(57)【要約】本発明は、Ｗｎｔ経路シグナリングに関連する疾患及び障害を治療するための任意の様々な療法で使用され得る、抗ＬＲＰ５／６モノクローナル抗体及び関連する組成物を提供する。表１Ａのいずれかの抗体について記載されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３配列、ならびに／または表１Ａのいずれかの抗体について記載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３配列を含む、１つ以上のＬＲＰ５またはＬＲＰ６受容体と結合する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは１つ以上のアミノ酸修飾を含む当該抗体のバリアントまたはその抗原結合フラグメントであって、当該ＣＤＲ配列中に８つ未満のアミノ酸置換を含む、当該抗体のバリアントまたはその抗原結合フラグメント。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上のＬＲＰ５またはＬＲＰ６受容体に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、下記を含む配列：
（ｉ）表１Ａのいずれかの抗体について記載されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３配列、
（ｉｉ）表１Ａのいずれかの抗体について記載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３配列、ならびに／または
（ｉｉｉ）表２のいずれかの抗体について記載されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ３、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３配列、を含む、単離抗体またはその抗原結合フラグメント、
あるいは、１つ以上のアミノ酸修飾を含む前記抗体のバリアントまたはその抗原結合フラグメントであって、前記ＣＤＲ配列中に８つ未満のアミノ酸置換を含む、前記抗体のバリアントまたはその抗原結合フラグメント。
【請求項２】
配列番号１〜２４のいずれかに記載されたアミノ酸配列に対し少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３】
配列番号１〜２４のいずれかに記載されたアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む、請求項２に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項４】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがヒト化されている、請求項１〜３のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、１本鎖抗体、ｓｃＦｖ、ヒンジ領域を欠いた１価抗体、ＶＨＨもしくはｓｄＡｂ、またはミニボディである、請求項１〜５のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがＶＨＨ  ＶＨＨまたはｓｄＡｂである、請求項５に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項７】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントである、請求項１に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項８】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが融合タンパク質である、請求項１〜７のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項９】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、１つ以上のフリズルド（Ｆｚｄ）受容体に結合するポリペプチド配列と融合している、請求項８に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１０】
１つ以上のＦｚｄ受容体に結合する前記ポリペプチド配列が、１つ以上のＦｚｄ受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである、請求項９に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１１】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがＬＲＰ５に結合する、請求項１〜１０のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１２】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがＬＲＰ６に結合する、請求項１１に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１３】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントがＬＲＰ５及びＬＲＰ６に結合する、請求項１２に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１４】
ヒトＬＲＰ５またはＬＲＰ６との結合において請求項１〜１３のいずれかに記載の抗体と競合する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１５】
前記ＬＲＰ５またはＬＲＰ６に５０μＭ以下のＫＤで結合する、請求項１〜１４のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１６】
細胞内の、任意選択で哺乳類細胞内のＷｎｔシグナリング経路を調節する、請求項１〜１５のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１７】
前記細胞内の前記Ｗｎｔシグナリング経路を介してシグナリングを増加させる、請求項１６に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１８】
前記細胞内の前記Ｗｎｔシグナリング経路を介してシグナリングを減少させる、請求項１６に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項１９】
前記Ｗｎｔシグナリング経路がカノニカルＷｎｔシグナリング経路である、請求項１６〜１８のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２０】
前記Ｗｎｔシグナリング経路が非カノニカルＷｎｔシグナリング経路である、請求項１６〜１８のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする、単離ポリヌクレオチド。
【請求項２２】
請求項２２に記載の単離ポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項２３】
請求項２２に記載の発現ベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項２４】
生理的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と、請求項１〜２０または３３のいずれかに記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量とを含む、医薬組成物。
【請求項２５】
細胞内のＷｎｔシグナリング経路を刺激するための方法であって、前記細胞を、請求項１７に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントに接触させることを含む、方法。
【請求項２６】
前記抗体またはその抗原結合フラグメントが、１つ以上のフリズルド（Ｆｚｄ）受容体に結合するポリペプチド配列を含む融合タンパク質である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
細胞内のＷｎｔシグナリング経路を阻害するための方法であって、前記細胞を、請求項１８に記載の単離抗体またはその抗原結合フラグメントに接触させることを含む、方法。
【請求項２８】
Ｗｎｔシグナリング低減に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、請求項２４に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含み、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがＷｎｔシグナリング経路のアゴニストである、方法。
【請求項２９】
前記疾患または障害が、骨折、疲労骨折、脊椎圧迫骨折、変形性関節症、骨粗鬆症、骨粗鬆症性骨折、癒合不全骨折、癒合遅延骨折、脊椎固定、脊椎手術のための術前最適化、骨壊死、移植または整形外科デバイスの骨結合、骨形成不全症、骨移植、腱修復、腱−骨結合、歯の成長及び再生、顎顔面手術、歯科インプラント、歯周病、顎顔面再構築、顎、臀部、または大腿骨頭の骨壊死、無血管性壊死、脱毛症、難聴、前庭機能低下、黄斑変性、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、硝子体網膜症、網膜症、糖尿病性網膜症、網膜変性疾患、フックスジストロフィー、角膜疾患、卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、サルコペニア及びカヘキシーにおける筋萎縮、血液脳関門（ＢＢＢ）に影響を及ぼす疾患、脊髄損傷、脊髄疾患、口腔粘膜炎、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、メタボリックシンドローム、糖尿病、脂質異常症、膵炎、膵外分泌機能不全、創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、褥瘡、静脈性下腿潰瘍、表皮水疱症、皮膚形成不全、心筋梗塞、冠動脈疾患、心不全、造血細胞障害、免疫不全、移植片対宿主病、急性腎損傷、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症、あらゆる原因の急性肝不全、薬物誘発性急性肝不全、アルコール性肝疾患、あらゆる原因の慢性肝不全、肝硬変、あらゆる原因の肝線維症、門脈圧亢進症、あらゆる原因の慢性肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（脂肪肝）、アルコール性肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＢＶ）、その他のウイルス性肝炎（例えば、Ａ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＡＶ）及びＤ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＤＶ））、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、肝臓手術、肝損傷、肝移植、肝臓の手術及び移植における「過小グラフト（ｓｍａｌｌ  ｆｏｒ  ｓｉｚｅ）」症候群、先天性肝疾患及び肝障害、遺伝性疾患、変性、加齢、薬物、または損傷に起因するその他の任意の肝障害または検出からなる群より選択される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
Ｗｎｔシグナリング増加または強化に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法であって、前記対象に、請求項２４に記載の医薬組成物の有効量を投与することを含み、前記単離抗体またはその抗原結合フラグメントがＷｎｔシグナリング経路の阻害物質である、方法。
【請求項３１】
前記疾患または障害が、腫瘍及び癌、変性性障害、任意の臓器または組織の線維症、心不全、冠動脈疾患、異所性骨化、骨粗鬆症、及び先天性高骨量障害からなる群より選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
ＬＲＰ６受容体に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、前記ＬＲＰ６受容体のＥ３  β−プロペラ領域、またはＬＲＰ５受容体の対応領域に結合する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３３】
ＬＲＰ６受容体に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、アミノ酸残基６３７〜８７８を含むまたはそれからなる前記ＬＲＰ６受容体の領域内の１つ以上のエピトープ、またはＬＲＰ５受容体の対応領域に結合する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項３４】
１つ以上のＬＲＰ受容体に結合する単離抗体またはその抗原結合フラグメントであって、表３に示されるいずれかのアミノ酸残基のセットにて、５オングストローム未満の距離で前記ＬＲＰ受容体に接触する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１９日に出願された米国仮出願第６２／６０７，８７９号及び２０１８年６月４日に出願された米国仮出願第６２／６８０，５１５号の優先権を主張するものであり、これらの出願はいずれも、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
配列表に関する記述
本発明に付随する配列表は、紙の複写の代わりにテキスト形式で提供され、参照により本明細書に援用される。配列表を含むテキストファイルの名称は、ＳＲＺＮ＿００５＿０２ＷＯ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。このテキストファイルは、１８１ＫＢであり、２０１８年１２月１９日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００３】
本発明は概して、抗ＬＲＰ５／６抗体ならびに抗ＬＲＰ５／６抗体を用いた組成物及び使用方法に関する。このような抗体は、例えば、Ｗｎｔシグナリング経路を調節する方法に有用である。
【背景技術】
【０００４】
Ｗｎｔ（「ウイングレス関連統合部位」または「ウイングレス及びＩｎｔ−１」または「ウイングレス−Ｉｎｔ」）リガンド及びそのシグナルは、多くの本質的な臓器及び組織（骨、肝臓、皮膚、胃、腸、腎臓、中枢神経系、乳腺、味蕾、卵巣、蝸牛、及び他の多くの組織を含む）の発生、ホメオスタシス、及び再生の調節において重要な役割を担っている（例えば、Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｌｏｈ，ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ，２０１４；３４６：１ｔａｂｌｅ  １Ｂ８０１２により概説されている）。Ｗｎｔシグナリング経路の調節は、変性性疾患及び組織損傷の治療に有力である。
Ｗｎｔシグナリング調節の治療薬としての課題の１つは、複数のＷｎｔリガンド及びＷｎｔ受容体、フリズルド１〜１０（Ｆｚｄ１〜１０）の存在であり、多くの組織が複数の重複するＦｚｄを発現する。また、カノニカルＷｎｔシグナルは、Ｆｚｄに加えて、共受容体として、様々な組織内で広く発現する低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質５（ＬＲＰ５）または低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体関連タンパク質６（ＬＲＰ６）にも関係する。したがって、当技術分野では、１つ以上のＦｚｄ、ＬＲＰ５、またはＬＲＰ６と特異的に結合する結合部分（例えば、抗体）が明確に必要とされている。本発明は、この必要性に対処するものである。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｃｌｅｖｅｒｓ，Ｌｏｈ，ａｎｄ  Ｎｕｓｓｅ，２０１４；３４６：１ｔａｂｌｅ  １Ｂ８０１２
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
表１Ａのいずれかの抗体について記載されたＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３配列、ならびに／または表１Ａのいずれかの抗体について記載されたＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３配列を含む、１つ以上のＬＲＰ５またはＬＲＰ６受容体と結合する、単離抗体またはその抗原結合フラグメント、あるいは１つ以上のアミノ酸修飾を含む当該抗体のバリアントまたはその抗原結合フラグメントであって、当該ＣＤＲ配列中に８つ未満のアミノ酸置換を含む、当該抗体のバリアントまたはその抗原結合フラグメント。特定の実施形態において、単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号１〜２４のいずれかに記載のアミノ酸配列に対する少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、または配列番号１〜２４のいずれかに記載のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域を含む。
【０００７】
特定の実施形態において、任意の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されている。ある特定の実施形態において、任意の抗体またはその抗原結合フラグメントは、１本鎖抗体、ｓｃＦｖ、ヒンジ領域を欠いた１価抗体、ＶＨＨもしくは単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）、またはミニボディである。特定の実施形態において、任意の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＶＨＨまたはｓｄＡｂである。特定の実施形態において、任意の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＦａｂまたはＦａｂ’フラグメントである。
【０００８】
ある特定の実施形態において、任意の抗体またはその抗原結合フラグメントは、融合タンパク質である。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つ以上のＦｚｄ受容体に結合するポリペプチド配列と融合している。ある特定の実施形態において、１つ以上のＦｚｄ受容体に結合するポリペプチド配列は、１つ以上のＦｚｄ受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントである。
【０００９】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されている任意の単離抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＬＲＰ５、ＬＲＰ６、またはＬＲＰ５及びＬＲＰ６両方に結合する。
【００１０】
関連する実施形態において、本開示は、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６への結合において本明細書で開示されている任意の抗体と競合する、単離抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００１１】
特定の実施形態において、任意の抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６に５０μＭ以下のＫＤで結合する。
【００１２】
特定の実施形態において、任意の抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞内の、任意選択で哺乳類細胞内のＷｎｔシグナリング経路を調節する。特定の実施形態において、任意の抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞内のＷｎｔシグナリング経路を介したシグナリングを増加させる。特定の実施形態において、任意の抗体またはその抗原結合フラグメントは、細胞内のＷｎｔシグナリング経路を介したシグナリングを減少させる。ある特定の実施形態において、Ｗｎｔシグナリング経路は、カノニカルＷｎｔシグナリング経路または非カノニカルＷｎｔシグナリング経路である。
【００１３】
さらなる関連する実施形態において、本開示は、本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離ポリヌクレオチドを提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、単離ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び発現ベクターを含む単離宿主細胞を提供する。
【００１４】
別の実施形態において、本開示は、生理的に許容される賦形剤、希釈剤、または担体と、本明細書で開示されている単離抗体またはその抗原結合フラグメントの治療有効量とを含む、医薬組成物を提供する。
【００１５】
さらなる実施形態において、本開示は、細胞内のＷｎｔシグナリング経路を刺激するための方法であって、細胞を、本明細書で開示されている、Ｗｎｔシグナリングを増加させる単離抗体またはその抗原結合フラグメントに接触させることを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、１つ以上のフリズルド（Ｆｚｄ）受容体に結合するポリペプチド配列を含む融合タンパク質である。
【００１６】
別の実施形態において、本開示は、細胞内のＷｎｔシグナリング経路を阻害するための方法であって、細胞を、本明細書で開示されている、Ｗｎｔシグナリングを阻害する単離抗体またはその抗原結合フラグメントに接触させることを含む、方法を提供する。
【００１７】
別の実施形態において、本開示は、Ｗｎｔシグナリング低減に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法であって、対象に、本明細書で開示されている、Ｗｎｔシグナリング経路のアゴニストである単離抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法を含む。特定の実施形態において、疾患または障害は、骨折、疲労骨折、脊椎圧迫骨折、変形性関節症、骨粗鬆症、骨粗鬆症性骨折、癒合不全骨折、癒合遅延骨折、脊椎固定、脊椎手術のための術前最適化、骨壊死、移植または整形外科デバイスの骨結合、骨形成不全症、骨移植、腱修復、腱−骨結合、歯の成長及び再生、顎顔面手術、歯科インプラント、歯周病、顎顔面再構築、顎、臀部、または大腿骨頭の骨壊死、無血管性壊死、脱毛症、難聴、前庭機能低下、黄斑変性、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、硝子体網膜症、網膜症、糖尿病性網膜症、網膜変性疾患、フックスジストロフィー、角膜疾患、卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、サルコペニア及びカヘキシーにおける筋萎縮、血液脳関門（ＢＢＢ）に影響を及ぼす疾患、脊髄損傷、脊髄疾患、口腔粘膜炎、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、メタボリックシンドローム、糖尿病、脂質異常症、膵炎、膵外分泌機能不全、創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、褥瘡、静脈性下腿潰瘍、表皮水疱症、皮膚形成不全、心筋梗塞、冠動脈疾患、心不全、造血細胞障害、免疫不全、移植片対宿主病、急性腎損傷、慢性腎疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、特発性肺線維症、あらゆる原因の急性肝不全、薬物誘発性急性肝不全、アルコール性肝疾患、あらゆる原因の慢性肝不全、肝硬変、あらゆる原因の肝線維症、門脈圧亢進症、あらゆる原因の慢性肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）（脂肪肝）、アルコール性肝炎、Ｃ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＣＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＢＶ）、その他のウイルス性肝炎（例えば、Ａ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＡＶ）及びＤ型肝炎ウイルス誘発性肝疾患（ＨＤＶ））、原発性胆汁性肝硬変、自己免疫性肝炎、肝臓手術、肝損傷、肝移植、肝臓の手術及び移植における「過小グラフト（ｓｍａｌｌ  ｆｏｒ  ｓｉｚｅ）」症候群、先天性肝疾患及び肝障害、遺伝性疾患、変性、加齢、薬物、または損傷に起因するその他の任意の肝障害または検出からなる群より選択される。
【００１８】
関連する実施形態において、本開示は、Ｗｎｔシグナリングの増加または強化に関連する疾患または障害を有する対象を治療するための方法であって、対象に、本明細書で開示されている、Ｗｎｔシグナリング経路の阻害物質である単離抗体またはその抗原結合フラグメントを含む医薬組成物の有効量を投与することを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、疾患または障害は、腫瘍及び癌、変性性障害、線維症、心不全、冠動脈疾患、異所性骨化、骨粗鬆症、及び先天性高骨量障害からなる群より選択される。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、ＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ２６結合複合体の結晶構造の図式表現を示している。ＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４は透明な灰色、ＶＨＨ２６は濃い灰色で表されている。ＶＨＨ２６のＣＤＲループの位置がマークされている。ＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４の表面上のグリカンはスティック表現で示されている。
【図２】図２は、ＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ３６結合複合体の結晶構造の図式表現を示している。ＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４は透明な灰色、ＶＨＨ３６は濃い灰色で示されている。ＶＨＨ３６のＣＤＲループの位置がマークされている。ＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４の表面上のグリカンはスティック表現で示されている。
【図３】図３Ａは、Ａ３７５  Ｗｎｔレポーターアッセイを用いたＷｎｔ活性化を示している。図３Ｂは、Ｒｓｐｏを加えたＨＥＫ２９３細胞におけるＷｎｔレポート活性化を示している。両方のアッセイで試験したクローンは、Ｆｚｄ結合物質１８Ｒ５  ｓｃＦｖとＬＲＰ  ＶＨＨまたはｓｄＡｂ結合物質との組合せを含むＷｎｔサロゲート分子である。１８Ｒ５：ＬＲＰサロゲート分子にＦＬＡＧ及びＨｉｓタグを付着させた。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本開示は、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６と特異的に結合する抗体及びその抗原結合フラグメント、詳細には、特定のＬＲＰ受容体特異性及び機能的特性を有する抗体に関する。本発明の１つの実施形態は、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合し、下流Ｗｎｔ経路シグナリング及び生物学的効果を調節することができる、特定のヒト化抗体及びそのフラグメントを包含する。便宜上、「抗ＬＲＰ５／６」という用語は、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６のいずれかまたは両方に結合する抗体及びその抗原結合フラグメントを総称して指すために使用される。
【００２１】
本発明の実施形態は、Ｗｎｔシグナリング経路に関連する疾患及び障害の診断、評価、及び治療のための、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントの使用に関する。ある特定の実施形態において、主題抗体は、Ｗｎｔシグナリングの異常（例えば、増加もしくは減少）に関連する、またはＷｎｔシグナリングの減少もしくは増加が治療利益をもたらすと考えられる、疾患及び障害の治療または防止で使用される。
【００２２】
本発明の実施には、反対の内容が明示されない限り、ウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学、及び組換えＤＮＡ技法の従来的方法が当業者の技能範囲内で用いられ、これらの多くについては例示のために後述する。このような技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ＢｉｏｌｏｇｙまたはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（２００９）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ  ＆  ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）及びその他の類似の参考文献を参照。
【００２３】
本明細書及び付属の請求項で使用する単数形「１つの（ａ／ａｎ）」及び「当該（ｔｈｅ）」は、内容による別段の明確な定めがない限り、複数の指示対象を含む。
【００２４】
本明細書全体において、文脈上他の意味が要求されない限り、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変化形は、述べられた要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群を含み、ただし、いかなる他の要素もしくは整数、または要素もしくは整数の群も除外しないことを意味するものと理解されたい。
【００２５】
本明細書中の各実施形態は、別段の明記がない限り、必要な変更を考慮しながら、他のあらゆる実施形態にも適用されるものとする。
【００２６】
組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換については、標準的な技法を使用することができる（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）。酵素反応及び精製の技法は、製造業者の仕様に従って、または当技術分野で一般的に遂行されているように、または本明細書で説明されているように実施することができる。これら及び関連する技法及び手順は、概して、当技術分野で周知されている従来的な方法に従って、また本明細書全体で引用され論じられている様々な全般的及びより具体的な参考文献に記載されているように、実施することができる。具体的な定義が示されない限り、本明細書で説明されている分子生物学、分析化学、合成有機化学、ならびに医療的化学及び薬学的化学に関連して利用されている名称、ならびにこれらの分野の検査手順及び技法は、当技術分野で周知され一般的に使用されているものである。組換え技術、分子生物学、微生物学、化学合成、化学分析、医薬の調製、製剤、及び送達、ならびに患者の治療については、標準的な技法を使用することができる。
【００２７】
本発明の実施形態は、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合する抗体に関する。例示的な抗体、またはその抗原結合フラグメントもしくは相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列番号１〜２４に記載されている。
【００２８】
当技術分野で周知されているように、抗体は、標的（例えば、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなど）に対し、免疫グロブリン分子の可変領域内にある少なくとも１つのエピトープ認識部位を介して特異的に結合することができる、免疫グロブリン分子である。本明細書で使用する場合、当該用語は、インタクトなポリクローナルまたはモノクローナル抗体を包含するだけでなく、そのフラグメント（例えば、ｄＡｂ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、１本鎖（ｓｃＦｖ）、ＶＨＨまたはｓｄＡｂ（ナノボディの別名でも知られている）、その合成バリアント、天然バリアント、必要とされる特異性を有する抗原結合フラグメントを有する抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、及び必要とされる特異性を有する抗原結合部位またはフラグメント（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の他の任意の修飾配置も包含する。遺伝子融合によって構築された多価性または多重特異的フラグメントである「ダイアボディ」（ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，１９９３）も、本明細書で企図されている抗体の１つの特定の形態である。ＣＨ３ドメインに連結したｓｃＦｖを含むミニボディも本明細書に含まれる（Ｓ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６）。例えば、Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９）；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２，４２３−４２６，１９８８；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ＵＳＡ，８５，５８７９−５８８３，１９８８）；ＰＣＴ／ＵＳ９２／０９９６５；ＷＯ９４／１３８０４；Ｐ．Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０  ６４４４−６４４８，１９９３；Ｙ．Ｒｅｉｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，１４，１２３９−１２４５，１９９６；Ｓ．Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．，５６，３０５５−３０６１，１９９６を参照。
【００２９】
「抗原結合フラグメント」という用語は、本明細書で使用する場合、目的抗原に、詳細にはＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合する免疫グロブリン重鎖及び／または軽鎖の少なくとも１つのＣＤＲを含む、ポリペプチドフラグメントを指す。この点において、本明細書で説明されている抗体の抗原結合フラグメントは、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合する抗体由来の、本明細書に記載のＶＨ及びＶＬ配列の１、２、３、４、５、または６つ全てのＣＤＲを含むことができる。本明細書で説明されているＬＲＰ５／６特異的抗体の抗原結合フラグメントは、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合することができる。ある特定の実施形態において、抗原結合フラグメントまたは抗原結合フラグメントを含む抗体は、Ｗｎｔシグナリング事象を増加させる。ある特定の実施形態において、抗体または抗原結合フラグメントは、ヒトＷｎｔシグナリング経路の生物学的活性に対し特異的に結合するか、またはそれを調節する。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｗｎｔシグナリングを増加または減少させる。
【００３０】
「抗原」という用語は、選択的結合剤（例えば、抗体）が結合することができ、さらに、動物内で使用してその抗原のエピトープに結合可能な抗体を産生することができる、分子または分子の一部分を指す。抗原は、１つ以上のエピトープを有することができる。ある特定の実施形態において、抗体は、タンパク質及び／または巨大分子の複合混合物内の標的抗原を優先的に認識する場合、抗原と特異的に結合するとされる。ある特定の実施形態において、抗体は、平衡解離定数が≦１０−７または１０−８Ｍの場合、抗原と特異的に結合するとされる。いくつかの実施形態において、平衡解離定数は≦１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍとすることができる。
【００３１】
「エピトープ」という用語は、免疫グロブリンまたはＴ細胞受容体と特異的に結合することができる任意の決定因子、好ましくはポリペプチド決定因子を含む。エピトープは、抗体が結合する抗原の一領域である。ある特定の実施形態において、エピトープ決定因子には、アミノ酸、糖側鎖、ホスホリル、またはスルホニルなどの分子の化学的に活性な表面グルーピングを含まれ、ある特定の実施形態においては、特定の３次元構造特性、及び／または特定の電荷特性を有することができる。ある特定の実施形態において、抗体は、タンパク質及び／または巨大分子の複合混合物内の標的抗原を優先的に認識する場合、抗原と特異的に結合するとされる。抗体は、平衡解離定数が≦１０−７または１０−８Ｍの場合、抗原と特異的に結合するとされる。いくつかの実施形態において、平衡解離定数は≦１０−９Ｍまたは１０−１０Ｍとすることができる。
【００３２】
ある特定の実施形態において、本明細書で説明されている抗体及びその抗原結合フラグメントは重鎖及び軽鎖のＣＤＲセットを含み、これらはそれぞれ、重鎖及び軽鎖のフレームワーク領域（ＦＲ）セットの間に存在する。ＦＲセットは、ＣＤＲを支持し、ＣＤＲの相互の空間関係を定義する。本明細書で使用する場合、「ＣＤＲセット」という用語は、重鎖または軽鎖のＶ領域の３つの超可変領域を指す。これらの領域は、重鎖または軽鎖のＮ末端側から進めて、それぞれ「ＣＤＲ１」、「ＣＤＲ２」、及び「ＣＤＲ３」として示される。そのため、抗原結合部位は、重鎖及び軽鎖の各Ｖ領域からのＣＤＲセットを含む、６つのＣＤＲを含む。単一のＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、またはＣＤＲ３）を含むポリペプチドは、本明細書では「分子認識単位」と呼ばれる。複数の抗原−抗体複合体の結晶学的解析により、ＣＤＲのアミノ酸残基が結合抗原と広範な接触を形成し、最も広範な抗原接触が重鎖ＣＤＲ３による接触であることが実証されている。したがって、分子認識単位は、主に抗原結合部位の特異性を担当する。
【００３３】
本明細書で使用する場合、「ＦＲセット」という用語は、重鎖または軽鎖のＶ領域のＣＤＲセットのＣＤＲをフレーム化する、４つの隣接するアミノ酸配列を指す。一部のＦＲ残基が結合抗原に接触する場合もあるが、ＦＲは主として、Ｖ領域を抗原結合部位に、詳細にはＣＤＲに直接隣接するＦＲ残基に折り畳む役割を担う。ＦＲ内では、ある特定のアミノ残基及びある特定の構造的特徴が非常に高度に保存されている。この点において、全てのＶ領域配列は、およそ９０アミノ酸残基の内部ジスルフィドループを含む。Ｖ領域が結合部位に折り畳まれると、ＣＤＲは、抗原結合表面を形成する突出したループモチーフとして提示される。概して、詳細なＣＤＲアミノ酸配列に関係なく、折り畳まれた形状のＣＤＲループがある特定の「カノニカル」構造になるように影響を及ぼす、ＦＲの保存的構造領域が存在することが認識されている。さらに、ある特定のＦＲ残基は、抗体の重鎖及び軽鎖の相互作用を安定化する非共有結合的なドメイン間接触に関与することが知られている。
【００３４】
免疫グロブリン可変ドメインの構造及び位置は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ．４ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ．ＵＳ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ．１９８７及びその最新情報（インターネット（ｉｍｍｕｎｏ．ｂｍｅ．ｎｗｕ．ｅｄｕ）で利用可能）を参照することによって決定することができる。代替的に、ＣＤＲは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇで利用可能なＩＭＧＴ（登録商標）（国際ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ情報システム（登録商標））を使用することによって決定することができる（例えば、Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２７：２０９−２１２；Ｒｕｉｚ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２８：２１９−２２１；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．（２００１）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２９：２０７−２０９；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．（２００３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３１：３０７−３１０；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｉｎ  Ｓｉｌｉｃｏ  Ｂｉｏｌ．，５，０００６［Ｅｐｕｂ］，５：４５−６０（２００５）］；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３３：Ｄ５９３−５９７；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７：Ｄ１００６−１０１２；Ｌｅｆｒａｎｃ，Ｍ．−Ｐ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，４３：Ｄ４１３−４２２を参照）。
【００３５】
「モノクローナル抗体」とは、エピトープの選択的結合に関与するアミノ酸（天然または非天然）から構成される、同質の抗体集団を指す。モノクローナル抗体は特異性が高く、単一のエピトープに向けられる。「モノクローナル抗体」という用語は、インタクトなモノクローナル抗体及び全長モノクローナル抗体を包含するだけでなく、これらのフラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ）、１本鎖（ｓｃＦｖ）、これらのバリアント、モノクローナル抗体の抗原結合部分を含む融合タンパク質、ヒト化モノクローナル抗体、キメラモノクローナル抗体、ならびに必要とされる特異性及びエピトープへの結合能力を有する抗原結合フラグメント（エピトープ認識部位）を含む免疫グロブリン分子の他の任意の修飾配置も包含する。抗体の供給源または抗体が作製される様式（例えば、ハイブリドーマ、ファージ選択、組換え発現、トランスジェニック動物など）については、限定的であるように意図されていない。当該用語は、全免疫グロブリンに加えて、「抗体」の定義において上記で説明されているフラグメントなども含む。
【００３６】
タンパク質分解酵素パパインは、ＩｇＧ分子を優先的に切断していくつかのフラグメントを産生し、そのうちの２つ（Ｆ（ａｂ）フラグメント）はそれぞれ、インタクトな抗原結合部位を含む共有結合的なヘテロ２量体を含む。酵素ペプシンは、ＩｇＧ分子を切断して、両方の抗原結合部位を含むＦ（ａｂ’）２を含めたいくつかのフラグメントをもたらすことができる。本発明のある特定の実施形態に従って使用するＦｖフラグメントは、ＩｇＭ免疫グロブリン分子の、稀な場合にはＩｇＧまたはＩｇＡ免疫グロブリン分子の優先的タンパク質切断によって産生することができる。ただし、Ｆｖフラグメントは、当技術分野で公知の組換え技法を用いて誘導するのがより一般的である。Ｆｖフラグメントは、ネイティブ抗体分子の抗原認識及び結合能力の多くを保持する抗原結合部位を含む、非共有結合的ＶＨ：：ＶＬヘテロ２量体を含む。Ｉｎｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９７２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ６９：２６５９−２６６２；Ｈｏｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５：２７０６−２７１０；及びＥｈｒｌｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９：４０９１−４０９６。
【００３７】
ある特定の実施形態において、１本鎖Ｆｖ抗体、すなわちｓｃＦＶ抗体が企図されている。例えば、カッパボディ（Ｋａｐｐａ  ｂｏｄｙ）（Ｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：９４９−５７（１９９７）；ミニボディ（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １３：５３０５−９（１９９４）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９０：６４４４−８（１９９３）；またはヤヌシン（Ｊａｎｕｓｉｎ）（Ｔｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ  １０：３６５５−５９（１９９１）及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｕｐｐｌ．７：５１−５２（１９９２））は、所望の特異性を有する抗体の選択について本出願の教示に従い、標準的な分子生物学技法を用いて調製することができる。また他の実施形態において、本開示のリガンドを包含する二重特異的抗体またはキメラ抗体が作製され得る。例えば、キメラ抗体は、異なる抗体からのＣＤＲ及びフレームワーク領域を含むことができ、一方、１つの結合ドメインを介してＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６と特異的に結合し、第２の結合ドメインを介して第２の分子と特異的に結合する二重特異的抗体を生成することができる。これらの抗体は、組換え分子生物学の技法を通じて産生することができ、または物理的に一緒に結合体化させることができる。
【００３８】
１本鎖抗体Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ポリペプチドは、ペプチドコードリンカーによって結合したＶＨ−及びＶＬ−コード遺伝子を含む遺伝子融合から発現する、共有結合ＶＨ：：ＶＬヘテロ２量体である。Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５（１６）：５８７９−５８８３。抗体Ｖ領域からの天然に凝集した（ただし、化学的には分離した）ポリペプチド軽鎖及び重鎖を、抗原結合部位の構造と実質的に同様の３次元構造に折り畳まれるｓｃＦｖ分子に変換するための、化学構造を識別する複数の方法が説明されている。例えば、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第５，０９１，５１３号及び第５，１３２，４０５号、ならびにＬａｄｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．に対する米国特許第４，９４６，７７８号を参照。
【００３９】
ある特定の実施形態において、本明細書で説明されているＬＲＰ５／６結合抗体は、ダイアボディの形態をとる。ダイアボディはポリペプチドの多量体であり、各ポリペプチドは、免疫グロブリン軽鎖の結合領域を含む第１のドメインと、免疫グロブリン重鎖の結合領域を含む第２のドメインとを含み、この２つのドメインは（例えば、ペプチドリンカーによって）結合しているが、互いに会合して抗原結合部位を形成することはできない。抗原結合部位は、多量体内のあるポリペプチドの第１のドメインと、多量体内の別のポリペプチドの第２のドメインとの会合によって形成される（ＷＯ９４／１３８０４）。
【００４０】
抗体のｄＡｂフラグメントは、ＶＨドメインからなる（Ｗａｒｄ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））。
【００４１】
二重特異的抗体を使用する場合、それは、様々な方法（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ  Ｇ．Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．４，４４６−４４９（１９９３））で製造することができる（例えば、化学的にまたはハイブリッドハイブリドーマから調製することができる）従来の二重特異的抗体であってもよく、または上述の任意の二重特異的抗体フラグメントであってもよい。ダイアボディ及びｓｃＦｖは、可変ドメインのみを用いてＦｃ領域なしで構築することができ、これにより、抗イディオタイプ反応の影響が潜在的に低減される。
【００４２】
二重特異的ダイアボディは、二重特異的全抗体と対比すると、容易に構築しＥ．ｃｏｌｉ内で発現させることができるため、特に有用でもあり得る。適切な結合特異性のダイアボディ（及び他の多くのポリペプチド（例えば、抗体フラグメント））は、ファージディスプレイ（ＷＯ９４／１３８０４）を用いてライブラリーから容易に選択することができる。ダイアボディの一方のアームが、例えば、抗原Ｘに向けられる特異性について定常性を保つようにする場合、他方のアームを変化させ、適切な特異性の抗体が選択されるようにライブラリーを作製することができる。二重特異的全抗体は、ノブズ・イントゥ・ホールズ（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）操作によって作製することができる（Ｊ．Ｂ．Ｂ．Ｒｉｄｇｅｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，９，６１６−６２１，１９９６）。
【００４３】
ある特定の実施形態において、本明細書で説明されている抗体は、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）の形態で提供することができる。ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、ヒンジ領域が除去されたＩｇＧ４抗体である（ＧｅｎＭａｂ  Ｕｔｒｅｃｈｔ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓを参照；また、例えばＵＳ２００９０２２６４２１も参照）。この独自の抗体技術は、現状の小型抗体形式よりも長い予測治療ウインドウを有する、より小型の安定した抗体形式を創出する。ＩｇＧ４抗体は不活性であると考えられ、したがって免疫システムと相互作用しない。完全ヒトＩｇＧ４抗体は、抗体のヒンジ領域を除去することによって修飾することができ、これにより、対応するインタクトなＩｇＧ４に対し異なる安定性特性を有する半分子フラグメントが得られる（ＧｅｎＭａｂ，Ｕｔｒｅｃｈｔ）。ＩｇＧ４分子を有することで、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）上には同族抗原（例えば、疾患標的）に結合することができるエリアが１つしか残らないため、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、標的細胞上の１つの部位のみに１価で結合する。ある特定のがん細胞表面抗原については、１価の結合が、同じ抗原特異性を有する２価抗体を用いた場合に見られるようにはがん細胞の成長を刺激しないことがあることにより、ＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）技術は、従来的な抗体を用いた治療に抵抗性のいくつかのタイプの癌に対する治療選択肢をもたらすことができる。サイズの小さなＵｎｉＢｏｄｙ（登録商標）は、いくつかの癌形態を治療する場合に非常に有益と考えられ、より大きな固形腫瘍により良好な分子分布をもたらし、有効性を高める可能性がある。
【００４４】
ある特定の実施形態において、本開示の抗体は、ＶＨＨまたはｓｄＡｂの形態をとることができる。ＶＨＨまたはｓｄＡｂは、単一の遺伝子によってコードされ、ほぼ全ての原核生物及び真核生物の宿主内で、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号を参照）、カビ（例えば、ＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓまたはＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、及び酵母（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、またはＰｉｃｈｉａ）（例えば、米国特許第６，８３８，２５４号）内で効率的に産生される。産生プロセスはスケーラブルであり、数キログラムの量のＶＨＨまたはｓｄＡｂが産生されている。ＶＨＨまたはｓｄＡｂは、貯蔵寿命の長い、すぐに使用可能な溶液として製剤化することができる。Ｎａｎｏｃｌｏｎｅ（登録商標）法（例えば、ＷＯ０６／０７９３７２を参照）は、所望の標的に対するＶＨＨまたはｓｄＡｂを生成するための独自の方法であり、Ｂ細胞の自動化高スループット選択に基づいている。
【００４５】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントは、ヒト化されている。これはキメラ分子を意味し、キメラ分子は、概して、組換え技法を用いて調製され、非ヒト種からの免疫グロブリンに由来する抗原結合部位を有し、分子における残りの免疫グロブリン構造は、ヒト免疫グロブリンの構造及び／または配列に基づいている。抗原結合部位は、定常ドメインと融合した完全な可変ドメインか、または可変ドメイン内の適切なフレームワーク領域にグラフトされたＣＤＲのみを含み得る。エピトープ結合部位は、野生型であっても、１つ以上のアミノ酸置換によって修飾されていてもよい。これは、ヒト個体における免疫原としての定常領域を除去するが、外的な可変領域に対する免疫応答の可能性は残存する（ＬｏＢｕｇｌｉｏ，Ａ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８６：４２２０−４２２４；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９８８）８６：１００２９−１００３３；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９８８）３３２：３２３−３２７）。本明細書で開示されている抗ＬＲＰ５／６抗体をヒト化するための例示的な方法としては、米国特許第７，４６２，６９７号に記載の方法が挙げられる。
【００４６】
もう１つのアプローチは、ヒト由来定常領域の提供だけではなく可変領域の修飾にも着目して、できる限りヒトの形態に近づけて再整形するというものである。重鎖及び軽鎖の両方の可変領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むことが知られている。ＣＤＲは問題のエピトープに応答して変化し、結合能力を決定し、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）と隣接している。ＦＲは所与の種で比較的保存されており、ＣＤＲのためのスキャフォールディングを提供すると推定されている。非ヒト抗体が特定のエピトープに対し調製される場合、可変領域は、修飾を行うヒト抗体内に存在するＦＲ上に非ヒト抗体に由来するＣＤＲをグラフトすることにより、「再整形」または「ヒト化」することができる。様々な抗体に対するこのアプローチの適用は、以下文献によって報告されている：Ｓａｔｏ，Ｋ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５３：８５１−８５６．Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，Ｌ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６；Ｋｅｔｔｌｅｂｏｒｏｕｇｈ，Ｃ．Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ４：７７３−３７８３；Ｍａｅｄａ，Ｈ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ  ２：１２４−１３４；Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：４１８１−４１８５；Ｔｅｍｐｅｓｔ，Ｐ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２６６−２７１；Ｃｏ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８：２８６９−２８７３；Ｃａｒｔｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９：４２８５−４２８９；及びＣｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４８：１１４９−１１５４。いくつかの実施形態において、ヒト化抗体は、全てのＣＤＲ配列を保存する（例えば、マウス抗体からの６つ全てのＣＤＲを含むヒト化マウス抗体）。他の実施形態において、ヒト化抗体は、元の抗体に対し改変されている１つ以上（１、２、３、４、５、６つ）のＣＤＲを有し、これは元の抗体からの１つ以上のＣＤＲに「由来する」１つ以上のＣＤＲとも称される。
【００４７】
ある特定の実施形態において、本開示の抗体はキメラ抗体であり得る。この点において、キメラ抗体は、異なる抗体の異種Ｆｃ部分と作用可能に結合した、または融合した、抗ＬＲＰ５／６抗体の抗原結合フラグメントから構成されている。ある特定の実施形態において、異種Ｆｃドメインはヒト起源のものである。他の実施形態において、異種Ｆｃドメインは、患者抗体からの異なるＩｇクラスからのものであってもよく、異なるＩｇクラスにはＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）、ならびにＩｇＭが含まれる。さらなる実施形態において、異種Ｆｃドメインは、１つ以上の異なるＩｇクラスからのＣＨ２及びＣＨ３ドメインから構成されてもよい。ヒト化抗体について上記で述べられているように、キメラ抗体の抗ＬＲＰ５／６抗原結合フラグメントは、本明細書で説明されている抗体のＣＤＲのうちの１つ以上のみ（例えば、本明細書で説明されている抗体の１、２、３、４、５、または６つのＣＤＲ）を含む場合もあれば、全体の可変ドメイン（ＶＬ、ＶＨ、または両方）を含む場合もある。
【００４８】
ある特定の実施形態において、抗体またはそのフラグメントのＦｃ領域は、限定されるものではないが、野生型もしくは修飾ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、もしくはその他のアイソタイプ、例えば、野生型もしくは修飾ヒトＩｇＧ１、ヒトＩｇＧ２、ヒトＩｇＧ３、ヒトＩｇＧ４、ヒトＩｇＧ４Ｐｒｏ（ＩｇＧ４半分子の形成を防止するコアヒンジ領域の変異を含む）、ヒトＩｇＡ、ヒトＩｇＥ、ヒトＩｇＭ、またはＩｇＧ１  ＬＡＬＡＰＧと呼ばれる修飾ＩｇＧ１を含めた、様々な異なるＦｃのいずれかに由来することができる。Ｌ２３５Ａ、Ｐ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ−ＰＧ）バリアントは、補体結合及び固定を除去することに加えて、Ｆｃ−γ依存性の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を除去することがマウスＩｇＧ２ａ及びヒトＩｇＧ１の両方において示されている。本明細書で開示されている任意のＩｇＧにおける特定の実施形態において、ＩｇＧは、以下のアミノ酸置換：Ｎ２９７Ｇ、Ｎ２９７Ａ、Ｎ２９７Ｅ、Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、またはＰ２３６Ｇのうちの１つ以上を含む。
【００４９】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合フラグメントは融合タンパク質を含み、例えば、本明細書では「Ｗｎｔサロゲート」とも呼ばれるＷｎｔシグナリング経路アゴニスト融合タンパク質を含む。本発明のＷｎｔサロゲートは通常、同族フリズルド受容体との結合において、及びＷｎｔシグナリングの活性化において生物学的に活性であり、すなわち、当該サロゲートはＷｎｔアゴニストである。「Ｗｎｔアゴニスト活性」という用語は、Ｗｎｔタンパク質のフリズルドタンパク質に結合する効果または活性を模倣するアゴニストの能力を指す。Ｗｎｔの活性を模倣する本発明のアゴニストの能力は、複数のアッセイで確認することができる。本発明のアゴニストは、典型的には、受容体の天然リガンドが開始する反応または活性と同様のまたは同じ反応または活性を開始する。詳細には、本発明のアゴニストは、カノニカルＷｎｔ／β−カテニンシグナリング経路を強化する。本明細書で使用する場合、「強化する」という用語は、本発明のアゴニスト不在下でのレベルと比べての、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングのレベルの測定可能な増加を指す。
【００５０】
特定の実施形態において、Ｗｎｔシグナリング経路アゴニスト融合タンパク質（またはＷｎｔサロゲート）は、本明細書で開示されている、１つ以上のフリズルド（Ｆｚｄ）受容体と特異的に結合するポリペプチドと融合した抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントを含む。特定の実施形態において、１つ以上のＦｚｄ受容と特異的に結合するポリペプチドは、抗体またはその抗原結合フラグメントである。ある特定の実施形態において、これは、２０１７年１２月１９日に出願された代理人整理番号ＳＲＺＮ−００４／００ＵＳ、「Ａｎｔｉ−Ｆｒｉｚｚｌｅｄ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  Ｕｓｅ」という表題の米国仮特許出願第６２／６０７，８７７号で開示されている、抗体またはその抗原結合フラグメントであり、当該出願はその全体が参照により本明細書に援用される。
【００５１】
ある特定の実施形態において、Ｆｚｄ結合ドメインは、高い親和性で、例えば、少なくとも約１×１０−７Ｍ、少なくとも１×１０−８Ｍ、少なくとも１×１０−９Ｍ、少なくとも１×１０−１０ＭのＫＤでＦｚｄに結合する任意のドメインから選択することができる。好適なＦｚｄ結合ドメインとしては、限定されるものではないが、新規設計されたＦｚｄ結合タンパク質、抗体由来結合タンパク質（例えば、ｓｃＦｖ、Ｆａｂなど）、及び１つ以上のＦｚｄ受容体と特異的に結合する抗体の他の部分；ＶＨＨまたはｓｄＡｂ由来の結合ドメイン；ノッチンベースの操作されたスキャフォールド；ノリン及びノリン由来の操作された結合フラグメント、天然のＦｚｄ結合ドメイン、などが挙げられる。Ｆｚｄ結合ドメインは、所望される１つまたは複数のＦｚｄタンパク質への結合を強化して、例えば、組織選択性をもたらすように、親和性選択的であり得る。
【００５２】
いくつかの実施形態において、Ｆｚｄ結合ドメインは、１つ、２つ、３つ、４つ、５つまたはそれ以上の異なるフリズルドタンパク質、例えば、ヒトフリズルドタンパク質Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ３、Ｆｚｄ４、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ６、Ｆｚｄ７、Ｆｚｄ８、Ｆｚｄ９、Ｆｚｄ１０のうちの１つ以上に結合する。いくつかの実施形態において、Ｆｚｄ結合ドメインは、Ｆｚｄ１、Ｆｚｄ２、Ｆｚｄ５、Ｆｚｄ７、及びＦｚｄ８に結合する。他の実施形態において、Ｆｚｄ結合ドメインは、１つ以上の目的フリズルドタンパク質に対し選択的であり、例えば、１つ以上の所望のフリズルドタンパク質に対し、他のフリズルドタンパク質との対比で少なくとも１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、２００倍、またはそれ以上の特異性を有する。
【００５３】
ある特定の実施形態において、Ｆｚｄ結合ドメインは、汎特異的フリズルド抗体ＯＭＰ−１８Ｒ５（バンチクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ））の６つのＣＤＲ領域を含む。ある特定の実施形態において、Ｆｚｄ結合ドメインは、汎特異的フリズルド抗体ＯＭＰ−１８Ｒ５（バンチクツマブ（ｖａｎｔｉｃｔｕｍａｂ））の６つのＣＤＲ領域を含むｓｃＦｖである。例えば、米国特許第８５０７４４２号を参照（参照により具体的に本明細書に援用される）。例えば、ＯＭＰ−１８Ｒ５のＣＤＲ配列は、ＧＦＴＦＳＨＹＴＬＳ（配列番号２５）を含む重鎖ＣＤＲ１、ＶＩＳＧＤＧＳＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号２６）を含む重鎖ＣＤＲ２、及びＮＦＩＫＹＶＦＡＮ（配列番号２７）を含む重鎖ＣＤＲ３と、（ｉｉ）ＳＧＤＫＬＧＫＫＹＡＳ（配列番号２８）またはＳＧＤＮＩＧＳＦＹＶＨ（配列番号３１）を含む軽鎖ＣＤＲ１、ＥＫＤＮＲＰＳＧ（配列番号２９）またはＤＫＳＮＲＰＳＧ（配列番号３２）を含む軽鎖ＣＤＲ２、及びＳＳＦＡＧＮＳＬＥ（配列番号３０）またはＱＳＹＡＮＴＬＳＬ（配列番号３３）を含む軽鎖ＣＤＲ３と、を含む。特定の実施形態において、フリズルド結合ドメインは、限定されるものではないが、ｓｃＦｖ、ミニボディ、ＶＨＨまたはｓｄＡｂ、及びこれらのＣＤＲ配列のいずれかを含む様々な抗体模倣体を含めた抗体またはその誘導体である。ある特定の実施形態において、これらのＣＤＲ配列は、１つ以上のアミノ酸修飾を含む。
【００５４】
他の実施形態では、Ｆｚｄ結合ドメインは、複数のフリズルド特異的抗体のいずれかからの可変領域配列、またはそのＣＤＲを含み、このような抗体は当技術分野において公知であり、商業的に入手可能であり、または新規に生成することができる。任意のフリズルドポリペプチドは、免疫原として使用することができ、または抗体を開発するためのスクリーニングアッセイで使用することができる。フリズルド結合ドメインの非限定的な例としては、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから入手可能な抗体、例えば、ヒトフリズルド４（ＣＤ３４４）に対し特異的なクローンＣＨ３Ａ４Ａ７；ヒトＦｚ９（ＣＤ３４９）に対し特異的なクローンＷ３Ｃ４Ｅ１１；Ａｂｃａｍから入手可能な抗体、例えば、Ｆｚ７に対し特異的なａｂ６４６３６；ヒトＦｚ４に対し特異的なａｂ８３０４２；ヒトＦｚ７に対し特異的なａｂ７７３７９；ヒトＦｚ８に対し特異的なａｂ７５２３５；ヒトＦｚ９に対し特異的なａｂ１０２９５６；などが挙げられる。その他の好適な抗体の例は、中でも米国特許出願第２０１４０１０５９１７号、米国特許出願第２０１３０２３０５２１号、米国特許出願第２００８０２６７９５５号、米国特許出願第２００８００３８２７２号、米国特許出願第２００３００４４４０９号などで説明されており、各々が参照により具体的に本明細書に援用される。
【００５５】
サロゲートのＦｚｄ結合部分は、Ｗｎｔタンパク質のフリズルド結合領域に対する構造的相同性によって選択される、操作されたタンパク質であり得る。このようなタンパク質は、相同性についての構造データベースをスクリーニングすることによって特定することができる。このようにして、最初のタンパク質（例えば、微生物のＢｈ１４７８タンパク質）が特定される。次いで、ネイティブなタンパク質は親和性を増加させるアミノ酸置換をもたらすように操作され、さらに、所望のフリズルドタンパク質への結合における親和性及び選択性を増加させるために親和性成熟によって選択されてもよい。フリズルド結合部分の非限定的な例としては、Ｆｚ２７及びＦｚ２７−Ｂ１２タンパク質が挙げられる。
【００５６】
抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント、及びＦｚｄ結合ドメインは、直接連結していても、リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー、または非ペプチドリンカーなど）によって分離されていてもよい。１つ以上のＦｚｄ受容体に結合するＷｎｔサロゲートの領域とＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合するＷｎｔサロゲートの領域とは、連続していても、リンカー（例えば、ポリペプチドリンカー、または非ペプチドリンカーなど）によって分離されていてもよい。リンカーの長さ、すなわち結合ドメイン間の間隔は、シグナル強度の調節に使用することができ、またＷｎｔサロゲートの所望の使用に応じて選択することができる。結合ドメイン間の強制的距離は様々であり得るが、ある特定の実施形態では、約１００オングストローム未満、約９０オングストローム未満、約８０オングストローム未満、約７０オングストローム未満、約６０オングストローム未満、約５０オングストローム未満とすることができる。いくつかの実施形態において、リンカーはリジッドリンカーであり、他の実施形態において、リンカーはフレキシブルリンカーである。リンカーがペプチドリンカーである場合、リンカーは、長さが約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０アミノ酸またはそれ以上であり得、結合ドメイン間の距離を強化するのに十分な長さ及びアミノ酸組成である。いくつかの実施形態において、リンカーは、１つ以上のグリシン及び／またはセリン残基を含むか、またはそれらからなる。
【００５７】
Ｗｎｔサロゲートは、例えば、Ｆｃドメインを介し、連鎖、コイルドコイル、ポリペプチドジッパー、ビオチン／アビジンまたはストレプトアビジン多量体化などにより、多量体化することができる。また、Ｗｎｔサロゲートは、当技術分野で公知のようにＰＥＧ、Ｆｃなどのような部分に連結させてｉｎ  ｖｉｖｏで安定性を強化することもできる。
【００５８】
ある特定の実施形態において、Ｗｎｔサロゲートは、１つ以上のＦｚｄタンパク質ならびにＬＲＰ５及びまたはＬＲＰ６に結合することにより、詳細には、細胞表面上、例えば、ヒト細胞の細胞表面上のこれらのタンパク質に結合することにより、カノニカルＷｎｔシグナリングを直接活性化する。ＷｎｔサロゲートによるＷｎｔシグナリングの直接活性化は、ネイティブＷｎｔタンパク質が存在する場合のみ活性を強化するＷｎｔシグナリング増強とは対照的である。
【００５９】
このＷｎｔサロゲートは、例えば、フリズルドタンパク質に結合するＷｎｔタンパク質の効果または活性を模倣することにより、Ｗｎｔシグナリングを活性化する。本発明のＷｎｔサロゲートがＷｎｔの活性を模倣する能力は、複数のアッセイで確認することができる。Ｗｎｔサロゲートは、典型的には、受容体の天然リガンドが開始する反応または活性と同様のまたは同じ反応または活性を開始する。詳細には、本発明のＷｎｔサロゲートは、カノニカルＷｎｔ／β−カテニンシグナリング経路を強化する。本明細書で使用する場合、「強化する」という用語は、本発明のＷｎｔサロゲート不在下でのレベルと比べての、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングのレベルの測定可能な増加を指す。
【００６０】
ある特定の実施形態において、本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｗｎｔ経路シグナリングを阻害する。特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントは、内在的Ｗｎｔが細胞表面上にある１つ以上のＬＲＰ５／６受容体に結合するのを遮断または阻害し、よってＷｎｔシグナリングを低減または阻害する。
【００６１】
Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングのレベルを測定するための様々な方法が当技術分野において公知である。このような方法としては、以下に限定されないが、Ｗｎｔ／β−カテニン標的遺伝子発現、ＴＣＦレポーター遺伝子発現、β−カテニン安定化、ＬＲＰリン酸化、アキシンの細胞質から細胞膜への転座及びＬＲＰへの結合を測定するアッセイが挙げられる。カノニカルＷｎｔ／β−カテニンシグナリング経路は、最終的には、転写因子ＴＣＦ７、ＴＣＦ７Ｌ１、ＴＣＦ７Ｌ２、及びＬＥＦを介して遺伝子発現における変化をもたらす。Ｗｎｔ活性化への転写応答は、複数の細胞及び組織で特性が明らかにされている。そのため、当技術分野で周知の方法による全般的な転写プロファイリングは、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングの活性化または阻害の評価に使用することができる。
【００６２】
Ｗｎｔ応答性遺伝子発現の変化は、概して、ＴＣＦ及びＬＥＦ転写因子によって媒介される。ＴＣＦレポーターアッセイは、ＴＣＦ／ＬＥＦ制御遺伝子の転写の変化を評価して、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングのレベルを決定する。ＴＣＦレポーターアッセイは、最初にＫｏｒｉｎｅｋ，Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，１９９７によって説明された。ＴＯＰ／ＦＯＰの別名でも知られているこの方法は、最適なＴＣＦモチーフＣＣＴＴＴＧＡＴＣの３つのコピーまたは変異モチーフＣＣＴＴＴＧＧＣＣの３つのコピーを、ルシフェラーゼ発現を推進する最小限のｃ−Ｆｏｓプロモーターの上流に使用して（それぞれｐＴＯＰＦｌ＿ＡＳＨ及びｐＦＯＰＦｌ＿ＡＳＨ）、内在性ｐ−カテニン／ＴＣＦ４のトランス活性化活性を決定することを伴う。この２つのレポーター活性（ＴＯＰ／ＦＯＰ）の比率が高いほどβ−カテニン／ＴＣＦ４活性が高いことを示し、この２つのレポーター活性が低いほどβ−カテニン／ＴＣＦ４活性が低いことを示す。
【００６３】
Ｗｎｔシグナルに応答する様々な他のレポーター導入遺伝子がインタクトな状態で動物内に存在し、そのため、内在性Ｗｎｔシグナリングを有効に反映する。このようなレポーターは、ＬａｃＺまたはＧＦＰの発現を推進する多量体化されたＴＣＦ結合部位に基づいており、当技術分野で公知の方法により容易に検出可能である。このようなレポーター遺伝子としては、ＴＯＰ−ＧＡＬ、ＢＡＴ−ＧＡＬ、ｉｎｓ−ＴＯＰＥＧＦＰ、ｉｎｓ−ＴＯＰＧＡＬ、ＬＥＦ−ＥＧＦＰ、アキシン２−ＬａｃＺ、アキシン２−ｄ２ＥＧＦＰ、Ｌｇｒ５ｔｍ１（ｃｒｅ／ＥＲＴ２）、ＴＯＰｄＧＦＰが挙げられる。
【００６４】
脱リン酸化β−カテニンの膜への動員、β−カテニンの安定化及びリン酸化状態、ならびにβ−カテニンの核への転座（Ｋｌａｐｈｏｌｚ−Ｂｒｏｗｎ  Ｚ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２（９）ｅ９４５，２００７）、は、いくつかの場合にはＴＣＦ転写因子及びＴＮＩＫとの複合体形成により媒介され、Ｗｎｔシグナリング経路における重要なステップである。安定化は、「破壊」複合体を阻害するディシブルドファミリータンパク質により媒介され、その結果、細胞内β−カテニンの分解が低減され、その後にβ−カテニンの核への転座が行われる。そのため、細胞内でのβ−カテニンのレベル及び位置の測定は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングのレベルを良好に反映するものである。このようなアッセイの非限定的な一例は、「ＢｉｏＩｍａｇｅ  β−Ｃａｔｅｎｉｎ  Ｒｅｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ」（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、これは、高感度緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）のＣ末端に融合したヒトβ−カテニンを安定的に発現する組換えＵ２０Ｓ細胞を提供する。イメージング及び解析は、ＥＧＦＰ−β−カテニンのレベル及び分布の可視化を可能にする蛍光顕微鏡またはＨＣＳプラットフォームを用いて実施される。
【００６５】
破壊複合体を阻害するもう１つの方法は、アキシンをＷｎｔ共受容体ＬＲＰの細胞質側末端に動員することによるアキシン除去による方法である。アキシンは、リン酸化形態のＬＲＰテールと優先的に結合することが示されている。そのため、アキシン転座の可視化（例えば、ＧＦＰ−アキシン融合タンパク質を用いて）は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナリングのレベルを評価するためのもう１つの方法である。
【００６６】
ある特定の実施形態において、Ｗｎｔシグナリング経路アゴニストは、上記のアッセイで、例えば、ＴＯＰＦｌａｓｈアッセイで測定した場合に、カノニカルＷｎｔシグナリング（例えば、β−カテニンシグナリング）を、中性物質または陰性対照により誘発されるβ−カテニンシグナリングと比べて少なくとも３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１１０％、１５０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、または５００％強化するまたは増加させる。このようなアッセイでは陰性対照が含まれ得る。特定の実施形態において、Ｗｎｔアゴニストは、上記のアッセイ、例えば、ＴＯＰＦｌａｓｈアッセイ、または本明細書で言及されている他のアッセイのいずれかで測定したときに、β−カテニンシグナリングを、アゴニストの不在下での活性と比べて２倍、５倍、１０倍、１００倍、１０００倍、１００００倍、またはそれ以上強化することができる。
【００６７】
ある特定の実施形態において、Ｗｎｔシグナリング経路アンタゴニストまたは阻害物質は、上記のアッセイで、例えば、ＴＯＰＦｌａｓｈアッセイで測定した場合に、カノニカルＷｎｔシグナリング（例えば、β−カテニンシグナリング）を、中性物質または陰性対照の存在下で観察されるβ−カテニンシグナリングと比べて少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、または１００％阻害するまたは減少させる。このようなアッセイでは陽性対照が含まれ得る。
【００６８】
「Ｗｎｔ遺伝子産物」または「Ｗｎｔポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、ネイティブ配列Ｗｎｔポリペプチド、Ｗｎｔポリペプチドバリアント、Ｗｎｔポリペプチド断片、及びキメラＷｎｔポリペプチドを包含する。特定の実施形態において、Ｗｎｔポリペプチドは、ネイティブヒト全長成熟Ｗｎｔタンパク質である。
【００６９】
例えば、本出願における目的ヒトネイティブ配列Ｗｎｔタンパク質としては、以下のものが挙げられる：Ｗｎｔ−１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００５４３０）；Ｗｎｔ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００３３９１）；Ｗｎｔ−２Ｂ（Ｗｎｔ−１３）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４１８５（アイソフォーム１）、ＮＭ＿０２４４９４．２（アイソフォーム２））、Ｗｎｔ−３（ＲｅｆＳｅｑ．：ＮＭ＿０３０７５３）、Ｗｎｔ３ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０３３１３１）、Ｗｎｔ−４（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０３０７６１）、Ｗｎｔ−５Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００３３９２）、Ｗｎｔ−５Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０３２６４２）、Ｗｎｔ−６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００６５２２）、Ｗｎｔ−７Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４６２５）、Ｗｎｔ−７Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０５８２３８）、Ｗｎｔ−８Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０５８２４４）、Ｗｎｔ−８Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００３３９３）、Ｗｎｔ−９Ａ（Ｗｎｔ−１４）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００３３９５）、Ｗｎｔ−９Ｂ（Ｗｎｔ−１５）（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００３３９６）、Ｗｎｔ−１０Ａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０２５２１６）、Ｗｎｔ−１０Ｂ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００３３９４）、Ｗｎｔ−１１（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿００４６２６）、Ｗｎｔ−１６（ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＮｏ．ＮＭ＿０１６０８７））。各メンバーは、当該ファミリーに対し様々な程度の配列同一性を有するが、全てが、小さい（すなわち、３９〜４６ｋＤ）、アシル化され、パルミトイル化され、スペーシングが高度に保存された２３〜２４個のシステイン保存残基を含む、分泌糖タンパク質をコードする（ＭｃＭａｈｏｎ，Ａ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．１９９２；８：２３６−２４２；Ｍｉｌｌｅｒ，ＪＲ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌ．２００２；３（１）：３００１．１−３００１．１５）。目的Ｗｎｔポリペプチドの他のネイティブ配列としては、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、実験用、またはペット用動物を含めた任意の哺乳類、例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ラット、マウス、カエル、ゼブラフィッシュ、ショウジョウバエ、虫などからの上記のオルソログが挙げられる。
【００７０】
「Ｗｎｔ経路シグナリング」または「Ｗｎｔシグナリング」は、生物学的活性Ｗｎｔが、細胞の活性を調節するために細胞に対しその効果を発揮する機構を指すように本明細書で使用されている。Ｗｎｔタンパク質は、フリズルド（Ｆｚｄ）ファミリータンパク質からのタンパク質、ＲＯＲファミリータンパク質からのタンパク質、ＬＲＰファミリータンパク質からのタンパク質ＬＲＰ５及びＬＲＰ６、タンパク質ＦＲＬ１／ｃｒｙｐｔｏ、及びタンパク質Ｄｅｒａｉｌｅｄ／Ｒｙｋを含めたＷｎｔ受容体に結合することにより、細胞活性を調節する。Ｗｎｔ受容体（１つまたは複数）は、ひとたびＷｎｔ結合により活性化されると、１つ以上の細胞内シグナリングカスケードを活性化する。このようなシグナリングカスケードは、カノニカルＷｎｔシグナリング経路；Ｗｎｔ／平面内細胞極性（Ｗｎｔ／ＰＣＰ）経路；Ｗｎｔ−カルシウム（Ｗｎｔ／Ｃａ２＋）経路（Ｇｉｌｅｓ，ＲＨ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  １６５３，１−２４；Ｐｅｉｆｅｒ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １２０：３６９−３８０；Ｐａｐｋｏｆｆ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ（１９９６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１６：２１２８−２１３４；Ｖｅｅｍａｎ，Ｍ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ５：３６７−３７７）；及び当技術分野で周知されているような他のＷｎｔシグナリング経路を含む。
【００７１】
例えば、カノニカルＷｎｔシグナリング経路が活性化された結果、細胞内タンパク質β−カテニンのリン酸化が阻害され、β−カテニンのサイトゾル中での蓄積とその後の核への転座とにつながり、核においてβ−カテニンは転写因子（例えば、ＴＣＦ／ＬＥＦ）と相互作用して、標的遺伝子を活性化する。Ｗｎｔ／ＰＣＰ経路の活性化により、ＲｈｏＡ、ｃ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）、及びネモ様キナーゼ（ＮＬＫ）シグナリングカスケードが活性化されて、組織極性及び細胞運動のような生物学的プロセスをコントロールする。例えば、Ｗｎｔ−４、Ｗｎｔ−５Ａ、またはＷｎｔ−１１の結合によるＷｎｔ／Ｃａ２＋の活性化は、カルシウムイオンの細胞内放出を誘発し、それによりタンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）、カルシウム−カルモジュリン依存性キナーゼＩＩ（ＣａｍＫＩＩ）、またはカルシニューリン（ＣａＣＮ）のようなカルシウム感受性酵素が活性化される。上記のシグナリング経路の活性をアッセイすることにより、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）の生物学的活性を容易に決定することができる。
【００７２】
ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体及びその抗原結合フラグメントの機能的特性は、当業者に知られている様々な方法を用いて評価することができ、このような方法としては、例えば、親和性／結合アッセイ（例えば、表面プラズモン共鳴法、競合阻害アッセイ）、細胞傷害性アッセイ、細胞生存能アッセイ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏモデル（限定されるものではないが、本明細書で説明されている任意のものを含む）を用いたＷｎｔ、がん細胞、及び／または腫瘍成長阻害に応答した細胞の増殖または分化アッセイが挙げられる。その他のアッセイは、正常なＷｎｔ／ＬＲＰ５／６媒介応答を遮断する本明細書に記載の抗体の能力を試験するものであり得る。本明細書に記載の抗体及びその抗原結合フラグメントは、ＬＲＰ５／６受容体内在化に及ぼす効果、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏの有効性などについても試験され得る。このようなアッセイは、当業者に知られている十分に確立したプロトコル（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．Ｉｎｃ．＆  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（編集：Ｊｏｈｎ  Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａｄａ  Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄａｖｉｄ  Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅｔｈａｎ  Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ，Ｗａｒｒｅｎ  Ｓｔｒｏｂｅｒ  ２００１  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，ＮＹを参照）、または市販のキットを用いて実施することができる。
【００７３】
ある特定の実施形態において、ＬＲＰ５／６結合抗体は、本明細書で説明されているＣＤＲのうちの１つ以上を含む。この点において、場合により、所望の特異的結合を保持しながら抗体のＶＨＣＤＲ３のみの移行を実施できることが示されている（Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９５）９２：２５２９−２５３３）。また、ＭｃＬａｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９５）９２：５２１４−５２１８，Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．（１９９４）１１６：２１６１−２１６２も参照。
【００７４】
Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ。（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１９９２，１０：７７９−７８３）は、抗体可変ドメインのレパートリーを産生する方法であって、可変ドメインエリアの５’末端に向けられたまたはそれに隣接するコンセンサスプライマーがヒトＶＨ遺伝子の第３フレームワーク領域に対するコンセンサスプライマーと共に使用されて、ＣＤＲ３を欠いたＶＨ可変ドメインのレパートリーをもたらす、方法について説明している。Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌはさらに、このレパートリーがどのように特定の抗体のＣＤＲ３と組み合わされ得るかについても説明している。類似の技法を用いて、本明細書で説明している抗体のＣＤＲ３由来配列を、ＣＤＲ３を欠いたＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーとシャッフルすることができ、シャッフルした完全なＶＨまたはＶＬドメインは同族ＶＬまたはＶＨドメインと組み合わされて、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントをもたらす。次いで、好適な抗体またはその抗原結合フラグメントが選択されるように、レパートリーをＷＯ９２／０１０４７のファージディスプレイシステムのような好適な宿主システム内で提示することができる。レパートリーは、少なくとも約１０４の個別のメンバーからなることができ、数桁上がって、例えば、約１０６から１０８もしくは１０１０まで、またはそれ以上のメンバーからなることができる。類似のシャッフリングまたはコンビナトリアル技法は、Ｓｔｅｍｍｅｒ（Ｎａｔｕｒｅ，１９９４，３７０：３８９−３９１）によっても開示されている。Ｓｔｅｍｍｅｒはβ−ラクタマーゼ遺伝子に関連する技法について説明しているが、このアプローチは抗体の生成に使用することができると述べている。
【００７５】
さらなる選択肢は、全体の可変ドメイン内で変異を生成するための１つ以上の選択されたＶＨ及び／またはＶＬ遺伝子のランダム変異誘発を用いて、本明細書で説明されている発明実施形態の１つ以上のＣＤＲ由来配列を保有する、新規のＶＨまたはＶＬ領域を生成することである。このような技法は、エラープローンＰＣＲを使用したＧｒａｍ  ｅｔ  ａｌ（１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，８９：３５７６−３５８０）によって説明されている。使用され得るもう１つの方法は、ＶＨまたはＶＬ遺伝子のＣＤＲ領域に対し変異誘発を指示することである。このような技法は、Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，９１：３８０９−３８１３）及びＳｃｈｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９９６，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：５５１−５６７）によって開示されている。
【００７６】
ある特定の実施形態において、本明細書で説明されている抗体の特定のＶＨ及び／またはＶＬは、望ましい特性（例えば、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に対する親和性増加）を有する抗体を特定するための相補性可変ドメインのライブラリーをスクリーニングするのに使用することができる。このような方法は、例えば、Ｐｏｒｔｏｌａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．（１９９３）１５０：８８０−８８７；Ｃｌａｒｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（１９９１）３５２：６２４−６２８で説明されている。
【００７７】
他の方法もＣＤＲの混合及び適合に使用して、所望の結合活性（例えば、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６への結合）を有する抗体を特定することができる。例えば、Ｋｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ（２０００）８３：２５２−２６０は、マウスＶＬと、ＣＤＲ３及びＦＲ４がマウスＶＨから保持されているヒトＶＨとのライブラリーを用いたスクリーニングプロセスについて説明している。抗体を得た後、ＶＨをヒトＶＬライブラリーに対しスクリーニングして、抗原に結合する抗体を得た。Ｂｅｉｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２０００）２９６：８３３−８４９は、全体のマウス重鎖及びヒト軽鎖ライブラリーを用いたスクリーニングプロセスについて説明している。抗体を得た後、１つのＶＬを、マウスのＣＤＲ３が保持されたヒトＶＨライブラリーと組み合わせた。抗原に結合可能な抗体が得られた。Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９８）９５：８９１０−８９１５は、上記のＢｅｉｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌと同様のプロセスについて説明している。
【００７８】
ここで説明した技法は、それ自体は当技術分野で公知のものである。しかし、当業者は、このような技法を使用して、本明細書で説明されている本発明のいくつかの実施形態に従う抗体またはその抗原結合フラグメントを、当技術分野で通例的な方法論を用いて得ることができるであろう。
【００７９】
また、本明細書では、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６抗原に対し特異的な抗体または抗原結合ドメインを得るための方法であって、本明細書で示されるＶＨドメイン、当該ＶＨドメインのアミノ酸配列バリアントであるＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸の付加、欠失、置換、または挿入によって提供することと、任意選択で、このようにして提供されたＶＨドメインを１つ以上のＶＬドメインと組み合わせることと、ＶＨドメインまたはＶＨ／ＶＬ組合せ（１つまたは複数）を試験して、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に対し特異的な、及び任意選択で１つ以上の所望の特性を有する、抗体抗原結合ドメインの特異的結合メンバーを特定することと、を含む、方法が開示されている。ＶＬドメインは、実質的に本明細書で示されているアミノ酸配列を有することができる。本明細書で開示されているＶＬドメインの１つ以上の配列バリアントが１つ以上のＶＨドメインと組み合わされる、類似の方法が用いられてもよい。
【００８０】
特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体及びその抗原結合フラグメントは水溶性である。「水溶性」とは、界面活性剤の不在下で水性緩衝液に可溶であり、ポリペプチドの生物学的有効用量をもたらす濃度で通常可溶である組成物を意味する。水溶性である組成物は、実質的に均質な組成物を形成し、その比活性は、精製の元となる出発材料の少なくとも約５％、通例的には出発材料の少なくとも約１０％、２０％、または３０％、より通例的には出発材料の約４０％、５０％、または６０％であり、約５０％、約９０％、またはそれ以上の場合もある。本発明の抗ＬＲＰ５／６抗体及びその抗原結合フラグメント（Ｗｎｔサロゲートを含む）は、典型的には、少なくとも２５μＭ以上の濃度、例えば、少なくとも２５μＭ、４０μＭ、または５０μＭ、通例的には少なくとも６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、または９０μＭ、時として１００μＭ、１２０μＭ、または１５０μＭもの濃度の、実質的に均質な水溶液を形成する。言い換えれば、本発明の組成物は、典型的には、約０．１ｍｇ／ｍｌ、約０．５ｍｇ／ｍｌ、約１ｍｇ／ｍｌまたはそれ以上の濃度の、実質的に均質な水溶液を形成する。
【００８１】
抗体またはポリペプチドに「特異的に結合する」または「優先的に結合する」（本明細書では交換可能に使用される）エピトープは、当技術分野で十分に理解されている用語であり、このような特異的または優先的な結合を決定する方法も当技術分野で周知されている。ある分子が、代替的な細胞または物質よりも高頻度に、迅速に、長い持続期間で、及び／または高い親和性で、特定の細胞または物質と反応または会合する場合、その分子は「特異的な結合」または「優先的な結合」を示すものとされる。抗体が、標的と「特異的に結合する」または「優先的に結合する」のは、その抗体が、他の物質に対するよりも大きな親和性、アビディティーで、より容易に、かつ／またはより長い持続期間で結合する場合である。例えば、ＬＲＰ５と特異的または優先的に結合する抗体は、ＬＲＰ６または非ＬＲＰ５／６タンパク質に対するよりも大きな親和性、アビディティーで、より容易に、かつ／またはより長い持続期間で、ＬＲＰ５に結合する抗体である。また、この定義を読み取ることにより、例えば、第１の標的と特異的または優先的に結合する抗体（または部分もしくはエピトープ）は、第２の標的と特異的または優先的に結合する場合もあれば結合しない場合もあることも理解される。そのため、「特異的な結合」または「優先的な結合」は、必ずしも排他的結合を必要とするわけではない（ただし、これを含むことはできる）。概して、ただし必ずではないが、結合に対する言及は優先的な結合を意味する。
【００８２】
免疫学的結合とは、概して、免疫グロブリン分子とその免疫グロブリン分子が特異的である抗原との間に生じるタイプの非共有結合的な相互作用を指し、例えば、限定ではなく例示として、静電気的、イオン的、親水的及び／または疎水的な引力または反発、立体的な力、水素結合、ファンデルワールス力、及びその他の相互作用が挙げられる。免疫学的結合相互作用の強度または親和性は、相互作用の解離定数（Ｋｄ）の観点で表現することができ、Ｋｄが小さいほど親和性が大きいことを表す。選択されたポリペプチドの免疫学的結合特性は、当技術分野で周知の方法を用いて定量化することができる。１つのこのような方法は、抗原結合部位／抗原複合体の形成及び解離の速度を測定することを伴い、このような速度は、複合体パートナーの濃度、相互作用の親和性、及び両方向の速度に等しく影響を及ぼす幾何的パラメーターに依存する。したがって、「オン速度定数」（Ｋｏｎ）及び「オフ速度定数」（Ｋｏｆｆ）の両方は、濃度の計算ならびに会合及び解離の実際の速度によって決定することができる。Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎの比は、親和性に関係しない全てのパラメーターの解除を可能にし、したがって解離定数Ｋｄに等しい。全般的には、Ｄａｖｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．５９：４３９−４７３を参照。
【００８３】
ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体は、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に、約１×１０−４Ｍ以下、約１×１０−５Ｍ以下、約１×１０−６Ｍ以下、約１×１０−７Ｍ以下、約１×１０−８Ｍ以下、約１×１０−９Ｍ以下、または少なくとも約１×１０−１０ＭのＫＤで結合する。ある特定の実施形態において、本明細書で説明されている抗ＬＲＰ５／６抗体は、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に、約１０，０００ｎＭ未満、約１０００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約１ｎＭ未満、約０．１ｎＭ未満のＫＤで結合し、いくつかの実施形態においては、抗体は、１つ以上のＦｚｄ受容体に対するさらに高い親和性を有し得る。ある特定の実施形態において、本明細書で説明されている抗ＬＲＰ５／６抗体は、約１００、１５０、１５５、１６０、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、または１９９ピコモルのＫＤの親和性を有し、いくつかの実施形態においては、抗体は、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に対するさらに高い親和性を有し得る。
【００８４】
「免疫学的に活性」という用語は、免疫学的に活性であるまたは「活性を保っている」エピトープに関し、種々の条件下における、例えば、エピトープが還元及び変性条件に供された後における、抗体（例えば、抗ＬＲＰ５／６抗体）のエピトープ結合能力を指す。
【００８５】
本出願のある特定の好ましい実施形態に従う抗体またはその抗原結合フラグメントは、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６との結合において、（ｉ）抗原と特異的に結合し、かつ（ｉｉ）本明細書で開示されているＶＨ及び／もしくはＶＬドメインを含む、または本明細書で開示されているＶＨ  ＣＤＲ３を含む、本明細書で説明されている任意の抗体、またはこれらのいずれかのバリアントと競合するものであり得る。抗体間の競合は、例えば、ＥＬＩＳＡを用いて、かつ／または、他のタグ付けされていない抗体の存在下で検出され得るある抗体に特異的レポーター分子をタグ付けすることにより、容易にｉｎ  ｖｉｔｒｏでアッセイすることができ、これにより、同じエピトープまたは重複するエピトープに結合する特異的抗体を識別することが可能になる。したがって、本明細書では、本明細書で説明されているＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合する抗体と競合するヒト抗体抗原結合部位を含む、特異的な抗体またはその抗原結合フラグメントが提供される。
【００８６】
この点において、本明細書で使用する場合、「〜と競合する」、「結合を阻害する」、及び「結合を遮断する」（例えば、ＷｎｔのＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６との結合の阻害／遮断を指すか、または抗ＬＲＰ５／６抗体のＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６との結合の阻害／遮断を指す）という用語は、交換可能に使用され、部分的及び完全な阻害／遮断を包含する。ＷｎｔのＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６との阻害／遮断は、好ましくは、Ｗｎｔが阻害または遮断なしでＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合するときに生じる正常なレベルまたはタイプの細胞シグナリングを低減または改変する。また、阻害及び遮断は、本明細書で開示されている抗ＬＲＰ５／６抗体と接触させたときにおける、抗ＬＲＰ５／６抗体に接触させていないリガンドと比べての、ＷｎｔのＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６との結合における任意の測定可能な減少、例えば、ＷｎｔをＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に対し少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％遮断することも含むように意図されている。
【００８７】
免疫グロブリンの定常領域は、可変領域よりも少ない配列多様性を示し、複数の天然タンパク質に結合して重要な生化学的事象を誘発する役目を果たしている。ヒトにおいては、５つの異なる抗体クラスが存在し、これにはＩｇＡ（サブクラスＩｇＡ１及びＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ（サブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む）、ならびにＩｇＭが含まれる。これらの抗体クラスを区別する特徴は定常領域であるが、Ｖ領域内によりわずかな相違が存在することがある。
【００８８】
抗体のＦｃ領域は、複数のＦｃ受容体及びリガンドと相互作用し、エフェクター機能と呼ばれる多数の重要な機能的能力を付与する。ＩｇＧの場合、Ｆｃ領域はＩｇドメインＣＨ２及びＣＨ３を含み、Ｎ末端側ヒンジはＣＨ２につながっている。ＩｇＧクラスにおけるＦｃ受容体の重要なファミリーは、Ｆｃガンマ受容体（ＦｃγＲ）である。これらの受容体は、抗体と免疫システムの細胞アームとの間の情報交換を媒介する（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０；Ｒａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２７５−２９０）。ヒトにおいては、このタンパク質ファミリーは、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）（アイソフォームＦｃγＲＩａ、ＦｃγＲＩｂ、及びＦｃγＲＩｃを含む）；ＦｃγＲＩＩ（ＣＤ３２）（アイソフォームＦｃγＲＩＩａ（アロタイプＨ１３１及びＲ１３１を含む）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＦｃγＲＩＩｂ−１及びＦｃγＲＩＩｂ−２を含む）、ならびにＦｃγＲＩＩｃを含む）；ならびにＦｃγＲＩＩＩ（ＣＤ１６）（アイソフォームＦｃγＲＩＩＩａ（アロタイプＶ１５８及びＦ１５８を含む）ならびにＦｃγＲＩＩＩｂ（アロタイプＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ１及びＦｃγＲＩＩＩｂ−ＮＡ２を含む）を含む（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）。これらの受容体は、典型的には、Ｆｃとの結合を媒介する細胞外ドメインと、膜貫通領域と、細胞内の何らかのシグナリング事象を媒介し得る細胞内ドメインを有する。これらの受容体は、単球、マクロファージ、好中球、樹状細胞、好酸球、マスト細胞、血小板、Ｂ細胞、大顆粒リンパ球、ランゲルハンス細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、及びＴ細胞を含めた様々な免疫細胞内で発現する。Ｆｃ／ＦｃγＲ複合体の形成は、これらのエフェクター細胞を結合抗原部位に動員し、典型的には、細胞内のシグナリング事象及び後に続く重要な免疫応答、例えば、炎症メディエーターの放出、Ｂ細胞活性化、エンドサイトーシス、食作用、及び細胞傷害性攻撃をもたらす。
【００８９】
細胞傷害性及び食作用性エフェクター機能を媒介する能力は、抗体が標的細胞を破壊する有力な機構である。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の溶解を引き起こす細胞媒介性反応は、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）と呼ばれる（Ｒａｇｈａｖａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  １２：１８１−２２０；Ｇｈｅｔｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８：７３９−７６６；Ｒａｖｅｔｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：２７５−２９０）。ＦｃγＲを発現する非特異的細胞傷害性細胞が、標的細胞上の結合抗体を認識し、続いて標的細胞の食作用を引き起こす細胞媒介性反応は、抗体依存性細胞媒介性食作用（ＡＤＣＰ）と呼ばれる。全てのＦｃγＲは、Ｃｇ２（ＣＨ２）ドメインのＮ末端及びすぐ前のヒンジでＦｃ上の同じ領域に結合する。この相互作用は、構造的に十分に特徴づけられており（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３０９：７３７−７４９）、ヒトＦｃＩＩＩｂの細胞外ドメインに結合したヒトＦｃのいくつかの構造が解明されている（ｐｄｂアクセッションコード１Ｅ４Ｋ）（Ｓｏｎｄｅｒｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０００，Ｎａｔｕｒｅ  ４０６：２６７−２７３）（ｐｄｂアクセッションコード１ＩＩＳ及び１ＩＩＸ）（Ｒａｄａｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７６：１６４６９−１６４７７）。
【００９０】
異なるＩｇＧサブクラスはＦｃγＲに対する異なる親和性を有し、典型的に、ＩｇＧ１及びＩｇＧ３は、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４よりも実質的に良好に受容体に結合する（Ｊｅｆｆｅｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｌｅｔｔ  ８２：５７−６５）。全てのＦｃγＲは、ＩｇＧ  Ｆｃ上の同じ領域に、ただし異なる親和性で結合し、高親和性結合物質ＦｃγＲＩはＩｇＧ１に対し１０−８Ｍ−１のＫＤを有し、一方低親和性受容体ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩは概してそれぞれ１０−６及び１０−５で結合する。ＦｃγＲＩＩＩａ及びＦｃγＲＩＩＩｂの細胞外ドメインは９６％同一であるが、ＦｃγＲＩＩＩｂは細胞内シグナリングドメインを有しない。さらに、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ／ｃ、及びＦｃγＲＩＩＩａが、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞内ドメインを有することを特徴とする、正の制御物質であるのに対し、ＦｃγＲＩＩｂは、免疫受容体チロシンベース阻害モチーフを有し、そのため阻害性である。したがって、前者は活性化受容体と呼ばれ、ＦｃγＲＩＩｂは阻害性受容体と呼ばれる。これらの受容体は、異なる免疫細胞上での発現のパターン及びレベルも異なる。また別のレベルの複雑性は、ヒトプロテオームにおける複数のＦｃγＲ多形の存在である。特に臨床的重要性に関連する多形は、Ｖ１５８／Ｆ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａである。ヒトＩｇＧ１は、Ｆ１５８アロタイプに対するよりも高い親和性でＶ１５８アロタイプと結合する。この親和性の違い、ならびに推定されるＡＤＣＣ及び／またはＡＤＣＰに及ぼすその効果の違いは、抗ＣＤ２０抗体リツキシマブ（Ｒｉｔｕｘａｎ（登録商標）、ＩＤＥＣ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎの登録商標）における有効性の重要な決定因子であることが示されている。Ｖ１５８アロタイプを有する患者は、リツキシマブの治療に好都合に応答するが、低親和性Ｆ１５８アロタイプを有する患者は十分に応答しない（Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９：７５４−７５８）。ヒトのおよそ１０〜２０％がＶ１５８／Ｖ１５８ホモ接合性であり、４５％がＶ１５８／Ｆ１５８ヘテロ接合性であり、ヒトの３５〜４５％がＦ１５８／Ｆ１５８ホモ接合性である（Ｌｅｈｒｎｂｅｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９９，Ｂｌｏｏｄ  ９４：４２２０−４２３２；Ｃａｒｔｒｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｂｌｏｏｄ  ９９：７５４−７５８）。したがって、ヒトの８０〜９０％はプアレスポンダーであり、すなわち、少なくとも１つのＦ１５８  ＦｃγＲＩＩＩａアレルを有する。
【００９１】
Ｆｃ領域は、補体カスケードの活性化にも関与する。古典的な補体経路では、Ｃ１はそのＣ１ｑサブユニットによって、抗原（１つまたは複数）と複合体を形成したＩｇＧまたはＩｇＭのＦｃフラグメントに結合する。本発明のある特定の実施形態において、Ｆｃ領域に対する修飾は、本明細書で説明されている＊＊＊特異的抗体の能力を改変（強化または減少）して、補体システムを活性化する（例えば、米国特許第７，７４０，８４７号を参照）。補体活性化を評価するために、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイを実施することができる（例えば、Ｇａｚｚａｎｏ−Ｓａｎｔｏｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０２：１６３（１９９６）を参照）。
【００９２】
したがって、ある特定の実施形態において、本発明は、機能的特性の改変（例えば、ＣＤＣ、ＡＤＣＣ、もしくはＡＤＣＰ活性の低減もしくは強化、または特定のＦｃγＲに対する結合親和性の強化、または血清半減期の増加）を伴った修飾Ｆｃ領域を有する抗ＬＲＰ５／６抗体を提供する。本明細書で企図されているその他の修飾Ｆｃ領域は、例えば、発行済みの米国特許第７，３１７，０９１号、第７，６５７，３８０号、第７，６６２，９２５号、第６，５３８，１２４号、第６，５２８，６２４号、第７，２９７，７７５号、第７，３６４，７３１号、公開された米国出願ＵＳ２００９０９２５９９、ＵＳ２００８０１３１４３５、ＵＳ２００８０１３８３４４、及び公開された国際出願ＷＯ２００６／１０５３３８号、ＷＯ２００４／０６３３５１、ＷＯ２００６／０８８４９４、ＷＯ２００７／０２４２４９で説明されている。
【００９３】
したがって、ある特定の実施形態において、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメインは、免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合している。ある特定の実施形態において、融合は、ヒンジ、ＣＨ２、及びＣＨ３領域の少なくとも一部を含むＩｇ重鎖定常ドメインとの融合である。融合物の少なくとも１つに存在する軽鎖結合に必要な部位を含む第１の重鎖定常領域（ＣＨ１）を有することが好ましい。免疫グロブリン重鎖融合物及び（所望の場合）免疫グロブリン軽鎖をコードするＤＮＡは、別々の発現ベクターに挿入し、好適な宿主細胞に同時形質移入する。このことにより、等しくない比率の３つのポリペプチド鎖を構築に使用することで所望の二重特異的抗体の最適な収率がもたらされる実施形態では、３つのポリペプチドフラグメントの相互の割合を調整する際により高い柔軟性がもたらされる。ただし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらす場合や、比率が、所望の鎖の組合せの収率に意味のある影響を及ぼさない場合は、２つまたは３つ全てのポリペプチド鎖のコード配列を単一の発現ベクターに挿入することが可能である。
【００９４】
本発明の抗体（ならびにその抗原結合フラグメント及びバリアント）は、例えば、精製または診断の応用先で使用するために、エピトープタグまたは標識を含むように修飾することもできる。抗体結合体を作製するための多数の結合基が当技術分野で公知であり、このような結合基としては、例えば、米国特許第５，２０８，０２０号または欧州特許第０  ４２５  ２３５  Ｂ１号、及びＣｈａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）で開示されているものが挙げられる。結合基としては、上記で特定した特許で開示されているように、ジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定基、感光基、ペプチダーゼ不安定基、またはエステラーゼ不安定基が挙げられ、ジスルフィド基及びチオエーテル基が好ましい。
【００９５】
別の企図された実施形態において、本明細書で説明されているＬＲＰ５／６特異的抗体は、別の治療用化合物と結合体化しているかまたは作用可能に結合してもよく、これを本明細書では結合体と呼ぶ。結合体は、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、サイトカイン、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害物質、毒素、放射性同位体、またはその他の治療活性剤であり得る。化学療法剤、サイトカイン、抗血管新生剤、チロシンキナーゼ阻害物質、及びその他の治療剤は上記で説明されており、上述の治療剤の全てが抗体結合体として使用することができる。
【００９６】
免疫結合体は、様々な二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、Ｎ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオナート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシラート、イミノチオラン（ＩＴ）、イミノジエステルの二官能性誘導体（例えば、アジプイミド酸ジメチルＨＣＬ）、活性エステル（例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル）、アルデヒド（例えば、グルタルアルデヒド）、ビス−アジド化合物（例えば、ビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミン）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えば、ビス（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）−エチレンジアミン）、ジイソシアナート（例えば、トルエン２，６−ジイソシアナート）、及びビスー活性フッ素化合物（例えば、１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼン）を用いて、作製される。特定のカップリング剤としては、ジスルフィド結合をもたらすためのＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオ）プロピオナート（ＳＰＤＰ）（Ｃａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．１７３：７２３−７３７［１９７８］）及びＮ−スクシンイミジル−４−（２−ピリジルチオ）ペンタノアート（ＳＰＰ）が挙げられる。リンカーは、１つ以上の切断可能な構成要素の放出を促進する「クリーバブルリンカー」であり得る。例えば、酸不安定性リンカー（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５２：１２７−１３１（１９９２）；米国特許第５，２０８，０２０号）を使用することができる。
【００９７】
ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体及びその抗原結合フラグメントはモノクローナル抗体である。ある特定の実施形態において、これらはヒト化されている。
【００９８】
本発明はさらに、ある特定の実施形態において、本明細書で説明されている抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする単離核酸、例えば、本明細書で説明されているＣＤＲまたはＶＨもしくはＶＬドメインをコードする核酸を提供する。核酸には、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。これら及び関連する実施形態は、本明細書で説明されているＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドを含むことができる。本明細書で使用する場合、「単離ポリヌクレオチド」という用語は、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源またはこれらの何らかの組合せのポリヌクレオチドを意味するものとし、その起源に基づき、単離ポリヌクレオチドは、（１）単離ポリヌクレオチドが自然界で見られる場合においてポリヌクレオチドの全てまたは一部分と会合しない、（２）自然界では結合しないポリヌクレオチドと結合する、または（３）自然界ではより大きな配列の一部として発生しない。
【００９９】
「作用可能に結合した」という用語は、当該用語が適用される構成要素が、好適な条件下でその固有の機能を実行できる関係性にあることを意味する。例えば、タンパク質コード配列と「作用可能に結合した」転写制御配列は、制御配列の転写活性と適合性の条件下でタンパク質コード配列の発現が達成されるように、タンパク質コード配列と連結している。
【０１００】
本明細書で使用する場合、「制御配列」という用語は、自らが連結または作用可能に結合したコード配列の発現、プロセッシング、または細胞内局在化に影響を及ぼすことができるポリヌクレオチド配列を指す。このような制御配列の性質は、宿主生物に依存し得る。特定の実施形態において、原核生物の転写制御配列は、プロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列を含むことができる。他の特定の実施形態において、真核生物の転写制御配列は、１つまたは複数の転写因子の認識部位を含むプロモーター、転写エンハンサー配列、転写終結配列、及びポリアデニル化配列を含むことができる。ある特定の実施形態において、「制御配列」は、リーダー配列及び／または融合パートナー配列を含むことができる。
【０１０１】
本明細書で言及する場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、１本鎖または２本鎖の核酸ポリマーを意味する。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドを含むヌクレオチドは、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、またはいずれかのタイプのヌクレオチドの修飾形態であり得る。前述の修飾としては、塩基修飾（例えば、ブロモウリジン）、リボース修飾（例えば、アラビノシド及び２’，３’−ジデオキシリボース）、ならびにヌクレオチド間結合修飾（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホスホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホルアニラダート、及びホスホロアミダート）が挙げられる。「ポリヌクレオチド」という用語は、具体的には、１本鎖及び２本鎖の形態のＤＮＡを含む。
【０１０２】
「天然ヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド及びリボヌクレオチドを含む。「修飾ヌクレオチド」という用語は、修飾または置換された糖基などを有するヌクレオチドを含む。
【０１０３】
「オリゴヌクレオチド結合」という用語は、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート、ホルホロセレノアート、ホスホロジセレノアート、ホスホロアニロチオアート、ホスホルアニラダート、ホスホロアミダートなどのオリゴヌクレオチド結合を含む。例えば、ＬａＰｌａｎｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１４：９０８１；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，１０６：６０７７；Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６：３２０９；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ａｎｔｉ−Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｓｉｇｎ，６：５３９；Ｚｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，ＯＬＩＧＯＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥＳ  ＡＮＤ  ＡＮＡＬＯＧＵＥＳ：Ａ  ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ  ＡＰＰＲＯＡＣＨ，ｐｐ．８７−１０８（Ｆ．Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，Ｅｄ．），Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｅｎｇｌａｎｄ；Ｓｔｅｃ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，１５１，５１０号；Ｕｈｌｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｐｅｙｍａｎ，１９９０，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，９０：５４３を参照（これらの開示内容は、あらゆる目的において参照により本明細書に援用される）。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドまたはそのハイブリダイゼーションの検出を可能にするために、検出可能な標識を含むことができる。
【０１０４】
「ベクター」という用語は、コード情報を宿主細胞に転送するのに使用される任意の分子（例えば、核酸、プラスミド、またはウイルス）を指すために使用される。「発現ベクター」という用語は、宿主細胞の形質転換に好適であり、かつ、挿入された異種核酸配列の発現を指示及び／または制御する核酸配列を含むベクターを指す。発現には、限定されるものではないが、転写、翻訳、及びイントロンが存在する場合はＲＮＡスプライシングなどのプロセスが含まれる。
【０１０５】
当業者が理解するであろうように、ポリヌクレオチドには、タンパク質、ポリペプチド、ペプチドなどを発現する、または発現するように適合され得るゲノム配列、ゲノム外及びプラスミドコード配列、ならびにより小さな操作遺伝子セグメントが含まれ得る。このようなセグメントは、天然に単離されても、当業者によって合成的に修飾されてもよい。
【０１０６】
これもまた当業者が認識するであろうように、ポリヌクレオチドは、１本鎖（コードまたはアンチセンス）であっても２本鎖であってもよく、またＤＮＡ分子（ゲノム、ｃＤＮＡ、または合成）であってもＲＮＡ分子であってもよい。ＲＮＡ分子には、イントロンを含みＤＮＡ分子に一対一で対応するＨｎＲＮＡ分子と、イントロンを含まないｍＲＮＡ分子とが含まれ得る。さらなるコード配列または非コード配列は、その必要があるわけではないが、本開示に従うポリヌクレオチド内に存在してもよく、ポリヌクレオチドは、その必要があるわけではないが、他の分子及び／または支持材料に結合してもよい。ポリヌクレオチドは、ネイティブ配列を含んでもよく、またはこのような配列のバリアントもしくは誘導体をコードする配列を含んでもよい。
【０１０７】
そのため、これら及び関連する実施形態によれば、本開示は、本明細書で説明されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチドも提供する。ある特定の実施形態において、本明細書で説明されている抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列の一部または全てと、このようなポリヌクレオチドの補体とを含むポリヌクレオチドが提供される。
【０１０８】
当業者には、遺伝暗号の縮重の結果として、本明細書で説明されている抗体をコードするヌクレオチド配列が多数存在することが理解されよう。このようなポリヌクレオチドのいくつかは、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合する抗体をコードするネイティブまたは元のポリヌクレオチド配列のヌクレオチド配列に対し、最小限の配列同一性を有する。それでも、本開示により、コドン使用の相違によって異なるポリヌクレオチドが明示的に企図されている。ある特定の実施形態において、哺乳類発現に対しコドン最適化された配列が特に企図されている。
【０１０９】
そのため、本発明の別の実施形態において、変異誘発アプローチ（例えば、部位特異的変異誘発）が、本明細書で説明されている抗体のバリアント及び／または誘導体の調製のために用いられ得る。このアプローチにより、ポリペプチド配列における特定の修飾は、それらをコードする基礎ポリヌクレオチドの変異誘発を通じて行われ得る。これらの技法は、１つ以上のヌクレオチド配列変化をポリヌクレオチドに導入することにより、例えば、前述の考慮事項のうちの１つ以上を組み込んで、配列バリアントを調製及び試験するための分かりやすいアプローチをもたらす。
【０１１０】
部位特異的変異誘発は、所望の変異のＤＮＡ配列をコードする特定のオリゴヌクレオチド配列と、十分な数の隣接ヌクレオチドとを使用して、横断されている欠失接合部の両側に安定したデュプレックスを形成するために十分なサイズ及び配列複雑性のプライマー配列を提供することにより、変異体の産生を可能にする。変異は、選択されたポリヌクレオチド配列で用いて、ポリヌクレオチド自体の特性を改善、改変、減少、修飾、または他の形で変化させる、かつ／またはコードされたポリペプチドの特性、活性、組成、安定性、または一次配列を改変することができる。
【０１１１】
ある特定の実施形態において、発明者らは、本明細書で開示されている抗体またはその抗原結合フラグメントをコードするポリヌクレオチド配列を変異誘発して、コードされたポリペプチドの１つ以上の特性（例えば、抗体もしくはその抗原結合フラグメントの結合親和性、または特定のＦｃ領域の機能、または特定のＦｃγＲに対するＦｃ領域の親和性）を改変することを企図している。部位特異的変異誘発の技法は当技術分野で周知されており、ポリペプチド及びポリヌクレオチド両方のバリアントを創出するのに広く使用されている。例えば、部位特異的変異誘発は、ＤＮＡ分子の特定の部分を改変するのにしばしば使用される。このような実施形態において、典型的には約１４〜約２５ヌクレオチド長程度を含むプライマーが用いられ、配列の接合部の両側の約５〜約１０残基が改変される。
【０１１２】
当業者が理解するであろうように、部位特異的変異誘発技法は、多くの場合、１本鎖及び２本鎖両方の形態で存在するファージベクターを用いる。部位特異的変異誘発に有用な典型的なベクターとしては、Ｍ１３ファージなどのベクターが挙げられる。このようなファージは容易に商業的に入手可能であり、その使用は当業者に広く周知されている。また、２本鎖プラスミドも、目的遺伝子をプラスミドからファージに移行させるステップを省く部位特異的変異誘発で通例的に用いられている。
【０１１３】
多くの実施形態において、主題モノクローナル抗体をコードする核酸は、宿主細胞に直接導入され、細胞は、コードされる抗体の発現を誘発するのに十分な条件下でインキュベートされる。本開示の抗体は、当業者に周知された標準的な技法を、本明細書で提供されるポリペプチド及び核酸配列と組み合わせて用いて調製される。ポリペプチド配列は、本明細書で開示されている特定の抗体をコードする適切な核酸配列を決定するのに使用することができる。核酸配列は、当業者に周知された標準的方法に従って、様々な発現システムにおける特定のコドン「優先性」を反映するように最適化することができる。
【０１１４】
ある特定の関連する実施形態によれば、本明細書で説明されている１つ以上のコンストラクトと、任意の抗体、ＣＤＲ、ＶＨもしくはＶＬドメイン、またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸とを含む組換え宿主細胞、ならびにコードされた産物を産生する方法であって、そのためのコード核酸から発現させることを含む、方法が提供される。発現は、適切な条件下で、核酸を含む組換え宿主細胞を培養することにより、好都合に達成することができる。発現により産生した後、抗体またはその抗原結合フラグメントは、任意の好適な技法を用いて単離及び／または精製し、次いで所望に応じて使用することができる。
【０１１５】
本明細書で提供される抗体またはその抗原結合フラグメント、ならびにコード核酸分子及びベクターは、例えばそれらの天然の環境から実質的に純粋もしくは均質な形態で、または、核酸の場合は、所望の機能を有するポリペプチドをコードする配列以外で核酸もしくは起源の遺伝子を含まずにもしくは実質的に含まずに、単離及び／または精製することができる。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得、全体的または部分的に合成であり得る。本明細書で示されるヌクレオチド配列への言及は、文脈上他の意味が要求されない限り、指定の配列を有するＤＮＡ分子を包含し、また、Ｔの代わりにＵが用いられた指定の配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０１１６】
様々な異なる宿主細胞でポリペプチドをクローニング及び発現するためのシステムは周知されている。好適な宿主細胞としては、細菌、哺乳類細胞、酵母、及びバキュロウイルスシステムが挙げられる。異種ポリペプチド発現の技術分野で利用可能な哺乳類細胞株としては、チャイニーズハムスター卵巣細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓細胞、ＮＳＯマウス黒色腫細胞、その他多数の細胞が挙げられる。一般的な好ましい細菌宿主はＥ．ｃｏｌｉである。
【０１１７】
Ｅ．ｃｏｌｉなどの原核細胞内での抗体及び抗原結合フラグメントの発現は、当技術分野で十分に確立されている。概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ａ．Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：５４５−５５１（１９９１）を参照。また、培養下の真核細胞内での発現も、抗体またはその抗原結合フラグメントの産生における選択肢として、当業者には利用可能である。最近の概説として、例えば、Ｒｅｆ，Ｍ．Ｅ．（１９９３）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ．４：５７３−５７６；Ｔｒｉｌｌ  Ｊ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ６：５５３−５６０を参照。
【０１１８】
プロモーター配列、終結配列、ポリアデニル化配列、エンハンサー配列を含めた適切な制御配列、マーカー遺伝子、及び必要に応じてその他の配列を含む好適なベクターが選択または構築され得る。ベクターは、必要に応じて、プラスミド、ウイルス（例えば、ファージ）、またはファージミドとすることができる。さらなる詳細については、例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ：２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓを参照。核酸の操作、例えば、核酸コンストラクトの調製、変異誘発、シークエンシング、細胞内へのＤＮＡ導入及び遺伝子発現、ならびにタンパク質の分析における核酸の操作については、多くの公知の技法及びプロトコルがＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，１９９２、または後続の改訂で詳細に説明されている。
【０１１９】
「宿主細胞」という用語は、本明細書で説明されている抗体のうちの１つ以上をコードする核酸配列が導入された、または導入させることが可能である、そしてさらに、選択された目的遺伝子（例えば、本明細書で説明されている任意の抗体をコードする遺伝子）を発現させる、または発現させることが可能である細胞を指すために使用される。当該用語は、親細胞の後代を含み、選択された遺伝子が存在する限り、その後代が形態学または遺伝子的構成において元の親と同一であるかどうかにかかわらずこれを含む。したがって、このような核酸を宿主細胞に導入することを含む方法も企図されている。この導入は、任意の利用可能な技法を用いることができる。真核細胞については、好適な技法としては、リン酸カルシウム形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン、エレクトロポレーション、リポソーム媒介形質移入、及びレトロウイルスまたは他のウイルス（例えば、ワクシニアウイルス、または昆虫細胞の場合はバキュロウイルス）を用いた形質導入を挙げることができる。細菌細胞については、好適な技法としては、塩化カルシウム形質転換、エレクトロポレーション、及びバクテリオファージを用いた形質移入を挙げることができる。導入の後は、例えば、宿主細胞を遺伝子発現向けの条件下で培養することにより、核酸からの発現を引き起こすまたは可能にすることができる。１つの実施形態において、核酸は、宿主細胞のゲノム（例えば、染色体）に組み込まれる。組込みは、標準的な技法に従って、ゲノムとの組換えを促進する配列を含めることによって促進することができる。
【０１２０】
また、本発明は、ある特定の実施形態において、本明細書で説明されているようなＬＲＰ５またはＬＲＰ６特異的抗体などの特定のポリペプチドを発現させるために、発現システム内で上述のようにコンストラクトを使用することを含む方法も提供する。「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」という用語は、通常はファージにより、遺伝子をある細菌から別の細菌へ移行することを指すために使用される。また「形質導入」は、レトロウイルスによる真核細胞配列の取得及び移行も指す。「形質移入（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」という用語は、細胞が外的または外来ＤＮＡを取り込むことを指し、外来ＤＮＡが細胞膜の内側に導入された場合、細胞は「形質移入」されたことになる。複数の形質移入技法が当技術分野で周知されており、本明細書で開示されている。例えば、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，１９７３，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ５２：４５６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ；Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８６，ＢＡＳＩＣ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ；及びＣｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｇｅｎｅ  １３：１９７を参照。このような技法は、１つ以上の外来ＤＮＡ部分を好適な宿主細胞に導入するのに使用することができる。
【０１２１】
本明細書で使用する場合、「形質転換（ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）」という用語は、細胞の遺伝子的特徴の変化を指し、細胞が新たなＤＮＡを含むように修飾された場合、細胞は形質転換したことになる。例えば、細胞は、そのネイティブな状態から遺伝子的に修飾されている場合、形質転換している。形質移入または形質導入の後、形質転換ＤＮＡは、細胞の染色体に物理的に組み込むことによって細胞のＤＮＡと組換えを行う場合もあれば、複製されることなくエピソームエレメントとして一時的に維持される場合もあれば、プラスミドとして独立に複製する場合もある。細胞は、ＤＮＡが細胞分裂で複製される場合、安定的に形質転換したとみなされる。「天然」または「ネイティブ」という用語は、核酸分子、ポリペプチド、宿主細胞などのような生物学的材料と共に使用される場合、自然界に見られ、ヒトによって操作されていない材料を指す。同様に、本明細書で使用する場合、「非天然」または「非ネイティブ」という用語は、自然界に見られず、ヒトによって構造的に修飾または合成された材料を指す。
【０１２２】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」、ならびに「糖タンパク質」という用語は、交換可能に使用され、いかなる特定の長さにも限定されないアミノ酸のポリマーを意味する。当該用語は、ミリスチル化、硫酸化、グリコシル化、リン酸化、及びシグナル配列の付加または欠失のような修飾を除外しない。「ポリペプチド」または「タンパク質」という用語は、アミノ酸の１つ以上の鎖を意味し、各鎖は、ペプチド結合によって共有結合したアミノ酸を含み、当該ポリペプチドまたはタンパク質は、ネイティブタンパク質の、すなわち、天然であり明確に組換えでない細胞によって産生されたタンパク質の配列を有する、ペプチド結合によって共に非共有結合及び／または共有結合した複数の鎖を含んでもよく、また、ネイティブタンパク質のアミノ酸配列を有する分子、またはネイティブ配列からの欠失、ネイティブ配列に対する付加、及び／もしくはネイティブ配列の１つ以上のアミノ酸の置換を有する分子を含んでもよい。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、具体的には、本開示のＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合する抗体、または抗Ｆｚｄ抗体からの欠失、抗Ｆｚｄ抗体に対する付加、及び／もしくは抗ＬＲＰ５または抗ＬＲＰ６抗体の１つ以上のアミノ酸の置換を有する配列を包含する。したがって、「ポリペプチド」または「タンパク質」は、１つのアミノ酸鎖（「単量体」と称される）も複数のアミノ酸鎖（「多量体」と称される）も含むことができる。
【０１２３】
「単離タンパク質」という用語は、本明細書では、主題タンパク質が、（１）典型的には自然界で共に見られると考えられる少なくともいくつかの他のタンパク質を含まないこと、（２）同じ供給源からの（例えば、同じ種からの）他のタンパク質を本質的に含まないこと、（３）異なる種からの細胞によって発現すること、（４）ポリヌクレオチド、脂質、炭水化物、もしくは自然界で会合している他の材料の少なくとも約５０％から分離されていること、（５）「単離タンパク質」が自然界で会合しているタンパク質の一部と（共有結合的もしくは非共有結合的な相互作用によって）会合していないこと、（６）自然界で会合していないポリペプチドと（共有結合的もしくは非共有結合的な相互作用によって）作用可能に会合していること、または（７）自然界で発生しないことを意味する。このような単離タンパク質は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、もしくはその他のＲＮＡによってコードすることができ、または合成起源のものであってもよく、またはこれらの任意の組合せであってもよい。ある特定の実施形態において、単離タンパク質は、その使用（治療用、診断用、予防用、研究用、または他の用途）を妨害すると考えられる、タンパク質もしくはポリペプチドまたは天然の環境で見られるその他の混入物を実質的に含まない。
【０１２４】
本明細書で説明されている抗体のアミノ酸配列修飾が企図されている。例えば、抗体の結合親和性及び／またはその他の生物学的特性を改善するのが望ましい場合がある。例えば、抗体のアミノ酸配列バリアントは、適切なヌクレオチド変化を抗体もしくはその鎖をコードするポリヌクレオチドに導入することにより、またはペプチド合成により、調製することができる。このような修飾としては、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／または当該残基への挿入、及び／または当該残基の置換が挙げられる。最終抗体に到達するために任意の組合せの欠失、挿入、及び置換を行うことができるが、これは、最終コンストラクトが所望の特徴（例えば、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に対する高親和性結合）を所持することを条件とする。また、アミノ酸変化は、抗体の翻訳後プロセスも改変し得、例えば、グリコシル化部位の数また配置の変化をもたらし得る。本発明のポリペプチドについて上記で説明された任意のバリエーション及び修飾は、本発明の抗体に含めることができる。
【０１２５】
本開示は、本明細書で開示されている抗体のバリアントを提供する。ある特定の実施形態において、このようなバリアント抗体またはその抗原結合フラグメントもしくはＣＤＲは、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に対し、本明細書に具体的に記載された抗体配列の少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、ある特定の実施形態においては少なくとも約９０％結合する。さらなる実施形態において、このようなバリアント抗体またはその抗原結合フラグメントもしくはＣＤＲは、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に対し、本明細書に記載の抗体よりも高い親和性で結合し、例えば、本明細書に具体的に記載された抗体配列の少なくとも約１０５％、１０６％、１０７％、１０８％、１０９％、または１１０％定量的に結合する。
【０１２６】
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメント、例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨもしくはｓｄＡｂ、またはＷｎｔサロゲートは、ａ）ｉ．本明細書で説明されている選択された抗体の重鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域と、ｉｉ．選択された抗体の重鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域と、ｉｉｉ．選択された抗体の重鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域とを含む、重鎖可変領域；及び／またはｂ）ｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ１領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ１領域と、ｉｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ２領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ２領域と、ｉｉｉ．選択された抗体の軽鎖ＣＤＲ３領域とアミノ酸配列が同一であるＣＤＲ３領域とを含む、軽鎖可変領域を含むことができ、抗体は、選択された標的（例えば、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６）と特異的に結合する。さらなる実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、バリアント抗体であり、当該バリアントは、ＶＨ及びＶＬ領域のＣＤＲ領域内の最大８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、またはそれ以上のアミノ酸置換以外では、選択された抗体と同一である重鎖及び軽鎖を含む。この点において、選択された抗体のＣＤＲ領域内に１、２、３、４、５、６、７、８、またはある特定の実施形態においては９、１０、１１、１２、１３、１４、１５以上のアミノ酸置換が存在し得る。置換は、ＶＨ及び／またはＶＬ領域のいずれかにおけるＣＤＲ内のものであり得る。（例えば、Ｍｕｌｌｅｒ，１９９８，Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ６：１１５３−１１６７を参照）
特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨもしくはｓｄＡｂ、またはＷｎｔサロゲート）は、任意の特定の抗体について表１Ａで特定されているＣＤＲのうちの１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つを含み得る。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、配列番号３４〜１７２のいずれかを含むもしくはそれからなるＣＤＲＨ１、配列番号１７３〜３１２のいずれかを含むもしくはそれからなるＣＤＲＨ２、配列番号３１３〜４８５のいずれかを含むもしくはそれからなるＣＤＲＨ３、配列番号４８６〜５２４のいずれかを含むもしくはそれからなるＣＤＲＬ１、配列番号５２５〜５５６のいずれかを含むもしくはそれからなるＣＤＲＬ２、及び／または配列番号５５７〜６０７のいずれかを含むもしくはそれからなるＣＤＲＬ３を含む。
【０１２７】
特定の実施形態において、主題抗体（例えば、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨもしくはｓｄＡｂ、またはＷｎｔサロゲート）は、ａ）本明細書で説明されている抗ＬＲＰ５／６抗体の重鎖可変領域に対し少なくとも８０％同一、少なくとも９５％同一、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する重鎖可変領域；及び／またはｂ）本明細書で説明されている抗ＬＲＰ５／６抗体の軽鎖可変領域に対し少なくとも８０％同一、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９８％もしくは９９％同一であるアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を有し得る。例示的なその重鎖領域及び／または軽鎖領域のアミノ酸配列は、配列番号１〜２４に記載されている。
【０１２８】
代表的なポリペプチド（例えば、本明細書で提供されるバリアントＬＲＰ％／６特異的抗体、例えば、本明細書で提供される抗原結合フラグメントを有する抗体タンパク質）の３次元構造の決定は、そのように誘導された構造的バリアントが本明細書で開示されている種の空間充填特性を保持するかどうかを決定する目的で、選択された天然または非天然のアミノ酸による１つ以上のアミノ酸の置換、付加、欠失、または挿入が仮想的にモデル化できるように、通例的な方法論を通じて行うことができる。例えば、Ｄｏｎａｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４  Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．３：２３７８；Ｂｒａｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１８６８−１８７１（２００５）；Ｓｃｈｕｅｌｅｒ−Ｆｕｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１０：６３８（２００５）；Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０３：１２４４（２００６）；Ｄｏｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：１７６（２００７）；Ｑｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４５０：２５９（２００７）；Ｒａｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２７：１０１４−１０１８（２０１０）を参照。これら及び関連する実施形態に、例えば、本明細書で提供されるＬＲＰ５／６特異的抗体、その抗原結合フラグメントの合理的な設計に使用され得る、コンピューターアルゴリズムの追加的ないくつかの非限定的例としては、３Ｄグラフィック及びビルトインスクリプトを用いて大きな生体分子システムを表示、動画化、及び分析するための分子視覚化プログラムであるＶＭＤが挙げられる（Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃｓ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｉｌｌｉｎｏｉｓ  ａｔ  Ｕｒｂａｎａ−Ｃｈａｍｐａｇｎｅのウェブサイト：ｋｓ．ｕｉｕｃ．ｅｄｕ／Ｒｅｓｅａｒｃｈ／ｖｍｄ／を参照）。エネルギー最小化立体構造の空間充填モデルからの原子寸法（ファンデルワールス半径）の決定を可能にする他の多数のコンピュータープログラムが、当技術分野で公知であり、当業者が利用可能であり、異なる化学基に対する高親和性の領域を決定して結合の強化を試みるＧＲＩＤ、数学的アラインメントを計算するＭｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ研究、力場計算及び分析を評価するＣＨＡＲＭＭ（Ｂｒｏｏｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．４：１８７−２１７）及びＡＭＢＥＲ（Ｗｅｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ（１９８１）Ｊ．Ｃｏｍｐｕｔ．Ｃｈｅｍ．１０６：７６５）がある（Ｅｉｓｅｎｆｉｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２６１：Ｃ３７６−３８６；Ｌｙｂｒａｎｄ（１９９１）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｅｌｇ．４６：４９−５４；Ｆｒｏｉｍｏｗｉｔｚ（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ８：６４０−６４４；Ｂｕｒｂａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ７：９９−１１１；Ｐｅｄｅｒｓｅｎ（１９８５）Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ．６１：１８５−１９０；及びＫｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｊ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｄｙｎ．９：４７５−４８８も参照）。様々な適切な計算的コンピュータープログラムが商業的に���入手可能である（例えば、Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ（Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ））。
【０１２９】
特定の実施形態において、本開示は、ＬＲＰ６のＥ３  Ｅ４領域に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。特定の実施形態において、これらは、ＬＲＰ６のＥ３  β−プロペラ領域に結合する。ある特定の実施形態において、これらは、アミノ酸残基６３７〜８７８を含むまたはそれからなるＬＲＰ６の領域に結合し、アミノ酸配列及びナンバリングは実施例に記載のものと一致する。ある特定の実施形態において、これらは、アミノ酸６３７〜８７８を含むＬＲＰ６の領域内のエピトープに結合する。ある特定の実施形態において、抗体またはその抗原結合フラグメントは、表３に開示されている接触点のいずれかまたは全ての点でＬＲＰ６に接触する。１つの実施形態において、ＬＲＰ６上のコア相互作用部位またはエピトープ（５．０Å以下のＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４とＶＨＨ２６との間の原子間距離）は、ＬＲＰ６のＡｒｇ６３９、Ａｌａ６４０、Ｌｙｓ６２２、Ｇｌｕ６６３、Ｉｌｅ６８１、Ｓｅｒ６８２、Ｌｙｓ６８４、Ａｓｐ７０５、Ｔｙｒ７０６、Ｇｌｕ７０８、Ｔｈｒ７２４、Ｇｌｙ７２５、Ａｒｇ７５１、Ｔｒｙ７６７、Ｇｌｙ７６８、Ｇｌｙ７６９、Ａｒｇ７９２、Ｌｅｕ８１０、Ａｓｐ８１１、Ｈｉｓ８３４、Ｐｈｅ８３６、Ｔｒｐ８５０、Ｓｅｒ８５１、Ａｒｇ８５３、Ａｓｐ８７４、Ｔｙｒ８７５、及びＭｅｔ８７７を含む。別の実施形態において、コア相互作用部位（５．０Å以下のＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４とＶＨＨ３６との間の原子間距離）は、ＬＲＰ６のＧｌｕ６６３、Ｓｅｒ６６５、Ｉｌｅ６８１、Ｔｙｒ７０６、Ｇｌｕ７０８、Ｔｈｒ７２４、Ｓｅｒ７４９、Ａｒｇ７５１、Ｔｒｐ７６７、Ｇｌｙ７６８、Ａｒｇ７９２、Ｌｅｕ８１０、Ａｓｎ８１３、Ｐｒｏ８３３、Ｈｉｓ８３４、Ｐｈｅ８３６、Ｔｒｐ８５０、Ｓｅｒ８５１、Ａｒｇ８５３、Ａｓｐ８７４、Ｔｒｙ８７５、及びＭｅｔ８７７を含む。
【０１３０】
本発明の別の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体及びそのヒト化バージョンは、ウサギモノクローナル抗体に由来し、詳細には、ＲａｂＭＡｂ（登録商標）技術を用いて生成される。このような抗体は、必要な配列修飾が最小限であり、それにより、変異系統誘導型（ＭＬＧ：ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ  ｌｉｎｅａｇｅ  ｇｕｉｄｅｄ）ヒト化技術を用いたヒト化後の機能的特性の保持が容易であるため、有利である（例えば、米国特許第７，４６２，６９７号を参照）。したがって、本開示の抗＊＊＊抗体を作製するための例示的方法には、例えば、米国特許第５，６７５，０６３号及び第７，４２９，４８７号で説明されているＲａｂＭａｂ（登録商標）ウサギモノクローナル抗体技術が含まれる。この点において、ある特定の実施形態において、本開示の抗ＬＲＰ５／６抗体はウサギ内で産生される。特定の実施形態において、抗体を産生するハイブリッド細胞を産生するために、ウサギ脾細胞と融合可能なウサギ由来不死Ｂリンパ球が使用される。不死Ｂリンパ球は、内在的免疫グロブリン重鎖を検出可能に発現せず、ある特定の実施形態においては、改変された免疫グロブリン重鎖コード遺伝子を含むことができる。
【０１３１】
組成物
本明細書で説明されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）と、１つ以上の医薬的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む、医薬組成物も開示される。特定の実施形態において、医薬組成物はさらに、１つ以上のＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドを含む。
【０１３２】
さらなる実施形態において、本明細書で説明されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸を含むポリヌクレオチドと、１つ以上の医薬的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む、医薬組成物も開示される。特定の実施形態において、医薬組成物はさらに、ＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）である。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列及び／または３’テーリング配列（例えば、ポリＡテール）をさらに含む修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コード配列と作用可能に結合したプロモーターを含む発現カセットである。ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列、及びＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列は、同じポリヌクレオチド内に存在する。
【０１３３】
さらなる実施形態において、本明細書で説明されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）と、１つ以上の医薬的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む、医薬組成物も開示される。特定の実施形態において、医薬組成物はさらに、ＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドを含む発現ベクター（例えば、ウイルスベクター）を含む。ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列、及びＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列は、同じポリヌクレオチド（例えば、発現カセット）内に存在する。
【０１３４】
本発明はさらに、本明細書で説明されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸と作用可能に結合したプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞と、１つ以上の医薬的に許容される希釈剤、担体、または賦形剤とを含む、医薬組成物を企図している。特定の実施形態において、医薬組成物はさらに、ＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列と作用可能に結合したプロモーターを含むポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む細胞を含む。ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列、及びＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列は、同じポリヌクレオチド（例えば、発現カセット）内に、及び／または同じ細胞内に存在する。特定の実施形態において、細胞は異種細胞であるか、または治療を行う対象から得られた自家細胞である。特定の実施形態において、細胞は幹細胞（例えば、脂肪由来幹細胞または造血幹細胞）である。
【０１３５】
本開示は、第１の活性薬剤としての抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）を送達するための第１の分子と、ＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドを送達するための第２の分子とを含む、医薬組成物を企図している。第１及び第２の分子は、同じタイプの分子であっても異なるタイプの分子であってもよい。例えば、ある特定の実施形態において、第１及び第２の分子はそれぞれ、以下のタイプの分子から独立に選択され得る：ポリペプチド、有機小分子、第１及び第２の活性薬剤をコードする核酸（任意選択でＤＮＡまたはｍＲＮＡ、任意選択で修飾ＲＮＡ）、第１または第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含むベクター（任意選択で発現ベクターまたはウイルスベクター）、ならびに第１または第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含む細胞（任意選択で発現カセット）。
【０１３６】
主題分子は、単独または組合せで、概して安全で、無毒性で、望ましい製剤の調製に有用な医薬的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、及び試薬と共に組み合わせることができ、哺乳類（例えば、ヒトまたは霊長類）の使用に許容される賦形剤を含む。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアロゾル組成物の場合には気体であり得る。このような担体、希釈剤、及び賦形剤の例としては、限定されるものではないが、水、食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。追加の活性化合物も製剤に組み込むことができる。製剤に使用される溶液または懸濁液としては、無菌希釈剤、例えば、注射用水、食塩液、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶媒；抗菌化合物、例えば、ベンジルアルコールまたはメチルパラベン；抗酸化剤、例えば、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウム；キレート化合物、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）；緩衝液、例えば、酢酸、クエン酸、またはリン酸；凝集を防止するための界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ  ２０；ならびに浸透圧調整用化合物、例えば、塩化ナトリウムまたはデキストロースが挙げられ得る。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムのような酸または塩基を用いて調整することができる。特定の実施形態において、医薬組成物は無菌である。
【０１３７】
医薬組成物はさらに、無菌水溶液または分散液、及び無菌注射溶液または分散液を即時調製するための無菌散剤を含んでもよい。静脈内投与向けには、好適な担体としては、生理食塩水、静菌水、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。場合によっては、組成物は無菌であり、また注射が容易な程度に流動性であるべきである。ある特定の実施形態において、組成物は、製造条件及び貯蔵条件下で安定し、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用から守られる。担体は、例えば、溶媒または分散媒とすることができ、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、ならびにこれらの好適な混合物を含む溶媒または分散媒とすることができる。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散させる場合には必要な粒径の維持により、そして界面活性剤の使用により、維持することができる。微生物作用の防止は、様々な抗菌剤及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成することができる。多くの場合、組成物中に等張剤、例えば、糖、ポリアルコール、例えば、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウムを含めるのが好ましいと考えられる。内部組成物の持続的吸収は、組成物中に吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含めることによりもたらされ得る。
【０１３８】
無菌溶液は、必要とされる量の抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（またはコードポリヌクレオチドもしくはこれを含む細胞）を、必要に応じて上記で挙げた成分のうちの１つまたは組合せを有する適切な溶媒に組み込み、その後にフィルター滅菌することにより、調製することができる。概して、分散液は、活性化合物を、基本分散媒と上に挙げた他の成分のうち必要な成分とを含む無菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。無菌注射溶液の調製用の無菌粉末の場合、調製方法は真空乾燥及びフリーズドライであり、これらを用いることで事前に滅菌濾過した溶液から活性成分及び任意の追加的な所望成分を含む粉末がもたらされる。
【０１３９】
１つの実施形態において、医薬組成物は、抗体またはその抗原結合フラグメントを身体からの急速な除去に対し保護する担体（例えば、留置用剤及びマイクロカプセル化送達システムを含めた制御放出製剤）を用いて調製される。生分解性、生体適合性のポリマー、例えば、エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、及びポリ乳酸を使用することができる。このような製剤を調製するための方法は、当業者に明らかであると考えられる。材料も商業的に入手することができる。リポソーム懸濁液も、医薬的に許容される担体として使用することができる。これらは、当業者に公知の方法に従って調製することができる。
【０１４０】
投与を容易にし、薬用量を均一にするために、薬用量単位形態で医薬組成物を製剤化することは有利であり得る。本明細書で使用する場合、薬用量単位形態とは、治療する対象の単位薬用量に適した物理的に別々の単位を指し、各単位は、必要とされる医薬担体と共に所望の効果をもたらすように計算された活性の抗体またはその抗原結合フラグメントの所定量を含む。薬用量単位形態の仕様は、抗体またはその抗原結合フラグメントに特有の特徴、達成すべき特定の治療効果、及び個体の治療向けにこのような活性の抗体またはその抗原結合フラグメントを配合する技術分野に固有の制約によって規定され、これらに直接的に依存する。
【０１４１】
医薬組成物は、容器、パック、またはディスペンサー、例えばシリンジ、例えば充填済みシリンジ内に、投与の説明書と共に含めることができる。
【０１４２】
本発明の医薬組成物は、任意の医薬的に許容される塩、エステル、もしくはこのようなエステルの塩、または、ヒトを含む動物に投与したときに、生物学的活性の抗体もしくはその抗原結合フラグメントを（直接的もしくは間接的に）提供することができる他の任意の化合物を包含する。
【０１４３】
本発明は、本明細書で説明されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）の医薬的に許容される塩を含む。「医薬的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生理的かつ医薬的に許容される塩、すなわち、親化合物の所望の生物学的活性を保持し、所望でない毒性学的効果をそれに付与しない塩を指す。様々な医薬的に許容される塩が当技術分野で公知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，１７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｅｄ．），Ｍａｒｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ＵＳＡ，１９８５（及び最近の版）、“Ｅｎｃｙｃｌｏｐａｅｄｉａ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ”，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｊａｍｅｓ  Ｓｗａｒｂｒｉｃｋ（Ｅｄ．），Ｉｎｆｏｒｍａ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ＵＳＡ（Ｉｎｃ．），ＮＹ，ＵＳＡ，２００７、及びＪ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：２（１９７７）で説明されている。また、好適な塩の概説については、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ”（Ｓｔａｈｌ  ａｎｄ  Ｗｅｒｍｕｔｈ）（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，２００２）も参照。
【０１４４】
医薬的に許容される塩基付加塩は、金属またはアミン、例えば、アルカリ金属及びアルカリ土類金属、または有機アミンを用いて形成される。カチオンとして使用される金属は、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなどを含む。アミンは、Ｎ−Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、ジシクロヘキシルアミン、エチレンジアミン、Ｎ−メチルグルカミン、及びプロカインを含む（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ，”Ｊ．Ｐｈａｒｍａ  Ｓｃｉ．，１９７７，６６，１１９を参照）。前述の酸性化合物の塩基付加塩は、従来的な方法で、遊離酸形態を、塩を産生するのに十分な量の所望の塩基に接触させることにより、調製される。遊離酸形態は、従来的な方法で、塩形態を酸に接触させ遊離酸を単離することにより、再生することができる。遊離酸形態は、それぞれの塩形態とは、ある特定の物理的特性（例えば、極性溶媒における可溶性）が多少異なるが、他の点では、本発明の目的において、塩はそれぞれの遊離酸と同等である。
【０１４５】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される医薬組成物は、本明細書で説明されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）の治療有効量を、医薬的に許容される担体、希釈剤、及び／または賦形剤（例えば、食塩水、リン酸緩衝食塩水、リン酸及びアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝液、保存料、及びその他のタンパク質）と混和して含む。例示的なアミノ酸、ポリマー、及び糖などは、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアラート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、スクロース、フルクトース、デキストロース、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシまたはヒト血清アルブミン、シトラート、アセタート、リンゲル液、ハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リジン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン、及びグリコールである。好ましくは、この製剤は４℃で少なくとも６ヵ月間安定性である。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、本明細書で提供される医薬組成物は緩衝液を含み、例えば、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、及び当業者に公知のその他の緩衝液、例えば、Ｇｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：４６７によって説明されているものを含む。緩衝液のｐＨは、６．５〜７．７５、好ましくは７〜７．５、最も好ましくは７．２〜７．４の範囲内とすることができる。
【０１４７】
使用方法
また、本開示は、例えば、Ｗｎｔシグナリング経路を調節するために、例えば、Ｗｎｔシグナリングを増加または減少させるために、本明細書で開示されているＦｚｄ特異的抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）を使用するための方法、ならびにＬＲＰ５／６特異的抗体またはその抗原結合フラグメント及びＷｎｔサロゲートを様々な治療設定で投与するための方法も提供する。本明細書では、１つ以上のＦｚｄ受容体に結合する抗体またはその抗原結合フラグメントを用いた治療方法が提供される。１つの実施形態において、本発明の抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｗｎｔシグナリングの不適切性または脱制御、例えば、Ｗｎｔシグナリングの増加または低減に関係する疾患を有する対象に提供される。
【０１４８】
Ｗｎｔシグナリング経路の増加及び関連する治療方法
ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）は、組織または細胞内のＷｎｔシグナリングを増加させるのに使用することができる。したがって、いくつかの態様において、本発明は、組織または細胞内のＷｎｔシグナリングを増加させるまたはＷｎｔシグナリングを強化するための方法であって、組織または細胞を、本明細書で開示されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）の有効量に接触させることを含み、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントがＷｎｔシグナリング経路アゴニストである、方法を提供する。いくつかの実施形態において、接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで行う。特定の実施形態において、細胞は培養細胞であり、接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。ある特定の実施形態において、本方法はさらに、組織または細胞を、１つ以上のＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドに接触させることを含む。
【０１４９】
関連する態様において、本発明は、組織または細胞内のＷｎｔシグナリングを増加させるための方法であって、組織または細胞を、本発明の抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）を含むポリヌクレオチドの有効量に接触させることを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、標的組織または細胞を、ＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドにも接触させる。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）である。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列及び／または３’テーリング配列（例えば、ポリＡテール）をさらに含む修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コード配列と作用可能に結合したプロモーターを含む発現カセットである。ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列、及びＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列は、同じポリヌクレオチド内に存在する。
【０１５０】
関連する態様において、本発明は、組織または細胞内のＷｎｔシグナリングを増加させるための方法であって、組織または細胞を、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列を含むベクターの有効量に接触させることを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、組織または細胞を、ＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターにも接触させる。ある特定の実施形態において、ベクターは発現ベクターであり、核酸配列と作用可能に結合したプロモーターを含むことができる。特定の実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列、及びＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列は、同じベクター内に、例えば、同じ発現カセット内に存在する。
【０１５１】
関連する態様において、本発明は、組織内のＷｎｔシグナリングを増加させるための方法であって、組織を、本発明の抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列を含む細胞の有効量に接触させることを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、組織を、ＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞にも接触させる。ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列、及びＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列は、同じ細胞内に存在する。特定の実施形態において、細胞は異種細胞であるか、または治療を行う対象から得られた自家細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、抗ＬＲＰ５／６抗体もしくはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする、またはＷｎｔポリペプチドもしくはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする発現カセットを含むベクターを形質導入したものである。特定の実施形態において、細胞は幹細胞（例えば、脂肪由来幹細胞または造血幹細胞）である。
【０１５２】
抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）は、例えば、標的とされる細胞、組織、または臓器内のＷｎｔシグナリングを増加させることにより、疾患、障害、または状態を治療するために使用することができる。したがって、いくつかの態様において、本発明は、その必要のある対象における疾患または状態、例えば、Ｗｎｔシグナリングの低減に関連する疾患もしくは障害、またはＷｎｔシグナリングの増加が治療利益をもたらすと考えられる疾患もしくは障害を治療するための方法であって、対象を、本開示の組成物の有効量に接触させることを含む、方法を提供する。特定の実施形態において、組成物は、以下のいずれかを含む医薬組成物である：抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）；抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ、任意選択で修飾ｍＲＮＡ；抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列を含むベクター、例えば、発現ベクターまたはウイルスベクター；あるいは抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列を含む細胞、例えば、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする発現ベクターまたはウイルスベクターを形質導入した細胞。特定の実施形態において、疾患または状態は、病理学的な疾患もしくは障害、または損傷（例えば、創傷から生じる損傷）である。ある特定の実施形態において、創傷は、別の治療的処置の結果であり得る。ある特定の実施形態において、疾患または状態は、組織の修復、治癒、もしくは再生の不良を含み、または組織の修復、治癒、もしくは再生の増加から利益を得ると考えられる。いくつかの実施形態において、接触はｉｎ  ｖｉｖｏで行われ、すなわち、主題組成物が対象に投与される。
【０１５３】
ある特定の実施形態において、本方法はさらに、対象を、１つ以上のＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドを含む医薬組成物に接触させることを含む。本開示は、対象を、第１の活性薬剤としての抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）を送達するための第１の分子と、ＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドを送達するための第２の分子とに接触させることを含む。第１及び第２の分子は、同じタイプの分子であっても異なるタイプの分子であってもよい。例えば、ある特定の実施形態において、第１及び第２の分子はそれぞれ、以下のタイプの分子から独立に選択され得る：ポリペプチド、有機小分子、第１及び第２の活性薬剤をコードする核酸（任意選択でＤＮＡまたはｍＲＮＡ、任意選択で修飾ＲＮＡ）、第１または第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含むベクター（任意選択で発現ベクターまたはウイルスベクター）、ならびに第１または第２の活性薬剤をコードする核酸配列を含む細胞（任意選択で発現カセット）。
【０１５４】
関連する態様において、本発明は、疾患または状態、例えば、Ｗｎｔシグナリングの低減に関連する疾患もしくは障害、またはＷｎｔシグナリングの増加が治療利益をもたらすと考えられる疾患もしくは障害を治療するための方法であって、その必要のある対象を、本明細書で開示されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの有効量を含む医薬組成物に接触させることを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、対象を、ＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの有効量を含む医薬組成物にも接触させる。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）である。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列及び／または３’テーリング配列（例えば、ポリＡテール）をさらに含む修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コード配列と作用可能に結合したプロモーターを含む発現カセットである。ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列、及びＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列は、同じポリヌクレオチド内に存在する。
【０１５５】
関連する態様において、本発明は、疾患または状態、例えば、Ｗｎｔシグナリングの低減に関連する疾患もしくは障害、またはＷｎｔシグナリングの増加が治療利益をもたらすと考えられる疾患もしくは障害を治療するための方法であって、その必要のある対象を、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列を含むベクターの有効量を含む医薬組成物に接触させることを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、対象を、ＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターの有効量を含む医薬組成物にも接触させる。ある特定の実施形態において、ベクターは発現ベクターであり、核酸配列と作用可能に結合したプロモーターを含むことができる。特定の実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列、及びＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列は、同じベクター内に、例えば、同じ発現カセット内に存在する。
【０１５６】
関連する態様において、本発明は、疾患または状態、例えば、Ｗｎｔシグナリングの低減に関連する疾患もしくは障害、またはＷｎｔシグナリングの増加が治療利益をもたらすと考えられる疾患もしくは障害を治療するための方法であって、その必要のある対象を、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列を含む細胞の有効量を含む医薬組成物に接触させることを含む、方法を提供する。ある特定の実施形態において、対象を、ＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列を含む細胞にも接触させる。ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする核酸配列、及びＷｎｔポリペプチドまたはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする核酸配列は、同じ細胞内に存在する。特定の実施形態において、細胞は異種細胞であるか、または治療を行う対象から得られた自家細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、抗ＬＲＰ５／６抗体もしくはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）をコードする、またはＷｎｔポリペプチドもしくはＮｏｒｒｉｎポリペプチドをコードする発現カセットを含むベクターを形質導入したものである。特定の実施形態において、細胞は幹細胞（例えば、脂肪由来幹細胞または造血幹細胞）である。
【０１５７】
Ｗｎｔシグナリングは、幹細胞の発生プロセス及び維持において重要な役割を担っている。Ｗｎｔシグナルの再活性化は、損傷及び疾患の後のほとんどの組織の再生及び修復に関連する。抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート分子）は、損傷及び疾患に応答して治癒及び組織修復の利益をもたらすことが予想される。組織ダメージ及び喪失の原因としては、限定されるものではないが、加齢、変性、遺伝性状態、感染症及び炎症、外傷性損傷、毒素／代謝誘発性毒性、またはその他の病理学的状態が挙げられる。Ｗｎｔシグナル及びＷｎｔシグナルのエンハンサーは、成体の組織常在性幹細胞を活性化することが示されている。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、病的なまたはダメージを受けた組織の治療で使用するために、組織再生で使用するために、細胞の成長及び増殖で使用するために、ならびに／または組織操作で使用するために投与される。
【０１５８】
例えば、本発明の組成物は、骨の成長または再生、骨グラフト、骨折の治癒、骨粗鬆症及び骨粗鬆症性骨折、脊椎癒合、椎骨圧迫骨折を含めた脊髄損傷、術前脊椎手術最適化、整形外科デバイスの骨結合、腱−骨結合、歯の成長及び再生、歯科インプラント、歯周病、顎顔面再構築、ならびに顎の骨壊死の治療を促進するまたは増加させるのに使用することができる。また、本発明の組成物は、脱毛症の治療；感覚器官の再生強化、例えば、難聴の治療（内及び外有毛細胞再生、前庭機能低下の治療を含む）、黄斑変性の治療、網膜症（硝子体網膜症、糖尿病性網膜症、その他の網膜変性疾患を含む）、フックスジストロフィー、その他の角膜疾患などの治療；卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、多発性硬化症、筋ジストロフィー、サルコペニアまたはカヘキシーの結果としての筋萎縮、及び血液脳関門の変性または完全性に影響を及ぼすその他の状態の治療で使用することもできる。また、本発明の組成物は、口腔粘膜炎の治療、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）（クローン病（ＣＤ）及び潰瘍性大腸炎（ＵＣ）、特に瘻孔形成を伴うＣＤを含む）、その他の胃腸管障害の治療；メタボリックシンドローム、脂質異常症の治療、糖尿病の治療、膵炎、膵外及び膵内分泌組織がダメージを受けている状態の治療；表皮再生強化が所望される状態、例えば、表皮創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、歯、爪、または皮膚の形成不全を伴う症候群など、血管新生が有益な状態の治療；心筋梗塞、冠動脈疾患、心不全の治療；造血細胞の成長の強化、例えば、骨髄、動員末梢血からの造血幹細胞移植の強化、免疫不全、移植片対宿主病などの治療；急性腎損傷、慢性腎疾患の治療；肺疾患、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症（特発性肺線維症を含む）の治療、肺組織の再生強化で使用することもできる。また、本発明の組成物は、肝細胞の再生（例えば、肝再生）の強化、肝硬変の治療、肝移植の強化、急性肝不全の治療、Ｃ型もしくはＢ型肝炎ウイルス感染を伴うまたは抗ウイルス薬療法後の慢性肝疾患、アルコール性肝疾患、アルコール性肝炎、肝脂肪化または脂肪性肝炎を伴う非アルコール性肝疾患などの治療で使用することもできる。本発明の組成物は、限定されるものではないが、再生的細胞成長が所望される状態を含めた、疾患及び障害を治療することができる。
【０１５９】
Ｗｎｔシグナリング構成要素における機能喪失または機能獲得変異を伴うヒト遺伝学により、骨成長のためのＷｎｔシグナル強化を支持する強力なエビデンスが示されている。骨成長の強化が所望される状態としては、限定されるものではないが、骨折、グラフト、人工装具周囲の骨成長、骨粗鬆症、骨粗鬆症性骨折、脊椎癒合、椎骨圧迫骨折、脊椎手術のための術前最適化、顎の骨壊死、歯科インプラント、歯周病、顎顔面再構築などが挙げられる。抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）は、骨再生の促進に極めて重要なＷｎｔシグナルを強化及び促進する。骨組織を再生するための方法は本発明の化合物の投与から利益を得、投与は全身的であっても局在的であってもよい。いくつかの実施形態において、骨髄細胞は本発明の分子に曝露され、その結果骨髄細胞内の幹細胞が活性化される。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、応答性の細胞集団（例えば、骨髄、骨前駆細胞、骨幹細胞など）を、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、本明細書で開示されているＷｎｔサロゲート）の有効用量に接触させることにより、骨再生が強化される。骨組織の再生のための方法は、本明細書で開示されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）の投与から利益が得られ、投与は全身的であっても局在的であってもよい。いくつかのこのような実施形態において、接触はｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。他のこのような実施形態において、接触はｅｘ  ｖｉｖｏで実施される。分子は、例えば、任意選択で生分解性の、そして任意選択で活性作用物質の徐放を提供するマトリックス上に装填することにより、作用部位に局在化させることができる。マトリックス担体としては、以下に限定されないが、吸収性コラーゲンスポンジ、セラミックス、ヒドロゲル、ポリマーミクロスフェア、ナノ粒子、骨セメントなどが挙げられる。
【０１６１】
本明細書で開示されている１つ以上の抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）を含む組成物は、骨格組織欠損のｉｎ  ｖｉｖｏ治療で使用することができる。「骨格組織欠損」とは、骨または他の骨結合組織の欠損であって、どのように欠損が生じたかにかかわらず、例えば、外科的介入、腫瘍の除去、潰瘍、移植、骨折、または他の外傷もしくは変性状態のいずれかの結果として、骨または結合組織の回復が所望される任意の部位における欠損を意味する。本発明の組成物は、結合組織に対する軟骨機能の回復、軟骨組織の異常または病変の修復、例えば、変性摩耗及び関節炎、組織への外傷、半月板断裂の置換、半月板切除術、靱帯裂傷による関節脱臼、関節のアラインメント不良、骨折、または遺伝性疾患によるものの修復のためのレジメンの一部として使用することができる。
【０１６２】
抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）は、歯周病の治療に使用することもできる。歯周病は、歯喪失の主因であり、複数の全身状態に関連づけられる。いくつかの実施形態において、応答性細胞集団を接触させることにより、歯または基底骨の再生が強化される。いくつかのこのような実施形態において、接触はｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。その他のこのような実施形態において、接触はｅｘ  ｖｉｖｏで実施され、続いて、活性化された幹細胞または前駆細胞の移植が行われる。分子は、例えば、任意選択で生分解性の、そして任意選択で活性作用物質の徐放を提供するマトリックス上に装填することにより、作用部位に局在化させることができる。マトリックス担体としては、限定されるものではないが、吸収性コラーゲンスポンジ、セラミックス、ヒドロゲル、骨セメント、ポリマーミクロスフェア、ナノ粒子などが挙げられる。
【０１６３】
複数の試験により、Ｗｎｔシグナリング及びＲ−スポンジンの生物学は、損傷、加齢、または変性の後の内耳における感覚有毛細胞の再生を促進できることが示されている。難聴または前庭機能低下に関与する内耳における感覚有毛細胞の喪失も、本発明の組成物から利益を得ることができる。内耳において、聴覚器官は、音の振動を電気インパルスに変換するのに必要とされる機械感受性の有毛細胞を収容している。半規管（ＳＳＣ）、卵形嚢、及び球形嚢から構成される前庭器官も、頭部の位置及び動きを検出するために感覚有毛細胞を含む。本発明の組成物は、聴覚再生の強化のために、例えば、注入で、マトリックスもしくは他のデポーシステムで、または、その他の耳への局所的適用で、使用することができる。
【０１６４】
抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）は、網膜組織の再生に使用することもできる。成体哺乳類の網膜では、ミュラーグリア細胞は、例えばｉｎ  ｖｉｖｏの神経毒性損傷後に、光受容体を含めた網膜細胞を再生することができる。Ｗｎｔシグナリング及びＷｎｔシグナリングのエンハンサーは、損傷後または変性中のミュラーグリア由来網膜前駆細胞の増殖を促進することができる。本発明の組成物は、眼内の組織及びその他の細胞タイプの再生に使用することもできる。例えば、加齢性黄斑変性（ＡＭＤ）、その他の網膜変性疾患、角膜疾患、フックスジストロフィー、硝子体網膜症、遺伝性疾患などは、本発明の組成物から利益を得ることができる。ＡＭＤは、中心視野及び視力の進行的な減少によって特徴づけられる。フックスジストロフィーは、角膜内皮細胞の進行的な喪失によって特徴づけられる。Ｗｎｔシグナル及びＷｎｔシグナルの強化は、眼組織内の角膜内皮、網膜上皮などの再生を促進することができる。他の実施形態において、本発明の組成物は、黄斑変性の網膜再生及び治療のために、例えば、注入で、マトリックスもしくは他のデポーシステムで、または目へのその他の局所的適用で、使用することができる。
【０１６５】
肝細胞の恒常的再生における特定の増殖細胞集団が系統追跡研究を通じて特定されており、その例が中心周囲領域内のアキシン２陽性細胞である。系統追跡研究はさらなる潜在的な肝前駆細胞も特定しており、限定されるものではないが、Ｌｇｒ陽性細胞がこれに含まれる。自己再生肝細胞、ならびにＬｇｒ５陽性細胞及びアキシン２陽性細胞を含めたその他の潜在的前駆細胞集団は、損傷後にＷｎｔシグナル及び／またはＲ−スポンジンに応答した再生が可能であることが明らかになっている。急性肝損傷及び慢性肝疾患における多数の前臨床モデルにより、肝細胞の回復及び再生はＷｎｔシグナルから利益を得ることが示された。本発明の組成物は、急性肝不全、急性アルコール性肝損傷の治療、Ｃ型またはＢ型ウイルス肝炎感染を伴うまたは抗ウイルス薬療法後の慢性肝疾患、慢性アルコール性肝疾患、アルコール性肝炎、非アルコール性脂肪性肝疾患及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）の治療、肝硬変及び全ての原因の慢性肝疾患の治療、ならびに肝細胞の再生の強化で使用することができる。肝組織を再生するための方法は本発明の化合物の投与から利益を得、投与は全身的であっても局在的であってもよい。このような方法としては、限定されるものではないが、全身投与の方法及び局在化投与の方法、例えば、肝組織への注射により、肝臓につながる静脈または血管への注射により、持続放出製剤の留置などによる局在化投与が挙げられる。
【０１６６】
Ｗｎｔシグナルは、様々な上皮組織の再生において重要な役割を担っている。様々な表皮状態は、本発明の化合物を用いた処置から利益を得る。粘膜炎は、胃腸管の内側を覆う上皮細胞の迅速な分裂が途絶したときに生じ、粘膜組織が潰瘍及び感染を受けやすい状態で放置される。口内を覆う上皮内層部分は、口腔粘膜と呼ばれ、身体の中で最も敏感な部分の１つであり、化学療法及び放射線に対し特に脆弱である。口腔粘膜炎は、癌治療において、詳細には化学療法及び放射線において、おそらくは最も一般的な衰弱性の合併症である。加えて、本発明の組成物は、短腸症候群、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、またはその他の胃腸管障害の治療にも利益をもたらし得る。その他の表皮状態としては、表皮創傷治癒、糖尿病性足部潰瘍、歯、爪、または皮膚の形成不全に関係する症候群などが挙げられる。本発明の分子は、全てのこのような状態で使用することができ、このとき再生細胞は本発明の化合物に接触される。上皮組織を再生するための方法は本発明の化合物の投与から利益を得、投与は全身的であっても局在的であってもよい。接触は、例えば、局所的（皮内、皮下を含む）であり、ゲル、ローション、クリームなどにおいて、標的部位などに適用され得る。
【０１６７】
ＷｎｔシグナルならびにＷｎｔシグナルの強化及び促進は、皮膚及び胃腸管に加えて、前臨床モデルにおける膵臓、腎臓、及び肺を含めた組織の修復及び再生でも重要な役割を担っている。抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）は、膵外及び膵内分泌部、腎臓、または肺に関係する様々な疾患状態に利益をもたらし得る。抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントは、メタボリックシンドロームの治療、糖尿病の治療、急性または慢性膵炎、膵外分泌部機能不全の治療、急性腎損傷、慢性腎疾患の治療、限定されるものではないが、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺線維症、詳細には特発性肺線維症（ＩＰＦ）、及び肺上皮組織の喪失を引き起こすその他の状態を含めた肺疾患の治療で使用することができる。これらの組織を再生するための方法は本発明の化合物の投与から利益を得、投与は全身的であっても局在的であってもよい。
【０１６８】
他の発生因子経由のシグナリングと協働した表皮Ｗｎｔシグナリングは、成人の毛包再生に極めて重要である。脱毛は一般的な問題であり、アンドロゲン性脱毛症（しばしば男性型脱毛症と呼ばれる）は、男性における脱毛の最も一般的な形態である。いくつかの実施形態において、応答性細胞集団を本発明の分子に接触させることにより、毛包再生が強化される。いくつかのこのような実施形態において、接触はｉｎ  ｖｉｖｏで実施される。他のこのような実施形態において、接触はｅｘ  ｖｉｖｏで実施される。当該分子は、例えば、局所的なローション、ゲル、クリームなどで作用部位に局在化させることができる。
【０１６９】
卒中、外傷性脳損傷、アルツハイマー病、多発性硬化症、及び血液脳関門（ＢＢＢ）に影響を及ぼすその他の状態は、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）を用いて治療することができる。血管新生は、酸素及び栄養を身体全体にわたる多くの組織に供給することを確実にするために極めて重要であり、また中枢神経系にとっては、神経組織が低酸素症及び虚血に対し敏感であることから、特に重要である。ＢＢＢを形成する中枢神経系内皮細胞は、タイトジャンクションによって共に保持されている高分極性の細胞であり、かつ特定のトランスポーターを発現するという点において、非神経組織内の内皮細胞とは異なる。Ｗｎｔシグナリングは、中枢神経系の血管形成及び／または機能を制御する。ＢＢＢが損なわれている状態は、本発明の化合物の投与から利益を得ることができ、投与は、全身的であっても、例えば、直接注射、髄腔内投与、徐放性製剤の植込みなどによって局在的であってもよい。加えて、Ｗｎｔシグナルは、神経発生に積極的に関与しており、損傷後の神経保護という役割を担う。本発明の組成物は、脊髄損傷、その他の脊髄疾患、卒中、外傷性脳損傷などの治療でも使用することができる。
【０１７０】
Ｗｎｔシグナルは、血管新生でも役割を担う。抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）は、血管新生が有益であるような状態や、心筋梗塞、冠動脈疾患、心不全、糖尿病性網膜症などの治療や、遺伝性疾患に由来する状態に利益をもたらし得る。これらの組織を再生するための方法は本発明の化合物の投与から利益を得、投与は全身的であっても局在的であってもよい。
【０１７１】
ある特定の実施形態において、本発明の方法は、例えば、ダメージを受けた、または組織もしくは細胞の低減もしくは喪失を受けた組織における、組織再生を促進する。喪失またはダメージは、細胞数を減少させる任意の事象とすることができ、このような事象には疾患または損傷が含まれる。例えば、事故、自己免疫障害、治療の副作用、または疾患状態は、外傷を構成すると考えられる。組織再生は、組織内の細胞数を増加させ、好ましくは組織の細胞間の接続が再確立するのを可能にし、より好ましくは組織の機能性が回復するのを可能にする。
【０１７２】
Ｗｎｔシグナリング経路の低減及び関連する治療方法
ある特定の実施形態において、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントは、組織または細胞内のＷｎｔシグナリングを減少させるまたは阻害するのに使用することができる。したがって、いくつかの態様において、本発明は、組織または細胞内のＷｎｔシグナリングを減少させるまたはＷｎｔシグナリングを阻害するための方法であって、組織または細胞を、本明細書で開示されている抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量に接触させることを含み、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｗｎｔシグナリング経路アンタゴニストまたは阻害物質である、方法を提供する。いくつかの実施形態において、接触は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで行う。特定の実施形態において、細胞は培養細胞であり、接触はｉｎ  ｖｉｔｒｏで行う。
【０１７３】
関連する態様において、本発明は、組織または細胞内のＷｎｔシグナリングを減少させるまたは阻害するための方法であって、組織または細胞を、本発明の抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントを含むポリヌクレオチドの有効量に接触させることを含み、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｗｎｔシグナリング経路アンタゴニストまたは阻害物質である、方法を提供する。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）である。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列及び／または３’テーリング配列（例えば、ポリＡテール）をさらに含む修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コード配列と作用可能に結合したプロモーターを含む発現カセットである。
【０１７４】
関連する態様において、本発明は、組織または細胞内のＷｎｔシグナリングを減少させるまたは阻害するための方法であって、組織または細胞を、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むベクターの有効量に接触させることを含み、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｗｎｔシグナリング経路アンタゴニストまたは阻害物質である、方法を提供する。ある特定の実施形態において、ベクターは発現ベクターであり、核酸配列と作用可能に結合したプロモーターを含むことができる。特定の実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。
【０１７５】
関連する態様において、本発明は、組織内のＷｎｔシグナリングを減少させるまたは阻害するための方法であって、組織を、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む細胞の有効量に接触させることを含み、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｗｎｔシグナリング経路アンタゴニストまたは阻害物質である、方法を提供する。特定の実施形態において、細胞は異種細胞であるか、または治療を行う対象から得られた自家細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする発現カセットを含むベクターを形質導入したものであり、このとき、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントは、Ｗｎｔシグナリング経路アンタゴニストまたは阻害物質である。特定の実施形態において、細胞は幹細胞（例えば、脂肪由来幹細胞または造血幹細胞）である。
【０１７６】
抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントがＷｎｔシグナリング経路アンタゴニストまたは阻害物質である、抗ＬＲＰ５／６抗体及びその抗原結合フラグメントは、例えば、細胞、組織、または臓器内のＷｎｔシグナリングを減少させるまたは阻害することにより、疾患、障害、または状態を治療するために使用することができる。したがって、いくつかの態様において、本発明は、その必要のある対象における疾患または状態、例えば、Ｗｎｔシグナリングの増加もしくは脱制御に関連する疾患もしくは障害、またはＷｎｔシグナリングの減少が治療利益をもたらすと考えられる疾患もしくは障害を治療するための方法であって、対象を、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントを含む組成物の有効量に接触させることを含み、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｗｎｔシグナリング経路アンタゴニストまたは阻害物質である、方法を提供する。特定の実施形態において、組成物は、以下のいずれかを含む医薬組成物である：抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント；抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ、任意選択で修飾ｍＲＮＡ；抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むベクター、例えば、発現ベクターまたはウイルスベクター；あるいは抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む細胞、例えば、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする発現ベクターまたはウイルスベクターを形質導入した細胞。特定の実施形態において、疾患または状態は、病理学的な疾患もしくは障害、または損傷である。いくつかの実施形態において、接触はｉｎ  ｖｉｖｏで行われ、すなわち、主題組成物が対象に投与される。
【０１７７】
関連する態様において、本発明は、疾患または状態、例えば、Ｗｎｔシグナリングの増加に関連する疾患もしくは障害、またはＷｎｔシグナリングの低減が治療利益をもたらすと考えられる疾患もしくは障害を治療するための方法であって、その必要のある対象を、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むポリヌクレオチドの有効量を含む医薬組成物に接触させることを含み、抗体またはその抗原結合フラグメントが、本明細書で開示されているＷｎｔシグナリング経路アンタゴニストまたは阻害物質である、方法を提供する。ある特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡまたはｍＲＮＡ（例えば、修飾ｍＲＮＡ）である。特定の実施形態において、ポリヌクレオチドは、５’キャップ配列及び／または３’テーリング配列（例えば、ポリＡテール）をさらに含む修飾ｍＲＮＡである。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、コード配列と作用可能に結合したプロモーターを含む発現カセットである。
【０１７８】
関連する態様において、本発明は、疾患または状態、例えば、Ｗｎｔシグナリングの増加に関連する疾患もしくは障害、またはＷｎｔシグナリングの減少が治療利益をもたらすと考えられる疾患もしくは障害を治療するための方法であって、その必要のある対象を、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含むベクターの有効量を含む医薬組成物に接触させることを含み、抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｗｎｔシグナリング経路アンタゴニストまたは阻害物質である、方法を提供する。ある特定の実施形態において、ベクターは発現ベクターであり、核酸配列と作用可能に結合したプロモーターを含むことができる。特定の実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。
【０１７９】
関連する態様において、本発明は、疾患または状態、例えば、Ｗｎｔシグナリングの増加に関連する疾患もしくは障害、またはＷｎｔシグナリングの減少が治療利益をもたらすと考えられる疾患もしくは障害を治療するための方法であって、その必要のある対象を、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする核酸配列を含む細胞の有効量を含む医薬組成物に接触させることを含み、抗体またはその抗原結合フラグメントが、Ｗｎｔシグナリング経路アンタゴニストまたは阻害物質である、方法を提供する。特定の実施形態において、細胞は異種細胞であるか、または治療を行う対象から得られた自家細胞である。ある特定の実施形態において、細胞は、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントをコードする発現カセットを含むベクターを形質導入したものである。特定の実施形態において、細胞は幹細胞（例えば、脂肪由来幹細胞または造血幹細胞）である。
【０１８０】
ある特定の実施形態において、その必要のある対象における疾患または障害を、対象に、Ｗｎｔシグナリング経路の阻害物質である抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を提供することによって治療する方法は、癌または腫瘍（例えば、固形腫瘍または液体腫瘍）を治療するのに使用することができる。治療することができる癌及び腫瘍の例としては、限定されるものではないが、結腸腫瘍（例えば、結腸癌または結腸腺腫）、胃腫瘍（例えば、胃癌）、小腸腫瘍（例えば、小腸癌）、肝臓腫瘍（例えば、肝臓癌）、膵臓腫瘍（例えば、膵臓癌）、肺腫瘍（例えば、肺癌）、卵巣腫瘍（例えば、卵巣癌）、腎臓（例えば、腎臓癌）、脳腫瘍（例えば、脳癌）、脊髄腫瘍（例えば、脊髄癌）、皮膚腫瘍（例えば、皮膚癌または黒色腫）、頭頚部腫瘍（例えば、頭頚部癌）、胃腸管腫瘍（例えば、胃腸管癌、食道癌、口腔粘膜癌、舌癌、胃癌、腸癌、結腸癌）、乳房腫瘍（例えば、乳癌）、前立腺腫瘍（例えば、前立腺癌）、骨腫瘍（例えば、骨癌）、血管腫瘍、ウィルムス腫瘍、白血病／リンパ腫、軟部組織腫瘍（例えば、軟部組織肉腫または滑膜肉腫）、及び転移性癌などが挙げられる。
【０１８１】
ある特定の実施形態において、その必要のある対象における疾患または障害を、対象に、Ｗｎｔシグナリング経路の阻害物質である抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を提供することによって治療する方法は、変性疾患を治療するのに使用することができる。治療することができる変性疾患の例としては、限定されるものではないが、変形性関節症、軟骨変性、スポーツ損傷（例えば、軟骨損傷）、網膜症、アテローム性動脈硬化症、神経変性障害、及び血管障害、例えば、血管炎、異常な血管新生を伴う状態が挙げられる。
【０１８２】
ある特定の実施形態において、その必要のある対象における疾患または障害を、対象に、Ｗｎｔシグナリング経路の阻害物質である抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を提供することによって治療する方法は、線維症の治療に使用することができる。治療することができる線維症の例としては、限定されるものではないが、肺線維症（限定されるものではないが、ＣＯＰＤ、特発性肺線維症を含む）、腎線維症（例えば、末期腎不全）、肝線維症、先天性肝貯蔵疾患、ならびに心臓線維症が挙げられる。
【０１８３】
ある特定の実施形態において、その必要のある対象における疾患または障害を、対象に、Ｗｎｔシグナリング経路の阻害物質である抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を提供することによって治療する方法は、心不全、例えば、うっ血性心不全、収縮期心不全、駆出率保持性心不全、または冠動脈疾患の治療に使用することができる。
【０１８４】
ある特定の実施形態において、その必要のある対象における疾患または障害を、対象に、Ｗｎｔシグナリング経路の阻害物質である抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントの有効量を提供することによって治療する方法は、異所性骨化、骨粗鬆症、または先天性高骨量障害の治療に使用することができる。
【０１８５】
「投与する」または「導入する」または「提供する」という用語は、本明細書で使用する場合、組成物を対象の１つの細胞、複数の細胞、組織、及び／もしくは臓器に、または対象に送達することを指す。このような投与または導入は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｅｘ  ｖｉｖｏで行うことができる。
【０１８６】
特定の実施形態において、医薬組成物は、非経口的に（例えば、静脈内に）、経口的に、直腸に、または注射によって投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、局在的に（例えば、局所的または筋肉内に）投与される。いくつかの実施形態において、組成物は、標的組織に（例えば、骨、関節、耳組織、眼組織、胃腸管、皮膚、創傷部位、または脊髄に）投与される。本発明の方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏで実施することができる。いくつかの実施形態において、標的細胞または組織を組織特異的Ｗｎｔシグナル強化分子に接触させることはｅｘ  ｖｉｖｏで実施し、続いて、細胞または組織（例えば、活性化した幹細胞または前駆細胞）を対象に移植する。当業者は、治療する疾患または障害に基づき、適切な投与の部位及び経路を決定することができる。
【０１８７】
用量及び投薬レジメンは、医師によって容易に判断される様々な因子、例えば、疾患または障害の性質、対象の特徴、及び対象の病歴に依存し得る。特定の実施形態において、対象に投与または提供する抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント（例えば、Ｗｎｔサロゲート）の量は、対象の体重当たり約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、または０．１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【０１８８】
「治療」、「治療すること」などの用語は、本明細書では、所望の薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを広く意味するように使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全もしくは部分的に防止する（例えば、疾患もしくはその症状が対象に生じる可能性を低減する）という観点で予防的であってもよく、かつ／または、疾患もしくは疾患に起因し得る有害作用を部分的もしくは完全に治癒するという観点で治療的であってもよい。本明細書で使用する場合、「治療」は、哺乳類における疾患の任意の治療を網羅し、（ａ）疾患にかかりやすい可能性があるがまだそれを有すると診断されていない対象において疾患が生じるのを防止すること；（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発生を抑止すること；または（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち、疾患の後退を引き起こすことを含む。治療剤（例えば、抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメント）は、疾患または損傷の発症前、発症中、または発症後に投与することができる。進行中の疾患の治療は、その治療が患者の望ましくない臨床的症状を安定化または低減する場合、特に関心対象となる。このような治療は、患部組織が完全に機能喪失する前に実施することが望ましい。主題療法は、疾患の症候段階中に投与し、場合によっては疾患の症候段階後に投与することが望ましい。いくつかの実施形態において、主題方法は、治療利益（例えば、障害の発生の防止、障害の進行の停止、障害の進行の逆行など）をもたらす。いくつかの実施形態において、主題方法は、治療利益が達成されたことを検出するステップを含む。当業者は、このような治療有効性の尺度が、修飾されている特定の疾患に適用可能であることを理解し、治療有効性の測定に使用するのに適切な検出方法を認識するであろう。
【０１８９】
細胞、組織、オルガノイドの成長の促進及び関連する方法
他の実施形態は、部分的には、細胞、組織、及びオルガノイドの成長または増殖を促進または強化するための、本明細書で開示されているＷｎｔサロゲート分子の使用であって、これは、例えば、細胞または組織を、任意選択でＮｏｒｒｉｎまたはＲスポンジンポリペプチドと組み合わせて、１つ以上のＷｎｔサロゲートに接触させることによって行う。ある特定の実施形態において、細胞または組織は、ｅｘ  ｖｉｖｏ、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、またはｉｎ  ｖｉｖｏで接触させる。このような方法は、例えば、対象に移植またはグラフティングされる、治療使用のための細胞、組織、またはオルガノイドの生成に使用することができる。また、このような方法は、研究使用のための細胞、組織、またはオルガノイドの生成に使用することもできる。Ｗｎｔサロゲート分子は、非治療的方法、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏの研究方法で広範に適用される。
【０１９０】
本発明は、ダメージを受けた組織（例えば、上記で論じられた組織）の組織再生のための方法であって、Ｗｎｔサロゲート分子を細胞に投与することを含む方法を提供する。Ｗｎｔサロゲート分子は、ｉｎ  ｖｉｖｏで細胞に直接投与しても、経口的に、静脈内に、または当技術分野で公知の他の方法により対象に投与しても、ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞に投与してもよい。Ｗｎｔサロゲート分子がｅｘ  ｖｉｖｏ細胞に投与されるいくつかの実施形態において、このような細胞は、Ｗｎｔサロゲート分子を投与する前、後、または最中に、対象に移植され得る。
【０１９１】
Ｗｎｔシグナリングは、幹細胞培養の主要な構成要素である。例えば、ＷＯ２０１０／０９０５１３、ＷＯ２０１２／０１４０７６、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１（ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ  ２０１１；１４１：１７６２−１７７２）、及びＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９（Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，２６２−５）に記載されているような幹細胞培地。本明細書で開示されているＷｎｔサロゲート分子は、このような幹細胞培地で使用するのに好適なＲスポンジン代替物であり、またはＲスポンジンと組み合わせることができる。
【０１９２】
したがって、１つの実施形態において、本開示は、幹細胞の増殖を強化するための方法であって、幹細胞を、本明細書で開示されている１つ以上のＷｎｔサロゲート分子に接触させることを含む、方法を提供する。１つの実施形態において、本開示は、本明細書で開示されているＷｎｔサロゲート分子を含む細胞培地を提供する。いくつかの実施形態において、細胞培地は、通常はＷｎｔまたはＲスポンジンを含む、当技術分野で既に知られている任意の細胞培地であって、ＷｎｔまたはＲスポンジンが、本明細書で開示されているＷｎｔサロゲート分子（１つまたは複数）で（完全にまたは部分的に）置き換えられているか、または補充されている、任意の細胞培地とすることができる。例えば、培地は、ＷＯ２０１０／０９０５１３、ＷＯ２０１２／０１４０７６、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１（ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ  ２０１１；１４１：１７６２−１７７２）、及びＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９（Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，２６２−５）に記載されているようなものであってもよく、これらはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０１９３】
幹細胞培地は、多くの場合、追加の成長因子を含む。したがって、当該方法は、幹細胞に成長因子を供給することを追加的に含んでもよい。細胞培地で一般的に使用される成長因子としては、上皮成長因子（ＥＧＦ、（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ））、形質転換成長因子（ＴＧＦ−アルファ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、及びケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ、ＦＧＦ７の別名でも知られている）が挙げられる。ＥＧＦは、様々な培養された外胚葉及び中胚葉細胞に対する強力な分裂促進因子であり、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｉｎ  ｖｉｔｒｏでの特定の細胞の分化と、細胞培養におけるいくつかの線維芽細胞の分化とに、著明な効果を有する。ＥＧＦ前駆体は、タンパク質切断されて細胞を刺激する５３アミノ酸ペプチドホルモンを生成する、膜結合分子として存在する。ＥＧＦまたはその他の分裂促進成長因子は、このようにして幹細胞に供給され得る。幹細胞の培養中、分裂促進成長因子を２日に１回培地に添加してもよく、一方、培地は４日に１回取り替えることが好ましい。概して、分裂促進因子は、ｉ）ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、及びＫＧＦ；ｉｉ）ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、及びＦＧＦ７；ｉｉｉ）ＥＧＦ、ＴＧＦ−アルファ、及びＦＧＦ；ｉｖ）ＥＧＦ及びＫＧＦ；ｖ）ＥＧＦ及びＦＧＦ７；ｖｉ）ＥＧＦ及びＦＧＦ；ｖｉｉ）ＴＧＦ−アルファ及びＫＧＦ；ｖｉｉｉ）ＴＧＦ−アルファ及びＦＧＦ７；またはｉｘ）ＴＧＦ−アルファ及びＦＧＦからなる群より選択される。ある特定の実施形態において、本開示は、例えば、任意選択で、本明細書に記載の１つ以上の成長因子またはその組合せと組み合わせて、本明細書で開示されているＷｎｔサロゲート分子を含む、幹細胞培地を含む。
【０１９４】
幹細胞の増殖を強化するこれらの方法は、例えば、ＷＯ２０１０／０９０５１３、ＷＯ２０１２／０１４０７６、Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１（ＧＡＳＴＲＯＥＮＴＥＲＯＬＯＧＹ  ２０１１；１４１：１７６２−１７７２）、及びＳａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２００９（Ｎａｔｕｒｅ  ４５９，２６２−５）で説明されているように、幹細胞から新たなオルガノイド及び組織を成長させるのに使用することができる。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、Ｗｎｔサロゲート分子は、幹細胞再生の強化に使用される。例示的な目的幹細胞としては、限定されるものではないが、筋サテライト細胞；造血幹細胞及びそれに由来する前駆細胞（米国特許第５，０６１，６２０号）；神経幹細胞（Ｍｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｃｅｌｌ  ９６：７３７−７４９を参照）；胚幹細胞；間葉幹細胞；中胚葉幹細胞；肝臓幹細胞；脂肪組織由来幹細胞などが挙げられる。
【０１９６】
診断方法及び関連する方法
本発明の他の実施形態は、部分的には、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６を発現する細胞または組織の存在を検出するための診断的適用に関する。したがって、本開示は、試料中のＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６を検出する方法、例えば、ＬＲＰ５またはＬＲＰ６を発現する細胞または組織を検出する方法を提供する。このような方法は、様々な公知の検出形式に適用することができ、検出形式としては、限定されるものではないが、免疫組織化学検査（ＩＨＣ）、免疫細胞化学検査（ＩＣＣ）、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＩＳＨ）、全載ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＷＩＳＨ）、蛍光ＤＮＡ  ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）、フローサイトメトリー、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ）、及び酵素結合イムノアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が挙げられる。特定の実施形態において、方法は、（例えば、対象から得られた）組織または細胞を、本明細書で開示されている抗Ｆｚｄ抗体またはその抗原結合フラグメントに接触させ、次いで、抗体またはその抗原結合フラグメントの組織または細胞に結合する量を決定し、次いで、組織または細胞内のＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６受容体（１つまたは複数）の存在または量を決定することを含む。
【０１９７】
ＩＳＨは、標識された相補的ＤＮＡまたはＲＮＡ鎖（すなわち、一次結合剤）を使用して、細胞もしくは組織の一部分もしくは切片内で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）、または組織が十分に小さい場合は全体の組織内で（全載）、特定のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を局在化させるハイブリダイゼーションのタイプである。当業者であれば、このＩＳＨが、抗体を一次結合剤として用いて組織切片内でタンパク質を局在化させる免疫組織化学検査とは異なるということを理解するであろう。ＤＮＡ  ＩＳＨは、染色体の構造を決定するためにゲノムＤＮＡ上で使用することができる。蛍光ＤＮＡ  ＩＳＨ（ＦＩＳＨ）は、例えば、染色体の完全性を評価するために医学的診断で使用することができる。ＲＮＡ  ＩＳＨ（ハイブリダイゼーション組織化学検査）は、組織切片または全載内のｍＲＮＡ及びその他の転写物を測定及び局在化するために使用される。
【０１９８】
様々な実施形態において、本明細書で説明されている抗体及びその抗原結合フラグメントは、直接的または間接的に検出することができる検出可能な標識と結合体化する。この点において、抗体「結合体」とは、検出可能な標識と共有結合した抗ＬＲＰ５／６抗体またはその抗原結合フラグメントを指す。本発明において、ＤＮＡプローブ、ＲＮＡプローブ、モノクローナル抗体、その抗原結合フラグメント、その抗体誘導体、例えば、１本鎖可変フラグメント抗体またはエピトープタグ化抗体は、全て検出可能な標識と共有結合することができる。「直接的検出」では、１つのみの検出可能抗体、すなわち、検出可能な一次抗体が使用される。したがって、直接的検出とは、検出可能な標識と結合体化している抗体が、それ自体、第２の抗体（二次抗体）を追加する必要なく検出することができることを意味する。
【０１９９】
「検出可能な標識」とは、試料中の標識の存在及び／または濃度を示す（例えば、視覚的、電気的、または別の形で）検出可能なシグナルを産生することができる分子または物質である。検出可能な標識は、抗体と結合体化している場合、特定の抗体が向けられている標的を位置特定及び／または定量化するために使用することができる。それにより、試料中の標的の存在及び／または濃度は、検出可能な標識によって産生されたシグナルを検出することにより、検出することができる。検出可能な標識は直接的または間接的に検出することができ、異なる特定の抗体と結合体化したいくつかの異なる検出可能な標識を使用して、１つ以上の標的を検出することができる。
【０２００】
直接的に検出することができる検出可能な標識の例としては、蛍光色素及び放射性物質及び金属粒子が挙げられる。これに対し、間接的な検出は、一次抗体の適用後に１つ以上のさらなる抗体、すなわち、二次抗体の適用が必要となる。したがって、検出は、二次抗体または結合剤における、検出可能な一次抗体との結合を検出することにより、実施される。二次結合物質または抗体の追加を必要とする検出可能な一次結合剤または抗体の例としては、検出可能な酵素結合剤及び検出可能なハプテン結合剤が挙げられる。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、検出可能な標識は、（例えば、ＩＳＨ、ＷＩＳＨ、またはＦＩＳＨプロセスにおいて）第１の結合剤を含む核酸ポリマーと結合体化する。他の実施形態において、検出可能な標識は、（例えば、ＩＨＣプロセスにおいて）第１の結合剤を含む抗体と結合体化する。
【０２０２】
本開示の方法で使用される抗体と結合体化することができる検出可能な標識の例としては、蛍光標識、酵素標識、放射性同位体、化学発光標識、電気化学発光標識、生物発光標識、ポリマー、ポリマー粒子、金属粒子、ハプテン、及び色素が挙げられる。
【０２０３】
蛍光標識の例としては、５−（及び６）−カルボキシフルオレセイン、５−または６−カルボキシフルオレセイン、６−（フルオレセイン）−５−（及び６）−カルボキサミドヘキサン酸、フルオレセインイソチオシアナート、ローダミン、テトラメチルローダミン、ならびにＣｙ２、Ｃｙ３、及びＣｙ５などの色素、任意選択で置換されたクマリン（ＡＭＣＡを含む）、ＰｅｒＣＰ、フィコビリンタンパク質（Ｒ−フィコエリトリン（ＲＰＥ）及びアロフィコエリトリン（ＡＰＣ）を含む）、テキサスレッド、プリンストンレッド、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びその類似体、ならびにＲ−フィコエリトリンまたはアロフィコエリトリンの結合体、無機蛍光標識、例えば、コーティングされたＣｄＳｅナノ結晶子のような半導体材料に基づく粒子が挙げられる。
【０２０４】
ポリマー粒子標識の例としては、蛍光色素を埋め込むことができるポリスチレン、ＰＭＭＡ、もしくはシリカの微粒子もしくはラテックス粒子、または色素、酵素、もしくは基質を含むポリマーミセルもしくはカプセルが挙げられる。
【０２０５】
金属粒子の例としては、金粒子及びコーティング金粒子が挙げられ、これらは銀染色によって変換することができる。ハプテンの例としては、ＤＮＰ、フルオレセインイソチオシアナート（ＦＩＴＣ）、ビオチン、及びジゴキシゲニンが挙げられる。酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＬＰまたはＡＰ）、β−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−リン酸デヒドロゲナーゼ、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、インベルターゼ、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、及びグルコースオキシダーゼ（ＧＯ）が挙げられる。一般的に使用される西洋ワサビペルオキシダーゼの基質の例としては、３，３’−ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）、ニッケル強化を伴うジアミノベンジジン、３−アミノ−９−エチルカルバゾール（ＡＥＣ）、ベンジジン二塩酸塩（ＢＤＨＣ）、ハンカー・イエーツ（Ｈａｎｋｅｒ−Ｙａｔｅｓ）試薬（ＨＹＲ）、インドファン（Ｉｎｄｏｐｈａｎｅ）ブルー（ＩＢ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）、４−クロロ−１−ナフトール（ＣＮ）、アルファ−ナフトールピロニン（アルファ−ＮＰ）、ｏ−ジアニシジン（ＯＤ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスファート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）、２−（ｐ−ヨードフェニル）−３−ｐ−ニトロフェニル−５−フェニルテトラゾリウムクロリド（ＩＮＴ）、テトラニトロブルーテトラゾリウム（ＴＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドキシル−ベータ−Ｄ−ガラクトシド／フェリシアン化鉄（ＩＩ）（ＢＣＩＧ／ＦＦ）が挙げられる。
【０２０６】
一般的に使用される西洋ワサビペルオキシダーゼの基質アルカリホスファターゼの基質の例としては、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスファート／ファストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−ホスファート／ファストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスファート／ファストレッドＴＲ（ＮＡＢＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−ＭＸ−ホスファート／ファストレッドＴＲ（ＮＡＭＰ／ＦＲ）、ナフトール−ＡＳ−Ｂ１−ホスファート／ニューフクシン（ＮＡＢＰ／ＮＦ）、ブロモクロロインドリルホスファート／ニトロブルーテトラゾリウム（ＢＣＩＰ／ＮＢＴ）、５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリル−ｂ−ｄ−ガラクトピラノシド（ＢＣＩＧ）が挙げられる。
【０２０７】
発光標識の例としては、ルミノール、イソルミノール、アクリジニウムエステル、１，２−ジオキセタン、及びピリドピリダジンが挙げられる。電気化学発光標識の例としては、ルテニウム誘導体が挙げられる。放射性標識の例としては、ヨウ化物、コバルト、セレニウム、トリチウム、炭素、硫黄、及びリンの放射性同位体が挙げられる。
【０２０８】
検出可能な標識は、本明細書で説明されている抗体と結合しても、目的の生物学的マーカーと特異的に結合する他の任意の分子（例えば、抗体、核酸プローブ、またはポリマー）と結合してもよい。さらに、当業者であれば、検出可能な標識は、第２の、及び／または第３の、及び／または第４の、及び／または第５の結合剤または抗体などと結合体化してもよいことを理解するであろう。さらに、当業者であれば、目的の生物学的マーカーを特徴づけるために使用される各々の追加の結合剤または抗体がシグナル増幅ステップとしての働きをすることも理解するであろう。生物学的マーカーは、検出可能な標識が例えば、色素、コロイド金粒子、または発光試薬である場合に、例えば光学顕微鏡、蛍光顕微鏡、電子顕微鏡を用いて、視覚的に検出することができる。また、生物学的マーカーに結合した視覚的に検出可能な物質は、分光光度計を用いて検出することもできる。検出可能な物質が放射性同位体である場合、検出は、オートラジオグラフィーによって視覚的に行うこともあれば、シンチレーションカウンターを用いて非視覚的に行うこともある。例えば、Ｌａｒｓｓｏｎ，１９８８，Ｉｍｍｕｎｏｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，（ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．８０  １９９８，Ｊｏｈｎ  Ｄ．Ｐｏｕｎｄ（ｅｄ．）（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，Ｎ．Ｊ．）を参照。
【０２０９】
本発明はさらに、試料中の１つ以上のＬＲＰ受容体または１つ以上のＬＲＰ受容体を発現する細胞もしくは組織を検出するためのキットであって、本明細書で説明されている少なくとも１つの抗体、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、ベクター、または宿主細胞を含む、キットを提供する。ある特定の実施形態において、キットは、緩衝液、酵素、標識、基質、本発明の抗体が付着するビーズまたはその他の表面など、及び使用説明書を含むことができる。
【０２１０】
本明細書で参照されている、及び／または出願データシートに列挙されている上記全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０２１１】
上記のことから、例示の目的で本発明の特定の実施形態が説明されているものの、様々な変更が本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく行われ得ることが理解されよう。したがって、本発明は、付属の特許請求の範囲以外で限定されることはない。
【実施例】
【０２１２】
実施例１
抗ＬＲＰ５／６抗体のキャラクタリゼーション
本明細書で開示されている抗体Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ＶＨＨまたはｓｄＡｂフラグメントをシークエンシングし、発現、精製、及び様々なＬＲＰ受容体に対する結合親和性キャラクタリゼーションのために哺乳類発現ベクターにサブクローニングした。
【０２１３】
製造業者の指示に従って、それぞれの発現ベクターをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に形質移入することにより、可溶性の組換えタンパク質を調製した。簡潔に述べると、形質移入から４日後、細胞ペレット沈降後に細胞培地を収集した。培地を、ヒトＩｇＧ−Ｆｃ部分を含むタンパク質を収集するためのプロテインＡ樹脂（ＲＥＰＬＩＧＥＮ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）、またはＨｉｓタグと結合体化したタンパク質を収集するためのニッケル親和性樹脂（Ｒｏｃｈｅ，Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のいずれかと共にインキュベートした。１０ｍＭグリシン、ｐＨ３．５を用いてプロテインＡ樹脂から、または１５０ｍＭインダゾール、ｐＨ７．４を用いてニッケル親和性樹脂から、それぞれタンパク質を溶離した。
【０２１４】
続いて、タンパク質溶離物を分画し、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によってさらに精製した。ＳＥＣは、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ  １０／３００  ＧＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）を用いた高速タンパク質液体クロマトグラフィーにより、ＨＢＳ緩衝液（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）中で実施した。各タンパク質を４７５μｌまたは５００μｌの体積でカラムに注入した。２８０ｎｍにおける吸光度をモニターし、全溶離物の５００μｌ分画物を収集した。メインピーク付近の各収集分画物（ｆａｃｔｉｏｎ）をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってさらに分析して、内容物を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、トリス−ＨＣｌ  ４〜１５％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて非還元条件下及び還元条件下の両方で実施した。試料をレムリー試料緩衝液中で調製し、１００℃で５分間加熱した。
【０２１５】
ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて直接ＵＶ  Ａ２８０法によってタンパク質濃度を決定した。吸光度のタンパク質濃度に対する関係は、ランベルト・ベール（Ｂｅｅｒ−Ｌａｍｂｅｒ）方程式Ａ＝εｌｃに基づけば線形である（Ａは吸光度の値であり、εは波長依存的な吸光係数であり、ｌはセンチメートル単位のパス長であり、ｃはタンパク質濃度である）。全ての産生タンパク質の実験的吸光係数を、そのアミノ酸配列によって推定した。
【０２１６】
抗体フラグメントにおける、ＬＲＰ５細胞外ドメイン（ＬＲＰ５  ＥＣＤ）及び／またはＬＲＰ６細胞外ドメイン（ＬＲＰ６  ＥＣＤ）タンパク質標的に対する結合動態を、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）により、ストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサーを伴った３０℃、１０００ｒｐｍにおけるＯｃｔｅｔ  Ｒｅｄ  ９６（ＰＡＬＬ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ，Ｆｒｅｍｏｎｔ，ＣＡ）装置を用いて決定した。Ｃ末端側ビオチン化ＬＲＰ  ＥＣＤ組換えタンパク質をランニング緩衝液中（ＰＢＳ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、０．５％  ＢＳＡ、ｐＨ７．２）で２０ｎＭに希釈し、カップリング長が０．２ｎｍに達するまでＳＡバイオセンサーに捕捉した。ＬＲＰ５またはＬＲＰ６の捕捉後、捕捉したビオチン化ＬＲＰ５またはビオチン化ＬＲＰ６を伴ったＳＡバイオセンサーを、ランニング緩衝液中に７つの異なる濃度（０、１．３７、４．１２、１２．４、３７、１１１．１、３３３．３、１０００ｎＭ）の関連抗体フラグメントを含むウェル、及び参照チャネルとしてのランニング緩衝液のみを有するウェルの中に浸漬した。製造業者の推奨設定に従ってグローバルフィッティングにより、１：１結合モデルでＫＤを決定した。
【０２１７】
また、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ１００（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上での表面プラズモン共鳴法によって結合測定も実施し、全てのタンパク質をＳＥＣで精製してから実験を行った。ビオチン化Ｌｒｐ６  Ｅ３Ｅ４を、ＳＡセンサーチップ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）上のストレプトアビジンと低密度で結合させた。無関係のビオチン化タンパク質を、対照フローセルと同等の結合密度にてキャプチャーした。濃度を漸増させたｓｃＦｖ−Ｎａｂ融合分子（例えば、１８Ｒ５  ｓｃＦｖ−ＬＲＰ６結合Ｎａｂ）を、４０μｌ／ｍｌの０．５％  ＢＳＡを含む１×ＨＢＳ−Ｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）中のチップ上に流した。各注入の後に、チップ表面を６０秒間、ＨＢＳ−Ｐ中２Ｍ  ＭｇＣｌ２で再生した。曲線は基準値を差し引いたものであり、全てのデータを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ１００評価ソフトウェアバージョン２．０を用いて１：１ラングミュア結合モデルにより分析してＫＤ値を決定した。
【０２１８】
表１Ａは、示された抗体クローンにおける重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、及びＣＤＲＨ３）ならびに軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、及びＣＤＲＬ３）を提示しており、抗体フラグメントが結合を示した最初のＬＲＰ５またはＬＲＰ６を示している。Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｅｄ  Ｂｉｏ製Ａｂｇｅｎｅｓｉｓソフトウェアを使用して、以下に示す特異性決定領域（ＳＤＲ）をマッピングした。これは、ＣＤＲのＫａｂａｔ定義を含む（Ｐａｄｌａｎ  ｅｔ  ａｌ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ．９，１３３−１３９（１９９５））。
【０２１９】
軽鎖ＣＤＲが示されない場合は、抗体フラグメントが軽鎖を含まなかったということである。
【表１Ａ−１】
2021508683.tif 000003
【表１Ａ−２】
2021508683.tif 000004
【表１Ａ−３】
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【表１Ａ−４】
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【表１Ａ−５】
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【表１Ａ−６】
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【表１Ａ−７】
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【表１Ａ−８】
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【表１Ａ−９】
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【表１Ａ−１０】
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【表１Ａ−１１】
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【表１Ａ−１２】
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【表１Ａ−１３】
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【表１Ａ−１４】
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【表１Ａ−１５】
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【表１Ａ−１６】
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【表１Ａ−１７】
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【表１Ａ−１８】
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【表１Ａ−１９】
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【０２２０】
表１Ｂは、重鎖領域のみを有する例示的なクローンの抗体重鎖フラグメント（ＨＣ）の配列識別番号と、その結合特徴とを提示している。ある特定の実施形態において、ＬＲＰ５／６結合ドメインはＦａｂであるか、またはＦａｂから誘導されたものであり、そのため表１ＢはＶＨ及びＣＨ１配列を含むが、ＣＨ２またはＣＨ３配列を含まない。ある特定の実施形態において、ＬＲＰ５／６結合ドメインは、ＶＨＨもしくはｓｄＡｂであるか、またはＶＨＨもしくはｓｄＡｂから誘導されたものであり、そのため表２ＢはＶＨＨドメインを含む。Ｏｃｔｅｔ  ＢＬＩによって決定した様々なＦｚｄ受容体におけるＫＤデータを示している。「確認した結合」カラムは、Ｏｃｔｅｔ  ＢＬＩ結合またはＢＩＡｃｏｒｅ  ＳＰＲからの結合結果を示している。空欄は、特定のＦｚｄ受容体との結合がまだ決定していないことを示す。表１Ｂに示されているように、抗ＬＲＰ５／６抗体フラグメントにおけるＯｃｔｅｔ  ＢＬＩまたはＢＩＡｃｏｒｅセンサーグラムは、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に対する一連の親和性を実証した。
【表１Ｂ】
2021508683.tif 000022
【０２２１】
表１Ｃは、ＬＲＰ６Ｅ１Ｅ２ドメイン及びＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４ドメインに対する相対的結合親和性を含めた、ある特定のクローンにおけるさらなる結合特徴を提示している。「ｎ．ｂ．」という記載は結合なしを示す。
【表１Ｃ−１】
2021508683.tif 000023
【表１Ｃ−２】
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【０２２２】
実施例２
抗ＬＲＰ６抗体フラグメントのアラニンスキャニング変異
１つの抗体フラグメント、００９Ｓ−Ｅ０４をＣＤＲのアラニンスキャニング変異誘発のために選択し、様々な変異体におけるそれぞれのＬＲＰ６結合親和性を、実施例１で説明のようにＯｃｔｅｔ  ＢＬＩによって決定した。表２に示されているように、多数の変異体が野生型抗体フラグメントと同様の親和性でＬＲＰ６に結合しており、これはＬＲＰ６抗体及びその抗原結合フラグメントがＣＤＲ内のアミノ酸修飾を許容し得ることを実証するものである。
【表２】
2021508683.tif 000025
【０２２３】
実施例３
２９３及びＡ３７５のＷｎｔ依存的レポーターアッセイにおける１８Ｒ５ｓｃＦｖ−Ｌｒｐ  ＶＨＨ  Ｗｎｔサロゲート融合タンパク質のキャラクタリゼーション
１つ以上のＦｚｄに結合するｓｃＦｖ領域と、ＬＲＰ５及び／またはＬＲＰ６に結合するＶＨＨまたはｓｄＡｂ（または単一ドメイン抗体Ｎａｂ）領域とを含む、Ｗｎｔサロゲート融合タンパク質の能力を実証した。ｓｃＦｖ形式のＦｚｄ結合物質１８Ｒ５を、本明細書で開示されている様々なＬｒｐ５及びＬｒｐ６結合物質と融合した。ＬＲＰ結合物質をＮａｂとし、６アミノ酸リンカーを用いて１８Ｒ５  ｓｃＦｖのＣ末端と融合した。Ｃ末端側のポリＨｉｓタグを含む融合タンパク質を、製造業者のプロトコルに従ってｅｘｐｉ２９３細胞内で発現させ、ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｈｉｓタグ精製用レジンと、ＨＢＳ（１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．３、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  １０／３００  ＧＬとを用いて、条件培地から精製した。単量体融合物を含む画分をプールし濃縮した。
【０２２４】
以下の条件下での２９３及びＡ３７５細胞株におけるＷｎｔ依存的レポーターアッセイを用いて、融合タンパク質のＷｎｔ経路シグナリング誘発能力を試験した。１０，０００個のＡ３７５及びＨＥＫ２９３  Ｗｎｔレポーター細胞に、ＳＴＦ  Ｗｎｔレポータープラスミドまたはそのバリアントを安定的に形質移入し、各条件ごとに３連で９６ウェルプレートに播種し、２５ｎＭ  Ｆｃ−Ｒｓｐｏ２の存在下または不在下で１６〜２０時間、融合タンパク質で刺激した。１０−２ｎＭ〜１０３ｎＭの範囲の各融合タンパク質の様々な濃度を含む条件で試験した。ＰＢＳで細胞を洗浄した後、各ウェル中の細胞を３０μｌの受動的溶解緩衝液（ｐａｓｓｉｖｅ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ）（Ｐｒｏｍｅｇａ）に溶解した。ホタルルシフェラーゼアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて、ウェル当たり１０μｌのライセートをアッセイした。
【０２２５】
結果から、試験した複数のＷｎｔサロゲートが濃度依存的様式でＷｎｔシグナリング経路を活性化することが実証され、これはＦｃ−Ｒｓｐｏ２を用いた処置によってさらに強化された（データは示さず）。
【０２２６】
実施例４
Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４結合物質複合体の結晶構造
Ｌｒｐ６（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質６）は１６１３アミノ酸であり、β−カテニンシグナリングのＷｎｔ媒介活性化において極めて重要な役割を担う１回膜タンパク質を含む。Ｌｒｐ６及び関連するＬｒｐ５は、それらの間で７０％の配列同一性を共有する。Ｌｒｐ６及びＬｒｐ５の細胞外領域は４つのβ−プロペラドメインを含み、本明細書ではそれらをＥ１、Ｅ２、Ｅ３、及びＥ４ドメインと呼ぶ。このセッションでは、Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４ドメイン（ｕｎｉｐｒｏｔエントリーＯ７５５８１の６３１〜１２４６残基（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ／ｕｎｉｐｒｏｔ／Ｏ７５５８１））の構造を説明する。構造研究に使用した、Ｃ末端にビオチンアクセプターペプチド（ＢＡＰ）及び８ヒスチジンモチーフを含むＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４の配列は以下の通りである。
ＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４＿Ｏ７５５８１＿６３１−１２４６：
ＥＡＦＬＬＦＳＲＲＡＤＩＲＲＩＳＬＥＴＮＮＮＮＶＡＩＰＬＴＧＶＫＥＡＳＡＬＤＦＤＶＴＤＮＲＩＹＷＴＤＩＳＬＫＴＩＳＲＡＦＭＮＧＳＡＬＥＨＶＶＥＦＧＬＤＹＰＥＧＭＡＶＤＷＬＧＫＮＬＹＷＡＤＴＧＴＮＲＩＥＶＳＫＬＤＧＱＨＲＱＶＬＶＷＫＤＬＤＳＰＲＡＬＡＬＤＰＡＥＧＦＭＹＷＴＥＷＧＧＫＰＫＩＤＲＡＡＭＤＧＳＥＲＴＴＬＶＰＮＶＧＲＡＮＧＬＴＩＤＹＡＫＲＲＬＹＷＴＤＬＤＴＮＬＩＥＳＳＮＭＬＧＬＮＲＥＶＩＡＤＤＬＰＨＰＦＧＬＴＱＹＱＤＹＩＹＷＴＤＷＳＲＲＳＩＥＲＡＮＫＴＳＧＱＮＲＴＩＩＱＧＨＬＤＹＶＭＤＩＬＶＦＨＳＳＲＱＳＧＷＮＥＣＡＳＳＮＧＨＣＳＨＬＣＬＡＶＰＶＧＧＦＶＣＧＣＰＡＨＹＳＬＮＡＤＮＲＴＣＳＡＰＴＴＦＬＬＦＳＱＫＳＡＩＮＲＭＶＩＤＥＱＱＳＰＤＩＩＬＰＩＨＳＬＲＮＶＲＡＩＤＹＤＰＬＤＫＱＬＹＷＩＤＳＲＱＮＭＩＲＫＡＱＥＤＧＳＱＧＦＴＶＶＶＳＳＶＰＳＱＮＬＥＩＱＰＹＤＬＳＩＤＩＹＳＲＹＩＹＷＴＣＥＡＴＮＶＩＮＶＴＲＬＤＧＲＳＶＧＶＶＬＫＧＥＱＤＲＰＲＡＶＶＶＮＰＥＫＧＹＭＹＦＴＮＬＱＥＲＳＰＫＩＥＲＡＡＬＤＧＴＥＲＥＶＬＦＦＳＧＬＳＫＰＩＡＬＡＬＤＳＲＬＧＫＬＦＷＡＤＳＤＬＲＲＩＥＳＳＤＬＳＧＡＮＲＩＶＬＥＤＳＮＩＬＱＰＶＧＬＴＶＦＥＮＷＬＹＷＩＤＫＱＱＱＭＩＥＫＩＤＭＴＧＲＥＧＲＴＫＶＱＡＲＩＡＱＬＳＤＩＨＡＶＫＥＬＮＬＱＥＹＲＱＨＰＣＡＱＤＮＧＧＣＳＨＩＣＬＶＫＧＤＧＴＴＲＣＳＣＰＭＨＬＶＬＬＱＤＥＬＳＣＧＥＰＰＳＧＳＧＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥＧＳＧＳＨＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号６１９）
【０２２７】
実施例５
構造研究のためのＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４の発現及び精製
Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４ドメインを発現する安定した細胞株を、Ｅｘｐｉ２９３細胞においてＧ４１８選択により生成した。ラージスケール発現のため、Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４を発現するＥｘｐｉ２９３細胞の凍結バイアルをＥｘｐｉ２９３培地（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）２０ｍＬ中で解凍した。細胞の生存率をモニターし、別の日に細胞を所望の体積（典型的には６〜１０Ｌ）で約３．０〜４．０×１０６細胞／ｍＬに到達するまで増殖させた（ｅｘｐｅｎｄｅｄ）。この段階で、細胞をバルプロ酸２ｍＭで処置し、さらに高密度になるまで持続的に成長させ、約４８時間後に遠心分離によって培地を採取した。Ｆｚｄ  ＣＲＤ＿Ｘｔａｌタンパク質を、ＰＢＳ（５０ｍＭリン酸二水素ナトリウム  ｐＨ８．０、３００ｍＭ  ＮａＣｌ）中で予め平衡化したＨｉｓＣｏｍｐｌｅｔｅレジン（培地１ｍＬ当たり１ｍＬ；Ｒｏｃｈｅ）とのインキュベートによって培地から精製し、２５０ｍＭイミダゾールで溶離した。溶離液を５ｍＬに濃縮し、ＨＢＳ（２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．４、及び１５０ｍＭ塩化ナトリウム）で予め平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でさらに研磨した。メインピーク付近の分画物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってさらに分析して、内容物を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、トリス−ＨＣｌ  ４〜１５％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて両方の非還元条件下で実施した。試料をレムリー試料緩衝液中で調製し、１００℃で５分間加熱した。ＬＲＰ６Ｅ３Ｅ４を含む画分を約２ｍｇ／ｍＬに濃縮し、さらに使用するまで保管用に１０％グリセロールの存在下−８０Ｃで凍結した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて直接ＵＶ  Ａ２８０法によってタンパク質濃度を決定した。吸光度のタンパク質濃度に対する関係は、ランベルト・ベール方程式Ａ＝εｌｃに基づいて線形である（Ａは吸光度の値であり、εは波長依存的な吸光係数であり、ｌはセンチメートル単位のパス長であり、ｃはタンパク質濃度である）。全ての産生タンパク質の吸光係数を、そのアミノ酸配列によって推定した。
【０２２８】
実施例６
ＶＨＨもしくはｓｄＡｂまたはＦａｂ結合物質の発現及び精製
製造業者（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）からの標準的プロトコルに従って、Ｆａｂの場合における軽鎖及び重鎖（そのＣ末端にヘキサヒスチジンを有する）を発現するプラスミドまたはＶＨＨ結合物質を発現するそのようなプラスミドを、典型的には１０００ｍＬスケールでの発現のためにＥｘｐｉ２９３細胞に形質移入した。４日間持続的に細胞成長させた後、培地を遠心分離により採取し、ＰＢＳ中で予め平衡化したＣｏｍｐｌｅｔｅ  Ｈｉｓレジン（培地１Ｌ当たり２．５ｍＬ；Ｒｏｃｈｅ）と結合させ、ＰＢＳ中２５０ｍＭイミダゾールを用いて重力流下で溶離した。Ｆａｂ結合物質を含む溶離液を約５ｍＬに濃縮し、ＨＢＳで予め平衡化したＨｉＬｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇカラム（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上でさらに研磨した。メインピーク付近の分画物をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によってさらに分析して、内容物を確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥは、トリス−ＨＣｌ  ４〜１５％ゲル（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）を用いて両方の非還元条件下で実施した。試料をレムリー試料緩衝液中で調製し、１００℃で５分間加熱した。ＦａｂまたはＶＨＨ結合物質を含む画分を約３ｍｇ／ｍＬに濃縮し、さらに使用するまで保管用に１０％グリセロールの存在下−８０Ｃで凍結した。ＮａｎｏＤｒｏｐ分光光度計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて直接ＵＶ  Ａ２８０法によってタンパク質濃度を決定した。吸光度のタンパク質濃度に対する関係は、ランベルト・ベール方程式Ａ＝εｌｃに基づいて線形である（Ａは吸光度の値であり、εは波長依存的な吸光係数であり、ｌはセンチメートル単位のパス長であり、ｃはタンパク質濃度である）。全ての産生タンパク質の吸光係数を、そのアミノ酸配列によって推定した。
【０２２９】
実施例７
Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ／Ｆａｂ複合体形成、結晶化、及び構造決定
精製したＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４及びＶＨＨ／Ｆａｂ結合物質を１．１：１モル比で（分子量が小さい方のタンパク質を少々過剰に）混合し、１００：１のｗ／ｗ比のカルボキシ−ペプチダーゼＡ及びＢと共に４℃で一晩インキュベートした。複合体の形成は、ＨＢＳ中で予め平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  Ｓ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ（１０／３００  ＧＬ）カラム上で単一のメジャーピークを観察することにより確認した。複合体を含む画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥによってさらにチェックし、結晶化スクリーンのために１０〜２５ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。市販のＭＣＳＧ１、ＭＣＳＧ２、ＭＣＳＧ３、ＭＣＳＧ４、ＰＡＣＴ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ）、ＰＥＧ  Ｉ、及びＰＥＧ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ）スクリーンを使用した最初の結晶化スクリーン、ならびにグリッドスクリーンまたはマイクロシードマトリックススクリーン［ＭＭＳ；Ｍｉｃｒｏｓｅｅｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ：ｗｈａｔ  ｈａｖｅ  ｗｅ  ｌｅａｒｎｅｄ？  Ｄ’Ａｒｃｙ，Ａ．，Ｂｅｒｇｆｏｒｓ，Ｔ．，Ｃｏｗａｎ−Ｊａｃｏｂ  Ｓ．Ｗ．，ａｎｄ  Ｍａｒｓｈｄ，Ｍ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｆ７０，１１１７−１１２６（２０１４）］による最適化をＭｏｓｑｕｉｔｏ（ＴＴＰ  ＬａｂＴｅｃｈ）分注機を用いて実施し、ＥｃｈｏＴｈｅｒｍインキュベーター（Ｔｏｒｒｅｙ  Ｐｉｎｅｓ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）内で１８℃にて平衡化した。９６ウェルプレート結晶スクリーニング実験を、Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｖ２０立体顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）によって手作業で定期的にモニターし、結晶を、様々な凍結保護物質（典型的には１５〜３０％  ｖ／ｖのグリセロールもしくはエチレングリコール、または１．１〜２．５Ｍマロン酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ  ｍａｌａｎｏｔｅ）ｐＨ７．０）の存在下で液体窒素に漬けることにより、データ収集用に凍結した。Ｘ線回折データセットをＢｅｒｋｅｌｅｙ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｔ  ｔｈｅ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（ＡＬＳ）（Ｂｅｒｋｅｌｅｙ  ＣＡ）で収集し、ＸＤＳ［Ｋａｂｓｃｈ，Ｗ．ＸＤＳ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，１２５−１３２（２０１０）］及びｘｄｓｍｅ［Ｌｅｇｒａｎｄ，Ｐ．ＸＤＳＭＥ：ＸＤＳ  Ｍａｄｅ  Ｅａｓｉｅｒ（２０１７）ＧｉｔＨｕｂ  ｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ，ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｌｅｇｒａｎｄｐ／ｘｄｓｍｅ  ＤＯＩ  １０．５２８１／ｚｅｎｏｄｏ．８３７８８５］プログラムで処理した。Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ／Ｆａｂ複合体の構造を、Ｐｈａｓｅｒ［Ｐｈａｓｅｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ  ｓｏｆｔｗａｒｅ．Ａ．Ｊ．ＭｃＣｏｙ，Ｒ．Ｗ．Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ｐ．Ｄ．Ａｄａｍｓ，Ｍ．Ｄ．Ｗｉｎｎ，Ｌ．Ｃ．Ｓｔｏｒｏｎｉ，ａｎｄ  Ｒ．Ｊ．Ｒｅａｄ．Ｊ  Ａｐｐｌ  Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ  ４０，６５８−６７４（２００７）］を用いた分子置換法により、公開されているＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４の構造［ＰＤＢコード：４Ａ０Ｐ；Ｃｈｅｎ  Ｓ，Ｂｕｂｅｃｋ  Ｄ，ＭａｃＤｏｎａｌｄ  ＢＴ，Ｌｉａｎｇ  ＷＸ，���ａｏ  ＪＨ，Ｍａｌｉｎａｕｓｋａｓ  Ｔ，Ｌｌｏｒｃａ  Ｏ，Ａｒｉｃｅｓｃｕ  ＡＲ，Ｓｉｅｂｏｌｄ  Ｃ，Ｈｅ  Ｘ，Ｊｏｎｅｓ  ＥＹ．Ｄｅｖ．Ｃｅｌｌ  ２１  ８４８−６１（２０１１）］及びＶＨＨまたはｓｄＡｂの構造［ＰＤＢコード：６Ｂ２０，ｃｈａｉｎ  Ｅ；Ｇｕｌａｔｉ  Ｓ，Ｊｉｎ  Ｈ，Ｍａｓｕｈｏ  Ｉ，Ｏｒｂａｎ  Ｔ，Ｃａｉ  Ｙ，Ｐａｒｄｏｎ  Ｅ，Ｍａｒｔｅｍｙａｎｏｖ  ＫＡ，Ｋｉｓｅｒ  ＰＤ，Ｓｔｅｗａｒｔ  ＰＬ，Ｆｏｒｄ  ＣＰ，ＳｔｅｙａｅｒｔＪ，Ｐａｌｃｚｅｗｓｋｉ  Ｋ．Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ９  １９９６（２０１８）］を用いて決定し、次いで、Ｐｈｅｎｉｘに実装されたＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ［ＰＨＥＮＩＸ：ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｐｙｔｈｏｎ−ｂａｓｅｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ．Ｐ．Ｄ．Ａｄａｍｓ，Ｐ．Ｖ．Ａｆｏｎｉｎｅ，Ｇ．Ｂｕｎｋｏｃｚｉ，Ｖ．Ｂ．Ｃｈｅｎ，Ｉ．Ｗ．Ｄａｖｉｓ，Ｎ．Ｅｃｈｏｌｓ，Ｊ．Ｊ．Ｈｅａｄｄ，Ｌ．Ｗ．Ｈｕｎｇ，Ｇ．Ｊ．Ｋａｐｒａｌ，Ｒ．Ｗ．Ｇｒｏｓｓｅ−Ｋｕｎｓｔｌｅｖｅ，Ａ．Ｊ．ＭｃＣｏｙ，Ｎ．Ｗ．Ｍｏｒｉａｒｔｙ，Ｒ．Ｏｅｆｆｎｅｒ，Ｒ．Ｊ．Ｒｅａｄ，Ｄ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｊ．Ｓ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，Ｔ．Ｃ．Ｔｅｒｗｉｌｌｉｇｅｒ，ａｎｄ  Ｐ．Ｈ．Ｚｗａｒｔ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，２１３−２２１（２０１０）；ＭｏｌＰｒｏｂｉｔｙ：ａｌｌ−ａｔｏｍ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ．Ｖ．Ｂ．Ｃｈｅｎ，Ｗ．Ｂ．Ａｒｅｎｄａｌｌ，Ｊ．Ｊ．Ｈｅａｄｄ，Ｄ．Ａ．Ｋｅｅｄｙ，Ｒ．Ｍ．Ｉｍｍｏｒｍｉｎｏ，Ｇ．Ｊ．Ｋａｐｒａｌ，Ｌ．Ｗ．Ｍｕｒｒａｙ，Ｊ．Ｓ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ，ａｎｄ  Ｄ．Ｃ．Ｒｉｃｈａｒｄｓｏｎ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，１２−２１（２０１０）］による精密化及び検証を行った。ＣＯＯＴ［Ｆｅａｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃｏｏｔ．Ｐ．Ｅｍｓｌｅｙ，Ｂ．Ｌｏｈｋａｍｐ，Ｗ．Ｇ．Ｓｃｏｔｔ，ａｎｄ  Ｋ．Ｃｏｗｔａｎ．Ａｃｔａ  Ｃｒｙｓｔ．Ｄ６６，４８６−５０１（２０１０）］を用いて、結晶学モデルを手作業で点検し構築した。ＭＯＥ（ＣＣＧ）及びＰｙＭｏｌ（Ｓｃｈｒｏｄｉｎｇｅｒ）を用いて、精密化した結晶構造の分析及び画像作成を実施した。
【０２３０】
実施例８
Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ２６複合体の構造
ＶＨＨ２６（００９Ｓ−Ｅ０４）の配列：
ＤＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＡＣＡＧＳＧＲＩＦＡＩＹＤＩＡＷＹＲＨＰＰＧＮＱＲＥＬＶＡＭＩＲＰＶＶＴＥＩＤＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＮＮＡＭＫＴＶＹＬＱＭＮＮＬＫＰＥＤＴＡＶＹＹＣＮＡＫＲＰＷＧＳＲＤＥＹＷＧＱＧＴＱＶＴＶＳＳＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号６２０）
Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ２６の回折品質結晶（濃度＝１２．４ｍｇ／ｍＬ）をＭＭＳにより、ＰＡＣＴスクリーン、０．２Ｍ硫酸ナトリウム、０．１Ｍビス−トリス−プロパンｐＨ７．５、及び２０％（ｖ／ｖ）ＰＥＧ３３５０を含むＧ８条件で得た。ウェル溶液中の２７％グリセロールを用いて結晶を凍結保護した。Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ２６複合体は、Ｐ３１２１空間群（ａ＝ｂ＝１３６．６４Å及びｃ＝１０４．７０Å）において非対称単位当たり１つの複合体分子で複合体結晶化した。Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ２６複合体の構造を２．４０Åの分解能で決定し、Ｒ結晶因子及びＲ遊離因子それぞれ１８．５％及び２３．０％に精密化した。
【０２３１】
図３．１（Ａ）に示されているＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ２６複合体の全体構造は、ＶＨＨ２６に対するＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４上のエピトープ（図４．１（Ｂ））がＬｒｐ６のＥ３  β−プロペラ内に局在化されているのを明らかにするものである。複合体の構造から、ＶＨＨ２６に対するＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４のエピトープを特定することができ、次に示すＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４の残基はコア相互作用部位（Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４とＶＨＨ２６との間の原子間距離が５．０Å以下）を定義する：
Ａｒｇ６３９、Ａｌａ６４０、Ｌｙｓ６２２、Ｇｌｕ６６３、Ｉｌｅ６８１、Ｓｅｒ６８２、Ｌｙｓ６８４、Ａｓｐ７０５、Ｔｙｒ７０６、Ｇｌｕ７０８、Ｔｈｒ７２４、Ｇｌｙ７２５、Ａｒｇ７５１、Ｔｒｐ７６７、Ｇｌｙ７６８、Ｇｌｙ７６９、Ａｒｇ７９２、Ｌｅｕ８１０、Ａｓｐ８１１、Ｈｉｓ８３４、Ｐｈｅ８３６、Ｔｒｐ８５０、Ｓｅｒ８５１、Ａｒｇ８５３、Ａｓｐ８７４、Ｔｙｒ８７５、及びＭｅｔ８７７。
【０２３２】
加えて、次に示すＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４上の残基は、直接相互作用部位（Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４とＶＨＨ２６との間の原子間距離が５．０Å超８．０Å以下）として特定されると考えられる：
Ａｒｇ６３８、Ａｓｐ６４１、Ｖａｌ６６１、Ａｌａ６６４、Ｓｅｒ６６５、Ａｓｐ６８０、Ｌｅｕ６８３、Ｔｈｒ６８５、Ｌｅｕ７０４、Ｐｒｏ７０７、Ａｓｐ７２３、Ｔｈｒ７２６、Ａｓｎ７２７、Ａｓｐ７４８、Ｓｅｒ７４９、Ｐｒｏ７５０、Ｌｙｓ７７０、Ｐｒｏ７７１、Ｇｌｙ７９１、Ａｓｎ７９４、Ａｓｐ８０９、Ｔｈｒ８１２、Ａｓｎ８１３、Ｐｒｏ８３３、Ｐｒｏ８３５、Ａｓｐ８４９、及びＡｒｇ８５２。
【０２３３】
また、Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ２６複合体の構造から、次に示すＶＨＨ２６上の残基もコア相互作用部位（Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４とＶＨＨ２６との間の原子間距離が５．０Å以下）として特定することができる：
Ｇｌｙ２６、Ａｒｇ２７、Ｐｈｅ２９、Ａｌａ３０、Ｉｌｅ３１、Ｔｙｒ３２、Ａｒｇ５２、Ｐｒｏ５３、Ｖａｌ５４、Ｖａｌ５５、Ｇｌｕ５７、Ａｓｎ７４、Ａｌａ７５、Ｌｙｓ７７、Ａｒｇ１００、Ｐｒｏ１０１、Ｔｒｐ１０２、Ｇｌｙ１０３、Ｓｅｒ１０４、Ａｒｇ１０５、Ａｓｐ１０６、及びＴｙｒ１０８。
【０２３４】
また、Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ２６複合体の構造から、次に示すＶＨＨ２６上の残基もコア相互作用部位（Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４とＶＨＨ２６との間の原子間距離が５．０Å超８．０Å以下）として特定することができる：
Ｇｌｙ２４、Ｓｅｒ２５、Ｉｌｅ２８、Ａｓｐ３３、Ｍｅｔ５０、Ｉｌｅ５１、Ｔｈｒ５６、Ａｒｇ７２、Ａｓｎ７３、Ｍｅｔ７６、Ｌｙｓ９９、及びＧｌｕ１０７。
【０２３５】
実施例９
Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ３６複合体の構造
ＶＨＨ３６（０１３Ｓ−Ｄ０５）の配列：
ＱＶＫＬＥＥＳＧＧＧＬＶＱＡＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＲＩＦＳＩＹＤＭＧＷＦＲＱＡＰＧＫＥＲＥＦＶＳＧＩＲＷＳＧＧＴＳＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＫＤＮＡＫＮＴＩＹＬＱＭＮＮＬＫＡＥＤＴＡＶＹＹＣＧＳＲＧＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＧＳＧＳＧＨＨＨＨＨＨ（配列番号６２１）
Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ３６の回折品質結晶（濃度＝１４．０ｍｇ／ｍＬ）を、１．６Ｍ硫酸アンモニウム及び０．１ＭトリスｐＨ８．２を含む条件下でのグリッドスクリーン最適化によって得た。１．６Ｍ硫酸アンモニウム及びトリスｐＨ９．０中の１．１Ｍマロン酸ナトリウムｐＨ７．０を用いて結晶を凍結保護した。Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ３６複合体は、Ｐ６５空間群（ａ＝ｂ＝１８０．６１Å及びｃ＝９８．６３Å）において非対称単位当たり１つの複合体分子で複合体結晶化した。Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ３６複合体の構造を２．７０Åの分解能で決定し、Ｒ結晶因子及びＲ遊離因子それぞれ１８．６％及び２２．８％に精密化した。
【０２３６】
図３．１（Ａ）に示されているＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ３６複合体の全体構造は、ＶＨＨ３６に対するＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４上のエピトープ（図４．１（Ｂ））がＬｒｐ６のＥ３  β−プロペラ内に局在化されているのを明らかにするものである。複合体の構造から、ＶＨＨ３６に対するＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４のエピトープを特定することができ、次に示すＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４の残基はコア相互作用部位（Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４とＶＨＨ３６との間の原子間距離が５．０Å以下）を定義する：
Ｇｌｕ６６３、Ｓｅｒ６６５、Ｉｌｅ６８１、Ｔｙｒ７０６、Ｇｌｕ７０８、Ｔｈｒ７２４、Ｓｅｒ７４９、Ａｒｇ７５１、Ｔｒｐ７６７、Ｇｌｙ７６８、Ａｒｇ７９２、Ｌｅｕ８１０、Ａｓｎ８１３、Ｐｒｏ８３３、Ｈｉｓ８３４、Ｐｈｅ８３６、Ｔｒｐ８５０、Ｓｅｒ８５１、Ａｒｇ８５３、Ａｓｐ８７４、Ｔｙｒ８７５、及びＭｅｔ８７７。
【０２３７】
加えて、次に示すＬｒｐ６Ｅ３Ｅ４上の残基は、直接相互作用部位（Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４とＶＨＨ３６との間の原子間距離が５．０Å超８．０Å以下）として特定されると考えられる：
Ｓｅｒ６３７、Ａｒｇ６３８、Ａｒｇ６３９、Ｌｙｓ６６２、Ａｌａ６６４、Ａｌａ６６６、Ｔｈｒ６７９、Ａｓｐ６８０、Ｓｅｒ６８２、Ｌｙｓ６８４、Ｐｒｏ７０７、Ｇｌｙ７２５、Ａｓｎ７２７、Ａｓｐ７４８、Ｐｒｏ７５０、Ｇｌｕ７６６、Ｇｌｙ７６９、Ｐｒｏ７７１、Ａｓｎ７９４、Ｔｈｒ８０８、Ａｓｐ８０９、Ａｓｐ８１１、Ｔｈｒ８１２、Ｌｅｕ８１４、Ｌｅｕ８３２、Ｐｒｏ８３５、Ａｓｐ８４９、Ａｒｇ８５２、Ｈｉｓ８７２、Ｌｅｕ８７３、Ｖａｌ８７６、及びＡｓｐ８７８。
【０２３８】
また、Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ３６複合体の構造から、次に示すＶＨＨ３６上の残基もコア相互作用部位（Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４とＶＨＨ３６との間の原子間距離が５．０Å以下）として特定することができる：
Ｇｌｎ１（ピログルタミン酸として修飾）、Ｖａｌ２、Ｌｙｓ３、Ａｌａ２４、Ｓｅｒ２５、Ｇｌｙ２６、Ａｒｇ２７、Ｉｌｅ２８、Ｓｅｒ３０、Ｉｌｅ３１、Ｔｙｒ３２、Ｔｒｐ５３、Ａｓｎ７３、Ａｓｎ７６、Ａｒｇ９８、及びＴｙｒ１００。
【０２３９】
また、Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４：ＶＨＨ３６複合体の構造から、次に示すＶＨＨ３６上の残基もコア相互作用部位（Ｌｒｐ６Ｅ３Ｅ４とＶＨＨ３６との間の原子間距離が５．０Å超８．０Å以下）として特定することができる：
Ｌｅｕ４、Ａｌａ２３、Ｐｈｅ２９、Ａｓｐ３３、Ａｒｇ５２、Ｓｅｒ５４、Ｌｙｓ７１、Ａｓｐ７２、Ａｌａ７４、Ｌｙｓ７５、Ｓｅｒ９７、及びＧｌｙ９９。
【表３−１】
2021508683.tif 000026
【表３−２】
2021508683.tif 000027
【０２４０】
上記の様々な実施形態は、組み合わせてさらなる実施形態をもたらすことができる。本明細書で参照されている、及び／または出願データシートに列挙されている全ての米国特許、米国特許出願公開、米国特許出願、外国特許、外国特許出願、及び非特許刊行物は、その全体が参照により本明細書に援用される。実施形態の態様は、なおさらなる実施形態を提供するために様々な特許、出願、及び刊行物の概念を用いる必要がある場合、修正することができる。
【０２４１】
これら及びその他の変更は、上記の詳細な説明に照らして、実施形態に対し行われ得る。概して、以下の請求項において、使用されている用語は、請求項を明細書及び請求項で開示されている特定の実施形態に限定するように解釈されるべきではなく、このような用語は、請求項が権利を有する全ての範囲の等価物と共に、全ての可能な実施形態を含むように解釈されるべきである。したがって、請求項は本開示による限定を受けない。
【図１】
2021508683.tif 000028
【図２】
2021508683.tif 000029
【図３】
2021508683.tif 000030
【配列表】
2021508683000001.app
【国際調査報告】
2021508683.tif 000031
2021508683.tif 000032
2021508683.tif 000033