(57)【要約】変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物を作製および使用する方法が提供される。非ヒト動物は、インスリン分泌能の増大を有し得る。一局面において、ゲノムに、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座が含まれる非ヒト動物が提供され、上記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードし、上記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する非ヒト動物を結果としてもたらす。
2021502089.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲノムに、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座が含まれる非ヒト動物であって、前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードし、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する非ヒト動物を結果としてもたらす、非ヒト動物。
【請求項２】
前記インスリン分泌能の増強が、高血糖に応答するものである、請求項１に記載の非ヒト動物。
【請求項３】
前記変異を有さない非ヒト動物と比べて、インスリン受容体の阻害によって誘導される高血糖に応答したインスリン分泌の増大を有する、請求項２に記載の非ヒト動物。
【請求項４】
前記インスリン受容体の阻害によって誘導される高血糖に応答したインスリン分泌の増大が、前記変異を有さない非ヒト動物と比べたベータ細胞増殖またはベータ細胞質量の増大に関連しない、請求項３に記載の非ヒト動物。
【請求項５】
前記インスリン分泌能の増強が、高脂肪食を摂食させた場合のものである、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項６】
高脂肪食を摂食させた場合、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌の増大を有し、前記インスリン分泌の増大が、前記変異を有さない非ヒト動物と比べたベータ細胞増殖またはベータ細胞質量の増大に関連する、請求項５に記載の非ヒト動物。
【請求項７】
前記ベータ細胞増殖の増大が、インスリン受容体依存性である、請求項６に記載の非ヒト動物。
【請求項８】
前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、中途終止コドンを有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項９】
前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子の第３のエクソンに変異を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項１０】
前記変異が、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子の第３のエクソンの３’末端にある、請求項９に記載の非ヒト動物。
【請求項１１】
前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、ナンセンス変異を含む、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項１２】
前記ナンセンス変異が、前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子によってコードされるＳＬＣ３０Ａ８タンパク質を配列番号１４と最適にアラインメントした場合、配列番号１４のＲ１３８をコードするコドンに対応するコドンにある、請求項１１に記載の非ヒト動物。
【請求項１３】
前記ナンセンス変異が、前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子のコード配列を配列番号２１と最適にアラインメントした場合、配列番号２１の残基４１２に対応する位置にある、請求項１１または１２に記載の非ヒト動物。
【請求項１４】
前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、前記非ヒト動物に対して内因性である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項１５】
ラットまたはマウスである、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項１６】
マウスである、請求項１５に記載の非ヒト動物。
【請求項１７】
前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、配列番号１３に記載の配列を含むＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードする、請求項１６に記載の非ヒト動物。
【請求項１８】
前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、配列番号２２に記載のコード配列を含む、請求項１６または１７に記載の非ヒト動物。
【請求項１９】
前記変異を有さない非ヒト動物と比べてミトコンドリア遺伝子発現の低減を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２０】
前記変異を有さない非ヒト動物と比べてＨｖｃｎ１発現の増大を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２１】
対照固形飼料食では、前記変異を有さない非ヒト動物と比べて正常なグルコース恒常性およびグルコース誘導性インスリン分泌を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２２】
対照固形飼料食では、前記変異を有さない非ヒト動物と比べて正常な代謝表現型を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２３】
前記変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴：
（ａ）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大；
（ｂ）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大；
（ｃ）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大；および
（ｄ）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大
のうちの１つまたは複数を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２４】
前記変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴：
（ａ）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大；
（ｂ）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大；
（ｃ）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大；および
（ｄ）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大
の全てを有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２５】
前記変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴：
（ａ）２０週間高脂肪食を摂食させた後の循環インスリンレベルの増大；
（ｂ）２０週間高脂肪食を摂食させた後の膵ベータ細胞の数の増大；
（ｃ）高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低減；および
（ｄ）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大
のうちの１つまたは複数を有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２６】
前記変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴：
（ａ）２０週間高脂肪食を摂食させた後の循環インスリンレベルの増大；
（ｂ）２０週間高脂肪食を摂食させた後の膵ベータ細胞の数の増大；
（ｃ）高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低減；および
（ｄ）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大
の全てを有する、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２７】
前記非ヒト動物の島におけるＳｌｃ３０ａ８  ｍＲＮＡ発現レベルが、前記変異を有さない非ヒト動物の島におけるＳｌｃ３０ａ８  ｍＲＮＡ発現レベルの少なくとも２５％である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２８】
前記変異についてヘテロ接合性である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項２９】
前記変異についてホモ接合性である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項３０】
雄である、前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物。
【請求項３１】
雌である、請求項１から２９のいずれか一項に記載の非ヒト動物。
【請求項３２】
前記請求項のいずれかに記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞のゲノムを、
（ｉ）Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイズする５’相同アームと前記Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイズする３’相同アームに挟まれた挿入核酸を含む外因性修復鋳型であって、前記挿入核酸が変異を含む、外因性修復鋳型；
（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質；および
（ｉｉｉ）前記Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡ
と接触させるステップであって、
Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が、前記変異を含むように改変される、ステップと、
（ｂ）改変された前記非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入するステップと、
（ｃ）前記宿主胚を代理母に移植して、前記Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が前記変異を含むように改変された遺伝子改変Ｆ０世代非ヒト動物を作出するステップであって、前記変異が、高脂肪食を摂食させた場合、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有するＦ０世代非ヒト動物を結果としてもたらす、ステップと
を含む、方法。
【請求項３３】
前記多能性細胞が、胚性幹（ＥＳ）細胞である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記外因性修復鋳型が、少なくとも１０ｋｂの長さである大型標的化ベクターであるか、または前記外因性修復鋳型が、前記５’相同アームと前記３’相同アームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである大型標的化ベクターである、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
請求項１から３１のいずれか一項に記載の非ヒト動物を作製する方法であって、
（ａ）非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを、
（ｉ）Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイズする５’相同アームと前記Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイズする３’相同アームに挟まれた挿入核酸を含む外因性修復鋳型であって、前記挿入核酸が変異を含む、外因性修復鋳型；
（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質；および
（ｉｉｉ）前記Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡ
と接触させるステップであって、
Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が、前記変異を含むように改変される、ステップと、
（ｂ）改変された前記非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、前記Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が前記変異を含むように改変された遺伝子改変Ｆ０世代非ヒト動物を作出するステップであって、前記変異が、高脂肪食を摂食させた場合、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有するＦ０世代非ヒト動物を結果としてもたらす、ステップと
を含む、方法。
【請求項３６】
ステップ（ａ）が、前記非ヒト動物多能性細胞または前記非ヒト１細胞期胚のゲノムを前記Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと接触させることをさらに含む、請求項３２から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記外因性修復鋳型が、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである、請求項３２、３３、３５、および３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記外因性修復鋳型が、約８０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドの間の長さである、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
化合物を、２型糖尿病を好転させるまたは増悪させる活性についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１から３１のいずれか一項に記載の対象非ヒト動物を前記化合物と接触させるステップと、
（ｂ）前記化合物と接触させていない対照非ヒト動物と比べて、前記対象非ヒト動物における以下：（１）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌；（２）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖レベル；（３）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数；および（４）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルのうちの１つまたは複数を測定するステップであって、前記対照非ヒト動物が、前記対象非ヒト動物と同じＳｌｃ３０ａ８変異を含む、ステップと
を含み、
前記対象非ヒト動物において、前記対照非ヒト動物と比較して、以下：（１）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大；（２）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大；（３）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大；および（４）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大のうちの１つまたは複数により、２型糖尿病を好転させる活性が同定され、
前記対象非ヒト動物において、前記対照非ヒト動物と比較して、以下：（１）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の低減；（２）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の低減；（３）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の低減、および（４）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの低減のうちの１つまたは複数により、２型糖尿病を増悪させる活性が同定される、方法。
【請求項４０】
化合物を、２型糖尿病を好転させるまたは増悪させる活性についてスクリーニングする方法であって、
（ａ）請求項１から３１のいずれか一項に記載の対象非ヒト動物を前記化合物と接触させるステップと、
（ｂ）前記化合物と接触させていない対照非ヒト動物と比べて、前記対象非ヒト動物における以下：（１）高血糖に応答したインスリンを分泌する能力；（２）インスリンクリアランス；（３）ミトコンドリア遺伝子発現；および（４）Ｈｖｃｎ１発現のうちの１つまたは複数を測定するステップであって、前記対照非ヒト動物が、前記対象非ヒト動物と同じＳｌｃ３０ａ８変異を含む、ステップと
を含み、
前記対象非ヒト動物において、前記対照非ヒト動物と比較して、以下：（１）高血糖に応答したインスリンを分泌する能力の増大；（２）インスリンクリアランスの増大；（３）ミトコンドリア遺伝子発現の低減；および（４）Ｈｖｃｎ１発現の増大のうちの１つまたは複数により、２型糖尿病を好転させる活性が同定され、
前記対象非ヒト動物において、前記対照非ヒト動物と比較して、以下：（１）高血糖に応答したインスリンを分泌する能力の低減；（２）インスリンクリアランスの低減；（３）ミトコンドリア遺伝子発現の増大；および（４）Ｈｖｃｎ１発現の低減のうちの１つまたは複数により、２型糖尿病を増悪させる活性が同定される、方法。
【請求項４１】
ゲノムに、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座が含まれる非ヒト動物細胞であって、前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードし、前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む非ヒト動物が、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する、非ヒト動物細胞。
【請求項４２】
変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムであって、前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードし、前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む非ヒト動物が、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する、非ヒト動物ゲノム。
【請求項４３】
非ヒト動物における内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座において変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を生成するための標的化ベクターであって、前記標的化ベクターは、前記内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の５’標的配列を標的化する５’相同アームおよび前記内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の３’標的配列を標的化する３’相同アームを含み、前記標的化ベクターは、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子に変異を含み、前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードし、そして前記変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む非ヒト動物が、前記変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する、標的化ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願はそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１１月１０日に出願された米国特許出願第６２／５８４，２２８号、２０１８年５月３日に出願された米国特許出願第６２／６６６，３３７号、および２０１８年６月２６日に出願された米国特許出願第６２／６８９，９４５号の利益を主張するものである。
【０００２】
ＥＦＳ  ＷＥＢを介してテキストファイルとして提出された配列表の参照
ファイル５２３０６０ＳＥＱＬＩＳＴ．ｔｘｔで書かれた配列表は、３９．２キロバイトであり、２０１８年１１月５日に作成されたものであり、これにより参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
糖尿病は、結果として体内の適正な血糖レベルを維持することができなくなる、インスリン応答性組織およびインスリン産生膵ベータ細胞の代謝的欠陥により特徴付けられる障害である。ヒトにおける糖尿病は、絶食時血漿グルコース濃度が１２５ｍｇ／ｄＬよりも高いこと、または７５ｇの経口グルコース負荷の摂取２時間後の血漿グルコース濃度が１９９ｍｇ／ｄＬよりも高いこととに相当する障害であると定義することができる。１型糖尿病（Ｔ１Ｄ）および２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）が糖尿病の２つの主要な形態である。Ｔ１Ｄは、ベータ膵臓細胞の破壊、およびグルコース利用を制御するホルモンであるインスリンの絶対的欠乏を結果としてもたらす自己免疫障害である。対照的に、Ｔ２Ｄは、組織がインスリンに適切に応答することができないことから、正常なまたはさらには増大したインスリンのレベルを伴って生じ得る。大半のＴ２Ｄ患者ではインスリン感受性が損なわれている。インスリン分泌は、インスリンに応答する末梢組織の抵抗性を補うことができない。多くのＴ２Ｄ患者は肥満である。１．５型糖尿病（成人における遅発性自己免疫性発症）は、Ｔ１ＤおよびＴ２Ｄの特徴をいくつか示す。
【０００４】
インスリンの生合成およびプロセシングには亜鉛が必要である。２つの亜鉛イオンがプロインスリンの六量体形態として複合体を形成し、これが最終的にインスリンにプロセシングされる。
【０００５】
ＳＬＣ３０Ａ８は、主に膵島において発現され、そこで亜鉛をインスリン含有分泌顆粒に輸送する亜鉛輸送体をコードする。ＳＬＣ３０Ａ８におけるヘテロ接合性機能喪失型（ＬＯＦ）変異はヒトにおいて２型糖尿病から保護する。いくつかのＳｌｃ３０ａ８ノックアウトマウス系統が特徴付けられているが、これらは保護的ヒト表現型を十分に再現しない。むしろ、Ｓｌｃ３０ａ８欠損マウスは血漿インスリンレベルの低下および耐糖能障害を有する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物、ならびに、そのような非ヒト動物を作製および使用する方法が提供される。変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムまたは細胞も提供される。
【０００７】
一態様では、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物が提供される。そのような非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物は、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含み得、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子は、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードし、変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する非ヒト動物を結果としてもたらす。
【０００８】
一態様では、そのゲノムが変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物であって、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードし、変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する非ヒト動物を結果としてもたらす、非ヒト動物が提供される。
【０００９】
一部のそのような非ヒト動物では、非ヒト動物は、高血糖に応答したインスリン分泌能の増強を示す。必要に応じて、非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物と比べて、インスリン受容体の阻害によって誘導される高血糖に応答したインスリン分泌の増大を有する。必要に応じて、インスリン受容体の阻害によって誘導される高血糖に応答したインスリン分泌の増大は、変異を有さない非ヒト動物と比べたベータ細胞増殖またはベータ細胞質量の増大に関連しない。
【００１０】
一部のそのような非ヒト動物では、非ヒト動物に高脂肪食を摂食させた場合、インスリン分泌能の増強が観察される。必要に応じて、非ヒト動物は、高脂肪食を摂食させた場合、変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌の増大を有し、インスリン分泌の増大は、変異を有さない非ヒト動物と比べたベータ細胞増殖またはベータ細胞質量の増大に関連する。必要に応じて、ベータ細胞増殖の増大は、インスリン受容体依存性である（例えば、ベータ細胞におけるインスリン受容体に依存する）。
【００１１】
一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物ゲノムでは、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子は、中途終止コドンを有する。一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物ゲノムでは、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子は、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子の第３のエクソンに変異を含む。必要に応じて、変異は、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子の第３のエクソンの３’末端にある。
【００１２】
一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物ゲノムでは、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子は、ナンセンス変異を含む。必要に応じて、ナンセンス変異は、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子によってコードされるＳＬＣ３０Ａ８タンパク質を配列番号１４と最適にアラインメントした場合、配列番号１４のＲ１３８をコードするコドンに対応するコドンにある。必要に応じて、ナンセンス変異は、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子のコード配列を配列番号２１と最適にアラインメントした場合、配列番号２１の残基４１２に対応する位置にある。
【００１３】
一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物ゲノムでは、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子は、非ヒト動物に対して内因性である。一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物である。一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物ゲノムでは、非ヒト動物は、ラットまたはマウスである。必要に応じて、非ヒト動物は、マウスである。必要に応じて、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子は、配列番号１３に記載の配列を含むＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードする。必要に応じて、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子は、配列番号２２に記載のコード配列または同じアミノ酸配列をコードするその縮重体（degenerate）を含む。
【００１４】
一部のそのような非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物と比べて、インスリン受容体の阻害によって誘導される高血糖に応答したインスリン分泌の増大を有する。一部のそのような非ヒト動物では、インスリン分泌の増大は、変異を有さない非ヒト動物と比べたベータ細胞増殖またはベータ細胞質量の増大に関連しない。一部のそのような非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物と比べてミトコンドリア遺伝子発現の低減を有する。一部のそのような非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物と比べてＨｖｃｎ１発現の増大を有する。一部のそのような非ヒト動物では、非ヒト動物は、対照固形飼料食では、変異を有さない非ヒト動物と比べて正常なグルコース恒常性およびグルコース誘導性インスリン分泌を有する。一部のそのような非ヒト動物では、非ヒト動物は、対照固形飼料食では、変異を有さない非ヒト動物と比べて正常な代謝表現型を有する。
【００１５】
一部のそのような非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴：（ａ）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大；（ｂ）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大；（ｃ）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大；および（ｄ）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大のうちの１つまたは複数を有する。必要に応じて、非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴：（ａ）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大；（ｂ）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大；（ｃ）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大；および（ｄ）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大の全てを有する。
【００１６】
一部のそのような非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴：（ａ）２０週間高脂肪食を摂食させた後の循環インスリンレベルの増大；（ｂ）２０週間高脂肪食を摂食させた後の膵ベータ細胞の数の増大；（ｃ）高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低減；および（ｄ）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大のうちの１つまたは複数を有する。必要に応じて、非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物と比べて、以下の特徴：（ａ）２０週間高脂肪食を摂食させた後の循環インスリンレベルの増大；（ｂ）２０週間高脂肪食を摂食させた後の膵ベータ細胞の数の増大；（ｃ）高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低減；および（ｄ）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大の全てを有する。
【００１７】
一部のそのような非ヒト動物では、非ヒト動物の島におけるＳｌｃ３０ａ８  ｍＲＮＡ発現レベルは、変異を有さない非ヒト動物の島におけるＳｌｃ３０ａ８  ｍＲＮＡ発現レベルの少なくとも２５％である。
【００１８】
一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物ゲノムは、変異についてヘテロ接合性である。一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物ゲノムは、変異についてホモ接合性である。一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物ゲノムは、雄である。一部のそのような非ヒト動物、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物ゲノムは、雌である。
【００１９】
別の態様では、上記の非ヒト動物のいずれかを作製するための方法が提供される。一部のそのような方法は、（ａ）１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞のゲノムを、（ｉ）Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイズする５’相同アームとＳｌｃ３０ａ８遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイズする３’相同アームに挟まれた挿入核酸を含む外因性修復鋳型であって、挿入核酸が変異を含む、外因性修復鋳型；および（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質；および（ｉｉｉ）Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと接触させるステップであって、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が、変異を含むように改変される、ステップと、（ｂ）改変された非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入するステップと、（ｃ）宿主胚を代理母に移植して、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が変異を含むように改変された遺伝子改変Ｆ０世代非ヒト動物を作出するステップであって、変異が、高脂肪食を摂食させた場合、変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有するＦ０世代非ヒト動物を結果としてもたらす、ステップとを含む。一部のそのような方法は、（ａ）１細胞期胚ではない非ヒト動物多能性細胞のゲノムを、（ｉ）Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイズする５’相同アームとＳｌｃ３０ａ８遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイズする３’相同アームに挟まれた挿入核酸を含む外因性修復鋳型であって、挿入核酸が変異を含む、外因性修復鋳型；および（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質；および（ｉｉｉ）Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと接触させるステップであって、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が、変異を含むように改変される、ステップと、（ｂ）改変された非ヒト動物多能性細胞を宿主胚に導入するステップと、（ｃ）代理母において宿主胚を妊娠させて、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が変異を含むように改変された遺伝子改変Ｆ０世代非ヒト動物を作出するステップであって、変異が、高脂肪食を摂食させた場合、変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有するＦ０世代非ヒト動物を結果としてもたらす、ステップとを含む。必要に応じて、多能性細胞は、胚性幹細胞である。必要に応じて、外因性修復鋳型は、少なくとも１０ｋｂの長さである大型標的化ベクターであるか、または外因性修復鋳型は、５’相同アームと３’相同アームの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである大型標的化ベクターである。
【００２０】
一部のそのような方法は、（ａ）非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを、（ｉ）Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイズする５’相同アームとＳｌｃ３０ａ８遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイズする３’相同アームに挟まれた挿入核酸を含む外因性修復鋳型であって、挿入核酸が変異を含む、外因性修復鋳型；（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質；および（ｉｉｉ）Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと接触させるステップであって、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が、変異を含むように改変される、ステップと、（ｂ）改変された非ヒト動物１細胞期胚を代理母に移植して、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が変異を含むように改変された遺伝子改変Ｆ０世代非ヒト動物を作出するステップであって、変異が、高脂肪食を摂食させた場合、変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有するＦ０世代非ヒト動物を結果としてもたらす、ステップとを含む。一部のそのような方法は、（ａ）非ヒト動物１細胞期胚のゲノムを、（ｉ）Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の５’標的配列にハイブリダイズする５’相同アームとＳｌｃ３０ａ８遺伝子座の３’標的配列にハイブリダイズする３’相同アームに挟まれた挿入核酸を含む外因性修復鋳型であって、挿入核酸が変異を含む、外因性修復鋳型；（ｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質；および（ｉｉｉ）Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座内のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズするガイドＲＮＡと接触させるステップであって、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が、変異を含むように改変される、ステップと、（ｂ）代理母の改変された非ヒト動物１細胞期胚を妊娠させて、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が変異を含むように改変された遺伝子改変Ｆ０世代非ヒト動物を作出するステップであって、変異が、高脂肪食を摂食させた場合、変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有するＦ０世代非ヒト動物を結果としてもたらす、ステップとを含む。
【００２１】
一部のそのような方法では、ステップ（ａ）は、非ヒト動物多能性細胞または非ヒト１細胞期胚のゲノムをＳｌｃ３０ａ８遺伝子座内の第２のガイドＲＮＡ認識配列にハイブリダイズする第２のガイドＲＮＡと接触させることをさらに含む。
【００２２】
一部のそのような方法では、外因性修復鋳型は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチドである。必要に応じて、外因性修復鋳型は、約８０ヌクレオチド〜約２００ヌクレオチドの間の長さである。
【００２３】
別の態様では、化合物を、２型糖尿病を好転させるまたは増悪させる活性についてスクリーニングする方法が提供される。一部のそのような方法は、（ａ）上記の対象非ヒト動物のいずれかを化合物と接触させるステップと、（ｂ）化合物と接触させていない対照非ヒト動物と比べて、対象非ヒト動物における以下：（１）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌；（２）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖レベル；（３）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数；および（４）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルのうちの１つまたは複数を測定するステップであって、対照非ヒト動物が、対象非ヒト動物と同じＳｌｃ３０ａ８変異を含む、ステップとを含み、
対象非ヒト動物において、対照非ヒト動物と比較して、以下：（１）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大；（２）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大；（３）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大；および（４）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大のうちの１つまたは複数により、２型糖尿病を好転させる活性が同定され、
対象非ヒト動物において、対照非ヒト動物と比較して、以下：（１）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の低減；（２）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の低減；（３）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の低減、および（４）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの低減のうちの１つまたは複数により、２型糖尿病を増悪させる活性が同定される。
【００２４】
一部のそのような方法は、（ａ）上記の対象非ヒト動物のいずれかを化合物と接触させるステップと、（ｂ）化合物と接触させていない対照非ヒト動物と比べて、対象非ヒト動物における以下：（１）高血糖に応答してインスリンを分泌する能力；（２）インスリンクリアランス；（３）ミトコンドリア遺伝子発現；および（４）Ｈｖｃｎ１発現のうちの１つまたは複数を測定するステップであって、対照非ヒト動物が、対象非ヒト動物と同じＳｌｃ３０ａ８変異を含む、ステップとを含み、
対象非ヒト動物において、対照非ヒト動物と比較して、以下：（１）高血糖に応答してインスリンを分泌する能力の増大；（２）インスリンクリアランスの増大；（３）ミトコンドリア遺伝子発現の低減；および（４）Ｈｖｃｎ１発現の増大のうちの１つまたは複数により、２型糖尿病を好転させる活性が同定され、
対象非ヒト動物において、対照非ヒト動物と比較して、以下：（１）高血糖に応答してインスリンを分泌する能力の低減；（２）インスリンクリアランスの低減；（３）ミトコンドリア遺伝子発現の増大；および（４）Ｈｖｃｎ１発現の低減のうちの１つまたは複数により、２型糖尿病を増悪させる活性が同定される。
【００２５】
別の態様では、そのゲノムが、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物細胞であって、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードし、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む非ヒト動物が、変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する、非ヒト動物細胞が提供される。
【００２６】
別の態様では、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノムであって、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードし、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む非ヒト動物が、変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する、非ヒト動物ゲノムが提供される。
【００２７】
別の態様では、非ヒト動物における内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座において変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を生成するための、内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の５’標的配列を標的化する５’相同アームおよび内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の３’標的配列を標的化する３’相同アームを含み、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子に変異を含む、標的化ベクターであって、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子が、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードし、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を含む非ヒト動物が、変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する、標的化ベクターが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１Ａ〜１Ｄは、固形飼料食下の雄Ｒ１３８Ｘマウス由来の島におけるＳｌｃ３０ａ８  ＲＮＡおよびタンパク質の解析を示す。図１Ａは、野生型（ＷＴ）、ホモ接合性ノックアウト（ＫＯ）、およびホモ接合性Ｒ１３８Ｘマウスから単離された膵島のＳｌｃ３０ａ８  ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを示す。ＫＯ島は陰性対照として使用した。赤色：グルカゴンＲＮＡ、緑色：インスリンＲＮＡ、白色：Ｓｌｃ３０ａ８  ＲＮＡ。図１Ｂは、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）解析を使用した島Ｓｌｃ３０ａ８  ＲＮＡレベルの定量化を示す。図１Ｃは、固形飼料を摂食させたＷＴ、ＫＯおよびＲ１３８Ｘマウスから単離した島のウエスタンブロットを示す。ＫＯ島は陰性対照として使用した。矢印：ＳＬＣ３０Ａ８タンパク質；＊は非特異的バンドを示す。図１Ｄは、ＷＴ、ＫＯ、およびＲ１３８Ｘマウスから単離した膵島のジチゾン染色を示す。
【００２９】
【図２−１】図２Ａ〜２Ｐは、固形飼料食下の雄ホモ接合性Ｒ１３８Ｘマウスの代謝表現型を示す。図２Ａ〜２Ｄおよび２Ｌは、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおける体重（図２Ｌ）、血中グルコース（図２Ａ）、血漿インスリン（図２Ｂ）、プロインスリン（図２Ｃ）、およびＣペプチド（図２Ｄ）のレベルを示す。図２Ｅ〜２Ｆは、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおけるプロインスリン／インスリン比（図２Ｅ）およびＣペプチド／インスリン比（図２Ｆ）を示す。図２Ｇは、ＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおける経口グルコース負荷試験を示す。データを経時的な血中グルコースとして示している。図２Ｈは、一晩絶食後（時間０）およびグルコースの腹腔内注射後の示されている時間における、ＷＴまたはＲ１３８Ｘマウスにおける血漿インスリンレベルを示す。データを経時的な血中グルコースレベルとして示している。図２Ｉは、ＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスから単離した膵臓におけるインスリンについての組織学を示す。図２Ｊは、膵臓インスリン染色の定量化を示す。図２Ｋは、島の数の定量化を示す。値は、平均±ＳＥＭ（遺伝子型当たりｎ＝６〜２０匹のマウス）を表す。図２Ｍは、４時間絶食させたＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおけるインスリン負荷試験の結果を示す。データを経時的な血中グルコースレベルとして示している（ｎ＝６／遺伝子型）。図２Ｎは、膵臓インスリン染色のさらなる定量化を示す（島の質量；ｎ＝６／遺伝子型）。値は、平均±ＳＥＭを表す。図２Ｏ〜２Ｐは、固形飼料食下の、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおけるプロインスリン／Ｃペプチド比（図２Ｏ）およびインスリン／Ｃペプチド比（図２Ｐ）を示す。遺伝子型当たりＮ＝１８〜２０匹のマウス。
【図２−２】図２Ａ〜２Ｐは、固形飼料食下の雄ホモ接合性Ｒ１３８Ｘマウスの代謝表現型を示す。図２Ａ〜２Ｄおよび２Ｌは、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおける体重（図２Ｌ）、血中グルコース（図２Ａ）、血漿インスリン（図２Ｂ）、プロインスリン（図２Ｃ）、およびＣペプチド（図２Ｄ）のレベルを示す。図２Ｅ〜２Ｆは、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおけるプロインスリン／インスリン比（図２Ｅ）およびＣペプチド／インスリン比（図２Ｆ）を示す。図２Ｇは、ＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおける経口グルコース負荷試験を示す。データを経時的な血中グルコースとして示している。図２Ｈは、一晩絶食後（時間０）およびグルコースの腹腔内注射後の示されている時間における、ＷＴまたはＲ１３８Ｘマウスにおける血漿インスリンレベルを示す。データを経時的な血中グルコースレベルとして示している。図２Ｉは、ＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスから単離した膵臓におけるインスリンについての組織学を示す。図２Ｊは、膵臓インスリン染色の定量化を示す。図２Ｋは、島の数の定量化を示す。値は、平均±ＳＥＭ（遺伝子型当たりｎ＝６〜２０匹のマウス）を表す。図２Ｍは、４時間絶食させたＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおけるインスリン負荷試験の結果を示す。データを経時的な血中グルコースレベルとして示している（ｎ＝６／遺伝子型）。図２Ｎは、膵臓インスリン染色のさらなる定量化を示す（島の質量；ｎ＝６／遺伝子型）。値は、平均±ＳＥＭを表す。図２Ｏ〜２Ｐは、固形飼料食下の、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおけるプロインスリン／Ｃペプチド比（図２Ｏ）およびインスリン／Ｃペプチド比（図２Ｐ）を示す。遺伝子型当たりＮ＝１８〜２０匹のマウス。
【００３０】
【図３】図３Ａ〜３Ｍは、ＨＦＤ食下の雄ホモ接合性Ｒ１３８Ｘマウスの代謝表現型を示す。図３Ａ〜３Ｆは、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおける血中グルコース（図３Ａ）、血漿インスリン（図３Ｂ）、プロインスリン（図３Ｃ）、およびＣペプチド（図３Ｄ）のレベルを示す。図３Ｅ〜３Ｆは、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおけるプロインスリン／インスリン比（図３Ｅ）およびＣペプチド／インスリン比（図３Ｆ）を示す。図３Ｇは、ＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおける経口グルコース負荷試験を示す。データを経時的な血中グルコースとして示している。曲線下面積が右側に示されている。図３Ｈは、一晩絶食後（時間０）およびグルコースの腹腔内注射後の示されている時間におけるＷＴまたはＲ１３８Ｘマウスにおける血中インスリンレベルを示す。データを経時的な血中グルコースレベルとして示している。図３Ｉは、ＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスから単離した膵臓におけるインスリンについての組織学を示す。図３Ｊは、膵臓インスリン染色の定量化を示す。図３Ｋは、島の数の定量化を示す。図３Ｌは、Ｋｉ６７（緑色）およびインスリン（赤色）についての免疫組織化学を示す。図３Ｍは、Ｋｉ６７およびインスリン二重陽性細胞の定量化を示す。値は、平均±ＳＥＭを表す（遺伝子型当たりｎ＝４〜１７匹のマウス）。
【００３１】
【図４】図４Ａ〜４Ｋは、ＨＦＤ食下の雄ホモ接合性Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスの代謝表現型を示す。図４Ａ〜４Ｄは、摂食および絶食中のＷＴおよびＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおける血中グルコース（図４Ａ）、血漿インスリン（図４Ｂ）、プロインスリン（図４Ｃ）、およびＣペプチド（図４Ｄ）のレベルを示す。図４Ｅ〜４Ｆは、摂食および絶食中のＷＴおよびＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおけるプロインスリン／インスリン比（図４Ｅ）およびＣペプチド／インスリン比（図４Ｆ）を示す。図４Ｇは、ＷＴおよびＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおける経口グルコース負荷試験を示す。データを経時的な血中グルコースレベルとして示している。図４Ｈは、一晩絶食後（時間０）およびグルコースの腹腔内注射後の示されている時間における、ＷＴまたはＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおける血中インスリンレベルを示す。データを経時的なグルコースレベルとして示している。図４Ｉは、ＷＴおよびＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスから単離した膵臓におけるインスリンについての組織学を示す。図４Ｊは、膵臓インスリン染色の定量化を示す。図４Ｋは、島の数の定量化を示す。値は、平均±ＳＥＭを表す（遺伝子型当たりｎ＝６〜１７匹のマウス）。
【００３２】
【図５】図５は、プロテアソーム阻害によるヒトＲ１３８Ｘタンパク質のｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける発現および安定化を示す。ｍｙｃタグを付したＳＬＣ３０Ａ８  ＷＴまたはＲ１３８Ｘタンパク質のいずれか単独またはそれら一緒の過剰発現後のＨＥＫ２９３溶解物のウエスタンブロット解析が示されている。細胞を示されている化合物で６時間処理し、それぞれの抗体を用いてプローブした。
【００３３】
【図６】図６Ａ〜６Ｅは、雄ホモ接合性Ｒ１３８Ｘマウスにおける固形飼料およびＨＦＤ条件でグルカゴン組織学が変化しないことを示す。図６Ａは、固形飼料を摂食させたＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスから単離した膵臓におけるグルカゴンについての組織学を示す。図６Ｂおよび６Ｅは、図６Ａに示されている膵臓グルカゴン染色の定量化を示す。値は、平均±ＳＥＭを表す（遺伝子型当たりｎ＝６）。図６Ｃは、ＨＦＤを摂食させたＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスから単離した膵臓におけるグルカゴンについての組織学を示す。図６Ｄは、図６Ｃに示されている膵臓グルカゴン染色の定量化を示す（遺伝子型当たりｎ＝４〜１７匹のマウス）。
【００３４】
【図７】図７Ａ〜７Ｋは、固形飼料食下の雄ホモ接合性Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスの代謝表現型を示す。図７Ａ〜７Ｄは、摂食および絶食中のＷＴおよびＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおける血中グルコース（図７Ａ）、血漿インスリン（図７Ｂ）、プロインスリン（図７Ｃ）、およびＣペプチド（図７Ｄ）のレベルを示す。図７Ｅ〜７Ｆは、摂食および絶食中のＷＴおよびＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおけるプロインスリン／インスリン比（図７Ｅ）およびＣペプチド／インスリン比（図７Ｆ）を示す。図７Ｇは、ＷＴおよびＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおける経口グルコース負荷試験を示す。データを経時的な血中グルコースレベルとして示している。図７Ｈは、一晩絶食後（時間０）およびグルコースの腹腔内注射後の示されている時間における、ＷＴまたはＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおける血漿インスリンレベルを示す。データを経時的な血中グルコースレベルとして示している。図７Ｉは、ＷＴおよびＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスから単離した膵臓におけるインスリンについての組織学を示す。図７Ｊは、膵臓インスリン染色の定量化を示す。図７Ｋは、島の数の定量化を示す。値は、平均±ＳＥＭを表す（遺伝子型当たりｎ＝６〜１０匹のマウス）。
【００３５】
【図８】図８Ａ〜８Ｋは、ＨＦＤ下の雌ホモ接合性Ｒ１３８Ｘマウスの代謝表現型を示す。図８Ａ〜８Ｄは、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおける血中グルコース（図８Ａ）、血漿インスリン（図８Ｂ）、プロインスリン（図８Ｃ）、およびＣペプチド（図８Ｄ）のレベルを示す。図８Ｅ〜８Ｆは、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおけるプロインスリン／インスリン比（図８Ｅ）およびＣペプチド／インスリン比（図８Ｆ）を示す。図８Ｇは、ＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおける経口グルコース負荷試験を示す。データを経時的なグルコースレベルとして示している。図８Ｈは、一晩絶食後（時間０）およびグルコースの腹腔内注射後の示されている時間における、ＷＴまたはＲ１３８Ｘマウスにおける血漿インスリンレベルを示す。データを経時的なグルコースレベルとして示している。図８Ｉは、ＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスから単離した膵臓におけるインスリンについての組織学を示す。図８Ｊは、膵臓インスリン染色の定量化を示す。図８Ｋは、島の数の定量化を示す。値は、平均±ＳＥＭを表す（遺伝子型当たりｎ＝６〜９匹のマウス）。
【００３６】
【図９】図９Ａ〜９Ｍは、ＨＦＤ下のヘテロ接合性Ｒ１３８Ｘ（ＨＥＴ）マウスがより高いグルコース刺激性インスリンレベルを有することを示す。図９Ａは、固形飼料を摂食させたＷＴ、ヘテロ接合性Ｒ１３８Ｘマウスから単離した島のウエスタンブロットを示す。矢印：ＳＬＣ３０Ａ８タンパク質；＊は非特異的バンドを示す。図９Ｂは、ＷＴおよびヘテロ接合性Ｒ１３８Ｘマウスから単離した膵島のジチゾン染色を示す。図９Ｃ〜９Ｆは、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘ  ＨＥＴマウスおける血中グルコース（図９Ｃ）、血漿インスリン（図９Ｄ）、プロインスリン（図９Ｅ）、およびＣペプチド（図９Ｆ）のレベルを示す。図９Ｇ〜９Ｈは、摂食および絶食中のＷＴおよびＨＥＴマウスにおけるプロインスリン／インスリン比（図９Ｇ）およびＣペプチド／インスリン比（図９Ｈ）を示す。図９Ｉは、ＷＴおよびＲ１３８Ｘ  ＨＥＴマウスにおける経口グルコース負荷試験を示す。データを経時的な血中グルコースレベルとして示している。図９Ｊは、一晩絶食後（時間０）およびグルコースの腹腔内注射後の示されている時間における、ＷＴまたはＲ１３８Ｘ  ＨＥＴマウスにおける血漿インスリンレベルを示す。データを経時的なグルコースレベルとして示している。図９Ｋは、ＷＴおよびＲ１３８Ｘ  ＨＥＴマウスから単離した膵臓におけるインスリンについての組織学を示す。図９Ｌは、膵臓インスリン染色の定量化を示す。図９Ｍは、島の数の定量化を示す。値は、平均±ＳＥＭを表す（遺伝子型当たりｎ＝６〜９匹のマウス）。
【００３７】
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｃは、マウスＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を標的化してＲ１３８Ｘマウスを生成するための概略図である。図１０Ａは、野生型マウス遺伝子座を示し、標的化によって生成されるｐＡｒｇ１３７＊Ｃ＞Ｔ点変異および２９ｂｐの欠失の場所を示す。対立遺伝子特異的スクリーニングアッセイ（８０８４ＡＳ）およびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）下流スクリーニングアッセイ（８０８４ＴＤ）が示されている。図１０Ｂは、標的とする遺伝子座の概略図を示す。図１０Ｃは、自己欠失性薬物選択カセットの自己切除後の標的とする遺伝子座の概略図を示す。
【００３８】
【図１１】図１１は、野生型マウスＳＬＣ３０Ａ８タンパク質（配列番号１２）、Ｒ１３８Ｘマウスにおける予測される短縮されたＳＬＣ３０Ａ８  Ａｒｇ１３７＊タンパク質（配列番号１３）、および野生型ヒトＳＬＣ３０Ａ８タンパク質（配列番号１４）のタンパク質アラインメントを示す。
【００３９】
【図１２】図１２は、一定ミニポンプ注入を使用してＳ９６１（破線）またはＰＢＳ（実線）のいずれかで処置したＷＴマウス（黒塗りの記号）およびホモ接合性Ｒ１３８Ｘマウス（白抜きの記号）における摂食下血漿グルコースレベルおよび摂食下血漿インスリンレベルを示す。摂食下血漿グルコースレベルおよびインスリンレベルを、実験全体（２１日間）を通して示されている時点で測定した。
【００４０】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｉは、Ｒ１３８Ｘマウスがインスリン受容体アンタゴニストＳ９６１によって引き起こされる慢性的な高血糖下でより多くのインスリンを分泌することを示す。図１３Ａは、インスリン受容体アンタゴニストＳ９６１（２０ｎＭｏｌ／週）またはＰＢＳで２２日間継続的に処置したＲ１３８ＸおよびＷＴマウスにおける、非絶食下血漿グルコースレベルを示す。図１３Ｂは、Ｓ９６１（２０ｎＭｏｌ／週）またはＰＢＳで処置したＲ１３８ＸおよびＷＴマウスの０、４、１９および２２日目の非絶食下血漿インスリンを示す。図１３Ｃは、２２日間の処置後のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおける血漿中活性ＧＬＰ−１レベルを示す。図１３Ｄおよび１３Ｅは、処置開始後１９および２０日目に測定した摂食下および絶食下のグルコース（図１３Ｄ）およびインスリン（図１３Ｅ）のレベルを示す。図１３Ｆは、ＫＩ−６７（白色）、インスリン（緑色）、およびグルカゴン（赤色）についての免疫組織化学を示す。図１３Ｇは、ＫＩ−６７およびインスリン二重陽性細胞の定量化を示す。図１３Ｈは、（図１３Ｉ）に示されている膵臓インスリン染色の定量化を示す。図１３Ｉは、２２日間の処置後のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスから単離した膵臓におけるインスリンについての組織学を示す。値は、平均±ＳＥＭを表す（処置および遺伝子型当たりｎ＝５〜７匹のマウス）。
【００４１】
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｇは、２２日間のインスリン受容体アンタゴニストＳ９６１（２０ｎＭｏｌ／週）またはＰＢＳ  Ｓ９６１処置後のホルモンレベルおよびグルカゴン組織学を示す。２２日間の処置後の、摂食および絶食中のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおけるインスリン（図１４Ａ）、プロインスリン（図１４Ｂ）、Ｃペプチド（図１４Ｃ）、プロインスリン／Ｃペプチド比（図１４Ｄ）、インスリン／Ｃペプチド比（図１４Ｅ）。図１４Ｆは、図１４Ｇに示されている膵臓グルカゴン染色の定量化を示す。図１４Ｇは２２日間の処置後のＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスから単離した膵臓における、グルカゴンについての組織学を示す。値は、平均±ＳＥＭを表す（遺伝子型当たりｎ＝５〜７匹のマウス）。
【００４２】
【図１５】図１５は、ＲＰＫＭ（ｒｅａｄｓ  ｐｅｒ  ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｍｉｌｌｉｏｎ）で表されるＳｌｃ３０ａ８の遺伝子発現を示す。
【００４３】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、ＷＴ対Ｒ１３８Ｘマウス由来の島における遺伝子発現の変化を示す。図１６Ａは、インスリン２（Ｉｎｓ２）およびインスリン１（Ｉｎｓ１）についてのＲＰＫＭ値を示す。図１６Ｂは、ベータ細胞制御因子についてのＲＰＫＭ値を示す。図１６Ｃは、Ｈｖｃｎ１についてのＲＰＫＭ値を示す。
【００４４】
【図１７】図１７は、２０週間の高脂肪食（ＨＦＤ）下の後の、摂食および絶食中の雄ＷＴおよびホモ接合性Ｒ１３８Ｘマウスにおける循環亜鉛レベルを示す。マウスはおよそ２９週齢であった。１２匹のＷＴマウスを評価し、１３匹のＲ１３８Ｘマウスを評価した。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
定義
本明細書で互換的に使用される「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コードされたおよびコードされていないアミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾されたまたは誘導体化されたアミノ酸を含めたアミノ酸の任意の長さのポリマー形態を含む。用語は、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーも含む。「ドメイン」という用語は、特定の機能または構造を有するタンパク質またはポリペプチドの任意の一部を指す。
【００４６】
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言える。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸で終わる、タンパク質またはポリペプチドの開始点に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）で終わる、アミノ酸の鎖（タンパク質またはポリペプチド）の終了点に関する。
【００４７】
本明細書で互換的に使用される「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはその類似体もしくは修飾バージョンを含めたヌクレオチドの任意の長さのポリマー形態を含む。これらは、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡもしくはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学修飾された、生化学修飾された、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含む。
【００４８】
核酸は、モノヌクレオチドが１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸がその隣接体の３’酸素にホスホジエステル連結を介して一方向に付着するような様式で反応してオリゴヌクレオチドを作製するので、「５’末端」および「３’末端」を有すると言える。オリゴヌクレオチドの末端は、その５’リン酸がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結していない場合、「５’末端」と称される。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸に連結していない場合、「３’末端」と称される。より大きなオリゴヌクレオチドの内部にある核酸配列であっても、同様に５’および３’末端を有すると言うことができる。直鎖状または環状のいずれのＤＮＡ分子では、別々のエレメントは、「上流」もしくは５’側または「下流」もしくは３’側のエレメントと称される。
【００４９】
「ゲノムにより組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノム内に組み込まれるように細胞に導入された核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定な組込みのために任意のプロトコールを使用することができる。
【００５０】
「標的化ベクター」という用語は、相同組換え、非相同末端結合媒介性ライゲーション、または細胞のゲノム内の標的位置への組換えの任意の他の手段によって導入することができる組換え核酸を指す。
【００５１】
「野生型」という用語は、正常な（変異体、疾患にかかっている、変更された、などとは対照的）状態または状況で見出される構造および／または活性を有する実体を含む。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、多数の異なる形態で存在する（例えば、対立遺伝子）。
【００５２】
「内因性配列」という用語は、細胞または非ヒト動物内に天然に存在する核酸配列を指す。例えば、非ヒト動物の内因性Ｓｌｃ３０ａ８配列は、非ヒト動物においてＳｌｃ３０ａ８遺伝子座に天然に存在するネイティブなＳｌｃ３０ａ８配列を指す。「内因性遺伝子座」という用語は、特定の遺伝子エレメントが天然に見出される染色体上の場所を指す。例えば、非ヒト動物の内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座は、非ヒト動物において天然に存在するＳｌｃ３０ａ８遺伝子座（すなわち、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が天然に見出される非ヒト動物ゲノムの領域）を指す。例として、内因性マウスＳｌｃ３０ａ８遺伝子座は、第１５染色体にマッピングされる（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＧｅｎｅＩＤ  ２３９４３６；Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＧＲＣｍ３８．ｐ４；ｌｏｃａｔｉｏｎ  ＮＣ＿００００８１．６（５２２９５５５３−５２３３５７３３））。非ヒト動物の「内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座」という用語は、非ヒト動物のゲノムにランダムに挿入されたまたはＳｌｃ３０ａ８遺伝子が天然に見出される非ヒト動物ゲノムの領域以外の領域に挿入されたＳｌｃ３０ａ８遺伝子は指さない。同様に、非ヒト動物の「内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座」という用語は、例えば、非ヒト動物に移植された細胞（例えば、ヒトベータ細胞）内に位置するＳｌｃ３０ａ８遺伝子は指さない。
【００５３】
「外因性」分子または配列は、通常は細胞内にその形態で存在しない分子または配列を含む。通常の存在とは、細胞の特定の発生段階および環境条件に関した存在を含む。外因性分子または配列は、例えば、細胞内の対応する内因性配列の変異したバージョンを含み得る、または細胞内の内因性配列に対応するが、形態が異なる（すなわち、染色体内にない）配列を含み得る。対照的に、内因性分子または配列は、特定の環境条件下、特定の発生段階において特定の細胞内にその形態で通常存在する分子または配列を含む。
【００５４】
「異種」という用語は、核酸またはタンパク質に関して使用される場合、核酸またはタンパク質が同じ分子内に一緒には天然に存在しない少なくとも２つのセグメントを含むことを示す。例えば、「異種」という用語は、核酸のセグメントまたはタンパク質のセグメントを参照して使用される場合、天然では核酸またはタンパク質が互いに同じ関係（例えば、接合している）では見出されない２つまたはそれよりも多いサブ配列を含むことを示す。一例として、核酸ベクターの「異種」領域は、天然では他の分子に付随して見出されない、別の核酸分子内のまたはそれに付着した核酸のセグメントである。例えば、核酸ベクターの異種領域は、天然ではコード配列に付随して見出されない配列に挟まれたコード配列を含み得る。同様に、タンパク質の「異種」領域は、天然では他のペプチド分子に付随して見出されない別のペプチド分子内のまたはそれに付着したアミノ酸のセグメントである（例えば、融合タンパク質、またはタグを有するタンパク質）。同様に、核酸またはタンパク質は、異種標識または異種分泌または局在化配列を含み得る。
【００５５】
「コドン最適化」は、アミノ酸を指定する３塩基対のコドンの組合せの多重性によって示されるコドンの縮重を利用し、一般に、特定の宿主細胞における発現の増強のために、ネイティブなアミノ酸配列を維持しながら、ネイティブな配列の少なくとも１つのコドンを宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって核酸配列を改変するプロセスを含む。例えば、Ｃａｓ９タンパク質をコードする核酸を、天然に存在する核酸配列と比較して、細菌細胞、酵母細胞、ヒト細胞、非ヒト細胞、哺乳動物細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、ハムスター細胞、または任意の他の宿主細胞を含めた所与の原核または真核細胞においてより高い使用頻度を有するコドンに置換するように改変することができる。コドン使用表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能である。これらの表をいくつかの仕方で適合させることができる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるNakamura et al. (2000) Nucleic Acids Research 28: 292を参照されたい。特定の宿主における発現のために特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照されたい）。
【００５６】
「遺伝子座」という用語は、遺伝子の特定の場所（または重要な配列）、ＤＮＡ配列、ポリペプチドをコードする配列、または生物体のゲノムの染色体上の位置を指す。例えば、「Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座」は、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子の特定の場所、Ｓｌｃ３０ａ８  ＤＮＡ配列、ＳＬＣ３０ａ８をコードする配列、またはそのような配列が存在すると同定された生物体のゲノムの染色体上のＳｌｃ３０ａ８位置を指し得る。「Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座」は、例えば、エンハンサー、プロモーター、５’および／もしくは３’非翻訳領域（ＵＴＲ）、またはこれらの組合せを含めた、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子の制御エレメントを含み得る。
【００５７】
「遺伝子」という用語は、産物（例えば、ＲＮＡ産物および／またはポリペプチド産物）をコードする染色体内のＤＮＡ配列を指し、遺伝子が全長ｍＲＮＡ（５’および３’非翻訳配列を含む）に対応するように、非コードイントロンならびに５’末端および３’末端の両方においてコード領域に隣接して位置する配列で遮られたコード領域を含む。「遺伝子」という用語は、制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、および転写因子結合性部位）、ポリアデニル化シグナル、配列内リボソーム進入部位、サイレンサー、絶縁配列（insulating sequence）、およびマトリックス付着領域を含めた他の非コード配列も含む。これらの配列は、遺伝子のコード領域に近接していても（例えば、１０ｋｂ内）、遠位部位にあってもよく、これらは、遺伝子の転写および翻訳のレベルまたは速度に影響を及ぼす。
【００５８】
「対立遺伝子」という用語は、遺伝子のバリアント形態を指す。一部の遺伝子は様々な異なる形態を有し、これらは、染色体上の同じ位置、または遺伝子座に位置する。二倍体の生物体は各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子が存在する場合にはホモ接合性と、２つの対立遺伝子が異なる場合にはヘテロ接合性と記載される。
【００５９】
遺伝子の「コード領域」または「コード配列」は、タンパク質をコードするエクソンで構成される遺伝子のＤＮＡまたはＲＮＡの一部からなる。領域は、５’末端の開始コドンで始まり、３’末端の停止コドンで終わる。
【００６０】
「プロモーター」は、特定のポリヌクレオチド配列に対する適正な転写開始部位においてＲＮＡ合成を開始するようにＲＮＡポリメラーゼＩＩを方向付けることができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの制御領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結したポリヌクレオチドの転写をモジュレートする。プロモーターは、本明細書に開示される細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、齧歯類細胞、多能性細胞、１細胞期胚、分化細胞、またはこれらの組合せ）のうちの１つまたは複数において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、コンディショナルプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に制御されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができる。
【００６１】
「作動可能な連結」または「作動可能に連結して」いるは、両方の構成成分が正常に機能し、構成成分の少なくとも１つが他の構成成分の少なくとも１つに対して発揮される機能を媒介することができる可能性を可能にするように、２つまたはそれよりも多くの構成成分（例えば、プロモーターおよび別の配列エレメント）の並置を含む。例えば、プロモーターは、プロモーターにより、１つまたは複数の転写制御因子の存在または非存在に応答してコード配列の転写のレベルが調節される場合、コード配列に作動可能に連結し得る。作動可能な連結は、互いと連続したまたはトランスに作用するような配列を含み得る（例えば、制御配列は、離れて作用して、コード配列の転写を調節し得る）。
【００６２】
「バリアント」という用語は、集団内に最も行きわたっている配列とは異なる（例えば、１ヌクレオチドが異なる）ヌクレオチド配列または集団内に最も行きわたっている配列とは異なる（例えば、１アミノ酸が異なる）タンパク質配列を指す。
【００６３】
「配列同一性」または「同一性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関しては、指定の比較ウインドウにわたって最大の対応でアラインメントした場合に同じである２つの配列内の残基に言及する。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一でない残基の位置は、多くの場合、アミノ酸残基が同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換され、したがって分子の機能的特性は変化しない保存的アミノ酸置換によって異なる。配列が保存的置換で異なる場合、パーセント配列同一性を上向きに調整して、置換の保存的性質を補正することができる。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言える。この調整を行うための手段は周知である。一般には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なものとしてスコア化し、それにより、パーセンテージ配列同一性を増大させることを伴う。したがって、例えば、同一のアミノ酸に１というスコアを与え、非保存的置換にゼロというスコアを与える場合、保存的置換には、ゼロと１の間のスコアが与えられる。保存的置換のスコア化は、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行される通り算出される。
【００６４】
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウインドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列（最大数の完全にマッチした残基）を比較することによって決定される値を含み、比較ウインドウ内のポリヌクレオチド配列の一部は、２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、両方の配列内に同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が存在する位置の数を決定してマッチする位置の数を得、マッチする位置の数を比較ウインドウ内の位置の総数で割り、結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって算出される。別段の指定がない限り（例えば、短い方の配列が連結した異種配列を含む）、比較ウインドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の全長である。
【００６５】
別段の指定のない限り、配列同一性／類似性値は、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０を使用し、以下のパラメーターを使用して得られる値を含む：５０のＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔおよび３のＬｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコア化行列を使用したヌクレオチド配列についての％同一性および％類似性；８のＧＡＰ  Ｗｅｉｇｈｔおよび２のＬｅｎｇｔｈ  Ｗｅｉｇｈｔ、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア化行列を使用したアミノ酸配列についての％同一性および％類似性；またはその任意の等価のプログラム。「等価のプログラム」は、任意の問題の２つの配列に関して、ＧＡＰ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合に同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基マッチおよび同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
【００６６】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列内に通常存在するアミノ酸の、同様のサイズ、電荷、または極性の異なるアミノ酸での置換を指す。保存的置換の例として、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基での別の非極性残基の置換が挙げられる。同様に、保存的置換の例として、アルギニンとリシンの間、グルタミンとアスパラギンの間、またはグリシンとセリンの間などの１つの極性（親水性）残基での別の極性（親水性）残基の置換が挙げられる。さらに、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基での別の塩基性残基の置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などの１つの酸性残基での別の酸性残基の置換は保存的置換のさらなる例である。非保存的置換の例としては、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、もしくはメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸残基でのシステイン、グルタミン、グルタミン酸もしくはリシンなどの極性（親水性）残基の、および／または極性残基での非極性残基の置換が挙げられる。典型的なアミノ酸カテゴリー化を以下に要約する。
【００６７】
【表１】
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【００６８】
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、公知の参照配列と同一または実質的に同様であり、したがって、公知の参照配列と、例えば少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一である配列を含む。相同配列は、例えば、オルソロガス配列およびパラロガス配列を含み得る。相同な遺伝子は、例えば、一般には、共通の祖先ＤＮＡ配列から、種分化事象（オルソロガス遺伝子）または遺伝子重複事象（パラロガス遺伝子）を通じてのいずれかで伝わる。「オルソロガス」遺伝子は、共通の祖先遺伝子から種分化によって進化した異なる種の遺伝子を含む。オルソログは、一般には、進化の過程中、同じ機能を保持する。「パラロガス」遺伝子は、ゲノム内の重複によって関連する遺伝子を含む。パラログは、進化の過程中、新しい機能を進化させ得る。
【００６９】
「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工的な環境、および人工的な環境（例えば、試験管）の中で起こるプロセスまたは反応を含む。「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、天然の環境（例えば、細胞または生物体または身体）、および天然の環境の中で起こるプロセスまたは反応を含む。「ｅｘ  ｖｉｖｏ」という用語は、個体の身体から取り出された細胞およびそのような細胞の中で起こるプロセスまたは反応を含む。
【００７０】
「レポーター遺伝子」という用語は、内因性または異種プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントに作動可能に連結したレポーター遺伝子配列を含む構築物を、プロモーターおよび／またはエンハンサーエレメントの活性化に必要な因子を含有する（または含有するようにすることができる）細胞に導入した場合に容易にかつ定量化可能にアッセイされる遺伝子産物（一般には酵素）をコードする配列を有する核酸を指す。レポーター遺伝子の例としては、これだけに限定されないが、ベータ−ガラクトシダーゼをコードする遺伝子（ｌａｃＺ）、細菌クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）遺伝子、ホタルルシフェラーゼ遺伝子、ベータ−グルクロニダーゼをコードする遺伝子（ＧＵＳ）、および蛍光タンパク質をコードする遺伝子が挙げられる。「レポータータンパク質」は、レポーター遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。
【００７１】
「蛍光レポータータンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、蛍光に基づいて検出可能なレポータータンパク質を意味し、蛍光は、レポータータンパク質から直接、レポータータンパク質の蛍光発生基質に対する活性、または蛍光タグを付した化合物への結合について親和性を有するタンパク質からのいずれかであり得る。蛍光タンパク質の例としては、緑色蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ、ＧＦＰ−２、ｔａｇＧＦＰ、ｔｕｒｂｏＧＦＰ、ｅＧＦＰ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ＣｏｐＧＦＰ、ＡｃｅＧＦＰ、およびＺｓＧｒｅｅｎｌ）、黄色蛍光タンパク質（例えば、ＹＦＰ、ｅＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＰｈｉＹＦＰ、およびＺｓＹｅｌｌｏｗｌ）、青色蛍光タンパク質（例えば、ＢＦＰ、ｅＢＦＰ、ｅＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ、ＧＦＰｕｖ、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、およびＴ−ｓａｐｐｈｉｒｅ）、シアン蛍光タンパク質（例えば、ＣＦＰ、ｅＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎｌ、およびＭｉｄｏｒｉｉｓｈｉ−Ｃｙａｎ）、赤色蛍光タンパク質（例えば、ＲＦＰ、ｍＫａｔｅ、ｍＫａｔｅ２、ｍＰｌｕｍ、ＤｓＲｅｄ単量体、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＲＦＰ１、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄｌ、ＡｓＲｅｄ２、ｅｑＦＰ６１１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、およびＪｒｅｄ）、オレンジ蛍光タンパク質（例えば、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＫＯ、Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ  Ｋｕｓａｂｉｒａ−Ｏｒａｎｇｅ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、およびｔｄＴｏｍａｔｏ）、および細胞におけるその存在をフローサイトメトリー法によって検出することができる任意の他の適切な蛍光タンパク質が挙げられる。
【００７２】
二本鎖切断（ＤＳＢ）に応答した修復は、主に２つの保存されたＤＮＡ修復経路：相同組換え（ＨＲ）および非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を通じて起こる。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるKasparek & Humphrey (2011) Seminars in Cell & Dev. Biol. 22:886-897を参照されたい。同様に、外因性ドナー核酸によって媒介される標的核酸の修復は、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み得る。
【００７３】
「組換え」という用語は、２つのポリヌクレオチド間での遺伝情報の交換の任意のプロセスを含み、任意の機構によって起こり得る。組換えは、相同組換え修復（ＨＤＲ）または相同組換え（ＨＲ）を介して起こり得る。ＨＤＲまたはＨＲは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし得、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の修復の鋳型として「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の伝達を導く、核酸修復の形態を含む。いかなる特定の理論にも束縛されることなく、そのような伝達は、切断された標的とドナーの間に形成されるヘテロ二本鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／または、標的の一部になる遺伝情報を再合成するためにドナーが使用される合成依存性鎖アニーリング、および／または関連するプロセスを含み得る。一部の場合では、ドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの一部、ドナーポリヌクレオチドのコピー、またはドナーポリヌクレオチドのコピーの一部を標的ＤＮＡに組み込む。そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるWang et al. (2013) Cell 153: 910-918；Mandalos et al. (2012) PLOS ONE7: e45768: 1-9；およびWang et al. (2013) Nat Biotechnol. 31: 530-532を参照されたい。
【００７４】
ＮＨＥＪは、核酸における二本鎖切断の、切断末端の互いとのまたは外因性配列との、相同な鋳型を必要としない直接ライゲーションによる修復を含む。連続していない配列のＮＨＥＪによるライゲーションは、多くの場合、二本鎖切断の部位の付近の欠失、挿入、または転座を結果としてもたらし得る。例えば、ＮＨＥＪは、切断末端の外因性ドナー核酸の末端との直接ライゲーションを通じた外因性ドナー核酸の標的化組込みももたらし得る（すなわち、ＮＨＥＪに基づく捕捉）。そのようなＮＨＥＪ媒介性標的化組込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）経路が容易に使用可能でない場合に（例えば、非分裂細胞、初代細胞、および相同性に基づくＤＮＡ修復が不十分に行われる細胞において）外因性ドナー核酸の挿入のために好ましい場合がある。さらに、相同組換え修復とは対照的に、切断部位を挟む大きな領域の配列同一性に関する知識が必要なく、これは、ゲノム配列に関する知識が限られているゲノムを有する生物体への標的化挿入を試みる場合に有益であり得る。組込みは、外因性ドナー核酸と切断されたゲノム配列の間の平滑末端のライゲーションによって、または切断されたゲノム配列においてヌクレアーゼ作用剤によって生じるものと適合する突出部に挟まれた外因性ドナー核酸を使用した粘着末端（すなわち、５’または３’突出部を有する）のライゲーションによって進行し得る。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０２０７２２、ＷＯ２０１４／０３３６４４、ＷＯ２０１４／０８９２９０、およびMaresca et al. (2013) Genome Res. 23 (3): 539-546を参照されたい。平滑末端がライゲーションされる場合、断片接合のために必要なマイクロホモロジーの領域を生成するために標的および／またはドナーリセクションが必要になる場合があり、これにより、標的配列に不要な変更が創出される恐れがある。
【００７５】
「Ｒ１３８Ｘマウス」という用語は、ヒトＳＬＣ３０Ａ８推定ＬＯＦ変異、Ｒ１３８Ｘに対応するマウスＳｌｃ３０ａ８遺伝子座に変異を有するマウスを指す。マウスＳｌｃ３０ａ８遺伝子座における変異は、ｃ．４０９Ｃ＞Ｔ（転写物受託番号ＮＭ＿１７２８１６．３）、ｐ．Ａｒｇ１３７Ｘであり、コード配列のヌクレオチド４０９におけるＣのＴへの置換を意味し、その結果、アミノ酸残基１３７をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンから停止コドン（Ｒ１３７＊停止）に変異する。対応するヒトＳＬＣ３０Ａ８変異は、ｃ．４１２Ｃ＞Ｔ（転写物受託番号ＮＭ＿１７３８５１）、ｐ．Ａｒｇ１３８Ｘであり、コード配列のヌクレオチド４１２におけるＣのＴへの置換を意味し、その結果、アミノ酸残基１３８をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンから停止コドン（Ｒ１３８＊停止）に変異する。マウスＳＬＣ３０Ａ８タンパク質のアミノ酸残基１３７は、ヒトＳＬＣ３０Ａ８タンパク質のアミノ酸残基１３８と、２つを最適にアラインメントした場合に対応する。図１１を参照されたい。マウスＳｌｃ３０ａ８遺伝子における変異はマウスＳＬＣ３０Ａ８タンパク質のアミノ酸残基１３７をコードするコドンにおけるものであるが、これらのマウスは、本明細書では、対応するヒトＳＬＣ３０Ａ８変異に関して「Ｒ１３８Ｘマウス」と称される。
【００７６】
１つまたは複数の記載されている要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分と組み合わせて含有し得る。「から本質的になる」という移行句は、特許請求の範囲に記載されている指定の要素ならびに特許請求された発明の基本的および新規の特徴（複数可）に実質的に影響を及ぼさない要素が特許請求の範囲に包含されると解釈されるべきであることを意味する。したがって、「から本質的になる」という用語は、本発明の特許請求の範囲において使用される場合、「含む」と同等であると解釈されるものではない。
【００７７】
「必要に応じた」または「必要に応じて」は、その後に記載されている事象または状況が、起こってもよく起こらなくてもよいこと、および記載には事象または状況が起こる例と起こらない例が含まれることを意味する。
【００７８】
値の範囲の指定は、範囲内のまたは範囲を規定する全ての整数、および範囲内の整数によって規定される全ての部分範囲を含む。
【００７９】
文脈からそうでないことが明らかでない限り、「約」という用語は、明示された値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）の範囲内の値を包含する。
【００８０】
「および／または（ａｎｄ／ｏｒ）」という用語は、付随して列挙される項目のうちの１つまたは複数の任意のおよび全ての可能性のある組合せ、ならびに、代替（「または（ｏｒ）」）と解釈される場合は組合せの欠如を指し、それを包含する。
【００８１】
「または（ｏｒ）」という用語は、特定の一覧の任意の１メンバーを指し、その一覧のメンバーの任意の組合せも含む。
【００８２】
「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という単数形の冠詞は、文脈によりそうでないことが明確に規定されない限り、複数の参照物を含む。例えば、「１つのタンパク質（ａ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」または「少なくとも１つのタンパク質（ａｔ  ｌｅａｓｔ  ｏｎｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）」という用語は、それらの混合物を含め、複数のタンパク質を含み得る。
【００８３】
統計的に有意とは、ｐ≦０．０５を意味する。
【００８４】
詳細な説明
Ｉ．概要
変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座をゲノムに含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物、ならびにそのような非ヒト動物細胞および非ヒト動物を使用する方法が本明細書に開示される。亜鉛輸送体ＳＬＣ３０Ａ８は、主に膵内分泌部の島において発現される。ＳＬＣ３０Ａ８は、現在まで、推定上の機能喪失型変異により２型糖尿病の発生から保護されることが示されているたった３つの遺伝子のうち１つである。これは興味深いが、Ｓｌｃ３０ａ８が欠損したマウスモデルはグルコース恒常性が穏やかに損なわれるので、不可解な知見でもある。本発明者らは、保護的なヒトＳＬＣ３０Ａ８対立遺伝子を模倣する変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含むマウスモデルを生成した。このマウスモデルにより、何故ヒトが２型糖尿病から保護されるかを初めて説明することができる。マウスはインスリン分泌能の増大を有する。特に、マウスは、より高いグルコース誘導性インスリン分泌を有し、これは、膵ベータ細胞の数の増大によって一部媒介され得る。これらのＳＬＣ３０Ａ８変異データにより、ベータ細胞の増大が２型糖尿病を管理するための効果的な治療戦略であるという概念が裏付けられる。
【００８５】
本明細書に開示される細胞および非ヒト動物モデルは、薬物スクリーニングのため、ならびに、Ｔ２Ｄの機構（例えば、ＳＬＣ３０Ａ８がインスリンプロセシングおよび糖尿病に寄与する機構）および潜在的に新しい治療および診断標的に関する洞察をもたらすために使用することができる。
【００８６】
ＩＩ．変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物
本明細書に開示される細胞および非ヒト動物は、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座における変異（例えば、非ヒト動物において天然には存在しない変異）を含む（例えば、それらのゲノム内に）。変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座は、中途終止コドンを有し得る、および／または短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードし得る。変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物は、高脂肪食を摂食させた場合、同じ食餌を摂食させた場合変異を有さない非ヒト動物と比べて、インスリン分泌能の増強を有する。
【００８７】
Ａ．Ｓｌｃ３０ａ８
本明細書に記載の細胞および非ヒト動物は、変異したＳｌｃ３０ａ８（溶質キャリアファミリー３０メンバー８（ｓｏｌｕｔｅ  ｃａｒｒｉｅｒ  ｆａｍｉｌｙ  ３０  ｍｅｍｂｅｒ  ８））遺伝子座を含む。ＳＬＣ３０Ａ８の他の名称として、亜鉛輸送体８、ＺｎＴ−８、およびＺｎｔ８が挙げられる。Ｓｌｃ３０ａ８によってコードされるタンパク質は、細胞内小胞中の亜鉛の蓄積に関与する亜鉛輸送体である。Ｓｌｃ３０ａ８は、膵臓、特にランゲルハンス島において高いレベルで発現される。コードされるタンパク質は、インスリン分泌ＩＮＳ−１細胞の分泌経路顆粒においてインスリンと共局在化する。
【００８８】
ヒトＳＬＣ３０Ａ８は、第８染色体上のヒト８ｑ２４．１１にマッピングされる（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＧｅｎｅＩＤ  １６９０２６；Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＧＲＣｈ３８．ｐ７；ｌｏｃａｔｉｏｎ  １１６９５０２７３−１１７１７６７１４）。遺伝子は、８つのエクソンおよび７つのイントロンを有することが報告されている。しかし、８つよりも多くのエクソン（非コードエクソンを含む）を有するアイソフォームも可能である。野生型ヒトＳＬＣ３０Ａ８タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＩＷＵ４に割り当てられている。２つのアイソフォーム、Ｑ８ＩＷＵ４アイソフォーム１（配列番号１４）およびＱ８ＩＷＵ４アイソフォーム２が公知である。アイソフォーム１をコードするｍＲＮＡは、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿１７３８５１．２（配列番号１７）に割り当てられる。全長ヒトタンパク質は、６つの膜貫通領域、４つの細胞内トポロジカルドメイン、および３つの細胞外トポロジカルドメインを含む、３６９アミノ酸を有する。これらのドメイン間の描写はＵｎｉＰｒｏｔに示されている通りである。ヒトＳＣＬ３０Ａ８への言及は、基準の（野生型）形態ならびに全ての対立遺伝子形態およびアイソフォームを含む。ヒトＳＬＣ３０Ａ８の任意の他の形態は、野生型形態との最大のアラインメントで番号を付したアミノ酸を有し、アラインメントされたアミノ酸は同じ番号で示される。
【００８９】
マウスＳｌｃ３０ａ８は、第１５染色体にマッピングされる（ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＧｅｎｅＩＤ  ２３９４３６；Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ＧＲＣｍ３８．ｐ４；ｌｏｃａｔｉｏｎ  ＮＣ_００００８１．６（５２２９５５５３−５２３３５７３３））。遺伝子は、８つのエクソンおよび７つのイントロンを有することが報告されている。野生型マウスＳＬＣ３０Ａ８タンパク質はＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＢＧＧ０（配列番号１２）に割り当てられている。マウスＳＬＣ３０Ａ８をコードするｍＲＮＡはＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ  ＮＭ＿１７２８１６．３（配列番号１６）に割り当てられる。全長マウスタンパク質は、６つの膜貫通領域、４つの細胞内トポロジカルドメイン、および３つの細胞外トポロジカルドメインを含む、３６７アミノ酸を有する。これらのドメイン間の描写はＵｎｉＰｒｏｔに示されている通りである。マウスＳＣＬ３０Ａ８への言及は、基準の（野生型）形態、ならびに全ての対立遺伝子形態およびアイソフォームを含む。マウスＳＬＣ３０Ａ８の任意の他の形態は、野生型形態との最大のアラインメントで番号を付したアミノ酸を有し、アラインメントされたアミノ酸は同じ番号で示される。
【００９０】
例示的なラットＳＬＣ３０Ａ８タンパク質は、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０ＣＥ４６によって示される。
【００９１】
ヒトＳＬＣ３０Ａ８遺伝子における多型は、２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）のリスクの変更に関連する。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるSladek et al. (2007) Nature 445 (7130): 881-885およびDavidson et al.(2014) Trends Endocrinol. Metab. 25 (8): 415-424を参照されたい。ヒトにおける一部のそのような多型または変異は、ヒトにおいて、Ｔ２Ｄのリスクを低減することができるまたはＴ２Ｄに対して保護的である。Ｔ２Ｄのリスクを低減するＳＬＣ３０Ａ８遺伝子における多型または変異は、Ｔ２Ｄからの保護を付与する、Ｔ２Ｄに対する抵抗性を付与する、または、Ｔ２Ｄからの保護もしくはＴ２Ｄに対する抵抗性に関連する多型または変異を含む。例えば、ヒトＳＬＣ３０Ａ８における、タンパク質短縮を引き起こす種々の停止コドン変異、フレームシフト変異、スプライス部位変異、または開始コドン変異が、ヘテロ接合性の場合にＴ２Ｄから保護する。これらのうちの１つはｃ．４１２  Ｃ＞Ｔ（転写物受託番号ＮＭ＿１７３８５１）、ｐ．Ａｒｇ１３８Ｘと名付けられ、コード配列のヌクレオチド４１２におけるＣのＴへの置換を意味し、その結果、アミノ酸残基１３８をコードするコドンがアルギニン残基をコードするコドンから停止コドン（Ｒ１３８＊停止）に変異する。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFlannicket al. (2014) Nat. Genet. 46 (4): 357-363を参照されたい。これらの表現型は、以前の動物モデルでは複製されていないが、本明細書に開示される非ヒト動物では複製される。
【００９２】
Ｂ．変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座
本明細書に開示される変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座により、高脂肪食を摂食させた場合、同じ食餌を摂食させた場合変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌能の増強を有する非ヒト動物がもたらされる。変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座により、Ｔ２Ｄリスクが低減し得る。変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比べて、以下の特徴：（１）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大；（２）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞増殖の増大；（３）高脂肪食を摂食させた場合の膵ベータ細胞の数の増大；および（４）インスリン受容体の遮断（例えば、Ｓ９６１を用いた）後の摂食下血漿インスリンレベルの増大のうちの１つまたは複数または全てを有し得る。それに加えて、またはその代わりに、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比べて、以下の特徴：（１）２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０週間高脂肪食を摂食させた後（例えば、２０または３０週間後）の循環インスリンレベルの増大；（２）２０、２５、３０、３５、４０、４５、または５０週間高脂肪食を摂食させた後（例えば、２０または３０週間後）の膵ベータ細胞の数の増大；（３）高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低減；（４）インスリン受容体の遮断後（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３後、２４、または２５日後）の摂食下血漿インスリンレベルの増大；ならびに（５）インスリンプロセシングの改善およびより良好な健康を有する膵ベータ細胞（例えば、高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低減によって証明される）のうちの１つまたは複数または全てを有し得る。それに加えて、またはその代わりに、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物は、島における顕著なＳｌｃ３０ａ８  ｍＲＮＡ発現を有し得る（例えば、野生型レベルの少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％、例えば、野生型レベルの少なくとも２５％または３０％）。
【００９３】
変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比較して、対照固形飼料食を摂食させた場合、正常な代謝表現型を有し得る。変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比較して、対照固形飼料食を摂食させた場合、正常なグルコース恒常性および／または正常なグルコース誘導性インスリン分泌を有し得る。変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比較して、対照固形飼料食を摂食させた場合、以下の特徴：体重が顕著に異ならないこと、循環血中グルコースレベルが顕著に異ならないこと、循環インスリンレベルが顕著に異ならないこと、循環プロインスリンレベルが顕著に異ならないこと、循環Ｃペプチドレベルが顕著に異ならないこと、プロインスリン／Ｃペプチド比が顕著に異ならないこと、耐糖能が顕著に異ならないこと、インスリン感受性が顕著に異ならないこと、グルコース誘導性インスリン分泌が顕著に異ならないこと、ベータ細胞質量が顕著に異ならないこと、アルファ細胞質量が顕著に異ならないことのうちの１つまたは複数または全ても有し得る。変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比較して、対照固形飼料食を摂食させた場合、インスリン／Ｃペプチド比の低減を有し得る。これにより、より高いインスリンクリアランスが示され得る。
【００９４】
変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比較して、インスリンを分泌する能力の増大を有する。一例として、非ヒト動物は、高脂肪食を摂食させた場合、インスリン分泌能の増強を有し得る。そのような非ヒト動物は、高脂肪食を摂食させた場合、変異を有さない非ヒト動物と比べてインスリン分泌の増大を有し得、インスリン分泌の増大は、変異を有さない非ヒト動物と比べたベータ細胞増殖またはベータ細胞質量の増大に関連する。ベータ細胞増殖の増大は、インスリン受容体依存性（例えば、ベータ細胞におけるインスリン受容体に依存する）であり得る。別の例として、非ヒト動物は、重篤な高血糖などの高血糖に応答して、インスリン分泌能の増強を有し得る。そのような非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物と比べて、インスリン受容体の阻害によって誘導される高血糖に応答したインスリン分泌の増大を有し得る。例えば、そのような非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物と比べて、インスリン受容体の阻害によって誘導される高血糖に応答したインスリン分泌の増大を有し得、インスリン分泌の増大は、変異を有さない非ヒト動物と比べたベータ細胞増殖またはベータ細胞質量の増大に関連しない。変異を有さない非ヒト動物と比較したインスリン分泌の増大は、少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、または５０％であり得る。例えば、非ヒト動物は、インスリン受容体アンタゴニストＳ９６１によって引き起こされる高血糖などのインスリン受容体の阻害によって誘導される高血糖に応答したインスリン分泌の増大を有し得る。一部の非ヒト動物では、この効果は、ベータ細胞増殖の増強またはベータ細胞質量の増大に関連しない。一部の非ヒト動物では、血漿インスリンの増大は、以下：プロインスリンプロセシングの改善、インスリンクリアランスの低減、ベータ細胞増殖の増大、島の質量の増大、ベータ細胞質量の増大、アルファ細胞質量の増大、またはベータ細胞におけるインスリン枯渇の１つまたは複数または全ての結果ではない。
【００９５】
変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比較して、ミトコンドリア遺伝子発現の低減（例えば、ミトコンドリア酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）系の遺伝子の発現の低減）を有し得る。そのような遺伝子の例は、実施例２および表７〜９においてより詳細に記載されている。変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比較して、Ｈｖｃｎ１（水素電位依存性チャネル１、または電位依存性水素チャネル１）発現の増大を有し得る。
【００９６】
変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比較して、島亜鉛蓄積の喪失を有し得る。
【００９７】
変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比較して、対照固形飼料食を摂食させた場合、以下の特徴：体重、血中グルコース、インスリン、またはＣペプチドレベル（摂食下または絶食下）が異ならないこと；摂食下プロインスリンレベルに変化がないこと；絶食下プロインスリンレベルの低減を有し得ること；プロインスリンのインスリンに対する比（摂食下または絶食下）に変化がないこと；摂食下のＣペプチドのインスリンに対する比が増大していること；絶食下のＣペプチドのインスリンに対する比に変化がないこと；および耐糖能またはグルコース誘導性インスリン分泌に変化がないことのうちの１つまたは複数または全ても有し得る。
【００９８】
変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物（例えば、野生型非ヒト動物）と比較して、高脂肪食を摂食させた場合、以下の特徴：摂食下または絶食下の血中グルコースに変化がないこと；摂食下の循環インスリンレベルが増大していること；絶食下の循環インスリンレベルに変化がないこと；摂食下プロインスリンレベルに変化がないこと；絶食下プロインスリンレベルが低減していること；摂食下の循環Ｃペプチドレベルが増大していること；絶食下の循環Ｃペプチドレベルに変化がないこと；プロインスリンのインスリンに対する比（摂食下および絶食下）が低減していること；Ｃペプチドのインスリンに対する比に変化がないこと；膵臓内のインスリン陽性面積が増大していること；膵臓面積当たりの島の数が増大していること；ベータ細胞増殖が増大していること；ならびにインスリン産生ベータ細胞の数が増大していることのうちの１つまたは複数または全ても有し得る。さらに、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物は、変異を有さない非ヒト動物と比較して、インスリン受容体の遮断（例えば、Ｓ９６１を使用した）後の摂食下血漿インスリンレベルの増大を有し得る。
【００９９】
本明細書に開示される変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座は、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードするＳｌｃ３０ａ８遺伝子座（すなわち、タンパク質短縮性バリアント）であり得る。短縮を引き起こす変異は、例えば、フレームシフト変異、ナンセンス変異、スプライス部位変異、または開始コドンＳＮＶであり得る。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFlannick et al. (2014) Nat. Genet. 46 (4): 357-363を参照されたい。ナンセンス変異は、遺伝暗号によって指定される２０種のアミノ酸のうちの１つに対応するセンスコドンが読み終りコドン（chain-terminatingcodon）（すなわち、終止コドンまたは停止コドン）に変化する変異である。フレームシフト変異は、コドンの正常な配列が１つまたは複数のヌクレオチドの挿入または欠失によって乱された場合に生じるが、ただし、付加または除去されるヌクレオチドの数は３の倍数ではない。フレームシフト変異は、参照配列と比較して翻訳が別のフレームにシフトする、翻訳開始コドン（開始コドン）と終止コドン（停止コドン）の間の配列変化である。例えば、リーディングフレームが５’方向に１ヌクレオチドシフト（−１フレームシフト）または３’方向に１ヌクレオチドシフト（＋１フレームシフト）し得る。フレームシフト変異を有する遺伝子によってコードされるタンパク質は、Ｎ末端からフレームシフト変異までは野生型遺伝子によってコードされるタンパク質と同一であるが、その点を超えると異なる。そのようなフレームシフトは、中途終止コドンを結果としてもたらし得る。スプライス部位変異は、例えば、エクソンのスキッピングおよび潜在的にその後の中途終止コドンを結果としてもたらすフレームシフトを結果としてもたらし得る。一例では、本明細書に開示される変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座は、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子が中途終止コドン（すなわち、停止コドン）を有するＳｌｃ３０ａ８遺伝子座であり得る。具体的な例では、変異は、ナンセンス変異を含む、それから本質的になる、またはそれからなる。
【０１００】
変異は、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座内のどこにでもあり得る。例えば、変異は、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子の第１のエクソン、第２のエクソン、第３のエクソン、第４のエクソン、第５のエクソン、第６のエクソン、第７のエクソン、または第８のエクソンにあり得る。同様に、変異は、ヒトＳＬＣ３０Ａ８遺伝子と最適にアラインメントした場合、ヒトＳＬＣ３０Ａ８遺伝子の第１、第２、第３、第４、第５、第６、第７、または第８のエクソンに対応するＳｌｃ３０ａ８遺伝子の領域にあり得る。具体的な例では、変異は、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子の第３のエクソンまたはヒトＳＬＣ３０Ａ８遺伝子と最適にアラインメントした場合ヒトＳＬＣ３０Ａ８遺伝子の第３のエクソンに対応するＳｌｃ３０ａ８遺伝子の領域にある。より具体的な例では、変異は、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子の第３のエクソンの３’末端またはヒトＳＬＣ３０Ａ８遺伝子と最適にアラインメントした場合ヒトＳＬＣ３０Ａ８遺伝子の第３のエクソンの３’末端に対応するＳｌｃ３０ａ８遺伝子の領域にある。
【０１０１】
一例では、変異は、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子のコード配列を配列番号２１と最適にアラインメントした場合、配列番号２１に記載のヒトＳＬＣ３０Ａ８コード配列（ＣＤＳ）の残基４１２（すなわち、残基ｃ．４１２、転写物受託番号ＮＭ＿１７３８５１）に対応する残基にある。あるいは、変異は、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子のコード配列を配列番号２１と最適にアラインメントした場合、配列番号２１に記載のヒトＳＬＣ３０Ａ８コード配列の残基４１２（すなわち、残基ｃ．４１２、転写物受託番号ＮＭ＿１７３８５１）から１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチド以内の残基にある。
【０１０２】
別の例では、変異は、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子のコード配列を配列番号２０と最適にアラインメントした場合、配列番号２０に記載のマウスＳｌｃ３０ａ８コード配列（ＣＤＳ）の残基４０９（すなわち、残基ｃ．４０９、転写物受託番号ＮＭ＿１７３８５１．２）に対応する残基にある。あるいは、変異は、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子のコード配列を配列番号２０と最適にアラインメントした場合、配列番号２０に記載のマウスＳｌｃ３０ａ８コード配列の残基４０９（すなわち、残基ｃ．４０９、転写物受託番号ＮＭ＿１７３８５１．２）から１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、１００、２００、３００、４００、または５００ヌクレオチド以内の残基にある。
【０１０３】
別の例では、変異は、配列番号１４と最適にアラインメントした場合、配列番号１４に記載のヒトＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の残基１３８に対応するコドン（すなわち、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＩＷＵ４．２のアミノ酸１３８）に停止コドンを結果としてもたらす。あるいは、停止コドンは、配列番号１４と最適にアラインメントした場合、配列番号１４に記載のヒトＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の残基１３８（すなわち、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＩＷＵ４．２のアミノ酸１３８）から１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０アミノ酸以内のコドンに対応する。
【０１０４】
別の例では、変異は、配列番号１２と最適にアラインメントした場合、配列番号１２に記載のマウスＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の残基１３７（すなわち、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＢＧＧ０．１のアミノ酸１３７）に対応するコドンに停止コドンを結果としてもたらす。あるいは、停止コドンは、配列番号１２と最適にアラインメントした場合、配列番号１２に記載のマウスＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の残基１３７（すなわち、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ８ＢＧＧ０．１のアミノ酸１３７）から１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、または２５０アミノ酸以内のコドンに対応する。
【０１０５】
変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座は、非ヒト動物に対して内因性であり得る。具体的な例では、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座は、配列番号１８と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含む、それから本質的になる、またはそれからなるｍＲＮＡ（ｃＤＮＡ）をコードする。変異したＳＬＣ３０Ａ８遺伝子座のコード配列は、配列番号２２と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、もしくは１００％同一である配列または同じアミノ酸配列をコードするその縮重体を含み、それから本質的になり、またはそれからなり得る。結果得られる、変異したＳＬＣ３０Ａ８遺伝子座によってコードされるＳＬＣ３０Ａ８タンパク質は、配列番号１３と少なくとも８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％同一である配列を含み、それから本質的になり、またはそれからなり得る。
【０１０６】
必要に応じて、変異したＳＬＣ３０Ａ８遺伝子座は、他の外因性または異種エレメントを含み得る。そのようなエレメントの例は、選択カセット、レポーター遺伝子、リコンビナーゼ認識部位、または他のエレメントを含み得る。一例として、変異したＳＬＣ３０Ａ８遺伝子座は、リコンビナーゼ認識配列（例えば、ｌｏｘＰ部位）に挟まれた除去可能な選択カセット（例えば、自己欠失性選択カセット）を含み得る。あるいは、変異したＳＬＣ３０Ａ８遺伝子座は、他のエレメントを欠き得る（例えば、選択カセットを欠き得、かつ／またはレポーター遺伝子を欠き得る）。適切なレポーター遺伝子およびレポータータンパク質の例は、本明細書の他の箇所で開示されている。適切な選択マーカーの例としては、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）、ハイグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ（ｈｙｇｒ）、ピューロマイシン−Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ（ｐｕｒｏｒ）、ブラストサイジンＳデアミナーゼ（ｂｓｒｒ）、キサンチン／グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ｇｐｔ）、および単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｋ）が挙げられる。リコンビナーゼの例としては、Ｃｒｅ、Ｆｌｐ、およびＤｒｅリコンビナーゼが挙げられる。Ｃｒｅリコンビナーゼ遺伝子の１つの例は、Ｃｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンがイントロンによって分離されて原核細胞におけるその発現が妨げられているＣｒｅｉである。そのようなリコンビナーゼは、核への局在化を容易にするための核局在化シグナルをさらに含み得る（例えば、ＮＬＳ−Ｃｒｅｉ）。リコンビナーゼ認識部位は、部位特異的リコンビナーゼによって認識されるヌクレオチド配列を含み、組換え事象の基質として機能を果し得る。リコンビナーゼ認識部位の例としては、ＦＲＴ、ＦＲＴ１１、ＦＲＴ７１、ａｔｔｐ、ａｔｔ、ｒｏｘ、ならびにｌｏｘＰ、ｌｏｘ５１１、ｌｏｘ２２７２、ｌｏｘ６６、ｌｏｘ７１、ｌｏｘＭ２、およびｌｏｘ５１７１などのｌｏｘ部位が挙げられる。
【０１０７】
レポーター遺伝子または選択カセットなどの他のエレメントは、リコンビナーゼ認識部位に挟まれた自己欠失性カセットであり得る。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，６９７，８５１およびＵＳ２０１３／０３１２１２９を参照されたい。例として、自己欠失性カセットは、マウスＰｒｍ１プロモーターに作動可能に連結したＣｒｅｉ遺伝子（イントロンによって分離されたＣｒｅリコンビナーゼをコードする２つのエクソンを含む）およびヒトユビキチンプロモーターに作動可能に連結したネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。Ｐｒｍ１プロモーターを用いることにより、特にＦ０動物の雄胚細胞において自己欠失性カセットを欠失させることができる。選択マーカーをコードするポリヌクレオチドを、標的とする細胞において活性なプロモーターに作動可能に連結することができる。プロモーターの例は、本明細書の他の箇所に記載されている。別の具体的な例として、自己欠失性選択カセットは、１つまたは複数のプロモーター（例えば、ヒトユビキチンプロモーターおよびＥＭ７プロモーターの両方）に作動可能に連結したハイグロマイシン耐性遺伝子コード配列、続いてポリアデニル化シグナル、続いて１つまたは複数のプロモーター（例えば、ｍＰｒｍ１プロモーター）に作動可能に連結したＣｒｅｉコード配列、続いて、別のポリアデニル化シグナルを含み得、カセット全体がｌｏｘＰ部位に挟まれている。
【０１０８】
変異したＳＬＣ３０Ａ８遺伝子座は、コンディショナル対立遺伝子でもあり得る。例えば、コンディショナル対立遺伝子は、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１０４７９９に記載されている多機能性対立遺伝子であり得る。例えば、コンディショナル対立遺伝子は、（ａ）標的遺伝子の転写に対してセンス方向の作動性配列；（ｂ）センスまたはアンチセンス方向の薬物選択カセット（ＤＳＣ）；（ｃ）アンチセンス方向の目的のヌクレオチド配列（ＮＳＩ）；および（ｄ）リバース方向の反転によるコンディショナルモジュール（ＣＯＩＮ、エクソンを分割するイントロンおよび反転可能な遺伝トラップ様モジュールを利用する）を含み得る。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。コンディショナル対立遺伝子は、第１のリコンビナーゼに曝露すると組み換えられて、（ｉ）作動性配列およびＤＳＣを欠き、（ｉｉ）センス方向のＮＳＩおよびアンチセンス方向のＣＯＩＮを含有するコンディショナル対立遺伝子を形成する組換え可能単位をさらに含み得る。例えば、ＵＳ２０１１／０１０４７９９を参照されたい。
【０１０９】
Ｃ．変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物
本明細書の他の箇所に記載の変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、および非ヒト動物が提供される。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、雄または雌であり得る。ゲノム、細胞、または非ヒト動物は、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座についてヘテロ接合性、またはホモ接合性であり得る。二倍体の生物体は、各遺伝子座に２つの対立遺伝子を有する。対立遺伝子の各対は、特定の遺伝子座の遺伝子型を表す。遺伝子型は、特定の遺伝子座に２つの同一の対立遺伝子が存在する場合、ホモ接合性と、２つの対立遺伝子が異なる場合、ヘテロ接合性と記載される。
【０１１０】
本明細書で提供される非ヒト動物ゲノムまたは細胞は、例えば、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座またはヒトＳＬＣ３０Ａ８遺伝子座と相同もしくはオルソロガスなゲノム遺伝子座を含む任意の非ヒト動物ゲノムまたは細胞であり得る。ゲノムは真核細胞由来であり得る、または細胞は真核細胞であり得、真核細胞としては、例えば、動物細胞、哺乳動物細胞、非ヒト哺乳動物細胞、およびヒト細胞が挙げられる。「動物」という用語は、例えば、哺乳動物、魚類、は虫類、両生類、鳥類、および虫を含めた、動物界の任意のメンバーを含む。哺乳動物細胞は、例えば、非ヒト哺乳動物細胞、齧歯類細胞、ラット細胞、マウス細胞、またはハムスター細胞であり得る。他の非ヒト哺乳動物としては、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウサギ、ウマ、家畜（例えば、雌牛、雄牛などのウシ種；ヒツジ、ヤギなどのヒツジ種；およびブタおよびイノシシなどのブタ種）が挙げられる。飼育動物および農業動物も含まれる。「非ヒト」という用語は、ヒトを排除する。
【０１１１】
細胞は、任意の型の未分化のまたは分化した状態でもあり得る。例えば、細胞は、全能性細胞、多能性細胞（例えば、ヒト多能性細胞またはマウス胚性幹（ＥＳ）細胞もしくはラットＥＳ細胞などの非ヒト多能性細胞）、または非多能性細胞であり得る。全能性細胞は、任意の細胞型を生じさせることができる未分化細胞を含み、多能性細胞は、１つよりも多くの分化細胞型に発生する能力を有する未分化細胞を含む。そのような多能性および／または全能性細胞は、例えば、ＥＳ細胞または人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞などのＥＳ様細胞であり得る。ＥＳ細胞は、胚に導入されると発生中の胚の任意の組織に寄与することができる胚由来の全能性または多能性細胞を含む。ＥＳ細胞は、胚盤胞の内部細胞塊に由来し得、３つの脊椎動物胚葉（内胚葉、外胚葉、および中胚葉）のいずれかの細胞に分化することができる。
【０１１２】
本明細書で提供される細胞は、胚細胞（例えば、精子または卵母細胞）でもあり得る。細胞は、有糸分裂コンピテント細胞または有糸分裂不活性細胞、減数分裂コンピテント細胞または減数分裂不活性細胞であり得る。同様に、細胞は、初代体細胞または初代体細胞ではない細胞の場合もある。体細胞は、配偶子、胚細胞、生殖母細胞、または未分化幹細胞ではない任意の細胞を含む。例えば、細胞は、ベータ細胞、膵島細胞、または膵臓細胞であり得る。
【０１１３】
本明細書で提供される適切な細胞は、初代細胞も含む。初代細胞は、生物体、臓器、または組織から直接単離された細胞または細胞培養物を含む。初代細胞は、形質転換されてもなく、不死でもない細胞を含む。初代細胞は、以前に組織培養で継代されていないまたは以前に組織培養で継代されたが組織培養で無制限に継代することはできない生物体、臓器、または組織から得られる任意の細胞を含む。そのような細胞は、従来の技法によって単離することができ、例えば、ベータ細胞が挙げられる。
【０１１４】
本明細書で提供される他の適切な細胞は、不死化細胞を含む。不死化細胞は、通常は無制限に増殖しないが、変異または変更に起因して、正常な細胞老化を逃れ、その代わりに分裂し続けることができる多細胞生物体に由来する細胞を含む。そのような変異または変更は、天然に起こることも、意図的に誘導することもできる。不死化細胞系の具体的な例は、ＥｎｄｏＣ−βＨ２、１．１Ｂ４、１．４Ｅ７、１．１Ｅ７、ＲＩＮ、ＨＩＴ、ＭＩＮ、ＩＮＳ−１、およびβＴＣ細胞系である。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるScharfmann et al. (2014) J. Clin. Invest. 124 (5): 2087-2098およびMcCluskeyet al. (2011) J. Biol. Chem. 286 (25): 21982-21992を参照されたい。多数の型の不死化細胞が周知である。不死化または初代細胞は、一般には組換え遺伝子またはタンパク質を培養するためまたは発現させるために使用される細胞を含む。
【０１１５】
本明細書で提供される細胞は、１細胞期胚（すなわち、受精した卵母細胞または接合体）も含む。そのような１細胞期胚は、任意の遺伝的背景に由来していてもよく（例えば、マウスについてはＢＡＬＢ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６、１２９、またはこれらの組合せ）、新鮮であっても凍結させてあってもよく、自然交配またはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおける受精に由来していてもよい。
【０１１６】
本明細書で提供される細胞は、正常な、健康な細胞の場合もあり、疾患にかかっているまたは変異体を有する細胞の場合もある。
【０１１７】
本明細書に記載の変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物は、本明細書の他の箇所に記載の方法によって作製することができる。「動物」という用語は、例えば、哺乳動物、魚類、は虫類、両生類、鳥類、および虫を含めた動物界の任意のメンバーを含む。具体的な例では、非ヒト動物は、非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物としては、例えば、非ヒト霊長類、サル、類人猿、オランウータン、ネコ、イヌ、ウマ、ウサギ、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、および家畜（例えば、雌牛および雄牛などのウシ種；ヒツジおよびヤギなどのヒツジ種；およびブタおよびイノシシなどのブタ種）が挙げられる。飼育動物および農業動物も含まれる。「非ヒト動物」という用語は、ヒトを排除する。好ましい非ヒト動物としては、例えば、マウスおよびラットなどの齧歯類が挙げられる。
【０１１８】
非ヒト動物は、任意の遺伝的背景に由来し得る。例えば、適切なマウスは、は、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、１２９とＣ５７ＢＬ／６のミックス、ＢＡＬＢ／ｃ系統、またはＳｗｉｓｓ  Ｗｅｂｓｔｅｒ系統に由来し得る。１２９系統の例としては、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／Ｓｖｌｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、および１２９Ｔ２が挙げられる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFesting et al. (1999) Mammalian Genome 10: 836を参照されたい。Ｃ５７ＢＬ系統の例としては、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／Ｋａｌ＿ｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、およびＣ５７ＢＬ／Ｏｌａが挙げられる。適切なマウスは、上述の１２９系統と上述のＣ５７ＢＬ／６系統のミックス（例えば、５０％１２９および５０％Ｃ５７ＢＬ／６）にも由来し得る。同様に、適切なマウスは、上述の１２９系統のミックスまたは上述のＢＬ／６系統のミックス（例えば、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統）に由来し得る。
【０１１９】
同様に、ラットは、例えば、ＡＣＩラット系統、Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ３４４もしくはＦｉｓｈｅｒ  Ｆ６などのＦｉｓｃｈｅｒラット系統を含めた任意のラット系統に由来し得る。ラットは、上記の２つまたはそれよりも多くの系統のミックスに由来する系統から得ることもできる。例えば、適切なラットは、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統に由来し得る。ＡＣＩラット系統は、黒色アグーチを有し、腹部と足が白色であり、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプであると特徴付けられる。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた様々な供給源から入手可能である。Ｄａｒｋ  Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統は、アグーチコートおよび、ＲＴ１ａｖ１ハプロタイプを有すると特徴付けられる。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ  ＲｉｖｅｒおよびＨａｒｌａｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含めた様々な供給源から入手可能である。一部の適切なラットは、近交系ラット系統に由来し得る。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０２３５９３３を参照されたい。
【０１２０】
ＩＩＩ．変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物を作製する方法
本明細書の他の箇所で開示されている変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物ゲノム、非ヒト動物細胞、または非ヒト動物を作製するための様々な方法が提供される。遺伝子改変された生物体を作出するための任意の都合のよい方法またはプロトコールが、そのような遺伝子改変された非ヒト動物を作出するために適している。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるCho et al. (2009) Current Protocols in Cell Biology 42: 19．11: 19.11.1-19.11.22およびGamaSosa et al. (2010) Brain Struct. Funct. 214 (2-3): 91-109を参照されたい。そのような遺伝子改変された非ヒト動物は、例えば、標的とするＳｌｃ３０ａ８遺伝子座での遺伝子ノックインによって生成することができる。
【０１２１】
例えば、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物を作出する方法は、（１）多能性細胞のゲノムを、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含むように改変するステップと、（２）変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップと、（３）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入するステップと、（４）宿主胚を代理母に移植し、妊娠させるステップとを含み得る。例えば、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物を作出する方法は、（１）多能性細胞のゲノムを、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含むように改変するステップと、（２）変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む遺伝子改変された多能性細胞を同定または選択するステップと、（３）遺伝子改変された多能性細胞を非ヒト動物宿主胚に導入するステップと、（４）代理母において宿主胚を妊娠させるステップとを含み得る。必要に応じて、改変された多能性細胞（例えば、非ヒトＥＳ細胞）を含む宿主胚を胚盤胞段階までインキュベートした後に代理母に移植し妊娠させて、Ｆ０非ヒト動物を作出することができる。次いで、代理母により変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含むＦ０世代非ヒト動物を作出することができる。
【０１２２】
方法は、改変された標的ゲノム遺伝子座（すなわち、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座）を有する細胞または動物を同定するステップをさらに含み得る。様々な方法を使用して、標的とする遺伝子改変を有する細胞および動物を同定することができる。
【０１２３】
ゲノムを改変するステップでは、例えば、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座を本明細書に開示されるＳｌｃ３０ａ８変異を含むように改変するために、外因性修復鋳型（例えば、標的化ベクター）を利用することができる。一例として、標的化ベクターは、内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座（例えば、内因性非ヒト動物Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座）において変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子を生成するためのものであってよく、標的化ベクターは、内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の５’標的配列を標的化する５’相同アームおよび内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座の３’標的配列を標的化する３’相同アームを含み、標的化ベクターは、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子における変異を含み、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子は、短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質をコードする。具体的な例として、変異は、ヒトＳＬＣ３０Ａ８タンパク質における残基１３８に対応するコドンに停止コドンを結果としてもたらし得る。
【０１２４】
外因性修復鋳型は、非相同末端結合媒介性挿入または相同組換えのためのものであってよい。外因性修復鋳型は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）を含んでよく、これらは、一本鎖であっても二本鎖であってもよく、直鎖形態であっても環状形態であってもよい。例えば、修復鋳型は、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であってよい。
【０１２５】
外因性修復鋳型は、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座に組み込まれるＤＮＡのセグメントを含む核酸挿入物も含んでよい。Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座における核酸挿入物の組込みは、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座における目的の核酸配列の付加、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座における目的の核酸配列の欠失、またはＳｌｃ３０ａ８遺伝子座における目的の核酸配列の置き換え（すなわち、欠失および挿入）を結果としてもたらすことができる。
【０１２６】
外因性修復鋳型は、標的とされない内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座には存在しない異種配列も含んでよい。例えば、外因性修復鋳型は、リコンビナーゼ認識部位に挟まれた選択カセットなどの選択カセットを含んでよい。
【０１２７】
一部の外因性修復鋳型は、相同アームを含む。外因性修復鋳型が核酸挿入物も含む場合、相同アームは核酸挿入物を挟んでいてよい。参照しやすくするために、相同アームは、本明細書では５’および３’（すなわち、上流および下流の）相同アームと称される。この用語法は、外因性修復鋳型内での核酸挿入物に対する相同アームの相対的な位置に関する。５’および３’相同アームは、本明細書においてそれぞれ「５’標的配列」および「３’標的配列」と称されるＳｌｃ３０ａ８遺伝子座内の領域に対応する。
【０１２８】
相同アームと標的配列は、２つの領域が相同組換え反応の基質として作用するために十分なレベルの互いとの配列同一性を共有する場合、互いに「対応する（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄ）」または「対応している（ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ）」。「相同性」という用語は、対応する配列と同一であるかまたはそれと配列同一性を共有するＤＮＡ配列を含む。所与の標的配列と外因性修復鋳型内に見出される対応する相同アームの間の配列同一性は、相同組換えが起こることを可能にする任意の程度の配列同一性であってよい。例えば、外因性修復鋳型の相同アーム（またはその断片）と標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であってよい。さらに、相同アームと対応する標的配列の間の対応する相同性の領域は、相同組換えを促進するために十分な任意の長さのものであってよい。一部の標的化ベクターでは、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座における意図された変異を相同アームの一方に含める。他の標的化ベクターでは、Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座における意図された変異を、相同アームに挟まれた挿入核酸に含める。
【０１２９】
１細胞期胚以外の細胞では、外因性修復鋳型は、「大型標的化ベクター」または「ＬＴＶＥＣ」であってよく、これは、細胞における相同組換えを行うことが意図された他の手法によって一般に使用されるものよりも大きな核酸配列に対応し、それに由来する相同アームを含む標的化ベクターを含む。ＬＴＶＥＣは、細胞における相同組換えを行うことが意図された他の手法によって一般に使用されるものよりも大きな核酸配列を有する核酸挿入物を含む標的化ベクターも含み得る。例えば、ＬＴＶＥＣにより、従来のプラスミドに基づく標的化ベクターではそれらのサイズによる限定が原因で適応させることができない大きな遺伝子座の改変が可能になる。例えば、標的とする遺伝子座は、従来の方法を使用して標的とすることができないまたはヌクレアーゼ作用剤（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニックもしくは二本鎖切断の非存在下では不正確にしかもしくは顕著に低い効率でしか標的とすることができない、細胞の遺伝子座であり得る（すなわち、５’および３’相同アームがそれに対応し得る）。ＬＴＶＥＣは、任意の長さのものであってよく、一般には、少なくとも１０ｋｂの長さである。ＬＴＶＥＣ内の５’相同アームと３’相同アームの合計は、一般には少なくとも１０ｋｂである。
【０１３０】
スクリーニングステップは、例えば、親染色体の対立遺伝子（ＭＯＡ）の改変を評価するための定量的アッセイを含み得る。例えば、定量的アッセイをリアルタイムＰＣＲ（ｑＰＣＲ）などの定量的ＰＣＲによって行うことができる。リアルタイムＰＣＲには、標的遺伝子座を認識する第１のプライマーセットおよび標的としない参照遺伝子座を認識する第２のプライマーセットを利用することができる。プライマーセットは、増幅された配列を認識する蛍光プローブを含み得る。対立遺伝子喪失（ＬＯＡ）アッセイおよび対立遺伝子獲得（ＧＯＡ）アッセイを含めた対立遺伝子改変（ＭＯＡ）アッセイは、例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０１７８８７９およびFrendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476: 295-307に記載されている。そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０１４５６４６およびＷＯ２０１６／０８１９２３に記載されている保持アッセイも使用することができる。
【０１３１】
適切な定量的アッセイの他の例としては、蛍光媒介性ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、比較ゲノムハイブリダイゼーション、等温ＤＮＡ増幅、固定化されているプローブ（複数可）への定量的ハイブリダイゼーション、ＩＮＶＡＤＥＲ（登録商標）Ｐｒｏｂｅ、ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｅａｃｏｎプローブ、またはＥＣＬＩＰＳＥ（商標）プローブ技術が挙げられる（例えば、その全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００５／０１４４６５５を参照されたい）。
【０１３２】
適切な多能性細胞の例は、胚性幹（ＥＳ）細胞（例えば、マウスＥＳ細胞またはラットＥＳ細胞）である。改変された多能性細胞を、例えば、（ａ）細胞に、例えば５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームに挟まれた必要に応じた挿入核酸を含む１つまたは複数の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を導入するステップであって、挿入核酸または相同アームの一方が、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座またはＳｌｃ３０ａ８遺伝子座においてなされる変異を含む、ステップと、（ｂ）ゲノム内に内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座に組み込まれた挿入核酸を含む少なくとも１つの細胞を同定するステップとによる組換えによって生成することができる。改変された多能性細胞を、例えば、（ａ）細胞に、５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームに挟まれた挿入核酸を含む１つまたは複数の標的化ベクターを導入するステップであって、挿入核酸が、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座またはＳｌｃ３０ａ８遺伝子座においてなされる変異を含む、ステップと、（ｂ）ゲノム内に内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座に組み込まれた挿入核酸を含む少なくとも１つの細胞を同定するステップとによる組換えによって生成することができる。任意の標的化ベクターを使用することができる。一例では、大型標的化ベクター（ＬＴＶＥＣ）を使用する。ＬＴＶＥＣは、例えば、少なくとも１０ｋｂの長さであり得る、または５’相同アームおよび３’相同アームを有し得、それらの合計が少なくとも１０ｋｂの長さである。別の例として、標的化ベクターは、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）であり得る。ｓｓＯＤＮは、例えば、約８０〜約２００ヌクレオチドの長さであり得る。
【０１３３】
あるいは、改変された多能性細胞を、（ａ）細胞に、（ｉ）内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座内の認識部位におけるニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ作用剤；ならびに（ｉｉ）例えば、認識部位の十分な近傍に位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームに挟まれた挿入核酸を必要に応じて含む１つまたは複数の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）であって、挿入核酸または相同アームの一方が、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座またはＳｌｃ３０ａ８遺伝子座においてなされる変異を含む、１つまたは複数の外因性ドナー核酸（例えば、標的化ベクター）を導入するステップと、（ｃ）内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座に改変（例えば、挿入核酸の組込み）を含む少なくとも１つの細胞を同定するステップとによって生成することができる。あるいは、改変された多能性細胞を、（ａ）細胞に、（ｉ）内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座内の認識部位におけるニックまたは二本鎖切断を誘導するヌクレアーゼ作用剤；ならびに（ｉｉ）認識部位の十分な近傍に位置する５’および３’標的部位に対応する５’および３’相同アームに挟まれた挿入核酸を含む１つまたは複数の標的化ベクターであって、挿入核酸が、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座またはＳｌｃ３０ａ８遺伝子座においてなされる変異を含む、１つまたは複数の標的化ベクターを導入するステップと、（ｃ）内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座に改変（例えば、挿入核酸の組込み）を含む少なくとも１つの細胞を同定するステップとによって生成することができる。所望の認識部位へニックまたは二本鎖切断を誘導する任意のヌクレアーゼ作用剤を使用することができる。適切なヌクレアーゼの例としては、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、メガヌクレアーゼ、およびクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ  Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ  Ｓｈｏｒｔ  Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ  Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）／ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系）またはそのような系の構成成分（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が挙げられる。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１３／０３０９６７０およびＵＳ２０１５／０１５９１７５を参照されたい。細胞へ標的とする改変を行うための適切な方法の例は、例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１６／０１４５６４６およびＷＯ２０１６／０８１９２３に記載されている。
【０１３４】
ドナー細胞は、胚盤胞期または前桑実胚期（すなわち、４細胞期または８細胞期）などの任意の段階の宿主胚に導入することができる。生殖細胞系列を通じて遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，２９４，７５４号を参照されたい。
【０１３５】
あるいは、本明細書の他の箇所に記載の非ヒト動物を作出する方法は、（１）多能性細胞を改変するために、上記の方法を使用して１細胞期胚のゲノムを変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含むように改変するステップと、（２）遺伝子改変された胚を選択するステップと、（３）遺伝子改変された胚を代理母に移植し、妊娠させるステップとを含み得る。あるいは、本明細書の他の箇所に記載の非ヒト動物を作出する方法は、（１）多能性細胞を改変するために、上記の方法を使用して１細胞期胚のゲノムを変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含むように改変するステップと、（２）遺伝子改変された胚を選択するステップと、（３）代理母の遺伝子改変された胚を妊娠させるステップとを含み得る。生殖細胞系列を通じて遺伝子改変を伝達することができる子孫が生成される。
【０１３６】
核移植技法を使用して非ヒト動物を生成することもできる。簡単に述べると、核移植のための方法は、（１）卵母細胞を除核するまたは除核された卵母細胞を提供するステップと、（２）除核された卵母細胞と組み合わせるドナー細胞または核を単離または提供するステップと、（３）細胞または核を除核された卵母細胞に挿入して、再構成された細胞を形成するステップと、（４）再構成された細胞を動物の子宮内に移植して、胚を形成するステップと、（５）胚を発生させるステップとを含み得る。そのような方法では、卵母細胞は、一般に、死亡した動物から回収されるが、生きている動物の卵管および／または卵巣のいずれかからも単離することができる。卵母細胞を除核前に様々な周知の培地で成熟させることができる。卵母細胞の除核は、いくつかの周知の様式で実施することができる。再構成された細胞を形成するための除核された卵母細胞へのドナー細胞または核の挿入は、融合前に透明帯の下にドナー細胞を微量注射することによるものであってよい。融合は、接触／融合平面にわたるＤＣ電気パルスの適用によって（電気融合）、細胞のポリエチレングリコールなどの融合促進性化学物質への曝露によって、またはセンダイウイルスなどの不活化ウイルスによって誘導することができる。再構成された細胞を、核ドナーとレシピエント卵母細胞の融合前、その間、および／またはその後に、電気的および／または非電気的手段によって活性化することができる。活性化方法としては、電気パルス、化学的に誘導されるショック、精子による透過、卵母細胞における二価カチオンのレベルを増大させること、および卵母細胞における細胞タンパク質のリン酸化を低減すること（キナーゼ阻害剤によるものなど）が挙げられる。活性化され再構成された細胞、または胚を周知の培地中で培養し、次いで、動物の子宮内に移植することができる。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００８／００９２２４９、ＷＯ１９９９／００５２６６、ＵＳ２００４／０１７７３９０、ＷＯ２００８／０１７２３４、および米国特許第７，６１２，２５０号を参照されたい。
【０１３７】
本明細書で提供される様々な方法により、その細胞が、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む、遺伝子改変された非ヒトＦ０動物の生成が可能になる。Ｆ０動物を生成するために使用される方法に応じて、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有するＦ０動物内の細胞の数は変動する。ドナーＥＳ細胞の、対応する生物体に由来する前桑実胚期胚（例えば、８細胞期マウス胚）への、例えばＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法による導入により、Ｆ０動物のより大きなパーセンテージの細胞集団に、標的とする遺伝子改変を含む目的のヌクレオチド配列を有する細胞を含めることが可能になる。例えば、非ヒトＦ０動物の細胞寄与の少なくとも５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８５％、８６％、８７％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％が、標的とする改変を有する細胞集団を含み得る。
【０１３８】
遺伝子改変されたＦ０動物の細胞は、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座についてヘテロ接合性の場合もあり、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座についてホモ接合性の場合もある。
【０１３９】
ＩＶ．化合物をスクリーニングする方法
化合物を、２型糖尿病を阻害する、好転させる、もしくは軽減する、もしくは２型糖尿病様症状を好転させるのに潜在的に有用な活性についてスクリーニングするため、または化合物を、２型糖尿病もしくは２型糖尿病様症状を促進するもしくは増悪させるのに潜在的に有害な活性についてスクリーニングするために、本明細書に記載の変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有する非ヒト動物を使用することができる。本明細書に記載の保護的な変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座に関連する表現型の態様をモニタリングすることにより、化合物を、２型糖尿病を阻害する、好転させる、もしくは軽減するのに、もしくは２型糖尿病様症状を好転させるのに潜在的に有用な活性についてスクリーニングするため、または化合物を、２型糖尿病もしくは２型糖尿病様症状を促進するもしくは増悪させるのに潜在的に有害な活性についてスクリーニングするために、本明細書に記載の変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を有さない野生型非ヒト動物または非ヒト動物を使用することもできる。２型糖尿病を阻害する、好転させる、もしくは軽減する、または２型糖尿病様症状を好転させる活性を有する化合物は、２型糖尿病に対する治療薬または予防薬として潜在的に有用である。２型糖尿病または２型糖尿病様症状を促進するまたは増悪させる活性を有する化合物は、毒性であると識別され、治療薬としてまたはヒトと接触する恐れのある他の状況（例えば、食品、農業、建設、または水供給）において回避されるべきである。
【０１４０】
スクリーニングすることができる化合物の例としては、抗体、抗原結合性タンパク質、部位特異的ＤＮＡ結合性タンパク質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体）、ポリペプチド、ベータ−ターン模倣体、多糖、リン脂質、ホルモン、プロスタグランジン、ステロイド、芳香族化合物、複素環化合物、ベンゾジアゼピン、オリゴマーＮ置換グリシン、およびオリゴカルバメートが挙げられる。そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＷＯ１９９５／０１２６０８、ＷＯ１９９３／００６１２１、ＷＯ１９９４／００８０５１、ＷＯ１９９５／０３５５０３、およびＷＯ１９９５／０３０６４２に記載されているコードされた合成ライブラリー（ＥＳＬ）法により、化合物の大きなコンビナトリアルライブラリーを構築することができる。ペプチドライブラリーは、ファージディスプレイ法によって生成することもできる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ５，４３２，０１８を参照されたい。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を異なる遺伝子に標的化するためのガイドＲＮＡのライブラリーの使用が、例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１４／２０４７２７、ＷＯ２０１４／０９３７０１、ＷＯ２０１５／０６５９６４、およびＷＯ２０１６／０１１０８０に開示されている。
【０１４１】
動物に基づくアッセイは、一般に、変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含む非ヒト動物に化合物を投与し、２型糖尿病のものと酷似した徴候もしくは症状、２型糖尿病に関連する徴候もしくは症状、またはヒトにおけるグルコース、インスリン、グルコース代謝、もしくは２型糖尿病に関連する表現型の態様の応答の変化について評価することを伴う。変化は、非ヒト動物を化合物と接触させる前後で、または同じＳｌｃ３０ａ８変異を有する対照動物（例えば、野生型コホート同胞）を用い、化合物を用いずに実施される対照実験を実施することによって評価することができる。
【０１４２】
モニタリングすることができる適切な表現型の態様としては、例えば、インスリンを分泌する能力が挙げられる。例えば、高脂肪食を摂食させた場合のインスリンを分泌する能力をモニタリングすることができる。あるいは、重篤な高血糖などの高血糖に応答してインスリンを分泌する能力をモニタリングすることができる。例えば、インスリン分泌は、インスリン受容体アンタゴニストＳ９６１によって引き起こされる高血糖などの、インスリン受容体の阻害によって誘導される高血糖に応答したものであり得る。
【０１４３】
モニタリングすることができる他の適切な表現型の態様としては、ミトコンドリア遺伝子発現（例えば、ミトコンドリア酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）系の遺伝子の発現）またはＨｖｃｎ１の発現が挙げられる。そのようなミトコンドリア遺伝子の例は、実施例２および表６〜８においてより詳細に記載されている。モニタリングすることができる他の適切な表現型の態様としては、対照固形飼料食を摂食させた場合のインスリン／Ｃペプチド比またはインスリンクリアランスが挙げられる。モニタリングすることができる他の適切な表現型の態様としては、島亜鉛蓄積が挙げられる。
【０１４４】
モニタリングすることができる他の適切な表現型の態様としては、例えば、（１）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌（例えば、高脂肪食を２０週間摂食させた後の循環インスリンレベル）；（２）高脂肪食を摂食させた場合（例えば、高脂肪食を２０週間摂食させた後）の膵ベータ細胞増殖レベル；（３）高脂肪食を摂食させた場合（例えば、高脂肪食を２０週間摂食させた後）の膵ベータ細胞の数；および（４）インスリン受容体の遮断（例えば、Ｓ９６１を使用した）後の摂食下血漿インスリンレベルが挙げられる。その代わりにまたはそれに加えて、モニタリングすることができる適切な表現型の態様としては、例えば、高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比、または膵ベータ細胞のインスリンプロセシングおよび健康が挙げられる。
【０１４５】
例えば、２型糖尿病を増悪させる活性は、（１）（例えば、高脂肪食を摂食させた場合の、または高血糖に応答した）インスリンを分泌する能力の低減または（２）インスリンクリアランスの低下（例えば、対照固形飼料食を摂食させた場合のインスリン／Ｃペプチド比の増大）のうちの一方または両方によって同定することができる。２型糖尿病を増悪させる活性は、（１）ミトコンドリア遺伝子発現の増大（例えば、ミトコンドリア酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）系の遺伝子の発現）または（２）Ｈｖｃｎ１の発現の低減のうちの一方または両方によって同定することもできる。
【０１４６】
２型糖尿病を増悪させる活性は、（１）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の低減（例えば、高脂肪食を２０週間摂食させた後の循環インスリンレベルの低減）；（２）高脂肪食を摂食させた場合（例えば、高脂肪食を２０週間摂食させた後）の膵ベータ細胞増殖の低減；（３）高脂肪食を摂食させた場合（例えば、高脂肪食を２０週間摂食させた後）の膵ベータ細胞の数の低減；および（４）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの低減のうちの１つまたは複数または全てによって同定することもできる。その代わりにまたはそれに加えて、２型糖尿病を増悪させる活性は、プロインスリン対インスリン比の増大ならびに膵ベータ細胞のインスリンプロセシングおよび健康の悪化（例えば、高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の増大によって証明される）のうちの１つまたは複数または全てによって同定することができる。
【０１４７】
あるいは、２型糖尿病を好転させる活性は、（１）インスリンを分泌する能力の増大（例えば、高脂肪食を摂食させた場合の、または高血糖に応答して）または（２）インスリンクリアランスの増大（例えば、対照固形飼料食を摂食させた場合のインスリン／Ｃペプチド比の増大）のうちの一方または両方によって同定することができる。２型糖尿病を増悪させる活性は、（１）ミトコンドリア遺伝子発現（例えば、ミトコンドリア酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）系の遺伝子の発現）の低減または（２）Ｈｖｃｎ１の発現の増大のうちの一方または両方によって同定することもできる。
【０１４８】
２型糖尿病を好転させる活性は、（１）高脂肪食を摂食させた場合のグルコース誘導性インスリン分泌の増大（例えば、高脂肪食を２０週間摂食させた後の循環インスリンレベルの増大）；（２）高脂肪食を摂食させた場合（例えば、高脂肪食を２０週間摂食させた後）の膵ベータ細胞増殖の増大；（３）高脂肪食を摂食させた場合（例えば、高脂肪食を２０週間摂食させた後）の膵ベータ細胞の数の増大；および（４）インスリン受容体の遮断後の摂食下血漿インスリンレベルの増大のうちの１つまたは複数または全てによって同定することもできる。その代わりにまたはそれに加えて、２型糖尿病を好転させる活性は、プロインスリン対インスリン比の低減ならびに膵ベータ細胞のインスリンプロセシングおよび健康の改善（例えば、高脂肪食を摂食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低減によって証明される）のうちの１つまたは複数または全てによって同定することができる。
【０１４９】
そのような表現型の態様は、本明細書で提供される実施例に記載の通りアッセイすることができる。低減または増大は、統計的に有意であり得る。例えば、低減または増大は、少なくとも約１％、少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または１００％であり得る。
【０１５０】
上または下で引用されている全ての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、受託番号などは、あたかも各個別の項目が参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されているのと同じ程度に、あらゆる目的に関してその全体が参照により組み込まれる。異なるバージョンの配列が異なる時期に受託番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日に受託番号に関連付けられたバージョンが意味を持つ。有効な出願日とは、実際の出願日よりも前または該当する場合受託番号を参照している優先出願の出願日を意味する。同様に、異なるバージョンの刊行物、ウェブサイトなどが異なる時期に公開されている場合、別段の指定のない限り、出願の有効な出願日時点の直近に公開されたバージョンが意味を持つ。特に他の指示がなければ、本発明の任意の特色、ステップ、要素、実施形態、または態様を任意の他のものと組み合わせて使用することができる。明瞭さおよび理解のために本発明を一部の詳細な実例および例として記載してきたが、ある特定の変化および改変を添付の特許請求の範囲の範囲内で行うことができることが明らかになろう。
【０１５１】
配列の簡単な説明
添付の配列表に列挙されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基については標準の文字略語、およびアミノ酸については３文字コードを使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まり、３’末端まで前方に（すなわち、各線の左から右に）進行する標準の慣習に従う。各ヌクレオチド配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖への任意の言及によって含まれることが理解される。アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列が提供される場合、同じアミノ酸配列をコードするそのコドン縮重バリアントも提供されることが理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まり、カルボキシ末端まで前方に（すなわち、各線の左から右に）進行する標準の慣習に従う。
【０１５２】
【表２】
2021502089.tif 000004
【実施例】
【０１５３】
（実施例１  変異したＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を含むマウスの生成）
推定ヒトＳＬＣ３０Ａ８  ＬＯＦ対立遺伝子（ｃ．４１２Ｃ＞Ｔ（転写物受託番号ＮＭ＿１７３８５１．２）、ｐ．Ａｒｇ１３８Ｘ）に対応する対立遺伝子を有するマウスモデルを生成するために、変異したマウスＳｌｃ３０ａ８対立遺伝子を生成した（ｃ．４０９Ｃ＞Ｔ（転写物受託番号ＮＭ＿１７２８１６．３）、ｐ．Ａｒｇ１３７Ｘ）。マウスＳｌｃ３０ａ８遺伝子およびヒトＳＬＣ３０Ａ８遺伝子に関する情報を表３に提示する。ヒトＳＬＣ３０Ａ８とマウスＳＬＣ３０Ａ８タンパク質のアラインメントを図１１に示す。変異した対立遺伝子は、エクソン３内のＲ１３７をコードするマウスＳｌｃ３０ａ８コドンにおけるｄＣのｄＴによる置き換え（ｃ．４０９Ｃ＞Ｔ）を有し、コドンをＣＧＡからＴＧＡに変化させ（ｐ．Ａｒｇ１３７Ｘ）、短縮されたタンパク質を産生することが予測される停止コドンを作製する。変異した対立遺伝子は、イントロン３に挿入された、ｌｏｘＰ部位に挟まれた自己欠失性ネオマイシン選択カセットも有し（ｌｏｘＰ−ｍＰｒｍ１−Ｃｒｅｉ−ｈＵｂ１−ｅｍ７−Ｎｅｏ−ｐＡ−ｌｏｘＰカセット（４，８１０ｂｐ））、内因性イントロン３配列の２９ｂｐを欠失させる。内因性Ｓｌｃ３０ａ８遺伝子座を図１０Ａに示し、標的とするＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を図１０Ｂに示す。Ｓｌｃ３０ａ８イントロン２／Ｓｌｃ３０ａ８エクソン３  ｐＡｒｇ１３７＊／Ｓｌｃ３０ａ８イントロン３の境界を含む領域（図１０Ｂにおいて横線「Ａ」により示されている）の予測される配列は配列番号８に記載されている。Ｓｌｃ３０ａ８イントロン３／ＸｈｏＩ／（ｌｏｘＰ）自己欠失性カセットの境界を含む領域（図１０Ｂにおいて横線「Ｂ」により示されている）の予測される配列は配列番号９に記載されている。自己欠失性カセット（ｌｏｘＰ）／ＩＣＥＵＩ／ＮｈｅＩ／Ｓｌｃ３０ａ８イントロン３の境界を含む領域（図１０Ｂにおいて横線「Ｃ」により示されている）の予測される配列は配列番号１０に記載されている。
【０１５４】
【表３】
2021502089.tif 000005
【０１５５】
自己欠失性ｌｏｘＰ−ｍＰｒｍ１−Ｃｒｅｉ−ｈＵｂ１−ｅｍ７−Ｎｅｏ−ｐＡ  −ｌｏｘＰカセットを欠失させた後の標的とするＳｌｃ３０ａ８遺伝子座を図１０Ｃに示す。カセット欠失後、ｌｏｘＰおよびクローニング部位（７７ｂｐ）はＳｌｃ３０ａ８イントロン３内に残る。Ｓｌｃ３０ａ８イントロン２／Ｓｌｃ３０ａ８エクソン３  ｐＡｒｇ１３７＊／Ｓｌｃ３０ａ８イントロン３の境界を含む領域（図１０Ｃにおいて横線「Ａ」により示されている）の予測される配列は配列番号８に記載されている。Ｓｌｃ３０ａ８イントロン３／ＸｈｏＩ／ｌｏｘＰ／ＩＣＥＵＩ／ＮｈｅＩ／Ｓｌｃ３０ａ８イントロン３の境界を含む領域（図１０Ｃにおいて横線「Ｂ」により示されている）の予測される配列は配列番号１１に記載されている。
【０１５６】
欠失の標的とされるＳｌｃ３０ａ８内の領域から上流の６２ｋｂの配列（しかしＲ１３７をコードするマウスＳｌｃ３０ａ８コドンに点変異を有する）および欠失の標的とされるＳｌｃ３０ａ８内の領域の下流の１３６ｋｂの配列を含む５’相同アームを含む大型標的化ベクターを生成した。大型標的化ベクターは、Ｒ１３７をコードするエクソン３内のマウスＳｌｃ３０ａ８コドンに点変異を導入するように、かつイントロン３内の２９ｂｐの領域を４，８１０ｂｐの自己欠失性ネオマイシン選択カセットで置き換えるように設計した。図１０Ｂを参照されたい。自己欠失性ネオマイシン選択カセットは、５’から３’まで以下の構成成分を含んだ：ｌｏｘＰ部位、マウスプロタミン（Ｐｒｍ１）プロモーター、Ｃｒｅｉ（イントロンを含むように最適化されたＣｒｅコード配列）、ヒトユビキチンプロモーター、ＥＭ７プロモーター、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏｒ）コード配列、ポリＡ、およびｌｏｘＰ部位。標的とする対立遺伝子を生成するために、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９構成成分をＦ１Ｈ４マウス胚性幹細胞に大型標的化ベクターと共に導入した。表４に記載されているプライマーおよびプローブを使用した対立遺伝子喪失アッセイおよび対立遺伝子特異的ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）アッセイを実施して、Ｓｌｃ３０ａ８対立遺伝子の正確な改変を確認した。図１０Ａにおいて対立遺伝子喪失アッセイは「８０８４ＴＤ」（ＴＡＱＭＡＮ（登録商標）Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ａｓｓａｙ）と示され、対立遺伝子特異的アッセイは「８０８４ＡＳ」（対立遺伝子特異的アッセイ）と示されている。そのようなアッセイは、例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０１７８８７９；ＵＳ２０１６／０１４５６４６；ＷＯ２０１６／０８１９２３；およびFrendewey et al. (2010) Methods Enzymol. 476: 295-307に記載されている。
【０１５７】
【表４】
2021502089.tif 000006
【０１５８】
次いで、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法を使用して標的とするＥＳ細胞クローンからＦ０マウスを生成した。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７，５７６，２５９；ＵＳ７，６５９，４４２；ＵＳ７，２９４，７５４；ＵＳ２００８／００７８００；およびPoueymirou et al. (2007) Nature Biotech. 25 (1): 91-99を参照されたい。
【０１５９】
野生型マウス遺伝子座から発現される予測されるＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の配列は配列番号１２に記載されている。標的とするマウス遺伝子座（ＳＬＣ３０Ａ８  Ａｒｇ１３７＊）から発現される予測される短縮されたＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の配列は配列番号１３に記載されている。２つの配列のアラインメントは図１１に示されている。
【０１６０】
（実施例２  ＳＬＣ３０Ａ８  Ｒ１３８Ｘマウスの特徴付け）
概要
ＳＬＣ３０Ａ８は、主に膵臓のランゲルハンス島において発現される亜鉛輸送体をコードする。ベータ細胞において、ＳＬＣ３０Ａ８は亜鉛をインスリン含有分泌顆粒に輸送する。ＳＬＣ３０Ａ８において機能喪失型（ＬＯＦ）変異は、ヒトにおいて２型糖尿病から保護する。いくつかのＳｌｃ３０ａ８ノックアウトマウス系統が特徴付けられているが、ヒト表現型を十分に再現するものではない。実際に、Ｓｌｃ３０ａ８欠損マウスは血漿インスリンレベルの低下および耐糖能障害を有し、これは、本発明者らがここで対照Ｓｌｃ３０ａ８欠損マウスで再現した表現型である。本発明者らは、ヒトＳＬＣ３０Ａ８推定ＬＯＦ変異、Ｒ１３８Ｘに対応するマウスＳｌｃ３０ａ８遺伝子座における変異（ｃ．４０９Ｃ＞Ｔ（転写物受託番号ＮＭ＿１７２８１６．３）、ｐ．Ａｒｇ１３７Ｘ）を有するノックインマウスモデルを生成した。マウスＳｌｃ３０ａ８遺伝子における変異は、マウスＳＬＣ３０Ａ８タンパク質のアミノ酸残基１３７をコードするコドンにおいてであるが、これらのマウスは、本明細書では、対応するヒト変異に関して「Ｒ１３８Ｘマウス」と称される。興味深いことに、Ｒ１３８Ｘマウスは、高脂肪食を摂食させた場合、グルコース誘導性インスリン分泌の増大を有した。これは、ベータ細胞増殖の増大およびベータ細胞面積の拡大に関連していた。重要なことに、ヘテロ接合性Ｒ１３８Ｘマウスでは、グルコース誘導性インスリン分泌に同様の増大が示された。対照的に、固形飼料を摂食させたＲ１３８Ｘマウスは、正常な体重、耐糖能、および膵臓ベータ細胞質量を有した。興味深いことに、インスリン受容体アンタゴニストＳ９６１によって誘導される高血糖条件では、Ｒ１３８Ｘマウスはインスリン分泌の約５０％の増大を示した。この効果は、ベータ細胞増殖またはベータ細胞質量の増強に関連していなかった。これらのデータから、ヒトにおけるＳＬＣ３０Ａ８  Ｒ１３８Ｘ変異が、一部においてベータ細胞のインスリンを分泌する能力を増大させることによって２型糖尿病から保護することが示唆される。これは、一部において膵ベータ細胞の数の増大によって媒介され得る。
【０１６１】
緒言
ＳＬＣ３０Ａ８は、膵内分泌部の島細胞内に位置する亜鉛輸送体（ＺｎＴ８）である。ベータ細胞において、ＳＬＣ３０Ａ８が亜鉛をインスリン含有顆粒に輸送する。２つの亜鉛イオンが六量体形態のインスリンと結合し、それを安定化し、インスリン結晶化を誘発する。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるDodson and Steiner (1998) Curr. Opin. Struct. Biol. 8 (2): 189-194を参照されたい。島ＳＬＣ３０Ａ８の喪失により、島亜鉛含有量およびインスリン結晶化が実質的に低減するが、プロインスリンプロセシング、分泌およびグルコース代謝の制御に対するその効果は依然として不明である。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるLemaireet al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (35): 14872-14877およびNicolson etal. (2009) Diabetes 58 (9): 2070-2083を参照されたい。いくつかのグループが、包括的にまたは膵ベータ細胞に制限してＳｌｃ３０ａ８ノックアウト（ＫＯ）マウスモデルを生成している。これらのモデルの観察される代謝表現型は、弱く、研究間で差異があるが、モデルの大部分で、血漿インスリンレベルの低下または変化なしに関連する耐糖能の変化がないか、または軽度の機能障害が示される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるRutteret al. (2016) Proc. Nutr. Soc. 75 (1): 61-72を参照されたい。最も重要なことに、いずれの研究でもＳｌｃ３０ａ８欠損に関連する有益な効果は報告されていない。したがって、Flannickおよび共同研究者により、ＳＬＣ３０Ａ８のハプロ不全がヒトにおける２型糖尿病（Ｔ２Ｄ）の発生に対して保護的であることが報告された時には驚かされた。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFlannicket al. (2014) Nat. Genet. 46 (4): 357-363を参照されたい。彼らの研究により、Ｔ２Ｄのリスクを６５％集合的に低減する１２種の推定機能喪失型（ＬＯＦ）バリアントが同定された。最も豊富なバリアントのうちの１つである、中途停止コドンを引き起こすｐ．Ａｒｇ１３８＊（本明細書ではＲ１３８Ｘと称される）は、Ｔ２Ｄからの保護に個別に関連付けられ、不安定なＺｎＴ８タンパク質をコードすることが報告された。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFlannicket al. (2014) Nat. Genet. 46 (4): 357-363を参照されたい。したがって、マウスとヒトのデータは、表面上は互いに矛盾し、稀な推定ＬＯＦバリアントによりどのようにＴ２Ｄのリスクが低減するかは現在のところ明らかでない。
【０１６２】
ヒトＳＬＣ３０Ａ８推定ＬＯＦバリアントとＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスモデルの効果の間のこの矛盾点を調査する、ならびに何故ＳＬＣ３０Ａ８推定ＬＯＦバリアントがヒトにおいて保護的であるのかに関しての洞察を得るために、本発明者らは、代表的なヒト推定ＬＯＦバリアントとしてＲ１３８Ｘ変異を有する新しいＳｌｃ３０ａ８マウスモデルを生成し、表現型決定した。興味深いことに、本発明者らは、Ｒ１３８Ｘマウスにおけるベータ細胞が重篤な高血糖に応答して極端なインスリンを分泌する能力を有することを見出した。
【０１６３】
結果
Ｒ１３８Ｘ島は、ナンセンス媒介性崩壊からのＲ１３８Ｘ転写物の部分的保護にもかかわらずＳＬＣ３０Ａ８機能の喪失を示すと思われる。ヒトＳＬＣ３０Ａ８推定ＬＯＦバリアントがＴ２Ｄのリスクにどのように影響を及ぼすかを調査するために、本発明者らは、実施例１において詳述されている通り、アミノ酸残基１３７をコードするマウスゲノム内のＳｌｃ３０ａ８のコドン（コドン１３７、ヒトにおけるコドン１３８と同等である）をＣＧＡからＴＧＡに変更し、アルギニンを停止コドン（Ｒ１３８Ｘ）に変化させた。Ｒ１３８Ｘマウスは、予測されるメンデル比で生まれており、明白な成長異常はなかった。ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、野生型（ＷＴ）マウス由来の膵島では強力なＳｌｃ３０ａ８  ｍＲＮＡ染色が示されたが、ホモ接合性Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウス由来の島において染色は示されず、プローブの特異性が検証された（図１Ａ）。Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウス由来の島とは対照的に、Ｒ１３８Ｘマウス由来の島では実質的な量のＳｌｃ３０ａ８  ＲＮＡ染色が示された（図１Ａ）。リアルタイムＰＣＲを使用したＳｌｃ３０ａ８  ｍＲＮＡの定量化により、Ｒ１３８Ｘ島における７０％の低下が明らかになったが、Ｒ１３８Ｘ島における絶対的なＳｌｃ３０ａ８転写レベル（ＣＴ値：２２．２）は依然として高く、ハウスキーピング遺伝子であるＧａｐｄｈの発現レベル（ＣＴ値：２２．１）と同等であった（図１Ｂ）。Ｒ１３８Ｘマウスにおけるこの高レベルのＳｌｃ３０ａ８  ＲＮＡの存在により、中途翻訳終止コドンを有するｍＲＮＡを分解するプロセスであるナンセンス媒介性ｍＲＮＡ崩壊ではＲ１３８Ｘ転写物を有効に分解することができないことが示唆される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるHolbrook et al. (2004) Nat. Genet. 36 (8): 801-808を参照されたい。
【０１６４】
Ｒ１３８Ｘマウスにおいて検出されたＲＮＡが短縮されたタンパク質に翻訳されるかどうかを決定するために、本発明者らは、マウスタンパク質のＮ末端ペプチドに対して生じた抗体を使用してＳＬＣ３０Ａ８タンパク質についてのウエスタン（イムノ）ブロッティングを実施した。現条件下で単離された島由来の溶解物では短縮されたタンパク質を予測される分子量（単量体で約１６ｋＤａ）で同定することはできなかった（図１Ｃ）が、それにもかかわらず、Ｒ１３８Ｘタンパク質を検出し、そしてＨＥＫ２９３細胞において過剰発現された場合、プロテアソーム阻害によってそれを安定化することができた（図５）。同様に、ＷＴおよびＲ１３８Ｘ島由来の全細胞溶解物または免疫沈降物の質量分析により、Ｒ１３８Ｘ島においてＳＬＣ３０Ａ８ペプチドは同定されなかった（データは示していない）。さらに、ジチゾンを使用した亜鉛染色により、ＫＯおよびＲ１３８Ｘマウス由来の島では亜鉛が枯渇していることが明らかになり、これにより、どちらのマウス系統においても機能的なＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の非存在が実証される（図１Ｄ）。しかし、循環亜鉛レベルに顕著な変化は観察されなかった（図１７）。要約すると、ヒトＲ１３８Ｘ推定ＬＯＦバリアントのマウスＳｌｃ３０ａ８遺伝子への導入により、ＳＬＣ３０Ａ８機能の喪失が結果としてもたらされると思われる。
【０１６５】
固形飼料食下のＲ１３８Ｘマウスは正常な代謝表現型を有する。本発明者らは、まず、Ｒ１３８Ｘ停止コドンの導入により固形飼料を摂食させたマウスにおける代謝パラメーターが変更されるかどうかを調査した。ＷＴマウスとＲ１３８Ｘマウスは体重ならびに循環血中グルコースおよびインスリンレベルは異ならなかった（図２Ａ〜２Ｃ、２Ｌ；表５）。亜鉛はインスリンプロセシングおよびクリアランスに関係付けられているので、本発明者らは、循環プロインスリンおよびＣペプチドレベルも測定し、これらのホルモンのインスリンに対する比を算出した（図２Ｃ〜２Ｆ）。循環Ｃペプチドに差異はなかったが、絶食下プロインスリンレベルはＲ１３８Ｘマウスではわずかに低下した（図２Ｃ）。プロインスリンのインスリンに対する比はＷＴマウスとＲ１３８Ｘマウスの間で異ならなかったが、摂食状態でのＣペプチドのインスリンに対する比はわずかに上昇し、これにより、インスリンクリアランスの低下が示唆される（図２Ｅ〜２Ｆ）。循環プロインスリンおよびＣペプチドレベルはＷＴマウスとＲ１３８Ｘマウスの間で同様であった（図２Ｃ〜２Ｄ）。プロインスリン／Ｃペプチド比は変化しなかったが、インスリン／Ｃペプチド比の軽度の低減が観察され、これにより、Ｒ１３８Ｘマウスにおける、Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおいて観察されたものと同様に、より高いインスリンクリアランスが示唆される（図２Ｐ）。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるTamaki et al. (2013) J. Clin. Invest. 123 (10): 4513-4524を参照されたい。耐糖能の低下はＲ１３８Ｘマウスにおいては明白ではなく、グルコース誘導性インスリン分泌の変化は観察されなかった（図２Ｇ〜２Ｈ）。耐糖能およびインスリン感受性はＲ１３８Ｘマウスと対照マウスとで同様であり、グルコース誘導性インスリン分泌の変化は観察されなかった（図２Ｇ、２Ｈ、および２Ｍ）。さらに、インスリンおよびグルカゴン染色が変更されなかったので、島亜鉛の非存在は島の形態には影響を及ぼさなかった（図２Ｉ〜２Ｋ；図６Ａ〜６Ｂ）。さらに、ベータ細胞およびアルファ細胞質量が変更されなかったので、島亜鉛の非存在は島の形態に影響を及ぼさなかった（図２Ｉ、２Ｎ、６Ａ、および６Ｅ）。総合すると、これらのデータから、固形飼料を摂食させたマウスではＲ１３８Ｘバリアントはグルコース恒常性またはグルコース誘導性インスリン分泌に影響を及ぼさないことが示される。
【０１６６】
【表５】
2021502089.tif 000007
【０１６７】
【表６】
2021502089.tif 000008
【０１６８】
本発明者らは、Ｓｌｃ３０ａ８開始コドンからＳｌｃ３０ａ８停止コドンまでのコード配列（すなわち、コード配列全体）が欠失したＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスも生成した。次いで、固形飼料食下のＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスを表現型決定した（図７Ａ〜７Ｋ）。公開された結果と一致して、Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスでは軽度の耐糖能障害およびグルコース誘導性血漿インスリンレベルの低下が示された（図７Ｂ、７Ｇ、７Ｈ）。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるLemaire et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (35):14872-14877；Nicolson et al. (2009) Diabetes 58 (9): 2070-2083；およびRutter et al.(2016) Proc. Nutr. Soc. 75 (1): 61-72を参照されたい。さらに、Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスではＣペプチドのインスリンに対する比がより高く、これは、最近の報告と同様にインスリンクリアランスの増大を示唆し、おそらくＳｌｃ３０ａ８  ＫＯ島からの亜鉛分泌が損なわれたことを反映している。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるTamakiet al. (2013) J. Clin. Invest. 123 (10): 4513-4524およびMitchell et al. (2016)Mol. Endocrinol. 30 (1): 77-91を参照されたい。
【０１６９】
総合すると、これらのデータから、通常の固形飼料食で維持されたマウスでは、Ｒ１３８Ｘ推定ＬＯＦバリアントの導入は、プロインスリンプロセシングに対して軽微な効果を有し、グルコース恒常性もグルコース誘導性インスリン分泌も変更しないことが示される。したがって、このＲ１３８Ｘ表現型は、通常の固形飼料食で維持した場合、耐糖能障害およびグルコース誘導性血漿インスリンレベルの低下を有するＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおいて観察されるものとは異なる。
【０１７０】
高脂肪食下のＲ１３８Ｘマウスはインスリン分泌およびベータ細胞数の増大を有する。ヒトＲ１３８Ｘの保有者はＴ２Ｄの発生から保護されるので、本発明者らは、マウスを高脂肪食（ＨＦＤ）でチャレンジした。体重および摂食下のグルコースレベルはＷＴマウスとＲ１３８Ｘマウスの間で異ならなかった（表５、図３Ａ）。しかし、２０週間のＨＦＤの後、摂食下のＲ１３８ＸマウスにおいてＷＴマウスと比較してより高い循環インスリンレベルが観察された（図３Ｂ）。循環Ｃペプチドレベルはインスリンレベルを模倣したが、絶食下プロインスリンレベルはＲ１３８Ｘマウスにおいてより低く、プロインスリン対インスリン比の低減が結果としてもたらされた（図３Ｃ〜３Ｆ）。Ｒ１３８Ｘマウスでは、摂食下のインスリンの増大にもかかわらず、耐糖能は顕著には改善されなかった（図３Ｇ）。インスリン分泌をより詳細に調べるために、本発明者らは、経口グルコース負荷試験（ｏＧＴＴ）後の循環インスリンを測定した。Ｒ１３８Ｘマウスでは、経口グルコースボーラスにより、ＷＴマウスと比較した場合、１５分時点で循環インスリンの量が倍増した（図３Ｈ）。著しく、これは、インスリン産生ベータ細胞の数の増大に関連した（図３Ｉ）。インスリン染色の定量化により、インスリン陽性面積、ならびに島の数の倍増が示された（図３Ｊ〜３Ｋ）。対照的に、グルカゴン染色を使用したアルファ細胞の数に変化は検出されなかった（図６Ｃ〜６Ｄ）。Ｋｉ６７染色により、ベータ細胞面積の増大がベータ細胞増殖の増強に続発することが示唆された。インスリンおよびＫｉ６７  二重陽性細胞の数はＲ１３８Ｘマウスの膵臓においてＷＴマウスと比較して２倍に増大した。明白さは劣るが同様の代謝表現型が雌Ｒ１３８Ｘマウスにおいて観察された（図８Ａ〜８Ｋ）。２０週間を超えるＨＦＤの後、雌Ｒ１３８Ｘマウスでは、絶食させた場合のプロインスリン対インスリン比の低下、およびより高い数の島に関連した循環インスリンレベルの増大が示された（図８Ｂ〜８Ｋ）。
【０１７１】
Ｒ１３８Ｘバリアントの保護的表現型はヘテロ接合性保有者において観察されたので、本発明者らは、ＨＦＤ下のヘテロ接合性Ｒ１３８Ｘマウスも解析した（図９Ａ〜９Ｍ）。ウエスタンブロット解析により、ヘテロ接合性Ｒ１３８Ｘマウス由来の島においてＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の強力な低下が示されたが（図９Ａ）、島亜鉛レベルはジチゾン染色によって調べたところＷＴマウスと同等であった（図９Ｂ）。表現型はホモ接合性Ｒ１３８Ｘマウスと比較してより穏やかであったが、ヘテロ接合性Ｒ１３８Ｘマウスでは、２０週間を超えるＨＦＤの後、ベータ細胞面積の拡大に関連するグルコース誘導性インスリン分泌の増大（図９Ｊ）が示された（図９Ｋ〜９Ｍ）。総合すると、これらのデータから、ヒトＲ１３８Ｘ変異を有するＨＦＤマウスはインスリンを分泌するより大きな能力を有し、これは、ベータ細胞の数の増大に一部起因することが示唆される。
【０１７２】
インスリン抵抗性を誘導し、ベータ細胞によるインスリン分泌を増大させるための代替法として、Ｒ１３８ＸマウスおよびＷＴマウスにおいて、本発明者らは、インスリン受容体アンタゴニストＳ９６１を使用して、インスリン受容体を遮断した。インスリン受容体の遮断により、予測通り、Ｒ１３８ＸマウスおよびＷＴマウスの両方で循環グルコースおよびインスリンレベルが増大した。しかし、Ｒ１３８ＸマウスではＷＴマウスと比較して循環インスリンの倍増が観察された。図１２を参照されたい。ＳＬＣ３０Ａ８  ＫＯマウスではＷＴマウスに対するこのインスリン分泌の増大は示されない（データは示していない）。これらのデータは、ヒトＲ１３８Ｘ変異を有するＨＦＤマウスがインスリンを分泌するより大きな能力を有することを示唆するデータと一致する。
【０１７３】
高脂肪食下のＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスは循環インスリンレベルまたはベータ細胞数の増大を有さない。本発明者らのＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスを２０週間のＨＦＤの後にも調べた（図４Ａ〜４Ｋ）。これらのマウスは摂食下の循環インスリンレベルの増大を示さなかったが、絶食下のインスリン、プロインスリンおよびＣペプチドレベルの低下を有した（図４Ｂ〜４Ｄ）。Ｒ１３８Ｘマウスと同様に、プロインスリン対インスリン比はＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおいてより低かった（図４Ｅ）。しかし、Ｃペプチド対インスリン比は、Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおいて、固形飼料食で観察されたものと同様に上昇した。Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスでは、耐糖能は変化しなかったが、より低いグルコース誘導性循環インスリンレベルが示された。Ｒ１３８Ｘマウスにおいて観察されたものとは対照的に、Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスではベータ細胞数は変化しなかった（図４Ｉ〜４Ｋ）。
【０１７４】
Ｒ１３８Ｘマウスはインスリン受容体の阻害により誘導される高血糖に応答してインスリン分泌の増大を有する。次に、本発明者らは、代謝的にチャレンジされたマウスにおけるＲ１３８Ｘ変異の潜在的な効果を調査することを望んだ。インスリン受容体アンタゴニストＳ９６１を使用して、重篤なインスリン抵抗性および高血糖を誘導した。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSchaffer et al. (2008) Biochem. Biophys. Res. Commun. 376 (2): 380-383を参照されたい。予測通り、Ｓ９６１により、処置した動物の全てで高血糖（およそ６００ｍｇ／ｄｌ）が引き起こされたが、対照動物では正常な摂食下のグルコースレベル（およそ２００ｍｇ／ｄｌ）が維持された（図１３Ａ）。循環インスリンレベルは処置したマウスの全てでＳ９６１に応答して上昇した。著しく、Ｒ１３８Ｘマウスは、Ｓ９６１誘導性高血糖時にＳ９６１で処置したＷＴマウスと比較して５０％超高い循環インスリンレベルを有した（ＷＴ：４２．３３±５．０３ｎｇ／ｍｌ；Ｒ１３８Ｘ：６７．７５±１９．１６ｎｇ／ｍｌ）（図１３Ｂ）。血漿インスリンの増大は、プロインスリンプロセシングの改善またはインスリンクリアランスの低減の結果でも（図１４Ａ〜１４Ｅ）、Ｒ１３８ＸマウスとＷＴマウスの間の循環ＧＬＰ−１レベルの変化でもなかった（図１３Ｃ）。循環インスリンはＳ９６１を用いて処置したＲ１３８Ｘマウスにおいて摂食下および絶食下条件でより高かったが、血中グルコースレベルはＳ９６１によるインスリン受容体に対するインスリン作用の阻害に起因して遺伝子型の間で異ならなかった（図１３Ｄ〜１３Ｅ）。注目すべきことに、ＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおいて、Ｓ９６１処置により、ＰＢＳで処置したマウスと比較した場合、絶食時血中グルコースレベルは正常であるにもかかわらず、絶食下のインスリンレベルが実質的に上昇した。
【０１７５】
変異体マウスにおけるインスリンレベルが高いことがベータ細胞増殖の増大の結果であるかどうかを調査するために、本発明者らは、Ｋｉ−６７／インスリン陽性ベータ細胞を測定した。ベータ細胞増殖はＳ９６１処置で明白に増大したが、Ｒ１３８ＸマウスとＷＴマウスの間でベータ細胞増殖に差異はなかった（図１３Ｆ〜１３Ｇ）。増殖データと一致して、Ｓ９６１で処置したＷＴおよびＲ１３８Ｘマウスにおける島のまたはアルファ細胞の質量に差異はなかった（図１３Ｆおよび１３Ｈ、図１４Ｆ〜１４Ｇ）。血中インスリンが大きく増大したにもかかわらず、Ｓ９６１で処置したＲ１３８Ｘマウス由来のベータ細胞は、Ｓ９６１で処置したＷＴマウス由来のベータ細胞よりもインスリン枯渇が多いようではなかった（図１３Ｆ）。要約すると、これらのデータから、Ｒ１３８Ｘマウス由来の島が高血糖でチャレンジされた場合、インスリンを分泌するより高い能力を有することが示唆される。
【０１７６】
Ｒ１３８Ｘマウス由来の島はミトコンドリア遺伝子発現の低減およびＨｖｃｎ１発現の増大を有する。ＷＴ島とＲ１３８Ｘ島の差異をより詳細に理解するために、本発明者らは、固形飼料を摂食させたマウスから単離した島に対してＲＮＡ配列決定を実施した。本発明者らのＲＮＡｓｃｏｐｅおよびＴＡＱＭＡＮ（登録商標）データ（図１Ａ〜１Ｂ）を確認して、Ｓｌｃ３０ａ８  ｍＲＮＡの量は強力に減少したが（ＷＴにおけるおよそ５００ＲＰＫＭからＲ１３８Ｘにおけるおよそ１００ＲＫＰＭまで）、存在はしていた（図１５）。本発明者らは、Ｒ１３８Ｘ島では６１種の遺伝子（１９種の遺伝子が増大し、４３種の遺伝子が低減した）が示差的に制御されることを見出した（表７）。興味深いことに、この遺伝子一覧は、亜鉛代謝またはインスリン生合成に関与する遺伝子を含有しない。しかし、インスリン２（Ｉｎｓ２）の発現は顕著に下方制御され、インスリン１（Ｉｎｓ１）の発現も低下する傾向があった（図１６Ａ）。このことはインスリンの転写因子を含めたベータ細胞制御因子の発現レベルをより慎重に調べるよう本発明者らを促した。図１６Ｂに示されている通り、ＭａｆａはＲ１３８Ｘマウスの島において顕著に上方制御されたが、本発明者らのカットオフである１．５倍では見逃された。Ｍａｆａはインスリン転写を正に制御し、その発現は通常ホルモンの発現と正に関連するので、Ｉｎｓ２遺伝子発現の低下を説明するものではない。４３種の下方制御された遺伝子のうち、１２種の遺伝子はミトコンドリアのタンパク質であり、７種はＯｘｐｈｏｓ遺伝子の群に属していた（表７）。したがって、本発明者らは、全てのＯｘｐｈｏｓ遺伝子の発現レベルを調べ、これらの遺伝子の大部分の発現が低下することが認められた（表８、表９）。複合体Ｉ、ＩＩＩ、およびＶは、主に約４０％の遺伝子発現の低下の影響を受け、これにより、ＡＴＰを生成する能力の低下が示唆される。
【０１７７】
【表７】
2021502089.tif 000009
【０１７８】
【表８】
2021502089.tif 000010
【０１７９】
【表９−１】
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【表９−２】
2021502089.tif 000012
【０１８０】
注目すべきことに、電位依存性プロトンチャネルＨｖ１（Ｈｖｃｎ１、代替名ＶＳＯＰ、ＨＶ１）の発現がＲ１３８Ｘマウス由来の島において上方制御された。このチャネルはＺｎ２＋に制御され、インスリン分泌顆粒中に存在し、Ｈｖｃｎ１発現が喪失するとｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるインスリン分泌が損なわれるので、これは、Ｒ１３８Ｘマウスにおいて観察された表現型に関して重要であり得る。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるZhao et al. (2015) Biochem. Biophys. Res. Commun. 468 (4): 746-751；Wanget al. (2017) "The Voltage−gated Proton Channel Hv1 Is Required forInsulin Secretion in Pancreatic β Cells," bioRxiv 097816,doi.org/10.1101/097816；およびQiu et al. (2016) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.113(40): E5962-E5971を参照されたい。
【０１８１】
考察
この研究では、本発明者らは、２つの最も一般的なヒトＳＬＣ３０Ａ８推定ＬＯＦのうちの１つ（ｐ．Ａｒｇ１３８＊）を模倣する新しいＳｌｃ３０ａ８推定ＬＯＦマウスモデル（Ｒ１３８Ｘマウス）を生成した。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFlannick et al. (2014) Nat. Genet. 46 (4): 357-363を参照されたい。これらのマウスから得られたデータにより、ヒトにおけるＳＬＣ３０Ａ８推定ＬＯＦ変異が何故Ｔ２Ｄの発生に対して保護的であるかを初めて説明することができる。Ｒ１３８Ｘ変異の導入により、ベータ細胞の数の増大が結果としてもたらされ、それにより、インスリン抵抗性の状態でより高いインスリン分泌が可能になる。これらのデータから、したがって、Ｒ１３８Ｘベータ細胞がインスリン要求の増大を代償し、ベータ細胞の不全およびＴ２Ｄの発症を防止し、かつ／または遅延することが示される。このモデルを使用し、本発明者らは、Ｒ１３８Ｘ変異の導入により、高血糖に応答して５０％多いインスリンの分泌が結果としてもたらされることを示す。これらのデータから、ヒトにおけるＴ２Ｄからの保護が、少なくとも一部において、インスリン分泌能の増大によって媒介され、ベータ細胞がインスリン要求の増強を代償することが可能になり、それにより、これらの細胞の不全およびＴ２Ｄの発症を防止または遅延することが示唆される。したがって、本手法により、同定されたヒトＴ２Ｄリスクまたは保護的な遺伝子がどのように作用するかの機構を探究するためにマウス遺伝学を使用することの実現性が実証される。本手法では、ヒトにおけるＴ２Ｄのリスクに影響を及ぼす遺伝子バリアントの機構を探究するためのマウス遺伝学の有用性も強調される。
【０１８２】
８種を超える異なるＳｌｃ３０ａ８ノックアウトマウスモデルが報告されている。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるLemaire et al. (2009) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (35):14872-14877；Nicolson et al. (2009) Diabetes 58 (9): 2070-2083；Tamaki et al.(2013) J. Clin. Invest. 123 (10): 4513-4524；Pound et al. (2009) Biochem. J. 421(3): 371-376；Pound et al. (2012) PLoS One 7(7): e40972；Wijesekara et al. (2010)Diabetologia 53 (8): 1656-1668；およびHardy et al. (2012) Am. J. Physiol.Endocrinol. Metab. 302(9): E1084-E1096を参照されたい。これらのモデルは、遺伝的背景、Ｓｌｃ３０ａ８標的化戦略、およびベータ細胞特異的欠失を有するマウスを生成した場合に使用された具体的なＣｒｅ系統が異なる。これらのマウスの代謝表現型も異なる。固形飼料と高脂肪食（ＨＦＤ）下とで体重増加、耐糖能およびインスリン分泌の差異が報告されている。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるRutteret al. (2016) Proc. Nutr. Soc. 75 (1): 61-72を参照されたい。しかし、公開されたＳｌｃ３０ａ８ノックアウト表現型は全て、少なくとも６つの刊行物において見られる、耐糖能障害を伴うグルコース調節の悪化を指している。比較のために、本発明者らは、Ｒ１３８Ｘと同じ１００％Ｃ５７ＢＬ／６背景のＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウス系統も生成した。このノックアウトマウスでは、耐糖能障害（固形飼料食下）、グルコース誘導性インスリン分泌がより少ないこと（固形飼料およびＨＦＤ下）、およびインスリンクリアランスが損なわれていること（固形飼料およびＨＦＤ下）を示す公開されたデータが大きな程度まで表現型模写された。これに反して、固形飼料食下のＲ１３８Ｘマウスにおけるグルコース調節の悪化を含めた主要な代謝表現型は観察されなかった。ノックアウトマウス系統とＲ１３８Ｘマウス系統の差異は、２０週間を超えるＨＦＤの後にさらにいっそう明らかになった。インスリン分泌およびベータ細胞の量はＲ１３８Ｘマウスでは増大したが、Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスでは増大しなかった。観察された表現型の後での出現により、ベータ細胞増殖および数の代償的な増大がＨＦＤ摂食のどちらかといえば後期に起こることが示唆される。しかし、インスリン分泌の変化が観察されていない１０週間のＨＦＤ後にベータ細胞の数がすでに異なっていた可能性を排除することはできない。Hardyらは、包括的なＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおいて１６週間のＨＦＤによる処置後にベータ細胞の数および循環インスリンの増大を観察した。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるHardyet al. (2012) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302(9): E1084-E1096を参照されたい。しかし、これは、本研究では観察されなかった効果である、HardyらのＫＯマウスにおける野生型マウスと比較した顕著な肥満、高血糖、およびインスリン抵抗性の増強を伴うグルコース調節の悪化の結果である可能性が最も高い。重要なことに、HardyらはＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおけるプロインスリン対インスリン比の増大を観察したが、本発明者らは、ＨＦＤ下のＲ１３８Ｘマウスにおいてこの比の低減を観察し、これにより、ベータ細胞がＷＴベータ細胞よりも改善されたインスリンプロセシングおよび良好な健康を有したことが示��される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるHardyet al. (2012) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 302 (9): E1084-E1096を参照されたい。興味深いことに、プロインスリン対インスリン比の改善は本発明者らのＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスにおいても観察され、これにより、ノックアウトマウスとＲ１３８Ｘマウスが全ての代謝の態様において異ならないことが示される。プロインスリン対インスリン比が高いことはヒトにおけるＴ２Ｄへの増悪に関連するため、これは、Ｔ２ＤからのＳＬＣ３０Ａ８  ＬＯＦ媒介性保護にも寄与し得る。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるKirchhoffet al. (2008) Diabetologia 51 (4): 597-601；Loopstra-Masters et al. (2011)Diabetologia 54 (12): 3047-3054；およびSaad et al. (1990) J. Clin. Endocrinol.Metab. 70 (5): 1247-1253を参照されたい。
【０１８３】
全てのＳｌｃ３０ａ８  ＫＯ表現型が循環インスリンの変化を示さないかまたは低減を示し、これは、一部の例では、耐糖能の悪化に関連した。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるNicolson et al., (2009) Diabetes 58 (9): 2070-2083；Pound et al.(2009) Biochem. J. 421 (3): 371-376；およびMitchell et al. (2016) Mol. Endocrinol.30 (1): 77-91を参照されたい。これに反して、３種のＫＯモデル由来の島においてｉｎ  ｖｉｔｒｏインスリン分泌の増大が観察された。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるNicolsonet al., (2009) Diabetes 58 (9): 2070-2083；Tamaki et al. (2013) J. Clin. Invest.123 (10): 4513-4524；およびHardy et al. (2012) Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab.302 (9): E1084-E1096を参照されたい。固形飼料を摂食させたＲ１３８Ｘマウスにおいて、グルコース誘導性インスリン分泌の変化を含めた主要な代謝表現型は観察されなかった。しかし、Ｓ９６１でチャレンジすると、これらのマウスはそれらのＷＴ対応物よりもはるかに多くのインスリンを分泌することができた。このインスリン分泌の増大はベータ細胞質量の増大に続発するものではなく、Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯモデルのいずれにおいても報告されていない。
【０１８４】
Ｒ１３８Ｘマウスの代謝表現型がＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスと何故それほど異なるのかは不明であるが、データから、Ｒ１３８Ｘ対立遺伝子についての潜在的な機能獲得が示唆される。現在のところ、Ｒ１３８ＸマウスがＳｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスと同様であるかは、残りのｍＲＮＡが短縮されたタンパク質に翻訳されることを除外することができないので、不明である。本発明者らは、Ｒ１３８Ｘマウスの島における表現型の差異を容易に説明することができる短縮されたバージョンのＳＬＣ３０Ａ８タンパク質を検出することはできなかった。しかし、ＲＮＡは明白に存在しており、過剰発現されたＲ１３８Ｘタンパク質がＨＥＫ２９３細胞において検出され、プロテアソーム阻害によって蓄積し（図５）、これは、ＨｅＬａ細胞において以前に観察されたものに反する。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFlannick et al. (2014) Nat. Genet. 46 (4): 357-363を参照されたい。したがって、おそらくＲ１３８Ｘマウス由来の島細胞のサブセットにおける低レベルのタンパク質の存在を排除することはできない。Ｒ１３８ＸマウスにおけるＳＬＣ３０Ａ８タンパク質の潜在的な発現とは無関係に、ジチゾン染色により、Ｒ１３８Ｘ推定ＬＯＦ変異の導入が、Ｓｌｃ３０ａ８  ＫＯマウスに関して記載されているものと一致する島亜鉛蓄積の減少を結果としてもたらしたことが明白に示された。別の可能性は、短縮されたＳｌｃ３０ａ８  ｍＲＮＡが、もはやペプチドをコードしないが、今は長鎖非コードＲＮＡとしての役割を果たし、関連する遺伝子（場合によって他のＳｌｃ３０ａファミリーメンバーを含む）の転写にｉｎ  ｔｒａｎｓで影響を及ぼすというものである。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるBatistaand Chang (2013) Cell 152 (6): 1298-1307を参照されたい。
【０１８５】
細胞内の遊離Ｚｎ２＋の変化により、いくつかの理由から、増殖および／またはインスリン分泌の増大が導かれる可能性がある。大多数の細胞内シグナル伝達系は、哺乳動物細胞における遊離Ｚｎ２＋による影響を受け、細胞プロテオームのほぼ１０％がこれらのイオンを結合することができる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるRutter et al. (2016) Proc. Nutr. Soc. 75 (1): 61-72を参照されたい。遊離Ｚｎ２＋濃度は、ベータ細胞におけるＳｌｃ３０ａ８不活化により細胞質ゾルにおいて全体的に低下する可能性が高いが、Ｒ１３８Ｘベータ細胞における原形質膜の付近に高度に局在化する遊離Ｚｎ２＋の増大により、タンパク質チロシンホスファターゼが阻害されることによって受容体チロシンキナーゼ（例えば、インスリンまたはＩＧＦ１受容体）によるシグナル伝達が増強され、したがって、細胞成長が促進される可能性がある。例えば、そのそれぞれの全体があらゆる目的に関して参照により本明細書に組み込まれるGerberet al. (2014) Diabetologia 57 (8): 1635-1644およびBellomo et al. (2014)Metallomics 6 (7): 1229-1239を参照されたい。他方では、細胞質ゾルＺｎ２＋レベルの全体的な低下により、例えば、カスパーゼとの相互作用によりアポトーシス率が低下することが予測される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFukamachiet al. (1998) Biochem. Biophys. Res. Commun. 246 (2): 364-369を参照されたい。
【０１８６】
Ｒ１３８Ｘマウスでは、電位依存性プロトンチャネルＨｖｃｎ１の上方制御によってインスリン分泌が上方制御され得る。Ｈｖｃｎ１は、分泌顆粒中に存在し、亜鉛イオンによって阻害される。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるQiu et al. (2016) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 113 (40): E5962-E5971を参照されたい。さらに、Ｈｖｃｎ１  ＫＯマウスではインスリン分泌が低減しており、グルコース調節が損なわれている。あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるWanget al. (2017) "The Voltage-gated Proton Channel Hv1 Is Required forInsulin Secretion in Pancreatic β Cells," bioRxiv 097816,doi.org/10.1101/097816。Ｒ１３８Ｘマウス由来の島は亜鉛が枯渇しているので、このチャネルの活性の増大が予想される。その上、Ｒ１３８Ｘマウス由来の島においてＨｖｃｎ１転写物の３倍の上方制御が見られる。これらのデータから、インスリン分泌の増大が少なくとも一部においてＨｖｃｎ１によって媒介されることが示唆されるが、さらなる実験によりこの仮説を検証する必要がある。別の興味深い所見は、Ｒ１３８Ｘマウスにおけるミトコンドリア遺伝子発現の低下である。これは、妥当なインスリン分泌にはＡＴＰ合成が必要であるので、どちらかといえば反直観的であると思われる。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるWiederkehrand Wollheim (2012) Mol. Cell. Endocrinol. 353 (1-2):128-137を参照されたい。しかし、最近の研究により、ベータ細胞におけるインスリン分泌を活性化する代替経路が記載されている。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるDeMarchi et al. (2017) J. Cell. Sci. 130 (11): 1929-1939を参照されたい。この経路は、ＡＴＰ合成（オリゴマイシン抵抗性）からは独立しており、許容的な細胞質ゾルＣａ２＋に依存し、より小さなミトコンドリアグルタチオン低下が付随し、ミトコンドリア複合体ＩＩの活性化によって達成される。これは、Ｒ１３８ＸマウスにおいてＧｐｘ２発現（グルタチオンペルオキシダーゼ２）（表７）、およびＯｘｐｈｏｓ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ＩＩ由来の遺伝子の１つのみが低下したことを考慮に入れると興味深い。対応して、ベータ細胞における、プロテインキナーゼである肝臓キナーゼＢ１（ＬＫＢ１）の選択的な欠失により、顕著なミトコンドリア欠陥および損なわれたＣａ２＋動力学が導かれるが、後者の経路の上方制御に起因してグルコース刺激性インスリン分泌が増強される可能性が最も高い。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるSwisaet al. (2015) J. Biol. Chem. 290 (34): 20934-20946を参照されたい。この代替経路がＲ１３８Ｘマウス由来のベータ細胞において主に使用されるかどうかを調査するために呼吸およびインスリン分泌を調べるさらなる実験を行うことができる。
【０１８７】
ベータ細胞数の回復は、新規のＴ２Ｄ薬を開発するための重要な戦略である。この手法に対する最も大きな難題の１つは、齧歯類におけるベータ細胞の複製を促進する因子では、多くの場合ヒトベータ細胞の複製を促進できないことである。しかし、ヒトＳＬＣ３０Ａ８  Ｒ１３８Ｘ変異をモデル化するマウスにおける本発明者らのデータにより、ベータ細胞数の増大が、ヒトにおけるいくつかのＳＬＣ３０Ａ８変異のＴ２Ｄ保護効果の基礎をなす機構の１つであることが示唆される。したがって、Ｒ１３８Ｘマウスにおいて観察されたベータ細胞面積の拡大の基礎をなす機構を理解することが、ヒトへ移行される見込みがより高い新規の治療標的の同定につながり得る。
【０１８８】
結論として、Ｒ１３８Ｘマウスからの本発明者らのデータは、Ｒ１３８Ｘ変異を有するヒトが何故Ｔ２Ｄから保護されるかに関する説明を初めてもたらす。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるFlannick et al. (2014) Nat. Genet. 46 (4): 357-363を参照されたい。したがって、Ｒ１３８Ｘマウスは、この保護の基礎をなす機構を研究するための関連性のあるモデルである。これは、インスリン分泌を増大させることがＴ２Ｄと闘うための卓越した治療戦略であることを考慮すると、特に重要である。したがって、Ｒ１３８Ｘマウスにおけるインスリン分泌の増大の基礎をなす機構を理解することが、新規の治療標的の同定につながり得る。
【０１８９】
作用機構
本発明者らは、ヒトを２型糖尿病の発生から保護するヒトＳＬＣ３０Ａ８  ＬｏＦ変異ｐ．Ａｒｇ１３８＊を模倣する新しいマウスモデル（Ｒ１３８Ｘ）を生成した。高脂肪食（high-fed‐diet）条件下のＲ１３８Ｘマウスはベータ細胞質量および増殖の増大に関連するインスリン分泌の増大を有する。あるいは、Ｓ９６１（インスリン受容体の阻害剤）を使用して高血糖を誘導した場合、Ｒ１３８Ｘマウスは、ＷＴマウスと比較して、ベータ細胞質量および増殖の変化とは無関係にインスリン分泌の５０％の増大を有する。これにより、Ｒ１３８Ｘマウスにおける増殖の増大にはインスリン受容体が必要であることが示唆される。さらに、ベータ細胞におけるインスリン受容体は高脂肪食下のマウスにおけるベータ細胞増殖の増大に必要であることが示されている。Ｒ１３８Ｘマウスはインスリンを分泌する能力の増大を有するので、ＷＴマウスよりも高いインスリンがベータ細胞におけるインスリン受容体に対して作用し、増殖を大きな程度まで誘導し得る。これを調査するために、高脂肪食またはＳ９６１で処置したＷＴおよびＲ１３８Ｘマウス由来の膵臓におけるｐ−Ａｋｔ、ｐ−Ｓ６、およびｐ−Ｅｒｋについての組織学を行うことにより、インスリン経路の活性化を調べる。さらに、単離された島を調べて、これらがより高いｐ−ＡＫＴおよびｐ−Ｅｒｋレベルを有するかどうか、ならびにこれらがｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてより多く増殖するかどうかを決定する。
【０１９０】
方法
動物。全ての手順をＲｅｇｅｎｅｒｏｎ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより認可されたプロトコールに従って行った。Ｓｌｃ３０ａ８  Ｒ１３８Ｘおよびノックアウトマウス系統は純粋なＣ５７ＢＬ／６ＮＴａｃ背景でＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ技術を使用して作製した。例えば、あらゆる目的に関してその全体が参照により本明細書に組み込まれるValenzuela et al. (2003) Nat. Biotechnol. 21 (6): 652-659を参照されたい。ノックアウトマウス系統の生成のために、Ｓｌｃ３０ａ８コード領域全体を欠失させ、ＬａｃＺ遺伝子で置き換えた。自己欠失性ネオマイシン選択カセットの使用によってネオマイシン遺伝子を除去した。Ｒ１３８Ｘマウスの生成のために、エクソン３内のヌクレオチド４０９をＴからＣに変化させ、それによりアルギニンを停止コドンに変化させた。変異した対立遺伝子は、イントロン３に挿入されたｌｏｘＰ部位に挟まれた自己欠失性ネオマイシン選択カセットを有し、２９ｂｐの内因性イントロン３配列（ＣＡＧＣＴＧＡＣＡＧＣＡＡＧＡＴＴＡＡＴＧＧＡＡＧＴＡＣＣ（配列番号２４））を欠失させる。マウスを制御された環境（１２時間の明／暗サイクル、２２±１℃、湿度６０〜７０％）下に収容し（ケージ当たり最大５匹のマウス）、１２〜１８週齢で開始して固形飼料（Ｐｕｒｉｎａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ２３  Ｒｏｄｅｎｔ  Ｄｉｅｔ  ５００１、ＬａｂＤｉｅｔ）または高脂肪食（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉｅｔｓ、Ｄ１２４９２；カロリーで６０％が脂肪）のいずれかを自由に摂食させた。示されているデータは全てＷＴ同腹仔と比較したものである。
【０１９１】
グルコース負荷試験。マウスを一晩（１６時間）絶食させ、その後、グルコース（Ｓｉｇｍａ）を２ｇ／ｋｇ体重で経口胃管栄養を行った。示されている時点で尾静脈から血液試料を得、ＡｌｐｈａＴｒａｋ２グルコメーター（Ａｂｂｏｔｔ）を使用してグルコースレベルを測定した。インスリンのための顎下採血をグルコース測定に干渉しないように別個の実験で注入後０、１５、および３０分に行った。
【０１９２】
インスリン負荷試験。マウスを４時間絶食させ、その後、ヒトインスリン（Ｅｌｉ  Ｌｉｌｌｙ）を０．７５Ｕ／ｋｇ（固形飼料を摂食させた）または１．５Ｕ／ｋｇ（高脂肪を摂食させた）のいずれかで腹腔内注射した。示されている時点で尾静脈から血液試料を得、ＡｌｐｈａＴｒａｋ２グルコメーター（Ａｂｂｏｔｔ）を使用してグルコースを測定した。
【０１９３】
血漿インスリン、プロインスリンおよびＣペプチドの測定。一晩絶食させたかまたは摂食させた動物の顎下採血を朝またはｏＧＴＴ後に行った。インスリンをマウスインスリンＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）で解析した。プロインスリンをマウスプロインスリンＥＬＩＳＡ（Ｍｅｒｃｏｄｉａ）で解析した。ＣペプチドをマウスＣペプチドＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ）で解析した。ＥＬＩＳＡは全て製造者の指示に従って実施した。
【０１９４】
組織学。膵臓を１０％中性緩衝ホルマリン溶液中に４８時間固定し、次いで、パラフィン包埋した。各動物から２つの膵臓切片をα−グルカゴン（ＲＥＧＮ７４５、社内で生成したα−グルカゴンモノクローナル抗体）またはα−インスリン（Ｄａｋｏ）抗体で染色し、グルカゴンおよびインスリン陽性細胞の面積を、Ｈａｌｏデジタルイメージング解析ソフトウェア（Ｉｎｄｉｃａ  Ｌａｂｓ）を使用して測定した。グルカゴンおよびインスリン陽性面積のパーセントを膵臓全体の面積に対する割合として算出した。スライド当たりの島の数を計数し、膵臓全体の面積に対して正規化した。インスリン陽性細胞の全てのクラスターを単一細胞分解能に至るまで捕捉するように解析を設定した。１つの単一のベータ細胞よりも小さなアーチファクト（例えば、デブリ）（＜１５０μｍ２；直径約１４μｍを使用して算出した面積）を排除した。蛍光染色のために、膵臓切片をα−インスリン（Ｄａｋｏ、Ａ０５６４）抗体とα−ＫＩ６７抗体（Ｒ＆Ｄ）の組合せで染色し、その後、適正な二次抗体で染色した。顕微鏡スライドスキャナー（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｓｃａｎ．Ｚ１）を使用して蛍光シグナルを検出した。Ｃｙｔｏｎｕｃｌｅａｒ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅモジュール（Ｉｎｄｉｃａ  Ｌａｂｓ）を使用するＨＡＬＯ画像解析を使用し、島細胞型を定量化した。グルカゴン陽性およびインスリン陽性面積の膵臓全体の面積に対するパーセントを算出した。面積を基礎として、各動物についてのα−細胞面積に動物の膵臓の重量を掛けることによってα−細胞質量を算出した。島の質量を定量化するために、切片におけるインスリン陽性島の数を計数することによって島の数およびサイズを測定した。１５０μｍよりも大きな染色された領域全てを島として計数した。島の数を、個々の膵臓の重量を掛けた膵臓全体の面積に対して正規化して島の質量を得た。
【０１９５】
ＲＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション。ＲＮＡ解析のために、膵臓組織を透過処理し、製造者（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）の指示に従ってマウスＧｃｇ、Ｉｎｓ２、およびＳｌｃ３０Ａ８に対するｍＲＮＡプローブの組合せにハイブリダイズした。蛍光キットを使用してｍＲＮＡシグナルを増幅した。顕微鏡スライドスキャナー（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｓｃａｎ．Ｚ１）を使用して蛍光シグナルを検出した。
【０１９６】
島の単離およびジチゾン染色。膵臓にＬｉｂｅｒａｓｅ  ＴＬ（Ｒｏｃｈｅ、＃０５４０１０２０００１）を総胆管を通じて灌流させた後に、マウス島を密度勾配分離によって単離した。３７℃で１３分間消化した後、膵臓溶液を洗浄し、４００μｍの針金メッシュストレーナーを通して濾過し、島をＨｉｓｔｏｐａｑｕｅ勾配遠心分離（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、＃Ｈ  １０７７）によって、または解剖顕微鏡下で手で選び取ることによって分離した。単離された島を、１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ、１０ｍＭのＨＥＰＥＳ、５０μＭのβ−メルカプトエタノール、１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム、１００Ｕ／ｍＬのペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンを補充したＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）中、３７℃、空気雰囲気中５％ＣＯ２で一晩培養した。最大５０個の島を手で選び取り、１００μｇ／ｍｌのジチゾン溶液を含有する新しいディッシュに移した。島を最大１０分間染色し、顕微鏡検査（Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡）のためにまたＰＢＳ溶液に移した。
【０１９７】
ウエスタン（イムノ）ブロット解析。島をＲＩＰＡ溶解緩衝液に溶解させ、タンパク質濃度を決定した。総細胞溶解物２０μｇを、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ４〜２０％プレキャストゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を還元条件下で使用したＳＤＳ／ＰＡＧＥによって分解し、ニトロセルロースメンブレンに移した。メンブレンをポリクローナルα−マウス−ＳＬＣ３０Ａ８ウサギＡｂ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒへの特注品）でプローブし、増強化学発光検出システムを使用して検出した。マウスＳＬＣ３０Ａ８タンパク質のアミノ酸２９〜４３にわたるペプチドに対してＳＬＣ３０Ａ８ポリクローナルＡｂが生じた。
【０１９８】
Ｒ１３８Ｘ過剰発現およびプロテアソーム阻害。ヒトＳＬＣ３０Ａ８  ＷＴおよび最初の１３７アミノ酸、その後の停止コドンを、Ｃ末端ｍｙｃタグを用いてクローニングした。ＨＥＫ２９３細胞（細胞０．４×１０６個／ウェル）を６ウェルプレートに播種した。翌日、細胞に、Ｍｉｒｕｓ  ＴｒａｎｓＩＴ−ＴＬ１を製造者の指示に従って使用してＤＮＡ０．１μｇ／ウェルでトランスフェクトした。トランスフェクションの２日後に、ＤＭＳＯ、プロテアソーム阻害剤（１０μＭのＭＧ−１３２または１μＭのエポキソミシン）またはリソソーム阻害剤（１０μｇ／ｍｌのクロロキン塩）のいずれかをスパイクした。細胞を、ＲＩＰＡ緩衝液中６時間の処理後に回収した。細胞溶解物３０μｇをウエスタンブロッティングによって解析した。
【０１９９】
ｑＰＣＲ解析。実行するＲＴ−ｑＰＣＲアッセイ当たり３７．５ナノグラム〜３７５ナノグラムの間のＲＮＡをＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（登録商標）ＶＩＬＯ（商標）Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号１１７５５５００）と混合し、製造者の指示に従ってサイクルにかけた。ｃＤＮＡを、ヌクレアーゼを含まない水を用いて１マイクロリットル当たり０．５ナノグラム〜１マイクロリットル当たり５ナノグラムの間に希釈した。水、マスターミックス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号４３７００７４またはＢｉｏｌｉｎｅ、Ｃａｔ番号ＣＳＡ−０１１１３）、および２０×アッセイミックスを合わせることによってＲＴ−ｑＰＣＲアッセイを作製した。アッセイミックスは、蛍光標識されたおよびクエンチされたプローブ配列と組み合わせたフォワードおよびリバースプライマーの市販の混合物であった（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号３５１３７２またはＬＧＣ  ＢｉｏＳｅａｒｃｈ、Ｃａｔ番号ＤＬＯ−ＲＦＢＬ−ＭＩＸ）。試料を３連で３８４ウェルプレート（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号４３４３３７０）に、希釈したｃＤＮＡ  ５マイクロリットルおよび適正なＲＴ−ＰＣＲアッセイ１０マイクロリットルを各ウェルにピペットで入れることによって試行した。３８４ウェルプレートを光学的に透明なシール（Ａｇｉｌｅｎｔ、Ｃａｔ番号１６９８５−００１）で覆い、スピンダウンさせ、３８４−ＷｅｌｌＢｌｏｃｋ  ＭｏｄｕｌｅおよびＡｕｔｏｍａｔｉｏｎ  Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｃａｔ番号４３２９００２）を備えたＡＢＩ７９００ＨＴ  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍを用い、使用するマスターミックスの特質に応じて４０サイクルにわたって読み取った。Ｓｌｃ３０ａ８プローブおよびプライマーの配列は以下の通りである：プローブ：ＴＣＣＡＡＡＡＣＴＧＧＧＣＡＧＴＧＡＧＴＴＣＡＡＣＡ（配列番号２５）、フォワードプライマー：ＡＡＴＴＧＣＡＧＴＧＣＴＧＣＴＴＴＧＣ（配列番号２６）、リバースプライマー：ＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＧＴＴＧＴＴＧＴＣ（配列番号２７）。
【０２００】
ＲＮＡ調製。島を上記の通り単離し、３７℃で一晩インキュベートした。翌日、遺伝子型当たり５００個の島を１つの試料としてＴｒｉｚｏｌ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中に選び取り、ＲＮＡ抽出および配列決定まで−８０℃で維持した。５つの異なるＷＴ試料および４つの異なるＲ１３８Ｘ試料を解析した。全ＲＮＡを全ての試料からＭａｇＭＡＸ（商標）−９６  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏａｒｒｙｓ  Ｔｏａｌ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＡｍｂｉｏｎ）を製造者の仕様に従って使用して精製した。ＭａｇＭＡＸ（商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）ＤＮａｓｅ  Ｂｕｆｆｅｒおよび上に列挙されているＭａｇＭＡＸキット（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによるＡｍｂｉｏｎ）からのＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅを使用してゲノムＤＮＡを取り出した。ｍＲＮＡを全ＲＮＡからＤｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）ｍＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して精製した。鎖特異的ＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーをＫＡＰＡ  ｍＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｌｉｂｒａｒｙ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｋａｐａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して調製した。１２サイクルのＰＣＲを実施してライブラリーを増幅した。配列決定をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ（登録商標）２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）において３３サイクルの多重化された単一の読み取り実行によって実施した。
【０２０１】
ＲＮＡｓｅｑ読み取りマッピングおよび示差的に発現されたＲＮＡの統計解析。生配列データ（ＢＣＬファイル）をＩｌｌｕｍｉｎａ  ｂｃｌ２ｆａｓｔｑ  ｖ２．１７によってＦＡＳＴＱフォーマットに変換した。読み取りをそれらのバーコードに基づいて解読し、読み取りの質をＦａｓｔＱＣで評価した。読み取りを、ＡｒｒａｙＳｔｕｄｉｏ（登録商標）ソフトウェア（ＯｍｉｃＳｏｆｔ（登録商標））を使用し、２つのミスマッチを許容してマウスゲノム（ＮＣＢＩ  ＧＲＣｍ３８）にマッピングした。遺伝子のエクソンにマッピングされた読み取りを遺伝子レベルで合計した。示差的に発現された遺伝子をＤＥＳｅｑ２パッケージによって同定し、顕著に撹乱された遺伝子を上方向または下方向のいずれかで１．５以上の倍率変化、かつ少なくとも０．０１のｐ値で定義した。
【０２０２】
データ解析。データを平均±ＳＥＭとして報告する。Ｐｒｉｓｍ  ６．０（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を使用して統計解析を実施した。全てのパラメーターを、示されている通り、常に無処理の遺伝子型と比較して二元配置ＡＮＯＶＡ（＊ｐ）およびスチューデントのＴ検定（＃ｐ）によって解析した；閾値Ｐ＜０．０５を統計的に有意であるとみなした。二元配置ＡＮＯＶＡによる遺伝子型間の有意差をグラフの上に示す。特定のデータ点の有意差を点／グラフの上に示す。＊ｐ／＃ｐ＜０．５、＊＊ｐ／＃＃ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ／＃＃＃ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ／＃＃＃＃ｐ＜０．０００１。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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