(57)【要約】  本技術は、少なくとも二つのチオール官能基を有するビスチオール含有架橋剤を使用して架橋されたマレイミド含有ポリマーから形成された３Ｄプリントヒドロゲル、該３Ｄプリントヒドロゲルを調製するためのプロセス、およびその使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも二つのチオール官能基を有するビスチオール含有架橋剤を使用して架橋されたマレイミド含有ポリマーから形成された３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２】
マレイミド含有ポリマーは、フルクトース、スクロース、またはグルコースモノマーを含有するポリマーを含む、マレイミド含有多糖類；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）マレイミド、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）マレイミド、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）マレイミド、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）マレイミド、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）マレイミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡＭ）マレイミド、ポリ（フマル酸プロピレン）（ＰＰＦ）マレイミド、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）マレイミド、ポリ（３−メタクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム（ＰＭＡＥＴＭＡ）マレイミド、ポリ（L−リジン）（ＰＬＬ）マレイミド、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）マレイミド、ポリ（スチレンスルホナート）（ＰＳＳ）マレイミド、ポリ（アクリル酸−ｓｔａｔ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド）（Ｐ（ＡＡ−ｓｔａｔ−ＤＭＡＥＭＡ））マレイミド、およびポリ（メタクリル酸アルギニン）マレイミド、またはその誘導体を含む、合成ポリマー；ゼラチンマレイミド（ｇｅｌａｔｉｎ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、セルロースマレイミド（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ヒアルロン酸マレイミド、およびアルギン酸マレイミドを含む、マレイミド含有バイオポリマー；アデニン、チアミン、グアニン、および／またはシトシン反復単位を含むマレイミド含有核酸塩基ポリマー；およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項３】
マレイミド含有ポリマーはＰＥＧマレイミドを含む、請求項２に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項４】
マレイミド含有ポリマーはゼラチンマレイミド（ｇｅｌａｔｉｎ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）を含む、請求項２に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項５】
前記ビスチオール含有架橋剤は、合成ポリマー、バイオポリマー、小分子、生理活性分子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項６】
前記合成ポリマーは、ＰＥＧビスチオール（ＰＥＧ−ｂｉｓ−ｔｈｉｏｌ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ビスチオール（ＮＩＰＡＡＭビスチオール）、ポリ（アクリル酸）ビスチオール、ポリ（メタクリル酸）ビスチオール、ポリ（スチレンスルホナート）ビスチオール、ポリ（アミド）ビスチオール、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項７】
前記ビスチオール含有架橋剤はＰＥＧビスチオールである、請求項６に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項８】
前記バイオポリマーはチオール−ゼラチン、チオール−セルロース、チオール−キトサン、チオール−ヒアルロン酸、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項９】
前記小分子はジチオスレイトール（ＤＴＴ）である、請求項５に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１０】
前記生理活性分子は、少なくとも二つのシステインアミノ酸基を有する短鎖ペプチド、不活性短鎖ペプチド、酵素感受性短鎖ペプチド、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）感受性ペプチド、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項５に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１１】
前記生理活性分子は、ＭＭＰ感受性ビスシステインペプチドである、請求項１０に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１２】
前記ＭＭＰ感受性ペプチドは、ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ、ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＥＡＰＬＫＱＤＲＣＧ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１１に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１３】
前記マレイミド含有ポリマーはＰＥＧマレイミドであり、ビスチオール含有架橋剤はＰＥＧビスチオール、ＭＭＰ感受性ペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１４】
前記マレイミド含有ポリマーは、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、およびＩＫＶＡＶから選択される少なくとも一つの生理活性分子で置換されたＰＥＧマレイミドであり、前記ビスチオール含有架橋剤は、ＰＥＧビスチオール、ＭＭＰ感受性ペプチド、およびそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１５】
ＭＭＰ感受性ペプチドは、ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ、ＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ、またはそれらの組み合わせである、請求項１３または１４に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１６】
前記マレイミド含有ポリマーはゼラチンマレイミドであり、ビスチオール含有架橋剤はＰＥＧビスチオールである、請求項１に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１７】
マレイミド含有ポリマーとビスチオール含有架橋剤のモル比が１０：１から１：１０の範囲である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１８】
細胞を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１９】
前記細胞はヒドロゲルの一部内に懸濁されている、または前記細胞は実質的にヒドロゲル全体に均一に懸濁されている、請求項１８に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２０】
印刷された細胞の濃度は１×１０5〜５×１０8細胞／ｍＬの範囲にある、請求項１８または１９に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２１】
前記細胞は、肝細胞、胃腸細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、泌尿生殖器細胞、乳房細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周皮細胞、中皮細胞、内分泌組織由来細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、リンパ細胞、血液細胞、内胚葉由来細胞、外肺葉由来細胞、および中胚葉由来細胞、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２２】
生理活性分子をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２３】
前記生理活性分子は、遊離生理活性分子である、またはマレイミド含有ポリマー、ビスチオール含有架橋剤、またはマレイミド含有ポリマーおよびビスチオール含有架橋剤の両方に結合している、請求項２２に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２４】
前記生理活性分子は、ペプチド、ＭＭＰ感受性ペプチド、タンパク質、多糖類、薬剤（ｄｒｕｇ）、治療薬（therapeutic agent）、抗体、小分子阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、抗原、病原体、血小板、成長因子、サイトカイン、アミノ酸、栄養素、馴化培地、抗生物質、抗ウイルス薬、ＲＮＡ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２５】
前記生理活性分子はコラーゲンである、請求項２４に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２６】
細胞培養培地をさらに含む、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２７】
マレイミド含有ポリマーを含むポリマーバイオインクを提供する工程；
少なくとも二つのチオール官能基を有するビスチオール含有架橋剤を含む活性化剤を提供する工程；および
ポリマーバイオインクおよび活性化剤を印刷して３Ｄプリントヒドロゲルを形成する工程
を含む、３Ｄプリントヒドロゲルを調製する方法。
【請求項２８】
細胞を提供して、細胞含有３Ｄプリントヒドロゲル（３D ｐｒｉｎｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）を形成する工程をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞は、ポリマーバイオインク中、活性化剤中、ポリマーバイオインクおよび活性化剤の両方の中、または３Ｄ印刷の前の別個の培地（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ３Ｄ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）の中に存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記３Ｄプリントヒドロゲルは、ポリマーバイオインクと活性化剤の印刷から３０分以内、または１０分以内、または１分以内、または３０秒以内、または１０秒以内、または１秒以内で形成される、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ポリマーバイオインク、活性化剤、またはその両方を印刷前に約ｐＨ７．４に調整する、請求項２７〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ｐＨはＮａＯＨを使用して調整される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の細胞を含む３Ｄプリントヒドロゲルを含む細胞アッセイ。
【請求項３４】
細胞アッセイのための、請求項１８〜２１のいずれか一項に記載の細胞を含む３Ｄプリントヒドロゲルの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１８年７月２４日に出願された「３Ｄ印刷用のバイオインク」と題されたオーストラリア仮特許出願第２０１８９０２６７４号からの優先権を主張し、その全内容は相互参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本技術は３Ｄバイオプリンティングのためのバイオインクに広く関連している。特に、この技術は、架橋剤を使用して架橋されたポリマーから形成された３Ｄ印刷されたヒドロゲル、ヒドロゲルを調製するためのプロセス、およびそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞外マトリックス（ＥＣＭ）内に三次元的に存在する。細胞とＥＣＭの間の相互作用は、細胞の生物学的特性および挙動を制御する上で重要な役割を果たす。がん生物学では、三次元（３Ｄ）  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイを使用して、細胞の本来の環境を厳密に模倣した環境で細胞を培養する。このようなアッセイは、二次元単層培養には存在しない生理学的な細胞間相互作用および細胞・マトリックス相互作用を維持する。
【０００４】
３Ｄバイオプリンティングは、３Ｄ印刷技術を使用して、細胞および他の生体材料を組み合わせて、ＥＣＭを模倣する合成構造を調製する。一般的に、３Ｄバイオプリンターは、ドロップオンデマンドまたは押出し印刷技術のいずれかを利用して、３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを印刷する。ドロップオンデマンドバイオプリンティングは、印刷時に高い細胞生存率を維持することが報告されているが、現在の３Ｄバイオインクの粘度の低さおよび細胞密度の低さのため、この手法は押出しのバイオプリンティングと比較してあまり一般的に利用されていない。
【０００５】
合成および天然の両方のヒドロゲルは、ＥＣＭ模倣物として広く使用されてきた。特に、合成ヒドロゲルは再現性が高く、物理的および細胞応答性の優れた制御を提供できる。これは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究のＥＣＭ模倣物として非常に望ましい。３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを手動で作成するための現在のアプローチでは、ＥＣＭ模倣物として主にマトリゲル（登録商標）またはコラーゲンを利用している。広く使用されている他の材料は、ヒアルロン酸、キトサン、およびアルギン酸塩である。それらは天然物から供給されるため、天然ヒドロゲルは通常生体適合性があり、場合によっては、細胞・マトリックス相互作用に必要な生体分子を輸送する。しかしながら、天然のヒドロゲルは、バッチ間のばらつきの影響を受けやすく、物理的および生化学的モジュール性に欠け、および／または取り扱いが難しいため、ＥＣＭ模倣物としての制限がある。
【０００６】
天然ヒドロゲルの様々な制限を克服するために、様々な合成ヒドロゲルが調製されてきた。特に、共有結合で架橋された合成ヒドロゲルは、天然のヒドロゲルよりも堅牢および機械的に正確なシステムを提供できる。しかしながら、これらの合成ヒドロゲルの多くは、細胞・マトリックス相互作用を促進する生化学的特性を欠いている。さらに、共有結合で架橋された合成ヒドロゲルを細胞の３Ｄバイオプリンティングに適用するには、細胞をヒドロゲル内でその場で印刷できるようにするために、材料が生体適合性である必要がある。たとえば、ポリ（アクリルアミド）は細胞生物学で使用される生体適合性の合成ヒドロゲルであるが（Ｃａｌｉａｒｉ  ａｎｄ  Ｂｕｒｄｉｃｋ、２０１６）、対応するヒドロゲル前駆体は生体適合性がないため、細胞の３Ｄバイオプリンティングには不適である。
【０００７】
３Ｄバイオプリンティングへの現在のアプローチは、迅速なヒドロゲル形成を可能にするＵＶ開始ラジカル架橋反応を含む（Ｍｕｒｐｈｙ  ａｎｄ  Ａｔａｌａ，  ２０１４；  Ｄｏｎｄｅｒｗｉｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１７：  Ｊｕｎｇｓｔ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１６  Ｌｏｗｅ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１４）。たとえば、光架橋性のアクリレート化ＰＥＧおよびペプチドのインクジェット印刷は、間葉系幹細胞をカプセル化するための３Ｄヒドロゲルコンストラクトの生成に好適であることが見出された（Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１７；  Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ，  ２０１５）。しかしながら、生細胞の３Ｄバイオプリンティングにこのアプローチを使用する可能性が示されている一方で、ＵＶ照射を使用して光架橋を開始すると、生体内のＤＮＡに損傷を与える可能性があり、生成されたフリーラジカルも感受性細胞に損傷を与える可能性がある。
【０００８】
３Ｄバイオプリンティングの進歩は、近年顕著であり、３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養アッセイへの現在のアプローチの制限を緩和する可能性がある。しかしながら、３Ｄ印刷された細胞培養の利点は十分に確立されているが、細胞生物学における３Ｄ印刷されたｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの利用は、その複雑さ、労働集約的、および低スループットの性質によって依然として制約されている。したがって、３Ｄバイオプリンティングで使用するための代替ＥＣＭ模倣物に対するニーズがある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明者らは、生体適合性があり、実質的に非毒性の化学的経路を介してヒドロゲルを迅速に形成することができる、３Ｄ印刷に好適なバイオインクを開発した。
【００１０】
第一の態様では、本技術は、少なくとも二つのチオール官能基を有するビスチオール含有架橋剤を使用して架橋されたマレイミド含有ポリマーから形成された３Ｄプリントヒドロゲルを提供する。
【００１１】
架橋剤を含むビスチオールは、二つより多いチオール官能基を含んでもよい。
【００１２】
一つの実施形態では、３Ｄプリンターを使用して、マレイミド含有ポリマー（ポリマーバイオインク）を含む溶液とビスチオール含有架橋剤（活性化剤）を含む溶液とを組み合わせると、ヒドロゲルの形成が起こる。
【００１３】
一つの実施形態では、３Ｄプリントされたヒドロゲルは、ポリマーバイオインクおよび活性化剤の印刷から約３０分以下、または１０分以下、または１分以下、または３０秒以下、または１０秒以下、または１秒以下で形成される。
【００１４】
一つの実施形態では、ポリマーバイオインクは、細胞と生体適合性である。
【００１５】
一つの実施形態では、活性化剤は、細胞と生体適合性である。
【００１６】
一つの実施形態では、３Ｄ印刷中に組み合わされると、ポリマーバイオインクおよび活性化剤は、細胞と生体適合性であるヒドロゲルを形成する。
【００１７】
一つの実施形態では、マレイミド含有ポリマーは、マレイミド含有多糖類、たとえばフルクトース、スクロース、またはグルコースモノマーを含有するポリマー；合成ポリマー、たとえばポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）マレイミド、ポリ（メタクリル酸ヒドロキシエチル）（ＰＨＥＭＡ）マレイミド、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）マレイミド、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）マレイミド、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）マレイミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡＭ）マレイミド、ポリ（フマル酸プロピレン）（ＰＰＦ）マレイミド、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）マレイミド、ポリ（３−メタクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム（ＰＭＡＥＴＭＡ）マレイミド、およびポリ（L−リジン）（ＰＬＬ）マレイミド、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）マレイミド、ポリ（スチレンスルホナート）（ＰＳＳ）マレイミド、ポリ（アクリル酸−ｓｔａｔ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド）（Ｐ（ＡＡ−ｓｔａｔ−ＤＭＡＥＭＡ））マレイミド、およびポリ（メタクリル酸アルギニン）マレイミド、またはその誘導体；マレイミド含有バイオポリマー、たとえばゼラチンマレイミド（ｇｅｌａｔｉｎ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、セルロースマレイミド（ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）、ヒアルロン酸マレイミド、およびアルギン酸マレイミド；およびマレイミド含有核酸塩基ポリマー（すなわち、アデニン、チアミン、グアニン、および／またはシトシン反復単位のポリマーを含むマレイミド）；およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００１８】
一つの実施形態では、マレイミド含有ポリマーは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）マレイミドを含む。
【００１９】
一つの実施形態では、マレイミド含有ポリマーは、ゼラチンマレイミドを含む。
【００２０】
一つの実施形態では、ビスチオール含有架橋剤は、合成ポリマー、バイオポリマー、小分子、生理活性分子、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００２１】
一つの実施形態では、合成ポリマーは、ＰＥＧビスチオール（ＰＥＧ−ｂｉｓ−ｔｈｉｏｌ）、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ビスチオール（ＮＩＰＡＡＭビスチオール）、ポリ（アクリル酸）ビスチオール、ポリ（メタクリル酸）ビスチオール、ポリ（スチレンスルホナート）ビスチオール、ポリ（アミド）ビスチオール、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。一つの実施形態では、ビスチオール含有架橋剤はＰＥＧビスチオールである。
【００２２】
一つの実施形態では、バイオポリマーはチオール−ゼラチン、チオール−セルロース、チオール−キトサン、チオール−ヒアルロン酸、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００２３】
一つの実施形態では、小分子はジチオスレイトール（ＤＴＴ）である。
【００２４】
一つの実施形態では、生理活性分子は、少なくとも二つのシステインアミノ酸基を有する短鎖ペプチド、不活性短鎖ペプチド、酵素感受性短鎖ペプチド、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）感受性ペプチド、またはそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００２５】
一つの実施形態では、ビスチオール含有生理活性分子は、ＭＭＰ感受性ビスシステインペプチドから選択される。
【００２６】
一つの実施形態では、ＭＭＰ感受性ペプチドは、ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ、ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＥＡＰＬＫＱＤＲＣＧ、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００２７】
一つの実施形態では、マレイミド含有ポリマーはＰＥＧマレイミドであり、ビスチオール含有架橋剤は、ＰＥＧビスチオール、ＭＭＰ感受性ペプチド、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。
【００２８】
一つの実施形態では、マレイミド含有ポリマーは、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、およびＩＫＶＡＶから選択される少なくとも一つの生理活性分子で置換されたＰＥＧマレイミドであり、ビスチオール含有架橋剤は、ＰＥＧビスチオール、ＭＭＰ感受性ペプチド、およびそれらの組み合わせから選択される。
【００２９】
一つの実施形態では、ＭＭＰ感受性ペプチドは、ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ、ＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ、またはそれらの組み合わせである。
【００３０】
一つの実施形態では、マレイミド含有ポリマーはゼラチンマレイミドであり、ビスチオール含有架橋剤はＰＥＧビスチオールである。
【００３１】
一つの実施形態では、マレイミド含有ポリマーとビスチオール含有ポリマーのモル比は約１０：１から約１：１０の範囲である。マレイミド含有ポリマー（単数または複数）中のマレイミド基に対するビスチオール含有架橋剤（単数または複数）中のチオール基の比率は、約６０％を超えてもよい。
【００３２】
一つの実施形態では、ヒドロゲルは、ポリマーバイオインクの一滴を基板上に印刷し、続いて活性化剤の一滴を印刷してヒドロゲル液滴を形成することによって形成することができ、または活性化剤の一滴を基板に適用し、続いてヒドロゲルを形成するためのポリマーバイオインクの一滴を適用することができる。印刷工程を繰り返すと、ヒドロゲルが形成される。印刷プロセス中、細胞は、ポリマーバイオインク、活性化剤、またはポリマーバイオインクおよび活性化剤の両方に含めることができる。追加的または代替的に、細胞は細胞培養培地に含まれていてもよい。細胞培養培地は、ポリマーバイオインク、活性化剤に含まれていてもよく、またはポリマーバイオインクおよび活性化剤から分離されていてもよい。たとえば、細胞培養培地は、ポリマーバイオインクおよび活性化剤から形成された３Ｄ印刷されたヒドロゲルの層間に懸濁されていてもよく、またはヒドロゲルの表面上に堆積されていてもよい。
【００３３】
一つの実施形態では、基板は、任意の好適な容器から選択される。例は、異なるウェル構成（６、２４、４８、および９６ウェル）のマイクロタイタープレート、異なるウェル構成（６、２４、４８、および９６ウェル）のカバーガラス底部を備えたマイクロタイタープレート、様々なサイズのフルオロディッシュ、異なるチャンバー構成（１、２、４、８、および１６）のチャンバースライド、カバーガラス、または顕微鏡スライドを含む。容器は、細胞を収容、保持、または増殖させるのに好適であってもよい。
【００３４】
一つの実施形態では、３Ｄプリントヒドロゲルは、生理活性分子をさらに含む。生理活性分子は、マレイミド含有ポリマー、ビスチオール含有架橋剤、またはマレイミド含有ポリマーとビスチオール含有架橋剤の両方に結合してもよい。追加的または代替的に、遊離の生理活性分子が３Ｄプリントヒドロゲルに存在してもよい。遊離の生理活性分子は、ポリマーバイオインク、活性化剤、またはその両方に存在してもよい。生理活性分子は、ペプチド、ＭＭＰ感受性ペプチド、タンパク質、多糖類、薬剤（ｄｒｕｇ）、治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗体、小分子阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、抗原、病原体、血小板、成長因子、サイトカイン、アミノ酸、栄養素、馴化培地、抗生物質、抗ウイルス薬、ＲＮＡ、およびそれらの任意の組み合わせから選択することができる。ナノ粒子はまた、３Ｄプリントヒドロゲルに組み込むこともできる。
【００３５】
一つの実施形態では、生理活性分子は、ＣＲＧＤＳ、ＣＩＫＶＡＶ、ＣＹＩＧＳＲ、Ｃ末端不対システインを有するＶＥＧＦ、タンパク質（たとえば、ラミニン、コラーゲン）、およびＭＭＰ感受性ペプチド（たとえば、ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ、ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＥＡＰＬＫＱＤＲＣＧ）；およびそれらの任意の組み合わせから選択される。
【００３６】
一つの実施形態では、３Ｄプリントヒドロゲルは、細胞培養培地をさらに含む。好適な培養培地の例は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｄｉａ  １９９培地、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、マッコイ５Ａ培地、およびロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地をさらに含む。細胞培養培地は、ポリマーバイオインク、活性化剤、または両方に存在してもよい。
【００３７】
一つの実施形態では、ヒドロゲルは細胞を含む。
【００３８】
一つの実施形態では、細胞は、ポリマーバイオインク中、活性化剤中、ポリマーバイオインクと活性化剤の両方の中、または３Ｄ印刷の前の別個の培地（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ３Ｄ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）中に存在し、細胞を含むヒドロゲルの印刷を可能にする。
【００３９】
一つの実施形態では、細胞は、ヒドロゲル全体に実質的に均一に懸濁されている。
【００４０】
印刷された細胞の濃度は約１×１０5〜約５×１０8細胞／ｍＬの範囲にあってもよい。より低いまたはより高い濃度の細胞を印刷して、細胞を含む印刷されたヒドロゲルを形成することができることが理解されよう。
【００４１】
一つの実施形態では、細胞は、肝細胞、胃腸細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、泌尿生殖器細胞、乳房細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周皮細胞、中皮細胞、内分泌組織由来細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、リンパ細胞、血液細胞、内胚葉由来細胞、外肺葉由来細胞、および中胚葉由来細胞、ならびにそれらの任意の組み合わせから選択することができる。
【００４２】
第二の態様では、本技術は、３Ｄプリントされたヒドロゲルを調製する方法を提供し、該方法は、以下の工程を含む：
マレイミド含有ポリマーを含むポリマーバイオインクを提供する工程；
少なくとも二つのチオール官能基を有するビスチオール含有架橋剤を含む活性化剤を提供する工程；および
ポリマーバイオインクおよび活性化剤を印刷して３Ｄプリントヒドロゲルを形成する工程。
【００４３】
一つの実施形態では、本方法は、細胞を提供して、細胞含有３Ｄプリントヒドロゲル（３Ｄ  ｐｒｉｎｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）を形成する工程をさらに含む。細胞は、ポリマーバイオインク中、活性化剤中、ポリマーバイオインクおよび活性化剤の両方の中、または３Ｄ印刷の前の別個の培地（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ３Ｄ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）の中に存在してもよい。
【００４４】
一つの実施形態では、３Ｄプリントヒドロゲルは、ポリマーバイオインクと活性化剤の印刷から３０分以内、または１０分以内、または１分以内、または３０秒以内、または１０秒以内、または１秒以内で形成される。
【００４５】
一つの実施形態では、ポリマーバイオインク、活性化剤、またはその両方を印刷前に約ｐＨ７．４に調整する。
【００４６】
一つの実施形態では、ｐＨはＮａＯＨを使用して調整される。
【００４７】
本方法は、第一の態様による３Ｄプリントヒドロゲルの調製に使用することができる。
【００４８】
第三の態様では、本技術は、３Ｄ印刷のためのキットを提供し、該キットは、以下を含む：
マレイミド含有ポリマーを含むポリマーバイオインク；および
少なくとも二つのチオール官能基を有するビスチオール含有架橋剤を含む活性化剤。
【００４９】
一つの実施形態では、キットは、細胞をさらに含む。
【００５０】
一つの実施形態では、キットは、印刷基材（ｐｒｉｎｔｉｎｇ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）をさらに含む。
【００５１】
第四の態様では、本技術は、第一の態様による細胞含有３Ｄプリントヒドロゲル（３Ｄ  ｐｒｉｎｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）を含む細胞アッセイを提供する。
【００５２】
第五の態様では、本技術は、細胞アッセイのための第一の態様による細胞含有３Ｄプリントヒドロゲル（３Ｄ  ｐｒｉｎｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）の使用を提供する。
【００５３】
定義
以下は、本明細書を理解するのに役立ちうる、当技術分野で使用される用語のいくつかの定義である。これらは一般的な定義として意図されており、本発明の範囲をそれらの用語のみに限定するものではなく、以下の説明をよりよく理解するために提示されている。
【００５４】
文脈上、別段または反対の記載を必要としない限り、本明細書で単数整数、工程、または要素として列挙される、本発明の整数、工程、または要素は、列挙された整数、工程、または要素の単数および複数の形態の両方を明らかに包含する。
【００５５】
本明細書で使用する場合、用語「約」は、記載された値の±１０％を意味する。
【００５６】
本明細書で使用する場合、用語「架橋剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）」および「架橋剤（ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」は、互換的に使用され、マレイミド含有ポリマーを共有結合的に架橋することができる化合物を意味する。本技術の架橋剤は、少なくとも２つのチオール官能基を含み、本明細書では「ビスチオール含有架橋剤（ｂｉｓ−ｔｈｉｏｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｅｒ）」または「ビスチオール含有架橋剤（ｂｉｓ−ｔｈｉｏｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｒｏｓｓ−ｌｉｎｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）」と呼ばれる。ビスチオール含有架橋剤は、２つより多いチオール官能基、たとえば、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上のチオール官能基を含んでもよい。
【００５７】
本明細書で使用する場合、用語「ポリマーバイオインク」は、マレイミド含有ポリマー、または２つ以上のマレイミド含有ポリマーの組み合わせを含む溶液、好ましくは水溶液を指す。本明細書で使用する場合、用語「活性化剤」は、少なくとも一つのビスチオール含有架橋剤を含む溶液、好ましくは水溶液を指す。ポリマーバイオインクと本技術の活性化剤を混合すると、すなわち３Ｄ印刷中に、チオール−マレイミド架橋反応が起こり、ヒドロゲルが形成される。
【００５８】
本明細書で使用する場合、物質に関する「生体適合性」という用語は、物質が生細胞または組織に対して実質的に無毒であることを意味する。
【００５９】
本明細書で使用する場合、用語「生理活性分子」は、培養細胞で使用することができる生物学的活性を有する分子を指す。
【００６０】
本明細書で使用する場合、用語「細胞ポリマーバイオインク」は、少なくとも一つのマレイミド含有ポリマーを含むポリマーバイオインクと混合した細胞を指す。本明細書で使用する場合、用語「細胞活性化剤」は、少なくとも一つのビスチオール含有架橋剤を含む活性化剤と混合した細胞を指す。本技術の細胞ポリマーバイオインクおよび細胞活性化剤は、一つ以上の種類の生理活性分子の水溶液であってもよく、その中に細胞が懸濁され、３Ｄバイオプリンティングプロセス全体を通じて懸濁されたままであってもよい。
【００６１】
用語「細胞培養培地」は、細胞を貯蔵、維持、生育、または培養するために使用することができる液体を指す。
【００６２】
本明細書で使用する場合、３Ｄバイオプリンティングに関する「トロップオンデマンド」という用語は、バイオインクの送達が個別の液滴の生成に基づく印刷プロセスを指す。ドロップオンデマンドバイオプリンティングは、サーマルインクジェット、ピエゾインクジェット、およびマイクロバルブベースのバイオプリンティングを含むが、これらに限定されない。
【００６３】
本明細書および特許請求の範囲の全体にわたって値の範囲が与えられている場合、列挙された範囲は、その範囲内の任意の値を含むことを意図している。
【００６４】
本明細書に含まれている文書、行為、材料、装置、物品等の考察は、本発明の文脈を提供することのみを目的としている。これらの事項のいずれかまたはすべてが先行技術の基礎の一部を形成すること、または本明細書の各請求項の優先日より前に存在した本発明に関連する分野の一般的な知識であったことを認めるものと見なされるべきではない。
【００６５】
本明細書の全体を通して、文脈が別段の定めをしない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」等の変形は、記載された要素、整数、もしくは工程、または要素、整数、もしくは工程の群を含むことを意味するが、他の要素、整数、もしくは工程、または要素、整数、もしくは工程の群を除外することはない。
【００６６】
用語「からなる」は、「のみからなる」を意味する。つまり、指定された要素、整数、または工程を含み、これらに限定され、他の要素、整数、または工程は除外される。用語「本質的にからなる」は、記載された要素、整数、または工程を含むことを意味するが、本発明の作用を実質的に改変または寄与しない他の要素、整数、または工程も含まれてもよい。
【００６７】
本技術をより明確に理解するために、以下の図面および実施例を参照して、好ましい実施形態を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００６８】
【図１】図１は、３Ｄバイオプリンティングプロセスの代表的な模式図（ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ  ｓｃｈｅｍａｔｉｃ）である。
【図２】図２は、（ａ）ＵＶ分析；および（ｂ）ＣＲＧＤＳによる４アームＰＥＧ−Ｍａｌの修飾の1Ｈ  ＮＭＲによるＣＲＧＤＳ共役解析（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｅｓ）の定量化を示す。
【図３】図３は、２．５ｍＭ  ＲＧＤ（１０重量％）を含む４アームＰＥＧ−Ｍａｌヒドロゲルから調製され、ＰＥＧビスチオールおよびＭＭＰ２応答性ビスシステインペプチドで架橋されたヒドロゲル（５０：５０のチオールモル濃度で混合）の流動学的研究の（ａ）周波数；（ｂ）ひずみ；（ｃ）剛性；および（ｄ）粘性の結果を示す。
【図４】図４は、（ａ）ＰＥＧビスチオールで架橋された７．５重量％のブランク４アームＰＥＧ−Ｍａｌヒドロゲル、および（ｂ）ＭＭＰ感受性ビスシステインペプチド活性化剤で架橋されたＰＥＧトリペプチドヒドロゲルの剛性流動学的研究の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６９】
本技術は、３Ｄプリントヒドロゲルに関する。３Ｄプリントヒドロゲルは、長期間にわたって細胞の生存率を維持できる可能性がある。本技術のヒドロゲルは、生体適合性があり、印刷時にヒドロゲルを迅速に形成するポリマーバイオインクおよび活性化剤の３Ｄ印刷によって調製され、３Ｄ細胞構造およびアッセイの高スループット生成を可能にする。
【００７０】
特に、本発明者らは、ビスチオール含有架橋剤を使用して共有結合的に架橋されたマレイミド含有ポリマーが、生理学的条件下で、今日反応物の助けを借りずに、生体適合性の架橋経路を介した、均一なヒドロゲルの迅速な形成を可能にし、有毒な副産物を生成しないことを見出した。したがって、本技術の３Ｄプリントヒドロゲルは、マレイミド含有ポリマーを含むポリマーバイオインクと、少なくとも２つのチオール官能基を有するビスチオール含有架橋剤を含む活性化剤とを組み合わせることによって形成される。
【００７１】
ポリマーバイオインク
本技術のポリマーバイオインクは、マレイミド含有ポリマー、または組み合わせ、または二つ以上のマレイミド含有ポリマーを含む。マレイミド含有ポリマーは、ヒドロゲルの形成のためのマレイミド反応基を含む任意のポリマーであってもよい。遊離マレイミド基を含むポリマーもヒドロゲル中に存在してもよい。
【００７２】
様々な分子量、分子構造、分子分布、および機能性のポリマーを含むマレイミドを、ポリマーバイオインクに使用することができる。たとえば、マレイミド含有ポリマーの分子量は、約１ｋＤａから約１０，０００ｋＤａ、または約５ｋＤａから約１０，０００ｋＤａ、または約５ｋＤａから約５，０００ｋＤａ、または約５ｋＤａから約１，０００ｋＤａ、または約１０ｋＤａから約５００ｋＤａの範囲でありうる。マレイミド含有ポリマーは、とりわけ、任意の好適な分子構造、たとえば、線状ポリマー、ブロックポリマー、分岐ポリマー、星型ポリマー、環状ポリマー、コーム、またはブラシポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを有してもよい。ポリマー骨格に沿ったモノマー単位の分布を指す分子分布は、とりわけ、ホモ、ブロック、統計的、ランダム、またはマルチブロック分布、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよい。機能性（すなわち、モノマーのタイプ）は、とりわけ、ヒドロキシル、アミン、チオールカルボン酸、アルケン、アルキン、および多員炭素環を含みうるが、これらに限定されない。ポリマーは、１つの官能性、または２つ以上の官能性（すなわち、コポリマー）を含んでもよい。
【００７３】
一つの実施形態では、マレイミド含有ポリマーは、生体適合性である。
【００７４】
マレイミド含有ポリマーは、２つ以上のマレイミド反応基をポリマーに組み込むことによって合成的に調製される。２つ以上のマレイミド基は、当技術分野で知られている任意の好適な方法、たとえば、カルボジイミドカップリング、シュテークリヒエステル化、および過剰のビスマレイミド分子とのチオール−マレイミドカップリングによってポリマーに組み込むことができる。追加的または代替的に、市販のマレイミド含有ポリマーを使用することができる。
【００７５】
本技術のポリマーバイオインクにおける使用のための好適なマレイミド含有ポリマーの非限定的な例は、フルクトース、スクロース、またはグルコースモノマーを含むポリマー等のマレイミド含有多糖類；ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）マレイミド、ポリ（ヒドロキシエチルメタクリレート（ＰＨＥＭＡ）マレイミド、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）マレイミド、ポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）マレイミド、ポリ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）マレイミド、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）（ＮＩＰＡＡＭ）マレイミド、ポリ（プロピレンフマレート）（ＰＰＦ）マレイミド、ポリ（エチレンイミン）（ＰＥＩ）マレイミド、ポリ（３−メタクリルアミドプロピル）トリメチルアンモニウム（ＰＭＡＥＴＭＡ）マレイミド、ポリ（L−リジン）（ＰＬＬ）マレイミド）、ポリ（アクリル酸）（ＰＡＡ）マレイミド、ポリ（スチレンスルホネート）（ＰＳＳ）マレイミド）、ポリ（アクリル酸−ｓｔａｔ−ジメチルアミノエチルメタクリルアミド）（Ｐ（ＡＡ−ｓｔａｔ−ＤＭＡＥＭＡ））マレイミド、およびポリ（アルギニンメタクリレート）マレイミド、またはそれらの誘導体等の合成ポリマー；ゼラチンマレイミド、セルロースマレイミド、ヒアルロン酸マレイミド、およびアルギン酸マレイミド等のマレイミド含有バイオポリマー；およびマレイミド含有核酸塩基ポリマー（すなわち、アデニン、チアミン、グアニン、および／またはシトシン繰り返し単位のマレイミド含有ポリマー）；またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００７６】
ＰＥＧは、市販されており、不活性であり、生物学的用途において無毒であり、そして様々な化学修飾に対して多用途であるため、ＥＣＭ模倣物として合成ヒドロゲルの調製にとって特に魅力的な材料である。さらに、ＰＥＧベースのポリマーバイオインクは、ＰＥＧポリマー前駆体の分子量が低いために相対粘度が低く、ドロップオンデマンドバイオプリンティングに特に好適である可能性がある。したがって、一つの実施形態では、マレイミド含有ポリマーは、少なくとも２つのマレイミド反応基（ＰＥＧ−マレイミド）を含むポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）ポリマーである。ＰＥＧ−マレイミドは、３アームＰＥＧマレイミド、４アームＰＥＧマレイミド、少なくとも２つのマレイミド基を有するＰＥＧのブロックコポリマー、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない、任意の好適な分子構造を有してもよい。ＰＥＧ基は、任意の好適な分子量を有してもよい。たとえば、ＰＥＧ基の分子量は、約１ｋＤａから約５０ｋＤａ、または約１ｋＤａから約４０ｋＤａ、または約１ｋＤａから約３０ｋＤａ、または約５ｋＤａから約３０ｋＤａ、または約５ｋＤａから約２０ｋＤａ、または約５ｋＤａから約１０ｋＤａ、または約１０ｋＤａから約２０ｋＤａの範囲であってもよい。一つの実施形態では、ＰＥＧ基の分子量は、約５ｋＤａ、または約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａである。
【００７７】
用語「３アームＰＥＧマレイミド」は、以下の構造（ｎ＝３８−３、７８８）：
【００７８】
【化１】
2021531780.tif 000002
【００７９】
を有するポリマー化合物を指す。
【００８０】
用語「４アームＰＥＧマレイミド」は、以下の構造（ｎ＝２８−２、８４１）：
【００８１】
【化２】
2021531780.tif 000003
【００８２】
を有するポリマー化合物を指す。
【００８３】
マレイミド含有ポリマーの特性は、マレイミド基を１つまたは複数の官能基または他の部分で部分的に修飾することによって、特定の用途に合わせて調整することができる。部分的修飾とは、ビスチオール含有架橋剤との架橋のために、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのマレイミド基がインタクトなままであることを意味する。したがって、生理活性分子がマレイミド含有ポリマーに組み込まれる場合、マレイミド含有ポリマーは、少なくとも２つ、典型的には少なくとも３つのマレイミド基を含む。このアプローチにより、ポリマーの再現性およびモジュール性を維持しながら、関連する生物学的特性を３Ｄプリントヒドロゲルに導入することができる。したがって、一つの実施形態では、マレイミド含有ポリマーのマレイミド基は、１つまたは複数の生理活性分子で部分的に修飾されてもよい。
【００８４】
本技術のポリマーバイオインクは、当技術で知られている任意の好適な処方でマレイミド含有ポリマーを含む水溶液として調製することができる。たとえば、ポリマーバイオインクは、少なくとも１つのマレイミド含有ポリマー、および、任意選択で、１つ以上の生理活性分子を含む水性製剤として調製することができる。たとえば、水性製剤は、ｐＨ緩衝液または細胞培養培地中にマレイミド含有ポリマーを含む溶液であってもよい。一部の実施形態では、ポリマーバイオインクは、２つのマレイミド含有ポリマーを任意の比率、たとえば約１０：１から約１：１０の間の比率、例として、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０で含んでもよい。
【００８５】
一つの実施形態では、ポリマーバイオインクは、マレイミド含有ポリマーを含む水溶液の形態で提供される。典型的には、ポリマーバイオインクは、マレイミド含有ポリマーを溶液、好ましくは培養培地に溶解させることによって調製される。一部の実施形態では、ポリマーバイオインクは、２つ以上のマレイミド含有ポリマーの混合物を含んでもよい。ポリマーバイオインクは、溶液中に任意の好適な濃度のマレイミド含有ポリマーを含んでもよい。たとえば、ポリマーバイオインク溶液中のマレイミド含有ポリマーの濃度は、約１重量％から５０重量％、または約１％から４０重量％、または約１重量％から約３０重量％、約５重量％から２０重量％、約５重量％から１５重量％、または約１０重量％から２０重量％の範囲であってもよい。ポリマーバイオインクは、マレイミド含有ポリマーに共有結合する１つ以上の生理活性分子を含んでもよい。追加的または代替的に、ポリマーバイオインクは、溶液中に１つ以上の遊離生理活性分子を含んでもよい。ポリマーバイオインク中の生理活性分子の濃度は、約０．１ｍＭから１０ｍＭ、約０．５ｍＭから１０ｍＭ、約１ｍＭから１０ｍＭ、約１ｍＭから５ｍＭ、やく２ｍＭから５ｍＭ、または約２ｍＭから３Ｍの範囲であってもよい。
【００８６】
一つの実施形態では、ポリマーバイオインクは、滅菌溶液として調製される。滅菌溶液を調製するための好適な方法、またはポリマーバイオインクを滅菌する方法は、当業者に知られているであろう。
【００８７】
一つの実施形態では、ポリマーバイオインクは生体適合性である。
【００８８】
活性化剤
本技術の活性化剤は、ビスチオール含有架橋剤を含む。ビスチオール含有架橋剤は、本明細書でビスチオールと呼ばれる、少なくとも２つのチオール基を含む任意の化合物であってもよい。好ましくは、チオール基は、末端チオール基である。
【００８９】
一つの実施形態では、ビスチオール含有架橋剤は、生体適合性である。
【００９０】
一つの実施形態では、ビスチオール含有架橋剤は、ビスチオール含有ポリマー、好ましくは末端ビスチオール含有合成ポリマーであってもよい。好適なビスチオール含有合成ポリマーは、ＰＥＧビスチオール、ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）ビスチオール（ＮＩＰＡＡＭビスチオール）、ポリ（アクリル酸）ビスチオール、ポリ（メタクリル酸）ビスチオール、ポリ（スチレンスルホネート）ビスチオール、ポリ（アミド）ビスチオール、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。代替的に、ビスチオール含有架橋剤は、ビスチオール含有バイオポリマー、好ましくは末端ビスチオール含有バイオポリマーであってもよい。好適なビスチオール含有バイオポリマーは、チオール−ゼラチン（たとえば、ウシ、ブタ、および冷水魚（ｃｏｌｄ  ｆｉｓｈ）由来）、チオール−ヒアルロン酸（たとえば、ストレプトコッカス・エクイ（ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、ウシ、およびヒト臍帯由来）、およびそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００９１】
一つの実施形態では、ビスチオール含有架橋剤は、ＰＥＧビスチオールである。ＰＥＧビスチオールは、とりわけ、線状、分岐、および星型ＰＥＧ構造を含むが、これらに限定されない、任意の好適な分子構造を有してもよい。一つの実施形態では、ＰＥＧビスチオールは、線状ＰＥＧビスチオールである。ＰＥＧ基の分子量は変動してもよく、たとえば、ＰＥＧ基の分子量は、約１ｋＤａから約５０ｋＤａ、または約１ｋＤａから約４０ｋＤａ、または約１ｋＤａから約３０ｋＤａ、または約５ｋＤａから約３０ｋＤａ、または約５ｋＤａから約２０ｋＤａ、または約５ｋＤａから約１０ｋＤａ、または約１０ｋＤａから約２０ｋＤａの範囲であってもよい。一つの実施形態では、ＰＥＧ基の分子量は、約５ｋＤａ、または約１０ｋＤａ、または約２０ｋＤａである。
【００９２】
線状ＰＥＧビスチオールの例は、以下の構造（ｎ＝１１−１、１３６）：
【００９３】
【化３】
2021531780.tif 000004
【００９４】
を有する。
【００９５】
一部の実施形態では、ビスチオール含有架橋剤は、ビスチオール含有小分子であってもよい。好適なビスチオール含有分子は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）（ホウ酸ナトリウムまたはホウ砂の有無にかかわらず使用される）、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。別の実施形態では、ビスチオール含有架橋剤は、少なくとも２つのシステインアミノ酸基、好ましくは末端システイン基（すなわち、チオール隣接アミノ酸配列）を有するビスチオール含有短鎖ペプチドであってもよい。好適な２つのシステインアミノ酸基と隣接したビスチオール含有短鎖ペプチドは、不活性な短鎖ペプチド配列、酵素感受性短鎖ペプチド（たとえば、ＭＭＰ感受性、セリン感受性、システイン感受性、アスパラギン酸感受性（ａｓｐａｒｔｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）、グルタミン酸感受性（ｇｌｕｔａｍｉｃ  ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ）、カスパーゼ感受性、またはトリプシン感受性ペプチド配列）、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。
【００９６】
一つの実施形態では、ビスチオール含有架橋剤は、ビスチオール含有生理活性分子である。たとえば、ビスチオール含有短鎖ペプチドは、ＭＭＰ感受性ビスシステインペプチドであってもよい。たとえば、ＭＭＰ感受性ペプチドは、ＭＭＰ２感受性ビスシステインペプチド（たとえば、ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ）、ＭＭＰ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、およびＭＭＰ９感受性ビスシステインペプチド（たとえば、ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ）、ＭＭＰ１５感受性チオール化ペプチド（たとえば、ＧＣＲＤＥＡＰＬＫＱＤＲＣＧ）、またはＭＭＰ１、ＭＭＰ、ＭＭＰ３、ＭＭＰ７、ＭＭＰ８、ＭＭＰ９、ＭＭＰ１２、ＭＭＰ１３、およびＭＭＰ１４感受性ビスシステインペプチド（たとえば、ＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ）であってもよい。
【００９７】
活性化剤は、任意の比率で架橋剤を含む２つ以上の種類のビスチオールの組み合わせを含んでもよい。たとえば、活性化剤は、２種類のビスチオール含有架橋剤の組み合わせを、約１０：１から約１：１０の間の比率、例として、約１０：１、９：１、８：１、７：１、６：１、５：１、４：１、３：１、２：１、１：１、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、または１：１０で含んでもよい。
【００９８】
一つの実施形態では、活性剤は、ビスチオール含有架橋剤を含む水溶液の形態であってもよい。水溶液は細胞培養培地であってもよい。一部の実施形態において、活性化剤は、２つ以上のビスチオール（ｂｉｏ−ｔｈｉｏｌ）含有架橋剤の混合物を含んでもよい。活性化剤は、溶液中に任意の好適な濃度のビスチオール含有架橋剤を含んでもよい。好適な実施形態では、活性化剤中のビスチオール含有架橋剤の濃度は、補完ポリマーバイオインク（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｂｉｏ−ｉｎｋ）中のマレイミド含有ポリマーの濃度以下である。マレイミド含有ポリマーとビスチオール含有架橋剤とのモル比は、約１０：１から１：１、約９：１から１：１、約８：１から１：１、約７：１から１：１、約６：１から１：１、約５：１から１：１、約４：１から１：１、約３：１から１：１、または約２：１から１：１の範囲であってもよい。ビスチオール含有架橋剤は、生理活性分子を含んでもよく、またはそれに共有結合した１つ以上の生理活性分子を含んでもよい。追加的または代替的に、活性化剤は、溶液中に１つまたは複数の遊離生理活性分子を含んでもよい。活性化剤中の生理活性分子の濃度は、約０．１ｍＭから１０ｍＭ、約０．５ｍＭから１０ｍＭ、約１ｍＭから１０ｍＭ、約１ｍＭから５ｍＭ、約２ｍＭから５ｍＭ、または約２ｍＭから３ｍＭの範囲であってもよい。
【００９９】
一つの実施形態では、活性剤は滅菌溶液である。滅菌溶液を調製するための好適な方法、または活性化剤溶液を滅菌する方法は、当業者に知られているであろう。
【０１００】
活性化剤の製剤は、ポリマーバイオインクの製剤と同じであってもよく、またはそれは異なっていてもよい。好ましい実施形態では、ポリマーバイオインクおよび活性化剤に使用される製剤は同じである。
【０１０１】
一つの実施形態では、活性化剤は生体適合性である。
【０１０２】
３Ｄプリントヒドロゲル
本技術の３Ｄプリントヒドロゲルは、ビスチオール含有架橋剤を使用して架橋されたマレイミド含有ポリマーを含む。一つの実施形態では、３Ｄプリントヒドロゲルは細胞を含む。
【０１０３】
一つの実施形態では、３Ｄプリントヒドロゲルは、マレイミド含有ポリマーと、ビスチオール含有架橋剤を含む活性化剤とを含むポリマーバイオインクの３Ｄ印刷によって調製される。
【０１０４】
３Ｄバイオプリンティングでの使用に好適であるためには、ヒドロゲルの形成が迅速に起こるべきである。しかしながら、従来技術で使用されるヒドロゲルの急速な形成は、典型的には、不規則なヒドロゲルの形成をもたらした。３Ｄバイオプリンティングで架橋速度を制御し、均一なゲルを生成するための現在のアプローチは、ＵＶ照射や共反応物または触媒等の外部駆動力の利用を含む。これらの外部駆動力は、ヒドロゲルの形成に関与せず、むしろヒドロゲルの形成を補助し、ヒドロゲルにカプセル化された細胞の細胞特性および生物学的特性に影響を与える可能性がある。特に、ＵＶ照射の使用を含む光化学的架橋反応は、ヒドロゲル中の細胞と相互作用しないように生成物から除去されなければならないフリーラジカル源の使用を含みうる。
【０１０５】
本発明者らは、驚くべきことに、マレイミド含有ポリマーをビスチオール含有架橋剤と反応させることにより、高密度および生存率で細胞を支持することができる均一なヒドロゲルの迅速な形成を達成できることを見出した。マレイミド基は、生理学的条件下でチオールと迅速かつ自発的に反応する。この反応は外部の駆動力を必要としないため、細胞毒性の可能性のある共反応物、ラジカル開始剤、またはＵＶ照射の必要性を排除するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの３Ｄバイオプリンティングでの使用に特に魅力的である。さらに、不要なまたは細胞毒性の副産物が生成されないため、不要な副産物を生成することなく細胞のｉｎ  ｓｉｔｕ印刷が可能になる。
【０１０６】
ビスチオール含有架橋剤を使用するマレイミド含有ポリマー間の架橋反応は、ポリマーバイオインクが活性化剤と接触すると急速に起こり、３Ｄプリントされたヒドロゲルの迅速な形成を可能にする。したがって、一部の実施形態では、ヒドロゲルは、ポリマーバイオインクおよび活性化剤の印刷から３０分以内に形成される。たとえば、ヒドロゲルは、ポリマーバイオインクと活性化剤の印刷から３０分以内、または２０分以内、または１０分以内、または１分以内、または３０秒以内、または１０秒以内、または１秒以内で形成されうる。サイズ、形状、組成などのさまざまな要因が、３Ｄプリントヒドロゲルの形成速度に影響を与える可能性がある。
【０１０７】
マレイミド含有ポリマーとビスチオール含有架橋剤との間の例示的な反応を以下のスキーム１に示す。この反応は、ビスチオール含有架橋剤（１）上のチオール基とマレイミド含有ポリマー（２）上のマレイミド部分のアルケン官能基との求核性（マイケル）付加を含み、水性条件下（たとえば、細胞培養培地中）に３−置換スクシンイミド基を生成する。この反応は、細胞毒性の可能性のある共反応物、ラジカル開始剤、またはＵＶ照射の必要性を排除するため、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイの３Ｄバイオプリンティングに特に役立つ。さらに、共有結合架橋は、マレイミド含有ポリマーとビスチオール架橋剤を生理学的条件下（たとえば、約６．５〜７．５のｐＨ、好ましくはｐＨ７．４）で混合して架橋ポリマー（３）を生成すると、迅速かつ自発的に起こる。
【０１０８】
【化４】
2021531780.tif 000005
スキーム１
【０１０９】
一つの実施形態では、ポリマーバイオインク、活性化剤、またはその両方のｐＨは、３Ｄ印刷の前に、好適な塩基を使用して、生理学的ｐＨ（例えば、約６．５〜７．５、好ましくは約ｐＨ７．４）に調整されてもよい。好適な塩基は、当業者には明らかであろう。
【０１１０】
一つの実施形態では、塩基はＮａＯＨである。
【０１１１】
本発明者らは、ＮａＯＨを使用してポリマーバイオインクのｐＨを調整することにより、活性化剤が３Ｄ印刷中のゲル化を加速し、３Ｄプリントヒドロゲルの迅速な形成を可能にする（たとえば、約１秒未満）ことを見出した。さらに、本発明者らは、ＮａＯＨの存在が、ポリマーバイオインク、活性化剤、またはその両方における細胞凝集を低減し、小さなノズル開口部を通して３Ｄ印刷のために高濃度の細胞を溶液中に分散させることを可能にすることを見出した。
【０１１２】
一部の実施形態では、マレイミド含有ポリマーのモル比は、ビスチオール含有架橋剤よりも大きいため、ビスチオール含有架橋剤が消費される。得られるヒドロゲルは、追加の望ましくない副生成物なしに、架橋生成物および過剰のマレイミド含有ポリマー（もしあれば）を含みうる。たとえば、マレイミド含有ポリマーとビスチオール含有架橋剤とのモル比は、約１０：１から２：１、約９：１から２：１、約８：１から２：１、約７：１から２：１、約６：１から２：１、約５：１から２：１、約４：１から２：１、約３：１から２：１の範囲であってもよい。
【０１１３】
好ましくは、ヒドロゲル形成のために、ビスチオール含有架橋剤中のチオール基の数は、マレイミド含有ポリマー中のマレイミド基の数の約６０％より大きい。たとえば、マレイミド含有ポリマー中のマレイミド基へのビスチオール含有架橋剤中のチオール基の数は、約６０％、または７０％、または８０％、または９０％、または１００％、または２００％以上であってもよい。一部の実施形態では、ビスチオール含有架橋剤中のチオール基の数は、マレイミド含有ポリマー中のマレイミド基の数と同じ（すなわち、１００％）である。
【０１１４】
本明細書に開示されるポリマーバイオインクおよび活性化剤は、大量のアッセイを生成するために使用されうるので、ポリマーバイオインクおよび活性化剤の調製に使用される材料は、好ましくは、バルクで容易に市販で入手できるか、またはそのような市販の材料から容易に調製される。
【０１１５】
本技術の３Ｄプリントヒドロゲルの調製のための典型的プロセスは、以下の工程を含んでもよい：
マレイミド含有ポリマーを含むポリマーバイオインクを提供する工程；
ビスチオール含有架橋剤を含む活性化剤を提供する工程；および
ポリマーバイオインクおよび活性化剤を３Ｄ印刷して、３Ｄプリントヒドロゲルを形成する工程。
【０１１６】
一つの実施形態では、プロセスは、ポリマーバイオインク、活性化剤、および細胞の３Ｄ印刷が細胞を含む３Ｄプリントヒドロゲルを形成するように、細胞を提供することをさらに含む。
【０１１７】
一つの実施形態では、細胞はヒドロゲルに懸濁されている。細胞は、ポリマーバイオインク、活性化剤、もしくはその両方、または別の培地で提供されてもよい。細胞は、ヒドロゲルの一部（または複数の部分）に懸濁されていてもよく、またはヒドロゲル全体に実質的に均一に懸濁されていてもよい。
【０１１８】
一つの実施形態では、細胞は、細胞培養培地で提供される。細胞培養培地は、ポリマーバイオインク、活性化剤内に含まれてもよく、またはポリマーバイオインクおよび活性化剤とは別に提供されてもよい。たとえば、細胞培養培地は、ポリマーバイオインクと活性化剤から形成された３Ｄプリントヒドロゲルの層間に懸濁されてもよく、またはヒドロゲルの表面上に堆積されていてもよい。
【０１１９】
一つの実施形態では、３Ｄプリントヒドロゲルは、生理活性分子をさらに含む。生理活性分子は、ポリマーバイオインクまたは活性化剤、またはその両方で提供されうる。生理活性分子は、ポリマーバイオインクまたは活性化剤、またはその両方に自由に懸濁されてもよく、またはマレイミド含有ポリマーおよび／またはビスチオール含有架橋剤に結合されていてもよい。
【０１２０】
一つの実施形態では、３Ｄ印刷プロセスは、実質的に無菌の環境で実行される。
【０１２１】
生理活性分子
本技術の３Ｄプリントヒドロゲルは、特定の生物学的特性を導入するために、１つまたは複数の生理活性分子によって修飾されていてもよい。たとえば、３Ｄプリントヒドロゲルの生物学的特性は、タンパク質、ペプチド（たとえば、ＭＭＰ応答性ペプチド）、化学誘引物質、成長因子、有機色素、蛍光色素、薬剤、治療薬、抗体、小分子阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、抗原、病原体、血小板、サイトカイン、栄養素（たとえば、単糖および多糖）、馴化培地、抗生物質、抗ウイルス、ＲＮＡおよび関連するバリアント（たとえば、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ）等を組み込むことによって改変されうる。マレイミド含有ポリマー、ビスチオール含有架橋剤、またはそれらの任意の組み合わせに共有結合することにより、１つまたは複数の生理活性分子を３Ｄプリントヒドロゲルに組み込むことができる。ナノ粒子も、３Ｄプリントヒドロゲルに組み込むことができる。
【０１２２】
一つの実施形態では、生理活性分子は、短鎖ペプチド（たとえば、ＮまたはＣ末端のいずれかにシステイン（Ｃ）アミノ酸を含むＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ））、成長因子（たとえば、ＶＥＧＦ）、タンパク質（たとえば、ラミニン、コラーゲン）、または化学誘引物質（たとえば、間質細胞由来因子−１（ＣＸＣＬ１２））、またはそれらの任意の組み合わせである。他の好適な生理活性分子は、当業者に知られているであろう。
【０１２３】
一部の実施形態では、１つ以上の生理活性分子は、遊離生理活性分子をポリマーバイオインク、活性化剤、またはその両方に組み込むことによって、３Ｄプリントヒドロゲルに組み込まれてもよい。ポリマーバイオインク、活性剤、またはその両方は、細胞培養培地を含んでもよい。
【０１２４】
一つの実施形態では、生理活性分子は、マレイミド含有ポリマーに結合することができる。生理活性分子は、マレイミド基を生物活性分子と反応させて共有結合を形成することにより、マレイミド含有ポリマーに導入することができる。たとえば、共有結合は、チオールとビニルを有する（ｖｉｎｙｌ−ｃａｒｒｙｉｎｇ）生物活性分子との間のマイケル型付加反応（たとえば、水性媒体中）、アミノ基とアルデヒド基との間のシッフ塩基反応、ディールス・アルダー反応、クリック化学、活性エステル基へのアミノリシス反応、または酵素架橋によって形成されうる。チオール部分は多くの生理活性分子に豊富に存在するため、マレイミド含有ポリマーへの生理活性分子の取り込みは、マレイミド基のアルケン部分へのチオール基の求核性（マイケル）付加によって起こり、３−置換スクシンイミド部分を生成する。使用される反応物の条件およびモル比に応じて、得られる化合物は、少なくとも１つのマレイミド基を、３−置換スクシンイミド基を有する生理活性分子に変換し、少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つのマレイミド基をインタクトのままにする。当業者は、少なくとも１つ、または少なくとも２つ以上のマレイミド基がインタクトのままであることを確実にするために反応を制御するための適切な条件（たとえば、反応物のモル比）を決定することができるであろう。
【０１２５】
チオール含有生理活性分子をマレイミド含有ポリマーに組み込むための典型的なプロセスにおいて、生理活性分子およびマレイミド含有ポリマーは、水溶液（たとえば、緩衝液または細胞培養培地）中で、マレイミド含有ポリマーが生理活性分子の比率を超える（たとえば、３：１、または４：１、または５：１）モル比で室温で混合される。反応の完了は、たとえばエルマンアッセイを介してモニターして、遊離チオール基が残っていないことを確認することができる。典型的な反応時間は約３０分である。反応の完了後、必要に応じて好適な塩基（たとえば、ＮａＯＨ）を加えて、溶液のｐＨを生理学的ｐＨ（約７．４）に調整することができる。ｐＨを生理学的ｐＨに調整するための好適な塩基は、当業者には明らかであろう。得られた修飾マレイミド含有ポリマー溶液は、単離または精製を必要とせずに使用することができる。
【０１２６】
一つの実施形態では、生体分子含有ポリマーバイオインクまたは活性化剤溶液のｐＨは、ＮａＯＨを使用して生理学的ｐＨ（例えば、約６．５〜７．５、好ましくはｐＨ７．４）に調整される。ポリマーバイオインクまたは活性化剤のｐＨを調整するためにＮａＯＨを使用すると、その後の３Ｄ印刷中に迅速な重合が可能になり、それによってヒドロゲル形成が加速される（たとえば、１秒未満）。さらに、ＮａＯＨを使用すると、ポリマーバイオインク、活性化剤、またはその両方での細胞凝集が減少し、小さなノズル開口部から３Ｄ印刷用の溶液に高濃度の細胞を分散させることができる。
【０１２７】
ＲＧＤで部分的に修飾された４アームＰＥＧ−マレイミド（４アームＰＥＧ−マレイミド−ＲＧＤ）の例は、４アームＰＥＧ−マレイミドをＣＲＧＤＳと４：１のモル比で反応させることによって調製され、以下の構造（ｎ＝２８−２、８４１）：
【０１２８】
【化５】
2021531780.tif 000006
【０１２９】
を有する。
【０１３０】
ＶＥＧＦで部分的に修飾された４アームＰＥＧ−マレイミド（４アームＰＥＧ−マレイミド−ＶＥＧＦ）の例は、４アームＰＥＧ−マレイミドをＶＥＧＦと４：１のモル比で反応させることによって調製され、以下の構造（ｎ＝２８−２、８４１）：
【０１３１】
【化６】
2021531780.tif 000007
【０１３２】
を有する。
【０１３３】
一部の実施形態では、生理活性分子、たとえばＣＲＧＤＳ、ＣＩＫＶＡＶ、Ｃ末端不対システインを有するＶＥＧＦ、および／またはＭＭＰ感受性ペプチド（たとえば、ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ、ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ．ＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ、またはＧＣＲＤＥＡＰＬＫＱＤＲＣＧ）は、生物学的機能を導入するために３Ｄプリントヒドロゲルに組み込まれる。たとえば、細胞接着は、ＣＲＧＤＳまたはＣＩＫＶＡＶ細胞接着モチーフの組み込みによって導入することができ、血管新生は、ＶＥＧＦの導入によって促進することができ、そして細胞運動性は、ＭＭＰ感受性ペプチド架橋剤の組み込みによって促進できる。ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧは、架橋剤中のビスチオール含有架橋剤としての使用に特に好適であるが、追加的または代替的に、マレイミド含有ポリマー、ビスチオール含有架橋剤、またはその両方に共有結合するか、またはポリマーバイオインク、活性剤、またはその両方への遊離生理活性分子として添加することができる。
【０１３４】
生理活性分子は、所望の生物学的特性を達成するために、任意の好適な濃度で３Ｄ印刷されたヒドロゲル中に存在してもよい。たとえば、生理活性分子は、約１ｎＭから１００μＭ、約１ｎＭから５０μＭ、約５ｎＭから５０μＭ、約１０ｎＭから５０μＭ、約５０ｎＭから５０μＭ、約１００ｎＭから５０μＭ、約１００ｎＭから１μＭ、または約５００ｎＭから１μＭの範囲の濃度で３Ｄプリントヒドロゲルに存在してもよい。
【０１３５】
細胞
細胞は、本技術の３Ｄ印刷されたヒドロゲルに組み込まれうる。細胞培養培地もヒドロゲルに組み込んで、細胞の生存率を維持したり、増殖および細胞分裂を促進したりすることもできる。細胞および／または細胞培養培地は、それらをポリマーバイオインクまたは活性化剤、あるいはその両方に組み込むことによって、ヒドロゲルに組み込むことができる。
【０１３６】
一つの実施形態では、細胞は、ポリマーバイオインク、活性化剤、ポリマーバイオインクおよび活性化剤の両方、または別個の培地で提供される。
【０１３７】
ポリマーバイオインクおよび／または活性化剤は、細胞培養培地を含んでいてもよい。細胞培養培地は、細胞と適合性があり、３Ｄ印刷プロセス中に細胞の生存率を維持する任意の好適な培地から選択することができる。たとえば、細胞培養培地は、水（たとえば、滅菌されたＭｉｌｌｉＱ水）、緩衝液、および細胞培養培地を含む溶液であってもよい。好適な緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、および２−（シクロヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない。好適な細胞培養培地の非限定的な例は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、最小必須培地（ＭＥＭ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｄｉａ  １９９培地、ハムＦ１０培地、ハムＦ１２培地、マッコイ５Ａ培地、およびロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培地を含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、還元剤（たとえば、２−メルカプトエタノールまたはトリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ））、安定剤（たとえば、フィコール（登録商標）またはＰＶＰ）、および／または生育サプリメント［ｇｒｏｗｔｈ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ］（たとえば、Ｌ−グルタミンまたはヒドロコルチゾン）をさらに含んでもよい。好適な生育サプリメントの非限定的な例は、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＢＦ）、線維芽細胞増殖因子（ＦＢＦ）、内皮細胞増殖因子（ＥＣＧＦ）、インスリン様増殖因子１（ＩＧＦ−１）、および血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）を含む。還元剤は、たとえば、架橋剤中の遊離チオール基間のジスルフィド架橋の形成を防止することができる。安定剤は、たとえば、細胞が細胞培養培地から沈降するのを防ぐために使用することができる。必要に応じて、適切な塩基を使用して、細胞培養培地のｐＨを約７．４の生理学的ｐＨに調整することができる。一つの実施形態では、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）は、細胞凝集を促進しないので、細胞培養培地のｐＨを中和または制御するための塩基として使用される。
【０１３９】
回収した細胞を、ポリマーバイオインクまたは活性化剤、またはその両方において選択された細胞濃度で再懸濁することができる。ポリマーバイオインク、および／または活性化剤中の細胞の濃度は、約１×１０5から約５×１０8細胞／ｍＬ、または約１×１０5から約１×１０8細胞／ｍＬ、または約１×１０5から約１×１０7細胞／ｍＬ、または約５×１０5から約１×１０7細胞／ｍＬ、または約５×１０5から約５×１０6細胞／ｍＬ、または約５×１０6から約５×１０6細胞／ｍＬの範囲であってもよい。一つの実施形態では、細胞は、ポリマーバイオインク、および／または活性化剤、または細胞培養培地中に、ポリマーバイオインク、および／または活性化剤の約４×１０6細胞／ｍＬ、または５×１０6細胞／ｍＬで懸濁される。
【０１４０】
任意の好適な細胞を、本技術のポリマーバイオインクおよび活性化剤と一緒に使用することができる。たとえば、好適な細胞は、哺乳動物肝細胞、胃腸細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、泌尿生殖器細胞、乳房細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周皮細胞、中皮細胞、内分泌組織由来細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、リンパ細胞、血液細胞、内胚葉由来細胞、外肺葉由来細胞、中胚葉由来細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含んでもよいが、これらに限定されない。
【０１４１】
他の好適な細胞型は、他の真核細胞（たとえば、チャイニーズハムスター卵巣細胞）、細菌（たとえば、ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｙｌｏｒｉ）、真菌（たとえば、ペニシリウム・クリソゲナム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ））、および酵母（たとえば、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を含んでもよい。
【０１４２】
３Ｄプリントヒドロゲルは、少なくとも約１００、または約１，０００、または約５，０００、または約１０，０００、または約５０，０００、または約１００，０００、または約１５０，０００、または約２００，０００、または約２５０，０００、または約３００，０００、または約３５０，０００、または約４００，０００、または約４５０，０００、または約５００，０００以上の細胞を含んでもよい。他の数の細胞を使用できることは当業者には理解されるであろう。
【０１４３】
一部の実施形態では、プロセスは、細胞の増殖または維持を可能にする条件下で、ヒドロゲルに懸濁された細胞をインキュベートすることをさらに含む。一部の実施形態では、細胞は、幹細胞の分化を可能にする条件下でヒドロゲルに懸濁することができる。インキュベーションは、任意の好適な温度および条件で行うことができる。たとえば、細胞の増殖、維持、または分化に好適なインキュベーションは、約３７℃で約５％のＣＯ2を用いて少なくとも２４時間行うことができる。インキュベーションは、ヒドロゲル中の細胞の種類の細胞増殖、維持または分化を可能にする任意の温度および持続時間で実施できることが理解されよう。
【０１４４】
他の実施形態では、プロセスは、細胞増殖に好適でない可能性がある条件下で、ヒドロゲルに懸濁された細胞をインキュベートすることをさらに含む。たとえば、インキュベーションは、酸素を欠く条件下で、細胞を飢餓状態にするための無血清環境で、酸性または塩基性環境で、加えられた外圧下で、電場の存在下で、一定の振とう下で、またはそれらの任意の組み合わせで行うことができる。特定の生物学的状態を模倣するための他の好適な条件は、当業者に知られているであろう。
【０１４５】
３Ｄバイオプリンティング
本技術のポリマーバイオインクおよび活性化剤は、ドロップオンデマンド（ＤＯＤ）バイオプリンティングに好適であり、それにより、バイオプリンティングは、ポリマーバイオインクおよび活性化剤の個別の液滴の生成に基づいており、とりわけ、サーマルインクジェット、ピエゾインクジェット、マイクロバルブベースのバイオプリンティングを含みうる。他のドロップオンデマンド印刷技術と同様に、ポリマーバイオインクおよび活性剤はバイオプリンターカートリッジ内で液体でなければならない。さらに、ポリマーバイオインクおよび活性化剤は、バイオプリンティングカートリッジに保存したときに高い細胞生存率を維持するために、生体適合性材料で製造する必要がある。
【０１４６】
３ＤアッセイのＤＯＤバイオプリンティングは、ポリマーバイオインクの液滴およびバイオプリンターソフトウェアによって決定された基板上のあるサイズおよび位置での活性化剤の反復堆積を含む。したがって、一つの実施形態では、３Ｄバイオプリンティングは、液滴を形成および堆積することができる３Ｄバイオプリンターを使用して行われる。バイオプリンターは、少なくともポリマーバイオインク、活性化剤、および洗浄溶液用の流体リザーバー、３軸運動制御ステージ、ドロップオンデマンド液滴分配システム、ならびに流体リザーバー内の圧力を制御するための圧力調整器を有してもよい。液滴分配システムおよび３軸ステージは、層流キャビネット等の無菌チャンバー内に収容できる。印刷プラットフォームは、マイクロウェルプレートおよびペトリ皿等、さまざまな種類の素材に印刷するためのアダプターを含んでもよい。印刷プラットフォームは、細胞増殖を補助するために約３７℃に加熱することができる。
【０１４７】
３Ｄバイオプリンターは、印刷フォーマットを定義するためのソフトウェアを有するコンピューターによって制御されうる。
【０１４８】
３Ｄバイオプリンターは、細胞の完全性、生存能力または機能性を可能にする方法で、ポリマーバイオインクおよび活性化剤の液滴を印刷（堆積）するように構成できる。ポリマーバイオインクおよび活性化剤の堆積は、任意の順序で実施できることが理解されよう。ポリマーバイオインクの液滴を基板に適用し、続いて活性化剤の液滴を適用してヒドロゲル液滴を形成するか、または活性化剤の液滴を基板に適用し、続いてポリマーバイオインクの液滴を適用してヒドロゲル液滴を形成することができる。
【０１４９】
本技術のプロセスによって形成されたヒドロゲルは、実質的に均一な３Ｄ構造を含む。ヒドロゲルが細胞を含む場合、細胞は、ヒドロゲル全体に実質的に均一に分布してもよく、またはそれらは、ヒドロゲルのヒドロゲルの一部内に懸濁されてもよい。細胞は、ヒドロゲル内の１つ以上の選択された位置に堆積されてもよい。
【０１５０】
印刷基板は、印刷されたヒドロゲル構造を封入および培養するために使用される生体適合性の消耗品である。基板は、細胞を収容、保持、または増殖させるための任意の好適な容器から選択することができる。例は、異なるウェル構成（６、２４、４８、および９６ウェル）のマイクロタイタープレート、異なるウェル構成（６、２４、４８、および９６ウェル）のカバーガラス底部を備えたマイクロタイタープレート、様々なサイズのフルオロディッシュ、異なるチャンバー構成（１、２、４、８、および１６）のチャンバースライド、カバーガラス、または顕微鏡スライド、またはペトリ皿を含む。一部の実施形態では、３Ｄバイオプリンティングプロセスは、基板上に複数の３Ｄ組織培養モデルを形成するために行われる。たとえば、９６ウェルマイクロタイタープレートは好適な基板であり、複数の細胞アッセイに使用できる。他の好適な容器は、当業者に知られているであろう。
【０１５１】
アッセイの３Ｄ構造は、バイオプリンターソフトウェアを使用して設計することができる。 好適なバイオプリンターおよびバイオプリンターソフトウェアは、当業者に知られているであろう。たとえば、９６ウェルプレートでのバイオプリンティングの場合、バイオプリンターソフトウェアは、選択された直径の層でウェル内の液滴を繰り返し堆積するように構成することができる。
【０１５２】
ポリマーバイオインクおよび活性化剤は、印刷時に迅速に反応してヒドロゲルを形成し、３Ｄ構造およびアッセイの迅速なハイスループット生成を可能にする。一つの実施形態では、本技術のポリマーバイオインクおよび活性化剤は、混合の数秒以内に（すなわち、印刷時に）ヒドロゲルを形成する。たとえば、ヒドロゲルは、混合の５秒以内に、好ましくは混合の４、３、２、または１秒以内に形成されうる。
【０１５３】
本技術のポリマーバイオインクおよび活性化剤は、任意の適切なＤＯＤバイオプリンティングシステムと共に使用することができる。本発明者らは最近、３Ｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイのバイオプリンティングのために特別に設計されたＤＯＤバイオプリンティングシステムを開発した。より具体的には、バイオプリンターは、ポリマーバイオインクおよび活性化剤を最大２００ｃＰで、最大５億細胞／ｍＬの細胞で９５％を超える細胞生存率で印刷することができる。開発されたシステムは、ハイスループットな方法で３Ｄスフェロイドアッセイをバイオプリンティングするために首尾よく使用されている。したがって、本技術のバイオインクは、本発明者らによって開発された３Ｄバイオプリンティングシステムを使用する３Ｄ細胞印刷に特に有用である。
【０１５４】
本技術のヒドロゲルの高速ゲル化特性は、開発されたバイオプリンターの新規の印刷ロジックと組み合わされて、バイオプリンターを９６ウェルフォーマットでの複雑な３Ｄアッセイの迅速な印刷を可能にした。たとえば、９６ウェルプレートにおける３Ｄアッセイのバイオプリンティングは、約１時間未満、好ましくは約３０分未満、たとえば、約２５分、または約２０分、または約１５分、またはそれ以下で達成されうる。
【０１５５】
ポリマーバイオインクおよび活性化剤は、印刷の直前に別個の滅菌カートリッジに装填することができ、またはそれらをカートリッジに保存することができる。細胞バイオインクをカートリッジに保存する場合、カートリッジは、さらに使用する必要があるまで４℃で保存することが好ましい。本技術のポリマーバイオインクおよび活性化剤は、印刷前の長期間の細胞生存率を補助しうる。たとえば、細胞は、少なくとも約２時間印刷する前に、ポリマーバイオインクおよび活性剤中で生存し続けることができる。一部の実施形態では、本技術のポリマーバイオインクおよび活性化剤は、細胞生存率に実質的に影響を与えることなく、−２０℃で少なくとも６ヶ月間保存することができる。同様に、本技術の３Ｄプリントヒドロゲルは、印刷後の長期間の細胞生存率を補助しうる。たとえば、細胞は３Ｄプリントヒドロゲルで少なくとも約２１日間生存し続けることができる。
【０１５６】
使用する準備ができたら、カートリッジを清潔なバイオプリンターに接続することができる。カートリッジおよび／またはバイオプリンター（流体ライン、バルブおよびノズルを含む）の洗浄は、当技術分野で知られている任意の好適な方法、たとえば、エタノール（水中７０ｖ／ｖ％）の拭き取り、空気乾燥、およびバイオセーフティキャビネット内に配置することによって達成することができる。好ましくは、バイオプリンターは、洗浄後および印刷前に、使用されている組織培養培地でパージされる。
【０１５７】
用途
本技術の３Ｄプリントヒドロゲルは、様々なｉｎ  ｖｉｔｒｏ用途を有しうる。一例では、本技術の３Ｄプリントヒドロゲルを使用して、細胞運動性、細胞遊走、細胞浸潤、経内皮遊走、上皮−間葉移行、間葉−上皮移行、スフェロイドの形成および増殖、細胞分化（たとえば、幹細胞分化、細胞分化マーカーのモニタリング）、細胞死（たとえば、細胞アポトーシス、細胞ネクローシス）、細胞オートファジー、細胞増殖、細胞代謝、タンパク質代謝回転、タンパク質分布および場所、細胞シグナル伝達および下流イベント、薬剤有効性、薬力学、薬物作用メカニズム、薬物受容体媒介輸送、薬物内在化メカニズム、バイオマーカー評価、細胞間接合、細胞間シグナル伝達および下流イベント、細胞形態、細胞接着、遺伝子発現、タンパク質発現、細胞ホーミング、細胞サイクルの調節および制御、サイトカイン放出、インスリン産生、タンパク質分泌および細胞内輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）および輸送（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ）、受容体−リガンド結合、抗体結合、抗体特異性、タンパク質リン酸化、プロテオソーム機能、酵素機能（たとえば、酵素阻害）、免疫調節、クローン形成能、酸化ストレス、タンパク質フォールディング、細胞骨格、オルガネラの形態および機能（たとえば、ミトコンドリア、葉緑体、ペルオキシソーム、分泌小胞、液胞、リボソーム、核、リソソーム、繊毛、小胞体、ゴルジ）、膜輸送、低酸素症、血管新生、創傷治癒、神経突起（成長または形成）、キナーゼ機能、ホスファターゼ機能、葉状仮足（ｌａｍｅｌｌｉｐｏｄｉａｌ）形成およびダイナミクス、焦点接触／接着形成、ダイナミクスおよびシグナル伝達、細胞センシング、および機械的シグナル伝達を含むがこれらに限定されない生物学的表現型の試験のためのアッセイを調製することができる。
【０１５８】
本技術の３Ｄ印刷されたヒドロゲルはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏ用途（たとえば、動物研究）に好適である可能性がある。たとえば、本技術の３Ｄプリントヒドロゲルは、細胞の有無にかかわらず、同所性および皮下モデルで使用することができる。
【実施例】
【０１５９】
以下の実施例は、本技術および本技術の３Ｄプリントヒドロゲルで達成することができ、有益な効果の例示であり、限定として解釈されるべきではない。
【０１６０】
材料
４アームＰＥＧマレイミド（ＰＥＧ−Ｍａｌ、分子量  ５、１０、および２０ｋＤａ、ＪｅｎＫｅｍ）、ＰＥＧビスチオール（分子量  １ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、ゼラチン（ウシ、魚、またはブタ由来、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＮＨＳ、Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、ＣＲＧＤＳ、ＣＩＫＶＡＶ、ＣＹＩＧＳＲ、ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ、およびＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ（＞９０％、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、塩化カルシウムを含まないリン酸緩衝液（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ）、カルシウムを含まないＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）、ピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ）、Ｌ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ）、トリプシン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）、０．２２μｍシリンジフィルター（ポリエーテルスルホン膜、Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）Ｔ７５およびＴ１５０フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、１５ｍＬ遠心管（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、エタノール（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を受け取ったまま使用した。
【０１６１】
実施例１  −ＰＥＧ−Ｍａｌポリマーバイオインクの調製
実施例１ａ  −ＰＢＳにおけるポリマーバイオインクの調製
３種類のＰＥＧ−ＭａｌポリマーバイオインクをＰＢＳ緩衝液中で調製した。
【０１６２】
ＰＥＧ−Ｍａｌポリマーバイオインク
ＰＥＧ−Ｍａｌポリマーバイオインクは、ＰＥＧ−Ｍａｌ（７．５重量％）をＰＢＳ緩衝液に室温で混合することにより調製した。 完全に溶解した後、溶液を０．２２μｍシリンジフィルターで無菌的に濾過した。
【０１６３】
ＰＥＧ−ＲＧＤポリマーバイオインク
ＲＧＤ含有ＰＥＧ−Ｍａｌ（ＰＥＧ−ＲＧＤ）ポリマーバイオインクは、ＣＲＧＤＳを、ＰＢＳ緩衝液中のＰＥＧ−Ｍａｌ（１０重量％で）と室温で３０分間混合することによって調製し、合計５ｍＭのＲＧＤ濃度を得た。反応の完了は、遊離チオールが記録されていないときにエルマンアッセイによって確認した。反応生成物は、１０重量％および５ｍＭのＲＧＤ濃度のＰＥＧ−ＲＧＤを含み、ＰＢＳに溶解した。完全に溶解した後、ＲＧＤ濃度と等モル濃度のＮａＯＨを溶液に加えて、溶液のpHを７．４に上げた。この溶液を、０．２２μｍシリンジフィルターで無菌的に濾過して滅菌した。
【０１６４】
ＰＥＧ−トリペプチドポリマーバイオインク
ＲＧＤ、ＩＫＶＡＶおよびＹＩＧＳＲ（ＰＥＧ−トリペプチド）ポリマーバイオインクを含むＰＥＧ−Ｍａｌは、ＣＲＧＤＳ、ＣＩＫＶＡＶおよびＣＹＩＧＳＲ（所望のモル濃度で）をＰＢＳ緩衝液中のＰＥＧ−Ｍａｌ（１５重量％で）と混合することによって調製した。室温で３０分間溶液を溶解し、１５重量％のＰＥＧ−トリペプチドおよび０．６７ｍＭのＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、およびＩＫＶＡＶを得た。完全に溶解した後、１Ｍ  ＮａＯＨを滴下して溶液のｐＨを７．４に上げた。 次に、得られた溶液を、０．２２μｍシリンジフィルターで無菌的に濾過することにより滅菌した。
【０１６５】
図２は、ＣＲＧＤＳによる４アームＰＥＧ−Ｍａｌの修飾の分析を示す。ＵＶ分析では、反応開始時に４１２ｎｍに明確なピークが見られた（図２（ａ））。これは、エルマン試薬のジスルフィド結合がチオール部分（この場合はＣＲＧＤＳ）によって切断され、イオン化されたときに生成されるＴＮＢ2-（２−ニトロ−５−チオベンゾエート）イオンの存在を表している。対照的に、このようなピークは、ＣＲＧＤＳを含まない４アームＰＥＧ−Ｍａｌ溶液には存在せず、反応を３０分間進行させた後、４アームＰＥＧ−Ｍａｌがエルマン試薬と反応していないことを示唆しており、ＣＲＧＤＳがそれぞれ３０分後に完全に反応した。ＣＲＧＤＳ結合の定量化は、1Ｈ  ＮＭＲを使用して、アミドおよびマレイミドのプロトンピークを比較することで確認した（図２（ｂ））。
【０１６６】
実施例１ｂ  −細胞培養培地中におけるポリマーバイオインクの調製
細胞培養培地中のＲＧＤ含有ＰＥＧ−Ｍａｌポリマーバイオインクは、ＰＢＳ溶液の代わりに、印刷される細胞に適切な細胞培養溶液を使用して、実施例１ａの手順に従って調製した。得られたポリマーバイオインクを、濾過（０．２２μｍフィルター）により無菌的に滅菌した。
【０１６７】
実施例１に従って調製されたポリマーバイオインクは、さらなる使用が必要になるまで−２０℃で保存した。ポリマーバイオインクは、機能に影響を与えることなく、−２０℃で少なくとも６カ月間保存できる。
【０１６８】
実施例２  −ＰＥＧビスチオールおよびＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ活性化剤の調製
実施例２ａ  −ＰＢＳ中での活性化剤の調製
活性化剤は、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＰＥＧビスチオール、ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ、およびＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ、またはそれらの様々な組み合わせを、相補的ポリマーバイオインクのマレイミド濃度に等モルの総チオール濃度でＰＢＳ中で混合することによって調製した。得られた溶液を、０．２２μｍシリンジフィルターで無菌的に濾過して滅菌した。
【０１６９】
実施例２ｂ  −細胞培養培地中における活性化剤の調製
活性化剤は、印刷される細胞に適切な細胞培養溶液中で、相補的バイオインクのマレイミド濃度に等モルの総チオール濃度で、ジチオスレイトール（ＤＴＴ）、ＰＥＧビスチオール、ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ、およびＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧを混合することによって調製した。得られた溶液を無菌的に濾過（０．２２μｍフィルター）により滅菌した。
【０１７０】
実施例２に従って調製された活性化剤は、さらなる使用が必要になるまで−２０℃で保存した。活性化剤は、機能に影響を与えることなく、−２０℃で少なくとも６カ月間保存できる。
【０１７１】
実施例３  −細胞培養
ＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）（ヒト神経芽細胞腫）、ＫｒａｓG12Dおよびｐ５３Ｒ172H（膵管腺がん）、ＭＣＦ７（ヒト乳がん）、およびＵ８７ｖＩＩＩ（ヒト神経膠芽腫）細胞を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）／ＤＭＥＭで３７℃／５％  ＣＯ2で個別に維持した。ヒト非小細胞肺がんＨ４６０細胞は、ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）１６４０培地および１０％ＦＣＳで３７℃／５％  ＣＯ2で培養された。細胞株は定期的にスクリーニングされ、マイコプラズマ汚染はなかった。
【０１７２】
実施例４  −トリパンブルー色素排除試験
実施例３に従って培養したＳＫ−Ｎ−ＢＥ（２）、ＫｒａｓG12Dおよびｐ５３Ｒ172H、Ｈ４６０、およびＵ８７ｖＩＩＩ細胞を、トリプシン／ＰＢＳを使用してＴ７５フラスコから収集し、遠心分離を使用してペレット化した。細胞を、ＰＥＧ−Ｍａｌ及びＰＥＧ−ＲＧＤを１０重量％および５ｍＭ  ＲＧＤ濃度で含むポリマーバイオインクに再懸濁して、細胞濃度を２×１０6細胞／ｍＬにした。サンプルを、印刷された対照および印刷されていない対照の２つの群に分けた。印刷されたサンプルは３Ｄバイオプリンターを通過し、室温で３０分間無菌状態に保たれた。０．４％トリパンブルー染色（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して死細胞を同定した。細胞数は、各サンプルの生細胞と死細胞の数を数えることによって得られた。細胞生存率は、生細胞の総数を細胞の総数（生＋死）で割ることによって決定された。
【０１７３】
実施例５  −細胞ポリマーバイオインクの調製
特定の培養密度での目的の培養細胞を、実施例４の手順に従って収集した。細胞ポリマーバイオインクを構成するために、収集した細胞を、適切な細胞濃度で実施例１（ａ）または１（ｂ）に従って調製した滅菌ポリマーバイオインクに再懸濁し、２×１０6細胞／ｍＬの１ｍＬの滅菌ポリマーバイオインクを得た。
【０１７４】
実施例６  −細胞活性化剤の調製
特定の培養密度での目的の培養細胞を、実施例４の手順に従って収集した。細胞活性化剤を構成するために、収集した細胞を、適切な細胞濃度で実施例２（ａ）または２（ｂ）に従って調製した滅菌活性化剤に再懸濁した。
【０１７５】
実施例７  −３Ｄ細胞生存率アッセイ
生／死染色を使用して、ヒドロゲルカプセル化細胞の生存率をモニターした。ＤＭＥＭ中のカルセインＡＭ（１μＬｍＬ-1）およびエチジウムホモダイマー−Ｉ（４μＬｍＬ-1）を使用して、それぞれ生細胞と死細胞とを染色した。実施例５に従って調製された細胞ポリマーバイオインクを使用して、カプセル化された細胞を有するヒドロゲルを３Ｄバイオプリンティングした。必要なインキュベーション期間後、共焦点蛍光顕微鏡分析の前に、バイオプリントヒドロゲルを生／死染色とともに３７℃／５％  ＣＯ2で少なくとも２時間インキュベートした。
【０１７６】
実施例８  −レオロジー解析
５ｍＭ  ＲＧＤ（１０重量％）を有する４アームＰＥＧ−Ｍａｌヒドロゲルから調製され（実施例１（ａ）に従って調製された）、ＰＥＧビスチオールおよびＭＭＰ２感受性ビスシステインペプチドＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ（５０：５０チオールモル濃度で混合）（実施例２（ａ）に従って調製された）で架橋されたヒドロゲルについて機械的特性を研究した。
【０１７７】
ヒドロゲルレオロジーは、同心円筒状スピンドルおよびカップシステムを備えたアントンパールモジュラーコンパクトレオメーター（ＭＣＲ）３０２を使用して測定した。粘度測定は、１〜１０００ｓ-1のせん断速度値で行った。ヒドロゲルのレオロジー特性は、平行平板形状（直径２５ｍｍ）システムと液体の蒸発を最小限に抑えるための溶媒トラップを備えた同じマシンを使用して測定した。レオロジー測定は予熱されたプレート上で行われ、３７℃の一定温度に維持された。振幅ひずみ掃引実験（γ：１  １００％）を行い、１０Ｈｚの固定周波数で線形粘弾性領域（ＬＶＲ）を決定した。各サンプルのＬＶＲを確立し、ヒドロゲルの線形粘弾性領域で固定ひずみで動的周波数掃引を行った（ω：０．１〜１０Ｈｚ）。時間掃引測定は、通常、固定周波数（１０Ｈｚ）およびひずみ振幅（ＬＶＲ内）で行った。
【０１７８】
図３に示されるように、周波数（図３（ａ））およびひずみ（図３（ｂ））掃引研究は、ゲルの機械的特性がこれらの２つのパラメータから独立していることを確認した。
【０１７９】
その後の剛性の決定は、ヒドロゲルの粘弾性領域内の一定の周波数およびひずみ値で行った（図３（ｃ））。ヒドロゲルをキャストしてから１分以内に測定を行った。図３（ｃ）は、測定期間を通じて、貯蔵弾性率（Ｇ’）値が常に損失弾性率（Ｇ’’）値よりも高かったことを示している。約１．１ｋＰａの一定の貯蔵弾性率値は、ゲル化プロセスが１分以内に完了したことを示している。ポリマーバイオインクと活性剤の両方の粘度研究では、粘度値が１０  ｃＰ未満であることが示され、ポリマーバイオインクと活性剤の両方がドロップオンデマンドバイオプリンティングプロセスに非常に好適である（図３（ｄ））。
【０１８０】
ＰＥＧビスチオール（実施例２（ａ）に従って調製された）で架橋された４アームＰＥＧ−Ｍａｌブランクポリマーバイオインク（実施例１（ａ）に従って調製された）から調製されたヒドロゲル、およびＭＭＰ感受性活性化剤（(ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ）  実施例２（ａ）に従って調製された）で架橋されたＰＥＧトリペプチドから調製されたヒドロゲルについても機械的特性を研究した。剛性の決定は、ＰＥＧ−Ｍａｌヒドロゲル（図４（ａ））およびＰＥＧトリペプチドヒドロゲル（図４（ｂ））の粘弾性領域内で一定の周波数とひずみの値で行った。ヒドロゲルをキャストしてから１分以内に測定を行った。図４（ａ）および４（ｂ）は、貯蔵弾性率（Ｇ’）値が、測定期間を通じて常に損失弾性率（Ｇ’’）値よりも高かったことを示している。この観察により、バイオインクと活性化剤が混合されたときにヒドロゲルの存在を確認した。定量的に、ＰＥＧ−ＭａｌブランクポリマーバイオインクとＰＥＧビス-活性化剤から形成されたヒドロゲルの剛性値は約０．２ｋＰａであり、ＰＥＧトリペプチド／ＭＭＰ感受性ヒドロゲルの剛性値は約１．６ｋＰａであった。
【０１８１】
実施例９  −３Ｄバイオプリンティングプラットフォーム
本実施例で使用される３Ｄバイオプリンターの構成要素は、３軸運動制御ステージ、ドロップオンデマンド液滴分配システム、および流体リザーバー内の圧力を制御するための圧力調整器を含む。液滴分配システムおよび３軸ステージは、層流キャビネット等の無菌チャンバー内に収容することができる。印刷プラットフォームは、マイクロウェルプレートやペトリ皿等、さまざまな種類の基板に印刷するためのアダプターを含む。印刷プラットフォームは、細胞増殖を補助するために３７℃に加熱することができる。
【０１８２】
３軸運動制御ステージ（ＭＸ８０Ｓ、Ｐａｒｋｅｒ）は、３つすべての（Ｘ、ＹおよびＺ）次元において１０μｍの解像度で液滴分配システムを正確に配置することができる。１０個の液滴ディスペンシングシステムは、マイクロコントローラー（Ａｒｄｕｉｎｏ  Ｍｅｇａ  ２５６０、Ａｒｄｕｉｎｏ）によって制御されるｊｅｗｅｌｌｅｄ  ｏｒｉｆｉｃｅ  ｄｉｓｐｅｎｓｉｎｇ  ｎｏｚｚｌｅ  （ＭＩＮＳＴＡＣ  Ｎｏｚｚｌｅ，  Ｔｈｅ  Ｌｅｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）を備えた電磁弁（ＶＨＳシリーズ電磁弁、Ｔｈｅ  Ｌｅｅ  Ｃｏｍｐａｎｙ）からなる。ｊｅｗｅｌｌｅｄ  ｏｒｉｆｉｃｅ  ｎｏｚｚｌｅの内径は、流体の粘度および所望の液滴量に応じて、１２７〜２５４μｍにすることができる。各液滴分配システムは、ポリマーバイオインクおよび活性化剤溶液が柔軟なチューブを介して分配されるための静圧リザーバーに取り付けられている。流体リザーバーの背圧および電磁弁の開放時間を使用して、必要な液滴量を調整することもできる。通常、背圧は１〜３００ｋＰａの圧力に設定され、電磁弁の開放時間は０．３ｍｓ以上で、液滴の体積は１〜５００ｎＬである。ポリマーバイオインクと活性化剤リザーバーを接続するフレキシブルチューブは、システムのプライミングと印刷ルーチンの最後のパージにかかる時間を最小限に抑えるために、可能な限り短く保たれた。
【０１８３】
実施例１０  −コントロールソフトウェア
３Ｄバイオプリンターは、生物学的アッセイを印刷するために開発されたカスタムソフトウェアを介して制御された。このソフトウェアは、グラフィカルユーザーインターフェイス（ＧＵＩ）を含んでおり、Ｐｙｔｈｏｎプログラミング言語で記述されている。ＧＵＩを介して、エンドユーザーはさまざまなアッセイ印刷ルーチンを選択し、液滴間隔や液滴体積などのアッセイパラメーターを変更できる。ユーザーは、液滴ディスペンシングシステムの空間位置を手動で制御し、液滴のカスタムパターンを作成することもできる。ソフトウェアの追加機能は、液滴ディスペンシングシステムをプライミングおよびパージするためのルーチンを含む。
【０１８４】
実施例１１  −３Ｄバイオプリンティング
滅菌ポリマーバイオインクおよび活性化剤を、印刷前に室温に加熱した。目的の細胞を、ポリマーバイオインクおよび／または活性化剤と所望の細胞濃度で混合した。次に、すべての溶液をバイオプリンターのサンプルトレイにロードした。バイオプリンティングは、Ｒａｓｔｒｕｍ（商標）モジュラー３Ｄバイオプリンター（Ｉｎｖｅｎｔｉａ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（ＩＬＳ））を使用して行った。構造は、Ｒａｓｔｒｕｍ（商標）ソフトウェア（ＩＬＳ）を使用して設計した。２つの異なるバイオプリントサンプルを印刷した；直径約６．３５ｃｍ、厚さ４００μｍの円筒形構造と直径１００μｍの半球構造で、直径６．３５ｃｍ、厚さ１００μｍの不活性ゲル層の上にある。ポリマーバイオインクと活性化剤の両方の溶液は、２０〜１００ｋＰａの印刷圧力で印刷された。バイオプリンティングプロセスの前に、Ｒａｓｔｒｕｍ（商標）バイオプリンターは自動滅菌およびプライミングステップを実施した。
【０１８５】
３Ｄオブジェクトの生成は、ポリマーバイオインク液滴の堆積によって達成され、その後、ソフトウェアによって決定された位置で、その直後に活性化剤液滴がその上に堆積された。すべての印刷は９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で行われた。完了したら、細胞に関連する細胞培養培地（１５０μＬ）を添加し、プレートをインキュベーターに移動した。
【０１８６】
図１は、３Ｄバイオプリンティングプロセスの代表的な概略図である。使用されたポリマーバイオインクは、４アームＰＥＧマレイミド（ＰＥＧ−Ｍａｌ）、ＣＲＧＤＳ、および所望のがん細胞（実施例１（ａ）および５に従って調製された）を含んでいた。活性化剤は、ＰＥＧビスチオールおよびビスチオールＭＭＰ感受性ペプチドＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ（実施例２（ａ）に従って調製された）の混合物を含んでいた。両方の溶液を、実施例９に従ってＩＬＳ  ３Ｄバイオプリンターシステムにロードし、これは、空間的に制御された方法でポリマーバイオインクと活性化剤の組み合わせを堆積させた。両方の溶液を混合すると即座にゲル化が起こり、９６ウェルプレート内のヒドロゲル内に三次元的にカプセル化された細胞が生成された。
【０１８７】
実施例１２  −膵管腺がん（ＫｒａｓG12Dおよびｐ５３Ｒ172H）の３Ｄバイオプリンティング
チオール−マレイミド架橋ＰＥＧヒドロゲル内の三次元的にカプセル化されたがん細胞の複数のサンプルを、ＩＬＳ  ３Ｄバイオプリンターを使用してバイオプリントした。具体的には、がん細胞、ポリマーバイオインク、および活性化剤の同時送達が、バイオプリンターを使用して行われ、バイオプリンティングされたヒドロゲル内のｉｎ  ｓｉｔｕ細胞カプセル化の迅速な作成を達成した。
【０１８８】
細胞培養
Ｔ１５０フラスコ中の８０％培養密度の膵管腺がん細胞ＫｒａｓG12Dおよびｐ５３Ｒ172Hを３ｍＬのＰＢＳで洗浄した。過剰なＰＢＳを吸引した後、３ｍＬのトリプシンを添加し、フラスコを３７℃でインキュベートして、フラスコ表面から細胞を５分間解離させた。続いて、ＤＭＥＭとＦＣＳを１０ｖ/ｖ％で混合して調製した７ｍＬの組織培養培地を添加し、解離した細胞を１５ｍＬチューブに移動した。細胞分散液を４００ｇで３分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを５ｍＬの培地に再懸濁した。次に、等量の細胞懸濁液とトリパンブルー染色を混合して細胞濃度を決定することにより、細胞計数を行った。
【０１８９】
基板
組み込まれたＣｏｒｎｉｎｇによって供給された９６ウェルプレートは、受け取ったままで使用された。内容物の無菌性を維持するために、無菌包装を無菌環境で開封した。
【０１９０】
ポリマーバイオインク
ポリマーバイオインクを調製するために、ＰＥＧ−Ｍａｌ（０．１５０ｇ）を１．５ｍＬのＰＢＳに溶解して、１０重量％のポリマーバイオインクを得た。ＰＥＧ−ＲＧＤを組み込む場合は、ＣＲＧＤＳ（１．３４ｍｇ）を溶液に加え、３０分間撹拌して、５ｍＭ  ＲＧＤを含む１０重量％ＰＥＧ−Ｍａｌ／ＰＥＧ−ＲＧＤポリマーバイオインクを得た。この溶液に、２．５μＬの１Ｍ  ＮａＯＨを添加し、溶液のｐＨを７．４に上げた。次に、溶液を無菌環境下で０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。
【０１９１】
２×１０6細胞／ｍＬで１ｍＬのＤＭＥＭに分散された、収集されたＫｒａｓG12Dおよびｐ５３Ｒ172Hを遠心分離して、５００，０００細胞の細胞ペレットを得た。次に、得られたペレットをポリマーバイオインク（１ｍＬ）に再分散させて、２×１０6細胞／ｍＬでＫｒａｓG12Dおよびｐ５３Ｒ172H細胞を分散させた細胞ポリマーバイオインク溶液を得た。
【０１９２】
活性化剤
非ＭＭＰおよびＭＭＰ感受性ヒドロゲルの両方を生成するために、２つの異なる活性化剤を調製した。２つの活性化剤は、ＰＥＧビスチオール（０．０１９７５ｇ）のみ、またはＰＥＧビスチオール（０．００９６ｇ）とＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ（０．０１１１ｇ）の組み合わせのいずれかから調製し、それぞれ１ｍＬ  ＰＢＳに溶解して、ポリマーバイオインクのマレイミド濃度に等モルの総チオール濃度の活性化剤を得た。次に、各溶液を無菌環境下で０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。
【０１９３】
細胞印刷条件
細胞ポリマーバイオインクおよび活性化剤を、バイオプリンターに接続された関連するカートリッジにロードした。細胞ポリマーバイオインクと活性化剤の両方を０．００７”ノズルに接続し、１０Ｐｓｉで動作させた。
【０１９４】
プリンターは、最初にエタノール（水中で７０ｖ／ｖ％）で拭き取り、空気乾燥することによって洗浄された。流体ライン、バルブ、およびノズルも、エタノール、水、および組織培養培地のパージによって、この順序で滅菌された。次に、細胞ポリマーのバイオインクおよび活性化剤をそれぞれのバイアルにロードした。次に、印刷ルーチンを開始する前に、プリントヘッドをプライミングした。
【０１９５】
アッセイの３Ｄ構造は、ＩＬＳカスタムメイドソフトウェアを使用して設計した。３Ｄアッセイは、総直径６．３５ｍｍの円形ゲルの３層で構成されていた。３Ｄアッセイのバイオプリンティングは、ソフトウェアを介して決定された位置にポリマーバイオインクと活性化剤のペアの液滴を繰り返し堆積させることによって行った。
【０１９６】
細胞濃度
２×１０6細胞／ｍＬの濃度の細胞ポリマーバイオインクをこの実験で使用した。
【０１９７】
細胞生存率
９５％以上の細胞生存率が得られた。
【０１９８】
実施例１３  −ヒト乳がん細胞（ＭＣＦ７）の３Ｄバイオプリンティング
細胞培養
Ｔ７５フラスコ中の８０％培養密度のＭＣＦ７細胞を３ｍＬのＰＢＳで洗浄した。過剰なＰＢＳを吸引した後、１ｍＬのトリプシンを添加し、フラスコを３７℃でインキュベートして、フラスコ表面から細胞を３分間解離させた。続いて、ＤＭＥＭとＦＣＳを１０ｖ／ｖ％で混合して調製した７ｍＬの組織培養培地を添加し、解離した細胞を１５ｍＬチューブに移動した。細胞分散液を４００ｇで３分間遠心分離した。上清を廃棄し、細胞ペレットを５ｍＬの培地に再懸濁した。次に、等量の細胞懸濁液とトリパンブルー染色を混合して細胞濃度を決定することにより、細胞計数を行った。
【０１９９】
基板
組み込まれたＣｏｒｎｉｎｇによって供給された９６ウェルプレートは、受け取ったままで使用された。内容物の無菌性を維持するために、無菌包装を無菌環境で開封した。
【０２００】
ポリマーバイオインク
ポリマーバイオインクを調製するために、ＰＥＧ−Ｍａｌ（０．１１２５ｇ）を１．５ｍＬのＰＢＳに溶解して、７．５重量％のポリマーバイオインクを得た。ＰＥＧトリペプチドは、ＣＲＧＤＳ（０．５４ｍｇ）、ＣＩＫＶＡＶ（０．６４ｍｇ）、ＣＹＩＧＳＲ（０．７０ｍｇ）、およびＰＥＧ−Ｍａｌ（０．２２５ｇ）を１．５ｍＬのＰＢＳで３０分間混合して、１５重量％のＰＥＧ−トリペプチドおよび０．６７ｍＭのＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、およびＩＫＶＡＶを得た。１Ｍ  ＮａＯＨを滴下して溶液のｐＨを７．４に上げた。両方の溶液を、０．２２μｍシリンジフィルターで無菌的に濾過した。
【０２０１】
活性化剤
非ＭＭＰおよびＭＭＰ感受性ヒドロゲルの両方を生成するために、２つの異なる活性化剤を調製した。２つの活性化剤は、ＰＥＧビスチオール（０．００１５ｇ）、またはＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ（０．０１９ｇ）のいずれかから調製し、それぞれ１ｍＬ  ＰＢＳに溶解して、それぞれブランクバイオインクおよびＰＥＧトリペプチドのマレイミド濃度に等モルの総チオール濃度の活性化剤を得た。次に、ＭＭＰ感受性活性化剤溶液を１Ｍ  ＮａＯＨを滴下してｐＨを７．４に上げた。次に、各溶液を無菌環境下で０．２２μｍシリンジフィルターで濾過した。
【０２０２】
１ｍＬのＤＭＥＭに分散された収集されたＭＣＦ７を遠心分離して、１０．０００，０００細胞の細胞ペレットを得た。次に、得られたペレットを活性化剤（１ｍＬ）に再分散させて、ＭＣＦ７細胞を１×１０7細胞／ｍＬで分散させた細胞ＭＭＰ−活性化剤溶液を得た。
【０２０３】
細胞印刷条件
ポリマーバイオインク、ＰＥＧビスチオール活性化剤、およびＭＭＰ感受性細胞活性化剤を、バイオプリンターに接続された関連するカートリッジにロードした。ポリマーバイオインク、ＰＥＧビスチオール活性化剤、およびＭＭＰ感受性細胞活性化剤をそれぞれ０．００７”ノズルに接続し、２５〜３０ｋＰａで動作させた。
【０２０４】
プリンターは、最初にエタノール（水中で７０ｖ／ｖ％）で拭き取り、空気乾燥することによって洗浄された。流体ライン、バルブ、およびノズルも、エタノール、滅菌水パージによって、この順序で滅菌された。次に、ポリマーバイオインク、ＰＥＧビスチオール活性化剤、およびＭＭＰ感受性細胞活性化剤をそれぞれのバイアルにロードした。次に、印刷ルーチンを開始する前に、プリントヘッドをプライミングした。
【０２０５】
アッセイの３Ｄ構造は、ＩＬＳカスタムメイドソフトウェアを使用して設計した。３Ｄアッセイは、直径６．３５ｃｍ、厚さ１００μｍの下部ゲル層と、直径１ｍｍ、厚さ２００μｍの細胞を含んだドーム型のゲルで構成されていた。
【０２０６】
細胞濃度
１×１０7細胞／ｍＬの濃度の細胞活性化剤をこの実験で使用した。
【０２０７】
細胞生存率
９５％以上の細胞生存率が得られた。
【０２０８】
実施例１４  −細胞配列の比較
膵がんの細胞配列に対するヒドロゲル微小環境の効果を、本技術のポリマーバイオインクおよび活性化剤を使用して試験した。膵がん細胞は、その生物学的特性が細胞培養環境に大きく依存しているために選択された。直径６ｍｍ、高さ０．４ｍｍのヒドロゲルサンプルを９６ウェルプレートにバイオプリンティングすることにより、２つの異なる細胞配列を試験した。最初に、細胞をヒドロゲルの上に３Ｄバイオプリントし、次に、細胞をヒドロゲルの内側に印刷しました（すなわち、カプセル化した）。試験した両方の細胞配置において、生細胞が観察された。さらに、ヒドロゲルへの突起を形成する細胞の能力によって表されるように、細胞−ゲル相互作用が目に見えた。全体として、生体適合性および生体関連の３Ｄアッセイは、ＰＥＧベースのポリマーバイオインクで正常にバイオプリントされました。
【０２０９】
ヒドロゲル上に播種された膵がん細胞
細胞ポリマーバイオインクは、採取した膵管腺がん細胞（ＫｒａｓG12Dおよびｐ５３Ｒ172H）および３Ｄバイオプリンティング用の５ｍＭ  ＲＧＤポリマーバイオインクを備えた４アームＰＥＧ−Ｍａｌ（１０ｋＤａ）から調製した。膵がん細胞は、推定５，０００細胞／ウェルを播種するのに適切な濃度で細胞ポリマーバイオインクに分散された。
【０２１０】
無細胞ヒドロゲルは、最初に、５ｍＭ  ＲＧＤポリマーバイオインクを備えた４アームＰＥＧ−Ｍａｌ（１０ｋＤａ）およびＰＥＧビスチオールおよびＭＭＰ２（ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ）活性化剤（５０：５０のチオール濃度比で）から、９６ウェルプレート上に３Ｄバイオプリンティングされた。次に、細胞ポリマーバイオインクを、ＰＥＧビスチオールおよびＭＭＰ２活性化剤（５０：５０のチオール濃度比で）とともにヒドロゲルの上に印刷して、推定５，０００細胞／ウェルを播種した。
【０２１１】
ヒドロゲル上に播種された膵がん細胞の顕微鏡画像を撮影した。３日間のインキュベーション後、組織培養プラスチックの上に播種した場合の同じ細胞の形態学的差異が観察された。ヒドロゲル上に播種すると、細胞−ゲル相互作用と細胞間相互作用の両方が促進され、三次元すべてに広範な細胞突起を備えた拡張細胞ネットワークが形成された。３日間のインキュベーション後、培養細胞は生／死染色アッセイにより生存していることが確認された。細胞生存率は＞９８％であることが確認され、小さな個々の死細胞がより大きな生細胞クラスター内にはっきりと見えた。
【０２１２】
膵がん細胞はまた、比較のために様々な基板に播種された。顕微鏡画像は、組織培養ウェルプレートの上に播種された膵がん細胞が非常に個性的であることを示した。対照的に、膵がん細胞は、ヒドロゲル上に播種されたときに、複数の細胞間に拡張されたネットワークを形成した。ヒドロゲル上に播種されている間、細胞はヒドロゲルに侵入し、３Ｄ細胞ネットワークを形成することができた。顕微鏡でｚ軸のゲルをスキャンし、ヒドロゲル内に３Ｄ細胞ネットワークが存在することを確認する。
【０２１３】
生物学的に不活性なヒドロゲルにカプセル化された膵がん細胞
膵管腺がん細胞（ＫｒａｓG12Dおよびｐ５３Ｒ172H）を、ＰＥＧ−ＲＧＤを含まないポリマーバイオインクに２×１０6細胞／ｍＬで分散させて、細胞ポリマーバイオインクおよび細胞ポリマーバイオインクを、ＭＭＰ２感受性ペプチドを含まない活性化剤と一緒に印刷した。ｉｎ  ｓｉｔｕカプセル化は、９６ウェルプレート上のＰＥＧビスチオール活性化剤を用いて細胞バイオインクを直接３Ｄバイオプリンティングすることによって達成された。
【０２１４】
共焦点画像は、ヒドロゲル内にカプセル化された膵がん細胞を示した。細胞の形態は、インキュベーション期間にわたって確認された。ＲＧＤおよびＭＭＰ２架橋剤がないため、細胞はゲル内の形態が丸みを帯びていた。この形態は、細胞がヒドロゲルと相互作用して接着斑を生成することができず、ゲル内を移動することができなかったことを示した。生／死アッセイは、３日間のインキュベーション期間後にカプセル化された細胞で実施された。蛍光画像は、３日間のインキュベーション後に生細胞（＞９５％の生存率）を示した。
【０２１５】
生物学的に活性なヒドロゲルにカプセル化された膵がん細胞
膵管腺がん細胞（ＫｒａｓG12Dおよびｐ５３Ｒ172H）を２×１０6細胞／ｍＬで細胞ポリマーバイオインクに分散させ、ＭＭＰ２感受性ペプチド活性化剤（５０：５０チオール濃度比で）と一緒に印刷した。ｉｎ  ｓｉｔｕカプセル化は、９６ウェルプレート上にＰＥＧビスチオールおよびＭＭＰ２活性化剤（ＭＭＰ−２  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を使用して細胞ポリマーバイオインクを直接３Ｄバイオプリンティングすることによって達成した。ＭＭＰ２活性化剤（ＭＭＰ−２  ａｃｔｉｖａｔｏｒ）を使用して、細胞浸潤を可能にした。
【０２１６】
共焦点画像は、ヒドロゲル内にカプセル化された膵がん細胞を示した。細胞の形態学的変化は、インキュベーション期間にわたって確認された。ゲル内部では、細胞間相互作用は細胞クラスターの形成によって表され、細胞−ゲル相互作用および細胞浸潤は細胞膜突起の存在によって確認された。生／死アッセイは、３日間および６日間のインキュベーション期間後にカプセル化された細胞で行われた。明視野および蛍光画像は、３日間のインキュベーション後に生細胞（＞９８％の生存率）を示し、細胞間相互作用および細胞−ゲル相互作用の存在を確認した。細胞浸潤は６日間のインキュベーションでより顕著であり、強い細胞−ゲル相互作用を示している。同時に、ゲル内で６日間培養した後も、９８％を超える細胞生存率が維持された。
【０２１７】
ヒドロゲルに播種されたＭＣＦ７乳がん細胞
細胞活性は、３日間のインキュベーション後、明視野顕微鏡下での細胞形態の観察を介して確認された。インキュベーション期間後、単一のＭＣＦ７細胞の凝集が見られ、あらかじめ決められたゲル領域に複数のスフェロイドが形成された。これは、個々のＭＣＦ７細胞がヒドロゲル内で互いに移動できることを示している。
【０２１８】
実施例１５  −マレイミド基による冷水魚の皮膚由来のゼラチンの修飾
魚皮由来のゼラチン（１ｇ）を、４０℃で２０ｍＬの２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）緩衝液に溶解した。別の容器に、６−マレイミドヘキサン酸（ＭＨＡ；  ０．２１１ｇ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ、１：２０  ＥＤＣ：ＭＨＡモル比で）、およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、１：２  ＮＨＳ：ＥＤＣモル比で）を１ｍＬのＭＥＳバッファーに溶解し、２０分間撹拌して、カルボン酸（ＣＯＯＨ）基を活性化した。次に、活性化されたＣＯＯＨ基の溶液をゼラチン溶液に移動し、反応を２４時間進行させた。得られた溶液を、１０ｍＭ塩酸（ＨＣｌ）および１重量％塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）に対する２日間の透析、続いて１０ｍＭ  ＨＣｌに対する１日間の透析によって精製した。次に、精製ゼラチン溶液を凍結乾燥して、マレイミド修飾魚ゼラチンを得た。
【０２１９】
実施例１６  −マレイミド基によるブタ皮膚由来のゼラチンの修飾
ブタの皮膚由来のゼラチン（ゲル強度３００、タイプＡ、１ｇ）を、４０℃で２０ｍＬのＭＥＳ緩衝液に溶解した。別の容器で、ＭＨＡ（０．１３９ｇ）、ＥＤＣ（１：２０  ＥＤＣ：ＭＨＡモル比で）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ、１：２  ＮＨＳ：ＥＤＣモル比で）を１ｍＬ  ＭＥＳバッファーに溶解し、２０分間撹拌して、ＣＯＯＨ基を活性化した。次に、活性化されたＣＯＯＨ基の溶液をゼラチン溶液に移動し、反応を２４時間進行させた。得られた溶液を、１０ｍＭ  ＨＣｌおよび１重量％  ＮａＣｌに対する２日間の透析、続いて１０ｍＭ  ＨＣｌに対する１日間の透析によって精製した。次に、精製ゼラチン溶液を凍結乾燥して、マレイミド修飾ブタゼラチンを得た。
【０２２０】
実施例１７  −マレイミド修飾ゼラチンのゲル化
実施例１５および１６で合成された、ブタおよび冷水魚の皮膚の両方由来のマレイミド修飾ゼラチンを、それぞれ２０重量％のＰＢＳに溶解して、ポリマーバイオインクを得た。各溶液のｐＨを１Ｍ  ＮａＯＨでｐＨ７．４に中和した。活性化剤を調製するために、マレイミドモル濃度と等しいＳＨモル濃度のＰＥＧビスチオールをＰＢＳに溶解した。ゲル化は、等量の各ポリマーバイオインクと活性化剤とを混合することによって達成された。
【０２２１】
実施例１８  −コラーゲン含有ＰＥＧヒドロゲルの３Ｄバイオプリンティング
基板
Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒによって供給された細胞培養皿を、９６ウェルプレートの寸法を模倣する標的グリッドでエッチングした。
【０２２２】
ポリマーバイオインク
ポリマーバイオインクを調製するために、ＰＥＧ−Ｍａｌ（０．１５ｇ）を１．５ｍＬのＰＢＳに溶解して、１０重量％のポリマーバイオインクを得た。溶液を０．２２μｍシリンジフィルターで無菌的に濾過した。
【０２２３】
活性化剤
コラーゲン含有活性化剤は、ＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ（０．０１ｇ）を０．５ｍＬのＰＢＳに混合することによって調製された。続いて、０．５ｍＬのＩ型ウシコラーゲン（３．１ｍｇ）を活性化剤溶液に混合して、コラーゲン含有ＭＭＰ活性化剤を得た。続いて、１Ｍ  ＮａＯＨを滴下することにより、溶液のｐＨをｐＨ７．４に調整した。次に、溶液を０．２２μｍシリンジフィルターで無菌的に濾過した。
【０２２４】
印刷条件
ポリマーバイオインクおよびコラーゲン含有ＭＭＰ活性化剤を、バイオプリンターに接続された適切なカートリッジにロードした。ポリマーバイオインクと活性化剤の両方が０．００７”ノズルに接続され、２５〜３０ｋＰａで動作した。
【０２２５】
アッセイの３Ｄ構造は、ＩＬＳカスタムメイドソフトウェアを使用して設計された。３Ｄ直角プリズム構造は、長さと幅が約４．５ｃｍ、厚さが１５０μｍの下部ゲル層で構成されていた。
【０２２６】
構造の検証
得られたヒドロゲル構造を、ＵＳＢデジタル顕微鏡を使用して画像化した。
【０２２７】
実施例１９  −コラーゲン含有ＰＥＧヒドロゲル内の線維芽細胞培養
コラーゲン含有ポリマーバイオインクは、１：１のｖ／ｖ比で、ＰＢＳ中の１０重量％のＰＥＧ−ＭａｌとＩ型ウシコラーゲンとを混合することによって調製した。１Ｍ  ＮａＯＨ溶液を滴下することにより、溶液のｐＨを７．４に上げた。マレイミド濃度に対して等モルのチオールを含むＰＥＧビスチオール活性化剤をＰＢＳで調製した。収集したヒト肺線維芽細胞（ＭＲＣ−５）細胞をペレット化し、コラーゲン含有ポリマーバイオインクに再懸濁した。ＰＥＧヒドロゲルは、最初にポリマーバイオインクをウェルプレートに移動し、続いて等量の細胞含有活性化剤を同じウェルに移動ことによって調製した。次に、１００μＬのＤＭＥＭ＋１０ｖ/ｖ％  ＦＢＳを各ウェルに添加し、サンプルを６日間インキュベートし、０、３、および６日目に明視野画像を撮影して細胞活性をモニターした。
【０２２８】
線維芽細胞培養に対するゲルの生物学的適合性は、線維芽細胞の形態が丸い形態から紡錘体様の形態に変化するのを調べることによって評価した。
【０２２９】
当業者は、本開示が、具体的に記載されたもの以外の変形および改変を受けやすいことを理解するであろう。本発明は、広く説明されているように、本発明の趣旨または範囲から逸脱することなく、そのようなすべての変形および改変を含むことが理解されるべきである。したがって、本実施形態は、すべての点で例示的であり、限定的ではないと見なされるべきである。
【０２３０】
本開示はまた、本明細書において個別にまたは集合的に言及または示されたすべての工程、特徴、組成物、および化合物、ならびに該工程、特徴、組成物、および化合物の任意の２つ以上の任意およびすべての組み合わせを含む。
【０２３１】
参考文献
１．  Caliari, S. R.; Burdick, J. A., A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods 13, 405 (2016).
２．  Murphy, S. V.; Atala, A., 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology 32, 773 (2014).
３．  Donderwinkel, I.; van Hest, J. C. M.; Cameron, N. R., Bio-inks for 3D bioprinting: recent advances and future prospects. Polymer Chemistry 8, 4451-4471 (2017).
４．  Jungst, T.; Smolan, W.; Schacht, K.; Scheibel, T.; Groll, J., Strategies and Molecular Design Criteria for 3D Printable Hydrogels. Chemical Reviews 116, 1496-1539 (2016).
５．  Lowe, S. B.; Tan, V. T. G.; Soeriyadi, A. H.; Davis, T. P.; Gooding, J. J., Synthesis and High-Throughput Processing of Polymeric Hydrogels for 3D Cell Culture. Bioconjugate Chemistry 25, 1581-1601 (2014).
６．  Gao, G.; Hubbell, K.; Schilling, A. F.; Dai, G.; Cui, X., Bioprinting Cartilage Tissue from Mesenchymal Stem Cells and PEG Hydrogel. In 3D Cell Culture: Methods and Protocols, Koledova, Z., Ed. Springer New York: New York, NY, 2017; pp 391-398.
７．  Gao, G.; Yonezawa, T.; Hubbell, K.; Dai, G.; Cui, X., Inkjet-bioprinted acrylated peptides and PEG hydrogel with human mesenchymal stem cells promote robust bone and cartilage formation with minimal printhead clogging. Biotechnology Journal 10, 1568-1577 (2015).
【図１】
2021531780.tif 000008
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年5月19日(2020.5.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
少なくとも二つのチオール官能基を有するビスチオール含有架橋剤を使用して架橋され、ＰＥＧマレイミド、ゼラチンマレイミド、またはそれらの組み合わせから選択されるマレイミド含有ポリマーから形成される、ドロップオンデマンドの３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２】
前記マレイミド含有ポリマーはＰＥＧマレイミドを含む、請求項１に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項３】
前記マレイミド含有ポリマーはゼラチンマレイミド（ｇｅｌａｔｉｎ  ｍａｌｅｉｍｉｄｅ）を含む、請求項１に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項４】
前記ビスチオール含有架橋剤は、合成ポリマー、バイオポリマー、小分子、生理活性分子、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項５】
前記ビスチオール含有架橋剤が、ＰＥＧビスチオール、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）感受性ペプチド、またはそれらの組み合わせから選択される、請求項４に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項６】
前記ビスチオール含有架橋剤はＰＥＧビスチオールである、請求項５に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項７】
前記ビスチオール含有架橋剤は、マトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）感受性ペプチドである、請求項５に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項８】
前記ＭＭＰ感受性ペプチドは、ＭＭＰ感受性ビスシステインペプチドである、請求項７に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項９】
前記ＭＭＰ感受性ペプチドは、ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ、ＧＣＲＤＧＰＱＧＩＷＧＱＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ、ＧＣＲＤＥＡＰＬＫＱＤＲＣＧ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項８に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１０】
前記ＭＭＰ感受性ペプチドは、ＧＣＩＰＶＳＬＲＳＧＣＧ、ＧＣＲＤＰＬＧＬＤＲＣＧ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項９に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１１】
前記マレイミド含有ポリマーは、ＲＧＤ、ＹＩＧＳＲ、およびＩＫＶＡＶから選択される少なくとも一つの生理活性分子で置換されたＰＥＧマレイミドである、請求項２に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１２】
前記マレイミド含有ポリマーはゼラチンマレイミドであり、前記ビスチオール含有架橋剤はＰＥＧビスチオールである、請求項３に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１３】
マレイミド含有ポリマーとビスチオール含有架橋剤のモル比が１０：１から１：１０の範囲である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１４】
細胞を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１５】
前記細胞は前記ヒドロゲルの一部内に懸濁されている、または前記細胞は実質的に前記ヒドロゲル全体に均一に懸濁されている、請求項１４に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１６】
前記印刷された細胞の濃度は１×１０5〜５×１０8細胞／ｍＬの範囲にある、請求項１４または１５に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１７】
前記細胞は、肝細胞、胃腸細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、気管細胞、血管細胞、骨格筋細胞、心臓細胞、皮膚細胞、平滑筋細胞、結合組織細胞、角膜細胞、泌尿生殖器細胞、乳房細胞、生殖細胞、内皮細胞、上皮細胞、線維芽細胞、神経細胞、シュワン細胞、脂肪細胞、骨細胞、骨髄細胞、軟骨細胞、周皮細胞、中皮細胞、内分泌組織由来細胞、間質細胞、幹細胞、前駆細胞、リンパ細胞、血液細胞、内胚葉由来細胞、外肺葉由来細胞、および中胚葉由来細胞、ならびにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１８】
生理活性分子をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項１９】
前記生理活性分子は、遊離生理活性分子である、またはマレイミド含有ポリマー、ビスチオール含有架橋剤、またはマレイミド含有ポリマーおよびビスチオール含有架橋剤の両方に結合している、請求項１８に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２０】
前記生理活性分子は、ペプチド、ＭＭＰ感受性ペプチド、タンパク質、多糖類、薬剤（ｄｒｕｇ）、治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｇｅｎｔ）、抗体、小分子阻害剤、キナーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、抗原、病原体、血小板、成長因子、サイトカイン、アミノ酸、栄養素、馴化培地、抗生物質、抗ウイルス薬、ＲＮＡ、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される、請求項１８または１９に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２１】
前記生理活性分子はコラーゲンである、請求項２０に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２２】
細胞培養培地をさらに含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の３Ｄプリントヒドロゲル。
【請求項２３】
ＰＥＧマレイミド、ゼラチンマレイミド、またはそれらの組み合わせから選択されるマレイミド含有ポリマーを含む、ポリマーバイオインクを提供する工程；
少なくとも二つのチオール官能基を有するビスチオール含有架橋剤を含む活性化剤を提供する工程；
ドロップオンデマンド印刷によるポリマーバイオインクおよび活性化剤を印刷する工程であって、ここで、ポリマーバイオインクの液滴が基板に適用され、続いて活性化剤の液滴が適用されて前記ヒドロゲルを形成するか、または活性化剤の液滴が基板に適用され、続いて ポリマーバイオインクの液滴が適用されてヒドロゲル液滴を形成する工程；
ポリマーバイオインクおよび活性化剤の液滴をヒドロゲル液滴に繰り返し堆積させて、３Ｄプリントヒドロゲルを形成する工程
を含む、ドロップオンデマンドの３Ｄプリントヒドロゲルを調製する方法。
【請求項２４】
印刷中に細胞を提供して、細胞含有３Ｄプリントヒドロゲル（３Ｄ  ｐｒｉｎｔｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｃｅｌｌｓ）を形成する工程をさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記細胞は、ポリマーバイオインク中、活性化剤中、ポリマーバイオインクおよび活性化剤の両方の中、または３Ｄ印刷の前の別個の培地（ｓｅｐａｒａｔｅ  ｍｅｄｉｕｍ  ｐｒｉｏｒ  ｔｏ  ３Ｄ  ｐｒｉｎｔｉｎｇ）の中に存在する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記３Ｄプリントヒドロゲルは、前記ポリマーバイオインクと前記活性化剤の印刷から３０分以内、または１０分以内、または１分以内、または３０秒以内、または１０秒以内、または１秒以内で形成される、請求項２３〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記３Ｄプリントヒドロゲルは、前記ポリマーバイオインクと前記活性化剤の印刷から１秒以内で形成される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記ポリマーバイオインク、前記活性化剤、または前記ポリマーバイオインクおよび前記活性化剤の両方を印刷前に約ｐＨ７．４に調整する、請求項２３〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ｐＨはＮａＯＨを使用して調整される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の細胞を含む３Ｄプリントヒドロゲルを含む細胞アッセイ。
【請求項３１】
細胞アッセイのための、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の細胞を含む３Ｄプリントヒドロゲルの使用。
【国際調査報告】
2021531780.tif 000012
2021531780.tif 000013
2021531780.tif 000014
2021531780.tif 000015
2021531780.tif 000016