(57)【要約】本発明は、より好都合な処置アウトカムを経験する可能性が高い患者を同定し、かつ処置するために、免疫系パラメータを評価する方法を提供する。本発明は、患者における特定の種類の処置指標についてのレベルおよび/または量の少なくとも1つの値または測定値を得、該値または測定値がその値または測定値についての処置閾値を超えているまたはそれ未満であることを確認し、かつ患者へ樹状細胞治療を施すことによる、ヒト患者を樹状細胞治療によって処置するための方法も提供する。2021502419.tif 000003
2021502419.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程を含む、癌患者を樹状細胞ワクチンによって処置するための方法：
（a）患者の血中の単位体積当たりのTregの数を得る工程；
（b）該数が、単位体積当たりのTregの処置閾値を超えていることを確認する工程；および
（c）樹状細胞ワクチンを該患者へ投与する工程。
【請求項２】
前記樹状細胞ワクチンが、抗原を負荷されたPME-CD40L成熟DCを含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記DCが、前記抗原をコードするRNAによるトランスフェクションによって前記抗原を負荷されている、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記RNAが前記患者の癌細胞から調製されている、請求項3記載の方法。
【請求項５】
前記Treg細胞が、CD4+、CD25+、およびFoxP3+またはCD127-の一方として同定される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
前記Treg細胞が、CD4+、CD25+、FoxP3+、およびCD127-として同定される、請求項1記載の方法。
【請求項７】
前記閾値が、500個のTreg/100マイクロリットル全血または同等の測定値を超える、請求項1記載の方法。
【請求項８】
前記閾値が、650個のTreg/100マイクロリットル全血または同等の測定値を超える、請求項1記載の方法。
【請求項９】
少なくとも650個のTreg/100マイクロリットル全血の全血Treg数を有する患者において使用するための、腎細胞癌の処置のための樹状細胞ワクチン。
【請求項１０】
以下の工程を含む、患者において処置によって免疫応答が誘導されたか否かを判定する方法：
（a）ベースライン読み取り値を確立するために、患者の血液試料中に存在するTreg細胞および/またはTreg/eff細胞の個数を定量化する工程；
（b）処置後読み取り値を確立するために、該患者へ処置を施した後、該患者の血液試料中に存在するTreg細胞および/またはTreg/eff細胞の個数を定量化する工程；
（c）該患者の血液試料中に存在するTreg細胞および/またはTreg/eff細胞の頻度または量が増加したか否かを判定するために、該ベースライン読み取り値と該処置後読み取り値とを比較する工程であって、
Treg細胞の頻度もしくは量の顕著な減少および/またはTreg/eff細胞の頻度もしくは量の顕著な増加が、該患者において免疫応答が誘導されたことを示す、
工程。
【請求項１１】
前記処置が、インビトロで調製された自己成熟DCを前記患者へ投与することを含む、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
以下の工程を含む、患者へ樹状細胞治療を施すための方法：
（a）（i）血漿リンパ球値；
（ii）CD8+CD28+および/もしくはCD8+CD28+PD-1+である細胞ならびに/またはIFNγを分泌するCD8+CD28+PD-1+細胞の数；
（iii）TregであるCD4+細胞のパーセント；
（iv）血小板数；
（v）C反応性タンパク質値；
（vi）リンパ球/単球比；
（vii）単球数（Elutra前）；ならびに
（viii）単球/白血球比
からなるリストより選択される1種または複数種の処置指標についての測定値または値を得る工程；
（b）該測定値または値が、適宜、処置閾値より高いまたは低いことを確認する工程；ならびに
（c）樹状細胞ワクチンを該患者へ投与する工程。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、樹状細胞の治療的使用、および樹状細胞治療による処置の有効性の見込みについての患者の評価に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景
患者において免疫応答を開始させるための細胞治療は、修飾型抗原提示細胞（APC）または免疫エフェクター細胞を利用する。抗原提示細胞は、免疫応答を開始させるので、具体的には、Tリンパ球からの一次免疫応答を誘導することができるので、細胞治療に重要である。
【０００３】
樹状細胞（DC）は、適応免疫に関与する最も強力なAPCである。それらは、ナイーブT細胞およびB細胞による免疫応答の開始を協調させ、抗原特異的な細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答を誘導する。DCは、インビボでヘルパーT細胞およびキラーT細胞をプライミングするように、いくつかの方法で特殊化されている。例えば、末梢組織に存在する未熟DCは、抗原を捕獲し、免疫原性のMHC-ペプチド複合体を生成することができるよう装備されている。未熟DCは、炎症性サイトカインのような成熟誘導刺激に応答して接着分子および共刺激分子をアップレギュレートすることによって、強力なT細胞刺激要因へ発達し、二次リンパ器官へ遊走して、稀な抗原特異的T細胞を選択し刺激する。応答性T細胞のエフェクター機能を指図する共刺激分子に加えて、細胞表面上のMHC/ペプチド複合体の利用可能性を増加させる過程であるDC成熟の後にのみ、T細胞の強力な刺激が起こる。
【０００４】
T細胞が、クローン増大を誘導するために十分なサイトカインレベルを産生するためには、典型的には、共刺激が必要である。樹状細胞を強力な抗原提示細胞にしている一つの特徴は、Tリンパ球上の分子CD28を活性化する、分子CD80およびCD86のような免疫応答の共刺激分子が豊富である点である。その代わりに、Tヘルパー細胞は、DC上のCD40に結合するCD40L（CD40リガンド）を発現している。DCとT細胞との間のこれらの相互作用は、DCの成熟およびT細胞におけるエフェクター機能の発達をもたらす。分子CD54または分子CD11a/CD18のような接着分子の発現は、DCとT細胞との間の協調を容易にする。DCのもう一つの特別な特徴は、分化の段階に依って異なる機能を備えていることである。例えば、未熟樹状細胞の2種の主な機能は、抗原の捕獲および抗原の変換であるが、T細胞を刺激するために抗原を提示する能力は、樹状細胞が組織およびリンパ系へ遊走し、成熟すると、増加する。従って、未熟樹状細胞から成熟樹状細胞への移行は、免疫応答の開始における基本的な段階である。
【０００５】
いくつかの報告において、成熟過程における細胞上の表面マーカーの変化をモニタリングすることによって、DC成熟が追跡された。DCの異なる成熟段階に特徴的な、より重要な細胞表面マーカーのうちのいくつかには、造血幹細胞についてのCD34+；単球についてのCD14++、DR+、CD86+、CD16+/-、CD54+、およびCD40+；未熟樹状細胞についてのCD14+/-、CD16-、CD80+/-、CD83-、CD86+、CD1a+、CD54+、DQ+、およびDR++；ならびに成熟樹状細胞についてのCD14-、CD83++、CD86++、CD80++、DR+++、DQ++、CD40++、CD54++、およびCD1a+/-が含まれ、ここで、「+」は陽性発現を示し、「++」はより高度の発現を示し、「+/-」はより弱いまたはより低い発現を示し、「-」は極めて弱い、低い、または検出不可能な発現を示す。表面マーカーおよびその他の遺伝子の発現は、当技術分野において公知であるように、細胞の成熟過程に依って変動し、発現を測定する方法によっても変動し得る（例えば、Hasan et al.(2015)Clin.Immunol.157:261-76（非特許文献1）を参照すること）。
【０００６】
免疫治療のためには、成熟DCは、現在、未熟DCより好ましい。完全成熟DCの子孫のみが、GM-CSF受容体（GM-CSF-R）を欠いており、安定的に成熟を維持するのは、GM-CSFを除去した時および/またはGM-CSFの非存在下である。成熟DCは、インビトロおよびインビボでのT細胞応答の誘導において優れていることも示されており、インビトロまたはインビボで、抗原を取り込み、Tリンパ球へ提示することができる。修飾型抗原提示DCおよび/またはこれらの修飾型DCから教育されたT細胞は、診断、治療、予防接種、研究、スクリーニング、および遺伝子送達を含む多くの適用を有する。
【０００７】
成熟樹状細胞の末梢血からの単離は、このカテゴリに属するのが白血球のうちのl％未満であるため、困難であり、成熟DCを組織から抽出することも困難である。この困難さは、別の起源を使用して成熟樹状細胞を発生させる新たな方法の研究および開発を進展させた。未熟樹状細胞から成熟DCを作製する数種の方法が報告されており、異なる方法は異なる特性を有する成熟DCを作製し得ることが示されている。
【０００８】
PME-CD40L DCは、表現型的にはCD83+およびCCR7+でもある成熟DCである。PME-CD40L DCは、例えば、以下の連続的な工程を含む方法によって作製され得る：（a）CD83+成熟樹状細胞を作製するために、およそ12〜30時間、TNFαRアゴニストおよびPGE2の存在下で、インターフェロンγ受容体（IFNγR）アゴニストと共に、単離された未熟樹状細胞（iDC）を培養する工程；ならびに（b）一過性のCD40シグナルを作製するために、該CD83+成熟樹状細胞（mDC）にCD40アゴニストをトランスフェクトする工程。CD40アゴニストは、CD40LポリペプチドをコードするmRNAとして提供され得；いくつかの場合において、このmRNAは、WO2007117682（特許文献1）のSEQ ID NO:2のアミノ酸残基21〜261からなるCD40Lポリペプチドをコードする。PME-CD40L DCを作製するために、CD40LポリペプチドをコードするmRNAを、抗原をコードするmRNAとともにコトランスフェクトしてもよい。
【０００９】
PME-CD40L DCの作製のより詳細な方法には、WO2006042177（Healeyら）（特許文献2）；WO2007117682（Tcherepanovaら）（特許文献1）；DeBenedette et al.(2008)J.Immunol.181:5296-5305（非特許文献2）；およびCalderhead et al.(2008)J.Immunother.31:731-41（非特許文献3）に開示されたものが含まれる。得られた「PME-CD40L」DCは、癌または免疫疾患もしくは免疫障害を有するヒト患者を処置するために使用され得、有利なT細胞のインビボまたはインビトロでの作製を刺激するためにも使用され得る。
【００１０】
PME-CD40L DCは、WO2015/127190（DeBenedetteら）（特許文献3）および対応する米国特許出願公開第20170065690号（DeBenedetteら）（特許文献4）に記載されたように、インビボおよびインビトロの両方での「幹細胞メモリ」T細胞（「TSCM細胞」）の作製の刺激を含む、有利な特性を有する。TSCM細胞は、多能性である幹細胞メモリT細胞であり、子孫細胞を生じることもでき、それらの子孫細胞自体もTSCM細胞である。PME-CD40L DCへの曝露によるTSCM細胞の作製は、エイズまたはHIV感染を含む免疫疾患または免疫障害を有するヒト患者においてインビボで起こり得、PME-CD40L DCがリンパ球と共培養された時、インビトロでも起こり得る。PME-CD40L DCは、長期の抗原特異的CTLエフェクター機能を支持し、急速増大高アビディティ（Rapidly Expanding High-Avidity）（「REHA」）細胞と名付けられた1種のエフェクターメモリCTLを誘導することも示されている（DeBenedette et al.(2008)J.Immunol.181:5296-5305（非特許文献2）を参照すること）。次いで、これらのTSCM細胞および/またはREHA細胞は、それらが由来した患者の免疫応答の刺激を補助するため（即ち、自己処置）、または養子移入治療において他の患者を処置するため（即ち、異種処置）、患者へ再導入され得る。
【００１１】
「AGS-003」または「Rocapuldencel-T」と名付けられた腎細胞癌のためのArgos Therapeutic,Inc.の（「Argos」）PME-CD40L DC治療の第3相臨床試験は、2013年1月に開始され、現在進行中である。この「ADAPT」治験は、標準治療（「SOC」）と組み合わせてRocapuldencel-Tを受容した、新たに診断された転移性腎細胞癌（「mRCC」）を有する患者における全生存期間（「OS」）を、SOC単独と比較して評価するために設計された。2017年2月に、独立データモニタリング委員会（「IDMC」）によって中間分析が実施され、ハザード比が、1.10であり、0.98という最終中間分析のための予め定義された無益性境界より大きいことが見出された。従って、IDMCは、無益であるとして、研究の中止を推奨した。Argosは、研究からの利用可能データの拡張的な分析を実施し、FDAとの協議の後、臨床試験を継続することを決断した（2017年4月18日付、Argos Press Release（非特許文献4）を参照すること）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１２】
【特許文献１】WO2007117682
【特許文献２】WO2006042177
【特許文献３】WO2015/127190
【特許文献４】米国特許出願公開第20170065690号
【非特許文献】
【００１３】
【非特許文献１】Hasan et al.(2015)Clin.Immunol.157:261-76
【非特許文献２】DeBenedette et al.(2008)J.Immunol.181:5296-5305
【非特許文献３】Calderhead et al.(2008)J.Immunother.31:731-41
【非特許文献４】2017年4月18日付、Argos Press Release
【発明の概要】
【００１４】
驚くべきことに、本発明者らは、ある種の免疫系特性を有する患者は、樹状細胞治療から好都合な処置アウトカムを経験する可能性がより高いことを発見した。本発明は、より好都合な処置アウトカムを経験する可能性が高い患者の同定および処置を補助するために使用するための、例えば、制御性T細胞（「Treg」）の数のような免疫系パラメータを評価する方法を提供する。
【００１５】
例えば、高レベルのTreg細胞を有する患者は、樹状細胞治療から利益を得る可能性が高い。有効な樹状細胞治療によるこれらの患者の処置は、該患者において、免疫応答を生成し、その一部は、Treg細胞の個数および/またはレベルの減少である。そのような患者は、より低レベルのTreg細胞を有する他の患者より、樹状細胞治療から利益を得ることができる。
【００１６】
いくつかの態様において、患者を処置するために使用される樹状細胞治療は、抗原を負荷されたPME-CD40L成熟DCを含む。いくつかの態様において、DCは、抗原をコードするRNAによるトランスフェクションによって、抗原を負荷される。いくつかの態様において、抗原をコードするRNAは、患者の癌細胞から調製される（即ち、抗原は患者に対して「自己」である）。
【００１７】
従って、本発明は、例えば、患者における免疫細胞および/または血清化学マーカーのような特定の種類の処置指標についてのレベルおよび/または量の少なくとも1つの値または測定値を得る工程；該値または測定値が、適宜、その値または測定値についての処置閾値を超えているまたはそれ未満であることを確認する工程；ならびに患者へ樹状細胞治療を施す工程を含む、ヒト患者を樹状細胞治療によって処置するための方法を提供する。本発明は、特定の種類の処置指標についてのレベルおよび/または量の少なくとも1つの値または測定値を得る工程；該値または測定値が、適宜、その値または測定値についての処置閾値を超えているまたはそれ未満であることを確認する工程；ならびに患者へ樹状細胞治療を施す工程を含む、患者へ樹状細胞治療を施すための方法も提供する。いくつかの態様において、本法は、2つ、3つ、または4つの値または測定値を得る工程、処置閾値が各々について満たされていることを確認する工程、および患者へ樹状細胞治療を施す工程を含む。
【００１８】
いくつかの態様において、本発明は、患者の血中の単位体積当たりのTregの数を得る工程；該数がTregの処置閾値を超えていることを確認する工程；および樹状細胞ワクチンを患者へ投与する工程を含む、ヒト患者を樹状細胞治療によって処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、処置閾値は、少なくとも500個のTreg/100マイクロリットル患者全血、または少なくとも550、600、650、700、750、800、850、もしくは900個のTreg/100マイクロリットル患者全血の、単位体積当たりのTregである。いくつかの態様において、方法は、Treg細胞であるCD4+細胞のパーセンテージを決定する工程を含み、処置閾値は、少なくとも1％、1.5％、1.75％、もしくは2％、またはそれ以上である。
【００１９】
いくつかの態様において、Tregの処置閾値は、癌または免疫疾患もしくは免疫障害のような疾患または障害のための治療的処置および/または薬学的処置の前に、患者において測定される（本明細書中で「ベースライン」と呼ばれる）。いくつかの態様において、患者におけるTregの処置閾値は、疾患または障害のための1回または複数回の治療的処置および/または薬学的処置の後に測定される。
【００２０】
いくつかの態様において、樹状細胞治療による患者の処置は、例えば、患者の血中の単位体積当たりのTregの個数の低下によって測定されるように、免疫応答を刺激する。本発明は、処置後の患者における免疫応答の刺激を評価する方法、例えば、以下にさらに記載されるように、Treg/eff細胞のような細胞集団の増加を検出する方法も提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】全血中の制御性T細胞（「Treg」）を同定するためのマルチカラーフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す。左のパネルは、FoxP3（y軸）およびCD4（x軸）の発現によってゲーティングしたCD3+ T細胞を示す。FoxP3+およびCD4+（左のパネル、右上の四半分）として同定された細胞を、右のパネルに示されるように、CD127（y軸）およびCD25（x軸）の発現についてさらにゲーティングし、従って、FoxP3+/CD4+/CD25+/CD127- Treg細胞が、右のパネルの右下の四半分において定量化される。制御性T細胞の個数は、Trucountビーズチューブ（BD Biosciences）を使用して決定される。左およびパネルの各コーナーに示された数字は、内側の線によって画定されたその四半分内の細胞のパーセンテージを示す。右のパネルは、左のパネルにおいてFoxP3+およびCD4+として同定された細胞のさらなるゲーティングを示すので、最初の細胞集団におけるFoxP3+/CD4+/CD25+/CD127- Treg細胞のパーセンテージは、8.44％の44.1％、即ち、3.72％と計算され得る。
【図２】PD-1およびCXCR4の発現によるFoxp3+/CD25+ Tregサブセットのインビトロ検出を示す。細胞は、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して定量化される。この方法は、血液または組織培養培地の単位体積当たりの細胞の絶対個数を決定する。AGS-003臨床試験に登録された患者から、2回目の来院時（AGS-003の投与前）および12回目の来院時（AGS-003の患者への7回目の投与の後）に、PBMCを収集した。PBMCを、10％AB血清を含有しているXvivo培地において6日間培養し；付加的な刺激は培養物に添加しなかった。6日目に、活性化されたFoxP3+/CD25+/CD4+ T細胞の個数を決定するためのフローサイトメトリーのために、PBMC培養物を染色した。まず、図2の一番左のパネルの四角で囲まれたエリアに示されるような、CD25+/CD45RA- T細胞を同定するために、CD4+ T細胞をゲーティングした。次いで、Treg細胞をTreg/eff細胞と区別すべく、PD-1の発現およびCD4の発現レベルを決定するために、これらのCD25+/CD45RA- T細胞をさらにゲーティングした（図2、2番目のパネルセットを参照すること）。ここで、PD-1-/CD4低発現（Treg）細胞は、左下の四半分に示され、PD-1+/CD4高発現Tregエフェクター細胞（Treg/eff）は、これらのパネルの右上の四半分に示される。次いで、これらのTreg/eff集団およびTreg集団の各々を、図2中の、それぞれ、左から3番目および4番目のパネルのセットに示されるように、FoxP3（y軸）およびCXCR4（x軸）の発現によってサブゲーティングした。3番目のパネルのセットは、PD-1+/CD4高発現/FoxP3+細胞がCXCR4陰性であることを示す（図2、3番目のパネル、左上の四半分）。4番目のパネルのセットは、PD-1-/CD4低発現/FoxP3+細胞がCXCR4陽性であることを示す（図2、4番目のパネルのセット、右上の四半分）。示されるように、このゲーティング戦略は、CD4+/CD25+/CD45RA-/FoxP3+制御性T細胞の2種のFoxP3+サブセット：それぞれ3番目および4番目のパネルのセットに示されるTreg/eff（FoxP3+/PD-1+/CXCR4-）およびTreg（FoxP3+/PD-1-/CXCR4+）を同定するために使用され得る。処置前のPBMCを、AGS-003樹状細胞生成物の7回投与後の同患者に由来するPBMCと比較している、このデータによって証明されるように、AGS-003処置は、インビトロ培養物増大後にTreg/eff細胞の個数を増加させることができる。
【図３】PD-1およびCXCR4のコンビナトリアル発現による古典的Treg細胞とTreg/eff細胞との識別を図示する。古典的Treg細胞は、PD-1-/CXCR4+であり、Tregエフェクター細胞は、PD-1+/CXCR4-である。図3は、CD4+/PD-1+/FoxP3+ T細胞が、AGS-003 DC生成物によって刺激された時にインビトロで増殖することを示す。患者の1回目の来院時（ベースライン）に収集されたPBMCを、10:1比で、自己AGS-003 DC生成物と共に、10％AB血清を含有しているXvivo培地において6日間培養した。図3は、まず、CD25+/CD4+ T細胞を同定するようにCD25およびCD4の発現についてゲーティングした細胞を示す（最初のパネル、四角で囲まれたエリア）；次いで、これらの細胞を、PD-1の発現によって、PD-1+（2番目のパネル、右上の四半分）およびPD-1- T細胞へゲーティングした（2番目のパネル）。次いで、FoxP3発現、および増殖を判定するための細胞周期マーカーKi67の発現について、細胞を調査した（図3、3番目および4番目のパネル）。Treg/eff細胞は増殖中であることが示され（図3、3番目のパネル、右上の四半分、CD4+高発現/CD25+/FoxP3+/PD-1+細胞がKi67+細胞を含むことを示している）、Treg細胞の大部分は増殖中でなかった（図3、4番目のパネル、左上の四半分、CD4+低発現/CD25+/FoxP3+/PD-1-細胞が主としてKi67-細胞を含むことを示している）。
【図４】PBMCのAGS-003 DC自己生成物とのインビトロ培養後のTregエフェクター細胞およびCTLの同時増大を示す。ベースライン時に15人のADAPT臨床試験対象からPBMCを収集し、自己AGS-003 DC生成物と共に6日間培養した。6日目に、CD3+/CD8+/CD25+/CD45RA-/Grb+ CTLの個数（y軸）を決定し、CD3+/CD4+/CD25+CD45RA-/PD-1+/Foxp3+ Tregエフェクター細胞の個数（x軸）に対してプロットした。培養物中のCTLの個数とTreg/eff細胞の個数との間に、統計的に有意な関連が検出された（ρ＝0.59、p＜0.0208）。
【図５】最高四分位群にベースラインリンパ球数を有していたArgosのADAPT臨床試験に登録された患者の全生存期間のカプランマイヤープロットを示す。組み合わせ処置アーム（AGS-003および標準治療、上方の線）における患者からのデータの、標準治療アームにおける患者からのデータに対するハザード比は、0.5999であった。
【図６】最高四分位群にベースラインリンパ球/単球比を有していたArgosのADAPT臨床試験に登録された患者の全生存期間のカプランマイヤープロットを示す。組み合わせ処置アーム（AGS-003および標準治療、グラフの右側の上方の線）における患者からのデータの、標準治療アームにおける患者からのデータに対するハザード比は、0.7356であった。
【図７】最高四分位群にベースラインC反応性タンパク質値を有していたArgosのADAPT臨床試験に登録された患者の全生存期間のカプランマイヤープロットを示す。組み合わせ処置アーム（AGS-003および標準治療、上方の線）における患者からのデータの、標準治療アームにおける患者からのデータに対するハザード比は、0.7164であった。
【図８】ベースライン％Treg値によって群に分けられたArgosのADAPT臨床試験に登録された患者の全生存期間のカプランマイヤープロットを示す。治験の組み合わせ処置アーム（AGS-003および標準治療）における患者からのデータは、左のパネルに示され、標準治療アームにおける患者からのデータは、右のパネルに示される。組み合わせ処置アーム（左のパネル）において、上方の線は、上から3個の四分位群にベースライン％Treg値を有する患者からのデータを示し、下方の線は、最低四分位群にベースライン％Treg値を有する患者からのデータを示す。標準治療アーム（右のパネル）において、（右へ延びた時の）上方の線は、最低四分位群にベースライン％Treg値を有する患者からのデータを示し、下方の線は、上から3個の四分位群にベースライン％Treg値を有する患者からのデータを示す。
【図９】上から3個の四分位群にベースライン％Treg値を有していたArgosの臨床試験に登録された患者の全生存期間のカプランマイヤープロットを示す。組み合わせ処置アーム（AGS-003および標準治療）における患者からのデータの、標準治療アームにおける患者からのデータに対するハザード比は、0.74であった。
【図１０】ベースライン単球数によって群に分けられたArgosの臨床試験の組み合わせアームに登録された患者の全生存期間のカプランマイヤープロットを示す。メジアン以下の単球数を有する患者からのデータ（上方の線）の、メジアンを超える単球数を有する患者からのデータ（下方の線）に対するハザード比は、0.6498であった。
【図１１】最高四分位群のベースライン血小板数を有するArgosの臨床試験に登録された患者の全生存期間のカプランマイヤープロットを示す。組み合わせ処置アーム（AGS-003および標準治療、上方の線）における患者からのデータの、標準治療アームにおける患者からのデータに対するハザード比は、0.6954であった。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
発明の詳細な説明
驚くべきことに、本発明者らは、ある種の免疫系特性を有する患者は、樹状細胞治療からより好都合な処置アウトカムを経験する可能性がより高いことを発見した。本発明は、より好都合な処置アウトカムを経験する可能性が高い患者を同定し、かつ処置するために、例えば、制御性T細胞（「Treg」）数のような免疫系パラメータを評価する方法を提供する。
【００２３】
従って、本発明は、患者における特定の種類の免疫細胞および/または血清化学マーカーのレベルおよび/または量の少なくとも1つの値または測定値を得る工程；該値または測定値が、適宜、その値または測定値についての処置閾値を超えているまたはそれ未満であることを確認する工程；ならびに患者へ樹状細胞治療を施す工程を含む、ヒト患者を樹状細胞治療によって処置するための方法を提供する。本発明は、特定の種類の処置指標についてのレベルおよび/または量の少なくとも1つの値または測定値を得る工程；該値または測定値が、適宜、その値または測定値についての処置閾値を超えているまたはそれ未満であることを確認する工程；ならびに患者へ樹状細胞治療を施す工程を含む、患者へ樹状細胞治療を施すための方法も提供する。
【００２４】
例えば、驚くべきことに、本発明者らは、高レベルのTreg細胞を有する患者は、樹状細胞治療から利益を得る可能性が高いことを発見した。有効な樹状細胞治療によるこれらの患者の処置は、該患者において、免疫応答を生成し、その一部は、Treg細胞の個数および/またはレベルの減少である。いくつかの態様において、免疫応答は、培養物中でTreg/eff細胞を生成する能力について、インビトロで患者DCを評価することによって測定される。従って、本発明は、特定の種類の処置指標についてのレベルおよび/または量の少なくとも1つの値または測定値を得る工程；該値または測定値が、適宜、その値または測定値についての処置閾値を超えているまたはそれ未満であることを確認する工程；ならびに患者へ樹状細胞治療を施す工程を含み、任意で、患者の免疫応答が刺激されたことを判定するまたは確認するためのアッセイを実施する工程を含む、患者における免疫応答を刺激する方法も提供する。
【００２５】
「Treg」とは、本明細書中で使用されるように、制御性T細胞を意味する。Tregは、例えば、CD4+、CD25+、および/またはFoxP3+のような、特定の細胞表面マーカーの発現またはその他の遺伝子の発現によって同定され得る。Tregは、例えば、CD127のような特定の遺伝子またはマーカーの発現の欠如によっても、T細胞の他の型と区別され得る。従って、いくつかの態様において、本明細書中で言及されるTregは、CD4+、CD25+、FoxP3+、およびCD127-である細胞として同定される。さらに、Tregは、CD3+、PD-1-、および/またはCXCR4+のうちの1つまたは複数として同定され得る。いくつかの態様において、本明細書中で言及されるTregは、表現型によって、CD3+、CD4+、CD25+、FoxP3+、CD127-、PD-1-、およびCXCR4+のうちの1つ、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つとして同定される。
【００２６】
一般に、本明細書中で使用されるように、当技術分野において公知の任意の適当な方法によって、例えば、フローサイトメトリーを使用して平均蛍光強度（MFI）を評価することによって測定されるように、「+」は、陽性発現を示し、「++」は、より高度の発現を示し、「+/-」は、より弱い発現を示し、「-」は、極めて弱いかまたは検出不可能な発現を示す。細胞表面マーカーおよびその他の遺伝子の発現を測定し、細胞の異なる集団および/または亜集団の間で発現を比較するための詳細な方法およびプロトコルは、例えば、Hasan et al.(2015)Clin.Immunol.157:261-76に記述されているように、当技術分野において公知である。
【００２７】
いくつかの態様において、抑制活性を有するTregは、転写因子FoxP3の細胞内発現と組み合わせた、細胞表面表現型マーカーCD3、CD4、およびCD25の陽性発現と、CD127の発現陰性との組み合わせについてのマルチカラーフローサイトメトリー染色によって同定される。
【００２８】
いくつかの態様において、本発明は、患者の血中のTregの初期（ベースライン）の個数または量に基づき、（即ち、免疫応答の誘導によって）治療に応答する可能性が最も高い癌患者を同定するために、フローサイトメトリーに基づくアッセイを使用する方法を提供する。いくつかの態様において、本発明は、治療による少なくとも1回の処置または投与の後の患者の血中のTregの個数の増加の検出に基づき、その治療が免疫応答を誘導する可能性が高い癌患者を同定するために、フローサイトメトリーに基づくアッセイを使用する方法を提供する。「癌患者」とは、癌を有すると診断された患者を意味し；いくつかの態様において、癌患者は、転移性腎細胞癌（RCC）を有すると診断されている。
【００２９】
いくつかの態様において、本発明は、ベースライン読み取り値を確立するために、患者の血液試料中に存在するTreg細胞の個数を定量化する工程；処置後読み取り値を確立するために、患者へ処置を施した後、患者の血液試料中に存在するTreg細胞の個数を定量化する工程；および患者の血液試料中に存在するTreg細胞の頻度または量が減少したか否かを判定するために、該ベースライン読み取り値と該処置後読み取り値とを比較する工程であって、Treg細胞の頻度または量の顕著な減少が、患者において免疫応答が誘導されたことを示す、工程を含む、患者において処置によって免疫応答が誘導されたか否かを判定する方法を提供する。いくつかの態様において、処置は、例えば、Rocapuldencel-T（AGS-003）のような、インビトロで調製された自己成熟DCを、患者へ投与する工程を含む。
【００３０】
本明細書中の実施例は、Foxp3+ Tregエフェクター細胞（「Treg/eff細胞」）が、AGS-003樹状細胞とのインビトロ培養の結果として増殖することの証拠を提供する。これらのTreg/eff細胞は、PD-1の陽性発現およびケモカイン受容体CXCR4の陰性発現によって、Tregと異なる。これらのTreg/eff細胞は、活性化されたCD4+/FoxP3+/PD-1+/CXCR4- T細胞の新規集団であり、提供される実施例において証明されるように、インビボでまたはインビトロ培養によって樹状細胞治療に起因する免疫刺激を測定するために使用され得る。
【００３１】
従って、いくつかの態様において、本発明は、ベースライン読み取り値を確立するために、患者の血液試料中に存在するTreg/eff細胞の個数を定量化する工程；処置後読み取り値を確立するために、患者へ処置を施した後に、患者の血液試料中に存在するTreg/eff細胞の個数を定量化する工程；ならびに患者の血液試料中に存在するTreg/eff細胞の頻度または量が増加したか否かを判定するために、該ベースライン読み取り値と該処置後読み取り値とを比較する工程であって、Treg/eff細胞の頻度または量の顕著な増加が、患者において免疫応答が誘導されたことを示す、工程を含む、患者において処置によって免疫応答が誘導されたか否かを判定する方法を提供する。いくつかの態様において、Treg/eff細胞は、増殖について評価され、ここで、処置後の患者における増殖中のTreg/eff細胞の顕著な集団または顕著に増加した集団の存在は、患者において免疫応答が誘導されたことを示す。
【００３２】
いくつかの態様において、本発明は、例えば、患者の身体、体液、または組織における特定の種類の免疫細胞および/または血清化学マーカーのレベルおよび/または量のような処置指標の少なくとも1つの値または測定値を得る工程；該値または測定値が、適宜、その値または測定値についての処置閾値を超えているまたはそれ未満であることを確認する工程；ならびに樹状細胞ワクチンを患者へ投与する工程を含む、ヒト患者を樹状細胞治療によって処置するための方法を提供する。いくつかの態様において、処置指標の値または測定値は、患者の血液または血液成分1ml当たりのTreg細胞数；CD8+CD28+ CTL数；CD4+細胞のうちの％CD4+CD25+CD127-FoxP3+細胞（または他のマーカーもしくはQAMAアッセイを使用した％Treg）；例えば、C反応性タンパク質（「CRP」）のような1種または複数種の血清化学RISKマーカーの血中レベル；および1種または複数種のDC欠損マーカーの血中レベル：のうちの1種または複数種に関する。血清化学RISKマーカーは、当技術分野において公知であり、Alb、CRP、ESR、AST/ALT、Ca等を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００３３】
従って、いくつかの態様において、患者は、例えば、血漿リンパ球のレベル；CD8+CD28+細胞数；CD8+CD28+PD-1+細胞数；IFNγを分泌するCD8+CD28+PD-1+細胞の数；TregであるCD4+細胞のパーセンテージ；血中血小板数；C反応性タンパク質（CRP）レベル；リンパ球/単球比；単球数（Elutra前）；および好中球/白血球比のような処置指標の値または数について、樹状細胞治療による処置の前にスクリーニングされるであろう。本明細書中で使用されるように、「処置指標」とは、樹状細胞治療によって処置される患者の改善または処置成功の見込みに関する情報を提供することができる、腫瘍もしくは患者の生物学の測定値、血液化学のパラメータ、または患者細胞の培養もしくは加工の結果を指す。「処置閾値」とは、本明細書中で使用されるように、処置指標についての上方閾値または下方閾値として同定された数値を指し、それぞれ、それより下または上で、樹状細胞治療による患者の処置が、推奨され、かつ/または患者のための1種もしくは複数種の利益を生成する、即ち、患者の健康もしくは処置成功の1種もしくは複数種の測定値の改善を生成する可能性が高いものとして同定される。
【００３４】
従って、例えば、樹状細胞ワクチンによる患者の処置の前または一次スクリーニング（「ベースライン」）時の処置閾値には、例えば、少なくとも1.58％、または少なくとも1.60％、1.65％、1.70％、1.75％、1.80％、1.85％、1.90％、2.00％、もしくはそれ以上の、TregであるCD4+細胞のパーセント；少なくとも500個のTreg/100マイクロリットル全血、または少なくとも400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、もしくは1000個のTreg/100マイクロリットル全血、またはそれ以上の、患者血液1ml当たりのTregの絶対個数；血液1マイクロリットル当たり少なくとも500,000個、または少なくとも600,000個；650,000個；700,000個；750,000個；800,000個；850,000個；900,000個；もしくは1,000,000個の血小板数；少なくとも約4mg/L、または42mg/L、または少なくとも40mg/L、42mg/L、45mg/L、50mg/L、55mg/L、60mg/L、65mg/L、70mg/L、もしくは75mg/L、もしくは76mg/LのC反応性タンパク質値（hs-CRP）；少なくとも2.50、または少なくとも2.60、2.70、2.75、2.80、2.85、2.90、3.00、3.10、3.20、3.30、3.33、もしくは3.35、またはそれ以上のリンパ球/単球比；500個未満、450個未満、400個未満、350個未満、300個未満、250個未満、200個未満、もしくは150個未満の単球/uL血液、またはそれ以下の単球数（Elutra前）；7％以下、または6％未満、5.5％未満、5％未満、4.5％未満、4％未満、もしくは3.5％未満、またはそれ以下の、白血球に対するパーセンテージとしての単球；10.0未満、9.0未満、8.0未満、7.0未満、6.0未満、5.9未満、5.5未満、5.0未満、4.5未満、4.0未満、もしくは3.0未満、またはそれ以下の単球/白血球比；患者についてのメジアン値以上または患者の最高四分位群に相当する血漿リンパ球値；および患者のメジアン以下であるかまたは最低四分位群に相当するCD8+CD28+細胞数またはCD8+CD28+PD-1+細胞数またはIFNγを分泌するCD8+CD28+PD-1+細胞の数、のいずれかが含まれ得る。
【００３５】
いくつかの態様において、処置指標の処置閾値は、樹状細胞治療の作製のための患者の血液の加工の後に決定される。例えば、処置閾値には、26％未満、または35％未満、30％未満、28％未満、24％未満、22％未満、20％未満、18％未満、もしくは15％未満、またはそれ以下の、白血球アフェレーシス後の白血球に対するパーセンテージとしての単球が含まれる。
【００３６】
いくつかの態様において、樹状細胞ワクチンによる患者の処置の前または一次スクリーニング（「ベースライン」）時の処置閾値には、TregであるCD4+細胞の少なくとも2.5％、または少なくとも3％、3.5％、4％、4.5％、5％、5.5％、6％、6.5％、7％、8％、もしくは9％、またはそれ以上のパーセントの、TregであるCD4+細胞のパーセントが含まれ得る。これらの測定値は、例えば、フローサイトメトリーによって得られた直接の細胞数であってもよいし、または、例えば、FoxP3-TSDR領域のメチル化の判定のような、当技術分野において公知のアッセイを使用して決定されてもよい。
【００３７】
いくつかの態様において、処置閾値には、患者の血液から作製された樹状細胞治療の測定値が含まれる。例えば、処置閾値には、1回用量当たり少なくとも1.3×107個の生存DC、または少なくとも7×106個；9×106個、1×107個、1.5×107個、2×107個；2.5×107個；3×107個；またはそれ以上の生存DCの、生存DC/1回用量が含まれる。「1回用量」とは、患者へ投与されるかまたは投与されることになっているDCのアリコートである。いくつかの態様において、患者血液の1回の採取からDCの複数個の1回用量が作製される。
【００３８】
いくつかの態様において、樹状細胞ワクチンによる患者の処置を継続すべきか、または別の処置を施すべきかを判定する方法が、提供される。ArgosのADAPT臨床試験からのデータは、ベースライン測定から48週までに、％Treg細胞の最大の減少を経験した、組み合わせアームにおける患者は、全生存期間の増加も示すことを示した。従って、患者の％Tregの変化の検出またはモニタリングは、％Tregの変化を単独で考慮するかまたは他の測定値もしくは値と組み合わせて考慮することによって、樹状細胞ワクチンの投与によるその患者の処置を継続すべきかもしくは中止すべきかの決断、付加的なもしくは別の処置を施すべきかの決断、またはその患者の予後の判定において、情報を与えることができる。
【００３９】
いくつかの態様において、樹状細胞治療による患者の処置、または患者の評価は、複数種の処置閾値を考慮する工程を含むであろう。従って、例えば、いくつかの態様において、患者の処置の方法は、当業者が適切であると考えかつ/または有用である見なす任意の組み合わせで、血漿リンパ球値；CD8+CD28+細胞数；CD8+CD28+PD-1+細胞数；IFNγを分泌するCD8+CD28+PD-1+細胞の数；TregであるCD4+細胞のパーセント；血液または血液成分の単位体積当たりのTregの数；血小板数；C反応性タンパク質（CRP）値；リンパ球/単球比；単球数（Elutra前）；および好中球/白血球比からなる群より選択される処置指標についての1つ以上、2つ以上、3つ以上、4つ以上、5つ以上、6つ以上、または7つ以上の数または値を、測定するかまたは決定するかまたは考慮する工程を含むであろう。いくつかの態様において、患者の処置の方法は、CRPおよび％Tregについての処置閾値を満たすかまたは超えるように、該患者についてのC反応性タンパク質の、42以上である測定値と、（CD4+細胞に対するパーセンテージとしての）％Treg細胞の、1.75％より大きい測定値とを得る工程を含む。
【００４０】
いくつかの態様において、患者を処置する方法、または処置指標もしくは処置閾値を考慮する工程は、多変量統計分析、または2種以上の処置指標値が入力される統計モデルから、処置成功の可能性の予測を得ることを含む。いくつかの態様において、患者が樹状細胞治療による処置から利益を得る可能性が高いか否かを査定するために、多変量統計分析が使用される。いくつかの態様において、患者のC反応性タンパク質レベル、リンパ球/単球比、単球/白血球比、％Treg、またはこれらのうちの2種以上についての値が、統計モデルに入力される。いくつかの態様において、C反応性タンパク質およびパーセントT-regについての値が、統計モデルに入力される。本発明の方法において、患者がDC治療による処置から利益を得るか否かについての予測値を示す処置指標および処置閾値のうちの任意のものと共に、任意の適当な統計モデルが使用され得；適当な統計モデル、方法、および技術は、当技術分野において周知であり、適当なソフトウェアパッケージは、例えば、SAS（登録商標）Institute,Inc.（Cary,North Carolina）から、容易に商業的に入手可能である。
【００４１】
成熟DCを作製する方法は、当技術分野において公知である。成熟DCを作製するためのいくつかの方法が、WO2006042177（Healeyら）；WO2007117682（Tcherepanovaら）；DeBenedette et al.(2008)J.Immunol.181:5296-5305；およびCalderhead et al.(2008)J.Immunor.31:731-41に詳細に記載されている。これらの方法のうちのいくつかにおいては、未熟DCが、連続的に、CD83+CCR7-成熟DCを作製するための第1のシグナル（IFNγ受容体アゴニストおよび、任意で、TNFα受容体アゴニスト）によってシグナリングされ、次いで、CD83+CCR7+成熟DCを作製するのに有効な量の第2のシグナル（CD40アゴニスト）によってシグナリングされ；様々なIFNγ受容体アゴニストおよび/またはTNFα受容体アゴニストが使用され得る。「PME-CD40L過程」（Post Maturation Electroporation with CD40Lの略）と呼ばれる方法においては、まず、IFNγおよびTNFαを培養培地に添加することによって、未熟DCを表現型的に成熟させ；任意で、PGE2も添加する。次いで、およそ12〜30時間後（いくつかの態様において、約18時間後）、細胞に、CD40L mRNAを電気穿孔で導入し、任意で、抗原をコードするmRNAも電気穿孔で導入する。このPME-CD40L過程は、CD83+CCR7+成熟DCを生成する。電気穿孔の後（例えば、電気穿孔の4時間後）に、この過程から採集され、ワクチンとして製剤化された細胞は、インビトロアッセイにおいて最大の免疫効力を媒介することが示された。
【００４２】
PME-CD40L過程によって作成される樹状細胞（本明細書中、「PME-CD40L DC」）は、長期の抗原特異的CTLエフェクター機能を支持し、急速増大高アビディティ（「REHA」）細胞と名付けられた1種のエフェクターメモリCTLを誘導することができるため（DeBenedette et al.(2008)J.Immunol.181:5296-5305を参照すること）、従来公知の樹状細胞と異なっている。REHA細胞は、増大し、サイトカインを産生し、標的細胞を死滅させる能力を保持しており、従って、頑強な長期CTLエフェクター機能を提供する。従って、PME-CD40L DCは、抗原特異的T細胞の集団からCD28+CD45RA-メモリ/エフェクターT細胞の集団を優先的に誘導する。PME-CD40L DCは、TSCM細胞を生成することも示された（WO2015/127190（DeBenedetteら）および対応する米国特許出願公開第20170065690号（DeBenedetteら））。いくつかの場合において、CD83+CCR7+成熟DCは、CD40Lポリペプチドを一過性発現し；いくつかの場合において、CD40Lは、細胞表面ではなく細胞内に主として局在している。
【００４３】
PME-CD40L DCは、（a）共刺激分子CD80、CD83、およびCD86の上昇した細胞表面発現を示し；（b）CCR7+であり；（c）IL-12 p70ポリペプチドまたはタンパク質を分泌し、かつ/または顕著に低下したレベル（DC 100万個当たり1ml当たり0〜500pg）のIL-10を分泌するという、いくつかの独特の特徴を示す（例えば、WO2006042177（Healeyら）およびWO2007117682（Tcherepanovaら）に提示されたデータおよび実験を参照すること）。これらの成熟CD83+CCR7+ DCは、DC 106個当たり少なくとも1000pgのIL-12を産生する；IL-10およびIL-12のレベルは、未熟DCからのDC成熟の誘導の36時間後までに収集された培養上清のELISAによって決定され得る（Wierda et al.(2000)Blood 96:2917；Ajdary et al.(2000)Infection and Immunity 68:1760）。当業者は、CD40L mRNAおよび/もしくはCD40Lポリペプチドを発現するかまたはインターロイキン12（IL-12）p35タンパク質を発現する成熟DCの存在について、ある細胞集団からDCの細胞または部分集団を試料採取することによって、いつPME-CD40Lが生成されたかを判定することもできる。これらの細胞のその他の特徴は、例えば、WO2006042177（Healeyら）；WO2007117682（Tcherepanovaら）；DeBenedetteら（(2008)J.Immunol.181:5296-5305)；およびCalderheadら（(2008)J.Immunor.31:731-41）に記述されている。
【００４４】
PME-CD40L DCを作製するために使用される未熟DCは、DC前駆細胞を含有している適当な組織起源から単離または調製され、未熟DCを作製するためにインビトロで分化させてもよい。未熟DCは、末梢血単核細胞（PBMC）から単離されてもよく、PBMCは、PBMCが未熟DCへ分化するよう、インターロイキン4（IL-4）および/またはIL-13の存在下または非存在下で、有効量の顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）によって任意で処理されている。いくつかの態様において、PBMCは、未熟DCを作製するために、GM-CSFおよびIL-4の存在下で、約4〜7日間、好ましくは、約5〜6日間、培養される。いくつかの態様において、第1のシグナルは、4日目、5日目、6日目、または7日目に与えられ、最も好ましくは、5日目または6日目に与えられる。さらに、GM-CSFも、IL-4および/またはIL-13も、第1および/または第2のシグナリングの時点で、培地中に存在してよい。あるいは、未熟樹状細胞は、有効量のTNFα受容体アゴニストによってシグナリングされ、その後、CD40アゴニストによってシグナリングされてもよい。未熟DCは、IFNγRアゴニストおよびTNFαRアゴニストの第1のシグナルを受容するのとほぼ同時に、PGE2と接触させてもよい。いくつかの方法において、シグナリングは、有効量のIL-1βおよび/またはIL-6の非存在下で行われる。GM-CSF、およびIL-4またはIL-13のうちの少なくとも1種が、樹状細胞が第1および第2のシグナルを受容する時点で、培地中に存在してよい。
【００４５】
IFNγ受容体アゴニスト、TNFα受容体アゴニスト、および/またはCD40アゴニストによるシグナリングは、細胞を、それぞれ、IFNγポリペプチドおよび/もしくはタンパク質、ならびに/またはTNFαポリペプチドもしくはタンパク質、ならびに/またはCD40アゴニストと直接接触させることによって達成され得る。同様に、IFNγおよびTNFαの受容体アゴニストは、IFNγおよびTNFαと類似の生物学的活性を有するアプタマー、抗体等であり得る。あるいは、IFNγRアゴニスト、TNFαRアゴニスト、および/またはCD40アゴニストによる細胞のシグナリングは、樹状細胞におけるそのようなポリペプチドまたはタンパク質をコードするmRNAの翻訳によって起こってもよい。そのようなmRNAは、トランスフェクションまたはその他の手段によって細胞へ導入され得、次いで、シグナリングが、IFNγRアゴニスト、TNFαRアゴニスト、およびCD40アゴニストのポリペプチドおよび/またはタンパク質の発現によって起こる。従って、シグナリングは、培養培地へのシグナリングアゴニストの供給、アゴニストの細胞への導入、および/またはアゴニストポリペプチドをコードするmRNAの樹状細胞における翻訳によって開始され得る。方法は、インビボまたはエクスビボで実施され得る。次いで、エクスビボで成熟した樹状細胞は、DCとの共培養によって作製されたTSCMと共に、免疫応答を誘導または増強するために対象へ投与され得る。
【００４６】
樹状細胞は、免疫原（例えば、抗原）のDCへの投与によって、さらに修飾され得る。免疫原は、インビボまたはエクスビボで送達され得る。免疫原は、当技術分野において公知の方法を使用して細胞へ送達され得、（例えば、「パルス処理」によって）ポリペプチドもしくはタンパク質として送達されてもよいし、または（例えば、トランスフェクションもしくは電気穿孔によって）免疫原をコードする核酸として送達されてもよい。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドは、mRNAである。PME-CD40L DCを作製するいくつかの方法において、抗原をコードするmRNAは、CD40アゴニストをコードするmRNAと共に、またはCD40アゴニストシグナリングと実質的に同時に電気穿孔で導入される。
【００４７】
PME-CD40L DCには、関心対象の任意の病原体または疾患に由来する抗原をコードするRNAがトランスフェクトされてもよい；そのような抗原は、1人の個々の対象に由来してもよいし、または複数人の対象に由来してもよく、抗原が単離された対象の病原体感染に由来してもよいし、または他の対象に由来してもよい。コンセンサス抗原および病原体特異的抗原は、当技術分野において公知であり、PME-CD40L DCを調製する方法においても使用され得る。DCは、抗原をプロセシングし、抗原を細胞表面上に呈示するであろう；これらの成熟DCは、ナイーブ免疫エフェクター細胞を教育するために使用され得る。対象から取り出された癌および/または腫瘍の試料に由来する抗原をコードするRNAが、このように、DCにトランスフェクトするために使用され得る。対象から取り出された試料に由来するHIV抗原をコードするRNAも、DCにトランスフェクトするために使用され得る。例えば、MARTをコードするmRNAをトランスフェクトされたPME-CD40L DCは、例えば、WO2006042177（Healeyら）およびWO2007117682（Tcherepanovaら）に記載されたように、自己CD8+ T細胞を刺激して、レスポンダーCD8+ T細胞を生成した。また、腎細胞癌（「RCC」）腫瘍の増幅された全RNAを負荷されたPME-CD40L成熟DCは、完全自己CTL応答を誘導した（WO2006042177（Healeyら）を参照すること）。
【００４８】
いくつかの態様において、PME-CD40L DCには、WO2006031870および米国特許出願公開第20080311155号（Nicoletteら）に記載されたように、HIVタンパク質Gag、Nef、Tat、およびRevの一部または全部をコードするRNAがトランスフェクトされる。簡単に説明すると、DCには、個々の対象に存在するHIVの複数の株に由来する1種または複数種のポリペプチドをコードするRNAがトランスフェクトされ；RNAは、病原体ポリヌクレオチドの核酸増幅に由来する。そのような病原体ポリヌクレオチドを増幅するプライマーは、WO2006031870および米国特許出願公開第20080311155号に記載されたように、例えば、病原体がHIVである時、病原体の複数の株の間の配列可変性を補償するために設計され得る。そのようなプライマーには、例えば、WO2006031870に開示されたプライマーが含まれ、Gag、Nef、Tat、およびRevのための順方向プライマーおよび逆方向プライマーが含まれる。この過程から得られたDCは、HIV患者においてHIVに対する免疫応答を刺激し得ることが示された。このように、患者に対して自己のDC治療を、作製し、その患者に見出されるHIV株に対する免疫応答を刺激するために使用することができる。
【００４９】
PME-CD40L DCは、濃縮された樹状細胞集団を、適当な条件の下で、適当な凍結保存剤と接触させ、凍結させることによって保管されてもよい（例えば、WO2002016560およびU.S.Pat.No.8,574,901（Schulerら）を参照すること）。
【００５０】
インビトロで増大させ、樹状細胞へ分化させるための、CD34+幹細胞を含む様々な細胞の単離および増大のための多くの方法が、当技術分野において公知である（例えば、U.S.Pat.No.5,199,942を参照すること）。当業者には明らかであるように、幹細胞および単球を樹状細胞へ分化させるための用量範囲は、おおよそである。異なる供給元、および同一の供給元からの異なるロットのサイトカインは、サイトカインの活性について変動する。当業者は、特定のサイトカインについての最適用量を決定するために、使用される各サイトカインを容易に滴定することができる。当技術分野において公知であるように、ある種の細胞型は、他の細胞型との共培養によって誘導するまたは成熟させることができる。「共培養」という用語は、少なくとも2種の異なる型の細胞を含有していることが既知の細胞培養物を指す。
【００５１】
DCは、GM-CSFおよびIL-4またはGM-CSFおよびIL-13を含有している培地における培養によって、末梢血中の非増殖中のCD14+前駆細胞（単球）から発生し得る（例えば、WO97/29182；Sallusto and Lanzavecchia(1994)J.Exp.Med.179:1109およびRomani et al.(1994)J.Exp.Med.180:83を参照すること）。いくつかの態様において、DCは、患者または対象に対して自己である；即ち、DCまたはその前駆細胞は、それらが投与されるのと同一の患者または対象から得られる。他の態様において、DCまたはその前駆細胞は、それらが投与されるのと異なる患者から得られる（即ち、それらは同種または異種である）。
【００５２】
細胞がHIV患者から単離される時には、HIV感染細胞が、例えば、CD4-PE40（例えば、25nM）のような試薬を使用して、集団から優先的に取り出される。CD4-PE40は、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）外毒素Aの移行（translocation）ドメインおよびADPリボシル化ドメインに連結されたHIV-l結合CD4ドメインからなる組換えタンパク質であり；HIV感染細胞培養物におけるp24産生を阻害し、HIV-1感染細胞を選択的に死滅させることが示されている。細胞増殖を刺激するために、OKT3モノクローナル抗体（Ortho Diagnostics（商標）,Inc.）が添加されてもよい。
【００５３】
抗原は、患者自身の癌細胞から調製され、DCへ負荷されてよく、次いで、そのDCが、患者へ戻し注入される。HIV/エイズの処置のためには、抗原が、HIV患者（即ち、HIVに感染した患者）から調製され、DCへ負荷され、そのDCが、患者へ戻し注入される。HIV患者に由来する抗原を調製し、それを提示するDCを調製する方法は、例えば、WO2006031870（Nicoletteら）に記載されたように、当技術分野において公知である。
【００５４】
Tregは、例えば、IL-10および/またはTGFβのような様々なサイトカインを産生することもできる。そのようなサイトカインを検出し測定する方法は、当技術分野において公知である。特異的なサイトカインの発現のような特定の機能的特質に基づき、細胞を分離する方法は、（例えば、Kammula et al.(1999)J.Immunol.12:6867-75およびKammula et al.(2008)J.Transl.Med.2008:60に記述されるように）当技術分野において公知であり、細胞は、（例えば、Brosterhus et al.(1999)Eur.J.Immunol.12:4053-59に記述されるように）サイトカイン捕獲剤を使用してサイトカイン発現に基づき選択され得る。
【００５５】
別の局面において、細胞は、特定の遺伝子の発現に基づき、同定されかつ/または単離され得る。細胞表面マーカーは、このように、特に有用であり得る。例えば、DCは、MHC分子ならびに共刺激分子（例えば、B7-1およびB7-2）を発現し、顆粒球、NK細胞、B細胞、およびT細胞に特異的なマーカーを欠くことから、他の細胞と区別され得る。Tregは、CD4、CD25、およびFoxP3を発現するが、CD127の発現をほとんどまたは全く有しておらず、そのことを、例えば、フローサイトメトリーを使用して、それらを活性化T細胞と区別するために使用することができる。発現のマーカーは、これらの細胞の同定、精製、および少なくとも1種の異なるマーカーを発現する他の細胞からの分離を容易にし；マーカーの任意の適当な組み合わせが使用され得、当業者によって容易に決定される。陰性マーカーまたは細胞選択も使用され得る。このように、Treg細胞および/またはTreg/eff細胞は、CD4、CD25、FoxP3、CD127、PD-1、およびCXCR4のうちの1種または複数種の発現に基づき、他の細胞から同定され、分離され、単離され、または濃縮され得る。細胞は、FACS分析のようなフローサイトメトリー方法によっても、当技術分野において公知の任意の適当な方法によっても、単離されかつ/または特徴決定され得る。例えば、Lowther et al.(2016)JCI Insight 1(5):e85935；Raimondi et al.(2006)J.Immunol.176:2808-16を参照すること。従って、例えば、Tregは、マルチカラーフローサイトメトリーによって、マーカーCD4、CD25、およびFoxP3について陽性である（即ち、それらを検出可能なレベルで発現する）が、低いかまたは検出不可能なレベルのCD127の発現を示す細胞として同定され得る。インビボまたはインビトロでのその後の使用のために、TregもしくはTreg/effのような特異的な細胞型を、これらのマーカーのうちの1種もしくは複数種を有する細胞の磁気ビーズ単離を使用して、他の細胞から濃縮し、単離し、もしくは精製してもよいし、または、いくつかの場合において、適切なマーカーを使用して、混合細胞集団から他の細胞型を除去することが好ましいことがある。いくつかの態様において、本明細書中の他の場所に、より詳細に記述されるようなQAMAアッセイ（「メチル化対立遺伝子の定量分析（Quantitative Analysis of Methylated Alleles」）を使用して、Tregを測定してもよい。
【００５６】
細胞、細胞群、または細胞型による、「低い」または「陰性の」細胞表面マーカーの発現または他の遺伝子の発現とは、発現が、他の細胞、細胞群、もしくは細胞型より低いこと、または発現が、当技術分野において公知の方法を使用して、ほとんど検出可能でないかもしくは検出不可能であることを意味する（例えば、Hasan et al.(2015)Clin.Immunol.157:261-76を参照すること）。
【００５７】
（細胞表面マーカーを含む）細胞抗原を同定し、検出し、かつ/またはモニタリングするために使用され得る標識剤は、当技術分野において公知であり、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、タンパク質、またはアフィニティマトリクス、炭水化物、もしくは脂質のようなその他のポリマーを含むが、これらに限定されるわけではない。検出は、イムノブロッティング、ウエスタンブロット分析、放射性マーカーもしくは生物発光マーカーの追跡、キャピラリー電気泳動、またはサイズ、電荷、もしくは親和性に基づき分子を追跡するその他の方法のような任意の公知の方法によって進められる。
【００５８】
表面マーカーの発現に基づく細胞分離方法は、当技術分野において公知であり、磁気ビーズ単離、（例えば、Basu et al.(2010)J.Vis.Exp.41に記述されたような）マルチカラーフローサイトメトリーまたはFACS選別、および（例えば、Shoji and Kawai(2011)Top.Curr.Chem.2011:1-25に記述されたような）微小電気機械系チップ（「MEMS」チップ）に基づく選別の使用を含む。FACS機およびセルソーターは、商業的に入手可能であり（例えば、BD Bioscience LSRIIおよびBD FACSAria）、製造業者の説明書に従って使用され得る。
【００５９】
細胞は、適宜、ポジティブ選択もしくはネガティブ選択によって、またはポジティブ選択およびネガティブ選択の両方によって、他の細胞から単離されるかまたは分離されてもよい。例えば、Treg細胞は、他の細胞型を枯渇させるためのネガティブ選択を使用して、任意で、その後、CD4、CD25、CXCR4、および/またはFoxP3についてのポジティブ選択を使用して、PBMCまたはリンパ球のような他の細胞を含む集団から濃縮され得る。当業者が公知の細胞型を単離するかまたは精製することを可能にする、多様な精製工程のためのキットおよび試薬が、当技術分野において公知である；例えば、InvitrogenのDynabeads（登録商標）Untouched（商標）ヒトT細胞キットは、非T細胞：ヒトCD14、CD16、CD19、CD36、CD56、CDw123、およびCD235aに対するマウスIgG抗体を含む抗体を使用して、ヒトB細胞、NK細胞、単球、マクロファージ、血小板、樹状細胞、顆粒球、および赤血球を枯渇させるために設計されている。当業者は、細胞の集団から公知の細胞型を濃縮しかつ/または枯渇させるために、特定の（しばしば、商業的に入手可能な）抗体および選択ツールを選択することができることが、この例から理解されるであろう。
【００６０】
特定のマーカーを保持している細胞の選択または検出は、一度に1種のマーカーについて実施されてもよいし、または（例えば、Stemberger et al.(2012)PloS One 4:e35798に記述されたように）一度に複数種のマーカーについて実施されてもよい。選択または検出は、連続的に実施されてもよく、後の工程において、所望の部分集団を得るかまたは検出するかまたはモニタリングするために、細胞の特定の群または集団において、異なる型の選択または検出が使用されてもよい。細胞は、（例えば、Keenan et al.(2001)Br.J.Haematol.2:428-34に記述されたように）HLA-ペプチド複合体に反応性のT細胞を単離することによって、直接、抗原特異性に基づき選択されるかまたは同定されてもよい。同定、スクリーニング、および/または選択のために有用である細胞マーカーには、CD4、CD8、CD25、CD27、CD28、CD38、CD57、CD95、CD127、FoxP3、PD-1、HLA-DR、およびCD45RAが含まれる。
【００６１】
Argos第3相ADAPT臨床試験は、標準治療処置（「SOC」）と組み合わせて（本明細書中、AGS-003とも呼ばれる）Rocapuldencel-Tを受容した、新たに診断された転移性腎細胞癌（「RCC」）を有する対象患者における全生存期間を、SOC単独と比較して評価するために、設計された。SOCアームにおける患者には、スニチニブ（SUTENT（登録商標））またはその他のチロシンキナーゼ阻害剤（「TKI」）が与えられ、AGS-003アームにおける患者には、スニチニブまたはその他のチロシンキナーゼ阻害剤（「TKI」）に加えて、治験プロトコルによるAGS-003の複数回投与が与えられた。標準治療に一致する処置のために適当なチロシンキナーゼ阻害剤は、例えば、Broekman et al.(2011)World J.Clin.Oncol.2:80-93に記述されるように、当技術分野において公知である。「AGS-003」とは、患者自身の腫瘍材料に由来するRNA抗原ペイロードを含有しているPME-CD40L DCを指す。研究の両アームにおいて、患者の免疫応答を、処置の前および後に評価した。SOC患者については、患者におけるより高い初期Treg細胞数またはレベルと、その患者についての比較的不良の処置の進行および/またはアウトカムとの間に、正の相関が存在した。しかしながら、驚くべきことに、AGS-003によって処置された患者については、患者におけるより高い初期Treg数またはレベルと、その患者についての比較的良好な処置の進行および/またはアウトカム、例えば、全生存期間との間に、正の相関が存在した。これは、治験のSOCアームにおける患者に関する知見から、また、高いTregレベルを有する患者は、典型的には、より不良の処置の進行および/またはアウトカムを経験するという以前の報告からみても、驚くべきものである（例えば、Afzali and Lombardi(2013)BJU International 112:538-9；Schwarzer et al.(2012)PLOS One 7:e46600；Griffiths et al.(2007)Cancer Immunol.Immunother.56:1743-53；Cesana et al.(2006)J.Clin.Oncol.24:1169-77を参照すること）。Argos ADAPT臨床試験において、SOCアームにおける患者は、スニチニブによって処置された1回目の治験来院と2回目の来院との間にTreg細胞の減少を示したが、AGS-003によって処置された患者は、その後の来院時にもTregの減少を示し続けた。
【００６２】
このように、本発明は、ベースライン読み取り値を確立するために、患者の血液試料中に存在するTreg細胞の個数を定量化する工程；閾値を超えているか否かを判定するために、Tregの数または値を評価する工程；ならびに、超えている場合に、インビトロで調製された自己成熟DCを患者へ投与する工程を含む、患者を処置するための方法を提供する。
【００６３】
ヒト全血中の典型的なTregの数またはレベルは、約200〜1000個のTreg/100マイクロリットル全血の範囲であり、メジアンは、約500個のTreg/100マイクロリットル全血である。臨床試験結果の分析は、治験においてより良好なアウトカムを有したAGS-003患者についてのTregの数またはレベルが、AGS-003による処置の開始前に、典型的には、少なくとも650個のTreg/100マイクロリットル全血であったことを示した。いくつかの態様において、細胞は、精製、培養、または（例えば、培養物中のサイトカインもしくはその他の細胞による）刺激なしに、全血から測定され、数または値は、全血100マイクロリットル当たりのTreg細胞の絶対個数である。血液画分におけるまたはその他の体積単位を使用したその他の同等の測定値は、患者における（即ち、患者の全血中の）Tregの同一の数、レベル、または頻度を表すことが、当業者によって理解される。いくつかの態様において、Tregと、例えば、Tエフェクター細胞のような他の細胞型の細胞との比が使用されてもよい；しかしながら、この比は、時に、患者における炎症または疾患の存在によって影響を受ける。
【００６４】
Treg細胞は、時に、CD4、CD25、およびFoxP3の発現によって特徴決定されるが、活性化されたヒト非制御性T細胞は、抑制機能を有しないにも関わらず、FoxP3を一過性発現することが報告されている。Tregは、FoxP3-TSDR（「Treg Specific Demethylated Region」）として公知の領域の脱メチルを示すという点で、これらの細胞と異なっており、Treg細胞と他の細胞との間のメチル化の違いを査定し、血液試料中のTreg細胞の測定値を提供するために、定量的PCRアッセイ（QAMA）が使用され得ることも示されている。従って、いくつかの態様において、患者におけるTregの数、レベル、または頻度は、FoxP3-TSDR領域のメチル化を判定するための定量的PCRアッセイを使用して間接的に査定される。そのようなアッセイは、例えば、Tatura et al.(2012)PloS ONE 7:e49962、「リアルタイムPCRに基づくメチル化アッセイおよびフローサイトメトリーによる敗血症患者における制御性T細胞の定量化」に教示されているように、当技術分野において公知である。
【００６５】
この説明から理解されるように、本発明は、適宜、その指標についての処置閾値を超えているまたはそれ未満である少なくとも1つのベースライン処置指標値または数を有する患者の処置において使用するための、樹状細胞治療である医薬も提供する。いくつかの態様において、本発明は、適宜、その指標についての処置閾値を超えているまたはそれ未満である少なくとも2つ、少なくとも3つ、または少なくとも4つのベースライン処置指標値または数を有する患者の処置において使用するための、樹状細胞治療である医薬を提供する。このように、例えば、本発明は、1.75％のTreg細胞であるCD4+細胞、または650個のTreg/100マイクロリットル患者全血、もしくは単位体積当たりの同等の測定値である、閾値を超えている初期Treg数または値を有する患者の処置において使用するための、樹状細胞治療である医薬を提供する。いくつかの態様において、医薬は、樹状細胞治療または樹状細胞ワクチンと薬学的に許容される担体とを含む。いくつかの態様において、医薬は、例えば、チロシンキナーゼ阻害剤のような他の薬学的組成物に加えて、樹状細胞治療または樹状細胞ワクチンと薬学的に許容される担体とを含む。例えば、スニチニブ、または、例えば、Broekman et al.(2011)World J.Clin.Oncol.2:80-93に記述されたもののようなその他のチロシンキナーゼ阻害剤のような、樹状細胞ワクチンによっても処置される患者へ投与するための適当なチロシンキナーゼ阻害剤は、当技術分野において公知である。
【００６６】
「ベースライン値」または「ベースライン」とは、例えば、スニチニブによる処置および/またはAGS-003による処置のような特定の処置の開始前の患者についての処置指標についての数もしくは値またはその他の測定値を意味する。「閾値」とは、患者が、少なくとも約500個のTreg/100マイクロリットル全血、または少なくとも約600、650、700、750、800、850、900、もしくは950個のTreg/100マイクロリットル全血、またはそれ以上の初期Treg数または値を有することを意味する。
【００６７】
いくつかの場合において、増殖中の細胞集団を同定し、かつ/または特定の細胞型もしくは集団が増殖中であるか否かを判定することが、有用であり得；適当な方法は、当技術分野において公知である。例えば、増殖中である細胞型を同定するためには、CFSEを、その他の細胞マーカーと共に使用することができる。CFSElo T細胞の頻度は、例えば、PME-CD40L DCによる刺激後のインビトロの増殖中のT細胞のパーセンテージを表す。Ki67染色も、フローサイトメトリーを使用して細胞増殖をモニタリングするために使用され得る。
【００６８】
AGS-003によって処置された患者におけるTreg細胞の減少とAGS-003に対する好都合な応答との間の相関のため、これらの患者におけるTreg細胞の頻度および/または変化は、免疫応答の有用な指標となる。このように、（例えば、AGS-003臨床試験におけるPME-CD40L DCによる）処置後の患者におけるTreg細胞の頻度および/または変化は、患者の可能性の高い臨床アウトカムを査定するための貴重なツールである。例えば、いくつかの態様において、AGS-003による処置は、好都合な応答を示す、CD4+/CD25+/FoxP3+/PD-1-である増殖中の（Ki67+）Treg細胞の喪失をもたらす。いくつかの態様において、AGS-003による処置は、FoxP3-TSDR領域のメチル化のアッセイを使用して決定されるような、血液の単位体積当たりのTregの頻度および/または個数の減少をもたらすであろう。同様に、患者におけるTreg/eff細胞の量の変化は、患者の免疫応答の有用な指標であり得、Treg/eff細胞の量および/または増殖中のTreg/eff細胞の量の増加は、陽性免疫応答を示す。
【００６９】
樹状細胞ワクチンまたは樹状細胞治療によって処置された患者におけるTreg細胞、Treg/eff細胞、および/またはCTLの頻度および/または変化をモニタリングすることによって、患者の処置が、例えば、腫瘍特異的CTLおよび/または無増悪生存の増加によって測定されるような免疫応答の誘導において有効であったかまたは有効であるかを予測するかまたは判定することが可能である。同様に、患者におけるTreg細胞、Treg/eff細胞、およびCTLのうちの1種または複数種の頻度および/または変化をモニタリングすることによって、処置が免疫応答の誘導においていつ有効であったかを評価することも可能である。いくつかの場合において、患者におけるTreg細胞の少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、100％、もしくは200％、またはそれ以上の減少は、処置（例えば、AGS-003による処置）が、処置閾値に達し、的確に中止され得るよう、十分な免疫応答を、患者が有したことを示すであろう。いくつかの場合において、患者におけるTreg/eff細胞および/またはCTLの少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、100％、もしくは200％、またはそれ以上の増加は、処置（例えば、AGS-003による処置）が、処置閾値に達し、的確に中止され得るよう、十分な免疫応答を、患者が有したことを示すであろう。そのような増加および減少は、フローサイトメトリー使用して決定された細胞数によって直接測定されてもよいし、またはFoxP3-TSDR QAMAアッセイ（例えば、Tatura et al.(2012)PLoS ONE 7:e49962を参照すること）のような定量的PCRアッセイを使用して間接的に測定されてもよい。
【００７０】
処置決断は、患者の健康の既知の測定値のガイダンスによって、また、本明細書中に記載される患者の細胞の数またはレベルの測定によっても、医師の技術の範囲内である。このように、本発明は、処置が有効であり得るか否かもしくは有効であったか否か、および/または特定の処置が継続されるべきかもしくは中止されるべきかの判定の方法を提供する。いくつかの態様において、患者は、例えば、転移性腎細胞癌のような癌を有すると診断されている。
【００７１】
いくつかの態様において、癌を有すると診断された患者の有効な処置を判定するまたは確認する方法は、患者から血液のアリコートを得る工程；患者の血中に存在するTreg細胞、Treg/eff細胞、および/またはCTLの個数または（例えば、他のCD4+細胞に対する）パーセンテージを定量化する工程；DCを含む処置を該患者へ施す工程；ある間隔の後、患者の血中に存在する同一の型の細胞の個数を定量化する工程；ならびにその患者についての細胞の数または値が増加したか減少したかを評価する工程：を含む。このように、Treg数の減少、Treg/eff数の増加、および/またはCTL数の増加は、患者の免疫応答の指標または測定値として役立つ。いくつかの態様において、処置の所望の結果は、Treg細胞の減少が測定され得るよう；即ち、Treg数が少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、もしくは90％、またはそれ以上減少するよう、免疫応答が刺激されることである。これらの態様において、処置は、Treg数のそのような減少をもたらす場合、有効であると判定される。患者の進行または処置の有効性もしくは進行を評価するために、当技術分野において周知であるように、RECIST基準が使用されてもよい。いくつかの態様において、処置は、RECIST測定値を改善するか、患者群の全体生存期間を増加させるか、または1人もしくは複数人の患者についての無増悪生存をもたらす場合、有効であると判定される。
【００７２】
Tregの数もしくは値の決定および/またはTreg増殖の査定を含む測定のために、患者の血液試料を得る工程；インビトロで調製された自己成熟DCを該患者へ投与する工程；その後、処置後のTreg細胞の量、頻度、および/または増殖を判定するために、患者の血液試料を得る工程；ならびに処置後の患者の血中に存在するTreg細胞の量、頻度、および/または増殖を処置前の量と比較する工程であって、Treg細胞の顕著な減少および/または増殖の減少が、患者において免疫応答が誘導されたことを示す、工程を含む、癌患者における免疫応答を測定する方法も本発明によって提供される。
【００７３】
Treg/effの数もしくは値の決定を含む測定のために、患者の血液試料を得る工程；インビトロで調製された自己成熟DCを該患者へ投与する工程；その後、処置後のTreg/eff細胞の量および/または頻度を判定するために、患者の血液試料を得る工程；ならびに処置後の患者の血中に存在するTreg/eff細胞の量および/または頻度を処置前の量と比較する工程であって、Treg/eff細胞の顕著な増加および/または増殖中であるTreg/eff細胞の割合の顕著な増加が、患者において免疫応答が誘導されたことを示す、工程を含む、癌患者における免疫応答を測定する方法も本発明によって提供される。いくつかの態様において、Treg/effの数または値の決定は、（例えば、PBMCのような）患者の細胞をインビトロで培養した後に実施される。
【００７４】
樹状細胞ワクチンを患者へ投与するための適当な方法は、当技術分野において公知であり、複数の経路が、特定の細胞組成物を投与するために使用され得るが、しばしば、特定の経路が、他の経路より迅速で有効な反応を提供することができる。投与は、最終的に対象の血液細胞または組織細胞と接触するよう、細胞を成功裏に送達するために、当技術分野において公知の方法によって行われ得る。好ましい投与の経路には、皮内投与、リンパ節内投与、および静脈内投与が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【００７５】
薬学的に許容される担体は、一部分、投与される特定の組成物およびそれを投与するために使用される特定の方法によって決定される。従って、樹状細胞を含む薬学的組成物の極めて多様な適当な製剤が存在する。対象へ投与される細胞の用量は、時間と共に対象における所望の有益な治療的応答を達成するために、例えば、癌細胞の成長を阻害するために、または感染を阻害するために有効な量（即ち、「有効量」）である；しかしながら、完全な治癒が達成されないとしても、患者は、免疫応答の測定値の増加から利益を得ることができることを、当業者は認識する。
【００７６】
投与のために、樹状細胞ワクチンは、多数の対象および対象の健康全般に適用される、有効な用量によって、細胞型のLD-50（もしくは毒性のその他の測定値）によって、ならびに/または様々な濃度における細胞型の副作用によって決定される速度で、投与され得る。投与は、単回投与または分割投与を介して達成され得る。本発明の細胞は、細胞傷害性薬剤、ヌクレオチド類似体、および生物学的応答修飾剤を含む、公知の従来の治療による状態のその他の処置を補うことができる。同様に、生物学的応答修飾剤が、任意で、処置のために追加され；例えば、細胞は、任意で、アジュバント、またはGM-CSF、IL-12、もしくはIL-2のようなサイトカインと共に投与され得る。
【００７７】
PME-CD40L過程において使用されるIFNγRアゴニストは、IFNγまたはその生物学的活性断片であってよく、哺乳動物IFNγまたはヒトIFNγであってよい。ヒトIFNγのcDNA配列およびアミノ酸配列は、それぞれ、WO2007117682のSEQ ID NO:5および6に示されている。いくつかの態様において、IFNγは、WO2007117682のSEQ ID NO:6に示された配列またはその生物学的活性断片を有する。一つの態様において、IFNγRは、WO2007117682のSEQ ID NO:6との少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドを含む。好ましくは、IFNγRアゴニストは、WO2007117682のSEQ ID NO:6との少なくとも85％、90％、95％、97％、98％、または99％の配列同一性を有する。IFNγRアゴニストの活性を試験する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Magro et al.(2004)Br.J.Pharmacol.142:1281-92を参照すること）。未熟DCは、IFNγRアゴニストを培養培地に添加することによって、または樹状細胞においてIFNγRアゴニストを発現させることによってシグナリングされ得る。いくつかの態様において、DCには、WO2007117682のSEQ ID NO:6またはその生物学的活性断片のようなIFNγRアゴニストをコードするmRNAがトランスフェクトされる。次いで、樹状細胞におけるmRNAの翻訳によって、シグナリングが起こるであろう。IFNγRアゴニストは、未熟DCを含有している培養培地へ添加され得る。好ましい態様において、培養培地は、PGE2および/またはGM-CSF＋IL-4またはIL-13をさらに含む。
【００７８】
PME-CD40L DCを作製するために使用される第2のシグナルは、例えば、CD40LのようなCD40アゴニストによる一過性シグナルである。DCにCD40アゴニストをコードするmRNAが負荷される場合、またはCD40アゴニストを含有している培地がDCから除去される場合、そのシグナルは一過性と見なされる。従って、レンチウイルスベクターからのCD40Lの構成性発現のようなCD40アゴニストポリペプチドの持続的な発現は、一過性発現とは見なされない。CD40アゴニストシグナルは、（1）CD40アゴニスト発現を駆動するプロモーターがDCにおいて構成性でないか、または（2）発現ベクターがDCゲノムに組み込まれずDCにおいて複製されないことを条件として、DCに、CD40アゴニストをコードするRNAまたは発現ベクターが負荷される/トランスフェクトされる場合にも、一過性と見なされ得る。
【００７９】
PME-CD40L DCを調製するいくつかの方法において、CD40アゴニストは、CD40LポリペプチドまたはCD40アゴニスト抗体である。一般に、CD40に結合するリガンドは、CD40アゴニストとして作用することができ、例えば、CD40アゴニストは、CD40に結合するアプタマーであり得る。好ましくは、CD40アゴニストは、CD40LをコードするmRNAとして送達される。CD40L mRNAによる未熟DCまたは成熟DCのトランスフェクションによる、CD40Lを含む第2のシグナルの細胞への投与は、免疫抑制応答ではなく免疫刺激応答を誘導する修飾型PME-CD40L DCを生成する。
【００８０】
PME-CD40L DCを作製するために使用されるいくつかの方法において、CD40L-mRNAをトランスフェクトされた樹状細胞は、トランスフェクションの直後に、従って、有効量のCD40Lシグナルを生成するためのCD40L mRNAの翻訳の前に、IFNγ（および、任意で、PGE2）を含有している培地において培養される。この状況において、IFNγは、CD40L mRNAによるトランスフェクションの後に添加されるが、樹状細胞は、CD40L mRNAの翻訳に起因するシグナルの前にIFNγシグナルを受容する。従って、薬剤が細胞へ送達される順序は、CD40LシグナリングがIFNγシグナリングの後に起こらなければならないという点でのみ重要である。これらの方法において、DCのシグナリングは、インビボで起こってもよいし、またはエクスビボで起こってもよく、あるいは1種または複数種のシグナリング工程がエクスビボで起こり、方法の残りの工程がインビボで起こってもよい。
【００８１】
本明細書中で使用されるように、「CD40リガンド」（CD40L）には、CD40受容体を特異的に認識し、活性化し、その生物学的活性を活性化する任意のポリペプチドまたはタンパク質が包含される。その用語には、CD40Lの膜貫通型および可溶型が含まれる。好ましい態様において、CD40アゴニストは、哺乳動物CD40L、好ましくは、ヒトCD40Lである。ヒトCD40L cDNAおよび対応するアミノ酸の配列は、それぞれ、WO2007117682のSEQ ID NO:1および2に示されている。
【００８２】
PME-CD40L DCを調製するために使用されるいくつかの方法において、方法は、以下の連続的な工程：（a）IFNγRアゴニストによってシグナリングされた樹状細胞を作製するために、インターフェロンγ受容体（IFNγR）アゴニストおよびTNFαRアゴニストを含む第1のシグナルによって、単離された未熟樹状細胞（iDC）をシグナリングする工程；ならびに（b）CD83+CCR7+成熟樹状細胞を作製するために、IFNγRアゴニストによってシグナリングされた樹状細胞を、有効量のCD40Lポリペプチドを含む第2の一過性シグナルによってシグナリングする工程を含み、ここで、CD40Lポリペプチドは、WO2007117682のSEQ ID NO:2のアミノ酸残基21〜261から本質的になるか、またはWO2007117682のSEQ ID NO:2のアミノ酸残基21〜261との少なくとも80％の配列同一性を有するポリペプチドである。
【００８３】
PME-CD40L DCを調製するために使用されるいくつかの方法において、方法は、以下の連続的な工程：（a）CD83+成熟樹状細胞を作製するために、およそ12〜30時間、TNFαRアゴニストおよびPGE2の存在下で、インターフェロンγ受容体（IFNγR）アゴニストと共に、単離された未熟樹状細胞（iDC）を培養する工程；ならびに（b）CD83+CCR7+成熟樹状細胞を作製するために、第1の工程（a）のおよそ12〜30時間後に、WO2007117682のSEQ ID NO:2のアミノ酸残基21〜261からなるCD40LポリペプチドをコードするmRNAおよび1種または複数種の抗原をコードするmRNAを、CD83+成熟樹状細胞（mDC）にトランスフェクトする工程を含む。
【００８４】
PME-CD40L DCを作製するために使用される方法は、有効量の抗原を未熟DCまたは成熟DCへ送達する工程を含んでいてもよく、次いで、抗原は、成熟DCによってプロセシングされ提示される。抗原は、天然に存在するものであってもよいし、または組換え作製されてもよい。抗原は、当技術分野において公知の方法を使用して、ポリペプチドもしくはタンパク質として、またはそれらをコードする核酸として細胞へ送達され得る。いくつかの方法において、1種または複数種の抗原をコードする1種または複数種のポリヌクレオチドが、電気穿孔のような当業者に公知の方法によって、iDC、シグナリングされたDC、またはCCR7+成熟DCへ導入される。最も好ましくは、ポリヌクレオチドは、mRNAである。好ましい態様において、抗原または抗原をコードするmRNAは、CD40アゴニストをコードするmRNAと共に、またはCD40アゴニストシグナリングと実質的に同時に導入される。
【００８５】
樹状細胞に抗原を負荷する方法は、当業者に公知である。一つの態様において、樹状細胞が、抗原を含有している培地において培養される。次いで、DCが、抗原を取り込み、MHC分子と共に細胞表面上でプロセシングする。好ましくは、DCは、抗原をコードする核酸、例えば、mRNAによるトランスフェクションによって、抗原を負荷される。抗原をコードするmRNAが、DCへ導入されてよく、CD40LポリペプチドをコードするmRNAとともにコトランスフェクトされてもよい。DCにトランスフェクトする方法は、当業者に公知である。
【００８６】
抗原は、単一の公知の抗原であってもよいし、または抗原の集合物であってもよい。抗原の集合物は、例えば、患者の癌細胞もしくはHIV感染細胞のようなある特定の起源に由来してもよいし、または、例えば、数人の異なる患者に由来するHIV感染細胞のような数種の起源に由来してもよい。PME-CD40L DCを作製する方法において使用するための抗原には、病原体、病原体溶解物、病原体抽出物、病原体ポリペプチド、ウイルス粒子、細菌、タンパク質、ポリペプチド、癌細胞、癌細胞溶解物、癌細胞抽出物、および癌細胞特異的ポリペプチドに由来する抗原が含まれるが、これらに限定されるわけではない。例えば、PME-CD40L DCを作製する方法において使用され得る抗原には、例えば、MART-1のような周知の抗原が含まれる。
【００８７】
あるいは、抗原は、天然に存在する化合物とは異なる構造を有していてもよいし、または第1のポリペプチドに由来する配列の一部（例えば、第1の抗原）を、第2のポリペプチドに由来する配列の一部（例えば、第2の抗原、シグナル配列、膜貫通ドメイン、精製モエティ等）と、ペプチド結合によって連結することによって作製された融合タンパク質であってもよい。当業者は、本発明に従って使用するためのそのような融合タンパク質の多様性を理解するであろう。
【００８８】
好ましい態様において、樹状細胞へ提供される抗原は、癌細胞または病原体に由来する。癌細胞は、（例えば、腎細胞癌に由来する）腎臓癌細胞、多発性骨髄腫細胞、またはメラノーマ細胞を含む、任意の型の癌細胞であり得る。好ましい抗原には、HIVおよびHCVが含まれる。好ましい態様において、抗原は、癌細胞もしくは病原体もしくは病原体感染細胞（例えば、HIV感染細胞）から単離された、またはそれらに由来するRNAの形態で、DCへ送達される。細胞（例えば、癌細胞または病原体感染細胞）から抽出されたRNAのRT-PCR、およびインビトロ転写の方法は、WO2006031870（Nicoletteら）および米国特許出願公開第20070248578号（Tcherepanovaら）に開示されており、それらの内容は参照によって本明細書に組み入れられる。
【００８９】
本明細書および特許請求の範囲において使用されるように、単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」には、前後関係が他のことを明白に指示しない限り、複数の指示が含まれる。例えば、「1つの細胞（a cell）」という用語には、複数の細胞、例えば、それらの混合物が含まれる。
【００９０】
本明細書中で使用されるように、「含む」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他のものを排除しないことを意味するものとする。「から本質的になる」とは、組成物および方法を定義するために使用される時、組み合わせに対して本質的に重要な他の要素を排除することを意味する。従って、本明細書中に定義される要素から本質的になる組成物は、単離および精製の方法からの微量混入物、ならびにリン酸緩衝生理食塩水、保存剤等のような薬学的に許容される担体を排除しないであろう。「からなる」とは、微量を超える他の構成要素および実質的な方法工程を排除することを意味する。これらの移行用語の各々によって定義される態様は、本発明の範囲内にある。
【００９１】
「抗原」という用語は、当技術分野においてよく理解されており、免疫原性である物質、即ち、免疫原を含む。「抗原」または「免疫原」という用語は、複数種の免疫原の集合物に当てはまり、従って、複数種の免疫原に対する免疫応答が、同時にモジュレートされ得る。さらに、その用語には、免疫原または抗原の多様な異なる製剤のうちの任意のものが含まれる。「腫瘍関連抗原」、「腫瘍抗原」、または「TAA」という用語は、腫瘍に関連している抗原を指す。周知のTAAの例には、gp100、MART、およびMAGEが含まれる。他の腫瘍抗原は、特定の患者における特定の腫瘍に特異的であり得る。
【００９２】
「主要組織適合性複合体」または「MHC」という用語は、T細胞への抗原提示および迅速な移植片拒絶のために必要とされる細胞表面分子をコードする遺伝子の複合体を指す。ヒトにおいて、MHCは、「ヒト白血球抗原」または「HLA」複合体としても公知である。MHCによってコードされたタンパク質は、「MHC分子」として公知であり、当技術分野において周知であるように、クラスIおよびクラスIIのMHC分子へ分類される。
【００９３】
「抗原提示細胞（APC）」という用語は、免疫系の特異的エフェクター細胞によって認識可能なペプチド-MHC複合体の形態で、1種または複数種の抗原を提示することができ、それによって、提示されている抗原に対して有効な細胞性免疫応答を誘導することができる細胞のクラスを指す。APCは、マクロファージ、B細胞、内皮細胞、活性化T細胞、および樹状細胞のような無傷の完全細胞であり得る。多くの型の細胞が、T細胞認識に関して、細胞表面上に抗原を提示することができるが、樹状細胞のみが、細胞傷害性Tリンパ球（CTL）応答のためにナイーブT細胞を活性化するように、抗原を提示する能力を有する。
【００９４】
「樹状細胞」という用語（本明細書中、「DC」とも）は、多様なリンパ系組織および非リンパ系組織に見出される形態学的に類似の細胞型の多様な集団を指す（例えば、Steinman(1991)Ann.Rev.Immunol.9:271-296を参照すること）。樹状細胞は、生物における最も強力で好ましいAPCを構成する。DCは、単球から分化することができるが、表現型的に単球と異なる；例えば、CD14抗原は、樹状細胞には見出されないが、単球によって発現されている。また、成熟樹状細胞は食作用性でないが、単球は強力な貪食細胞である。成熟DCは、T細胞の活性化および増殖のために必要な全てのシグナルを提供し得ることが示されている。
【００９５】
「免疫エフェクター細胞」という用語は、抗原に結合することができ免疫応答を媒介する細胞を指す。これらの細胞には、T細胞、B細胞、単球、マクロファージ、NK細胞、および細胞傷害性Tリンパ球（CTL）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。「ナイーブ」免疫エフェクター細胞とは、その細胞を活性化することができる抗原に曝されたことがない免疫エフェクター細胞である。ナイーブ免疫エフェクター細胞の活性化は、細胞が、増殖し、抗原特異的武装エフェクターT細胞へ分化するために、ペプチド:MHC複合体の認識、およびプロフェッショナルAPCによる共刺激シグナルの同時送達の両方を必要とする。
【００９６】
本明細書中で使用されるように、「教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞」という用語は、以前に抗原に遭遇したことがある前記定義の免疫エフェクター細胞である。そのナイーブカウンターパートとは対照的に、教育された抗原特異的免疫エフェクター細胞の活性化は、共刺激シグナルを必要とせず；ペプチド:MHC複合体の認識で十分である。
【００９７】
「活性化された」とは、T細胞に関して使用される時、細胞が、もはやG0期になく、その細胞型（例えば、CD8+またはCD4+）に特徴的なサイトトキシン、サイトカイン、およびその他の関連膜会合型タンパク質のうちの1種または複数種を産生し始めており、特定のペプチド/MHC複合体を表面上に呈示する標的細胞を認識し、それに結合し、エフェクター分子を放出することができることを意味する。
【００９８】
「免疫応答」とは、広範囲に、外来物質に対するリンパ球の抗原特異的応答を指す。免疫応答を誘発することができる任意の物質が、「免疫原性」であると言われ、「免疫原」と呼ばれる。免疫応答は、（抗体活性を介した）体液性、または（T細胞活性化を介した）細胞性であり得る。本明細書中で使用されるように、「対象における免疫応答の誘導」または対象において免疫応答を誘導すること、とは、当技術分野において理解されており、抗原が対象へ導入された後、抗原が対象へ導入される前の免疫応答（存在する場合）と比べて、少なくとも約2倍、あるいは少なくとも約5倍、あるいは少なくとも約10倍、あるいは少なくとも約100倍、あるいは少なくとも約500倍、あるいは少なくとも約1000倍、またはそれ以上の、抗原に対する免疫応答の増加が検出され得るかまたは測定され得ることを指す。いくつかの態様において、処置前に対象が示した抗原に対する免疫応答と比較して、少なくとも20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、またはそれ以上、免疫応答が増加する場合、その処置は、その対象において抗原に対する免疫応答を誘導したと見なされる。抗原に対する免疫応答には、抗原特異的抗体の産生または抗原特異的抗体の産生の増加；同定可能な免疫細胞型の量または頻度の増加または減少；および抗原と特異的に結合する分子を表面上に発現している免疫細胞の生成：が含まれるが、これらに限定されるわけではない。ある抗原に対する免疫応答が誘導されたか否かを判定する方法は、当技術分野において周知である。例えば、ELISAアッセイを含むが、これに限定されるわけではない、当技術分野において公知の多様なイムノアッセイのいずれかを使用して、抗原特異的抗体を検出することができる。
【００９９】
本明細書中で使用されるように、「サイトカイン」という用語は、例えば、成長または増殖の誘導を含む、多様な効果を細胞に対して発揮する多数の因子のうちの任意のものを指す。本発明の実施において単独でまたは組み合わせて使用され得るサイトカインの非限定的な例には、インターロイキン2（IL-2）、インターロイキン12（IL-12）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）が含まれる。サイトカインは、容易に商業的に入手可能であり、「天然の」精製されたサイトカインであってもよいし、または組換え作製されてもよい。
【０１００】
「ポリヌクレオチド」、「核酸」、および「核酸分子」という用語は、任意の長さのヌクレオチドのポリマー型を指すために、交換可能に使用される。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、および/またはそれらの類似体を含有していてよい。「ポリヌクレオチド」という用語には、例えば、遺伝子または遺伝子断片、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離されたDNA、任意の配列の単離されたRNA、核酸プローブ、およびプライマーが含まれる。本明細書中で使用されるように、mRNAとは、樹状細胞において翻訳され得るRNAを指す。そのようなmRNAは、典型的には、キャッピングされており、リボソーム結合部位（コザック配列）および翻訳開始コドンを有する。本明細書中で使用されるように、cDNA配列に対応するRNAとは、ヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドの代わりにリボヌクレオチドであり、DNAにおけるチミン（T）塩基がRNAにおいてはウラシル（U）塩基に置換されていることを除き、cDNA配列と同一の配列を有するRNA配列を指す。
【０１０１】
「ペプチド」という用語は、2個以上のサブユニットアミノ酸、アミノ酸類似体、またはペプチドミメティクス（peptidomimetics）の化合物を指すために、最も広義に使用される。サブユニットは、ペプチド結合によって連結されていてもよいし、または、いくつかの態様において、他の結合、例えば、エステル、エーテル等によって連結されていてもよい。本明細書中で使用されるように、「アミノ酸」という用語は、グリシンならびにD光学異性体およびL光学異性体の両方、アミノ酸類似体、ならびにペプチドミメティクスを含む、天然アミノ酸および/または非天然もしくは合成のアミノ酸のいずれかを指す。3アミノ酸以上のペプチドは、一般的に、ペプチド鎖が比較的短い場合には、オリゴペプチドと呼ばれ、ペプチド鎖が長い場合には、ペプチドは、一般的に、ポリペプチドまたはタンパク質と呼ばれる。
【０１０２】
ポリペプチドまたはタンパク質に対する「保存的改変」とは、電荷密度、親水性もしくは疎水性、サイズ、および/または配置が類似している別のアミノ酸をもたらすもの（例えば、ValとIle）である。対照的に、「非保存的改変」とは、電荷密度、親水性もしくは疎水性、サイズ、および/または配置が異なる別のアミノ酸をもたらすもの（例えば、ValとPhe）である。そのような修飾を作成する手段は、当技術分野において周知である。
【０１０３】
「遺伝学的に修飾された」という用語は、細胞またはその子孫の遺伝子型または表現型を修飾する外来の遺伝子または核酸配列を含有しておりかつ/または発現していることを意味する。換言すると、それは、細胞の内因性ヌクレオチドの付加、欠失、または破壊を指す。
【０１０４】
本明細書中で使用されるように、ポリヌクレオチドの「発現」とは、ポリヌクレオチドがmRNAへ転写され、mRNAがペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質へ翻訳される過程を指す。ポリヌクレオチドが適切な真核生物宿主のゲノムDNAに由来する場合、発現は、mRNAのスプライシングを含み得る。発現のために必要とされる制御要素は、当技術分野において公知であり、RNAポリメラーゼに結合するプロモーター配列およびリボソーム結合のための転写開始配列を含む。細菌および/または真核生物における発現のための適切なベクターは、当技術分野において公知であり、商業的に入手可能である。
【０１０５】
「転写調節下」とは、当技術分野において理解されている用語であり、ポリヌクレオチド配列（一般的に、DNA配列）の転写が、転写の開始に寄与するかまたは転写を促進する要素との機能的な連結に依存することを示す。「機能的に連結された」とは、要素が、それらが機能することが可能であるよう配置されている並置を指す。
【０１０６】
「遺伝子送達媒体」とは、挿入されたポリヌクレオチドを宿主細胞へ運搬することができる分子として定義される。遺伝子送達媒体の例には、多様な真核生物および原核生物の宿主における発現について記載されている、当技術分野において使用されているリポソーム、生体適合性ポリマー、およびその他の組換え媒体が含まれる。「遺伝子送達」、「遺伝子移入」、「トランスフェクション」等は、本明細書中で使用されるように、導入のために使用される方法に関わらず、外因性ポリヌクレオチドの宿主細胞への導入を指す。トランスフェクションとは、細胞の内部への核酸の送達を指し、電気穿孔；タンパク質に基づく核酸送達複合体、脂質に基づく核酸送達複合体、および陽イオンに基づく核酸送達複合体；ウイルスベクター；「遺伝子銃」送達；ならびに当技術分野において公知の様々なその他の技術のような、多様な技術を含み得る。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定的に維持されてもよいし、または一過性発現されてもよい。好ましい態様において、mRNAが、DCへ導入され、一過性発現される。安定的な維持は、典型的には、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の複製開始点を含有しているか、または染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）または核もしくはミトコンドリアの染色体のような宿主細胞のレプリコンへ組み込まれることを必要とする。多数のベクターが、哺乳動物細胞への遺伝子の移入を媒介することができ、当技術分野において公知である。
【０１０７】
ポリヌクレオチドもしくはその一部分（またはポリペプチドもしくはその一部分）の配列は、別の配列との「配列同一性」のある程度のパーセンテージ（例えば、80％、85％、90％、または95％）を有し、2種の配列が整列化され比較された時、そのパーセンテージの塩基またはアミノ酸が同一である。2種の配列の的確なアライメントおよびパーセント配列同一性は、例えば、「BLAST」のような、周知の公に利用可能なアライメントプログラムのうちの一つをデフォルトパラメータによって使用して決定され得る。
【０１０８】
「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片が、自然界で通常会合している細胞構成物およびその他の構成物から分離されていることを意味する。例えば、単離されたポリヌクレオチドは、染色体において通常会合している5'配列および3'配列から分離されたものである。樹状細胞のような哺乳動物細胞は、生物においてそれが見出される解剖学的部位から除去されている場合、その生物から単離されている。さらに、「濃縮された」、「分離された」、または「希釈された」ポリヌクレオチド、ペプチド、ポリペプチド、タンパク質、抗体、またはそれらの断片は、体積当たりの分子の濃度または個数が、その天然に存在するカウンターパートより大きいため、その天然に存在するカウンターパートと区別可能である。
【０１０９】
「宿主細胞」、「標的細胞」、または「レシピエント細胞」には、外因性の核酸分子、ポリヌクレオチド、および/またはタンパク質のベクターまたは組み込みのためのレシピエントになり得るかまたはそうであった任意の個々の細胞または細胞培養物が含まれるものとする。それには、単一の細胞の子孫が含まれるものとする。いくつかの場合において、子孫細胞は、天然の、偶然の、または意図的な変異により、（形態学またはゲノムもしくは全DNA相補体が）最初の親細胞と完全には同一でない可能性がある。細胞は、原核生物であってもよいしまたは真核細胞であってもよく、細菌細胞、酵母細胞、動物細胞、および哺乳動物細胞、例えば、マウス、ラット、サル、またはヒトを含むが、これらに限定されるわけではない。
【０１１０】
「対象」または「患者」は、哺乳動物であり；多くの態様において、患者は、ヒト患者である。対象または患者は、サルもしくは類人猿、またはイヌ、ネコ、ウマ等のような家畜を含む、任意の他の哺乳動物であってもよい。
【０１１１】
「癌」とは、比較的自律的な成長を示す細胞の異常な存在を意味し、従って、癌細胞は、細胞増殖調節の顕著な喪失を特徴とする異常な成長表現型を示す（即ち、腫瘍性である）。癌細胞は、良性または悪性であり得る。様々な態様において、癌は、膀胱、血液、脳、乳房、結腸、消化管、肺、卵巣、膵臓、前立腺、または皮膚の細胞に影響を与える。癌細胞の定義には、本明細書中で使用されるように、原発癌細胞のみならず、転移した癌細胞、インビトロ培養物、および癌細胞に由来する細胞株を含む、癌細胞祖先に由来する細胞も含まれる。癌には、固形腫瘍、液性腫瘍、血液悪性疾患、腎細胞癌、メラノーマ、乳癌、前立腺癌、精巣癌、膀胱癌、卵巣癌、子宮頸癌、胃癌、食道癌、膵臓癌、肺癌、神経芽細胞腫、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、白血病、骨髄腫、リンパ腫、肝細胞腫、腺癌、肉腫、細胞腫、芽細胞腫等が含まれる。固形腫瘍として通常出現する型の癌に言及する時、「臨床的に検出可能な」腫瘍とは、例えば、CATスキャン、磁気共鳴画像法（MRI）、X線、超音波、または触診のような手法によって、腫瘍塊に基づき検出可能であるものである。生化学的または免疫学的な所見は、単独では、この定義を満たすために不十分であり得る。
【０１１２】
「培養すること」という用語は、適当な培地における細胞のインビトロの維持、分化、および/または繁殖を指す。
【０１１３】
「濃縮された」とは、例えば、生物においてそれらが存在する組織、またはそれらが以前に存在していた細胞の群、混合物、もしくは培養物のような、別の組成物に見出されるより高い全細胞に対するパーセンテージで存在する細胞を含む組成物を意味する。組成物（例えば、培地または保存緩衝液のアリコート）中の「濃縮された」細胞は、その組成物中の細胞の10％、20％、30％、40％、50％、60％、または70％を超えるものとして存在する。同様に、細胞は、特定の細胞型の細胞（例えば、Treg細胞）が、組成物（例えば、培地または保存緩衝液のアリコート）中の細胞の30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、または95％、または99％を超えるものとして存在する場合、「精製されている」または「単離されている」と見なされる。反対に、「枯渇している」とは、その細胞型の頻度が、特定の組成物または細胞の群において、例えば、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、もしくは90％、またはそれ以上、または100％減少していることを意味する。「濃縮すること」または「濃縮」とは、本明細書中で使用されるように、細胞の集団もしくは群から、選択的にもしくは優先的に取り出すためのポジティブ選択を使用して、細胞が「濃縮される」こと、または所望の細胞型が残存するよう、出発時の細胞の集団もしくは群から、他の細胞を、選択的にもしくは優先的に除去するためのネガティブ選択を使用して、細胞が「濃縮される」ことを意味する。ポジティブ選択および/またはネガティブ選択は、当技術分野において公知の材料および技術を使用して容易に達成され得る。例えば、特定の細胞表面マーカーを発現する細胞は、カラムまたは磁気ビーズにカップリングされた、マーカーに結合するモノクローナル抗体を使用して、他の細胞から分離され得；分離は、標準的な技術および/または製造業者もしくは供給元の指示に従って容易に実施される。
【０１１４】
（時に、本明細書中で「マーカー」または「細胞マーカー」と呼ばれる）「細胞表面マーカー」とは、任意の適当な方法を使用して、例えば、当技術分野において公知の標識された抗体またはその他の手段を使用して検出され得る、細胞の表面上に発現された分子を意味する。細胞表面マーカーには、タンパク質、糖タンパク質、またはタンパク質および/もしくは糖タンパク質の群が含まれ得る。いくつかの場合において、細胞表面マーカーは、特定の細胞型または1種もしくは複数種の細胞機能と相関するか、またはそれらの指標となることが公知である。ある種の細胞集団は、マーカーの特定のセットもしくは組み合わせ、またはその何らかのサブセットの発現によって同定され得る。
【０１１５】
細胞表面マーカーまたはその他のマーカーに関して、「陽性発現」または「について陽性」とは、本明細書中で使用されるように、一般に、マーカーが、細胞上で、または細胞の群もしくは細胞の集団において、検出可能なレベルで発現されていることを意味する。いくつかの場合において、「陽性発現」または「について陽性」とは、他の細胞もしくは他の細胞の群もしくは集団との比較によって評価され得るか、またはバックグラウンド、低い、もしくは陰性として同定された選択された発現レベルであり得る、バックグラウンドレベルまたは「低い」もしくは「陰性の」レベルより、顕著に高いレベルで、特定の細胞表面マーカーを発現する細胞を指すために使用される。マーカーの発現を検出する技術、および「陽性」発現を「バックグラウンド」または「陰性」の発現と区別する発現レベルを決定する技術は、当業者に周知である。特定のマーカーについて「陽性発現」を有するかまたは「陽性」である細胞は、バックグラウンド発現より少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、100％、150％、200％、300％、400％、もしくは500％高いか、またはバックグラウンドの、低い、または陰性の発現の少なくとも10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、もしくは100倍、もしくはそれ以上である発現を示し得る。いくつかの態様において、マーカーは、細胞内で発現されるが、発現は、当技術分野において公知の技術を使用して検出可能である。一般に、マーカーの発現は、例えば、本明細書中の実施例に記載され、当技術分野において公知の実験によって証明されるように、製造業者または供給元の指示に従って、FACS装置を使用して測定され得る、蛍光標識またはその他の標識にカップリングされた、マーカーに結合するモエティ（例えば、抗体）によって検出される（例えば、Hasan et al.(2015)Clin.Immunol.157:261-76を参照すること）。
【０１１６】
「薬学的組成物」には、組成物をインビトロまたはインビボでの診断的または治療的な使用のために適当なものにする、活性薬剤と不活性担体または活性担体との組み合わせが含まれるものとする。「薬学的に許容される担体」という用語には、リン酸緩衝生理食塩水溶液、水、および水中油型または油中水型のエマルジョンのようなエマルジョン、ならびに様々な型の湿潤剤のような、標準的な薬学的担体のうちの任意のものが包含される。組成物は、安定剤および保存剤も含んでいてよい。担体、安定剤、および佐剤の例については、Martin,Remington's Pharmaceutical Sciences,18th Ed.(Mack Publ.Co.,Easton(1990)）を参照すること。
【０１１７】
「有効量」とは、増強された免疫応答、医学的状態（疾患、感染等）の処置、防止、または寛解のような、有益なまたは所望の結果を生じるために十分な量である。有効量は、1種または複数種の投与、適用、または投薬量で投与され得る。適当な投薬量は、体重、年齢、健康、処置される疾患または状態、および投与の経路に依って変動するであろう；有効量を決定する方法は、当技術分野において公知である。陽性免疫応答は、例えば、それがない場合より他の処置が有効であるよう、患者の免疫応答を強化することによって、患者における癌が完全には治癒しないとしても、患者（例えば、癌患者）へ利益を提供し得ることが、当業者によって理解される。
【０１１８】
本明細書中で使用されるように、「シグナリング」とは、未熟樹状細胞または成熟樹状細胞を、IFNγ受容体アゴニスト、TNFα受容体アゴニスト、CD40Lポリペプチドまたはその他のCD40アゴニストと接触させることを意味する。一つの態様において、そのようなアゴニストは、外部に（例えば、細胞培養培地に）提供される。別の態様において、ポリペプチドアゴニストは、ポリペプチドをコードする核酸による未熟樹状細胞または成熟樹状細胞のトランスフェクションを介して提供される。ポリペプチドをコードする核酸を樹状細胞にトランスフェクトすることによってポリペプチドが提供されるケースにおいて、シグナリングは、核酸によるトランスフェクションによってではなく、ポリペプチドをコードするmRNAの翻訳によってもたらされる。本明細書中で使用されるように、「成熟樹状細胞」という用語は、未熟DC（iDC）と比較して上昇した共刺激分子CD83の細胞表面発現を示す樹状細胞を意味する。
【０１１９】
本明細書中で使用されるように、「顕著な差」という用語は、測定されたパラメータの増加または減少が、適切な統計試験を使用して決定されるように、統計的に有意であることを意味する。そのような方法は、当技術分野において公知であり、的確な試験は当業者によって容易に選択される。
【０１２０】
本開示全体において、様々な公開、特許、および公開された特許明細書が、同定する引用によって参照される。これらの公開、特許、および公開された特許明細書の開示は、本発明が属する技術分野の状態をより完全に説明するために、参照によって具体的に本開示に組み入れられる。
【０１２１】
本発明の実施は、他に示されない限り、当業者によって容易に実施され得る、（組換え技術を含む）分子生物学、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を利用する。そのような技術は、当技術分野において公知であり、文献中に説明されている。前記の説明によると、以下の実施例は、本発明の様々な局面を例示するためのものであって、限定するためのものではない。
【実施例】
【０１２２】
実験実施例
実施例1
DC成熟過程および評価
本質的にAmin et al.(2015)J.Immunother.Cancer 3:14に記載されたように、PME-CD40L樹状細胞（DC）を調製した（本明細書中、「AGS-003」または「AGS-003 DC」と呼ばれる）。簡単に説明すると、腎摘除術または転移巣摘除術の組織試料から自己腫瘍全RNAを単離し、Slagter-Jager et al.(2013)Mol.Ther.Nucl.Acids 2013:2e91に以前に記載されたようなRT/PCRおよびインビトロ転写技術を使用して、メッセンジャーRNAを増幅した。Tcherepanova et al.(2008)PLoS One 3(1):e1489に記載されたようなインビトロ転写および転写後キャッピング法を使用して、CD40L RNAを製造した。患者は、COBE Spectra（登録商標）白血球アフェレーシス系（Gambro BCT,Lakewood,CO）を使用して、臨床現場のドナーセンターにおいて白血球アフェレーシスを受けた。単球を、GM-CSF（Berlex）およびIL-4（R&D Systems）を含むAIM-V培地において培養して、未熟DCを発生させ、次いで、それをTNFα（R&D Systems）、IFNγ（InterMune）、およびプロスタグランジンE2（Sigma）を使用して成熟させた。成熟後電気穿孔プロトコル（Calderhead et al.(2008)J.Immunother.31:731-41）を使用して、成熟DCに、増幅された腫瘍RNAおよびCD40L RNAを電気穿孔で導入した。
【０１２３】
80％自己血漿、10％デキストロース（50％w/v）（Hospira）、および10％DMSO（Sigma）中、1.4×107 DC/0.7mLとして、最終AGS-003生成物を製剤化し、液体窒素蒸気相において凍結保存した。最終生成物の解凍された試料を、臨床使用のためのリリースの前に、無菌性、マイコプラズマ、エンドトキシン、および生存度について査定した。
【０１２４】
フローサイトメトリー分析のために、DCを採集し、冷PBS/1％FCSに再懸濁させ、次いで、CD1a、CD209、ヒト白血球抗原（HLA）-ABC、HLA-DR、CD80、CD86、CD38、CD40、CD25、CD123、CD83、CCR6、CCR7、CD70、およびCD14に対して特異的な、フィコエリトリン（PE）またはFITCとコンジュゲートした抗体と混合した；アイソタイプ一致抗体を対照として使用した。充分に洗浄した後、LSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences（商標））およびFlowJoソフトウェア（Treestar）による蛍光分析を実施した。DCの走化性を、8μmの孔サイズのポリカーボネートフィルターを通した遊走によって測定した。DC上清中のIL-10およびIL-12の濃度を、ELISAを使用して決定した。
【０１２５】
実施例2
AGS-003はTregエフェクター細胞を生成する
Argos Therapeutics,Inc.の臨床試験（「ADAPT治験」）において、本質的にAmin et al.(2015)J.Immunother.Cancer 3:14に記載されたように、腎細胞癌（RCC）患者が自己樹状細胞治療AGS-003によって処置された。患者T細胞の集団に対するこの治療の効果を、CD3、CD4、CD25、CD127を含む多様な細胞表面表現型マーカーの発現およびFoxP3を含むマーカーの細胞内発現を査定するためのマルチカラーフローサイトメトリーを使用してモニタリングした。
【０１２６】
AGS-003による処置の前に患者から得られた患者PBMCを、AGS-003と共にインビトロで培養し、次いで、マルチカラーフローサイトメトリーを使用して査定した。以下に提示されるデータは、処置前に収集された患者PBMCは、制御性T細胞（「Treg」）を含有しているが、AGS-003 DC生成物とのインビトロ培養によって、Tregエフェクター（Treg/eff）細胞が生成されることを示している。Tregエフェクター細胞は、PD-1の発現およびCXCR4の発現欠如によって、「古典的」Tregと異なる。さらに、AGS-003 DC生成物によるインビトロでの患者PBMCの刺激は、Tregエフェクター細胞の増殖を誘導し、古典的Treg細胞の増殖は誘導しない。
【０１２７】
ADAPT患者におけるT細胞の研究。抑制活性を有する制御性T細胞は、CD3+/CD4+/CD25+/CD127-/FoxP3+である。FoxP3発現は、炎症誘発エフェクター機能を有するCD3 T細胞の初期活性化マーカーでもあるため、本発明は、特定の作用機序によって限定されないが、AGS-003のインビボ投与は、FoxP3+ Treg細胞の機能を抑制機能から炎症誘発機能へシフトさせる可能性がある。AGS-003によって処置された患者から集められたデータは、FoxP3+ Treg/eff細胞が、AGS-003樹状細胞（DC）と共にインビトロで培養された時、増殖することを示唆している。これらのAGS-003によって誘導されたTreg/eff細胞は、PD-1の陽性発現およびケモカイン受容体CXCR4の陰性発現（即ち、発現欠如）によって、「古典的」Tregと異なる。従って、「Treg/eff」という表記は、AGS-003 DCとの培養の後に増殖することができる活性化されたCD4+/FoxP3+/PD-1+/CXCR4- T細胞の新規集団を同定するために、本明細書中で使用される。
【０１２８】
末梢全血収集物中の制御性T細胞の個数を決定する方法。少量の全血をヘパリン硫酸チューブに収集し、抗CD3抗体、抗CD25抗体、抗CD4抗体、および抗CD127抗体を含む、蛍光色素とコンジュゲートした抗体のカクテルによって染色した。染色後、赤血球を溶解し、標識された細胞を固定し、透過処理した。透過処理された細胞において、蛍光コンジュゲート抗FoxP3抗体を使用して、細胞内FoxP3発現を検出した。標識された細胞を、固定された体積でTrucountビーズチューブ（BD Biosciences）に添加し、細胞イベントをフローサイトメーターで収集した。Treg細胞の個数を、細胞の個数/100マイクロリットル全血として表す。
【０１２９】
インビトロPBMC培養物中の制御性T細胞の個数を決定する方法。インビトロ培養後、PBMCを、抗CD3抗体、抗CD25抗体、抗CD4抗体、および抗CD127抗体を含む、蛍光色素コンジュゲート抗体のカクテルによって染色した。付加的なコンジュゲート抗体（例えば、抗PD-1および抗CXCR4）を、その他の細胞表面マーカーを染色するために、カクテルに添加してもよい。次いで、細胞を固定し、透過処理し、蛍光コンジュゲート抗FoxP3抗体を使用して、FoxP3の発現を検出した。増殖中の細胞の個数を測定するために、抗Ki67のような付加的なコンジュゲート抗体を、固定された/透過処理された細胞に添加してもよい（例えば、図3に示されたデータを参照すること）。標識された細胞を、固定された体積でTrucountビーズチューブ（BD Biosciences（登録商標））に添加し、細胞イベントをフローサイトメーターで収集した。制御性T細胞の個数を、細胞の個数/mL培養物として表す。
【０１３０】
全血中の制御性T細胞を同定するためのゲーティング戦略。図1は、全血中の制御性T細胞を同定するためのマルチカラーフローサイトメトリーゲーティング戦略を示す。CD3+ T細胞を、FoxP3+細胞およびCD4+細胞を同定するためにゲーティングし、次いで、FoxP3+/CD4+/CD25+/CD127- Treg細胞の集団を定量化すべく、CD25+細胞およびCD127-細胞を同定するために、それをさらにゲーティングした。制御性T細胞の個数をTrucountビーズチューブ（BD Biosciences（登録商標））を使用して決定し、細胞の個数/100マイクロリットル全血として表した。
【０１３１】
PD-1およびCXCR4の発現によるFoxp3+/CD25+ Tregサブセットのインビトロ検出（図2に示されたデータ）。ADAPT臨床試験において、2回目の来院時（AGS-003の投与前）および12回目の来院時（AGS-003の7回投与後）に、PBMCを患者から収集し、10％AB血清を含有しているXvivo培地において6日間培養した。付加的な刺激は培養物に添加しなかった。6日目に、活性化されたFoxP3+/CD25+/CD4+ T細胞の個数を決定するためのフローサイトメトリーのために、PBMC培養物を染色した。まず、CD25+/CD45RA- T細胞を同定するために、CD4+ T細胞をゲーティングし、次いで、Treg細胞をTreg/eff細胞と区別すべく、PD-1の発現およびCD4の発現レベルを決定するために、これらの細胞をゲーティングした。Treg細胞を、CD4低発現PD-1-細胞として同定し、Treg/eff細胞を、CD4高発現PD-1+細胞として同定した。次いで、これらのTreg集団およびTreg/eff集団の各々を、FoxP3およびCXCR4の発現によってサブゲーティングした。（図1に提示された）データは、PD-1+、CD4高発現、およびFoxP3+として同定されたTreg/eff細胞が、CXCR4陰性であり、PD-1-、CD4低発現、およびFoxP3+として同定されたTreg細胞が、CXCR4陽性であることを示した。従って、このゲーティング戦略は、2種のFoxP3+細胞サブセット：Treg/eff（Foxp3+/PD-1+CXCR4-）およびTreg（Foxp3+/PD-1-CXCR4+）を定義した。このように、古典的Treg細胞およびTreg/eff細胞は、PD-1およびCXCR4のコンビナトリアル発現によって識別され：古典的Treg細胞は、PD-1-/CXCR4+であり、Tregエフェクター細胞は、PD-1+/CXCR4-である。これらのデータは、AGS-003 DC生成物のインビボ投与が、インビトロでの培養物の増大後、Tregエフェクター細胞の個数を増加させ得ることも示している。
【０１３２】
CD4+/PD-1+FoxP3+ T細胞（Treg/eff細胞）は、AGS-003 DC生成物によって刺激された時、インビトロで増殖する（図3に示されたデータ）。1回目の来院（ベースライン）時にADAPT治験患者から収集されたPBMCを、10:1比で、自己AGS-003 DC生成物と共に、10％AB血清を含有しているXvivo培地において6日間培養した。フローサイトメトリーをTreg/eff細胞（CD4+CD25+PD-1+FoxP3+）を同定するために使用し、次いで、増殖を調査するために、細胞を細胞周期マーカーKi67によって染色した。図3に示されるように、Treg/eff細胞は、増殖を示すKi67について陽性であった。対照的に、Treg細胞（CD4 lo/CD25+/PD-1-/FoxP3+）は、主として、Ki67の発現についての染色の欠如を示し、増殖中でないことが示された。従って、患者細胞のAGS-003 DC生成物との共培養は、Treg/eff細胞の増殖を誘導したが、Treg細胞の増殖は誘導しなかった。
【０１３３】
図4は、PBMCのAGS-003 DC自己生成物とのインビトロ培養が、Treg/eff細胞およびCTLの同時の増大を生じることを示す。PBMCを15人の臨床試験（「ADAPT」）対象からベースライン時に収集し、自己AGS-003 DC生成物と共にインビトロで6日間培養した。6日目に、溶解性CTL（CD3+/CD8+/CD25+/CD45RA-/GrB+細胞）の個数を決定し、Treg/eff細胞（CD3+/CD4+/CD25+CD45RA-/PD-1+/Foxp3+細胞；図4を参照すること）の個数に対してプロットした。培養物中のCTLの個数とTreg/eff細胞の個数との間に統計的に有意な関連が検出された（ρ＝0.59、p＜0.0208）。従って、本発明は、特定の作用機序に限定されず拘束されないが、AGS-003 DC生成物は、少なくとも一部分、CTLおよびTreg/effの両方の増大を引き起こすことによって免疫応答を刺激する可能性がある。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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