(57)【要約】  質量分析により、試料中の、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ）、３−ヒドロキシオクタノアート、３−メチルグルタリルカルニチン、３−ウレイドプロピオナート、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、シトラート、フコース、フマラート、γ−トコフェロール、グルタマート、グルタラート、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、マレアート、マロナート、マンノース、オロタート、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、パルミトレアート、リノレナート、キサンチン、キシリトールおよびそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の分析物の量を決定する方法が記載される。方法は、分析物のうちの１つ以上のそれぞれから質量分析によって検出可能な１つ以上のイオンを生成するのに適した条件下で、イオン化源に試料を供すること、質量分析によって、１つ以上の分析物のそれぞれからの１つ以上のイオンの量を測定すること、および１つ以上のイオンの測定量を使用して、試料中の１つ以上の分析物のそれぞれの量を決定することを含む。また、１つ以上の分析物のそれぞれの内部標準としての１つ以上の同位体標識類似体を含むキットも記載される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
質量分析により、試料中の、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ）、３−ヒドロキシオクタノアート、３−メチルグルタリルカルニチン、３−ウレイドプロピオナート、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、シトラート、フコース、フマラート、γ−トコフェロール、グルタマート、グルタラート、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、マレアート、マロナート、マンノース、オロタート、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、パルミトレアート、リノレナート、キサンチン、キシリトールおよびそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の分析物の量を決定する方法であって、
ａ）前記１つ以上の分析物のそれぞれから質量分析によって検出可能な１つ以上のイオンを生成するのに適した条件下で、イオン化源に前記試料を供し、前記分析物は、イオン化の前に誘導体化されず、
ｂ）質量分析によって、前記１つ以上の分析物のそれぞれからの前記１つ以上のイオンの量を測定し、
ｃ）前記１つ以上のイオンの測定量を使用して、前記試料中の前記１つ以上の分析物のそれぞれの量を決定すること、を含む方法。
【請求項２】
前記１つ以上の分析物が、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシオクタン酸、クエン酸、フコース、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、マロン酸、パルミトレイン酸、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、キサンチン、キシリトールおよびリノレン酸からなる群から選択され、前記１つ以上の分析物の量が、単回注入で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記１つ以上の分析物が、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルＬ−カルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタミン酸、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリンおよびタウロコラートからなる群から選択され、前記１つ以上の分析物の量が、単回注入で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の分析物が、２，３−ピリジンジカルボン酸、３−ヒドロキシブチラート、フコース、フマル酸、グルタミン酸、グルタラート、グリセロール、ヒポキサンチン、マレイン酸、マロン酸、マンノース、オロタート、リボース、セリン、タウリン、３−ウレイドプロピオン酸、キサンチンおよびキシリトールからなる群から選択され、前記１つ以上の分析物の量が、単回注入で決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記イオン化源が、負イオン化モードで操作される、請求項２または請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記イオン化源が、正イオン化モードで操作される、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
２つ以上の分析物の量が決定される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
３つ以上の分析物の量が決定される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
４つ以上の分析物の量が決定される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
５つ以上の分析物の量が決定される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
６つ以上の分析物の量が決定される、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記１つ以上の分析物のそれぞれの量を決定するために使用される前記１つ以上のイオンが、表２、表３および表４のイオンから選択される１つ以上のイオンである、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
イオン化源に供される前に、前記試料が液体クロマトグラフィーによって精製されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記液体クロマトグラフィーが、高速液体クロマトグラフィー、超高速液体クロマトグラフィーおよび乱流液体クロマトグラフィーからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料が、イオン化源に供される前に、高速液体クロマトグラフィーまたは超高速液体クロマトグラフィーのいずれかによって精製されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
内部標準を使用して、前記試料中の前記１つ以上の分析物の量を決定する、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記内部標準が、測定される前記１つ以上の分析物のうちの少なくとも１つの同位体標識類似体を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記試料が生物学的試料を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料が、血液、血漿および血清からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記質量分析がタンデム質量分析である、請求項１に記載の方法。
【請求項２１】
肝機能の臨床的決定に有用な他の方法を使用して前記試料を分析することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記他の方法が、総コレステロール、総トリグリセリド、アルブミン、アルブミン／グロブリン比、総タンパク質、直接ビリルビン、総ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）および血清コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ）、３−ヒドロキシオクタノアート、３−メチルグルタリルカルニチン、３−ウレイドプロピオナート、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、シトラート、フコース、フマラート、γ−トコフェロール、グルタマート、グルタラート、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、マレアート、マロナート、マンノース、オロタート、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、パルミトレアート、リノレナート、キサンチン、キシリトールおよびそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の分析物のそれぞれの内部標準としての１つ以上の同位体標識類似体と、包装材料と、キットを使用するための説明書とを含むキット。
【請求項２４】
前記１つ以上の分析物が、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシオクタン酸、クエン酸、フコース、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、マロン酸、パルミトレイン酸、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、キサンチン、キシリトール、リノレン酸およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
前記１つ以上の分析物が、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルＬ−カルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタミン酸、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリン、タウロコラートおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２６】
前記１つ以上の分析物が、２，３−ピリジンジカルボン酸、３−ヒドロキシブチラート、フコース、フマル酸、グルタミン酸、グルタラート、グリセロール、ヒポキサンチン、マレイン酸、マロン酸、マンノース、オロタート、リボース、セリン、タウリン、３−ウレイドプロピオン酸、キサンチン、キシリトールおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項２３に記載のキット。
【請求項２７】
前記内部標準が、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ−ｄ４、３−ヒドロキシオクタン酸−ｄ１２、クエン酸−２，２，４，４−ｄ４酸、フコース−１３Ｃ６、グリセロール１３Ｃ３、グリコケノデオキシコール−ｄ４酸、グリココール−ｄ４酸、マロン酸−ｄ４、パルミトレイン酸−ｄ１４、Ｌ−セリン（２，３，３−ｄ３）、タウリン−１，１，２，２−ｄ４、タウロケノデオキシコラート−ｄ４、タウロコラート−ｄ４、キサンチン−１３Ｃ１５Ｎ２、キシリトール−ｄ７、ｄ４−リノレン酸およびそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の内部標準を含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２８】
前記内部標準が、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ−ｄ４、３−メチル−グルタロイルＮ−（メチル−ｄ３）−カルニチン、７ａ−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン−ｄ７、γ−トコフェロール−ｄ４、グルタミン酸−ｄ５、グリコケノデオキシコール−ｄ４酸、グリココール−ｄ４酸、ヒポキサンチン−１３Ｃ５，１５Ｎ４、Ｌ−Ｌ−セリン（２，３，３−ｄ３）、タウロコラート−ｄ４およびそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の内部標準を含む、請求項２５に記載のキット。
【請求項２９】
前記内部標準が、キノリン酸１３Ｃ３１５Ｎ、ｄ４−３−ヒドロキシブチラート、フコース−１３Ｃ６、フマル酸−１３Ｃ４、Ｌ−グルタミン酸−ｄ５、１３Ｃ２−グルタラート、グリセロール１３Ｃ３、ヒポキサンチン−１３Ｃ５，１５Ｎ４、マレイン酸２，３−ｄ２、マロン酸−ｄ４、マンノース１３Ｃ６、オロタート−１３Ｃ１５Ｎ２、Ｄ−リボース−１３Ｃ５、Ｌ−セリン（２，３，３−ｄ３）、タウリン−１，１，２，２−ｄ４、１３Ｃ４１５Ｎ２−ウレイドプロピオン酸、キサンチン−１３Ｃ１５Ｎ２、キシリトール−ｄ７およびそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の内部標準を含む、請求項２６に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
本発明の背景を説明するための以下の情報は、本発明の理解を助けるために提供されており、本発明に対する先行技術を構成または説明すると認めるものではない。
【０００２】
肝機能は、例えば、食事、アルコール乱用、脂肪肝疾患、感染症、薬物および癌を含む様々な生活様式、疾患および障害によって影響を受けることがある。多くの場合、人が肝機能障害の症状を経験する前に、かなりの量の肝組織が損傷を受けている可能性がある。現在、肝機能を評価するための最も一般的な検査には、血液中の特定の酵素およびタンパク質の測定が含まれる。これらの検査には、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、および血清コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）、総コレステロール、総トリグリセリド、アルブミン、アルブミン／グロブリン比、総タンパク質、直接ビリルビン、および総ビリルビンが含まれる。
【０００３】
現在の肝血液検査は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、線維症および肝硬変を含む肝疾患の最初の徴候を提供し得るが、この検査は、肝機能の早期変化を検出せず、疾患を鑑別することができない。その後の評価で肝疾患の明らかな理由（薬物、ウイルス性肝炎、またはアルコールの過剰使用など）が示されず、肝臓のＸ線検査または画像検査で脂肪が認められる場合、ＮＡＳＨが疑われるが、ＮＡＳＨの診断を証明し、単純性脂肪肝と鑑別する唯一の方法は肝生検である。肝線維症の存在および病期分類を決定するのにも、肝生検が必要である。現在、血液検査またはスキャンでは、この情報を確実に提供することはできない。肝生検は、皮膚を通して針を挿入し、肝臓の小片を採取する必要がある侵襲的な手技である。この手技は痛みを伴い、過度の出血のリスクを伴う。したがって、現在利用可能な臨床アッセイを補足する、肝機能を評価するための侵襲性の低い方法（すなわち、肝生検を必要としない方法）の必要性が存在する。
【０００４】
単純な良性脂肪肝から、脂質蓄積、炎症、肝細胞のバルーニング（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅ  ｂａｌｌｏｏｎｉｎｇ）、および様々な程度の線維症を特徴とするＮＡＳＨに及ぶ組織学的スペクトル全体を包含するＮＡＦＬＤの有病率は、肥満の流行とともに増加し続けている。肥満関連肝疾患の認識が高まっているにもかかわらず、ＮＡＦＬＤおよびＮＡＳＨの病因は十分に理解されておらず、ＮＡＳＨを適応症とするＦＤＡ承認治療は存在しない。ＮＡＳＨの診断は依然として複雑であり、侵襲的な肝生検が必要なため重大なリスクを伴う。したがって、ＮＡＦＬＤを診断および病期分類する能力を含め、肝機能の評価に有用な、血液に基づく代謝物バイオマーカーのプロファイルの同定は、重要な満たされていない医学的ニーズである。
【０００５】
本明細書では、生物学的試料中の、肝機能の評価に有用な分析物を検出および定量するための方法を記載する。測定される分析物は、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ、３−ＨＢ）、３−ヒドロキシオクタノアート（３−ヒドロキシオクタン酸）、３−メチルグルタリルカルニチン、３−ウレイドプロピオナート（３−ウレイドプロピオン酸）、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、シトラート（クエン酸）、フコース、フマラート（フマル酸）、γ−トコフェロール、グルタマート（グルタミン酸）、グルタラート（グルタル酸）、グリセロール、グリコケノデオキシコラート（グリコケノデオキシコール酸）、グリココラート（グリココール酸）、ヒポキサンチン、マレアート（マレイン酸）、マロナート（マロン酸）、マンノース、オロタート（オロチン酸）、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート（タウロケノデオキシコール酸）、タウロコラート（タウロコール酸）、パルミトレアート（パルミトレイン酸）、リノレナート（リノレン酸）、キサンチン、キシリトールから選択される１つ以上の分析物から構成される一団を含み得る。これらの分析物の組合せは、総コレステロール、総トリグリセリド、アルブミン、アルブミン／グロブリン比、総タンパク質、直接ビリルビン、総ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）および血清コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）を含む従来の臨床生化学アッセイとともに使用され得る。これらの方法の結果は、炎症、損傷、酸化ストレス、線維症、脂肪肝およびＮＡＳＨの存在、非存在またはレベル（病期）の評価を含め、肝機能の評価を可能にする。このアプローチの利点には、その非侵襲性と、肝機能を評価するためのルーチンの臨床診療での使いやすさとが含まれる。さらに、代謝物アッセイは、必要とする試料サイズが少量であり、誘導体化を必要とせず、質量分析法を使用して行うことができる。
【発明の概要】
【０００６】
本発明の第１の態様では、方法は、質量分析により、試料中の、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ）、３−ヒドロキシオクタノアート、３−メチルグルタリルカルニチン、３−ウレイドプロピオナート、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、シトラート、フコース、フマラート、γ−トコフェロール、グルタマート、グルタラート、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、マレアート、マロナート、マンノース、オロタート、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、パルミトレアート、リノレナート、キサンチン、キシリトールおよびそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の分析物から構成される一団の分析物の量を検出および決定することを含む。一実施形態では、方法は、１つ以上の分析物のそれぞれから質量分析によって検出可能な１つ以上のイオンを生成するのに適した条件下で、イオン化源に試料を供することを含む。別の実施形態では、分析物は、イオン化の前に誘導体化されない。生物学的試料から分析物を抽出し、質量分析による検出に先立ってクロマトグラフィーにより分析物を分離する方法も提供される。
【０００７】
一実施形態では、質量分析はタンデム質量分析である。
【０００８】
一実施形態では、方法は、単回注入を使用する質量分析によって、試料中の複数の分析物の量、例えば、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシオクタン酸、クエン酸、フコース、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、マロン酸、パルミトレイン酸、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、キサンチン、キシリトールおよびリノレン酸からなる群から選択される１つ以上の分析物の量などを決定することを含む。
【０００９】
一実施形態では、方法は、単回注入を使用する質量分析によって、試料中の複数の分析物の量、例えば、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルＬ−カルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタミン酸、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリンおよびタウロコラートからなる群から選択される１つ以上の分析物の量などを決定することを含む。
【００１０】
一実施形態では、方法は、単回注入を使用する質量分析によって、試料中の複数の分析物の量、例えば、２，３−ピリジンジカルボン酸、３−ヒドロキシブチラート、フコース、フマル酸、グルタミン酸、グルタラート、グリセロール、ヒポキサンチン、マレイン酸、マロン酸、マンノース、オロタート、リボース、セリン、タウリン、３−ウレイドプロピオン酸、キサンチンおよびキシリトールからなる群から選択される１つ以上の分析物の量などを決定することを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上または７つ以上の分析物の量が決定される。２つ以上の分析物の量が決定される場合、２つ以上の分析物は、「複数の分析物」と呼ばれ得る。複数の分析物が定量される場合、分析物は「一団」または「一団の分析物」と呼ばれ得る。
【００１２】
一実施形態では、実行時間は９分以下であり得る。別の実施形態では、実行時間は８分未満であり得る。
【００１３】
実施形態では、試料は、血漿試料または血清試料であり得る。試料体積は、１０μｌ〜２００μｌであり得る。例えば、試料体積は、１０μｌ、１５、２０、２５、３０、４０、５０μｌ、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０もしくは２００μｌ、または１０〜２００μｌの任意の他の体積であり得る。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
試料中の、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ）、３−ヒドロキシオクタノアート、３−メチルグルタリルカルニチン、３−ウレイドプロピオナート、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、シトラート、フコース、フマラート、γ−トコフェロール、グルタマート、グルタラート、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、マレアート、マロナート、マンノース、オロタート、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、パルミトレアート、リノレナート、キサンチン、キシリトールおよびそれらの組合せからなる代謝物の群から選択される１つ以上の分析物の量を測定するための方法が記載される。単回注入法を使用して、試料中の単一および複数の分析物を定量するための質量分析法が記載される。方法は、ＵＰＬＣまたはＨＩＬＩＣなどの液体クロマトグラフィー工程を使用して、質量分析の方法と組み合わせて、選択された分析物の分離（精製、濃縮）を行い、それにより、試料中の複数の分析物を定量するための自動化に適したハイスループットアッセイシステムを提供し得る。
【００１５】
本明細書に提示される方法は、これらの分析物を測定するための現在の方法に勝る利点を提供する。様々な組合せの複数の分析物を単回注入で定量的に測定する能力は、分析結果を得るために必要な時間を短縮し、実験室の処分物（例えば、チューブ、ピペットチップ、試薬）、実験室の機器、および人的資源の観点から、使用する資源を減少させる。これらの改善は、アッセイのコストを削減し、試料分析のための機器と実験室の能力とを増加させることによって節約をもたらす。
【００１６】
本発明をさらに詳細に説明する前に、以下の用語を定義する。
【００１７】
定義
用語「固相抽出」は、複合混合物の成分（すなわち、移動相）が、固体粒子クロマトグラフィー充填材（すなわち、固相または固定相）を使用して、それらの物理的特性および化学的特性に従って分離される試料調製プロセスを指す。固体粒子充填材は、カートリッジタイプの装置（例えば、カラム）に含まれ得る。
【００１８】
用語「分離」は、複合混合物をその成分分子または代謝物に分離するプロセスを指す。一般的な例示的な実験室分離技術には、電気泳動およびクロマトグラフィーが含まれる。
【００１９】
用語「クロマトグラフィー」は、分離される成分（すなわち、化学成分）が２つの相の間に分配され、一方の相は固定され（固定相）、他方の相（移動相）は一定の方向に移動する物理的分離法を指す。移動相は、気体（「ガスクロマトグラフィー」、「ＧＣ」）または液体（「液体クロマトグラフィー」、「ＬＣ」）であり得る。本明細書に記載の方法の実施形態では、クロマトグラフィー出力データが使用され得る。
【００２０】
用語「液体クロマトグラフィー」または「ＬＣ」は、流体が細かく分割された物質のカラムを通って、または毛細管通路を通って均一に移動する際に、流体溶液の１つ以上の成分を選択的に抑制するプロセスを指す。抑制は、移動相が固定相に対して移動する際に、１つ以上の固定相と移動相との間の混合物の成分の分配による。「液体クロマトグラフィー」の例には、「逆相液体クロマトグラフィー」もしくは「ＲＰＬＣ」、「高速液体クロマトグラフィー」もしくは「ＨＰＬＣ」、「超高速液体クロマトグラフィー」もしくは「ＵＰＬＣ」もしくは「ＵＨＰＬＣ」、または親水性相互作用クロマトグラフィーもしくは「ＨＩＬＩＣ」が挙げられる。
【００２１】
用語「保持時間」は、試料が分離装置に導入されてからのクロマトグラフィープロセスでの経過時間を指す。試料の成分の保持時間とは、試料を分離装置に注入した時間から、試料の成分が固定相を含む分離装置の部分から溶出する（例えば、それから出る）時間までのクロマトグラフィープロセスでの経過時間を指す。
【００２２】
試料成分の「保持指数」という用語は、試料成分のピークの前後に溶出された標準物質の保持時間に対して、試料成分の保持時間または保持係数を関連付ける内挿（通常、対数的）により得られる数を指し、この内挿は、既知の標準物質の分離特性を使用して系統誤差を排除する機構である。
【００２３】
用語「分離指数」は、分離技術によって分離された化学成分に関連する測定基準を指す。クロマトグラフ分離技術では、分離指数は保持時間または保持指数であり得る。非クロマトグラフ分離技術では、分離指数は、化学成分が移動した物理的距離であり得る。
【００２４】
本明細書で使用される場合、用語「分離情報」および「分離データ」は、分離指数に関して化学成分の存在または非存在を示すデータを指す。例えば、分離データは、特定の時間に溶出する特定の質量を有する化学成分の存在を示し得る。分離データは、経時的に溶出する化学成分の量が増加し、ピークに達し、その後減少することを示し得る。分離指数（例えば、時間）にわたってプロットされた化学成分の存在のグラフは、図示的なピークを示し得る。したがって、分離データの文脈内では、用語「ピーク情報」および「ピークデータ」は、用語「分離情報」および「分離データ」と同義である。
【００２５】
用語「質量分析」（ＭＳ）は、標的分子をイオン化するかイオン化および断片化し、次いで、それらの質量／電荷比に基づいてイオンを分析して、「分子フィンガープリント」として機能する質量スペクトルを生成することを含む、分子を測定および分析するための技術を指す。物体の質量／電荷比の決定は、電磁エネルギーがその物体によって吸収される波長を決定する手段によって行われ得る。イオンの質量対電荷比を決定するために一般的に使用される方法はいくつかあり、イオン軌道と電磁波との相互作用を測定する方法もあれば、イオンが所与の距離を移動するのに要する時間を測定する方法、またはその両方の組合せもある。これらの断片質量測定から得られたデータをデータベースに対して検索して、標的分子の同定を得ることができる。
【００２６】
用語「負のモードで操作する」または「負の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作する」または「負イオン化モードで操作する」は、負イオンが生成および検出される質量分析法を指す。用語「正のモードで操作する」または「正の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作する」または「正イオン化モードで操作する」は、正イオンが生成および検出される質量分析法を指す。
【００２７】
用語「質量分析器」は、イオンの混合物をそれらの質量対電荷（「ｍ／ｚ」）比によって分離する、質量分析計内の装置を指す。
【００２８】
用語「ｍ／ｚ」は、イオンの質量数をその電荷数で割ることによって形成される無次元量を指す。これは長い間「質量対電荷」比と呼ばれてきた。
【００２９】
本明細書で使用される場合、用語「供給源」または「イオン化源」は、分析される試料をイオン化する、質量分析計内の装置を指す。イオン化源の例には、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）、マトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）などが挙げられる。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「検出器」は、イオンを検出する、質量分析計内の装置を指す。
【００３１】
用語「イオン」は、例えば、物体に電子を付加するか、物体から電子を除去することによって形成され得る、電荷を含む任意の物体を指す。
【００３２】
用語「質量スペクトル」は、典型的には、ｘ軸にｍ／ｚ値およびｙ軸に強度値を含む、質量分析計によって生成されたデータのプロットを指す。
【００３３】
用語「スキャン」は、特定の分離指数と関連する質量スペクトルを指す。例えば、クロマトグラフ分離技術を使用するシステムは複数のスキャンを生成し得、各スキャンは異なる保持時間にある。
【００３４】
用語「実行時間」は、試料注入から機器データの生成までの時間を指す。
【００３５】
用語「タンデムＭＳ」は、「一次ＭＳ」と呼ばれる第１のＭＳ工程が行われ、その後、一般に「二次ＭＳ」と呼ばれる後続のＭＳ工程のうちの１つ以上が行われる操作を指す。一次ＭＳでは、一次質量スペクトルの生成中に、１つ（場合によっては複数）の化学成分を表すイオンが検出および記録される。イオンによって表される物質を二次ＭＳに供し、二次ＭＳでは、目的の物質を断片化して物質をサブ成分に分解し、これを二次質量スペクトルとして検出および記録する。実際のタンデムＭＳでは、一次ＭＳ中の目的のイオンと二次ＭＳ中に生成される結果として得られるピークとの間に明確な関係が存在する。一次ＭＳでの目的のイオンは、「親」または前駆イオンに相当し、二次ＭＳ中に生成されるイオンは、親イオンのサブ成分に相当し、本明細書中で「娘」または「生成物」イオンと呼ばれる。
【００３６】
したがって、タンデムＭＳにより、複合混合物中の化学成分の親―娘関係を表すデータ構造を生成することが可能になる。この関係は、親イオンと娘イオンとの相互の関係を例示する樹状構造によって表され得、娘イオンは、親イオンのサブ成分を表す。タンデムＭＳは、例えば「孫娘」イオンを決定するために、娘イオンに対して繰り返され得る。したがって、タンデムＭＳは、２つのレベルの断片化に限定されるものではなく、「ＭＳｎ」とも呼ばれるマルチレベルのＭＳを指すのに一般に使用される。用語「ＭＳ／ＭＳ」は「ＭＳ２」の同義語である。簡潔を期すために、以下の用語「娘イオン」は、二次または高次（すなわち、一次ではない）ＭＳによって生成される任意のイオンを指す。
【００３７】
１つ以上のバイオマーカーの「レベル」とは、試料中で測定されたバイオマーカーの絶対的または相対的な量または濃度を意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「分析物」または「代謝物」は、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ）、３−ヒドロキシオクタノアート、３−メチルグルタリルカルニチン、３−ウレイドプロピオナート、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、シトラート、フコース、フマラート、γ−トコフェロール、グルタマート、グルタラート、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、マレアート、マロナート、マンノース、オロタート、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、パルミトレアート、リノレナート、キサンチン、キシリトールおよびそれらの組合せを指す。この用語は、大きな高分子、例えば、大きなタンパク質（例えば、分子量が２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１０，０００を超えるタンパク質）、大きな核酸（例えば、分子量が２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１０，０００を超える核酸）または大きな多糖類（例えば、分子量が２，０００、３，０００、４，０００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００または１０，０００を超える多糖類）を含まない。
【００３９】
「試料」または「生物学的試料」とは、対象から単離された生物学的材料を意味する。生物学的試料は、所望のバイオマーカーを検出するのに適した任意の生物学的材料を含有し得、対象由来の細胞材料および／または非細胞材料を含み得る。試料は、例えば、血液、血漿（ｂｌｏｏｄ  ｐｌａｓｍａ）（血漿（ｐｌａｓｍａ））、血清（ｂｌｏｏｄ  ｓｅｒｕｍ）（血清（ｓｅｒｕｍ））、尿、脳脊髄液（ＣＳＦ）、糞便または組織などの任意の好適な生物学的流体または組織から単離することができる。
【００４０】
「対象」とは、任意の動物を意味するが、好ましくは、例えば、ヒト、サル、マウス、イヌ、ウサギまたはラットなどの哺乳動物である。
【００４１】
Ｉ．試料調製および品質管理（ＱＣ）
分析物を含有する試料抽出物は、試料中に存在する可能性のある高分子（例えば、タンパク質、核酸、脂質）から分析物を単離することによって調製される。試料中の一部または全部の分析物がタンパク質に結合している場合がある。ＭＳ分析の前に、様々な方法を使用して、分析物とタンパク質との間の相互作用を妨げてもよい。例えば、試料から分析物を抽出して液体抽出物を生成してもよく、存在する可能性のあるタンパク質を沈殿させ除去してもよい。タンパク質は、例えば、酢酸エチルまたはメタノールの溶液を使用して沈殿させてもよい。試料中のタンパク質を沈殿させるには、酢酸エチルまたはメタノールの溶液を試料に加え、次いで、混合物を遠心分離機で回転させて、沈殿したタンパク質から、抽出された分析物を含有する液体上清を分離してもよい。
【００４２】
他の実施形態では、分析物は、タンパク質を沈殿させることなくタンパク質から放出され得る。例えば、試料にギ酸溶液を加えて、タンパク質と分析物との間の相互作用を妨げてもよい。あるいは、硫酸アンモニウム、ギ酸のエタノール溶液、またはギ酸のメタノール溶液を試料に加えて、タンパク質を沈殿させることなくタンパク質と分析物との間のイオン相互作用を妨げてもよい。一例では、アセトニトリル、メタノール、水およびギ酸の溶液を使用して、試料から分析物を抽出してもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるように、液体クロマトグラフィー、電気泳動、濾過、遠心分離およびアフィニティー分離を含む様々な方法に抽出物を供して、試料中の１つ以上の他の成分と比較して、選択された分析物の量を精製または濃縮してもよい。
【００４４】
例えば、分析物を検出および定量する方法の精度、正確さ、校正範囲または分析感度を評価するために、品質管理（ＱＣ）試料が使用されてもよい。ＱＣ試料に使用される所与の分析物の濃度は、試料中で検出された所与の分析物の定量下限（ＬＬＯＱ）または定量上限（ＵＬＯＱ）に基づいて決定され得る。一例では、ＬＬＯＱは、標準物質（例えば、標準物質Ａ）の濃度によって表され得、ＵＬＯＱは、第２の標準物質（例えば、標準物質Ｈ）の濃度によって表され得る。低ＱＣ値は、約３Ｘ  ＬＬＯＱの濃度に設定され得、中ＱＣ値は、高ＱＣの約２５〜約５０％の濃度に設定され得、高ＱＣ値は、ＵＬＯＱの約８０％の濃度に設定され得る。ＱＣの標的濃度レベルは、分析測定範囲（ＡＭＲ）と、一連の代表的な試料に対して測定されるような試料結果の頻度との組合せに基づいて選択され得る。
【００４５】
ＩＩ．クロマトグラフィー
分析物抽出物は、質量分析の前に、電気泳動、濾過、遠心分離、アフィニティー分離またはクロマトグラフィーなどの１つ以上の分離方法に供され得る。一実施形態では、分離方法は、例えば、超高速ＬＣ（ＵＨＰＬＣ）を含む液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を含み得る。
【００４６】
いくつかの実施形態では、ＵＨＰＬＣは、逆相カラムクロマトグラフィーシステム、親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）または混合相カラムクロマトグラフィーシステムを使用して行われ得る。
【００４７】
ＬＣ用のカラムヒータ（またはカラムマネージャ）は、約２５℃〜約８０℃の温度に設定され得る。例えば、カラムヒータは、約３０℃、約４０℃、約５０℃、約６０℃、約７０℃などに設定され得る。
【００４８】
一例では、ＵＨＰＬＣは、ＨＩＬＩＣシステムを使用して行われ得る。別の例では、ＵＨＰＬＣは、逆相カラムクロマトグラフィーシステムを使用して行われ得る。システムは、２つ以上の移動相を含み得る。移動相は、例えば、移動相Ａ、移動相Ｂ、移動相Ａ’および移動相Ｂ’と呼ばれ得る。
【００４９】
２つの移動相ＡおよびＢを使用する例示的な実施形態では、移動相Ａは水中に重炭酸アンモニウムを含み得、移動相Ｂはメタノールおよび水中に重炭酸アンモニウムを含み得る。重炭酸アンモニウムの濃度は１ｍＭ〜１０ｍＭの範囲であり得、メタノールの濃度は１％〜９９％の範囲であり得る。いくつかの例では、移動相Ａ中の重炭酸アンモニウムの濃度は、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０または８．５ｍＭであり得る。いくつかの例では、移動相Ｂ中の重炭酸アンモニウムの濃度は、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０、５．５、６．０、６．５、７．０、７．５、８．０または８．５ｍＭであり得、メタノールの濃度は、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８または９９％であり得る。
【００５０】
一例では、クロマトグラフィーに直線勾配溶出が使用されてもよい。直線勾配溶出の開始条件は、移動相（例えば、移動相Ｂ）の濃度および／またはカラムを通る移動相（例えば、移動相Ｂ）の流量を含み得る。開始条件は、１つ以上の分析物の分離および／または保持に対して最適化されてもよい。また、勾配条件は、分析物の分離および／または保持に対して最適化されてもよく、選択された流量に応じて変化させてもよい。例えば、初期条件は、移動相Ｂ  ０．５％および流量３５０μＬ／分であり得る。移動相Ｂは、５０〜７５％に増加し、約４分の時点で約７５〜約９９％に増加し、１〜２分間維持され得る。移動相Ｂは、６．２分の時点で０．５％に戻り得、そこで次の試料注入に対する平衡化のために１〜２分間維持され得る。総実行時間は７．５分以下であり得る。
【００５１】
別の例では、移動相Ａは、ペルフルオロペンタン酸（ＰＦＰＡ）、ギ酸および水を含み得、移動相Ｂは、ＰＦＰＡ、ギ酸およびメタノールを含み得る。ＰＦＰＡの濃度は、約０．０１〜約０．５００％であり得、ギ酸の濃度は、約０．００１〜約１．０％であり得る。いくつかの例では、移動相Ａ中のペルフルオロペンタン酸（ＰＦＰＡ）の濃度は、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２または０．３％であり得、ギ酸の濃度は、０．００１、０．００５、０．１、０．２、０．３、０．４または０．５％であり得る。他の例では、移動相Ｂ中のＰＦＰＡの濃度は、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２または０．３％であり得、ギ酸の濃度は、０．００１、０．００５、０．１、０．２、０．３、０．４または０．５％であり得る。クロマトグラフィーには直線勾配溶出が使用されてもよい。例えば、初期条件は、移動相Ｂ  ５％および流量４５０μＬ／分であり得る。移動相Ｂは、約５分の時点で約７５〜約９９％に増加し、約３分間維持され得る。移動相Ｂは、８分の時点で５％に戻り得、そこで次の試料注入に対する平衡化のために約１分間維持され得る。総実行時間は９分以下であり得る。
【００５２】
さらに他の実施形態では、移動相Ａは、ギ酸アンモニウム、アセトニトリル、メタノールおよび水を含み得、移動相Ｂは、ギ酸アンモニウムおよびアセトニトリルを含み得る。移動相Ａ中のギ酸アンモニウムの濃度は０．１ｍＭ〜１００ｍＭの範囲であり得、アセトニトリルの濃度は０％〜１００％の範囲であり得る。いくつかの例では、移動相Ａ中のギ酸アンモニウムの濃度は、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭまたは５０ｍＭであり得、アセトニトリルの濃度は、６０、７０、８０または９０％であり得る。他の例では、移動相Ｂ中のギ酸アンモニウムの濃度は、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ、１５ｍＭ、２０ｍＭ、２５ｍＭまたは５０ｍＭであり得、アセトニトリルの濃度は、３０％、４０％、５０％または６０％であり得る。クロマトグラフィーには直線勾配溶出が使用されてもよい。例えば、初期条件は、移動相Ｂ  ５％および流量５００μＬ／分であり得る。移動相Ｂは、約３〜約４分の時点で約４０〜約６０％に増加し、４〜６分の時点で約７５〜約９９％に増加し、約１分間維持され得る。移動相Ｂは、６〜７分の時点で５％に戻り得、そこで次の試料注入に対する平衡化のために約１分間維持され得る。総実行時間は７．５分以下であり得る。
【００５３】
ＩＩＩ．質量分析および定量
１つ以上の分析物は、例えば、質量分析によってイオン化され得る。質量分析は、分画された試料をイオン化し、さらに分析するために荷電分子を生成するためのイオン化源を含む質量分析計を使用して行われる。試料のイオン化は、例えば、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）によって行われ得る。他のイオン源には、例えば、大気圧化学イオン化（ＡＰＣＩ）、加熱エレクトロスプレーイオン化（ＨＥＳＩ）、大気圧光イオン化（ＡＰＰＩ）、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）またはマトリックス支援レーザ脱離イオン化（ＭＡＬＤＩ）が含まれ得る。イオン化方法の選択は、いくつかの考慮事項に基づいて決定され得る。例示的な考慮事項には、測定される分析物、試料のタイプ、検出器のタイプ、および正のモードまたは負のモードの選択が含まれる。いくつかの例では、質量分析法は、感度を高めるために２つ以上の期間に分割され得る。
【００５４】
１つ以上の分析物は、正のモードまたは負のモードでイオン化されて、１つ以上のイオンを生成してもよい。例えば、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルカルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタマート、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリンおよびタウロコラートといった分析物は、正のモードでイオン化され得る。さらに別の例では、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ）、３−ヒドロキシオクタノアート、３−ウレイドプロピオナート、シトラート、フコース、フマラート、グルタマート、グルタラート、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、マレアート、マロナート、マンノース、オロタート、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、パルミトレアート、リノレナート、キサンチン、キシリトールといった分析物は、負のモードでイオン化され得る。いくつかの例では、分析物は、単回注入で正のモードおよび負のモードでイオン化され得る。
【００５５】
一例では、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシオクタン酸、クエン酸、フコース、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、マロン酸、パルミトレイン酸、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、キサンチン、キシリトールおよびリノレン酸といった分析物は、負のモードでイオン化され得、単回注入で測定され得る。別の例では、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルＬ−カルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタミン酸、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリンおよびタウロコラートといった分析物は、正のモードでイオン化され得、単回注入で測定され得る。さらに別の例では、２，３−ピリジンジカルボン酸、３−ヒドロキシブチラート、フコース、フマル酸、グルタミン酸、グルタラート、グリセロール、ヒポキサンチン、マレイン酸、マロン酸、マンノース、オロタート、リボース、セリン、タウリン、３−ウレイドプロピオン酸、キサンチンおよびキシリトールといった分析物は、負のモードでイオン化され得、単回注入で測定され得る。
【００５６】
質量分析計の機器設定は、所与の分析方法に対して、および／または使用される特定の質量分析計に対して最適化され得る。機器は、様々なガス、例えば、窒素、ヘリウム、アルゴンまたはゼロエアを使用し得る。一実施形態では、質量分析は、ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＱＴｒａｐ  ５５００質量分析計を使用して行われ得る。一例では、質量分析計は、正の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで操作され得る。イオンスプレー電圧設定は、約０．５ｋＶ〜約６．０ｋＶの範囲であり得る。一実施形態では、電圧は５．５ｋＶに設定され得る。供給源温度は、約３５０°Ｃ〜約６００°Ｃの範囲であり得る。一実施形態では、供給源温度は５００℃に設定され得る。カーテンガスは、約１０〜約５５ｐｓｉの範囲であり得る。一実施形態では、カーテンガスは３０ｐｓｉに設定される。ネブライザガスおよび脱溶媒和ガスの流量は、約０〜約９０ｐｓｉの範囲であり得る。一実施形態では、流量は７０に設定され得る。ＣＡＤガス設定は、高から低の範囲であり得る。一実施形態では、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ガスは中程度に設定される。デクラスタリング電位は、約２０Ｖ〜約１９０Ｖの範囲であり得る。衝突エネルギー（ＣＥ）は、約１０Ｖ〜約７０Ｖの範囲であり得る。エントランス電位（ＥＰ）は、約１０Ｖであり得る。コリジョンセルイグジット電位（ＣＸＰ）設定は、約２Ｖ〜約３０Ｖの範囲であり得る。
【００５７】
別の例では、ＭＳ機器は、負のＭＲＭモードで操作され得る。イオンスプレー電圧設定は、−０．５ｋＶ〜−５．５ｋＶの範囲であり得る。一実施形態では、電圧は、−４．５ｋＶに設定され得る。供給源温度は、約３５０°Ｃ〜約６００°Ｃの範囲であり得る。一実施形態では、供給源温度は５００℃に設定され得る。カーテンガスは１０〜４０の範囲であり得る。一実施形態では、カーテンガスは３０に設定され得る。ネブライザガスおよび脱溶媒和ガスの流量は、４０〜９０の範囲であり得る。一実施形態では、流量は７０に設定され得る。別の実施形態では、流量は８０に設定され得る。別の例では、ネブライザガスの流量は８０に設定され得、脱溶媒和ガスの流量は６５に設定され得る。ＣＡＤガスは、低から高の範囲であり得る。一例では、ＣＡＤは、例えば、中程度に設定され得る。別の例では、ＣＡＤは高く設定され得る。デクラスタリング電位は、約−１０Ｖ〜約−２９０Ｖの範囲であり得る。衝突エネルギー（ＣＥ）は、約−１０Ｖ〜約−１３０Ｖの範囲であり得る。エントランス電位（ＥＰ）は、約−１０Ｖであり得る。コリジョンセルイグジット電位（ＣＸＰ）設定は、約−５Ｖ〜約−３５Ｖの範囲であり得る。
【００５８】
試料がイオン化された後、正または負に帯電したイオンを分析して、質量対電荷比を決定してもよい。質量対電荷比を決定するための例示的な好適な分析器には、四重極分析器、イオントラップ分析器および飛行時間分析器が含まれる。イオンは、例えば、選択モードまたはスキャンモードを使用して検出され得る。例示的なスキャンモードには、ＭＲＭおよび選択反応モニタリング（ＳＲＭ）が含まれる。
【００５９】
分析結果には、タンデムＭＳによって生成されたデータが含まれ得る。例示的な実施形態では、タンデムＭＳは、精密質量タンデムＭＳであり得る。例えば、精密質量タンデム質量分析は、四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）分析器を使用し得る。タンデムＭＳにより、複合混合物中の化学成分の親―娘関係を表すデータ構造を生成することが可能になる。この関係は、親イオンと娘イオンとの相互の関係を例示する樹状構造によって表され得、娘イオンは、親イオンのサブ成分を表す。
【００６０】
例えば、一次質量スペクトルは、５つの図示的なピークとして表され得る５つの異なるイオンを含み得る。一次ＭＳでの各イオンは親イオンであり得る。各親イオンは、その特定の親イオンに対する娘イオンを示す質量スペクトルを生成する二次ＭＳに供され得る。
【００６１】
親／娘関係は、分離された成分（例えば、クロマトグラフィー状態から溶出している成分）と一次ＭＳで検出されたイオンとの関係、および分析される試料と分離された成分との関係を表すように拡張され得る。
【００６２】
質量分析計は、典型的には、ユーザにイオンスキャン（すなわち、所与の範囲にわたり特定の質量／電荷を有する各イオンの相対的存在量）を提供する。質量分析データは、いくつかの方法によって、元の試料中の分析物の量に関連付けられ得る。一例では、所与のイオンの相対的存在量が元の分析物の絶対量に変換され得るように、校正標準を使用して標準曲線（校正曲線）を生成する。別の例では、校正標準は外部標準であり得、標準曲線が、それらの標準物質から生成されたイオンに基づいて生成されて、もう１つの分析物の量を計算してもよい。さらなる例では、外部標準は、標識されていない分析物であり得る。
【００６３】
内部標準が、校正標準および／または試験試料に加えられてもよい。試料中の測定された分析物のさらに正確な値を得るために、内部標準を使用して、試料処理中の分析物の損失を把握してもよい。校正標準のレベルにおける分析物のピーク面積と内部標準のピーク面積との比を使用して、校正曲線を生成し、試料を定量してもよい。分析物の１つ以上の同位体標識類似体、例えば、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ−ｄ４、１３Ｃ２−グルタラート、１３Ｃ４１５Ｎ２−ウレイドプロピオン酸、３−ヒドロキシオクタン酸−ｄ１２、７ａ−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン−ｄ７、クエン酸−２，２，４，４−ｄ４酸（Ｃｉｔｒｉｃ  Ａｃｉｄ−２，２，４，４−ｄ４  ａｃｉｄ）、ｄ４−３−ヒドロキシブチラート、Ｄ−リボース−１３Ｃ５、フコース−１３Ｃ６、フマル酸−１３Ｃ４、γ−トコフェロール−ｄ４、グリセロール１３Ｃ３、グリコケノデオキシコール−ｄ４酸（Ｇｌｙｃｏｃｈｅｎｏｄｅｏｘｙｃｈｏｌｉｃ−ｄ４  ａｃｉｄ）、グリココール−ｄ４酸（Ｇｌｙｃｏｃｈｏｌｉｃ−ｄ４  ａｃｉｄ）、ヒポキサンチン−１３Ｃ５，１５Ｎ４、Ｌ−グルタミン酸−ｄ５、Ｌ−セリン（２，３，３−ｄ３）、マレイン酸２，３−ｄ２、マロン酸−ｄ４、マンノース１３Ｃ６、パルミトレイン酸−ｄ１４、キノリン酸１３Ｃ３１５Ｎ、タウリン−１，１，２，２−ｄ４、タウロケノデオキシコラート−ｄ４、タウロコラート−ｄ４、キシリトール−ｄ７、ｄ４−リノレン酸、キサンチン−１３Ｃ１５Ｎ２、オロタート−１３Ｃ１５Ｎ２および３−メチル−グルタロイルＮ−（メチル−ｄ３）−カルニチンが内部標準として使用され得る。
【００６４】
ＭＳ機器からの分析データは、コンピュータに送信され、コンピュータソフトウェアを使用して処理され得る。一例では、内部標準に対する分析物のピーク面積比が、定量のための統計的回帰法を使用して、校正標準の濃度に対して適合される。別の例では、統計的回帰は、加重線形最小二乗回帰である。校正曲線を使用して計算された傾きおよび切片を使用して、実験試料中の分析物の未知の濃度を計算してもよい。
【００６５】
１つ以上の一団の肝臓分析物の濃度を得た後、濃度値を多変量アルゴリズムに入力して、肝機能スコアを生成してもよい。例えば、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ）、３−ヒドロキシオクタノアート、３−メチルグルタリルカルニチン、３−ウレイドプロピオナート、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、シトラート、フコース、フマラート、γ−トコフェロール、グルタマート、グルタラート、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、マレアート、マロナート、マンノース、オロタート、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、パルミトレアート、リノレナート、キサンチンおよびキシリトールからなる群から選択される２つの分析物、３つの分析物、４つの分析物、５つの分析物または６つ以上の分析物の濃度が決定されてもよい。一例では、総コレステロール、総トリグリセリド、アルブミン、アルブミン／グロブリン比、総タンパク質、直接ビリルビン、総ビリルビン、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）、γ−グルタミルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）および血清コリンエステラーゼ（ＣｈＥ）を含む１つ以上の従来の臨床生化学アッセイが、本明細書に記載の方法を使用して得られた分析物の濃度値と組み合わせて使用されてもよい。従来の臨床生化学アッセイは、例えば、Ａｂｂｏｔｔ製のＡＲＣＨＩＴＥＣＴ分析器を使用することを含め、当技術分野で公知の方法を使用して行われてもよい。
【００６６】
ＩＶ．キット
１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ）、３−ヒドロキシオクタノアート、３−メチルグルタリルカルニチン、３−ウレイドプロピオナート、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、シトラート、フコース、フマラート、γ−トコフェロール、グルタマート、グルタラート、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、マレアート、マロナート、マンノース、オロタート、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、パルミトレアート、リノレナート、キサンチン、キシリトールおよびそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上または複数の一団の腎臓分析物をアッセイするためのキットが本明細書に記載されている。例えば、キットは、包装材料と、１つ以上のアッセイに十分な量の１つ以上の分析物標準物質または内部標準の測定量とを含み得る。例示的な実施形態では、内部標準は標識され得（同位体標識または放射標識など）、キットは、予め作製された移動相溶液を含み得、および／またはキットは、移動相試薬と、移動相溶液を調製するための説明書とを含み得る。キットはまた、試薬を使用して１つ以上の分析物を測定するために、実体のある形態で記録された説明書（例えば、書面で、例えば、取扱説明書または電子媒体など）を含み得る。
【００６７】
例示的な実施形態では、キットとともに使用するための１つ以上の内部標準は、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ−ｄ４、１３Ｃ２−グルタラート、１３Ｃ４１５Ｎ２−ウレイドプロピオン酸、３−ヒドロキシオクタン酸−ｄ１２、７ａ−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン−ｄ７、クエン酸−２，２，４，４−ｄ４酸、ｄ４−３−ヒドロキシブチラート、Ｄ−リボース−１３Ｃ５、フコース−１３Ｃ６、フマル酸−１３Ｃ４、γ−トコフェロール−ｄ４、グリセロール１３Ｃ３、グリコケノデオキシコール−ｄ４酸、グリココール−ｄ４酸、ヒポキサンチン−１３Ｃ５，１５Ｎ４、Ｌ−グルタミン酸−ｄ５、Ｌ−セリン（２，３，３−ｄ３）、マレイン酸２，３−ｄ２、マロン酸−ｄ４、マンノース１３Ｃ６、パルミトレイン酸−ｄ１４、キノリン酸１３Ｃ３１５Ｎ、タウリン−１，１，２，２−ｄ４、タウロケノデオキシコラート−ｄ４、タウロコラート−ｄ４、キシリトール−ｄ７、ｄ４−リノレン酸、キサンチン−１３Ｃ１５Ｎ２、オロタート−１３Ｃ１５Ｎ２、３−メチル−グルタロイルＮ−（メチル−ｄ３）−カルニチンおよびそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上の内部標準を含み得る。
【００６８】
一実施形態では、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシオクタン酸、クエン酸、フコース、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、マロン酸、パルミトレイン酸、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、キサンチン、キシリトール、リノレン酸およびそれらの組合せからなる群から選択される一団の腎臓分析物のうちの１つ以上をアッセイするためのキットが本明細書に記載されている。キットとともに使用するための内部標準は、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ−ｄ４、３−ヒドロキシオクタン酸−ｄ１２、クエン酸−２，２，４，４−ｄ４酸、フコース−１３Ｃ６、グリセロール１３Ｃ３、グリコケノデオキシコール−ｄ４酸、グリココール−ｄ４酸、マロン酸−ｄ４、パルミトレイン酸−ｄ１４、Ｌ−セリン（２，３，３−ｄ３）、タウリン−１，１，２，２−ｄ４、タウロケノデオキシコラート−ｄ４、タウロコラート−ｄ４、キサンチン−１３Ｃ１５Ｎ２、キシリトール−ｄ７およびｄ４−リノレン酸からなる群から選択され得る。
【００６９】
別の実施形態では、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルＬ−カルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタミン酸、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリン、タウロコラートおよびそれらの組合せからなる群から選択される一団の腎臓分析物のうちの１つ以上をアッセイするためのキットが本明細書に記載されている。キットとともに使用するための内部標準は、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ−ｄ４、３−メチル−グルタロイルＮ−（メチル−ｄ３）−カルニチン、７ａ−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン−ｄ７、γ−トコフェロール−ｄ４、グルタミン酸−ｄ５、グリコケノデオキシコール−ｄ４酸、グリココール−ｄ４酸、ヒポキサンチン−１３Ｃ５，１５Ｎ４、Ｌ−Ｌ−セリン（２，３，３−ｄ３）およびタウロコラート−ｄ４からなる群から選択され得る。
【００７０】
別の実施形態では、２，３−ピリジンジカルボン酸、３−ヒドロキシブチラート、フコース、フマル酸、グルタミン酸、グルタラート、グリセロール、ヒポキサンチン、マレイン酸、マロン酸、マンノース、オロタート、リボース、セリン、タウリン、３−ウレイドプロピオン酸、キサンチン、キシリトールおよびそれらの組合せからなる群から選択される一団の腎臓分析物のうちの１つ以上をアッセイするためのキットが本明細書に記載されている。キットとともに使用するための内部標準は、キノリン酸１３Ｃ３１５Ｎ、ｄ４−３−ヒドロキシブチラート、フコース−１３Ｃ６、フマル酸−１３Ｃ４、Ｌ−グルタミン酸−ｄ５、１３Ｃ２−グルタラート、グリセロール１３Ｃ３、ヒポキサンチン−１３Ｃ５，１５Ｎ４、マレイン酸２，３−ｄ２、マロン酸−ｄ４、マンノース１３Ｃ６、オロタート−１３Ｃ１５Ｎ２、Ｄ−リボース−１３Ｃ５、Ｌ−セリン（２，３，３−ｄ３）、タウリン−１，１，２，２−ｄ４、１３Ｃ４１５Ｎ２−ウレイドプロピオン酸、キサンチン−１３Ｃ１５Ｎ２およびキシリトール−ｄ７からなる群から選択され得る。
【実施例】
【００７１】
Ｉ．試料調製
Ａ．試薬および機器
質量分析グレード（９８％）のギ酸およびギ酸アンモニウム（＞９８％）をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから入手し、ＨＰＬＣグレードのメタノールおよびアセトニトリルをＪＴ  Ｂａｋｅｒから入手し、塩酸、６Ｎ（認定済み）をＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手した。混合には、ＶＷＲ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＭｕｌｔｉ−Ｔｕｂｅ  Ｖｏｒｔｅｘｅｒを使用した。プレートの遠心分離は、３６１７バケットロータを有する、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ製のＳｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  ４０Ｒ遠心分離機で行った。内部標準は商用供給元から入手した。
【００７２】
Ｂ．試料調製
試料を氷上で解凍し、ボルテックスした。試験試料およびＱＣ試料から分析物を抽出するために、４５０μＬのメタノールと、適切な内部標準を含有する３０μＬの作業内部標準（ＷＩＳ）溶液とを試料に加えた。ＷＩＳ溶液は、１つ以上の内部標準から構成され得、本明細書に記載の分析物のそれぞれについて１つ以上の内部標準を含み得る。内部標準を含めずに４５０μＬのメタノールと３０μＬのＷＩＳ溶媒とを加えることによって、試料ブランクを抽出した。ＷＩＳ濃度の決定は、例えば、校正範囲内の分析物の濃度に基づき得る。例えば、分析物のＷＩＳの濃度は、分析物の校正標準ＣおよびＤの濃度とほぼ同じであり得る。
【００７３】
分析物の校正範囲を決定した。各分析物の校正範囲を表１に列挙する。各分析物について、ＬＬＯＱは校正範囲の下限を表し、校正範囲の上限はＵＬＯＱによって表される。当業者であれば、過度の実験を用いることなく各分析物の校正範囲を決定する方法を理解するであろう。一例では、８つの検量用試料（標準物質Ａ〜Ｈ）を使用して、校正範囲を網羅してもよい。対応する校正濃度の２０倍で、校正用スパイキング溶液（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｓｐｉｋｉｎｇ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を調製してもよい。
【表１】
2021520485.tif 000002
【００７４】
ＱＣレベルは、ＬＬＯＱおよびＵＬＯＱに基づいて決定されてもよい。低、中および高レベルのＱＣ試料は、必要に応じて分析物を強化しながら、適切な分析物濃度のヒト血清プールから調製されてもよい。ＬＬＯＱ試料は、例えば、あらゆる分析物の標準物質Ａと同じ濃度で、脂肪酸不含ＢＳＡ溶液（ＰＢＳ中７．５％）中で調製されてもよい。ＱＣ試料は−８０°Ｃで保存されてもよい。
【００７５】
試料分析のために、抽出した試料２５μＬをプレートの適切なウェルに移した。プレートを密封し、プレートシェーカー上で高速で約２分間混合した。プレートを４°Ｃで１０分間、４，０００ｒｐｍで遠心分離し、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のために、１５０μＬの上清のアリコートを新しいプレートに移した。試料回収を評価するために、校正標準Ｅと同等の濃度により、媒体ＱＣ試料をスパイクしてもよい。ストック溶液、校正用スパイキング溶液および内部標準溶液を４°Ｃで保存した。
【００７６】
例１：クロマトグラフィーによる試料からの分析物の精製および分離
ＵＨＰＬＣを使用するクロマトグラフ法を開発して、単回注入から１つ以上および最大１８の分析物を分析した。各クロマトグラフ法では、分析される各試料用のＵＰＬＣカラムに、１．０μＬの最終抽出溶液の単一の固定されたアリコートを注入した。クロマトグラフィー法１および２では逆相カラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  Ｃ１８、１．７μｍ、２．１ｘ１００ｍｍ）を用いる液体クロマトグラフィーに、ならびにクロマトグラフィー法３ではＨＩＬＩＣカラム（Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨアミド、１．７μｍ、２．１ｘ１５０ｍｍ）を用いる液体クロマトグラフィーに、バイナリ溶媒ポンプユニット、冷蔵オートサンプラおよびカラムヒータを備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２９０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＵＨＰＬＣシステムを使用した。各クロマトグラフィー法を以下にさらに例示する。
【００７７】
Ａ．クロマトグラフィー法１
一例では、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシオクタン酸、クエン酸、フコース、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、マロン酸、パルミトレイン酸、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、キサンチン、キシリトールおよびリノレン酸ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上、２つ以上および最大１６全部の分析物を同一注入で精製および分離するための液体クロマトグラフィー法を開発した。
【００７８】
移動相Ａは水中の重炭酸アンモニウムであり、移動相Ｂはメタノールおよび水中の重炭酸アンモニウムであった。移動相Ｂ  ０．５％および流量３５０μＬ／分の初期条件を用いて、直線勾配溶出を行った。総実行時間は７．５分であった。
【００７９】
クロマトグラフィー法１では、良好なピーク形状を有する複数の最大１６の分析物が分離された。おおよその保持時間（分単位）は、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシオクタン酸、クエン酸、フコース、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、マロン酸、パルミトレイン酸、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、キサンチン、キシリトールおよびリノレン酸について、それぞれ５．２７、３．５９、０．６２、０．８５７、０．８０７、５．３７、５．２８、０．７８３、５．６３、０．７３１、０．７３２、５．３６、５．２８、０．８３２、０．７６８および５．５３であった。
【００８０】
Ｂ．クロマトグラフィー法２
別の例では、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルＬ−カルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタミン酸、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリンおよびタウロコラートならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上、２つ以上および最大１０全部の分析物を同一注入で精製および分離するための液体クロマトグラフィー法を開発した。
【００８１】
移動相ＡはＰＦＰＡ、ギ酸および水であり、移動相ＢはＰＦＰＡ、ギ酸およびメタノールであった。移動相Ｂ  ５％および流量４５０μＬ／分の初期条件を用いて、直線勾配溶出を行った。総実行時間は９．０分であった。
【００８２】
クロマトグラフィー法２では、良好なピーク形状を有する複数の最大１０の分析物が分離された。おおよその保持時間（分単位）は、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルＬ−カルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタミン酸、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリンおよびタウロコラートについて、それぞれ５．１７、２．８５、６．１６、３．３３、１．０７、５．１６、４．８７、０．９９８、０．８７８および４．５１であった。
【００８３】
Ｃ．クロマトグラフィー法３
別の例では、２，３−ピリジンジカルボン酸、３−ヒドロキシブチラート、フコース、フマル酸、グルタミン酸、グルタラート、グリセロール、ヒポキサンチン、マレイン酸、マロン酸、マンノース、オロタート、リボース、セリン、タウリン、３−ウレイドプロピオン酸、キサンチンおよびキシリトールならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上、２つ以上および最大１８全部の分析物を同一注入で精製および分離するための液体クロマトグラフィー法を開発した。
【００８４】
移動相Ａはギ酸アンモニウム、アセトニトリル、メタノールおよび水であり、移動相Ｂはギ酸アンモニウムおよびアセトニトリルであった。移動相Ｂ  ５％および流量５００μＬ／分の初期条件を用いて、直線勾配溶出を行った。総実行時間は７．５分であった。
【００８５】
クロマトグラフィー法３では、良好なピーク形状を有する複数の最大１８の分析物が分離された。おおよその保持時間（分単位）は、２，３−ピリジンジカルボン酸、３−ヒドロキシブチラート、フコース、フマル酸、グルタミン酸、グルタラート、グリセロール、ヒポキサンチン、マレイン酸、マロン酸、マンノース、オロタート、リボース、セリン、タウリン、３−ウレイドプロピオン酸、キサンチンおよびキシリトールについて、それぞれ３．４９、１．５８、１．７５、３．２７、３．２２、３．４１、１．２９、１．５９、２．６２、３．７２、２．３９、１．７４、１．５６、３．２５、２．０４、２．４４、２．１４および２．００であった。
【００８６】
例２：分析物のＭＳ／ＭＳ測定
Ｔｕｒｂｏ  Ｖ  ｓｏｕｒｃｅ（ＥＳＩ）を有するＡＢ  Ｓｃｉｅｘ  ＱＴｒａｐ  ５５００質量分析計を使用して、以下の方法で説明するように、試料抽出物に対して質量分析を行った。機器から生データを取得し、Ａｎａｌｙｓｔ  １．６．２ソフトウェア（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を使用して処理した。定量では、加重（１／ｘ２）線形最小二乗回帰によって、校正標準の濃度に対して、内部標準に対する分析物のピーク面積比を適合させた。校正曲線の得られた傾きおよび切片を使用して、実験試料の未知の濃度を計算した。
【００８７】
Ａ．ＭＳ／ＭＳ法１
１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシオクタン酸、クエン酸、フコース、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、マロン酸、パルミトレイン酸、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、キサンチン、キシリトールおよびリノレン酸ならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上、２つ以上および最大１６全部の分析物のレベルを単回注入で検出する方法を開発した。
【００８８】
同じＭＳ／ＭＳ法を使用して、２，３−ピリジンジカルボン酸、３−ヒドロキシブチラート、フコース、フマル酸、グルタミン酸、グルタラート、グリセロール、ヒポキサンチン、マレイン酸、マロン酸、マンノース、オロタート、リボース、セリン、タウリン、３−ウレイドプロピオン酸、キサンチンおよびキシリトールならびにそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上、２つ以上および最大１８全部の分析物のレベルを別個の単回注入で検出した。
【００８９】
質量分析計のエレクトロスプレー源に、例１、クロマトグラフィー法１に記載のクロマトグラフィーカラムから得られた溶離液を直接かつ自動的に導入した。別の例では、質量分析計のエレクトロスプレー源に、例１、クロマトグラフィー法３に記載のクロマトグラフィーカラムから得られた溶離液を直接かつ自動的に導入した。針の洗浄にはメタノールまたはイソプロパノールを使用した。負の多重反応モニタリング（ＭＲＭ）モードで機器を操作した。イオンスプレー電圧を−４．５ｋＶ、供給源温度を５００°Ｃ、カーテンガス（例えば、窒素）を３０ｐｓｉ、ネブライザガスおよび脱溶媒和ガス（例えば、窒素）の流量を７０ｐｓｉ、衝突活性化解離（ＣＡＤ）ガス（例えば、窒素）を中程度に設定した。
【００９０】
機器から生データを取得し、Ａｎａｌｙｓｔ  １．６．２ソフトウェア（ＡＢ  Ｓｃｉｅｘ）を使用して処理した。定量では、加重（１／ｘ２）線形最小二乗回帰によって、校正標準の濃度に対して、内部標準に対する分析物のピーク面積比を適合させた。校正曲線の得られた傾きおよび切片を使用して、実験試料の未知の濃度を計算した。１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシオクタン酸、クエン酸、フコース、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、マロン酸、パルミトレイン酸、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、キサンチン、キシリトールおよびリノレン酸の定量のために生成された例示的なイオンを表２に列挙する。２，３−ピリジンジカルボン酸、３−ヒドロキシブチラート、フコース、フマル酸、グルタミン酸、グルタラート、グリセロール、ヒポキサンチン、マレイン酸、マロン酸、マンノース、オロタート、リボース、セリン、タウリン、３−ウレイドプロピオン酸、キサンチンおよびキシリトールの定量のために生成された例示的なイオンを表３に列挙する。先頭に「親イオン（ｍ／ｚ）」が付く列の下に親イオンを列挙し、「定量のための娘イオン（ｍ／ｚ）」と表示された列に、本例での定量のために使用された娘イオンを列挙する。分析測定範囲にわたる感度に対して、本例での定量のための娘イオンの選択を最適化したが、追加の娘イオンを選択して、これらの例での定量のために使用された娘イオンを置き換えるか増強してもよい。
【表２−１】
2021520485.tif 000003
【表２−２】
2021520485.tif 000004
【表２−３】
2021520485.tif 000005
【表３−１】
2021520485.tif 000006
【表３−２】
2021520485.tif 000007
【表３−３】
2021520485.tif 000008
【００９１】
Ｂ．ＭＳ／ＭＳ法２
別の例では、１つ以上、２つ以上および最大全部の１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルＬ−カルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタミン酸、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリンおよびタウロコラートならびにそれらの組合せのレベルを同一注入で検出する方法を開発した。質量分析計のエレクトロスプレー源に、例１、クロマトグラフィー法２に記載のクロマトグラフィーカラムから得られた溶離液を直接かつ自動的に導入した。針の洗浄にはイソプロパノールを使用した。
【００９２】
正のＭＲＭモードで機器を操作した。イオンスプレー電圧を５．５ｋＶ、供給源温度を５００°Ｃおよびカーテンガスを３０ｐｓｉに設定し、ネブライザガスおよび脱溶媒和ガスの流量を７０ｐｓｉ、ＣＡＤガスを中程度に設定した。
【００９３】
１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルＬ−カルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタミン酸、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリンおよびタウロコラートの定量のために生成された例示的なイオンを表４に示す。先頭に「親イオン（ｍ／ｚ）」が付く列の下に親イオンを列挙し、「定量のための娘イオン（ｍ／ｚ）」と表示された列に、本例での定量のために使用された娘イオンを列挙する。分析測定範囲にわたる感度に対して、本例での定量のための娘イオンの選択を最適化したが、娘イオンのいずれかを選択して、これらの例での定量のために使用された娘イオンを置き換えるか増強してもよい。
【表４−１】
2021520485.tif 000009
【表４−２】
2021520485.tif 000010
【表４−３】
2021520485.tif 000011
【００９４】
例３：実験試料中の分析物の定量的測定。
上記のＩ．Ｂ．試料調製のセクションに示されているように、６つの血清試料を調製した。例１および例２に記載のＬＣ法およびＭＳ法を使用して、実験試料中の分析物を測定した。これらの方法を使用して、血清試料中の、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ、３−ＨＢ）、３−ヒドロキシオクタノアート（３−ヒドロキシオクタン酸）、３−メチルグルタリルカルニチン、３−ウレイドプロピオナート（３−ウレイドプロピオン酸）、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、シトラート（クエン酸）、フコース、フマラート（フマル酸）、γ−トコフェロール、グルタマート（グルタミン酸）、グルタラート（グルタル酸）、グリセロール、グリコケノデオキシコラート（グリコケノデオキシコール酸）、グリココラート（グリココール酸）、ヒポキサンチン、マレアート（マレイン酸）、マロナート（マロン酸）、マンノース、オロタート（オロチン酸）、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート（タウロケノデオキシコール酸）、タウロコラート（タウロコール酸）、パルミトレアート（パルミトレイン酸）、リノレナート（リノレン酸）、キサンチン、キシリトールといった分析物の絶対量（濃度）を決定した。
【００９５】
クロマトグラフィー法１およびＭＳ法１を使用して、７．５分の実行時間により、単回注入で１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシオクタン酸、クエン酸、フコース、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、マロン酸、パルミトレイン酸、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、キサンチン、キシリトールおよびリノレン酸といった分析物を測定した。
【００９６】
クロマトグラフィー法２およびＭＳ法２を使用して、９．０分の実行時間により、単回注入で１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルＬ−カルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタミン酸、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリンおよびタウロコラートといった分析物を測定した。
【００９７】
クロマトグラフィー法３およびＭＳ法１を使用して、７．５分の実行時間により、単回注入で２，３−ピリジンジカルボン酸、３−ヒドロキシブチラート、フコース、フマル酸、グルタミン酸、グルタラート、グリセロール、ヒポキサンチン、マレイン酸、マロン酸、マンノース、オロタート、リボース、セリン、タウリン、３−ウレイドプロピオン酸、キサンチンおよびキシリトールといった分析物を測定した。
【００９８】
記載されている方法を使用して、６つの血清試料中の分析物の測定量を決定した。６つの血清試料全部について測定された分析物レベルを平均し、分析物の濃度（ｎｇ／ｍＬ）を表５に示す。
【表５】
2021520485.tif 000012
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月3日(2020.12.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
ＩＶ．キット
１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシブチラート（ＢＨＢＡ）、３−ヒドロキシオクタノアート、３−メチルグルタリルカルニチン、３−ウレイドプロピオナート、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、シトラート、フコース、フマラート、γ−トコフェロール、グルタマート、グルタラート、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、マレアート、マロナート、マンノース、オロタート、２，３−ピリジンジカルボキシラート、リボース、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、パルミトレアート、リノレナート、キサンチン、キシリトールおよびそれらの組合せからなる群から選択される１つ以上または複数の一団の肝臓分析物をアッセイするためのキットが本明細書に記載されている。例えば、キットは、包装材料と、１つ以上のアッセイに十分な量の１つ以上の分析物標準物質または内部標準の測定量とを含み得る。例示的な実施形態では、内部標準は標識され得（同位体標識または放射標識など）、キットは、予め作製された移動相溶液を含み得、および／またはキットは、移動相試薬と、移動相溶液を調製するための説明書とを含み得る。キットはまた、試薬を使用して１つ以上の分析物を測定するために、実体のある形態で記録された説明書（例えば、書面で、例えば、取扱説明書または電子媒体など）を含み得る。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６８】
一実施形態では、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−ヒドロキシオクタン酸、クエン酸、フコース、グリセロール、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、マロン酸、パルミトレイン酸、セリン、タウリン、タウロケノデオキシコラート、タウロコラート、キサンチン、キシリトール、リノレン酸およびそれらの組合せからなる群から選択される一団の肝臓分析物のうちの１つ以上をアッセイするためのキットが本明細書に記載されている。キットとともに使用するための内部標準は、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ−ｄ４、３−ヒドロキシオクタン酸−ｄ１２、クエン酸−２，２，４，４−ｄ４酸、フコース−１３Ｃ６、グリセロール１３Ｃ３、グリコケノデオキシコール−ｄ４酸、グリココール−ｄ４酸、マロン酸−ｄ４、パルミトレイン酸−ｄ１４、Ｌ−セリン（２，３，３−ｄ３）、タウリン−１，１，２，２−ｄ４、タウロケノデオキシコラート−ｄ４、タウロコラート−ｄ４、キサンチン−１３Ｃ１５Ｎ２、キシリトール−ｄ７およびｄ４−リノレン酸からなる群から選択され得る。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６９】
別の実施形態では、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ、３−メチルグルタリルＬ−カルニチン、７−α−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン（７−Ｈｏｃａ）、γ−トコフェロール、グルタミン酸、グリコケノデオキシコラート、グリココラート、ヒポキサンチン、セリン、タウロコラートおよびそれらの組合せからなる群から選択される一団の肝臓分析物のうちの１つ以上をアッセイするためのキットが本明細書に記載されている。キットとともに使用するための内部標準は、１２，１３−ＤｉＨＯＭＥ−ｄ４、３−メチル−グルタロイルＮ−（メチル−ｄ３）−カルニチン、７ａ−ヒドロキシ−４−コレステン−３−オン−ｄ７、γ−トコフェロール−ｄ４、グルタミン酸−ｄ５、グリコケノデオキシコール−ｄ４酸、グリココール−ｄ４酸、ヒポキサンチン−１３Ｃ５，１５Ｎ４、Ｌ−Ｌ−セリン（２，３，３−ｄ３）およびタウロコラート−ｄ４からなる群から選択され得る。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７０】
別の実施形態では、２，３−ピリジンジカルボン酸、３−ヒドロキシブチラート、フコース、フマル酸、グルタミン酸、グルタラート、グリセロール、ヒポキサンチン、マレイン酸、マロン酸、マンノース、オロタート、リボース、セリン、タウリン、３−ウレイドプロピオン酸、キサンチン、キシリトールおよびそれらの組合せからなる群から選択される一団の肝臓分析物のうちの１つ以上をアッセイするためのキットが本明細書に記載されている。キットとともに使用するための内部標準は、キノリン酸１３Ｃ３１５Ｎ、ｄ４−３−ヒドロキシブチラート、フコース−１３Ｃ６、フマル酸−１３Ｃ４、Ｌ−グルタミン酸−ｄ５、１３Ｃ２−グルタラート、グリセロール１３Ｃ３、ヒポキサンチン−１３Ｃ５，１５Ｎ４、マレイン酸２，３−ｄ２、マロン酸−ｄ４、マンノース１３Ｃ６、オロタート−１３Ｃ１５Ｎ２、Ｄ−リボース−１３Ｃ５、Ｌ−セリン（２，３，３−ｄ３）、タウリン−１，１，２，２−ｄ４、１３Ｃ４１５Ｎ２−ウレイドプロピオン酸、キサンチン−１３Ｃ１５Ｎ２およびキシリトール−ｄ７からなる群から選択され得る。
【国際調査報告】
2021520485.tif 000013
2021520485.tif 000014
2021520485.tif 000015