(57)【要約】本発明は、指向性進化スクリーニングの分野に属し、特に、可視的な連続的空間指向性進化の方法に関するものである。宿主は固体培養空間で成長して移動し、前記宿主は進化する外来標的遺伝子を有し、前記宿主自体は標的遺伝子の進化を補助する遺伝的要素を含み、前記標的遺伝子は前記宿主の成長および移動に関連し、前記宿主が成長し移動するプロセスにおいて、前記固体培養空間で異なる空間分布パターンを形成してスクリーニングすることにより進化の生成物を得る。前記方法は、固体培養空間で直接実施されることができ、肉眼で認識できる異なる空間分布パターン画像を局所に形成することにより、進化の生成物を更に選別し、液体流加培養装置を使用することを省くことができる。、また、進化中に形成される感染スポットを肉眼で認識することにより進化の効果を把握することにより、リアルタイムモニタリング装置を使用することを省くことができ、かつ操作が簡単であり、スループットが高いという利点を有している。
2021508461.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主は固体培養空間において成長して移動し、前記宿主は進化させる外来標的遺伝子を保有し、前記宿主自体は標的遺伝子の進化を補助する遺伝的要素を含み、前記標的遺伝子は前記宿主の成長と移動に関連し、
前記宿主の成長と移動により前記固体培養空間に異なる空間分布パターンを形成し、かつそれに対してスクリーニングすることにより進化の生成物を得ることを特徴とする可視的な連続的空間指向性進化の方法。
【請求項２】
前記標的遺伝子は前記宿主ゲノムまたはプラスミドまたは前記宿主に対応する寄生生物内に存在することを特徴とする請求項１に記載の可視的な連続的空間指向性進化の方法。
【請求項３】
前記寄生生物は、ファージ、シアノファージ、動植物ウイルス、真菌ウイルス、マイコプラズマ、クラミジアおよび細菌のうちいずれか１つを含むことを特徴とする請求項１に記載の可視的な連続的空間指向性進化の方法。
【請求項４】
前記寄生生物はファージであり、
前記宿主は、
前記ファージの非欠損株の天然宿主細菌、
前記ファージの非欠損株の天然宿主細菌に対して遺伝子の組み換えにより得られる菌株、
遺伝子の組み換えにより得られかつ感受性が低い非天然宿主細菌のうちいずれか１つであり、
前記宿主は、大腸菌、パスツレラ、赤痢菌、シュードモナス、キサントモナス、サルモネラ、黄色ブドウ球菌および遺伝子の組み換えによりその感受性が変化する改変株を含み、
好ましくは、前記宿主はＦ因子を保有する大腸菌であり、
前記ファージは、溶原性ファージ、毒性ファージまたは慢性感染ファージであり、
前記ファージは、繊維状ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、Ｘファージ、Ｐ１ファージ、Ｐ２ファージ、Ｐ２２ファージ、９Ｘ１７４ファージおよびＳＰ６ファージを含み、
好ましくは、前記繊維状ファージはＭ１３繊維状ファージおよびｆ１繊維状ファージを含むことを特徴とする請求項１に記載の可視的な連続的空間指向性進化の方法。
【請求項５】
前記標的遺伝子は１つまたは複数のタンパク質のコード遺伝子と非コード遺伝子の組み合わせであり、
前記標的遺伝子は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、プロテアーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子および密度感知遺伝子のうち１つまたは複数であることを特徴とする請求項１に記載の可視的な連続的空間指向性進化の方法。
【請求項６】
前記標的遺伝子の進化を補助する遺伝的要素は変異誘発プラスミドであり、前記変異誘発プラスミドは進化前後の標的遺伝子により発現をそれぞれ促進するか或いは発現を誘導することを特徴とする請求項１に記載の可視的な連続的空間指向性進化の方法。
【請求項７】
前記変異誘発プラスミドは変異誘発遺伝子を含み、前記変異誘発遺伝子は、１２位と１４位のアミノ酸がＡｌａに変異しているＤＮＡＱ遺伝子変異体のＤＮＡＱ９２６遺伝子、デオキシアデノシンメチラーゼｄａｍ遺伝子、ヘミメチル化ＧＡＴＣ結合タンパク質ｓｅｑＡ遺伝子、活性化誘導シトシンデアミナーゼ遺伝子ＡＩＤ、ファージＰＢＳ２のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害遺伝子Ｕｇｉおよび転写抑制因子ｅｍｒＲのうち少なくとも１つであることを特徴とする請求項６に記載の可視的な連続的空間指向性進化の方法。
【請求項８】
前記固体培養空間は二次元平面培養構造と三次元空間培養構造を含み、
前記固体培養空間の垂直方向の移動と進化は定期的に形成されるキャスティング固体培養システムにより連続性を維持し、
前記指向性進化は高スループット進化であり、
前記高スループット進化は複数の固体培養空間または固体培養空間の異なる位置により実施されることを特徴とする請求項１に記載の可視的な連続的空間指向性進化の方法。
【請求項９】
前記標的遺伝子はヘルパープラスミドを介して前記宿主の成長および移動に関連付けられ、前記ヘルパープラスミドは少なくとも第１のヘルパープラスミドを含み、前記第１のヘルパープラスミドはヘルパープラスミドＣＣＰ１またはヘルパープラスミドＣＣＰ２であり、ヘルパープラスミドＣＣＰ１の核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示され、ヘルパープラスミドＣＣＰ２の核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示され、
前記ヘルパープラスミドは第２のヘルパープラスミドを更に含み、前記第２のヘルパープラスミドはヘルパープラスミドＣＣＰ３またはヘルパープラスミドＣＣＰ４であり、
ヘルパープラスミドＣＣＰ３の核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示されていることを特徴とする請求項４〜８のうちいずれか一項に記載の可視的な連続的空間指向性進化の方法。
【請求項１０】
前記指向性進化は異なる宿主を交代に用いることにより実施され、かつ後の宿主に含まれかつファージの増殖をサポートする遺伝的要素は、進化後のファージの増殖をサポートするヘルパープラスミドと、進化前のファージの増殖を抑制するヘルパープラスミドを含むことを特徴とする請求項９に記載の可視的な連続的空間指向性進化の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、２０１７年１２月２７日に中国特許庁に出願され、発明の名称が「可視的な連続的空間指向性進化の方法」であり、特許出願番号が第２０１７１１４４６３６２．３号である中国特許出願の優先権を主張し、その全文の内容は引用により本出願に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、指向性進化スクリーニングの分野に属し、具体的には、可視的な連続的空間指向性進化の方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
指向性進化（実験室進化とも呼ばれる）は生物学的進化プロセスを制御することにより特定の機能を備えた生体分子を生成することができる有効な技術的手段である。生成された生体分子は、工業生産、生物工学、医薬品開発などの多くの分野で広く使用されている。ハーバード大学のＤａｖｉｄ  Ｒ  Ｌｉｕ実験室は、ファージの成長による連続的進化システム（ファージにより連続的進化を補助する、ＰＡＣＥ）を開発した。そのシステムは、主として、ＬＷＳ、ＣＣＰ、ＩＭＰの３つのモジュールを含む。ファージモジュール（ＬＷＳ）において、宿主細菌のパッケージングと感染に必要なファージＭ１３遺伝子中のｇＩＩＩ遺伝子を切除し、進化させる生体分子の遺伝子を挿入する。ｇＩＩＩが切除されるファージは、宿主を感染させることにより子孫ファージを生成することができない。変異誘発モジュール（ＩＭＰ）において、ＤＮＡＱ９２６、ｄａｍおよびｓｅｑＡの発現を誘導する誘導物質としてアラビノースを用いるので、ＤＮＡ複製中にポリメラーゼによって導入される不適当な塩基を切除することができず、かつ突然変異率を増加させ、アラビノースによって誘導されたＩＭＰによりファージの突然変異率を数百倍増加させることができる。補助モジュール（ＣＣＰ）において、ファージが宿主細胞を感染させかつ増殖することにより用いられるｇＩＩＩ遺伝子を含み、ＣＣＰ上のｇＩＩＩの発現とＬＷＳ上において進化させる標的遺伝子の生物活性と関連させる（例えば、あるＲＮＡポリメラーゼを特定の方向に進化させる必要がある場合、進化の方向と一致するプロモーターによりｇＩＩＩの発現を制御する）ことにより、各突然変異ＬＷＳが感染活性を有する子孫ファージＬＷＳを生成することができるか否かを決定する。
【０００４】
進化プールにおいて、進化させる野生型標的遺伝子を保有するファージが宿主細胞を感染させるとき、その遺伝物質の野生型ＬＷＳを宿主細菌に注入し、宿主細菌内の複製システムにより遺伝物質を複製する。また、アラビノースの誘導が存在する場合、宿主細胞内のＩＭＰのＤＮＡＱ９２６、ｄａｍとｓｅｑＡの発現によりＬＷＳには突然変異が生じる。ＬＷＳが得た突然変異（つまり、ＬＷＳ上の標的遺伝子の突然変異）がｇＩＩＩタンパク質の発現を促進することができると、感染性がある子孫ファージを生成することができる。生成された前記子孫ファージ突然変異株ＬＷＳｅは宿主細菌の外部に分泌され、新しい宿主細菌を感染させ、次の複製と増殖をする。その結果、ｇＩＩＩ発現を促進することができるＬＷＳｅ突然変異株は増殖を続け、その数を増やすことができるが、野生型のＬＷＳとｇＩＩＩの発現を促進することができない突然変異ＬＷＳは子孫ファージを分泌して増殖することができず、かつその数を増加させることができない。このとき、新しい宿主細菌培養物を一定の速度で進化プールに添加し続けるとともに元の培養物を排出すると、ｇＩＩＩの発現を促進することができないか或いは発現の能力が低い野生型ＬＷＳおよびその突然変異株は直ちに溶出され、ｇＩＩＩの発現を効率的に促進することができるＬＷＳｅ突然変異株は最後まで保留される。
【０００５】
前記システムは、サイズが比較的大きく、高感度のリアルタイムモニタリングシステムを備えている一連の自動流加培養装置により流加培養を連続的に行う必要がある。さまざまな進化の生成物を混合して培養槽内に入れて希釈するので、検出と分離を直接行うのは難しい。システムは、大量の試薬を消費し、培養装置のコストが高く、進化操作が複雑であるという欠点を有している。また、前記システムは、一度に１つの標的遺伝子しか進化させることができないため、スループットが低いという欠点を有している。
【０００６】
これに鑑み、次のような本発明を提案する。
【発明の概要】
【０００７】
サンプルの検出と分離が困難であり、スループットが低く、コストが高く、進化の操作が複雑であるという従来技術の問題を解決するため、本発明は可視的な連続的空間指向性進化の方法を提供する。それを採用する場合、固体培養プレートの表面などの固体培養空間において直接進化することができ、液体流加培養装置を必要としない。また、進化のプロセスで形成される感染スポットの空間内の形態と分布を肉眼で観察することにより進化の効果を把握することができるので、リアルタイムモニタリング装置を必要とせず、操作が簡単であり、スループットが高く、一度に複数グループの進化実験を行うことができる。
【０００８】
前記目的を実現するため、本発明は下記の技術的手段を採用する。
【０００９】
可視的な連続的空間指向性進化の方法であって、宿主は固体培養空間において成長して移動し、前記宿主は進化させる外来標的遺伝子を保有し、前記宿主自体は標的遺伝子の進化を補助する遺伝的要素を含み、前記標的遺伝子は前記宿主の成長と移動に関連し、
前記宿主の成長と移動により前記固体培養空間に異なる空間分布パターンを形成し、かつそれに対してスクリーニングをすることにより進化の生成物を得る。
【００１０】
本発明の可視的な連続的空間指向性進化の方法（Spatial  Phage-Assisted  Continuous  Evolution、ＳＰＡＣＥ)において、当該システムには進化させる標的遺伝子と宿主が含まれ、宿主には標的遺伝子の進化を補助する遺伝的要素が含まれ、かつ標的遺伝子は宿主と関連している。標的遺伝子は宿主が固体培養空間において成長し移動することにより進化し、進化後は肉眼で認識できるさまざまな空間分布パターンが形成され、この状態において進化の生成物を選別する。
【００１１】
進化とスクリーニングのプロセス全体は、二次元平面または三次元空間に広がり、異なる進化の生成物は平面の異なる領域に分布しかつ互いに混合することはできない。各生成物の活性が異なることにより局部には肉眼で認識できる異なる空間分布パターン画像が形成される。進化が続くことに伴い、その画像は更に拡大される。進化の生成物が現れると、対応する位置に画像を形成することができる。生成物の量が極めて少なくてもその画像は薄くなったり不鮮明になったりはしない。画像の状態によりニーズを満たす進化の生成物を直接選別して分離することができる。そのシステムは、操作が簡単で、コストが低く、特別な装置を必要とせず、１人で一度に複数グループの進化実験を行うことができ、かつ標的遺伝子の指向性進化を高スループットで行うことができる。
【００１２】
本発明の実施例において、前記標的遺伝子は、前記宿主ゲノム、プラスミドまたは前記宿主に対応する寄生生物内に存在する。標的遺伝子は遺伝子の組換えにより宿主ゲノムに挿入され、宿主にプラスミドを導入するか或いは寄生生物が宿主に侵入することにより、進化させる標的遺伝子が含まれている宿主を得ることができる。
【００１３】
本発明の実施例において、前記寄生生物は、ファージ、シアノファージ、動植物ウイルス、真菌ウイルス、マイコプラズマ、クラミジアおよび細菌のうちいずれか１つを含む。
【００１４】
本発明の実施例において、前記寄生生物はファージであり、
前記宿主は、
前記ファージの非欠損株の天然宿主細菌、
前記ファージの非欠損株の天然宿主細菌に対して遺伝子の組み換えにより得られる菌株、
遺伝子の組み換えにより得られかつ感受性が低い非天然宿主細菌のうちいずれか１つであり、
前記宿主は、大腸菌、パスツレラ、赤痢菌、シュードモナス、キサントモナス、サルモネラ、黄色ブドウ球菌および遺伝子の組み換えによりその感受性が変化する改変株を含み、
好ましくは、前記宿主はＦ因子を保有する大腸菌であり、
前記ファージは、溶原性ファージ、毒性ファージまたは慢性感染ファージであり、
前記ファージは、繊維状ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、λファージ、Ｐ１ファージ、Ｐ２ファージ、Ｐ２２ファージ、φＸ１７４ファージ、ＳＰ６ファージを含み、
好ましくは、前記繊維状ファージは、Ｍ１３繊維状ファージ、ｆ１繊維状ファージを含む。
【００１５】
本発明の好適な実施例において、前記ファージはＭ１３ファージであり、宿主細菌のパッケージングおよび感染に必要なｇＩＩＩ遺伝子は切除され、ヘルパープラスミドなどの標的遺伝子の進化を補助する遺伝的要素は前記ｇＩＩＩ遺伝子を含む。ファージは通常、宿主細菌に侵入しかつＤＮＡを複製することができる。しかしながら、所定のヘルパープラスミドがない場合、感染活性を有する子孫をパッケージすることができない。
【００１６】
本発明の実施例において、前記標的遺伝子は１つまたは複数のタンパク質のコード遺伝子と非コード遺伝子の組み合わせである。
【００１７】
本発明の実施例において、前記標的遺伝子は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子、プロテアーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、密度感知遺伝子のうち１つまたは複数でから選択される。
【００１８】
本発明の実施例において、前記標的遺伝子の進化を補助する遺伝的要素は変異誘発プラスミドであり、前記変異誘発プラスミドは進化前後の標的遺伝子の発現をそれぞれ促進するか或いは発現を誘導する。
【００１９】
好ましくは、前記変異誘発プラスミドは変異誘発遺伝子を含み、前記変異誘発遺伝子は、１２位と１４位のアミノ酸がＡｌａに変異しているＤＮＡＱ遺伝子変異体ＤＮＡＱ９２６遺伝子、デオキシアデノシンメチラーゼｄａｍ遺伝子、ヘミメチル化ＧＡＴＣ結合タンパク質ｓｅｑＡ遺伝子、活性化誘導シトシンデアミナーゼ遺伝子ＡＩＤ、ファージＰＢＳ２におけるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害遺伝子Ｕｇｉ、転写抑制因子ｅｍｒＲのうち少なくとも１つである。
【００２０】
変異誘発遺伝子は複製や転写などの伝達プロセスの遺伝情報の突然変異率を増加させることができる。変異誘発プラスミドＩＭＰは、同じ方法により誘導と発現をする（例えば、ｐｓｐプロモーターにより誘導および制御をする）ことができる。異なる実施例において、ＩＭＰ１、ＩＭＰ２、ＩＭＰ３などの複数の変異誘発プラスミドＩＭＰが存在する場合、それらの変異誘発プラスミドは同じであってもよく、進化前後の標的遺伝子は発現をそれぞれ促進することもできる。その場合、ＩＭＰとＩＭＰ２は異なるＩＭＰを表す。
【００２１】
本発明の実施例において、前記固体培養空間は二次元平面培養構造および三次元空間培養構造を含む。
【００２２】
本発明の実施例において、前記固体培養空間の垂直方向の移動と進化は定期的に形成されるキャスティング固体培養システムにより連続性を維持する。
【００２３】
本発明の実施例において、前記指向性進化は高スループット進化である。
【００２４】
本発明の実施例において、前記高スループット進化は複数の固体培養空間または固体培養空間のさまざまな位置により実現することができる。
【００２５】
本発明の実施例において、前記標的遺伝子は、ヘルパープラスミを介して、前記宿主の成長および移動と関連し、前記ヘルパープラスミドは少なくとも第１のヘルパープラスミドを含み、前記第１のヘルパープラスミドはヘルパープラスミドＣＣＰ１またはヘルパープラスミドＣＣＰ２であり、ヘルパープラスミドＣＣＰ１の核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３に示すとおりであり、ヘルパープラスミドＣＣＰ２の核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４に示すとおりである。
【００２６】
前記ヘルパープラスミドＣＣＰ１またはヘルパープラスミドＣＣＰ２は、ファージ進化前の低レベルの複製と増殖をサポートし、進化後の標的遺伝子の活性が増加すると、ヘルパープラスミドＣＣＰ１またはヘルパープラスミドＣＣＰ２はファージの進化がより高いレベルの複製および増殖することをサポートする。
【００２７】
本発明の実施例において、前記ヘルパープラスミドは第２のヘルパープラスミドを更に含み、前記第２のヘルパープラスミドはヘルパープラスミドＣＣＰ３またはヘルパープラスミドＣＣＰ４であり、ヘルパープラスミドＣＣＰ３の核酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５に示すとおりである。
【００２８】
前記ヘルパープラスミドＣＣＰ３とヘルパープラスミドＣＣＰ４は、機能的な欠陥を有しているので、進化前のファージの増殖をサポートすることができない。
【００２９】
具体的には、宿主細菌Ｓ１は、ＩＭＰ１とＣＣＰ１を有しており、培養プレート上において成長し移動することができる。宿主細菌Ｓ１は、移動するときファージＬＷＳと接触し、かつ進化後の標的遺伝子を保有するファージＬＷＳｅが生成されるまでにＬＷＳと共に進化する。ファージＬＷＳは増殖欠陥を有しているので、進化の前ＬＷＳはＣＣＰ１のバックグラウンド発現により低レベルの感染と増殖をすることができる。進化後の標的遺伝子の少なくとも一部分の機能は、進化後のファージＬＷＳｅの増殖をサポートするＣＣＰ２の遺伝的要素の機能と関連している。したがって、ＬＷＳｅは、Ｓ１においてＣＣＰ１により感染性複製を効率的に実施することができる。ファージの感染性複製が効率的に行われると、宿主細菌の成長が抑制されるので、ＬＷＳｅ感染領域には細菌が少なくかつ肉眼で認識できる透明な感染スポットが形成される。その感染スポットにより進化の効果を直接分析することができる。
【００３０】
本発明の実施例において、宿主細菌は、培養プレート上で成長し移動する宿主細菌Ｓ２または宿主細菌Ｓ３を更に含む。宿主細菌Ｓ２は、移動するとき最初に進化したファージＬＷＳｅと接触し、かつ進化した標的遺伝子を保有するファージＬＷＳｅＮが生成されるまで、ＬＷＳｅと共に進化する。前記宿主細菌Ｓ２は、進化したファージＬＷＳｅまたはＬＷＳｅＮの増殖をサポートするヘルパープラスミドＣＣＰ２、進化前のファージＬＷＳの増殖を抑制するヘルパープラスミドＣＣＰ３および変異誘発プラスミドＩＭＰ２を含む。進化後の標的遺伝子の少なくとも一部分の機能は、進化後のファージＬＷＳｅまたはＬＷＳｅＮの増殖をサポートするＣＣＰ２の遺伝的要素の機能と関連している。ＣＣＰ３とＣＣＰ４上の遺伝的要素の機能は、進化前の標的遺伝子の機能と関連しており、ＣＣＰ３とＣＣＰ４が保有する遺伝的要素は、機能的欠陥を有しており、進化前のファージＬＷＳの増殖をサポートすることができない。それによりファージＬＷＳｅＮ上の標的遺伝子の野生型活性は更に低下する。ファージＬＷＳｅＮ内の標的遺伝子の野生型活性が十分に低い場合、Ｓ２においてＣＣＰ２を用いることにより感染性複製を効率的に実施することができる。ファージの感染性複製が効率的に行われると、宿主細菌の成長が抑制されるので、ファージＬＷＳｅＮ感染領域には細菌が少なくかつ肉眼で認識できる透明な感染スポットが形成される。その感染スポットにより進化の効果を直接分析することができる。前記宿主細菌Ｓ３は、進化後のファージＬＷＳｅまたはＬＷＳｅＮの増殖をサポートするヘルパープラスミドＣＣＰ２、進化前のファージＬＷＳの増殖を抑制するヘルパープラスミドＣＣＰ４および変異誘発プラスミドＩＭＰ２を含む。ＣＣＰ４は、高コピープラスミドであり、欠損性遺伝的要素のレベルが高いことを示す。すなわちＣＣＰ４はＣＣＰ３の強化型である。Ｓ２細菌の代わりにＳ３細菌を用いることにより、ファージＬＷＳｅが更に進化するようにする。同様に、ＣＣＰ２プラスミドはコピー数がＣＣＰ１より低く、低コピーのＣＣＰ２のバックグラウンド発現が低いため、進化前のファージＬＷＳの複製をサポートすることができず、より強力な進化の選択圧を提供することができる。
【００３１】
本発明の実施例において、前記方法は、宿主細菌がプレートの端部に移動するとき、宿主細菌と進化後のファージを次のプレートに移動させて進化を続けることを更に含む。
【００３２】
本発明の実施例において、前記指向性進化は、異なる宿主を交代に用いることにより実施され、かつ後の宿主に含まれかつファージの増殖をサポートする遺伝的要素は、進化後のファージの増殖をサポートするヘルパープラスミドと、進化前のファージの増殖を抑制するヘルパープラスミドを含む。
【００３３】
従来技術と比較して、本発明の有益な効果は以下のとおりである。
【００３４】
（１）本発明が提供する可視的な連続的空間指向性進化の方法は空間属性を有し、進化プロセス全体は二次元平面空間または三次元立体空間において実施され、空間はサポートプラットフォームだけでなく進化の選択圧でもある。少量の進化の生成物があっても所定の位置にプラークなどの空間分布パターンが直接形成されるので、進化時形成される感染スポットのサイズ、プラーク数またはレポーター遺伝子をリアルタイムでモニタリングすることにより、標的遺伝子の活性とファージの増殖活性を把握し、かつ進化の生成物を直接認識しかつ分離することができる。そのため、液体流加培養装置やリアルタイムモニタリング装置を必要としない。
【００３５】
（２）本発明に係る可視的な連続的空間指向性進化の方法を採用する場合、異なる空間的位置に現れる進化結果はその位置に固定され、他の成分による希釈と混合の影響を受けず、直接分離することができる。また、異なる空間的位置に現れる進化結果の信号は進化の方向に沿って増幅されるので、進化の効果を向上させ、より高い検出感度を得ることができる。
【００３６】
（３）本発明に係る可視的な連続的空間指向性進化の方法は、進化の操作が簡単で、スループットが高く、一度に複数グループの進化実験を行うことができる。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
本発明の実施例または従来技術の技術的事項をより明確に説明するため、以下、実施例または従来技術に係る図面を簡単に説明する。
【００３８】
【図１】本発明の実施例の宿主細菌の移動および感染スポットの効果を示す図である。
【図２】本発明の実施例の連続空間指向性進化の原理を示す図である。
【図３】本発明の実施例の連続空間指向性進化のモデルを示す図である。
【図４】本発明の実施例４の１回目のＳＰＡＣＥポジティブスクリーニング進化の結果を示す図である。
【図５】本発明の実施例５および６の複数回のＳＰＡＣＥ進化の結果を示す図である。
【図６】本発明の実験例１における、ＩＭＰ３の誘導によるＳＰＡＣＥ進化の効果と異なるファージの数を示す棒グラフである。
【図７】本発明の実験例２における、Ｔ７ファージの感染移動効果とファージの数を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
以下、具体的な実施例により本発明の技術的事項を詳細に説明するが、周知のように、下記の実施例は単なる例示であり、本発明の技術的範囲を限定するものではない。下記の実施例に特定の条件が示されていない場合、従来の条件または製造元が推薦する条件により実施することができる。本発明において使用する試薬や機器にメーカーが示されていない場合、いずれも市場で購入することができる従来の製品である。
【００４０】
本発明が提供する可視的な連続的空間指向性進化の方法において、ファージと宿主細菌を混合してプレートにコーティングするとき、М１３ファージにより感染した宿主細菌と感染していない宿主細菌との間の成長のバラツキが存在するので、肉眼で認識できるプラークが形成される。レポーター遺伝子は、特異性、感度および操作性に係る問題を有している。本発明は、レポーター遺伝子を用いないで、感染プロセスで形成されるスポットをＳＰＡＣＥの指標信号として直接用いることにより、ＳＰＡＣＥの可視化を実現することができる。
【００４１】
プラークを形成する実験と同様に、宿主細菌を培養プレートの中央に接種し、宿主細菌の周囲の３つの隅に野生ファージを接種する（図１ａを参照）。このとき、宿主細菌はプレート上で成長するとともにプレートの端部へ移動する。移動中の宿主細菌はファージと接触し、感染するとともに子孫ファージを生成し、かつ外縁へ移動し続ける。感染した宿主細菌の成長は遅く、非感染領域の宿主細菌は元の状態を維持しているため、感染領域には細菌が少なくかつ肉眼で認識できるＶ字型の感染スポットが形成される（図１ｂを参照）。その透明な感染スポットはファージが感染したことを示すため、透明スポットの透明度とサイズによりファージの感染活性を表すことができる。
【００４２】
本発明の発明者が空間進化システムを研究してきた経験により発明したＳＰＡＣＥの核心的な設計原理は、図２、図３に示すとおりである。標的遺伝子を保有するファージＬＷＳにより変異誘発プラスミドＩＭＰとヘルパープラスミドＣＣＰを有している宿主細菌が感染すると、ファージゲノムは複製と突然変異を行う。突然変異子孫ＬＷＳがＣＣＰ上のｇＩＩＩ遺伝子の発現を活性化させることができる場合、感染活性を有する子孫ファージＬＷＳｅが生成され、次の感染進化が始まる。活性化させることができない場合、感染活性を有していない欠損性子孫ファージが生成される。進化が進むにつれ、ＬＷＳｅは増加し続けるが、野生型ＬＷＳファージと感染活性欠損子孫ファージは増加しないか或いは若干増加する。図中のＬＷＳ上のＧＯＩ（gene  of  interest）は進化させる標的遺伝子を表す。
【００４３】
ＣＣＰとＩＭＰが含まれる宿主細菌を培養プレートの中央に接種し、宿主細菌の周囲の３つの隅にファージＬＷＳを接種する。このとき、宿主細菌は、プレート上で成長・分裂しながら、自体のべん毛によりプレートの端部へ移動し、かつ特定の位置においてその位置に予め接種するファージＬＷＳと接触する。ファージＬＷＳは、宿主細菌に侵入し、かつ宿主細菌に担持されるまま前へ移動する。最初に、ファージＬＷＳはＣＣＰ上のｇＩＩＩの発現を促進することができず、ＣＣＰのバックグラウンド発現のみにより低レベルの増殖することができる。このとき、ファージの増殖レベルが非常に低いので、宿主細菌に与える影響は小さい。感染した宿主細菌と感染していない宿主細菌はほぼ同じ速度で成長・分裂し、肉眼で認識できる形態の差異はない。同時に、ファージＬＷＳの低レベルの増殖速度は宿主細菌の成長移動速度より遅いため、非効率的なファージＬＷＳは移動している宿主細菌に直ちに追い越される。
【００４４】
ファージＬＷＳが増殖しているとき、ＣＣＰの発現を効率的に促進できるファージＬＷＳｅが進化するまで、ＩＭＰにより突然変異進化する。このとき、ファージＬＷＳｅは直接ＣＣＰを促進し、高効率の増殖により子孫ファージが連続的に生成され、移動中の細菌を連続的に感染させる。ファージＬＷＳｅの効率的な増殖により、宿主細菌の成長は破壊され、細菌の成長は遅くなる。したがって、進化により形成されるファージＬＷＳｅの所定の位置には宿主細菌の成長が遅くかつ細菌が少なくなる透明な領域が形成される。進化の進行とファージＬＷＳｅに感染した細菌が継続的な移動することにより、前記透明領域は移動方向に拡大し続け、最終的にプレートには肉眼で認識できるＶ字型感染スポットが形成される。感染スポットの外側に近ければ近いほど、進化時間は長くなり、進化の効果もより明らかになる。感染したスポットにより所定の進化後のファージＬＷＳｅを取得することができる。
【００４５】
図２、３に示すように、本発明の一実施形態に係るファージが補助する連続空間指向性進化システムは、ポジティブスクリーニング（ａ）と、ネガティブスクリーニング（ｂ）２つの部分を含む。なお、本発明の実施可能な実施例において、ポジティブスクリーニング（ａ）の部分のみにより進化させる標的遺伝子を進化後の標的遺伝子に進化させる目的を達成することができる。したがって、ネガティブスクリーニング（ｂ）の部分は、本発明の指向性進化システムを更に改良して得られた技術的解決手段と見なすことができる。実際の応用において、ポジティブスクリーニング（ａ）の部分により「進化する標的遺伝子」から「進化後の標的遺伝子」への質的変化を実現し、ネガティブスクリーニング（ｂ）の部分により「進化後の標的遺伝子」の機能が更に強化される量的変化を実現する。
【００４６】
本発明において、いわゆる「進化する標的遺伝子」（ＧＯＩ）とは「進化前の標的遺伝子」と同一であり得る。すなわち、本発明のシステムと方法によって進化性突然変異が発生していない標的遺伝子を「野生型遺伝子」と呼ぶこともできる。いわゆる「進化後の標的遺伝子」とは「進化させる標的遺伝子」に相対するものであり、「進化後の標的遺伝子」は、進化する新しい機能を有しているが、元の機能を有することもあり得る。元の機能が完全に消えることもある。本発明において、標的遺伝子が進化により新しい機能を有する場合、元の機能が存在するか否かに関わらず、「進化後の標的遺伝子」と呼ぶことができる。
【００４７】
なお、本発明中の記号、例えば、ＬＷＳ、ＣＣＰ、ＩＭＰおよびＳ等は単なる例示的な記号表現である。それらの記号がつけられる対象に他の名称をつけることもできる。例えば、ファージＬＷＳを進化前のファージと呼び、ファージＬＷＳｅを進化後のファージと呼ぶか或いは進化後のファージと総称することもできる。ファージＬＷＳｅＮを更に進化したファージと呼ぶこともできる。その番号Ｎ（例えば、１、２、３または他のアルファベットと数字の組み合わせなど）は、継代培養数、進化の回数または異なる条件下での進化などを指すことができる。宿主細菌Ｓ１を第１の宿主細菌と呼び、宿主細菌Ｓ２を第２の宿主細菌と呼び、宿主細菌Ｓ３を第３の宿主細菌と呼び、ヘルパープラスミドＣＣＰ１を第１のヘルパープラスミドと呼び、ヘルパープラスミドＣＣＰ２を第２のヘルパープラスミドと呼び、ヘルパープラスミドＣＣＰ３を第３のヘルパープラスミドと呼び、ヘルパープラスミドＣＣＰ４を第４のヘルパープラスミドと呼び、変異誘発プラスミドＩＭＰ１を第１の変異誘発プラスミドと呼び、変異誘発プラスミドＩＭＰ２を第２の変異誘発プラスミドと呼ぶこともできる。変異誘発プラスミドＩＭＰ３を第３の変異誘発プラスミドと呼ぶこともできる。進化後のファージＬＷＳｅの増殖をサポートするプラスミドＣＣＰ１、ＣＣＰ２をポジティブスクリーンＣＣＰと総称することもできる。同様に、進化前のファージＬＷＳの増殖を抑制するプラスミドＣＣＰ３、ＣＣＰ４をネガティブスクリーンＣＣＰと総称することもできる。突然変異の生成に用いられるプラスミドＩＭＰ１、ＩＭＰ２およびＩＭＰ３をＩＭＰと総称する。
【００４８】
なお、本発明の宿主細菌は、前記宿主細菌Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３だけでなく、他の宿主細菌を更に含むことができる。なお、本発明の宿主細菌Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３は、「菌種」が異なることを意味するものでなく、菌株に含まれるヘルパープラスミドまたは変異誘発プラスミドが異なることを意味する。本発明において、宿主細菌Ｓ１、Ｓ２、Ｓ３は、同じ菌種に異なるプラスミドをそれぞれ導入することにより得られる細菌、例えば、Ｆ因子を保有する大腸菌等であり得る。
【００４９】
図２、３に示すように、本発明の一実施形態に係るファージが補助する連続空間指向性進化システムは進化させる標的遺伝子を保有するファージＬＷＳを含む。前記ファージＬＷＳは増殖欠陥を有している。いわゆる「増殖欠陥」とはファージのライフサイクルの所定の機能、例えば、宿主細菌のパッケージングおよび／または感染の機能に欠陥があることを指す。その機能は関連遺伝子の突然変異により引き起こされる可能性がある。異なるファージにおいて、宿主細菌のパッケージングおよび／または感染などの機能を担当する遺伝子は異なる。例えば、本発明の一実施例において、ファージＬＷＳはＭ１３ファージであり、宿主細菌のパッケージングおよび感染に用いられるｇＩＩＩ遺伝子が切除されることにより、宿主細菌の正常なパッケージングおよび感染をすることができない。周知のとおり、前記ファージと類似している任意のファージを本発明のファージＬＷＳとして用いることができ、本発明はＭ１３ファージにのみ限定されるものでない。
【００５０】
図２、３に示す指向性進化システムにおいて、宿主細菌Ｓ１は進化後のＬＷＳｅの増殖をサポートするヘルパープラスミドＣＣＰ１と変異誘発プラスミドＩＭＰ１を含む。進化前のＬＷＳはＣＣＰ１のバックグラウンド発現により低レベルの感染増殖することができる。進化後のＬＷＳｅの増殖に対するヘルパープラスミドＣＣＰ１とＣＣＰ２のサポートは、進化後の標的遺伝子の少なくとも一部分の機能とＣＣＰ１およびＣＣＰ２上の進化後のＬＷＳｅの増殖をサポートする遺伝的要素の機能を関連させることにより実施される。いわゆる「少なくとも一部」とは、進化後の標的遺伝子の一部分の機能と進化後のＬＷＳｅの増殖をサポートする遺伝的要素の機能を関連させることだけでなく、その一部分の機能と進化前のＬＷＳの増殖をサポートする遺伝的要素の機能と関連させることも意味する。例えば、本発明の一実施例において、進化前の標的遺伝子はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子を指し、進化後の標的遺伝子はＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ機能を有する遺伝子（Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ機能を更に含む）を指し、ＣＣＰ２上の遺伝的要素はＴ３プロモーターを指し、その遺伝的要素は下流のｇＩＩＩ遺伝子の発現を制御することによりｇＩＩＩの機能的欠損のファージＬＷＳｅの増殖を補助する。それにより、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子はＴ７プロモーターの機能と関連し、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子はＴ３プロモーターの機能と関連する。なお、本発明の一実施例において、ＩＭＰ１は、進化の前にＬＷＳが保有する標的遺伝子が発現するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼにより促進され、かつＬＷＳの突然変異進化を誘導する。ＩＭＰ２は、進化の後にＬＷＳｅが保有する標的遺伝子が発現するＴ３  ＲＮＡポリメラーゼにより促進され、かつ突然変異進化を続けるようにＬＷＳｅを誘導する。
【００５１】
周知のとおり、本発明は、進化前の標的遺伝子として「Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子」を使用する前記実施例に限定されるものでなく、類似している任意の技術的解決手段を用いることができる。具体的には、プロテアーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、密度感知遺伝子、抗体遺伝子などの異なる標的遺伝子である場合、異なる原理によりそれらの機能をヘルパープラスミドの機能に関連させることができる。
【００５２】
理解を容易にするために、本発明において、いくつかの他の標的遺伝子活性をＣＣＰ上のｇＩＩＩに関連させる方法を簡単に紹介する。標的遺伝子活性をｇＩＩＩに関連させる方法は多くあり、本発明の方法にのみ限定されるものでない。プロテアーゼ遺伝子の場合、（１）標的プロテアーゼの分解配列を連結フラグメントとし、ｇＩＩＩ遺伝子とｇＩＩＩタンパク質をブロックさせる補助タンパク質（Ｍ１３ファージのｇ６タンパク質など）と融合させて発現させる。このとき、タンパク質と融合するｇＩＩＩの一部分はブロックされかつ活性がなくなる。標的プロテアーゼが特定の活性を進化させ、所定の分解配列を分解する場合のみ、活性のあるｇＩＩＩを放出することができる。（２）Ｔ７ポリメラーゼを媒介とし、標的プロテアーゼの分解配列を連結フラグメントとし、Ｔ７ポリメラーゼとＴ７リゾチームを融合させて発現させ、新しいポリメラーゼを形成する。前記新しいポリメラーゼの活性はＴ７リゾチームによりブロックされる。進化するプロテアーゼのみが、設定される分解配列を認識し、かつリゾチーム部分を切除することでき、それにより得られるポリメラーゼは活性を有する。セルラーゼ遺伝子の場合、セルロースの酵素加水分解生成物であるグルコースに抑制される乳糖オペロンにより、ｇＩＩＩ遺伝子の発現を制御することができる。蛍光タンパク質遺伝子の場合、標的蛍光タンパク質が発光する蛍光に感度を有している光誘導プロモーターにより、ｇＩＩＩ遺伝子の発現を促進することができる。密度感知遺伝子の場合、密度感知システムによりｇＩＩＩ遺伝子の発現を制御することができる。抗体遺伝子の場合、抗体とｇＩＩＩ発現を制御する転写因子と融合させて発現させ、抗体結合部位と転写酵素を融合させて発現させることができる。
【００５３】
図２のネガティブスクリーニング（ｂ）には本発明を更に改良する技術的解決手段が示されている。前記システムは宿主細菌Ｓ２またはＳ３を更に含み、前記宿主細菌Ｓ２は、進化後のＬＷＳｅの増殖をサポートするヘルパープラスミドＣＣＰ２および変異誘発プラスミドＩＭＰ２と、ヘルパープラスミドＣＣＰ３を含む。当該宿主細菌Ｓ３は、進化後のＬＷＳｅの増殖をサポートするヘルパープラスミドＣＣＰ２および変異誘発プラスミドＩＭＰ２と、ヘルパープラスミドＣＣＰ４を含む。ヘルパープラスミドＣＣＰ２および変異誘発プラスミドＩＭＰ２はポジティブスクリーニング（ａ）の部分と類似し、その相違点は、ＣＣＰ１が高コピープラスミドであり、ＣＣＰ２が低コピープラスミドであることにある。ＩＭＰ１およびＩＭＰ２はそれぞれ、進化前と進化後の標的遺伝子によりその発現が促進される。しかしながら、ＣＣＰ３とＣＣＰ４上の遺伝的要素の機能は進化前の標的遺伝子の機能と関連しており、ＣＣＰ３およびＣＣＰ４には機能的欠陥があるので、進化前のＬＷＳの増殖をサポートすることができない。本発明の一実施例において、ヘルパープラスミドＣＣＰ３、ＣＣＰ４上の遺伝的要素はＴ７プロモーターであり、当該Ｔ７プロモーターはｇＩＩＩ−ｎｅｇ遺伝子の発現を制御し、ｇＩＩＩ−ｎｅｇは、欠損のあるｇＩＩＩであり、ｇＩＩＩ遺伝子ａａ２８０〜ａａ３５０の間の約７０個のアミノ酸が欠損しているので、ＬＷＳの増殖進化をサポートすることができない。ｇＩＩＩ−ｎｅｇとｇＩＩＩを共に発現するとき、ＬＷＳ増殖を競合的に抑制する。周知のとおり、ｇＩＩＩ−ｎｅｇは本発明の例示にしかすぎないものであり、ファージが異なることにより異なる遺伝子を用いることができ、同じ遺伝子であっても異なる突然変異を発生させることができる。なお、本発明の一実施例において、ＩＭＰ２は、進化後にＬＷＳｅが保有する進化後の標的遺伝子が発現するＴ３  ＲＮＡポリメラーゼにより促進され、かつＬＷＳｅ突然変異進化を誘導する。実際の応用において、ＩＭＰ１、ＩＭＰ２は同じ方法によって誘導および発現される（例えば、ｐｓｐプロモーターによって誘導および制御される）ことができ、その場合、ＩＭＰ１、ＩＭＰ２の代わりに同じＩＭＰ３プラスミドを用いることができる。ｐｓｐプロモーターは細菌に対するＭ１３ファージの感染を感知することができる。ｐｓｐプロモーターは通常、自己抑制状態になっており、それに制御される遺伝子は基本的に発現しないが、感染するときｐｓｐプロモーターが活性化するので、それに制御される遺伝子は効率的に発現することができる。ＩＰＭ３のプロモーション発現はファージＬＷＳが保有する標的遺伝子の有無に係っていないので、ＩＰＭ１およびＩＰＭ２の代わりにＩＰＭ３を用いるとき、ポジティブとネガティブスクリーニングにおいてＩＭＰプラスミドを置き換える必要がない。突然変異の生成に用いられるプラスミドＩＭＰ１、ＩＭＰ２およびＩＭＰ３はＩＭＰと総称される。
【００５４】
本発明の好適な実施例において、変異誘発プラスミドＩＭＰは変異誘発遺伝子を含み、当該変異誘発遺伝子は、１２位と１４位のアミノ酸がＡｌａに変異しているＤＮＡＱ遺伝子変異体ＤＮＡＱ９２６遺伝子、デオキシアデノシンメチラーゼｄａｍ遺伝子、ヘミメチル化ＧＡＴＣ結合タンパク質ｓｅｑＡ遺伝子、活性化誘導シトシンデアミナーゼ遺伝子ＡＩＤ、ファージＰＢＳ２のウラシルＤＮＡグリコシラーゼ阻害遺伝子Ｕｇｉ、転写抑制因子ｅｍｒＲのうちの少なくとも１つである。それらは、ＤＮＡの複製プロセスを妨害し、突然変異の頻度を高めることができる。実際には、突然変異効率を高めることができる遺伝子はいずれも、本発明において変異誘発遺伝子として用いることができる。
【００５５】
本発明が提供する指向性進化方法は、ＩＭＰ１とＣＣＰ１を保有する宿主細菌Ｓ１を培養プレートにおいて成長し移動させることと、宿主細菌Ｓ１が移動するときファージＬＷＳと接触し、かつ進化後の標的遺伝子を保有するファージＬＷＳｅが生成されるまでＬＷＳと共に進化することを含む。前記ファージＬＷＳは増殖欠陥があり、進化の前ＬＷＳはＣＣＰ１のバックグラウンド発現により低レベルの感染と増殖することができる。進化後の標的遺伝子の少なくとも一部分の機能はＣＣＰ２上の進化後のＬＷＳｅの増殖をサポートする遺伝的要素の機能と関連している。したがって、ＬＷＳｅはＳ１においてＣＣＰ１により高効率の感染性増殖を実施することができる。ファージの高効率の感染性増殖は宿主細菌の成長を抑制し、それによりＬＷＳｅ感染領域には細菌が少なくかつ肉眼で認識できる透明な感染スポットが形成される。その感染スポットにより進化の効果を直接分析することができる。
【００５６】
改良後の前記方法は宿主細菌Ｓ２またはＳ３が培養プレート上で成長し移動することを更に含むことができる。宿主細菌Ｓ２が移動するとき初期に進化するファージＬＷＳｅと接触し、かつ進化する標的遺伝子を保有するファージＬＷＳｅＮが生成されるまでＬＷＳｅと共に進化し続ける。前記宿主細菌Ｓ２は、進化後のＬＷＳｅの増殖をサポートするヘルパープラスミドＣＣＰ２、進化前のＬＷＳの増殖を抑制するヘルパープラスミドＣＣＰ３および変異誘発プラスミドＩＭＰ２を含む。前記宿主細菌Ｓ３は、進化後のＬＷＳｅの増殖をサポートするヘルパープラスミドＣＣＰ２、進化前のＬＷＳの増殖を抑制するヘルパープラスミドＣＣＰ４および変異誘発プラスミドＩＭＰ２を含む。進化後の標的遺伝子の少なくとも一部分の機能はＣＣＰ２上の進化後のＬＷＳの増殖をサポートする遺伝的要素の機能と関連している。ＣＣＰ３とＣＣＰ４上の遺伝的要素の機能は進化前の標的遺伝子の機能と関連しており、ＣＣＰ３とＣＣＰ４が保有する遺伝的要素には機能的欠陥があるので、進化前のＬＷＳの増殖をサポートすることができない。それによりＬＷＳｅＮ上の標的遺伝子の野生型活性を低下させることができる。したがって、ＬＷＳｅＮ上の標的遺伝子の野生型活性が十分に低くなる場合、Ｓ２においてＣＣＰ２により高効率の感染性複製を実施することができる。ファージの高効率の感染性複製により宿主細菌の成長を抑制し、それによりＬＷＳｅＮ感染領域には細菌が少なくかつ肉眼で認識できる透明な感染スポットが形成される。その感染スポットにより進化の効果を直接分析することができる。ＣＣＰ４は、高コピープラスミドであり、欠損性遺伝的要素を発現するレベルが高い。すなわち、ＣＣＰ４はＣＣＰ３の強化型である。Ｓ２宿主細菌の代わりにＳ３宿主細菌を用いることによりＳ２宿主細菌において進化するファージを更に進化させることができる。同様に、ＣＣＰ２プラスミドのコピー数はＣＣＰ１より少なく、低コピーのＣＣＰ２のバックグラウンド発現が低いので、進化前のＬＷＳファージの複製をサポートすることができず、より強力な進化の選択圧を提供することができる。
【００５７】
また、宿主細菌が外へ移動し続けることにより、増殖の効率が低くかつ含量が少ない野生型標的遺伝子の活性を有し、低い増殖効率と少ない含有量のファージを溶出することができる。なお、進化感染スポットのサイズ、プラーク数またはレポーター遺伝子のリアルタイムモニタリングを観察することにより、標的遺伝子の活性とファージの増殖活性を示すことができる。
【００５８】
ＣＣＰ２．１はＣＣＰ２上のｇＩＩＩ遺伝子を制御するＴ３をＴ７プロモーターに改変することにより得られるものである。宿主細菌Ｓ４はＣＣＰ２を有しており、宿主細菌Ｓ５はＣＣＰ２．１を有している。本発明は、進化後のファージＬＷＳｅＮがＳ４、Ｓ５宿主細菌にそれぞれ形成するプラーク数の差により、ＬＷＳｅＮ上の進化後の標的遺伝子のＴ７とＴ３ポリメラーゼの活性を比較する。
【００５９】
以下、Ｔ７プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１）を認識するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子Ｔ７  ＲＮＡＰを、Ｔ３プロモーター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２）を認識するＴ３ポリメラーゼ遺伝子Ｔ３  ＲＮＡＰに進化させることを例として本発明を詳細に説明するが、本発明の保護は、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子の進化にのみ限定されるものでない。そのＴ３ポリメラーゼは進化実験により得て、Ｔ３プロモーターを機能的に認識できるポリメラーゼを意味するが、前記ポリメラーゼが天然のＴ３  ＲＮＡポリメラーゼと同じ遺伝子配列を有していることを意味するものでない。ファージＬＷＳに含まれかつ進化させる標的遺伝子はＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子であり、ヘルパープラスミドＣＣＰ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３）上のｇＩＩＩ遺伝子の発現はＴ３プロモーターにより制御され、ヘルパープラスミドＣＣＰ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４）上のｇＩＩＩ遺伝子の発現はＴ３プロモーターにより制御され、ヘルパープラスミドＣＣＰ２．１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６）上のｇＩＩＩ遺伝子の発現はＴ７プロモーターにより制御され、ヘルパープラスミドＣＣＰ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５）上のｇＩＩＩ−ｎｅｇの発現はＴ７プロモーターにより制御され、ヘルパープラスミドＣＣＰ４上のｇＩＩＩ−ｎｅｇの発現はＴ７プロモーターにより制御される。ｇＩＩＩ−ｎｅｇは、欠損のあるｇＩＩＩであり、ｇＩＩＩ遺伝子のａａ２８０〜ａａ３５０の間の約７０個のアミノ酸が欠損しているので、ＬＷＳの増殖進化をサポートすることができない。ｇＩＩＩ−ｎｅｇとｇＩＩＩを共に発現するとき、ＬＷＳ増殖を競合的に抑制する。
【００６０】
本発明において、ファージＬＷＳ、およびヘルパープラスミドＣＣＰ４はそれぞれ、出願番号２０１６１０３４９２５４．３の発明に開示されたファージＳＭ、ＨＰ４と同じである。
【００６１】
変異誘発プラスミドＩＭＰ１上の変異誘発遺伝子の発現はＴ７プロモーターにより制御され、変異誘発プラスミドＩＭＰ２と変異誘発プラスミドＩＭＰ１の相違点は、変異誘発遺伝子の発現がＴ３プロモーターにより制御されることにある。変異誘発プラスミドＩＭＰ２の遺伝子配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７に示すとおりである。変異誘発プラスミドＩＭＰ３上の変異誘発遺伝子の発現がｐｓｐプロモーターによって制御されるという点において、変異誘発プラスミドＩＭＰ３は変異誘発プラスミドＩＭＰ２と異なる。ファージＭ１３−ＷＴはＮＥＢから購入したＭ１３ＫＯ７ファージに遺伝子を挿入することにより得られる野生型ファージである。ファージＬＷＳと比較すると、Ｍ１３−ＷＴ（ＮＣＢＩ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：Ｖ００６０４）とＴ７ファージ（ＮＣＢＩ  ＡＣＣＥＳＳＩＯＮ：ＮＣ＿００１６０４）のゲノムと機能は完全であり、宿主細菌において独自に感染して増殖することができる。
【００６２】
本発明の一部分のファージ、プラスミドは、本発明の発明者がＤａｖｉｄ  Ｒ  Ｌｉｕの実験室が提供する一部分の材料をさらに改良して得られたものである。所定の文献（Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．  ２０１４  Ｍａｒｃｈ；１０（３）：  ２１６−２２２）にはその遺伝情報が既に記載されている。他のプラスミドと菌株は本発明の発明者が研究により得られたものである。本発明の宿主細菌はＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１５であり、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１５はＥ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２シリーズのＥ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５にＦプラスミドを導入することにより得られたものであり、遺伝子型は、Ｆ´ｐｒｏＡ＋Ｂ＋  ｌａｃＩｑ  Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５  ｚｚｆ：：Ｔｎ１０（ＴｅｔＲ）／ａｔｔＢ：：ａｐｈ  ｔｅｔＲである。
【００６３】
なお、本発明の宿主細菌は、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１５にのみ限定されるものでなく、Ｆ因子を保有する任意の大腸菌であり得る。また、本発明のＥ．ｃｏｌｉ  Ｍ１５およびＬＷＳ、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ２．１、ＣＣＰ３、ＣＣＰ４、ＩＭＰ１、ＩＭＰ２、ＩＭＰ３（図４−１２）はいずれも、遺伝子マップと配列を参照することができ、ＰＣＲ、酵素消化とライゲーション、遺伝子の組換えなどの従来の分子クローニング方法により得ることができる。遺伝子の組換え、ＰＣＲ、酵素消化とライゲーションなどの分子クローニング方法は本技術分野の周知の技術であり、その方法により所定の菌株、プラスミドおよびファージを得ることができる。したがって、本発明の宿主細菌、プラスミドおよびファージは、再現可能な特徴を有しており、当業者は従来の方法によりそれを得ることができる。当業者が理解することができるとおり、本発明において菌種の保存を提供しなくても本発明を充分に実施することができる。
【００６４】
本発明において、ＣＣＰ１とＩＭＰ１を保有する宿主細菌はＳ１と呼ばれ、ＩＭＰ２、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３を保有する宿主細菌はＳ２と呼ばれ、ＩＭＰ２、ＣＣＰ２、ＣＣＰ４を保有する宿主細菌はＳ３と呼ばれる。ポジティブスクリーニングにおいて、最初のＬＷＳはＳ１菌内において連続的指向性進化を実施する。最初のＬＷＳは、Ｔ７  ＲＮＡＰ遺伝子を保有し、Ｓ１菌でのみＣＣＰ１のバックグラウンド発現により低いレベルの増殖と突然変異進化する。ＬＷＳが保有するＴ７ＲＮＡＰがＴ３ＲＮＡＰの方向に進化し続けることにより、ＣＣＰ１上のＴ３プロモーターに制御されるｇＩＩＩの発現を促進するＬＷＳ突然変異株が生産される。当該突然変異株は、Ｓ１菌においてより高いレベルの増殖と進化を行い、ＣＣＰ１中のＴ３プロモーターが制御するｇＩＩＩのプロモーション活性を更に改善し、突然変異ファージＬＷＳｅとｐｒｅ−Ｔ３ＲＮＡＰに進化した標的遺伝子を得ることができる（図２ａ）。そのプロセスはポジティブスクリーニングと呼ばれる。
【００６５】
進化後のＬＷＳｅ上のｐｒｅ−Ｔ３ＲＮＡＰは、Ｔ７、Ｔ３プロモーターに対していずれも高い活性を有する。Ｔ３プロモーターに対するｐｒｅ−Ｔ３ＲＮＡＰの特異性を改善するため、Ｔ７プロモーターに対する認識プロモーション性能が低いＴ３ＲＮＡＰを進化させてスクリーニングする必要がある。このプロセスはネガティブスクリーニングと呼ばれる。
【００６６】
ネガティブスクリーニングはＣＣＰ３またはＣＣＰ４を用いる必要があり、ポジティブスクリーニングによって進化したＬＷＳｅによりＳ２菌が感染するとき、ＬＷＳｅ上の進化後の標的遺伝子ｐｒｅ−Ｔ３ＲＮＡＰは、ｇＩＩＩ−Ｒ５の発現を促進することができ、それによりその増殖を抑制することができる。その状況はＬＷＳｅがいくつかの新しいファージ突然変異株を進化させるまで続く。それらの新しいファージ突然変異株が保有する標的遺伝子は、ＣＣＰ２上のＴ３プロモーターが制御するｇＩＩＩ遺伝子の発現を効率的に促進することができるが、ＣＣＰ３またはＣＣＰ４上のＴ７プロモーターが制御するｇＩＩＩ−Ｒ５遺伝子の発現を促進しないか或いはほとんど促進しない。このとき、それらの新しいファージ突然変異株はＳ２またはＳ３菌株内において更に進化し続け、最終的に進化して、高特異性のＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子Ｔ３ＲＮＡＰを運ぶファージＬＷＳｅＮを得ることができる（図２ｂ）。ＣＣＰ４は、高コピープラスミドであり、欠損性遺伝的要素を発現するレベルが高い。すなわち、ＣＣＰ４はＣＣＰ３の強化型である。Ｓ２宿主細菌の代わりにＳ３宿主細菌を用いることにより、Ｓ２宿主細菌において進化したファージをＳ３宿主細菌に転送して更に進化させることができる。
【００６７】
以下、実施例によって本発明の実行可能性を説明する。なお、下記の実施例は単なる例示であり、下記の実施例により本発明の実行可能性を説明するが、それらにより本発明の保護範囲を限定する意図はない。
【００６８】
実施例１
進化実験を行う前に、下記の準備をする。
【００６９】
１）ＣＣＰ１およびＩＭＰ１プラスミドを保有する宿主細菌Ｓ１を、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれるＬＢ培地に入れた後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件によりＯＤ６００＝０．３まで培養する。次に、Ｓ１を１００倍に希釈した後、同じ培養条件により再びＯＤ６００＝０．３まで培養する。２回の培養後、宿主細菌Ｓ１を進化実験に用いることができる。
【００７０】
２）ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＩＭＰ２プラスミドを保有する宿主細菌Ｓ２を、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれるＬＢ培地に入れた後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件によりＯＤ６００＝０．３まで培養する。次に、Ｓ２を１００倍に希釈した後、同じ培養条件により再びＯＤ６００＝０．３まで培養する。２回の培養後、宿主細菌Ｓ２を進化実験に用いることができる。
【００７１】
３）ＣＣＰ２、ＣＣＰ４およびＩＭＰ２プラスミドを保有する宿主細菌Ｓ３を、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれるＬＢ培地に入れた後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件によりＯＤ６００＝０．３まで培養する。次に、Ｓ３を１００倍に希釈した後、同じ培養条件により再びＯＤ６００＝０．３まで培養する。２回の培養後、宿主細菌Ｓ３を進化実験に用いることができる。
【００７２】
４）ＣＣＰ２を保有する宿主細菌Ｓ４を、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンが含まれるＬＢ培地に入れた後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件によりＯＤ６００＝０．３まで培養する。次に、Ｓ４を１００倍に希釈した後、同じ培養条件により再びＯＤ６００＝０．３まで培養する。２回の培養後、宿主細菌Ｓ４を実験に用いることができる。
【００７３】
５）ＣＣＰ２．１を保有する宿主細菌Ｓ５を、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンが含まれるＬＢ培地に入れた後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件によりＯＤ６００＝０．３まで培養する。次に、Ｓ５を１００倍に希釈した後、同じ培養条件により再びＯＤ６００＝０．３まで培養する。２回の培養後、宿主細菌Ｓ５を実験に用いることができる。
【００７４】
６）ＣＣＰ１を保有する宿主細菌Ｓ６を、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンおよび５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンが含まれるＬＢ培地に入れた後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件によりＯＤ６００＝０．３まで培養する。次に、Ｓ６を１００倍に希釈した後、同じ培養条件により再びＯＤ６００＝０．３まで培養する。２回の培養後、宿主細菌Ｓ６を進化実験に用いることができる。
【００７５】
７）ＩＭＰ３およびＣＣＰ１を保有する宿主細菌Ｓ７を、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールが含まれるＬＢ培地に入れた後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件によりＯＤ６００＝０．３まで培養する。次に、Ｓ７を１００倍に希釈した後、同じ培養条件により再びＯＤ６００＝０．３まで培養する。２回の培養後、宿主細菌Ｓ７を実験に用いることができる。
【００７６】
８）Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１５を５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンが含まれるＬＢ培地に入れた後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件によりＯＤ６００＝０．３まで培養する。次に、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１５を１００倍に希釈した後、同じ培養条件により再びＯＤ６００＝０．３まで培養する。２回の培養後、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｍ１５を実験に用いることができる。
【００７７】
９）Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５をＬＢ培地に入れた後、３７℃、２２０ｒｐｍの条件によりＯＤ６００＝０．３まで培養する。次に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５を１００倍に希釈した後、同じ培養条件により再びＯＤ６００＝０．３まで培養する。２回の培養後、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５を実験に用いることができる。
【００７８】
実施例２
Ｓ４またはＳ５の宿主細菌におけるＬＷＳプラークの観察方法
【００７９】
１）１０ｃｍの細菌培養プレート上に１０ｍｌの１．５％アガロースゲルを１層広げた後、室温で２０ｍｉｎ放置することによりそれを凝固させる。
【００８０】
２）ファージＬＷＳの濃度がわからない場合、ＬＷＳを１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７倍の比率で連続的に勾配希釈する必要がある。
【００８１】
３）「実施例１」で準備した２００μＬのＳ４またはＳ５宿主細菌を複数組取り、各組に希釈勾配が異なる「２）」のＬＷＳを１０μＬずつ添加した後、５５℃で保存し、かつ０．４％の細菌学用寒天が含まれている４ｍｌのＬＢ培地と最終濃度が５０μｇ／ｍｌであるカルベニシリンを更に添加する。ボルテックスミキサーにより均一に混合した後、サンプルを「１）」で準備したプレート上に広げ、かつ室温で１ｈ放置することによりそのサンプルを凝固させる。
【００８２】
４）３７℃の生化学インキュベーターで一晩培養する。
【００８３】
５）各勾配希釈サンプルによって形成されたプラーク数を検出してカウントし、元のサンプルＬＷＳの濃度を算出する。
【００８４】
Ｓ５が保有するＣＣＰ２．１のｇＩＩＩ遺伝子はＴ７プロモーターにより促進され、Ｔ７  ＲＮＡＰ標的遺伝子を保有するファージＬＷＳはＳ５宿主細菌においてプラークを希釈することができる。Ｓ４が保有するＣＣＰ２のｇＩＩＩ遺伝子はＴ３プロモーターにより促進され、含有される標的遺伝子のみによりＴ３  ＲＮＡＰ活性を有するＬＷＳｅを進化させ、Ｓ４宿主細菌にプラークを形成することができる。ＬＷＳｅによりＳ４、Ｓ５宿主細菌に形成されたプラーク数の変化を比較することにより、ＬＷＳｅの進化の効果を直接分析することができる。
【００８５】
実施例３
宿主細菌、ファージ感染および移動テスト
【００８６】
１）１０ｃｍの細菌培養プレートに、０．２５％細菌学用寒天が含まれている１０ｍｌのＬＢ培地を添加する。培地は５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリンと５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む。室温で１ｈ放置することによりそれを凝固させる。
【００８７】
２）図１ａに示すように、２μｌの「実施例１」で準備した宿主細菌Ｓ５をプレートの中央表面に接種する。Ｓ５接種部位から１ｃｍ離れた外側の３つのコーナーには保存濃度が１０６ｐｆｕ／ｍｌであるＬＷＳファージを２μｌずつ接種する。
【００８８】
３）プレートを３７℃の生化学インキュベーターに入れて一晩培養する。その後、図１ｂに示す現象を観察できる。宿主細菌は、中央から端に移動し、移動中の宿主細菌はファージと接触することにより感染しかつ子孫ファージを生成し、その後外縁へ移動し続ける。感染した宿主細菌の成長が遅いため、細菌の数は比較的少なく、非感染領域の宿主細菌が元の状態を維持するため、細菌の数は比較的多い。したがって、感染領域には細菌が少なくかつ透明なＶ字型感染スポットが形成されていることを見つけることができる。前記透明な感染スポットはファージが感染することを意味し、透明スポットの透明度とサイズはファージの感染活性を意味する。
【００８９】
実施例４
ＳＰＡＣＥポジティブスクリーニング進化
【００９０】
１）１回目の進化：３つの１０ｃｍの細菌培養プレートａ、ｂ、ｃを準備し、各培養プレートに０．２５％の細菌学用寒天が含まれている１０ｍｌのＬＢ培地を添加する。培地は、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンを含む。室温で１ｈ放置することによりそれを凝固させる。
【００９１】
４つの１０ｃｍの細菌培養プレートｄ、ｅ、ｆ、ｇを準備し、各培養プレートに０．２５％の細菌学用寒天が含まれている１０ｍｌのＬＢ培地を添加する。培地は、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む。室温で１ｈ放置することによりそれを凝固させる。
【００９２】
２）図１ａに示すように、２μｌの「実施例１」で準備した宿主細菌Ｓ６を３つのプレートａ、ｂ、ｃの中央表面に接種する。Ｓ６接種部位から１ｃｍ離れたプレートａの外側の３つのコーナーに保存濃度が１０８ｐｆｕ／ｍｌであるＬＷＳファージを２μｌずつ接種する。Ｓ６接種部位から１ｃｍ離れたプレートｂの外側の３つのコーナーに保存濃度が１０９ｐｆｕ／ｍｌであるＬＷＳファージを２μｌずつ接種する。Ｓ６接種部位から１ｃｍ離れたプレートｃの外側の３つのコーナーに保存濃度が１０１０ｐｆｕ／ｍｌであるＬＷＳファージを２μｌずつ接種する。
【００９３】
２μｌの「実施例１」で準備した宿主細菌Ｓ１を４つのプレートｄ、ｅ、ｆ、ｇの中央表面に接種する。Ｓ１接種部位から１ｃｍ離れたプレートｄの外側の３つのコーナーに保存濃度が１０８ｐｆｕ／ｍｌであるＬＷＳファージを２μｌずつ接種する。Ｓ１接種部位から１ｃｍ離れたプレートｅの外側の３つのコーナーに保存濃度が１０９ｐｆｕ／ｍｌであるＬＷＳファージを２μｌずつ接種する。Ｓ１接種部位から１ｃｍ離れたプレートｆの外側の３つのコーナーに保存濃度が１０１０ｐｆｕ／ｍｌであるＬＷＳファージを２μｌずつ接種する。プレートｇにはファージを接種しない。
【００９４】
プレートｄ、ｅ、ｆは異なる量の初期ファージが添加されたＳＡＰＣＥ進化グループであり、プレートａ、ｂ、ｃは異なる量のファージが添加されかつ変異誘発プラスミドＩＭＰ１が含まれていないコントロールグループであり、プレートｇはファージが含まれていないネガティブコントロールグループである。
【００９５】
３）プレートを３７℃の生化学インキュベーターに入れて一晩培養する。
【００９６】
４）プレートａ〜ｇの培養効果は４ａ〜ｇに示すとおりである。プレートａ、ｂ、ｃ中のＳ６宿主細菌は変異誘発プラスミドを有しておらず、ファージは突然変異進化することができない。プレートａ、ｂ、ｃでは、ファージＬＷＳは、ＣＣＰ１のバックグラウンド発現のみにより促進されかつ弱く増殖するため、移動中の宿主細菌に直ちに振り払われ、かつ肉眼で認識できる感染スポットを形成することができない。最終結果はｇ組のネガティブコントロールと同じである。
【００９７】
プレートｄ、ｅ、ｆ中の宿主細菌Ｓ１は変異誘発プラスミドＩＭＰ１を保有している。したがって、最初時のファージＬＷＳはＣＣＰ１のバックグラウンド発現のみにより促進されかつ複製および増殖する。しかしながら、ファージＬＷＳはＩＭＰ１上の突然変異誘発遺伝子を促進することによりそれ自体がＴ３ＲＮＡＰ活性を突然変異進化させるようにすることができる。したがって、プレートｄ、ｅ、ｆには感染スポットが直ちに形成され、かつ最初に添加されたファージ量が多ければ多いほど感染スポットがより明らかになる。
【００９８】
プレートｅ中の感染スポットは明らかであり、ｅと同じ量の初期ファージＬＷＳが添加されたプレートｂには非特異的な感染スポットが形成されない。したがって、後の実施例においてプレートｅを選択して実験分析する。
【００９９】
プレートｅで進化した感染スポットには進化後のファージＬＷＳｅがある。プレートｅにおける感染スポットの開始点α（プレートの中央付近）、中間点β、終点γ（プレートの中央から離れた位置）において５μｌのサンプルをそれぞれ採取し、それらをＬＷＳｅα、ＬＷＳｅβ、ＬＷＳｅγと表記する。サンプルをＬＢ液体培地により１００倍に希釈した後、ボルテックスミキサーにより２ｍｉｎ均一に混合する。次に、均一に混合されたサンプルを０．２２μｍの小型フィルタで濾過し、「実施例２」に記載の方法により、Ｔ３プロモーターでｇＩＩＩ遺伝子の発現を制御するＳ４宿主細菌中のサンプルＬＷＳｅα、ＬＷＳｅβ、ＬＷＳｅγによりＳ４宿主細菌に形成されるプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅの形成状況と、Ｔ７プロモーターでｇＩＩＩ遺伝子の発現を制御するＳ５宿主細菌に形成されるプラークＴ７  ｐｌａｑｕｅの形成状況をそれぞれ検出する。
【０１００】
図４ｈに示すように、進化前のファージＬＷＳは、野生型のＴ７ＲＮＡＰ遺伝子を保有し、宿主細菌Ｓ５のみでＴ７  ｐｌａｑｕｅを形成することができ、宿主細菌Ｓ４でＴ３  ｐｌａｑｕｅを形成することができない。進化が進むにつれ、ファージＬＷＳはファージＬＷＳｅになる。ＬＷＳｅが保有する標的遺伝子は、絶えず突然変異しているので、Ｔ３  ＲＮＡＰ活性を持ち始め、Ｔ３プロモーターを認識することができ、かつ宿主細菌Ｓ４にＴ３  ｐｌａｑｕｅを形成することができる。また、プレートの中央から離れれば離れるほど、進化の時間は長くなり、進化の効果が高くなり、ＬＷＳｅにより得られるＴ３ＲＮＡＰの活性が明らかになる。図４ｈに示すように、ＬＷＳ〜ＬＷＳｅγがＳ４においてＴ３  ｐｌａｑｕｅを形成する能力が強くなる。したがって、後の実施例において、進化するたびにプレートの中央から離れた感染スポットの終点においてサンプルを採取し、それを１００倍に希釈し、０．２２μｍの小型フィルタで濾過し、分析または進化を続ける。
【０１０１】
後の実施例との一致性を確保するため、以下、ＬＷＳｅγサンプルをＬＷＳｅ１と表記する。ここで、「１」は進化を１回したことを表す。、本発明において、ＬＷＳｅ１とＬＷＳｅγは異なるシーンにおける同じサンプルの名称の表記を表す。
【０１０２】
２回目の進化：同じプレートにおいて、Ｓ１宿主細菌をプレートの中央に接種し、Ｓ１接種部位の外側から１ｃｍ離れた３つのコーナーに濾過後のファージＬＷＳｅ１を２μｌずつ接種し、同じ条件で２回目の進化を行う。
【０１０３】
２回目の進化感染スポットの最後に、ＬＷＳｅ２ファージサンプルを５μｌ採取して１００倍に希釈し、０．２２μｍの小型フィルタで濾過し、サンプルによりＳ４宿主細菌に形成されるプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅの形成状況と、Ｓ５宿主細菌に形成されるプラークＴ７  ｐｌａｑｕｅの形成状況をそれぞれ検出する。図５に示すように、追加の進化を１回した後、ＬＷＳｅ２によりＳ４宿主細菌にプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅを形成する能力はＬＷＳｅ１よりも強くなる。
【０１０４】
実施例５
Ｓ２またはＳ３宿主細菌によるＳＰＡＣＥネガティブスクリーニング進化
【０１０５】
１）３回目の進化：１０ｃｍの培養プレートに０．２５％の細菌学用寒天が含まれている１０ｍｌのＬＢ培地を添加する。培地は、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む。室温で１ｈ放置することによりそれを凝固させる。Ｓ２が保有するＣＣＰ３およびＣＣＰ４プラスミドにはＴ７プロモーターだけでなくテオフィリンに誘導されるリボスイッチも含まれている。リボスイッチは厳密ではないので、テオフィリンを添加しなくても一定のｇＩＩＩ−ｎｅｇバックグラウンド発現が存在し、標的遺伝子を保有し、かつ野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ活性を有するファージＬＷＳｅの増殖を抑制する。
【０１０６】
プレートの中央に２μｌの宿主細菌Ｓ２を接種した後、Ｓ２接種部位の外側から１ｃｍ離れた３つのコーナーに濾過後のファージＬＷＳｅ２を２μｌずつ接種し、３７℃のインキュベーターで一晩培養する。３回目の進化を行う。
【０１０７】
３回目の進化感染スポットの最後において、ＬＷＳｅ３ファージサンプルを５μｌ採取して１００倍に希釈し、０．２２μｍの小型フィルタで濾過し、サンプルによりＳ４宿主細菌に形成されるプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅの形成状況と、Ｓ５宿主細菌に形成されるプラークＴ７  ｐｌａｑｕｅの形成状況をそれぞれ検出する。
【０１０８】
２）４回目の進化：本実施例のステップ「１）」と同じ条件により濾過後のＬＷＳｅ３サンプルに対して４回目の進化を行う。同様に、４回目の進化感染スポットの最後において、ＬＷＳｅ４ファージサンプルを５μｌ採取して１００倍に希釈し、０．２２μｍの小型フィルタで濾過し、サンプルによりＳ４宿主細菌に形成されるプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅの形成状況と、Ｓ５宿主細菌に形成されるサンプルのプラークＴ７  ｐｌａｑｕｅの形成状況をそれぞれ検出する。
【０１０９】
３）５回目の進化：１０ｃｍの培養プレートに０．２５％の細菌学用寒天が含まれている１０ｍｌのＬＢ培地を添加する。培地は、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１ｍＭテオフィリンを含む。室温で１ｈ放置することによりそれを凝固させる。テオフィリンを添加することによりＣＣＰ３およびＣＣＰ４のｇＩＩＩ−ｎｅｇの発現を向上させ、進化スクリーニングの圧力を強めることができる。
【０１１０】
プレートの中央に２μｌの宿主細菌Ｓ２を接種した後、Ｓ２接種部位の外側から１ｃｍ離れた３つのコーナーに濾過後のファージＬＷＳｅ４を２μｌずつ接種し、３７℃のインキュベーターで一晩培養する。５回目の進化を行う。
【０１１１】
５回目の進化感染スポットの最後において、ＬＷＳｅ５ファージサンプルを５μｌ採取して１００倍に希釈し、０．２２μｍの小型フィルタで濾過し、サンプルによりＳ４宿主細菌に形成されるプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅの形成状況と、Ｓ５宿主細菌に形成されるプラークＴ７  ｐｌａｑｕｅの形成状況をそれぞれ検出する。
【０１１２】
４）６回目の進化：１０ｃｍの培養プレートに０．２５％の細菌学用寒天が含まれている１０ｍｌのＬＢ培地を添加する。培地は、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む。室温で１ｈ放置することによりそれを凝固させる。
【０１１３】
プレートの中央に２μｌの宿主細菌Ｓ３を接種した後、Ｓ３接種部位の外側から１ｃｍ離れた３つのコーナーに濾過後のファージＬＷＳｅ５を２μｌずつ接種し、３７℃のインキュベーターで一晩培養する。６回目の進化を行う。
【０１１４】
６回目の進化感染スポットの最後において、ＬＷＳｅ６ファージサンプルを５μｌ採取して１００倍に希釈し、０．２２μｍの小型フィルタで濾過し、、サンプルによりＳ４宿主細菌に形成されるプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅの形成状況と、Ｓ５宿主細菌に形成されるプラークＴ７  ｐｌａｑｕｅの形成状況をそれぞれ検出する。
【０１１５】
５）７回目の進化：１０ｃｍの培養プレートに０．２５％の細菌学用寒天が含まれている１０ｍｌのＬＢ培地を添加する。培地は、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリン、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシン、２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールおよび１ｍＭテオフィリンを含む。室温で１ｈ放置することによりそれを凝固させる。
【０１１６】
プレートの中央に２μｌの宿主細菌Ｓ３を接種した後、Ｓ３接種部位の外側から１ｃｍ離れた３つのコーナーに濾過後のファージＬＷＳｅ６を２μｌずつ接種し、３７℃のインキュベーターで一晩培養する。７回目の進化を行う。
【０１１７】
７回目の進化感染スポットの最後において、ＬＷＳｅ７ファージサンプルを５μｌ採取して１００倍に希釈し、０．２２μｍの小型フィルタで濾過した後、サンプルによりＳ４宿主細菌に形成されるプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅの形成状況と、Ｓ５宿主細菌に形成されるプラークＴ７  ｐｌａｑｕｅの形成状況をそれぞれ検出する。
【０１１８】
７回目の進化の効果は図５に示すとおりである。図５中のａ部分は異なるＣＣＰのコピー数を示している。コピー数は、遺伝子の発現レベルに影響を与え、進化プロセスにおける選択圧にも影響を与える。図５中のｂ部分は各進化によるプレート上の効果を示している。ｂ部分の進化圧線において、明るい色から暗い色に変化する色により、異なる進化条件で、進化選択圧が弱から強に変化することを示している。図５中のｃ部分は各進化の生成物によりＳ４、Ｓ５宿主細菌に形成されるプラークの形成効果を示している。図に示すように、進化の回数が増加すると、進化プロセスの選択圧は強くなり、進化の効果は明らかになる。野生型Ｔ７  ＲＮＡＰ遺伝子を保有するＬＷＳファージは、Ｔ７プロモーターのみによりｇＩＩＩ遺伝子の発現を制御できるＳ５宿主細菌においてプラークＴ７  ｐｌａｑｕｅを形成することができるが、Ｔ３プロモーターによりｇＩＩＩ遺伝子の発現を制御するＳ４宿主細菌においてプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅを形成することができない。進化が進むにつれ、ＬＷＳｅ１からＬＷＳｅ７ファージまでのファージによりＳ５宿主細菌にプラークＴ７  ｐｌａｑｕｅを形成する能力は全体的に弱くなるが、Ｓ４宿主細菌にプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅを形成する能力は全体的に強くなる。
【０１１９】
実施例６
ＳＰＡＣＥ生成物の配列決定分析
【０１２０】
最初の２回の進化生成物のファージＬＷＳｅ１、ＬＷＳｅ２に対して、いくつかのクローンを精製することにより標的遺伝子を配列決定する。図５ｄに示すように、ファージが保有する標的遺伝子はいずれも、Ｎ末端の第１〜３１０のアミノ酸において対応する突然変異が発生した。この領域がＴ７  ＲＮＡＰがプロモーターを認識することに関連しているという報告がある。Ｅ２２２Ｋの突然変異はＴ７  ＲＮＡＰの特異性に影響を与えることが、Ｄａｖｉｄ  Ｒ  Ｌｉｕによって報告されている。
【０１２１】
進化前後のファージがＳ５、Ｓ４宿主細菌においてプラークを形成する能力および配列決定結果を比較すると、ＬＷＳｅファージが保有する標的遺伝子の活性がＴ７ＲＮＡＰからＴ３ＲＮＡＰに変化することはＳＡＰＣＥ進化による突然変異により引き起こされることが分かる。
【０１２２】
実験例１
ＩＭＰ３誘導によるＳＰＡＣＥ進化テスト
【０１２３】
１）３つの１０ｃｍの細菌培養プレートａ、ｂ、ｃを準備し、各培養プレートに０．２５％の細菌学用寒天が含まれる１０ｍｌのＬＢ培地を添加する。培地は、５０μｇ／ｍｌのテトラサイクリン、５０μｇ／ｍｌのスペクチノマイシンおよび２５μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含む。室温で１ｈ放置することによりそれを凝固させる。
【０１２４】
２）図１ａに示すように、２μｌの実施例１で準備した宿主細菌Ｓ７をプレートａ、ｃの中央表面にそれぞれ接種する。プレートａの宿主細菌Ｓ７の接種部位から１ｃｍ離れた外側の３つのコーナーに、保存濃度が１０９ｐｆｕ／ｍｌであるＬＷＳファージを２μｌ接種する。ｎｅｇａｔｉｖｅ組であるプレートｃにはファージを接種しない。
【０１２５】
２μｌの実施例１で準備した宿主細菌Ｓ１をプレートｂの中央表面に接種する。プレートｂの宿主細菌Ｓ１の接種部位から１ｃｍ離れた外側の３つのコーナーに保存濃度が１０９ｐｆｕ／ｍｌであるＬＷＳファージを２μｌずつ接種する。
【０１２６】
３）プレートを３７℃の生化学インキュベーターに入れて一晩培養する。
【０１２７】
４）プレートａ〜ｃの進化の効果は図６ａ〜６ｃに示すとおりであり、ＩＰＭ３を保有する宿主細菌Ｓ７とＩＭＰ１を保有する宿主細菌Ｓ１には進化が類似する感染スポットが形成される。宿主細菌Ｓ７組の進化感染スポットの最後において、進化後のファージサンプルＬＷＳｅＰ１を５μｌ採取して１００倍に希釈した後、０．２２μｍの小型フィルタで濾過する。次に、サンプルによりＳ４宿主細菌に形成されるプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅの形成状況と、Ｓ５宿主細菌に形成されるプラークＴ７  ｐｌａｑｕｅの形成状況をそれぞれ検出する。
【０１２８】
進化による宿主細菌Ｓ１組の感染スポットの終点において進化後のファージサンプルＬＷＳｅＴ１を５μｌ採取して１００倍に希釈した後、０．２２μｍの小型フィルタで濾過する。次に、サンプルによりＳ４宿主細菌に形成されるプラークＴ３  ｐｌａｑｕｅの形成状況と、Ｓ５宿主細菌に形成されるプラークＴ７  ｐｌａｑｕｅの形成状況をそれぞれ検出する。
【０１２９】
図６ｄに示すように、ＬＷＳｅＴ１とＬＷＳｅＰ１のＴ３、Ｔ７ｐｌａｑｕｅの数は類似している。それはｐｓｐオペロンに制御されるＩＭＰ３とＩＭＰ１により突然変異進化を促進する効果が同様であることを示す。
【０１３０】
以上のとおり、ＩＭＰ１とＩＭＰ２の代わりにＩＭＰ３を直接用いることによりＩＭＰの発現を標的遺伝子の活性から分離させることができる。このとき、標的遺伝子の進化的合成に係らず、ポジティブスクリーニングまたはネガティブスクリーニングをするときいずれも、同じＩＭＰ３を用いることができる。
【０１３１】
実験例２
毒性ファージの感染移動テスト
【０１３２】
１）前記実施例は慢性感染Ｍ１３ファージにより実行されるものである。しかしながら、本発明は他のファージにより進化実験をすることもできる。本実施例において、毒性ファージのＴ７ファージを例として説明する。
【０１３３】
２）１０ｃｍの細菌培養プレートに０．２５％の細菌学用寒天が含まれている１０ｍｌのＬＢ培地を添加し、室温で１ｈ放置することによりそれを凝固させる。
【０１３４】
３）図１ａに示すように、２μｌの「実施例１」で準備した宿主細菌Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５をプレートの中央表面に接種する。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５接種部位から１ｃｍ離れた外側の３つのコーナーに保存濃度が１０４、１０５、１０６ｐｆｕ／ｍｌであるＴ７ファージを２μｌずつ接種する。コントロール組において、ファージの代わりにＬＢ培地を用いる。
【０１３５】
４）プレートを３７℃の生化学インキュベーターに入れて一晩培養する。その後、図７ｂに示す現象を見つけることができる。宿主細菌は中央から端部に移動し、移動中の宿主細菌はファージと接触することにより、感染するとともに子孫ファージを生成し、かつ外縁へ移動し続ける。Ｔ７ファージは強力なファージであり、感染する宿主細菌はいずれも分解して死亡する。したがって、プレート上にＶ字型の透明な感染スポットが形成される。コントロール組１６ａにはファージがないため、Ｖ字型感染スポットが形成されず、その細菌は円状に均等に分布する。接種量が１０６ｐｆｕ／ｍｌである組において、図７ｂの感染領域のα点、非感染領域のβ点および交差領域のγ点でサンプルをそれぞれ採取し、「実施例２」に従って、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＭＧ１６５５によりプラーク数をカウントする。図７ｃに示すように、γ点において１０９ｐｆｕ／ｍｌレベルのＴ７ファージが検出された。Ｔ７激烈ファージはプレートにおいて宿主細菌と共に移動しながら感染し、かつ肉眼で認識できる感染スポットを感染の兆候とすることができる。Ｍ１３ファージにより実施される本発明実施例をＴ７ファージにより実施することもできる。
【０１３６】
前記実施例において、Ｔ７プロモーターを認識するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子Ｔ７ＲＮＡＰを、Ｔ３プロモーターを認識するＴ３  ＲＮＡポリメラーゼ遺伝子Ｔ３  ＲＮＡＰに進化させることを例として本発明を説明してきた。しかしながら、他の実施例において、ＬＷＳにおけるＴ７ＲＮＡＰ遺伝子の代わり他の標的遺伝子（プロテアーゼ遺伝子、セルラーゼ遺伝子、蛍光タンパク質遺伝子、密度感知遺伝子など）を用い、ＣＣＰ１、ＣＣＰ２、ＣＣＰ３およびＣＣＰ４プラスミド中のｇＩＩＩとｇＩＩＩ−Ｒ５遺伝子の発現の調節方法と発現後の修飾方式を対応させて調整することにより、ｇＩＩＩおよびｇＩＩＩ−Ｒ５の発現とＬＷＳ上の新しい進化待ちの標的遺伝子の生物活性を関連させることができる。それにより本システムは新しい標的遺伝子に対して指向性進化することができる。
【０１３７】
具体的な実施例により本発明を説明してきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱しない範囲内において、さまざまな変更および改良等をすることができ、それらがあっても本発明に含まれることは勿論である。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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