(57)【要約】全長ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片の合成、増幅、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための組成物及び方法を提供する。ＲＮＡの逆転写及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために増幅するための方法が提供される。さらに、樹状細胞にＲＮＡ及び相同ライセートを免疫刺激のためにロードするための方法が提供される。【選択図】図１２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１の配列を含むオリゴヌクレオチド。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドが、プライマーとしてさらに定義される、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドが、４０未満のヌクレオチドを含む、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
前記オリゴヌクレオチドが、配列番号１からなる、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
第１のプライマー及び第２のプライマーを含む組成物であって、前記第１のプライマーが、配列番号１の核酸配列を含み、前記第２のプライマーが、配列番号２の核酸配列を含む、前記組成物。
【請求項６】
前記組成物が、核酸増幅反応混合物としてさらに定義される、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
第３のプライマーをさらに含み、前記第３のプライマーが、配列番号３の核酸配列を含む、請求項５または６に記載の組成物。
【請求項８】
核酸をさらに含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記核酸がＲＮＡである、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
第１のｃＤＮＡ鎖を鋳型ｍＲＮＡから合成する方法であって、
ａ）第１のプライマーを前記鋳型ｍＲＮＡにハイブリダイズするステップであって、前記第１のプライマーが、配列番号２の核酸配列を含む、前記ステップと、
ｂ）ターミナルトランスフェラーゼ及び鋳型スイッチング活性を有する逆転写酵素を使用して前記第１のプライマーを伸長し、オリゴ（Ｃ）オーバーハングを有する部分的な第１のｃＤＮＡ鎖を生成するステップと、
ｃ）第２のプライマーを前記部分的な第１のｃＤＮＡ鎖の前記オリゴ（Ｃ）オーバーハングにハイブリダイズするステップであって、前記第２のプライマーが、配列番号１の核酸配列を含む、前記ステップと、
ｄ）前記第２のプライマーを前記鋳型として使用して、前記オリゴ（Ｃ）オーバーハングから前記部分的な第１のｃＤＮＡ鎖を伸長するステップであって、これによって前記第１のｃＤＮＡ鎖を生成する、前記ステップと、を含む、前記方法。
【請求項１１】
ｅ）前記鋳型ｍＲＮＡと第１のｃＤＮＡ鎖を分離することと、
ｆ）前記第１のｃＤＮＡ鎖に第３のプライマーをハイブリダイズすることと、
ｇ）前記第３のプライマーを伸長して第２のｃＤＮＡ鎖を生成し、それによって二本鎖ｃＤＮＡを生成することと、をさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記第２のプライマーが、配列番号１の核酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第３のプライマーが、配列番号３の核酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記鋳型ｍＲＮＡが、サンプルから得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記細胞サンプルが、腫瘍サンプルである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍サンプルが、対象からの除去後、ＲＮＡ安定化溶液中に保存される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡ安定化溶液が、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記二本鎖ｃＤＮＡからＲＮＡを合成することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１９】
前記二本鎖ｃＤＮＡからＲＮＡを前記合成することは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、第４のプライマー、第５のプライマー、及びＲＮＡポリメラーゼを添加すること、ならびに前記ＲＮＡポリメラーゼを用いて、前記二本鎖ｃＤＮＡからＲＮＡを合成すること、を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記第４のプライマーが、配列番号１の核酸配列を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記第４のプライマーが、配列番号３の核酸配列を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＲＮＡをキャッピングすることをさらに含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２４】
前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅させることをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２のプライマーが、配列番号１の核酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記第３のプライマーが、配列番号３の核酸配列を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記二本鎖ｃＤＮＡを増幅させることは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、第４のプライマー、及び第５のプライマーを添加すること、及びポリメラーゼ連鎖反応により前記ｃＤＮＡを増幅させること、を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記第４のプライマーが、配列番号１の核酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記第５のプライマーが、配列番号３の核酸配列を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅させたｃＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写して、センス鎖を増幅させたｍＲＮＡを生成することをさらに含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項３１】
前記第２のプライマーが、配列番号１の核酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記第３のプライマーが、配列番号３の核酸配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記増幅させたｃＤＮＡの前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、配列番号１及び配列番号３の配列を有するプライマーを前記増幅させたｃＤＮＡに添加すること、及び前記プライマーを前記増幅させたｃＤＮＡにハイブリダイズすることを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３４】
前記増幅させたｃＤＮＡの前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写が、ＲＮＡポリメラーゼを前記増幅させたｃＤＮＡに添加すること、及び前記ハイブリダイズされたプライマーを伸長してＲＮＡを生成することを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記増幅させたＲＮＡをキャッピングすることをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
樹状細胞集団を形質導入するための方法であって、前記方法が、前記樹状細胞集団を、１つ以上の抗原をコードする核酸と接触させることを含み、前記核酸が、請求項１８〜３５のいずれか１項に記載の方法によって生成されたＲＮＡを含む、前記方法。
【請求項３７】
前記樹状細胞集団を腫瘍細胞ライセートと接触させることをさらに含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記腫瘍細胞ライセートが、１つ以上の抗原をコードする前記核酸の配列と最小５つのアミノ酸が重複している配列を有するエピトープを有する腫瘍抗原を含む、請求項３７記載の方法。
【請求項３９】
罹患した細胞集団を有する対象に免疫応答を提供するための方法であって、
ａ）請求項３６または３７に記載の方法により作製された、抗原刺激樹状細胞集団を得ることと、
ｂ）有効量の前記抗原刺激樹状細胞集団を前記対象に投与することと、を含む、前記方法。
【請求項４０】
前記抗原刺激樹状細胞が、がん、自己免疫疾患または感染症に関連する抗原により刺激されている、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記抗原刺激樹状細胞が、少なくとも１つの腫瘍抗原で刺激されている、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
免疫チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記免疫チェックポイント阻害剤が、イピリムマブ、ペンブロリズマブまたはニボルマブである、請求項４２記載の方法。
【請求項４５】
請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号２のオリゴヌクレオチドプライマー及び／または配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーを含むキット。
【請求項４６】
がん細胞から単離された核酸をさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４７】
ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４８】
ＲＮＡ安定化溶液をさらに含む、請求項４５に記載のキット。
【請求項４９】
前記ＲＮＡ安定化溶液が、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）である、請求項４８に記載のキット。
【請求項５０】
前記キットが、ｃＤＮＡ合成キットとしてさらに定義される、請求項４５に記載のキット。
【請求項５１】
ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、逆転写酵素、及び／またはＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む、請求項５０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９，４７２号の優先権を主張し、その全体は参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００２】
配列表の組み込み
１ＫＢ（ＭｉｃｒｏｓｏｆｔＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）であり、ファイル名「ＢＡＣＭＰ０００６ＷＯ＿＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」中に含まれ、２０１８年１２月１１日に作成された配列表は、本明細書と共に電子出願され、参照により本明細書に組み込まれるものとする。
【０００３】
本発明は、概して分子生物学の分野に関する。より具体的には、本発明は、ｍＲＮＡの逆転写及びそれらの産物の増幅に関する。
【背景技術】
【０００４】
分子生物学における重要なツールは、ＤＮＡ及びＲＮＡを複製する能力である。ＤＮＡは、プライマーが、反対側の末端及び標的核酸の反対側の鎖にハイブリダイズするポリメラーゼ連鎖反応によりｉｎ  ｖｉｔｒｏで複製し、増幅することができ、また、プライマーは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。ＲＮＡは、一般にｉｎ  ｖｉｖｏにおいて一時的に存在するが、ＲＮＡに比べてはるかに安定したＤＮＡコピーを生成するために、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）によって逆転写され得る。相補的ＤＮＡまたはｃＤＮＡと呼ばれる逆転写から生成されたＤＮＡは、増幅、配列決定、ＲＮＡへの転写、クローニングのためのベクターへの組み込み、またはこれらの組み合わせを実施することができる。
ＲＮＡをＤＮＡに逆転写する様々な方法及び酵素が現在存在する。多くの場合、ｍＲＮＡ鋳型からｃＤＮＡ合成用のプライマーを設計するとき、研究者らは、ｍＲＮＡの３’末端に存在するポリ（Ａ）テールを利用する。これにより、研究者らは、プライマーの３’末端にポリ（Ｔ）配列を有するプライマーを使用でき、ｍＲＮＡからの３’配列情報の取得が非常に簡素になる。標的配列の５’末端に対応する第２のプライマーは、標準的なＰＣＲと同様に、ランダム配列または標的配列のいずれかを含む。５’プライマーの３番目の選択肢は、いくつかの逆転写酵素の固有の鋳型スイッチング活性を利用して、第２のプライマーを逆転写酵素によって生成されたポリヌクレオチドオーバーハングにハイブリダイズし、その後、第２のプライマーに相補的な鎖を合成する（例えば、米国特許第５，９６２，２７１号を参照されたい）。次に、標準的なＰＣＲ反応を使用して相補的なＤＮＡ鎖をコピーし、配列を増幅させることができる。ｃＤＮＡの合成及び増幅で使用されるプライマーとしては、プロモーターを挙げることができ、これにより、ｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの転写プロセスを使用して転写し、大量の標的ｍＲＮＡを生成できるようになる。Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成されたＲＮＡは、樹状細胞に抗原提示を誘導するために使用され得る。しかし、逆転写及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の方法は、逆転写プロセス中の高いバイアス、及び非効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に悩まされており、これらのプロセスを向上させるための改善された方法及び組成物の必要性が示されている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】米国特許第５，９６２，２７１号明細書
【発明の概要】
【０００６】
第１の実施形態では、配列番号１の配列を含むオリゴヌクレオチドが提供される。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドはプライマーとしてさらに定義される。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、４０未満のヌクレオチドを含む。特定の態様では、オリゴヌクレオチドは、配列番号１からなる。
【０００７】
さらなる実施形態では、第１のプライマー及び第２のプライマーを含む組成物が提供され、第１のプライマーは、配列番号１の核酸配列を含み、第２のプライマーは配列番号２の核酸配列を含む。いくつかの態様では、組成物は、核酸増幅反応混合物としてさらに定義される。他の態様では、組成物は、第３のプライマーをさらに含み、第３のプライマーは、配列番号３の核酸配列を含む。
【０００８】
なおさらなる実施形態では、以下のステップ：ａ）第１のプライマーを鋳型ｍＲＮＡにハイブリダイズすることであって、第１のプライマーが配列番号２の核酸配列を含む、ハイブリダイズすることと、ｂ）ターミナルトランスフェラーゼ及び鋳型スイッチング活性を有する逆転写酵素を使用して第１のプライマーを伸長し、オリゴ（Ｃ）オーバーハングを有する部分的な第１のｃＤＮＡ鎖を生成することと、ｃ）第２のプライマーを部分的第１のｃＤＮＡ鎖のオリゴ（Ｃ）オーバーハングにハイブリダイズすることであって、第２のプライマーが配列番号１の核酸配列を含む、ハイブリダイズすることと、ｄ）第２のプライマーを鋳型として使用して、オリゴ（Ｃ）オーバーハングから部分的第１のｃＤＮＡ鎖を伸長し、これによって第１のｃＤＮＡ鎖を生成することと、を含む、鋳型ｍＲＮＡから第１のｃＤＮＡ鎖を合成する方法を提供する。いくつかの態様では、方法は、ステップ、ｅ）鋳型ｍＲＮＡと第１のｃＤＮＡ鎖とを分離することと；ｆ）第１のｃＤＮＡ鎖に第３のプライマーをハイブリダイズすることと；ｇ）第３のプライマーを伸長して第２のｃＤＮＡ鎖を生成し、それにより二本鎖ｃＤＮＡを生成することと、をさらに含む。特定の態様では、第２のプライマーは、配列番号１の核酸配列を含む。いくつかの態様では、第３のプライマーは、配列番号３の核酸配列を含む。さらなる態様では、鋳型ｍＲＮＡは、サンプルから得られる。いくつかの特定の態様では、サンプルは、腫瘍サンプルである。ある特定の態様では、腫瘍サンプルは、対象からの除去後、ＲＮＡ安定化溶液中に保存される。なおさらなる態様では、ＲＮＡ安定化溶液はＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）である。
【０００９】
追加の態様では、本方法は、二本鎖ｃＤＮＡからＲＮＡを合成することをさらに含む。いくつかの態様では、二本鎖ｃＤＮＡからの合成ＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写を含む。より具体的な態様では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、第４のプライマー、第５のプライマー、及びＲＮＡポリメラーゼを加えること、ならびにＲＮＡポリメラーゼを用いて二本鎖ｃＤＮＡからＲＮＡを合成することを含む。特定の態様では、第４のプライマーは、配列番号１の核酸配列を含む。さらなる態様では、第４のプライマーは、配列番号３の核酸配列を含む。別の態様では、方法は、ＲＮＡをキャッピングすることをさらに含む。
【００１０】
特定の態様では、方法は、二本鎖ｃＤＮＡを増幅させることをさらに含む。いくつかの態様では、第２のプライマーは、配列番号１の核酸配列を含む。他の態様では、第３のプライマーは、配列番号３の核酸配列を含む。特定の態様では、二本鎖ｃＤＮＡを増幅させることは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、第４のプライマー、及び第５のプライマーを添加すること、及びポリメラーゼ連鎖反応によりｃＤＮＡを増幅させることを含む。いくつかの特定の態様では、第４のプライマーは、配列番号１の核酸配列を含む。別の態様では、第５のプライマーは、配列番号３の核酸配列を含む。
【００１１】
さらなる態様では、方法は、増幅させたｃＤＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写して、センス鎖を増幅させたｍＲＮＡを生成することをさらに含む。いくつかの態様では、第２のプライマーは、配列番号１の核酸配列を含む。特定の態様では、第３のプライマーは、配列番号３の核酸配列を含む。いくつかのさらなる態様では、増幅させたｃＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、配列番号１及び配列番号３の配列を有するプライマーを増幅させたｃＤＮＡに添加すること、及び増幅させたｃＤＮＡにプライマーをハイブリダイズさせることを含む。特定の態様では、増幅させたｃＤＮＡの  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、増幅させたｃＤＮＡにＲＮＡポリメラーゼを添加すること、及びハイブリダイズしたプライマーを伸長してＲＮＡを生成することを含む。別の態様では、方法は、増幅させたＲＮＡをキャッピングすることをさらに含む。
【００１２】
本発明のさらなる実施形態は、樹状細胞集団を形質導入する方法を提供し、本方法は、樹状細胞集団を１つ以上の抗原をコードする核酸と接触させることを含み、核酸は、上記の方法及び態様のいずれかによって生成されたＲＮＡを含む。いくつかの態様では、方法は、樹状細胞集団を腫瘍細胞ライセートと接触させることをさらに含む。別の態様では、腫瘍細胞ライセートは、１つ以上の抗原をコードする核酸の配列と最小５つのアミノ酸が重複している配列を有するエピトープを有する腫瘍抗原を含む。
【００１３】
さらに別の実施形態では、罹患細胞集団を有する対象に免疫応答を提供するための方法が提供され、本方法は、ａ）請求項３６または３７に記載の方法によって生成された、抗原刺激樹状細胞集団を得ることと、ｂ）有効量の抗原刺激樹状細胞集団を対象に投与するステップとを含む。特定の態様では、抗原刺激樹状細胞は、がん、自己免疫疾患または感染症に関連する抗原により刺激されている。いくつかの態様では、抗原刺激樹状細胞は、少なくとも１つの腫瘍抗原で刺激されている。追加の態様では、方法は、免疫チェックポイント阻害剤を投与することをさらに含む。別の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストである。特定の態様では、免疫チェックポイント阻害剤は、イピリムマブ、ペンブロリズマブまたはニボルマブである。
【００１４】
本発明のなおさらなる実施形態は、請求項１に記載のオリゴヌクレオチドプライマー、配列番号２のオリゴヌクレオチドプライマー及び／または配列番号３のオリゴヌクレオチドプライマーを含むキットを提供する。いくつかの態様では、キットは、がん細胞から単離させた核酸、ＤＮＡポリメラーゼ、及び／またはＲＮＡ安定化溶液をさらに含み得る。特定の態様では、ＲＮＡ安定化溶液はＲＮＡＬＡＴＥＲ（登録商標）である。別の態様では、キットは、ｃＤＮＡ合成キットとしてさらに定義される。追加の態様では、キットは、ｄＮＴＰ、ＭｇＣｌ２、逆転写酵素、及び／またはＲＮａｓｅ阻害剤をさらに含む。
【００１５】
本明細書で使用する場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」とは、特定の成分がいずれも意図的に組成物に配合されておらず、かつ／または汚染物質としてまたは微量でのみ存在することを意味するために本明細書で使用される。組成物のあらゆる意図しない汚染から生じる特定の成分の総量は、好ましくは０．０１％未満である。最も好ましいのは、特定の成分の量がいずれも標準分析方法で検出され得ない組成物である。
【００１６】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。用語「含む」と共に使用されるとき、明細書及び特許請求の範囲で使用される単語「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。明細書及び特許請求の範囲で使用されるとき、「別の」または「さらなる」は、少なくとも第２またはそれ以上を意味し得る。
【００１７】
本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「約」という用語は、値が、デバイスのエラーの固有の変動を含み、その方法では、その値を決定するために使用されるか、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００１８】
本発明の他の目的、特徴、及び利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかし、この詳細な説明及び具体的実施例では、本発明の趣旨及び範囲内の様々な変更及び修正が、この詳細な説明から当業者に明らかになるため、本発明の特定の実施形態を示しながら、例示としてのみ与えられている。
【００１９】
以下の図面は、本明細書の一部をなし、かつ本発明の特定の態様をさらに示すために含まれる。本発明は、これらの図面のうちの１つ以上を本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて参照することによって、より良く理解され得る。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】新たに採取した腫瘍サンプルでは、凍結保存サンプルよりも高品質のＲＮＡを生成する。凍結腫瘍組織または新鮮な腫瘍組織のいずれかから単離させたＲＮＡを非変性１％アガロースゲルで泳動させた写真を示す図である。左から右へ：Ｌ：ラダー。１：凍結腫瘍サンプルＲＮＡ；２凍結腫瘍サンプルＲＮＡ；３：凍結腫瘍サンプルＲＮＡ；４：新鮮な腫瘍サンプルＲＮＡ。
【図２】２つの異なるＲＮＡ単離方法の比較を示す図である。写真のＲＮＡサンプルは、非変性１％アガロースゲルで泳動させた。レーン１：カラム精製により３０ｍｇの腫瘍組織から単離されたＲＮＡである。レーン２：グアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルム精製により３０ｍｇの腫瘍組織から単離されたＲＮＡである。
【図３】本発明で使用される逆転写のプロセスを示す概略図であり、使用されるプライマーを示している。ＶＫＷＤプライマーは、配列番号１のヌクレオチド配列を有する。ＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴプライマーは、配列番号２のヌクレオチド配列を有する。Ｔ７パワースイッチプライマーは、配列番号３のヌクレオチド配列を有する。
【図４】逆転写及びその後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写の方法を比較したものを示す図である。写真では、４つの異なるプロトコルを使用して、同一の出発物質からｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写させたＲＮＡを生成した。レーン１、Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ法（Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）によって生成されたキャップ構造を有さない転写産物である。レーン２、Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ法（Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）によって生成されたキャップ構造を有する転写産物である。レーン３、本明細書に記載の方法により生成されたキャップ構造を有さないＲＮＡである。レーン４、本明細書に記載の方法により生成されたキャップ構造を有するＲＮＡである。
【図５】２つの異なる方法で生成し、キャッピングしたｍＲＮＡの比較を示す図である。５ｕｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写ｍＲＮＡを１％アガロース非変性ゲルで泳動させた。レーン１、以前の方法（Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）によって生成され、転写後キャップ構造を有するｍＲＮＡを示す。レーン２、現在の方法で生成され、共転写的にキャッピングされたｍＲＮＡを示す。
【図６】ＩＦＮγ産生は、キャップ構造を有するｍＲＮＡ及びライセートがロードされた樹状細胞と共培養させたＴ細胞によって著しく増強されることを示す図である。写真には、以前の方法（Ａｒｇｏｓ（Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ））または現在の方法（ＶＫＷＤ）で生成されたキャップ構造を有さないまたはキャップ構造を有するｍＲＮＡ及びライセート、または不一致のｍＲＮＡ及びライセートをロードした細胞についてＥＬＩＳＡにより測定したＩＦＮ−γ分泌の相対量を示す。
【図７】抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞の産生は、キャップ構造を有するｍＲＮＡ及びライセートを相同的にロードした樹状細胞と共培養したときに増大することを示す図である。写真では、データの下に示されている、ｍＲＮＡがロードされた樹状細胞による再刺激後、抗原特異的活性化マーカーについてのＴ細胞のフローサイトメトリー分析を示す。
【図８】樹状細胞ライセートのウエスタンブロット分析を示す図である。レーン１：非ロード樹状細胞。レーン２：Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ法を使用して生成されたキャップ構造を有さないｍＲＮＡをロードさせた樹状細胞。レーン３：Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ法を使用して生成されたキャップ構造を有するｍＲＮＡをロードさせた樹状細胞。レーン４：本明細書に記載の方法を使用して生成された、キャップ構造を有さないｍＲＮＡをロードさせた樹状細胞。レーン５：本明細書に記載の方法を使用して生成された、キャップ構造を有するｍＲＮＡをロードさせた樹状細胞。レーン６：不一致のｍＲＮＡ及びライセートをロードさせた樹状細胞。レーン７：本明細書に記載の方法を使用して生成され、共転写的にキャップ構造を有するｍＲＮＡをロードさせた樹状細胞。
【図９】Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び増幅させたｍＲＮＡをロードした相同抗原により、ＣＴＬＡ４の保持が増大することを示す図である。写真は、ロードされていないかまたは指し示されたｍＲＮＡ、ライセート、２ｘ（ｍＲＮＡ及びライセート）、ならびにＭＭ（不一致のｍＲＮＡ及びライセート）がロードされた樹状細胞のフローサイトメトリー分析である。
【図１０】相同的にロードされた樹状細胞のＣＴＬＡ４の保持の増大及びその樹状細胞からのＣＴＬＡ４放出の減少を示す図である。写真は、樹状細胞培養物の上清またはライセート中のＣＴＬＡ４を検出するウエスタンブロットである。樹状細胞は、ロードされていない（ＵＬ）か、またはｍＲＮＡ、ライセート、その両方、もしくは不一致のｍＲＮＡ及びライセートがロードされている。ｍＲＮＡはカラムベースの方法またはグアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルム法のいずれかにより単離させた。
【図１１】ライセート及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡが相同的にロードされた樹状細胞において、ＩＬ−１２転写産物レベルが上昇していることを示す図である。指し示されたＲＮＡ及び／またはライセートをロードした樹状細胞について、ＥＬＩＳＡによって検出されたＩＬ−１２ａ及びＩＬ−１２ｂレベルを示す。左軸には、ロードされていない対照ＤＣに正規化され、１．０に設定した任意の転写単位を示す。
【図１２】樹状細胞ワクチンの調製を説明するフローチャートを示す図である。
【図１３Ａ】増幅ｍＲＮＡは、相同ライセートと共にＤＣにロードさせたとき、ネイティブポリＡ  ｍＲＮＡと同じ効率で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＴＨ１免疫応答が生じることを示す図である。単球由来のヒトＤＣに、ａ）ネイティブポリＡ腫瘍ｍＲＮＡ及び相同／異種ライセート、または２）キャップ構造を有するＩＶＴ増幅ｍＲＮＡ及び相同／異種ライセートをロードした。次に、ＤＣをＴ細胞と共培養し、活性化されたＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｉｆｎｇ＋細胞の割合をフローで分析した。ロードされていないＤＣまたはキャップ構造を有さないｍＲＮＡがロードされたＤＣと共培養したＴ細胞は、対照として機能させた。
【図１３Ｂ】増幅ｍＲＮＡは、相同ライセートと共にＤＣにロードさせたとき、ネイティブポリＡ  ｍＲＮＡと同じ効率で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいてＴＨ１免疫応答が生じることを示す図である。ポリＡｍＲＮＡまたはＩＶＴ増幅ｍＲＮＡ及び相同または異種細胞ライセートの様々な組み合わせをロードしたＤＣを４８時間成熟させ、細胞内ＣＴＬＡ４レベルをフローサイトメトリーで分析した。単独でロードされたＤＣ及びロードされていないＤＣが対照として機能する。細胞内ＣＴＬＡ−４の上方制御は、保持の増大及びそれによる分泌の減少を示す。ＵＬ−非ロードＤＣ、キャップ構造を有さないｍＲＮＡ−キャップ構造を有さないＩＶＴ  ｍＲＮＡをロードしたＤＣ、ｍＲＮＡ−ポリＡ  ｍＲＮＡをロードしたＤＣ、ライセート−ライセートをロードしたＤＣ、２ｘｗ／キャップ構造を有さない−キャップ構造を有さないＩＶＴ  ｍＲＮＡ及び相同ライセートをロードしたＤＣ、２ｘキャップ構造を有する−キャップ構造を有するＩＶＴ  ｍＲＮＡ及び相同ライセートがロードされたＤＣ、キャップ構造を有さないＭＭ−キャップ構造を有さないＩＶＴ  ｍＲＮＡ及び異種ライセートがロードされたＤＣ、キャップ構造を有するＭＭ−キャップ構造を有するＩＶＴ  ｍＲＮＡ及び異種ライセートがロードされたＤＣ。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
逆転写は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼがＲＮＡを鋳型として使用してＤＮＡを合成するプロセスであり、遺伝子発現を理解し、かつ細胞ＲＮＡの配列決定を行うための分子生物学のツールとしてますます重要になっている。逆転写後のｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写及び増幅のプロセスを使用することで、鋳型ＲＮＡから大量のＲＮＡを生成できる。しかし、バイアスを減少させ、逆転写プロセスの効率を高める方法が必要とされている。
【００２２】
したがって、特定の実施形態では、本開示は、逆転写プロセスのバイアスを減少させるための方法を提供し、逆転写された分子の増幅効率を高める方法を提供する。特に、本研究では、効率的なｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のために、プライマーのヌクレオチド組成及び配列が、逆転写プロセス及びプライマーでのプロモーター配列の組み込みにとって重要であることを見出した。
【００２３】
具体的には、いくつかの実施形態では、全長ｃＤＮＡまたはｃＤＮＡ断片の合成、増幅、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のための組成物及び方法を提供する。この方法は、ＲＮＡを、ｍＲＮＡのポリ（Ａ）テールにアニーリングできるプライマー、逆転写酵素活性を有する好適な酵素、及びｍＲＮＡ鋳型に相補的なｃＤＮＡであるプライマーの鋳型依存性伸長を可能にするのに十分な条件下で鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドと接触させることを含み得る。鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドは、新しく生成されたｃＤＮＡの３’末端で逆転写酵素により生成されたオーバーハングにハイブリダイズし、逆転写酵素がｃＤＮＡの３’末端にある鋳型スイッチングオリゴヌクレオチドの補体を合成し続けることができるようになる。その後の増幅により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のためにプロモーター配列を導入することができる。次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたＲＮＡを、免疫刺激のために相同ライセートと共に樹状細胞にロードすることができる。したがって、さらなる実施形態では、樹状細胞をロードするための方法、及びがんなどの疾患の治療のために樹状細胞ワクチンを使用すること提供する。
【００２４】
定義
本明細書で使用される「増幅」は、ヌクレオチド配列（複数可）のコピー数を増加させるためのｉｎ  ｖｉｔｒｏプロセスを指す。核酸増幅の結果、ヌクレオチドがＤＮＡまたはＲＮＡに取り込まれる。本明細書で使用されるように、１つの増幅反応は、多くのラウンドのＤＮＡ複製から構成され得る。例えば、１つのＰＣＲ反応は、３０〜１００サイクルの変性及び複製で構成され得る。
【００２５】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長により特定のＤＮＡ配列をｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅させるための反応を意味する。換言すると、ＰＣＲは、プライマー結合部位が隣接している標的核酸の複数のコピーまたは複製を作製するための反応であり、そのような反応は、以下のステップの１つ以上の繰り返しを含む：（ｉ）標的核酸を変性すること、（ｉｉ）プライマーをプライマー結合部位へアニーリングすること、及び（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下で核酸ポリメラーゼによりプライマーを伸長させること。通常、反応はサーマルサイクラー装置での各ステップに最適化された異なる温度により循環する。特定の温度、各ステップにおける期間、及びステップ間の変化速度は、当業者に周知である多くの要因に依存し、例えば、参考文献：ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｉｔｏｒｓ，ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｎｄ  ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９１及び１９９５）によって例示されている。
【００２６】
「プライマー」は、ポリヌクレオチド鋳型と二本鎖を形成するときに、核酸合成の開始点として作用し、かつその鋳型に沿ってその３’末端から伸張することができ、それにより伸長二本鎖が形成されるように、天然または合成のいずれかであるオリゴヌクレオチドを意味する。伸長プロセス中に付加されるヌクレオチドの配列は、鋳型ポリヌクレオチドの配列によって決定する。通常、プライマーはＤＮＡポリメラーゼによって伸長される。プライマーは、一般に、プライマー伸長産物の合成におけるその使用に適合する長さであり、通常、長さが８〜１００ヌクレオチドの範囲、例えば、１０〜７５、１５〜６０、１５〜４０、１８〜３０、２０〜４０、２１〜５０、２２〜４５、２５〜４０などであり、より典型的には１８〜４０、２０〜３５、２１〜３０ヌクレオチド長の範囲、及び記載された範囲の間の任意長さである。典型的なプライマーは、１０〜５０ヌクレオチド長の範囲、例えば１５〜４５、１８〜４０、２０〜３０、２１〜２５など、及び指定された範囲の間の任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、プライマーは通常、長さが約１０、１２、１５、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、または７０ヌクレオチド以下である。
【００２７】
本明細書で使用される「組み込む」とは、核酸ポリマーの一部になることを意味する。
【００２８】
本明細書で使用される「外因性操作がない場合」という用語は、核酸分子が修飾されている溶液を変更することなく、核酸分子の修飾が存在することを指す。特定の実施形態では、修飾は、ヒトの手の不在下で、または緩衝液条件とも呼ばれ得る溶液条件を変化させる機械の不在下で起こる。しかし、修飾中に温度変化が生じ得る。
【００２９】
「ヌクレオシド」は、塩基−糖の組み合わせ、すなわち、リン酸を有さないヌクレオチドである。当技術分野では、ヌクレオシド及びヌクレオチドという用語の使用には一定の相互交換性があることが認識されている。例えば、ヌクレオチドのデオキシウリジン三リン酸、ｄＵＴＰは、デオキシリボヌクレオシド三リン酸である。ＤＮＡに組み込まれた後、ｄＵＴＰは、ＤＮＡモノマーとして機能し、正式にはデオキシウリジル酸、すなわちｄＵＭＰまたはデオキシウリジン一リン酸になる。結果として得られるＤＮＡ内にｄＵＴＰ部分がない場合であっても、ｄＵＴＰをＤＮＡに組み込むと言うことができる。同様に、たとえそれが基質分子の一部のみである場合も、デオキシウリジンをＤＮＡに組み込むと言うことができる。
【００３０】
本明細書で使用される「ヌクレオチド」は、塩基−糖−リン酸の組み合わせを指す技術用語である。ヌクレオチドは、核酸ポリマー、すなわち、ＤＮＡ及びＲＮＡのモノマー単位である。この用語としては、ｒＡＴＰ、ｒＣＴＰ、ｒＧＴＰ、またはｒＵＴＰなどのリボヌクレオチド三リン酸、及びｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＧＴＰ、またはｄＴＴＰなどのデオキシリボヌクレオチド三リン酸が挙げられる。
【００３１】
「核酸」または「ポリヌクレオチド」という用語は一般に、例えば、ＤＮＡ（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」及びシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ（例えば、「Ａ」、「Ｇ」、ウラシル「Ｕ」及びＣ）に見られる天然に存在するプリンまたはピリミジン塩基など、少なくとも１つの核酸塩基を含む、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡキメラまたはその誘導体もしくは類似体の少なくとも１つの分子または鎖を指す。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」を包含する。本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という２つの技術用語を集合的かつ互換的に指す。オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドとは異なる技術用語であるが、それらの間に正確な境界線はなく、それらは本明細書では同義的に使用されることに留意されたい。「アダプター」という用語は、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語と同義的に使用され得る。さらに、用語「アダプター」は、直鎖状アダプター（一本鎖もしくは二本鎖のいずれか）またはステムループアダプターを示し得る。これらの定義は一般に少なくとも１つの一本鎖分子を指すが、特定の実施形態では、少なくとも１つの一本鎖分子に部分的、実質的、または完全に相補的である少なくとも１つの追加の鎖も包含する。したがって、核酸は、分子の鎖を含む特定の配列の１つ以上の相補鎖（複数可）または「補体（複数可）」を含む少なくとも１つの二本鎖分子または少なくとも１つの三本鎖分子を含み得る。本明細書で使用する場合、一本鎖核酸は接頭辞「ｓｓ」によって示し、二本鎖核酸は接頭辞「ｄｓ」によって示す。
【００３２】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」は、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という２つの技術用語を集合的かつ互換的に指す。オリゴヌクレオチドとポリヌクレオチドとは異なる技術用語であるが、それらの間に正確な境界線はなく、それらは本明細書では同義的に使用されることに留意されたい。「アダプター」という用語は、「オリゴヌクレオチド」及び「ポリヌクレオチド」という用語と同義的に使用され得る。
【００３３】
「核酸分子」または「核酸標的分子」は、標準的な基準塩基、高次修飾塩基、非天然塩基、またはそれらの塩基の任意の組み合わせなど、任意の一本鎖または二本鎖核酸分子を指す。例えば、これらに限定するものではないが、核酸分子は、４つの基準ＤＮＡ塩基−アデニン、シトシン、グアニン、及びチミン、ならびに／または４つの基準ＲＮＡ塩基−アデニン、シトシン、グアニン、及びウラシルを含む。ヌクレオシドが２’−デオキシリボース基を含む場合、ウラシルがチミンの代わりに使用され得る。核酸分子は、ＲＮＡからＤＮＡへ、及びＤＮＡからＲＮＡへと変換され得る。例えば、これらに限定するものではないが、ｍＲＮＡは、逆転写酵素を使用して相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に作製でき、ＤＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼを使用してＲＮＡに作製できる。核酸分子は、生物学的起源または合成起源であり得る。核酸分子の例としては、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド、増幅させたＤＮＡ、既存の核酸ライブラリーなどが挙げられる。核酸は、血液、血清、血漿、脳脊髄液、頬の擦過、生検、精液、尿、糞便、唾液、汗などのヒトのサンプルから取得できる。核酸分子は、修復処理及び断片化処理など、様々な処理に供してもよい。断片化処理としては、機械的、音波及び流体力学的剪断が挙げられる。修復処理としては、伸長及び／またはライゲーションによるニックの修復、平滑末端を作製するための研磨のほか、脱アミノ化、誘導体化、脱塩基、または架橋ヌクレオチドなどの損傷した塩基の除去などが挙げられる。目的の核酸分子はまた、化学修飾（例えば、亜硫酸水素塩変換、メチル化／脱メチル化）、伸長、増幅（例えば、ＰＣＲ、等温など）などに供されてもよい。
【００３４】
プリン及びピリミジンの「類似」形態は当技術分野で周知であり、これらに限定されないが、アジリジニルシトシン、４−アセチルシトシン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウラシル、５−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、イノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデニン、１−メチルアデニン、１−メチルシュードウラシル、１−メチルグアニン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアニン、２−メチルアデニン、２−メチルグアニン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、７−メチルグアニン、５−メチルアミノメチルウラシル、５−メトキシアミノメチル−２−チオウラシル、β−Ｄ−マンノシルケオシン、５−メトキシウラシル、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、シュードウラシル、クオシン、２−チオシトシン、５−メチル−２−チオウラシル、２−チオウラシル、４−チオウラシル、５−メチルウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、及び２，６−ジアミノプリンが挙げられる。核酸分子はまた、１つ以上の超修飾塩基、例えば、これらに限定されないが、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−ヒドロキシウラシル、ａ−プトレシニルチミン、５−ヒドロキシメチルシトシン、５−ヒドロキシシトシン、５−メチルシトシン、Ｎ４−メチルシトシン、２−アミノアデニン、ａ−カルバモイルメチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２，６−ジアミンプリン（２，６−ｄｉａｍｉｎｐｕｒｉｎｅ）、及びＮ７−メチルグアニンを挙げることができる。核酸分子はまた、例えばこれらに限定されないが、７−デアザ−７−ヒドロキシメチルアデニン、７−デアザ−７−ヒドロキシメチルグアニン、イソシトシン（ｉｓｏＣ）、５−メチルイソシトシン、及びイソグアニン（ｉｓｏＧ）など、１つ以上の非天然塩基を含み得る。基準、超修飾、非天然塩基、またはそれらの塩基の任意の組み合わせのみを含む核酸分子は、例えば、これらに限定されないが、ヌクレオチド残基間の各連結が、標準的なホスホジエステル連結からなることができ、さらに、非架橋酸素原子の窒素原子への置換（すなわち、ホスホルアミデート連結、硫黄原子（すなわち、ホスホロチオエート連結）、またはアルキルもしくはアリール基（すなわち、アルキルもしくはアリールホスホネート）、架橋酸素原子の硫黄原子への置換（すなわち、ホスホロチオレート）、ホスホジエステル結合のペプチド結合への置換（すなわち、ペプチド核酸またはＰＮＡ）、または１つ以上の追加の共有結合の形成（すなわち、ロックされた核酸もしくはＬＮＡ）を含んでもよく、これは、リボース糖の２’−酸素と４’−炭素の間に追加の結合を有する。
【００３５】
「相補的」または「補体（複数可）」である核酸は、標準的なワトソン−クリック、フーグスティーンまたは逆フーグスティーン結合相補性規則に従って塩基対形成できるものである。本明細書で使用される場合、用語「相補的」または「補体（複数可）」は、上記の同じヌクレオチド比較によって評価され得るように、実質的に相補的である核酸を指し得る。「実質的に相補的」という用語は、連続する核酸塩基の少なくとも１つの配列を含むか、または１つ以上の核酸塩基部分が分子内に存在しない場合、半連続的な核酸塩基は、すべての核酸塩基が対応する核酸塩基と塩基対を形成していない場合であっても、少なくとも１つの核酸鎖または二重鎖にハイブリダイズできる核酸を指す。特定の実施形態では、「実質的に相補的な」核酸は、核酸塩基配列の約７０％、約７１％、約７２％、約７３％、約７４％、約７５％、約７６％、約７７％、約７７％、約７８％、約７９％、約８０％、約８１％、約８２％、約８３％、約８４％、約８５％、約８６％、約８７％、約８８％、約８９％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％〜約１００％、及びその中の任意の範囲が、ハイブリダイゼーション中に少なくとも１つの一本鎖または二本鎖の核酸分子と塩基対を形成することができる少なくとも１つの配列を含む。特定の実施形態では、用語「実質的に相補的」は、ストリンジェントな条件で少なくとも１つの核酸鎖または二重鎖にハイブリダイズし得る少なくとも１つの核酸を指す。特定の実施形態では、「部分的に相補的な」核酸は、低ストリンジェント条件で少なくとも１つの一本鎖または二本鎖核酸にハイブリダイズし得る少なくとも１つの配列を含むか、または核酸塩基配列の約７０％未満がハイブリダイゼーション中に少なくとも１つの一本鎖または二本鎖の核酸分子と塩基対を形成することができる少なくとも１つの配列を含む。
【００３６】
「非相補的」という用語は、特定の水素結合を介して少なくとも１つのワトソンクリック塩基対を形成する能力を有さない核酸配列を指す。
【００３７】
本明細書で使用される「平滑末端」という用語は、５’末端及び３’末端を有するｄｓＤＮＡ分子の末端を指し、５’末端及び３’末端は同じヌクレオチド位置で終結する。したがって、平滑末端は５’または３’オーバーハングを含まない。
【００３８】
本明細書で使用される「オーバーハング」という用語は、５’末端及び３’末端を有するｄｓＤＮＡ分子の末端を指し、５’末端及び３’末端が異なるヌクレオチド位置で終結し、これにより５’末端及び３’末端のいずれかの末端にそれらと水素結合するヌクレオチドを有さない少なくとも１つのヌクレオチドが残存している。
【００３９】
本明細書で使用される「キャップ」という用語は、その５’−炭素を介して三リン酸基に結合し、次いで、一次ｍＲＮＡ転写産物のほとんどの５’−ヌクレオチドの５’−炭素に結合するグアニンヌクレオシドであり、ほとんどの真核生物では、キャップヌクレオチド内のグアニンの７位にある窒素がメチル化される。ほとんどの真核生物の細胞のｍＲＮＡ転写産物及びほとんどの真核生物のウイルスのｍＲＮＡ転写産物は、５’末端でブロックされているかまたは「キャップ構造を有する」。ｍＲＮＡに加えて、これらに限定されないが、核内低分子ＲＮＡ（「ｓｎＲＮＡ」）及びプレマイクロＲＮＡ（すなわち、「プレｍｉＲＮＡ」、プロセシングを受けてｍｉＲＮＡになる一次転写産物）などの真核生物ＲＮＡの他の形態もキャップ構造を有する。真核生物の細胞性及びウイルス性ｍＲＮＡ（及びＲＮＡの他のいくつかの形態）の５’キャップは、ＲＮＡの安定性及びプロセシングにおいて重要な役割を果たす。例えば、キャップは、核内のＲＮＡ転写産物のプロセシング及び成熟、核から細胞質へのｍＲＮＡの輸送、ｍＲＮＡ安定性、及びタンパク質へのｍＲＮＡの効率的な翻訳のために、それらの程度を変更するために必要とされる。
【００４０】
「サンプル」とは、目的の核酸を含む、新鮮なまたは保存された生物学的サンプルまたは合成によって作製された供給源から取得されたまたは単離された物質を意味する。特定の実施形態では、サンプルは、データまたは情報が求められる可変免疫領域（複数可）を含む生物学的物質である。サンプルには、少なくとも１つの細胞、胎児細胞、細胞培養、組織標本、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙液、膣分泌物、汗、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹腔液、腹水液、便物質、体液、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊水、胚組織、多細胞胚、ライセート、抽出物、溶液、または目的の免疫核酸を含んでいる疑いがある反応混合物を挙げることができる。サンプルとしてはまた、非ヒト霊長類、げっ歯類及び他の哺乳動物、他の動物、植物、真菌、細菌、及びウイルスなどの非ヒト供給源を挙げることができる。
【００４１】
ヌクレオチド配列に関して本明細書で使用される場合、「実質的に公知である」は、その増幅など、核酸分子の調製を可能にするために十分な配列情報を有することを指す。これは典型的には約１００％であるが、いくつかの実施形態では、アダプター配列の一部はランダムであるか、または縮退している。したがって、特定の実施形態では、実質的に公知であるとは、約５０％〜約１００％、約６０％〜約１００％、約７０％〜約１００％、約８０％〜約１００％、約９０％〜約１００％、約９５％〜約１００％、約９７％〜約１００％、約９８％〜約１００％、または約９９％〜約１００％を指す。
【００４２】
実施形態の核酸
本開示の核酸は、増幅、逆転写、及び／またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写プライマー及びオリゴヌクレオチド、腫瘍由来の核酸、及び／または腫瘍もしくは腫瘍細胞に対して有効である免疫応答を誘導し得るものなどの１つ以上のタンパク質またはペプチドをコードする組換え核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、免疫応答を誘導し得る核酸の生成は、ｃＤＮＡを生成するための標的ｍＲＮＡの逆転写を含む。逆転写の方法は当技術分野でよく知られている（米国特許第５，９６２，２７１号及び６，５１８，０１９号、参照により本明細書に組み入れられる）。逆転写は、逆転写酵素としても公知であるＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによって行われる。逆転写酵素は、標的ｍＲＮＡの３’末端にハイブリダイズしたプライマーに結合し、ｍＲＮＡに相補的なＤＮＡを合成する。逆転写酵素では、新たに合成されたｃＤＮＡの３’末端に、短いポリ（Ｃ）テールなどのいくつかの非鋳型ヌクレオチドを追加し得る。第２のプライマーは、新生ｃＤＮＡの３’末端にハイブリダイズされ得、逆転写酵素は、第２のプライマーをその鋳型として使用するための鋳型スイッチ活性を使用して、プライマーに相補的なＤＮＡの合成を継続し得る。
【００４３】
逆転写または増幅で使用されるプライマーまたはオリゴヌクレオチドでは、相補鎖合成中に、標的配列の５’末端及び３’末端への外因性ＤＮＡまたはＲＮＡ配列の付加が可能になり得る。逆転写または増幅反応を抗原刺激するために使用されるプライマーまたはオリゴヌクレオチドは、これらに限定されないが、転写プロモーター、リボソーム結合部位、または制限エンドヌクレアーゼ切断部位など、様々な特徴を組み込んでもよい。いくつかの実施形態では、プライマーは、転写プロモーター配列を含み得る。
【００４４】
逆転写により調製されたｃＤＮＡは、ＲＮＡに増幅または転写することができる。ｃＤＮＡの濃度を上昇させるために、ｃＤＮＡは、ＰＣＲによって増幅され得る。逆転写用のプライマーは、ＰＣＲ用のプライマーとして使用してもよく、または別のプライマーを追加してもよい。ＰＣＲ反応では、ｃＤＮＡを増幅させるために逆転写酵素を利用してもよく、またはＤＮＡ増幅の効率を高めるために、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを追加してもよい。逆転写またはＤＮＡ増幅のためのプライマーとしては、Ｔ７プロモーター配列などの転写プロモーター配列を挙げることができる。ｃＤＮＡまたは増幅させたｃＤＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写プロセスで転写されて、ＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ７−ＦＬＡＳＨ（登録商標）（ＬＵＣＩＧＥＮ（登録商標）カタログ番号ＡＳＦ３２５７）などの任意の市販のＲＮＡポリメラーゼまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写キットを使用して大量の初期標的ＲＮＡを生成し得る。
【００４５】
特定の実施形態では、核酸組成物は、腫瘍由来の核酸集団及び組換え核酸成分の両方を含む。この組み合わせ核酸組成物により、既知の腫瘍抗原が増加する、または本明細書に記載される方法及び組成物の有効性を高めるタンパク質またはペプチドをコードする特定のまたは他の核酸が増加する。
【００４６】
「腫瘍由来の」核酸は、その起源が腫瘍細胞内にあり、かつ腫瘍抗原（複数可）に対応しているＲＮＡを含む核酸を指す。腫瘍抗原または以前に同定された腫瘍抗原の全てまたは一部分をコードするＲＮＡが含まれる。このような核酸は、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写」できる。例えば、逆転写され得、ＰＣＲにより増幅され得、その後、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、ｃＤＮＡをクローニングするかまたはクローニングせずに転写され得るｃＤＮＡを生成する。また、腫瘍細胞の分画調製物として提供されるＲＮＡも含まれる。未分画ＲＮＡ調製物（例えば、総ＲＮＡまたは総ポリＡＲＮＡ）であっても使用可能であるため、腫瘍抗原を同定する必要はない。一実施形態では、細胞の非ＲＮＡ成分（複数可）に関して、調製物を分画させる。これは、タンパク質、脂質及び／またはＤＮＡなどの非ＲＮＡ成分の濃度を低下させて、ＲＮＡの調製物を富化するためである。所望であれば、ＲＮＡに関して調製物を（例えば、サブトラクティブハイブリダイゼーションによって）さらに分画して、「腫瘍特異的」または「病原体特異的」ＲＮＡが生成されるようにする。
【００４７】
「腫瘍特異的」ＲＮＡとは、未分画の腫瘍由来のＲＮＡに対して、非腫瘍細胞と比較して腫瘍細胞内に優先的に存在している高含有量のＲＮＡを有するＲＮＡサンプルを意味する。例えば、腫瘍特異的ＲＮＡとしては、腫瘍細胞内には存在するが非腫瘍細胞内には存在しないＲＮＡが挙げられる。また、この定義には、腫瘍細胞内及び非腫瘍細胞内の両方に存在するが、非腫瘍細胞内よりも腫瘍細胞内において高レベルで存在するＲＮＡを含むＲＮＡサンプルが包含される。また、この定義には、以前に同定された腫瘍抗原をコードし、例えばプラスミドから、またはＰＣＲによってｉｎｖｉｔｒｏで生成されるＲＮＡも含まれる。あるいは、腫瘍サンプルを分画することにより、腫瘍抗原に対応するＲＮＡの割合が、未分画腫瘍由来のＲＮＡと比較して増加するように、腫瘍特異的ＲＮＡを調製することができる。例えば、腫瘍特異的ＲＮＡは、非腫瘍細胞からのＲＮＡに対する従来のサブトラクティブハイブリダイゼーション技術を使用して腫瘍由来ＲＮＡを分画することにより調製することができる。
【００４８】
腫瘍由来の核酸またはＲＮＡの生成に好適である方法が本明細書に提供されている。これらの核酸は、樹状細胞の抗原刺激及び成熟樹状細胞の調製に使用できる。核酸が精製された形態でＤＣに提供される必要はない。好ましくは、ＲＮＡサンプル（すなわち、分画された腫瘍調製物）は、少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＲＮＡである。
【００４９】
当技術分野で既知のトランスフェクション法は、腫瘍由来の核酸を樹状細胞に導入するのに好適である。例えば、５００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の５〜５０μｇのＲＮＡを、１０〜１００μｇの濃度でカチオン性脂質と混合し、室温で２０〜３０分間インキュベートすることができる。他の好適な脂質としては、ＬＩＰＯＦＥＣＴＩＮ（商標）（１：１（ｗ／ｗ）ＤＯＴＭＡ：ＤＯＰＥ）、ＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（商標）（（３：１（ｗ／ｗ）ＤＯＳＰＡ：ＤＯＰＥ）、ＤＯＤＡＣ：ＤＯＰＥ（１：１）、ＣＨＯＬ：ＤＯＰＥ（１：１）、ＤＭＥＤＡ、ＣＨＯＬ、ＤＤＡＢ、ＤＭＥＤＡ、ＤＯＤＡＣ、ＤＯＰＥ、ＤＯＲＩ、ＤＯＲＩＥ、ＤＯＳＰＡ、ＤＯＴＡＰ、及びＤＯＴＭＡが挙げられる。次に、得られたＲＮＡ−脂質複合体を、１〜３ｘ１０６細胞、好ましくは２ｘ１０６の抗原提示細胞に加え、総量約２ｍｌ（例えばＯｐｔｉ−ＭＥＭ中）で、３７℃で２〜４時間インキュベートする。あるいは、１〜５ｘ１０６細胞及び５〜５０μｇのＲＮＡを用いたエレクトロポレーションまたはリン酸カルシウムトランスフェクションなどの従来の技術を使用することにより、ＲＮＡは、抗原提示細胞に導入され得る。典型的には、５〜２０μｇのポリＡ  ＲＮＡまたは２５〜５０μｇのトータルＲＮＡが典型的には使用される。
【００５０】
ＲＮＡが腫瘍調製物として提供される場合、典型的には、調製物は分画されるか、さもなければ処理されて、調製物中のタンパク質、脂質、及び／またはＤＮＡの濃度を低下させ、ＲＮＡの調製物を富化させる。例えば、当該技術分野で既知のＲＮＡ精製法を使用して、腫瘍細胞または病原体からＲＮＡを少なくとも部分的に精製することができる。ＲＮＡ調製物をプロテアーゼまたはＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅで処理することもできる。
【００５１】
実施形態の樹状細胞集団
樹状細胞を単離、培養及び抗原刺激するための方法は、当技術分野のおいて周知である。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，７２８，８０６号は、実施形態の組成物及び方法で使用され得る抗原刺激樹状細胞を提供するための詳細な方法を提供している。特定の態様では、実施形態に従って使用するための樹状細胞は、実施形態の方法によって治療される対象から単離される。他の態様では、樹状細胞は、ＨＬＡ適合ドナーなどの異なる対象に由来し得る。特定の態様では、樹状細胞は、定義されたＨＬＡタイピングを有する樹状細胞のバンクに由来する。好ましい態様では、実施形態に従って使用するための抗原刺激樹状細胞は、本明細書及び米国特許第８，７２８，８０６号に詳述されるように、抗原を相同的にロードされる。
【００５２】
樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞を富化させた細胞集団を、血液及び骨髄など、様々な供給源から単離するための方法は、当技術分野で知られている。例えば、樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞は、ヘパリン添加血液を採取することにより、アフェレーシスまたは白血球除去法により、バフィーコートの調製、ロゼット様構造の形成、遠心分離、密度勾配遠心分離（例えば、ＦＩＣＯＬＬ（ＦＩＣＯＬＬ−ＰＡＱＵＥ（登録商標）など）を使用）、ＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）（非透析性ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、スクロースなどでコーティングされたコロイダルシリカ粒子（直径１５〜３０ｍｍ））、細胞の示差溶解、濾過などにより単離され得る。特定の実施形態では、白血球集団は、例えば、対象から血液を収集し、細かく砕いて血小板を除去し、赤血球を溶解することなどによって調製することができる。樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞は、任意により、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（登録商標）勾配による遠心分離により、単球性樹状細胞前駆体に対して富化され得る。他の態様では、樹状細胞前駆体は、Ｇ−ＣＳＦ動員末梢血のＣＤ１４選択を使用して選択することができる。
【００５３】
樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞は、任意により、閉鎖された無菌システムで調製され得る。本明細書で使用する場合、「閉鎖無菌系」または「閉鎖系」という用語は、滅菌されていない周囲もしくは循環空気または他の滅菌されていない状態への曝露が最小限に抑えられるかまたは排除されるシステムを指す。樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞を単離するための閉鎖系は、一般に、オープントップチューブでの密度勾配遠心分離、細胞のオープンエアー移送移動、組織培養プレートまたは非密閉フラスコでの細胞培養などを除外する。典型的な実施形態では、閉鎖系では、非無菌空気に暴露することなく、樹状細胞前駆体及び未成熟樹状細胞の初期収集容器から密閉型組織培養容器への無菌移送が可能になる。
【００５４】
特定の実施形態では、単球性樹状細胞前駆体は、単球結合基質へ付着することによって単離される。例えば、白血球の集団（例えば、白血球アフェレーシスにより単離されたもの）は、単球樹状細胞前駆体が付着している基質と接触させることができる。白血球の集団が基質と接触するときに、白血球の集団中の単球性樹状細胞前駆体が優先的に基質に付着する。他の白血球（他の潜在的な樹状細胞前駆体など）は、基質に対する結合親和性の低下を呈し、それにより、単球性樹状細胞前駆体をその基質の表面上で優先的に富化することができる。
【００５５】
好適な基質としては、例えば、表面積対体積比が大きいものが挙げられる。こうした基質は、例えば、粒子状または繊維状基質であり得る。好適な粒子状基質としては、例えば、ガラス粒子、プラスチック粒子、ガラス被覆プラスチック粒子、ガラス被覆ポリスチレン粒子、及びタンパク質の吸収に好適である他のビーズが挙げられる。好適な繊維性基質としては、微小毛細管及び微絨毛膜が挙げられる。粒子状または繊維状基質は、通常、付着した細胞の生存能を実質的に低下させることなく、付着した単球性樹状細胞前駆体を溶出させることができる。粒子状または繊維性基質は、基質からの単球樹状細胞前駆体または樹状細胞の溶出を容易にするために実質的に非多孔性であり得る。「実質的に非多孔性の」基質は、基質中での細胞の取り込みを少なくとも最小限に抑えるために、基質中に存在する少なくとも大部分の孔が細胞よりも小さい基質である。
【００５６】
単球樹状細胞前駆体の基質への付着は、結合培地を添加することにより任意に増大させることができる。好適な結合培地としては、サイトカイン（例えば、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、またはインターロイキン１３（ＩＬ−１３））、血漿、血清（例えば、ヒト血清、例えば自家または同種血清など）、精製されたタンパク質、例えば、血清アルブミンなど、二価陽イオン（例えば、カルシウム及び／またはマグネシウムイオン）ならびに単球樹状細胞前駆体の基質への特定の付着を助けるか、または非単球樹状細胞前駆体の基質への付着を防ぐ他の分子を個別に、または任意の組み合わせで補充した、単球性樹状細胞前駆体培地（例えば、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ１５（登録商標）など）を挙げることができる。特定の実施形態では、血漿または血清は加熱不活性化され得る。加熱不活性化させた血漿は、白血球に対して自家または異種であり得る。
【００５７】
単球性樹状細胞前駆体が基質へ付着した後、非付着性白血球は、単球性樹状細胞前駆体／基質複合体から分離される。非付着性細胞を複合体から分離するために、任意の好適な手段が使用され得る。例えば、非付着性白血球と複合体との混合物を沈降させ、非付着性白血球及び培地をデカントまたは排出することができる。あるいは、混合物は、遠心分離して、付着していない白血球を含む上清を、ペレット化した複合体からデカントまたは排出することができる。
【００５８】
単離された樹状細胞前駆体は、分化、成熟及び／または拡大のために、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養させてもよい。（本明細書で使用される場合、単離された未成熟樹状細胞、樹状細胞前駆体、Ｔ細胞、及び他の細胞は、ヒトの手によって、その本来の環境から離れて存在し、したがって自然の産物ではない細胞を指す。単離細胞は、精製形態、半精製形態、または非ネイティブ環境で存在し得る。）簡潔に述べると、ｅｘ  ｖｉｖｏ分化は、典型的には、樹状細胞前駆体、または樹状細胞前駆体を有する細胞の集団を、１つ以上複数の分化剤の存在下で培養することを含む。好適な分化剤は、例えば、細胞増殖因子（例えば、（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキン４（ＩＬ−４）、インターロイキン１３（ＩＬ−１３）、及び／またはそれらの組み合わせなどのサイトカイン）であり得る。特定の実施形態では、単球樹状細胞前駆体は分化して、単球由来の未成熟樹状細胞を形成する。
【００５９】
樹状細胞前駆体は、好適な培養条件で培養させ、分化させることができる。好適な組織培養培地としては、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ１５（登録商標）などが挙げられる。組織培養培地は、細胞の分化を促進するために、血清、アミノ酸、ビタミンのほか、ＧＭ−ＣＳＦ及び／またはＩＬ−４などのサイトカイン、二価カチオンなどを補充することができる。特定の実施形態では、樹状細胞前駆体は、無血清培地で培養することができる。そのような培養条件では、任意により動物由来のいかなる生成物も除外され得る。典型的な樹状細胞培養培地における典型的なサイトカインの組み合わせは、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−４（１０ｎｇ／ｍｌ）がそれぞれ約５００単位／ｍｌである。樹状細胞前駆体は、分化して未成熟樹状細胞を形成する場合、皮膚のランゲルハンス細胞と表現型がほぼ同じである。未熟樹状細胞は典型的には、ＣＤ１４−及びＣＤ１１ｃ＋であり、低レベルのＣＤ８６及びＣＤ８３を発現し、特殊なエンドサイトーシスを介して可溶性抗原を捕捉することができる。未熟ＤＣは、非常に高いレベルのＣＤ８６を発現した。また、集団はＣＤ１４及びＣＤ１１Ｃに関して混合した。大部分がＣＤ１１ｃ＋であったが、異なるサブ集団があり、それはＣＤ１１ｃ−及びＣＤ１４＋であった。
【００６０】
未成熟樹状細胞は、成熟して成熟樹状細胞を形成する。成熟ＤＣでは、抗原を取り込み、共刺激性細胞表面分子及び様々なサイトカインの上方制御された発現を表示する能力を失う。具体的には、成熟ＤＣは、未成熟樹状細胞よりも高いレベルのＭＨＣクラスＩ及びＩＩ抗原を発現し、成熟樹状細胞は、一般にＣＤ８０＋、ＣＤ８３＋、ＣＤ８６＋、及びＣＤ１４−であると識別されている。ＭＨＣの発現が増加することにより、ＤＣ表面での抗原密度が増大するが、共刺激分子ＣＤ８０及びＣＤ８６の上方制御により、Ｔ細胞上のＣＤ２８などの共刺激分子の対応物を介してＴ細胞活性化シグナルが強化される。
【００６１】
本発明の成熟樹状細胞は、未成熟樹状細胞を有効量または濃度の核酸組成物及び腫瘍抗原組成物と接触させることにより調製する（すなわち、成熟させる）ことができる。核酸組成物の有効量は、典型的には、培養皿または細胞あたり、最大、少なくとも、または約０．０１、０．１、１、５、１０から１０、１５、２０、５０、１００ｎｇまたはｍｇ、その間のすべての値及び範囲などの核酸の範囲である。腫瘍抗原組成物の有効量は、典型的には、培養皿または細胞あたり、最大で、少なくとも、または約０．０１、０．１、１、５、１０から１０、１５、２０、５０、１００ｎｇまたはｍｇのタンパク質の範囲である。特定の態様では、０．００１ｎｇの腫瘍抗原／細胞から１μｇの腫瘍抗原／百万細胞を使用することができる。腫瘍抗原組成物は、樹状細胞と接触する前に、任意により熱で不活性化または処理する（例えば、プロテアーゼに曝露させる）ことができる。未成熟樹状細胞を核酸組成物及び腫瘍抗原組成物により成熟させることにより、１型（Ｔｈ−１）応答に対して成熟樹状細胞の抗原刺激を行うことができる。
【００６２】
未成熟ＤＣは、典型的には、最大で、少なくとも、または約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２〜１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４分、時間、または日の間、有効量の核酸組成物及び腫瘍抗原組成物と接触する。未成熟樹状細胞は、好適な成熟培養条件で培養し、成熟させることができる。好適な組織培養培地としては、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ１５（登録商標）などが挙げられる。組織培養培地は、細胞の成熟を促進するために、アミノ酸、ビタミンのほか、ＧＭ−ＣＳＦ及び／またはＩＬ−４などのサイトカイン、二価カチオンなどを補充することができる。
【００６３】
樹状細胞の成熟は、当技術分野で公知である方法によって監視することができる。細胞表面マーカーは、フローサイトメトリー、免疫組織化学などの当技術分野でよく知られているアッセイで検出することができる。細胞はまた、サイトカインの産生について監視され得る（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳ、または他の免疫アッセイによる）。樹状細胞前駆体、未成熟樹状細胞、及び抗原による刺激を受けているか、または刺激を受けていない成熟した樹状細胞は、後日使用するために凍結保存できる。凍結保存するための方法は、当技術分野でよく知られている。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７８８，９６３号。
【００６４】
核酸または核酸による刺激を受けた樹状細胞は、ＲＮＡ、例えば腫瘍または腫瘍細胞に由来するＲＮＡと共にインキュベートされたかまたはトランスフェクトされた樹状細胞である。そのようなＲＮＡは、脂質媒介トランスフェクション、エレクトロポレーション、及びリン酸カルシウムトランスフェクションなどの従来の核酸トランスフェクション法を使用してトランスフェクトすることができる。例えば、３７℃で１〜２４時間（例えば、２時間）、ＤＣをＲＮＡ（または抽出物）とインキュベートすることにより、ＲＮＡをＤＣに導入することができる。
【００６５】
本開示の核酸がロードされた抗原提示細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏにおいてＣＴＬ増殖を刺激するために使用され得る。核酸ロード樹状細胞がＣＴＬ応答を刺激する能力は、エフェクター細胞が標的細胞を溶解する能力を分析することによって測定することができる。例えば、一般的に使用されているユウロピウム放出アッセイが使用され得る。典型的には、５〜１０ｘ１０６個の標的細胞は、４℃で２０分間、ユウロピウムジエチレントリアミンペンタアセテートにより標識する。数回洗浄後、エフェクター：標的比５０：１〜６．２５：１の範囲で、１０４ユウロピウムで標識された標的細胞及びエフェクター細胞の段階希釈液を、９６ウェルプレート内の１０％加熱不活化ウシ胎児血清を含む２００μｌＲＰＭＩ１６４０でインキュベートする。プレートを５００ｘｇで３分間遠心分離し、３７℃、５％ＣＯ２で４時間インキュベートする。上清の５０μｌアリコットを収集し、ユウロピウムの放出を時間分解蛍光（Ｖｏｌｇｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １１９：４５−５１，１９８９）によって測定する。
【００６６】
Ａ．遺伝子改変樹状細胞
実施形態の特定の態様は、遺伝子改変された樹状細胞に関する。いくつかの態様では、遺伝子改変は、阻害性核酸などの外因性導入遺伝子を細胞へ導入することを含む。さらなる態様では、導入遺伝子は、誘導性プロモーターの制御下で、チミジンキナーゼをコードする遺伝子などの自殺遺伝子であり得る。従って、いくつかの態様では、免疫応答を刺激した後、投与された樹状細胞は、自殺遺伝子の発現を制御するプロモーターの誘導によって死滅され得る。
【００６７】
さらなる態様では、遺伝子改変は、細胞集団におけるゲノムの欠失または挿入を含む。例えば、１つ以上のＨＬＡ遺伝子を破壊して、樹状細胞を、治療される対象にとって有効なＨＬＡ適合にすることができる。
【００６８】
実施形態のさらなる態様は、ＣＴＬＡ−４の発現を低下させるなどのため、遺伝子改変された樹状細胞に関する。いくつかの態様では、遺伝子改変は、ＣＴＬＡ−４に特異的な外因性阻害性核酸を導入することを含む。特定の態様では、阻害性核酸は、樹状細胞においてＤＮＡベクターから発現されるＲＮＡなどのＲＮＡである。さらなる態様では、阻害性核酸は、樹状細胞に導入されるｓｉＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡであってもよい。こうしたＲＮＡの詳細な開示は、上記に提供されている。
【００６９】
さらなる態様では、遺伝子改変は、ＣＴＬＡ−４を減少させる細胞集団におけるゲノムの欠失または挿入を含む。他の態様では、樹状細胞は、ＣＴＬＡ−４遺伝子内のヘミ接合体欠失またはホモ接合体欠失を含む。例えば、いくつかの態様では、樹状細胞のＣＴＬＡ−４遺伝子の一方または両方のコピーを完全にまたは部分的に欠失させることができ、これにより、ＣＴＬＡ−４ポリペプチドの発現が阻害されるようになる。いくつかの態様では、細胞が１つ以上のＣＴＬＡ−４遺伝子を発現しないように細胞を改変することは、ＣＴＬＡ−４遺伝子座を特異的に標的とする人工ヌクレアーゼを細胞に導入することを含み得る。様々な態様では、人工ヌクレアーゼは、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９であり得る。様々な態様では、人工ヌクレアーゼを細胞に導入することは、人工ヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡを細胞に導入することを含み得る。
【００７０】
併用療法
本実施形態によって生成された核酸により形質転換された樹状細胞を含む樹状細胞療法の有効性を高めるために、これらの組成物を目的の疾患の治療に有効な他の剤と組み合わせることが望ましい場合がある。
【００７１】
非限定的な例として、がんの治療は、他の抗がん剤と共に、本発明の実施形態の抗原刺激樹状細胞組成物を用いて実施されてもよい。「抗がん」剤は、例えば、がん細胞を死滅させること、がん細胞においてアポトーシスを誘導すること、がん細胞の成長速度を低下させること、転移の発生率または数を減少させること、腫瘍サイズを減少させること、腫瘍成長を阻害すること、腫瘍細胞またはがん細胞への血液供給を減少させること、がん細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を防止もしくは阻害すること、またはがんを有する対象の寿命を延長することにより、対象においてがんに悪影響を及ぼすことができる。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を死滅させることまたは細胞の増殖を阻害することに有効な組み合わせ量で提供される。このプロセスは、細胞を抗がんペプチドまたはナノ粒子複合体及び剤（複数可）または複数の因子（複数可）と同時に接触させることを伴い得る。これは、細胞を両方の剤を含む単一の組成物もしくは薬理学的配合物と接触させることにより、または同時に細胞を２つの異なる組成物もしくは配合物と接触させることにより達成され得、一方の組成物は樹状細胞組成物を含み、他方の組成物は、第２の剤（複数可）を含む。
【００７２】
樹状細胞組成物による治療は、数分から数週間の範囲の間隔で他の剤による治療の前または後に行うことができる。他の剤及び樹状細胞組成物が対象に別々に適用される実施形態では、一般に、確実に、各々の送達の間に有意な期間が終了しないようにする。これにより、剤及び樹状細胞組成物が依然として細胞に対して有利な組み合わせ効果を発揮できるようになる。こうした例では、互いに約１２〜２４時間以内に、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に両方の療法が細胞に接触できるよう企図される。いくつかの状況では、それぞれの投与の間に、数日間（例えば、２日、３日、４日、５日、６日、または７日間）から数週間（例えば、１週、２週、３週、４週、５週、６週、７週、または８週間）が経過する状態で、治療のための期間を有意に延長させることが望ましい場合がある。
【００７３】
樹状細胞療法が「Ａ」であり、放射線療法、化学療法または抗炎症剤などの二次的剤が「Ｂ」である場合、様々な組み合わせを使用してもよい：
Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ｂ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ｂ／Ｂ
Ｂ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ｂ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ｂ／Ａ／Ａ
Ｂ／Ａ／Ｂ／Ａ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ａ／Ａ／Ａ／Ｂ  Ｂ／Ａ／Ａ／Ａ  Ａ／Ｂ／Ａ／Ａ  Ａ／Ａ／Ｂ／Ａ
特定の実施形態では、患者への本実施形態の樹状細胞療法剤の投与は、（存在する場合には）ベクターの毒性を考慮して、化学療法剤を投与するための一般的なプロトコルに従う。治療サイクルは必要に応じて繰り返されることが予想される。また、様々な標準的な治療法、ならびに外科的介入が、記載された過剰増殖性細胞治療と組み合わせて適用され得ることが企図される。
【００７４】
Ａ．化学療法
がん治療には、様々な併用療法も含まれる。いくつかの態様では、実施形態の樹状細胞組成物は、化学療法剤と組み合わせて投与（または配合）される。例えば、いくつかの態様では、化学療法剤は、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦＲ、ＡＫＴ、Ｅｒｂ１、Ｅｒｂ２、ＥｒｂＢ、Ｓｙｋ、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＪＡＫ、Ｓｒｃ、ＧＳＫ−３、ＰＩ３Ｋ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＡＰＫ、ＭＡＰＫＫ、ｍＴＯＲ、ｃ−Ｋｉｔ、ｅｐｈ受容体またはＢＲＡＦ阻害剤などのタンパク質キナーゼ阻害剤である。タンパク質キナーゼ阻害剤の非限定的な例としては、アファチニブ、アキシチニブ、ベバシズマブ、ボスチニブ、セツキシマブ、クリゾチニブ、ダサチニブ、エルロチニブ、フォスタマチニブ、ゲフィチニブ、イマチニブ、ラパチニブ、レンバチニブ、ムブリチニブ、ニロチニブ、パニツムマブ、パゾパニブ、ペガプタニブ、ラニビズマブ、ルキソリチニブ、サラカチニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、トラスツズマブ、バンデタニブ、ＡＰ２３４５１、ベムラフェニブ、ＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３、Ａ−４４３６５４、ＶＱＤ−００２、ミルテホシン、ペリホシン、ＣＡＬ１０１、ＰＸ−８６６、ＬＹ２９４００２、ラパマイシン、テムシロリムス、エベロリムス、リダホロリムス、アルボシジブ、ゲニステイン、セルメチニブ、ＡＺＤ−６２４４、バタラニブ、Ｐ１４４６Ａ−０５、ＡＧ−０２４３２２、ＺＤ１８３９、Ｐ２７６−００、ＧＷ５７２０１６、またはこれらの混合物が挙げられる。
【００７５】
さらに他の併用化学療法としては、例えば、チオテパ及びシクロホスファミドなどのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのスルホン酸アルキル；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ（ｍｅｔｕｒｅｄｏｐａ）、及びウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド及びトリメチルオロメラミンなどのエチレンイミン及びメチルアメラミン（ｍｅｔｈｙｌａｍｅｌａｍｉｎｅ）；アセトゲニン（特にブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンなど）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（アドゼレシン、カルゼレシン、ビゼレシン合成類似体など）；クリプトフィシン（特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ−２１８９及びＣＢ１−ＴＭ１など）；エレウテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；ナイトロジェンマスタード、例えば、クロラムブシル、クロルナファジン、シクロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、ノブエンビキン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタード；ニトロソウレア、例えば、カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、及びラニムスチン；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマＩ及びカリケアマイシンオメガＩ１；ダイネミシン（ダイネミシンＡなど）；ビスホスホネート、例えば、クロドロネート；エスペラマイシン；ネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、アントラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシニス（ｃｈｒｏｍｏｍｙｃｉｎｉｓ）、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン（モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ−ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシン）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルチセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン（ｎｏｇａｌａｒｎｙｃｉｎ）、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン（ｐｏｔｆｉｒｏｍｙｃｉｎ）、ピューロマイシン、クエラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；葉酸類似体、例えば、デノプテリン、プテロプテリン、トリメトレキセート；プリン類似体、例えば、フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなど；ピリミジン類似体、例えば、アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジン；アンドロゲン、例えば、カルステロン、ドロスタノロンプロピオン酸エステル（ｄｒｏｍｏｓｔａｎｏｌｏｎｅ  ｐｒｏｐｉｏｎａｔｅ）、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン；抗副腎、例えばミトタン、トリロスタン；葉酸補充剤、例えば、フロリン酸；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート；デフォファミン（ｄｅｆｏｆａｍｉｎｅ）；デメコルシン；ジアジコン；エルフォルミチン（ｅｌｆｏｒｍｉｔｈｉｎｅ）；エリプチニウム酢酸塩；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン（ｌｏｎｉｄａｉｎｉｎｅ）；メイタンシノイド、例えば、メイタンシン及びアンサミトシン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール（ｍｏｐｉｄａｎｍｏｌ）；ニトラリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジコン；２，２’，２’’−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（特にＴ−２毒素、ベラクリンＡ、ロリジンＡ及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン（ｇａｃｙｔｏｓｉｎｅ）；アラビノシド（「Ａｒａ−Ｃ」）；シクロホスファミド；タキソイド、例えば、パクリタキセル及びドセタキセルゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；白金配位錯体、例えば、シスプラチン、オキサリプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（例えば、ＣＰＴ−１１）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ  ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；カルボプラチン、プロカルバジン、プリコマイシン、ゲムシタビン、ナベルビン、ファルネシルタンパク質タンスフェラーゼ阻害剤、トランスプラチナ、ならびに上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。特定の実施形態では、本明細書で提供される組成物は、ゲフィチニブと組み合わせて使用されてもよい。他の実施形態では、本実施形態は、Ｇｌｅｅｖａｃと組み合わせて実施され得る（例えば、約４００〜約８００ｍｇ／日のＧｌｅｅｖａｃを患者に投与することができる）。特定の実施形態では、１つ以上の化学療法剤を、本明細書で提供される組成物と組み合わせて使用されてもよい。
【００７６】
Ｂ．放射線療法
ＤＮＡ損傷を引き起こし、かつ広範囲に使用されている他の因子は、γ線、Ｘ線、及び／または腫瘍細胞への放射性同位体の直接送達として一般的に知られているものが挙げられる。マイクロ波及びＵＶ照射など、他の形態のＤＮＡ損傷因子も考えられる。これらの因子のすべてが、ＤＮＡ、ＤＮＡの前駆体、ＤＮＡの複製及び修復、ならびに染色体の組み立て及び維持に広範囲の損傷を与える可能性が最も高い。Ｘ線の線量範囲は、長期間（３〜４週間）の１日線量５０〜２００レントゲンから、単回線量２０００〜６０００レントゲンのまで範囲である。放射性同位体の線量範囲は大きく異なり、アイソトープの半減期、放出される放射線の強度及び種類、ならびに新生物細胞による取り込みに依存する。
【００７７】
用語「接触させる」及び「曝露させる」は、細胞に適用されるときに、治療用組成物及び化学療法剤または放射線療法剤が標的細胞に送達されるか、もしくは標的細胞と直接並置して配置されるプロセスを説明するために本明細書で使用される。細胞の死滅またはうっ血を達成するために、例えば、両方の剤が、細胞を死滅させるか、または細胞の分裂を防止するために有効な組み合わせ量で、細胞に送達される。
【００７８】
Ｃ．遺伝子治療
さらに別の実施形態では、二次治療は、治療用ポリヌクレオチドが治療用組成物の前、後、または同時に投与される遺伝子治療である。遺伝子産物の発現のためのウイルスベクターは、当技術分野において周知であり、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ワクシニアウイルスなどのポックスウイルス、及びＳＶ４０などのパピローマウイルスなどの真核生物発現系が挙げられる。あるいは、発現構築物の投与は、リポソームまたはＤＯＴＡＰ：コレステロール小胞などの脂質ベースのベクターを用いて達成することができる。これらの方法はすべて、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８；Ａｕｓｕｂｅｌ，１９９６を参照のこと）。
【００７９】
Ｄ．手術
がん患者の約６０％は、ある種の手術（予防的、診断的、病期分類、治癒的及び緩和的手術など）を受ける。治癒的手術は、本明細書で提供される治療、化学療法、放射線療法、ホルモン療法、遺伝子療法、免疫療法及び／または代替療法など、他の療法と組み合わせて使用され得るがん治療である。
【００８０】
治癒的手術としては、癌性組織の全てまたは一部が物理的に除去、切除、及び／または破壊される切除が挙げられる。腫瘍切除とは、腫瘍の少なくとも一部を物理的に切除することを指す。腫瘍の切除のほかに、手術による治療としては、レーザー手術、凍結手術、電気手術、及び顕微鏡制御された手術（モース手術）が挙げられる。本実施形態は、表在性がん、前がん、または偶発的な量の正常組織の除去と組み合わせて使用され得ることがさらに企図される。いくつかの態様では、腫瘍切除後、実施形態の樹状細胞組成物は、以前の腫瘍部位から排出されたリンパ系組織に投与される。
【００８１】
キット
本明細書の技術は、サンプル中のｍＲＮＡからｃＤＮＡを生成するため、及びｃＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写のためのキットを含む。「キット」とは、物理的要素の組み合わせを指す。例えば、キットとしては、例えば、これらに限定されないが、特定のプライマー、酵素、反応緩衝液、指示書、及び本明細書に記載の技術を実施するのに有用な他の要素などの１つ以上の構成要素を挙げることができる。これらの物理的要素は、本発明を実施するために好適である任意の方法で配置することができる。
【００８２】
キットは、例えば、Φ２９ポリメラーゼ、Ｂｓｔポリメラーゼ、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＤＮＡポリメラーゼＩ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウ断片、９ｏＮｍポリメラーゼ、Ｔ４ポリメラーゼ、Ｔ７  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｆｕ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｑ５（登録商標）ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）、またはＲＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼ、及び逆転写酵素をさらに含んでもよい。３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を有さないＴ７ファージＤＮＡポリメラーゼの変異型、またはそれらの混合物。
【００８３】
キットは、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉＲＮＡポリメラーゼ、ＳＰ６  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼ、またはそれらの変異体など、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写用のＲＮＡポリメラーゼをさらに含み得る。
【００８４】
キットの成分は、水性媒体または凍結乾燥形態のいずれかで包装され得る。キットの容器手段としては、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段が挙げられ、その中に成分が入れられ、好ましくは、好適に分注される（例えば、マイクロタイタープレートのウェルに分注される）。キット内に複数の成分が存在する場合、キットには通常、追加の成分を個別に配置できる第２、第３、または他の追加の容器も含まれる。しかし、成分の様々な組み合わせが単一のバイアル内に含まれ得る。本発明のキットとしてはまた、典型的には、核酸を収容するための手段、及び商業的販売のために厳重に閉じ込めた任意の他の試薬容器が挙げられる。こうした容器は、内部で所望のバイアルが保持される射出またはブロー成形プラスチック容器を含み得る。
【００８５】
キットはまた、キット成分を用いるための指示書、ならびにキットに含まれていない任意の他の試薬の使用を含むこともある。指示書には、実装可能な変形が含まれ得る。こうした試薬は、本発明のキットの実施形態であると考えられる。しかし、こうしたキットは、上記で特定された特定の項目に限定されるものではなく、遺伝子のメチル化の操作または特徴付けのために使用される任意の試薬を含み得る。
【００８６】
キットの容器手段としては、一般に、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、または他の容器手段が挙げられ、その内部に成分が配置され、好ましくは、好適に分注される。キット内に複数の成分が存在する場合、キットには通常、内部で追加の成分を個別に配置できる追加の容器も含まれる。しかし、成分の様々な組み合わせが容器内に含まれ得る。本発明のキットはまた、典型的には、成分容器を商業的販売のために厳重に閉じ込めて包装するための手段を含む。こうした包装としては、所望の成分容器が保持される射出またはブロー成形プラスチック容器を挙げることができる。
【実施例】
【００８７】
以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含む。以下の実施例において開示された技術は、本発明の実行において良好に機能するように本発明者によって発見された技術を表し、したがって、その実施にあたって好ましい様態を構成すると考えられ得ることを、当業者に理解されるべきである。しかし、当業者は、本開示に照らして、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、多くの変更が開示される特定の実施形態においてなされるが、それでも同様なまたは類似する結果を得ることができることを理解するべきである。
【００８８】
実施例１−材料及び方法
新鮮な組織のプロセシング−腫瘍の外科的除去後、腫瘍組織の重量を量り、スライスして小片（約２０ｍｇ／片以下）にした。すべての片を１ｍＬのＲＮＡ安定化溶液（ＲＮＡＬＡＴＥＲ（商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含む１．５ｍＬクライオバイアルに入れた。ＲＮＡＬＡＴＥＲ（商標）及び切開した腫瘍を含むクリオバイアルを４℃で一晩放置し、ＲＮａｓｅ活性を防ぐ。４℃で一晩インキュベーションした後、組織を含むＲＮＡＬＡＴＥＲ（商標）溶液の入ったクリオバイアルを、１０，０００ＲＰＭ、４℃で１分間遠心分離した。遠心分離後、上清をピペッティングにより除去し、組織の切片を秤量した。組織の１０％は、その後のトータルＲＮＡの調製に使用し、残りの９０％は、その後の抗原ライセートの調製に使用した。
【００８９】
抗原ライセートの調製−切開した腫瘍組織を１５ｍＬコニカルチューブに加え、滅菌ＰＢＳで１００ｍｇ／ｍＬに希釈した。次に、手持ち式組織ホモジナイザーを使用して、組織を含むＰＢＳの均質懸濁液を作製した。次に、均質懸濁液の入ったチューブを液体窒素またはドライアイス／エタノール浴に浸して、懸濁液を凍結させた。凍結後、細胞懸濁液を５５℃の水浴で完全に解凍するまでインキュベートした。この凍結融解サイクルをさらに２回繰り返した。最終解凍後、無菌性及び完全な細胞死を確保するために、セシウム照射器を介して、細胞懸濁液に２５００Ｇｙ超の放射線をガンマ線照射した。次にライセートをさらに使用するまで−２０℃で保存した。
【００９０】
抗原のｍＲＮＡの調製−トータルＲＮＡを、スピンカラムを利用するＲＮＥＡＳＹ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎカタログ番号７４１０４）、またはグアニジニウムチオシアネート及びフェノール混合物を利用するＴＲＩＰＵＲＥ（登録商標）（Ｒｏｃｈｅ）法を、それぞれ製造業者の指示に従って用いて、ＲＮＡＬＡＴＥＲ（商標）試薬で安定化させた組織から単離した。
【００９１】
ＲＮｅａｓｙトータルＲＮＡの調製−６００μＬの緩衝液ＲＬＴを３０ｍｇの組織に添加し、得られた混合物を手持ち式組織ホモジナイザーを使用してホモジナイズした。ライセートに６００μＬの７０％エタノールを添加し、ピペッティングにより混合した。７００μＬのサンプルをＲＮｅａｓｙスピンカラムに移し、２ｍＬのコレクションチューブに入れた。サンプルを８，０００ｘｇで１分間遠心分離した。遠心分離後、通過画分は廃棄した。残りのライセートをスピンカラムに加え、再度遠心分離した。遠心分離後、通過画分は廃棄した。３５０μＬの緩衝液ＲＷ１をカラムに加え、遠心分離した。ＤＮａｓｅ  Ｉ溶液は、１０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉストック溶液を７０μＬの緩衝液ＲＤＤに加え、その後穏やかに混合して調製した。次に、８０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉ溶液をカラムに加え、室温で１５分間インキュベートした。ＤＮａｓｅ  Ｉのインキュベーション後、３５０μＬの緩衝液ＲＷ１をカラムに加え、カラムを８０００ｘｇで１分間遠心分離した。遠心分離後、通過画分は廃棄した。次に、さらに７００μＬの緩衝液ＲＷ１を追加して膜を洗浄し、さらに８０００ｘｇで１分間遠心分離した後、５００μｌで、緩衝液ＲＰＥで２回洗浄し、８０００ｘｇで２回遠心分離した。次に、膜を２分間の遠心分離により乾燥させた。予め加温したヌクレアーゼフリーの水５０μｌをカラム内の膜に直接加え、１分間インキュベートし、８０００ｘｇで１分間遠心分離することにより、ＲＮＡを新しいカラムに溶出した。ＲＮＡを濃縮するために、溶離液を使用して２回目の溶離を行った。次にトータルＲＮＡを定量化した。トータルＲＮＡは、長期保存のために−８０℃で保存した。
【００９２】
グアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルムＲＮＡの単離−腫瘍組織５０ｍｇごとに、１ｍＬのグアニジニウムチオシアネート及びフェノール試薬（ＴＲＩｐｕｒｅ（商標）試薬（Ｒｏｃｈｅ）、カタログ番号１１  ６６７  １５７  ００１）を加え、得られた混合物を、手持ち式組織ホモジナイザーを使用してホモジナイズした。次に、ホモジナイズさせた混合物を１３，０００ＲＰＭで５分間４℃で遠心分離して、ホモジネートを取り除いた。ホモジネートの上清を新しいＲＮａｓｅフリーのチューブに移した。上清を取り除くために、４００ｕＬのクロロホルムを加え、混合物を逆さにして完全に混合した。次に、上清／クロロホルム混合物を室温で５〜１０分間インキュベートした。次に、混合物を４５００ＲＰＭで４５分間または１２，０００ｘｇで１５分間４℃で遠心分離して、上清を取り除いた。遠心分離後、得られた混合物は３つの相（有機相、界面、水相）で存在する。水相をピペッティングで収集し、事前に冷却したチューブに直接移す。出発物質のグアニジニウムチオシアネート及びフェノール試薬１ｍＬごとに、イソプロパノール０．５ｍＬを加えた。イソプロパノール／上清混合物を穏やかに混合し、室温で１０分間インキュベートした。インキュベーション後、４５００ＲＰＭで４５分間、または１２０００ｘＧ、１５分間、４℃で遠心分離することにより、ＲＮＡをペレット化した。ペレット化ＲＮＡを１ｍＬの７０％エタノールで洗浄し、再度遠心分離した。上清をピペッティングにより除去し、ペレットを氷上で５〜１０分間風乾させた。次に、ペレットを１００ｕＬのＲＮａｓｅフリー水に溶解し、５５℃で５分間インキュベートした。次にトータルＲＮＡの濃度を測定した。トータルＲＮＡは、長期保存のために−８０℃で保存した。第１の鎖合成の前に、グアニジニウムチオシアネート法を使用して単離させたトータルＲＮＡは、４ｕｇのトータルＲＮＡを含む１Ｘに希釈された１０Ｘ緩衝液に１ｕＬの増幅グレードＤＮａｓｅ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１８０６８−０１５）を加えることによりＤＮａｓｅ処理した。ＤＮａｓｅ反応を１５分間進行させ、１ｕＬのＥＤＴＡを加えることによって停止させた。
【００９３】
ｃＤＮＡ合成−各サンプル及び対照に、次のＲＮＡ／プライマーアニーリングミックスを無菌０．２ｍＬＰＣＲチューブで調製した：総反応体積１９ｕＬに対して、４ｕＬの１０ｕＭ配列番号１の溶液（ＶＫＷＤオリゴ）、配列番号２の１０ｕＭ溶液４ｕＬ（ＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴ）、サンプルＲＮＡ４ｕｇ、及び水。溶液を混合し、マイクロフュージで短時間回転させて、溶液をチューブの底に凝縮させた。次に、この溶液を予熱したサーモサイクラーで７２℃で２分間インキュベートし、４℃まで冷却した。次に、第１の鎖合成マスターミックスを調製する間、サンプルを氷上で保存した。
【００９４】
各反応プラス１つの非鋳型対照を考慮して、第１の鎖合成マスターミックスを調製し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ（登録商標）Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ番号１１９０４−０１８）内の試薬から調製した。マスターミックスには、サンプルごとに、サンプルあたり２１μＬの総体積に対して４ｕＬの１０Ｘ  Ｆｉｒｓｔ−Ｓｔｒａｎｄ緩衝液、４ｕＬのＤＴＴ（１００ｍＭ）、１ｕＬのＲＮａｓｅ阻害剤（ＲＮａｓｅ  Ｏｕｔ（商標））、４ｕＬのＭｇＣｌ２（２５ｍＭ）、４ｕＬのｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、及びｄＴＴＰのそれぞれ１０ｍＭ）、及び４ＵＬのＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ逆転写酵素（登録商標）を含めた。
【００９５】
２１ｕＬの第１の鎖合成マスターミックスを、１９ｕｌのＲＮＡ／プライマーアニーリングミックスの入った各チューブに加えた。ＮＴＣなど、各反応物を４２℃で１時間インキュベートし、ｃＤＮＡの第１の鎖を合成した。次に、第１の鎖合成反応物を微量遠心機での短時間の遠心分離によって収集し、第２の鎖ｃＤＮＡを合成する前に氷上で冷却した。
【００９６】
第２の鎖合成マスターミックスは、ＭｇＣｌ２を含む１００ｕＬ  ＦａｓｔＳｔａｒｔ（商標）高忠実度反応緩衝液、４０ｕＬの１０μｍｏｌ／Ｌ  ＣＤＳ６４Ｔ＋オリゴ（配列番号２）、２０ｕＬの２０μｍｏｌ／Ｌ  Ｐｏｗｅｒｓｗｉｔｃｈ  Ｔ７プライマー（配列番号３）、２０ｕＬ  ｄＮＴＰミックス（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＴＴＰ各１０ｍＭ）、２０ｕＬのＦａｓｔＳｔａｒｔ高忠実度酵素、及び７８０ｕＬの水（合計９８０ｕＬ／サンプル）を添加して調製した。２０ｕＬの第１の鎖合成反応物を第２の鎖合成マスターミックスに加えた。次に、得られた混合物を、０．２ｍＬ  ＰＣＲチューブ内で、各々１００ｕＬの１０等量に分割した。これらの各反応物は、次のプログラムを使用して熱サイクルに供した：
１ｘ  ９５℃、５分間
１１ｘ  ９５℃、３０秒間
６５℃、３０秒間
６７℃、６分間
９ｘ  ９５℃、３５秒間
６５℃、３５秒間
６７℃、６分５秒
追加のサイクルごとに、６７℃での延長がさらに５秒増加する。例えば、サイクル１＝６：０５、サイクル２＝６：１０、サイクル３＝６：１５など。
１ｘ  ６７℃、７分間
４℃を保持する。
【００９７】
次に、二本鎖ｃＤＮＡを塩エタノール沈殿法を使用して精製した。酢酸ナトリウム（３Ｍ）を１：１０の体積比（ｖｏｌ：ｖｏｌ）、その後２：１の体積比（ｖｏｌ：ｖｏｌ）の冷却１００％エタノールでサンプルに加えた。サンプルを穏やかに混合し、−２０℃で１時間インキュベートした。次に、混合物を１３，０００ＲＰＭで２０分間遠心分離して、ＤＮＡをペレット化した。上清をペレット化ＤＮＡから注意深くピペットで取り除いた。次に、得られたペレットを、１００ｕＬの冷却７０％エタノールを加えることにより洗浄し、再懸濁した。次に溶液を１３，０００ＲＰＭで１０分間遠心分離し、上清をピペットで取り除いた。次に、ペレットを１０分間風乾した後、ヌクレアーゼフリー水２０ｕＬに溶解した。ｃＤＮＡの濃度はナノドロップで測定した。
【００９８】
Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写は、ＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ７−ＦＬＡＳＨ（登録商標）ｉｎ  ｖｉｔｒｏ増幅キット（ＬＵＣＩＧＥＮ（商標）カタログ番号ＡＳＦ３２５７）を使用して行った。次の順序で追加して、２０ｕＬの反応体積を調製した：ＸｕＬのＲＮａｓｅフリー水（Ｘは２０ｕＬの反応体積を達成するために必要な水の量）；１ｕｇのｃＤＮＡ鋳型；２ｕＬのＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ７−ＦＬＡＳＨ（登録商標）１０Ｘ反応緩衝液；１００ｍＭ  ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰが各々１．８ｕＬ；２ｕＬ  ＤＴＴ；０．５ｕＬのＲＩＢＯＧＵＡＲＤ（商標）ＲＮａｓｅ阻害剤；及び２ｕＬ  ＡＭＰＬＩＳＣＲＩＢＥ（商標）Ｔ７−ＦＬＡＳＨ（登録商標）酵素溶液。次に、反応物をサーモサイクラーで４２℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、１ｕＬのＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅ  Ｉを加え、反応液を３７℃で１５分間インキュベートした。ＤＮａｓｅ処理されたｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物は、２９ｕＬのＲＮａｓｅフリーの水を添加して５０ｕＬとした。次に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応物を、塩及びエタノール沈殿及び精製により精製した。５０μＬの５Ｍ酢酸アンモニウム及び１００ｕＬの氷冷１００％エタノールをｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写反応に加え、混合した。次に、得られた混合物を−２０℃で１時間インキュベートした。インキュベーション後、混合物を４℃で１５分間１０，０００ｘｇで遠心分離した。上清をピペッティングによりペレットから除去した。次に、ペレットを１００ｕＬの冷却７０％エタノールで洗浄し、１０，０００ｘｇで１５分間４℃で再度遠心分離した。上清をピペッティングにより除去し、ペレットを風燥させた後、５０ｕＬのＲＮａｓｅフリー水に再懸濁した。
【００９９】
キャップ構造を有さないｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写生成ＲＮＡのキャッピング−ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成されたＲＮＡのキャッピングは、製造業者の指示に従って、ＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標）ｍ７Ｇキャッピングシステム及びＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標）２’−Ｏ−メチルトランスフェラーゼキット（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ（商標）カタログ番号Ｃ−ＳＣＣＥ０６２５及びＣ−ＳＣＭＴ０６２５）を用いて行った。簡潔に言えば、５０〜６０ｕｇのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたキャップ構造を有さないＲＮＡをＲＮａｓｅフリーの水に加えて、総体積を６７ｕＬにした。次に、希釈したＲＮＡを６５℃で１０分間インキュベートして、変性させ、その後氷上で保存した。キャッピングマスターミックスは、サンプルあたり１０ｕＬの１０Ｘ  ＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標）キャッピング緩衝液、１０ｕＬの１０ｍＭ  ＧＴＰ、２．５ｕＬの２０ｍＭ  Ｓ−アデノシルメチオニン、２．５ｕＬ  ＳＣＲＩＰＴＧＵＡＲＤ（商標）ＲＮａｓｅ阻害剤、及び４ｕＬ  ＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標）２’−Ｏメチルトランスフェラーゼを添加して調製した。キャッピング反応物は、４ｕＬのＳＣＲＩＰＴＣＡＰ（商標）キャッピング酵素を２９ｕＬのキャッピングマスターミックスに加え、そのミックスを熱変性ＲＮＡに添加することで組み立てた。キャッピング反応を３７℃で３０分間進行させた。キャップ構造を有するＲＮＡを上記のように塩及びエタノール沈殿及び精製により精製し、ＲＮａｓｅフリーの水５０μＬに再懸濁した。キャップ構造を有するｍＲＮＡの品質を評価するために、１ｕｇのキャップ構造を有するｍＲＮＡを５０ｍＬ、１％アガロース非変性ゲルで泳動させた。キャップ構造を有するｍＲＮＡは−８０℃で保存した。
【０１００】
抗原性ライセートの調製−ＭＨＣクラスＩＩ決定基を生成するために、組織１００ｍｇあたり１ｍＬのＰＢＳを、単離させた組織画分に加え、ＰＯＬＹＴＲＯＮ（商標）ＰＴ１２００Ｅ組織ホモジナイザー（Ｋｉｎｅｍａｔｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｂｏｈｅｍｉａ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を使用して破壊した。次に、ホモジナイズさせた組織画分を、３回繰り返して凍結融解サイクルに供し、ホモジナイズさせた混合物を液体窒素及び５５℃の水浴の間で循環させ、−２０℃で保存した。
【０１０１】
ヒト（Ｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）及び野生型マウス（Ｋｏｎｄｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）の樹状細胞を、記載したとおりに調製し、ロードし、成熟させた。前述のとおりｉｎ  ｖｉｔｒｏ共培養を行った（Ｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｄｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００９；Ｋｏｎｄｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。
【０１０２】
キャップ構造を有するｍＲＮＡがロードされた樹状細胞と共培養したＴ細胞によるＩＦＮγの産生。共培養中の総ＰＢＭＣを１０μｇ／ｍｌブレフェルジンＡ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で５時間処理した。細胞を表面マーカーについて抗ＣＤ３、抗ＣＤ８、及び抗ＣＤ２５抗体で染色し、製造業者の指示に従ってＣｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍキット（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して、ＩＦＮ−γの細胞内染色のために固定／透過処理した。
【０１０３】
相同抗原をロードすることにより、ＡＩＭｐ１の産生が増加し、ＣＴＬＡ−４が保持される。ＡＩＭｐ１の産生の増加は、ウエスタンブロットによって実証された。ＣＴＬＡ−４の保持の増大は、細胞培養上清のＣＴＬＡ−４ウエスタンブロット（放出を決定するため）及び保持されたＣＴＬＡ−４含有量を決定する細胞内フローサイトメトリーによって実証された。細胞内ＣＴＬＡ−４のヒストグラム分析は、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８０＋ＣＤ８３＋ＣＤ８６＋細胞集団に基づく。
【０１０４】
ウエスタンブロット分析。全細胞ライセートの調製：プロテアーゼ阻害剤カクテル、ホスファターゼ阻害剤カクテル２及びホスファターゼ阻害剤カクテル３（すべてＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入）を含む１％ＮＰ−４０溶解緩衝液で細胞を氷上で溶解し、１０〜１５分ごとにボルテックスした。細胞ライセートを１４，０００ｘｇで１５分間遠心分離し、透明なライセートを５％β−メルカプトエタノール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を含むレムリ緩衝液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）で１０分間変性させた。さらなる分析のために、変性全細胞ライセートサンプルを−２０℃で保存した。電気泳動及びブロッティング：タンパク質サンプルをＳＤＳゲル電気泳動（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で分離し、その後抗体プローブ用に０．４５μｍニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）に移した。すべてのブロッキング及び抗体染色ステップは、５％ＢＳＡ（ＲＰＩ、Ｇｒａｉｎｇｅｒ）／１ｘＴＢＳＴ緩衝液（０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０）で行った。Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアバージョン２．０．１（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）でサポートされているＣＨＥＭＩＤＯＣ（登録商標）ＸＲＳデジタル画像システムを使用して、ＳＵＰＥＲＳＩＧＮＡＬ（登録商標）ＷｅｓｔＦｅｍｔｏ  Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によりウエスタンブロット化学発光シグナルを検出した。デンシトメトリーは、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアを用いて行った。
【０１０５】
実施例２−結果
新鮮な組織からのＲＮＡ単離により高品質のＲＮＡが得られる−新鮮な組織または凍結組織が下流プロセシングでより高品質のＲＮＡを生成したかを確認するために、３０ｍｇの３つの異なる凍結腫瘍組織または単一の新鮮な腫瘍からトータルＲＮＡを単離した。図１で確認されるように、３つの凍結組織から単離されたＲＮＡは、レーン内に大きいスメアとして目で確認される有意な分解を呈する。レーン４は、２つの明確に定義されたバンドを有し、ＲＮＡの完全性が高いことを示している。
【０１０６】
商業ＲＮＡ単離方法の比較−トータルＲＮＡを、ＲＮＥＡＳＹ（登録商標）ミニキット（Ｑｉａｇｅｎ）またはグアニジニウムチオシアネート／フェノール／クロロホルムに基づく方法であるＴＲＩＰＵＲＥ（登録商標）ＲＮＡ単離試薬（Ｒｏｃｈｅ）のいずれかを使用して、腫瘍組織３０ｍｇから単離した。これらの方法は両方とも、図２に見られるように高品質のＲＮＡをもたらした。しかし、ＴＲＩＰＵＲＥ（登録商標）法では、同じ投入量でＲＮＥＡＳＹ（登録商標）キットよりも４．４倍多いＲＮＡが得られた。
【０１０７】
腫瘍細胞から単離されたｍＲＮＡからのｉｎ  Ｖｉｔｒｏ転写ＲＮＡ−図３は、腫瘍細胞から単離されたｍＲＮＡの逆転写、及びその後の本発明の方法によるｃＤＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写に使用される方法（実施例１を参照）のためのプライマーなどの図を示す。２つの異なる逆転写及びｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写法を比較した（図４）。レーン１及び２は、Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ法（Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）によって調製された、キャップ構造を有さないＲＮＡまたはキャップ構造を有するＲＮＡのいずれかを示している。レーン３及び４は、本明細書に記載の方法により調製されたキャップ構造を有さないＲＮＡまたはＲＮＡのいずれかを示す。以前の方法では、非常に小さい転写産物の富化を示したが、本明細書に記載された方法では、より大きい分子量においてＲＮＡのスメアをもたらした。
【０１０８】
共転写キャッピングによる小さい転写産物の富化。すべての転写産物を確実に正確に表現するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写されたｍＲＮＡのキャッピングについて２つの方法を試験した。図５には、各方法により生成されたキャップ構造を有するＲＮＡのアガロースゲルを示す。レーン１は、転写後にキャップ構造を有するＲＮＡを示し、レーン２は共転写後にキャップ構造を有するＲＮＡを示す。明らかに、レーン２において、転写スメアがはるかに明白であり、ＲＮＡが現在の方法で生成され、共転写によりキャップ構造を有する。表１及び表２には、Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ法（Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）によって生成された生成物の濃度、体積、及び収量を示す。Ｋｏｎｄｕｒｉ／Ｄｅｃｋｅｒハイブリッドの調製は、本方法に準拠する。
【０１０９】
【表１】
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【０１１０】
【表２】
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【０１１１】
ＩＦＮγの産生は、ロードされたＤＣとの共培養によって増加する−樹状細胞には、本明細書に記載の方法で調製された抗原ライセート及びｍＲＮＡが相同的にロードされ、または前立腺ｍＲＮＡ及び膵臓腫瘍ライセートが異種にロードされた（不一致）。図６は、指し示された樹状細胞と共培養したＴ細胞によって産生された相対的ＩＦＮγレベルを示す。キャップ構造を有するＲＮＡ及び抗原ライセートがロードされた樹状細胞は、明らかにＩＦＮγ産生を刺激し、キャップ構造を有さないＲＮＡがロードされた樹状細胞、または未成熟またはロードされていない樹状細胞よりも優れている。
【０１１２】
相同的にロードされた樹状細胞との共培養では、抗原特異的なＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞が増加する―図７には、本明細書に記載の方法により生成されたキャップ構造を有さないｍＲＮＡまたはキャップ構造を有するｍＲＮＡのいずれか及びライセートを相同的にロードしたか、または前立腺ｍＲＮＡ及び膵臓腫瘍ライセート（不一致）をロードした樹状細胞と共培養した後、ＩＦＮγレベルでソートしたＣＤ８＋ＣＤ２５＋細胞のフローサイトメトリー分析の結果を示す。本明細書に記載の方法により生成された相同的にロードされたライセート及びｍＲＮＡでは、抗原特異的ＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞のレベルが有意に増大する。
【０１１３】
相同的抗原をロードすることにより、ＡＩＭｐ１の生成及びＣＴＬＡ４の保持が増大する−相同的抗原のロードまたは異種抗原のロード（不一致）後の樹状細胞のＡＩＭｐ１生成及びＣＴＬＡ４の保持を評価した。図８は、対照として提供されたβ−アクチンを含むライセートにおけるＡＩＭｐ１及びＣＴＬＡ−４のウエスタンブロットを示す。本明細書で提供される方法によって作製されたキャップ構造を有するｍＲＮＡを用いた相同抗原のロードは、レーン５で見られるように、ＡＩＭｐｌの量及び細胞内ＣＴＬＡ−４の量が増加している。このことを確認するために、ロードされていない、ｍＲＮＡのみがロードされている、ライセートのみ、両方、または不一致抗原のいずれかで、樹状細胞に対してフローサイトメトリーを行った。図９には、ＣＴＬＡ４の保持が、ｍＲＮＡ及び相同抗原ライセートの両方がロードされたＣＤ１１ｃ＋ＣＤ８０＋ＣＤ８３＋ＣＤ８６＋細胞において有意に増大していることを示す。本明細書に提供されている方法により生成された抗原ライセート及びｍＲＮＡが相同的にロードされた細胞では、ＣＴＬＡ４の保持が増大していることがさらに確認され、ＣＬＴＡ４について、樹状細胞ライセート及び上清をウエスタンブロットによりプローブした（図１０）。抗原ライセート及びいずれかの方法で調製したｍＲＮＡをロードすることにより、上清に存在するＣＴＬＡ４の量が減少し、保持が増大したことを示している。
【０１１４】
相同抗原ロードでは、樹状細胞内でのＩＬ−１２転写が増加する―樹状細胞は、ＲＴ−ｑＰＣＲによってＩＬ−１２ａ及びＩＬ−１２ｂの産生について評価した。図１１に見られるように、本明細書で提供される方法（ＴＲＩｐｕｒｅ−ＩＶＴ）によって生成されたライセート及びｍＲＮＡの両方を伴う抗原ロードでは、ライセート、ｍＲＮＡ、または異種ロードのみのロードよりも両方のＩＬ−１２転写産物が増加し、また、以前の方法で調製したｍＲＮＡをロードした場合よりもＩＬ−１２転写産物の産生が増加する（カラム−ＩＶＴ）。
【０１１５】
実施例３−増幅させたｍＲＮＡを用いた追加の研究
追加の研究が行われ、増幅させたｍＲＮＡが、相同ライセートと共にＤＣにロードされたときに、ネイティブポリＡ  ｍＲＮＡと同じ効率で、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＴＨ１免疫応答が生じることが示された。例えば、図１３Ａに示す結果では、ａ）ネイティブポリＡ腫瘍ｍＲＮＡ及び相同／異種ライセート、または２）キャップ構造を有するＩＶＴ増幅ｍＲＮＡ及び相同／異種ライセートがロードされた単球由来のヒトＤＣを示す。次に、ＤＣをＴ細胞と共培養し、活性化されたＣＤ８＋ＣＤ２５＋Ｉｆｎｇ＋細胞の割合をフローで分析した。ロードされていないＤＣまたはキャップ構造を有さないｍＲＮＡがロードされたＤＣと共培養したＴ細胞は、対照として機能させた。図１３Ｂには、ポリＡｍＲＮＡまたはＩＶＴ増幅ｍＲＮＡ及び相同または異種細胞ライセートの様々な組み合わせをロードしたＤＣを４８時間成熟させ、細胞内ＣＴＬＡ４レベルをフローサイトメトリーで分析した結果を示す。単独でロードされたＤＣ及びロードされていないＤＣが対照として機能する。細胞内ＣＴＬＡ−４の上方制御は、保持の増大及びそれによる分泌の減少を示す。ＵＬ−非ロードＤＣ、キャップ構造を有さないｍＲＮＡ−キャップ構造を有さないＩＶＴ  ｍＲＮＡをロードしたＤＣ、ｍＲＮＡ−ポリＡ  ｍＲＮＡをロードしたＤＣ、ライセート−ライセートをロードしたＤＣ、２ｘｗ／キャップ構造を有さない−キャップ構造を有さないＩＶＴ  ｍＲＮＡ及び相同ライセートをロードしたＤＣ、２ｘキャップ構造を有する−キャップ構造を有するＩＶＴ  ｍＲＮＡ及び相同ライセートがロードされたＤＣ、キャップ構造を有さないＭＭ−キャップ構造を有さないＩＶＴ  ｍＲＮＡ及び異種ライセートがロードされたＤＣ、キャップ構造を有するＭＭ−キャップ構造を有するＩＶＴ  ｍＲＮＡ及び異種ライセートがロードされたＤＣ。
【０１１６】
実施形態の方法では、非常に少量の出発組織から、免疫応答を刺激する際に使用するために十分な量のｍＲＮＡを増幅させることができた。以下の表３に示す結果には、様々な出発サンプルから生成され得るＲＮＡの量を示す。
【０１１７】
【表３】
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【０１１８】
本明細書に開示され主張される方法のすべては、本開示に照らして、過度の実験なく実行かつ達成され得る。本発明の組成物及び方法が、好ましい実施形態に関して記述されているが、変形が、本発明の概念、趣旨、または範囲から逸脱することなく、本明細書に記載される方法及びステップまたは本方法のステップの順序において適用され得ることが、当業者には明らかであろう。より具体的には、同一または類似の結果が達成される限り、化学的及び生理学的の両方に関連する特定の剤が、本明細書に記載される剤に置き換えられ得ることが明らかであろう。当業者にとって明らかであるすべてのこうした類似の置換及び修正は、添付の特許請求の範囲により定義される本発明の趣旨、範囲、及び概念の範囲内にあるとみなされる。
参考文献
以下の参考文献は、これらが例示的な手法または他の細部の補足を本明細書に記載されるものに提供する限りにおいて、特に参考により本明細書に組み込まれる。
Ｓｌａｇｔｅｒ−Ｊａｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．「Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｔｏ  Ｉｍｐｒｏｖｅ  ＤＣ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｅ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ」Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２（５）：ｅ９１，２０１３
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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