(57)【要約】  本発明は、凝集剤および組換えタンパク質を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出する方法であって、（ａ）ヘパリンおよび界面活性剤をサンプルに添加すること、（ｂ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること、ならびに（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプル中の核酸を検出することを含んでなる方法に関する。本発明はまた、凝集剤および組換えタンパク質を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出する方法であって、（ａ）界面活性剤および水酸化ナトリウムをサンプルに添加すること、（ｂ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること、ならびに（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプル中の核酸を検出することを含んでなる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するための方法であって、
（ａ）界面活性剤および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を前記サンプルに添加すること、
（ｂ）前記核酸の少なくとも一部分を増幅すること、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、前記サンプル中の核酸を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項２】
前記界面活性剤がＳＤＳである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凝集剤がＰＥＩである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記サンプルが凝集剤を約２０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍの濃度で含んでなる、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記サンプルが組換えタンパク質を約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記界面活性剤がＳＤＳであり、前記サンプル中のＳＤＳの濃度が約０．０１％〜約２．０％である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記サンプル中のＮａＯＨの濃度が約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｃ）の増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含んでなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記核酸が宿主細胞のＤＮＡである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記組換えタンパク質が抗体、例えば、モノクローナル抗体である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するための方法であって、
（ａ）界面活性剤を前記サンプルに添加すること、
（ｂ）前記サンプルのｐＨを少なくとも約８に調整すること、
（ｃ）前記核酸の少なくとも一部分を増幅すること、および
（ｄ）工程（ｃ）の増幅を検出し、それにより、前記サンプル中の核酸を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項１２】
前記界面活性剤がＳＤＳである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記凝集剤がＰＥＩである、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記サンプルが凝集剤を約２０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍの濃度で含んでなる、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記サンプルが組換えタンパク質を約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬの濃度で含んでなる、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記界面活性剤がＳＤＳであり、前記サンプル中のＳＤＳの濃度が約０．１％〜約２．０％である、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
工程（ｃ）の増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含んでなる、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記核酸が宿主細胞のＤＮＡである、請求項１１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記組換えタンパク質が抗体、例えば、モノクローナル抗体である、請求項１１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
凝集剤および組換えタンパク質を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するための方法であって、
（ａ）ヘパリンおよび界面活性剤を前記サンプルに添加すること、
（ｂ）前記核酸の少なくとも一部分を増幅すること、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、前記サンプル中の核酸を検出すること
を含んでなる、方法。
【請求項２１】
前記界面活性剤がサルコシルである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記凝集剤がＰＥＩである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記凝集剤が前記サンプル中に約１００ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍの濃度で存在する、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記組換えタンパク質が前記サンプル中に約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記界面活性剤がサルコシルであり、前記サンプル中のサルコシルの濃度が約０．０１％〜約２．０％である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記サンプル中のヘパリンの濃度が約５０μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬである、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
工程（ｂ）の増幅がポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を含んでなる、請求項２０〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記核酸が宿主細胞のＤＮＡである、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記組換えタンパク質が抗体、例えば、モノクローナル抗体である、請求項２０〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組換えタンパク質サンプル中の核酸を定量するためのアッセイにおいて、ヘパリンおよび界面活性剤をサンプルに添加すること、または界面活性剤および水酸化ナトリウムをサンプルに添加すること、または界面活性剤をサンプルに添加することおよびそのサンプルのｐＨを少なくとも約８に調整することによって干渉を軽減する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
組換えタンパク質の大規模生産は、バイオテクノロジー産業にとって重要な課題である。組換えタンパク質は通常、宿主細胞培養または無細胞系によって生産される。いずれの場合でも、タンパク質は、不純物を含んでなるサンプルから、ヒト治療目的として使用するために十分な純度まで精製される。
【０００３】
典型的な方法は、まず、固体粒子を除去するための清澄化、次に、十分な純度を確保するための精製を含む。清澄化は、精製の際に、続いてのクロマトグラフィー工程での負荷を引き下げることができる。典型的な清澄化工程は、遠心分離工程、または濾過工程、またはその両方を含んでなる。清澄化の前に、サンプルをコンディショニングする方法として前処理工程が使用される場合もある。コンディショニング前処理工程の一例が、固体粒子により大きな凝集塊を形成させる凝集であり、これらはその後、清澄化により除去される。ＰＥＩ（ポリエチレンイミン）は凝集剤であり、抗体精製工程で広く使用されている。
【０００４】
生物医薬製剤の生産の際、残留宿主細胞ＤＮＡは、それが許容可能なレベル内にあることを保証するために定量する必要がある不純物である。残留ＤＮＡのレベルは一般に、生産工程および原薬の出荷の全域で密接に監視および規制される。リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、組換え治療用タンパク質中の残留ＤＮＡの定量のための広く認知されているアプローチである。しかしながら、サンプル（例えば、工程内または原薬サンプル）中の残留ＰＥＩは残留ＤＮＡ  ｑＰＣＲアッセイならびに生物医薬製剤の製品品質および出荷検査に使用される他の多くのアッセイを著しく阻害する。一般に、２０ｐｐｍ以上の濃度でのＰＥＩの存在によるアッセイ干渉を克服するためには、極めて高いサンプル希釈（例えば、１：１０，０００）が必要とされる。サンプルを希釈すれば、これはさらに、非経口用量当たりに存在する残留宿主細胞ゲノムＤＮＡの量に関する規制要件（例えば、１０ｎｇ／用量）を満たすために必要なアッセイ感度に対する重大なリスクをもたらす。
【発明の概要】
【０００５】
よって、組換えプロテインサンプルにおける残留宿主細胞ＤＮＡの定量におけるアッセイ感度を向上させるための方法の必要がある。
【０００６】
１つの側面において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するための方法が提供され、この方法は、
（ａ）界面活性剤および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）をサンプルに添加すること、
（ｂ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプル中の核酸を検出すること
を含んでなる。
【０００７】
別の側面において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するための方法が提供され、その方法は、
（ａ）界面活性剤を前記サンプルに添加すること、
（ｂ）サンプルのｐＨを少なくとも約８に調整すること、
（ｃ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること、および
（ｄ）工程（ｃ）の増幅を検出し、それにより、サンプル中の核酸を検出すること
を含んでなる。
【０００８】
さらに別の側面において、凝集剤および組換えタンパク質を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するための方法が提供され、その方法は、
（ａ）ヘパリンおよび界面活性剤をサンプルに添加すること、
（ｂ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプル中の核酸を検出すること
を含んでなる。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】図１Ａは、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の分子構造を示す模式図であり、ＰＥＩの繰り返し単位（上）および分岐ＰＥＩ断片の例（下）が示される。
【図１Ｂ】図１Ｂは、ＰＥＩ結合ＤＮＡおよび複合体の形成を示す模式図である。
【図１Ｃ】図１Ｃは、ヘパリンの分子構造を示す模式図である。
【図２】図２は、異なる洗浄バッファーおよび溶出バッファーを用いる処理条件などの異なる条件下で得られたサンプルにおける回収率を示す表である。
【図３】図３は、アッセイ感度に対する、ＰＥＩおよびＤＮＡを含有するサンプルにヘパリンおよびサルコシルを添加する効果を決定するための実験手順を示す模式図である。
【図４Ａ】図４Ａは、ヘパリンおよびサルコシルで処理したサンプルにおける添加回収率を示す表である。
【図４Ｂ】図４Ｂは、図４Ａの表に示される結果のプロットである。
【図５】図５は、ヘパリン（８０μｇ／ｍＬ）およびサルコシル（０．０５％）で処理した、１００ｐｐｍ  ＰＥＩを含むｍＡｂ１溶出液における添加回収率を示す表とプロットのセットである。
【図６】図６は、サルコシルまたはＳＤＳとＮａＯＨで処理した、２０ｐｐｍ  ＰＥＩを含むｍＡｂ１バルク原薬（ＢＤＳ）サンプルにおける添加回収率を示すプロットである。
【図７】図７は、異なる濃度のＳＤＳおよびＮａＯＨで処理した、２０ｐｐｍ  ＰＥＩおよび１０４ｐｇ／ｍＬチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＮＡを含むｍＡｂ２バルク原薬（ＢＤＳ）サンプルにおける添加回収率を示すプロットである。
【図８】図８は、種々の濃度のＮａＯＨで、２０ｐｐｍ  ＰＥＩを含むｍＡｂ２バルク原薬（ＢＤＳ）サンプルにおける添加回収率を示すプロットのセットである。
【図９】図９は、０．５％ＳＤＳおよび２５ｍＭ  ＮａＯＨ、およびＷａｋｏ  ＤＮＡ抽出で処理した、２０ｐｐｍ  ＰＥＩおよび１０４ｐｇ／ｍＬチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）ＤＮＡを含むｍＡｂ１、ｍＡｂ２、およびｍＡｂ３バルク原薬（ＢＤＳ）サンプルにおける添加回収率を示すプロットのセットである。
【発明の具体的説明】
【００１０】
本発明は、少なくとも一部には、ＰＥＩを含有する組換えタンパク質サンプル（例えば、工程内またはバルク原薬サンプル）において残留ＤＮＡを定量するためのより高感度のアッセイが、ｑＰＣＲ分析を実施する前にサンプルをヘパリンおよび界面活性剤（例えば、サルコシル）、または界面活性剤（例えば、ＳＤＳ）および水酸化ナトリウムで処理することにより達成され得るという発見に基づく。サンプル中の微量のＰＥＩは、いくつかのアッセイ、特に、残留宿主細胞ＤＮＡ  ｑＰＣＲを阻害する可能性がある。
【００１１】
残留宿主細胞ＤＮＡ  ｑＰＣＲアッセイならびにプロセス開発および原薬出荷検査に使用される他のアッセイに対して、ＰＥＩを除去し、ＤＮＡを保持し、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）の干渉を克服することは、生物医薬製剤のＤＮＡクリアランスを実証するために必要なアッセイ感度を達成するために極めて重要である。
【００１２】
理論に拘束されるものではないが、サンプルをヘパリンおよび界面活性剤または界面活性剤および水酸化ナトリウムで処理することは、ＰＥＩとＤＮＡの間の相互作用を軽減し、従って、ＰＥＩからの干渉の軽減およびｑＰＣＲアッセイ感度の向上をもたらすと考えられる。理論に拘束されるものではないが、ＰＥＩはＤＮＡと結合すること、および負電荷を帯びた分子（例えば、ヘパリン）はＰＥＩに競合的に結合することができ（ＰＥＩは、正電荷を帯びている）、それにより、ＤＮＡを遊離させると考えられる。
【００１３】
本発明は特定の方法、試薬、化合物、組成物、または生物学的システムに限定されず、当然のことながら多様であり得ると理解されるべきである。また、本明細書で使用される技術用語は限定を意図するものではないが、単に特定の実施形態を記載するために使用されるに過ぎないことも理解されるべきである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する場合、単数形「１つの(“a”, “an”)」、および「その(“the”)」は、内容がそうではないことを明らかに示さない限り、複数の指示対象を含む。よって、例えば、「１つのポリペプチド」という場合には、２つ以上のポリペプチドの組合せなどを含む。
【００１４】
用語「を含んでなる」は、「を含む」または「からなる」を包含し、例えば、Ｘ「を含んでなる」組成物は、排他的にＸからなってもよいし、または何らかの付加を含んでもよい（例えば、Ｘ＋Ｙ）。用語「から本質的になる」は、特徴の範囲を、指定された材料または工程および特許請求された特徴の基本的特性に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。用語「からなる」は、いずれの付加的成分の存在も排除する。
【００１５】
「約」は、本明細書で使用する場合、量、持続時間などの測定可能な値に関して、開示されている方法を実施するためにそのような変動が適当である限り、指定の値からの±２０％または±１０％、例えば、±５％、±１％、および±０．１％の変動を包含することを意味する。
【００１６】
そうではないことが定義されない限り、本明細書で使用される総ての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解しているものと同じ意味を有する。本発明の試験のための実施には、本明細書に記載されているものと類似または等価ないずれの方法および材料も使用可能であるが、好ましい材料および方法を本明細書に記載する。
【００１７】
組換えタンパク質
「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指して本明細書において互換的に使用される。
【００１８】
「ペプチド」は、本明細書で使用する場合、本明細書に具体的に例示されるペプチドの保存的変種であるペプチドを含む。「保存的変種」は、本明細書で使用する場合、アミノ酸残基の、別の生物学的類似の残基による置換を表す。保存的変形形態の例としては、限定されるものではないが、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、システイン、グリシン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、ノルロイシンまたはメチオニンなどのある疎水性残基の別のものとの置換、またはある極性残基の別のものとの置換、例えば、アルギニンのリシンとの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸との置換、またはグルタミンのアスパラギンとの置換などが含まれる。互いに置換可能な中性親水性アミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリンおよびトレオニンが含まれる。
【００１９】
「保存的変種」はまた、置換ポリペプチドに対して生じた抗体も非置換ポリペプチドと免疫反応性がある限り、非置換親アミノ酸の代わりに置換アミノ酸の使用も含む。このような保存的置換は、本明細書に記載のタンパク質のクラスの定義の範囲内にある。
【００２０】
本明細書で使用する場合、「治療用タンパク質」は、組織、系、動物またはヒトの生物学的応答または免疫応答を惹起するために哺乳動物に投与することができるいずれのタンパク質および／またはポリペプチドも指す。組換えタンパク質は、２つ以上の生物学的応答または医学的応答を惹起し得る。さらに、用語「治療上有効な量」は、そのような量を受容しなかった対応する対象に比べて、限定されるものではないが、疾患、障害、もしくは副作用の治癒、予防、もしくは改善、または疾患もしくは障害の進行速度の低減をもたらすいずれの量も意味する。この用語はまた、その範囲内に、通常の生理機能を増進するために有効な量ならびに患者において第２の医薬剤の治療効果を増強または補助する生理機能を生じるために有効な量も含む。
【００２１】
「組換え」とは、タンパク質に関して使用する場合、そのタンパク質が宿主細胞において組換え発現されたことを示す。
【００２２】
組換えタンパク質は、抗原結合タンパク質、例えば、抗体、モノクローナル抗体、抗体フラグメント、またはドメイン抗体を含んでなり得る。組換えタンパク質は、ウイルスタンパク質、細菌毒素、細菌トキソイド、または癌抗原を含んでなり得る。１つの実施形態において組換えタンパク質はモノクローナル抗体である。
【００２３】
用語「抗原結合タンパク質」は、本明細書で使用する場合、抗体、抗体フラグメントおよびその他のタンパク質構築物、例えば、抗原に結合し得るドメインを指す。
【００２４】
用語「抗体」は、本明細書では、免疫グロブリン様ドメインを有する分子を指して、最も広い意味で使用される。本明細書で使用する場合、「免疫グロブリン様ドメイン」は、抗体分子に特徴的な免疫グロブリン折り畳みを保持するポリペプチドのファミリーを指し、これらは２つのβシートと通常は保存されたジスルフィド結合を含有する。このファミリーには、モノクローナル（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＤまたはＩｇＥ）、組換え、ポリクローナル、キメラ、ヒト化、二重特異性およびヘテロコンジュゲート抗体；単一可変ドメイン、ドメイン抗体、抗原結合フラグメント、免疫学的に有効なフラグメント、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ジスルフィド結合Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ、ダイアボディ、ＴＡＮＤＡＢＳ（商標）などが含まれる。
【００２５】
「単一可変ドメイン」という句は、異なる可変領域またはドメインとは独立に抗原またはエピトープと特異的に結合する抗原結合タンパク質可変ドメイン（例えば、ＶＨ、ＶＨＨ、ＶＬ）を指す。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、抗原またはエピトープに結合し得る「単一可変ドメイン」と同じと考えられ得る。用語「エピトープ結合ドメイン」は、異なるドメインとは独立に抗原またはエピトープと特異的に結合するドメインを指す。
【００２６】
ドメイン抗体は、他の可変領域または可変ドメインとともに１つの形式（例えば、ホモまたはヘテロ多量体）で存在することができ、そこでは、それらの他の領域またはドメインは単一免疫グロブリン可変ドメインによる抗原結合に必要とされない（すなわち、免疫グロブリン単一可変ドメインは付加的可変ドメインとは独立に抗原と結合する）。
【００２７】
ドメイン抗体は、ヒト抗体可変ドメインであり得る。ｄＡｂは、ヒト起源のものであり得る。言い換えれば、ｄＡｂは、ヒトＩｇフレームワーク配列に基づき得る。
【００２８】
本明細書において使用する場合、用語「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合し得る抗原結合タンパク質上の部位を指し、これは単一ドメインであってもよいし、または標準的な抗体で見られるような対合したＶＨ／ＶＬドメインであってもよい。一本鎖Ｆｖ（ＳｃＦｖ）ドメインもまた抗原結合部位を提供し得る。
【００２９】
抗原結合タンパク質は、ｍＡｂｄＡｂのタンパク質足場形式を採ってもよい。「ｍＡｂｄＡｂ」および「ｄＡｂｍＡｂ」は互換的に使用され、本明細書で使用する場合、同じ意味を有するものとする。このような抗原結合タンパク質は、さらなる結合ドメイン、例えば、ドメイン抗体と連結される、タンパク質足場、例えば、Ｉｇ足場、例えば、ＩｇＧ、例えば、モノクローナル抗体を含んでなる。ｍＡｂｄＡｂは少なくとも２つの抗原結合部位を有し、そのうち少なくとも１つはドメイン抗体に由来し、少なくとも１つは対合したＶＨ／ＶＬドメインに由来する。
【００３０】
本明細書で使用する場合、「薬物」は、個体の生物学的標的分子との結合および／またはその機能の変更を介して有益な治療効果または診断効果をもたらすためにその個体に投与され得るいずれの化合物（例えば、小有機分子、核酸、ポリペプチド）も指す。標的分子は、個体のゲノムによりコードされている内因性標的分子（例えば、個体のゲノムによりコードされている酵素、受容体、増殖因子、サイトカイン）また病原体のゲノムによりコードされている外因性標的分子であり得る。薬物はｄＡｂまたはｍＡｂであり得る。
【００３１】
「ｄＡｂ複合体」は、薬物が共有結合または非共有結合的結合の手段によって化学的にコンジュゲートされたｄＡｂを含んでなる組成物を指す。好ましくは、ｄＡｂと薬物は共有結合される。このような共有結合は、ペプチド結合のよるものでもまたは修飾側鎖を介するものなどの他の手段によるものでもよい。非共有結合的結合は直接的であっても（例えば、静電気的相互作用、疎水性相互作用）または間接的であってもよい（例えば、相補的結合相手（例えば、ビオチンおよびアビジン）の非共有結合的結合を介する、この場合、一方の結合相手が薬物に共有結合され、相補的結合相手はｄＡｂに共有結合される）。相補的結合相手が使用される場合、その結合相手の一方は薬物に直接または好適なリンカー部分を介して共有結合させることができ、相補的結合相手はｄＡｂに直接または好適なリンカー部分を介して共有結合させることができる。
【００３２】
本明細書で使用する場合、「ｄＡｂ融合物」は、ｄＡｂとポリペプチド薬（ポリペプチド、ｄＡｂまたはｍＡｂであり得る）を含んでなる融合タンパク質を指す。ｄＡｂおよびポリペプチド薬は単一の連続したポリペプチド鎖の不連続部分（成分）として存在する。
【００３３】
本開示の方法は、組換えタンパク質、抗原結合タンパク質、抗体、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ドメイン抗体（ｄＡｂ）、ｄＡｂ複合体、ｄＡｂ融合物、ｍＡｂｄＡｂ、または上記の他のいずれかの抗原結合タンパク質のうち１以上を含有するサンプルにおいて核酸を検出するために適用することができる。
【００３４】
１つの実施形態において、組換えタンパク質サンプルは、治療用タンパク質を含んでなる。別の実施形態において、サンプルは、抗原結合タンパク質を含んでなる。１つの実施形態において、サンプルは、モノクローナル抗体を含んでなる。
【００３５】
タンパク質の発現
組換えタンパク質は、いくつかの従来技術のいずれによって作製してもよい。例えば、このタンパク質は、それらを本来発現する細胞から精製してもよいし（例えば、抗体はそれを生産するハイブリドーマから精製することができる）、または組換え発現系で生産してもよい。１つの実施形態において、組換えタンパク質は、哺乳動物細胞または細菌細胞から生産／誘導される。さらなる実施形態において、哺乳動物細胞は、ヒトまたは齧歯類（例えば、ハムスターまたはマウス）細胞から選択される。なおさらなる実施形態において、ヒト細胞はＨＥＫ細胞であり、ハムスター細胞はＣＨＯ細胞であり、またはマウス細胞はＮＳ０細胞である。１つの実施形態において、宿主細胞はＣＨＯ細胞である。
【００３６】
特定の実施形態において、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＮＳ０細胞、Ｓｐ２／０細胞、ＣＯＳ細胞、Ｋ５６２細胞、ＢＨＫ細胞、ＰＥＲ．Ｃ６細胞、およびＨＥＫ細胞からなる群から選択される。あるいは、宿主細胞は、大腸菌(E. coli)（例えば、Ｗ３１１０、ＢＬ２１）、枯草菌(B. subtilis)および／または他の好適な細菌からなる群から選択される細菌細胞；真菌または酵母細胞（例えば、ピキア・パストリス(Pichia pastoris,)、アスペルギルス(Aspergillus)種、サッカロミセス・セレビシエ(Saccharomyces cerevisiae)、シゾサッカロミセス・ポムベ(Schizosaccharomyces pombe)、アカパンカビ(Neurospora crassa）などの真核細胞であり得る。
【００３７】
組換えタンパク質をコードする組換え核酸分子を含んでなるベクターもまた本明細書に記載される。ベクターは、１以上の発現制御エレメントまたは組換え核酸に機能的に連結された配列を含んでなる発現ベクターであり得る。ベクターの例としては。プラスミドおよびファージミドが含まれる。
【００３８】
好適な発現ベクターは、いくつかの成分、例えば、複製起点、選択マーカー遺伝子、１以上の発現制御エレメント、例えば、転写制御エレメント（例えば、プロモーター、エンハンサー、ターミネーター）および／または１以上の翻訳シグナル、シグナル配列またはリーダー配列を含有し得る。発現制御エレメントおよびシグナル配列は、存在する場合、ベクターまたは他の供給源により提供することができる。例えば、抗体鎖をコードするクローニング核酸の転写および／または翻訳制御配列を、発現を指示するために使用することができる。プロモーターは所望の細胞で発現を提供することができる。プロモーターは、構成的または誘導型であり得る。例えば、プロモーターは、それが核酸の転写を指示するように、抗体、抗体鎖またはその一部をコードする核酸と機能的に連結することができる。
【００３９】
宿主細胞は、上記の組換え核酸分子またはベクターを含んでなる。
【００４０】
組換えタンパク質は、細胞内で発現させることができる。別の実施形態において、発現された組換えタンパク質は、タンパク質を細胞の分泌経路に向けるシグナル配列（シグナルペプチドとしても知られる）を有する。
【００４１】
宿主細胞は、組換えタンパク質の発現に好適な条件下で増殖させる。宿主細胞培養物は、宿主細胞の増殖および組換えタンパク質の発現を支持するいずれの培地で培養してもよい。このような培地は当業者に周知である。組換えタンパク質の発現は宿主細胞の細胞質で起こるが、その組換えタンパク質の最終的な場所は、組換えタンパク質の性質、使用する宿主細胞、および使用する発酵条件によって、細胞質、原形質周辺または細胞外であり得る。
【００４２】
発酵槽の容量は、
（ｉ）約１０，０００リットル；約５，０００リットル；約２，０００リットル；約１，０００リットル；約５００リットル；約１２５リットル；約５０リットル；約２０リットル；約１０リットル；約５リットル；または
（ｉｉ）５〜１０，０００リットル；１０〜５，０００リットル；２０〜２，０００リットル；５０〜１，０００リットル
であり得る。
【００４３】
収穫は発酵の終了である。収穫は、発酵工程が終了し、発現された組換えタンパク質を回収するのに十分であると考えられる発酵中のいずれの時点であってもよい。収穫は、細胞および細胞外培地（すなわち、細胞培養物または培養液）の発酵槽を空にする任意選択の工程を含み得る。
【００４４】
タンパク質の精製
典型的な精製工程は、まず、固体粒子を除去するための清澄化、次に、組換えタンパク質の十分な純度を確保するための精製を含む。清澄化は、精製の際に、続いてのクロマトグラフィー工程での負荷を引き下げることができる。典型的な清澄化工程は、沈降工程―沈澱としても知られる（例えば、重力による）、および／または遠心分離工程、および／または濾過工程を含んでなる。清澄化の前に、サンプルをコンディショニングする方法として前処理工程が使用される場合もある。コンディショニング前処理工程の一例が、固体粒子により大きな凝集塊を形成させる凝集であり、これらはその後、清澄化により除去される。
【００４５】
精製においては１以上のクロマトグラフィー工程、例えば、１以上のクロマトグラフィー樹脂；および／または１以上の濾過工程が使用され得る。例えば、プロテインＡまたはＬなどの樹脂を用いたアフィニティークロマトグラフィーを組換えタンパク質の精製に使用してもよい。その代わりに、またはそれに加えて、陽イオン交換樹脂などのイオン交換樹脂を組換えタンパク質の精製に使用してもよい。
【００４６】
精製された組換えタンパク質は、薬学上許容可能な組成物として調剤してもよい。
【００４７】
サンプル
本明細書で使用する場合、「バルク原薬」サンプルまたは「ＢＤＳ」サンプルは、高濃度の組換えタンパク質を含有するサンプルである。一般に、バルク原薬サンプルは、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有する。１つの実施形態において、バルク原薬サンプルは、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約１２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有する。
【００４８】
１つの実施形態において、ＢＤＳサンプルは、なくとも約５０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質、少なくとも約１００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質、少なくとも約１０５ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質、少なくとも約１１０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質、少なくとも約１１５ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質、少なくとも約１２０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質、少なくとも約１２５ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質、少なくとも約１５０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質、少なくとも約２００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質、または少なくとも約２５０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなる。１つの実施形態において、ＢＤＳサンプルは、約５０ｍｇ／ｍＬ〜約２５０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなる。別の実施形態において、ＢＤＳサンプルは、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約２００ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなる。別の実施形態において、ＢＤＳサンプルは、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約１５０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなる。別の実施形態において、ＢＤＳサンプルは、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約１２０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなる。１つの実施形態において、組換えタンパク質は、モノクローナル抗体である。
【００４９】
本明細書で使用する場合、「工程内」サンプルは、低濃度の組換えタンパク質を含有するサンプルである。例えば、工程内サンプルは一般に、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有する。１つの実施形態において、工程内サンプルは、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬのタンパク質濃度を有する。
【００５０】
１つの実施形態において、工程内サンプルは、約０．１ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質〜約２０ｍｇ／ｍＬを含んでなる。１つの実施形態において、工程内サンプルは、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなる。別の実施形態において、工程内サンプルは、約１ｍｇ／ｍＬ〜約２０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなる。別の実施形態において、工程内サンプルは、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなる。１つの実施形態において、組換えタンパク質は、モノクローナル抗体である。
【００５１】
分析方法
本明細書に記載の方法は、サンプルからポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を除去するために使用することができ、それにより、様々な分析方法におけるアッセイ感度を向上させる。このような分析方法としては、限定されるものではないが、リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、キャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）），および逆相ＨＰＬＣが含まれる。
【００５２】
凝集剤を含んでなるサンプルにおいて分析物を検出するためのアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高める方法であって、ヘパリンおよび界面活性剤をサンプルに添加し、それにより、サンプル中の分析物を検出するためのアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高めることを含んでなる方法が提供される。１つの実施形態において、凝集剤はＰＥＩである。１つの実施形態において、分析物は核酸である。１つの実施形態において、サンプルは、組換えタンパク質をさらにを含んでなる。１つの実施形態において、界面活性剤はサルコシルまたはＳＤＳである。１つの実施形態において、アッセイは生物薬剤学的分析方法である。別の実施形態において、アッセイは、核酸を検出するための増幅に基づくアッセイである。１つの実施形態において、アッセイはｑＰＣＲである。別の実施形態において、アッセイはキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）である。別の実施形態において、アッセイは表面プラズモン共鳴である。別の実施形態において、アッセイは逆相ＨＰＬＣである。１つの実施形態において、ヘパリンは終濃度が約５０μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬとなるようにサンプルに添加される。１つの実施形態において、サルコシルは終濃度が約０．０１％〜約２．０％となるようにサンプルに添加される。
【００５３】
凝集剤を含んでなるサンプルにおいて分析物を検出するためのアッセイにおいて、干渉を軽減する、および／または感度を高めるための方法であって、（ａ）サンプルの界面活性剤および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加し、それにより、サンプルにおいて分析物を検出するためのアッセイにおいて、干渉を軽減する、および／または感度を高めることを含んでなる方法が提供される。１つの実施形態において、凝集剤はＰＥＩである。１つの実施形態において、分析物は核酸である。１つの実施形態において、サンプルは組換えタンパク質をさらに含んでなる。１つの実施形態において、界面活性剤はサルコシルまたはＳＤＳである。１つの実施形態において、アッセイは、生物薬剤学的分析方法である。別の実施形態において、アッセイは、核酸を検出するための増幅に基づくアッセイである。１つの実施形態において、アッセイはｑＰＣＲである。別の実施形態において、アッセイはキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）である。別の実施形態において、アッセイは表面プラズモン共鳴である。別の実施形態において、アッセイは逆相ＨＰＬＣである。１つの実施形態において、ＳＤＳは終濃度が約０．０１％〜約２．０％となるようにサンプルに添加される。１つの実施形態において、ＮａＯＨは終濃度が約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭとなるようにサンプルに添加される。
【００５４】
凝集剤を含んでなるサンプルにおいて分析物を検出するためのアッセイにおいて、干渉を軽減する、および／または感度を高めるための方法であって、（ａ）サンプルに界面活性剤を添加すること、および（ｂ）前記サンプルのｐＨを少なくとも約８に調整し、それにより、サンプルにおいて分析物を検出するためのアッセイにおいて、干渉を軽減する、および／または感度を高めることを含んでなる方法が提供される。１つの実施形態において、凝集剤はＰＥＩである。１つの実施形態において、分析物は核酸である。１つの実施形態において、サンプルは組換えタンパク質をさらに含んでなる。１つの実施形態において、界面活性剤はサルコシルまたはＳＤＳである。１つの実施形態において、アッセイは生物薬剤学的分析方法である。別の実施形態において、アッセイは、核酸を検出するための増幅に基づくアッセイである。１つの実施形態において、アッセイはｑＰＣＲである。別の実施形態において、アッセイはキャピラリーゲル電気泳動（ＣＧＥ）である。別の実施形態において、アッセイは表面プラズモン共鳴である。別の実施形態において、アッセイは逆相ＨＰＬＣである。１つの実施形態において、ｐＨは約９に調整される。いくつかの実施形態において、ＳＤＳは終濃度が約０．０１％〜２．０％となるようにサンプルに添加される。１つの側面において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するための方法であって、（ａ）界面活性剤および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）をサンプルに添加すること；（ｂ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること；ならびに（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプル中の核酸を検出することを含んでなる方法が提供される。
【００５５】
１つの一側面において、凝集剤および組換えタンパク質を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するためのアッセイにおいて、干渉を軽減する、および／または感度を高める方法であって、（ａ）ヘパリンおよび界面活性剤をサンプルに添加することを含んでなり、工程（ａ）は、アッセイ中に核酸の増幅を阻害する核酸と凝集剤の間の相互作用を軽減し、それにより、サンプルにおいて核酸を検出するためのアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高める方法が提供される。１つの側面において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するための方法であって、（ａ）ヘパリンおよび界面活性剤をサンプルに添加すること；（ｂ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること；ならびに（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプル中の核酸を検出することを含んでなり；工程（ａ）は、アッセイ中に核酸の増幅を阻害する核酸と凝集剤の間の相互作用を軽減し、それにより、サンプルにおいて核酸を検出するためのアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高める方法が提供される。いくつかの実施形態において、アッセイはｑＰＣＲである。１つの実施形態において、ヘパリンは、終濃度が約５０μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬとなるようにサンプルに添加される。１つの実施形態において、界面活性剤がサルコシルである。１つの実施形態において、サルコシルは、終濃度が約０．０１％〜約２．０％となるようにサンプルに添加される。
【００５６】
１つの側面において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいてｑＰＣＲを用いて核酸を検出するための方法であって、（ａ）ヘパリンおよび界面活性剤をサンプルに添加すること；（ｂ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること；ならびに（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより前記サンプル中の核酸を検出することを含んでなり；工程（ａ）は、アッセイ中に核酸の増幅を阻害する核酸と凝集剤の間の相互作用を軽減し、それにより、サンプルにおいて核酸を検出するためのアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高める方法が提供される。
【００５７】
１つの側面において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいてｑＰＣＲを用いて核酸を検出するための方法であって、（ａ）ヘパリンおよび界面活性剤をサンプルに添加すること、ここで、ヘパリンは、終濃度が約５０μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬとなるようにサンプルに添加される；（ｂ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること；ならびに（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより前記サンプル中の核酸を検出することを含んでなり；工程（ａ）は、アッセイ中に核酸の増幅を阻害する核酸と凝集剤の間の相互作用を軽減し、それにより、サンプルにおいて核酸を検出するためのアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高める方法が提供される。
【００５８】
１つの側面において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいてｑＰＣＲを用いて核酸を検出するための方法であって、（ａ）ヘパリンおよび界面活性剤をサンプルに添加すること、ここで、界面活性剤はサルコシルであり、かつ、終濃度が約０．０１％〜約２％となるようにサンプルに添加される；（ｂ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること；ならびに（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより前記サンプル中の核酸を検出することを含んでなり；工程（ａ）は、アッセイ中に核酸の増幅を阻害する核酸と凝集剤の間の相互作用を軽減し、それにより、サンプルにおいて核酸を検出するためのアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高める方法が提供される。
【００５９】
１つの側面において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいてｑＰＣＲを用いて核酸を検出するための方法であって、（ａ）ヘパリンおよび界面活性剤をサンプルに添加すること、ここで、界面活性剤はＳＤＳであり、かつ、終濃度が約０．０１％〜約２％となるようにサンプルに添加される；（ｂ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること；ならびに（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより前記サンプル中の核酸を検出することを含んでなり；工程（ａ）は、アッセイ中に核酸の増幅を阻害する核酸と凝集剤の間の相互作用を軽減し、それにより、サンプルにおいて核酸を検出するためのアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高める方法が提供される。
【００６０】
別の側面において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出ための増幅に基づくアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高めるための方法であって、サンプルに界面活性剤および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加することを含んでなり、工程（ａ）は、アッセイ中に核酸の増幅を阻害する核酸−凝集剤相互作用を軽減し、それにより、サンプルにおいて核酸を検出するためのアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高める方法が提供される。１つの実施形態において、アッセイはｑＰＣＲである。１つの実施形態において、界面活性剤はＳＤＳである。１つの実施形態において、ＳＤＳは、終濃度が約０．０１％〜約２．０％となるようにサンプルに添加される。１つの実施形態において、ＮａＯＨは、終濃度が約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭとなるようにサンプルに添加される。
【００６１】
さらに別の側面において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出ための増幅に基づくアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高めるための方法であって、（ａ）界面活性剤をサンプルに添加すること、および（ｂ）サンプルのｐＨを少なくとも約８に調整することを含んでなり、工程（ａ）および（ｂ）は、アッセイ中に核酸の増幅を阻害する核酸−凝集剤相互作用を軽減し、それにより、サンプルにおいて核酸を検出するためのアッセイにおいて干渉を軽減する、および／または感度を高める方法が提供される。１つの実施形態において、アッセイはｑＰＣＲである。１つの実施形態において、ｐＨは約９に調整される。１つの実施形態において、ＳＤＳは、終濃度が約０．０１％〜２．０％となるようにサンプルに添加される。
【００６２】
１つの実施形態において、本方法によるサンプルの処理は、アッセイの感度に非処理サンプルを用いるアッセイの感度の約５倍〜２００倍の増加をもたらす。１つの実施形態において、アッセイの感度は、非処理サンプルを用いるアッセイの感度の約５倍、約１０倍、約１５倍、約２０倍、約３０倍、約４０倍、約５０倍、約６０倍、約７０倍、約８０倍、約９０倍、約１００倍、約１２０倍、約１４０倍、約１６０倍、約１８０倍、または約２００倍の増加である。
【００６３】
１つの実施形態において、アッセイは、核酸を検出するための増幅に基づくアッセイである。１つの実施形態において、アッセイはｑＰＣＲである。１つの実施形態において、本方法によるサンプルの処理は、非処理サンプルを用いる場合の約１：２０００〜１：１００００という希釈倍率に比べ、約１：２００〜約１：５００の希釈倍率でサンプルが希釈される場合に許容可能な回収率をもたらす。
【００６４】
核酸を検出または定量するための方法
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡ融解およびＤＮＡポリメラーゼを用いるＤＮＡの酵素的複製のための反応の加熱および冷却の反復サイクルからなるＤＮＡを増幅するための、一般的なサーマルサイクリング依存性核酸増幅技術である。リアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）は、生体サンプル中の所与の核酸配列のコピー数を定量するために使用される技術である。現在、ｑＰＣＲは、反応中、リアルタイムで反応生成物の検出を利用し、その増幅プロフィールを各反応の初めに既知量の核酸を含有する対照の増幅（または未知の試験核酸に対する核酸の相対比）と比較する。対照の結果を用い、一般に標準反応増幅曲線の対数部分に基づいて標準曲線を作成する。これらの値は、それらの増幅曲線がどこで標準対照量に匹敵したかに基づいて未知の量を外挿するために使用される。
【００６５】
ＰＣＲに加え、非サーマルサイクリング依存性増幅システムまたは等温核酸増幅技術が存在し、限定されるものではないが、ニッキング増幅反応、ローリングサークル型増幅（ＲＣＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、ループ媒介増幅（ＬＡＭＰ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、自家持続配列複製（３ＳＲ）、核酸配列に基づく増幅（ＮＡＳＢＡ）、シングルプライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、Ｑ−βレプリカーゼシステム、およびリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）が含まれる。他の増幅技術としては、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、多重置換増幅（ＭＤＡ）、ヘリカーゼ依存性増幅（ＨＤＡ）、および分枝依存性増幅（ＲＡＭ）が含まれる。
【００６６】
ＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲシステムは、残留宿主細胞ＤＮＡの定量に広く使用されている。ＴａｑＭａｎ  ｑＰＣＲシステムは、２つのプライマーの間に蛍光標識プローブを付加し、ＰＣＲ中にＤＮＡフラグメントを合成し、ポリメラーゼはプローブをつかみ、リポーター色素はクエンチャー色素からの制御を失い、ＰＣＲにより合成されたＤＮＡフラグメントの数に比例して蛍光シグナルを生じる。ハイスループットを伴う９６ウェル形式は、従来のＰＣＲである第一世代のＰＣＲよりも効率および定量力を劇的に高めた。ｑＰＣＲ法は、感度および特異度に関しては優れているが、サンプル基質からの干渉には弱い。通常、残留ＤＮＡ宿主細胞ＤＮＡ  ｑＰＣＲアッセイは、サンプル希釈、ＤＮＡ抽出および陽性対照ＤＮＡの添加を必要とし、添加回収率を評価する。
【００６７】
１つの実施形態において、サンプル中の核酸がリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により検出または定量される。１つの実施形態において、サンプル中の宿主細胞ＤＮＡがリアルタイム定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）により検出または定量される。
【００６８】
界面活性剤
界面活性剤が組換えタンパク質サンプルに添加される。１つの実施形態において、界面活性剤はサルコシルである。サルコシルは陰イオン性界面活性剤である。サルコシルは、細胞溶解およびタンパク質の可溶化に使用することができる。サルコシルの構造を以下に示す。
【化１】
2021536241.tif 000002
【００６９】
別の実施形態において、界面活性剤はドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）である。ＳＤＳの構造を以下に示す。
【化２】
2021536241.tif 000003
【００７０】
他のいくつかの実施形態において、界面活性剤は、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム、トリトンＸ１００、またはツィーン２０である。
【００７１】
１つの実施形態において、界面活性剤は、サンプル中の界面活性剤の濃度が約０．０１％〜約２．０％となるように組換えタンパク質サンプルに添加される。別の実施形態において、サンプル中の界面活性剤の濃度は、約０．０５％〜約１．０％である。１つの実施形態において、サンプル中の界面活性剤の濃度は、少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１．０％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２．０％である。別の実施形態において、サンプル中の界面活性剤の濃度は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％または約２．０％である。
【００７２】
１つの実施形態において、サルコシルは、サンプル中のサルコシルの濃度が約０．０１％〜約２．０％となるように組換えタンパク質サンプルに添加される。別の実施形態において、サンプル中のサルコシルの濃度は、約０．０５％〜約１．０％である。１つの実施形態において、サンプル中のサルコシルの濃度は、少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１．０％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２．０％である。別の実施形態において、サンプル中のサルコシルの濃度は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、または約２．０％である。
【００７３】
１つの実施形態において、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、サンプル中のＳＤＳの濃度が約０．０１％〜２．０％となるように組換えタンパク質サンプルに添加される。別の実施形態において、サンプル中のＳＤＳの濃度は、約０．０５％〜約１．０％である。１つの実施形態において、サンプル中のＳＤＳの濃度は、少なくとも約０．０１％、少なくとも約０．０５％、少なくとも約０．１％、少なくとも約０．５％、少なくとも約１．０％、少なくとも約１．５％、または少なくとも約２．０％である。別の実施形態において、サンプル中のＳＤＳの濃度は、約０．０１％、約０．０５％、約０．１％、約０．２％、約０．３％、約０．４％、約０．５％、約０．６％、約０．７％、約０．８％、約０．９％、約１．０％、約１．１％、約１．２％、約１．３％、約１．４％、約１．５％、約１．６％、約１．７％、約１．８％、約１．９％、または約２．０％である。
【００７４】
１つの実施形態において、サンプルのｐＨは、少なくとも約８である。別の実施形態において、サンプルのｐＨは、約８〜約１１、ｏｒ約９〜約１１である。１つの実施形態において、サンプルのｐＨは、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、または少なくとも約１１である。別の実施形態において、サンプルのｐＨは、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５、または約１１である。
【００７５】
水酸化ナトリウム
１つの実施形態において、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）が組換えタンパク質サンプルに添加される。１つの実施形態において、ＮａＯＨは、サンプル中のＮａＯＨの濃度が約０．１ｍＭ〜約１００ｍＭとなるようにサンプルに添加される。１つの実施形態において、サンプル中のＮａＯＨの濃度は、約０．１ｍＭ、約０．５ｍＭ、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、約２０ｍＭ、約２５ｍＭ、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、または約１００ｍＭである。
【００７６】
１つの実施形態において、サンプルにＮａＯＨを添加した後、サンプルのｐＨは、少なくとも約８、少なくとも約９、少なくとも約１０、または少なくとも約１１である。別の実施形態において、サンプルのｐＨは、約８〜約１１、または約９〜約１１である。１つの実施形態において、サンプルのｐＨは、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約１０．５、または約１１である。
【００７７】
ヘパリン
ヘパリンは、強い負電荷を有する分子である。それは抗凝固剤（血液希釈剤）として使用することができる。ヘパリンの構造は図１Ｃに示されている。
【００７８】
１つの実施形態において、ヘパリンが組換えタンパク質サンプルに添加される。１つの実施形態において、ヘパリンは、サンプル中のヘパリンの濃度が約５０μｇ／ｍＬ〜約１０００μｇ／ｍＬとなるようにサンプルに添加される。別の実施形態において、ヘパリンの濃度は、約８０μｇ／ｍＬ〜約７５０μｇ／ｍＬである。１つの実施形態において、サンプル中のヘパリンの濃度は、少なくとも約５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約６０μｇ／ｍＬ、少なくとも約７０μｇ／ｍＬ、少なくとも約８０μｇ／ｍＬ、少なくとも約９０μｇ／ｍＬ、少なくとも約１００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２００μｇ／ｍＬ、少なくとも約２５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約３００μｇ／ｍＬ、少なくとも約４００μｇ／ｍＬ、少なくとも約５００μｇ／ｍＬ、少なくとも約６００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７００μｇ／ｍＬ、少なくとも約７５０μｇ／ｍＬ、少なくとも約８００μｇ／ｍＬ、少なくとも約９００μｇ／ｍＬ、または少なくとも約１０００μｇ／ｍＬである。１つの実施形態において、サンプル中のヘパリンの濃度は、約５０μｇ／ｍＬ、約６０μｇ／ｍＬ、約７０μｇ／ｍＬ、約８０μｇ／ｍＬ、約９０μｇ／ｍＬ、約１００μｇ／ｍＬ、約２００μｇ／ｍＬ、約２５０μｇ／ｍＬ、約３００μｇ／ｍＬ、約４００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬ、約６００μｇ／ｍＬ、約７００μｇ／ｍＬ、約７５０μｇ／ｍＬ、約８００μｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ、または約１０００μｇ／ｍＬである。
【００７９】
凝集剤
凝集剤は、不溶性または固体の材料の凝集を生じ、従って、可溶性の組換えタンパク質は溶液中に留まる。
【００８０】
凝集剤としては、無機または植物ヒドロコロイド；陽イオンポリ電解質（例えば、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、陽イオンポリアクリルアミド）；ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム（ＰＤＡＤＭＡＣ）；ポリアミン；ポリアミノ酸；ポリアクリルアミド；ポリアリルアミン；ポリビニルアミン；ポリ−Ｎ−メチルビニルアミン（ＰＭＶＡ）；微生物由来天然ポリマー（例えば、キトサン）；および化学凝集剤、例えば、硫酸アルミニウム、合成および非合成ポリマーが含まれる。凝集剤の具体例としては、ＰＥＩ、ポリ（塩化ジアリルジメチルアンモニウム）（ＰＤＡＤＭＡＣ）（低分子量型ＭＷ：１００ｋＤａ〜２００ｋＤａ；または高分子量型４００ｋＤａ〜５００ｋＤａ）、酸沈澱ＣａＣｌ２、キトサン（ＭＷ：１１０ｋＤａ）が含まれる。
【００８１】
１つの実施形態において、凝集剤は、陽イオンポリマーである。１つの実施形態において、凝集剤は、ポリ塩化ジアリルジメチルアンモニウム（ｐＤＡＤＭＡＣ）、ポリアミン、ポリアミノ酸、ポリアクリルアミド、キトサン、ポリアリルアミン、ポリビニルアミン、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、またはポリ−Ｎ−メチルビニルアミン（ＰＭＶＡ）である。
【００８２】
１つの実施形態において、凝集剤は、ポリエチレンイミン(polytheyleneimine)（ＰＥＩ）である。ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）は、有機ポリ陽イオン（正電荷ポリマー）である。ＰＥＩは、直鎖、分岐型（低分岐、高分岐）であり得、強い正電荷を有する（図１Ａ）。ＰＥＩは、ＤＮＡと強固に結合する（図１Ｂ）。ＰＥＩは、下流精製工程で宿主細胞ＤＮＡおよびＨＣＰを除去するために凝集剤として使用することができる。ＰＥＩは、微生物の細胞培養およびＣＨＯプラットフォーム下流精製工程で使用することができる。ＰＥＩはまた、遺伝子療法およびトランスフェクションのための非ウイルスベクターとしても広く使用されている。一般に、下流精製で使用されるＰＥＩは高分岐型で、７５０ｋＤａの分子量を有する。
【００８３】
１つの実施形態において、凝集剤は陽イオン性である。１つの実施形態において、凝集剤は、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）である。１つの実施形態において、ＰＥＩは高分岐型である。１つの実施形態において、ＰＥＩは、７５０ｋＤａの分子量を有する。
【００８４】
１つの実施形態において、組換えタンパク質サンプルは、約０〜約１０００ｐｐｍ、または約１０〜約１０００ｐｐｍ、または約２０〜１０００ｐｐｍ、または約１００〜約１０００ｐｐｍ、または約２０〜約２００ｐｐｍの凝集剤を含有する。１つの実施形態において、サンプルは、少なくとも約０．００１ｐｐｍの凝集剤、少なくとも約０．０１ｐｐｍの凝集剤、少なくとも約０．１ｐｐｍの凝集剤、少なくとも約１ｐｐｍの凝集剤、少なくとも約１０ｐｐｍの凝集剤、少なくとも約２０ｐｐｍの凝集剤、少なくとも約５０ｐｐｍの凝集剤、少なくとも約１００ｐｐｍの凝集剤、少なくとも約２００ｐｐｍの凝集剤、少なくとも約５００ｐｐｍの凝集剤、または少なくとも約１０００ｐｐｍの凝集剤を含有する。１つの実施形態において、サンプルは、約５０ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍの凝集剤を含有する。１つの実施形態において、サンプルは、約１００ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍの凝集剤を含有する。１つの実施形態において、サンプルは、約１０ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍの凝集剤を含有する。１つの実施形態において、サンプルは、約２０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍの凝集剤を含有する。
【００８５】
１つの実施形態において、サンプルは、約０〜約１０００ｐｐｍのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含有する。１つの実施形態において、サンプルは、少なくとも約０．００１ｐｐｍのＰＥＩ、少なくとも約０．０１ｐｐｍのＰＥＩ、少なくとも約０．１ｐｐｍのＰＥＩ、少なくとも約１ｐｐｍのＰＥＩ、少なくとも約１０ｐｐｍのＰＥＩ、少なくとも約２０ｐｐｍのＰＥＩ、少なくとも約５０ｐｐｍのＰＥＩ、少なくとも約１００ｐｐｍのＰＥＩ、少なくとも約２００ｐｐｍのＰＥＩ、少なくとも約５００ｐｐｍのＰＥＩ、または少なくとも約１０００ｐｐｍのＰＥＩを含有する。１つの実施形態において、サンプルは、約５０ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍのＰＥＩを含有する。１つの実施形態において、サンプルは、約１００ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍのＰＥＩを含有する。１つの実施形態において、サンプルは、約１０ｐｐｍ〜約５００ｐｐｍのＰＥＩを含有する。１つの実施形態において、サンプルは、約２０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍのＰＥＩを含有する。
【００８６】
１つの実施形態において、ヘパリンおよびサルコシルは、サンプルがＰＥＩ、ヘパリン、およびサルコシルを約１０００ｐｐｍ  ＰＥＩ：７５０μｇ／ｍＬヘパリン：１％サルコシルの比率で含有するように組換えタンパク質サンプルに添加される。
【００８７】
１つの実施形態において、ＳＤＳおよび水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）がサンプルに添加され、サンプル中のＳＤＳの濃度は約０．５％であり、サンプル中のＮａＯＨの濃度は約２５ｍＭである。
【００８８】
１つの実施形態において、サルコシルおよびヘパリンがサンプルに添加され、サンプル中のサルコシルの濃度は約１．０％であり、サンプル中のヘパリンの濃度は約７５０μｇ／ｍＬであり、サンプルは約１０００ｐｐｍのＰＥＩを含んでなり、サンプルは約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなる。別の実施形態において、サルコシルおよびヘパリンがサンプルに添加され、サンプル中のサルコシルの濃度は約０．０５％であり、サンプル中のヘパリンの濃度は約８０μｇ／ｍＬであり、サンプルは約１００ｐｐｍのＰＥＩを含んでなり、サンプルは約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなる。
【００８９】
１つの実施形態において、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質および約１００ｐｐｍ〜約１０００ｐｐｍのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含んでなるサンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出するための方法であって、
（ａ）サンプルにヘパリンおよびサルコシルを添加すること、このヘパリンの濃度は約８０μｇ／ｍＬ〜約７５０μｇ／ｍＬであり、サルコシルの濃度は約０．０５％〜約１．０％である、
（ｂ）宿主細胞のＤＮＡの少なくとも一部分を増幅すること、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出すること
を含んでなる方法が提供される。
【００９０】
１つの実施形態において、約１ｍｇ／ｍＬ〜約１５ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなるサンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出するための方法であって、
（ａ）サンプルにヘパリンおよびサルコシルを添加すること、このヘパリンの濃度は約８０μｇ／ｍＬ〜約７５０μｇ／ｍＬであり、サルコシルの濃度は約０．０５％〜約１．０％である、
（ｂ）宿主細胞のＤＮＡの少なくとも一部分を増幅すること、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出すること
を含んでなる方法が提供される。
【００９１】
１つの実施形態において、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約１２０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質および約２０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含んでなるサンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出するための方法であって、
（ａ）サンプルにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加すること、このサンプルのｐＨは少なくとも約８であり、サンプル中のＳＤＳの濃度は約０．５％であり、サンプル中のＮａＯＨの濃度は約２５ｍＭである、
（ｂ）宿主細胞のＤＮＡの少なくとも一部分を増幅すること、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出すること
を含んでなる方法が提供される。
【００９２】
１つの実施形態において、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約１２０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなるサンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出するための方法であって、
（ａ）サンプルにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）を添加すること、このサンプルのｐＨは少なくとも約８であり、サンプル中のＳＤＳの濃度は約０．５％であり、サンプル中のＮａＯＨの濃度は約２５ｍＭである、
（ｂ）宿主細胞のＤＮＡの少なくとも一部分を増幅すること、ならびに
（ｃ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出すること
を含んでなる方法が提供される。
【００９３】
１つの実施形態において、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約１２０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質および約２０ｐｐｍ〜約２００ｐｐｍのポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を含んでなるサンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出するための方法であって、
（ａ）サンプルにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加すること、このサンプル中のＳＤＳの濃度は約０．５％である、
（ｂ）サンプルのｐＨを少なくとも約８に調整すること、
（ｃ）宿主細胞のＤＮＡの少なくとも一部分を増幅すること、および
（ｄ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出すること
を含んでなる方法が提供される。
【００９４】
１つの実施形態において、約１００ｍｇ／ｍＬ〜約１２０ｍｇ／ｍＬの組換えタンパク質を含んでなるサンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出するための方法であって、
（ａ）サンプルにドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）を添加すること、このサンプル中のＳＤＳの濃度は約０．５％である、
（ｂ）サンプルのｐＨを少なくとも約８に調整すること、
（ｃ）宿主細胞のＤＮＡの少なくとも一部分を増幅すること、および
（ｄ）工程（ｂ）の増幅を検出し、それにより、サンプルにおいて宿主細胞のＤＮＡを検出すること
を含んでなる方法が提供される。
【００９５】
１つの実施形態において、サンプル中の核酸の濃度は、約１０９ｐｇ／ｍＬ〜約１０３ｐｇ／ｍＬである。１つの実施形態において、サンプル中の核酸の濃度は、約１０９ｐｇ／ｍＬ、約１０８ｐｇ／ｍＬ、約１０７ｐｇ／ｍＬ、約１０６ｐｇ／ｍＬ、約１０５ｐｇ／ｍＬ、約１０４ｐｇ／ｍＬ、または約１０３ｐｇ／ｍＬである。１つの実施形態において、サンプル中の核酸はＤＮＡである。１つの実施形態において、サンプル中の核酸は宿主細胞ＤＮＡである。
【００９６】
１つの実施形態において、本方法は、サンプル中の核酸を変性させる工程をさらに含んでなる。１つの実施形態において、核酸を変性させる工程は、核酸の熱変性を含んでなる。１つの実施形態において、核酸を変性させる工程は、サンプルを約８５℃、約９０℃、または約９５℃の温度でインキュベートすることを含んでなる。１つの実施形態において、核酸を変性させる工程は、サンプルを約８５℃、約９０℃、または約９５℃で約５分、約１０分、または約１５分間インキュベートすることを含んでなる。１つの実施形態において、核酸を変性させる工程は、サンプルに界面活性剤を添加する工程の後に行われる。１つの実施形態において、核酸を変性させる工程は、サンプルに界面活性剤およびＮａＯＨを添加する工程の後に行われる。別の実施形態において、核酸を変性させる工程は、サンプルに界面活性剤を添加する工程およびサンプルのｐＨを少なくとも約８に調整する工程の後に行われる。別の実施形態において、核酸を変性させる工程は、サンプルにヘパリンおよび界面活性剤を添加する工程の後に行われる。１つの実施形態において、核酸はＤＮＡである。
【００９７】
１つの実施形態において、本方法は、サンプルを遠心分離する工程をさらに含んでなる。１つの実施形態において、サンプルを遠心分離する工程は、サンプルを約１００００ｒｐｍ〜約１６０００ｒｐｍで遠心分離することを含んでなる。１つの実施形態において、サンプルは、約１００００ｒｐｍ、約１１０００ｒｐｍ、約１２０００ｒｐｍ、約１３０００ｒｐｍ、約１４０００ｒｐｍ、約１５０００ｒｐｍ、または約１６０００ｒｐｍで遠心分離される。１つの実施形態において、サンプルを遠心分離する工程は、サンプルを約１００００ｒｐｍ、約１１０００ｒｐｍ、約１２０００ｒｐｍ、約１３０００ｒｐｍ、約１４０００ｒｐｍ、約１５０００ｒｐｍ、または約１６０００ｒｐｍで約５分、約１０分、または約１５分間遠心分離することを含んでなる。１つの実施形態において、サンプルを遠心分離する工程は、サンプルに界面活性剤を添加する工程の後に行われる。１つの実施形態において、サンプルを遠心分離する工程は、サンプルに界面活性剤およびＮａＯＨを添加する工程の後に行われる。別の実施形態において、サンプルを遠心分離する工程は、サンプルに界面活性剤を添加する工程およびサンプルのｐＨを少なくとも約８に調整する工程の後に行われる。別の実施形態において、サンプルを遠心分離する工程は、サンプルにヘパリンおよび界面活性剤を添加する工程の後に行われる。別の実施形態において、サンプルを遠心分離する工程は、核酸を変性させる工程の後に行われる。１つの実施形態において、核酸はＤＮＡである。
【００９８】
１つの実施形態において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するための方法であって、
（ａ）界面活性剤および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）をサンプルに添加すること、
（ｂ）核酸を変性させること、
（ｃ）サンプルを遠心分離すること、
（ｄ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること、ならびに
（ｅ）工程（ｄ）の増幅を検出し、それにより、サンプル中の核酸を検出すること
を含んでなる方法が提供される。
【００９９】
別の実施形態において、組換えタンパク質および凝集剤を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するための方法であって、
（ａ）界面活性剤をサンプルに添加すること、
（ｂ）サンプルのｐＨを少なくとも約８に調整すること、
（ｃ）核酸を変性させること、
（ｄ）サンプルを遠心分離すること、
（ｅ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること、および
（ｆ）工程（ｅ）の増幅を検出し、それにより前記サンプル中の核酸を検出すること
を含んでなる方法が提供される。
【０１００】
さらに別の実施形態において、凝集剤および組換えタンパク質を含んでなるサンプルにおいて核酸を検出するための方法であって、
（ａ）ヘパリンおよび界面活性剤をサンプルに添加すること、
（ｂ）核酸を変性させること、
（ｃ）サンプルを遠心分離すること、
（ｄ）核酸の少なくとも一部分を増幅すること、ならびに
（ｅ）工程（ｄ）の増幅を検出し、それにより前記サンプル中の核酸を検出すること
を含んでなる方法が提供される。
【実施例】
【０１０１】
本発明者らは、残留ＤＮＡ  ｑＰＣＲアッセイに関してＰＥＩによる干渉作用を克服する能力を実証したサンプル調製プロトコールを考案した。開発されたサンプル調製は、加熱変性および遠心分離の前にサンプルに添加される陰イオン薬剤（ヘパリン）と界面活性剤（サルコシル）の新規な混合物を用いる。開発した他のサンプル調製では、サンプルに添加される界面活性剤（ＳＤＳ）および水酸化ナトリウムを用いた。いくつかのサンプル調製において、ＰＥＩとＤＮＡをヘパリン／サルコシルで分離し、サンプルを遠心分離してＰＥＩ／ヘパリン／サルコシル複合体を、遠心分離後に溶液中に留まったＤＮＡから分離することにより、ＰＥＩを分離および除去した（部分的または完全に）。これらのサンプルの少なくとも一部は、ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、またはｍＡｂ３を含有する工程内サンプルまたはバルク原薬サンプルであった。ｍＡｂ１、ｍＡｂ２、およびｍＡｂ３はモノクローナル抗体であり、それぞれ異なる標的に結合する。
【０１０２】
実施例１
ｑＰＣＲに対するＰＥＩの干渉
一般に、工程内サンプル中には１００ｐｐｍ（０．０１％）のＰＥＩおよびＢＤＳ（バルク原薬）サンプル中には２０ｐｐｍ（０．００２％）のＰＥＩが存在する。これらのサンプルはｑＰＣＲにより許容可能なＤＮＡの回収率を得るために２０００倍〜１００００倍希釈を行う必要があった（図２）。これは２つの問題を招く。第１に、アッセイ感度の低下があり、結果が定量限界（ＬＯＱ）×希釈倍率未満と報告される場合、希釈倍率は１００００であり、ＬＯＱは１ｐｇ／ｍＬであり、結果が１００００ｐｇ／ｍＬ未満である。第２に、残留ＤＮＡのＦＤＡ要件（１０ｎｇ／用量）を満たすことができない重大なリスクがある。
【０１０３】
ヘパリンおよびサルコシルで処理したサンプルに関するＷａｋｏ  ＤＮＡ／ｑＰＣＲの結果
図４は、ＰＥＩ  ０．１％（１０００ｐｐｍ）＋終濃度１０４ｐｇ／ｍＬのチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞ＤＮＡを含有するサンプルの回収を示す。ＰＥＩ単独（無処理）をヘパリンおよびサルコシル処理と比べた場合、大きな干渉がある。１００００倍希釈でのＰＥＩ単独（無処理）では、第１水準の添加によってＤＮＡは検出されず、第２水準の添加回収率は２５％であった。１：１００のヘパリンおよびサルコシル処理では、第１水準の添加は７６．５％の回収率を示し、第２水準の添加回収率は６２．７％であった。アッセイ感度は少なくとも１００倍改善された。
【０１０４】
図５は、ヘパリン（８０μｇ／ｍＬ）およびサルコシル（０．０５％）で処理した１００ｐｐｍのＰＥＩでｍＡｂ１液体フェニル溶出液サンプルの回収率を示す。
【０１０５】
バルク原薬（ＢＤＳ）サンプルに関する結果
本発明者らは、ヘパリンおよびサルコシルで処理したＢＤＳサンプルがサンプルを加熱し遠心分離した後であっても固体様の粘稠度を有することを見出した。
【０１０６】
ヘパリンおよびサルコシルの代わりに、ＢＤＳサンプルをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）および水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で処理した。図６は、２０ｐｐｍ  ＰＥＩおよび１０４ｐｇ／ｍＬ  ＣＨＯ細胞ＤＮＡを含むｍＡｂ１バルク原薬（ＢＤＳ）サンプルをＳＤＳおよびＮａＯＨで処処理したものの回収率を示す。図６の結果は、ＳＤＳとＮａＯＨがサルコシルよりも良好に働いたことを示す。図７および８は、２０ｐｐｍ  ＰＥＩおよび１０４ｐｇ／ｍＬ  ＣＨＯ細胞ＤＮＡを含むｍＡｂ２  ＢＤＳをＳＤＳおよびＮａＯＨで処理したものの回収率を示す。結果は０．５％ＳＤＳ＋２５ｍＭ  ＮａＯＨが、ＢＤＳサンプルからＰＥＩを除去することを示す。図７の結果はまた、０．５％ＳＤＳが最良のアッセイ条件であり、１０ｍＭ  ＮａＯＨが５ｍＭ  ＮａＯＨよりも良好に働いたことも示す。ＳＤＳおよびＮａＯＨで処理したサンプルは、約９〜１１のｐＨであった。
【０１０７】
図９は、２０ｐｐｍ  ＰＥＩおよび１０４ｐｇ／ｍＬ  ＣＨＯ細胞ＤＮＡを有するｍＡｂ１  ＢＤＳ、ｍＡｂ２  ＢＤＳ、およびｍＡｂ３  ＢＤＳサンプルを０．５％ＳＤＳおよび２５ｍＭ  ＮａＯＨで処理したものの回収率を示す。処理無しでは、２０ｐｐｍ  ＰＥＩを有するＢＤＳは、６０％を超える添加回収率にＴ達するために１：２０００希釈を必要とした。０．５％ＳＤＳ＋２５ｍＭ  ＮａＯＨ処理は、アッセイ感度を約１０媒改善した。１：２００希釈により、ｑＰＣＲ結果は残留ＤＮＡ  ｑＰＣＲアッセイのＦＤＡ要件を容易に満たすことができた。
【０１０８】
結果の要約
要約すると、これらの結果は、サンプル中０．５％ＳＤＳおよび２５ｍＭ  ＮａＯＨ（終濃度）の使用は、サンプルから効果的にＰＥＩを除去し、ＢＤＳサンプル（２０ｐｐｍ  ＰＥＩ）に関してアッセイ感度を１０倍にしたことを示す。これらの結果はまた、１０００ｐｐｍ  ＰＥＩに関しては７５０μｇ／ｍＬヘパリン＋１％サルコシルが、および１００ｐｐｍ  ＰＥＩに関しては８０μｇ／ｍＬヘパリン＋０．０５％サルコシルが、工程内サンプルのｑＰＣＲアッセイ感度を２０〜１００倍にしたことも示す。
【０１０９】
実施例１に記載の結果は、以下の材料および方法を用いて得たものである。
【０１１０】
材料および方法
化学物質およびサンプル
ヘパリンナトリウム塩は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（Ｈ３１４９）。Ｎ−ラウロイルサルコシン（サルコシル）ナトリウム塩は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（Ｌ９１５０）。１０％ＳＤＳ、すなわち、ドデシル硫酸ナトリウム溶液は、Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙによりｇｉｂｃｏから購入された（２４７３０）。水酸化ナトリウムは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した（Ｓ８０４５）。ポリエチレンイミン７５０ｋＤａ（ＰＥＩ）は、Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙカタログ番号１８１８７８、ロット番号ＭＫＢＷ９５０８ＶからのＨ２Ｏ中５０重量％であった。デオキシコール酸ナトリウムはＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｄ５６７０）から。Ｗａｋｏ  ＤＮＡ抽出キットは和光から（２９５−５０２０１）。Ｋｉｎｇｆｉｓｈｅｒ  ｆｌｅｘ自動ＤＮＡ  抽出試薬：ＥａｓｙＭａｇ試薬はＢｉｏＭｅｒｉｅｕｘから、ＥａｓｙＭａｇバッファー１＃２８０１３０、ＥａｓｙＭａｇバッファー２＃２８０１３１、ＥａｓｙＭａｇバッファー３＃２８０１３２、ＥａｓｙＭａｇ溶解バッファー＃２８０１３４、ＥａｓｙＭａｇ    Ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｓｉｌｉｃａ  ＃２８０１３３。ＣＨＯ細胞で生産された５つの異なる抗体のＢＤＳ（バルク原薬）サンプルおよび工程内サンプルを本試験に使用した。
【０１１１】
ＣＨＯ  ＤＮＡ  ｑＰＣＲ法
ＴａｑＭａｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ＰＣＲ  ＭａｓｔｅｒミックスはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（カタログ番号４３０４４３７）から購入した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓからの７５００リアルタイムＰＣＲシステムを使用した。このアッセイのために選択したプライマーおよびプローブは、ＣＨＯ  Ａｌｕ−２等価配列を標的とする。アンプリコンサイズは１０７ｂｐである。ＣＨＯ  ＤＮＡ標準は、ＣＨＯ  ＤＧ４４ヌル細胞株から単離されたゲノムＤＮＡである。ＤＮＡ濃度を分光光度計（Ａｇｉｌｅｎｔ  ８４５３）を用いてＯＤ２６０／２８０により決定した。ヌクレアーゼ不含水はＡｍｂｉｏｎ（ＡＭ９９３２）から。ＴａｑＭａｎ標準プログラム４５サイクルを実施し、ＤＮＡ抽出は２反復で行い、ｑＰＣＲは無添加４反復および添加４反復で行った。ＣＨＯ  ＤＮＡ  ｑＰＣＲのＬＯＤおよびＬＯＱは、０．３および１．０ｐｇ／ｍＬである。添加回収率は、添加サンプルの濃度の平均−無添加サンプルの平均濃度／１００００ｐｇ／ｍＬにより算出した。添加回収率の承認基準は６０％〜１４０％である。
【０１１２】
Ｗａｋｏ  ＤＮＡ抽出／ｑＰＣＲは時間と労力がかかり得るので、Ｄｉｒｅｃｔ  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）もまた、異なるアッセイ条件を比較するために使用した。Ｂｉｏ−Ｒａｄ  ｄｄＰＣＲシステム（Ｑｘ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｏｒ、ＰＸ１  ＰＣＲプレートシーラー、Ｔ１００  Ｔｈｅｒｍａｌ  Ｃｙｃｌｅｒ、ＱＸ２００  Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ）。ｄｄＰＣＲ試薬はＢｉｏ−Ｒａｄから購入した、プローブ用ｄｄＰＣＲ  Ｓｕｐｐｅｒｍｉｘ（カタログ番号１８６３０１０）、プローブ用Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｏｉｌ（カタログ番号１８６３００５）、Ｄｒｏｐｌｅｔ  Ｒｅａｄｅｒ  Ｏｉｌ（カタログ番号１８６３０３１）。プライマーおよびプローブは、リアルタイムＰＣＲにより使用されたものと同じであり、μＬ当たりのコピー数としてのＣＨＯ  ＤＮＡ標準のｐｇ／ｍＬへの変換もリアルタイムＰＣＲにより使用されたものと同じである。
【０１１３】
サンプル調製
下記のサンプル調製の流れ図を図３に示す。
１）ＰＥＩをサンプルまたは水に終濃度２０ｐｐｍ（０．００２％）〜２０００ｐｐｍ（０．２％）で添加する。ＰＥＩを含有する５０μＬのサンプルまたは水をエッペンドルフ管に移す。１０μＬのＣＨＯ  ＤＮＡ標準（１０５ｐｇ／ｍＬまたは１０６ｐｇ／ｍＬ）を加える。これを第１水準添加とする。ボルテックスにかけて混合し、室温で１０分間置く。ＰＥＩはＤＮＡにすぐに強く結合する。
２）ヘパリンを終濃度８０〜７５０μｇ／ｍＬ、サルコシルを終濃度０．０５〜１％で添加する。総容量は１００μＬである。ボルテックスにかけて混合し、室温で１０分間置く。
３）ヒートブロックにより９０℃で１０分間インキュベートする。
４）室温、１４０００ｒｐｍで１０分遠心分離する。
５）サンプルをヌクレアーゼ不含水で１：５０〜１００００希釈し、サンプルにＣＨＯ  ＤＮＡを添加し最終１０４ｐｇ／ｍＬ、５μＬの１０６ｐｇ／ｍＬ  ＣＨＯ  ＤＮＡを５００μＬの希釈サンプルに添加）、これを第２水準添加とする。ｄｄＰＣＲまたはＷａｋｏ  ＤＮＡ抽出／ｑＰＣＲを行う。
【図１Ａ】
2021536241.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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