(57)【要約】本出願は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、自己破壊性ドメインとをタンデム配置で含むＧＤ２に基づくキメラ抗原受容体であって、該抗原結合ドメインは、腫瘍表面抗原に結合し、該腫瘍表面抗原は、ＧＤ２であり、かつ抗原結合ドメインは、腫瘍表面抗原ＧＤ２に対する一本鎖抗体であり、自己破壊性ドメインは、カスパーゼ９ドメインである、ＧＤ２に基づくキメラ抗原受容体に関する。ステージＩＶの、腫瘍特異的標的ＧＤ２を発現する神経芽細胞腫の患者に実際に投与する時、本願のキメラ抗原受容体は、より少ない臨床的副作用、より高い安全性、効果的な固形腫瘍を減少させる能力、及びＧＤ２−ＣＡＲＴの長期間存続のために全般的な患者の生存率を効果的に増加させるなどの利益を有する。
2021531008.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、自己破壊性ドメインとをタンデム配置で含むＧＤ２に基づくキメラ抗原受容体であって、
前記抗原結合ドメインは、腫瘍表面抗原に結合し、前記腫瘍表面抗原は、ＧＤ２であり、かつ前記抗原結合ドメインは、前記腫瘍表面抗原ＧＤ２に対する一本鎖抗体であり、前記腫瘍表面抗原ＧＤ２に対する前記一本鎖抗体は、
（１）配列番号１〜配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、
（２）配列番号１〜配列番号３に示されるアミノ酸配列から１つ以上のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失によって誘導される、前記キメラ抗原受容体に特異的に結合し、ＧＤ２に結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する機能を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を有する、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
配列番号１〜配列番号３に示されるアミノ酸配列から１つ以上のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失によって誘導される前記アミノ酸配列は、配列番号１〜配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％の同一性を有する、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン及び／又はＣＤ８α膜貫通ドメインであり、
好ましくは、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインと４−１ＢＢシグナル伝達ドメインとの組み合わせであり、
好ましくは、前記共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
前記自己破壊性ドメインは、カスパーゼ９ドメインを含み、
好ましくは、前記カスパーゼ９ドメインは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、
好ましくは、前記自己破壊性ドメインは、２Ａ配列を介して前記ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとタンデムに連結されている、請求項１〜３のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
前記キメラ抗原受容体は、シグナルペプチドと、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、２Ａ配列と、自己破壊性ドメインとをタンデム配置で含み、
好ましくは、前記キメラ抗原受容体は、タンデム配置での、分泌シグナルペプチド、ＧＤ２抗原結合ドメイン、ＣＤ８α及び／又はＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、２Ａ配列、並びにカスパーゼ９ドメインであり、
好ましくは、前記キメラ抗原受容体は、分泌−ＧＤ２−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−２Ａ−ＦＢＫＰ．Ｃａｓｐ９であり、
好ましくは、分泌−ＧＤ２−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−２Ａ−ＦＢＫＰ．Ｃａｓｐ９の前記キメラ抗原受容体は、配列番号１２〜配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体を含むウイルスベクター。
【請求項７】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター及び／又はレトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターである、請求項６に記載のウイルスベクター。
【請求項８】
発現のための請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列でトランスフェクションされているＴ細胞。
【請求項９】
前記Ｔ細胞は、ウイルスベクター及び／又は真核性発現プラスミド、好ましくはウイルスベクターを介してトランスフェクションされている、請求項８に記載のＴ細胞。
【請求項１０】
哺乳動物細胞を、請求項６又は７に記載のウイルスベクターとパッケージングヘルパープラスミドｐＮＨＰ及びｐＨＥＦ−ＶＳＶＧとで同時トランスフェクションすることによって得られる組換えレンチウイルス。
【請求項１１】
前記哺乳動物細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞及びＴＥ６７１細胞からなる群のうちのいずれか１つ、又はそれらの少なくとも２つの組み合わせである、請求項１０に記載の組換えレンチウイルス。
【請求項１２】
請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体及び／又は請求項１０若しくは１１に記載の組換えレンチウイルスを含む組成物。
【請求項１３】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞又は免疫細胞又は腫瘍治療薬の作製のための、請求項１〜５のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体、請求項１０若しくは１１に記載の組換えレンチウイルス、又は請求項１２に記載の組成物の使用。
【請求項１４】
前記腫瘍は、前記ＧＤ２抗原が特異的に発現されている癌である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記ＧＤ２抗原が特異的に発現されている前記腫瘍は、神経芽細胞腫である、請求項１４に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、腫瘍のための細胞性免疫療法の分野に関し、特に、ＧＤ２に基づくキメラ抗原受容体及びその利用、詳細には、腫瘍特異的標的ＧＤ２に基づくキメラ抗原受容体Ｔ（ＣＡＲ−Ｔ）細胞技術を構築する方法、及び抗腫瘍療法におけるその利用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍に関する免疫学理論及び臨床技術の発達により、キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）免疫療法は、癌治療のための最も有望な免疫療法の１つとなった。キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、典型的には、腫瘍関連抗原結合領域と、細胞外ヒンジ領域と、膜貫通領域と、細胞内シグナル伝達領域とからなる。ＣＡＲは一般に、ヒンジ領域及び膜貫通領域を介してＴ細胞シグナル伝達分子の細胞質ドメインに結合された、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）に特異的な抗体の一本鎖フラグメント可変（ｓｃＦｖ）領域又は結合ドメインを含む。最も一般的なリンパ球活性化部には、Ｔ細胞エフェクター機能誘発（例えばＣＤ３ζ）部とタンデムにＴ細胞共刺激ドメインが含まれる。ＣＡＲを媒介する養子免疫療法により、ＣＡＲ移植Ｔ細胞は、ＨＬＡに制限されずに標的腫瘍細胞上のＴＡＡを直接認識することが可能となる。
【０００３】
神経芽細胞腫は、小児で最も一般的な頭蓋外固形悪性腫瘍である。その中の小児の５０％は腫瘍の大規模な広がり及び転移を有することが判明している。従来の手術、化学療法、放射線療法、及び自家幹細胞移植は、この患者群に対しては限られた治療効果しか有しない。病状が緩和するように管理されている場合でも、患者の８０％より多くが１年以内に再燃して死亡することとなる。これらの患者を治療するための１つのアプローチは、ＣＡＲの発現によって腫瘍細胞上に発現される抗原を標的とするようにＴ細胞を遺伝子改変することである。ＣＡＲは、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）に依存しない様式で細胞表面抗原を認識するように設計された抗原受容体である。ＣＡＲを発現する遺伝子改変細胞を使用してこれらの種類の患者を治療する試みは有望な成功を収めている。
【０００４】
ＧＤ２は神経芽細胞腫及び黒色腫等の腫瘍で広く発現されているが、正常組織でのＧＤ２の発現は少量であり制限されている。したがって、ＧＤ２は免疫療法にとって理想的な腫瘍抗原である。抗ＧＤ２抗体を使用する療法は、神経芽細胞腫のための現在の免疫療法で十分に発達した治療であり、初期の臨床的成果を収めている。しかしながら、抗体療法には以下の制限がある。投与された抗体は末梢血中に存在し、腫瘍組織又は微小残存腫瘍を伴う部位に浸透しにくい。さらに、投与された抗体は、体内に長期間存続することができない。さらに、抗ＧＤ２抗体はヒト−マウスキメラ抗体の構造を有するため、該抗体に対する抵抗性を誘導する可能性があり、それにより再治療の困難性が高まる。
【０００５】
特許文献１では、ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）結合ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、ＧＤ２結合ドメインは、ａ）相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する重鎖可変領域（ＶＨ）と、ｂ）ＣＤＲを有する軽鎖可変領域（ＶＬ）とを含む、キメラ抗原受容体、及び幾つかの癌の治療におけるそのようなＣＡＲを発現するＴ細胞の使用が開示された。この特許のキメラ抗原受容体とＧＤ２との間の結合効果を改善する必要があり、免疫エフェクタードメインを更に改善することができる。
【０００６】
抗体療法の利点に加えて、完全ヒト化キメラ抗原受容体ＧＤ２−ＣＡＲＴ細胞は、Ｔ細胞自体の特性により腫瘍組織に的確に浸透し、体内に長期間存続することができるため、再燃性及び難治性の神経芽細胞腫又は他のＧＤ２陽性腫瘍に対してより有効な治療をもたらし得る。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】中国特許出願公開第１０６５３６５６３号
【発明の概要】
【０００８】
ＣＡＲ−Ｔによる腫瘍の治療における不十分な標的化及びＣＡＲ−Ｔ技術の治療効果に対する腫瘍微小環境の影響を踏まえて、本出願は、ＧＤ２に基づくレンチウイルスキメラ抗原受容体及びその利用を提供する。本出願で作製されるキメラ抗原受容体は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の長期的な免疫及び安全性を高め、ＧＤ２−ＣＡＲコンストラクトのシグナル伝達ドメインを遺伝子改変することによりＣＡＲ−Ｔ細胞の治療効果を増強する。
【０００９】
この目的を達成するために、本出願は以下の技術的な解決手段を採用する。
【００１０】
１つの態様において、本出願は、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、自己破壊性ドメインとをタンデム配置で含むＧＤ２に基づくキメラ抗原受容体であって、
抗原結合ドメインは、腫瘍表面抗原に結合し、腫瘍表面抗原は、ＧＤ２であり、かつ抗原結合ドメインは、腫瘍表面抗原ＧＤ２に対する一本鎖抗体であり、腫瘍表面抗原ＧＤ２に対する一本鎖抗体は、
（ａ）配列番号１〜配列番号３に示されるアミノ酸配列、又は、
（ｂ）配列番号１〜配列番号３に示されるアミノ酸配列から１つ以上のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失によって誘導される、キメラ抗原受容体に特異的に結合し、ＧＤ２に結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する機能を有するアミノ酸配列、
から選択されるアミノ酸配列を有する、キメラ抗原受容体を提供する。
【００１１】
本出願では、抗原結合ドメインの一本鎖抗体及びＣＡＲの遺伝子構造は、遺伝子改変されたＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍上のＧＤ抗原に特異的に結合することができるように特異的に改変され、それにより比較的穏やかなシグナル刺激を得ることが可能であり、効果的な殺傷効果を発揮し得るが、一方で、免疫サイトカインはゆっくりと放出されるため、サイトカイン放出症候群の危険性は低減される。他のキメラ抗原受容体及び他の腫瘍抗原と比較して、本出願のＣＡＲは、より優れた効果を有し、より安全である。
【００１２】
腫瘍表面抗原ＧＤ２に対する一本鎖抗体のアミノ酸配列（配列番号１〜配列番号３）の一覧は以下の通りである。
【００１３】
配列番号１に示されるアミノ酸配列：
ＨＰＡＦＬＬＩＰＱＶＱＬＶＥＳＧＰＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＩＳＣＡＶＳＧＦＳＶＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＩＴＮＹＮＳＡＦＭＳＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＡＳＲＧＧＨＹＧＹＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴＫＧＥＩＶＭＴＱＴＰＡＴＬＳＶＳＡＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＴＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＳＡＳＮＲＹＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＹＧＴＥＦＴＦＴＩＳＳＶＱＳＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＤＹＳＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ。
【００１４】
配列番号２に示されるアミノ酸配列：
ＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＨＬＫＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＳＧＭＥＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴＫＧＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫ。
【００１５】
配列番号３に示されるアミノ酸配列：
ＡＦＬＬＩＰＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＬＰＧＤＳＬＲＬＳＣＡＴＳＥＦＴＦＴＤＹＹＭＴＷＶＲＱＰＰＲＫＡＬＥＷＬＧＦＩＲＮＲＡＮＧＹＴＴＥＹＮＰＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＴＬＲＴＥＤＳＡＴＹＹＣＡＲＶＳＮＷＡＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴＫＧＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＫＮＮＧＮＴＦＬＨＷＹＬＱＫＳＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＹＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＩＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ。
【００１６】
本出願において、腫瘍表面抗原ＧＤ２に対するＣＡＲのシグナル構造は、種々の抗ＧＤ２一本鎖抗体の代替ｓｃＦｖ遺伝子を使用することによって、改変されたＣＡＲがより強力な免疫刺激能力を示すように特異的に改変され、また迅速に改変され得る。
【００１７】
本発明によれば、配列番号１〜配列番号３に示されるアミノ酸配列から１つ以上のアミノ酸の置換、付加及び／又は欠失によって誘導されるアミノ酸配列は、配列番号１〜配列番号３に示されるアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の同一性、好ましくは９５％の同一性を有する。改変されたアミノ酸配列は、依然としてキメラ抗原受容体に特異的に結合することができ、ＧＤ２に結合してＴ細胞シグナル伝達を誘導する機能を有している。
【００１８】
９０％の同一性は、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性であり得る。
【００１９】
本出願によれば、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン（ＣＤ２８細胞外シグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８細胞膜シグナル伝達ドメイン）及び／又はＣＤ８α膜貫通ドメインである。幾つかの特定の実施の形態では、膜貫通ドメインは選択され得るか、又はアミノ酸置換によって改変され得る。
【００２０】
本出願によれば、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメインと４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメインとの組み合わせである。ＣＤ２８の細胞外シグナル伝達ドメイン、細胞膜シグナル伝達ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインを組み合わせると、完全長のＣＤ２８シグナル伝達ドメインとなる。完全長のＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢシグナル伝達ドメインの配置は、必要に応じて当業者によって調整され得る。完全長のＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢシグナル伝達ドメインの種々の配置によっても、キメラ抗原受容体に影響は及ぼされない。本出願では、ＣＤ２８−４−１ＢＢの配置を使用する。共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号４に示されるアミノ酸配列を有し、該配列は、具体的には以下の通りである：
ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ。
【００２１】
この中のリンカー配列は、複数のＧＧＧＧＳの反復配列である。
【００２２】
本出願によれば、完全長のＣＤ２８シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８細胞外シグナル、ＣＤ２８細胞膜シグナル、及びＣＤ２８細胞内シグナルを含む。ＣＤ２８細胞外シグナルは、具体的には以下の通り：ＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰである配列番号５に示される配列を有し、ＣＤ２８細胞膜シグナルは、具体的には以下の通り：ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶである配列番号６に示される配列を有し、ＣＤ２８細胞内シグナルは、具体的には以下の通り：ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＡＳである配列番号７に示される配列を有する。
【００２３】
本出願によれば、４−１ＢＢ細胞内シグナルは、具体的には以下の通り：ＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬである配列番号８に示される配列を有する。
【００２４】
本出願によれば、自己破壊性ドメインは、誘導性カスパーゼ９ドメインを含む。誘導性カスパーゼ９ドメインは、配列番号９に示されるアミノ酸配列を有し、該配列は以下の通りである：
ＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＭＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＲＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＡＳ。
【００２５】
本出願によれば、自己破壊性ドメインは、２Ａ配列を介してＣＤ３ζシグナル伝達ドメインとタンデムに連結されている。２Ａ配列は、自己破壊性ドメインにより発現されたタンパク質をキメラ抗原受容体タンパク質から破断し、それによりキメラ抗原受容体はその機能を発揮することが可能となる。しかしながら、アクチベーターを注入することによって自己破壊性ドメインが活性化され得ると、細胞死が誘導され、それによりキメラ抗原受容体はその機能を失う。
【００２６】
本出願によれば、キメラ抗原受容体は、キメラ抗原受容体の膜貫通輸送を指揮することができる任意のシグナルペプチドであり得るシグナルペプチドを更に含む。当該技術分野で慣用のシグナルペプチドは、必要に応じて当業者によって選択され得る。シグナルペプチドは、配列番号１０又は配列番号１１に示されるアミノ酸配列を有する分泌シグナルペプチドである。分泌シグナルペプチドは、以下の通り：ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰのアミノ酸配列（配列番号１０）を有する、又は分泌シグナルペプチドは、以下の通り：ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰのアミノ酸配列（配列番号１１）を有する。
【００２７】
本出願のキメラ抗原受容体は、ヒンジ領域を更に含み得る。ヒンジ領域は、実際の状況に応じて当業者により選択され得て、本明細書では特に限定されない。ヒンジ領域が存在することにより、本出願のキメラ抗原受容体の性能に影響は及ぼされない。
【００２８】
本出願のキメラ抗原受容体は、ＥＦ１ａ又は高発現されるプロモーターのいずれか１つであり得るプロモーターを更に含み得る。プロモーターは、実際の状況に応じて当業者により選択され得て、本明細書では特に限定されない。プロモーターが存在することにより、本出願のキメラ抗原受容体の性能に影響は及ぼされない。
【００２９】
本出願によれば、キメラ抗原受容体は、シグナルペプチドと、抗原結合ドメインと、膜貫通ドメインと、共刺激シグナル伝達ドメインと、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと、２Ａ配列と、自己破壊性ドメインとをタンデム配置で含む。
【００３０】
好ましい技術的な解決手段としては、キメラ抗原受容体は、タンデム配置での、分泌シグナルペプチド、ＧＤ２抗原結合ドメイン、ＣＤ８α及び／又はＣＤ２８膜貫通ドメイン、完全長のＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、４−１ＢＢ細胞内シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、２Ａ配列、並びにカスパーゼ９ドメインである。具体的には、その配置は以下の通りである：
分泌−ＧＤ２ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−２Ａ−ＦＢＫＰ．Ｃａｓｐ９。
【００３１】
本出願によれば、分泌−ＧＤ２ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−２Ａ−ＦＢＫＰ．Ｃａｓｐ９のキメラ抗原受容体は、配列番号１２〜配列番号１４に示されるアミノ酸配列を有し、該配列の一覧は、具体的には以下の通りである。
【００３２】
配列番号１２に示されるアミノ酸配列：
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＱＶＱＬＶＥＳＧＰＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＩＳＣＡＶＳＧＦＳＶＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＩＴＮＹＮＳＡＦＭＳＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＡＳＲＧＧＨＹＧＹＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴＫＧＥＩＶＭＴＱＴＰＡＴＬＳＶＳＡＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＴＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＳＡＳＮＲＹＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＹＧＴＥＦＴＦＴＩＳＳＶＱＳＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＤＹＳＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＴＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＭＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＲＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＡＳ。
【００３３】
配列番号１３に示されるアミノ酸配列：
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＨＬＫＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＳＧＭＥＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴＫＧＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＴＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＭＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＲＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＡＳ。
【００３４】
配列番号１４に示されるアミノ酸配列：
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＡＦＬＬＩＰＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＬＰＧＤＳＬＲＬＳＣＡＴＳＥＦＴＦＴＤＹＹＭＴＷＶＲＱＰＰＲＫＡＬＥＷＬＧＦＩＲＮＲＡＮＧＹＴＴＥＹＮＰＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＴＬＲＴＥＤＳＡＴＹＹＣＡＲＶＳＮＷＡＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴＫＧＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＫＮＮＧＮＴＦＬＨＷＹＬＱＫＳＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＹＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＩＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＴＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＭＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＲＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＡＳ。
【００３５】
第２の態様において、本出願は、第１の態様に記載のキメラ抗原受容体を含むウイルスベクターを提供する。
【００３６】
本出願によれば、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクター及び／又はレトロウイルスベクター、好ましくはレンチウイルスベクターである。
【００３７】
第３の態様において、本出願は、発現のための第１の態様に記載のキメラ抗原受容体をコードする核酸配列でウイルス形質導入されているＴ細胞を提供する。
【００３８】
本出願によれば、Ｔ細胞は、ウイルスベクター及び／又は真核性発現プラスミド、好ましくはウイルスベクターを介して形質導入されている。
【００３９】
本出願では、Ｔ細胞は優れた標的化された殺傷効果を有し、低用量の免疫因子を放出することができ、低毒性及び高免疫殺傷応答の特性を有する。
【００４０】
第４の態様において、本出願は、哺乳動物細胞を、第１の態様に記載のウイルスベクターとパッケージングヘルパープラスミドｐＮＨＰ及びｐＨＥＦ−ＶＳＶＧとで同時トランスフェクションすることによって得られる組換えレンチウイルスを提供する。
【００４１】
本出願によれば、哺乳動物細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞及びＴＥ６７１細胞からなる群のうちのいずれか１つ、又はそれらの少なくとも２つの組み合わせである。
【００４２】
第５の態様において、本出願は、第１の態様に記載のキメラ抗原受容体及び／又は第４の態様に記載の組換えレンチウイルスを含む組成物を提供する。
【００４３】
第６の態様において、本出願は、キメラ抗原受容体Ｔ細胞及び腫瘍治療薬の作製のための、第１の態様に記載のキメラ抗原受容体、第２の態様に記載のウイルスベクター、第３の態様に記載のＴ細胞、第４の態様に記載の組換えレンチウイルス、又は第５の態様に記載の組成物の使用を提供する。
【００４４】
好ましくは、腫瘍は、ＧＤ２抗原が特異的に発現されている腫瘍疾患であり、ＧＤ２抗原が特異的に発現されている腫瘍疾患は、神経芽細胞腫である。
【００４５】
従来技術と比較して、本出願は、以下の有益な効果を有する。
【００４６】
（１）本出願では、腫瘍表面抗原ＧＤ２に対するキメラ抗原受容体のＴ細胞の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインが特異的に遺伝子改変されている。改変されたキメラ抗原受容体は、ＧＤ２に特異的に結合した後により良好な応答効果を引き起こし、ＣＡＲ−Ｔ細胞は腫瘍に対してより強力な免疫応答を生ずる。
【００４７】
（２）本出願を実際に人体に投与した場合に、本出願のＣＡＲ−Ｔ細胞は、他のＧＤ２に基づくキメラ抗原受容体Ｔ細胞と比較してより高い安全性を示す。有害反応が起こっても、本出願のＣＡＲ−Ｔ細胞はアポトーシスを誘導するシグナルを含むため、アポトーシスを誘導する薬物によって本出願のＣＡＲ−Ｔ細胞を除去することもできる。
【００４８】
（３）本出願のＣＡＲ−Ｔ細胞の再注入後に、ｉｎ  ｖｉｖｏでＣＡＲ−Ｔの存在を長期間検出することができ、これがその長期的な効果を証明し、患者に長期の寛解をもたらすことができる。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】本出願のキメラ抗原受容体の合成遺伝子配列マップを示す図である。
【図２】安全かつ有効なレンチウイルスＣＡＲベクターの適用を示す図であり、ここで、タイプ１は実施例１で作製されたキメラ抗原受容体であり、タイプ２は実施例２で作製されたキメラ抗原受容体であり、タイプ３は実施例３で作製されたキメラ抗原受容体である。
【図３】３つのタイプのＧＤ２ＳｃＦｖ  ＣＡＲ  Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺傷結果を示す図であり、ここで、タイプ１は実施例１で作製されたキメラ抗原受容体であり、タイプ２は実施例２で作製されたキメラ抗原受容体であり、タイプ３は実施例３で作製されたキメラ抗原受容体である。
【図４】神経芽細胞腫を伴う患者からの腫瘍切片の免疫組織化学的染色の結果を示す図であり、ここで、図４（ａ）は腫瘍切片のネガティブコントロールであり、図４（ｂ）は陽性のＧＤ２発現を示す。
【図５】ＧＤ２−ＣＡＲＴ再注入後の神経芽細胞腫を伴う患者における毒性を示すグラフである。
【図６】ＧＤ２−ＣＡＲＴ再注入後のｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＡＲのコピー数の曲線を示すグラフである。
【図７】ＧＤ２−ＣＡＲＴ再注入後に神経芽細胞腫を伴う患者においてＢ−スキャン超音波検査法によって検出された腫瘍体積の変化の曲線を示すグラフである。
【図８】ＧＤ２−ＣＡＲＴ再注入の前（図８（ａ））及び後（図８（ｂ））に神経芽細胞腫を伴う患者において増強ＣＴによって検出された腹部腫瘤を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
本出願により採用された技術的手段及びその効果を更に説明するために、本出願の技術的な解決手段を、添付の図面及び具体的な実施形態を参照して以下で更に説明するが、本出願はそれらの実施形態の範囲に限定されない。
【００５１】
実施例において、具体的に示されていない技術又は条件は、当該技術分野の文献に記載される技術若しくは条件に従って又は製品の使用説明書に従って行われる。製造業者により示されていない使用される試薬又は機器は、多くの供給元から市販されている慣例的な製品である。
【実施例】
【００５２】
実施例１：キメラ抗原受容体の構築（Ｉ）
（１）図１に示される、分泌シグナルペプチド、ＧＤ２抗原結合ドメイン、ＣＤ２８細胞外ドメイン及び膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞内シグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、２Ａ配列、並びにカスパーゼ９ドメイン、すなわち、分泌−ＧＤ２ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−２Ａ−ＦＢＫＰ．Ｃａｓｐ９を、全遺伝子合成によって合成した。
【００５３】
キメラ抗原受容体のアミノ酸配列（配列番号１２）は、以下の通りである：
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＨＰＡＦＬＬＩＰＱＶＱＬＶＥＳＧＰＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＩＳＣＡＶＳＧＦＳＶＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＰＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＡＧＧＩＴＮＹＮＳＡＦＭＳＲＬＴＩＳＫＤＮＳＫＮＴＶＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＭＹＹＣＡＳＲＧＧＨＹＧＹＡＬＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴＫＧＥＩＶＭＴＱＴＰＡＴＬＳＶＳＡＧＥＲＶＴＩＴＣＫＡＳＱＳＶＳＮＤＶＴＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＳＡＳＮＲＹＳＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＹＧＴＥＦＴＦＴＩＳＳＶＱＳＥＤＦＡＶＹＦＣＱＱＤＹＳＳＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＴＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＭＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＲＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＡＳ。
【００５４】
実施例２：キメラ抗原受容体の構築（ＩＩ）
（１）分泌シグナルペプチド、ＧＤ２抗原結合ドメイン、ＣＤ２８細胞外ドメイン及び膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、２Ａ配列、並びにカスパーゼ９ドメイン、すなわち、分泌−ＧＤ２ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−２Ａ−ＦＢＫＰ．Ｃａｓｐ９を、全遺伝子合成によって合成した。
【００５５】
キメラ抗原受容体のアミノ酸配列（配列番号１３）は、以下の通りである：
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＥＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＥＫＰＧＡＳＶＫＩＳＣＫＡＳＧＳＳＦＴＧＹＮＭＮＷＶＲＱＮＩＧＫＳＬＥＷＩＧＡＩＤＰＹＹＧＧＴＳＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＫＳＴＳＴＡＹＭＨＬＫＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＶＳＧＭＥＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴＫＧＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＲＮＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＨＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＰＬＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＴＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＭＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＲＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＡＳ。
【００５６】
実施例３：キメラ抗原受容体の構築（ＩＩＩ）
（１）分泌シグナルペプチド、ＧＤ２抗原結合ドメイン、ＣＤ２８細胞外ドメイン及び膜貫通ドメイン、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン及び４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメイン、２Ａ配列、並びにカスパーゼ９ドメイン、すなわち、分泌−ＧＤ２ｓｃＦｖ−ＣＤ２８−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ−２Ａ−ＦＢＫＰ．Ｃａｓｐ９を、全遺伝子合成によって合成した。
【００５７】
キメラ抗原受容体のアミノ酸配列（配列番号１４）は、以下の通りである：
ＭＬＬＬＶＴＳＬＬＬＣＥＬＰＡＦＬＬＩＰＥＶＫＬＶＥＳＧＧＧＬＶＬＰＧＤＳＬＲＬＳＣＡＴＳＥＦＴＦＴＤＹＹＭＴＷＶＲＱＰＰＲＫＡＬＥＷＬＧＦＩＲＮＲＡＮＧＹＴＴＥＹＮＰＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＱＳＩＬＹＬＱＭＮＴＬＲＴＥＤＳＡＴＹＹＣＡＲＶＳＮＷＡＦＤＹＷＧＱＧＴＴＬＴＶＳＳＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＳＥＧＳＴＫＧＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＬＫＮＮＧＮＴＦＬＨＷＹＬＱＫＳＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＬＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＹＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＩＰＹＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＡＡＡＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳＡＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＶＶＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲＴＳＧＳＧＡＴＮＦＳＬＬＫＱＡＧＤＶＥＥＮＰＧＰＭＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＡＭＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＲＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳＡＳ。
【００５８】
実施例４：レンチウイルスのパッケージング
（１）２９３Ｔ細胞を、６ウェルプレートにおいて１×１０６細胞／ウェルの密度で１７時間〜１８時間培養することができる。
（２）１０％ＦＢＳを含有する６００μＬ／ウェルの新たな(fresh)ＤＭＥＭを添加した。
（３）滅菌遠心チューブに以下の試薬：各ウェルから収集した７５μＬのＤＭＥＭ、ヘルパーＤＮＡミックス（ｐＮＨＰ、ｐＨＥＦ−ＶＳＶ−Ｇ）、ＧＦＰレポータープラスミド、及びｐＴＹＦ  ＣＡＲ  ＤＮＡベクター（実施例１、実施例２又は実施例３より）を添加した後に、ボルテックスした。
（４）各ウェルの中心から７μＬのＳｕｐｅｒｆｅｃｔを取り、遠心チューブに加え、上下に５回ピペッティングすることにより混合し、室温で７分間〜１０分間放置した。
（５）各培養ウェルに、遠心チューブ内のＤＮＡ−Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ混合物を滴加し、ボルテックスにより混合した。
（６）３％のＣＯ２を含む３７℃のインキュベーター中で４時間〜５時間インキュベートした。
（７）培地を除去し、細胞を１．５ｍＬの培養培地ですすいだ後に、１．５ｍＬの培地を添加して、更にインキュベートした。
（８）プレートを５％のＣＯ２を含むインキュベーター中に戻し入れ、一晩インキュベートした。翌朝に、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現に基づきトランスフェクション効率を観察した。
【００５９】
実施例５：レンチウイルスの精製及び濃縮
１）ウイルスの精製
細胞片を１０００ｇで５分間の遠心分離により除去して、ウイルス上清を得た。ウイルス上清を低タンパク質結合フィルターで濾過した後に、ウイルスを小分けにして、−８０℃で貯蔵した。
【００６０】
典型的には、培地１ｍｌ当たり１０６〜１０８形質導入単位の力価のレンチウイルスベクターが、トランスフェクトされた細胞によって産生され得る。
【００６１】
２）フィルターを用いたレンチウイルスの濃縮
（１）バイオセーフティキャビネット内で、フィルターチューブをアルコールで消毒した後に、滅菌ＰＢＳで洗浄した。
（２）ウイルス上清をフィルターチューブに添加した後に、２５００ｇで３０分間にわたって又はウイルス容積が２０分の１〜５０分の１に減少するまで遠心分離した。
（３）フィルターチューブを振盪した後に、４００ｇで２分間遠心分離し、濃縮されたウイルスを収集カップ中に収集し、最終的に全てのチューブ内のウイルスを１つの遠心チューブに収集した。
【００６２】
実施例６：ＣＡＲ−Ｔ細胞の形質導入
活性化させたＴ細胞を成長因子ＩＬ−２、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含むＡＩＭ−Ｖ培地で接種し、１０μｇ／ｍＬのポリブレンを添加した。ＣＡＲ遺伝子を含む濃縮されたレンチウイルスを添加し、１００ｇの遠心力にて室温で１００分間遠心分離した後に、３７℃で２４時間インキュベートした。次いで、培養培地を添加し、４日間インキュベートした。次いで、細胞を採取し、計数し、患者に注入する前に２日間培養した。
【００６３】
図２に示される腫瘍の治療に対する効果により、ＣＡＲ−Ｔ細胞が腫瘍を効果的に減少させ、安全であることが示された。これらの効果をｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ及びｉｎ  ｖｉｖｏアッセイによって具体的に検証した。
【００６４】
実施例７：ＣＡＲ−Ｔ細胞を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺傷アッセイ
（１）ＧＤ２陽性腫瘍細胞系統に緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）を発現するレンチウイルスベクターを形質導入し、ＧＦＰを安定的に発現させた。
（２）ＧＤ２  ｓｃＦｖとは異なる非特異的Ｔ細胞又はＣＡＲ−Ｔ細胞を上記腫瘍細胞と一緒に３７℃、５％のＣＯ２のインキュベーター中で２４時間〜７２時間共培養した。
（３）腫瘍細胞の生存を蛍光顕微鏡法により観察した。死滅した腫瘍細胞が緑色蛍光タンパク質を発現しないという事実に基づいて、種々のＧＤ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ殺傷効率を評価した。これらの結果を図３に示した。
【００６５】
図３から、コントロールＴ細胞と比較して、３つのタイプのＳｃＦｖ  ＧＤ２−ＣＡＲ−Ｔ細胞が明らかな殺傷効果を有し、タイプ３のｓｃＦｖが最良の効果を示すことが分かり、こうして、本出願で使用されるベクター物質により、その後の臨床使用のために有効なＣＡＲ構造物が迅速にスクリーニングされることが確認された。
【００６６】
実施例８：ＣＡＲ−Ｔ細胞の治療効果
（１）神経芽細胞腫を伴う患者からの非染色の腫瘍切片を、免疫組織化学的染色によりＧＤ２発現が陽性であることを確認した。これらの結果は図４に示される通りであった。高いＧＤ２発現を伴う腫瘍は、図４（ａ）と図４（ｂ）との間で区別され得る。
（２）患者から白血球細胞を収集した。Ｆｉｃｏｌｌを用いた勾配密度遠心分離によって白血球細胞から末梢血単核リンパ球を分離し、Ｔ細胞をＣＤ３磁性ビーズでスクリーニングした。そのＴ細胞に抗ＣＤ２８抗体を添加して、Ｔ細胞を活性化させた。その後のＧＤ２−ＣＡＲＴの作製は、１×１０６個のＣＡＲＴ細胞／ｋｇ（体重）で実施した。
（３）患者を低用量化学療法で前治療した。前治療レジメンは、シクロホスファミド２５０ｍｇ／ｍ２を３日間及びフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２を３日間の投与であった。前治療をＣＡＲＴ注入の２４時間前に行い、３日間継続した（化学療法レジメンは患者の病状に応じて変更することができ、この例は列挙としてのみ使用される）。
（４）静脈内注射を介してＣＡＲ  Ｔ細胞を再注入した。
（５）注入後に、臨床医が患者を監視し、毒性応答を評価した。これらの結果を図５に示した。
【００６７】
ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞の安全性は図５における統計結果から分かり、ＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞は安全であった。注入後に、患者の２４％は有害反応を有さず、５０％がグレード１の有害反応を有し、２６％がグレード２の有害反応を有した。これらの有害反応には、発熱、倦怠感、発疹及び低血圧等が含まれ、これらは臨床において効果的に管理され得る。
【００６８】
（６）注入後に、患者から少量の末梢血を取得し、末梢血単核リンパ球を調製して、染色体ＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を抽出した。末梢血中のＣＡＲコピー数を、特異的なプライマーを使用したｑＰＣＲによって定量化した。これらの結果は図６に示される。
【００６９】
図６から分かるように、ＣＡＲ値はｉｎ  ｖｉｖｏで患者において注入の約２０日後にピークを迎え、約半年間体内で維持された。
【００７０】
（７）ＧＤ２−ＣＡＲＴ注入後の画像診断により腫瘍サイズを評価し、それらの結果を図７及び図８に示した。
【００７１】
図７から分かるように、ＧＤ２−ＣＡＲＴ注入２８日後に、Ｂ−スキャン超音波検査法によって検出された患者における腹部腫瘤及び縦隔腫瘤は、注入前と比較して約９５％減少し、半年間維持された。ここまで、患者の病状は依然として安定している。図８（ａ）−図８（ｂ）から分かるように、別の患者における腹部腫瘤を、注入の２ヶ月後に増強ＣＴでスキャンしたところ、腫瘤は、図８（ａ）に示される１．９ｃｍの長さ及び４．９ｃｍの幅の当初のサイズから、図８（ｂ）に示される１．９ｃｍの長さ及び３．２ｃｍの幅のサイズにまで減少した。
【００７２】
まとめると、本出願のＧＤ２−ＣＡＲ  Ｔ細胞は、他のキメラ抗原受容体及び他の腫瘍抗原よりも優れた効果を有すると共に、安全性及び長期的な効果を有し、再燃及び難治性のステージＩＶの神経芽細胞腫を伴う患者において優れた効果を達成した。
【００７３】
本出願人は、本出願の詳細な方法が上記実施例を通して説明されたと言明するが、本出願は上記の詳細な方法に限定されない。すなわち、本出願の実施が上記の詳細な方法によるものでなければならないことを意味するものではない。当業者は、原材料の同等物による置き換え又は本出願の生成物への補助成分の追加及び特定の方法の選択等を含む本出願のあらゆる改善が、本出願の保護範囲及び開示範囲に含まれるものと理解すべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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