(57)【要約】  本発明は、目的タンパク質を産生する細胞についてトランスジェニック細胞の集団をスクリーニングする方法に関する。本方法は、少なくとも１種の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を細胞培養培地中に含む培養条件で、トランスジェニック細胞を培養する工程を含む。トランスジェニック細胞は、目的タンパク質をコードする第１のドメイン、及びトランスジェニック細胞が第２のドメインを発現したときに、目的タンパク質を発現するトランスジェニック細胞の検出を容易にするドメインをコードする第２のドメインを有する、融合タンパク質をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む。
2021536263.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
目的タンパク質を産生する細胞についてトランスジェニック細胞の集団をスクリーニングする方法であって、
ａ）タンパク質合成を可能にする培養条件下で前記トランスジェニック細胞を培養する工程であって、前記細胞培養条件は、細胞培養培地中に少なくとも１種の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を含む、培養する工程及び
ｂ）どの前記トランスジェニック細胞が前記目的タンパク質を産生するのかを決定する工程を含み、
前記トランスジェニック細胞は、（ｉ）少なくとも１種のｎｎＡＡ、目的タンパク質をコードする第１のドメイン、及び前記トランスジェニック細胞が第２のドメインを発現したときに、前記目的タンパク質を産生する前記トランスジェニック細胞の検出を容易にするドメインをコードする前記第２のドメインを含む融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、並びに（ｉｉ）少なくとも１種の直交ｔＲＮＡ、及び前記少なくとも１種のｎｎＡＡを受容し、前記少なくとも１種の直交ｔＲＮＡを認識する少なくとも１種の直交ｔＲＮＡシンセターゼを含む方法。
【請求項２】
前記少なくとも１種のｎｎＡＡをコードする前記ポリヌクレオチドは、前記ｎｎＡＡの存在下で翻訳終結の抑制をサポートするアンバー終止コドンである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記少なくとも１種のｎｎＡＡはピロリシンであり、前記直交ｔＲＮＡはピロリシル−ｔＲＮＡ（ｔＲＮＡ−Ｐｙｌ）であり、前記直交ｔＲＮＡシンセターゼはピロリル−ｔＲＮＡシンセターゼ（ＰｙｒｌＲＳ）である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記融合タンパク質の前記第２のドメインは、膜貫通タンパク質ドメイン、細胞膜アンカードメイン又はタグを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記トランスジェニック細胞は哺乳動物細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記トランスジェニック細胞は、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＶＥＲＯ細胞又はマウスハイブリドーマ細胞である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記トランスジェニック細胞は、原核細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記融合タンパク質は、前記第１のドメインと前記第２のドメインとの間にリンカーペプチド配列を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記第２のドメインは、膜貫通タンパク質ドメインである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第２のドメインは、前記細胞膜に存在するＧＰＩ部分への前記目的タンパク質の固定を促進するグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナルペプチドである細胞膜アンカードメインである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＧＰＩシグナルペプチドは、崩壊促進因子７タンパク質（ＤＡＦ−７）由来のＧＰＩシグナルペプチドである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記融合タンパク質の前記第１のドメインは、抗体又は抗体断片である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記目的タンパク質が前記トランスジェニック細胞内又は上で産生されるかどうかを決定する工程は、前記トランスジェニック細胞の集団中の他のトランスジェニック細胞と比較して、どの前記トランスジェニック細胞が前記目的タンパク質をより高いレベルで産生するのかを決定するために、前記トランスジェニック細胞の表面にディスプレイされる前記目的タンパク質のレベルを決定する工程を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記目的タンパク質をより多量産生する前記トランスジェニック細胞を、前記目的タンパク質をより少量産生する前記トランスジェニック細胞から分離する、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記トランスジェニック細胞の分離は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）の使用を含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記分離された、より高産生のトランスジェニック細胞を、続いて、タンパク質合成を可能にする細胞培養条件下で培養する、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記より高産生のトランスジェニック細胞は、前記少なくとも１種のｎｎＡＡの非存在下の細胞培養環境中で培養され、前記少なくとも１種のｎｎＡＡの非存在下における前記トランスジェニック細胞の培養が、前記融合タンパク質の前記第２のドメインを含むことなく前記目的タンパク質の産生をもたらす、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞培養環境から、前記目的タンパク質を単離する工程をさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記第２のドメインは、タンパク質タグである、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記タグは、親和性、エピトープ又は蛍光タグである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記融合タンパク質の前記第１のドメインは、複合膜タンパク質（ＣＭＰ）である、請求項１〜８、１９及び２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記目的タンパク質が前記トランスジェニック細胞内又は上で産生されるかどうかを決定する工程は、どのトランスジェニック細胞が前記目的タンパク質を産生しているのかを決定するために、蛍光タンパク質から放出される蛍光シグナルを検出する工程を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記目的タンパク質を産生する前記トランスジェニック細胞を、前記目的タンパク質を産生しない前記トランスジェニック細胞から分離する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記目的タンパク質を産生しない前記トランスジェニック細胞の分離は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記目的タンパク質を産生する前記分離されたトランスジェニック細胞を、続いて、タンパク質合成を可能にする細胞培養条件下で培養する、請求項２３又は２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記目的タンパク質を産生する前記トランスジェニック細胞は、前記少なくとも１種のｎｎＡＡの非存在下の細胞培養環境中で培養され、前記少なくとも１種のｎｎＡＡの非存在下における前記トランスジェニック細胞の培養は、前記融合タンパク質の前記第２のドメインを含むことなく前記目的タンパク質の産生をもたらす、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、目的タンパク質を産生する細胞についてトランスジェニック細胞の集団をスクリーニングする方法に関する。本方法は、少なくとも１種の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を細胞培養培地中に含む培養条件で、トランスジェニック細胞を培養する工程を含む。トランスジェニック細胞は、融合タンパク質をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含み、この融合タンパク質は、目的タンパク質をコードする第１のドメインと、トランスジェニック細胞が第２のドメインを発現したときに、目的タンパク質を発現したトランスジェニック細胞の検出を容易にするドメインをコードする第２のドメインとを有する。融合タンパク質はまた、少なくとも１種のｎｎＡＡを含む。
【背景技術】
【０００２】
目的タンパク質を産生するトランスジェニック細胞は、薬剤の開発全般を通して使用される。例えば、薬剤開発の初期では、そのような細胞は抗体生成キャンペーン及び活性を評価する細胞ベースのアッセイに使用され、薬剤開発の後期では、そのような細胞はバイオ医薬品を製造するために使用される。したがって、トランスジェニック細胞の選択は薬剤開発にとって極めて重要である。
【０００３】
目的タンパク質を産生するトランスジェニック細胞を選択する代替的な方法を提供するために多くの努力がなされてきた。例えば、フローサイトメトリーは、特定の特徴を有する細胞の同定をより実行可能なものにした。フローサイトメトリーの重要な利点は、多数の細胞をスクリーニングする能力を含むことである。しかしながら、フローサイトメトリーは時間と労力を要する。
【０００４】
本発明は、例えば、作業負荷を低減し、効率を向上させることによって、既存の方法を上回る利点を提供する。例えば、特許文献１は、融合タンパク質（この融合タンパク質のドメインの１つは、抗生物質耐性のための遺伝子である）のリードスルー及び発現を可能にする終止コドンの抑制技術を使用するシステムを開示している。細胞は、その後、融合体を発現する細胞を決定するために、抗生物質の存在下で培養される。しかし、この方法は、高レベルの融合タンパク質産生体の選択を可能にするものではなく、したがって、高産生クローンを選択する機構は存在しない。同様に、特許文献２は、終止コドンの抑制が達成できるまで少なくとも２日間、培養液中でトランスジェニック細胞が抗生物質に十分に曝露されるような、抗生物質依存性システムの使用を開示している。これらの方法もまた、一回のクローニング／選択の後に、高産生体を選択する能力をもたらすものではない。特許文献３は、終止コドンの漏れやすいリードスルーを可能にするコドン配列を利用する。このようなシステムは誘導性ではなく、効率が低く、厳密に制御することができない。したがって、このシステムもまた、１回のクローニング及び選択の後、目的タンパク質の高産生体を選択することができない。
【０００５】
本発明は、効率及び制御の向上を含む多くの利点を有するトランスジェニック細胞を濃縮し選択するための新規な方法を提供する。この方法はまた、多くの様々な目的タンパク質で有効であり、したがって、任意の目的タンパク質を発現するトランスジェニック細胞を濃縮し選択するためのプラットフォームとして使用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】国際公開第２００３／０１４３６１号パンフレット
【特許文献２】国際公開第２００５／０７３３７５号パンフレット
【特許文献３】国際公開第２０１０／０２２９６１号パンフレット
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明は、目的タンパク質を産生する細胞についてトランスジェニック細胞の集団をスクリーニングする方法に関する。本方法は、少なくとも１種の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を細胞培養培地中に含む培養条件で、トランスジェニック細胞を培養する工程を含む。トランスジェニック細胞は、融合タンパク質をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含み、この融合タンパク質は、目的タンパク質をコードする第１のドメインと、トランスジェニック細胞が第２のドメインを発現したときに、目的タンパク質を発現したトランスジェニック細胞の検出を容易にするドメインをコードする第２のドメインとを有する。融合タンパク質はまた、少なくとも１種のｎｎＡＡを含む。
【０００８】
一実施形態では、トランスジェニック細胞は、融合タンパク質をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含み、この融合タンパク質は、目的タンパク質をコードする第１のドメインと、トランスジェニック細胞が第２のドメインを発現したときに、目的タンパク質を細胞膜に固定するアンカードメインをコードする第２のドメインを有する。これらの融合タンパク質はまた、少なくとも１種のｎｎＡＡを含む。
【０００９】
別の実施形態では、トランスジェニック細胞は、融合タンパク質をコードする少なくとも一つのポリヌクレオチドを含み、この融合タンパク質は、目的タンパク質をコードする第１のドメインと、トランスジェニック細胞が第２のドメインを発現したときに、目的タンパク質を標識するタグをコードする第２のドメインとを有する。これらの融合タンパク質はまた、少なくとも１種のｎｎＡＡを含む。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】図１は、本発明の方法で使用する誘導性システムを示す。ｎｎＡＡの存在は、標的遺伝子の３’末端でコードされたアンバー終止コドンのリードスルーと、融合タンパク質、例えば、膜貫通ドメイン又は抗体の細胞膜への固定を可能にするグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）付着配列を含有する抗体の発現とをもたらす。これらの同一の細胞で、細胞培養培地中にｎｎＡＡが存在しないと、膜アンカーを有さない抗体が発現し、細胞培養培地中に分泌される。これらの実施形態では、ｎｎＡＡをコードするコドンは抗体の重鎖のＣ末端にあり、これは、重鎖を介して細胞膜上への抗体の固定を可能にする。
【図２】図２は、本発明のトランスジェニック細胞に挿入することができるポリヌクレオチドを示す。この実施形態では、ＨＣは抗体の重鎖を表し、ＤＡＦ−７は細胞表面膜上への重鎖の固定を可能にするＧＰＩシグナルペプチドを表す。ＴＭは膜貫通タンパク質からの膜貫通ドメインを表す。この実施例では、ヒトトロンボモジュリンのＴＭドメインを用いた。ＴＡＧ（赤色の星）は、ｎｎＡＡが培養培地中に存在するとき、それをコードするアンバー終止コドンを表す。ＴＧＡ及びＴＡＡ（緑色の星）は、ｎｎＡＡの組み込み部位ではない終止コドンを表す。
【図３−１】図３は、本発明の方法を用いたフローサイトメトリーの結果を示す。示された構築物を発現する細胞を、ｎｎＡＡの存在下又は非存在下で増殖させ、表面結合ＩｇＧを、抗ＨＣ及び抗ＬＣ抗体で検出した。構築物「ＩｇＧ−ＤＡＦ−Ａｍｂｅｒ」は、細胞培養培地中、ｎｎＡＡ非存在下で低い表面蛍光を示すが、ｎｎＡＡ存在下では高い表面蛍光を示す。構築物「ＩｇＧ−ＴＭ−１×Ａｍｂｅｒ」は、細胞培養培地中、ｎｎＡＡ非存在下で低い表面蛍光を示すが、ｎｎＡＡ存在下では高い表面蛍光を示す。
【図３−２】図３は、本発明の方法を用いたフローサイトメトリーの結果を示す。示された構築物を発現する細胞を、ｎｎＡＡの存在下又は非存在下で増殖させ、表面結合ＩｇＧを、抗ＨＣ及び抗ＬＣ抗体で検出した。構築物「ＩｇＧ−ＤＡＦ−Ａｍｂｅｒ」は、細胞培養培地中、ｎｎＡＡ非存在下で低い表面蛍光を示すが、ｎｎＡＡ存在下では高い表面蛍光を示す。構築物「ＩｇＧ−ＴＭ−１×Ａｍｂｅｒ」は、細胞培養培地中、ｎｎＡＡ非存在下で低い表面蛍光を示すが、ｎｎＡＡ存在下では高い表面蛍光を示す。
【図４Ａ】図４は、２ｍＭ、０．ｍＭ及び０．１ｍＭのｎｎＡＡで表面ディスプレイシステムを活性化した後に選択された、発現プールのＭＦＩと発現力価との相関を示す。表面ディスプレイによって得られた発現とＭＦＩとの間の相関は、ｎｎＡＡのより低い濃度で改善された。Ｂ）抗体−ＧＰＩ融合体の表面ディスプレイの程度は、ｎｎＡＡの濃度及びｎｎＡＡへの細胞の曝露時間の調節によって調整することができる。暴露が長くなるほど、又はｎｎＡＡ濃度が増加するほど、集団のＭＦＩは増加する。
【図４Ｂ−１】図４は、２ｍＭ、０．ｍＭ及び０．１ｍＭのｎｎＡＡで表面ディスプレイシステムを活性化した後に選択された、発現プールのＭＦＩと発現力価との相関を示す。表面ディスプレイによって得られた発現とＭＦＩとの間の相関は、ｎｎＡＡのより低い濃度で改善された。Ｂ）抗体−ＧＰＩ融合体の表面ディスプレイの程度は、ｎｎＡＡの濃度及びｎｎＡＡへの細胞の曝露時間の調節によって調整することができる。暴露が長くなるほど、又はｎｎＡＡ濃度が増加するほど、集団のＭＦＩは増加する。
【図４Ｂ−２】図４は、２ｍＭ、０．ｍＭ及び０．１ｍＭのｎｎＡＡで表面ディスプレイシステムを活性化した後に選択された、発現プールのＭＦＩと発現力価との相関を示す。表面ディスプレイによって得られた発現とＭＦＩとの間の相関は、ｎｎＡＡのより低い濃度で改善された。Ｂ）抗体−ＧＰＩ融合体の表面ディスプレイの程度は、ｎｎＡＡの濃度及びｎｎＡＡへの細胞の曝露時間の調節によって調整することができる。暴露が長くなるほど、又はｎｎＡＡ濃度が増加するほど、集団のＭＦＩは増加する。
【図５】図５は、安定プールの表面ディスプレイベースの選択を示す。Ａ）ＩｇＧ−ＧＰＩ−アンバーを安定に発現する細胞の分取ゲートを、ｎｎＡＡの非存在下（−ｎｎＡＡ）又は存在下（＋ｎｎＡＡ）で増殖させ、ＨＣ発現に基づくＦＡＣＳによってプールに分取し、細胞を非濃縮、低（下位）及び高（上位）表面ディスプレイプールに分離した。Ｂ）分取したサブプールを増殖させ、それらの流加力価及びＣ）比産生性（Ｑｐ）を決定した。高表面ディスプレイから分取した細胞は、非濃縮又は低表面ディスプレイプールよりも高い総力価を示した。
【図６】図６は、高い表面ディスプレイレベルが力価の増加と相関することを示す。Ａ）安定なＩｇＧ−ＧＰＩ−アンバープールをｎｎＡＡの存在下で増殖させ、ＦＡＣＳによって低、中及び高表面染色プールにバルク分取した。Ｂ）流加培養により、分取したサブプールの発現レベルを決定した（ｎ＝３）。Ｃ）分取したサブプールの表面ディスプレイを、増殖後にフローサイトメトリーにより測定した。表面染色レベルが異なる３つの重複集団を、流加法により保存した。Ｄ）重鎖表面ディスプレイＭＦＩとサブプール力価とは、強い正の相関を示す。決定係数（Ｒ２）が示されている。
【図７】図７は、高発現クローンの同定及び単離についての表面ディスプレイの有用性を示す。Ａ）ＩｇＧ−ＧＰＩ−アンバーを発現する単一細胞を、表面ディスプレイを用いて高、中及び低表面ディスプレイゲートから分取し、細胞を単一細胞密度で９６ウェルプレートに分取した。これらのクローンの発現レベルを、９６ディープウェル流加培養で測定した。表面ディスプレイの非存在下で分取した対照集団と共に、各クローンの発現レベルを、プロットした。高表面ディスプレイゲートからの平均発現値は、中、低及び非濃縮集団に対して統計的に有意な差を示した。示された一対に対するＰ値が示されている。Ｂ）表面ディスプレイを用いて高産生クローンの濃縮を強調するために、選択された力価を超えるクローンの頻度を積み上げグラフにプロットした。高表面ディスプレイの選択は、他のゲート又は非濃縮集団よりも非常に高い産生クローン（＞８．５ｇ／Ｌ）の濃縮を示した。Ｃ）表面ディスプレイゲートの各分画からの３０クローンについて、表面ディスプレイのＭＦＩと発現レベルとの相関を調べた。フィッティングした回帰直線が、その決定係数（Ｒ２）と共に示されている。これらのデータは、表面ディスプレイと発現力価との間に強い相関があることを示す。
【図８】図８は、発現が困難な分子の高発現体の濃縮及び選択に対する表面ディスプレイの有用性を示す。Ａ）従来の細胞株操作のスクリーニングでは、低い力価を示した二重特異性抗体を安定的に発現する細胞を、表面ディスプレイに供し、単一細胞を選択するために高及び低ゲートを使用した。非濃縮集団に由来するクローンも単離した。Ｂ）単離したクローンを、９６ディープウェルの流加培養により発現力価を評価した。高表面ディスプレイゲートに由来するクローンは、より高い総発現力価レベルを示すが、より多数の高産生クローンも示す。
【図９】図９は、Ｊｕｍｐ−Ｉｎ  ＣＨＯＫ１細胞株におけるアンバーサプレッションのフローサイトメトリー測定を示す。ｍＣｈｅｒｒｙＡＭＢＧＦＰレポーターでトランスフェクトしたプール１の代表的なデータ（９Ａ）。ｍＣｈｅｒｒｙＡＭＢＧＦＰレポーターでトランスフェクトしたクローン７（９Ｂ）。
【図１０】図１０は、この（誘導性）方法の検証のためのＤＮＡ及びタンパク質の構築物を示す。アンバーサプレッション依存性（ＡＭＢ）変異体及びリードスルー（Ｋ）変異体を表すＤＮＡ構築物。ｐｙｌＲＳ／ｔＲＮＡ対によって組み込まれたＡｚＫリシン類似体（１０Ａ）。ｎｎＡＡ補充がある場合及びない場合の、アンバーサプレッション依存性（ＡＭＢ）変異体及びリードスルー（Ｋ）変異体を表すタンパク質（１０Ｂ）。ｎｎＡＡの非存在下では、ＡＭＢ構築物を含有する細胞は「非タグ化」タンパク質変異体のみを発現するが、ｎｎＡＡの存在下では、細胞は「非タグ化」及び「タグ化」タンパク質変異体の両方を発現する。リードスルー構築物を含有する細胞は、「タグ化」タンパク質変異体のみを発現する。内部Ｒｈｏ  １Ｄ４配列（＊）はＲｈｏ  １Ｄ４抗体によって認識されない。
【図１１】図１１は、タグ化膜タンパク質発現がｎｎＡＡへの細胞の暴露によって特異的に誘発されることを示すウェスタンブロットを示す。ＥｐｈＡ２発現細胞、クローディン１発現細胞、ＣＸＣＲ２発現細胞又はＣＸＣＲ４発現細胞にｎｎＡＡを補充し、ＧＦＰの発現を誘導した。ｎｎＡＡへの曝露の０、２４、及び４８時間後に、全細胞溶解物を作製し、Ｒｈｏ  １Ｄ４、ｅＧＦＰ、及びチューブリンに対する抗体を使用してウェスタンブロットにより評価した。矢印は、「非タグ化」膜タンパク質（単一星形）及び「タグ化」膜タンパク質（二重星形）を示す。各膜タンパク質（図示せず）の「リードスルー」変異体を用いて、「タグ化」変異体を同定した。
【図１２−１】図１２は、親、予備分取、及び分取集団の比較分析を示す。親、予備分取及び分取集団における「非タグ化」ＥｐｈＡ２、クローディン１、ＣＸＣＲ２、及びＣＸＣＲ４の全発現をウェスタンブロットによって評価した（１２Ａ）。抗ＥｐｈＡ２として１Ｃ１を用いた細胞表面ＦＣＭ（１２Ｂ）。抗クローディン１としてＦＡＢ４６１８Ｒを用いた細胞表面ＦＣＭ（１２Ｃ）。抗ＣＸＣＲ２−としてＸ２−７５３を用いた細胞表面ＦＣＭ（１２Ｄ）。抗ＣＸＣＲ４としてＭＥＤＩ３１８５を用いた細胞表面ＦＣＭ（１２Ｅ）。親及び分取した「非タグ化」ＣＸＣＲ２発現細胞株（１２Ｆ）に結合したＩＬ−８リガンド。親及び分取した「非タグ化」ＣＸＣＲ４発現細胞株に結合したＳＤＦ−１αリガンド（１２Ｇ）。
【図１２−２】図１２は、親、予備分取、及び分取集団の比較分析を示す。親、予備分取及び分取集団における「非タグ化」ＥｐｈＡ２、クローディン１、ＣＸＣＲ２、及びＣＸＣＲ４の全発現をウェスタンブロットによって評価した（１２Ａ）。抗ＥｐｈＡ２として１Ｃ１を用いた細胞表面ＦＣＭ（１２Ｂ）。抗クローディン１としてＦＡＢ４６１８Ｒを用いた細胞表面ＦＣＭ（１２Ｃ）。抗ＣＸＣＲ２−としてＸ２−７５３を用いた細胞表面ＦＣＭ（１２Ｄ）。抗ＣＸＣＲ４としてＭＥＤＩ３１８５を用いた細胞表面ＦＣＭ（１２Ｅ）。親及び分取した「非タグ化」ＣＸＣＲ２発現細胞株（１２Ｆ）に結合したＩＬ−８リガンド。親及び分取した「非タグ化」ＣＸＣＲ４発現細胞株に結合したＳＤＦ−１αリガンド（１２Ｇ）。
【図１３Ａ】図１３は、ｎｎＡＡ曝露から０時間及び４８時間後における膜タンパク質細胞株の蛍光顕微鏡法を示す。ｎｎＡＡへの暴露から４８時間後に、ＥｐｈＡ２−、クローディン１−、ＣＸＣＲ２−又はＣＸＣＲ４を発現するクローン７細胞を蛍光顕微鏡によって評価した。各膜タンパク質の「タグ化」変異体は、「リードスルー」変異体と同様の細胞分布を示した。クローディン１融合タンパク質は、細胞間接触領域への局在化を示す。矢印は細胞間相互作用を示す。
【図１３Ｂ】図１３は、ｎｎＡＡ曝露から０時間及び４８時間後における膜タンパク質細胞株の蛍光顕微鏡法を示す。ｎｎＡＡへの暴露から４８時間後に、ＥｐｈＡ２−、クローディン１−、ＣＸＣＲ２−又はＣＸＣＲ４を発現するクローン７細胞を蛍光顕微鏡によって評価した。各膜タンパク質の「タグ化」変異体は、「リードスルー」変異体と同様の細胞分布を示した。クローディン１融合タンパク質は、細胞間接触領域への局在化を示す。矢印は細胞間相互作用を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本発明は、目的タンパク質を産生する細胞についてトランスジェニック細胞の集団をスクリーニングする方法に関する。本方法は、少なくとも１種の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を細胞培養培地中に含む培養条件で、トランスジェニック細胞を培養する工程を含む。トランスジェニック細胞は、融合タンパク質をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含み、この融合タンパク質は、目的タンパク質をコードする第１のドメインと、トランスジェニック細胞が第２のドメインを発現したときに、目的タンパク質を発現したトランスジェニック細胞の検出を容易にするドメインをコードする第２のドメインとを有する。融合タンパク質はまた、少なくとも１種のｎｎＡＡを含む。
【００１２】
１つの特定の実施形態では、本発明は、トランスジェニック細胞の集団内で、より低いレベルの目的タンパク質を産生する他の細胞と比較して、より高いレベルの目的タンパク質を産生する細胞について、トランスジェニック細胞の集団をスクリーニングする方法に関する。本方法は、少なくとも１種の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を細胞培養培地中に含む培養条件で、トランスジェニック細胞を培養する工程を含む。トランスジェニック細胞は、目的タンパク質をコードする第１のドメイン、及びトランスジェニック細胞が第２のドメインを発現したときに目的タンパク質を細胞膜に固定するアンカードメインをコードする第２のドメインを有する融合タンパク質をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む。これらの融合タンパク質はまた、少なくとも１種のｎｎＡＡを含む。
【００１３】
本発明の別の特定の実施形態において、図１は、本発明の方法で使用する誘導性システムを示す。ｎｎＡＡの存在は、標的遺伝子の３’末端にコードされたアンバー終止コドンのリードスルー、及び抗体の細胞膜への固定を可能にする融合タンパク質、例えば、膜貫通ドメイン又はグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）付着配列を含有する抗体の発現をもたらす。これらの同じ細胞において、細胞培養培地中にｎｎＡＡが存在しないと、膜アンカーを有さない抗体が発現し、細胞培養培地中に分泌される。これらの実施形態では、ｎｎＡＡをコードするコドンは抗体の重鎖のＣ末端にあり、これは、重鎖を介して細胞膜上への抗体の固定を可能にする。
【００１４】
本発明の別の特定の実施形態において、図２は、本発明のトランスジェニック細胞に挿入することができるポリヌクレオチドを示す。この実施形態では、ＨＣは抗体の重鎖を表し、ＤＡＦ−７は細胞表面膜上への重鎖の固定を可能にするＧＰＩシグナルペプチドを表す。ＴＭは膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインを表す。この実施例では、ヒトトロンボモジュリンのＴＭドメインを用いた。ＴＡＧ（赤色の星）は、ｎｎＡＡが培養培地中に存在するとき、それをコードするアンバー終止コドンを表す。ＴＧＡ及びＴＡＡ（緑色の星）は、ｎｎＡＡの組み込み部位ではない終止コドンを表す。
【００１５】
別の特定の実施形態では、本発明は少なくとも１種の膜貫通ドメインを含有する目的タンパク質を産生する細胞について、トランスジェニック細胞の集団をスクリーニングする方法に関する。本方法は、少なくとも１種の非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）を細胞培養培地中に含む培養条件で、トランスジェニック細胞を培養する工程を含む。トランスジェニック細胞は、目的タンパク質をコードする第１のドメイン、及びトランスジェニック細胞が第２のドメインを発現したときに目的タンパク質を標識するタグをコードする第２のドメインを有する融合タンパク質をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む。これらの融合タンパク質はまた、少なくとも１種のｎｎＡＡを含む。
【００１６】
本発明のトランスジェニック細胞は、細胞培養培地中にｎｎＡＡが存在する場合、ｎｎＡＡをポリペプチド鎖に組み込むよう操作されている。本明細書で使用する場合、非天然アミノ酸（ｎｎＡＡ）という用語は、標準的な遺伝子コードの２０種の「タンパク質構成」アミノ酸の１つでないアミノ酸構造を有する任意の分子を意味するために使用される。当業者は標準的な遺伝子コードの２０種のタンパク質構成アミノ酸を完全に認識しており、したがって、当業者は、ｎｎＡＡであるアミノ酸を容易に認識するであろう。具体的には、ｎｎＡＡという用語は以下のアミノ酸を含まない：アルギニン、リシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン、アラニン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、バリン、プロリン、グリシン。しかしながら、上に列挙したアミノ酸の誘導体は、これらの誘導体が標準的な遺伝子コードの２０のタンパク質構成アミノ酸のいずれでもない限り、ｎｎＡＡという用語に含まれ得る。重要なことに、ｎｎＡＡ自体のアイデンティティは、ｎｎＡＡが成長するポリペプチド鎖に組み込まれ、アンバーサプレッションをサポートし得るならば、本発明の方法にとって重要ではない。むしろ、ｎｎＡＡが成長するポリペプチド鎖に組み込まれ得る限り、トランスジェニック細胞培養環境にｎｎＡＡが存在するかしないかということのみが重要である。本発明の方法で使用することができるｎｎＡＡの例としては、Ｌｉｕ，Ｃ．ａｎｄ  Ｓｈｕｌｔｚ，Ｐ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，７９：４１３−４４４（２０１０）及びＷａｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．２０１４  Ｊｕｎ；１８４４（６）：１０５９−１０７０）（これらの文献は参照により組み込まれる）に記載されるｎｎＡＡが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１７】
特定の一実施形態では、本発明の方法において細胞培養環境に存在するｎｎＡＡは、リシン類似体（ピロリシン、リシンアジド、プロパルギルリシン、リシン−Ａｌｏｃ、及びＢｏｃ−リシンを含むが、これらに限定されない）である。本発明の方法で使用するｎｎＡＡのアイデンティティは、必然的に直交ｔＲＮＡ及び直交ｔＲＮＡシンセターゼを特定するであろう。例えば、本発明のｎｎＡＡがリシンアジドである場合、直交ｔＲＮＡシンセターゼはピロリシル−ｔＲＮＡシンセターゼ又はＰｙｌＲＳと特定され、その同族ｔＲＮＡはｔＲＮＡ−Ｐｙｌ（又はｔＲＮＡ（Ｐｙｌ））と特定される。したがって、一実施形態では、ｎｎＡＡはリシンアジドであり、直交ｔＲＮＡシンセターゼはピロリシル−ｔＲＮＡシンセターゼであり、ｔＲＮＡはｔＲＮＡ−Ｐｙｌである。
【００１８】
別の特定の実施形態では、本発明の方法において、ある特定の天然に存在するアミノ酸が使用され得る。そのような場合、本明細書又は特許請求の範囲に記載されるｎｎＡＡもまた、それらの特定の天然に存在するアミノ酸を含むであろう。そのような天然に存在するアミノ酸としては、ピロリシンが挙げられるが、これに限定されない。
【００１９】
ｎｎＡＡをペプチドのアミノ酸配列に組み込む能力を有する細胞を、これらのペプチドが正常な細胞転写及び翻訳プロセスによって作製される場合にどのように構築するかは、今日、当該技術分野でよく知られている。すなわち、成長するペプチド鎖にｎｎＡＡを組み込む能力を有する細胞は、ｎｎＡＡを「受容」するように操作されている直交ｔＲＮＡ、並びに直交ｔＲＮＡ及びｎｎＡＡに「適合」したｔＲＮＡシンセターゼを含まなければならない。直交ｔＲＮＡシンセターゼは、エステル化反応の間に直交ｔＲＮＡにｎｎＡＡを「結合」させて、ｎｎＡＡとアミノアシルｔＲＮＡを形成する。本明細書で使用する場合、「直交ｔＲＮＡシンセターゼ」という用語は、当該技術分野で使用されているのと同様に、培養される特定の細胞型には通常存在しないｔＲＮＡシンセターゼの種を意味するために使用される。通常、直交ｔＲＮＡシンセターゼはｎｎＡＡに対して特異性を有し、エステル化プロセスの間に、いかなる天然に存在するアミノ酸も受容しない。加えて、“直交ｔＲＮＡ”は宿主細胞のｔＲＮＡシンセターゼには認識されない。しかしながら、本発明のトランスジェニック細胞は、直交ｔＲＮＡがｎｎＡＡでロードされるよう、直交ｔＲＮＡシンセターゼ及びｔＲＮＡの両者を発現するよう操作されている。任意の公知の直交ｔＲＮＡシンセターゼ及びｔＲＮＡ対は、ｔＲＮＡがｎｎＡＡでロードされて、アンバーサプレッションを組み込み、且つサポートし得る限り、本発明で使用することができる。
【００２０】
本発明の方法の操作の間、ｎｎＡＡが培養環境中に存在する場合には、直交ｔＲＮＡ及び適合直交ｔＲＮＡシンセターゼは、アンバー終止コドンによって指定された部位に、適合ｎｎＡＡを成長するペプチド鎖に挿入するであろう。ｎｎＡＡが培養環境に存在しない場合には、直交ｔＲＮＡは、天然に存在するいかなるアミノ酸も受容せず、したがって、アンバーコドンは終止コドンとして機能し、ペプチド合成の停止をもたらすであろう。換言すれば、本発明の方法で使用するトランスジェニック細胞中に存在する直交ｔＲＮＡは、ｔＲＮＡの抗コドンループがｍＲＮＡ分子上の終止コドンに対を置くように操作される。したがって、トランスジェニック細胞を用いた培養条件におけるｎｎＡＡの存在は、トランスジェニック細胞中で成長するポリペプチド鎖の伸長を可能にし、それによって、ｎｎＡＡは成長するポリペプチド鎖に組み込まれる。さらに、トランスジェニック細胞を用いた培養条件におけるｎｎＡＡの非存在は、アミノ酸がアンバー終止コドンを越えてポリペプチド鎖に挿入されないので、ポリペプチド鎖の成長を停止させるであろう。このように、トランスジェニック細胞を用いた培養条件におけるｎｎＡＡの有無は、ポリペプチド伸長のための「ゲートキーパー」として作用する。したがって、ｎｎＡＡは単にポリペプチド伸長のゲートキーパーとして作用しているに過ぎないので、ｎｎＡＡ自体のアイデンティティは本発明の方法の操作にとって重要ではない。
【００２１】
本発明のトランスジェニック細胞は、培養することができ、直交ｔＲＮＡ及び適合する直交ｔＲＮＡシンセターゼを産生するよう操作することができる任意の細胞型とすることができる。本発明の方法で使用できる細胞の例としては、以下に限定されないが哺乳動物細胞、昆虫細胞及び酵母細胞などの真核細胞、並びに細菌細胞などの原核細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の方法で使用できるトランスジェニック細胞の具体例としては、大腸菌細胞、ＣＨＯ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＰＥＲＣ６細胞、ＣＯＳ−１細胞、ＨｅＬａ細胞、ＶＥＲＯ細胞及びマウスハイブリドーマ細胞が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、国際公開第２０１４／０４４８７２号パンフレットで開示されている細胞を本発明の方法に使用することができる。
【００２２】
本発明のトランスジェニック細胞はまた、目的タンパク質をコードする少なくとも１つの第１のドメイン、及びトランスジェニック細胞内又は上で目的タンパク質を発現するトランスジェニック細胞の検出を容易にするドメインをコードする少なくとも１つの第２のドメインを有する、融合タンパク質をコードする少なくとも１種のポリヌクレオチドを含む。第１と第２のドメインの融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、ｎｎＡＡをコードする少なくとも１つのコドンを含む。上で説明したように、ｎｎＡＡが培養条件中に存在する場合、ポリペプチド鎖はタンパク質合成中に伸長し続け、その結果、第１と第２のドメインは両者ともタンパク質合成中に生成される。これらの第１及び第２のドメインは少なくとも１つのｎｎＡＡによって分離される。特定の一実施形態では、ポリヌクレオチドは、２つ以上のｎｎＡＡをコードする。より特定の実施形態では、これらの複数のｎｎＡＡは同じｎｎＡＡである。別のより特定の実施形態では、複数のｎｎＡＡは異なるｎｎＡＡである。３つ以上のｎｎＡＡがポリヌクレオチド中でコードされるならば、２つ以上のｎｎＡＡは、同じであるか又は互いに異なり得る。第１と第２のドメインの間の第１のｎｎＡＡをコードするこの第１のコドンはまた、タンパク質合成の間、停止コドンとして働き、その結果、ポリペプチド鎖は第１のドメインが生成された後に成長を停止する。
【００２３】
選択された実施形態では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、第１と第２のドメインの間のリンカーペプチドをコードする。これらの実施形態では、少なくとも１つのｎｎＡＡをコードするコドンは、リンカーペプチドの５’位又は３’位であり得る。本明細書で使用する場合、リンカーペプチドは、２つのドメインを１つの結合ドメインへと機能的に連結することを容易にするよう設計された、典型的には約１〜約１２０アミノ酸長の範囲のポリペプチドを意味するために使用される。明確にするために、単一のアミノ酸は、本発明の目的のためのリンカーペプチドと考えることができる。当然ながら、本発明の融合タンパク質で使用するリンカーペプチドは、長さが１２０残基を超えるアミノ酸を含んでいても、又は構成されていてもよい。リンカーペプチドが存在する場合、その長さは、サブドメインリンカーペプチドがサブドメイン間を機能的に連結することが可能である限り、融合タンパク質の機能には重要でないかもしれない。リンカーとして有用に使用され得るアミノ酸配列は、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６（１９８５），Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８３：８２５８−８５６２（１９８６）、米国特許第４，９３５，２３３号明細書及び米国特許第４，７５１，１８０号明細書（これらの全ては参照により組み込まれる）に記載されているものが挙げられる。
【００２４】
リンカーペプチドの文脈における「機能的連結」という用語は、連結した融合ポリペプチドが、それが由来するドメインの機能的特徴又は生物学的活性のいくつか又は全てを模倣することを可能にする三次元構造への、各ドメインのポリペプチドの折り畳みを容易にする連結を示す。機能的連結という用語はまた、連結したドメインが、結合ドメインが所望のように機能するために必要とされる安定性、可撓性及び／又は張力の少なくとも最小限の程度を有することを示す。本発明の一実施形態では、ドメインリンカーペプチドは、同種のアミノ酸を含むか、又は同種のアミノ酸からなる。別の実施形態では、ドメインリンカーペプチドのアミノ酸は互いに異なる。
【００２５】
本発明のさらなる実施形態では、少なくとも１種のポリヌクレオチドは、３つ以上のドメインを有する融合タンパク質をコードし、その複数のドメインのうちの少なくとも１つは、目的タンパク質を発現するトランスジェニック細胞の検出を容易にするドメインをコードする。特定の実施形態では、複数のドメインを有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ｎｎＡＡをコードする少なくとも１つのコドンを含む。特定の実施形態では、複数のドメインを有する融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、各ドメイン間に少なくとも１つのｎｎＡＡをコードする、少なくとも１つのコドンを含む。この実施形態では、ｎｎＡＡをコードする複数のコドンは、同種のｎｎＡＡをコードしてもよく、コードしなくてもよい。したがって、トランスジェニック細胞が２セット以上の直交ｔＲＮＡ／直交ｔＲＮＡシンセターゼを含む場合、すなわち、各セットが異なるｎｎＡＡに対応する場合、培養培地に特定のｎｎＡＡを含むことは可能であるが、他方についてはそうではない。この場合、第１のドメインに融合した１つ、２つ又はそれより多くのドメインを有するタンパク質の産生を制御し得る。
【００２６】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、少なくとも１つの目的タンパク質をコードするべきである。本発明の方法は、目的タンパク質のアイデンティティによって限定されない。融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを作製する方法は、当該技術分野で非常によく知られているので、実質的に任意のコード配列を使用して、任意の目的タンパク質を作製することができる。目的タンパク質の例としては、構造タンパク質、酵素、抗体及び他の防御タンパク質、シグナル伝達タンパク質、調節タンパク質、輸送タンパク質、感覚タンパク質、モータータンパク質、並びに貯蔵タンパク質が挙げられる。
【００２７】
融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドはまた、目的タンパク質を発現するトランスジェニック細胞の検出を容易にする、少なくとも１つの第２のドメインをコードするべきである。一実施形態では、第２のドメインは、融合タンパク質を発現するトランスジェニック細胞の細胞膜に融合タンパク質全体を固定するアンカードメインである。本明細書で使用する場合、アンカードメインは、目的の目的タンパク質がトランスジェニック細胞の表面に「ディスプレイされる」ことを可能にするドメインであり、その結果、目的タンパク質は細胞内に生成されるが、細胞は目的タンパク質を細胞から分離された細胞培養環境中に分泌することができない。アンカードメインは、それ自体が完全なタンパク質である必要はなく、融合タンパク質を発現するトランスジェニック細胞の細胞膜に、融合タンパク質を固定することができるタンパク質の機能的部分を含む。例えば、より複雑なタンパク質の膜貫通ドメイン部分を、本発明の方法でアンカードメインとして使用することができる。アンカードメインの例には、シングルパス膜貫通ドメイン、膜貫通ベータバレル、又はそれらの任意の部分が含まれるが、これらに限定されない。本発明のアンカードメインとして使用し得る膜貫通ドメインの具体的な例としては、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバー由来の膜貫通ドメイン、ＣＤ３０、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ、例えば、ヒトＰＤＧＦＲのアミノ酸５１４〜５６２；Ｃｈｅｓｔｎｕｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９６  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １９３：１７−２７；Ｇｒｏｎｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．１９８８  ＰＮＡＳ  ８５：３４３５も参照）；神経成長因子受容体、マウスＢ７−１（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９１  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １７４：６２５−６３１）、アシアロ糖タンパク質受容体Ｈ１サブユニット（ＡＳＧＰＲ；Ｓｐｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．１９８５  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２６０：１９７９−１９８２）、ＣＤ２７、ＣＤ４０、ＣＤ１２０ａ、ＣＤ１２０ｂ、ＣＤ８０（Ｆｒｅｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．１９８９  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４３：２７１４−２２）リンホトキシンβ受容体、ガラクトシルトランスフェラーゼ（Ｅ．Ｇ．ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ１５５５８２）、シアル酸トランスフェラーゼ（Ｅ．Ｇ．ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ−００３０３２）、アスパルチルトランスフェラーゼ１（Ａｓｐ１；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ２００３４２）、アスパルチルトランスフェラーゼ２（Ａｓｐ２；例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ−０１２１０４）、シンタキシン６（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ−００５８１９）、ユビキチン、ドーパミン受容体、インスリンＢ鎖、アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ−００２４０６）、ＡＰＰ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ａ３３２９２）、Ｇタンパク質共役受容体、トロンボモジュリン（Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．１９８７  ＥＭＢＯ  Ｊ  ６，１８９１）、凝集素結合サブユニット及びＴＲＡＩＬ受容体が挙げられるが、これらに限定されない。膜貫通ドメインの例は、国際公開第１９９８／０２１２３２号パンフレット、国際公開第２００３／１０４４１５号パンフレット及び国際公開第２００７／０４７５７８号パンフレットにも記載されている。
【００２８】
他の実施形態では、アンカードメインは、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）シグナルペプチドであり、これは細胞膜に存在するＧＰＩ部分への目的タンパク質の固定を促進する。ＧＰＩシグナルペプチドは当該技術分野でよく知られており、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ  ｏｆ  Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ．Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖａｒｋｉ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．Ｅｄｓ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（２００９）（これは参照により援用される）の第１１章で論じられている、ＧＰＩアンカータンパク質由来のシグナルペプチドを含む。ＧＰＩシグナルペプチドの具体例としては、崩壊促進因子７（ＤＡＦ−７）由来のＧＰＩシグナルペプチド、ｎｏｇｏ受容体、トレイルデコイ受容体、葉酸受容体、膜固定セリンプロテアーゼ、及びスクレイピープリオンタンパク質が挙げられる。
【００２９】
一実施形態では、第２のドメインは目的タンパク質を標識するタグである。タグは発現されたタンパク質の検出又は精製を容易にするためにタンパク質に結合した任意の検出可能な分子、例えば、ペプチド配列であり得る。本発明の融合タンパク質は２つ、３つ、４つ、又はそれより多くのドメインを含み得、その各々は個別のタグであり得る。本発明の融合タンパク質が２つ以上のタグを含有する場合、タグは化学的に同じであっても、同じでなくてもよい。ある実施形態では、タグは、親和性、エピトープ又は蛍光タグであり得る。親和性、エピトープ、又は蛍光タグは、当該技術分野で知られている。本発明の融合タンパク質の一部である親和性タグの例としては、グルタチオン−Ｓトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ポリヒスチジンタグ（Ｈｉｓ）、カルモジュリン結合タンパク質（ＣＢＰ）、及びマルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）が挙げられるが、これらに限定されない。本発明の融合タンパク質の一部であるエピトープタグの例としては、ｍｙｃ、ヒトインフルエンザ赤血球凝集素（ＨＡ）、及びＦＬＡＧが挙げられるが、これらに限定されない。本発明の融合タンパク質の一部である蛍光タグの例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ、ＺｓＧｒｅｅｎ）、赤色シフトＧＦＰ（ｒｓ−ＧＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＤｓＲｅｄ２、ＨｃＲｅｄ１、ｄｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓを含むＲＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ、Ｚｓｙｅｌｌｏｗ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ、ＡｍＣｙａｎ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）及びフィコビリタンパク質、並びにこれらのタンパク質の増強版及び変異が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの蛍光タンパク質について、増強は、タンパク質の明るさを増加させることによる、又はより速い発色団の成熟を有するタンパク質を作製することによる、発光の最適化を示す。これらの増強は、蛍光タンパク質へと変異を操作することによって達成することができる。
【００３０】
本方法は、タンパク質合成を可能にする培養条件下でトランスジェニック細胞を培養する工程を含む。本発明によって培養されるトランスジェニック細胞は、培養され、技術者によって必要とされる実験条件にしたがって播種又は懸濁され得る。本明細書の実施例では、本明細書に記載の方法と共に使用することができる、培養条件の少なくとも１つの機能的セットを示す。知られていない場合、所予の細胞型についてタンパク質合成を促進するための播種又は懸濁及び培養条件は、当業者であれば、ルーチンの実験のみで決定することができる。細胞は、培養容器の表面に播種しても播種しなくてもよいが、播種する場合は、付着因子を使用して細胞を培養容器の表面に播種することができる。付着因子を使用する場合、培養容器を、１つの天然、組換え若しくは合成付着因子、又は因子群、又はそのペプチドフラグメント（例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、及びその天然又は合成フラグメントが挙げられるが、これらに限定されない）で予めコーティングすることができる。
【００３１】
培養条件における細胞播種密度は、必要とされる特定の培養条件に対して操作され得る。プラスチック培養容器中でのルーチンの培養では、トランスジェニック細胞の播種密度は、１ｃｍ２当たり約１×１０４〜約１×１０７個の細胞とすることができるが、これはかなり一般的であり、例えば、３５ｍｍ２〜１００ｍｍ２の組織培養ペトリ皿では、多くの場合、１×１０６個の細胞が培養される。細胞密度は、任意の継代において必要に応じて変化させることができる。
【００３２】
本発明の方法を用いてタンパク質合成のために哺乳動物のトランスジェニック細胞を培養する場合、これらの細胞は、一般に、細胞インキュベータ中、約３７℃、通常の大気圧で培養される。インキュベータ雰囲気は、通常、加湿され、多くの場合、空気中に約３〜１０％の二酸化炭素を含有する。温度、圧力及びＣＯ２濃度は、細胞が依然生存可能であれば、必要に応じて変更することができる。培養培地のｐＨは、約７．１〜約７．６、特には約７．１〜約７．４、より特には約７．１〜約７．３の範囲であり得る。
【００３３】
トランスジェニック細胞は、タンパク質合成が起こるのを可能にする条件下で培養される。培養条件の間に１種以上のｎｎＡＡが存在する場合、２つ以上のドメインを含む完全長融合タンパク質が合成され、目的タンパク質はトランスジェニック細胞に若しくは同細胞上に固定されるか、又は目的タンパク質は標識されるであろう。培養条件の間に１種以上のｎｎＡＡが存在しない場合には、完全長融合タンパク質は合成されないであろう。その代わりに、ｎｎＡＡをコードするコドンは、ｎｎＡＡが存在しない場合に終止コドンとして作用するので、目的タンパク質のみが発現される。特定の実施形態では、ｎｎＡＡはトランスジェニック細胞と共に細胞培養条件下に約４８時間又はそれ未満の時間置かれ、その後、ｎｎＡＡを含有する細胞培養培地はｎｎＡＡを含まない細胞培養培地で置き換えられる。細胞培養培地を除去し、緩衝液（限定されないが、ＰＢＳなど）で細胞を洗浄して、微量の以前の細胞培養培地を除去することはルーチンの作業である。より特定の実施形態では、ｎｎＡＡはトランスジェニック細胞と共に細胞培養条件に、約４８時間未満、約４６時間未満、約４４時間未満、約４２時間未満、約４０時間未満、約３８時間未満、約３６時間未満、約３４時間未満、約３２時間未満、約３０時間未満、約２８時間未満、約２６時間未満、約２４時間未満、約２２時間未満、約２０時間未満、約１８時間未満、約１６時間未満、約１４時間未満、約１２時間未満、約１０時間未満、約８時間未満、約６時間未満、約５時間未満、約４時間未満、約３時間未満、約２時間未満、約１時間未満置かれ、その後、ｎｎＡＡを含有する細胞培養培地は、ｎｎＡＡを含まない細胞培養培地で置き換えられる。
【００３４】
他の実施形態では、細胞培養培地中の１種以上のｎｎＡＡの濃度は変化し得る。特定の一実施形態では、細胞培養培地中の１種以上のｎｎＡＡの全濃度は、約５ｍＭ以下である。より特定の実施形態では、細胞培養培地中の１種以上のｎｎＡＡの全濃度は、約２ｍＭ〜約１０μＭである。さらにより特定の実施形態では、細胞培養培地中の１種以上のｎｎＡＡの全濃度は、約１０μＭ〜約２０μＭ、約２０μＭ〜約３０μＭ、約３０μＭ〜約４０μＭ、約４０μＭ〜約５０μＭ、約５０μＭ〜約６０μＭ、約６０μＭ〜約７０μＭ、約７０μＭ〜約８０μＭ、約８０μＭ〜約９０μＭ、約９０μＭ〜約１００μＭ、約１００μＭ〜約１２０μＭ、約１２０μＭ〜約１４０μＭ、約１４０μＭ〜約１６０μＭ、約１６０μＭ〜約１８０μＭ、約１８０μＭ〜約２００μＭ、約２００μＭ〜約２５０μＭ、約２５０μＭ〜約３００μＭ、約３００μＭ〜約３５０μＭ、約３５０μＭ〜約４００μＭ、約４００μＭ〜約４５０μＭ又は約４５０μＭ〜約５００μＭ、約５００μＭ〜約５５０μＭ、約５５０μＭ〜約６００μＭ、約６００μＭ〜約６５０μＭ又は約６５０μＭ〜約７００μＭ、約７００μＭ〜約７５０μＭ、約７５０μＭ〜約８００μＭ、約８００μＭ〜約８５０μＭ又は約８５０μＭ〜約９００μＭ、約９００μＭ〜約９５０μＭ、約９５０μＭ〜約１．０ｍＭ、約１．０ｍＭ〜約１．１ｍＭ、約１．１ｍＭ〜約１．２ｍＭ、約１．２ｍＭ〜約１．３ｍＭ、約１．３ｍＭ〜約１．４ｍＭ、約１．４ｍＭ〜約１．５ｍＭ、約１．５ｍＭ〜約１．６ｍＭ、約１．６ｍＭ〜約１．７ｍＭ、約１．７ｍＭ〜約１．８ｍＭ、約１．８ｍＭ〜約１．９ｍＭ、約１．９ｍＭ〜約２．０ｍＭ、約２．０ｍＭ〜約２．１ｍＭ、約２．１ｍＭ〜約２．２ｍＭ、約２．２ｍＭ〜約２．３ｍＭ、約２．３ｍＭ〜約２．４ｍＭ、約２．４ｍＭ〜約２．５ｍＭ、約２．５ｍＭ〜約２．６ｍＭ、約２．６ｍＭ〜約２．７ｍＭ、約２．７ｍＭ〜約２．８ｍＭ、約２．８ｍＭ〜約２．９ｍＭ、約２．９ｍＭ〜約３．０ｍＭ、約３．０ｍＭ〜約３．１ｍＭ、約３．１ｍＭ〜約３．２ｍＭ、約３．２ｍＭ〜約３．３ｍＭ、約３．３ｍＭ〜約３．４ｍＭ、約３．４ｍＭ〜約３．５ｍＭ、約３．５ｍＭ〜約３．６ｍＭ、約３．６ｍＭ〜約３．７ｍＭ、約３．７ｍＭ〜約３．８ｍＭ、約３．８ｍＭ〜約３．９ｍＭ、約３．９ｍＭ〜約４．０ｍＭ；約４．０ｍＭ〜約４．１ｍＭ、約４．１ｍＭ〜約４．２ｍＭ、約４．２ｍＭ〜約４．３ｍＭ、約４．３ｍＭ〜約４．４ｍＭ、約４．４ｍＭ〜約４．５ｍＭ、約４．５ｍＭ〜約４．６ｍＭ、約４．６ｍＭ〜約４．７ｍＭ、約４．７ｍＭ〜約４．８ｍＭ、約４．８ｍＭ〜約４．９ｍＭ、約４．９ｍＭ〜約５．０ｍＭである。
【００３５】
融合タンパク質が合成される場合、すなわち、培養条件が１種以上のｎｎＡＡを含む場合、目的タンパク質は、トランスジェニック細胞の表面にディスプレイされる。本発明の方法は、次に、トランスジェニック細胞で産生される目的タンパク質のレベル又は量を決定する方法を含むであろう。個々の細胞上に、又はトランスジェニック細胞集団内の細胞サブグループ内にディスプレイされた目的タンパク質のレベルを決定することにより、次に、トランスジェニック細胞集団の残りの細胞と比較して、個々の細胞又は細胞のサブグループのどれが、より多量の目的の目的タンパク質を産生するかを決定することができる。
【００３６】
細胞の表面にディスプレイされたタンパク質を決定及び定量する方法は、当該技術分野ではルーチンである。一実施形態では、トランスジェニック細胞の表面にディスプレイされた目的タンパク質のレベルの決定には、フローサイトメトリーが含まれる。他の実施形態では、トランスジェニック細胞の表面にディスプレイされた目的タンパク質のレベルの決定には、細胞ベースのＥＬＩＳＡ、均一系アッセイ、ウェスタンブロット、リガンド結合、抗原結合、機能アッセイ、抗体依存性キリングアッセイが含まれる。
【００３７】
特定の一実施形態では、トランスジェニック細胞の表面にディスプレイされる目的タンパク質をより少なく産生するトランスジェニック細胞は、残りのトランスジェニック細胞集団から分離される。特定の一実施形態では、トランスジェニック細胞の表面にディスプレイされる目的タンパク質をより多く産生するトランスジェニック細胞は、残りのトランスジェニック細胞集団から分離される。細胞の集団内から細胞を分離する方法は、当該技術分野でルーチンであり、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、ビーズベースの分取、ＣｌｏｎｅＰｉｘ、Ｂｅｒｋｌｅｙ  ｌｉｇｈｔｓ技術、並びに限界希釈クローニング及び発現評価を含むが、これらに限定されない。
【００３８】
目的タンパク質のレベル、量又は量を決定するときに、本明細書で使用される場合、これらの決定は、相対的又は絶対的なものであり得る。例えば、ＦＡＣＳを使用して、細胞の残りの集団からより高い産生体を分取する場合、１つの決定は単に、細胞集団の他のメンバーと比較して、より明るい又はより強い蛍光シグナルを測定することであり得る。
【００３９】
本明細書で使用する場合、「より高い」という用語は、目的タンパク質の量と共に使用する場合、技術者によって設定され得る相対的な用語である。例えば、トランスジェニック細胞の表面にディスプレイされた、目的タンパク質の量の代用測定として蛍光を使用する場合、オペレーターは、「より高い」産生体と考えられるようにディスプレイされなければならない最小量の蛍光を設定することができる。或いは、技術者は単に、目的タンパク質の最高レベルをディスプレイする細胞のある部分又はある割合を選択することができる。特定の実施形態では、「より高い」という用語は、目的タンパク質の量と共に使用する場合、融合タンパク質の合成を可能にする条件下に置かれたトランスジェニック細胞の最初の集団から目的タンパク質をディスプレイした、上位約５０％、上位約４５％、上位約４０％、上位約３５％、上位約３０％、上位約２５％、上位約２０％、上位約１５％、上位約１０％、上位約５％又は上位約１％の細胞を意味する。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「より低い」という用語は、目的タンパク質の量と共に使用する場合、技術者によって設定され得る相対的な用語である。例えば、トランスジェニック細胞の表面にディスプレイされた、目的タンパク質の量の代用測定として蛍光を使用する場合、オペレーターは、「より低い」産生体と考えられないようにディスプレイされなければならない最小量の蛍光を設定することができる。或いは、技術者は単に、目的タンパク質の最低レベルをディスプレイする細胞のある部分又はある割合を選択することができる。特定の実施形態では、「より低い」という用語は、目的タンパク質の量と共に使用する場合、融合タンパク質の合成を可能にする条件下に置かれたトランスジェニック細胞の最初の集団から目的の目的タンパク質をディスプレイした、下位約５０％、下位約４５％、下位約４０％、下位約３５％、下位約３０％、下位約２５％、下位約２０％、下位約１５％、下位約１０％、下位約５％又は下位約１％の細胞を意味する。
【００４１】
一旦、細胞が分取され、したがってトランスジェニック細胞の初期集団から、目的の目的タンパク質のより高い産生体又は「より低くない産生体」に単離されたならば、次に、これらの単離された細胞を後続の細胞培養環境に置かれ得る。後続の細胞培養環境は、ｎｎＡＡを含有していても、含有していなくてもよい。一実施形態では、目的タンパク質が融合構築物の一部としてではなく産生されるように、後続の細胞培養環境はｎｎＡＡを含有しない。別の実施形態では、後続の細胞培養環境は、最初はｎｎＡＡを含有しないが、ある期間後に又は細胞を継代した後に、１種以上のｎｎＡＡが細胞培養環境に加えられる。一旦、ｎｎＡＡが加えられると、細胞は融合タンパク質を産生することができ、トランスジェニック細胞のこの後続の集団は、産生レベルについて再評価され得る。このような細胞培養培地へのｎｎＡＡ添加の繰返し、及びその後のタンパク質レベルの決定は、目的の目的タンパク質のより高い産生体をさらに単離するために使用され得る。
【００４２】
一旦、タンパク質合成が可能で、且つｎｎＡＡが存在しない細胞培養環境に細胞が置かれた場合、細胞はその後、融合タンパク質の第１のドメインを産生し得る。したがって、例えば、固定されていないタンパク質は、次に、細胞培養培地中に分泌され、その後、従来のタンパク質単離技術を使用して単離され得る。同様に、正しく折り畳まれた非標識タンパク質は、トランスジェニック細胞中で産生され得る。
【００４３】
本明細書中の実施例は、例示を意味するものであり、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【００４４】
実施例１−複合膜タンパク質の発現
アンバー終止コドンの位置に非天然リシン誘導体の取り込みを容易にするために、メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）のピロリシルｔＲＮＡシンセターゼ（ｐｙｌＲＳ）及びｔＲＮＡｐｙｌをコードするプラスミドを作製した。このｔＲＮＡシンセターゼとｔＲＮＡの対は、種々の宿主細胞で直交し、改変なしに種々のリシン類似体を収容し得る。最初にｐＭＯＡＶ２由来のＦＬＡＧタグ化ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌをｐＤＯＮＲ２２１に移し、最後にゲートウェイＢＰクロナーゼ反応を介してｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１−Ｐｕｒｏに移してｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１−Ｐｕｒｏ−ＭＯＡＶ２を作製した。このベクター内で、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターは改変ｐｙｌＲＳ遺伝子の転写を制御し、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターはｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の１８コピーの転写を制御する。
【００４５】
ＥＦ１−ピューロマイシン耐性カセットをＳＶ４０−ブラスチシジン耐性カセットのものと置き換えるように改変されたレンチウイルスベクター（ｐＣＤＨ１−ＣＭＶ−ＭＣＳ−Ｐｕｒｏ、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）中のアンバー終止コドン（ＴＡＧ）又はリシンコドン（ＡＡＧ）のいずれかによって分離された増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）の融合タンパク質として、複合膜タンパク質をコードするプラスミドを作製した。リシン含有変異体は、細胞株における「リードスルー」制御タンパク質として働いた。発現ベクターをさらに改変して、非タグ化タンパク質及びタグ化タンパク質のウェスタンブロットによる検出を容易にした：（１）アンバー終止／リシンコドン融合タンパク質の接合の前に、三重アラニン（ＡＡＡ）リンカーによって分離されたＡＶＩＴＡＧ（商標）配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）とＲｈｏ  １Ｄ４エピトープ（ＴＥＴＳＱＶＡＰＡ−ＣＯＯＨ）とを含有するように膜タンパク質配列を改変し；そして（２）アンバー終止／リシン接合の後に、ｅＧＦＰにグリシン／セリンリッチリンカー（Ｇ（ＧＳＧ）４Ｇ）を先行させ、グリシン／セリンリッチリンカー（Ｇ（ＧＳＧ）４Ｇ）、ＦＬＡＧエピトープ（ＤＹＤＤＤＤＫ）、グリシン／セリンリンカー（ＧＳＧ）及びＲｈｏ  １Ｄ４エピトープを続けた。Ｒｈｏ  １Ｄ４抗体は、タンパク質のＣ末端のエピトープに特異的である；したがって、内部エピトープはアンバーサプレッション時の場合のように検出されない。ＤＮＡ配列決定を用いて、全ての構築物を確認した。
【００４６】
Ｊｕｍｐ−Ｉｎ  ＣＨＯＫ１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を維持し、Ｆ１２培地中で増殖させた。培地には、１０％ＦＢＳ及びｐｙｌＲＳ機能を妨害し、ｐｙｌＲＳ及びｔＲＮＡｐｙｌを含有する細胞株の健康な増殖を促進する非加水分解性ピロリシン類似体である１ｍＭの５−（（（（アリルオキシ）カルボニル）アミノ）ペンタン酸を補充した。Ｊｕｍｐ−Ｉｎ  ＣＨＯＫ１をｐＥＦ−ＤＥＳＴ５１−Ｐｕｒｏ−ＭＯＡＶ２で安定にトランスフェクトし、トランスフェクションの２４時間後から、５μｇ／ｍＬのピューロマイシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）による選択を開始した。細胞株におけるアンバーサプレッションを評価するために、選択され、混合された集団からなるピューロマイシン選択増殖物を、ＣＭＶプロモーターの制御下でｍＣｈｅｒｒｙＡＭＢＧＦＰレポーターをコードするｐＭａｘ−ｍＣｈｅｒｒｙＯｐｔ−ＧＦＰ  ａｍｂで一時的にトランスフェクトし、２ｍＭのＮ６−（（２−アジドエトキシ）カルボニル）−Ｌ−リシン塩酸塩（リシンアジド）（ＩＲＩＳ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｍａｒｋｔｒｅｄｗｉｔｚ、Ｇｅｒｍａｎｙ）中で増殖させた。このレポーター構築物でトランスフェクトされた細胞は、ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を示し、アンバーコドンをサプレッションする細胞はｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ蛍光を示す。１００μｍノズル及びシース流体としてＰＢＳを使用して、ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ｍＣｈｅｒｒｙ）及びＦＩＴＣ（ＧＦＰ）チャネルにおける蛍光について、フローサイトメトリー及びＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ上での蛍光活性化細胞分取によって細胞を評価した。ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ蛍光を示す細胞を、１ｍＭデコイ及び５μｇ／ｍＬピューロマイシンを補充した、２００μＬ増殖培地を含有する９６ウェルプレート中に分取した。９６ウェルプレートで増殖させた後、１２のコロニーをさらに１２ウェルプレート中で、そして最後にＴ７５フラスコ中で増殖させた後、凍結して液体窒素中で保存した。細胞株を「Ｊｕｍｐ−Ｉｎ  ＣＨＯＫ１＋ＭＯＡＶ２」と名前を付け変えた。
【００４７】
個々のＪｕｍｐ−Ｉｎ  ＣＨＯＫ１＋ＭＯＡＶ２クローン１〜１２におけるアンバーサプレッションの特異性を評価するために、ｍＣｈｅｒｒｙＡＭＢＧＦＰレポータープラスミドを一時的にトランスフェクトし、１ｍＭデコイ又は２ｍＭリシンアジドを補充したいずれかの培地中でクローンを増殖させた。ＰＥ−Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ（ｍＣｈｅｒｒｙ）及びＦＩＴＣ（ＧＦＰ）チャネルにおける蛍光について、トランスフェクトされた細胞をＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａにより分析した。これらから、誘導系のキャラクタリゼーション用にクローン７を選択した。
【００４８】
膜タンパク質の発現のためのレンチウイルスは、以下のように、懸濁２９３Ｆ細胞へＤＮＡを一時的にトランスフェクションすることによって産生させた：２９３フェクチン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて、膜タンパク質をコードする１．６５μｇのレンチウイルスベクタープラスミド及び８．３５μｇのｐＰＡＣＫＨ１（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）をトランスフェクトした。レンチウイルスを含有する細胞上清を、トランスフェクションの２日後に収集し、超遠心分離によって５０倍に濃縮した。１０％ＦＢＳ及び１ｍＭデコイを補充した２ｍＬのＦ１２中のレンチウイルス（ＭＯＩ＝２．５）及び２μｇ／ｍＬポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａ、Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ、ＷＩ）により、クローン７の細胞にスピン形質導入し、続いて２，５００ｒｐｍ、３２℃で１．５時間、遠心分離した。ポリブレンを形質導入２４時間後に細胞から除去し、形質導入２日後にブラスチシジン耐性（１０μｇ／ｍＬ）細胞を選択した。ブラスチシジン選択はおよそ７〜１０日後に完了した。抗生物質選択で生き残った細胞は、遺伝的座位、コピー数及び発現表現型が変化する選択された混合集団を表す。
【００４９】
膜タンパク質細胞株の細胞分取のために、ＥｐｈＡ２、クローディン１、ＣＸＣＲ２、又はＣＸＣＲ４を発現するクローン７細胞をＰＢＳで十分に洗浄し、１０％ＦＢＳ及び２ｍＭリシンアジドを補充したＦ１２中で増殖させて、細胞分取の４８時間前にＧＦＰタグの翻訳を誘導した。細胞分取の日に、Ｔｒｙｐ−ＬＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で細胞を剥離させ、洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液（２％ＦＢＳを補充したＰＢＳ、ｐＨ７．４）に再懸濁させ、濾過した。ＢＤ  ＩＮＦＬＵＸ（商標）Ｃｅｌｌ  Ｓｏｒｔｅｒ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）により試料を分取し、これによりＧＦＰ陽性細胞の上位１０％を回収し、バルクで増殖させた。
【００５０】
フローサイトメトリー（ＦＣＭ）のために、細胞をＴｒｙｐ−ＬＥで培養皿から剥離し、ＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中の１０μｇ／ｍＬのＨｙ２９−１（ＣＸＣＲ２）、Ｘ２−７５３（ＣＸＣＲ２）、又はＭＥＤＩ３１８５（ＣＸＣＲ４）により氷上で３０分間染色した。細胞を十分に洗浄し、ＦＡＣＳ緩衝液中の１０μｇ／ｍＬのヤギ抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により氷上で３０分間染色し、十分に洗浄した。アイソタイプ対照抗体のＲ３４７を陰性対照として使用した。試料はＭＡＣＳＱｕａｎｔ  ＶＹＢ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）で測定し、生細胞をゲートした。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて行った。
【００５１】
この誘導性方法が、この切り替え可能なタグシステムを制御するのに使用し得ることを確認したので、ＦＡＣＳによる細胞株のタグベースの濃縮を、それがタンパク質特異的抗体法の代替として使用され得るかどうかを決定するために調査した。この方法の理論的根拠は、膜タンパク質、すなわち、タグ化融合タンパク質構築物内のｅＧＦＰの固定比率に由来する。４８時間のリシンアジド誘導後に、モデル膜タンパク質の「ＡＭＢ」バージョンを発現する、選択した混合集団細胞株を細胞分取にかけた。ＧＦＰ陽性細胞の上位１０％を単離し、バルクで増殖させた。或いは、分取細胞は単一細胞希釈によってクローニングできたであろう；しかし、この方法の目的は、膜タンパク質濃縮のための誘導法を評価することであり、したがって、ワークフローを単純化するためにバルク増殖を選択した。細胞分取濃縮を評価するために、非タグ化モデル膜タンパク質を発現する、選択、混合及び分取した細胞集団を、抗Ｒｈｏ  １Ｄ４及びチューブリンウェスタンブロット並びに膜タンパク質特異的ＦＣＭにより評価した。
【００５２】
細胞分取が高発現細胞での全体的な濃縮をもたらすかどうかを評価するために、抗Ｒｈｏ  １Ｄ４抗体を用いたウェスタンブロットによりモデル膜タンパク質の全発現を評価した。ＥｐｈＡ２、クローディン１、ＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４は、混合集団に対してそれぞれ約２倍、１．３倍、７．６倍及び１．５倍の発現改善を示すことが分かった（図１３Ａ）。これらの結果は、十分に発現されたモデル膜タンパク質、ＥｐｈＡ２、クローディン１及びＣＸＣＲ４について、ＣＸＣＲ２の同レベルの濃縮が観察されなかったので、生物学的膜内の部位が限定的であり得ることを示唆する。しかし、これらの結果は、低い発現レベルを有する複合タンパク質に対して、この方法が最も有用であることを示している。
【００５３】
ウェスタンブロット法はタンパク質の局在性に関係なく全発現レベルの評価を提供するものであるから、モデル膜タンパク質の表面発現を評価するためにタンパク質特異的ＦＣＭを探求した。ウェスタンブロットで観察された濃縮レベルから、また機能的スクリーニング及び創薬に対する受容体表面発現の関与度から、ＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４を調べた。この目的を達成するために、抗ＣＸＣＲ２抗体であるＨＹ２９−１及びＸ２−７５３、並びに抗ＣＸＣＲ４抗体であるＭＥＤＩ３１８５を使用した。ＨＹ２９−１及びＸ２−７５３は、機能アッセイにおいて可変リガンド阻害を有する特徴的なＣＸＣＲ２エピトープを有する。「非タグ化」ＣＸＣＲ２を発現する、分取し、選択した混合集団に対してＨＹ２９−１及びＸ２−７５３を用いると、選択した混合集団に対する分取物について、それぞれ２．２５倍及び２．５３倍の発現の改善が観察された（図１３Ｂ）。次いで、ＭＥＤＩ３１８５を、ＣＸＣＲ４発現細胞のＦＣＭ分析に使用したが、この場合、ＭＥＤＩ３１８５は、強力な抗ＣＸＣＲ４アンタゴニスト抗体である。「非タグ化」ＣＸＣＲ４を発現する、分取し、選択した混合集団に対してＭＥＤＩ３１８５を使用すると、表面発現において約１０％の改善が観察された（図１３）。
【００５４】
ウェスタンブロット及びＦＣＭ分析によりそれぞれ測定したＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４の全発現濃縮及び表面発現濃縮について観察された差異からは、これらの濃縮物のオルガネラ位置の違いが強調される。例えば、全発現に対する濃縮物は、小胞体、ゴルジ装置、及び細胞膜を含む分泌経路の全ての生物学的な膜を占めると予想される。ＣＸＣＲ２については、全発現の７．６倍の濃縮が表面発現では約２．４倍の濃縮をもたらした。生物物理学的及び構造的なキャラクタリゼーションのための膜タンパク質の精製のようないくつかのアプリケーションでは、全発現濃縮は十分であり得るが；しかし、細胞ベースの創薬及び機能的アッセイのような他のアプリケーションでは、表面発現に対する濃縮が所望される。所望の発現表現型は、バルク分取の複数回の繰り返し、単一細胞分取、又は表面発現の検出に特異的な融合ストラテジーを使用することによって達成され得る。
【００５５】
クローン７対照細胞及びＣＭＰ含有細胞の０、２４、又は４８時間後誘導物の全細胞溶解物を、１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）及び１×完全プロテアーゼインヒビター（Ｒｏｃｈｅ）を含有する２００μＬのＰＢＳ中で１Ｅ７個の細胞を溶解し、続いて１×Ｓａｍｐｌｅ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中に再懸濁させ、５５℃で１０分間加熱することによって生成した。次いで、タンパク質を４〜１２％ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）によって分離し、ニトロセルロース膜（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｋｉｒｙａ  Ｓｈｍｏｎａ、Ｉｓｒａｅｌ）に移した。ＳＴＡＲＴＩＮＧＢＬＯＣＫ（商標）（ＰＢＳ）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｂｕｆｆｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、ＩＬ）によりブロットを１時間ブロックし、Ｒｈｏ  １Ｄ４（１：１０００、ａｂ５４１７、Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）、ＦＬＡＧ（登録商標）Ｍ２−ＨＲＰコンジュゲート（１：５０００、Ａ８５９２、Ｓｉｇｍａ、ＳｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）、ＧＦＰ（１：５０００、ａｂ６５５６、Ａｂｃａｍ）、又はチューブリン（１：５０００、ａｂ６１６０、Ａｂｃａｍ）に対する一次抗体を用いて４℃で終夜プローブした。ブロットを十分に洗浄し、適切なホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合二次抗体と共に室温で１時間インキュベートした。ＬｕｍｉＧＬＯ化学発光基質Ａ＋Ｂ（ＳｅｒａＣａｒｅ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ）を用いてシグナルを検出し、フィルム上に記録した。発現改善の定性的推定は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを用いたバンド強度の比較によって達成された。生データはチューブリン負荷対照に対して正規化した。ウェスタンブロット画像を、明るさ及びコントラストについて一様に修正した。
【００５６】
対照細胞及び０、２４、又は４８時間誘導後のＡＭＢ膜タンパク質発現細胞株の蛍光イメージングを、ＥＶＯＳ（商標）ＦＬ  Ａｕｔｏ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を用いて１０×又は２０×光学対物レンズによりデジタル的に捕捉した。複数の実験からの代表的画像を、明るさとコントラストについて一様に調整した。
【００５７】
誘導性方法の有用性を調べるために、均質で高効率のアンバーサプレッションが可能なクローン細胞株を作製した。メタノサルシナ・マゼイ（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ  ｍａｚｅｉ）由来のピロリシルｔＲＮＡシンセターゼ（ｐｙｌＲＳ）及びｔＲＮＡ（ＣＵＡ  ｐｙｌ）遺伝子を安定に発現するように、Ｊｕｍｐ−Ｉｎ  ＣＨＯＫ１細胞をトランスフェクトした。Ｊｕｍｐ−Ｉｎ  ＣＨＯＫ１細胞株は、以下の理由によりモデルシステムとして選択した：１）創薬のための高発現細胞プールを容易に生成すること、及び２）ＣＨＯ由来細胞株は効率的なアンバーサプレッションをサポートするという報告があること。融合タンパク質を妨げるアンバーコドンを含有するｍＣｈｅｒｒｙＡＭＢＧＦＰをコードする、レポータープラスミドの一時的なトランスフェクションによって、選択した細胞のアンバーサプレッション能を評価した。したがって、この構築物は、ｍＣｈｅｒｒｙ−ＧＦＰ融合体の構成的発現を可能にする。細胞集団内のアンバーサプレッションの効率は、融合タンパク質（ｍＣｈｅｒｒｙ＋／ＧＦＰ＋）を発現する細胞のパーセンテージによって測定することができる。このレポーターを用いた場合、不均一集団内では、効率的なアンバーサプレッションはまれであり、この場合、非天然アミノ酸Ｎ６−（（２−アジドエトキシ）カルボニル）−Ｌ−リシン（リシンアジド）を補充した培地に応答して、約２％のみの細胞が効率的なアンバーサプレッションを示した（図９Ａ）。所望の表現型（ｍＣｈｅｒｒｙ及びＧＦＰ陽性の上位２％）を示す細胞を、単一細胞分取によって単離し、増殖させた。単離されたクローンのうちの１つ（クローン７）は、このクローンがリシンアジドを補充した培地で高いアンバーサプレッション活性（４３％）を示し、リシンアジドの非存在下で低いバックグラウンドサプレッション（２．５％）を示したので、さらなるキャラクタリゼーションのためにこれを選択した（図９Ｂ）。
【００５８】
この方法が膜貫通タンパク質の発現に適用できるかどうかを評価するために、下記の膜貫通ドメインの複雑性、Ｎ末端及びＣ末端の配向性、生理学的機能、及び発現レベルが異なるモデル膜タンパク質をコードするレンチウイルスを上記のクローン７に形質導入した（表１）。
【００５９】
【表１】
2021536263.tif 000003
【００６０】
【表２】
2021536263.tif 000004
【００６１】
エフリンＡ型受容体２（ＥｐｈＡ２）、クローディン１、Ｃ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体２（ＣＸＣＲ２）及びＣ−Ｘ−Ｃケモカイン受容体４（ＣＸＣＲ４）は、ＦＬＡＧ及びＲｈｏ  １Ｄ４エピトープを有する増強緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を有する、アンバーサプレッション依存性及びリードスルーの融合タンパク質として発現した（図１０）。発現の比較分析を可能にするために、アンバー終止コドンの前にＲｈｏ  １Ｄ４エピトープを含有するよう、天然の膜タンパク質配列をさらに改変した。「切り替え可能な」発現について、この誘導性の概念を評価するために、ｎｎＡＡ誘導後にウェスタンブロット（図１１）及び蛍光顕微鏡（図１３Ａ）によって、モデル膜タンパク質を発現する細胞を分析した。アンバーサプレッションは、試験した全てのタンパク質で厳密に制御された。タグ化タンパク質は、細胞培養培地にリシンアジドを補充した場合にのみ検出された。さらに、ＥｐｈＡ２とクローディン１はこのシステムでよく発現したが、ＣＸＣＲ２とＣＸＣＲ４はあまり発現しなかったことから、発現が全てのタンパク質にとって重大な障害となり得ないことが示唆された。タグ化ＥｐｈＡ２、ＣＸＣＲ２、及びＣＸＣＲ４は細胞膜において十分に分布した局在性を示したが、タグ化クローディン１は、密着結合形成の際の役割と一致して、細胞間に特異的局在性を示した（図１３Ｂ）。試験した全てのモデルタンパク質で、膜タンパク質のタグ化変異体を発現する細胞は、対応するリードスルー変異体と類似の細胞分布を示した。
【００６２】
この方法が、モデル膜タンパク質の「切り替え可能な」発現を制御するために使用できることを確認したので、本発明者らは、次に、ＦＡＣＳによる細胞株のタグベースの濃縮がタンパク質特異的抗体法の代替として使用し得るかどうかを調べた。誘導の４８時間後、モデル膜タンパク質を発現するＧＦＰ陽性細胞の上位１０％を分取し、増殖させた。改善されたレベルの「非タグ化」膜タンパク質を発現する細胞集団の濃縮を、ウェスタンブロット及び細胞表面ＦＣＭによって評価した。図１２Ａに示すように、分取したＥｐｈＡ２、クローディン１、ＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４細胞株は、ウェスタンブロットの測定によれば、予備分取した集団よりも全発現において約２００〜８００％の改善を示した。しかし、この全発現の改善は、同時に起こる細胞表面発現の増加を必ずしも反映しているわけでない。表面発現レベルの特異的改善を決定するために、モデル膜タンパク質の各々に特異的な参照抗体を用いて細胞を標識し、ＦＣＭによって蛍光レベルを定量した。興味深いことに、発現制限Ｇタンパク質結合受容体ＣＸＣＲ２は、予備分取集団に対して表面染色で約２．５倍の増加を示した。対照的に、分取したＥｐｈＡ２、クローディン１及びＣＸＣＲ４細胞の表面発現は１０〜２０％とわずかに改善されただけであり（図１２Ｂ〜Ｅ）、このことは、これらのタンパク質はこれらの細胞において既に、それらの最大又はそれに近い表面発現レベルにあることを示唆している。最後に、濃縮細胞株受容体の構造的完全性を、それら受容体が天然リガンドに結合する能力によって試験した。本発明者らは、ＧＰＣＲの折り畳みが複雑であることから、これらの努力をＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４に焦点を当てた［４０］。ビオチン化インターロイキン８（ＩＬ−８）又は間質細胞由来因子−１α（ＳＤＦ−１α）リガンドを有するストレプトアビジン複合体を、それぞれ「非タグ化」ＣＸＣＲ２又はＣＸＣＲ４を発現する親細胞株及び分取細胞株に曝露し、ＦＣＭによってリガンド結合を評価した。親細胞におけるＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４の低レベルの内因性発現にもかかわらず、高発現ＣＸＣＲ２及びＣＸＣＲ４細胞株は特異的染色を示し、受容体が適切に折り畳まれたことを示した（図１２Ｆ及びＧ）。まとめると、これらの結果はこの方法をプラットフォームとして立証しており、低い開始発現レベルを有する膜タンパク質を発現する細胞株の濃縮及び選択に特に有益であり得ることを示している。
【００６３】
実施例２−抗体発現
ＥｐｈＡ２に向けられるＩｇＧの重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）をコードする遺伝子を、ベクターｐＣＬＤのＵＣＯＥエレメント近傍のＣＭＶプロモーターの制御下に置いた（ＩｇＧ対照）。膜関連ＩｇＧは、ＤＡＦ−７（ＩｇＧ−ＤＡＦ−ｎｏＡｍｂｅｒ）のグリコシルホスファチジルイノシトール膜アンカー配列に融合したＨＣを発現させて作製した（ＩｇＧ−ＤＡＦ−ｎｏＡｍｂｅｒ）。ＨＣ−ＤＡＦ−７接合部では、アンバーコドンがフレーム内にコードされ、（ＩｇＧ−ＤＡＦ−Ａｍｂｅｒ）が作製された。
【００６４】
ｐＭＯＡＶ２ベクターは、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターの制御下にある、ＣＭＶ−ｐｙｌＲＳ発現カセット及びｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の１８のタンデム反復を含有する、ｐＳＥＬＥＣＴ−Ｊｕｍｐ−Ｉｎ（Ｔｈｅｒｍｏ）ベクターに基づくものであった。ｐＣＬＤ−ｐｕｒｏ−ｐｙｌＲＳ−ｔＲＮＡベクターは、Ｕ６  ｓｎＲＮＡプロモーターの制御下にある、ピューロマイシン耐性マーカー、ＣＭＶ−ｐｙｌＲＳ発現カセット及びｔＲＮＡｐｙｌ遺伝子の１８のタンデム反復を含有するｐＣＬＤベクターに基づくものであった。ｐＲＦＰ−ＧＦＰａｍｂベクターは、ＲＦＰとＧＦＰとのフルオロフォア間にアンバーコドンを含有するＲＦＰ−ＧＦＰ融合体をコードするレポーター構築物であった。
【００６５】
ｎｎＡＡの取り込みが可能な宿主細胞の作製方法は、公知であり、記載されている。要するに、ＣＨＯ細胞には、ｐＭＯＡＶ２又はｐＣＬＤ−ｐｕｒｏ−ｐｙｌＲＳ−ｔＲＮＡによるトランスフェクトがなされ、ヒグロマイシン又はピューロマイシン（６．５μｇ／ｍｌ）含有培地中での増殖物に対する選択段階が供された。生存体をｐＲＦＰ−ＧＦＰａｍｂでトランスフェクトし、２ｍＭのｎｎＡＡの存在下で１６〜２４時間増殖させた。最良のＲＦＰを示す分離株：ＧＦＰ比（Ｃ１３〜４３）をさらなる分析のために選択した。
【００６６】
或いは、Ｉ−２１宿主を作製するために、ＧＦＰ−ＲＦＰ＋細胞のプールを分取した。標的ＩｇＧにｎｎＡＡを組み込む能力について候補の宿主をさらに評価し、力価を測定した。最良の候補Ｃ１３〜４３及びＩ−２１を同定した。
【００６７】
ｍＡｂのアンバーサプレッション誘導表面ディスプレイを試験するために、１Ｃ１−ＤＡＦを発現する１×１０７トランスフェクト細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、リシンアジドを含有する１０ｍｌの新鮮な培養培地に再懸濁させ、３７℃、１２０ｒｐｍで２時間又は４時間振盪しながらインキュベートした。リシンアジド処理後、１×１０個６個の細胞を３００ｇで５分間遠心分離し、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ中の２％ウシ胎児血清）で洗浄し、ＦＩＴＣ結合γ鎖抗体及びＡＰＣ結合カッパ軽鎖抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で１５分間室温で染色した。表面染色した細胞をＦＡＣＳ緩衝液で２回洗浄し、ＬＳＲＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）によるフローサイトメトリー分析のためにＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させた。異なる濃度のリシンアジドを試験して、最適濃度を決定した。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ，Ｉｎｃ．、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を用いて行った。
【００６８】
１２５ｍｌ振盪フラスコ中の３０ｍｌの社内培養培地中に、３×１０５細胞／ｍｌで細胞を播き、軌道振盪プラットフォームインキュベーターにより、３７℃、６％ＣＯ２及び１２０ｒｐｍで増殖させた。ＶｉＣｅｌｌ自動細胞カウンター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ、Ｂｒｅａ、ＣＡ）を用いて生存細胞密度及び生存率を測定した後、細胞を週２回継代した。
【００６９】
ＢＤ  Ｉｎｆｌｕｘセルソーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、ｍＡｂ表面ディスプレイに基づくバルク及び単一細胞分取を行った。簡単に述べると、細胞をリシンアジドで２又は４時間処理し、その後、バルク及び単一細胞分取のために、それぞれ２０×１０６個及び１×１０６個の細胞を遠心分離によって回収した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ、０．５％組換えヒト血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ、ｔＬｏｕｉｓ、ＭＯ）、５ｍＭ  ＥＤＴＡ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）及び２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）を含有する分取緩衝液を用いてＦＩＴＣ結合γ鎖抗体で染色した。バルク分取のために、染色した細胞を２回洗浄し、１×１０７細胞／ｍｌの濃度にまで分取緩衝液中に再懸濁させ、２．５×１０５個の表面を染色してゲートした（高又は低ＦＩＴＣ蛍光強度に基づく）細胞を、培養培地を含有する５ｍｌの回収チューブに入れた。分取した細胞を遠心分離し、２．５ｍｌの新鮮な培養培地に再懸濁させ、６ウェルプレートに播いた。単一細胞分取のために、染色した細胞を洗浄し、１×１０６細胞／ｍｌの濃度まで分取緩衝液に再懸濁させ、馴化培地を含有する３８４ウェルプレートのウェル当たり１個の細胞を入れた。
【００７０】
バルク及び単一分取した細胞を増殖、繁殖させ、最後に抗体産生のために流加培養培地に播種した。培養物に通常のフェードを１２〜１４日間与え、その後、Ｏｃｔｅｔ  ＱＫ３８４のＰｒｏｔｅｉｎ  Ａバイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を用いて細胞培養上清中の抗体力価を決定した。
【００７１】
切り替え可能なＩｇＧ膜アンカーが細胞表面に効果的にディスプレイされ、可視化され得るかどうかを確立するために、アンバーサプレッション宿主細胞Ｉ−２１を、ＩｇＧ発現プラスミドで一時的にトランスフェクトし、安定なプールを作成した。対照ＩｇＧ、ＨＣ−グリコシルホスファチジルイノシトール膜アンカー（ＧＰＩ−アンカー）を含有するＩｇＧ、又はＧＰＩカセットの前で且つＧＰＩカセットとインフレームの、アンバー終止コドンも含有するＨＣ−ＧＰＩアンカーを含有するＩｇＧのいずれかをコードする３つの異なる構築物がこれらの細胞中で発現した。別々の膜染色が観察可能であるかどうかを評価するために、一時的にトランスフェクトしたＩ−２１細胞をリシンアジドで１２時間処理し、膜結合ＬＣ及びＨＣについて免疫染色し、フローサイトメトリーによって分析した。目的の細胞はＩｇＧ−ＤＡＦ−Ａｍｂｅｒでトランスフェクトし、ＩｇＧ−対照及びＩｇＧ−ＤＡＦ−ｎｏＡｍｂｅｒでトランスフェクトした細胞は、それぞれ陰性及び陽性対照として用いた。フローサイトメトリー分析では、陰性対照細胞（ＩｇＧ−対照）では表面ディスプレイはなく、陽性対照細胞（ＩｇＧ−ＤＡＦ−ｎｏＡｍｂｅｒ）では、リシンアジンアジドの存在及び非存在の両方において５０％以上のＬＣ＋ＨＣ＋の集団が、そしてリシンアジドの存在下では４２％のＩｇＧ−ＤＡＦ−Ａｍｂｅｒを有する二重陽性細胞が表面ディスプレイを示すことが明らかになった。重要なことに、ｎｎＡＡの非存在下では、この構築物の表面染色はＩｇＧ対照試料と類似であり、細胞表面にＩｇＧの有意な蓄積がないことが示された。これらの結果は、細胞表面におけるＩｇＧ−ＧＰＩの明確で識別可能な蓄積を示している（図３）。
【００７２】
このディスプレイが安定なプールに適用可能であるかどうかを決定するために、ＩｇＧ−ＤＡＦ−アンバー構築物でトランスフェクトされたＩ−２１及びＣ１３〜４３プラットフォーム細胞の安定なプールにおいて表面結合を分析した。１２時間のリシンアジド処理及び免疫染色後、ＬＣ＋ＨＣ＋の二重陽性集団の存在から明らかなように、Ｉ−２１及びＣ１３〜４３の両安定プールにおいてＩｇＧの顕著な表面ディスプレイが観察された。ＩｇＧ−ＤＡＦ融合物の明確なディスプレイが、安定な細胞において観察された。種々の、ｎｎＡＡ濃度及び処理時間を調べて、細胞膜の飽和を伴わない最短時間におけるアンバーサプレッションの最適効率に対するｎｎＡＡの時間及び濃度の効果を決定した。ＩｇＧ−ＤＡＦ−アンバー構築物について表面ディスプレイの最良の条件を決定するために、２ｍＭのｎｎＡＡ、０．５ｍＭのｎｎＡＡで２４時間又は０．１ｍＭのｎｎＡＡで１２時間のいずれかにより活性化した細胞集団から、高表面ディスプレイゲートから分取した細胞を回収した。本発明者らの結果は、０．１ｍＭのｎｎＡＡ下で１２時間活性化した細胞で、ＭＦＩに対する力価の相関が改善されたことを示しており、この方法によって低及び高産生体を効果的に識別するためには、このシステムの最適な活性化が必要であることを示している（図４）。さらに、これらの条件の最適化には、各標的がそれらの相対発現レベルに一致することが必要となり得る。この標的を用いたさらなる最適化により、２〜４時間の５〜２５μＭリシンアジド処理が、ｍＡｂの検出可能な細胞表面結合を誘導するのに十分であることを決定した。
【００７３】
膜結合ＩｇＧの発現が分泌ＩｇＧ力価と相関するかどうかを評価するために、ＩｇＧ−ＤＡＦを発現するＩ−２１及びＣ１３〜４３の安定プールをリシンアジドで処理し、フローサイトメトリーによって検出された膜結合ＩｇＧの高及び低発現レベルに基づいて２つの集団に分取した。分取した細胞を継代し、振盪フラスコ中での流加培養の１１日後に、それらの産生性を測定した。高レベルの表面ディスプレイを示すことで選択された細胞は、低レベルの表面ディスプレイを示すことで選択された細胞又は非選択集団よりも改善された発現レベルを示した。高及び低表面ディスプレイからの力価は、Ｉ−２１プールでは２．４及び１．２ｇ／Ｌ（図５）、Ｃ１３〜４３プールでは３．４及び１．５ｇ／Ｌ（図６）をそれぞれ有し、アンバーサプレッション依存性表面ディスプレイが培地中の分泌ＩｇＧに比例することを示唆している。さらに、ＦＡＣＳ濃縮は、非濃縮細胞と比較して、２倍の産生性の増加をもたらした。
【００７４】
産生性と表面ディスプレイとの間の相関をさらに調べるために、Ｃ１３〜４３プールを、高、中及び低表面ディスプレイに基づいて分取し、分取後の細胞を、流加培養並びに表面結合の分析のために増殖させた。力価の値を膜結合ＩｇＧの蛍光強度に対してプロットすると、相関係数が０．９００５と有意な相関が観察され（図６）、ｎｎＡＡ誘導表面ディスプレイは細胞産生性の代表として使用できることが示された。
【００７５】
Ｃ１３〜４３−ＩｇＧ−ＤＡＦ安定プールのリシンアジド処理及び表面染色後、膜結合ＩｇＧ−ＨＣの低（下位５％）、中（中位５％）及び高（上位３％）蛍光強度に基づき、３８４ウェルプレートの各ウェルに単一の細胞を入れた。無処理の細胞を染色せずにクローニングした。合計２８３クローン（上位７７、中位５０、下位８４及び無処理７２）を流加培養でスクリーニングし、産生性を分析した。上部ディスプレイゲート領域から得られたクローンは、下部の表面ディスプレイクローンと比較して、有意に高い産生性を有した。さらに、上位クローンの平均産生性は、非濃縮クローンよりも高かった。
【００７６】
クローン細胞の分泌抗体と膜結合抗体との相関を決定するために、種々の力価レベルを有する高、中及び低表面ディスプレイ群の各々からの３３個のクローンを、さらなる分析のために選択した（図７）。個々のクローン細胞をリシンアジドで処理し、軽鎖及び重鎖の表面結合のために染色し、フローサイトメトリーによって分析した。クローンの力価は、膜結合重鎖抗体のメジアン蛍光強度（ＭＦＩ）に対してプロットすると、正の相関（Ｒ２＝０．７６１１）を示し、それによって、この方法の効率が強化され、この戦略は、バイオマニュファクチャリングプロセスにおける高産生細胞の高スループットスクリーニングのための有効なツールを提供することが示された。
【００７７】
実施例３−タンパク質発現の発現は困難
複合組換え分子は、次世代の治療薬として出現しつつある。これらの高度に操作されたタンパク質には、二重特異性抗体（例えば、ＢｉＴＥＳ、ＤＡＲＴＳ、及びＩｇＧ−ｓｃＦｖｓ）と、疾患治療のための機能を強化した重要な新薬を代表する融合タンパク質が含まれる。しかし、これらの分子は、発現力価が低く、比産生性が低いため、「発現が困難」と言われることが多い。このボトルネックに対処するために、発明者らは、発現が困難な標的の高産生細胞を単離するための表面ディスプレイ法の使用を調べた。これを行うために、可逆的ＧＰＩ膜アンカーを有し、所有権がある二重特異性抗体（ＭＥＤＩ−Ｘ）をコードする、プラスミドで安定にＣ１３〜３４細胞をトランスフェクトした。ＩｇＧ−ｓｃＦｖ融合タンパク質であるＭＥＤＩ−Ｘが選択された一部の理由は、１ｇ／Ｌの収率が得られる細胞株の単離をもたらす広範な従来型スクリーニングが最近実施されたからである。トランスフェクトされた細胞を、表面ディスプレイに供し、また高表面染色及び低表面染色ゲートの両方からの選択に供し、この方法が以前に観察された収率を改善し得るかどうかを決定した。表面ディスプレイ条件の最適化から、この低発現分子の表面ディスプレイを実証するには、１ｍＭリシンアジド及び４時間の活性化で十分であることが分かった。この条件をクローンの選択及び分取に使用した。表面ディスプレイなしで分取した対照集団を、並行して生成した（非濃縮）。９６ディープウェルプレート中、流加培養によって回収したクローンを増殖させ、それらの産生性を決定した（図８Ａ）。非濃縮集団からの上位のクローンは、以前の取り組みと一致する約８００ｍｇ／Ｌの力価を達成した。しかし、表面ディスプレイでは、上位の発現体力価の有意な改善（１．８ｇ／Ｌまで）だけでなく、８００ｍｇ／Ｌを超える力価を有する１８個のさらなるクローン（収率が１ｇ／Ｌを超える５個のクローンを含む）も見られた（図８Ｂ）。これらのデータは、高発現体クローンの濃縮及び選択にこの方法が有用であることを示している（図８）。
【図１】
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【図２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ−１】
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【図４Ｂ−２】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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