(57)【要約】  ＤＮＡ配列の検出および分析のための三次元格子マイクロアレイシステムと、その構成要素を含むキットが本明細書で提供される。上記システムでは、固体支持体は、蛍光標識を随意に有する複数の二官能性ポリマーリンカーを有し、トップドメインおよびボトムエンドを有する二官能性ポリマーリンカーの各々はボトムエンドで固体支持体に結合され、複数の核酸プローブは、複数の二官能性ポリマーリンカーのトップドメインに結合される。マイクロアレイシステムを製作する方法、および、植物サンプル中の病原体を検出および同定する方法、あるいは内部標準として合成ＤＮＡの既知のコピー数を使用することにより、未精製の核酸サンプル中の病原体ＤＮＡのコピー数を決定する方法がさらに提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
三次元格子マイクロアレイシステムであって、前記三次元格子マイクロアレイシステムは：
前面および背面を備えた固体支持体と；
複数の二官能性ポリマーリンカーであって、その各々がトップドメインおよびボトムエンドを有し、前記ボトムエンドが固体支持体に結合されている、複数の二官能性ポリマーリンカーと；
複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のトップドメインに結合されている複数の核酸プローブと、
を含む、三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項２】
複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は、そのトップドメインの末端に共有結合されるか、あるいは内部に共有結合される蛍光標識をさらに含む、請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項３】
前記固体支持体は、その前面に結合した複数の化学的に活性可能な基をさらに含み、ここで、複数の二官能性ポリマーリンカーは、それらのボトムエンドによって複数の化学的に活性可能な基の各々に共有結合される、請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項４】
化学的に活性可能な基は、エポキシシラン基、マレイミド基、アミノ基、あるいは活性化カルボン酸エステルである、請求項３記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項５】
複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は、固体支持体中の化学的に活性可能な基に共有結合するためのボトムエンドにおける第１の反応性部分、または複数の核酸の各々に共有結合するためのトップドメインにおける第２の反応性部分、あるいはそれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項６】
第１の反応性部分は、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、あるいはカルボキシレートである、請求項５に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項７】
第２の反応性部分は、ヌクレオチド塩基、アミノ酸、あるいはアミノ糖である、請求項５に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項８】
複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は、固体支持体に非共有結合するためにボトムエンドに吸着性基を有する、請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項９】
吸着性基は、一本鎖核酸、アミン多糖、あるいは拡張した平面疎水基である、請求項８に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項１０】
複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は、オリゴヌクレオチド、アミノ多糖、ポリアミン、あるいはポリアミノ酸である、請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項１１】
複数の核酸プローブの各々は、５’末端および３’末端で少なくとも３つの末端チミジン塩基を有する、請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項１２】
チミジン塩基は、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々の第２の反応性部分に共有結合される、請求項１１に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項１３】
核酸プローブは、病原体、植物、あるいは動物中のシグネチャーヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項１４】
固体支持体は、ホウケイ酸ガラス、不活性金属、熱可塑性アクリル樹脂、シクロオレフィンポリマー、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ナイロン、セラミック、操作された炭素表面、あるいはそれらの組み合わせである、請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステム。
【請求項１５】
三次元格子マイクロアレイシステムを製造する方法であって、前記方法は：
請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステム内の固体支持体を、
（ｉ）複数の核酸プローブ；
（ｉｉ）複数の二官能性ポリマーリンカー；および
（ｉｉｉ）水と水混和性液体を含む、１００°Ｃより高い沸点を有する溶媒混合液；を含む製剤と接触させる工程と：
第１の結合反応として、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のボトムエンドを、固体支持体の前面に結合させる工程と；
溶媒混合液中の水を蒸発させ、それにより、複数の核酸プローブおよび固体支持体に結合する複数の二官能性ポリマーリンカーを濃縮する工程と；
第２の結合反応として、核酸プローブの各々を複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のトップドメインに共有結合させる工程と；
三次元格子マイクロアレイシステムを製造するために、固体支持体を少なくとも一回洗浄して、結合されていない二官能性ポリマーリンカーおよび核酸プローブを除去する工程と、
を含む、方法。
【請求項１６】
第１の結合反応は吸着である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
第１の結合反応は、固体支持体上の化学的に活性可能な基と、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のボトムエンド上の第１の反応性部分との共有結合によるものである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
水混和性液体は、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、プロパンジオール、あるいはその組み合わせである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
第１の結合反応は、０°Ｃから４０°Ｃの間の温度で生じる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
第２の結合反応は、０°Ｃから４０°Ｃの間の温度で生じる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
第２の結合反応は、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のトップドメインにおける第２の反応性部分を、複数の核酸プローブに光化学的架橋することによって生じる、請求項１５に記載の方法。
【請求項２２】
カスタマイズ可能なマイクロアレイキットであって、前記マイクロアレイキットは：
請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステム内の固体支持体および複数の二官能性ポリマーリンカーと；
複数の核酸プローブであって、その各々が、病原体、植物、あるいは動物中のシグネチャーヌクレオチド配列に相補的な配列を有する、複数の核酸プローブと；
溶媒混合液と；
前記キットを使用するための説明書と、
を備える、カスタマイズ可能なマイクロアレイキット。
【請求項２３】
核酸プローブは、５’末端および３’末端で少なくとも３つの末端チミジン塩基を有する、請求項２２に記載のカスタマイズ可能なマイクロアレイキット。
【請求項２４】
溶媒混合液は、約１０：１〜約１００：１の体積比の、水と、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、あるいはプロパンジオールのうち１つとの混合物を含む、請求項２２に記載のカスタマイズ可能なマイクロアレイキット。
【請求項２５】
植物サンプル中の病原体を検出するための方法であって、前記方法は：
ａ）植物組織サンプルを収集する工程と；
ｂ）植物組織サンプルからＤＮＡを含む全核酸を単離する工程と；
ｃ）１つ以上の病原体特異的な第１のアンプリコンを得るために、各々が少なくとも１つの病原体のＤＮＡに選択的なフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む少なくとも１つの第１のプライマー対を使用して、単一のアッセイにおいて、第１の増幅をタンデムで行う工程と；
ｄ）鋳型としての病原体特異的な第１のアンプリコンおよび少なくとも１つの第２のプライマー対を使用して、第２の増幅をタンデムで行う工程であって、蛍光標識された第２のアンプリコンを得るために、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第１のアンプリコン中に、内部隣接領域に相補的な配列を有するフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む、工程と；
ｅ）請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステムを使用して：
（ｉ）第２のアンプリコンを、病原体ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸プローブは、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々を介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と；
（ｉｉ）マイクロアレイを少なくとも一回洗浄する工程と；
（ｉｉｉ）蛍光標識された第２のアンプリコンからの蛍光シグナルを検出するために、マイクロアレイを画像化し、それにより、植物サンプル中の病原体を検出する工程と、を行う、工程と、
を含む、方法。
【請求項２６】
複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は蛍光標識を含み、前記方法は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの蛍光シグナルを検出するためにマイクロアレイを画像化する工程と、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーのシグナル上に、蛍光標識された第２のアンプリコンのシグナルを重ね合わせ、それにより、植物サンプル中で検出された病原体を同定する工程と、をさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
病原体は、細菌、真菌、ウイルス、藻類、または原生動物、あるいはそれらの組み合わせである、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
病原体は細菌であり、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７および１３８にそれぞれ示される配列を有し、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および２０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および２２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５および２６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７および２８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９および３０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１および３０にそれぞれ示される配列を有し、核酸プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−８５に示される配列を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
病原体は真菌であり、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５および１６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５および１３６にそれぞれ示される配列を有し、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１および３２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３および３４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９および１４０にそれぞれ示される配列を有し、核酸プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６−１２５に示される配列を有する、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン中の蛍光標識は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカー中の蛍光標識とは異なる、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
単一アッセイにおいて、植物および病原体からＤＮＡを同時に検出するための方法であって、前記方法は：
ａ）１つ以上の病原体を潜在的に含む植物組織サンプルを収集する工程と；
ｂ）少なくとも植物組織および１つ以上の病原体からＤＮＡを含む全核酸を単離する工程と；
ｃ）病原体特異的な第１のアンプリコンおよび植物特異的な第１のアンプリコンを得るために、少なくとも１つの病原体ＤＮＡ選択的な第１のプライマー対と、少なくとも１つの植物ＤＮＡ選択的な第１のプライマー対を使用して、全核酸上で単一アッセイにおいて、第１の増幅をタンデムで行う工程と；
ｄ）蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンを得るために、鋳型としての病原体特異的な第１アンプリコンおよび植物特異的な第１アンプリコンと、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第１のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有する少なくとも１つの第２のプライマー対と、蛍光標識で標識され、かつ植物特異的な第１のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有する少なくとも１つの第２のプライマー対とを使用して、第２の増幅をタンデムで行う工程と；
ｅ）請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステムを使用して：
（ｉ）蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコン、および蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンを、病原体ＤＮＡおよび植物ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と；
（ｉｉ）マイクロアレイを少なくとも一回洗浄する工程と；
（ｉｉｉ）蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコンから、および蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンから、蛍光シグナルを検出するために、マイクロアレイを画像化し、それにより、サンプル中の病原体および植物を同時に検出する工程と、を行う、工程と、
を含む、方法。
【請求項３２】
複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は蛍光標識を含み、前記方法は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの蛍光シグナルを検出するためにマイクロアレイを画像化する工程と、蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコンのシグナルを、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーのシグナルの上に重ね合わせ、それにより、植物サンプル中で検出された病原体および植物を同時に同定する工程と、をさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
病原体は細菌であり、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７および１３８にそれぞれ示される配列を有し、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および２０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および２２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５および２６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７および２８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９および３０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１および３０にそれぞれ示される配列を有し、核酸プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−８５に示される配列を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
病原体は真菌であり、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５および１６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５および１３６にそれぞれ示される配列を有し、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１および３２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３および３４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９および１４０にそれぞれ示される配列を有し、核酸プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６−１２５に示される配列を有する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
植物サンプル中の１つ以上の病原体ＤＮＡのコピー数を定量化するための方法であって、前記方法は：
ａ）病原体を潜在的に含む植物組織サンプルを収集する工程と；
ｂ）ＤＮＡを含む全核酸を単離する工程と；
ｃ）内部参照標準としての少なくとも１つの合成ＤＮＡ配列の既知のコピー数を、単離された全核酸に加える工程であって、合成ＤＮＡ配列の各々は：
病原体ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子とは異なるヌクレオチド配列を有する中央領域と；
病原体ＤＮＡ中のコンセンサス配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する５’末端および３’末端と；
を含む、工程と；
ｄ）１つ以上の病原体ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコンおよび合成ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコンを得るために、各々が病原体ＤＮＡに選択的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも１つの第１のプライマー対を使用して、全核酸上で単一のアッセイにおいて、第１の増幅をタンデムで行う工程と；
ｅ）蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンをそれぞれ得るために、鋳型としての病原体特異的な第１のアンプリコンおよび合成ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコン、ならびに少なくとも１つの第２のプライマー対を使用して、第２の増幅をタンデムで行う工程であって、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第１のアンプリコンおよび合成ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、工程と；
ｆ）請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステムを使用して：
（ｉ）病原体ＤＮＡおよび合成ＤＮＡのそれぞれにおけるシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブで第２のアンプリコンをハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸プローブは、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と；
（ｉｉ）マイクロアレイを少なくとも一回洗浄する工程と；
（ｉｉｉ）蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介してマイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化された核酸プローブに対応する蛍光シグナル、および、病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンならびに合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの各々の蛍光シグナルを検出するために、マイクロアレイを画像化する工程と、を行う工程と；
ｇ）重ね合わせたシグナル画像を得るために、病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンと合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの蛍光シグナルの画像を、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの画像上に重ね合わせる工程と；
ｈ）マイクロアレイ上の１つ以上の重ね合わせたシグナル位置での核酸プローブの配列を、複数の病原体ＤＮＡのシグネチャー配列決定因子のデータベースと比較し、それにより、サンプル中の病原体を同定する工程と；
ｉ）病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンと、合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの蛍光シグナルからの蛍光シグナル強度および単離された全核酸に加えられた合成ＤＮＡの既知のコピー数を数学的に相関させ、それにより、サンプル中の病原体ＤＮＡのコピー数を定量化する工程と、
を含む、方法。
【請求項３６】
合成ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４−１５７に示される配列を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
病原体は細菌であり、コンセンサス配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３に示され、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７および１３８にそれぞれ示される配列を有し、コンセンサス配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３に示され、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および２０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および２２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５および２６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７および２８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９および３０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１および３０にそれぞれ示される配列を有し、細菌に特異的な核酸プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−８５に示される配列を有し、合成ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４にそれぞれ示される配列を有する合成ＤＮＡ特異的核酸プローブにハイブリタイズする、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７に示される配列を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
病原体は真菌であり、コンセンサス配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２に示され、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５および１６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５および１３６にそれぞれ示される配列を有し、コンセンサス配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２に示され、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１および３２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３および３４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９および１４０にそれぞれ示される配列を有し、真菌に特異的な核酸プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６−１２５に示される配列を有し、合成ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５に示される配列を有する合成ＤＮＡ特異的核酸プローブにハイブリタイズする、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４に示される配列を有する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
数学的に相関させる工程は、以下の関係を使用して行われ：
Ｃｎ／Ｃｏ  ＝  Ｐ（Ｓｎ／Ｓｏ）ｘ、
式中、
Ｃｎは、定量化される病原体種の病原体ＤＮＡの各タイプｎのコピー数であり、Ｃｏは、第１の増幅工程を行う前にサンプルに加えられた、合成ＤＮＡの既知のコピー数であり、Ｓｎは、マイクロアレイ上の特定の既知の位置で病原体ＤＮＡ特異的な核酸プローブにハイブリタイズした、病原体ＤＮＡ特異的な蛍光標識された第２のアンプリコンからの相対蛍光単位（ＲＦＵ）での病原体種のタイプｎの各々の蛍光シグナル強度であり、Ｓｏは、マイクロアレイ上の特定の既知の位置で合成ＤＮＡ特異的な核酸プローブにハイブリタイズした、合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンからのＲＦＵでの蛍光シグナル強度であり、Ｐは、約０．１〜約１０に及ぶ定数であり、ならびにＸは、約１〜約３に及ぶ指数因子である、請求項３５に記載の方法。
【請求項４０】
蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン中の蛍光標識は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカー中の蛍光標識とは異なる、請求項３５に記載の方法。
【請求項４１】
単一のアッセイにおいて、植物組織サンプル中の１つ以上の病原体および植物のＤＮＡのコピー数を同時に定量化するための方法であって、前記方法は：
ａ）１つ以上の病原体を潜在的に含む植物組織サンプルを収集する工程と；
ｂ）少なくとも植物組織ＤＮＡおよび病原体ＤＮＡを含む全核酸を単離する工程と；
ｃ）内部参照標準としての少なくとも１つの合成ＤＮＡ配列の既知のコピー数を、単離された全核酸に加える工程であって、合成ＤＮＡ配列の各々は：
病原体ＤＮＡおよび植物ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子とは異なるヌクレオチド配列を有する中央領域と；
病原体ＤＮＡ中のコンセンサス配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する５’末端および３’末端と；
を含む、工程と；
ｄ）病原体ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコン、植物ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコン、および合成ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコンを得るために、少なくとも１つの病原体特異的な第１のプライマー対、および少なくとも１つの合成ＤＮＡ特異的な第１のプライマー対、および少なくとも１つの植物特異的な第１のプライマー対を使用して、全核酸上で単一アッセイにおいて、第１の増幅をタンデムで行う工程と；
ｅ）蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、蛍光標識された植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、ならびに蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンを得るために、鋳型としての第１のアンプリコン、少なくとも１つの病原体ＤＮＡ特異的な第２のプライマー対、および少なくとも１つの植物ＤＮＡ特異的な第２のプライマー対を使用して、第２の増幅をタンデムで行う工程であって、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ、第１のアンプリコン中の内部隣接領域に相補的な配列をそれぞれ有する、工程と；
ｆ）請求項１に記載の三次元格子マイクロアレイシステムを使用して：
（ｉ）第２のアンプリコンを、病原体ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、および合成ＤＮＡそれぞれにおけるシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸プローブは、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と；
（ｉｉ）マイクロアレイを少なくとも一回洗浄する工程と；
（ｉｉｉ）蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介してマイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化された核酸プローブに対応する蛍光シグナルと、蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、蛍光標識された植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、および蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの各々に対応する蛍光シグナルとを検出するために、マイクロアレイを画像化する工程と、を行う工程と；
ｇ）重ね合わせたシグナル画像を得るために、蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、蛍光標識された植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、および蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンのシグナルを、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの画像シグナル上に重ね合わせる工程と；
ｈ）マイクロアレイ上の１つ以上の重ね合わせたシグナル位置での核酸プローブの配列を、複数の病原体ＤＮＡおよび植物ＤＮＡのシグネチャー配列決定因子のデータベースと比較し、それにより、サンプル中の病原体および植物を同定する工程と；
ｉ）病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンと、合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンからの蛍光シグナル強度および合成ＤＮＡの既知のコピー数を数学的に相関させ、それにより、サンプル中の病原体ＤＮＡのコピー数を定量化する工程と；
ｊ）植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンからの蛍光シグナル強度を、合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンからの蛍光シグナル強度および合成ＤＮＡの既知のコピー数と数学的に相関させ、それにより、サンプル中の植物ＤＮＡのコピー数を定量化する工程と、
を含む、方法。
【請求項４２】
病原体は細菌であり、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３に示され、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７および１３８にそれぞれ示される配列を有し、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３に示され、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および２０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および２２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５および２６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７および２８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９および３０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１および３０にそれぞれ示される配列を有し、細菌に特異的な核酸プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−８５に示される配列を有し、ここで、合成ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４にそれぞれ示される配列を有する合成ＤＮＡ特異的な核酸プローブにハイブリタイズする、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７に示される配列を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
病原体は真菌であり、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２に示され、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５および１６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５および１３６にそれぞれ示される配列を有し、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２に示され、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１および３２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３および３４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９および１４０にそれぞれ示される配列を有し、真菌に特異的な核酸プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６−１２５に示される配列を有し、合成ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５に示される配列を有する合成ＤＮＡ特異的核酸プローブにハイブリタイズする、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４に示される配列を有する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
数学的に相関させる工程は、以下の関係を使用して行われ：
Ｃｎ／Ｃｏ  ＝  Ｐ（Ｓｎ／Ｓｏ）ｘ、
式中、
Ｃｎは、定量化される病原体または植物の種の各タイプｎの病原体ＤＮＡあるいは植物ＤＮＡのコピー数であり、Ｃｏは、第１の増幅工程を行う前にサンプルに加えられた、合成ＤＮＡの既知のコピー数であり、Ｓｎは、病原体種のタイプｎの各々について、マイクロアレイ上の特定の既知の位置で病原体ＤＮＡ特異的な核酸プローブにハイブリタイズした、病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンからの相対蛍光単位（ＲＦＵ）での、蛍光シグナル強度であるか、あるいは、植物種のタイプｎの各々について、マイクロアレイ上の特定の既知の位置で植物ＤＮＡ特異的な核酸プローブにハイブリタイズした、植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンからのＲＦＵでの蛍光シグナル強度であり、Ｓｏは、マイクロアレイ上の特定の既知の位置で合成ＤＮＡ特異的な核酸プローブにハイブリタイズした、合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンからのＲＦＵでの蛍光シグナル強度であり、Ｐは、約０．１〜約１０に及ぶ定数であり、ならびにＸは、約１〜約３に及ぶ指数因子である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４５】
蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、蛍光標識された植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、および蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン中の蛍光標識は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカー中の蛍光標識とは異なる、請求項４１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この国際出願は、２０１８年１０月１１日に出願された係属中の米国出願第１６／１５８，２７６号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０に基づく優先権の利益を主張するものであり、上記米国出願は、２０１８年３月８日に出願された、係属中の米国出願第１５／９１６，０３６号および米国出願第１５／９１６，０６２号の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１２０に基づく一部継続出願であり、それらのすべてが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
本開示は、ＤＮＡに基づいた病原体および植物の分析の技術分野にある。より詳しくは、本開示は、核酸プローブを固定するための多重アッセイおよび三次元格子マイクロアレイ技術を使用する、植物、農業、食物、および水の材料の病原体分析の技術分野にある。（関連技術の詳細）
【０００３】
微生物病原体を同定するために使用される現在の技術は、確立された臨床微生物学モニタリングに依存する。病原体の同定は、標準的な培養物および感受性試験を使用して実施される。これらの試験は、時間、労力、コスト、ならびに不安定製品の多額の投資を必要とする。現在の技術は、大規模な数のサンプルを試験するのに理想的ではない。培養物ベースの試験は、偽陽性と偽陰性の両方含む不正確さ、ならびにコロニー形成単位（ＣＦＵ）の信頼性が低い定量化を伴っている。従来の培養方法を使用しても現われない、生きているが培養ができない微生物の存在が問題である。ある培養物試験は、有害および無害な種の両方を検出するという点で非特異性であり、これにより、試験されているサンプル中に脅威が存在するか否かを判定する試験の有用性を減少させる。
【０００４】
偽陽性や微生物を培養する課題に応じて、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅技術などのＤＮＡベースの診断法が開発された。ＰＣＲを使用して病原体を分析するために、ＤＮＡは分析に先立って材料から抽出されるが、これは時間および費用のかかる工程である。
【０００５】
ＰＣＲの分析前の抽出工程を除去する試みにおいて、コロニーＰＣＲが開発された。プレートまたは液体培養のコロニーから細胞を直接使用するコロニーＰＣＲにより、サンプルを調製せずに細菌細胞のＰＣＲを行うことができる。この技術は部分的に成功したが、培養物ほど敏感ではなく、検体中の要素によるＰＣＲの干渉に関する可能性のある問題を示す。この可能性のある干渉は、行なわれた試験の有用性を無効にするほど重要ではないこともあるが、特定のタイプの試験の病原体の高感度検出においては重要になり得る。結果的に、コロニーＰＣＲは、特に、病原体の高感度検出のために、ＰＣＲの使用のための分析前の抽出工程を除去しなかった。
【０００６】
細菌中の１６ｓＤＮＡ、および酵母またはカビのＤＮＡ中の内部転写されたスペーサー２（ＩＴＳ２）座位をＰＣＲ増幅することができ、一度増幅されると、分析して、特定の細菌または特定のカビ、あるいは植物材料中の、あるいはその植物材料上の酵母汚染に関する情報を提供することが可能であることが知られている。さらに、血液、排泄物などの特定のサンプルについては、ＤＮＡの抽出がない場合、そのようなサンプル中のＤＮＡに対してＰＣＲが行われ得る。しかし、血液については、そのような直接ＰＣＲの結果は、血液分析物による阻害により、サンプルごとにかなりの変動が生じる傾向があることが知られている。さらに、植物成分によるＰＣＲの大幅な阻害により、植物に対して直接ＰＣＲ分析を行なう試みは一般的に失敗している。
【０００７】
長い年月にわたって、病原体の適時で特異的な検出および同定の課題を改善するための、さらなる方法および技術が開発された。免疫測定技術は特定の分析を提供する。しかし、その技術では、化学消耗品の使用に費用がかかり、かつ応答時間が長い。光学のセンサー技術は、高速のリアルタイム検出をもたらすが、同定の特異性を欠いている。なぜなら、病原体は、通常、その良性のバックグラウンドに光学的に類似しているため、光学のセンサー技術は一般的検出機能を提供するからである。定量のポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）技術は、１時間未満でＤＮＡサンプルの増幅および検出が可能である。しかし、ｑＰＣＲは、主に、単一の病原体の分析に制限されている。結果的に、植物、農業、食物、および水材料の場合と同様に、多くの病原体が同時に分析される場合、比較的多くの個々の試験が平行して行われる。
【０００８】
生物学的マイクロアレイは、ＤＮＡを検出および分析するために使用される広範囲のツールにおいて重要なメカニズムになっている。マイクロアレイベースの検出は、ＤＮＡ増幅をマイクロアレイ技術の幅広いスクリーニング能力と組み合わせたものである。これは、特異的な検出およびプロセス速度の改善を結果としてもたらす。ＤＮＡマイクロアレイは、ハイブリダイゼーションによって、酵母ならびにカビなどの細菌および真核細胞のＤＮＡの特定のセグメントを調べる能力を備えて製造され得る。しかし、下流のマイクロアレイ用途のために多くのＰＣＲ反応を処理するにはコストがかかり、複雑な組織的な支援を有する非常に熟練した個人を必要とする。これらの課題のために、マイクロアレイ技術は、下流の用途の開発につながらなかった。
【０００９】
ＤＮＡは、ＤＮＡ分析の目的のために、固体支持体に結合され得ることが良く知られている。それらの例では、表面関連ＤＮＡは、「オリゴヌクレオチドプローブ」（核酸プローブ、ＤＮＡプローブ）と通常呼ばれ、プローブが結合するように設計されているその同族のパートナーは、ハイブリダイゼーション標的（ＤＮＡ標的）と呼ばれる。そのような装置において、ＤＮＡ標的の検出および／または定量化は、「ＤＮＡハイブリダイゼーション」（ハイブリダイゼーション）とも呼ばれるプロセスである、二本鎖形成を介する表面結合プローブへの標的の結合を観察することにより得られる。
【００１０】
核酸プローブがセルロースなどの中性表面へ吸着する時、あるいは核酸プローブがアミノ−シランでコーティングされたガラスまたはプラスチックなどの陽イオン性表面に吸着する時に生じるように、固体支持体への核酸プローブ結合は、表面への直接のＤＮＡの非共有結合の吸着によって達成されることがある。支持体への核酸プローブの直接の非共有結合の吸着には、いくつかの制限がある。核酸プローブは、必ず表面と直接物理的に接触して配置され、それにより、ＤＮＡ標的へのその結合に対する立体的制約を提示する。なぜなら、所望の（結合）標的プローブ複合体は、標的ＤＮＡ鎖を、結合プローブＤＮＡのまわりに巻き付けることによってのみ形成することができる二重らせんであるからである（上記表面への核酸プローブの直接的な物理吸着によって、基本的に阻害される相互作用）。
【００１１】
核酸プローブ結合はさらに、核酸プローブの表面への共有結合により生じることもある。反応性基（一級アミンなど）をプローブに導入し、その後、アミンを介して、表面上に配置されるアミン反応性部分（エポキシ基、またはイソシアネート基など）にプローブを共有結合して、二級アミンあるいは尿素結合をそれぞれ形成することにより、核酸プローブ結合を引き起こすことができる。ＤＮＡは、エポキシドまたはイソシアン酸あるいは他の同様の標準的な求核置換と通常は反応性ではないので、ＤＮＡプローブは、最初に第一アミンまたはチオールなどの「非天然の」リガンドで化学的に修飾されなければならない。そのような化学は、オリゴヌクレオチド合成中に容易に実行されることができるが、化学的修飾に関連したコストにより、ＤＮＡプローブのコストが２倍を超えて高くなる。関連するＵＶ架橋ベースの手法は、非天然の塩基化学の必要性を回避し、ここで、プローブＤＮＡは、二級アミン付加物を形成するために、アミン表面へのプローブＤＮＡ内のチミンの光化学付加によって媒介されるＤＮＡの直接ＵＶ架橋によって表面に結合することができる。しかし、効率的な架橋のための高エネルギーＵＶの必要性は、使用を超えて核酸プローブを破損する可能性がある実質的な副作用を結果としてもたらす。吸着性結合のためのケースのように、修飾された核酸プローブと反応性表面との間で可能である共有結合は短く、１０未満ほどの回転可能な結合であり、したがって、上記表面から２ｎｍ以内に核酸プローブを配置する。標準的な核酸プローブが＞２０塩基長さ（＞１０ｎｍの長さ）であるとすると、プローブ／リンカーの長さの比＞１０／１は、所望の標的プローブ二本鎖（Ｔａｒｇｅｔ−Ｐｒｏｂｅ  Ｄｕｐｌｅｘ）の後続する形成の不安定な阻害も提供する。
【００１２】
これらの問題に対処する以前の試みは成功していない。とりわけ、アクリルアミドおよび多糖を重合することにより作製されるものなどの、三次元のゲル相内への核酸プローブ捕捉による表面への核酸プローブの結合は、ゲル相の高密度性質のために問題があった。これらのゲル剤中の孔径（約１０ｎｍ）は、ゲル内での核酸プローブの補足および／または結合を可能にするが、核酸プローブと比べて典型的に何倍も長い溶液相ＤＮＡ標的は、ゲルマトリックスへの浸透がブロックされ、それによって、これらのゲル相系の使用を、標的のＤＮＡへの不十分な溶液相アクセスにより制限する。
【００１３】
さらに、したがって、従来技術は、正確さ、特異性、および信頼度を維持しながら、より少数の化学的で不安定な生成物を使用し、処理工程を少なくし、より速い結果を提供する病原体ＤＮＡを検出および同定するためのシステムならびに方法が不十分である。従来技術は、複数の病原体を含む未精製の核酸サンプル中の病原体特異的ＤＮＡの絶対的なコピー数を決定する方法も不十分である。本発明は、この長年のニーズと先行技術分野での要望を満たすものである。
【発明の概要】
【００１４】
本発明は三次元格子マイクロアレイシステムに関するものである。上記システムは、前面および背面を備えた固定支持体を含む。各々がトップドメインおよびボトムエンドを有する複数の二官能性ポリマーリンカーは、ボトムエンドで固体支持体に結合されている。複数の核酸プローブは、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のトップドメインに結合される。本発明は、トップドメインのトップエンドに共有結合するか、あるいは、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々の内部で共有結合する蛍光標識をさらに含む、関連する三次元のマイクロアレイに関する。本発明は、他の関連する三次元のマイクロアレイに関し、上記三次元のマイクロアレイは、固体支持体の前面に結合する複数の化学的に活性化可能な基をさらに含み、ここで、複数の二官能性ポリマーリンカーが、それらのボトムエンドにより複数の化学的に活性化可能な基の各々に共有結合する。
【００１５】
本発明は、さらに三次元格子マイクロアレイシステムを製造する方法に関する。上記方法では、本明細書に記載される三次元格子マイクロアレイシステムの固体支持体は、複数の核酸プローブと、複数の二官能性ポリマーリンカーと、１００°Ｃより高い沸点を有する水混和性の液体を含む溶媒混合液の含む水とを含む製剤と接触する。複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のボトムエンドは、第１の結合反応として固体支持体の前面に結合している。溶媒混合液中の水が蒸発し、それにより、複数の核酸プローブおよび固体支持体に結合する複数の二官能性ポリマーリンカーが濃縮される。核酸プローブの各々は、第２の結合反応として、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のトップドメインに結合している。三次元格子マイクロアレイシステムを製造するために、固体支持体を少なくとも一回洗浄して、結合されていない二官能性ポリマーリンカーおよび核酸プローブを除去する。
【００１６】
本発明は、カスタマイズ可能なマイクロアレイキットにさらに関する。マイクロアレイキットは、本明細書に記載される三次元格子マイクロアレイシステム中の固体支持体、複数の二官能性ポリマーリンカー、各々が病原体中のシグネチャーヌクレオチド配列に相補的な配列を有する複数の核酸プローブ、植物あるいは動物、溶媒混合液、およびキットを使用するための説明書を含む。
【００１７】
本発明は、植物サンプル中の病原体を検出するための方法にさらに関する。上記方法では、植物組織サンプルが収集され、ＤＮＡを含む全核酸が植物組織サンプルから単離される。第１の増幅は、１つ以上の病原体特異的な第１のアンプリコンを得るために、各々が少なくとも１つの病原体のＤＮＡに選択的なフォワードプライマーとリバースプライマーを含む少なくとも１つの第１のプライマー対を使用して、単一のアッセイにおいて、タンデムで行なわれる。第２の増幅は、蛍光標識された第２のアンプリコンを得るために、鋳型および少なくとも１つの第２のプライマー対として、病原体特異的な第１のアンプリコンを使用してタンデムで行なわれ、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第１アンプリコン中の内部隣接領域に相補的な配列を備えたフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む。本明細書に記載される三次元格子マイクロアレイシステムを使用して、第２のアンプリコンは、病原体ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリダイズされ、ここで、核酸プローブが複数の二官能性ポリマーリンカーの各々を介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化され、および、マイクロアレイは少なくとも１回洗浄される。マイクロアレイは、蛍光標識された第２のアンプリコンから蛍光シグナルを検出するために画像化され、それにより、植物サンプル中の病原体を検出する。本発明は複数の二官能性ポリマーリンカーの各々が蛍光標識を含む関連方法に関し、上記方法は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの蛍光シグナルを検出するためにマイクロアレイを画像化する工程と、蛍光標識された第２のアンプリコンのシグナルを、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーのシグナル上に重ね合わせ、それにより、植物サンプル中で検出された病原体を同定する工程とをさらに含む。
【００１８】
本発明は、単一アッセイにおいて、植物および病原体からＤＮＡを同時に検出するための方法にさらに関する。上記方法では、１つ以上の病原体を潜在的に含む植物組織サンプルが収集され、および、ＤＮＡを含む全核酸が、少なくとも植物組織および１つ以上の病原体から単離される。病原体特異的な第１のアンプリコンおよび植物特異的な第１のアンプリコンを得るために、少なくとも１つの病原体ＤＮＡ選択的な第１のプライマー対と植物ＤＮＡ選択的な第１のプライマー対を使用して、単一アッセイにおいて全核酸上で、第１の増幅がタンデムで行なわれる。蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンを得るために、鋳型としての病原体特異的な第１アンプリコンおよび植物特異的な第１アンプリコンと、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第１のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有する少なくとも１つの第２のプライマー対と、蛍光標識で標識され、かつ植物特異的な第１のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有する少なくとも１つの第２のプライマー対とを使用して、第２の増幅がタンデムで行なわれる。本明細書に記載される三次元格子マイクロアレイシステムを使用して、蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコン、および蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンは、病原体ＤＮＡおよび植物ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリタイズされ、ここで、核酸は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化され、ならびに、マイクロアレイは少なくとも１回洗浄される。マイクロアレイは、蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコンから、および蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンから、蛍光シグナルを検出するために画像化され、それにより、サンプル中の病原体および植物が同時に検出される。本発明は関連方法に関連し、ここで、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は蛍光標識を含み、上記方法は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの蛍光シグナルを検出するためにマイクロアレイを画像化する工程と、蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコンのシグナルを、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーのシグナルの上に重ね合わせ、それにより、植物サンプル中で検出された病原体および植物を同時に同定する工程を含む。
【００１９】
本発明は、植物サンプル中の１つ以上の病原体ＤＮＡのコピー数を定量化する方法にさらに関する。上記方法では、病原体を潜在的に有する植物組織サンプルが収集され、および、ＤＮＡを含む全核酸が単離される。内部参照標準としての少なくとも１つの合成ＤＮＡ配列の既知のコピー数は、単離された全核酸に加えられ、ここで、合成ＤＮＡ配列の各々は、病原体ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子とは異なるヌクレオチド配列を有する中心領域と、病原体ＤＮＡ中のコンセンサス配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する５’末端および３’末端とを含む。１つ以上の病原体ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコンおよび合成ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコンを得るために、各々が病原体ＤＮＡに選択的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも１つの第１のプライマー対を使用して、全核酸上で単一のアッセイにおいて、第１の増幅がタンデムで行なわれる。蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンをそれぞれ得るために、鋳型としての病原体特異的な第１アンプリコンおよび合成ＤＮＡ特異的な第１アンプリコン、ならびに少なくとも１つの第２のプライマー対を使用して、第２の増幅がタンデムで行なわれ、ここで、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第１のアンプリコンおよび合成ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む。
【００２０】
本明細書に記載される三次元格子マイクロアレイシステムを使用して、第２のアンプリコンは、病原体ＤＮＡおよび合成ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリタイズされ、ここで、核酸プローブが蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化され、および、マイクロアレイは少なくとも１回洗浄される。蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介してマイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化された核酸プローブに対応する蛍光シグナル、ならびに、病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンならびに合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの各々の蛍光シグナルを検出するために、マイクロアレイが画像化される。病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンおよび合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの蛍光シグナルの画像は、重ね合わせたシグナル画像を得るために、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの画像上に重ね合わせられ、マイクロアレイ上の１つ以上の重ね合わせたシグナル位置での核酸プローブの配列は、複数の病原体ＤＮＡのシグネチャー配列決定因子のデータベースと比較され、それにより、サンプル中の病原体が同定される。病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンと、合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの蛍光シグナルからの蛍光シグナル強度および単離された全核酸に加えられた合成ＤＮＡの既知のコピー数は、数学的に相関し、それにより、サンプル中の病原体ＤＮＡのコピー数が定量化される。
【００２１】
本発明は、単一アッセイにおいて、植物組織サンプル中の１つ以上の病原体および植物のＤＮＡのコピー数を同時に定量化するための方法にさらに関する。上記方法では、１つ以上の病原体を含む潜在的に含む植物組織サンプルが収集され、少なくとも植物組織ＤＮＡおよび病原体ＤＮＡを含む全核酸が単離される。内部参照標準としての少なくとも１つの合成ＤＮＡ配列の既知のコピー数が、単離された全核酸に加えられ、ここで、合成ＤＮＡ配列の各々は、病原体ＤＮＡおよび植物ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子とは異なるヌクレオチド配列を有する中央領域と、病原体ＤＮＡ中のコンセンサス配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する５’末端および３’末端とを含む。病原体ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコン、植物ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコン、および合成ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコンを得るために、少なくとも１つの病原体特異的な第１のプライマー対および少なくとも１つの合成ＤＮＡ特異的な第１のプライマー対および少なくとも１つの植物特異的な第１のプライマー対を使用して、全核酸上で単一アッセイにおいて、第１の増幅がタンデムで行なわれる。蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、蛍光標識された植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、ならびに蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンを得るために、鋳型としての第１のアンプリコン、少なくとも１つの病原体ＤＮＡ特異的な第２のプライマー対、および少なくとも１つの植物ＤＮＡ特異的な第２のプライマー対を使用して、第２の増幅がタンデムで行なわれ、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ、第１のアンプリコン中の内部隣接領域に相補的な配列をそれぞれ有する。
【００２２】
本明細書に記載される三次元格子マイクロアレイシステムを使用して、第２のアンプリコンは、病原体ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、および合成ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリタイズされ、ここで、核酸プローブが蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化され、および、マイクロアレイは少なくとも１回洗浄される。蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介してマイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化された核酸プローブに対応する蛍光シグナルと、蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、蛍光標識された植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、および蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの各々に対応する蛍光シグナルとを検出するために、マイクロアレイが画像化される。蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、蛍光標識された植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、および蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンのシグナルは、重ね合わせたシグナル画像を得るために、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの画像シグナル上に重ね合わされ、マイクロアレイの１つ以上の重ね合わせたシグナル位置での核酸プローブの配列は、複数の病原体ＤＮＡおよび植物ＤＮＡのシグネチャー配列決定因子のデータベースと比較され、それにより、サンプル中の病原体および植物が同定される。植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンからの蛍光シグナル強度は、合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンおよび合成ＤＮＡの既知のコピー数の蛍光シグナル強度と相関し、それにより、サンプル中の植物ＤＮＡのコピー数が定量化される。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本開示の実施形態のこれらのおよび他の特徴、態様、ならびに利点は、以下の詳細な説明が添付の図面を参照して読まれる場合、より良く理解されるようになり、図中の同様の文字は図面の全体にわたって同様の部分を表す。
【００２４】
本開示の実施形態のこれらのおよび他の特徴、態様、ならびに利点は、以下の詳細な説明が添付の図面を参照して読まれる場合、より良く理解されるようになり、図中の同様の文字は図面の全体にわたって同様の部分を表す。
【００２５】
【図１】活性化表面上にプリントされたプローブおよび二官能性標識を有する共有結合マイクロアレイシステムを示す。図１のＡは、構成要素−未修飾の核酸プローブと、水および高沸点の水混和性液体を含む溶媒中のアミン官能化（ＮＨ）二官能性ポリマーリンカーおよびアミン官能化（ＮＨ）蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーと、化学的に活性可能な基（Ｘ）を備えた固体支持体とを示す。図１のＢは、化学的に活性化された固体支持体と二官能性ポリマーリンカーとの反応の第１工程を示し、ここで、二官能性ポリマーリンカーが、アミン基によって固体支持体上で化学的に活性化された基に共有結合される。図１のＣは、反応物−核酸プローブおよび二官能性ポリマーリンカーの濃縮を増加させるための、溶媒からの水の蒸発による濃縮の第２の工程を示す。図１のＤは、蒸着表面内の二官能性ポリマーリンカーへのチミジン塩基を介した核酸プローブのＵＶ架橋の第３の工程を示し、これは、場合によっては、隣接する二官能性ポリマーリンカーをともに、架橋を介して核酸プローブに共有結合するのにも役立つ。
【図２】プローブおよび二官能性ポリマーリンカーを含む、吸着性のマイクロアレイシステムを示す。図２のＡは構成要素；未修飾の核酸プローブと、水および高沸点の水混和性液体を含む溶媒中の官能化された（Ｒｎ）二官能性ポリマーリンカーならびに同様に官能化され蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーと、固体支持体とを示し、ここで、Ｒｎ基は、固体支持体表面へ吸着に適合する。図２のＢは、固体支持体上の二官能性ポリマーリンカーの第１の工程の吸着を示し、ここで、二官能性ポリマーリンカーは、Ｒｎ群によって固体支持体に非共有結合するようになる。図２のＣは、反応物−核酸プローブおよび二官能性ポリマーリンカーの濃縮を増加させるための、溶媒からの水の蒸発による濃縮の第２の工程を示す。図２のＤは、蒸着表面内の二官能性ポリマーリンカーおよび他の核酸プローブへのチミジン塩基を介した核酸プローブのＵＶ架橋の第３の工程を示し、これは、場合によっては、隣接する二官能性ポリマーリンカーをともに、架橋を介して核酸プローブに共有結合するのにも役立つ。
【図３】共有結合のマイクロアレイシステムを使用する実験データを示す。本発明のこの例では、二官能性ポリマーリンカーは、化学的に修飾された４０の塩基長さのオリゴデオキシチミジン（ＯｌｉｇｏｄＴ）であった。上記オリゴデオキシチミジンは、その５’末端で結合されたＣｙ５蛍光色素とその３’末端で結合されたアミノ基とを有し、エポキシシランを有するその表面上で化学的に活性化されたホウケイ酸ガラス固体支持体との共有結合に適していた。核酸プローブは、溶液状態の標的に結合するのに適したＤＮＡオリゴヌクレオチドを含み、各オリゴヌクレオチドは、約５〜７のチミジンで終結して、ポリマー（ｏｌｉｇｏｄＴ）リンカーのトップドメインにおいてチミジンとの光化学的架橋を可能にする。図３のＡは、６３５ｎｍで視覚化された、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の、画像化されたマイクロアレイを示す。６３５ｎｍの画像は、各マイクロアレイスポットに位置マーカーとしてマイクロアレイ製作中に導入された二官能性ポリマーリンカー（ＯｌｉｇｏｄＴ）の５’末端に結合する（赤）ＣＹ５蛍光からのシグナルに由来する。図３のＢは、５３２ｎｍで視覚化された、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後に画像化されたマイクロアレイを示す。５３２ｎｍの画像は、ＤＮＡ含有サンプルのＰＣＲ反応＃２中に得られた、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの５’末端に結合された（緑）ＣＹ３蛍光からのシグナルに由来する。図３のＣは、重ね合わせた５３２ｎｍおよび６３５ｎｍの両方で視覚化された、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の画像化されたマイクロアレイを示す。重ね合わせた画像は、ＣＹ３で標識されたＰＣＲ産物の配列特異的結合と比較した、Ｃｙ５で標識されたＯｌｉｇｏｄＴの位置マーカーの平行結合の有用性を表示する。
【図４】図４のＡは、カンナビス（Ｃａｎｎａｂｉｓ）洗浄および関連する植物洗浄から得られた未精製の細菌汚染をＰＣＲ増幅するために使用される、１６ｓ座位（すべての細菌）内で使用されるＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示である。これらのＰＣＲプライマーは、マイクロアレイハイブリダイゼーションによる細菌の分析のために、そのようなサンプルからのＤＮＡを増幅および色素標識するために使用される。図４のＢは、カンナビス洗浄および関連する植物洗浄から得られた未精製の細菌汚染をＰＣＲ増幅するために使用される、ｓｔｘ１座位（病原性大腸菌）内で使用されるＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示である。これらのＰＣＲプライマーは、マイクロアレイハイブリダイゼーションによる細菌の分析のために、そのようなサンプルからのＤＮＡを増幅および色素標識するために使用される。
【図５】図５のＡは、カンナビス洗浄および関連する植物洗浄から得られた未精製の細菌汚染をＰＣＲ増幅するために使用される、ｓｔｘ２座位（病原性大腸菌）内で２段階ＰＣＲ反応として使用されるＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示である。これらのＰＣＲプライマーは、マイクロアレイハイブリダイゼーションによる細菌の分析のために、そのようなサンプルからＤＮＡを増幅および色素標識するために使用される。図５のＢは、カンナビス洗浄および関連する植物洗浄から得られた未精製の細菌汚染をＰＣＲ増幅するために使用される、ｉｎｖＡ座位（サルモネラ）内で使用されるＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示である。これらのＰＣＲプライマーは、マイクロアレイハイブリダイゼーションによる細菌の分析のために、そのようなサンプルからＤＮＡを増幅および色素標識するために使用される。
【図６】カンナビス洗浄および関連する植物洗浄から得られた未精製の細菌汚染をＰＣＲ増幅するために使用される、ｔｕｆ座位（大腸菌）内で使用されるＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示である。これらのＰＣＲプライマーは、マイクロアレイハイブリダイゼーションによる細菌の分析のために、そのようなサンプルからＤＮＡを増幅および色素標識するために使用される。
【図７】カンナビス洗浄および関連する植物洗浄から得られた未精製の酵母、カビ、および真菌汚染をＰＣＲ増幅するために使用される、ＩＴＳ２座位（酵母およびカビ）内で使用されるＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示である。これらのＰＣＲプライマーは、マイクロアレイハイブリダイゼーションによる酵母およびカビの分析のために、そのようなサンプルからＤＮＡを増幅および色素標識するために使用される。
【図８】カンナビス洗浄から得られた未精製のＤＮＡをＰＣＲ増幅するために使用される、ＩＴＳ１座位（カンナビス植物対照）内で使用されるＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示である。これらのＰＣＲプライマーは、マイクロアレイハイブリダイゼーションによるＤＮＡ分析のために、そのようなサンプルからのＤＮＡを増幅および色素標識するために使用される。このＰＣＲ反応を使用して、同じマイクロアレイ上のマイクロアレイ分析によって得られた細菌、酵母、カビ、および真菌シグナルを正規化するために使用される内部植物宿主対照シグナル（ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｐｌａｎｔ  ｈｏｓｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｓｉｇｎａｌ）を、ハイブリダイゼーションを介して生成する。
【図９】植物サンプルの病原体の補体を分析するべく、生のカンナビスあるいは関連する植物材料をＰＣＲ増幅し、その後、その材料についてマイクロアレイ分析を行なうために、未精製のカンナビス洗浄あるいはカンナビス（および関連する植物材料）からの他の表面サンプリングの処理を示すフロー図である。
【図１０】核酸プローブを実行するために使用されるマイクロアレイフォーマットの代表的な画像である。この代表的なフォーマットは、スライドガラス上にプリントされた１２のマイクロアレイを含み、その各々はテフロン（登録商標）ディバイダー（左）によって分離されている。各マイクロアレイは、完全な病原体検出パネルを四通りで解析する。さらに、カンビナスおよび関連する植物材料中の病原体の分析のための、１つのそのようなマイクロアレイの拡大図（右）が示される。各マイクロアレイのまわりのテフロン（登録商標）縁は、ハイブリダイゼーション分析のための約５０μＬ流体サンプルを局所化するために適しており、ここで、アンプリコンは、蛍光標識されて３０分間マイクロアレイ上に室温に静置され、続いて、室温で洗浄され、その後、色素で標識された病原体および宿主カンナビスＤＮＡのマイクロアレイ画像の走査が行われる。
【図１１Ａ】精製された細菌ＤＮＡ標準（図１１のＡ）および精製された真菌ＤＮＡ標準（図１１のＢ）から得られた代表的なマイクロアレイハイブリダイゼーションデータを示す。各ケースでは、精製された細菌ＤＮＡは、あたかもそれが未精製のＤＮＡであったかのようにＰＣＲ増幅され、その後、上記のマイクロアレイプローブを介してマイクロアレイ上でハイブリタイズされる。上記データは、このマイクロアレイフォーマットでは、細菌の各々は、室温ハイブリダイゼーションおよび洗浄によって、特異的に同定することができることを示す。同様に、精製された真菌ＤＮＡは、あたかもそれが未精製のＤＮＡであったかのようにＰＣＲ増幅され、その後、上記のマイクロアレイプローブを介してマイクロアレイ上でハイブリタイズされる。上記データは、このマイクロアレイフォーマットでは、真菌ＤＮＡの各々は、室温ハイブリダイゼーションおよび洗浄によって、特異的に同定することができることを示す。
【図１１Ｂ】精製された細菌ＤＮＡ標準（図１１のＡ）および精製された真菌ＤＮＡ標準（図１１のＢ）から得られた代表的なマイクロアレイハイブリダイゼーションデータを示す。各ケースでは、精製された細菌ＤＮＡは、あたかもそれが未精製のＤＮＡであるかのようにＰＣＲ増幅され、その後、上記のマイクロアレイプローブを介してマイクロアレイ上でハイブリタイズされる。上記データは、このマイクロアレイフォーマットでは、細菌の各々は、室温ハイブリダイゼーションおよび洗浄によって、特異的に同定することができることを示す。同様に、精製された真菌ＤＮＡは、あたかもそれが未精製のＤＮＡであったかのようにＰＣＲ増幅され、その後、上記のマイクロアレイプローブを介してマイクロアレイ上でハイブリタイズされる。上記データは、このマイクロアレイフォーマットでは、真菌ＤＮＡの各々は、室温ハイブリダイゼーションおよび洗浄によって、特異的に同定することができることを示す。
【図１２】５つの代表的な生のカンナビス洗浄サンプルから得られた代表的なマイクロアレイハイブリダイゼーションデータを示す。各ケースでは、これらの５つのサンプルの生の病原体の補体は、ＰＣＲ増幅され、その後、上記のマイクロアレイプローブを介してマイクロアレイ上でハイブリタイズされる。データは、このマイクロアレイフォーマットでは、特に、室温ハイブリダイゼーションおよび洗浄によって特定の細菌性、酵母、カビと菌による汚染物質を同定することができることを示す。
【図１３】代表的な（生の）高度に特徴付けられたカンジダサンプルと比較した、代表的な生のカンナビス洗浄サンプルから得られた代表的なマイクロアレイハイブリダイゼーションデータを示す。各ケースでは、各サンプルの生の病原体の補体はＰＣＲ増幅され、その後、上記のマイクロアレイプローブを介してマイクロアレイ上でハイブリタイズされる。上記データにより、このマイクロアレイフォーマットでは、室温ハイブリダイゼーション、および生のカンナビス洗浄液あるいはクローン化された真菌サンプルいずれかでの洗浄によって、真菌汚染物質を特異的に同定することができることが示される。
【図１４】大腸菌を含む腸内細菌科の細菌の低レベルの検出のための実施形態の変形において使用される、ＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示を示す。これらのＰＣＲプライマーは、マイクロアレイハイブリダイゼーションを介した分析のための、標的化された生命体からのＤＮＡを選択的に増幅および色素標識するために使用される。
【図１５Ａ】マイクロアレイハイブリダイゼーションデータのグラフ表示であり、ホップ（ホップ植物）にスパイクされた特定の細菌の列挙されたコロニーからなる認証標準物質からの大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７の低レベルの検出を実証する。
【図１５Ｂ】マイクロアレイハイブリダイゼーションデータのグラフ表示であり、ホップ（ホップ植物）にスパイクされた特定の細菌の列挙されたコロニーからなる認証標準物質からの大腸菌Ｏ１１１１の低レベルの検出を実証する。
【図１５Ｃ】マイクロアレイハイブリダイゼーションデータのグラフ表示であり、ホップ（ホップ植物）にスパイクされた特定の細菌の列挙されたコロニーからなる認証標準物質からのサルモネラ菌の低レベルの検出を実証する。
【図１６】２つの方法からのサンプル採取および調製のための図を示す。テーププル（ｔａｐｅ  ｐｕｌｌ）法および洗浄法の両方が、サンプルを処理して、マイクロアレイ分析を介した微生物の検出のための溶液を提供するために使用される。
【図１７】図１７のＡは、カンナビス洗浄あるいは関連する植物洗浄において、未精製の細菌汚染をＰＣＲ増幅するために使用されるＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示である。２セットのＰＣＲプライマーが使用される。フォワードプライマー（ＦＰ）およびリバースプライマー（ＲＰ）の第１のセットは「座位ＰＣＲ」工程をサポートし、ここで、細菌の組換えＤＮＡ（ｒＤＮＡ）の増幅は、すべての細菌中に存在する１６ｓ座位に基づく。プライマーの第２のセットは「標識ＰＣＲ」工程をサポートし、ここで、プライマーは色素標識され、対象の細菌に特異的である。本発明における２つのＰＣＲ工程は、第１のＰＣＲを行う前に、内部参照標準として、合成ＤＮＡ配列の既知のコピー数をサンプルに添加することにおいて図４Ａおよび４Ｂと異なり、ここで、合成ＤＮＡ配列は、サンプル中の細菌の配列から同定可能であり、かつ、ＦＰおよびＲＰの配列に相補的な末端配列を有し、その結果、合成ＤＮＡ配列はサンプル中の細菌の配列と共同増幅される。図１７のＢは、カンナビス洗浄あるいは関連する植物洗浄において、未精製の細菌汚染をＰＣＲ増幅するために使用されるＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示である。２セットのＰＣＲプライマーが使用される。フォワードプライマー（ＦＰ）およびリバースプライマー（ＲＰ）の第１のセットは「座位ＰＣＲ」工程をサポートし、ここで、細菌のゲノムＤＮＡ（ＤＮＡ）の増幅は、すべての細菌中に存在する１６ｓ座位に基づく。プライマーの第２のセットは「標識ＰＣＲ」工程をサポートし、ここで、プライマーは色素標識され、対象の細菌に特異的である。本発明における２つのＰＣＲ工程は、第１のＰＣＲを行なう前に、内部参照標準として、合成ＤＮＡ配列の既知のコピー数をサンプルに添加することにおいて図４Ａおよび４Ｂとは異なり、ここで、合成ＤＮＡ配列は、サンプル中の細菌の配列から同定可能であり、かつ、ＦＰおよびＲＰの配列に相補的な末端配列を有し、その結果、合成ＤＮＡ配列はサンプル中の細菌の配列と共同増幅される。
【図１８】カンナビス洗浄あるいは関連する植物洗浄において未精製の真核生物（例えば、酵母あるいはカビ）汚染をＰＣＲ増幅するために使用されるＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示である。２セットのＰＣＲプライマーが使用される。フォワードプライマー（ＦＰ）およびリバースプライマー（ＲＰ）の第１のセットは「座位ＰＣＲ」工程をサポートし、ここで、真核生物のＤＮＡの増幅は、すべての真核生物中に存在するＩＴＳ２座位に基づく。プライマーの第２のセットは「標識ＰＣＲ」工程をサポートし、ここで、プライマーは色素標識され、対象の真核生物に特異的である。本発明における２つのＰＣＲ工程は、第１のＰＣＲを行う前の、内部参照標準としての、合成ＤＮＡ配列のサンプルの既知のコピー数への添加において図４Ａおよび４Ｂとは異なり、ここで、合成ＤＮＡ配列は、サンプル中の真核生物の配列から識別可能であり、かつ、ＦＰとＲＰ中の配列に相補的な末端配列を有し、その結果、合成ＤＮＡ配列はサンプル中の真核生物の配列と共同増幅される。
【図１９】図１９のＡは、アスペルギルスのための全酵母およびカビの核酸プローブと、内部標準のためのＴＹＭ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌプローブを使用して、内部参照標準としての全酵母およびカビの量的対照（ＴＹＭ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）の３０００のコピー（既知量）の存在下において行なわれる１つのＰＣＲ反応当たり、およそ０〜３０，０００のコピーを送達するために変動するアスペルギルス・フラブス中のＩＴＳ２領域の計算されたコピーを示す。アスペルギルス（未知のコピー数）の滴定曲線間とＴＹＭ内部参照標準（既知のコピー数）との間のアスペルギルスとＴＹＭ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌのそれぞれの３０００のコピーでの交差点（矢印）は、サンプル中のアスペルギルスＤＮＡのコピー数を明らかにする。図１９のＢは、アスペルギルスのための全酵母およびカビの核酸プローブと、内部標準のためのＴＹＭ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌプローブとを使用して、内部参照標準としての全酵母およびカビの量的対照（ＹＭ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌ）の３０００のコピー（既知量）の存在下において行なわれる１つのＰＣＲ反応当たり、およそ０〜３０，０００のコピーを送達するために変動する出芽酵母中のＩＴＳ２領域の計算されたコピーを示す。アスペルギルス（未知のコピー数）の滴定曲線間とＴＹＭ内部参照標準（既知のコピー数）との間の、アスペルギルスとＴＹＭ  Ｑｕａｎｔ  Ｃｏｎｔｒｏｌのそれぞれの３０００のコピーでの交差点（矢印）は、サンプル中のアスペルギルスＤＮＡのコピー数を明らかにする。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明の一実施形態では、三次元格子マイクロアレイシステムが提供され、上記三次元格子マイクロアレイシステムは、前面および背面を備えた固体支持体と；複数の二官能性ポリマーリンカーであって、その各々がトップドメインおよびボトムエンドを有し、上記ボトムエンドが固体支持体に結合されている、複数の二官能性ポリマーリンカーと；複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のトップドメインに結合されている複数の核酸プローブと、を含む。
【００２７】
この実施形態において、固体支持体は、ホウケイ酸ガラス、不活性金属、熱可塑性アクリル樹脂、シクロオレフィンポリマー、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ナイロン、セラミック、操作された炭素表面、あるいはそれらの組み合わせであり得るが、当技術分野で既知の任意の適切な材料は、固体支持体を含む。例えば、適切な熱可塑性アクリル樹脂はポリ（メタクリル酸メチル−ＶＳＵＶＴ（ＰＭＭＡ−ＶＳＵＶＴ）であり、適切なシクロオレフィンポリマーはＺＥＯＮＯＲ（登録商標）  １０６０Ｒであり、適切な不活性金属は金であり、プラチナ、ＴｉＯ２、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）、および、適切な操作された炭素表面はグラフェンである。
【００２８】
さらに、この実施形態では、固体支持体は、その前面に結合した複数の化学的に活性可能な基をさらに含み、ここで、複数の二官能性ポリマーリンカーは、それらのボトムエンドによって複数の化学的に活性可能な基の各々に共有結合する。特に、化学的に活性可能な基は、エポキシシラン基、マレイミド基、アミノ基、活性化カルボン酸エステル、イソシアン酸、スクシンイミド、カルボジイミド、あるいはアルデヒドであってもよい。好ましくは、固体支持体は、エポキシシラン官能化ホウケイ酸ガラス支持体である。これらは、当該技術分野において周知であり、当業者は、必要に応じてこれらの支持体のいずれかを容易に官能化することができる。
【００２９】
さらに、この実施形態では、二官能性ポリマーリンカーの各々は、トップドメインの末端に共有結合されるか、あるいは  内部に共有結合される蛍光標識を含む。例えば、蛍光標識は、Ｃｙ５、ＤＹＬＩＧＨＴ  ＤＹ６４７、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ６４７、Ｃｙ３、ＤＹＬＩＧＨＴ  ＤＹ５４７、あるいはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ  ５５０であり得る。特に、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は、オリゴヌクレオチド、アミノ多糖、ポリアミン、あるいはポリアミノ酸である。オリゴヌクレオチドの一例は、ＯｌｉｇｏｄＴ、５’−ＯｌｉｇｏｄＴ、５’−ジゴキシゲニンＯｌｉｇｏｄＴ、５’−ピレンＯｌｉｇｏｄＴあるいは５’−Ｃｙ５  ＯｌｉｇｏｄＴであり、アミノ多糖の一例は、キトサンであり、ポリアミンの例は、スペルミン、スペルミジン、カダベリン、およびプトレッシンであり、ポリアミノ酸の一例は、リジンまたはヒスチジンを含み得、あるいは、二官能性ポリマーリンカーは、ボトムエンド上の化学的に活性可能な固体支持体およびトップドメイン上の核酸プローブに結合することができる二重官能基を有する任意の他のポリマー化合物であり得る。好ましくは、二官能性ポリマーリンカーは、５’末端でアミン基を有するＯｌｉｇｏｄＴである。
【００３０】
この実施形態の一態様では、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は、固体支持体中の化学的に活性可能な基に共有結合するためのボトムエンドにおける第１の反応性部分、あるいは複数の核酸の各々に共有結合するためのトップドメインにおける第２の反応性部分、あるいはそれらの組み合わせを含み得る。特に、第１の反応性部分は、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、あるいはカルボキシレート、好ましくは、アミノ基であり得る。特に、第２の反応性部分は、ヌクレオチド塩基、アミノ酸、あるいはアミノ糖であり得る。例えば、第２の反応性部分は、チミジン、アデニン、グアニン、シチジン、ウラシル、あるいはブロモデオキシウリジンであり得る。あるいは、第２の反応性部分は、システイン、フェニルアラニン、チロシン、グリシン、セリン、トリプトファン、シスチン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、あるいはアミノ糖であり得る。そのような反応性基の化学は当技術分野において周知であり、当業者は、蛍光標識を結合するための選択された二官能性ポリマーリンカー上の適切な基を容易に同定することができる。好ましくは、二官能性ポリマーリンカーは、固体支持体の活性化表面に共有結合するためにその３’−末端で結合するアミノ基を有するＣｙ５標識ＯｌｉｇｏｄＴである。
【００３１】
この実施形態の別の態様では、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は、固体支持体に非共有結合するために、ボトムエンドに吸着性基を有する場合がある。本態様では、吸着性基は、一本鎖核酸、アミン多糖、あるいは拡張した平面疎水基であり得る。通常は、吸着性基は、固体支持体の前面との非共有結合吸着に適合する１つ以上の官能基（「Ｒｎ」で示される）を含み得る。例えば、一本鎖核酸適合吸着性Ｒ基はＯｌｉｇｏｄＴであり得、アミン多糖適合吸着性Ｒ基はキトサンであり得、あるいは、拡張した平面疎水基適合吸着性Ｒ基は、ジゴキシゲニン、ピレン、あるいはＣｙ５色素であり得る。
【００３２】
加えて、この実施形態では、複数の核酸プローブの各々は、５’末端および３’末端で少なくとも３つの末端チミジン塩基（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｂａｓｅ）を有し得る。一態様では、チミジン塩基は、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々の第２の反応性部分に共有結合され得る。さらに、核酸プローブは、病原体、植物、あるいは動物中のシグネチャーヌクレオチド配列に相補的な配列を有し得る。
【００３３】
関連する実施形態では、三次元格子マイクロアレイシステムが提供され、前面および背面を備えた固体支持体と；複数の二官能性ポリマーリンカーであって、その各々がトップドメインおよびボトムエンドと、トップドメインの末端に共有結合されるか、あるいは内部に共有結合される蛍光標識とを有し、上記ボトムエンドは上記固体支持体に結合される、複数の二官能性ポリマーリンカーと；複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のトップドメインに結合する複数の核酸プローブと、を有する。
【００３４】
この実施形態に加えて、固体支持体は、その前面に結合した複数の化学的に活性可能な基を含み、ここで、複数の二官能性ポリマーリンカーは、複数の化学的に活性可能な基に結合している。さらなる実施形態では、化学的に活性可能な基は、エポキシシラン基、マレイミド基、アミノ基、あるいは活性化カルボン酸エステルであり得る。両方の実施形態において、固体支持体は、ホウケイ酸ガラス、不活性金属、熱可塑性アクリル樹脂、シクロオレフィンポリマー、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ナイロン、セラミック、操作された炭素表面、あるいはそれらの組み合わせであり得る。すべての実施形態において、化学的に活性可能な基対二官能性ポリマーリンカーのモル比は、約１０より大きい。
【００３５】
両方の実施形態の一態様では、複数の二官能性ポリマーリンカーは、固体支持体中の化学的に活性可能な基に共有結合するためのボトムエンドにおける第１の反応性部分、あるいは複数の核酸に共有結合するためのトップドメインにおける第２の反応性部分、あるいはそれらの組み合わせを含み得る。第１の反応性部分は、アミノ基、チオール基、アルデヒド基、あるいはカルボキシレートであり得る。第２の反応性部分は、ヌクレオチド塩基、アミノ酸、あるいはアミノ糖であり得る。ヌクレオチド塩基の例は、チミジン、アデニン、グアニン、シチジン、ウラシル、あるいはブロモデオキシウリジンである。アミノ酸の例は、システイン、フェニルアラニン、チロシングリシン、セリン、トリプトファン、シスチン、メチオニン、ヒスチジン、アルギニン、あるいはリジンである。
【００３６】
両方の実施形態の別の態様では、二官能性ポリマーは、そのボトムエンドに吸着性基を含む場合がある。この態様では、吸着性基は、一本鎖核酸、アミン多糖、あるいは拡張した平面疎水基であり得る。一本鎖核酸の一例は、ＯｌｉｇｏｄＴあるいは同等のチミジンに富む核酸である。アミン多糖の一例はキトサンである。拡張した平面疎水基の一例は、ピレン、ジゴキシゲニン、あるいはＣｙ５色素である。
【００３７】
両方の実施形態およびその態様では、二官能性ポリマーリンカーは、オリゴヌクレオチド、アミノ多糖、ポリアミン、あるいはポリアミノ酸であり得る。特に、オリゴヌクレオチドは、ＯｌｉｇｏｄＴあるいは同等のチミジンに豊む核酸である。さらに、二官能性ポリマーリンカー対核酸プローブのモル比は、０．１より大きい場合がある。
【００３８】
さらに、両方の実施形態およびその態様では、複数の核酸プローブの各々は、５’末端、およびその３’末端の少なくとも３つの末端チミジン塩基を含み得る。これらの実施形態および態様では、チミジン塩基は、二官能性ポリマーリンカー上の第２の反応性部分に共有結合され得る。加えて、核酸プローブは、病原体、植物、あるいは動物中のシグネチャーヌクレオチド配列に相補的な配列を有し得る。
【００３９】
別の関連する実施形態では、共有結合した三次元格子マイクロアレイシステムが提供され、上記共有結合した三次元格子マイクロアレイシステムは；前面および背面を備えた固体支持体と；複数の二官能性ポリマーリンカーであって、その各々がトップドメインおよびボトムエンドを有し、上記ボトムエンドが固体支持体に結合されている、複数の二官能性ポリマーリンカーと；二官能性ポリマーリンカーのトップドメインに結合した、病原体、植物、あるいは動物中のシグネチャーヌクレオチド配列に相補的な配列を備えた複数の核酸プローブと、を有する。
【００４０】
この実施形態に加えて、固体支持体は、その前面に結合した複数の化学的に活性可能な基を含み、ここで、複数の二官能性ポリマーリンカーは、複数の化学的に活性可能な基に結合している。このさらなる実施形態では、化学的に活性可能な基、化学的に活性可能な基対二官能性ポリマーリンカーのモル比、および固体支持体は、上記の通りである。
【００４１】
別のさらなる実施形態では、二官能性ポリマーリンカーは、そのトップドメインの末端に共有結合されるか、あるいは内部に共有結合される蛍光標識を含み得る。このさらなる実施形態では、二官能性ポリマーリンカー、二官能性ポリマーリンカーに結合した第１の反応性部分、二官能性ポリマーリンカーに結合した第２の反応性部分、二官能性ポリマーリンカーに結合した蛍光標識、吸着性基、および、二官能性ポリマーリンカー対核酸プローブのモル比は、上記の通りである。
【００４２】
さらに、すべての実施形態およびその態様では、複数の核酸プローブの各々は、５’末端、およびその３’末端の少なくとも３つの末端チミジン塩基を含み得る。これらの実施形態および態様では、チミジン塩基は、二官能性ポリマーリンカー上の第２の反応性部分に共有結合され得る。
【００４３】
本発明の別の実施形態では、三次元格子マイクロアレイシステムを製造する方法が提供され、上記方法は；上述される三次元格子マイクロアレイシステム中の固体支持体を、複数の核酸プローブと；複数の二官能性ポリマーリンカーと；水および１００°Ｃより高い沸点を有する水混和性液体を含む溶媒混合液とを含む製剤と接触させる工程と；第１の結合反応として、複数の二官能性ポリマーリンカーのボトムエンドを固体支持体の前面に結合させる工程と；溶媒混合液中の水を蒸発させ、それにより、複数の核酸プローブおよび固体支持体に結合する複数の二官能性ポリマーリンカーを濃縮する工程と；第２の結合反応として、核酸プローブの各々を二官能性ポリマーリンカーのトップドメインに共有結合する工程と；未結合の二官能性ポリマーリンカーおよび核酸プローブを除去するために、固体支持体を少なくとも一回洗浄する工程と、を含む。
【００４４】
この実施形態における一態様では、固体支持体に対する複数の二官能性ポリマーリンカーの第１の結合反応は、固体支持体上の化学的に活性可能な基と、複数の二官能性ポリマーリンカーのボトムエンド上の第１の反応性部分との共有結合によるものである。本態様では、化学的に活性可能な基対二官能性ポリマーリンカーのモル比は、１０より大きい。別の態様では、第１の結合は、固体支持体の前面と、複数の二官能性ポリマーリンカーのボトムエンドとの間の吸着または静電結合による場合がある。この実施形態およびその態様では、第１の結合反応は、０°Ｃから４０°Ｃの間の温度で生じ得る。さらに、第１の結合反応は、約５分〜約１００分間生じる。加えて、水を蒸発させる工程は、２０°Ｃから４０°Ｃの間の温度で生じる。さらに、水を蒸発させる工程は、約１時間〜約２４時間の期間生じる。
【００４５】
さらに、この実施形態では、第２の結合反応は、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々のトップドメインにおける第２の反応性部分を、複数の核酸プローブに光化学的架橋することによって生じる場合がある。例えば、光化学的架橋は、複数の二官能性ポリマーリンカーのトップドメイン上に存在する末端チミジン塩基を介して生じる。この実施形態では、光化学的架橋は、紫外線あるいはレーザー源への暴露によって生じる。特に、紫外線は、２５４ｎｍの波長および３００メガモジュール（ｍｊｏｕｌｅｓ）のエネルギーを有し得る。この実施形態では、二官能性ポリマーリンカー対核酸プローブのモル比は、０．１より大きい場合がある。この実施形態およびその態様では、第２の結合反応は、０°Ｃから４０°Ｃの間の温度で生じ得る。加えて、第２の結合反応は、約１分〜約１０分間生じる。
【００４６】
さらに、この実施形態では、接触させる工程は、標準的な印刷技術、例えば、圧電印刷、密着焼付け、インクジェット印刷、あるいはピペッティングを含み得、これにより、活性化された支持体上に製剤を均一に塗布することを可能にする。固体支持体は、ホウケイ酸ガラス、ポリカーボネート、グラフェン、金、熱可塑性アクリル樹脂、例えば、ポリ（メタクリル酸メチル−ＶＳＵＶＴ（ＰＭＭＡ−ＶＳＵＶＴ）、およびシクロオレフィンポリマー、例えば、ＺＥＯＮＯＲＲ  １０６０（登録商標）であり得る。
【００４７】
さらに、この実施形態では、溶媒混合液は、約１０：１〜約１００：１の水対水混和性液体の容積比を含み得る。さらに、水混和性液体は、グリセロール、ＤＭＳＯ、あるいはプロパンジオールであり得る。あるいは、液体は、すべての溶媒が蒸発工程中に失われないように、水より高い沸点を有する任意の適切な水混和性液体であり得る。これにより、分子反応物−核酸プローブおよび二官能性リンカーが、蒸発中に連続的に濃縮されることを可能にする。そのような制御された蒸発は、核酸プローブ間の垂直間隔を制御し、ハイブリダイゼーション中にそれらの立体障害を回避し、それにより、マイクロアレイの精度および精密度を改善するため、本発明にとって重要である。水対高沸点溶媒の比は１０：１〜１００：１の間で維持され、それによって、両極端では、平衡状態の際に、流体相の体積が、水蒸発により原体積の１／１００〜１／１０の間に減少し、したがって、反応物濃度の１００倍〜１０倍の増加を引き起こす。好ましい実施形態では、水混和性溶媒はプロパンジオールであり、水対プロパンジオールの比は１００：１である。
【００４８】
本発明のさらに別の実施形態では、上述される三次元格子マイクロアレイシステム中の固体支持体および複数の二官能性ポリマーリンカーと、各々が病原体、植物、あるいは動物中のシグネチャーヌクレオチド配列に相補的な配列を有する複数の核酸プローブと、溶媒混合液と、キットを使用するための説明書とを含む、カスタマイズ可能なマイクロアレイキットが提供される。
【００４９】
この実施形態では、核酸プローブは、５’末端および３’末端で少なくとも３つの末端チミジン塩基を有し得る。さらに、この実施形態では、溶媒混合液は、約１０：１〜約１００：１の体積比の水と、グリセロール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、あるいはプロパンジオールのうち１つとの混合物を含む。
【００５０】
このキットを含む構成要素の各々は、エンドユーザの目的に基づいて、出荷前に個々にカスタマイズされ得る。例えば、固体支持体は、未修飾であってもよく、二官能性ポリマーリンカー中に基への非共有結合が可能な特性を有していてもよい。あるいは、固体支持体は、化学的に活性可能な基を有する前面上で活性化され得る。チミジン塩基は、化学薬品、光化学的あるいは熱的結合による、二官能性ポリマーリンカーへの核酸プローブの共有結合を可能にする。好ましくは、二官能性ポリマーリンカーへの核酸プローブの共有結合は、紫外線を使用する光化学的手段によるものである。
【００５１】
キットは、植物、動物、あるいは病原体中の配列決定因子を同定する目的で設計された複数の核酸プローブを提供し、ならびに、植物、動物、あるいは病原体中の配列決定因子のＤＮＡコピー数を定量化するための、サンプルに加えられる合成ＤＮＡ内部参照標準を含み得る。合成ＤＮＡは、検索されている未知のＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子とは異なるヌクレオチド配列を有する中央領域と、未知のＤＮＡ中のコンセンサス配列と実質的に同一の５’および３’末端配列とを有する。例えば、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２および１５３に示される配列であり得る。合成ＤＮＡのそのような構造は、検索されている未知のＤＮＡの超可変領域を増幅するために使用される同じＰＣＲプライマーの対による、合成ＤＮＡの増幅を可能にする。例えば、使用される可能性がある合成ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４−１５７に示される配列を有し得る。
【００５２】
関連する実施形態では、上述される三次元格子マイクロアレイシステム中の固体支持体と、各々がトップドメインおよびボトムエンドを有する複数の二官能性ポリマーリンカーと、トップドメインの末端に共有結合されるか、あるいは内部に共有結合される蛍光標識と；各々が病原体、植物、あるいは動物中のシグネチャーヌクレオチド配列に相補的な配列を有する複数の核酸プローブと、溶媒混合液と、キットを使用するための説明書とを含む、カスタマイズ可能なマイクロアレイキットが提供される。
【００５３】
この実施形態では、固体支持体、二官能性ポリマーリンカー、および蛍光標識は、上述される通りである。さらに、この実施形態では、核酸プローブは、５’末端および３’末端で少なくとも３つの末端チミジン塩基を有し得る。加えて、この実施形態では、溶媒混合液は上述される通りである。
【００５４】
本発明のさらに別の実施形態では、植物サンプル中の病原体を検出するための方法が提供され、上記方法は；植物組織サンプルを収集する工程と；植物組織サンプルからＤＮＡを含む全核酸を単離する工程と；１つ以上の病原体特異的な第１のアンプリコンを得るために、各々が少なくとも１つの病原体のＤＮＡに選択的なフォワードプライマーとリバースプライマーとを含む少なくとも１つの第１のプライマー対を使用して、単一のアッセイにおいて、第１の増幅をタンデムで実行する工程と；鋳型としての病原体特異的な第１のアンプリコンおよび少なくとも１つの第２のプライマー対を使用して、第２の増幅をタンデムで行う工程であって、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第１のアンプリコン中に、内部隣接領域に相補的な配列を有するフォワードプライマーとリバースプライマーを含む、工程と、病原体ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブで第２のアンプリコンをハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸プローブは、二官能性ポリマーリンカーを介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と、マイクロアレイを少なくとも一回洗浄する工程と、蛍光標識された第２のアンプリコンから蛍光シグナルを検出するために、マイクロアレイを画像化し、それにより、植物サンプル中の病原体を検出する工程とを、上述される三次元格子マイクロアレイシステムを使用して行う工程と、を含む。
【００５５】
この実施形態に加えて、二官能性ポリマーリンカーは、蛍光標識、方法、含むこと、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの蛍光シグナルを検出するためにマイクロアレイを画像化する工程と、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーのシグナル上に蛍光標識された第２のアンプリコンのシグナルを重ね合わせ、それにより、植物サンプル中で検出された病原体を同定する工程とを含む方法を含む。この実施形態では、蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン中の蛍光標識は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカー中の蛍光標識とは異なる。
【００５６】
両方の実施形態において、その一態様では、植物表面上に存在する病原体は、水で植物を洗浄して病原体を回収し、その後、無菌の０．４μｍのフィルターでの濾過により濃縮することによって収集することができる。両方の実施形態の別の態様では、植物組織内の病原体は、植物組織サンプルおよび病原体を流動化し、その後、遠心分離機にかけて植物細胞および病原体細胞のペレットを得ることによって収集することができる。一方の実施形態では、収集したサンプルを、全核酸を放出するために破壊して、それをさらに精製することなく後の工程で使用する。
【００５７】
両方の実施形態では、病原体（外病原体）からの核酸あるいは病原体および植物（内病原体）の両方からの核酸を含むサンプルは、病原体特異的な第１のプライマー対を使用して病原体ＤＮＡの第１の増幅を行い、１つ以上の病原体特異的な第１のアンプリコンを得るために使用される。サンプル中のＤＮＡ補体を選択的に増幅することができるループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）あるいはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含む、任意のＤＮＡ増幅法が使用され得る。好ましい実施形態において、増幅はＰＣＲによるものである。
【００５８】
両方の実施形態では蛍光標識された第２のアンプリコンは、上に詳細に記載される複数の核酸プローブを有する三次元格子マイクロアレイシステム上でハイブリタイズされる。一態様では、二官能性ポリマーリンカーは、結合された蛍光標識（第２のアンプリコン上の標識とは異なる）を有し、それにより、ハイブリダイゼーション後にマイクロアレイを画像化し、洗浄することにより、２つの別個の蛍光シグナル−製作中に核酸プローブに共有結合される蛍光性の二官能性ポリマーリンカーからのシグナル（マイクロアレイ中に含まれる各スポットで検出される）と、核酸プローブ配列が第２のアンプリコンに相補的であるスポットでのみ検出される第２のアンプリコンシグナル（本来、サンプル中の病原体ＤＮＡからの増幅に由来する）と、が得られる。したがって、コンピューターを使用して２つの画像を重ね合わせることにより、本発明において請求されるシステムおよび方法に有益な特質が提供される。なぜなら、核酸プローブ配列およびこの配列のマイクロアレイ位置を、植物または病原体中の既知のＤＮＡシグネチャーと関連付けるデータベースから、サンプル中に含まれる植物および病原体を容易に同定することができるからである。
【００５９】
両方の実施形態およびその態様では、病原体は、細菌（真菌）、ウイルス、藻類または原生動物、あるいはこれらの病原体の組み合わせである。これらの病原体は、土壌、無土壌栽培成長培地、水耕栽培成長培地、あるいは、植物サンプルが成長した水の成分として存在し得る。植物は、土壌、無土壌培地、水耕栽培成長培地、あるいは水中で増大する、カラナハソウ属（Ｈｕｍｕｌｕｓ）またはカンナビスなどの陸上植物、水草、着生植物、あるいは岩生植物であってもよい。好ましくは、植物はカンナビスである。
【００６０】
一態様では、病原体は細菌であり、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７および１３８にそれぞれ示される配列を有し、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および２０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および２２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５および２６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７および２８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９および３０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１および３０にそれぞれ示される配列を有し、ここで、核酸プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−８５に示される配列を有する。
【００６１】
別の態様では、病原体は真菌であり、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５および１６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５および１３６にそれぞれ示される配列を有し、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１および３２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３および３４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９および１４０にそれぞれ示される配列を有し、核酸プローブはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６−１２５に示される配列を有する。
【００６２】
本発明のさらに別の実施形態では、単一アッセイにおいて、植物および病原体からＤＮＡを同時に検出するための方法が提供され、上記方法は、１つ以上の病原体を潜在的に含む植物組織サンプルを収集する工程と；少なくとも植物組織および１つ以上の病原体からＤＮＡを含む全核酸を単離する工程と；病原体特異的な第１のアンプリコンおよび植物特異的な第１のアンプリコンを得るために、少なくとも１つの病原体ＤＮＡ選択的な第１のプライマー対と少なくとも１つの植物ＤＮＡ選択的な第１のプライマー対を使用して、全核酸上で単一アッセイにおいて、第１の増幅をタンデムで行う工程と；蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンを得るために、鋳型としての病原体特異的な第１アンプリコンおよび植物特異的な第１アンプリコンと、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第１のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有する少なくとも１つの第２のプライマー対と、蛍光標識で標識され、かつ植物特異的な第１のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有する少なくとも１つの第２のプライマー対とを使用して、第２の増幅をタンデムで行う工程と；蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンを、病原体ＤＮＡおよび植物ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して、三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と、マイクロアレイを少なくとも１回洗浄する工程と、蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコンから、および蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンから、蛍光シグナルを検出するために、マイクロアレイを画像化し、それにより、サンプル中の病原体および植物を同時に検出する工程とを、上述される三次元格子マイクロアレイシステムを使用して行う工程と、を含む。
【００６３】
この実施形態に加えて、複数の二官能性ポリマーリンカーの各々は蛍光標識を含み、上記方法は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの蛍光シグナルを検出するためにマイクロアレイを画像化する工程と、蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコンのシグナルを、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーのシグナルの上に重ね合わせ、それにより、植物サンプル中で検出された病原体および植物を同時に同定する工程を含む。
【００６４】
両方の実施形態では、上記方法は、１つ以上の病原体を潜在的に含む植物組織サンプルを収集する工程と、植物組織サンプルおよび１つ以上の病原体を流動化する工程と、少なくとも植物組織からのＤＮＡおよび上述される１つ以上の病原体からのＤＮＡを含む全核酸を単離する工程とを含む。さらに、両方の実施形態では、未精製の全核酸サンプルの第１の増幅と、第１の増幅よって生産された病原体特異的な第１のアンプリコンおよび植物特異的な第１のアンプリコンの第２の増幅は、上述の通りであり、ならびに、元の収集されたサンプル中の病原体ＤＮＡと植物ＤＮＡにそれぞれ対応する、蛍光標識された病原体特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された植物特異的な第２のアンプリコンを生産する。
【００６５】
両方の実施形態では、病原体は、ヒト病原体、動物病原体、あるいは植物病原体、特に、細菌、真菌、ウイルス、酵母、藻類、原生動物、またはその組み合わせであってもよい。特に、病原体は、細菌あるいは真菌であってもよく、ならびに、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対配列、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対配列、および核酸プローブ配列は、上述される通りである。
【００６６】
本発明のさらに別の実施形態では、植物サンプル中の１つ以上の病原体ＤＮＡのコピー数を定量化するための方法が提供され、上記方法は、病原体を潜在的に有する植物組織サンプルを収集する工程と；ＤＮＡを含む全核酸を単離する工程と；内部参照標準としての少なくとも１つの合成ＤＮＡ配列の既知のコピー数を、単離された全核酸に加える工程であって、合成ＤＮＡ配列の各々は、病原体ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子とは異なるヌクレオチド配列を有する中心領域と、病原体ＤＮＡ中のコンセンサス配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する５’末端および３’末端とを含む、工程と；１つ以上の病原体ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコンおよび合成ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコンを得るために、各々が病原体ＤＮＡに選択的なフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む少なくとも１つの第１のプライマー対を使用して、全核酸上で、単一のアッセイにおいて、第１の増幅をタンデムで行う工程と；蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンをそれぞれ得るために、鋳型としての病原体特異的な第１アンプリコンおよび合成ＤＮＡ特異的な第１アンプリコン、ならびに少なくとも１つの第２のプライマー対を使用して、第２の増幅をタンデムで行う工程であって、ここで、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ病原体特異的な第１のアンプリコンおよび合成ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコン中に内部隣接領域に相補的な配列を有するフォワードプライマーおよびリバースプライマーを含む、工程と；病原体ＤＮＡおよび合成ＤＮＡのそれぞれにおけるシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブで第２のアンプリコンをハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸プローブは、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して、三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と、マイクロアレイを少なくとも一回洗浄する工程と、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介してマイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化された核酸プローブに対応する蛍光シグナル、ならびに、病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンならびに合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの各々の蛍光シグナルを検出するために、マイクロアレイを画像化する工程とを、上述される三次元格子マイクロアレイシステムを使用して行う工程と；重ね合わせたシグナル画像を得るために、病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンと合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの蛍光シグナルの画像を、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの画像上に重ね合わせる工程と；マイクロアレイ上の１つ以上の重ね合わせたシグナル位置での核酸プローブの配列を、複数の病原体ＤＮＡのシグネチャー配列決定因子のデータベースと比較し、それにより、サンプル中の病原体を同定する工程と；病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンと、合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの蛍光シグナルからの蛍光シグナル強度と単離された全核酸に加えられた合成ＤＮＡの既知のコピー数を数学的に相関させ、それにより、サンプル中の病原体ＤＮＡのコピー数を定量化する工程と、を含む。
【００６７】
この実施形態では一般的に、請求される方法で利用される方法、例えば、収集、全核酸の単離、第１および第２の増幅、ならびに三次元格子マイクロアレイシステムは、上述される通りである。一般には、植物、病原体、蛍光標識、およびプライマー対配列は、上述される通りである。
【００６８】
この実施形態では、蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン中の蛍光標識は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカー中の蛍光標識とは異なる。ハイブリダイゼーションの後にマイクロアレイを画像化し、画像を重ね合わせることにより、２つの蛍光シグナル−製作中に核酸プローブに共有結合する蛍光性の二官能性ポリマーリンカーからのシグナル（マイクロアレイに含まれる各場所で検出される）と、蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンおよび蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンからのシグナル（核酸プローブ配列が病原体特異的な第２のアンプリコン（本来、サンプル中の病原体ＤＮＡからの増幅に由来する）および合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンに相補的な位置（スポット）でのみ検出される）とを結果としてもたらす。したがって、コンピューターを使用してシグナルを重ね合わせることにより、本発明において請求されるシステムおよび方法に有益な特質が提供される。なぜなら、核酸プローブ配列およびこの配列のマイクロアレイ位置を、植物または病原体中の既知のＤＮＡシグネチャーと関連付けるデータベースから、サンプル中に含まれる植物および病原体を容易に同定することができるからである。
【００６９】
さらに、この実施形態では、数学的に相関させる工程は、以下の関係を利用して行われ得る：
Ｃｎ／Ｃｏ＝Ｐ（Ｓｎ／Ｓｏ）ｘ、式中：
Ｃｎ＝マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用される、２つのタンデムＰＣＲ反応の１つ目に加えられた元のサンプル混合物中に存在する、各タイプ（ｎ）の微生物ＤＮＡコピー数；
Ｃｏ＝マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用される、２つのＰＣＲ反応の１つ目に加えられた既知の合成ＤＮＡコピー数（内部参照標準）、ここで、Ｃｏは、遭遇し得る未知の微生物コピーの範囲に応じて、例えば、１００、５００、３，０００、および５，０００の値に設定され得る。好ましい実施形態では、Ｃｏ＝３０００であり；
Ｓｎ＝ＰＣＲ増幅、およびｎ番目の微生物種のマイクロアレイのハイブリダイゼーション、その後の画像分析の後に得られる、相対蛍光単位（ＲＦＵ）シグナルデータであり；
Ｓｏ＝ＰＣＲ増幅、および合成ＤＮＡ種のマイクロアレイのハイブリダイゼーション、その後の画像分析の後に得られる、相対蛍光単位（ＲＦＵ）シグナルデータであり；
Ｘ＝元のサンプル中に存在する微生物ＤＮＡコピーＶＳ合成ＤＮＡ標準コピーの基礎となる比（Ｃｎ／Ｃｏ）に対する、実験用マイクロアレイデータ比（Ｓｎ／Ｓｏ）間の関数関係を定義する複素指数因子である。Ｘは、線形関数あるいは指数関数または関連する関数の形式、もしくは、それ自体がマイクロアレイ分析および画像化の増幅パラメータおよび増幅条件の関数である定数であり得る。一態様では、Ｘは約１〜約３に及ぶ指数因子であり；および、
Ｐ＝実験用マイクロアレイデータ比（Ｓｎ／Ｓｏ）を、マイクロアレイに結合する増幅されたＰＣＲ産物の濃度に関連付ける定数であり、ここで、一態様では、Ｐは約０．１〜約１０に及ぶ。
【００７０】
加えて、この実施形態では、合成ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４−１５７に示される配列を有し得る。合成ＤＮＡは、検索されている未知のＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子とは異なるヌクレオチド配列を有する中央領域と、未知のＤＮＡ中のコンセンサス配列と実質的に同一の５’および３’末端配列とを有する。例えば、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２および１５３に示される配列であり得る。合成ＤＮＡのそのような構造は、検索されている未知のＤＮＡの超可変領域を増幅するために使用される同じＰＣＲプライマーの対による、合成ＤＮＡの増幅を可能にする。
【００７１】
この実施形態の１つの態様では、病原体は細菌であり得、ここで、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３に示され、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７および１３８にそれぞれ示される配列を含み、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３に示され、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および２０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および２２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５および２６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７および２８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９および３０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１および３０にそれぞれ示される配列を有し、細菌に特異的な核酸プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−８５に示される配列を有し、合成ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４にそれぞれ示される配列を有する合成ＤＮＡ特異的核酸プローブにハイブリタイズする、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７に示される配列を有する。
【００７２】
この実施形態の別の態様では、病原体は真菌であり、コンセンサス配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２に示され、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５および１６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５および１３６にそれぞれ示される配列を有し、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２に示され、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１および３２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３および３４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９および１４０にそれぞれ示される配列を有し、真菌に特異的な核酸プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６−１２５に示される配列を有し、合成ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５に示される配列を有する合成ＤＮＡ特異的核酸プローブにハイブリタイズする、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４に示される配列を有する。
【００７３】
本発明のさらに別の実施形態では、単一のアッセイにおいて、植物組織サンプル中の１つ以上の病原体および植物のＤＮＡのコピー数を同時に定量化するための方法が提供され、上記方法は；１つ以上の病原体を潜在的に含む植物組織サンプルを収集する工程と；少なくとも植物組織ＤＮＡおよび病原体ＤＮＡを含む全核酸を単離する工程と；内部参照標準としての少なくとも１つの合成ＤＮＡ配列の既知のコピー数を、単離された全核酸に加える工程であって、合成ＤＮＡ配列の各々は、病原体ＤＮＡおよび植物ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子とは異なるヌクレオチド配列を有する中心領域と、病原体ＤＮＡ中のコンセンサス配列と実質的に同一のヌクレオチド配列を有する５’末端および３’末端とを含む、工程と；病原体ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコン、植物ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコン、および合成ＤＮＡ特異的な第１のアンプリコンを得るために、少なくとも１つの病原体特異な的第１のプライマー対および少なくとも１つの合成ＤＮＡ特異的な第１のプライマー対および少なくとも１つの植物特異的な第１のプライマー対を使用して、全核酸上で単一アッセイにおいて、第１の増幅をタンデムで行う工程と；蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、蛍光標識された植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、ならびに蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンを得るために、鋳型としての第１のアンプリコン、少なくとも１つの病原体ＤＮＡ特異的な第２のプライマー対、および少なくとも１つの植物ＤＮＡ特異的な第２のプライマー対を使用して、第２の増幅をタンデムで行う工程であって、ここで、各プライマー対は、蛍光標識で標識され、かつ、第１のアンプリコン中の内部隣接領域に相補的な配列をそれぞれ有する、工程と；第２のアンプリコンを、病原体ＤＮＡ、植物ＤＮＡ、および合成ＤＮＡ中のシグネチャー配列決定因子に特異的な核酸プローブでハイブリタイズする工程であって、ここで、核酸プローブは、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介して三次元格子マイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化される、工程と、マイクロアレイを少なくとも一回洗浄する工程と、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーを介してマイクロアレイ上の特定の既知の位置で固定化された核酸プローブに対応する蛍光シグナルと、蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、蛍光標識された植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、および蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンの各々に対応する蛍光シグナルとを検出するために、マイクロアレイを画像化する工程とを、上述される三次元格子マイクロアレイシステムを使用して行う工程と；重ね合わせたシグナル画像を得るために、蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、蛍光標識された植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、および蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンのシグナルを、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカーの画像シグナル上に重ね合わせる工程と；マイクロアレイ上の１つ以上の重ね合わせたシグナル位置での核酸プローブの配列を、複数の病原体ＤＮＡおよび植物ＤＮＡのシグネチャー配列決定因子のデータベースと比較し、それにより、サンプル中の病原体および植物を同定する工程と；病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンと、合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンからの蛍光シグナル強度および合成ＤＮＡの既知のコピー数を数学的に相関させ、それにより、サンプルの病原体ＤＮＡのコピー数を定量化する工程と；植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンからの蛍光シグナル強度を、合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコンおよび合成ＤＮＡの既知のコピー数の蛍光シグナル強度と数学的に相関させ、それにより、サンプル中の植物ＤＮＡのコピー数を定量化する工程とを含む。
【００７４】
この実施形態では一般的に、請求される方法で利用される方法、例えば、収集、全核酸の単離、第１と第２の増幅、および重ね合わせ、ならびに三次元格子マイクロアレイシステムは、上述される通りである。一般には、植物、病原体、蛍光標識、およびプライマー対配列は、上述される通りである。
【００７５】
この実施形態では、蛍光標識された病原体ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、蛍光標識された植物ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン、および蛍光標識された合成ＤＮＡ特異的な第２のアンプリコン中の蛍光標識は、蛍光標識された二官能性ポリマーリンカー中の蛍光標識とは異なる。
【００７６】
さらに、この実施形態では、数学的に相関させる工程は、上述される関係Ｃｎ／Ｃｏ＝Ｐ（Ｓｎ／Ｓｏ）ｘで行なわれる。
【００７７】
この実施形態の１つの態様では、病原体は細菌であり得、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３に示され、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１および２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３および４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５および６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７および８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９および１０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１および１２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３７および１３８にそれぞれ示される配列を含み、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３に示され、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９および２０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１および２２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２３および２４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２５および２６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２７および２８、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９および３０、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１および３０にそれぞれ示される配列を有し、細菌に特異的な核酸プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３７−８５に示される配列を有し、合成ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４にそれぞれ示される配列を有する合成ＤＮＡ特異的核酸プローブにハイブリタイズする、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５６、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７に示される配列を有する。
【００７８】
この実施形態の１つの態様では、病原体は真菌であり得、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２に示され、第１の増幅フォワードプライマーとリバースプライマー対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３および１４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５および１６、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３５および１３６にそれぞれ示される配列を有し、コンセンサス配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２に示され、第２の増幅フォワードプライマーとリバースプライマーの対は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１および３２、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３および３４、あるいはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３９および１４０にそれぞれ示される配列を有し、真菌に特異的な核酸プローブは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８６−１２５に示される配列を有し、合成ＤＮＡは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４５に示される配列を有する合成ＤＮＡ特異的核酸プローブにハイブリタイズする、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４に示される配列を有する。
【００７９】
以下の例は、本発明の様々な実施形態を例証する目的で与えられ、いかなる方法でも本発明を制限することを意図していない。
【００８０】
実施例１：三次元格子マイクロアレイシステムの製作
本発明は、二官能性ポリマーリンカーの使用によって、核酸プローブを固体支持体表面に結合させる方法を教示する。核酸プローブは、ＰＣＲアンプリコン、合成オリゴヌクレオチド、等温増幅産物、プラスミド、あるいは一本鎖または二本鎖の形態のゲノムＤＮＡ断片であり得る。本発明は、核酸プローブが結合される上記表面の性質に基づいて、２つのクラスへと細分することができる。
【００８１】
活性化された固体支持体を備えた共有結合のマイクロアレイシステム
これらの核酸プローブのいずれか１つの共有結合は、上記表面に対して直接生じないが、その代わり、表面との化学反応が可能であり、かつ核酸プローブで効率的なＵＶ開始架橋も可能である、比較的長い二官能性ポリマーリンカーによって媒介される。このプロセスの力学は、自発的な３Ｄ自己アセンブリ（ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ３Ｄ  ｓｅｌｆ  ａｓｓｅｍｂｌｙ）であり、図１Ａ−１Ｄにおいて例示される。図１Ａで見られるように、このマイクロアレイシステムを製作するために必要な構成要素は以下の通りである：（ａ）オリゴヌクレオチド、ＰＣＲまたは等温アンプリコン、プラスミドあるいはゲノムＤＮＡなどの未修飾の核酸プローブ（３）；（ｂ）エポキシシラン、イソシアネート、スクシンイミド、カルボジイミド、アルデヒドなどの一級アミンとの反応に適合する化学的に活性可能な基（「Ｘ」で示される）を備えた化学的に活性可能な表面（１）；（ｃ）天然あるいは修飾されたＯｌｉｇｏｄＴ、アミノ多糖、支持体表面上の化学的に活性可能な基に結合するのに適したアミノポリペプチドなどの、二官能性ポリマーリンカー（２）（その各々に蛍光標識（４）が結合する）；および、（ｄ）水と、グリセロール、ＤＭＳＯ、あるいはプロパンジオールなどの高沸点の水混和性液体を含む溶媒（１０：１〜１００：１の間の水対溶媒の比率）。
【００８２】
表１は、単なる例示の目的のみのために、二官能性ポリマーリンカー上の化学的に活性可能な基および一致した反応性基の例を示し、いかなる方法においても、一致した反応性対の他の組み合わせの使用を排除しない。
【００８３】
【表１】
2021516995.tif 000002
【００８４】
本発明中で使用される場合、化学的に活性可能な表面、二官能性ポリマーリンカー、および未修飾の核酸プローブは、密着焼付け、圧電印刷、インクジェット印刷、あるいはピペッティングなどの、ＤＮＡハイブリダイゼーション試験を生成するために使用される通常の製作方法によって、化学的に活性化された表面（４）に適用される溶液として含まれる。
【００８５】
化学的に活性可能な表面、二官能性ポリマーリンカー、および未修飾の核酸プローブの混合物を上記表面に適応することにより、マイクロアレイ製作が始まる。第１の工程は、活性化された表面に対する二官能性リンカーの反応および共有結合である（図１Ｂ）。一般に、二官能性リンカーの化学的濃度は、表面上の反応部位の１００％未満が二官能性リンカーへの共有結合を形成するように設定される。そのような低密度では、二官能性リンカー分子間の平均距離は、格子幅（図１Ｂ中の「ＬＷ」）で示される間隔を定義する。
【００８６】
第２の工程では、溶媒中の水を蒸発させて、溶媒からの水の蒸発を介してＤＮＡおよび二官能性リンカーを濃縮する（図１Ｃ）。一般には、マトリックス製作中の溶媒としての純水の使用は、高い表面積／体積比ゆえに水が蒸発によって素早く除去されるため、不利である。これを克服するために、本発明では、グリセリン、ＤＭＳＯ、あるいはプロパンジオールなどの高沸点の水混和性溶媒と水の混合物を溶媒として使用した。この場合、蒸発の際に、水成分は蒸発するが、高沸点溶媒は蒸発しない。その結果、蒸発により水が失われるにつれて、ＤＮＡおよび二官能性リンカーは連続的に濃縮される（分子反応物）。本発明では、水対高沸点溶媒の比率は１０：１〜１００：１の間で維持される。したがって、２つの極端な場合では、平衡状態の際に、流体相の体積は、水蒸発により原体積の１／１００〜１／１０の間に減少し、したがって、反応物濃度の１００倍〜１０倍の増加を引き起こす。そのような制御された蒸発は、蒸発濃縮の程度に反比例する核酸プローブ間の垂直間隔（垂直分離、図１Ｃ中の「ＶＧ」）を制御するため、本発明にとって重要である。
【００８７】
第３の工程では、核酸プローブ中の末端チミジン塩基は、蒸発した表面内の二官能性リンカーにＵＶ架橋される（図１Ｄ）。このプロセスは、チミジン塩基の周知の光化学反応性によって媒介され、タンパク質および炭水化物とのＤＮＡ反応あるいは光化学反応において他のチミジン塩基への共有結合の形成を引き起こす。二官能性架橋剤はＯｌｉｇｏｄＴであり、架橋反応は双方向であり、すなわち、光化学は、核酸プローブあるいは二官能性ＯｌｉｇｏｄＴリンカーのいずれかにおいて開始することができる。他方では、二官能性リンカーがキトサンまたはポリアミノ酸などのアミノ多糖であり、その中にリジンまたはヒスチジンを有する場合、光化学は、核酸プローブにおいて始まり、二官能性リンカーは光化学の標的となる。
【００８８】
非共有結合の未修飾の固体支持体を備えたマイクロアレイシステム
このマイクロアレイシステムでは、核酸プローブの結合は、上記表面には直接生じないが、その代り、固体支持体で非共有的に結合するが、ＵＶ開始架橋により核酸プローブで共有結合的に結合する比較的長い二官能性ポリマーリンカーを介して媒介される。このプロセスの力学は、自発的な３Ｄ自己アセンブリであり、図２Ａ−２Ｄにおいて例示される。図２Ａで見られるように、このマイクロアレイシステムを製作するために必要な構成要素は以下の通りである：
（１）オリゴヌクレオチド、ＰＣＲまたは等温アンプリコン、プラスミドあるいはゲノムＤＮＡなどの未修飾の核酸プローブ（３）；
（２）未修飾の固体支持体（１）；
（３）固体支持体への吸着性結合に適合する官能基（「Ｒ」で示される）を本質的に有するか、またはそれを有するように修飾される、ＯｌｉｇｏｄＴあるいはアミノ多糖、アミノポリペプチドなどの二官能性ポリマーリンカー（２）（各々が蛍光標識（４）を有する）；および、
（４）水と、グリセロール、ＤＭＳＯ、あるいはプロパンジオールなどの高沸点の水混和性液体を含む溶媒（１０：１〜１００：１の間の水対溶媒の比率）。
【００８９】
【表２】
2021516995.tif 000003
【００９０】
表２は、単なる例示の目的のみのために、二官能性ポリマーリンカー上の未修飾の支持体表面および一致した吸着性基の例を示し、いかなる方法においても、これらの他の組み合わせの使用を排除しない。
【００９１】
本発明中で使用される場合、構成要素（１）−（３）は、密着焼付け、圧電印刷、インクジェット印刷、あるいはピペッティングなどの、ＤＮＡハイブリダイゼーション試験を生成するために使用される通常の製作方法によって、固体支持体表面に適用される溶液として含まれる。
【００９２】
マイクロアレイ製作は、構成要素（１）−（３）を混合物の上記表面に適用することにより開始する。第１の工程は、支持体表面に対する二官能性リンカーの吸着である（図２Ｂ）。二官能性リンカーの濃度は、二官能性リンカー分子間の平均距離が格子幅（図２Ｂ中の「ＬＷ」）として示される間隔を定義するように設定される。
【００９３】
第２の工程では、溶媒中の水を蒸発させて、溶媒からの水の蒸発を介してＤＮＡおよび二官能性リンカーを濃縮する（図２Ｃ）。一般には、マトリックス製作中の溶媒としての純水の使用は、高い表面積／体積比ゆえに水が蒸発によって素早く除去されるため、不利である。これを克服するために、本発明では、グリセリン、ＤＭＳＯ、あるいはプロパンジオールなどの高沸点の水混和性溶媒と水の混合物を溶媒として使用した。この場合、蒸発の際に、水成分は蒸発するが、高沸点溶媒は蒸発しない。その結果、蒸発により水が失われるにつれて、ＤＮＡおよび二官能性リンカーは連続的に濃縮される（分子反応物）。本発明では、水対高沸点溶媒の比率は１０：１〜１００：１の間で維持される。したがって、２つの極端な場合では、平衡状態の際に、流体相の体積は、水蒸発により原体積の１／１００〜１／１０の間に減少し、したがって、反応物濃度の１００倍〜１０倍の増加を引き起こす。
【００９４】
第３の工程では、核酸プローブ中の末端チミジン塩基は、蒸発した表面内の二官能性リンカーにＵＶ架橋される（図２Ｄ）。このプロセスは、チミジン塩基の周知の光化学反応性によって媒介され、タンパク質および炭水化物とのＤＮＡ反応あるいは光化学反応において他のチミジン塩基への共有結合の形成を引き起こす。二官能性架橋剤はＯｌｉｇｏｄＴであり、架橋反応は双方向であり、すなわち、光化学は、核酸プローブあるいは二官能性ＯｌｉｇｏｄＴリンカーのいずれかにおいて開始することができる。他方では、二官能性リンカーがキトサンまたはポリアミノ酸などのアミノ多糖であり、その中にリジンまたはヒスチジンを有する場合、光化学は、核酸プローブにおいて始まり、二官能性リンカーは光化学の標的となる。
【００９５】
第１の工程に記載されるそのような非共有結合の吸着は、単独で生じる場合、全体として、弱く、可逆的であるが、二官能性ポリマーリンカーと上記表面との間の多くのそのような弱い吸着性事象が近接して生じる場合、および、密に詰まったポリマーリンカーがその後チミジン媒介性光化学的架橋を介して互いに結合される場合、新しく作られた、拡張された多分子（交差結合された）複合体が表面上でさらに安定化し、これによって、その表面への直接の共有結合がない状態で、表面に安定した複合体を作ることが、本発明において教示される。
【００９６】
本発明は、核酸プローブとして合成オリゴヌクレオチドの結合に効率的に作用して、微生物ＤＮＡ標的の分析のためのマイクロアレイベースのハイブリダイゼーション装置を形成する。しかし、同発明は、ＰＣＲアンプリコン、合成オリゴヌクレオチド、等温増幅産物、プラスミドＤＮＡ、あるいはゲノムＤＮＡ断片を核酸プローブとして結合するために使用されてもよいことが明らかである。さらに、マイクロアレイでないハイブリダイゼーション装置を製造するために、同じ技術を使用することができることは明らかである。
【００９７】
上述され、かつ図１あるいは図２に例示されるように展開するために、表３に記載されるようにＤＮＡ核酸プローブを製剤化する。４８のそのようなプローブの１セット（表４）を、微生物ＤＮＡの様々な配列決定因子に特異的に設計し、その各々は、上述され、かつ図１に例示されるように、各末端で５−７Ｔの塩基のストリングを提示し、それらのＵＶ架橋を容易にして共有結合されたマイクロアレイのエレメント（ｅｌｅｍｅｎｔ）を形成するように製作された。４８の異なるプローブの各々を、表３に示される配列を有する１４４のエレメント（１２×１２）のマイクロアレイを形成するために、３回繰り返してプリントした。
【００９８】
【表３】
2021516995.tif 000004
【００９９】
【表４−１】
2021516995.tif 000005
【０１００】
【表４−２】
2021516995.tif 000006
【０１０１】
その後、表４の４８の異なるプローブのセットを、表３に記載されるように製剤化し、その後、１つのスポット当たり約１ｎＬの製剤を堆積する、Ａｒｒａｙｉｔ  ＳＭＰピンを備えたＧｅｎｔｉｃｓ  Ｑ−Ａｒｒａｙミニコンタクトプリンタを使用して、エポキシシランでコーティングされたホウケイ酸ガラス上にプリントした。図１に記載されるように、その後、このようにプリントされたアレイを、室温でエポキシシラン表面と反応させ、その後、室温で蒸発させて遊離水を除去した。蒸発工程（典型的に一晩）の完了時に、その後、空気乾燥したマイクロアレイを、ＴＡＴＯＬＩＮＫＥＲ（登録商標）  ＵＶ照射システム：２５４ｎｍでの３００メガジュールの照射でＵＶ処置し、チミジン媒介性架橋を開始する。その後、マイクロアレイは使える状態になり、洗浄またはキャッピングは必要ではない。
【０１０２】
実施例２
ＤＮＡ分析のための三次元格子マイクロアレイシステムを使用することサンプル処理植物表面からの病原体の収集は以下の工程を含む：
１．１ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で植物サンプルを洗浄またはテーププルする
２．植物材料／テープを除去する
３．遠心機にかけて細胞をペレット化し、上清を廃棄する
４．Ｓａｍｐｌｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒであらかじめ混合したＰａｔｈｏｇｅｎＤｘ（登録商標）  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｂｕｆｆｅｒ中で再懸濁する
５．５５°Ｃで４５分間加熱する
６．ボルテックスしてペレットを消散させる
７．９５°Ｃで１５分間加熱する
８．ＰＣＲでの使用前にボルテックスし、短時間遠心機にかける
【０１０３】
ＰＣＲによる増幅
増幅およびハイブリダイゼーション分析に使用されるサンプルは、認可されたカンナビス研究所（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｌａｂ）からのカンナビスの花洗浄液（Ｃａｎｎａｂｉｓ  ｆｌｏｗｅｒ  ｗａｓｈ）であった。その後、洗浄した花材料を遠心分離によってペレット化した。次に、ペレットをプロテイナーゼＫで消化し、その後、ＰＣＲ増幅前に既知量のサルモネラ菌ＤＮＡでスパイクした。
【０１０４】
【表５】
2021516995.tif 000007
【０１０５】
その後、サルモネラ菌ＤＮＡスパイクサンプルを、タンデムＰＣＲ反応中の腸内細菌科の１６ｓ領域に特異的なＰＣＲプライマー（Ｐ１−表５）で増幅し、標的化された領域（ＰＣＲ反応＃１）と、陽性対照として使用されるカンナビスＤＮＡ（ＩＴＳ）のセグメントを増幅するＰＣＲプライマー（Ｐ１−表５）とを最初に単離する。
【０１０６】
次に、ＰＣＲ反応＃１（１μＬ）の産物を、第２のＰＣＲ反応（ＰＣＲ反応＃２）にさらし、それにより、２つの標的化された領域（１６ｓ、ＩＴＳ）をさらに増幅し、緑ＣＹ３フルオロフォア標識プライマー（Ｐ２−表５）で標識化する。その後、ＰＣＲ反応＃２（５０μＬ）の産物を、ハイブリダイゼーション緩衝液（４ｘＳＳＣ＋５ｘデンハルト溶液）で１−１に希釈し、その後、ハイブリダイゼーションのためにマイクロアレイに直接適用した。
【０１０７】
ハイブリダイゼーション
マイクロアレイ製造の従来の方法は、マイクロアレイ表面の前処理を必要とせずにハイブリダイゼーションを介してＤＮＡを分析することができるので、そのマイクロアレイの使用は単純であり、６つの手動あるいは自動のピッペッティング工程を含む。
１）増幅されたＤＮＡ＋結合緩衝液をマイクロアレイ上にピッペッティングする
２）３０分間インキュベートして、マイクロアレイにＤＮＡを結合させる（典型的に室温（ＲＴ）で）
３）ピッペッティングによりＤＮＡ＋結合緩衝液を除去する。
４）５０μＬの洗浄緩衝液をマイクロアレイ（０．４ｘＳＳＣ＋０．５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ）上でピッペッティングし、室温で５分間インキュベートする
５）ピペッティングにより洗浄緩衝液を除去する
６）工程４および５を繰り返す
７）５３２ｎｍおよび６３５ｎｍで画像分析を行い、プローブスポット位置（５３２ｎｍ）およびＰＣＲ産物ハイブリダイゼーション（６３５ｎｍ）を検出する。
【０１０８】
画像分析
以下の画像化条件で、ラスターベースの共焦点スキャナ：ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂマイクロアレイスキャナ上において、２つの波長（５３２ｎｍおよび６３５ｎｍ）で画像分析を行った：３３％のレーザーパワー、５３２ｎｍでの４００ＰＭＴ設定／３３％のレーザーパワー、６３５ｎｍでの７００ＰＭＴ設定。
【０１０９】
図３は、マイクロアレイの構造およびハイブリダイゼーション性能の例を示す。図３のＡは、６３５ｎｍで視覚化された、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の、上述される代表的なマイクロアレイの画像化を明らかにする。６３５ｎｍの画像は、マイクロアレイ製作中に各マイクロアレイスポットにおける位置マーカーとして導入された二官能性ポリマーリンカーＯｌｉｇｏｄＴの５’末端に結合した（赤）ＣＹ５蛍光からのシグナルに由来する（図１および表３を参照）。図３のＡのデータにより、図１に記載されるように、二官能性リンカーの組み合わせた活性およびその後のＵＶ架橋を介して、Ｃｙ５標識ＯｌｉｇｏｄＴがマイクロアレイ表面に恒久的に結合されたことを確認する。
【０１１０】
図３のＢは、５３２ｎｍで視覚化された、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の、上述される代表的なマイクロアレイの画像化を明らかにする。５３２ｎｍの画像は、ＰＣＲ反応＃２中に得られた、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの５’末端に結合された（緑）ＣＹ３蛍光からのシグナルに由来する。４８の別々のプローブの小さなサブセットのみがＣｙ３標識ＰＣＲ産物に結合することが図３Ｂから明らかであり、したがって、核酸プローブを結合してマイクロアレイ（図１）を形成するための本方法は、（同族の）溶液状態の標的への配列特異的結合が可能なマイクロアレイ産物を産出することを確認する。図３のＢのデータは、データの基礎となる３倍の繰り返しを明らかにする（つまり、アレイは、最終的な４８×３＝１４４エレメントのマイクロアレイを形成するために、３つの別個のサブアレイとして３回プリントされた４８のプローブの同じセットである）。４８のプローブの同じセットが、３回繰り返されたサブドメインとして、３回プリントされるという観察は、本発明が再現可能なマイクロアレイ産物を生成することを示している。
【０１１１】
図３のＣは、重ね合わせた５３２ｎｍおよび６３５ｎｍの画像の両方で視覚化された、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の、上述される代表的なマイクロアレイの画像化を明らかにする。重ね合わせた画像は、ＣＹ３で標識されたＰＣＲ産物の配列特異的結合と比較した、Ｃｙ５で標識されたＯｌｉｇｏｄＴの位置マーカーの平行アタッチメントの有用性を示す。
【０１１２】
実施例３
増幅、ハイブリダイゼーション、およびマイクロアレイ分析
図４Ａは、第１のＰＣＲ工程の模範を示す。標準的なものとして、そのようなＰＣＲ反応を、ＰＣＲプライマーの適用によって開始する。プライマーは、ＰＣＲベースのＤＮＡ増幅反応の開始点および停止点を定義する。この実施形態では、必要とされるＤＮＡ増幅をサポートするために、１対のＰＣＲ反応を利用する。一般に、そのようなＰＣＲ増幅は連続して行なわれ：図４のＡの接尾辞「Ｐ１」を有する第１の対のＰＣＲは、約１μＬの任意の未精製のＤＮＡサンプル、例えば、生のカンナビス葉洗浄液などを増幅するために使用される。第１のＰＣＲ反応の約１μＬの産物を、ＤＮＡに蛍光色素標識を取り付けるために使用される第２のＰＣＲ反応の基板として使用し、その結果、その標識は、ハイブリダイゼーションによってマイクロアレイに結合するとき、ＰＣＲ産物を検出するために使用することができる。第１および第２のＰＣＲのためのプライマー配列が表６に示される。この２段階反応の役割は、分析される病原体ＤＮＡを精製する必要性を回避することである。プライマー「Ｐ１」を有する第１のＰＣＲ反応を、生の出発物質に対応するために最適化するが、第２のＰＣＲプライマー対「Ｐ２」は、最大のＤＮＡ収率と第１の反応の産物からの色素標識化とを得るために最適化する。まとめると、２つの反応の合計は、対象の病原体ＤＮＡの精製あるいは特徴付けを不必要にする。
【０１１３】
図４のＡは、ハイブリダイゼーションによって後に調べられる可能性がある領域を単離および増幅するために、実施形態において増幅される１６ｓ  ｒＤＮＡ領域を低解像度で明らかにする。この１６ｓ  ｒＤＮＡ領域のＤＮＡ配列は、様々な細菌種間で大きく異なることが知られている。結果的に、この領域を２段階ＰＣＲによって増幅して、その配列多様性を後続のマイクロアレイハイブリダイゼーション工程によって調べることができる。
【０１１４】
【表６−１】
2021516995.tif 000008
【０１１５】
【表６−２】
2021516995.tif 000009
【０１１６】
図４のＢは、大腸菌の最も重要な病原性菌株中に存在し、かつＳｈｉｇａｔｏｘｉｎ  １をコード化するｓｔｘ１座位を示す。同じ２段階ＰＣＲ手法を使用して、２つのＰＣＲプライマー対のセットを設計し、それを、マイクロアレイベースのＤＮＡハイブリダイゼーションによる分析のためのｓｔｘ１座位を提示するように、未処理の細菌のサンプルを増幅および標識化するべく、タンデムで使用することができる。
【０１１７】
図５のＡはさらに、大腸菌の最も重要な病原性菌株中に存在し、かつＳｈｉｇａｔｏｘｉｎ  ２をコード化するｓｔｘ２座位を示す。同じ２段階ＰＣＲ手法を使用して、２つのＰＣＲプライマー対のセットを設計し、それを、マイクロアレイベースのＤＮＡハイブリダイゼーションによる分析のためのｓｔｘ２座位を提示するように、未処理の細菌のサンプルを増幅および標識化するためにタンデムで使用することができる。
【０１１８】
図５のＢは、サルモネラ菌のすべての菌株中に存在し、かつＩｎｖＡｓｉｏｎ  Ａ遺伝子産物をコード化する、ｉｎｖＡ座位を示す。同じ２段階ＰＣＲ手法を使用して、２つのＰＣＲプライマー対のセットを設計し、それを、マイクロアレイベースのＤＮＡハイブリダイゼーションによる分析のためのｉｎｖＡ座位を提示するように、未処理の細菌のサンプルを増幅および標識化するためにタンデムで使用することができる。
【０１１９】
図６は、大腸菌のすべての菌株中に存在し、かつリボソーム伸長因子Ｔｕをコード化するｔｕｆ座位を示す。同じ２段階ＰＣＲ手法を使用して、２つのＰＣＲプライマー対のセットを設計し、それは、マイクロアレイベースのＤＮＡハイブリダイゼーションによる分析のためのｔｕｆ座位を提示するように、未処理の細菌のサンプルを増幅および標識化するためにタンデムで使用することができる。
【０１２０】
図７は、酵母およびカビのすべての株を含むすべての真核生物中に存在し、かつリボソーム遺伝子５．８Ｓと２８Ｓとの間の遺伝子間領域をコード化するＩＴＳ２座位を示す。ＩＴＳ２は配列が大きく変動し、その配列多様性は、酵母およびカビ中の菌株の違いを解決するために使用することができる。同じ２段階ＰＣＲ手法を使用して、２つのＰＣＲプライマー対のセットを設計し、それを、マイクロアレイベースのＤＮＡハイブリダイゼーションによる分析のためのＩＴＳ２座位を提示するように、未処理の酵母およびカビのサンプルを増幅および標識化するためにタンデムで使用することができる。
【０１２１】
図８は、すべての植物および動物を含むすべての真核生物中に存在し、かつリボソーム遺伝子１８Ｓと５．８Ｓとの間の遺伝子間領域をコード化する、ＩＴＳ１座位を示す。ＩＴＳ１は、高等植物間で配列が大きく変動し、その配列多様性は、植物種を同定するために使用することができる。同じ２段階ＰＣＲ手法を使用して、２つのＰＣＲプライマー対のセットを設計し、それを、マイクロアレイベースのＤＮＡハイブリダイゼーションによる分析のためのＩＴＳ１座位を提示するように、未処理のカンナビスサンプルを増幅および標識化するためにタンデムで使用することができる。ＩＴＳ１のカンナビス配列変異の同定および定量化を、同じカンナビスサンプルから回収された病原体の分析において、内部正規化標準として使用する。
【０１２２】
表７は、図４に記載されるような細菌の１６ｓ座位のＤＮＡマイクロアレイベース分析のための実施形態において、マイクロアレイプローブとして使用される代表的なオリゴヌクレオチド配列を示す。それらのプローブの配列は、細菌間の種に違いに応じて生じる同族の配列多様性に対応するために変化している。すべての場合において、プローブ配列は、マイクロアレイ製造時に、マイクロアレイ表面へのプローブ結合の効率を向上させるために、各末端でＴ’のストリングで終結する。表８は、マイクロアレイで使用される較正および陰性対照の配列を示す。
【０１２３】
表９は、図７に記載されるＩＴＳ２座位に基づく、真核生物の病原体（真菌、酵母、およびカビ）のＤＮＡマイクロアレイベースの分析のための実施形態において、マイクロアレイのプローブとして使用される代表的なオリゴヌクレオチド配列を示す。表８に示される配列を対照として使用する。それらのプローブの配列は、真菌、酵母、およびカビ間の種の違いに応じて生じる同族の配列多様性に適応するために変化している。すべての場合において、プローブ配列は、マイクロアレイ製造時に、マイクロアレイ表面へのプローブ結合の効率を向上させるために、各末端でＴ’のストリングで終結する。
【０１２４】
【表７−１】
2021516995.tif 000010
【０１２５】
【表７−２】
2021516995.tif 000011
【０１２６】
【表７−３】
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【０１２７】
【表８】
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【０１２８】
【表９−１】
2021516995.tif 000014
【０１２９】
【表９−２】
2021516995.tif 000015
【０１３０】
【表９−３】
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【０１３１】
表１０は、ＩＴＳ１座位（カンビナス属種）でのカンナビスのＤＮＡマイクロアレイベース分析のための実施形態において、マイクロアレイプローブとして使用される代表的なオリゴヌクレオチド配列を示す。
【０１３２】
【表１０】
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【０１３３】
表１１は、細菌性病原体（ｓｔｘ１、ｓｔｘ２、ｉｎｖＡ、ｔｕｆ）のＤＮＡマイクロアレイベースの分析およびＩＴＳ１座位（カンビナス属種）での存在宿主カンナビスのＤＮＡ分析のための実施形態において、マイクロアレイプローブとして使用される代表的なオリゴヌクレオチド配列を示す。ＩＴＳ１配列を変更した同じ手法が、そのようなエキス剤中の他の植物宿主の存在を分析するために使用可能であることに留意されたい。
【０１３４】
【表１１】
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【０１３５】
図９は、カンナビスあるいは関連する植物サンプルの細菌性病原体または酵母およびカビ補体を分析するために、実施形態がどのように使用されるかを説明するためのフロー図を示す。病原体サンプルを、表面結合病原体のテーププルによって、もしくは葉または芽あるいは茎の簡単な洗浄によってカンナビス植物材料から収集することができ、その後、単一のマルチプレックス「座位増強（Ｌｏｃｉ  Ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔ）」マルチプレックスＰＣＲ反応を行い、その後、単一のマルチプレックス「標識ＰＣＲ」を行う。真菌、酵母およびカビを分析するために使用した２段階ＰＣＲ反応の対とは異なる２段階ＰＣＲ反応の対を、細菌を分析するために使用した。すべての場合において、標的の細菌あるいは真菌、酵母およびビのＤＮＡを、２段階ＰＣＲの前に、ＤＮＡの抽出あるいは特性付けなしにＰＣＲ増幅した。座位増強および標識ＰＣＲの工程に続いて、結果として生じるＰＣＲ産物を、結合緩衝液へと簡単に希釈して、その後、マイクロアレイ試験に適用する。分析（ハイブリダイゼーションおよび洗浄）に必要な後続のマイクロアレイ工程は、研究所の周囲温度で行なわれる。
【０１３６】
図１０は、実施形態において使用されるマイクロアレイの代表的な実施の画像を提供する。この実施では、カンナビスＤＮＡ対照（表７および１０）に加えて、細菌の分析に必要なすべて核酸プローブは、表１０に示されるようなさらなる細菌およびカンナビスプローブとともに、単一の１４４エレメント（１２ｘ１２）マイクロアレイへと製作される。この実施では、カンナビスＤＮＡ対照に加えて、真菌、酵母、およびカビの分析に必要なすべての核酸プローブは、表９に示されるさらなる真菌プローブとともに、単一の１４４エレメント（１２ｘ１２）マイクロアレイへと製作される。アレイを、６つの同一のマイクロアレイの２カラムとして、ＰＴＦＥコーティングスライドガラス上で製造する。１２の同一のマイクロアレイの各々は、使用された核酸プローブに応じて、完全なマイクロアレイベースの分析細菌性分析、あるいは真菌、酵母、およびカビの完全なマイクロアレイベースの分析を行うことができる。圧電ベースまたは接触ベースとするマイクロ流体プリンティング（ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）、あるいは同等物によって、核酸プローブをガラス支持体に結合した。個々のマイクロアレイを、この場合では、疎水性ＰＴＦＥコーティングによって、他の１１のマイクロアレイから流体的に単離するが、物理的な単離の他の方法も使用することができる。
【０１３７】
図１１Ａ−１１Ｂは、実施形態の代表的なＤＮＡマイクロアレイ分析を示す。この場合、精製された細菌ＤＮＡあるいは精製された真菌ＤＮＡを使用して、２段階ＰＣＲ反応およびマイクロアレイベースのハイブリダイゼーション分析の後に親和性および特異性の試験をした。見られ得るように、細菌ＤＮＡ（上部）あるいは真菌ＤＮＡ（下部）の各々を検出するように設計された核酸プローブは、ハイブリダイゼーションによって標的ＤＮＡに正確に結合し、したがって、細菌または酵母を正確に検出した。図１２は、実施形態の代表的なＤＮＡマイクロアレイ分析を示す。この場合、５つの異なる未精製の生のカンナビス葉洗浄サンプルを使用して、２段階ＰＣＲ反応およびマイクロアレイベースのハイブリダイゼーション分析の後に親和性および特異性の試験をした。各サンプルを半分に分割し、その後、細菌の分析、あるいは真菌、酵母、およびカビの分析のためにそれらをそれぞれ処理することにより、細菌および真菌の両方の分析を全ての５つの葉洗浄サンプルに対して行った。図１２のデータを、両方のアッセイの結果を組み合わせることにより得た。図１２は、図９に記載されるような、２段階ＰＣＲとマイクロアレイハイブリダイゼーション分析の組み合わせが、通例のカンナビス葉洗浄液の病原体補体を分析するために使用することができることを示す。任意の植物材料のそのような洗浄を同様に行なうことができることが期待されるが、示されていない。
【０１３８】
図１３は、実施形態の代表的なＤＮＡマイクロアレイ分析を示す。この場合、１つの未精製の（生の）カンナビス葉洗浄サンプルを、生きているカンジダ属の、商業的に得られた同種の酵母ビトロイド（ｖｉｔｒｏｉｄ）培養物から得られたデータと比較するために使用して、２段階ＰＣＲ反応およびマイクロアレイベースのハイブリダイゼーション分析の後に親和性と特異性について試験した。カンナビス葉洗浄液および培養された真菌の両方の分析を、真菌に特異的なプローブを介した分析のために、それらをそれぞれ処理することにより行った（表９および１１を参照）。
【０１３９】
図１３のデータを、葉洗浄液および酵母ビトロイド培養物サンプルの両方の分析の結果を組み合わせることにより得た。図１３のデータは、図９に記載されるような、純粋な（生きている）真菌サンプルで行うことができるのと同じくらい適切な、通例のカンナビス葉洗浄液の真菌補体を調べるために、２段階ＰＣＲとマイクロアレイハイブリダイゼーション分析の組み合わせを使用することができることを示す。任意の植物材料のそのような洗浄を介した真菌の分析を同様に行なうことができることが期待される。
【０１４０】
図１４は、大腸菌を含む腸内細菌科の細菌の低レベルの検出のための実施形態の変形で使用される、ＰＣＲプライマーの位置のグラフ表示を示す。これらのＰＣＲプライマーは、マイクロアレイハイブリダイゼーションを介した分析のための、標的化された生命体からのＤＮＡを選択的に増幅および色素標識するために使用される。
【０１４１】
図１５Ａ−１５Ｃは、一連の微生物入力に対するアッセイ感度を実証する代表的なＤＮＡマイクロアレイ分析を示す。この場合、大腸菌Ｏ１５７：Ｈ７、大腸菌Ｏ１１１（図１５Ａ−１５Ｂ）、およびサルモネラ菌（図１５Ｃ）の列挙された細菌コロニーからなる認証標準物質を、ホップ植物代替マトリックス（ｈｏｐｓ  ｐｌａｎｔ  ｓｕｒｒｏｇａｔｅ  ｍａｔｒｉｘ）上に希釈系列としてスパイクし、その後、図１４に記載されるアッセイバージョンを使用して処理した。図７の関連するプローブからのハイブリダイゼーションの結果が示される。Ｘ軸上の大きい数は、各ホップ植物サンプル上にスパイクされた細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）の合計数を表し、Ｘ軸上の小さい数は、アッセイに実際に入力された、スパイクされた材料のＣＦＵの数を表す。元のスパイクされたホップサンプルの体積の約１／５０のみを実際に分析した。図１５Ａ−１５ＣのＸ軸上の小さい数は、その合計（より低い）値のちょうど１／５０である。見られるように、図１５Ａ−１５Ｃは、実施形態のマイクロアレイ試験が、１マイクロアレイアッセイ当たり１未満のＣＦＵを検出することができることを示す。図１５Ａ−１５Ｃで示される細菌ゲノム内の核酸標的は、１６ｓ  ｒＤＮＡを含む。これらの細菌生命体の各々における１６ｓ  ｒＤＮＡ遺伝子の複数のコピーがあり、それは、＜１ＣＦＵレベルの検出を可能にする。コロニー形成単位が多くの場合では、単一の細菌に近くなり、図１５Ａ−１５Ｃのデータは、本マイクロアレイアッセイが、１アッセイ当たりの単一（あるいは少数の）細菌を検出する能力に近い感度を有することを実証する。すべての細菌および真核生物の微生物が、１つの細胞当たりリボソームｒＤＮＡ遺伝子の複数のコピーを提示することが知られるという点で、すべての細菌および真核生物の微生物に同様の感度が期待される。
【０１４２】
表１２Ａおよび１２Ｂは、粉末乾燥食品サンプル（比較のために濃縮なしのものと、１８時間濃縮されたもの）から得られた代表的なマイクロアレイハイブリダイゼーションのデータの収集を示す。上記データは、細菌の微生物が、濃縮の必要なく、本発明のマイクロアレイ上で成功裡に検出されたことを示す。
【０１４３】
図１６および表１３−１５は、果物の分析のための実施形態、野菜の分析のための実施形態、および他の植物の分析のための実施形態を記載している。例として、上記教示は、カンナビスおよびホップにおける未処理の葉ならびに芽のサンプルを水性水溶液中洗浄して、微生物病原体を含有する水洗浄液を生成し、その後、それを、ＲＳＧとマイクロアレイの組み合わせによって分析することができる。
【０１４４】
果物および野菜からの新鮮な葉、花、茎、あるいは根の材料も、同じ方法で、水溶液中で洗浄する場合（新鮮なとき、あるいは乾燥、粉砕、または他のタイプの処理の後に）、ＲＳＧとマイクロアレイ分析の組み合わせにより、それらの他の植物材料中のそれらの微生物のＤＮＡ補体を回収および分析することができる。
【０１４５】
果物および野菜には、サンプル収集の少なくとも２つの方法が可能である。１つの方法は、カンナビスについて上記されるのとまったく同じ通りに果物を簡単にすすぐことである。果物および野菜からのサンプル収集のもう１つの方法は「テーププル」であり、この方法では、１片の標準的な法医学のテープを果物の表面に適用し、その後、引き剥がす。引き剥がした後、テープを上記の標準的な洗浄緩衝液中に浸し、テープに付着した微生物を懸濁する。テープ洗浄工程の後に、上述される通りに、処理および分析の他のすべての態様（つまり、生サンプルのジェノタイピング、ＰＣＲ、その後、マイクロアレイ分析）は、上述されるのとまったく同じ通りである。
【０１４６】
【表１２Ａ】
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【０１４７】
【表１２Ｂ】
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【０１４８】
表１３−１５のデータは、果物の簡単な洗浄および果物のテーププルされたサンプリングが、同様の微生物のデータを生成することを実証する。ボトリティスがブルーベリーの良く知られた真菌汚染物質であるため、ブルーベリーのサンプルは、予想通り、ボトリティスに対して陽性であることが示される。ペニシリウムがレモンの良く知られた真菌汚染物質であるため、レモンのサンプルは、予想通り、ペニシリウム属の対して陽性であることが示される。
【０１４９】
【表１３】
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【０１５０】
【表１４−１】
2021516995.tif 000022
【０１５１】
【表１４−２】
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【０１５２】
図１６および表１３−１５において具体化されたデータは、果物（この場合、ブルーベリーとレモン）の表面上の酵母微生物の回収および分析のための実施形態の使用を示すが、実施形態は、細菌および真菌の両方の汚染の分析のために、他の果物および野菜まで拡張することができる。
【０１５３】
【表１５−１】
2021516995.tif 000024
【０１５４】
【表１５−２】
2021516995.tif 000025
【０１５５】
表１６は、環境水サンプル／サンプルの分析のための実施形態を示す。例として、上記教示は、カンナビスおよびホップにおける未処理の葉ならびに芽のサンプルを水性水溶液中洗浄して、微生物病原体を含有する水洗浄液を生成し、その後、それを、生サンプルのジェノタイピング（ＲＳＧ）とマイクロアレイの組み合わせによって分析することができる。微生物を含有する水サンプルを、環境源（井戸水、海水、土壌流出  、あるいは公共給水の水）から得て、その後、直接分析する場合、あるいは、通常の水の濾過後にフィルターの表面上に微生物補体を濃縮する場合、ＲＳＧとマイクロアレイ分析の組み合わせは、それらの微生物のＤＮＡ補体を回収および分析することができる。
【０１５６】
表１６で具体化されたデータを、「陰性対照」と呼ばれるｍｉｌｌｉＱ実験用の水（逆浸透によって得られた）の２つのサンプルと共に、５つの井戸水サンプル（２Ｈ、９Ｄ、２１、２３、２５と呼ばれる）から得た。すべてのサンプルを、無菌の０．４ｕｍフィルター上で濾過を行った。その後、濾過後に、補足された可能性のある任意の微生物汚染を有するフィルターを、カンナビスと果物の洗浄について上述されるのとまったく同じ通りに、標準的な洗浄溶液で洗浄した。その洗浄後に、洗浄溶液中の懸濁された微生物に対して、遠心分離（微生物ペレットを生成するために）、その後、未処理のペレット溶解物の溶解およびＰＣＲ（カンナビスについて上述されるのとまったく同じ通りに）、続いて、カンナビスについて上述される通りにＰＣＲおよびマイクロアレイ分析という、まったく同じ組み合わせを行った。
【０１５７】
【表１６−１】
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【０１５８】
【表１６−２】
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【０１５９】
【表１６−３】
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【０１６０】
【表１６−４】
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【０１６１】
表１６において見られるデータは、カンナビスならびに果物の洗浄に使用される、生サンプルのジェノタイピング、その後の、ＰＣＲおよびマイクロアレイ分析の同じ組み合わせによって、環境水サンプルの濾液上に収集された微生物を分析することができることを実証する。表１６のイタリック体の要素は、５つの未処理の井戸水サンプルのすべてが、好気性菌および胆汁酸抵抗性グラム陰性菌を含有することを示す。両方のクラスの細菌の存在が、未処理（生の）井戸水で期待される。したがって、表１６のデータは、本発明のこの実施形態が、環境に由来する水サンプルの分析に使用することができることを示す。
【０１６２】
例として、上記教示は、カンナビスおよびホップにおける未処理の葉ならびに芽のサンプルを水性水溶液中洗浄して、微生物病原体を含有する水洗浄液を生成し、その後、それを、ＲＳＧとマイクロアレイの組み合わせによって分析することができる。上記のデータは、環境に由来する井戸水サンプルが実施形態によって分析され得ることをさらに示す。さらに、微生物を含有する水サンプルを、産業処理源（果物、野菜、穀物、肉の処理からの排水など）から得て、その後、直接分析する場合、あるいは、通常の水の濾過後にフィルターの表面上に微生物補体を濃縮する場合、ＲＳＧとマイクロアレイ分析の組み合わせは、それらの微生物のＤＮＡ補体を回収および分析することができる。
【０１６３】
さらに、エアロゾルとして微生物を含むか、あるいは浮遊粉じんに吸着した空気サンプルを、通常のエアフィルター（農業または食品加工工場、あるいは工場の床、または公共の建物もしくは個人の家でのろ過に使用されるものなど）での空気ろ過によって得た場合、植物で実証されているように、そのようなエアフィルターを水溶液で洗浄して、微生物を含有しているフィルターの溶出液を生成することができる。その結果、生サンプルのジェノタイピング（ＲＳＧ）およびマイクロアレイ分析の組み合わせは、それらの微生物のＤＮＡ補体を回収して分析することができる。
【０１６４】
実施形態の前述の説明は、当業者が、現在最良の形態と考えられるものを作り、使用することを可能にし、当業者は、本明細書に記載の特定の実施形態、方法、および実施例の変形、組み合わせ、および同等物の存在を理解するであろう。したがって、本開示は、上述の実施形態、方法、および実施例によって限定されるべきではなく、本開示の範囲および精神内のすべての実施形態および方法によって限定されるべきである。
【０１６５】
実施例４
定量的ＤＮＡ分析のために、三次元格子マイクロアレイシステムを使用する方法
サンプル処理植物表面からの微生物の収集は以下の工程を含む：
１．１ｘリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中で植物サンプルを洗浄またはテーププルする
２．植物材料／テープを除去する
３．遠心機にかけて細胞をペレット化し、上清を廃棄する
４．Ｓａｍｐｌｅ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒであらかじめ混合したＰａｔｈｏｇｅｎＤｘ（登録商標）  Ｓａｍｐｌｅ  Ｐｒｅｐ  Ｂｕｆｆｅｒ中で再懸濁する
５．５５°Ｃで４５分間加熱する
６．ボルテックスしてペレットを消散させる
７．９５°Ｃで１５分間加熱する
８．ボルテックスし、短時間遠心機にかけて、１つ以上のタイプの微生物からＤＮＡを含むサンプルを得る。
【０１６６】
処理されたサンプルへの合成ＤＮＡの添加
既知量（既知のコピー数）の合成ＤＮＡを、上記のサンプル処理工程で得られたサンプルに加える。合成ＤＮＡは、増幅されている１６ｓ（細菌）またはＩＴＳ２（真核生物）ＤＮＡ配列と同様の長さと配列構造を有するが、合成ＤＮＡをサンプル中の細菌および真核生物のＤＮＡと区別するために、異なる中央領域配列を有する。合成ＤＮＡの５’および３’末端配列は、検索されている未知の細菌あるいは未知の真核生物のＤＮＡ中のコンセンサス配列と実質的に同一であるように設計され、サンプル中の未知のＤＮＡの増幅に使用された同じＰＣＲプライマーの対を使用した増幅を可能にする。そのようなコンセンサス配列の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３に示される（表１７）。これらの特徴により、サンプル中の合成ＤＮＡおよび未知の微生物プールＤＮＡの両方を偏りなく増幅することができる。合成ＤＮＡ配列の例は、ＳＥＱ  ＩＤ、Ｎｏ：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７に示される（表１７）。
【０１６７】
ＰＣＲによる増幅
座位特異的プライマー対を使用して、合成ＤＮＡ配列を含むサンプルを  増幅した（ＰＣＲ反応＃１）（表６および１８）。その後、ＰＣＲ反応＃１（１μＬ）の産物を、標識化プライマー（表６および１８）を使用して第２のＰＣＲ反応（ＰＣＲ反応＃２）にさらし、それを、２つの標的化領域をさらに増幅して標識化し、フルオロフォア標識アンプリコンを生成した。その後、ＰＣＲ反応＃２（５０μＬ）の産物を、ハイブリダイゼーション緩衝液（４ｘＳＳＣ＋５ｘデンハルト溶液）で１−１に希釈し、次に、ハイブリダイゼーションのためにマイクロアレイに直接適用した。
【０１６８】
ハイブリダイゼーション
マイクロアレイ製造の従来の方法は、マイクロアレイ表面の前処理を必要とせずにハイブリダイゼーションを介してＤＮＡを分析することを可能にするため、マイクロアレイの使用は単純であり、６つの手動あるいは自動のピッペッティング工程を含む。
１）増幅されたＤＮＡ＋結合緩衝液を、検索されている病原体遺伝子のオリゴヌクレオチドプローブ配列が固定化されているマイクロアレイ上でピペッティングし、合成ＤＮＡは内部参照標準として使用する（表７−１１および１９）。
２）３０分間インキュベートして、マイクロアレイにＤＮＡを結合させる（典型的に室温（ＲＴ）で）
３）ピッペッティングによりＤＮＡ＋結合緩衝液を除去する。
４）５０μＬの洗浄緩衝液をマイクロアレイ（０．４ｘＳＳＣ＋０．５ｘＤｅｎｈａｒｄｔ）上でピペッティングし、室温で５分間インキュベートする
５）ピペッティングにより洗浄緩衝液を除去する
６）工程４および５を繰り返す
７）５３２ｎｍおよび６３５ｎｍで画像分析を行い、プローブスポット位置（５３２ｎｍ）およびＰＣＲ産物ハイブリダイゼーション（６３５ｎｍ）を検出する。
【０１６９】
【表１７−１】
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【０１７０】
【表１７−２】
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【０１７１】
【表１８】
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【０１７２】
【表１９−１】
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【０１７３】
【表１９−２】
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【０１７４】
画像分析
以下の画像化条件で、ラスターベースの共焦点スキャナ：ＧｅｎｅＰｉｘ４０００Ｂマイクロアレイスキャナ上で、２つの波長（５３２ｎｍおよび６３５ｎｍ）で画像分析を行った：３３％のレーザーパワー、５３２ｎｍでの４００ＰＭＴ設定／３３％のレーザーパワー、６３５ｎｍでの７００ＰＭＴ設定。図３は、マイクロアレイの構造およびハイブリダイゼーション性能の例を示す。
【０１７５】
図３のＡは、６３５ｎｍで視覚化された、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の、上述される代表的なマイクロアレイの画像化を明らかにする。６３５ｎｍの画像は、マイクロアレイ製作中に各マイクロアレイスポットにおける位置マーカーとして導入された二官能性ポリマーリンカーＯｌｉｇｏｄＴの５’末端に結合した（赤）ＣＹ５蛍光からのシグナルに由来する（図１および表３を参照）。図３のＡのデータは、図１に記載されるように、二官能性リンカーの組み合わせた活性およびその後のＵＶ架橋を介して、Ｃｙ５標識ＯｌｉｇｏｄＴがマイクロアレイ表面に恒久的に結合されたことを確認する。
【０１７６】
図３のＢは、５３２ｎｍで視覚化された、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の、上述される代表的なマイクロアレイの画像化を明らかにする。５３２ｎｍの画像は、ＰＣＲ反応＃２中に得られた、ＰＣＲ増幅ＤＮＡの５’末端に結合された（緑）ＣＹ３蛍光からのシグナルに由来する。４８の別々のプローブの小さなサブセットのみがＣｙ３標識ＰＣＲ産物に結合することが図３Ｂから明らかであり、したがって、核酸プローブを結合してマイクロアレイ（図１）を形成するための本方法は、（同族の）溶液状態の標的への配列特異的結合が可能なマイクロアレイ産物を産出することを確認する。図３Ｂのデータは、データの基礎となる３倍の繰り返しを明らかにする（つまり、アレイは、最終的な４８×３＝１４４エレメントのマイクロアレイを形成するために、３つの別個のサブアレイとして３回プリントされた４８のプローブの同じセットである）。４８のプローブの同じセットが、３回繰り返されたサブドメインとして、３回プリントされるという観察は、本発明が再現可能なマイクロアレイ産物を生成することを示す。
【０１７７】
図３のＣは、重ね合わせた５３２ｎｍおよび６３５ｎｍの画像の両方で視覚化された、ハイブリダイゼーションおよび洗浄後の、上述される代表的なマイクロアレイの画像化を明らかにする。重ね合わせた画像は、ＣＹ３で標識されたＰＣＲ産物の配列特異的結合と比較した、Ｃｙ５で標識されたＯｌｉｇｏｄＴの位置マーカーの平行アタッチメントの有用性を表示する。
【０１７８】
実施例５
絶対的なＤＮＡコピー数の定量化
本発明で開示されるようなサンプル中の対象の微生物の絶対的なＤＮＡコピー数の定量化は、第１のＰＣＲ増幅工程前の合成ＤＮＡの既知のコピー数をサンプルに導入することにより達成される。合成ＤＮＡは、第１のＰＣＲ（図１７Ａ、１７Ｂ、および１８）で生成された１６ｓ（細菌）またはＩＴＳ２（真核生物）ＤＮＡアンプリコンと同様の長さと配列構造を有するが、合成ＤＮＡをサンプル中の細菌および真核生物のＤＮＡと区別するために、異なる中央領域配列を有する。合成ＤＮＡの５’および３’末端配列は、検索されている未知の細菌あるいは未知の真核生物のＤＮＡ中のコンセンサス配列と実質的に同一であるように設計され、サンプル中の未知のＤＮＡの増幅に使用された同じＰＣＲプライマー対を使用した増幅を可能にする。これらの特徴は、検索されている未知の微生物の超可変領域を増幅するために使用される同じＰＣＲプライマー対によって合成ＤＮＡが増幅されることを可能にする。その結果、合成ＤＮＡは、第１および第２のＰＣＲ増幅反応中のプライマー／鋳型のハイブリダイゼーションに関しては、サンプル中の微生物のプールＤＮＡと区別がつかない。このことは、合成（内部参照標準）ＤＮＡと微生物（未知）ＤＮＡの偏りのない増幅を確かなものにし、それにより、検索されているＤＮＡおよび合成ＤＮＡからのアンプリコンのシグナル強度は、各ＤＮＡの元のコピー数にそれぞれ比例する（以下に議論される）。そのようなコンセンサス配列の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５２、およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５３（表１７）に示される。合成ＤＮＡ配列の例は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５４〜ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５７に示される（表１７）。
【０１７９】
本マイクロアレイベースの分析において展開されるようなＰＣＲは、一般に、一種のエンドポイントＰＣＲとして行なわれる。最も単純な近似ではあるが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は一種の連鎖反応として説明されているのは、ＰＣＲ反応のプロセスの開始時にＤＮＡ標的鎖が非常に希薄である場合、ＰＣＲの各サイクルは、一般に、ＤＮＡ産物の幾何級数的増加、すなわち、新しいＰＣＲ熱サイクルそれぞれで増幅されたＤＮＡ産物のほぼ正確に２倍の増加を生じさせる。そのような２倍の増加が無期限に生じる場合、増幅されたＤＮＡ産物の濃縮は理論上無限に指数関数的に増加するはずである。しかし、実際問題として、そのような無限のＤＮＡ産物の増加は生じず、ならびに、ＰＣＲ反応物混合物の１つ以上の成分、あるいは、ＰＣＲ産物混合物の１つ以上の成分がアンプリコン産生で飽和を引き起こす、よく知られた「Ｓ形の」シグモイドＰＣＲ反応曲線を観察する。反応混合物中のＰＣＲプライマーの消費により、そのような「水平な」Ｓ形のＰＣＲ曲線が生じると一般には考えられている。したがって、本発明では、プライマーの枯渇がＰＣＲ増幅の飽和に寄与することができないように、ＰＣＲ反応の両方（１つ目、座位ＰＣＲ、２つ目、標識ＰＣＲ、図１７Ａ−１７Ｂおよび１８を参照）におけるＰＣＲプライマーの濃縮を、大モル過剰で意図的に維持する。しかし、ＰＣＲ反応物の過剰でさえ、両方のＰＣＲから生成されたアンプリコンが「水平な」状態であり続け、複雑な「エンドポイント」ＰＣＲを生成することが観察され、ここで、アンプリコンの数は、反応物の濃縮の増加にもかかわらず増加しない。反応におけるこの飽和は、酵素学的な最終産物阻害により生じる。本発明では、マイクロアレイハイブリダイゼーションが、サンプル中の低い微生物の密度に非常に選択的であり、かつ感受性があり続けることを確実にするために、そのような阻害は、相当な量のＰＣＲ産物を生成することができる。
【０１８０】
したがって、本発明の鍵は、前述の合成ＤＮＡ内部参照標準の展開に基づく。その結果、ＰＣＲ反応が、最終産物阻害（あるいは、ＰＣＲレベリングの他のメカニズム）によって飽和するにもかかわらず、未知量のその微生物源に由来する任意のＤＮＡの相対存在量を内部参照標準と直接比較することができ、それにより、既知の合成ＤＮＡ（内部参照標準）と比較した未知のＤＮＡの存在量は、ＰＣＲ反応の程度に対して鈍感になる。ＰＣＲ反応が飽和（最終産物阻害に関連する）に近づくと、以下に議論されるように様々な増幅された種の量が相互作用し始めると理解し、この効果を本発明で利用した。
【０１８１】
ｉ）未知のＤＮＡコピー＝標準ＤＮＡコピー
合成ＤＮＡ（標準的な種）のコピーの数が、元のサンプル中の微生物ＤＮＡ（未知の種）のコピーの数と等しい場合、微生物ＤＮＡ対合成ＤＮＡの比率は、ＰＣＲ反応の始め（増幅は指数関数的である）からＰＣＲ反応の終わり（増幅は、最終産物阻害を介して飽和させ始める）まで１に等しくなる。
Ｃｎ／Ｃｏ＝Ｓｎ／Ｓｏ、
式中、
Ｃｎ＝マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用された２つのタンデムＰＣＲ反応の１つ目に加えられる、元のサンプル混合物中に存在する各タイプの微生物ＤＮＡコピーの数（ｎ）、
Ｃｏ＝マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用された２つのＰＣＲ反応の１つ目に加えられる、既知の合成ＤＮＡのコピー数（内部参照標準）、
Ｓｎ＝ＰＣＲ増幅、およびｎ番目の微生物種のマイクロアレイハイブリダイゼーション、その後、画像分析の後に得られた、相対蛍光単位（ＲＦＵ）シグナルデータ、
Ｓｏ＝ＰＣＲ増幅、および合成ＤＮＡ種のマイクロアレイハイブリダイゼーション、その後の画像分析の後に得られた、相対蛍光単位（ＲＦＵ）シグナルデータ
【０１８２】
ｉｉ）未知のＤＮＡコピー＞標準ＤＮＡコピー
微生物ＤＮＡ（未知の種）が既知の合成ＤＮＡ（標準の種）に対して大過剰であった場合、微生物ＤＮＡ対合成ＤＮＡの比率は＞１である。この状況では、ＰＣＲ反応の開始時に、アンプリコン（ＰＣＲ産物）の相対存在量は、元の入力鎖比率（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｉｎｐｕｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｒａｔｉｏ）（未知：標準）の真実の表現（ｔｒｕｔｈｆｕｌ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）になる。しかし、反応が飽和へと進むにつれ、１つ以上の反応物の消費、あるいは、ＰＣＲ反応産物−ピロリン酸および／またはアンプリコンによる酵素阻害のいずれかにより、より豊富な種（この場合、未知の種）が最初に最終産物飽和に近づく。その結果、比較的それほど豊富ではない標準種の増幅は阻害される。この状況では、増幅されたＤＮＡ産物種の存在量は、「未知の種＞標準種」の適切な定性的関係を保持するが、ＤＮＡ産物の比率は、元の入力サンプル中の未知：標準の比率と直線的に関連しない。
Ｃｎ／Ｃｏ≠Ｓｎ／Ｓｏ
入力と反応のそのような非線形の関係は、化成皮膜中あるいは電荷結合素子（ＣＣＤ）中の粒子密度対光子露光の関係などの、化学と物理分析においてよく知られており、ここで、写真の入力の相対的な明るさは、結果として生じる像において相対的順位で維持されるが、非線形の反応についての詳細な理解は、反応データ（増幅およびマイクロアレイハイブリダイゼーション後のＰＣＲ産物シグナルと類似する）から元の入力（元のサンプル中のＤＮＡコピー数と類似する）の相対的存在量を予測することを必要とする。
【０１８３】
ｉｉｉ）未知のＤＮＡコピー＜標準ＤＮＡコピー
微生物ＤＮＡ（未知の種）が既知の合成ＤＮＡ（標準の種）より少なかった場合、微生物ＤＮＡ対合成ＤＮＡの比率は＜１である。この状況では、ＰＣＲ反応の開始時に、アンプリコン（ＰＣＲ産物）の相対存在量は、元の入力鎖比率（ｏｒｉｇｉｎａｌ  ｉｎｐｕｔ  ｓｔｒａｎｄ  ｒａｔｉｏ）（未知：標準）の真実の表現（ｔｒｕｔｈｆｕｌ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）になる。しかし、反応が飽和へと進むにつれ、１つ以上の反応物の消費、あるいは、ＰＣＲ反応産物−ピロリン酸および／またはアンプリコンによる酵素阻害のいずれかにより、より豊富な種（この場合、標準の種）はが最初に最終産物飽和に近づく。その結果、比較的それほど豊富ではない未知種の増幅は阻害される。この状況では、増幅されたＤＮＡ産物種の存在量は、「未知の種＞標準種」の適切な定性的関係を保持するが、ＤＮＡ産物の比率は、元の入力サンプル中の未知：標準の比率と直線的に関連しない；
Ｃｎ／Ｃｏ≠Ｓｎ／Ｓｏ。
【０１８４】
入力と反応のそのような非線形の関係は、化成皮膜中あるいは電荷結合素子（ＣＣＤ）中の粒子密度対光子露光の関係などの、化学と物理分析においてよく知られており、ここで、写真の入力の相対的な明るさは、結果として生じる像において相対的順位で維持されるが、非線形の反応についての詳細な理解は、反応データ（増幅およびマイクロアレイハイブリダイゼーション後のＰＣＲ産物シグナルと類似する）から元の入力（元のサンプル中のＤＮＡコピー数と類似する）の相対的存在量を予測することを必要とする。
【０１８５】
上述される非線形の関係は、化成皮膜中あるいは電荷結合素子（ＣＣＤ）中の粒子密度対光子露光の関係などの、化学と物理分析において観察されるものと類似しており、ここで、写真の入力の相対的な明るさは、結果として生じる像において相対的順位で維持されるが、非線形の反応についての詳細な理解は、反応データ（増幅およびマイクロアレイハイブリダイゼーション後のＰＣＲ産物シグナルと類似する）から元の入力（元のサンプル中のＤＮＡコピー数と類似する）の相対的存在量を予測することを必要とする。本発明では、それは判定される、未知の微生物ＤＮＡと標準ＤＮＡとの間の観察された競合は、図１９Ａに示される種類の、有用で、通常は予期されない「Ｘ形の」関係を表示する。
【０１８６】
ＰＣＲマイクロアレイによる微生物ＤＮＡ（ｒＤＮＡまたはＩＴＳ２）コピー数の分析
図１９Ａおよび１９Ｂにおいて示される種類の「クロスオーバー」滴定データは、本出願に記載されるＰＣＲマイクロアレイ分析に固有であると判定された。合成ＤＮＡコピー数が一定に保持され、標的微生物ＤＮＡコピー数が増加するにつれ、微生物ＰＣＲ反応の産物、したがって、マイクロアレイ表面上の同族のプローブへのそれらの産物の結合によるシグナルは、微生物ＤＮＡコピー数の増加に伴い増加するが、（固定された）一致した内部参照標準から得られたシグナルは一斉に減少する（図１９Ａ−１９Ｂ）。２つの曲線は、コピー数等値で、あるいはそのコピー数等値の近くで交差し（矢印、図１９Ａ−１９Ｂ）、微生物ＤＮＡコピーの数は、内部参照標準ＤＮＡコピーの数と等しくなる。
【０１８７】
本発明と一致するＰＣＲ条件（つまり、未知の微生物ＤＮＡと加えられたＤＮＡ標準の競合によりＰＣＲシグナル飽和の条件）の範囲にわたり、ＤＮＡの入力と出力の関係は、                Ｃｎ／Ｃｏ＝Ｐ（Ｓｎ／Ｓｏ）ｘ        方程式＃１
として近似され得、式中、
Ｃｎ＝マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用される、２つのタンデムＰＣＲ反応の１つ目に加えられた元のサンプル混合物中に存在する各タイプの微生物ＤＮＡコピー数（ｎ）、
Ｃｏ＝マイクロアレイ分析のためのアンプリコンを調製するために使用される、２つのＰＣＲ反応の１つ目に加えられた既知の合成ＤＮＡコピー数（内部参照標準）
Ｓｎ＝ＰＣＲ増幅、およびｎ番目の微生物種のマイクロアレイのハイブリダイゼーション、その後の画像分析後に得られる、相対蛍光単位（ＲＦＵ）シグナルデータ；
Ｓｏ＝ＰＣＲ増幅、および合成ＤＮＡ種のマイクロアレイハイブリダイゼーション、その後の画像分析の後に得られた、相対蛍光単位（ＲＦＵ）シグナルデータ
Ｘ＝元のサンプル（Ｃｎ／Ｃｏ）中に存在する微生物ＤＮＡコピーＶＳ合成ＤＮＡ標準コピーの基礎となる比率に対する、実験用マイクロアレイデータ比率（Ｓｎ／Ｓｏ）間の関数関係を定義する複素指数因子
Ｐ＝実験用のマイクロアレイデータ比率（Ｓｎ／Ｓｏ）を、マイクロアレイに結合する増幅されたＰＣＲ産物の濃縮と関連づける定数。
【０１８８】
一般に、本明細書に提示された例（図１９Ａ−１９Ｂ）の場合、Ｐ＝１である。一般に、Ｘは、線形関数あるいは指数関数的または関連する関数形式、もしくは、それ自体がマイクロアレイ分析および画像化のＰＣＲパラメータおよび条件の関数である定数であり得る。本発明において示される代表的なデータに基づいて、Ｘは、２に近い値を有する定数として近似される。
【０１８９】
【表２０】
2021516995.tif 000035
【０１９０】
一般的に、関数（Ｘ）は、元のＤＮＡコピー数比率（Ｃｎ／Ｃｏ）を、マイクロアレイハイブリダイゼーションＲＦＵシグナルデータから生成された、実験用のマイクロアレイデータ比率（Ｓｎ／Ｓｏ）と関連づける。関数（Ｘ）は、ＰＣＲ反応およびマイクロアレイハイブリダイゼーションの詳細に依存して、様々な関数形式を有し得る。しかし、（１）微生物ＤＮＡのＰＣＲ反応すべてが内部参照標準と同じＰＣＲプライマー対を使用し；および（２）マイクロアレイ表面に適用されたハイブリダイゼーションプローブすべてが、ＰＣＲ反応によって生成されたそれらの同族のＤＮＡ配列に親和性があり；ならびに（３）ＰＣＲ産物すべてが、光学的プローブ用の同じ蛍光色素で標識化される場合；Ｘは、図１９Ａに提示されるデータにおいて２に近い値を想定する定数に近似することが決定される。これらの条件下では、方程式＃１は以下のように単純化される場合がある；
Ｃｎ＝Ｃｏ（Ｓｎ／Ｓｏ）２  方程式＃２  
式中、
Ｃｎ＝元のサンプル中に存在する微生物ＤＮＡコピーの数であり、
Ｃｏ＝合成ＤＮＡの標準コピーの既知数を元のサンプルに加えることにより、調節される。
Ｘ＝２であり（図１９Ａに見られるような実験データから評価される）
Ｐ＝１であり（図１９Ａに見られるような実験によって決定される）。
【０１９１】
図１９Ａについては、合成ＤＮＡ参照標準コピー数（Ｃｏ）は、３，０００で意図的に保持されたが、遭遇し得る未知の微生物コピーの範囲に応じて、例えば、１００、５００、３，０００、あるいは５，０００に設定される場合がある。
【０１９２】
食物またはカンナビスあるいは他の植物中の微生物試験、あるいは水試験のための本発明の特定の実施では、州または連邦の規制は、微生物汚染について特定の最小許容値を要求するかもしれない。１微生物ゲノムあたりのｒＤＮＡあるいはＩＴＳ−２  ＤＮＡコピーの数のその調節された値および知識に基づいて、ＰＣＲおよびマイクロアレイハイブリダイゼーションの工程前に元のサンプルに加えられた調整可能な標準コピー数値Ｃｏは、規制基準をＰＣＲマイクロアレイアッセイに直接「ダイヤル（ｄｉａｌ）」する手段として値を持つものとみなすことができる。
【図１】
2021516995.tif 000036
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021516995.tif 000042
【図８】
2021516995.tif 000043
【図９】
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【図１０】
2021516995.tif 000045
【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
2021516995.tif 000047
【図１２】
2021516995.tif 000048
【図１３】
2021516995.tif 000049
【図１４】
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【図１５Ａ】
2021516995.tif 000051
【図１５Ｂ】
2021516995.tif 000052
【図１５Ｃ】
2021516995.tif 000053
【図１６】
2021516995.tif 000054
【図１７】
2021516995.tif 000055
【図１８】
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【図１９】
2021516995.tif 000057
【配列表】
2021516995000001.app
【国際調査報告】
2021516995.tif 000058
2021516995.tif 000059
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