(57)【要約】  組み換え単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、組み換えＨＳＶ−１ベクター、及びその製造方法に係り、該組み換えＨＳＶ−１は、ＩＣＰ６及びＩＲ領域が同時に欠失されることにより、比較的大サイズの外来遺伝子を挿入するか、あるいは多様な外来遺伝子を同時に挿入することができ、遺伝子操作が容易である。また、安全でありながらも、癌細胞殺傷効果にすぐれる抗癌ウイルスであり、て癌治療分野に多様に活用されうる。【選択図】図１
2021532820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）のゲノム領域のうち、ＩＣＰ６（infected-cell protein ６）が欠失され、ＵＬ（unique long）領域とＵＳ（unique short）領域との間のＩＲ（internal repeat）領域が欠失されたＨＳＶ−１ゲノムを有する、組み換えＨＳＶ−１。
【請求項２】
前記組み換えＨＳＶ−１は、ＴＲＬ（terminal repeat of long region）領域；ＵＬ１ないしＵＬ３８、及びＵＬ４０ないしＵＬ５６のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＬ領域；ＵＳ１ないしＵＳ１２のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＳ領域；並びにＴＲＳ（terminal repeat of short region）領域からなる群から選択されるＨＳＶ−１の１以上のゲノム領域を含む、請求項１に記載の組み換えＨＳＶ−１。
【請求項３】
前記ＩＣＰ６は、ＵＬ３９遺伝子である、請求項１に記載の組み換えＨＳＶ−１。
【請求項４】
前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、ＨＳＶ−１のＩＣＰ６遺伝子のヌクレオチド配列のうち、配列番号１のヌクレオチド配列が欠失されたものである、請求項１に記載の組み換えＨＳＶ−１。
【請求項５】
前記ＩＲ領域は、ＩＲＬ（internal repeat of long region）領域及びＩＲＳ（internal repeat of short region）領域を含むものである、請求項１に記載の組み換えＨＳＶ−１。
【請求項６】
前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、ＨＳＶ−１のＩＲ領域のヌクレオチド配列のうち、配列番号２のヌクレオチド配列が欠失されたものである、請求項１に記載の組み換えＨＳＶ−１。
【請求項７】
ＵＬ５６遺伝子の一部ヌクレオチド配列が追加して欠失されたものである、請求項１に記載の組み換えＨＳＶ−１。
【請求項８】
前記欠失されたＵＬ５６遺伝子の一部ヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列である、請求項７に記載の組み換えＨＳＶ−１。
【請求項９】
前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、配列番号４のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の組み換えＨＳＶ−１。
【請求項１０】
前記組み換えＨＳＶ−１は、癌細胞または腫瘍細胞の特異性を示すものである、請求項１に記載の組み換えＨＳＶ−１。
【請求項１１】
請求項１ないし１０のうちいずれか１項に記載の組み換えＨＳＶ−１のゲノムヌクレオチド配列を含む、組み換えＨＳＶ−１ベクター。
【請求項１２】
外来遺伝子のヌクレオチド配列を追加して含むものである、請求項１１に記載の組み換えＨＳＶ−１ベクター。
【請求項１３】
ＩＣＰ６及びＩＲ領域が欠失されたＨＳＶ−１のゲノムヌクレオチド配列を含む組み換えＨＳＶ−１ベクターを製造する段階と、
前記ベクターを細胞に形質感染させ、組み換えＨＳＶ−１を得る段階と、を含む、組み換えＨＳＶ−１を製造する方法。
【請求項１４】
前記組み換えＨＳＶ−１ベクターは、ＴＲＬ領域；ＵＬ１ないしＵＬ３８、及びＵＬ４０ないしＵＬ５６のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＬ領域；ＵＳ１ないしＵＳ１２のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＳ領域；並びにＴＲＳ領域からなる群から選択されるＨＳＶ−１の１以上のゲノム領域のヌクレオチド配列を含むものである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
請求項１に記載の組み換えＨＳＶ−１、または請求項１１に記載の組み換えＨＳＶ−１ベクターを含む癌予防用または治療用の薬学的組成物。
【請求項１６】
請求項１に記載の組み換えＨＳＶ−１、または請求項１１に記載の組み換えＨＳＶ−１ベクターの有効量を、それを必要とする個体に投与する段階を含む、癌を予防したり治療したりする方法。
【請求項１７】
癌の予防用薬剤または治療用薬剤の製造のための請求項１に記載の組み換えＨＳＶ−１、または請求項１１に記載の組み換えＨＳＶ−１ベクターの用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、組み換え単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）、組み換えＨＳＶ−１ベクター及びその製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ：herpes simplex virus：ＨＳＶ）は、ヘルペスウイルス科に属するウイルスの一種であり、ＨＳＶ−１型とＨＳＶ−２型とに区別され、それぞれヒトヘルペスウイルス１型及びヒトヘルペスウイルス２型としても知られている。核酸は、二本鎖、線状ＤＮＡであり、分子量は、９６ｘ１０６ダルトンである。
【０００３】
２０１５年、米国ＦＤＡ承認を受けたＴ−ＶＥＣが、悪性黒色腫を対象に臨床に使用されることにより、ヘルペスウイルスを基にして、癌ウイルスの開発が進められている。しかし、現在開発されたほとんどの抗癌ＨＳＶ−１は、ウイルス複製に必要な遺伝子が消失されることによってウイルス複製が制限され、その治療効能が低いという限界点がある。また、ＨＳＶ−１の場合、１５２ｋｂのサイズが大きいＤＮＡウイルスであるために、遺伝子操作が容易ではないという問題点がある。
【０００４】
従って、すぐれた癌治療効能を有しながらも、遺伝子操作が容易である組み換えＨＳＶ−１ベクターの開発が必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一様相は、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）のゲノム領域のうち、ＩＣＰ６及びＩＲ領域が欠失されたＨＳＶ−１ゲノムを有する組み換えＨＳＶ−１を提供することである。
【０００６】
他の様相は、前記一様相による組み換えＨＳＶ−１のゲノムヌクレオチド配列を含む組み換えＨＳＶ−１ベクターを提供することである。
【０００７】
他の様相は、前記一様相による組み換えＨＳＶ−１を製造する方法を提供することである。
【０００８】
他の様相は、前記組み換えＨＳＶ−１または組み換えＨＳＶ−１ベクターを含む癌予防用または治療用の薬学的組成物を提供することである。
【０００９】
他の様相は、前記組み換えＨＳＶ−１または組み換えＨＳＶ−１ベクターの有効量をそれを必要とする個体に投与する段階を含む、癌を予防したり治療したりする方法を提供することである。
【００１０】
他の様相は、癌の予防用薬剤または治療用薬剤の製造のための、前記組み換えＨＳＶ−１または組み換えＨＳＶ−１ベクターの用途を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一様相は、組み換え単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１:herpes simplex virus type １）を提供する。
【００１２】
本発明の一様相による組み換えＨＳＶ−１は、ＨＳＶ−１のゲノム領域のうち、ＩＣＰ６（infected-cell protein６）が欠失され、ＵＬ（unique long）領域とＵＳ（unique short）領域との間のＩＲ（internal repeat）領域が欠失されたＨＳＶ−１ゲノムを有する。ＨＳＶ−１のゲノム領域のうち、ＩＣＰ６及びＩＲ領域が同時に消失されたベクター構造は、これまでのところ報告されていないので、本発明の一様相による組み換えＨＳＶ−１は、新規構造の組み換えウイルスである。ＩＣＰ６及びＩＲ領域が欠失されることにより、約２０ｋｂの遺伝子が消失されたことになるので、比較的大サイズの外来遺伝子の挿入、または１種以上の多様な外来遺伝子の同時挿入が可能である。リボヌクレオチド還元酵素（ribonucleotide reductase）であるＩＣＰ６は、ＨＳＶ−１のＤＮＡ生合成に関与する酵素であり、正常細胞への感染時、ウイルスのＤＮＡ複製に必要な酵素である。最近、リボヌクレオチド還元酵素は、多様な癌細胞に過発現されていると知られている。従って、ＩＣＰ６遺伝子を除去する場合、正常細胞においては、ウイルスの複製が制限される一方、癌細胞においては、ウイルスが活発に複製が可能であるウイルスを作製することができる。また、ＨＳＶ−１には、ＩＣＰ０、ＩＣＰ３４．５、ＩＣＰ４が２コピー（copy）ずつ存在し、１コピーだけでもウイルスの複製が可能である。従って、ＩＲ領域にあるＩＣＰ０、ＩＣＰ３４．５、ＩＣＰ４の１コピーを除去する場合、ウイルス複製に何の影響もなしに、多様な大きさと種類との治療遺伝子挿入が可能になる。それだけではなく、ＨＳＶ−１は、ＩＲ領域があり、総４個のアイソタイプ（isotype）のウイルスを作ることになるが、ＩＲ領域を除去する場合、ただ１個のＨＳＶ−１アイソタイプであるさらに安定したウイルスを作ることができる。すなわち、ＨＳＶ−１ゲノム領域のうち、ＩＣＰ６遺伝子を除去することにより、癌細胞選択性を付与することができ、ＨＳＶ−１ゲノム領域のうち、ＩＲ領域を除去することにより、ＨＳＶ−１抗癌ウイルスの構造的安定性と共に、治療遺伝子を挿入することができる空間確保が可能になる。
【００１３】
用語「欠失（deletion）」は、ウイルスゲノム上に存在する遺伝子を除去することを意味する。例えば、制限酵素を使用し、遺伝子を除去することができる。制限酵素を使用する遺伝子クローニング方法により、全体遺伝子を除去するか、あるいは遺伝子ヌクレオチド配列の一部を除去することもできる。前記遺伝子欠失により、遺伝子の機能的蛋白質の発現が起きないか、あるいは阻害される。約２０ｋｂの大きさに該当するＩＣＰ６及びＩＲ領域を欠失させることにより、ヌクレオチド配列の長さが長い外来遺伝子の挿入が可能である。
【００１４】
「単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ：herpes simplex virus）」は、ヘルペスウイルス科ビリデ（Herpesviridae）に属するウイルスであり、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１：herpes simplex virus type １）及び単純ヘルペスウイルス２型（ＨＳＶ−２：herpes simplex virus type ２）に区分される。ＨＳＶ−１は、ヒトヘルペスウイルス１型（ＨＨＶ−１：human herpes virus type １：）とも言う。ＨＳＶ−１の核酸は、二本鎖線形ＤＮＡである。従って、ＨＳＶ−１のゲノムは、二本鎖線形ＤＮＡによって構成されたものでもある。ＨＳＶ−１のゲノム配列は、公知されたＨＳＶ−１菌株（strain）のゲノム配列であるならば、その種類を制限するものではない。ＨＳＶ−１ゲノムの例示的な配列は、ＮＣＢＩ GenBank Accession Ｎｏ．ＪＱ６７３４８０．１に記載されている。本願において、何の指示もない限り、「ＨＳＶ−１」は、「野生型ＨＳＶ−１」と相互交換的に使用され、前記一様相による「組み換えＨＳＶ−１」と区別される。
【００１５】
ＨＳＶ−１ゲノム領域は、ＴＲＬ（terminal repeat of long region）領域、ＵＬ（unique long）領域、ＩＲＬ（internal repeat of long region）領域、ＩＲＳ（internal repeat of short region）領域、ＵＳ（unique short）領域及びＴＲＳ（terminal repeat of short region）を含むものでもある。前記ＵＬ領域は、ＵＬ１遺伝子ないしＵＬ５６遺伝子のヌクレオチド配列を含むものでもある。前記ＵＳ領域は、ＵＳ１遺伝子ないしＵＳ１２遺伝子のヌクレオチド配列を含むものでもある。また、ＨＳＶ−１ゲノム領域は、ＴＲＬ領域及びＴＲＳ領域を含まないのでもある。例えば、ＨＳＶ−１ゲノム領域は、ＵＬ領域、ＩＲＬ領域、ＩＲＳ領域及びＵＳ領域を含むものでもある。
【００１６】
一具体例において、前記組み換えＨＳＶ−１は、ＴＲＬ領域；ＵＬ１ないしＵＬ３８、及びＵＬ４０ないしＵＬ５６のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＬ領域；ＵＳ１ないしＵＳ１２のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＳ領域；並びにＴＲＳ領域からなる群から選択されるＨＳＶ−１の１以上のゲノム領域を含むものでもある。他の具体例において、前記組み換えＨＳＶ−１は、ＴＲＬ領域；ＵＬ１ないしＵＬ３８、及びＵＬ４０ないしＵＬ５６のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＬ領域；ＵＳ１ないしＵＳ１２のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＳ領域；並びにＴＲＳ領域からなる群から選択されるＨＳＶ−１のゲノム領域の任意の組み合わせを含むものでもある。他の具体例において、前記組み換えＨＳＶ−１は、ＴＲＬ領域；ＵＬ１遺伝子ないしＵＬ３８遺伝子、及びＵＬ４０遺伝子ないしＵＬ５６遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＬ領域；ＵＳ１遺伝子ないしＵＳ１２遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＳ領域；並びにＴＲＳ領域をいずれも含んでもよい。
【００１７】
前記「ＴＲＬ領域」は、約９．２ｋｂの大きさを有することができる。
前記「ＵＬ領域」は、約１０８ｋｂの大きさを有することができる。ＨＳＶ−１のＵＬ領域は、ＵＬ１遺伝子ないしＵＬ５６遺伝子のヌクレオチド配列を含むものでもある。本発明の一様相による組み換えＨＳＶ−１は、ＵＬ領域を含み、前記ＵＬ領域は、ＵＬ１ないしＵＬ３８、及びＵＬ４０ないしＵＬ５６のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むものでもある。
【００１８】
前記「ＩＣＰ６」は、ＵＬ３９遺伝子でもある。前記ＩＣＰ６のヌクレオチド配列は、約４．８ｋｂの大きさを有することができる。ＩＣＰ６遺伝子の例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ GenBank Accession Ｎｏ．ＪＱ６７３４８０．１に記載されたＨＳＶ−１ゲノム配列のうち、８６，３６４ないし８９，７７７番目ヌクレオチド配列でもある。一具体例において、前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、ＩＣＰ６遺伝子の全部または一部が欠失されたものでもある。他の具体例において、前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、野生型ＨＳＶ−１ゲノム配列において、８６，９０１ないし８９，５７８番目ヌクレオチドが欠失されたものでもある。例えば、前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、ＨＳＶ−１のＩＣＰ６遺伝子のヌクレオチド配列のうち、配列番号１のヌクレオチド配列が欠失されたものでもある。ＩＣＰ６蛋白質の例示的なアミノ酸配列は、ＮＣＢＩ GenBank Accession Ｎｏ．ＡＦＥ６２８６７．１に記載されている。
【００１９】
一具体例において、前記欠失されたＩＲ領域は、ＩＲＬ領域及びＩＲＳ領域のうち１以上の領域を含むものでもある。他の具体例において、前記欠失されたＩＲ領域は、ＩＲＬ領域及びＩＲＳ領域のいずれも含むものでもある。前記「ＩＲＬ領域」は、約９．２ｋｂの大きさを有することができる。前記「ＩＲＳ領域」は、約６．６ｋｂの大きさを有することができる。ＩＲＬ領域の例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ GenBank Accession Ｎｏ．ＪＱ６７３４８０．１に記載されたＨＳＶ−１ゲノム配列のうち、１１７，０８０ないし１２５，８４５番目ヌクレオチド配列でもある。ＩＲＳ領域の例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ GenBank Accession Ｎｏ．ＪＱ６７３４８０．１に記載されたＨＳＶ−１ゲノム配列のうち、１２６，２４１ないし１３２，４６３番目ヌクレオチド配列でもある。一具体例において、前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、ＩＲ領域の全部または一部が欠失されたものでもある。他の具体例において、前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、野生型ＨＳＶ−１ゲノム配列において、１１７，０８０ないし１３１，２６１番目ヌクレオチドが欠失されたものでもある。例えば、前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、ＨＳＶ−１のＩＲ領域のヌクレオチド配列のうち、配列番号２のヌクレオチド配列が欠失されたものでもある。
【００２０】
一具体例において、前記組み換えＨＳＶ−１は、ＩＲ領域の全部または一部の欠失と共に、ＵＬ５６遺伝子の一部ヌクレオチド配列が追加して欠失されたものでもある。ＵＬ５６遺伝子の例示的なヌクレオチド配列は、ＮＣＢＩ GenBank Accession Ｎｏ．ＪＱ６７３４８０．１に記載されたＨＳＶ−１ゲノム配列のうち、１１６，１４２ないし１１６，８４６番目ヌクレオチド配列でもある。他の具体例において、前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、野生型ＨＳＶ−１ゲノム配列において、１１６，２００ないし１１６，８４６番目ヌクレオチドが欠失されたものでもある。例えば、前記欠失されたＵＬ５６遺伝子の一部ヌクレオチド配列は、配列番号３のヌクレオチド配列でもある。他の具体例において、前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、野生型ＨＳＶ−１ゲノム配列において、１１６，２００ないし１３１，２６１番目ヌクレオチドが欠失されたものでもある。
【００２１】
前記「ＵＳ領域」は、約１３ｋｂの大きさを有することができる。ＨＳＶ−１のＵＳ領域は、ＵＳ１遺伝子ないしＵＳ１２遺伝子のヌクレオチド配列を含むものでもある。本発明の一様相による組み換えＨＳＶ−１は、ＵＳ領域を含み、前記ＵＳ領域は、ＵＳ１ないしＵＳ１２のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むものでもある。
【００２２】
前記「ＴＲＳ領域」は、約４ｋｂの大きさを有することができる。
【００２３】
前記組み換えＨＳＶ−１のゲノムは、配列番号４のヌクレオチド配列を含むものでもある。
【００２４】
前記組み換えＨＳＶ−１は、癌殺傷ウイルス（oncolytic virus）でもある。用語「癌殺傷ウイルス」は、「癌溶解ウイルス」、「抗癌ウイルス」と相互交換的に使用される。前記癌殺傷ウイルスは、癌細胞または腫瘍細胞を特異的に死滅させることにより、癌細胞の抗原を露出させ、免疫細胞を活性化させることができる。従って、癌殺傷ウイルスは、それ自体で抗癌用途に使用することができ、他の抗癌剤と併用し、抗癌効果を増進させることもできる。また、癌殺傷ウイルスベクターに多様な治療遺伝子を挿入し、抗癌効果を増進させることができる。
【００２５】
前記遺伝子配列は、実質的な同一性（substantial identity）、または実質的な類似性（substantial similarity）を示す遺伝子配列も含むものであると解釈される。前述の実質的な同一性は、前述の本発明の配列、と任意の他の配列とを最大限対応させるように整列し、当業界で一般的に利用されるアルゴリズムを利用して整列された配列を分析した場合、最小８０％の相同性、さらに望ましくは、９０％の相同性、最も望ましくは、９５％の相同性を示す配列を意味する。前述の実質的な類似性は、１以上の塩基の欠損または挿入のような遺伝子配列の変化が、組み換えウイルスベクターとの相同性組み換えを最小化させる本発明の目的に影響を及ぼさない変化を総称する。
【００２６】
他の様相は、前記一様相による組み換えＨＳＶ−１のゲノムヌクレオチド配列を含む組み換えＨＳＶ−１ベクターを提供する。
【００２７】
具体的には、単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）のゲノムヌクレオチド配列を含む組み換えＨＳＶ−１ベクターにおいて、前記ＨＳＶ−１のゲノムヌクレオチド配列は、ＩＣＰ６が欠失され、ＵＬ領域とＵＳ領域との間のヌクレオチド配列が欠失されたものである組み換えＨＳＶ−１ベクターを提供する。
【００２８】
用語「ウイルスベクター」は、外来または異種の遺伝情報を宿主に伝達することができるウイルス由来ベクターを意味する。
【００２９】
前述のＨＳＶ−１、組み換えＨＳＶ−１、ＩＣＰ６、ＩＲ領域及び欠失は、前述の通りである。
【００３０】
一具体例において、前記ベクターは、ＴＲＬ領域；ＵＬ１ないしＵＬ３８、及びＵＬ４０ないしＵＬ５６のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＬ領域；ＵＳ１ないしＵＳ１２のうち１以上の遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＳ領域；並びにＴＲＳ領域からなる群から選択されるＨＳＶ−１の１以上のゲノム領域のヌクレオチド配列を含むものでもある。他の具体例において、前記ベクターは、ＴＲＬ領域；ＵＬ１遺伝子ないしＵＬ３８遺伝子、及びＵＬ４０遺伝子ないしＵＬ５６遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＬ領域；ＵＳ１遺伝子ないしＵＳ１２遺伝子のヌクレオチド配列を含むＵＳ領域；並びにＴＲＳ領域をいずれも含んでもよい。
【００３１】
前記組み換えＨＳＶ−１ベクターは、外来遺伝子のヌクレオチド配列を追加して含んでもよい。一具体例において、外来遺伝子のヌクレオチド配列は、欠失されたＩＣＰ６またはＩＲ領域にも挿入される。他の具体例において、挿入する外来遺伝子が一つを超える場合、各外来遺伝子のヌクレオチド配列は、ＩＣＰ６及びＩＲ領域にそれぞれ挿入されうるが、それに限定されるものではない。前記ベクターによって運搬されうる外来遺伝子は、いかなるヌクレオチド配列も可能である。例えば、前記ベクターによって運搬されうる外来遺伝子は、抗癌効果を有する遺伝子でもあるが、それに限定されるものではない。
【００３２】
前記組み換えＨＳＶ−１ベクターは、順に、ＴＲＬ領域、ＵＬ領域、ＵＳ領域及びＴＲＳ領域のヌクレオチド配列を含み、ＩＣＰ６及びＩＲ領域が欠失されたことを特徴とする。一具体例において、前記組み換えＨＳＶ−１ベクターは、図１Ｃの遺伝子地図を有する。ＩＣＰ６及びＩＲ領域のヌクレオチド配列が欠失されたＨＳＶ−１のゲノムヌクレオチド配列を含む前記一様相による組み換えＨＳＶ−１ベクターは、「ΔＩＣＰ６ΔＩＲ ＨＳＶ−１ベクター」と命名された。
【００３３】
前記組み換えＨＳＶ−１ベクターは、ウイルスベクターに一般的に含まれる構成を追加して含んでもよい。例えば、前記組み換えＨＳＶ−１ベクターは、外来遺伝子に作動可能に連結されたプローモーターを含むものでもある。前記プローモーターの種類は、当該技術分野に公知されたものであるならば、いずれも使用することができ、その種類を限定するものではない。
【００３４】
他の様相は、前記一様相による組み換えＨＳＶ−１を製造する方法を提供する。
【００３５】
具体的には、前記方法は、ＩＣＰ６及びＩＲ領域が欠失されたＨＳＶ−１のゲノムヌクレオチド配列を含む組み換えＨＳＶ−１ベクターを製造する段階と、前記ベクターを細胞に形質感染させ、組み換えＨＳＶ−１を得る段階と、を含む。
【００３６】
前記組み換えＨＳＶ−１ベクターは、前述の通りである。
【００３７】
前記ベクターを細胞に形質感染させる方法は、当業界に公知された多様な方法を介して遂行することができる。例えば、微細注入法（Capecchi, M. R., Cell, 22: 479 (1980)、並びにHarland及びWeintraub, J. Cell Biol. 101: 1094-1099 (1985)）、リン酸カルシウム沈澱法（Graham, F. L. et al., Virology, 52: 456 (1973)、並びにChen及びOkayama, Mol. Cell. Biol. 7: 2745-2752 (1987)）、電気穿孔法（Neumann, E. et al., EMBO J., 1: 841 (1982)、及びTur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6: 716-718 (1986)）、リポソーム媒介形質感染法（Wong, T. K. et al., Gene, 10: 87 (1980)，Nicolau及びSene, Biochim. Biophys. Acta, 721: 185-190 (1982)、並びにNicolau et al., Methods Enzymol., 149: 157-176 (1987)）、ＤＥＡＥ・デキストラン処理法（Gopal, Mol. Cell Biol., 5: 1188-1190 (1985)）、そして遺伝子bombardment法（Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87: 9568-9572 (1990)）の技法により、ベクターを細胞に形質感染させることができる。
【００３８】
他の様相は、前記組み換えＨＳＶ−１または組み換えＨＳＶ−１ベクターを含む薬学的組成物を提供する。
【００３９】
他の様相は、組み換えＨＳＶ−１または組み換えＨＳＶ−１ベクターの有効量をそれを必要とする個体に投与する段階を含む、癌を予防したり治療したりする方法を提供する。
【００４０】
他の様相は、癌の予防用薬剤または治療用薬剤の製造のための組み換えＨＳＶ−１または組み換えＨＳＶ−１ベクターの用途を提供する。
【００４１】
前記組み換えＨＳＶ−１及び組み換えＨＳＶ−１ベクターは、前述の通りである。
【００４２】
前記薬学的組成物は、抗癌用薬学的組成物でもある。
【００４３】
前記疾病は、癌または腫瘍でもある。
【００４４】
前記「癌」は、細胞が正常な成長限界を無視して分裂及び成長する攻撃的（aggressive）特性、周囲組織に侵透する浸透的（invasive）特性、及び体内外の他部位に広がる転移的（metastatic）特性を有する細胞による疾病を総称する。前記癌は、悪性腫瘍（malignant tumor）または腫瘍（tumor）と同一意味に使用され、固体腫瘍及び血液腫瘍（blood born tumor）を含むものでもある。前記癌は、その種類を限定するものではない。
【００４５】
前記薬学的組成物は、既存の癌治療物質（例：抗癌剤）と併用され、癌の治療効能を向上させることができる。前記抗癌剤は、代謝拮抗剤、アルキル化剤、トポイソメラーゼ拮抗剤、微細小管拮抗剤、抗癌抗生物質、植物由来アルカロイド、抗体抗癌剤または分子標的抗癌剤でもあり、さらに具体的には、タキソール、ナイトロジェンマスタード、イマチニブ、オキサリプラチン、リツキクシマブ、エロチニブ、トラスツズマブ、ゲフィチニブ、ボルテゾミブ、スニチニブ、カルボプラチン、ソラフェニブ、ベバシズマブ、シスプラチン、セツキシマブ、ビスクムアルブム、アスパラギナーゼ、トレチノイン、ヒドロキシカルバミド、ダサチニブ、エストラムスチン、ゲムツズマブオゾガマイシン、イブリツモマブチウキセタン、ヘプタプラチン、メチルアミノレブリン酸、アムサクリン、アレムツズマブ、プロカルバジン、アルプロスタジル、硝酸ホルミウムキトサン、ゲムシタビン、ドキシフルリジン、ペメトレキセド、テガフール、カペシタビン、ギメラシル、オテラシル、アザシチジン、メトトレキセート、ウラシル、シタラビン、フルオロウラシル、フルダラビン、エノシタビン、デシタビン、メルカプトプリン、チオグアニン、クラドリビン、カルモファー、ラルチトレキセド、ドセタキセル、パクリタキセル、イリノテカン、ベロテカン、トポテカン、ビノレルビン、エトポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、テニポシド、ドキソルビン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ミトマイシン、ブレオマイシン、ダウノルビシン、ダクチノマイシン、ピラルビシン、アクラルビシン、ペプロマイシン、テモゾロマイド、ブスルファン、イホスファミド、シクロホスファミド、メルファラン、アルトレタミン、ダカバジン、チオテパ、ニムスチン、クロラムブシル、ミトラクトル、ロムスチン及びカルムスチン、イマチニブ、ゲフィチニブ、エルトチニブ、トリスツズマブ、ロシレチニブ、ネシツムマブ、エベロリムス、ラムシルマブ、ダコミチニブ、フォレチニブ、ペムブロリズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ダブラペニブ、ベリパリブ、セリチニブ、カルムスチン、シクロホスファミド、イホスファミド、イクサベピロン、メルファラン、メルカプトプリン、ミトサントロン、またはＴＳ−１でもあるが、それらに限定されるものではない。
【００４６】
前記組成物は、免疫関門抑制剤（immune checkpoint inhibitor）と同時に、別途にまたは順次にも併用投与される。前記「免疫関門」は、免疫細胞表面において、免疫反応の刺激または抑制信号を誘発するのに関与する蛋白質を総称し、癌細胞は、そのような免疫関門を介し、免疫反応の刺激、及びそれによる癌細胞の抑制が正しく進められないように操作し、免疫体系の監視網を回避することになり、すなわち、抗腫瘍免疫反応を無力化させる。前記免疫関門抑制剤は、ＰＤ−１（programmed cell death−１）、ＰＤ−Ｌ１（programmed cell death-ligand １）、ＰＤ−Ｌ２（programmed cell death−ligand ２）、ＣＤ２７（cluster of differentiation ２７）、ＣＤ２８（cluster of differentiation ２８）、ＣＤ７０（cluster of differentiation ７０）、ＣＤ８０（cluster of differentiation ８０；Ｂ７−１としても知られている）、ＣＤ８６（cluster of differentiation ８６；Ｂ７−２としても知られている）、ＣＤ１３７（cluster of differentiation １３７）、ＣＤ２７６（cluster of differentiation ２７６）、ＫＩＲｓ（killer-cell immunoglobulin-like receptors）、ＬＡＧ３（lymphocyte-activation gene ３）、ＴＮＦＲＳＦ４（tumor necrosis factor receptor superfamily member ４；ＣＤ１３４としても知られている）、ＧＩＴＲ（glucocorticoid-induced ＴＮＦＲ−related protein）、ＧＩＴＲＬ（glucocorticoid-induced ＴＮＦＲ−related protein ligand）、４−１ＢＢＬ（４−１ＢＢ ligand）及びＣＴＬＡ−４（cytolytic Ｔ lymphocyte associated antigen−４）の拮抗剤のうち１以上を含んでもよいが、それらに限定されるものではない。
【００４７】
前記薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体または希釈剤をさらに含んでもよい。薬学的に許容可能な担体または希釈剤は、当業界に知られたものでもある。前記担体または前記希釈剤は、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギネート、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微細結晶性セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロース、水（例えば、食塩水及び滅菌水）、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、滑石、ステアリン酸マグネシウム、ミネラルオイル、リンゲル液、緩衝剤、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、デキストラン、アルブミン、またはそれらの任意の組み合わせでもある。前記薬学的組成物は、潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、懸濁液剤または保存剤をさらに含んでもよい。
【００４８】
前記薬学的組成物は、当業者に知られた方法により、薬剤学的に許容される担体及び／または賦形剤を利用して製剤化させることにより、単位用量形態に製造されるか、あるいは多用量容器内に内入させても製造される。このとき、剤形は、オイル中または水性溶媒中の溶液、懸濁液、シロップ剤または乳化液形態であるかエキス剤、散剤、粉末剤、顆粒剤、錠剤またはカプセル剤の形態でもあり、分散剤または安定化剤を追加して含んでもよい。前記水性溶媒は、生理食塩水またはＰＢＳを含むものでもある。一具体例による前記薬学的組成物は、経口または非経口の投与形態、望ましくは、非経口投与形態にも製剤化される。筋肉内、腹腔内、皮下及び静脈内への投与形態の場合、一般的に、活性成分の滅菌溶液を製造し、溶液のｐＨを適するように調節することができる緩衝剤を含み、静脈内投与の場合、製剤に等張性が付与されるように等張化剤を含むものでもある。
【００４９】
前記薬学的組成物の投与量（有効量）は、製剤化方法、投与方式、患者の年齢・体重・性別・病的状態、食物、投与時間、投与経路、排泄速度及び反応感応性のような要因によっても多様に処方され、当業者であるならば、そのような要因を考慮し、投与量を適切に調節することができるであろう。可能な投与経路には、非経口（例えば、皮下、筋肉内、動脈内、腹腔内、硬膜内または静脈内）、局所（経皮含む）及び注射、あるいは移植性装置または物質挿入を含むのでもある。一具体例による治療の対象動物としては、ヒト、及びそれ以外の目的とする哺乳動物を例として挙げることができ、具体的には、ヒト、猿、マウス、ラット、兎、羊、牛、犬、馬、豚などが含まれる。
【００５０】
他の様相は、個体に、前記組み換えＨＳＶ−１または組み換えＨＳＶ−１ベクター、または前記組み換えＨＳＶ−１または組み換えＨＳＶ−１ベクターを含む薬学的組成物の有効量を投与する段階を含む癌細胞または腫瘍細胞の生存能を阻害する方法を提供する。 前記方法は、癌治療方法でもある。
【００５１】
用語「治療」は、疾患、障害または病態、またはその１以上の症状の軽減、進行抑制または予防を称するか、あるいはそれを含み、「有効成分」または「薬剤学的有効量」は、疾患、障害または病態、またはその１以上の症状の軽減、進行抑制または予防に十分な、本願で提供される発明を実施する過程で利用される組成物の任意量を意味しうる。
【００５２】
用語である「投与する」、「注入する」及び「移植する」は、相互交換的に使用され、一具体例による組成物の所望部位への少なくとも部分的局所化をもたらす方法または経路による、個体内への一具体例による組成物の配置を意味しうる。一具体例による組成物の有効成分を、生存する個体内における所望位置に伝達する任意の適切な経路によっても投与される。個体投与後、細胞の生存期間は、短ければ数時間、例えば、２４時間ないし数日、あるいは長ければ、数年でもある。
【００５３】
用語である「対象体」、「個体」及び「患者」は、脊椎動物、望ましくは、哺乳動物、さらに望ましくは、ヒトを指称するために、本願において相互交換可能に使用される。該哺乳動物は、ネズミ科、猿、ヒト、農場動物、スポーツ動物及びペットを含むが、それらに限定されるものではない。生体内で得られたり、試験管内で培養されたりする生物学的エンティティ（entity）の組織、細胞、及びそれらの子孫もまた含まれる。
【００５４】
用語である「有効量」または「治療的有効量」は、有利であるか、あるいは要望される結果を引き起こすのに十分な作用剤の量を称する。該治療的有効量は、治療される対象体及び病態、対象体の体重及び年齢、病態の重症度、投与方式などのうち１以上によっても異なり、それは、当業者によって容易に決定されるであろう。また、前記用語は、本願に記述された映像化方法のうち任意のものによる検出のためのイメージを提供する用量に適用される。特定用量は、選択された特定作用剤、続く投与療法、それらが他の化合物と併用して投与されるか否かということ、投与時期、映像化される組織、及びそれを運搬する身体伝達システムのうち１以上によっても異なる。
【発明の効果】
【００５５】
一様相による組み換えＨＳＶ−１は、ＩＣＰ６及びＩＲ領域が同時に欠失されることにより、比較的大サイズの外来遺伝子を挿入するか、あるいは多様な外来遺伝子を同時に挿入することができ、遺伝子操作が容易である。また、安全でありながらも、癌細胞殺傷効果にすぐれる抗癌ウイルスとして、癌治療分野に多様に活用されうる。
【図面の簡単な説明】
【００５６】
【図１】図１Ａは、野生型ＨＳＶ−１のゲノム模式図である。図１Ｂは、ＩＣＰ６が欠失された（ΔＩＣＰ６）ＨＳＶ−１ゲノム模式図である。図１Ｃは、ＩＣＰ６及びＩＲ領域が欠失された（ΔＩＣＰ６ΔＩＲ）ＨＳＶ−１ゲノム模式図である。
【図２】ｒｐｓＬ−ｎｅｏ遺伝子と、ＵＬ５６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏプライマー及びＵｓＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏプライマーとの位置を示した模式図である。
【図３】ΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏの模式図である。
【図４】ＵＬ５５ ＳプライマーとＵｓＩＲ−ｒｐｓＬ ｎｅｏ ＡＳプライマーとでもってＰＣＲを行い、ｒｐｓＬ−ｎｅｏの挿入いかんを確認したＰＣＲ遂行結果である。陰性対照群として、ＨＳＶ−１ＷＴを使用し、陽性対照群として、ΔＩＣＰ６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを使用した。
【図５】ｒｐｓＬ ｎｅｏ Ｓプライマー及びｒｐｓＬ ｎｅｏ ＡＳプライマーでＰＣＲを行い、ｒｐｓＬ−ｎｅｏの挿入いかんを確認したＰＣＲ遂行結果である。陰性対照群として、ＨＳＶ−１ ＷＴを使用し、陽性対照群として、ΔＩＣＰ６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを使用した。
【図６】糖蛋白質Ｃを検出するｇＣ Ｓプライマー及びｇＣ ＡＳプライマーでＰＣＲを行い、ｒｐｓＬ−ｎｅｏの挿入いかんを確認したＰＣＲ遂行結果である。陰性対照群として、ＨＳＶ−１ ＷＴを使用し、陽性対照群として、ΔＩＣＰ６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを使用した。
【図７】ＵＬ５５ Ｓプライマー及びΔＩＲ ＡＳプライマーでＰＣＲを行い、ΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスにおいて、ＩＲが十分に除去されたか否かということを確認したＰＣＲ遂行結果である。陽性対照群として、ΔＩＲウイルスを使用した。
【図８】ｒｐｓＬ−ｎｅｏ Ｓプライマー及びｒｐｓＬ−ｎｅｏ ＡＳプライマーでＰＣＲを行い、ＩＣＰ６ΔＩＲウイルスにおいて、外来遺伝子ｒｐｓＬ−ｎｅｏが十分に除去されたか否かということを確認したＰＣＲ遂行結果である。対照群として、ΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを使用した。
【図９】ＵＬ５５ Ｓプライマー及びｒｐｓＬ−ｎｅｏ Ｓ ＡＳプライマーでＰＣＲを行い、ＩＣＰ６ΔＩＲウイルスにおいて、ＩＲ及びｒｐｓＬ−ｎｅｏが十分に除去されたか否かということを確認したＰＣＲ遂行結果である。対照群として、ΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを使用した。
【図１０】ΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスの抗癌効果及び安全性を確認したグラフであり、ａは、Ａ５４９細胞で確認した結果であり、ｂは、Ｕ２５１Ｎ細胞で確認した結果であり、ｃは、ＶＥＲＯ細胞で確認した結果であり、ｄは、ＨｓｗＣ細胞で確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００５７】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【００５８】
実施例１：ＩＣＰ６及びＩＲ領域が欠失された組み換えＨＳＶ−１（ΔＩＣＰ６ΔＩＲ ＨＳＶ−１）の作製
図１Ａは、野生型ＨＳＶ−１のゲノム模式図である。ＨＳＶ−１ゲノムは、大きく見て、ＵＬ領域とＵＳ領域とに分けられる。ＵＬ領域は、１つの複製原点と、ＴＲ（terminal repeat）とＩＲ（internal repeat）とによって構成されたａ及びｂが５’に存在し、逆方向のａ及びｂが３’に存在する。ＵＳ領域は、２つの複製原点と、逆方向のｃ配列とが５’に存在し、裏側に正方向のｃが反復され、３’終端には、ａ配列がさらに一度反復される。
【００５９】
まず、野生型のＨＳＶ−１ ＷＴウイルスゲノム配列において、ＩＣＰ６一部領域が欠損されたΔＩＣＰ６ ＨＳＶ−１ウイルスを作製した。野生型ＨＳＶ−１ゲノム配列において、８６，３６４から８９，７７７番目ヌクレオチドは、ＩＣＰ６遺伝子をコーディングする配列である。該遺伝子のうち一部領域である８６，９０１ないし８９，５７８番目ヌクレオチドを当業界に公知された方法で欠損させ、それをΔＩＣＰ６ ＨＳＶ−１ウイルスと命名した。
【００６０】
図１Ｂは、ＩＣＰ６が欠失された（ΔＩＣＰ６）ＨＳＶ−１ゲノム模式図である。
【００６１】
次に、前記ΔＩＣＰ６ ＨＳＶ−１ウイルスをテンプレートにし、ＩＣＰ６及びＩＲ領域が欠損されたΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスを作製した。野生型ＨＳＶ−１ゲノム配列において、１１６，１４１ないし１１６，８４６番目ヌクレオチドは、ＵＬ５６配列であり、ＩＲ領域は、大きく見て、ｂ’（１１７，０８０ないし１２５，８４５）、ａ’（１２５，８４６ないし１２６，２４０）、ｃ’（１２６，２４１ないし１３２，４６３）で構成されている。この領域において、ＵＬ５６遺伝子の一部領域からＩＲ領域の一部領域までに該当する１１６，２００ないし１３１，２６１番目ヌクレオチドを、当業界に公知された方法で欠損させた。それを、ΔＩＣＰ６ΔＩＲ ＨＳＶ−１ウイルスと命名した。図１Ｃは、ＩＣＰ６及びＩＲ領域が欠失された（ΔＩＣＰ６ΔＩＲ）ＨＳＶ−１ゲノム模式図である。
【００６２】
実施例２：外来遺伝子ｒｐｓＬ−ｎｅｏが挿入されたΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏの作製
ＩＣＰ６遺伝子とＩＲ遺伝子とが同時に消失された前記実施例１のΔＩＣＰ６ΔＩＲ ＨＳＶ−１に、外来遺伝子であるｒｐｓＬ−ｎｅｏ遺伝子１３１９ｂｐを挿入してウイルスを作製し、外来遺伝子挿入いかんを検証した。
【００６３】
具体的には、下記表１のように、ＵＬ５６とｒｐｓＬ−ｎｅｏにと相補的な配列を有するＵＬ５６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏプライマーと、ＵｓＩＲとｒｐｓＬ−ｎｅｏとに相補的な配列を有するＵｓＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏプライマーと、を作製した。ｒｐｓＬ−ｎｅｏ遺伝子２００ｎｇをテンプレートに、１０ｐｍｏｌのＵＬ５６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏプライマー、ＵｓＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏプライマー及び２Ｘ green master mix（thermo scientific）反応酵素を使用し、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物を、前記実施例１のΔＩＣＰ６トータルベクターと共に、ＤＨ１０ｂ大腸菌に形質転換（transformation）させ、相同組み換え（homologous recombination）を誘導し、ｒｐｓＬ−ｎｅｏを発現するΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを作製した。
【００６４】
図２は、ｒｐｓＬ−ｎｅｏ遺伝子と、ＵＬ５６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏプライマー及びＵｓＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏプライマーとの位置を示した模式図である。
【００６５】
図３は、ΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏの模式図である。
【００６６】
【表１】
2021532820.tif 000003
前記相同組み換えの生成いかんを検証するために、下記表２のＰＣＲプライマーを使用し、ＰＣＲを行った。それぞれＰＣＲの条件は、次の3通りである。２００ｎｇをテンプレートにし、１０ｐｍｏｌのＵＬ５５ Ｓプライマー及びＵｓＩＲ−ｒｐｓＬ ｎｅｏ ＡＳプライマーに、２Ｘ green master mix（thermo scientific）反応酵素を添加した後、ＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−ｒａｄ）により、変性（denature）９５℃ ３０秒、アニーリング（annealing）５８℃ ３０秒、伸長（extend）７２℃ ２分の条件でＰＣＲを行った。ｒｐｓＬ−ｎｅｏ及び糖蛋白質Ｃを確認するためには、前述のところと同一混合物比率で、変性９５℃ ３０秒、アニーリング５８℃ ３０秒、伸長７２℃ ３０秒の条件でＰＣＲを行った。
【００６７】
【表２】
2021532820.tif 000004
図４は、ＵＬ５５ ＳプライマーとＵｓＩＲ−ｒｐｓＬ ｎｅｏ ＡＳプライマーとでＰＣＲを行い、ｒｐｓＬ−ｎｅｏの挿入いかんを確認したＰＣＲ遂行結果である。陰性対照群として、ＨＳＶ−１ ＷＴを使用し、陽性対照群として、ΔＩＣＰ６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを使用した。ΔＩＣＰ６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏは、２００ｎｇをテンプレートにし、１０ｐｍｏｌのＩＣＰ６Ｒ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏ Ｓプライマー及びＩＣＰ６Ｒ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏ ＡＳｐｒｉｍｅｒプライマーと、２Ｘ green master mix（thermo scientific）反応酵素とを添加した後、ＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−ｒａｄ）により、変性９５℃ ３０秒、アニーリング５８℃ ３０秒、伸長７２℃ １分３０秒の条件でＰＣＲを行った。ｒｐｓＬ−ｎｅｏのＰＣＲ産物を、野生型ＨＳＶ−１トータルベクターと共に、ＤＨ１０ｂ大腸菌に形質転換させて相同組み換えを誘導し、ΔＩＣＰ６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを作製した。その結果、作製されたΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏにおいて、陽性対照群と同一２３００ｂｐのバンドを確認したので、相同組み換えが成功に至ったことを確認した。図５は、ｒｐｓＬ ｎｅｏ Ｓプライマー及びｒｐｓＬ ｎｅｏ ＡＳプライマーでＰＣＲを行い、ｒｐｓＬ−ｎｅｏの挿入いかんを確認したＰＣＲ遂行結果である。陰性対照群として、ＨＳＶ−１ ＷＴを使用し、陽性対照群として、ΔＩＣＰ６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを使用した。その結果、作製されたΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏにおいて、陽性対照群と同一５３４ｂｐのバンドを確認したので、相同組み換えが成功に至ったことを確認した。
【００６８】
図６は、糖蛋白質Ｃを検出するｇＣ Ｓプライマー及びｇＣ ＡＳプライマーでＰＣＲを行い、ｒｐｓＬ−ｎｅｏの挿入いかんを確認したＰＣＲ遂行結果である。陰性対照群として、ＨＳＶ−１ ＷＴを使用し、陽性対照群として、ΔＩＣＰ６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを使用した。その結果、作製されたΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏにおいて、陽性対照群と同一５１２ｂｐのバンドを確認したので、相同組み換えが成功に至ったことを確認した。
【００６９】
従って、ΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスに、外来遺伝子であるｒｐｓＬ−ｎｅｏ遺伝子が成功に至るべく挿入されたことを確認した。
【００７０】
実施例３：ΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスの作製
前記実施例２で作製されたΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏにおいて、外来遺伝子ｒｐｓＬ−ｎｅｏを除去し、ΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスを作製した。
【００７１】
具体的には、下記表３のプライマーを作製した後、徐冷復元法（primer annealing）を遂行し、相補的配列が結合した二本鎖オリゴマーを作製した。作製したオリゴマーを、前記実施例２のΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏトータルベクターと共に、ＤＨ１０ｂ大腸菌に形質転換させて相同組み換えを誘導し、ｄＩＣＰ６−ｄＩＲを作製した。
【００７２】
【表３】
2021532820.tif 000005
前記外来遺伝子が除去されたΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスが成功に至るべく作製されたか否かということを確認するために、前述のＰＣＲプライマーを使用し、ＰＣＲを行った。２００ｎｇをテンプレートにし、１０ｐｍｏｌのＵＬ５５ Ｓプライマー及びΔＩＲ ＡＳプライマーに、２Ｘ green master mix（thermo scientific）反応酵素を添加した後、ＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−ｒａｄ）により、変性９５℃ ３０秒、アニーリング５８℃ ３０秒、伸長７２℃ １分の条件でＰＣＲを行った。ｒｐｓＬ−ｎｅｏを確認するためには、前述のところと同一混合物の比率で、伸長９５℃ ３０秒、アニーリング５８℃ ３０秒、伸長７２℃ ３０秒の条件でＰＣＲを行った。図７は、ＵＬ５５ Ｓプライマー及びΔＩＲ ＡＳプライマーでＰＣＲを行い、ΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスにおいて、ＩＲが十分に除去されたか否かということを確認したＰＣＲ遂行結果である。陽性対照群として、ΔＩＲウイルスを使用した。ΔＩＲウイルスは、２００ｎｇをテンプレートにし、１０ｐｍｏｌのＵＬ５６−ｒｐｓＬ−ｎｅｏプライマー及びＵｓＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏプライマーに、２Ｘ green master mix（thermo scientific）反応酵素を添加した後、ＰＣＲ機器（Ｂｉｏ−ｒａｄ）により、変性９５℃ ３０秒、アニーリング５８℃ ３０秒、伸長７２℃ １分の条件でＰＣＲを行った。ｒｐｓＬ−ｎｅｏのＰＣＲ産物を、野生型ＨＳＶ−１トータルベクターと共に、ＤＨ１０ｂ大腸菌に形質転換させて相同組み換えを誘導し、ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏウイルスを作製した。その後、プライマーΔＩＲＳとΔＩＲ ＡＳとに対し、徐冷復元法遂行した後、ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏトータルベクターと共に、ＤＨ１０ｂ大腸菌に形質転換させて相同組み換えを誘導し、ΔＩＲウイルスを作製した。
【００７３】
その結果、作製されたΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスにおいて、陽性対照群と同一１ｋｂサイズのバンドを確認したので、ＩＲが成功に至るべく除去されたことを確認した。
【００７４】
図８は、ｒｐｓＬ−ｎｅｏ Ｓプライマー及びｒｐｓＬ−ｎｅｏ ＡＳプライマーでＰＣＲを行い、ＩＣＰ６ΔＩＲウイルスにおいて、外来遺伝子ｒｐｓＬ−ｎｅｏが十分に除去されたか否かということを確認したＰＣＲ遂行結果である。対照群として、前記実施例２で作製されたΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを使用した。その結果、対照群であるΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏは、約５００ｂｐのバンドを示すところと異なり、ΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスは、バンドが生成されなかったので、外来遺伝子ｒｐｓＬ−ｎｅｏが成功に至るべく除去されたことを確認した。
【００７５】
図９は、ＵＬ５５ Ｓプライマー及びｒｐｓＬ−ｎｅｏ Ｓ ＡＳプライマーでＰＣＲを行い、ＩＣＰ６ΔＩＲウイルスにおいて、ＩＲ及びｒｐｓＬ−ｎｅｏが十分に除去されたか否かということを確認したＰＣＲ遂行結果である。対照群として、前記実施例２で作製されたΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏを使用した。その結果、対照群であるΔＩＣＰ６−ΔＩＲ−ｒｐｓＬ−ｎｅｏは、約１７００ｂｐのバンドを生成したところと異なり、ΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスは、バンドが生成されなかったので、ＩＲ及び外来遺伝子が成功に至るべく除去されたことを確認した。
【００７６】
従って、外来遺伝子が除去されたΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスが成功に至るべく作製されたことを確認した。
【００７７】
実験例１：実施例３のΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルスの抗癌効果及び安全性確認
６−ウェルプレートに、Ａ５４９（human lung cancer、ＡＴＣＣR ＣＲＭ−ＣＣＬ−１８５ＴＭ）、Ｕ２５１Ｎ（human glioma、ＡＴＣＣR）及びＶＥＲＯ（monkey normal kidney、ＡＴＣＣR ＣＣＬ−８１ＴＭ）細胞を、３．５Ｘ１０５セル／ウェルに分注し、ＨｓｗＣ（ｉＸｃｅｌｌｓ、１０ＨＵ−１８８）細胞は、３Ｘ１０５セル／ウェルに分注し、２４時間後、野生型ＨＳＶ−１、ＩＣＰ６のみ欠損されたΔＩＣＰ６、ＩＲのみ欠損されたΔＩＲ、及びＩＣＰ６とＩＲとがいずれも欠損されたΔＩＣＰ６ΔＩＲウイルス、それぞれを０．１ ＭＯＩで感染（infection）させた。
【００７８】
２４，４８，７２，１２０時間後、細胞と上澄み液とをいずれも収去し、４℃で３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。得られたペレットと上澄み液とを分離し、上澄み液は、４℃保管し、ペレットは、冷凍（freezing）／解凍（thawing）を３回反復した後、上澄み液と合わせ、さらに一度、４℃で３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、上澄み液だけ分離し、次のようにプラーク分析（plaque assay）を行った。
【００７９】
１２−ウェルプレートに、１．５Ｘ１０５で分注されたＶＥＲＯ細胞に、前述の方法で獲得した上澄み液を順次に感染させた後、８時間後、１％メチルセルロースを１ｍｌ添加した。感染させてから３日後、１％クリスタルバイオレット染色溶液（crystal violet staining solution）で染色し、プラーク数を数えた。
【００８０】
その結果、ΔＩＣＰ６ΔＩＲは、野生型ウイルスＨＳＶ−１と類似した癌細胞殺傷能を示し、ΔＩＣＰ６またはΔＩＲと比較し、さらに高い癌細胞殺傷能を示すことを確認した。また、ＨｓｗＣ細胞において、低い力価の子ウイルス（progeny virus）が生産され、人体に安全なベクターの特徴を示した。
【図１】
2021532820.tif 000006
【図２】
2021532820.tif 000007
【図３】
2021532820.tif 000008
【図４】
2021532820.tif 000009
【図５】
2021532820.tif 000010
【図６】
2021532820.tif 000011
【図７】
2021532820.tif 000012
【図８】
2021532820.tif 000013
【図９】
2021532820.tif 000014
【図１０】
2021532820.tif 000015
【配列表】
2021532820000001.app
【国際調査報告】
2021532820.tif 000016
2021532820.tif 000017
2021532820.tif 000018
2021532820.tif 000019
2021532820.tif 000020
2021532820.tif 000021
2021532820.tif 000022
2021532820.tif 000023