、範囲の下限の１×１０４、２．５×１０４、５×１０４、および１×１０５細胞／ｋｇから、範囲の上限の２．５×１０４、５×１０４、１×１０５、２．５×１０５、５×１０５、および１×１０６細胞／ｋｇの間であってもよい。いくつかの実施形態では、対象に再注入または別様に送達されるＰＢＬの数は、５×１０５、１×１０６、２．５×１０６、５×１０６、１×１０７、２．５×１０７、５×１０７、および１×１０８細胞より少なく、範囲の下限であってもよく、また範囲の上限の２．５×１０６、５×１０６、１×１０７、２．５×１０７、５×１０７、１×１０８、２．５×１０８、５×１０８、および１×１０９細胞であってもよい。いくつかの実施形態では、７０ｋｇの対象または患者への注入または再注入に利用可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞の数は、７×１０５〜２．５×１０８細胞の間である。他の実施形態では、形質導入に利用可能なＴ細胞および／またはＮＫ細胞の数は、約７×１０６プラスまたはマイナス１０％である。
【０１２７】
操作されたシグナル伝達ポリペプチド（複数可）
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に接触するために使用される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、１つ以上の操作されたシグナル伝達ポリペプチドをコードする１つ以上の転写単位を有するポリヌクレオチドまたは核酸を有する。いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、１つ以上の細胞内活性化ドメイン、任意選択で１つ以上の調節ドメイン（例えば共刺激ドメイン）、および任意選択で１つ以上のＴ細胞生存モチーフと組み合わせて、細胞外ドメイン（例えば抗原特異的標的化領域またはＡＳＴＲ）、ストークおよび膜貫通ドメインの任意の組み合わせを含む。例示的な実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドの少なくとも１つ、２つ、または全ては、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはキメラリンパ増殖性要素（ＣＬＥ）等のリンパ増殖性要素（ＬＥ）である。いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドの少なくとも１つ、２つ、または全ては、組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）である。いくつかの実施形態では、２つのシグナル伝達ポリペプチドが利用される場合、一方はリンパ増殖性要素をコードし、他方は抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。本明細書に開示される操作されたシグナル伝達ポリペプチドの任意のドメインについて、例示的な配列は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１９／０５５９４６に見出され得る。当業者は、そのような操作されたポリペプチドが組み換えポリペプチドとも呼ばれ得ることを認識するであろう。本明細書で提供されるＣＡＲｓ、組み換えＴＣＲ、ＬＥ、およびＣＬＥ等の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、典型的には、そのようなシグナル伝達ポリペプチドを発現するための、リンパ球、特にＴ細胞およびＮＫ細胞、とりわけ本明細書で提供される方法および組成物を使用して操作されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞に対する導入遺伝子である。
【０１２８】
細胞外ドメイン
いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、特異的結合対のメンバーである細胞外ドメインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、サイトカイン受容体、またはその突然変異体、またはホルモン受容体、またはその突然変異体の細胞外ドメインであってもよい。いくつかの実施形態におけるそのような突然変異細胞外ドメインは、少なくともいくつかの細胞型において発現される場合、構成的に活性であることが報告されている。例示的な実施形態では、そのような細胞外および膜貫通ドメインは、リガンド結合領域を含まない。そのようなドメインは、操作されたシグナル伝達ポリペプチドに存在し、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および／またはＮＫ細胞で発現される場合、リガンドに結合しないと考えられている。そのような受容体突然変異体の突然変異は、細胞外膜近傍領域で発生し得る。理論に限定されないが、本明細書で提供される操作されたシグナル伝達ポリペプチドの少なくともいくつかの細胞外ドメイン（およびいくつかの細胞外膜貫通ドメイン）の突然変異は、通常は一緒ではない活性化鎖を一緒にすることによって、リガンドの非存在下で操作されたシグナル伝達ポリペプチドのシグナル伝達に関与する。細胞外ドメインの突然変異を含む細胞外ドメインに関するさらなる実施形態は、例えば、本明細書のリンパ増殖性要素のセクションに見出すことができる。
【０１２９】
特定の例示的な実施形態では、細胞外ドメインは、二量体化モチーフを含む。例示的な実施形態では、二量体化モチーフは、ロイシンジッパーを含む。いくつかの実施形態では、ロイシンジッパーは、ｊｕｎポリペプチド、例えば、ｃ−ｊｕｎに由来する。二量体化モチーフを含む細胞外ドメインに関するさらなる実施形態は、例えば、本明細書のリンパ増殖性要素のセクションに見出すことができる。
【０１３０】
特定の実施形態では、細胞外ドメインは、本明細書では抗原結合ドメインと呼ばれることもある抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）である。特異的結合対は、これらに限定されないが、抗原−抗体結合対、リガンド−受容体結合対等を含む。したがって、本開示の操作されたシグナル伝達ポリペプチドでの使用に適した特異的結合対のメンバーは、抗体であるＡＳＴＲ、抗原、リガンド、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体、受容体のリガンド結合ドメイン、およびアフィボディを含む。
【０１３１】
本開示の操作されたシグナル伝達ポリペプチドでの使用に適したＡＳＴＲは、任意の抗原結合ポリペプチドであってもよい。特定の実施形態では、ＡＳＴＲは、全長抗体、一本鎖抗体、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、（Ｆａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、および二価一本鎖抗体またはジアボディ等の抗体である。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、重鎖は、操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおける軽鎖のＮ末端に配置される。他の実施形態では、軽鎖は、操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおける重鎖のＮ末端に配置される。開示された実施形態のいずれにおいても、本明細書でより詳細に論じられるように、重鎖および軽鎖は、リンカーによって分離され得る。開示された実施形態のいずれにおいても、重鎖または軽鎖は、操作されたシグナル伝達ポリペプチドのＮ末端にあってもよく、典型的には、シグナル配列またはペプチド等の別のドメインのＣ末端である。
【０１３３】
他の抗体ベースの認識ドメイン（ｃＡｂ  ＶＨＨ（ラクダ抗体可変ドメイン）およびヒト化バージョン、ＩｇＮＡＲ  ＶＨ（サメ抗体可変ドメイン）およびヒト化バージョン、ｓｄＡｂ  ＶＨ（単一ドメイン抗体可変ドメイン）および「ラクダ化」抗体可変ドメインは、操作されたシグナル伝達ポリペプチドとともに使用すること、および本開示の操作されたシグナル伝達ポリペプチドを使用する方法に適している。いくつかの場合において、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ベースの認識ドメインである。
【０１３４】
ＣＡＲを含む本明細書の任意の態様または実施形態の特定の実施形態は、内因性ＴＣＲシグナル伝達複合体およびＣＤ３Ｚシグナル伝達経路を採用するように操作された細胞外ドメインを有するＣＡＲｓを含む。一実施形態では、キメラ抗原受容体ＡＳＴＲは、内因性ＴＣＲ複合体鎖（例えば、ＴＣＲアルファ、ＣＤ３Ｅ等）の１つに融合されて、ＴＣＲ複合体への取り込みおよび内因性ＣＤ３Ｚ鎖を介したシグナル伝達を促進する。他の実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲ複合体に結合する第１のｓｃＦｖまたはタンパク質、および標的抗原（例えば腫瘍抗原）に結合する第２のｓｃＦｖまたはタンパク質を含む。別の実施形態では、ＴＣＲは、単鎖ＴＣＲ（ｓｃＴｖ、ＶαＶβを含む一本鎖２ドメインＴＣＲ）であってもよい。最後に、特定のＭＨＣ／ペプチド複合体を認識し、それによって代理ＴＣＲとして機能するようにｓｃＦｖを生成することもできる。そのようなペプチド／ＭＨＣ  ｓｃＦｖ結合因子は、ＣＡＲと同様の多くの構成で使用され得る。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、多重特異性、例えば二重特異性抗体であってもよい。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位に対して結合特異性を有する。特定の実施形態では、結合特異性の１つは、１つの標的抗原に対するものであり、他は別の標的抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、標的抗原の２つの異なるエピトープに結合し得る。二重特異性抗体を使用して、標的抗原を発現する細胞に細胞毒性剤を局在化させることもできる。二重特異性抗体は、全長抗体または抗体断片として調製され得る。
【０１３６】
本開示の操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適したＡＳＴＲは、様々な抗原結合特異性を有し得る。いくつかの場合において、抗原結合ドメインは、標的細胞によって発現される（合成される）抗原に存在するエピトープに特異的である。一例では、標的細胞は、癌細胞関連抗原である。癌細胞関連抗原は、例えば乳癌細胞、Ｂ細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫、肺癌細胞（例えば小細胞肺癌細胞）、非ホジキンＢ細胞リンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）細胞、卵巣癌細胞、前立腺癌細胞、中皮腫細胞、肺癌細胞（例えば小細胞肺癌細胞）、メラノーマ細胞、慢性リンパ球性白血病細胞、急性リンパ球性白血病細胞、神経芽細胞腫細胞、神経膠腫、神経膠芽細胞腫、髄芽細胞腫、結腸直腸癌細胞等に関連する抗原であってもよい。癌細胞関連抗原はまた、非癌性細胞によって発現され得る。
【０１３７】
操作されたシグナル伝達ポリペプチドのＡＳＴＲが結合し得る抗原の限定されない例には、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ３８、ＣＤ３０、ＥＲＢＢ２、ＣＡ１２５、ＭＵＣ−１、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ＣＤ４４表面接着分子、メソセリン、癌胚性抗原（ＣＥＡ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦＲ２）、高分子量メラノーマ関連抗原（ＨＭＷ−ＭＡＡ）、ＭＡＧＥ−Ａｌ、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＧＤ２、Ａｘｌ、Ｒｏｒ２等が含まれる。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した特異的結合対のメンバーは、受容体のリガンドであるＡＳＴＲである。リガンドは、これらに限定されないが、ホルモン（例えば、エリスロポエチン、成長ホルモン、レプチン等）；サイトカイン（例えば、インターフェロン、インターロイキン、特定のホルモン等）；成長因子（例えば、ヘレグリン；血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）等）；インテグリン結合ペプチド（例えば、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（配列番号１）を含むペプチド）等を含む。
【０１３９】
操作されたシグナル伝達ポリペプチドの特異的結合ペアのメンバーがリガンドである場合、操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、特異的結合ペアの第２のメンバーの存在下で活性化され得、特異的結合ペアの第２のメンバーは、リガンドの受容体である。例えば、リガンドがＶＥＧＦである場合、特異的結合対の第２のメンバーは、可溶性ＶＥＧＦ受容体を含むＶＥＧＦ受容体であってもよい。
【０１４０】
上記のように、いくつかの場合では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドに含まれる特異的結合対のメンバーは、受容体、例えば、リガンドの受容体、補助受容体等であるＡＳＴＲである。受容体は、受容体のリガンド結合断片であってもよい。適切な受容体には、これらに限定されないが、成長因子受容体（例えばＶＥＧＦ受容体）；キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＫ、メンバー１（ＮＫＧ２Ｄ）ポリペプチド（ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、およびＵＬＢ６の受容体）；サイトカイン受容体（例えば、ＩＬ−１３受容体；ＩＬ−２受容体等）；ＣＤ２７；天然の細胞毒性受容体（ＮＣＲ）（例えば、ＮＫＰ３０（ＮＣＲ３／ＣＤ３３７）ポリペプチド（ＨＬＡ−Ｂ関連転写物３（ＢＡＴ３）およびＢ７−Ｈ６の受容体）等）等が含まれる。
【０１４１】
ＡＳＴＲを含む本明細書で提供される態様のいずれかの特定の実施形態では、ＡＳＴＲは、ＡＳＴＲを標的細胞上に発現される標的分子と連結する中間タンパク質に向けることができる。中間タンパク質は、内因的に発現または外因的に導入されてもよく、また天然であってもよく、操作されてもよく、または化学的に修飾されてもよい。特定の実施形態では、ＡＳＴＲは、少なくとも１つのタグ付き中間体、典型的には抗体−タグコンジュゲートが、ＡＳＴＲによって認識されるタグと、標的細胞上で発現される標的分子、典型的にはタンパク質標的との間に含まれるような抗タグＡＳＴＲであってもよい。したがって、そのような実施形態では、ＡＳＴＲはタグに結合し、タグは、癌細胞等の標的細胞上の抗原に対する抗体にコンジュゲートされる。タグの限定されない例には、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、ストレプトアビジン、ビオチン、ヒスチジン、ジニトロフェノール、ペリジニンクロロフィルタンパク質複合体、緑色蛍光タンパク質、フィコエリトリン（ＰＥ）、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、パルミトイル化、ニトロシル化、アルカリホスファターゼ、グルコースオキシダーゼ、およびマルトース結合タンパク質が含まれる。そのため、ＡＳＴＲは、タグに結合する分子を含む。
【０１４２】
ストーク
いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、細胞の外側にあり、ＡＳＴＲと膜貫通ドメインとの間に介在する操作されたシグナル伝達ポリペプチドの部分に位置するストークを含む。いくつかの実施形態では、ストークは、野生型ＣＤ８ストーク領域（ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧ  ＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡ（配列番号２））に対して少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する、野生型ＣＤ２８ストーク領域（ＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号３）に対して少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する、または野生型免疫グロブリン重鎖ストーク領域に対して少なくとも８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の同一性を有する。操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおいて、使用されるストークは、抗原特異的標的化領域、および典型的には操作されたシグナル伝達ポリペプチド全体が、標的抗原への増加した結合を保持することを可能にする。
【０１４３】
ストーク領域は、約４アミノ酸〜約５０アミノ酸、例えば約４ａａ〜約１０ａａ、約１０ａａ〜約１５ａａ、約１５ａａ〜約２０ａａ、約２０ａａ〜約２５ａａ、約２５ａａ〜約３０ａａ、約３０ａａ〜約４０ａａ、または約４０ａａ〜約５０ａａの長さを有し得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドのストークは、少なくとも１つのシステインを含む。例えば、いくつかの実施形態では、ストークは、配列Ｃｙｓ−Ｐｒｏ−Ｐｒｏ−Ｃｙｓ（配列番号４）を含み得る。存在する場合、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドのストークのシステインは、第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドのストークとジスルフィド結合を形成するために利用可能となり得る。
【０１４５】
ストークは、当該技術分野で知られている免疫グロブリンヒンジ領域アミノ酸配列を含み得る。例えばＴａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１６２；およびＨｕｃｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１４：１７７９を参照されたい。限定されない例として、免疫グロブリンヒンジ領域は、以下のアミノ酸配列のいずれかのアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：ＤＫＴＨＴ（配列番号５）；ＣＰＰＣ（配列番号４）；ＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲ（配列番号６）（例えば、Ｇｌａｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８０：４１４９４を参照されたい）；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴ（配列番号７）；ＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰ（配列番号８）；ＫＣＣＶＤＣＰ（配列番号９）；ＫＹＧＰＰＣＰ（配列番号１０）；ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ（配列番号１１）（ヒトＩｇＧ１ヒンジ）；ＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰ（配列番号１２）（ヒトＩｇＧ２ヒンジ）；ＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰ（配列番号１３）（ヒトＩｇＧ３ヒンジ）；ＳＰＮＭＶＰＨＡＨＨＡＱ（配列番号１４）（ヒトＩｇＧ４ヒンジ）等。ストークは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４ヒンジ領域のアミノ酸配列を有するヒンジ領域を含み得る。ストークは、野生型（自然発生）ヒンジ領域と比較して、１つ以上のアミノ酸置換および／または挿入および／または欠失を含み得る。例えば、ストークが配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＹＴＣＰＰＣＰ（配列番号１５）を含むように、ヒトＩｇＧ１ヒンジのＨｉｓ２２９をＴｙｒで置換することができる（例えば、Ｙａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８７：５８９１を参照されたい）。ストークは、ヒトＣＤ８に由来するアミノ酸配列を含み得、例えば、ストークは、アミノ酸配列：ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１６）、またはそのバリアントを含み得る。
【０１４６】
膜貫通ドメイン
本開示の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、真核細胞膜に挿入するための膜貫通ドメインを含み得る。膜貫通ドメインは、ＡＳＴＲと共刺激ドメインの間に介在し得る。膜貫通ドメインは、キメラ抗原受容体がアミノ末端（Ｎ末端）からカルボキシル末端（Ｃ末端）の順にＡＳＴＲ；ストーク；膜貫通ドメイン；および活性化ドメインを含むように、ストークと共刺激ドメインとの間に介在し得る。
【０１４７】
真核生物（例えば哺乳動物）細胞の細胞膜へのポリペプチドの挿入を提供する任意の膜貫通（ＴＭ）ドメインは、本明細書に開示される態様および実施形態での使用に適している。
【０１４８】
本明細書で提供される態様または実施形態のいずれかに適したＴＭドメインの限定されない例には、以下のＴＭドメインまたは組み合わされたストークおよびＴＭドメインのいずれかのアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９または１００％の配列同一性を有するドメインが含まれる：ａ）ＣＤ８アルファＴＭ（配列番号１７）；ｂ）ＣＤ８ベータＴＭ（配列番号１８）；ｃ）ＣＤ４ストーク（配列番号１９）；ｄ）ＣＤ３Ｚ  ＴＭ（配列番号２０）；ｅ）ＣＤ２８ＴＭ（配列番号２１）；ｆ）ＣＤ１３４（ＯＸ４０）ＴＭ：（配列番号２２）；ｇ）ＣＤ７ＴＭ（配列番号２３）；ｈ）ＣＤ８ストークおよびＴＭ（配列番号２４）；ならびにｉ）ＣＤ２８ストークおよびＴＭ（配列番号２５）。
【０１４９】
限定されない例として、本発明の一態様の膜貫通ドメインは、または配列番号１７の膜貫通ドメインに対して少なくとも８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有し得、または１００％の配列同一性を有し得、あるいは、以下の遺伝子のそれぞれからの膜貫通ドメインのいずれかに対して１００％の配列同一性を有し得る：ＣＤ８ベータ膜貫通ドメイン、ＣＤ４膜貫通ドメイン、ＣＤ３ゼータ膜貫通ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ１３４膜貫通ドメイン、またはＣＤ７膜貫通ドメイン。
【０１５０】
細胞内活性化ドメイン
活性化されると、本開示の操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した細胞内活性化ドメインは、典型的には、１つ以上のサイトカインの産生を誘導する；細胞死を増加させる；ならびに／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞、γδＴ細胞、および／もしくは好中球の増殖を増加させる。活性化ドメインは、本明細書では活性化ドメインと呼ばれることもある。活性化ドメインは、ＣＡＲまたは本明細書で提供されるリンパ増殖性要素において使用することができる。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、細胞内活性化ドメインは、以下に記載されるように、少なくとも１つ（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ等）のＩＴＡＭモチーフを含む。いくつかの実施形態では、本発明の一態様の細胞内活性化ドメインは、以下に説明するように、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８、またはＺＡＰ７０ドメインに対して少なくとも８０％、９０％、もしくは９５％の配列同一性を有し得るか、または１００％の配列同一性を有し得る。
【０１５２】
本開示の操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した細胞内活性化ドメインは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含む。ＩＴＡＭモチーフはＹＸ１Ｘ２Ｌ／Ｉであり、式中Ｘ１およびＸ２は、独立して任意のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドの細胞内活性化ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、または５つのＩＴＡＭモチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＩＴＡＭモチーフは、細胞内活性化ドメインにおいて２回繰り返され、ここで、ＩＴＡＭモチーフの第１および第２のインスタンスは、６〜８アミノ酸によって互いに隔てられ、例えば（ＹＸ１Ｘ２Ｌ／Ｉ）（Ｘ３）ｎ（ＹＸ１Ｘ２Ｌ／Ｉ）であり、式中ｎは６〜８の整数であり、６〜８つのＸ３のそれぞれは任意のアミノ酸であり得る。いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドの細胞内活性化ドメインは、３つのＩＴＡＭモチーフを含む。
【０１５３】
適切な細胞内活性化ドメインは、ＩＴＡＭモチーフを含むポリペプチドに由来するＩＴＡＭモチーフを含む部分であってもよい。例えば、適切な細胞内活性化ドメインは、任意のＩＴＡＭモチーフ含有タンパク質からのＩＴＡＭモチーフ含有ドメインであってもよい。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、それが由来するタンパク質全体の配列全体を含む必要はない。適切なＩＴＡＭモチーフ含有ポリペプチドの例には、これらに限定されないが、ＣＤ３Ｚ（ＣＤ３ゼータ）；ＣＤ３Ｄ（ＣＤ３デルタ）；ＣＤ３Ｅ（ＣＤ３イプシロン）；ＣＤ３Ｇ（ＣＤ３ガンマ）；ＣＤ７９Ａ（抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖）；ＣＤ７９Ｂ（抗原受容体複合体関連タンパク質ベータ鎖）ＤＡＰ１２；およびＦＣＥＲ１Ｇ（Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖）が含まれる。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ゼータ鎖（ＣＤ３Ｚ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ゼータ鎖、ＣＤ２４７、ＣＤ３−ＺＥＴＡ、ＣＤ３Ｈ、ＣＤ３Ｑ、Ｔ３Ｚ、ＴＣＲＺ等としても知られる）に由来する。例えば、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０もしくは全てのアミノ酸に対して、または以下のアミノ酸配列（２アイソフォーム）のいずれかの一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、もしくは約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％配列同一性を有するドメインを含み得る。
【化１】
2021536245.tif 000002
またはＭＫＷＫＡＬＦＴＡＡＩＬＱＡＱＬＰＩＴＥＡＱＳＦＧＬＬＤＰＫＬＣＹＬＬＤＧＩＬＦＩＹＧＶＩＬＴＡＬＦＬＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬ［ＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬ］ＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬ［ＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩ］ＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬ［ＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬ］ＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２７）（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に記載されている）。
【０１５５】
同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３ゼータアミノ酸配列の一部を含むＩＴＡＭモチーフを含み得る。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０もしくは全てのアミノ酸に対して、または以下のアミノ酸配列のいずれかの連続した一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、もしくは約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬ［ＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬ］ＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬ［ＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩ］ＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬ［ＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬ］ＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２８）；ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬ［ＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬ］ＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬ［ＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩ］ＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬ［ＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬ］ＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号２９）；ＮＱＬ［ＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬ］ＤＫＲ（配列番号３０）；ＥＧＬ［ＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩ］ＧＭＫ（配列番号３１）；またはＤＧＬ［ＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬ］ＨＭＱ（配列番号３２）（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖（ＣＤ３Ｄ；ＣＤ３−デルタ；Ｔ３Ｄ；ＣＤ３抗原、デルタサブユニット；ＣＤ３デルタ；ＣＤ３ｄ抗原、デルタポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）；ＯＫＴ３、デルタ鎖；Ｔ細胞受容体Ｔ３デルタ鎖；Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３デルタ鎖等としても知られる）に由来する。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０もしくは全てのアミノ酸に対して、または以下のアミノ酸配列のいずれかの連続した一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、もしくは約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：ＭＥＨＳＴＦＬＳＧＬＶＬＡＴＬＬＳＱＶＳＰＦＫＩＰＩＥＥＬＥＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳＩＴＷＶＥＧＴＶＧＴＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩＹＲＣＮＧＴＤＩＹＫＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹＲＭＣＱＳＣＶＥＬＤＰＡＴＶＡＧＩＩＶＴＤＶＩＡＴＬＬＬＡＬＧＶＦＣＦＡＧＨＥＴＧＲＬＳＧＡＡＤＴＱＡＬＬＲＮＤＱＶ［ＹＱＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹＳＨＬ］ＧＧＮＷＡＲＮＫ（配列番号３３）またはＭＥＨＳＴＦＬＳＧＬＶＬＡＴＬＬＳＱＶＳＰＦＫＩＰＩＥＥＬＥＤＲＶＦＶＮＣＮＴＳＩＴＷＶＥＧＴＶＧＴＬＬＳＤＩＴＲＬＤＬＧＫＲＩＬＤＰＲＧＩＹＲＣＮＧＴＤＩＹＫＤＫＥＳＴＶＱＶＨＹＲＴＡＤＴＱＡＬＬＲＮＤＱＶ［ＹＱＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹＳＨＬ］ＧＧＮＷＡＲＮＫ（配列番号３４）（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１５７】
同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３デルタアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：ＤＱＶ［ＹＱＰＬＲＤＲＤＤＡＱＹＳＨＬ］ＧＧＮ（配列番号３５）（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖（ＣＤ３ｅ、Ｔ細胞表面抗原Ｔ３／Ｌｅｕ−４イプシロン鎖、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３イプシロン鎖、ＡＩ５０４７８３、ＣＤ３、ＣＤ３イプシロン、Ｔ３ｅ等としても知られる）に由来する。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０もしくは全てのアミノ酸に対して、または以下のアミノ酸配列の連続した一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、もしくは約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：ＭＱＳＧＴＨＷＲＶＬＧＬＣＬＬＳＶＧＶＷＧＱＤＧＮＥＥＭＧＧＩＴＱＴＰＹＫＶＳＩＳＧＴＴＶＩＬＴＣＰＱＹＰＧＳＥＩＬＷＱＨＮＤＫＮＩＧＧＤＥＤＤＫＮＩＧＳＤＥＤＨＬＳＬＫＥＦＳＥＬＥＱＳＧＹＹＶＣＹＰＲＧＳＫＰＥＤＡＮＦＹＬＹＬＲＡＲＶＣＥＮＣＭＥＭＤＭＳＶＡＴＩＶＩＶＤＩＣＩＴＧＧＬＬＬＬＶＹＹＷＳＫＮＲＫＡＫＡＫＰＶＴＲＧＡＧＡＧＧＲＱＲＧＱＮＫＥＲＰＰＰＶＰＮＰＤ［ＹＥＰＩＲＫＧＱＲＤＬＹＳＧＬ］ＮＱＲＲＩ（配列番号３６）（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１５９】
同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３イプシロンアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：
【化２】
2021536245.tif 000003
（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、細胞内活性化ドメインは、Ｔ細胞表面糖タンパク質ＣＤ３ガンマ鎖（ＣＤ３Ｇ、Ｔ細胞受容体Ｔ３ガンマ鎖、ＣＤ３−ＧＡＭＭＡ、Ｔ３Ｇ、ガンマポリペプチド（ＴｉＴ３複合体）等としても知られる）に由来する。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０もしくは全てのアミノ酸に対して、または以下のアミノ酸配列の連続した一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、もしくは約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：ＭＥＱＧＫＧＬＡＶＬＩＬＡＩＩＬＬＱＧＴＬＡＱＳＩＫＧＮＨＬＶＫＶＹＤＹＱＥＤＧＳＶＬＬＴＣＤＡＥＡＫＮＩＴＷＦＫＤＧＫＭＩＧＦＬＴＥＤＫＫＫＷＮＬＧＳＮＡＫＤＰＲＧＭＹＱＣＫＧＳＱＮＫＳＫＰＬＱＶＹＹＲＭＣＱＮＣＩＥＬＮＡＡＴＩＳＧＦＬＦＡＥＩＶＳＩＦＶＬＡＶＧＶＹＦＩＡＧＱＤＧＶＲＱＳＲＡＳＤＫＱＴＬＬＰＮＤＱＬ［ＹＱＰＬＫＤＲＥＤＤＱＹＳＨＬ］ＱＧＮＱＬＲＲＮ（配列番号３８）（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１６１】
同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ３ガンマアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：
【化３】
2021536245.tif 000004
（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ７９Ａ（Ｂ細胞抗原受容体複合体関連タンパク質アルファ鎖；ＣＤ７９ａ抗原（免疫グロブリン関連アルファ）；ＭＢ−１膜糖タンパク質；Ｉｇ−アルファ；膜結合免疫グロブリン関連タンパク質；表面ＩｇＭ関連タンパク質等としても知られる）に由来する。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０もしくは全てのアミノ酸に対して、または以下のアミノ酸配列のいずれかの連続した一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、もしくは約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：ＭＰＧＧＰＧＶＬＱＡＬＰＡＴＩＦＬＬＦＬＬＳＡＶＹＬＧＰＧＣＱＡＬＷＭＨＫＶＰＡＳＬＭＶＳＬＧＥＤＡＨＦＱＣＰＨＮＳＳＮＮＡＮＶＴＷＷＲＶＬＨＧＮＹＴＷＰＰＥＦＬＧＰＧＥＤＰＮＧＴＬＩＩＱＮＶＮＫＳＨＧＧＩＹＶＣＲＶＱＥＧＮＥＳＹＱＱＳＣＧＴＹＬＲＶＲＱＰＰＰＲＰＦＬＤＭＧＥＧＴＫＮＲＩＩＴＡＥＧＩＩＬＬＦＣＡＶＶＰＧＴＬＬＬＦＲＫＲＷＱＮＥＫＬＧＬＤＡＧＤＥＹＥＤＥＮＬ［ＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩ］ＳＲＧＬＱＧＴＹＱＤＶＧＳＬＮＩＧＤＶＱＬＥＫＰ（配列番号４０）またはＭＰＧＧＰＧＶＬＱＡＬＰＡＴＩＦＬＬＦＬＬＳＡＶＹＬＧＰＧＣＱＡＬＷＭＨＫＶＰＡＳＬＭＶＳＬＧＥＤＡＨＦＱＣＰＨＮＳＳＮＮＡＮＶＴＷＷＲＶＬＨＧＮＹＴＷＰＰＥＦＬＧＰＧＥＤＰＮＥＰＰＰＲＰＦＬＤＭＧＥＧＴＫＮＲＩＩＴＡＥＧＩＩＬＬＦＣＡＶＶＰＧＴＬＬＬＦＲＫＲＷＱＮＥＫＬＧＬＤＡＧＤＥＹＥＤＥＮＬ［ＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩ］ＳＲＧＬＱＧＴＹＱＤＶＧＳＬＮＩＧＤＶＱＬＥＫＰ（配列番号４１）（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１６３】
同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＣＤ７９Ａアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：ＥＮＬ［ＹＥＧＬＮＬＤＤＣＳＭＹＥＤＩ］ＳＲＧ（配列番号４２）（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、細胞内活性化ドメインは、ＤＡＰ１２（ＴＹＲＯＢＰ；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；ＫＡＲＡＰ；ＰＬＯＳＬ；ＤＮＡＸ活性化タンパク質１２；ＫＡＲ関連タンパク質；ＴＹＲＯタンパク質チロシンキナーゼ結合タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質；キラー活性化受容体関連タンパク質等としても知られる）に由来する。例えば、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０もしくは全てのアミノ酸に対して、または以下のアミノ酸配列（４つのアイソフォーム）のいずれかの連続した一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、もしくは約１５０ａａ〜約１６０ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：ＭＧＧＬＥＰＣＳＲＬＬＬＬＰＬＬＬＡＶＳＧＬＲＰＶＱＡＱＡＱＳＤＣＳＣＳＴＶＳＰＧＶＬＡＧＩＶＭＧＤＬＶＬＴＶＬＩＡＬＡＶＹＦＬＧＲＬＶＰＲＧＲＧＡＡＥＡＡＴＲＫＱＲＩＴＥＴＥＳＰ［ＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬ］ＮＴＱＲＰＹＹＫ（配列番号４３）、ＭＧＧＬＥＰＣＳＲＬＬＬＬＰＬＬＬＡＶＳＧＬＲＰＶＱＡＱＡＱＳＤＣＳＣＳＴＶＳＰＧＶＬＡＧＩＶＭＧＤＬＶＬＴＶＬＩＡＬＡＶＹＦＬＧＲＬＶＰＲＧＲＧＡＡＥＡＴＲＫＱＲＩＴＥＴＥＳＰ［ＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬ］ＮＴＱ（配列番号４４）、ＭＧＧＬＥＰＣＳＲＬＬＬＬＰＬＬＬＡＶＳＤＣＳＣＳＴＶＳＰＧＶＬＡＧＩＶＭＧＤＬＶＬＴＶＬＩＡＬＡＶＹＦＬＧＲＬＶＰＲＧＲＧＡＡＥＡＡＴＲＫＱＲＩＴＥＴＥＳＰ［ＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬ］ＮＴＱＲＰＹＹＫ（配列番号４５）、またはＭＧＧＬＥＰＣＳＲＬＬＬＬＰＬＬＬＡＶＳＤＣＳＣＳＴＶＳＰＧＶＬＡＧＩＶＭＧＤＬＶＬＴＶＬＩＡＬＡＶＹＦＬＧＲＬＶＰＲＧＲＧＡＡＥＡＴＲＫＱＲＩＴＥＴＥＳＰ［ＹＱＥＬＱＧＱＲＳＤＶＹＳＤＬ］ＮＴＱＲＰＹＹＫ（配列番号４６）（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１６５】
同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＤＡＰ１２アミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：
【化４】
2021536245.tif 000005
（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、細胞内活性化ドメインは、ＦＣＥＲ１Ｇ（ＦＣＲＧ；Ｆｃイプシロン受容体Ｉガンマ鎖；Ｆｃ受容体ガンマ鎖；ｆｃ−イプシロンＲＩ−ガンマ；ｆｃＲガンマ；ｆｃｅＲＩガンマ；高親和性免疫グロブリンイプシロン受容体サブユニットガンマ；免疫グロブリンＥ受容体、高親和性、ガンマ鎖等としても知られる）に由来する。例えば、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０もしくは全てのアミノ酸に対して、または以下のアミノ酸配列の連続した一続きの約５０アミノ酸〜約６０アミノ酸（ａａ）、約６０ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約８０ａａ、もしくは約８０〜約８８ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：ＭＩＰＡＶＶＬＬＬＬＬＬＶＥＱＡＡＡＬＧＥＰＱＬＣＹＩＬＤＡＩＬＦＬＹＧＩＶＬＴＬＬＹＣＲＬＫＩＱＶＲＫＡＡＩＴＳＹＥＫＳＤＧＶ［ＹＴＧＬＳＴＲＮＱＥＴＹＥＴＬ］ＫＨＥＫＰＰＱ（配列番号４８）（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１６７】
同様に、適切な細胞内活性化ドメインポリペプチドは、全長ＦＣＥＲ１Ｇアミノ酸配列のＩＴＡＭモチーフ含有部分を含み得る。したがって、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：
【化５】
2021536245.tif 000006
（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。
【０１６８】
本開示の操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した細胞内活性化ドメインは、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８タイプのシグナル伝達鎖を含む。ＤＡＰ１０シグナル伝達鎖の例は、アミノ酸配列番号５０である。いくつかの実施形態では、適切な細胞内活性化ドメインは、配列番号５０における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含む。
【０１６９】
ＣＤ２８シグナル伝達鎖の例は、配列番号５１のアミノ酸配列である。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号５１における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含む。
【０１７０】
本開示の操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した細胞内活性化ドメインは、ＺＡＰ７０ポリペプチドを含む。例えば、適切な細胞内活性化ドメインは、以下の配列における一続きの少なくとも１０、１５、２０もしくは全てのアミノ酸に対して、または配列番号５２の連続した一続きの約３００アミノ酸〜約４００アミノ酸、約４００アミノ酸〜約５００アミノ酸、または約５００アミノ酸〜６１９アミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。
【０１７１】
調節ドメイン
調節ドメインは、活性化ドメインの下流効果を増強もしくは減弱すること、または応答の性質を変更することを含めて、操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおける細胞内活性化ドメインの効果を変えることができる。本開示の操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した調節ドメインは、共刺激ドメインを含む。操作されたシグナル伝達ポリペプチドに含めるのに適した調節ドメインは、約３０アミノ酸〜約７０アミノ酸（ａａ）の長さを有し得、例えば、調節ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有し得る。他の場合において、調節ドメインは、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約２００ａａ、または２００ａａを超える長さを有し得る。
【０１７２】
共刺激ドメインは、典型的には、活性化ドメインへの応答の性質を強化および／または変更する。本開示の操作されたシグナル伝達ポリペプチドでの使用に適した共刺激ドメインは、一般に、受容体に由来するポリペプチドである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインはホモ二量体化する。対象の共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質の細胞内部分であってもよい（すなわち、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質に由来し得る）。適切な共刺激ポリペプチドの限定されない例には、４−ｌＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８欠失Ｌｃｋ結合（ＩＣΔ）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲおよびＨＶＥＭが含まれるが、これらに限定されない。例えば、本発明の一態様の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８欠失Ｌｃｋ結合（ＩＣΔ）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、またはＨＶＥＭの共刺激ドメインに対して少なくとも８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有し得る。例えば、本発明の一態様の共刺激ドメインは、これらに限定されないが、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８欠失Ｌｃｋ結合（ＩＣΔ）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、およびＨＶＥＭを含む適切な共刺激ポリペプチドの限定されない例の共刺激ドメインに対して少なくとも８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有し得る。例えば、本発明の一態様の共刺激ドメインは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ２８欠失Ｌｃｋ結合（ＩＣΔ）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、またはＨＶＥＭの共刺激ドメインに対して少なくとも８０％、９０％、または９５％の配列同一性を有し得る。
【０１７３】
操作されたシグナル伝達ポリペプチドに含めるのに適した共刺激ドメインは、約３０アミノ酸〜約７０アミノ酸（ａａ）の長さを有し得、例えば、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有し得る。他の場合において、共刺激ドメインは、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約２００ａａ、または２００ａａを超える長さを有し得る。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ１３７（ＴＮＦＲＳＦ９；ＣＤ１３７；４−１ＢＢ；ＣＤｗ１３７；ＩＬＡ等としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、配列番号５３における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１７５】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ２８（Ｔｐ４４としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、配列番号５４における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ２８欠失Ｌｃｋ結合（ＩＣΔ）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、配列番号５５における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＩＣＯＳ（ＡＩＬＩＭ、ＣＤ２７８、およびＣＶＩＤ１としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、配列番号５６における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＰ５−９０２Ｐ８．３、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、ＯＸ−４０、ＴＸＧＰ１Ｌとしても知られている）の細胞内部分に由来する。ＯＸ４０は、残基３４〜５７にｐ８５  ＰＩ３Ｋ結合モチーフおよび残基７６〜１０２にＴＲＡＦ結合モチーフを含み、これらの残基はそれぞれ配列番号２９６（表１の）からのものである。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＯＸ４０のｐ８５  ＰＩ３Ｋ結合モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、ＯＸ４０のＴＲＡＦ結合モチーフを含み得る。配列番号２９６のアミノ酸１７および４１に対応するリジンは、ユビキチン標的化モチーフの一部として機能する潜在的に負の調節部位である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０の共刺激ドメインにおけるこれらのリジンの一方または両方は、突然変異したアルギニンまたは別のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、適切な共刺激ドメインは、配列番号５７における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約２０ａａ〜約２５ａａ、約２５ａａ〜約３０ａａ、３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、または約４５ａａ〜約５０ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、共刺激ドメインは、約２０ａａ〜約５０ａａ、例えば２０ａａ〜４５ａａ、または２０ａａ〜４２ａａの長さを有する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ２７（Ｓ１５２、Ｔ１４、ＴＮＦＲＳＦ７、およびＴｐ５５としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、配列番号５８における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、または約４５ａａ〜約５０ａａの長さを有する。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＢＴＬＡ（ＢＴＬＡｌおよびＣＤ２７２としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、配列番号５９における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８、Ｄ１Ｓ１６６Ｅ、およびＫｉ−１としても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、配列番号６０の一続きの約１００アミノ酸〜約１１０アミノ酸（ａａ）、約１１０ａａ〜約１１５ａａ、約１１５ａａ〜約１２０ａａ、約１２０ａａ〜約１３０ａａ、約１３０ａａ〜約１４０ａａ、約１４０ａａ〜約１５０ａａ、約１５０ａａ〜約１６０ａａ、または約１６０ａａ〜約１８５ａａに対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８、ＲＰ５−９０２Ｐ８．２、ＡＩＴＲ、ＣＤ３５７、およびＧＩＴＲ−Ｄとしても知られている）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、配列番号６１における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、共刺激ドメインは、膜貫通タンパク質ＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４、ＲＰ３−３９５Ｍ２０．６、ＡＴＡＲ、ＣＤ２７０、ＨＶＥＡ、ＨＶＥＭ、ＬＩＧＨＴＲ、およびＴＲ２としても知られる）の細胞内部分に由来する。例えば、適切な共刺激ドメインは、配列番号６２における一続きの少なくとも１０、１５、２０または全てのアミノ酸に対して、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、第１および第２のポリペプチドの両方の共刺激ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０１８４】
リンカー
いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、任意の２つの隣接するドメイン間にリンカーを含む。例えば、リンカーは、膜貫通ドメインと最初の共刺激ドメインとの間にあってもよい。別の例として、ＡＳＴＲは抗体であってもよく、リンカーは重鎖と軽鎖の間にあってもよい。別の例として、リンカーは、ＡＳＴＲと膜貫通ドメインと共刺激ドメインとの間にあってもよい。別の例として、リンカーは、第２のポリペプチドの共刺激ドメインと細胞内活性化ドメインとの間にあってもよい。別の例として、リンカーは、ＡＳＴＲと細胞内シグナル伝達ドメインとの間にあってもよい。
【０１８５】
リンカーペプチドは、様々なアミノ酸配列のいずれかを有し得る。タンパク質は、一般に柔軟な性質のスペーサーペプチドによって結合され得るが、他の化学的結合は除外されない。リンカーは、長さが約１〜約１００アミノ酸の間、または長さが約１〜約２５アミノ酸の間のペプチドであってもよい。これらのリンカーは、合成のリンカーをコードするオリゴヌクレオチドを使用してタンパク質を結合することによって生成され得る。ある程度の柔軟性を備えたペプチドリンカーが使用され得る。連結ペプチドは、適切なリンカーが概して柔軟なペプチドをもたらす配列を有することを考慮して、事実上任意のアミノ酸配列を有し得る。グリシンおよびアラニン等の小さなアミノ酸の使用は、柔軟なペプチドの形成に役立つ。そのような配列の形成は、当業者にとって日常的である。
【０１８６】
適切なリンカーは容易に選択することができ、１アミノ酸（例えばＧｌｙ）〜２０アミノ酸、２アミノ酸〜１５アミノ酸、３アミノ酸〜１２アミノ酸、４アミノ酸〜１０アミノ酸、５アミノ酸〜９アミノ酸、６アミノ酸〜８アミノ酸、または７アミノ酸から８アミノ酸等の好適な異なる長さのいずれかであってもよく、１、２、３、４、５、６または７アミノ酸であってもよい。
【０１８７】
例示的な柔軟なリンカーは、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ、ＧＧＧＳｎ、およびＧＧＧＧＳｎを含み、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、および当該技術分野で知られている他の柔軟なリンカーを含む。グリシンおよびグリシン−セリンポリマーは、これらのアミノ酸は両方とも比較的構造化されておらず、したがって成分間の中性テザーとして機能し得るため、興味深い。グリシンはアラニンよりもはるかに多くのファイ−プサイ空間にアクセスし、より長い側鎖を有する残基よりもはるかに制限が少ないため、グリシンポリマーが特に興味深い（Ｓｃｈｅｒａｇａ，Ｒｅｖ．Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｃｈｅｍ．１１１７３−１４２（１９９２）を参照されたい）。例示的な柔軟なリンカーは、これらに限定されないが、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６３）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６４）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号６５）、ＧＧＳＧ（配列番号６６）、ＧＧＳＧＧ（配列番号６７）、ＧＳＧＳＧ（配列番号６８）、ＧＳＧＧＧ（配列番号６９）、ＧＧＧＳＧ（配列番号７０）、ＧＳＳＳＧ（配列番号７１）等を含む。当業者は、上記の任意の要素にコンジュゲートされたペプチドの設計が、全てまたは部分的に柔軟なリンカーを含み得、その結果、リンカーは、柔軟なリンカーならびにより柔軟でない構造を与える１つ以上の部分を含み得ることを認識するであろう。
【０１８８】
組み合わせ
いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子によって提供されるポリヌクレオチドは、１つ以上の操作されたシグナル伝達ポリペプチドの特定の組み合わせをコードする１つ以上の転写単位を有する。本明細書で提供されるいくつかの方法および組成物において、遺伝子改変Ｔ細胞は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子によるＴ細胞の形質導入後、１つ以上の操作されたシグナル伝達ポリペプチドの組み合わせを含む。第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド等の参照は便宜上のものであり、「第１のポリペプチド」上の要素および「第２のポリペプチド」上の要素は、典型的にはその特定のポリペプチドに対するさらなる要素またはステップにおいて、要素が、参照および慣例としてのみ第１または第２と称される異なるポリペプチド上にあることを意味することが理解されよう。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、抗原に結合することができる細胞外抗原結合ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。他の実施形態では、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドはまた、Ｔ細胞生存モチーフおよび／または膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、共刺激ドメインを含まないが、他の実施形態では、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、共刺激ドメインを含む。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、リンパ増殖性遺伝子産物および任意選択で細胞外抗原結合ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドはまた、Ｔ細胞生存モチーフ、細胞内シグナル伝達ドメイン、および１つ以上の共刺激ドメインのうちの１つ以上を含む。他の実施形態では、２つの操作されたシグナル伝達ポリペプチドが使用される場合、少なくとも１つはＣＡＲである。
【０１９１】
一実施形態では、１つ以上の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、Ｔ細胞特異的プロモーターまたは同じ転写物の下の一般的なプロモーターの下で発現され、転写物において、操作されたシグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸は、１つ以上の内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥ）または１つ以上のプロテアーゼ開裂ペプチドをコードする核酸によって分離される。
【０１９２】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、２つの操作されたシグナル伝達ポリペプチドをコードし、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、第１の抗原に結合することができる第１の細胞外抗原結合ドメイン、および共刺激ドメインではなく第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第２のポリペプチドは、ＶＥＧＦに結合することができる第２の細胞外抗原結合ドメイン、および例えば共刺激分子のシグナル伝達ドメイン等の第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。特定の実施形態では、第１の抗原は、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、またはＢＣＭＡである。特定の実施形態では、第１の細胞外抗原結合ドメインは、抗体またはその断片（例えばｓｃＦｖ）、例えば、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、またはＢＣＭＡに特異的な抗体またはその断片を含む。特定の実施形態では、ＶＥＧＦに結合する第２の細胞外抗原結合ドメインは、ＶＥＧＦの受容体、すなわちＶＥＧＦＲである。特定の実施形態では、ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、またはＶＥＧＦＲ３である。特定の実施形態では、ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ２である。
【０１９３】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つの操作されたシグナル伝達ポリペプチドをコードし、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは細胞外腫瘍抗原結合ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは抗原結合ドメイン（抗原は血管新生または脈管新生因子である）および１つ以上の共刺激分子シグナル伝達ドメインを含む。血管新生因子は、例えば、ＶＥＧＦであってもよい。１つ以上の共刺激分子シグナル伝達モチーフは、例えば、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、および４−１ＢＢのそれぞれからの共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。
【０１９４】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つの操作されたシグナル伝達ポリペプチドをコードし、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、細胞外腫瘍抗原結合ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、第２のポリペプチドは、ＶＥＧＦに結合することができる抗原結合ドメイン、ならびにＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、および４−１ＢＢのそれぞれからの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。さらなる実施形態では、第１のシグナル伝達ポリペプチドまたは第２のシグナル伝達ポリペプチドはまた、Ｔ細胞生存モチーフを有する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞生存モチーフは、ＩＬ−７受容体（ＩＬ−７Ｒ）の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ−１２受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ−１５受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、ＩＬ−２１受容体の細胞内シグナル伝達ドメイン、または形質転換成長因子β（ＴＧＦβ）受容体もしくはＴＧＦβデコイ受容体（ＴＧＦ−β−ドミナントネガティブ受容体ＩＩ（ＤＮＲＩＩ））の細胞内シグナル伝達ドメインであるか、またはそれに由来する。
【０１９５】
特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つの操作されたシグナル伝達ポリペプチドをコードし、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、細胞外腫瘍抗原結合ドメインおよびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含み、第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、ＶＥＧＦに結合することができる抗原結合ドメイン、ＩＬ−７受容体細胞内Ｔ細胞生存モチーフ、ならびにＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、および４−１ＢＢのそれぞれからの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、３つ以上のシグナル伝達ポリペプチドは、ポリヌクレオチドによってコードされる。特定の実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドのうちの１つのみが、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、操作されたシグナル伝達ポリペプチドの残りのそれぞれは、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原ではない抗原に結合する抗原結合ドメインを含む。他の実施形態では、２つ以上の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、１つ以上の腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原に結合する抗原結合ドメインを含み、操作されたシグナル伝達ポリペプチドの少なくとも１つは、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原に結合しない抗原結合ドメインを含む。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原は、Ｈｅｒ２、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、ＰＳＭＡ（前立腺特異的膜抗原）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、癌抗原−１２５（ＣＡ−１２５）、ＣＡ１９−９、カルレチニン、ＭＵＣ−１、上皮膜タンパク質（ＥＭＡ）、上皮腫瘍抗原（ＥＴＡ）、チロシナーゼ、メラノーマ関連抗原（ＭＡＧＥ）、ＣＤ３４、ＣＤ４５、ＣＤ９９、ＣＤ１１７、クロモグラニン、サイトケラチン、デスミン、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、肉眼的嚢胞性疾患液タンパク質（ＧＣＤＦＰ−１５）、ＨＭＢ−４５抗原、タンパク質メラン−Ａ（Ｔリンパ球によって認識されるメラノーマ抗原；ＭＡＲＴ−１）、ｍｙｏ−Ｄ１、筋肉特異的アクチン（ＭＳＡ）、ニューロフィラメント、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、胎盤アルカリホスファターゼ、シナプトフィジン、サイログロブリン、甲状腺転写因子−１、ピルビン酸キナーゼイソ酵素タイプＭ２の二量体形態（腫瘍Ｍ２−ＰＫ）、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ７０、ＧＤ２（ガングリオシドＧ２）、ＥｐｈＡ２、ＣＳＰＧ４、ＣＤ１３８、ＦＡＰ（線維芽細胞活性化タンパク質）、ＣＤ１７１、カッパ、ラムダ、５Ｔ４、αｖβ６インテグリン、インテグリンανβ３（ＣＤ６１）、ガラクチン、Ｋ−Ｒａｓ（Ｖ−Ｋｉ−ｒａｓ２  Ｋｉｒｓｔｅｎラット肉腫ウイルス腫瘍遺伝子）、Ｒａｌ−Ｂ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ１２３、ＥＧＦＲ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥｐＣＡＭ、胎児ＡｃｈＲ、ＦＲα、ＧＤ３、ＨＬＡ−Ａ１＋ＭＡＧＥ１、ＨＬＡ−Ａ１＋ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＩＬ−１１Ｒα、ＩＬ−１３Ｒα２、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＲＯＲ１、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ、ＶＥＧＦＲ２、ＥＧＦＲｖＩＩＩ（上皮成長因子バリアントＩＩＩ）、精子タンパク質１７（Ｓｐ１７）、メソセリン、ＰＡＰ（前立腺酸ホスファターゼ）、プロスタイン、ＴＡＲＰ（Ｔ細胞受容体ガンマ代替リーディングフレームタンパク質）、Ｔｒｐ−ｐ８、ＳＴＥＡＰ１（前立腺の６回膜貫通上皮抗原１）、異常なｒａｓタンパク質、または異常なｐ５３タンパク質である。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、第１の抗原に結合する第１の細胞外抗原結合ドメイン、および第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、第２の抗原に結合する第２の細胞外抗原結合ドメイン、または第２の抗原に結合する受容体、および第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、共刺激ドメインを含まない。特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、独立して、受容体の抗原結合部分または抗体の抗原結合部分である。特定の実施形態では、第１の抗原結合ドメインまたは第２の抗原結合ドメインのいずれかまたは両方が、ｓｃＦｖ抗体断片である。特定の実施形態では、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドおよび／または第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、膜貫通ドメインをさらに含む。特定の実施形態では、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドまたは第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、Ｔ細胞生存モチーフ、例えば本明細書に記載のＴ細胞生存モチーフのいずれかを含む。
【０１９９】
別の実施形態では、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、ＨＥＲ２に結合する第１の細胞外抗原結合ドメインを含み、第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、ＭＵＣ−１に結合する第２の細胞外抗原結合ドメインを含む。
【０２００】
別の実施形態では、第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドの第２の細胞外抗原結合ドメインは、インターロイキンに結合する。
【０２０１】
別の実施形態では、第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドの第２の細胞外抗原結合ドメインは、ダメージ関連分子パターン分子（ＤＡＭＰ；アラーミンとしても知られている）に結合する。他の実施形態では、ＤＡＭＰは、熱ショックタンパク質、クロマチン関連タンパク質高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）、Ｓ１００Ａ８（ＭＲＰ８、またはカルグラヌリンＡとしても知られる）、Ｓ１００Ａ９（ＭＲＰ１４、またはカルグラヌリンＢとしても知られる）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）、デオキシリボ核酸、アデノシン三リン酸、尿酸、またはヘパラン硫酸である。
【０２０２】
特定の実施形態では、前記第２の抗原は、腫瘍細胞によって提示される抗原に結合する抗体上の抗原である。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドを介したシグナル伝達活性化は、非抗原性であるが、低酸素症に関連している。特定の実施形態では、低酸素症は、低酸素誘導因子−１α（ＨＩＦ−１α）、ＨＩＦ−１β、ＨＩＦ−２α、ＨＩＦ−２β、ＨＩＦ−３α、またはＨＩＦ−３βの活性化によって誘導される。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の操作されたシグナル伝達ポリペプチドの発現は、本明細書でより詳細に開示される制御要素によって調節される。
【０２０５】
追加の配列
ＣＡＲ等の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、１つ以上の追加のポリペプチドドメインをさらに含んでもよく、そのようなドメインは、これらに限定されないが、シグナル配列；エピトープタグ；親和性ドメイン；および、例えば抗体アッセイによって、またはそれが検出可能なシグナルを生成するポリペプチドであるために、その存在または活性が検出され得るポリペプチド（検出可能なマーカー）を含む。本明細書で提供される態様または実施形態のいずれかの追加のドメインの限定されない例には、下に記載される以下の配列のいずれかに対する少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインが含まれる：シグナル配列、エピトープタグ、親和性ドメイン、または検出可能なシグナルを生成するポリペプチド。
【０２０６】
対象のＣＡＲにおける、例えば、対象のＣＡＲの第１のポリペプチドにおける使用に適したシグナル配列は、自然発生シグナル配列、合成（例えば人工）シグナル配列等を含む、任意の真核生物シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、例えば、シグナル配列は、ＣＤ８シグナル配列ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号７２）であってもよい。
【０２０７】
適切なエピトープタグは、これらに限定されないが、血球凝集素（ＨＡ；例えばＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号７３）；ＦＬＡＧ（例えばＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号７４）；ｃ−ｍｙｃ（例えばＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号７５）等を含む。
【０２０８】
親和性ドメインは、例えば、固体支持体上に固定化されたもの等、結合パートナーと相互作用することができ、特定または精製に有用なペプチド配列を含む。ヒスチジン等の複数の連続する単一アミノ酸をコードするＤＮＡ配列は、発現タンパク質に融合すると、ニッケルセファロース等の樹脂カラムに高親和性で結合することにより、組み換えタンパク質のワンステップ精製に使用され得る。例示的な親和性ドメインは、Ｈｉｓ５（ＨＨＨＨＨ；配列番号７６）、ＨｉｓＸ６（ＨＨＨＨＨＨ；配列番号７７）、ｃ−ｍｙｃ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ；配列番号７５）、Ｆｌａｇ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ；配列番号７４）、Ｓｔｒｅｐ  Ｔａｇ（ＷＳＨＰＱＦＥＫ；配列番号７８）、血球凝集素、例えばＨＡ  Ｔａｇ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ；配列番号７３）、ＧＳＴ、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、ＲＹＩＲＳ（配列番号７９）、Ｐｈｅ−Ｈｉｓ−Ｈｉｓ−Ｔｈｒ（配列番号８０）、キチン結合ドメイン、Ｓ−ペプチド、Ｔ７ペプチド、ＳＨ２ドメイン、Ｃ末端ＲＮＡタグ、ＷＥＡＡＡＲＥＡＣＣＲＥＣＣＡＲＡ（配列番号８１）、金属結合ドメイン、例えば亜鉛結合ドメインまたはカルシウム結合タンパク質からのもの等のカルシウム結合ドメイン、例えばカルモジュリン、トロポニンＣ、カルシニューリンＢ、ミオシン軽鎖、リカバリン、Ｓ−モジュリン、ビシニン、ＶＩＬＩＰ、ニューロカルシン、ヒポカルシン、フレケニン、カルトラクチン、カルパイン大サブユニット、Ｓ１００タンパク質、パルブアルブミン、カルビンジンＤ９Ｋ、カルビンジンＤ２８Ｋ、およびカルレチニン、インテイン、ビオチン、ストレプトアビジン、ＭｙｏＤ、Ｉｄ、ロイシンジッパー配列、ならびにマルトース結合タンパク質を含む。
【０２０９】
適切な検出可能なシグナル生成タンパク質は、例えば、蛍光タンパク質；生成物として検出可能なシグナルを生成する反応を触媒する酵素等を含む。
【０２１０】
適切な蛍光タンパク質は、これらに限定されないが、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはそのバリアント、ＧＦＰの青色蛍光バリアント（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光バリアント（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光バリアント（ＹＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、強化ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｔｏｐａｚ（ＴＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−ｍｏｎｏｍｅｒ、Ｊ−Ｒｅｄ、ｄｉｍｅｒ２、ｔ−ｄｉｍｅｒ２（１２）、ｍＲＦＰｌ、ポシロポリン、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ  ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質およびキンドリングタンパク質、Ｂ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリンおよびアロフィコシアニンを含むフィコビリタンパク質およびフィコビリタンパク質コンジュゲートを含む。蛍光タンパク質の他の例には、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅｌ、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９０５−９０９）等が含まれる。例えばＭａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９−９７３に記載されているように、Ａｎｔｈｏｚｏａｎ種からの様々な蛍光および着色タンパク質のいずれかが使用に適している。
【０２１１】
適切な酵素は、これらに限定されないが、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチン、オキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）等を含む。
【０２１２】
認識および／または除去ドメイン
本明細書で提供される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子のいずれも、本明細書で提供される操作されたシグナル伝達ポリペプチドのいずれかをコードする核酸の一部として、またはそれとは別に、認識または除去ドメインをコードする核酸を含み得る。したがって、本明細書で提供される操作されたシグナル伝達ポリペプチドのいずれも、認識または除去ドメインを含み得る。例えば、本明細書に開示されるＣＡＲｓのいずれも、認識または除去ドメインを含み得る。さらに、認識または除去ドメインは、本明細書に開示されるリンパ増殖性要素のいずれかと一緒に発現され得るか、またはさらには融合され得る。認識または除去ドメインは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞で発現するが、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子では発現しない。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、認識または除去ドメインは、単純ヘルペスウイルス由来の酵素チミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）または誘導性カスパーゼ−９に由来し得る。いくつかの実施形態では、認識または除去ドメインは、例えば、米国特許第８，８０２，３７４号に開示されているように、改変された内因性細胞表面分子を含み得る。改変された内因性細胞表面分子は、改変された任意の細胞表面関連受容体、リガンド、糖タンパク質、細胞接着分子、抗原、インテグリン、または分化クラスター（ＣＤ）であってもよい。いくつかの実施形態では、改変された内因性細胞表面分子は、切断されたチロシンキナーゼ受容体である。一態様では、切断されたチロシンキナーゼ受容体は、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）ファミリーのメンバーである（例えば、ＥｒｂＢ１、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、およびＥｒｂＢ４）。いくつかの実施形態では、認識ドメインは、ＥＧＦＲメンバーの細胞外ドメインを認識する抗体によって認識されるポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、認識ドメインは、ＥＧＦＲファミリーメンバーの少なくとも２０個の連続するアミノ酸、または例えば、ＥＧＦＲファミリーメンバーの２０〜５０個の連続するアミノ酸であってもよい。例えば、配列番号８２は、ＥＧＦＲメンバーの細胞外ドメインを認識する抗体によって認識され、適切な条件下で結合される例示的なポリペプチドである。そのような細胞外ＥＧＦＲエピトープは、本明細書ではｅＴａｇと呼ばれることがある。例示的な実施形態では、そのようなエピトープは、市販の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体によって認識される。
【０２１４】
ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ１およびＨＥＲ１としても知られる上皮成長因子受容体は、細胞外リガンドの上皮成長因子ファミリーのメンバーの細胞表面受容体である。ＥＧＦＲ活性の変化は、特定の癌に関係している。いくつかの実施形態では、ヒト上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）を含むＥＧＦＲポリペプチドをコードする遺伝子は、膜遠位ＥＧＦ結合ドメインおよび細胞質シグナル伝達尾部を含むポリペプチドをコードするが、抗ＥＧＦＲ抗体によって認識される細胞外膜近位エピトープを保持する核酸配列の除去によって構築される。好ましくは、抗体は、セツキシマブ、マツズマブ、ネシツムマブまたはパニツムマブ等の既知の市販の抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体である。
【０２１５】
他の研究者は、ビオチン化セツキシマブを抗ビオチンマイクロビーズと組み合わせて免疫磁気選択に適用することにより、ＥＧＦＲｔ含有構築物でレンチウイルスにより形質導入されたＴ細胞を、集団の２％から９０％を超える純度まで、細胞調製物対する観察可能な毒性なしに濃縮することに成功したことを示している。さらに、他の研究者は、この不活性ＥＧＦＲ分子の構成的発現は、協調的に発現するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＤ１９Ｒによって指示されるＴ細胞の表現型またはエフェクター機能に影響を与えないことを示している。さらに、フローサイトメトリー分析を通じて、ＥＧＦＲがマウスのＴ細胞生着のインビボ追跡マーカーとしてうまく利用されたことを示した研究者もいる。さらに、ＥＧＦＲは、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標）媒介抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）経路を介した自殺遺伝子の可能性があることが実証された。本開示の発明者は、レンチウイルスベクターを使用してＰＢＭＣにおいてｅＴａｇを首尾よく発現することに成功し、セツキシマブに曝露されたＰＢＭＣによるインビトロでのｅＴａｇの発現が、ＰＢＭＣの効果的な除去メカニズムを提供することを見出した。したがって、ＥＧＦＲは、非免疫原性選択ツール、追跡マーカー、および免疫療法の可能性を有する形質導入されたＴ細胞のための自殺遺伝子として使用され得る。ＥＧＦＲ核酸はまた、当該技術分野で周知の手段によって検出され得る。
【０２１６】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、ＥＧＦＲは、ＣＡＲも含む単一のポリペプチドの一部として、またはリンパ増殖性要素を含む単一のポリペプチドの一部として発現される。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ認識ドメインをコードするアミノ酸配列は、開裂シグナルおよび／またはリボソームスキップ配列によって、キメラ抗原受容体をコードするアミノ酸配列から分離され得る。リボソームスキップおよび／または開裂シグナルは、当該技術分野で知られている任意のリボソームスキップおよび／または開裂シグナルであってもよい。理論に限定されないが、リボソームスキップ配列は、例えば、アミノ酸配列ＧＳＧＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ（配列番号８３）を有するＴ２Ａ（本明細書では２Ａ−１とも呼ばれる）であってもよい。理論に限定されないが、開裂シグナルおよびリボソームスキップ配列の他の例には、ＦＭＤＶ  ２Ａ（Ｆ２Ａ）；ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａ（Ｅ２Ａと略される）；ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）；およびＴｈｏｓｅａａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）が含まれる。いくつかの実施形態では、認識ドメインをコードするポリヌクレオチド配列は、ＣＡＲまたはリンパ増殖性要素と同じ転写物上にあり得るが、内部リボソーム侵入部位によってＣＡＲまたはリンパ増殖性要素をコードするポリヌクレオチド配列から分離され得る。
【０２１７】
本明細書で経験的に例示される他の実施形態では、認識ドメインは、リンパ増殖性要素に融合された融合ポリペプチドの一部として発現され得る。そのような構築物は、特に本明細書で提供される他の「スペース節約」要素と組み合わせて、別個のポリペプチドと比較してＲＮＡゲノム上でより少ないゲノムスペースを占めるという利点を提供する。１つの例示的な実施形態では、ｅＴａｇは、本明細書で実験的に実証されるように、ＩＬ７Ｒα突然変異体に融合された融合ポリペプチドとして発現される。
【０２１８】
キメラ抗原受容体
本発明のいくつかの態様では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはＣＡＲをコードするポリヌクレオチドであり、これは、簡単にするために、本明細書では「ＣＡＲ」と呼ばれる。本開示のＣＡＲは、ａ）少なくとも１つの抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）；ｂ）膜貫通ドメイン；およびｃ）細胞内活性化ドメインを含む。例示的な実施形態では、ＣＡＲの抗原特異的標的化領域は、標的抗原に対する抗体のｓｃＦｖ部分である。例示的な実施形態では、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８、またはＺＡＰ７０に由来し、いくつかのさらなる例示的な実施形態では、ＣＤ３ｚに由来する。例示的な実施形態では、ＣＡＲは、共刺激ドメイン、例えば、上記の調節ドメインのセクションで提供される共刺激ドメインのいずれかをさらに含み、さらなる例示的な実施形態では、共刺激ドメインは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ−４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、およびＨＶＥＭの細胞内共刺激ドメインである。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、上記の膜貫通ドメインのセクションに列挙された膜貫通ドメインのいずれかを含む。
【０２１９】
本開示のＣＡＲは、真核細胞、例えば哺乳動物細胞の原形質膜に存在することができ、適切な哺乳動物細胞は、これらに限定されないが、細胞毒性細胞、Ｔリンパ球、幹細胞、幹細胞の子孫、前駆細胞、前駆細胞の子孫、およびＮＫ細胞、ＮＫ−Ｔ細胞、およびマクロファージを含む。真核細胞の原形質膜に存在する場合、本開示のＣＡＲは、特定の条件下でＡＳＴＲに結合する１つ以上の標的抗原の存在下で活性である。標的抗原は、特異的結合ペアの第２のメンバーである。特異的結合対の標的抗原は、可溶性（例えば細胞に結合していない）因子；標的細胞等の細胞の表面に存在する因子；固体表面に提示された因子；脂質二重層に存在する因子等であってもよい。ＡＳＴＲが抗体であり、特異的結合対の第２のメンバーが抗原である場合、抗原は、可溶性（例えば細胞に結合していない）抗原；標的細胞等の細胞の表面に存在する抗原；固体表面に提示された抗原；脂質二重層に存在する抗原等であってもよい。
【０２２０】
いくつかの場合において、本開示のＣＡＲは、真核細胞の原形質膜に存在する場合、および１つ以上の標的抗原によって活性化される場合、細胞内の少なくとも１つの核酸の発現を増加させる。例えば、いくつかの場合において、本開示のＣＡＲは、真核細胞の原形質膜に存在する場合、および１つ以上の標的抗原によって活性化される場合、細胞内の少なくとも１つの核酸の発現を、１つ以上の標的抗原の非存在下での核酸の転写レベルと比較して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍超増加させる。
【０２２１】
一例として、本開示のＣＡＲは、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内シグナル伝達ポリペプチドを含み得る。
【０２２２】
本開示のＣＡＲは、真核細胞の原形質膜に存在する場合、および１つ以上の標的抗原によって活性化される場合、いくつかの場合において、細胞による１つ以上のサイトカインの産生の増加をもたらし得る。例えば、本開示のＣＡＲは、真核細胞の原形質膜に存在する場合、および１つ以上の標的抗原によって活性化される場合、細胞によるサイトカインの産生を、１つ以上の標的抗原の非存在下で細胞によって産生されるサイトカインの量と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍超増加させることができる。産生が増加され得るサイトカインは、これらに限定されないが、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）、腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−ａ）、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−１０；ケモカイン；成長因子等を含む。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の原形質膜に存在する場合、および１つ以上の標的抗原によって活性化される場合、細胞内の核酸の転写の増加および細胞によるサイトカインの産生の増加の両方をもたらし得る。
【０２２４】
いくつかの場合において、本開示のＣＡＲは、真核細胞の原形質膜に存在する場合、および１つ以上の標的抗原によって活性化される場合、その細胞表面にＣＡＲの第１のポリペプチドの抗原結合ドメインが結合する抗原を発現する標的細胞に対する細胞による細胞毒性活性をもたらす。例えば、真核細胞が細胞毒性細胞（例えば、ＮＫ細胞または細胞毒性Ｔリンパ球）である場合、本開示のＣＡＲは、細胞の原形質膜に存在する場合、および１つ以上の標的抗原によって活性化される場合、細胞表面に１つ以上の標的抗原を発現する標的細胞に対する細胞の細胞毒性活性を増加させる。例えば、真核細胞がＮＫ細胞またはＴリンパ球である場合、本開示のＣＡＲは、細胞の原形質膜に存在する場合、および１つ以上の標的抗原によって活性化される場合、細胞の細胞毒性活性を、１つ以上の標的抗原の非存在下での細胞の細胞毒性活性と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約１０倍、または１０倍超増加させる。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の原形質膜に存在する場合、および１つ以上の標的抗原によって活性化される場合、増殖および拡張等の他のＣＡＲ活性化関連事象をもたらし得る（増加した細胞分裂または抗アポトーシス反応に起因する）。
【０２２６】
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、真核細胞の原形質膜に存在する場合、および１つ以上の標的抗原によって活性化される場合、細胞内シグナル伝達調節、細胞分化、または細胞死等の他のＣＡＲ活性化関連事象をもたらし得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、本開示のＣＡＲは、微小環境が制限されている。この特性は通常、ＣＡＲのＡＳＴＲドメインの微小環境が制限された性質の結果である。したがって、本開示のＣＡＲｓは、より低い結合親和性を有することができ、または例示的な実施形態では、通常の生理学的環境の条件下よりも、微小環境の条件下で１つ以上の標的抗原に対してより高い結合親和性を有し得る。
【０２２８】
特定の例示的な実施形態では、本明細書で提供されるＣＡＲｓは、細胞内活性化ドメインに加えて共刺激ドメインを含み、共刺激ドメインは、例えば、リンパ増殖性要素（ＬＥ）のための本明細書で提供される細胞内シグナル伝達ドメインのいずれ、例えばＣＬＥの細胞内ドメイン等である。特定の例示的な実施形態では、本明細書のＣＡＲｓの共刺激ドメインは、Ｐ３ドメインの非存在下で本明細書のＣＬＥの有効な細胞内シグナル伝達ドメインとして示されるＣＬＥまたはＰ４ドメインについて本明細書で特定される第１の細胞内ドメイン（Ｐ３ドメイン）である。さらに、特定の例示的な実施形態では、ＣＡＲｓの共刺激ドメインは、本明細書でＣＬＥについて特定されたＰ３およびＰ４細胞内シグナル伝達ドメインの両方を含み得る。特定の例示的な下位実施形態は、本明細書でＣＬＥについて特定されているように、特に効果的なＰ３およびＰ４パートナー細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な実施形態では、共刺激ドメインは、共刺激ドメインの一部として、またはさらなる例示的な実施形態では唯一の共刺激ドメインとして、ＣＡＲのＩＴＡＭ含有細胞内ドメイン以外のものである。
【０２２９】
ＬＥの有効な細胞内ドメインとして本明細書で特定された共刺激ドメインを有するＣＡＲを含むこれらの実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、本明細書で提供される表１の任意の細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。表１の細胞内ドメインのいずれかの活性断片は、ＣＡＲの共刺激ドメインであってもよい。例示的な実施形態では、ＣＡＲのＡＳＴＲは、ｓｃＦＶを含む。例示的な実施形態では、ＣＬＥのｃ刺激細胞内ドメインに加えて、これらのＣＡＲｓは、例示的な実施形態ではＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｃである細胞内活性化ドメインを含む。ＤＡＰ１０／ＣＤ２８、またはＺＡＰ７０細胞内活性化ドメイン、またはさらなる例示的な実施形態では、ＣＤ３ｚ細胞内活性化ドメインである。
【０２３０】
これらの例示的な実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦＲ、ＬＭＰ１、ＭＰＬ、ＭｙＤ８８、ＯＳＭＲ、またはＰＲＬＲからのシグナル伝達ドメインを含む、細胞内ドメインまたはその機能的シグナル伝達断片を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦＲ、ＬＭＰ１、ＭＰＬ、ＭｙＤ８８、ＯＳＭＲ、またはＰＲＬＲからのシグナル伝達ドメインを含む、細胞内ドメインまたはその機能的シグナル伝達断片を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＭＰＬ、ＭｙＤ８８、またはＯＳＭＲからのシグナル伝達ドメインを含む、細胞内ドメインまたはその機能的断片を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＭＰＬ、ＭｙＤ８８、またはＯＳＭＲからのシグナル伝達ドメインを含む、細胞内ドメインまたはその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３Ｒ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＥ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ３１ＲＡ、ＭＰＬ、ＭｙＤ８８、ＯＳＭＲ、またはＰＲＬＲからのシグナル伝達ドメインを含む、細胞内ドメインまたはその機能的シグナル伝達断片を含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３Ｒ、ＩＦＮＧＲ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１７ＲＥ、ＩＬ３１ＲＡ、ＭＰＬ、またはＭｙＤ８８からのシグナル伝達ドメインを含む、細胞内ドメインまたはその機能的シグナル伝達断片を含み得る。
【０２３１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲの共刺激ドメインは、ＣＳＦ３Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ２７ＲＡ、ＭＰＬ、およびＭｙＤ８８からのシグナル伝達ドメインを含む、細胞内ドメインまたはその断片を含み得る。特定の例示的な下位実施形態では、ＣＡＲの細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ｚに由来する。
【０２３２】
組み換えＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、細胞内および細胞外タンパク質に由来する特定のタンパク質断片を認識する。タンパク質がペプチド断片に分解されると、それらは主要組織適合遺伝子複合体、またはヒトではＨＬＡ（ヒト白血球抗原）複合体と呼ばれるＭＨＣと呼ばれる別のタンパク質とともに細胞表面に提示される。脊椎動物における３つの異なるＴ細胞抗原受容体の組み合わせは、αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、およびｐｒｅ−ＴＣＲである。そのような組み合わせは、αＴＣＲサブユニットおよびβＴＣＲサブユニット、γＴＣＲサブユニットおよびδＴＣＲサブユニット、ならびにｐｒｅ−ＴＣＲの場合はｐＴαサブユニットおよびβＴＣＲサブユニット等の二量体化サブタイプのメンバー間の二量体化によって形成される。ＴＣＲサブユニットのセットは二量体化し、ＭＨＣのコンテキストで提示された標的ペプチド断片を認識する。ｐｒｅ−ＴＣＲは未成熟αβＴ細胞の表面にのみ発現し、αβＴＣＲは成熟αβＴ細胞およびＮＫ  Ｔ細胞の表面に発現し、γδＴＣＲはγδＴ細胞の表面に発現する。Ｔ細胞の表面上のαβＴＣＲは、ＭＨＣＩまたはＭＨＣＩＩによって提示されるペプチドを認識し、ＮＫ  Ｔ細胞の表面上のαβＴＣＲは、ＣＤ１によって提示される脂質抗原を認識する。γδＴＣＲは、ＭＨＣおよびＭＨＣ様分子を認識でき、ウイルス糖タンパク質等の非ＭＨＣ分子も認識することができる。リガンドが認識されると、αβＴＣＲおよびγδＴＣＲはＣＤ３ゼータ鎖を介して活性化シグナルを伝達し、これはＴ細胞の増殖およびサイトカインの分泌を刺激する。
【０２３３】
ＴＣＲ分子は免疫グロブリンスーパーファミリーに属し、Ｖ領域に抗原特異的に存在し、ＣＤＲ３はＣＤＲ１およびＣＤＲ２よりも変動性が高く、ＴＣＲの抗原結合特異性を直接決定付ける。ＭＨＣ−抗原ペプチド複合体がＴＣＲによって認識されると、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２はＭＨＣ分子抗原結合チャネルの側壁を認識してそれに結合し、ＣＤＲ３は抗原ペプチドに直接結合する。したがって、ＭＨＣに提示された腫瘍特異的タンパク質断片を認識する組み換えＴＣＲが操作され得る。
【０２３４】
したがって、一般的なＨＬＡを有する特定のペプチドを認識するヒトＴＣＲαおよびＴＣＲβペアに由来するもの等の組み換えＴＣＲは、腫瘍特異的タンパク質に対する特異性を伴って生成され得る（Ｓｃｈｍｉｔｔ，ＴＭ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。組み換えＴＣＲの標的は、本明細書で提供されるＣＡＲ  ＡＳＴＲの抗原標的のいずれかに由来するペプチドであり得るが、より一般的には、癌胎児性抗原等の細胞内腫瘍特異的タンパク質、または正常な細胞内タンパク質もしくは他の癌特異的ネオエピトープの突然変異体に由来する。ＴＣＲサブユニットのライブラリは、標的抗原に対するそれらの選択性についてスクリーニングすることができる。天然および／または組み換えＴＣＲサブユニットのスクリーニングは、標的抗原に対して高いアビディティおよび／または反応性を有するＴＣＲサブユニットのセットを特定することができる。そのようなＴＣＲサブユニットのセットのメンバーを選択およびクローン化して、ＴＣＲサブユニットをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを産生することができる。
【０２３５】
そのようなＴＣＲサブユニットのセットをコードするポリヌクレオチドは、リンパ球が組み換えＴＣＲを発現するように、リンパ球、または例示的な実施形態ではＴ細胞もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子に含まれ得る。したがって、１つ以上のＣＡＲｓおよび／またはリンパ増殖性要素を含む実施形態等の、操作されたシグナル伝達ポリペプチドを含む本明細書で提供される任意の態様または実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、１つ以上のセットの組み換えγδＴＣＲ鎖、または例示的な実施形態ではαβＴＣＲ鎖を含むことができるか、またはそのような鎖であってもよい。セットを形成するＴＣＲ鎖は、ＣＡＲｓおよびリンパ増殖性要素等の２つ以上の他の操作されたシグナル伝達ポリペプチドを発現するために、本明細書に開示されるように２つのＴＣＲ鎖を共発現するためのいくつかの異なる技術を使用して共発現され得る。例えば、２Ａプロテアーゼ、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、および別個のプロモーター等のプロテアーゼ開裂エピトープが使用され得る。
【０２３６】
混合ＴＣＲ二量体形成の可能性を低減するためにいくつかの戦略が採用されている。一般に、これには、導入されたＴＣＲ鎖の相互の優先的ペアリングを促進する一方で、内因性ＴＣＲ鎖とのペアリングに成功する可能性を低くするように、ＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖の定常（Ｃ）ドメインを改変することが含まれる。インビトロでいくらかの見込みを示した１つのアプローチは、ヒトＴＣＲαおよびＴＣＲβ鎖のＣドメインをそれらのマウス対応物で置き換えることを含む。別のアプローチは、自己ペアリングを促進するためのヒトＴＣＲα共通ドメインおよびＴＣＲβ鎖共通領域の突然変異、またはウイルス遺伝子構築物内の内因性ＴＣＲアルファおよびＴＣＲベータｍｉＲＮＡの発現を含む。したがって、操作されたシグナル伝達ポリペプチドとしてＴＣＲ鎖の１つ以上のセットを含む本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、ＴＣＲ鎖、例示的な実施形態ではαβＴＣＲ鎖のセットの各メンバーは、互いに優先的なペアリングを促進する改変された定常ドメインを含む。いくつかの下位実施形態では、ＴＣＲ鎖、例示的な実施形態ではαβＴＣＲ鎖のセットの各メンバーは、同じＴＣＲ鎖タイプからのマウス定常ドメイン、または同じＴＣＲ鎖サブタイプからのマウス定常ドメインに由来する十分な配列を有する同じＴＣＲ鎖サブタイプからの定常ドメインを含み、したがってＴＣＲ鎖のセットの相互への二量体化がヒトＴＣＲ鎖との二量体化よりも優先されるか、またはそれを排除して行われる。他の下位実施形態では、ＴＣＲ鎖、例示的な実施形態ではαβＴＣＲ鎖のセットの各メンバーは、その定常ドメインに対応する突然変異を含み、したがって、ＴＣＲ鎖のセットの互いへの二量体化がヒト定常ドメインを有するＴＣＲ鎖との二量体化よりも優先されるか、またはそれを排除して行われる。例示的な実施形態におけるそのような好ましいまたは排他的な二量体化は、生理学的条件下である。
【０２３７】
リンパ増殖性要素
末梢Ｔリンパ球数は、細胞の継続的な追加にもかかわらず、胸腺からの移動および抗原の遭遇に応じた増殖、ならびに抗原クリアランス後の抗原特異的エフェクターの除去による細胞の喪失のために、成人期を通して著しく安定したレベルに維持される（Ｍａｒｒａｋ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １：１０７−１１１；Ｆｒｅｉｔａｓ，Ａ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．２０００．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：８３−１１１）。末梢Ｔ細胞コンパートメントのサイズは、増殖および生存の両方に影響を与える複数の要因によって調節される。しかしながら、リンパ球減少環境では、末梢Ｔ細胞コンパートメントのサイズを維持する「急性恒常性増殖」メカニズムにより、Ｔリンパ球は同族の抗原とは独立して分裂する。リンパ球減少症の状態は、養子細胞療法中に、インビトロでＴ細胞を増殖させ、それらをリンパ球枯渇した対象に導入することによって対象または患者において確立され、その結果、移入されたＴ細胞の生着および抗腫瘍機能が増強される。しかしながら、対象のリンパ球枯渇は、免疫機能障害および死亡を含む深刻な副作用を引き起こす可能性があるため、望ましくない。
【０２３８】
研究によると、リンパ球枯渇は恒常性サイトカインの細胞シンクとして機能する内因性リンパ球を除去し、それによってサイトカインを解放して養子移入細胞の生存および増殖を誘導することが示されている。例えばＩＬ−７およびＩＬ−１５等のいくつかのサイトカインは、Ｔ細胞の抗原非依存性増殖を媒介することが知られており、したがって、非リンパ球減少環境において恒常性増殖を誘発することができる。しかしながら、これらのサイトカインおよびその受容体は、恒常性におけるリンパ増殖性疾患を予防する固有の制御メカニズムを有する。
【０２３９】
本明細書で提供される実施形態の多くは、リンパ増殖性要素、またはそれをコードする核酸を、典型的には操作されたシグナル伝達ポリペプチドの一部として含む。したがって、本発明のいくつかの態様では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、キメラリンパ増殖性要素（ＣＬＥ）等のリンパ増殖性要素（ＬＥ）である。典型的には、ＬＥは、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および増殖を駆動する少なくとも１つの細胞内シグナル伝達ドメイン、および例示的な実施形態では第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、第１および／または第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、第１および／または第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２７、突然変異デルタＬｃｋ  ＣＤ２８、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＣＧＲＡ２、ＧＨＲ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ１７ＲＥ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦＲ、ＬＭＰ１、ＭＰＬ、ＭＹＤ８８、ＯＳＭＲ、ＰＲＬＲ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１４、もしくはＴＮＦＲＳＦ１８、またはそれらの機能的突然変異体および／もしくは断片を含み得る。例示的な実施形態では、第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＭｙＤ８８、またはその機能的突然変異体および／もしくは断片を含み得る。さらなる例示的な実施形態では、第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＭｙＤ８８、またはその機能的突然変異体および／もしくはその断片を含み得、第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＩＣＯＳ、ＴＮＦＲＳＦ４、もしくはＴＮＳＦＲ１８、またはそれらの機能的突然変異体および／もしくはその断片を含み得る。いくつかの実施形態では、第１の細胞内ドメインは、ＭｙＤ８８であり、第２の細胞内ドメインは、ＩＴＡＭを含む細胞内ドメイン、例えば、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８、またはＺＡＰ７０からの細胞内ドメインである。いくつかの実施形態では、第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＮＦＲＳＦ１８、またはその機能的突然変異体および／もしくは断片を含み得る。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの融合を含み得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの融合は、ｅＴＡＧ  ＩＬ７ＲＡ  Ｉｎｓ  ＰＰＣＬ（インターロイキン７受容体）、Ｍｙｃ  ＬＭＰ１、ＬＭＰ１、ｅＴＡＧ  ＣＲＬＦ２、ｅＴＡＧ  ＣＳＦ２ＲＢ、ｅＴＡＧ  ＣＳＦ３Ｒ、ｅＴＡＧ  ＥＰＯＲ、ｅＴＡＧ  ＧＨＲ、Ｆｎ  Ｆ５２３Ｃ  ＩＬ２７ＲＡの後が切断されたｅＴＡＧ、もしくはＦｎ  Ｓ５０５Ｎ  ＭＰＬの後が切断されたｅＴＡＧ、またはそれらの機能的突然変異体および／もしくは断片を含み得る。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、細胞外ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、カルボキシ末端に０、１つ、２つ、３つ、または４つの追加のアラニンを有するｅＴａｇを含み得る。いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、カルボキシ末端に０、１つ、２つ、３つ、もしくは４つの追加のアラニンを有するＭｙｃ、またはその機能的突然変異体および／もしくは断片を含み得る。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、膜貫通ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ  ＣＤ２４７、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＣＧＲＡ２、ＧＨＲ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ７ＲＡ  Ｉｎｓ  ＰＰＣＬ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ１７ＲＥ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦＲ、ＭＰＬ、ＯＳＭＲ、ＰＲＬＲ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１４、もしくはＴＮＦＲＳＦ１８、またはそれらの機能的突然変異体および／もしくは断片を含み得る。
【０２４３】
本明細書の任意の態様または実施形態で使用するためのＣＬＥは、ＷＯ２０１９／０５５９４６（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に開示される任意のＣＬＥを含み得、その大部分は、構成的に活性であるように設計され、構成的に活性であると考えられる。そこに示されているように、ＣＬＥの第１および第２の細胞内シグナル伝達ドメインが存在する場合、第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、膜結合モチーフと第２の細胞内ドメインとの間に配置される。
【０２４４】
別の実施形態では、ＬＥは、インビボでＴ細胞の増殖を駆動する特性を提供することができ、および／またはその特性を保有する（または、ＬＥで遺伝子改変および／または形質導入された細胞は、インビボでのＴ細胞の拡張の駆動を提供することができ、それに適応し、その特性を保有し、および／またはそのために改変される）。そのようなインビボ試験を実行するための方法は、実施例６に提供されている。例えば、実施例６に示されるように、インビボ試験は、マウスモデルを利用して、Ｔ細胞がＬＥをコードするレンチウイルスベクターと接触され、マウスに導入された後に、インビボで１５〜２５日、またはインビボで１９〜２１日、またはインビボで約２１日でＴ細胞拡張を測定し得る。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、表１に列挙されている配列（配列番号８４〜３０２）のいずれかを含み得る。表１は、ＣＬＥで試験されたドメインの部分、名称（遺伝子名を含む）、およびアミノ酸配列を示す。典型的には、ＣＬＥは、細胞外ドメイン（Ｐ１と表示）、膜貫通ドメイン（Ｐ２と表示）、第１の細胞内ドメイン（Ｐ３と表示）、および第２の細胞内ドメイン（Ｐ４と表示）を含む。典型的には、リンパ増殖性要素は、第１の細胞内ドメインを含む。例示的な実施形態では、第１の細胞内ドメインは、Ｓ０３６〜Ｓ０２１６として、もしくは表１に列挙されている部分のいずれか、またはその機能的突然変異体および／もしくは断片を含み得る。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、第２の細胞内ドメインを含み得る。例示的な実施形態では、第２の細胞内ドメインは、Ｓ０３６〜Ｓ０２１６として、もしくは表１に列挙されている部分のいずれか、またはその機能的突然変異体および／もしくは断片を含み得る。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、細胞外ドメインを含み得る。例示的な実施形態では、細胞外ドメインは、表１にＭ００１〜Ｍ０４９もしくはＥ００６〜Ｅ０１５として列挙されている部分の配列のいずれか、またはその機能的突然変異体および／もしくは断片を含み得る。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、膜貫通ドメインを含み得る。例示的な実施形態では、膜貫通ドメインは、表１にＭ００１〜Ｍ０４９もしくはＴ００１〜Ｔ０８２として列挙されている部分のいずれか、またはその機能的突然変異体および／もしくは断片を含み得る。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、細胞外／膜貫通ドメイン（表１のＭ００１〜Ｍ０４９）、第１の細胞内ドメイン（表１のＳ０３６〜Ｓ０２１６）、および第２の細胞内ドメイン（表１のＳ０３６〜Ｓ２１６）の融合物であってもよい。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、細胞外ドメイン（表１のＥ００６〜Ｅ０１５）、膜貫通ドメイン（表１のＴ００１〜Ｔ０８２）、第１の細胞内ドメイン（表１のＳ０３６〜Ｓ０２１６）、および第２の細胞内ドメイン（表１のＳ０３６〜Ｓ０２１６）の融合物であってもよい。例えば、リンパ増殖性要素は、Ｅ００６、Ｔ００１、Ｓ０３６、およびＳ２１６の融合物であってもよく、これは、Ｅ００６−Ｔ００１−Ｓ０３６−Ｓ２１６としても記述される。例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、融合Ｅ０１０−Ｔ０７２−Ｓ１９２−Ｓ２１２、Ｅ００７−Ｔ０５４−Ｓ１９７−Ｓ２１２、Ｅ００６−Ｔ００６−Ｓ１９４−Ｓ２１１、Ｅ００９−Ｔ０７３−Ｓ０６２−Ｓ０５３、Ｅ００８−Ｔ００１−Ｓ１２１−Ｓ２１２、Ｅ００６−Ｔ０４４−Ｓ１８６−Ｓ０５３、またはＥ００６−Ｔ０１６−Ｓ１８６−Ｓ０５０であってもよい。
【０２４６】
例示的な実施形態では、ＬＥの細胞内ドメイン、または２つ以上の細胞内ドメインを有するＬＥの第１の細胞内ドメインは、ＩＴＡＭ含有細胞内ドメインからの機能的細胞内活性化ドメイン、例えば、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８、またはＺＡＰ７０、およびさらなる例示的な下位実施形態ではＣＤ３ｚからの細胞内ドメイン以外のものである。例示的な実施形態では、ＬＥの第２の細胞内ドメインは、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＯＸ−４０、ＢＴＬＡ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、およびＨＶＥＭの共刺激ドメイン以外のものである。例示的な実施形態では、ＬＥの細胞外ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含まない。さらなる例示的な実施形態では、結合パートナーに結合するとＬＥを活性化するＬＥの細胞外ドメインは、一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含まない。
【０２４７】
ＣＬＥは、ＡＳＴＲと、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８、またはＺＡＰ７０からの活性化ドメインの両方を含まない。理論に限定されないが、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインが増殖を促進するための効果的なコンフォメーション／方向／局在化にあることを保証し、ＬＥにおいてサポートの役割を果たすと考えられている。したがって、増殖を駆動するＬＥの能力は、ＬＥの細胞内ドメインによって提供されると考えられており、細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインは、細胞内ドメインと比較して二次的な役割を果たすと考えられている。リンパ増殖性要素は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞の増殖を促進することができるシグナル伝達ポリペプチドである細胞内ドメインを含み、このドメインは、膜会合モチーフ（膜貫通ドメイン等）を介して膜に会合し、活性なコンフォメーションで配向する、またはそのようなコンフォメーションに配向し得る。例示的な実施形態におけるＬＥのＡＳＴＲは、ｓｃＦｖを含まない。本明細書では、膜貫通ドメイン、ＧＰＩアンカー、ミリストイル化領域、パルミトイル化領域、および／またはプレニル化領域を含めること等によって、細胞内ドメインを膜と関連付けるための戦略が提供される。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、細胞外ドメインを含まない。
【０２４８】
ＬＥの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインは、それぞれのアミノ酸の長さが異なり得る。例えば、複製能力のないレトロウイルス粒子を含む実施形態では、レトロウイルス粒子にパッケージングできるポリヌクレオチドの長さに制限があるため、特定の例示的な実施形態では、より短いアミノ酸配列を有するＬＥが有利となり得る。いくつかの実施形態では、ＬＥの全長は、３〜４０００アミノ酸の間、例えば１０〜３０００、１０〜２０００、５０〜２０００、２５０〜２０００アミノ酸の間であってもよく、例示的な実施形態では、５０〜１０００、１００〜１０００または２５０〜１０００アミノ酸の間であってもよい。細胞外ドメインは、細胞外および膜貫通ドメインを形成するために存在する場合、１〜１０００アミノ酸の間であってもよく、典型的には４〜４００、４〜２００、４〜１００、４〜５０、４〜２５、または４〜２０アミノ酸の間である。一実施形態では、細胞外領域は、本発明のこの態様の細胞外および膜貫通ドメインのＧＧＧＳである。膜貫通ドメイン、または細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインの膜貫通領域は、１０〜２５０アミノ酸の間であってもよく、より典型的には少なくとも１５アミノ酸の長さであってもよく、例えば、１５〜１００、１５〜７５、１５〜５０、１５〜４０、または１５〜３０アミノ酸の間の長さであってもよい。細胞内シグナル伝達ドメインは、例えば、１０〜１０００、１０〜７５０、１０〜５００、１０〜２５０、または１０〜１００アミノ酸の間であってもよい。例示的な実施形態では、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも３０、または３０〜５００、３０〜２５０、３０〜１５０、３０〜１００、５０〜５００、５０〜２５０、５０〜１５０、または５０から１００アミノ酸の間であってもよい。いくつかの実施形態では、特定の遺伝子の細胞内シグナル伝達ドメインは、その細胞内シグナル伝達ドメインの配列、例えばその細胞内ドメインに関して本明細書で提供される配列からの少なくとも１０、２５、３０、４０、または５０アミノ酸から、細胞内ドメイン配列全体のサイズまでに対して、少なくとも９０％、９５％、９８％、９９％または１００％同一であり、例えば、追加の１、２、３、４、５、１０、２０または２５アミノ酸までを含んでもよく、ただし、そのような配列は依然として、本明細書に開示されるＬＥの特性のいずれかを提供することができる。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、これに限定されないが、その受容体につながれたサイトカイン等のキメラサイトカイン受容体であり、典型的には、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、および例示的な実施形態ではＳＴＡＴ５等の対応する活性化野生型サイトカイン受容体と同じＳＴＡＴ経路を構成的に活性化する。いくつかの実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、リンカーを介して、その同族受容体またはその断片につながれた、または共有結合したインターロイキンまたはその断片である。いくつかの実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、ＩＬ７Ｒα（ＩＬ７ＲＡとしても知られている）につながれたＩＬ７である。他の実施形態では、キメラサイトカイン受容体は、例えばＩＬ−７Ｒαの細胞外ドメインおよび／またはＩＬ−７Ｒαの膜貫通ドメイン等の、ＩＬ７ＲαのドメインにつながれたＩＬ−７である。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、サイトカインにつながれていないサイトカイン受容体であり、実際、例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、サイトカインにつながれていない構成的に活性なサイトカイン受容体である。これらのキメラＩＬ−７受容体は、典型的には、発現するとＳＴＡＴ５を構成的に活性化する。
【０２５０】
リンパ増殖性要素がサイトカインもしくはサイトカイン受容体ポリペプチド、またはシグナル伝達ドメインを含むその断片である、リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、リンカーを介して同族のインターロイキン受容体ポリペプチドの一部に共有結合したインターロイキンポリペプチドを含み得る。典型的には、同族のインターロイキン受容体のこの部分は、インターロイキンサイトカインおよび膜貫通ドメインに結合することができる細胞外ドメインの機能的部分を含む。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、同族のインターロイキン受容体の細胞内部分である。いくつかの実施形態では、細胞内ドメインは、リンパ球増殖を促進することができる異なるサイトカイン受容体の細胞内部分である。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、リンカーを介してその全長同族インターロイキン受容体ポリペプチドに共有結合したインターロイキンポリペプチドである。
【０２５１】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、タンパク質ＩＬ７ＲＡの一部に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＬ７ＲＡのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＬ７ＲＡポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。ＩＬ７ＲＡタンパク質は、セリン残基が豊富なＳ領域（全長ＩＬ７ＲＡの３５９〜３９４、配列番号２４８の残基９６〜１３３に対応）、３つのチロシン残基（全長ＩＬ７ＲＡの残基Ｙ４０１、Ｙ４４９、およびＹ４５６、配列番号２４８の残基Ｙ１３８、Ｙ１８、およびＹ１９３に対応）を有するＴ領域、ならびにシグナル伝達キナーゼＪａｋ１に結合し得るＢｏｘ１モチーフ（全長ＩＬ７ＲＡの残基２７２〜２８０、配列番号２４８および２４９の残基９〜１７に対応）を有する（Ｊｉａｎｇ，Ｑｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ．ａｎｄ  Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．２４（１４）：６５０１−１３（２００４））。いくつかの実施形態では、本明細書のリンパ増殖性要素は、本明細書に開示されるか、またはＴ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導することが知られているＩＬ７ＲＡのドメインおよびモチーフの１つ以上、例えば全てを含み得る。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２４８または２４９のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ７ＲＡに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜１５０ａａ、約１５０〜約１７５ａａ、または約１７５ａａ〜約２００ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＩＬ７ＲＡに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約２００ａａの長さを有する。ＩＬ７ＲＡに由来する第１の細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素の例示的な実施形態では、第２の細胞内ドメインは、ＴＮＦＲＳＦ８に由来し得る。
【０２５２】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、タンパク質ＩＬ１２ＲＢの一部に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＬ１２ＲＢのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＬ１２ＲＢポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＩＬ１２ＲＢは、少なくとも１つのＢｏｘ１モチーフＰＸＸＰ（配列番号３０６）を含み、各Ｘは、任意のアミノ酸（配列番号２５４および２５５の残基１０〜１２、および配列番号２５６の残基１０７〜１１０および１３９〜１４２）であってもよい（Ｐｒｅｓｋｙ  ＤＨ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９６  Ｎｏｖ  ２６；９３（２４））。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２ＲＢ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導することが知られているＩＬ１２ＲＢの上記のＢｏｘ１モチーフもしくは他のモチーフ、ドメイン、または突然変異のうちの１つ以上を含み得る。ＩＬ１２ＲＢのＢｏｘ１モチーフは当該技術分野で知られており、当業者はＩＬ１２ＲＢポリペプチドの対応するモチーフを特定することができる。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２５４〜２５６のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ１２ＲＢに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１００ａａ約１２５ａａ、約１２５ａａ〜１５０ａａ、約１５０〜約１７５ａａ、約１７５ａａ〜約２００ａａ、または約２００ａａ〜約２１９ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＩＬ１２ＲＢに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約２１９ａａ、例えば、３０ａａ〜９２ａａ、または３０ａａ〜９０ａａの長さを有する。
【０２５３】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、タンパク質ＩＬ３１ＲＡの一部に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＬ３１ＲＡのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＬ３１ＲＡポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＩＬ３１ＲＡは、Ｂｏｘ１モチーフＰＸＸＰ（配列番号３０６）を含み、各Ｘは、任意のアミノ酸（配列番号２７５および２７６の残基１２〜１５に対応）であってもよい（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２  Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；９１（６−７）：５５２−６６）。いくつかの実施形態では、ＩＬ３１ＲＡ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、Ｂｏｘ１モチーフを含み得る。全長ＩＬ３１ＲＡはまた、下流のシグナル伝達に重要な３つのリン酸化可能なチロシン残基、Ｙ６５２、Ｙ６８３、およびＹ７２１（配列番号２７５の残基Ｙ９６、Ｙ２３７、およびＹ１６５に対応；これらのチロシン残基は配列番号２７６に存在しない）を含む（Ｃｏｒｎｅｌｉｓｓｅｎ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１２  Ｊｕｎ−Ｊｕｌ；９１（６−７）：５５２−６６）。３つのチロシン残基は全てＳＴＡＴ１の活性化に寄与するが、Ｙ６５２はＳＴＡＴ５の活性化に必要であり、Ｙ７２１はＳＴＡＴ３を動員する。いくつかの実施形態では、ＩＬ３１ＲＡ細胞内ドメインを有するリンパ増殖性要素は、Ｂｏｘ１モチーフおよび／または本明細書に開示される既知のリン酸化部位を含む。ＩＬ３１ＲＡのＢｏｘ１モチーフおよびリン酸化可能なチロシンは当該技術分野で知られており、当業者は、同様のＩＬ３１ＲＡポリペプチド中の対応するモチーフおよびリン酸化可能なチロシンを特定することができるであろう。他の実施形態では、ＩＬ３１ＲＡ細胞内ドメインを有するリンパ増殖性要素は、本明細書に開示される既知のリン酸化部位を含まない。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２７５または２７６のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ３１ＲＡに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜１５０ａａ、約１５０〜約１７５ａａ、または約１７５ａａ〜約１８９ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＩＬ３１ＲＡに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約２００ａａ、例えば３０ａａ〜１８９ａａ、３０ａａ〜１０６ａａの長さを有する。
【０２５４】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ４０の細胞内部分に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＣＤ４０のドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＣＤ４０ポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。ＣＤ４０タンパク質は、ＴＲＡＦタンパク質のいくつかの結合部位を含む。理論に限定されないが、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、およびＴＲＡＦ３の結合部位は、ＣＤ４０の細胞内部分の膜遠位ドメインに位置し、アミノ酸配列ＰＸＱＸＴ（配列番号３０３）を含み、各Ｘは、任意のアミノ酸（配列番号２０８のアミノ酸３５〜３９に対応）であってもよい（Ｅｌｇｕｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００９  Ｍａｙ；２２９（１）：１５２−７２）。ＴＲＡＦ２は、コンセンサス配列ＳＸＸＥ（配列番号３０４）に結合することも示されており、各Ｘは、任意のアミノ酸（配列番号２０８のアミノ酸５７〜６０に対応）であってもよい（Ｅｌｇｕｅｔａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．２００９  Ｍａｙ；２２９（１）：１５２−７２）。ＴＲＡＦ６の別個の結合部位は、ＣＤ４０の細胞内部分の膜近位ドメインに位置し、コンセンサス配列ＱＸＰＸＥＸ（配列番号３０５）を含み、各Ｘは、任意のアミノ酸（配列番号２０８のアミノ酸１６〜２１に対応）であってもよい（Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００３  Ｎｏｖ  １４；２７８（４６）：４５４１４−８）。例示的な実施形態では、膜貫通タンパク質ＣＤ４０の細胞内部分は、ＴＲＡＦタンパク質の全ての結合部位を含み得る。ＴＲＡＦ結合部位は当該技術分野で知られており、当業者は、同様のＣＤ４０ポリペプチド中の対応するＴＲＡＦ結合部位を特定することができるであろう。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２０８または配列番号２０９のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ４０に由来する細胞内ドメインは、約３０アミノ酸（ａａ）〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、または約６０ａａ〜約６５ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＣＤ４０に由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約６６ａａ、例えば、３０ａａ〜６５ａａ、または５０ａａ〜６６ａａの長さを有する。ＣＤ４０に由来する第１の細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素の例示的な実施形態では、第２の細胞内ドメインは、ＭｙＤ８８、ＣＤ２８ファミリーメンバー（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）、パターン認識受容体、Ｃ反応性タンパク質受容体（すなわち、Ｎｏｄｉ、Ｎｏｄ２、ＰｔＸ３−Ｒ）、ＴＮＦ受容体、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、４��１ＢＢ）、ＨＳＰ受容体（Ｌｏｘ−１およびＣＤ９１）、またはＣＤ２８に由来する細胞内ドメイン以外であってもよい。パターン認識受容体は、これらに限定されないが、エンドサイトーシスのパターン認識受容体（すなわち、マンノース受容体、スカベンジャー受容体（すなわち、Ｍａｃ−１、ＬＲＰ、ペプチドグリカン、テコイン酸、毒素、ＣＤ１  １  ｃ／ＣＲ４））、外部シグナルパターン認識受容体（Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ１、ＴＬＲ２、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、ＴＬＲ５、ＴＬＲ６、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８、ＴＬＲ９、ＴＬＲ１０）、ペプチドグリカン認識タンパク質（ＰＧＲＰは細菌ペプチドグリカンおよびＣＤ１４に結合する）；内部シグナルパターン認識受容体（すなわち、ＮＯＤ受容体１および２）、ならびにＲＩＧ１を含む。
【０２５５】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＤ２７の細胞内部分に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＣＤ２７のドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＣＤ２７ポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＣＤ２７のアミノ酸２１９のセリン（配列番号２０５のアミノ酸６のセリンに対応する）はリン酸化されていることが示されている。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２０５のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２７に由来する細胞内ドメインは、約３０アミノ酸（ａａ）〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、または約４５ａａ〜約５０ａａの長さを有する。
【０２５６】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、ＣＳＦ２ＲＢの細胞内部分に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＣＳＦ２ＲＢのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＣＳＦ２ＲＢポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＣＳＦ２ＲＢは、アミノ酸４７４〜４８２（配列番号２１３のアミノ酸１４〜２２に対応する）にＢｏｘ１モチーフを含む。全長ＣＳＦ２ＲＢのアミノ酸７６６のチロシン（配列番号２１３のアミノ酸３０６のチロシンに対応する）は、リン酸化されていることが示されている。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２１３のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ２ＲＢに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜１５０ａａ、約１５０〜約１７５ａａ、約１７５ａａ〜約２００ａａ、約２００ａａ〜約２５０ａａ、約２５０ａａ〜３００ａａ、約３００ａａ〜３５０ａａ、約３５０ａａ〜約４００ａａ、または約４００ａａ〜約４５０ａａの長さを有する。
【０２５７】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、ＩＬ２ＲＢの細胞内部分に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＬ２ＲＢのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＬ２ＲＢポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＩＬ２ＲＢは、アミノ酸２７８〜２８６（配列番号２４０のアミノ酸１３〜２１に対応する）にＢｏｘ１モチーフを含む。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２４０のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ２ＲＢに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜１５０ａａ、約１５０〜約１７５ａａ、約１７５ａａ〜約２００ａａ、約２００ａａ〜約２５０ａａ、または約２５０ａａ〜３００ａａの長さを有する。
【０２５８】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、ＩＬ６ＳＴの細胞内部分に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＬ６ＳＴのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＬ６ＳＴポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＩＬ６ＳＴは、アミノ酸６５１〜６５９（配列番号２４７のアミノ酸１０〜１８に対応する）にＢｏｘ１モチーフを含む。全長ＩＬ６ＳＴのアミノ酸６６１、６６７、７８２、７８９、８２９、および８３９のセリン（それぞれ、配列番号２４７のアミノ酸２０、２６、１４１、１４８、１８８、および１９８のセリンに対応する）は、リン酸化されていることが示されている。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２４６または配列番号２４７のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ６ＳＴに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜１５０ａａ、約１５０〜約１７５ａａ、約１７５ａａ〜約２００ａａ、約２００ａａ〜約２５０ａａ、または約２５０ａａ〜３００ａａの長さを有する。
【０２５９】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、ＩＬ１７ＲＥの細胞内部分に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＬ１７ＲＥのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＬ１７ＲＥポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＩＬ１７ＲＥは、アミノ酸３７２〜４９５（配列番号２６５のアミノ酸１３〜１３６に対応する）にＴＩＲドメインを含む。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２６５のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ１７ＲＥに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜１５０ａａ、約１５０〜約１７５ａａ、または約１７５ａａ〜約２００ａａの長さを有する。
【０２６０】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、ＩＬ２ＲＧの細胞内部分に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＬ２ＲＧのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＬ２ＲＧポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＩＬ２ＲＧは、アミノ酸２８６〜２９４（配列番号２４１のアミノ酸３〜１１に対応する）にＢｏｘ１モチーフを含む。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２４１のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ２ＲＧに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、または約７０ａａ〜約１００ａａの長さを有する。
【０２６１】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、ＩＬ１８Ｒ１の細胞内部分に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＬ１８Ｒ１のドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＬ１８Ｒ１ポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＩＬ１８Ｒ１は、アミノ酸２２２−３６４（配列番号２６６のアミノ酸２８〜１７０に対応する）にＴＩＲドメインを含む。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２６６のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ１８Ｒ１に由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、または約７０ａａ〜約１００ａａの長さを有する。
【０２６２】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、ＩＬ２７ＲＡの細胞内部分に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＬ２７ＲＡのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＬ２７ＲＡポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＩＬ２７ＲＡは、アミノ酸５５４〜５６２（配列番号２７３のアミノ酸１７〜２５に対応する）にＢｏｘ１モチーフを含む。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２７３または配列番号２７４のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＬ２７ＲＡに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、または約７０ａａ〜約１００ａａの長さを有する。
【０２６３】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、ＩＦＮＧＲ２の細胞内部分に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＦＮＧＲ２のドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＦＮＧＲ２ポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＩＦＮＧＲ２は、アミノ酸２７６〜２７７（配列番号２３０のアミノ酸８〜９に対応する）にジロイシン内在化モチーフを含む。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２３０のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＦＮＧＲ２に由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、または約６５ａａ〜約７０ａａの長さを有する。
【０２６４】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、タンパク質ＭｙＤ８８の一部に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＭｙＤ８８のドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＭｙＤ８８ポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。ＭｙＤ８８タンパク質は、他のデスドメイン含有タンパク質との相互作用を媒介するＮ末端デスドメイン（配列番号２８４のアミノ酸２９〜１０６に対応）、ＩＬ−１Ｒ関連キナーゼと相互作用する中間ドメイン（配列番号２８４のアミノ酸１０７〜１５６に対応する）、およびＴＬＲ−ＴＩＲドメインと関連するＣ末端ＴＩＲドメイン（配列番号２８４のアミノ酸１６０〜３０４に対応する）を有する（Ｂｉｏｌ  Ｒｅｓ．２００７；４０（２）：９７−１１２）。ＭｙＤ８８はまた、標準的な核局在化およびエクスポートモチーフを有する。点突然変異はＭｙＤ８８で特定されており、機能喪失型突然変異Ｌ９３ＰおよびＲ１９３Ｃ（配列番号２８４のＬ９３ＰおよびＲ１９６Ｃに対応）、および機能獲得型突然変異Ｌ２６５Ｐ（配列番号２８４のＬ２６０Ｐに対応）を含む（Ｄｅｇｕｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂａｒｔｏｎ．Ｆ１０００Ｐｒｉｍｅ  Ｒｅｐ．２０１４  Ｎｏｖ  ４；６：９７）。いくつかの実施形態では、本明細書のリンパ増殖性要素は、１つ以上、例えば、本明細書に開示されるＭｙＤ８８のドメインおよびモチーフの全てを含み得る。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２８４〜２９３のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得、例示的な実施形態では、以下のＭｙＤ８８ドメイン／モチーフの１つ以上、例示的な実施形態では全てを含む：デスドメイン、中間ドメイン、ＴＩＲドメイン、核局在化およびエクスポートモチーフ、ならびにＬ９３位、Ｒ１９３位、およびＬ２６５位またはＰ２６５位に対応するアミノ酸。いくつかの実施形態では、ＭｙＤ８８に由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜１５０ａａ、約１５０〜約１７５ａａ、約１７５ａａ〜約２００ａａ、約２００ａａ〜約２５０ａａ、約２５０ａａ〜３００ａａ、または約３００ａａ〜３５０ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＭｙＤ８８に由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５０ａａ、例えば５０ａａ〜３５０ａａ、または１００ａａ〜３５０ａａ、１００ａａ〜３０４ａａ、１００ａａ〜２９６ａａ、１００ａａ〜２５１ａａ、１００ａａ〜１９１ａａ、１００ａａ〜１７２ａａ、１００ａａ〜１４６ａａ、または１００ａａ〜１２７ａａの長さを有する。ＭｙＤ８８に由来する第１の細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素の例示的な実施形態では、第２の細胞内ドメインは、ＴＮＦＲＳＦ４またはＴＮＦＲＳＦ８に由来し得る。ＭｙＤ８８に由来する第１の細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素の他の例示的な実施形態では、第２の細胞内ドメインは、ＣＤ２８ファミリーメンバー（例えば、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ）、パターン認識受容体、Ｃ反応性タンパク質受容体（すなわち、Ｎｏｄｉ、Ｎｏｄ２、ＰｔＸ３−Ｒ）、ＴＮＦ受容体（すなわち、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、４−１ＢＢ）、ＨＳＰ受容体（Ｌｏｘ−１およびＣＤ９１）、またはＣＤ２８に由来する細胞内ドメイン以外であってもよい。
【０２６５】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、膜貫通タンパク質ＭＰＬの一部に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＭＰＬのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＭＰＬポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。膜貫通型ＭＰＬタンパク質は、Ｂｏｘ１モチーフＰＸＸＰ（配列番号３０６）（各Ｘは任意のアミノ酸（配列番号２８３のアミノ酸１７〜２０に対応）であってもよい）ならびにＢｏｘ２モチーフ（セリンおよびグルタミン酸含有量が増加した領域）（配列番号２８３のアミノ酸４６〜６４に対応）を含む（Ｄｒａｃｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９７  Ｍａｒ  １８；９４（６）：２３５０−５）。Ｂｏｘ１およびＢｏｘ２モチーフは、ＪＡＫへの結合およびシグナル伝達に関与するが、Ｂｏｘ２モチーフの存在は、増殖シグナルに必ずしも必要とされない（Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９１  Ｄｅｃ  １５；８８（２４）：１１３４９−５３、Ｆｕｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９１  Ｏｃｔ；１０（１０）：２８５５−６５、およびＯ’Ｎｅａｌ  ａｎｄ  Ｌｅｅ．Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１９９３  Ｏｃｔ；１２（５）：３０９−１２）。多くのサイトカイン受容体は、Ｂｏｘ１モチーフに対して１位、２位、および６位に疎水性残基を有し（それぞれ配列番号２８３のアミノ酸１６、１５、および１１に対応）、これらは、サイトカイン誘導性ＪＡＫ２活性化に必要であるがＪＡＫ２結合には必要ではない「スイッチモチーフ」を形成する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００１  Ｆｅｂ；７（２）：３７７−８５；ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００１  Ｄｅｃ；８（６）：１３２７−３８）。配列番号２８３のアミノ酸７０〜９５を含む領域の欠失は、ｖ−ｍｐｌと関連してウイルス形質転換をサポートすることが示されており（Ｂｅｎｉｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９４  Ａｕｇ；６８（８）：５２７０−４）、したがってこれに関連したｍｐｌの機能にこの領域が必要ないことを示している。Ｍｏｒｅｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  １９９５  Ｊｕｌｙ；８６（８）：５５７−７１は、同じ欠失を使用して、この領域がヘマトポエチン受容体応答性ＣＡＴレポーター遺伝子構築物の転写を刺激するために必要ではないことを示し、さらに、ＤｒａｃｈｍａｎおよびＫａｕｓｈａｎｓｋｙにより示唆されたように、この欠失がこの領域における非必須の否定的な要素の除去に期待されるわずかに増強された転写をもたらすことを見出した。したがって、いくつかの実施形態では、ＭＰＬ細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号２８３のアミノ酸７０〜９５を含む領域を含まない。全長ＭＰＬでは、リジンＫ５５３（配列番号２８３のＫ４０に対応）およびＫ５７３（配列番号２８３のＫ６０に対応）は、ユビキチン化標的化モチーフの一部として機能する負の調節部位であることが示されている（Ｓａｕｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ  ２０１０  Ｆｅｂ  １１；１１５（６）：１２５４−６３）。したがって、本明細書のいくつかの実施形態では、ＭＰＬ細胞内シグナル伝達ドメインは、これらのユビキチン化標的化モチーフ残基を含まない。全長ＭＰＬにおいて、チロシンＹ５２１（配列番号２８３のＹ８に対応）、Ｙ５４２（配列番号２８３のＹ２９に対応）、Ｙ５９１（配列番号２８３のＹ７８に対応）、Ｙ６２６（配列番号２８３のＹ１１３に対応）、およびＹ６３１（配列番号２８３のＹ１１８に対応）がリン酸化されることが示されている（Ｖａｒｇｈｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｒｏｎｔ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ（Ｌａｕｓａｎｎｅ）．２０１７  Ｍａｒ  ３１；８：５９）。全長ＭＰＬのＹ５２１およびＹ５９１は、リソソーム標的化モチーフ（Ｙ５２１）の一部として、またはアダプタータンパク質ＡＰ２（Ｙ５９１）との相互作用を介してのいずれかで機能する負の調節部位である（Ｄｒａｃｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９７  Ｍａｒ  １８；９４（６）：２３５０−５、およびＨｉｔｃｈｃｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２００８  Ｓｅｐ  １５；１１２（６）：２２２２−３１）。全長ＭＰＬのＹ６２６およびＹ６３１は、正の調節部位であり（Ｄｒａｃｈｍａｎ  ａｎｄ  Ｋａｕｓｈａｎｓｋｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９７  Ｍａｒ  １８；９４（６）：２３５０−５）、Ｙ６２６のマウスホモログは、細胞分化およびＳｈｃのリン酸化に必要とされ（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９６  Ｄｅｃ  ２；１５（２３）：６５３１−４０）、Ｙ６２６もまた、以下に説明されるＷ５１５Ａ変異を有するＭＰＬの構成的シグナル伝達に必要とされる（Ｐｅｃｑｕｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１０  Ｆｅｂ  ４；１１５（５）：１０３７−４８）。ＭＰＬはＳｈｃホスホチロシン結合結合モチーフＮＸＸＹ（配列番号３０７）を含み、各Ｘは任意のアミノ酸（配列番号２８３のアミノ酸１１０−１１３に対応）であってもよく、このチロシンはリン酸化されており、Ｓｈｃ、ＳＨＩＰ、およびＳＴＡＴ３のＴＰＯ依存性リン酸化に重要である（Ｌａｍｉｎｅｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９６  Ｊａｎ  ５；２７１（１）：２６４−９；およびｖａｎ  ｄｅｒ  Ｇｅｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９６  Ｆｅｂ  ６；９３（３）：９６３−８）。ＭＰＬはまた、ＳＴＡＴ３コンセンサス結合配列ＹＸＸＱ（配列番号３０８）を含み、各Ｘは、任意のアミノ酸（配列番号２８３のアミノ酸１１８〜１２１に対応）であってもよい（Ｓｔａｈｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９５  Ｍａｒ  ３；２６７（５２０２）：１３４９−５３）。この配列のチロシンはリン酸化され得、ＭＰＬは部分的なＳＴＡＴ３動員が可能である（ＤｒａｃｈｍａｎおよびＫａｕｓｈａｎｓｋｙ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９７  Ｍａｒ  １８；９４（６）：２３５０−５）。ＭＰＬはまた、配列ＹＬＰＬ（配列番号３０９）（配列番号２８３のアミノ酸１１３〜���１６に対応する）を含み、これは、ＳＴＡＴ５動員ｐＹＬＸＬ（配列番号３１０）のコンセンサス結合部位に類似しており、ｐＹはホスホチロシンであり、Ｘは任意のアミノ酸であってもよい（Ｍａｙ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．１９９６  Ｓｅｐ  ３０；３９４（２）：２２１−６）。Ｌｅｅらは、コンピュータシミュレーションを使用して、ＭＰＬの膜貫通ドメインに臨床的に関連する突然変異が次の順序でＭＰＬを活性化するはずであることを発見した：Ｗ５１５Ｋ（配列番号２８３のアミノ酸置換Ｗ２Ｋに対応）＞Ｓ５０５Ａ（配列番号１８７のアミノ酸置換Ｓ１４Ａに対応）＞Ｗ５１５Ｉ（配列番号２８３のアミノ酸置換Ｗ２Ｉに対応）＞Ｓ５０５Ｎ（配列番号１８７のアミノ酸置換Ｓ１４Ｎに対応、これは部分Ｔ０７５（配列番号１８８）として実施例１２において試験された）（ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１１；６（８）：ｅ２３３９６）。シミュレーションは、これらの突然変異がＭＰＬのキナーゼパートナーであるＪＡＫ２の構成的活性化を引き起こし得ることを予測した。いくつかの実施形態では、ＭＰＬの細胞内部分は、配列番号２８３に存在する、本明細書に記載の１つ以上、または全てのドメインおよびモチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＰＬの膜貫通部分は、配列番号１８７に存在する、本明細書に記載の１つ以上、または全てのドメインおよびモチーフを含み得る。本明細書で提供されるＭＰＬのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、例示的な実施形態における本明細書のＭＰＬ細胞内シグナル伝達ドメインが、増殖活性を促進することが示され、ＭＰＬ増殖活性を阻害することが示されているものは含まない１つ以上の対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を含むことを認識するであろう。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２８３のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＭＰＬに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜１５０ａａ、約１５０〜約１７５ａａ、約１７５ａａ〜約２００ａａ、約２００ａａ〜約２５０ａａ、約２５０ａａ〜３００ａａ、約３００ａａ〜３５０ａａ、約３５０ａａ〜約４００ａａ、約４００ａａ〜約４５０ａａ、約４５０ａａ〜約５００ａａ、約５００ａａ〜約５５０ａａ、約５５０ａａ〜約６００ａａ、または約６００ａａ〜約６３５ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＭＰＬに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約２００ａａ、例えば３０ａａ〜１５０ａａ、３０ａａ〜１１９ａａ、３０ａａ〜１２１ａａ、３０ａａ〜１２２ａａ、または５０ａａ〜１２５ａａの長さを有する。ＭＰＬに由来する第１の細胞内ドメインを含むリ���パ増殖性要素の例示的な実施形態では、第２の細胞内ドメインはＣＤ７９Ｂに由来し得る。
【０２６６】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、Ｂ２９；ＩＧＢ；ＡＧＭ６としても知られる膜貫通タンパク質ＣＤ７９Ｂの一部に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＣＤ７９Ｂのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＣＤ７９Ｂポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。ＣＤ７９Ｂは、残基１９３〜２１２（配列番号２１１のアミノ酸１６〜３０に対応）にＩＴＡＭモチーフを含む。ＣＤ７９Ｂは、リン酸化されることが知られている２つのチロシン、Ｙ１９６およびＹ２０７（配列番号２１１のＹ１６およびＹ２７に対応）を有する。いくつかの実施形態では、膜貫通タンパク質ＣＤ７９Ｂの細胞内部分は、ＩＴＡＭモチーフおよび／または本明細書に開示される既知のリン酸化部位を含む。ＣＤ７９Ｂのモチーフおよびリン酸化可能なチロシンは当該技術分野で知られており、当業者は、類似のＣＤ７９Ｂポリペプチド中の対応するモチーフおよびリン酸化可能なチロシンを特定することができるであろう。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２１１のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ７９Ｂに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、または約４５ａａ〜約５０ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＣＤ７９Ｂに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約５０ａａの長さを有する。例えば、適切なＣＤ７９Ｂ細胞内活性化ドメインは、次の配列のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る：ＬＤＫＤＤＳＫＡＧＭＥＥＤＨＴ［ＹＥＧＬＤＩＤＱＴＡＴＹＥＤＩ］ＶＴＬＲＴＧＥＶＫＷＳＶＧＥＨＰＧＱＥ（配列番号２１１）（ＩＴＡＭモチーフは括弧内に示されている）。ＣＤ７９Ｂに由来する第２の細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素の例示的な実施形態では、第１の細胞内ドメインはＣＳＦ３Ｒに由来し得る。
【０２６７】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、膜貫通タンパク質ＯＳＭＲの一部に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＯＳＭＲのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＯＳＭＲポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。ＯＳＭＲは、アイソフォーム３のアミノ酸７７１〜７７９（配列番号２９４のアミノ酸１６〜３０に対応）にＢｏｘ１モチーフを含む。ＯＳＭＲは、リン酸化されることが知られているアイソフォーム３のアミノ酸８２９および８９０に２つのセリン（配列番号２９４のアミノ酸６５および１２８のセリン）を有する。いくつかの実施形態では、タンパク質ＯＳＭＲの細胞内部分は、Ｂｏｘ１モチーフおよび本明細書に開示される既知のリン酸化部位を含むことができる。ＯＳＭＲのモチーフおよびリン酸化可能なセリンは当該技術分野で知られており、当業者は、類似のＯＳＭＲポリペプチド中の対応するモチーフおよびリン酸化可能なセリンを特定することができるであろう。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２９４のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＯＳＭＲに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜１５０ａａ、約１５０〜約１７５ａａ、約１７５ａａ〜約２００ａａ、または約２００ａａ〜約２５０ａａの長さを有する。
【０２６８】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、膜貫通タンパク質ＰＲＬＲの一部に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＰＲＬＲのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＰＲＬＲポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。ＰＲＬＲは、アイソフォーム６のアミノ酸１８５〜２６１（配列番号２９５のアミノ酸２８〜１０４に対応）に成長ホルモン受容体結合ドメインを含む。ＰＲＬＲの成長ホルモン受容体結合ドメインは当該技術分野で知られており、当業者は、同様のＰＲＬＲポリペプチド中の対応するドメインを特定することができるであろう。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２９５のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＰＲＬＲに由来する細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜１５０ａａ、約１５０〜約１７５ａａ、約１７５ａａ〜約２００ａａ、約２００ａａ〜約２５０ａａ、約２５０ａａ〜３００ａａ、約３００ａａ〜３５０ａａ、または約３５０ａａ〜約４００ａａの長さを有する。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素の細胞内ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８、Ｄ１Ｓ１６６Ｅ、およびＫｉ−１としても知られている）の細胞内部分に由来する。
【０２７０】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、タンパク質ＣＤ２８の一部に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＣＤ２８のドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＣＤ２８ポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＣＤ２８は、配列番号２０６および２０７の残基１２〜１５に対応するＰＩ３−ＫおよびＧｒｂ２結合モチーフを含む（Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００３  Ｊａｎ  ２０；１９７（２）：２５７−６２）。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ＰＩ３−ＫおよびＧｒｂ２結合モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２０６または２０７のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８に由来する細胞内ドメインは、約５ａａ〜約１０ａａ、約１０ａａ〜約１５ａａ、約１５ａａ〜約２０ａａ、約２０ａａ〜約２５ａａ、約２５ａａ〜約３０ａａ、約３０ａａ〜約３５ａａ、または約３５ａａ〜約４２ａａの長さを有する。
【０２７１】
リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法および組成物のいずれかの例示的な実施形態では、細胞内ドメインは、タンパク質ＩＣＯＳの一部に由来し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＣＯＳのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＣＯＳポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。ＣＤ２８とは異なり、ＩＣＯＳは、Ｇｒｂ２ではなくＰＩ３−Ｋに結合する。全長ＩＣＯＳのＰＩ３−Ｋ結合モチーフは、配列番号２２５の残基１９〜２２に対応する。このモチーフの単一のアミノ酸置換は、ＩＣＯＳによるＧｒｂ２結合およびＩＬ−２産生の増加をもたらし得る（Ｈａｒａｄａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ．２００３  Ｊａｎ  ２０；１９７（２）：２５７−６２）。この突然変異は、配列番号２２５のフェニルアラニン２１をアスパラギンに突然変異させることに対応する。当業者は、配列番号２２５のこの残基を突然変異させ、ＰＩ３−Ｋに加えてＧｒｂ２に結合するＩＣＯＳ細胞内ドメインを生成する方法を理解するであろう。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ＰＩ３−Ｋ結合モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、Ｇｒｂ２にさらに結合するように突然変異されたＰＩ３−Ｋ結合モチーフを含むことができる。ＩＣＯＳはまた、ＩＣＯＳ支援カルシウムシグナル伝達に不可欠な細胞質尾部の膜近位モチーフを含む（Ｌｅｃｏｎｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６  Ｎｏｖ；７９：３８−４６）。このカルシウムシグナル伝達モチーフは、配列番号２２５の残基５〜８に対応する。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、カルシウムシグナル伝達モチーフを含み得る。他の２つの保存されたモチーフが、全長ＩＣＯＳで特定されている。残基１７０〜１７９（配列番号２２５の残基９〜１８に対応）の第１の保存モチーフおよび残基１８５〜１９１（配列番号２２５の残基２４〜３０に対応）の第２の保存モチーフである（Ｐｅｄｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６  Ｊｕｌ；１７（７）：８２５−３３）。これらの２つの保存されたモチーフは、下流のＩＣＯＳシグナル伝達を媒介する重要な機能を有し得る。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、第１または第２の保存モチーフのうちの少なくとも１つを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、第１の保存モチーフを含まないか、第２の保存モチーフを含まないか、または第１および第２の保存モチーフを含まない。いくつかの実施形態では、適切な細胞内ドメインは、配列番号２２５のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＩＣＯＳに由来する細胞内ドメインは��約５ａａ〜約１０ａａ、約１０ａａ〜約１５ａａ、約１５ａａ〜約２０ａａ、約２０ａａ〜約２５ａａ、約２５ａａ〜約３０ａａ、約３０ａａ〜約３５ａａ、または約３５ａａ〜約３８ａａの長さを有する。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、キメラリンパ増殖性要素の細胞内ドメインは、膜貫通タンパク質ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４、ＲＰ５−９０２Ｐ８．３、ＡＣＴ３５、ＣＤ１３４、ＯＸ−４０、ＴＸＧＰ１Ｌとしても知られている）の細胞内部分に由来する。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＯＸ４０のドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＯＸ４０ポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。ＯＸ４０は、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、およびＴＲＡＦ５の結合に重要な全長ＯＸ４０の残基２５６〜２６３（配列番号２９６の残基２０〜２７に対応）にＴＲＡＦ結合モチーフを含む（Ｋａｗａｍａｔａ，Ｓ，ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９８  Ｍａｒ  ６；２７３（１０）：５８０８−１４；Ｈｏｒｉ，Ｔ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｈｅｍａｔｏｌ．２００６  Ｊａｎ；８３（１）：１７−２２）。全長ＯＸ４０はまた、残基３４〜５７にｐ８５ＰＩ３Ｋ結合モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０がリンパ増殖性要素の細胞内ドメインとして存在する場合、それは、ＯＸ４０のｐ８５  ＰＩ３Ｋ結合モチーフを含む。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０の細胞内ドメインは、ＯＸ４０のＴＲＡＦ結合モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０の細胞内ドメインは、ＴＲＡＦ１、ＴＲＡＦ２、ＴＲＡＦ３、およびＴＲＡＦ５に結合し得る。配列番号２９６のアミノ酸１７および４１に対応するリジンは、ユビキチン標的化モチーフの一部として機能する潜在的に負の調節部位である。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０の細胞内ドメインにおけるこれらのリジンの一方または両方は、突然変異したアルギニンまたは別のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素の適切な細胞内ドメインは、配列番号５７のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、ＯＸ４０の細胞内ドメインは、約２０ａａ〜約２５ａａ、約２５ａａ〜約３０ａａ、３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、または約４５ａａ〜約５０ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＯＸ４０の細胞内ドメインは、約２０ａａ〜約５０ａａ、例えば２０ａａ〜４５ａａ、または２０ａａ〜４２ａａの長さを有する。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、キメラリンパ増殖性要素の細胞内ドメインは、膜貫通タンパク質ＩＦＮＡＲ２の細胞内部分に由来する。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＩＦＮＡＲ２のドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＩＦＮＡＲ２ポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＩＦＮＡＲ２は、Ｂｏｘ１モチーフならびに２つのＢｏｘ２モチーフ（Ｂｏｘ２ＡおよびＢｏｘ２Ｂとして知られている）を含む。（Ｕｓａｃｈｅｖａ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２  Ｄｅｃ  １３；２７７（５０）：４８２２０−６）。いくつかの実施形態では、ＩＦＮＡＲ２細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ボックス１またはボックス２モチーフの１つ以上を含み得る。例示的な実施形態では、ＩＦＮＡＲ２細胞内ドメインは、ボックス１、ボックス２Ａ、またはボックス２Ｂモチーフの１つ以上を含み得る。ＩＦＮＡＲ２は、ＪＡＫ１結合部位を含む（Ｇａｕｚｚｉ  ＭＣ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ．１９９７  Ｏｃｔ  ２８；９４（２２）：１１８３９−４４；Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００７  Ｊｕｌ  １３；２８２（２８）：２００５９−６３）。いくつかの実施形態では、ＩＦＮＡＲ２細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ＪＡＫ１結合部位を含み得る。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素の適切な細胞内ドメインは、配列番号２２７または２２８のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、ＩＦＮＡＲ２の細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜約１５０ａａ、約１５０ａａ〜約１７５ａａ、約１７５ａａ〜約２００ａａ、または約２００ａａ〜約２５１ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＯＸ４０の細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約２５１ａａ、例えば３０ａａ〜６７ａａの長さを有する。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、キメラリンパ増殖性要素の細胞内ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＳＦ３Ｒの細胞内部分に由来する。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＣＳＦ３Ｒのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＣＳＦ３Ｒポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＣＳＦ３Ｒは、Ｂｏｘ１およびＢｏｘ２モチーフ、ならびにＢｏｘ３モチーフを含む（Ｎｇｕｙｅｎ−Ｊａｃｋｓｏｎ  ＨＴ  ｅｔ  ａｌ．Ｇ−ＣＳＦ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｔｗｅｎｔｙ  Ｙｅａｒｓ  ｏｆ  Ｇ−ＣＳＦ，（２０１１）８３−１０５）。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ３Ｒ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ボックス１、ボックス２、またはボックス３モチーフの１つ以上を含み得る。ＣＳＦ３Ｒは、全長ＣＳＦ３Ｒに４つのチロシン残基Ｙ７０４、Ｙ７２９、Ｙ７４４、およびＹ７６４を含み、これらは、ＳＴＡＴ３（Ｙ７０４およびＹ７４４）、ＳＯＣＳ３（Ｙ７２９）、ならびにＧｒｂ２およびｐ２１Ｒａｓ（Ｙ７６４）の結合に重要である。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ３Ｒ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、全長ＣＳＦ３ＲのＹ７０４、Ｙ７２９、Ｙ７４４、およびＹ７６４に対応するチロシン残基の１つ、２つ、３つ、または全てを含み得る。ＣＳＦ３Ｒは、全長ＣＳＦ３Ｒに２つのスレオニン残基Ｔ６１５およびＴ６１８を含み、それぞれアラニンおよびイソロイシン（Ｔ６１５ＡおよびＴ６１８Ｉ）に突然変異すると受容体の二量体化および活性を増加させ得る（Ｍａｘｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２０１４  Ｆｅｂ  ２８；２８９（９）：５８２０−７）。いくつかの実施形態では、ＣＳＦ３Ｒ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、Ｔ６１５ＡおよびＴ６１８Ｉに対応する突然変異の１つ以上を含み得る。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素の適切な細胞内ドメインは、配列番号２１６、２１７、または２１８のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＳＦ３Ｒの細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜約１５０ａａ、約１５０ａａ〜約１７５ａａ、約１７５ａａ〜約２００ａａ、または約２００ａａ〜約２１３ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＣＳＦ３Ｒの細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約２１３ａａ、例えば約３０ａａ〜約１８６または約３０ａａ〜約１３３ａａの長さを有する。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、キメラリンパ増殖性要素の細胞内ドメインは、膜貫通タンパク質ＥＰＯＲの細胞内部分に由来する。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＥＰＯＲのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＥＰＯＲポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。ＥＰＯＲは、Ｂｏｘ１（全長ＥＰＯＲの残基２５７〜２６４）およびＢｏｘ２（全長ＥＰＯＲの残基３０３〜３１３）モチーフを含む（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ  ＳＮ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．１９９９  Ｄｅｃ；１０（１）：１８−２３）。ＥＰＯＲはまた、チロシンキナーゼ受容体ＫＩＴの結合に重要な拡張Ｂｏｘ２モチーフ（残基３２９〜３７２）を含む（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ  ＳＮ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．１９９９  Ｄｅｃ；１０（１）：１８−２３）。いくつかの実施形態では、ＥＰＯＲ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、Ｂｏｘ１、Ｂｏｘ２、または拡張Ｂｏｘ２モチーフの１つ以上を含み得る。ＥＰＯＲはまた、ＥＰＯＲの内在化に重要な短いセグメントを含む（全長ＥＰＯＲの残基２６７〜２７６）。いくつかの実施形態では、ＥＰＯＲ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、内在化セグメントを含まない。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素の適切な細胞内ドメインは、配列番号２１９または２２０のアミノ酸の一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対する少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、ＥＰＯＲの細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、約４０ａａ〜約４５ａａ、約４５ａａ〜約５０ａａ、約５０ａａ〜約５５ａａ、約５５ａａ〜約６０ａａ、約６０ａａ〜約６５ａａ、約６５ａａ〜約７０ａａ、約７０ａａ〜約１００ａａ、約１００ａａ〜約１２５ａａ、約１２５ａａ〜約１５０ａａ、約１５０ａａ〜約１７５ａａ、約１７５ａａ〜約２００ａａ、または約２００ａａ〜約２３５ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＥＰＯＲの細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約２３５ａａの長さを有する。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、キメラリンパ増殖性要素の細胞内ドメインは、膜貫通タンパク質ＣＤ３Ｇの細胞内部分に由来する。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＣＤ３Ｇのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＣＤ３Ｇポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。全長ＣＤ３Ｇの２つのセリン残基、Ｓ１２３およびＳ１２６は、イオノマイシンに応答してＴ細胞でリン酸化されることが示されている（Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８７  Ａｕｇ  １５；２６２（２３）：１０９１８−２１）。いくつかの実施形態では、ＣＤ３Ｇ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、全長Ｓ１２３およびＳ１２６に対応するセリン残基の１つ以上を含み得る。さらに、Ｓ１２３ではなくＳ１２６でのリン酸化が、ＰＫＣ媒介下方調節に必要であることが示された（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９４  Ｍａｙ  １；１３（９）：２１５６−６６）。いくつかの実施形態では、ＣＤ３Ｇ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、全長Ｓ１２３に対応するセリン残基を含み得、全長Ｓ１２６に対応するセリン残基を含み得ない。いくつかの実施形態では、ＣＤ３Ｇ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、全長Ｓ１２６に対応するセリン残基でのリン酸化不可能なアミノ酸置換を含み得る。例示的な実施形態では、アミノ酸置換は、セリンからアラニンへの突然変異であってもよい。さらに、全長ＣＤ３Ｇのジロイシンモチーフ、Ｌ１３１およびＬ１３２のいずれかのロイシンのロイシンからアラニンへの突然変異は、ＰＫＣ媒介下方調節を防ぐことが示された（Ｄｉｅｔｒｉｃｈ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９４  Ｍａｙ  １；１３（９）：２１５６−６６）。いくつかの実施形態では、ＣＤ３Ｇ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、全長ＣＤ３ＧのＬ１３１またはＬ１３２に対応するロイシン残基での少なくとも１つのアミノ酸置換を含み得る。例示的な実施形態では、アミノ酸置換は、ロイシンからアラニンへの突然変異であってもよい。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素の適切な細胞内ドメインは、配列番号１９９のアミノ酸一続きの少なくとも１０、１５、２０、または全てに対して少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するドメインを含み得る。これらの実施形態のいくつかでは、ＣＤ３Ｇの細胞内ドメインは、約２０ａａ〜約２５ａａ、約２５ａａ〜約３０ａａ、約３０ａａ〜約３５ａａ、約３５ａａ〜約４０ａａ、または約４０ａａ〜約４５ａａの長さを有する。例示的な実施形態では、ＣＤ３Ｄの細胞内ドメインは、約３０ａａ〜約４５ａａの長さを有する。
【０２７７】
例示的な実施形態ではＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１４、またはＴＮＦＲＳＦ１８であってもよいＴＮＦ受容体（ＴＮＦＲ）の細胞質ドメインは、ＴＲＡＦ（ＴＮＦ受容体関連因子）および／または「デスドメイン」（ＤＤ）分子を含むシグナル伝達分子を動員し得る。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖および／または生存を誘導するＴＮＦＲのドメイン、モチーフ、および点突然変異は当該技術分野で知られており、当業者は、ＴＮＦＲポリペプチドの対応するドメイン、モチーフ、および点突然変異を特定することができ、そのうちのいくつかがこの段落で論じられる。哺乳類には、少なくとも６つのＴＲＡＦ分子およびいくつかの非受容体ＤＤ分子がある。ＴＲＡＦに結合する受容体およびアダプタータンパク質は、当該技術分野で知られている短いコンセンサスＴＲＡＦ結合モチーフを共有する（Ｍｅａｄｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１０  Ａｕｇ  １；１８５（３）：１６０６−１５）。ＤＤ結合モチーフは、当該技術分野でも知られている６つの保存α−ヘリックスのおよそ６０アミノ酸の球状束である（Ｌｏｃｋｓｌｅｙ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００１  Ｆｅｂ  ２３；１０４（４）：４８７−５０１）。当業者は、例えば、既知の結合モチーフへの配列アラインメントを使用して、異なるＴＮＦＲファミリーにおけるＴＲＡＦおよび／またはＤＤ結合モチーフを特定することができるであろう。ＴＮＦＲはＴＲＡＤＤおよびＴＲＡＦ２を動員し、ＮＦ−κＢ、ＭＡＰＫ、ＪＮＫを活性化することができる（Ｓｅｄｇｅｒ  ａｎｄ  ＭｃＤｅｒｍｏｔｔ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｖ．２０１４  Ａｕｇ；２５（４）：４５３−７２）。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、１つ以上のＴＲＡＦ結合モチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ＤＤ結合モチーフを含まないか、または細胞内ドメイン内で１つ以上のＤＤ結合モチーフが欠失もしくは突然変異している。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ＴＲＡＤＤおよび／またはＴＲＡＦ２を動員し得る。ＴＮＦＲはまた、リガンド結合に重要なシステインリッチドメイン（ＣＲＤ）を含む（Ｌｏｃｋｓｌｅｙ  ＲＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２００１  Ｆｅｂ  ２３；１０４（４）：４８７−５０１）。いくつかの実施形態では、ＴＮＦＲ細胞内ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ＴＮＦＲ  ＣＲＤを含まない。
【０２７８】
本明細書に開示される態様のいずれかに含めることができるリンパ増殖性要素およびＣＬＥは、ＷＯ２０１９／０５５９４６に開示されるＬＥまたはＣＬＥのいずれかであってもよい。そこでは、形質導入後７日目と２１日目、２８日目、３５日目および／または４２日目と間にＣＬＥをコードするレンチウイルス粒子で形質導入されたＰＢＭＣの細胞培養における増殖を促進するＣＬＥが開示された。さらに、そこでは、ＣＡＲによって認識される抗原の存在下または非存在下でマウスのインビボで増殖を促進するＣＬＥが特定され、ＣＬＥおよびＣＡＲの１つを発現するＴ細胞がマウスに導入された。本明細書で例示されるように、試験および／または基準を使用して、ＬＥ、またはＬＥの試験ドメイン、例えば第１の細胞内ドメイン、もしくは第２の細胞内ドメイン、もしくは第１および第２の細胞内ドメインの両方を含む任意の試験ポリペプチドを特定することができ、これらは、実際にＬＥまたはＬＥの有効な細胞内ドメイン、または特に有効なＬＥまたはＬＥの細胞内ドメインである。したがって、特定の実施形態では、ＬＥまたはＬＥをコードするポリヌクレオチドまたは核酸を含む本明細書で提供される任意の態様または他の実施形態は、ＬＥが、本明細書で提供されたＬＥを特定するための特定された試験または基準の任意の１つ以上を満たす、またはその特性を提供する、またはその特性を提供および／もしくは保有すること、あるいは、ＬＥをコードするレンチウイルス粒子等のレトロウイルス粒子で遺伝子改変および／または形質導入された細胞が、説明された試験の１つ以上の結果を提供し得る、達成するように適合される、その特性を保有する、および／または達成するように改変されることを説明し得る。一実施形態では、同一条件下での対照レトロウイルス粒子、例えばレンチウイルス粒子と比較して、外因的に添加されたサイトカインの非存在下での形質導入後７日目と２１日目、２８日目、３５日目および／または４２日目との間に、ＬＥは、ＣＤ３ゼータ細胞内活性化ドメインを含むが共刺激ドメインを含まない抗ＣＤ１９  ＣＡＲをコードする核酸を含むレンチウイルスで形質導入された事前活性化ＰＢＭＣへの改善された拡張を提供する、提供することができる、および／もしくはその特性を保有する（または、ＬＥをコードするレトロウイルス粒子で遺伝子改変および／もしくは形質導入された細胞が、それを提供することができる、それに適合される、その特性を保有する、および／もしくはそのために改変される）。いくつかの実施形態では、推定ＬＥ（試験細胞）をコードする試験構築物をコードするゲノムを有するレトロウイルス粒子（例えばレンチウイルス粒子）で形質導入された細胞の生存、拡張、および／または増殖の改善または増強についてのリンパ増殖性要素試験が、例えば、非形質導入細胞、またはリンパ増殖性要素をコードする核酸を含むがリンパ増殖性要素を欠く、もしくは試験ポリペプチド構築物の細胞内ドメインを欠くが、存在する場合は同じ細胞外ドメイン、およびそれぞれの試験ポリペプチド構築物の同じ膜貫通領域もしくは膜標的化領域を含むレンチウイルス粒子と同一の対照レトロウイルス（例えばレンチウイルス）粒子で形質導入された細胞で���ってもよい対照細胞との比較に基づいて実行され得る。いくつかの実施形態では、対照細胞は、リンパ増殖性要素またはその細胞内ドメインをコードするゲノムを有するレトロウイルス粒子（例えばレンチウイルス粒子）で形質導入され、リンパ増殖性要素を例示するものとして本明細書で特定される。そのような実施形態では、試験基準は、試験構築物をコードするゲノムを有するレトロウイルス粒子（例えばレンチウイルス粒子）対対照リンパ増殖性要素をコードするレトロウイルス粒子（例えばレンチウイルス粒子）を使用して、典型的にはそれで転写された細胞を分析することにより試験がレトロウイルス粒子（例えばレンチウイルス粒子）を使用して実行される場合、少なくとも同程度の濃縮、生存および／もしくは拡張が存在するか、または濃縮、生存、および／もしくは拡張の統計的差異がないことを含み得る。本明細書のリンパ増殖性要素の例示的または説明的な実施形態は、いくつかの実施形態では、そのような試験のための対照リンパ増殖性要素の説明的な実施形態である。
【０２７９】
いくつかの実施形態では、推定または試験リンパ増殖性要素の改善された特性についてのこの試験は、複製を実行すること、および／または統計的試験を実行することによって実行される。当業者は、多くの統計的試験がそのようなリンパ増殖性要素試験に使用され得ることを認識するであろう。これらの実施形態におけるそのような試験について企図されるのは、当該技術分野で知られているそのような試験のいずれかである。いくつかの実施形態では、統計的試験は、Ｔ検定またはマンホイットニーウィルコクソン検定であってもよい。いくつかの実施形態では、試験構築物の正規化された濃縮レベルは、０．１未満、または０．０５未満、または０．０１未満のｐ値で有意である。
【０２８０】
別の実施形態では、ＬＥは、外因的に添加されたサイトカインの非存在下でのインビトロ培養の７日目と２１、２８、３５および／または４２日目との間に、ＣＤ３ゼータ細胞内活性化ドメインを含むが共刺激ドメインを含まない抗ＣＤ１９ＣＡＲとともに形質導入された場合、ＬＥをコードする核酸で形質導入された事前活性化ＰＢＭＣの少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、もしくは１０倍の拡張、または１．５倍から２５倍の拡張、または２倍から２０倍の拡張、または２倍〜１５倍の拡張、または５倍〜２５倍の拡張、または５倍〜２０倍の拡張、または５倍〜１５倍の拡張を提供する、提供することができる、および／もしくはその特性を保有する（または、ＬＥで遺伝子改変および／もしくは形質導入された細胞が、それを提供することができる、それに適合される、その特性を保有する、および／もしくはそのために改変される）。いくつかの実施形態では、試験は、ＰＢＭＣの存在下で、例えば形質導入された細胞対ＰＢＭＣの１：１の比率で実行され、これは、例えば、適合ドナーからのものであってもよく、いくつかの実施形態では、試験は、ＰＢＭＣの非存在下で行われる。いくつかの実施形態では、これらの試験のいずれかの拡張の分析は、ＷＯ２０１９／０５５９４６に示されているように実行される。いくつかの実施形態では、試験は、さらなる統計的試験および０．１、０．０５、または０．０１未満のＰ値等のカットオフを含み得、試験ポリペプチドまたはそれをコードする核酸は、一方または両方の閾値を満たす必要がある（すなわち、倍数拡張および統計的カットオフ）。
【０２８１】
本明細書で提供されるリンパ増殖性要素試験のいずれについても、試験細胞の数および対照細胞の数を、形質導入後７日目と１４日目、２１日目、２８日目、３５日目、４２日目または６０日目との間で比較することができる。いくつかの実施形態では、試験細胞および対照細胞の数は、ＤＮＡを配列決定し、各構築物に存在する一意の識別子の出現をカウントすることによって決定され得る。いくつかの実施形態では、試験細胞および対照細胞の数は、例えば血球計または細胞カウンターを用いて直接カウントされ得る。いくつかの実施形態では、全ての試験細胞および対照細胞が、同じ容器、ウェル、またはフラスコ内で増殖され得る。いくつかの実施形態では、試験細胞は、１つ以上のウェル、フラスコまたは容器に播種され得、対照細胞は、１つ以上のフラスコまたは容器に播種され得る。いくつかの実施形態では、試験細胞および対照細胞は、ウェルまたはフラスコに個別に、例えばウェルあたり１つの細胞で播種され得る。いくつかの実施形態では、試験細胞および対照細胞の数は、濃縮レベルを使用して比較され得る。いくつかの実施形態では、試験または対照構築物の濃縮レベルは、各構築物に対して、後の時点（１４、２１、２８、３５、または４５日目）での細胞の数を７日目の細胞の数で割ることによって計算され得る。いくつかの実施形態では、試験または対照構築物の濃縮レベルは、ある時点（１４、２１、２８、３５、または４５日目）での細胞の数を、形質導入されていない細胞に対するその時点での細胞の数で割ることによって計算され得る。いくつかの実施形態では、各試験構築物の濃縮レベルをそれぞれの対照構築物の濃縮レベルに正規化して、正規化された濃縮レベルを生成することができる。いくつかの実施形態では、試験構築物にコードされるＬＥは、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、もしくは１０倍の正規化濃縮レベル、または１．５倍〜２５倍の正規化濃縮レベル、または３倍〜２０倍の正規化濃縮レベル、または５倍〜２５倍の正規化濃縮レベル、または５倍〜２０倍正規化濃縮レベル、５倍〜１５倍の正規化濃縮レベルを提供する（あるいは、ＬＥをコードするゲノムを有するレトロウイルス粒子（例えばレンチウイルス粒子）で遺伝子改変および／または形質導入された細胞が、そのような正規化濃縮レベルを提供することができる、それに適合される、その特性を保有する、および／またはそのために改変される）。濃縮は、例えば、直接細胞カウントによって測定され得る。カットオフ値は、１回の試験、２回、３回、４回、もしくは５回の反復、または多数の繰り返しに基づき得る。リンパ増殖性要素が１つ以上の反復試験を満たすか、全ての反復でカットオフを満たすもしくは超えると、カットオフを満たすことができる。いくつかの実施形態では、濃縮は、ｌｏｇ２（（試験日での正規化されたカウントデータ＋１）／（７日目の正規化されたカウントデータ＋１））として測定される。
【０２８２】
ＷＯ２０１９／０５５９４６に示されているように、ＣＬＥは、リンパ系または骨髄系細胞の増殖および／または生存を誘導すると考えられる細胞内ドメイン、ならびに細胞内活性化ドメインを含むが共刺激ドメインは含まない抗ＣＤ１９ＣＡＲを含むように設計された試験キメラポリペプチドをコードする構築物を含む構築物のライブラリから特定された。３７℃で一晩行った事前活性化は、ＰＢＭＣ、リンパ球用の市販培地（Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ細胞拡張ＳＦＭ）、組み換えヒトインターロイキン−２（１００ＩＵ／ｍｌ）、および抗ＣＤ３Ａｂ（ＯＫＴ３）（５０ｎｇ／ｍｌ）を含む事前活性化反応混合物において行われた。事前活性化に続いて、感染多重度（ＭＯＩ）５で、試験および対照レンチウイルス粒子を事前活性化反応混合物に添加した後、３７℃で一晩形質導入を行った。いくつかの対照レンチウイルス粒子は、細胞外および膜貫通ドメインを有するが細胞内ドメインを有しないポリペプチドをコードする構築物を含んでいた。対照的に、試験レンチウイルス粒子は、細胞外および膜貫通ドメインならびに１つまたは２つの細胞内ドメインを有するポリペプチドをコードする構築物を含んでいた。形質導入後、Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭを添加して反応混合物を５〜２０倍に希釈し、細胞を３７℃で最長４５日間培養した。形質導入後７日目に、培養物に追加の形質導入されていないドナー適合ＰＢＭＣを「供給」するか、または「供給」しなかった（「供給なし」）。形質導入反応混合物が最初に形成された後、市販の培地に存在しなかったこれらの培養物に、追加のサイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−７、またはＩＬ−１５および他のリンパ系マイトジェン剤）は添加されなかった。拡張は、７日目のカウントプラス１に対する分析の最後の日の正規化カウントプラス１の比の底２の対数として計算されるように濃縮が正であるように、混合培養ＰＢＭＣ細胞集団の各構築物の一意の識別子の核酸配列カウントとして実際にカウントされた細胞カウントの濃縮を分析することによって測定された。ＬＥを特定するために実行された試験に関する追加の詳細は、実験条件を含め、ＷＯ２０１９／０５５９４６に示されている。
【０２８３】
ＷＯ２０１９／０５５９４６に示されているように、ＣＬＥは７日目と２１日目、２８日目、３５日目、および／または４２日目との間にＩＬ−２等のサイトカインを添加せずにこれらの供給または非供給培養で増殖／拡張を誘導したため、試験構築物はＣＬＥとして識別された。例えば、ＷＯ２０１９／０５５９４６に示されているように、有効なＣＬＥは、いかなる細胞内ドメインも含まない対照構築物と比較して、形質導入後７日目と２１日目、２８日目、３５日目、および／または４２日目との間に、形質導入されていないＰＢＭＣが供給された、または供給されていないに関わらず、これらのインビトロ培養物の拡張の増加を提供した試験ＣＬＥを特性することにより特定された。ＷＯ２０１９／０５５９４６は、試験遺伝子からの細胞内ドメインを含む少なくとも１つ、典型的には２つ以上の試験ＣＬＥが、細胞内ドメインを含まない形質導入後７日目に存在する全ての対照構築物よりも多くの拡張を提供したことを開示している。ＷＯ２０１９／０５５９４６は、第１の細胞内ドメイン、およびこれらの遺伝子からの１つ以上の例示的な細胞内ドメイン（複数可）について非常に有効な遺伝子を特定するために使用された統計的方法をさらに提供する。この方法は、マンホイットニーウィルコクソン検定、および０．１未満または０．０５未満の誤発見カットオフ率を使用した。ＷＯ２０１９／０５５９４６は、例えば、その遺伝子を有する全ての構築物の組み合わせスコアとして計算された遺伝子のスコアを分析することによって、第１の細胞内ドメインまたは第２の細胞内ドメインに特に有効な遺伝子を特定した。そのような分析では、ＷＯ２０１９／０５５９４６に開示されているいくつかの試験で示されているように、１より大きい、または細胞内ドメインのない陰性対照構築物より大きい、または２より大きいカットオフを使用できる。
【０２８４】
別の実施形態では、ＬＥは、インビボでＴ細胞の増殖を駆動する特性を提供することができ、および／またはその特性を保有する（または、ＬＥで遺伝子改変および／または形質導入された細胞は、インビボでのＴ細胞の拡張の駆動を提供することができ、それに適応し、その特性を保有し、および／またはそのために改変される）。例えば、インビボ試験は、マウスモデルを利用して、Ｔ細胞がＬＥをコードするレンチウイルスベクターと接触され、ＷＯ２０１９／０５５９４６に開示されているようにマウスに導入された後、インビボで１５〜２５日、またはインビボで１９〜２１日、またはインビボで約２１日でＴ細胞拡張を測定することができる。
【０２８５】
遺伝子改変のための本明細書で提供される方法、遺伝子改変および／または形質導入された細胞、ならびにその使用等、典型的にはＣＡＲを含むＬＥを含む例示的な態様および実施形態では、遺伝子改変された細胞は、遺伝子改変および／または形質導入の前に細胞が以前に保有していなかった新たな特性を保有するように改変される。そのような特性は、ＣＡＲまたはＬＥをコードする核酸、および例示的な実施形態では、ＣＡＲおよびＬＥの両方による遺伝子改変によって提供され得る。例えば、特定の実施形態では、遺伝子改変および／または形質導入された細胞は、添加ＩＬ−２の非存在下、または添加サイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−７の非存在下、および特定の例示的な実施形態ではＣＡＲによって認識される抗原の存在下で、少なくとも７、１４、２１、２８、３５、４２もしくは６０日間、または形質導入後７日目と１４、２１、２８、３５、４２、または６０日目との間で、エクスビボ培養における生存および／または増殖が可能である、それに適合されている、その特性を保有する、および／またはそのために改変されており、方法は、シュードタイピング要素および任意選択でその表面上の別個のまたは融合された活性化ドメインを有するレトロウイルス粒子を使用して遺伝子改変することを含み、典型的には事前活性化を必要としない。
【０２８６】
特定の実施形態において、生存および／または拡張を増強することができるとは、遺伝子改変および／または形質導入された細胞が、遺伝子改質および／もしくは形質導入される前の遺伝子改変および／もしくは形質導入された細胞と同一の、またはＬＥもしくは推定ＬＥを含む試験レトロウイルス粒子と同一であるがＬＥもしくはＬＥの細胞内ドメインを有しないレトロウイルス粒子で形質導入された対照細胞と同一の対照細胞と比較して、１つ以上の追加のサイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−７、または追加のリンパ球マイトジェン剤の非存在下での培養培地でのエクスビボまたはインビトロ培養における改善された生存または拡張を示す、それが可能であり、それに適合されている、その特性を保有する、および／またはそのために改変されていることを意味し、前記対照細胞の前記生存または増殖は、前記１つ以上のサイトカイン、例えばＩＬ−２、ＩＬ−１５もしくはＩＬ−７、またはリンパ球マイトジェン剤を培養培地に添加することにより促進される。サイトカインまたはリンパ球マイトジェン剤を添加するとは、サイトカインまたはリンパ球マイトジェン剤を外因性供給源から培養培地に添加して、最初の培養培地と比較して細胞の培養中に培養培地中の前記サイトカインまたはリンパ球マイトジェン剤の濃度を増加させることを意味し、いくつかの実施形態では、前記添加前に最初の培養培地に存在しなくてもよい。「添加された」または「外因的に添加された」とは、そのようなサイトカインまたはリンパ球マイトジェン剤が、遺伝子改変後に遺伝子改変および／または形質導入細胞を培養するために使用されるリンパ球培地に添加されることを意味し、培養培地は、すでにサイトカインまたはリンパ球マイトジェン剤を保有してもよい、または保有しなくてもよい。複数の培地成分の混合物を含む培地の全てまたは一部は、典型的には保存され、例示的な実施形態では、外因的に添加されたサイトカインまたはリンパ球マイトジェン剤なしで、培養が行われる場所に輸送される。いくつかの実施形態におけるリンパ球培地は、供給業者から購入され、供給業者によって雇用されておらず、供給者施設内にいない技術者等の使用者は、外因的に添加されたサイトカインまたはリンパ球マイトジェン剤をリンパ球培地に添加し、次いで遺伝子改変されるおよび／または形質導入された細胞は、そのような外因的に添加されたサイトカインまたはリンパ球マイトジェン剤の存在下または非存在下で培養される。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、改善または増強された生存、拡張、および／または増殖は、ＣＬＥをコードするゲノムを有するレトロウイルス粒子（例えばレンチウイルス粒子）で形質導入された細胞からのＤＮＡを配列決定し、各ＣＬＥからの一意の識別子に存在する配列の発生をカウントすることにより決定される細胞の数の増加として示され得る。いくつかの実施形態では、改善された生存および／または改善された拡張は、各時点で、例えば血球計または細胞カウンターを用いて細胞を直接カウントすることによって決定され得る。いくつかの実施形態では、改善された生存および／または改善された拡張および／または濃縮は、各構築物に対して、後の時点（２１、２８、３５、および／または４５日目）での細胞の数を、７日日での細胞の数で割ることによって計算され得る。いくつかの実施形態では、細胞は、血球計または細胞カウンターによってカウントされ得る。いくつかの実施形態では、各特定の試験構築物の核酸カウントまたは細胞カウントを使用して決定された濃縮レベルは、それぞれの対照構築物、すなわち同じ細胞外ドメインおよび膜貫通ドメインを有するが、試験構築物に存在する細胞内ドメインを欠く構築物の濃縮レベルに正規化され得る。これらの実施形態では、構築物にコードされたＬＥ（またはＬＥをコードするゲノムを有するレトロウイルス粒子（例えばレンチウイルス粒子）で遺伝子改変および／または形質導入された細胞）は、少なくとも１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、もしくは１０倍の正規化濃縮レベル、または１．５倍〜２５倍の正規化濃縮レベル、または３倍〜２０倍の正規化濃縮レベル、または５倍〜２５倍の正規化濃縮レベル、または５倍〜２０倍の正規化濃縮レベル、または５倍〜１５倍の正規化濃縮レベルを提供する、提供することができる、それに適合されている、その特性を保有する、および／またはそのために改変されている。
【０２８８】
リンパ増殖性要素を含む、本明細書で提供される方法、使用、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞、ならびに他の組成物の態様のいずれかの例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、Ｐ４ドメインを伴ってもしくは伴わずにＰ３シグナル伝達ドメインを有する遺伝子のいずれか、またはインビボでＴ細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の拡張を促進する本明細書の表４〜８で特定されるＣＬＥにおいてＰ３ドメインがリンカーであるＰ４ドメインを有する遺伝子のいずれかからの、細胞内ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインを含むその断片を含み得る。Ｐ３およびＰ４ドメインを有するリンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法、使用、および組成物の態様のいずれかの例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、インビボでＴ細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の拡張を促進する本明細書の表４〜８で特定されるＣＬＥにＰ３およびＰ４シグナル伝達ドメインを有する構築物にＰ４シグナル伝達ドメインを有する遺伝子のいずれかからのシグナル伝達ドメインをＰ４位に含む細胞内ドメインまたはその断片を含み得る。リンパ増殖性要素を含む本明細書で提供される方法、使用、および組成物の態様のいずれかの例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、Ｐ３シグナル伝達ドメインを有する遺伝子のいずれかからのシグナル伝達ドメイン、ならびにインビボでＴ細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の拡張を促進する本明細書の表４〜８で特定されるＣＬＥのいずれかにおいて、同じＣＬＥに、例示的な実施形態ではそれぞれＰ３およびＰ４位にＰ４ドメインを有する遺伝子のいずれかからのシグナル伝達ドメインを含む細胞内ドメインまたはその断片を含み得る。この段落で提供される実施形態のＣＬＥのいずれかにおいて、Ｐ２ドメインは、本明細書の表４〜８に見出されるＣＬＥにおいてＰ２部分を有すると特定された遺伝子のいずれかからのものであってもよい。さらに、ＣＬＥは、いくつかの例示的な実施形態では、表４〜８のＰ１ドメインを含み得る。
【０２８９】
リンパ増殖性要素を含む、本明細書で提供される方法、使用、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞、ならびに他の組成物の態様のいずれかの例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、インビボでＴ細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の拡張を促進する本明細書の表４〜８に特定されるＣＬＥのいずれかからのＰ３シグナル伝達ドメイン、または、インビボでＴ細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の拡張を促進する本明細書の表４〜８に特定されるＣＬＥのいずれかからのＰ３シグナル伝達ドメインを有しないコンストラクトにおけるＰ４シグナル伝達ドメインを含み得る。Ｐ３およびＰ４ドメインを有するリンパ増殖性要素を含む、本明細書で提供される方法、使用、および組成物の態様のいずれかの例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、Ｐ４位に、インビボでＴ細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の拡張を促進する本明細書の表４〜８に特定されるＣＬＥにＰ３およびＰ４シグナル伝達ドメインを有する構築物中のＰ４シグナル伝達ドメインを含み得る。リンパ増殖性要素を含む、本明細書で提供される方法、使用、および組成物の態様のいずれかの例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、インビボでＴ細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞の拡張を促進する本明細書の表４〜８に特定されるＣＬＥのいずれか１つからの、それぞれＰ３およびＰ４位にＰ３シグナル伝達ドメインおよびＰ４シグナル伝達ドメインを含み得る。さらに、ＣＬＥは、いくつかの例示的な実施形態では、表４〜８のＰ１ドメインを含み得る。この段落で提供される実施形態のＣＬＥのいずれかにおいて、Ｐ２ドメインは、本明細書の表４〜８に見出されるＣＬＥからの任意のＰ２ドメインを含み得るか、もしくはそれであってもよく、または、例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、Ｐ２ドメイン、Ｐ３ドメインおよびＰ４ドメイン、ならびに任意選択でＰ１ドメインを含み得、これらは全て、本明細書の表４〜８に特定される同じＣＬＥからのものである。リンパ増殖性要素を含む、本明細書で提供される方法、使用、遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞のいずれかの特定の例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、Ｐ３およびＰ４ドメインＳ１２１−Ｓ２１２もしくはＳ１８６−Ｓ０５３、またはＰ２、Ｐ３およびＰ４ドメインＴ００１−Ｓ１２１−Ｓ２１２もしくはＴ０４４−Ｓ１８６−Ｓ０５３、任意選択でＰ１ドメインＥ００８もしくはＥ００６を有し得る。
【０２９０】
いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、サイトカイン受容体またはそのシグナル伝達ドメインを含む断片を含み得る。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２Ｒ、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１３Ｒ、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５Ｒ、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＥ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦＲ、ＭＰＬ、ＯＳＭＲ、ＰＲＬＲ、ＴＧＦβＲ、ＴＧＦβデコイ受容体、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１４、またはＴＮＦＲＳＦ１８であってもよい。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体は、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＥ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦＲ、ＭＰＬ、ＯＳＭＲ、ＰＲＬＲ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１４、またはＴＮＦＲＳＦ１８であってもよい。
【０２９１】
例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、サイトカイン受容体ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＭＰＬ、ＯＳＭＲ、ＰＲＬＲ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１４、またはＴＮＦＲＳＦ１８からの細胞内ドメインを含み得る。例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素中の細胞内ドメインは、ＣＤ４０、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ７Ｒ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ３１ＲＡ、ＭＰＬ、ＭＹＤ８８、ＴＮＦＲＳＦ１４、またはＴＮＦＲＳＦ１８からのドメインを含み、これらは、ＷＯ２０１９／０５５９４６に開示されているように、初期スクリーニングおよび反復スクリーニングで特に注目すべき濃縮を示した構築物に存在した。
【０２９２】
例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＯＸ４０（ＴＮＦＲＳＦ４とも呼ばれる）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８とも呼ばれる）、またはＨＶＥＭ（ＴＮＦＲＳＦ１４とも呼ばれる）からの共刺激ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０からの共刺激ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、またはＨＶＥＭからの細胞内ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ＧＩＴＲからの共刺激ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、またはＨＶＥＭからの細胞内ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８からの共刺激ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ＣＤ３Ｚ、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、またはＨＶＥＭからの細胞内ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、ＯＸ４０、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＢＴＬＡ、ＣＤ３０、ＧＩＴＲ、またはＨＶＥＭからの共刺激ドメインを含むリンパ増殖性要素は、膜貫通ドメインのＮ末端のコイルドコイルスペーサードメインを含まない。いくつかの実施形態では、ＧＩＴＲからの共刺激ドメインを含むリンパ増殖性要素は、ＧＩＴＲの共刺激ドメインのＮ末端であるＣＤ３Ｚからの細胞内ドメインを含まない。
【０２９３】
特定の例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、ＣＤ４０、ＭＰＬおよびＩＬ２Ｒｂの細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、サイトカイン受容体以外であってもよい。いくつかの実施形態では、サイトカイン受容体以外のリンパ増殖性要素は、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ８ＲＡ、ＣＤ８ＲＢ、ＣＤ２８、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｃ、またはＩＣＯＳからの細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。
【０２９４】
いくつかの実施形態では、ＣＬＥを含むリンパ増殖性要素は、本明細書で上記に開示されるような細胞内活性化ドメインを含む。いくつかの例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、ＩＴＡＭ含有ドメインを含む細胞内活性化ドメインを含むＣＬＥであり、したがって、ＣＬＥは、本明細書で提供されるＣＤ３Ｚ、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＤＡＰ１２、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＤＡＰ１０／ＣＤ２８、またはＺＡＰ７０ドメインに対して少なくとも８０％、９０％、９５％、９８％、または１００％の配列同一性を有する細胞内活性化ドメインを含み得、ＣＬＥはＡＳＴＲを含まない。特定の例示的な実施形態では、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ａ、またはＦＣＧＲ２ＣからのＩＴＡＭ含有ドメインである。これらの細胞内活性化ドメインを含むＣＬＥは、ＷＯ２０１９／０５５９４６において、外因性ＩＬ−２等の外因性サイトカインの非存在下で、培養物中エクスビボでＰＢＭＣの増殖を促進するのに効果的であるとして示されている。いくつかの実施形態では、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ７９Ａ、ＦＣＥＲ１Ｇからの細胞内ドメインを含むＣＬＥが本明細書で提供される。
【０２９５】
いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素の１つ以上のドメインは、共刺激ドメイン等の調節ドメイン、および／またはＣＡＲの細胞内活性化ドメインに融合される。全血中のリンパ球を形質導入するための組成物および方法の態様のいくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素の１つ以上の細胞内ドメインは、ＣＡＲと同じポリペプチドの一部であるか、または融合され、任意選択でＣＡＲのいくつかの成分に機能的に接続され得る。さらに他の実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、ＡＳＴＲ、細胞内活性化ドメイン（ＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメイン等）、共刺激ドメイン、およびリンパ増殖性ドメインを含み得る。共刺激ドメイン、細胞内活性化ドメイン、ＡＳＴＲおよび他のＣＡＲドメインに関するさらなる詳細は、本明細書の他の場所に開示されている。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、ポリペプチドではなく、むしろ阻害性ＲＮＡを含む。いくつかの実施形態では、本明細書の任意の態様による方法、使用、組成物、およびプロセスの生成物は、阻害性ＲＮＡを含むリンパ増殖性要素、および操作されたシグナル伝達ポリペプチドであるリンパ増殖性要素の両方を含む。リンパ増殖性要素が阻害性ＲＮＡ、または複数の阻害性ＲＮＡであるかまたはそれを含む実施形態では、阻害性ＲＮＡまたは複数の阻害性ＲＮＡは、本明細書の他の場所、例えば本明細書の阻害性ＲＮＡ分子セクションで特定される構造のいずれかを有し得る。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡは、典型的には、ＳＯＣＳ経路における負の調節因子を分解またはその下方調節を引き起こすことによりＳＴＡＴ５の活性化を増強することによって、ＳＴＡＴ５経路を刺激するｍｉＲＮＡであってもよい。阻害性ＲＮＡリンパ増殖性要素は、本明細書の阻害性ＲＮＡ分子のセクションまたは本明細書の他の場所で特定されたｍＲＮＡのいずれかを標的とし得る。
【０２９７】
例示的な実施形態では、本明細書に例示されるように、そのような阻害性ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）は、パッケージング細胞、および／または複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子ゲノム、および／またはレトロウイルスベクターのイントロンに位置し得、典型的にはＴ細胞および／またはＮＫ細胞で活性なプロモーターによって駆動される発現を伴う。理論によって制限されないが、転写単位にイントロンを含めることは、転写物のより高い発現および／または安定性をもたらすと考えられている。したがって、レトロウイルスゲノムのイントロン内にｍｉＲＮＡを配置する能力は、レンチウイルスゲノム等のレトロウイルスのサイズ制限に最大の活性を得ようとする従来技術における課題を克服する本開示の教示に追加される。いくつかの実施形態では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のｍｉＲＮＡ、例示的な実施形態では、２〜５つの間、例えば４つのｍｉＲＮＡ（そのうちの１つ以上は、それぞれ本明細書に開示される標的の１つ以上をコードする核酸に結合する）は、組み換えレトロウイルスゲノムに含まれ、本明細書で提供される方法を使用して、標的細胞、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞に送達され得る。実際に、本明細書で提供されるように、１、２、３、または４つのｍｉＲＮＡは、ＥＦ１−αイントロン等の単一のイントロンに送達することができる。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、ＭＰＬを含むか、またはＭＰＬもしくはそのバリアントおよび／もしくは断片であり、これは、ＭＰＬの膜貫通および／もしくは細胞外ドメインの有無にかかわらず、ＭＰＬの細胞内ドメインの少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％を含み、ならびに／または、ＭＰＬの膜貫通および／もしくは細胞外ドメインの有無にかかわらず、ＭＰＬの細胞外ドメインに対して少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、もしくは１００％の配列同一性を有し、バリアントおよび／または断片は、ＰＢＭＣ、およびいくつかの実施形態ではＴ細胞の細胞増殖を促進する能力を保持する。例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、ＭＰＬの細胞内ドメイン、またはＭＰＬの細胞内ドメインの少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％を含むそのバリアントもしくは断片を含み、リンパ増殖性要素は、ＭＰＬの膜貫通ドメインを含まない。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、ＭＰＬの細胞内ドメイン、またはＭＰＬの細胞内ドメインの少なくとも７５、８０、８５、９０、９５、９６、９７、９８、９９、または１００％を含むそのバリアントもしくは断片を含み、リンパ増殖性要素は、ＭＰＬの膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＭＰＬの細胞内および膜貫通ドメインを含むリンパ増殖性要素を発現する細胞は、エルトロンボパグと接触、それに曝露、またはそれで処理され得る。理論に限定されないが、エルトロンボパグはＭＰＬの膜貫通ドメインに結合し、ＭＰＬの細胞内ドメインの活性化を誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書の組成物および方法に含まれるＭＰＬ断片は、ＪＡＫ−２結合ドメインを有する、および／または保持する。いくつかの実施形態では、本明細書に含まれるＭＰＬ断片は、ＳＴＡＴを活性化する能力を有する、または保持する。ＭＰＬの完全な細胞内ドメインは、配列番号２８３（ＷＯ２０１９／０５５９４６に示されている部分Ｓ１８６）である。ＭＰＬは、トロンボポエチンの受容体である。トロンボポエチンおよびＥＰＯ等のいくつかのサイトカインは、文献および本明細書において、ホルモンまたはサイトカインと呼ばれる。
【０２９９】
本開示の別個の態様を提供するいくつかの実施形態では、キメラリンパ増殖性要素（ＣＬＥ）であるキメラポリペプチド、ならびにそれをコードする単離されたポリヌクレオチドおよび核酸配列が本明細書で提供される。ＣＬＥは、このセクションで説明した特定の遺伝子に由来するドメインのいずれかを含み得る。同様に、ＣＬＥをコードする単離されたポリヌクレオチドおよび核酸配列は、ＣＬＥの一部として、このセクションで論じられる特定の遺伝子に由来するドメインのいずれかをコードすることができる。
【０３００】
本明細書で提供されるリンパ増殖性要素は、典型的には膜貫通ドメインを含む。例えば、膜貫通ドメインは、ＷＯ２０１９／０５５９４６に開示されている以下の遺伝子および代表的な配列からの膜貫通ドメインのいずれか１つに対して８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し得る：ＣＤ８ベータ、ＣＤ４、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２８、ＣＤ１３４、ＣＤ７、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ３Ｚ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ  ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＣＧＲＡ２、ＧＨＲ、ＧＨＲ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＡＲ、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ１７ＲＥ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦＲ、ＭＰＬ、ＯＳＭＲ、ＰＲＬＲ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１４、およびＴＮＦＲＳＦ１８。任意の操作されたシグナル伝達ポリペプチドにおける使用に適した膜貫通（ＴＭ）ドメインは、これらに限定されないが、本明細書でより詳細に論じられるように、構成的に活性なサイトカイン受容体、ＬＭＰ１からのＴＭドメイン、および二量体化モチーフを含む１型ＴＭタンパク質からのＴＭドメインを含む。Ｉ型膜貫通タンパク質からの膜貫通ドメインを含む本明細書に開示される態様のいずれにおいても、膜貫通ドメインは、Ｉ型成長因子受容体、ホルモン受容体、Ｔ細胞受容体、またはＴＮＦファミリー受容体であってもよい。
【０３０１】
エルトロンボパグは、トロンボポエチン受容体ＭＰＬ（ＴＰＯＲとしても知られている）の小分子活性化因子である。いくつかの態様では、ＭＰＬ膜貫通ドメインを含むＬＥを発現する細胞は、エルトロンボパグに曝露または接触され得、またはそのような細胞が注入された患者または対象は、エルトロンボパグで処置され得る。前記接触または処置後、ＬＥの増殖および／または生存特性が活性化されて細胞に提供され、それにより、エルトロンボパグの非存在下と比較して、細胞の生存および／または増殖が増加する。理論に限定されないが、エルトロンボパグの結合は、膜貫通ドメインで生じ、同じポリペプチドの一部である１つ以上の細胞内ドメインを活性化することができる。当業者は、ＭＰＬ膜貫通ドメインを含むＣＬＥを活性化するために使用されるエルトロンボパグの量を理解するであろう。
【０３０２】
いくつかの実施形態では、ＣＬＥは、同じタンパク質、例示的な実施形態では同じ受容体からの細胞外部分および膜貫通部分の両方を含み、そのいずれかは、例示的な実施形態では突然変異体であり、したがって細胞外および膜貫通ドメインを形成する。これらのドメインは、少なくともいくつかの細胞型で発現されたときに構成的に活性であると報告されているいくつかの実施形態では、サイトカイン受容体、またはその突然変異体、またはホルモン受容体、またはその突然変異体からのものであってもよい。例示的な実施形態では、そのような細胞外および膜貫通ドメインは、リガンド結合領域を含まない。そのようなドメインは、ＣＬＥに存在し、Ｂ細胞、Ｔ細胞、および／またはＮＫ細胞で発現される場合、リガンドに結合しないと考えられている。そのような受容体突然変異体の突然変異は、膜貫通領域または細胞外膜近傍領域で発生し得る。理論に限定されないが、本明細書で提供されるＣＬＥの少なくともいくつかの細胞外膜貫通ドメインにおける突然変異は、通常は一緒ではない活性化鎖を一緒にすることによって、または連結された膜貫通ドメインおよびもしくは細胞内ドメインの確認を変更することによって、リガンドの非存在下でのＣＬＥのシグナル伝達に関与する。
【０３０３】
例示的な実施形態では、そのようなドメインを含む実施形態のＣＬＥの例示的な細胞外および膜貫通ドメインは、典型的には、構成的であると報告されている突然変異受容体からの膜貫通ドメインとともに、膜近位細胞外ドメインの３０アミノ酸未満である細胞外領域であり、これは、関連する細胞外ドメインの活性化にリガンド結合を必要としない。例示的な実施形態では、そのような細胞外および膜貫通ドメインは、ＩＬ７ＲＡ  Ｉｎｓ  ＰＰＣＬ、ＣＲＬＦ２  Ｆ２３２Ｃ、ＣＳＦ２ＲＢ  Ｖ４４９Ｅ、ＣＳＦ３Ｒ  Ｔ６４０Ｎ、ＥＰＯＲ  Ｌ２５１Ｃ  Ｉ２５２Ｃ、ＧＨＲ  Ｅ２６０Ｃ  Ｉ２７０Ｃ、ＩＬ２７ＲＡ  Ｆ５２３Ｃ、およびＭＰＬ  Ｓ５０５Ｎを含む。いくつかの実施形態では、細胞外および膜貫通ドメインは、ＩＬ７ＲＡの細胞外および／または膜貫通ドメインの一部、またはその突然変異体と配列が同一である１０、２０、２５、３０または５０を超える連続したアミノ酸を含まない。いくつかの実施形態では、細胞外および膜貫通ドメインは、ＩＬ７ＲＡ  Ｉｎｓ  ＰＰＣＬ以外である。いくつかの実施形態では、細胞外および膜貫通は、ＩＬ１５Ｒの細胞外および／または膜貫通ドメインの一部と配列が同一である１０、２０、２５、３０、または５０を超える連続したアミノ酸を含まない。
【０３０４】
この態様の一実施形態では、本明細書で提供されるＬＥは、細胞外ドメインを含み、例示的な実施形態では、細胞外ドメインは、二量体化モチーフを含む。この態様の例示的な実施形態では、細胞外ドメインは、ロイシンジッパーを含む。いくつかの実施形態では、ロイシンジッパーは、ｊｕｎポリペプチド、例えば、ｃ−ｊｕｎに由来する。特定の実施形態では、ｃ−ｊｕｎポリペプチドは、ＥＣＤ−１１のｃ−ｊｕｎポリペプチド領域である。
【０３０５】
これらの態様のいずれかの実施形態および膜貫通ドメインがＩ型膜貫通タンパク質である実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｉ型成長因子受容体、ホルモン受容体、Ｔ細胞受容体、またはＴＮＦファミリー受容体であってもよい。態様のいずれかの実施形態およびキメラポリペプチドが細胞外ドメインを含み、細胞外ドメインが二量体化モチーフを含む実施形態では、膜貫通ドメインは、Ｉ型サイトカイン受容体、ホルモン受容体、Ｔ細胞受容体、またはＴＮＦファミリー受容体であってもよい。
【０３０６】
例示的な膜貫通ドメインは、ＷＯ２０１９／０５５９４６に示されている任意の膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４、ＣＤ８ＲＢ、ＣＤ４０、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＧＨＲ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＥ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＰＲＬＲ、およびＴＮＦＲＳＦ８、または特定の細胞型でシグナル伝達活性を促進することが知られている突然変異体（そのような突然変異がＷＯ２０１９／０５５９４６で提供される構築物に存在する場合）からのものである。いくつかの実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＰＲＬＲ、ＩＬ３ＲＡ、またはＩＬ６ＳＴからのものである。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、細胞外および膜貫通ドメインは、ウイルスタンパク質ＬＭＰ１、またはその突然変異体および／もしくは断片である。ＬＭＰ１は、脂質ラフトを標的とした場合、またはＣＤ４０に融合した場合に、リガンドとは無関係に細胞シグナル伝達を活性化することが知られているマルチスパン膜貫通タンパク質である（Ｋａｙｋａｓ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．２０：２６４１（２００１））。ＬＭＰ１の断片は、典型的には、原形質膜にまたがり、連結された細胞内ドメインを活性化するのに十分な長さである。例えば、ＬＭＰ１は、１５〜３８６、１５〜２００、１５〜１５０、１５〜１００、１８〜５０、１８〜３０、２０〜２００、２０〜１５０、２０〜５０、２０〜３０、２０〜１００、２０〜４０、または２０〜２５アミノ酸の間であってもよい。本明細書で提供されるＣＬＥに含まれる場合、ＬＭＰ１の突然変異体および／または断片は、細胞内ドメインを活性化するその能力を保持している。さらに、存在する場合、細胞外ドメインは、少なくとも１つであるが典型的には少なくとも４つのアミノ酸を含み、典型的には、クリアランスドメイン、例えばｅＴａｇ等の別の機能的ポリペプチドに連結されている。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、ＬＭＰ１膜貫通ドメインを含む。例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、ＬＭＰ１膜貫通ドメインを含み、１つ以上の細胞内ドメインは、ＴＮＦＲＳＦタンパク質（すなわち、ＣＤ４０、４−ＩＢＢ、ＲＡＮＫ、ＴＡＣＩ、ＯＸ４０、ＣＤ２７、ＧＩＴＲ、ＬＴＲ、およびＢＡＦＦＲ）、ＴＬＲ１〜ＴＬＲ１３、インテグリン、ＦｃｙＲＩＩＩ、デクチン１、デクチン２、ＮＯＤ１、ＮＯＤ２、ＣＤ１６、ＩＬ−２Ｒ、タイプＩＩＩインターフェロン受容体、ＣＣＲ５およびＣＣＲ７等のケモカイン受容体、Ｇタンパク質共役受容体、ＴＲＥＭ１、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、Ｉｇ−アルファ、ＩＰＳ−１、ＭｙＤ８８、ＲＩＧ−１、ＭＤＡ５、ＣＤ３Ｚ、ＭｙＤ８８ΔＴＩＲ、ＴＲＩＦ、ＴＲＡＭ、ＴＩＲＡＰ、ＭＡＬ、ＢＴＫ、ＲＴＫ、ＲＡＣ１、ＳＹＫ、ＮＡＬＰ３（ＮＬＲＰ３）、ＮＡＬＰ３ΔＬＲＲ、ＮＡＬＰ１、ＣＡＲＤ９、ＤＡＩ、ＩＰＡＧ、ＳＴＩＮＧ、Ｚａｐ７０、またはＬＡＴからの細胞内ドメインを含まない。
【０３０８】
本明細書で提供されるＣＬＥの他の実施形態では、細胞外ドメインは二量体化部分を含む。本明細書に開示される多くの異なる二量体化部分をこれらの実施形態に使用することができる。例示的な実施形態では、二量体化部分はホモ二量体化することができる。理論に限定されないが、二量体化部分は、膜貫通ドメインを介してそれに接続された細胞内ドメイン上で活性化機能を提供し得る。そのような活性化は、例えば、膜貫通ドメインを介してそれに接続された細胞内ドメインの方向の変化を引き起こし得る、または細胞内ドメインを近接させることができる二量体化部分の二量体化後に提供され得る。二量体化部分を有する細胞外ドメインはまた、ＣＬＥを発現する細胞に認識タグを接続する機能を果たすことができる。いくつかの実施形態では、二量体化剤は、細胞外ではなく細胞内に位置し得る。いくつかの実施形態では、２つ以上または複数の二量体化ドメインが使用され得る。
【０３０９】
細胞外ドメインが二量体化モチーフを有する実施形態の細胞外ドメインは、ロイシンジッパー二量体等の二量体を形成するのに十分な長さである。したがって、二量体化部分を含む細胞外ドメインは、１５〜１００、２０〜５０、３０〜４５、または３５〜４０アミノ酸であってもよく、例示的な実施形態では、ｃ−Ｊｕｎ細胞外ドメインのｃ−Ｊｕｎ部分である。二量体化部分を含むポリペプチドの細胞外ドメインは、他の機能を保持していない可能性がある。例えば、ロイシンジッパーの実施形態の場合、そのようなロイシンジッパーは、アルファヘリックスに沿って７残基離れたロイシンのモチーフを保持するため、二量体を形成することができる。しかしながら、本明細書で提供されるＣＬＥの特定の実施形態のロイシンジッパー部分は、それらのＤＮＡ結合機能を保持しても、または保持しなくてもよい。
【０３１０】
１〜４個のアラニン残基のスペーサーを、二量体化部分を有する細胞外ドメインと膜貫通ドメインとの間のＣＬＥに含めることができる。理論に限定されないが、アラニンスペーサーは、細胞内ドメインの方向を変化させることにより、膜貫通ドメインを介してロイシンジッパー細胞外領域に接続された細胞内ドメインのシグナル伝達に影響を与えると考えられている。
【０３１１】
本明細書で提供されるＣＬＥの第１および任意選択の第２の細胞内ドメインは、増殖、生存（抗アポトーシス）を促進し、および／または増殖の可能性もしくは細胞死に対する耐性を増強する共刺激シグナルを提供する、少なくともいくつかの細胞型で知られている遺伝子の細胞内シグナル伝達ドメインである。したがって、これらの細胞内ドメインは、リンパ増殖性要素からの細胞内ドメインおよび本明細書で提供される共刺激ドメインであってもよい。候補キメラポリペプチドの細胞内ドメインのいくつかは、ＪＡＫ１／ＪＡＫ２、ＪＡＫ３、ＳＴＡＴ１、ＳＴＡＴ２、ＳＴＡＴ３、ＳＴＡＴ４、ＳＴＡＴ５、およびＳＴＡＴ６シグナル伝達を活性化することが知られている。このシグナル伝達に関与するサイトカイン受容体の細胞内ドメインに見られる保存モチーフが知られていえう（例えば、Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｅｔａｉｌｓ  ｏｆ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｖｉａ  ｔｈｅ  ＪＡＫ／ＳＴＡＴ  ｐａｔｈｗａｙ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（２０１８）２７：１９８４−２００９を参照されたい）。Ｂｏｘ１およびＢｏｘ２モチーフは、ＪＡＫへの結合およびシグナル伝達に関与するが、Ｂｏｘ２モチーフの存在は、増殖シグナルに必ずしも必要とされない（Ｍｕｒａｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９１  Ｄｅｃ  １５；８８（２４）：１１３４９−５３、Ｆｕｋｕｎａｇａ  ｅｔ  ａｌ．ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９１  Ｏｃｔ；１０（１０）：２８５５−６５、およびＯ’Ｎｅａｌ  ａｎｄ  Ｌｅｅ．Ｌｙｍｐｈｏｋｉｎｅ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ  Ｒｅｓ．１９９３  Ｏｃｔ；１２（５）：３０９−１２）。したがって、いくつかの実施形態では、本明細書のリンパ増殖性要素は、ボックス１ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）結合モチーフ、任意選択でボックス２  ＪＡＫ結合モチーフ、およびチロシン残基を含むシグナル伝達兼転写活性化因子（ＳＴＡＴ）結合モチーフを含むサイトカイン受容体の細胞内ドメインを含むトランスジェニックＢＯＸ１含有サイトカイン受容体である。多くのサイトカイン受容体は、Ｂｏｘ１モチーフに対して１位、２位、および６位に疎水性残基を有し、これらは、サイトカイン誘導性ＪＡＫ２活性化に必要であるがＪＡＫ２結合には必要ではない「スイッチモチーフ」を形成する（Ｃｏｎｓｔａｎｔｉｎｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００１  Ｆｅｂ；７（２）：３７７−８５；およびＨｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００１  Ｄｅｃ；８（６）：１３２７−３８）。したがって、トランスジェニックＢＯＸ１含有サイトカイン受容体の特定の実施形態では、リンパ増殖性要素はスイッチモチーフを有し、これは、例示的な実施形態では、Ｂｏｘ１モチーフに対して位１位、２位、および６位に１つ以上、好ましくは全ての疎水性残基を有する。特定の実施形態では、リンパ増殖性要素のＩＣＤであるＢｏｘ１モチーフは、膜貫通ドメインの近位に位置するＢｏｘ２モチーフに比べて膜貫通（ＴＭ）ドメインの近位に位置し（例えば、ＴＭドメインから５〜１５または約１０残基下流）、Ｂｏｘ２モチーフは、ＳＴＡＴ結合モチーフに比べて膜貫通ドメインの近位に位置��る（例えば、ＴＭドメインから１０〜５０残基下流）。ＳＴＡＴ結合モチーフは、典型的にはチロシン残基を含み、そのリン酸化は、リンパ増殖性要素のＳＴＡＴ結合モチーフへのＳＴＡＴの結合に影響を与える。いくつかの実施形態では、ＩＣＤは、複数のＳＴＡＴ結合モチーフが天然のＩＣＤ（例えば、ＥＰＯ受容体およびＩＬ−６受容体シグナル伝達鎖（ｇｐ１３０））に存在する、複数のＳＴＡＴ結合モチーフを含む。
【０３１２】
ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＢ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２７Ｒ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＩＦＲ、およびＯＳＭＲからの細胞内ドメインは、ＪＡＫ１シグナル伝達を活性化することが当該技術分野で知られている。ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＧＨＲ、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７Ｒ、ＬＥＰＲ、ＭＰＬ、およびＰＲＬＲからの細胞内ドメインは、ＪＡＫ２を活性化することが当該技術分野で知られている。ＩＬ２ＲＧからの細胞内ドメインは、ＪＡＫ３を活性化することが当該技術分野で知られている。ＧＨＲ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ５ＲＢ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＩＦＲ、ＭＰＬ、およびＯＳＭＲからの細胞内ドメインは、ＳＴＡＴ１を活性化することが当該技術分野で知られている。ＩＦＮＡＲ１およびＩＦＮＡＲ２からの細胞内ドメインは、ＳＴＡＴ２を活性化することが当該技術分野で知られている。ＧＨＲ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７Ｒ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦＲ、ＭＰＬ、およびＯＳＭＲからの細胞内ドメインは、ＳＴＡＴ３を活性化することが当該技術分野で知られている。ＩＬ１２ＲＢ１からの細胞内ドメインは、ＳＴＡＴ４を活性化することが当該技術分野で知られている。ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＧＨＲ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ５ＲＢ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＩＦＲ、ＭＰＬ、ＯＳＭＲ、およびＰＲＬＲの細胞内ドメインは、ＳＴＡＴ５を活性化することが当該技術分野で知られている。ＩＬ４ＲおよびＯＳＭＲからの細胞内ドメインは、ＳＴＡＴ６を活性化することが当該技術分野で知られている。第１の細胞内ドメインに見出される遺伝子およびその細胞内ドメインは、第１および第２の細胞内ドメインが同一である場合、少なくとも１つ、典型的には膜貫通ドメインおよび細胞外ドメインの両方が同じ遺伝子からのものではないことを除いて、任意選択の第２の細胞内ドメインと同じである。
【０３１３】
いくつかの実施形態では、ＣＬＥの全てのドメインが、ＩＬ−７受容体、またはその突然変異体、および／またはＩＬ−７受容体の少なくとも１０、１５、２０、もしくは２５の連続するアミノ酸を有するその断片以外であり、または、ＩＬ−１５受容体、またはその突然変異体、および／またはＩＬ−１５受容体の少なくとも１０、１５、２０、または２５の連続したアミノ酸を有するその断片以外である。いくつかの実施形態では、ＣＬＥは、ＣＤ４０およびＭｙＤ８８の第１の細胞内ドメインおよび第２の細胞内ドメインの組み合わせを含まない。
【０３１４】
例示的な実施形態では、ＣＬＥは、認識および／または除去ドメインを含む。認識および／または除去ドメインに関する詳細は、本書の他のセクションに記載されている。本明細書で提供される認識および／または除去ドメインのいずれも、ＣＬＥの一部であってもよい。典型的には、認識ドメインは、細胞外ドメインのＮ末端に連結している。理論に限定されないが、いくつかの実施形態では、細胞外ドメインは、リンカー、例示的な実施形態ではＣＬＥを発現する細胞に認識ドメインを連結する柔軟なリンカーを提供する機能を含む。
【０３１５】
さらに、本明細書で提供されるＣＬＥをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドはまた、典型的には、発現を原形質膜に向けるためのシグナル配列を含む。例示的なシグナル配列は、本明細書の他のセクションに記載されている。特定の実施形態では、ＣＡＲおよびＣＬＥの両方が同じ転写物から発現されるように、転写物上に要素が提供され得る。
【０３１６】
ＣＬＥの細胞外ドメインが二量体化モチーフを含む任意の態様または実施形態では、二量体化モチーフは、ロイシンジッパーモチーフ含有ポリペプチド、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ９６、Ｃｄ１０５、Ｃｄ１６１、Ｃｄ１６２、Ｃｄ２４９、ＣＤ２７１、およびＣｄ３２４、ならびに二量体化する能力を保持する突然変異体および／またはそれらの活性断片からなる群から選択され得る。ＣＬＥの細胞外ドメインが二量体化モチーフを含む本明細書の態様および実施形態のいずれかにおいて、二量体化モチーフは二量体化剤を必要とし得、二量体化モチーフおよび関連する二量体化剤は、ＦＫＢＰおよびラパマイシンもしくはその類似体、ＧｙｒＢおよびクメルマイシンもしくはその類似体、ＤＨＦＲおよびメトトレキサートもしくはその類似体、またはＤｍｒＢおよびＡＰ２０１８７もしくはその類似体、ならびに二量体化する能力を保持する記載された二量体化タンパク質の突然変異体および／または活性断片からなる群から選択され得る。いくつかの態様および例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、構成的に活性であり、活性化のために二量体化剤を必要とするリンパ増殖性要素以外のものである。
【０３１７】
ＣＬＥの細胞外ドメインが二量体化モチーフを含む、本明細書の任意の態様または実施形態の例示的な実施形態では、細胞外ドメインは、ロイシンジッパーモチーフを含み得る。いくつかの実施形態では、ロイシンジッパーモチーフは、ｊｕｎポリペプチド、例えば、ｃ−ｊｕｎからのものである。特定の実施形態では、ｃ−ｊｕｎポリペプチドは、ＥＣＤ−１１のｃ−ｊｕｎポリペプチド領域である。一実施形態における内部二量体化および／または多量体化リンパ増殖性要素は、脂質透過性免疫抑制薬、ＦＫ５０６の二量体類似体を使用する系の不可欠な部分であり、ＦＫ５０６結合タンパク質、ＦＫＢＰ１２に遺伝的に融合した分子を架橋する能力を獲得する一方で、その通常の生物活性を失う。１つ以上のＦＫＢＰとミリストイル化配列を標的受容体の細胞質シグナル伝達ドメインに融合することにより、二量体化薬依存的であるがリガンドおよび外部ドメイン非依存的な様式でシグナル伝達を刺激することができる。これにより、一時的な制御、単量体性薬物類似体を使用した可逆性、および強化された特異性が系に提供される。結合ドメインＦＫＢＰ１２に対する第３世代ＡＰ２０１８７／ＡＰ１９０３二量体化薬の高い親和性は、内因性ＦＫＢＰ１２を介して非特異的な副作用を誘発することなく、インビボで組み換え受容体の特異的活性化を可能にする。二量体化薬に結合する、ＦＫＢＰ１２Ｖ３６等のアミノ酸置換および欠失を有するＦＫＢＰ１２バリアントもまた使用され得る。さらに、合成リガンドは、プロテアーゼ分解に耐性があり、ほとんどの送達されたタンパク質剤よりも、インビボで受容体を活性化するのにより効率的となる。
【０３１８】
シュードタイピング要素
本明細書で提供される方法および組成物の多くは、シュードタイピング要素を含む。異種エンベロープ糖タンパク質を用いた複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子のシュードタイピングは、典型的には、ウイルスの指向性を変化させ、宿主細胞の形質導入を促進する。本明細書で使用されるシュードタイピング要素は、標的宿主細胞を特定および結合する、典型的には糖タンパク質である１つ以上のポリペプチドを含む「結合ポリペプチド」、およびレトロウイルスと標的宿主細胞膜の融合を媒介し、それによりレトロウイルスゲノムが標的宿主細胞に入ることを可能にする１つ以上の「融合性ポリペプチド」を含み得る。本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、シュードタイピング要素は、ポリペプチド／タンパク質として、またはポリペプチド／タンパク質をコードする核酸配列として提供される。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、シュードタイピング要素は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス両向性エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス同種指向性エンベロープタンパク質、小胞性口内炎ウイルスエンベロープタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）（配列番号３３６）、ヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）（配列番号３３７）、マウス白血病エンベロープタンパク質（ＭｕＬＶ）（配列番号３３８）、インフルエンザ糖タンパク質ＨＡ表面糖タンパク質（ＨＡ）、インフルエンザ糖タンパク質ニューロミニダーゼ（ＮＡ）、パラミクソウイルス麻疹エンベロープタンパク質Ｈ、パラミクソウイルス麻疹エンベロープタンパク質Ｆ、および／またはこれらのエンベロープタンパク質のいずれかの機能的突然変異体もしくは断片である。
【０３２０】
いくつかの実施形態では、シュードタイピング要素は、野生型ＢａＥＶであってもよい。理論に限定されないが、ＢａＥＶは、形質導入を阻害することが示されているＲペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶは、Ｒペプチドの欠失を含み得る。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶは、本明細書でＢａＥＶΔＲ（ＨＡ）（配列番号３３９）と呼ばれるアミノ酸配列ＨＡをコードするヌクレオチドの後に阻害性Ｒペプチドの欠失を含み得る。いくつかの実施形態では、ＢａＥＶは、本明細書でＢａＥＶΔＲ（ＨＡＭ）（配列番号３４０）と呼ばれるアミノ酸配列ＨＡＭをコードするヌクレオチドの後に阻害性Ｒペプチドの欠失を含み得る。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、シュードタイピング要素は、野生型ＭｕＬＶであってもよい。いくつかの実施形態では、ＭｕＬＶは、エンベロープ糖タンパク質の膜貫通（ＴＭ）サブユニットと表面（ＳＵ）サブユニットとの間に位置するフューリン媒介開裂部位を除去するための１つ以上の突然変異を含み得る。いくつかの実施形態では、ＭｕＬＶは、パッケージング細胞におけるＭｕＬＶエンベロープタンパク質のフューリン媒介開裂を阻害するＳＵｘ突然変異（ＭｕＬＶＳＵｘ）（配列番号４５３）を含む。特定の実施形態では、ＭｕＬＶまたはＭｕＬＶＳＵｘタンパク質の細胞質尾部のＣ末端は、４〜３１個のアミノ酸によって切断されている。特定の実施形態では、ＭｕＬＶまたはＭｕＬＶＳＵｘタンパク質の細胞質尾部のＣ末端は、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、または３１個のアミノ酸によって切断されている。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、シュードタイピング要素は、異なるタンパク質に由来する結合ポリペプチドおよび融合性ポリペプチドを含む。例えば、本明細書に開示される方法および組成物の複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、麻疹ウイルス（ＭＶ）、限定されない例としてＭＶの臨床野生型株、およびエドモンストン株（ＭＶ−Ｅｄｍ）（ＧｅｎＢａｎｋ；ＡＦ２６６２８８．２）またはその断片を含むワクチン株の融合（Ｆ）および／または血球凝集素（Ｈ）ポリペプチドでシュードタイピングされ得る。理論に限定されないが、血球凝集素（Ｈ）および融合（Ｆ）ポリペプチドの両方が宿主細胞への侵入において役割を果たすと考えられており、Ｈタンパク質はＭＶを標的細胞上の受容体ＣＤ４６、ＳＬＡＭ、およびネクチン−４に結合し、Ｆは、レトロウイルスおよび宿主細胞膜の融合を媒介する。例示的な実施形態では、特に標的細胞がＴ細胞および／またはＮＫ細胞である場合、結合ポリペプチドは麻疹ウイルスＨポリペプチドであり、融合性ポリペプチドは麻疹ウイルスＦポリペプチドである。
【０３２３】
いくつかの研究では、切断されたＦおよびＨポリペプチドでシュードタイピングされたレンチウイルス粒子は、力価および形質導入効率が大幅に増加した（Ｆｕｎｋｅ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ．１６（８）：１４２７−１４３６）（Ｆｒｅｃｈａ  ｅｔ  ａｌ．２００８．Ｂｌｏｏｄ．１１２（１３）：４８４３−４８５２）。最高の力価は、Ｆ細胞質尾部が３０残基で切断された場合（ＭＶ（Ｅｄ）−ＦΔ３０（配列番号３１３）と呼ばれる）に得られた。Ｈバリアントでは、１８または１９残基が削除された場合に最適な切断が発生した（ＭＶ（Ｅｄ）−ＨΔ１８（配列番号３１４）またはＭＶ（Ｅｄ）−ＨΔ１９）が、欠失残基のアラニンによる置換の有無にかかわらず２４残基の切断を有するバリアント（ＭＶ（Ｅｄ）−ＨΔ２４（配列番号３１５）およびＭＶ（Ｅｄ）−ＨΔ２４＋Ａ）が最適な力価をもたらした。したがって、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入に誘導されたものを含むいくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法および組成物の複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、麻疹ウイルス融合（Ｆ）および血球凝集素（Ｈ）ポリペプチドの突然変異型またはバリアント、例示的な例では、麻疹ウイルスＦおよびＨポリペプチドの細胞質ドメイン欠失バリアントでシュードタイピングされる。いくつかの実施形態では、突然変異したＦおよびＨポリペプチドは、細胞質部分が切断された、すなわちアミノ酸残基（またはタンパク質をコードする対応する核酸分子のコード核酸）が欠失した「切断されたＨ」または「切断されたＦ」ポリペプチドである。「ＨΔＹ」および「ＦΔＸ」はそれぞれ、そのような切断されたＨおよびＦポリペプチドを示し、「Ｙ」は、細胞質ドメインのアミノ末端から削除された１〜３４残基を指し、「Ｘ」は、カルボキシ末端から削除された１〜３５残基を指す。さらなる実施形態では、「切断されたＦポリペプチド」は、ＦΔ２４またはＦΔ３０であり、および／または「切断されたＨタンパク質」は、ＨΔ１４、ＨΔ１５、ＨΔ１６、ＨΔ１７、ＨΔ１８、ＨΔ１９、ＨΔ２０、ＨΔ２１＋Ａ、ＨΔ２４およびＨΔ２４＋４Ａ、より好ましくはＨΔ１８またはＨΔ２４からなる群から選択される。例示的な実施形態では、切断されたＦポリペプチドはＭＶ（Ｅｄ）−ＦΔ３０であり、切断されたＨポリペプチドはＭＶ（Ｅｄ）−ＨΔ１８である。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、シュードタイピング要素は、異なるタンパク質に由来するポリペプチドを含む。例えば、シュードタイピング要素は、インフルエンザタンパク質ヘマグルチニンＨＡおよび／またはノイラミニダーゼ（ＮＡ）を含み得る。特定の実施形態では、ＨＡはインフルエンザＡウイルスサブタイプＨ１Ｎ１からのものである。例示的な実施形態では、ＨＡは、一塩基性トリプシン依存性開裂部位がより無差別な多塩基性配列（配列番号３１１）に突然変異しているＨ１Ｎ１  ＰＲ８  １９３４からのものである。特定の実施形態では、ＮＡは、インフルエンザＡウイルスサブタイプＨ１０Ｎ７からのものである。例示的な実施形態では、ＮＡは、Ｈ１０Ｎ７−ＨＫＷＦ４４６Ｃ−０７（配列番号３１２）からのものである。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、２つ以上の異種ウイルスからのエンベロープ糖タンパク質と同時シュードタイピングされる。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、ＶＳＶ−Ｇ、またはその機能的バリアントもしくは断片、ならびにＲＤ１１４、ＢａＥＶ、ＭｕＬＶ、インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、および／またはその機能的バリアントもしくは断片からのエンベロープタンパク質で同時シュードタイピングされる。いくつかの実施形態では、ウイルス粒子は、ＶＳＶ−Ｇ、およびＭＶ（Ｅｄ）−Ｈ糖タンパク質または切断された細胞質ドメインを有するＭＶ（Ｅｄ）−Ｈ糖タンパク質と同時シュードタイピングされる。例示的な実施形態では、ウイルス粒子は、ＶＳＶ−ＧおよびＭＶ（Ｅｄ）−ＨΔ２４で同時シュードタイピングされる。特定の実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、ＭｕＬＶまたは切断された細胞質ドメインを有するＭｕＬＶと同時シュードタイピングされる。他の実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、ＭｕＬＶＳＵｘまたは切断された細胞質ドメインを有するＭｕＬＶＳＵｘと同時シュードタイピングされる。さらなる例示的な実施形態では、ＶＳＶ−Ｇは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＭｕＬＶへの融合を用いて同時シュードタイピングされる。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、融合性ポリペプチドは、１つのポリペプチドとして発現される複数の要素を含む。いくつかの実施形態では、結合ポリペプチドおよび融合性ポリペプチドは、同じ転写物からであるが別個のリボソーム結合部位から翻訳され、他の実施形態では、結合ポリペプチドおよび融合性ポリペプチドは、理論に束縛されないが、文献において一般的であるように翻訳後に切断される開裂ペプチド部位、またはリボソームスキップ配列によって分離される。いくつかの実施形態では、別個のリボソーム結合部位からの結合ポリペプチドおよび融合性ポリペプチドの翻訳は、結合性ポリペプチドと比較して、より大量の融合性ポリペプチドをもたらす。いくつかの実施形態では、融合性ポリペプチド対結合ポリペプチドの比は、少なくとも２：１、少なくとも３：１、少なくとも４：１、少なくとも５：１、少なくとも６：１、少なくとも７：１、または少なくとも８：１である。いくつかの実施形態では、融合性ポリペプチド対結合ポリペプチドの比は、範囲の下限の１．５：１、２：１または３：１と、範囲の上限の３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１または１０：１との間である。
【０３２７】
活性化要素
本開示の方法および組成物の態様の多くは、本明細書ではＴ細胞活性化要素とも呼ばれる活性化要素、または活性化要素をコードする核酸を含む。休止Ｔ細胞へのレンチウイルス（ＬＶ）形質導入に関連する制限は、一連の進入前障壁および進入後障壁、ならびに細胞制限因子に起因する（Ｓｔｒｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ  ２００９．ＢＭＣ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ７：４８）。１つの制限は、エンベロープのシュードタイプＬＶ粒子が潜在的な受容体を認識できず、細胞膜との融合を媒介できないことである。しかしながら、特定の条件下では、ＨＩＶ−１ベースのレンチウイルスベクターによる休止Ｔ細胞の形質導入は、主にＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤ３複合体およびＣＤ２８の共刺激後に（Ｋｏｒｉｎ  ＆  Ｚａｃｋ．１９９８．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ．７２：３１６１−８、Ｍａｕｒｉｃｅ  ｅｔ  ａｌ．２００２．Ｂｌｏｏｄ  ９９：２３４２−５０）、ならびにサイトカインへの曝露により（Ｃａｖａｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００３）可能である。
【０３２８】
Ｔリンパ球等の免疫系の細胞は、受容体または受容体複合体を介して特定の抗原を認識してそれと相互作用し、受容体または受容体複合体は、そのような抗原の認識またはそれとの相互作用後に細胞の活性化および体内での拡張をもたらす。そのような受容体の例は、抗原特異的Ｔリンパ球受容体複合体（ＴＣＲ／ＣＤ３）である。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）はＴリンパ球の表面に発現する。１つの成分であるＣＤ３は、リガンドによるＴＣＲの占有に続く細胞内シグナル伝達に関与する。抗原−ＣＤ３複合体（ＴＣＲ／ＣＤ３）のＴリンパ球受容体は、主要組織適合複合体（ＭＨＣ）のタンパク質によって提示される抗原ペプチドを認識する。ＭＨＣおよびペプチドの複合体は、抗原提示細胞およびその他のＴリンパ球標的の表面に発現する。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体の刺激は、Ｔリンパ球の活性化、およびその結果としての抗原特異的免疫応答をもたらす。ＴＣＲ／ＣＤ３複合体は、エフェクター機能および免疫系の調節において中心的な役割を果たす。したがって、本明細書で提供される活性化要素は、Ｔ細胞受容体関連複合体の１つ以上の成分に結合することによって、例えばＣＤ３に結合することによってＴ細胞を活性化する。いくつかの実施形態では、活性化要素は、単独で活性化することができる。他の場合では、活性化は、細胞をさらに活性化するために、ＴＣＲ受容体複合体を介した活性化を必要とする。
【０３２９】
Ｔリンパ球はまた、インビボで完全に活性化するために第２の共刺激シグナルを必要とする。そのようなシグナルがないと、Ｔリンパ球はＴＣＲに結合する抗原に反応しないか、またはアネルギーになる。しかしながら、第２の共刺激シグナルはＴ細胞の形質導入および拡張には必要ない。そのような共刺激シグナルは、例えば、抗原産生細胞上のＣＤ８０およびＣＤ８６と相互作用するＴリンパ球タンパク質であるＣＤ２８によって提供される。本明細書で使用される場合、ＣＤ８０の機能的細胞外断片は、ＣＤ２８と相互作用するその能力を保持する。ＯＸ４０、４−１ＢＢ、およびＩＣＯＳ（Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ＣＯＳｔｉｍｕｌａｔｏｒ）、その他のＴリンパ球タンパク質は、それぞれのリガンドであるＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、およびＩＣＯＳＬＧの１つ以上に結合すると、共刺激シグナルを提供する。
【０３３０】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ＣＤ３複合体の活性化およびＣＤ２８との共刺激は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされた固体表面（例えばビーズ）へのエクスビボ曝露によって生じ得る。本明細書に開示される方法および組成物のいくつかの実施形態では、休止Ｔ細胞は、エクスビボで抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８でコーティングされた固体表面への曝露によって活性化される。他の実施形態では、休止Ｔ細胞またはＮＫ細胞、および例示的な実施形態では休止Ｔ細胞は、可溶性抗ＣＤ３抗体（例えば、５０〜１５０、または７５〜１２５、または１００ｎｇ／ｍｌ）への曝露によって活性化される。例示的な実施形態では事前活性化を伴わない、遺伝子改変または形質導入のための方法の一部となり得るそのような実施形態では、そのような活性化および／または接触は、形質導入反応混合物に抗ＣＤ３を含め、本明細書で提供された期間のずれかでの任意選択のインキュベーションを伴う接触を行うことによって実行され得る。さらに、可溶性抗ＣＤ３によるそのような活性化は、ＰＢＭＣ等のリンパ球、例示的な実施形態ではＮＫ細胞、より例示的な実施形態ではＴ細胞を、抗ＣＤ３を含む培地中でレトロウイルス粒子と接触させた後にインキュベートすることによって生じ得る。そのようなインキュベーションは、例えば、範囲の下限の５、１０、１５、３０、４５、６０、または１２０分間から、範囲の上限の１５、３０、４５、６０、１２０、１８０、または２４０分間まで、例えば１５〜１時間または２時間の間であってもよい。
【０３３１】
本明細書で提供される方法および組成物の特定の例示的な実施形態では、活性化Ｔ細胞表面タンパク質に結合することができるポリペプチドは、本明細書に開示される方法および組成物の複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面上の「活性化要素」として提示され、これもまた本発明の態様である。例示的な実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面上の活性化要素は、ＣＤ３に結合することができる１つ以上のポリペプチドを含み得る。例示的な実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面上の活性化要素は、ＣＤ３のイプシロン鎖（ＣＤ３イプシロン）に結合することができる１つ以上のポリペプチドを含み得る。他の実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面上の活性化要素は、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、および／またはＣＤ８２、ならびに任意選択でＣＤ３に結合できる１つ以上のポリペプチドを含み得る。例示的な実施形態では、活性化要素は、Ｔ細胞表面タンパク質アゴニストであり得る。活性化要素は、Ｔ細胞表面タンパク質のリガンドとして作用するポリペプチドを含むことができる。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞表面タンパク質のリガンドとして作用するポリペプチドは、ＯＸ４０Ｌ、４−１ＢＢＬ、またはＩＣＯＳＬＧのうちの１つ以上であるか、またはそれらを含む。
【０３３２】
いくつかの実施形態では、これらの活性化要素のうちの１つ以上の１つまたは典型的にはそれより多くのコピーが、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面上に発現され得るが、これは、ポリペプチドがシュードタイピング要素とは別個で異なるためである。いくつかの実施形態では、活性化要素は、融合ポリペプチドとして複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面上に発現され得る。例示的な実施形態では、融合ポリペプチドは、１つ以上の活性化要素および１つ以上のシュードタイピング要素を含む。さらなる例示的な実施形態では、融合ポリペプチドは、抗ＣＤ３、例えば抗ＣＤ３ｓｃＦｖ、または抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ、およびウイルスエンベロープタンパク質を含む。一例では、融合ポリペプチドは、Ｍａｕｒｉｃｅら（２００２）に示されているように、ＭｕＬＶエンベロープタンパク質等のウイルスエンベロープタンパク質のアミノ末端に融合したＯＫＴ−３ｓｃＦｖである。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、ウイルスエンベロープタンパク質、例えばＭｕＬＶエンベロープタンパク質（配列番号３４１）、ＭｕＬＶＳＵｘエンベロープタンパク質（配列番号４５４）、ＶＳＶ−Ｇ（配列番号４５５もしくは配列番号４５６）、またはその機能的突然変異体もしくは断片（本明細書で提供される膜タンパク質切断のいずれかを含む）である。そのような融合構築物、および活性化要素がレトロウイルス粒子の表面につながれている他の任意の構築物において、特に全血中のリンパ球を形質導入するための本明細書の組成物および方法の例示的な実施形態は、レトロウイルス粒子の外側にある融合タンパク質の部分に血液タンパク質（例えば、血液因子（例えば第Ｘ因子））開裂部位を含まない。いくつかの実施形態では、融合構築物は、フューリン開裂部位を含まない。フューリンは、検査した全ての哺乳動物細胞で発現する膜結合プロテアーゼであり、その一部は血漿中で分泌され、活性を示す（例えば、Ｃ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｎｔｅｒｎａｌ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１８）２８４；３７７−３８７を参照されたい）。そのようなプロテアーゼ開裂部位を除去するための既知の方法を使用して、融合構築物に突然変異を生じさせることができる。
【０３３３】
ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、またはＩＣＯＳに結合するポリペプチドは、休止Ｔ細胞を活性化する能力があるため、活性化要素と呼ばれる。特定の実施形態では、そのような活性化要素をコードする核酸は、その表面に活性化要素を含む複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子のゲノムに見られる。他の実施形態では、活性化要素をコードする核酸は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子ゲノムには見られない。さらに他の実施形態では、活性化要素をコードする核酸は、ウイルスパッケージング細胞のゲノムに見出される。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、活性化要素は、ＣＤ３に結合することができるポリペプチドである。特定の実施形態では、ＣＤ３に結合することができるポリペプチドは、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、またはＣＤ３Ｚに結合する。例示的な実施形態では、活性化要素は、ＣＤ３Ｅに結合することができるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３に結合することができるポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体、またはＣＤ３に結合する能力を保持するその断片である。例示的な実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその断片は、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ等であるがこれに限定されない、一本鎖抗ＣＤ３抗体である。別の例示的な実施形態では、ＣＤ３に結合することができるポリペプチドは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃである。
【０３３５】
これらに限定されないが、ＵＣＨＴ１、ＯＫＴ−３、ＨＩＴ３Ａ、ＴＲＸ４、Ｘ３５−３、ＶＩＴ３、ＢＭＡ０３０（ＢＷ２６４／５６）、ＣＬＢ−Ｔ３／３、ＣＲＩＳ７、ＹＴＨ１２．５、Ｆ１１１４０９、ＣＬＢ−Ｔ３．４．２、ＴＲ−６６、ＷＴ３１、ＷＴ３２、ＳＰｖ−Ｔ３ｂ、１１Ｄ８、ＸＩＩＩ−１４１、ＸＩＩＩ４６、ＸＩＩＩ−８７、１２Ｆ６、Ｔ３／ＲＷ２−８Ｃ８、Ｔ３／ＲＷ２４Ｂ６、ＯＫＴ３Ｄ、Ｍ−Ｔ３０１、ＳＭＣ２およびＦ１０１．０１を含む多数の抗ヒトＣＤ３モノクローナル抗体およびその抗体断片が利用可能であり、本発明において使用され得る。
【０３３６】
いくつかの実施形態では、活性化要素は、ＣＤ２８に結合することができるポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８に結合することができるポリペプチドは、抗ＣＤ２８抗体、またはＣＤ２８に結合する能力を保持するその断片である。他の実施形態では、ＣＤ２８に結合することができるポリペプチドは、ＣＤ８０、ＣＤ８６、または、ＣＤ２８に結合し、ＣＤ８０の外部断片等のＣＤ２８媒介Ａｋｔの活性化を誘導することができるそれらの機能的断片である。本明細書のいくつかの態様では、ＣＤ８０の外部断片は、ＣＤ８０の通常の細胞位置において細胞の外側に典型的に存在し、ＣＤ２８に結合する能力を保持する断片を意味する。例示的な実施形態では、抗ＣＤ２８抗体またはその断片は、これに限定されないが、抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖ等の一本鎖抗ＣＤ２８抗体である。別の例示的な実施形態では、ＣＤ２８に結合することができるポリペプチドは、ＣＤ８０、またはＣＤ８０の外部断片等のＣＤ８０の断片である。
【０３３７】
抗ＣＤ２８抗体は当該技術分野で知られており、限定されない例として、モノクローナル抗体９．３、ＩｇＧ２ａ抗体（Ｄｒ．Ｊｅｆｆｅｒｙ  Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、Ｂｒｉｓｔｏｌ  Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）、モノクローナル抗体ＫＯＬＴ−２、ＩｇＧ１抗体、１５Ｅ８、ＩｇＧ１抗体、２４８．２３．２、ＩｇＭ抗体、およびＥＸ５．３Ｄ１０、ＩｇＧ２ａ抗体を含み得る。
【０３３８】
例示的な実施形態では、活性化要素は、２つのポリペプチド、ＣＤ３に結合することができるポリペプチドおよびＣＤ２８に結合することができるポリペプチドを含む。
【０３３９】
特定の実施形態では、ＣＤ３またはＣＤ２８に結合することができるポリペプチドは、抗体、一本鎖モノクローナル抗体または抗体断片、例えば一本鎖抗体断片である。したがって、抗体断片は、例えば、一本鎖断片可変領域（ｓｃＦｖ）、抗体の抗体結合（Ｆａｂ）断片、一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦａｂ）、システインを含まない一本鎖抗原結合断片（ｓｃＦａｂΔＣ）、断片可変領域（Ｆｖ）、抗原の隣接エピトープに特異的な構築物（ＣＲＡｂ）、または単一ドメイン抗体（ＶＨもしくはＶＬ）であってもよい。
【０３４０】
本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、活性化要素、またはそれをコードする核酸は、二量体化またはより高次の多量体化モチーフを含み得る。二量体化および多量体化モチーフは当該技術分野で周知であり、当業者は、効果的な二量体化または多量体化のためにそれらをポリペプチドに組み込む方法を理解するであろう。例えば、いくつかの実施形態では、二量体化モチーフを含む活性化要素は、ＣＤ３および／またはＣＤ２８に結合することができる１つ以上のポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、ＣＤ３に結合することができるポリペプチドは、抗ＣＤ３抗体、またはＣＤ３に結合する能力を保持するその断片である。例示的な実施形態では、抗ＣＤ３抗体またはその断片は、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ等であるがこれに限定されない、一本鎖抗ＣＤ３抗体である。別の例示的な実施形態では、ＣＤ３に結合することができるポリペプチドは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃであり、これは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ構築物が別個の二量体化モチーフを必要とすることなく二量体化し得ることが知られているため、いくつかの実施形態では、追加の二量体化モチーフを伴わない二量体化モチーフを有する抗ＣＤ３と見なされる。
【０３４１】
いくつかの実施形態では、二量体化もしくは多量体化モチーフ、またはそれをコードする核酸配列は、ホモ二量体または多量体として自然に存在する膜貫通ポリペプチドからのアミノ酸配列であってもよい。いくつかの実施形態では、二量体化もしくは多量体化モチーフ、またはそれをコードする核酸配列は、天然タンパク質または操作されたタンパク質の断片からのアミノ酸配列であってもよい。一実施形態では、ホモ二量体ポリペプチドは、ロイシンジッパーモチーフ含有ポリペプチド（ロイシンジッパーポリペプチド）である。例えば、ｃ−ＪＵＮに由来するロイシンジッパーポリペプチドであり、その限定されない例は、本明細書のキメラリンパ増殖性要素（ＣＬＥ）に関連して開示されている。
【０３４２】
いくつかの実施形態では、これらの膜貫通ホモ二量体ポリペプチドは、初期活性化抗原ＣＤ６９（ＣＤ６９）、トランスフェリン受容体タンパク質１（ＣＤ７１）、Ｂ細胞分化抗原（ＣＤ７２）、Ｔ細胞表面タンパク質触覚（ＣＤ９６）、エンドグリン（Ｃｄ１０５）、キラー細胞レクチン様受容体サブファミリーＢメンバー１（Ｃｄ１６１）、Ｐ−セレクチン糖タンパク質リガンド１（Ｃｄ１６２）、グルタミルアミノペプチダーゼ（Ｃｄ２４９）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー１６（ＣＤ２７１）、カドヘリン−１（Ｅ−カドヘリン）（Ｃｄ３２４）、またはそれらの活性断片を含み得る。いくつかの実施形態では、二量体化モチーフ、およびそれをコードする核酸は、リガンド（本明細書では二量体化物質または二量体化剤とも呼ばれる）結合後に二量体化する膜貫通タンパク質からのアミノ酸配列を含み得る。いくつかの実施形態では、二量体化モチーフおよび二量体化物質は（二量体化物質は二量体化物質結合対に続く括弧内にある）、ＦＫＢＰおよびＦＫＢＰ（ラパマイシン）；ＧｙｒＢおよびＧｙｒＢ（クメルマイシン）；ＤＨＦＲおよびＤＨＦＲ（メトトレキサート）；またはＤｍｒＢおよびＤｍｒＢ（ＡＰ２０１８７）を含み得る。上記のように、ラパマイシンは二量体として機能し得る。代替として、ラパマイシン誘導体または類似体を使用することができる（例えば、ＷＯ９６／４１８６５；ＷＯ  ９９／３６５５３；ＷＯ  ０１／１４３８７；およびＹｅ  ｅｔ  ａｌ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３：８８−９１を参照されたい）。例えば、ラパマイシンに構造的に関連する類似体、同族体、誘導体、および他の化合物（「ラパログ」）は、とりわけ、ラパマイシンと比較して以下の改変のうちの１つ以上を有するラパマイシンのバリアントを含む：Ｃ７、Ｃ４２および／またはＣ２９におけるメトキシの脱メチル化、脱離または置換；Ｃ１３、Ｃ４３および／またはＣ２８でのヒドロキシの脱離、誘導体化または置換；Ｃ１４、Ｃ２４および／またはＣ３０でのケトンの還元、脱離または誘導体化；６員ピペコリン酸環の５員プロリル環での置換；ならびにシクロヘキシル環での代替的置換またはシクロヘキシル環の置換シクロペンチル環による置換。追加的な情報は、例えば、米国特許第５，５２５，６１０号；米国特許第５，３１０，９０３、米国特許第５，３６２，７１８号；および米国特許第５，５２７，９０７号に示されている。Ｃ−２８ヒドロキシル基の選択的エピマー化が説明されている（例えば、ＷＯ０１／１４３８７を参照されたい）。ラパマイシンの代替として使用するのに適した追加の合成二量体化剤は、米国特許出願公開第２０１２／０１３００７６号に記載されているものを含む。上記のように、クメルマイシンは二量体化剤として役立ち得る。代替として、クメルマイシン類似体を使用することができる（例えば、Ｆａｒｒａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  ３８３：１７８−１８１；および米国特許第６，９１６，８４６号を参照されたい）。上記のように、いくつかの場合では、二量体化剤はメトトレキサート、例えば非細胞毒性のホモ二官能性メトトレキサート二量体である（例えば、米国特許第８，２３６，９２５号を参照された��）。リンパ増殖性要素のいくつかの実施形態は二量体化剤を含むが、いくつかの態様および例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は構成的に活性であり、活性化のために二量体化剤を必要とするリンパ増殖性要素以外である。
【０３４３】
いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面に存在する場合、二量体化モチーフを含む活性化要素は、二量体化剤の非存在下で活性であり得る。例えば、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ９６、Ｃｄ１０５、Ｃｄ１６１、Ｃｄ１６２、Ｃｄ２４９、ＣＤ２７１、Ｃｄ３２４、それらの活性突然変異体、および／またはその活性断片を含む膜貫通ホモ二量体ポリペプチドからの二量体化モチーフを含む活性化要素は、二量体化剤の非存在下で活性であり得る。いくつかの実施形態では、活性化要素は、抗ＣＤ３一本鎖断片であってもよく、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＤ７２、ＣＤ９６、Ｃｄ１０５、Ｃｄ１６１、Ｃｄ１６２、Ｃｄ２４９、ＣＤ２７１、Ｃｄ３２４、それらの活性突然変異体、および／またはその活性断片からなる群から選択される二量体化モチーフを含み得る。
いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面に存在する場合、二量体化モチーフを含む活性化要素は、二量体化剤の存在下で活性であり得る。例えば、ＦＫＢＰ、ＧｙｒＢ、ＤＨＦＲ、またはＤｍｒＢからの二量体化モチーフを含む活性化要素は、それぞれの二量体化剤またはその類似体、例えばそれぞれラパマイシン、クメルマイシン、メトトレキサート、およびＡＰ２０１８７の存在下で活性であり得る。いくつかの実施形態では、活性化要素は、抗ＣＤ３もしくは抗ＣＤ２８に対する一本鎖抗体断片、またはＣＤ３もしくはＣＤ２８に結合する別の分子であってもよく、二量体化モチーフおよび二量体化剤は、ＦＫＢＰおよびラパマイシンもしくはその類似体、ＧｙｒＢおよびクメルマイシンもしくはその類似体、ＤＨＦＲおよびメトトレキサートもしくはその類似体、またはＤｍｒＢおよびＡＰ２０１８７もしくはその類似体からなる群から選択され得る。
【０３４４】
いくつかの実施形態では、活性化要素は、異種シグナル配列および／もしくは異種膜付着配列または膜結合タンパク質に融合され、これらは全て、活性化要素を膜に向けるのを助ける。異種シグナル配列は、活性化要素を小胞体に標的化し、異種膜付着配列は、１つ以上の脂肪酸に共有結合し（翻訳後脂質改変としても知られる）、異種膜付着配列に融合される活性化要素が原形質膜の脂質ラフトに固定されるようにする。いくつかの実施形態では、翻訳後脂質改変は、ミリストイル化、パルミトイル化、またはＧＰＩ固定を介して生じ得る。ミリストイル化は翻訳後タンパク質改変であり、真核生物またはウイルスタンパク質のＮ末端グリシンへの１４炭素飽和脂肪酸であるミリスチン酸の共有結合に対応する。パルミトイル化は翻訳後タンパク質改変であり、Ｃ１６アシル鎖のシステインへの共有結合に対応するが、タンパク質のセリンおよびスレオニン残基への共有結合はそれほど頻繁ではない。ＧＰＩ固定とは、翻訳後改変中にタンパク質のＣ末端にグリコシルホスファチジルイノシトールまたはＧＰＩが結合することを指す。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、異種膜付着配列は、ＧＰＩアンカー付着配列である。異種ＧＰＩアンカー付着配列は、任意の既知のＧＰＩアンカー型タンパク質に由来し得る（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ＭＡＪ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｔ，Ｈａｒｔ  ＧＷ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  Ａｎｃｈｏｒｓ．Ｉｎ：Ｖａｒｋｉ  Ａ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＤ，Ｅｓｋｏ  ＪＤ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００９．Ｃｈａｐｔｅｒ  １１に概説される）。いくつかの実施形態では、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ４８、ＣＤ５５（ＤＡＦ）、ＣＤ５９、ＣＤ８０、およびＣＤ８７からのＧＰＩアンカー付着配列である。いくつかの実施形態では、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、ＣＤ１６に由来する。例示的な実施形態では、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）または崩壊促進因子（ＤＡＦ）、別名補体崩壊促進因子またはＣＤ５５に由来する。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、活性化要素の一方または両方が、活性化要素の細胞膜への直接発現を助けるための異種シグナル配列を含む。パッケージング細胞株で活性な任意のシグナル配列が使用され得る。いくつかの実施形態では、シグナル配列は、ＤＡＦシグナル配列である。例示的な実施形態では、活性化要素は、そのＮ末端でＤＡＦシグナル配列に融合され、そのＣ末端でＧＰＩアンカー付着配列に融合される。
【０３４７】
例示的な実施形態では、活性化要素は、ＣＤ１４に由来するＧＰＩアンカー付着配列に融合された抗ＣＤ３  ｓｃＦｖＦｃ、およびＣＤ１６ｂに由来するＧＰＩアンカー付着配列に融合されたＣＤ８０を含み、両方とも、本明細書で提供される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面に発現される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖＦｃは、そのＮ末端でＤＡＦシグナル配列およびそのＣ末端でＣＤ１４に由来するＧＰＩアンカー付着配列に融合され、ＣＤ８０はそのＮ末端でＤＡＦシグナル配列およびそのＣ末端でＣＤ１６ｂに由来するＧＰＩアンカー付着配列に融合され、両方とも、本明細書で提供される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面に発現される。いくつかの実施形態では、ＤＡＦシグナル配列は、ＤＡＦタンパク質のアミノ酸残基１〜３０を含む。
【０３４８】
膜結合サイトカイン
本明細書で提供される方法および組成物の態様のいくつかの実施形態は、膜結合サイトカイン、または膜結合型サイトカインをコードするポリヌクレオチドを含む。サイトカインは、常にではないが、典型的には分泌タンパク質である。自然に分泌されるサイトカインは、膜結合するように融合タンパク質として操作され得る。膜結合サイトカイン融合ポリペプチドは、本明細書に開示される方法および組成物に含まれ、本発明の一態様でもある。いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に結合し、その増殖および／または生存を促進することができる膜結合サイトカイン融合ポリペプチドをその表面上に有する。典型的には、膜結合ポリペプチドは複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の膜に組み込まれ、細胞が複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子によって形質導入されると、レトロウイルス膜および宿主細胞膜の融合により、ポリペプチドが形質導入された細胞の膜に結合する。
【０３４９】
いくつかの実施形態では、サイトカイン融合ポリペプチドは、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、またはそれらの活性断片を含む。膜結合サイトカイン融合ポリペプチドは、典型的には、異種シグナル配列および／または異種膜付着配列に融合されたサイトカインである。いくつかの実施形態では、異種膜付着配列は、ＧＰＩアンカー付着配列である。異種ＧＰＩアンカー付着配列は、任意の既知のＧＰＩアンカー型タンパク質に由来し得る（Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  ＭＡＪ，Ｋｉｎｏｓｈｉｔａ  Ｔ，Ｈａｒｔ  ＧＷ．Ｇｌｙｃｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ  Ａｎｃｈｏｒｓ．Ｉｎ：Ｖａｒｋｉ  Ａ，Ｃｕｍｍｉｎｇｓ  ＲＤ，Ｅｓｋｏ  ＪＤ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ．Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ．２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（ＮＹ）：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；２００９．Ｃｈａｐｔｅｒ  １１に概説される）。いくつかの実施形態では、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ４８、ＣＤ５５（ＤＡＦ）、ＣＤ５９、ＣＤ８０、およびＣＤ８７からのＧＰＩアンカー付着配列である。いくつかの実施形態では、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、ＣＤ１６に由来する。例示的な実施形態では、異種ＧＰＩアンカー付着配列は、Ｆｃ受容体ＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ）に由来する。いくつかの実施形態では、ＧＰＩアンカーは、ＤＡＦのＧＰＩアンカーである。
【０３５０】
例示的な実施形態では、膜結合サイトカインは、ＤＡＦに融合されたサイトカインの融合ポリペプチドである。ＤＡＦは、パッケージング細胞から出芽する複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の膜に組み込まれる脂質ラフトに蓄積することが知られている。したがって、理論に限定されないが、ＤＡＦ融合タンパク質は、組み換えレトロウイルス膜の一部となるパッケージング細胞の膜の部分を優先的に標的化すると考えられている。
【０３５１】
限定されない例示的な実施形態では、サイトカイン融合ポリペプチドは、ＤＡＦに融合されたＩＬ−７またはその活性断片である。特定の限定されない例示的な実施形態では、融合サイトカインポリペプチドは、ＤＡＦシグナル配列（ＤＡＦの残基１〜３１）、そのシグナル配列を含まないＩＬ−７、およびＤＡＦの残基３６〜５２５を順番に含む。
【０３５２】
パッケージング細胞株／組み換えレトロウイルス粒子の作製方法
本開示は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を産生する哺乳動物パッケージング細胞およびパッケージング細胞株を提供する。複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を産生する細胞株は、本明細書ではパッケージング細胞株とも呼ばれる。そのような方法の限定されない例は、ＷＯ２０１９／０５５９４６に示されている。レトロウイルス粒子を作製するためのさらなる例示的な方法は、本明細書、例えば本明細書の実施例のセクションに記載されている。そのような方法は、例えば、ＧＰＩ結合抗ＣＤ３等のウイルスエンベロープとの融合ではないＴ細胞活性化要素等の追加の膜結合タンパク質をコードする核酸が含まれる場合、４プラスミド系または５プラスミド系を含む（ＷＯ２０１９／０５５４６を参照されたい）。例示的な実施形態では、ＧＰＩ結合抗ＣＤ３等のＴ細胞活性化要素が、ウイルスエンベロープをコードするプラスミドまたはＲＥＶをコードするプラスミド等のパッケージングプラスミドの１つにコードされる４プラスミド系が本明細書で提供され、任意選択で、膜結合サイトカイン等の第２のウイルス膜関連導入遺伝子は、他のパッケージングプラスミドにコードされ得る。いずれの場合も、ウイルスタンパク質をコードする核酸は、ＩＲＥＳまたはＰ２ＡもしくはＴ２Ａ等のリボソームスキップ配列によって導入遺伝子から分離されている。実施例に記載されるような４プラスミド系および関連するポリヌクレオチドは、一過性トランスフェクションにおいて５ベクター系と比較して増加した力価を提供し、したがって、本明細書の例示的な実施形態を提供する。本開示は、標的哺乳動物細胞および標的哺乳動物細胞自体を遺伝子改変する複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を産生するパッケージング細胞株であるパッケージング細胞および哺乳動物細胞株を提供する。例示的な実施形態では、パッケージング細胞は、複製能力のないレトロウイルス粒子のパッケージング可能なＲＮＡゲノム、ＲＥＶタンパク質、ｇａｇポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、およびシュードタイピング要素をコードする核酸配列を含む。
【０３５３】
パッケージング細胞株の細胞は、接着細胞または浮遊細胞であってもよい。例示的な細胞型を、本明細書の以下に記載する。例示的な実施形態では、パッケージング細胞株は、浮遊細胞株、すなわち、成長中に表面に付着しない細胞株であってもよい。細胞は、化学的に定義された培地および／または無血清培地で増殖させることができる。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞株は、付着細胞株に由来する浮遊細胞株であり得、例えば、ＨＥＫ２９３細胞株は、当該技術分野で知られている方法に従って、懸濁液適応ＨＥＫ２９３細胞株を生成する条件で増殖させることができる。パッケージング細胞株は通常、既知組成培地で成長させる。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞株培地は、血清を含み得る。いくつかの実施形態では、パッケージング細胞株培地は、当該技術分野で知られているように、血清代替物を含み得る。例示的な実施形態では、パッケージング細胞株培地は、無血清培地であってもよい。そのような培地は、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）の現在の適正製造基準（ＣＧＭＰ）規制に準拠して製造された、既知組成無血清製剤であってもよい。パッケージング細胞株培地は、異種不含で完全であってもよいいくつかの実施形態では、パッケージング細胞株培地は、ＦＤＡ  ５１０（ｋ）クリアデバイス等のエクスビボ細胞処理で使用するために規制当局によってクリアされている。
【０３５４】
したがって、一態様では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を作製する方法であって、Ａ．パッケージング細胞を無血清培地中で懸濁状態で培養することであって、パッケージング細胞は、複製能力のないレトロウイルス粒子のパッケージング可能なＲＮＡゲノム、ＲＥＶタンパク質、ｇａｇポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、およびシュードタイピング要素をコードする核酸配列を含む、培養することと；Ｂ．無血清培地から複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を採取することとを含む方法が本明細書で提供される。別の態様では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子でリンパ球を形質導入する方法であって、Ａ．パッケージング細胞を無血清培地中で懸濁状態で培養することであって、パッケージング細胞は、複製能力のないレトロウイルス粒子のパッケージング可能なＲＮＡゲノム、ＲＥＶタンパク質、ｇａｇポリペプチド、ｐｏｌポリペプチド、およびシュードタイピング要素をコードする核酸配列を含む、培養することと；Ｂ．無血清培地から複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を採取することと；Ｃ．リンパ球を複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と接触させることであって、接触は、２４時間未満、２０時間未満、１８時間未満、１２時間未満、８時間未満、４時間未満、２時間未満、１時間未満、３０分未満、または１５分未満（または接触の間、およびインキュベーションなし、または範囲の下限の１５分、３０分、１時間、２時間、３時間もしくは４時間から、範囲の上限の１時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、１８時間、２０時間もしくは２４時間まで）行われ、それによってリンパ球が形質導入される、接触させることとを含む方法が本明細書で提供される。
【０３５５】
パッケージング可能なＲＮＡゲノムは、特定の例示的な実施形態では、ｇａｇおよびｐｏｌ等のレトロウイルス成分から、本明細書に開示される操作されたシグナル伝達ポリペプチドのいずれか、および／または１つ以上（例えば２つ以上）の反対方向の（例えば反対の鎖および反対の方向でのコード化）阻害性ＲＮＡ分子を限定されない例として含む、１つ以上の標的ポリペプチドを発現するように設計される。例えば、パッケージング可能なＲＮＡゲノムは、５’から３’に向けて、５’末端反復配列またはその活性切断断片；レトロウイルスのシス作用性ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列；反対方向の操作されたシグナル伝達ポリペプチド等の、第１および任意選択で第２の標的ポリペプチドをコードする核酸配列（これは、５’末端反復配列およびシス作用性ＲＮＡパッケージング要素に対してこの反対方向のプロモーターから排除され得、これはいくつかの実施形態では便宜上「第４の」プロモーターと呼ばれ（また本明細書においてＴ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターと呼ばれることがある）、これはＴ細胞および／またはＮＫ細胞等の標的細胞において活性であるが、例示的な例ではパッケージング細胞において活性ではない、またはパッケージング細胞において誘導的にもしくは最小限に活性である）；ならびに３’末端反復配列またはその活性切断断片を含み得る。いくつかの実施形態では、パッケージング可能なＲＮＡゲノムは、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）／中央終結配列（ＣＴＳ）要素を含み得る。いくつかの実施形態では、レトロウイルスシス作用性ＲＮＡパッケージング要素は、ＨＩＶ  Ｐｓｉであってもよい。いくつかの実施形態では、レトロウイルスシス作用性ＲＮＡパッケージング要素は、Ｒｅｖ応答要素であってもよい。例示的な実施形態では、５’末端反復配列とは反対の方向でプロモーターによって駆動される操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、本明細書に開示される操作されたシグナル伝達ポリペプチドの１つ以上であり、本明細書ならびにＷＯ２０１７／１６５２４５Ａ２、ＷＯ２０１８／００９９２３Ａ１およびＷＯ２０１８／１６１０６４Ａ１でより詳細に開示されるように、任意選択で１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子を発現し得る。
【０３５６】
第１、第２、第３、第４のプロモーター等のプロモーター番号は便宜上のものであることが理解されよう。「第４の」プロモーターと呼ばれるプロモーターは、そのような他のプロモーターが明示的に記載されていない限り、第１、第２または第３のプロモーター等の任意の追加のプロモーターがあることを意味すると解釈されるべきではない。各プロモーターは、適切な細胞型で転写物の発現を駆動することができ、そのような転写物は転写単位を形成することに留意されたい。
【０３５７】
いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、第１のリンパ増殖性要素を含み得る。適切なリンパ増殖性要素は、本明細書の他のセクションに開示されている。限定されない例として、リンパ増殖性要素は、本明細書に開示されるように、ｅＴａｇ等の認識ドメインとの融合物として発現され得る。いくつかの実施形態では、パッケージング可能なＲＮＡゲノムは、本明細書で提供される任意のＣＡＲ実施形態をコードする、キメラ抗原受容体を含む第２の操作されたポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含み得る。例えば、第２の操作されたポリペプチドは、第１の抗原特異的標的化領域、第１の膜貫通ドメイン、および第１の細胞内活性化ドメインを含み得る。抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインの例は、本明細書の他の場所に開示されている。標的細胞がＴ細胞であるいくつかの実施形態では、標的細胞において活性であるプロモーターは、本明細書の他の場所に開示されるように、Ｔ細胞において活性である。
【０３５８】
いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、ＣＡＲを含み得、核酸配列は、本明細書で提供される任意のＣＡＲ実施形態をコードし得る。例えば、操作されたポリペプチドは、第１の抗原特異的標的化領域、第１の膜貫通ドメイン、および第１の細胞内活性化ドメインを含み得る。抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインの例は、本明細書の他の場所に開示されている。いくつかの実施形態では、パッケージング可能なＲＮＡゲノムは、第２の操作されたポリペプチドをコードする核酸配列をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、第２の操作されたポリペプチドは、リンパ増殖性要素であってもよい。標的細胞がＴ細胞またはＮＫ細胞であるいくつかの実施形態では、本明細書の他の場所に開示されているように、標的細胞において活性であるプロモーターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞において活性である。
【０３５９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される態様のいずれかに含まれるパッケージング可能なＲＮＡゲノムは、ＷＯ２０１７／１６５２４５Ａ２、ＷＯ２０１８／００９９２３Ａ１、およびＷＯ２０１８／１６１０６４Ａ１で論じられるように、リボスイッチをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、操作されたシグナル伝達ポリペプチドをコードする核酸配列は、５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲによって確立された５’から３’の方向に対して逆の方向であり得る。さらなる実施形態では、パッケージング可能なＲＮＡゲノムは、リボスイッチをさらに含み得、任意選択でリボスイッチは逆の方向であってもよい。本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、要素のいずれかを含むポリヌクレオチドは、プライマー結合部位を含み得る。例示的な実施形態では、インスレーターおよび／またはポリアデニル化配列を遺伝子の前、後、間、または近くに配置して、無秩序な転写を防止または低減することができる。いくつかの実施形態では、インスレーターは、ニワトリＨＳ４インスレーター、Ｋａｉｓｏインスレーター、ＳＡＲ／ＭＡＲ要素、キメラニワトリインスレーター−ＳＡＲ要素、ＣＴＣＦインスレーター、ジプシーインスレーター、もしくは当該技術分野で知られているβ−グロビンインスレーターまたはそれらの断片であってもよい。いくつかの実施形態では、インスレーターおよび／またはポリアデニル化配列は、ｈＧＨポリＡ（配列番号３１６）、ＳＰＡ１（配列番号３１７）、ＳＰＡ２（配列番号３１８）、ｂ−グロビンポリＡスペーサーＢ（配列番号３１９）、ｂ−グロビンポリＡスペーサーＡ（配列番号３２０）、２５０  ｃＨＳ４インスレーターｖ１（配列番号３２１）、２５０  ｃＨＳ４インスレーターｖ２（配列番号３２２）、６５０  ｃＨＳ４インスレーター（配列番号３２３）、４００  ｃＨＳ４インスレーター（配列番号３２４）、６５０  ｃＨＳ４インスレーターおよびｂ−グロビンポリＡスペーサーＢ（配列番号３２５）、またはｂ−グロビンポリＡスペーサーＢおよび６５０ｃＨＳ４インスレーター（配列番号３２６）であってもよい。
【０３６０】
本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、Ｖｐｘをコードする核酸配列は、第２もしくは任意選択の第３の転写単位上、または第１の誘導性プロモーターに作動可能に連結される追加の転写単位上にあり得る。
【０３６１】
本開示のいくつかの態様は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入のためのレンチウイルス等の複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を作製するためのパッケージング細胞として使用される細胞、例示的な例では哺乳動物細胞を含むか、またはそれらの細胞である。
【０３６２】
本発明によれば、ウイルスまたはウイルス粒子、例えばリダイレクトされた組み換えレトロウイルス粒子のインビトロ産生のために、多種多様な細胞のいずれかを選択することができる。真核細胞、特にヒト、サル、イヌ、ネコ、ウマおよびげっ歯類の細胞を含む哺乳動物細胞が典型的に使用される。例示的な例では、細胞は、ヒト細胞である。さらなる例示的な実施形態では、細胞は無制限に複製し、したがって不死である。本発明において有利に使用され得る細胞の例には、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞、ＣＯＳ細胞、Ｍａｄｉｎ−Ｄａｒｂｙイヌ腎臓細胞、ヒト胎児２９３Ｔ細胞、および２９３Ｔ細胞に由来するｇｐｎｌｓｌａｃＺφＮＸ細胞等のそのような細胞に由来する任意の細胞が含まれる。ヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞等の高度にトランスフェクト可能な細胞が使用され得る。「高度にトランスフェクト可能」とは、細胞の少なくとも約５０％、より好ましくは少なくとも約７０％、最も好ましくは少なくとも約８０％が、導入されたＤＮＡの遺伝子を発現できることを意味する。
【０３６３】
適切な哺乳動物細胞は、一次細胞および不死化細胞株を含む。適切な哺乳動物細胞株は、ヒト細胞株、非ヒト霊長類細胞株、げっ歯類（例えば、マウス、ラット）細胞株等を含む。適切な哺乳動物細胞株は、これらに限定されないが、ＨｅＬａ細胞（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）Ｎｏ．ＣＣＬ−２）、ＣＨＯ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ９６１８、ＣＣＬ６１、ＣＲＬ９０９６）、２９３細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１５７３）、Ｖｅｒｏ細胞、ＮＩＨ  ３Ｔ３細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ−１６５８）、Ｈｕｈ−７細胞、ＢＨＫ細胞（例えば、ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬ１０）、ＰＣ１２細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１７２１）、ＣＯＳ細胞、ＣＯＳ−７細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１６５１）、ＲＡＴ１細胞、マウスＬ細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＣＬＩ．３）、ヒト胚性腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＡＴＣＣ  Ｎｏ．ＣＲＬ１５７３）、ＨＬＨｅｐＧ２細胞、Ｈｕｔ−７８、Ｊｕｒｋａｔ、ＨＬ−６０等を含む。
【０３６４】
レトロウイルスゲノムサイズ
本明細書で提供される方法および組成物において、組み換えレトロウイルスゲノム、限定されない例示的な例ではレンチウイルスゲノムは、ウイルス粒子にパッケージングされ得るポリヌクレオチドの数に制限を有する。本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドコード領域によってコードされるポリペプチドは、ポリヌクレオチドコード領域が野生型ポリペプチドのポリヌクレオチドコード領域よりも少ないヌクレオチドによってコードされるような機能的活性を保持する切断または他の欠失であってもよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドコード領域によってコードされるポリペプチドは、１つのプロモーターから発現され得る融合ポリペプチドであってもよい。いくつかの実施形態では、融合ポリペプチドは、１つの融合ポリペプチドおよび１つのプロモーターから２つ以上の機能的ポリペプチドを生成するための開裂シグナルを有し得る。さらに、最初のエクスビボ形質導入後に必要とされないいくつかの機能は、レトロウイルスゲノムに含まれず、むしろ、パッケージング細胞膜を介して複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の表面に存在する。これらの様々な戦略は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子内にパッケージされている機能的要素を最大化するために本明細書で使用される。
【０３６５】
いくつかの実施形態では、パッケージングされる組み換えレトロウイルスゲノムは、範囲の下限の１，０００、２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、および８，０００ヌクレオチドから、範囲の上限の２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、および１１，０００ヌクレオチドの間であってもよい。パッケージングされるレトロウイルスゲノムは、本明細書に詳細に開示されるように、第１および第２の操作シグナル伝達ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド領域を含む。いくつかの実施形態では、パッケージングされる組み換えレトロウイルスゲノムは、５，０００、６，０００、７０００、８，０００、９，０００、１０，０００、または１１，０００ヌクレオチド未満であってもよい。パッケージングすることができる本明細書の他の場所で論じられる機能は、レトロウイルスのアセンブリおよびパッケージングに必要なレトロウイルス配列、例えば、レトロウイルスのｒｅｖ、ｇａｇ、およびｐｏｌコード領域、ならびに５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲ、またはそれらの活性な切断された断片、レトロウイルスシス作用性ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列、ならびにｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素を含む。さらに、例示的な実施形態では、本明細書の複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、以下のいずれか１つ以上または全てを含むことができ、いくつかの実施形態では、レトロウイルス５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲによって確立される５’から３’の方向に対して逆の方向である（限定されない例としてＷＯ２０１９／０５５９４６に示されている）：第１および第２の操作シグナル伝達ポリペプチドをコードする１つ以上のポリヌクレオチド領域（その少なくとも１つは少なくとも１つのリンパ増殖性要素を含む）；キメラ抗原受容体を含み得る第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチド；ｍｉＲＮＡ、リボスイッチ等の制御要素（これは典型的には第１および／もしくは第２の操作シグナル伝達ポリペプチドの発現を調節する）；認識ドメイン、イントロン、Ｔ細胞等の標的細胞において活性なプロモーター、２Ａ開裂シグナルならびに／またはＩＲＥＳ。
【０３６６】
組み換えレトロウイルス粒子
組み換えレトロウイルス粒子は、例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を形質導入して遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞を作製するために、本明細書で提供される方法および組成物に開示されている。組み換えレトロウイルス粒子は、それ自体が本発明の態様である。典型的には、本明細書で提供される態様に含まれる組み換えレトロウイルス粒子は複製能力がなく、これは、組み換えレトロウイルス粒子がパッケージング細胞を離れると複製できないことを意味する。例示的な実施形態では、組み換えレトロウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。
【０３６７】
いくつかの態様では、細胞、典型的にはリンパ球および例示的な実施形態ではＴ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入において使用するための複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が、本明細書で提供される。複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、本明細書の他の場所で論じられているシュードタイピング要素のいずれかを含み得る。いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、本明細書の他の場所で論じられる活性化要素のいずれかを含み得る。一態様では、Ａ．Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の転写単位であって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする１つ以上の転写単位と；Ｂ．その表面上のシュードタイピング要素およびＴ細胞活性化要素であって、Ｔ細胞活性化要素は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子中のポリヌクレオチドによってコードされていない、シュードタイピング要素およびＴ細胞活性化要とを含むポリヌクレオチドを含む複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化要素は、本明細書の他の場所で論じられている活性化要素のいずれかであり得る。例示的な実施形態では、Ｔ細胞活性化要素は、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖＦｃであり得る。別の態様では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の転写単位を含むポリペプチドを含む複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が本明細書で提供され、１つ以上の転写単位は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第１のポリペプチドおよびリンパ増殖性要素を含む第２のポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、キメラリンパ増殖性要素であり得る。例示的な実施形態では、リンパ増殖性要素は、ＩＬ−７受容体アルファ鎖またはその断片につながれたＩＬ−７を含まない。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体ベータ鎖につながれたＩＬ−１５を含まない。
【０３６８】
いくつかの態様では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の転写単位を含むポリペプチドを含む複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が本明細書で提供され、１つ以上の転写単位は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第１のポリペプチドおよびキメラリンパ増殖性要素、例えば構成的に活性なキメラリンパ増殖性要素を含む第２のポリペプチドをコードする。例示的な実施形態では、キメラリンパ増殖性要素は、その同族受容体につながれた、またはその同族受容体の断片につながれたサイトカインを含まない。
【０３６９】
いくつかの態様では、（ｉ）Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に結合し、それへの組換えレトロウイルス粒子の膜融合を促進することができるシュードタイピング要素と；（ｉｉ）Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の転写単位を有するポリヌクレオチド（１つ以上の転写単位は、抗原特異的標的化領域、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を有する第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチド、ならびに少なくとも１つのリンパ増殖性要素を含む第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドをコードし、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドおよび／または第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドの発現は、インビボ制御要素によって調節される）と；（ｉｉｉ）その表面上の活性化要素であって、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に結合することができ、組み換えレトロウイルス粒子中のポリヌクレオチドによってコードされていない活性化要素とを含む、組み換えレトロウイルス粒子が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターは、パッケージング細胞株において活性ではないか、または誘導可能な様式でパッケージング細胞株において活性であるのみである。本明細書に開示される実施形態のいずれかにおいて、第１および第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドのいずれかは、キメラ抗原受容体を有することができ、他の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、少なくとも１つのリンパ増殖性要素を有することができる。
【０３７０】
複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子に含まれる様々な要素および要素の組み合わせ、例えば、シュードタイピング要素、活性化要素、および膜結合サイトカイン、ならびに、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子のゲノムに含まれる核酸配列、例えば、これらに限定されないが、ＣＡＲをコードする核酸；リンパ増殖性要素をコードする核酸；リボスイッチ等の制御要素をコードする核酸；プロモーター、特にＴ細胞において構成的に活性または誘導性であるプロモーター；および阻害性ＲＮＡ分子をコードする核酸等が、本開示全体を通して提供される。さらに、組み換えレトロウイルス粒子を作製する方法、養子細胞療法を実行する方法、およびＴ細胞を形質導入する方法等の本明細書で提供される様々な態様は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を生成および／または含む。そのような方法自体で生成および／または含まれる複製能力のない組み換えレトロウイルスは、単離された形態であってもよい複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子組成物として本発明の別個の態様を形成する。そのような組成物は、乾燥（例えば凍結乾燥）形態であってもよく、またはレトロウイルス粒子の貯蔵および使用のための当該技術分野で知られている適切な溶液もしくは培地であってもよい。
【０３７１】
したがって、限定されない例として、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を有するポリヌクレオチドをゲノム内に有する複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が本明細書において別の態様で提供され、これは、いくつかの場合において、本明細書に記載のように、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードする第１の核酸配列、およびキメラ抗原受容体、またはＣＡＲをコードする第２の核酸配列を含む。他の実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子ではない、本明細書で前述した少なくとも１つのリンパ増殖性要素をコードする第３の核酸配列が存在する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチドは、存在する場合、第１の核酸配列、第２の核酸配列、および／または第３の核酸配列に作動可能に連結される、本明細書に提示されるような１つ以上のリボスイッチを含む。そのような構築物では、１つ以上の阻害性ＲＮＡ、ＣＡＲ、および／または阻害性ＲＮＡではない１つ以上のリンパ増殖性要素の発現は、リボスイッチによって制御される。いくつかの実施形態では、２〜１０個の阻害性ＲＮＡ分子は、第１の核酸配列によってコードされる。さらなる実施形態では、２〜６個の阻害性ＲＮＡ分子は、第１の核酸配列によってコードされる。例示的な実施形態では、４つの阻害性ＲＮＡ分子は、第１の核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、イントロン内に位置する。特定の実施形態では、イントロンは、プロモーターの全部または一部を含む。プロモーターは、Ｐｏｌ  Ｉ、Ｐｏｌ  ＩＩ、またはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターであり得る。いくつかの例示的な実施形態では、プロモーターは、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである。いくつかの実施形態では、イントロンは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに隣接し、その下流にある。いくつかの実施形態では、イントロンは、ＥＦ１−αイントロンＡである。
【０３７２】
本明細書における組み換えレトロウイルス粒子の実施形態は、レトロウイルス粒子が、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子をコードする１つ以上の核酸を含むゲノムを含むものを含む。レトロウイルス粒子のゲノムに含まれ得る阻害性ＲＮＡ分子をコードするそのような核酸の様々な代替の実施形態は、そのような核酸と、ＣＡＲまたは阻害性ＲＮＡ分子以外のリンパ増殖性要素をコードする他の核酸との組み合わせを含めて、例えば本明細書で、およびこれらの実施形態を組み合わせた他の様々な段落で提供される阻害性ＲＮＡセクションに含まれる。さらに、そのような複製能力のない組み換えレトロウイルスの様々な代替物は、本明細書に開示されるパッケージング細胞株の態様内で開示される例示的な核酸によって特定され得る。当業者は、１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードするゲノムを含む組み換えレトロウイルス粒子のこのセクションにおける開示が、本明細書の他のセクションで提供される阻害性ＲＮＡ分子をコードするそのような核酸の様々な代替物と組み合わせることができることを認識するであろう。さらに、当業者は、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子をコードするそのような核酸が、例えば、阻害性ＲＮＡ分子およびこれらの分子をコードする核酸に焦点を当てている本明細書のセクションに開示されるように、本明細書で提供される様々な他の機能的核酸要素と組み合わせることができることを認識するであろう。さらに、本明細書の他のセクションで提供される特定の阻害性ＲＮＡ分子の様々な実施形態は、本開示の組み換えレトロウイルス粒子の態様で使用され得る。
【０３７３】
レンチウイルスベクター等の組み換えレトロウイルスベクターの必要な要素は、当該技術分野で知られている。これらの要素は、パッケージング細胞株のセクション、および実施例のセクションで提供され、ＷＯ２０１９／０５５９４６に示されているような複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を作製するための詳細に含まれている。例えば、レンチウイルス粒子は、典型的には、１つ以上のパッケージングプラスミドを介してパッケージング細胞株に送達され得るパッケージング要素ＲＥＶ、ＧＡＧおよびＰＯＬ、シュードタイピングプラスミドを介してパッケージング細胞株に送達され得るシュードタイピング要素（その様々な例は本明細書に記載されている）、ならびにトランスファープラスミドを介して宿主細胞に送達されるポリヌクレオチドによって生成されるゲノムを含む。このポリヌクレオチドは、典型的には、ウイルスＬＴＲおよびｐｓｉパッケージングシグナルを含む。５’ＬＴＲは、Ｔａｔトランス活性化に依存しない５’ＬＴＲを含む、異種プロモーターに融合されたキメラ５’ＬＴＲであってもよい。トランスファープラスミドは、例えば３’ＬＴＲのＵ３領域を除去することにより、自己不活化し得る。いくつかの限定されない実施形態では、Ｓｒｃ−ＦＬＡＧ−Ｖｐｕを含むがこれらに限定されない、Ｖｐｕを含むポリペプチド（本明細書では「Ｖｐｕポリペプチド」と呼ばれることがある）等のＶｐｕは、レトロウイルス粒子を含む本明細書で提供される任意の組成物または方法の態様および実施形態に関して、レトロウイルス粒子内にパッケージングされる。いくつかの限定されない実施形態では、Ｓｒｃ−ＦＬＡＧ−Ｖｐｘ等のＶｐｘは、レトロウイルス粒子内にパッケージングされる。理論に限定されないが、Ｔ細胞の伝達時に、Ｖｐｘは細胞のサイトゾルに入ってＳＡＭＨＤ１の分解を促進し、逆転写に利用できる細胞質ｄＮＴＰのプールを増加させる。いくつかの限定されない実施形態では、ＶｐｕおよびＶｐｘは、本明細書で提供されるレトロウイルス粒子を含む任意の組成物または方法の態様および実施形態に関して、レトロウイルス粒子内にパッケージングされる。
【０３７４】
本発明の様々な態様に含まれるレトロウイルス粒子（例えばレンチウイルス粒子）は、例示的な実施形態では、特にそのようなレトロウイルス粒子で形質導入された細胞を対象に導入することを含む実施形態の安全上の理由から、複製能力がない。複製能力のないレトロウイルス粒子を使用して細胞を形質導入する場合、形質導入された細胞からレトロウイルス粒子は生成されない。ゲノムを含むレトロウイルス粒子が複製能力がないことを保証するためのレトロウイルスゲノムへの改変は、当該技術分野で知られている。しかしながら、本明細書で提供される態様のいずれかのいくつかの実施形態では、複製能力のある組み換えレトロウイルス粒子が使用され得ることが理解されるであろう。
【０３７５】
当業者は、本明細書で論じられる機能的要素が、発現ベクター等の異なるタイプのベクターを使用して、パッケージング細胞および／またはＴ細胞に送達され得ることを認識するであろう。本発明の例示的な態様は、レトロウイルスベクター、およびいくつかの特に例示的な実施形態ではレンチウイルスベクターを利用する。他の適切な発現ベクターを使用して、本明細書の特定の実施形態を達成することができる。そのような発現ベクターは、これらに限定されないが、ウイルスベクター（例えば、ワクシニアウイルス；ポリオウイルス；アデノウイルス（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：２５４３  ２５４９，１９９４；Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：５１５  ５２４，１９９９；Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ  ９２：７７００  ７７０４，１９９５；Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１０８８  １０９７，１９９９；ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照されたい）；アデノ随伴ウイルス（例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：８１  ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：６９１６  ６９２１，１９９７；Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３８：２８５７  ２８６３，１９９７；Ｊｏｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：６８３  ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：６４１  ６４８，１９９９；Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５：５９１  ５９４，１９９６；Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｉｎ  ＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８；Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５；およびＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照されたい）；ＳＶ４０；単純ヘルペスウイルス；またはレトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾臓壊死ウイルス、ならびにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、および乳腺腫瘍ウイルス等のレトロウイルスに由来するベクター）、例えばガンマレトロウイルス；またはヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：１０３１９  ２３，１９９７；Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７８１２  ７８１６，１９９９を参照されたい）等をベースとしたウイルスベクター）を含む。
【０３７６】
本明細書に開示されるように、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、遺伝子送達のための一般的なツールである（Ｍｉｌｌｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ（１９９２）３５７：４５５−４６０）。複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が再構成されていない核酸配列を広範囲のげっ歯類、霊長類およびヒトの体細胞に送達する能力により、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、遺伝子を細胞に移すのに非常に適している。いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、アルファレトロウイルス属、ベータレトロウイルス属、ガンマレトロウイルス属、デルタレトロウイルス属、イプシロンレトロウイルス属、レンチウイルス属、またはスプマウイルス属に由来し得る。本明細書に開示される方法での使用に適した多くのレトロウイルスが存在する。例えば、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）、藤波肉腫ウイルス（ＦｕＳＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍｏ−ＭＬＶ）、ＦＢＲネズミ骨肉腫ウイルス（ＦＢＲ  ＭＳＶ）、モロニーネズミ肉腫ウイルス（Ｍｏ−ＭＳＶ）、アベルソンネズミ白血病ウイルス（Ａ−ＭＬＶ）、トリ骨髄球腫症ウイルス−２９（ＭＣ２９）、およびトリ赤芽球症ウイルス（ＡＥＶ）が使用され得る。レトロウイルスの詳細なリストは、Ｃｏｆｆｉｎら（“Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ”１９９７  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  Ｅｄｓ：Ｊ  Ｍ  Ｃｏｆｆｉｎ，Ｓ  Ｍ  Ｈｕｇｈｅｓ，Ｈ  Ｅ  Ｖａｒｍｕｓ  ｐｐ  ７５８−７６３）に見出すことができる。いくつかのレトロウイルスのゲノム構造の詳細は、当該技術分野で見出すことができる。例として、ＨＩＶの詳細は、ＮＣＢＩ  Ｇｅｎｂａｎｋ（すなわち、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．ＡＦ０３３８１９）から見出すことができる。
【０３７７】
例示的な実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、レンチウイルス属に由来し得る。いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、ＨＩＶ、ＳＩＶ、またはＦＩＶに由来し得る。さらなる例示的な実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、レンチウイルス属のヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）に由来し得る。レンチウイルスは複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖに加えて、調節機能または構造機能を持つ他の遺伝子を含む。より高い複雑さにより、潜伏感染の過程のように、レンチウイルスはそのライフサイクルを調整することができる。典型的なレンチウイルスは、エイズの病原体であるヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である。インビボでは、ＨＩＶは、リンパ球およびマクロファージ等、めったに分裂しない最終分化細胞に感染し得る。
【０３７８】
例示的な実施形態では、本明細書で提供される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、Ｖｐｘポリペプチドを含む。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、Ｖｐｕポリペプチドを含む、および／または含有する。
【０３８０】
例示的な実施形態では、レトロウイルス粒子はレンチウイルス粒子である。そのようなレトロウイルス粒子は、典型的には、ウイルスエンベロープ内に位置するキャプシド内にレトロウイルスゲノムを含む。
【０３８１】
いくつかの実施形態では、組み換えレトロウイルス粒子の代わりに、ＤＮＡ含有ウイルス粒子が利用される。そのようなウイルス粒子は、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス、サイトメガロウイルス、ポックスウイルス、アビポックスウイルス、インフルエンザウイルス、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）、またはシンドビスウイルスであってもよい。当業者は、異なるウイルスおよびレトロウイルス、またはレトロウイルス粒子とともに使用するために本明細書に開示される方法を改変する方法を理解するであろう。ＤＮＡゲノムを含むウイルス粒子が使用される場合、当業者は、ウイルス粒子のＤＮＡゲノムの全部または一部の、そのようなウイルスで形質導入されたＴ細胞のゲノムへの組み込みを誘導するためにそのようなゲノムに機能単位を含めることができることを理解するであろう。
【０３８２】
いくつかの実施形態では、ＨＩＶ  ＲＲＥおよびＨＩＶ  Ｒｅｖをコードするポリヌクレオチド領域は、Ｎ末端ＲＧＧボックスＲＮＡ結合モチーフおよびＩＣＰ２７をコードするポリヌクレオチド領域で置き換えることができる。いくつかの実施形態では、ＨＩＶ  Ｒｅｖをコードするポリヌクレオチド領域は、アデノウイルスＥ１Ｂ  ５５−ｋＤａおよびＥ４  Ｏｒｆ６をコードする１つ以上のポリヌクレオチド領域で置き換えることができる。
【０３８３】
一態様では、本明細書で提供される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の態様のいずれかによる、単離された複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を含むコンテナ、例えば市販のコンテナもしくはパッケージ、またはそれを含むキットが本明細書で提供される。さらに、別の態様では、本明細書で提供されるパッケージング細胞および／またはパッケージング細胞株の態様のいずれかによる、単離されたパッケージング細胞、例示的な実施形態ではパッケージング細胞株からの単離されたパッケージング細胞を含むコンテナ、例えば市販のコンテナもしくはパッケージ、またはそれを含むキットが本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、キットは、本明細書で提供される方法で使用される緩衝液または試薬等の追加の試薬を含む追加のコンテナを含む。さらに、特定の態様では、本明細書で提供される任意の態様によるＴ細胞またはＮＫ細胞を遺伝子改変するためのキットの製造における、任意の態様で本明細書で提供される任意の複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の使用が本明細書で提供される。さらに、特定の態様では、本明細書で提供される任意の態様による複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を生成するためのキットの製造における、任意の態様で本明細書で提供される任意のパッケージング細胞またはパッケージング細胞株の使用が本明細書で提供される。
【０３８４】
一態様では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を含む市販のコンテナ、および対象における腫瘍増殖を処置するためのその使用説明書が本明細書で提供され、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結した１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドをそのゲノム内に含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸配列の核酸配列は、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の核酸配列の核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子をコードし得る。
【０３８５】
組み換えレトロウイルス粒子を含むコンテナは、チューブ、バイアル、プレートのウェル、または組み換えレトロウイルス粒子を貯蔵するための他の容器であってもよい。キットは２つ以上のコンテナを含むことができ、第２または他のコンテナは、例えば、Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞の形質導入のための溶液もしくは培地を含んでもよく、ならびに／または第２もしくは他のコンテナは、ｐＨ調節薬理学的作用物質を含んでもよい。これらのコンテナはいずれも、工業用の強度およびグレードのものであってもよい。キットおよび阻害性ＲＮＡ分子をコードする核酸を含むそのような態様における複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、本明細書で提供される阻害性ＲＮＡの実施形態のいずれかを含む、本明細書で提供されるそのような複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の実施形態のいずれかであってもよい。
【０３８６】
別の態様では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を遺伝子改変するためのキットの製造における複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の使用が本明細書で提供され、キットの使用は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子とエクスビボで接触させることを含み、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、表面上のシュードタイピング要素および表面上のＴ細胞活性化要素を含み、前記接触は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子によるＴ細胞またはＮＫ細胞の形質導入を促進し、それによって遺伝子改変Ｔ細胞またはＮＫ細胞を生成する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、対象からのものであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化要素は、膜結合され得る。いくつかの実施形態では、接触は、範囲の下限の１、２、３、４、５、６、７、または８時間から、範囲の上限の４、５、６、７、８、１０、１２、１５、１８、２１、および２４時間まで、例えば１〜１２時間の間行われ得る。キットの製造に使用するための複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、本明細書の他の場所で論じられる態様、実施形態、または下位実施形態のいずれかを含み得る。
【０３８７】
別の態様では、活性成分として複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を含む、癌または腫瘍成長を処置または予防するための医薬組成物が本明細書で提供される。別の態様では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を含む、癌または腫瘍成長を処置または予防するための注入組成物または他の送達溶液が本明細書で提供される。医薬組成物または注入組成物の複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、上記または本明細書の他の場所で論じられた態様、実施形態、または下位実施形態のいずれかを含み得る。
【０３８８】
遺伝子改変されたＴ細胞およびＮＫ細胞
本明細書の方法および組成物の実施形態では、遺伝子改変されたリンパ球が生成され、それ自体が本発明の別個の態様である。そのような遺伝子改変リンパ球は、遺伝子改変および／または形質導入されたリンパ球であってもよい。一態様では、本明細書で提供される血液またはその成分中のＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変するための任意の態様による方法を使用して作製される、遺伝子改変されたＴ細胞またはＮＫ細胞が本明細書で提供される例えば、いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドを発現するように遺伝子改変されている。例示的な実施形態では、第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチドは、リンパ増殖性要素、または抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むＣＡＲであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、ＣＡＲまたはリンパ増殖性要素であってもよい第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、キメラリンパ増殖性要素であり得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、表面上にシュードタイピング要素をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞は、表面上に活性化要素をさらに含み得る。遺伝子改変されたＴ細胞またはＮＫ細胞のＣＡＲ、リンパ増殖性要素、シュードタイピング要素、および活性化要素は、本明細書に開示される態様、実施形態、または下位実施形態のいずれかを含み得る。例示的な実施形態では、活性化要素は、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖＦｃ等の抗ＣＤ３抗体であり得る。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変リンパ球は、少なくとも１つのリンパ増殖性要素を含む第１の操作されたシグナル伝達ポリペプチド、ならびに／または、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を含む第２の操作されたシグナル伝達ポリペプチドを発現するように遺伝子改変されたＴ細胞またはＮＫ細胞等のリンパ球である。本明細書の態様のいずれかのいくつかの実施形態では、ＮＫ細胞はＮＫＴ細胞である。ＮＫＴ細胞は、ＣＤ３を発現し、典型的にはαβＴ細胞受容体を共発現するＴ細胞のサブセットであるが、典型的にはＮＫ細胞に関連する様々な分子マーカー（ＮＫ１．１またはＣＤ５６等）も発現する。
【０３９０】
本開示の遺伝子改変されたリンパ球は、組み換えＤＮＡ法によってリンパ球に導入された異種核酸配列を保有する。例えば、例示的な実施形態における異種配列は、本明細書で提供されるリンパ球を形質導入するための方法の間にリンパ球に挿入される。異種核酸はリンパ球内に見出され、いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたリンパ球のゲノムに組み込まれるか、または組み込まれない。
【０３９１】
例示的な実施形態では、異種核酸は、遺伝子改変されたリンパ球のゲノムに組み込まれる。そのようなリンパ球は、例示的な実施形態では、組み換えレトロウイルス粒子を利用する、本明細書で提供されるリンパ球を形質導入するための方法を使用して生成される。そのような組み換えレトロウイルス粒子は、典型的には少なくとも抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチドを含み得る。本明細書において、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子および複製能力のないレトロウイルス粒子のゲノムにコードされるポリヌクレオチドの様々な実施形態が本開示の他のセクションで提供され、これは、それ自体が本開示の別の態様を形成する遺伝子改変リンパ球を生成するために使用され得る。
【０３９２】
本開示の遺伝子改変リンパ球は、体外で単離され得る。例えば、そのようなリンパ球は、本明細書で提供されるようなエクスビボ形質導入に使用される培地および他の溶液に見出すことができる。リンパ球は、本明細書で提供される方法で対象から採取された血液中に遺伝子改変されていない形態で存在し、次いで形質導入の方法の間に遺伝子改変され得る。遺伝子改変されたリンパ球は、それらが遺伝子改変された後に対象に導入または再導入された後、対象の内部に見出すことができる。遺伝子改変リンパ球は、休止Ｔ細胞もしくは休止ＮＫ細胞であってもよく、または、遺伝子改変Ｔ細胞もしくはＮＫ細胞は、特に、本明細書で開示されるような形質導入後にＴ細胞またはＮＫ細胞に挿入される核酸中に提供される機能要素のいくつかを発現した後、活発に分裂し得る。
【０３９３】
一態様では、そのゲノムにおいて、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の転写単位を含む組み換えポリヌクレオチドを含む、形質導入および／または遺伝子改変Ｔ細胞またはＮＫ細胞が本明細書で提供される。
【０３９４】
いくつかの実施形態では、遺伝子改変リンパ球、例示的な実施形態では血またはその成分中のＴ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入のためのいずれかの態様に関連するＴ細胞および／またはＮＫ細胞が本明細書で提供され、これは、１つ、２つまたはそれ以上（例えば、１〜１０、２〜１０、４〜１０、１〜６、２〜６、３〜６、４〜６、１〜４、２〜４、３〜４個）の阻害性ＲＮＡ分子をコードする転写単位を含む。いくつかの実施形態では、そのような阻害性ＲＮＡ分子はリンパ増殖性要素であり、したがって、それらがＴ細胞および／またはＮＫ細胞の増殖を誘導するか、または本明細書で提供されるリンパ増殖性要素について別様に試験に適合する限り、リンパ増殖性要素として本明細書に開示される任意の態様または実施形態に含めることができる。
【０３９５】
様々な標的ＲＮＡを対象とする阻害性ＲＮＡ分子は、本明細書で提供される態様のいずれかの実施形態で使用することができる。例えば、１つ（例えば２つ）以上の阻害性ＲＮＡ分子の１つ、ほとんどまたは全てが、内因性ＴＣＲの発現を減少させる。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ標的は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３ゼータ、ＳＯＣＳ、ＳＭＡＤ２、ｍｉＲ−１５５標的、ＩＦＮガンマ、ｃＣＢＬ、ＴＲＡＩＬ２、ＰＰ２Ａ、およびＡＢＣＧ１からなる群から選択される遺伝子から転写されるｍＲＮＡである。この態様のいくつかの実施形態では、１つ（例えば２つ）以上の阻害性ＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つが、ｍｉＲ−１５５である。
【０３９６】
Ｔ細胞またはＮＫ細胞が１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子およびＣＡＲ、またはそれをコードする核酸を含む直前の態様のいくつかの実施形態では、ＣＡＲのＡＳＴＲはＭＲＢ  ＡＳＴＲである、および／またはＣＡＲのＡＳＴＲは腫瘍関連抗原に結合する。さらに、上記の態様のいくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、例えばヌクレオシド類似体に結合することができるリボスイッチに作動可能に連結され、例示的な実施形態では、これはアシクロビル等の抗ウイルス薬である。
【０３９７】
本明細書に開示される方法および組成物において、操作されたシグナル伝達ポリペプチドの発現は、制御要素によって調節され、いくつかの実施形態では、制御要素は、リボスイッチを含むポリヌクレオチドである。特定の実施形態では、リボスイッチは、ヌクレオシド類似体に結合することができ、ヌクレオシド類似体が存在する場合、操作されたシグナル伝達ポリペプチドの一方または両方が発現される。
【０３９８】
核酸
本開示は、本開示のポリペプチドをコードする核酸を提供する。いくつかの実施形態では、核酸は、例えば組み換え発現ベクターを含むＤＮＡである。いくつかの実施形態では、核酸は、ＲＮＡ、例えばインビトロで合成されたＲＮＡである。
【０３９９】
いくつかの実施形態では、核酸は、例えば哺乳動物細胞において、本開示のポリペプチドの生成を提供する。他の場合では、主題の核酸は、本開示のポリペプチドをコードする核酸の増幅を提供する。
【０４００】
本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、転写制御要素、例えば、プロモーター、およびエンハンサー等に作動可能に連結され得る。
【０４０１】
適切なプロモーターおよびエンハンサー要素は、当該技術分野で知られている。細菌細胞での発現の場合、適切なプロモーターは、これらに限定されないが、ｌａｃｌ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰ、およびｔｒｃを含む。真核細胞での発現の場合、適切なプロモーターは、これらに限定されないが、軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン遺伝子プロモーターおよびエンハンサー要素；サイトメガロウイルス前初期プロモーター；単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼプロモーター；初期および後期ＳＶ４０プロモーター；レトロウイルスからの末端反復配列に存在するプロモーター；マウスメタロチオネイン−Ｉプロモーター；ならびに様々な当該技術分野で知られている組織特異的プロモーターを含む。
【０４０２】
可逆的誘導性プロモーターを含む適切な可逆的プロモーターは、当該技術分野で知られている。そのような可逆的プロモーターは、真核生物および原核生物等の多くの生物から単離および誘導され得る。第１の原核生物および第２の真核生物、第１の真核生物および第２の原核生物等、第２の生物で使用するための第１の成分に由来する可逆的プロモーターの改変は、当該技術分野で周知である。そのような可逆的プロモーター、およびそのような可逆的プロモーターに基づくが追加の制御タンパク質も含む系は、これらに限定されないが、アルコール調節プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランスアクチベータータンパク質（ＡｌｃＲ）に応答するプロモーター等）、テトラサイクリン調節プロモーター（例えば、ＴｅｔＡｃｔｉｖａｔｏｒｓ、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦ等を含むプロモーター系）、ステロイド調節プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーター系、ヒトエストロゲン受容体プロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系等）、金属調節プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター系等）、病因関連調節プロモーター（例えば、サリチル酸調節プロモーター、エチレン調節プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節プロモーター等）、温度調節プロモーター（例えば、熱ショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ−７０、ＨＳＰ−９０、大豆熱ショックプロモーター等）、光調節プロモーター、合成誘導性プロモーター等を含む。
【０４０３】
いくつかの場合において、適切なプロモーターを含む遺伝子座または構築物または導入遺伝子は、誘導性の系の誘導によって不可逆的に切り替えられる。不可逆スイッチの誘導に適した系は当該技術分野で周知であり、例えば、不可逆スイッチの誘導は、Ｃｒｅ−ｌｏｘ媒介組み換えを利用することができる（例えば、参照によりその開示が本明細書に組み込まれるＦｕｈｒｍａｎｎ−Ｂｅｎｚａｋｅｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（２０００）２８：ｅ９９を参照されたい）。当該技術分野で知られているリコンビナーゼ、エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、組み換え部位等の任意の適切な組み合わせを使用して、不可逆的に切り替え可能なプロモーターを生成することができる。本明細書の他の場所に記載されている部位特異的組み換えを実行するための方法、メカニズム、および要件は、不可逆的に切り替えられるプロモーターの生成に使用され、当該技術分野において周知である。例えば、亜参照によりその開示が本明細書に組み込まれるＧｒｉｎｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，５６７−６０５およびＴｒｏｐｐ（２０１２）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｎｅｓ  ＆  Ｂａｒｔｌｅｔｔ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｓｕｄｂｕｒｙ，ＭＡ）を参照されたい。
【０４０４】
いくつかの場合では、プロモーターはＣＤ８細胞特異的プロモーター、ＣＤ４細胞特異的プロモーター、好中球特異的プロモーター、またはＮＫ特異的プロモーターである。例えば、ＣＤ４遺伝子プロモーターが使用され得る。例えば、Ｓａｌｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：７７３９；ａｎｄ  Ｍａｒｏｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：３４１６を参照されたい。別の例として、ＣＤ８遺伝子プロモーターを使用することができる。ＮＫ細胞特異的発現は、Ｎｅｒｉ（ｐ４６）プロモーターを使用することにより達成され得る。例えば、Ｅｃｋｅｌｈａｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｂｌｏｏｄ  １１７：１５６５を参照されたい。
【０４０５】
いくつかの実施形態では、例えば酵母細胞における発現のために、適切なプロモーターは、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫ１プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＰＹＫ１プロモーター等の構成的プロモーター；または、ＧＡＬＩプロモーター、ＧＡＬ１０プロモーター、ＡＤＨ２プロモーター、ＰＨ０５プロモーター、ＣＵＰ１プロモーター、ＧＡＬ７プロモーター、ＭＥＴ２５プロモーター、ＭＥＴ３プロモーター、ＣＹＣｌプロモーター、ＨＩＳ３プロモーター、ＡＤＨ１プロモーター、ＰＧＫプロモーター、ＧＡＰＤＨプロモーター、ＡＤＣ１プロモーター、ＴＲＰ１プロモーター、ＵＲＡ３プロモーター、ＬＥＵ２プロモーター、ＥＮＯプロモーター、ＴＰ１プロモーター、およびＡＯＸ１（例えば、ピキアで使用するため）等の調節可能なプロモーターである。適切なベクターおよびプロモーターの選択は、当業者のレベルの範囲内である。
【０４０６】
原核生物宿主細胞で使用するのに適したプロモーターは、これらに限定されないが、バクテリオファージＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター；ｔｒｐプロモーター；ｌａｃオペロンプロモーター；ハイブリッドプロモーター、例えば、ｌａｃ／ｔａｃハイブリッドプロモーター、ｔａｃ／ｔｒｃハイブリッドプロモーター、ｔｒｐ／ｌａｃプロモーター、Ｔ７／ｌａｃプロモーター；ｔｒｃプロモーター；ｔａｃプロモーターおよび同様のもの；ａｒａＢＡＤプロモーター；インビボ調節プロモーター、例えばｓｓａＧプロモーターまたは関連プロモーター（例えば米国特許第２００４０１３１６３７を参照されたい）、ｐａｇＣプロモーター（Ｐｕｌｋｋｉｎｅｎ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉａｌ．，１９９１：１７３（１）：８６−９３；Ａｌｐｕｃｈｅ−Ａｒａｎｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９２；８９（２１）：１００７９−８３）、ｎｉｒＢプロモーター（Ｈａｒｂｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｍａｌ．Ｍｉｃｒｏ．６：２８０５−２８１３）および同様のもの（例えば、Ｄｕｎｓｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．６７：５１３３−５１４１；ＭｃＫｅｌｖｉｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｖａｃｃｉｎｅ  ２２：３２４３−３２５５；ａｎｄ  Ｃｈａｔｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１０：８８８−８９２を参照されたい）；ｓｉｇｍａ７０プロモーター、例えば、コンセンサスｓｉｇｍａ７０プロモーター（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏｓ．ＡＸ７９８９８０、ＡＸ７９８９６１、およびＡＸ７９８１８３を参照されたい）；固定相プロモーター、例えばｄｐｓプロモーター、ｓｐｖプロモーター、および同様のもの；病原性島ＳＰＩ−２に由来するプロモーター（例えばＷ０９６／１７９５１を参照されたい）；ａｃｔＡプロモーター（例えばＳｈｅｔｒｏｎ−Ｒａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｉｎｆｅｃｔ．Ｉｍｍｕｎ．７０：１０８７−１０９６を参照されたい）；ｒｐｓＭプロモーター（例えばＶａｌｄｉｖｉａ  ａｎｄ  Ｆａｌｋｏｗ（１９９６）．Ｍａｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ．２２：３６７を参照されたい）；ｔｅｔプロモーター（例えばＨｉｌｌｅｎ，Ｗ．ａｎｄ  Ｗｉｓｓｍａｎｎ，Ａ．（１９８９）Ｉｎ  Ｓａｅｎｇｅｒ，Ｗ．ａｎｄ  Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ，Ｕ．（ｅｄｓ），Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ．Ｍａｃｍｉｌｌａｎ，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，Ｖｏｌ．１０，ｐｐ．１４３−１６２を参照されたい）；ＳＰ６プロモーター（例えばＭｅｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：７０３５を参照されたい）等を含む。大腸菌等の原核生物で使用するのに適した強力なプロモーターは、これらに限定されないが、Ｔｒｃ、Ｔａｃ、Ｔ５、Ｔ７、およびＰｌａｍｂｄａを含む。細菌宿主細胞で使用するためのオペレーターの限定されない例には、ラクトースプロモーターオペレーター（Ｌａｃｉリプレッサータンパク質はラクトースと接触するとコンフォメーションを変化させ、それによってＬａｃｉリプレッサ���タンパク質がオペレーターに結合するのを防ぐ）、トリプトファンプロモーターオペレーター（トリプトファンと複合体を形成すると、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質はオペレーターに結合するコンフォメーションを有し；トリプトファンがない場合、ＴｒｐＲリプレッサータンパク質はオペレーターに結合しないコンフォメーションを有する）、およびｔａｃプロモーターオペレーターが含まれる（例えば、ｄｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５を参照されたい）。
【０４０７】
本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、発現ベクターおよび／またはクローニングベクターに存在し得る。２つの別個のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、同じまたは別個のベクターにクローン化され得る。発現ベクターは、選択可能なマーカー、複製起点、ならびにベクターの複製および／または維持を提供する他の特徴を含み得る。適切な発現ベクターは、例えば、プラスミド、ウイルスベクター等を含む。
【０４０８】
多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に知られており、多くは、対照の組み換え構築物を生成するために市販されている。例として、以下の細菌ベクターが提供されている：ｐＢｓ、ｐｈａｇｅｓｃｒｉｐｔ、ＰｓｉＸ１７４、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ  ＳＫ、ｐＢｓ  ＫＳ、ｐＮＨ８ａ、ｐＮＨ１６ａ、ｐＮＨ１８ａ、ｐＮＨ４６ａ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、Ｌａ  Ｊｏｌｌａ、ＣＡ、ＵＳＡ）；ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＫＫ２３３−３、ｐＤＲ５４０、およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）。例として、以下の真核生物ベクターが提供されている：ｐＷＬｎｅｏ、ｐＳＶ２ｃａｔ、ｐＯＧ４４、ＰＸＲ１、ｐＳＧ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、およびｐＳＶＬ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。
【０４０９】
発現ベクターは一般に、異種タンパク質をコードする核酸配列の挿入を提供するために、プロモーター配列の近くに位置する便利な制限部位を有する。発現宿主で機能する選択可能なマーカーが存在してもよい。
【０４１０】
上記のように、いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドをコードする核酸は、いくつかの実施形態ではＲＮＡ、例えばインビトロで合成されたＲＮＡである。ＲＮＡのインビトロ合成のための方法は当該技術分野で知られており、任意の既知の方法を使用して、本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを合成することができる。ＲＮＡを宿主細胞に導入するための方法は、当該技術分野で知られている。例えば、Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１５：９０５３を参照されたい。本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを宿主細胞に導入することは、インビトロまたはエクスビボまたはインビボで実行することができる。例えば、宿主細胞（例えば、ＮＫ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球等）は、本開示のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＲＮＡを用いて、インビトロまたはエクスビボでエレクトロポレーションされ得る。
【０４１１】
ポリヌクレオチド、核酸配列、および／もしくは転写単位、ならびに／またはそれらを含むベクターを含む様々な態様および実施形態は、コザック型配列（本明細書ではコザック関連配列とも呼ばれる）、ウッドチャック肝炎ウイルスの転写後調節要素（ＷＰＲＥ）、および二重終止コドンまたは三重終止コドンの１つ以上をさらに含み、二重終止コドンまたは三重終止コドンの１つ以上の終止コドンは、１つ以上の転写単位の少なくとも１つからの読み取りの終了を定義する。特定の実施形態では、ポリヌクレオチド、核酸配列、および／もしくは転写単位、ならびに／またはそれらを含むベクターは、１つ以上の転写単位の少なくとも１つの開始コドンの１０ヌクレオチド以内の上流に５’ヌクレオチドを有するコザック型配列をさらに含む。コザックは、６９９の脊椎動物のｍＲＮＡについて、コザックコンセンサス配列（ＧＣＣ）ＧＣＣＲＣＣＡＴＧ（配列番号３２７）を決定したが、ここでＲはプリン（ＡまたはＧ）である（Ｋｏｚａｋ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８７  Ｏｃｔ  ２６；１５（２０）：８１２５−４８）。一実施形態では、コザック型配列は、ＣＣＡＣＣＡＴ／ＵＧ（Ｇ）（配列番号３２８）、ＣＣＧＣＣＡＴ／ＵＧ（Ｇ）（配列番号３２９）、ＧＣＣＧＣＣＧＣＣＡＴ／ＵＧ（Ｇ）（配列番号３３０）、またはＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＴ／ＵＧ（Ｇ）（配列番号３３１）（括弧内のヌクレオチドは任意選択のヌクレオチドを表し、スラッシュで区切られたヌクレオチドは、例えば、核酸がＤＮＡであるかまたはＲＮＡであるかによって、その位置で異なる可能なヌクレオチドを示した）である、またはそれらを含む。ＡＵ／ＴＧ開始コドンを含むこれらの実施形態では、Ａは位置０と見なすことができる。特定の例示的な実施形態では、−３および＋４のヌクレオチドは同一であり、例えば、３および＋４ヌクレオチドはＧであってもよい。別の実施形態では、コザック型配列は、ＡＴＧの上流の３番目の位置にＡまたはＧを含み、ＡＴＧは開始コドンである。別の実施形態では、コザック型配列は、ＡＵＧの上流の３番目の位置にＡまたはＧを含み、ＡＵＧは開始コドンである。例示的な実施形態では、コザック配列は、（ＧＣＣ）ＧＣＣＲＣＣＡＴＧ（配列番号３２７）であり、Ｒはプリン（ＡまたはＧ）である。例示的な実施形態では、コザック型配列は、ＧＣＣＧＣＣＡＣＣＡＵＧ（配列番号３３２）である。コザック型配列を含む前述の実施形態、および／または三重終止コドンを含む以下の実施形態と組み合わせることができる別の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＷＰＲＥ要素を含む。ＷＰＲＥは、当該技術分野において特性評価されており（例えば、（Ｈｉｇａｓｈｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２００７；１４：１２９８）を参照）、ＷＯ２０１９／０５５９４６に例示されている。いくつかの実施形態では、ＷＰＲＥ要素は、１つ以上の転写単位の終止コドンの３’に位置し、ポリヌクレオチドの３’ＬＴＲに対して５’に位置する。前述の実施形態のいずれかまたは両方と組み合わせることができる別の実施形態（すなわち、ポリヌクレオチドがコザック型配列を含む実施形態および／またはポリヌクレオチドがＷＰＲＥを含む実施形態）では���１つ以上の転写単位は、二重終止コドンまたは三重終止コドンの１つ以上の終止コドンで終端し、二重終止コドンは、第１のリーディングフレームの第１の終止コドンおよび第２のリーディングフレームの第２の終止コドン、または第２の終止コドンとインフレームの第１の終止コドンを含み、三重終止コドンは、第１のリーディングフレームの第１の終止コドン、第２のリーディングフレームの第２の終止コドン、および第３のリーディングフレームの第３の終止コドン、または第２の終止コドンおよび第３の終止コドンとインフレームの第１の終止コドンを含む。
【０４１２】
本明細書の三重終止コドンは、３つの終止コドンを含み、各リーディングフレームに１つあり、互いに１０ヌクレオチド以内であり、好ましくは重複配列を有するか、または同じリーディングフレーム内に、好ましくは連続するコドンに３つの終止コドンを含む。二重終止コドンとは、それぞれが異なるリーディングフレームにあり、互いに１０ヌクレオチド以内にあり、好ましくは重複配列を有する２つの終止コドン、または同じリーディングフレーム内に、好ましくは連続するコドンにある２つの終止コドンを意味する。
【０４１３】
本明細書に開示される方法および組成物のいくつかでは、ＰＢＭＣ、Ｂ細胞、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞へのＤＮＡの導入、ならびに任意選択で宿主細胞ゲノムへのＤＮＡの組み込みは、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を利用しない方法を使用して行われる。例えば、限定されない例として、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルス−１に由来するもの等の他のウイルスベクターが利用され得る。
【０４１４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される方法は、非ウイルスベクターで標的細胞をトランスフェクトすることを含み得る。非ウイルスベクターを利用して標的細胞をトランスフェクトする本明細書に開示される実施形態のいずれにおいても、裸のＤＮＡを含む非ウイルスベクターは、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、リポソーム製剤、脂質、デンドリマー、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）およびポリ（ｌ−リジン）（ＰＬＬ）等のカチオン性ポリマー、ナノ粒子、細胞透過性ペプチド、マイクロインジェクション、ならびに／または非組み込みレンチウイルスベクターを含む方法を使用して、例えばＰＢＭＣ、Ｂ細胞、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞等の標的細胞に導入され得る。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、リポソームおよびプロタミンとの複合体において、ＰＢＭＣ、Ｂ細胞、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞等の標的細胞に導入され得る。本明細書で提供される方法の実施形態で使用され得るエクスビボでＴ細胞および／またはＮＫ細胞をトランスフェクトするための他の方法は、当該技術分野で知られている（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭｏｒｇａｎ  ａｎｄ  Ｂｏｙｅｒｉｎａｓ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅｓ．２０１６  Ａｐｒ  ２０；４（２）．ｐｉｉ：Ｅ９を参照されたい）。
【０４１５】
本明細書で提供される方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡは、目的の遺伝子の５’および３’末端にトランスポゾンＩＴＲ断片およびＤＮＡまたはｍＲＮＡまたはタンパク質または部位特異的セリンリコンビナーゼ、例えばヒトゲノムの偽ａｔｔＰ部位に目的の遺伝子を組み込むｐｈｉＣ３１等を含むプラスミドとして、標的ＤＮＡの同時トランスフェクション、同時ヌクレオフェクションまたは同時エレクトロポレーションによりトランスポゾンベースの担体系を使用してゲノムに組み込まれ得、この場合では、ＤＮＡベクターは、リコンビナーゼ酵素の認識配列であり（Ｂｈａｓｋａｒ  Ｔｈｙａｇａｒａｊａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｉｔｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  Ｐｈａｇｅ  φＣ３１  Ｉｎｔｅｇｒａｓｅ，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００１  Ｊｕｎ；２１（１２）：３９２６−３９３４）、リコンビナーゼで同時トランスフェクトされる３４〜４０ｂｐのａｔｔＢ部位を含む。Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の場合、本明細書で提供される特定の方法で使用され得るトランスポゾンベースの系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ  ＤＮＡ担体系（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第６，４８９，４５８号および米国特許出願第１５／４３４，５９５号を参照されたい）、ＰｉｇｇｙＢａｃ  ＤＮＡ担体系（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＭａｎｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ａｐｒ；２１（４）：４２７−３７を参照されたい）、またはＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくはタンパク質の形態のＴｏｌ２トランスポゾン系（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＴｓｕｋａｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．２０１５  Ｆｅｂ；２２（２）：２０９−２１５を参照されたい）を利用する。いくつかの実施形態では、トランスポゾンベースのベクター系のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に導入される前に、ミニサークルＤＮＡベクターとして生成され得る（例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＨｕｄｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｒｅｓｕｌｔｓ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．２０１６；２０９：３７−５０およびＭｏｎｊｅｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌｅｕｋｅｍｉａ．２０１７  Ｊａｎ；３１（１）：１８６−１９４を参照されたい）。ＣＡＲまたはリンパ増殖性要素は、ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮを介した組み込みを使用して、標的部位の５’および３’の組み込みに相同な５０〜１０００ｂｐの相同性アームを追加することにより、ゲノム内の定義された特定の部位に組み込むこともできる（Ｊａｅ  Ｓｅｏｎｇ  Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ５，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：８５７２（２０１５），Ｓｉｔｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ＣＨＯ  ｃｅｌｌｓ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  ａｎｄ  ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＤＮＡ  ｒｅｐａｉｒ  ｐａｔｈｗａｙ）。ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮは特異性およびゲノム標的開裂を提供��、構築物は相同性を介した末端結合を介して組み込まれる（Ｙａｏ  Ｘ  ａｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１７  Ｊｕｎ；２７（６）：８０１−８１４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｃｒ．２０１７．７６．Ｅｐｕｂ  ２０１７  Ｍａｙ  １９）。ＣＲＩＳＰＲまたはＴＡＬＥＮは、ＤＮＡ、ｍＲＮＡ、またはタンパク質として標的プラスミドで同時トランスフェクトされ得る。
【０４１６】
阻害性分子
本明細書で提供される態様のいずれかの実施形態は、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）等の宿主細胞への組み込み後に、ゲノムが１つ以上の、例示的な実施形態では２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子、例えばｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡ等の発現を誘導するように構築される組み換えレトロウイルス粒子を含み得る。そのような阻害性ＲＮＡ分子は、例えば、ＥＦ１−αイントロンを含むイントロン内にコードされ得る。これは、パッケージング可能なレトロウイルスゲノムに含めることができる機能要素を最大化する方法の現在の教示を利用して、以前の教示の欠点を克服し、養子Ｔ細胞療法におけるそのような組み換えレトロウイルス粒子の有効性を最大化する。
【０４１７】
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、２本の鎖が細胞環境内で１８〜２５ヌクレオチドＲＮＡ二重鎖を形成し得るように、互いに部分的または完全に相補的である５’鎖および３’鎖（いくつかの例では、センス鎖およびアンチセンス鎖）を含む。５’鎖の長さは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドであってもよく、３’鎖の長さは１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドであってもよい。５’鎖および３’鎖は同じ長さでも異なる長さでもよく、ＲＮＡ二重鎖は１つ以上のミスマッチを含み得る。あるいは、ＲＮＡ二重鎖は、ミスマッチを有しない。
【０４１８】
本明細書で提供される組成物および方法に含まれる阻害性ＲＮＡ分子は、特定の例示的な例では、それらがゲノムに挿入されるＴ細胞において存在しない、および／または自然に発現されない。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡである。いくつかの実施形態では、本明細書または優先出願において、ｓｉＲＮＡをコードする核酸への言及がなされる場合、特に、核酸がゲノムの一部である状況において、そのような核酸は、ＤＩＣＥＲによって処理されて二本鎖ＲＮＡ（これは典型的にはＲＩＳＫ複合体と相互作用するか、またはその一部となる）を形成するｓｉＲＮＡ前駆体、例えばｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを細胞内で形成することができることが理解される。いくつかの実施形態では、本開示の実施形態の阻害性分子は、例えば、Ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡまたはＰｒｅ−ｍｉＲＮＡ等のｍｉＲＮＡの前駆体、またはｓｈＲＮＡの前駆体である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、人工的に誘導される（すなわち、人工ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡ）。他の実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、ｓｉＲＮＡに処理されるｄｓＲＮＡ（転写もしくは人工的に導入された）またはｓｉＲＮＡ自体である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、自然界に見出されない配列を有するか、または自然界に見出されない少なくとも１つの機能的セグメントを有するか、または自然界に見出されない機能的セグメントの組み合わせを有する。
【０４１９】
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、複数のｍｉＲＮＡ配列が単一のポリシストロン性ｍｉＲＮＡ転写物から同時に発現されるように、直列または多重配置で第１の核酸分子に配置される。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、非機能的リンカー配列によって直接的または間接的に互いに隣接し得る。いくつかの実施形態におけるリンカー配列は、長さが５〜１２０ヌクレオチドの間であり、いくつかの実施形態では、限定されない例として、長さが１０〜４０ヌクレオチドの間であってもよい。例示的な実施形態では、１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡをコードする第１の核酸配列およびＣＡＲ（例えば、ＭＲＢ−ＣＡＲ）をコードする第２の核酸配列は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞において構成的に活性であるか、または誘導され得るプロモーターに作動可能に連結される。このように、阻害性ＲＮＡ分子（例えばｍｉＲＮＡ）およびＣＡＲは、ポリシストロン様式で発現される。さらに、機能的配列は同じ転写産物から発現され得る。例えば、阻害性ＲＮＡ分子ではない本明細書で提供されるリンパ増殖性要素のいずれかは、ＣＡＲおよび１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子と同じ転写物から発現され得る。
【０４２０】
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、ｍｉＲ−１５５等であるがこれに限定されない自然発生ｍｉＲＮＡである。あるいは、ハイブリダイズ／相補的ステム構造を形成することができ、標的ＲＮＡを対象とする配列が、ｍｉｃｒｏＲＮＡ処理のためのｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列、および任意選択でステム配列間の隣接配列と同じ自然発生ｍｉＲＮＡから得ることができるループを含むｍｉＲＮＡフレームワークに配置される、人工ｍｉＲＮＡが生成され得る。したがって、いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、５’から３’の方向に、５’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列、５’ステム、ループ、前記５’ステムに部分的または完全に相補的である３’ステム、および３’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列を含む。いくつかの実施形態では、５’ステム（本明細書では５’アームとも呼ばれる）の長さは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、３’ステム（本明細書では３’アームとも呼ばれる）の長さは、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、または２５ヌクレオチドである。いくつかの実施形態では、ループは、３から４０、１０から４０、２０から４０、または２０から３０ヌクレオチド長であり、例示的な実施形態では、ループは、１８、１９、２０、２１、または２２ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、一方のステムは、他方のステムより２ヌクレオチド長い。より長いステムは、５’または３’のステムであり得る。
【０４２１】
いくつかの実施形態では、５’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列、３’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列、またはその両方は、これらに限定されないが、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−２１等の自然発生ｍｉＲＮＡに由来する。特定の実施形態では、５’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列、３’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列、またはその両方は、例えば、ハツカネズミまたはホモサピエンスからのｍｉＲ−１５５等のｍｉＲ−１５５に由来する。合成ｍｉＲＮＡステムループをｍｉＲ−１５５フレームワーク（すなわち、５’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列、３’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列、およびｍｉＲＮＡ  ５’および３’ステム間のループ）に挿入することは、当業者に知られている（Ｃｈｕｎｇ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．２００６．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ．３４（７）：ｅ５３；米国特許第７，３８７，８９６号）。例えば、ＳＩＢＲ（合成阻害性ＢＩＣ由来ＲＮＡ）配列（Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６、上記参照）は、ハツカネズミＢＩＣ非コードｍＲＮＡのヌクレオチド１３４〜１６１（配列番号３３３）からなる５’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ  ＡＹ０９６００３．１）、およびハツカネズミＢＩＣ非コードｍＲＮＡのヌクレオチド２２３〜２８３からなる３’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列（Ｇｅｎｂａｎｋ  ＩＤ  ＡＹ０９６００３．１）を有する。ある研究では、ｍｉＲＮＡの発現を増強するためにＳＩＢＲ配列が改変された（ｅＳＩＢＲ）（Ｆｏｗｌｅｒ，Ｄ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．２０１５．Ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４４（５）：ｅ４８）。本開示のいくつかの実施形態では、ｍｉＲＮＡは、ＳＩＢＲまたはｅＳＩＢＲ  ｍｉＲ−１５５フレームワークに配置され得る。本明細書の例示的な実施形態では、ｍｉＲＮＡは、配列番号３３３で表されるｍｉＲ−１５５の５’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列、配列番号３３４で表される３’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列（ハツカネズミＢＩＣ非コードｍＲＮＡのヌクレオチド２２１〜２６５）；および改変されたｍｉＲ−１５５ループ（配列番号３３５）を含むｍｉＲ−１５５フレームワークに配置される。したがって、いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１５５の５’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列は、配列番号３３３またはその機能的バリアント、例えば、配列番号３３３と同じ長さ、または配列番号３３３の９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、もしくは５０％の長さ、または１００ヌクレオチド以下、９５ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８５ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチドまたは７５ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６５ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５５ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、もしくは２５ヌクレオチド以下；および配列番号３３３と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％同一の配列である。いくつかの実施形態では、ｍｉＲ−１５５の３’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列は、配列番号３３４またはその機能的突然変異体、例えば、配列番号３３４と同じ長さ、または配列番号３３４の９５％、９０％、８０％、８５％、７５％、または５０％の長さ、または１００ヌクレオチド以下、９５ヌクレオチド以下、９０ヌクレオチド以下、８５ヌクレオチド以下、８０ヌクレオチド以下、７５ヌクレオチド以下、７０ヌクレオチド以下、６５ヌクレオチド以下、６０ヌクレオチド以下、５５ヌクレオチド以下、５０ヌクレオチド以下、４５ヌクレオチド以下、４０ヌクレオチド以下、３５ヌクレオチド以下、３０ヌクレオチド以下、もしくは２５ヌクレオチド以下；および配列番号３３４と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、もしくは９５％同一の配列である。しかしながら、それらが結合する標的ｍＲＮＡの発現を阻害することができる成熟ｍｉＲＮＡを形成するためにその中に挿入されたｍｉＲＮＡの細胞内で適切な処理を提供するように機能する任意の既知のｍｉｃｒｏＲＮＡフレームワークが、本開示内で企図される。
【０４２２】
いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子のポリヌクレオチド内の核酸配列によってコードされる阻害性ＲＮＡ分子の少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、または少なくとも４つは、５’から３’の方向に以下の配置を有する：５’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列、５’ステム、ループ、前記５’ステムに部分的または完全に相補的である３’ステム、および３’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子の全てが、５’から３’の方向に以下の配置を有する：５’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列、５’ステム、ループ、前記５’ステムに部分的または完全に相補的である３’ステム、および３’ｍｉｃｒｏＲＮＡ隣接配列。本明細書に開示されるように、阻害性ＲＮＡ分子は、１つ以上のリンカー配列によって分離され得、いくつかの実施形態では、これは阻害性ＲＮＡ分子間のスペーサーとして作用することを除いて機能を有しない。
【０４２３】
２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子（いくつかの例では、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の阻害性ＲＮＡ分子）が含まれるいくつかの実施形態では、これらの阻害性ＲＮＡ分子は、同じまたは異なるＲＮＡ標的（例えば目的の遺伝子から転写されたｍＲＮＡ等）を対象とする。例示的な実施形態では、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、３〜５、３〜６、または４個の阻害性ＲＮＡ分子が、第１の核酸配列に含まれる。例示的な実施形態では、４個の阻害性ＲＮＡ分子が、第１の核酸配列に含まれる。
【０４２４】
いくつかの実施形態では、１つ以上の阻害剤ＲＮＡ分子は、１つ以上のリンパ増殖性要素であり、したがって、本明細書で提供される任意の態様または実施形態において、それと不適合でない限り、またはそこですでに記載されていない限り、リンパ増殖性要素（例えば、ポリペプチドリンパ増殖性要素）を含む。いくつかの実施形態では、ＲＮＡ標的は、これらに限定されないが、ＰＤ−１（不活化を防止する）；ＣＴＬＡ４（不活化を防止する）；ＴＣＲａ（安全性−自己免疫を防止する）；ＴＣＲｂ（安全性−自己免疫を防止する）；ＣＤ３Ｚ（安全性−自己免疫を防止する）；ＳＯＣＳ１（不活性化を防止する）；ＳＭＡＤ２（不活性化を防止する）；ｍｉＲ−１５５標的（活性化を促進する）；ＩＦＮガンマ（ＣＲＳを低減する）；ｃＣＢＬ（シグナル伝達を延長する）；ＴＲＡＩＬ２（死を防止する）；ＰＰ２Ａ（シグナル伝達を延長する）；ＡＢＣＧ１（コレステロールのクリアランスを制限することによりコレステロールマイクロドメインの含有量を増やす）等のＴ細胞によって発現される遺伝子から転写されるｍＲＮＡである。例示的な例では、本明細書で提供される方法でＴ細胞のゲノムに挿入されたｍｉＲＮＡは、Ｔ細胞の増殖が誘導および／もしくは増強される、ならびに／またはアポトーシスが抑制されるように標的を対象とする。
【０４２５】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ標的は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の成分をコードするｍＲＮＡを含む。そのような成分は、Ｔ細胞受容体複合体の生成および／または形成のための成分、および／またはＴ細胞受容体複合体の適切な機能のための成分を含み得る。したがって、一実施形態では、２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つは、ＴＣＲ複合体、例示的な実施形態ではＴ細胞の１つ以上の内因性ＴＣＲ複合体の形成および／または機能の低下を引き起こす。Ｔ細胞受容体複合体は、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、およびＣＤ３ｚを含む。これらの成分には複雑な相互依存性があり、いずれか１つのサブユニットの発現が低下すると、複合体の発現および機能が低下することが知られている。したがって、一実施形態では、ＲＮＡ標的は、形質導入されたＴ細胞に内因性のＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、ＣＤ３ｄ、ＣＤ３ｅ、ＣＤ３ｇ、およびＣＤ３ｚのうちの１つ以上を発現するｍＲＮＡである。特定の実施形態では、ＲＮＡ標的は、そのゲノムが１つ以上のｍｉＲＮＡをコードする第１の核酸配列を含む、Ｔ細胞の内因性ＴＣＲαまたはＴＣＲβ遺伝子から転写されたｍＲＮＡである。例示的な実施形態では、ＲＮＡ標的は、ＴＣＲα遺伝子から転写されたｍＲＮＡである。特定の実施形態では、同様の期待される有用性を有する標的遺伝子から転写されたｍＲＮＡを対象とする阻害性ＲＮＡ分子を組み合わせることができる。他の実施形態では、相補的有用性を有する標的遺伝子から転写された標的ｍＲＮＡを対象とする阻害性ＲＮＡ分子を組み合わせることができる。いくつかの実施形態では、２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子は、標的遺伝子ＣＤ３Ｚ、ＰＤ１、ＳＯＣＳ１、および／またはＩＦＮガンマから転写されたｍＲＮＡを対象とする。
【０４２６】
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡは、Ｃｂｌプロトオンコジーン（ＲＮＦ５５）（ｃＣＢＬおよびＲＮＦ５５としても知られる）（ＨＧＮＣ：１５４１、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：８６７、ＯＭＩＭ：１６５３６０）、Ｔ細胞受容体Ｔ３をゼータ鎖（ＣＤ３ｚ）（ＨＧＮＣ：１６７７、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：９１９、ＯＭＩＭ：１８６７８０）、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、Ｔ細胞免疫グロブリンムチン３（ＴＩＭ３）（Ａ型肝炎ウイルス細胞受容体２としても知られる）（ＨＧＮＣ：１８４３７  Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：８４８６８、ＯＭＩＭ：６０６６５２）、リンパ球活性化３（ＬＡＧ３）（ＨＧＮＣ：６４７６、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：３９０２、ＯＭＩＭ：１５３３３７）、ＳＭＡＤ２、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー１０ｂ（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ）（ＨＧＮＣ：１１９０５、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：８７９５、ＯＭＩＭ：６０３６１２）、タンパク質ホスファターゼ２触媒サブユニットアルファ（ＰＰＰ２ＣＡ）（ＨＧＮＣ：９２９９、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：５５１５、ＯＭＩＭ：１７６９１５）、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーメンバー６（ＴＮＦＲＳＦ６）（Ｆａｓ細胞表面死受容体（ＦＡＳ）としても知られる）（ＨＧＮＣ：１１９２０、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：３５５、ＯＭＩＭ：１３４６３７）、ＢおよびＴリンパ球関連（ＢＴＬＡ）（ＨＧＮＣ：２１０８７、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：１５１８８８、ＯＭＩＭ：６０７９２５）、ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ）（ＨＧＮＣ：２６８３８、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：２０１６３３、ＯＭＩＭ：６１２８５９）、アデノシンＡ２ａ受容体（ＡＤＯＲＡ２ＡもしくはＡ２ＡＲ）（ＨＧＮＣ：２６３、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：１３５、ＯＭＩＭ：１０２７７６）、アリール炭化水素受容体（ＡＨＲ）（ＨＧＮＣ：３４８、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：１９６、ＯＭＩＭ：６００２５３）、エオメソデルミン（ＥＯＭＥＳ）（ＨＧＮＣ：３３７２、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：８３２０、ＯＭＩＭ：６０４６１５）、ＳＭＡＤファミリーメンバー３（ＳＭＡＤ３）（ＨＧＮＣ：６７６９、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：４０８８、ＯＭＩＭ：６０３１０９）、ＳＭＡＤファミリーメンバー４（ＳＭＡＤ４）（ＧＮＣ：６７７０、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：４０８９、ＯＭＩＭ：６００９９３）、ＴＧＦＢＲ２、タンパク質ホスファターゼ２調節サブユニットＢデルタ（ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ）（ＨＧＮＣ：２３７３２、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：５５８４４、ＯＭＩＭ：６１３９９２）、腫瘍壊死因子リガンドスーパーファミリーメンバー６（ＴＮＦＳＦ６）（ＦＡＳＬとしても知られる）（ＨＧＮＣ：１１９３６、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：３５６、ＯＭＩＭ：１３４６３８）、カスパーゼ３（ＣＡＳＰ３）ＨＧＮＣ：１５０４、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：８３６、ＯＭＩＭ：６００６３６）、サイトカインシグナル伝達の抑制因子２（ＳＯＣＳ２）（ＨＧＮＣ：１９３８２、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：８８３５、ＯＭＩＭ：６０５１１７）、クルッペル様因子１０（ＫＬＦ１０）（ＴＧＦＢ誘導性初期成長応答タンパク質１（ＴＩＥＧ１）としても知られる）（ＨＧＮＣ：１１８１０、Ｅｎｔ���ｅｚ  Ｇｅｎｅ：７０７１、ＯＭＩＭ：６０１８７８）、ＪｕｎＢプロトオンコジーン、ＡＰ−１転写因子サブユニット（ＪｕｎＢ）（ＨＧＮＣ：６２０５、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：３７２６、ＯＭＩＭ：１６５１６１）、Ｃｂｘ３、Ｔｅｔメチルシトシンジオキシゲナーゼ２（Ｔｅｔ２）（ＨＧＮＣ：２５９４１、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：５４７９０、ＯＭＩＭ：６１２８３９）、ヘキソキナーゼ２（ＨＫ２）（ＨＧＮＣ：４９２３、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：３０９９、ＯＭＩＭ：６０１１２５）、Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ−１（ＳＨＰ１）（ＨＧＮＣ：９６５８、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：５７７７、ＯＭＩＭ：１７６８８３）Ｓｒｃ相同性領域２ドメイン含有ホスファターゼ−２（ＳＨＰ２）（ＨＧＮＣ：９６４４、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：５７８１、ＯＭＩＭ：１７６８７６）をコードするｍＲＮＡ；または、いくつかの実施形態ではＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳ）、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、Ａ２ＡＲ、ＡＨＲ、ＥＯＭＥＳ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＴＮＦＳＦ６（ＦＡＳＬ）、ＣＡＳＰ３、ＳＯＣＳ２、ＴＩＥＧ１、ＪｕｎＢ、Ｃｂｘ３、Ｔｅｔ２、ＨＫ２、ＳＨＰ１、もしくはＳＨＰ２をコードするｍＲＮＡを標的化する。いくつかの例示的な実施形態では、阻害性ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡは、ＦＡＳ、ＡＨＲ、ＣＤ３ｚ、ｃＣＢＬ、Ｃｈｒｏｍｏｂｏｘ１（Ｃｂｘ）（ＨＧＮＣ：１５５１、Ｅｎｔｒｅｚ  Ｇｅｎｅ：１０９５１、ＯＭＩＭ：６０４５１１）、ＨＫ２、ＦＡＳＬ、ＳＭＡＤ４、もしくはＥＯＭＥＳをコードするｍＲＮＡを標的化し；または、いくつかの例示的な実施形態では、阻害性ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡは、ＦＡＳ、ＡＨＲ、Ｃｂｘ３、ＨＫ２、ＦＡＳＬ、ＳＭＡＤ４、もしくはＥＯＭＥＳをコードするｍＲＮＡを標的化し；または、いくつかの例示的な実施形態では、阻害性ＲＮＡ、例えばｍｉＲＮＡは、ＡＨＲ、Ｃｂｘ３、ＨＫ２、ＳＭＡＤ４、もしくはＥＯＭＥＳをコードするｍＲＮＡを標的化する。
【０４２７】
いくつかのさらなる例示的な実施形態では、本明細書におけるベクターまたはゲノムは、２つ以上、２〜１０、２〜８、２〜６、３〜５、２、３、４、５、６、７、または８つの、本明細書で、例えばすぐ上の段落で特定される阻害性ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）を含む。いくつかのさらなる例示的な実施形態では、本明細書におけるベクターまたはゲノムは、２つ以上、２〜１０、２〜８、２〜６、３〜５、２、３、４、５、６、７、または８つの、ＦＡＳ、ｃＣＢＬ、ＡＨＲ、ＣＤ３ｚ、Ｃｂｘ、ＥＯＭＥＳ、もしくはＨＫ２をコードするｍＲＮＡを標的化する阻害性ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）、またはそのようなｍＲＮＡを標的化する１つ以上の阻害性ＲＮＡの組み合わせを含む。いくつかのさらなる例示的な実施形態では、本明細書におけるベクターまたはゲノムは、２つ以上、２〜１０、２〜８、２〜６、３〜５、２、３、４、５、６、７、または８つの、ＡＨＲ、Ｃｂｘ３、ＥＯＭＥＳ、もしくはＨＫ２をコードするｍＲＮＡを標的化する阻害性ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）、またはそのようなｍＲＮＡを標的化する１つ以上の阻害性ＲＮＡの組み合わせを標的化する。
【０４２８】
本明細書で提供されるいくつかの実施形態では、２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子は、これに限定されないが、ＥＦ１−αイントロンＡ等の単一のイントロンで送達され得る。本開示のためにｍｉＲＮＡを収容するために使用され得るイントロン配列は、Ｔ細胞内で処理される任意のイントロンを含む。本明細書に示されるように、そのような配置の１つの利点は、これが、本明細書で提供される方法においてそのような配列をＴ細胞に送達するために使用されるレトロウイルスゲノムのサイズ制約内にｍｉＲＮＡ配列を含める能力を最大化するのに役立つことである。これは、第１の核酸配列のイントロンが、ポリシストロン様式で、そのイントロンを発現するために使用されるプロモーター配列の全部または一部、ＣＡＲ配列、および阻害性ＲＮＡ分子ではないリンパ増殖性要素等の本明細書で提供される他の機能的配列を含む場合に特に当てはまる。イントロンの配列要件は、当該技術分野において既知である。いくつかの実施形態では、そのようなイントロン処理は、本明細書に開示される任意のリボスイッチ等のリボスイッチに作動可能に連結されている。したがって、リボスイッチは、第１の核酸配列上の１つ以上のｍｉＲＮＡ配列の発現を制御するための調節要素を提供し得る。したがって、例示的な実施形態では、内因性Ｔ細胞受容体サブユニットを対象とするｍｉＲＮＡの組み合わせが本明細書で提供され、ｍｉＲＮＡの発現は、本明細書で論じられるリボスイッチのいずれかであり得るリボスイッチによって調節される。
【０４２９】
いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、同じまたは異なる転写単位に含まれ得る複数の核酸配列上に提供され得る。例えば、第１の核酸配列は、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、第１のプロモーターから発現され得、第２の核酸配列は、１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、第２のプロモーターから発現され得る。例示的な実施形態では、２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子は、単一のプロモーターから発現される第１の核酸配列上に位置する。そのようなｍｉＲＮＡを発現するために使用されるプロモーターは、典型的には、そのゲノム内のｍｉＲＮＡを標的Ｔ細胞に送達するレトロウイルス粒子を発現するために使用されるパッケージング細胞では不活性であるが、そのようなプロモーターは、Ｔ細胞において構成的に、または誘導的様式で活性である。プロモーターは、Ｐｏｌ  Ｉ、Ｐｏｌ  ＩＩ、またはＰｏｌ  ＩＩＩプロモーターであり得る。いくつかの例示的な実施形態では、プロモーターは、Ｐｏｌ  ＩＩプロモーターである。
【０４３０】
特性評価および商業生産方法
本開示は、科学実験における研究試薬として、および商業生産に使用され得る様々な方法および組成物を提供する。そのような科学的実験は、例えば本明細書で提供されるリンパ球を形質導入するための方法を使用して、リンパ球、例えばＮＫ細胞、例示的な実施形態ではＴ細胞を特性評価するための方法を含み得る。そのような方法は、例えば、リンパ球の活性化、および活性化がそのような細胞を形質導入可能にする詳細な分子メカニズムを研究するために使用され得る。さらに、例えば、Ｔ細胞の増殖および生存に影響を与える要因をよりよく理解するための研究ツールとしての有用性を有する遺伝子改変されたリンパ球が、本明細書で提供される。そのような遺伝子改変リンパ球、例えばＮＫ細胞および例示的な実施形態ではＴ細胞はさらに、商業生産、例えば、成長因子および免疫調節剤等の特定の因子の生産に使用することができ、これらは、収集および試験され得る、または商業製品の生産に使用され得る。
【０４３１】
リンパ球の科学的実験および／または特性評価は、リンパ球を分析または比較するのに有用な、本明細書で提供される態様、実施形態、または下位実施形態のいずれかを含み得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞は、ポリヌクレオチドを含む、本明細書で提供される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子で形質導入され得る。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の形質導入は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、例えば、ＣＡＲ、リンパ増殖性要素、および／または活性化要素を含むポリヌクレオチドを含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書の他の場所で議論されるように、阻害性ＲＮＡ分子を含み得る。いくつかの実施形態では、リンパ増殖性要素は、キメラリンパ増殖性要素であってもよい。
【０４３２】
例示的な実施形態
この例示的な実施形態のセクションでは、本明細書で提供され、本明細書全体でさらに論じられる例示的な態様および実施形態が提供される。簡潔さのために、および便宜上、開示された態様および実施形態の全て、ならびに開示された態様および実施形態の可能な組み合わせの全てがこのセクションで列挙されるわけではない。本開示全体で論じられるように、多くの態様の特定の実施形態である実施形態が提供されることが理解されよう。本明細書の全開示を鑑みて、以下において、またはこの全開示において列挙される任意の個々の実施形態は、態様においてすでに存在する要素に対してより狭い要素である場合、または態様に追加され得る追加的要素であるために、以下において、またはこの全開示において列挙される任意の態様と組み合わされてもよいことが意図される。そのような組み合わせは、この詳細な説明の他のセクションで詳しく説明される。
【０４３３】
態様または実施形態と不適合でない限り、またはそこですでに記載されていない限り、リンパ球（例えばＰＢＭＣ、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞）を遺伝子改変および／または形質導入するための方法、あるいはそのような方法を含む使用、あるいはそのような方法を使用して生成された遺伝子改変細胞、ならびに、これに限定されないがこの例示的な実施形態のセクションを含む本明細書で提供される、レトロウイルス粒子をリンパ球（例えばＰＢＭＣ、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞）と接触させる接触ステップを含むプロセスによる任意の他の方法または生成物のいずれかに関して、特定の実施形態では、接触ステップは、３０秒〜７２時間の間、例えば１分〜１２時間の間、または５分〜１２時間の間、１０時間、８時間、６時間、４時間、２時間、１時間、３０分間、または１５分間実行され得る（または生じ得る）。いくつかの実施形態では、接触は、２４時間未満、例えば、１２時間未満、８時間未満、４時間未満、および例示的な実施形態では２時間未満、１時間未満、３０未満または１５分未満で実行され得るが、いずれの場合も、レトロウイルス粒子および細胞を形質導入反応混合物中で懸濁状態で接触させる最初の接触ステップが少なくとも存在する。そのような懸濁は、細胞およびレトロウイルス粒子を沈降させること、または遠心力等の力の印加により容器もしくはチャンバの底へのそのような沈降をもたらすことを含み得る。しかしながら、特定の例示的な実施形態では、そのような力は、本明細書でより詳細に論じられるように、スピノキュレーションに使用される力よりも小さい。そのような最初の接触の後、溶液中で遊離状態を維持し細胞と会合しないレトロウイルス粒子を除去することなく、指定された期間、反応混合物中の懸濁状態の細胞およびレトロウイルス粒子を含む反応混合物中で、追加の任意選択のインキュベーションが行われてもよい。例示的な実施形態では、接触は、範囲の下限の３０秒または１、２、５、１０、１５、３０もしくは４５分、または１、２、３、４、５、６、７、または８時間から、範囲の上限の１０分、１５分、３０分、または１、２、４、６、８、１０、１２、１８、２４、３６、４８、および７２時間まで実行され得る（または生じ得る）。特定の例示的な実施形態では、接触ステップは、範囲の下限の３０秒間、１分間、５分間、１０分間、１５分間、または３０分間から、範囲の上限の１時間、２時間、４時間、６時間、８時間、１０時間、または１２時間まで実行され得る。いくつかの実施形態では、接触ステップは、範囲の下限の３０秒、１分、および５分から、範囲の上限の１０分、１５分、３０分、４５分、または６０分間まで実行され得る。別の例示的な実施形態では、接触は、反応混合物中でのさらなるインキュベーションなしに、最初の接触ステップのみ（懸濁状態の遊離レトロウイルス粒子および懸濁状態の細胞を含む反応混合物中でのさらなるインキュベーションなし）の間、または５分以下、１０分以下、１５分以下、３０分以下、または１時間以下の反応混合物中でのインキュベーションとともに実行される。いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、遺伝子改変および／または形質導入される細胞にそれらを加えた後、直ちに洗い流されてもよく、その結果、接触時間は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を洗い流すのにかかる時間の長さにわたって実行される。したがって、典型的には、接触は、レトロウイルス粒子および細胞が形質導入反応混合物中で懸濁状態で接触させられる、少なくとも最初の接触工程を含む。そのような方法は、事前に活性化せずに実行することができる。
【０４３４】
この例示的な実施形態のセクションに提供される態様および実施形態を含むがこれらに限定されない、阻害性ＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む、または任意選択で含む、本明細書で提供される態様および実施形態のいずれかにおいて、そこですでに記載されていない限り、またはそれと不適合でない限り、そのような核酸配列が含まれ、そのような阻害性ＲＮＡ分子は、特定の実施形態では、例えば本明細書の阻害性ＲＮＡ分子セクションで特定された遺伝子標的（例えば標的をコードするｍＲＮＡ）のいずれかを標的化し；または、特定の実施形態では、ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、ＳＯＣＳ１、ｍｉＲ１５５標的、ＩＦＮガンマ、ｃＣＢＬ、ＴＲＡＩＬ２、ＰＰ２Ａ、ＡＢＣＧ１、ｃＣＢＬ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ３ｚ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＳＭＡＤ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳ）、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、Ａ２ＡＲ、ＡＨＲ、ＥＯＭＥＳ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＴＧＦＢＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＴＮＦＳＦ６（ＦＡＳＬ）、ＣＡＳＰ３、ＳＯＣＳ２、ＴＩＥＧ１、ＪｕｎＢ、Ｃｂｘ３、Ｔｅｔ２、ＨＫ２、ＳＨＰ１、もしくはＳＨＰ２を標的化し；または、特定の実施形態では、ｃＣＢＬ、ＣＤ３ｚ、ＣＤ３ｚ、ＰＤ１、ＣＴＬＡ４、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＳＭＡＤ２、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳ）、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、Ａ２ＡＲ、ＡＨＲ、ＥＯＭＥＳ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＴＧＦＢＲ２、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＴＮＦ（ＦＡＳＬ）、ＣＡＳＰ３、ＳＯＣＳ２、ＴＩＥＧ１、ＪｕｎＢ、Ｃｂｘ３、Ｔｅｔ２、ＨＫ２、ＳＨＰ１、もしくはＳＨＰ２を標的化し；または、特定の実施形態では、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳ）、ＢＴＬＡ、ＴＩＧＩＴ、Ａ２ＡＲ、ＡＨＲ、ＥＯＭＥＳ、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＰＰＰ２Ｒ２Ｄ、ＴＮＦＳＦ６（ＦＡＳＬ）、ＣＡＳＰ３、ＳＯＣＳ２、ＴＩＥＧ１、ＪｕｎＢ、Ｃｂｘ３、Ｔｅｔ２、ＨＫ２、ＳＨＰ１、もしくはＳＨＰ２をコードするｍＲＮＡを標的化し；または、特定の例示的な実施形態では、ＦＡＳ、ＡＨＲ、ＣＤ３ｚ、ｃＣＢＬ、Ｃｂｘ、ＨＫ２、ＦＡＳＬ、ＳＭＡＤ４、もしくはＥＯＭＥＳをコードするｍＲＮＡを標的化し；または、特定の例示的な実施形態では、ＦＡＳ、ＡＨＲ、Ｃｂｘ３、ＨＫ２、ＦＡＳＬ、ＳＭＡＤ４、もしくはＥＯＭＥＳをコードするｍＲＮＡを標的化し；または、さらなる例示的な実施形態では、ＡＨＲ、Ｃｂｘ３、ＨＫ２、ＳＭＡＤ４、もしくはＥＯＭＥＳをコードするｍＲＮＡを標的化する。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号３４２〜４４９の配列の少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、配列番号３９４〜４０１、４０６〜４０９、４３８〜４４１、または４４６〜４４９の配列の少なくとも１つを含む。
【０４３５】
この例示的な実施形態のセクションに提供される態様および実施形態を含むがこれらに限定されない、阻害性ＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む、または任意選択で含む、本明細書で提供される態様および実施形態のいずれかにおいて、そこですでに記載されていない限り、またはそれと不適合でない限り、そのような核酸配列が含まれ、そのような阻害性ＲＮＡ分子は、特定の実施形態では、２つ以上、２〜１０、２〜８、２〜６、３〜５、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの阻害性ＲＮＡ、もしくは本明細書、例えば直前の段落で特定された標的化阻害性ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）を含み；あるいは、特定の実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、ＦＡＳ、ｃＣＢＬ、ＡＨＲ、ＣＤ３ｚ、Ｃｂｘ、ＥＯＭＥＳ、もしくはＨＫ２をコードするｍＲＮＡを標的化する、２つ以上、２〜１０、２〜８、２〜６、３〜５、２、３、４、５、６、７、または８つの阻害性ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）、またはそのようなｍＲＮＡを標的化する１つ以上の阻害性ＲＮＡの組み合わせを含み；あるいは、特定のさらなる例示的な実施形態では、そのようなポリヌクレオチドは、ＦＡＳ、ＡＨＲ、Ｃｂｘ３、ＥＯＭＥＳ、もしくはＨＫ２をコードするｍＲＮＡを標的化する、２つ以上、２〜１０、２〜８、２〜６、３〜５、２、３、４、５、６、７、もしくは８つの阻害性ＲＮＡ（例えばｍｉＲＮＡ）、またはそのようなｍＲＮＡを標的化する１つ以上の阻害性ＲＮＡの組み合わせを含む。阻害性ＲＮＡ分子をコードする核酸を含む本明細書で提供されるそのような態様および実施形態は、これらに限定されないが、ポリヌクレオチドまたはベクター、例えば複製能力のないレトロウイルス粒子を対象とする本明細書で提供される態様および実施形態、または単離された細胞もしくは複製能力のないレトロウイルス粒子等のゲノムを含む態様を含む。
【０４３６】
一態様では、リンパ球（例えばＴ細胞もしくはＮＫ細胞）またはその集団を遺伝子改変および／または形質導入するための方法が本明細書で提供され、この方法は、リンパ球（例えばＴ細胞もしくはＮＫ細胞）またはその集団を含む血液細胞を、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドをそのゲノムに含む複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子とエクスビボで接触させることを含み、１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、任意選択で、１つ以上の核酸配列の別のものは、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、さらに任意選択で、１つ以上の核酸配列の別のものは、ポリペプチドリンパ増殖性要素をコードし、前記接触は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子によるリンパ球（例えばＴ細胞もしくはＮＫ細胞）または少なくともいくつかのリンパ球（例えばＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞）の遺伝子改変および／または形質導入を促進し、それにより遺伝子改変および／または形質導入されたリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を生成する。そのような方法において、接触は、典型的には、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）の集団を含み、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の集団と接触される、本明細書では形質導入反応混合物と呼ばれることもある反応混合物中で行われる。複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子へのリンパ球（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞）の膜会合、および最終的な膜融合を促進するためにこの態様で使用することができる、様々な接触時間が、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される。例示的な実施形態では、接触は、１５分間未満実行される。
【０４３７】
一態様では、対象のリンパ球（例えばＴ細胞またはＮＫ細胞）を遺伝子改変するためのキットの製造における複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の使用が本明細書で提供され、キットの使用は、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を含む血液細胞を、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と反応混合物中でエクスビボで接触させることを含み、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、その表面にシュードタイピング要素を含み、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列、典型的には転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、１つ以上の転写単位は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第１のポリペプチド、リンパ球増殖性要素（ＬＥ）を含む第１のポリペプチド、またはＬＥを含む第１のポリペプチドおよびＣＡＲを含む第２のポリペプチドをコードし、それにより遺伝子改変リンパ球（例えば遺伝子改変Ｔ細胞および／または遺伝子改変ＮＫ細胞）を生成する。複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子へのリンパ球（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞）の膜会合、および最終的な膜融合を促進するためにこの態様で使用することができる、様々な接触時間が、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される。例示的な実施形態では、接触は、１５分間未満実施される。
【０４３８】
別の態様では、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む血液細胞を複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と反応混合物中でエクスビボで接触させることを含む方法に従ってリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）を遺伝子改変することによって作製される遺伝子改変リンパ球（例えばＴ細胞またはＮＫ細胞）が本明細書で提供され、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、その表面にシュードタイピング要素を含み、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列、典型的には転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、１つ以上の転写単位は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第１のポリペプチド、リンパ球増殖性要素（ＬＥ）を含む第１のポリペプチド、またはＬＥを含む第１のポリペプチドおよびＣＡＲを含む第２のポリペプチドをコードし、それにより遺伝子改変リンパ球（例えばＴ細胞および／または遺伝子改変ＮＫ細胞）を生成する。複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子へのリンパ球（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞）の膜会合、および最終的な膜融合を促進するためにこの態様で使用することができる、様々な接触時間が、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される。例示的な実施形態では、接触は、１５分間未満実施される。
【０４３９】
別の態様では、リンパ球、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変する方法で使用するための複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が本明細書で提供され、この方法は、対象のリンパ球、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含む血液細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドをそのゲノムに含む複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と反応混合物中でエクスビボで接触させることを含み、１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、任意選択で、１つ以上の核酸配列の別のものは、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、さらに任意選択で、１つ以上の核酸配列の別のものは、ポリペプチドリンパ増殖性要素をコードし、前記接触は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子による休止Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の少なくともいくつかの形質導入を促進し、それにより遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成する。複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子へのリンパ球（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞）の膜会合、および最終的な膜融合を促進するためにこの態様で使用することができる、様々な接触時間が、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される。例示的な実施形態では、接触は、１５分間未満実施される。いくつかの実施形態では、この方法は、遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入することをさらに含み得る。例示的な実施形態では、リンパ球を含む血液細胞（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞）は、対象由来であり、したがって、導入は、再導入である。この態様では、いくつかの実施形態において、リンパ球の集団（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）は、接触ステップで接触され、遺伝子改変および／または形質導入され、導入ステップで対象に導入される。
【０４４０】
別の態様では、対象のリンパ球、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変するためのキットの製造における複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の使用が本明細書で提供され、キットの使用は、対象のリンパ球、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含む血液細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドをそのゲノムに含む複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と反応混合物中でエクスビボで接触させることを含み、１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、任意選択で、１つ以上の核酸配列の別のものは、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、さらに任意選択で、１つ以上の核酸配列の別のものは、ポリペプチドリンパ増殖性要素をコードし、前記接触は、複製能力のない組み換えレトロウイルスによる少なくともいくつかのＴ細胞および／またはＮＫ細胞の遺伝子改変を促進し、それにより遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成する。本明細書に示されるように、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子へのリンパ球（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞）の膜会合、および最終的な膜融合を促進するためにこの態様で使用することができる、様々な接触時間が本明細書で提供される。例示的な実施形態では、接触は、１５分間未満実施される。例示的な実施形態では、リンパ球を含む血液細胞（例えば、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞）は、対象由来であり、したがって、導入は、再導入である。この態様では、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の集団は、接触ステップで接触され、遺伝子改変および／または形質導入され、導入ステップで対象に導入される。
【０４４１】
別の態様では、対象のリンパ球、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変するための医薬の製造における複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の使用が本明細書で提供され、医薬の使用は、
Ａ）対象のＴ細胞および／またはＮＫ細胞を含む血液細胞を、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドをそのゲノムに含む複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と反応混合物中でエクスビボで接触させることを含み、１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、任意選択で、１つ以上の核酸配列の別のものは、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、さらに任意選択で、１つ以上の核酸配列の別のものは、ポリペプチドリンパ増殖性要素をコードし、前記接触は、複製能力のない組み換えレトロウイルスによる少なくともいくつかのリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）の遺伝子改変を促進し、それにより遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成し；また任意選択で、
Ｂ）遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に導入し、それにより対象のリンパ球、例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変することを含む。
【０４４２】
本明細書に示されるように、直前の段落のそのような態様では、様々な接触時間が本明細書に記載されるが、これをこの態様で使用して、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子へのリンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）の膜会合および最終的な膜融合を促進することができる。例示的な実施形態では、接触は、１５分間未満実行される。そのような方法のいくつかの実施形態では、血液細胞、リンパ球（例えばＴ細胞および／またはＮＫ細胞）は、対象からのものであり、典型的には、そのような実施形態では、対象から採取された血液からのものである。この段落で提供される方法の態様のいくつかの実施形態では、遺伝子改変および／または形質導入されたリンパ球（例えばＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞）またはその集団が、対象に導入または再導入される。
【０４４３】
本明細書の使用の態様、本明細書の遺伝子改変リンパ球（例えばＴ細胞もしくはＮＫ細胞）の態様、または本明細書のいずれかの実施形態によるリンパ球（例えばＴ細胞もしくはＮＫ細胞）を遺伝子改変および／もしくは形質導入するための方法の態様（これらに限定されないが、上述のものを含むこの例示的な実施形態のセクションにおける任意の実施形態を含む）のいずれかにおいて、不適合でない限り、またはすでに記載されていない限り、反応混合物は、少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の全血、および任意選択で有効量の抗凝固剤を含み、または、反応混合物は、ＰＢＭＣではない少なくとも１つの追加の血液もしくは血液調製成分をさらに含み、さらなる例示的な実施形態では、そのような血液または血液調製成分は、本明細書で提供される注目すべき非ＰＢＭＣ血液または血液調製成分の１つ以上である。
【０４４４】
別の態様では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子、Ｔ細胞活性化要素、および血液細胞を含む反応混合物が本明細書で提供され、組み換えレトロウイルス粒子は、その表面にシュードタイピング要素を含み、血液細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含み、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列、典型的には転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、１つ以上の転写単位は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第１のポリペプチド、リンパ増殖性要素（ＬＥ）を含む第１のポリペプチド、および／または１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、反応混合物は、少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または９９％の全血を含む。１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子（複数可）は、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される任意の標的を対象とすることができる。
【０４４５】
一態様では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子および血液細胞を含む反応混合物が本明細書で提供され、組み換えレトロウイルス粒子は、その表面にシュードダイピング要素を含み、血液細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含み、反応混合物は、少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の全血、および任意選択で有効量の抗凝固剤を含み、または、反応混合物は、ＰＢＭＣではない少なくとも１つの追加の血液もしくは血液調製成分をさらに含み、例示的な実施形態では、そのような血液または血液調製成分は、本明細書で提供される注目すべき非ＰＢＭＣ血液または血液調製成分の１つ以上である。
【０４４６】
別の態様では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子、Ｔ細胞活性化要素、および血液細胞を含む反応混合物が本明細書で提供され、組み換えレトロウイルス粒子は、その表面にシュードダイピング要素を含み、血液細胞は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含み、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列、典型的には転写単位を含むポリヌクレオチドを含み、１つ以上の転写単位は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む第１のポリペプチド、リンパ増殖性要素（ＬＥ）を含む第１のポリペプチド、および／または１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、反応混合物は、少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の全血、および任意選択で有効量の抗凝固剤を含み、または、反応混合物は、ＰＢＭＣではない少なくとも１つの追加の血液もしくは血液調製成分をさらに含み、例示的な実施形態では、そのような血液または血液調製成分は、本明細書で提供される注目すべき非ＰＢＭＣ血液または血液調製成分の１つ以上である。１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子（複数可）は、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される任意の標的を対象とすることができる。
【０４４７】
別の態様では、血液中のＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞またはその成分を遺伝子改変するための方法が本明細書で提供され、この方法は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含む血液細胞を、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と反応混合物中でエクスビボで接触させることを含み、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、その表面にシュードタイピング要素を含み、前記接触は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞と複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子との会合を促進し、組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変および／または形質導入し、反応混合物は、少なくとも１０％、１０％、２０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の全血、および任意選択で有効量の抗凝固剤を含み、または、反応混合物は、ＰＢＭＣではない少なくとも１つの追加の血液もしくは血液調製成分をさらに含み、例示的な実施形態では、そのような血液または血液調製成分は、本明細書で提供される注目すべき非ＰＢＭＣ血液または血液調製成分の１つ以上である。
【０４４８】
別の態様では、対象のＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変するためのキットの製造における複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の使用が本明細書で提供され、キットの使用は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含む血液細胞を、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と反応混合物中でエクスビボで接触させることを含み、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、その表面にシュードタイピング要素を含み、前記接触は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞と複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子との会合を促進し、組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変および／または形質導入し、血液細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞を含み、反応混合物は、少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の全血、および任意選択で有効量の抗凝固剤を含み、または、反応混合物は、ＰＢＭＣではない少なくとも１つの追加の血液もしくは血液調製成分をさらに含み、例示的な実施形態では、そのような血液または血液調製成分は、本明細書で提供される注目すべき非ＰＢＭＣ血液または血液調製成分の１つ以上である。
【０４４９】
別の態様では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を含む血液細胞を複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子と反応混合物中でエクスビボで接触させることを含む方法に従ってＴ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変することによって作製される遺伝子改変Ｔ細胞またはＮＫ細胞が本明細書で提供され、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、その表面にシュードタイピング要素を含み、前記接触は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞と複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子との会合を促進し、組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を遺伝子改変および／または形質導入し、反応混合物は、少なくとも１０％、２０％、２５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％の全血、および任意選択で有効量の抗凝固剤を含み、または、反応混合物は、ＰＢＭＣではない少なくとも１つの追加の血液もしくは血液調製成分をさらに含み、例示的な実施形態では、そのような血液または血液調製成分は、本明細書で提供される注目すべき非ＰＢＭＣ血液または血液調製成分の１つ以上である。
【０４５０】
１つ以上の注目すべき非ＰＢＭＣ血液または血液調製成分は、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の例示的な実施形態に存在し、これらの特定の例示的な実施形態では、反応混合物は少なくとも１０％の全血を含むため、この例示的な実施形態のセクションで提供されるものを含むがこれに限定されない。この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物は、範囲の下限の１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、もしくは７５％から、範囲の上限の８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、もしくは９９．９９％の全血、または少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、もしくは９９．９９％の全血を含む。
【０４５１】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物中の血液細胞は、反応混合物中の白血球のパーセントとして、少なくとも１０％の好中球および少なくとも０．５％の好酸球を含む。
【０４５２】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物は、反応混合物中の白血球のパーセントとして少なくとも２０％、２５％、３０％、もしくは４０％の好中球、または、反応混合物中の白血球のパーセントとして２０％〜８０％、２５％〜７５％、または４０％〜６０％の間の好中球を含む。
【０４５３】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物は、反応混合物中の白血球のパーセントとして少なくとも０．１％の好酸球、または０．２５％〜８％の間の好酸球、または０．５％〜４％を含む。
【０４５４】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物中の血液細胞は、接触の前にＰＢＭＣ濃縮手順に供されない。
【０４５５】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物は、組み換えレトロウイルス粒子を全血に添加することによって形成される。
【０４５６】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物は、有効量の抗凝固剤を含む実質的全血に組み換えレトロウイルス粒子を添加することによって形成される。
【０４５７】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物は、閉鎖型細胞処理システム内にある。そのような反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法の特定の実施形態では、反応混合物中の血液細胞はＰＢＭＣであり、反応混合物は、閉鎖型細胞処理システムにおける白血球除去フィルタアセンブリと接触しており、任意選択のさらなる実施形態では、白血球除去フィルタアセンブリは、ＨｅｍａＴｒａｔｅフィルタを含む。
【０４５８】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物は、抗凝固剤を含む。例えば、特定の実施形態では、抗凝固剤は、酸性クエン酸塩デキストロース、ＥＤＴＡ、またはヘパリンからなる群から選択される。特定の実施形態では、抗凝固剤は、酸性クエン酸塩デキストロース以外のものである。特定の実施形態では、抗凝固剤は、有効量のヘパリンを含む。
【０４５９】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物は、接触中、血液バッグ内にある。
【０４６０】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物は、接触の前に、閉鎖型細胞処理システムにおいてＴリンパ球および／またはＮＫ細胞濃縮フィルタと接触しており、反応混合物は顆粒球を含み、顆粒球は、反応混合物中の白血球の少なくとも１０％を含む、または、反応混合物は、Ｔ細胞と少なくとも１０％の数の顆粒球を含み、遺伝子改変されたリンパ球（例えばＴ細胞またはＮＫ細胞）は、接触の後にＰＢＭＣ濃縮プロセスに供される。
【０４６１】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物中の血液細胞は、ＰＢＭＣであり、反応混合物中の任意選択のインキュベーションを含む接触の後、反応混合物は、閉鎖型細胞処理システム内の白血球除去フィルタアセンブリと接触している。
【０４６２】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、全血は、臍帯血以外である。
【０４６３】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかの特定の実施形態では、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態ですでに記載されていない限り、反応混合物は、接触の前に、組み換えレトロウイルス粒子および血液細胞が接触するときに、任意選択の反応混合物中でのインキュベーションを含む接触中に、ならびに／または任意選択の反応混合物中でのインキュベーションを含む接触の後に、閉鎖型細胞処理システムにおいて白血球除去フィルタアセンブリと接触しており、Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞、または遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞は、さらにＰＢＭＣ濃縮手順に供される。
【０４６４】
一態様では、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドをそのゲノムに含む複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が本明細書で提供され、
ａ．１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、
ｂ．１つ以上の核酸配列の第２の核酸配列は、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子（複数可）は、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される任意の標的を対象とすることができる。
【０４６５】
本明細書の別の態様では、複製能力のないレトロウイルス粒子のパッケージング可能なＲＮＡゲノムを含む哺乳動物パッケージング細胞株が提供され、該パッケージング可能なＲＮＡゲノムは、以下を含む。
ａ．長い５’末端反復、またはその活性断片、
ｂ．レトロウイルスのシス作用性ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列、
ｃ．Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチド（ここで、１つ以上の核酸の第１の核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば、２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、１つ以上の核酸配列の第２の核酸配列は、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする）、および
【０４６６】
ｄ．長い３’末端反復、またはその活性断片。１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子（複数可）は、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される任意の標的を対象とすることができる。本明細書の別の態様では、複製能力のないレトロウイルス粒子のパッケージング可能なＲＮＡゲノムを含むレトロウイルスベクターが提供され、該パッケージング可能なＲＮＡゲノムは、以下を含む。
ａ．長い５’末端反復、またはその活性断片、
ｂ．レトロウイルスのシス作用性ＲＮＡパッケージング要素をコードする核酸配列、
ｃ．Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチド（ここで、１つ以上の核酸の第１の核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば、２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、１つ以上の核酸配列の第２の核酸配列は、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする）、および
ｄ．長い３’末端反復、またはその活性断片。１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子（複数可）は、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される任意の標的を対象とすることができる。
【０４６７】
レトロウイルスベクターの態様または哺乳動物のパッケージング細胞株の態様のいくつかの実施形態では、（ｃ）のポリヌクレオチドは、レトロウイルスのシス作用性ＲＮＡパッケージング要素（ｂ）をコードする核酸配列、長さ５’末端反復配列（ａ）、および／または３’末端反復配列（ｄ）に対して逆方向となり得る。
【０４６８】
レトロウイルスベクターの態様または哺乳動物のパッケージング細胞株の態様のいくつかの実施形態では、パッケージング可能なＲＮＡゲノムの発現は、哺乳動物のパッケージング細胞株において活性な誘導性プロモーターによって駆動される。
【０４６９】
レトロウイルスベクターの態様または哺乳動物のパッケージング細胞株の態様のいくつかの実施形態では、レトロウイルスのシス作用性ＲＮＡパッケージング要素は、中央ポリプリントラクト（ｃＰＰＴ）／中央終結配列、ＨＩＶ  Ｐｓｉ、またはそれらの組み合わせを含み得る。レトロウイルスベクターは、任意選択で、抗生物質耐性遺伝子および／または検出可能なマーカーを含み得る。
【０４７０】
別の態様では、
ａ．１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子、ならびに
ｂ．抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞が本明細書で提供され、前記１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子およびＣＡＲは、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の遺伝子改変である核酸配列によってコードされる。１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子（複数可）は、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される任意の標的を対象とすることができる。
【０４７１】
遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞の態様のいくつかの実施形態では、遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞はまた、阻害性ＲＮＡ分子ではない少なくとも１つのリンパ増殖性要素、典型的にはポリペプチドリンパ増殖性要素を含み、前記リンパ増殖性要素は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の遺伝子改変である核酸によってコードされる。いくつかの実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子、ＣＡＲ、および／または少なくとも１つのポリペプチドリンパ増殖性要素は、ポリシストロン性物質で発現される。例示的な実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子は、単一のポリシストロン性転写物から発現される。
【０４７２】
別の態様では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子が本明細書で提供され、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドをそのゲノムに含み、１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、１つ以上の核酸配列の第２の核酸配列は、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、方法は、対象のＴ細胞および／またはＮＫ細胞をエクスビボで接触させることを含み、前記接触は、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子による休止Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の少なくともいくつかの形質導入を促進し、それにより遺伝子改変Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞を生成する。１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子（複数可）は、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される任意の標的を対象とすることができる。
【０４７３】
別の態様では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子、および任意選択で、対象における腫瘍成長を処置するためのそれらの使用に関する指示を含む市販のコンテナが本明細書で提供され、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドをそのゲノムに含み、１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、１つ以上の核酸配列の第２の核酸配列は、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする。１つ以上の阻害性ＲＮＡ分子（複数可）は、この例示的な実施形態の項を含むがこれに限定されない、本明細書で提供される任意の標的を対象とすることができる。
【０４７４】
Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、すぐ上に提供された態様のいずれかにおいて、１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、１つ以上の核酸配列の第２の核酸配列は、抗原特異的標的化領域（ＡＳＴＲ）、膜貫通ドメイン、および細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードし、ポリヌクレオチドは、阻害性ＲＮＡ分子ではない少なくとも１つのリンパ増殖性要素をコードする第３の核酸配列をさらに含み得、例示的な実施形態では、ポリペプチド、例えば本明細書に開示されるポリペプチドリンパ増殖性要のいずれかである。
【０４７５】
Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、すぐ上に提供された態様のいずれかにおいて、１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、阻害性ＲＮＡ分子は、任意の構造を有し得、および／または本明細書の「阻害性ＲＮＡ分子」セクションに提供される実施形態のいずれかであってもよい。例えば、阻害性ＲＮＡは、いくつかの実施形態では、互いに部分的または完全に相補的である５’鎖および３’鎖を含んでもよく、前記５’鎖および前記３’鎖は、１８〜２５ヌクレオチドＲＮＡ二重鎖を形成し得る。さらに、阻害性ＲＮＡ分子は、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであってもよく、特定の実施形態では、阻害性ＲＮＡ分子の少なくとも１つまたは全ては、自然発生ｍｉＲＮＡに由来する５’アーム、３’アーム、またはその両方を含む。例えば、自然発生ｍｉＲＮＡ等は、ｍｉＲ−１５５、ｍｉＲ−３０、ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２２、およびｍｉＲ−２１、および例示的な実施形態ではｍｉＲ−１５５からなる群から選択され得る。
【０４７６】
Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、上記に提供された態様のいずれかにおいて、１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする２つ以上の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、２〜４つの阻害性ＲＮＡ分子をコードする。例示的な実施形態では、２〜１０、２〜８、２〜６、２〜５、２〜４、３〜５、または３〜６つの間の阻害性ＲＮＡ分子が第１の核酸配列に含まれる。例示的な実施形態では、４つの阻害性ＲＮＡ分子が、第１の核酸配列に含まれる。
【０４７７】
Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結された１つ以上の核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む、すぐ上に提供された態様のいずれかにおいて、１つ以上の核酸配列の第１の核酸配列は、１つ以上のＲＮＡ標的を対象とする１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子をコードし、１つ以上（例えば２つ以上）の阻害性ＲＮＡ分子はイントロンにあってもよい。いくつかの実施形態では、イントロンは、プロモーター内にある。例示的な実施形態では、イントロンは、ＥＦ−１アルファイントロンＡである。いくつかの実施形態では、イントロンは、プロモーターに隣接し、プロモーターの下流にあり、例示的な実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を生成するために使用されるパッケージング細胞において不活性である。
【０４７８】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法の態様および実施形態のいずれかでは、不適合でない限り、または別段に記載されていない限り、複製能力のないレトロウイルス粒子と組み合わされて反応混合物を形成する場合、Ｔ細胞の少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、ほとんど、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％が休止Ｔ細胞であり、またはＮＫ細胞の少なくとも１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、ほとんど、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％が休止ＮＫ細胞である。
【０４７９】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法の態様および実施形態のいずれかでは、不適合でない限り、または別段に記載されていない限り、細胞は、スピノキュレーション手順に供されない、例えば少なくとも８００ｇのスピノキュレーションに少なくとも３０分間供されない。
【０４８０】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法の態様および実施形態のいずれかのいくつかの実施形態では、不適合でない限り、または別段に記載されていない限り、方法は、遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞を対象に投与することをさらに含み、任意選択で、対象は、血液細胞の供給源である。これらのいくつかの下位実施形態、ならびにこの例示的な実施形態のセクションにおけるものを含む本明細書の方法および使用のいずれかの実施形態では、不適合でない限り、またはすでに記載されていない限り、遺伝子改変および／または形質導入されたリンパ球（例えばＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞）またはその集団は、対象に導入または再導入される前に、エクスビボで４つ以下の細胞分裂を生じる。いくつかの実施形態では、血液が対象から採取されてから遺伝子改変されたＴ細胞および／またはＮＫ細胞が対象に再導入されるまでの間に、８時間、６時間、４時間、２時間、または１時間以内が経過する。いくつかの実施形態では、血液が採取された後、および血液が再導入される前の全てのステップは、閉鎖システムで実行され、任意選択で、人が処理全体を通して閉鎖システムを監視する。
【０４８１】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子、反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法のいずれかでは不適合でない限り、または別段に記載されない限り、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、その表面に膜結合Ｔ細胞活性化要素を含む。これらのいくつかの下位実施形態、およびこの例示的な実施形態のセクションにおけるものを含む本明細書で提供される態様のいずれかの実施形態では、不適合でない限り、または既に記載されていない限り、Ｔ細胞活性化要素は、抗ＣＤ３抗体または抗ＣＤ２８抗体の１つ以上であってもよい。これらのいくつかの実施形態、およびこの例示的な実施形態のセクションにおけるものを含むがこれらに限定されない本明細書で提供される態様のいずれかの実施形態では、不適合でない限り、または別段に記載されない限り、Ｔ細胞活性化要素は、１つ以上のポリペプチド、例示的な実施形態ではＣＤ２８、ＯＸ４０、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ９、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ８１、および／またはＣＤ８２に結合し得る膜結合ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ＣＤ３に結合し得る膜結合ポリペプチドは、異種ＧＰＩアンカー付着配列に融合され、および／または、ＣＤ２８に結合し得る膜結合ポリペプチドは、異種ＧＰＩアンカー付着配列に融合される。例示的な実施形態では、ＣＤ２８に結合し得る膜結合ポリペプチドは、ＣＤ１６Ｂ  ＧＰＩアンカー付着配列に結合したＣＤ８０またはその細胞外ドメインである。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞活性化要素は、ＣＤ３に結合し得る１つ以上のポリペプチドをさらに含む。これらのいくつかの下位実施形態、およびこの例示的な実施形態のセクションにおけるものを含む本明細書で提供される態様のいずれかの実施形態では、不適合でない限り、またはすでに記載されていない限り、Ｔ細胞活性化要素は、膜結合抗ＣＤ３抗体であり、抗ＣＤ３抗体は、組み換えレトロウイルス粒子の膜に結合している。いくつかの実施形態では、膜結合抗ＣＤ３抗体は、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖまたは抗ＣＤ３  ｓｃＦｖＦｃである。いくつかの実施形態では、膜結合抗ＣＤ３抗体は、異種ＧＰＩアンカーによって膜に結合される。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、ウイルスエンベロープタンパク質との組み換え融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３抗体は、ＭｕＬＶからのウイルスエンベロープタンパク質との組み換え融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ３は、フューリン開裂部位で突然変異しているＭｕｌＶのウイルスエンベロープタンパク質との組み換え融合タンパク質である。
【０４８２】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法の態様および実施形態のいずれかでは、不適合でない限り、または別段に記載されていない限り、ＡＢＣトランスポーター阻害剤および／または基質、さらなる下位実施形態では外因性ＡＢＣトランスポーター阻害剤および／または基質は、遺伝子改変および／または形質導入の前、最中、またはその前および最中の両方に存在しない。
【０４８３】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法の態様および実施形態のいずれかでは、不適合でない限り、または別段に記載されていない限り、組み換えレトロウイルス粒子は、０．１〜５０、０．５〜５０、０．５〜２０、０．５〜１０、１〜２５、１〜１５、１〜１０、１〜５、２〜１５、２〜１０、２〜７、２〜３、３〜１０、３〜１５、もしくは５〜１５の間、または少なくとも０．１、０．５、１、２、２．５、３、５、１０もしくは１５のＭＯＩで反応混合物中に存在し、あるいは、少なくとも０．１、０．５、１、２、２．５、３、５、１０または１５のＭＯＩで反応混合物中に存在する。
【０４８４】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法の態様および実施形態のいずれかでは、不適合でない限り、または別段に記載されていない限り、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞の少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、もしくは少なくとも２０％が遺伝子改変されている、または範囲の下限の５％、１０％、１５％、２０％、もしくは２５％から、範囲の上限の２０％、２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、もしくは８５％の間が遺伝子改変されている。
【０４８５】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供されるポリヌクレオチド、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子、反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法の態様および実施形態のいずれかでは、不適合でない限り、または別段に記載されていない限り、１つ以上の転写単位は、リンパ増殖性要素（ＬＥ）を含むポリペプチドをコードし得る。本明細書に開示されるポリペプチドリンパ増殖性要素のいずれか、例えば、これらに限定されないが、本明細書の「リンパ増殖性要素」セクションに開示されるもの、またはその機能的突然変異体および／もしくは断片がコードされ得る。いくつかの実施形態では、ＬＥは、ＣＤ２、ＣＤ３Ｄ、ＣＤ３Ｅ、ＣＤ３Ｇ、ＣＤ４、ＣＤ８Ａ、ＣＤ８Ｂ、ＣＤ２７、突然変異デルタＬｃｋ  ＣＤ２８、ＣＤ２８、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＲＬＦ２、ＣＳＦ２ＲＢ、ＣＳＦ２ＲＡ、ＣＳＦ３Ｒ、ＥＰＯＲ、ＦＣＥＲ１Ｇ、ＦＣＧＲ２Ｃ、ＦＣＧＲＡ２、ＧＨＲ、ＩＣＯＳ、ＩＦＮＡＲ１、ＩＦＮＡＲ２、ＩＦＮＧＲ１、ＩＦＮＧＲ２、ＩＦＮＬＲ１、ＩＬ１Ｒ１、ＩＬ１ＲＡＰ、ＩＬ１ＲＬ１、ＩＬ１ＲＬ２、ＩＬ２ＲＡ、ＩＬ２ＲＢ、ＩＬ２ＲＧ、ＩＬ３ＲＡ、ＩＬ４Ｒ、ＩＬ５ＲＡ、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＩＬ７ＲＡ、ＩＬ９Ｒ、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＩＬ１１ＲＡ、ＩＬ１２ＲＢ１、ＩＬ１２ＲＢ２、ＩＬ１３ＲＡ１、ＩＬ１３ＲＡ２、ＩＬ１５ＲＡ、ＩＬ１７ＲＡ、ＩＬ１７ＲＢ、ＩＬ１７ＲＣ、ＩＬ１７ＲＤ、ＩＬ１７ＲＥ、ＩＬ１８Ｒ１、ＩＬ１８ＲＡＰ、ＩＬ２０ＲＡ、ＩＬ２０ＲＢ、ＩＬ２１Ｒ、ＩＬ２２ＲＡ１、ＩＬ２３Ｒ、ＩＬ２７ＲＡ、ＩＬ３１ＲＡ、ＬＥＰＲ、ＬＩＦＲ、ＬＭＰ１、ＭＰＬ、ＭＹＤ８８、ＯＳＭＲ、ＰＲＬＲ、ＴＮＦＲＳＦ４、ＴＮＦＲＳＦ８、ＴＮＦＲＳＦ９、ＴＮＦＲＳＦ１４、もしくはＴＮＦＲＳＦ１８、またはその機能的突然変異体および／もしくは断片からの細胞内ドメインを含む。
【０４８６】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子、反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法の態様および実施形態のいずれかでは、不適合でない限り、または別段に記載されていない限り、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、レンチウイルス粒子である。さらなる例示的な実施形態では、遺伝子改変された細胞は、遺伝子改変されたＴ細胞または遺伝子改変されたＮＫＴ細胞である。
【０４８７】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供されるポリヌクレオチド、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子、反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法の態様および実施形態のいずれかでは、不適合でない限り、または別段に記載されていない限り、１つ以上の転写単位は、ＣＡＲを含むポリペプチドをコードし得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、微小環境が制限された生物学的（ＭＲＢ）−ＣＡＲである。他の実施形態では、ＣＡＲのＡＳＴＲは、腫瘍関連抗原に結合する。他の実施形態では、ＣＡＲのＡＳＴＲは、微小環境が制限された生物学的（ＭＲＢ）−ＡＳＴＲである。
【０４８８】
特定の実施形態では、本明細書で提供される態様および実施形態のいずれかは、いくつかの場合では複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子または遺伝子改変Ｔ細胞および／もしくはＮＫ細胞のゲノムに、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含み、これは、少なくとも１つのポリペプチドリンパ増殖性要素をコードする。例示的な実施形態では、ポリペプチドリンパ増殖性要素は、本明細書に開示されるポリペプチドリンパ増殖性要素のいずれかである。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される核酸配列のいずれかまたは全ては、リボスイッチに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、リボスイッチは、ヌクレオシド類似体に結合することができる。いくつかの実施形態では、ヌクレオシド類似体は、抗ウイルス薬である。
【０４８９】
この例示的な実施形態のセクションにおける態様および実施形態を含むがこれらに限定されない、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を含む本明細書で提供される態様および実施形態のいずれかでは、不適合でない限り、または態様もしくは実施形態にいてすでに記載されていない限り、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、Ｔ細胞および／またはＮＫ細胞に結合し、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子の膜融合を促進し得るシュードダイピング要素をその表面に含む。いくつかの実施形態では、シュードタイピング要素は、ウイルスエンベロープタンパク質である。いくつかの実施形態では、ウイルスエンベロープタンパク質は、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルス両向性エンベロープタンパク質、オンコレトロウイルスエ同種指向性エンベロープタンパク質、小胞性口内炎ウイルスエンベロープタンパク質（ＶＳＶ−Ｇ）、ヒヒレトロウイルスエンベロープ糖タンパク質（ＢａＥＶ）、マウス白血病エンベロープタンパク質（ＭｕＬＶ）、および／もしくはパラミクソウイルス麻疹エンベロープタンパク質ＨおよびＦ、または休止Ｔ細胞および／もしくは休止ＮＫ細胞に結合する能力を保持するそれらのいずれかの断片のうちの１つ以上である。例示的な実施形態では、シュードタイピング要素は、ＶＳＶ−Ｇである。本明細書の他の場所で論じられるように、シュードタイピング要素は、Ｔ細胞活性化要素との融合を含み得、これは、例示的な実施形態では、エンベロープタンパク質シュードタイピング要素、例えばＭｕＬＶまたはＶＳＶ−Ｇのいずれかの、抗ＣＤ３抗体との融合であり得る。さらなる例示的な実施形態では、シュードタイピング要素は、ＶＳＶ−Ｇと、抗ＣＤ３ｓｃＦｖのＭｕＬＶへの融合との両方を含む。
【０４９０】
複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子を含む本明細書で提供される態様のいずれかにおいて、いくつかの実施形態では、複製能力のない組み換えレトロウイルス粒子は、モノクローナル抗体承認生物学的製剤によって認識されるドメインをコードする核酸をその表面に含む。
【０４９１】
この例示的な実施形態のセクションに提供されるものを含むがこれらに限定されない、本明細書で提供される反応混合物、使用、遺伝子改変されたＴ細胞もしくはＮＫ細胞、またはＴ細胞および／もしくはＮＫ細胞を遺伝子改変するための方法の態様および実施形態のいずれかの特定の例示的な実施形態では、不適合でない限り、または別段に記載されていない限り、反応混合物中の血液細胞は、ＰＢＭＣ濃縮手順によって生成された血液細胞であり、ＰＢＭＣを含む、または、血液細胞は、例示的な実施形態では、ＰＢＭＣである。例示的な実施形態では、ＰＭＢＣ濃縮を含むそのような実施形態は、反応混合物が少なくとも１０％の全血を含む実施形態と組み合わされない。したがって、本明細書の特定の例示的な実施形態では、反応混合物中の血液細胞は、レトロウイルス粒子が添加されて反応混合物を形成するＰＢＭＣ濃縮手順からのＰＢＭＣ細胞画分であり、他の例示的な実施形態では、反応混合物中の血液細胞は、レトロウイルス粒子が添加されて反応混合物を形成する全血からのものである。
【０４９２】
以下の限定されない例は、例示的な実施形態を純粋に例示することを目的として提供されており、本開示の範囲および精神を決して制限するものではない。さらに、本明細書に開示または請求される任意の発明は、本明細書に記載される任意の１つ以上の特徴の全ての変形、組み合わせ、および順列を包含することが理解されるべきである。特定の除外が本明細書に明示的に記載されていない場合でも、任意の１つ以上の特徴が特許請求の範囲から明示的に除外され得る。また、ある方法で使用するための試薬の開示は、本明細書に開示される特定の方法、または当業者が別様に理解しない限り、当該技術分野において知られている他の方法に従うその試薬の使用を含むその方法と同意である（またそれを支援する）ことが理解されるべきである。さらに、明細書および／または特許請求の範囲が方法を開示する場合、当業者が別様に理解しない限り、本明細書に開示される試薬のいずれか１つ以上が方法で使用され得る。
【実施例】
【０４９３】
実施例１．形質導入実験のための材料および方法。
この実施例は、本明細書の後続の実施例に開示される実験で使用される材料および方法を提供する。
一過性トランスフェクションによる組み換えレンチウイルス粒子の産生。
【０４９４】
２９３Ｔ細胞（Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）２９３Ｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を、Ｆ１ＸＴ細胞と呼ばれるＦｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）での連続成長により懸濁培養に適合させ、別段に記載がない限り、本明細書の実験のパッケージング細胞として使用した。
【０４９５】
記載されている場合、典型的な４ベクターパッケージング系は、（ｉ）ｇａｇ／ｐｏｌ、（ｉｉ）ｒｅｖ、および（ｉｉｉ）ＶＳＶ−Ｇ等のシュードタイピング要素をコードする３つのパッケージングプラスミドを含んでいた。このパッケージング系の第４のベクターは、目的の１つ以上の遺伝子をコードする第３世代レンチウイルス発現ベクター（自己不活化をもたらす３’ＬＴＲの欠失を含む）であるゲノムプラスミドである。４つのプラスミドを使用したトランスフェクションの場合、使用した全ＤＮＡ（１μｇ／ｍＬの培養容量）は、別段に記載されない限り、次のモル比の４つのプラスミドの混合物であった：１×ｇａｇ／ｐｏｌ含有プラスミド、１×Ｒｅｖ含有プラスミド、１×ウイルスエンベロープ含有プラスミド（別段に記載されない限りＶＳＶ−Ｇ）、および２×ゲノムプラスミド。記載されている場合、典型的な５ベクターパッケージング系が使用され、別様では、第５のベクターエンコーディング、例えば、抗ＣＤ３−ｓｃＦｖＦｃ−ＧＰＩ等のＴ細胞活性化要素が４ベクターパッケージング系に追加された。５つのプラスミドを使用したトランスフェクションの場合、使用した全ＤＮＡ（１μｇ／ｍＬの培養容量）は、別段に記載されない限り、次のモル比の５つのプラスミドの混合物であった：１×ｇａｇ／ｐｏｌ含有プラスミド、１×Ｒｅｖ含有プラスミド、１×ＶＳＶ−Ｇ含有プラスミド、２×ノムプラスミド、および１×第５のベクター。
【０４９６】
パッケージング細胞を含む培養液３０ｍＬごとに、プラスミドＤＮＡを１．５ｍｌのＧｉｂｃｏ（商標）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）成長培地に溶解した。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）（弱酸に溶解）を、１．５ｍｌのＧｉｂｃｏ（商標）Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）で２μｇ／ｍＬに希釈した。ＰＥＩおよびＤＮＡの３ｍｌ混合物を、２ｕｇのＰＥＩ対１ｕｇのＤＮＡの比率で２つの調製された試薬を組み合わせることによって作製した。室温で５分間インキュベートした後、２つの溶液を完全に混合し、室温でさらに２０分間インキュベートした。１２５ｍＬの三角フラスコ内で、最終体積（３ｍｌ）を１×１０６細胞／ｍＬで懸濁したパッケージング細胞の３０ミリリットルに添加した。次いで、トランスフェクションのために８％ＣＯ２で１２５ｒｐｍで回転させながら細胞を３７℃で７２時間インキュベートした。
【０４９７】
７２時間後、上清を回収し、１，２００ｇで１０分間遠心分離して清澄化した。清澄化した上清を新しいチューブにデカントした。ウイルスは、遠心分離、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）沈殿、または深層濾過によって、清澄化された上清から精製した。遠心分離による精製では、レンチウイルス粒子を、４℃で３，３００ｇで一晩遠心分離することにより沈殿させた。上清を廃棄し、レンチウイルス粒子ペレットを１：１００の初期容量のパッケージング細胞培養液中に再懸濁した。ＰＥＧ沈殿による精製では、１／４容量のＰＥＧを清澄化した上清に加え、４℃で一晩インキュベートした。次いで、混合物を１６００ｇで１時間（５０ｍｌコニカルチューブの場合）または１８００ｇで１．５時間（５００ｍｌコニカルチューブの場合）遠心分離した。上清を廃棄し、レンチウイルス粒子ペレットを１：１００の初期容量のパッケージング細胞培養液中に再懸濁した。深層濾過による精製では、清澄化した上清をタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）で高濃度化し、ベンゾナーゼで消化した。次いで、ウイルスを精製し、透析濾過によって最終製剤（２％ラクトースを含むＰＢＳ）に緩衝液交換した。
【０４９８】
レンチウイルス粒子は、２９３Ｔおよび／またはＪｕｒｋａｔ細胞への形質導入、およびＬｅｎｔｉ−Ｘ（商標）ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（＃６３１２３５）またはタカラのｐ２４アッセイＥＬＩＳＡキット（Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）ｐ２４  Ｒａｐｉｄ  Ｔｉｔｅｒ  Ｋｉｔ＃６３２２００）を使用したレンチウイルスゲノムのＦＡＣＳまたはｑＰＣＲによる導入遺伝子発現の分析によって、導入遺伝子発現の段階希釈および分析により力価測定した。
【０４９９】
実施例で使用されるゲノムプラスミド。
以下のレンチウイルスゲノムベクターは、示されているように目的の遺伝子および特徴をコードしている。
【０５００】
Ｆ１−３−２３は、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ、ＣＤ８ストークおよび膜貫通領域、ならびにＣＤ３ｚからの細胞内ドメインとそれに続くＴ２ＡおよびｅＴａｇ（ａＣＤ１９：ＣＤ８：ＣＤ３ｚ−Ｔ２Ａ−ｅＴａｇ）を含むＣＤ１９ＣＡＲをコードしている。
【０５０１】
追加のレンチウイルスゲノムベクターは、特定の例で説明されている。
【０５０２】
実施例２．ＶＳＶ−ＧまたはインフルエンザＨＡおよびＮＡでシュードタイピングされ、任意選択でＶＳＶ−Ｇ、ＭＶ、またはＭｕＬＶに由来するエンベロープで同時シュードダイピングされ、さらに任意選択で抗ＣＤ３ｓｃＦｖをその表面上にディスプレイするレトロウイルス粒子に４時間曝露された、非刺激ＰＢＭＣの形質導入効率。
この実施例では、様々な異なるエンベロープタンパク質でシュードタイピングまたは同時シュードダイピングされ、任意選択でＴ細胞活性化要素をディスプレイするレンチウイルス粒子を、非刺激ヒトＰＢＭＣに４時間曝露し、形質導入効率を評価した。
【０５０３】
組み換えレンチウイルス粒子を、Ｆ１ＸＴ細胞で産生した。細胞を、ＰＥＩを使用して、ゲノムプラスミド、およびｇａｇ／ｐｏｌ、ｒｅｖをコードする個別のパッケージングプラスミド、およびエンベローププラスミドで一過性にトランスフェクトした。特定の試料では、トランスフェクション反応混合物はまた、ＵＣＨＴ１ｓｃＦｖＦｃ−ＧＰＩをコードするプラスミド、同時シュードダイピングエンベロープ、または抗ＣＤ３ｓｃＦｖに融合した同時シュードダイピングエンベロープも含んでいた。この実施例の試料に使用されたゲノムプラスミドは、本明細書の他の実施例に開示されているように、Ｆ１−０−０３であった。この実施例の試料に使用されたシュードタイピングおよび同時シュードタイピングプラスミドは、ＵＣＨＴ１からの抗ＣＤ３ｓｃＦｖが融合されたＶＳＶ−Ｇ（配列番号３３６）、Ｕ−ＶＳＶ−Ｇ（配列番号４５５）、ＶＳＶ−Ｇエンベロープのアミノ末端、Ｈ１Ｎ１  ＰＲ８  １９３４からのインフルエンザＨＡ（配列番号３１１）およびＨ１０Ｎ７−ＨＫＷＦ４４６Ｃ−０７からのＮＡ（配列番号３１２）、ＵＣＨＴ１からの抗ＣＤ３ｓｃＦｖがＭｕＬＶエンベロープのアミノ末端に融合されたＵ−ＭｕＬＶ（配列番号３４１）、８〜３１個のＣ末端アミノ酸が細胞質尾部から削除されたＵ−ＭｕＬＶバリアント、Ｕ−ＭｕＬＶのフューリン媒介開裂部位Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−ＡｒｇがＩｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇペプチドで置き換えられたＵ−ＭｕＬＶＳＵｘ（配列番号４５４）、または麻疹ウイルスＨタンパク質のＣ末端２４アミノ酸が除去されたＭＶＨΔ２４（配列番号３１５）からのエンベロープタンパク質をコードした。
【０５０４】
特定の試料では、Ｕ−ＭｕＬＶエンベロープタンパク質は、Ｕ−ＭｕＬＶ−ＩＲＥＳ２−ｒｅｖ（ＭｕＬＶＩＲ）の形式またはＵ−ＭｕＬＶ−Ｔ２Ａ−ｒｅｖ（ＭｕＬＶ２Ｒ）の形式でタンデムにｒｅｖパッケージングプラスミドにコードされていた。同時シュードダイピング要素をｒｅｖ等のパッケージングベクターに配置することにより、５つではなく４つの別個のプラスミドを使用してパッケージング細胞をトランスフェクトした。本明細書では、５個ではなく４個のプラスミドでトランスフェクトすると、より高いウイルス力価が得られることが観察された。
【０５０５】
０日目に、単球を除去するための追加のステップなしで、実施例１に記載されるように、２人のドナーからの軟膜からＰＢＭＣを調製した。単離後、１ｍｌのＸ−Ｖｉｖｏ１５中１×１０６の非刺激ＰＢＭＣを、９６ディープウェルプレートの各ウェルに播種した。示されているようにウイルス粒子を１または１０のＭＯＩで添加し、プレートを３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。４時間の曝露後、細胞を４００ｇで５分間ペレット化し、細胞を２ｍｌのＤＰＢＳ＋２％ＨＳＡに再懸濁し、４００ｇで５分間遠心分離することで３回洗浄した後、各ウェルの細胞を１ｍｌのＸ−Ｖｉｖｏ１５に再懸濁し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。外因性サイトカインは、いかなる時点でも試料に添加しなかった。各試料は、２人のドナーのそれぞれからのＰＢＭＣを使用して重複して実行された。６日目に試料を収集し、ｅＴＡＧ、ならびに前方および側方散乱に基づくリンパ球ゲートを使用したＦＡＣ分析により決定されるＣＤ３発現に基づいて、形質導入効率を決定した。
【０５０６】
図３Ａは、形質導入後６日目のウェルあたりの生細胞の総数を示している。ＶＳＶ−Ｇのみでシュードタイピングされたウイルス粒子に曝露された試料と比較して、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされ、ＵＣＨＴ１もディスプレイするウイルス粒子に曝露された試料は、ウェルあたりの細胞数がより多かった。これは、ＵＣＨＴ１ｓｃＦｖがＧＰＩに連結されたｓｃＦｖＦｃとしてディスプレイされた場合と、ｓｃＦｖがＶＳＶ−ＧまたはＭｕＬＶウイルスエンベロープのいずれかに融合された場合の両方で観察された。理論によって制限されないが、抗ＣＤ３ｓｃＦｖによるＣＤ３＋ＴおよびＮＫ細胞の刺激は、細胞数のこの増加の少なくとも一部を説明し得る増殖および生存をもたらすと考えられている。
【０５０７】
図３Ｂは、ｅＴＡＧ発現によって測定された、形質導入されたＣＤ３＋細胞のパーセントを示す。ＵＣＨＴ１ＳｃＦｖＦｃ−ＧＰＩもディスプレイするか、またはＵ−ＭｕＬＶ、Ｕ−ＭｕＬＶＳＵｘ、Ｕ−ＶＳＶ−Ｇ、もしくはＭＶＨΔ２４で同時シュードタイピングされたＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされたウイルス粒子に曝露された試料は、抗ＣＤ３抗体をディスプレイしなかったＶＳＶ−Ｇのみでシュードタイピングされたウイルス粒子に曝露された試料よりも高い形質導入効率を有していた。この実験で１０のＭＯＩで試験された４つの試料のうち、ＶＳＶ−Ｇ＋ＵＣＨＴ１ｓｃＦｖＦｃ−ＧＰＩウイルス粒子がＣＤ３＋非刺激ＰＢＭＣを形質導入する効率は、６４．３％、６６．３％、７８．０％、および７６．７％であった。この実験で１０のＭＯＩで試験された４つの試料のうち、ＶＳＶ−Ｇ＋Ｕ−ＭｕＬＶウイルス粒子がＣＤ３＋非刺激ＰＢＭＣを形質導入する効率は、３７．６％、４３．８％、２０．５％、および３０．８％であった。ＶＳＶ−Ｇで同時シュードタイピングした場合、４、８、１２、１６、２０、２４、２８、および３１個のＣ末端アミノ酸が欠失したＵ−ＭｕＬＶの個々のバリアントが、全長Ｕ−ＭｕＬＶ（図示せず）と同様に４時間でＣＤ３＋非刺激ＰＢＭＣを形質導入した。同様に、ＶＳＶ−Ｇで同時シュードタイピングした場合、膜貫通（ＴＭ）単位と表面（ＳＵ）単位との間の第Ｘ因子開裂部位（ＡＡＡＩＥＧＲ）が（Ｇ４Ｓ）３または「ＡＡＡＩＡＧＡ」に置き換えられたＵ−ＭｕＬＶＳＵｘの個々のバリアントが、Ｕ−ＭｕＬＶＳＵｘ（図示せず）と同様に４時間でＣＤ３＋非刺激ＰＢＭＣを形質導入した。この実験で１０のＭＯＩで試験された４つの試料のうち、ＶＳＶ−Ｇ＋ＭＶＨΔ２４ウイルス粒子がＣＤ３＋非刺激ＰＢＭＣを形質導入する効率は、６４．５％、６２．４％、７２．３％、および７１．５％であった。別個の実験において、Ｈ１Ｎ１  ＰＲ８  １９３４からのインフルエンザＨＡおよびＨ１０Ｎ７−ＨＫＷＦ４４６Ｃ−０７からのＮＡでシュードタイピングされたウイルス粒子は、ＶＳＶ−Ｇ＋Ｕ−ＭｕＬＶで同時シュードタイピングされたウイルス粒子と同等の効率でＣＤ３＋非刺激ＰＢＭＣを形質導入した。
【０５０８】
実施例３．全血を組み換えレトロウイルス粒子に４時間曝露し、続いてＰＢＭＣ濃縮手順を行うことによる、休止リンパ球の効率的な遺伝子改変。
この実施例では、全血と、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされ、その表面にＴ細胞活性化要素をディスプレイするレトロウイルス粒子とを含む反応混合物の４時間のインキュベーションによって、非刺激ヒトＴ細胞およびＮＫＴ細胞を効果的に遺伝子改変した。続いて、従来の密度勾配遠心分離に基づくＰＢＭＣ濃縮手順を使用して、形質導入反応混合物からＰＢＭＣを単離した。ＣＤ３＋細胞の形質導入は、フローサイトメトリーを使用したｅＴａｇ導入遺伝子の発現によって評価した。
【０５０９】
深層濾過を使用して、この実施例で使用した以下のレンチウイルス粒子を精製した。ＶＳＶ−ＧでシュードタイピングされたＦ１−３−２３（Ｆ１−３−２３Ｇ）；およびＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされ、Ｔ細胞活性化要素であるＵＣＨＴ１−ｓｃＦｖＦｃ−ＧＰＩ（Ｆ１−３−２３ＧＵ）をディスプレイするＦ１−３−２３。
【０５１０】
抗凝固剤を含むバキュテナー管内の全新鮮血液の１０ｍｌ試料を購入した。（ＳｔｅｍＥｘｐｒｅｓｓ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ）。個々の試料中の抗凝固剤は、ＥＤＴＡ  １．８ｍｇ／ｍｌまたはＮａ−ヘパリン１６ＵＳＰ単位／ｍＬ血液であった。組み換えレンチウイルス粒子を５のＭＯＩ（１×１０６ＰＢＭＣ／ｍｌ血液と仮定）で全血のバキュテナー管に直接添加して、レンチウイルス粒子の全血中のリンパ球への接触を開始し、任意の沈殿を破壊するために毎時間穏やかに混合しながら、３７℃で４時間、５％ＣＯ２でインキュベートした。４時間のインキュベーション後、ＳｅｐＭａｔｅ５０管（ＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を製造元のプロトコルに従って使用して、各全血試料からＰＢＭＣを個別に単離した。ＰＢＭＣを１５ｍｌのコニカル管に回収し、細胞を１０ｍｌのＤＰＢＳ＋２％ＨＳＡに再懸濁し、４００ｇで５分間遠心分離することにより洗浄した。この洗浄手順を３回繰り返してから、細胞を１０ｍｌのＸ−Ｖｉｖｏ１５に再懸濁し、３７℃および５％ＣＯ２でＴ７５フラスコ中で直立培養した。外因性サイトカインは、いかなる時点でも試料に添加しなかった。ｅＴＡＧに基づいて形質導入効率を決定するために６日目に試料を収集し、前方および側方散乱に基づくリンパ球ゲートを使用したＦＡＣ分析によって生細胞上のＣＤ３発現を決定した。
【０５１１】
図４Ａおよび４Ｂは、全血の形質導入後６日目の１ｍｌあたりの絶対生細胞数（図４Ａ）およびＣＤ３＋ｅＴａｇ＋細胞（すなわち形質導入されたＴ細胞）のパーセンテージ（図４Ｂ）のヒストグラムを示す。以前の結果、および単離されたＰＢＭＣの形質導入を研究した他の結果と一致して、この実施例では、ＶＳＶ−Ｇのみでシュードタイピングされた組み換えレトロウイルス粒子が全血中のＰＢＭＣの形質導入において極めて非効率的であることが分かる。しかしながら、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされ、Ｔ細胞活性化要素をディスプレイする組み換えレトロウイルス粒子は、単離されたＰＢＭＣを効率的に形質導入し得ることを以前に見てきた。驚くべきことに、これらのヒストグラムは、レトロウイルス粒子が全血中に存在するＰＢＭＣを効率的に形質導入するためにＰＢＭＣ濃縮ステップが必要ないことを示している。むしろ、ＶＳＶ−Ｇでシュードタイピングされ、抗凝固剤を含む全血に直接添加されたときに抗ＣＤ３−ｓｃＦｖＦｃをディスプレイするレトロウイルス粒子は、その中のＰＢＭＣを効果的に遺伝子改変および形質導入し得る。遺伝子改変は、細胞を洗浄して遊離組み換えレトロウイルス粒子を除去する前に、わずか４時間の接触およびインキュベーションによって達成され得る。細胞が遺伝子改変された後、ＰＢＭＣ濃縮手順を使用してそれを効果的に単離することができる。この実施例に示されるように、抗凝固剤は、ＥＤＴＡまたはＮａ−ヘパリンであってもよい。他の実験で抗凝固剤としてＡＣＤを使用しても、同様の結果が得られた。
【０５１２】
実施例４．４時間から１分未満の曝露時間による非刺激ＰＢＭＣのレトロウイルス形質導入の経時変化。
この実験では、組み換えレンチウイルス粒子を非刺激ＰＢＭＣと接触させ、４時間から１分未満の間インキュベートし、ＰＢＭＣを形質導入して外因性サイトカインの非存在下でインビトロでの生存および／または増殖を促進する能力について検査した。
【０５１３】
方法
組み換えレンチウイルス粒子を、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中での懸濁培養に適合した２９３Ｔ細胞（Ｌｅｎｔｉ−Ｘ（商標）２９３Ｔ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）で産生した。細胞を、ＷＯ２０１９／０５５９４６の実施例３に記載されているように、ＰＥＩを使用して、ゲノムプラスミド、およびｇａｇ／ｐｏｌ、ｒｅｖをコードする別個のパッケージングプラスミド、およびＶＳＶ−Ｇをコードするシュードタイピングプラスミドで一過性にトランスフェクトした。特定の試料では、トランスフェクション反応混合物はまた、ＷＯ２０１９／０５５９４６の実施例３にさらに記載されているように、ＵＣＨＴ１ｓｃＦｖＦｃ−ＧＰＩをコードするプラスミドも含んでいた。この実施例では、２つのゲノムプラスミドを使用した。第１のプラスミドは、コザック配列、ＣＤ８ａシグナルペプチド、ＦＬＡＧタグ、および抗ＣＤ１９：ＣＤ８：ＣＤ３ｚ  ＣＡＲとそれに続く三重終止配列（Ｆ１−３−２５３）を含んでいた。第２のプラスミドは、コザック配列、ＣＤ８ａシグナルペプチド、ＦＬＡＧタグ、抗ＣＤ１９：ＣＤ８：ＣＤ３ｚ  ＣＡＲ、Ｔ２Ａ、およびＣＬＥ  ＤＬ３Ａ−４（Ｅ０１３−Ｔ０４１−Ｓ１８６−Ｓ０５１）とそれに続く三重終止配列（Ｆ１−３−４５１）を含んでいた。
【０５１４】
０日目に、製造元の指示に従って、Ｆｉｃｏｌｌ−ＰａｑｕｅＰＲＥＭＩＵＭ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびＳｅｐＭａｔｅ（商標）−５０（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ（商標）Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用した密度勾配遠心分離により、２人のドナーからの軟膜（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  Ｂｌｏｏｄ  Ｂａｎｋ）からＰＢＭＣを濃縮した。単球を除去するための追加の手順は実行しなかった。単離後、ＰＢＭＣを１ｍｌのＸ−Ｖｉｖｏ１５（ＬＯＮＺＡ）あたり１×１０６のＰＢＭＣに希釈し、９６個のディープウェルプレートの各ウェルに１ｍｌを播種した。各ドナーからの細胞はまた、ＦＡＣＳによる表現型分析のために確保した。抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、ＩＬ−２、ＩＬ−７、または他の外因性サイトカインは、形質導入前にリンパ球を活性化または別様に刺激するために添加しなかった。レンチウイルス粒子を、１のＭＯＩで非刺激ＰＢＭＣに直接添加した。形質導入物を３７℃および５％ＣＯ２で４時間、２時間、３０分、１５分、７．５分、５分、２．５分間インキュベートするか、またはまったくインキュベートせず、その後４００ｇで５分の遠心分離を用いて細胞を沈降させ、次いで４００ｇで５分間の遠心分離を用いて１ｍｌのＤＰＢＳ＋２％ＨＳＡで３回洗浄した。したがって、形質導入およびインキュベーションの合計時間の計算には、最初の遠心分離を考慮するために５分を加えることができ、この遠心分離では、細胞に会合しないレンチウイルス粒子の大部分が細胞から分離されたと考えられる。次いで、各ウェル内の細胞を１ｍｌのＸ−Ｖｉｖｏ１５に再懸濁し、３７℃および５％ＣＯ２でインキュベートした。抗ウイルス薬で処理した試料では、ダピビリンまたはドルテグラビルを形質導入中１０μＭの最終濃度まで添加し、形質導入物を３７℃および５％ＣＯ２で４時間インキュベートした。薬物は、３回の洗浄後、回収培地に同じ濃度で補充した。外因性サイトカインは、いかなる時点でも試料に添加しなかった。６日目に試料を収集し、前方および側方散乱に基づくリンパ球ゲートを使用したＦＡＣＳ分析によって、ＦＬＡＧ発現に基づく形質導入効率を決定した。
【０５１５】
結果
この実施例では、１分未満のインキュベーション期間は、４時間のインキュベーション期間と同様に、組み換えレンチウイルス粒子による非刺激ＰＢＭＣの形質導入を促進するのに効果的であることが分かった。図５は、示された期間の異なる組み換えレンチウイルス粒子による１ドナーからの非刺激ＰＢＭＣの形質導入後６日目のＣＤ３＋ＦＬＡＧ＋絶対細胞数（１μｌあたり）を示す。組み換えレンチウイルス粒子のそれぞれのＰＢＭＣを形質導入する能力は、全てのインキュベーション期間にわたって類似していた。これは、抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ−ＧＰＩを発現し、非抗ＣＤ３ｓｃＦｖＦｃ−ＧＰＩを発現する対応物よりも高い形質導入効率を有していたレンチウイルス粒子で特に明らかである。検査した全てのインキュベーション時間において、形質導入されたＰＢＭＣの総数は、［Ｆ１−３−４５１ＧＵ］よりも［Ｆ１−３−４５１ＧＵ］で形質導入された試料の方が多く、これは、Ｆ１−３−４５１にコードされたＤＬ３Ａ  ＣＬＥがこれらの細胞の生存および／または増殖を促進していることを示している。逆転写酵素であるダピビリン、およびインテグラーゼ阻害剤であるドルテグラビルによる形質導入の阻害は、図５に示すように、これらのＰＢＭＣによる遺伝子改変および導入遺伝子発現が偽形質導入ではなく、ウイルス導入遺伝子ＲＮＡが逆転写され、ＰＢＭＣのゲノムに組み込まれ、発現される形質導入の結果であることを示している。同様の結果は、第２のドナーからのＰＢＭＣを使用して観察された。
【０５１６】
実施例５．ｍｉＲＮＡ発現は、ＣＡＲを発現する形質導入された細胞のインビボ生存および／または増殖を増加させた。
この実施例では、４つのｍｉＲＮＡ前駆体の候補（推定）ブロックの２つのｍｉＲＮＡライブラリ（ライブラリ３１４およびライブラリ３１５）を、個々のｍｉＲＮＡ前駆体のプールから直列にアセンブルした。ｍｉＲＮＡブロックを、ＣＡＲの発現を駆動するＥＦ−１アルファプロモーターをコードするレンチウイルス構築物のＥＦ−１アルファイントロンに挿入した。ヒトＰＢＭＣに、これらのライブラリをコードするレンチウイルス粒子を形質導入し、担癌マウスに注射した。２０日後、腫瘍を採取し、腫瘍からのＰＢＭＣのｍｉＲＮＡブロックの同一性を、ＰＣＲおよびそれに続くサンガー配列決定によって決定した。したがって、スクリーニングにより、腫瘍内の形質導入されたＰＢＭＣの増殖および／または生存を促進し得るｍｉＲＮＡブロックが特定された。
【０５１７】
方法
ライブラリの調製
１０８のｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）Ｇｅｎｅ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓを使用して、それぞれ位置１（Ｐ１）、２（Ｐ２）、３（Ｐ３）、および４（Ｐ４）に４つのｍｉＲＮＡ前駆体を直列に含む構築物のライブラリを生成した。各ｇＢｌｏｃｋ（登録商標）は、Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、またはＰ４に特異的であり、ＷＯ２０１９／０５５９４６の実施例１７に記載されているように５’アームおよび３’アームを含むｍｉＲ−１５５フレームワーク（配列番号４５７）を含んでおり、２７の異なる遺伝子のうちの１つに対応するｍＲＮＡ転写物を標的化する固有のｍｉＲＮＡ断片を使用して、ｍｉＲ−１５５ステム−ループ前駆体を置き換えた。明確にするために、ｍｉＲＮＡ断片の配列は、同じ遺伝子に対応するｍＲＮＡ転写物を標的化したｍｉＲＮＡ断片間でも、位置Ｐ１〜Ｐ４ごとに異なっていた。各位置のｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）は固有の４０ｂｐオーバーラップ配列を含み、タイプＩＩｓアセンブリ法を使用して、４つのｇＢｌｏｃｋｓ（登録商標）の組み合わせを所定の順序でアセンブルし、ライブラリを生成した。これらの方法により、５３１，４４１の固有の構築物（Ｐ１に２７のｍｉＲＮＡ、Ｐ２に２７のｍｉＲＮＡ、Ｐ３に２７のｍｉＲＮＡ、Ｐ４に２７のｍｉＲＮＡ）の多様性が可能であった。
【０５１８】
ｍｉＲＮＡ構築物のライブラリをＦ１−１−３１５およびＦ１−２−３１４のＥＦ−１アルファイントロンＡに別個にクローニングして、それぞれライブラリ３１５およびライブラリ３１４を生成した。ＥＦ−１アルファプロモーターに加えて、Ｆ１−１−３１５は、ＣＤ８ａシグナルペプチド、抗ＲＯＲ２：ＣＤ２８：ＣＤ３ｚ  ＣＡＲ、Ｔ２Ａ、およびｅＴａｇを含んでいた。同様に、ＥＦ−１アルファプロモーターに加えて、Ｆ１−２−３１４は、ＣＤ８ａシグナルペプチド、抗Ａｘｌ：ＣＤ８：ＣＤ３ｚ  ＣＡＲ、Ｔ２Ａ、およびｅＴａｇを含んでいた。ＷＯ２０１９／０５５９４６の図２６Ａおよび２６Ｂは、いずれかのＣＡＲの代わりにＧＦＰの発現を駆動する４つのｍｉＲＮＡ前駆体を有するイントロンＡを含む、ＥＦ−１アルファプロモーターを有する同様のレンチウイルスベクターを含む。
【０５１９】
この実施例における２７の遺伝子標的、および各位置のｍｉＲＮＡに対応するＤＮＡ配列の配列識別番号を以下の表２に示す。
【表１】
2021536245.tif 000007
【０５２０】
レンチウイルス粒子の産生
ライブラリ３１５およびライブラリ３１４を別個に使用して、２９３Ｔ細胞の３０ｍｌ懸濁培養でレンチウイルス粒子を産生した。レンチウイルス粒子を回収し、ＰＥＧ沈殿によって高濃度化した。レンチウイルス粒子の産生に関する他の詳細は、ＷＯ２０１９／０５５９４６の実施例１７に記載されている。
【０５２１】
形質導入
０日目に、ＰＢＭＣをＡＣＤ末梢血から単離し、５．０×１０７の生存ＰＢＭＣを、２つの１Ｌ  Ｇ−Ｒｅｘデバイスのそれぞれに、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＭＰ−ＣＤ６６）、１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＭＰ−ＣＤ４７）、および５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３抗体（Ｎｏｖｏｐｒｏｔｅｉｎ、ＧＭＰ−Ａ０１８）を添加したＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭを用いて１００ｍｌ中で播種してＰＢＭＣを活性化し、これがウイルス形質導入のためのＴ細胞およびＮＫ細胞を誘導した。レンチウイルス粒子を、ライブラリ３１５用の一方のＧ−Ｒｅｘおよびライブラリ３１４用の他方のＧ−Ｒｅｘ中の活性化ＰＢＭＣに５のＭＯＩで直接添加し、一晩インキュベートした。Ｇ−Ｒｅｘデバイスを、標準的な加湿組織培養インキュベータ内で、３７°Ｃおよび５％ＣＯ２で、１００ＩＵ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌの組み換えヒトＩＬ−７溶液を４８時間ごとに添加してインキュベートし、培養物を１２日目まで拡張したが、その時点で細胞は主にＴ細胞である。ＰＢＭＣ濃縮、形質導入、およびエクスビボ拡張に関する他の詳細は、ＷＯ２０１９／０５５９４６の実施例１６に記載されている。
【０５２２】
腫瘍の接種および形質導入細胞の投与
ＮＯＤ  Ｓｃｉｄ  Ｇａｍｍａ（ＮＳＧ）マウスを使用した異種移植モデルを選択して、ライブラリ３１５またはライブラリ３１４のレンチウイルス粒子で形質導入されたヒトＰＢＭＣがインビボで生存および／または増殖する能力を調べたが、腫瘍は、これらのレンチウイルス粒子のゲノムにコードされたＣＡＲにより認識された抗原を発現した、または発現しなかった。マウスは、施設内動物管理使用委員会が承認したプロトコルに従って取り扱われた。皮下（ｓｃ）腫瘍異種移植片を、１２週齢の雌ＮＯＤ−Ｐｒｋｄｃｓｃｉｄ  Ｉｌ２ｒｇｔｍ１／Ｂｅｇｅｎ（Ｂ−ＮＳＧ）マウス（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）の後部脇腹に確立した。簡単に説明すると、培養ＣＨＯ細胞、ヒトＲＯＲ２（ＣＨＯ−ＲＯＲ２）またはヒトＡＸＬ（ＣＨＯ−ＡＸＬ）を安定して発現するようにトランスフェクトされた培養ＣＨＯ細胞を、ＤＰＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）で別個に洗浄し、カウントし、冷ＤＰＢＳに再懸濁し、氷上で０．４７×１０６細胞／２００μｌの濃度で適切な量のＭａｔｒｉｇｅｌ  ＥＣＭ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、最終濃度５ｍｇ／ｍＬ）と混合した。動物を、注射前に脱毛（Ｎａｉｒ）を伴う標準的な承認された麻酔を使用して注射用に準備した。ＥＣＭ中のいずれかの細胞懸濁液２００μｌを、ＣＨＯ細胞（ｎ＝２）、ＣＨＯ−ＲＯＲ２細胞（ｎ＝１）、およびＣＨＯ−ＡＸＬ細胞（ｎ＝１）のそれぞれに対して、後部脇腹に皮下注入した。
【０５２３】
腫瘍接種から５日後、ＣＨＯ腫瘍を有する１匹のマウスおよびＣＨＯ−ＲＯＲ２腫瘍を有する１匹のマウスに、１２日のエクスビボ培養後のライブラリ３１５からのレンチウイルス粒子で形質導入された１×１０７個のＰＢＭＣを含む２００μｌのＤＰＢＳを尾静脈注射によって静脈内（ＩＶ）投与した。同様に、腫瘍接種から５日後、ＣＨＯ腫瘍を有する１匹のマウスおよびＣＨＯ−Ａｘｌ腫瘍を有する１匹のマウスに、ライブラリ３１４からのレンチウイルス粒子で形質導入された１×１０７個のＰＢＭＣを含む２００μｌのＤＰＢＳを尾静脈注射によって静脈内（ＩＶ）投与した。
【０５２４】
腫瘍採取およびＤＮＡ配列決定
形質導入されたＰＢＭＣを投与した後２０日目に、腫瘍を切除した。各腫瘍の半分からＤＮＡを抽出し、各腫瘍からの４ｕｇを、２５サイクルのＰＣＲ反応においてテンプレートとして使用し、ＥＦ−１アルファイントロンを増幅した。アンプリコンを配列決定ベクターにクローニングし、細菌に形質転換し、プレートにストリークした。合計１８個のコロニー（マウスあたり約５個）を選択し、サンガー配列決定を使用してＤＮＡを調製および分析し、腫瘍に存在するｍｉＲＮＡ構築物の試料の配列を決定した。
【０５２５】
結果
マウス異種移植モデルを使用して、特定の遺伝子転写物を標的化するｍｉＲＮＡが、ＣＡＲを発現する形質導入ＰＢＭＣの増殖および／または生存をインビボで増加させることができるかどうかを決定したが、異種移植片は、ＣＡＲの標的抗原の発現を有する、または有さない腫瘍であった。この分析のために、２７の異なる標的を対象とするｍｉＲＮＡからなるｍｉＲＮＡ構築物のライブラリを生成した。分析されたｍｉＲＮＡ構築物は、ＷＯ２０１９／０５５９４６の図２６Ｂおよび実施例１７および実施例１８に示されるように、４つの別個のｍｉＲＮＡに対して４つの位置を含んでいた。ＥＦ−１アルファイントロンを配列決定することにより腫瘍ＤＮＡを分析し、形質導入されたＰＢＭＣの注射から２０日後にどのｍｉＲＮＡ構築物が存在し、したがってどのｍｉＲＮＡ構築物が増殖および／または生存を増加させたかを特定した。
【０５２６】
直列の４つのｍｉＲＮＡの５３１，４４１の異なる組み合わせが可能であった。配列決定された１８個のＥＦ−１アルファイントロンのうち、１３個は構築物内の４個のｍｉＲＮＡが全て１つの標的を対象とするｍｉＲＮＡ構築物を含み、２個は複数の標的を対象とするｍｉＲＮＡ構築物を含んでいた。以下の表３は、この実施例で調査された４つの腫瘍のそれぞれから回収されたｍｉＲＮＡ種を示す。
【表２】
2021536245.tif 000008
【０５２７】
特に、６つのＥＦ−１アルファイントロンは、４つ全てのｍｉＲＮＡがＴＮＦＲＳＦ６（ＦＡＳ）を対象とするｍｉＲＮＡ構築物を含んでいた。２つのＥＦ−１アルファイントロンは、４つ全てのｍｉＲＮＡがｃＣＢＬを対象とするｍｉＲＮＡ構築物を含んでいた。ＡＨＲ、ＣＤ３ｚ、Ｃｂｘ、およびＨＫ２のそれぞれについては、４つ全てのｍｉＲＮＡがその遺伝子転写物を対象とするｍｉＲＮＡ構築物を含む１つのＥＦ−１アルファイントロンが特定された。「ＮＡ」は、その位置にｍｉＲＮＡブロックが特定されなかったことを示す。まとめると、これらの結果は、ＦＡＳ、ｃＣＢＬ、ＣＤ３ｚ、Ｃｂｘ、ＨＫ２、ＦＡＳＬ、ＳＭＡＤ４、ＥＯＭＥＳ、およびＡＨＲをコードする転写産物をノックダウンすると、腫瘍微小環境におけるＴ細胞の生存および／または増殖を促進できることを示している。検査した１８個の試料のうち６つの試料で各条件下でＦＡＳに直列に４つのｍｉＲＮＡが特定されたことは、ＦＡＳ転写産物をノックダウンすると、生存および／または増殖に特別な利点がもたらされることを示している。さらに、このデータは、ＦＡＳ、ｃＣＢＬ、ＡＨＲ、ＣＤ３ｚ、Ｃｂｘ、およびＨＫ２を対象とする４種のｍｉＲＮＡが、１、２、または３種よりもこれらの遺伝子をコードする転写産物のノックダウンを増大させるような投与効果があること、ならびにこの増大したノックダウンは生存および／または増殖の利点を与えることを示唆している。
【０５２８】
実施例６．インビボアッセイを使用した候補キメラポリペプチドリンパ増殖性要素の特定。
この実施例では、図６に記載のキメラポリペプチドをコードする構築物に従い、候補（推定）キメラリンパ増殖性要素（ＣＬＥ）の２つのキメラポリペプチドライブラリ（ライブラリ６およびライブラリ８）を、細胞外膜貫通ブロック配列、細胞内ブロック配列、およびバーコードライブラリのプールからウイルスベクターにアセンブルした。キメラライブラリ候補（推定ＣＬＥ）を、候補キメラポリペプチドがインビボでＴ細胞の拡張を促進する能力についてスクリーニングした。
【０５２９】
ライブラリ構築物
この研究では、ライブラリ６およびライブラリ８の２つのライブラリを作製および分析した。ライブラリは、図６に示す共通の構造を共有していた。図６は、レンチウイルスベクター骨格において、ＥＦ−１アルファプロモーターおよびコザック型配列（ＧＣＣＧＣＣＡＣＣ（配列番号４５０）によって駆動される４つのモジュールを有するライブラリからのＣＡＲおよび候補ＣＬＥをコードするポリヌクレオチド配列を含む限定されない例示的な導入遺伝子発現カセットの概略図を提供する。配列番号４５０））。各候補リンパ増殖性要素は、細胞外モジュール（Ｐ１）、膜貫通モジュール（Ｐ２）、ならびに２つの細胞内モジュール（Ｐ３およびＰ４）の４つのモジュールを含んでいた。Ｐ１モジュールは、ｃ−Ｊｕｎドメインの５’末端でｅＴＡＧをコードしていた。三重終止配列（ＴＡＡＴＡＧＴＧＡ（配列番号４５１））は、Ｐ４をＤＮＡバーコード（Ｐ５）から分離していた。ＡＷＰＲＥ（ＧＴＣＣＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＧＣＣＴＧＴＧＴＴＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＧＣＧＧＧＡＣＧＴＣＣＴＴＣＴＧＣＴＡＣＧＴＣＣＣＴＴＣＧＧＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＴＴＣＣＴＴＣＣＣＧＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＣＣＧＧＣＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＣＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＣＣＧＣＣＴＧ（配列番号４５２））は、最後の終止コドン（Ｐ５の最後のヌクレオチドの後に始まる４ｂｐ）と３’ＬＴＲ（ＷＰＲＥの最後のヌクレオチドの後に８３個のヌクレオチドを開始）の間に存在していた。
【０５３０】
ＣＡＲおよびＰ１は、Ｔ２Ａリボソームスキップ配列をコードするポリヌクレオチド配列によって分離されていた。バーコードを含むライブラリの一般的な設計および構築は、この実施例の後半でより詳細に説明されるように、Ｐ１およびＰ２ドメインを除いて、ＷＯ２０１９／０５５９４６の実施例１１に開示されている通りであった。
【０５３１】
ライブラリ６およびライブラリ８の設計は、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドのみが異なっていた。ライブラリ６のＣＡＲは、ヒトＡＸＬ、ＣＤ２８ストークおよび膜貫通配列（配列番号２５）、Ｌｃｋ結合が欠失したＣＤ２８細胞内ドメイン（ＩＣΔ）（配列番号５５）、およびＣＤ３ｚからの細胞内活性化ドメイン（配列番号２８）を認識するｓｃＦｖを有するＭＲＢ−ＡＳＴＲをコードしていた。ライブラリ８のＣＡＲは、ヒトＲＯＲ２、ＣＤ８ストークおよび膜貫通配列（配列番号２４）、ＣＤ１３７細胞内ドメイン（配列番号５３）、ＣＤ３ｚからの細胞内活性化ドメイン（配列番号２８）を認識するｓｃＦｖを有するＦＬＡＧタグ付きＭＲＢ−ＡＳＴＲをコードしていた。
【０５３２】
ウイルスベクターの合成およびレンチウイルスの産生
ＷＯ２０１９／０５５９４６の実施例１１に開示されているように、ベクターを合成し、レンチウイルス粒子を各ライブラリ毎に産生した。
【０５３３】
ＰＢＭＣの形質導入および培養
ＷＯ２０１９／０５５９４６の実施例１２に記載されているように、２人の健康なドナーからの全ヒト血液を採取し、Ｓｅｐａｘ  ２  Ｓ−１００デバイスを使用して別個に処理し、ＰＢＭＣを得た。ライブラリ６および８用の４．７５ｅ７または５ｅ７の生存可能なＰＢＭＣを、それぞれ１００ｍｌの２つの１Ｌ  Ｇ−Ｒｅｘデバイスのそれぞれに播種し、活性化し、形質導入し、培養物を上記の実施例５で説明したように１２日間拡張させた。ライブラリ６では３．９ｅ９の全細胞が回収され（８２倍の拡張）、そのうち９．７１ｅ７はＣＤ３＋ｅＴＡＧ＋形質導入されたＴ細胞であった。ライブラリ８では２．４７ｅ９の全細胞が回収され（４９倍の拡張）、そのうち２．４４ｅ８はＣＤ３＋ｅＴＡＧ＋形質導入されたＴ細胞であった。各拡張からの４ｅ６細胞を、次世代配列決定による後の分析用に確保し、凍結した。
【０５３４】
腫瘍の接種および形質導入細胞の投与
ＮＳＧマウスを使用した異種移植モデルを選択して、ライブラリ６またはライブラリ８のレンチウイルス粒子で形質導入されたヒトＰＢＭＣがインビボで生存および／または増殖する能力を調べたが、腫瘍は、これらのレンチウイルス粒子のゲノムにコードされたＣＡＲにより認識された抗原を発現した、または発現しなかった。皮下（ｓｃ）ＣＨＯ、ＣＨＯ−ＲＯＲ２、またはＣＨＯ−ＡＸＬ腫瘍異種移植片を、実施例５に記載されているように、Ｂ−ＮＳＧ（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ  Ｃｏ．Ｌｔｄ．）マウスの後部脇腹に確立した。
【０５３５】
腫瘍接種から５日後、ＣＨＯ腫瘍を有する６匹のマウスおよびＣＨＯ−Ａｘｌ腫瘍を有する５匹のマウスに、ライブラリ６からのレンチウイルス粒子で形質導入された７×１０７個のＰＢＭＣを含む２００μｌのＤＰＢＳを尾静脈注射によって静脈内（ＩＶ）を投与した。同様に、腫瘍接種から５日後、ＣＨＯ腫瘍を有する６匹のマウスおよびＣＨＯ−ＲＯＲ２腫瘍を有する５匹のマウスに、ライブラリ８からのレンチウイルス粒子で形質導入された７×１７個のＰＢＭＣを含む２００μｌのＤＰＢＳを尾静脈注射によってＩＶ投与した。ＣＨＯ腫瘍、ＣＨＯ−ＡＸＬ腫瘍、またはＣＨＯ−ＲＯＲ２腫瘍を有するマウスはまた、対照として２００μｌのＤＰＢＳのみを投与した。
【０５３６】
組織採取、ヒトＣＤ４５＋細胞の単離、およびＤＮＡ配列決定
形質導入されたＰＢＭＣを投与した後７、１４、および２１日目（ライブラリ６の場合）または７、１４、および１９日目（ライブラリ８の場合）に、各マウスから約１００μｌの血液を採取した。２１日目または１９日目にマウスを安楽死させたときに、脾臓および腫瘍も採取した。組織を機械的に破壊し、コラゲナーゼＩＶおよびＤＮＡｓｅ  Ｉで酵素消化し、ｈＣＤ４５抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３０４００４）を使用して細胞を磁気的に単離することにより、各組織の半分を処理してヒトＣＤ４５＋細胞を単離した。これらのｈＣＤ４５＋細胞からゲノムＤＮＡを調製したが、これらは「精製された脾臓」および「精製された腫瘍」試料に対応する。各組織の残りの半分からゲノムＤＮＡを直接調製したが、これらは「精製されていない脾臓」および「精製されていない腫瘍」に対応する。精製されたゲノムＤＮＡを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑを使用して配列決定し、ペアエンド１５０ｂｐ読み取りを生成した。通常、１，０００万回の読み取りのサブセットが各インデックス付きｆａｓｔｑファイルから抽出され、定常領域の存在に基づいてバーコード配列を抽出するように操作されたカスタムＲスクリプトであるバーコードリーダーを使用した分析のために処理された。また、精製されたゲノムＤＮＡを、ＰａｃＢｉｏ配列決定システムで配列決定し、バーコードを構築物に関連付けるためのより長い読み取り長を得た。
【０５３７】
ｑＰＣＲ
組織試料から単離されたゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、生物分析ｑＰＣＲによって形質導入されたリンパ球の存在について評価した。ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ  ５１１０６）を使用して試料からゲノムＤＮＡを単離し、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｍｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（５６３０４）を使用してＤＮＡをさらに洗浄した。レンチウイルスの５’ＬＴＲに特異的なプライマーおよびプローブセットを使用して、単離されたゲノムＤＮＡに対してＴａｑＭａｎアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を実行し、組織１ｕｇあたりのレンチウイルスのコピー数を定量化した。
【０５３８】
データ分析
ＤＮＡバーコードを、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ配列決定読み取りの２，０００万のサブセットで識別した。全ての試料のカウントデータを集め、２つ未満の試料に存在するバーコードは人為的であると見なして破棄した。注射前のＰＢＭＣからのカウントデータは、初期バーコード母集団の表現として使用した。完全長の構築物は、いくつかの選択された試料のロングリード配列決定によって作成された関連付けテーブルを使用して識別した。同じ構築物にマッピングされたバーコードのカウントを合計した後、全てのデータを、組織１ｕｇあたりのｑＰＣＲで定量化されたレンチウイルスのコピー数に基づいてスケーリングした。レンチウイルスのコピー数が非常に少ない試料は、分析から除外した。ＣＡＲ／抗原シグナル非依存性キメラポリペプチド候補のランク付けは、ＣＡＲによって認識される同族の標的抗原を欠くＣＨＯ腫瘍を有するマウスからの目的の各組織における各構築物の総数を計算することによって得られた。ＣＡＲ／抗原シグナル依存性ドライバーのランク付けは、次の式：ＭＲ＊−ｌｏｇ１０（Ｐ）を使用して得られ、式中、ＭＲは、抗原のある腫瘍（ＣＨＯ−ＡＸＬまたはＣＨＯ−ＲＯＲ２）を有するマウスのカウント値と、抗原のない腫瘍（ＣＨＯ）を有するマウスのカウント値との間の平均比率であり、Ｐは、抗原の有無にかかわらず腫瘍を有するマウスにおけるカウント値を比較する片側マンホイットニーウィルコクソン検定から得られたｐ値であった。片側マンホイットニーウィルコクソン検定を使用して、特定の位置について、他の全ての表現された部分と比較して特定の部分が濃縮されているかどうかを決定した。個々の組織のｐ値を、Ｓｔｏｕｆｆｅｒ  ｓｕｍｚ法を使用して集計し、最終的なランク付けを得た。完全な構築物のランク付けは、個々の組織ランクを平均することによって得た。
【０５３９】
結果
この実験において、キメラポリペプチド候補は、細胞外ドメイン（Ｐ１）、膜貫通ドメイン（Ｐ２）、第１の細胞内ドメイン（Ｐ３）、および第２の細胞内ドメイン（Ｐ４）を含む４つの試験ドメインを有するように設計された（図６）。ＷＯ２０１９／０５５９４６の実施例１１および１２で説明されているように、構築物は、次世代配列決定を使用した構築物の分析および識別を支援するためのＤＮＡバーコードを含んでいた。さらに、全ての構築物は、細胞外ドメインとインフレームで認識および／または除去ドメインをコードする核酸配列を含んでいた。この実施例における構築物はまた、キメラポリペプチド候補の上流のヒトＡＸＬまたはヒトＲＯＲ２を対象とするＣＡＲをコードしていた（図６）。ライブラリ６およびライブラリ８でキメラポリペプチド候補を生成するために使用された細胞外ドメイン（Ｐ１）、膜貫通ドメイン（Ｐ２）、第１の細胞内ドメイン（Ｐ３）、および第２の細胞内ドメイン（Ｐ４）は、ＷＯ２０１９／０５５９４６の実施例１２と同じであった。ライブラリは、Ｐ１−Ｐ４ドメインの可能な組み合わせの全を含まなかった。
【０５４０】
ＰＢＭＣの形質導入および外因性サイトカインの存在下での培養における１２日間の成長後に存在する構築物の数を、１２日目の培養試料での複数回の読み取りにおいて存在した個々のバーコードの数を数えることによって、ライブラリ６およびライブラリ８の両方について決定した。６９７，４１０の潜在的な組み合わせのうち、ライブラリ６およびライブラリ８でそれぞれ２１９，６４９および１２７，６３４の異なる構築物が検出された。分析された上位候補に関する詳細情報は、表１および表４〜８から決定され得る。構築物のコード化システムは、ＷＯ２０１９／０５５９４６の実施例１１および１２で説明したものと同じである。
【０５４１】
１２日間培養した後、形質導入されたＰＢＭＣを、抗原の有無にかかわらず腫瘍を有するマウスに注射した。抗ＡＸＬＣＡＲをコードするライブラリ６からの構築物で形質導入されたＰＢＭＣを、ＣＨＯ腫瘍またはＣＨＯ−ＡＸＬ腫瘍を有するマウスに注射し、抗ＲＯＲ２ＣＡＲをコードするライブラリ８からの構築物で形質導入されたＰＢＭＣを、ＣＨＯ腫瘍またはＣＨＯ−ＲＯＲ２腫瘍を有するマウスに注射した。２１日または１９日のインビボ拡張（それぞれライブラリ６およびライブラリ８）の後、各マウスの血液、脾臓、および腫瘍から試料を採取した。各脾臓および腫瘍の半分を、ＣＤ４５＋細胞を単離するために処理したが、これは本明細書のこの実施例では「精製された」試料と呼ばれる。各マウスからの各試料（血液、未精製脾臓、精製脾臓、非精製腫瘍、および精製腫瘍）からのＤＮＡを配列決定した。各構築物のバーコードを使用して、各試料の各構築物の配列決定読み取り数を特定および合計した。
【０５４２】
ノンパラメトリック分析を使用して、ＣＡＲ／抗原シグナル非依存的またはＣＡＲ／抗原シグナル依存性的にインビボでＰＢＭＣ細胞増殖を促進する構築物を特定した。ＣＡＲ／抗原シグナルに依存しないキメラポリペプチド候補を特定するために、各構築物の各試料を、ＣＨＯ腫瘍を有するマウスの配列決定読み取り数に基づいてランク付けした。上位の構築物は、５つの組織試料の中で最高の平均ランクを有すると特定された。ライブラリ６およびライブラリ８でＣＡＲ／抗原シグナルに依存しなかった上位１００のキメラポリペプチド候補を、それぞれ表３１および３２に示す。
【０５４３】
ＣＡＲ／抗原シグナル依存性であるキメラポリペプチド候補を特定するために、各試料のランク付けには、抗原のある腫瘍（ＣＨＯ−ＡＸＬまたはＣＨＯ−ＲＯＲ２）を有するマウスと抗原のない腫瘍（ＣＨＯ）を有するマウスとの間の読み取りの比率が含まれていた。ライブラリ６およびライブラリ８についてＣＡＲ／抗原シグナル依存的であった上位１００のキメラポリペプチド候補を、それぞれ表３３および３４に示す。
【０５４４】
追加の分析を実行して、ＣＡＲ／抗原シグナルに依存しない注目すべきキメラポリペプチド候補を特定した。この分析では、特定の位置で他の全ての表現された部分と比較して特定の部分が濃縮されているかどうかを決定する統計的検定に基づいて、任意のＰ２、Ｐ３、またはＰ４の位置で最高の性能を示す２０の部分を最初に特定した。この複合分析では、これらの２０の部分の少なくとも１つを含む構築物から、ＣＨＯ腫瘍を有するマウスでの正規化されたカウントの合計に基づいてライブラリ６またはライブラリ８のいずれかからの最高の性能の構築物を特定した。ＣＡＲ／抗原シグナルに依存しない、この分析による３０の最高性能キメラポリペプチド候補を表８に示す。
【０５４５】
ライブラリスクリーンで特定され、表８に示されているＣＬＥのいくつかは、ライブラリ６で構成された抗ＡＸＬ  ＣＡＲの背後にあるレンチウイルス構築物の個々のキメラポリペプチドとして生成され、確認用のインビトロスクリーンで実行された。３人のドナーからの凍結ＰＢＭＣを解凍し、１００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−７を添加したＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ＳＦＭで、３７℃および５％ＣＯ２の標準的な加湿組織培養インキュベータで一晩休ませた。ＰＢＭＣを０日目に５０ｎｇ／ｍｌの抗ＣＤ３で活性化し、１日目に５のＭＯＩでウイルス粒子で形質導入した。２日目に、ＰＢＭＣを２４ウェルＧ−Ｒｅｘプレートのウェルに移し、３５日目まで外因性サイトカインの非存在下でＣｏｍｐｌｅｔｅ  ＯｐＴｍｉｚｅｒ（商標）ＣＴＳ（商標）Ｔ細胞拡張ＳＦＭで培養した。３人のドナーからのＰＢＭＣを使用して実行された反復実験では、Ｐ２、Ｐ３、およびＰ４構成Ｔ００１−Ｓ１２１−Ｓ２１２およびＴ０４４−Ｓ１８６−Ｓ０５３のＣＬＥは、１４、２１、２８、および３５日目に特に注目すべき拡張を示した。
【０５４６】
開示された実施形態、実施例、および実験は、開示の範囲を限定すること、または以下の実験が実行される全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保するための努力がなされてきたが、ある程度の実験誤差および偏差が考慮されるべきである。記載されている方法の変形は、実験が説明することを意図している基本的な態様を変更することなく行うことができることが理解されたい。
【０５４７】
当業者は、本開示の範囲内および精神においてで多くの修正および他の実施形態を考案することができる。実際に、記載された材料、方法、図面、実験、例、および実施形態の変形は、本開示の基本的な態様を変更することなく、当業者によって行うことができる。開示された実施形態のいずれも、他の開示された実施形態のいずれかと組み合わせて使用することができる。
【０５４８】
いくつかの例において、いくつかの概念が特定の実施形態を参照して説明されてきた。しかしながら、当業者は、以下の特許請求の範囲に記載されるように、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な修正および変更を行うことができることを理解している。したがって、明細書および図は、限定的な意味ではなく例示的な意味で解釈されるべきであり、そのような全ての修正は、本発明の範囲内に含まれることが意図される。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表３−３】
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【表３−４】
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【表３−５】
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【表３−６】
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【表３−７】
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【表３−８】
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【表３−９】
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【表３−１０】
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【表３−１１】
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【表３−１２】
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【表３−１３】
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【表３−１４】
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【表３−１５】
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【表３−１６】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【表５−１】
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【表５−２】
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【表６−１】
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【表６−２】
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【表７−１】
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【表７−２】
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【表８】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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