(57)【要約】  新規Ｎ末端融合パートナー、前記融合パートナーおよび目的ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、ならびにこれを用いた目的ポリペプチドの生産方法に関する。本発明に係る新規融合パートナーを使用すれば、従来の融合パートナーに比べて、目的ポリペプチド（組換えポリペプチド）の収率を高めることができる。遺伝子組換え技術を利用して、分子量が比較的小さく、分解しやすいアミノ末端を有する目的ポリペプチドを作製する場合に特に有用である。また、本発明に係る融合パートナーを含む融合ポリペプチドは、宿主細胞内で封入体の形態で発現されるように誘導されることにより、宿主細胞のタンパク質分解酵素などから保護されて、目的ポリペプチドを安定的に生産することができるという利点がある。したがって、本発明は、従来の融合パートナーを使用した場合と比較して、向上した安定性及び収率を有する組換えペプチドの生産方法を提供することができる。【選択図】図１
2021511785.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記一般式（１）：
Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−（Ｚ）ｎ
（１）
（前記一般式（１）中、
Ｘａａ１〜Ｘａａ６は、互いに独立して、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）からなる群より選択され、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列の１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である）
で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナー、
目的ポリペプチド、および、
前記Ｎ末端融合パートナーと前記目的ポリペプチドとの間に位置するリンカー、を含む
ことを特徴とする融合ポリペプチド。
【請求項２】
前記Ｎ末端融合パートナーが、下記一般式（２）：
Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−（Ｚ）ｎ    （２）
（前記一般式（２）中、
Ｘａａ１は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である）
で表されるアミノ酸配列を含む
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項３】
前記Ｎ末端融合パートナーが、下記一般式（３）：
Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｘａａ２−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−（Ｚ）ｎ    （３）
（前記一般式（３）中、
Ｘａａ２は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である）
で表されるアミノ酸配列を含む
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｎ末端融合パートナーが、下記一般式（４）：
Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−（Ｚ）ｎ    （４）
（前記一般式（４）中、
Ｘａａ３は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である）
で表されるアミノ酸配列を含む
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｎ末端融合パートナーが、下記一般式（５）：
Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｘａａ４−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−（Ｚ）ｎ    （５）
（前記一般式（５）中、
Ｘａａ４は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である）
で表されるアミノ酸配列を含む
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項６】
前記Ｎ末端融合パートナーが、下記一般式（６）：
Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｘａａ５−Ｈｉｓ−（Ｚ）ｎ    （６）
（前記一般式（６）中、
Ｘａａ５は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である）
で表されるアミノ酸配列を含む
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項７】
前記Ｎ末端融合パートナーが、下記一般式（７）：
Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘａａ６−（Ｚ）ｎ    （７）
（前記一般式（７）中、
Ｘａａ６は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である）
で表されるアミノ酸配列を含む
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項８】
前記Ｎ末端融合パートナーが、配列番号８〜１３９のうちのいずれか一つのアミノ酸配列からなる
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項９】
前記Ｎ末端融合パートナーが、配列番号９、３１、５３、７５、９７または１１９のアミノ酸配列からなる
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１０】
前記リンカーが、親和性タグを含む
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１１】
前記リンカーが、プロテアーゼ認識配列を含む
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１２】
前記プロテアーゼ認識配列が、タバコエッチウイルスプロテアーゼ認識配列、エンテロキナーゼ認識配列、ユビキチンカルボキシ末端加水分解酵素認識配列、第Ｘａ因子認識配列、プリン認識配列およびこれらの組み合わせからなる群より選択される
請求項１１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１３】
前記目的ポリペプチドが、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４（ｈＰＴＨ  １−３４）、ヒト副甲状腺ホルモン１−８４（ｈＰＴＨ  １−３４）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）前駆体ペプチド、エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、テデュグルチド（ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ）、エカランチド（ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ）、ネシリチド（ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ）、インスリンおよびインスリン類似体からなる群より選択されるいずれか一つである
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１４】
前記目的ポリペプチドが、配列番号１５１、３４０、３４１、４８４、４８５、６２８、６３８、６４２および６５２のアミノ酸配列のうちのいずれか一つのアミノ酸配列からなる
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１５】
前記融合ポリペプチドが、配列番号１６０〜２９１、３４３〜４７４、４８７〜６１８、６３０〜６３２、６４４〜６４６、および６５４〜６５６のアミノ酸配列のうちのいずれか一つのアミノ酸配列からなる
請求項１に記載の融合ポリペプチド。
【請求項１６】
請求項１ないし１５のいずれかに記載の融合ポリペプチドをコードする
ことを特徴とするヌクレオチド。
【請求項１７】
前記ヌクレオチドが、配列番号２９４、２９５、４７８〜４８３、６２１〜６２７、６３５〜６３７、６４９〜６５１、および６５９〜６６１の塩基配列のうちのいずれか一つの塩基配列からなる
請求項１６に記載のヌクレオチド。
【請求項１８】
請求項１６に記載のヌクレオチドを含む
ことを特徴とする発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１８に記載の発現ベクターを含む
ことを特徴とする宿主細胞。
【請求項２０】
（ａ）請求項１９に記載の宿主細胞を培養するステップ、
（ｂ）前記宿主細胞において発現された融合ポリペプチドを精製するステップ、および、
（ｃ）前記精製された融合ポリペプチドを切断酵素と共に培養して目的ポリペプチドを回収するステップ
を含む
ことを特徴とする目的ポリペプチドの生産方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規Ｎ末端融合パートナー、前記融合パートナーおよび目的ポリペプチドを含む融合ポリペプチド、ならびにこれを用いた目的ポリペプチドの生産方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、遺伝子工学及びバイオテクノロジーの発達に伴い大腸菌、酵母、動植物細胞などを用いて有用な外来タンパク質が多く生産され、これらのタンパク質が医薬品などに幅広く使われている。具体的には、免疫調整剤、酵素阻害剤およびホルモンなどの医薬及び研究用のタンパク質や反応添加酵素などの産業用タンパク質の生産プロセス技術の開発及び産業化が進んでいる。
【０００３】
この中でも、遺伝子組換え技術は、様々なターゲットタンパク質の核酸を発現ベクターにクローニングして組換え発現ベクターを得、これを適当な宿主細胞に形質転換して培養することにより、ターゲットタンパク質（目的ポリペプチド）を生産する方法である。しかしながら、この技術は、宿主細胞内の分解酵素（例えば、プロテアーゼ（ｐｒｏｔｅａｓｅ）またはペプチダーゼ（ｐｅｐｔｉｄａｓｅ））によってターゲットタンパク質の全部又は一部が分解されて収率が低くなり、または、融合パートナーとして使用するペプチドのサイズが、製造しようとするターゲットタンパク質の大きさに比べて大きすぎて収率が著しく低下する問題がある。
【０００４】
したがって、遺伝子組換え技術を利用してターゲットタンパク質を大量生産したい場合には、ターゲットタンパク質を安定的に発現させながらも生産収率を向上させられる融合パートナーを開発することが重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明の目的は、組換えポリペプチドを生産するための、新規のアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーを提供することである。
【０００６】
本発明の他の目的は、前記Ｎ末端融合パートナーおよび目的ポリペプチドを含む融合ポリペプチドを提供することである。
【０００７】
本発明のまた他の目的は、前記融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド、前記ヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供することである。
【０００８】
本発明のまた他の目的は、前記融合ポリペプチドを用いた目的ポリペプチドの生産方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
上記目的を達成するために、本発明の一態様は、下記一般式（１）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナー、目的ポリペプチド、および、前記Ｎ末端融合パートナーと前記目的ポリペプチドとの間に位置するリンカーを含む、融合ポリペプチドを提供する：
Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−（Ｚ）ｎ（１）
（前記一般式（１）中、
Ｘａａ１〜Ｘａａ６は、互いに独立して、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ、）からなる群より選択され、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である）。
【００１０】
本発明の他の態様は、前記融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド、前記ヌクレオチドを含む発現ベクター、及び、前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１１】
本発明のさらに他の態様は、前記宿主細胞を培養するステップ、前記宿主細胞において発現された融合ポリペプチドを精製するステップ、および、前記精製された融合ポリペプチドを切断酵素と共に培養して目的ポリペプチドを回収するステップを含む、組み換えポリペプチドの生産方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明に係る新規融合パートナーを使用すれば、従来の融合パートナーに比べて、目的ポリペプチド（組換えポリペプチド）の収率を高めることができる。本発明は、遺伝子組換え技術を利用して、分子量が比較的小さく、分解しやすいアミノ末端を有する目的ポリペプチドを作製する場合に特に有用である。また、本発明に係る融合パートナーを含む融合ポリペプチドは、宿主細胞内で封入体の形態で発現されるように誘導されることにより、宿主細胞のタンパク質分解酵素などから保護されて、目的ポリペプチドを安定的に生産することができるという利点がある。したがって、本発明は、従来の融合パートナーを使用した場合と比較して、向上した安定性及び収率を有する組換えペプチドの生産方法を提供することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】組換え大腸菌において発現されたｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの全細胞画分を、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（菌株番号ＰＧ００１）、レーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（菌株番号ＰＧ００２）、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（菌株番号ＰＧ００３）、レーン４：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（菌株番号ＰＧ００４））。
【図２】組換え大腸菌において発現されたｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの全細胞画分を可溶性画分と不溶性画分とに分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンＳ：可溶性画分、レーンＩ：不溶性画分、レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（菌株番号ＰＧ００１）、レーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（菌株番号ＰＧ００２）、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（菌株番号ＰＧ００３）、レーン４：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（菌株番号ＰＧ００４））。
【図３ａ】ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４を大量生産するための流加式培養時の経時的な光学密度（ＯＤ６００）およびイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）投与時間を示すグラフである。
【図３ｂ】流加式培養により組換え大腸菌から生産されたＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４を時間ごとにサンプリングした後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図４】組換え大腸菌において発現されたＰＧ１５（Δ２−７）−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーン１：ＰＧ１５（Δ２−７）−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４、レーン２：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４）。
【図５】ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４内のＰＧ１５の２番目または３番目のアミノ酸残基をイソロイシン（Ｉ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）で置換したｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの変異体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図６】ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４内のＰＧ１５の４番目または５番目のアミノ酸残基をイソロイシン（Ｉ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）で置換したｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの変異体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図７】ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４内のＰＧ１５の６番目または７番目のアミノ酸残基をイソロイシン（Ｉ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）で置換したｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの変異体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図８ａ】クロマトグラフィーを用いて、不溶性画分内のＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドを精製した結果である（クロマトグラムにおいて、実線、破線、点線は、それぞれ２８０ｎｍの波長での吸光度、導電率（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）、溶出緩衝液の割合を示す）。
【図８ｂ】クロマトグラフィーを用いて精製したＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンｓ：精製前の試料、レーン２〜４：通過液画分、レーン８〜１１：溶出液画分）。矢印は、ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドを示す。
【図９ａ】クロマトグラフィーを用いて、不溶性画分内のＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドを精製した結果である（クロマトグラムにおいて、実線、破線、点線は、それぞれ２８０ｎｍの波長での吸光度、導電率（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）、溶出緩衝液の割合を示す）。
【図９ｂ】クロマトグラフィーを用いて精製したＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンｓ：精製前の試料、レーン２〜４：通過液画分、レーン８〜１１：溶出液画分）。矢印は、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドを示す。
【図１０ａ】クロマトグラフィーを用いて、不溶性画分内のＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドを精製した結果である（クロマトグラムにおいて、実線、破線、点線は、それぞれ２８０ｎｍの波長での吸光度、導電率（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）、溶出緩衝液の割合を示す）。
【図１０ｂ】クロマトグラフィーを用いて精製したＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンｓ：精製前の試料、レーン２〜４：通過液画分、レーン８〜１１：溶出液画分）。矢印は、ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドを示す。
【図１１】ＴＥＶプロテアーゼを用いて精製された各試料の融合ポリペプチドを切断した後、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンＣ：ＴＥＶプロテアーゼで処理していない試料、レーンＴ：ＴＥＶプロテアーゼで処理した試料、レーン１：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４、レーン２：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４、レーン３：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４）。
【図１２】ＴＥＶプロテアーゼを用いて精製されたＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドを切断した後、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ ：マーカータンパク質、レーンＣ：ＴＥＶプロテアーゼで処理していない試料、レーンＴ：ＴＥＶプロテアーゼで処理した試料）。
【図１３ａ】等電点の差を利用して、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドからＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶとｈＰＴＨ１−３４を分離した結果を示したものである（クロマトグラムにおいて、実線、破線、点線は、それぞれ２８０ｎｍの波長での吸光度、導電率（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）、溶出緩衝液の割合を示す）。
【図１３ｂ】等電点の差を利用して、分離したＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドの画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンｓ：精製前の試料、レーン１〜３：通過液画分、レーン５〜９：溶出液画分）。
【図１４ａ】平均疎水性度の差を利用して、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドからＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶとｈＰＴＨ１−３４を分離した結果を示したものである（クロマトグラムにおいて、実線、点線は、それぞれ２８０ｎｍの波長での吸光度と溶出緩衝液の割合を示す）。
【図１４ｂ】平均疎水性度の差を利用して、分離したＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４融合ポリペプチドの画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンｓ：精製前の試料、レーン１〜５：１ｓｔピーク画分、レーン１〜７：２ｎｄピーク画分）。
【図１５】ｈＰＴＨ  １−３４標準物質の分子量を測定した結果を示したものである。
【図１６】本発明により精製されたｈＰＴＨ  １−３４の分子量を測定した結果を示したものである。
【図１７】米国薬局方（ＵＳＰ）のｈＰＴＨ  １−３４同定基準試験法により、標準物質ｈＰＴＨ  １−３４と本発明に係る組換えｈＴＰＨ  １−３４の滞留時間及び純度を確認したグラフである。
【図１８】逆相クロマトグラフィーおよび米国薬局方（ＵＳＰ）のｈＰＴＨ  １−３４同定基準試験法のうちのペプチドマッピング方法により、標準物質ｈＰＴＨ  １−３４と本発明に係る組換えｈＴＰＨ  １−３４の同等性を分析した結果である。
【図１９】組換え大腸菌において生産された全タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００５）、レーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００６）、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００７）、レーン４：ＰＧ２２−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００８）、レーン５：ＰＧ２９−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００９）、レーン６：ＰＧ３６−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ０１０）、レーン７：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ０１１））。
【図２０】組換え大腸菌の全細胞画分を可溶性画分と不溶性画分とに分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンＴ：総画分、レーンＳ：可溶性画分、レーンＩ：不溶性画分、レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００５）、レーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００６）、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００７）、レーン４：ＰＧ２２−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００８））。
【図２１】組換え大腸菌の全細胞画分を可溶性画分と不溶性画分とに分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンＴ：総画分、レーンＳ：可溶性画分、レーンＩ：不溶性画分、レーン５：ＰＧ２９−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００９）、レーン６：ＰＧ３６−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ０１０）、レーン７：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ０１１））。
【図２２】ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ内のＰＧ４３の２番目または３番目のアミノ酸残基をイソロイシン（Ｉ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）で置換したＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの変異体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図２３】ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ内のＰＧ４３の４番目または５番目のアミノ酸残基をイソロイシン（Ｉ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）で置換したＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの変異体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図２４】ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ内のＰＧ４３の６番目または７番目のアミノ酸残基をイソロイシン（Ｉ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）で置換したＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの変異体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図２５】クロマトグラフィーを用いて、不溶性画分内のＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドを精製した結果である（クロマトグラムにおいて、実線、点線は、それぞれ２８０ｎｍの波長での吸光度及び溶出緩衝液の割合を示す）。
【図２６】クロマトグラフィーを用いて精製したＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンＳ：精製前の試料、ＦＴ：通過液画分、レーンＥ ：溶出液画分）。矢印は、ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１  Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドを示す。
【図２７】ＴＥＶプロテアーゼを用いて精製されたＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドを切断した後、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ ：マーカータンパク質、レーンＣ：ＴＥＶプロテアーゼで処理していない試料、レーンＴ：ＴＥＶプロテアーゼで処理した試料）。
【図２８】本発明により精製されたＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒの分子量を測定した結果を示したものである。
【図２９】組換え大腸菌において生産された全タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１２）、レーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ  （菌株番号ＰＧ０１３）、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１４）、レーン４：ＰＧ２２−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１５）、レーン５：ＰＧ２９−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１６）、レの６：ＰＧ３６−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１７）、レーン７：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１８））。
【図３０】組換え大腸菌の全細胞画分を可溶性画分と不溶性画分とに分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンＳ：可溶性画分、レーンＩ：不溶性画分、レーン５：ＰＧ２９−  Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１６）、レーン６：ＰＧ３６−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１７）、レーン７：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１８））。
【図３１】ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ内のＰＧ４３の２番目または３番目のアミノ酸残基をイソロイシン（Ｉ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）で置換したＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの変異体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図３２】ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ内のＰＧ４３の４番目または５番目のアミノ酸残基をイソロイシン（Ｉ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）で置換したＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの変異体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図３３】ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ内のＰＧ４３の６番目または７番目のアミノ酸残基をイソロイシン（Ｉ）、アスパラギン（Ｎ）、アルギニン（Ｒ）、アスパラギン酸（Ｄ）で置換したＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの変異体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である。
【図３４】クロマトグラフィーを用いて、不溶性画分内のＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２融合ポリペプチドを精製した結果である（クロマトグラムにおいて、実線、点線は、それぞれ２８０ｎｍの波長での吸光度と溶出緩衝液の割合を示す）。
【図３５】クロマトグラフィーを用いて精製したＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２融合ポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンＳ：精製前の試料、ＦＴ：通過液画分、レーン１  〜５：溶出液画分）。矢印は、ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２融合ポリペプチドを示す。
【図３６】ＴＥＶプロテアーゼを用いて精製されたＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドを切断した後、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ ：マーカータンパク質、レーンＣ：ＴＥＶプロテアーゼで処理していない試料、レーンＴ：ＴＥＶプロテアーゼで処理した試料）。
【図３７】本発明により精製されたＧＬＰ−２Ａ２Ｇの分子量を測定した結果を示したものである。
【図３８】組換え大腸菌において発現されたエカランチド融合ポリペプチドの全細胞画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０１９）、レーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２０）、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２１）、レーン４：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２２））。
【図３９】組換え大腸菌において発現されたエカランチド融合ポリペプチドの全細胞画分を可溶性画分と不溶性画分とに分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンＳ：可溶性画分、レーンＩ  ：不溶性画分、レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０１９）、レーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２０）、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２１）、レーン４：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２２））。
【図４０】組換え大腸菌において発現されたネシリチド融合ポリペプチドの全細胞画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２３）、レーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２４）、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２５）、レーン４：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２６））。
【図４１】組換え大腸菌において発現されたネシリチド融合ポリペプチドの全細胞画分を可溶性画分と不溶性画分とに分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンＳ：可溶性画分、レーンＩ  ：不溶性画分、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２５）、レーン４：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２６））。
【図４２】組換え大腸菌において生産された全タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４（菌株番号ＰＧ０２７）、レーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４  （菌株番号ＰＧ０２８）、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４（菌株番号ＰＧ０２９）、レーン４：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４（菌株番号ＰＧ０３０））。
【図４３】組換え大腸菌の全細胞画分を可溶性画分と不溶性画分とに分離した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンＳ：可溶性画分、レーンＩ：不溶性画分、レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−  ｈＰＴＨ１−８４（菌株番号ＰＧ０２７）、レーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４（菌株番号ＰＧ０２８）、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４（菌株番号ＰＧ０２９）、レーン４：ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−  ８４（菌株番号ＰＧ０３０））。
【図４４】クロマトグラフィーを用いて、不溶性画分内のＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４融合ポリペプチドを精製した結果である（クロマトグラムにおいて、糸色、点線は、それぞれ２８０ｎｍの波長での吸光度と溶出緩衝液の割合を示す）  。
【図４５】クロマトグラフィーを用いて精製したＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４融合ポリペプチドを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ：マーカータンパク質、レーンＳ：精製前の試料、ＦＴ：通過液画分、レーン１  〜５：溶出液画分）。矢印は、ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４融合ポリペプチドを示す。
【図４６】ＴＥＶプロテアーゼを用いて精製されたＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４融合ポリペプチドを切断した後、画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果である（レーンＭ ：マーカータンパク質、レーンＣ：ＴＥＶプロテアーゼで処理していない試料、レーンＴ：ＴＥＶプロテアーゼで処理した試料）。
【図４７】本発明により精製されたｈＰＴＨ１−８４の分子量を測定した結果を示したものである。
【図４８】菌株ＰＧ００１、ＰＧ００３、ＰＧ０３１、ＰＧ０３２及びＰＧ０３３において発現させたそれぞれの融合ポリペプチドの構造を図式化したものである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の一実施例は、下記一般式（１）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナー、目的ポリペプチド、および、前記Ｎ末端融合パートナーと前記目的ポリペプチドとの間に位置するリンカーを含む、融合ポリペプチドを提供する。
【００１５】
Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｘａａ２−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−Ｘａａ６−（Ｚ）ｎ    （１）
【００１６】
前記一般式（１）中、
Ｘａａ１〜Ｘａａ６は、互いに独立して、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、メチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、トリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）およびグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ、）からなる群より選択され、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である。
【００１７】
具体的には、前記Ｘａａ１〜Ｘａａ６は、互いに独立して、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、プロリン（Ｐｒｏ、Ｐ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）からなる群より選択されてもよい。
【００１８】
前記ｎが０の整数である場合、前記Ｎ末端融合パートナーは、７個のアミノ酸からなるものであってもよい。また、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個または３６個のアミノ酸であってもよい。具体的には、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる８個、１５個、２２個、２９個または３６個のアミノ酸であってもよい。
【００１９】
組換え微生物システムを利用して種々の目的ポリペプチドを生産する場合、そのターゲット物質の物性に応じて、宿主細胞内の酵素による分解、低発現レベル、不適切なタンパク質の折り畳みおよび／または低いｍＲＮＡ安定性などにより、収率が低下するおそれがある。例えば、従来の融合パートナーとして活用されているマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ：ｍａｌｔｏｓｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ）、グルタチオンＳ−転移酵素（ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ−Ｓ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）、チオレドキシン（ｔｈｉｏｒｅｄｏｘｉｎ）、ＳＵＭＯ、ユビキチンなどは、それぞれ３９７、２１６、１０６、１０１、７６個のアミノ酸を有するが、比較的低分子量の目的ポリペプチドなどを生産する際に収率が良くない問題があった。
【００２０】
これに対し、本発明に係る前記Ｎ末端融合パートナーは、７〜４３個のアミノ酸からなる、比較的分子量の小さいペプチドであって、これを適用してｈＰＴＨ  １−３４などの目的ポリペプチドを生産する場合、従来の融合パートナーを用いた場合と比較して、向上した収率を有するｈＰＴＨ  １−３４を得ることができる。例えば、組換え融合ポリペプチドにおけるｈＰＴＨ  １−３４の割合を、下記の表１に概略的に示した。
【００２１】
【表１】
2021511785.tif 000003
＊ｈＰＴＨ１−３４を基準としてリンカーを含めて計算
【００２２】
表１に示すように、従来の融合パートナーを用いた融合ポリペプチドにおけるｈＰＴＨ  １−３４の割合は、８％〜２９％にとどまるのに対し、本発明に係る融合パートナーが融合された融合ポリペプチドにおけるｈＰＴＨ  １−３４の割合は、３７％〜６２％であることが確認される。したがって、本発明の場合、同じ濃度の融合ポリペプチドから得られるｈＰＴＨ  １−３４の量が、従来の融合パートナーに比べて高いので、最終生産収率の向上を図ることができる。
【００２３】
また、本発明に係る融合パートナーは、融合ポリペプチドの不溶性発現を誘導することで、融合ポリペプチドが不溶性封入体として宿主細胞内に高濃度で蓄積できるようにする。したがって、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）などの宿主細胞内でプロテアーゼ及びペプチダーゼによって全部又は一部が分解あるいは切断されるおそれがある目的ポリペプチドを、高収率で得しやすいという利点がある。
【００２４】
例えば、前記Ｎ末端融合パートナーは、下記一般式（２）で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００２５】
Ｍｅｔ−Ｘａａ１−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−（Ｚ）ｎ    （２）
【００２６】
前記一般式（２）中、
Ｘａａ１は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である。
【００２７】
また、前記Ｘａａ１は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群より選択されてもよい。具体的には、前記Ｘａａ１は、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）からなる群より選択されてもよい。
【００２８】
前記ｎが０の整数である場合、前記Ｎ末端融合パートナーは、７個のアミノ酸からなるものであってもよい。また、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個または３６個のアミノ酸であってもよい。具体的には、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる８個、１５個、２２個、２９個または３６個のアミノ酸であってもよい。
【００２９】
一具体例として、前記一般式（２）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号８、３０、５２、７４、９６または１１８のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３０】
また、前記Ｘａａ１は、アスパラギン、セリン、トレオニン、システインおよびグルタミンからなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（２）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号９、３１、５３、７５、９７または１１９のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３１】
また、前記Ｘａａ１は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（２）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号１０、３２、５４、７６、９８または１２０のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３２】
また、前記Ｘａａ１は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。一具体例として、前記一般式（２）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号１１、３３、５５、７７、９９または１２１のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００３３】
また、前記Ｎ末端融合パートナーは、下記一般式（３）で表されるアミノ酸配列を含ものであってもよい。
【００３４】
Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｘａａ２−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−（Ｚ）ｎ    （３）
【００３５】
前記一般式（３）中、
Ｘａａ２は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である。
【００３６】
具体的には、前記Ｘａａ１は、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）からなる群より選択されてもよい。
【００３７】
前記ｎが０の整数である場合、前記Ｎ末端融合パートナーは、７個のアミノ酸からなるものであってもよい。また、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個または３６個のアミノ酸であってもよい。具体的には、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる８個、１５個、２２個、２９個または３６個のアミノ酸であってもよい。
【００３８】
また、前記Ｘａａ２は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群より選択されてもよい。
【００３９】
一具体例として、前記一般式（３）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号９、３１、５３、７５、９７または１１９のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００４０】
また、前記Ｘａａ２は、アスパラギン、セリン、トレオニン、システインおよびグルタミンからなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（３）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号１２、３４、５６、７８、１００または１２２のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００４１】
また、前記Ｘａａ２は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（３）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号１３、３５、５７、７９、１０１または１２３のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００４２】
また、前記Ｘａａ２は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。一具体例として、前記一般式（３）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号１４、３６、５８、８０、１０２または１２４のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００４３】
また、前記Ｎ末端融合パートナーは、下記一般式（４）で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００４４】
Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ｘａａ３−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−（Ｚ）ｎ    （４）
【００４５】
前記一般式（４）中、
Ｘａａ３は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である。
【００４６】
また、前記Ｘａａ３は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群より選択されてもよい。具体的には、前記Ｘａａ１は、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）からなる群より選択されてもよい。
【００４７】
前記ｎが０の整数である場合、前記Ｎ末端融合パートナーは、７個のアミノ酸からなるものであってもよい。また、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個または３６個のアミノ酸であってもよい。具体的には、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる８個、１５個、２２個、２９個または３６個のアアミノ酸であってもよい。
【００４８】
一具体例として、前記一般式（４）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号１５、３７、５９、８１、１０３または１２５のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００４９】
また、前記Ｘａａ３は、アスパラギン、セリン、トレオニン、システインおよびグルタミンからなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（４）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号１６、３８、６０、８２、１０４または１２６のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５０】
また、前記Ｘａａ３は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（４）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号９、３１、５３、７５、９７または１１９のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５１】
また、前記Ｘａａ３は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。一具体例として、前記一般式（４）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号１７、３９、６１、８３、１０５または１２７のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５２】
また、前記Ｎ末端融合パートナーは、下記一般式（５）で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００５３】
Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｘａａ４−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−（Ｚ）ｎ    （５）
【００５４】
前記一般式（５）中、
Ｘａａ４は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である。
【００５５】
また、前記Ｘａａ４は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群より選択されてもよい。具体的には、前記Ｘａａ１は、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）からなる群より選択されてもよい。 
【００５６】
前記ｎが０の整数である場合、前記Ｎ末端融合パートナーは、７個のアミノ酸からなるものであってもよい。また、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個または３６個のアミノ酸であってもよい。具体的には、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる８個、１５個、２２個、２９個または３６個のアミノ酸であってもよい。
【００５７】
一具体例として、前記一般式（５）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号８、４０、６２、８４、１０６または１２８のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５８】
また、前記Ｘａａ４は、アスパラギン、セリン、トレオニン、システインおよびグルタミンからなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（５）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号１９、４１、６３、８５、１０７または１２９のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００５９】
また、前記Ｘａａ４は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（５）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号２０、４２、６４、８６、１０８または１３０のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００６０】
また、前記Ｘａａ４は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。一具体例として、前記一般式（５）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号２１、４３、６５、８７、１９０または１３１のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００６１】
また、前記Ｎ末端融合パートナーは、下記一般式（６）で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００６２】
Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｘａａ５−Ｈｉｓ−（Ｚ）ｎ    （６）
【００６３】
前記一般式（６）中、
Ｘａａ５は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である。
【００６４】
また、前記Ｘａａ５は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群より選択されてもよい。具体的には、前記Ｘａａ１は、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）からなる群より選択されてもよい。 
【００６５】
前記ｎが０の整数である場合、前記Ｎ末端融合パートナーは、７個のアミノ酸からなるものであってもよい。また、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個または３６個のアミノ酸であってもよい。具体的には、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる８個、１５個、２２個、２９個または３６個のアミノ酸であってもよい。
【００６６】
一具体例として、前記一般式（６）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号２２、４４、６６、８８、１１０または１３２のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００６７】
また、前記Ｘａａ５は、アスパラギン、セリン、トレオニン、システインおよびグルタミンからなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（６）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号２３、４５、６７、８９、１１１または１３５のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００６８】
また、前記Ｘａａ５は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（６）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号２４、４６、６８、９０、１１２または１３４のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００６９】
また、前記Ｘａａ５は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。一具体例として、前記一般式（６）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号２５、４７、６９、９１、１１３または１３５のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００７０】
また、前記Ｎ末端融合パートナーは、下記一般式（７）で表されるアミノ酸配列を含むものであってもよい。
【００７１】
Ｍｅｔ−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｘａａ６−（Ｚ）ｎ    （７）
【００７２】
前記一般式（７）中、
Ｘａａ６は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、アスパラギン、セリン、トレオニン、システイン、グルタミン、アルギニン、リジン、ヒスチジン、アスパラギン酸またはグルタミン酸であり、
前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１〜３６個のアミノ酸であり、
前記ｎは、０または１の整数である。
【００７３】
また、前記Ｘａａ６は、イソロイシン、グリシン、アラニン、プロリン、バリン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンからなる群より選択されてもよい。具体的には、前記Ｘａａ１は、イソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）及びアスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）からなる群より選択されてもよい。
【００７４】
前記ｎが０の整数である場合、前記Ｎ末端融合パートナーは、７個のアミノ酸からなるものであってもよい。また、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、２６個、２７個、２８個、２９個、３０個、３１個、３２個、３３個、３４個、３５個または３６個のアミノ酸であってもよい。具体的には、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる８個、１５個、２２個、２９個または３６個のアミノ酸であってもよい。
【００７５】
一具体例として、前記一般式（７）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号２６、４８、７０、９２、１１４または１３６のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００７６】
また、前記Ｘａａ６は、アスパラギン、セリン、トレオニン、システインおよび文通り民からなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（７）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号２７、４９、７１、９３、１１５または１３７のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００７７】
また、前記Ｘａａ６は、アルギニン、リジンおよびヒスチジンからなる群より選択されてもよい。一具体例として、前記一般式（７）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号２８、５０、７２、９４、１１６または１３８のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００７８】
また、前記Ｘａａ６は、アスパラギン酸またはグルタミン酸であってもよい。一具体例として、前記一般式（７）で表されるアミノ酸配列からなるＮ末端融合パートナーは、配列番号２９、５１、７３、９５、１１７または１３９のアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００７９】
前記一般式（１）〜（７）において、前記ｎが０の整数である場合、前記Ｎ末端融合パートナーは、７個のアミノ酸からなるものであり得、本発明において７個のアミノ酸からなるＮ末端融合パートナーを「ＰＧ０７」と命名した。また、前記ｎが１の整数である場合、前記Ｚは、配列番号６６６で表されるアミノ酸配列における１番目のアミノ酸から始まる８個、１５個、２２個、２９個または３６個のアミノ酸であってもよい。この場合、前記Ｎ末端融合パートナーは、１５個、２２個、２９個、３６個または４３個のアミノ酸からなるものであり得、本発明において１５個、２２個、２９個、３６個または４３個のアミノ酸からなるＮ末端融合パートナーをそれぞれ順に「ＰＧ１５」、「ＰＧ２２」、「ＰＧ２９」、「ＰＧ３６」、「ＰＧ４３」と命名した。
【００８０】
前記Ｎ末端融合パートナーは、シャペロン１０（ｃｈａｐｅｒｏｎｅ  １０、ＧｒｏＥＳ  ｐｒｏｔｅｏｎ）のＮ末端誘導体であってもよい。また、前記Ｎ末端融合パートナーは、７〜４３個のアミノ酸を有するペプチドであって、配列番号１１９のＮ末端からＣ末端に向かって７〜４３個の連続したアミノ酸からなるものであってもよい。
【００８１】
具体的には、前記Ｎ末端融合パートナーは、配列番号８〜１３９のうちのいずれか一つのアミノ酸配列からなるものであってもよい。前記融合パートナーのアミノ酸数は、目的ポリペプチドの特性に応じて調節されてもよい。例えば、７個、８個、９個、１０個、１３個、１５個、１７個、２２個、２５個、２７個、２９個、３０個、３３個、３８個、４０個、４３個などであってもよい。一具体例として、前記Ｎ末端融合パートナーは、配列番号９、３１、５３、７５、９７または１１９で表されるアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００８２】
本発明のさらに他の態様は、前述したような新規Ｎ末端融合パートナー、目的ポリペプチド、および、前記Ｎ末端融合パートナーと前記目的ポリペプチドとの間に位置するリンカーを含む、融合ポリペプチドを提供する。
【００８３】
前記リンカーは、親和性タグを含んでもよい。本発明で使用される用語「親和性タグ」は、組換え融合ポリペプチドまたはこれをコードする核酸に導入されるペプチドまたは核酸配列であって、さまざまな目的のために使用でき、例えば、目的ポリペプチドの精製効率を高めるために使用できる。本発明で使用される親和性タグは、当業界に公知の任意の適切な物質を必要に応じて使用することができる。例えば、本発明に使用される親和性タグとしては、ポリヒスチジンタグ（配列番号７または８）、ポリリジンタグ（配列番号９または１０）またはポリアルギニンタグ（配列番号１１または１２）が挙げられる。
【００８４】
また、前記リンカーは、プロテアーゼ認識配列を含み得る。プロテアーゼとは、特定のアミノ酸配列を認識して、認識した配列内のペプチド結合や、その配列の最後のアミノ酸と融合されたポリペプチドの最初のアミノ酸とのペプチド結合を切断するタンパク質分解酵素である。本発明に係る融合ポリペプチドは、プロテアーゼ認識配列を有するリンカーを含むことにより、最終段階でポリペプチド精製の際、切断酵素認識配列を有するアミノ末端（親和性タグを使用した場合には親和性タグを含む）と、目的ポリペプチドのＮ末端とを分離させて目的ポリペプチドを回収することができる。
【００８５】
具体的には、前記プロテアーゼ認識配列は、タバコエッチウイルスプロテアーゼ認識配列、エンテロキナーゼ認識配列、ユビキチン加水分解酵素認識配列、第Ｘａ因子、プリンおよびこれらの組み合わせからなる群より選択される認識配列であってもよい。例えば、前記プロテアーゼ認識配列は、配列番号１４６〜１５０のアミノ酸配列のうちのいずれか一つを含み得る。
【００８６】
本発明で使用される用語「目的ポリペプチド」は、組換え生産システムを介して得られるポリペプチドを意味する。
【００８７】
前記目的ポリペプチドは、本発明に係るＮ末端融合パートナーとの融合により、向上した発現レベルを有するのみならず、不溶性封入体の形態で細胞内に蓄積されることにより、宿主細胞内の酵素による分解から保護されることができ、その結果、より高い収率で得られる。また、前記目的ポリペプチドは、配列番号１８〜２７のアミノ酸配列のうちのいずれか一つを含んでもよい。好ましくは、前記目的ポリペプチドは、２ｋＤａ〜１５ｋＤａ、２．５ｋＤａ〜１４ｋＤａ、３ｋＤａ〜１３ｋＤａ、３．５ｋＤａ〜１２ｋＤａ、４ｋＤａ〜１１ｋＤａの分子量を有するものであってもよい。
【００８８】
具体的には、前記目的ポリペプチドは、ヒト副甲状腺ホルモン１−３４（ｈＰＴＨ  １−３４）、ヒト副甲状腺ホルモン１−８４（ｈＰＴＨ  １−８４）、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）、リラグルチド（ｌｉｒａｇｌｕｔｉｄｅ）前駆体ペプチド、エキセナチド（ｅｘｅｎａｔｉｄｅ）、インスリン様成長因子−１（ＩＧＦ−１）、グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）、テデュグルチド（ｔｅｄｕｇｌｕｔｉｄｅ）、エカランチド（ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ）、ネシリチド（ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ）、インスリンおよびインスリン類似体からなる群より選択されるいずれか一つであってもよい。
【００８９】
前記ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ末端断片であるｈＰＴＨ  １−３４（Ｈｕｍａｎ  Ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  １−３４）は、甲状腺によって分泌される１１５個のアミノ酸（ａａ）のプレプロペプチド（ｐｒｅｐｒｏｐｅｐｔｉｄｅ）の形で発現され、信号配列及びプロペプチド除去後、血液に分泌されるペプチドであり、血液中のカルシウム濃度を上昇させる働きをし、骨形成を刺激することが知られている。ｈＰＴＨ  １−３４は、ヒト副甲状腺ホルモンのアミノ末端部位の３４個のアミノ酸を有するペプチドであって、テリパラチド（Ｔｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅ）とも呼ばれる。例えば、前記ｈＰＴＨ  １−３４ポリペプチドは、配列番号１５１のアミノ酸配列からなってもよく、前記アミノ酸配列は、配列番号２９２の塩基配列によってコードされてもよい。  
【００９０】
また、前記ヒト副甲状腺ホルモン１−８４（ｈＰＴＨ  １−８４）は、甲状腺によって分泌される１１５個のアミノ酸（ａａ）のプレプロペプチドから由来した８４個のアミノ酸を有するペプチドであり、血液中のカルシウム濃度を上昇させる働きをし、骨形成を刺激することが知られている。一般的に、ｈＰＴＨ  １−８４は、希少疾患である低カルシウム血症（ｈｙｐｏｃａｌｃｅｍｉａ）または副甲状腺機能低下症（ｈｙｐｏｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄｉｓｍ）の治療剤として使用される。例えば、前記ｈＰＴＨ  １−８４ポリペプチドは、配列番号６２８のアミノ酸配列からなってもよく、前記アミノ酸配列は、配列番号６３３の塩基配列によってコードされてもよい。前記目的ポリペプチドは、配列番号１５１、３４０、３４１、４８４、４８５、６２８、６３８、６４２および６５２のアミノ酸配列のうちのいずれか一つのアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【００９１】
また、前記グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）は、３１個のアミノ酸からなるポリペプチドである。これに関連し、リラグルチドは、その類似体であり、ＧＬＰ−１の２８番目のリジンがアルギニンで置換（Ｋ２８Ｒ）されており、２０番目のリジン残基のアミノ基に、パルミチン酸およびグルタミン酸からなるＮ−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄが結合されている形態を有する。リラグルチドは、第２型糖尿病または肥満の治療剤として使用され得る。一般的に、Ｎ−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄが結合されていないリラグルチド前駆体ペプチド（ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ）を生産し、その２０番目のリジン残基にＮ−Ｐａｌｍｉｔｏｙｌ−Ｌ−ｇｌｕｔａｍｉｃ  ａｃｉｄを結合させる工程によりリラグルチドを生産することができる（Ｄｕｎｗｅｂｅｒ、Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ。２００７）。例えば、前記ＧＬＰ−１ポリペプチドは、配列番号３４０のアミノ酸配列からなってもよく、前記アミノ酸配列は、配列番号４７５の塩基配列によってコードされてもよい。また、前記リラグルチド前駆体ペプチド（ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ）は、配列番号３４１のアミノ酸配列からなってもよく、前記アミノ酸配列は、配列番号４７６の塩基配列によってコードされてもよい。
【００９２】
また、前記グルカゴン様ペプチド−２（ＧＬＰ−２）は、３３個のアミノ酸からなるポリペプチドである。これに関連し、テデュグルチドは、その類似体であり、ＧＬＰ−２の２番目のアラニンがグリシンで置換（Ａ２Ｇ）されている形態を有する。テデュグルチドは、希少疾患である短腸症候群（Ｓｈｏｒｔ  Ｂｏｗｅｌ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ）、化学療法誘発性下痢（Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ−Ｉｎｄｕｃｅｄ  Ｄｉａｒｒｈｅａ）および腸管皮膚瘻（Ｅｎｔｅｒｏｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ｆｉｓｔｕｌａ）の治療剤として使用され得る。例えば、前記ＧＬＰ−２ポリペプチドは、配列番号４８４のアミノ酸配列からなってもよく、前記アミノ酸配列は、配列番号６１９の塩基配列によってコードされてもよい。また、前記テデュグルチドポリペプチド（ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ）は、配列番号４８５のアミノ酸配列からなってもよく、前記アミノ酸配列は、配列番号６２０の塩基配列によってコードされてもよい。
【００９３】
また、前記エカランチドは、６０個のアミノ酸からなるポリペプチドであって、ヒト血漿カリクレイン（ｋａｌｌｉｋｒｅｉｎ）を阻害することができ、結果として、高分子量を有するカリクレインがブラジキニン（Ｂｒａｄｙｋｉｎｉｎ）に変換されることを阻害する働きをする。エカランチドは、希少疾患である遺伝性血管性浮腫（Ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ  Ａｎｇｉｏｅｄｅｍａ）の治療剤として使用され得る。例えば、前記エカランチドポリペプチドは、配列番号６４２のアミノ酸配列からなってもよく、前記アミノ酸配列は、配列番号６４７の塩基配列によってコードされてもよい。
【００９４】
また、前記ネシリチドは、３２個のアミノ酸からなるポリペプチドであって、ヒト心室心筋（ｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉｕｍ）によって分泌されるB型ナトリウム利尿ペプチド（ｎａｔｒｉｕｒｅｔｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅ）である。ネシリチドは、うっ血性心不全の治療剤として使用され得る。例えば、前記ネシリチドポリペプチドは、配列番号６５２のアミノ酸配列からなってもよく、前記アミノ酸配列は、配列番号６５７の塩基配列によってコードされてもよい。
【００９５】
また、前記エキセナチドポリペプチドは、配列番号６３８のアミノ酸配列からなってもよく、前記アミノ酸配列は、配列番号６３９の塩基配列によってコードされてもよい。また、前記インスリン類似成長因子−１（ＩＧＦ−１）ポリペプチドは、配列番号６４０のアミノ酸配列からなってもよく、前記アミノ酸配列は、配列番号６４１の塩基配列によってコードされてもよい。
【００９６】
一方、本発明に係る融合ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む融合パートナーと目的ポリペプチドとが互いに異なる等電点を有することにより、目的ポリペプチドが容易に高純度で精製され得る。タンパク質の等電点（ｉｓｏｅｌｅｃｔｒｉｃ  ｐｏｉｎｔ：ｐＩ）は、タンパク質分子の電荷の総和が０になるｐＨであり、等電点に基づいてタンパク質が分離され得る。
【００９７】
例えば、本発明の配列番号８〜１３９のアミノ酸配列を有するＮ末端融合パートナーのｐＩ値は、９．５〜１０．５であり得る。具体的には、配列番号９、３１、５３、７５、９７または１１９のアミノ酸配列を有するＮ末端融合パートナーのｐＩ値は、それぞれ９．５２、１１．７２、１０．２７、１０．２７、１０．４３、１０．４２であり得る。
【００９８】
また、目的ポリペプチドの例示としてのｈＰＴＨ  １−３４、ｈＰＴＨ  １−８４、リラグルチド前駆体ペプチド、テデュグルチド、エカランチド、ネシリチドのｐＩ値は、それぞれ８．２９、９．１０、５．５３、４．１７、５．５８、  １０．９５である。つまり、目的ポリペプチドのｐＩ値とＮ末端融合パートナー及びこれを含む融合パートナーのｐＩ値は、実質的に異なる。したがって、イオン交換クロマトグラフィー、等電点沈殿法などの方法を用いて、融合パートナーから目的ポリペプチドを容易に精製することができる。
【００９９】
また、前記融合パートナー、リンカーおよび目的ポリペプチドを含む新規な融合ポリペプチドは、配列番号１６０〜２９１、３４３〜４７４、４８７〜６１８、６３０〜６３２、６４４〜６４６、および６５４〜６５６のアミノ酸配列のうちのいずれか一つのアミノ酸配列からなるものであってもよい。
【０１００】
本発明の他の態様は、前述した融合ポリペプチドをコードするヌクレオチドを提供することができ、例えば、１６０〜２９１、３４３〜４７４、４８７〜６１８、６３０〜６３２、６４４〜６４６、および６５４〜６５６のアミノ酸配列のうちのいずれか一つをコードすることができる。前記ヌクレオチドは、配列番号２９４、２９５、４７８〜４８３、６２１〜６２７、６３５〜６３７、６４９〜６５１、および６５９〜６６１の塩基配列のうちいずれか一つの塩基配列からなるものであってもよい。
【０１０１】
本発明のさらに他の態様は、前述した融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド分子を含む発現ベクターを提供する。本発明で使用される用語「ベクター」は、宿主細胞に導入されて宿主細胞の遺伝体内に組換え及び挿入され得る。または、前記ベクターは、エピソームベクターであり、自発的に複製できるヌクレオチド配列を含む核酸の手段として理解される。前記ベクターは、線形核酸、プラスミド、ファージミド、コースミド、ＲＮＡベクター、ウイルスベクターおよびその類似体を含む。ウイルスベクターの例としては、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。また、前記プラスミドは、抗生物質耐性遺伝子などの選別マーカーを含み得、プラスミドを維持する宿主細胞は、選択的な条件の下で培養され得る。
【０１０２】
本発明で使用される用語「宿主細胞」は、組換え発現ベクターが導入される原核細胞または真核細胞を指す。本発明で使用される用語「形質導入」は、当業界に公知の技術を用いて細胞内に核酸（例えば、ベクター）を導入することを指す。
【０１０３】
本発明の他の態様は、前記発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。前記宿主細胞は、本発明の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチドが含まれるように形質転換されて、目的ポリペプチドの発現および／または分泌に使用され得る。本発明に使用できる好適な宿主細胞は、大腸菌細胞、不死のハイブリドーマ細胞、ＮＳ／０骨髄腫細胞、２９３細胞、中国のハムスターの卵巣細胞（ＣＨＯ  ｃｅｌｌ）、ＨｅＬａ細胞、ヒト羊水由来細胞（ＣａｐＴ  ｃｅｌｌ）またはＣＯＳ細胞を含む。例えば、本発明の融合ポリペプチドの発現に使用された宿主菌株は、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であり、前記遺伝子およびこれらの使用方法は、当業界に公知されている。
【０１０４】
本発明のさらに他の態様は、（ａ）前述した宿主細胞を培養するステップ、（ｂ）宿主細胞において発現された融合ポリペプチドを精製するステップ、および、（ｃ）前記精製された融合ポリペプチドを切断酵素と共に培養して目的ポリペプチドを回収するステップを含む、目的ポリペプチド（組換えポリペプチド）の生産方法を提供する。
【０１０５】
前記（ａ）ステップでは、本発明の融合ポリペプチドをコードするヌクレオチドを有する発現ベクターを含む宿主細胞を培養する。
【０１０６】
このとき、前記宿主細胞は、任意の発酵法により培養することができる。例えば、回分式、流加式、半連続式および連続式の発酵法を採用することができる。実施例において、発酵培地は、複合培地もしくは限定培地から選択される。特定の実施例では、限定培地が選択される。限定培地は、低レベルのアミノ酸、チアミンなどのビタミン又は他の成分により補充され得る。本発明の方法において有用な培養手順及び無機塩培地についての詳細は、文献（Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ、Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ。、１９９１）に記載されている。
【０１０７】
例えば、融合ポリペプチドの生産は、発酵器培養により達成することができる。例えば、２Ｌの限定培地を含む発酵器において３７℃で培養し、塩酸やアンモニアを添加してｐＨ値を６．８に維持することができる。溶存酸素のレベルは、攪拌速度及び発酵器内の空気流量（ａｉｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：空気流速）を増やすことにより、または必要に応じて純酸素を注入するにより、可能な限り高く維持することができる。発酵器内で細胞を高濃度に培養するために、細胞の培養中にグルコースやグリセロールを含む注入溶液（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を培養液に加えることができる。
【０１０８】
また、前記条件を維持したまま、例えば、誘導のための目標培養液の光学密度（ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）が波長６００ｎｍで特定値の光学密度（Ａ６００）に達すると、イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（Ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ  β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：ＩＰＴＧ）を添加して融合ポリペプチドの発現が開始される。誘導時に、細胞の光学密度、ＩＰＴＧ濃度、ｐＨ、温度、溶存酸素レベルをそれぞれ変化させることで、最適な発現条件を決定することができる。また、誘導時に、細胞の光学密度は、Ａ６００  ３０〜３００の範囲で変化させることができる。さらに、ＩＰＴＧ濃度は０．０１ｍＭ〜１．０ｍＭの範囲で、ｐＨは５．５〜７．５の範囲で、温度は１５℃〜３７℃の範囲で、空気流量は１ｖｖｍ（空気１Ｌ／培地１Ｌ／分）〜５ｖｖｍの範囲で、それぞれ変化させることができる。誘導後４〜４８時間後に、発酵器からの培養液を遠心分離して細胞を回収し、細胞ペレットを−８０℃で冷凍することができる。培養液試料は、組換え融合ポリペプチドの発現程度を分析するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥなどの方法で分析することができる。
【０１０９】
一方、温度１５〜４０℃およびｐＨ約５．５〜約７．５の条件下で、宿主細胞を培養することができる。Ｌａｃ系プロモーターを有する発現構造物の使用時に、ＩＰＴＧを約０．０１〜約１．０ｍＭの最終濃度で培養物に添加して、発現を誘導することができる。
【０１１０】
誘導剤を添加した後、培養液を一定期間、例えば約１２時間培養することができ、その間に組換えタンパク質が発現される。誘導剤を添加した後、培養液を約４〜４８時間培養することができる。
【０１１１】
細胞培養液を遠心分離して、細胞が存在しない培地（上清液）を除去し、細胞を回収することができる。例えば、細胞培養液を１２，０００ｒｐｍの条件で３０分間（４℃）遠心分離して上清液を除去することで、不溶性画分を得ることができる。遠心分離により得られた不溶性画分に不溶性封入体の形態で存在する組換え融合ポリペプチドの可溶化のために、不溶性画分を、尿素や塩酸グアニジンなどのカオトロピック剤（ｃｈａｏｔｒｏｐｉｃ  ａｇｅｎｔ）を含む緩衝液で再懸濁することができる。実施例において、細胞を、高圧機械的細胞破砕装置（例えば、マイクロフルイダイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ））を用いて破壊する。再懸濁された細胞を、例えば、超音波処理を用いて破壊することができる。、細胞を溶解するのに適した、当業界に公知の任意の方法を用いて、細胞中に蓄積された封入体を回収することができる。例えば、実施例では、化学的および／または酵素的細胞溶解試薬、例えば細胞壁溶解酵素（ｌｙｓｏｚｙｍｅ）及びＥＤＴＡを使用することができる。
【０１１２】
前記（ｂ）ステップでは、前記（ａ）ステップで培養した宿主細胞において発現された融合ポリペプチドを精製する。
【０１１３】
このとき、不溶性画分には、不溶性封入体の形態で発現された融合ポリペプチドが主に存在する。不溶性画分に存在する封入体の可溶化は、カオトロピック剤を含む変性条件下で行うことができる。封入体可溶化条件は、カオトロピック剤を含む緩衝液の使用を含み得、封入体可溶化緩衝液は、カオトロピックゼロ尿素または塩酸グアニジン、リン酸ナトリウムまたはトリス緩衝液、および塩化ナトリウムを含み得る。また、（アフィニティークロマトグラフィー（親和性クロマトグラフィー）を固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）により行う場合、封入体可溶化緩衝液はイミダゾールを含む。実施例において、封入体可溶化緩衝液は、４〜１０Ｍの尿素または３〜８Ｍの塩酸グアニジンを含み得る。また、封入体可溶化緩衝液は、５〜１００ｍＭのリン酸ナトリウムまたはトリス（ｐＨ７〜９）を含み得る。封入体可溶化緩衝液は、０〜１Ｍの塩化ナトリウムを含み得る。また、ＩＭＡＣのための封入体可溶化緩衝液は、０〜５０ｍＭのイミダゾールを含み得る。このとき、封入体可溶化緩衝液は、８Ｍの尿素、２０ｍＭのトリス、５００ｍＭの塩化ナトリウム、５０ｍＭのイミダゾール、ｐＨ７．４を含み、溶解された細胞の遠心分離により得られた不溶性画分を再懸濁することにより、不溶性画分の融合ポリペプチドの封入体を可溶化することができる。
【０１１４】
例えば、封入体可溶化緩衝液で不溶性画分の封入体を可溶化する場合、２〜８℃の温度で約１〜６時間振とう培養した後、１２，０００ｒｐｍ（１２，０００×ｇ）の条件で３０分間（４℃）遠心分離して、不溶性画分に存在する破砕細胞の残骸を除去することで、可溶化された融合ポリペプチドを含む上清液を得る。上清液は、デプスフィルター（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ）および膜フィルターで濾過して不溶性および固形成分を除去することで、精製用カラムに注入できるようにする。
【０１１５】
また、不溶性封入体の形態で発現された後、可溶化された組換え融合ポリペプチドまたは目的ポリペプチドは、サイズ排除、陰イオンまたは陽イオン交換、疎水性相互作用、またはアフィニティークロマトグラフィー方法により他の蛋白質及び細胞残骸から分離したり精製したりすることができる。
【０１１６】
例えば、本発明の融合ポリペプチドは、ポリヒスチジンタグ（６−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ）が含まれているので、Ｎｉ−ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦが充填されているＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ  ５ｍＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製することができる。可溶化された組換え融合ポリペプチドを、ＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ２５クロマトグラフィーシステムに装着されたＳ９試料ポンプを用いて、封入体可溶化緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾールゾル、ｐＨ７．４）で平衡化されたＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ５ｍＬカラム内に注入し、封入体可溶化緩衝液で洗浄した。その後、溶出緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）の割合を段階的に１００％まで徐々に増やして、カラムに結合している融合ポリペプチドを溶出させ、画分を収集することができる。
【０１１７】
前記（ｃ）ステップでは、前述した方法で精製された融合ポリペプチドを切断酵素と共に培養して目的ポリペプチドを回収する。
【０１１８】
このとき、融合ポリペプチドは切断酵素によって適切に切断され、これにより、目的ポリペプチドを適切な形態に遊離することができる。精製された融合ポリペプチド画分には８Ｍの尿素が添加されているので、切断酵素の変性を防ぐために、希釈緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）を用いて尿素濃度を１Ｍに希釈することが望ましい。融合ポリペプチドは、精製後に尿素濃度を１Ｍに希釈し、２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４、１Ｍ尿素、６２．５ｍＭ塩化ナトリウム、６２．５ｍＭイミダゾールを含有する緩衝液に存在することができる。組換え融合ポリペプチドは、切断酵素と反応して、親和性タグ及び切断酵素認識配列を有するアミノ末端融合パートナーと目的ポリペプチドとに切断される。プロテアーゼ切断方法としては、当業界に公知の、メーカーの指示書を含む文献に記載の任意の適切な方法を用いることができる。好ましくは、精製後、尿素濃度を１Ｍに希釈した融合ポリペプチドに、ＴＥＶプロテアーゼを添加して最終濃度５００ｎＭとし、室温で６時間以上切断反応を行う。例えば、ＴＥＶプロテアーゼは、組換え融合ポリペプチドの約６０％〜約１００％を切断する。
【０１１９】
組換え融合ポリペプチドまたは目的ポリペプチドの収率は、当業者に公知の方法、例えば、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ：ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｄｅｃｙｌ  ｓｕｌｆａｔｅ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ  ｇｅｌ  ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）またはウエスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）分析によって決定される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより電気泳動されたゲル（ｇｅｌ）は、染色（ｓｔａｉｎｉｎｇ）、脱色（ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ）、デジタル映像化過程を経て、組換え融合ポリペプチドまたは目的ポリペプチドのおおよそ定量的および定性的分析が可能である。
【０１２０】
また、精製された融合ポリペプチドまたは目的ポリペプチドの濃度は、当業界に公知及び文献に記載の方法による吸光度分光法によって決定される。
【０１２１】
精製された融合ポリペプチドまたは目的ポリペプチドの収率又は純度を決定するためのウエスタンブロット分析は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に移し、目的ポリペプチドに特異的な抗体を用いる、当業界に公知の適切な方法により行うことができる。実施例では、目的ポリペプチドの純度を測定するための方法として、ＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ  ａｓｓａｙ）方法を用いることができる。
【０１２２】
精製された融合ポリペプチドまたは目的ポリペプチドの収率は、培養液の単位体積当たり精製された融合ポリペプチドまたは目的ポリペプチドの量（例えば、培養液の体積に対するタンパク質の重量の比率、すなわち、ｇ又はｍｇのタンパク質／ｌ（リットル）の培養液体積）、融合ポリペプチドの百分率（例えば、組換え融合ポリペプチドの量／全細胞タンパク質（ｔｏｔａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ）の量）ｍ、および乾燥菌体量（ｄｒｙ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔ）に対する百分率または比率を含む。本明細書に記載のポリペプチドの収率の測定は、完全な形態で発現された当該ポリペプチドの量に基づく。
【０１２３】
収率が、培養液の単位体積あたりの精製された融合ポリペプチドまたは目的ポリペプチドの量で表現される場合、培養細胞の密度又は濃度は、収率を決定する際に考慮に入れられる。
【０１２４】
また、切断酵素による切断後に得られた目的ポリペプチドの収率は、約０．５４ｇ／Ｌ〜約１３．５ｇ／Ｌであり得る。本発明において、目的ポリペプチドの収率は、５ｍｌ〜２Ｌ以上のスケールで約０．５４ｇ／Ｌであり得る。
【０１２５】
本発明の具体例は、配列番号１のアミノ酸配列を有する融合パートナーと組換えされた融合ポリペプチドを用いて目的ポリペプチドを得ることにより、目的ポリペプチドが細胞内で酵素によって分解されたり、不適切な折り畳み（ｆｏｌｄｉｎｇ）を示したりするなどの問題を最小限に抑えることにより、目的ポリペプチドを高収率で生産する方法を提供することができる。具体的な製造方法の一例は、実施例にて詳述する。
【実施例】
【０１２６】
以下、本発明を下記の実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、下記の実施例は、本発明を例示するものに過ぎず、本発明の範囲が下記の実施例によって限定されるものではない。
【０１２７】
実施例１．ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの製造および生産
実施例１．１．ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチド発現プラスミドの作製
ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの遺伝子は、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ｏｖｅｒｌａｐ  ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ：ＯＥ−ＰＣＲ）法を用いて合成した。このとき、前記ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドには、アミノ末端融合パートナーとしての、ＰＧ０７（配列番号９）、ＰＧ１５（配列番号３１）およびＰＧ４３（配列番号１１９）のうちのいずれか一つと、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびｈＰＴＨ  １−３４のアミノ酸配列（配列番号１５１）が含まれている。
【０１２８】
対照群として使用されたｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチド（Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４）には、アミノ末端融合パートナーが含まれておらず、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびｈＰＴＨ  １−３４のアミノ酸配列（配列番号１５１）が含まれている。各融合ポリペプチドの遺伝子は、制限酵素ＮｄｅＩ、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの認識配列と１つの終止コドンを含む。前記ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２９４〜２９６に対応し、対照群は、配列番号２９３に対応する。
【０１２９】
下記表２に記載のｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチド発現プラスミドｐＳＧＫ４１９、ｐＳＧＫ４７６、ｐＳＧＫ４７７およびｐＳＧＫ４７８を作製するために、ＯＥ−ＰＣＲにより合成されたｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチド遺伝子断片を、ＮｄｅＩ及びＸｈｏＩ制限酵素を用いて切断し、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレータ及びＬａｃＩ遺伝子を含めてＩＰＴＧによる発現調節が可能な発現ベクターｐＥＴ２６ｂにクローニングした。
【０１３０】
【表２】
2021511785.tif 000004
【０１３１】
作製したｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチド発現プラスミドは、ＤＮＡ塩基配列の確認により正確なクローニングの有無が確認された。作製したｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチド発現プラスミドを用いて、塩化カルシウムを使用した化学的方法により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質導入された大腸菌は、カナマイシン（ｋａｎａｍｙｃｉｎ）が５０μｇ／ｍｌの濃度で含まれているＬＢ固体培地においてコロニーを形成した。形質転換された大腸菌を、それぞれカナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地に培養した後、５０％グリセロールを培養液と同じ容量（体積）で添加して細胞ストック（ｃｅｌｌ  ｓｔｏｃｋ）を作成し、これを温度−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０１３２】
実施例１．２．形質転換された細胞の培養及びｈＰＴＨ  １−３４の発現
−８０℃で保管されたｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質転換された大腸菌の細胞ストックを室温で溶かした後、５０μｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地５ｍｌを含む試験管に添加して、３７℃の振とう培養器で１２時間種菌培養した。種菌培養された大腸菌２ｍｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地２００ｍｌを含むフラスコに添加して、３７℃の振とう培養器で培養した。約３時間培養後、細胞の光学密度（ＯＤ６００）が約１．０になったとき、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように添加して、ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現を誘導した。発現誘導４時間後に光学密度を測定することで、細胞の光学密度を測定した。
【０１３３】
実施例１．３．発現レベルの比較分析のための試料の製造
発現誘導された細胞の光学密度が１０．０になるように細胞を濃縮し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で再懸濁した後、超音波細胞破砕機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を用いて細胞を破砕した。破砕された細胞は、全細胞画分として標識した。細胞破砕液は、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清液を回収し、可溶性画分として標識した。不溶性画分は、５００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で超音波細胞破砕機を用いて再懸濁し、不溶性画分として標識した。
【０１３４】
実施例１．４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により生産されたｈＰＴＨ  １−３４の確認
５０μｌの全細胞、可溶性および不溶性画分を、それぞれ５０μｌの２倍濃縮されたＳＤＳ試料緩衝液（ＳＤＳサンプルバッファー  ２×ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ、Ｓｉｇｍａ）に混合した後、９５℃で５分間加熱して、各試料のタンパク質を変性させた。試料中の変性タンパク質は、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＴＡＮＫ緩衝液を用いて、分子量サイズに応じて、ゲル内で分離できるようにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを、クマシーブリリアントブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｂｌｕｅ）Ｒ−２５０を含む染色緩衝液で染色した後、脱色緩衝液で脱色することで、染色されたタンパク質のみが見えるようにした。その結果を、図１および図２に示した。
【０１３５】
図１を参照すると、対照群である配列番号１のアミノ酸配列を含む融合パートナーが含まれていないＨ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４（５．９ｋＤａの分子量）のバンドは、本願発明に係るｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドと比較して、最も低い発現レベルを示した。本発明に係る融合パートナーであるＰＧ７、ＰＧ１５及びＰＧ４３が融合されたｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドであるＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４（６．９ｋＤａの分子量）、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４（７．９ｋＤａの分子量）及びＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４（１０．６ｋＤａの分子量）の発現レベルは、対照群（Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４）に比べて増加したことが確認された。濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）分析により、ＰＧ７、ＰＧ１５及びＰＧ４３の中でＰ１５の融合によるＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４の発現レベルは、すべてのｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの中で最も高いことが確認された。
【０１３６】
また、図２を参照すると、対照群を含むすべてのｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドは、可溶性画分では観察されず、すべて不溶性画分で観察されることがわかる。
【０１３７】
実施例１．５．ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４の大量生産のための流加式培養
文献（Ｒｉｅｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓｃｈｕｌｚ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１）に記載の培地組成を用いて、２Ｌの限定培地を有する３７℃の発酵器で細胞を培養し、塩酸とアンモニアを添加してｐＨ６．８に維持した。発酵器内で細胞を高濃度に培養するために、細胞の培養中にグルコース（ブドウ糖）含有注入溶液（ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を培養液に注入した。８時間の培養後、１．０ｍＭ濃度のＩＰＴＧを添加して、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４の発現を１１時間誘導した。
【０１３８】
その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４の発現レベルを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析の結果、ＩＰＴＧによる発現誘導後、細胞の成長及びＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４の発現レベルが持続的に増加することが確認された。濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）による分析結果、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４の発現レベルは全タンパク質の約２７％であることが確認された（図３）。
【０１３９】
実施例１．６．Ｎ末端融合パートナーのアミノ酸置換によるｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現レベルの向上
ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４内のＰＧ１５のＮ末端配列が、ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現レベルに及ぼす影響を調べるために、ＰＧ１５のアミノ酸配列における２番から７番までの合計６個のアミノ酸を欠失させたＰＧ１５（△２−７）−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（配列番号３３９）の発現プラスミドを作製して、大腸菌内の発現レベルをＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４と比較した。形質転換からＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いた発現レベルの分析は、実施例１．２〜１．４と同様に行った。
【０１４０】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに対する濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）分析により、ＰＧ１５（△２−７）−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４の発現レベルは、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４と比較して５倍以上減少することが確認された（図４）。したがって、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４内のＰＧ１５の２番から７番までの配列がｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現レベルに大きく影響を与えることが確認された。
【０１４１】
また、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４内のＰＧ１５の２番から７番までの６個のアアミノ酸残基の変化がｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現レベルに及ぼす影響を調べるために、それぞれのアミノ酸残基をイソロイシン、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸で置換した合計２１個のｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの変異体を作製して、細胞内の発現レベルをＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４と比較した。
【０１４２】
ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの変異体発現用のプラスミドＤＮＡは、位置指定突然変異（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ：部位特異的突然変異）法を用いて作製した。位置指定突然変異のための鋳型（ｔｅｍｐｌａｔｅ）としては、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４発現プラスミドであるｐＳＧＫ４７７を使用し、プライマーとしては、それぞれの変異体のアミノ酸置換部位の塩基配列が変更されたフォワード（ｆｏｒｗａｒｄ）およびリバース（ｒｅｖｅｒｓｅ）の一本鎖ＤＮＡオリゴマーを用いた。実験で使用したプライマーを下記表３に示した。
【０１４３】
【表３】
2021511785.tif 000005
2021511785.tif 000006
2021511785.tif 000007
【０１４４】
それぞれの変異体の位置指定突然変異後に得られた発現プラスミドは、ＤＮＡ塩基配列の確認により正確なクローニングの有無が確認された。
【０１４５】
作製したｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの変異体発現プラスミドを用いて、塩化カルシウムを使用した化学的方法により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質転換された大腸菌は、カナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で含まれているＬＢ固体培地においてコロニーを形成した。形質転換された大腸菌を、それぞれカナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地に培養した後、５０％グリセロールを培養液と同じ容量（体積）で添加して細胞ストックを作成し、これを温度−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０１４６】
−８０℃で保管されたｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの変異体発現プラスミドが形質転換された大腸菌の細胞ストックを室温で溶かした後、５０μｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地５ｍｌを含む試験管に添加して、３７℃の振とう培養器で１２時間種菌培養した。種菌培養された大腸菌２ｍｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地２００ｍｌを含むフラスコに添加して、３７℃の振とう培養器で培養した。約３時間培養後、細胞の光学密度（ＯＤ６００）が約１．０になったとき、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように添加して、ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現を誘導した。発現誘導４時間後に光学密度を測定することで、細胞の光学密度を測定した。
【０１４７】
発現誘導された細胞の光学密度が１０．０になるように細胞を濃縮し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で再懸濁した後、超音波細胞破砕機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を用いて細胞を破砕した。破砕された細胞は、全細胞画分として標識した。細胞破砕液は、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清液を回収し、可溶性画分として標識した。不溶性画分は、５００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で超音波細胞破砕機を用いて再懸濁し、不溶性画分として標識した。
【０１４８】
５０μｌの全細胞、可溶性および不溶性画分を、それぞれ５０μｌの２倍濃縮されたＳＤＳ試料緩衝液（ＳＤＳサンプルバッファー  ２×ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ，Ｓｉｇｍａ）に混合した後、９５℃で５分間加熱して、各試料のタンパク質を変性させた。試料中の変性タンパク質は、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＴＡＮＫ緩衝液を用いて、分子量サイズに応じて、ゲル内で分離できるようにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０を含む染色緩衝液で染色した後、脱色緩衝液で脱色することで、染色されたタンパク質のみが見えるようにした。その結果を、図５〜図７に示した。
【０１４９】
対照群であるＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４の発現レベルと比較して、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４内のＰＧ１５の２番から７番までの６個のアミノ酸残基の変化により発現レベルが向上した変異体、および低下した変異体を確認した。特に、濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）分析により、４番目の残基がアスパラギン酸で置換された変異株と、７番目の残基がアルギニンで置換された変異株とは、対照群に比べて発現レベルが３倍以上向上することが確認された。
【０１５０】
実施例２．ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの回収及び精製
実施例２．１．細胞破砕及び不溶性封入体の回収
フラスコスケールで発現された細胞の冷凍細胞ペレットを、５０ｍｌ緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）を添加して解凍した。再懸濁された細胞は、超音波細胞破砕機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を用いて破砕した。溶解された細胞は１２，０００ｒｐｍ（１２，０００×ｇ）の条件で３０分間遠心分離し、上清液を除去することで、組換え融合ポリペプチドを含む不溶性封入体画分を回収した。
【０１５１】
実施例２．２．不溶性封入体の可溶化
回収された不溶性封入体画分に２０ｍｌの封入体可溶化緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を添加し、２５℃で４時間振とう培養して、不溶性画分内の封入体形態の組換え融合ポリペプチドの可溶化を行った。可溶化された不溶性画分試料を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清液を膜フィルター（０．４５／０．２μｍ）でろ過した。
【０１５２】
実施例２．３．ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの精製
可溶化された不溶性画分内のｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドを精製するために、Ｓ９試料ポンプ（Ｓａｍｐｌｅ  ｐｕｍｐ  Ｓ９）及びＦ９−Ｃ画分収集器（Ｆ９−Ｃフラクションコレクター）を備えたＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ２５クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。可溶化された不溶性画分試料を、封入体可溶化緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で予め平衡化されたＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ  １ｍｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。注入完了後、カラムを５倍カラム容量(体積)の平衡緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を５倍カラム容量で使用し、その割合を段階的に１００％まで徐々に増やして、カラムの樹脂に結合しているｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドを溶出した。溶出後、得られた画分の結果をそれぞれ図８ａ〜図１０ｂに示した。
【０１５３】
実施例３．プロテアーゼ処理によるリンカー配列の切断
精製した約５ｍｌのｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの画分を合わせた後、１４０ｍｌの希釈緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）を添加して、尿素濃度１Ｍに希釈した。希釈された組換え融合ポリペプチドに、ＴＥＶプロテアーゼを最終濃度５００ｎＭになるように添加し、室温で１２時間切断反応を行った。
【０１５４】
ＴＥＶプロテアーゼによる切断の有無を確認するために、切断後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、その結果を図１１及び図１２に示した。一方、図９ａを参照すると、７．９ｋＤａのＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４は、ほぼ１００％の収率で、Ｎ末端融合パートナー、６ヒスチジンタグ及びＴＥＶプロテアーゼ認識配列融合体であるＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ断片と、目的ポリペプチドあるｈＰＴＨ  １−３４断片とに分離されていることが確認された。
【０１５５】
実施例４．ｈＰＴＨ  １−３４精製
実施例４．１．陽イオン交換クロマトグラフィーを用いたｈＰＴＨ  １−３４分離及び精製        
ＴＥＶプロテアーゼによる切断によりＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドから遊離したｈＰＴＨ  １−３４を精製するために、Ｓ９試料ポンプ（Ｓａｍｐｌｅ  ｐｕｍｐ  Ｓ９）及びＦ９−Ｃ画分収集器（Ｆ９−Ｃフラクションコレクター）を備えたＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ２５クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。ＴＥＶプロテアーゼで切断された個々の試料を、結合緩衝液（２０ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ９．３）への緩衝液交換を行い、その後、同じ緩衝液で予め平衡化されたＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＦＦ  １ｍｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。注入完了後、カラムを５倍カラム容量の結合緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液（２０ｍＭ酢酸アンモニウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ９．３）を５倍カラム容量で使用し、その割合は段階的に１００％まで徐々に増やし、容量はカラムの１０倍容量まで直線的に増やして、カラムの樹脂に結合しているｈＰＴＨ  １−３４を溶出した。画分収集器の精製画分を、前述したＳＤＳ−ＰＡＧＥの方法で分析した。
【０１５６】
組換え融合ポリペプチド（ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４）の切断により遊離したｈＰＴＨ  １−３４のｐＩは、精製用のタグ及び切断酵素認識配列を含むアミノ末端融合パートナー（ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ）のｐＩよりも約３が低い。具体的には、ｐＨ９．３の緩衝液において１１．７２のｐＩ値を有するＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶは正電荷を有し、８．２９のｐＩ値を有するｈＰＴＨ  １−３４も正電荷を有するので、イオン交換クロマトグラフィーを用いたＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶとｈＰＴＨ  １−３４との分離が容易である。ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４が切断されてＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶとｈＰＴＨ  １−３４とが混合されている試料を、陽イオン交換樹脂が充填されているＨｉＴｒａｐ  ＳＰ  ＦＦ  １ｍＬカラムに注入した。図１３ａ及び図１３ｂを参照すると、陰イオンを帯びているｈＰＴＨ  １−３４は、陽イオン交換樹脂に結合されずに通過液（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）画分において確認され、陽イオンを帯びているＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶは、陽イオン交換樹脂に結合した後、塩化ナトリウム濃度の増加により溶出されることが確認された。したがって、比較的高いｐＩ値を有する本発明のＮ末端融合パートナーは、イオン交換クロマトグラフィーを用いて除去可能であるため、ｈＰＴＨ  １−３４の分離精製を容易にすることができる。
【０１５７】
実施例４．２．疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いたｈＰＴＨ  １−３４分離及び精製
ＴＥＶプロテアーゼによる切断によりＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドから遊離したｈＰＴＨ  １−３４を精製するために、Ｓ９試料ポンプ（Ｓａｍｐｌｅ  ｐｕｍｐ  Ｓ９）及びＦ９−Ｃ画分収集器（Ｆ９−Ｃフラクションコレクター）を備えたＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ ２５クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。ＴＥＶプロテアーゼで切断された個々の試料を結合緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ７．０）への緩衝液交換を行い、その後、同じ緩衝液で予め平衡化されたＨｉＴｒａｐ  Ｂｕｔｙｌ  ＨＰ  １ｍＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。注入完了後、カラムを５倍カラム容量の結合緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）を５倍カラム容量で使用し、その割合は段階的に１００％まで徐々に増やし、容量はカラムの１０倍容量まで直線的に増やして、カラムの樹脂に結合しているｈＰＴＨ  １−３４を溶出した。画分収集器の精製画分を、前述したＳＤＳ−ＰＡＧＥの方法で分析した。
【０１５８】
組換え融合ポリペプチド（ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４）の切断により遊離したｈＰＴＨ  １−３４の平均疎水性（ＧＲＡＶＹ）値（−０．６７１）は、精製用のタグ及び切断酵素認識配列を含むアミノ末端融合パートナー（ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ）の平均疎水性値（−１．２７２）よりも０．４８８だけ高いので、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いたＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶとｈＰＴＨ  １−３４との分離が容易である。図１４ａ及び図１４ｂに示すように、ほとんどのＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶとｈＰＴＨ  １−３４は、疎水性相互作用樹脂に結合して通過液（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）画分から検出されなかった。硫酸アンモニウムを含まない溶出緩衝液の割合が徐々に増加するにつれて、低い平均疎水性を有するＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶか溶出し、溶出緩衝液の割合がさらに上がって硫酸アンモニウム濃度が低くなるにつれて、ｈＰＴＨ  １−３４が溶出することが確認された。したがって、比較的低い平均疎水性値を有する本発明のＮ末端融合パートナーは、疎水性相互作用クロマトグラフィーを用いて除去可能であるため、ｈＰＴＨ  １−３４の分離精製を容易にすることができる。
【０１５９】
実施例５．切断後のｈＰＴＨ  １−３４の分子量分析
完全な形態のＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４の発現の有無、ＴＥＶプロテアーゼによる正確な切断の有無、および切断後に得られたｈＰＴＨ  １−３４の変形（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）の有無を確認するために、ＭＡＬＴＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた分子量分析を実施した。ｈＰＴＨ  １−３４標準物質の分子量を測定した結果と、本発明により得られたｈＰＴＨ  １−３４の分子量を測定した結果とを、図１５及び図１６に示した。
【０１６０】
図１５及び図１６を参考すると、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４から得られたｈＰＴＨ  １−３４の分子量は、理論的な分子量と誤差範囲内で一致しているので、大腸菌内で蛋白質分解酵素（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）によるアミノまたはカルボキシ末端の部分切断や分解せずに完全な形態で発現されたことが確認された。したがって、ＴＥＶプロテアーゼは、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−３４内の認識配列であるＥＮＬＦＱ配列を認識し、最後のアミノ酸であるＱ（グルタミン）とｈＰＴＨ  １−３４の最初のアミノ酸であるＳ（セリン）との間のペプチド結合を正確に切断することで判断される。
【０１６１】
実施例６．精製されたｈＰＴＨ  １−３４の逆相ＨＰＬＣ分析
米国薬局方（ＵＳＰ  ３９、Ｏｆｆｉｃａｉｌ  Ｍｏｎｏｇｒａｐｈｓ、Ｔｅｒｉｐａｒａｔｉｄｅ，６０５８−６０６２）に記載のｈＰＴＨ  １−３４の同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）基準試験法による標準品ｈＰＴＨ  １−３４（ＵＳＰ  Ｃａｔａｌｏｇ＃１６４３９６２）と、本発明により生産された組換えｈＰＴＨ  １−３４とを、逆相ＨＰＬＣで分析した。その結果、両方のｈＰＴＨ  １−３４すべて同じ滞留時間を示し、組換えｈＰＴＨ  １−３４の純度は９９．５％以上であることが確認された（図１７）。
【０１６２】
また、アメリカ薬局方（ＵＳＰ）に記載のｈＰＴＨ  １−３４の同定（ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）方法の中でペプチドマッピング（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｍａｐｐｉｎｇ）方法をさらに使用して、標準品ｈＰＴＨ  １−３４（ＵＳＰ  Ｃａｔａｌｏｇ＃１６４３９６２）と、本発明により生産された組換えｈＰＴＨ  １−３４との同等性を分析した。前記両方のｈＰＴＨ  １−３４をそれぞれ黄色ブドウ球菌Ｖ８プロテアーゼ（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｖ８  ｐｒｏｔｅａｓｅ）で処理して、５個のペプチド断片（ｐｅｐｔｉｄｅ  ｆｒａｇｍｅｎｔ）に分離した後、逆相ＨＰＬＣで分析した結果、両方のｈＰＴＨ  １−３４から分離された５個のペプチド断片がすべて同じ滞在時間を示し、これにより標準品ｈＰＴＨ  １−３４と組換えｈＰＴＨ  １−３４との同等性が確認された（図１８）。
【０１６３】
実施例７．リラグルチド前駆体ペプチド（ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ）融合ポリペプチドの製造および生産
実施例７．１．ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチド発現プラスミドの作製
ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの遺伝子は、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）法を用いて合成した。このとき、前記ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドには、アミノ末端融合パートナーとしての、ＰＧ０７（配列番号９）、ＰＧ１５（配列番号３１）、ＰＧ２２（配列番号５３）、ＰＧ２９（配列番号７５）、ＰＧ３６（配列番号９７）及びＰＧ４３（配列番号１１９）のうちのいずれか一つと、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒのアミノ酸配列（配列番号３４１）が含まれている。
【０１６４】
対照群として使用されたＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチド（Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ）には、アミノ末端融合パートナーが含まれておらず、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒのアミノ酸配列（配列番号３４１）が含まれている。各融合ポリペプチドの遺伝子は、制限酵素ＮｄｅＩ、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの認識配列と１つの終止コドンを含む。前記ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号４７８〜４８３に対応し、対照群は、配列番号４７７に対応する。
【０１６５】
下記表４に記載のＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチド発現プラスミドｐＳＧＫ５３０、ｐＳＧＫ４９５、ｐＳＧＫ４９６、ｐＳＧＫ５００、ｐＳＧＫ５０１、ｐＳＧＫ５０２およびｐＳＧＫ４９７を作製するために、ＯＥ−ＰＣＲにより合成されたＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチド遺伝子断片を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて切断し、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレータ及びＬａｃＩ遺伝子を含めてＩＰＴＧによる発現調節が可能な発現ベクターｐＥＴ２６ｂにクローニングした。
【０１６６】
【表４】
2021511785.tif 000008
【０１６７】
作製したＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチド発現プラスミドは、ＤＮＡ塩基配列の確認により正確なクローニングの有無が確認された。作製したＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチド発現プラスミドを用いて、塩化カルシウムを使用した化学的方法により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質導入された大腸菌は、カナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で含まれているＬＢ固体培地においてコロニーを形成した。形質転換された大腸菌を、それぞれカナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地に培養した後、５０％グリセロールを培養液と同じ容量で添加して細胞ストックを作成し、これを温度−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０１６８】
実施例７．２．形質転換された細胞の培養およびＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒの発現
−８０℃で保管されたＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質転換された大腸菌の細胞ストックを室温で溶かした後、５０μｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地５ｍｌを含む試験管に添加して、３７℃の振とう培養器で１２時間種菌培養した。種菌培養された大腸菌２ｍｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地２００ｍｌを含むフラスコに添加して、３７℃の振とう培養器で培養した。約３時間培養後、細胞の光学密度（ＯＤ６００）が約１．０になったとき、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように添加して、ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの発現を誘導した。発現誘導４時間後に光学密度を測定することで、細胞の光学密度を測定した。
【０１６９】
実施例７．３．発現レベルの比較分析のための試料の製造
発現誘導された細胞の光学密度が１０．０になるように細胞を濃縮し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で再懸濁した後、超音波細胞破砕機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を用いて細胞を破砕した。破砕された細胞は、全細胞画分として標識した。細胞破砕液は、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清液を回収し、可溶性画分として標識した。不溶性画分は、５００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で超音波細胞破砕機を用いて再懸濁し、不溶性画分として標識した。
【０１７０】
実施例７．４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により生産されたＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒの確認
５０μｌの全細胞、可溶性および不溶性画分を、それぞれ５０μｌの２倍濃縮されたＳＤＳ試料緩衝液（ＳＤＳサンプルバッファー  ２×ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ，Ｓｉｇｍａ）に混合した後、９５℃で５分間加熱して、各試料のタンパク質を変性させた。試料中の変性タンパク質は、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＴＡＮＫ緩衝液を用いて、分子量サイズに応じて、ゲル内で分離できるようにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０を含む染色緩衝液で染色した後、脱色緩衝液で脱色することで、染色されたタンパク質のみが見えるようにした。その結果を、図１９及び図２０に示した。
【０１７１】
図１９を参照すると、対照群である配列番号１のアミノ酸配列を含む融合パートナーが含まれていないＨ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（５．１ｋＤａの分子量）のバンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは検出されず、発現後に細胞内のタンパク質分解酵素によって分解されたようである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの発現は、分子量が最も小さいアミノ末端融合パートナーであるＰＧ０７が融合されたＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（６．１ｋＤａの分子量）から確認された。
【０１７２】
アミノ末端融合パートナーであるＰＧ１５が融合されたＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（７．１ｋＤａの分子量）の発現レベルは、ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒに比べて増加した。アミノ末端融合パートナーであるＰＧ１５、ＰＧ２２、ＰＧ２９、ＰＧ３６及びＰＧ４３が融合されたＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドであるＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（７．１ｋＤａの分子量）、ＰＧ２２−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（７．９ｋＤａの分子量）、ＰＧ２９−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（８．４ｋＤａの分子量）、ＰＧ３６−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（９．１ｋＤａの分子量）及びＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（１１．７ｋＤａの分子量）の発現レベルは、対照群（Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ）に比べて非常に向上したことが確認された。
【０１７３】
濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）分析により、ＰＧ０７、ＰＧ１５、ＰＧ２２、ＰＧ２９、ＰＧ３６及びＰＧ４３のＰＧ２２、ＰＧ２９、ＰＧ３６及びＰＧ４３が融合された各融合ポリペプチドの発現レベルは類似しており、ＰＧ０７、ＰＧ１５が融合された融合ポリペプチドよりもはるかに高いことが確認された（図２０、図２１）。
【０１７４】
また、図２０を参照すると、対照群を含むすべてのＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドは、可溶性画分では観察されず、すべての不溶性画分で観察されることがわかる（レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００５）及びレーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ（菌株番号ＰＧ００６）の場合、目的ペプチドが発現されないか発現レベルが低いため、可溶性テストを実行しない）。
【０１７５】
実施例７．５．Ｎ末端融合パートナーのアミノ酸置換によるＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの発現レベルの変化
ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ内のＰＧ４３の２番から７番までの６個のアミノ酸残基の変化がＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの発現レベルに及ぼす影響を調べるために、それぞれのアミノ酸残基をイソロイシン、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸で置換した合計２２個のＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの変異体を作製して、細胞内の発現レベルをＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒと比較した。
【０１７６】
ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの変異体発現用のプラスミドＤＮＡは、位置指定突然変異法を用いて作製した。位置指定突然変異のための鋳型としては、ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ発現プラスミドであるｐＳＧＫ４９７を使用した。プライマーとしては、それぞれの変異体のアミノ酸置換部位の塩基配列が変更されたフォワードおよびリバースの一本鎖ＤＮＡオリゴマーを用いた。実験で使用したプライマーを下記表５に示した。
【０１７７】
【表５】
2021511785.tif 000009
2021511785.tif 000010
2021511785.tif 000011
【０１７８】
それぞれの変異体の位置指定突然変異後に得られた発現プラスミドは、ＤＮＡ塩基配列の確認により正確なクローニングの有無が確認された。
【０１７９】
作製したＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの変異体発現プラスミドを用いて、塩化カルシウムを使用した化学的方法により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質転換された大腸菌は、カナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で含まれているＬＢ固体培地においてコロニーを形成した。形質転換された大腸菌を、それぞれカナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地に培養した後、５０％グリセロールを培養液と同じ容量で添加して細胞ストックを作成し、これを温度−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０１８０】
−８０℃で保管されたＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの変異体発現プラスミドが形質転換された大腸菌の細胞ストックを室温で溶かした後、５０μｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地５ｍｌを含む試験管に添加して、３７℃の振とう培養器で１２時間種菌培養した。種菌培養された大腸菌２ｍｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地２００ｍｌを含むフラスコに添加して、３７℃の振とう培養器で培養した。約３時間培養後、細胞の光学密度（ＯＤ６００）が約１．０になったとき、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように添加して、ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの発現を誘導した。発現誘導４時間後に光学密度を測定することで、細胞の光学密度を測定した。
【０１８１】
発現誘導された細胞の光学密度が１０．０になるように細胞を濃縮し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で再懸濁した後、超音波細胞破砕機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を用いて細胞を破砕した。破砕された細胞は、全細胞画分として標識した。細胞破砕液は、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清液を回収し、可溶性画分として標識した。不溶性画分は、５００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で超音波細胞破砕機を用いて再懸濁し、不溶性画分として標識した。
【０１８２】
５０μｌの全細胞、可溶性および不溶性画分を、それぞれ５０μｌの２倍濃縮されたＳＤＳ試料緩衝液（ＳＤＳサンプルバッファー  ２×ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ，Ｓｉｇｍａ）に混合した後、９５℃で５分間加熱して、各試料のタンパク質を変性させた。試料中の変性タンパク質は、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＴＡＮＫ緩衝液を用いて、分子量サイズに応じて、ゲル内で分離できるようにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０を含む染色緩衝液で染色した後、脱色緩衝液で脱色することで、染色されたタンパク質のみが見えるようにした。
【０１８３】
図２２〜図２４に示すように、対照群であるＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒの発現レベルと比較して、ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ内のＰＧ４３の２番から７番までの６個のアミノ酸残基の変化により発現レベルが向上した変異体、および低下した変異体を確認した。特に、濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）分析により、２番目の残基がアスパラギン酸で置換された変異株と、７番目の残基がアイソロイシン、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸で置換された変異株とは、対照群に比べて発現レベルが３倍以上向上することが確認された。
【０１８４】
実施例８．ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの回収及び精製
実施例８．１．細胞破砕及び不溶性封入体の回収
フラスコスケールで発現された細胞の冷凍細胞ペレットを、５０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）を添加して解凍した。再懸濁された細胞は、超音波細胞破砕機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を用いて破砕した。溶解された細胞は、１２，０００ｒｐｍ（１２，０００×ｇ）の条件で３０分間遠心分離し、上清液を除去することで、組換え融合ポリペプチドを含む不溶性封入体画分を回収した。
【０１８５】
実施例８．２．不溶性封入体の可溶化
回収された不溶性封入体画分に２０ｍｌの封入体可溶化緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を添加し、２５℃で４時間振とう培養して、不溶性画分内の封入体形態の組換え融合ポリペプチドの可溶化を行った。可溶化された不溶性画分試料を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清液を（０．４５／０．２μｍ）膜フィルターでろ過した。
【０１８６】
実施例８．３．ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの精製
７個のＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの中から発現レベルが最も高いＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒを精製した。まず、可溶化された不溶性画分内のＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドを精製するために、Ｓ９試料ポンプ（Ｓａｍｐｌｅ  ｐｕｍｐ  Ｓ９）及びＦ９−Ｃ画分収集器（Ｆ９−Ｃフラクションコレクター）を備えたＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ２５クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。可溶化された不溶性画分試料を、封入体可溶化緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で予め平衡化されたＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ  １ｍｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。
【０１８７】
注入完了後、カラムを５倍カラム容量の平衡緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を５倍カラム容量で使用し、その割合を段階的に１００％まで徐々に増やして、カラムの樹脂に結合しているＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドを溶出した。溶出後、得られた画分の結果をそれぞれ図２５及び図２６に示した。カラムに注入された、可溶化された不溶性画分試料内のＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドは、ほとんどカラム内の樹脂に結合した後、溶出されて９５％以上の純度を示した。
【０１８８】
実施例９．プロテアーゼ処理によるリンカー配列の切断
精製した約５ｍｌのＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドの画分を合わせた後、１４０ｍｌの希釈緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）を添加して、尿素濃度１Ｍに希釈した。希釈された組換え融合ポリペプチドに、ＴＥＶプロテアーゼを最終濃度５００ｎＭになるように添加し、室温で１２時間切断反応を行った。
【０１８９】
ＴＥＶプロテアーゼによる切断の有無を確認するために、切断後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、その結果を図２７に示した。ＴＥＶプロテアーゼによる、ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチド（ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ）の切断前後をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、７．９ｋＤａのＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドは、ほぼ１００％の収率で、アミノ末端融合パートナー、６ヒスチジンタグ及びＴＥＶプロテアーゼ認識配列融合体であるＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶと、目的ポリペプチドであるＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒとに切断されていることが確認された。
【０１９０】
実施例１０．切断後のＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒの分子量分析
完全な形態のＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチド（ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ）の発現の有無、ＴＥＶプロテアーゼによる正確な切断の有無、および切断後に得られたＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒの変形の有無を確認するために、ＭＡＬＴＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた分子量分析を実施した。本発明により得られたＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒの分子量を測定した結果を、図面28に示した。
【０１９１】
図２８を参照すると、ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒから得られたＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒの分子量は、３３８２．５９Ｄａであると測定され、理論分子量３３８３．７２Ｄａと誤差範囲内で一致しているので、大腸菌内で蛋白質分解酵素（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）によるアミノまたはカルボキシ末端の部分切断や分解せずに完全な形態で発現されたことが確認された。
【０１９２】
したがって、ＴＥＶプロテアーゼは、ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ内の認識配列であるＥＮＬＦＱ配列を認識し、最後のアミノ酸であるＱ（グルタミン）とＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒの最初のアミノ酸であるＨ（ヒスチジン）との間のペプチド結合を正確に切断することで判断される。
【０１９３】
実施例１１．テデュグルチド（ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ）融合ポリペプチドの製造および生産
実施例１１．１．ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチド発現プラスミドの作製
ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの遺伝子は、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）法を用いて合成した。このとき、前記ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドには、アミノ末端融合パートナーとしての、ＰＧ０７（配列番号９）、ＰＧ１５（配列番号３１）、ＰＧ２２（配列番号５３）、ＰＧ２９（配列番号７５）、ＰＧ３６（配列番号９７）及びＰＧ４３（配列番号１１９）のうちのいずれか一つと、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびＧＬＰ−２Ａ２Ｇのアミノ酸配列（配列番号４８５）が含まれている。
【０１９４】
対照群として使用されたＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチド（Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ）には、アミノ末端融合パートナーが含まれておらず、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびＧＬＰ−２Ａ２Ｇのアミノ酸配列（配列番号４８５）が含まれている。各融合ポリペプチドの遺伝子は、制限酵素ＮｄｅＩ、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの認識配列と１つの終止コドンを含む。前記ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６２２〜６２７に対応し、対照群は、配列番号６２１に対応する。
【０１９５】
下記表６に記載のＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチド発現プラスミドｐＳＧＫ５２０、ｐＳＧＫ５２１、ｐＳＧＫ５２２、ｐＳＧＫ５４７、ｐＳＧＫ５４８、ｐＳＧＫ５４９およびｐＳＧＫ５２３を作製するために、ＯＥ−ＰＣＲにより合成されたＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチド遺伝子単片を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて切断し、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレータ及びＬａｃＩ遺伝子を含めてＩＰＴＧによる発現調節が可能な発現ベクターｐＥＴ２６ｂにクローニングした。
【０１９６】
【表６】
2021511785.tif 000012
【０１９７】
作製したＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチド発現プラスミドは、ＤＮＡ塩基配列の確認により正確なクローニングの有無が確認された。作製したＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチド発現プラスミドを用いて、塩化カルシウムを使用した化学的方法により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質導入された大腸菌は、カナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で含まれているＬＢ固体培地においてコロニーを形成した。形質転換された大腸菌を、それぞれカナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地に培養した後、５０％グリセロールを培養液と同じ容量で添加して細胞ストックを作成し、これを温度−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０１９８】
実施例１１．２．形質転換された細胞の培養およびＧＬＰ−２Ａ２Ｇの発現
−８０℃で保管されたＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質転換された大腸菌の細胞ストックを室温で溶かした後、５０μｌを、カナマイシン５０μｇ／  ｍＬの濃度で存在するＬＢ液体培地５ｍｌを含む試験管に添加して、３７℃の振とう培養器で１２時間種菌培養した。種菌培養された大腸菌２ｍｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地２００ｍｌを含むフラスコに添加して、３７℃の振とう培養器で倍の量た。約３時間培養後、細胞の光学密度（ＯＤ６００）が約１．０になったとき、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように添加して、ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの発現を誘導した。発現誘導４時間後に光学密度を測定することで、細胞の光学密度を測定した。
【０１９９】
実施例１１．３．発現レベルの比較分析のための試料の製造
発現誘導された細胞の光学密度が１０．０になるように細胞を濃縮し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で再懸濁した後、超音波細胞破砕機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を用いて細胞を破砕した。破砕された細胞は、全細胞画分として標識した。細胞破砕液は、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清液を回収し、可溶性画分として標識した。不溶性画分は、５００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で超音波細胞破砕機を用いて再懸濁し、不溶性画分として標識した。
【０２００】
実施例１１．４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により生産されたＧＬＰ−２Ａ２Ｇの確認
５０μｌの全細胞、可溶性および不溶性画分を、それぞれ５０μｌの２倍濃縮されたＳＤＳ試料緩衝液（ＳＤＳサンプルバッファー  ２×ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ，Ｓｉｇｍａ）に混合した後、９５℃で５分間加熱して、各試料のタンパク質を変性させた。試料中の変性タンパク質は、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＴＡＮＫ緩衝液を用いて、分子量サイズに応じて、ゲル内で分離できるようにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０を含む染色緩衝液で染色した後、脱色緩衝液で脱色することで、染色されたタンパク質のみが見えるようにした。その結果を、図２９および図３０に示した。
【０２０１】
図２９を参照すると、対照群である配列番号１のアミノ酸配列を含む融合パートナーが含まれていないＨ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（５．５ｋＤａの分子量）のバンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは検出されず、発現後に細胞内のタンパク質分解酵素によって分解されたようである。
【０２０２】
アミノ末端融合パートナーであるＰＧ０７、ＰＧ１５、ＰＧ２２、ＰＧ２９、ＰＧ３６及びＰＧ４３が融合されたＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドであるＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（６．５ｋＤａの分子量）、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（７．５ｋＤａの分子量）、ＰＧ２２−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（７．５ｋＤａの分子量）、ＰＧ２９−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（８．３ｋＤａの分子量）、ＰＧ３６−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（９．５ｋＤａの分子量）及びＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（１２．１ｋＤａの分子量）のうちでＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により発現が確認されたものは、ＰＧ２２−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ、ＰＧ２９−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ、ＰＧ３６−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ及びＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇであった。
【０２０３】
濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）分析により、ＰＧ０７、ＰＧ１５、ＰＧ２２、ＰＧ２９、ＰＧ３６及びＰＧ４３のＰＧ４３の融合によるＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇの発現レベルは、すべてのＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの中で最も高いことが確認された。
【０２０４】
また、図３０を参照すると、発現が確認されたすべてのＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドは、可溶性画分では観察されず、すべての不溶性画分で観察されることがわかる（レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１２）、レーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１３）、レーン３：ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１４）及びレーン４：ＰＧ２２−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ（菌株番号ＰＧ０１５）の場合、目的ペプチドが発現されないため、可溶性テストを実行しない）。
【０２０５】
実施例１１．５．Ｎ末端融合パートナーのアミノ酸置換によるＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの発現レベルの変化
ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ内のＰＧ４３の２番から７番までの６個のアミノ酸残基の変化がＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの発現レベルに及ぼす影響を調べるために、それぞれのアミノ酸残基をイソロイシン、アスパラギン、アルギニン、アスパラギン酸で置換した合計２２個のＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの変異体を作製して、細胞内の発現レベルをＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇと比較した。
【０２０６】
具体的には、ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの変異体発現用のプラスミドＤＮＡは、位置指定突然変異法を用いて作製した。位置指定突然変異のための鋳型としては、ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ発現プラスミドであるｐＳＧＫ５２３を使用した。プライマーとしては、それぞれの変異体のアミノ酸置換部位の塩基配列が変更されたフォワードおよびリバースの一本鎖ＤＮＡオリゴマーを用いた。実験で使用したプライマーを下記の表７に示した。
【０２０７】
【表７】
2021511785.tif 000013
2021511785.tif 000014
2021511785.tif 000015
【０２０８】
それぞれの変異体の位置指定突然変異後に得られた発現プラスミドは、ＤＮＡ塩基配列の確認により正確なクローニングの有無が確認された。
【０２０９】
作製したＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの変異体発現プラスミドを用いて、塩化カルシウムを使用した化学的方法により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質導入された大腸菌は、カナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で含まれているＬＢ固体培地においてコロニーを形成した。形質転換された大腸菌を、それぞれカナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地に培養した後、５０％グリセロールを培養液と同じ容量で添加して細胞ストックを作成し、これを温度−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０２１０】
−８０℃で保管されたＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの変異体発現プラスミドが形質転換された大腸菌の細胞ストックを室温で溶かした後、５０μｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地５ｍｌを含む試験管に添加して、３７℃の振とう培養器で１２時間種菌培養した。種菌培養された大腸菌２ｍｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地２００ｍｌを含むフラスコに添加して、３７℃の振とう培養器で培養した。約３時間培養後、細胞の光学密度（ＯＤ６００）が約１．０になったとき、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように添加して、ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの発現を誘導した。発現誘導４時間後に光学密度を測定することで、細胞の光学密度を測定した。
【０２１１】
発現誘導された細胞の光学密度が１０．０になるように細胞を濃縮し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で再懸濁した後、超音波細胞破砕機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を用いて細胞を破砕した。破砕された細胞は、全細胞画分として標識した。細胞破砕液は、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清液を回収し、可溶性画分として標識した。不溶性画分は、５００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で超音波細胞破砕機を用いて再懸濁し、不溶性画分として標識した。
【０２１２】
５０μｌの全細胞、可溶性および不溶性画分を、それぞれ５０μｌの２倍濃縮されたＳＤＳ試料緩衝液（ＳＤＳサンプルバッファー  ２×ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ，Ｓｉｇｍａ）に混合した後、９５℃で５分間加熱して、各試料のタンパク質を変性させた。試料中の変性タンパク質は、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＴＡＮＫ緩衝液を用いて、分子量サイズに応じて、ゲル内で分離できるようにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０を含む染色緩衝液で染色した後、脱色緩衝液で脱色することで、染色されたタンパク質のみが見えるようにした。
【０２１３】
図３１〜図３３に示すように、対照群であるＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇの発現レベルと比較して、ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ内のＰＧ４３の２番から７番までの６個のアミノ酸残基の変化により発現レベルが変化した変異体を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）分析により確認した。ＰＧ４３の２番から７番までの６個のアミノ酸残基の変化は、ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの発現レベルを大幅に向上させられず、５番目の残基がアルギニンで置換された変異株と、７番目の残基がアルギニンで置換された変異株とは、発現レベルが対照群に比べて５０％以下に減少した。
【０２１４】
実施例１２．ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの回収及び精製
実施例１２．１．細胞破砕及び不溶性封入体の回収
フラスコスケールで発現された細胞の冷凍細胞ペレットを、５０ｍｌの緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２）を添加して解凍した。再懸濁された細胞は、超音波細胞破砕機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を用いて破砕した。溶解された細胞は、１２，０００ｒｐｍ（１２，０００×ｇ）の条件で３０分間遠心分離し、上清液を除去することで、組換え融合ポリペプチドを含む不溶性封入体画分を回収した。
【０２１５】
実施例１２．２．不溶性封入体の可溶化
回収された不溶性封入体画分に２０ｍｌの封入体可溶化緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を添加し、２５℃で４時間振とう培養して、不溶性画分内の封入体形態の組換え融合ポリペプチドの可溶化を行った。可溶化された不溶性画分試料を１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清液を（０．４５／０．２μｍ）膜フィルターでろ過した。
【０２１６】
実施例１２．３．ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの精製
７個のＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの中から発現レベルが最も高いＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇを精製した。まず、可溶化された不溶性画分内のＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドを精製するために、Ｓ９試料ポンプ（Ｓａｍｐｌｅ  ｐｕｍｐ  Ｓ９）及びＦ９−Ｃ画分収集器（Ｆ９−Ｃフラクションコレクター）を備えたＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ２５クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。可溶化された不溶性画分試料を、封入体可溶化緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で予め平衡化されたＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ  １ｍｌカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。
【０２１７】
注入完了後、カラムを５倍カラム容量の平衡緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を５倍カラム容量で使用し、その割合を段階的に１００％まで徐々に増やして、カラムの樹脂に結合しているＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドを溶出した。溶出後、得られた画分の結果をそれぞれ図３４及び図３５に示した。カラムに注入された、可溶化された不溶性画分試料内のＧＬＰ−１Ｋ２８Ｒ融合ポリペプチドは、ほとんどカラム内の樹脂に結合した後、溶出されて９５％以上の純度を示した。
【０２１８】
実施例１３．プロテアーゼ処理によるリンカー配列の切断
精製した約５ｍｌのＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドの画分を合わせた後、１４０ｍｌの希釈緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）を添加して、尿素濃度１Ｍに希釈した。希釈された組換え融合ポリペプチドに、ＴＥＶプロテアーゼを最終濃度５００ｎＭになるように添加し、室温で１２時間切断反応を行った。
【０２１９】
ＴＥＶプロテアーゼによる切断の有無を確認するために、切断後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、その結果を図３６に示した。ＴＥＶプロテアーゼによる、ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチド（ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ）の切断前後をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、１２．１ｋＤａのＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチドは、ほぼ１００％の収率で、アミノ末端融合パートナー、６ヒスチジンタグ及びＴＥＶプロテアーゼ認識配列融合チェーンＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶと、目的ポリペプチドであるＧＬＰ−２Ａ２Ｇとに切断されていることが確認された。
【０２２０】
実施例１４．切断後のＧＬＰ−２Ａ２Ｇの分子量分析
完全な形態のＧＬＰ−２Ａ２Ｇ融合ポリペプチド（ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ）の発現の有無、ＴＥＶプロテアーゼによる正確な切断の有無、および切断後に得られたＧＬＰ−２Ａ２Ｇの変形の有無を確認するために、ＭＡＬＴＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた分子量分析を実施した。本発明により得られたＧＬＰ−２Ａ２Ｇの分子量を測定した結果を、図面37に示した。
【０２２１】
図３７を参照すると、ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇから得られたＧＬＰ−２Ａ２Ｇの分子量は、３７５３．１０Ｄａであると測定され、理論分子量３７５２．１３Ｄａと誤差範囲内で一致しているので、大腸菌内で蛋白質分解酵素（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）によるアミノまたはカルボキシ末端の部分切断や分解せずに完全な形態で発現されたことが確認された。
【０２２２】
したがって、ＴＥＶプロテアーゼは、ＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ＧＬＰ−２Ａ２Ｇ内の認識配列であるＥＮＬＦＱ配列を認識し、最後のアミノ酸であるＱ（グルタミン）とＧＬＰ−２Ａ２Ｇの最初のアミノ酸であるＨ（ヒスチジン）との間のペプチド結合を正確に切断することで判断される（目的ペプチドが発現されないため、可溶性テストを実行しない）。
【０２２３】
実施例１５．エカランチドの製造および生産
実施例１５．１エカランチド融合ポリペプチド発現プラスミドの作製
エカランチド融合ポリペプチドの遺伝子は、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）法を用いて合成した。このとき、前記エカランチド融合ポリペプチドには、アミノ末端融合パートナーとしての、ＰＧ０７（配列番号９）、ＰＧ１５（配列番号３１）およびＰＧ４３（配列番号１１９）のうちのいずれか一つと、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびエカランチドのアミノ酸配列（配列番号６３８）が含まれている。
【０２２４】
対照群として使用されたエカランチド融合ポリペプチド（Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ）には、アミノ末端融合パートナーが含まれておらず、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびエカランチドのアミノ酸配列（配列番号６４２）が含まれている。各融合ポリペプチドの遺伝子は、制限酵素ＮｄｅＩ、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの認識配列と１つの終止コドンを含む。前記エカランチド融合ポリペプチドをコードするニュークレミスグレード配列（ＰＧ０７、ＰＧ１５及びＰＧ４３）は、それぞれ配列番号６４４〜６４６に対応し、対照群は、配列番号６４３に対応する。
【０２２５】
下記表８に記載のエカランチド融合ポリペプチド発現プラスミドｐＳＧＫ５１２、ｐＳＧＫ５１３、ｐＳＧＫ５１４およびｐＳＧＫ５１５を作製するために、ＯＥ−ＰＣＲにより合成されたのエカランチド融合ポリペプチド遺伝子断片を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて切断し、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレータ及びＬａｃＩ遺伝子を含めてＩＰＴＧによる発現調節が可能な発現ベクターｐＥＴ２６ｂにクローニングした。
【０２２６】
【表８】
2021511785.tif 000016
【０２２７】
エカランチド融合ポリペプチド発現プラスミドは、実施例１．１と同様な方法で作製し、温度−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０２２８】
実施例１５．２．形質転換された細胞の培養およびエカランチドの発現
−８０℃で保管されたエカランチド融合ポリペプチドの発現プラスミドに形質転換された細胞の培養およびエカランチドの発現は、実施例１．２と同様の方法で行われた。
【０２２９】
実施例１５．３．発現レベルの比較分析のための試料の製造
エカランチド関連試料の製造は、実施例１．３と同様の方法で行われた。
【０２３０】
実施例１５．４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により生産されたエカランチドの確認
実施例１．４と同様の方法および条件下で各試料のタンパク質を処理した後、その結果を図３８および図３９に示した。
【０２３１】
図３８を参照すると、対照群である配列番号１のアミノ酸配列を含む融合パートナーが含まれていないＨ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（８．８ｋＤａの分子量）のバンドは、他のエカランチド融合ポリペプチドと比較して最も低い発現レベルを示した。アミノ末端融合パートナーであるＰＧ７、ＰＧ１５及びＰＧ４３が融合されたエカランチド融合ポリペプチドであるＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（９．８ｋＤａの分子量）、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（１０．８ｋＤａの分子量）及びＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ（１５．４ｋＤａの分子量）の発現レベルは、対照群（Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅ）に比べて増加したことが確認された。濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）分析により、ＰＧ７、ＰＧ１５及びＰＧ４３の中でＰＧ０７の融合によるＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−Ｅｃａｌｌａｎｔｉｄｅの発現レベルは、すべてのエカランチド融合ポリペプチドの中で最も高いことが確認された。
【０２３２】
また、図３９を参照すると、対照群を含むすべてのエカランチド融合ポリペプチドは、可溶性画分では観察されず、すべての不溶性画分で観察されることがわかる。
【０２３３】
実施例１６．ネシリチドの製造および生産
実施例１６．１．ネシリチド融合ポリペプチド発現プラスミドの作製
ネシリチド融合ポリペプチドの遺伝子は、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）法を用いて合成した。このとき、前記ネシリチド融合ポリペプチドには、アミノ末端融合パートナーとしての、ＰＧ０７（配列番号９）、ＰＧ１５（配列番号３１）およびＰＧ４３（配列番号１１９）のうちのいずれか一つと、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびネシリチドのアミノ酸配列（配列番号６５２）が含まれている。
【０２３４】
対照群として使用されたネシリチド融合ポリペプチド（Ｈ６ＴＥＶ− Nｅｓｉｒｉｔｉｄｅ）には、アミノ末端融合パートナーが含まれておらず、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびネシリチドのアミノ酸配列（配列番号６５２）が含まれている。各融合ポリペプチドの遺伝子は、制限酵素ＮｄｅＩ、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの認識配列と１つの終止コドンを含む。前記ネシリチド融合ポリペプチドをコードするニュークレミスグレード配列は、それぞれ配列番号６５４〜６５６に対応し、対照群は、配列番号６５３に対応する。
【０２３５】
下記表９に記載のネシリチド融合ポリペプチド発現プラスミドｐＳＧＫ５１６、ｐＳＧＫ５１７、ｐＳＧＫ５１８およびｐＳＧＫ５１９を作製するために、ＯＥ−ＰＣＲにより合成されたネシリチド融合ポリペプチド遺伝子断片を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて切断し、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレータ及びＬａｃＩ遺伝子を含めてＩＰＴＧによる発現調節が可能な発現ベクターｐＥＴ２６ｂにクローニングした。
【０２３６】
【表９】
2021511785.tif 000017
【０２３７】
ネシリチド融合ポリペプチド発現プラスミドは、実施例１．１と同様な方法で作製し、温度−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０２３８】
実施例１６．２．形質転換された細胞の培養およびネシリチドの発現
−８０℃で保管されたネシリチド融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質転換された細胞の培養およびネシリチドの発現は、実施例１．２と同様の方法で行われた。
【０２３９】
実施例１６．３．発現レベルの比較分析のための試料の製造
ネシリチド関連試料の製造は、実施例１．３と同様の方法で行われた。
【０２４０】
実施例１６．４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により生産されたネシリチドの確認
実施例１．４と同様の方法および条件下で各試料のタンパク質を処理した後、その結果を図４０および図４１に示した。
【０２４１】
図４０を参照すると、対照群である配列番号１のアミノ酸配列を含む融合パートナーが含まれていないＨ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（５．２ｋＤａの分子量）、および、アミノ末端融合パートナーであるＰＧ０７が融合されたネシリチド融合ポリペプチドであるＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（６．２ｋＤａの分子量）のバンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルでは検出されず、発現後に細胞内のタンパク質分解酵素によって分解されたようである。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおけるネシリチド融合ポリペプチドデの発現は、分子量が最も小さいアミノ末端融合パートナーであるＰＧ１５が融合されたＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（７．２ｋＤａの分子量）から確認された。アミノ末端融合パートナーであるＰＧ４３が融合されたネシリチド融合ポリペプチドであるＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（１１．８ｋＤａの分子量）の発現レベルは、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（７．２ｋＤａの分子量）に比べて向上したことが確認された。濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）分析により、ＰＧ０７、ＰＧ１５およびＰＧ４３の中でＰＧ４３の融合によるＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅの発現レベルは、すべてのネシリチド融合ポリペプチドの中で最も高いことが確認された。
【０２４２】
また、図４１を参照すると、対照群を含むすべてのネシリチド融合ポリペプチドは、可溶性画分では観察されず、すべての不溶性画分で観察されることがわかる（レーン１：Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２３）及びレーン２：ＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−Ｎｅｓｉｒｉｔｉｄｅ（菌株番号ＰＧ０２４）の場合、目的ペプチドが発現されないため、可溶性テストを実行しない）。
【０２４３】
実施例１７．ｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドの製造および生産
実施例１７．１．ｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチド発現プラスミドの作製
ｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドの遺伝子は、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）法を用いて合成した。このとき、前記ｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドには、アミノ末端融合パートナーとしての、ＰＧ０７（配列番号９）、ＰＧ１５（配列番号３１）およびＰＧ４３（配列番号１１９）のうちのいずれか一つと、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびｈＰＴＨ  １−８４のアミノ酸配列（配列番号１８）が含まれている。
【０２４４】
対照群として使用されたｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチド（Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ  １−８４）には、アミノ末端融合パートナーが含まれておらず、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）およびｈＰＴＨ  １−８４のアミノ酸配列（配列番号６２８）が含まれている。各融合ポリペプチドの遺伝子は、制限酵素ＮｄｅＩ、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの認識配列と１つの終止コドンを含む。前記ｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号６３５〜６３７に対応し、対照群は、配列番号６５４に対応する。
【０２４５】
下記表１０に記載のｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチド発現プラスミドｐＳＧＫ５４３、ｐＳＧＫ５４４、ｐＳＧＫ５４５およびｐＳＧＫ５４６を作製するために、ＯＥ−ＰＣＲにより合成されたｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチド遺伝子断片を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いして切断し、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレータ及びＬａｃＩ遺伝子を含めてＩＰＴＧによる発現調節が可能な発現ベクターｐＥＴ２６ｂにクローニングした。
【０２４６】
【表１０】
2021511785.tif 000018
【０２４７】
作製したｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチド発現プラスミドは、ＤＮＡ塩基配列の確認により正確なクローニングの有無が確認された。作製したｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチド発現プラスミドを用いて、塩化カルシウムを使用した化学的方法により、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞を形質転換した。ｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質導入された大腸菌は、カナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で含まれているＬＢ固体培地においてコロニーを形成した。形質転換された大腸菌を、それぞれカナマイシンが５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地に培養した後、５０％グリセロールを培養液と同じ容量で添加して細胞ストックを作成し、これを温度−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０２４８】
実施例１７．２．形質転換された細胞の培養およびｈＰＴＨ  １−８４の発現
−８０℃で保管されたｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドの発現プラスミドが形質転換された大腸菌の細胞ストックを室温で溶かした後、５０μｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地５ｍｌを含む試験管に添加して、３７℃の振とう培養器で１２時間種菌培養した。種菌培養された大腸菌２ｍｌを、カナマイシン５０μｇ／ｍｌの濃度で存在するＬＢ液体培地２００ｍｌを含むフラスコに添加して、３７℃の振とう培養器で培養した。約３時間培養後、細胞の光学密度（ＯＤ６００）が約１．０になったとき、ＩＰＴＧを最終濃度０．１ｍＭになるように添加して、ｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドの発現を誘導した。発現誘導４時間後に光学密度を測定することで、細胞の光学密度を測定した。
【０２４９】
実施例１７．３．発現レベルの比較分析のための試料の製造
発現誘導された細胞の光学密度が１０．０になるように細胞を濃縮し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で再懸濁した後、超音波細胞破砕機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を用いて細胞を破砕した。破砕された細胞は、全細胞画分として標識した。細胞破砕液は、１２，０００×ｇ、４℃で１５分間遠心分離した。上清液を回収し、可溶性画分として標識した。不溶性画分は、５００μｌの５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．２緩衝液で超音波細胞破砕機を用いて再懸濁し、不溶性画分として標識した。
【０２５０】
実施例１７．４．ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析により生産されたｈＰＴＨ  １−８４の確認
５０μｌの全細胞、可溶性および不溶性画分を、それぞれ５０μｌの２倍濃縮されたＳＤＳ試料緩衝液（ＳＤＳサンプルバッファー  ２×ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅ，Ｓｉｇｍａ）に混合した後、９５℃で５分間加熱して、各試料のタンパク質を変性させた。試料中の変性タンパク質は、１６％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよびＴＡＮＫ緩衝液を用いて、分子量サイズに応じて、ゲル内で分離できるようにした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、ゲルを、クマシーブリリアントブルーＲ−２５０を含む染色緩衝液で染色した後、脱色緩衝液で脱色することで、染色されたタンパク質のみが見えるようにした。その結果を、図４２および図４３に示した。
【０２５１】
図４２を参照すると、対照群である配列番号１のアミノ酸配列を含む融合パートナーが含まれていないＨ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４（１１．２ｋＤａの分子量）のバンドは、他のｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドと比較して最も低い発現レベルを示した。
【０２５２】
アミノ末端融合パートナーであるＰＧ０７、ＰＧ１５及びＰＧ４３が融合されたｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドであるＰＧ０７−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４（１２．２ｋＤａの分子量）、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４（１３．２ｋＤａの分子量）及びＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４（１５．９ｋＤａの分子量）の発現レベルは、対照群（Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４）に比べて向上したことが確認された。濃度計（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ）分析により、ＰＧ０７、ＰＧ１５およびＰＧ４３の中でＰＧ１５の融合によるＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４の発現レベルは、すべてのｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドの中で最も高いことが確認された。
【０２５３】
また、図４３を参照すると、対照群を含むすべてのｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドは、可溶性画分で観察されたが、アミノ末端融合パートナーのサイズが大きくなるほどｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドの不溶性画分の割合が増加し、最もサイズが大きいＰＧ４３が融合されたＰＧ４３−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４は、全タンパク質の約７０％が不溶性画分で観察されることがわかる。
【０２５４】
実施例１８．ｈＰＴＨ１−８４融合ポリペプチドの回収及び精製
実施例１８．１．細胞破砕および可溶化
４個のｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドは高い可溶性発現率を有するので、全細胞画分からｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドを精製した。フラスコスケールで発現された細胞の冷凍細胞ペレットを、２０ｍｌの封入体可溶化緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を添加して解凍および再懸濁した。再懸濁された細胞は、超音波細胞破砕機（ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ，Ｃｏｌｅ−Ｐａｒｍｅｒ）を用いて破砕した。溶解された細胞は１２，０００ｒｐｍ（１２，０００×ｇ）の条件で３０分間遠心分離し、上清液を除去することで、組換え融合ポリペプチドを含む不溶性封入体画分を除去し、可溶性画分である上清液を回収した。可溶性画分試料は１２，０００×ｇで３０分間遠心分離し、上清液を（０．４５／０．２μｍ）膜フィルターでろ過した。
【０２５５】
実施例１８．２．ｈＰＴＨ１−８４融合ポリペプチドの精製
４個のｈＰＴＨ１−８４融合ポリペプチドの中から発現レベルが最も高いＰＧ１５−ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４を精製した。まず、可溶性画分内のｈＰＴＨ１−８４融合ポリペプチドを精製するために、Ｓ９試料ポンプ（Ｓａｍｐｌｅ  ｐｕｍｐ  Ｓ９）及びＦ９−Ｃ画分収集器（Ｆ９−Ｃフラクションコレクター）を備えたＡＫＴＡ  ｐｕｒｅ  ２５クロマトグラフィーシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いた。可溶化された不溶性画分試料を、封入体可溶化緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）で予め平衡化されたＨｉｓＴｒａｐ  ＦＦ  １ｍＬカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に注入した。
【０２５６】
注入完了後、カラムを５倍カラム容量の平衡緩衝液で洗浄した。溶出緩衝液（８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス、５００ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４）を５倍カラム容量で使用し、その割合を段階的に１００％まで徐々に増やして、カラムの樹脂に結合しているｈＰＴＨ１−８４融合ポリペプチドを溶出した。溶出後、得られた画分の結果をそれぞれ図４４および図４５に示した。カラムに注入された、可溶化された不溶性画分試料内のｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチドは、ほとんどカラム内の樹脂に結合した後、溶出されて９０％以上の純度を示した。
【０２５７】
実施例１９．プロテアーゼ処理によるリンカー配列の切断
精製した約５ｍｌのｈＰＴＨ１−８４融合ポリペプチドの画分を合わせた後、１４０ｍｌの希釈緩衝液（２０ｍＭトリス、ｐＨ７．４）を添加して、尿素濃度１Ｍに希釈した。希釈された組換え融合ポリペプチドに、ＴＥＶプロテアーゼを最終濃度５００ｎＭになるように添加し、室温で１２時間切断反応を行った。
【０２５８】
ＴＥＶプロテアーゼによる切断の有無を確認するために、切断後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行い、その結果を図４６に示した。ＴＥＶプロテアーゼによる、ｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチド（ＰＧ１５−ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４）の切断前後をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した結果、１３．２ｋＤａのｈＰＴＨ１−８４融合ポリペプチドは、ほぼ１００％の収率で、アミノ末端融合パートナー、６ヒスチジンタグ及びＴＥＶプロテアーゼ認識配列融合チェーンＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶと、目的ポリペプチドであるｈＰＴＨ  １−８４とに切断されていることが確認された。
【０２５９】
実施例２０．切断後のｈＰＴＨ  １−８４の分子量分析
完全な形態のｈＰＴＨ  １−８４融合ポリペプチド（ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４）の発現の有無、ＴＥＶプロテアーゼによる正確な切断の有無、および切断後に得られたｈＰＴＨ１−８４の変形の有無を確認するために、ＭＡＬＴＩ−ＴＯＦ  ＭＳを用いた分子量分析を実施した。本発明により得られたｈＰＴＨ１−８４の分子量を測定した結果を、図４７に示した。
【０２６０】
図４７を参照すると、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４から得られたｈＰＴＨ  １−８４の分子量は、９４２５．５４Ｄａであると測定され、理論分子量９４２４．７３Ｄａと誤差範囲内で一致しているので、大腸菌内で蛋白質分解酵素（ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｅｎｚｙｍｅ）によるアミノまたはカルボキシ末端の部分切断や分解せずに完全な形態で発現されたことが確認された。
【０２６１】
したがって、ＴＥＶプロテアーゼは、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−８４内の認識配列であるＥＮＬＦＱ配列を認識し、最後のアミノ酸であるＱ（グルタミン）とｈＰＴＨ１−８４の最初のアミノ酸であるＳ（セリン）との間のペプチド結合を正確に切断することで判断される。
【０２６２】
実施例２１．融合パートナーの位置によるｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現レベルの比較
実施例２１．１．ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチド発現プラスミドの追加作製
ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの遺伝子は、オーバーラップ伸長ポリメラーゼ連鎖反応（ＯＥ−ＰＣＲ）法を用いて合成した。このとき、前記ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドには、アミノ末端融合パートナーとしてＰＧ１５（配列番号３１）、６ヒスチジンタグ（配列番号１４０）、ＴＥＶプロテアーゼ認識配列（配列番号１４６）またはｈＰＴＨ  １−３４のアミノ酸配列（配列番号１５１）が含まれている。
【０２６３】
各融合ポリペプチドの遺伝子は、制限酵素ＮｄｅＩ、ＮｃｏＩおよびＸｈｏＩの認識配列と１つの終止コドンを含む。前記ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、それぞれ配列番号２９４および２９５に対応する。
【０２６４】
下記表１１に記載のｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチド発現プラスミドｐＳＧＫ５５４、ｐＳＧＫ５５５、ｐＳＧＫ５５６を作製するために、ＯＥ−ＰＣＲにより合成されたｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチド遺伝子断片を、ＮｄｅＩおよびＸｈｏＩ制限酵素を用いて切断し、Ｔ７プロモーター、ｌａｃオペレータ及びＬａｃＩ遺伝子を含めてＩＰＴＧによる発現調節が可能な発現ベクターｐＥＴ２６ｂにクローニングした。前記ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチド発現プラスミドは、実施例１．１と同様な方法で作製し、温度−８０℃の冷凍庫に保管した。
【０２６５】
【表１１】
2021511785.tif 000019
【０２６６】
実施例２１．２．形質転換された細胞の培養及びｈＰＴＨ  １−３４の発現
前記表２に記載の菌株ＰＧ００１及びＰＧ００３、前記表１２の菌株ＰＧ０３１、ＰＧ０３２及びＰＧ０３３を、それぞれ２００ｍｌのＬＢ培地を含むフラスコで培養し、ＩＰＴＧを添加して、ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現を誘導した。それぞれの融合ポリペプチドの構造を図式化して図４８に示した。
【０２６７】
誘導後、各培養物試料の全細胞画分の発現レベルをＳＤＳ−ＰＡＧＥにより比較分析した（図４８）。アミノ融合パートナーが融合されていないＨ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（５．９ｋＤａの分子量）のバンドは検出されなかったが、Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４のアミノ末端にＰＧ１５タグが融合されたＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（７．９ｋＤａの分子量）は、高いレベルで発現されることが確認された。ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４内の親和性タグであるＨ６（６−ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ  ｔａｇ）が除去されたＰＧ１５−ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（７．１ｋＤａの分子量）は、ＰＧ１５−Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４と類似のレベルで発現されること確認された。
【０２６８】
一方、Ｈ６配列をアミノ末端配列に融合位置を変更させたＨ６ＰＧ１５−ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４（７．９ｋＤａの分子量）の発現レベルは、発現の有無のみを確認できる程度に非常に低いことがわかる。また、Ｈ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４のカルボキシル末端にＰＧ１５タグが融合されたＨ６ＴＥＶ−ｈＰＴＨ１−３４−ＰＧ１５（７．９ｋＤａの分子量）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に当該サイズのバンドが検出されないことから、ほとんど発現していないと判断される。
【０２６９】
結論として、本発明に係るＮ末端融合パートナーであるＰＧ１５は、ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドにおけるアミノ末端に融合されなければ、ｈＰＴＨ  １−３４の高発現を誘導できないことがわかる。また、親和性タグは、ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドから除去されるか、またはＮ末端融合パートナーのカルボキシ末端に位置する場合、ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの高発現性を維持することができる。しかしながら、発現が維持されるが、Ｎ末端融合パートナーのアミノ末端に位置する場合、ｈＰＴＨ  １−３４融合ポリペプチドの発現レベルが顕著に低下することを確認することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３ａ】
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【図３ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図９ａ】
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【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ａ】
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【図１３ｂ】
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【図１４ａ】
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【図１４ｂ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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