(57)【要約】本開示の実施態様は、ヒトパピローマウイルス感染およびそれに関連する疾患の免疫療法のための方法および組成物に関する。具体的な実施態様において、方法は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を採用する、ただしＩＬ−６および／またはＩＬ−１２を採用しない刺激工程を有する方法を含む、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８の１つまたはそれより多くの抗原を標的化する免疫細胞の生産に関する。他の具体的な実施態様は、特定の細胞、例えば共刺激細胞および特定の抗原提示細胞の存在下における刺激を利用する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成または拡大する方法であって、ＨＬＡ陰性ＬＣＬの存在下における、ＨＰＶ抗原のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によって、免疫細胞の集団を、任意選択でＰＢＭＣの集団を、刺激する工程を含む、上記方法。
【請求項２】
前記ＨＬＡ陰性ＬＣＬが、ＥＢＶ複製欠損型である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＡＰＣが、活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）、樹状細胞（ＤＣ）またはＢ−ブラスト（ＢＢ）である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＤＣが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から単離されたＣＤ１４＋細胞から得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＤＣが、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下でＣＤ１４＋細胞を培養して、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を生産することを含む方法によって、ＣＤ１４＋細胞から得られる、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
前記ＤＣをＣＤ１４＋細胞から得る前記方法が、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌ；（ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＰＬＡおよびＩＦＮγ；（ｃ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα；または（ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＡｍｐＢおよびＩＦＮγの存在下における培養によって、前記ｉＤＣを培養して成熟ＤＣを生産することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ＤＣが、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌ；（ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＰＬＡおよびＩＦＮγ；（ｃ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα；または（ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＡｍｐＢおよびＩＦＮγの存在下における培養を含む方法によって、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）から得られる、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
刺激された前記免疫細胞の集団が、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させている、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記刺激が、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における培養によって実行され、任意選択で該ＩＬ−１５は、前記培養中に、１５ｎｇ／ｍｌより高い最終濃度で存在する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記刺激が、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における培養によって実行される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成または拡大する方法であって、ＨＰＶ抗原のペプチドを提示する樹状細胞（ＤＣ）の存在下における培養によって免疫細胞の集団を刺激することを含み、該ＤＣは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から単離されたＣＤ１４＋細胞から得られる、上記方法。
【請求項１２】
前記ＤＣが、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下でＣＤ１４＋細胞を培養して、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を生産することを含む方法によって、ＣＤ１４＋細胞から得られる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＤＣをＣＤ１４＋細胞から得る前記方法が、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌ；（ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＰＬＡおよびＩＦＮγ；（ｃ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα；または（ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＡｍｐＢおよびＩＦＮγの存在下における培養によって、前記ｉＤＣを培養して成熟ＤＣを生産することをさらに含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成または拡大する方法であって、ＨＰＶ抗原のペプチドを提示する樹状細胞（ＤＣ）の存在下における培養によって免疫細胞の集団を刺激することを含み、該ＤＣは、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌ；（ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＰＬＡおよびＩＦＮγ；（ｃ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα；または（ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＡｍｐＢおよびＩＦＮγの存在下における培養を含む方法によって、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）から得られる、上記方法。
【請求項１５】
前記刺激が、ＨＬＡ陰性ＬＣＬの存在下における培養を含み、任意選択で該ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＥＢＶ複製欠損型である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
刺激された前記免疫細胞の集団が、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させている、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記刺激が、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における培養によって実行され、任意選択で該ＩＬ−１５は、前記培養中に、１５ｎｇ／ｍｌより高い最終濃度で存在する、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記刺激が、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における培養によって実行される、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成または拡大する方法であって、ＨＰＶ抗原のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における培養によって、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させた免疫細胞の集団を刺激することを含む、上記方法。
【請求項２０】
前記刺激が、ＨＬＡ陰性ＬＣＬの存在下における培養を含み、任意選択で該ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＥＢＶ複製欠損型である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＡＰＣが、活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）、樹状細胞（ＤＣ）またはＢ−ブラスト（ＢＢ）である、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＤＣが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から単離されたＣＤ１４＋細胞から得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＤＣが、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下でＣＤ１４＋細胞を培養して、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を生産することを含む方法によって、ＣＤ１４＋細胞から得られる、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＤＣをＣＤ１４＋細胞から得る前記方法が、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌ；（ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＰＬＡおよびＩＦＮγ；（ｃ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα；または（ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＡｍｐＢおよびＩＦＮγの存在下における培養によって、前記ｉＤＣを培養して成熟ＤＣを生産することをさらに含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＤＣが、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌ；（ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＰＬＡおよびＩＦＮγ；（ｃ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα；または（ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＡｍｐＢおよびＩＦＮγの存在下における培養を含む方法によって、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）から得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２６】
前記刺激が、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における培養によって実行され、任意選択で該ＩＬ−１５は、前記培養中に、１５ｎｇ／ｍｌより高い最終濃度で存在する、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記刺激が、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における培養によって実行される、請求項１９〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成または拡大する方法であって、ＨＰＶ抗原のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における培養によって、免疫細胞の集団を刺激する工程を含む、上記方法。
【請求項２９】
前記ＩＬ−１５が、前記培養中に、１５ｎｇ／ｍｌより高い最終濃度で存在する、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成または拡大する方法であって、ＨＰＶ抗原のペプチドを提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ）の存在下における、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における培養によって、免疫細胞の集団を刺激する工程を含む、上記方法。
【請求項３１】
前記刺激が、ＨＬＡ陰性ＬＣＬの存在下における培養を含み、任意選択で該ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＥＢＶ複製欠損型である、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記ＡＰＣが、活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）、樹状細胞（ＤＣ）またはＢ−ブラスト（ＢＢ）である、請求項２８〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ＤＣが、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から単離されたＣＤ１４＋細胞から得られる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＤＣが、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦの存在下でＣＤ１４＋細胞を培養して、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を生産することを含む方法によって、ＣＤ１４＋細胞から得られる、請求項３２または３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＤＣをＣＤ１４＋細胞から得る前記方法が、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌ；（ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＰＬＡおよびＩＦＮγ；（ｃ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα；または（ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＡｍｐＢおよびＩＦＮγの存在下における培養によって、前記ｉＤＣを培養して成熟ＤＣを生産することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＤＣが、（ａ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌ；（ｂ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＰＬＡおよびＩＦＮγ；（ｃ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮα；または（ｄ）ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＡｍｐＢおよびＩＦＮγの存在下における培養を含む方法によって、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）から得られる、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
刺激された前記免疫細胞の集団が、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させている、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＡＰＣまたはＤＣが、１つまたはそれより多くのＨＰＶ抗原に対応する１つまたはそれより多くのペプチドでパルス化されている、請求項１〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記１つまたはそれより多くのＨＰＶ抗原が、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６およびＥ７から選択される、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記１つまたはそれより多くのＨＰＶ抗原が、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２および／またはＨＰＶ３の抗原である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
刺激された前記免疫細胞の集団が、ＨＰＶ抗原のペプチドを提示するＡＰＣの存在下で、任意選択でＰＢＭＣの集団内からのＡＰＣの存在下で培養することによる免疫細胞の事前の刺激から得られる、請求項１〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
ＨＰＶ抗原のペプチドを提示するＡＰＣの存在下における培養によって免疫細胞の集団を刺激することを含む１つまたはそれより多くのさらなる工程をさらに含む、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法に従って得られる、ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団。
【請求項４４】
ＨＰＶ関連疾患の処置または予防方法において使用するための、請求項４３に記載の免疫細胞の集団。
【請求項４５】
ＨＰＶ関連疾患の処置または予防に使用するための医薬品の製造における、請求項４３に記載の免疫細胞の集団の使用。
【請求項４６】
前記処置が、養子細胞移入（ＡＣＴ）によってＨＰＶ関連疾患を処置または防止する方法である、請求項４３または４４に記載の使用のための免疫細胞の集団、または請求項４５に記載の使用。
【請求項４７】
ＡＣＴによって処置する前記方法が、自己細胞または同種細胞の対象への投与を含む、請求項４６に記載の使用のための免疫細胞の集団または使用。
【請求項４８】
対象におけるＨＰＶ関連疾患を処置または防止する方法であって、対象に、請求項４３に記載の治療的または予防的に有効な量の免疫細胞の集団を投与することを含む、上記方法。
【請求項４９】
対象におけるＨＰＶ関連疾患を処置または防止する方法であって、
（ａ）請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法に従って、ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成または拡大すること、および
（ｂ）治療的または予防的に有効な量の、工程（ａ）で得られたＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を対象に投与すること
を含む、上記方法。
【請求項５０】
前記ＨＰＶ関連疾患が、がんである、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の使用のための免疫細胞の集団、使用または方法。
【請求項５１】
前記がんが、子宮頸がん、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、中咽頭がん、上咽頭癌、喉頭乳頭腫症、喉頭がん、頭頸部がん、またはそれらの部位のいずれかの異形成から選択される、請求項５０に記載の使用のための免疫細胞の集団、使用または方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１７年９月１５日付けで出願された国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７３２７４号の一部継続出願である。国際出願ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０７３２７４号は、２０１６年９月１６日付けで出願された米国仮特許出願第６２／３９５，４４０号および２０１６年１０月２１日付けで出願された米国実用出願第１５／３３１，６５９号の優先権を主張する。米国実用出願第１５／３３１，６５９号はまた、米国仮特許出願第６２／３９５，４４０号の優先権も主張する。本出願はまた、２０１７年９月１３日付けで出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／５１２８４号の優先権も主張する。国際出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／５１２８４号は、２０１６年９月１６日付けで出願された米国仮特許出願第６２／３９５，４３８号の優先権を主張する。参照された出願の全ては、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府によって支援された調査または開発に関する陳述
[0001]本発明は、国立癌研究所（National Cancer Institute）によって付与されたＰ５０ＣＡ０９７００７およびＰＯ１ＣＡ９４２３７に基づく政府支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【技術分野】
【０００３】
[0002]本発明の開示は、少なくとも免疫学、細胞生物学、分子生物学、およびがん医学を含む医学の分野に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
[0003]ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）は、皮膚または粘膜のケラチノサイトにおいて増殖性感染を確立するＤＮＡウイルスである。１７０種を超えるタイプのＨＰＶがあり、そのＨＰＶタイプの一部は、発癌性であり、例えば子宮頸部上皮内腫瘍（ＣＩＮ）、外陰上皮内腫瘍（ＶＩＮ）、陰茎上皮内腫瘍（ＰＩＮ）、および／または肛門上皮内腫瘍（ＡＩＮ）などの生殖器における新形成に発達する可能性がある高いリスクの性感染タイプを含む。ウイルス配列が宿主細胞の細胞ＤＮＡに統合されると、ＨＰＶ誘発性のがんが生じる。ＨＰＶ「初期」遺伝子の一部、例えばＥ６およびＥ７は、腫瘍増殖や悪性転換を促進する腫瘍遺伝子として作用する。
【０００５】
[0004]Ramosら（J Immunother 2013;36:66-76）は、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＥ７に特異的なＴ細胞を生成するための末梢血単核細胞を刺激するための方法を記載している。簡単に言えば、この方法は、樹状細胞で末梢血単核細胞を刺激し、ここで細胞を、サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５の組合せを含む、または含まないＣＴＬ培地中で培養し、共培養物にＩＬ−２を補充する第２の刺激を行い、ＩＬ−１５の存在下で事前に混合および負荷されたアクセサリー抗原提示細胞（例えば、Ｂ−ブラスト（B-blast））で週１回刺激することを含む。この参考文献は、サイトカインＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５の組合せが、検出可能なＴ細胞応答のために、患者サンプルからのＨＰＶ特異的なＴ細胞の拡大に必要であることを教示している。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ramosら（J Immunother 2013;36:66-76）
【発明の概要】
【０００７】
[0005]本発明の開示は、例えば、少なくともＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に関連するものなどのＨＰＶ関連疾患を処置するための、当業界における長年の切実な必要性の軽減を提供する。
【０００８】
簡潔な要旨
[0006]本発明の開示は、特定の標的を免疫原性によって認識するように改変された免疫系細胞に関する方法および組成物に向けられる。一部の実施態様において、本発明の開示は、個体において免疫応答を惹起する生物学的な部分を標的化する免疫細胞（細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ、また細胞傷害性Ｔ細胞とも称される）を含む）の開発に関する。具体的な実施態様において、本発明の開示は、ＨＰＶ疾患関連の抗原を含むＨＰＶ抗原を標的化する細胞傷害性Ｔ細胞の開発に関する。一部の場合において、細胞傷害性Ｔ細胞の混合物が生産され、この混合物は、一部の場合において、１つより多くのＨＰＶタイプの１つより多くの抗原を含む１つより多くのＨＰＶ抗原を標的化する。
【０００９】
[0007]本開示の実施態様は、ＨＰＶに感染した、または例えばがんなどのＨＰＶ関連疾患を有する個体に療法を提供するための方法および組成物に関する。「ＨＰＶ関連疾患」は、ＨＰＶ感染によって引き起こされるかもしくは悪化する疾患、ＨＰＶ感染がリスク因子である疾患、および／またはＨＰＶ感染が疾患の発症、発生、進行または重症度に正に関連する疾患であり得る。ＨＰＶ関連疾患は、本発明の方法および組成物が、治療作用（例えば、疾患の発生／進行の阻害、疾患の発症の遅延／防止、疾患の症状の重症度の低減、疾患症状の回復、および／または生存の延長）を提供する疾患であり得る。本発明の方法および組成物の治療的有用性が、ＨＰＶ感染細胞の数の低減によって利益を得ると予想される本質的にあらゆる疾患／状態に及ぶことが、当業者には明らかであると予想される。具体的な実施態様において、本開示は、ＨＰＶ関連、例えばＨＰＶ１６関連、ＨＰＶ１８関連、ＨＰＶ１関連、ＨＰＶ２関連および／またはＨＰＶ３関連の医学的状態（がんを含む）を標的化でき、それに対する治療効果を有する、養子細胞免疫療法のための方法および組成物に関する。
【００１０】
[0008]特定の形態において、本発明の開示は、ＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２および／またはＨＰＶ３からの抗原を標的化する複数のＴ細胞の開発に関する。本発明の開示は、ＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２および／またはＨＰＶ３抗原に対して特異性を有するＴ細胞株を生成するための方法に対する有意で非自明的な改善を提供する。
【００１１】
[0009]本開示の一部の実施態様において、個体は、本開示の方法および／または組成物が必要な個体である。特定の実施態様において、個体は、ＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２および／またはＨＰＶ３に曝露されたことがあるか（これらの存在は、個体が認識していてもよいし、または認識していなくてもよい）、または個体は、ＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２および／またはＨＰＶ３に曝露された疑いがあるか、もしくは曝露されるリスクがある。特定の実施態様において、個体は、がんを含む、ＨＰＶ関連疾患、例えば、ＨＰＶ１６関連、ＨＰＶ１８関連、ＨＰＶ１関連、ＨＰＶ２関連および／またはＨＰＶ３関連疾患を有するか、またはそれを有する疑いがあるか、またはそれを有するリスクがある。
【００１２】
[0010]本方法の一部の具体的な実施態様において、特定のＨＰＶ、例えば、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２および／またはＨＰＶ３抗原は、特定の抗原の一部または全てにわたる１つまたはそれより多くのペプチドの形態で抗原提示細胞（ＡＰＣ）に提示される。抗原性ペプチドは、ペプミックス（pepmix）と称することもできるペプチド混合物のライブラリー中の抗原提示細胞に提供することができる。本開示の特定の形態において、ＡＰＣへの曝露のための様々なペプミックスのプールがある。抗原を発現するＡＰＣは、特定の条件下で末梢血Ｔ細胞に曝露されて、特定のＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞の刺激を引き起こすことができる。
【００１３】
[0011]本発明の開示の一部の形態および実施態様は、ＨＰＶ特異的なＴ細胞の生成および／または拡大に関する。
[0012]第１の形態において、本発明の開示は、末梢血液細胞、好ましくは末梢血Ｔ細胞を刺激するための方法であって、末梢血Ｔ細胞を、インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、少なくとも一部の場合において、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、上記方法を提供する。本明細書で開示された様々な形態によれば、刺激／培養が所与のサイトカイン「の存在下で」実行される場合、関連するサイトカイン（例えば組換えおよび／または外因性サイトカイン）が、刺激／培養物に添加されていてもよい。刺激／培養が所与のサイトカイン「の非存在下で」実行される場合、関連するサイトカイン（例えば組換えおよび／または外因性サイトカイン）は、刺激／培養物に添加されていないことになる。
【００１４】
[0013]一部の実施態様において、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法であって、末梢血Ｔ細胞を、インターロイキンＩＬ−７およびＩＬ−１５のうちの１つまたはそれより多くの存在下で、少なくとも一部の場合において、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、抗原提示細胞で刺激する工程を含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、刺激する工程は、ＨＰＶ関連疾患のための治療効果があるＴ細胞を生産する、上記方法が提供される。
【００１５】
[0014]一部の実施態様において、刺激される末梢血Ｔ細胞は、末梢血液細胞を事前に刺激することにより得られる。事前の刺激は、末梢血液細胞を、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、少なくとも一部の場合において、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の存在下で、抗原提示細胞で刺激することを含んでいてもよく、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。
【００１６】
[0015]したがって、末梢血Ｔ細胞を刺激する前に、本方法は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、少なくとも一部の場合において、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の存在下で、末梢血液細胞を抗原提示細胞で刺激して、末梢血Ｔ細胞を生産するすることをさらに含んでいてもよく、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。
【００１７】
[0016]一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、ＨＰＶ１６の１つまたはそれより多くのタンパク質；ＨＰＶ１８の１つまたはそれより多くのタンパク質；またはＨＰＶ１６の１つまたはそれより多くのタンパク質およびＨＰＶ１８の１つまたはそれより多くのタンパク質の両方の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、ＨＰＶ１の１つまたはそれより多くのタンパク質；ＨＰＶ２の１つまたはそれより多くのタンパク質；ＨＰＶ３の１つまたはそれより多くのタンパク質；またはＨＰＶ１、ＨＰＶ２および／もしくはＨＰＶ３の１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、タンパク質Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１およびＬ２のうちの１つまたはそれより多くに対応する配列を含む。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、および／またはＬ２ペプチドを含むペプチドのライブラリーであってもよい。
【００１８】
[0017]一部の実施態様において、本方法は、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的な免疫細胞、例えばＴ細胞を生産することができる。一部の実施態様において、本方法は、ＨＰＶまたは少なくとも１つのＨＰＶ抗原に特異的な末梢血Ｔ細胞中に存在するＴ細胞の集団を拡大することができる。本開示の方法によって生産され得るＴ細胞以外の免疫細胞としては、ＮＫ細胞およびＮＫＴ細胞が挙げられる。
【００１９】
[0018]一部の実施態様において、抗原提示細胞は、例えば、活性化されたＴ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）、またはＰＢＭＣである。
[0019]一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における末梢血Ｔ細胞の刺激は、少なくともＩＬ−２の非存在下で起こる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における末梢血Ｔ細胞の刺激は、少なくともＩＬ−４の非存在下で起こる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における末梢血Ｔ細胞の刺激は、少なくともＩＬ−６の非存在下で起こる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における末梢血Ｔ細胞の刺激は、少なくともＩＬ−１２の非存在下で起こる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における末梢血Ｔ細胞の刺激は、少なくともＩＬ−２１の非存在下で起こる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における末梢血Ｔ細胞の刺激は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の非存在下で起こる。
【００２０】
[0020]いくつかの特定の実施態様において、本発明の第１の形態の方法における細胞の刺激は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の非存在下で起こる。
[0021]一部の実施態様において、末梢血Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団中に存在していてもよいし、またはそれから得られるかもしくは単離される。集団中のＰＢＭＣは、非接着性ＰＢＭＣであり得る。抗原提示細胞は、例えば、活性化Ｔ細胞、樹状細胞、Ｂ−ブラスト、またはＰＢＭＣであり得る。
【００２１】
[0022]第２の形態において、本発明の開示は、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を刺激するための方法であって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択で共刺激細胞の存在下で、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、上記方法を提供する。
【００２２】
[0023]一部の実施態様において、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法であって、インターロイキンＩＬ−７およびＩＬ−１５のうちの１つまたはそれより多くの存在下で、任意選択で共刺激細胞の存在下で、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程を含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、刺激する工程は、１つまたはそれより多くのＨＰＶ関連疾患のための治療効果があるＴ細胞を生産する、上記方法が提供される。
【００２３】
[0024]一部の実施態様において、抗原提示細胞は、活性化Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）またはＰＢＭＣである。特定の実施態様において、抗原提示細胞は、活性化Ｔ細胞である。
【００２４】
[0025]一部の実施態様において、共刺激細胞は、ＣＤ８０＋細胞、ＣＤ８６＋細胞、ＣＤ８３＋細胞、４−１ＢＢＬ＋細胞、ＣＤ４０＋細胞、ＯＸ４０＋細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたはそれより多くの細胞型である。共刺激細胞は、ＣＤ８０＋／ＣＤ８６＋／ＣＤ８３＋／４−１ＢＢＬ＋細胞であり得る。
【００２５】
[0026]一部の実施態様において、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞の刺激は、第１の刺激工程ではない。刺激される細胞であるＴ細胞は、事前の刺激、例えば本発明の開示の第１の形態の方法を使用した事前の刺激の生成物であってもよい。
【００２６】
[0027]一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、ＨＰＶ１６の１つまたはそれより多くのタンパク質；ＨＰＶ１８の１つまたはそれより多くのタンパク質；またはＨＰＶ１６の１つまたはそれより多くのタンパク質およびＨＰＶ１８の１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、ＨＰＶ１の１つまたはそれより多くのタンパク質；ＨＰＶ２の１つまたはそれより多くのタンパク質；ＨＰＶ３の１つまたはそれより多くのタンパク質；またはＨＰＶ１、ＨＰＶ２および／もしくはＨＰＶ３の１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、タンパク質Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１およびＬ２のうちの１つまたはそれより多くに対応する配列を含む。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、および／またはＬ２ペプチドを含むペプチドのライブラリーであってもよい。
【００２７】
[0028]一部の実施態様において、本方法は、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を生産することができる。一部の実施態様において、本方法は、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞の集団を拡大することができる。
【００２８】
[0029]特定の実施態様において、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞の刺激は、ＩＬ−７、ＩＬ−１５の存在下で、１つまたはそれより多くのタイプの共刺激細胞の存在下で、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含む。
【００２９】
[0030]一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下におけるＴ細胞の刺激は、ＩＬ−２の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下におけるＴ細胞の刺激は、ＩＬ−４の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下におけるＴ細胞の刺激は、ＩＬ−６の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下におけるＴ細胞の刺激は、ＩＬ−７の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下におけるＴ細胞の刺激は、ＩＬ−１２の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下におけるＴ細胞の刺激は、ＩＬ−２１の非存在下でなされる。一部の実施態様において、本発明の第１の形態の方法におけるＴ細胞の刺激は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の非存在下でなされる。
【００３０】
[0031]本発明の開示の第１および第２の形態に係る方法は、ＨＰＶ関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法であり得る。細胞の刺激は、ＨＰＶ関連疾患のための治療効果があるＴ細胞を生産することができる。
【００３１】
[0032]第３の形態において、第１および第２の形態の方法を組み合わせて、ＨＰＶ関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法であって、
末梢血液細胞、好ましくは末梢血Ｔ細胞を刺激する工程であって、本方法は、インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程；
インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択で１つまたはそれより多くのタイプの共刺激細胞の存在下で、（ｉ）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程
を含む、上記方法を提供することができる。
【００３２】
[0033]一部の実施態様において、工程（ｉｉ）の前に、（ｉ）から得られたＴ細胞は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ただし共刺激細胞の非存在下で、任意選択でＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、再刺激されてもよい。このような再刺激は、必要に応じて、１、２、３、４、５回またはそれより多くの回数行われてもよい。
【００３３】
[0034]一部の実施態様において、（ｉ）で使用される抗原提示細胞は、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）またはＰＢＭＣである。一部の実施態様において、（ｉｉ）で使用される抗原提示細胞は、活性化Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）またはＰＢＭＣである。一部の実施態様において、（ｉ）で使用される抗原提示細胞は、（ｉｉ）で使用される抗原提示細胞と異なるが、特定の場合において、それらは同じであってもよい。特定の実施態様において、（ｉｉ）で使用される抗原提示細胞は、活性化Ｔ細胞である。
【００３４】
[0035]一部の実施態様において、共刺激細胞は、ＣＤ８０＋細胞、ＣＤ８６＋細胞、ＣＤ８３＋細胞、４−１ＢＢＬ＋細胞、ＣＤ４０＋細胞、ＯＸ４０＋細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたはそれより多くの細胞型である。共刺激細胞は、ＣＤ８０＋／ＣＤ８６＋／ＣＤ８３＋／４−１ＢＢＬ＋細胞であり得る。
【００３５】
[0036]一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−２の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−４の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−６の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−１２の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−２１の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の非存在下でなされる。
【００３６】
[0037]一部の好ましい実施態様において、工程（ｉ）における細胞の刺激は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の非存在下でなされる。
[0038]一部の実施態様において、工程（ｉｉ）における細胞の刺激は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の非存在下でなされる。
【００３７】
[0039]したがって、一部の実施態様において、ＨＰＶ関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法であって、
（ｉ）末梢血液細胞を刺激する工程であって、この方法は、インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択でＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程；
（ｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択でＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、（ｉ）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、（ｉｉ）は、任意選択で１回またはそれより多くの回数繰り返される、工程；および
（ｉｉｉ）ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択で共刺激細胞の存在下で、（ｉｉ）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、（ｉｉｉ）は、任意選択で１回またはそれより多くの回数繰り返される、工程
を含む、上記方法が提供される。
【００３８】
[0040]一部の実施態様において、（ｉ）および（ｉｉ）で使用される抗原提示細胞は、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）またはＰＢＭＣである。一部の実施態様において、（ｉｉｉ）で使用される抗原提示細胞は、活性化Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）またはＰＢＭＣである。一部の実施態様において、（ｉｉｉ）で使用される抗原提示細胞は、（ｉ）および／または（ｉｉ）で使用される抗原提示細胞と異なる。好ましい実施態様において、（ｉｉｉ）で使用される抗原提示細胞は、活性化Ｔ細胞である。
【００３９】
[0041]好ましい実施態様において、（ｉｉｉ）における刺激は、共刺激細胞の存在下である。一部の実施態様において、共刺激細胞は、ＣＤ８０＋細胞、ＣＤ８６＋細胞、ＣＤ８３＋細胞、４−１ＢＢＬ＋細胞、ＣＤ４０＋細胞、ＯＸ４０＋細胞、およびそれらの組合せからなる群から選択される１つまたはそれより多くの細胞型である。共刺激細胞は、ＣＤ８０＋／ＣＤ８６＋／ＣＤ８３＋／４−１ＢＢＬ＋細胞であり得る。
【００４０】
[0042]一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−２の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−４の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−６の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−１２の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−２１の非存在下でなされる。一部の実施態様において、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における細胞の刺激は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の非存在下でなされる。
【００４１】
[0043]一部の実施態様において、工程（ｉ）における細胞の刺激は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の非存在下でなされる。一部の他の実施態様において、工程（ｉ）における細胞の刺激は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の存在下でなされる。
【００４２】
[0044]いくつかの特定の実施態様において、工程（ｉｉ）における細胞の刺激は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の非存在下でなされる。いくつかの特定の実施態様において、工程（ｉｉｉ）における細胞の刺激は、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の非存在下でなされる。
【００４３】
[0045]いくつかの特定の実施態様において、本発明の開示の方法は、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８に特異的なＴ細胞を生産するためである。いくつかの特定の実施態様において、本発明の方法は、ＨＰＶ１６関連および／またはＨＰＶ１８関連疾患に特異的なＴ細胞を生産するためである。
【００４４】
[0046]一部の実施態様において、末梢血Ｔ細胞は、ＨＰＶ；ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８；ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８の両方；ＨＰＶ１、ＨＰＶ２および／またはＨＰＶ３に感染していることが分かっている、またはそれに感染している疑いがある個体から得てもよい。
【００４５】
[0047]一部の実施態様において、抗原提示細胞は、ＨＰＶ；ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８；ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８の両方；ＨＰＶ１、ＨＰＶ２および／またはＨＰＶ３に感染していることが分かっている、またはそれに感染している疑いがある個体から得てもよい。
【００４６】
[0048]一部の実施態様において、本方法は、本方法によって生産されたＴ細胞を、事前にペプチドのライブラリーに曝露させた活性化Ｂ細胞に曝露することなく、行ってもよい。
【００４７】
[0049]一部の実施態様において、抗原提示細胞は、得られた治療的Ｔ細胞での処置が意図される個体にとって、自己得られた治療的Ｔ細胞での処置が意図される個体にとって、自己または同種であってもよいし、または同種であってもよい。
【００４８】
[0050]一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、ＨＰＶ１６の１つまたはそれより多くのタンパク質；ＨＰＶ１８の１つまたはそれより多くのタンパク質；またはＨＰＶ１６の１つまたはそれより多くのタンパク質およびＨＰＶ１８の１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、ＨＰＶ１の１つまたはそれより多くのタンパク質；ＨＰＶ２の１つまたはそれより多くのタンパク質；ＨＰＶ３の１つまたはそれより多くのタンパク質；またはＨＰＶ１、ＨＰＶ２および／もしくはＨＰＶ３の１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。一部の実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、またはＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８に由来するタンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、および／またはＬ２のうちの１つまたはそれより多くに対応する配列を含む。
【００４９】
[0051]本発明の開示の実施態様において、ペプチドは、ＨＰＶタンパク質Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、および／またはＬ２のうちの１つまたはそれより多くに対応する配列を含んでいてもよい。一部の実施態様において、ペプチドは、例えばＨＰＶに感染した細胞における、プロウイルスの統合後に発現される１つまたはそれより多くのＨＰＶタンパク質（例えばＥ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６および／またはＥ７）に対応する配列を含んでいてもよい。一部の実施態様において、ペプチドは、１つまたはそれより多くの形質転換ＨＰＶタンパク質（例えばＥ６、および／またはＥ７）に対応する配列を含んでいてもよい。ペプチドは、ＨＰＶタンパク質内に存在する連続するアミノ酸配列に対応していてもよい。ペプチドは、長さが少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個、またはそれら以下のアミノ酸の長さ、または長さが１５個のアミノ酸の長さを有していてもよい。ペプチドの集合体は、ライブラリーを形成でき、ライブラリー中のペプチドは、配列中、あらゆる好適な量で、例えば３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、または１４個のアミノ酸が他のペプチドとオーバーラップしていてもよい。ペプチドは、ａ）ＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質および／もしくはＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質、ならびに／またはｂ）ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質および／もしくはＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質に対応する配列を含んでいてもよい。
【００５０】
[0052]本発明の開示の実施態様において、ＨＰＶは、ＨＰＶ１６もしくはＨＰＶ１８、またはその両方であり得る。ＨＰＶ関連疾患の処置に関する実施態様において、疾患は、がんであってもよく、ペプチドは、Ｅ６およびＥ７の一方または両方に対応する配列を含んでいてもよい。ＨＰＶ関連疾患が前がん性病変である場合、ペプチドは、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、およびＬ２のうちの１つ、一部、または全てに対応する配列を含んでいてもよい。
【００５１】
[0053]本発明の開示の方法によって生産されたＴ細胞は、単離および／または精製することができ、例えば、他の細胞から単離／精製することができる。
[0054]一部の実施態様において、治療有効量の本発明の開示の方法によって生産されたＴ細胞は、ＨＰＶに曝露されたことがある個体、またはＨＰＶ関連疾患を有する個体に提供される。関連する形態において、ＨＰＶ関連疾患の処置において使用するための、本発明の開示の方法によって生産されたＴ細胞が提供される。別の関連する形態において、ＨＰＶ関連疾患の処置に使用するための医薬品の製造で使用するための、本発明の開示の方法によって生産されたＴ細胞の使用が提供される。
【００５２】
[0055]本発明の一形態において、養子細胞免疫療法の方法において使用するためのＴ細胞であって、Ｔ細胞は、本明細書に記載される末梢血液もしくはＴ細胞を刺激するための方法または治療的Ｔ細胞を生産する方法によって得られるか、それによって入手できるか、またはその生成物であり、養子細胞免疫療法の方法は、Ｔ細胞を対象に投与することを含む、上記方法が提供される。
【００５３】
[0056]本発明の一形態において、Ｔ細胞を対象に投与することを含む養子細胞免疫療法の方法に使用するための医薬品の製造におけるＴ細胞の使用であって、Ｔ細胞は、本明細書に記載される末梢血液もしくはＴ細胞を刺激するための方法または治療的Ｔ細胞を生産する方法によって得られるか、それによって入手できるか、またはその生成物である、上記使用が提供される。
【００５４】
[0057]本発明の一形態において、医薬組成物、医薬またはワクチンを調製する方法であって、本明細書に記載される方法に係る末梢血液またはＴ細胞を刺激すること、または本明細書に記載される方法に係る治療的Ｔ細胞を生産すること、および得られた細胞を、医薬的に許容される担体、アジュバント、希釈剤または賦形剤と混合することを含む、上記方法が提供される。
【００５５】
[0058]処置しようとする疾患は、新生物であり得る。新生物は、がんであり得る。がんは、ＨＰＶ陽性がん、例えばＨＰＶ１６陽性がんおよび／またはＨＰＶ１８陽性がんであり得る。
【００５６】
[0059]処置しようとする個体は、ヒトであり得る。個体は、患者であり得る。個体は、ＨＰＶ、例えばＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、またはＨＰＶ１６とＨＰＶ１８の両方に曝露されたことがある個体でもよいし、またはＨＰＶ、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８関連疾患を有する。ＨＰＶ、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８関連疾患は、新生物であり得る。新生物は、がんであり得る。
【００５７】
[0060]がんは、あらゆる種類のがんであり得る。一部の実施態様において、がんは、子宮頸がん、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、または中咽頭がんである。一部の実施態様において、がんは、ＨＰＶ関連がんであり得る。「ＨＰＶ関連がん」は、ＨＰＶ感染によって引き起こされるかもしくは悪化するがん、ＨＰＶ感染がリスク因子であるがん、および／またはＨＰＶ感染が発症、発生、進行、重症度または転移に正に関連するがんであり得る。ＨＰＶ関連がんは、本発明の方法および組成物が治療作用（例えば、がんの発生／進行の阻害、がんの発症の遅延／防止、転移の低減／遅延／防止、がんの症状の重症度の低減、がん細胞の数の低減、腫瘍サイズの低減、および／または生存の延長）を提供するがんであり得る。一部の実施態様において、がんは、ＨＰＶ関連の癌腫、ＨＰＶ陽性中咽頭癌、ＨＰＶ陽性子宮頸癌、ＨＰＶ陽性肛門癌、ＨＰＶ陽性外陰癌、上咽頭癌、ＨＰＶ陽性陰茎癌、あらゆる部位のＨＰＶ陽性異形成、または喉頭乳頭腫症である。
【００５８】
[0061]個体または対象は、追加のがん療法を受けたことがある個体または対象でもよいし、それを受けている個体または対象でもよいし、または受けると予想される個体または対象である。追加のがん療法は、外科手術、放射線、ホルモン療法、化学療法、免疫療法、またはそれらの組合せであり得る。
【００５９】
[0062]個体または対象は、ＨＰＶ関連がんまたはＨＰＶ陽性がんを有すると決定されていてもよい。個体は、ＨＰＶ１６関連がんまたはＨＰＶ１６陽性がんを有すると決定されていてもよい。個体は、ＨＰＶ１８関連がんまたはＨＰＶ１８陽性がんを有すると決定されていてもよい。個体または対象は、あらゆる動物またはヒトであってもよい。個体または対象は、好ましくは哺乳類であってもよく、より好ましくはヒトである。個体または対象は、非ヒト哺乳動物であってもよいが、より好ましくはヒトである。個体または対象は、雄または雌であり得る。個体または対象は、患者であり得る。
【００６０】
[0063]細胞を刺激する工程を含む本発明の開示に係る方法は、インビトロまたはエクスビボで実行することができる。用語「インビトロ」は、実験室条件または培養で材料、生物学的な物質、細胞および／または組織を用いた研究を包含することが意図される。「エクスビボ」は、生物の外部で、例えばヒトまたは動物の体外に存在する何か、またはそこで起こることを指し、そのような場所は、生物から採取された組織（例えば臓器全体）または細胞の上であり得る。
【００６１】
[0064]一実施態様において、末梢血液細胞を刺激するための方法があり、本方法は、インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。末梢血Ｔ細胞は、末梢血液細胞を事前に刺激することにより得ることができ、例えば、末梢血液細胞を事前に刺激することは、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の存在下で、末梢血液細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。具体的な場合において、末梢血Ｔ細胞を刺激する前に、本方法は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の存在下で、末梢血液細胞を抗原提示細胞で刺激して、末梢血Ｔ細胞を生産することをさらに含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。
【００６２】
[0065]一実施態様において、ＨＰＶ関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法があり、本方法は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５のうちの１つまたはそれより多くの存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程を含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、刺激する工程は、ＨＰＶ関連疾患のための治療効果があるＴ細胞を生産する。末梢血Ｔ細胞は、末梢血液細胞を事前に刺激することにより得ることができ、例えば、末梢血液細胞を事前に刺激することは、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の存在下で、末梢血液細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。具体的な場合において、末梢血Ｔ細胞を刺激する前に、本方法は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の存在下で、末梢血液細胞を抗原提示細胞で刺激して、末梢血Ｔ細胞を生産することをさらに含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。
【００６３】
[0066]本開示に包含される方法の実施態様において、抗原提示細胞は、活性化Ｔ細胞、樹状細胞、Ｂ−ブラスト、またはＰＢＭＣである。末梢血Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団中に存在していてもよいし、または少なくとも一部の場合において、それから得られるかもしくは単離され、集団中のＰＢＭＣは、非接着性ＰＢＭＣであり得る。共刺激細胞は、採用される場合、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ８３＋、４−１ＢＢＬ＋、ＣＤ４０＋細胞、ＯＸ４０＋細胞、またはそれらの組合せであり得る。
【００６４】
[0067]特定の実施態様において、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を刺激するための方法があり、本方法は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、共刺激細胞の存在下で、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む。
【００６５】
[0068]特定の実施態様において、ＨＰＶ関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法があり、本方法は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５のうちの１つまたはそれより多くの存在下で、共刺激細胞の存在下で、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程を含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、刺激する工程は、ＨＰＶ関連疾患のための治療効果があるＴ細胞を生産する。
【００６６】
[0069]一実施態様において、ＨＰＶ関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法があり、本方法は、（ｉ）末梢血液細胞を刺激する工程であって、この方法は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択でＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程；および（ｉｉ）ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、共刺激細胞の存在下で、（ｉ）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程を含む。具体的な実施態様において、工程（ｉｉ）の前に、（ｉ）から得られたＴ細胞は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ただし共刺激細胞の非存在下で再刺激されてもよい。
【００６７】
[0070]一実施態様において、ＨＰＶ関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法であって、（ｉ）末梢血液細胞を刺激する工程であって、この方法は、インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択でＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程；（ｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択でＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、（ｉ）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、（ｉｉ）は、任意選択で１回またはそれより多くの回数繰り返される、工程；および（ｉｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、共刺激細胞の存在下で、（ｉｉ）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、（ｉｉｉ）は、任意選択で１回またはそれより多くの回数繰り返される、工程を含む、上記方法が提供される。
【００６８】
[0071]本開示のいずれの方法においても、ＨＰＶは、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ１、ＨＰＶ２およびＨＰＶ３であり得る。Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、およびＬ２のうちの１つまたはそれより多くに対応する配列を含むペプチドは、本開示のいずれの方法でも利用することができる。ペプチドは、ａ）ＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質および／もしくはＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質、ならびに／またはｂ）ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質および／もしくはＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質に対応する配列を含んでいてもよい。一部の場合において、有効量の本明細書に記載される細胞が提供されている個体は、ＨＰＶ関連疾患、例えばがんを有し、ペプチドは、Ｅ６およびＥ７の一方または両方に対応する配列を含む。具体的な形態において、１つまたはそれより多くのペプチドは、長さが少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個、またはそれら以下のアミノ酸のペプチドを含み、特定には、１つまたはそれより多くのペプチドは、長さが１５個のアミノ酸のペプチドを含む。具体的な実施態様において、１つまたはそれより多くのペプチドは、ライブラリーを形成し、ライブラリー中のペプチドは、配列中、他のペプチドと１１個のアミノ酸がオーバーラップする。
【００６９】
[0072]特定の実施態様において、治療有効量の本方法によって生産されたＴ細胞は、ＨＰＶに曝露されたことがある個体、またはＨＰＶ関連疾患を有する個体に提供される。具体的な実施態様において、ＨＰＶ関連疾患は、新生物を含む。
【００７０】
[0073]治療有効量の本開示の方法によって生産されたＴ細胞は、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、またはその両方に曝露されたことがある個体、またはがんなどの新生物を含むＨＰＶ１６関連および／またはＨＰＶ１８関連疾患を有する個体に提供することができる。
【００７１】
[0074]特定の実施態様において、がんは、子宮頸がん、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、中咽頭がん、上咽頭癌、喉頭乳頭腫症、喉頭がん、頭頸部がん、またはそれらのあらゆる部位の異形成である。
【００７２】
[0075]一部の場合において、本開示の細胞を受けた、および／または受けると予想される個体はまた、追加のがん療法、例えば外科手術、放射線、ホルモン療法、化学療法、免疫療法、またはそれらの組合せも受けたことがあってもよいし、それを受けていてもよいし、またはそれを受けると予想される個体である。
【００７３】
[0076]特定の形態において、本開示の細胞を受けた、および／または受けると予想される個体は、ＨＰＶ関連がん、例えばＨＰＶ１６関連がんまたはＨＰＶ１８関連がんを有すると決定されている。
【００７４】
[0077]以下の番号付けされたパラグラフは、本明細書において開示された本発明の技術的な特徴の広範な組合せの記述を含む。
１．末梢血液細胞を刺激するための方法であって、インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、上記方法。
【００７５】
２．ＨＰＶ関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法であって、
ＩＬ−７およびＩＬ−１５のうちの１つまたはそれより多くの存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程
を含み、
刺激する工程は、ＨＰＶ関連疾患のための治療効果があるＴ細胞を生産する、上記方法。
【００７６】
３．末梢血Ｔ細胞が、末梢血液細胞を事前に刺激することにより得られる、パラグラフ１または２に記載の方法。
４．末梢血液細胞を事前に刺激することが、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の存在下で、末梢血液細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、パラグラフ３に記載の方法。
【００７７】
５．前記末梢血Ｔ細胞を刺激する前に、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の存在下で、末梢血液細胞を抗原提示細胞で刺激して、末梢血Ｔ細胞を生産することをさらに含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、パラグラフ１または２に記載の方法。
【００７８】
６．抗原提示細胞が、樹状細胞、Ｂ−ブラスト、またはＰＢＭＣである、パラグラフ１〜７のいずれか一項に記載の方法。
７．末梢血Ｔ細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団中に存在するか、またはそれから得られるかもしくは単離される、パラグラフ１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【００７９】
８．集団中のＰＢＭＣが、非接着性ＰＢＭＣである、パラグラフ７に記載の方法。
９．ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を刺激するための方法であって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、共刺激細胞の存在下で、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、上記方法。
【００８０】
１０．ＨＰＶ関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法であって、ＩＬ−７およびＩＬ−１５のうちの１つまたはそれより多くの存在下で、共刺激細胞の存在下で、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程を含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、刺激する工程は、ＨＰＶ関連疾患のための治療効果があるＴ細胞を生産する、上記方法。
【００８１】
１１．抗原提示細胞が、活性化Ｔ細胞、樹状細胞、Ｂ−ブラスト、またはＰＢＭＣである、パラグラフ９または１０に記載の方法。
１２．前記共刺激細胞が、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ８３＋、４−１ＢＢＬ＋、ＣＤ４０＋細胞、ＯＸ４０＋細胞、またはそれらの組合せである、パラグラフ９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【００８２】
１３．ＨＰＶ関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法であって、
（ｉ）末梢血液細胞を刺激する工程であって、この方法は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択でＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程；および
（ｉｉ）ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、共刺激細胞の存在下で、（ｉ）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程
を含む、上記方法。
【００８３】
１４．工程（ｉｉ）の前に、（ｉ）から得られたＴ細胞が、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ただし共刺激細胞の非存在下で再刺激されてもよい、パラグラフ１３に記載の方法。
【００８４】
１５．（ｉ）で使用される抗原提示細胞が、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）またはＰＢＭＣである、パラグラフ１３または１４に記載の方法。
１６．（ｉｉ）で使用される抗原提示細胞が、活性化Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）またはＢ−ブラスト（ＢＢ）である、パラグラフ１３〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【００８５】
１７．前記共刺激細胞が、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ８３＋、４−１ＢＢＬ＋、ＣＤ４０＋細胞、ＯＸ４０＋細胞、またはそれらの組合せである、パラグラフ１３〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【００８６】
１８．ＨＰＶ関連疾患のための治療的Ｔ細胞を生産する方法であって
（ｉ）末梢血液細胞を刺激する工程であって、この方法は、インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択でＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、末梢血Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程；
（ｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、任意選択でＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、（ｉ）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、（ｉｉ）は、任意選択で１回またはそれより多くの回数繰り返される、工程；および
（ｉｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、共刺激細胞の存在下で、（ｉｉ）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、（ｉｉｉ）は、任意選択で１回またはそれより多くの回数繰り返される、工程
を含む、上記方法が提供される。
【００８７】
１９．（ｉ）および（ｉｉ）で使用される抗原提示細胞が、ＤＣ、ＢＢ、またはＰＢＭＣである、パラグラフ１８に記載の方法。
２０．（ｉｉｉ）で使用される抗原提示細胞が、活性化Ｔ細胞、ＤＣ、ＢＢ、またはＰＢＭＣである、パラグラフ１８または１９に記載の方法。
【００８８】
２１．前記共刺激細胞が、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ８３＋、４−１ＢＢＬ＋、ＣＤ４０＋細胞、ＯＸ４０＋細胞またはそれらの組合せである、パラグラフ１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【００８９】
２２．ＨＰＶが、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８である、パラグラフ１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
２３．ペプチドが、Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、およびＬ２のうちの１つまたはそれより多くに対応する配列を含む、パラグラフ１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【００９０】
２４．ＨＰＶ関連疾患が、がんであり、ペプチドが、Ｅ６およびＥ７の一方または両方に対応する配列を含む、パラグラフ１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
２５．前記ペプチドが、
ａ）ＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質および／もしくはＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質、ならびに／または
ｂ）ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質および／もしくはＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質
に対応する配列を含む、パラグラフ１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【００９１】
２６．１つまたはそれより多くのペプチドが、長さが、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０個、またはそれら以下のアミノ酸のペプチドを含む、パラグラフ１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【００９２】
２７．１つまたはそれより多くのペプチドが、長さが１５個のアミノ酸のペプチドを含む、パラグラフ１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
２８．１つまたはそれより多くのペプチドが、ライブラリーを形成し、ライブラリー中のペプチドは、は、配列中、他のペプチドと１１個のアミノ酸がオーバーラップする、パラグラフ１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【００９３】
２９．治療有効量の本方法によって生産されたＴ細胞が、ＨＰＶに曝露されたことがある個体、またはＨＰＶ関連疾患を有する個体に提供される、パラグラフ１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【００９４】
３０．ＨＰＶ関連疾患が、新生物を含む、パラグラフ２９に記載の方法。
３１．治療有効量の本方法によって生産されたＴ細胞が、ＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８またはその両方に曝露されたことがある個体、またはＨＰＶ１６関連および／またはＨＰＶ１８関連疾患を有する個体に提供される、パラグラフ１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【００９５】
３２．ＨＰＶ１６関連および／またはＨＰＶ１８関連疾患が、新生物を含む、パラグラフ３１に記載の方法。
３３．新生物が、がんである、パラグラフ３１または３２に記載の方法。
【００９６】
３４．がんが、子宮頸がん、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、中咽頭がん、上咽頭癌、喉頭乳頭腫症、喉頭がん、頭頸部がん、またはそれらの部位のいずれかの異形成である、パラグラフ３３に記載の方法。
【００９７】
３５．個体が、追加のがん療法を受けたことがあるか、それを受けているか、または受けると予想される個体である、パラグラフ３３または３４に記載の方法。
３６．追加のがん療法が、外科手術、放射線、ホルモン療法、化学療法、免疫療法、またはそれらの組合せである、パラグラフ３５に記載の方法。
【００９８】
３７．個体が、ＨＰＶ関連がんを有すると決定されている、パラグラフ３３〜３６のいずれか一項に記載の方法。
３８．個体が、ＨＰＶ１６関連がんを有すると決定されている、パラグラフ３３〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【００９９】
３９．個体が、ＨＰＶ１８関連がんを有すると決定されている、パラグラフ３３〜３８のいずれか一項に記載の方法。
４０．養子細胞免疫療法の方法において使用するためのＴ細胞であって、Ｔ細胞は、パラグラフ１〜３９のいずれか一項に記載の末梢血液またはＴ細胞を刺激するための方法または治療的Ｔ細胞を生産する方法によって得られるか、それによって入手できるか、またはその生成物であり、養子細胞免疫療法の方法は、Ｔ細胞を対象に投与することを含む、上記Ｔ細胞。
【０１００】
４１．Ｔ細胞を対象に投与することを含む、養子細胞免疫療法の方法に使用するための医薬品の製造におけるＴ細胞の使用であって、Ｔ細胞は、請求項１〜３９のいずれか一項に記載の末梢血液またはＴ細胞を刺激するための方法または治療的Ｔ細胞を生産する方法によって得られるか、それによって入手できるか、またはその生成物である、上記使用。
【０１０１】
４２．医薬組成物、医薬またはワクチンを調製する方法であって、請求項１〜３９のいずれか一項に従って、末梢血液またはＴ細胞を刺激すること、または治療的Ｔ細胞を生産すること、および得られた細胞を、医薬的に許容される担体、アジュバント、希釈剤または賦形剤と混合することを含む、上記方法。
【０１０２】
４３．対象におけるがんを処置する方法であって、
（１）対象からＴ細胞を単離する工程；
（２）インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含む方法によって、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に特異的なＴ細胞の集団を生成または拡大する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程；および
（３）生成または拡大されたＴ細胞の集団を対象に投与する工程
を含む、上記方法。
【０１０３】
４４．（２）で刺激されたＴ細胞が、末梢血液細胞またはＴ細胞を事前に刺激することにより得られる、パラグラフ４３に記載の方法。
４５．前記Ｔ細胞を刺激する前に、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の存在下で、末梢血液細胞またはＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、パラグラフ４３に記載の方法。
【０１０４】
４６．（２）の後および（３）の前に、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、共刺激細胞の存在下で、（２）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、パラグラフ４３に記載の方法。
【０１０５】
４７．前記共刺激細胞が、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ８３＋、４−１ＢＢＬ＋、ＣＤ４０＋細胞、ＯＸ４０＋細胞、またはそれらの組合せである、パラグラフ４６に記載の方法。
【０１０６】
４８．（２）の後および（３）の前に、（ｉ）ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ただし共刺激細胞の非存在下で、（２）から得られたＴ細胞を再刺激すること、および（ｉｉ）ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、共刺激細胞の存在下で、（ｉ）の後に得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含み、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、パラグラフ４３に記載の方法。
【０１０７】
４９．前記抗原提示細胞が、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、パラグラフ４３に記載の方法。
５０．（１）において、Ｔ細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団から単離される、パラグラフ４３に記載の方法。
【０１０８】
５１．がんが、子宮頸がん、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、中咽頭がん、上咽頭癌、喉頭乳頭腫症、喉頭がん、頭頸部がん、またはそれらの部位のいずれかの異形成である、パラグラフ４３に記載の方法。
【０１０９】
５２．がんが、ＨＰＶ陽性である、パラグラフ４３に記載の方法。
５３．対象が、ＨＰＶ関連がんを有すると決定されている、パラグラフ４３に記載の方法。
【０１１０】
５４．対象におけるがんを処置する方法であって、
（１）対象からＴ細胞を単離する工程；
（２）（ｉ）インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、Ｔ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程；
（ｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で、（ｉ）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、（ｉｉ）は、任意選択で１回またはそれより多くの回数繰り返される、工程；および
（ｉｉｉ）インターロイキン（ＩＬ）−７およびＩＬ−１５の存在下で、共刺激細胞の存在下で、（ｉｉ）から得られたＴ細胞を抗原提示細胞で刺激する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含み、（ｉｉｉ）は、任意選択で１回またはそれより多くの回数繰り返される、工程
を含む方法によって、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に特異的なＴ細胞の集団を生成または拡大する工程；
（３）生成または拡大されたＴ細胞の集団を対象に投与する工程
を含む、上記方法。
【０１１１】
５５．（ｉ）におけるＴ細胞の刺激が、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の存在下である、パラグラフ５４に記載の方法。
５６．（ｉ）および（ｉｉ）で使用される抗原提示細胞が、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、パラグラフ５４に記載の方法。
【０１１２】
５７．（ｉｉｉ）で使用される抗原提示細胞が、活性化Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、パラグラフ５４に記載の方法。
【０１１３】
５８．前記共刺激細胞が、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ８３＋、４−１ＢＢＬ＋、ＣＤ４０＋細胞、ＯＸ４０＋細胞またはそれらの組合せである、パラグラフ５４に記載の方法。
【０１１４】
５９．対象におけるがんを処置する方法であって、
（１）対象からＴ細胞を単離する工程；
（２）ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、共刺激細胞の存在下で、ＨＰＶまたはＨＰＶ抗原に特異的なＴ細胞を抗原提示細胞で刺激することを含む方法によって、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）に特異的なＴ細胞の集団を生成または拡大する工程であって、抗原提示細胞は事前に、１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されており、ペプチドは、ＨＰＶの１つまたはそれより多くのタンパク質の配列の少なくとも一部に対応する配列を含む、工程；および
（３）生成または拡大されたＴ細胞の集団を対象に投与する工程
を含む、上記方法。
【０１１５】
６０．前記抗原提示細胞が、活性化Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、パラグラフ５９に記載の方法。
６１．前記共刺激細胞が、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ８３＋、４−１ＢＢＬ＋、ＣＤ４０＋細胞、ＯＸ４０＋細胞、またはそれらの組合せである、パラグラフ５９に記載の方法。
【０１１６】
[0078]以上の記載は、以下に記載される発明の詳細な説明をよりよく理解できるようにするために、本発明の特徴および技術的な利点をかなり概略的に概説したものである。本発明の特許請求の範囲の主題を形成する本発明の追加の特徴および利点を以下に説明する。当業者であれば認識しているものと予想される開示された概念および具体的な実施態様は、本発明の同じ目的を達成するために、他の構造を改変または設計するための基礎として容易に利用できる。このような等価な構築が、添付の特許請求の範囲に記載された本発明の本質および範囲から逸脱しないことは、当業者によって理解されているものと予想される。その構成と操作方法の両方に関して本発明に特徴的であると考えられる新規の特徴は、さらなる目的および利点と共に、添付の図面と関連して検討すると、以下の説明からよりよく理解されると予想される。しかしながら、図面のそれぞれは、単に例証および説明の目的で提供され、本発明の限定の定義として意図されないことが明示的に理解されるものとする。
【０１１７】
[0079]本発明は、記載された形態および好ましい特徴の組合せを含むが、このような組合せが明らかに容認できないかまたは明示的に回避される場合を除く。
[0080]本明細書において使用される章の見出しは、単に系統化する目的のためであり、記載された主題を限定するものとして解釈されないものとする。
【０１１８】
[0081]本発明の形態および実施態様をここで、一例として、添付の図面を参照しながら例示する。さらなる形態および実施態様は、当業者には明らかであると予想される。本明細書に記載された全ての文書は、参照により本明細書に組み入れられる。
【０１１９】
[0082]続いて記載される特許請求の範囲を含む本明細書の全体にわたり、文脈上別の意味で解釈すべき場合を除き、言葉「含む（comprise）」、および「含む（comprises）」や「含むこと」などの変化形は、必然的に述べられた整数値もしくは工程または整数値もしくは工程の群の包含を含むだけでなく、他のあらゆる整数値または工程または整数値もしくは工程の群も除外されないと理解されるものとする。
【図面の簡単な説明】
【０１２０】
【図１Ａ】[0083]図１Ａは、ＨＰＶ１６特異的なＴ細胞の生産のための特定の条件を利用する当業界における方法を実証する。図１Ａは、ペプミックスなし（Ｎｅｇ）、ＨＰＶ１６  Ｅ６ペプミックス（ＨＰＶ１６  Ｅ６）またはＨＰＶ１６  Ｅ７ペプミックス（ＨＰＶ１６  Ｅ７）を負荷した自己ＤＣを用いた、３人のＨＰＶ関連がん患者ＰＢＭＣの刺激に対するスポット形成コロニー（ＳＦＣ）の生産を示す棒グラフである（ＯＣＶ、ＨＮＤおよびＨＮＣとして識別した）。患者ＯＣＶの場合、左から右に存在する３本のバーは、Ｎｅｇ、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＨＰＶ１６  Ｅ７である。患者ＨＮＤおよびＨＮＣの場合、左から右に存在する２本のバーは、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＨＰＶ１６  Ｅ７である。
【図１Ｂ】[0084]図１Ｂは、特定の新規の条件下で、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下における、ＩＬ−６およびＩＬ−１２の非存在下におけるＴ細胞の刺激による、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８に特異的なＴ細胞の混合物の生産を利用する本開示の方法を実証する。図１Ｂは、３人のＨＰＶ関連がん患者ＰＢＭＣの刺激に対するスポット形成コロニー（ＳＦＣ）の生産を示す棒グラフである（ＯＣＶ、ＰＣＶおよびＨＮＤとして識別した）。患者ＯＣＶの場合、左から右に存在する５本のバーは、ペプミックスなし（Ｎｅｇ）、ＨＰＶ１６  Ｅ６ペプミックス（ＨＰＶ１６  Ｅ６）、ＨＰＶ１６  Ｅ７ペプミックス（ＨＰＶ１６  Ｅ７）、ＨＰＶ１８  Ｅ６ペプミックス（ＨＰＶ１８  Ｅ６）、およびＨＰＶ１８  Ｅ７ペプミックス（ＨＰＶ１８  Ｅ７）である。患者ＰＣＤの場合、左から右に存在する２本のバーは、ＨＰＶ１６  Ｅ６およびＨＰＶ１６  Ｅ７である。患者ＨＮＤの場合、左から右に存在する４本のバーは、ＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、ＨＰＶ１８  Ｅ６およびＨＰＶ１８  Ｅ７である。
【図２】[0085]図２は、輸注後のタイムポイントにおける、患者番号１におけるＴＧＦ−ベータのドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲＩＩ）で形質導入された、輸注されたＨＰＶで刺激されたＴ細胞のインビボにおける拡大および持続性を示すチャートである。
【図３】[0086]図３は、輸注後のタイムポイントにおける、患者番号２におけるＴＧＦ−ベータのドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲＩＩ）で形質導入された、輸注されたＨＰＶで刺激されたＴ細胞のインビボにおける拡大および持続性を示すチャートである。
【図４】[0087]図４は、患者番号２のＰＥＴスキャン（左および中心）および身体検査の写真（右）を示す。上の列：前処置。下の列：本発明により生産されたＨＰＶで刺激されたＴ細胞での処置の６週後。
【図５Ａ】[0088]図５Ａおよび５Ｂは、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１（表４を参照）による培養後の、ドナー１  ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ由来の単球由来ＤＣによる（図５Ａ）ＣＤ８３およびＣＤ８０、ならびに（図５Ｂ）ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１発現の表面発現を示す散布図である。
【図５Ｂ】[0088]図５Ａおよび５Ｂは、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１（表４を参照）による培養後の、ドナー１  ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ由来の単球由来ＤＣによる（図５Ａ）ＣＤ８３およびＣＤ８０、ならびに（図５Ｂ）ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１発現の表面発現を示す散布図である。
【図６Ａ】[0089]図６Ａおよび６Ｂは、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー１由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＣＤ４＋Ｔ細胞による（図６Ａ）、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞による（図６Ｂ）ＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＯの表面発現を示す散布図である。
【図６Ｂ】[0089]図６Ａおよび６Ｂは、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー１由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＣＤ４＋Ｔ細胞による（図６Ａ）、ならびにＣＤ８＋Ｔ細胞による（図６Ｂ）ＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＯの表面発現を示す散布図である。
【図７】[0090]図７は、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー１由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ウイルス特異的なＴ細胞の総数を示す棒グラフである。
【図８】[0091]図８は、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー１由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率（バックグラウンドを引いた）を示す棒グラフである。
【図９】[0092]図９は、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー１由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＥＢＶ抗原反応性ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率（バックグラウンドを引いた）を示す棒グラフである。
【図１０】[0093]図１０は、異なる実験条件下（表４を参照）で培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー１由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬの比率に対してプロットしたウイルス特異的なＴ細胞の総数を示すグラフである。
【図１１Ａ】[0094]図１１Ａおよび１１Ｂは、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０（表４を参照）による培養後の、ドナー２  ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ由来の単球由来ＤＣによる（図１１Ａ）ＣＤ８３およびＣＤ８０、ならびに（図１１Ｂ）ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１発現の表面発現を示す散布図である。
【図１１Ｂ】[0094]図１１Ａおよび１１Ｂは、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０（表４を参照）による培養後の、ドナー２  ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ由来の単球由来ＤＣによる（図１１Ａ）ＣＤ８３およびＣＤ８０、ならびに（図１１Ｂ）ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１発現の表面発現を示す散布図である。
【図１２Ａ】[0095]図１２Ａおよび１２Ｂは、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー２由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１２Ａ）、ならびに（図１２Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＯの表面発現を示す散布図である。
【図１２Ｂ】[0095]図１２Ａおよび１２Ｂは、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー２由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図１２Ａ）、ならびに（図１２Ｂ）ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＯの表面発現を示す散布図である。
【図１３】[0096]図１３は、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー２由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ウイルス特異的なＴ細胞の総数を示す棒グラフである。
【図１４】[0097]図１４は、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー２由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率（バックグラウンドを引いた）を示す棒グラフである。
【図１５】[0098]図１５は、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー２由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＥＢＶ抗原反応性ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率（バックグラウンドを引いた）を示す棒グラフである。
【図１６】[0099]図１６は、異なる実験条件下（表４を参照）で培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー２由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬの比率に対してプロットしたウイルス特異的なＴ細胞の総数を示すグラフである。
【図１７Ａ】[0100]図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄおよび１７Ｅは、実験条件１、２、５、１８、１９および２０（表４を参照）による培養後の３人の異なるドナー由来の単球由来ＤＣによる、（図１７Ａ）ＣＤ８０およびＣＤ８３、ならびに（図１７Ｂ）ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１の表面発現を示す散布図および棒グラフである。図１７Ｃは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３−細胞の比率を示し、図１７Ｄは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３＋細胞の比率を示し、図１７Ｅは、ＰＤ−Ｌ１＋細胞の比率を示す。
【図１７Ｂ】[0100]図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄおよび１７Ｅは、実験条件１、２、５、１８、１９および２０（表４を参照）による培養後の３人の異なるドナー由来の単球由来ＤＣによる、（図１７Ａ）ＣＤ８０およびＣＤ８３、ならびに（図１７Ｂ）ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１の表面発現を示す散布図および棒グラフである。図１７Ｃは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３−細胞の比率を示し、図１７Ｄは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３＋細胞の比率を示し、図１７Ｅは、ＰＤ−Ｌ１＋細胞の比率を示す。
【図１７Ｃ】[0100]図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄおよび１７Ｅは、実験条件１、２、５、１８、１９および２０（表４を参照）による培養後の３人の異なるドナー由来の単球由来ＤＣによる、（図１７Ａ）ＣＤ８０およびＣＤ８３、ならびに（図１７Ｂ）ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１の表面発現を示す散布図および棒グラフである。図１７Ｃは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３−細胞の比率を示し、図１７Ｄは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３＋細胞の比率を示し、図１７Ｅは、ＰＤ−Ｌ１＋細胞の比率を示す。
【図１７Ｄ】[0100]図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄおよび１７Ｅは、実験条件１、２、５、１８、１９および２０（表４を参照）による培養後の３人の異なるドナー由来の単球由来ＤＣによる、（図１７Ａ）ＣＤ８０およびＣＤ８３、ならびに（図１７Ｂ）ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１の表面発現を示す散布図および棒グラフである。図１７Ｃは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３−細胞の比率を示し、図１７Ｄは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３＋細胞の比率を示し、図１７Ｅは、ＰＤ−Ｌ１＋細胞の比率を示す。
【図１７Ｅ】[0100]図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、１７Ｄおよび１７Ｅは、実験条件１、２、５、１８、１９および２０（表４を参照）による培養後の３人の異なるドナー由来の単球由来ＤＣによる、（図１７Ａ）ＣＤ８０およびＣＤ８３、ならびに（図１７Ｂ）ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１の表面発現を示す散布図および棒グラフである。図１７Ｃは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３−細胞の比率を示し、図１７Ｄは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３＋細胞の比率を示し、図１７Ｅは、ＰＤ−Ｌ１＋細胞の比率を示す。
【図１８】[0101]図１８は、実験条件２、５、１８、１９および２０（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間の３人の異なるドナー由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ウイルス特異的なＴ細胞の総数を示す棒グラフである。
【図１９】[0102]図１９は、実験条件２、５、１８、１９および２０（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間の異なるドナー由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率（バックグラウンドを引いた）を示す棒グラフである。
【図２０】[0103]図２０は、実験条件２、５、１８、１９および２０（表４を参照）に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間の異なるドナー由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＥＢＶ抗原反応性ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率（バックグラウンドを引いた）を示す。
【図２１】[0104]図２１は、異なる実験条件下（表４を参照）で培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間の３人のドナー由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ウイルス特異的なＴ細胞の概算の総数およびＩＦＮγ＋Ｔ細胞の概算の頻度を示すグラフである。
【図２２Ａ】[0105]図２２Ａおよび２２Ｂは、ＵＬＣＬクローン番号５および番号１３と比較した、共刺激細胞としてＫ５６２−ｃｓ細胞を使用した刺激後の細胞の全体の拡大倍率を調査する２つの別個の実験の結果を示すグラフである。
【図２２Ｂ】[0105]図２２Ａおよび２２Ｂは、ＵＬＣＬクローン番号５および番号１３と比較した、共刺激細胞としてＫ５６２−ｃｓ細胞を使用した刺激後の細胞の全体の拡大倍率を調査する２つの別個の実験の結果を示すグラフである。
【図２３Ａ】[0106]図２３Ａおよび２３Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、ＵＬＣＬクローン番号５および番号１３と比較した、共刺激細胞としてＫ５６２−ｃｓ細胞を使用した刺激後のウイルス特異的なＴ細胞の全体の拡大倍率を調査する、２つの別個の実験の結果を示すグラフである。
【図２３Ｂ】[0106]図２３Ａおよび２３Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、ＵＬＣＬクローン番号５および番号１３と比較した、共刺激細胞としてＫ５６２−ｃｓ細胞を使用した刺激後のウイルス特異的なＴ細胞の全体の拡大倍率を調査する、２つの別個の実験の結果を示すグラフである。
【図２４Ａ】[0107]図２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃは、Ｋ５６２−ｃｓ細胞または共刺激細胞としてＵＬＣＬクローン番号５および番号１３を使用して拡大した集団中の、（図２４Ａ）ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、（図２４Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに（図２４Ｃ）ガンマデルタＴ細胞およびアルファベータＴ細胞の比率を示す、代表的なドナー（ｎ＝７）からの散布図を提供する。
【図２４Ｂ】[0107]図２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃは、Ｋ５６２−ｃｓ細胞または共刺激細胞としてＵＬＣＬクローン番号５および番号１３を使用して拡大した集団中の、（図２４Ａ）ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、（図２４Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに（図２４Ｃ）ガンマデルタＴ細胞およびアルファベータＴ細胞の比率を示す、代表的なドナー（ｎ＝７）からの散布図を提供する。
【図２４Ｃ】[0107]図２４Ａ、２４Ｂおよび２４Ｃは、Ｋ５６２−ｃｓ細胞または共刺激細胞としてＵＬＣＬクローン番号５および番号１３を使用して拡大した集団中の、（図２４Ａ）ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、（図２４Ｂ）ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞、ならびに（図２４Ｃ）ガンマデルタＴ細胞およびアルファベータＴ細胞の比率を示す、代表的なドナー（ｎ＝７）からの散布図を提供する。
【図２５】[0108]図２５は、Ｋ５６２ｃｓ細胞による発現と比較した場合の、ＵＬＣＬクローン番号５および番号１３によるガンマデルタＴＣＲ発現の特徴付けの代表的な結果を示すヒストグラムを提供する。
【図２６Ａ】[0109]図２６Ａおよび２６Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、Ｋ５６２−ｃｓ細胞または共刺激細胞としてＵＬＣＬクローン番号５および番号１３を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度を示す、２人の異なるドナーの棒グラフである。
【図２６Ｂ】[0109]図２６Ａおよび２６Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、Ｋ５６２−ｃｓ細胞または共刺激細胞としてＵＬＣＬクローン番号５および番号１３を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度を示す、２人の異なるドナーの棒グラフである。
【図２７Ａ】[0110]図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃおよび２７Ｄは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞（Ｋ）、ＵＬＣＬクローン番号５（５）またはＬＣＬ（Ｌ）を使用した示された数の刺激後の、示されたＥＢＶ抗原に特異的なＴ細胞の頻度を示す４人の異なるドナーの棒グラフである。
【図２７Ｂ】[0110]図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃおよび２７Ｄは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞（Ｋ）、ＵＬＣＬクローン番号５（５）またはＬＣＬ（Ｌ）を使用した示された数の刺激後の、示されたＥＢＶ抗原に特異的なＴ細胞の頻度を示す４人の異なるドナーの棒グラフである。
【図２７Ｃ】[0110]図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃおよび２７Ｄは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞（Ｋ）、ＵＬＣＬクローン番号５（５）またはＬＣＬ（Ｌ）を使用した示された数の刺激後の、示されたＥＢＶ抗原に特異的なＴ細胞の頻度を示す４人の異なるドナーの棒グラフである。
【図２７Ｄ】[0110]図２７Ａ、２７Ｂ、２７Ｃおよび２７Ｄは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞（Ｋ）、ＵＬＣＬクローン番号５（５）またはＬＣＬ（Ｌ）を使用した示された数の刺激後の、示されたＥＢＶ抗原に特異的なＴ細胞の頻度を示す４人の異なるドナーの棒グラフである。
【図２８Ａ】[0111]図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃおよび２８Ｄは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、共刺激細胞としてＫ５６２−ｃｓ細胞またはＵＬＣＬクローン番号４、番号５および番号１３を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度および拡大倍率を示す棒グラフおよびグラフである。
【図２８Ｂ】[0111]図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃおよび２８Ｄは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、共刺激細胞としてＫ５６２−ｃｓ細胞またはＵＬＣＬクローン番号４、番号５および番号１３を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度および拡大倍率を示す棒グラフおよびグラフである。
【図２８Ｃ】[0111]図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃおよび２８Ｄは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、共刺激細胞としてＫ５６２−ｃｓ細胞またはＵＬＣＬクローン番号４、番号５および番号１３を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度および拡大倍率を示す棒グラフおよびグラフである。
【図２８Ｄ】[0111]図２８Ａ、２８Ｂ、２８Ｃおよび２８Ｄは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、共刺激細胞としてＫ５６２−ｃｓ細胞またはＵＬＣＬクローン番号４、番号５および番号１３を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度および拡大倍率を示す棒グラフおよびグラフである。
【図２９Ａ】[0112]図２９Ａおよび２９Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号４または共刺激細胞として親ＵＬＣＬ細胞を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度を示す棒グラフである。
【図２９Ｂ】[0112]図２９Ａおよび２９Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号４または共刺激細胞として親ＵＬＣＬ細胞を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度を示す棒グラフである。
【図３０Ａ】[0113]図３０Ａおよび３０Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度を示す２人の異なるドナーの棒グラフである。
【図３０Ｂ】[0113]図３０Ａおよび３０Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度を示す２人の異なるドナーの棒グラフである。
【図３１Ａ】[0114]図３１Ａおよび３１Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の拡大倍率を示す２人の異なるドナーの棒グラフである。
【図３１Ｂ】[0114]図３１Ａおよび３１Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の拡大倍率を示す２人の異なるドナーの棒グラフである。
【図３２】[0115]図３２は、ドナーＰＢに関する、フローサイトメトリーによって決定された、示された数の刺激後のＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞によるＣＤ３およびＣＤ５６の表面発現を示す散布図を提供する。
【図３３】[0116]図３３は、ドナーＫＰに関する、フローサイトメトリーによって決定された、示された数の刺激後のＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞によるＣＤ３およびＣＤ５６の表面発現を示す散布図を提供する。
【図３４】[0117]図３４は、ドナーＰＢに関する、フローサイトメトリーによって決定された、示された数の刺激後のＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞によるＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の表面発現を示す散布図を提供する。
【図３５】[0118]図３５は、ドナーＫＰに関する、フローサイトメトリーによって決定された、示された数の刺激後のＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞によるＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の表面発現を示す散布図を提供する。
【図３６Ａ】[0119]図３６Ａおよび３６Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度を示す２人の異なるドナーの棒グラフである。
【図３６Ｂ】[0119]図３６Ａおよび３６Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の頻度を示す２人の異なるドナーの棒グラフである。
【図３７Ａ】[0120]図３７Ａおよび３７Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の拡大倍率を示す２人の異なるドナーの棒グラフである。
【図３７Ｂ】[0120]図３７Ａおよび３７Ｂは、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団中のウイルス特異的なＴ細胞の拡大倍率を示す２人の異なるドナーの棒グラフである。
【図３８】[0121]図３８は、１人のドナーに関する、フローサイトメトリーによって決定された、示された数の刺激後のＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞によるＣＤ３およびＣＤ５６の表面発現を示す散布図を提供する。
【図３９】[0122]図３９は、１人のドナーに関する、フローサイトメトリーによって決定された、示された数の刺激後のＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞によるＣＤ３およびＣＤ５６の表面発現を示す散布図を提供する。
【図４０】[0123]図４０は、１人のドナーに関する、フローサイトメトリーによって決定された、示された数の刺激後のＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞によるＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の表面発現を示す散布図を提供する。
【図４１】[0124]図４１は、１人のドナーに関する、フローサイトメトリーによって決定された、示された数の刺激後のＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞によるＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の表面発現を示す散布図を提供する。
【図４２】[0125]図４２は、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、示されたサイトカインを含む刺激下における、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団中のＨＰＶ特異的なＴ細胞の頻度を示す棒グラフである。
【図４３】[0126]図４３は、示されたサイトカインを含む刺激下における、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団中の細胞の拡大倍率を示すグラフである。
【図４４】[0127]図４４は、フローサイトメトリーによって決定された、示されたサイトカインを含む刺激下における、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞によるＣＤ３およびＣＤ５６の表面発現を示す散布図を提供する。
【図４５】[0128]図４５は、フローサイトメトリーによって決定された、示されたサイトカインを含む刺激下における、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞によるＣＤ４およびＣＤ８の表面発現を示す散布図を提供する。
【図４６】[0129]図４６は、フローサイトメトリーによって決定された、示されたサイトカインを含む刺激下における、示された数の刺激後の、ＵＬＣＬクローン番号５または共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞によるＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の表面発現を示す散布図を提供する。
【図４７】[0130]図４７は、本開示のウイルス特異的なＴ細胞（ＶＳＴ）生成方法の一般的な実施態様の概略図である。
【図４８】[0131]図４８は、ＩＬ−４およびＩＬ−７を採用する公知の方法と比較した、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を採用する本開示の方法の改善された特異性を実証する棒グラフを提供する。
【図４９】[0132]図４９は、ＥＬＩＳＰＯＴによって決定された、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で実行された刺激により得られたリンパ腫患者のＥＢＶＳＴの改善されたＥＢＶ抗原特異性を示す棒グラフである。
【図５０】[0133]図５０は、高用量のＩＬ−１５の存在下における刺激がＶＳＴの頻度を増加させることを実証する棒グラフである。
【図５１】[0134]図５１は、高用量のＩＬ−１５の存在下における刺激がセントラルメモリーＥＢＶＳＴの比率を増加させることを示す棒グラフである。
【図５２】[0135]図５２は、一部の患者からのＥＢＶＳＴ中の過剰なＮＫ細胞の成長を示す棒グラフを提供する。
【図５３】[0136]図５３は、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞枯渇ＰＢＭＣからのペプミックスによって活性化されたＥＢＶＳＴの生成の概略図である。
【図５４】[0137]図５４は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇が、健康なドナーから拡大したＥＢＶＳＴ中のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の頻度を減少させることを示す棒グラフである。
【図５５】[0138]図５５は、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の除去がＥＢＶＳＴの増殖を増加させることを示す棒グラフである。
【図５６】[0139]図５６は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇がＥＢＶＳＴの拡大倍率を強化することを実証するグラフである。
【図５７】[0140]図５７は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇が、第２の刺激の終了時（１６日目）にＥＢＶＳＴの抗原特異性を強化することを示す棒グラフである。
【図５８】[0141]図５８は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇が、ＥＢＶＳＴの抗原特異性を強化することを実証する棒グラフである。
【図５９】[0142]図５９は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇ＥＢＶＳＴの抗原特異性の増加は、第３の刺激後に持続することを実証する棒グラフである。
【図６０】[0143]図６０は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇がリンパ腫患者のＥＢＶＳＴ中のＮＫ細胞集団の成長を減少させることを実証する棒グラフである。
【図６１】[0144]図６１は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇が、リンパ腫患者のＥＢＶＳＴ中の抗原特異的なＴ細胞の頻度を増加させることを示す棒グラフである。
【図６２】[0145]図６２は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇が、リンパ腫患者からのＥＢＶＳＴにおける抗原特異性を増加させることを実証する棒グラフである。
【図６３】[0146]図６３は、リンパ腫患者のＥＢＶＳＴの増殖に対するＣＤ４５ＲＡ枯渇の作用を示す棒グラフである。
【図６４】[0147]図６４は、ＣＤ４５ＲＡ−枯渇が、ペプミックスパルス化自己活性化Ｔ細胞（ａＡＴＣ）に対する細胞溶解活性を強化することを実証するチャートである。
【発明を実施するための形態】
【０１２１】
[0148]本出願の範囲が、本明細書に記載されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法および工程の特定の実施態様に限定されることは意図されない。
[0149]長年にわたる特許法の慣例に従って、言葉「１つの（a）」および「１つの（an）」は、特許請求の範囲を含む本明細書において含むという言葉と共に使用される場合、「１つまたはそれより多くの」を意味する。本発明の一部の実施態様は、本発明のうちの１つまたはそれより多くのエレメント、方法の工程、および／または方法からなっていてもよいし、またはそれから本質的になっていてもよい。本明細書に記載されるあらゆる方法または組成物が、本明細書に記載される他のあらゆる方法または組成物に関して実行できることが予期される。
【０１２２】
[0150]本発明の開示は、例えばＨＰＶ感染およびＨＰＶ関連の医学的状態を処置するための、ＨＰＶ特異的なＴ細胞、例えば、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８特異的なＴ細胞を必要とする個体のための治療的Ｔ細胞の生産および使用に関する。特定の実施態様において、本方法および組成物は、ＨＰＶ感染に間接的または直接的に関する新生物を処置することに有用であり、このような新生物は、良性であってもよいし、または悪性であってもよい。１３〜１８種のＨＰＶ株が、高い腫瘍形成性リスクを付与するとして特徴付けられており、これらの株のうち１２種は、ＨＰＶ種７（ＨＰＶ−１８、−３９、−４５、−５９、−６８）および種９（ＨＰＶ−１６、−３１、−３３、−３５、−５２、−５８、−６７）に属する。ＨＰＶタイプ６および１１は、喉頭乳頭腫症（laryngeal papillomatisis）を引き起こす。
【０１２３】
Ｉ．  [0151]ＨＰＶ抗原およびペプミックスの生成
[0152]本開示の方法は、Ｔ細胞にペプチドの混合物を提示する抗原提示細胞を利用する。このような「負荷された」ＡＰＣは、末梢血Ｔ細胞の刺激のための末梢血Ｔ細胞への曝露の前に生成され、負荷されたＡＰＣの生成は、末梢血Ｔ細胞のための刺激工程を実行する個人または組織によって実行されてもよいし、またはそうでなくてもよい。したがって、一部の実施態様において、有効量のペプチドのライブラリーは、最終的に治療的ＣＴＬを生成する方法の一部としてＡＰＣに提供される。本開示の方法において、刺激工程の前に、ＡＰＣは、十分な量のペプチドのライブラリーに曝露される。ライブラリーは、特定の場合において、同じ抗原の一部または全てに及ぶペプチドの混合物（「ペプミックス」）を含むが、一部の場合において、ライブラリーは、１つまたはそれより多くの抗原の一部または全てに及ぶペプミックスを含み、１つまたはそれより多くの抗原は、同じＨＰＶ由来であってもよいし、またはそうでなくてもよい。特定の実施態様において、ＡＰＣのためのペプチドは、非天然であり、それらは、化学合成されるかもしくは組換え手段によって生産されてもよいし、またはそうでなくてもよい。
【０１２４】
[0153]１つまたはそれより多くのＨＰＶ抗原由来のペプチドの混合物のライブラリーを利用することにおいて、様々なペプチドが、所与のタンパク質のあらゆる部分に由来し得るが、具体的な場合において、ペプチドは集合的にタンパク質の大部分または全ての長さに及び、その場合、特定の抗原の望ましい領域全体の網羅を容易にするために、ペプチドの配列は、少なくとも部分的にオーバーラップする。一部の場合において、ペプチドは、ペプチドが対応するそれぞれの抗原の１つまたはそれより多くの公知のエピトープまたはドメインの長さに及ぶ。特定の領域は、例えばＮ末端ドメイン、Ｃ末端ドメイン、細胞外ドメイン、または細胞内ドメインなどの領域を含む領域の長さに及ぶペプチドによって網羅することができる。
【０１２５】
[0154]ペプチドが得られる抗原は、ＨＰＶに関する抗原であって、あらゆる種類のものであり得るが、具体的な実施態様において、抗原は、細胞傷害性Ｔ細胞を、ＨＰＶ感染に関連するがんなどの新生物に方向付けることを可能にするようなものである。特定の実施態様において、ペプチドは、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８などの少なくとも１つのＨＰＶタイプの１つまたはそれより多くの抗原の少なくとも一部由来であるか、またはそれに対応する配列を有する。例えば、後期子宮頸がんにおいて、ＨＰＶウイルスは、腫瘍細胞ゲノムに統合され、Ｅ６およびＥ７を除くその他の遺伝子の全てを失うため、一部の場合において、これらの抗原が標的化される。例えばウイルスが統合される前に、がんの初期ステージを処置する実施態様において、例えばＥ５およびＬ１およびＬ２などの、Ｅ６およびＥ７以外の抗原由来のペプチドを利用することが可能であった。しかしながら、高いリスクのＨＰＶタイプの２種の一次腫瘍性タンパク質がＥ６およびＥ７であることを考えれば、具体的な実施態様において、ペプチドの配列は、具体的にはＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８以外のいずれかのＨＰＶ由来のＥ６および／またはＥ７から得られる。抗原Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、および／またはＬ２のいずれか由来のペプチドが、本開示の方法において利用することができる。
【０１２６】
[0155]一部の場合において、ペプミックスライブラリーは、単一タイプのＨＰＶウイルス由来の１つまたはそれより多くの抗原に対応するペプチドを含み、これらのペプチドは、問題の抗原全体にわたる配列の網羅を提供してもよいし、またはそうでなくてもよい。他の場合において、ペプミックスライブラリーは、１つより多くのＨＰＶウイルス由来の１つまたはそれより多くの抗原に対応するペプチドを含み、これらのペプチドは、問題の抗原全体にわたり配列の網羅を提供してもよいし、またはそうでなくてもよい。ペプミックスは、１つもしくはそれより多くの特定の抗原の１つもしくはそれより多くの特定の領域に対応する、または１つもしくはそれより多くの特定の抗原の全体に対応するペプチドが高濃度化されていてもよいし、またはそうでなくてもよい。
【０１２７】
[0156]本開示で利用されるペプミックスは、例えば、商業的に入手可能なペプチドライブラリー由来であってもよいし、または合成的に生成してもよい。利用可能なライブラリーの例としては、ＪＰＴテクノロジー（JPT Technologies）（バージニア州スプリングフィールド）またはミルテニーバイオテク（Miltenyi Biotec）（カリフォルニア州オーバーン）からのものが挙げられる。当業者は、例えばＨＰＶ１６  Ｅ６、ＨＰＶ１６  Ｅ７、ＨＰＶ１８  Ｅ６、およびＨＰＶ１８  Ｅ７の公知の配列に基づいて、それらの例示的なそれぞれの配列に対応するペプチドを生成することができる程度の十分な情報を有すると予想される。ＨＰＶ１６  Ｅ６タンパク質の配列の例は、国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）データベースにおいて、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＩＱ８２７７６．１  ＧＩ：６８８０１０７０３で利用可能である。ＨＰＶ１６  Ｅ７タンパク質の配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＩＱ８２８１４．１  ＧＩ：６８８０１０７８９である。ＨＰＶ１８  Ｅ６タンパク質の配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＧＵ９０４２３．１  ＧＩ：５３７８０１９７５である。ＨＰＶ１８  Ｅ７タンパク質の配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）受託番号ＡＧＵ９０４２４．１  ＧＩ：５３７８０１９７６である。
【０１２８】
[0157]特定の実施態様において、ライブラリーは、それらそれぞれの抗原に対応する特定の長さを有するペプチドで構成されるが、一部の場合において、ライブラリーは、２つまたはそれより多くの異なる長さを有するペプチドの混合物で構成される。ペプチドは、特定の長さを有していてもよく、それらは、配列の特定の量がオーバーラップしていてもよいが、一部のライブラリー中においてオーバーラップの長さの変動があってもよい。特定の実施態様において、ペプチドは、例えば、長さが少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、または３５個の、またはそれより多くのアミノ酸である。特定の実施態様において、ペプチド間で、例えば、長さが少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４個のアミノ酸のオーバーラップがある。具体的な実施態様において、ペプチドは、長さが１５個のアミノ酸であり、１１個のアミノ酸が互いにオーバーラップする。異なるペプチドの混合物は、あらゆる比率の異なるペプチドを含んでいてもよいが、一部の実施態様において、特定のペプチドのそれぞれは、混合物中において別の特定のペプチドと実質的に同じ数で存在する。ペプチドの配列における抗原の網羅は、ランダムな場合があり、実質的に抗原の所与の領域を超えていることさえあるが、一部の実施態様において、ライブラリーは、１つまたはそれより多くの特定のペプチド、例えば、エピトープまたはその一部をコードすることがわかっている１つまたはそれより多くのペプチドが高濃度化されていてもよい。
【０１２９】
[0158]特定の実施態様において、特定の抗原タンパク質のペプミックスは、例えば長さが８〜１０個のアミノ酸のあらゆる可能なＨＬＡクラスＩエピトープを含む。具体的な実施態様において、特定のペプチドの全てのクラスＩＩエピトープを網羅するために、それより長いペプチドが利用される。特定の形態において、ペプチドは、長さが最大３０個のアミノ酸であり、２５個のアミノ酸のオーバーラップを有する。
【０１３０】
ＩＩ．  [0159]治療的Ｔ細胞を生産および使用する方法
Ａ．治療的Ｔ細胞の生産
[0160]特定の形態において、本発明の開示は、少なくとも１種のＨＰＶウイルス由来の１つまたはそれより多くの抗原を標的化する、免疫細胞、例えば細胞傷害性Ｔ細胞の開発に関する。
【０１３１】
[0161]本明細書で開示される方法は、免疫細胞の刺激および／または拡大を含んでいてもよい。本方法は、末梢血液細胞、例えば末梢血単核細胞の刺激および／または拡大を含んでいてもよい。本方法は、免疫細胞の集団（例えばＰＢＭＣ）内からの免疫細胞集団（例えばＴ細胞の集団）の拡大を含んでいてもよい。例えば、Ｔ細胞の集団は、ＰＢＭＣの集団内のＴ細胞の刺激によって、ＰＢＭＣの集団内から拡大されてもよい。したがって、本明細書で開示された方法の実施態様において、Ｔ細胞の刺激および／または拡大は、ＰＢＭＣの集団の刺激を含んでいてもよい。一部の実施態様において、Ｔ細胞の集団は、腫瘍浸潤リンパ球の集団内のＴ細胞の刺激によって、腫瘍浸潤リンパ球の集団内から拡大されてもよい。したがって、本明細書で開示された方法の実施態様において、Ｔ細胞の刺激および／または拡大は、腫瘍浸潤リンパ球の集団の刺激を含んでいてもよい。一部の実施態様において、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の集団（例えば不均質な特異性を有するＴ細胞の集団）内から拡大されてもよく、このようなＴ細胞の集団は、血液サンプル、ＰＢＭＣの集団から、または腫瘍浸潤リンパ球の集団から得られたものでもよい。刺激／拡大は、刺激／拡大の終了時に、細胞集団中において、ＨＰＶ特異的な免疫細胞（例えばＨＰＶ特異的なＴ細胞、例えばＨＰＶ特異的なＣＴＬ）の数の増加をもたらすか、および／またはこのような細胞の比率の増加をもたらすことができる。本方法は、Ｔ細胞の刺激および／または拡大を含んでいてもよい。細胞は、処置しようとする患者から得られたものでもよいし（すなわち、自己細胞）、または別の個体から得られたものでもよい（すなわち、同種細胞）。本方法は、特定の実施態様において、単離された免疫細胞の刺激および／または拡大を含む。すなわち、具体的な方法は、実質的に非免疫細胞、例えば赤血球を含有しない細胞の集団に対して実行することができる。一部の場合において、免疫細胞は、単離されたＰＢＭＣ、または単離されたＴ細胞である。細胞は、血液のサンプル、例えば患者または個体から得られた血液のサンプルから得られたものでもよい。細胞は、組織サンプルまたは生検から得られたものでもよい。細胞は、腫瘍から得られたものでもよい（例えば腫瘍浸潤リンパ球）。本明細書で開示される特定の方法は、患者から得られたサンプルからＰＢＭＣおよび／またはＴ細胞を得る工程を含む。方法の特定の実施態様は、患者または個体から血液または細胞のサンプルを得る工程を含まないが、その代わりに、事前に得られたサンプルまたは細胞に実行される。本方法は、サンプルを処理することを含んでいてもよく、例えばサンプルの免疫細胞、例えばＰＢＭＣおよび／またはＴ細胞を高濃度化することを含んでいてもよい。このような方法は、サンプル中の赤血球、血小板、血清および／または血漿を除去すること、またはそれらの量を実質的に低減させることを含んでいてもよい。これは、赤血球などの実質的に他の細胞を含有しない免疫細胞の集団をもたらすことができる。本明細書で開示される方法は、単離された免疫細胞に、または他の細胞に加えて免疫細胞を含有するサンプルに実行することができる。
【０１３２】
[0162]Ｔ細胞を生産する方法において、末梢血Ｔ細胞は、最初に、少なくとも１つのＨＰＶ抗原の一部または全てに及ぶ１つまたはそれより多くのペプチドに曝露されたことがあるＡＰＣで刺激されてもよい。抗原性ペプチドは、ペプチド混合物のライブラリー中のＡＰＣに提供されてもよく、ペプミックスの複数のライブラリーは、ＡＰＣの同じ集合体に提供されてもよい。一部の実施態様において、集合体は、免疫優性の抗原と準優性の抗原の両方を含む。
【０１３３】
[0163]本開示の実施態様において、治療的Ｔ細胞が生成され、ＨＰＶ感染を有する個体、または間接的または直接的にＨＰＶ感染が原因のＨＰＶ関連の医学的状態を有するリスクがある個体に提供することができる。治療的Ｔ細胞を生産する方法において、特定の条件下で、末梢血Ｔ細胞は、例えば、Ｅ６および／またはＥ７を含むＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８抗原の一部または全てを含む１つまたはそれより多くの抗原の一部または全てに及ぶペプチドのライブラリーが負荷されているＡＰＣと混合される。具体的な実施態様において、刺激する工程のために、Ｔ細胞は、ＰＢＭＣの集団内に存在する。
【０１３４】
[0164]一部の実施態様において、特定の工程で使用されるＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）であり得る。ＤＣの生成のための方法は当業界において周知であり、例えばRamosら、上記を参照されたい。単球は、ＣＤ１４選択によってＰＢＭＣから単離し、８００Ｕ／ｍｌの顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）および１０００Ｕ／ｍｌのインターロイキン４（ＩＬ−４）を含む、ＤＣ培地および２ｍＭアラニル−グルタミン中で５日間培養してもよい。３日目に、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−４を補充してもよい。５日目に、ＤＣは、１０ｎｇ／ｍｌのインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）、１００ｎｇ／ｍｌのインターロイキン６（ＩＬ−６）、１０ｎｇ／ｍｌのプロスタグランジンＥ２、８００Ｕ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦおよび１０００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４を含むＤＣ培地中で成熟する。ＤＣ成熟をフローサイトメトリーによって評価して、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６およびＨＬＡ−ＤＲの上方調節を検出することができる。
【０１３５】
[0165]一部の実施態様において、特定の工程で使用されるＡＰＣは、活性化Ｔ細胞である。活性化Ｔ細胞は、静脈切開による血液から単離された自己ＰＢＭＣの一部を使用して生成されたポリクローナルＴ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）であり得る。細胞は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた細胞培養皿で培養することによって活性化することができる。次いで細胞を培養して、ＩＬ−２の存在下で２週間拡大する。拡大したＴ−ＡＰＣは、後の使用のために低温保存することができる。刺激のために（例えば、刺激の第３のサイクルのため、任意選択でそれに続く刺激のために）Ｔ−ＡＰＣを使用する２〜３日前に、低温保存した細胞を融解させ、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた細胞培養皿中で再刺激する。刺激の日に、Ｔ−ＡＰＣ細胞を回収し、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ペプチドでパルス化し、続いてＨＰＶで刺激されたＴ細胞の進行中の培養に１：１の比率で添加する。
【０１３６】
[0166]一部の実施態様において、特定の工程および／または方法で使用されるＡＰＣは、Ｂ−ブラスト（ＢＢ）であり得る。Ｂ−ブラストは、例えば患者の自己ＰＢＭＣから生成することができる。ＰＢＭＣ内のＢリンパ球を、放射線照射した同種ＣＤ４０Ｌを発現するＭＲＣ５上皮細胞株と共培養することによって活性化し、１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−４および１マイクログラム／ｍｌのシクロスポリンＡを含有する培地中で拡大する。
【０１３７】
[0167]一部の実施態様において、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８の一方または両方由来の少なくとも１つの抗原を標的化するＴ細胞を生成する方法があり、これは、一般的に、複数のＰＢＭＣを、１つまたはそれより多くの特定のＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８ウイルス抗原に対応するペプチドのライブラリーからのペプチドが負荷された複数のＡＰＣと接触させることによって行われる。具体的な実施態様において、２つの細胞集団の曝露は、Ｔ細胞の拡大を可能にする。特定の実施態様において、刺激工程は、１つまたはそれより多くの特定のサイトカインの存在下で行われ、このようなサイトカインは、哺乳類（例えばマウス、ヒト）またはヒトサイトカインであり得る。特定の実施態様において、１つまたはそれより多くのサイトカインは、ＩＬ−７およびＩＬ−１５であるが、代替の実施態様において、サイトカインは、ＩＬ−１５、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１２、ＩＬ−６、ＩＬ−４、およびそれらの組合せからなる群から選択される。具体的な実施態様において、本方法のうちの１つまたはそれより多くの工程は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２１の存在下で行われないが、代替として、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、および／またはＩＬ−２１を利用することができる。サイトカインの存在への言及は、外因的に添加されたサイトカインの存在に対するものであり、すなわち細胞内に存在するかまたは細胞の培養によって分泌されたあらゆるサイトカインは除外される。一部の実施態様において、ペプチドはさらに、配列中、ＨＰＶ抗原の一部または全てに及ぶようにオーバーラップするペプチドと定義される。例えば、特定の形態において、ペプチドは、少なくとも１０個のアミノ酸、および特定には１１個のアミノ酸がオーバーラップしており、一部の実施態様において、ペプチドは、長さが少なくとも１２個またはそれより多くのアミノ酸、特定には長さが１５個のアミノ酸である。
【０１３８】
[0168]細胞培養中に含めるための所与のサイトカインの適切な量または濃度の選択は、当業者の能力または通常の技術の範囲内である。一例として、使用することができる特定のインターロイキンの列挙および適切な濃度の例をいかに記載する。
【０１３９】
[0169]インターロイキン６（ＩＬ−６）：５０〜１５０ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ、６０ｎｇ／ｍｌ、７０ｎｇ／ｍｌ、８０ｎｇ／ｍｌ、９０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ、１１０ｎｇ／ｍｌ、１２０ｎｇ／ｍｌ、１３０ｎｇ／ｍｌ、１４０ｎｇ／ｍｌまたは１５０ｎｇ／ｍｌのうちの１つ。
【０１４０】
[0170]インターロイキン７（ＩＬ−７）：５〜１５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌまたは１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ。
【０１４１】
[0171]インターロイキン１２（ＩＬ−１２）：５〜１５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌまたは１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ。
【０１４２】
[0172]インターロイキン１５（ＩＬ−１５）：５〜１５ｎｇ／ｍｌ、約５ｎｇ／ｍｌ、６ｎｇ／ｍｌ、７ｎｇ／ｍｌ、８ｎｇ／ｍｌ、９ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１１ｎｇ／ｍｌ、１２ｎｇ／ｍｌ、１３ｎｇ／ｍｌ、１４ｎｇ／ｍｌまたは１５ｎｇ／ｍｌのうちの１つ。
【０１４３】
[0173]以下の表１は、本開示の方法の特定の実施態様の例を提供する。
【０１４４】
【表１】
2021511805.tif 000003
【０１４５】
[0175]したがって、特定の実施態様において、Ｔ細胞の集団（この場合、集団は、実質的に全てのＴ細胞を含んでいてもよいし、またはＴ細胞の集団は、別の細胞の集団内、例えばＰＢＭＣ内のものである）は、ＡＰＣの集団に曝露されて、少なくとも：ａ）ＨＰＶ１６  Ｅ６および／もしくはＥ７を標的化することにおける有効性、ならびに／またはＨＰＶ１８  Ｅ６および／もしくはＥ７を標的化することにおける有効性；ｂ）ポリクローナル性；ｃ）ＴＨ１バイアス；またはｄ）それらの組合せなどの特定の特徴を有するＴ細胞株を生成する。生成されたＴ細胞株は、ＨＰＶ種７（ＨＰＶ−１８、−３９、−４５、−５９、−６８）および種９（ＨＰＶ−１６、−３１、−３３、−３５、−５２、−５８、−６７）、ならびにタイプ６および１１、を標的化することにおいて有効であるように生産でき、これは、以下の抗原：Ｅ１、Ｅ２、Ｅ３、Ｅ４、Ｅ５、Ｅ６、Ｅ７、Ｌ１、および／またはＬ２のいずれか１つまたはそれより多くに向けられたペプミックスの結果であり得る。
【０１４６】
[0176]一部の場合において、Ｔ細胞は、１回より多く刺激され、異なる刺激工程は、細胞の集団を同じ条件に曝露してもよいし、またはそうでなくてもよい。具体的な実施態様において、第１の刺激は、第２の刺激および／または第３の刺激などのそれに続く刺激と異なる条件を有する。具体的な実施態様において、本方法の第１の刺激工程は、ペプミックスが負荷されたＤＣまたはペプミックスが負荷されたＰＢＭＣであるＡＰＣを利用し、ＩＬ−７およびＩＬ−１５を利用する。この刺激工程は、任意選択で、１回またはそれより多くの回数繰り返してもよい。
【０１４７】
[0177]本方法の特定の実施態様において、末梢血Ｔ細胞（またはＰＢＭＣ）のペプミックスまたはＡＰＣへの最初の曝露後の８日目から１０日目の間、８日目、９日目、または１０日目に（ただしそれより後の日を除く）、ＰＢＭＣの再刺激が行われてもよく、次いでそれに続く再刺激が、１５日目、１６日目、または  １７日目に行われてもよい。
【０１４８】
[0178]第１の刺激工程（任意選択の第１の刺激工程の繰り返しを含む）に続く刺激工程において、その結果生じた、第１の刺激の後に得られたＴ細胞（これは、細胞の不均質な集団中であってもよい）は、ペプミックスが負荷されたＤＣまたはペプミックスが負荷されたＰＢＭＣおよび／または自己活性化Ｔ細胞に曝露される。第１および第２の刺激工程に続く刺激において、第２または後続の刺激の後に得られたＴ細胞（これは、細胞の不均質な集団中に存在していてもよい）は、ペプミックス自己活性化Ｔ細胞に曝露される。あらゆる刺激工程で利用可能な共刺激細胞としては、少なくともＣＤ８６、４−１ＢＢ、ＣＤ８３、ＣＤ４０、ＯＸ４０、および／またはＣＤ８０を発現する細胞が挙げられる。具体的な場合において、共刺激細胞は、Ｋ５６２細胞であり得る。
【０１４９】
[0179]一部の実施態様において、本方法の工程中、培養中の細胞は、改変される。具体的な実施態様において、細胞は、具体的な目的または機能にとって細胞を有効に、もしくはより有効にする遺伝子産物、例えば、特定の標的を標的化するために有効に、またはより有効にする遺伝子産物、ならびに／または例えば、Ｔ細胞媒介細胞傷害性に関する機能が強化された遺伝子産物、および／もしくは腫瘍抗原特異的な細胞性免疫に耐性を有するように改変された遺伝子産物を発現するポリヌクレオチドを内包するように改変される。
【０１５０】
[0180]一部の実施態様において、Ｔ細胞が、望ましい標的細胞、例えば特定の抗原を発現する標的細胞を効果的に、またはより効果的に標的化するようにできる特定の非天然受容体を発現するように、細胞が改変される。細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、αβＴ細胞受容体などを発現するように改変されてもよい。細胞は、本方法中に、具体的なタイムポイントで、発現ベクター（ウイルス（レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスなどを含む）または非ウイルス発現ベクターであり得る）を発現するように改変されてもよく、例えばこのようなベクターは、例えば培養の２日目〜５日目に導入される。一部の実施態様において、細胞は、各刺激後の約３日以内に発現ベクターに曝露されるが、このような場合、改変は、それほど長期ではない能力を有するより分化したＴ細胞（特定の環境において望ましい）で起こる。
【０１５１】
[0181]具体的な実施態様において、がん抗原、例えばＥｐｈＡ２、ＨＥＲ２、ＧＤ２、グリピカン−３、５Ｔ４、８Ｈ９、αｖβ６インテグリン、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ６、ＣＡＩＸ、ＣＡ９、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、カッパ軽鎖、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ４４ｖ７／８、ＣＤ７０、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ＣＤ１７１、ＣＥＡ、ＣＳＰＧ４、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＥＧＰ２、ＥＧＰ４０、ＥＰＣＡＭ、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＥｒｂＢ３／４、ＦＡＰ、ＦＡＲ、ＦＢＰ、胎児ＡｃｈＲ、葉酸受容体α、ＧＤ２、ＧＤ３、ＨＬＡ−ＡＩ  ＭＡＧＥ  Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＩＬ１１Ｒａ、ＩＬ１３Ｒａ２、ＫＤＲ、ラムダ、ルイス−Ｙ、ＭＣＳＰ、メソテリン、Ｍｕｃ１、Ｍｕｃ１６、ＮＣＡＭ、ＮＫＧ２Ｄリガンド、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＰＲＡＭＥ、ＰＳＣＡ、ＰＳＣ１、ＰＳＭＡ、ＲＯＲ１、Ｓｐ１７、サバイビン、ＴＡＧ７２、ＴＥＭ１、ＴＥＭ８、ＶＥＧＲＲ２、癌胎児性抗原、ＨＭＷ−ＭＡＡ、ＶＥＧＦ受容体、ならびに／またはフィブロネクチン、テネイシンの腫瘍胎児性バリアント、または腫瘍の壊死領域などの腫瘍の細胞外マトリックス中に存在する他の例示的な抗原を標的化するＣＡＲ、ならびに例えば腫瘍のゲノム分析および／または差次的発現研究を介して同定される他の腫瘍関連抗原または有効な突然変異を発現するように、細胞が改変される。
【０１５２】
[0182]一部の実施態様において、例えばトランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）によって媒介される腫瘍抗原特異的な細胞性免疫に耐性を有するように、細胞が改変される。例えば、ＴＧＦ−ベータのドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲＩＩ）、例えばFosterら（Antitumor activity of EBV-specific T lymphocytes transduced with a dominant negative TGF-beta receptor. J Immunother. 2008;31:500-505、参照により本明細書に組み入れられる）に記載されたようなものを発現するように、細胞は改変されてもよい。これは、免疫原性ヘマグルチニンタグの除去によって改変されたドミナントネガティブＴＧＦ−β受容体ＩＩ型（ＤＮＲＩＩ）をコードするレトロウイルス発現ベクターで細胞をトランスフェクトすることを含んでいてもよい。このような改変されたＴ細胞は、ＴＧＦ−βを分泌する腫瘍の存在下で、強化された抗腫瘍活性などの改変されていないＴ細胞を超える機能的な利点を有することが示されている（Fosterら、上記）。
【０１５３】
[0183]本発明に係る方法は、先行技術の方法と比較して、ウイルス特異的なＴ細胞の集団の拡大速度を改善することができる。Ｔ細胞集団の拡大速度は、当業者周知の方法によって分析することができる。方法の例としては、１つまたはそれより多くのタイムポイントにおけるＴ細胞の数を測定することが挙げられる。例えば、本発明に係る方法を実行した後に、Ｔ細胞の数を決定し、方法の始めにおけるＴ細胞の数と比較することができ、次いでＴ細胞の数における拡大倍率を計算することができる。
【０１５４】
[0184]拡大速度はまた、所定時間にわたりＴ細胞によって細胞分裂を分析することによっても決定することができる。所与のＴ細胞の集団の細胞分裂は、例えば参照によりその全体が本明細書に組み入れられるFulcherおよびWong、Immunol Cell Biol(1999)77(6): 559〜564に記載されているように、例えば、３Ｈ−チミジンの取り込みのインビトロでの分析によって、またはＣＦＳＥ希釈アッセイによって分析することができる。
【０１５５】
[0185]本発明に係る方法によって達成される拡大速度における改善は、本発明に係る方法を実行すること、およびその方法におけるＴ細胞の拡大を、例えばRamosら（J Immunother 2013；36：66〜76）の方法のような匹敵する対照方法と比較することによって決定することができる。
【０１５６】
[0186]一部の実施態様において、本発明に係る方法におけるＴ細胞の集団の拡大速度は、匹敵する対照方法における拡大速度の、少なくとも１．００１倍、１．００２倍、１．００３倍、１．００４倍、１．００５倍、１．００６倍、１．００７倍、１．００８倍、１．００９倍、１．０１倍、１．０２倍、１．０３倍、１．０４倍、１．０５倍、１．０６倍、１．０７倍、１．０８倍、１．０９倍、１．１倍、１．２倍、１．３倍、１．４倍、１．５倍、１．６倍、１．７倍、１．８倍、１．９倍、または２倍のいずれかである。
【０１５７】
[0187]拡大速度は、ウイルス特異的なＴ細胞集団、または全Ｔ細胞集団の拡大速度であり得る。
[0188]本発明の方法に従って生成／拡大したウイルス特異的なＴ細胞は、少なくとも、先行技術の方法によって生成／拡大されたウイルス特異的なＴ細胞と同じ機能特性を保持し得る。すなわち、加速された拡大速度は、拡大されたＴ細胞の機能特性に負の影響を与えない。
【０１５８】
[0189]例えば、本方法がウイルス特異的なＴ細胞の集団を生成／拡大する実施態様において、Ｔ細胞は、先行技術の方法によって拡大されたウイルス特異的なＴ細胞のようなウイルスに感染した、またはウイルスのペプチドを含む／発現する細胞と類似の細胞傷害性を示す。
【０１５９】
[0190]拡大されたＴ細胞の細胞傷害性は、例えば、拡大されたＴ細胞集団を、Ｔ細胞が特異的なウイルスのペプチドを提示するＡＰＣと共に、異なるエフェクター（すなわちＴ細胞）と標的（すなわちＡＰＣ）との比率で、培養すること、およびＡＰＣの特異的な溶解物を測定することによって分析することができる。例えば、ＨＰＶ特異的なＣＴＬ集団の細胞傷害性は、異なるエフェクターと標的との比率でＨＰＶによって形質転換されたＬＣＬ細胞の特異的な溶解を測定することによって分析することができる。
【０１６０】
Ｂ．治療的Ｔ細胞の使用
[0191]特定の実施態様において、本開示の方法によって生産された細胞は、ウイルス感染によって引き起こされるものなどの医学的状態を処置するために、または医学的状態の症状が検出できない、もしくは出現してしないウイルス感染を標的化するために、それを必要とする個体に提供される。「処置」または「処置すること」は、本明細書で使用される場合、疾患または病態の症状または病状に対するあらゆる有益な、または望ましい作用を含み、さらに、最低限でも、処置されている疾患または状態の、例えばがんの１つまたはそれより多くの測定可能なマーカーにおける低減を含む場合もある。処置は、任意選択で疾患もしくは状態の症状の低減もしくは緩和、または疾患もしくは状態の進行の遅延のいずれかを含む場合もある。「処置」は、必ずしも疾患もしくは状態、またはそれらの関連する症状の完全な根絶または治癒を示すわけではない。
【０１６１】
[0192]本開示に包含される方法において、治療的Ｔ細胞は、単一の非ＨＰＶウイルスによって直接的または間接的に引き起こされるウイルス関連疾患を処置するのに利用されるか、またはそれ以外の状況で単一の非ＨＰＶウイルスに関して血清陽性である個体に提供される。他の場合において、治療的Ｔ細胞は、１つより多くのウイルスによって直接的または間接的に引き起こされるウイルス関連疾患を処置するのに利用されるか、またはそれ以外の状況で１つより多くのウイルスに関して血清陽性である個体に提供される。治療的Ｔ細胞の集合体において、各Ｔ細胞およびその後代は、１つのウイルスからの１つの抗原における１つのみのペプチドに対して特異性を有しており、例えば、治療的Ｔ細胞の集合体の生産のとき、例えば全体として各ウイルス抗原における複数のエピトープに対する多重特異性を有するＴ細胞の集団クローンが拡大される。
【０１６２】
[0193]本開示の少なくとも一部の方法において、それによって生成された治療有効量のＣＴＬが、個体に、例えば、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８関連疾患を有することがわかっている、もしくは有する疑いがある、またはその影響を受けやすい個体に投与される。具体的な実施態様において、細胞は、例えば、注射、例えば静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹膜内注射などによって投与される。一部の実施態様において、ＣＴＬはさらに、ポリクローナルＣＤ４＋およびＣＤ８＋ＣＴＬと定義される。ＰＢＭＣは、個体にとって同種であってもよいし、または個体にとって自己であってもよい。
【０１６３】
[0194]特定の場合において、新生物が本開示の細胞で処置され、新生物は、良性、悪性、またはがんに至る可能性がある前がん病変であってもよい。したがって、個体は、前がん病変のステージで、および／または病変が悪性になった後に、本開示の方法によって生産された細胞で処置することができる。個体は、初期または後期のがんを有していてもよく、および当業者は、細胞を生産する方法は、例えば初期がんとそれに対して後期がんに関連する抗原由来のＡＰＣのペプチドを利用することによって、このようながんの異なるステージに応じて調整できることを承知している。具体的な実施態様において、がんは、原発性、転移性、再発性、難治性などであり得る。
【０１６４】
[0195]特定の場合において、がんに至る可能性がある前がん病変、例えば、子宮頸、陰門、膣、陰茎、喉頭、中咽頭、肛門、および他の上気道消化管の領域の前がん病変などが、本開示の方法によって生産された細胞で処置される。したがって、個体は、前がん病変のステージで、および／または病変が悪性になった後に、本開示の方法によって生産された細胞で処置することができる。本開示の方法によって生産された細胞で処置することができるＨＰＶ関連の医学的状態としては、少なくとも、生殖器の領域の異形成、子宮頸部上皮内腫瘍、外陰上皮内腫瘍、陰茎上皮内腫瘍、肛門上皮内腫瘍、子宮頸がん、肛門がん、外陰がん、膣がん、陰茎がん、生殖器のがん、中咽頭がん、上咽頭癌、口腔パピローマおよび他の上気道消化管の病変が挙げられる。
【０１６５】
[0196]一部の場合において、細胞の投与の前に、がんに関連する血清型が決定されてもよいが、一部の場合において、血清型は決定されない。具体的な実施態様において、ＨＰＶ１６特異的な、またはＨＰＶ１８特異的な細胞は、それぞれＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８陽性である腫瘍に活性を有するが、一部の場合において、異なるＨＰＶ血清型との交差反応性がある。交差反応する能力は、わかっていてもよいし、またはそうでなくてもよく、特定の場合において、例えば、ＨＰＶ１６感染またはＨＰＶ１６関連の医学的状態を有する個体は、ＨＰＶ１８特異的なＴ細胞が投与され、逆もまた同様である。このような場合において、個体は、個体がその血清型を有するかどうかがわからない血清型に特異的な細胞で処置してもよく、それでもなおその細胞は、交差反応性のために治療上有効である。
【０１６６】
[0197]本方法の刺激工程のＡＰＣが、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８ペプミックスで一緒に負荷される場合、このようなＡＰＣを介して拡大されたＴ細胞の投与の結果は、個体が、問題のウイルスに曝露されたことがあるかどうかによって決定される。例えば、個体がＨＰＶ１８に感染しているが、ＨＰＶ１６に感染していない場合、ＨＰＶ１８特異的なＴ細胞のみが応答すると予想され、これはなぜなら、感染が、ＨＰＶ１８に対するＴ細胞応答を最初に刺激したと予想されるためである。このようなＴ細胞は個体中で拡大し、次いでメモリーＴ細胞になり、例えばそれまで活性化されなかったＨＰＶ１６に特異的なＴ細胞より多くの数で存在すると予想される。
【０１６７】
[0198]処置されている個体は、がんを有することがわかっている、がんを有する疑いがある、またはがんを有するリスクがある（例えば、個人または家族歴；性的に活発である、例えば性交渉の相手を選ばない；および／または１つまたはそれより多くの特異的なマーカーなどの遺伝学的素因を有する）個体であってもよい。処置されている個体は、ＨＰＶウイルスの存在を有していてもよいが、いずれのＨＰＶ関連の医学的状態の有害な症状がまだ現れていない。個体は、良性または悪性新生物を有していてもよい。個体は、初期または後期がんを有していてもよく、当業者は、細胞を生産する方法は、例えば初期がんとそれに対して後期がんに関連する抗原由来のＡＰＣのペプチドを利用することによって、このようながんの異なるステージに応じて調整できることを承知している。具体的な実施態様において、ＨＰＶ関連疾患は、口または生殖器の領域の悪性がんである。具体的な実施態様において、がんは、原発性、転移性、再発性、難治性などであり得る。個体は、あらゆる種類の性行為またはあらゆる種類の密接な肉体的接触の結果として、ＨＰＶ１６および／またはＨＰＶ１８に感染した個体であり得る。
【０１６８】
[0199]ＨＰＶの感染のあらゆるステージが、本開示に包含される細胞で処置することができる。本開示の方法で処置されている確立されたＨＰＶ関連がんを有する個体は、上皮内癌（ステージ０）、ステージＩ、ステージＩＩ、ステージＩＩＩ、またはステージＩＶ（これは、ＭＲＩ、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャンなどによって決定することができる）を含む。加えて、前がん病変（異形成）を有する個体も処置することができる。
【０１６９】
[0200]一部の実施態様において、本開示の方法によって生産された細胞の１回またはそれより多くの投与は、それを必要とする個体に提供される。異なる投与間の時間の長さは、およそ１〜７日、１〜４週、１〜１２ヶ月、または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０年、またはそれより多くの年数などのあらゆる好適な期間であり得る。一部の場合において、約１年以内の複数回の輸注が採用される可能性がある。１回より多くの細胞の投与が個体に提供される場合、細胞が標的化する抗原は、初期の投与で利用された細胞で標的化された抗原と同じであってもよいし、またはそうでなくてもよい。例えば、第１の細胞の投与において、細胞は、ＨＰＶ１８  Ｅ６を標的化していてもよく、それに対して別の細胞の投与において、細胞は、ＨＰＶ１８  Ｅ７を標的化するか、または逆もまた同様である。例えばがんが難治性になる場合、追加の投与が必要な場合もある。１つまたはそれより多くの他のタイプのがん処置と共に追加の刺激が採用される場合もある。
【０１７０】
[0201]一部の場合において、個体は、任意選択で、当業界におけるあらゆる好適な手段によってＨＰＶ感染を有すると決定されている。ＨＰＶは細胞培養で培養できないため、ＨＰＶ感染の診断方法、例えばＰＣＲ、サザンブロットハイブリダイゼーション、および／またはインサイチュハイブリダイゼーションを利用するＤＮＡ試験を利用してもよく、これらの方法は、例えば、コルポスコピー；酢酸試験；生検；身体検査；および／またはパプ塗抹標本と共に使用してもよいし、またはそうでなくてもよい。
【０１７１】
[0202]具体的な実施態様において、男性個体に、その個体が感染しているＨＰＶを標的化するために、有効量の本開示の方法によって生産された細胞が提供され、このような場合、個体はその後、他者に、例えば女性個体に性行為を介して感染させる機会を低減させる。男性個体は、本開示の方法の細胞への曝露前に、ＨＰＶに感染していることが決定されていてもよいし、またはそうでなくてもよい。一部の場合において、個体が、腫瘍形成性ＨＰＶに感染していることが示されている場合、個体のリスクを消滅させるために、その個体を細胞で処置することは価値があると予想される。細胞が有効であった場合、個体は、ウイルスをその個体のパートナーに伝染させる機会も低減されると予想される。
【０１７２】
[0203]具体的な実施態様において、個体は、免疫無防備状態である（これ例えば、免疫系によって感染症またはがんと戦うその能力が損なわれているかまたは全くない個体と定義することができる）。具体的な実施態様において、免疫不全個体は、幹細胞移植（造血幹細胞移植を含む）を受けたことがある、臓器移植を受けたことがある、および／または例えば化学療法または放射線を含む１回またはそれより多くのがん処置を受けたことがある個体である。一部の場合において、個体は、後天性または遺伝性免疫不全障害を有する。一部の実施態様において、自身の疾患および／またはその処置によって免疫無防備状態である者に、本開示の方法および／または組成物が提供される。
【０１７３】
[0204]薬物療法の方法は、ヒト対象における悪性腫瘍を緩和する、処置する、または防止する方法によるがんの処置を含んでいてもよく、その場合、本方法の工程は、がん性細胞の根絶において、免疫系を補助するかまたはブーストする。このような方法は、がん性細胞を破壊するために、能動的な免疫応答を引き起こす（または受動的な免疫応答を達成する）本発明に係る細胞の投与を含んでいてもよい。処置方法は、任意選択で、化学療法、放射線、または外科手術などのがんを処置するための従来の療法と組み合わせた、生物学的なアジュバント（例えば、インターロイキン、サイトカイン、カルメット−ゲラン菌（Bacillus Comette-Guerin）、モノホスホリル脂質Ａなど）の共投与を含んでいてもよい。処置方法は、免疫系を活性化してがん細胞の成長を防止または破壊することによって機能するワクチンとして、本発明に係る組成物を投与することを含んでいてもよい。また薬物療法の方法は、インビボの、エクスビボの、および養子免疫療法、例えば自己および／または異種細胞または不死化細胞株を使用するものなどを含んでいてもよい。
【０１７４】
ＩＩＩ．  [0205]医薬組成物
[0206]この開示によれば、用語「医薬組成物」は、個体への投与のための組成物に関する。特定の実施態様において、医薬組成物は、非経口、経皮、腔内、動脈内、髄腔内もしくは静脈内投与のための、または新生物、例えばがんへの直接注射のための、治療的な免疫細胞を含む組成物を含む。具体的には、医薬組成物は、輸注または注射を介して個体に投与されることが想定される。好適な組成物の投与は、様々な方法によって、例えば、静脈内、皮下、腹膜内、筋肉内、局所または皮内投与によって実行することができる。
【０１７５】
[0207]本発明の開示の医薬組成物は、医薬的に許容される担体をさらに含んでいてもよい。好適な医薬用担体の例は当業界において周知であり、その例としては、リン酸緩衝生理食塩水、水、エマルジョン、例えば油／水エマルジョン、様々な種類の湿潤剤、滅菌溶液などが挙げられる。このような担体を含む組成物は、周知の従来の方法によって製剤化することができる。これらの医薬組成物は、好適な用量で対象に投与することができる。
【０１７６】
[0208]投薬レジメンは、主治医および臨床的な要因によって決定されると予想される。医療分野において周知の通り、いずれか１人の患者に対する投薬は、患者のサイズ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の時間および経路、全身の健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物などの多くの要因によって決まる。投与のための特定の投薬量は、体表面積１ｍ２当たり、細胞２×１０７個／ｍ２〜細胞１×１０１０個／ｍ２の範囲であり得る。進行は、定期的な評価によってモニターすることができる。
【０１７７】
[0209]本開示の組成物は、局所的に、または全身に投与することができる。好ましい実施態様において、医薬組成物は、皮下投与され、さらにより好ましい実施態様において静脈内投与される。非経口投与のための製剤としては、滅菌水性または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、例えばオリーブ油、および注射用有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体としては、水、アルコール性／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば生理食塩水および緩衝化培地などが挙げられる。非経口媒体としては、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸リンゲル液、または不揮発性油が挙げられる。静脈内媒体としては、液体および栄養素補充剤、電解質補充液（例えばリンゲルデキストロースをベースとするもの）などが挙げられる。また、例えば、抗微生物剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在していてもよい。加えて、本発明の開示の医薬組成物は、タンパク質様の担体、例えば、血清アルブミンまたは免疫グロブリンなど、好ましくはヒト起源のものを含んでいてもよい。本開示の医薬組成物は、この開示に記載される細胞に加えて、医薬組成物の意図した使用に応じて、さらなる生物活性薬剤を含み得ることが想定される。
【０１７８】
ＩＶ．  [0210]併用療法
[0211]ＨＰＶ抗原に対して生成したＣＴＬに関する本開示の特定の実施態様において、臨床的な形態のための本発明の開示の方法は、過剰増殖性の疾患の処置において有効な他の薬剤、例えば抗がん剤と組み合わされる。「抗がん」剤は、例えば、がん細胞を致死させること、がん細胞においてアポトーシスを誘発させること、がん細胞の増殖速度を低減すること、転移の発生率または数を低減させること、腫瘍サイズを低減すること、腫瘍増殖を阻害すること、腫瘍またはがん細胞への血液供給を低減すること、がん細胞または腫瘍に対する免疫応答を促進すること、がんの進行を防止または阻害すること、またはがんを有する対象の寿命を延長することによって、対象におけるがんに負の影響を与えることが可能である。より一般的には、これらの他の組成物は、細胞を致死させる、または細胞の増殖を阻害するのに有効な組み合わされた量で提供され得る。これは、がん細胞を、両方の薬剤を含む単一の組成物または薬理学的な調合物と接触させることによって、またはがん細胞を２つの別個の組成物または調合物と同時に接触させることによって達成でき、後者の場合、一方の組成物が発現コンストラクトを含み、他方が第２の薬剤を含む。他の場合において、細胞および第２の組成物の投与は、別々であってもよいし、別々の投与経路および／または担体を有していてもよい。
【０１７９】
[0212]腫瘍細胞の化学療法剤および放射線療法剤への耐性は、臨床腫瘍学における主要な問題の一つである。現在のがん研究の１つの目標は、化学および／または放射線療法の効能を、それを追加の療法と組み合わせることによって改善する方法を発見することである。本発明の開示の状況で、細胞療法は、例えば、化学療法、放射線療法および／または免疫治療的介入と協同して同様に使用できることが予期される。
【０１８０】
[0213]代替として、本発明の療法は、数分から数週間、数ヶ月、または数年にわたる範囲のインターバルで、他の薬剤処置の前に行ってもよいし、またはその後に行ってもよい。他の薬剤および本発明が別々に個体に適用される実施態様において、一般的に、送達時間と送達時間との間に、有効な期間が終わらないようにして、薬剤および発明の療法が、それでもなお細胞に対して有利に組み合わされた作用を発揮することが可能になると予想される。このような例において、細胞は、互いに約１２〜２４時間以内に、より好ましくは互いに約６〜１２時間以内に両方の様式で接触させてもよい。一部の状況において、処置のための期間を顕著に延長することが望ましい場合があるが、その場合、それぞれの投与間に、数日（２、３、４、５、６または７日）から数週間（１、２、３、４、５、６、７または８週間）経過させる。
【０１８１】
[0214]処置サイクルは、必要に応じて繰り返されることが期待される。また、本発明の細胞療法と組み合わせて、様々な標準的な療法や外科的介入が適用され得ることも予期される。
【０１８２】
[0215]本開示の方法から生産された細胞と共に使用できるＨＰＶ関連がん処置の例（一例として）としては、少なくとも以下：１）外科手術（腫瘍切除、頸部切開、円錐切除、子宮摘出など）；２）アバスチン（Avastin）（登録商標）（ベバシズマブ）；ブレノキサン（Blenoxane）（ブレオマイシン）；ハイカムチン（Hycamtin）（登録商標）（塩酸トポテカン）；またはそれらの組合せを含み得る薬物療法；３）放射線療法；４）本開示以外の免疫療法；５）ホルモン療法；または６）それらの組合せが挙げられる。
【０１８３】
Ｖ．  [0216]本開示のキット
[0217]本明細書に記載される組成物のいずれかは、キットに含まれていてもよい。非限定的な例において、キット中に、ペプミックスのライブラリーが含まれていてもよく、キット中に、あらゆるタイプの細胞が提供されていてもよく、および／またはキット中に、ペプミックスおよび／または細胞の操作のための試薬が提供されていてもよい。キット中に、サイトカインまたはそれらを生産する手段（例えばそれらをコードするベクター）が含まれていてもよい。細胞培養試薬および／または装置が含まれていてもよい。これらの成分は、好適な容器手段中に提供される。
【０１８４】
[0218]一実施態様において、キットは、好ましくは輸注による対象への投与のために、より好ましくは自己養子細胞免疫療法における輸注による投与のために製剤化された（例えば好適な担体、賦形剤、希釈剤、またはアジュバントとの混合によって）本発明の方法により得られた所定量のＴ細胞を含む容器を含んでいてもよい。キットは、予め決定された温度で、例えば約４℃未満、約−２℃未満、または約−５０℃未満の温度で維持することができる。キットは、キットの貯蔵および／もしくは輸送に関する、ならびに／またはＴ細胞の投与に関する説明書をさらに含んでいてもよい。
【０１８５】
[0219]キットは、好適に等分した本発明の組成物を含んでいてもよい。キットの成分は、水性媒体、または凍結乾燥形態のいずれかでパッケージ化されてもよい。キットの容器手段は、一般的に、成分を入れて、好ましくは好適に等分することができる、少なくとも１つのバイアル、試験管、フラスコ、ボトル、シリンジまたは他の容器手段を含むと予想される。キット中に１つより多くの成分が存在する場合、キットはまた、一般的に、追加の成分を別々に入れることができる第２、第３または他の追加の容器も含有すると予想される。しかしながら、成分の様々な組合せがバイアル中に含まれていてもよい。本発明のキットはまた、典型的には、商業的な販売のために厳重に閉じ込めた状態で成分を含有するための手段も含むと予想される。このような容器としては、望ましいバイアルがその中に保持された、射出または吹込成形されたプラスチック容器が挙げられる。
【０１８６】
[0220]しかしながら、キットの成分は、乾燥粉末として提供されてもよい。試薬および／または成分が乾燥粉末として提供される場合、粉末は、好適な溶媒の添加によって再構成することができる。また溶媒は、別の容器手段に提供され得ることも想定される。
【０１８７】
[0221]一部の場合において、キット中に、ＨＰＶ感染を検出するための試薬および／またはデバイスが含まれていてもよい。その例としては、スワブ、へら、細胞採取用ブラシ、スライド、カバースライド、細胞学的サンプルの収集貯蔵装置などが挙げられる。キット中に、ベバシズマブ；ブレオマイシン；塩酸トポテカン；またはそれらの組合せなどの、ＨＰＶ感染またはがんのための追加の薬物が含まれていてもよい。
【０１８８】
ＶＩ．  [0222]高ＩＬ−１５
[0223]本発明の開示の形態の一部の実施態様において、刺激は、ＩＬ−１５の存在下で実行される。一部の実施態様において、刺激は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で実行される。一部の実施態様において、刺激は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５のみの存在下で実行される。一部の実施態様において、刺激は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ＩＬ−６および／またはＩＬ−１２の非存在下で実行される。
【０１８９】
[0224]刺激がＩＬ−１５の存在下で実行される本発明の開示の実施態様において、ＩＬ−１５は、１５ｎｇ／ｍｌより高い最終濃度で培養物中に存在していてもよい。１５ｎｇ／ｍｌより高い最終的なＩＬ−１５濃度は、本明細書で、高ＩＬ−１５と言及される場合がある。一部の実施態様において、ＩＬ−１５は、２０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、２０〜９００ｎｇ／ｍｌ、２０〜８００ｎｇ／ｍｌ、２０〜７００ｎｇ／ｍｌ、２０〜６００ｎｇ／ｍｌ、２０〜５００ｎｇ／ｍｌ、３０〜５００ｎｇ／ｍｌ、４０〜５００ｎｇ／ｍｌ、５０〜５００ｎｇ／ｍｌ、５０〜４００ｎｇ／ｍｌ、５０〜３００ｎｇ／ｍｌ、５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、５０〜１７５ｎｇ／ｍｌ、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌ、７５〜１５０ｎｇ／ｍｌ、７５〜１２５ｎｇ／ｍｌ、８０〜１２０ｎｇ／ｍｌ、９０〜１１０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。高ＩＬ−１５を使用した刺激は、特定には、ＨＰＶ特異的な免疫細胞の集団がＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させた細胞（例えば血液細胞、免疫細胞またはＰＢＭＣ）の集団内から生成／拡大される方法と関連して企図される。
【０１９０】
[0225]高ＩＬ−１５を使用した刺激は、有利な特性を提供することができる。例えば、高ＩＬ−１５を使用した刺激を含む方法は、改善された効率（例えば同じ期間内でより大きい拡大倍率）でＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するのに有用であり得る。高ＩＬ−１５を使用した刺激を含む方法は、先行技術の方法に従って生成／拡大された集団と比較して、生成／拡大された集団における、低減された数／頻度の望ましくない免疫細胞のサブセット（例えばＮＫ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および／またはナイーブＴ細胞）、増加した比率／頻度の望ましい免疫細胞のサブセット（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、ＩＦＮγ産生細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、抗原を経験したＴ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞）、および／または増加した比率／頻度のウイルスおよび／または抗原特異的な細胞を含む、ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するのに有用であり得る。
【０１９１】
ＶＩＩ．  [0226]ＨＬＡ陰性ＬＣＬ
[0227]本発明の開示の形態において、本明細書に記載される刺激工程で使用される共刺激細胞は、ＭＨＣクラスＩおよび／またはＭＨＣクラスＩＩの遺伝子および／またはタンパク質発現が欠如したリンパ芽球様細胞株（ＬＣＬ）の細胞であり得る。一部の実施態様において、ＬＣＬは、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの表面発現が欠如していてもよく、このようなＬＣＬは、本明細書で、「ＨＬＡ陰性ＬＣＬ」、「ユニバーサルＬＣＬ」または「ＵＬＣＬ」と言及される場合がある。
【０１９２】
[0228]ＬＣＬは、Ｂ細胞のウイルス形質転換によって調製することができる。ＬＣＬは、典型的には、Ｂ細胞のエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）での形質転換によって生産される。ＬＣＬの生成および特徴は、例えば、両方とも参照によりその全体が本明細書に組み入れられるHui-Yuenら、J Vis Exp (2011) 57: 3321、およびHussainおよびMulherkar、Int J Mol Cell Med (2012) 1(2): 75〜87で詳細に説明されている。簡単に言えば、ＬＣＬは、シクロスポリンＡの存在下で、ＰＢＭＣを、ＥＢＶを生産する細胞、例えばＢ９５〜８細胞の濃縮した細胞培養上清と共にインキュベートすることによって生産することができる。
【０１９３】
[0229]ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＭＨＣクラスＩポリペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩポリペプチドの表面発現が欠如していてもよい。「ＭＨＣクラスＩポリペプチド」は、ＭＨＣクラスＩ分子（すなわちＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチドおよびＢ２Ｍポリペプチドのポリペプチド複合体）の構成成分であるポリペプチドを指す。「ＭＨＣクラスＩＩポリペプチド」は、ＭＨＣクラスＩＩ分子（すなわちＭＨＣクラスＩＩα鎖ポリペプチドおよびＭＨＣクラスＩＩβ鎖ポリペプチドのポリペプチド複合体）の構成成分であるポリペプチドを指す。表面発現は、細胞表面（すなわち細胞膜中または細胞膜上）で検出可能な関連するポリペプチド／ポリペプチド複合体の発現を指す。表面発現は、ポリペプチド／ポリペプチド複合体が細胞表面で発現される場合、例えば無傷細胞上で、細胞に対して細胞外のポリペプチド／ポリペプチド複合体の領域に特異的な抗原結合分子を使用して分析することができる。
【０１９４】
[0230]一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、例えば遺伝子および／またはタンパク質発現を検出するための適切な方法によって決定した場合、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの遺伝子／タンパク質発現を実質的に呈示しない。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、例えば、ＭＨＣクラスＩに結合することが可能な抗体およびＭＨＣクラスＩＩに結合することが可能な抗体を使用したフローサイトメトリーによる分析によって決定した場合、ＭＨＣクラスＩおよびＭＨＣクラスＩＩの表面発現を実質的に呈示しない。このようなアッセイにおいて、関連抗体によるＨＬＡ陰性ＬＣＬの染色のレベルは、同じアイソタイプの適切な陰性対照抗体による細胞の染色のレベルより有意に大きい可能性がある。
【０１９５】
[0231]ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＭＨＣクラスＩ分子およびＭＨＣクラスＩ分子（例えばＢ２Ｍポリペプチド、ＭＨＣクラスＩα鎖ポリペプチド（例えばＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢまたはＨＬＡ−Ｃ）、ＭＨＣクラスＩＩα鎖ポリペプチド（例えばＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２またはＨＬＡ−ＤＲＡ）、ならびに／またはＭＨＣクラスＩＩβ鎖ポリペプチド（例えばＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ２、ＨＬＡ−ＤＲＢ１、ＨＬＡ−ＤＲＢ３、ＨＬＡ−ＤＲＢ４またはＨＬＡ−ＤＲＢ５））のうちの１つまたはそれより多くのポリペプチドの遺伝子および／またはタンパク質発現を低減／防止するための改変（例えば例えば１つまたはそれより多くのヌクレオチドの挿入、置換または欠失による核酸への改変）により得られたものでもよい。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、未改変ＬＣＬによる遺伝子および／またはタンパク質発現と比較して、ＭＨＣクラスＩポリペプチド（例えばＢ２Ｍ）の遺伝子および／またはタンパク質発現を低減／防止するための改変、ならびに１つまたはそれより多くのＭＨＣクラスＩＩポリペプチド（例えばＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰ）の遺伝子および／またはタンパク質発現を低減／防止するための改変を含む。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、およびＨＬＡ−ＤＰの遺伝子および／またはタンパク質発現を低減／防止するための改変を含む。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、例えば配列特異的ヌクレアーゼ（ＳＳＮ）を使用した、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、およびＨＬＡ−ＤＰをコードする遺伝子の標的化されたノックアウトにより得てもよい。ＳＳＮを使用する遺伝子編集は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み入れられるEidおよびMahfouz、Exp Mol Med. 2016 Oct; 48(10): e265で総論されている。一部の実施態様において、ＭＨＣクラスＩポリペプチド（例えばＢ２Ｍ）の遺伝子および／またはタンパク質発現を低減／防止するための改変、および／または１つまたはそれより多くのＭＨＣクラスＩＩポリペプチド（例えばＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＱ、およびＨＬＡ−ＤＰ）の遺伝子および／またはタンパク質発現を低減／防止するための改変は、関連するポリペプチドをコードするｃｒＲＮＡ標的化核酸を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９系を使用して達成される。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、Ｂ２Ｍ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＱＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ２、およびＨＬＡ−ＤＰをコードする遺伝子の逐次的なノックアウトによって得られる。[0232]一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは加えて、ＥＢＶ複製／感染に必要な１つまたはそれより多くのポリペプチドをコードする核酸に対する改変を含む。ＥＢＶ複製／感染を低減／防止するための改変を含むＬＣＬは、本明細書では、ＥＢＶ複製欠損型であると記載される場合もある。したがって、一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＥＢＶ複製欠損型である。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、例えばＳＳＮを使用した、ＢＦＬＦ１、ＢＦＬＦ２、ＢＦＲＦ１、ＢＦＲＦ２およびＢＦＲＦ３のうちの１つまたはそれより多くをコードする核酸に対する改変（例えば１つまたはそれより多くのヌクレオチドの挿入、置換または欠失による）を含む。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＢＦＬＦ１をコードする核酸および／またはＢＦＲＦ１をコードする核酸に対する改変を含む。一部の実施態様において、改変は、関連するポリペプチドをコードするｃｒＲＮＡ標的化核酸を含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−９系を使用して達成される。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ウイルス複製を抑制する薬剤（例えばアシクロビル）の存在下における培養を含む方法によって得られる。一部の実施態様において、ＥＢＶ複製欠損型ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＰＢＭＣと先行技術に記載されるＬＣＬとの共培養後のＰＢＭＣの集団内からのＢ細胞の増殖のレベルと比較してより低い程度で、ＰＢＭＣとの共培養後のＰＢＭＣの集団内からのＢ細胞の増殖を刺激する。一部の実施態様において、ＥＢＶ複製欠損型ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＰＢＭＣとの共培養においてＢ細胞の成長を促進する能力を欠如している。ＥＢＶ複製に必要な１つまたはそれより多くのポリペプチドの遺伝子および／またはタンパク質発現を低減／防止するように改変されたＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＥＢＶ複製に必要な１つまたはそれより多くのポリペプチドの遺伝子および／またはタンパク質発現を低減／防止するための改変が欠失したＬＣＬと比較して、改善された安全性プロファイルを有し得る。
【０１９６】
[0232]本発明の開示のＨＬＡ陰性ＬＣＬは、典型的に共刺激細胞がウイルス特異的なＴ細胞を生成／拡大するための方法で採用されるようにして、共刺激細胞として採用される。例えば、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、放射線照射した細胞集団として、レスポンダー細胞および抗原提示細胞（ＡＰＣ）に対して適切な比率で提供することができる。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、刺激において使用する前に、それらの増殖を防止するために放射線照射されているか、または物質（例えばマイトマイシンＣ）で処置されている。本発明の方法によるＬＣＬの放射線照射は、典型的には、６０００〜１２０００ｒａｄでなされる。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、１：１：１〜１：１：１０のうち１つ、例えば約１：１：５のレスポンダー細胞：ＡＰＣ：ＨＬＡ陰性ＬＣＬの比率で、レスポンダー細胞、ＡＰＣおよびＨＬＡ陰性ＬＣＬを含む刺激下で存在する。
【０１９７】
[0233]本明細書に記載されるＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＨＰＶ特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するための方法における共刺激細胞としてのそれらの使用に関連する有利な特性を提供することができる。例えば、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、改善された効率（例えば同じ期間内でより大きい拡大倍率）でＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するのに有用であり得る。ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、先行技術の方法に従って生成／拡大された集団と比較して、生成／拡大された集団における、低減された数／頻度の望ましくない免疫細胞のサブセット（例えばＮＫ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および／またはナイーブＴ細胞）、増加した比率／頻度の望ましい免疫細胞のサブセット（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、ＩＦＮγ産生細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、抗原を経験したＴ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞）、および／または増加した比率／頻度のウイルスおよび／または抗原特異的な細胞を含む、ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するための方法において有用であり得る。
【０１９８】
[0234]ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＨＰＶ特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するための先行技術の方法と比較して低減したアロ反応性を有するＨＰＶ特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するのに有用である。したがって、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、自己の適用と同種の適用の両方で使用するためのＨＰＶ特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するのに有用である。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、同種のドナーから得られたＨＬＡ陰性ＬＣＬおよびＰＢＭＣを含む共培養におけるＰＢＭＣの増殖を、ＨＬＡ陽性ＬＣＬ（すなわち先行技術に記載されるＬＣＬ）と比較してより低い程度で刺激する。一部の実施態様において、ＨＬＡ陰性ＬＣＬは、ＨＬＡ適合のドナーから得られたＨＬＡ陰性ＬＣＬおよびＰＢＭＣを含む共培養におけるＰＢＭＣの増殖を、ＨＬＡ陽性ＬＣＬと比較してより低い程度で刺激する。
【０１９９】
ＶＩＩＩ．  [0235]樹状細胞
[0236]本発明の開示の形態において、本明細書に記載される刺激工程で使用される樹状細胞は、対象から得られた血液細胞の集団内の細胞由来であってもよい。一部の実施態様において、樹状細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の集団内の細胞由来である。一部の実施態様において、樹状細胞は、ＰＢＭＣの集団内のＣＤ１４＋陽性細胞由来である。一部の実施態様において、樹状細胞は、単球由来の樹状細胞（本明細書ではｍｏＤＣとも称される）である。
【０２００】
[0237]一部の実施態様において、樹状細胞は、他の細胞（すなわちＣＤ１４−細胞）から、例えばＰＢＭＣの集団内からＣＤ１４＋細胞を分離することを含むプロセスによって得られる。分離は、適切な陽性または陰性選択によって実行することができる。一部の実施態様において、ＣＤ１４＋陽性細胞は、ＣＤ１４に特異的に結合することが可能な抗体でコーティングされたビーズを使用して、細胞の集団内から陽性選択することができる。例えば、ＣＤ１４＋細胞は、ＣＤ１４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク）を使用するＭＡＣＳ細胞分離によって単離してもよい。
【０２０１】
[0238]一部の実施態様において、樹状細胞は、ＣＤ１４＋細胞からの未成熟樹状細胞（本明細書ではｉＤＣとも称される）の分化を促進する因子の存在下で細胞を培養することを含むプロセスによって得られる。ｉＤＣの分化を促進する因子の存在下で培養された細胞は、例えば、ＰＢＭＣ、またはＰＢＭＣの集団から単離されたＣＤ１４＋細胞であり得る。細胞は、あらゆる好適な密度で、例えば、細胞０．１×１０６〜１×１０６個／ｍｌ、細胞０．２×１０６〜０．９×１０６個／ｍｌ、細胞０．３×１０６〜０．８×１０６個／ｍｌ、細胞０．４×１０６〜０．７×１０６個／ｍｌまたは細胞０．５×１０６個／ｍｌのうち１つの密度で培養されてもよい。未成熟樹状細胞の分化を促進する因子としては、ＩＬ−４および／またはＧＭ−ＣＳＦを挙げることができる。一部の実施態様において、培養物は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含む。ＩＬ−４は、５０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１００〜８００ＩＵ／ｍｌ、１５０〜７００ＩＵ／ｍｌ、２００〜６００ＩＵ／ｍｌ、２５０〜５００ＩＵ／ｍｌ、３００〜５００ＩＵ／ｍｌまたは４００ＩＵ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ＧＭ−ＣＳＦは、１００〜１５００ＩＵ／ｍｌ、２００〜１４００ＩＵ／ｍｌ、３００〜１３００ＩＵ／ｍｌ、４００〜１２００ＩＵ／ｍｌ、５００〜１１００ＩＵ／ｍｌ、６００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、７００〜９００ＩＵ／ｍｌまたは８００ＩＵ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。培養は、未成熟ＤＣの分化にとって好適なあらゆる期間にわたり、例えば１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日または１０日のうちいずれかの期間にわたりなされてもよい。
【０２０２】
[0239]一部の実施態様において、本明細書に記載される刺激工程で使用される樹状細胞は、細胞（すなわち成熟樹状細胞の前駆細胞、例えば未成熟樹状細胞）を成熟樹状細胞まで培養することを含むプロセスによって得られる。一部の実施態様において、プロセスは、成熟ＤＣ（例えばｍｏＤＣ）の分化を促進する因子の存在下で細胞を培養することを含む。成熟ＤＣの分化を促進する因子の存在下で培養された細胞は、例えば、ＰＢＭＣの集団、または未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）から単離された（すなわち分離および／または精製された）ＰＢＭＣ、ＣＤ１４＋細胞であり得る。細胞は、あらゆる好適な密度で、例えば、細胞０．１×１０６〜１×１０６個／ｍｌ、細胞０．２×１０６〜０．９×１０６個／ｍｌ、細胞０．３×１０６〜０．８×１０６個／ｍｌ、細胞０．４×１０６〜０．７×１０６個／ｍｌまたは細胞０．５×１０６個／ｍｌのうち１つの密度で培養されてもよい。成熟ＤＣへの未成熟樹状細胞の分化を促進する因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＰＧＥ−１、ＣＤ４０Ｌ、ポリ（Ｉ：Ｃ）、ＭＰＬＡ、レシキモド、ＩＦＮα、ＩＦＮγまたはＡｍｐＢのうちの１つまたはそれより多くであり得る。一部の実施態様において、培養物は、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＰＧＥ−１を含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６およびＴＮＦαを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＰＧＥ−１およびＣＤ４０Ｌを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＰＧＥ−１およびポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびポリ（Ｉ：Ｃ）を含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＰＧＥ−１およびＭＰＬＡを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＭＰＬＡを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＰＧＥ−１およびレシキモドを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびレシキモドを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＰＧＥ−１およびＩＦＮαを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＦＮαを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＰＧＥ−１およびＩＦＮγを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＩＦＮγを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＰＧＥ−１、ＩＦＮαおよびＩＦＮγを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＩＦＮαおよびＩＦＮγを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ＰＧＥ−１、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびＭＰＬＡを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦα、ポリ（Ｉ：Ｃ）およびＭＰＬＡを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＰＬＡおよびＩＦＮγを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮαを含む。一部の実施態様において、培養物は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＦＮγおよびＡｍｐＢを含む。ＩＬ−４は、５０〜１０００ＩＵ／ｍｌ、１００〜８００ＩＵ／ｍｌ、１５０〜７００ＩＵ／ｍｌ、２００〜６００ＩＵ／ｍｌ、２５０〜５００ＩＵ／ｍｌ、３００〜５００ＩＵ／ｍｌまたは４００ＩＵ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ＧＭ−ＣＳＦは、１００〜１５００ＩＵ／ｍｌ、２００〜１４００ＩＵ／ｍｌ、３００〜１３００ＩＵ／ｍｌ、４００〜１２００ＩＵ／ｍｌ、５００〜１１００ＩＵ／ｍｌ、６００〜１０００ＩＵ／ｍｌ、７００〜９００ＩＵ／ｍｌまたは８００ＩＵ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ＩＬ−１βは、１〜１００ｐｇ／ｍｌ、１〜７５ｐｇ／ｍｌ、５〜５０ｐｇ／ｍｌ、５〜４０ｐｇ／ｍｌ、５〜３０ｐｇ／ｍｌ、５〜２５ｐｇ／ｍｌ、５〜２０ｐｇ／ｍｌ、５〜１５ｐｇ／ｍｌまたは１０ｐｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ＩＬ−６は、１０〜１０００ｐｇ／ｍｌ、１０〜７５０ｐｇ／ｍｌ、５０〜５００ｐｇ／ｍｌ、５０〜４００ｐｇ／ｍｌ、５０〜３００ｐｇ／ｍｌ、５０〜２５０ｐｇ／ｍｌ、５０〜２００ｐｇ／ｍｌ、５０〜１５０ｐｇ／ｍｌまたは１００ｐｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ＴＮＦαは、１〜１００ｐｇ／ｍｌ、１〜７５ｐｇ／ｍｌ、５〜５０ｐｇ／ｍｌ、５〜４０ｐｇ／ｍｌ、５〜３０ｐｇ／ｍｌ、５〜２５ｐｇ／ｍｌ、５〜２０ｐｇ／ｍｌ、５〜１５ｐｇ／ｍｌまたは１０ｐｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ＰＧＥ−１は、０．１〜１０ｎｇ／ｍｌ、０．１〜７．５ｎｇ／ｍｌ、０．５〜５ｎｇ／ｍｌ、０．５〜４ｎｇ／ｍｌ、０．５〜３ｎｇ／ｍｌ、０．５〜２．５ｎｇ／ｍｌ、０．５〜２ｎｇ／ｍｌ、０．５〜１．５ｎｇ／ｍｌまたは１ｎｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ＣＤ４０Ｌは、１０〜１０００ｐｇ／ｍｌ、１０〜７５０ｐｇ／ｍｌ、５０〜５００ｐｇ／ｍｌ、５０〜４００ｐｇ／ｍｌ、５０〜３００ｐｇ／ｍｌ、５０〜２５０ｐｇ／ｍｌ、５０〜２００ｐｇ／ｍｌ、５０〜１５０ｐｇ／ｍｌまたは１００ｐｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ポリ（Ｉ：Ｃ）は、０．１〜１０μｇ／ｍｌ、０．１〜７．５μｇ／ｍｌ、０．５〜５μｇ／ｍｌ、０．５〜４μｇ／ｍｌ、０．５〜３μｇ／ｍｌ、０．５〜２．５μｇ／ｍｌ、０．５〜２μｇ／ｍｌ、０．５〜１．５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ＭＰＬＡは、０．１〜１０μｇ／ｍｌ、０．１〜７．５μｇ／ｍｌ、０．５〜５μｇ／ｍｌ、０．５〜４μｇ／ｍｌ、０．５〜３μｇ／ｍｌ、０．５〜２．５μｇ／ｍｌ、０．５〜２μｇ／ｍｌ、０．５〜１．５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。レシキモドは、０．１〜１０μｇ／ｍｌ、０．１〜７．５μｇ／ｍｌ、０．５〜５μｇ／ｍｌ、０．５〜４μｇ／ｍｌ、０．５〜３μｇ／ｍｌ、０．５〜２．５μｇ／ｍｌ、０．５〜２μｇ／ｍｌ、０．５〜１．５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ＩＦＮαは、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１０〜７５０ｎｇ／ｍｌ、５０〜５００ｎｇ／ｍｌ、５０〜４００ｎｇ／ｍｌ、５０〜３００ｎｇ／ｍｌ、５０〜２５０ｎｇ／ｍｌ、５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ＩＦＮγは、１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、１０〜７５０ｎｇ／ｍｌ、５０〜５００ｎｇ／ｍｌ、５０〜４００ｎｇ／ｍｌ、５０〜３００ｎｇ／ｍｌ、５０〜２５０ｎｇ／ｍｌ、５０〜２００ｎｇ／ｍｌ、５０〜１５０ｎｇ／ｍｌまたは１００ｎｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。ＡｍｐＢは、０．１〜１０μｇ／ｍｌ、０．１〜７．５μｇ／ｍｌ、０．５〜５μｇ／ｍｌ、０．５〜４μｇ／ｍｌ、０．５〜３μｇ／ｍｌ、０．５〜２．５μｇ／ｍｌ、０．５〜２μｇ／ｍｌ、０．５〜１．５μｇ／ｍｌまたは１μｇ／ｍｌのうち１つの最終濃度で培養物中に存在していてもよい。培養は、成熟ＤＣの分化にとって好適なあらゆる期間にわたり、例えば６時間〜５日、１２時間〜４日、１２時間〜７２時間、１２時間〜４８時間、１２時間〜３６時間、または２４時間のうちいずれかの期間にわたりなされてもよい。一部の実施態様において、刺激で使用される樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌの存在下で、未成熟ＤＣを培養することを含むプロセスによって得られる。一部の実施態様において、刺激で使用される樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＰＬＡおよびＩＦＮγの存在下で、未成熟ＤＣを培養することを含むプロセスによって得られる。
【０２０３】
[0240]本明細書に記載される方法による培養により得られた樹状細胞は、先行技術で開示された方法による培養により得られた樹状細胞と比較して、ＣＤ８０および／またはＣＤ８３のより多く表面発現を呈示し得る。本明細書に記載される方法による培養により得られた樹状細胞の集団は、先行技術で開示された方法による培養により得られた樹状細胞の集団と比較して、より高い比率のＣＤ８０および／またはＣＤ８３の表面発現を呈示する細胞を含んでいてもよい。
【０２０４】
[0241]本明細書に記載される方法による培養により得られた樹状細胞は、ＨＰＶ特異的な免疫細胞を拡大するための方法における抗原提示細胞（ＡＰＣ）としてのそれらの使用に関連する有利な特性を提供することができる。例えば、ＤＣは、改善された効率（例えば同じ期間内でより大きい拡大倍率）でＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するのに有用であり得る。本明細書に記載される方法による培養により得られたＤＣは、先行技術の方法に従って生成／拡大された集団と比較して、生成／拡大された集団における、低減された数／頻度の望ましくない免疫細胞のサブセット（例えばＮＫ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および／またはナイーブＴ細胞）、増加した比率／頻度の望ましい免疫細胞のサブセット（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、ＩＦＮγ産生細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、抗原を経験したＴ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞）、および／または増加した比率／頻度のウイルスおよび／または抗原特異的な細胞を含む、ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するための方法において有用であり得る。
【０２０５】
ＶＩＩＩ．  [0242]ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇
[0243]本発明の開示の形態において、ＨＰＶ特異的な免疫細胞の集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞（すなわちＣＤ４５ＲＡ−細胞集団）を枯渇させた細胞（例えば血液細胞、免疫細胞またはＰＢＭＣ）の集団から生成／拡大される。一部の実施態様において、ＨＰＶ特異的な免疫細胞の集団は、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させたＰＢＭＣの集団から生成／拡大される。一部の実施態様において、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇は、  他の細胞（すなわちＣＤ４５ＲＡ＋細胞）からのＣＤ４５ＲＡ−細胞の分離によって達成することができる。分離は、適切な陽性または陰性選択によって実行することができる。一部の実施態様において、ＣＤ４５ＲＡ−細胞は、ＣＤ４５ＲＡに特異的に結合することが可能な抗体でコーティングされたビーズを使用して、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞から分離することができる。例えば、ＣＤ４５ＲＡ−細胞は、ＣＤ４５ＲＡマイクロビーズ（ミルテニーバイオテク）を使用するＭＡＣＳ細胞分離によって、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞から分離することができる。一部の実施態様において、細胞の集団は、加えて、ＣＤ１４＋細胞を枯渇させていてもよい。
【０２０６】
[0244]ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇は、ＮＫ細胞、Ｔｒｅｇおよび／またはナイーブＴ細胞を除去して、本発明の開示による刺激中のこれらの細胞型の実質的な成長を防止することができる。ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇はまた、最初の細胞の集団においてＣＤ４５ＲＯ＋細胞および／または抗原を経験したＴ細胞も高濃度化して、本発明の開示による刺激において、これらの望ましい細胞型の優先的な拡大を促進することことができる。
【０２０７】
[0245]一部の実施態様において、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇は、特に１回またはそれより多くの刺激においてＩＬ−７およびＩＬ−１５を採用する方法において、特定には高濃度の（すなわち１５ｎｇ／ｍｌより高い濃度、例えば約１００ｎｇ／ｍｌの）ＩＬ−１５が使用される場合に予期され、これはなぜなら、このような方法は、ＮＫ細胞成長の問題を特に受けやすい可能性があるためである。拡大で使用される初発の細胞の集団からのＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇はまた、特定にはＨＰＶ特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するための方法でＫ５６２ｃｓ共刺激細胞を採用する方法において、および／またはＨＰＶ特異的な免疫細胞が、患者、例えばＨＰＶ関連疾患を有する患者から得られた免疫細胞（例えばＰＢＭＣ）の集団から拡大される方法においても予期される。
【０２０８】
[0246]ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させた細胞（例えば血液細胞、免疫細胞またはＰＢＭＣ）の集団内からのＨＰＶ特異的な免疫細胞の集団の生成／拡大は、ＨＰＶ特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するための先行技術の方法を超える利点を提供することができる。例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させた免疫細胞集団は、改善された効率（例えば同じ期間内でより大きい拡大倍率）でＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するのに有用であり得る。ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させた免疫細胞集団（例えばＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させたＰＢＭＣ）は、先行技術の方法に従って生成／拡大された集団と比較して、生成／拡大された集団における、低減された数／頻度の望ましくない免疫細胞のサブセット（例えばＮＫ細胞、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および／またはナイーブＴ細胞）、増加した比率／頻度の望ましい免疫細胞のサブセット（例えばＣＤ８＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞、ＩＦＮγ産生細胞、メモリーＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、抗原を経験したＴ細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞）、および／または増加した比率／頻度のウイルスおよび／または抗原特異的な細胞を含む、ＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団を生成／拡大するための方法において有用であり得る。
【０２０９】
ＩＸ．  [0247]同種および自己の適用
[0248]本明細書で開示された方法は、自己の適用と同種の適用の両方で、例えば細胞免疫療法で使用するためのＨＰＶ特異的な免疫細胞を生成／拡大する状況において予期される。本明細書で開示された方法により調製されたＨＰＶに特異的な免疫細胞の集団は、それらの生成／拡大の後に使用してもよいし、または後の日付での使用のために凍結してもよい。
【０２１０】
[0249]一部の実施態様において、ＨＰＶに特異的な免疫細胞の生成／拡大された集団は、集団を生成／拡大する最初の免疫細胞の集団を得た／誘導した対象において使用するために調製される。一部の実施態様において、ＨＰＶに特異的な免疫細胞の生成／拡大された集団は、あらゆる対象、例えば、集団を生成／拡大する最初の免疫細胞の集団を得た／誘導した対象と異なる対象との使用のために調製される。
【０２１１】
[0250]したがって、一部の実施態様において、ＨＰＶに特異的な免疫細胞の生成／拡大された集団は、集団を生成／拡大する最初の免疫細胞の集団を得た／誘導した対象に養子移入される。一部の実施態様において、ＨＰＶに特異的な免疫細胞の生成／拡大された集団は、集団を生成／拡大する最初の免疫細胞の集団を得た／誘導した対象と異なる対象に養子導入される。
【０２１２】
実施例
[0251]以下の実施例は、本発明の好ましい実施態様をより詳細に例示するために提示される。しかしながら、それらは、本発明の広範な範囲を限定するものとして決して解釈されないものとする。
【実施例１】
【０２１３】
治療的Ｔ細胞の生産
[0252]本開示の一部の実施態様において、致命的であり得る１つまたはそれより多くのヒトパピローマウイルス由来の様々な抗原に一貫して特異的なポリクローナル（例えば、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋）ＣＴＬを含むＴ細胞の単一の調製物を迅速に生成できるメカニズムがある。本開示は、臨床的な実施に容易に適合させることができ、「既製品の」ＨＰＶ抗ウイルス剤として使用することができる。本方法および組成物は、臨床的な実施に容易に適合させることができ、個体にとって安全で有効なＨＰＶ抗ウイルス剤として有用である。
【０２１４】
[0253]具体的な実施態様において、末梢血Ｔ細胞を、特定のアクセサリーサイトカインの存在または非存在下で、Ｅ６／Ｅ７にわたるペプミックス［１１個のアミノ酸（ａａ）がオーバーラップする１５−ｍｅｒのペプチドのライブラリー］で負荷された単球由来の樹状細胞で刺激した。得られたＴ細胞株を、ペプミックスが負荷された活性化Ｂ細胞ブラストと共にさらに拡大した。１６人中８人の子宮頸がん患者および５２人中３３人の中咽頭がん患者から、Ｅ６特異的／Ｅ７特異的なＴ細胞がうまく再活性化および拡大された（＞１２００倍）。
【０２１５】
[0254]サイトカインであるインターロイキン（ＩＬ）−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、およびＩＬ−１５の存在は、本方法において、本方法の具体的な実施態様において、有用である。生産されたＴ細胞株は、ポリクローナル性、複数のＴ細胞サブセットの存在（メモリー区画を含む）およびＴＨ１バイアスの望ましい特徴を有し、Ｅ６／Ｅ７標的を排除する。本開示は、ＨＰＶ１６関連がんを有する患者からＨＰＶ１６  Ｅ６／Ｅ７指向性Ｔ細胞株をロバストに生成することが可能であることを示した。この技術はスケーラブルであり、適正製造基準に準拠していることから、これらの株は、ＨＰＶ１６がんを有する患者の養子細胞免疫療法に有用であり、ＨＰＶ１８がんにも適用することができる。
【０２１６】
[0255]ＨＰＶ１６のためのＴ細胞を生産するための公知の方法は、３人のＨＰＶ関連がん患者の結果（ＨＰＶ１６−ペプミックスのみで負荷されたＤＣによるＰＢＭＣの刺激の後に得られた細胞株で得られた、γＩＦＮ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ）を示す図１Ａで実証されている。図１Ｂにおいて、結果は、第３の個体に加えて、図１Ａにおいて結果が同様に実証された患者のうち２人について示される。図１Ｂは、ＨＰＶ１６−ペプミックスおよびＨＰＶ１８−ペプミックスで負荷されたＤＣによるＰＢＭＣの刺激の後に得られた細胞株のγＩＦＮ  ＥＬＩＳｐｏｔアッセイの結果を示す。ＨＰＶ１６とＨＰＶ１８の両方の抗原に対する反応性を検出することができる（全ての患者が両方の血清型に対して反応性を有するとは限らない）。
【０２１７】
[0256]本方法の特性に関して、特定の場合において、ＤＣは、ＨＰＶ１６−Ｅ６／Ｅ７およびＨＰＶ１８−Ｅ６／Ｅ７ペプミックスライブラリーで負荷される。このような場合、細胞株は、ＨＰＶ１６およびＨＰＶ１８のＥ６およびＥ７抗原の両方（例えば、ＨＰＶ１６抗原のみの代わりに）を認識することができる。少なくとも特定の場合、Ｔ細胞の拡大は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ただしＩＬ−２の非存在下で行われる。本方法の条件におけるＩＬ−７およびＩＬ−１５は、刺激および拡大の各工程で存在していてもよいし、またはそうでなくてもよい。一部の実施態様において、ＤＣでの最初の生成／拡大後のＨＰＶ特異的なＴ細胞の拡大は、ＩＬ−１５の存在下でペプミックスで負荷された自己Ｂ−ブラストを伴わずに行われるが、その代わりに、共刺激細胞（ＣＤ８０／ＣＤ８６／ＣＤ８３／４−１ＢＢＬ）、ならびにＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下でペプミックスで負荷された自己ポリクローナル活性化Ｔ細胞を利用する。これらの条件を採用して、Ｔ細胞の拡大は、公知の方法により達成される速度の少なくとも１０倍のより迅速な速度で行われ、３回の刺激の後に、特異性を損なうことなく成功が実証された。
【０２１８】
[0257]表２に、３人のＨＰＶ関連がん患者での公知の方法を使用した細胞拡大の倍率の要約を提供する。
【０２１９】
【表２】
2021511805.tif 000004
【０２２０】
[0258]表３に、３人のＨＰＶ関連がん患者での本開示の新規の方法を使用した細胞拡大の倍率の要約を示す。３回の刺激後の拡大倍率は、公知の方法を使用した場合より平均しておよそ５０倍大きい。特異性は維持される（番号１で例示される）。
【０２２１】
【表３】
2021511805.tif 000005
【実施例２】
【０２２２】
ＨＰＶ  Ｔ細胞の拡大のためのプロトコール
[0259]ＨＰＶで刺激されたＴ細胞（ＨＰＶＳＴ）をまず、１０〜２０：１のＰＢＭＣ：ＤＣの比率で、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ペプチドパルス化自己樹状細胞（ＤＣ）によって活性化し、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する培養培地中で８日間培養する（例えばRamosら（J Immunother 2013;36:66〜76）によって記載された第１の刺激工程に従って）。
【０２２３】
[0260]９日目における第２の刺激工程を、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中で、５〜１０：１のＰＢＭＣ：ＤＣの比率で、ペプチドパルス化ＤＣを使用して行う。
【０２２４】
[0261]次いで、それに続く週１回の刺激／拡大工程を実行して、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ペプチドパルス化自己Ｔ−ＡＰＣを１：１の比率で使用して、等しい数の放射線照射した同種のＫ５６２−ｃｓ共刺激細胞の存在下で、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中で、望ましい数のＨＰＶＳＴを得る。ポリクローナルＴ細胞（Ｔ−ＡＰＣ）は、静脈切開による血液から単離された自己ＰＢＭＣの一部を使用して生成される。細胞を、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた細胞培養皿で培養することによって活性化する。次いで細胞を培養して、ＩＬ−２の存在下で２週間拡大する。拡大したＴ−ＡＰＣは、後の使用のために低温保存することができる。Ｔ−ＨＰＶＳＴ再刺激（ＨＰＶＳＴ再刺激の第３のサイクルおよびそれ以降）のためにＡＰＣを使用する２〜３日前に、低温保存した細胞を融解させ、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体でコーティングされた細胞培養皿中で再刺激する。ＨＰＶＳＴ再刺激の日に、Ｔ−ＡＰＣ細胞を回収し、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ペプチドでパルス化し、続いてＨＰＶＳＴの進行中の培養に１：１の比率で添加する。
【実施例３】
【０２２５】
ヒト患者における輸注されたＨＰＶＳＴのインビボでの拡大および持続性
[0262]実施例２から得られたＨＰＶＳＴを、ＴＧＦ−ベータのドミナントネガティブ受容体（ＤＮＲＩＩ）で形質導入した［Fosterら、Antitumor activity of EBV-specific T lymphocytes transduced with a dominant negative TGF-beta receptor. J Immunother.2008;31:500〜505を参照］。
【０２２６】
[0263]ＨＰＶＳＴを２人のヒト患者に投与し、インビボでの拡大および持続性に関して試験した。患者番号１は、広範囲に転移した中咽頭がんを有しており、前の療法を中断していた。患者番号２は、頸部に転移した中咽頭がんを有しており、ニボルマブの併用処置を受けており、以前にニボルマブ単独に対する応答を示さなかった。
【０２２７】
[0264]輸注されたＨＰＶＳＴのインビボでの拡大および持続性を、患者からの末梢血液から単離されたＰＢＭＣにおいて実行されたＤＮＲＩＩ遺伝子に関するｑＰＣＲによって評価した。図２および３におけるデータポイントは、ＨＰＶＳＴ輸注後における重要な輸注後のインターバルを表す。
【０２２８】
[0265]患者番号１において、進行性膨張を観察した（図２）。患者番号２において、拡大は限定的であったが（図３）、６週にＨＰＶＳＴの再輸注に一致するピークを示し、患者は部分的な臨床応答を有していた。ＨＰＶＳＴ輸注の６週間後、患者番号２は、前処置のベースラインと比較して、ＰＥＴスキャンおよび身体検査によって測定された疾患負荷の減少を示した（図４）。
【実施例４】
【０２２９】
ＤＣ成熟の最適化
[0266]血液サンプルを、ヘパリンバキュテイナー中でＥＢＶ反応性ドナーから収集し、ＰＢＭＣを、フィコール密度勾配遠心分離によって血液サンプルから単離した。次いでＣＤ１４マイクロビーズ（ミルテニーバイオテク）を使用して、陽性選択によってＰＢＭＣ内からＣＤ１４＋細胞を単離した。細胞数を数え、ＣＤ１４−細胞集団を凍結し、貯蔵した。[0275]次いでＣＤ１４＋細胞を未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）に分化させた。簡単に言えば、ＣＤ１４＋細胞を、２４ウェルプレートのウェル中で、４００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４および８００ＩＵ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含有するＤＣ細胞培養培地中で、細胞０．５×１０６個／ｍｌの濃度で５日間培養した。
【０２３０】
[0267]次いでｉＤＣを、以下の表４におけるＤＣ細胞培養培地中で２４時間培養することによって１〜２０のうち１つに示される条件に従って成熟ＤＣに成熟させた：
【０２３１】
【表４】
2021511805.tif 000006
【０２３２】
[0268]次いで成熟ＤＣを、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１の発現に関してフローサイトメトリーによって分析した。事前に凍結されたＣＤ１４−画分を融解させ、細胞培養培地中で２４時間静置した。
【０２３３】
[0269]次いで未成熟および成熟ＤＣを、個々のＥＢＶ抗原ペプミックス（ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＢＲＡＦ１またはＥＢＮＡ１）でパルス化し、ペプチドパルス化ＤＣを使用して、自己ＣＤ１４−細胞を、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下での共培養によって９日間刺激した。次いで拡大されたＴ細胞集団を、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯの発現に関してフローサイトメトリーによって、ＩＦＮγに関してＥＢＶペプチド反応性および細胞内染色によって分析した。
【０２３４】
[0270]図５Ａおよび５Ｂは、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１（表４を参照）による培養後の、ドナー１  ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ由来の単球由来ＤＣによるＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１発現を示す。
【０２３５】
[0271]図６Ａおよび６Ｂは、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー１由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＯ発現を示す。拡大されたＴ細胞集団に関して、Ｔ細胞メモリー表現型における大きな差は観察されなかった。
【０２３６】
[0272]図７は、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー１由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られたウイルス特異的なＴ細胞の総数を示す。
【０２３７】
[0273]図８は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー１由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られたＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率を示す。示された頻度は、ＥＢＶペプチド刺激の非存在下で実行された対照条件で得られたバックグラウンドシグナルを引いたものである。
【０２３８】
[0274]図９は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、実験条件１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー１由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られたＥＢＶ抗原反応性ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率を示す。示された頻度は、ＥＢＶペプチド刺激の非存在下で実行された対照条件で得られたバックグラウンドシグナルを引いたものである。ドナー１がＬＭＰ２に強く応答した。
【０２３９】
[0275]図１０は、異なる実験条件下で培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー１由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ウイルス特異的なＴ細胞の総数およびＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬの比率を示す。条件番号５（「ＣＤ４０Ｌ  ｗｏ」）は、条件２（「標準ＰＧＥ」）より良好な性能を示したことが示されたため、それをさらなる評価のための有望な候補として同定した。
【０２４０】
[0276]図１１Ａおよび１１Ｂは、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０による培養後の、ドナー２  ＣＤ１４＋ＰＢＭＣ由来の単球由来ＤＣによるＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１発現を示す。
【０２４１】
[0277]図１２Ａおよび１２Ｂは、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー２由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られたＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞によるＣＣＲ７およびＣＤ４５ＲＯ発現を示す。拡大されたＴ細胞集団に関して、Ｔ細胞メモリー表現型における大きな差は観察されなかった。
【０２４２】
[0278]図１３は、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー２由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られたウイルス特異的なＴ細胞の総数を示す。
【０２４３】
[0279]図１４は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー２由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られたＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率を示す。示された頻度は、ＥＢＶペプチド刺激の非存在下で実行された対照条件で得られたバックグラウンドシグナルを引いたものである。
【０２４４】
[0280]図１５は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、実験条件１、２、３、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー２由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られたＥＢＶ抗原反応性ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率を示す。示された頻度は、ＥＢＶペプチド刺激の非存在下で実行された対照条件で得られたバックグラウンドシグナルを引いたものである。ドナー２がＬＭＰ２に強く応答した。
【０２４５】
[0281]図１６は、異なる実験条件下で培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間のドナー２由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られたウイルス特異的なＴ細胞の総数およびＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬの比率を示す。条件番号１８、１９および２０（「ポリＩＣ  ＭＰＬＡ  ｗｏ」、「ポリＩＣ  ＭＰＬＡ  ＰＧＥ」および「ＭＰＬＡ  ＩＦＮγ」）は、条件２（「標準ＰＧＥ」）より良好な性能を示したことが示されたため、それらをさらなる評価のための有望な候補として同定した。
【０２４６】
[0282]次いで本発明者らは、４つの最も有望なＤＣ成熟条件５、１８、１９および２０（表４を参照）のさらなる調査に着手し、特徴付けを３人の異なるドナー由来の細胞にも行った。
【０２４７】
[0283]図１７Ａおよび１７Ｂは、実験条件１、２、５、１８、１９および２０による培養後の、３人の異なるドナー由来の単球由来ＤＣによる代表的なＣＤ８３、ＣＤ８０、ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１発現を示す。図１７Ｃは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３−ＤＣの比率を示し、図１７Ｄは、ＣＤ８０＋ＣＤ８３＋ＤＣの比率を示し、図１７Ｅは、ＰＤ−Ｌ１＋ＤＣの比率を示す。
【０２４８】
[0284]図１８は、実験条件２、５、１８、１９および２０に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間の３人の異なるドナー由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られたウイルス特異的なＴ細胞の総数を示す。異なる条件下で拡大された成熟ＤＣは、類似した拡大の全体レベルを有していた。
【０２４９】
[0285]図１９は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、実験条件２、５、１８、１９および２０に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間の異なるドナー由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られたＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率を示す。示された頻度は、ＥＢＶペプチド刺激の非存在下で実行された対照条件で得られたバックグラウンドシグナルを引いたものである。
【０２５０】
[0286]図２０は、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、実験条件２、５、１８、１９および２０に従って培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間の異なるドナー由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ＥＢＶ抗原反応性ＩＦＮγ＋ＣＤ８＋ＣＴＬおよびＩＦＮγ＋ＣＤ４＋Ｔｈ細胞の比率を示す。示された頻度は、ＥＢＶペプチド刺激の非存在下で実行された対照条件で得られたバックグラウンドシグナルを引いたものである。
【０２５１】
[0287]図２１は、異なる実験条件下で培養されたＥＢＶペプチドパルス化成熟ＤＣを用いた９日間の３人のドナー由来の自己ＣＤ１４−ＰＢＭＣの刺激後に得られた、ウイルス特異的なＴ細胞の概算の総数およびＩＦＮγ＋Ｔ細胞の概算の頻度を示す。
【０２５２】
[0288]全体として、これらの結果から、ＤＣ成熟の最良の条件は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＴＮＦαおよびＣＤ４０Ｌの存在下における培養であることが示唆された。別の優れた条件は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＭＰＬＡおよびＩＦＮγの存在下における培養である。
【実施例５】
【０２５３】
ＤＣ成熟のさらなる最適化
[0289]血液サンプルを、ヘパリンバキュテイナー中でＥＢＶ反応性ドナーから収集し、ＰＢＭＣを、フィコール密度勾配遠心分離によって血液サンプルから単離する。次いでＣＤ１４＋マイクロビーズを使用して、陽性選択によってＰＢＭＣ内からＣＤ１４＋細胞を単離する。細胞数を数え、ＣＤ１４−細胞集団を凍結し、貯蔵する。
【０２５４】
[0290]次いでＣＤ１４＋細胞を未成熟樹状細胞（ｉＤＣ）に分化させる。簡単に言えば、ＣＤ１４＋細胞を２４ウェルプレートのウェル中で、４００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−４および８００ＩＵ／ｍｌのＧＭ−ＣＳＦを含有するＤＣ細胞培養培地中で、細胞０．５×１０６個／ｍｌの濃度で５日間培養する。
【０２５５】
[0291]次いでｉＤＣを、以下の表５における１、２、２１または２５のうち１つに示される条件に従ってＤＣ細胞培養培地中で２４時間培養することによって成熟ＤＣに成熟させる：
【０２５６】
【表５】
2021511805.tif 000007
【０２５７】
[0292]次いで成熟ＤＣを、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＣＲ７およびＰＤ−Ｌ１の発現に関してフローサイトメトリーによって分析する。事前に凍結されたＣＤ１４−画分を融解させ、細胞培養培地中で２４時間静置する。
【０２５８】
[0293]次いで未成熟および成熟ＤＣを、個々のＥＢＶ抗原ペプミックス（ＬＭＰ１、ＬＭＰ２、ＢＲＡＦ１またはＥＢＮＡ１）でパルス化し、ペプチドパルス化ＤＣを使用して、自己ＣＤ１４−細胞を、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下での共培養によって３日間または９日間刺激する。次いで拡大されたＴ細胞集団を、ＣＣＲ７、ＣＤ４５ＲＯの発現に関してフローサイトメトリーによって、ＩＦＮγに関してＥＢＶペプチド反応性および細胞内染色によって分析する。
【０２５９】
[0294]条件２１および２２に従って成熟させたＤＣは、条件２に従って成熟させたＤＣと比較して有利な特性に関連することが期待される。
【実施例６】
【０２６０】
異なる共刺激細胞の存在下における刺激培養によって拡大されたウイルス特異的なＴ細胞の特徴付け
[0295]本発明者らは次に、ウイルス特異的なＴ細胞の集団を生成／拡大するための方法における刺激での、共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞およびＨＬＡ陰性ＬＣＬ（本明細書ではユニバーサルＬＣＬ（ＵＬＣＬ）とも称される）の使用を調査した。簡単に言えば、ＰＢＭＣを回収し、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下でＥＢＶ抗原（ＥＢＮＡ−１、ＬＭＰ−１、ＬＭＰ−２およびＢＡＲＦ−１）に対応するＥＢＶペプミックスでパルス化して、ＥＢＶ特異的なＴ細胞の拡大を刺激した。９日目に、およびその後７日毎に、再刺激工程を、（ｉ）ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、放射線照射Ｋ５６２−ｃｓ共刺激細胞の存在下で、１：１：５のレスポンダー細胞：ＡＴＣ：Ｋ５６２−ｃｓの比率で、ＥＢＶペプミックスでパルス化した放射線照射自己ＡＴＣを用いるか、または（ｉｉ）ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、放射線照射ＵＬＣＬの存在下で、１：１：５のレスポンダー細胞：ＡＴＣ：ＵＬＣＬの比率で、ＥＢＶペプミックスでパルス化した放射線照射自己ＡＴＣを用いるかのいずれかで実行した。
【０２６１】
[0296]ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩの表面発現が欠如したＬＣＬ（すなわちＨＬＡ陰性ＬＣＬ）を、ＨＬＡクラスＩおよびＨＬＡクラスＩＩ分子をコードする遺伝子の標的化されたノックアウトによって得た。ＨＬＡ陰性ＬＣＬをさらに改変してＥＢＶ複製に必要な遺伝子をノックアウトした。３つの異なるＵＬＣＬクローン（番号４、番号５および番号１３）を分析した。
【０２６２】
[0297]図２２Ａおよび２２Ｂは、培養における細胞の全体の拡大倍率が、ＵＬＣＬと比較して、共刺激細胞としてＫ５６２−ｃｓ細胞を使用して拡大した細胞でより高かったことを実証する２つの別個の実験の結果を示す。しかしながら、図２３Ａおよび２３Ｂで示されるように、ＵＬＣＬクローン番号５は、ＩＦＮγ産生細胞の数のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定した場合、より多くの数のウイルス特異的なＴ細胞に拡大することが見出された。
【０２６３】
[0298]本発明者らは次に、細胞表面マーカーに特異的な抗体を使用したフローサイトメトリーによって、共刺激細胞としてＫ５６２−ｃｓまたはＵＬＣＬを使用した示された数の刺激後の拡大された異なる細胞型の比率を分析した。図３２Ａ〜３２Ｃは、拡大された集団中のＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、ガンマデルタＴ細胞およびアルファベータＴ細胞の比率を示す代表的なドナー（ｎ＝７）からの散布図を示す。ＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の類似した比率が拡大された集団で見出されたが（図２４Ａ）、一方でＫ５６２ｃｓ細胞を使用した刺激により得られた集団は、拡大された集団中のＣＤ４＋Ｔ細胞の比率を低減させる傾向があり（図２４Ｂ）、ＵＬＣＬを使用した刺激により得られた集団は、拡大された集団中のアルファベータＴ細胞の比率を増加させる傾向があった（図２４Ｃ）。図２５は、Ｋ５６２ｃｓ細胞による発現と比較した場合の、ＵＬＣＬクローン番号５および番号１３によるガンマデルタＴＣＲ発現の特徴付けの代表的な結果を示す。
【０２６４】
[0299]本発明者らは次に、第２および第３の刺激の終了時に、ＩＦＮγ生産のＥＬＩＳＰＯＴ分析によって、ＵＬＣＬクローン番号５または番号１３、またはＫ５６２ｃｓ細胞を使用した刺激によって拡大された細胞の集団中の抗原特異的なＴ細胞の頻度を分析した。図２６Ａおよび２６Ｂに、２人の異なるドナーから得られた結果を示す。細胞がＵＬＣＬ細胞を使用した刺激によって拡大された場合、より多くのウイルス特異的な細胞が検出された。図２７Ａ〜２７Ｄは、ＥＬＩＳＰＯＴ分析によって決定された、共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞、ＵＬＣＬクローン番号５またはＬＣＬを使用した示された数の刺激後の４人の異なるドナーにつき示されたＥＢＶ抗原に特異的な細胞１００，０００個当たりの細胞の数を示す。
【０２６５】
[0300]本発明者らは、ウイルス特異的なＴ細胞の拡大の分析を４種の刺激にも行ったところ、共刺激細胞としてＵＬＣＬを採用する刺激が、Ｋ５６２ｃｓ細胞を使用して実行された刺激と比較してより高い比率のウイルス特異的な細胞を含有する集団を拡大したことを見出した（図２８Ａ〜２８Ｄ）。ＵＬＣＬクローン番号４細胞は、ＩＦＮγを生産するウイルス特異的なＴ細胞を拡大する能力に関して、親ＵＬＣＬクローンの細胞とそれほど異なっていないことが見出された（図２９Ａおよび２９Ｂ）。
【０２６６】
[0301]２人の異なるドナーから得られたＰＢＭＣを使用したさらなる実験において、ＵＬＣＬクローン番号５を使用した刺激は、刺激において（図３０Ａおよび３０Ｂ）、類似の拡大倍率で（図３１Ａおよび３１Ｂ）、Ｋ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団における頻度と比較してより高い頻度でＩＦＮγを生産するウイルス特異的なＴ細胞を含む細胞の集団をもたらした。図３２および３３は、拡大された集団におけるＣＤ３＋およびＣＤ５６＋細胞の比率は、ＵＬＣＬクローン番号５を使用して拡大した集団において、Ｋ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団と比較してそれほど異なっていなかったことを示し、図３４および３５は、Ｋ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団は、わずかに大きい比率のセントラルメモリー細胞を拡大したことを示す。
【０２６７】
[0302]図３６Ａおよび３６Ｂは、２人のさらなるドナーから得られたＰＢＭＣを使用して得られた実験からの結果を示し、それによれば、ＵＬＣＬクローン番号５を使用した刺激は、刺激においてＫ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団における頻度と比較してより高い頻度でＩＦＮγを生産するウイルス特異的なＴ細胞を含む細胞の集団をもたらしたことが実証される。これらの実験において、刺激にＫ５６２ｃｓ細胞を使用した場合、全体の拡大倍率はより高かった（図３７Ａおよび３７Ｂ）。図３８および３９は、拡大された集団におけるＣＤ３＋およびＣＤ５６＋細胞の比率が、ＵＬＣＬクローン番号５を使用して拡大した集団において、Ｋ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団と比較してそれほど異なっていなかったことを示し、図４０および４１は、Ｋ５６２ｃｓ細胞を使用して拡大した集団が、わずかに大きい比率のセントラルメモリー細胞を拡大したことを示す。
【実施例７】
【０２６８】
サイトカインの異なる組合せの存在下における、異なる共刺激細胞を用いた刺激培養によって拡大されたＨＰＶ特異的なＴ細胞のさらなる特徴付け
[0303]ＨＰＶで刺激されたＴ細胞（ＨＰＶＳＴ）をまず、１０〜２０：１のＰＢＭＣ：ＤＣ比率で、ＨＰＶ  Ｅ６／Ｅ７ペプチドパルス化自己樹状細胞（ＤＣ）によって活性化し、ＩＬ−６（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１２（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）を含有する培養培地中で８日間培養した（例えばRamosら（J Immunother 2013;36:66〜76）によって記載された第１の刺激工程に従って）。
【０２６９】
[0304]次いで、それに続く週１回の再刺激工程を、表６で示されるようにして、合計４つの刺激で行った。
【０２７０】
【表６】
2021511805.tif 000008
【０２７１】
[0305]各刺激の終了時に、細胞を数え、フローサイトメトリーによって分析して、拡大された集団中の異なる細胞型の比率を決定し、ＥＬＩＳＰＯＴによって分析して、拡大された集団中のＩＦＮγを生産するウイルス特異的な細胞の頻度を決定した。
【０２７２】
[0306]図４２は、ＨＰＶ特異的なＴ細胞が、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５の存在下における刺激を採用する方法によって拡大された細胞の集団中に、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下のみでの刺激と比較して、より高い頻度で存在していたことを示す。ＨＰＶ特異的なＴ細胞も、共刺激細胞としてＵＬＣＬを使用した方法によって拡大された細胞の集団中に、共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用した方法と比較して、より高い頻度で存在していた。
【０２７３】
[0307]図４３は、異なるプロトコールに従って拡大された細胞の全体の拡大倍率を示す。ＩＬ−７およびＩＬ−１５のみの存在下における刺激を含む方法は、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５の存在下における刺激を含む方法と比較して、より多くのＨＰＶ特異的なＴ細胞を拡大することが見出された。共刺激細胞としてＵＬＣＬを使用した刺激を含む方法は、共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓ細胞を使用した刺激を含む方法と比較して、より多くのＨＰＶ特異的なＴ細胞を拡大することが示された。
【０２７４】
[0308]図４４は、示された数の刺激後の、異なるプロトコールに従って刺激された細胞によるＣＤ３およびＣＤ５６の発現を示す。ＩＬ−７およびＩＬ−１５のみの存在下における刺激によって拡大された細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５の存在下における刺激によって拡大された細胞と比較して、ＣＤ３＋ＣＤ５６−細胞のより大きい比率を有することが示された。共刺激細胞としてＨＬＡ陰性ＬＣＬを使用した刺激によって拡大された細胞は、共刺激細胞としてＫ５６２ｃｓを使用した刺激によって拡大された細胞と比較して、ＣＤ３＋ＣＤ５６−細胞のより大きい比率を有することが示された。
【０２７５】
[0309]図４５は、示された数の刺激後の、異なるプロトコールに従って刺激された細胞によるＣＤ４およびＣＤ８の発現を示す。ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５の存在下における刺激によって拡大された細胞は、ＩＬ−７およびＩＬ−１５のみの存在下における刺激によって拡大された細胞と比較して、ＣＤ８＋細胞のより大きい比率を有することが示された。
【０２７６】
[0310]図４６は、示された数の刺激後の、異なるプロトコールに従って刺激された細胞によるＣＤ４５ＲＯおよびＣＣＲ７の発現を示す。ＩＬ−７およびＩＬ−１５のみの存在下における刺激によって拡大された細胞は、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２およびＩＬ−１５の存在下における刺激によって拡大された細胞と比較して、セントラルメモリー（すなわちＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋）細胞のより大きい比率を有することが示された。
【実施例８】
【０２７７】
ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させたＰＢＭＣからのウイルス特異的なＴ細胞の生成
[0311]本発明者らは、拡大された集団において、ウイルス特異的な抗原特異的なＴ細胞の頻度を増加させ、ＮＫ細胞の頻度を低減させるために、ウイルス特異的なＴ細胞を拡大するための方法への改変を調査した。
【０２７８】
[0312]図４７は、この実施例においてウイルス特異的なＴ細胞を生成するのに使用された方法の工程の概略図を提供する。簡単に言えば、０日目に、ＰＢＭＣ（これは、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させたＰＢＭＣか、またはＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させなかったＰＢＭＣかのいずれかであった）を、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、またはＩＬ−４およびＩＬ−７の存在下で、ウイルスペプチドでパルス化した。９日目に、共刺激細胞として放射線照射ＨＬＡ陰性ＬＣＬの存在下で、ＩＬ−７（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌ）の存在下で、またはＩＬ−４およびＩＬ−７の存在下で、ペプチドパルス化放射線照射自己抗原提示活性化Ｔ細胞（ＡＴＣ）を使用して、細胞を再刺激した。１６日目に、細胞を回収し、分析した。
【０２７９】
[0313]図４８は、刺激においてＩＬ−７およびＩＬ−１５を使用する方法が、刺激においてＩＬ−４およびＩＬ−７を使用した方法と比較して、より高い頻度でウイルス特異的なＴ細胞を拡大したことを示すＥＬＩＳＰＯＴ分析の結果を示す。
【０２８０】
[0314]ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下での刺激を含む方法は、リンパ腫患者から得られたＰＢＭＣからウイルス抗原特異的なＴ細胞を拡大できることが見出された（図４９）。ＩＬ−４の代わりにＩＬ−１５を使用することは、患者のＥＢＶ特異的なＴ細胞において抗原特異的なＴ細胞の頻度を増加させることが見出された。
【０２８１】
[0315]刺激で使用されるＩＬ−１５の最適な濃度の調査から、より高い用量のＩＬ−１５（１００ｎｇ／ｍｌ）が、ウイルス特異的なＴ細胞の頻度を増加させるのに最良であったことが解明された（５ｎｇ／ｍＬの標準的用量と比較して１００ｎｇ／ｍＬ）。図５０を参照されたい。図５１は、高用量のＩＬ−１５が、拡大された細胞集団においてセントラルメモリーＥＢＶ特異的Ｔ細胞の比率を増加させたことを実証する。
【０２８２】
[0316]本発明者らは次に、どのように健康なドナーおよびリンパ腫患者のＰＢＭＣから生成した拡大された細胞の集団中のＮＫ細胞の成長を最小化するかを調査した。ＮＫ細胞の優先的な成長は、刺激においてＩＬ−１５を使用する方法においてより高いことが見出された（ＮＫ細胞集団は、ＩＬ−１５およびＩＬ−７を使用した刺激により得られた集団中でより大きいようである）。これに対処するために、過剰なＮＫ細胞成長を回避する条件を開発した。刺激前のＰＢＭＣからのＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇を調査した。ＣＤ４５ＲＡは、天然の制御性Ｔ細胞およびＮＫ細胞でも発現されるナイーブＴ細胞マーカーでありことから、ＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇が初発のＰＢＭＣ集団からＮＫ細胞を除去するということは理にかなっていた。またＣＤ４５ＲＡ＋細胞の枯渇は、特にがん患者における抗原特異的なＴ細胞の成長を阻害できる制御性Ｔ細胞も除去し、さらに、バイスタンダー細胞として増殖して抗原特異的なＴ細胞を希釈することができるナイーブ細胞も除去する。枯渇は、例えば磁気での標識付けおよび分離を使用する（例えば、ミルテニー（Miltenyi）（登録商標）バイオテクカラムを使用する）あらゆる好適な方法によって達成することができる。磁気ビーズまたはナノバブルを使用して細胞を枯渇させるための抗体の使用も行うことができる。
【０２８３】
[0317]図５３に、ＣＤ４５ＲＡを枯渇させたＰＢＭＣからのペプミックスによって活性化されたＥＢＶ特異的なＴ細胞の生成に使用されるプロセスを模式的に例示する。そこで示した通り、ＰＢＭＣ集団全体のＣＤ４５ＲＡ（または比較目的でＣＤ４５ＲＯ）を枯渇させ、第１の刺激（Ｓ１）の０日目または１日目から始めて、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、枯渇させた細胞にＥＢＶペプミックスを添加して、ＥＢＶＳＴを生産した。Ｓ１の終了時および第２の刺激Ｓ２の開始時に（例えば、８日目から１０日目の間に）、ＥＢＶＳＴを、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の存在下で、ただしＩＬ−２の非存在下で、十分な量のＥＢＶペプミックスパルス化ＡＴＣおよび十分な量の共刺激細胞（例えばＫ５６２ｃｓ細胞）に曝露して、望ましいペプミックスによって活性化されたＥＢＶＳＴを生産した。図５４は、ＣＤ４５ＲＡ枯渇（健康なドナーからのＣＤ４５ＲＡ＋ＰＢＭＣを、ミルテニー（登録商標）カラムおよびＧＭＰグレードのＣＤ４５ＲＡコンジュゲートビーズを使用して枯渇させた）が、拡大された集団においてＣＤ３−ＣＤ５６＋ＮＫ細胞の頻度を減少させたことを見出した結果を実証し、それに伴いＥＢＶＳＴの増殖を増加させた（図５５）。図５６は、第２の刺激工程の終了時における健康なドナーからのＣＤ４５ＲＡ枯渇後のＥＢＶＳＴの強化された拡大倍率を例示する。加えて、ＣＤ４５ＲＡ枯渇は、第２の刺激の終了時（例えば、１６日目）におけるＥＢＶＳＴの抗原特異性を強化することが見出された（図５７および５８を参照、両方とも健康なドナーのデータを示す）。ＣＤ４５ＲＡ＋細胞を枯渇させたＰＢＭＣからの拡大によって生成されたＥＢＶＳＴの増加した抗原特異性は、第３の刺激後に持続することが見出された（図５９）。
【０２８４】
[0318]次いで、枯渇なしで増殖したＥＢＶＳＴがＮＫ細胞の高い頻度を示したため、またはそれらが増殖できなかったか、もしくは抗原特異性を示さなかったためのいずれかの理由で選ばれたリンパ腫患者から得られたＰＢＭＣからの拡大により得られたウイルス特異的なＴ細胞において、ＣＤ４５ＲＡ枯渇の作用を特徴付けた。図６０は、５人のリンパ腫患者における第２の刺激工程の終了時における全ＮＫ細胞集団を示し、それから、ＣＤ４５ＲＡ枯渇が、リンパ腫患者のＥＢＶＳＴにおけるＮＫ細胞集団成長を減少させたこと、およびこの枯渇が、抗原特異的なＴ細胞の頻度を増加させたことが実証される（第２の刺激の終了時におけるＩＦＮγ放出ＥＬＩｓｐｏｔアッセイによって例示された；図６１）。この実験を、第１の刺激のための樹状細胞の非存在下で実行した（すなわちＣＤ４５ＲＡ＋細胞枯渇ＰＢＭＣを、ＥＢＶペプミックスと直接接触させた）。健康なドナーからのＰＢＭＣを使用した方法で観察された結果と類似して、ＣＤ４５ＲＡ枯渇は、リンパ腫患者からのＥＢＶＳＴにおいて抗原特異性を増加させることが見出された（図６２）。リンパ腫患者のＥＢＶＳＴの増殖は、図６３で実証されている。さらに、ＣＤ４５ＲＡ枯渇は、ペプミックスでパルス化した自己活性化Ｔ細胞（ａＡＴＣ）に対する細胞溶解活性を強化した；２０：１のエフェクターと標的との比率で、溶解物のパーセンテージを観察した（図６４）。
【０２８５】
[0319]本発明およびその利点を詳細に説明したが、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の本質および範囲から逸脱することなく、本明細書において様々な変化、置換および変更をなし得ることが理解されるものとする。さらに、本出願の範囲が、本明細書に記載されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法および工程の特定の実施態様に限定されることは意図されない。当業者であれば本発明の開示から容易に理解すると予想されるように、本明細書に記載される対応する実施態様と実質的に同じ機能を発揮する、または実質的に同じ結果を達成する、既存の、または後に開発されるプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法、または工程を本発明に従って利用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、それらの範囲内に、このようなプロセス、装置、製造、組成物、手段、方法、または工程を含むことが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１７Ｃ】
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【図１７Ｄ】
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【図１７Ｅ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【国際調査報告】
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