(57)【要約】  本発明は、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列を含むタンパク質、それらのタンパク質をコードする遺伝子発現構築物、それらのタンパク質を発現する細胞ならびにそれらのタンパク質、遺伝子発現構築物および細胞の医薬製剤ならびに癌を含む種々のヒト疾患の処置における使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１×１０-６Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１と結合するＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻害する、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列を含むタンパク質。
【請求項２】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドが、一般式（Ｉ）
ＦＲ１−（Ｘａａ）ｎ−ＦＲ２−（Ｘａａ）ｍ−ＦＲ３  （Ｉ）
［式中、
ＦＲ１は、ＭＩＰＧＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡ（配列番号１）で示されるポリペプチド配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド配列であり；
ＦＲ２は、ＧＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦＫＳＬ（配列番号２）で示されるポリペプチド配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド配列であり;
ＦＲ３は、ＥＤＬＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ（配列番号３）で示されるポリペプチド配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド配列であり；
Ｘａａは、その存在毎に個別に、アミノ酸残基であり；そして
ｎおよびｍはそれぞれ独立して、３から２０までの整数である］
で示されるアミノ酸配列を有する、請求項１記載のタンパク質。
【請求項３】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドが、一般式：
ＭＩＰ−Ｘａａ１−ＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡ−（Ｘａａ）ｎ−Ｘａａ２−ＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−（Ｘａａ）ｍ−Ｘａａ６−Ｄ−Ｘａａ７−ＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ (配列番号４)
［式中、
Ｘａａは、その存在毎に個別に、アミノ酸残基であり；
ｎおよびｍはそれぞれ独立して、３から２０までの整数であり；
Ｘａａ１は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａａ３は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａａ４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａａ５は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏであり；
Ｘａａ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；そして
Ｘａａ７は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＬｙｓである］
で示されるアミノ酸配列を有する、請求項２記載のタンパク質。
【請求項４】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドが、一般式：
ＭＩＰＲＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡ−（Ｘａａ）ｎ−ＳＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦＮＧＰ−（Ｘａａ）ｍ−ＡＤＲＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ (配列番号５)
［式中、
Ｘａａは、その存在毎に個別に、アミノ酸残基であり；そして
ｎおよびｍはそれぞれ独立して、３から２０までの整数である］
で示されるアミノ酸配列を有する、請求項２記載のタンパク質。
【請求項５】
（Ｘａａ）ｎが、一般式（ＩＩ）
−ａａ１−ａａ２−ａａ３−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ａａ４−ａａ５−Ｔｒｐ−ａａ６−（ＩＩ）
［式中、
ａａ１は、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ２は、アミノ酸残基、好ましくは中性極性もしくは非極性側鎖、または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは小さい脂肪族側鎖、中性極性側鎖または塩基性もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ３は、芳香族側鎖または塩基性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ４は、中性極性側鎖もしくは非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ５は、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖、あるいは小さい脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；そして
ａａ６は、芳香族側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表す］
で示されるアミノ酸配列である、請求項２、３または４記載のタンパク質。
【請求項６】
（Ｘａａ）ｎが、一般式（ＩＩＩ）
−ａａ１−ａａ２−ａａ３−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ａａ４−ａａ５−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−（ＩＩＩ）
［式中、
ａａ１は、塩基性側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ２は、アミノ酸残基、好ましくは中性極性もしくは非極性側鎖、または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは小さい脂肪族側鎖、中性極性側鎖または塩基性もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ３は、芳香族側鎖または塩基性側鎖を有するアミノ酸残基を表し、好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＨｉｓであり、より好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐもしくはＨｉｓであり、さらにより好ましくは、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓであり；
ａａ４は、中性極性側鎖もしくは非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；そして
ａａ５は、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖、あるいは小さい脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくは、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇである］
で示されるアミノ酸配列である、請求項２、３または４記載のタンパク質。
【請求項７】
（Ｘａａ）ｎが、配列番号６から４１より選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列である、請求項２、３または４記載のタンパク質。
【請求項８】
（Ｘａａ）ｎが、配列番号６から４１より選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項２、３または４記載のタンパク質。
【請求項９】
（Ｘａａ）ｍが、一般式（ＩＶ）
−ａａ７−ａａ８−ａａ９−ａａ１０−ａａ１１−ａａ１２−ａａ１３−ａａ１４−ａａ１５−（ＩＶ）
［式中、
ａａ７は、中性極性もしくは非極性側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ８は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性もしくは非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ９はアミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または非極性側鎖、または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基であり、より好ましくは中性極性側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ１０は、アミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性もしくは非極性側鎖、または荷電性（酸性もしくは塩基性）側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、中性極性側鎖もしくは塩基性側鎖もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基であり、より好ましくは、中性極性側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ１１は、アミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、中性極性側鎖または塩基性もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ１２は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ１３は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ１４は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し；そして
ａａ１５は、アミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性もしくは中性非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性もしくは中性非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表す］
で示されるアミノ酸配列である、請求項２から８のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１０】
（Ｘａａ）ｍが、配列番号４２から７７より選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列である、請求項２から８のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１１】
（Ｘａａ）ｍが、配列番号４２から７７より選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列である、請求項２から８のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１２】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドが、配列番号７８から８６より選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１３】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドが、配列番号７８から８６より選択されるアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１４】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドが、配列番号８７から９４のいずれか１つのヌクレオチド１−３３６に対応するコーディング配列を有する核酸によりコード化され得るアミノ酸配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するコーディング配列を有する、請求項１から１１のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１５】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドが、４５℃での６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、次いで６５℃にて０．２Ｘ ＳＳＣでの洗浄というストリンジェントな条件下で、配列番号８７から９４のいずれか１つにハイブリダイズするコーディング配列を含む核酸によりコード化され得るアミノ酸配列を有する、請求項１から１４のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１６】
ＰＤ−Ｌ１に結合するタンパク質の結合が、抗ＰＤ−Ｌ１抗体アテゾリズマブ、アベルマブおよび／またはドゥルバルマブによるＰＤ−Ｌ１結合と競合する、請求項１から１５のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１７】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドが、Ｉｌｅ−５４、Ｔｙｒ−５６、Ｇｌｕ−５８、Ｇｌｕ−６０、Ａｓｐ−６１、Ｌｙｓ−６２、Ａｓｎ−６３、Ｇｌｎ６６、Ｖａｌ−６８、Ｖａｌ−７６、Ｖａｌ−１１１、Ａｒｇ−１１３、Ｍｅｔ−１１５、Ｉｌｅ−１１６、Ｓｅｒ−１１７、Ｇｌｙ−１２０、Ａｌａ−１２１、Ａｓｐ−１２２、Ｔｙｒ−１２３およびＡｒｇ−１２５から選択されるＰＤ−Ｌ１の少なくとも１０残基が関与する界面を含むＰＤ−Ｌ１と結晶構造を形成する、請求項１から１６のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１８】
ＰＤ−Ｌ１への結合が、（ａ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖を増加させ；（ｂ）ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロン−γ産生を増加させ；および／または、（ｃ）ＭＬＲアッセイにおいてインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を増加させる、請求項１から１７のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項１９】
分泌シグナル配列、ペプチドリンカー配列、親和性タグ、膜貫通ドメイン、細胞表面保持配列、翻訳後修飾のための基質認識配列、タンパク質−タンパク質相互作用により凝集するタンパク質の多量体構造を形成するための多量体化ドメイン、半減期延長ポリペプチド部位、抗体の組織局在および抗原結合部位を変化させるためのポリペプチド配列、およびＰＤ−Ｌ１または別の標的を結合する１以上のさらなるアフィマーポリペプチド配列からなる群より選択される１以上のさらなるアミノ酸配列を含む融合タンパク質である、請求項１から１８のいずれか一項記載のタンパク質。
【請求項２０】
Ｆｃドメインまたはその一部、アルブミンタンパク質またはその一部、アルブミン結合ポリペプチド部位、トランスフェリンまたはその一部、トランスフェリン結合ポリペプチド部位、フィブロネクチンまたはその一部、あるいはフィブロネクチン結合ポリペプチド部位からなる群より選択される半減期延長ポリペプチド部位を含む融合タンパク質である、請求項１９記載のタンパク質。
【請求項２１】
Ｆｃドメインまたはその一部がＦｃＲｎ結合を保持する、請求項２０記載のタンパク質。
【請求項２２】
Ｆｃドメインまたはその一部が、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭまたはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２のようなそれらのサブクラス（アイソタイプ）に由来する、請求項２０記載のタンパク質。
【請求項２３】
Ｆｃドメインまたはその一部が、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）；貪食；Ｂ細胞受容体の下方制御、またはそれらの組み合わせより選択されるエフェクター機能を保持する、請求項２０記載のタンパク質。
【請求項２４】
半減期延長ポリペプチド部位が、それがない場合と比べて、タンパク質の血清半減期を少なくとも５倍増加させる、請求項２０記載のタンパク質。
【請求項２５】
配列番号１１２または配列番号１１３のアミノ酸配列あるいはそれと少なくとも７０％の相同性を有する配列を含む、請求項２２記載のタンパク質。
【請求項２６】
標的抗原に結合する１以上の抗原結合部位を形成する１以上のＶＨおよび／またはＶＬ鎖を含む組換え抗体であって、ここで、ＶＨおよび／またはＶＬ鎖の少なくとも１つが、１×１０-６Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、それと結合するＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害する少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列を含む融合タンパク質である、組換え抗体。
【請求項２７】
ＶＨ鎖がＦｃドメインを含む、請求項２６記載の組換え抗体。
【請求項２８】
標的抗原が免疫チェックポイントである、請求項２６記載の組換え抗体。
【請求項２９】
標的抗原が免疫共刺激受容体であり、キメラ抗体が、結合時に共刺激受容体をアゴナイズする、請求項２６記載の組換え抗体。
【請求項３０】
標的抗原が、血管新生因子またはその受容体であり、キメラ抗体が、血管新生因子またはその受容体をアンタゴナイズする、請求項２６記載の組換え抗体。
【請求項３１】
標的抗原が腫瘍抗原である、請求項２６記載の組換え抗体。
【請求項３２】
標的抗原が、可溶性免疫抑制因子またはその受容体であり、キメラ抗体が、免疫抑制因子の免疫抑制活性を阻害して、免疫刺激シグナルとして作用する、請求項２６記載の組換え抗体。
【請求項３３】
標的抗原が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＮＫＧ２Ａ、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ９６、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＤＮＡＭ−１もしくはＣＤ２８Ｈ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、ガレクチン−９、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４ＯＬ、ＰＶＲ、ＳＩＲＰα、ＴＣＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ６、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＴＳＬＰからなる群より選択される、請求項２６記載の組換え抗体。
【請求項３４】
（ｉ）配列番号１１２のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有する配列を有する、アフィマー−重鎖融合タンパク質（ここで、分泌シグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ (配列番号１３６)は除去されていてもよい）、
（ｉｉ）配列番号１１３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有する配列を有する、軽鎖タンパク質（ここで、分泌シグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ (配列番号１３６)は除去されていてもよい）
を含む、組換えアフィマー−イピリムマブ抗体融合タンパク質。
【請求項３５】
（ｉ）配列番号１１６または１１８のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有する配列を有する、アフィマー−重鎖融合タンパク質（ここで、分泌シグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ(配列番号１３６)は除去されていてもよい）、および
（ｉｉ）配列番号１１６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有する配列を有する、軽鎖タンパク質（ここで、分泌シグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ (配列番号１３６)は除去されていてもよい）
を含む、組換えアフィマー−ベバシズマブ抗体融合タンパク質。
【請求項３６】
（ｉ）受容体のリガンド結合ドメイン、および（ｉｉ）１×１０-６Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１と結合するＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻害する、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列を含む、組換え受容体トラップ融合タンパク質。
【請求項３７】
結合ドメインが、ＰＧＥ２、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＣＣＬ２、ＩＤＯ、ＣＳＦ１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３またはアデノシンに結合する、請求項３６記載の組換え受容体トラップ融合タンパク質。
【請求項３８】
組換え受容体トラップ融合タンパク質の多量体化を誘導する多量体化ドメインをさらに含む、請求項３６記載の組換え受容体トラップ融合タンパク質。
【請求項３９】
（ｉ）その同族受容体にアゴナイズまたはアンタゴナイズするポリペプチドリガンド配列、および（ｉｉ）１×１０-６Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１と結合するＰＤ−Ｌ１とのＰＤ−１の相互作用を阻害するＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列を含む、組換え受容体リガンド融合タンパク質。
【請求項４０】
該ポリペプチドリガンドが共刺激性受容体のリガンドであり、結合時に共刺激性受容体をアゴナイズする、請求項３９記載の組換え受容体リガンド融合タンパク質。
【請求項４１】
該ポリペプチドリガンドが、Ｂ７．１、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬおよびＬＩＧＨＴより選択される、請求項４０記載の組換え受容体リガンド融合タンパク質。
【請求項４２】
組換え受容体リガンド融合タンパク質の多量体化を誘導する多量体化ドメインをさらに含む、請求項３９記載の組換え受容体リガンド融合タンパク質。
【請求項４３】
該ポリペプチドリガンドが、抗腫瘍免疫を促進する免疫刺激性サイトカインである、請求項３９記載の組換え受容体リガンド融合タンパク質。
【請求項４４】
該ポリペプチドリガンドが、ＩＦＮ−α２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１およびＩＬ−１２より選択される、請求項４３記載の組換え受容体リガンド融合タンパク質。
【請求項４５】
（ｉ）Ｔ細胞表面上でＣＤ３に結合するＣＤ３結合ポリペプチド、および（ｉｉ）１×１０-６Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１と結合するＰＤ−Ｌ１とのＰＤ−１の相互作用を阻害するＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列を含む、多重特異性Ｔ細胞結合融合タンパク質。
【請求項４６】
（ｉ）１×１０-６Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１と結合しているＰＤ−Ｌ１とのＰＤ−１の相互作用を阻害するＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列を含む、細胞外部分；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；ならびに、（ｉｉｉ）４−１ＢＢシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３εシグナル伝達ドメイン、および要すれば共刺激シグナル伝達領域を含む細胞質ドメイン
を含む、キメラ受容体融合タンパク質。
【請求項４７】
請求項１から４６のいずれか一項記載のタンパク質をコードするコード化配列を含む核酸。
【請求項４８】
該コード化配列が、プロモーターおよび／またはエンハンサーなどの１以上の転写調節配列に作動可能に連結されている、請求項４７記載の核酸。
【請求項４９】
１以上の複製起点、ミニ染色体維持エレメント（ＭＭＥ）および／または核局在化エレメントを含む、請求項４７記載の核酸。
【請求項５０】
該コード化配列と作動可能に連結され、転写されるポリアデニル化シグナル配列をさらに含む、請求項４７記載の核酸。
【請求項５１】
該コード化配列が、１以上のイントロン配列を含む、請求項４７記載の核酸。
【請求項５２】
該コード化配列とともに転写される１以上のリボソーム結合部位を含む、請求項４７記載の核酸。
【請求項５３】
ＤＮＡである、請求項４７記載の核酸。
【請求項５４】
ＲＮＡである、請求項４７記載の核酸。
【請求項５５】
請求項４７記載の核酸を含むウイルスベクター。
【請求項５６】
請求項４７記載の核酸を含むプラスミドＤＮＡ、プラスミドベクターまたはミニサークル。
【請求項５７】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドがコンジュゲートされたものをさらに含む、抗体またはその抗原結合フラグメント。
【請求項５８】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドがコンジュゲートされたものをさらに含む、可溶性受容体またはそのリガンド結合ドメイン。
【請求項５９】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドがコンジュゲートされたものをさらに含む、増殖因子、サイトカインもしくはケモカインまたはそれらの生物学的に活性なポリペプチドフラグメント。
【請求項６０】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドがコンジュゲートされたものをさらに含む、共刺激アゴニストポリペプチド。
【請求項６１】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドがコンジュゲートされたものをさらに含む、チェックポイント阻害ポリペプチド。
【請求項６２】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドおよび検出可能な標識、毒素または１以上の治療薬がコンジュゲートされたものを含む、アフィマー剤。
【請求項６３】
（ｉ）請求項１から２５のいずれか一項記載の組換えタンパク質、請求項２６から３５のいずれか一項記載の組換え抗体、請求項３６から３８のいずれか一項記載の組換え受容体トラップ融合タンパク質、請求項３９から４４のいずれか一項記載の組換え受容体リガンド融合タンパク質、請求項４５記載の多重特異性Ｔ細胞結合融合タンパク質、請求項４６記載のキメラ受容体融合タンパク質、請求項５７記載の抗体、請求項５８記載の可溶性受容体、請求項５９記載の増殖因子、サイトカインまたはケモカイン、請求項６０記載の共刺激アゴニストポリペプチド、請求項６１記載のチェックポイント阻害ポリペプチドあるいは請求項６２記載のアフィマー剤、ならびに（ｉｉ）１以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、塩などを含む、ヒト患者における治療的使用に適する医薬製剤。
【請求項６４】
（ｉ）請求項４７から５４のいずれか一項記載の核酸、請求項５５記載のウイルスベクターまたは請求項５６記載のプラスミドＤＮＡ、プラスミドベクターもしくはミニサークル、ならびに（ｉｉ）１以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、塩、トランスフェクションエンハンサー、エレクトロポレーションエンハンサーなどを含む、ヒト患者における治療的遺伝子送達に適する医薬製剤。
【請求項６５】
請求項１から６４のいずれか一項記載のタンパク質、組換え抗体または核酸を対象に投与することを含む、方法。
【請求項６６】
該対象が、ＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞を含み、要すれば該癌細胞が黒色腫細胞である、請求項６５記載の方法。
【請求項６７】
該タンパク質、組換え抗体または核酸が、混合リンパ球反応を誘発するのに有効な量で投与される、請求項６５または６６記載の方法。
【請求項６８】
該タンパク質、組換え抗体または核酸が、ビークルのみの対照と比較して、対象においてＴ細胞によるＩＦＮγ産生を少なくとも２倍増加させるのに有効な量で投与される、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
対象が、ＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞を含む腫瘍を有し、腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドの蓄積レベルが、投与の９６時間後に、血漿中にて少なくとも５倍である、請求項６６から６８のいずれか一項記載の方法。
【請求項７０】
対象が、ＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞を含む腫瘍を有し、タンパク質、組換え抗体または核酸を該対象において腫瘍の増殖を少なくとも１０％阻害するのに有用な量で投与される、請求項６６から６８のいずれか一項記載の方法。
【請求項７１】
対象が黒色腫を有する、請求項６５から７０のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、その内容全体が引用により本明細書に包含される、２０１８年４月１１日出願の英国特許出願番号第１８０５９６３．４号に対する特許法（35 U.S.C.）第１１９条（ａ）に規定される優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ヒト癌は、多数の遺伝的および後成的改変を含み、免疫系により認識され得る可能性のあるネオ抗原（neoantigen）を産生する(Sjoblom et al., Science 314:268-74 (2006))。癌に対する内因性免疫応答は、前臨床モデルおよび患者において観察されるが、この応答は効果的ではなく、確立された癌は“自己”とみなされ、免疫系に寛容である。この寛容な状態を受けて、腫瘍は、宿主免疫応答を積極的に抑制するために、いくつかの異なるメカニズムを利用している可能性がある（(Topalian et al., J Clin Oncol 29:4828-36 (2011); Mellman et al., Nature 480:480-489 (2011))。これらのメカニズムのうち、通常は免疫応答を終結させて付随組織の損傷を軽減する内因性の“免疫チェックポイント”を腫瘍が採用することにより、免疫破壊を回避することができる。特定の免疫チェックポイント経路阻害剤を開発する取り組みは、進行性黒色腫患者の処置のための抗ＣＴＬＡ−４抗体、イピリムマブの開発を含む、癌処置のための新しい免疫療法アプローチを提供し始めている(Nodi et al., New Engl J Med 363:711-23 (2010))。
【０００３】
プログラムされた細胞死−１（ＰＤ−１）は、活性化Ｔ細胞およびＢ細胞により発現される重要な免疫チェックポイント受容体であり、免疫抑制に介在する。ＰＤ−１は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳ、ＰＤ−１およびＢＴＬＡを含む受容体のＣＤ２８ファミリーのメンバーである。ＰＤ−１に対する２つの細胞表面糖タンパク質リガンド、プログラムされた細胞死リガンド−１(ＰＤ−Ｌ１)およびプログラムされた細胞死リガンド−２(ＰＤ−Ｌ２)が同定されており、これらは抗原提示細胞ならびに多くのヒト癌で発現され、ＰＤ−１への結合により、Ｔ細胞活性化およびサイトカイン分泌を下方制御することが示されている(Freeman et al., J. Exp. Med. 192(7): 1027-34 (2000); Latchm an et al., Nat Immunol 2:261-8 (2001))。
【０００４】
ＰＤ−１は、腫瘍および／または間質細胞により発現される免疫抑制性ＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１またはＣＤ２７４とも称される）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ）リガンドに遭遇し得る周辺組織で主に機能する（Flies et al., Yale J Biol Med 84:409-21 (2011); Topalian et al., Curr Opin Immuno 24:1-6 (2012)）。
【０００５】
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用の阻害は、前臨床モデルにおいて強力な抗腫瘍活性を媒介する（米国特許第８，００８，４４９号および同第７，９４３，７４３号）。ＰＤ−Ｌ１の上方制御は、癌が宿主免疫系を回避するのを可能にし得ると考えられる。腎細胞癌腫患者からの１９６の腫瘍標本の分析により、ＰＤ−Ｌ１の高腫瘍発現は、腫瘍の攻撃性の増加および死亡リスクの４．５倍の増加と関連していることが明らかになった（Thompson et al., Proc Natl Acad Sci USA 101 (49): 17174-9 (2004)）。ＰＤ−Ｌ１発現が高い卵巣癌患者は、発現が低い患者に比べて有意に予後が悪かった。ＰＤ−Ｌ１発現は、上皮内ＣＤ８＋ Ｔリンパ球数と逆相関しており、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１が抗腫瘍ＣＤ８＋ Ｔ細胞を抑制する可能性を示唆している（Hamanishi et al., Proc Natl Acad Sci USA 104 (9): 3360-3365 (2007)）。
【０００６】
ＰＤ−Ｌ１はまた、感染症、特に慢性感染症にも関与している。細胞傷害性ＣＤ８ Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、感染症の制御において極めて重要な役割を果たしている。しかしながら、活性化されたＣＴＬは、慢性感染症においてエフェクター機能を失うことが多い。Ｂ７／ＣＤ２８ファミリーのＰＤ−１受容体およびそのリガンドであるＰＤ−Ｌ１は、Ｔ細胞共阻害経路として機能し、ヒト免疫不全ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ヘルペスウイルスならびに慢性感染症を引き起こす可能性のある他の細菌、原虫およびウイルス病原体による慢性感染症時にエフェクターＣＴＬを枯渇したＣＴＬに変換する主要な調節因子として生じる。そのような細菌性および原虫性病原体としては、大腸菌、スタフィロコッカス種、ストレプトコッカス種、結核菌マイコバクテリウム、ジアルジア、マラリア、リーシュマニアおよび緑膿菌シュードモナスが挙げられる。重要なことは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の遮断が、枯渇したＣＴＬの機能を回復させ得るということである。従って、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１は、慢性細菌感染症およびウイルス感染症に対する効果的な予防的および治療的ワクチン接種を開発するための標的である（例えば、Hofmeyer et al., Journal of Biomedicine and Biotechnology, vol. 2011, Article ID 451694, 9 pages, doi:10.1155/2011/451694参照)。
【０００７】
最近の研究では、全身的な免疫抑制が、神経変性疾患における脳の修復に必要な細胞を介する防御的な免疫応答を獲得する能力を抑制し得ることも示されている。アルツハイマー病のマウスモデルを用いて、プログラムされた細胞死−１（ＰＤ−１）経路に対する免疫チェックポイント遮断を行うと、インターフェロンγに依存した全身性免疫応答が誘発され、その後、単球由来のマクロファージが脳に捕捉されることが示された。病状が確立したマウスにこの免疫応答を誘導すると、脳アミロイドβ（Ａβ）プラークが除去され、認知機能が改善された。これらの知見は、免疫チェックポイントが、ＰＤ−Ｌ１に対する抗体を用いて、アルツハイマー病などの神経変性疾患において治療的に標的化され得ることを示唆している（例えば、Baruch et al., Nature Medicine、January 2016、doi:10.1038/nm.4022参照)。
【０００８】
ＰＤ−Ｌ１に対する特異的抗体が、抗癌剤として開発されている（米国特許第９，２１２，２２４号および同第８，００８，４４９を参照のこと）。癌処置のためのＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用のＡｂ阻害剤の使用は、臨床治験に入っている(Brahmer et al., J Clin Oncol 28:3167-75 (2010); Flies et al., Yale J Biol Med 84:409-21 (2011); Topalian et al., N Engl J Med 366:2443-54 (2012); Brahmer et al., N Engl J Med 366:2455-65 (2012))。しかしながら、癌、感染症および神経変性疾患、例えばアルツハイマー病の処置に有用な追加のＰＤ−Ｌ１阻害活性、例えば、治療活性またはＰＫ／ＡＤＭＥ修飾活性を提供する他のポリペプチド配列との融合タンパク質の一部として容易にフォーマット化することができるＰＤ−Ｌ１阻害剤が必要とされている。本発明は、このようなおよび他のニーズを満たす。
【発明の概要】
【０００９】
概要
ある面において、本発明は、１×１０−６M以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１と結合するＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１との相互作用を阻害するＰＤ−Ｌ１結合アフィマー（Affimer）ポリペプチド配列を含むタンパク質を提供する。
【００１０】
ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、ヒトＰＤ−１との相互作用を阻害する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、ヒトＣＤ８０との相互作用を阻害する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１×１０−７Ｍ以下のＫｄ、１×１０−８Ｍ以下のＫｄ、１×１０−９Ｍ以下のＫｄ、または１×１０−１０Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０−３ ｓ−１またはそれより遅い、１０−４ ｓ−１またはそれより遅い、あるいはさらには１０−５ ｓ−１またはそれより遅いＫｏｆｆでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０３ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０４ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０５ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、あるいはさらには１０６ Ｍ−１ｓ−１またはより速いＫｏｎでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、ヒトＰＤ−１との競合結合アッセイにおいて、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、またはさらには０．１ｎＭ以下のＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００１１】
ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、ヒトＣＤ８０（Ｂ７−１）との競合結合アッセイにおいて、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下のＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１を結合する。
【００１２】
ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、一般式（Ｉ）
ＦＲ１−（Ｘａａ）ｎ−ＦＲ２−（Ｘａａ）ｍ−ＦＲ３（Ｉ）
［式中、
ＦＲ１は、ＭＩＰＧＧＬＳＥＡＫ ＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶ ＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫ ＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡ ＶＱＹＫＴＱＶＬＡ（配列番号１）で表されるポリペプチド配列、またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド配列であり;
ＦＲ２は、ＧＴＮＹＹＩＫＶＲＡ ＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶ ＦＫＳＬ（配列番号２）で表されるポリペプチド配列、またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド配列であり；
ＦＲ３は、ＥＤＬＶＬＴＧＹＱＶ ＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧ Ｆ（配列番号３）またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド配列であり；
Ｘａａは、Ｘａａの存在毎に個別に、アミノ酸残基であり；そして
ｎおよびｍは、それぞれ独立して、３から２０までの整数である］
で表されるアミノ酸配列を有する。
【００１３】
ある態様では、ＦＲ１は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには９８％の相同性を有するポリペプチド配列であってもよい。ある態様では、ＦＲ２は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには９８％の相同性を有するポリペプチド配列である。ある態様では、ＦＲ３は、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには９８％の相同性を有するポリペプチド配列である。
【００１４】
ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、一般式： 
ＭＩＰ−Ｘａａ１−ＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡ−（Ｘａａ）ｎ−Ｘａａ２−ＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−（Ｘａａ）ｍ−Ｘａａ６−Ｄ−Ｘａａ７−ＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ（配列番号４）
［式中、
Ｘａａは、その存在毎に個別に、アミノ酸残基であり；
ｎおよびｍはそれぞれ独立して、３から２０までの整数であり;
Ｘａａ１は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａａ３は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａａ４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；
Ｘａａ５は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏであり；
Ｘａａ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；そして
Ｘａａ７は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＬｙｓである］
で表されるアミノ酸配列を有する。
【００１５】
ある態様では、Ｘａａ１は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、さらにより好ましくはＧｌｙまたはＡｒｇである。ある態様では、Ｘａａ２はＧｌｙまたはＳｅｒである。ある態様では、Ｘａａ３は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり、より好ましくは、ＬｙｓまたはＡｓｎである。ある態様では、Ｘａａ４は、ＧｌｙまたはＳｅｒである。ある態様では、Ｘａａ５は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏであり、より好ましくは、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＰｒｏであり、さらにより好ましくは、ＬｅｕまたはＰｒｏである。ある態様では、Ｘａａ６は、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、さらにより好ましくは、ＡｌａまたはＧｌｕである。ある態様では、Ｘａａ７は、Ｉｌｅ、ＬｅｕまたはＡｒｇであり、より好ましくは、ＬｅｕまたはＡｒｇである。
【００１６】
ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、一般式：
ＭＩＰＲＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡ−（Ｘａａ）ｎ−ＳＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦＮＧＰ−（Ｘａａ）ｍ−ＡＤＲＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ（配列番号５）
［式中、Ｘａａは、その存在毎に個別に、アミノ酸残基であり；そして、ｎおよびｍはそれぞれ独立して、３から２０までの整数である］
で表されるアミノ酸配列を有する。
【００１７】
上記配列のある態様において、（Ｘａａ）ｎ（“ループ２”）は、一般式（ＩＩ）
−ａａ１−ａａ２−ａａ３−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ａａ４−ａａ５−Ｔｒｐ−ａａ６−（ＩＩ）
［式中、
ａａ１は、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ２は、アミノ酸残基、好ましくは中性極性もしくは非極性側鎖、または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは小さい脂肪族側鎖、中性極性側鎖または塩基性もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ３は、芳香族側鎖または塩基性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ４は、中性極性側鎖もしくは非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ５は、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖、あるいは小さい脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；そして
ａａ６は、芳香族側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表す］
で表されるアミノ酸配列である。
【００１８】
ある態様では、ａａ１は、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し、より好ましくは、ＬｙｓまたはＡｒｇである。ある態様では、ａａ２は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し、より好ましくはＡｌａ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕである。ある態様では、ａａ３は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し、好ましくはＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐであり、より好ましくはＨｉｓまたはＴｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓである。ある態様では、ａａ４は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し、より好ましくはＧｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕである。ある態様では、ａａ５は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し、より好ましくはＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇである。ある態様では、ａａ６は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表し、好ましくはＴｒｐまたはＡｓｐであり、より好ましくはＴｒｐである。
【００１９】
上記の配列の他の特定の態様において、（Ｘａａ）ｎ（“ループ２”）は、一般式（ＩＩＩ）
−ａａ１−ａａ２−ａａ３−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ａａ４−ａａ５−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−（ＩＩＩ）
［式中、
ａａ１は、塩基性側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ２は、アミノ酸残基、好ましくは中性極性もしくは非極性側鎖、または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは小さい脂肪族側鎖、中性極性側鎖または塩基性もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ３は、芳香族側鎖または塩基性側鎖を有するアミノ酸残基を表し、好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＨｉｓであり、より好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐもしくはＨｉｓであり、さらにより好ましくは、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓであり；
ａａ４は、中性極性側鎖もしくは非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；そして
ａａ５は、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖、あるいは小さい脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくは、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇである］
で示されるアミノ酸配列である。
【００２０】
ある態様では、ａａ１は、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎを表し、より好ましくは、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり、さらにより好ましくはＬｙｓまたはＡｓｎである。ある態様では、ａａ２は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し、より好ましくは、Ａｌａ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕである。ある態様では、ａａ３は、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し、より好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくは、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓである。ある態様では、ａａ４は、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し、さらにより好ましくは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕである。ある態様では、ａａ５は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＨｉｓを表し、さらにより好ましくは、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇである。
【００２１】
上記の配列のある態様において、（Ｘａａ）ｎ (“ループ２”)は、配列番号６から４１より選択されるアミノ酸配列であるか、またはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列であり、より好ましくは、それと少なくとも８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の相同性を有するアミノ酸配列である。
【００２２】
上記の配列のある態様において、（Ｘａａ）ｎ（“ループ２”）は、配列番号６から より選択されるアミノ酸配列であるか、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であり、より好ましくは、それと少なくとも８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２３】
上記の配列のある態様において、（Ｘａａ）ｍ（“ループ４”）は、一般式（ＩＶ）
−ａａ７−ａａ８−ａａ９−ａａ１０−ａａ１１−ａａ１２−ａａ１３−ａａ１４−ａａ１５−（ＩＶ）
［式中、
ａａ７は、中性極性もしくは非極性側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ８は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性もしくは非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ９はアミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または非極性側鎖、または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基であり、より好ましくは中性極性側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ１０は、アミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性もしくは非極性側鎖、または荷電性（酸性もしくは塩基性）側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、中性極性側鎖もしくは塩基性側鎖もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基であり、より好ましくは、中性極性側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ１１は、アミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、中性極性側鎖または塩基性もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ１２は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ１３は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；
ａａ１４は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し；そして
ａａ１５は、アミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性もしくは中性非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性もしくは中性非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表す］
で示されるアミノ酸配列である。
【００２４】
ある態様では、ａａ７は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕを表し、さらにより好ましくは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕである。ある態様では、ａａ８は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、ＴｙｒまたはＰｈｅを表し、さらにより好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＧｌｎである。ある態様では、ａａ９は、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＴｙｒを表し、さらにより好ましくは、Ｇｌｎ、ＴｈｒまたはＡｓｐである。ある態様では、ａａ１０は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＧｌｙを表し、さらにより好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、ＴｒｐまたはＧｌｙである。ある態様では、ａａ１１は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＴｙｒまたはＧｌｙを表し、さらにより好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＨｉｓである。ある態様では、ａａ１２は、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＧｌｙを表し、さらにより好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｒｇまたはＬｙｓである。ある態様では、ａａ１３は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅを表し、さらにより好ましくは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＧｌｕである。ある態様では、ａａ１４は、Ａｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＡｓｎを表し、さらにより好ましくは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＧｌｎまたはＡｓｎである。ある態様では、ａａ１５は、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｈｅを表し、さらにより好ましくは、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＡｓｎである。
【００２５】
上記の配列のある態様において、（Ｘａａ）ｍ (“ループ４”)は、配列番号４２から７７より選択されるアミノ酸配列であるか、またはそれと少なくとも８０％の相同性を有するアミノ酸配列であり、より好ましくはそれと少なくとも８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の相同性を有するアミノ酸配列である。
【００２６】
上記の配列のある態様において、（Ｘａａ）ｍ (“ループ４”)は、配列番号４２から７７より選択されるアミノ酸配列であるか、またはそれと少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であり、より好ましくはそれと少なくとも８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【００２７】
ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、配列番号７８から８６より選択されるアミノ酸配列を有するか、またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、さらにより好ましくは、それと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の相同性を有するアミノ酸配列を有する。
【００２８】
ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、配列番号７８から８６より選択されるアミノ酸配列を有するか、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するアミノ酸を有し、さらにより好ましくは、それと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性を有するアミノ酸を有する。
【００２９】
ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、配列番号８７から９４のいずれか１つのヌクレオチド１−３３６に対応するコーディング配列、またはそれと少なくとも７０％の同一性を有するコーディング配列、さらにより好ましくはそれと少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性を有するコーディング配列を有する核酸によりコード化され得るアミノ酸配列を有する。
【００３０】
ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、４５℃での６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）、次いで６５℃にて０．２Ｘ ＳＳＣでの洗浄というストリンジェントな条件下で、配列番号８７から９４のいずれか１つにハイブリダイズするコーディング配列を含む核酸によりコード化され得るアミノ酸配列を有する。
【００３１】
ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤タンパク質は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体アテゾリズマブ、アベルマブおよび／またはドゥルバルマブによるＰＤ−Ｌ１結合と競合する様式で、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドを介してＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００３２】
ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤タンパク質としては、Ｉｌｅ−５４、Ｔｙｒ−５６、Ｇｌｕ−５８、Ｇｌｕ−６０、Ａｓｐ−６１、Ｌｙｓ−６２、Ａｓｎ−６３、Ｇｌｎ ６６、Ｖａｌ−６８、Ｖａｌ−７６、Ｖａｌ−１１１、Ａｒｇ−１１３、Ｍｅｔ−１１５、Ｉｌｅ−１１６、Ｓｅｒ−１１７、Ｇｌｙ−１２０、Ａｌａ−１２１、Ａｓｐ−１２２、Ｔｙｒ−１２３およびＡｒｇ−１２５より選択されるＰＤ−Ｌ１の少なくとも１０残基が関与する界面を含むＰＤ−Ｌ１と結晶構造を形成するＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドが挙げられる。
【００３３】
ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１に結合するＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドに依存する態様で、（ａ）ブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）で処置されるとき、ヒトＰＢＭＣにおいて特定のＶｆｉ鎖、例えばＶＢ３、ＶＢ１２、ＶＢ１４およびＶＢ１７を担持するＴ細胞のサブセットにおいてＴ細胞受容体シグナル伝達を増加させ；（ｂ）ＳＥＢアッセイにおいてインターフェロン−γ産生を増加させ；および／または、（ｃ）ＳＥＢアッセイにおいて用量依存的にインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を増加させる。
【００３４】
ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１に結合するＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドに依存する態様で、（ａ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖を増加させ；（ｂ）ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロン−γ産生を増加させ；および／または、（ｃ）ＭＬＲアッセイにおいてインターロイキン−２（ＩＬ−２）分泌を増加させる。
【００３５】
ある態様において、アフィマー剤は、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドに加えて、分泌シグナル配列、ペプチドリンカー配列、親和性タグ、膜貫通ドメイン、細胞表面保持配列、翻訳後修飾のための基質認識配列、タンパク質−タンパク質相互作用により凝集するタンパク質の多量体構造を形成するための多量体化ドメイン、半減期延長ポリペプチド部位、抗体の組織局在および抗原結合部位を変化させるためのポリペプチド配列、およびＰＤ−Ｌ１または別の標的を結合する１以上のさらなるアフィマーポリペプチド配列からなる群より選択される１以上のさらなるアミノ酸配列を含んでいてよい融合タンパク質である。
【００３６】
ある態様において、融合タンパク質は、Ｆｃドメインまたはその一部、アルブミンタンパク質またはその一部、アルブミン結合ポリペプチド部分、トランスフェリンまたはその一部、トランスフェリン結合ポリペプチド部分、フィブロネクチンまたはその一部、あるいはフィブロネクチン結合ポリペプチド部分からなる群より選択されるような半減期延長ポリペプチド部分を含む。
【００３７】
融合タンパク質がＦｃドメインまたはその一部を含む場合、ある態様において、それはＦｃＲｎ結合を保持するＦｃドメインである。
【００３８】
融合タンパク質がＦｃドメインまたはその一部を含む場合、ある態様において、Ｆｃドメインまたはその一部は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭまたはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２などのそれらのサブクラス（アイソタイプ）に由来する。
【００３９】
ある態様において、融合タンパク質は、配列番号１１１または配列番号１１２のアミノ酸配列を有するか、またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するアミノ酸配列を有し、さらにより好ましくは、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【００４０】
融合タンパク質がＦｃドメインまたはその一部を含む場合、ある態様において、Ｆｃドメインまたはその一部は、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）、抗体依存性細胞介在性細胞毒性（ＡＤＣＣ）；貪食；Ｂ細胞受容体の下方制御、またはそれらの組み合わせより選択されるエフェクター機能を保持する。
【００４１】
ある態様において、融合タンパク質が半減期延長ポリペプチド部分を含む場合、その部位は、タンパク質の血清半減期を、該タンパク質の不存在時と比較して、少なくとも５倍、例えば１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、２００倍、５００倍またはさらには１０００倍まで増加させる。
【００４２】
ある態様において、本発明の融合タンパク質は、１以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、塩などをさらに含む、ヒト患者における治療用途に適した医薬製剤として提供される。
【００４３】
本発明の別の面において、標的抗原に結合する１以上の抗原結合部位を形成する１以上のＶＨおよび／またはＶＬ鎖を含む組換え抗体であって、ここで、ＶＨおよび／またはＶＬ鎖の少なくとも１つが、１×１０−６Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、それと結合しているＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１との相互作用を阻害する少なくとも１つのＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列を含む融合タンパク質である。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、ヒトＰＤ−Ｌ１を結合し、ヒトＰＤ−１との相互作用を阻害する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１×１０−７Ｍ以下のＫｄ、１×１０−８Ｍ以下のＫｄ、１×１０−９Ｍ以下のＫｄ、または１×１０−１０Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１を結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０−３ ｓ−１またはそれより遅い、１０−４ ｓ−１またはそれより遅い、あるいはさらには１０−５ ｓ−１またはそれより遅いＫｏｆｆでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０３ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０４ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０５ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、あるいはさらには１０６ Ｍ−１ｓ−１またはより速いＫｏｎでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、ヒトＰＤ−１との競合結合アッセイにおいて、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、またはさらには０．１ｎＭ以下のＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１を結合する。
【００４４】
ある態様において、ＶＨ鎖は、Ｆｃドメインを含む。
ある態様において、標的抗原は、免疫チェックポイントを含む。
ある態様において、標的抗原は、免疫共刺激受容体であり、キメラ抗体は、結合時に該共刺激受容体をアゴナイズする。
ある態様において、標的抗原は、血管新生因子またはその受容体であり、キメラ抗体は、該血管新生因子またはその受容体をアンタゴナイズする。
ある態様において、標的抗原は腫瘍抗原である。
ある態様において、標的抗原は、可溶性免疫抑制因子またはその受容体であり、キメラ抗体は、免疫抑制因子の免疫抑制活性を阻害し、免疫刺激シグナルとして作用する。
【００４５】
ある態様において、標的抗原は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＮＫＧ２Ａ、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ９６、ＶＩＳＴＡ、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＤＮＡＭ−１またはＣＤ２８Ｈ、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、ガレクチン−９、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４ＯＬ、ＰＶＲ、ＳＩＲＰα、ＴＣＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ６、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＴＳＬＰからなる群より選択される。
【００４６】
ある態様において、配列番号１１３のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の相同性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性）を有するアミノ酸配列を有する、アフィマー−重鎖融合タンパク質（ここで、分泌シグナル配列 ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ(配列番号１３６)は要すれば除去されていてよい）、および
配列番号１１４のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の相同性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性）を有するアミノ酸配列を有する軽鎖タンパク質（ここで、分泌シグナル配列 ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ(配列番号１３６)は要すれば除去されていてよい）
を含む、組換えアフィマー−イピリムマブ抗体融合タンパク質を提供する。
【００４７】
ある態様において、配列番号１１５もしくは１１７のアミノ酸配列またはそれらと少なくとも７０％の相同性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性）を有するアミノ酸配列を有する、アフィマー−重鎖融合タンパク質（ここで、分泌シグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ(配列番号１３６)は要すれば除去されていてよい）、および
配列番号１１６のアミノ酸配列またはそれと少なくとも７０％の相同性（例えば、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性）を有するアミノ酸配列を有する軽鎖タンパク質（ここで、分泌シグナル配列 ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ(配列番号１３６)は要すれば除去されていてよい）
を含む、組換えアフィマー−ベバシズマブ抗体融合タンパク質を提供する。
【００４８】
ある態様において、本発明の組換え抗体は、１以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、塩などをさらに含む、ヒト患者における治療用途に適する医薬製剤として提供される。
【００４９】
本発明の別の面において、（ｉ）受容体のリガンド結合ドメイン、および（ｉｉ）１×１０−６Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１と結合するＰＤ−Ｌ１の相互作用を阻害するＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列（複数可）を含む、組換え受容体トラップ融合タンパク質を提供する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１×１０−７Ｍ以下のＫｄ、１×１０−８Ｍ以下のＫｄ、１×１０−９Ｍ以下のＫｄ、または１×１０−１０Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１を結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０−３ ｓ−１またはそれより遅い、１０−４ ｓ−１またはそれより遅い、あるいはさらには１０−５ ｓ−１またはそれより遅いＫｏｆｆでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０３ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０４ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０５ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、あるいはさらには１０６ Ｍ−１ｓ−１またはより速いＫｏｎでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、ヒトＰＤ−１との競合結合アッセイにおいて、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、またはさらには０．１ｎＭ以下のＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１に結合する。
【００５０】
ある態様において、結合ドメインは、ＰＧＥ２、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＣＣＬ２、ＩＤＯ、ＣＳＦ１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３またはアデノシン二結合する。
【００５１】
ある態様において、組換え受容体トラップ融合タンパク質は、組換え受容体トラップ融合タンパク質の多量体化を誘導する１以上の多量体化ドメイン、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９またはさらには１０個の組換え受容体トラップ融合タンパク質を多量体複合体として含む複合体を含む
【００５２】
ある態様において、本発明の組換え受容体トラップ融合タンパク質は、１以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、塩などをさらに含む、ヒト患者における治療的使用に適した医薬製剤として提供される。
【００５３】
本発明の別の面において、（ｉ）その同族受容体にアゴナイズまたはアンタゴナイズするポリペプチドリガンド配列、および（ｉｉ）１×１０-６Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１と結合しているＰＤ−Ｌ１とのＰＤ−１の相互作用を阻害するＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列（複数可）を含む、組換え受容体リガンド融合タンパク質を提供する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１×１０−７Ｍ以下のＫｄ、１×１０−８Ｍ以下のＫｄ、１×１０−９Ｍ以下のＫｄ、または１×１０−１０Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０−３ ｓ−１またはそれより遅い、１０−４ ｓ−１またはそれより遅い、あるいはさらには１０−５ ｓ−１またはそれより遅いＫｏｆｆでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０３ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０４ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０５ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、あるいはさらには１０６ Ｍ−１ｓ−１またはより速いＫｏｎでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、ヒトＰＤ−１との競合結合アッセイにおいて、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、またはさらには０．１ｎＭ以下のＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１を結合する。
【００５４】
組換え受容体リガンド融合タンパク質のある態様において、ポリペプチドリガンドは、共刺激受容体のリガンドであり、結合時に共刺激受容体をアゴナイズする。
【００５５】
例えば、ポリペプチドリガンドは、Ｂ７．１、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬまたはＬＩＧＨＴより選択され得る。
【００５６】
例えば、ポリペプチドリガンドは、抗腫瘍免疫を促進する免疫刺激サイトカイン、例えばＩＦＮ−α２、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１およびＩＬ−１２であり得る。
【００５７】
ある態様において、組換え受容体リガンド融合タンパク質は、組換え受容体リガンド融合タンパク質の多量体化を誘導する１以上の多量体化ドメイン、すなわち、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の組換え受容体リガンド融合タンパク質を多量体複合体として含む複合体を含む。
【００５８】
ある態様において、本発明の組換え受容体リガンド融合タンパク質は、１以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、塩などをさらに含む、ヒト患者における治療的使用に適した医薬製剤として提供される。
【００５９】
本発明の別の面において、（ｉ）Ｔ細胞表面上でＣＤ３に結合するＣＤ３結合ポリペプチド、および（ｉｉ）１×１０-６Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１と結合しているＰＤ−Ｌ１とのＰＤ−１の相互作用を阻害するＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列（複数可）を含む、多重特異性Ｔ細胞結合（engaging）融合タンパク質を提供する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１×１０−７Ｍ以下のＫｄ、１×１０−８Ｍ以下のＫｄ、１×１０−９Ｍ以下のＫｄ、またはさらには１×１０−１０Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０−３ ｓ−１またはそれより遅い、１０−４ ｓ−１またはそれより遅い、あるいはさらには１０−５ ｓ−１またはそれより遅いＫｏｆｆでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０３ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０４ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０５ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、あるいはさらには１０６ Ｍ−１ｓ−１またはより速いＫｏｎでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、ヒトＰＤ−１との競合結合アッセイにおいて、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、またはさらには０．１ｎＭ以下のＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１を結合する。
【００６０】
ある態様において、本発明の多重特異性Ｔ細胞結合融合タンパク質は、１以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、塩などをさらに含む、ヒト患者における治療的使用に適した医薬製剤として提供される。
【００６１】
本発明の別の面において、（ｉ）１×１０-６Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合し、ＰＤ−１と結合しているＰＤ−Ｌ１とのＰＤ−１の相互作用を阻害するＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド配列を含む、細胞外部分；（ｉｉ）膜貫通ドメイン；ならびに、（ｉｉｉ）４−１ＢＢシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３εシグナル伝達ドメイン、および要すれば共刺激シグナル伝達領域を含む細胞質ドメイン、を含む、キメラ受容体融合タンパク質を提供する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１×１０−７Ｍ以下のＫｄ、１×１０−８Ｍ以下のＫｄ、１×１０−９Ｍ以下のＫｄ、またはさらには１×１０−１０Ｍ以下のＫｄでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０−３ ｓ−１またはそれより遅い、１０−４ ｓ−１またはそれより遅い、あるいはさらには１０−５ ｓ−１またはそれより遅いＫｏｆｆでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、１０３ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０４ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、１０５ Ｍ−１ｓ−１またはより速い、あるいはさらには１０６ Ｍ−１ｓ−１またはより速いＫｏｎでＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、ヒトＰＤ−１との競合結合アッセイにおいて、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、４０ｎＭ以下、２０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、またはさらには０．１ｎＭ以下のＩＣ５０でＰＤ−Ｌ１を結合する。
【００６２】
特定の態様において、本発明はまた、キメラ受容体融合タンパク質をコードする遺伝子であって、発現されると細胞表面上にキメラ受容体融合タンパク質の提示をもたらす遺伝子で操作された細胞、好ましくはリンパ球、さらにより好ましくはＴリンパ球を提供する。
【００６３】
本発明の別の面において、上記の（本明細書に記載の）タンパク質などのアフィマー剤をコードするコーディング配列を含む核酸を提供する。
【００６４】
ある態様において、該コーディング配列は、例えばプロモーターおよび／またはエンハンサーなどの１以上の転写調節配列と作動可能に連結されている。
【００６５】
ある態様において、該核酸は、１以上の複製起点、ミニ染色体維持要素（ＭＭＥ）および／または核局在化エレメントを含む。
ある態様において、該核酸は、コーディング配列と作動可能に連結され、転写される、ポリアデニル化シグナル配列を含む。
ある態様において、コーディング配列は、１以上のイントロン配列を含む。
ある態様において、核酸は、コーディング配列と共に転写される１以上のリボソーム結合部位を含む。
ある態様において、核酸はＤＮＡである。
ある態様において、核酸は、ｍＲＮＡなどのＲＮＡである。
【００６６】
本発明の別の面において、上記の（および本明細書に記載の）タンパク質などのアフィマー剤をコードするコード化配列を含むウイルスベクターを提供する。
【００６７】
本発明の別の面において、上記の（および本明細書に記載の）タンパク質などのアフィマー剤をコードするコーディング配列を含むプラスミドＤＮＡ、プラスミドベクターまたはミニサークルを提供する。
【００６８】
本発明の別の面において、本発明は、それにコンジュゲートされたＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドをさらに含む、抗体またはその抗原結合フラグメントを提供する。
【００６９】
本発明の別の面において、本発明は、それにコンジュゲートされたＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドをさらに含む、可溶性受容体またはそのリガンド結合ドメインを提供する。
【００７０】
本発明の別の面において、本発明は、それにコンジュゲートされたＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドをさらに含む、増殖得因子、サイトカインまたはケモカインあるいはそれらの生物学的に活性なポリペプチドフラグメントを提供する。
【００７１】
本発明の別の面において、本発明は、それにコンジュゲートされたＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドをさらに含む、共刺激アゴニストポリペプチドを提供する。
【００７２】
本発明の別の面において、本発明は、それにコンジュゲートされたＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドをさらに含む、チェックポイント阻害ポリペプチドを提供する。
【００７３】
本発明の別の面において、本発明は、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドと、それにコンジュゲートされた検出可能なラベル、毒素または１以上の治療剤を含む、アフィマー剤を提供する。
【００７４】
また、本発明は、本発明の核酸、ウイルスベクター、プラスミドＤＮＡ、プラスミドベクターまたはミニサークル、および（ｉｉ）１以上の薬学的に許容される賦形剤、緩衝剤、塩、トランスフェクションエンハンサー、エレクトロポレーションエンハンサーなどを含む、ヒト患者において治療的遺伝子送達に適する医薬製剤を提供する。
【００７５】
本発明はさらに、本明細書に記載のタンパク質、組換え抗体または核酸（ＰＤ−Ｌ１に結合するアフィマーを含む）を対象に投与することを含む方法をさらに提供する。
【００７６】
ある態様において、対象は、ＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞を含み、ここで、要すれば、該癌細胞は黒色腫細胞である。
【００７７】
ある態様において、タンパク質、組換え抗体または核酸は、混合リンパ球反応においてＴ細胞によるＩＦＮγ産生の増加を誘発するために有効な量で投与される。
【００７８】
ある態様において、タンパク質、組換え抗体または核酸は、ビークルのみの対照と比較して、対象においてＴ細胞によるＩＦＮγ産生を少なくとも２倍増加させるのに有効な量で投与される。
【００７９】
ある態様において、対象は、ＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞を含む腫瘍を有し、該腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチド蓄積レベルが、血漿中、投与の９６時間後に少なくとも５倍である。
【００８０】
ある態様において、対象は、ＰＤ−Ｌ１を発現する癌細胞を含む腫瘍を有し、タンパク質、組換え抗体または核酸は、対象における腫瘍の増殖を少なくとも１０％阻害するのに有効な量で投与される。
ある態様において、対象は黒色腫を有する。
【図面の簡単な説明】
【００８１】
【図１】図１．アフィマーライブラリーの作製：可変化された結合ループにより、ユニークな結合表面および選択可能なアフィマー結合体が生じる。
【図２】図２．単量体アフィマー結合。ヒト肺腺癌細胞株におけるフローサイトメトリーによるアフィマー結合。
【図３】図３．アフィマー多量体は、大腸菌で容易に発現されて、複数の多量体形態の高収率・高純度（シェーカーフラスコの製造であっても）が可能である。
【図４】図４Ａおよび４Ｂ．アフィマー多量体は、単量体結合ドメインを超えたアビディティを示す動態でＰＤ−Ｌ１に結合する。
【図５】図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃ．アフィマーＦｃ融合は、エフェクター機能、半減期延長、および増強された親和性を提供する。
【図６】図６Ａ−６Ｃ．ＰＤ−１およびＣＤ８０に対する、およびＰＤ−Ｌ１抗体ベンチマークに対する競合ＥＬＩＳＡ。
【図７】図７．アフィマー−Ｆｃ融合は、増加した血清半減期を示す。
【図８】図８．ヒトＰＢＭＣ刺激アッセイによる免疫原性試験は、コアアフィマー配列がヒトにおいて免疫原性であるリスクが低いことを示している。
【図９】図９．データは、アフィマーがヒトＦｃ上の様々な部位でフォーマット化され得て、ＩｇＧ−アフィマー融合物に変換できることを示す。代表的な発現収率は、４００−８００ｍｇ／ｌの範囲であった。分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて純度を評価した。
【図１０】図１０． Biacoreを用いて決定された幾つかのＰＤ−Ｌ１アフィマーＦｃフォーマットのＫＤを示し、治療標的に合わせて結合速度を微調整するための高度に柔軟なフォーマットを示している。２価のＦｃフォーマットでのアビディティ効果が明確に観察される。
【００８２】
【図１１】図１１Ａ−１１Ｂ．Expi293F細胞で一過的に発現されたイピリムマブ(バイオシミラー)／AVA04-141を、プロテインＡ精製後に約１６０ｍｇ／Ｌの収量で精製した。
【図１２】図１２Ａ−１２Ｃ．最適化されていないBiacoreは、二特異性抗体−アフィマー融合体が両標的に結合できることを示している。
【図１３】図１３Ａ−１３Ｄ．Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一過的に発現されたベバシズマブ (バイオシミラー)／ＡＶＡ０４−２５１を、９７％以上の収率で精製することができ、Biacoreは、構築物が可撓性リンカー[(G4S)3]またはリジッドリンカー（rigid linker）[Ａ（ＥＡＡＡＫ）３]を含むかどうかにかかわらず、二重特異性抗体−アフィマー融合体が両標的に結合できることを示している。その後、リジッドリンカーを含む構築物をマウスにて薬物動態試験で試験した（図１３Ｄ）。
【図１４】図１４．抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーＡＶＡ０４−２６１およびタンパク質複合体の結晶化に由来するヒトＰＤ−Ｌ１の計算された三次元構造を示す。
【図１５】図１５．ヒトＰＤ−Ｌ１由来の物に結合した抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーＡＶＡ０４−２６１の結晶由来構造から、図１５は、２つのタンパク質間の接触界面でアミノ酸残基間の水素結合相互作用を提供する。
【図１６】図１６．ヒトＰＤ−Ｌ１由来の物に結合した抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーＡＶＡ０４−２６１の結晶由来構造から、図１６は、２つのタンパク質間の接触界面に関与するアミノ酸残基のリストを提供する。
【図１７】図１７Ａ−１７Ｂ．Ｆｃ融合体（二価のＰＤ−Ｌ１結合フォーマットおよび二重特異性の、二価のＰＤ−Ｌ１結合体および標的Ｘ結合体フォーマットを示す)、インライン抗体融合体の様々なフォーマット、BiTEフォーマットおよび受容体トラップドメインを含む抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーのインライン融合体を含む、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーフォーマットの例示図。可撓性リンカー（Ｇ４Ｓ）６は、配列番号１０６に対応する。リジッドリンカーＡ（ＥＡＡＡＫ）６ は、配列番号１９６に対応する。
【００８３】
【図１８】図１８Ａ−１８Ｂ。図１８Ａは、ＡＶＡ０４アフィマー、リジッドまたは可撓性リンカーおよびアフィマーＸＴ (ＡＶＡ０３−４２)を組み合わせた様々なクローン組成物を示す。分析的ＳＥＣ−ＨＰＬＣを用いて、各クローンの純度を評価した。図１８Ｂは、ｒｈＰＤ−１−ＦｃまたはｈｕＳＡ上の様々なアフィマーＸＴの動態分析の結果を示す。
【図１９】図１９．１μｌの精製変異体タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動。表は、各アフィマーの大腸菌生産量、ループ４のアミノ酸位置にわたるＡＶＡ０４−２５１アラニンスキャン、およびBiacore結合結果をまとめている。ループ２配列は、配列番号３９に対応する。ループ４配列は、上から順に配列番号１８７−１９５に対応する。
【図２０】図２０．＋４℃の条件でＰＢＳ １ｘ緩衝液中に保存したとき、９ヶ月間のＡＶＡ０４−２５１ Ｖ.２の安定性。Yarra-3000 (Phenomenex) カラム泳動でのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析をＰＢＳ １ｘ緩衝液中１ｍｌ／分で行った。
【図２１】図２１．ＡＶＡ０４−２５１ ＣＧの構造およびＳＥＣ−ＨＰＬＣ／ＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果。最終的なＡＶＡ０４−２５１ ＣＧは、ＰＢＳ １ｘ緩衝液中で１ｍｌ／分でUltimate 3000 HPLC（Thermo）上で実行されたSEC-HPLC Yarra-3000カラム上で９８％以上の純度であった。SDS-PAGE画像は、還元されたＡＶＡ０４−２５１ ＣＧと還元されていないＡＶＡ０４−２５１ ＣＧとの間のｋＤａの違いを示している。
【図２２】図２２．ＡＶＡ０４−２５１ ＣＦのSEC-HPLCおよびSDS-PAGE結果。最終的なＡＶＡ０４−２５１ ＣＦは、ＰＢＳ １ｘ緩衝液中で１ｍｌ／分でUltimate 3000 HPLC (Thermo)上で実行されたSEC-HPLC Yarra-3000カラム上で９９％以上の純度であった。SDS-PAGE画像は、SDS-PAGE画像は、還元されたＡＶＡ０４−２５１ ＣＦと還元されていないＡＶＡ０４−２５１ ＣＦの間のｋＤａの差を示す。
【図２３】図２３．ＡＶＡ０４−２６１ ＢＮフォーマットの精製および動態解析の結果。SDS-PAGE画像は、非還元条件下でヒンジ内のシステインを介して二量化する二量体種を示し、還元緩衝液中でモノマーに還元されたＡＶＡ０４−２６１ ＢＮフォーマットは、モノマーＡＶＡ０４−２６１と比較して、PD-1 PD-L1遮断バイオアッセイ(Promega)でのアビディティを有し、Biacore上で５９．９ｐＭのＫＤを有する。
【図２４】図２４．ＡＶＡ０４−２５１ ＡＺヒト（リンカーなしでｈＦｃ１上にフォーマットされたＡＶＡ０４−２５１）の精製および動的解析の結果。最終的なタンパク質は、ＰＢＳ １ｘ緩衝液中で１ｍｌ／分でUltimate 3000 HPLC (Thermo)上で実行されたSEC-HPLC Yarra-3000カラム上で９９％以上の純度であった。Biacore単一サイクル動態データブランクを減算し、１：１結合モデルに適合させ、３１．５ｐＭのＫＤが得られた。PD-1 PD-L1遮断バイオアッセイ (Promega) は、Ｆｃヒンジとアフィマーの間の（Ｇ４Ｓ）４ (配列番号１９７)リンカーのＶ．２フォーマットと同じ活性を実証する。
【００８４】
【図２５】図２５．ＡＶＡ０４−２５１ ＡＧ.３およびＡＶＡ０４−２５１ ＢＳフォーマットの精製および動的解析の結果。分析SEC-HPLCを用いて、各タンパク質の純度を評価した。Biacore 単一サイクル動態データブランクを減算し、１：１結合モデルに適合させ、ＡＶＡ０４−２５１ ＡＧ.３およびＡＶＡ０４−２５１ ＢＳについて、それぞれ３６．２ｐＭおよび２５．７ｐＭのＫＤを実証した。
【図２６】図２６．非共有結合複合体のストキオメトリーを分析するために、Ｆｃ融合ＡＶＡ０４−２５１ Ｖ.２またはＡＶＡ０４−２３６ Ｖ(８２ｋＤａ)とＰＤ−Ｌ１結合ドメイン(１４ｋＤａ)のクロスリンク質量分析。
【図２７】図２７．フォーマット化されたＡＶＡ０４−２５１ ＦｃのカニクイザルＰＤ−Ｌ１への結合の交差反応性。
【図２８】図２８．フォーマット化されたＡＶＡ０４−２５１ ＦｃのカニクイザルＰＤ−Ｌ１への結合の交差反応性。
【図２９】図２９Ａ−２９Ｂ。ＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２処置後に増加する混合リンパ球反応におけるＩＦＮγのレベル。
【図３０】図３０．ブドウ球菌エンテロトキシンＢ刺激アッセイにおけるAVA04-251_V.2での処置後のＩＬ２の増加。
【図３１】図３１．半減期を計算できるように、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスでＡＶＡ０４-２５１ ＸＴフォーマットで注射したマウスからの血清中のＥＬＩＳＡによって投与された時間の関数としての濃度。
【図３２】図３２Ａ−３２Ｂ。同所移植ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を有するヒト化ＮＯＧマウスの組織分布試験におけるＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２のインビボ特性評価。
【図３３】図３３Ａ−３３Ｄ。ヒト化ＭＣ３８同所移植モデルにおいて腫瘍増殖を遅らせるAVA04-251_V.2のインビボでの有効性。
【図３４】図３４Ａ−３４Ｄ。A375 XenograftモデルにおけるＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２のインビボでの効果。
【図３５】図３５Ａ−３５Ｂ。マウス同種混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるマウスサロゲーＡＶＡ０４−１８２ Ｖ.２の活性。対照物質をアイソタイプ対照と比較するペアｔ検定を用いて、データを個々の反応および平均±SEM *P<0.05、**p<0.01として示す。
【図３６】図３６Ａ−３６Ｂ。ＭＢ４９マウス同所移植モデル（図３６Ａ）における腫瘍増殖阻害；ＭＢ４９モデル（図３６Ｂ）における処置の２１日後の腫瘍サイズ。
【発明を実施するための形態】
【００８５】
詳細な説明
Ｉ．概要
本発明は、ＰＤ−Ｌ１に結合し、その分子とＰＤ−１との相互作用を阻害するアフィマーの生成に基づいており、その結果、癌、異形成、新生物ならびに特定のウイルスおよび寄生虫感染の処置に有用なチェックポイント阻害剤を示す。
【００８６】
天然タンパク質（シスタチン）に基づいて、結合表面を作製する２つのループを安定して表示するように設計された、本発明のＰＤ−Ｌ１結合アフィマーポリペプチドは、抗体、抗体フラグメントおよび他の非抗体結合タンパク質に勝る多くの利点を提供する。
【００８７】
１つは、アフィマーポリペプチド自体のサイズが小さいことである。単量体形態において、約１４ｋＤａであるか、または抗体の１０分の１のサイズである。この小さなサイズは、特に血管新生が不十分な、および／または線維性標的組織（腫瘍など）において、組織浸透の増加の可能性を高める。
【００８８】
アフィマーは、アフィマーは、単純なタンパク質構造（対マルチドメイン抗体）を有し、該アフィマーは、機能のためにジスルフィド結合または他の翻訳後修飾を必要としないため、これらのポリペプチドを含むフォーマットの態様の多くは、原核生物系および真核生物系で製造することができる。
【００８９】
アフィマーのライブラリー（例えば、添付の実施例に記載のファージディスプレイ技術など）ならびに部位特異的変異誘発を利用する能力により、アフィマーは、治療用途のための理想的な範囲を有する調整可能な結合動態で生成することができる。例えば、アフィマーは、例えば、単量体アフィマーについて一桁のナノモルまたはそれ以下のＫＤ、および多価フォーマットについてピコモルのＫＤおよびアビディティなどの、ＰＤ−Ｌ１に対する高い親和性を有し得る。アフィマーは、標的組織の局在化に有利な１０−４〜１０−５ (ｓ−１)の範囲の遅いＫｏｆｆ速度など、ＰＤ−Ｌ１に対するタイトな結合動態で生成することができる。
【００９０】
本発明のＰＤ−Ｌ１結合アフィマーには、本開示のＰＤ−Ｌ１結合アフィマーは、優れた選択性を有するアフィマーが含まれる。
【００９１】
さらに、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーは、容易にフォーマット化することができ、Ｆｃ融合、全抗体融合およびインラインマルチマーのようなフォーマットを容易に生成および製造することができる。
【００９２】
ジスルフィド結合および翻訳後修飾の必要性の欠如はまた、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマー（または単量体アフィマー）を含むタンパク質の多くの態様が、タンパク質が全身的に送達される（筋肉組織からの発現などの）フォーマットまたは局所送達される（尿道内遺伝子送達などの）フォーマットを含む、患者の組織に導入される遺伝子送達構築物の発現によって治療的に送達されることを可能にする。
【００９３】
ＩＩ．定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語および語句を以下に定義する。
【００９４】
ａ．アフィマー
用語“ステフィン（Stefin）ポリペプチド”とは、複数のシスタチン様配列を含むタンパク質を含むシスタチンスーパーファミリーのタンパク質のサブグループを意味する。
【００９５】
シスタチンファミリーのステフィンサブグループは、比較的小さい（約１００アミノ酸）単一ドメインタンパク質である。これらのタンパク質は、既知の翻訳後修飾を受けず、ジスルフィド結合を欠いているため、細胞外および細胞内環境の広い範囲で同じように折り畳むことができることを示唆している。ステフィンＡ自体は、９８アミノ酸の単量体、一本鎖、単一ドメインのタンパク質である。ステフィンＡの構造が解かれ、ステフィンＡのアフィマー足場への合理的な変異が容易になった。シスタチンの唯一の既知の生物学的活性は、カテプシン活性の阻害であり、これにより、本発明者らの設計したタンパク質の残留生物学的活性を網羅的に試験することができた。
【００９６】
用語“アフィマー”（または、“アフィマー足場”または“アフィマーポリペプチド”）とは、ステフィンポリペプチドの組換え的に操作された変異体である、小さい、高度に安定なタンパク質を意味する。アフィマータンパク質は、モノクローナル抗体と同様の方法で、高い親和性および特異性を有する所望の標的タンパク質に結合するように、全て無作為化することができる２つのペプチドループおよびＮ末端配列を示す。ステフィンタンパク質の足場による２つのペプチドの安定化は、ペプチドが取ることができる可能性のある構造を制限し、遊離ペプチドのライブラリーと比較して結合親和性および特異性を向上させる。これらの工学的に設計された非抗体結合タンパク質は、異なる用途においてモノクローナル抗体の分子認識特性を模倣するように設計される。ステフィンポリペプチド配列の他の部分への改変を実施することができ、そのような改変は、安定性を増加させ、温度およびｐＨなどの範囲にわたってロバストにする、これらの親和性試薬の特性を改善する。好ましくは、アフィマーは、ヒトステフィンＡなどのステフィンＡ野生型配列と実質的に同一性を共有する、ステフィンＡに由来する配列を含む。本発明から逸脱することなく、改変を足場配列に行ってもよいことは、当業者には明らかであろう。特に、アフィマー足場は、ヒトステフィンＡに対応する配列に対して少なくとも２５％、３５％、４５％、５５％または６０％の同一性を有するアミノ酸配列、好ましくは少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２％、少なくとも９４％、少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有していてよく、例えば、ここで、配列改変が、所望の標的（例えば、ＰＤ−Ｌ１）に結合するための足場の能力に悪影響を及ぼさず、例えば、野生型ステフィンＡが有するが、本明細書に記載の変異変化で廃止されるような生物学的機能を回復させないか、または生じさせないものである。
【００９７】
“アフィマー剤”とは、アフィマーポリペプチド配列を含み、患者への送達を意図した治療的に活性なタンパク質を表すように、他の任意の修飾（例えば、複合体、翻訳後修飾など）を有するポリペプチドを意味する。
【００９８】
“ＰＤ−Ｌ１”、“分化２７４のクラスター”、“ＣＤ２７４”、“Ｂ７ホモログ１”または“Ｂ７−Ｈ１”としても公知の“プログラムされた細胞死−リガンド１”は、ヒトの場合、ＣＤ２７４遺伝子によりコードされるタンパク質を意味する。ヒトＰＤ−Ｌ１は、４０ｋＤａの１型膜貫通タンパク質であり、様々な状況下で免疫系の抑制に大きな役割を果たしている。代表的なヒトＰＤ−Ｌ１の配列は、UniProtKBプライマリーアクセッション番号Ｑ９ＮＺＱ７により提供されており、その他のヒトアイソフォームを含み得る。ＰＤ−Ｌ１は、その受容体であるＰＤ−１に結合し、活性化されたＴ細胞、Ｂ細胞およびミエロイド細胞上に見出され、活性化または阻害を調節する。また、ＰＤ−Ｌ１は、共刺激分子であるＣＤ８０（Ｂ７−１）に対してもかなりの親和性を有している。ＰＤ−Ｌ１がその受容体ＰＤ−１（“プログラムされた細胞死タンパク質１”または“ＣＤ２７９”）とＴ細胞上で結合すると、ＴＣＲが介在するＩＬ−２産生の活性化およびＴ細胞増殖を阻害するシグナルが伝達される。この点で、ＰＤ−Ｌ１はチェックポイントと考えられ、腫瘍におけるその上方制御された発現は、Ｔ細胞介在抗腫瘍応答の阻害に寄与する。ＰＤ−Ｌ１は、様々な哺乳動物種からのＰＤ−Ｌ１を参照して一般的に用いられるが、ＰＤ−Ｌ１への参照は、ヒトＰＤ−Ｌ１を含み、好ましくは、ヒトＰＤ−Ｌ１自体を参照していることが、本出願を通して理解され得る。
【００９９】
“ＰＤ-Ｌ１アフィマー剤”とは、少なくとも１０-６Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する、ＰＤ−Ｌ１、特にヒトＰＤ−Ｌ１に結合する少なくとも１つのアフィマーポリペプチドを有するアフィマー剤を意味する。
【０１００】
“コード化されたアフィマー”は、遺伝子送達プロセスを介して患者の体内の細胞によって発現されたとき、インビボで意図されたアフィマー剤を産生する核酸構築物を意味する。
【０１０１】
“アフィマー連結コンジュゲート”（Affimer-linked Conjugate）は、アフィマーポリペプチド配列を含むアフィマー剤のポリペプチド部分のＣ末端またはＮ末端を介した連続ペプチド結合の形成以外の化学的なコンジュゲートにより、アフィマー剤にコンジュゲートされた１または複数の部位を有するアフィマー剤を意味する。アフィマー連結コンジュゲートは、“アフィマー剤コンジュゲート（Affimer-Drug Conjugate）”であってもよく、それは、アフィマー剤にコンジュゲートされた１以上の薬理学的に活性な部位を含むアフィマー剤を意味する。また、アフィマー結合型コンジュゲートは、“アフィマータグコンジュゲート”であってもよく、これは、コンジュゲートされた１以上の検出可能な部位（すなわち、検出可能なラベル）を含むアフィマー剤を意味する。
【０１０２】
ｂ．ポリペプチド
用語“ポリペプチド”および“ペプチド”および“タンパク質”は、本明細書中互換的に用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマーを意味する。ポリマーは、直鎖状または分岐状であってもよく、それは修飾されたアミノ酸を含んでいてよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。この用語はまた、天然にまたは介入によって修飾されたアミノ酸ポリマーも含む；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、リポキシ化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との共役のような他の操作または修飾されたアミノ酸ポリマーも含む。また、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸を含む）の１以上の類縁体を含むポリペプチド、ならびに当技術分野で公知の他の修飾体も含まれる。
【０１０３】
用語“アミノ酸残基”および“アミノ酸”は互換的に用いられ、ポリペプチドの文脈中、ポリペプチドの２以上のペプチド結合に関与しているアミノ酸を意味する。一般的に、アミノ酸を指定するための本明細書で用いる略語は、生化学命名法に関するIUPAC-IUB委員会の勧告に基づいている（Biochemistry (1972) 11:1726-1732参照)。例えば、Ｍｅｔ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＡｌａおよびＧｌｙは、それぞれメチオニン、イソロイシン、ロイシン、アラニンおよびグリシンの“残基”を示す。残基とは、カルボキシル基のＯＨ部分およびα−アミノ基のＨ部分を除去して得られる、対応するα−アミノ酸に由来するラジカルを意味する。用語“アミノ酸側鎖”は、K.D. Koppleの、“Peptides and Amino Acids”、W.A. Benjamin Inc. New York and Amsterdam, 1966, pages 2 and 33で定義されているように、−ＣＨ（ＮＨ２）ＣＯＯＨ部分を除いたアミノ酸の一部である。
【０１０４】
ほとんどの場合、本明細書の適用に用いるアミノ酸は、タンパク質中に見いだされる天然アミノ酸であるか、またはアミノ基およびカルボキシル基を含むそのようなアミノ酸の天然の同化または異化産物である。特に、好適なアミノ酸側鎖には、以下のアミノ酸：グリシン、アラニン、バリン、システイン、ロイシン、イソロイシン、セリン、スレオニン、メチオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、リシン、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファン、ならびにペプチジルグリカン細菌細胞壁の構成要素として同定されているそれらのアミノ酸およびアミノ酸類縁体から選択される側鎖が含まれる。
【０１０５】
“塩基性側鎖”を有するアミノ酸残基には、Ａｒｇ、ＬｙｓおよびＨｉｓが含まれる。“酸性側鎖”を有するアミノ酸残基には、ＧｌｕおよびＡｓｐが含まれる。“天然極性側鎖”を有するアミノ酸残基には、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＣｙｓおよびＴｙｒが含まれる。“天然非極性側鎖”を有するアミノ酸残基には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｒｏ、ＴｒｐおよびＰｈｅが含まれる。“非極性脂肪族側鎖”を有するアミノ酸残基には、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＩｌｅおよびＬｅｕが含まれる。“疎水性側鎖”を有するアミノ酸残基には、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、ＴｙｒおよびＴｒｐが含まれる。“小さい疎水性側鎖”を有するアミノ酸残基にｈ、ＡｌａおよびＶａｌが含まれる。“芳香族側鎖”を有するアミノ酸残基には、Ｔｙｒ、ＴｒｐおよびＰｈｅが含まれる。
【０１０６】
用語アミノ酸残基にはさらに、本明細書で言及される任意の特定のアミノ酸の類縁体、誘導体および同族体をさらに含み、例えば、対象のアフィマー（特に、化学合成によって生成された場合）としては、例えば、シアノアラニン、カナバニン、ジャンコール酸、ノルロイシン、３−ホスホセリン、ホモセリン、ジヒドロキシフェニルアラニン、５−ヒドロキシトリプトファン、１−メチルヒスチジン、３−メチルヒスチジン、ジアミノピメル酸、オルニチンまたはジアミノ酪酸などのアミノ酸類縁体が挙げられる。本明細書で好適な側鎖を有する他の天然アミノ酸代謝物または前駆体は、当業者によって認識され、本発明の範囲に含まれる。
【０１０７】
アミノ酸の構造が立体異体を認めるとき、そのようなアミノ酸の（Ｄ）および（Ｌ）立体異性体もまた含まれる。本明細書に記載のアミノ酸およびアミノ酸残基の構成は、適当な記号（Ｄ）、（Ｌ）または（ＤＬ）によって示され、さらに構成が指定されていないとき、アミノ酸または残基は、（Ｄ）、（Ｌ）または（ＤＬ）の構成を有し得る。本発明のいくつかの化合物の構造は、不斉炭素原子を含むことが特記され得る。従って、このような非対称性から生じる異性体が本発明の範囲内に含まれることは理解されるべきである。かかる異性体は、古典的な分離技術によって、および立体的に制御された合成によって、実質的に純粋な形態で得ることができる。本発明の目的のために、特に反対の記載がない限り、指定されたアミノ酸は、（Ｄ）または（Ｌ）立体異性体の両方を含むと解釈されるべきである。
【０１０８】
２以上の核酸またはポリペプチドの文脈中、用語“同一”または“同一性（％）”は、保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部として考慮しないで、最大の対応（correspondene）を得るために（必要に応じてギャップを導入して）比較およびアラインメントしたときに、同一であるか、または同一のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基の特定の割合を有する２以上の配列または部分配列を意味する。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアまたはアルゴリズムを用いて、または目視検査によって測定してもよい。アミノ酸配列またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために用いられ得る様々なアルゴリズムおよびソフトウェアは、当技術分野でよく知られている。これらには、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ、およびそれらの変形が含まれるが、これらに限定されない。ある態様において、本発明の２つの核酸またはポリペプチドは、実質的に同一であり、これは、配列比較アルゴリズムを用いてまたは目視検査によって測定されるように、最大の対応関係のために比較およびアラインメントされたとき、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、およびある態様において、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチド残基またはアミノ酸残基の同一性を有することを意味する。ある態様において、同一性は、少なくとも約１０残基、少なくとも約２０残基、少なくとも約４０〜６０残基、少なくとも約６０〜８０残基の長さ、またはその間の任意の整数であるアミノ酸配列の領域にわたって存在する。ある態様において、同一性は、少なくとも約８０〜１００残基のような６０〜８０残基よりも長い領域にわたって存在し、ある態様において、配列は、標的タンパク質または抗体のコーディング領域のような、比較される配列の全長にわたって実質的に同一である。ある態様において、同一性は、少なくとも約１０塩基、少なくとも約２０塩基、少なくとも約４０〜６０塩基、少なくとも約６０〜８０塩基の長さ、またはその間の任意の整数であるヌクレオチド配列の領域にわたって存在する。ある態様において、同一性は、少なくとも約８０〜約１０００塩基またはそれ以上のような、６０〜８０塩基よりも長い領域にわたって存在し、ある態様において、配列は、比較される配列の全長にわたって実質的に同一であり、例えば、目的のタンパク質をコードするヌクレオチド配列のようなものである。
【０１０９】
“保存的アミノ酸置換”は、あるアミノ酸残基が同様の側鎖を有する別のアミノ酸残基で置換されているものである。塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベータ−分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含む、同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、一般的に定義されてきた。例えば、チロシンに対するフェニルアラニンの置換は、保存的置換である。一般に、本発明のポリペプチド、可溶性タンパク質および／または抗体の配列における保存的置換は、そのアミノ酸配列を含むポリペプチド、可溶性タンパク質または抗体の標的結合部位への結合を損なうものではない。結合を排除しないアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当技術分野でよく知られている。
【０１１０】
“単離された”ポリペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、天然に見いだされない形態のポリペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物である。単離されたポリペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、それらがもはや天然に見出されない形態である程度に精製されたものを含む。ある態様において、単離されたポリペプチド、可溶性タンパク質、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞または組成物は、実質的に純粋である。
【０１１１】
本明細書で用いる“実質的に純粋”は、少なくとも５０％純粋（すなわち、汚染物質を含まない）、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である材料を意味する。
【０１１２】
本明細書で用いる用語“融合タンパク質”または“融合ポリペプチド”は、少なくとも２つの遺伝子のヌクレオチド配列を含む核酸分子によって発現されるハイブリッドタンパク質を意味する。
【０１１３】
本明細書で用いる用語“リンカー”または“リンカー領域”は、第１のポリペプチド（例えば、アフィマーのコピー）と第２のポリペプチド（例えば、別のアフィマー、Ｆｃドメイン、リガンド結合ドメインなど）との間に挿入されたリンカーを意味する。ある態様において、リンカーはペプチドリンカーである。リンカーは、ポリペプチドの発現、分泌または生物活性に悪影響を及ぼしてはならない。好ましくは、リンカーは抗原性ではなく、免疫応答を誘発しない。
【０１１４】
“アフィマー−抗体融合”は、アフィマーポリペプチド部分と抗体の可変領域を含む融合タンパク質を意味する。アフィマー−抗体融合体は、例えば、そのＶＨおよび／またはＶＬ鎖の１以上のＣ末端またはＮ末端に付加された１以上のアフィマーポリペプチド配列を有する全長抗体を含み、すなわち、組み立てられた抗体の少なくとも１つの鎖は、アフィマーポリペプチドとの融合タンパク質である。アフィマー−抗体融合はまた、１以上のアフィマーポリペプチド配列が、抗体フラグメントの抗原結合部位または可変領域との融合タンパク質の一部として提供される態様を含む。
【０１１５】
本明細書で用いる用語“抗体”は、抗原結合部位は通常、免疫グロブリン分子の可変領域内にある少なくとも１つの抗原結合部位を介して、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質またはそれらの組合せなどの標的を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を意味する。本明細書で用いる用語は、それらの断片がＦｃまたは他のＦｃγＲＩＩＩ結合ドメイン、多重特異性抗体、二重特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質（Ｆｃまたは他のＦｃγＲＩＩＩ結合ドメインを含むようにフォーマット化された）、および抗体が所望の生物学的活性を示す限り、抗原結合部位を含む何れか他の改変された免疫グロブリン分子を含むようにフォーマットされている場合、無傷のポリクローナル抗体、無傷のモノクローナル抗体、抗体フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２およびＦｖフラグメント）、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体を含む。
【０１１６】
抗体は、α、δ、ε、γおよびｍｕと呼ばれるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの５つの主要クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、またはそれらのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）のいずれであってもよい。
【０１１７】
用語、抗体の“可変領域”とは、抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を単独でまたは組合せて意味する。一般的に、重鎖および軽鎖の可変領域はそれぞれ、４つのフレームワーク領域（ＦＲ）および３つの、“超可変領域”としても知られる相補性決定領域（ＣＤＲ）から構成されている。各鎖中のＣＤＲは、フレームワーク領域によって互いに近接して保持されており、他の鎖のＣＤＲとともに、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している。ＣＤＲを決定するための少なくとも２つの技術がある：（１）異種間の配列変動性に基づくアプローチ（すなわち、Kabat et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Edition, National Institutes of Health, Bethesda Md.)、および（２）抗原−抗体複合体の結晶構造解析に基づくアプローチ（Al Lazikani et al., 1997, J. Mol. Biol., 273:927-948)。さらに、これらの２つのアプローチの組合せが、ＣＤＲを決定するために当技術分野で用いられることがある。
【０１１８】
本明細書で用いる用語“ヒト化抗体”とは、特定の免疫グロブリン鎖、キメラ免疫グロブリンまたは最小の非ヒト配列を含むそれらのフラグメントである、非ヒト（例えば、マウス）抗体の形態を意味する。一般的には、ヒト化抗体は、ＣＤＲの残基が、所望の特異性、親和性および／または結合能を有する非ヒト種（例えば、マウス、ラット、ウサギもしくはハムスター）のＣＤＲに由来する残基で置換されているヒト免疫グロブリンである。ある例において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域残基は、非ヒト種由来の抗体中の対応する残基で置換される。ヒト化抗体は、抗体特異性、親和性および／または結合能を増強させ、最適化するために、Ｆｖフレームワーク領域内および／または置換された非ヒト残基内のいずれかの付加的な残基の置換によって、さらに改変され得る。ヒト化抗体は、フレームワーク領域のすべてまたは実質的にすべてがヒト免疫グロブリン配列のものであるのに対し、非ヒト免疫グロブリンに対応するＣＤＲのすべてまたは実質的にすべてを含む可変ドメインを含んでいてよい。ある態様において、可変ドメインは、ヒト免疫グロブリン配列のフレームワーク領域を含む。ある態様において、可変ドメインは、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のフレームワーク領域を含む。ヒト化抗体はまた、一般的にはヒト免疫グロブリン由来である、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部を含んでいてよい。ヒト化抗体は、通常、キメラ抗体とは異なるものと考えられる。
【０１１９】
用語“エピトープ”および“抗原決定基”は、本明細書中互換的に用いられ、特定の抗体、特定のアフィマーまたは他の特定の結合ドメインによって認識され、特異的に結合され得る抗原の部分を意味する。抗原がポリペプチドであるとき、エピトープは、タンパク質の三次元折り畳みによって並置された隣接アミノ酸および非隣接アミノ酸の両方から形成され得る。隣接するアミノ酸から形成されたエピトープ（線形エピトープとも呼ばれる）は、通常、タンパク質の変性時に保持されるが、三次元折り畳みによって形成されたエピトープ（立体構造エピトープとも呼ばれる）は、通常、タンパク質変性時に失われる。エピトープは、一般的には、独特の空間的構造で少なくとも３つ、より一般的には少なくとも５、６、７または８から１０個のアミノ酸を含む。
【０１２０】
本明細書で用いる用語“〜に特異的に結合する”または“〜に特異的である”は、生体分子を含む分子の異種集団の存在下での標的の存在を決定する、標的とアフィマー、抗体または他の結合パートナーとの間の結合のような、測定可能でかつ再現性のある相互作用を意味する。例えば、標的に特異的に結合するアフィマーは、他の標的に結合するよりも、より大きな親和性、アビディティ（多量体形態の場合）、より容易に、および／またはより長い持続時間で、この標的に結合するアフィマーである。
【０１２１】
本明細書で用いる“コンジュゲート”、“コンジュゲーション”またはそれらの文法的な変形は、当技術分野で知られている何らかの結合または連結方法によって、別の化合物の形成をもたらす２以上の化合物の結合または連結を意味する。また、２以上の化合物の結合または連結によって生成される化合物を意味することもできる。例えば、１以上の化学的部位またはポリペプチドに直接または間接的に連結された抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーは、例示的なコンジュゲートである。このようなコンジュゲートには、融合タンパク質、化学的コンジュゲートによって生成されたもの、および何らかの他の方法によって生成されたものが含まれる。
【０１２２】
ｃ．核酸
用語“ポリヌクレオチド”、“核酸”および“核酸分子”は、本明細書中互換的に用いられ、ＤＮＡおよびＲＮＡを含む、任意のヌクレオチド長のポリマーを意味する。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドまたは塩基、および／またはそれらの類縁体、あるいはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによりポリマーに組み込まれ得る基質であり得る。
【０１２３】
本明細書で用いる用語“〜をコードする核酸分子”、“〜をコードするＤＮＡ配列”および“〜をコードするＤＮＡ”は、デオキシリボ核酸デオキシリボヌクレオチド鎖に沿ったヌクレオチドの順序または配列を意味する。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序は、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序を決定する。従って、核酸配列はアミノ酸配列をコードする。
【０１２４】
ヌクレオチド配列に関して用いられるとき、本明細書で用いる用語“配列”は、文法的および他の形態では、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでいてよく、一本鎖または二本鎖であってもよい。核酸配列は、変異していてもよい。核酸配列は、任意の長さ、例えば、約２から１０００，０００以上のヌクレオチド（またはそれ以上もしくはその間の任意の整数）、例えば、約１００から約１０，０００、または約２００ヌクレオチドから約５００ヌクレオチド長を有していてもよい。
【０１２５】
本明細書で用いる用語“ベクター”は、宿主細胞に目的の１以上の遺伝子または配列を送達し、通常発現することができる構築物を意味する。ベクターの例としては、ウイルスベクター、裸の（naked）ＤＮＡまたはＲＮＡ発現ベクター、プラスミド、コスミドまたはファージベクター、カチオン縮合剤に結合したＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクター、およびリポソームにカプセル化されたＤＮＡもしくはＲＮＡ発現ベクターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２６】
本明細書で用いる用語“トランスフェクション”は、真核細胞への外因性核酸の導入を意味する。トランスフェクションは、リン酸カルシウム−ＤＮＡ共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン介在トランスフェクション、ポリブレン介在トランスフェクション、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、リポソーム融合、リポフェクション、プロトプラスト融合、レトロウイルス感染、および生物学的技術（biolistics technology）を含む、当技術分野で知られている様々な手段によって達成され得る。
【０１２７】
本明細書で用いる用語“担体”は、組成物を細胞の内部に送達するために用いられ得る単離された核酸を含む単離核酸である。直鎖状ポリヌクレオチド、イオン性または両親媒性化合物に関連するポリヌクレオチド、プラスミドおよびウイルスを含むがこれらに限定されない多数の担体が当技術分野において知られている。したがって、用語“ベクター”は、自己複製するプラスミドまたはウイルスを含む。該用語は、非プラスミドおよび非ウイルス化合物、例えばポリリジン化合物、リポソームなどの細胞内への核酸の移入を容易にすることを含むように解釈されるべきである。ウイルスベクターの例としては、
アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクターなどが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２８】
本明細書で用いる用語“発現ベクター”は、発現制御配列を含む組換えポリヌクレオチドおよび作動可能に連結されて発現されるヌクレオチド配列を含むベクターを意味する。発現ベクターは、発現に用いられる十分なシス作用エレメント（cis-acting elements)を含む；発現用の他のエレメントは、宿主細胞またはインビトロ発現系により供給される。発現ベクターには、コスミド（例えば、裸のまたはリポソームに含まれる）およびウイルス（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）などの、当技術分野で知られているすべてのものが含まれる。
【０１２９】
本明細書で用いる用語“作動可能に連結された”は、調節配列と異種核酸配列との間の機能的結合が、後者の発現をもたらすように連結されていることを意味する。例えば、第１の核酸配列と第２の核酸配列が機能的に結合しているとき、該第１の核酸配列と第２の核酸配列は作動可能に連結されている。例えば、プロモーターがコーディング配列の転写または発現に影響を与える場合、プロモーターは、コーディング配列に作動可能に連結されている。一般的には、作動可能に連結されたＤＮＡ配列は連続しており、必要に応じて同じリーディングフレーム内の２つのタンパク質コーディング領域を結合している。
【０１３０】
本明細書で用いる用語“プロモーター”は、ポリヌクレオチド配列または導入されたポリヌクレオチド配列の細胞特異的転写の合成機構に必要な合成機構によって認識されるプロモーターＤＮＡ配列として定義される。
【０１３１】
本明細書で用いる用語“構成的発現”は、生理的条件下で発現される全てのものを意味する。
【０１３２】
本明細書で用いる用語“誘導性発現”は、細胞内シグナル伝達経路の活性化（もしくは不活性化）または発現構築物を含む細胞を、小分子の濃度に感受性の誘導性プロモーターに作動可能に連結された遺伝子の発現（もしくは発現の程度）を調節する小分子と接触させることなどの特定の条件下で発現することを意味する。
【０１３３】
用語“エレクトロポレーション”は、生体膜に微細経路（細孔）を生じさせるための膜貫通電場パルスの使用を意味し、それらの存在は、プラスミドまたは他のオリゴヌクレオチドなどの生体分子が細胞膜の一方の側から他方の側へと通過するのを可能にする。
【０１３４】
ｄ．チェックポイント阻害剤、共刺激アゴニストおよび化学療法剤
“チェックポイント分子”とは、組織および／または免疫細胞によって発現され、チェックポイント分子の発現レベルに依存する方法で免疫応答の効力を低下させるタンパク質を意味する。これらのタンパク質が阻害されると、免疫系の“ブレーキ”が解除され、例えば、Ｔ細胞が、より効果的に癌細胞を殺すことができる。Ｔ細胞または癌細胞上に見出されるチェックポイントタンパク質の例としては、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１およびＣＴＬＡ−４／Ｂ７−１／Ｂ７−２、ＰＤ−Ｌ２、ＮＫＧ２Ａ、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ９６、ＶＩＳＴＡおよびＴＩＧＩＴが挙げられる。
【０１３５】
“チェックポイント阻害剤”とは、チェックポイント分子からの免疫抑制シグナルを反転させる薬物を意味する。
【０１３６】
“共刺激分子”は、Ｔ細胞の同族結合パートナーなどの免疫細胞が、刺激性リガンドと特異的に結合することにより、これに限定されないが、増殖などの共刺激に介在するものを意味する。共刺激分子は、抗原受容体またはリガンド以外の細胞表面分子であり、効果的な免疫応答を促進する。共刺激分子としては、ＭＨＣＩ分子、ＢＴＬＡ受容体およびＴｏｌｌリガンド、およびＯＸ４０、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１Ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）などが挙げられるが、これらに限定されない。共刺激性分子の例としては、以下のものが挙げられるが、これらに限定されない：ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ８β、ＩＬ２Ｒβ、ＩＬ２Ｒγ、ＩＬ７Ｒα、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｃ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４，２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａおよびＣＤ８３リガンド。
【０１３７】
“共刺激アゴニスト”とは、共刺激リガンドなどの共刺激分子を活性化（アゴナイズ）し、免疫刺激シグナルを生じるか、さもなければ免疫応答の効力または効果を増強させる薬物を意味する。
【０１３８】
“化学療法剤”は、癌の処置に有用な化合物を意味する。化学療法剤の例としては、以下が含まれる：チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）などのアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メチュレドーパおよびウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミドおよびトリメチルオロメラミンを含むエチレンイミンおよびメチルアメラミン；アセトゲニン（とりわけ、ブラタシンおよびブラタシノン）；デルタ−９−テトラヒドロカンナビノール（ドロナビノール、ＭＡＲＩＮＯＬ）；ベータ−ラパコン；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン（合成類縁体トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ）、ＣＰＴ−１１（イリノテカン、ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）、アセチルカンプトテシン、スコポレクチンおよび９−アミノカンプトテシンを含む）；ブリオスタチン；ペメトレキセド；カリスタチン；ＣＣ−１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシンおよびビゼレシン合成類縁体を含む）；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸；テニポシド；クリプトフィシン（特に、クリプトフィシン１およびクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（その合成類縁体、ＫＷ−２１８９およびＣＢ１−ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；ＴＬＫ−２８６；ＣＤＰ３２３、経口アルファ−４ インテグリン阻害剤；サルコディクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミン、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチンおよびラニムヌスチンなどのニトロ尿素；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、とりわけカリケアマイシンガンマ１ＩおよびカリケアマイシンオメガＩ１（例えば、Nicolaou et al., Angew. Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)参照）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；エスペラマイシン；ならびに、ネオカルジノスタチンクロモフォアおよび関連するクロモプロテインエンジイン抗生物質クロモフォア、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カルミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorubicin)、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン（アドリアマイシン、モルホリノ−ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２−ピロリノ−ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣｌリポソーム注射（ＤＯＸＩＬ）およびデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイ��ン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；メトトレキサート、ゲムシタビン(GEMZAR)、テガフール(UFTORAL)、カペシタビン(XELODA)、エポチロンおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの抗代謝産物；デノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)のような葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類縁体；ピリミジン類縁体、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６−アザウリジン、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロキシウリジン(floxuridine)およびイマチニブ（２−フェニルアミノピリミジン誘導体）、ならびに他のｃ−Ｋｉｔ阻害剤；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸(frolinic acid)のような葉酸リプレニッシャー(replenisher)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン；酢酸エリプチニウム；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；オキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)：メイタンシンおよびアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖複合体(JHS Natural Products、Eugene、Oreg.)；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２”−トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（とりわけ、Ｔ−２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡおよびアンギジン）；ウレタン；ビンデシン（ELDISINE、FILDESIN)；ダカルバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド（“Ara-C”）；チオテパ；タキソイド、例えばパクリタキセル（タキソール）、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANE)およびドセタキセル(タキソテール)；クロランブシル；６−チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチンおよびカルボプラチンのような白金類縁体；ビンブラスチン(VELBAN)；プラチナ；エトポシド(ＶＰ−１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN)；オキサリプラチン；ロイコボビン；ビノレルビン(NAVELBINE)；ノバントロン(novantron)；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸などのレチノイド；上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体；ならびに、シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチンおよびプレドニゾロンの併用療法の略語であるＣＨＯＰ、ならびに５−ＦＵとロイコボビンを組み合わせたオキサリプラチン (ELOXATIN)の処置レジメンの略語であるＦＯＬＦＯＸなどの、上記の２以上の組合せ。
【０１３９】
また、この定義には、癌の増殖を促進し得るホルモンの影響を調節、減少、遮断または阻害するように作用する抗ホルモン剤も含まれ、多くの場合、全身的処置または全身処置の形で行われる。それらはホルモン自体であってもよい。例としては、抗エストロゲンおよび選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）、例えばタモキシフェン（NOLVADEXタモキシフェンを含む）、ラロキシフェン(EVISTA)、ドロロキシフェン、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、およびトレミフェン(FARESTON)；抗プロゲステロン；エストロゲン受容体下方制御剤(ERD)；フルベストラント(FASLODEX)などのエストロゲン受容体アンタゴニスト；卵巣を抑制またはシャットダウンするように機能する薬剤、例えば、酢酸リュープロリド（LUPRONおよびELIGARD）、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリンおよびトリプテレリンなどの黄体形成ホルモン放出ホルモン（LHRH)アゴニスト；フルタミド、ニルタミドおよびビカルタミドなどの抗アンドロゲン；ならびに、副腎におけるエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば、４（５）−イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(MEGASE)、エキセメスタン(AROMASIN)、フォルメスタニー、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR)、レトロゾール(FEMARA)およびアナストロゾール(ARIMIDEX)が挙げられる。さらに、化学療法剤のそのような定義には、クロドロネート（例えば、BONEFOSまたはOSTAC）、エチドロネート（DIDROCAL）、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート（ZOMETA）、アレンドロネート（FOSAMAX）、パミドロネート（AREDIA）、チルドロネート（SKELID）またはリセドロネート(ACTONEL)などのビスホスホネート；ならびに、トロキサシタビン（１，３−ジオキソランヌクレオシドシトシン類縁体）；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に異常な細胞増殖に関与するシグナル伝達経路における遺伝子発現を阻害するもの、例えば、ＰＫＣ−α、Ｒａｆ、Ｈ−Ｒａｓおよび上皮細胞増殖因子受容体（ＥＧＦ−Ｒ）など；THERATOPEワクチンおよび遺伝子療法ワクチンなどのワクチン、例えば、ALLOVECTINワクチン、LEUVECTINワクチンおよびVAXIDワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤（例えば、ルルトテカン（LURTOTECAN））；フルベストラントなどの抗エストロゲン；イマチニブまたはＥＸＥＬ−０８６２（チロシンキナーゼ阻害剤）などのキット阻害剤；エルロチニブまたはセツキシマブなどのＥＧＦＲ阻害剤；ベバシズマブなどの抗ＶＥＧＦ阻害剤；アリノテカン；ｒｍＲＨ（例えば、アバレリクス）；ラパチニブおよびトシル酸ラパチニブ（ErbB-2およびEGFR二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤、GW572016としても知られる）；１７ＡＡＧ（熱ショックタンパク質（Ｈｓｐ）９０毒素であるゲルダナマイシン誘導体）、およびそれらの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられる。
【０１４０】
本明細書で用いる用語“サイトカイン”は、一般的に、細胞間メディエーターとして別の細胞に作用するか、またはタンパク質を産生する細胞に対して自己分泌作用を有する、ある細胞集団によって放出されるタンパク質を意味する。そのようなサイトカインの例としては、リンパカイン、モノカイン；インターロイキン（ＩＬ）−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１７Ａ−Ｆ、ＩＬ−１８〜ＩＬ−２９（ＩＬ−２３など）、プロロイキン（PROLEUKIN）ｒＩＬ−２を含むＩＬ−３１などのＩＬ類；ＴＮＦ−αまたはＴＮＦ−β、ＴＧＦ−β１−３などの腫瘍壊死因子；および、白血病抑制因子（“ＬＩＦ”）、繊毛神経栄養因子（“ＣＮＴＦ”）、ＣＮＴＦ様サイトカイン（“ＣＬＣ”）、カルジオトロフィン（“ＣＴ”）およびキットリガンド（“ＫＬ”）を含む他のポリペプチド因子が挙げられる。
【０１４１】
本明細書で用いる用語“ケモカイン”は、白血球の走化性および活性化を選択的に誘導する能力を有する可溶性因子（例えば、サイトカイン）を意味する。ケモカインはまた、血管形成、炎症、創傷治癒および腫瘍形成のプロセスを誘発する。例示的なケモカインとしては、マウスケラチノサイト走化性物質（ＫＣ）のヒト同族体であるＩＬ−８が挙げられる。
【０１４２】
ｅ．処置
本明細書で用いる用語“機能不全”はまた、抗原認識に対して不応性（refractory）または無応答（unresponsive）の状態、具体的には、抗原認識を、増殖、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）産生および／または標的細胞死滅などの下流Ｔ細胞エフェクター機能に変換する能力が損なわれている状態を含む。
【０１４３】
用語“アネルギー”とは、Ｔ細胞受容体を介して送達されるシグナルが不完全または不十分であることから生じる抗原刺激に対する無反応の状態を意味する（例えば、ｒａｓ活性化がない場合の細胞内Ｃａ＋２の増加）。Ｔ細胞アネルギーはまた、共刺激がない状態で抗原を刺激した場合にも生じることがあり、その結果、細胞は、共刺激の文脈においても抗原によるその後の活性化に対して不応性になる。この無反応状態は、インターロイキン−２の存在によって無効にされる可能性がある。アネルギー性Ｔ細胞は、クローン増殖を受けず、および／またはエフェクター機能を獲得しない。
【０１４４】
用語“枯渇”とは、多くの慢性感染症および癌の発症時に生じる持続的なＴＣＲシグナル伝達から生じるＴ細胞機能不全の状態としてのＴ細胞の枯渇を意味する。これは、不完全または不十分なシグナル伝達によってではなく、持続的なシグナル伝達によって生じるという点で、アネルギーとは区別される。エフェクターの機能低下、阻害性受容体の持続的発現および機能的エフェクターまたはメモリーＴ細胞とは異なる転写状態によって定義される。枯渇は、感染症および腫瘍の最適な制御を妨げる。
【０１４５】
“Ｔ細胞機能を増強する”とは、Ｔ細胞が持続的もしくは増幅された生物学的機能を有するように誘導、誘発もしくは刺激すること、または枯渇したもしくは不活性なＴ細胞を更新もしくは再活性化することを意味する。Ｔ細胞機能を増強する例としては、例えば、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのγ−インターフェロンの分泌の増加、増殖の増加、介入前のそのようなレベルと比較した抗原応答性の増加（例えば、ウイルス、病原体または腫瘍クリアランス）などが挙げられる。ある態様において、増強のレベルは、少なくとも５０％、あるいは６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、２００％である。この増強を測定する方法は、当業者に知られている。
【０１４６】
“Ｔ細胞機能不全障害”とは、抗原刺激に対する応答性が低下することを特徴とするＴ細胞の障害または状態である。特定の態様において、Ｔ細胞機能不全障害は、ＰＤ−１の不適当な増加レベルに特異的に関連する障害である。Ｔ細胞機能不全障害はまた、Ｔ細胞抗腫瘍機能の抑制をもたらす腫瘍におけるＰＤ−Ｌ１の不適切な増加レベルと関連し得る。別の態様において、Ｔ細胞機能不全障害は、低応答性（アネルギー性）である、またはサイトカインを分泌する、増殖する、もしくは細胞溶解活性を実行する能力が低下しているものである。特定の面において、減少した応答性は、免疫原を発現する病原体または腫瘍の効果的な制御をもたらさない。Ｔ細胞機能不全により特徴付けられるＴ細胞機能不全障害の例としては、未解消の急性感染、慢性感染および腫瘍免疫が挙げられる。
【０１４７】
“腫瘍免疫”とは、腫瘍が免疫認識およびクリアランスを回避するプロセスを意味する。従って、治療概念として、腫瘍免疫は、そのような回避が減弱され、腫瘍が免疫系により認識され、攻撃される場合、“処置”される。腫瘍認識の例としては、腫瘍結合、腫瘍縮小および腫瘍クリアランスが挙げられる。
【０１４８】
“持続的応答”とは、処置の中止後に腫瘍増殖を減少させる効果が持続することを意味する。例えば、腫瘍の大きさは、投与段階の開始時の大きさと比較して、同じか、または小さいままであり得る。ある態様において、持続的応答は、少なくとも処置期間と同じ長さ、少なくとも１．５倍、２．０倍、２．５倍または３．０倍の期間を有する。
【０１４９】
本明細書で用いる用語“癌”および“癌性”は、細胞集団が制御されていない細胞増殖によって特徴づけられる哺乳動物における生理学的状態を意味するか、または説明する。癌の例としては、癌腫、芽細胞腫、肉腫ならびにリンパ腫および白血病などの血液の癌が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５０】
本明細書で用いる用語“腫瘍”および“新生物（neoplasm）”は、良性（非癌性）または前癌性病変を含む悪性（癌性）のいずれかの過剰な細胞増殖または増殖に起因する組織塊を意味する。腫瘍の増殖は一般に制御されておらず、進行性であり、正常細胞の増殖を誘導したり阻害したりすることはない。腫瘍は、膀胱、骨、脳、乳房、軟骨、グリア細胞、食道、卵管、胆嚢、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、神経組織、卵巣、膵臓、前立腺、骨格筋、皮膚、脊髄、脾臓、胃、精巣、胸腺、甲状腺、気管、尿道、尿管、子宮、膣臓器もしくは組織、または対応する細胞から選択されるが、これらに限定されない、様々な細胞、組織または臓器に影響を与え得る。腫瘍には、肉腫、癌腫、形質細胞腫または（悪性形質細胞）などの癌が含まれる。本発明の腫瘍には、白血病（例えば、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、急性前骨髄性白血病、急性骨髄性−単球性白血病、急性単球性白血病、急性白血病、慢性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、多血症）、リンパ腫（ホジキン病、非ホジキン病）、原発性マクログロブリン血症疾患、重鎖病、および肉腫がんなどの固形腫瘍（例えば、線維肉腫、筋肉肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、脊索腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、血管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋結合組織腫瘍、横紋筋肉腫、結腸癌、膵臓癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌を含む）、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、癌腫、気管支原性癌、髄様癌、腎細胞癌、肝細胞腫、ナイル管癌、絨毛癌、精巣腫瘍、胎児性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、子宮体癌、精巣癌、肺癌腫（小細胞肺癌および非小細胞肺癌またはＮＳＣＬＣを含む）、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起膠腫、シュワン腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、食道癌、胆嚢癌、腎臓癌、多発性骨髄腫が含まれる。好ましくは、“腫瘍”には、膵臓癌、肝臓癌、肺癌（ＮＳＣＬＣを含む）、胃癌、食道癌、頭頸部扁平上皮癌、前立腺癌、結腸癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌を含むが、これに限定されない）、リンパ腫、胆嚢癌、腎臓癌、白血病、多発性骨髄腫、卵巣癌、子宮頸癌、神経膠腫が含まれるが、これらに限定されない。
【０１５１】
本明細書で用いる用語“転移”とは、新たな場所で同様の癌病変が発生することに伴い、癌が発生部位から身体の他の領域に拡がるか、または転移するプロセスを意味する。“転移”または“転移性”細胞とは、隣接する細胞との接着を失い、疾患の原発部位から血流またはリンパを介して移動し、隣接する身体構造に侵入する細胞である。
【０１５２】
用語“癌細胞”および“腫瘍細胞”は、癌細胞集団の大部分を構成する非腫瘍性細胞および腫瘍原性幹細胞（癌幹細胞）の両方を含む、癌または腫瘍または前癌病変に由来する細胞の総集団を意味する。本明細書で用いる用語“癌細胞”または“腫瘍細胞”は、それらの腫瘍細胞を癌幹細胞と区別するために再生および分化する能力を欠く細胞のみを意味する場合には、“非腫瘍性”という用語によって修飾される。
【０１５３】
本明細書で用いる用語“有効量”は、治療上または予防上の利益を提供する量を意味する。
【０１５４】
本明細書で用いる用語“完全奏効”または“ＣＲ”とは、全ての標的病変の消失を意味する。“部分奏効”または“ＰＲ”とは、ベースラインの標的病変の最長径（ＳＬＤ）を基準として、標的病変のＳＬＤの合計が少なくとも３０％減少したことを意味する。そして、“安定した疾患”または“ＳＤ”とは、処置を開始してからの最小のＳＬＤを基準として、ＰＲとして適格となるような標的病変の十分な縮小またはＰＤとして適格となるような十分な増加のいずれもないことを意味する。
【０１５５】
本明細書で用いる“無増悪生存”（ＰＦＳ）とは、処置中および処置後に、処置される疾患（例えば、癌）が悪化しない期間の長さを意味する。無増悪生存期間は、患者が完全奏効または部分奏効を経験した時間、および患者が安定した疾患を経験した時間を含んでよい。
【０１５６】
本明細書で用いる“全奏効率”（ＯＲＲ）は、完全奏効（ＣＲ）率および部分奏効（ＰＲ）率の合計を意味する。
【０１５７】
本明細書で用いる“全生存率”とは、特定の期間後に生存している可能性が高いグループ内の個体の割合を意味する。
【０１５８】
本明細書で用いる用語“処置”は、細胞の介入によって引き起こされる臨床疾患のプロセスまたは処置を変更しようとする個々の試みを意味し、臨床病理学の予防的介入コースのいずれかであり得る。疾患の発生もしくは再発を予防するための治療、症状の緩和、あらゆる疾患の直接的もしくは間接的な病理学的結果の軽減、転移の予防、疾患の進行速度の低下、疾患の寛解の改善もしくは寛解、または予後の改善を含むがこれらに限定されない。
【０１５９】
用語“対象”は、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、げっ歯動物などを含むがこれらに限定されない動物（例えば、哺乳動物）を意味し、これらは特定の処置のレシピエントとなる。一般的には、用語“対象”および“患者”は、ヒト対象に関して、本明細書中互換的に用いられる。
【０１６０】
本明細書で用いる用語“アゴニスト”および“アゴニスト性”は、標的または標的経路の生物学的活性を直接的または間接的に実質的に誘導、活性化、促進、増加または増強することができる薬物を意味する。本明細書で用いる用語“アゴニスト”は、タンパク質または他の目的の標的の活性を部分的または完全に誘導、活性化、促進、増加または増強する何らかの薬物を含む。
【０１６１】
本明細書で用いる用語“アンタゴニスト”および“アンタゴニスト性”は、標的および／または経路の生物学的活性を直接的または間接的に、部分的または完全に遮断、阻害、低減または中和することができる薬物を意味するかまたは説明する。本明細書で用いる用語“アンタゴニスト”は、タンパク質または他の目的の標的の活性を部分的または完全に遮断、阻害、低減または中和する何らかの薬物を含む。
【０１６２】
本明細書で用いる用語“調節”および“調節する”は、生物学的活性の変化または改変を意味する。調節には、活性を刺激することまたは阻害することが含まれるが、これに限定されない。調節は、活性の増加もしくは活性の減少、結合特性の変化、またはタンパク質、経路、システムもしくは他の目的の生物学的標的の活性に関連する生物学的、機能的または免疫学的特性のその他の変化であり得る。
【０１６３】
本明細書で用いる用語“免疫応答”は、自然免疫系および獲得免疫系の両方の応答を含む。これには、細胞性および／または体液性免疫応答の両方が含まれる。これには、Ｔ細胞およびＢ細胞応答の両方、ならびにナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、マクロファージなどの免疫系の他の細胞からの応答が含まれる。
【０１６４】
用語“薬学的に許容される”は、連邦政府または州政府の規制機関によって承認されたか、または承認され得るか、あるいはヒトを含む動物での使用について、米国薬局方または他の一般に認められている薬局方に記載される物質を意味する。
【０１６５】
用語“薬学的に許容される賦形剤、担体またはアジュバント”または“許容される医薬担体”は、本発明の少なくとも１つの薬剤と共に対象に投与され得て、かつその薬理活性を破壊せず、また、治療効果をもたらすのに十分な用量で投与されたとき無毒である、賦形剤、担体またはアジュバントを意味する。一般的に、当業者および米国ＦＤＡは、薬学的に許容される賦形剤、担体、またはアジュバントを、製剤の不活性成分であると見なしている。
【０１６６】
用語“有効量”または“治療的有効量”または“治療効果”とは、哺乳動物などの対象における疾患または障害を“処置する”のに有効な本明細書に記載のアフィマー剤の量を意味する。癌または腫瘍の場合、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマー剤の治療有効量は、治療効果を有し、したがって、免疫応答を高め、抗腫瘍応答を高め、免疫細胞の細胞溶解活性を高め、免疫細胞による腫瘍細胞の細胞死を増強させ、腫瘍細胞数を低減し；腫瘍形成性、腫瘍形成頻度または腫瘍形成能を低下させ；がん幹細胞の数または頻度を低減し；腫瘍サイズを縮小し；癌細胞集団の数を減らし；例えば、軟組織および骨への癌の拡散を含む、周辺臓器への癌細胞の浸潤を阻害または停止し；腫瘍または癌細胞の転移を阻害および停止し；腫瘍または癌細胞の増殖を阻害および停止し；癌に関連する症状の１以上をある程度緩和し；罹患率および死亡率を減らし；生活の質を向上させ；または、それらの効果の組み合わせを生じさせ得る。
【０１６７】
用語“処置する”または“処置”または“処置すること”または“軽減する”または“軽減すること”とは、１）診断された病状または障害を治し、減退させ、その症状を減らし、かつ／またはその進行を停止させる治療的手段、および２）標的とする病状または障害の発症を防止し、または遅らせる予防的または防止的手段との両方を意味する。したがって、処置を必要とする者には、既に該障害を有する者、該障害を患いやすい者、および該障害を防止すべき者が含まれる。癌または腫瘍の場合、患者が以下の１以上を示す場合は、対象は本発明の方法に従って成功裏に“処置”される：免疫応答の増加、抗腫瘍応答の増加、免疫細胞の細胞溶解活性の増加、免疫細胞による腫瘍細胞の死滅の増加、癌細胞の数の減少または完全な消失；腫瘍サイズの縮小；軟組織および骨への癌細胞の拡散を含む、周辺臓器への癌細胞浸潤の阻害または欠如；腫瘍または癌細胞の転移の阻害または欠如；癌の増殖の阻害または欠如；特定の癌に関連する１以上の症状の緩和；罹患率および死亡率の低下；生活の質の向上；腫瘍形成能の低下；癌幹細胞の数または頻度の減少；あるいは、これらの効果のいくつかの組み合わせ。
【０１６８】
ｆ．その他
本明細書では、態様が“含む”という語句で記載されている場合、“〜からなる”および／または“本質的に〜からなる”という語句で記載されている別の類似の態様も提供されることが理解される。また、本明細書では、態様が“本質的に〜からなる”という語句で記載されている場合、“〜からなる”という語句で記載されている別の類似の態様も提供されることが理解される。
【０１６９】
本明細書で用いる、“約”または“およそ”の値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータに向けられた態様を包含（そして記載）する。例えば“約Ｘ”という記載は“Ｘ”の記載を包含する。本明細書で“Ａおよび／またはＢ”のような語句で用いられる用語“および／または”は、ＡおよびＢの両方；ＡまたはＢ；Ａ（単独）；およびＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、“Ａ、Ｂおよび／またはＣ”のような語句で用いられる用語“および／または”は、以下の各態様を包含するを意図する：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびに、Ｃ（単独）。
【０１７０】
ＩＩＩ．ＰＤ−Ｌ１結合アフィマー
アフィマーは、ステフィンＡに基づく足場（scaffold）であり、ステフィンＡ、例えば哺乳動物ステフィンＡ、例えばヒトステフィンＡに由来する配列を有することを意味する。本発明のある面は、ＰＤ−Ｌ１を結合するアフィマー（“抗ＰＤ−Ｌ１アフィマー”とも呼ばれる）を提供し、このアフィマーは、好ましくは選択的に、より好ましくは１０−６Ｍ以下のＫｄで、ＰＤ−Ｌ１を結合する能力を有するアフィマーを提供するために、アミノ酸配列を有する野生型ステフィンＡタンパク質由来の溶媒アクセス可能なループのうちの１以上を含むアフィマーを含む。
【０１７１】
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーは、骨格配列を有する野生型ヒトステフィンＡタンパク質に由来し、ループ２［（Ｘａａ）ｎと記載される］およびループ４［（Ｘａａ）ｍと記載される］の一方または両方が代替ループ配列（Ｘａａ）ｎおよび（Ｘａａ）ｍで置換されており、一般式（ｉ）を有する。
ＦＲ１−（Ｘａａ）ｎ−ＦＲ２−（Ｘａａ）ｍ−ＦＲ３（Ｉ）
［式中、
ＦＲ１は、ＭＩＰＧＧＬＳＥＡＫ ＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶ ＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫ ＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡ ＶＱＹＫＴＱＶＬＡ (配列番号１)で示されるポリペプチド配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド配列であり；
ＦＲ２は、ＧＴＮＹＹＩＫＶＲＡ ＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶ ＦＫＳＬ (配列番号２)で示されるポリペプチド配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド配列であり;
ＦＲ３は、ＥＤＬＶＬＴＧＹＱＶ ＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧ Ｆ (配列番号３)で示されるポリペプチド配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有するポリペプチド配列であり；
Ｘａａは、その存在毎に個別に、アミノ酸残基であり；そして
ｎおよびｍはそれぞれ独立して、３から２０までの整数である。］
【０１７２】
ある態様において、ＦＲ１は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには９８％の相同性を有するポリペプチド配列である。ある態様において、ＦＲ１は、配列番号１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには９８％の同一性を有するポリペプチド配列である。ある態様において、ＦＲ２は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには９８％の相同性を有するポリペプチド配列である。ある態様において、ＦＲ２は、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには９８％の同一性を有するポリペプチド配列である。ある態様において、ＦＲ３は、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには９８％の相同性を有するポリペプチド配列である。ある態様において、ＦＲ３は、配列番号３と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、またはさらには９８％の同一性を有するポリペプチド配列である。
【０１７３】
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーは、一般式：
ＭＩＰ−Ｘａａ１−ＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡ−（Ｘａａ）ｎ−Ｘａａ２−ＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦ−Ｘａａ３−Ｘａａ４−Ｘａａ５−（Ｘａａ）ｍ−Ｘａａ６−Ｄ−Ｘａａ７−ＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ (配列番号４)
［式中、
Ｘａａは、その存在毎に個別に、アミノ酸残基であり；
ｎおよびｍはそれぞれ独立して、３から２０までの整数であり；
Ｘａａ１は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；より好ましくは、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＡｒｇまたはＬｙｓ、さらにより好ましくはＧｌｙまたはＡｒｇであり；
Ｘａａ２は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；より好ましくはＧｌｙまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ３は、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；より好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎ、さらにより好ましくはＬｙｓまたはＡｓｎであり；
Ｘａａ４は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり；より好ましくはＧｌｙまたはＳｅｒであり；
Ｘａａ５は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｒｏであり；より好ましくはＩｌｅ、ＬｅｕまたはＰｒｏであり、さらにより好ましくはＬｅｕまたはＰｒｏであり；
Ｘａａ６は、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；より好ましくはＡｌａ、Ｖａｌ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、さらにより好ましくはＡｌａまたはＧｌｕであり；そして
Ｘａａ７は、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、ＡｒｇまたはＬｙｓであり、より好ましくはＩｌｅ、ＬｅｕまたはＡｒｇであり、さらにより好ましくはＬｅｕまたはＡｒｇである］
で示されるアミノ酸配列を有する。
【０１７４】
例えば、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーは、一般式：
ＭＩＰＲＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡ−（Ｘａａ）ｎ−ＳＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦＮＧＰ−（Ｘａａ）ｍ−ＡＤＲＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ (配列番号５)
［式中、
Ｘａａは、その存在毎に個別に、アミノ酸残基であり；ｎおよびｍはそれぞれ独立して、３から２０までの整数である］
で示されるアミノ酸配列を有し得る。
【０１７５】
ある態様において、ｎは３〜１５、３〜１２、３〜９、３〜７、５〜７、５〜９、５〜１２、５〜１５、７〜１２または７〜９である。
ある態様において、ｍは、３〜１５、３〜１２、３〜９、３〜７、５〜７、５〜９、５〜１２、５〜１５、７〜１２または７〜９である。
【０１７６】
ある態様において、Ｘａａは、その存在毎に個別に、原核細胞または真核細胞において組換え発現によりポリペプチドに付加され得るアミノ酸であり、さらにより好ましくは、２０個の天然アミノ酸の１つである。
【０１７７】
上記の配列および式のある態様において、（Ｘａａ）ｎは、一般式（ＩＩ）
−ａａ１−ａａ２−ａａ３−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−ａａ４−ａａ５−Ｔｒｐ−ａａ６−（ＩＩ）
［式中、
ａａ１は、塩基性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；より好ましくはＬｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくはＬｙｓまたはＡｒｇであり；
ａａ２は、アミノ酸残基、好ましくは中性極性もしくは非極性側鎖、または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは小さい脂肪族側鎖、中性極性側鎖または塩基性もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；さらにより好ましくはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくはＡｌａ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
ａａ３は、芳香族側鎖または塩基性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；好ましくはＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、より好ましくはＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐであり、さらにより好ましくはＨｉｓまたはＴｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓであり；
ａａ４は、中性極性側鎖もしくは非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基；好ましくは、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し；より好ましくはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
ａａ５は、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖、あるいは小さい脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基；好ましくは、中性極性側鎖または荷電性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；より好ましくはＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくはＳｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇであり；そして
ａａ６は、芳香族側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；好ましくはＰｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；より好ましくは、ＴｒｐまたはＡｓｐであり；さらにより好ましくは、Ｔｒｐである］
で示されるアミノ酸配列である。
【０１７８】
上記の配列および式のある態様において、（Ｘａａ）ｎは、一般式（ＩＩＩ）
−ａａ１−ａａ２−ａａ３−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ−ａａ４−ａａ５−Ｐｈｅ−Ｔｒｐ−（ＩＩＩ）
［式中、
ａａ１は、塩基性側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し；好ましくはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり、より好ましくはＬｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｎまたはＧｌｎであり、さらにより好ましくはＬｙｓまたはＡｓｎであり；
ａａ２は、アミノ酸残基、好ましくは中性極性もしくは非極性側鎖、または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは小さい脂肪族側鎖、中性極性側鎖または塩基性もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；さらにより好ましくはＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくはＡｌａ、Ｇｌｎ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
ａａ３は、芳香族側鎖または塩基性側鎖を有するアミノ酸残基を表し、好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｌｙｓ、ＡｒｇもしくはＨｉｓであり、より好ましくは、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐもしくはＨｉｓであり、さらにより好ましくは、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＨｉｓであり；
ａａ４は、中性極性側鎖もしくは非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ｉｌｅ、Ｇｌｎ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくは、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；そして
ａａ５は、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖、あるいは小さい脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、ＡｒｇまたはＨｉｓであり、さらにより好ましくは、Ｓｅｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ａｓｐ、ＧｌｕまたはＡｒｇである］
で示されるアミノ酸配列である。
【０１７９】
上記の配列および式のある態様において、（Ｘａａ）ｎは、配列番号６から４１より選択されるアミノ酸配列であるか、または配列番号６から４１より選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の相同性を有するアミノ酸配列である。ある態様において、（Ｘａａ）ｎは、配列番号６から４１より選択される配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【０１８０】
【表１】
2021520851.tif 000002
【０１８１】
上記の配列および式のある態様において、（Ｘａａ）ｍは、一般式（ＩＶ）
−ａａ７−ａａ８−ａａ９−ａａ１０−ａａ１１−ａａ１２−ａａ１３−ａａ１４−ａａ１５−（ＩＶ）
［式中、
ａａ７は、中性極性もしくは非極性側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり、さらにより好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ｔｒｐ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
ａａ８は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性もしくは非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し；より好ましくは荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、さらにより好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、ＨｉｓまたはＧｌｎであり；
ａａ９はアミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または非極性側鎖、または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基であり、より好ましくは中性極性側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；より好ましくはＧｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｇｌｙ、Ｌｅｕ、ＰｒｏまたはＴｙｒであり、さらにより好ましくはＧｌｎ、ＴｈｒまたはＡｓｐであり；
ａａ１０は、アミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性もしくは非極性側鎖、または荷電性（酸性もしくは塩基性）側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、中性極性側鎖もしくは塩基性側鎖もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基であり、より好ましくは、中性極性側鎖または酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；より好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＰｒｏまたはＧｌｙであり、さらにより好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｅｕ、ＴｒｐまたはＧｌｙであり；
ａａ１１は、アミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは、中性極性側鎖または塩基性もしくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；より好ましくはＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、ＴｙｒまたはＧｌｙであり、さらにより好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、ＬｙｓまたはＨｉｓであり；
ａａ１２は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；より好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、ＰｈｅまたはＧｌｙであり、さらにより好ましくは、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、ＡｒｇまたはＬｙｓであり；
ａａ１３は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖または非極性脂肪族側鎖または芳香族側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくは酸性側鎖を有するアミノ酸残基を表し；より好ましくはＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｔｒｐ、ＴｙｒまたはＰｈｅであり、さらにより好ましくは、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ、ＡｓｐまたはＧｌｕであり；
ａａ１４は、アミノ酸残基を表し、好ましくは中性極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し；より好ましくはＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｔｒｐ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＡｓｎであり、さらにより好ましくは、Ａｌａ、Ｐｒｏ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ｓｅｒ、ＧｌｎまたはＡｓｎであり；そして
ａａ１５は、アミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性もしくは中性非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、好ましくは、中性極性もしくは中性非極性側鎖または荷電性（酸性または塩基性）側鎖を有するアミノ酸残基を表し、より好ましくはＨｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｇｌｎ、Ａｓｎ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、ＧｌｙまたはＰｈｅであり、さらにより好ましくは、Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ、Ａｓｐ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、ＧｌｎまたはＡｓｎである］
で示されるアミノ酸配列である。
【０１８２】
上記の配列および式のある態様において、（Ｘａａ）ｍは、配列番号４２から７７より選択されるアミノ酸配列であるか、またはそれと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の相同性を有するアミノ酸配列である。ある態様において、（Ｘａａ）ｍは、配列番号４２から７７より選択されるアミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性を有するアミノ酸配列である。
【０１８３】
【表２】
2021520851.tif 000003
【０１８４】
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーは、配列番号７８から８６より選択されるアミノ酸配列を有するか、または配列番号７８から８６より選択される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の相同性を有するアミノ酸配列である。ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーは、配列番号７８から８６より選択される配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性を有するアミノ酸配列を有する。
【０１８５】
【表３】
2021520851.tif 000004
【０１８６】
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーは、配列番号８７から９４のいずれか１つのヌクレオチド１−３３６に対応するコーディング配列を有する核酸によりコード化されるアミノ酸配列、または配列番号８７から９４のいずれか１つのヌクレオチド１−３３６と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはさらには９８％の同一性を有するコーディング配列を有する核酸によりコード化され得るアミノ酸配列、または４５℃での６Ｘ塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）の存在、次いで６５℃にて０．２Ｘ ＳＳＣでの洗浄というストリンジェントな条件下で、配列番号８７から９４のいずれか１つのヌクレオチド１−３３６にハイブリダイズするコーディング配列を有する核酸によりコード化され得るアミノ酸配列を有する。
【０１８７】
【表４】
2021520851.tif 000005
【表５】
2021520851.tif 000006
【０１８８】
さらに、軽微な改変はまた、例えば、ステフィンＡまたはステフィンＡ由来アフィマーポリペプチドに対して  −上記のループ２およびループ４の挿入を越えて−  最大１０個までのアミノ酸の付加または欠失を含む、本明細書に記載のステフィンＡまたはステフィンＡ由来の配列に対する小さな欠失または付加を含み得る。ある態様において、アフィマー剤は、約１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下または約０．１ｎＭ以下の解離定数(ＫＤ)を有するモノマーとしてヒトＰＤ−Ｌ１を結合するアフィマーポリペプチド部分を有するＰＤ−Ｌ１結合アフィマー剤である。
【０１８９】
ある態様において、アフィマー剤は、Biacoreによって測定されるような約１０−３ ｓ−１（すなわち、１／秒の単位）またはそれより遅い；約１０−４ ｓ−１またはそれより遅い；あるいは約１０−５ ｓ−１またはそれより遅いオフレート定数（Ｋｏｆｆ）を有するモノマーとしてのヒトＰＤ−Ｌ１を結合するアフィマーポリペプチド部分を有するＰＤ−Ｌ１結合アフィマー剤である。
【０１９０】
ある態様において、アフィマー剤は、Biacoreによって測定されるような、少なくとも約１０３ Ｍ−１ｓ−１またはそれより早い；少なくとも約１０４ Ｍ−１ｓ−１またはそれより早い；少なくとも約１０５ Ｍ−１ｓ−１またはそれより早い；またはさらには少なくとも約約１０６ Ｍ−１ｓ−１またはそれより早い結合定数（Ｋｏｎ）を有するモノマーとしてヒトＰＤ−Ｌ１を結合するアフィマーポリペプチド部分を有するＰＤ−Ｌ１結合アフィマー剤である。
【０１９１】
ある態様において、アフィマー剤は、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマー Agent having an ヒトＰＤ−１との競合結合アッセイにおいて、１μＭ以下、約１００ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、または約０．１ｎＭ以下のＩＣ５０を有するモノマーとしてヒトＰＤ−Ｌ１を結合するアフィマーポリペプチド部分を有するＰＤ−Ｌ１結合アフィマー剤である。
【０１９２】
ある態様において、アフィマー剤は、６５℃以上、好ましくは少なくとも７０℃、７５℃、８０℃またはさらには８５℃以上の融解温度（Ｔｍ、すなわち、折り畳まれた状態と折り畳まれていない状態の両方が均等に存在する温度）を有する。融解温度は、特に、タンパク質の安定性の特に有用な指標である。折り畳まれたタンパク質と折り畳まれていないタンパク質の相対的な比率は、当業者に知られている多くの技術、例えば、示差走査熱量測定、紫外線差分光法、蛍光、円形二色性（ＣＤ）およびＮＭＲ（Pace et al. (1997) “Measuring the conformational stability of a protein” in Protein structure: A practical approach 2: 299-321)によって決定することができる。
【０１９３】
ａ．融合タンパク質 − 一般的説明
ある態様において、アフィマーポリペプチドはさらに、アフィマーポリペプチドの生物学的活性を調節するさらなる挿入、置換または欠失をさらに含んでいてよい。例えば、付加、置換または欠失は、修飾されたアフィマーの１以上の特性または活性を改変し得る。例えば、付加、置換または欠失は、アフィマーポリペプチドに対する親和性、例えば、ＰＤ−１への結合および阻害を調節し、循環半減期を調節し、治療半減期を調節し、アフィマーポリペプチドの安定性を調節し、プロテアーゼによる開裂を調節し、用量を調節し、放出またはバイオアベイラビリティを調節し、精製を容易にし、脱アミド化を減少させ、貯蔵寿命を改善し、または特定の投与経路の改善もしくは変更を可能にする。同様に、アフィマーポリペプチドは、プロテアーゼ切断配列、反応基、抗体結合ドメイン（ＦＬＡＧまたはポリを含むが、これらに限定されない）または他の親和性に基づく配列（ＦＬＡＧ、ポリＨｉｓ、ＧＳＴなどを含むが、これらに限定されない）またはポリペプチドの検出、精製または他の特性を改善する連結分子（ビオチンを含むが、これに限定されない）を含んでいてよい。
【０１９４】
例えば、これらのさらなる配列は、融合タンパク質の形態でアフィマーポリペプチドの一方の末端および／または他方の末端に付加される。従って、本発明の特定の面において、アフィマー剤は、少なくとも１つのアフィマーポリペプチド配列および１以上の異種ポリペプチド配列（本明細書中、“融合ドメイン”）を有する融合タンパク質である。融合ドメインは、細胞からの分泌または細胞表面上の保持（すなわち、コード化されたアフィマーの場合）などの所望の特性を付与するように、翻訳後修飾のための基質または他の認識配列として機能するように、タンパク質−タンパク質相互作用を介して凝集する多量体構造を作成するように、血清半減期を変化させる（多くの場合、延長する）ように、または組織局在化もしくは組織排除およびその他のＡＤＭＥ特性を変化させるように、−単なる例として−選択され得る。
【０１９５】
例えば、いくつかの融合ドメインは、親和性クロマトグラフィーによるなど、融合タンパク質の単離および／または精製に特に有用である。発現または精製を容易にするそのような融合ドメインのよく知られた例としては、単なる例示であるが、ポリヒスチジン（すなわち、Ｈｉｓ６タグ）、Strep IIタグ、ストレプトアビジン結合ペプチド（ＳＢＰ）タグ、カルモジュリン結合ペプチド（ＣＢＰ）、グルタチオン Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、ＨＡタグ、ｃ−Ｍｙｃタグ、チオレドキシン、プロテインＡおよびプロテインＧなどの親和性タグが挙げられる。
【０１９６】
アフィマー剤が分泌されるために、それは、一般的に、小胞体の内腔へのタンパク質の輸送を指向し、最終的に分泌される（または、膜貫通ドメインもしくは他の細胞表面保持シグナルの場合は細胞表面に保持される）シグナル配列を含む。シグナル配列（シグナルペプチドまたはリーダー配列とも呼ばれる）は、新生ポリペプチドのＮ末端に位置している。それらはポリペプチドを小胞体に標的化し、タンパク質がその目的地、例えば、オルガネラの内部空間へ、内膜へ、細胞外膜へ、または分泌を介して細胞外へと選別される。ほとんどのシグナル配列は、タンパク質が小胞体へ輸送された後、シグナルペプチダーゼによってタンパク質から切断される。ポリペプチドからのシグナル配列の切断は、通常、アミノ酸配列中の特定の部位で起こり、シグナル配列内のアミノ酸残基に依存する。
【０１９７】
ある態様において、シグナルペプチドは、約５〜約約４０アミノ酸長（例えば、約５〜約７、約７〜約１０、約１０〜約１５、約１５〜約２０、約２０〜約２５、または約２５〜約３０、約３０〜約３５、または約３５〜約４０アミノ酸長）である。
【０１９８】
ある態様において、シグナルペプチドは、ヒトタンパク質由来の天然のシグナルペプチドである。他の態様において、シグナルペプチドは、非天然シグナルペプチドである。例えば、ある態様において、非天然シグナルペプチドは、対応する天然の分泌されたヒトタンパク質由来の変異体天然シグナルペプチドであり、１以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０もしくはそれ以上）の置換、挿入または欠失を含み得る。
【０１９９】
ある態様において、シグナルペプチドは、免疫グロブリン（ＩｇＧ重鎖またはＩｇＧカッパ軽鎖など）、サイトカイン（インターロイキン−２（ＩＬ−２）またはＣＤ３３など）、血清アルブミンタンパク質（例えばＨＳＡまたはアルブミン）、ヒトアズロシジンプレタンパク質シグナル配列、ルシフェラーゼ、トリプシノーゲン（例えば、キモトリプシノーゲンまたはトリプシノーゲン）などの非ＩｇＳＦタンパク質ファミリーからのシグナルペプチドまたはその変異体、あるいは細胞からタンパク質を効率的に分泌できる他のシグナルペプチドである。例示的なシグナルペプチドには、以下が含まれるが、これらに限定されない：
【０２００】
【表６】
2021520851.tif 000007
【０２０１】
分泌されたアフィマー剤のある態様において、組換えポリペプチドは、発現されるときシグナルペプチドを含み、シグナルペプチド（またはその一部）は、分泌されるとアフィマー剤から切断される。
【０２０２】
対象となる融合タンパク質はまた、異種タンパク質配列またはドメインを分離する１以上のリンカーを含んでいてよい。本明細書で用いる用語“リンカー”は、第１のポリペプチド（例えば、アフィマー）と第２のポリペプチド（例えば、第２のアフィマー、Ｆｃ領域、受容体トラップ、アルブミンなど）との間に挿入されるリンカーアミノ酸配列を意味する。研究者によって設計された経験的リンカーは、一般に、その構造に応じて３つのカテゴリーに分類される：可撓性リンカー、リジッドリンカー、およびインビボ開裂性リンカーである。機能ドメインを連結する（可撓性リンカーおよびリジッドリンカーのような）、または遊離機能ドメインをインビボで放出する（インビボで切断可能なリンカーのような）という基本的な役割の他に、リンカーは、生物学的活性の向上、発現量の増加および望ましい薬物動態プロファイルの達成など、融合タンパク質の産生のために他の多くの利点を提供することができる。リンカーは、融合タンパク質の発現、分泌または生物活性に悪影響を及ぼすべきではない。リンカーは、抗原性であってはならず、免疫応答を誘発してはならない。
【０２０３】
好適なリンカーは当業者によく知られており、しばしばグリシンおよびセリン残基の混合物を含み、しばしば立体障害のないアミノ酸を含む。有用なリンカーに組み込むことができる他のアミノ酸としては、スレオニン残基およびアラニン残基が挙げられる。リンカーの長さは、例えば、１〜５０アミノ酸長、１〜２２アミノ酸長、１〜１０アミノ酸長、１〜５アミノ酸長、または１〜３アミノ酸長の範囲であり得る。ある態様において、リンカーは、切断部位を含んでいてよい。ある態様において、リンカーは、第２のポリペプチドが第１のポリペプチドから分離され得るように、酵素切断部位を含み得る。
【０２０４】
ある態様において、リンカーは、可撓性であることを特徴とし得る。可撓性リンカーは、通常、結合されたドメインがある程度の動きまたは相互作用を必要とする場合に適用される。それらは、一般に、小さい、非極性（例えば、Ｇｌｙ）または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）アミノ酸から構成される。例えば、Argos P. (1990) “An investigation of oligopeptides linking domains in protein tertiary structure and possible candidates for general gene fusion” J Mol Biol. 211:943-958を参照のこと。これらのアミノ酸の小さいサイズは、可撓性を提供し、連結する機能ドメインの移動を可能にする。ＳｅｒまたはＴｈｒの組み込みは、水分子と水素結合を形成することにより、水溶液中でのリンカーの安定性を維持することができるため、リンカーとタンパク質部分との間の好ましくない相互作用を減少させる。最も一般的に用いられる可撓性リンカーは、主にＧｌｙ残基およびＳｅｒ残基の伸張からなる配列（“ＧＳ”リンカー）を有する。最も広く用いられている可撓性リンカーの例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎの配列を有する。コピー数“ｎ”を調整することにより、このＧＳリンカーの長さを最適化して、機能ドメインの適当な分離を達成したり、必要なドメイン間相互作用を維持したりできる。ＧＳリンカー以外にも、組換え融合タンパク質用に多くの可撓性リンカーが設計されている。これらの可撓性リンカーはまた、ＧｌｙおよびＳｅｒのような小さいアミノ酸または極性アミノ酸を豊富に含むが、可撓性を維持するためにＴｈｒおよびＡｌａのような追加のアミノ酸、ならびに溶解性を改善するためにＬｙｓおよびＧｌｕのような極性アミノ酸を含めることができる。
【０２０５】
ある態様において、リンカーは、リジッド（剛性）として特徴付けることができる。可撓性リンカーは機能ドメインを受動的に連結し、ある程度の動きを許容するという利点を有するが、これらのリンカーの剛性の欠如は、発現収量または生物学的活性などの特定の融合タンパク質の態様において制限となり得る。これらの例における可撓性リンカーの非効率性は、タンパク質ドメインの非効率的な分離、またはそれらの相互干渉の不十分な減少に起因していた。このような状況下では、ドメイン間の距離を一定に保ち、ドメイン間の独立した機能を維持するために、リジッドリンカーが成功裏に適用されている。
【０２０６】
多くの天然リンカーはα−ヘリックス構造を示した。α−ヘリックス構造は、セグメント内の水素結合と密に充填された骨格を有し、剛性の安定な構造であった。したがって、硬いα−ヘリックスリンカーは、タンパク質ドメイン間のリジッドスペーサーとして機能し得る。George et al. (2002) “An analysis of protein domain linkers: their classification and role in protein folding” Protein Eng. 15(11):871-9参照。一般に、リジッドリンカーは、α−ヘリックス構造を採用するか、または複数のＰｒｏ残基を含むことにより、比較的硬い構造を示す。多くの状況下で、それらは、可撓性リンカーよりも効率的に機能ドメインを分離する。リンカー長は、ドメイン間の最適な距離を達成するためにコピー数を変えることによって容易に調整することができる。その結果、融合タンパク質の安定性または生物活性を維持するためにドメインの空間的分離が重要であるときには、リジッドリンカーが選択される。この点で、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（配列番号２０１）の配列を有するα−ヘリックス形成リンカーは、多くの組換え融合タンパク質の構築に適用されてきた。別のタイプのリジッドリンカーは、Ｘが任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、ＬｙｓまたはＧｌｕである、Ｐｒｏに富む配列（ＸＰ）ｎを有する。
【０２０７】
すなわち例示すると、例示的リンカーには以下のものが含まれる。
【表７】
2021520851.tif 000008
【０２０８】
対象となる融合タンパク質に用いられ得る他のリンカーとしては、ＳｅｒＧｌｙ、ＧＧＳＧ（配列番号２０３）、ＧＳＧＳ（配列番号２０４）、ＧＧＧＳ（配列番号２０５）、Ｓ（ＧＧＳ）ｎ （配列番号２０６）（ここで、ｎは１−７である）、ＧＲＡ、ポリ（Ｇｌｙ）、ポリ（Ａｌａ）、ＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１６６）、ＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号１６７）、ＬＥＳＧＧＧＧＶＴ（配列番号１６８）、ＧＲＡＱＶＴ（配列番号１６９）、ＷＲＡＱＶＴ（配列番号１７０）およびＡＲＧＲＡＱＶＴ（配列番号１７１）が挙げられるが、これらに限定されない。以下に記載されるＦｃ融合体のヒンジ領域もまた、リンカーとみなされ得る。
【０２０９】
細胞膜上にタンパク質を固定するために、様々な要素(element)を採用することができる。例えば、ｔｙｐｅ−Ｉ（細胞外にＮ末端を有するように配向された）およびｔｙｐｅ−ＩＩ（細胞質内にＮ末端を有するように配向された）内在性膜タンパク質の膜貫通ドメイン（ＴＭ）を用いて、キメラタンパク質を細胞膜に標的化することができる。タンパク質はまた、遺伝子の３’末端へのＧＰＩ（グリコホスファチジルイノシトール脂質）シグナルの融合によって細胞表面に付着させることもできる。短いカルボキシ末端ペプチドの切断により、アミド結合を介して新たに露出したＣ末端へ糖脂質を結合させることができる。Udenfriend et al. （1995）“How Glycosylphoshpatidylinositol Anchored Membrane Proteins are Made” Annu Rev Biochem 64:563-591を参照のこと。
【０２１０】
ある態様において、融合タンパク質は、膜貫通ポリペプチド配列（膜貫通ドメイン）を含む。適切な膜貫通ポリペプチドの識別特徴は、アフィマー剤が提示されるべき細胞の表面で発現される能力を含む。ある態様において、それは、免疫細胞、特にリンパ球細胞またはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞であってもよく、一旦そこに存在して、ＰＤ−Ｌ１が上方制御される予め定義された標的腫瘍細胞に対する免疫細胞の細胞応答を導くように、ＰＤ−Ｌ１と相互作用する。膜貫通ドメインは、天然または合成のいずれかに由来し得る。膜貫通ドメインは、何らかの膜結合タンパク質または膜貫通タンパク質に由来し得る。限定されない例としては、膜貫通ポリペプチドは、α、β、γまたはδのようなＴ細胞受容体のサブユニット、ＣＤ３複合体を構成するポリペプチド、ＩＬ２受容体ｐ５５（α鎖）、ｐ７５（β鎖）またはγ鎖、Ｆｃ受容体のサブユニット鎖、特にＦｅｙ受容体ＩＩＩＩまたはＣＤタンパク質であり得る。あるいは、膜貫通ドメインは、合成であり得て、ロイシンおよびバリンのような主な疎水性残基を含んでいてよい。
【０２１１】
特定の他の態様において、アフィマー剤は、アフィマーポリペプチドに加えて、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）アンカーの翻訳後付加をシグナル伝達する配列を含む融合タンパク質である。ＧＰＩアンカーは、多くの真核生物タンパク質のＣ末端に翻訳後に付加される糖脂質構造体である。アフィマー剤へのこの改変は、アフィマー剤が組換えタンパク質（すなわち、下記のコード化されたアフィマー）として再発現された細胞の細胞膜の細胞外表面にアンカー（付着）されることを引き起こす。これらの態様において、ＧＰＩアンカードメインは、アフィマーポリペプチド配列に対してＣ末端であり、好ましくは融合タンパク質のＣ末端に存在する。
【０２１２】
ある態様において、ＧＰＩアンカードメインは、その一部である融合タンパク質が真核生物系で発現されるときに、ＧＰＩアンカーの翻訳後付加をシグナル伝達するポリペプチドである。ＧＰＩアンカーシグナル配列は、アンカー付加部位（ω部位）の小アミノ酸のセットと、それに続く親水性スペーサーおよび末端の疎水性ストレッチからなる（Low, (1989) FASEB J. 3:1600-1608）。このシグナル配列の切断は、保存された中心成分を有するが、可変の周辺部位を有するアンカーの付加の前に、ＥＲで起こる（Homans et al., Nature, 333:269-272 (1988)）。ＧＰＩアンカータンパク質のＣ末端は、高度に保存されたコアグリカンであるマンノース（α１−２）マンノース（α１−６）マンノース（α１−４）グルコサミン（α１−６）ミオイノシトールにホスホエタノールアミン橋を介して連結されている。リン脂質の末端がＧＰＩアンカーを細胞膜に付着させている。
【０２１３】
対象のアフィマー含有融合タンパク質で用いられ得る例示的ＧＰＩアンカードメインには、以下が含まれる：
ＳＧＴＴＳＧＴＴＲＬＬＳＧＨＴＣＦＴＬＴＧＬＬＧＴＬＶＴＭＧＬＬＴ  （配列番号１７２）
ＳＧＴＳＰＧＬＳＡＧＡＴＶＧＩＭＩＧＶＬＶＧＶＡＬＩ  （配列番号１７３）
ＳＡＰＶＬＳＡＶＡＴＶＧＩＴＩＧＶＬＡＲＶＡＬＩ  （配列番号１７４）
ＳＳＰＤＬＳＡＧＴＡＶＳＩＭＩＧＶＬＡＧＭＡＬＩ  （配列番号１７５）
ＴＬＧＧＮＳＡＳＹＴＦＶＳＬＬＦＳＡＶＴＬＬＬＬＣ  （配列番号１７６）
ＳＧＴＳＰＧＬＳＡＧＡＴＶＧＩＭＩＧＶＬＶＧＶＡＬＩ  (配列番号１７７)
【０２１４】
ＧＰＩアンカー付着が、ＧＰＩアンカードメインを含むアフィマー融合タンパク質を、ＧＰＩ翻訳後修飾を行うことできる真核生物系で発現させることによって達成され得る。膜貫通ドメイン融合タンパク質と同様に、リンパ球および抗腫瘍の開始または促進に関与する他の細胞を含むヒト細胞は、顕著に有用であり、ＧＰＩアンカードメインを含む発現された融合体を含む発現されたアフィマーを操作された細胞の表面上に保持するために、ＧＰＩアンカードメインを含むコード化されたアフィマーを発現するように操作され得る。
【０２１５】
アフィマーポリペプチド配列自体または融合タンパク質の一部として提供される隣接ポリペプチド部位に対して行うことができるさらに他の修飾は、酵素による翻訳後修飾のための部位である１以上の配列である。これらには、グリコシル化、アセチル化、アシル化、脂質修飾、パルミトイル化、パルミチン酸付加、リン酸化、糖脂質結合修飾などが含まれ得るが、これらに限定されない。
【０２１６】
b．ＰＫおよびＡＤＭＥ特性の操作
ある態様において、アフィマー剤は、非経腸治療用量投与などの投与経路に最適な半減期および／またはＰＫプロファイルを有していなくてもよい。用語“半減期”とは、本発明のアフィマー剤のような物質が、その薬理活性または生理活性または濃度の半分を失うのに要する時間を意味する。生物学的半減期は、物質の排泄、排除、分解（例えば、酵素的な）または体内の特定の臓器もしくは組織における吸収および濃縮によって影響を受け得る。ある態様において、生物学的半減期は、物質の血漿濃度がその定常状態レベルの半分に達するまでの時間（“血漿半減期”）を決定することによって評価することができる。この欠点に対処するために、アフィマー剤の一部として半減期延長部位を組み込むことを含む、他のタンパク質治療薬の場合に用いられてきた半減期延長のための様々な一般的な戦略がある。
【０２１７】
用語“半減期延長部位”とは、要すれば、非天然にコードされたアミノ酸を介して、直接またはリンカーを介して、本明細書に記載のアフィマー剤を形成するためにアフィマーポリペプチドに共有結合（“共役”または“融合”）された、薬学的に許容される部位、ドメインまたは分子を意味し、それは、アフィマーポリペプチドのインビボでのタンパク質分解または他の活性を低下させる改変を阻止または軽減し、半減期を増加させ、および／または改変されたアフィマーポリペプチドの非共役化形態のような比較物質（comparator）と比較して、吸収率の増加、毒性の低減、溶解性の改善、タンパク質凝集の低減、修飾アフィマーポリペプチドの生物学的活性および／または標的選択性の増加、製造性の増加、および／または修飾アフィマーポリペプチドの免疫原性の低減を含むがこれらに限定されない他の薬物動態学的または生物物理学的特性を改善または改変することができる。用語“半減期延長部位”は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）または分離型（discrete）トＰＥＧのような水溶性ポリマー、ヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）、脂質、分岐または未分岐のアシル基、分岐または未分岐のＣ８−Ｃ３０アシル基、分岐または未分岐のアルキル基、および分岐または未分岐のＣ８−Ｃ３０アルキル基などの非タンパク質性の半減期延長部位；ならびに、タンパク質性半減期延長部位、例えば、血清アルブミン、トランスフェリン、アドネクチン（例えば、アルブミン結合性または薬物動態延長（ＰＫＥ）アドネクチン）、Ｆｃドメインおよび非構造化ポリペプチド、例えば、ＸＴＥＮおよびＰＡＳポリペプチド（例えば、アミノ酸Ｐｒｏ、Ａｌａおよび／またはＳｅｒからなる構造的に無秩序なポリペプチド配列）、ならびに上記のいずれかのフラグメントを含む。例えば、図示のＰＤ−１との抗ＰＤ−Ｌ１アフィマー複合体のようなアフィマーの結晶構造およびその標的との相互作用の試験は、どの特定のアミノ酸残基が完全にまたは部分的に溶媒にアクセス可能な側鎖を有するかを示し得る。
【０２１８】
ある態様において、半減期延長部位は、その部位にそのように共役していないタンパク質の半減期と比較して（例えば、アフィマーポリペプチド単独との比較）、哺乳動物の血清中で循環する得られたアフィマー剤の半減期を延長する。ある態様において、半減期は、約１．２倍、約１．５倍、約２．０倍、約３．０倍、約４．０倍、約５．０倍または約６．０倍、またはそれを超えて延長される。ある態様において、半減期は、半減期延長部位を含まないタンパク質と比較して、インビボ投与後、６時間以上、１２時間以上、２４時間以上、４８時間以上、７２時間以上、９６時間以上または１週間以上延長される。
【０２１９】
さらなる例示のための手段として、本発明のアフィマー剤の産生に用いられ得る半減期延長部位には、以下のものが含まれる：
【０２２０】
・薬理学的にアフィマー配列を天然の半減期の長いタンパク質またはタンパク質ドメインに遺伝子融合させること（例えば、Ｆｃ融合、トランスフェリン［Ｔｆ］融合またはアルブミン融合。例えば、Beck et al. (2011) “Therapeutic Fc-fusion proteins and peptides as successful alternatives to antibodies. MAbs. 3:1-2; Czajkowsky et al. (2012) “Fc-fusion proteins: new developments and future perspectives. EMBO Mol Med. 4:1015-28; Huang et al. (2009) “Receptor-Fc fusion therapeutics, traps, and Mimetibody technology” Curr Opin Biotechnol. 2009;20:692-9; Keefe et al. (2013) “Transferrin fusion protein therapies: acetylcholine receptor-transferrin fusion protein as a model. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; p. 345-56; Weimer et al. (2013) “Recombinant albumin fusion proteins. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 297-323; Walker et al. (2013) “Albumin-binding fusion proteins in the development of novel long-acting therapeutics. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: applications and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 325-43参照）。
【０２２１】
・薬理学的にアフィマー配列を不活性ポリペプチド、例えばＸＴＥＮ（組換えＰＥＧまたは“ｒＰＥＧ”としても知られる）、ホモアミノ酸ポリマー（ＨＡＰ；ＨＡＰ化）、プロリン−アラニン−セリンポリマー（ＰＡＳ；ＰＡＳ化）、またはエラスチン様ペプチド（ＥＬＰ；ＥＬＰ化）に遺伝子融合させること。例えば、Schellenberger et al. (2009) “A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner. Nat Biotechnol. 2009;27:1186-90; Schlapschy et al. Fusion of a recombinant antibody fragment with a homo-amino-acid polymer: effects on biophysical properties and prolonged plasma half-life. Protein Eng Des Sel. 2007;20:273-84; Schlapschy (2013) PASylation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma halflife of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sel. 26:489-501. Floss et al. (2012) “Elastin-like polypeptides revolutionize recombinant protein expression and their biomedical application. Trends Biotechnol. 28:37-45. Floss et al. “ELP-fusion technology for biopharmaceuticals. In: Schmidt S, editor. Fusion protein technologies for biopharmaceuticals: application and challenges. Hoboken: Wiley; 2013. p. 372-98参照）。
【０２２２】
・薬理学的に活性なペプチドまたはタンパク質への反復化学部位、例えば、ＰＥＧ（ＰＥＧ化）またはヒアルロン酸の、化学的結合による、水力学半径の増大。例えば、Caliceti et al. (2003) “Pharmacokinetic and biodistribution properties of poly(ethylene glycol)-protein conjugates” Adv Drug Delivery Rev. 55:1261-77; Jevsevar et al. (2010) PEGylation of therapeutic proteins. Biotechnol J 5:113-28; Kontermann (2009) “Strategies to extend plasma half-lives of recombinant antibodies” BioDrugs. 23:93-109; Kang et al. (2009) “Emerging PEGylated drugs” Expert Opin Emerg Drugs. 14:363-80; and Mero et al. (2013) “Conjugation of hyaluronan to proteins” Carb Polymers. 92:2163-70参照。
【０２２３】
・薬理学的に活性なペプチドまたはタンパク質をポリシアリル化して融合させて、負電荷を有意に増加させること；あるいは、（ｂ）ヒトＣＧのｂサブユニットのような天然タンパク質の半減期を延長することが知られている負電荷を有する高度にシアル化されたペプチド（例えば、カルボキシ末端ペプチド［ＣＴＰ；絨毛性ゴナドトロピン（ＣＧ）ｂ鎖の］）を生物学的薬剤候補に融合させること。例えば、Gregoriadis et al. (2005) “Improving the therapeutic efficacy of peptides and proteins: a role for polysialic acids” Int J Pharm. 2005; 300:125-30; Duijkers et al. “Single dose pharmacokinetics and effects on follicular growth and serum hormones of a long-acting recombinant FSH preparation (FSHCTP) in healthy pituitary-suppressed females” (2002) Hum Reprod. 17:1987-93; and Fares et al. “Design of a longacting follitropin agonist by fusing the C-terminal sequence of the chorionic gonadotropin beta subunit to the follitropin beta subunit” (1992) Proc Natl Acad Sci USA. 89:4304-8. 35; and Fares “Half-life extension through O-glycosylation参照。
【０２２４】
・ＨＳＡ、ヒトＩｇＧ、トランスフェリンまたはフィブロネクチンなどの通常半減期の長いタンパク質に生理活性タンパク質へのペプチドまたはタンパク質結合ドメインの付着を介して、非共有結合的に結合すること。例えば、Andersen et al. (2011) “Extending half-life by indirect targeting of the neonatal Fc receptor (FcRn) using a minimal albumin binding domain” J Biol Chem. 286:5234-41; O’Connor-Semmes et al. (2014) “GSK2374697, a novel albumin-binding domain antibody (albudAb), extends systemic exposure of extendin-4: first study in humans-PK/PD and safety” Clin Pharmacol Ther. 2014;96:704-12. Sockolosky et al. (2014) “Fusion of a short peptide that binds immunoglobulin G to a recombinant protein substantially increases its plasma half-life in mice” PLoS One. 2014;9:e102566参照）。
【０２２５】
長命な（long-lived）血清タンパク質への古典的な遺伝的融合は、ＰＥＧまたは脂質への化学的結合とは異なる半減期延長の代替法を提供する。抗体Ｆｃドメインおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の２つの主要なタンパク質が従来から融合パートナーとして用いられてきた。Ｆｃ融合は、抗体のＦｃ部分にペプチド、タンパク質、または受容体エキソドメインを融合させるものである。Ｆｃおよびアルブミンの両方の融合は、ペプチド薬物のサイズを大きくすることで半減期の延長を達成するだけでなく、どちらも体内の自然なリサイクルメカニズムである新生児Ｆｃ受容体ＦｃＲｎを利用している。これらのタンパク質のＦｃＲｎへのｐＨ依存的結合は、エンドソーム内での融合タンパク質の分解を防ぐ。これらのタンパク質に基づく融合体は、半減期が３〜１６日の範囲であり、一般的なＰＥＧ化ペプチドまたは脂質化ペプチドよりもはるかに長い。抗体Ｆｃドメインへの融合は、ペプチドまたはタンパク質薬物の溶解性および安定性を改善することができる。ペプチドＦｃ融合体の例としては、現在、後期臨床治験中のＧＬＰ−１受容体アゴニストであるデュラグチドが挙げられる。ヒト血清アルブミンは、脂肪アシル化ペプチドによって利用されるのと同じタンパク質であり、もう一つの一般的な融合パートナーである。アルビグルチドはこのプラットフォームをベースにしたＧＬＰ−１受容体アゴニストである。Ｆｃとアルブミンとの主な違いは、融合パートナーの選択に応じて融合ペプチドが二量体または単量体として提示される、Ｆｃの二量体の性質とＨＳＡの単量体構造の違いである。アフィマー−Ｆｃ融合の二量体の性質は、アフィマー標的、例えば腫瘍細胞上のＰＤ-Ｌ１のようなアフィマーが、十分に密接に一緒に間隔をあけているか、またはそれ自体が二量体である場合に、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１などのアフィマー標的が、十分に近接して配置されているか、またはそれ自体が二量体である場合、アビディティ効果を生じさせ得る。これは、標的によって望ましい場合、望ましくない場合がある。
【０２２６】
（ｉ）Ｆｃ融合
ある態様において、アフィマーポリペプチドは、免疫グロブリンＦｃドメイン（“Ｆｃドメイン”）、または機能的Ｆｃ領域などのそのフラグメントもしくは変異体との融合タンパク質の一部であり得る。この関係において、アフィマー−Ｆｃ融合タンパク質として作製されたアフィマー剤などのＦｃ融合（“Ｆｃ−ｆｕｓｉｏｎ”）は、免疫グロブリンのＦｃ領域にペプチド骨格を介して（直接または間接的に）共有結合された１以上のアフィマー配列を含むポリペプチドである。Ｆｃ融合体は、例えば、抗体のＦｃ領域（エフェクター機能および薬物動態を促進する）およびアフィマー配列を、同一ポリペプチドの一部として含んでいてよい。免疫グロブリンＦｃ領域はまた、１以上のアフィマーに間接的に結合されていてよい。種々のリンカーが当技術分野で知られており、要すれば、Ｆｃをアフィマー配列を含むポリペプチドに結合してＦｃ融合体を生成するために用いられてよい。ある態様において、Ｆｃ融合体は、二量体化してＦｃ融合ホモ二量体を形成することができ、または非同一のＦｃドメインを用いてＦｃ融合ヘテロ二量体を形成することができる。
【０２２７】
対象となるアフィマー剤を生成する際に用いるために、ヒト抗体のＦｃ領域をアフィマー融合タンパク質として選択する理由がいくつかある。主な理論的根拠は、抗体と比較して同様の薬物動態プロファイルを示すのに十分な大きさの安定なタンパク質を生成すること、およびＦｃ領域によって付与される特性を利用することである；これには、エンドサイトーシス後の細胞表面への融合タンパク質のＦｃＲｎを介したリサイクル、リソソーム分解の回避、その結果としての血流中への放出、それによって血清半減期の延長に寄与することを含む救出新生児ＦｃＲｎ受容体経路が含まれる。別の明白な利点は、ＦｃドメインのプロテインＡへの結合であり、これは、アフィマー剤の製造中の下流工程を簡略化し、高純度のアフィマー剤の調製物を生成することを可能にする。
【０２２８】
一般的に、Ｆｃドメインは、最初の定常領域免疫グロブリンドメインを除く抗体の定常領域を含み得る。従って、Ｆｃドメインは、ＩｇＡ、ＩｇＤおよびＩｇＧの最後の２つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにＩｇＥおよびＩｇＭの最後の３つの定常領域免疫グロブリンドメイン、ならびにこれらのドメインのＮ末端の可撓性ヒンジを意味する。ＩｇＡおよびＩｇＭについて、Ｆｃは、Ｊ鎖を含んでいてよい。ＩｇＧについて、Ｆｃは、免疫グロブリンドメインＣγ２およびＣγ３ならびにＣγ１とＣγ２との間のヒンジを含む。Ｆｃドメインの境界は変化してもよいが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、そのカルボキシル末端に残基Ｃ２２６またはＰ２３０を含むように定義され、ここで、番号付けは、Ｋａｂａｔに記載されるＥＵインデックスに従う（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, NIH, Bethesda, Md. (1991))。Ｆｃは、単独でこの領域を意味するか、または抗体全体、抗体フラグメント、またはFc融合タンパク質の文脈でのこの領域を意味し得る。多型は、多くの異なるＦｃ位置で観察されており、本明細書で用いられるＦｃドメインとしても含まれる。
【０２２９】
ある態様において、本明細書で用いる“機能的Ｆｃ領域”は、ＦｃＲｎと結合する能力を保持するＦｃドメインまたはそのフラグメントを意味する。機能的Ｆｃ領域はＦｃＲｎに結合するが、エフェクター機能を有さない。ＦｃＲｎに結合するＦｃ領域またはそのフラグメントの能力は、当技術分野で知られている標準的結合アッセイによって決定することができる。例示的“エフェクター機能”には、Ｃ１ｑ結合；補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）；貪食；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体；ＢＣＲ）の下方制御などが含まれる。そのようなエフェクター機能は、そのような抗体エフェクター機能を評価するための当技術分野で知られている様々なアッセイを用いて評価することができる。
【０２３０】
例示的態様において、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ１サブクラスに由来するが、他のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４）も用いることができる。用いられ得るヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメインの例示的な配列は、以下の通りである：
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号９５）。
【０２３１】
ある態様において、融合タンパク質で用いられるＦｃ領域は、Ｆｃ分子のヒンジ領域を含み得る。例示的なヒンジ領域は、上記で提供された例示的なヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメイン配列の位置１〜１６（すなわち、ＤＫＴＨＴＣＰＣＰＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１７８））にまたがるコアヒンジ残基を含む。ある態様において、アフィマー含有融合タンパク質は、部分的には、上記で提供される例示的なヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメイン配列のヒンジ領域内の位置６および９のシステイン残基に起因して、多量体構造（例えば、ダイマー）を採用してもよい。他の態様において、本明細書で用いるヒンジ領域は、上記で提供される例示的なヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメイン配列のコアヒンジ配列に隣接するＣＨ１およびＣＨ２領域に由来する残基をさらに含んでいてよい。さらに別の態様において、ヒンジ配列は、ＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１７９）またはＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧ（配列番号１８０）を含むか、またはそれらからなる。
【０２３２】
ある態様において、ヒンジ配列は、望ましい薬物動態学的特性、生物物理学的特性および／または生物学的特性を付与する１以上の置換を含んでもよい。いくつかの例示的なヒンジ配列は、以下である：
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  （配列番号１８１）；
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  （配列番号１８２）；
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ  （配列番号１８３）；
ＥＰＫＳＳＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ  （配列番号１８４）；
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ  （配列番号１８５）；および
ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ  （配列番号１５１）。
【０２３３】
ある態様において、上記の例示的なヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメイン配列の位置１８の残基Ｐは、Ｆｃエフェクター機能を除去するためにＳで置換されてもよく、この置換は、配列ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号１８３）、ＥＰＫＳＳＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号１８４）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号１８６）を有するヒンジにおいて例示される。別の態様において、上記の例示的なヒトＩｇＧ１免疫グロブリンＦｃドメイン配列の位置１〜２の残基ＤＫは、潜在的なクリップ部位を除去するためにＧＳで置換されてもよく、この置換は、配列ＥＰＫＳＳＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＧＧＳＳ（配列番号１８４）で例示される。別の態様において、ヒトＩｇＧ１の重鎖定常領域（すなわち、ドメインＣＨ１−ＣＨ３）の位置１０３のＣは、軽鎖の不存在下での不適切なシステイン結合形成を防ぐために、Ｓで置換されてもよい；この置換は、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳ（配列番号１８２）、ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号１８３）およびＥＰＫＳＳＧＳＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＳＳ（配列番号１８４）によって例示される。
【０２３４】
ある態様において、Ｆｃは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４に由来するＦｃドメインを含む、ヒトＦｃのような哺乳動物Ｆｃである。Fc領域は、天然Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％または約９９％の配列同一性を有していてよい。ある態様において、Ｆｃ領域は、天然Ｆｃ領域および／または親ポリペプチドのＦｃ領域と少なくとも約９０％の配列同一性を有していてよい。
【０２３５】
ある態様において、Ｆｃドメインは、配列番号９５から選択されるアミノ酸配列、または配列番号９６−１０８に供される例からのＦｃ配列を含む。ＦｃドメインのＣ末端リジンは、Ｆｃドメインを含む融合タンパク質の任意の成分であることが理解されるべきである。ある態様において、Ｆｃドメインは、そのＣ末端リジンが省略されていることを除き、配列番号９５−１０８から選択されるアミノ酸配列を含む。ある態様において、Ｆｃドメインは、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。ある態様において、Ｆｃドメインは、そのＣ末端リジンが省略されていることを除き、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。
【０２３６】
【表８】
2021520851.tif 000009
【表９】
2021520851.tif 000010
【０２３７】
ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーとＦｃとの例示的なＦｃ融合は、実施例および図面に提供され、アフィマー配列が、ＦｃドメインのＮ末端またはＣ末端のいずれかに配置され得て、直接付着してもよいか、または融合タンパク質が、Ｆｃドメインとアフィマーポリペプチド配列との間に介在する他のポリペプチド配列を有してもよいことを実証している。図示の例において、非構造化（可撓性）リンカーである（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎは、ＰＤ−Ｌ１結合アフィマー“２５１”（配列番号８６）およびヒトＩｇＧ１のＦｃドメイン（配列番号９５）と、およびＥＰＫＳＣＤＫＴＴＨＴＣＰＰＰＰＡＰＥＬＧであるヒンジ領域を用いる。コンストラクトは両方とも、タンパク質の成熟バージョンから切断されるＣＤ３３分泌シグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ（配列番号１３６）を含んでいた。
【０２３８】
【表１０】
2021520851.tif 000011
【０２３９】
“抗体依存性細胞介在細胞毒性”または“ＡＤＣＣ”は、特定の細胞傷害性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、好中球およびマクロファージ）上に存在するＦｃ受容体（ＦｃＲ）に結合した分泌されたＩｇが、これらの細胞傷害性エフェクター細胞が抗原を担持する標的細胞に特異的に結合し、その後細胞毒素で標的細胞を殺すのを可能にする、細胞傷害性の一形態を意味する。
【０２４０】
ある態様において、融合タンパク質は、結果として得られるアフィマー剤がＡＤＣＣおよび／または補体の活性化またはエフェクター機能を有さない（または低減された）Ｆｃドメイン配列を含む。例えば、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ２またはＩｇＧ４アイソタイプの天然に無効化された定常領域、または変異したＩｇＧ１定常領域を含み得る。好適な改変の例は、ＥＰ０３０７４３４に記載されている。一例としては、位置２３５および２３７におけるアラニン残基の置換からなる（ＥＵインデックス番号付け）。
【０２４１】
他の態様において、融合タンパク質は、例えば融合タンパク質がヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ３由来のＦｃドメインを含む場合、得られたアフィマー剤が一部またはすべてのＦｃ機能性を保持し得る、例えばＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性の一方または両方を有し得るように、Ｆｃドメイン配列を含む。エフェクター機能のレベルは、既知の技術に従って、例えば、ＣＨ２ドメインの変異によって、例えば、ＩｇＧ１ ＣＨ２ドメインが、位置２３９および３３２および３３０から選択される位置に１以上の変異を有する場合、例えば、変異がＳ２３９ＤおよびＩ３３２ＥおよびＡ３３０Ｌから選択されるように、抗体が増強されたエフェクター機能を有するように、および／または、例えば、Ｆｃ領域のフコシル化が減少するように、本発明の抗原結合タンパク質のグリコシル化プロファイルを変化させることによって、変えることができる。
【０２４２】
（ｉｉ）アルブミン融合体
他の態様において、アフィマー剤は、少なくとも１つのアフィマー配列に加えて、アルブミン配列またはアルブミンフラグメントを含む融合タンパク質である。他の態様において、アフィマー剤は、アフィマーを含むポリペプチド配列への挿入以外の化学的結合を介してアルブミン配列またはアルブミンフラグメントに結合される。ある態様において、アルブミン、アルブミン変異体、またはアルブミンフラグメントは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ヒト血清アルブミン変異体、またはヒト血清アルブミンフラグメントである。ＨＳＡに匹敵するアルブミン血清タンパク質は、例えば、カニクイザル、ウシ、イヌ、ウサギおよびラット見いだされる。ヒト以外の種で、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）は、ＨＳＡに最も構造的に類似している。例えば、Kosa et al., (2007) J Pharm Sci. 96(11):3117-24参照のこと。本発明は、カニクイザル血清アルブミンまたはウシ血清アルブミンに由来するアルブミン配列を含むが、これらに限定されない、非ヒト種由来のアルブミンの使用を企図する。
【０２４３】
約２０日の血清半減期を有する５８５アミノ酸ポリペプチド（約６７ｋＤａ）の成熟ＨＳＡは、主にコロイド浸透圧、血中ｐＨならびに多数の内因性および外因性リガンドの輸送および分布の維持に関与する。このタンパク質は、３つの構造的に相同なドメイン（ドメインＩ、ＩＩおよびＩＩＩ）を有し、ほぼ完全にアルファヘリックス構造であり、１７個のジスルフィド架橋によって高度に安定化されている。ある態様において、アフィマー剤は、１以上のアフィマーポリペプチド配列および成熟ヒト血清アルブミンの配列（配列番号１１３）または融合タンパク質に望まれる程度の成熟アルブミンのＰＫおよび／または生体内分布の特性を維持しているその変異体もしくはフラグメントを含むアルブミン融合タンパク質であり得る。
ＤＡＨＫＳＥＶＡＨＲＦＫＤＬＧＥＥＮＦＫＡＬＶＬＩＡＦＡＱＹＬＱＱＣＰＦＥＤＨＶＫＬＶＮＥＶＴＥＦＡＫＴＣＶＡＤＥＳＡＥＮＣＤＫＳＬＨＴＬＦＧＤＫＬＣＴＶＡＴＬＲＥＴＹＧＥＭＡＤＣＣＡＫＱＥＰＥＲＮＥＣＦＬＱＨＫＤＤＮＰＮＬＰＲＬＶＲＰＥＶＤＶＭＣＴＡＦＨＤＮＥＥＴＦＬＫＫＹＬＹＥＩＡＲＲＨＰＹＦＹＡＰＥＬＬＦＦＡＫＲＹＫＡＡＦＴＥＣＣＱＡＡＤＫＡＡＣＬＬＰＫＬＤＥＬＲＤＥＧＫＡＳＳＡＫＱＲＬＫＣＡＳＬＱＫＦＧＥＲＡＦＫＡＷＡＶＡＲＬＳＱＲＦＰＫＡＥＦＡＥＶＳＫＬＶＴＤＬＴＫＶＨＴＥＣＣＨＧＤＬＬＥＣＡＤＤＲＡＤＬＡＫＹＩＣＥＮＱＤＳＩＳＳＫＬＫＥＣＣＥＫＰＬＬＥＫＳＨＣＩＡＥＶＥＮＤＥＭＰＡＤＬＰＳＬＡＡＤＦＶＥＳＫＤＶＣＫＮＹＡＥＡＫＤＶＦＬＧＭＦＬＹＥＹＡＲＲＨＰＤＹＳＶＶＬＬＬＲＬＡＫＴＹＥＴＴＬＥＫＣＣＡＡＡＤＰＨＥＣＹＡＫＶＦＤＥＦＫＰＬＶＥＥＰＱＮＬＩＫＱＮＣＥＬＦＥＱＬＧＥＹＫＦＱＮＡＬＬＶＲＹＴＫＫＶＰＱＶＳＴＰＴＬＶＥＶＳＲＮＬＧＫＶＧＳＫＣＣＫＨＰＥＡＫＲＭＰＣＡＥＤＹＬＳＶＶＬＮＱＬＣＶＬＨＥＫＴＰＶＳＤＲＶＴＫＣＣＴＥＳＬＶＮＲＲＰＣＦＳＡＬＥＶＤＥＴＹＶＰＫＥＦＮＡＥＴＦＴＦＨＡＤＩＣＴＬＳＥＫＥＲＱＩＫＫＱＴＡＬＶＥＬＶＫＨＫＰＫＡＴＫＥＱＬＫＡＶＭＤＤＦＡＡＦＶＥＫＣＣＫＡＤＤＫＥＴＣＦＡＥＥＧＫＫＬＶＡＡＳＱＡＡＬＧＬ（配列番号１１３）。
【０２４４】
アルブミン配列は、上記のようにリンカー配列を用いることにより、アフィマーポリペプチド配列またはアフィマー剤中の他の隣接配列から離すことができる。
【０２４５】
特記しない限り、本明細書中、“アルブミン”または“成熟アルブミン”への言及は、ＨＳＡを指すことを意味する。しかしながら、完全長ＨＳＡは、１８アミノ酸のシグナルペプチド（ＭＫＷＶＴＦＩＳＬＬＦＬＦＳＳＡＹＳ（配列番号１３７））とそれに続く６アミノ酸のプロドメイン（ＲＧＶＦＲＲ）（配列番号２０７）を有することが特記される；この２４アミノ酸残基ペプチドは、プレプロドメインと称され得る。アフィマー−ＨＳＡ融合タンパク質を、組換えタンパク質をコードする配列中のＨＳＡプレプロドメインを用いて発現および分泌させることができる。あるいは、アフィマー−ＨＳＡ融合を、上記のような他の分泌シグナル配列を含むことにより発現および分泌させ得る。
【０２４６】
別の態様において、アフィマーポリペプチドとの融合タンパク質の一部として提供されるのではなく、血清アルブミンポリペプチドは、骨格アミド結合以外の結合、例えば、アルブミンポリペプチドおよびアフィマー含有ポリペプチドのそれぞれのアミノ酸側鎖の間の化学的結合によって架橋されたような結合を介して、アフィマー含有ポリペプチドに共有結合され得る。
【０２４７】
（ｉｉｉ）アルブミン結合ドメイン
ある態様において、アフィマー剤は、血清結合部位−アフィマーポリペプチド配列との融合タンパク質（ポリペプチドでもある場合）の一部として、または連続するポリペプチド鎖の一部である以外の部位を介して化学的に結合されたもの−を含み得る。
【０２４８】
ある態様において、血清結合ポリペプチドは、アルブミン結合部位である。アルブミンは、複数の疎水性結合ポケットを含み、脂肪酸およびステロイドのような種々の異なるリガンド、ならびに種々の薬物のトランスポーターとして自然に機能する。さらに、アルブミンの表面は負に帯電しており、水溶性が高くなっている。
【０２４９】
本明細書で用いる用語“アルブミン結合部分”は、アルブミンに結合することができる、すなわち、アルブミン結合親和性を有する何らかの化学基を意味する。アルブミンは脂肪酸などの内因性リガンドに結合する。しかしながら、ワルファリン、ペニシリンおよびジアゼパムなどの外因性リガンドとも相互作用する。これらの薬物のアルブミンへの結合は可逆的であるため、アルブミン−薬物複合体は、薬物の生体内分布およびバイオアベイラビリティを高め得る薬物リザーバーとして機能する。脂肪酸などの内因性アルブミン結合リガンドを模倣する成分の組み込みは、アルブミン結合を増強し、薬効を高めるために用いられてきた。
【０２５０】
ある態様において、タンパク質の半減期を増強させるために対象であるアフィマー剤の生成に適用できる化学修飾は、ペプチドの側鎖に脂肪酸の共有結合を含む脂質化である。インスリンの半減期を延長する方法として元々考案され開発された脂質化は、ＰＥＧ化と同じ半減期延長の基本メカニズムを共有し、すなわち、水力学的半径を大きくして腎濾過を減らす。しかしながら、脂質部分自体は比較的小さく、その効果は、循環するアルブミンへの脂質部分の非共有結合を介して間接的に仲介される。脂質化の１つの結果は、ペプチドの水溶性を低下させることであるが、ペプチドと脂肪酸との間のリンカーの操作により、たとえばリンカー内でグルタメートまたはミニＰＥＧを使用することにより、これを調整できる。リンカーエンジニアリングおよび脂質部分の変化は、自己凝集に影響を与え得て、アルブミンとは無関係に、生体内分布を遅くすることによって半減期の延長に寄与し得る。例えば、Jonassen. et al. （2012）Pharm Res. 29(8)：2104-14を参照のこと。
【０２５１】
特定のアフィマー剤の生成に用いるためのアルブミン結合部分の他の例には、アルブミン結合（ＰＫＥ２）アドネクチン（ＷＯ２０１１１４００８６“Serum Albumin Binding Molecules”，ＷＯ２０１５１４３１９９“Serum albumin-binding Fibronectin Type III Domains”およびＷＯ２０１７０５３６１７“Fast-off rate serum albumin binding fibronectin type iii domains”参照）、連鎖球菌株Ｇ１４８のプロテインＧのアルブミン結合ドメイン３（ＡＢＤ３）ならびにアルブミン結合ドメイン抗体ＧＳＫ２３７４６９７（“ＡｌｂｕｄＡｂ”）またはＡＴＮ−１０３のアルブミン結合ナノ体部分（オゾラリズマブ）が含まれる。
【０２５２】
（ｉｖ）ＰＥＧ化、ＸＴＥＮ、ＰＡＳおよび他のポリマー
様々な高分子ポリマーおよび他の分子を、得られるアフィマー剤の生物学的特性を調節し、および／またはアフィマー剤に新たな生物学的特性を提供するために、本発明のアフィマー含有ポリペプチドに連結することができる。これらの高分子ポリマーは、天然にコードされたアミノ酸を介して、非天然にコードされたアミノ酸を介して、または天然もしくは非天然のアミノ酸の任意の官能置換基を介して、または天然もしくは非天然のアミノ酸に付加された任意の置換基もしくは官能基を介して、アフィマー含有ポリペプチドに連結することができる。ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａ以上を含むがこれらに限定されない広い範囲のものであってもよい。ポリマーの分子量は、１００，０００Ｄａ、９５，０００Ｄａ、９０，０００Ｄａ、８５，０００Ｄａ、８０，０００Ｄａ、７５，０００Ｄａ、７０，０００Ｄａ、６５，０００Ｄａ、６０，０００Ｄａ、５５，０００Ｄａ、５０，０００Ｄａ、４５，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、３５，０００Ｄａ、３０，０００Ｄａ、２５，０００Ｄａ、２０，０００Ｄａ、１５，０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、９，０００Ｄａ、８，０００Ｄａ、７，０００Ｄａ、６，０００Ｄａ、５，０００Ｄａ、４，０００Ｄａ、３，０００Ｄａ、２，０００Ｄａ、１，０００Ｄａ、９００Ｄａ、８００Ｄａ、７００Ｄａ、６００Ｄａ、５００Ｄａ、４００Ｄａ、３００Ｄａ、２００Ｄａおよび１００Ｄａを含むがこれに限定されない、約１００Ｄａ〜約１００，０００Ｄａの範囲のものであってもよい。ある態様において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約５０，０００Ｄａである。ある態様において、ポリマーの分子量は、約１００Ｄａ〜約４０，００００Ｄａである。ある態様において、ポリマーの分子量は、約１０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある態様において、ポリマーの分子量は、約５，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。ある態様において、ポリマーの分子量は、約１０，０００Ｄａ〜約４０，０００Ｄａである。
【０２５３】
この目的のために、ペグ化、ポリシアル化、ＨＥＳ化、グリコシル化または可撓性かつ親水性のアミノ酸鎖（５００〜６００アミノ酸）に融合した組換えＰＥＧ類縁体を含む様々な方法が開発されている（Chapman, (2002) Adv Drug Deliv Rev. 54. 531-545; Schlapschy et al., (2007) Prot Eng Des Sel. 20, 273-283; Contermann (2011) Curr Op Biotechnol. 22, 868-876; Jevsevar et al., (2012) Methods Mol Biol. 901, 233-246参照)。
【０２５４】
ポリマーの例としては、ポリアルキルエーテルおよびそのアルコキシキャップされた類縁体（例えば、ポリオキシエチレングリコール、ポリオキシエチレン／プロピレングリコール、およびそれらのメトキシまたはエトキシでキャップされた類縁体、とりわけポリオキシエチレングリコール、後者はポリエチレングリコールまたはＰＥＧとしても知られている）；ディスクリートＰＥＧ（ｄＰＥＧ）；ポリビニルピロリドン；ポリビニルアルキルエーテル；ポリオキサゾリン、ポリアルキルオキサゾリンおよびポリヒドロキシアルキルオキサゾリン；ポリアクリルアミド、ポリアルキルアクリルアミド、およびポリヒドロキシアルキルアクリルアミド（例えば、ポリヒドロキシプロピルメタクリルアミドおよびその誘導体）；ポリヒドロキシアルキルアクリレート；ポリシアル酸およびその類縁体；親水性ペプチド配列；デキストランおよびデキストラン誘導体を含む多糖類およびその誘導体、例えばカルボキシメチルデキストラン、デキストラン硫酸塩、アミノデキストラン；セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシアルキルセルロース；キチンおよびその誘導体、例えば、キトサン、サクシニルキトサン、カルボキシメチルキチン、カルボキシメチルキトサン；ヒアルロン酸およびその誘導体；デンプン類；アルギン酸塩；コンドロイチン硫酸塩；アルブミン；プルランおよびカルボキシメチルプルラン；ポリアミノ酸およびその誘導体、例えばポリグルタミン酸、ポリリシン、ポリアスパラギン酸、ポリアスパルトアミド(polyaspartamide)；無水マレイン酸コポリマー、例えば：スチレン無水マレイン酸コポリマー、ジビニルエーテル無水マレイン酸コポリマー；ポリビニルアルコール；そのコポリマー；そのターポリマー；その混合物；および上記の誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２５５】
選択されるポリマーは、それが結合しているアフィマー剤が生理的環境などの水性環境で沈殿しないように水溶性であり得る。水溶性ポリマーは、直鎖状、分岐状（forked）または分岐状（branched）を含むがこれらに限定されない何らかの構造形態であってもよい。一般的には、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリ（アルキレングリコール）であるが、他の水溶性ポリマーを用いることもできる。例によって、ＰＥＧは、本発明のいくつかの態様を説明するためにっ用いられる。アフィマー剤の治療的使用のために、ポリマーは薬学的に許容され得る。
【０２５６】
用語“ＰＥＧ”は、サイズに関係なく、またはＰＥＧの末端での修飾に関係なく、任意のポリエチレングリコール分子を包含するように広義に用いられ、以下の式によってポリペプチドを含むアフィマーに連結されたものとして表すことができる。
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−ＣＨ２ＣＨ２−
または
ＸＯ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−
（式中、ｎは２〜１０，０００であり、Ｘは、ＨまたはＣ１〜４アルキル、保護基もしくは末端官能基を含むがこれに限定されない。）
ある場合において、本発明のポリペプチドで用いられるＰＥＧは、一端がヒドロキシまたはメトキシで終結しており、すなわちＸがＨまたはＣＨ３（“メトキシＰＥＧ”）である。
【０２５７】
末端“−”によって上記の式で示されるＰＥＧの他方の末端は、天然または非天然にコードされるアミノ酸を介して、ポリペプチドを含むアフィマーに結合してもよいことが特記される。例えば、結合は、ポリペプチドのアミン基（リシンのε−アミンまたはＮ末端を含むが、これらに限定されない）へのアミド、カルバメートまたは尿素の連結を介してもよい。あるいは、ポリマーは、チオール基（システインのチオール基を含むがこれらに限定されない）へのマレイミド連結によって連結され−これは、アフィマーポリペプチド配列へのそれ自体への付着の場合には、アフィマー配列中の残基をシステインに改変することを必要とする。
【０２５８】
アフィマー含有ポリペプチドに連結された水溶性ポリマーの数（すなわち、ＰＥＧ化またはグリコシル化の程度）は、結果として得られるアフィマー剤におけるインビボ半減期のような変化した（増減を含むがこれに限定されない）薬理学的、薬物動態学的または薬力学的特性を提供するように調整することができる。ある態様において、得られるアフィマー剤の半減期は、未修飾ポリペプチドに対して少なくとも約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０％、２倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍、１６倍、１７倍、１８倍、１９倍、２０倍、２５倍、３０倍、３５倍、４０倍、５０倍、または少なくとも約１００倍増加する。
【０２５９】
得られるアフィマー剤のＰＫまたは他の生物学的特性を改変するのに有用なポリマー系の別の変形は、特にアフィマーポリペプチド配列との融合タンパク質の一部として、ＰＥＧの機能的類縁体である非構造化親水性アミノ酸ポリマーを使用することである。ポリペプチドプラットフォームの固有の生分解性は、ＰＥＧの潜在的により良性の代替物として魅力的なものとなる。別の利点は、ＰＥＧの多分散性とは対照的に、組換え分子の精密な分子構造である。融合パートナーの三次元折り畳みを維持する必要があるＨＳＡおよびＦｃペプチド融合とは異なり、非構造化パートナーへの組換え融合は、多くの場合、より高温またはＨＰＬＣ精製のような過酷な条件に曝される可能性がある。
【０２６０】
このクラスのポリペプチドのより高度なものの１つは、ＸＴＥＮ（Ａｍｕｎｉｘ）と呼ばれ、８６４アミノ酸長であり、６つのアミノ酸（Ａ、Ｅ、Ｇ、Ｐ、ＳおよびＴ）からなる。Schellenberger et al. “A recombinant polypeptide extends the in vivo half-life of peptides and proteins in a tunable manner” 2009 Nat Biotechnol. 27(12):1186-90参照。ポリマーの生分解性により、これは一般的に用いられる４０ＫＤａのＰＥＧよりもはるかに大きく、半減期の延長をもたらし得る。ＸＴＥＮのアフィマー含有ポリペプチドへの融合は、最終的なアフィマー剤の半減期を未修飾ポリペプチドの６
０〜１３０倍に延長する結果になるはずである。
【０２６１】
同様の概念上の考慮に基づく第２のポリマーは、ＰＡＳ（ＸＬ−タンパク質ＧｍｂＨ）である。Schlapschy et al. “PASYlation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins” 2013 Protein Eng Des Sel. 26(8):489-501参照。ランダムコイルポリマーは、３つの小さな非電荷アミノ酸である、プロリン、アラニンおよびセリンのみのさらに制限されたセットで構成される。Ｆｃ、ＨＡＳおよびＸＴＥＮと同様に、ＰＡＳ修飾は、発現されたとき、インライン融合タンパク質を生成するために、アフィマーポリペプチド配列とともに遺伝的にコードされ得る。
【０２６２】
ｃ．多重特異性融合タンパク質
ある態様において、アフィマー剤は、例えば、第１の抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドおよび少なくとも１つのさらなる結合ドメインを含む多特異的ポリペプチドである。該さらなる結合ドメインは、例示するために、第２のアフィマーポリペプチド配列（第１のアフィマーポリペプチド配列と同じであっても異なっていてもよい）、抗体もしくはそのフラグメント、または他の抗原結合ポリペプチド、受容体（受容体トラップポリペプチドなど）のリガンド結合部分、受容体結合リガンド（サイトカイン、成長因子など）、人工Ｔ細胞受容体、酵素またはその触媒フラグメント、あるいはいくつかの機能を付与する他のポリペプチド配列から選択されるポリペプチド配列であってもよい。
【０２６３】
ある態様において、アフィマー剤は、ＰＤ−Ｌ１にも向けられている１以上の追加のアフィマーポリペプチド配列を含む。追加の抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーは、多特異的アフィマー融合タンパク質を作製するために、第１の抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドと同じか、または異なる（またはそれらの混合物）ものであってもよい。アフィマー剤は、ＰＤ−Ｌ１上の同じ部位または重複部位に結合することができるか、またはアフィマー剤が同じＰＤ−Ｌ１タンパク質上の２つの部位に同時に結合することができるような２つの異なる部位に結合することができる（バイパラトピック）か、または３以上の部位に結合することができる（マルチパラトピック）。
【０２６４】
ある態様において、アフィマー剤は、抗体からの１以上の抗原結合部位を含む。結果として得られるアフィマー剤は、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーおよび抗原結合部位の両方を含む単鎖（例えば、ｓｃＦＶの場合）であり得るか、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体の配列も融合された重鎖および／または軽鎖で組み立てられた抗体のような多量体タンパク質複合体であり得る。この形式の例示的なアフィマー／抗体融合体は、ＣＴＬＡ−４およびＰＤ−Ｌ１のそれぞれに対して二価である、図１１Ａに示されるイピリムマブ−ＡＶＡ０４−１４１二価抗体である。別の態様は、ＶＥＧＦ−ＡおよびＰＤ−Ｌ１のそれぞれに対して二価である、図１３Ａに示されるベバシズマブ−ＡＶＡ０４−２５１二重特異性抗体である。
【０２６５】
図示されたイピリムマブ−ＡＶＡ０４−１４１二重特異性抗体の場合、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドは、抗ＣＴＬＡ−４抗体の重鎖のＣ末端でのインライン融合として提供され、ここで、重鎖（除去可能な分泌シグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ（配列番号１３６）およびＧｌｙ４−Ｓｅｒリピートリンカーを含む）は、アフィマー融合配列を有している：
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＱＶＱＬＶＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＲＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＳＹＴＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＴＦＩＳＹＤＧＮＮＫＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＩＹＹＣＡＲＴＧＷＬＧＰＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＰＲＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＮＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡＡＡＨＦＰＥＨＦＷＳＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦＮＧＰＱＰＡＤＭＳＡＥＦＡＤＲＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ（配列番号１１４）
【０２６６】
そして、軽鎖（除去可能な分泌シグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ（配列番号１３６）を含む）は、天然イピリムマブ抗体の配列を有する：
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＥＩＶＬＴＱＳＰＧＴＬＳＬＳＰＧＥＲＡＴＬＳＣＲＡＳＱＳＶＧＳＳＹＬＡＷＹＱＱＫＰＧＱＡＰＲＬＬＩＹＧＡＦＳＲＡＴＧＩＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＲＬＥＰＥＤＦＡＶＹＹＣＱＱＹＧＳＳＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１１５）。
【０２６７】
同様に、例示されたベバシズマブ−ＡＶＡ０４−２５１二重特異性抗体の場合、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドは、抗ＶＥＧＦ−Ａ抗体の重鎖のＣ末端でのインライン融合として提供され、ここで、重鎖（除去可能な分泌シグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ（配列番号１３６）および可撓性Ｇｌｙ４−Ｓｅｒリピートリンカーを含む）は、アフィマー融合配列を有する：
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＩＰＲＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＧＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡＲＥＧＲＱＤＷＶＬＳＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦＮＧＰＷＶＰＦＰＨＱＱＬＡＤＲＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ（配列番号１１６）。
【０２６８】
そして、軽鎖（除去可能な分泌シグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ（配列番号１３６）を含む）は、天然ベバシズマブ抗体の配列を有する：
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＶＬＩＹＦＴＳＳＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＳＴＶＰＷＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号１１７）。
【０２６９】
本発明のアフィマーをフォーマットする際の柔軟性をさらに説明するために、軽鎖は上記と同じであるが、重鎖が抗体重鎖と抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーとの間にリジッドリンカーを含むベバシズマブ−ＡＶＡ０４−２５１二重特異性抗体のバージョンも生成され、ここで、重鎖（除去可能な分泌シグナル配列ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡ（配列番号１３６）およびリジッドなＡ（ＥＡＡＡＫ）３リンカー）は、アフィマー融合配列を有する：
ＭＰＬＬＬＬＬＰＬＬＷＡＧＡＬＡＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＴＦＴＮＹＧＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＷＩＮＴＹＴＧＥＰＴＹＡＡＤＦＫＲＲＦＴＦＳＬＤＴＳＫＳＴＡＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＹＰＨＹＹＧＳＳＨＷＹＦＤＶＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫＡＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＥＡＡＡＫＩＰＲＧＬＳＥＡＫＰＡＴＰＥＩＱＥＩＶＤＫＶＫＰＱＬＥＥＫＴＧＥＴＹＧＫＬＥＡＶＱＹＫＴＱＶＬＡＲＥＧＲＱＤＷＶＬＳＴＮＹＹＩＫＶＲＡＧＤＮＫＹＭＨＬＫＶＦＮＧＰＷＶＰＦＰＨＱＱＬＡＤＲＶＬＴＧＹＱＶＤＫＮＫＤＤＥＬＴＧＦ(配列番号１１８)。
【０２７０】
当業者には明らかであり、図１７に示されるように、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチド配列は、抗体の重鎖もしくは軽鎖のＮ末端もしくはＣ末端のいずれか、またはそれらの組合せ／順列（permuation）で添加することができる。さらに、多量体アフィマーの文脈で図９に示すように、２以上のアフィマー配列を任意の所与の抗体鎖に含めることができる。
【０２７１】
完全長の免疫グロブリンを含む多重特異性アフィマー剤に関して、ある態様において、アフィマーポリペプチド配列の抗体への融合は、免疫グロブリンのＦｃ領域のＦｃ機能を維持し得る。例えば、ある態様において、アフィマー剤は、そのＦｃ部分を介して、Ｆｃ受容体陽性細胞のＦｃ受容体に結合することができる。さらなる態様において、アフィマー剤は、Ｆｃ受容体陽性細胞に結合することにより、Ｆｃ受容体陽性細胞を活性化し、それによりサイトカインおよび／または共刺激抗原の発現を開始または増加させ得る。さらに、アフィマー剤は、共刺激抗原および／またはサイトカインを介して、Ｔ細胞の生理学的活性化に必要な少なくとも第２の活性化シグナルをＴ細胞に伝達し得る。
【０２７２】
ある態様において、免疫系からのエフェクター細胞の表面上に存在するＦｃ受容体を発現する他の細胞、例えば免疫細胞、肝細胞および内皮細胞へのそのＦｃ部分の結合に起因して、アフィマー剤は、抗体依存性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）機能を有していてもよく、これは、抗体によって膜表面抗原が結合した標的細胞を高活性で溶解することにより、ＡＤＣＣを介して腫瘍細胞死を引き起こす、細胞媒介免疫防御のメカニズムである。あるさらなる態様において、アフィマー剤は、ＡＤＣＣ機能を実証することができる（図５Ｃ）。
【０２７３】
上記のように、Ｆｃ媒介細胞毒性とは別に、Ｆｃ部分は、体内での安定性および持続性に重要なアフィマー剤の血清レベルの維持に寄与し得る。例えば、Ｆｃ部分が内皮細胞上および貪食細胞上のＦｃ受容体に結合すると、アフィマー剤は内在化され、アフィマー剤は体内化され、血液中にリサイクルされ、体内でのその半減期を高めることができる。
【０２７４】
追加のアフィマーポリペプチドの例示的な標的は、単に例示として、別の免疫チェックポイントタンパク質、および免疫共刺激性受容体（特に、追加のアフィマー（複数可）が共刺激性受容体をアゴナイズすることができる場合）、受容体、サイトカイン、増殖因子または腫瘍関連抗原を含むが、これらに限定されない。
【０２７５】
アフィマー剤が、アフィマー／抗体融合タンパク質である場合、免疫グロブリン部分は、例えば、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＥＧＦＲまたはＨｅｒ２／ｎｅｕに対するモノクローナル抗体であってもよい。そのような免疫グロブリンのいくつかの例示には、以下のいずれか中で含まれる抗体が含まれる：トラスツマブ、パニツズマブ、セツキシマブ、オビヌツズマブ、リツキシマブ、ペルツズマブ、アレムツズマブ、ベバシズマブ、トシツズマブ、イブリツズマブ、オータツズマブ、ブレンツキシマブおよびゲムツズマブ。
【０２７６】
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドは、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ−４、ＮＫＧ２Ａ、ＫＩＲ、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＤ９６、ＶＩＳＴＡまたはＴＩＧＩＴを含むがこれらに限定されない、Ｔ細胞上で発現されるような免疫チェックポイント分子を阻害する１以上の結合ドメインを含むアフィマー剤の一部である。
【０２７７】
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドは、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＤＮＡＭ−１またはＣＤ２８Ｈを含むが、これらに限定されない、Ｔ細胞上で発現されるような免疫共刺激分子をアゴナイズする１以上の結合ドメインを含むアフィマー剤の一部である。
【０２７８】
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドは、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、ＣＤ１３７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＤＮＡＭ−１またはＣＤ２８Ｈのアゴニストリガンドなどの免疫共刺激分子の１以上のリガンドアゴニストを含むアフィマー剤の一部である。
【０２７９】
抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーのＰＤ−Ｌ１阻害活性を、阻害性免疫チェックポイントの１つまたは複数を阻害および／または免疫調節経路の１つまたは複数を活性化する結合ドメインと組み合わせることにより、多特異的アフィマー剤は、そうでなければ枯渇した抗腫瘍Ｔ細胞を救済し、抗腫瘍免疫を増強し、それにより、癌患者の陽性活性を支持する。いくつかのさらなる態様において、協調的に発現された免疫チェックポイントタンパク質のアフィマー剤による二重遮断は、相加的または相乗的な抗腫瘍活性を生じさせることができる。
【０２８０】
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドは、可溶性免疫抑制分子（レセプタートラップなど）に結合する結合ドメインあるいは対応する同族受容体に結合し、ＰＧＥ２、ＴＧＦ−β、ＶＥＧＦ、ＣＣＬ２、ＩＤＯ、ＣＳＦ１、ＩＬ−１０、ＩＬ−１３、ＩＬ−２３、アデノシンまたはＳＴＡＴ３アクティベーターのアンタゴニストを含むがこれらに限定されない受容体のリガンド活性化を阻害する結合ドメインなどの、可溶性免疫抑制分子を阻害する１以上の結合ドメインを含むアフィマー剤の一部である。特定の例において、アフィマー剤は、アフリベセプトのＶＥＧＦ結合受容体ドメインなどのＶＥＧＦ受容体トラップドメインを含む。別の例において、アフィマー剤は、ＭＳＢ００１１３５９ＣのＴＧＦ−β結合受容体ドメインなどのＴＧＦ−β受容体トラップドメインを含む。
【０２８１】
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドは、腫瘍微小環境で上方制御されるタンパク質、すなわち、腫瘍内の腫瘍細胞、または腫瘍に浸潤するマクロファージ、線維芽細胞、Ｔ細胞もしくは他の免疫細胞で上方制御されるような腫瘍関連抗原に結合する１以上の結合ドメインを含むアフィマー剤の一部である。
【０２８２】
ある態様において、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドは、ＣＥＡＣＡＭ−１、ＣＥＡＣＡＭ−５、ＢＴＬＡ、ＬＡＩＲ１、ＣＤ１６０、２Ｂ４、ＴＧＦＲ、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、ＣＤ４０、ＣＤ４ＯＬ、ＣＤ４７、ＣＤ７０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ９４、ＣＤ１３７、ＣＤ１３７Ｌ、ＣＤ２２６、Ｇａｌｅｃｔｉｎ−９、ＧＩＴＲＬ、ＨＨＬＡ２、ＩＣＯＳ、ＩＣＯＳＬ、ＬＩＧＨＴ、ＭＨＣクラスＩもしくはＩＩ、ＮＫＧ２ａ、ＮＫＧ２ｄ、ＯＸ４ＯＬ、ＰＶＲ、ＳＩＲＰα、ＴＣＲ、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ５２、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体、ＥＧＦＲ、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、ＩＬＴ１、ＩＬＴ２、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＩＬＴ５、ＩＬＴ６、ＩＬＴ７、ＩＬＴ８、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２ＥまたはＴＳＬＰからなる群より選択されるタンパク質に結合する１以上の結合ドメインを含むアフィマー剤の一部である。
【０２８３】
ｄ．複合体
対象となるアフィマー剤はまた、アフィマー剤に検出可能性または追加の薬理活性を付与することを意図した１以上の官能基部分を含んでいてよい。検出用の官能基部分とは、アフィマー剤と細胞または組織（例えば、腫瘍細胞）とのインビボでの結合を検出するために用いられ得るものである。薬理活性を有する官能基部分とは、アフィマー剤の標的（本発明のＰＤ−Ｌ１アフィマー剤の場合はＰＤ−Ｌ１）を発現する組織に送達されることが意図されており、そうすることにより、標的とする組織または細胞に対して薬理作用を有する薬剤である。
【０２８４】
本発明は、多様な官能基、置換基または部分を有する物質の複合体を含むアフィマー剤を提供し、それらの官能基は、ラベル；色素；免疫接着分子；放射性核種；細胞傷害性化合物；薬物；親和性ラベル；光親和性ラベル；反応性化合物；樹脂；第２のタンパク質またはポリペプチドまたはポリペプチド類縁体；抗体または抗体フラグメント；金属キレート剤；補因子；脂肪酸；炭水化物；ポリヌクレオチド；ＤＮＡ；ＲＮＡ；アンチセンスポリヌクレオチド；糖質；水溶性デンドリマー；シクロデキストリン；抑制性リボ核酸；生体材料；ナノ粒子；スピンラベル；フルオロフォア、金属含有部位；放射性部位；新規官能基；共有結合または非共有結合で他の分子と相互作用する基；フォトケージド部分；アクチン放射線励起性部分；光異性化可能部分；ビオチン；ビオチンの誘導体；ビオチン類縁体；重原子を組み込んだ部分；化学的に開裂可能な基；光開裂可能な基；伸長側鎖；炭素結合糖；酸化還元活性剤；アミノチオ酸；毒性部位；同位体標識された部分；生物物理学的プローブ；リン光基；化学発光基；電子密度の高い基；磁性基；挿入基（intercalating group）；発色団；エネルギー伝達剤；生物学的に活性な薬剤；検出可能なラベル；低分子；量子ドット；ナノトランスミッター；放射性ヌクレオチド；放射性トランスミッタ；中性子捕獲剤；またはこれらの任意の組み合わせ、またはその他の望ましい化合物もしくは物質を含むがこれらに限定されない。
【０２８５】
（ｉ）ラベルおよび検出可能な物質
該部分が検出可能なラベルである場合、それは、蛍光ラベル、放射性ラベル、酵素ラベルまたは当業者に知られている任意の他のラベルであり得る。ある態様において、官能基部分は、医療用イメージングに適した特定のアフィマー剤を形成するための複合体の一部として含まれ得る検出可能なラベルである。“医療用イメージング”とは、診断、研究または治療の目的のために、ヒトまたは動物の体内領域を可視化するために用いられる何らかの技術を意味する。例えば、アフィマー剤は、放射線シンチグラフィ、磁気共鳴イメージング（ＭＲＩ）、コンピュータ断層撮影（ＣＴスキャン）、核イメージング、金属断層撮影（ＰＥＴ）造影剤を含む陽電子放出、光学イメージング（近赤外蛍光（ＮＩＲＦ）イメージングを含む蛍光イメージングなど）、生物発光イメージング、またはそれらの組み合わせによって検出（および定量化）され得る。官能基部分は、要すればＸ線画像のための造影剤である。このような技術を向上させるのに有用な薬剤は、体内の特定の遺伝子座、臓器または疾患部位の可視化を可能にし、および／または画像化技術によって生成される画像の品質のいくらかの改善をもたらし、それらの画像の改善されたまたは容易な解釈を提供する材料である。そのような薬剤は、本明細書では造影剤と呼ばれ、その使用は、画像のこれらの異なる領域間の“コントラスト”を増加させることにより、画像の異なる部分の区別を容易にする。したがって、用語“造影剤”は、画像の品質を向上させるために用いられる薬剤（例えば、ＭＲＩの場合のように）、および画像を生成するための前提条件である薬剤（例えば、核イメージングの場合のように）を包含する。
【０２８６】
ある態様において、検出可能なラベルは、金属をキレートするためのキレート部位、例えば、放射性金属イオンまたは常磁性イオンのためのキレート剤を含む。ある態様において、検出可能なラベルは、放射線療法または画像化手順に有用な放射性核種のキレート剤である。本発明の範囲内で有用な放射性核種には、ガンマ線放出体、陽電子放出体、オージェ電子エミッタ（Auger electron-emitter）、Ｘ線エミッタおよび蛍光エミッタが含まれ、治療用のベータ線エミッタまたはアルファ線放出体も含まれる。放射線療法における毒素として有用な放射性核種の例としては、以下のものが挙げられる：４３Ｋ、４７Ｓｃ、５１Ｃｒ、５７Ｃｏ、５８Ｃｏ、５９Ｆｅ、６４Ｃｕ、６７Ｇａ、６７Ｃｕ、６８Ｇａ、７１Ｇｅ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、７７Ａｓ、８１Ｒｂ、９０Ｙ、９７Ｒｕ、９９ｍＴｃ、１００Ｐｄ、１０１Ｒｈ、１０３Ｐｂ、１０５Ｒｈ、１０９Ｐｄ、１１１Ａｇ、１１１Ｉｎ、１１３Ｉｎ、１１９Ｓｂ、１２１Ｓｎ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１２７Ｃｓ、１２８Ｂａ、１２９Ｃｓ、１３１Ｉ、１３１Ｃｓ、１４３Ｐｒ、１５３Ｓｍ、１６１Ｔｂ、１６６Ｈｏ、１６９Ｅｕ、１７７Ｌｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、１８９Ｒｅ、１９１Ｏｓ、１９３Ｐｔ、１９４Ｉｒ、１９７Ｈｇ、１９９Ａｕ、２０３Ｐｂ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、２１２Ｂｉおよび２１３Ｂｉ。キレート剤が金属を配位する条件は、例えば、Gansowらの、米国特許第４，８３１，１７５号、同第４，４５４，１０６号および同第４，４７２，５０９号に記載されている。キレート剤の例には、単なる例示として、１，４，７−トリアザシクロノナン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”−三酢酸（ＮＯＴＡ）、１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＤＯＴＡ）、１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン−Ｎ，Ｎ’，Ｎ”，Ｎ’’’−テトラ酢酸（ＴＥＴＡ）が含まれる。
【０２８７】
アフィマーポリペプチドのアミノ酸残基に直接取り込まれ得るか、そうでなくてもキレート剤を必要としない他の検出可能な同位体には、３Ｈ、１４Ｃ、３２Ｐ、３５Ｓおよび３６Ｃｌが含まれる。
【０２８８】
診断手順に有用な常磁性イオンも投与することができる。常磁性イオンの例としては、クロム（III）、マンガン（II）、鉄（III）、鉄（II）、コバルト（II）、ニッケル（II）、銅（II）、ネオジム（III）、サマリウム（III）、イッテルビウム（III）、ガドリニウム（III）、バナジウム（II）、テルビウム（III）、ジスプロシウム（III）、ホルミウム（III）、エルビウム（III）またはこれらの常磁性イオンの組み合わせが挙げられる。
【０２８９】
蛍光標識の例としては、有機色素（例えば、シアニン、フルオレセイン、ローダミン、Alexa蛍光色素、Dylight蛍光色素、ATTO色素、BODIPY色素など）、生物学的フルオロフォア（例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、Ｒ−フィコエリトリンなど）および量子ドットが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９０】
本発明において用いられ得る非限定的な蛍光化合物としては、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５（Ｃｙ５++としても知られている）、Ｃｙ２、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、フィコエリトリン、Ｃｙ７、フルオレセイン（ＦＡＭ）、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５（ｃｙ３++としても知られている）、テキサスレッド、ライトサイクラーレッド６４０、ライトサイクラーレッド７０５、テトラメチルローダミン（ＴＭＲ）、ローダミン、ローダミン誘導体（ＲＯＸ）、ヘキサクロロフルオレセイン（ＨＥＸ）、ローダミン６Ｇ（Ｒ６Ｇ）、ローダミン誘導体ＪＡ１３３、アレクサ蛍光色素（アレクサフルオロ４８８、アレクサフルオロ５４６、アレクサフルオロ６３３、アレクサフルオロ５５５およびアレクサフルオロ６４７など）、４’，６−ジアミノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）、ヨウ化プロピジウム、ＡＭＣＡ、スペクトラムグリーン、スペクトラムオレンジ、スペクトラムアクア、リサミンおよびユーロピウムなどの蛍光遷移金属錯体などが挙げられる。また、使用できる蛍光化合物としては、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）、増強型ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質およびその誘導体（ＢＦＰ、ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、アズライト、ｍＫａｌａｍａ１）、シアン蛍光タンパク質およびその誘導体（ＣＦＰ、ＥＣＦＰ、セルリアン、ＣｙＰｅｔ）ならびに黄色蛍光タンパク質およびその誘導体（ＹＦＰ、シトリン、ヴィーナス、ＹＰｅｔ）などの蛍光タンパク質も挙げられる。ＷＯ２００８１４２５７１、ＷＯ２００９０５６２８２、ＷＯ９９２２０２６。
【０２９１】
酵素標識の例としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、グルコースオキシダーゼおよびβ−ガラクトシダーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９２】
別の周知のラベルはビオチンである。ビオチン標識は、一般的には、ビオチニル基、スペーサーアームおよびタンパク質上の標的官能基への結合を担う反応性基から構成される。ビオチンは、標識されたタンパク質をアビジン部分を含む他の部分に結合させるのに有用であり得る。
【０２９３】
（ｉｉ）アフィマー−薬物複合体
ある態様において、アフィマー剤は、例えば、アフィマー−薬物複合体を形成するための１以上の治療剤を含む。本明細書で用いる用語“治療剤”は、ヒトまたは別の動物における疾患の治癒、緩和、治療または予防に用いられ得る物質を意味する。このような治療剤には、米国の公式薬局方、米国ホメオパシー薬局方、公式の国民医薬品またはそれらいずれかのサプリメントに記載されている物質が含まれ、低分子、ヌクレオチド、オリゴペプチド、ポリペプチドなどが含まれるが、これらに限定されない。アフィマー含有ポリペプチドに結合され得る治療剤としては、細胞毒性剤、抗代謝物、アルキル化剤、抗生物質、増殖因子、サイトカイン、抗血管新生剤、有糸分裂阻害剤、毒素、アポトーシス剤、例えばＤＮＡアルキル化剤、トポイソメラーゼ阻害剤、小胞体ストレス誘導剤、白金化合物、代謝拮抗剤、ビンカルカロイド剤、タキサン類、エポチロン類、酵素阻害剤、受容体拮抗剤、治療用抗体、チロシンキナーゼ阻害剤、放射線増感剤、および化学療法併用療法（図示のような）などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９４】
ＤＮＡアルキル化剤の非限定的な例としては、メクロレタミン、シクロホスファミド（イホスファミド、トロホスファミド）、クロラムブシル（メルファラン、プレドニムスチン）、ベンダムスチン、ウラムスチンおよびエストラムスチンなどの窒素マスタード；カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（Ｓｅｍｕｓｔｉｎｅ）、フォテムスチン、ニムスチン、ラニムスチン、ストレプトゾシンなどのニトロソウレア；ブスルファン（マンノスルファン、トレオスルファン）などのアルキルスルホネート；カルボコン、チオテパ、トリアジコン、トリエチレンメラミンなどのアジリジン；ヒドラジン（プロカルバジン）；ダカルバジンおよびテモゾロミドなどのトリアジン；アルトレタミンおよびミトブロニトールが挙げられる。
【０２９５】
トポイソメラーゼＩ阻害剤の非限定的な例としては、ＣＰＴ-１１（イリノテカン）、ＳＮ-３８、ＡＰＣ、ＮＰＣ、カンプテシン、トポテカン、メシル酸エキサテカン、９−ニトロカンプトテシン、９−アミノカンプトテシン、ルルトテカン、ルビテカン、シラテカン、ギマテカン、ジフロモテカン、エクスタテカン、ＢＮ−８０９２７、ＤＸ−８９５１ｆおよびPommier Y. (2006) Nat. Rev. Cancer 6(10):789-802および米国特許公開第２００５１０２５０８５４号に記載のＭＡＧ−ＣＰＴ；Li et al. (2000) Biochemistry 39(24):7107-7116およびGatto et al. (1996) Cancer Res. 15(12):2795-2800に記載のプロトベルベリンおよびコラリンを含むプロトベルベリルアルカロイドおよびその誘導体；Makhey et al. (2003) Bioorg. Med. Chem. 11 (8): 1809-1820に記載のベンゾ［ｉ］フェナントリジン、ニチジンおよびファガロニンを含むフェナントロリン誘導体；Xu (1998) Biochemistry 37(10):3558-3566に記載のテルベンズイミダゾールおよびその誘導体；ならびに、Foglesong et al. (1992) Cancer Chemother. Pharmacol. 30(2):123-125, Crow et al. (1994) J. Med. Chem. 37(19):31913194およびCrespi et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 136(2):521-8に記載のドキソルビシン、ダウノルビシン、およびミトキサントロンを含むアントラサイクリン誘導体が挙げられる。トポイソメラーゼＩＩ阻害剤としては、エトポシドおよびテニポシドが挙げられるが、これらに限定されない。デュアルトポイソメラーゼＩおよびＩＩ阻害剤としては、サイントピン（saintopin）および他のナフテセンジオン、ＤＡＣＡおよび他のアクリジン−４−カルボキサミン、イントポリシンおよび他のベンゾピリドインドール、ＴＡＳ−１０３および他の７Ｈ−インデノ［２，１−ｃ］キノリン−７−オン、ピラゾロアクリジン、ＸＲ１１５７６および他のベンゾピリドインドール、ＸＲ５９４４および他の二量体化合物、７−オキソ−７Ｈ−ジベンズ［ｆ，ｉｊ］イソキノリンおよび７−オキソ−７Ｈ−ベンゾ［ｅ］ペリミジン、ならびに Anthracenyl-amino Acid Conjugates as described in Denny and Baguley (2003) Curr. Top. Med. Chem. 3(3):339-353に記載のアントラセニルアミノ酸複合体が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの薬剤は、トポイソメラーゼＩＩを阻害し、 and have ＤＮＡ intercalation activity such as, but not limited to, アントラサイクリン系（アクラルビシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アムルビシン、ピラルビシン、バルルビシン、ゾルビシン）およびアントラセンジオン系（ミトキサントロンおよびピキサントロン）などのＤＮＡインターカレーション活性を有するが、これらに限定されない。
【０２９６】
小胞体ストレス誘発剤の例としては、ジメチルセレコキシブ（ＤＭＣ）、ネルフィナビル、セレコキシブおよびホウ素放射線増感剤（すなわち、ベルケイド（ボルテゾミブ））が含まれるが、これらに限定されない。
【０２９７】
白金ベースの化合物の限定されない例としては、カルボプラチン、シスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、トリプラチンテトラナイトレート、サトラプラチン、アロプラチン（aroplatin）、ロバプラチンおよびＪＭ−２１６（McKeage et al. (1997) J. Clin. Oncol. 201:1232-1237および一般的に、CHEMOTHERAPY FOR GYNECOLOGICAL NEOPLASM、CURRENT THERAPY AND NOVEL APPROACHES、in the Series Basic and Clinical Oncology, Angioli et al. Eds., 2004参照)が挙げられる。
【０２９８】
代謝拮抗剤の限定されない例としては、葉酸ベース、すなわちジヒドロ葉酸還元酵素阻害剤、例えばアミノプテリン、メトトレキサートおよびペメトレキセド；チミジル酸合成酵素阻害剤、例えばラルチトレキセド、ペメトレキセド；プリンベース、すなわち、アデノシンアミナーゼ阻害剤、例えばペントスタチン、チオプリン、例えばチオグアニンおよびメルカプトプリン、ハロゲン化／リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、例えばクラドリビン、クロファラビン、フルダラビンまたはグアニン／グアノシン：チオプリン、例えばチオグアニン；または、ピリミジンベース、すなわちシトシン／シチジン：低メチル化剤、例えばアザシチジンおよびデシタビン、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、例えばシタラビン、リボヌクレオチド還元酵素阻害剤、例えばゲムシタビン、またはチミン／チミジン：チミジル酸合成酵素阻害剤、例えばフルオロウラシル（５−ＦＵ）が含まれる。５−ＦＵと同等のものには、 include プロドラッグs、analogs and derivative thereof such as ５’−デオキシ−５−フルオロウリジン（ドキシフルオロイジン）、１−テトラヒドロフラニル−５−フルオロウラシル（フトラフル)、カペシタビン（ゼロダ）、Ｓ−Ｉ（テガフールならびに２つのモジュレーター、５−クロロ−２,４−ジヒドロキシピリジンおよびオキソ酸カリウムからなるＭＢＭＳ−２４７６１６)、ラリチトレックス（トムデックス)、ノラトレキセド(no latrexed)(Thymitaq、AG337)、例えばPapamicheal (1999) The Oncologist 4:478-487に記載のＬＹ２３１５１４およびＺＤ９３３１などのプロドラッグ、類縁体およびその誘導体が挙げられる。
【０２９９】
ビンカルカロイドの例としては、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンフルニン、ビンデシンおよびビノレルビンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３００】
タキサン類の例としては、ドセタキセル、ラロタキセル、オルタタキセル、パクリタキセルおよびテセタキセルが挙げられるが、これらに限定されない。エポチロンの一例としては、イアベピロンが挙げられる。
【０３０１】
酵素阻害剤の例としては、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（チピファミブ）；ＣＤＫ阻害剤（アルボシジブ、セリシクリブ）；プロテアソーム阻害剤（ボルテゾミブ）；ホスホジエステラーゼ阻害剤（アナグレリド；ロリプラム）；ＩＭＰデヒドロゲナーゼ阻害剤（チアゾフリン）；およびリポキシゲナーゼ阻害剤（マソプロコール）が挙げられるが、これらに限定されない。受容体アンタゴニストの例としては、ＥＲＡ（アトラセンタン）；レチノイドＸ受容体（ベキサロテン）；および、性ステロイド（テストラクトン）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０２】
治療用抗体の例としては、抗ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ（セツキシマブ、パニツムマブ）；抗ＨＥＲ２／Ｎｅｕ（ｅｒｂＢ２）受容体（トラスツズマブ）、抗ＥｐＣＡＭ（カツマキソマブ、エドレコロマブ）、抗ＶＥＧＦ-Ａ（ベバシズマブ）；抗ＣＤ２０（リツキシマブ、トシツモマブ、イブリツモマブ）；抗ＣＤ５２（アレムツズマブ）；および、抗ＣＤ３３（ジェムツズマブ）が挙げられるが、これらに限定されない。米国特許第５，７７６，４２７号および同第７，６０１，３５５号。
【０３０３】
チロシンキナーゼ阻害剤の例としては、ＥｒｂＢ：ＨＥＲ１／ＥＧＦＲ（エルロチニブ、ゲフィチニブ、ラパチニブ、バンデタニブ、スニチニブ、ネラチニブ）；ＨＥＲ２／Ｎｅｕ（ラパチニブ、ネラチニブ）；ＲＴＫクラスＩＩＩ：Ｃ−ｋｉｔ（アクシチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ）、ＦＬＴ３（レスタウルスチニブ）、ＰＤＧＦＲ（アクシチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ）；および、ＶＥＧＦＲ（バンデタニブ、セマクサニブ、セディラニブ、アクシチニブ、ソラフェニブ）；ｂｃｒ−ａｂｌ（イマチニブ、ニロチニブ、ダサチニブ）；Ｓｒｃ（ボスチニブ）およびヤヌスキナーゼ２（レスタウルスチニブ）に対する阻害剤が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０４】
また、本発明のアフィマー含有ポリペプチドに結合させることができる化学療法剤としては、アムサクリン、トラベクチン、レチノイド（アリトレチノイン、トレチノイン）、三酸化ヒ素、アスパラギン枯渇剤アスパラギナーゼ／ペガスパルガーゼ）、セレコキシブ、デメコルシン、エレスクロモール、エルサミトルシン、エトグルシド、ロニダミン、ルカントン、ミトグアゾン、ミトタン、オブリメルセン、テムシロリムスおよびボリノスタットも挙げられ得る。
【０３０５】
本発明のアフィマー含有ポリペプチドに連結されているか、配位されているか、または結合することができる特定の治療剤の例としては、フロモキセフ；フォルティミシン(複数可)；ゲンタマイシン(複数可)；グルコスルホンソラスルホン；グラミシジンＳ；グラミシジン（複数可）；グレパフロキサシン；グアメサイクリン；ヘタシリン；イセパマイシン；ホサマイシン；カナマイシン（複数可）；フロモキセフ；フォルティマイシン（複数可）；ゲンタマイシン（複数可）；グルコスルホンソラスルホン、グラミシジンＳ；グラミシジン（複数可）；グレパフロキサシン；グアメサイクリン；ヘタシリン；イセパマイシン；ジョサマイシン；カナマイシン；バシトラシン；バンベルマイシン；ビアペネム；ブロディモプリム；ブチロシン；カプレオマイシン；カルベニシリン；カルボマイシン；カルモナム；セファドロキシル；セファマンドール；セファトリジン；セフブペラゾン；セフクリディン；セフジニル；セフジトレン；セフェピム；セフェタメット；セフィキシム；セフィネノキシム；セフィニノックス；クラドリビン；アパルシリン；アピサイクリン；アプラマイシン；アルベカシン；アスポキシシリン；アジダムフェニコール；アズトレオナム；セフォジジム；セフォニシド；セフォペラゾン；セフォラミド；セフォタキシム；セフォテタン；セフォティアム；セフォゾプラン；セフピミゾール（cefpimizole）；セフピラミド；セフピロム；セフプロジル；セフロキサジン；セフテラム；セフチブテン；セフゾナム；セファレキシン；セファログリシン；セファロスポリンＣ；セフラジン；クロラムフェニコール；クロルテトラサイクリン；クリナフロキサシン；クリンダマイシン；クロモサイクリン；コリスチン；シクラシリン；ダプソン；デメクロサイクリン；ジアチモスルホン；ジベカシン；ジヒドロストレプトマイシン；６−メルカプトプリン；チオグアニン；カペシタビン；ドセタキセル；エトポシド；ゲムシタビン；トポテカン；ビノレルビン；ビンクリスチン；ビンブラスチン；テニポシド；メルファラン；メトトレキサート；２−ｐ−スルファニリアニリノエタノール；４，４’−スルフィニルジアニリン；４−スルファニルアミドサリチル酸；ブトルファノール；ナルブフィン、ストレプトゾシン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；プリカマイシン；イダルビシン；マイトマイシンＣ；ペントスタチン；ミトキサントロン；シタラビン；フルダラビンホスフェート；ブトルファノール；ナルブフィン、ストレプトゾシン；ドキソルビシン；ダウノルビシン；プリカマイシン；イダルビシン；マイトマイシンＣ；ペントスタチン；ミトキサントロン；シタラビン；フルダラビンホスフェート；アセジアスルホン；アセトスルホン；アミカシン；アンホテリシンＢ；アンピシリン；アトルバスタチン；エナラプリル；ラニチジン；シプロフロキサシン；プラバスタチン；クラリスロマイシン；シクロスポリン；ファモチジン；リュープロリド；アシクロビル；パクリタキセル；アジスロマイシン；ラミブジン；ブデソニド；アルブテロール；インジナビル；メトホルミン；アレンドロネート；ニザチジン；ジドブジン；カルボプラチン；メトプロロール；アモキシシリン；ジクロフェナク；リシノプリル；セフトリアキソン；カプトプリル；サルメテロール；xinafoate；イミペネム；シラスタチン；ベナゼプリル；セファクロル（cefaclor）；セフタジジム；モルヒネ；ドーパミン；ビアラミコール；フルバスタチン；フェナミジン；ポドフィリン酸２−エチルヒドラジン；アクリフラビン；クロロアゾジン；サルバルサン；アミカルビライド（amicarbilide）；アミノキヌリド；キナプリル；オキシモルフォン；ブプレノルフィン；フロクスウリジン；ジリスロマイシン；ドキシサイクリン；エノキサシン；エンビオマイシン；エピシリン；エリスロマイシン；ロイコマイシン；リンコマイシン；ロメフロキサシン；ルセンソマイシン；リメサイクリン；メクロサイクリン；メロペネム；メタサイクリン；ミクロノミシン；ミデカマイシン；ミノサイクリン；モキサラクタム；ムピロシン；ナジフロキサシン；ナタマイシン；ネオマイシン；ネチルマイシン；ノルフロキサシン；オレアンドマイシン；オキシテトラサイクリン；p-スルファニルベンジルアミン；パニペネム；パロモマイシン；パズフロキサシン；ペニシリンN；ピパサイクリン；ピペミド酸；ポリミキシン；プリマイシン；キナシリン；リボスタマイシン；リファミド；リファンピン；リファマイシンＳＶ；リファペンチン；リファキシミン；リストセチン；リチペネム（ritipenem）；ロキタマイシン；ロリテトラサイクリン；ロサラマイシン；ロキシスロマイシン；サラゾスルファジミジン；サンサイクリン；シソマイシン；スパルフロキサシン；スペクチノマイシン；スピラマイシン；ストレプトマイシン；スクシスルホン；スルファクリソイジン；スルファロキシン酸；スルファミドクリソイジン；スルファニル酸；スルホキソン；テイコプラニン；テマフロキサシン；テモシリン；テトロキソプリム；チアンフェニコール；チアゾルスルホン；チオストレプトン；チカルシリン；チゲモナム；トブラマイシン；トスフロキサシン；トリメトプリム；トロスペクトマイシン；トロバフロキサシン；ツベラクチノマイシン；バンコマイシン；アザセリン；カンジシジン；クロルフェネシン；デルモスタチン；フィリピン；ファンギクロミン；メパルトリシン；ナイスタチン；オリゴマイシン；ペリマイシンA；ツベルシジン；６−アザウリジン；６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン；アクラシノマイシン；アンシタビン；アントラマイシン；アザシタジン；アザセリン；ブレオマイシン；ビスクマ酢酸エチル；エチリデンジクマロール；イロプロスト；ラミフィバン；タプロステン；チオクロマロール；チロフィバン；アミプリロース；ブシラミン；グスペリムス；ゲンチジン酸；グルカメタシン；サリチル酸グリコール；メクロフェナム酸；メフェナム酸；メサラミン；ニフルム酸；オルサラジン；オキサセプロル；Ｓ−エノシルメチオニン；サリチル酸；サルサレート；スルファサラジン；トルフェナム酸；カルビシン；カルジノフィリンＡ；クロロゾトシン；クロモマイシン；デノプテリン；ドキシフルリジン；エダトレキサート；エフロルニチン；エリプチニウム；エノシタビン；エピルビシン；マンノムスチン；メノガリル；ミトブロニトール；ミトラクトール；モピダモール；ミコフェノール酸；ノガラマイシン；オリボマイシン；ペプロマイシン；ピラルビシン；ピリトレキシム；プレドニマスチン；プロカルバジン；プテロプテリン；ピューロマイシン；ラニムスチン；ストレプトニグリン；チアミプリン；ミコフェノール酸；プロコダゾール；ロムルチド；シロリムス（ラパマイシン）；タクロリムス；ブテタミン；フェナルコミン；ヒドロキシテトラカイン；ネパイン（naepaine）；オルソカイン；ピリドカイン；サリチルアルコール；３−アミノ−４−ヒドロキシ酪酸；アセクロフェナク；アルミノプロフェン；アンフェナク；ブロムフェナク；ブロモサリゲニン；ブマジゾン；カルプロフェン；ジクロフェナク；ジフルニサル；ジタゾール；エンフェナミック酸；エトドラク；エトフェナメート；フェンドサル；フェプラジノール；フルフェナム酸；トムデックス（Ｎ−［［５−［［（１，４−ジヒドロ−２−メチル−４−オキソ−６−キナゾリニル）メチル］メチルアミノ］−２−チエニル]カルボニル]−Ｌ−グルタミン酸）、トリメトレキサート、ツベルシジン、ウベニメクス、ビンデシン、ゾルビシン；アルガトロバン；クメタロールまたはジクマロールである。
【０３０６】
ある態様において、アフィマー剤としては、ジプテリア毒素、緑膿菌エクソトキシンＡ鎖、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、α−サルシン、シナアブラギリ（Aleurites fordii）タンパク質および化合物（例えば、脂肪酸）、ジアンチンタンパク質、緑膿菌タンパク質ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩおよびＰＡＰ−Ｓ、ニガウリ（momordica charantia）阻害剤、クルシン、クロチン、サボンソウ（saponaria officinalis）阻害剤、ミトゲリン、リストリクトシン、フェノマイシンならびにエノマイシンなどの複合化した細胞傷害性因子が挙げられる。
【０３０７】
本発明の複合体を生成する際には、抗体および他のタンパク質にコンジュゲートするための当業者に知られている何らかの方法を採用することができ、これには、Hunter, et al., (1962) Nature 144:945; David、et al., (1974) Biochemistry 13:1014; Pain、et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219；および、Nygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407に記載された方法が含まれる。ペプチド、ポリペプチドならびに有機および無機部分を抗体および他のタンパク質に結合させるための方法は、従来から当技術分野でとてもよく知られており、対象となるアフィマー剤のこれらのバージョンを生成するために容易に適応されている。
【０３０８】
共役部位がペプチドまたはポリペプチドである場合、その部位は、アフィマー含有ポリペプチドに化学的に架橋され得るか、またはアフィマー含有ポリペプチドとの融合タンパク質の一部として含まれ得る。そして例示的な例は、ジプテリア毒素−アフィマー融合タンパク質であり得る。非ペプチド物質の場合、アフィマー含有ポリペプチドへの添加は、一般に、アフィマー含有ポリペプチドへの化学的結合の方法、例えば、アミノ酸側鎖上の官能基、またはポリペプチドのＣ末端のカルボキシル基またはＮ末端のアミノ基を介して行われる。ある態様において、融合タンパク質としてであろうと化学的に架橋された部位としてであろうと、結合部分は、酵素によって切断され得るか、または他の方法では、例えば腫瘍または他の疾患組織（または結合部位が健康な組織を保護するために機能する場合に、は保護されるべき組織）において、結合部位がアフィマー含有ポリペプチドから放出されることを可能にする環境条件（例えば、ｐＨ）に感受性である１以上の部位を含み得る。
【０３０９】
ＩＶ．発現方法および発現系
本明細書に記載の組換えアフィマー剤タンパク質は、当技術分野で知られている何らかの好適な方法により製造することができる。そのような方法は、タンパク質を直接合成する方法から、ポリペプチド配列をコードするＤＮＡ配列を構築し、それらの配列を適当な宿主中で発現させる方法まで様々である。化学修飾または複合体化などのさらなる修飾を含むそれらの組換えアフィマー剤タンパク質の場合、組換えアフィマー剤タンパク質は、宿主細胞からの単離または化学合成後に、化学的または酵素的にさらに操作され得る。
【０３１０】
本発明は、（ｉ）該アフィマー剤のアミノ酸配列をコードするポリヌクレオチドを宿主細胞に導入すること、例えば、該ポリヌクレオチドがベクター内にあり、および／またはプロモーターに作動可能に連結されていること、（ｉｉ）宿主細胞（例えば、真核生物または原核生物）をポリヌクレオチドの発現に有利な条件下で培養すること、および（ｉｉｉ）要すれば、宿主細胞および／または宿主細胞が増殖される培地からアフィマー剤を単離すること、を含む、本発明の組換えアフィマー剤タンパク質を組換え的に発現させるための組換え方法および核酸を含む。例えば、ＷＯ０４／０４１８６２、ＷＯ２００６／１２２７８６、ＷＯ２００８／０２００７９、ＷＯ２００８／１４２１６４またはＷＯ２００９／０６８６２７を参照のこと。
【０３１１】
ある態様において、目的の組換えアフィマー剤タンパク質をコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成装置を用いて化学合成により構築され得る。オリゴヌクレオチドは、所望のポリペプチドのアミノ酸配列に基づいて設計され、目的の組換えポリペプチドが産生される宿主細胞において好ましいコドンを選択することができる。標準的な方法は、単離された目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを合成するために適用され得る。例えば、完全なアミノ酸配列を用いて、逆翻訳された遺伝子を構築することができる。さらに、特定の単離ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むＤＮＡオリゴマーを合成することができる。例えば、所望のポリペプチドの一部をコードするいくつかの小さなオリゴヌクレオチドを合成し、次いでライゲーションすることができる。個々のオリゴヌクレオチドは、一般的に、相補的なアセンブリのための５’または３’オーバーハングを含む。
【０３１２】
本発明の組換えアフィマー剤タンパク質をコードする核酸配列が得られると、組換えアフィマー剤タンパク質を産生するためのベクターは、当技術分野でよく知られた技術を用いて、組換えＤＮＡ技術によって産生することができる。当業者によく知られた方法を用いて、組換えアフィマー剤をコードする配列ならびに適当な転写および翻訳制御シグナルを含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術およびインビボ遺伝子組換え法を含む（例えば、Sambrook et al, 1990, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, 2d Ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y. およびAusubel et al. eds., 1998, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NYに記載の技術を参照のこと)。
【０３１３】
組換えアフィマー剤タンパク質のヌクレオチド配列を含む発現ベクターを、常套技術（例えば、エレクトロポレーション、リポソームトランスフェクションおよびリン酸カルシウム沈殿）を用いて宿主細胞にトランスフェクトすることができ、その後、トランスフェクトされた細胞を常套技術によって培養して、本発明のアフィマー剤タンパク質を産生し得る。特定の態様において、組換えアフィマー剤タンパク質の発現は、構成的、誘導性または組織、特異的プロモーターによって調節される。
【０３１４】
発現ベクターは、発現に用いられる宿主細胞のタイプに基づいて選択され得るような、複製起点を含み得る。一例として、プラスミドｐＢＲ３２２（製品番号３０３−３ｓ、New England Biolabs、Beverly、Mass.）からの複製起点は、ほとんどのグラム陰性菌に有用である一方、ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、小胞性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）またはパピローマウイルス（ＨＰＶまたはＢＰＶなど）からのさまざまな複製起点は、哺乳動物細胞でベクターをクローニングするのに有用である。一般に、複製起点成分は哺乳動物の発現ベクターには不要である（例えば、ＳＶ４０起点は初期プロモーターを含むため、しばしば用いられる）。
【０３１５】
ベクターは、１以上の選択可能なマーカー遺伝子、例えば、選択培地中で増殖した宿主細胞の生存および増殖に必要なタンパク質をコードする遺伝的要素を含んでいてもよい。典型的な選択マーカー遺伝子は、（ａ）原核生物宿主細胞に、抗生物質または他の毒素、例えばアンピシリン、テトラサイクリンまたはカナマイシンに対する耐性を付与し、（ｂ）細胞の補助栄養欠乏を補完し、または（ｃ）複合培地からは入手できない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。好ましい選択可能なマーカーは、カナマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子およびテトラサイクリン耐性遺伝子である。ネオマイシン耐性遺伝子は、原核生物および真核生物宿主細胞での選択のために用いられてもよい。他の選択遺伝子は、発現する遺伝子を増幅するために用いてもよい。増幅は、増殖に重要なタンパク質の産生のためにより大きな需要がある遺伝子が、組換え細胞の次の世代の染色体内でタンデムに繰り返されるプロセスである。哺乳動物細胞の選択可能なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）およびチミジンキナーゼが挙げられる。哺乳動物細胞形質転換体は、ベクター中に存在するマーカーにより、形質転換体のみが生存するように特異的に適応された選択圧力下に置かれる。培地中の選択剤の濃度を連続的に変化させる条件下で形質転換細胞を培養することにより選択圧が課され、それにより選択遺伝子と組換えアフィマー剤タンパク質をコードするＤＮＡの両方が増幅される。その結果、増幅されたＤＮＡから組換えアフィマー剤タンパク質の合成量が増加する。
【０３１６】
また、ベクターは、組換えアフィマー剤タンパク質をコードする配列を含むｍＲＮＡに転写される１以上のリボソーム結合部位を含んでいてもよい。例えば、そのような部位は、シャインダルガルノ配列（原核生物）またはコザック配列（真核生物）によって特徴付けられる。この要素は、一般的には、プロモーターに対して３’の位置、発現されるべきポリペプチドのコーディング配列に対して５’の位置にある。シャインダルガルノ配列は様々であるが、一般的にはポリプリン（高いＡ−Ｇ含有量を有する）である。多くのシャインダルガルノ配列が同定されており、これらの配列の各々は、上記の方法を用いて容易に合成することができ、原核生物ベクター中で用いることができる。
【０３１７】
発現ベクターは、一般的には、宿主生物によって認識され、組換えアフィマー剤タンパク質をコードする核酸分子に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。発現に用いられる宿主細胞および所望の収量に応じて、天然プロモーターまたは異種プロモーターのいずれかを用いることができる。
【０３１８】
原核生物宿主で用いるためのプロモーターとしては、β−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーター系；アルカリホスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーター系；および、ｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが挙げられる。他の公知の細菌プロモーターも好適である。それらの配列は公表されており、制限部位を供給するために、所望のリンカーまたはアダプターを用いて、所望の核酸配列（複数可）にライゲーションすることができる。
【０３１９】
酵母宿主で用いるためのプロモーターもまた、当技術分野で知られている。酵母エンハンサーは、有利には酵母プロモーターと共に用いられる。哺乳動物宿主細胞との使用に適したプロモーターは周知であり、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（アデノウイルス２など）、ウシ乳頭腫ウイルス、鳥肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルスおよび最も好ましくは、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）などのウイルスゲノムから得られるものが含まれる。他の好適な哺乳動物プロモーターとしては、異種哺乳動物プロモーター、例えば、ヒートショックプロモーターおよびアクチンプロモーターが挙げられる。
【０３２０】
本発明の選択的結合剤を発現するために用いられ得るさらなるプロモーターには、以下のものが含まれるが、これらに限定されない：ＳＶ４０初期プロモーター領域(Bernoist and Chambon, Nature, 290:304-310, 1981)；ＣＭＶプロモーター；ラウス肉腫ウイルスの３’長末端リピートに含まれるプロモーター(Yamamoto et al. (1980), Cell 22: 787-97)；ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター(Wagner et al. (1981), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1444-5)；メタロチオニン遺伝子の調節配列（Brinster et al, Nature, 296; 39-42, 1982)；β−ラクタマーゼプロモーターなどの原核生物発現ベクター（Villa-Kamaroff, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75; 3727-3731, 1978)；または、ｔａｃプロモーター(DeBoer, et al. (1983), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80: 21-5）。また、組織特異性を示し、トランスジェニック動物において利用されてきた、以下の動物転写調節領域も対象である：膵腺房細胞において活性であるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swift et al. (1984), Cell 38: 639-46； Ornitz et al. (1986), Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald (1987), Hepatology 7: 425-515）；膵臓β細胞で活性なインスリン遺伝子制御領域（Hanahan (1985), Nature 315: 115-22）；リンパ球で活性な免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al. (1984), Cell 38; 647-58; Adames et al. (1985), Nature 318; 533-8; Alexander et al. (1987), Mol. Cell. Biol. 7: 1436-44）；精巣、乳房、リンパ系および肥満細胞で活性なマウス乳腺腫瘍ウイルス制御領域（Leder et al. (1986), Cell 45: 485-95）；肝臓で活性なアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert et al. (1987), Genes and Devel. 1: 268-76）；肝臓で活性なαフェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlauf et al. (1985), MoI. Cell. Biol. 5: 1639-48; Hammer et al. (1987), Science, 235: 53-8)；肝臓で活性なα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al. (1987), Genes and Devel. 1: 161-71）；骨髄系細胞で活性なβ−グロビン遺伝子制御領域（Mogram et al., Nature, 315 338-340, 1985; Kollias et al. (1986), Cell 46: 89-94)；脳のオリゴデンドロサイト細胞で活性なミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead et al. (1987), Cell, 48: 703-12)；骨格筋で活性なミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Sani (1985), Nature, 314: 283-6)；および視床下部で活性な性腺刺激ホルモン放出遺伝子制御領域（Mason et al. (1986), Science 234: 1372-8）。
【０３２１】
エンハンサー配列は、真核生物宿主細胞における転写を増加させるためにベクターに挿入されてもよい。哺乳動物遺伝子から利用可能ないくつかのエンハンサー配列が知られている（例えば、グロビン、エラスターゼ、アルブミン、アルファ−フェトプロテインおよびインスリン）。しかしながら、一般的には、ウイルス由来のエンハンサーが用いられる。ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、ポリオーマエンハンサーおよびアデノウイルスエンハンサーは、真核生物プロモーターの活性化のための例示的なエンハンサーである。
【０３２２】
エンハンサーは、ポリペプチドをコードする領域に対して５’または３’の位置でベクターにスプライシングされてもよいが、一般的にはプロモーターから５’の位置にある。
【０３２３】
核酸を発現するためのベクターには、細菌、昆虫、哺乳動物宿主細胞に適合するものが含まれる。そのようなベクターには、とりわけ、ｐＣＲＩＩ、ｐＣＲ３およびｐｃＤＮＡ３．１（Invitrogen Company、San Diego、Calif.）、ｐＢＳＩＩ（Stratagene Company、La Jolla、Calif.）、ｐＥＴ１５（Novagen、Madison、Wis.）、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech、Piscataway、N.J.）、ｐＥＧＦＰ−Ｎ２（Clontech, Palo Alto, Calif.）、ｐＥＴＬ（BlueBacII; Invitrogen）、ｐＤＳＲ−α（ＰＣＴ公開公報ＷＯ９０/１４３６３）、およびｐＦａｓｔＢａｃＤｕａｌ（Gibco/BRL, Grand Island, N.Y.）が含まれる。
【０３２４】
さらなる可能なベクターには、コスミド、プラスミドまたは改変ウイルスが含まれるが、これらに限定されないが、ベクター系は、選択された宿主細胞に適合しなければならない。そのようなベクターには、Bluescript（登録商標）プラスミド誘導体（高コピー数のColElベースのファージミド、Stratagene Cloning Systems Inc., La Jolla Calif.）、Ｔａｑ増幅ＰＣＲ産物をクローニングするために設計されたＰＣＲクローニングプラスミド（例えば、TOPO（商標） TA Cloning（登録商標） Kit、PCR2.1プラスミド誘導体、Invitrogen、Carlsbad、Calif.）およびバキュロウイルス発現システムなどの哺乳動物、酵母またはウイルスベクター（pBacPAKプラスミド誘導体、Clontech、Palo Alto、Calif.）が含まれるが、これらに限定されない。組換え分子は、形質転換、トランスフェクション、感染、エレクトロポレーションまたは他の既知の技術を介して宿主細胞に導入することができる。
【０３２５】
本明細書に記載の組換えアフィマー剤タンパク質の発現のための宿主としての哺乳動物細胞を含む真核生物および原核生物宿主細胞は、当技術分野でよく知られており、American Type Culture Collection（ATCC）から入手可能な多くの不死化細胞株を含む。これらには、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒト肝細胞癌細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞、ＨＥＫ−２９３細胞および他の多数の細胞株が含まれる。哺乳動物宿主細胞としては、ヒト、マウス、ラット、イヌ、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマおよびハムスター細胞が挙げられる。特に好ましい細胞株は、どの細胞株が高い発現レベルを有するかを決定することにより選択される。用いられ得る他の細胞株としては、昆虫細胞株、例えばＳｆ９細胞、両生動物細胞、細菌細胞、植物細胞、真菌細胞などが挙げられる。真菌細胞としては、例えば、ピキア・パストリス、ピキア・フィンランディカ、ピキア・トレハロフィラ、ピキア・コクラマエ、ピキア・メンブラナエファシエンス、ピキア・ミヌータ（オガテア・ミヌータ、ピキア・リンドネリ）、ピキア・オプンティアエ、ピキア・サーモトレランス、ピキア・サリクタリア（Pichia salictaria）、ピキア・グエルクウム（Pichia guercuum）、ピキア・ピエペリ（Pichia pijperi）、ピキア・スティプティス（Pichia stiptis）、ピキア・メタノリカ（Pichia methanolica）、ピキア属種、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）、サッカロミセス属種、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、クライベロミセス属種、クライベロミセス・ラクチス（Kluyveromyces lactis）、カンジダ・アルビカンス（Candida albicans）、アスペルギルス・ニデュランス（Aspergillus nidulans）、アスペルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、アスペルギルス・オリゼ（Aspergillus oryzae）、トリコデルマ・レエセイ（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ルクノウェンセ（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム属種、フザリウム・グラミネウム（Fusarium gramineum）、フザリウム・ベネナツム（Fusarium venenatum）、フィスコミトレラ・パテンス（Physcomitrella patens）およびニューロスポラ・クラッサ（Neurospora crassa）、ピキア種、サッカロミセス種、メタノール資化酵母（Hansenula polymorpha）、乳糖発酵性酵母（Kluyveromyces sp.）、カンジダ・アルビカンス、アスペルギルス（Aspergillus）属、糸状菌（Trichoderma reesei）、クリソスポリウム・ラクノウェンス（Chrysosporium lucknowense）、フザリウム種（Fusarium sp.）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）およびアカパンカビ（Neurospora crassa）を含む酵母細胞および糸状真菌細胞が含まれる。
【０３２６】
本発明の組換えアフィマー剤タンパク質を発現するために、種々の宿主発現ベクター系を利用してもよい。そのような宿主発現系は、組換えアフィマー剤タンパク質のコード化配列が産生され、その後精製され得るビークルを表すが、適切なヌクレオチドコード化配列で形質転換またはトランスフェクトされた場合に、本発明の組換えアフィマー剤タンパク質をインサイチュウで発現し得る細胞も意味する。これらには、アフィマー剤タンパク質をコードする配列を含む組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡまたはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換された細菌（例えば、大腸菌および枯草菌）などの微生物；酵母（例えば、Saccharomyces pichia.）を、アフィマー剤タンパク質をコードする配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換した細胞系；アフィマー剤タンパク質をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）で感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス）で感染した植物細胞系；アフィマー剤タンパク質をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ＣμＭＶ）およびタバコモザイクウイルス（ＴＭＶ）））で感染した植物細胞系；または、アフィマー剤タンパク質コーディング配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；あるいは、哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物ウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を含有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３細胞、リンパ球細胞（米国特許第５，８０７，７１５号を参照のこと）、Ｐｅｒ Ｃ６細胞（Crucellによって開発されたラット網膜細胞））が含まれるが、これらに限定されない。
【０３２７】
細菌系では、発現される組換えアフィマー剤タンパク質に意図される用途に応じて、多数の発現ベクターが有利に選択され得る。例えば、組換えアフィマー剤タンパク質の医薬組成物の生成のために、そのようなタンパク質を大量に生産しようとするとき、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産物の発現を指示するベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターには、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al. (1983) “Easy Identification Of cDNA Clones,” EMBO J. 2:1791-1794）が含まれるがこれに限定されず、この場合、融合タンパク質が産生されるように、アフィマー剤タンパク質のコーディング配列がｌａｃ Ｚコーディング領域とインフレームでベクターに個別にライゲーションされ得る；ｐＩＮベクター（Inouye et al. (1985) “Up-Promoter Mutations In The Lpp Gene Of Escherichia coli,” Nucleic Acids Res. 13:3101-3110; Van Heeke et al. (1989) “Expression Of Human Asparagine Synthetase In Escherichia coli,” J. Biol. Chem. 24:5503-5509）など。また、ｐＧＥＸベクターは、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ(ＧＳＴ)との融合タンパク質として、外来ポリペプチドを発現させるために用いることもできる。一般に、そのような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズへの吸着および結合に続いて、遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解した細胞から容易に精製することができる。ｐＧＥＸベクターは、クローン化された標的遺伝子産物がＧＳＴ部位から放出され得るように、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されている。
【０３２８】
昆虫系では、外来遺伝子を発現させるためのベクターとして、Autographa californica nuclear polyhedrosis virus (ＡｃＮＰＶ)が用いられる。このウイルスは、Spodoptera frugiperda細胞内で増殖する。アフィマー剤タンパク質コーディング配列は、ウイルスの非必須領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローニングされ、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれてもよい。
【０３２９】
哺乳動物宿主細胞において、多数のウイルスベースの発現系を利用することができる。発現ベクターとしてアデノウイルスを用いる場合、目的のアフィマー剤タンパク質コーディング配列を、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび３個に分割されたリーダー配列（tripartite leader sequence）にライゲーションしてもよい。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによってアデノウイルスゲノムに挿入されてもよい。ウイルスゲノムの非必須領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、感染した宿主において免疫グロブリン分子を発現することが可能な、生存可能な組換えウイルスをもたらす（例えば、Logan et al. (1984) “Adenovirus Tripartite Leader Sequence Enhances Translation Of mRNAs Late After Infection,” Proc. Natl.Acad. Sci. (U.S.A.) 81:3655-3659参照）。挿入されたアフィマー剤タンパク質コーディング配列の効率的な翻訳には、特異的な開始シグナルも必要とされ得る。これらのシグナルには、ＡＴＧ開始コドンおよび隣接する配列が含まれる。さらに、開始コドンは、挿入物全体の翻訳を確実にするために、所望のコーディング配列のリーディングフレームと位相を合わせ(in phase)なければならない。これらの外因性翻訳制御シグナルおよび開始コドンは、天然および合成の両方の様々な起源のものであり得る。発現の効率は、適当な転写エンハンサー物質、転写ターミネーターなどを含むことによって増強され得る（Bitter et al. (1987) “Expression And Secretion Vectors For Yeast,” Methods in Enzymol. 153:516-544)。
【０３３０】
さらに、挿入された配列の発現を調節するか、または所望の特定の方法で遺伝子産物を改変および処理する宿主細胞株を選択してもよい。タンパク質産物のそのような修飾（例えば、グリコシル化）およびプロセシング（例えば、開裂）は、タンパク質の機能にとって重要であり得る。異なる宿主細胞は、タンパク質および遺伝子産物の翻訳後プロセシングおよび修飾のための特徴的かつ特異的なメカニズムを有する。適切な細胞株または宿主系は、発現した外来タンパク質の正しい修飾およびプロセシングを確実にするために選択され得る。この目的のために、一次転写物の適切なプロセシング、グリコシル化および遺伝子産物のリン酸化のための細胞機構を有する真核生物宿主細胞を用いることができる。そのような哺乳動物宿主細胞としては、ＣＨＯ、ＶＥＲＹ、ＢＨＫ、Ｈｅｌａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、２９３Ｔ、３Ｔ３、ＷＩ３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７０３０およびＨｓ５７８Ｂｓｔが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３１】
組換えタンパク質の長期的かつ高収量生産のために、安定な発現が企図される。例えば、本発明の抗体を安定して発現する細胞株を操作することができる。ウイルスの複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適切な発現制御要素（例えば、プロモーター、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位など）、および選択可能なマーカーによって制御されるＤＮＡで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入後、操作された細胞は、濃縮培地中で１〜２日間増殖され、その後、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミド中の選択可能なマーカーは、選択に対する耐性を付与し、細胞が安定してプラスミドを染色体に融合させ、増殖させて増殖巣を形成させ、それをクローン化して、細胞株に成長させることができる。この方法は、本発明の組換えアフィマー剤タンパク質を発現する細胞株を操作するために、有利に用いられ得る。そのような操作された細胞株は、組換えアフィマー剤タンパク質と直接または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において特に有用であり得る。
【０３３２】
多くの選択系が使用されてもよく、それぞれｔｋ−、ｈｇｐｒｔ−またはａｐｌｔ−細胞に採用することができる、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al. (1977) “Transfer Of Purified Herpes Virus Thymidine Kinase Gene To Cultured Mouse Cells,” Cell 11:223-232)、ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska et al. (1962) “Genetics Of Human Cess Line. IV. DNA-Mediated Heritable Transformation Of A Biochemical Trait,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 48:2026-2034)、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al. (1980) “Isolation Of Transforming DNA: Cloning The Hamster Aprt Gene,” Cell 22:817-823)遺伝子が含まれるが、これに限定されない。また、代謝拮抗剤耐性は、以下の遺伝子の選択の基礎として用いられ得る：メトトレキサートに対する耐性を付与するｄｈｆｒ（Wigler et al. (1980) “Transformation Of Mammalian Cells With An Amplfiable Dominant-Acting Gene,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 77:3567-3570; O'Hare et al. (1981) “Transformation Of Mouse Fibroblasts To Methotrexate Resistance By A Recombinant Plasmid Expressing A Prokaryotic Dihydrofolate Reductase,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:1527-1531)；マイコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan et al. (1981) “Selection For Animal Cells That Express The Escherichia coli Gene Coding For Xanthine-Guanine Phosphoribosyltransferase,” Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:2072-2076）；アミノグリコシドＧ−４１８に対する耐性を付与するｎｅｏ（Tachibana et al. (1991) “Altered Reactivity Of Immunoglobutin Produced By Human-Human Hybridoma Cells Transfected By pSV.2-Neo Gene,” Cytotechnology 6(3):219-226; Tolstoshev (1993) “Gene Therapy, Concepts, Current Trials And Future Directions,” Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596; Mulligan (1993) “The Basic Science Of Gene Therapy,” Science 260:926-932; および、Morgan et al. (1993) “Human gene therapy,” Ann. Rev. Biochem. 62:191-217)。用いられ得る組換えＤＮＡ技術の当技術分野において一般に知られている方法は、Ausubel et al. (eds.), 1993, CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, NY; Kriegler, 1990, GENE TRANSFER AND EXPRESSION, A LABORATORY MANUAL, Stockton Press, NY; and in Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds), 1994, CURRENT PROTOCOLS IN HUMAN GENETICS, John Wiley & Sons, NY.; Colbere-Garapin et al. (1981) “A New Dominant Hybrid Selective Marker For Higher Eukaryotic Cells,” J. Mol. Biol. 150:1-14に記載されており、ハイグロマイシンに対する耐性を付与するｈｙｇｒｏが Santerre et al. (1984) “Expression Of Prokaryotic Genes For Hygromycin B And G418 Resistance As Dominant-Selection Markers In Mouse L Cells,” Gene 30:147-156)に記載されている。
【０３３３】
組換えアフィマー剤タンパク質の発現レベルは、ベクター増幅によって増加させることができる（レビューについては、Bebbington and Hentschel, “The Use Of Vectors Based On Gene Amplification For The Expression Of Cloned Genes In Mammaian Cells,” in DNA CLONING, Vol.3. (Academic Press, New York, 1987)を参照のこと）。組換えアフィマー剤タンパク質を発現するベクター系のマーカーが増幅可能な場合、宿主細胞の培養中に存在する阻害剤のレベルの増加は、マーカー遺伝子のコピー数を増加させる。増幅された領域は、組換えアフィマー剤タンパク質のヌクレオチド配列と関連しているため、組換えアフィマー剤タンパク質の産生も増加する（Crouse et al. (1983) “Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes,” Mol. Cell. Biol. 3:257-266）。
【０３３４】
アフィマー剤がアフィマー抗体融合体または他の多重タンパク質複合体である場合、宿主細胞は、２つの発現ベクター、例えば重鎖をコードする第１のベクターおよび軽鎖由来のポリペプチドをコードする第２のベクター、のうちの１つまたは両方がアフィマーポリペプチドをコードする配列を含む発現ベクターと同時トランスフェクトされてもよい。２つのベクターは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの同時発現を可能にする同一の選択可能なマーカーを含んでいてもよい。あるいは、重鎖ポリペプチドおよび軽鎖ポリペプチドの両方をコードする単一のベクターを用いてもよい。そのような状況では、軽鎖を重鎖の前に配置して、過剰な毒性のない重鎖を回避する必要がある（Proudfoot (1986) “Expression And Amplification Of Engineered Mouse Dihydrofolate Reductase Minigenes, ” Nature 322:562-565; Kohler (1980) “Immunoglobulin Chain Loss In Hybridoma Lines, ”Proc. Natl.Acad. Sci. (U.S.A.) 77:2197-2199)。重鎖および軽鎖のコーディング配列は、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡを含み得る。
【０３３５】
一般に、特定の細胞株またはトランスジェニック動物で産生された糖タンパク質は、その細胞株またはトランスジェニック動物で産生された糖タンパク質に特徴的なグリコシル化パターンを有し得る。したがって、組換えアフィマー剤タンパク質の特定のグリコシル化パターンは、そのタンパク質を生産するために用いられる特定の細胞株またはトランスジェニック動物に依存する。アフィマー／抗体融合のいくつかの態様において、非フコシル化Ｎ−グリカンのみを含むグリコシル化パターンが有利であり得るが、これは、抗体の場合、これが、一般的には、インビトロおよびインビボの両方において、フコシル化された対応物よりも強力な効力を示すことが示されているからである（例えば、Shinkawa et al., J. Biol. Chem. 278: 3466-3473 (2003); 米国特許第６，９４６，２９２号および同第７，２１４，７７５号）。
【０３３６】
さらに、生産細胞株からのアフィマー剤の発現は、多くの既知の技術を用いて増強することができる。例えば、グルタミン合成酵素遺伝子発現システム（ＧＳシステム）は、特定の条件下で発現を増強するための一般的なアプローチである。ＧＳシステムは、欧州特許第０２１６８４６号、同第０２５６０５５号および同第０３２３９９７号、ならびに欧州特許出願第８９３０３９６４．４号に関連して、その全体または一部に記載されている。したがって、本発明のいくつかの態様において、哺乳動物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ）は、グルタミン合成酵素遺伝子を欠いており、培地中のグルタミンの不存在下で増殖するが、免疫グロブリン鎖をコードするポリヌクレオチドは、宿主細胞中の遺伝子の欠失を補完するグルタミン合成酵素遺伝子を構成する。本明細書に記載のバインダーまたはポリヌクレオチドまたはベクターを含むそのような宿主細胞、およびそのような宿主細胞を用いて結合体を作製するための本明細書で論じふられる発現方法は、本発明の一部である。
【０３３７】
昆虫細胞培養系（例えば、バキュロウイルス）における組換えタンパク質の発現もまた、正しく折り畳まれた生物学的に機能的なタンパク質を生産するための強力な方法を提供する。昆虫細胞における異種タンパク質の生産のためのバキュロウイルス系は、当技術分野の当業者にはよく知られている。
【０３３８】
形質転換された宿主によって産生された組換えアフィマー剤タンパク質は、何らかの適切な方法に従って精製することができる。標準的な方法としては、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、示差溶解度またはタンパク質精製のための何らかの他の標準技術による方法が挙げられる。ヘキサヒスチジン、マルトース結合ドメイン、インフルエンザコート配列およびグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼなどのアフィニティタグは、適切な親和性カラム上を通過させることによって容易に精製できるように、タンパク質に付着させることができる。単離されたタンパク質は、プロテオライシス、質量分析（ＭＳ）、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）およびＸ線結晶構造解析などの技術を用いて物理的に特性評価することもできる。
【０３３９】
ある態様において、組換えアフィマーは、アフィマー剤タンパク質は、例えば、細菌培養中に産生される組換え細胞ペレットからの初期抽出、その後の１以上の濃縮、塩析、水性イオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィーステップによって単離することができる。最終的な精製ステップにはHPLCを採用することができる。組換えタンパク質の発現に採用される微生物細胞を、凍結融解サイクリング、超音波化、機械的破壊、または細胞溶解剤の使用を含む何らかの便利な方法で破壊することができる。
【０３４０】
Ｖ．インビボ送達のためのコード化されたアフィマー
ＰＤ−Ｌ１アフィマー剤のような治療用アフィマー剤タンパク質の送達に対する代替アプローチは、治療用ポリペプチドの産生を身体自体に任せることである。多数の臨床研究により、様々な異なる送達システムを用いた細胞へのインビボ遺伝子導入の有用性が示されている。インビボ遺伝子導入は、アフィマー剤ではなく、コード化されたアフィマーヌクレオチド配列を患者に投与しようとする。これにより、患者の体は、目的の治療用アフィマー剤を長期間にわたって産生し、産生部位に応じて、全身的または局所的に分泌させることができる。遺伝子ベースのコード化されたアフィマーは、アフィマー剤のポリペプチドバージョンの従来の生産、精製および投与に代わる労力および費用対効果の高い代替手段を提示することができる。コード化されたアフィマーの送達が適応され得る、多くの抗体発現プラットフォームがインビボで追求されてきた：これらには、ウイルスベクター、裸のＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。コード化されたアフィマー遺伝子導入は、製品のコストおよび生産のコストを削減することによってコスト削減を可能にするだけでなく、薬物投与の頻度を減らすことができるかもしれない。全体として、コード化されたアフィマーの発現による治療用アフィマー剤のインビボ産生の延長は、（ｉ）価格に敏感な状態でのアフィマー剤のより広範な治療的または予防的適用、（ｉｉ）先進国および開発途上国の両方での治療へのアクセス性の改善、および（ｉｉｉ）より効果的で手頃な治療法に貢献することが可能である。インビボでの遺伝子導入に加えて、宿主（またはドナー）から細胞を採取し、コード化されたアフィマー配列で遺伝子操作してアフィマー剤を製造し、患者に再投与することができる。
【０３４１】
筋肉内抗体遺伝子投与は、最も広く評価されており（Deal et al. (2015) “Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy” Curr Opin Immunol. 35:113−22に記載）、また、コード化されたアフィマーに適用するとき、最高の臨床的解釈可能性および適用性をもたらす。実際、骨格筋の固有の解剖学的、細胞学的および生理学的特性は、それを長期的なコード化されたアフィマーの発現および全身循環のための安定した環境にする。骨格筋は、容易にアクセス可能であり、複数回または繰り返しの投与が可能である。豊富な血液血管供給は、分泌された治療用アフィマー剤の循環への効率的な輸送システムを提供する。筋繊維の合胞性は、限られた浸透部位から繊維内の多数の隣接する核へのヌクレオチドの分散を可能にする。また、骨格筋繊維は最終分化細胞であり、線維内の核は分裂後のものである。したがって、宿主ゲノムへの統合は、延長されたｍＡｂ発現を達成するための前提条件ではない。肝臓は、前臨床抗体遺伝子導入にしばしば使用される別の部位であり、典型的には静脈注射によって導入され、また、アフィマー剤の局所送達（例えば、肝臓癌および／または異形成（metaplasia）の治療における）のため、または全身循環のために血管内に分泌されるアフィマー剤の生成のためのいずれかのコード化されたアフィマーのための遺伝子導入部位であり得る。この臓器は、血漿タンパク質の合成を含む様々な生理機能を有する。この臓器は、インビボでのコード化されたアフィマー発現に特に適している。
【０３４２】
腫瘍は、静脈内または直接注斜／エレクトロポレーションのいずれかを介して標的化されたコード化されたアフィマー移送のための別の部位を提供する。実際、腫瘍内でのコード化されたアフィマーの発現は、治療用アフィマー剤の局所的な産生を可能にし、さもなければ固形腫瘍に浸透して影響を与えるために必要とされ得る高レベルのアフィマー剤の全身投与の必要性を放棄することができる。同様の理由が脳にも適用され、抗体遺伝子導入のためには、血液脳関門輸送の困難さを回避するために頻繁に標的とされ、同様にコード化されたアフィマーの送達のための標的となるであろう。例えば、Beckman et al. (2015) “Antibody constructs in cancer therapy: protein engineering strategies to improve exposure in solid tumors” Cancer 109(2):170-9; Dronca et al. (2015) “Immunomodulatory antibody therapy of cancer: the closer, the better” Clin Cancer Res. 21(5):944-6; and Neves et al. (2016) “Antibody approaches to treat brain diseases” Trends Biotechnol. 34(1):36-48参照。
【０３４３】
遺伝子治療の成功は、主に非ウイルス性およびウイルス性遺伝子導入ベクターの改良によって推進されてきた。一連の物理的および化学的な非ウイルス法が、ＤＮＡおよびｍＲＮＡを哺乳動物細胞に移動するために用いられており、これらのかなりの数が、エクスビボおよびインビボの両方で、遺伝子治療のための臨床病期の技術として開発されており、本発明のコード化されたアフィマーの送達のために容易に適応される。例えば、カチオン性リポソーム技術を採用することができ、これは、正に荷電したヘッド部および疎水性の脂質テール部を有する両性脂質が、負に荷電したＤＮＡまたはＲＮＡに結合し、一般にエンドサイトーシスによって細胞内に入る粒子を形成する能力に基づいている。いくつかのカチオン性リポソームはまた、哺乳動物細胞によるリポソームの取り込みを強化すると考えられる中性の共脂質を含む。例えば、Fergnerら（1987）Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. MNAS 84:7413-7417; Sanら(1983) “Safety and short term toxicity of a novel cationic lipid formulation for human gene therapy” Hum. Gene Ther. 4:781-788; Xu et al. (1996) “Mechanical of DNA release from cationic liposome/DNA complexes used in cell transfection” Biochemistry 35,:5616-5623; and Legendre et al. (1992) “Delivery of plasmid DNA into mammalian cell lines using pH-sensitive liposomes: comparison with cationic liposomes” Pharm. Res. 9, 1235-1242; San et al. (1983) “Safety and short term toxic” Hum. Res. 9, 1235-1242を参照のこと.
【０３４４】
同様に、ポリ−ｌ−リジンおよびポリエチレン−イミンなどの他のポリカチオンを用いて、コード化されたアフィマーを送達することができる。これらのポリカチオンは、電荷相互作用を介して核酸と複合体を形成し、ＤＮＡまたはＲＮＡのナノ粒子への結合を助け、このナノ粒子は、その後、エンドソームを介した取り込みのための基質となる。これらのカチオン性核酸複合体技術のいくつかは、プラスミドＤＮＡ、オリゴデオキシヌクレオチド、および様々な形態の合成ＲＮＡとの複合体を含む、潜在的な臨床製品として開発されてきた。改変された（および未改変または“裸の”）ＤＮＡおよびＲＮＡもまた、多くの状況で遺伝子導入の成功を仲介することが示されており、コード化されたアフィマーの送達システムとしても使用できる。これらには、筋肉内直接注入によるプラスミドＤＮＡの使用、プラスミドＤＮＡの腫瘍注射の使用が含まれる。例えば、Rodrigo et al. (2012) “De novo automated design of small RNA circuits for engineering synthetic riboregulation in living cells” PNAS 109:15271-15276; Oishi et al. (2005) “Smart polyion complex micelles for targeted intracellular delivery of PEGylated antisense oligonucleotides containing acid-labile linkages” Chembiochem. 6:718-725; Bhatt et al. (2015) “Microbeads mediated oral plasmid DNA delivery using polymethacrylate vectors: an effectual groundwork for colorectal cancer” Drug Deliv. 22:849-861; Ulmer et al. (1994) Protective immunity by intramuscular injection of low doses of influenza virus DNA vaccines” Vaccine 12: 1541-1544; and Heinzerling et al. (2005) “Intratumoral injection of DNA encoding human interleukin 12 into patients with metastatic melanoma: clinical efficacy” Hum. Gene Ther. 16:35-48を参照のこと
【０３４５】
ウイルスベクターは、現在、前臨床および臨床遺伝子治療試験の大部分でおよび最初に承認され、指向された遺伝子治療において、送達ビークルとして用いられている。Gene Therapy Clinical Trials Worldwide 2017 (abedia.com/wiley/)を参照のこと。その主な推進力は、自然進化的発達を反映する、並外れた遺伝子送達効率である。ウイルスは感染によって細胞膜を通過する能力を進化させ、コード化されたアフィマーのような核酸を標的細胞に送達することができるため、ウイルスベクターシステムは遺伝子送達にとって魅力的である。アデノウイルス系によって開拓されたウイルスベクター媒介抗体遺伝子導入の分野は、過去数十年で大きな進歩を遂げた。投与経路、前臨床モデルおよび疾患適応症の評価に成功した無数の抗体遺伝子導入の能力は、当業者であれば、コード化されたアフィマー構築物のインビボ送達のための抗体遺伝子導入システムおよび技術を容易に特定し、適応させることができる。筋肉は、延長されたｍＡｂ発現のための選択の投与部位と同様に延長されたアフィマー剤の発現のために適した標的組織になり得る。ベクター化された腫瘍内コード化されたアフィマー遺伝子導入では、腫瘍溶解性ウイルスは、それらが腫瘍細胞を特異的に標的とし、アフィマー剤の発現を高めることができ、ＰＤ−Ｌ１アフィマー剤のような治療応答を増幅することができるような、明確な利点を有している。
【０３４６】
コード化されたアフィマーのインビボ遺伝子導入は、発現プラスミドなどの非ウイルス性ベクターを用いることによっても達成され得る。非ウイルスベクターは容易に産生され、特定の免疫応答を誘発しないようである。筋組織は、筋肉組織で血管新生が良好で、容易にアクセス可能であり、筋細胞は長寿命の細胞であるため、トランスフェクションの標的組織として最も頻繁に用いられる。裸のプラスミドＤＮＡを筋肉内に注入すると、一定割合の筋細胞のトランスフェクションが得られる。この方法を用いて、サイトカインおよびサイトカイン／ＩｇＧ１キメラタンパク質をコードするプラスミドＤＮＡがインビボで導入され、（自己免疫）疾患の転帰にポジティブな影響を与えている。
【０３４７】
ある場合には、いわゆる血管内送達を介してトランスフェクション効率を高めるために、遺伝子送達および発現レベルの増加が、静脈内に短期的な一過性の高圧を誘導することによって達成される。血管内圧力を一時的に上昇させることによって局所的な取り込みを促進し得る特別な血圧カフ（blood-pressure cuff）は、このタイプの遺伝子送達のためにヒト患者における使用に適合させることができる。例えば、Zhang et al. (2001) “Efficient expression of naked DNA delivered intraarterially to limb muscles of nonヒト primates” Hum。Gene Ther., 12:427-438参照。
【０３４８】
効率の向上は、化学的担体−カチオン性ポリマーまたは脂質の使用によって、または物理的アプローチ−遺伝子銃送達もしくはエレクトロポレーションを介して−によって核酸の送達が改善されるような他の技術によっても得ることができる。Tranchant et al. (2004) “Physicochemical optimisation of plasmid delivery by cationic lipids” J. Gene Med., 6 (Suppl. 1):S24-S35; and Niidome et al. (2002) “Gene therapy progress and prospects: nonviral vectors” Gene Ther., 9:1647-1652参照。エレクトロポレーションは、非ウイルス性遺伝子送達のための興味深い技術として特に見なされている。Somiari, et al. (2000) “Theory and in vivo application of electroporative gene delivery” Mol. Ther. 2:178-187; and Jaroszeski et al. (1999) “In vivo gene delivery by electroporation” Adv. Drug Delivery Rev., 35:131-137参照。エレクトロポレーションでは、パルス電流を局所組織領域に適用して細胞の透過性を高めて、膜を通過する遺伝子導入が行われる。研究によると、インビボでの遺伝子送達は、エレクトロポレーションを用いた場合、エレクトロポレーションを用いない場合と比較して、少なくとも１０〜１００倍の効率が得られることを示している。例えば、Aihara et al. (1998) “Gene transfer into muscle by electroporation in vivo” Nat. Biotechnol. 16:867-870; Mir, et al. (1999) “High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses” PNAS 96:4262-4267; Rizzuto, et al. (1999) “Efficient and regulated erythropoietin production by naked DNA injection and muscle electroporation” PNAS 96: 6417-6422; and Mathiesen (1999) “Electropermeabilization of skeletal muscle enhances gene transfer in vivo” Gene Ther., 6:508-514参照。
【０３４９】
コード化されたＰＤ−Ｌ１結合アフィマーは、ウイルス性、非ウイルス性または物理的なものを含む、遺伝子治療に一般的に用いられる広範囲の遺伝子送達システムによって送達され得る。例えば、Rosenberg et al., Science, 242:1575-1578、1988およびWolff et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:9011-9014 (1989)を参照のこと。遺伝子治療における使用のための方法および組成物の議論は、iscussion of methods and compositions for use in gene therapy include Eck et al., in Goodman & Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ninth Edition, Hardman et al., eds., McGraw-Hill, New York, (1996), Chapter 5, pp. 77-101; Wilson, Clin. Exp. Immunol. 107 (Suppl. 1):31-32, 1997; Wivel et al., Hematology/Oncology Clinics of North America, Gene Therapy, S. L. Eck, ed., 12(3):483-501, 1998; Romano et al., Stem Cells, 18:19-39, 2000、およびそこに引用されている文献を含む。米国特許第６，０８０，７２８号はまた、広範な遺伝子送達方法および組成物の議論を提供する。送達の経路には、例えば、全身投与およびインサイチュでの投与が含まれる。
【０３５０】
効果的なコード化されたアフィマー遺伝子導入アプローチは、それが必要とされる特定の組織／細胞に向けられなければならず、得られるトランスジェーン発現は、特定の用途に適したレベルでなければならない。プロモーターは、発現の全体的な強さ、ならびに細胞特異性を決定することができる、ベクターゲノム設計内の主要なシス作用要素である。
【０３５１】
【表１１】
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【表１２】
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【０３５２】
ある場合には、すべての細胞型におけるコード化されたアフィマー構築物のユビキタス発現が望まれる。ヒト伸長因子１α−サブユニット（ＥＦ１α）、最初期（immediate-early）サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）またはユビキチンＣ（ＵＢＣ）のような構成的プロモーターを、ほとんどの組織でコード化されたアフィマー構築物の発現を促進するために用いることができる。一般に、ＣＢＡおよびＣＡＧプロモーターは、構成的プロモーター間でより大きな発現を促進するが、ＣＭＶ（〜０．８ｋｂ）またはＥＦ１α（〜１．２ｋｂ）と比較して〜１．７ｋｂのそれらのサイズは、特にコード化されたアフィマー構築物の発現によって産生されるアフィマー剤が大きい場合、ＡＡＶのようなパッケージング制約のあるベクターでの使用を制限する可能性がある。ＧＵＳＢまたはＵＢＣプロモーターは、それぞれ３７８ｂｐｓおよび４０３ｂｐｓの小さいサイズでユビキタス遺伝子発現を提供することができるが、ＣＭＶまたはＣＢＡプロモーターよりもかなり弱い。したがって、その発現に影響を与えることなくサイズを小さくするための構成的プロモーターへの改変が追求されており、ＣＢｈ（〜８００ｂｐ）およびｍｉｎｉＣＢＡ（〜８００ｂｐ）のような例は、選択された組織において同等の、かつさらに高い発現を促進することができる（Gray et al., Hum Gene Ther. 2011 22:1143−1153）。
【０３５３】
コード化されたアフィマー構築物の発現が臓器内の特定の細胞型に制限されるべきである場合、プロモーターを用いて、この特異性を仲介することができる。例えば、神経系内では、ニューロン、アストロサイトまたはオリゴデンドロサイトに発現を制限するためにプロモーターが使用されてきた。ニューロンでは、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）プロモーターは、ユビキタスなプロモーターよりも強い発現を促進する。さらに、血小板由来成長因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ−β）、シナプシン（Ｓｙｎ）およびメチルＣｐＧ結合タンパク質２（ＭｅＣＰ２）プロモーターは、ＮＳＥよりも低いレベルでニューロン特異的な発現を促進することができる。アストロサイトでは、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ、２．２ｋｂ）プロモーターの６８０ｂｐ長の短縮バージョン［ｇｆａＡＢＣ（１）Ｄ］は、ＧＦＡＰプロモーターと同じアストロサイト特異性でより高いレベルの発現をもたらすことができる。オリゴデンドロサイトを標的とすることは、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモーターの選択によっても達成することができ、その発現はこのグリア細胞に限定されている；しかしながら、そのサイズは１．９ｋｂであり、発現レベルは低いため、その使用は制限されている。
【０３５４】
骨格筋細胞においてコード化されたアフィマー構築物を発現させる場合、筋クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）およびデスミン（１．７ｋｂ）に基づく例示的なプロモーターは、特異性の高い率を示した（要すれば、肝臓において最小の発現を有する）。α−ミオシン重鎖（α−ＭＨＣ；１．２ｋｂ）に基づくプロモーターは、他の筋肉プロモーターと比較して、有意な心臓特異性を示している（Lee et al., 2011 J Cardiol. 57(1):115-22）。造血幹細胞において、合成ＭＮＤプロモーター（Li et al., 2010 J Neurosci Methods. 189(1):56-64）および２ＡＵＣＯＥ（ユビキタスクロマチンオープニングエレメント）に含まれるプロモーターは、それぞれＥＦ１αおよびＣＭＶプロモーターと比較して、すべての細胞株においてより高い導入遺伝子発現を促進することが示されている（Zhang et al., 2007 Blood. 110(5):1448-57; Koldej 2013 Hum Gene Ther Clin Dev. 24(2):77-85; Dighe et al., 2014 PLoS One. 9(8):e104805）。逆に、ベクターを介した遺伝子導入後に肝臓肝細胞のみに発現を制限するためにプロモーターを使用することは、それがリスクとなるシステムでは導入遺伝子特異的な免疫応答を減少させ、さらには発現されたタンパク質に対する免疫寛容が誘導されることが示されている（Zhang et al., 2012 Hum Gene Ther. 23(5):460-72）、これは、特定のアフィマー剤にとって有益である可能性がある。α１−アンチトリプシン（ｈＡＡＴ；３４７ｂｐ）およびチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ；〜４００ｂｐ）プロモーターは、他の組織への浸潤を最小限に抑えながら肝臓に限定された遺伝子発現を促進する（Yan et al., 2012 Gene. 506(2):289-94; Cunningham et al., 2008 Mol Ther. 16(6):1081-8)。
【０３５５】
ある態様において、インビボでのコード化されたアフィマー発現の持続時間および量を制御する機構が一般的には望まれる。ウイルスベクター化およびプラスミドＤＮＡベースのコード化されたアフィマー遺伝子導入と共に用いるために適合され得る様々な誘導性プロモーターが存在する。Fang et al. (2007) “An antibody delivery system for regulated expression of therapeutic levels of monoclonal antibodies in vivo” Mol Ther. 5(6):1153-9；およびPerez et al. (2004) “Regulatable systemic production of monoclonal antibodies by in vivo muscle electroporation” Genet Vaccines Ther. 2(1):2参照。現在臨床評価中の例示的な調節可能なメカニズムは、低分子リガンドによって活性化されるエクジソンベースの遺伝子スイッチである。Cai et al. (2016) “Plasma pharmacokinetics of veledimex, a small-molecule activator ligand for a proprietary gene therapy promoter system, in healthy subjects” Clin Pharmacol Drug Dev. 2016。
【０３５６】
コード化されたアフィマー構築物のある態様では、ウイルスの転写後調節エレメント（ＰＲＥ）が用いられ得る。これらのシス作用エレメントは、イントロンのないウイルスＲＮＡの核外輸送に必要である（Huang and Yen, 1994 J Virol. 68(5):3193-9；および1995 Mol Cell Biol. 15(7):3864-9）。例としては、ＨＰＲＥ（Ｂ型肝炎ウイルスＰＲＥ、５３３ｂｐ）およびＷＰＲＥ（ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ、６００ｂｐ）が挙げられ、これは、特定の例において、導入遺伝子の発現レベルをほぼ１０倍に増加させることができる（Donello et al., 1998 J Virol. 72(6):5085-92）。さらなる例示のために、レンチウイルスおよびＡＡＶベクターを用いて、ＷＰＲＥは、ＣＭＶプロモーター駆動型導入遺伝子発現を増加させるとともに、ＰＰＥ、ＰＤＧＦおよびＮＳＥプロモーター駆動型導入遺伝子発現を増加させることが見出された。ＷＰＲＥの別の効果は、コード化されたアフィマー構築物の導入遺伝子をサイレンシングから保護することである（Paterna et al., 2000 Gene Ther. 7(15):1304-11; Xia et al., 2007 Stem Cells Dev. 2007 Feb; 16(1):167-76)。
【０３５７】
転写されたコード化されたアフィマー転写物のポリアデニル化は、核外輸送、翻訳およびｍＲＮＡの安定性にとっても重要であり得る。したがって、ある態様において、コード化されたアフィマー構築物は、ポリアデニル化シグナル配列を含む。遺伝子発現およびｍＲＮＡの安定性に対する異なるポリアデニル化シグナルの効果を決定した様々な試験が利用可能である。例示的なポリアデニル化シグナル配列には、ＳＶ４０後期またはウシ成長ホルモンポリＡ（ｂＧＨｐＡ）シグナル配列、および最小合成ポリＡ（ＳＰＡ）シグナルが含まれる（Levitt et al., 1989 Genes Dev. 3(7):1019-25; Yew et al., 1997 Hum Gene Ther. 1997 8(5):575-84）。ポリアデニル化の効率は、他のポリＡシグナルの上流に配置されたＳＶ４０後期ポリＡシグナル上流エンハンサー（ＵＳＥ）によって高められる（Schek et al., 1992 Mol Cell Biol. 12(12):5386-93）。ある態様において、単なる例示として、エンコードされたアフィマー構築物は、ＳＶ４０後期＋２ｘＵＳＥポリＡシグナルを含む。
【０３５８】
【表１３】
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【０３５９】
ある態様において、コード化されたアフィマー構築物は、すなわち、任意のプロモーター配列に加えて、１以上の調節エンハンサーを含むことが望ましい場合がある。ＣＭＶエンハンサーは、−５９８〜−６８でＣＭＶプロモーターの上流にあり（Boshart et al., 1985 Cell. 41(2):521-30)（〜６００ｂｐ）、転写結合部位を含む。ある態様において、ＡＮＦ（心房性ナトリウム利尿因子）プロモーター、ＣＣ１０（club cell 10）プロモーター、ＳＰ−Ｃ（サーファクタントタンパク質Ｃ）プロモーター、またはＰＤＧＦ−β（血小板由来成長因子−β）プロモーター（単なる例として）を用いるように、組織特異的なプロモーター駆動転写遺伝子発現を増加させるために、ＣＭＶエンハンサーを構築物に含めることができる。全体として、ＣＭＶエンハンサーは、異なる細胞特異的プロモーターおよび異なる細胞タイプの下で導入遺伝子の発現を増加させるため、導入遺伝子の発現レベルを増加させるために広く適用可能なツールである。筋肉において、例えば、ＡＡＶ発現系において、筋肉特異的プロモーターを有するＣＭＶエンハンサーを用いた導入遺伝子発現は、導入遺伝子によってコードされるタンパク質の発現レベルを増加させることができるため、患者の筋肉細胞に導入されたコードされたアフィマー構築物からアフィマー剤を発現させるために、本発明において特に有用であろう。
【０３６０】
対象のコード化されたアフィマー構築物はまた、１以上のイントロン配列を含み得る。ｍＲＮＡにおけるイントロンまたは介在配列の存在は、ｍＲＮＡのプロセシングおよび導入遺伝子発現の増加に重要であることが、インビトロで最初に記載された（Huang and Gorman, 1990 Mol Cell Biol. 10(4):1805-10; Niwa et al., 1990 Genes Dev. 4(9):1552-9）。イントロン（複数可）は、アフィマー剤のコーディング配列内に配置することができ、および／またはプロモーターと導入遺伝子との間に配置することができる。プロモーターと導入遺伝子との間に配置された様々なイントロン（表３）を、ＡＡＶ２を用いたマウスにおいて、肝臓導入遺伝子発現について比較した（Wuら、2008年）。ＭＶＭ（minute virus of mouse）イントロンは、試験した他のどのイントロンよりも導入遺伝子の発現を増加させ、またイントロンがない場合と比較して８０倍以上増加させた(Wuら、2008年)。しかしながら、ＡＡＶ発現カセットを用いた培養ニューロンにおいて、導入遺伝子の発現は、ＷＰＲＥと比較して導入遺伝子とポリＡシグナルとの間にキメライントロン（ヒトβ−グロビンドナーおよび免疫グロブリン重鎖アクセプター）を有するＣａＭＰＫＩＩＩプロモーターの下ではより少なかった（Choiら、2014年）。ともに、イントロンは、導入遺伝子の発現を増加させるために発現カセットに含める価値のある要素であり得る。
【０３６１】
【表１４】
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【０３６２】
エピソームベクターの場合、対象となるコード化されたアフィマー構築物はまた、１以上の複製起点、ミニ染色体維持要素（ＭＭＥ）および／または核局在化要素を含み得る。本発明のエピソームベクターは、そのようなベクターが自己複製性を有し、従って数世代にわたって宿主細胞内に存続するために必要とされる複製起点（ori）をコードするウイルスゲノムＤＮＡの一部を含む。さらに、本発明のエピソームベクターは、複製に必要なウイルスタンパク質、すなわちレプリケータータンパク質（複数可）をコードする１以上の遺伝子を含み得る。要すれば、複製の開始を助けるレプリケータータンパク質（複数可）は、本発明の自己複製エピソーム発現ベクターを含む宿主細胞において、別のベクター上または宿主ゲノムＤＮＡ上などの別のＤＮＡ分子上にトランス発現されてもよい。本発明の好ましい自己複製エピソームＬＣＲ含有発現ベクターは、感染性ウイルス粒子を産生するであろうコアタンパク質またはキャプシドタンパク質をコードするウイルスゲノムＤＮＡの領域、または完全長のウイルスゲノムＤＮＡ分子中に存在し得るウイルス発癌性配列など、真核生物宿主細胞における長期的な安定維持に必要とされないウイルス配列を含まない。本明細書中、用語“安定な維持”とは、本発明の自己複製エピソーム発現ベクターが、連続的な選択の不存在下で、２世代、３世代、４世代または５世代以上の間、ベクターのコピー数に有意な損失（例えば、５０％以上）を生じることなく、非分裂細胞または分裂細胞の子孫細胞において持続または維持される能力を意味する。ある態様において、ベクターは、１０〜１５またはそれ以上の細胞世代にわたって維持される。対照的に、宿主細胞におけるプラスミドの“一過性”または“短期”の持続は、ベクターが安定した方法で宿主細胞内で複製および分離することができないことを意味する。すなわち、ベクターは、１世代または２世代後に失われるか、または連続する世代間にそのコピー数の５１％以上の損失が生じ得る。
【０３６３】
本明細書では、有用ないくつかの代表的な自己複製するＬＣＲ含有エピソームベクターを以下にさらに記載する。自己複製機能は、代替的に、要すれば核保持に必要とされ得る１以上の配列と組み合わせて、Wohlge uth et al., 1996、Gene Therapy 3:503; Vos et al., 1995、Jour. Cell. Biol., Supp. 21A、433;および、Sun et al., 1994、Nature Genetics 8:33に記載されているような１以上の哺乳動物配列によって提供され得る。自己複製機能を提供するために哺乳動物、特にヒト配列を使用することの利点は、毒性または発癌性を有し得る外因性活性化因子が必要ないことである。本発明は、任意の１つの複製起点または任意の１つのエピソームベクターに限定されるものではなく、エピソームベクターにおけるＬＣＲの組織制限制御の組み合わせを包含することが当業者には理解され得る。また、ＷＯ１９９８００７８７６ “Self-replicating episomal expression vectors conferring tissue-specific gene expression”および米国特許第７７９０４４６号“Vectors、cell lines and their use in obtaining extended episomal maintenance replication of hybrid plasmids and expression of gene products”も参照のこと。
【０３６４】
エプスタインバーウイルス由来の自己複製エピソーム発現ベクター。エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）由来の潜在複製起点（oriP）は、Yates et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3806-3810 (1984); Yates et al., Nature 313:812-815 (1985); Krysan et al., Mol. Cell. Biol. 9:1026-1033 (1989); James et al., Gene 86: 233-239 (1990)、Peterson and Legerski, Gene 107:279-284 (1991);および、Pan et al., Som. Cell Molec. Genet. 18:163-177 (1992)に記載されている。本発明において有用なＥＢＶベースのエピソームベクターは、ＥＢＶの２．６１ｋｂフラグメントに担持されるＥＢＶのｏｒｉＰ領域と、ＥＢＶの２．１８ｋｂフラグメントに担持されるＥＢＮＡ−１遺伝子とを含み得る。ｏｒｉＰを含むベクターのトランスエピソーム複製をサポートするために必要な唯一のウイルス遺伝子産物であるEBNA-1タンパク質は、oriPを含む同じエピソーム発現ベクター上に提供されてもよい。トランスでのウイルスプラスミドの複製をサポートするために必要とされることが知られているＥＢＮＡ−１のような任意のタンパク質と同様に、この遺伝子もまた、別のＤＮＡベクターのような別のＤＮＡ分子上で発現されてもよいことが理解される。
【０３６５】
パピローマウイルスベースの自己複製エピソーム発現ベクター。本発明のエピソーム発現ベクターはまた、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）を含むがこれらに限定されない、パピローマファミリーのウイルスの複製機能に基づいていてもよい。ＢＰＶおよびＨＰＶは、哺乳動物細胞内で安定に維持されたプラスミドとして存続する。ＢＰＶおよびＨＰＶによってコードされる−Ｓトランス作用因子、すなわちＥｌおよびＥ２はまた、最小複製起点を介して多くの細胞型において複製を媒介するために必要かつ十分であることが同定されている（Ustav et al., EMBO J. 10: 449-457 (1991); Ustavet al., EMBO J. 10:4231-4329, (1991); Ustav et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 898-902 (1993)）。
【０３６６】
本発明に従って有用なエピソームベクターは、Piirsoo et al., EMBO J., 15:1 (1996)およびＷＯ９４/１２６２９に記載のＢＰＶ−Ｉベクター系である。Ｐｉｉｒｓｏｏらに記載されているＢＰＶ−１ベクター系は、ＢＰＶ−１複製起点（最小起点に加えて染色体外維持要素）、ならびに要すればＥｌおよびＥ２遺伝子を有するプラスミドを含む。ＢＰＶ−ｌ ＥｌおよびＥ２遺伝子は、ＢＰＶエピソームベクターの安定な維持に必要である。これらの因子は、プラスミドが細胞周期の状態に依存しない細胞あたり最大３０コピーの安定したコピー数に複製されることを確実にする。したがって、遺伝子構築物は、分裂している細胞と分裂していない細胞の両方で安定に持続する。これにより、造血幹細胞やより系譜化された前駆体細胞などの細胞内の遺伝子構築物の維持を可能にする。
【０３６７】
ＢＰＶの複製起点は、６０塩基対（ｂｐ）のＤＮＡフラグメント（ヌクレオチド（ｎｔ）７９１４〜７９２７）内の上流調節領域の３１末端に位置しており、その中には、ＥｌおよびＥ２複製因子の結合部位が含まれている。ＨＰＶの複製の最小起点もまた、特徴付けられ、ＨＰＶのＵＲＲフラグメント（ヌクレオチド（ｎｔ）７０２２〜７９２７）内に位置している（例えば、Chiang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5799-5803 (1992)を参照のこと)。本明細書で用いる“Ｅｌ”は、ＢＰＶサブタイプ１のヌクレオチド（ｎｔ）８４９−２６６３またはサブタイプ１１のＨＰＶのｎｔ８３２−２７７９によってコードされるタンパク質、他のパピローマウイルスの等価なＥｌタンパク質、またはパピローマウイルスのＥｌタンパク質の機能的フラグメントもしくは変異体、すなわち、Ｅｌの複製特性を有するＥｌのフラグメントまたは変異体をを意味する。
【０３６８】
本明細書で用いる“Ｅ２Ｈ”とは、ＢＰＶサブタイプ１のｎｔ２５９４−３８３７またはＨＰＶサブタイプ１１のｎｔ２７２３−３８２３によってコードされるタンパク質、他のパピローマウイルスの等価なＥ２タンパク質、またはパピローマウイルスＥ２タンパク質の機能的フラグメントもしくは変異体、すなわち、Ｅ２の複製特性を有するＥ２のフラグメントまたは変異体を意味する。"ミニ染色体維持要素”（ＭＭＥ）とは、Piirsooら（上記）に記載されているように、宿主細胞におけるパピローマウイルスＭＯの安定したエピソーム維持に不可欠な、パピローマウイルス複製に不可欠なウイルスまたはヒトタンパク質が結合する、パピローマウイルスゲノムの染色体外維持要素を意味する。好ましくは、ＭＭＥは、転写活性化因子Ｅ２に対する複数の結合部位を含む配列である。ＢＰＶにおけるＭＭＥは、本明細書では、少なくとも約６個の連続したＥ２結合部位を含み、約１０個の連続したＥ２結合部位を有する最適な安定維持を与える上流の調節領域内に位置するＢＰＶの領域として定義される。Ｅ２結合部位９は、本明細書中以下に記載のように、この部位の例示的な配列であり、ここで、連続部位は、約４〜約１０ヌクレオチド、最適には約６ヌクレオチドのスペーサーによって分離されている。ＥｌおよびＥ２は、ＷＯ９４／１２６２９およびPiirsooら（上記）にも記載されているように、シスまたはトランスのいずれかでプラスミドに提供され得る。
【０３６９】
“Ｅ２結合部位”とは、Ｅ２タンパク質が結合するパピローマウイルス二本鎖ＤＮＡの最小配列を意味する。Ｅ２結合部位は、ＢＰＶ−１ ＵＲＲの高親和性Ｅ２結合部位９である配列５’ ＡＣＣＧＴＴＧＣＣＧＧＴ ３’（配列番号２０８）を含んでもよく、あるいは、Ｅ２結合部位は、結合部位９の置換（permutation）を含んでもよく、この置換はＵＲＲ内に見出され、一般的なＥ２結合配列５’ ＡＣＣＮ６ＧＧＴ ３’（配列番号２０９）内にある。１以上の転写活性化因子Ｅ２結合部位は、ほとんどのパピローマウイルスにおいて、ＢＰＶおよびＨＰＶのように、上流の調節領域に位置している。本発明に従って有用なベクターは、ＢＰＶ遺伝地図上の６９５９〜７９４５／１〜４７０の間のＢＰＶの領域（ＷＯ９４／１２６２９に記載されているように）を含むことができ、この領域は、複製起点、目的の遺伝子と作動可能に結合する第１のプロモーター、Ｅｌ遺伝子の転写を駆動するための第２のプロモーターと作動可能に結合するＢＰＶ Ｅｌ遺伝子；および、Ｅ２遺伝子の転写を駆動するための第３のプロモーターと作動可能に結合するＢＰＶ Ｅ２遺伝子を含んでいてもよい。
【０３７０】
ＢＰＶ由来のＥｌおよびＥ２は、ＢＰＶ起点または多くのＨＰＶサブタイプの起点を含むベクターを複製する（Chiangら、上記）。ＨＰＶ由来のＥｌおよびＥ２は、ＢＰＶ起点を経由して、または多くのＨＰＶサブタイプの起点を経由して、ベクターを複製し得る（Chiangら、上記）。本発明のすべてのベクターと同様に、本発明のＢＰＶ由来のエピソーム発現ベクターは、宿主細胞の２〜５以上の分裂を通して持続しなければならない。
【０３７１】
米国特許第７７７９０４４６号およびＡｂｒｏｉら（２００４）“Analysis of chromatin attachment and partitioning functions of bovine papillomavirus type 1 E2 protein. Journal of Virology 78:2100-13も参照のこと。これらは、ＢＰＶ１ Ｅ２タンパク質依存性ＭＭＥおよびＥＢＶ ＥＢＮＡ１依存性ＦＲ分離／分割活性が、プラスミドの複製とは独立して機能することを示している。ＥＢＮＡ１／ＦＲおよびＥ２／ＭＭＥの安定維持機能を用いて、細胞複製起点のエピソームを長時間維持することができる。
【０３７２】
パポバウイルス（Papovavirus）ベースの自己複製エピソーム発現ベクター。本発明のベクターはまた、ヒトパポバウイルスＢＫゲノムＤＮＡ分子に由来するものであってもよい。例えば、ＢＫウイルスゲノムは、制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＢａｍＨＩで消化して、ベクターに安定な維持を与えることができる複製配列のＢＫウイルス起点を含む５キロ塩基（ｋｂ）フラグメントを生成することができ（例えば、De Benedetti and Rhoads、Nucleic Acids Res. 19:1925 (1991)参照）、ＢＫウイルスの３．２ｋｂフラグメントも含み得る（Cooper and Miron, Human Gene Therapy 4:557 (1993)参照）。
【０３７３】
本発明のコード化されたアフィマー構築物は、環状核酸または直鎖状核酸として提供され得る。環状核酸および直鎖状核酸は、適切な対象細胞におけるアフィマー剤コーディング配列の発現を指示することができる。アフィマー剤を発現させるための１以上の核酸系は、その構成要素の少なくとも１つが他の構成要素の少なくとも１つに関して異種であることを意味するキメラであってもよい。
【０３７４】
ａ．ウイルスベクター
本発明の使用に容易に適合される例示的なウイルス遺伝子療法システムには、プラスミド、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、レオウイルス、麻疹ウイルス、セムリキ森林ウイルスなどが含まれる。好ましいウイルスベクターは、非必須遺伝子が、エピトープおよび目的の標的配列をコードする核酸配列を有する核酸構築物で置換されている非細胞性真核生物ウイルスに基づくものである。
【０３７５】
さらなる例示のために、コード化されたアフィマーは、遺伝子療法におけるヒトへの使用が既に承認されている二本鎖ＤＮＡウイルスであるアデノウイルスおよびアデノ随伴（ＡＡＶ）ウイルスを用いて、インビボで送達され得る。
【０３７６】
アデノウイルスベクター
１以上の核酸配列のインビボ送達のための１つの例示的方法は、アデノウイルス（“ＡｄＶ”）発現ベクターの使用を含む。ＡｄＶは、宿主ゲノム内に組み込まれることも、細胞分裂中に複製されることもない、エンベロープを持たない二本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡｄＶを介した抗体遺伝子導入は、臨床に向けて進行している様々な疾患モデルにおいて治療効果を示している。全身のｍＡｂ発現は、ほとんどの場合、皮下（s.c.）および特に静脈内（i.v.）および筋肉内へのＡｄＶ注射を介して行われてきた。Wold et al. (2013) “Adenovirus vectors for gene therapy, vaccination and cancer gene therapy” Curr Gene Ther. 13(6):421-33；および、Deal et al. “Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy” 2015 Curr Opin Immunol. 35:113-22参照。他の送達経路は、コード化されたＡｄＶの鼻腔内、気管内または胸腔内投与を介したような、より局所的なｍＡｂ産生に焦点を当てている。腫瘍溶解性ベクターとしてのＡｄＶの使用は、特に腫瘍部位でのコード化抗体の生成のための一般的なアプローチである。現在のアデノウイルス遺伝子送達システムで送達された外来遺伝子は、エピソームであるため、宿主細胞に対する遺伝毒性は低い。したがって、アデノウイルス遺伝子送達システムを用いた遺伝子治療は、かなり安全であり得る。本発明は、特に、アデノウイルスベクターおよび送達システムの形態で送達されるコード化されたアフィマー構築物の発現によるアフィマー剤の送達を企図している。
【０３７７】
アデノウイルスは、その中型のゲノム、操作の容易さ、高い力価、広い標的細胞範囲および高い感染性のために、遺伝子送達ベクターとして通常用いられてきた。ウイルスゲノムの両端には、ウイルスＤＮＡの複製およびパッケージングに必要なシス要素である１００〜２００ｂｐのＩＴＲ（逆方向末端反復配列）が含まれている。ゲノムのＥ１領域（Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂ）は、ウイルスゲノムおよびいくつかの細胞遺伝子の転写調節に関与するタンパク質をコードしている。Ｅ２領域（Ｅ２ＡおよびＥ２Ｂ）は、ウイルスＤＮＡ複製に関与するタンパク質をコードしている。これまでに開発されたアデノウイルスベクターのうち、欠失したＥ１領域を有する複製不能のアデノウイルスが通常用いられ、本発明のコード化されたアフィマー構築物を生成するためのＡｄＶの１つの例示的な選択を表す。アデノウイルスベクターにおける欠失したＥ３領域は、導入遺伝子の挿入部位を提供し得る（Thimmappaya, B. et al., Cell, 31:543-551(1982); および、Riordan, J. R. et al., Science, 245:1066-1073(1989)）。
【０３７８】
“アデノウイルス発現ベクター”は、（ａ）構築物のパッケージングを支持するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物、および（ｂ）ＰＤ−Ｌ１結合アフィマーのようなアフィマー剤を含むポリペプチドをコードするポリヌクレオチド（コード化されたアフィマー配列）を発現するのに十分なアデノウイルス配列を含む構築物を含むことを意味する。ある態様において、コード化されたアフィマーの配列は、ＤＡプロモーター領域に挿入されてもよい。例示的な態様によれば、組換えアデノウイルスは、欠失したＥ１ＢおよびＥ３領域を含み、コード化されたアフィマーのヌクレオチド配列は、欠失したＥ１ＢおよびＥ３領域に挿入される。
【０３７９】
アデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）
ＡＡＶ（または、組換え型ＡＡＶの場合“ｒＡＡＶ”）は、分裂細胞と非分裂細胞の両方に感染することができる、エンベロープを持たない小型一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＡｄＶと同様に、ＡＡＶベースのベクターは核内でエピソーム状態のままであり、組み込みのリスクは限られている。一般的に限られたＡｄＶ媒介遺伝子導入の耐久性とは対照的に、導入遺伝子の発現は、筋肉内組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクター送達後も数年間持続し得る。
【０３８０】
ヒトリポタンパク質リパーゼ遺伝子をコードするｒＡＡＶであるアリポジーン・チパルボベック（Alipogene tiparvovec（Glybera（商標）））は、２０１２年に欧州で最初の遺伝子治療製品として承認された。その後、現在まで、様々なｒＡＡＶを用いた遺伝子治療製品が臨床評価を受けている。抗体遺伝子導入では、ｍＡｂをコードするｒＡＡＶをマウスに筋肉内注射することで、抗ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｍＡｂがインビボで産生されたという報告が多数ある。このｒＡＡＶベクターは、すなわち、２つのｍＡｂを発現させることによる併用療法の可能性も実証されている。ＡｄＶと同様に、筋肉内および静脈内（i.v.）でのｒＡＡＶ投与が最も頻繁に行われてきた。Dealらの、“Engineering humoral immunity as prophylaxis or therapy” 2015 Curr Opin Immunol. 35:113−22参照のこと。頭蓋内、鼻腔内、体腔内、髄腔内、胸膜内および腹腔内経路を含む様々な追加の送達部位も実証されており、より局所的な治療効果が達成されている。抗体遺伝子導入のためのｒＡＡＶの有用性が実証されたことにより、本発明はまた、インビボでのコード化されたアフィマー配列の送達のための、およびｒＡＡＶ構築物の発現の結果としての患者の体内でのアフィマー剤の産生のためのｒＡＡＶシステムの使用を明確に企図している。
【０３８１】
ＡＡＶの重要な特徴の１つは、これらの遺伝子導入ウイルスが、非分裂細胞および様々なタイプの細胞に感染することができ、本発明のコード化されたアフィマー送達システムを構築するのに有用であることである。例示的なＡＡＶベクターの使用および調製のための詳細な記載は、例えば、米国特許第５，１３９，９４１号および同第４，７９７，３６８号、ならびにLaFace et al, Viology, 162:483486 (1988), Zhou et al., Exp. Hematol. (NY), 21:928-933 (1993)、Walsh et al, J. Clin. Invest., 94:1440-1448(1994)およびFlotte et al., Gene Therapy, 2:29-37(1995)に見いだされる。ＡＡＶは、その安全性、すなわち、遺伝子操作（組換え）されたものが宿主ゲノムに組み込まれないため、送達ビヒクルの良い選択である。同様に、ＡＡＶは病原性がなく、いかなる疾患とも関連していない。ウイルスコーディング配列の除去は、ウイルス遺伝子発現に対する免疫反応を最小限に抑えるため、組換えＡＡＶは炎症反応を誘発しない。
【０３８２】
一般的には、組換えＡＡＶウイルスは、目的の遺伝子（すなわち、アフィマー剤をコードする配列）を２つのＡＡＶ末端反復配列で挟んで含むプラスミド（McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963-1973(1988); Samulski et al., J. Virol., 63:3822-3828(1989)）および末端反復配列を含まない野生型ＡＡＶコーディング配列を含む発現プラスミド（McCartyら、J. Virol.、65:2936-2945(1991)）を共トランスフェクトすることによって作製される。一般的には、コード化されたアフィマー構築物を含むウイルスベクターは、ポリペプチドを含むアフィマーをコードするポリヌクレオチド、適当な調節エレメントおよび細胞形質導入を媒介するコード化されたアフィマーの発現に必要な要素（エレメント）から組み立てられる。ある態様において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが用いられる。さらなる特定の態様において、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ６またはＡＡＶ８である。
【０３８３】
ＡＡＶ ＩＴＲによって結合されたコード化されたアフィマー配列を含むＡＡＶ発現ベクターは、主要なＡＡＶオープンリーディングフレーム（“ＯＲＦ”）を欠失させたＡＡＶゲノムに選択された配列（複数可）を直接挿入することによって構築することができる。
【０３８４】
真核細胞の場合、発現制御配列は、一般的には、プロモーター、免疫グロブリン遺伝子、ＳＶ４０、サイトメガロウイルスなどに由来するものなどのエンハンサー（上記参照）、ならびにスプライスドナーおよびアクセプター部位を含んでいてよいポリアデニル化配列を含む。ポリアデニル化配列は、一般に、導入遺伝子配列の後ろ、かつ３’ＩＴＲ配列の前に挿入される。
【０３８５】
これらおよび他の一般的なベクターおよび調節エレメントの選択は従来から行われており、多くのそのような配列が利用可能である。例えば、Sambrookら、およびその中で引用されている文献、例えば、３．１８−３．２６頁および１６．１７−１６．２７頁の文献およびAusubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons、New York, (1989)を参照のこと。もちろん、すべてのベクターおよび発現制御配列が、本発明のすべての導入遺伝子を発現するために等しく良好に機能するわけではない。しかしながら、当業者であれば、本発明の範囲から逸脱することなく、これらの発現制御配列の中から選択することができる。適切なプロモーター／エンハンサー配列は、本願により提供されるガイダンスを用いて、当業者によって選択され得る。そのような選択は、常套的な事項であり、分子または構築物を限定するものではない。
【０３８６】
レトロウイルスベクター
コード化されたアフィマー構築物の送達に関して有用な非細胞傷害性ウイルス（non-cytopathic virus）には、レトロウイルスが含まれ、そのライフサイクルは、ゲノムウイルスＲＮＡのＤＮＡへの逆転写とそれに続く宿主細胞ＤＮＡへのプロウイルスの組み込みを含む。レトロウイルスは、ヒト遺伝子治療治験のために承認されている。最も有用なのは、複製欠損（すなわち、所望のタンパク質の合成を指示することはできるが、感染性粒子を製造することができない）のレトロウイルスである。このような遺伝子改変レトロウイルス発現ベクターは、インビボでの遺伝子の高効率導入のための一般的な有用性を有する。複製欠損レトロウイルスを生産するための標準的なプロトコール（外来遺伝物質をプラスミドに組み込む工程、プラスミドを含む（lined with）パッケージング細胞のトランスフェクション工程、パッケージング細胞株による組換えレトロウイルスの生産工程、組織培養培地からのウイルス粒子の収集工程およびウイルス粒子で標的細胞を感染させる工程を含む）は、当業者に知られている。
【０３８７】
レトロウイルスベクターを構築するために、アフィマー剤コーディング配列を特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入し、複製欠損ウイルスを産生する。ウイルス粒子（ビリオン）を生産するために、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ遺伝子を含むが、ＬＴＲ（長い末端反復配列）およびｐｓｉ（ψ）成分を含まない、パッケージング細胞株を構築する（Mann et al., Cell, 33:153-159(1983)）。サイトカイン遺伝子、ＬＴＲおよびｐｓｉを含む組換えプラスミドをこの細胞株に導入すると、ｐｓｉ配列は、組換えプラスミドのＲＮＡ転写物をウイルス粒子にパッケージングすることを可能にし、このウイルス粒子はその後培地中に分泌される（Nicolas and Rubinstein “Retroviral vectors,” In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses, Rodriguez and Denhardt (eds.), Stoneham: Butterworth、494-513(1988)）。次に、組換えレトロウイルスを含む培地を回収し、要すれば濃縮し、遺伝子導入システムに用いる。
【０３８８】
このような第二世代レトロウイルスベクターを用いた遺伝子導入の成功例が報告されている。Kasaharaら(Science, 266:1373-1376(1994))は、ＥＰＯ（エリスロポエチン）配列がエンベロープ領域の代わりに挿入されたモロニーマウス白血病ウイルスの変異体を調製し、その結果、新規な結合特性を有するキメラ蛋白質を産生した。好ましくは、本発明の遺伝子送達システムは、第二世代レトロウイルスベクターの構築戦略に従って構築することができる。
【０３８９】
ある態様において、レトロウイルスは、レトロウイルス科レトロウイルス属を意味する“ガンマレトロウイルス”である。例示的なガンマレトロウイルスには、マウス幹細胞ウイルス、マウス白血病ウイルス、ネコ白血病ウイルス、ネコ肉腫ウイルスおよびトリ細網内皮症ウイルスが含まれる。
【０３９０】
ある態様において、本発明で用いるためのレトロウイルスベクターは、レンチウイルスベクターであり、これは、分裂細胞および非分裂細胞に感染することができ、一般的には高いウイルス力価を産生するレトロウイルス属を意味する。レンチウイルスのいくつかの例としては、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス：ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）；ウマ感染性貧血ウイルス；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；および、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。
【０３９１】
コード化されたアフィマーの送達および発現に用いられ得る広く用いられているレトロウイルスベクターの別のクラスには、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）およびそれらの組み合わせに基づくものが含まれる（例えば、Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739, 1992; Johann et al., J. Virol. 66: 1635-1640、1992; Sommerfelt et al., Virol. 176:58-59、1990; Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378、1989; Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224, 1991;および、ＰＣＴ／ＵＳ９４／０５７００参照）。
【０３９２】
本発明においても用いられ得るさらに他のレトロウイルスベクターには、例えば、ヒトフォーミーウイルス（ＨＦＶ）またはスプーマウイルス属の他のウイルスに基づくベクターが含まれる。フォーミーウイルス（ＦＶ）は、今日知られている最大のレトロウイルスであり、すべての非ヒト霊長動物種を含む種々の哺乳動物に蔓延しているが、ヒトには存在しない。この完全な非病原性（apathogenicity）は、ＦＶベクターがヒトにおける遺伝子治療のための理想的な遺伝子導入手段であることを証明しており、ＦＶベクターを遺伝子導入システムとしてＨＩＶ由来のベクターやガンマレトロウイルス由来のベクターと明確に区別する。
【０３９３】
本明細書で用いる好適なレトロウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，３９９，３４６号および同第５，２５２，４７９号；ならびに、ＷＩＰＯ公報ＷＯ９２/０７５７３、ＷＯ９０/０６９９７、ＷＯ８９/０５３４５、ＷＯ９２/０５２６６およびＷＯ９２/１４８２９に記載されており、これらは、そのようなレトロウイルスベクターを用いてヒト細胞に核酸を効率的に導入するための方法を記載している。他のレトロウイルスベクターとしては、例えば、マウス乳癌ウイルスベクター（例えば、Shackleford et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:9655-9659、1998）、レンチウイルスなどが挙げられる。
【０３９４】
ＰＤ−Ｌ１アフィマー剤をコードする導入遺伝子送達に容易に適合させることができる追加のレトロウイルス送達システムとしては、単なる例示として、公開ＰＣＴ出願ＷＯ／２０１０／０４５００２、ＷＯ／２０１０／１４８２０３、ＷＯ／２０１１／１２６８６４、ＷＯ／２０１２／０５８６７３、ＷＯ／２０１４／０６６７００、ＷＯ／２０１５／０２１０７７、ＷＯ／２０１５／１４８６８３、ＷＯ／２０１７／０４０８１５−その明細書および図面−が挙げられ、それらは引用により本明細書に包含される。
【０３９５】
ある態様において、レトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムのパッケージングおよび組み込みに必要なシス作用配列の全て、すなわち、（ａ）ベクターの各末端における長い末端反復配列（ＬＴＲ）またはその一部；（ｂ）負のおよび正のＤＮＡ鎖合成のためのプライマー結合部位；および、（ｃ）ゲノムＲＮＡのウイルスへの組み込みに必要なパッケージングシグナルを含む。レトロウイルスベクターに関する詳細は、Boesen, et al., 1994, Biotherapy 6:291-302; Clowes, et ai, 1994, J. Clin. Invest. 93:644-651; Kiem, et al., 1994, Blood 83: 1467-1473; Salmons and Gunzberg, 1993, Human Gene Therapy 4: 129-141; Miller, et al., 1993, Meth. Enzymol. 217:581-599；および、Grossman and Wilson, 1993, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3: 110-114に見いだされ得る。
【０３９６】
ある態様において、レトロウイルスは、以下を含む組換え複製可能レトロウイルスである：レトロウイルスＧＡＧタンパク質をコードする核酸配列；レトロウイルスＰＯＬタンパク質をコードする核酸配列；レトロウイルスエンベロープをコードする核酸配列；オンコレトロウイルスポリヌクレオチド配列の５’末端および３’末端に長い末端反復配列（ＬＴＲ）を含むオンコレトロウイルスポリヌクレオチド配列；ＰＤ−Ｌ１アフィマー剤などのアフィマー剤をコードする配列に作動可能に連結された内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含むカセット（該カセットは、３’ＬＴＲのＵ３領域に５’に、およびレトロウイルスエンベロープをコードする配列に３’に配置されている）；および、標的細胞内での逆転写、パッケージングおよび組み込みのためのシス作用配列。
【０３９７】
ある態様において、レトロウイルスは、以下を含む組換え複製可能レトロウイルスである：レトロウイルスＧＡＧタンパク質；レトロウイルスＰＯＬタンパク質；レトロウイルスエンベロープ；レトロウイルスポリヌクレオチド配列の３’末端の長い末端反復配列（ＬＴＲ）およびレトロウイルスポリヌクレオチド配列の５’末端のプロモーター配列（該プロモーターは、哺乳動物細胞での発現に適ししている）、ＧＡＧ核酸ドメイン、ＰＯＬ核酸ドメインおよびｅｎｖ核酸ドメインを含むレトロウイルスポリヌクレオチド配列；コード化されたアフィマー配列を含むカセット（該カセットは、３’ＬＴＲに対して５’位置にあり、作動可能に連結され、レトロウイルスエンベロープをコードするｅｎｖ核酸ドメインに対して３’位置にある）；および、標的細胞内での逆転写、パッケージングおよび組み込みのためのシス作用配列。
【０３９８】
組換え複製可能レトロウイルスのいくつかの態様において、エンベロープは、両種指向性（amphotropic）、ポリトロピック（polytropic）、異種指向性（xenotropic）、１０Ａ１、ＧＡＬＶ、ヒヒ内在性レトロウイルス（Baboon endogenous virus）、ＲＤ１１４、ラブドウイルス、アルファウイルス、麻疹ウイルスまたはインフルエンザウイルスエンベロープのうちの１つから選択される。
【０３９９】
組換え複製可能レトロウイルスのいくつかの態様では、レトロウイルスポリヌクレオチド配列は、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦｅＬＶ）、ヒト内在性レトロウイルス（ＢＥＶ）、ブタ内在性ウイルス（ＰＥＲＶ）、ネコ由来レトロウイルスＲＤ１１４、リスザルレトロウイルス、異種指向性マウス白血病ウイルス関連ウイルス（ＸＭＲＶ）、トリ網状内皮症ウイルス（ＲＥＶ）またはテナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）からなる群より選択されるウイルスから設計される。
【０４００】
組換え複製可能レトロウイルスのいくつかの態様では、レトロウイルスはガンマレトロウイルスである。
【０４０１】
組換え複製可能レトロウイルスのいくつかの態様では、別のチェックポイント阻害剤ポリペプチド、共刺激ポリペプチドおよび／または免疫刺激サイトカイン（単なる例示）などの第２の治療用タンパク質をコードする配列を含む第２のカセットが、例えば、カセットの下流に存在する。特定の例において、第２のカセットは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）または第２の治療用タンパク質のコーディング配列に作動可能に連結されたミニプロモーターもしくはｐｏｌＩＩＩプロモーターを含み得る。
【０４０２】
組換え複製可能レトロウイルスのいくつかの態様では、それは、好ましくは、腫瘍微小環境の細胞に選択的に感染して複製する、非溶解性、両種指向性レトロウイルス複製ベクターである。
【０４０３】
発現構築物としての他のウイルスベクター
ベクター化された腫瘍内コード化アフィマー遺伝子導入に関して、腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍細胞を特異的に標的化し、治療用アフィマー剤の発現を増強させ、抗腫瘍治療応答を増幅することができるため、明確な利点を有する。上記の特定のウイルス系と重複する腫瘍溶解性ウイルスは、選択的な腫瘍細胞の死滅および全身的な抗腫瘍免疫の誘導を介して抗腫瘍応答を促進する。その作用機序は完全には解明されていないが、形質転換細胞内でのウイルス複製、一次細胞死（primary cell death）の誘導、腫瘍細胞の抗ウイルス要素との相互作用ならびに自然および適応性の抗腫瘍免疫の開始に依存している可能性が高い。Kaufman et al. 2015 “Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs” Nat Rev Drug Discov. 14(9):642-62参照。現在クリニックで使用されている腫瘍溶解性ウイルスの多くは、癌細胞によって異常に発現している細胞表面タンパク質に対する自然な親和性（natural tropism）を有している。これまでに、ＡｄＶ、ポックスウイルス、コクサッキーウイルス、ポリオウイルス、麻疹ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、レオウイルスなどが早期臨床治験に入っている。２０１５年、ＦＤＡおよびＥＭＡは、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の遺伝子を備えた腫瘍溶解性ヘルペスウイルスである腫瘍溶解性免疫療法薬（talimogene laherparepvec）（T-VEC、Imlygic（商標））を承認した。腫瘍溶解性ウイルスの自己永続的な性質は、導入遺伝子産物がウイルス複製に伴って増幅され、それによって治療効果を最大化することができるため、本発明のコード化されたアフィマー遺伝子導入のための魅力的なプラットフォームとなっている。Liu et al. 2008 “Oncolytic adenoviruses for cancer gene therapy” Methods Mol Biol. 433:243-58。
【０４０４】
大きな融合タンパク質である、すなわち、単一のアフィマードメインを超えて他のタンパク質ドメインを含む、アフィマー剤の場合、局所的な腫瘍内発現は、それが問題となる可能性がある場合には、固体腫瘍における貧弱な浸透性を克服するための魅力的な戦略を提示することができる。Beckman et al. (2007) “Antibody constructs in cancer therapy: protein engineering strategies to improve exposure in solid tumors” Cancer 109(2):170−9；および、Dronca et al. 2015 “Immunomodulatory antibody therapy of cancer: the closer、the better” Clin Cancer Res. 21(5):944-6。同様に、コード化されたアフィマー構築物の腫瘍内送達およびアフィマー剤の併用局所発現は、用量制限毒性が、アフィマー剤が全身的に送達される（または発現される）場合に、そうでなければ有効性のための有効な腫瘍内濃度に達することを妨げる可能性がある、より良好な治療指標を作成することができる。
【０４０５】
本発明のＰＤ−Ｌ１アフィマー剤の場合、これらのアフィマーの免疫調節性は、腫瘍溶解性ウイルスの使用に顕著に関連している。実際に、腫瘍溶解性ウイルス治療の場合、免疫チェックポイント阻害剤ネットワークを無効にし、それによって癌内に炎症誘発性環境を作り出すことが望ましい。腫瘍溶解性ウイルスと従来の免疫調節性ｍＡｂ投与との組み合わせを評価するために、多数の臨床治験が現在進行中である。Kaufman et al. 2015 “Oncolytic viruses: a new class of immunotherapy drugs” Nat Rev Drug Discov. 14(9):642−62；および、Lichty et al. 2014 “Going viral with cancer immunotherapy” Nat Rev Cancer. 14(8):559-67。しかしながら、チェックポイント遮断ｍＡｂによる全身治療は、深刻な免疫関連の副作用をもたらす可能性があり、これはまた、対象となるＰＤ−Ｌ１アフィマー剤のいくつかの態様、例えばコード化されたアフィマー剤の腫瘍溶解性ウイルスを介した局所療法にとって問題となり得る。様々な研究が、このアプローチを追求しており、対象のコード化されたアフィマーを用いるために容易に適合させることができる。Diasらは、複製欠損および複製競合性の腫瘍溶解性ＡｄＶに抗ヒトＣＴＬＡ−４ ｍＡｂを供した。Dias et al. 2012 “Targeted cancer immunotherapy with oncolytic adenovirus coding for a fully human monoclonal antibody specific for CTLA-4” Gene Ther. 19(10):988-98。最近記載された別のシステム（および本発明のコード化されたアフィマーを用いるために適合され得るシステム）は、抗マウスプログラムされた細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）Ｆａｂ、ｓｃＦｖまたは全長ｍＡｂを供した腫瘍溶解性ワクシニアウイルスに関与していた。ウイルス複製を反映して、腫瘍内ｍＡｂレベルは、腫瘍モデルに応じて、９または３０μｇ／ｍｌの腫瘍内注射の３〜５日後にピークに達した。血清中ｍＡｂレベルは、３倍以上低いとはいえ同じ傾向をたどったが、ｍＡｂ検出は５日後に失われた。腫瘍内で発現したｍＡｂは、抗ＰＤ−１ ｍＡｂタンパク質の腫瘍内注射と比較して長く持続し、フォローアップは注射後１１日間に限定された。ＦａｂおよびｓｃＦｖ発現は報告されなかった。抗ＰＤ−１ ｓｃＦｖまたはｍＡｂのいずれかを添加したウイルスの抗腫瘍応答は、添加していないウイルスよりも優れており、添加していないウイルスと全身抗ＰＤ−１ ｍＡｂタンパク質注射の組み合わせと同等の効果があった。Kleinpeter et al. 2016 “Vectorization in an oncolytic vaccinia virus of an antibody, a Fab and a scFv against programmed cell death-1 (PD-1) allows their intratumoral delivery and an improved tumor-growth inhibition” Oncoimmunology. 5(10):e1220467 (online)。また、最近では、抗ＰＤ−Ｌ１ミニ抗体（ｓｃＦｖ ＣＨ２−ＣＨ３融合タンパク質）を添加した腫瘍溶解性ＡｄＶおよびヘルパー依存性ＡｄＶの組み合わせを腫瘍内投与すると、マウスにおけるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法の抗腫瘍効果が改善された。局所的に産生された抗ＰＤ−Ｌ１ミニ抗体の利点は、抗ＰＤ−Ｌ１ ＩｇＧ注射＋ＣＡＲ Ｔ細胞および非添加ＡｄＶの共投与では達成できなかった。Tanoue et al 2017 “Armed oncolytic adenovirus expressing PD-L1 mini-body enhances anti-tumor effects of chimeric antigen receptor T-cells in soid tumors” Cancer Res. 77(8):2040-51。そのシステムの使用、特にＣＡＲ-Ｔ細胞療法との組み合わせは、標的腫瘍にコード化されたアフィマーを送達するための使用もまた企図されている。
【０４０６】
本発明の遺伝子送達システムとして、他のウイルスベクターを用いることができる。ワクシニアウイルスなどのウイルスに由来するベクター（Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy, 10:649-657(1999); Ridgeway, “Mammalian expression vectors,” In: Vectors: A survey of molecular cloning vectors and their uses. Rodriguez and Denhardt, eds. Stoneham: Butterworth, 467-492(1988); Baichwal and Sugden, “Vectors for gene transfer derived from animal DNA viruses: Transient and stable expression of transferred genes,” In: Kucherlapati R, ed. Gene transfer. New York: Plenum Press, 117-148(1986) および Coupar et al., Gene, 68:1-10(1988))、レンチウイルス (Wang G. et al., J. Clin. Invest., 104(11):R55-62(1999))、単純ヘルペスウイルス（Chamber R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 92:1411-1415(1995))、ポックスウイルス(GCE, NJL, Krupa M, Esteban M., The poxvirus vectors MVA and NYVAC as gene delivery systems for vaccination against infectious diseases and cancer Curr Gene Ther 8(2):97-120(2008))、レオウイルス、麻疹ウイルス、セムリキフォレストウイルスおよびポリオウイルスは、目的の遺伝子を細胞にトランスフェクションするための本発明の送達システムで用いることができる。これらは、様々な哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な特徴を提供する。また、Ｂ型肝炎ウイルスも含まれる。
【０４０７】
ｂ．非ウイルスベクター
１９９０年に、Wolffらは、マウスの骨格筋に裸のプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）を注入すると、コード化されたタンパク質が局所的に発現することを示し、ＤＮＡベースの治療法分野を活性化させた。Wolff et al. 1990 “Direct gene transfer into mouse muscle” Science. 247(4949 Pt 1):1465-8を参照のこと。本発明のコード化されたアフィマーを送達するための“ｐＤＮＡ”の使用は、生物学的ベクターとしてのウイルスの必要性を放棄し、コード化されたアフィマー遺伝子導入のための魅力的なプラットフォームを提示する。ウイルスベクターと比較して、ｐＤＮＡは、免疫原性が低く（例えば、反復投与が可能である）、製造、出荷および貯蔵が安価であり、貯蔵寿命がはるかに長いと考えられる。核内に侵入した後、ｐＤＮＡは、非複製非組み込みエピソーム状態のままであり、有糸分裂阻害剤時の核エンベロープの破壊中に失われる。ｐＤＮＡは、ウイルスベクターと比較して、導入遺伝子の大きさに関する定義された制限はなく、そのモジュール式構造（modular nature）により、分子クローニングが容易になり、治療的使用のための操作および設計が容易になる。Hardee et al. 2017 “Advances in non-viral DNA vectors for gene therapy” Genes. 8(2):65。プラスミドは、進行中または完了した遺伝子治療臨床治験の約１７％で用いられており、耐容性が高く安全であることが示されている。
【０４０８】
ＤＮＡの投与方法は、導入遺伝子の発現に大きな影響を与え得る。インビボでのＤＮＡ介在性コード化アフィマー遺伝子導入は、抗体遺伝子導入に用いられているような物理的導入方法、例えばエレクトロポレーションまたは液体注入を利用することができる。エレクトロポレーションは、組織内に電場を伝播させ、細胞膜透過性の一過性の増加を誘導する。ＤＮＡの電気泳動は、（ｉ）ＤＮＡの細胞膜への電気泳動移動、（ｉｉ）ＤＮＡの蓄積および細胞膜との相互作用、（ｉｉｉ）ＤＮＡの核への細胞内輸送、を含む多段階プロセスであり、その後、遺伝子発現を開始することができる。Heller LC. 2015 “Gene electrotransfer clinical trials” Adv Genet. 89:235−62。筋肉内、腫瘍内および皮内投与は、臨床治験で評価されており、また、コード化されたアフィマー構築物のエレクトロポレーションに適した標的組織でもある。
【０４０９】
水力学に基づくトランスフェクションは、大量のｐＤＮＡを静脈内に注入することで、ＤＮＡ分子を血液循環から組織内に送り出す。他の潜在的に侵襲性の低い物理的送達方法としては、ソノポレーション（sonoporation）およびマグネトフェクションなどがある。ＤＮＡの取り込みは、分子を化学的送達ビークル（例えば、カチオン性脂質またはポリマーおよび脂質ナノ粒子）と複合体化させることにより改善することもできる。このような技術は、インビボでのＤＮＡ媒介コード化アフィマー遺伝子導入にも適用することができる。
【０４１０】
送達方法の選択に加えて、コード化されたアフィマー導入遺伝子の発現は、ｐＤＮＡ構築物の構成を変更することによって改善され得る。例えば、Hardee et al. 2017 “Advances in non-viral DNA vector for gene therapy” Genes 8(2):65;および、Simcikova et al. 2015 “Towards effective non-viral gene delivery vector” Biotechnol Genet Eng Rev. 31(1-2):82-107を参照のこと。従来のｐＤＮＡは、転写ユニットと細菌主鎖（backbone）からなる。転写ユニットは、調節要素とともにコード化されたアフィマー配列を運ぶ。細菌主鎖は、抗生物質耐性遺伝子、複製起点、非メチル化ＣｐＧモチーフおよび潜在的に暗号化された発現シグナルなどの要素が含まれる。これらの配列のいくつかは、プラスミドＤＮＡの産生に必要とされる。しかしながら、一般に、治療のためのコード化されたアフィマー遺伝子治療では、細菌主鎖の存在は逆効果になる可能性が高い。しかしながら、既に抗体遺伝子導入に使用されており、コード化されたアフィマー遺伝子導入に容易に適合させることができるミニサークルＤＮＡ（ｍｃＤＮＡ）を含む、選択可能なミニサークルベクターの様々なタイプが存在する。ミニサークルは、組換え、制限および／または精製プロセスを介して生成された、細菌配列を欠くプラスミド分子である。上記のSimcikova et al. 2015参照。細菌主鎖の除去は、様々な組織において、より高いトランスフェクション効率および延長された導入遺伝子発現を示している。
【０４１１】
また、本発明は、エレクトロポレーションを介して効率的に対象に送達され、かつそこに含まれるコード化されたアフィマー配列を発現することが可能な、直鎖状核酸または線状発現カセット（“ＬＥＣ”）もまた提供する。ＬＥＣは、何らかのリン酸主鎖を欠いた何らかの直鎖状ＤＮＡであってよい。ＬＥＣは、プロモーター、イントロン、停止コドンおよび／またはポリアデニル化シグナルを含んでいてよい。コード化されたアフィマーコーディング配列の発現は、プロモーターによって制御され得る。
【０４１２】
プラスミドベクター
ある態様において、対象となるコード化されたアフィマー構築物は、プラスミドベクターとして送達される。プラスミドベクターは、当技術分野で広く記載されており、当業者にはよく知られている。例えば、Sambrook et al., 1989（上記）を参照のこと。ここ数年、プラスミドベクターは、抗原コード遺伝子をインビボで細胞に送達するためのＤＮＡワクチンとして使用されている。それらは、他のベクターと比較して安全性の懸念を軽減するため、これに特に有利である。しかしながら、これらのプラスミドは、宿主細胞と適合性のプロモーターを有し、プラスミド内の核酸によってコードされるペプチドエピトープを発現することができる。他のプラスミドは当業者にはよく知られている。さらに、プラスミドは、ＤＮＡの特定の断片を除去および追加するために、制限酵素およびライゲーション反応を用いてカスタム設計されてもよい。プラスミドは、様々な非経腸的、粘膜的および局所的経路によって送達されてもよい。例えば、本発明のＤＮＡプラスミドは、筋肉内、皮内、皮下などの経路で注入することができる。また、経鼻スプレーや点滴、直腸座薬および経口投与などの方法で投与してもよい。また、遺伝子銃を用いて表皮または粘膜表面に投与することもできる。プラスミドは、水溶液中で、金粒子上で乾燥させて、またはリポソーム、デンドリマー、渦巻形（cochleate）、マイクロカプセル化を含むがこれらに限定されない別のＤＮＡ送達システムと関連して投与され得る。
【０４１３】
コード化されたアフィマー構築物をインビボで組織に送達するためにプラスミドＤＮＡを使用することのアプリケーションおよび効率を拡大するために、異なるアプローチは、先行技術の報告でより高いmAb発現または全体的な有効性を生成する原理に基づいて追求することができます。第一の戦略は、単に複数または繰り返しのpDNA用量を与えることに依存している。Kitaguchi et al. 2005 “Immune Deficiency enhances expression of recombinant human antibody in mouse after nonviral in vivo gene transfer” Int J Mol Med 16(4):683-8;および、Yamazaki et al. 2011 “Passive immune-prophylaxis against influenza virus infection by expression of neutralizing anti-hemagglutinininin monooclonal antibodies from plasmids” Jpn J Infect Dis. 64(1):40-9。別のアプローチは、送達アジュバントの使用に関する。ｐＤＮＡ電気泳動転写は、ヒアルロン酸を一時的に分解する酵素であるヒアルロニダーゼで筋肉を前処理し、細胞外マトリックスの粘度を低下させ、ＤＮＡの拡散を促進することで増強される。Yamazaki et al. 2011 （上記）;および、McMahon et al. 2001 “Optimisation of electrotransfer of plasmid into skeletal muscle by pretreatment with hyaluronidase: increased expression with reduced muscle damage” Gene Ther. 8(16):1264-70。抗体遺伝子導入については、これにより約３．５倍にｍＡｂ発現が増加し、３０μgのｐＤＮＡで３．５μｇ／ｍｌの血漿ピーク力価が達成され、コード化されたアフィマー遺伝子導入のために当業者により適合され得る。さらに別の戦略は、抗体またはカセット操作に焦点を当てている。コドン、ＲＮＡおよびリーダー配列の最適化に続いて、“最適化された”ｐＤＮＡの筋肉内電気泳動転写により、ピーク血清ｍＡｂまたはＦａｂの力価が達成された。例えば、Flingai et al. 2015 “Protection against dengue disease by synthetic nucleic acid antibody prophylaxis/immunotherapy” Sci Rep. 5:12616を参照のこと。
【０４１４】
本発明のプラスミドの目的は、核酸配列を細胞または組織に効率的に送達し、治療用アフィマー剤を発現させることである。特に、高いコピー数を達成し、プラスミド不安定性の潜在的な原因を回避し、プラスミド選択のための手段を提供することを目的とし得る。発現については、核酸カセットは、核酸カセット内にコード化されたアフィマーを発現させるために必要な要素を含む。発現は、挿入された遺伝子、核酸配列または核酸カセットをプラスミドとともに効率的に転写することを含む。したがって、いくつかの面では、アフィマー剤のためのコード化配列を含む発現カセットを含むコード化されたアフィマー構築物を発現するためのプラスミドが提供される；転写ユニットとも呼ばれる。プラスミドがエピトープ発現に適した環境に置かれると、転写ユニットは、アフィマー剤および構築物中にコードされた全てのものを発現する。転写ユニットは、細胞免疫応答エレメントをコードする配列と転写的に連結された転写制御配列を含む。転写制御配列は、上記のようなサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター／エンハンサー配列のようなプロモーター／エンハンサー配列を含むことができる。しかしながら、当業者は、ヒト患者細胞を含む哺乳動物細胞での発現に適した他の様々なプロモーター配列が知られており、本明細書に記載の構築物において同様に使用することができることを認識するであろう。アフィマー剤の発現レベルは、関連するプロモーターおよび関連するエンハンサーエレメントの存在および活性化に依存する。
【０４１５】
ある態様において、コード化されたアフィマー配列（所望のアフィマー剤をコードする）は、転写、翻訳、ＲＮＡ安定性および複製のための調節要素（すなわち、転写制御配列を含む）を含む発現プラスミドにクローニングすることができる。このような発現プラスミドは当技術分野でよく知られており、当業者であれば、インビボで組換えアフィマー剤を産生するための適切な発現構築物を設計することができるであろう。
【０４１６】
ミニサークル
ミニサークル（ｍｃＤＮＡ）をベースとした抗体遺伝子導入は、インビボでの組織へのコード化されたアフィマーの送達にも適合させることができる。特定の状況下では、非ウイルス性遺伝子導入に用いられるプラスミドＤＮＡは、許容できない炎症反応を引き起こす可能性がある。このような場合、免疫毒性応答は、主に、プラスミドＤＮＡの細菌伝播後のプラスミド上の非メチル化ＣｐＧモチーフおよびそれに関連する刺激配列の存在に起因する。インビトロでのＤＮＡの単純なメチル化は、炎症反応を減らすのに十分であるかもしれないが、遺伝子発現の低下をもたらす可能性がある。クローニングアウト（cloning out）によるＣｐＧアイランドの除去、または非必須配列の除去は、炎症反応を軽減するための成功した手法である。Yew et al. 2000 “Reduced inflammatory response to plasmid DNA vector by elimination and inhibition of immunostimulatory CpG motifs” Mol Ther 1(3), 255-62。
【０４１７】
細菌のＤＮＡには、哺乳動物のＤＮＡの平均４倍以上のＣｐＧアイランドが含まれるので、プラスミド産生の過程で遺伝子送達ベクターから、複製起点および抗生物質耐性遺伝子などの細菌の制御領域を完全に除去することが良好な解決策である。したがって、“親”プラスミドは、一般に送達されるべき遺伝子（この場合、コード化されたアフィマーコーディング配列）およびその発現に適した制御領域を含む“ミニサークル”と、一般に親プラスミドの残部を含むミニプラスミドとに組み換えられる。
【０４１８】
細菌配列の除去は、適切な−好ましくは哺乳動物の−制御領域の下で遺伝子発現要素のみからなるスーパーコイル状のＤＮＡミニサークルを作製しながら、可能な限り最小の切除部位を用いて、効率的に行う必要がある。ミニサークル産生のためのいくつかの技術は、ミニサークルＤＮＡを産生するために、細菌ファージラムダ（λ）インテグラーゼ媒介組換えを用いる。例えば、Darquet, et al. 1997 Gene Ther 4(12): 1341-9；Darquet et al. 1999 Gene Ther 6(2): 209-18；および、Kreiss, et al. 1998 Appl Micbiol Biotechnol 49(5):560-7を参照のこと。
【０４１９】
したがって、本明細書に記載の核酸構築物の態様は、ミニサークルＤＮＡの形態で処理され得る。ミニサークルＤＮＡは、すべての原核生物ベクター部分から遊離した小さな（２〜４ｋｂ）環状プラスミド誘導体に相当する。ミニサークルＤＮＡベクターは、細菌のＤＮＡ配列を含まないため、異物として認識されにくく、破壊されにくい。その結果、これらのベクターは、特定の従来のプラスミドと比較して、より長い期間発現することができる。ミニサークルのサイズが小さいことはまた、それらのクローニング能力が拡張され、細胞への送達が容易になる。ミニサークルＤＮＡを産生するためのキットは、当技術分野で知られており、市販されている(System Biosciences、Inc., Palo Alto、Calif.)。ミニサークルＤＮＡに関する情報は、Dietz et al., Vector Engineering and Delivery Molecular Therapy (2013); 21 8, 1526-1535 and Hou et al., Molecular Therapy-Methods & Clinical Development, Article number: 14062 (2015) doi:10.1038/mtm.2014.62に記載されている。ミニサークルに関する詳細については、Chen Z Y, He C Y, Ehrhardt A, Kay M A. Mol Ther. 2003 September; 8(3):495-500 および Minicircle DNA vectors achieve sustained expression reflected by active chromatin and transcriptional level. Gracey Maniar L E, Maniar J M, Chen Z Y, Lu J, Fire A Z, Kay M A. Mol Ther. 2013 January; 21(1):131-8に記載されている。
【０４２０】
限定されない例として、ミニサークルＤＮＡベクターは、以下のようにして作製することができる。コード化されたアフィマーコーディング配列を、その発現のための調節要素とともに含む発現カセットは、リコンビナーゼの結合部位に隣接している。リコンビナーゼをコードする配列は、発現カセットの外側に位置し、誘導性発現のための要素（例えば、誘導性プロモーターなど）を含む。リコンビナーゼの発現が誘導されると、ベクターＤＮＡが組み換えられ、その結果、２つの異なる環状ＤＮＡ分子が生じる。環状ＤＮＡ分子の１つは比較的小さく、コード化されたアフィマーの発現カセットを含むミニサークルを形成している；このミニサークルＤＮＡベクターには、細菌のＤＮＡ配列がない。２つ目の環状ＤＮＡ配列は、細菌配列およびリコンビナーゼをコードする配列を含む残りのベクター配列を含む。次に、コード化されたアフィマー配列を含むミニサークルＤＮＡを別個に単離し、精製することができる。ある態様において、ミニサークルＤＮＡベクターは、pBAD.φ.C31.hFIXおよびpBAD.φ.C31.RHBに類似したプラスミドを用いて作製され得る。例えば、Chen et al. (2003) Mol. Ther. 8:495-500参照のこと。
【０４２１】
ミニサークルＤＮＡベクターを作製するために用いられ得る例示的なリコンビナーゼには、ストレプトミセス・バクテリオファージφ３１インテグラーゼ、Ｃｒｅリコンビナーゼおよびλインテグラーゼ／ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶ複合体が含まれるが、これらに限定されない。これらのリコンビナーゼの各々は、異なる部位間の組換えを触媒する。例えば、φ３１インテグラーゼは、対応するａｔｔＰおよびａｔｔＢ部位間の組換えを触媒し、Ｃｒｅリコンビナーゼは、ｌｏｘＰ部位間の組換えを触媒し、λインテグラーゼ／ＤＮＡトポイソメラーゼＩＶ複合体は、バクテリオファージλａｔｔＰおよびａｔｔＢ部位間の組換えを触媒する。ある態様において、例えば、φ３１インテグラーゼを用いた場合、またはλタンパク質の不存在下でのλインテグラーゼを用いた場合のように、リコンビナーゼは、環状生成物のユニークな集団、したがって高い収率を得るために非可逆的反応を媒介する。他の態様において、例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼを用いて、またはλタンパク質の存在下でλインテグラーゼを用いて、リコンビナーゼは可逆的反応を媒介して、環状生成物の混合物を生成し、したがって収率を低下させる。Ｃｒｅリコンビナーゼによる可逆的反応は、変異型ｌｏｘＰ７１およびｌｏｘＰ６６部位を用いることによって操作でき、これらの部位は、高効率で組み換えられ、ミニサークル分子上の機能的に障害されたＰ７１／６６部位およびミニサークル分子上の野生型ｌｏｘＰ部位を生じさせ、それによって、ミニサークルＤＮＡ産物の生産に向けて平衡をシフトさせることができる。
【０４２２】
公開された米国特許出願第２０１７０３４２４２４号はまた、組換え部位で組換えを引き起こす酵素に曝露され、それにより、（ｉ）コード化されたアフィマー配列を含むミニサークル、および（ｉｉ）親プラスミドの残部を含むミニプラスミドを形成する親プラスミドを利用するシステムを記載している。一方の組換え部位は、その酵素との反応効率が野生型部位よりも低いように５’末端で修飾され、他方の組換え部位は、その酵素との反応効率が野生型部位よりも低いように３’末端で修飾され、他方の組換え部位は、その酵素との反応効率が野生型部位よりも低いように３'末端で修飾され、いずれの修飾部位も組換え後のミニサークル内に位置している。これにより、ミニサークルの形成が有利になる。
【０４２３】
ｃ．ＲＮＡを介したコード化されたアフィマー遺伝子導入
本発明のコード化されたＰＤ−Ｌ１アフィマー剤の例示的な核酸またはポリヌクレオチドとしては、リボ核酸（ＲＮＡ）、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、スレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロック核酸（ＬＮＡ；β−Ｄ−リボ配置を有するＬＮＡ、α−Ｌ−リボ配置を有するα−ＬＮＡ（ＬＮＡのジアステレオマー）、２’−アミノ官能基を有する２’−アミノ−ＬＮＡ、および２’−アミノ官能基を有する２’−アミノ−α−ＬＮＡを含む）、エチレン核酸（ＥＮＡ）、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）またはそれらのハイブリッドもしくは組み合わせが含まれるが、これらに限定されない
【０４２４】
ｍＲＮＡは、本発明のコード化されたアフィマー構築物の送達のために当業者によって適応され得る抗体遺伝子導入のための新たなプラットフォームを提示する。現在の結果はかなり異なっているが、特定の例では、ｍＲＮＡ構築物は、生成された血清ｍＡｂ力価の点でウイルスベクターに匹敵し得る。レベルは、ｍＲＮＡ投与後数時間以内に治療に関連する範囲にあり、ＤＮＡと比較して速度が顕著に変化した。脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）をｍＲＮＡトランスフェクションに使用することは、ＤＮＡに一般的に必要とされる物理的な方法ではなく、ある態様において、適用範囲に向けて顕著な利点を提供できる。
【０４２５】
Wolffら（1990年、上記）の試験では、ｐＤＮＡに加えて、インビトロ転写（ＩＶＴ）ｍＲＮＡの筋肉内注射も、コードされたタンパク質の局所的な発現をもたらすことを見い出した。当時、ｍＲＮＡは安定性が低いため、ＤＮＡほど積極的に用いられなかった。したしかし、ここ数年の進歩により、ｍＲＮＡはＤＮＡやウイルスベクターに追いつき、遺伝子導入のツールとして利用できるようになった。Sahin et al. (2014) “mRNA-based therapeutics: developing a new class of drugs” Nat Rev Drug Discov. 13(10):759-80に記載。概念的には、これらの発現プラットフォームとの間にはいくつかの相違点がある。ｍＲＮＡは、機能するために核に入る必要はない。細胞質に達すると、ｍＲＮＡは即時翻訳される。ｍＲＮＡベースの治療薬は、ＤＮＡまたはウイルスベクターを介した遺伝子導入と比較して、一過性に発現し、宿主ゲノムへの挿入変異誘発のリスクがない。ｍＲＮＡの生成は、比較的簡単で安価である。投与に関しては、エレクトロポレーションを用いてｍＲＮＡの取り込みを促進することができる。Broderick et al. 2017 “Enhanced delivery of DNA or RNA vaccines by electroporation” Methods Mol Biol. 2017;1499:193-200。しかしながら、ほとんどの焦点は、非物理的トランスフェクション方法に移っている。実際、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を含む様々なｍＲＮＡ複合製剤が開発されており、これは、様々な組織への投与に安全で非常に効率的なｍＲＮＡ担体であることが証明されている。すなわち、Pardi et al. 2015 “Expression kinetics of nucleoside-modified mRNA delivered in lipid nanoparticles to mouse by various routes” J Control Release 217:345-51。この進歩に伴い、ＩＶＴ ｍＲＮＡは臨床評価の段階に達している。
【０４２６】
Beissertらの、ＷＯ２０１７１６２２６６ “RNA Replicon for Versatile and Efficient Gene Expression”には、本発明のアフィマーの効率的な発現に適する薬剤および方法、例えば、腫瘍の予防および治療のための免疫療法に適した薬剤および方法が記載されている。例えば、アフィマー剤のコード配列は、アルファウイルス５’複製認識配列由来のような５’複製認識配列を含むＲＮＡレプリコンとして提供することができる。ある態様において、ＲＮＡレプリコンは、（改変された）５’複製認識配列と、アフィマー剤をコード化するオープンリーディングフレームを含み、特に、５’複製認識配列とオープンリーディングフレームとが重複しないような５’複製認識配列の下流に位置し、例えば、５’複製認識配列は、機能的な開始コドンを含まず、ある態様において、いかなる開始コドンも含まない。最も好ましくは、アフィマー剤をコード化するオープンリーディングフレームの開始コドンは、ＲＮＡレプリコンの５’→３’方向にある。
【０４２７】
ある態様において、免疫活性化を防ぐために、修飾ヌクレオシドをインビトロで転写されたｍＲＮＡに組み込むことができる。ある態様において、ＩＶＴ ＲＮＡは、５’キャップされたＩＶＴ、例えば、ｍ７Ｇ５’ｐｐｐ５’Ｇ２’−Ｏ−Ｍｅｔ−キャップされたＩＶＴであり得る。修飾されたｍＲＮＡの効率的な翻訳は、二本鎖ＲＮＡを除去することによって確実にされ得る。さらに、５’および３’ＵＴＲおよびポリ（Ａ）テールを最適化して、細胞内安定性および翻訳効率を改善することができる。例えば、Stadler et al. (2017) Nature Medicine 23:815−817 および Kariko et al. WO/2017/036889 “Method for Reducing Immunogenicity of RNA”を参照のこと。
【０４２８】
ある態様において、ＰＤ−Ｌ１アフィマー剤をコードするｍＲＮＡは、本明細書に記載の少なくとも１つの化学修飾を含んでいてよい。限定されない例としては、化学修飾は、１−メチルシュードウリジン、５−メチルシトシンまたは１−メチルシュードウリジンおよび５−メチルシトシンであり得る。ある態様において、インビトロ転写（ＩＶＴ）酵素合成法のみを用いて作製される、本発明の１以上のＰＤ−Ｌ１アフィマー剤をコードする直鎖ポリヌクレオチドは、“ＩＶＴポリヌクレオチド”と呼ばれる。ＩＶＴポリヌクレオチドを製造する方法は当技術分野で知られており、ＰＣＴ出願ＷＯ２０１３／１５１６６６に記載されており、その内容全体は引用により本明細書に包含される。
【０４２９】
別の態様において、サイズおよび／または化学修飾パターン、化学修飾位置、化学修飾パーセントまたは化学修飾集団およびそれらの組み合わせが異なる部分または領域を有する本発明のＰＤ−Ｌ１アフィマー剤をコードするポリヌクレオチドは、“キメラポリヌクレオチド”として知られている。本発明による“キメラ”は、２つまたはそれ以上の不一致または不均一な部分または領域を有する物質である。本明細書で用いる、ポリヌクレオチドの“部分”または“領域”は、ポリヌクレオチドの全長よりも短いポリヌクレオチドの任意の部分として定義される。このような構築物は、例えばＰＣＴ出願ＷＯ２０１５／０３４９２８に教示されている。
【０４３０】
さらに別の態様において、環状である本発明のポリヌクレオチドは、“環状ポリヌクレオチド”または“ｃｉｒｃＰ”として知られている。本明細書で用いる“環状ポリヌクレオチド”または“ｃｉｒｃＰ”は、実質的にＲＮＡのように作用し、かつＲＮＡの性質を有する一本鎖の環状ポリヌクレオチドを意味する。用語“環状”はまた、ｃｉｒｃＰの任意の二次構造または三次構造を包含することを意味する。そのような構造は、例えばＰＣＴ出願ＷＯ２０１５／０３４９２５およびＷＯ２０１５／０３４９２８に教示されており、それぞれの内容全体は、引用により本明細書に包含される。
【０４３１】
本発明のＰＤ−Ｌ１アフィマー剤をコードするために用いられ得る例示的なｍＲＮＡ（および他のポリヌクレオチド）は、例えばＰＣＴ公報ＷＯ２０１７/０４９２７５、ＷＯ２０１６/１１８７２４、ＷＯ２０１６/１１８７２５、ＷＯ２０１６/０１１２２６、ＷＯ２０１５/１９６１２８、ＷＯ/２０１５/１９６１３０、ＷＯ/２０１５/１９６１１８、ＷＯ/２０１５/０８９５１１およびＷＯ２０１５/１０５９２６（後に“Polynucleotides for the In vivo Production Of Antibodies”と題されたもの）の明細書および図面から適合させることができ、これらの各々は、引用により本明細書に包含される。
【０４３２】
下記の通り、エレクトロポレーションは、ｍＲＮＡまたは他のポリヌクレオチドを細胞に導入するための１つの例示的な方法である。
【０４３３】
脂質含有ナノ粒子組成物は、種々のＲＮＡ（および本明細書に記載の関連ポリヌクレオチド）の細胞および／または細胞内区画への輸送ビークルとして有効であることが証明されている。これらの組成物は、一般に、１以上の“カチオン性”および／またはイオン化可能脂質、多価不飽和脂質を含むリン脂質、構造脂質（例えば、ステロール）およびポリエチレングリコールを含む脂質（ＰＥＧ脂質）を含む。カチオン性および／またはイオン化可能脂質は、例えば、容易にプロトン化され得るアミン含有脂質を含む。
【０４３４】
ｄ．コード化されたアフィマー構築物の標的細胞への送達
遺伝子送達システムの宿主細胞への導入は、当業者に知られている様々な方法によって実施可能である。
【０４３５】
本発明の遺伝子送達システムがウイルスベクター構築に基づいて構築される場合、送達は、当技術分野で知られている従来の感染方法として実施され得る。
【０４３６】
ウイルスおよび非ウイルスの両方のコード化されたアフィマー構築物の送達を増強するための物理的方法としては、エレクトロポレーション(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982);および、Tur-Kaspa et al., Mol. Cell Biol., 6:716-718(1986))、遺伝子銃（Yang et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 87:9568-9572 (1990)）（ここで、ＤＮＡは（例えば、金）粒子にロードされ、細胞へのＤＮＡの浸透を達成させる）、ソノポレーション、マグネトフェクション、流体送達等が挙げられ、これらの全ては当業者には知られている。
【０４３７】
エレクトロポレーション
ここ数年で、インビボでのタンパク質産生に利用されるプラスミドＤＮＡ送達技術に大きな進歩があった。これには、ヒト細胞での発現のためのコドン最適化、ｍＲＮＡの安定性を向上させるためとリボソームレベルでのより効率的な翻訳のためのＲＮＡ最適化、翻訳効率を向上させるための特定のリーダー配列の付加、インビボでの生産をさらに向上させるための合成挿入体（インサート）の生成、およびインビボでの送達を向上させるための改良された適応型エレクトロポレーション（ＥＰ）送達プロトコールの使用が含まれる。ＥＰは、ＤＮＡがより効率的に細胞に入るのを可能にする電場を生成することにより、プラスミドＤＮＡの送達を支援する。インビボエレクトロポレーションは、多くの異なる組織へのプラスミドＤＮＡの効率的な送達のために成功裏に用いられている遺伝子送達技術である。Kimらの、“Gene therapy using plasmid DNA-encoded anti-HER2 antibody for cancers that overexpress HER2” (2016) Cancer Gene Ther. 23(10): 341-347は、血清中での抗体の高持続的発現をもたらすプラスミドの筋肉内注射およびインビボエレクトロポレーションのためのベクターおよびエレクトロポレーションシステムを教示している。Kimらのプラスミドおよびエレクトロポレーションシステムは、本発明のコード化されたＰＤ−Ｌ１結合アフィマーを発現するためのプラスミドのインビボ送達に容易に適合させることができる。
【０４３８】
従って、本発明の特定のいくつかの態様では、コード化アフィマー構築物は、エレクトロポレーションを介して標的細胞に導入される。
【０４３９】
エレクトロポレーションを介した組成物の投与は、哺乳動物の所望の組織に、細胞膜に可逆性細孔を形成させるのに有効なエネルギーのパルスを送達するように構成され得るエレクトロポレーション装置を用いて達成されてもよく、好ましくは、エネルギーのパルスは、使用者によって入力されるプリセット電流と同様の定電流である。エレクトロポレーション装置は、エレクトロポレーション構成要素と、電極アセンブリまたはハンドルアセンブリとを含んでいてよい。エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーション装置の様々な要素のうちの１以上を含み、組み込んでもよい：コントローラ、電流波形発生器、インピーダンステスター、波形ロガー、入力エレメント、ステータスレポートエレメント、通信ポート、メモリ構成要素、電源および電源スイッチを含む。エレクトロポレーションは、プラスミドによる細胞のトランスフェクションを容易にするために、インビボエレクトロポレーション装置、例えばCELLECTRA EPシステム（VGX Pharmaceuticals、Blue Bell、Pa.）またはElgenエレクトロポレーター（Genetronics、San Diego、California）を用いて達成されてもよい。
【０４４０】
エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーション装置の１つの要素として機能してもよく、他の要素は、エレクトロポレーション構成要素とは別個の要素（または構成要素）であり、エレクトロポレーション構成要素と通信している。該エレクトロポレーション構成要素は、エレクトロポレーション装置の２以上の要素として機能してもよく、他の要素は、エレクトロポレーション構成要素とは別個のエレクトロポレーション装置のさらに他の要素と通信することができる。１つの電気機械的または機械的装置の一部として存在するエレクトロポレーション装置の要素は、該要素が１つの装置として機能し得るか、互いに通信する別個の要素として機能し得るため、特に限定されない。エレクトロポレーション構成要素は、所望の組織に定電流を生成するエネルギーのパルスを送達することができ、フィードバック機構を含んでいてもよい。電極アセンブリは、空間的に配置された複数の電極を有する電極アレイを含んでもよく、ここで、電極アセンブリは、エレクトロポレーション構成要素からエネルギーのパルスを受け取り、それを電極を介して所望の組織に送達する。複数の電極のうちの少なくとも１つは、エネルギーのパルスの送達中に中性であり、所望の組織内のインピーダンスを測定し、エレクトロポレーション構成要素にインピーダンスを伝達する。フィードバック機構は、測定されたインピーダンスを受け取り、一定の電流を維持するようにエレクトロポレーション構成要素によって送達されるエネルギーのパルスを調整してもよい。
【０４４１】
複数の電極は、分散パターンでエネルギーのパルスを送達してもよい。複数の電極は、プログラムされたシーケンス下での電極の制御を介して、分散型パターンでエネルギーのパルスを送達してもよく、プログラムされたシーケンスは、使用者によってエレクトロポレーション構成要素に入力される。プログラムされたシーケンスは、連続して送達される複数のパルスを含んでいてよく、ここで、複数のパルスの各パルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を有する少なくとも２つの活性電極によって送達され、複数のパルスの後続のパルスは、インピーダンスを測定する１つの中性電極を備えた少なくとも２つの活性電極のうちの異なる１つの活性電極によって送達される。
【０４４２】
フィードバック機構は、ハードウェアまたはソフトウェアのいずれかによって実行され得る。フィードバック機構は、アナログ閉ループ回路によって実行され得る。フィードバックは、５０μｓ、２０μｓ、１０μｓまたは１μｓごとに発生するが、いくつかの態様において、リアルタイムフィードバックまたは瞬時（すなわち、応答時間を決定するために利用可能な技術によって決定される実質的に瞬時）である。中性電極は、所望の組織内のインピーダンスを測定し、そのインピーダンスをフィードバック機構に伝達することができ、フィードバック機構は、インピーダンスに応答して、予め設定された電流と同様の値で定電流を維持するようにエネルギーのパルスを調整する。フィードバック機構は、エネルギーのパルスの供給中、連続的かつ瞬時に定電流を維持し得る。
【０４４３】
本発明のコード化されたアフィマー構築物の送達を容易にし得るエレクトロポレーション装置およびエレクトロポレーション方法の例としては、米国特許第７，２４５，９６３号；同第６，３０２，８７４号；同第５，６７６，６４６号；同第６，２４１，７０１号；同第６，２３３，４８２号；同第６，２１６，０３４号；同第６，２０８，８９３号；同第６，１９２，２７０号；同第６，１８１，９６４号；同第６，１５０，１４８号；同第６，１２０，４９３号；同第６，０９６，０２０号；同第６，０６８，６５０号；および同第５，７０２，３５９号に記載されているものが含まれ、これらの内容全体は、引用により本明細書に包含される。エレクトロポレーションは、低侵襲装置を介して実施されてもよい。
【０４４４】
ある態様において、エレクトロポレーションは、低侵襲エレクトロポレーション装置（“ＭＩＤ”）を用いて実施される。装置は、中空針、ＤＮＡカセットおよび液体送達手段を含んでいてよく、ここで、該装置は、、コード化されたアフィマー核酸構築物を同時に（例えば、自動的に）体組織への針の挿入中に体組織に注入するように、使用中の液体送達手段を作動させるように適合される。これは、針が挿入されている間にＤＮＡおよび関連する液体を徐々に注入する能力が、体組織を通して液体のより均等な分布をもたらすという利点を有する。注入中に発生する痛みは、注入されるＤＮＡがより広い領域に分布するために軽減され得る。
【０４４５】
ＭＩＤは、針を使用せずに組織にコード化されたアフィマー核酸構築物を注入できる。ＭＩＤは、核酸が組織の表面を貫通し、下にある組織および／または筋肉に入るような力で、コード化されたアフィマー核酸構築物を小さな流れまたはジェットとして注入し得る。小流またはジェットの背後にある力は、マイクロオリフィスを介した二酸化炭素などの圧縮ガスの一瞬での膨張によって提供され得る。低侵襲エレクトロポレーション装置およびそれを使用する方法の例は、公開された米国特許出願第２００８０２３４６５５号；米国特許第６，５２０，９５０号；同第７，１７１，２６４号；同第６，２０８，８９３号；同第６，００９，３４７号；同第６，１２０，４９３号；同第７，２４５，９６３号；同第７，３２８，０６４号；および、同第６，７６３，２６４号に記載されており、各々その内容は引用により本明細書に包含される。
【０４４６】
ＭＩＤは、組織を痛みを伴わず貫通する液体の高速ジェットを生成する注射器を含んでいてもよい。そのような無針注射器は市販されている。本明細書で利用可能な無針注射器の例としては、米国特許第３，８０５，７８３号；同第４，４４７，２２３号；同第５，５０５，６９７；および、同第４，３４２，３１０号に記載されているものであり、各々その内容は引用により本明細書に包含される。
【０４４７】
直接的または間接的なエレクトロトランスポートに適した形態の所望のコード化されたアフィマー核酸構築物は、通常、組織への核酸の浸透を引き起こすのに十分な力で、薬剤のジェットの送達を作動させるように組織表面を注射器と接触させることにより、無針注射器を用いて、処置されるべき組織に導入（例えば、注射）され得る。例えば、処置されるべき組織が粘膜、皮膚または筋肉である場合、薬剤は、角質層を通って真皮層に、または下層の組織および筋肉に、それぞれ薬剤の浸透を引き起こすのに十分な力で、粘膜または皮膚の表面に向かって噴射される。無針注射器は、腫瘍への送達（腫瘍内送達）を含むあらゆるタイプの組織へのコード化されたアフィマー核酸構築物の送達に好適である。
【０４４８】
ＭＩＤは、組織をエレクトロポレーションする針電極を有していてもよい。複数の電極アレイ内の複数の電極の対間でパルスを発生させることにより、例えば、長方形または正方形のパターンで設定された複数の電極の対間でのパルスの結果よりも改善された結果が得られる。例えば、米国特許第５，７０２，３５９号に記載の、“Needle Electrodes for Mediated Delivery of Drugs and Genes”と題された針のアレイは、治療中に複数対の針をパルスすることができる針のアレイである。完全に記載されているかのように引用により本明細書に包含されるその出願では、針は、円形アレイに配置されていたが、針電極の対向する対の間のパルスを可能にするコネクタおよびスイッチング装置を有する。コード化されたアフィマー核酸構築物を細胞に送達するための一対の針電極を使用することができる。このような装置およびシステムは、米国特許第６，７６３，２６４号に記載されており、その内容は引用により本明細書に包含される。あるいは、通常の注射針に似た単一の針でＤＮＡの注入およびエレクトロポレーションを可能にし、現在使用されている装置によって送達されるものよりも低い電圧のパルスを印加し、従って患者が経験する電気感覚を軽減させる単一針装置を用いることができる。
【０４４９】
ＭＩＤは、１以上の電極アレイを含み得る。アレイは、同じ直径または異なる直径の２つ以上の針を含み得る。針は、等間隔または不等間隔であり得る。針は、０．００５インチから０．０３インチの間、０．０１インチから０．０２５インチの間、または０．０１５インチから０．０２０インチの間であってよい。針は、０．０１７５インチであってもよい。針は、０．５ｍｍ、１．０ｍｍ、１．５ｍｍ、２．０ｍｍ、２．５ｍｍ、３．０ｍｍ、３．５ｍｍ、４．０ｍｍまたはそれ以上の間隔で配置され得る。
【０４５０】
ＭＩＤは、パルス発生器と、コード化されたアフィマー核酸構築物およびエレクトロポレーションパルスを単一ステップで送達する２本以上の針ワクチン注射器とから構成され得る。パルス発生器は、フラッシュカードで操作されるパーソナルコンピュータを介して、パルスおよび注入パラメータの柔軟なプログラミングを可能にし、エレクトロポレーションおよび患者データの包括的な記録および保存を可能にし得る。パルス発生器は、短時間の間に様々なボルトパルスを送達することができる。例えば、パルス発生器は、持続時間が１００ｍｓの３回の１５ボルトパルスを送達することができる。そのようなＭＩＤの例は、米国特許第７，３２８，０６４号に記載されているイノビオバイオメディカルコーポレーション（Inovio Biomedical Corporation）によるによるエルゲン１０００（Elgen 1000）システムであり、その内容は引用により本明細書に包含される。
【０４５１】
ＭＩＤは、体内の選択された組織の細胞へのコード化されたアフィマー核酸構築物などの高分子の導入を容易にする、モジュラー電極システムである、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ（Inovio Pharmactionals, Plymousth Metriphationm Pa.）の装置およびシステムであってもよい。モジュラー電極システムは、複数の針電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電性リンクを提供する電気コネクタ；および電源、を含み得る。操作者（オペレーター）は、支持構造体に取り付けられた複数の針電極を把持し、それらを身体または植物の選択された組織中へ確実に挿入することができる。その後、皮下注射器によって核酸が選択された組織へと供給される。プログラム可能な定電流パルスコントローラが作動され、定電流電気パルスが複数の針電極に対して印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞中への核酸の導入を容易にする。定電流パルスにより組織内の電力消費を制限することで、細胞の過熱による細胞死を最小限に抑えることができる。Cellectraの装置およびシステムは、米国特許第７，２４５，９６３号に記載されており、その内容は引用により本明細書に包含される。
【０４５２】
ＭＩＤは、エルゲン１０００システム（Inovio Pharmuctionals）であってもよい。エルゲン１０００システムは、中空針および流体送達手段を提供する装置を含み得る。ここで、装置は、使用中の流体送達手段を作動させて、流体である本明細書に記載のコード化されたアフィマー核酸構築物を、体組織への針の挿入中にそこに同時に（例えば自動的に）注入するように適合されている。利点は、針が挿入されている間に徐々に流体を注入する能力が、身体組織全体に流体をより均一に分配することにつながることである。また、注入される流体の量がより広い領域に分布するため、注入中に経験する痛みが軽減されるとも考えられる。
【０４５３】
さらに、流体の自動注入により、注入された液体の実際の用量の自動監視および登録が容易になる。このデータは、所望により、文書化の目的のために制御装置によって保存することができる。
【０４５４】
注入の速度は線形または非線形のいずれかであり得て、注射は、針が治療対象の皮膚を通って挿入された後、そして針が身体組織内にさらに挿入されている間に実施され得ることが理解されるであろう。
【０４５５】
本発明の装置によって流体が注入され得る適切な組織は、単なる例として、腫瘍組織、皮膚および他の上皮組織、肝臓組織および筋肉組織が挙げられる。
【０４５６】
この装置はさらに、体組織への針の挿入をガイドするための針挿入手段を含む。流体の注入速度は、針の挿入速度によって制御される。これは、針の挿入と流体の注入の両方を制御することができ、そのような挿入の速度を必要に応じて注入速度に一致させることができるという利点がある。また、使用者（ユーザー）が装置を操作しやすくなる。所望により、体組織に針を自動的に挿入するための手段を提供することができる。
【０４５７】
使用者は、流体の注入をいつ開始するかを選択することができる。しかしながら、理想的には、注射は、針の先端が標的組織に到達したときに開始され、装置は、流体の注射を開始するのに十分な深さまで針が挿入されたことを感知するための手段を含み得る。これは、針が所望の深さ（通常は、筋肉組織が始まる深さ）に達したときに、流体の注入を自動的に開始するように促すことができることを意味する。筋肉組織が始まる深さは、例えば、針が皮膚層を通過するのに十分であると見なされる４ｍｍの値などの予め設定された針の挿入深さであると見なすことができる。
【０４５８】
感知手段は、超音波プローブを含み得る。感知手段は、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知するための手段を含み得る。この場合、手段は、体組織内での針の深さを記録するのではなく、針が別のタイプの体組織から筋肉に移動する際に、インピーダンスまたは抵抗の変化を感知するように適合され得る。これらの選択肢のいずれかは、注射が開始され得ることを感知する手段を動作させるための比較的正確で簡単な手段を提供する。針の挿入深さは、所望によりさらに記録することができ、針の挿入深さが記録されているときに注入される流体の量が決定されるように、流体の注入を制御するために用いられ得る。
【０４５９】
装置はさらに、以下を含み得る：針を支持するための基部；および、基部を収容するためのハウジング；ここで、基部は、該基部がハウジングに対して第１の後方位置にあるときに針がハウジング内に引き込まれ、基部がハウジング内で第２の前方位置にあるときに針がハウジング外に延びるように、ハウジングに対して相対的に可動である。これは、ハウジングを患者の皮膚上に並べることができ、次いで、ハウジングをベースに対して移動させることにより、針を患者の皮膚内に挿入することができるため、使用者にとって有利である。
【０４６０】
上記のように、流体が皮膚に挿入される際に針の長さ全体にわたって均一に分布するように、制御された速度の流体注入を達成することが望ましい。流体送達手段は、制御された速度で流体を注入するように適合されたピストン駆動手段を含んでいてよい。ピストン駆動手段は、例えば、サーボモータによって作動させることができる。しかしながら、ピストン駆動手段は、ベースがハウジングに対して軸方向に移動することによって作動され得る。流体送達のための代替手段が提供され得ることが理解され得る。従って、例えば、制御された速度または制御されていない速度で流体を送達するために圧搾することができる密閉容器を、注射器およびピストンシステムの代わりに提供することができる。
【０４６１】
上記の装置は、任意のタイプの注入に使用することができる。しかしながら、エレクトロポレーションの分野で特に有用であることが想定されており、従って、針に電圧を印加するための手段をさらに含み得る。これにより、針を注射のためだけでなく、エレクトロポレーション中の電極としても使用できる。これは、注入された流体と同じ領域に電場が印加されることを意味するため、特に有利である。従来、エレクトロポレーションでは、以前に注入された流体と電極を正確に位置合わせすることが非常に困難であるという問題があり、そのため、使用者は、注入された物質と電場との間の重複を保証しようとして、より広い領域に必要とされる量よりも多くの流体を注入し、より広い領域に電場を印加する傾向があった。本発明を用いて、電場と流体との間の良好な適合を達成しながら、注入される流体の量および印加される電場の大きさの両方を低減することができる。
【０４６２】
Draghia-Akliらによる米国特許第７，２４５，９６３号は、体内または植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を容易にするためのモジュラー電極システムおよびそれらの使用を記載している。モジュラー電極システムは、複数の針電極；皮下注射針；プログラム可能な定電流パルスコントローラから複数の針電極への導電性リンクを提供する電気コネクタ；および電源、を含み得る。操作者（オペレーター）は、支持構造体に取り付けられた複数の針電極を把持し、それらを身体または植物の選択された組織中へ確実に挿入することができる。その後、皮下注射器によって生体分子が選択された組織へと供給される。プログラム可能な定電流パルスコントローラが作動され、定電流電気パルスが複数の針電極に対して印加される。印加された定電流電気パルスは、複数の電極間の細胞中への生体分子の導入を容易にする。米国特許第７，２４５，９６３号の内容全体は引用により本明細書に包含される。
【０４６３】
Smithらによって提出された米国特許公開第２００５／００５２６３０は、体内または植物の選択された組織の細胞への生体分子の導入を効果的に促進するために使用され得るエレクトロポレーション装置を記載している。エレクトロポレーション装置は、動作がソフトウェアまたはファームウェアによって指定される電気運動デバイス（electro−kinetic device）（“ＥＫＤデバイス”）を含む。ＥＫＤデバイスは、使用者の制御およびパルスパラメータの入力に基づいて、アレイ内の電極間でプログラム可能な一連の定電流パルスパターンを生成し、電流波形データの保存および取得を可能にする。エレクトロポレーション装置はまた、針電極のアレイを有する交換可能な電極ディスク、注射針用の中央注射チャネル、および取り外し可能なガイドディスクを含む。米国特許公報２００５/００５２６３０の内容全体を引用により本明細書中に包含させる。
【０４６４】
米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５／００５２６３０号に記載された電極アレイおよび方法は、筋肉などの組織だけでなく、他の組織または臓器にも深く浸透するように適合され得る。電極アレイの構成のために、注射針（選択された生体分子を送達するための）もまた、標的臓器内に完全に挿入され、注入は、電極対して予め画定された領域において、標的に対して垂直に投与される。米国特許第７，２４５，９６３号および米国特許公開第２００５/００５２６３号に記載されている電極は、例えば、長さが２０ｍｍであり、２１ゲージである。
【０４６５】
インビボエレクトロポレーションの使用は、腫瘍組織内でのプラスミドＤＮＡの取り込みを高め、腫瘍内での発現をもたらし、プラスミドを筋肉組織に送達し、サイトカインなどの分泌されたタンパク質の全身発現をもたらす（例えば、ＵＳ８０２６２２３を参照のこと）。ＰＤ−Ｌ１アフィマー剤導入遺伝子をインビボで細胞にエレクトロポレーションするための追加の例示的な技術、ベクターおよび装置は、ＰＣＴ公報ＷＯ／２０１７／１０６７９５、ＷＯ／２０１６／１６１２０１、ＷＯ／２０１６／１５４４７３、ＷＯ／２０１６／１１２３５９およびＷＯ／２０１４／０６６６５５に記載のものを含む。
【０４６６】
一般的には、インビボ細胞のエレクトロポレーションに必要な電場は、一般に、インビトロの細胞に必要な電場と同様の大きさである。ある態様において、電場の大きさは、およそ１０Ｖ／ｃｍから約１５００Ｖ／ｃｍ、３００Ｖ／ｃｍから約１５００Ｖ／ｃｍ、または１０００Ｖ／ｃｍから約１５００Ｖ／ｃｍの範囲である。あるいは、より低い電界強度（約１０Ｖ／ｃｍから約１００Ｖ／ｃｍ、より好ましくは約２５Ｖ／ｃｍから約７５Ｖ／ｃｍ）では、パルス長は長い。例えば、公称電界が約２５〜７５Ｖ／ｃｍの場合、パルス長は約１０ｍｓｅｃであることが好ましい。
【０４６７】
パルス長は、約１０ｓｅｃ〜約１００ｍｓｅｃとすることができる。任意の所望の数のパルスがあり得るが、一般的には、１秒間に１〜１００パルスある可能性がある。パルスセット間の遅延は、１秒などの任意の所望の時間であり得る。波形、電界強度およびパルス持続時間はまた、細胞のタイプおよびエレクトロポレーションを介して細胞に入る分子のタイプに依存してもよい。
【０４６８】
また、電気化学インピーダンス分光法（“ＥＩＳ”）を組み込んだエレクトロポレーション装置も含まれる。そのような装置は、インビボ、特に、腫瘍内エレクトロポレーション効率に関するリアルタイムの情報を提供し、条件の最適化を可能にする。ＥＩＳを組み込んだエレクトロポレーションデバイスの例は、例えば、引用により本明細書に包含されるＷＯ２０１６／１６１２０１に見出され得る。
【０４６９】
本発明のコード化されたアフィマー核酸構築物の取り込みはまた、アバランシェトランスフェクション（avalanche transfection）とも呼ばれるプラズマエレクトロポレーションによって増強され得る。すなわち、マイクロ秒の放電により、電極表面にキャビテーションマイクロバブルが発生する。磁場と組み合わされた崩壊マイクロバブルによって生じる機械的な力は、従来のエレクトロポレーションに関連する拡散媒介輸送と比較して、細胞膜を横切る輸送効率を増加させるのに役立つ。プラズマエレクトロポレーションの技術は、米国特許第７，９２３，２５１号および同第８，２８３，１７１号に記載されている。この技術はまた、細胞の形質転換のためにインビボで用いられ得る。Chaiberg, et al (2006) Investigative Ophthalmology & Visual Science 47:4083-4090; Chaiberg, et al United States Patent No 8, 101 169 Issued January 24, 2012。
【０４７０】
他の代替エレクトロポレーション技術もまた企図されている。インビボ核酸送達は、低温プラズマを用いて実施することもできる。プラズマは、物質の４つの基本状態のうちの１つであり、他の状態は固体、液体、および気体である。プラズマは、結合していない正および負の粒子の電気的に中性の媒体である（すなわち、プラズマの全体的な電荷はおよそゼロである）。プラズマは、気体を加熱したり、レーザーやマイクロ波発生器を用いて強い電磁場に曝すことで生成できる。これにより電子の数が減少または増加し、イオンと呼ばれる正または負に帯電した粒子が生成され（Luo, et al. (1998) Phys. Plasma 5:2868-2870）、存在する場合、分子結合の解離が伴う。
【０４７１】
低温プラズマ（すなわち、非熱プラズマ）は、適切な電極へのパルス高電圧信号の送達によって生成される。低温プラズマ装置は、ガスジェット装置または誘電体バリア放電（ＤＢＤ）装置の形態をとることができる。低温プラズマは、比較的低いガス温度でプラズマを提供することにより、多くの熱意と関心を集めてきた。このような温度でプラズマを提供することは、創傷治癒、抗菌プロセス、その他の様々な医療治療および滅菌を含む様々な用途にとって興味深いものである。上記の通り、低温プラズマ（すなわち、非熱プラズマ）は、適切な電極へのパルス高電圧信号の送達によって生成される。低温プラズマ装置は、ガスジェット装置、誘電体バリア放電（ＤＢＤ）装置または多周波高調波リッチ電源の形態をとってよい。
【０４７２】
誘電体バリア放電デバイスは、低温プラズマを生成するために別のプロセスに依存している。誘電体バリア放電（ＤＢＤ）装置は、誘電体層で覆われた少なくとも１つの導電性電極を含む。電気的戻り経路は、低温プラズマ処理を受けているターゲット基板（target substrate）によって提供され得るか、または電極に内蔵された接地（ground）を提供することによって形成される。誘電体バリア放電装置のエネルギーは、上記のような高電圧電源によって提供され得る。より一般的には、エネルギーは、プラズマ放電を形成するためにパルス状のＤＣ電圧の形で誘電体バリア放電装置に入力される。誘電体層の存在により、放電が導電性電極から分離され、電極エッチングおよびガス加熱が低減される。パルスＤＣ電圧は、振幅と周波数を変化させて、さまざまな動作領域を実現できる。低温プラズマ発生のこのような原理を組み込んだ任意の装置（例えば、ＤＢＤ電極装置）は、本発明の様々な態様の範囲内にある。
【０４７３】
低温プラズマは、細胞を外来核酸でトランスフェクトするために用いられてきた。特に、腫瘍細胞のトランスフェクション（例えば、Connolly, et al. (2012) Human Vaccines & Immune-therapeutics 8: 1729-1733；および、Connolly et al. (2015) Bioelectrochemistry 103: 15-21を参照のこと）。
【０４７４】
特定の例示的な態様において、本発明のＰＤ−Ｌ１アフィマー剤をコードする導入遺伝子構築物は、以下を含むエレクトロポレーション装置を用いて送達される：アプリケーター；アプリケーターから延びる複数の電極であって、該電極はカバー領域に関連付けられている；電極と電気通信する電源であって、該電源はカバー領域内の細胞に１以上のエレクトロポレーション信号を生成するように構成されている；および、電極に結合されたガイド部材、ここで該ガイド部材は、電極のカバー領域を調整するように構成されている。電極の少なくとも一部は、円錐形の配置でアプリケーター内に配置され得る。１以上のエレクトロポレーション信号は、それぞれ電場に関連付けられ得る。装置はさらに、電源および電極に結合されたポテンショメーターを含み得る。ポテンショメーターは、電場を実質的に所定の範囲内に維持するように構成され得る。
【０４７５】
１以上のエレクトロポレーション信号は、それぞれ電場に関連付けられ得る。装置は、さらに、電源および電極に結合されたポテンショメーターを含み得る。ポテンショメーターは、カバー領域内の細胞における永久的な損傷を実質的に防止し、かつ／または痛みを実質的に最小化するように、電場を所定の範囲内に維持するように構成され得る。例えば、ポテンショメーターは、電場を約１３００Ｖ／ｃｍに維持するように構成され得る。
【０４７６】
電源は、第１の電極に第１の電気信号を供給し、第２の電極に第２の電気信号を供給してもよい。第１および第２の電気信号は、ビート周波数を有する波を生成するために結合してもよい。第１および第２の電気信号は、それぞれ、単極波形および双極波形のうちの少なくとも１つを有してもよい。第１の電気信号は、第１の周波数および第１の振幅を有してもよい。第２の電気信号は、第２の周波数および第２の振幅を有してもよい。第１の周波数は、第２の周波数と異なるか、または同じであってよい。第１の振幅は、第２の振幅と異なるか、または同じであってよい。
【０４７７】
ある態様において、本発明は、腫瘍を有する対象を治療するための方法を提供し、該方法は、以下を含む：ＰＤ−Ｌ１アフィマー剤をコードするプラスミドの有効量を腫瘍に注射すること；および、腫瘍にエレクトロポレーション療法を投与すること。ある態様において、エレクトロポレーション療法はさらに、約１００マイクロ秒から約２０ミリ秒のパルス幅にわたって約２００Ｖ／ｃｍから約１５００Ｖ／ｃｍの少なくとも１つの電圧パルスを投与することを含む。
【０４７８】
ある態様において、プラスミド（または第２のエレクトロポレーションプラスミド）は、さらに、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５およびＩＬ−１２とＩＬ−１５の組合せをコードする群から選択されるような、少なくとも１つの免疫刺激性サイトカインをコードする。
【０４７９】
トランスフェクションを増強する製剤
コード化されたアフィマー核酸構築物はまた、リポソーム、好ましくはカチオン性リポソーム中にカプセル化することができる（Wong, T. K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau and Sene, Biochim。Biophys. Acta, 721:185-190 (1982);および、Nicolau et al., Methods Enzymol., 149:157-176 (1987)）またはポリマーソーム（合成リポソーム）であって、細胞膜と相互作用して融合するか、またはエンドサイトーシスを受けて細胞内への核酸の移動をもたらすことができる。ＤＮＡはまた、ポリマー（ポリプレックス）との複合体、または細胞の細胞質に直接負荷を放出することができるデンドリマーとの複合体に形成することができる。
【０４８０】
この点で有用な例示的な担体には、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）、ポリアクリレート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストランなどの微粒子が含まれる。他の例示的な担体には、非液体親水性コア（例えば、架橋された多糖またはオリゴ糖）、および任意に、リン脂質などの両親媒性化合物を含む外層を含む超分子バイオベクターを含む（例えば、米国特許第５，１５１，２５４，２５４号およびＰＣＴ出願ＷＯ９４/２００７８、ＷＯ／９４／２３７０１およびＷＯ９６／０６６３８を参照のこと）。徐放性製剤内に含まれる活性剤の量は、移植部位、放出の速度および予想される持続時間、ならびに治療または予防されるべき状態の性質に依存する。
【０４８１】
生分解性ミクロスフェア（例えば、ポリ乳酸ポリグリコレート）を組成物の担体として用いることができる。好適な生分解性ミクロスフェアは、例えば、米国特許第４，８９７，２６８号；同第５，０７５，１０９号；同第５，９２８，６４７号；同第５，８１１，１２８号；同第５，８２０，８８３号；同第５，８５３，７６３号；同第５，８１４，３４４号；同第５，４０７，６０９号および同第５，９４２，２５２号に記載されている。ＷＯ／９９ ４０９３４およびそこに引用されている文献に記載されているような改変されたＢ型肝炎コアタンパク質担体システムもまた、多くの用途に有用である。別の例示的な担体／送達システムは、米国特許第５，９２８，６４７号に記載されているような粒子−タンパク質複合体を含む担体を用いており、これは、ＰＤ−Ｌ１アフィマーのコード化配列を送達するために腫瘍内で使用された場合に付加的な利点もたらし得る。
【０４８２】
生分解性高分子ナノ粒子は、細胞への非ウイルス性核酸の移動を促進する。小さな（約２００ｎｍ）、正に帯電した（約１０ｍＶ）粒子は、カチオン性の加水分解性分解性ポリ（β−アミノエステル）およびプラスミドＤＮＡの自己集合によって形成される。
【０４８３】
ポリヌクレオチドはまた、直接マイクロインジェクション、一時的な細胞透過化（例えば、細胞透過化剤とのリプレッサーおよび／またはアクティベーターの同時投与）、膜移行ペプチドとの融合などによって細胞に投与され得る。
【０４８４】
脂質を介した核酸送達およびｍＲＮＡを含む外来核酸の発現は、インビトロおよびインビボで大成功を収めている。脂質ベースの非ウイルス製剤は、ウイルス遺伝子治療の代替手段を提供する。現在のインビボ脂質送達方法は、皮下注射、皮内注射、腫瘍内注射または頭蓋内注射を用いている。脂質製剤の進歩により、インビボでの遺伝子導入の効率が改善された（ＰＣＴ出願ＷＯ９８／０７４０８を参照）。例えば、ｌ，２−ビス（オレイルオキシ）−３−（トリメチルアンモニオ）プロパン（ＤＯＴＡＰ）およびコレステロールの等モル比からなる脂質製剤は、全身的なインビボ遺伝子導入を有意に増強させ得る。ＤＯＴＡＰ：コレステロール脂質製剤は、“サンドイッチリポソーム”と呼ばれる独特の構造を形成している。この製剤は、凹凸のある二層構造または“花瓶状（vase）”構造の間にＤＮＡを“サンドイッチ”することが報告されている。これらの脂質構造の有益な特性には、正のｐ、コレステロールによるコロイド安定化、二次元核酸パッキングおよび血清安定性の増加が含まれる。
【０４８５】
カチオン性リポソーム技術は、正に荷電した頭部基および疎水性脂質の尾部（tail）を有する両親媒性脂質の能力に基づいており、負に荷電したＤＮＡまたはＲＮＡと結合し、一般にエンドサイトーシスによって細胞内に入る粒子を形成する。カチオン性リポソームの中には、哺乳動物細胞によるリポソームの取り込みを促進すると考えられている中性の共脂質も含まれているものがある。同様に、ポリ−ｌ−リジンおよびポリエチレン−イミンのような他の多価カチオンは、電荷相互作用を介して核酸と複合体を形成し、ＤＮＡまたはＲＮＡのナノ粒子への縮合を助け、これらは、その後、エンドソームを介した取り込みの基質となる。これらのカチオン性核酸複合体技術のいくつかは、プラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）、オリゴデオキシヌクレオチドおよび合成ＲＮＡの様々な形態との複合体を含む潜在的な臨床製品として開発されており、本発明のコード化されたアフィマー核酸構築物のための送達システムの一部として用いられる。
【０４８６】
本明細書に記載のコード化されたアフィマー核酸構築物は、細胞への取り込みを高めるのに役立つポリカチオン性分子と結合し得る。核酸構築物をポリカチオン性分子と複合化することはまた、それらのサイズが減少するように構築物をパッケージングするのを助け、これは細胞内への取り込みを助けると考えられている。エンドソームに入ると、複合体は低いｐＨのために解離し、ポリカチオン性分子がエンドソームの膜を破壊して、分解される前にＤＮＡが細胞質へ逃れるのを促進することができる。予備データは、核酸構築物の態様が、ポリカチオン性分子であるポリリジンまたはポリエチレンイミンと複合体おｗ形成したときに、ＤＣよりもＳＣへの取り込みが増強されたことを示している。
【０４８７】
核酸構築物との複合化に有用なポリカチオン性分子の一例としては、細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）が挙げられ、例としては、ポリリジン（上記）、ポリアルギニンおよびＴａｔペプチドが挙げられる。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、ＤＮＡに結合し、一旦放出されると細胞膜を通過してエンドソームから細胞質へのＤＮＡの放出を促進する小さなペプチドである。ＣＰＰの別の例は、ＭＰＧと呼ばれる２７残基のキメラペプチドに関連しており、安定した方法でｓｓ−およびｄｓ−オリゴヌクレオチドに結合し、ＤＮａｓｅによる分解から核酸を保護し、効果的にインビトロで細胞にオリゴヌクレオチドを送達する非共有複合体をもたらすこと少し前に示された（Mahapatro A, et al., J Nanobiotechnol, 2011, 9:55）。この複合体は、異なるペプチド：ＤＮＡ比、１０：１および５：１比（それぞれ１５０ｎｍおよび１ｕｍ）を調べたとき、約１５０ｎｍ〜１ｕｍの小粒子を形成した。別のＣＰＰは、修飾テトラペプチド［グアニジノカルボニルピロール（ＧＣＰ）基を含むテトラリシン（ＴＬ−ＧＣＰ）］に関連しており、これは、６．２ｋｂのプラスミドＤＮＡに高い親和性で結合し、７００−９００ｎｍの正電荷の凝集体をもたらすことが報告されている。Li et al., Agnew Chem Int Ed Enl 2015; 54(10):2941-4)。ＲＮＡはまた、インビボ送達のために、そのようなポリカチオン性分子によって複合体を形成することができる。
【０４８８】
本明細書に記載された核酸構築物と複合化され得るポリカチオン性分子の他の例としては、ＪＥＴＰＲＩＭＥ（登録商標）およびIn vivo JET（Polypus-transfection, S.A., Illkirch, France）として市販されているポリカチオン性ポリマーが挙げられる。
【０４８９】
ある態様において、本発明は、（ｉ）式（Ｉ）の化合物、リン脂質、構造脂質およびＰＥＧ脂質を含む脂質成分、および（ｉｉ）ｍＲＮＡ（または他のポリヌクレオチド）を含むナノ粒子組成物を投与することにより、ＰＤ−Ｌ１アフィマー剤をコードするｍＲＮＡ（または他のポリヌクレオチド）を患者の細胞に送達する方法であって、該投与は、該哺乳動物細胞を該ナノ粒子組成物と接触させることを含み、それにより該ｍＲＮＡ（または他のポリヌクレオチド）が該細胞に送達される、方法を企図している。
【０４９０】
例示的な態様において、ＰＥＧ脂質は、ＰＥＧ修飾ホスファチジルエタノールアミン、ＰＥＧ修飾ホスファチジル酸、ＰＥＧ修飾セラミド、ＰＥＧ修飾ジアルキルアミン、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロール、ＰＥＧ修飾ジアシルグリセロールおよびＰＥＧ修飾ジアルキルグリセロールからなる群より選択される。例示的な態様において、構造脂質は、コレステロール、フェコステロール、シトステロール、エルゴステロール、カンペステロール、スチグマステロール、ブラジカステロール、トマチジン、ウルソール酸およびα−トコフェロールからなる群より選択される。ある態様において、構造脂質はコレステロールである。
【０４９１】
例示的な態様において、リン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジン酸、２−リゾホスファチジルコリンおよびスフィンゴミエリンからなる群より選択される部位を含む。ある態様において、リン脂質は、ラウリン酸、ミリスチン酸、ミリストレイン酸、パルミチン酸、パルミトオレイン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノール酸、α−リノレン酸、エルカ酸、アラキジン酸、アラキドン酸、フィタン酸、エイコサペンタエン酸、ベヘン酸、ドコサペンタエン酸、およびドコサヘキサエン酸からなる群より選択される１以上の脂肪酸部分を含む。ある態様において、リン脂質は、１，２−ジリノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＬＰＣ）、１，２-ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ-３-ホスホコリン（ＤＭＰＣ）、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＯＰＣ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＰＰＣ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、１，２−ジウンデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＵＰＣ）、１−パルミトイル−２−オレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）、１，２−ジ−０−オクタデセニル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（1 8. 0−ジエーテルＰＣ）、１−オレイル−２−コレステリルヘミスクチノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＯＣｈｅｍｓＰＣ）、１−ヘキサデシル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（Ｃ１６ Ｌｙｓｏ ＰＣ）、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジアラチドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ME 1 6. 0 PE）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジリノレノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジアラチドノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジドコサヘキサエノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン、１，２−ジオレイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホ−ｒａｃ−（１−グリセロール）ナトリウム塩（ＤＯＰＧ）およびスフィンゴミエリンからなる群より選択される。ある態様において、リン脂質はＤＯＰＥまたはＤＳＰＣである。
【０４９２】
さらなる例示のために、リン脂質はＤＯＰＥであり得、該成分は、約３５モル％〜約４５モル％の該化合物、約１０モル％〜約２０モル％のＤＯＰＥ、約３８．５モル％〜約４８．５モル％の構造脂質、および約１．５モル％のＰＥＧ脂質を含み得る。脂質成分は、約４０モル％の前記化合物、約１５モル％のリン脂質、約４３．５モル％の構造脂質、および約１．５モル％のＰＥＧ脂質であり得る。
【０４９３】
ある態様において、ｍＲＮＡ（または他のポリヌクレオチド）をコードするＰＤ−Ｌ１アフィマー剤に対する脂質成分のｗｔ／ｗｔ比は、約５：１〜約５０：１、または約１０：１〜約４０：１である。
【０４９４】
ある態様において、該ナノ粒子組成物の平均サイズは、約５０ｎｍから約１５０ｎｍ、または約８０ｎｍから約１２０ｎｍである。
【０４９５】
ある態様において、該ナノ粒子組成物の多分散性指数は、約０から約０．１８まで、または約０．１３から約０．１７までである。
【０４９６】
ある態様において、前記ナノ粒子組成物は、約−１０〜約＋２０ｍＶのゼータ電位を有する。
【０４９７】
ある態様において、ナノ粒子組成物はさらに、３−（ジドデシルアミノ）−Ｎ１,Ｎ１，４−トリドデシル−１−ピペラジンエタナミン（KL1 0）、１４，２５−ジトリデシル−１ ５，１ ８，２１，２４−テトラアザ−オクタトリアコンタン（KL25）、１，２−ジリノレイロキシ−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノプロパン（DLin-DMA）、２，２−ジリノレイロキシ−４−ジメチルアミノメチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ-Ｋ-ＤＭＡ）、ヘプタトリアコンタ−６，９，２８，３１−テトラエン−１−９−イル４−（ジメチルアミノ）ブタノエート（ＤＬｉｎ-ＭＣ３-ＤＭＡ）、２，２−ジリノリル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ-ＫＣ２-ＤＭＡ）、１，２−ジオレイロキシ−Ｎ,Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＯＤＭＡ）および（２Ｒ）−２−（｛８−［（３Ｐ）−コレスト−５−エン−３−イルオキシ］オクチル｝オキシ）−Ｎ,Ｎ−ジメチル−３−［（９Ｚ，１ ２Ｚ）−オクタデカ−９,１２−ジエン−１−イルオキシ］プロパン−１−アミン（オクチル−ＣＬＩＮＤＭＡ（２Ｒ））からなる群より選択されるカチオン性および／またはイオン化可能な脂質を含む。
【０４９８】
ＶＩ．使用方法および医薬組成物
本発明のアフィマー剤は、癌の免疫療法などの治療的処置法を含むがこれに限定されない様々な用途において有用である。ある態様において、本発明のアフィマー剤は、免疫応答を活性化、促進、増加および／または増強し、腫瘍増殖を阻害し、腫瘍体積を減少させ、腫瘍の退縮を誘導し、腫瘍細胞のアポトーシスを増加させ、および／または腫瘍形成能を低下させるために有用である。ある態様において、本発明のポリペプチドまたは薬剤は、ウイルスなどの病原体に対する免疫療法にも有用である。ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤は、ウイルス感染を阻害し、ウイルス感染を減少させ、ウイルス感染細胞のアポトーシスを増加させ、および／またはウイルス感染細胞の死滅を増加させるのに有用である。使用方法は、インビトロ法、エクスビボ法またはインビボ法であってもよい。
【０４９９】
本発明は、アフィマー剤を用いて対象における免疫応答を活性化するための方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に記載のアフィマー剤を用いて対象における免疫応答を促進するための方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に記載のアフィマー剤を用いて、対象における免疫応答を増加させるための方法を提供する。ある態様において、本発明は、本明細書に記載のアフィマー剤を用いて、対象における免疫応答を増強する方法を提供する。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加、および／または増強は、細胞介在免疫を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、Ｔｈ１型応答を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、Ｔ細胞活性を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、ＣＤ４＋ Ｔ細胞活性を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞活性を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、ＣＴＬ活性を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、ＮＫ細胞活性を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、Ｔ細胞活性を増加させ、ＮＫ細胞活性を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、ＣＵ活性を増加させ、ＮＫ細胞活性を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、Ｔｒｅｇ細胞の抑制活性を阻害または減少させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、ＭＤＳＣの抑制活性を阻害または減少させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、メモリーＴ細胞の割合の数を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、長期的な免疫記憶機能を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、長期記憶機能を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、実質的な副作用および／または免疫毒性の証拠がないことから、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、長期記憶を増加させることを含む。ある態様において、免疫応答の活性化、促進、増加および／または増強は、サイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）またはサイトカインストームの証拠を含まない。ある態様において、免疫応答は、抗原刺激の結果である。ある態様において、抗原刺激は腫瘍細胞である。ある態様において、抗原刺激は癌である。ある態様において、抗原刺激は病原体である。ある態様において、抗原刺激は、ウイルス感染細胞である。
【０５００】
アフィマー剤が免疫応答を活性化するか、または阻害するかを決定するためのインビボおよびインビトロアッセイは、当技術分野で知られている。
【０５０１】
ある態様において、対象における免疫応答を増加させる方法は、本明細書に記載のアフィマー剤の治療的有効量を対象に投与することを含み、ここで、アフィマー剤はヒトＰＤ−Ｌ１に結合する。ある態様において、対象における免疫応答を増加させる方法は、本明細書に記載のアフィマー剤の治療的有効量を対象に投与することを含み、ここで、アフィマー剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するアフィマーポリペプチドを含むアフィマー含有抗体または受容体トラップ融合ポリペプチドである。ある態様において、対象における免疫応答を増加させる方法は、治療的有効量のコード化されたアフィマーを対象に投与することを含み、ここで、コード化されたアフィマーは、患者において発現されると、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドを含む組換えアフィマー剤ポリペプチドを生成する。
【０５０２】
本明細書に記載の方法のある態様において、腫瘍に対する持続的または長期的な免疫応答を活性化または増強する方法は、ヒトＰＤ−Ｌ１を結合するアフィマー剤の治療的有効量を対象に投与することを含む。ある態様において、腫瘍に対する持続性免疫応答を活性化または増強する方法は、本明細書に記載のアフィマー剤の治療的有効量を対象に投与することを含み、ここで、アフィマー剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するアフィマーポリペプチドを含むアフィマー含有抗体または受容体トラップ融合ポリペプチドである。ある態様において、腫瘍に対する持続性免疫応答を活性化または増強する方法は、治療的有効量のコード化されたアフィマーを対象に投与することを含み、ここで、コード化されたアフィマーは、患者において発現されると、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドを含む組換えアフィマー剤ポリペプチドを産生する。
【０５０３】
本明細書に記載の方法のある態様において、腫瘍の再発または腫瘍の再増殖を阻害する永続性のまたは長期の免疫を誘導する方法は、ヒトＰＤ−Ｌ１を結合するアフィマー剤の治療的有効量を対象に投与することを含む。ある態様において、腫瘍の再発または腫瘍の再増殖を阻害する永続性免疫を誘導する方法は、治療的有効量の本明細書に記載のアフィマー剤を対象に投与することを含み、ここで、該アフィマー剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するアフィマーポリペプチドを含むアフィマー含有抗体または受容体トラップ融合ポリペプチドである。ある態様において、腫瘍の再発または腫瘍の再増殖を阻害する永続性免疫を誘導する方法は、治療的有効量のコード化されたアフィマーを対象に投与することを含み、ここで、コード化されたアフィマーは、患者において発現されると、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドを含む組換えアフィマー剤ポリペプチドを産生する。
【０５０４】
本明細書に記載の方法のある態様において、腫瘍の再発または腫瘍の再増殖を阻害する方法は、ヒトＰＤ−Ｌ１を結合するアフィマー剤の治療的有効量を対象に投与することを含む。ある態様において、腫瘍の再発または腫瘍の再増殖を阻害する方法は、本明細書に記載のアフィマー剤の治療的有効量を対象に投与することを含み、ここで、該アフィマー剤は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するアフィマーポリペプチドを含むアフィマー含有抗体または受容体トラップ融合ポリペプチドである。ある態様において、腫瘍の再発または腫瘍の再増殖を阻害する方法は、治療的有効量のコード化されたアフィマーを対象に投与することを含み、ここで、コード化されたアフィマーは、患者において発現されると、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドを含む組換えアフィマー剤ポリペプチドを産生する。
【０５０５】
ある態様において、腫瘍は、抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーポリペプチドと共に、すなわち、アフィマー剤が二重特異的または多重特異的である場合に、アフィマー剤において提供される追加の結合体によって標的化される腫瘍抗原を発現するかまたは過剰発現する。
【０５０６】
ある態様において、腫瘍の増殖を阻害する方法は、本明細書に記載のアフィマー剤の治療的有効量を対象に投与することを含む。ある態様において、対象はヒトである。ある態様において、対象は腫瘍を有しているか、または対象は切除された腫瘍を有していた。
【０５０７】
ある態様において、腫瘍は固形腫瘍である。ある態様において、腫瘍は、結腸直腸腫瘍、膵臓腫瘍、肺腫瘍、卵巣腫瘍、肝臓腫瘍、乳房腫瘍、腎臓腫瘍、前立腺腫瘍、神経内分泌腫瘍、消化管腫瘍、黒色腫、子宮頸部腫瘍、膀胱腫瘍、神経膠芽細胞腫および頭頸部腫瘍からなる群より選択される腫瘍である。ある態様において、腫瘍は結腸直腸腫瘍である。ある態様において、腫瘍は卵巣腫瘍である。ある態様において、腫瘍は肺腫瘍である。ある態様において、腫瘍は膵臓腫瘍である。ある態様において、腫瘍はメラノーマ腫瘍（黒色腫）である。ある態様において、腫瘍は膀胱腫瘍である。
【０５０８】
さらなる例示のために、対象となるアフィマー剤を用いて、癌、例えば、骨肉腫、横紋筋肉腫、神経芽腫、腎臓癌、白血病、腎移行細胞癌、膀胱癌、ウィルムス癌、卵巣癌、膵臓癌、乳癌（トリプルネガティブ乳癌を含む）、前立腺癌、骨腫瘍、肺癌（例えば、小細胞肺癌または非小細胞肺癌）、胃癌、結腸直腸癌、子宮頸癌、滑膜肉腫、頭頸部癌、扁平上皮癌、多発性骨髄腫、腎細胞癌、網膜芽細胞腫、肝芽細胞腫、肝細胞癌、黒色腫、腎ラブドイド腫瘍、ユーイング肉腫、軟骨肉腫、脳腫瘍、神経膠芽細胞腫、髄膜腫、下垂体腺腫、前庭神経鞘腫、神経外胚葉性腫瘍、髄芽腫、星状細胞腫、未分化星状細胞腫、乏突起神経膠腫、上衣腫、脈絡叢乳頭腫、真性多血症、血小板血症、特発性骨髄線維症、軟部組織肉腫、甲状腺癌、子宮内膜癌、カルチノイド癌または肝臓癌、乳癌または胃癌に罹患している患者を処置することができる。本発明のある態様において、癌は、転移性癌、例えば、上記の多様な癌である。
【０５０９】
ある態様において、癌は血液の癌である。ある態様において、癌は、以下からなる群より選択される：急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｔ−ＡＬＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、有毛細胞性白血病、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）および皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）。
【０５１０】
本発明はまた、本明細書に記載のアフィマー剤および薬学的に許容されるビークルを含む医薬組成物を提供する。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、免疫療法における使用を見出す。ある態様において、医薬組成物は、免疫腫瘍学における使用を見いだす。ある態様において、組成物は、腫瘍増殖の阻害における使用を見い出す。ある態様において、医薬組成物は、対象（例えば、ヒト患者）における腫瘍増殖の阻害における使用を見いだす。ある態様において、組成物は、癌の処置における使用を見いだす。ある態様において、医薬組成物は、対象（例えば、ヒト患者）における癌の処置における使用を見いだす。
【０５１１】
製剤は、本発明の精製されたアフィマー剤を、薬学的に許容されるビークル（例えば、担体または賦形剤）と組み合わせることにより、貯蔵および使用のために調製される。当業者であれば、一般に、薬学的に許容される担体、賦形剤および／または安定化剤を、製剤または医薬組成物の不活性成分であると考える。
【０５１２】
ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤は、凍結乾燥され、および／または凍結保存される。ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤を含む製剤は、凍結乾燥される。
【０５１３】
好適な薬学的に許容されるビークルには、リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの非毒性緩衝液；塩化ナトリウムなどの塩類；アスコルビン酸およびメチオニンなどの抗酸化剤；オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド、ヘキサメトニウムクロライド、ベンザルコニウムクロライド、ベンゼトニウムクロライド、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノールならびにｍ−クレゾールなどの防腐剤；低分子量ポリペプチド（例えば、約１０未満アミノ酸残基）；血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、グルコース、マンノースまたはデキストリンなどの炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成性対イオン；Ｚｎ−タンパク質複合体などの金属複合体；および、ＴＷＥＥＮまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤（Remington: The Science and Practice of Pharmacy、22.sup.nd Edition、2012、Pharmaceutical Press、London.）が含まれるが、これらに限定されない。
【０５１４】
本発明の医薬組成物は、局所的または全身的な処置のために、多くの方法で投与することができる。投与は、表皮または経皮パッチ、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、ドロップ、坐薬、スプレー、液体および粉末による局所投与；ネブライザーによる、気管内および鼻腔内を含む粉末またはエアロゾルの吸入または吹き入れ(insufflation)による肺投与；経口投与；または、静脈内、動脈内、腫瘍内、皮下、腹腔内、筋肉内（例えば、注射または点滴）、または頭蓋内（例えば、髄腔内または脳室内）を含む非経腸投与が可能である。
【０５１５】
治療用製剤は、単位投与量形態であり得る。そのような製剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、粉末、顆粒剤、水性または非水性媒体中の溶液または懸濁液、あるいは坐剤が挙げられる。錠剤のような固体組成物では、主要な有効成分が医薬担体と混合される。従来の打錠成分としては、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および希釈剤（例えば、水）などが挙げられる。これらは、本発明の化合物またはその非毒性の薬学的に許容される塩の均質な混合物を含む固体の予備製剤組成物（preformulation composition）を形成するために用いられ得る。次いで、固体の予備製剤組成物は、上記のタイプの単位投与量形態に細分される。製剤または組成物の錠剤、丸剤等は、長期作用という利点をもたらす投与量形態を提供するために、コーティングされるか、他の方法では混合され得る。例えば、錠剤または丸剤（ピル）は、外側の成分によって覆われた内側の組成物を含み得る。さらに、２つの成分は、崩壊に抵抗するように働き、内部成分が胃をそのまま通過することを可能にするか、または放出の遅延を可能にする、腸溶コーティングによって分離することができる。そのような腸溶層またはコーティングには、様々な材料を用いることができ、そのような材料には、いくつかのポリマー酸ならびにポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよび酢酸セルロースなどの材料との混合物が含まれる。
【０５１６】
本明細書に記載のアフィマー剤は、マイクロカプセルに封入されてもよい。そのようなマイクロカプセルは、例えば、コアセルベーション技術または界面重合によって、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ（メチルメタシル酸）マイクロカプセルをそれぞれ、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子およびナノカプセル）中で、またはRemington: The Science and Practice of Pharmacy、22.sup.nd Edition、2012、Pharmaceutical Press、Londonに記載されているようなマクロエマルジョン中で調製される。
【０５１７】
ある態様において、医薬製剤は、リポソームと複合化した本発明のアフィマー剤を含む。リポソームを製造する方法は、当業者に知られている。例えば、いくつかのリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ−誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発によって生成することができる。リポソームは、定義された細孔サイズのフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームを得ることができる。
【０５１８】
ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤を含む徐放性製剤を製造することができる。徐放性製剤の好適な例には、アフィマー剤を含む固体疎水性ポリマーの半透過性マトリックスが含まれ、ここで、マトリックスは、成形品（例えば、フィルムまたはマイクロカプセル）の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）またはポリ（ビニルアルコール）のようなヒドロゲル、ポリ乳酸、Ｌ−グルタミン酸および７−エチル−Ｌ−グルタミン酸のコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ.ＴＭのような分解性乳酸−グリコール酸コポリマー（乳酸−グリコール酸コポリマーおよび酢酸リュープロリドからなる注入可能なマイクロスフィア）、スクロース酢酸イソブチレート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸などが挙げられる。
【０５１９】
ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤を投与することに加えて、方法または処置は、少なくとも１つの追加の免疫応答刺激剤を投与することをさらに含む。ある態様において、追加の免疫応答刺激剤としては、コロニー刺激因子（例えば、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ））、インターロイキン（例えば、ＩＬ−１、ＩＬ２、ＩＬ−３、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８）、チェックポイント阻害剤、免疫抑制機能を阻害する抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３抗体）、トール様受容体（例えば、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９）、またはＢ７ファミリーのメンバー（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６）が挙げられるが、これらに限定されない。追加の免疫応答刺激剤は、アフィマー剤の投与の前に、同時におよび／または後に投与することができる。アフィマー剤および免疫応答刺激剤を含む医薬組成物も提供される。ある態様において、免疫応答刺激剤は、１、２、３またはそれ以上の免疫応答刺激剤を含む。
【０５２０】
ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤を投与することに加えて、方法または処置は、少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。追加の治療剤は、アフィマー剤の投与の前に、同時におよび／または後に投与することができる。アフィマー剤および追加の治療剤（複数可）を含む医薬組成物も提供される。ある態様において、少なくとも１つの追加の治療剤は、１、２、３またはそれ以上の追加の治療剤を含む。
【０５２１】
２つまたはそれ以上の治療剤との併用療法は、必須ではないが、異なる作用機序で作用する薬剤を使用することが多い。異なる作用機序で作用する薬剤を用いた併用療法は、相加効果または相乗効果をもたらすことがある。併用療法は、単剤療法で用いられるよりも各薬剤の投与量を少なくすることを可能にし、それによって毒性のある副作用を減少させ、および／またはアフィマー剤の治療指数を増加させることができる。併用療法は、耐性癌細胞が発生する可能性を減少させ得る。ある態様において、併用療法は、免疫応答に影響を与える（例えば、応答を増強または活性化する）治療剤と、腫瘍／癌細胞に影響を与える（例えば、阻害または死滅させる）治療剤とを含む。
【０５２２】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、本明細書に記載のアフィマー剤と少なくとも１つの追加の治療剤との組み合わせは、相加的または相乗的な結果をもたらす。ある態様において、併用療法は、アフィマー剤の治療指数の増加をもたらす。ある態様において、併用療法は、追加の治療剤の治療指数の増加をもたらす。ある態様において、併用療法は、アフィマー剤の毒性および／または副作用の減少をもたらす。ある態様において、併用療法は、追加の治療剤の毒性および／または副作用の減少をもたらす。
【０５２３】
治療剤の有用なクラスには、例えば、抗チューブリン剤、オーリスタチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）および三核白金錯体、カルボプラチンなどの白金錯体）、アントラサイクリン、抗生物質、抗葉酸塩、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン（duocarmycin）、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソ尿素、プラチノール、プリン系代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン類、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどが挙げられる。ある態様において、アルキル化剤、代謝拮抗剤、有糸分裂阻害剤、トポイソメラーゼ阻害剤または血管新生阻害剤である。
【０５２４】
本明細書に記載のアフィマー剤と組み合わせて投与され得る治療剤としては、化学療法剤が挙げられる。したがって、ある態様において、方法または処置は、化学療法剤と組み合わせて、または化学療法剤のカクテルと組み合わせて、本発明のアフィマー剤を投与することを含む。アフィマー剤による処置は、化学療法剤の投与前、投与と同時に、または投与後に行うことができる。併用投与は、単一の医薬製剤または別個の製剤のいずれかを用いた同時投与、またはいずれかの順序での連続投与を含み得るが、一般に、すべての活性薬剤が同時に生物学的活性を発揮することができるような時間内での投与を含み得る。このような化学療法剤の調製および投与スケジュールは、製造業者の指示に従って、または当業者によって経験的に決定されるように用いることができる。そのような化学療法のための調製および投与スケジュールはまた、The Chemotherapy Source Book, 4.sup.th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.に記載されている。
【０５２５】
本発明で有用な化学療法剤には、チオテパおよびシクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）のようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファンおよびピポスルファンのようなアルキルスルホネート；ベンゾドーパ、カルボクオン、メチュレドーパおよびウレドパのようなアジリジン類；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレントリネホスファアミド、トリエチレントリネチオホスファアミド、トリメチルオロメラミン（trimethylolomelamime）などのエチレンイミン類およびメチロールメラミン類；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレスタミン、塩酸メクロレスタミン、メルファラン、ノベンビシン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどの窒素マスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソ尿素；アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カリケアマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６−ジアゾ−５−オキソ−Ｌ−ノルロイシン、ドキソルビシン、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシン、マイコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトゾシン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメックス、ジノスタチン、ゾルビシンなどのなどの抗生物質；メトトレキサートおよび５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類縁体；フルダラビン、６−メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類縁体；アンシタビン、アザシチジン、６−アザウリジン、カルモフール、シトシンアラビノシド、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスリジン、５−ＦＵなどのピリミジン類縁体；カルステロン、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオステイン、テストラクトンなどのアンドロゲン；アミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤（anti-adrenal）；フォリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン;アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトラキサート（edatraxate）；デフォファミン；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；エリプチニウム酢酸塩；エトグルシド（etoglucid）；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダモール；ニトラクリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ポドフィリン酸；２−エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ；ラゾキサン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２”−トリクロロトリエチルアミン；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン（mannomustine）；ミトブロニトール；ミトラクトール；��ポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）；タキソイド、例えばパクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）およびドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）；クロラムブシル；ゲムシタビン；６−チオグアニン；メルカプトプリン；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金類縁体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ−１６）；イホスファミド；マイトマイシンＣ；マイトキサントロン；ビンクリスチン；ビノレルビン；ナベルビン；ノバンドロン；テニポシド；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロネート；ＣＰＴ１１；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸；エスメラミン；カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）；および上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が含まれるが、これらに限定されない。化学療法剤としてはまた、例えばタモキシフェン、ラロキシフェン、アロマターゼ阻害性４（５）−イミダゾール、４−ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン、ケオキシフェン、ＬＹ１１７０１８、オナプリストン、トレミフェン（ＦＡＲＥＳＴＯＮ）などの抗エストロゲン剤；フルタミド、ニルタミド、ビカルタミド、リュープロリドおよびゴセリンなどの抗アンドロゲン剤；ならびに、上記のいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などの、腫瘍に対するホルモン作用を調節または阻害するように作用する抗ホルモン剤も挙げられる。ある態様において、追加の治療剤はシスプラチンである。ある態様において、追加の治療剤は、カルボプラチンである。
【０５２６】
本明細書に記載の方法のある態様において、化学療法剤は、トポイソメラーゼ阻害剤である。トポイソメラーゼ阻害剤は、トポイソメラーゼ酵素（例えば、トポイソメラーゼＩまたはＩＩ）の作用を阻害する化学療法剤である。トポイソメラーゼ阻害剤としては、ドキソルビシンＨＣｌ、ダウノルビシンクエン酸塩、マイトキサントロン塩酸塩、アクチノマイシンＤ、エトポシド、トポテカン塩酸塩、テニポシド（ＶＭ−２６）およびイリノテカン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、追加の治療剤はイリノテカンである。
【０５２７】
ある態様において、化学療法剤は代謝拮抗剤である。代謝拮抗剤とは、通常の生化学反応に必要な代謝物に類似しているが、細胞分裂などの細胞の１以上の正常な機能を妨害するのに十分に異なる構造を有する化学物質である。代謝拮抗剤としては、ゲムシタビン、フルオロウラシル、カペシタビン、メトトレキサートナトリウム、ラリトレキセド、ペメトレキセド、テガフール、シトシンアラビノシド、チオグアニン、５−アザシチジン、６−メルカプトプリン、アザチオプリン、６−チオグアニン、ペントスタチン、リン酸フルダラビンおよびクラドリビン、ならびにこれらのいずれかの薬学的に許容される塩、酸または誘導体などが挙げられるが、これらに限定されない。ある態様において、追加の治療剤はゲムシタビンである。
【０５２８】
本明細書に記載の方法のある態様において、化学療法剤は、チューブリンを結合する薬剤を含むが、これに限定されない、有糸分裂阻害剤である。ある態様において、薬剤はタキサンである。ある態様において、薬剤は、パクリタキセルもしくはドセタキセル、またはパクリタキセルもしくはドセタキセルの薬学的に許容される塩、酸もしくは誘導体である。ある態様において、薬剤は、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）、ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、アルブミン結合パクリタキセル（ｎａｂ−パクリタキセル；ＡＢＲＡＸＡＮＥ）、ＤＨＡ−パクリタキセル、またはＰＧ−パクリタキセルである。特定の代替的な態様において、有糸分裂阻害剤は、ビンカアルカロイド、例えばビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデルビンもしくはビンデシンまたはそれらの薬学的に許容される塩、酸もしくは誘導体を含む。ある態様において、有糸分裂阻害剤は、キネシンＥｇ５の阻害剤、またはオーロラＡもしくはＰｌｋ１のような分裂キナーゼの阻害剤である。ある態様において、追加の治療剤はパクリタキセルである。ある態様において、追加の治療剤は、ｎａｂ−パクリタキセルである。
【０５２９】
本明細書に記載の方法のある態様において、追加の治療剤は、低分子などの薬剤を含む。例えば、処置は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）および／またはＶＥＧＦを含むがこれらに限定されない腫瘍関連抗原に対する阻害剤として作用する低分子と、本発明のアフィマー剤の併用投与を含み得る。ある態様において、本発明のアフィマー剤は、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、ラパタニブ（lapatanib）、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ）、ＡＥＥ７８８、ＣＩ−１０３３、セディラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ）およびパゾパニブ（ＧＷ７８６０３４Ｂ）からなる群より選択されるプロテインキナーゼ阻害剤と組み合わせて投与される。ある態様において、追加の治療剤は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む。
【０５３０】
本明細書に記載の方法のある態様において、追加の治療剤は、癌幹細胞経路を阻害する低分子である。ある態様において、追加の治療剤は、Ｎｏｔｃｈ経路の阻害剤である。ある態様において、追加の治療剤は、Ｗｎｔ経路の阻害剤である。ある態様において、追加の治療剤は、ＢＭＰ経路の阻害剤である。ある態様において、追加の治療剤は、Ｈｉｐｐｏ経路の阻害剤である。ある態様において、追加の治療剤は、ｍＴＯＲ／ＡＫＲ経路の阻害剤である。ある態様において、追加の治療剤は、ＲＳＰＯ／ＬＧＲ経路の阻害剤である。
【０５３１】
本明細書に記載の方法のある態様において、追加の治療剤は、抗体などの生体分子を含む。例えば、治療は、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２および／またはＶＥＧＦを結合する抗体を含むがこれらに限定されない、腫瘍関連抗原に対する抗体と、本発明のアフィマー剤の併用投与を含み得る。ある態様において、追加の治療剤は、癌幹細胞マーカーに特異的な抗体である。ある態様において、追加の治療剤は、Ｎｏｔｃｈ経路の構成要素を結合する抗体である。ある態様において、追加の治療剤は、Ｗｎｔ経路の構成要素を結合する抗体である。ある態様において、追加の治療剤は、癌幹細胞経路を阻害する抗体である。ある態様において、追加の治療剤は、Notch経路の阻害剤である。ある態様において、追加の治療剤は、Ｗｎｔ経路の阻害剤である。ある態様において、追加の治療剤は、ＢＭＰ経路の阻害剤である。ある態様において、追加の治療剤は、β−カテニンシグナル伝達を阻害する抗体である。ある態様において、追加の治療剤は、血管新生阻害剤（例えば、抗ＶＥＧＦまたはＶＥＧＦ受容体抗体）である抗体である。ある態様において、追加の治療剤は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラムシルマブ、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ）、パニツズマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）、ニモツズマブ、ザルツズマブまたはセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）である。
【０５３２】
本明細書に記載の方法のある態様において、追加の治療剤は、免疫応答を調節する抗体である。ある態様において、追加の治療剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＭ−３抗体または抗ＴＩＧＩＴ抗体である。
【０５３３】
さらに、本明細書に記載のアフィマー剤による処置は、他の生物学的分子、例えば、１以上のサイトカイン（例えば、リンホカイン、インターロイキン類、腫瘍壊死因子および／または成長因子）との併用処置を含み得るか、または腫瘍の外科的切除、癌細胞の切除、または治療を行う医師が必要とみなす他の治療を伴い得る。ある態様において、追加の治療剤は、免疫応答刺激剤である。
【０５３４】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、アフィマー剤は、以下からなる群より選択される成長因子と組み合わせることができる：アドレノメデュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、Ｇ-ＣＳＦ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＧＤＦ９、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、遊走刺激因子（migration-stimulating factor）、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、ＰＤＧＦ、トロンボポエチン、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、Ｐ１ＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１８。
【０５３５】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、追加の治療剤は、免疫応答刺激剤である。ある態様において、免疫応答刺激剤は、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、インターロイキン３（ＩＬ−３）、インターロイキン１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン１（ＩＬ−１）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、４−１ＢＢリガンド、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＬＡＧ−３抗体および抗ＴＩＭ−３抗体からなる群より選択される
【０５３６】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、免疫応答刺激剤は、以下からなる群より選択される：ＰＤ−１活性のモジュレーター、ＰＤ−Ｌ２活性のモジュレーター、ＣＴＬＡ−４活性のモジュレーター、ＣＤ２８活性のモジュレーター、ＣＤ８０活性のモジュレーター、ＣＤ８６活性のモジュレーター、４−１ＢＢ活性のモジュレーター、ＯＸ４０活性のモジュレーター、ＫＩＲ活性のモジュレーター、Ｔｉｍ−３活性のモジュレーター、ＬＡＧ３活性のモジュレーター、ＣＤ２７活性のモジュレーター、ＣＤ４０活性のモジュレーター、ＧＩＴＲ活性のモジュレーター、ＴＩＧＩＴ活性のモジュレーター、ＣＤ２０活性のモジュレーター、ＣＤ９６活性のモジュレーター、ＩＤＯ１活性のモジュレーター、サイトカイン、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンパ球、腫瘍壊死因子(ＴＮＦ)ファミリーのメンバー、および免疫刺激オリゴヌクレオチド。
【０５３７】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、免疫応答刺激剤は、ＰＤ−１アンタゴニスト、ＰＤ−Ｌ２アンタゴニスト、ＣＴＬＡ−４アンタゴニスト、ＣＤ８０アンタゴニスト、ＣＤ８６アンタゴニスト、ＫＩＲアンタゴニスト、Ｔｉｍ−３アンタゴニスト、ＬＡＧ３アンタゴニスト、ＴＩＧＩＴアンタゴニスト、ＣＤ２０アンタゴニスト、ＣＤ９６アンタゴニスト、および／またはＩＤＯ１アンタゴニストからなる群より選択される。
【０５３８】
本明細書に記載の方法のいくつかの態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−１を特異的に結合する抗体である。ある態様において、ＰＤ−１を結合する抗体は、ＫＥＹＴＲＵＤＡ（ＭＫ−３４７５）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１）、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ、ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ−１１０６）、ＭＥＤＩ０６８０（ＡＭＰ−５１４）、ＲＥＧＮ２８１０、ＢＧＢ−Ａ３１７、ＰＤＲ−００１またはＳＴＩ−Ａ１１１０である。ある態様において、ＰＤ−１を結合する抗体は、ＰＣＴ公開公報ＷＯ２０１４／１７９６６４に記載されており、例えば、ＡＰＥ２０５８、ＡＰＥ１９２２、ＡＰＥ１９２３、ＡＰＥ１９２４、ＡＰＥ１９５０、ＡＰＥ１９６３として同定される抗体、またはこれらの抗体のいずれかのＣＤＲ領域を含む抗体である。他の態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは、ＰＤ−Ｌ２、例えばＡＭＰ−２２４を含む融合タンパク質である。他の態様において、ＰＤ−１アンタゴニストは、ペプチド阻害剤、例えば、ＡＵＮＰ‐１２である。
【０５３９】
ある態様において、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４を特異的に結合する抗体である。ある態様において、ＣＴＬＡ−４を結合する抗体は、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）またはトレメリムマブ（ＣＰ−６７５，２０６）である。ある態様において、ＣＴＬＡ−４アンタゴニストは、ＣＴＬＡ−４融合タンパク質、例えば、ＫＡＨＲ−１０２である。
【０５４０】
ある態様において、ＬＡＧ３アンタゴニストは、ＬＡＧ３を特異的に結合する抗体である。ある態様において、ＬＡＧ３を結合する抗体は、ＩＭＰ７０１、ＩＭＰ７３１、ＢＭＳ‐９８６０１６、ＬＡＧ５２５およびＧＳＫ２８３１７８１である。ある態様において、ＬＡＧ３アンタゴニストは、可溶性ＬＡＧ３受容体、例えば、ＩＭＰ３２１を含む。
【０５４１】
ある態様において、ＫＩＲアンタゴニストは、ＫＩＲを特異的に結合する抗体である。ある態様において、ＫＩＲを結合する抗体は、リリルマブである。
【０５４２】
ある態様において、免疫応答刺激剤は、ＣＤ２８アゴニスト、４−１ＢＢアゴニスト、ＯＸ４０アゴニスト、ＣＤ２７アゴニスト、ＣＤ８０アゴニスト、ＣＤ８６アゴニスト、ＣＤ４０アゴニストおよびＧＩＴＲアゴニストからなる群より選択される。ある態様において、ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０リガンド、またはそのＯＸ４０結合部分を含む。例えば、ＯＸ４０アゴニストは、ＭＥＤＩ６３８３であり得る。ある態様において、ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０を特異的に結合する抗体である。ある態様において、ＯＸ４０を結合する抗体は、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ０５６２またはＭＯＸＲ０９１６（ＲＧ７８８８）である。ある態様において、ＯＸ４０アゴニストは、ＯＸ４０リガンドを発現することが可能なベクター（例えば、発現ベクターまたはアデノウイルスなどのウイルス）である。ある態様において、ＯＸ４０発現ベクターは、Ｄｅｌｔａ−２４−ＲＧＤＯＸまたはＤＮＸ２４０１である。
【０５４３】
ある態様において、４-１ＢＢ（ＣＤ１３７）アゴニストは、アンチカリンなどの結合分子である。ある態様において、アンチカリンは、ＰＲＳ−３４３である。ある態様において、４−１ＢＢアゴニストは、４−１ＢＢを特異的に結合する抗体である。ある態様において、４−１ＢＢを結合する抗体は、ＰＦ−２５６６（ＰＦ−０５０８２５６６）またはウレルマブ（ＢＭＳ−６６３５１３）である。
【０５４４】
ある態様において、ＣＤ２７アゴニストは、ＣＤ２７を特異的に結合する抗体である。ある態様において、ＣＤ２７を結合する抗体は、バリルマブ（ＣＤＸ−１１２７）である。
【０５４５】
ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲリガンドまたはそのＧＩＴＲ結合部分を含む。ある態様において、ＧＩＴＲアゴニストは、ＧＩＴＲを特異的に結合する抗体である。ある態様において、ＧＩＴＲを結合する抗体は、ＴＲＸ５１８、ＭＫ−４１６６またはＩＮＢＲＸ−１１０である。
【０５４６】
ある態様において、免疫応答刺激剤は、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンパ球および腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーのメンバーなどのサイトカイン類を含むが、これらに限定されない。ある態様において、免疫応答刺激剤は、ＣｐＧジヌクレオチドなどの免疫刺激性オリゴヌクレオチドを含む。
【０５４７】
ある態様において、免疫応答刺激剤は、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ２抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ８０抗体、抗ＣＤ８６抗体、抗４−１ＢＢ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗Ｔｉｍ−３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ９６抗体、または抗ＩＤＯ１抗体を含むが、これらに限定されない。
【０５４８】
ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤は、単独で用いられるか、または放射線療法と併用され得る。
【０５４９】
ある態様において、本明細書に記載のアフィマー剤は、単独で用いられるか、または標的治療と併用され得る。標的療法の例としては、ホルモン療法、シグナル伝達阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ阻害剤、例えば、セツキシマブ（Erbitux）およびエルロチニブ（Tarceva）など）；ＨＥＲ２阻害剤（例えば、トラスツズマブ（Herceptin）およびペルツズマブ（Perjeta）など）；ＢＣＲ−ＡＢＬ阻害剤（イマチニブ（Gleevec）およびダサチニブ（Sprycel）など）；ＡＬＫ阻害剤（クリゾチニブ（Xalkori）およびセリチニブ（Zykadia）など）；ＢＲＡＦ阻害剤（ベムラフェニブ（Zelboraf）およびダブラフェニブ（Tafinlar）など）、遺伝子発現モジュレーター、アポトーシス誘導剤（例えば、ボルテゾミブ（Velcade）およびカーフィルゾミブ（Kyprolis））、血管形成阻害剤（例えば、ベバシズマブ（Avastin）およびラムシルマブ（Cyramza））、毒素に結合したモノクローナル抗体（例えば、ブレンツキシマブ・ベドチン（Adcetris）およびアド−トラスツズマブ・エムタンシン（Kadcyla））などが挙げられる。
【０５５０】
ある態様において、本発明のアフィマー剤は、抗癌治療剤、または免疫調節性受容体阻害剤、例えば、受容体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片などの免疫調節薬と組み合わせて用いられ得る。
【０５５１】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、アンタゴニスト、例えば、医薬組成物の一部として、Ｔｉｍ−３経路アンタゴニストと関連して投与される。
【０５５２】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、Ｖｉｓｔａ経路アンタゴニストと関連して投与される。
【０５５３】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、ＢＴＬＡ経路アンタゴニストと関連して投与される。
【０５５４】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、ＬＡＧ−３経路アンタゴニストと関連して投与される。
【０５５５】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、ＴＩＧＩＴ経路アンタゴニストと関連して投与される。
【０５５６】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、抗ＰＤＬ１抗体と関連して投与される。
【０５５７】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、ＢＭＳ−９３６５５９、ＭＳＢ００１０７１８ＣまたはＭＰＤＬ３２８０Ａと関連して投与される。
【０５５８】
本発明のある態様において、本発明の抗PD-1 抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＣＴＬＡ４抗体と関連して投与される。
【０５５９】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＣＳ１抗体と関連して投与される。
【０５６０】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＫＩＲ２ＤＬ１／２／３抗体と関連して投与される。
【０５６１】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＣＤ１３７抗体と関連して投与される。
【０５６２】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＧＩＴＲ抗体と関連して投与される。
【０５６３】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＰＤ−Ｌ２抗体と関連して投与される。
【０５６４】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＩＬＴ１抗体と関連して投与される。
【０５６５】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＩＬＴ２抗体と関連して投与される。
【０５６６】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＩＬＴ３抗体と関連して投与される。
【０５６７】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＩＬＴ４抗体と関連して投与される。
【０５６８】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＩＬＴ５抗体と関連して投与される。
【０５６９】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＩＬＴ６抗体と関連して投与される。
【０５７０】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＩＬＴ７抗体と関連して投与される。
【０５７１】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＩＬＴ８抗体と関連して投与される。
【０５７２】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＣＤ４０抗体と関連して投与される。
【０５７３】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＯＸ４０抗体と関連して投与される。
【０５７４】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＫＩＲ２ＤＬ１抗体と関連して投与される。
【０５７５】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＫＩＲ２ＤＬ２／３抗体と関連して投与される。
【０５７６】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＫＩＲ２ＤＬ４抗体と関連して投与される。
【０５７７】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ抗体と関連して投与される。
【０５７８】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ抗体と関連して投与される。
【０５７９】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＫＩＲ３ＤＬ１抗体と関連して投与される。
【０５８０】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＫＩＲ３ＤＬ２抗体と関連して投与される。
【０５８１】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＫＩＲ３ＤＬ３抗体と関連して投与される。
【０５８２】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＮＫＧ２Ａ抗体と関連して投与される。
【０５８３】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＮＫＧ２Ｃ抗体と関連して投与される。
【０５８４】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＩＣＯＳ抗体と関連して投与される。
【０５８５】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＳＩＲＰα抗体と関連して投与される。
【０５８６】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＣＤ４７抗体と関連して投与される。
【０５８７】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗４−１ ＢＢ抗体と関連して投与される。
【０５８８】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＩＬ−１０抗体と関連して投与される。
【０５８９】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＴＳＬＰ抗体と関連して投与される。
【０５９０】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、ＩＬ−１０またはＰＥＧ化ＩＬ−１０と関連して投与される。
【０５９１】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＡＰＲＩＬ抗体と関連して投与される。
【０５９２】
本発明のある態様において、本発明の抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合フラグメントは、例えば、医薬組成物の一部として、抗ＣＤ２７抗体と関連して投与される。
【０５９３】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、例えば、医薬組成物の一部として、ＳＴＩＮＧアゴニストと共に投与される。環状ジ−ヌクレオチド（ＣＤＮ）環状ジ−ＡＭＰ（リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）および他の細菌によって産生される）およびその類縁体である環状ジ−ＧＭＰおよび環状−ＧＭＰ−ＡＭＰは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰ）として宿主細胞によって認識され、これはインターフェロン遺伝子の刺激因子（ＳＴＩＮＧ）として知られる病原体認識受容体（ＰＲＲ）に結合する。ＳＴＩＮＧは、宿主哺乳動物細胞の細胞質に存在するアダプタータンパク質であり、ＴＡＮＫ結合キナーゼ(ＴＢＫ１)−ＩＲＦ３およびＮＦ−κＢシグナル伝達軸を活性化し、その結果、ＩＦＮ−βおよび他の遺伝子産物を誘導し、自然免疫を強力に活性化する。現在、ＳＴＩＮＧは、細胞内病原体の感染を感知し、それに応答してＩＦＮ−αの産生を誘導し、抗原特異的ＣＤ４＋およびＣＤ８＋ Ｔ細胞と病原体特異的抗体の両方からなる適応型防御病原体特異的免疫応答の発生につながる、宿主の細胞質監視経路の構成要素であることが認識されている。米国特許第７，７０９，４５８号および同第７，５９２，３２６号；ＰＣＴ公開公報ＷＯ２００７／０５４２７９、ＷＯ２０１４／０９３９３６、ＷＯ２０１４／１７９３３５、ＷＯ２０１４／１８９８０５、ＷＯ２０１５／１８５５６５、ＷＯ２０１６／０９６１７４、ＷＯ２０１６／１４５１０２、ＷＯ２０１７／０２７６４５、ＷＯ２０１７／０２７６４６およびＷＯ２０１７／０７５４７７；ならびに、Yan et al., Bioorg. Med. Chem Lett. 18:5631-4, 2008。
【０５９４】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、ＡＫＴ阻害剤と関連して投与される。例示的なＡＫＴ阻害剤としては、ＧＤＣ００６８（ＧＤＣ−００６８、イパタセルチブおよびＲＧ７４４０としても知られている）、ＭＫ−２２０６、ペリフォシン（ＫＲＸ−００４０１としても知られている）、ＧＳＫ６９０６９３、ＡＴ７８６７、トリシリビン、ＣＣＴ１２８９３０、Ａ−６７４５６３、ＰＨＴ−４２７、Ａｋｔｉ−１／２、アフレセルチブ（ＧＳＫ２１１０１８３としても知られる）、ＡＴ１３１４８、ＧＳＫ２１４１７９５、ＢＡＹ１１２５９７６、アップロセルチブ（ＧＳＫ２１４１７９５としても知られる）、ＡＫＴ阻害剤ＶＩＩＩ（１，３−ジヒドロ−１−［１−［４−（６−フェニル−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−７−イル）フェニル］ｍ−エチル］−４−ピペリジニル］−２Ｈ−ベンズイミダゾール−２−オン）、ＡＫＴ阻害剤Ｘ（２−クロロ−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１０Ｈ−フェノキサジン−１０−ブタンアミン、モノ塩酸塩）、ＭＫ−２２０６（８−（４−（１−アミノシクロブチル）フェニル）−９−フェニル−［１，２，４］トリアゾロ［３，４−ｆ］［−１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン）、アップロセルチブ（Ｎ−（（Ｓ）−１−アミノ−３−（３，４−ジフルオロフェニル）プロパン−２−イル）−５−クロロ−４−（４−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−５−イル）フラン−２−カルボキサミド）、イパタセルチブ（（Ｓ）−２−（４−クロロフェニル）−１−（４−（（５Ｒ，７Ｒ）−７−ヒドロキシ−５−メチル−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ｃ−シクロペンタ［ｄ］ピリミジン−４−イル）ピペラジン−１−イル）−３−（イソプロピルアミノ）プロパン−１−オン）、ＡＺＤ５３６３（４−ピペリジンカルボキサミド、４−アミノ−Ｎ−［（１Ｓ）−１−（４−クロロフェニル）−３−ヒドロキシプロピル］−１−（７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ｐ−イリミジン−４−イル）、ペリフォシン、ＧＳＫ６９０６９３、ＧＤＣ−００６８、トリシルビン、ＣＣＴ１２８９３０、Ａ−６７４５６３、ＰＦ−０４６９１５０２、ＡＴ７８６７、ミルテフォシン、ＰＨＴ−４２７、ホノキオール、リン酸トリシリビン、およびＫＰ３７２−１Ａ（１０Ｈ−インデノ［２，１−ｅ］テトラゾロ［１，５−ｂ］［１，２，４］トリアジン−１０−オン）、Ａｋｔ阻害剤ＩＸ（ＣＡＳ９８５１０−８０−６）が挙げられる。さらなるＡｋｔ阻害剤としては、以下のものが挙げられる：ＡＴＰ競合阻害剤、例えば、イソキノリン−５−スルホンアミド（例えば、Ｈ−８、Ｈ−８９、ＮＬ−７１−１０１）、アゼパン誘導体（例えば、（−）−バラノール誘導体）、アミノフラザン（例えば、ＧＳＫ６９０６９３）、複素環（例えば、７−アザインドール、６−フェニルプリン誘導体、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体、ＣＣＴ１２８９３０、３−アミノピロリジン、アニリノトリアゾール誘導体、スピロインドリン誘導体、ＡＺＤ５３６３、Ａ−６７４５６３、Ａ−４４３６５４）、フェニルピラゾール誘導体（例えば、ＡＴ７８６７、ＡＴ１３１４８）、チオフェンカルボキサミド誘導体（例えば、アフレセルチブ（ＧＳＫ２１１０１８３）、２−ピリミジル−５−アミドチオフェン誘導体（ＤＣ１２０）、アップロセルチブ（ＧＳＫ２１４１７９５）；アロステリック阻害剤、例えば２，３−ジフェニルキノキサリン類縁体（例えば、２，３−ジフェニルキノキサリン誘導体、トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−１誘導体（ＭＫ−２２０６））、アルキルリン脂質（例えば、エデルホシン（１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＥＴ−１８−ＯＣＨ３）、イルモフォシン（ＢＭ−４１．４４０）、ミルテフォシン（ヘキサデシルホスホコリン、ＨｅＰＣ）、ペリフォシン（Ｄ−２１２６６）、エルシルホスホコリン（ＥｒＰＣ）、エルフォシン（ＥｒＰＣ３、エルシルホスホコリン）、インドール−３−カルビノール類縁体（例えば、インドール−３−カルビノール、３−クロロアセチインドール、ジインドリルメタン、ジエチル６−メトキシ−５，７−ジヒドロインドロ［２，３−ｂ］カルバゾール−２，１０−ジカルボキシレート（ＳＲ１３６６８）、ＯＳＵ−Ａ９）、スルホンアミド誘導体（例えば、ＰＨ−３１６、ＰＨＴ−４２７）、チオ尿素誘導体（例えば、ＰＩＴ−１、ＰＩＴ−２、ＤＭ−ＰＩＴ−１、Ｎ−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］−Ｎ’−（３−ブロモフェニル）チオ尿素）、プリン誘導体（例えば、トリシリビン（ＴＣＮ、ＮＳＣ１５４０２０）、トリシリビン一リン酸活性類縁体（ＴＣＮ−Ｐ）、４−アミノ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体ＡＰＩ−１，３−フェニル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン誘導体、ＡＲＱ０９２）、ＢＡＹ１１２５９７６、３−メチルキサンチン、キノリン−４−カルボキサミド、２−［４−（シクロヘキサ−１，３−ジエン−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］フェノール、３−オキソ−チルカル酸（3-oxo-tirucallic acid）、３．α．および３．β．−アセトキシ−チルカル酸、アセトキシ−チルカル酸；および不可逆的阻害剤、例えば、天然物、抗生物質、ラクトキノマイシン、フレノリシンＢ、カラファンギン、メデルマイシン、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ビニルケトン、４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）、１，６−ナフチリジノン誘導体、およびイミダゾ−１，２−ピリジン誘導体などが挙げられる。
【０５９５】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、ＭＥＫ阻害剤と関連して投与される。例示的なＭＥＫ阻害剤としては、ＡＺＤ６２４４（セルメチニブ）、ＰＤ０３２５９０１、ＧＳＫ１１２０２１２（トラメチニブ）、Ｕ０１２６−ＥｔＯＨ、ＰＤ１８４３５２、ＲＤＥＡ１１９（ラファメチニブ）、ＰＤ９８０５９、ＢＩＸ０２１８９、ＭＥＫ１６２（ビニメチニブ）、ＡＳ−７０３０２６（ピマセルチブ）、ＳＬ−３２７、ＢＩＸ０２１８８、ＡＺＤ８３３０、ＴＡＫ−７３３、コビメチニブ、ＰＤ３１８０８８が挙げられる。
【０５９６】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、ペギル化リポソームドキソルビシンを含む、ドキソルビシンのようなアントラサイクリンおよびシクロホスファミドの両方と関連づけて投与される。
【０５９７】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、抗ＣＤ２０抗体および抗ＣＤ３抗体の両方、または二重特異性ＣＤ２０／ＣＤ３結合体（ＣＤ２０／ＣＤ３ ＢｉＴＥを含む）と関連して投与される。
【０５９８】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、ＣＤ７３阻害剤、ＣＤ３９阻害剤、またはその両方と関連して投与される。これらの阻害剤は、エクトヌクレオシダーゼ活性を阻害するＣＤ７３結合体またはＣＤ３９結合体（抗体、抗体断片または抗体模倣体など）であり得る。阻害剤は、エクトヌクレオシダーゼ活性を阻害する低分子の阻害剤であってもよく、例えば、６−Ｎ，Ｎ−ジエチル−β−γ−ジブロモメチレン−Ｄ−アデノシン−５’−三リン酸三ナトリウム塩水和物、ＰＳＢ０６９、ＰＳＢ０６１２６などが挙げられる。
【化１】
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【０５９９】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、阻害剤ポリＡＤＰリボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）と関連して投与される。例示的なＰＡＲＰ阻害剤としては、オラパリブ、ニラパリブ、ルカパリブ、タラゾパリブ、ベリパリブ、ＣＥＰ９７２２、ＭＫ４８２７およびＢＧＢ−２９０が挙げられる。
【０６００】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、腫瘍溶解性ウイルスと関連して投与される。例示的な腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解性免疫療法薬（Talimogene Laherparepvec）である。
【０６０１】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、ＣＳＦ−１アンタゴニスト、例えば、ＣＳＦ−１またはＣＳＦ１Ｒに結合し、マクロファージ上でのＣＳＦ−１とＣＳＦ１Ｒとの相互作用を阻害する薬剤などと関連して投与される。例示的なＣＳＦ−１アンタゴニストとしては、エマクツズマブおよびＦＰＡ００８が挙げられる。
【０６０２】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、抗ＣＤ３８抗体と関連して投与される。例示的な抗ＣＤ３９抗体としては、ダラツムマブおよびイサツキシマブが挙げられる。
【０６０３】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、抗ＣＤ４０抗体と関連して投与される。例示的な抗ＣＤ４０抗体としては、セリクレルマブおよびダセツズマブが挙げられる。
【０６０４】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、未分化リンパ腫キナーゼ（ＡＬＫ）の阻害剤と関連して投与される。例示的なＡＬＫ阻害剤としては、アレクチニブ、クリゾチニブおよびセリチニブが挙げられる。
【０６０５】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲおよびＦＧＦＲのファミリーメンバーからなる群より選択される１以上を阻害する多重キナーゼ阻害剤、または抗血管形成阻害剤と関連して投与される。例示的な阻害剤としては、アクシチニブ、セディラニブ（Cediranib）、リニファニブ、モテサニブ、ニンテダニブ、パゾパニブ、ポナチニブ、レゴラフェニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、チボザニブ、バタラニブ、ＬＹ２８７４４５５またはＳＵ５４０２が挙げられる。
【０６０６】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、１以上の所定の抗原に対する免疫応答を刺激することを意図する１以上のワクチンと組み合わせて投与される。抗原（複数可）は、個体に直接投与することができるか、または、例えば、自己もしくは同種異系であり得る腫瘍細胞ワクチン（例えば、ＧＶＡＸ）、樹状細胞ワクチン、ＤＮＡワクチン、ＲＮＡワクチン、ウイルスベースのワクチン、細菌もしくは酵母ワクチン（例えば、リステリア・モノサイトゲネスまたはサッカロマイセス・セレビシエ）などから個体内で発現させ得る。例えば、Guo et al., Adv. Cancer Res. 2013; 119: 421-475; Obeid et al., Semin Oncol. 2015 August; 42(4): 549-561参照のこと。標的抗原はまた、表に列記した抗原の免疫学的に活性な部分を含むフラグメントまたは融合ポリペプチドであり得る。
【０６０７】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、以下を含むが、これらに限定されない、１以上の鎮吐薬と関連して投与される：カソピタント（GlaxoSmithKline）、ネツピタント（MGI-Helsinn）および他のＮＫ−１受容体アンタゴニスト、パロノセトロン（MGI PharmaよりAloxiとして市販）、アプレピタント（Merck and Co.; Rahway、N.J.よりEmendとして市販）、ジフェンヒドラミン（Pfizer; New York、N.Y.よりBenadrylとして市販)、ヒドロキシジン（Pfizer; New York、N.Y.よりAtaraxとして市販)、メトクロプラミド（AH Robins Co,; Richmond、Va.よりReglanとして市販)、ロラゼパム（Wyeth; Madison、N.J.よりAtivanとして市販)、アルプラゾラム（Pfizer; New York、N.Y.よりXanaxとして市販)、ハロペリドール（Ortho-McNeil; Raritan、N.J.よりHaldolとして市販)、ドロペリドール（Inapsine）、ドロナビノール（Solvay Pharmaceuticals、Inc.; Marietta、Ga.よりMarinolとして市販)、デキサメサゾン（Merck and Co.; Rahway、N.J.よりDecadronとして市販）、メチルプレドニゾロン（Pfizer; New York、N.Y.よりMedrolとして市販)、プロクロルペラジン（Glaxosmithkline; Research Triangle Park、N.C.よりCompazineとして市販)、グラニセトロン（Hoffmann-La Roche Inc.; Nutley、N.J.よりKytrilとして市販)、オンダンセトロン（Glaxosmithkline; Research Triangle Park、N.C.よりZofranとして市販）、ドラセトロン（Sanofi-Aventis; New York、N.Y.よりAnzemetとして市販)、トロピセトロン（Novartis; East Hanover、N.J.よりNavobanとして市販）。
【０６０８】
癌処置の他の副作用には、赤血球と白血球の欠乏が含まれる。したがって、本発明のある態様において、アフィマー剤は、例えば、フィルグラスチム、ＰＥＧ−フィルグラスチム、エリスロポエチン、エポエチンアルファまたはダルベポエチンアルファなどのそのような欠乏を処置または予防する薬剤と関連して投与される。
【０６０９】
本発明のある態様において、本発明のアフィマー剤は、抗癌放射線療法と関連して投与される。例えば、本発明のある態様において、放射線療法は、体外照射療法（ＥＢＴ）であり、腫瘍の位置に高エネルギーＸ線ビームを送達するための方法である。ビームは患者の体外で（例えば、線形加速器によって）生成され、腫瘍部位に標的化される。これらのＸ線は癌細胞を破壊することができ、注意深い治療計画により周囲の正常組織を保護することができる。患者の体内には放射線源はない。本発明のある態様において、放射線療法は陽子線療法である：Ｘ線の代わりに陽子で病変組織に衝撃を与える一種の原体照射法である。本発明のある態様において、放射線療法は、原体外部照射療法（conformal external beam radiation therapy）：高度な技術を用いて、放射線療法を個体の身体構造に合わせて調整する方法である。本発明のある態様において、放射線療法は小線源治療（brachytherapy）である：体内に放射性物質を一時的に配置することであり、通常、ある領域に追加の用量（またはブースト）の放射線を与えるために用いられる。
【０６１０】
本明細書に記載のある態様において、処置は、抗ウイルス療法と組み合わせた本発明のアフィマー剤の投与を含む。アフィマー剤による処置は、抗ウイルス療法の投与前に、投与と同時に、または投与後に行うことができる。併用療法で用いられる抗ウイルス剤は、対象が感染しているウイルスによって異なる。
【０６１１】
併用投与は、単一の医薬製剤または別個の製剤のいずれかでの同時投与、またはいずれかの順序での連続投与を含み得るが、一般に、すべての活性薬剤がそれらの生物学的活性を同時に発揮することができるような時間内での投与を含み得る。
【０６１２】
本明細書に記載のアフィマー剤と少なくとも１つの追加の治療剤との組み合わせは、任意の順序で、または同時に投与され得ることが理解され得る。ある態様において、アフィマー剤は、第２の治療剤による治療を以前に受けた患者に投与され得る。特定の他の態様において、アフィマー剤および第２の治療剤は、実質的に同時にまたは同時に投与される。例えば、対象は、第２の治療剤（例えば、化学療法）による治療コースを受けている間に、アフィマー剤を投与されてもよい。ある態様において、アフィマー剤は、第２の治療剤による処置の１年以内に投与される。特定の代替的な態様において、アフィマー剤は、第２の治療剤を用いた任意の処置の１０、８、６、４または２月以内に投与される。ある特定の他の態様において、アフィマー剤は、第２の治療剤を用いた任意の処置の４週間、３週間、２週間または１週間以内に投与される。ある態様において、アフィマー剤は、第２の治療剤を用いた任意の処置から５日、４日、３日、２日または１日以内に投与される。２つの（またはそれ以上の）治療剤または療法剤が、数時間または数分以内に（すなわち、実質的に同時に）対象に投与され得ることが、さらに理解され得る。
【０６１３】
疾患の処置のために、本発明のアフィマー剤の適切な投与量は、処置すべき疾患の種類、疾患の重症度および経過、疾患の応答性、アフィマー剤が治療または予防目的で投与されるかどうか、以前の治療、患者の病歴などによって変わり、これらはすべて、治療を行う医師の裁量で決定される。アフィマー剤は、１回の投与でも、数日から数ヶ月間続く一連の治療でも、治癒がもたらされるか、または病状の軽減（例えば、腫瘍サイズの減少）が達成されるまで投与することができる。最適な投与スケジュールは、患者の体内での薬物蓄積の測定から計算することができ、個々の薬剤の相対的な効力によって異なる。投与する医師は、最適な投与量、投与方法および反復率を決定することができる。ある態様において、投与量は、体重１ｋｇあたり、０．０１μｇ〜１００ｍｇ、０．１μｇ〜１００ｍｇ、１μｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜１００ｍｇ、１ｍｇ〜８０ｍｇ、１０ｍｇ〜１００ｍｇ、１０ｍｇ〜７５ｍｇ、または１０ｍｇ〜５０ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約０．１ｍｇ〜約２０ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約０．１ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約０．２５ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約０．５ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約１ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約１．５ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約２ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約２．５ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約５ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約７．５ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約１０ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約１２．５ｍｇである。ある態様において、アフィマー剤の投与量は、体重１ｋｇあたり、約１５ｍｇである。ある態様において、投与量は、１日１回、週１回、月１回または年１回またはそれ以上投与することができる。ある態様において、アフィマー剤は、週１回、２週間に１回、３週間に１回、または４週間に１回投与される。
【０６１４】
ある態様において、アフィマー剤は、最初のより高い“負荷(loading)”用量で投与され、その後、１以上のより低い用量で投与されてもよい。ある態様において、投与頻度もまた変化してよい。ある態様において、投与レジメンは、初回量を投与し、その後、追加用量（または“維持”用量）を週に１回、２週間に１回、３週間に１回、または１ヶ月に１回投与することを含み得る。例えば、投与レジメンは、初回負荷用量を投与し、その後、例えば、初回量の半分の維持用量を週に１回投与することで構成されてもよい。あるいは、投与レジメンは、初回負荷用量を投与し、その後、例えば、初回量の半分の維持用量を隔週で投与することを含み得る。あるいは、投与レジメンは、初回量を３週間にわたり３回投与し、その後、例えば、隔週で同量の維持投与を行うことを含み得る。
【０６１５】
当業者には知られているように、任意の治療剤の投与は、副作用および／または毒性をもたらし得る。いくつかの場合には、副作用および／または毒性は、治療的有効量での特定の薬剤の投与を妨げるほど重篤である。場合によっては、薬物療法を中止しなければならず、他の薬剤が試みられることがある。しかしながら、同じ治療クラスの多くの薬剤は、同様の副作用および／または毒性を示すことが多く、これは、患者が治療を中止しなければならないか、または可能であれば、治療薬に関連する不快な副作用に苦しむことを意味する。
【０６１６】
ある態様において、投与スケジュールは、特定の数の投与または“サイクル”に限定され得る。ある態様において、アフィマー剤は、３、４、５、６、７、８またはそれ以上のサイクルで投与される。例えば、アフィマー剤は、２週間ごとに６サイクル投与され、アフィマー剤は、３週間ごとに６サイクル投与され、アフィマー剤は、２週間ごとに４サイクル投与され、アフィマー剤は、３週間ごとに４サイクル投与される、などである。投与スケジュールは、当業者によって決定され、その後変更され得る。
【０６１７】
したがって、本発明は、アフィマー剤、化学療法剤などの投与に関連した副作用および／または毒性を低減し得る、１以上の薬剤を投与するための間欠投与戦略を採用することを含む、本明細書に記載のポリペプチドまたは薬剤を対象に投与する方法を提供する。ある態様において、ヒト対象における癌を処置するための方法は、治療的有効量のアフィマー剤を、治療的有効量の化学療法剤と組み合わせて該対象に投与することを含み、ここで、これらの薬剤の一方または両方を間欠投与戦略に従って投与することを含む。ある態様において、間欠投与戦略は、アフィマー剤の初回量を対象に投与し、約２週間に１回、アフィマー剤のその後の用量を投与することを含む。ある態様において、間欠投与戦略は、アフィマー剤の初回量を対象に投与し、約３週間に１回、アフィマー剤のその後の用量を投与することを含む。ある態様において、間欠投与戦略は、アフィマー剤の初回量を対象に投与し、約４週間に１回、アフィマー剤のその後の用量を投与することを含む。ある態様において、間欠投与戦略を用いてアフィマー剤を投与し、化学療法剤は毎週投与される。
【０６１８】
ある態様において、本発明はまた、本発明のアフィマー剤を用いて対象を処置するための方法を提供し、ここで、対象は、ウイルス感染症に罹患している。ある態様において、ウイルス感染は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、肝炎ウイルス（Ａ、ＢまたはＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−Ｉ、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩおよびＣＭＶ、エプスタインバーウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、呼吸器多核体ウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟体動物ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルスまたはアルボウイルス脳炎ウイルスからなる群より選択される。
【０６１９】
ある態様において、本発明は、本発明のアフィマー剤を用いて対象を処置するための方法を提供し、ここで、対象は細菌感染症に罹患している。ある態様において、細菌感染は、クラミジア、リケッチア細菌、ミコバクテリア、ブドウ球菌、連鎖球菌、肺炎球菌、髄膜炎球菌および淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア菌、サルモネラ、バチルス、ビブリオ・コレラエ、クロストリジウム・テタン、クロストリジウム・ボツリヌス、バチルス・アンスリシス、イエシニア・ペスティス、マイコバクテリウム・レプラエ、マイコバクテリウム・レプロマトーシスおよびボリエラからなる群より選択される細菌による感染症である。
【０６２０】
ある態様において、本発明は、本発明のアフィマー剤を用いて対象を処置する方法を提供し、ここで対象は真菌感染症に罹患している。ある態様において、真菌感染は、カンジダ（albicans、krusei、glabrata、 tropicalisなど）、クリプトコッカス・ネオフォルマンズ、アスペルギルス（fumigatus、nigerなど）、ムコラレス属（genus Mucorales）（mucor、absidia、rhizopus）、スポロトリックス・シェンキィ、ブラストミセス・デルマティティジス、ブラジルパラコクシジオイデス（Paracoccidioides brasiliensis）、コクシジオイデス・イミチスおよびヒストプラズマ・カプスラーツムからなる群より選択される真菌による感染である
【０６２１】
ある態様において、本発明は、本発明のアフィマー剤を用いて対象を処置するための方法を提供し、ここで、対象は寄生虫感染症に罹患している。ある態様において、寄生虫感染は、赤痢アメーバ、バランチジウム・コリ、フォーラーネグレリア、アカントアメーバ、ジアルジア・ランビア、クリプトスポリジウム、ニューモシスチス・カリニ、三日熱マラリア原虫、バベシアミクロチ、トリパノソーマ、クルーズトリパノソーマ、リーシュマニア・ドノバニ、トキソプラズマゴンディ、ニッポストロングルス・ブラジリエンシス（Nippostrongylus brasiliensis）からなる群より選択される寄生虫による感染である。
【実施例】
【０６２２】
実施例
実施例１：ファージディスプレイライブラリーからのＰＤ−Ｌ１結合アフィマーの選択
本発明のペプチド、例えばＰＤ−Ｌ１結合成分は、例えば、一般的には同じ長さの９アミノ酸のランダムループを２つ有するアフィマーのライブラリーからの選択によって同定されてもよい。
【０６２３】
上記のように、本発明のＰＤ−Ｌ１結合ペプチドは、ステフィンＡの配列に基づいて一定のアフィマーフレームワーク主鎖に示された長さ９アミノ酸のランダムループ配列を含むファージディスプレイライブラリーからの選択によって同定されたものである。そのような選択手順は一般的に知られている。そのような手順によれば、ファージの懸濁液を標的抗原（ストレプトアビジンビーズ上に捕捉されたビオチン化抗原またはプレート上に捕捉された非ビオチン化抗原のいずれか）と共にインキュベートする。次いで、結合していないファージを洗い流し、その後、結合したファージを低ｐＨ溶液でインキュベートした後、高ｐＨ溶液でインキュベートすることにより溶出させる。次いで、大腸菌を放出されたｐＨ中和されたファージ溶液で感染させ、第１ラウンドファージの調製物を得る。このサイクルを、標的化ファージを濃縮するために、例えば２回または３回繰り返し、ストリンジェンシー条件では、後の選択のラウンドにおいて、例えば、洗浄ステップの数を増加させ、抗原濃度を下げ、ブロッキング試薬でコーティングされたストレプトアビジンビーズまたはウェルを用いて予め選択することにより、増加させることができる。
【０６２４】
ファージ増幅の連続ラウンドによる選択に続いて、ＰＤ−Ｌ１結合クローンを可溶性アフィマーＥＬＩＳＡにより同定した。すなわち、ファージベクターからアフィマーを過剰発現させ、細菌細胞を溶解させ、その溶解液をＥＬＩＳＡ法で用いて、アフィマー上のＨｉｓ６タグに結合した抗体をプレート上に固定化したＰＤ−Ｌ１へのアフィマー結合を検出した。特異的結合を示すクローンを、ループ配列を同定するために配列決定した。
【０６２５】
説明のために、アフィマーライブラリーからのＰＤ−Ｌ１結合ファージの選択を、約６×１０１０多様性のサイズのライブラリーから約１×１０１２ファージを加えたものを用いて、以下に記載するように実施した。
【０６２６】
ビオチン化抗原を、Ｍ２８０ストレプトアビジンまたはニュートラアビジンビーズ（Thermo Scientific）上に捕捉した。抗原は、Ｒ＆ＤによってＦｃ切断型で供給され、EZ Link Sulfo-NHS-LC Biotin kit（Pierce）を用いて、試験室内でビオチン化した。
【０６２７】
実施例２：ＰＤ−Ｌ１を発現するヒト癌細胞株への抗ＰＤ−Ｌ１アフィマーの結合親和性（図２）
ＡＶＡ０４アフィマーポリペプチドの結合親和性を、ヒト肺腺癌細胞株上でフローサイトメトリーを用いて決定した。ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ、Hyclone）およびストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ、Hyclone）を含む１０％のＦＢＳ（Gibco）を含むＲＰＭＩ-２６４０（Sigma）中で増殖させたＰＤ−Ｌ１を発現するＨ４４１細胞を、ＤＰＢＳを用いて洗浄した組織培養物から分離させた。細胞を３００ｒｐｍで５分間遠心分離して回収した。細胞をＰＢＳに再懸濁し、１ウェルあたり５００００個の細胞を丸底９６ウェルプレートに分散させた。細胞をＰＢＳで洗浄した。アフィマーおよび対照を染色バッファー（R&D）で二重に希釈し、間染色するために４±１℃で約６０分間細胞に添加した。細胞を洗浄し、二次抗シスタチンＡ抗体（Ｒ＆Ｄ）を染色バッファー（Ｒ＆Ｄ）で１：１５に希釈し、染色するために４±１℃にて約４０分間細胞に添加した。細胞を洗浄し、検出抗体Ａ４８８抗ヤギ抗体（Biolegend）を染色バッファー(R&D)中で１：１００に希釈し、染色するために４±１℃にて約３０分間細胞に添加した。最後に、細胞を洗浄し、生細胞および死細胞を、染色バッファーで希釈したＬ／ＤステインZombie Aqua（Biolegend）を用いて、４±１℃で約１０分間染色した。細胞を洗浄し、固定化バッファー（R&D）を各ウェルに４±１℃で１０分間添加し、フローサイトメーター（Guava 12 HT、Millipore）でプレートを読み取る前に、ＥＤＴＡ（Lonza）を含むＰＢＳを添加した。死細胞を除外し、蛍光緑色チャネル（４８８ｎｍ/５２５/３０）を取得した。結果はIncyteを用いて解析し、データはグラフパッドを用いてプロットした。
【０６２８】
ＡＶＡ０４アフィマーポリペプチドの例を、表４Ａ、４Ｂおよび５に示す。
【表１５】
2021520851.tif 000017
【０６２９】
【表１６】
2021520851.tif 000018
【０６３０】
【表１７】
2021520851.tif 000019
【表１８】
2021520851.tif 000020
【０６３１】
実施例３：大腸菌におけるアフィマー多量体の発現（図３）
２００ｎｇの発現プラスミドｐＤ８６１(Atum)を製造者のプロトコールに従って用いて、ＢＬ２１大腸菌細胞（Millipore）を形質転換した。全形質転換細胞混合物を、５０μｇ／ｍｌカナマイシン（AppliChem）を含むＬＢ寒天プレートに播種し、３７℃にて一晩インキュベートした。
【０６３２】
次に、形質転換された大腸菌のローン（lawn）を、１ｘブロス培地（Melford）および５０μｇ／ｍｌカナマイシンの滅菌フラスコに移し、３０℃で２５０ｒｐｍで振とう培養した。細胞が０．８−１．０のＯＤ６００に達したら、１０ｍＭラムノース（Alfa Aesar）を用いて発現を誘導し、その後３７℃にて５時間インキュベートした。４，５００ｒｐｍで１時間遠心して細胞を回収した。
【０６３３】
培養量が５００ｍｌ未満の場合、大腸菌ペレットを、湿潤細胞ペースト（Millipore）１グラムあたり０．５ｍｌの１０ｘ BugBuster、リゾチーム（Applichem）、ベンゾナーゼ（Millipore）を添加した１：１０ ＮＰＩ２０バッファー（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭ イミダゾール（Sigma））に再懸濁することにより溶解させた。細胞をボトルローラー上で室温にて１時間溶解した。培養量が５００ｍｌを超える場合、細胞ペレットを１：１０追加ＮＰＩ２０に再懸濁し、２分間超音波処理した（１０秒のオン／オフサイクル）。溶解後、溶液を２０，０００×ｇで４℃にて１時間遠心分離した。
【０６３４】
ニッケルアガロース親和性レジン（Super-NiNTA500; Generon）を用いて、清澄化した上清からのＨｉｓタグ付きタンパク質のバッチ結合親和性精製を行った。
適量のNiNTAレジン（タンパク質２０ｍｇあたり結合容量１ｍＬ）を５カラム容量（ＣＶ）の水で洗浄して保存液を除去した後、ＳｔＥＰ（商標）カラム（Thompson）で重力流を用いて５ＣＶのＮＰＩ２０緩衝液で平衡化した。レジンを、清澄化した大腸菌溶液と共に、室温にて１時間インキュベートした。その後、溶液を重力流によりＳｔＥＰ（商標）カラムに通し、樹脂を５ＣＶ ＮＰＩ２０バッファーで洗浄した。結合したタンパク質を、５ＣＶのＮＰＩ４００（５０ｍＭリン酸ナトリウム、０．５Ｍ ＮａＣｌ、０．４Ｍイミダゾール（Sigma））で樹脂から溶出させた。溶出したタンパク質を、Centripureカラム（emp Biotech GmbH）を用いて１ｘ ＰＢＳにて脱塩した。タンパク質収量を、Nanodrop (Thermo) A280読み取り値を用いて推定した。分取ＳＥＣを、HiLoad 26/600 Superdex 200pg (GE)を用いて、AKTA Xpress (GE)上で２．６ｍｌ／分の流量で１ｘＰＢＳ中で実行した。溶出したタンパク質サンプルを、Novex（商標） 20X Bolt（商標） MES SDS泳動バッファー（Thermo）中のSDS-PAGE Bolt Bis Trisプラス４−１２％ゲル（Thermo）上で、２００Ｖで９５℃にて１０分間、還元サンプルバッファーを用いて泳動した。ゲル上のタンパク質バンドをQuick Coommassie（Generon）で染色した。PageRulerで染色したタンパク質分子量マーカー（Thermo）をゲル上で泳動して、融合タンパク質の分子量を推定した。
【０６３５】
実施例４：競合ＥｌｉｓａアッセイおよびＰＤＬ−１結合Biacore（図４Ａおよび図４Ｂ
ＰＤ−Ｌ１/ＰＤ−１競合ＥＬＩＳＡ（図４Ａ）
アフィマー多量体の競合阻害を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価した。ｈｕ ＰＤ−１−Ｆｃ（R&D Systems）をプレート上に０．５μｇ／ｍｌでコーティングした。プレートを、１５０μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％）で２回洗浄し、ＰＢＳ中のカゼイン５％（Sigma）で、室温（２５±１℃）にて９０分間飽和させた。プレートを、上記のように洗浄した。次に、アフィマーおよび対照（hu PD-1-Fc、R&D Systems、ブランク）を２倍希釈し、３０ｎｇ／ｍｌのｈｕＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（R&D Systems）で３０分間プレインキュベートした後、室温（２５±１℃）にて９０分間プレートにロードした。プレートを、上記のように３回洗浄した。ビオチン化ポリクローナル抗体 抗ｈｕ ＰＤ−Ｌ１（R&D Systems）を希釈バッファーで希釈し、室温（２５±１℃）にて９０分間インキュベートした。プレートを上記のように３回洗浄し、ストレプトアビジンＨＲＰを室温（２５±１℃）にて３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、基質（TMB、Pierce Thermo-Scientific）をプレートに１０分間添加した。酸性溶液を用いて反応を停止させ、プレートを４５０〜６３０ｎｍで読み取った。次いで、補間された非線形４パラメータ標準曲線を用いてＩＣ５０を算出した。
【０６３６】
ＰＤ−Ｌ１結合Biacore（図４Ｂ）
Biacore T200動態解析を、アミンカップリング試薬(GE)を用いて、ランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰ＋(GE)およびＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ(R&D Systems)で固定化したシリーズＳセンサーＣＭ５チップを１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．０(GE)中で用いて、ＡＶＡ０４−１４１インライン融合（ILF）フォーマットで実施した。アフィマーモノマーの濃度滴定を、アフィマーモノマー分析物として、３０μｌ／分の流速で、１５０秒の会合時間、次いで３００秒の解離時間で実行した。アフィマー二量体、三量体および四量体融合タンパク質を分析物として用いて、３０μｌ／分の流速で、会合時間３００秒、その後解離時間６００秒で実行した。ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ固定化表面を５ｍＭ ＮａＯＨ（GE）で２０μｌ／分の流量で２０秒間再生した。データブランクを減算し、1:1 Langmuir結合モデル（BIAcore評価ソフトウェア；GE）に適合させて、見かけのＫＤ値を計算した。
【０６３７】
実施例５：アフィマーＦｃ融合およびエフェクター機能（ＡＤＣＣ）の特性評価
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ（図５Ａ）
懸濁ＨＥＫ細胞（Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞株; Thermo）トランスフェクションを、製造者のプロトコールに従って、Expifectamine試薬（Thermo）を用いて発現ベクターｐＤ２６１０ｖ１４（Atum）で行った。トランスフェクションの７日後に、１０，０００×ｇで１時間遠心して上清を回収し、０．４５μmのろ紙を用いてろ過した。タンパク質を、ＡＫＴＡ Ｘｐｒｅｓｓ（GE）上のmabSelect Sure HiTrapカラムを用いて精製した。レジンを５カラム容積（ＣＶ）の水で洗浄し、５ＣＶのＰＢＳ １ｘで平衡化した。その後、上清を５ｍｌ／分の流速で流し、１０ＣＶ ＰＢＳ １ｘで洗浄した。結合したタンパク質を５ＣＶ ０．１ＭグリシンｐＨ２．８で溶出させ、緩衝液をCentripure脱塩カラム（empBiotech GmbH）を用いてＰＢＳ １ｘに交換した。その後、実施例３に記載のように分取ＳＥＣを行った。分析ＳＥＣを、ＭＡｂＰａｃ ＳＥＣ−１カラム（Thermo）を用いて、Ultimate 3000 HPLC(Thermo)上で０．８ｍｌ／分でＰＢＳ １ｘ中で実行した。
【０６３８】
Biacore動態解析（図５Ｂ）
Biacore動態解析を、実施例４に記載のように、会合時間７００秒および解離時間１２００秒で実行した。表面再生（Surface regeneration）を、低濃度の場合は３．５ｎＭ ＮａＯＨ（GE）を用いて２０μｌ／分の流量で２０秒間行った。高濃度の場合は、時間を３０秒に増加させた。
【０６３９】
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイ（図５Ｃ）
ＡＤＣＣレポーターバイオアッセイは、ＡＤＣＣ作用機序（ＭＯＡ）アッセイにおいて、治療用抗体医薬による経路活性化に関する生物活性を定量するための、Promega社の生物発光レポーターアッセイである。機能的ＩｇＧ１ Ｆｃ上にフォーマットされたＡＶＡ０４−２５１は、１ｎＭのＥＣ５０でＡＤＣＣ機能を示すことができた。
【０６４０】
すなわち、標的細胞Ｈ４４１細胞（ｈｕＰＤ−Ｌ１を発現する）を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２００００細胞密度で１００μｌ播種し、加湿ＣＯ２インキュベーター中で２０時間インキュベートした。翌日、サンプルおよび対照をＡＤＣＣ緩衝液（Promega）で２倍希釈した。その間に、エフェクター細胞を解凍し（Jurkat FCgRIIIaレポーターNFAT細胞、Promega）、６３０μｌの初期細胞（initial cell）懸濁液を３．６ｍｌのＡＤＣＣ緩衝液で希釈した。９５μｌの培地をプレートから除去し、２５μｌのＡＤＣＣ緩衝液、２５μｌのサンプル希釈液または対照、および２５μｌのエフェクター細胞を各ウェルに添加した。プレートを加湿ＣＯ２インキュベーターで６時間インキュベートした。その後、プレートを室温で平衡化し、各反応ウェルに７５μｌのBioGLoルシフェラーゼアッセイ試薬（Promega）を添加し、室温にて５〜１０分間インキュベートした。その後、プレートリーダー（Clariostar、BMG）を用いて発光を測定した。結果は、誘導の倍数＝ｆ（対数濃度）としてグラフパッドを用いてプラット化（platted）した。
【０６４１】
実施例６：競合Ｅｌｉｓａアッセイ（図６Ａ−６Ｃ）
ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１競合ＥＬＩＳＡ（図６Ａ）
on_V.2でフォーマットされた種々のアフィマーポリペプチドを、図４Ａに記載のように、競合ＥＬＩＳＡで試験した。試験した全てのフォーマットされたアフィマーは、ＩＣ５０が０．２６〜２４．６ｎＭの範囲であり、競合性があった。対照抗体（29E2A3、Biolegend）は、フォーマット化されたアフィマーと同等のＩＣ５０（ＩＣ５０＝０．１８ｎＭ）で競合した。
【０６４２】
ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ８０競合ＥＬＩＳＡ（図６Ｂ）
on_V.2 でフォーマットされた種々のアフィマーポリペプチドを競合ＥＬＩＳＡで測定した。
試験した全てのアフィマーは、０．４１〜１２．７７ｎＭの範囲のＩＣ５０を有し、ＣＤ８０と競合した。対照抗体（29E2A3、Biolegend）は、フォーマット化されたアフィマーと同等のＩＣ５０（ＩＣ５０＝０．３１ｎＭ）で競合した。
【０６４３】
すなわち、競合阻害を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）で評価した。プレートを、１５０μｌの洗浄バッファー（PBS、Tween 20 0.1％）で２回洗浄し、ＰＢＳ中のカゼイン５％（Sigma）で、室温（２５±１℃）にて９０分間飽和させた。プレートを、上記のように洗浄した。アフィマーおよび対照（mAb抗huPD-L1 29E.2A3、Biolegend；hu PD-L1-Fc、R&D Systems、ブランク）を２倍希釈し、１．６ｎＭのｈｕＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ（R&D Systems）で３０分間プレインキュベートした後、室温（２５±１℃）にて９０分間プレートにロードした。プレートを、上記のように３回洗浄した。ビオチン化ポリクローナル抗体抗ｈｕ ＰＤ−Ｌ１（R&D Systems）を希釈バッファーで希釈し、室温（２５±１℃）にて９０分間インキュベートした。プレートを上記のように３回洗浄し、ストレプトアビジンＨＲＰを室温（２５±１℃）にて３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、基質（TMB、Pierce Thermo-Scientific）をプレートに１０分間添加した。酸性溶液を用いて反応を停止させ、プレートを４５０〜６３０ｎｍで読み取った。次いで、補間された非線形４パラメータ標準曲線を用いてＩＣ５０を算出した。
【０６４４】
ベンチマーク抗体競合ＥＬＩＳＡ（図６Ｃ）
AVA04-25_V.2 は、アベルマブ、アテゾリズマブ（Atezolizumab）およびドゥルバルマブに対して競合ＥＬＩＳＡ法で試験した。AVA04-251_V.2は、０．２９〜１．７１ｎＭの範囲のＩＣ５０で、各ベンチマーク抗体との競合性を示した。
【０６４５】
すなわち、ベンチマーク抗体による競合阻害を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）により評価した。アベルマブ、アテゾリズマブおよびドゥルバルマブを０．５μｇ／ｍｌでプレート上にコーティングした。プレートを、１５０ｌの洗浄緩衝液（ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％）で２回洗浄し、ＰＢＳ中のカゼイン５％（Sigma）で室温（２５±１℃）にて９０分間飽和させた。プレートを前記のように洗浄した。次いで、アフィマーおよびコントロール（ベンチマーク抗体、ブランク）を二重に希釈し、0.07 nMのhuPD-L1-Fc（R&D Systems）で60分間プレインキュベートした後、室温（25±1c）で90分間プレートに装填した。プレートを、上記のように３回洗浄した。ビオチン化ポリクローナル抗体抗ｈｕ ＰＤ−Ｌ１（R&D Systems）を希釈バッファーで希釈し、室温（２５±１℃）にて９０分間インキュベートした。プレートを上記のように３回洗浄し、ストレプトアビジンＨＲＰを室温（２５±１℃）にて３０分間インキュベートした。プレートを洗浄し、基質（TMB、Pierce Thermo-Scientific）をプレートに１０分間添加した。酸性溶液を用いて反応を停止させ、プレートを４５０〜６３０ｎｍで読み取った。次いで、補間された非線形４パラメータ標準曲線を用いてＩＣ５０を算出した。
【０６４６】
実施例７：アフィマー半減期延長（図７）および組織分布（図３０）の薬物動態試験
Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２を１０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射（ＩＶ）した。６匹のマウスに注射し、９つの時間点（０ｈ、０．２５ｈ、６ｈ、２４ｈ、７２ｈ、１２０、１６８ｈ、３３６ｈ、４８０ｈ）を採取した。各時点の血清サンプルをプールし、注入した分子を対照標準としてサンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。結果を、１５分後の初回用量に対するパーセンテージとして表した。
【０６４７】
この薬物動態学試験で用いたＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２は、実施例５に記載のように、Expifectamineトランスフェクションを用いてＥｘｐｉ２９３Ｆから産生した。Endosafe Nexgen-PTS（商標）リーダー（Charles River）を用いてＬＡＬアッセイを行い、タンパク質サンプル中のエンドトキシンレベルが０．０１ＥＵ／ｍｇであることを確認した。哺乳動物宿主細胞タンパク質を、製造者のプロトコールを用いて、ＨＥＫ２９３ ＨＣＰ第２世代ＥＬＩＳＡ（Cygnus）を用いて定量した。サンプルは、タンパク質１ｍｇ当たり５ｕｇ／ｍｌのＨＣＰを含んでいた。
【０６４８】
同所性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を有するヒト化ＮＯＧマウスへの１２５Ｉ−アフィマーおよび１２５Ｉ−アベルマブの静脈内投与後の総放射能の組織分布を評価した（図３２Ａ）。マウスを、腫瘍サイズに基づいて無作為化し、アベルマブまたはＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２を静脈注射した（群および時間点ごとにｎ＝５）。マウスを８時間および９６時間で殺した。血液および臓器を採取して取り出し、体重を測定した。生物学的サンプルに含まれる総放射能は、ガンマ線の検出および定量測定のために設計されたRIASTAR A5410マルチ検出器ガンマカウンター（Packard）を用いて決定した。秤量した試料のアリコートを５ｍＬのポリプロピレンチューブに入れた。次に、チューブを直接ガンマ線を検出するための計数トレイにロードした。図３１Ｂは、血漿／腫瘍の比率を示す。
全体として、ＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２は、アベルマブと同様の組織分布を有する。
【０６４９】
実施例９：ヒトＰＢＭＣ刺激アッセイによる免疫原性試験（図８）。
アフィマー親ＨＥＫ細胞トランスフェクションおよびｍａｂＳｅｌｅｃｔＳｕｒｅ精製を、ＳＰ高性能カラム(GE)を用いて、２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４緩衝液を用いて、カチオン交換精製工程を追加して、実施例５に記載のように行った。ランニングバッファーおよび０．１％トライトン１１４ｘ（Sigma）の１０ＣＶ洗浄を用いて、負に帯電したエンドトキシンを除去した。結合したタンパク質を２０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４および２Ｍ ＮａＣｌで溶出した。分取ＳＥＣを実施例３に記載のように実施した。ＬＡＬアッセイをEndosafe Nexgen-PTS（商標）リーダー（Charles River）を用いて実施し、タンパク質サンプル中のエンドトキシンレベルが０．０４ＥＵ／ｍｇであることを確認した。宿主細胞タンパク質を、HEK293 HCP定量キット（Cygnus）を用いて、製造者のプロトコルを用いて定量した。サンプルは、タンパク質１ｍｇ当たり３０ｎｇ／ｍｌのＨＣＰを含んでいた。
【０６５０】
健康なドナーのそれぞれから単離されたＰＢＭＣを、極低温貯蔵装置から取り出し、無血清細胞培養培地中で解凍し、組織培養処理された９６ウェル丸底マイクロプレートに播種した。全ての試験産物を無血清細胞培養培地で希釈し、最終濃度５０μｇ／ｍｌでウェルに添加し、ステフィンＡを２５μｇ／ｍｌで試験した。細胞を７日間培養した。ＣＤ４＋ Ｔ細胞増殖を、５−エチニル−２’−デオキシウリジン（ＥｄＵ）の取り込みを測定することによって評価した。培養６日目に、ＰＢＭＣ培養物を約１６時間ＥｄＵでパルス化した。７日目に、細胞をＴ細胞表面マーカー（ＣＤ３、ＣＤ４およびＣＤ８）で蛍光染色し、固定し、透過処理し、組み込まれたＥｄＵを蛍光アジドで染色した。刺激指数は培地に対する比率として算出した。ＳＩ＞２を陽性反応とした。応答者の％を、試験した各分子についてプロットした。
全体として、陽性対照ＫＬＨのみが、７日間の処置後にＴ細胞増殖を刺激することができた。
【０６５１】
実施例１０：Ｆｃ上の様々な部位でのアフィマーのフォーマット化（図９）
Ｅｘｐｉ２９３Ｆトランスフェクションおよび一段階のｍａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ精製を、AVA04-236-A(EAAAK)6（配列番号１９６） hlgG1 Fc (AR)、AVA04-236-A(EAAAK)6（配列番号１９６） hlgG1 Fc Ｃ末端アフィマー(AQ)およびhlgG1 Fc (AG)上のAVA04-236二量体で、実施例５に記載のように実施した。分析ＳＥＣを、MAbPac SEC-1（Thermo）を用いて行い、ＰＢＳ １ｘ移動相中で０．８ｍｌ／分で、Ultimate 3000 HPLC（Thermo）で泳動した。AVA04-236-A(EAAAK)6（配列番号１９６）hlgG1 Fc、AVA04-236-A(EAAAK)6（配列番号１９６）hlgG1 Fc Ｃ末端アフィマー、およびhlgG1 Fc上のAVA04-236二量体の結果は、それぞれ９６％、９７％および９２％であった。
【０６５２】
実施例１１：動態解析（図１０）
単量体アフィマー、Ｎ末端ｈｌｇＧ１ Ｆｃスティフリンカー（AR）、Ｎ末端二量体hlgG1 Fc（AG）、Ｃ末端ｈｌｇＧ１可撓性リンカー（AQ）およびＮ末端ｈｌｇＧ１可撓性リンカー（V.2）について、実施例４に記載のように実施されたBiacore動態解析を行った。解析には、会合時間５００秒、解離時間８００秒を用いた。再生は、３ｍＭ ＮａＯＨ（ＧＥ）を用いて、２０μｌ／分にて２０秒間行った。単量体アフィマー、Ｎ末端ｈｌｇＧ１ Ｆｃスティフリンカー、Ｎ末端ダイマーｈｌｇＧ１ Ｆｃ、Ｃ末端ｈｌｇＧ１可撓性リンカー、Ｎ末端hlgG1可撓性リンカーのＫＤの結果は、それぞれ６．４ｎＭ、０．８９ｎＭ、０．１９ｎＭ、２．０１ｎＭおよび０．６３ｎＭであった。
【０６５３】
実施例１２：イピリムマブ（バイオシミラー）融合分析（図１１Ａ−１１Ｂ）
Expi293Fのトランスフェクションを、イピリムマブおよびイピリムマブ−ＡＶＶＡ０４−１４１で、重鎖：軽鎖が１：１の比率のベクターｐＤ２６１０ｖ１４(Atum)で行った。アフィニティークロマトグラフィーおよび分析ＳＥＣ ＨＰＬＣを実施例５に記載のように行った。分取ＳＥＣならびに還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ ＱＣを、実施例３に記載のように実施した。
【０６５４】
実施例１３：動態解析（図１２Ａ〜１２Ｃ）
実施例４に記載のプロトコールを用いて、Biacore動態解析を行った。イピリムマブ−１４１融合タンパク質を、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４緩衝液（GE）中のアミンカップリングを用いてＣＭ５チップ表面に固定化した。ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ抗原またはＣＴＬＡ４−Ｆｃ抗原（R&D Systems）を、ＰＤ−Ｌ１−Ｆｃでは会合時間３００秒かつ解離時間６００秒、ＣＴＬＡ４−Ｆｃでは会合時間７００秒かつ解離時間１２００秒で滴定した。再生は、３ｍＭ ＮａＯＨ（GE）を用いて２０μｌ／分で２０秒間行った。
【０６５５】
実施例１４：二重特異性ベバシズマブ（バイオシミラー）−ＰＤ−Ｌ１アフィマー特性化（図１３Ａ〜１３Ｃ）および薬物動態解析による半減期決定（図１３Ｄ）
ベバシズマブ−ＡＶＡ０４−２５１二重特異性Ａｆ−ｍＡｂを、１：１のＶＨ：ＶｋプラスミドpD2610v14（Atum）のトランスフェクション比を用いて、実施例５に記載のように作製した。リジッド(rigid)または可撓性リンカーを有するベバシズマブ−ＡＶＡ０４−２５１二重特異性Af-mAbsを、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０（GE）を用いたアミンカップリングを用いてＣＭ５チップ表面に固定化し、hPDL1-Fc（R&D Systems）を分析物として会合時間３００秒および解離時間６００秒で分析を行い、３ｍＭ ＮａＯＨ（GE）を用いて２０μｌ／分で２０秒間再生した（図１３Ｂ）。
【０６５６】
ベバシズマブ−ＡＶＡ０４−２５１二重特異性Ａｆ−ｍＡｂまたはベバシズマブ（バイオシミラー、抗ＶＥＧＦ、Invivogen）を、それぞれ１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ４．５およびｐＨ５．５でアミンカップリングを用いてＣＭ５チップ表面に固定化した（GE）。hVEGF（Peprotech）を分析物として、単一サイクル動態として、ｘ５濃度を、会合時間７００秒および解離時間１２００秒で実行し、３．５ｍＭ ＮａＯＨ（GE）を用いて２０μｌ／分で２０秒間再生した。データブランクを減算し、1:1 Langmuir結合モデルBIAcore評価ソフトウェア；GE）を用いて分析し、見かけのＫＤ値を計算した。
【０６５７】
図１３Ｄ：Ｃ５７／Ｂｌ６マウスにおける薬物動態試験：図７に記載のように、マウスに１０ｍｇ／ｋｇで静脈内注射（ＩＶ）した。６匹のマウスに注射し、９つの時間点（０ｈ、０．２５ｈ、６ｈ、２４ｈ、７２ｈ、１２０、１６８ｈ、３３６ｈ）を収集した。各時点の血清サンプルを集め、対照標準として注射された分子を用いてサンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。結果を、１５分後の初回用量に対するパーセンテージとして表した。アフィマーAf-mAbの半減期は、Ｆｃフォーマットのアフィマー（AVA04-251_AQ.2）に匹敵するベータ段階（約１２７時間）で推定された。
【０６５８】
実施例１５：結晶化のためのタンパク質の製造（図１４〜１６）。
ｈＰＤ−Ｌ１結合ドメイン（Ｎ末端ＩｇＶドメイン１８−１３４）を、大腸菌において封入体として発現させた。細胞ペレットをトリス緩衝生理食塩水（ＴＢＳ）に可溶化し、４℃にて１６時間８Ｍ尿素を添加した。Ｈｉｓタグ付き抗原を、溶出バッファーＴＢＳ、８Ｍ尿素および４００ｍＭイミダゾールを用いて、図３に記載のようにＮｉＮＴＡを用いて精製した。タンパク質は、１Ｌのリフォールディングバッファー（０．５Ｍアルギニンを添加した１００ｍＭのトリスｐＨ ８）に約１００ｍｇのタンパク質を滴下することにより、再折り畳みされた。その後、０．２５ｍＭのグルタチオン（還元および酸化）およびプロテアーゼ阻害剤の錠剤（ＥＤＴＡ無添加、Roche）を、４℃にて一晩撹拌した。次いで、タンパク質をタンジェンシャルフロー・フィルトレーション（ＴＴＦ）により濃縮し、緩衝液をＴＢＳおよび１０％グリセロールに交換した。タンパク質を、ＴＢＳおよび１０％グリセロールランニングバッファー中で２．６ｍｌ／分で泳動されたAKTA Xpress（GE）を用いてHiload 26/600 Superdex ７５ｐｇを用いて精製した。ＡＶＡ０４−２６１を、ＴＢＳランニングバッファーを用いて、実施例３に記載のように発現させ、精製した。溶出したタンパク質を−２０℃にて２ｍｇ／ｍｌで保存した後、ＡＶＡ０４−２６１を等モル量のｈＰＤ−Ｌ１抗原と混合した。次いで、分取ＳＥＣを上記のように実行した。溶出画分を６８ｍｇ／ｍｌに濃縮した。
【０６５９】
結晶化を行うために、０．１μｌのタンパク質および０．１μｌのリザーバー溶液を用いて、シッティングドロップ蒸気拡散法を用いて、いくつかの市販のスクリーンを設定した。それらを室温で一晩放置し、多くの異なる緩衝液から六方晶を得た。２５％ Jeffamine SD-2001、１００ｍＭ ＭＥＳ ｐＨ５．５、１００ｍＭマロン酸ナトリウム二塩基で得られた結晶について回折データを収集した。結晶は、母液中の液体窒素中でフラッシュ冷却した。データは、英国のダイヤモンド光源（Diamond light source）で収集した。ＡＶＡ０４−２６１／ｈＰＤ−Ｌ１結合ドメインタンパク質複合体の構造を、ｐｄｂ構造３ＫＳＥ、４Ｎ６Ｔおよび５Ｃ３Ｔに由来するモデルとの分子置換を用いてＣＣＰ４スイートを用いて解いた。ｈＰＤ−Ｌ１結合面は、ＰＤ−Ｌ１を結合するタンパク質の文献例と顕著に類似していた（1. Lee, J. et al. (2016) Nature Communications 7, 13354、2. Zak, K. et al. (2016) Oncotarget, 7, 30323、3. Zhang F. et al (2017) Cell Discovery, 3, 17004)。
【０６６０】
実施例１６：半減期延長抗ヒトＰＤ−Ｌ１二量体アフィマーインライン融合（ＩＬＦ）：リジッドまたは可撓性遺伝子リンカーを用いた概略図およびＸＴ命名法（図１７Ａ〜１７Ｂ）
アフィマーＩＬＦを、実施例３に詳細に記載のように作製した。分取ＳＥＣに続いて、タンパク質を、実施例３に記載のようにＳＥＣ−ＨＰＬＣ上で実行し、すべての融合タンパク質について９５％を超える純度であった。図１７Ａを参照のこと。
【０６６１】
Biacore動態解析は、遺伝子的に融合されている間、抗ヒトＰＤ−Ｌ１および抗ヒト血清アルブミンアフィマーの両方が標的タンパク質と結合できることを実証し、ＡＶＡ０４アフィマーは２〜６倍の親和性でヒトＰＤ−Ｌ１を結合し、ＨＳＡアフィマーは５倍の親和性でＨＳＡを結合する（実験は、実施例４に記載のように行われた）。Biacore T200動態解析を、ランニングバッファーＨＢＳ−ＥＰ＋（GE）を用いて血清アルブミンに対して行い、シリーズＳセンサーＣＭ５チップを、アミンカップリング剤（GE）を用いて、１０ｍＭ酢酸ナトリウムｐＨ５．０（GE）中でヒト血清アルブミン（Sigma; A37812）を表面Ｆｃ２上に固定化した。アフィマー単量体の濃度滴定を、３０μｌ／分の流速で分析物として実行した。動態データをブランク減算し、１：１ Langmuir結合モデル（BIAcore評価ソフトウェア; GE）に適合させて、ＫＤ値を算出した。図１７Ｂを参照のこと。
【０６６２】
実施例１７：半減期延長を有するＩＬＦ三量体（図１８Ａ、Ｂおよび図３１）
Ａ、ＢまたはＣの位置に半減期延長アフィマーを有するＩＬＦ ＡＶＡ０４−２５１三量体：Biacore動態解析により、遺伝子的に融合されたアフィマーは標的タンパク質に結合することが示された。ＡＶＡ０４アフィマー二量体は２５１ ＩＬＦ二量体（ＢＨ形式）の２倍以内でヒトＰＤ−Ｌ１に結合し、他のアフィマーはＨＳＡに結合した。Biacoreは、ＰＤ−Ｌ１については実施例４に記載のように、ＨＳＡ結合については実施例４に記載のように実施した。
【０６６３】
図３１：ＩＬＦアフィマーＸＴの薬物動態。半減期延長を有するＩＬＦ ＡＶＡ０４-２５１三量体を、Ｃ５７／Ｂｌ６マウスにおける薬物動態試験で試験した。図７に記載のように、マウスに１０ｍｇ／ｋｇを静脈内注射（ＩＶ）した。６匹のマウスに注射し、９つの時間点（０ｈ、０．２５ｈ、６ｈ、２４ｈ、７２ｈ、１２０、１６８ｈおよび３３６ｈ）を採取した。各辞典の血清サンプルを集め、注射した分子を対照標準としてサンドイッチＥＬＩＳＡで分析した。結果を、１５分後の初回用量に対するパーセンテージとして表された。半減期延長なしのアフィマーＩＬＦ（ＢＨ）は速いクリアランス(ｔ1/2 ３．２時間）を示したが、ILF AVA04-251 XTフォーマットおよび半減期はベータ段階で２３．８〜２４．２時間の範囲で推定された。
【０６６４】
実施例１８：標的結合配列の分析（図１９）
ループ４のｘ９アミノ酸位置でのＡＶＡ０４−２５１アラニンスキャン。精製された変異体タンパク質１μｌの還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動を減らすと、すべての変異体についての大腸菌生産量は約１５０ｍｇ／Ｌになった。ｈＰＤ−Ｌ１ Biacore動態解析を５０ｎＭ濃度で行い、ループ４の位置１および４を標的結合に不可欠なものとして同定した。
【０６６５】
実施例１９：安定性（図２０）。
AVA04-251 V.2の安定性を試験するために、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析をYarra-3000（Phenomenex）カラムを用いて、ＰＢＳ １ｘ緩衝液中で１ｍｌ／分で、毎月、９ヶ月間実行した。サンプルは＋４℃で貯蔵した。単量体純度は３〜５％低下した。
【０６６６】
実施例２０（図２１）
ＡＶＡ０４−２５１ ＣＧ、抗ＰＤＬ１アフィマーを、ヒンジＳ２２８Ｐ変異および（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１９７）リンカーを有するＩｇＧ４ Ｆｃ融合タンパク質に結合させた。このタンパク質は、実施例５に記載のように、一過性のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞から作製した。融合タンパク質を、１００ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ３．５緩衝液中で溶出されたPrismA(GE)プロテインＡ親和性レジンを用いて精製した。次いで、実施例３に記載のように分取ＳＥＣを行った。純度を、ＰＢＳ １ｘ緩衝液中で１ｍｌ／分でUltimate 3000 HPLC（Thermo）上で実行されたSEC-HPLC Yarra-3000カラムを用いて評価した。最終タンパク質は、９８％を超える純度であった。
【０６６７】
実施例２１（図２２）
ＡＶＡ０４−２５１ ＣＦは、ＡＤＣＣを低下させるためのＬ１５３Ａ、Ｌ１５４Ａ Ｆｃ ＣＨ１変異を有するＩｇＧ１ Ｆｃ融合体であった。このタンパク質は、一過性のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞から産生され、実施例５に記載のように精製した。純度を、ＰＢＳ １ｘ緩衝液中で１ｍｌ／分でUltimate 3000 HPLC（Thermo）上でSEC-HPLC Yarra-3000カラムを用いて評価した。最終タンパク質は、９９％を超える純度であった。
【０６６８】
実施例２２（図２３）
ＡＶＡ０４−２６１アフィマーをＦｃのＩｇＧ１ヒンジ領域に遺伝的に融合させ、大腸菌（ＢＮフォーマット）から作製した。このタンパク質を実施例３に記載のように精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、非還元条件下でヒンジ内のシステインを介して二量体種が二量体化し、還元緩衝液中で単量体種に還元されたことを示した。ＰＤ−１ ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイ（Promega）アッセイを、製造業者の指示に従って、デュプリケートで行い、ＡＶＡ０４−２６１ ＢＮフォーマットが、単量体のＡＶＡ０４−２６１と比較したときにアビディティ（avidity）を有することを示した。ＡＶＡ０４−２６１ ＢＮフォーマットのBiacoreは５９．９ｐＭのＫＤをもたらした。
【０６６９】
実施例２３（図２４）
ＡＶＡ０４−２５１ ＡＺヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合タンパク質において、アフィマーをＦｃヒンジ領域に直接融合させた。このタンパク質を一過性のＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞から産生し、実施例５に記載のように精製した。純度を、ＰＢＳ １ｘ緩衝液中で１ｍｌ／分でUltimate 3000 HPLC（Thermo）上のSEC-HPLC Yarra-3000カラムを用いて評価した。最終的なタンパク質は９９％を超える純度であった。Biacore単一サイクル動態データブランクを減算し、１：１結合モデルに適合させ、３１．５ｐＭのＫＤを実証した。ＰＤ−１ ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイ(Promega)は、Ｆｃヒンジとアフィマーの間の（Ｇ４Ｓ）４（配列番号１９７）リンカーのＶ.２フォーマットと同じ活性を示した。
【０６７０】
実施例２４（図２５）
４つの抗ヒトＰＤ−Ｌ１アフィマーとのヒトＩｇＧ１ Ｆｃ融合体を、ＦｃのＮ末端またはＣ末端に融合させた。ＡＶＡ０４−２５１ ＡＧ.３、ＡＶＡ０４−２５１ ＢＳフォーマットをＥｘｐｉ２９３Ｆ細胞から作製し、mabselect sureレジンを用いて精製した。次いで、図５Ａに記載のように分取ＳＥＣを行った。ＰＤ−１ ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイ（Promega）において、両フォーマットはＰＤ−１へのＰＤ−Ｌ１結合の遮断を示した。Biacore単一サイクル動態データブランクを減算し、１：１結合モデルに適合させ、ＡＶＡ０４−２５１ ＡＧ.３およびＡＶＡ０４−２５１ ＢＳについて、それぞれ３６．２ｐＭおよび２５．７ｐＭのＫＤを実証した。
【０６７１】
実施例２５（図２６）
ＰＤ−Ｌ１結合ドメイン（１４ＫＤａ）とＦｃ融合体ＡＶＡ０４−２５１ Ｖ.２またはＡＶＡ０４−２３６ Ｖ（８２ｋＤａ）とのクロスリンキング質量分析を行い、非共有結合複合体を分析した。アフィマーＦｃ融合体を、特別に開発された架橋混合物を用いて、過剰のヒトＰＤ−Ｌ１ドメインと混合した（Bich, C et al. Anal. Chem. 2010, 82(1), pp 172-179）。この溶液を＋４℃で混合し、一晩置いた。高質量検出システムにより、０〜１５００ｋＤａの高質量範囲での相互作用を特徴付けた。ＭＳパラメータ、線形モードおよび正モードの両方、イオン源１：２０ｋＶＩＯＮ、源２：１７ｋＶ。レンズ１２ｋＶＰｕｌｓｅ、イオン抽出４００ｎｓＨＭ４、ゲイン電圧：３．１４ ｋＶおよび加速電圧２０ ｋＶ。高質量ＭＡＬＤＩ質量分析および化学架橋を用いて、ＡＶＡ０４−Ｆｃ融合タンパク質のみを検出し、１つのＰＤ−Ｌ１（＋１４ｋＤａ）および２つのＰＤ−Ｌ１（＋２８ｋＤａ）タンパク質を結合した種を検出し、１：１および２：１の化学両論（stoichiometry）の存在を確認した。
【０６７２】
実施例２８：カニクイザル交差反応性（図２７および２８）
ＡＶＡ０４−２５１ Ｖ.２およびＣＧフォーマットの交差反応を、図４に記載のように実行されたBiacoreを用いて例示した（図２７）。ヒトおよびカニクイザルＰＤ−Ｌ１ Ｆｃ抗原（R&D Systems社）との親和性は２倍以内であり、２６〜４７ｐＭの範囲内であった。
【０６７３】
ＥＬＩＳＡによる様々な＿Ｖ.２フォーマット化アフィマーの交差反応性（図２８）。試験した全てのフォーマット化されたアフィマーは、０．０８５〜０．３７５ｎＭの範囲のＥＣ５０で、カニクイザルＰＤ−Ｌ１に結合していた。ベンチマーク抗体は、最良のフォーマット化されたアフィマーと同様のＥＣ５０＝０.０４４ｎＭで検出された。
【０６７４】
すなわち、交差反応性を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によって評価した。カニクイザルＰＤ−Ｌ１ Ｈｉｓタグ（Sino Biological）を２μｇ／ｍｌでプレート上にコーティングした。プレートを１５０μｌの洗浄バッファー（ＰＢＳ、Ｔｗｅｅｎ ２０ ０．１％）で２回洗浄し、ＰＢＳ中のカゼイン５％（Sigma）で室温（２５±１℃）にて９０分間飽和させた。プレートを、上記のように洗浄した。次いで、アフィマーおよび対照（アテゾリズマブおよびブランク）を２倍希釈し、室温（２５±１℃）にて９０分間インキュベートした。プレートを、上記のように３回洗浄した。次に、ポリクローナル抗体ＨＲＰ抗ｈｕ Ｆｃ（Abcam）を希釈バッファーで希釈し、室温（２５±１℃）にて９０分間インキュベートした。プレートを上記のように３回洗浄し、基質（ＴＭＢ、Pierce Thermo-Scientific）をプレートに１０分間添加した。酸性溶液を用いて反応を停止させ、プレートを４５０〜６３０ｎｍで読み取った。次いで、ＥＣ５０を、補間された非線形４パラメータ標準曲線を用いて算出した。
【０６７５】
実施例２９．混合リンパ球反応（図２９Ａおよび２９Ｂ）
ｈＦｃ１フォーマットされたアフィマーを、ＭＬＲアッセイで試験した（図２９Ａ）。すなわち、７日間培養したＣＤ１４＋単球から単球由来の樹状細胞（ＤＣ）を調製した。未成熟ＤＣを７日目に使用し、同種異系Ｔ細胞（ネガティブ単離）および対照物質またはビークル対照と共に培養した。細胞を４日間培養し、培養終了時の上清中のＩＦＮ−γをＥＬＩＳＡにより測定した。データを、平均±S.E.M. pg/ml（左）またはビークル対照（右）に対して正規化したものとして示す（ｎ＝６）。**ｐ＜０．０１、***ｐ＜０．００１、****ｐ＜０．０００１、試験物質をそれぞれの濃度の SQT Gly V.2対照と比較するDunnettの事後検定を用いた双方向ＡＮＯＶＡを使用した。点線は平均ビークル（RPMI-10）値を示す。ＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２は、ベンチマーク抗体（アベルマブ）と同等の方法でＩＦＮγのレベルを２倍以上増加させた。
ＸＴフォーマットされたアフィマーを、上記のようにＭＬＲアッセイで試験した（図２９Ａ）。ＡＶＡ０４−２５１ ＸＴ１４およびＸＴ１６は、ＩＬＦフォーマットとしてＩＦＮγのレベルを増加させた（図２９Ｂ）。
【０６７６】
実施例３０．ＰＢＭＣのブドウ球菌性腸管毒素Ｂ刺激（図３０）
健康なヒトドナー（Ｎ＝５）由来のＰＢＭＣを、固定濃度のブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ；Toxin Technology）と共に低濃度（１０および１００ｎＭ）で、アッセイ開始時にＡＶＡ０４-２５１＿Ｖ.２または対照抗体を用いて９６時間培養した。培養上清中のＩＬ−２レベルをＨＴＲＦ分析（Cisbio）により測定し、検査項目なしの基底レベル、ＳＥＢ単独と比較した。ＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２は、用量依存的にインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生を増加させた。
【０６７７】
実施例３１．同所性ＭＤＡ−ＭＢ−２３１腫瘍細胞を有するヒト化ＮＯＧマウスにおけるＡＶＡ０４−２５１Ｆｃの組織分布（図３２Ａ）
マウス(５匹／群)に、１２５Ｉ−ＡＶＡ０４ Ｆｃまたは１２５Ｉ−アベルマブを１０ｍｇ／ｋｇ（５００μＣｉ／ｋｇ）でＩＶ注射した。マウスを８時間または９６時間で殺し、臓器を摘出して重さを測定した。生物学的サンプル中に含まれる総放射能を、RIASTAR A5410（Packard社）を用いて測定した。結果は、各臓器について、初回用量に対する割合（ＩＤ％）として示されている。腫瘍を超える血漿の割合（図３２Ｂ）は、腫瘍における蓄積が９６時間後の血漿中のレベルの５倍であり、アベルマブと同等であることを示している。
【０６７８】
実施例３２．Ｃ５７／Ｂｌ６マウス同所移植モデルにおけるヒト化ＰＤ−Ｌ１ ＭＣ３８におけるＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２での処置後の腫瘍増殖阻害（図３３Ａ−３３Ｄ）
マウス（ｎ＝８）を、ヒト化ＰＤ−Ｌ１ ＭＣ３８腫瘍細胞株（マウスＰＤ−Ｌ１細胞外部分がｈＰＤ−Ｌ１で置換されている）を右脇腹領域に皮下接種した。腫瘍が８０ｍｍ３になった時点で製品および対照を注入した。処置は、１０ｍｇ／ｋｇ（AVA04-251_V.2およびその対照SQT_V.2）または５ｍｇ／ｋｇ（対照抗体アテゾリズマブおよびアイソタイプ対照）の用量で週２回、３週間投与した。全体として、腫瘍増殖阻害が両方の処置について示された（図３３Ａ）。ＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２で処置された全てのマウスは、対照と比較して腫瘍サイズが減少した（図３３Ｂ）。１５００ｍｍ３での生存曲線は、ＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２を注射したマウスの５０％が、無作為化後２２日目にはまだ生きていることを示した（図３３Ｃ）。また、対照抗体（アテゾリズマブ）を用いた場合の生存曲線（図３３Ｄ）は、２２日目時点で５０％のマウスが生存していることを示した。
【０６７９】
実施例３３．ＮＣＧマウスにおける皮下Ａ３７５ヒト黒色腫ヒト化モデルの処置におけるインビボ有効性試験においてＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２で処置された群における腫瘍増殖阻害（図３４Ａ−３４Ｄ）
ＰＢＭＣを２人の健康なドナーから単離した。全Ｔ細胞を単離し、ＩＬ−２を添加した完全培地中で７〜１０日間、Ａ３７５細胞上で２ラウンドで増殖させた。マウス（ｎ＝１０）を、０．２ｍｌのＰＢＳ中のＡ３７５腫瘍細胞および活性化Ｔ細胞を右脇腹領域に皮下接種し、腫瘍の発生を促した。処置は細胞接種の１時間後に開始した。ＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２を用い、週２回、３週間投与した。全体として、対照と比較した場合、両処置について腫瘍増殖阻害が示された（図３４Ａ）。ＡＶＡ０４−２５１＿Ｖ.２で処置されたマウスの７０％以上は、対照群と比較して腫瘍サイズが減少した（図３４Ｂ）。また、対照抗体（アテゾリズマブ）の生存曲線（図３４Ｄ）は、対照抗体で処置された群のすべてのマウスが、無作為化の３２日後に等しく８００ｍｍ３の腫瘍サイズに到達したことを示した。
【０６８０】
実施例３４．マウス同種異系混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおけるマウスサロゲートＡＶＡ０４−１８２ Ｖ.２の活性
マウスＰＤ−Ｌ１に拮抗するマウスサロゲートアフィマーAVA04-182 V.2について、Ｃ５７／Ｂｌａｃｋ６マウスから調製された骨髄樹状細胞（ＢＭＤＣ）を用いて作用機序を実証した。ＢＭＤＣを採取し、Ｂａｌｂ／Ｃマウスの脾臓から単離したＣＤ４＋ Ｔ細胞と混合した。ＢＭＤＣおよびＣＤ４＋ Ｔ細胞を、アベルマブおよびアイソタイプ対照ｍＡｂについては７０ｎＭ、ＡＶＡ０４−１８２ Ｖ.２およびＳＱＴ Ｇｌｙ Ｖ.２については７、７０および７００ｎＭで、それぞれの試験分子を用いて４日間共培養した。上清中のマウスＩＦＮ−γ（図３５Ａ）およびＩＬ−２（図３５Ｂ）レベルをＥＬＩＳＡにより測定した。
【０６８１】
実施例３５．マウスＰＤ−Ｌ１に拮抗するマウスサルゲートアフィマーＡＶＡ０４−１８２ Ｖ.２を用いた腫瘍増殖阻害。ＡＶＡ０４−１８２ Ｖ.２およびアベルマブを用いたインビボＭＢ４９マウス膀胱癌同所移植モデル（図３６Ａ−３６Ｂ）
ＭＢ４９腫瘍細胞株をマウスの右脇腹に皮下接種した。処置は、腫瘍が５０ｍｍ３に達した時点で開始し、ＩＰ経路を介して、３週間の間、隔週で投与した（ｎ＝１０）。試験した分子は、アイソタイプｍａｂ対照ｈＩｇＧ１（１０ｍｇ／ｋｇ）、アフィマー対照ＳＱＴ−Ｇｌｙ Ｖ.２（１０および２０ｍｇ／ｋｇ）、マウスＰＤ−Ｌ１アンタゴニストＡＶＡ０４−１８２ Ｖ.２（１０および２０ｍｇ／ｋｇ）、アベルマブ（１０ｍｇ／ｋｇ）およびビークル対照（ＰＢＳ）であった。腫瘍の増殖曲線を測定し、実験の過程でプロットした（図３６Ａ）。ＡＶＡ０４−１８２ Ｖ.２は、統計的に有意であったビークルおよびアフィマー対照（SQT-GlyV.2）と比較して、１０および２０ｍｇ／ｋｇの両方で腫瘍の増殖率を有意に低下させることができることが示された（図３６Ｂ）。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１０−３】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１８−１】
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【図１８−２】
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【図１８−３】
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【図１８−４】
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【図１８−５】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３−１】
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【図３３−２】
2021520851.tif 000069
【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３５】
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【図３６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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