(57)【要約】本発明は、操作されたトランスグルタミナーゼ酵素、前記酵素をコードするポリヌクレオチド、前記酵素を含む組成物、これらの酵素を産生する方法、および操作されたトランスグルタミナーゼ酵素を使用する方法を提供する。本発明は、例えば、配列番号２、６、３４および／または２５６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する、操作されたトランスグルタミナーゼを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、６、３４および／または２５６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する、操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項２】
配列番号６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、位置７９、１０１、１０１／２０１／２１２／２８７、１０１／２０１／２８５、１０１／２８７および３２７から選択される１つまたはそれを超える位置における少なくとも１つの置換または置換セットとを有する操作されたトランスグルタミナーゼであって、前記位置が配列番号６に関してナンバリングされている、操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項３】
配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、位置４８、４８／６７／７０、４８／６７／７０／１８１／２０３／２５６、４８／６７／７０／１８１／２５６／３４５、４８／６７／７０／１８１／２９６／３４５／３７３、４８／６７／７０／２０３／２５６／２９６／３４５、４８／６７／７０／２０３／２５６／３４５／３５４／３７３、４８／６７／７０／２０３／３４５、４８／６７／７０／２５６、４８／６７／７０／２５６／２９６／３４５／３７３、４８／６７／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／２０３／２５６／３４５、４８／７０／１７０／２０３、４８／７０／２０３／２５４／２９６／３４３、４８／７０／２０３／２５６／３４５／３７３、４８／７０／２０３／２５６／３４５、４８／７０／２０３／３７３、４８／１７０／２０３、４８／１７０／２０３／２５４／２９６／３４６、４８／１７０／２０３／２５４／２９６／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／２５４／３４６、４８／１７０／２０３／２９６／３４３／３４６、４８／１７０／２０３／２９６／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／３４３／３４６、４８／１７０／２０３／３４６、４８／１７０／２０３／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／３７３、４８／１７０／２５４、４８／１７０／２９６、４８／１７０／２９６／３４３／３４６、４８／１７０／３４３／３４６、４８／１８１、４８／１８１／２０３／２５６／３４５、４８／１８１／２０３／３４５、４８／１８１／２５６／２９６／３４５、４８／１８１／２９６、４８／１８１／２９６／３４５、４８／２０３、４８／２０３／２５４／２９６、４８／２０３／２５４／２９６／３４３／３７３、４８／２０３／２５４／２９６／３４６／３７３、４８／２０３／２５４／３４６、４８／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／２０３／２５６、４８／２０３／２５６／２９６／３４５、４８／２０３／２９６／３４３／３４６／３７３、４８／２０３／２９６／３４３／３７３、４８／２０３／２９６／３４６、４８／２０３／２９６／３４６／３７３、４８／２０３／３４３／３４６、４８／２０３／３４３／３４６／３７３、４８／２０３／３４５、４８／２０３／３４６、４８／２０３／３４６／３７３、４８／２５４／２９６、４８／２５４／３４６、４８／２５６、４８／２５６／２９６、４８／２５６／２９６／３４５、４８／２９６／３４５、４８／２９６／３７３、４８／３４３／３４６、４８／３４５／３７３、６７／２５６、６７／２９６／３４５、６８／７４／１９０／２１５／３４６、６８／１３６／２１５／２５５／２８２／２９７／３４６、６８／１３６／２１５／２９７／３４６、６８／１３６／２３４、６８／１５８／１７４／２３４／２８２／２９７／３４６、６８／１５８／２１５／２９７／３４６、６８／２１５／２９７／３４６、６８／２３４、６８／２８２／２９７／３４６、６８／２９７／３４６、７４／１３６／１７４／２８２／３４６、７４／１３６／１７４／２９７／３４６、７４／１３６／３４６、７４／１５８／２５５／２９７、７４／２５５／３４６、７４／３４６、１３６／１５８／１９０／２１５／２５５／２９７／３４６、１３６／１５８／２１５／２９７／３４６、１３６／１７４／２１５／２５５／２８２／２９７／３４６、１３６／１９０／２１５／２９７／３４６、１３６／２１５／２３４／２８２／２９７、１３６／２１５／２３４／２９７／３４６、１３６／２１５／２９７、１３６／２９７／３４６、１５８／２１５／２５５／３４６、１５８／２１５／３４６、１７０／２０３／２５４／２９６／３４３／３４６、１７０／２０３／２５４／３４３／３７３、１７０／２０３／３４３／３４６、１７４／１９０／２３４／２９７／３４６、１７４／２１５／２３４／２９７／３４６、１７４／２１５／２５５／２９７／３４６、１７４／２８２／２９７／３４６、１９０／２５５／２８２／３４６、１９０／２９７／３４６、２０３／２９６、２０３／３４３、２０３／３４３／３４６、２０３／３４６、２１５／２５５／２９７／３４６、２１５／２３４／２９７／３４６、２１５／２５５／２９７／３４６、２１５／２９７、２１５／２９７／３４６、２１５／３４６、２３４／２５５／３４６、２５５／２９７／３４６、２５５／３４６、２９７／３４６、３４３／３４６／３７３、および３４６から選択される１つまたはそれを超える位置における少なくとも１つの置換または置換セットとを有する操作されたトランスグルタミナーゼであって、前記位置が配列番号２に関してナンバリングされている、操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項４】
配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、３３／６７／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、３６／４８／２０３／２５４／３４６、４８／６７／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／７０／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／１８１／２０３／２５６／３７３、４８／６７／１８１／２５６／２９６、４８／６７／２０３／２５６／２９６／３７３／３７８、４８／６７／２０３／２５６／３７３、４８／６７／２０３／２９６／３７３、４８／６７／２５６／２９６／３７３、４８／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／７０／１８１／２０３／２５６／３７３、４８／７０／１８１／２０３／２９６／３７３、４８／７０／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／７０／２０３／２５６／３７３、４８／７０／２０３／２９６、４８／７０／２０３／２９６／３７３、４８／７０／２０３／３７３、４８／７０／２５６／２９６／３７３、４８／７０／２９６／３７３、４８／１７６／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／１８１／２０３／２５６／３７３、４８／１８１／２０３／２９６、４８／１８１／２０３／３７３、４８／１８１／２５６／２９６／３７３、４８／２０３／２５４、４８／２０３／２５４／３４３、４８／２０３／２５４／３４３／３４６／３７３、４８／２０３／２５４／３４３／３５５／３７３、４８／２０３／２５４／３４３／３７３、４８／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／２０３／２５４／３７３、４８／２０３／２５６／２９６、４８／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／２０３／２５６／３７３、４８／２０３／２９６／３７３、４８／２０３／２９６／３７３／３７４、４８／２０３／３４３／３７３、４８／２０３／３７３、４８／２５４、４８／２５４／３４３／３４６／３７３、４８／２５４／３４３／３７３、４８／２５４／３４６／３７３、４８／２５４／３７３、４８／２５６／２９６／３７３、４８／２５６／３７３、４８／３７３、６７／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、６７／７０／１８１／２５６／２９６／３７３、６７／７０／１８１／３７３、６７／１８１／２０３／２５６／２９６、６７／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、６７／１８１／２０３／２５６／３７３、６７／２０３／２５６／２９６／３７３、６７／２５６／２９６／３７３、７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、７０／１８１／２０３／２９６／３７３、７０／２０３、７０／２０３／２５６／２９６／３７３、７０／２０３／２５６／３７３、７０／２０３／２９６／３７３、７４／１３６／２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／２８２／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／２９７、７４／１３６／２１５／２３４／２９７／３４３／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／３４６、７４／１３６／２１５／２８２／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／２８２／３４６、７４／１３６／２１５／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／３４６、７４／１３６／２３４／２８２／２９７／３４６、７４／１３６／２３４／３４６、７４／１３６／２８２／２９７／３４６、７４／２１５、７４／２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、７４／２１５／２８２／２９７／３４６、７４／２１５／３４６、１３６／２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、１３６／２１５／２８２／２９７、１３６／２１５／２８２／２９７／３４６、１３６／２１５／２８２／３４６、１３６／２１５／２９７／３４６、１３６／２１５／３４６、１３６／２３４／２９７、１３６／２３４／２９７／３４６、１３６／２３４／３４６、１３６／２８２／２９７、１８１／２０３／２５６、１８１／２０３／２５６／２９６、１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、１８１／２０３／２５６／３７３、１８１／２０３／２９６／３７３、１８１／２０３／３７３、１８１／２５６／２９６／３７３、１８１／２９６、２０３／２２４／２５４／３７３、２０３／２５４、２０３／２５４／３４３／３４６／３７３、２０３／２５４／３４３／３７３、２０３／２５４／３４６、２０３／２５４／３４６／３７３、２０３／２５４／３７３、２０３／３４６／３７３、２０３／３７３、２０３／２０９／２５６／３７３、２０３／２５６、２０３／２５６／２９６、２０３／２５６／２９６／３２０／３７３、２０３／２５６／２９６／３７３、２０３／２５６／２９６／３７３／３８６、２０３／２５６／３７３、２０３／２９６／３７３、２０３／３７３、２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、２１５／２３４／２８２／３４６、２１５／２３４／３４６、２３４／２８２／３４６、２５４、２５４／３４６、２５４／３４６／３７３、２５４／３７３、２５６／２９６、２５６／２９６／３７３、２５６／３７３、２８２／２９７／３４６、３４３／３７３、および３７３から選択される１つまたはそれを超える位置における少なくとも１つの置換または置換セットとを有する操作されたトランスグルタミナーゼであって、前記位置が配列番号２に関してナンバリングされている、操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項５】
配列番号３４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、４８／４９、４９、５０、５０、３３１、２９１、２９２、３３０および３３１から選択される１つまたはそれを超える位置における少なくとも１つの置換または置換セットとを有する操作されたトランスグルタミナーゼであって、前記位置が配列番号３４に関してナンバリングされている、操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項６】
配列番号２５６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、２７／４８／６７／７０／７４／２３４／２５６／２８２／３４６／３７３、２７／４８／６７／７０／１３６／２０３／２１５／２５６／２８２／３４６／３７３、２７／４８／６７／７０／３４６／３７３、２７／４８／６７／７４／２０３／２５６／３４６／３７３、２７／６７／２３４／２９６／３７３、４５／２８７／３２８／３３３、４５／２９２／３２８、４８、４８／２８４／２９２／３３３、４８／２８７／２９２／２９７、４８／２８７／２９７／３２８／３３３、４８／２９２、４８／２９２／２９７、４８／４９／５０／２９２／３３１、４８／４９／５０／２９２、４８／４９／５０／３３１、４８／４９／３３０／３３１、４８／４９／５０／３４９、４８／４９／５０／２９１／２９２／３３１、４８／４９／５０／２９２／３３１、４８／６７／７０／２０３／２１５／２３４／２５６／３４６、４８／６７／７０／２３４／２５６／２８２／２９７／３４６、４８／６７／７０／３４６、４８／６７／７４／２０３／２３４／２５６／２８２／３４６／３７３、４８／６７／７４／２３４／２９７／３４６／３７３、４８／６７／７４／３４６、４８／６７／２０３／３４６／３７３、４８／６７／２３４／２５６／２９７／３４６／３７３、４８／６７／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／６７／２１５／２８２／２９７／３４６／３７３、４８／６７／３４６／３７３、４８／７０／７４／２９７／３４６／３７３、４８／７０／２０３／２１５／２５６／２８２／３４６／３７３、４８／７０／２１５／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／７４／２０３／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／７４／２３４／２５６／２９７／３４６／３７３、４８／１３６／２５６／３４６／３７３、４８／２０３／２３４／２５６／２９７／３４６／３７３、４８／２０３／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／２０３／２３４／３４６／３７３、４８／２０３／２９６／３７３、４８／２１５／２３４／３４６／３７３、４８／２１５／３４６／３７３、４８／２３４／２５６／２９６／３４６／３７３、４８／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／２５６／３７３、４９／５０／２９２／３３１、４９／５０／２９２／３３１／３４９、４９／５０／３３１、４９／５０／３３１／３４９、５０、６７／７０／７４／１３６／２０３／２１５／２５６／３４６／３７３、６７／７０／７４／２０３／２１５／２３４／３４６／３７３、６７／７０／７４／２１５／２３４／２９７／３４６／３７３、６７／７０／７４／２１５／２５６／３７３、６７／７０／１３６／２０３／２９７／３４６／３７３、６７／７０／２０３／２１５／２５６／３４６／３７３、６７／７０／２０３／３７３、６７／７０／２１５、６７／７４／１３６、６７／７４／２０３／２３４／２５６、６７／７４／２１５／２５６／２９７／３４６／３７３、６７／７４／２１５／３４６／３７３、６７／７４／２５６／３４６／３７３、６７／１３６／２０３／２１５／２５６／３４６／３７３、６７／１３６／２０３／２５６／３４６／３７３、６７／２０３／２３４／２５６／３４６／３７３、６７／２０３／２９７／３４６／３７３、６７／２１５／２３４／２９７／３４６／３７３、６７／２９７／３４６、７０／７４／２０３／２１５／３４６／３７３、１３６、１３６／３４６／３７３、２０３／２３４／３４６、２０３／２３４／３４６／３７３、２０３／３７３、２３４／２８２、２８７、２３４／３４６／３７３、２８７／２９２、２８７／２９２／２９５／２９７、２８７／２９２／２９７、２８７／２９５／２９７、２８７／３３０／３３３、２９２、２９２／２９７、２９２／３３０／３３１、２９２／３３０／３３１、２９２／３３１、２９２／３３１／３４９、２９２／３４９、２９５、２９５／２９７／３３３、２９７／３２８、２９７／３７３、３２８／３３３、３３０、３３０／３３１、３３１、３３１／３４９、３３３、３４６／３７３、および３７３から選択される１つまたはそれを超える位置における少なくとも１つの置換または置換セットとを有する操作されたトランスグルタミナーゼであって、前記位置が配列番号２５６に関してナンバリングされている、操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項７】
配列番号２、６、３４および／または２５６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１〜６のいずれかに記載の操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項８】
配列番号２、６、３４および／または２５６と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項９】
配列番号２、６、３４または２５６に記載されているポリペプチド配列を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項１０】
表８．１、９．１、９．２、１０．１および／または１１．１に提供されているバリアントをコードするポリペプチド配列を含む、請求項１〜９のいずれかに記載の操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項１１】
配列番号４〜７５６に記載されている偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれかに記載の操作されたトランスグルタミナーゼをコードする、操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１３】
配列番号３〜７５５に記載されている奇数番号の配列から選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一のポリヌクレオチド配列を含む、請求項１２に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項１４】
請求項１２および／または１３に記載の操作されたポリヌクレオチド配列を含む、ベクター。
【請求項１５】
少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項１４に記載のベクター。
【請求項１６】
請求項１４および／または１５に記載のベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１７】
請求項１〜１１のいずれかに記載の操作されたトランスグルタミナーゼを産生するための方法であって、請求項１６に記載の宿主細胞を、前記操作されたトランスグルタミナーゼが前記宿主細胞により産生される条件下で培養することを含む、方法。
【請求項１８】
前記宿主細胞により産生された前記操作されたトランスグルタミナーゼを回収するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
グルタミン供与体の存在下でインスリン中の遊離アミノ酸を改変することができる、請求項１〜１１のいずれかに記載の操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項２０】
リジン供与体の存在下でインスリン中のグルタミンを改変することができる、請求項１〜１１のいずれかに記載の操作されたトランスグルタミナーゼ。
【請求項２１】
インスリンを改変する方法であって、インスリンおよび少なくとも１つの請求項１〜１１のいずれかに記載の操作されたトランスグルタミナーゼを提供すること、前記インスリンが改変されるような条件下で前記インスリン、グルタミンおよび少なくとも１つの操作されたトランスグルタミナーゼを組み合わせることを含む、方法。
【請求項２２】
インスリンを改変する方法であって、インスリンおよび少なくとも１つの請求項１〜１１のいずれかに記載の操作されたトランスグルタミナーゼを提供すること、前記インスリンが改変されるような条件下で前記インスリン、リジンおよび少なくとも１つの操作されたトランスグルタミナーゼを組み合わせることを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１１月７日に出願された米国仮特許出願第６２／５８２，５９３号（これは、すべての目的のためにその全体が参照により組み込まれる）の優先権を主張する。
【０００２】
本発明は、操作されたトランスグルタミナーゼ酵素、前記酵素をコードするポリヌクレオチド、前記酵素を含む組成物、これらの酵素を産生する方法、および操作されたトランスグルタミナーゼ酵素を使用する方法を提供する。
配列表、表またはコンピュータープログラムの参照
【０００３】
配列表の公式コピーは、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介してＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして本明細書と併せて提出されており、ファイル名は「ＣＸ２−１６４ＵＳＰ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、作成日は２０１７年１１月７日であり、サイズは１，８９６キロバイトである。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
トランスグルタミナーゼ（ＴＧａｓｅ；ＥＰ２．３．２．１３）（Ｒ−グルアミニル−ペプチド−アミナーゼ−ガンマ−グルタミルトランスフェラーゼ）は、タンパク質の翻訳後修飾を触媒する酵素ファミリーを構成し、ポリアミンまたはリジンにおける第１級アミン基（すなわち、アミン供与体）と、いくつかのタンパク質およびポリペプチドのグルタミル残基のガンマ−カルボキシアミド基（すなわち、アミン受容体）との間の共有結合的アミド結合をもたらす。この酵素作用の結果としては、タンパク質のコンフォメーションの改変、ならびに／または高分子量コンジュゲートを産生するための同じおよび異なるタンパク質の結合から生じる広範なコンフォメーション変化が挙げられる。これらの酵素は、食品、化粧品、繊維および製薬業界を含む様々な用途で使用される。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、操作されたトランスグルタミナーゼ酵素、前記酵素をコードするポリヌクレオチド、前記酵素を含む組成物、および操作されたトランスグルタミナーゼ酵素を使用する方法を提供する。
【０００６】
本発明は、配列番号２、６、３４および／または２５６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性を有する操作されたトランスグルタミナーゼを提供する。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼは、配列番号６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、位置７９、１０１、１０１／２０１／２１２／２８７、１０１／２０１／２８５、１０１／２８７および３２７から選択される１つまたはそれを超える位置における少なくとも１つの置換または置換セットとを有し、前記位置は配列番号６に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼは、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、位置４８、４８／６７／７０、４８／６７／７０／１８１／２０３／２５６、４８／６７／７０／１８１／２５６／３４５、４８／６７／７０／１８１／２９６／３４５／３７３、４８／６７／７０／２０３／２５６／２９６／３４５、４８／６７／７０／２０３／２５６／３４５／３５４／３７３、４８／６７／７０／２０３／３４５、４８／６７／７０／２５６、４８／６７／７０／２５６／２９６／３４５／３７３、４８／６７／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／２０３／２５６／３４５、４８／７０／１７０／２０３、４８／７０／２０３／２５４／２９６／３４３、４８／７０／２０３／２５６／３４５／３７３、４８／７０／２０３／２５６／３４５、４８／７０／２０３／３７３、４８／１７０／２０３、４８／１７０／２０３／２５４／２９６／３４６、４８／１７０／２０３／２５４／２９６／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／２５４／３４６、４８／１７０／２０３／２９６／３４３／３４６、４８／１７０／２０３／２９６／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／３４３／３４６、４８／１７０／２０３／３４６、４８／１７０／２０３／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／３７３、４８／１７０／２５４、４８／１７０／２９６、４８／１７０／２９６／３４３／３４６、４８／１７０／３４３／３４６、４８／１８１、４８／１８１／２０３／２５６／３４５、４８／１８１／２０３／３４５、４８／１８１／２５６／２９６／３４５、４８／１８１／２９６、４８／１８１／２９６／３４５、４８／２０３、４８／２０３／２５４／２９６、４８／２０３／２５４／２９６／３４３／３７３、４８／２０３／２５４／２９６／３４６／３７３、４８／２０３／２５４／３４６、４８／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／２０３／２５６、４８／２０３／２５６／２９６／３４５、４８／２０３／２９６／３４３／３４６／３７３、４８／２０３／２９６／３４３／３７３、４８／２０３／２９６／３４６、４８／２０３／２９６／３４６／３７３、４８／２０３／３４３／３４６、４８／２０３／３４３／３４６／３７３、４８／２０３／３４５、４８／２０３／３４６、４８／２０３／３４６／３７３、４８／２５４／２９６、４８／２５４／３４６、４８／２５６、４８／２５６／２９６、４８／２５６／２９６／３４５、４８／２９６／３４５、４８／２９６／３７３、４８／３４３／３４６、４８／３４５／３７３、６７／２５６、６７／２９６／３４５、６８／７４／１９０／２１５／３４６、６８／１３６／２１５／２５５／２８２／２９７／３４６、６８／１３６／２１５／２９７／３４６、６８／１３６／２３４、６８／１５８／１７４／２３４／２８２／２９７／３４６、６８／１５８／２１５／２９７／３４６、６８／２１５／２９７／３４６、６８／２３４、６８／２８２／２９７／３４６、６８／２９７／３４６、７４／１３６／１７４／２８２／３４６、７４／１３６／１７４／２９７／３４６、７４／１３６／３４６、７４／１５８／２５５／２９７、７４／２５５／３４６、７４／３４６、１３６／１５８／１９０／２１５／２５５／２９７／３４６、１３６／１５８／２１５／２９７／３４６、１３６／１７４／２１５／２５５／２８２／２９７／３４６、１３６／１９０／２１５／２９７／３４６、１３６／２１５／２３４／２８２／２９７、１３６／２１５／２３４／２９７／３４６、１３６／２１５／２９７、１３６／２９７／３４６、１５８／２１５／２５５／３４６、１５８／２１５／３４６、１７０／２０３／２５４／２９６／３４３／３４６、１７０／２０３／２５４／３４３／３７３、１７０／２０３／３４３／３４６、１７４／１９０／２３４／２９７／３４６、１７４／２１５／２３４／２９７／３４６、１７４／２１５／２５５／２９７／３４６、１７４／２８２／２９７／３４６、１９０／２５５／２８２／３４６、１９０／２９７／３４６、２０３／２９６、２０３／３４３、２０３／３４３／３４６、２０３／３４６、２１５／２５５／２９７／３４６、２１５／２３４／２９７／３４６、２１５／２５５／２９７／３４６、２１５／２９７、２１５／２９７／３４６、２１５／３４６、２３４／２５５／３４６、２５５／２９７／３４６、２５５／３４６、２９７／３４６、３４３／３４６／３７３、および３４６から選択される１つまたはそれを超える位置における少なくとも１つの置換または置換セットとを有し、前記位置は配列番号２に関してナンバリングされている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼは、配列番号２と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、３３／６７／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、３６／４８／２０３／２５４／３４６、４８／６７／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／７０／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／１８１／２０３／２５６／３７３、４８／６７／１８１／２５６／２９６、４８／６７／２０３／２５６／２９６／３７３／３７８、４８／６７／２０３／２５６／３７３、４８／６７／２０３／２９６／３７３、４８／６７／２５６／２９６／３７３、４８／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／７０／１８１／２０３／２５６／３７３、４８／７０／１８１／２０３／２９６／３７３、４８／７０／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／７０／２０３／２５６／３７３、４８／７０／２０３／２９６、４８／７０／２０３／２９６／３７３、４８／７０／２０３／３７３、４８／７０／２５６／２９６／３７３、４８／７０／２９６／３７３、４８／１７６／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／１８１／２０３／２５６／３７３、４８／１８１／２０３／２９６、４８／１８１／２０３／３７３、４８／１８１／２５６／２９６／３７３、４８／２０３／２５４、４８／２０３／２５４／３４３、４８／２０３／２５４／３４３／３４６／３７３、４８／２０３／２５４／３４３／３５５／３７３、４８／２０３／２５４／３４３／３７３、４８／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／２０３／２５４／３７３、４８／２０３／２５６／２９６、４８／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／２０３／２５６／３７３、４８／２０３／２９６／３７３、４８／２０３／２９６／３７３／３７４、４８／２０３／３４３／３７３、４８／２０３／３７３、４８／２５４、４８／２５４／３４３／３４６／３７３、４８／２５４／３４３／３７３、４８／２５４／３４６／３７３、４８／２５４／３７３、４８／２５６／２９６／３７３、４８／２５６／３７３、４８／３７３、６７／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、６７／７０／１８１／２５６／２９６／３７３、６７／７０／１８１／３７３、６７／１８１／２０３／２５６／２９６、６７／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、６７／１８１／２０３／２５６／３７３、６７／２０３／２５６／２９６／３７３、６７／２５６／２９６／３７３、７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、７０／１８１／２０３／２９６／３７３、７０／２０３、７０／２０３／２５６／２９６／３７３、７０／２０３／２５６／３７３、７０／２０３／２９６／３７３、７４／１３６／２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／２８２／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／２９７、７４／１３６／２１５／２３４／２９７／３４３／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／３４６、７４／１３６／２１５／２８２／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／２８２／３４６、７４／１３６／２１５／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／３４６、７４／１３６／２３４／２８２／２９７／３４６、７４／１３６／２３４／３４６、７４／１３６／２８２／２９７／３４６、７４／２１５、７４／２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、７４／２１５／２８２／２９７／３４６、７４／２１５／３４６、１３６／２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、１３６／２１５／２８２／２９７、１３６／２１５／２８２／２９７／３４６、１３６／２１５／２８２／３４６、１３６／２１５／２９７／３４６、１３６／２１５／３４６、１３６／２３４／２９７、１３６／２３４／２９７／３４６、１３６／２３４／３４６、１３６／２８２／２９７、１８１／２０３／２５６、１８１／２０３／２５６／２９６、１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、１８１／２０３／２５６／３７３、１８１／２０３／２９６／３７３、１８１／２０３／３７３、１８１／２５６／２９６／３７３、１８１／２９６、２０３／２２４／２５４／３７３、２０３／２５４、２０３／２５４／３４３／３４６／３７３、２０３／２５４／３４３／３７３、２０３／２５４／３４６、２０３／２５４／３４６／３７３、２０３／２５４／３７３、２０３／３４６／３７３、２０３／３７３、２０３／２０９／２５６／３７３、２０３／２５６、２０３／２５６／２９６、２０３／２５６／２９６／３２０／３７３、２０３／２５６／２９６／３７３、２０３／２５６／２９６／３７３／３８６、２０３／２５６／３７３、２０３／２９６／３７３、２０３／３７３、２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、２１５／２３４／２８２／３４６、２１５／２３４／３４６、２３４／２８２／３４６、２５４、２５４／３４６、２５４／３４６／３７３、２５４／３７３、２５６／２９６、２５６／２９６／３７３、２５６／３７３、２８２／２９７／３４６、３４３／３７３、および３７３から選択される１つまたはそれを超える位置における少なくとも１つの置換または置換セットとを有し、前記位置は配列番号２に関してナンバリングされている。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼは、配列番号３４と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、４８／４９、４９、５０、５０、３３１、２９１、２９２、３３０および３３１から選択される１つまたはそれを超える位置における少なくとも１つの置換または置換セットとを有し、前記位置は配列番号３４に関してナンバリングされている。さらにいくつかのさらなる実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼは、配列番号２５６と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超える配列同一性と、２７／４８／６７／７０／７４／２３４／２５６／２８２／３４６／３７３、２７／４８／６７／７０／１３６／２０３／２１５／２５６／２８２／３４６／３７３、２７／４８／６７／７０／３４６／３７３、２７／４８／６７／７４／２０３／２５６／３４６／３７３、２７／６７／２
３４／２９６／３７３、４５／２８７／３２８／３３３、４５／２９２／３２８、４８、４８／２８４／２９２／３３３、４８／２８７／２９２／２９７、４８／２８７／２９７／３２８／３３３、４８／２９２、４８／２９２／２９７、４８／４９／５０／２９２／３３１、４８／４９／５０／２９２、４８／４９／５０／３３１、４８／４９／３３０／３３１、４８／４９／５０／３４９、４８／４９／５０／２９１／２９２／３３１、４８／４９／５０／２９２／３３１、４８／６７／７０／２０３／２１５／２３４／２５６／３４６、４８／６７／７０／２３４／２５６／２８２／２９７／３４６、４８／６７／７０／３４６、４８／６７／７４／２０３／２３４／２５６／２８２／３４６／３７３、４８／６７／７４／２３４／２９７／３４６／３７３、４８／６７／７４／３４６、４８／６７／２０３／３４６／３７３、４８／６７／２３４／２５６／２９７／３４６／３７３、４８／６７／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／６７／２１５／２８２／２９７／３４６／３７３、４８／６７／３４６／３７３、４８／７０／７４／２９７／３４６／３７３、４８／７０／２０３／２１５／２５６／２８２／３４６／３７３、４８／７０／２１５／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／７４／２０３／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／７４／２３４／２５６／２９７／３４６／３７３、４８／１３６／２５６／３４６／３７３、４８／２０３／２３４／２５６／２９７／３４６／３７３、４８／２０３／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／２０３／２３４／３４６／３７３、４８／２０３／２９６／３７３、４８／２１５／２３４／３４６／３７３、４８／２１５／３４６／３７３、４８／２３４／２５６／２９６／３４６／３７３、４８／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／２５６／３７３、４９／５０／２９２／３３１、４９／５０／２９２／３３１／３４９、４９／５０／３３１、４９／５０／３３１／３４９、５０、６７／７０／７４／１３６／２０３／２１５／２５６／３４６／３７３、６７／７０／７４／２０３／２１５／２３４／３４６／３７３、６７／７０／７４／２１５／２３４／２９７／３４６／３７３、６７／７０／７４／２１５／２５６／３７３、６７／７０／１３６／２０３／２９７／３４６／３７３、６７／７０／２０３／２１５／２５６／３４６／３７３、６７／７０／２０３／３７３、６７／７０／２１５、６７／７４／１３６、６７／７４／２０３／２３４／２５６、６７／７４／２１５／２５６／２９７／３４６／３７３、６７／７４／２１５／３４６／３７３、６７／７４／２５６／３４６／３７３、６７／１３６／２０３／２１５／２５６／３４６／３７３、６７／１３６／２０３／２５６／３４６／３７３、６７／２０３／２３４／２５６／３４６／３７３、６７／２０３／２９７／３４６／３７３、６７／２１５／２３４／２９７／３４６／３７３、６７／２９７／３４６、７０／７４／２０３／２１５／３４６／３７３、１３６、１３６／３４６／３７３、２０３／２３４／３４６、２０３／２３４／３４６／３７３、２０３／３７３、２３４／２８２、２８７、２３４／３４６／３７３、２８７／２９２、２８７／２９２／２９５／２９７、２８７／２９２／２９７、２８７／２９５／２９７、２８７／３３０／３３３、２９２、２９２／２９７、２９２／３３０／３３１、２９２／３３０／３３１、２９２／３３１、２９２／３３１／３４９、２９２／３４９、２９５、２９５／２９７／３３３、２９７／３２８、２９７／３７３、３２８／３３３、３３０、３３０／３３１、３３１、３３１／３４９、３３３、３４６／３７３、および３７３から選択される１つまたはそれを超える位置における少なくとも１つの置換または置換セットとを有し、前記位置は配列番号２５６に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼは、配列番号２、６、３４および／または２５６と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む。いくつかの代替的な実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼは、配列番号２、６、３４および／または２５６と少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含むポリペプチド配列を含む。さらにいくつかのさらなる実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼは、配列番号２、６、３４または２５６に記載されているポリペプチド配列を含む。さらにいくつかのさらなる実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼは、表８．１、９．１、９．２、１０．１および／または１１．１に提供されているバリアントをコードするポリペプチド配列を含む。いくつかのさらなる実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼは、配列番号４〜７５６に記載されている偶数番号の配列から選択されるポリペプチド配列を含む。
【０００７】
本発明はまた、本明細書で提供される操作されたトランスグルタミナーゼをコードする操作されたポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号３〜７５５に記載されている奇数番号の配列から選択される配列と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれを超えて同一のポリヌクレオチド配列を含む。本発明はまた、本明細書で提供される操作されたポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの制御配列をさらに含む。本発明はまた、本明細書で提供されるベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０００８】
本発明はまた、本明細書で提供される操作されたトランスグルタミナーゼを産生するための方法であって、宿主細胞を、少なくとも１つの操作されたトランスグルタミナーゼが前記宿主細胞により産生される条件下で培養することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、操作されたトランスグルタミナーゼを産生する。いくつかの実施形態では、前記方法は、前記宿主細胞により産生された前記操作されたトランスグルタミナーゼを回収するステップをさらに含む。
【０００９】
本発明はまた、グルタミン供与体の存在下でインスリン中の遊離アミノ酸を改変することができる操作されたトランスグルタミナーゼを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される操作されたトランスグルタミナーゼは、リジン供与体の存在下でインスリン中のグルタミンを改変することができる。
【００１０】
本発明はまた、インスリンを改変する方法であって、インスリンおよび少なくとも１つの本明細書で提供される操作されたトランスグルタミナーゼを提供すること、前記インスリンが改変されるような条件下で前記インスリン、グルタミンおよび少なくとも１つの操作されたトランスグルタミナーゼを組み合わせることを含む方法を提供する。本発明はまた、インスリンを改変する方法であって、インスリンおよび少なくとも１つの本明細書で提供される操作されたトランスグルタミナーゼを提供すること、前記インスリンが改変されるような条件下で前記インスリン、リジンおよび少なくとも１つの操作されたトランスグルタミナーゼを組み合わせることを含む方法を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、操作されたトランスグルタミナーゼ酵素、前記酵素をコードするポリヌクレオチド、前記酵素を含む組成物、および操作されたトランスグルタミナーゼ酵素を使用する方法を提供する。
【００１２】
本明細書で提供されるトランスグルタミナーゼバリアントは、配列番号２のＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓトランスグルタミナーゼから操作され、以下に詳細に記載されているように、改善された酵素特性を生成するために様々な改変が導入されている。
【００１３】
本明細書で提供される説明では、単数の使用は、特に具体的な指定がない限り、複数を含む（逆もまた同じである）。例えば、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確な指示がない限り、複数の指示対象を含む。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は互換的であり、限定的であることを意図しない。
【００１４】
様々な実施形態の説明が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、いくつかの具体的な例では、実施形態は、「から本質的になる」または「からなる」という文言を使用して代替的に記載され得ることを当業者は理解することをさらに理解すべきである。
【００１５】
図を含む前述の一般的な説明および以下の詳細な説明は両方とも、単に例示および説明のためのものであり、本開示を限定するものではない。また、本明細書で使用されるセクションの見出しは、単に構成目的のためのものであり、記載されている主題を限定すると解釈されるべきではない。
定義
【００１６】
本明細書で使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。本開示に関して、本明細書における説明で使用される科学技術用語は、特に明確な定義がない限り、当業者により一般的に理解されている意味を有する。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するものとする。加えて、本明細書で言及される特許および刊行物はすべて、このような特許および刊行物に開示されているすべての配列を含めて、参照により明示的に組み込まれる。
【００１７】
特に指示がない限り、本発明の実施は、当業者に公知の分子生物学、発酵、微生物学および関連分野で一般的に使用される従来の技術を伴う。本明細書で特に定義がない限り、本明細書で使用されるすべての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験において使用し得るが、好ましい方法および材料が記載されている。実際、本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されず、これらは、それらが使用される状況に応じて変動し得ることを意図する。本明細書で提供される見出しは、全体として本明細書を参照することにより得られ得る本発明の様々な態様または実施形態を限定するものではない。したがって、以下で定義される用語は、全体として本明細書を参照することにより、より詳細に定義される。
【００１８】
それにもかかわらず、本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を以下に定義する。数値範囲は、その範囲を規定する数値を含む。したがって、本明細書に開示されるあらゆる数値範囲は、このようなより広い数値範囲内に入るあらゆるより狭い数値範囲を、このようなより狭い数値範囲が本明細書にすべて明確に記載されているかのように包含することを意図する。本明細書に開示されるあらゆる最大（または最小）の数値限定は、あらゆるより低い（またはより高い）数値限定を、このようなより低い（またはより高い）数値限定が本明細書に明確に記載されているかのように包含することも意図する。
【００１９】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同族の言語は、それらの包括的な意味で使用される（すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同族の言語と同等である）。
【００２０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上明確な指示がない限り、複数への言及を含む。したがって、例えば、「宿主細胞」への言及は、複数のこのような宿主細胞を含む。
【００２１】
特に指示がない限り、それぞれ、核酸は左から右に５’から３’方向で記載されており、アミノ酸配列は左から右にアミノからカルボキシ方向で記載されている。
【００２２】
本明細書で使用される場合、用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリスチル化、ユビキチン化など）にかかわらず、アミド結合により共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを表すために本明細書で互換的に使用される。Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸ならびにＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物は、この定義に含まれる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合的に互いに連結された２つまたはそれを超えるヌクレオシドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオシドから全体的に構成され得るか（すなわち、ＲＮＡ）、２’デオキシリボヌクレオチドから全体的に構成され得るか（すなわち、ＤＮＡ）、またはリボヌクレオシドと２’デオキシリボヌクレオシドとの混合物であり得る。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル連結を介して互いに連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つまたはそれを超える非標準的な連結を含み得る。ポリヌクレオチドは一本鎖もしくは二本鎖であり得るか、または一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含み得る。また、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）から構成されるが、１つまたはそれを超える改変核酸塩基および／または合成核酸塩基（例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなど）を含み得る。好ましくは、このような改変核酸塩基または合成核酸塩基は、コード核酸塩基である。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおけるハイブリダイゼーション条件、例えば洗浄条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低ストリンジェンシーの条件下で実施され、続いて、様々なより高ストリンジェンシーの洗浄が行われる。用語「中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、前記標的ＤＮＡと約６０％の同一性、好ましくは約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する；標的ポリヌクレオチドと約９０％を超える同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中程度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃での洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、規定のポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満の条件を指す。いくつかの実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃でハイブリッドが安定ではない場合、それは、本明細書で企図されるように高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、４２℃での５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳと同等の条件のハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＰＥおよび０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄により提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ：ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でハイブリダイズすることと同等の条件でハイブリダイズすること、および０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃で洗浄することである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件および中程度にストリンジェントな条件は、当業者に公知である。
【００２５】
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「コドン最適化」は、コードされるタンパク質が目的の生物内で効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンを、特定の生物において優先的に使用されるものに変更することを指す。いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化され得る。遺伝子コードは、ほとんどのアミノ酸が、「同義」または「同義の」コドンと称されるいくつかのコドンにより表されるという点で縮重するが、特定の生物によるコドン使用頻度（codon  usage）は非ランダムであり、特定のコドントリプレットに偏っていることが周知である。このコドン使用頻度バイアスは、所定の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、高度に発現されるタンパク質に関して、低コピー数タンパク質および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に対して高くなり得る。いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択された宿主生物からの最適な産生のためにコドン最適化され得る。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「好ましい最適な高コドン使用頻度バイアスのコドン」は、タンパク質コード領域において、同じアミノ酸をコードする他のコドンよりも高い頻度で使用されるコドンを互換的に指す。好ましいコドンは、１つの遺伝子、共通の機能もしくは起源の一連の遺伝子、高度に発現された遺伝子におけるコドン使用頻度、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度（codon  frequency）、関連生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度またはそれらの組み合わせに関して決定され得る。遺伝子発現のレベルと共にその頻度が増加するコドンは、典型的には、発現のための最適コドンである。例えば、クラスタ分析または対応分析を使用する多変量分析を含む、特異的生物におけるコドン出現頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的同義コドン使用頻度）およびコドン優先度を決定するための様々な方法、ならびに遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための様々な方法が公知である（例えば、ＧＣＧ  ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；ＣｏｄｏｎＷ，Ｊｏｈｎ  Ｐｅｄｅｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．，１４：３７２−７３［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２２２：４３７−４６［１９９４］；およびＷｒｉｇｈｔ，Ｇｅｎｅ  ８７：２３−２９［１９９０］を参照のこと）。増大する生物リストについては、コドン使用頻度表が利用可能である（例えば、Ｗａｄａら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０：２１１１−２１１８［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：２９２［２０００］；Ｄｕｒｅｔら、前掲；Ｈｅｎａｕｔ  ａｎｄ  Ｄａｎｃｈｉｎ，“Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，”Ｎｅｉｄｈａｒｄｔら（ｅｄｓ．），ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，［１９９６］，ｐ．２０４７−２０６６を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠し得る。これらのデータセットは、発現タンパク質をコードすることが実際に公知の核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴＳ）またはゲノム配列の予測されるコード領域を含む（例えば、Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．，２６６：２５９−２８１［１９９６］；Ｔｉｗａｒｉら、Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，１３：２６３−２７０［１９９７］を参照のこと）。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利なすべての成分を含むと本明細書で定義される。各制御配列は、目的のポリヌクレオチドに生来のものまたは外来のものでもあり得る。このような制御配列としては、限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター、シグナルペプチド配列および転写ターミネーターが挙げられる。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」は、制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指令または調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対する相対位置に適切に配置される（すなわち、機能的な関係）形状（configuration）として本明細書で定義される。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞により認識される核酸配列を指す。制御配列は、適切なプロモーター配列を含み得る。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。変異体プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターを含むプロモーターは、選択される宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、宿主細胞と同種または異種のいずれかの細胞外ポリペプチドまたは細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在するまたは野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、生物中に存在する配列であって、天然の供給源から単離され得、人為的操作により意図的に改変されていない配列である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「天然に存在しない」、「操作された」または「組換え」は、（例えば、細胞、核酸またはポリペプチド）に関して本開示で使用される場合、そうでなければ天然に存在しない様式で改変された材料または前記材料の天然もしくは生来の形態に対応する材料、を指す。いくつかの実施形態では、材料は、天然に存在する材料と同一であるが、合成材料からおよび／もしくは組換え技術を使用する操作により産生もしくは生成された材料または前記材料の天然もしくは生来の形態に対応する材料を指す。非限定的な例としては、特に、生来の（非組換え）形態の細胞に見られない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異なるレベルで発現される生来の遺伝子を発現する組換え細胞が挙げられる。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「配列同一性の割合」、「同一性率」および「同一率」は、ポリヌクレオチド配列間またはポリペプチド配列間の比較を指し、比較ウインドウにわたって最適にアライメントされた２つの配列を比較することにより決定され、比較ウインドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部は、２つの配列の最適なアライメントの参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。この割合は、両配列において同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が存在するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップとアライメントする位置の数を決定して一致位置の数を求め、一致位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を乗じて配列同一性の割合を求めることにより計算される。最適なアライメントおよび配列同一性率の決定は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムを使用して実施される（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９−３４０２［１９７７］を参照のこと）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎウェブサイトを通じて公的に入手可能である。
【００３４】
簡潔に言えば、ＢＬＡＳＴ分析は、データベース配列中の同じ長さのワードとアライメントされる場合、いくつかの正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たすクエリー配列中の短いワード長Ｗを特定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を最初に特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、前掲）。これらの初期隣接ワードヒットは、これらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとして作用する。次いで、累積アライメントスコアが増加し得る限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に拡張する。ヌクレオチド配列の場合、パラメータＭ（一致残基のペアの報酬スコア；常に＞０）およびＮ（不一致残基のペナルティースコア；常に＜０）を使用して、累積スコアを計算する。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下するか；１つもしくはそれを超える負のスコア残基アライメントの蓄積により、累積スコアが０もしくはそれ未満になるか；またはいずれかの配列の末端に到達したら、各方向へのワードヒットの拡張を中止する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、アライメントの感度およびスピードを決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列の場合）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：１０９１５［１９８９］を参照のこと）。
【００３５】
２つの配列の同一性率を提供する際にＢＬＡＳＴと同様に機能する多数の他のアルゴリズムが利用可能であり、当技術分野で公知である。比較のための配列の最適なアライメントは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［１９８１］の局所相同性アルゴリズムにより；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［１９７０］の相同性アライメントアルゴリズムにより；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：２４４４［１９８８］の類似性調査法により；ならびに／または、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装により［ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ中のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ］）または当技術分野で一般に公知の方法を使用した視覚的な検査により行われ得る。加えて、配列アライメントおよび配列同一性率の決定は、提供されるデフォルトパラメータを使用してＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）中のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用い得る。
【００３６】
本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウインドウにわたって、多くの場合には少なくとも３０〜５０残基の領域にわたって参照配列と比較される場合に、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性および８９〜９５パーセントの配列同一性、より通常には少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、配列同一性の割合は、参照配列を、比較ウインドウにわたって参照配列の合計２０パーセントまたはそれ未満となる欠失または付加を含む配列と比較することにより計算される。ポリペプチドに適用される具体的な実施形態では、用語「実質的な同一性」は、デフォルトギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴなどにより最適にアライメントした場合に、２つのポリペプチド配列が少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれを超える配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。いくつかの好ましい実施形態では、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換により異なる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、別の配列が比較される規定の配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであり得る。一般に、参照配列は、核酸またはポリペプチドの少なくとも２０ヌクレオチドもしくはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長または全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドはそれぞれ、（１）２つの配列間で類似する配列（すなわち、完全な配列の部分）を含み得、（２）２つの配列間で異なる配列をさらに含み得るので、２つの（またはそれを超える）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、比較ウインドウにわたって２つのポリヌクレオチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を同定および比較することにより実施される。用語「参照配列」は、野生型配列に限定されるものではなく、操作または変化された配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、「参照配列」は、予め操作または変化されたアミノ酸配列であり得る。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０個の連続ヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、配列は、少なくとも２０個の連続ヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較され得、比較ウインドウ中の配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウインドウは、２０個よりも長い連続残基であり得、必要に応じて３０個、４０個、５０個、１００個またはそれよりも長い領域を含む。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「に対応する」、「を参照して」および「と比べて」は、所定のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列のナンバリングの文脈で使用される場合、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合の特定の参照配列の残基のナンバリングを指す。換言すれば、所定のポリマーの残基番号または残基位置は、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の番号位置によってではなく、参照配列に対して指定される。例えば、操作されたトランスグルタミナーゼのアミノ酸配列などの所定のアミノ酸配列は、２つの配列間の残基一致を最適化するためにギャップを導入することにより、参照配列に対してアライメントされ得る。これらの場合では、ギャップは存在するが、所定のアミノ酸配列またはポリヌクレオチド配列における残基のナンバリングは、それがアライメントされている参照配列に対して行われる。本明細書で使用される場合、以下にさらに記載される「Ｘｎ」などの残基位置への言及は、特に具体的な指示がない限り、「に対応する残基」への言及と解釈されるべきである。したがって、例えば、「Ｘ９４」は、ポリペプチド配列の位置９４の任意のアミノ酸を指す。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、参照トランスグルタミナーゼと比較して任意の酵素特性の改善を示すトランスグルタミナーゼを指す。本明細書に記載される操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドでは、比較は、一般に、野生型トランスグルタミナーゼ酵素に対して行われるが、いくつかの実施形態では、参照トランスグルタミナーゼは、別の改善された操作されたトランスグルタミナーゼである。改善が望まれる酵素特性としては、限定されないが、酵素活性（これは、指定量のトランスグルタミナーゼを使用して指定の反応時間における基質の変換率に関して表され得る）、化学選択性、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性プロファイル、補因子要件、阻害剤（例えば、生成物阻害）に対する不応性、立体特異性および立体選択性（エナンチオ選択性を含む）が挙げられる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」は、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドの改善された特性（これは、参照トランスグルタミナーゼ酵素と比較した、比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質の重量）の増加、または生成物への基質の変換率（例えば、指定量のトランスグルタミナーゼを使用して指定期間における生成物への出発量の基質の変換率）の増加により表され得る）を指す。酵素活性を決定するための例示的な方法は、実施例に提供されている。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素特性を含む酵素活性に関する任意の特性が影響され得、これらの変化は酵素活性の増加をもたらし得る。酵素活性の改善は、対応する野生型トランスグルタミナーゼ酵素の酵素活性の約１．５倍から、トランスグルタミナーゼポリペプチドが由来する天然に存在するトランスグルタミナーゼまたは別の操作されたトランスグルタミナーゼよりも２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍またはそれを超える酵素活性までであり得る。具体的な実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼ酵素は、親トランスグルタミナーゼ酵素の酵素活性の１．５〜５０倍、１．５〜１００倍の範囲の改善された酵素活性を示す。触媒ターンオーバー速度が、任意の必要な補因子を含む基質の拡散速度を超えることはできないように、任意の酵素の活性は拡散限界的であることが当業者により理解される。拡散限界またはｋｃａｔ／Ｋｍの理論的最大値は、一般に、約１０８〜１０９（Ｍ−１ｓ−１）である。したがって、トランスグルタミナーゼの酵素活性の任意の改善は、トランスグルタミナーゼ酵素により作用される基質の拡散速度に関連する上限を有するであろう。トランスグルタミナーゼ活性は、当技術分野で利用可能な標準的なアッセイのいずれか１つ（例えば、ヒドロキシメートアッセイ）により測定され得る。酵素活性の比較は、本明細書にさらに詳細に記載されるように、酵素の規定の調製、セット条件下における規定のアッセイ、および１つまたはそれを超える規定の基質を使用して行われる。一般に、溶解物を比較する場合、細胞の数およびアッセイされるタンパク質の量を決定し、同一の発現系および同一の宿主細胞を使用して、宿主細胞により産生されて溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小化する。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」および「増加した活性」は、操作された酵素の改善された特性（これは、本明細書に記載される参照酵素と比較した、比活性（例えば、生成された生成物／時間／タンパク質の重量）の増加、または生成物への基質の変換率（例えば、指定量のトランスグルタミナーゼを使用して指定の期間における生成物への出発量の基質の変換率）の増加により表され得る）を指す。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素特性を含む酵素活性に関する任意の特性が影響され得、これらの変化は酵素活性の増加をもたらし得る。酵素活性の比較は、本明細書にさらに詳細に記載されるように、酵素の規定の調製、セット条件下における規定のアッセイ、および１つまたはそれを超える規定の基質を使用して行われる。一般に、細胞溶解物中の酵素を比較する場合、細胞の数およびアッセイされるタンパク質の量を決定し、同一の発現系および同一の宿主細胞を使用して、宿主細胞により産生されて溶解物中に存在する酵素の量の変動を最小化する。
【００４３】
本明細書で使用される場合、「変換」は、対応する生成物への基質の酵素的転換を指す。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「変換率」は、特定の条件下で一定期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、例えば、トランスグルタミナーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、生成物への基質の「変換率」として表され得る。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「化学選択性」は、化学または酵素反応において、ある生成物が別のものよりも優先的に形成されることを指す。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「耐熱性の」および「熱安定な」は、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）にわたって一連の温度条件（例えば、４０〜８０℃）に曝露した場合に、未処理酵素と比較して不活化に対して耐性であり、したがって、高温への曝露後に特定のレベルの残存活性（例えば、６０％超〜８０％）を保持するポリペプチドを指すために互換的に使用される。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「溶媒安定な」は、様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（例えば、イソプロピルアルコール、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）への一定期間（例えば、０．５〜２４時間）の曝露後に、未処理酵素と比較して同様の活性（例えば、例えば、６０％超〜８０％）を維持するポリペプチドの能力を指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「ｐＨ安定な」は、高または低ｐＨ（例えば、４．５〜６または８〜１２）への一定期間（例えば、０．５〜２４時間）の曝露後に、未処理酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％超〜８０％）を維持するトランスグルタミナーゼポリペプチドを指す。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「熱および溶媒安定な」は、耐熱性および溶媒安定の両方であるトランスグルタミナーゼポリペプチドを指す。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらの正規化コンセンサス疎水性尺度（normalized  consensus  hydrophobicity  scale）（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７９：１２５−１４２［１９８４］）にしたがって０未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる親水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチド中に含まれる場合、約６未満のｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失により、生理的ｐＨで負荷電側鎖を有する。遺伝的にコードされる酸性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチド中に含まれる場合、約６を超えるｐＫ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合により、生理的ｐＨで正荷電側鎖を有する。遺伝的にコードされる塩基性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨで非荷電であるが、２つの原子により一般に共有される電子対が、原子の一方によってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる極性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇらの正規化コンセンサス疎水性尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１７９：１２５−１４２［１９８４］）にしたがって０を超える疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる疎水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香族または芳香族複素環を含む側鎖を有する親水性または疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる芳香族アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）は、その芳香族複素環窒素原子のｐＫａにより塩基性残基として分類されるか、またはその側鎖が芳香族複素環を含むので芳香族残基として分類されることがあるが、本明細書では、ヒスチジンは、親水性残基または「拘束残基（constrained  residue）」として分類される（以下を参照のこと）。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「拘束アミノ酸または残基」は、拘束構造（constrained  geometry）を有するアミノ酸または残基を指す。本明細書では、拘束残基としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−Ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、比較的小さなイミダゾール環を有するので、拘束構造を有する。プロリンもまた５員環を有するので、拘束構造を有する。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「非極性アミノ酸または残基」は、生理的ｐＨで非荷電であり、２つの原子により一般に共有される電子対が、一般に、２つの各原子により同等に保持される結合を有する側鎖を有する（すなわち、側鎖が非極性である）疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる非極性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝的にコードされる脂肪族アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。システイン（または「Ｌ−Ｃｙｓ」もしくは「［Ｃ］」）は、他のＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸または他のスルファニル含有アミノ酸もしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成し得るという点で異常であることに留意する。「システイン様残基」としては、システインおよびジスルフィド架橋の形成に利用可能なスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸が挙げられる。還元型遊離−ＳＨまたは酸化型ジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在するＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨを含有する側鎖を有する他のアミノ酸）の能力は、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドへの正味の疎水性または親水性特徴に寄与するかどうかに影響を及ぼす。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇの正規化コンセンサス尺度（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら、１９８４、前掲）にしたがって０．２９の疎水性を示すが、本開示の目的では、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、それ自体のユニークなグループにカテゴリー化されることを理解すべきである。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「小型アミノ酸または残基」は、合計３つまたはそれ未満の炭素および／またはヘテロ原子（α−炭素および水素を除く）から構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小型アミノ酸または残基は、上記定義にしたがって、脂肪族、非極性、極性または酸性の小型アミノ酸または残基にさらにカテゴリー化され得る。遺伝的にコードされる小型アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝的にコードされるヒドロキシル含有アミノ酸としては、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸差異」および「残基差異」は、参照配列中の対応する位置のアミノ酸残基と比べた、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸差異の位置は、一般に、本明細書では「Ｘｎ」（ｎは、残基差異が基づく参照配列における対応する位置を指す）と称される。例えば、「配列番号２と比較した位置Ｘ４０の残基差異」は、配列番号２の位置４０に対応するポリペプチド位置のアミノ酸残基の差異を指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが位置４０にヒスチジンを有する場合、「配列番号２と比較した位置Ｘ４０の残基差異」は、配列番号２の位置４０に対応するポリペプチドの位置におけるヒスチジン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書におけるほとんどの例では、ある位置における特定のアミノ酸残基差異は、「ＸｎＹ」（「Ｘｎ」は、上記のように対応する位置を指定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドに見られるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中と異なる残基）の一文字識別子である）として示される。いくつかの場合では、本開示はまた、慣例的な表記「ＡｎＢ」（Ａは、参照配列中の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の一文字識別子である）により表される特定のアミノ酸差異を提供する。いくつかの場合では、本開示のポリペプチドは、参照配列と比べて１つまたはそれを超えるアミノ酸残基差異（これは、参照配列と比べて残基差異が存在する特定の位置のリストにより示される）を含み得る。いくつかの実施形態では、１つを超えるアミノ酸がポリペプチドの特定の残基位置において使用され得る場合、使用され得る様々なアミノ酸残基は、「／」により区切られる（例えば、Ｘ１９２Ａ／Ｇ）。本開示は、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換のいずれかまたは両方を含む１つまたはそれを超えるアミノ酸差異を含む操作されたポリペプチド配列を包含する。本開示の配列表に含まれる特定の組換え炭酸脱水酵素ポリペプチドのアミノ酸配列は、開始メチオニン（Ｍ）残基を含む（すなわち、Ｍは残基位置１を表す）。しかしながら、当業者は、例えば宿主細胞またはインビトロ翻訳系では、生物学的プロセシング機構によりこの開始メチオニン残基が除去されて、開始メチオニン残基を欠くが他の点では酵素の特性を保持する成熟タンパク質が生成され得ることを理解する。その結果として、用語「位置Ｘｎにおける配列番号２と比べたアミノ酸残基差異」は、本明細書で使用される場合、開始メチオニンを欠くようにプロセシングされた参照配列内の位置「Ｘｎ」または対応する位置（例えば、位置（Ｘ−１）ｎ）を指し得る。
【００６２】
本明細書で使用される場合、語句「保存的アミノ酸置換」は、類似側鎖を有する残基の互換性を指すので、典型的には、同じまたは類似の規定アミノ酸クラス内のアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を伴う。一例として限定されないが、いくつかの実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンで置換され、ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、セリンおよびトレオニンで置換され、芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジンで置換され、塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンで置換され、酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され、ならびに／または疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置き換えられる。例示的な保存的置換は、表１に提供されている。
【表１】
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【００６３】
本明細書で使用される場合、語句「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、規定のグループ内ではなく規定のグループ間のアミノ酸を使用し得、（ａ）置換（例えば、グリシンからプロリン）領域内のペプチド骨格の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性または（ｃ）側鎖の大部分に影響を与える。一例として限定されないが、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸、小型アミノ酸で置換された芳香族アミノ酸および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つまたはそれを超えるアミノ酸の除去によるポリペプチドの改変を指す。欠失は、酵素活性を保持し、および／または操作された酵素の改善された特性を保持しつつ、１個もしくはそれを超えるアミノ酸、２個もしくはそれを超えるアミノ酸、５個もしくはそれを超えるアミノ酸、１０個もしくはそれを超えるアミノ酸、１５個もしくはそれを超えるアミノ酸または２０個もしくはそれを超えるアミノ酸、ポリペプチドを構成する総アミノ酸数の最大１０％または総アミノ酸数の最大２０％の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とし得る。様々な実施形態では、欠失は連続セグメントを含み得るか、または不連続であり得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドへの１つまたはそれを超えるアミノ酸の付加によるポリペプチドの改変を指す。いくつかの実施形態では、改善された操作されたトランスグルタミナーゼ酵素は、天然に存在するトランスグルタミナーゼポリペプチドへの１個またはそれを超えるアミノ酸の挿入、および操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドへの１個またはそれを超えるアミノ酸の挿入を含む。挿入は、ポリペプチドの内部部分にあり得るか、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に対するものであり得る。本明細書で使用される場合、挿入は、当技術分野で公知であるように融合タンパク質を含む。挿入は、天然に存在するポリペプチドにおける連続アミノ酸セグメントであり得るか、または１つもしくはそれを超えるアミノ酸により分離され得る。
【００６６】
用語「アミノ酸置換セット」または「置換セット」は、参照配列と比較したポリペプチド配列内の一群のアミノ酸置換を指す。置換セットは、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個またはそれを超えるアミノ酸置換を有し得る。いくつかの実施形態では、置換セットは、実施例に提供されている表に列挙されているバリアントトランスグルタミナーゼのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が配列中の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、典型的には、全長トランスグルタミナーゼポリペプチド、例えば、配列番号２のポリペプチドの約８０％、約９０％、約９５％、約９８％または約９９％を有し得る。いくつかの実施形態では、断片は、「生物学的に活性」である（すなわち、全長配列と同じ酵素活性を示す）。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、それに天然に付随する他の混入物、例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチドから実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、その天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から回収または精製されたポリペプチドを包含する。改善されたトランスグルタミナーゼ酵素は、細胞内に存在し得るか、細胞培地中に存在し得るか、または様々な形態（例えば、溶解物または単離された調製物）で調製され得る。このように、いくつかの実施形態では、本開示の操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」は、ポリペプチド種が存在する優勢種である（すなわち、モルまたは重量基準で、それが、組成物中の任意の他の個々の高分子種よりも豊富である）組成物を指し、一般に、目的種が、モル％または重量％で、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを構成する場合、実質的に精製された組成物である。一般に、実質的に純粋な操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチド組成物は、モル％または重量％で、組成物中に存在するすべての高分子種の約６０％もしくはそれよりも多く、約７０％もしくはそれよりも多く、約８０％もしくはそれよりも多く、約９０％もしくはそれよりも多く、約９１％もしくはそれよりも多く、約９２％もしくはそれよりも多く、約９３％もしくはそれよりも多く、約９４％もしくはそれよりも多く、約９５％もしくはそれよりも多く、約９６％もしくはそれよりも多く、約９７％もしくはそれよりも多く、および約９８％もしくはそれよりも多くまたは約９９％を構成する。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、高分子種と見なされない。いくつかの実施形態では、単離された改善されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００７０】
本明細書で使用される場合、核酸またはポリペプチドに関して使用される際の用語「異種」は、生物（例えば、野生型生物）により通常は発現および分泌されない配列を指す。いくつかの実施形態では、この用語は、天然に通常は見出されるものと互いに同じ関係で見出されないか、またはその発現レベルもしくは細胞もしくは構造内の他の核酸もしくは他の分子との物理的関係が天然に通常は見出されないように組換え操作された２つまたはそれを超える部分配列を含む配列を包含する。例えば、天然に見られない様式で配置された非関連遺伝子に由来する２つまたはそれを超える配列を有する異種核酸は、典型的には、組換え産生される（例えば、ベクターなどの発現カセットに挿入されたプロモーター配列に作動可能に連結された本発明の核酸オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ））。いくつかの実施形態では、「異種ポリヌクレオチド」は、実験室技術により宿主細胞中に導入される任意のポリヌクレオチドを指し、宿主細胞から取り出され、実験室操作に供され、次いで宿主細胞中に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「適切な反応条件」は、本開示のトランスグルタミナーゼポリペプチドが目的の基質を改変することができる生体触媒反応溶液の条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼは、低分子量基質およびタンパク質を含む様々な基質中の置換グルタミンおよび置換リジンを架橋する。いくつかの実施形態では、本発明のトランスグルタミナーゼは、生体高分子の部位特異的改変をすることができる。例示的な「適切な反応条件」は本開示に提供されており、実施例により例示されている。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「化合物負荷」、「酵素負荷」または「補因子負荷」などの「負荷」は、反応開始時における反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、生体触媒媒介プロセスの文脈における「基質」は、生体触媒が作用する化合物または分子を指す。
【００７４】
本明細書で使用される場合、生体触媒媒介プロセスの文脈における「生成物」は、生体触媒の作用から生じる化合物または分子を指す。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「平衡」は、化学反応または酵素反応の順方向速度定数および逆方向速度定数により決定される、立体異性体の相互変換を含む化学反応または酵素反応（例えば、２つの種ＡおよびＢの相互変換）において化学種の定常状態の濃度をもたらすプロセスを指す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「トランスグルタミナーゼ」、「ＴＧ」、「ＴＧａｓｅ」および「トランスグルタミナーゼ活性を有するポリペプチド」は、ペプチド／タンパク質におけるガンマ−カルボキシアミド基（例えば、グルタミン残基）と、アミン供与体として作用する様々な第１級アミンとの間のアシル転移反応を触媒する能力を有する酵素を指す。いくつかの実施形態では、グルタミン酸の脱アミドによるグルタミンのグルタミン酸による置換反応がある。いくつかの実施形態では、リジンはアシル受容体として使用され、その結果、反応において使用されるタンパク質分子の富化をもたらす。ポリペプチド鎖におけるリジン残基へのアシルの転移は、架橋プロセス（すなわち、分子内または分子間架橋の形成）を誘導する（例えば、Ｋｉｅｌｉｓｚｅｋ  ａｎｄ  Ｍｉｓｉｅｗｉｃｚ、前掲；およびＫａｓｈｉｗａｇｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７７：４４２５２−４４２６０［２００２］を参照のこと）。いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼは、遊離アミン基の非存在下で、ただし、アシル受容体として作用する水の存在下で、脱アミノ化反応の触媒に使用される。これは、粘度、熱安定性、弾性および弾力性の変更を含む、影響を受けるタンパク質の物理的および化学的特性の有意な変化をもたらす（例えば、Ｋｉｅｌｉｓｚｅｋ  ａｎｄ  Ｍｉｓｉｅｗｉｃｚ、前掲；Ｍｏｔｏｋｉ  ａｎｄ  Ｓｅｇｕｒｏａ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｆｏｏｄ  Ｓｃｉ．Ｔｅｃｈｎｏｌ．，９：２０４−２１０［１９９８］；およびＫｕｒａｉｓｈｉら、Ｆｏｏｄ  Ｒｅｖ．Ｉｎｔｌ．，１７：２２１−２４６［２００１］を参照のこと）。トランスグルタミナーゼは、ヒト、細菌、線虫、酵母、藻類、植物および下等脊椎動物を含む様々な生物において広く分布することが公知である（例えば、Ｓａｎｔｏｓ  ａｎｄ  Ｔｏｒｎｅ，Ｒｅｃｅｎｔ  Ｐａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：１６６−１７４［２００９］を参照のこと）。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「トランスグルタミネーション」、「アミノ基転移」および「トランスグルタミナーゼ反応」は、タンパク質／ポリペプチド／ペプチド由来のグルタミン残基のガンマ−グルタミニル（gamma-glutaminyl）が、第１級アミンまたはリジンもしくは水のイプシロン（episilon）−アミノ基に転移され、アンモニア分子が放出される反応を指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、操作されたトランスグルタミナーゼ酵素の文脈で使用される際の「由来する」は、元のトランスグルタミナーゼ酵素、および／または操作のベースとなったこのようなトランスグルタミナーゼ酵素をコードする遺伝子を同定する。例えば、配列番号２９６の操作されたトランスグルタミナーゼ酵素は、配列番号２のＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓトランスグルタミナーゼをコードする遺伝子（配列番号１）を複数世代にわたって人工的に進化させることにより得られた。
【００７９】
したがって、この操作されたトランスグルタミナーゼ酵素は、配列番号２の天然に存在するまたは野生型トランスグルタミナーゼに「由来する」。
トランスグルタミナーゼ
【００８０】
本発明は、野生型Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓトランスグルタミナーゼ酵素から開発されたバリアントトランスグルタミナーゼを提供する。Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓはまた、Ｓｔｒｅｐｔｏｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｉｕｍ  ｍｏｂａｒａｅｓｅとして分類される。この酵素は約３８ｋＤａの分子量を有し、カルシウム非依存性である（例えば、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．，６４：４４７−４５４［２００４］；および米国特許出願公開第２０１０／００９９６１０号（これらは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００８１】
トランスグルタミナーゼは、様々なペプチドの特性を変化させるのに使用される。いくつかの実施形態では、前記酵素は、食品および乳業において、ならびに生理活性ペプチド、生物医学、生体材料、抗体、繊維産業（例えば、羊毛および皮革）、ペプチドコンジュゲーション方法、組織への薬剤の結合、化粧品などが関与する用途において有用なペプチドを架橋結合するために使用される（例えば、トランスグルタミナーゼ、それらの供給源および使用の議論については、欧州特許第９５０６６５号、欧州特許第７８５２７６号、国際公開第２００５／０７０４６８号、国際公開第２００６／１３４１４８号、国際公開第２００８／１０２００７号、国際公開第２００９／００３７３２号、米国特許第６，０１３，４９８号、米国特許出願公開第２０１０／００９９６１０号；米国特許出願公開第２０１０／０２４９０２９号；および米国特許出願公開第２０１０／００８７３７１号（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）；ならびにＳａｔｏ，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．，５４：４８７−５０４［２００２］；Ｖａｌｄｉｖｉａ，Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１２２：３２６−３３３［２００６］；Ｗａｄａ，Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｌｅｔｔ．，２３：１３６７−１３７２［２００１］；Ｋｉｅｌｉｓｚｅｋ  ａｎｄ  Ｍｉｓｉｅｗｉｃｚ，Ｆｏｌｉａ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，５９：２４１−２５０［２０１４］；Ｙｏｋｏｙａｍａら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｏｌ．，６４：４４７−４５４［２００４］；Ｗａｓｈｉｚｕら、Ｂｉｏｓｃｉ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，５８：８２−８７［１９９４］；Ｋａｎａｊｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１１５６５−１１５７２［１９９３］；Ａｎｄｏら、Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．５３：２６１３−２６１７［１９８９］；Ｍａｒｔｉｎｓら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８：６９５７−６９６４［２０１４］；Ｊｅｒｇｅｒら、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．，４９：９９９５−９９９７［２０１０］；Ｇｒｕｎｂｅｒｇら、ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８：ｅ６０３５０［２０１３］；Ｍｉｎｄｔら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，１９：２７１−２７８［２００８］；Ｌｈｏｓｐｉｃｅら、Ｍｏｌ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  １２：１８６３−１８７１［２０１５］；Ｄｅｎｎｌｅｒら、Ｂｉｏｃｏｎｊ．Ｃｈｅｍ．，２５：５６９−５７８［２０１４］；およびＳａｎｔｏｓ  ａｎｄ  Ｔｏｒｎｅ，Ｒｅｃ．Ｐａｔｅｎｔｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３：１６６−１７４［２００９］を参照のこと）。これらの酵素は、食品および他の製品の堅さ、粘度、弾性および水結合能力を改善することができる。
【００８２】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるトランスグルタミナーゼバリアントは、食品（例えば、ゼリー、ヨーグルト、チーズ、麺、チューインガム、キャンディー、焼き製品、大豆タンパク質、グミキャンディー、スナック、ピクルス、肉およびチョコレート）の生産のために、食品産業において使用されるが、いくつかの他の実施形態では、トランスグルタミナーゼバリアントは、他の産業（例えば、繊維、医薬品、診断など）において使用される。
【００８３】
いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号２、６、３４および／または２５６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有する操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドを提供する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、７９、１０１、１０１／２０１／２１２／２８７、１０１／２０１／２８５、１０１／２８７および３２７から選択される１つまたはそれを超える位置における置換を含み、前記位置は配列番号６に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、７９Ｋ、１０１Ｇ、１０１Ｇ／２０１Ｋ／２１２Ｋ／２８７Ｇ、１０１Ｇ／２０１Ｋ／２８５Ｑ、１０１Ｇ／２８７Ｇおよび３２７Ｒから選択される１つまたはそれを超える置換を含み、前記位置は配列番号６に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、Ｓ７９Ｋ、Ｙ１０１Ｇ、Ｙ１０１Ｇ／Ｑ２０１Ｋ／Ｒ２１２Ｋ／Ｓ２８７Ｇ、Ｙ１０１Ｇ／Ｑ２０１Ｋ／Ｒ２８５Ｑ、Ｙ１０１Ｇ／Ｓ２８７ＧおよびＧ３２７Ｒから選択される１つまたはそれを超える置換を含み、前記位置は配列番号６に関してナンバリングされている。
【００８５】
いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、４８、４８／６７／７０、４８／６７／７０／１８１／２０３／２５６、４８／６７／７０／１８１／２５６／３４５、４８／６７／７０／１８１／２９６／３４５／３７３、４８／６７／７０／２０３／２５６／２９６／３４５、４８／６７／７０／２０３／２５６／３４５／３５４／３７３、４８／６７／７０／２０３／３４５、４８／６７／７０／２５６、４８／６７／７０／２５６／２９６／３４５／３７３、４８／６７／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／２０３／２５６／３４５、４８／７０／１７０／２０３、４８／７０／２０３／２５４／２９６／３４３、４８／７０／２０３／２５６／３４５／３７３、４８／７０／２０３／２５６／３４５、４８／７０／２０３／３７３、４８／１７０／２０３、４８／１７０／２０３／２５４／２９６／３４６、４８／１７０／２０３／２５４／２９６／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／２５４／３４６、４８／１７０／２０３／２９６／３４３／３４６、４８／１７０／２０３／２９６／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／３４３／３４６、４８／１７０／２０３／３４６、４８／１７０／２０３／３４６／３７３、４８／１７０／２０３／３７３、４８／１７０／２５４、４８／１７０／２９６、４８／１７０／２９６／３４３／３４６、４８／１７０／３４３／３４６、４８／１８１、４８／１８１／２０３／２５６／３４５、４８／１８１／２０３／３４５、４８／１８１／２５６／２９６／３４５、４８／１８１／２９６、４８／１８１／２９６／３４５、４８／２０３、４８／２０３／２５４／２９６、４８／２０３／２５４／２９６／３４３／３７３、４８／２０３／２５４／２９６／３４６／３７３、４８／２０３／２５４／３４６、４８／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／２０３／２５６、４８／２０３／２５６／２９６／３４５、４８／２０３／２９６／３４３／３４６／３７３、４８／２０３／２９６／３４３／３７３、４８／２０３／２９６／３４６、４８／２０３／２９６／３４６／３７３、４８／２０３／３４３／３４６、４８／２０３／３４３／３４６／３７３、４８／２０３／３４５、４８／２０３／３４６、４８／２０３／３４６／３７３、４８／２５４／２９６、４８／２５４／３４６、４８／２５６、４８／２５６／２９６、４８／２５６／２９６／３４５、４８／２９６／３４５、４８／２９６／３７３、４８／３４３／３４６、４８／３４５／３７３、６７／２５６、６７／２９６／３４５、６８／７４／１９０／２１５／３４６、６８／１３６／２１５／２５５／２８２／２９７／３４６、６８／１３６／２１５／２９７／３４６、６８／１３６／２３４、６８／１５８／１７４／２３４／２８２／２９７／３４６、６８／１５８／２１５／２９７／３４６、６８／２１５／２９７／３４６、６８／２３４、６８／２８２／２９７／３４６、６８／２９７／３４６、７４／１３６／１７４／２８２／３４６、７４／１３６／１７４／２９７／３４６、７４／１３６／３４６、７４／１５８／２５５／２９７、７４／２５５／３４６、７４／３４６、１３６／１５８／１９０／２１５／２５５／２９７／３４６、１３６／１５８／２１５／２９７／３４６、１３６／１７４／２１５／２５５／２８２／２９７／３４６、１３６／１９０／２１５／２９７／３４６、１３６／２１５／２３４／２８２／２９７、１３６／２１５／２３４／２９７／３４６、１３６／２１５／２９７、１３６／２９７／３４６、１５８／２１５／２５５／３４６、１５８／２１５／３４６、１７０／２０３／２５４／２９６／３４３／３４６、１７０／２０３／２５４／３４３／３７３、１７０／２０３／３４３／３４６、１７４／１９０／２３４／２９７／３４６、１７４／２１５／２３４／２９７／３４６、１７４／２１５／２５５／２９７／３４６、１７４／２８２／２９７／３４６、１９０／２５５／２８２／３４６、１９０／２９７／３４６、２０３／２９６、２０３／３４３、２０３／３４３／３４６、２０３／３４６、２１５／２５５／２９７／３４６、２１５／２３４／２９７／３４６、２１５／２５５／２９７／３４６、２１５／２９７、２１５／２９７／３４６、２１５／３４６、２３４／２５５／３４６、２５５／２９７／３４６、２５５／３４６、２９７／３４６、３４３／３４６／３７３、および３４６から選択される１つまたはそれを超える位置における置換を含み、前記位置は配列番号２に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、４８Ｋ／７０Ｌ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／２９６Ｌ／３４３Ｒ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２０３Ｌ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／２９６Ｌ／３４６Ｈ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／２９６Ｌ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４６Ｈ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２０３Ｌ／２９６Ｌ／３４３Ｒ／３４６Ｈ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２０３Ｌ／２９６Ｌ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２０３Ｌ／３４３Ｒ／３４６Ｈ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２０３Ｌ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２０３Ｌ／３４６Ｈ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２０３Ｌ／３７３Ｍ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２５４Ｑ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２９６Ｌ、４８Ｋ／１７０Ｋ／２９６Ｌ／３４３Ｒ／３４６Ｈ、４８Ｋ／１７０Ｋ／３４３Ｒ／３４６Ｈ、４８Ｋ／２０３Ｌ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／２９６Ｌ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／２９６Ｌ／３４３Ｒ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／２９６Ｌ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４６Ｈ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２９６Ｌ／３４３Ｒ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２９６Ｌ／３４３Ｒ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２９６Ｌ／３４６Ｈ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２９６Ｌ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／３４３Ｒ／３４６Ｈ、４８Ｋ／２０３Ｌ／３４３Ｒ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／３４６Ｈ、４８Ｋ／２０３Ｌ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２５４Ｑ／３４６Ｈ、４８Ｋ／３４３Ｒ／３４６Ｈ、４８Ｖ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／１８１Ｋ／２５６Ｇ／３４５Ｅ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／１８１Ｋ／２９６Ｒ／３４５Ｅ／３７３Ｖ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３４５Ｅ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／２０３Ｖ／３４５Ｅ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３４５Ｅ／３７３Ｖ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｎ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３４５Ｅ／３５４Ｈ／３７３Ｌ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｎ／２５６Ｇ、４８Ｖ／６７Ｅ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／６７Ｅ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３４５Ｅ、４８Ｋ／７０Ｄ／１７０Ｋ／２０３Ｌ、４８Ｖ／７０Ｇ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３４５Ｅ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７０Ｎ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３４５Ｅ、４８Ｖ／７０Ｎ／２０３Ｖ／３７３Ｖ、４８Ｖ／１８１Ｋ、４８Ｖ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３４５Ｅ、４８Ｖ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／３４５Ｅ、４８Ｖ／１８１Ｋ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３４５Ｅ、４８Ｖ／１８１Ｋ／２９６Ｒ、４８Ｖ／１８１Ｋ／２９６Ｒ／３４５Ｅ、４８Ｖ／２０３Ｖ、４８Ｖ／２０３Ｖ／２５６Ｇ、４８Ｖ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３４５Ｅ、４８Ｖ／２０３Ｖ／３４５Ｅ、４８Ｋ／２５４Ｑ／２９６Ｌ、４８Ｖ／２５６Ｇ、４８Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ、４８Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３４５Ｅ、４８Ｖ／２９６Ｒ／３４５Ｅ、４８Ｖ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／３４５Ｅ／３７３Ｌ、６７Ｅ／２５６Ｇ、６７Ｅ／２９６Ｒ／３４５Ｅ、６８Ａ／７４Ｔ／１９０Ｇ／２１５Ｎ／３４６Ａ、６８Ａ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／２５５Ｒ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、６８Ａ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／２９７Ｗ／３４６Ａ、６８Ａ／１３６Ｙ／２３４Ｙ、６８Ａ／１５８Ｉ／１７４Ｄ／２３４Ｙ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、６８Ａ／１５８Ｉ／２１５Ｎ／２９７Ｗ／３４６Ａ、６８Ａ／２１５Ｎ／２９７Ｗ／３４６Ａ、６８Ａ／２３４Ｙ、６８Ａ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、６８Ａ／２９７Ｗ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／１７４Ｄ／２８２Ｋ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／１７４Ｄ／２９７Ｗ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／３４６Ａ、７４Ｔ／１５８Ｉ／２５５Ｒ／２９７Ｗ、７４Ｔ／２５５Ｒ／３４６Ａ、７４Ｔ／３４６Ａ、１３６Ｙ／１５８Ｉ／１９０Ｇ／２１５Ｎ／２５５Ｒ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１３６Ｙ／１５８Ｉ／２１５Ｎ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１３６Ｙ／１７４Ｄ／２１５Ｎ／２５５Ｒ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１３６Ｙ／１９０Ｇ／２１５Ｎ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１３６Ｙ／２１５Ｎ／２３４Ｙ／２８２Ｋ／２９７Ｗ、１３６Ｙ／２１５Ｎ／２３４Ｙ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１３６Ｙ／２１５Ｎ／２９７Ｗ、１３６Ｙ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１５８Ｉ／２１５Ｎ／２５５Ｒ／３４６Ａ、１５８Ｉ／２１５Ｎ／３４６Ａ、１７０Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／２９６Ｌ／３４３Ｒ／３４６Ｈ、１７０Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４３Ｒ／３７３Ｍ、１７０Ｋ／２０３Ｌ／３４３Ｒ／３４６Ｈ、１７４Ｄ／１９０Ｇ／２３４Ｙ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１７４Ｄ／２１５Ｎ／２３４Ｙ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１７４Ｄ／２１５Ｎ／２５５Ｒ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１７４Ｄ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１９０Ｇ／２５５Ｒ／２８２Ｋ／３４６Ａ、１９０Ｇ／２９７Ｗ／３４６Ａ、２０３Ｌ／２９６Ｌ、２０３Ｌ／３４３Ｒ／３４６Ｈ、２０３Ｌ／３４３Ｒ、２０３Ｌ／３４６Ｈ、２１５Ｈ／２５５Ｒ／２９７Ｗ／３４６Ａ、２１５Ｎ／２３４Ｙ／２９７Ｗ／３４６Ａ、２１５Ｎ／２５５Ｒ／２９７Ｗ／３４６Ａ、２１５Ｎ／２９７Ｗ、２１５Ｎ／２９７Ｗ／３４６Ａ、２１５Ｎ／３４６Ａ、２３４Ｙ／２５５Ｒ／３４６Ａ、２５５Ｒ／２９７Ｗ／３４６Ａ、２５５Ｒ／３４６Ａ、２９７Ｗ／３４６Ａ、３４３Ｒ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、および３４６Ａから選択される１つまたはそれを超える置換を含み、前記位置は配列番号２に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、Ｓ４８Ｋ／Ｙ７０Ｌ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｇ２９６Ｌ／Ｎ３４３Ｒ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｇ２９６Ｌ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｇ２９６Ｌ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｇ２９６Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｇ２９６Ｌ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｒ２５４Ｑ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２９６Ｌ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２９６Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｑ１７０Ｋ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｇ２９６Ｌ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｇ２９６Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｇ２９６Ｌ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｇ２９６Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｇ２９６Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｇ２９６Ｌ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｇ２９６Ｌ／Ｅ３４６Ｈ／
Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ、Ｓ４８Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｓ２５６Ｇ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２９６Ｒ／Ｓ３４５Ｅ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｓ３４５Ｅ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｎ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｓ３４５Ｅ／Ｇ３５４Ｈ／Ｋ３７３Ｌ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｎ／Ｓ２５６Ｇ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｋ／Ｙ７０Ｄ／Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｓ３４５Ｅ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｎ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｎ／Ｇ２０３Ｖ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ１８１Ｋ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ１８１Ｋ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２９６Ｒ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２９６Ｒ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２０３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｋ／Ｒ２５４Ｑ／Ｇ２９６Ｌ、Ｓ４８Ｖ／Ｓ２５６Ｇ、Ｓ４８Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ、Ｓ４８Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｓ３４５Ｅ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｓ３４５Ｅ／Ｋ３７３Ｌ、Ｒ６７Ｅ／Ｓ２５６Ｇ、Ｒ６７Ｅ／Ｇ２９６Ｒ／Ｓ３４５Ｅ、Ｐ６８Ａ／Ｅ７４Ｔ／Ｓ１９０Ｇ／Ｐ２１５Ｎ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ６８Ａ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｓ２５５Ｒ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ６８Ａ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ６８Ａ／Ｆ１３６Ｙ／Ｈ２３４Ｙ、Ｐ６８Ａ／Ｖ１５８Ｉ／Ｅ１７４Ｄ／Ｈ２３４Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ６８Ａ／Ｖ１５８Ｉ／Ｐ２１５Ｎ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ６８Ａ／Ｐ２１５Ｎ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ６８Ａ／Ｈ２３４Ｙ、Ｐ６８Ａ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ６８Ａ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｅ１７４Ｄ／Ｒ２８２Ｋ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｅ１７４Ｄ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｖ１５８Ｉ／Ｓ２５５Ｒ／Ｆ２９７Ｗ、Ｅ７４Ｔ／Ｓ２５５Ｒ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｖ１５８Ｉ／Ｓ１９０Ｇ／Ｐ２１５Ｎ／Ｓ２５５Ｒ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｖ１５８Ｉ／Ｐ２１５Ｎ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｅ１７４Ｄ／Ｐ２１５Ｎ／Ｓ２５５Ｒ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｓ１９０Ｇ／Ｐ２１５Ｎ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ、Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｆ２９７Ｗ、Ｆ１３６Ｙ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｖ１５８Ｉ／Ｐ２１５Ｎ／Ｓ２５５Ｒ／Ｅ３４６Ａ、Ｖ１５８Ｉ／Ｐ２１５Ｎ／Ｅ３４６Ａ、Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｇ２９６Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ、Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｎ３４３Ｒ／Ｋ３７３Ｍ、Ｑ１７０Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ、Ｅ１７４Ｄ／Ｓ１９０Ｇ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ１７４Ｄ／Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ１７４Ｄ／Ｐ２１５Ｎ／Ｓ２５５Ｒ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ１７４Ｄ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｓ１９０Ｇ／Ｓ２５５Ｒ／Ｒ２８２Ｋ／Ｅ３４６Ａ、Ｓ１９０Ｇ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｇ２０３Ｌ／Ｇ２９６Ｌ、Ｇ２０３Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ、Ｇ２０３Ｌ／Ｎ３４３Ｒ、Ｇ２０３Ｌ／Ｅ３４６Ｈ、Ｐ２１５Ｈ／Ｓ２５５Ｒ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ２１５Ｎ／Ｓ２５５Ｒ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ２１５Ｎ／Ｆ２９７Ｗ、Ｐ２１５Ｎ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ２１５Ｎ／Ｅ３４６Ａ、Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５５Ｒ／Ｅ３４６Ａ、Ｓ２５５Ｒ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｓ２５５Ｒ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、およびＥ３４６Ａから選択される１つまたはそれを超える置換を含み、前記位置は配列番号２に関してナンバリングされている。
【００８６】
いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、３３／６７／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、３６／４８／２０３／２５４／３４６、４８／６７／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／７０／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／６７／１８１／２０３／２５６／３７３、４８／６７／１８１／２５６／２９６、４８／６７／２０３／２５６／２９６／３７３／３７８、４８／６７／２０３／２５６／３７３、４８／６７／２０３／２９６／３７３、４８／６７／２５６／２９６／３７３、４８／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／７０／１８１／２０３／２５６／３７３、４８／７０／１８１／２０３／２９６／３７３、４８／７０／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／７０／２０３／２５６／３７３、４８／７０／２０３／２９６、４８／７０／２０３／２９６／３７３、４８／７０／２０３／３７３、４８／７０／２５６／２９６／３７３、４８／７０／２９６／３７３、４８／１７６／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／１８１／２０３／２５６／３７３、４８／１８１／２０３／２９６、４８／１８１／２０３／３７３、４８／１８１／２５６／２９６／３７３、４８／２０３／２５４、４８／２０３／２５４／３４３、４８／２０３／２５４／３４３／３４６／３７３、４８／２０３／２５４／３４３／３５５／３７３、４８／２０３／２５４／３４３／３７３、４８／２０３／２５４／３４６／３７３、４８／２０３／２５４／３７３、４８／２０３／２５６／２９６、４８／２０３／２５６／２９６／３７３、４８／２０３／２５６／３７３、４８／２０３／２９６／３７３、４８／２０３／２９６／３７３／３７４、４８／２０３／３４３／３７３、４８／２０３／３７３、４８／２５４、４８／２５４／３４３／３４６／３７３、４８／２５４／３４３／３７３、４８／２５４／３４６／３７３、４８／２５４／３７３、４８／２５６／２９６／３７３、４８／２５６／３７３、４８／３７３、６７／７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、６７／７０／１８１／２５６／２９６／３７３、６７／７０／１８１／３７３、６７／１８１／２０３／２５６／２９６、６７／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、６７／１８１／２０３／２５６／３７３、６７／２０３／２５６／２９６／３７３、６７／２５６／２９６／３７３、７０／１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、７０／１８１／２０３／２９６／３７３、７０／２０３、７０／２０３／２５６／２９６／３７３、７０／２０３／２５６／３７３、７０／２０３／２９６／３７３、７４／１３６／２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／２８２／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／２９７、７４／１３６／２１５／２３４／２９７／３４３／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／２３４／３４６、７４／１３６／２１５／２８２／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／２８２／３４６、７４／１３６／２１５／２９７／３４６、７４／１３６／２１５／３４６、７４／１３６／２３４／２８２／２９７／３４６、７４／１３６／２３４／３４６、７４／１３６／２８２／２９７／３４６、７４／２１５、７４／２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、７４／２１５／２８２／２９７／３４６、７４／２１５／３４６、１３６／２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、１３６／２１５／２８２／２９７、１３６／２１５／２８２／２９７／３４６、１３６／２１５／２８２／３４６、１３６／２１５／２９７／３４６、１３６／２１５／３４６、１３６／２３４／２９７、１３６／２３４／２９７／３４６、１３６／２３４／３４６、１３６／２８２／２９７、１８１／２０３／２５６、１８１／２０３／２５６／２９６、１８１／２０３／２５６／２９６／３７３、１８１／２０３／２５６／３７３、１８１／２０３／２９６／３７３、１８１／２０３／３７３、１８１／２５６／２９６／３７３、１８１／２９６、２０３／２２４／２５４／３７３、２０３／２５４、２０３／２５４／３４３／３４６／３７３、２０３／２５４／３４３／３７３、２０３／２５４／３４６、２０３／２５４／３４６／３７３、２０３／２５４／３７３、２０３／３４６／３７３、２０３／３７３、２０３／２０９／２５６／３７３、２０３／２５６、２０３／２５６／２９６、２０３／２５６／２９６／３２０／３７３、２０３／２５６／２９６／３７３、２０３／２５６／２９６／３７３／３８６、２０３／２５６／３７３、２０３／２９６／３７３、２０３／３７３、２１５／２３４／２８２／２９７／３４６、２１５／２３４／２８２／３４６、２１５／２３４／３４６、２３４／２８２／３４６、２５４、２５４／３４６、２５４／３４６／３７３、２５４／３７３、２５６／２９６、２５６／２９６／３７３、２５６／３７３、２８２／２９７／３４６、３４３／３７３、および３７３から選択される１つまたはそれを超える位置における置換を含み、前記位置は配列番号２に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、３３Ｄ／６７Ｅ／７０Ｇ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、３６Ｅ／４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４６Ｈ、４８Ｋ／１７６Ｔ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４３Ｒ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４３Ｒ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４３Ｒ／３５５Ｔ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４３Ｒ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４６Ｄ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／２５４Ｑ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／３４３Ｒ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２０３Ｌ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２５４Ｑ、４８Ｋ／２５４Ｑ／３４３Ｒ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２５４Ｑ／３４３Ｒ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２５４Ｑ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、４８Ｋ／２５４Ｑ／３７３Ｍ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／６７Ｅ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／６７Ｅ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、４８Ｖ／６７Ｅ／１８１Ｋ／２５６Ｇ／２９６Ｒ、４８Ｖ／６７Ｅ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ／３７８Ｄ、４８Ｖ／６７Ｅ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、４８Ｖ／６７Ｅ／２０３Ｖ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／６７Ｅ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７０Ｇ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７０Ｇ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７０Ｇ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７０Ｇ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７０Ｇ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７０Ｇ／２０３Ｖ／２９６Ｒ、４８Ｖ／７０Ｇ／２０３Ｖ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７０Ｇ／２０３Ｖ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７０Ｇ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７０Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、４８Ｖ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２９６Ｒ、４８Ｖ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／３７３Ｖ、４８Ｖ／１８１Ｋ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ、４８Ｖ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、４８Ｖ／２０３Ｖ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／２０３Ｖ／２９６Ｒ／３７３Ｖ／３７４Ｌ、４８Ｖ／２０３Ｖ／３７３Ｖ、４８Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、４８Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、４８Ｖ／３７３Ｖ、６７Ｅ／７０Ｇ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、６７Ｅ／７０Ｇ／１８１Ｋ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、６７Ｅ／７０Ｇ／１８１Ｋ／３７３Ｖ、６７Ｅ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ、６７Ｅ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、６７Ｅ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、６７Ｅ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、６７Ｅ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、７０Ｇ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、７０Ｇ／１８１Ｋ／２０３Ｖ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、７０Ｇ／２０３Ｖ、７０Ｇ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、７０Ｇ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、７０Ｇ／２０３Ｖ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／２３４Ｙ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／２３４Ｙ／２８２Ｋ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／２３４Ｙ／２９７Ｗ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／２３４Ｙ／２９７Ｗ／３４３Ｙ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／２３４Ｙ／２９７Ｗ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／２３４Ｙ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／２８２Ｋ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／２９７Ｗ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２１５Ｎ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２３４Ｙ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２３４Ｙ／３４６Ａ、７４Ｔ／１３６Ｙ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、７４Ｔ／２１５Ｎ、７４Ｔ／２１５Ｎ／２３４Ｙ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、７４Ｔ／２１５Ｎ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、７４Ｔ／２１５Ｎ／３４６Ａ、１３６Ｙ／２１５Ｎ／２３４Ｙ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１３６Ｙ／２１５Ｎ／２８２Ｋ／２９７Ｗ、１３６Ｙ／２１５Ｎ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１３６Ｙ／２１５Ｎ／２８２Ｋ／３４６Ａ、１３６Ｙ／２１５Ｎ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１３６Ｙ／２１５Ｎ／３４６Ａ、１３６Ｙ／２３４Ｙ／２９７Ｗ、１３６Ｙ／２３４Ｙ／２９７Ｗ／３４６Ａ、１３６Ｙ／２３４Ｙ／３４６Ａ、１３６Ｙ／２８２Ｋ／２９７Ｗ、１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ、１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ、１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、１８１Ｋ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、１８１Ｋ／２０３Ｖ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、１８１Ｋ／２０３Ｖ／３７３Ｖ、１８１Ｋ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、１８１Ｋ／２９６Ｒ、２０３Ｌ／２２４Ｔ／２５４Ｑ／３７３Ｍ、２０３Ｌ／２５４Ｑ、２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４３Ｒ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４３Ｒ／３７３Ｍ、２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４６Ｈ、２０３Ｌ／２５４Ｑ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、２０３Ｌ／２５４Ｑ／３７３Ｍ、２０３Ｌ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、２０３Ｌ／３７３Ｍ、２０３Ｖ／２０９Ｙ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、２０３Ｖ／２５６Ｇ、２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ、２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３２０Ｙ／３７３Ｖ、２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、２０３Ｖ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ／３８６Ｙ、２０３Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｖ、２０３Ｖ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、２０３Ｖ／３７３Ｖ、２１５Ｎ／２３４Ｙ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、２１５Ｎ／２３４Ｙ／２８２Ｋ／３４６Ａ、２１５Ｎ／２３４Ｙ／３４６Ａ、２３４Ｙ／２８２Ｋ／３４６Ａ、２５４Ｑ、２５４Ｑ／３４６Ｈ、２５４Ｑ／３４６Ｈ／３７３Ｍ、２５４Ｑ／３７３Ｍ、２５６Ｇ／２９６Ｒ、２５６Ｇ／２９６Ｒ／３７３Ｖ、２５６Ｇ／３７３Ｖ、２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、３４３Ｒ／３７３Ｍ、および３７３Ｍ／Ｖから選択される１つまたはそれを超える置換を含み、前記位置は配列番号２に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、Ａ３３Ｄ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ａ３６Ｅ／Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３
４６Ｈ、Ｓ４８Ｋ／Ａ１７６Ｔ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｎ３４３Ｒ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｎ３４３Ｒ／Ａ３５５Ｔ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｎ３４３Ｒ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｄ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｎ３４３Ｒ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｇ２０３Ｌ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｒ２５４Ｑ、Ｓ４８Ｋ／Ｒ２５４Ｑ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｒ２５４Ｑ／Ｎ３４３Ｒ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｋ／Ｒ２５４Ｑ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｒ１８１Ｋ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ／Ｇ３７８Ｄ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｇ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｒ１８１Ｋ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ／Ｑ３７４Ｌ、Ｓ４８Ｖ／Ｇ２０３Ｖ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ４８Ｖ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ、Ｒ６７Ｅ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｙ７０Ｇ／Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ、Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｙ７０Ｇ／Ｇ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ／Ｎ３４３Ｙ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｒ２８２Ｋ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｈ２３４Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｈ２３４Ｙ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｐ２１５Ｎ、Ｅ７４Ｔ／Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｐ２１５Ｎ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｅ７４Ｔ／Ｐ２１５Ｎ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ、Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｒ２８２Ｋ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｐ２１５Ｎ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ、Ｆ１３６Ｙ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｈ２３４Ｙ／Ｅ３４６Ａ、Ｆ１３６Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ、Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ、Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ、Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２０３Ｖ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ１８１Ｋ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ１８１Ｋ／Ｇ２９６Ｒ、Ｇ２０３Ｌ／Ｐ２２４Ｔ／Ｒ２５４Ｑ／Ｋ３７３Ｍ、Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ、Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｎ３４３Ｒ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｎ３４３Ｒ／Ｋ３７３Ｍ、Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｈ、Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｇ２０３Ｌ／Ｒ２５４Ｑ／Ｋ３７３Ｍ、Ｇ２０３Ｌ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｇ２０３Ｌ／Ｋ３７３Ｍ、Ｇ２０３Ｖ／Ｎ２０９Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ、Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ、Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｈ３２０Ｙ／Ｋ３７３Ｖ、Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ／Ｈ３８６Ｙ、Ｇ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｇ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｇ２０３Ｖ／Ｋ３７３Ｖ、Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｅ３４６Ａ、Ｐ２１５Ｎ／Ｈ２３４Ｙ／Ｅ３４６Ａ、Ｈ２３４Ｙ／Ｒ２８２Ｋ／Ｅ３４６Ａ、Ｒ２５４Ｑ、Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｈ、Ｒ２５４Ｑ／Ｅ３４６Ｈ／Ｋ３７３Ｍ、Ｒ２５４Ｑ／Ｋ３７３Ｍ、Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ、Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｖ、Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｅ３４６Ａ、Ｎ３４３Ｒ／Ｋ３７３Ｍ、およびＫ３７３Ｍ／Ｖから選択される１つまたはそれを超える置換を含み、前記位置は配列番号２に関してナンバリングされている。
【００８７】
いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、４８／４９、４９、５０、５０、３３１、２９１、２９２、３３０および３３１から選択される１つまたはそれを超える位置における置換を含み、前記位置は配列番号３４に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、４８Ｓ／４９Ｗ、４９Ｙ、５０Ａ／Ｆ／Ｑ／Ｒ、３３１Ｈ／Ｐ／Ｖ、２９１Ｃ、２９２Ｒ、３３０Ｈ／Ｙおよび３３１Ｒから選択される１つまたはそれを超える置換を含み、前記位置は配列番号３４に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、Ｋ４８Ｓ／Ｄ４９Ｗ、Ｄ４９Ｙ、Ｄ５０Ａ／Ｆ／Ｑ／Ｒ、Ｌ３３１Ｈ／Ｐ／Ｖ、Ｔ２９１Ｃ、Ｓ２９２Ｒ、Ｓ３３０Ｈ／ＹおよびＬ３３１Ｒから選択される１つまたはそれを超える置換を含み、前記位置は配列番号３４に関してナンバリングされている。
【００８８】
いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、２７／４８／６７／７０／７４／２３４／２５６／２８２／３４６／３７３、２７／４８／６７／７０／１３６／２０３／２１５／２５６／２８２／３４６／３７３、２７／４８／６７／７０／３４６／３７３、２７／４８／６７／７４／２０３／２５６／３４６／３７３、２７／６７／２３４／２９６／３７３、４５／２８７／３２８／３３３、４５／２９２／３２８、４８、４８／２８４／２９２／３３３、４８／２８７／２９２／２９７、４８／２８７／２９７／３２８／３３３、４８／２９２、４８／２９２／２９７、４８／４９／５０／２９２／３３１、４８／４９／５０／２９２、４８／４９／５０／３３１、４８／４９／３３０／３３１、４８／４９／５０／３４９、４８／４９／５０／２９１／２９２／３３１、４８／４９／５０／２９２／３３１、４８／６７／７０／２０３／２１５／２３４／２５６／３４６、４８／６７／７０／２３４／２５６／２８２／２９７／３４６、４８／６７／７０／３４６、４８／６７／７４／２０３／２３４／２５６／２８２／３４６／３７３、４８／６７／７４／２３４／２９７／３４６／３７３、４８／６７／７４／３４６、４８／６７／２０３／３４６／３７３、４８／６７／２３４／２５６／２９７／３４６／３７３、４８／６７／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／６７／２１５／２８２／２９７／３４６／３７３、４８／６７／３４６／３７３、４８／７０／７４／２９７／３４６／３７３、４８／７０／２０３／２１５／２５６／２８２／３４６／３７３、４８／７０／２１５／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／７４／２０３／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／７４／２３４／２５６／２９７／３４６／３７３、４８／１３６／２５６／３４６／３７３、４８／２０３／２３４／２５６／２９７／３４６／３７３、４８／２０３／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／２０３／２３４／３４６／３７３、４８／２０３／２９６／３７３、４８／２１５／２３４／３４６／３７３、４８／２１５／３４６／３７３、４８／２３４／２５６／２９６／３４６／３７３、４８／２３４／２５６／３４６／３７３、４８／２５６／３７３、４９／５０／２９２／３３１、４９／５０／２９２／３３１／３４９、４９／５０／３３１、４９／５０／３３１／３４９、５０、６７／７０／７４／１３６／２０３／２１５／２５６／３４６／３７３、６７／７０／７４／２０３／２１５／２３４／３４６／３７３、６７／７０／７４／２１５／２３４／２９７／３４６／３７３、６７／７０／７４／２１５／２５６／３７３、６７／７０／１３６／２０３／２９７／３４６／３７３、６７／７０／２０３／２１５／２５６／３４６／３７３、６７／７０／２０３／３７３、６７／７０／２１５、６７／７４／１３６、６７／７４／２０３／２３４／２５６、６７／７４／２１５／２５６／２９７／３４６／３７３、６７／７４／２１５／３４６／３７３、６７／７４／２５６／３４６／３７３、６７／１３６／２０３／２１５／２５６／３４６／３７３、６７／１３６／２０３／２５６／３４６／３７３、６７／２０３／２３４／２５６／３４６／３７３、６７／２０３／２９７／３４６／３７３、６７／２１５／２３４／２９７／３４６／３７３、６７／２９７／３４６、７０／７４／２０３／２１５／３４６／３７３、１３６、１３６／３４６／３７３、２０３／２３４／３４６、２０３／２３４／３４６／３７３、２０３／３７３、２３４／２８２、２８７、２３４／３４６／３７３、２８７／２９２、２８７／２９２／２９５／２９７、２８７／２９２／２９７、２８７／２９５／２９７、２８７／３３０／３３３、２９２、２９２／２９７、２９２／３３０／３３１、２９２／３３０／３３１、２９２／３３１、２９２／３３１／３４９、２９２／３４９、２９５、２９５／２９７／３３３、２９７／３２８、２９７／３７３、３２８／３３３、３３０、３３０／３３１、３３１、３３１／３４９、３３３、３４６／３７３、および３７３から選択される１つまたはそれを超える位置における置換を含み、前記位置は配列番号２５６に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、２７Ｓ／４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／７４Ｔ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／２８２Ｋ／３４６Ａ／３７３Ｌ、２７Ｓ／４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／１３６Ｙ／２０３Ｖ／２１５Ｈ／２５６Ｇ／２８２Ｋ／３４６Ａ／３７３Ｖ、２７Ｓ／４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｌ、
２７Ｓ／４８Ｖ／６７Ｅ／７４Ｔ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｍ、２７Ｓ／６７Ｅ／２３４Ｙ／２９６Ｒ／３７３Ｍ、４５Ｓ／２８７Ｓ／３２８Ｅ／３３３Ｐ、
４５Ｓ／２９２Ｋ／３２８Ｅ、４８Ａ、４８Ａ／２８４Ｇ／２９２Ｋ／３３３Ｐ、４８Ａ／２８７Ｓ／２９２Ｋ／２９７Ｙ、４８Ａ／２８７Ｓ／２９７Ｙ／３２８Ｅ／３３３Ｐ、
４８Ａ／２９２Ｋ、４８Ａ／２９２Ｋ／２９７Ｙ、４８Ｓ／４９Ｇ／５０Ａ／２９２Ｒ／３３１Ｐ、４８Ｓ／４９Ｗ／５０Ａ／２９２Ｒ、４８Ｓ／４９Ｗ／５０Ａ／３３１Ｖ、
４８Ｓ／４９Ｗ／３３０Ｙ／３３１Ｖ、４８Ｓ／４９Ｗ／５０Ａ／３４９Ｒ、４８Ｓ／４９Ｙ／５０Ａ／２９１Ｃ／２９２Ｒ／３３１Ｖ、４８Ｓ／４９Ｙ／５０Ｑ／２９２Ｒ／３３１Ｖ、
４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／２０３Ｖ／２１５Ｈ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／３４６Ａ、４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ、
４８Ｖ／６７Ｅ／７０Ｇ／３４６Ａ、４８Ｖ／６７Ｅ／７４Ｔ／２０３Ｖ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／２８２Ｋ／３４６Ａ／３７３Ｍ、４８Ｖ／６７Ｅ／７４Ｔ／２３４Ｙ／２９７Ｗ／３４６Ａ／３７３Ｍ、４８Ｖ／６７Ｅ／７４Ｔ／３４６Ａ、４８Ｖ／６７Ｅ／２０３Ｖ／３４６Ａ／３７３Ｍ、
４８Ｖ／６７Ｅ／２１５Ｈ／２８２Ｋ／２９７Ｗ／３４６Ａ／３７３Ｍ、４８Ｖ／６７Ｅ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／２９７Ｗ／３４６Ａ／３７３Ｖ、４８Ｖ／６７Ｅ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｍ、４８Ｖ／６７Ｅ／３４６Ａ／３７３Ｍ、４８Ｖ／７０Ｇ／７４Ｔ／２９７Ｗ／３４６Ａ／３７３Ｍ、
４８Ｖ／７０Ｇ／２０３Ｖ／２１５Ｈ／２５６Ｇ／２８２Ｋ／３４６Ａ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７０Ｇ／２１５Ｈ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｍ、
４８Ｖ／７４Ｔ／２０３Ｖ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｖ、４８Ｖ／７４Ｔ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／２９７Ｗ／３４６Ａ／３７３Ｖ、
４８Ｖ／１３６Ｙ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｍ、４８Ｖ／２０３Ｖ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／２９７Ｗ／３４６Ａ／３７３Ｖ、４８Ｖ／２０３Ｖ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｍ、４８Ｖ／２０３Ｖ／２３４Ｙ／３４６Ａ／３７３Ｍ、４８Ｖ／２０３Ｖ／２９６Ｒ／３７３Ｍ、
４８Ｖ／２１５Ｈ／２３４Ｙ／３４６Ａ／３７３Ｖ、４８Ｖ／２１５Ｈ／３４６Ａ／３７３Ｍ、４８Ｖ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／２９６Ｒ／３４６Ａ／３７３Ｍ、
４８Ｖ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｍ、４８Ｖ／２５６Ｇ／３７３Ｌ、４９Ｇ／５０Ａ／２９２Ｒ／３３１Ｖ、４９Ｇ／５０Ｑ／２９２Ｒ／３３１Ｖ／３４９Ｒ、
４９Ｗ／５０Ａ／３３１Ｖ、４９Ｗ／５０Ａ／３３１Ｖ／３４９Ｒ、５０Ａ、６７Ｅ／７０Ｇ／７４Ｔ／１３６Ｙ／２０３Ｖ／２１５Ｈ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｍ、
６７Ｅ／７０Ｇ／７４Ｔ／２０３Ｖ／２１５Ｈ／２３４Ｙ／３４６Ａ／３７３Ｖ、６７Ｅ／７０Ｇ／７４Ｔ／２１５Ｈ／２３４Ｙ／２９７Ｗ／３４６Ａ／３７３Ｌ、
６７Ｅ／７０Ｇ／７４Ｔ／２１５Ｈ／２５６Ｇ／３７３Ｍ、６７Ｅ／７０Ｇ／１３６Ｙ／２０３Ｖ／２９７Ｗ／３４６Ａ／３７３Ｍ、６７Ｅ／７０Ｇ／２０３Ｖ／２１５Ｈ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｌ、６７Ｅ／７０Ｇ／２０３Ｖ／３７３Ｍ、６７Ｅ／７０Ｇ／２１５Ｈ、６７Ｅ／７４Ｔ／１３６Ｙ、
６７Ｅ／７４Ｔ／２０３Ｖ／２３４Ｙ／２５６Ｇ、６７Ｅ／７４Ｔ／２１５Ｈ／２５６Ｇ／２９７Ｗ／３４６Ａ／３７３Ｌ、６７Ｅ／７４Ｔ／２１５Ｈ／３４６Ａ／３７３Ｖ、
６７Ｅ／７４Ｔ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｍ、６７Ｅ／１３６Ｙ／２０３Ｖ／２１５Ｈ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｖ、６７Ｅ／１３６Ｙ／２０３Ｖ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｍ、６７Ｅ／２０３Ｖ／２３４Ｙ／２５６Ｇ／３４６Ａ／３７３Ｖ、６７Ｅ／２０３Ｖ／２９７Ｗ／３４６Ａ／３７３Ｍ、
６７Ｅ／２１５Ｈ／２３４Ｙ／２９７Ｗ／３４６Ａ／３７３Ｖ、６７Ｅ／２９７Ｗ／３４６Ａ、７０Ｇ／７４Ｔ／２０３Ｖ／２１５Ｈ／３４６Ａ／３７３Ｖ、１３６Ｙ、
１３６Ｙ／３４６Ａ／３７３Ｍ、２０３Ｖ／２３４Ｙ／３４６Ａ、２０３Ｖ／２３４Ｙ／３４６Ａ／３７３Ｖ、２０３Ｖ／３７３Ｍ、２３４Ｙ／２８２Ｋ、２３４Ｙ／３４６Ａ／３７３Ｍ、２８７Ｓ、２８７Ｓ／２９２Ｋ、２８７Ｓ／２９２Ｋ／２９５Ｒ／２９７Ｙ、２８７Ｓ／２９２Ｋ／２９７Ｙ、２８７Ｓ／２９５Ｒ／２９７Ｙ、
２８７Ｓ／３３０Ｇ／３３３Ｐ、２９２Ｋ、２９２Ｋ／２９７Ｙ、２９２Ｒ、２９２Ｒ／３３０Ｙ／３３１Ｐ、２９２Ｒ／３３０Ｙ／３３１Ｖ、２９２Ｒ／３３１Ｖ、
２９２Ｒ／３３１Ｖ／３４９Ｒ、２９２Ｒ／３４９Ｒ、２９５Ｒ、２９５Ｒ／２９７Ｙ／３３３Ｐ、２９７Ｙ／３２８Ｅ、２９７Ｗ／３７３Ｍ、３２８Ｅ／３３３Ｐ、３３０Ｙ、３３０Ｙ／３３１Ｐ、３３１Ｖ、３３１Ｖ／３４９Ｒ、３３３Ｐ、３４６Ａ／３７３Ｖ、および３７３Ｍ／Ｖから選択される１つまたはそれを超える置換を含み、前記位置は配列番号２５６に関してナンバリングされている。いくつかの実施形態では、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドは、Ｎ２７Ｓ／Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｅ７４Ｔ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｒ２８２Ｋ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｌ、Ｎ２７Ｓ／Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｆ１３６Ｙ／Ｌ２０３Ｖ／Ｐ２１５Ｈ／Ｓ２５６Ｇ／Ｒ２８２Ｋ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｎ２７Ｓ／Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｌ、Ｎ２７Ｓ／Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｅ７４Ｔ／Ｌ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、
Ｎ２７Ｓ／Ｒ６７Ｅ／Ｈ２３４Ｙ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｍ、Ａ４５Ｓ／Ｐ２８７Ｓ／Ｎ３２８Ｅ／Ａ３３３Ｐ、Ａ４５Ｓ／Ｓ２９２Ｋ／Ｎ３２８Ｅ、Ｋ４８Ａ、
Ｋ４８Ａ／Ｒ２８４Ｇ／Ｓ２９２Ｋ／Ａ３３３Ｐ、Ｋ４８Ａ／Ｐ２８７Ｓ／Ｓ２９２Ｋ／Ｆ２９７Ｙ、Ｋ４８Ａ／Ｐ２８７Ｓ／Ｆ２９７Ｙ／Ｎ３２８Ｅ／Ａ３３３Ｐ、
Ｋ４８Ａ／Ｓ２９２Ｋ、Ｋ４８Ａ／Ｓ２９２Ｋ／Ｆ２９７Ｙ、Ｋ４８Ｓ／Ｄ４９Ｇ／Ｒ５０Ａ／Ｓ２９２Ｒ／Ｌ３３１Ｐ、Ｋ４８Ｓ／Ｄ４９Ｗ／Ｒ５０Ａ／Ｓ２９２Ｒ、
Ｋ４８Ｓ／Ｄ４９Ｗ／Ｒ５０Ａ／Ｌ３３１Ｖ、Ｋ４８Ｓ／Ｄ４９Ｗ／Ｓ３３０Ｙ／Ｌ３３１Ｖ、Ｋ４８Ｓ／Ｄ４９Ｗ／Ｒ５０Ａ／Ｓ３４９Ｒ、
Ｋ４８Ｓ／Ｄ４９Ｙ／Ｒ５０Ａ／Ｔ２９１Ｃ／Ｓ２９２Ｒ／Ｌ３３１Ｖ、Ｋ４８Ｓ／Ｄ４９Ｙ／Ｒ５０Ｑ／Ｓ２９２Ｒ／Ｌ３３１Ｖ、Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｌ２０３Ｖ／Ｐ２１５Ｈ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ、Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ、Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｈ３４６Ａ、
Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｅ７４Ｔ／Ｌ２０３Ｖ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｒ２８２Ｋ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｅ７４Ｔ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｅ７４Ｔ／Ｈ３４６Ａ、Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｌ２０３Ｖ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｐ２１５Ｈ／Ｒ２８２Ｋ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、
Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、
Ｋ４８Ｖ／Ｒ６７Ｅ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｋ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｅ７４Ｔ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｋ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｌ２０３Ｖ／Ｐ２１５Ｈ／Ｓ２５６Ｇ／Ｒ２８２Ｋ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｋ４８Ｖ／Ｙ７０Ｇ／Ｐ２１５Ｈ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｋ４８Ｖ／Ｅ７４Ｔ／Ｌ２０３Ｖ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｋ４８Ｖ／Ｅ７４Ｔ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｋ４８Ｖ／Ｆ１３６Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｋ４８Ｖ／Ｌ２０３Ｖ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｋ４８Ｖ／Ｌ２０３Ｖ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、
Ｋ４８Ｖ／Ｌ２０３Ｖ／Ｈ２３４Ｙ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｋ４８Ｖ／Ｌ２０３Ｖ／Ｇ２９６Ｒ／Ｋ３７３Ｍ、Ｋ４８Ｖ／Ｐ２１５Ｈ／Ｈ２３４Ｙ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｋ４８Ｖ／Ｐ２１５Ｈ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｋ４８Ｖ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｇ２９６Ｒ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｋ４８Ｖ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、
Ｋ４８Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｌ、Ｄ４９Ｇ／Ｒ５０Ａ／Ｓ２９２Ｒ／Ｌ３３１Ｖ、Ｄ４９Ｇ／Ｒ５０Ｑ／Ｓ２９２Ｒ／Ｌ３３１Ｖ／Ｓ３４９Ｒ、Ｄ４９Ｗ／Ｒ５０Ａ／Ｌ３３１Ｖ、Ｄ４９Ｗ／Ｒ５０Ａ／Ｌ３３１Ｖ／Ｓ３４９Ｒ、Ｒ５０Ａ、Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ／Ｌ２０３Ｖ／Ｐ２１５Ｈ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｅ７４Ｔ／Ｌ２０３Ｖ／Ｐ２１５Ｈ／Ｈ２３４Ｙ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｅ７４Ｔ／Ｐ２１５Ｈ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｌ、Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｅ７４Ｔ／Ｐ２１５Ｈ／Ｓ２５６Ｇ／Ｋ３７３Ｍ、Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｆ１３６Ｙ／Ｌ２０３Ｖ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｌ２０３Ｖ／Ｐ２１５Ｈ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｌ、Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｌ２０３Ｖ／Ｋ３７３Ｍ、Ｒ６７Ｅ／Ｙ７０Ｇ／Ｐ２１５Ｈ、Ｒ６７Ｅ／Ｅ７４Ｔ／Ｆ１３６Ｙ、Ｒ６７Ｅ／Ｅ７４Ｔ／Ｌ２０３Ｖ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ、Ｒ６７Ｅ／Ｅ７４Ｔ／Ｐ２１５Ｈ／Ｓ２５６Ｇ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｌ、Ｒ６７Ｅ／Ｅ７４Ｔ／Ｐ２１５Ｈ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｅ７４Ｔ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、
Ｒ６７Ｅ／Ｆ１３６Ｙ／Ｌ２０３Ｖ／Ｐ２１５Ｈ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｆ１３６Ｙ／Ｌ２０３Ｖ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、
Ｒ６７Ｅ／Ｌ２０３Ｖ／Ｈ２３４Ｙ／Ｓ２５６Ｇ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｌ２０３Ｖ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、
Ｒ６７Ｅ／Ｐ２１５Ｈ／Ｈ２３４Ｙ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｒ６７Ｅ／Ｆ２９７Ｗ／Ｈ３４６Ａ、Ｙ７０Ｇ／Ｅ７４Ｔ／Ｌ２０３Ｖ／Ｐ２１５Ｈ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｆ１３６Ｙ、Ｆ１３６Ｙ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｌ２０３Ｖ／Ｈ２３４Ｙ／Ｈ３４６Ａ、
Ｌ２０３Ｖ／Ｈ２３４Ｙ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、Ｌ２０３Ｖ／Ｋ３７３Ｍ、Ｈ２３４Ｙ／Ｒ２８２Ｋ、Ｈ２３４Ｙ／Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｍ、Ｐ２８７Ｓ、
Ｐ２８７Ｓ／Ｓ２９２Ｋ、Ｐ２８７Ｓ／Ｓ２９２Ｋ／Ｅ２９５Ｒ／Ｆ２９７Ｙ、Ｐ２８７Ｓ／Ｓ２９２Ｋ／Ｆ２９７Ｙ、Ｐ２８７Ｓ／Ｅ２９５Ｒ／Ｆ２９７Ｙ、Ｐ２８７Ｓ／Ｓ３３０Ｇ／Ａ３３３Ｐ、Ｓ２９２Ｋ、Ｓ２９２Ｋ／Ｆ２９７Ｙ、Ｓ２９２Ｒ、Ｓ２９２Ｒ／Ｓ３３０Ｙ／Ｌ３３１Ｐ、Ｓ２９２Ｒ／Ｓ３３０Ｙ／Ｌ３３１Ｖ、
Ｓ２９２Ｒ／Ｌ３３１Ｖ、Ｓ２９２Ｒ／Ｌ３３１Ｖ／Ｓ３４９Ｒ、Ｓ２９２Ｒ／Ｓ３４９Ｒ、Ｅ２９５Ｒ、Ｅ２９５Ｒ／Ｆ２９７Ｙ／Ａ３３３Ｐ、Ｆ２９７Ｙ／Ｎ３２８Ｅ、
Ｆ２９７Ｗ／Ｋ３７３Ｍ、Ｎ３２８Ｅ／Ａ３３３Ｐ、Ｓ３３０Ｙ、Ｓ３３０Ｙ／Ｌ３３１Ｐ、Ｌ３３１Ｖ、Ｌ３３１Ｖ／Ｓ３４９Ｒ、Ａ３３３Ｐ、Ｈ３４６Ａ／Ｋ３７３Ｖ、およびＫ３７３Ｍ／Ｖから選択される１つまたはそれを超える置換を含み、前記位置は配列番号２５６に関してナンバリングされている。
【００８９】
本発明はまた、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子発現を制御する１つまたはそれを超える異種調節配列にポリヌクレオチドを作動可能に連結して、前記ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製する。操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、対応するトランスグルタミナーゼポリペプチドを発現させ得る。
【００９０】
様々なアミノ酸に対応するコドンが知られているおかげで、タンパク質配列が利用できることで、対象をコードすることができるすべてのポリヌクレオチドの説明が得られる。同じアミノ酸が代替または同義コドンによりコードされる遺伝子コードの縮重は、非常に多数の核酸を作製することを可能にし、これらはすべて、本明細書に開示される改善されたトランスグルタミナーゼ酵素をコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を同定したら、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない方法で、１つまたはそれを超えるコドンの配列を単に改変することにより、任意の数の様々な核酸を作製し得る。これに関して、本開示は、可能なコドン選択に基づく組み合わせを選択することにより作製され得るポリヌクレオチドのそれぞれのおよびすべての可能なバリエーションを具体的に企図し、すべてのこのようなバリエーションは、本明細書の実施例の表に示されているアミノ酸配列を含む本明細書に開示される任意のポリペプチドについて具体的に開示されるとみなされるべきである。
【００９１】
様々な実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質が産生されている宿主細胞に適合するように選択される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌において遺伝子を発現させるために使用され；酵母において使用される好ましいコドンは、酵母における発現に使用され、哺乳動物において使用される好ましいコドンは、哺乳動物細胞における発現に使用される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、天然配列は好ましいコドンを含むので、および好ましいコドンの使用は、すべてのアミノ酸残基に必要とされない場合があるので、トランスグルタミナーゼポリペプチドのコドン使用頻度を最適化するために、すべてのコドンが置き換えられる必要はない。その結果として、トランスグルタミナーゼ酵素をコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、全長コード領域の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％または９０％を超えるコドン位置で好ましいコドンを含有し得る。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、６、３４および／または２５６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、６、３４および／または２５６と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、６、３４および／または２５６のトランスグルタミナーゼアミノ酸配列をコードする。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１、５、３３および／または２５５と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、配列番号１、５、３３および／または２５５と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するポリヌクレオチド配列を提供する。
【００９４】
いくつかの実施形態では、単離されたポリヌクレオチドは、改善されたもの（an  improved）をコードする。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号２、６、３４および／または２５６と少なくとも約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％またはそれを超える配列同一性を有するアミノ酸配列を有するトランスグルタミナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。ポリペプチドは、ポリペプチドの改善された活性および／または発現を提供するための様々な方法で操作される。発現ベクターに応じて、ベクターへの挿入前に、単離されたポリヌクレオチドの操作が望ましいかまたは必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技術は、当技術分野で周知である。
【００９５】
例えば、変異誘発および定向進化法をポリヌクレオチドに容易に適用してバリアントライブラリーを生成し得、これを発現させ、スクリーニングし、アッセイし得る。変異誘発および定向進化法は、当技術分野で周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、第５，８１１，２３８号、第５，８３０，７２１号、第５，８３４，２５２号、第５，８３７，４５８号、第５，９２８，９０５号、第６，０９６，５４８号、第６，１１７，６７９号、第６，１３２，９７０号、第６，１６５，７９３号、第６，１８０，４０６号、第６，２５１，６７４号、第６，２６５，２０１号、第６，２７７，６３８号、第６，２８７，８６１号、第６，２８７，８６２号、第６，２９１，２４２号、第６，２９７，０５３号、第６，３０３，３４４号、第６，３０９，８８３号、第６，３１９，７１３号、第６，３１９，７１４号、第６，３２３，０３０号、第６，３２６，２０４号、第６，３３５，１６０号、第６，３３５，１９８号、第６，３４４，３５６号、第６，３５２，８５９号、第６，３５５，４８４号、第６，３５８，７４０号、第６，３５８，７４２号、第６，３６５，３７７号、第６，３６５，４０８号、第６，３６８，８６１号、第６，３７２，４９７号、第６，３３７，１８６号、第６，３７６，２４６号、第６，３７９，９６４号、第６，３８７，７０２号、第６，３９１，５５２号、第６，３９１，６４０号、第６，３９５，５４７号、第６，４０６，８５５号、第６，４０６，９１０号、第６，４１３，７４５号、第６，４１３，７７４号、第６，４２０，１７５号、第６，４２３，５４２号、第６，４２６，２２４号、第６，４３６，６７５号、第６，４４４，４６８号、第６，４５５，２５３号、第６，４７９，６５２号、第６，４８２，６４７号、第６，４８３，０１１号、第６，４８４，１０５号、第６，４８９，１４６号、第６，５００，６１７号、第６，５００，６３９号、第６，５０６，６０２号、第６，５０６，６０３号、第６，５１８，０６５号、第６，５１９，０６５号、第６，５２１，４５３号、第６，５２８，３１１号、第６，５３７，７４６号、第６，５７３，０９８号、第６，５７６，４６７号、第６，５７９，６７８号、第６，５８６，１８２号、第６，６０２，９８６号、第６，６０５，４３０号、第６，６１３，５１４号、第６，６５３，０７２号、第６，６８６，５１５号、第６，７０３，２４０号、第６，７１６，６３１号、第６，８２５，００１号、第６，９０２，９２２号、第６，９１７，８８２号、第６，９４６，２９６号、第６，９６１，６６４号、第６，９９５，０１７号、第７，０２４，３１２号、第７，０５８，５１５号、第７，１０５，２９７号、第７，１４８，０５４号、第７，２２０，５６６号、第７，２８８，３７５号、第７，３８４，３８７号、第７，４２１，３４７号、第７，４３０，４７７号、第７，４６２，４６９号、第７，５３４，５６４号、第７，６２０，５００号、第７，６２０，５０２号、第７，６２９，１７０号、第７，７０２，４６４号、第７，７４７，３９１号、第７，７４７，３９３号、第７，７５１，９８６号、第７，７７６，５９８号、第７，７８３，４２８号、第７，７９５，０３０号、第７，８５３，４１０号、第７，８６８，１３８号、第７，７８３，４２８号、第７，８７３，４７７号、第７，８７３，４９９号、第７，９０４，２４９号、第７，９５７，９１２号、第７，９８１，６１４号、第８，０１４，９６１号、第８，０２９，９８８号、第８，０４８，６７４号、第８，０５８，００１号、第８，０７６，１３８号、第８，１０８，１５０号、第８，１７０，８０６号、第８，２２４，５８０号、第８，３７７，６８１号、第８，３８３，３４６号、第８，４５７，９０３号、第８，５０４，４９８号、第８，５８９，０８５号、第８，７６２，０６６号、第８，７６８，８７１号、第９，５９３，３２６号および関連するすべての米国および非米国の対応するもの；Ｌｉｎｇら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，２５４（２）：１５７−７８［１９９７］；Ｄａｌｅら、Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，５７：３６９−７４［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１９：４２３−４６２［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：１１９３−１２０１［１９８５］；Ｃａｒｔｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２３７：１−７［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒら、Ｃｅｌｌ，３８：８７９−８８７［１９８４］；Ｗｅｌｌｓら、Ｇｅｎｅ，３４：３１５−３２３［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌら、Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．，３：２８４−２９０［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１７：２５９−２６４［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔｕｒｅ，３９１：２８８−２９１［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１５：４３６−４３８［１９９７］；Ｚｈａｎｇら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９４：４５０４−４５０９［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１４：３１５−３１９［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ，３７０：３８９−３９１［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１：１０７４７−１０７５１［１９９４］；国際公開第９５／２２６２５号；国際公開第９７／００７８号；国際公開第９７／３５９６６号；国際公開第９８／２７２３０号；国際公開第００／４２６５１号；国際公開第０１／７５７６７号；および国際公開第２００９／１５２３３６号（これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【００９６】
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントトランスグルタミナーゼは、コードされる酵素の活性を変化させないさらなる配列をさらに含む。例えば、いくつかの実施形態では、バリアントトランスグルタミナーゼは、エピトープタグ、または精製において有用な別の配列に連結される。
【００９７】
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドは、それを発現する宿主細胞（例えば、酵母または糸状菌宿主細胞）から分泌され、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列であって、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向けさせるアミノ酸配列）を含むプレタンパク質として発現される。
【００９８】
いくつかの実施形態では、シグナルペプチドは、内因性Ｓ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓトランスグルタミナーゼシグナルペプチドである。いくつかのさらなる実施形態では、他のＳ．ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓ分泌タンパク質由来のシグナルペプチドが使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞および他の因子に応じて、他のシグナルペプチドが使用される。糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼおよびＴ．ｒｅｅｓｅｉセロビオヒドロラーゼＩＩから得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。細菌宿主細胞のためのシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ１１８３７マルトース生成アミラーゼ（ｍａｌｔｏｇｅｎｉｃ  ａｍｙｌａｓｅ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。いくつかのさらなる実施形態では、他のシグナルペプチドが本発明において使用される（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７：１０９−１３７［１９９３］（これは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。酵母宿主細胞のためのさらなる有用なシグナルペプチドとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ＳＵＣ２インベルターゼの遺伝子に由来するものが挙げられる（例えば、Ｔａｕｓｓｉｇ  ａｎｄ  Ｃａｒｌｓｏｎ，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１１：１９４３−５４［１９８３］；ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．Ｐ００７２４；およびＲｏｍａｎｏｓら、Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８［１９９２］を参照のこと）。いくつかの実施形態では、これらのシグナルペプチドのバリアントおよび他のシグナルペプチドが使用される。実際、当技術分野で公知の任意の適切なシグナルペプチドが本発明において使用されるので、本発明は、いかなる特定のシグナルペプチドにも限定されるものではない。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明は、本明細書に記載されるバリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドおよび／または生物学的に活性なその断片をコードするポリヌクレオチドを提供する。いくつかの実施形態では、遺伝子発現を制御する１つまたはそれを超える異種調節配列または制御配列にポリヌクレオチドを作動可能に連結して、ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを作製する。いくつかの実施形態では、バリアントトランスグルタミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を適切な宿主細胞に導入して、バリアントトランスグルタミナーゼを発現させる。
【０１００】
当業者は、遺伝子コードの縮重に起因して、本発明のバリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が多数存在することを理解する。例えば、コドンＡＧＡ、ＡＧＧ、ＣＧＡ、ＣＧＣ、ＣＧＧおよびＣＧＵはすべて、アミノ酸アルギニンをコードする。したがって、コドンによりアルギニンが指定される本発明の核酸内のすべての位置において、コドンは、コードされるポリペプチドを変化させずに、対応する上記コドンのいずれかに変化され得る。ＲＮＡ配列内の「Ｕ」は、ＤＮＡ配列内の「Ｔ」に対応することが理解される。本発明は、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することにより作製され得る本発明のポリペプチドをコードする核酸配列のそれぞれのおよびすべての可能なバリエーションを企図および提供する。
【０１０１】
上記に示されているように、トランスグルタミナーゼをコードするＤＮＡ配列はまた、高コドン使用頻度バイアスのコドン（同じアミノ酸をコードする他のコドンより、タンパク質コード領域において高い頻度で使用されるコドン）について設計され得る。好ましいコドンは、１個の遺伝子、共通の機能もしくは起源の一連の遺伝子、高度に発現された遺伝子におけるコドン使用頻度、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度、関連する生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン出現頻度、またはそれらの組み合わせに関して決定され得る。遺伝子発現レベルと共にその頻度が増加するコドンは、典型的には、発現のための最適なコドンである。特に、ＤＮＡ配列は、特定の宿主生物における発現のために最適化され得る。多変量分析（例えば、クラスタ分析または対応分析を使用する）を含む、特異的生物におけるコドン出現頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的な同義コドン使用頻度）およびコドン優先度を決定するための様々な方法、ならびに遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための様々な方法が当技術分野で周知である。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質をコードすることができる任意の入手可能なヌクレオチド配列に依拠し得る。これらのデータセットは、当技術分野で周知であるように、発現タンパク質をコードすることが実際に公知である核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現配列タグ（ＥＳＴ）、またはゲノム配列の予測されるコード領域を含む。バリアントトランスグルタミナーゼをコードするポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して調製され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドを個々に合成し、次いで、（例えば、酵素的ライゲーション法もしくは化学的ライゲーション法またはポリメラーゼ媒介法により）結合して、基本的に任意の所望の連続配列を形成する。いくつかの実施形態では、本発明のポリヌクレオチドは、限定されないが、自動合成法を含む当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用した化学合成により調製される。例えば、ホスホラミダイト法では、オリゴヌクレオチドを合成し（例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーで）、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクターにクローニングする。いくつかの実施形態では、次いで、相補鎖を合成し、その鎖を一緒に適切な条件下でアニーリングすることにより、または適切なプライマー配列を有するＤＮＡポリメラーゼを使用して相補鎖を付加することにより、二本鎖ＤＮＡ断片を得る。本発明において有用な方法を提供する多数の一般的および標準的なテキストが当業者に周知である。
【０１０２】
操作されたトランスグルタミナーゼは、天然に存在するトランスグルタミナーゼをコードするポリヌクレオチドを上記変異誘発および／または定向進化法に供することにより得られ得る。変異誘発は、ランダム変異誘発および部位特異的変異誘発を含む当技術分野で公知の技術のいずれかにしたがって実施され得る。定向進化法は、シャッフリングを含む、改善されたバリアントについてスクリーニングするための当技術分野で公知の技術のいずれかを用いて実施され得る。使用される他の定向進化法手順としては、限定されないが、互い違い伸長プロセス（ＳｔＥＰ）、インビトロ組換え、変異誘発ＰＣＲ、カセット変異誘発、オーバーラップ伸長によるスプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）、ＰｒｏＳＡＲ（商標）定向進化法など、ならびに任意の他の適切な方法が挙げられる。
【０１０３】
変異誘発処理にしたがって得られたクローンは、所望の改善された酵素特性を有する操作されたトランスグルタミナーゼについてスクリーニングされる。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、生成物が形成される速度をモニタリングする標準的な生化学技術を使用して実施され得る。所望の改善された酵素特性が熱安定性である場合、酵素調製物を規定温度に供し、熱処理後に残存する酵素活性の量を測定した後に、酵素活性を測定し得る。次いで、トランスグルタミナーゼをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを単離し、配列決定してヌクレオチド配列の変化を同定し（存在する場合）、これを使用して酵素を宿主細胞で発現させる。
【０１０４】
操作されたポリペプチドの配列が公知である場合、酵素をコードするポリヌクレオチドは、公知の合成方法にしたがって、標準的な固相法により調製され得る。いくつかの実施形態では、最大約１００塩基の断片を個々に合成し、次いで、（例えば、酵素的ライゲーション法もしくは化学的ライゲーション法またはポリメラーゼ媒介法により）結合して、任意の所望の連続配列を形成し得る。例えば、本発明のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、（典型的には、自動合成方法で実施されるので、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔ．Ｌｅｔｔ．，２２：１８５９−６９［１９８１］に記載されている古典的なホスホラミダイト法、またはＭａｔｔｈｅｓら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：８０１−０５［１９８４］に記載されている方法を使用した）化学合成により調製され得る。ホスホラミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドを、合成し（例えば、自動ＤＮＡシンセサイザーで）、精製し、アニーリングし、ライゲーションし、適切なベクターにクローニングする。加えて、基本的に任意の核酸が、様々な商業的供給源のいずれかから入手され得る（例えば、Ｔｈｅ  Ｍｉｄｌａｎｄ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｍｉｄｌａｎｄ，ＴＸ，Ｔｈｅ  Ｇｒｅａｔ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｒａｍｏｎａ，ＣＡ，ＥｘｐｒｅｓｓＧｅｎ  Ｉｎｃ．Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ，Ｏｐｅｒｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｌａｍｅｄａ，ＣＡなど）。
【０１０５】
本発明はまた、本明細書で提供されるように、少なくとも１つのバリアントトランスグルタミナーゼをコードする配列を含む組換え構築物を提供する。いくつかの実施形態では、本発明は、異種プロモーターに作動可能に連結されたバリアントトランスグルタミナーゼポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターを使用して適切な宿主細胞を形質転換して、宿主細胞がバリアントトランスグルタミナーゼタンパク質を発現するのを可能にする。真菌および他の生物におけるタンパク質の組換え発現のための方法は当技術分野で周知であり、いくつかの発現ベクターが利用可能であるかまたはルーチンな方法を使用して構築され得る。いくつかの実施形態では、本発明の核酸構築物は、本発明の核酸配列が挿入されたベクター、例えばプラスミド、コスミド、ファージ、ウイルス、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）などを含む。いくつかの実施形態では、バリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドを発現させるために適切な様々な発現ベクターのいずれか１つに本発明のポリヌクレオチドを組み込む。適切なベクターとしては、限定されないが、染色体ＤＮＡ配列、非染色体ＤＮＡ配列および合成ＤＮＡ配列（例えば、ＳＶ４０の誘導体）、ならびに細菌プラスミド、ファージＤＮＡ、バキュロウイルス、酵母プラスミド、プラスミドとファージＤＮＡの組み合わせに由来するベクター、ワクシニア、アデノウイルス、鶏痘ウイルス、仮性狂犬病、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルスおよび多くの他のものなどのウイルスＤＮＡが挙げられる。遺伝物質を細胞に形質導入し、複製が望まれる場合には関連宿主において複製可能かつ生存可能である任意の適切なベクターが本発明において使用される。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、構築物は、タンパク質をコードする配列に作動可能に連結された調節配列（限定されないがプロモーターを含む）をさらに含む。多数の適切なベクターおよびプロモーターが当業者に公知である。実際、いくつかの実施形態では、特定の宿主において高い発現のレベルを得るために、多くの場合、本発明のバリアントトランスグルタミナーゼを異種プロモーターの制御下で発現させることが有用である。いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して、プロモーター配列をバリアントトランスグルタミナーゼコード配列の５’領域に作動可能に連結する。バリアントトランスグルタミナーゼを発現させるために有用なプロモーターの例としては、限定されないが、真菌由来のプロモーターが挙げられる。いくつかの実施形態では、真菌株においてトランスグルタミナーゼ遺伝子以外の遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列が使用される。非限定的な例として、エンドグルカナーゼをコードする遺伝子由来の真菌プロモーターが使用され得る。いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼが由来する真菌株以外の真菌株においてトランスグルタミナーゼ遺伝子の発現を駆動するプロモーター配列が使用される。糸状菌宿主細胞において本発明のヌクレオチド構築物の転写を指令するために有用な他の適切なプロモーターの例としては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定α−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリ性プロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター（例えば、国際公開第９６／００７８７号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性α−アミラーゼの遺伝子由来のプロモーターとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ｃｂｈ１、ｃｂｈ２、ｅｇｌ１、ｅｇｌ２、ｐｅｐＡ、ｈｆｂ１、ｈｆｂ２、ｘｙｎ１、ａｍｙおよびｇｌａＡなどのプロモーター（例えば、Ｎｕｎｂｅｒｇら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．，４：２３０６−２３１５［１９８４］；Ｂｏｅｌら、ＥＭＢＯ  Ｊ．，３：１５８１−８５［１９８４］；および欧州特許出願第１３７２８０号（これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、ならびにその変異体プロモーター、短縮型プロモーターおよびハイブリッドプロモーターが挙げられる。
【０１０７】
酵母宿主細胞では、有用なプロモーターとしては、限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ｅｎｏ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ｇａｌ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）およびＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子由来のプロモーターが挙げられる。酵母宿主細胞に対して有用なさらなる有用なプロモーターは当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら、Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８［１９９２］（これは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。加えて、真菌におけるキチナーゼ産生に関連するプロモーターが本発明において使用される（例えば、Ｂｌａｉｓｅａｕ  ａｎｄ  Ｌａｆａｙ，Ｇｅｎｅ  １２０２４３−２４８［１９９２］；およびＬｉｍｏｎら、Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅｔ．，２８：４７８−８３［１９９５］（これらは両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１０８】
細菌宿主細胞については、本開示の核酸構築物の転写を指令するための適切なプロモーターとしては、限定されないが、大腸菌ｌａｃオペロン、大腸菌ｔｒｐオペロン、バクテリオファージλ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ  α−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡ遺伝子およびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物のβ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（例えば、Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：３７２７−３７３１［１９７８］を参照のこと）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８０：２１−２５［１９８３］を参照のこと）が挙げられる。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、クローニングされた本発明のバリアントトランスグルタミナーゼはまた、適切な転写ターミネーター配列（宿主細胞により認識されて転写を終結させる配列）を有する。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞内で機能的である任意のターミネーターが本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターとしては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる（例えば、米国特許第７，３９９，６２７号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）も参照のこと）。いくつかの実施形態では、酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターとしては、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素の遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは当業者に周知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら、Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−８８［１９９２］を参照のこと）。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、適切なリーダー配列（これは、宿主細胞による翻訳に重要なｍＲＮＡの非翻訳領域）は、クローニングされたバリアントトランスグルタミナーゼ配列の一部である。リーダー配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞内で機能的である任意のリーダー配列が本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーとしては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーとしては、限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸脱水素酵素（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られるものが挙げられる。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、本発明の配列はまた、ポリアデニル化配列（核酸配列の３’末端に作動可能に連結される配列であって、ポリアデノシン残基を転写されたｍＲＮＡに付加するシグナルとして転写時に宿主細胞により認識される配列）を含む。選択される宿主細胞内で機能的である任意のポリアデニル化配列が本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列としては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ  α−グルコシダーゼの遺伝子から得られるものが挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、当技術分野で公知である（例えば、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，ｌ５：５９８３−５９９０［１９９５］を参照のこと）。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードするシグナルペプチドコード領域を含み、コードされるポリペプチドを細胞の分泌経路に向けさせる。核酸配列のコード配列の５’末端は、翻訳読み枠において、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を固有に含有し得る。あるいは、コード配列の５’末端は、このコード配列にとって外来であるシグナルペプチドコード領域を含有し得る。コード配列がシグナルペプチドコード領域を天然に含有しない場合、外来シグナルペプチドコード領域が必要とされ得る。
【０１１３】
あるいは、ポリペプチドの分泌を増強するために、外来のシグナルペプチドコード領域で天然のシグナルペプチドコード領域を単に置き換え得る。しかしながら、選択される宿主細胞の分泌経路に発現したポリペプチドを誘導する任意のシグナルペプチドコード領域が本発明において使用され得る。
【０１１４】
細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ１１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ  α−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ  β−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野で公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５７：１０９−１３７［１９９３］を参照のこと）。
【０１１５】
糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。
【０１１６】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとしては、限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子が挙げられる。他の有用なシグナルペプチドコード領域は、当技術分野で公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓら、［１９９２］、前掲を参照のこと）。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域を含む。得られるポリペプチドは、プロ酵素またはプロポリペプチド（またはいくつかの場合では、チモーゲン）として公知である。プロポリペプチドは、一般に不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的切断または自己触媒的切断により、成熟活性トランスグルタミナーゼポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリ性プロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  α−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子から得られ得る（例えば、国際公開第９５／３３８３６号を参照のこと）。
【０１１８】
シグナルペプチドおよびプロペプチド領域が両方とも、ポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に配置され、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に配置される。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、調節配列はまた、宿主細胞の成長に関連して、ポリペプチドの発現の調節を可能にするために使用される。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的または物理的な刺激に応答して、遺伝子の発現をオンまたはオフするものである。原核生物宿主細胞では、適切な調節配列としては、限定されないが、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞では、適切な調節系としては、例として、ＡＤＨ２システムまたはＧＡＬ１システムが挙げられる。糸状菌では、適切な調節配列としては、ＴＡＫＡ  α−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０１２０】
調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物の系では、これらとしては、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子および重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子が挙げられる。これらの場合では、本発明のトランスグルタミナーゼポリペプチドをコードする核酸配列が調節配列に作動可能に連結される。
【０１２１】
したがって、さらなる実施形態では、本発明は、導入される宿主の種類に応じて、操作されたトランスグルタミナーゼポリペプチドまたはそのバリアントをコードするポリヌクレオチドと、１つまたはそれを超える発現調節領域、例えばプロモーターおよびターミネーターと、複製起点などとを含む組換え発現ベクターを提供する。いくつかの実施形態では、上記様々な核酸および制御配列を一緒に結合させて、１つまたはそれを超える便利な制限部位（これは、このような部位において、ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にする）を含み得る組換え発現ベクターを産生する。あるいは、いくつかの実施形態では、核酸配列は、該核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することにより発現させる。発現ベクターの作製では、コード配列は、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結されるようにベクター中に配置される。
【０１２２】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に簡便に供され得る任意の適切なベクターであって、ポリヌクレオチド配列の発現をもたらし得る任意の適切なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）を含む。ベクターの選択は、典型的には、ベクターが導入される宿主細胞とのベクターの適合性に依存する。いくつかの実施形態では、ベクターは、線状または閉環状プラスミドである。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、発現ベクターは自律複製ベクター（すなわち、染色体外の実体として存在し、その複製が染色体複製とは独立するベクター、例えばプラスミド、染色体外因子、ミニ染色体または人工染色体）である。いくつかの実施形態では、ベクターは、自己複製を保証するための何らかの手段を含有する。あるいは、いくつかの他の実施形態では、ベクターは、宿主細胞中に導入されるとゲノムに組み込まれて、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製される。さらに、さらなる実施形態では、宿主細胞のゲノム中またはトランスポゾン中に導入される全ＤＮＡを一緒に含有する１つのベクターもしくはプラスミドまたは２つもしくはそれを超えるベクターもしくはプラスミドが使用される。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つまたはそれを超える選択マーカーを含有する。「選択マーカー」は、その産物が殺生物剤耐性またはウイルス耐性、抗菌薬または重金属に対する耐性、栄養要求体への原栄養性などを与える遺伝子である。限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸還元酵素）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸脱炭酸酵素）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）ならびにこれらの等価物を含む、糸状菌宿主細胞において使用するための任意の適切な選択マーカーが本発明において使用される。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓなどの宿主細胞において有用なさらなるマーカーとしては、限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅのａｍｄＳ遺伝子およびｐｙｒＧ遺伝子、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓのｂａｒ遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なマーカーとしては、限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。細菌選択マーカーの例としては、限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールおよびまたはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、本発明の発現ベクターは、宿主細胞のゲノム中へのベクターの組み込みまたは細胞における、ゲノムとは独立したベクターの自律複製を可能にするエレメントを含有する。宿主細胞のゲノム中への組み込みを伴ういくつかの実施形態では、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、または相同組換えもしくは非相同組換えによりゲノム中にベクターを組み込むためのベクターの任意の他のエレメントに依拠する。
【０１２６】
いくつかの代替的な実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞のゲノム中への相同組換えによる組み込みを指令するさらなる核酸配列を含有する。さらなる核酸配列は、ベクターが、宿主細胞のゲノム中に、染色体（複数可）の正確な位置（複数可）に組み込まれることを可能にする。正確な位置に組み込まれる可能性（likelihood）を増加させるために、組み込みエレメントは、相同組換えの確率を増強するために対応する標的配列と高度に相同なヌクレオチドを、好ましくは、１００〜１０，０００塩基対、好ましくは４００〜１０，０００塩基対、および最も好ましくは８００〜１０，０００塩基対などの十分な数で含有する。組み込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同な任意の配列であり得る。さらに、組み込みエレメントは、非コード核酸配列またはコード核酸配列であり得る。他方、ベクターは、非相同組換えにより宿主細胞のゲノムに組み込まれ得る。
【０１２７】
自律複製のために、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において自律的に複製することを可能にする複製起点をさらに含み得る。細菌複製起点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉまたはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７の複製起点（Ｐ１５Ａ  ｏｒｉを有するプラスミド）、または大腸菌における複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４、ｐＴＡ１０６０、もしくはｐＡＭβ１である。酵母宿主細胞において使用するための複製起点の例は、２ミクロン複製起点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１とＣＥＮ３の組み合わせおよびＡＲＳ４とＣＥＮ６の組み合わせである。複製起点は、宿主細胞においてそれの機能性を温度感受性にする変異を有するものであり得る（例えば、Ｅｈｒｌｉｃｈ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７５：１４３３［１９７８］を参照のこと）。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、遺伝子産物の産生を増加させるために、１コピーを超える本発明の核酸配列を宿主細胞に挿入する。核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも１つのさらなるコピーを宿主細胞のゲノムに組み込むことにより、または増幅可能な選択マーカー遺伝子を核酸配列と共に含めることにより得られ得、この場合、細胞を適切な選択可能な薬剤の存在下で培養することにより、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーおよびそれにより核酸配列のさらなるコピーを含有する細胞が選択され得る。
【０１２９】
本発明において使用するための発現ベクターの多くは市販されている。適切な市販の発現ベクターとしては、限定されないが、ＣＭＶプロモーターと、哺乳動物宿主細胞における発現のためのｈＧＨポリアデニル化部位と、ｐＢＲ３２２複製起点と、大腸菌における増幅のためのアンピシリン耐性マーカーとを含む、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられる。他の適切な発現ベクターとしては、限定されないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙに由来するプラスミドが挙げられる（例えば、Ｌａｔｈｅら、Ｇｅｎｅ  ５７：１９３−２０１［１９８７］を参照のこと）。
【０１３０】
したがって、いくつかの実施形態では、ベクターの増殖およびバリアントトランスグルタミナーゼ（複数可）の発現を可能にするために、少なくとも１つのバリアントトランスグルタミナーゼをコードする配列を含むベクターを宿主細胞に形質転換する。いくつかの実施形態では、バリアントトランスグルタミナーゼを翻訳後修飾して、シグナルペプチドを除去し、いくつかの場合では、分泌後に切断され得る。いくつかの実施形態では、上記形質転換宿主細胞を、バリアントトランスグルタミナーゼ（複数可）の発現を可能にする条件下、適切な栄養培地で培養する。限定されないが、適切な補充物質を含有する最小培地または複合培地を含む、宿主細胞を培養するために有用な任意の適切な培地が本発明において使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞をＨＴＰ培地中で成長させる。適切な培地は、様々な商業的供給者から入手可能であるか、または公開されているレシピ（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎのカタログ中）にしたがって調製され得る。
【０１３１】
別の態様では、本発明は、本明細書で提供される改善されたトランスグルタミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって、宿主細胞においてトランスグルタミナーゼ酵素を発現させるための１つまたはそれを超える制御配列に作動可能に連結されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによりコードされるトランスグルタミナーゼポリペプチドの発現において使用するための宿主細胞は当技術分野で周知であり、限定されないが、細菌細胞、例えば、大腸菌（E.  coli）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ，Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ，Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２細胞およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、ＢＨＫ細胞、２９３細胞およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上記宿主細胞に適切な培養培地および成長条件は、当技術分野で周知である。
【０１３２】
トランスグルタミナーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の様々な方法により細胞に導入され得る。技術としては、特に、電気穿孔、微粒子銃衝撃（biolistic  particle  bombardment）、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するための様々な方法は、当業者に公知である。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。適切な真核生物宿主細胞としては、限定されないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。適切な真菌宿主細胞としては、限定されないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。いくつかの実施形態では、真菌宿主細胞は、酵母細胞および糸状菌細胞である。本発明の糸状菌宿主細胞は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門およびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門のすべての糸状形態を含む。糸状菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖類で構成される細胞壁を有する栄養菌体を特徴とする。本発明の糸状菌宿主細胞は、酵母とは形態学的に別個のものである。
【０１３４】
本発明のいくつかの実施形態では、糸状菌宿主細胞は、限定されないが、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍおよび／またはＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａならびに／またはそれらの完全世代もしくは不完全世代および同物異名、バシオニムもしくは分類学的等価物を含む任意の適切な属および種のものである。
【０１３５】
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、限定されないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ種の細胞を含む酵母細胞である。本発明のいくつかの実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０１３６】
本発明のいくつかの実施形態では、宿主細胞は、藻類細胞、例えばＣｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）である。
【０１３７】
いくつかの他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。適切な原核細胞としては、限定されないが、グラム陽性、グラム陰性およびグラム不定細菌細胞が挙げられる。限定されないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、ＹｅｒｓｉｎｉａおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓを含む任意の適切な細菌生物が本発明において使用される。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたはＺｙｍｏｍｏｎａｓの種である。いくつかの実施形態では、細菌宿主株は、ヒトに対して非病原性である。いくつかの実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本発明において適切である。本発明のいくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓおよびＡ．ｒｕｂｉ）である。本発明のいくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒｑｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓおよびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）である。本発明のいくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、限定されないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含む工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。いくつかの実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび／またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓおよびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、大腸菌）である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は大腸菌Ｗ３１１０である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａおよびＥ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよびＰ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ���Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉおよびＰ．ｓｐ．Ｄ−０ｌ  １０）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｕｂｅｒｉｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓおよびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。いくつかの実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓおよびＺ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【０１３８】
本発明において使用される多くの原核生物株および真核生物株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ｕｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ（ＤＳＭ）、Ｃｅｎｔｒａａｌｂｕｒｅａｕ  Ｖｏｏｒ  Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）およびＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ  Ｐａｔｅｎｔ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｒｅｇｉｏｎａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＮＲＲＬ）などのいくつかの培養細胞保存機関（culture  collection）から公的に容易に入手可能である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、タンパク質分泌、タンパク質安定性ならびに／またはタンパク質の発現および／もしくは分泌のために望ましい他の特性が改善される特徴を有するように遺伝子改変される。遺伝子改変は、遺伝子工学の技術および／または古典的な微生物学的技術（例えば、化学的なまたはＵＶ変異誘発およびその後の選択）により達成され得る。実際、いくつかの実施形態では、組換えによる改変と古典的な選択技術の組み合わせを使用して宿主細胞を産生する。組換え技術を使用して、核酸分子は、宿主細胞中および／または培養培地中でのトランスグルタミナーゼバリアント（複数可）の収量の増加がもたらされる様式で導入、欠失、阻害または改変され得る。例えば、Ａｌｐ１機能のノックアウトは、プロテアーゼが欠損した細胞をもたらし、ｐｙｒ５機能のノックアウトは、ピリミジン欠損表現型を有する細胞をもたらす。１つの遺伝子工学アプローチでは、コードされるタンパク質の発現を抑制するために、相同組換えを使用して、インビボで遺伝子を特異的にターゲティングすることによる標的遺伝子改変を誘導する。代替的なアプローチでは、遺伝子発現の阻害にｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよび／またはリボザイム技術を使用する。限定されないが、タンパク質をコードする遺伝子の全部または一部の欠失、および遺伝子産物の発現または活性を破壊する部位特異的変異誘発を含む、細胞におけるタンパク質の発現を低下させるための様々な方法が当技術分野で公知である（例えば、Ｃｈａｖｅｒｏｃｈｅら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：２２  ｅ９７［２０００］；Ｃｈｏら、Ｍｏｌｅｃ．Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｃｒｏｂｅ  Ｉｎｔｅｒａｃｔ．，１９：７−１５［２００６］；Ｍａｒｕｙａｍａ  ａｎｄ  Ｋｉｔａｍｏｔｏ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｌｅｔｔ．，３０：１８１１−１８１７［２００８］；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｏｍ．，２７２：３４４−３５２［２００４］；およびＹｏｕら、Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｉｏｂｉｏｌ．，１９１：６１５−６２２［２００９］（これらはすべて、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。ランダム変異誘発、その後の所望の変異についてのスクリーニングも使用される（例えば、Ｃｏｍｂｉｅｒら、ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，２２０：１４１−８［２００３］；およびＦｉｒｏｎら、Ｅｕｋａｒｙ．Ｃｅｌｌ  ２：２４７−５５［２００３］（これらは両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０１４０】
宿主細胞へのベクターまたはＤＮＡ構築物の導入は、限定されないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ＰＥＧ媒介形質転換、電気穿孔または他の当技術分野で公知の一般的な技術を含む、当技術分野で公知の任意の適切な方法を使用して達成され得る。いくつかの実施形態では、大腸菌発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉ（米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）が使用される。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、本発明の操作された宿主細胞（すなわち、「組換え宿主細胞」）は、プロモーターを活性化するために、形質転換体を選択するために、またはトランスグルタミナーゼポリヌクレオチドを増幅するために必要に応じて改変された従来の栄養培地中で培養される。培養条件、例えば温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞に以前使用したものであり、当業者には周知である。前述のように、細菌起源、植物起源、動物（特に哺乳動物）起源および古細菌起源の細胞を含む多くの細胞の培養および産生のために、多くの標準的な参考文献およびテキストが利用可能である。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、本発明のバリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドを発現する細胞を、バッチ発酵条件または連続発酵条件の下で成長させる。古典的な「バッチ発酵」は、閉鎖系であり、培地の組成は発酵の開始時に設定し、発酵中に人為的な交換には供さない。「フェドバッチ発酵」はバッチ系のバリエーションであり、これも本発明において使用される。このバリエーションでは、発酵が進行するにしたがって基質を徐々に増加させて添加する。フェドバッチ系は、異化産物抑制により細胞の代謝が阻害される可能性がある場合、および培地中の基質を限られた量にすることが望ましい場合に有用である。バッチ発酵およびフェドバッチ発酵は一般的であり、当技術分野で周知である。「連続発酵」は、開放系であり、規定の発酵培地をバイオリアクターに連続的に添加し、同時に処理のために等量の馴化培地を取り出す。連続発酵は、一般に、培養物を、細胞が主に対数期成長にある、一定の高密度に維持する。連続発酵系は、定常状態成長条件を維持するよう努める。連続発酵プロセスのために栄養分および成長因子をモジュレートするための方法ならびに生成物が形成される速度を最大にするための技術は、工業微生物学の技術分野で周知である。
【０１４３】
本発明のいくつかの実施形態では、バリアントトランスグルタミナーゼ（複数可）の産生において、無細胞転写／翻訳系が使用される。いくつかの系が市販されており、前記方法は当業者に周知である。
【０１４４】
本発明は、バリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を作製する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、配列番号２、６、３４および／または２５６に対して少なくとも約７０％（または少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％）の配列同一性を含み、本明細書で提供される少なくとも１つの変異を含むアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドで形質転換宿主細胞を提供すること；宿主細胞がコードされたバリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドを発現する条件下で、培養培地中で形質転換宿主細胞を培養すること；ならびに必要に応じて、発現されたバリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドを回収もしくは単離すること、および／または、発現されたバリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドを含有する培養培地を回収もしくは単離することを含む。いくつかの実施形態では、前記方法は、コードされるトランスグルタミナーゼポリペプチドの発現後に形質転換宿主細胞を必要に応じて溶解すること、ならびに発現されたバリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドを細胞溶解物から必要に応じて回収および／または単離することをさらに提供する。本発明は、バリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドで形質転換宿主細胞を、バリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドの生成に適切な条件下で培養すること、およびバリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドを回収することを含む、バリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドの作製方法をさらに提供する。典型的には、トランスグルタミナーゼポリペプチドの回収または単離は、宿主細胞の培養培地、宿主細胞またはその両方から、本明細書に記載されるものを含む当技術分野で周知のタンパク質回収技術を使用したものである。いくつかの実施形態では、宿主細胞を遠心分離により回収し、物理的または化学的手段により破壊し、得られた粗製抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、限定されないが、凍結解凍サイクリング、超音波処理、機械的破壊、および／または細胞溶解剤の使用、ならびに当業者に周知の多くの他の適切な方法を含む任意の便利な方法により破壊され得る。
【０１４５】
宿主細胞において発現された操作されたトランスグルタミナーゼ酵素は、特に、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含む、タンパク質精製のための当技術分野で公知の技術のいずれか１つまたはそれよりも多くを使用して細胞および／または培養培地から回収され得る。大腸菌などの細菌からのタンパク質の溶解および高効率での抽出のための適切な溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で市販されている。したがって、いくつかの実施形態では、得られたポリペプチドを回収／単離し、必要に応じて、当技術分野で公知のいくつかの方法のいずれかにより精製する。例えば、いくつかの実施形態では、ポリペプチドを、限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、クロマトフォーカシングおよびサイズ排除）または沈殿を含む従来の手順により栄養培地から単離する。いくつかの実施形態では、所望のとおり、成熟タンパク質の形状の完成において、タンパク質リフォールディングステップを使用する。加えて、いくつかの実施形態では、最終的な精製ステップにおいて高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を用いる。例えば、いくつかの実施形態では、当技術分野で公知の方法が本発明において使用される（例えば、Ｐａｒｒｙら、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，３５３：１１７［２００１］；およびＨｏｎｇら、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，７３：１３３１［２００７］（これらは両方とも、参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。実際に、当技術分野で公知の任意の適切な精製方法が本発明において使用される。
【０１４６】
トランスグルタミナーゼポリペプチドを単離するためのクロマトグラフィー技術としては、限定されないが、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味の電荷、疎水性、親水性、分子量、分子の形などの要因に部分的に依存し、当業者には公知である。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、改善されたトランスグルタミナーゼ酵素の単離において、親和性技術が使用される。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、トランスグルタミナーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体が使用され得る。抗体の産生のために、トランスグルタミナーゼによる注射により、限定されないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含む様々な宿主動物を免疫し得る。側鎖官能基により、または側鎖官能基に結合したリンカーにより、トランスグルタミナーゼポリペプチドをＢＳＡなどの適切な担体に結合させ得る。免疫学的応答を増加させるために、宿主種に応じて、限定されないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油乳剤、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含む様々なアジュバントを使用し得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼバリアントを調製し、酵素を発現する細胞の形態で、粗製抽出物として、または単離もしくは精製された調製物として使用する。いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼバリアントを凍結乾燥物として、粉末（例えば、アセトン粉末）の形態で、または酵素溶液として調製する。いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼバリアントは、実質的に純粋な調製物の形態である。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、トランスグルタミナーゼポリペプチドを任意の適切な固体基材に結合させる。固体基材としては、限定されないが、固相、面（surface）および／または膜が挙げられる。固体支持体としては、限定されないが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトなどの有機ポリマーが挙げられる。固体支持体はまた、無機物、例えばガラス、シリカ、細孔制御ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカまたは金属、例えば金または白金であり得る。基材の形状は、ビーズ、球体、粒子、顆粒、ゲル、膜または面の形態であり得る。面は、平面、実質的に平面または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤特性または非膨潤特性を有し得る。固体支持体は、ウェル、凹部（depression）または他の入れ物、容器、フィーチャまたは位置の形態で形成され得る。試薬のロボット送達が処理可能な様々な場所において、または検出方法および／もしくは機器により処理可能な様々な場所において、複数の支持体がアレイ上に配置され得る。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、免疫学的方法を使用してトランスグルタミナーゼバリアントを精製する。１つのアプローチでは、従来の方法を使用してバリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドに対して（例えば、配列番号２、６、３４および／または２５６のいずれかを含むポリペプチドおよび／またはそれらの免疫原性断片に対して）生じさせた抗体をビーズ上に固定し、バリアントトランスグルタミナーゼが結合する条件下で細胞培養培地と混合し、沈殿させる。関連アプローチでは、免疫クロマトグラフィーが使用される。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、バリアントトランスグルタミナーゼを、非酵素部分を含む融合タンパク質として発現させる。いくつかの実施形態では、バリアントトランスグルタミナーゼ配列を、精製を容易にするドメインと融合する。本明細書で使用される場合、用語「精製を容易にするドメイン」は、それが融合するポリペプチドの精製を媒介するドメインを指す。適切な精製ドメインとしては、限定されないが、金属キレート化ペプチド、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する；例えば、Ｗｉｌｓｏｎら、Ｃｅｌｌ  ３７：７６７［１９８４］を参照のこと）、マルトース結合性タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システムにおいて利用されるＦＬＡＧエピトープ（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐから入手可能なシステム）などが挙げられる。本明細書に記載される組成物および方法における使用が企図される１つの発現ベクターは、エンテロキナーゼ切断部位により分離された、ポリヒスチジン領域と融合した本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現をもたらす。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；例えば、Ｐｏｒａｔｈら、Ｐｒｏｔ．Ｅｘｐ．Ｐｕｒｉｆ．，３：２６３−２８１［１９９２］を参照のこと）による精製を容易にし、エンテロキナーゼ切断部位は、バリアントトランスグルタミナーゼポリペプチドを融合タンパク質から分離するための手段を提供する。外来ポリペプチドをグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために、ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）も使用され得る。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、溶解細胞から、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ融合物の場合にはグルタチオン−アガロース）への吸着、その後の遊離のリガンドの存在下での溶出により容易に精製され得る。
【実施例】
【０１５２】
実験
以下の代表的な実施例において、本開示の様々なフィーチャおよび実施形態を例証するが、これらは例示的なものであり、限定的なものではない。
【０１５３】
以下の実験的開示では、以下の略語が適用される：ｐｐｍ（百万分率）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμＭ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（１分当たりの回転数）；℃（摂氏度）；ＲＴ（室温）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ａａ（アミノ酸）；ＴＢ（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ；１２ｇ／Ｌのバクト−トリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、６５ｍＭのリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭのＭｇＳＯ４）；ＬＢ（ルリアベルターニブロス）；ＣＡＭ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルチオガラクトシド）；ＰＥＧ（ポリエチレングリコール）；ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）；ＣＨＥＳ（２−シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸；アセトニトリル（ＭｅＣＮ）；ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）；ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＵＰＬＣ（超高速液体クロマトグラフィー）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する改善倍率）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＭＷＤ（複数波長検出器）；ＵＶ（紫外線）；Ｃｏｄｅｘｉｓ（Ｃｏｄｅｘｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｒｅｄｗｏｏｄ  Ｃｉｔｙ，ＣＡ）；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｃｏｒｐ．，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ  ＭＡ）；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｄｅｔｒｏｉｔ，ＭＩ）；  ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ（ＧｅｎｅＯｒａｃｌｅ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）；Ｂｏｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｂｏｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｄ．，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，ＦＬ）；Ｐａｌｌ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｐｏｒｔ  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，ＮＹ）；  Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｌｉｔｔｌｅｔｏｎ，ＭＡ）；Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．，Ｈｏｌｌａｎｄ，ＭＩ）；Ｉｎｆｏｒｓ（Ｉｎｆｏｒｓ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ａｎｎａｐｏｌｉｓ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ，ＭＤ）；Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｃ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）；Ｄａｉｃｅｌ（Ｄａｉｃｅｌ，Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）；Ｇｅｎｅｔｉｘ（Ｇｅｎｅｔｉｘ  ＵＳＡ，Ｉｎｃ．，Ｂｅａｖｅｒｔｏｎ，ＯＲ）；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，ＬＬＣ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）；Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．の一部門、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃｏｒｐ．，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部門、Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）；（Ｉｎｆｏｒｓ；Ｉｎｆｏｒｓ−ＨＴ，Ｂｏｔｔｍｉｎｇｅｎ／Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）；Ｃｏｒｎｉｎｇ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）；およびＢｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｎｅｗｔｏｎ，ＭＡ）；Ｗａｔｅｒｓ（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）。
実施例１
野生型Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓトランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）遺伝子の取得および発現ベクターの構築
【０１５４】
Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｍｏｂａｒａｅｎｓｉｓトランスグルタミナーゼ（ＭＴＧ）をコードするプロ遺伝子を、報告されているアミノ酸配列（Ｓｈｉｍｏｎｉｓｈｉら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８：１１５６５−１１５７２０［１９９３］）に基づいて、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍにおける発現のためにコドン最適化した。ＧｅｎＯｒａｃｌｅにより遺伝子を合成し、専有のソフトウェアを使用してコドン最適化した。ＤＮＡを配列検証した。ＢｓｒＧＩ／ＮｇｏＭＩＶクローニング部位を使用して、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ「最適化」シグナルペプチド＋スペーサー領域（アミノ酸残基トレオニンおよびセリンをコードする６塩基）の後ろにおいて、プロＭＴＧ遺伝子を大腸菌／Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍシャトルベクターｐＳＳＢｍにクローニングした。ベクターｐＳＳＢｍは、シャトルベクターｐＭＭ１５２５（Ｂｏｃａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）をベースとする改変ベクターである。シグナルペプチドおよびプロ遺伝子は、シャトルベクター上に存在するキシロースリプレッサー遺伝子（ｘｙｌＲ）により調節されるキシロースプロモーター（Ｐｘｙｌ）の制御下にあった。ベクターは、Ｂａｃｉｌｌｕｓの「ｒｅｐＵ」複製起点と、テトラサイクリンアンピシリン耐性マーカーとを含有していた。ベクターはまた、ｐＢＲ３２２複製起点と、大腸菌における維持のためのアンピシリン耐性マーカーとを含有していた。Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍプロトプラストへのＤＮＡ移入の標準的なＰＥＧ媒介方法により、得られたプラスミド（ｐＳＳＢｍ−プレプロＭＴＧ）を形質転換した。形質転換体由来のプレプロＭＴＧ配列を検証した。Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍシグナルペプチドを含むプレプロＭＴＧのポリヌクレオチド配列をシャトルｐＳＳＢｍベクターにクローニングし、配列は配列番号６に提供されており、Ｃ末端ヒスチジン精製タグを有するプロＭＴＧの配列は配列番号２を含み、成熟ＭＴＧの配列は配列番号４を含む。
実施例２
Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ振盪フラスコ手順
【０１５５】
プレプロＭＴＧ遺伝子を有するプラスミドを含有するＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍの単一微生物コロニーを、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含有する３ｍｌのルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス（０．０１ｇ／Ｌカゼイン由来ペプトン、０．００５ｇ／Ｌ酵母抽出物、０．０１ｇ／Ｌ塩化ナトリウム）に接種した。細胞を、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で少なくとも１６時間一晩成長させた。次いで、培養物を、１０００ｍｌフラスコ中で１００ｍＬのＡ５培地（２ｇ／Ｌ（ＮＨ４）２ＳＯ４、３．５ｇ／Ｌ  ＫＨ２ＨＰＯ４、７．３ｇ／Ｌ  Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｇ／Ｌ酵母抽出物、ｐＨ６．８まで）、１００μＬの微量元素溶液（４９ｇ／Ｌ  ＭｎＣｌ２．４Ｈ２Ｏ、４５ｇ／Ｌ  ＣａＣｌ２、２．５ｇ／Ｌ（ＮＨ４）Ｍｏ７．Ｏ２４．Ｈ２Ｏ、２．５ｇ／Ｌ  ＣｏＣｌ２．６Ｈ２Ｏ）、１．５ｍＬの２０％グルコース、１５０μＬの１Ｍ  ＭｇＳＯ４、１００μＬの１０ｍｇ／ｍＬテトラサイクリン、１００μＬの２．５ｇ／Ｌ  ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏに希釈して、０．２の光学密度６００ｎｍ（ＯＤ６００）にし、３７℃で成長させた。培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８になったら、０．５％キシロース（最終濃度）でプレプロＭＴＧ遺伝子の発現を誘導し、少なくとも１６時間一晩インキュベートした。遠心分離（４０００ｒｐｍ、１５分間、４℃）により、細胞をペレット化した。分泌した成熟ＭＴＧ酵素を含有する透明な培地上清を収集し、６０ｍＬの上清をＪｕｍｂｏｓｅｐコンセントレーター（ＰＥＳ膜、細孔径３，０００ＭＷＣＯ；Ｐａｌｌ）の上部セルに移した。容量が２０ｍＬ未満になるまで（約４５分間）、上清を室温、４０００ｒｐｍで遠心分離した。濾液を廃棄し、残った２０ｍＬの上清を濃縮液に添加し、４０ｍＬの最終容量にした。容量が約２０ｍＬに達するまで（約４５分間）、４０ｍＬの遠心分離を室温、４０００ｒｐｍで継続した。２０ｍＬの５×濃縮液をＶｉｖａｓｐｉｎ  ２０コンセントレーター（ＰＥＳ膜、細孔径１０，０００ＭＷＣＯ；Ｖｉｖａｐｒｏｄｕｃｔｓ）に移し、容量が約１ｍＬになるまで（約６０分間）遠心分離した。次いで、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃバッファー、ｐＨ＝５．０を２０ｍＬ容量まで添加し（１回目のバッファー交換）、容量が約１ｍＬになるまで（約６０分間）、遠心分離を室温、４０００ｒｐｍで継続した。次いで、５０ｍＭ  ＮａＯＡｃバッファーｐＨ＝５．０を２０ｍＬ容量まで添加し（２回目のバッファー交換）、容量が約５ｍＬになるまで（約６０分間）、遠心分離を室温、４０００ｒｐｍで継続した。２０×濃縮液を十分に混合し、保存し、−２０℃で保存した。本明細書に記載されるヒドロキシメートアッセイおよびインスリンアッセイを使用してＭＴＧ活性を確認した。
実施例３
改善されたＭＴＧバリアントを同定するためのＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍのハイスループットアッセイ
【０１５６】
バリアントプレプロＭＴＧ遺伝子を含有するプラスミドライブラリーをＢ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍに形質転換し、ＤＭ３再生培地（４００ｍＭ二塩基性コハク酸ナトリウム、ｐＨ７．３、０．５％カザミノ酸、０．５％酵母抽出物、０．４％Ｋ２ＨＰＯ４、０．２％ＫＨ２ＰＯ４、２０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５％グルコースおよび０．２％ＢＳＡ）オーバーレイと共に３μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含有するルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天プレートにプレーティングした。３０℃で少なくとも１８時間インキュベートした後、Ｑ−ｂｏｔ（登録商標）ロボットコロニーピッカー（Ｇｅｎｅｔｉｘ）を使用して、コロニーを、１８０μＬのＬＢおよび１０μｇ／ｍＬテトラサイクリンを含有するシャロー９６ウェルウェルマイクロタイタープレートにピッキングした。細胞を、２００ｒｐｍで振盪しながら湿度８５％、３７℃で一晩成長させた。次いで、２０μＬのこの培養物を、１０μｇ／ｍＬテトラサイクリン、１％キシロースおよび０．２５ｍＭ  ＺｎＳＯ４と共に３８０μＬの継代培養培地（実施例２に記載されているＡ５  ０．３％グルコース培地）を含有する９６ウェルマイクロタイタープレート（ディープウェル）に移した。次いで、プレートを、２５０ｒｐｍで振盪しながら湿度８５％、３７℃で約１５〜１８時間インキュベートした。次いで、これらのプレートを４０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、分泌した成熟ＭＴＧ酵素を含有する透明な培地上清をハイスループットヒドロキシメートアッセイに使用した。
実施例４
組換えＴＧ遺伝子を含有する大腸菌発現宿主
【０１５７】
本発明の初期トランスグルタミナーゼ（ＴＧ）親酵素（配列番号６）を、大腸菌における発現のためにコドン最適化し、合成し、ｌａｃＩリプレッサーの制御下でｌａｃプロモーターに作動可能に連結してｐＣＫ１１０９００ベクターにクローニングした（例えば、米国特許第７，６２９，１５７号および米国特許出願公開第２０１６／０２４４７８７号（これらは両方とも、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。発現ベクターはまた、Ｐ１５ａ複製起点とクロラムフェニコール耐性遺伝子を含有する。当技術分野で公知の標準的な方法を使用して、得られたプラスミドを大腸菌Ｗ３１１０に形質転換した。当技術分野で公知のように（例えば、米国特許第８，３８３，３４６号および国際公開第２０１０／１４４１０３号（これらは両方とも、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）、細胞をクロラムフェニコール選択に供することにより、形質転換体を単離した。
実施例５
ＨＴＰ  ＴＧ含有湿細胞ペレットの調製
【０１５８】
モノクローナルコロニーからの組換えＴＧコード遺伝子を含有する大腸菌細胞を、各ウェルにおいて１％グルコースおよび３０μｇ／ｍＬクロラムフェニコールを含有する１８０μｌのＬＢを含有する９６ウェルシャローウェルマイクロタイタープレートのウェルに接種した。プレートをＯ２透過性シールで密封し、培養物を３０℃、２００ｒｐｍおよび湿度８５％で一晩成長させた。次いで、１０μｌの各細胞培養物を、３９０ｍＬのＴＢおよび３０μｇ／ｍＬ  ＣＡＭを含有する９６ウェルディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートをＯ２透過性シールで密閉し、０．６〜０．８のＯＤ６００が達成されるまで、３０℃、２５０ｒｐｍおよび湿度８５％でインキュベートした。次いで、ＩＰＴＧにより細胞培養物を  １ｍＭの最終濃度に誘導し、元々使用されているのと同じ条件下で一晩インキュベートした。次いで、４０００ｒｐｍにおける１０分間の遠心分離を使用して、細胞をペレット化した。上清を廃棄し、溶解前にペレットを−８０℃で凍結した。
【０１５９】
細胞を溶解させるために、２０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ７．５、１ｍｇ／ｍＬリゾチームおよび０．５ｍｇ／ｍＬ  ＰＭＢＳを含有する２２５μｌの溶解バッファーを細胞ペーストに添加した。細胞を、ベンチトップシェーカー上で振盪しながら室温で２時間インキュベートした。次いで、プレートを４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離し、透明な上清をその後のステップで使用した。
【０１６０】
プロ酵素を成熟酵素に活性化するために、６０ｕＬの５０ｍＭトリス−ＨＣｌバッファー、ｐＨ８．０中の２ｍｇ／ｍＬディスパーゼを１７５ｕＬの上記大腸菌上清に添加し、３７℃で１時間インキュベートした。
実施例６
ＴＧバリアントのＨＴＰ精製
【０１６１】
記載されているように改変した製造業者のプロトコールを使用して、ＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｎｉ−ＮＴＡスピンプレート（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ｃａｔ  ＃８８２３０）中で、活性化溶解物のＨＴＰ精製を行った。最初に、実施例５に記載されているように得た２２５ｕＬのディスパーゼ活性化溶解物を、５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび１０ｍＭイミダゾールを含有する等体積の結合バッファーで希釈した。次いで、１６５ｕＬの希釈溶解物を、結合バッファーで予め平衡化したＨｉｓＰｕｒ（商標）Ｎｉ−ＮＴＡスピンプレートに適用し、室温で１０分間インキュベートし、続いて、遠心分離した。このステップを１回繰り返した。次いで、スピンプレートを、５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２５ｍＭイミダゾールから構成される６００ｕＬの洗浄バッファーで洗浄した。次いで、精製酵素を、５０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７．５、３００ｍＭ  ＮａＣｌおよび２５０ｍＭイミダゾールを含有する１０５ｕＬの溶出バッファーで溶出させた。
実施例７
振盪フラスコ（ＳＦ）培養物からの凍結乾燥溶解物の調製
【０１６２】
上記のように成長させた選択したＨＴＰ培養物を、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭを含むＬＢ寒天プレート上にプレーティングし、３７℃で一晩成長させた。各培養物からの単一コロニーを、１％グルコースおよび３０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭを含む６ｍｌのＬＢに移した。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間成長させ、３０μｇ／ｍｌ  ＣＡＭを含有する２５０ｍｌのＴＢ中、約１：５０で継代培養し、０．０５の最終ＯＤ６００にした。培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで約１９５分間成長させて０．６〜０．８のＯＤ６００にし、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導した。次いで、培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間成長させた。培養物を４０００ｒｐｍ×２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを３０ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に再懸濁した。細胞をペレット化し（４０００ｒｐｍ×２０分間）、−８０℃で１２０分間凍結させた。凍結ペレットを３０ｍｌの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ７．５に再懸濁し、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）プロセッサーシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を使用して１８，０００ｐｓｉで溶解させた。溶解物をペレット化し（１０，０００ｒｐｍ×６０分間）、上清を凍結させ、凍結乾燥させて、振盪フラスコ（shake  flake）（ＳＦ）酵素を生成した。
実施例８
Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍにより発現されたトランスグルタミナーゼの活性の改善
【０１６３】
実施例３に記載されているように得たＨＴＰ  Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ細胞ペレットを４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離し、透明な培地上清をその後の生体触媒反応で使用した。１００μＬの０．２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０４Ｍグルタミル供与体基質Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ（Ｓｉｇｍａ，Ｃ６１５４）、０．１Ｍヒドロキシルアミン、０．０１Ｍグルタチオンおよび５μｌのＨＴＰ  Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ培養溶解物上清を含有する９６ウェルディープウェルプレート中で、ＨＴＰ反応を行った。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）タイタープレートシェーカー（３ｍｍ振幅（throw）、モデル＃  ＡＪ１８５，Ｉｎｆｏｒｓ）中で、ＨＴＰプレートを３７℃、１００ｒｐｍで３５分間インキュベートした。０．３Ｍトリクロロ酢酸および２Ｍ  ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏを含有する１００μｌの０．８Ｍ  ＨＣｌを用いて、反応をクエンチした。サンプルの吸光度を５２５ｎｍで記録した。
【０１６４】
指定された反応条件下における対応する骨格の吸光度により正規化された生成物の吸光度として、陽性対照に対する改善倍率（ＦＩＯＰＣ）を計算した。結果は以下の表８．１に示されている。
【表８】
2021502068.tif 000003
実施例９
大腸菌において発現された活性トランスグルタミナーゼの改善
【０１６５】
当技術分野で公知の十分に確立された技術（例えば、飽和変異誘発および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子を含有する親酵素（配列番号２）のライブラリーを産生した。実施例４に記載されているようにＨＴＰにおいて、各遺伝子によりコードされるポリペプチドを産生し、実施例５に記載されているように可溶性溶解物を生成した。以下のアッセイを使用して、これらのバリアントポリペプチドの活性を評価した。
アッセイＡ：グルタチオンアッセイ
【０１６６】
１００μＬの０．２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０．０４Ｍ  Ｚ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ、０．１Ｍヒドロキシルアミン、０．０１Ｍグルタチオンおよび１０ｕＬの活性化溶解物上清を含有する９６ウェルディープウェルプレート中で、ＨＴＰ反応を行った。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）タイタープレートシェーカー（３ｍｍ振幅、モデル＃  ＡＪ１８５，Ｉｎｆｏｒｓ）中で、ＨＴＰプレートを３７℃、３００ｒｐｍで３０分間インキュベートした。０．８Ｍ  ＨＣｌ、０．３Ｍトリクロロ酢酸および２Ｍ  ＦｅＣｌ３．６Ｈ２Ｏを含有する１００μｌのクエンチング溶液を用いて、反応をクエンチし、ベンチトップシェーカーを使用して１０分間混合した。次いで、プレートを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、吸光度を５２５ｎｍで記録した。指定された反応条件下における対応する骨格のＵＶシグナルにより正規化されたバリアントのＵＶシグナルとして、陽性対照に対する改善倍率（ＦＩＯＰＣ）を計算した。
アッセイＢ：インスリンアッセイ
【０１６７】
２００μＬの０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｇ／Ｌインスリン、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、１．２５ｍＭ  Ｚ−Ｇｌｎ−供与体基質および実施例６に記載されている７０ｕＬの精製溶解物を含有する９６ウェルディープウェルプレート中で、ＨＴＰ反応を行った。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）タイタープレートシェーカー（３ｍｍ振幅、モデル＃  ＡＪ１８５，Ｉｎｆｏｒｓ）中で、ＨＴＰプレートを３０℃、３００ｒｐｍで２４時間インキュベートした。２００μｌのＤＭＳＯを用いて、反応をクエンチし、ベンチトップシェーカーを使用して５分間混合した。次いで、プレートを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、分析のために上清をＬＣ−ＭＳにロードした。ＬＣ−ＭＳおよびＵＶシグナルの両方を収集した。指定された反応条件下における対応する骨格のＵＶシグナルにより正規化されたバリアント中の改変インスリンのＵＶシグナルとして、陽性対照に対する改善倍率（ＦＩＯＰＣ）を計算した。
【表９−１】
2021502068.tif 000004
【表９−２】
2021502068.tif 000005
【表９−３】
2021502068.tif 000006
【表９−４】
2021502068.tif 000007
【表９−５】
2021502068.tif 000008
【表９−６】
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【表９−７】
2021502068.tif 000010
【表９−８】
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【表９−９】
2021502068.tif 000012
【表９−１０】
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【表９−１１】
2021502068.tif 000014
【表９−１２】
2021502068.tif 000015
実施例１０
大腸菌において発現されたトランスグルタミナーゼバリアントの活性改善
【０１６８】
当技術分野で公知の十分に確立された技術（例えば、飽和変異誘発および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子を含有する親酵素（配列番号３４）のライブラリーを産生した。実施例４に記載されているようにＨＴＰにおいて、各遺伝子によりコードされるポリペプチドを産生し、実施例５に記載されているように可溶性溶解物を生成した。
【０１６９】
２００μＬの０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１ｇ／Ｌインスリン、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭリジン供与体基質および実施例６に記載されている７０ｕＬの精製溶解物を含有する９６ウェルディープウェルプレート中で、ＨＴＰ反応を行った。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）タイタープレートシェーカー（３ｍｍ振幅、モデル＃  ＡＪ１８５，Ｉｎｆｏｒｓ）中で、ＨＴＰプレートを３０℃、３００ｒｐｍで２２時間インキュベートした。２００μｌのＤＭＳＯを用いて、反応をクエンチし、ベンチトップシェーカーを使用して５分間混合した。次いで、プレートを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、分析のために上清をＬＣ−ＭＳにロードした。指定された反応条件下における対応する骨格の質量により正規化されたバリアント中の１つのリジン供与体で改変されたインスリンの質量として、陽性対照に対する改善倍率（ＦＩＯＰＣ）を計算した。
【表１０−１】
2021502068.tif 000016
【表１０−２】
2021502068.tif 000017
実施例１１
大腸菌において発現されたトランスグルタミナーゼバリアントの活性改善
【０１７０】
当技術分野で公知の十分に確立された技術（例えば、飽和変異誘発および以前に同定された有益な変異の組換え）を使用して、操作された遺伝子を含有する親酵素（配列番号２５６）のライブラリーを産生した。実施例４に記載されているようにＨＴＰにおいて、各遺伝子によりコードされるポリペプチドを産生し、実施例５に記載されているように可溶性溶解物を生成した。
【０１７１】
２００μＬの０．１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、２ｇ／Ｌインスリン、２５ｍＭ  ＥＤＴＡ、５ｍＭリジン供与体基質、１０％アセトニトリルおよび実施例６に記載されているように産生した７０ｕＬの精製溶解物を含有する９６ウェルディープウェルプレート中で、ＨＴＰ反応を行った。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）タイタープレートシェーカー（３ｍｍ振幅、モデル＃  ＡＪ１８５，Ｉｎｆｏｒｓ）中で、ＨＴＰプレートを３０℃、３００ｒｐｍで２２時間インキュベートした。２００μｌのＤＭＳＯを用いて、反応をクエンチし、ベンチトップシェーカーを使用して５分間混合した。次いで、プレートを４０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、分析のために上清をＬＣ−ＭＳにロードした。指定された反応条件下における対応する骨格の質量により正規化されたバリアント中の１つのリジン供与体で改変されたインスリンの質量として、陽性対照に対する改善倍率（ＦＩＯＰＣ）を計算した。
【表１１−１】
2021502068.tif 000018
【表１１−２】
2021502068.tif 000019
【表１１−３】
2021502068.tif 000020
【表１１−４】
2021502068.tif 000021
実施例１２
ＴＧ産生形成の分析的検出
【０１７２】
表１２．１または１２．２の分析方法を使用して、実施例８〜１１に記載されているデータを収集した。グルタミンＺ供与体によるインスリンの改変をもたらす生成物のＬＣ−ＭＳ分析方法は、表１２．１に提供されている。ＨＴＰアッセイ混合物を調製し、表１２．１に示されている機器パラメータおよび条件を使用してＬＣ−ＭＳ−ＵＶにより、改変インスリン生成物化合物の形成を検出した。生成物の質量を使用して基質および生成物ピークを決定し、ＵＶシグナルを使用してそれぞれの種を定量し、陽性対照と比較し、ＦＩＯＰを計算した。
【表１２−１】
2021502068.tif 000022
【０１７３】
リジン供与体基質によるインスリンの改変をもたらす生成物のＬＣ−ＭＳ分析は、表１２．２に示されている。ＨＴＰアッセイ混合物を調製し、表１２．２に提供されている機器パラメータおよび条件を使用してＬＣ−ＭＳ−ＵＶにより、改変インスリン生成物化合物の形成を検出した。生成物の質量を使用して基質および生成物ピークを決定し、ＵＶシグナルを使用してそれぞれの種を定量し、陽性対照と比較し、ＦＩＯＰを計算した。
【表１２−２】
2021502068.tif 000023
【０１７４】
具体的な実施形態を参照して本発明を説明したが、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、１つまたは複数のプロセスステップに適合させるように、様々な変更を行って、均等物を置換することができ、それにより、特許請求されている事項の範囲から逸脱せずに本発明の利益を達成することができる。
【０１７５】
アメリカ合衆国におけるすべての目的のために、本開示で引用されるそれぞれのおよびあらゆる刊行物および特許文献は、このような各刊行物または文献が参照により本明細書に組み込まれることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に組み込まれる。刊行物および特許文献の引用は、このような文献が関連先行技術であることを示すものではなく、その内容または日付に関する自認を構成するものではない。
【配列表】
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【国際調査報告】
2021502068.tif 000024
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