(57)【要約】  本発明は、癌診断の分野に属する。特に、本発明は、癌患者において、癌治療で使用される化学物質に対する耐性を獲得するリスクを決定するための方法に関する。本発明はさらに、癌を治療するために使用される化学物質に対する薬剤耐性を獲得すると診断された患者のための新規の併用療法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
癌細胞または腫瘍細胞が化学物質に対する耐性を獲得するかどうかを決定するための方法であって、前記方法は以下のステップ、
ａ）癌と診断された対象から得られた癌細胞または腫瘍細胞を含むかまたはそれらからなる１つ以上の試料の化学物質への曝露であって、癌と診断された前記対象は以前に前記化学物質を投与されていない、曝露するステップと、
ｂ）ａ）で使用された前記１つ以上の試料において抗癌剤耐性の獲得に関連する前記遺伝子の発現レベルを決定するステップと、
ｃ）ｂ）と前記同じ遺伝子の前記発現レベルを、ａ）で使用された前記化学物質に曝露されていない、癌と診断された前記対象からの前記１つ以上の試料において決定するステップと、を含み、
ｃ）で決定された前記発現レベルと比較してｂ）で決定された発現レベルの上昇は、前記試料に含まれる癌細胞または腫瘍細胞による前記化学物質に対する耐性の獲得を示す、方法。
【請求項２】
以前に癌と診断された対象が、前記癌を治療するために使用される化学物質に対する耐性を獲得するかどうかを決定するための方法であって、以下のステップ、
ａ）癌と診断された前記対象から得られた癌細胞または腫瘍細胞を含むかまたはそれらからなる１つ以上の試料の化学物質への曝露であって、癌と診断された前記対象は以前に前記化学物質を投与されていない、曝露するステップと、
ｂ）ａ）で使用された前記１つ以上の試料において抗癌剤耐性の獲得に関連する遺伝子の発現レベルを決定するステップと、
ｃ）ｂ）と同じ遺伝子の発現レベルを、ａ）で使用された前記化学物質に曝露されていない、癌と診断された前記対象からの前記１つ以上の試料において決定するステップと、を含み、
癌と診断された前記対象は、前記１つ以上の試料を得る前にａ）で使用された前記化学物質を投与されておらず、ｃ）で決定された発現レベルと比較してｂ）で決定された発現レベルの上昇は、前記患者による前記化学物質に対する耐性の獲得を示す、方法。
【請求項３】
前記１つ以上の試料は生検によって得られる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料は血液中の循環腫瘍細胞から得られる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項５】
耐性の獲得に関連する前記遺伝子は、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２からなる群から選択される遺伝子である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
耐性の獲得に関連する前記遺伝子はＳＯＸ２である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
癌は、非黒色腫皮膚癌、食道胃腺癌、神経膠芽腫、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、食道胃癌、黒色腫、非小細胞肺癌、子宮内膜癌、子宮頸部腺癌、食道扁平上皮癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、胚細胞腫瘍、小細胞肺癌、卵巣癌、軟部肉腫、肝細胞癌、結腸直腸腺癌、子宮頸部扁平上皮癌、胆管細胞癌、前立腺癌、上部尿路上皮癌、びまん性神経膠腫、結腸直腸癌、膨大部癌、副腎皮質癌、頭頸部癌、腎明細胞癌、肝胆道癌、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、中皮腫、唾液腺癌、腎非明細胞癌、その他の神経上皮腫瘍、褐色細胞腫、胸腺腫瘍、多発性骨髄腫、腎細胞癌、骨癌、膵癌、白血病、末梢神経系腫瘍、甲状腺癌、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病、モノクローナルＢ細胞リンパ球増加症、リンパ腫、有毛細胞白血病、急性骨髄性白血病、ウィルムス腫瘍、特に黒色腫および非小細胞肺癌である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記化学物質は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であるＥＧＦＲ経路の阻害剤（ＥＧＦＲｉ）またはＭＡＰＫ経路（ＭＡＰＫｉ）の阻害剤であり、好ましくは、前記ＭＡＰＫｉは、Ｂ−Ｒａｆ（ＢＲＡＦｉ）の阻害剤、ＭＥＫ（ＭＥＫｉ）の阻害剤、またはＥＲＫ（ＥＲＫｉ）の阻害剤である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記
ｉ）前記ＢＲＡＦｉは、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ４７２０、ＴＡＫ−６３２、ＭＬＮ２４８０、ＳＢ５９０８８５、ＸＬ２８１、ＢＭＳ−９０８６６２、ＰＬＸ３６０３、ＲＯ５１８５４２６、ＧＳＫ２１１８４３６もしくはＲＡＦ２６５であり、
ｉｉ）前記ＭＥＫｉはまＡＺＤ６２４４、トラメチニブ、セルメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、ＭＥＫ１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＧＤＣ−０６２３、ＰＤ  ０３２５９０１、ＣＩ−１０４０、ＰＤ−０３５９０１、ヒポテマイシンもしくはＴＡＫ−７３３であり、
ｉｉｉ）前記ＥＲＫｉは、ウリキセルチニブ、コリノキセイン、ＳＣＨ７７２９８４、ＸＭＤ８−９２、ＦＲ  １８０２０４、ＧＤＣ−０９９４、ＥＲＫ５−ＩＮ−１、ＤＥＬ−２２３７９、ＢＩＸ  ０２１８９、ＥＲＫ阻害剤（ＣＡＳ番号１０４９７３８−５４−６）、ＥＲＫ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号３３１６５６−９２−９）、ＧＤＣ−０９９４、ホノキオール、ＬＹ３２１４９９６、ＣＣ−９０００３、デルトニン、ＶＲＴ７５２２７１、ＴＩＣ１０、アストラガロシドＩＶ、ＸＭＤ８−９２、ＶＸ−１１ｅ、モグロール、もしくはＶＴＸ１１ｅであり、かつ／または
ｉｖ）前記ＥＧＦＲｉは、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、オシメルチニブ、アファチニブ、ＡＰ２６１１３、ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号  ８７９１２７−０７−８）ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤（ＣＡＳ番号８８１００１−１９−０）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２阻害剤（ＣＡＳ番号１７９２４８−６１−４）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩ（ＢＩＢＸ  １３８２、ＣＡＳ番号１９６６１２−９３−８）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号７３３００９−４２−２）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ番号９４４３４１−５４−２）もしくはＰＫＣβＩＩ／ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号１４５９１５−６０−２）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
化学物質であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を使用して前記化学物質に対する耐性を獲得すると決定された患者の癌の治療に、第２の化学物質と組み合わせて使用するためのものであり、前記第２の化学物質は、抗癌剤耐性の獲得に関連する遺伝子の発現を阻害する、使用するための化学物質。
【請求項１１】
１つ以上の化学物質の使用であって、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を使用して前記化学物質に対する耐性を獲得すると決定された患者を治療するために、第１の化学物質（単数または複数）に対する抗癌剤耐性の獲得に関連する１つ以上の遺伝子の発現を阻害するさらなる化学物質と組み合わされる、１つ以上の化学物質の使用。
【請求項１２】
請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法を使用して癌細胞または腫瘍細胞において抗癌剤耐性を誘導すると決定された１つ以上の化学物質と、第１の化学物質に対する抗癌剤耐性の獲得に関連する１つ以上の遺伝子の発現を阻害するさらなる化学物質との組み合わせを含有する、生成物。
【請求項１３】
癌は、非黒色腫皮膚癌、食道胃腺癌、神経膠芽腫、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、食道胃癌、黒色腫、非小細胞肺癌、子宮内膜癌、子宮頸部腺癌、食道扁平上皮癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、胚細胞腫瘍、小細胞肺癌、卵巣癌、軟部肉腫、肝細胞癌、結腸直腸腺癌、子宮頸部扁平上皮癌、胆管細胞癌、前立腺癌、上部尿路上皮癌、びまん性神経膠腫、結腸直腸癌、膨大部癌、副腎皮質癌、頭頸部癌、腎明細胞癌、肝胆道癌、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、中皮腫、唾液腺癌、腎非明細胞癌、その他の神経上皮腫瘍、褐色細胞腫、胸腺腫瘍、多発性骨髄腫、腎細胞癌、骨癌、膵癌、白血病、末梢神経系腫瘍、甲状腺癌、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病、モノクローナルＢ細胞リンパ球増加症、リンパ腫、有毛細胞白血病、急性骨髄性白血病、ウィルムス腫瘍、特に黒色腫および非小細胞肺癌である、請求項１０に記載の使用するための化学物質、請求項１１に記載の使用、および請求項１２に記載の生成物。
【請求項１４】
前記化学物質は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であるＥＧＦＲ経路の阻害剤（ＥＧＦＲｉ）、ＭＡＰＫ経路の阻害剤（ＭＡＰＫｉ）または癌の免疫療法に使用される薬剤であり、好ましくは、前記ＭＡＰＫｉはＢ−Ｒａｆの阻害剤（ＢＲＡＦｉ）、ＭＥＫの阻害剤（ＭＥＫｉ）、またはＥＲＫ（ＥＲＫｉ）の阻害剤である、請求項１０または請求項１３に記載の使用するための化学物質、請求項１１または請求項１３に記載の使用、および請求項１２または請求項１３に記載の生成物。
【請求項１５】
前記
ｉ）前記ＢＲＡＦｉは、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ４７２０、ＴＡＫ−６３２、ＭＬＮ２４８０、ＳＢ５９０８８５、ＸＬ２８１、ＢＭＳ−９０８６６２、ＰＬＸ３６０３、ＲＯ５１８５４２６、ＧＳＫ２１１８４３６またはＲＡＦ２６５であり、
ｉｉ）前記ＭＥＫｉはＡＺＤ６２４４、トラメチニブ、セルメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、ＭＥＫ１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＧＤＣ−０６２３、ＰＤ  ０３２５９０１、ＣＩ−１０４０、ＰＤ−０３５９０１、ヒポテマイシンまたはＴＡＫ−７３３であり、
ｉｉｉ）前記ＥＲＫｉは、ウリキセルチニブ、コリノキセイン、ＳＣＨ７７２９８４、ＸＭＤ８−９２、ＦＲ  １８０２０４、ＧＤＣ−０９９４、ＥＲＫ５−ＩＮ−１、ＤＥＬ−２２３７９、ＢＩＸ  ０２１８９、ＥＲＫ阻害剤（ＣＡＳ番号１０４９７３８−５４−６）、ＥＲＫ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号３３１６５６−９２−９）、ＧＤＣ−０９９４、ホノキオール、ＬＹ３２１４９９６、ＣＣ−９０００３、デルトニン、ＶＲＴ７５２２７１、ＴＩＣ１０、アストラガロシドＩＶ、ＸＭＤ８−９２、ＶＸ−１１ｅ、モグロール、またはＶＴＸ１１ｅであり、
ｉｖ）前記ＥＧＦＲｉはセツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、オシメルチニブ、アファチニブ、ＡＰ２６１１３、ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号８７９１２７−０７−８）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤（ＣＡＳ番号８８１００１−１９−０）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２阻害剤（ＣＡＳ番号１７９２４８−６１−４）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩ（ＢＩＢＸ  １３８２、ＣＡＳ番号１９６６１２−９３−８）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号７３３００９−４２−２）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ番号９４４３４１−５４−２）またはＰＫＣβＩＩ／ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号１４５９１５−６０−２）であり、かつ／または
ｖ）免疫療法に使用される前記薬剤は、ＣＤ５２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２０、またはＰＤ−１を標的とする薬剤であり、本発明の化合物と組み合わせて使用することができる薬剤は、例えば、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブを含む、請求項１４に記載の使用するための化学物質、使用、および生成物。
【請求項１６】
抗癌剤耐性の獲得に関連する遺伝子の発現を阻害する前記第２の化学物質は、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２からなる群から選択される遺伝子を阻害する、請求項１０、および１３〜１５のいずれか一項に記載の使用するための化学物質、請求項１１および１３〜１５のいずれか一項に記載の使用、ならびに請求項１２および１３〜１５のいずれか一項に記載の生成物。
【請求項１７】
耐性の獲得に関連する前記遺伝子はＳＯＸ２である、請求項１６に記載の使用のための化学物質、使用、および製品。
【請求項１８】
前記第２の化学物質は、臭化セトリモニウム、イダルビシン・ｈｃｌ、ネラチニブ（ｈｋｉ−２７２）、イソチオシアン酸ベンジル、ボリノスタット、エメチン二塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、ダクチノマイシン、キシノスタット（ｊｎｊ２６４８１５８５）、ニクロサミド、ドキソルビシン、ｐｃｉ−２４７８１（アベキシノスタット）、ラナトシドＣ、パノビノスタットｌｂｈ５８９）、サリノマイシン、ナトリウム、ブロキサルジン、テニポシド、プラシノスタット（ｓｂ９３９）、アザシチジン、ホモハリントニン、アクリソルシン、塩化トロニウム、ラドチニブ、アモジアキン二塩酸塩、塩化ベンゼトニウム、チダミド、ｃｕｄｃ−１０１、セラメクチン、テトランドリン、ベリノスタット（ｐｘｄ１０１）、エトラビリン（ｔｍｃ１２５）、アムシノニド、オキシベンダゾール、アセチル−Ｌ−ロイシン、クロロキシン、ナパブカシン、レスミノスタット、イドクスウリジン、チオグアニン、シクロヘキシミド、トリフルリジン、ベタメタゾン１７，２１，ジプロピオン酸、ドビチニブ（ｔｋｉ−２５８）二乳酸、コルヒチン、モセチノスタット（ｍｇｃｄ０１０３）、スニチニブ、ペリチニブ（ｅｋｂ−５６９）、ピマバンセリン、エフロキサート、ｔｇ１０１３４８（ｓａｒ３０２５０３）、プロピオン酸クロベタゾール、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、酢酸ジクロリゾン、アルベンダゾール、エンチノスタット（ｍｓ−２７５）、フルニソリド、アルテニモル、アミナクリン、フルメタゾン、ロシリノスタット（ａｃｙ−１２１５）、ブロノポール、グラミシジン（グラミシジンＡと示される）、アバメクチン（アベルメクチンＢ１ａと示される）、ジスルフィラム、ジフルプレドナート、アセトリゾ酸、酢酸イソフルプレドン、ｌｙ２８３５２１９、マレイン酸ペルヘキシリン、メテルゴリン、ホルメスタン、モネンシンナトリウム、フロクスウリジン、プレドニカルベート、リン酸デキサメタゾンナトリウム、レフルノミド、プロピオン酸ハロベタゾール、シロリムス、イプリフラボン、ニンテダニブ（ｂｉｂｆ  １１２０）、ピルビニウム、パモ酸塩、ルフロキサシン塩酸塩、フォスブレタブリン（コンブレタスタチンＡ４リン酸（ＣＡ４Ｐ）、二ナトリウム、トリアムシノロン二酢酸、オテナバント（ｃｐ−９４５５９８）ｈｃｌ、アプロチニン、プロピオン酸フルチカゾン、アムバチニブ（ｍｐ−４７０）、塩化メチルベンゼトニウム、フェンベンダゾール、塩酸ブピバカイン、ベタメタゾン、ピバル酸フルメタゾン、チオグアニン、マレイン酸テガセロド、酢酸プレドニゾロン、クロリンジオン、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、酢酸デキサメタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、イベルメクチン、プロフラビンヘミ硫酸塩、ランソプラゾール、セルデュラチニブ（ｐｒｔ０６２０７０、ｐｒｔ２０７０）、サリフンギン（ｓａｌｉｆｕｎｇｉｎ）、ハルシノニド、フドステイン、テルフェナジン、フルオシノニド、ヘキセチジン、アルテスネート、フルオシノロンアセトニド、リファンピン、トリアムシノロン、ゾルピデム、エトプロパジン、塩酸塩、レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３−４５０６）、塩酸テラゾシン、タンシノンＩＩＡ−スルホン酸ナトリウム、ノコダゾール、トリクロサ���、クロピドール、ソラフェニブトシレート、スルフィソミジン、メチレンブルー、クリゾチニブ（ｐｆ−０２３４１０６６）、プロスシラリジン、デキシブプロフェン、塩酸トリフルプロマジン、塩酸ピリベジル、カルモフール、スウェルチアマリン、スルタミシリントシレート、ジンセノサイドＲｃ、エトフィブラート、塩化セチルピリジニウム、ラベプラゾールナトリウム、塩酸アリザプリド、メチルアミノレブリン酸・ｈｃｌ、クロドロン酸二ナトリウム四水和物、アモキサピン、ベダキリン（ｔｍｃ２０７、ｒ２０７９１０）、オクテニジン、エカベトナトリウム、アピゲニン、ヨウ化グリコピロレート、ナトリウムモンモリロナイト、ヒドロコルチゾン、バルバジン、ＣＣＳ１４７７、ＳＧＣ−ＣＢＰ３０、ＣＰＩ−６３７、ＰＦ−ＣＢＰ１、ＩＣＧ−００１、ＰＲＩ−７２４、Ａ−４８５、Ｃ６４６、４−メチルチオ−２−オキソ酪酸（ＭＴＯＢ）、ＨＩＰＰ誘導体、環状ペプチドＣＰ６１、ＮＳＣ９５３９７、２−（ヒドロキシイミノ）−３−フェニルプロパン酸ならびにその４−クロロおよび３−クロロ類似体、ＭＬＮ４９２４、ＡＳ１８４２８５６、ＪＩＢ−０４、ＥＰ−５６７６、Ｎ−オキサリルグリシン（ＮＯＧ）、ピリジン−２，４−ジカルボキシレート（２，４−ＰＤＣＡ）、プラジエノライドＢ、ＩＤＣ１６、ＣＢＬ０１３７、ジフォペイン、Ｒ１８からなる群から選択される、請求項１０および１３〜１８のいずれか一項に記載の使用のための化学物質、請求項１１および１３〜１８のいずれか一項に記載の使用、ならびに請求項１２および１３〜１８のいずれか一項に記載の生成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、癌診断の分野に属する。特に、本発明は、癌患者において、癌治療で使用される化学物質に対する耐性を獲得するリスクを決定するための方法に関する。本発明はさらに、癌を治療するために使用される化学物質に対する薬剤耐性を獲得すると診断された患者のための新規の併用療法を提供する。
【０００２】
癌細胞の遺伝的変化は、細胞周期の制御、増殖、分化、および／またはシグナル伝達に関する重要な遺伝子に影響を与えることが多い。（Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．，Ｃｅｌｌ  １００，５７−７０（２０００）；Ｈａｎａｈａｎ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．，Ｃｅｌｌ  １４４，６４６−６７４（２０１１））ＭＡＰＫ経路の発癌活性化は、黒色腫、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）および膵臓癌を含む多くのヒト癌の代表的な特徴である。（Ｄｈｉｌｌｏｎ、ＡＳ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ２６、３２７９−３２９０（２００７））例えば、黒色腫の５０〜７０％は、構成的ＭＡＰＫシグナル伝達を活性化するＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｅ腫瘍性タンパク質によって引き起こされる。（Ｄａｖｉｅｓ、Ｈ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４１７、９４９−９５４（２００２））。ＢＲＡＦ阻害剤は、単独で、またはＭＥＫ阻害剤と組み合わさって、患者の生存率を大幅に向上させるが、通常、臨床反応の持続期間が限定されている。（Ｆｌａｈｅｒｔｙ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６３，８０９−８１９（２０１０）；Ｃｈａｐｍａｎ，Ｐ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６４，２５０７−２５１６（２０１１）；Ｈａｕｓｃｈｉｌｄ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３８０，３５８−６５（２０１２）；Ｆｌａｈｅｒｔｙ，Ｋ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３６７，１６９４−１７０３（２０１２）；Ｌａｒｋｉｎ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７１，１８６７−１８７６（２０１４）；Ｌｏｎｇ，Ｇ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７１，１８７７−１８８８（２０１４）；Ｒｏｂｅｒｔ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３７２，３０−３９（２０１５）；Ｌｏｎｇ，Ｇ．Ｖ．ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ  ３８６，４４４−４５１（２０１５））。
【０００３】
表現型およびシグナル伝達の可塑性、ならびに新規遺伝子変異の獲得は、癌治療で標的とされる阻害剤に対する耐性の獲得における推進因子であることが判明している。（Ｅｎｇｅｌｍａｎ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１６，１０３９−１０４３（２００７）；Ｋｕｇｅｌ，Ｃ．Ｈ．．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７４，４１２２−４１３２（２０１４）；Ｇｏｅｔｚ，Ｅ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．７４，７０７９−７０８９（２０１４）；Ｈａｒｔｓｏｕｇｈ，Ｅ．，Ｓｈａｏ，Ｙ．，Ａｐｌｉｎ，Ａ．Ｅ．，Ｊ．Ｉｎｖｅｓｔ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．１３４，３１９−３２５（２０１４）；Ｒｏｅｓｃｈ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ５９，１０９−１１２（２０１６）．）。薬剤耐性腫瘍の遺伝的景観の予測不可能な腫瘍間および腫瘍内の不均一性は、標的治療への耐性を防ぐための臨床試験の設計を複雑にする。（Ｒｏｍａｎｏ，Ｅ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１９，５７４９−５７５７（２０１３）；Ｓｈｉ，Ｈ．ｅｔ  ａｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．４，８０−９３（２０１４）；Ｖａｎ  Ａｌｌｅｎ，Ｅ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．４，９４−１０９（２０１４）；Ｒｏｅｓｃｈ，Ａ．，Ｏｎｃｏｇｅｎｅ  ３４，２９５１−２９５７（２０１５）；Ｓｈａｆｆｅｒ  Ｓ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５６４，４３１−４３５（２０１７））。
【０００４】
標的とされる阻害剤と追加の薬物の組み合わせを使用する新規治療法により患者の生存率を高めるための現在のアプローチは、多くの場合、選択されていない患者集団で使用されるか、または正常細胞と比較した癌細胞における、もしくは薬剤耐性癌細胞と比較した薬剤感受性癌細胞における、基礎遺伝子発現パターンによって左右される。（Ｅｖａｎｓ，Ｗ．Ｅ．，Ｒｅｌｌｉｎｇ，Ｍ．Ｖ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４２９，４６４−４６８（２０１４）；Ｇｌｉｎｓｋｙ，Ｇ．Ｖ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｖ．３，７９−９３（２００７）；Ｊｏｈａｎｎｅｓｓｅｎ，Ｃ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ５０４，３８−４２（２０１３））。薬物治療ならびに腫瘍内および腫瘍間の不均一性に応じた癌細胞の適応転写変化は、これらのアプローチの臨床効果を制限する。以前に観察された欠点を克服するための１つのアプローチは、ＷＯ２００９／１５１５０３に記載されている。その中で提供されるのは、新形成を従来の治療法による治療に耐性があると同定する方法である。この方法は、現在、新形成の医学的治療を受けている患者由来の試料中の様々なマーカーのレベル増加の同定を含む。したがって、患者は既に従来の治療を受けている。しかしながら、癌治療は癌細胞の変化を引き起こし、それによって薬剤耐性をもたらす可能性がある。（Ｓｍｉｔｈ，Ｍ．Ｐ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２９，２７０−２８４（２０１６））。これは、記載される方法では、患者が従来の治療に曝露される前に耐性を獲得するリスクを有する可能性があると同定できないことを意味する。
【０００５】
したがって、癌患者において所与の化学物質に対する耐性を獲得するリスクを確実に決定するための手段および方法を提供する必要があり、該方法は、長期治療戦略に適した患者を同定するために個別化された癌治療に使用することができる。
【０００６】
次に、本発明は、本発明の特許請求の範囲および以下の実施形態により具体的に定義される、そのような手段および方法を提供するという点でこの必要性を満たす。
【０００７】
一実施形態において、本発明は、細胞、特に癌細胞または腫瘍細胞が化学物質に対する耐性を獲得するかどうかを決定するための方法を提供し、該方法は以下のステップ、
ａ）癌と診断された対象から得られた癌細胞または腫瘍細胞を含むかまたはそれらからなる１つ以上の試料を化学物質への曝露であって、癌と診断された対象は以前に前記化学物質を投与されていない、曝露するステップと、
ｂ）ａ）で使用された１つ以上の試料において抗癌剤耐性の獲得に関連する遺伝子の発現レベルを決定するステップと、
ｃ）ｂ）と同じ遺伝子の発現レベルを、ａ）で使用された化学物質に曝露されていない、癌と診断された対象からの１つ以上の試料において決定するステップと、を含み、
ｃ）で決定された発現レベルと比較してｂ）で決定された発現レベルの上昇は、前記試料に含まれる癌細胞または腫瘍細胞による化学物質に対する耐性の獲得を示す。
【０００８】
それに伴って、本発明者らは、予想外にかつ驚くべきことに、癌と診断された対象から得られた試料に含まれる細胞、特に癌細胞または腫瘍細胞をインビトロで分析して、該試料に含まれる細胞、特に癌細胞または腫瘍細胞が、化学物質、具体的には癌の治療に使用される物質に対する耐性を獲得するかどうかを決定することができることを発見した。具体的には、癌の発生に関連する遺伝子の発現が、インビトロ法において化学物質によって誘導され得ることは知られていないまたは示唆されていない。当該技術分野で既知の以前の方法は、患者が化学物質に対する耐性を獲得する前に、または前記物質に対して依然として臨床的に感受性である間に患者から採取した試料の遺伝子シグネチャーと比較して、患者が化学物質に対する耐性を既に獲得した後に患者から採取した試料の変化した遺伝子シグネチャーを利用する。本発明者らによって発見されたように、薬物曝露は、治療において使用される化学物質に対する耐性の潜在的な獲得のその後のあらゆる分析に劇的な影響を与える可能性がある。本発明の方法は、１つ以上の試料を得る前に治療を受けていない対象に由来する試料を使用することにより、この欠点を克服する。
【０００９】
上記に従って、本発明はさらに、以前に癌と診断された対象が前記癌を治療するために使用される化学物質に対する耐性を獲得するかどうかを決定するための方法を提供し、該方法は以下のステップ、
ａ）癌と診断された対象から得られた癌細胞または腫瘍細胞を含むかまたはそれらからなる１つ以上の試料の化学物質への曝露であって、癌と診断された対象は以前に該化学物質を投与されていない、曝露するステップと、
ｂ）ａ）で使用された１つ以上の試料において抗癌剤耐性の獲得に関連する遺伝子の発現レベルを決定するステップと、
ｃ）ｂ）と同じ遺伝子の発現レベルを、ａ）で使用された化学物質に曝露されていない、癌と診断された対象からの１つ以上の試料において決定するステップと、を含み、
ｃ）で決定された発現レベルと比較してｂ）で決定された発現レベルの上昇は、患者による化学物質に対する耐性の獲得を示す。
【００１０】
細胞、特に癌細胞または腫瘍細胞が化学物質に対する耐性を獲得するかどうかを決定するための上記の方法と同様に、この方法は、癌と診断された対象が、前記癌を治療するために使用される化学物質に対して薬剤耐性を獲得するかどうかを決定するために用いられてもよい。本発明の方法は、化学物質を投与する前に用いることができ、それによって薬剤耐性の誘導を回避できるという驚くべきかつ予想外の利点を有する。そのような誘導を回避するために、試料はインビトロで分析されてもよく、そのために試料（複数可）は化学物質への曝露前に得られた。したがって、インビトロ分析によって薬剤耐性を獲得するリスクが上昇する場合、本発明によるインビトロ分析において、または本発明による組み合わせ治療または療法を追求することによって薬剤耐性を獲得するリスクの増加を示していない化学物質を用いた代替治療を適用することにより、そのような化学物質を用いた治療による耐性の誘導を防ぐことができる。
【００１１】
様々な実施形態において、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つによる方法に関し、試料は、腫瘍生検および血液中の循環腫瘍細胞から得られる試料からなる群から選択される。
【００１２】
様々なさらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つによる方法に関し、耐性の獲得に関連する前記遺伝子は、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２からなる群から選択される遺伝子である。
【００１３】
本発明の特定の実施形態において、耐性の獲得に関連する遺伝子はＳＯＸ２である。
【００１４】
ＳＯＸ２としても知られるＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２は、未分化胚性幹細胞の自己再生または多能性を維持するために不可欠な転写因子である。このタンパク質は、哺乳動物の発達の多くの段階において重要な役割を果たすことが示されている、転写因子のＳｏｘファミリーのメンバーである。例えば、Ｓｏｘ２は、肺の発達において気管支樹の分枝形態形成および気道上皮の分化を制御する。通常の条件下では、Ｓｏｘ２は、成人の気管上皮における基底細胞の自己再生および適切な割合を維持するために重要である。しかしながら、その過剰発現は、広範な上皮過形成を引き起こし、最終的には、発達中および成体の両方のマウス肺に細胞腫を引き起こす。さらに、扁平上皮癌では、遺伝子増幅は、頻繁に３ｑ２６．３領域を標的とする。Ｓｏｘ２の遺伝子はこの領域内に存在し、Ｓｏｘ２を発癌遺伝子として効果的に特徴付ける。Ｓｏｘ２は、肺扁平上皮癌の主要な上方制御因子であり、腫瘍の進行に関与する多くの遺伝子に指示を与える。Ｓｏｘ２の過剰発現は、Ｌｋｂ１発現の喪失と相まってマウスの肺扁平上皮肺癌を促進する。その過剰発現はまた、細胞遊走および足場非依存性増殖を活性化する。Ｓｏｘ２の発現はグリーソングレードの高い前立腺癌にも見られ、去勢抵抗性前立腺癌の増殖を促進する。Ｓｏｘ２は、乳癌におけるタモキシフェン耐性の獲得にも関連があることが示されている。ＳＯＸ２等の癌の発生に関連する遺伝子に関する知識にもかかわらず、化学物質の添加によって天然発現レベルを超えるそのような遺伝子の発現がインビトロで誘導され得ること、および誘導された過剰発現が適用された化学物質に対する耐性の獲得を示唆することは以前には知られていなかった。
【００１５】
様々なさらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つによる方法に関し、癌は、黒色腫、非小細胞肺癌、前立腺癌、胆管癌、膀胱癌、膵癌、甲状腺癌、卵巣癌、結腸直腸腫瘍、有毛細胞白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、肝臓癌、乳癌、食道癌、頭頸部癌および神経膠腫であり、上記の癌のいずれか１つに罹患する患者から得られた試料は、それぞれの癌細胞または腫瘍細胞を含むか、またはそれらからなる。
【００１６】
特定の実施形態において、癌は、黒色腫および／または非小細胞肺癌である。
【００１７】
本明細書で使用される「黒色腫」という用語は、メラニン細胞から発生するある種の癌に関する。黒色腫は、典型的には皮膚に生じるが、まれに口、腸、または眼に生じる場合があり、それらは全て本発明によって包含される。黒色腫の主な原因は、低レベルの皮膚色素を有する人の紫外線（ＵＶ）曝露である。ＵＶ光は、太陽から、または日焼け装置等の他の光源からであり得る。ほくろから発生する可能性もある。ほくろが多く、家族に発症した病歴があり、免疫機能が低下している人は、リスクがより大きい。色素性乾皮症を引き起こすもの等の多くの遺伝的欠陥も、黒色腫を発生するリスクを高める。診断は、任意の関連する皮膚病変の生検によって行うことができる。黒色腫の予防には、一般的に日焼け止めの使用および紫外線の回避が含まれる。最も一般的な治療は、手術による除去である。しかしながら、対象、特にわずかに大きい癌を有する対象は、転移について検査されてもよい。対象、特に黒色腫が転移した対象には、免疫療法、生物学的療法、放射線療法、および／または化学療法が必要な場合がある。当該技術分野で利用可能な様々な治療選択肢にもかかわらず、黒色腫は依然として最も危険な種類の皮膚癌である。世界的には、２０１２年に新たに２３２，０００人に発症している。２０１５年には、３１０人が活動性の疾患を有し、そのうち５９，８００人が死亡した。テモゾロミド、ダカルバジン（ＤＴＩＣとも称される）、免疫療法（インターロイキン２（ＩＬ−２）またはインターフェロン（ＩＦＮ）を使用）、および局所灌流等の様々な化学療法薬が利用可能である。それにもかかわらず、転移性黒色腫の全体的な成功はかなり限られている。ＩＬ−２（プロロイキン）もまた、黒色腫治療の貴重な標的であることが示されている。研究により、ＩＬ−２がこの疾患の完全かつ長期にわたる寛解の可能性を提供することが実証されている。転移性黒色腫の治療は、例えば、イピリムマブ、ペンブロリズマブ、および／またはニボルマブを含む生物学的免疫療法剤を含み、ベムラフェニブおよびダブラフェニブ等のＢＲＡＦ阻害剤、ならびにトラメチニブおよびコビメチニブ等のＭＥＫ阻害剤も、黒色腫の治療に利用可能である。しかしながら、癌細胞、特に黒色腫細胞は、治療に使用される利用可能な化学物質に対する耐性を獲得する可能性がある。したがって、耐性の獲得をもたらさない治療法の選択肢を提供するか、または対象が黒色腫の治療に使用される化学物質に対する耐性を獲得するかどうかを確実に予測する方法を提供することが望ましい。上記で詳述したように、本発明は、癌、特に黒色腫と診断された対象が、癌、特に黒色腫の治療に使用される化学物質、例えば上記の化学物質に対する耐性を獲得するかどうかを決定するために使用される信頼できる方法を提供する。したがって、いくつかの実施形態における本発明は、対象において耐性の獲得をもたらすことが以前に示されていない化学物質を使用することにより、前記対象における黒色腫を治療する方法に関する。本発明の方法は、対象がそのような治療を以前に受けたことがなく、したがって、以前に耐性を獲得していないため、有利である。
【００１８】
本発明の他の実施形態において、対象は非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と診断されている。ＮＳＣＬＣは全ての肺癌の約８５％を占め、したがって重大な脅威である。現在、ＮＳＣＬＣは、小細胞癌および他の種類の癌と比較して、化学療法に比較的非感受性である。術前（術前補助化学療法）および術後（術後補助化学療法）の両方に化学療法が使用されることが多くなっているが、可能であれば、ＮＳＣＬＣは、主に治癒目的の外科的切除によって治療される。ＮＳＣＬＣの最も一般的な種類は、扁平上皮癌、大細胞癌、および腺癌であるが、あまり頻繁に発生しない他のいくつかの種類が存在し、全ての種類が異常な組織学的変種および混合細胞型の組み合わせとして発生し得る。癌の病期、個人の全体的な健康状態、年齢、化学療法への反応、および治療の副作用の可能性等の他の要因に応じて、一般に２つ以上の種類の治療が使用される。当業者は利用可能な治療を熟知している。しかしながら、完全な病期分類後、典型的には３つの異なるカテゴリーの１つにＮＳＣＬＣ患者を分類することができる：初期の、非転移性疾患を有する患者（Ｉ期、ＩＩ期、および一部のＩＩＩ期の腫瘍）、胸腔に限局した局所的に進行した疾患を有する患者（例えば、大きな腫瘍、重要な胸部構造を含む腫瘍、または縦隔リンパ節陽性の患者）、または胸腔外の遠隔転移を有する患者。ＮＳＣＬＣは通常、化学療法および／または放射線に対してあまり感受性が高くない。しかしながら、当業者によって選択され得る多くの可能な化学療法剤が存在する。ほとんどが白金ベースの化学療法薬シスプラチンを含む。さらに、進行した（転移性）ＮＳＣＬＣに使用するための多種多様な化学療法の選択肢が存在する。これらの薬剤は、急速に分裂する全ての細胞を無差別に標的とするシスプラチンのような伝統的な化学療法と、患者の腫瘍内に見られる特定の遺伝的異常により合わせた新しい標的薬剤の両方を含む。現在、さらなる治療の意思決定を導くためにＮＳＣＬＣ腫瘍で日常的に特性が明らかにされている２つの遺伝子マーカー、ＥＧＦＲ内の変異および未分化リンパ腫キナーゼが存在する。また、ＮＳＣＬＣ内で変異していることが分かっており、将来の治療に影響を与え得る、ＢＲＡＦ（遺伝子）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＫＲＡＳを含む追加の遺伝子マーカーが多く存在する。
【００１９】
重要なのは、ＮＳＣＬＣ患者の約１０〜３５％がＥＧＦＲの薬剤感作性変異を有するということである。多くの異なるＥＧＦＲ変異が発見されているが、特定の異常はタンパク質の活動亢進形態をもたらす。これらの変異を有する患者は、腺癌組織学を有し、非喫煙者または軽喫煙者である可能性が高い。これらの患者は、チロシンキナーゼ阻害剤として知られる、ＥＧＦＲタンパク質をブロックする特定の薬物、具体的にはエルロチニブ、ゲフィチニブまたはアファチニブに感作されることが示されている。ＳＯＸ２は、ＥＧＦＲ阻害剤に曝露すると、培養されたＮＳＣＬＣ細胞株で転写的に誘導されることが示されている。診断技術の感度が変動するため、肺癌における変異を確実に特定するには注意深い検討が必要である。別の方法では、ＮＳＣＬＣ患者の最大７％がＲＯＳ１遺伝子にＥＭＬ４−ＡＬＫ転座または変異を有する：これらの患者は、当業者に既知のＡＬＫ阻害剤の恩恵を受けることができる。クリゾチニブはいくつかのキナーゼ、特にＡＬＫ、ＲＯＳ１、ＭＥＴの阻害剤として知られている。
【００２０】
ＥＧＦＲまたはＡＬＫ変異のいずれも見られない進行疾患のＮＳＣＬＣ患者には、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）を標的としたモノクローナル抗体薬であるベバシズマブを投与してもよい。これは、再発または進行した非小細胞肺癌（ＩＩＩＢ期またはＩＶ期）を有する特定の患者のカルボプラチンおよびパクリタキセルによる化学療法にベバシズマブを追加すると、全生存期間および無増悪生存期間の両方が増加する可能性があることを発見した、Ｅａｓｔｅｒｎ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  Ｇｒｏｕｐの研究に基づいている。別の治療選択肢は、進行性または転移性扁平上皮癌に対する抗ＰＤ−１剤ニボルマブ、または腫瘍がＰＤ−Ｌ１を発現し、他の化学療法剤を用いた治療に失敗した患者の転移性非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）の治療のためのペンブロリズマブである。
【００２１】
癌がＰＤＬ１を過剰発現し、かつ癌がＥＧＦＲまたはＡＬＫ変異を有しない場合、ペンブロリズマブはＮＳＣＬＣの治療において第１選択の治療となる最初の免疫療法となる：化学療法が既に施行されている場合、ペンブロリズマブは第２選択の治療として使用され得るが、癌がＥＧＦＲまたはＡＬＫ変異を有する場合、それらの変異を標的とする薬剤を最初に使用するべきである。ＰＤＬ１の評価は、検証および承認されたコンパニオン診断によって実行されなければならない。しかしながら、これらの全ての治療選択肢において、治療前に耐性を獲得する可能性を決定することが望ましい。黒色腫では、ＭＡＰＫを標的とする治療法は、抗ＰＤ−１療法に本質的に耐性がある腫瘍に検出されるものと同様の遺伝子発現変化を誘導する。（Ｈｕｇｏ，Ｗ．，Ｃｅｌｌ  １６５，３５−４４（２０１６））。本発明の方法は、治療前に患者に由来する１つ以上の試料を使用することにより、そのような有利な決定を提供する。
【００２２】
上記に従って、様々なさらなる実施形態において、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つによる方法に関し、前記化学物質は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であるＥＧＦＲ経路（ＥＧＦＲｉ）、チェックポイントキナーゼの阻害剤、ＭＡＰＫ経路の阻害剤（ＭＡＰＫｉ）または免疫療法に使用される薬剤であり、好ましくは、前記ＭＡＰＫｉはＢ−Ｒａｆの阻害剤（ＢＲＡＦｉ）、ＭＥＫの阻害剤（ＭＥＫｉ）、またはＥＲＫ（ＥＲＫｉ）の阻害剤である。化学物質は、癌の免疫療法に使用される薬剤、特に免疫腫瘍薬であってもよい。
【００２３】
様々な特定の実施形態において、
ｉ）前記ＢＲＡＦｉは、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ４７２０、ＴＡＫ−６３２、ＭＬＮ２４８０、ＳＢ５９０８８５、ＸＬ２８１、ＢＭＳ−９０８６６２、ＰＬＸ３６０３、ＲＯ５１８５４２６、ＧＳＫ２１１８４３６もしくはＲＡＦ２６５であり、
ｉｉ）前記ＭＥＫｉはまＡＺＤ６２４４、トラメチニブ、セルメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、ＭＥＫ１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＧＤＣ−０６２３、ＰＤ  ０３２５９０１、ＣＩ−１０４０、ＰＤ−０３５９０１、ヒポテマイシンもしくはＴＡＫ−７３３であり、
ｉｉｉ）前記ＥＲＫｉは、ウリキセルチニブ、コリノキセイン、ＳＣＨ７７２９８４、ＸＭＤ８−９２、ＦＲ  １８０２０４、ＧＤＣ−０９９４、ＥＲＫ５−ＩＮ−１、ＤＥＬ−２２３７９、ＢＩＸ  ０２１８９、ＥＲＫ阻害剤（ＣＡＳ番号１０４９７３８−５４−６）、ＥＲＫ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号３３１６５６−９２−９）、ＧＤＣ−０９９４、ホノキオール、ＬＹ３２１４９９６、ＣＣ−９０００３、デルトニン、ＶＲＴ７５２２７１、ＴＩＣ１０、アストラガロシドＩＶ、ＸＭＤ８−９２、ＶＸ−１１ｅ、モグロール、もしくはＶＴＸ１１ｅであり、かつ／または
ｉｖ）前記ＥＧＦＲｉは、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ネラチニブ、バンデタニブ、ネシツムマブ、オシメルチニブ、アファチニブ、ＡＰ２６１１３、ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号８７９１２７−０７−８）ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤（ＣＡＳ番号８８１００１−１９−０）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２阻害剤（ＣＡＳ番号１７９２４８−６１−４）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩ（ＢＩＢＸ  １３８２、ＣＡＳ番号１９６６１２−９３−８）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号７３３００９−４２−２）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ番号９４４３４１−５４−２）もしくはＰＫＣβＩＩ／ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号１４５９１５−６０−２）である。
【００２４】
本発明の特定の実施形態において、化学物質は、免疫療法剤、より具体的には、例えば、ＣＤ５２、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２０、またはＰＤ−１を標的とする剤等の免疫腫瘍剤である。本発明の化合物と組み合わせて使用することができる薬剤は、例えば、アレムツズマブ、アテゾリズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、オファツムマブ、ペンブロリズマブ、リツキシマブを含む。さらなる化学物質は、例えば、アファチニブ、アカラブルチニブ、アレクチニブ、アパチニブ、アキシチニブ、ボスチニブ、カボザンチニブ、カネルチニブ、クレノラニブ、セジラニブ、クリゾチニブ、ダムナカンタル、ダサチニブ、エントスプレチニブ、エントレクチニブ、エルロチニブ、エルロチニブ、フォレチニブ、フォスタマチニブ、ギルテリチニブ、グレサチニブ、ゲフィチニブ、イブルチニブ、イコチニブ、イマチニブ、リナファニブ、ラパチニブ、レスタウルチニブ、モテサニブ、ムブリチニブ、ニンテダニブ、ニロチニブ、ＯＮＴ−３８０、パゾパニブ、キザルチニブ、レゴラフェニブ、ロシレチニブ、ラドチニブ、サボリチニブ、シトラバチニブ、セマクサニブ、ソラフェニブ、スニチニブ、サボリチニブ、シトラバチニブ、テセバチ二ブ（ｔｅｓｅｖａｔｉｎｉｂ）、バタラニブ、ベムラフェニブ、またはバンデタニブである。
【００２５】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載される前述の実施形態のいずれか１つの方法に関し、１つ以上の試料が生検によって得られている。
【００２６】
本明細書で使用される場合、生検は、疾患の存在または程度を決定するための検査のために通常行われる試料細胞または組織（複数可）の抽出を含む医学的試験である。組織は、一般に、顕微鏡下で病理学者によって検査され、かつ／または化学的に分析される。しこりまたは疑わしい領域全体が除去される場合、この手順は切除生検と呼ばれる。組織の細胞の組織学的構造を維持しながら組織の標本のみを除去する場合、この手順は切開生検またはコア生検と呼ばれる。組織細胞の組織学的構造を維持せずに細胞が除去されるように針を用いて組織の標本または液体が除去される場合、この手順は針吸引生検と呼ばれる。別段の指定がない限り、全ての種類の生検が本発明に包含される。生検は、可能性のある癌性および／または炎症性の状態、特に癌を洞察するために最も一般的に行われる。癌が疑われる場合、当業者に既知の様々な生検技術を適用することができる。切除生検は病変全体を切除する試みである。検体が評価される場合、診断に加えて、病変周辺の非関与組織の量である検体の切除マージンが検査され、生検領域を超えて疾患が広がっているかどうかが確認される。「クリアマージン」または「ネガティブマージン」とは、生検検体の縁に疾患が見つからなかったことを意味する。「ポジティブマージン」とは、疾患が見つかったことを意味し、診断によってはより広い切除が必要になる場合がある。様々な理由で完全な切除が指示されない場合、切開生検で組織のくさびが採取されてもよい。本発明のいくつかの実施形態において、試料は、試料を「噛む」装置によって採取することができる。様々なサイズの針で内腔の組織を採取できる（コア生検）。直径の小さい針は、細胞および細胞クラスターを採取する（針吸引生検）。生検の病理学的検査は、病変が良性であるか悪性であるかを決定することができ、異なる種類の癌を区別するのに役立ち得る。病変の標本を採取するだけの生検とは対照的に、典型的には患者から既知の病変を根絶しようとする外科医から、切除片と呼ばれるより大きな切除検体が病理学者に届く場合がある。例えば、以前の非切除の乳房生検で既に乳癌の診断が確立している場合でも、病理学者は乳房切除術の検体を検査する。全乳房切除術検体の検査により、癌の正確な性質が確認され（腫瘍の細分類および組織学的「等級付け」）、その広がりの程度が明らかになる（病理学的「病期分類」）。本発明の別の実施形態において、生検は液体生検、すなわち循環腫瘍細胞の除去である。この方法は、癌における変異を評価し、個別の治療を計画するために、繰り返される侵襲性の生検に対する非侵襲性の代替法を提供する。さらに、癌は不均一な遺伝病であり、切除生検は腫瘍に発生する急速で動的な遺伝子変化の一部のスナップショットのみを提供するため、液体生検は組織生検ベースのゲノム検査より優れたいくつかの利点を提供する。ＣＴＣのゲノム変化を検出および定量化することにより、液体生検は、腫瘍の進行段階、治療効果、および癌転移リスクに関するリアルタイムの情報を提供することができる。ゆえに、本発明の一実施形態内において、液体生検を使用することが想定される。したがって、本発明の一実施形態において、癌と診断された対象から分析されるべき試料を得るために生検が使用される。
【００２７】
「決定」または「決定する」という用語は、患者が特定の化学物質、特に治療薬に対する耐性を獲得するリスクの評価を指すために本明細書で使用される。一実施形態において、決定または決定することは、それらの耐性の程度に関する。一実施形態において、決定または決定することは、治療、例えば特定の化学物質／治療薬による治療の後に、患者が耐性を獲得するリスクが増加／減少するかどうかに関する。
【００２８】
本発明はまた、追加の化学物質と組み合わせて、様々な実施形態において本明細書に記載される本発明の方法を使用して前記化学物質に対する耐性を獲得すると決定された患者の癌の治療に使用するための化学物質に関し、前記第２の化学物質は、第１の化学物質（単数または複数）に対する抗癌剤耐性の獲得に関連する遺伝子の発現を阻害する。
【００２９】
一実施形態において、本発明は、第１の化学物質（単数または複数）に対する抗癌剤耐性の獲得に関連する１つ以上の遺伝子の発現を阻害する追加の化学物質と組み合わせて、様々な実施形態において本明細書に記載される本発明の方法を使用して、前記化学物質に対する耐性を獲得すると決定された患者の癌を治療するための１つ以上の化学物質の使用に関する。
【００３０】
本発明によってさらに含まれるのは、様々な実施形態において本明細書に記載される本発明の方法と、本発明は、第１の化学物質に対する抗癌剤耐性の獲得に関連する１つ以上の遺伝子の発現を阻害する追加の化学物質と、を使用して、前記化学物質に対する耐性を誘導すると決定された患者の癌を治療するための１つ以上の化学物質の組み合わせを含有する生成物である。
【００３１】
前記治療される癌は、一実施形態において、非黒色腫皮膚癌、食道胃腺癌、神経膠芽腫、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、食道胃癌、黒色腫、非小細胞肺癌、子宮内膜癌、子宮頸部腺癌、食道扁平上皮癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、胚細胞腫瘍、小細胞肺癌、卵巣癌、軟部肉腫、肝細胞癌、結腸直腸腺癌、子宮頸部扁平上皮癌、胆管細胞癌、前立腺癌、上部尿路上皮癌、びまん性神経膠腫、結腸直腸癌、膨大部癌、副腎皮質癌、頭頸部癌、腎明細胞癌、肝胆道癌、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、中皮腫、唾液腺癌、腎非明細胞癌、その他の神経上皮腫瘍、褐色細胞腫、胸腺腫瘍、多発性骨髄腫、腎細胞癌、骨癌、膵癌、白血病、末梢神経系腫瘍、甲状腺癌、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病、モノクローナルＢ細胞リンパ球増加症、リンパ腫、有毛細胞白血病、急性骨髄性白血病、ウィルムス腫瘍、特に黒色腫および非小細胞肺癌であり得る。上記の疾患は、典型的には、ＲＴＫ（ＥＧＦＲ、ＥＲＢＢ２、ＥＲＢＢ３、ＥＲＢＢ４、ＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＲＡ、ＰＤＧＦＲＢ、ＫＩＴ、ＦＧＦ１、ＦＧＦＲ１、ＩＧＦ１、ＩＧＦＲ、ＶＥＧＦＡ、ＶＥＧＦＢ、ＫＤＲ）および／またはＭＡＰＫ経路メンバー（ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＲＡＦ１、ＭＡＰ３Ｋ１／２／３／４／５、ＭＡＰ２Ｋ１／２／３／４／５、ＭＡＰＫ１／３／４／６／７／８／９／１２／１４、ＤＡＢ、ＲＡＳＳＦ１、ＲＡＢ２５）の３％超の突然変異発生率を示す。
【００３２】
本発明の使用のための化学物質は、受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）であるＥＧＦＲ経路の阻害剤（ＥＧＦＲｉ）またはＭＡＰＫ経路（ＭＡＰＫｉ）の阻害剤であり得、好ましくは、前記ＭＡＰＫｉは、Ｂ−Ｒａｆ（ＢＲＡＦｉ）の阻害剤、ＭＥＫ（ＭＥＫｉ）の阻害剤、またはＥＲＫ（ＥＲＫｉ）の阻害剤である。本発明の好ましい実施形態において、化学物質は、ＢＲＡＦｉ、特にベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ４７２０、ＴＡＫ−６３２、ＭＬＮ２４８０、ＳＢ５９０８８５、ＸＬ２８１もしくはＲＡＦ２６５、および／またはＭＥＫｉ、特にＡＺＤ６２４４、トラメチニブ、セルメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、ＭＥＫ１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＧＤＣ−０６２３、ＰＤ  ０３２５９０１、ＣＩ−１０４０もしくはＴＡＫ−７３３、および／またはＥＲＫｉ、特にウリキセルチニブ、ＳＣＨ７７２９８４、ＸＭＤ８−９２、ＦＲ  １８０２０４、ＧＤＣ−０９９４、ＥＲＫ５−ＩＮ−１、ＤＥＬ−２２３７９、ＢＩＸ  ０２１８９、ＥＲＫ阻害剤（ＣＡＳ番号１０４９７３８−５４−６）、ＥＲＫ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号３３１６５６−９２−９）、ＧＤＣ−０９９４もしくはＶＴＸ１１ｅ、および／またはＥＧＦＲｉ、特にセツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＡＰ２６１１３、ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号８７９１２７−０７−８）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤（ＣＡＳ番号８８１００１−１９−０）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２阻害剤（ＣＡＳ番号１７９２４８−６１−４）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩ（ＢＩＢＸ１３８２、ＣＡＳ番号１９６６１２−９３−８）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号７３３００９−４２−２）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ番号９４４３４１−５４−２）またはＰＫＣβＩＩ／ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号１４５９１５−６０−２）であり得る。
【００３３】
第２の化学物質は、第１の化学物質と同時にまたは連続的に投与することができ、抗癌剤耐性の獲得に関連する遺伝子の発現を阻害する。好ましい態様において、第２の化学物質は、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２からなる群から選択される遺伝子を阻害する。第２の化学物質は、ＳＯＸ２の発現を阻害することが好ましい。
【００３４】
この点において、驚くべきことに、かつ予想外に、既存の承認済みの薬物が薬剤耐性に関連する遺伝子を阻害するために使用され得ることが本発明者らによって発見された。したがって、本発明の好ましい実施形態において、患者が癌を治療するために使用される化学物質に対する薬剤耐性を獲得するのを防ぐために、癌の治療に使用するための化学物質、好ましくは上記の阻害剤のうちの１つを、既存の承認済みの薬物と組み合わせることができる。したがって、本発明は、一実施形態において、本発明の癌の治療に使用するための化学物質に関し、第２の化学物質は、臭化セトリモニウム、イダルビシン・ｈｃｌ、ネラチニブ（ｈｋｉ−２７２）、イソチオシアン酸ベンジル、ボリノスタット、エメチン二塩酸塩、ダウノルビシン塩酸塩、ダクチノマイシン、キシノスタット（ｊｎｊ２６４８１５８５）、ニクロサミド、ドキソルビシン、ｐｃｉ−２４７８１（アベキシノスタット）、ラナトシドＣ、パノビノスタットｌｂｈ５８９）、サリノマイシン、ナトリウム、ブロキサルジン、テニポシド、プラシノスタット（ｓｂ９３９）、アザシチジン、ホモハリントニン、アクリソルシン、塩化トロニウム、ラドチニブ、アモジアキン二塩酸塩、塩化ベンゼトニウム、チダミド、ｃｕｄｃ−１０１、セラメクチン、テトランドリン、ベリノスタット（ｐｘｄ１０１）、エトラビリン（ｔｍｃ１２５）、アムシノニド、オキシベンダゾール、アセチル−Ｌ−ロイシン、クロロキシン、ナパブカシン、レスミノスタット、イドクスウリジン、チオグアニン、シクロヘキシミド、トリフルリジン、ベタメタゾン１７，２１，ジプロピオン酸、ドビチニブ（ｔｋｉ−２５８）二乳酸、コルヒチン、モセチノスタット（ｍｇｃｄ０１０３）、スニチニブ、ペリチニブ（ｅｋｂ−５６９）、ピマバンセリン、エフロキサート、ｔｇ１０１３４８（ｓａｒ３０２５０３）、プロピオン酸クロベタゾール、コハク酸メチルプレドニゾロンナトリウム、酢酸ジクロリゾン、アルベンダゾール、エンチノスタット（ｍｓ−２７５）、フルニソリド、アルテニモル、アミナクリン、フルメタゾン、ロシリノスタット（ａｃｙ−１２１５）、ブロノポール、グラミシジン（グラミシジンＡと示される）、アバメクチン（アベルメクチンＢ１ａと示される）、ジスルフィラム、ジフルプレドナート、アセトリゾ酸、酢酸イソフルプレドン、ｌｙ２８３５２１９、マレイン酸ペルヘキシリン、メテルゴリン、ホルメスタン、モネンシンナトリウム、フロクスウリジン、プレドニカルベート、リン酸デキサメタゾンナトリウム、レフルノミド、プロピオン酸ハロベタゾール、シロリムス、イプリフラボン、ニンテダニブ（ｂｉｂｆ  １１２０）、ピルビニウム、パモ酸塩、ルフロキサシン塩酸塩、フォスブレタブリン（コンブレタスタチンＡ４リン酸（ＣＡ４Ｐ）、二ナトリウム、トリアムシノロン二酢酸、オテナバント（ｃｐ−９４５５９８）ｈｃｌ、アプロチニン、プロピオン酸フルチカゾン、アムバチニブ（ｍｐ−４７０）、塩化メチルベンゼトニウム、フェンベンダゾール、塩酸ブピバカイン、ベタメタゾン、ピバル酸フルメタゾン、チオグアニン、マレイン酸テガセロド、酢酸プレドニゾロン、クロリンジオン、ヘミコハク酸ヒドロコルチゾン、酢酸デキ���メタゾン、酢酸フルドロコルチゾン、イベルメクチン、プロフラビンヘミ硫酸塩、ランソプラゾール、セルデュラチニブ（ｐｒｔ０６２０７０、ｐｒｔ２０７０）、サリフンギン（ｓａｌｉｆｕｎｇｉｎ）、ハルシノニド、フドステイン、テルフェナジン、フルオシノニド、ヘキセチジン、アルテスネート、フルオシノロンアセトニド、リファンピン、トリアムシノロン、ゾルピデム、エトプロパジン、塩酸塩、レゴラフェニブ（ＢＡＹ７３−４５０６）、塩酸テラゾシン、タンシノンＩＩＡ−スルホン酸ナトリウム、ノコダゾール、トリクロサン、クロピドール、ソラフェニブトシレート、スルフィソミジン、メチレンブルー、クリゾチニブ（ｐｆ−０２３４１０６６）、プロスシラリジン、デキシブプロフェン、塩酸トリフルプロマジン、塩酸ピリベジル、カルモフール、スウェルチアマリン、スルタミシリントシレート、ジンセノサイドＲｃ、エトフィブラート、塩化セチルピリジニウム、ラベプラゾールナトリウム、塩酸アリザプリド、メチルアミノレブリン酸・ｈｃｌ、クロドロン酸二ナトリウム四水和物、アモキサピン、ベダキリン（ｔｍｃ２０７、ｒ２０７９１０）、オクテニジン、エカベトナトリウム、アピゲニン、ヨウ化グリコピロレート、ナトリウムモンモリロナイト、ヒドロコルチゾンから選択される。薬剤耐性に関連する遺伝子の阻害剤として想定されるさらなる化学物質は、ＡＲＲＢ１、ＡＴＸＮ７Ｌ３、ＣＢＸ１、ＣＲＥＢＢＰ、ＣＴＢＰ２、ＣＵＬ３、ＤＤＢ２、ＦＭＲ１、ＦＯＸＯ１、ＫＤＭ４Ｂ、ＫＭＴ２Ｅ／ＭＬＬ５、ＮＩＰＢＬ、ＯＧＦＯＤ１、ＲＢＸ１、ＳＦ３Ｂ１、ＳＦＰＱ、ＳＲＳＦ１、ＳＳＲＰ１、ＹＷＨＡＺまたはＺＭＹＮＤ１１、例えば、バルバジン、ＣＣＳ１４７７、ＳＧＣ−ＣＢＰ３０、ＣＰＩ−６３７、ＰＦ−ＣＢＰ１、ＩＣＧ−００１、ＰＲＩ−７２４、Ａ−４８５、Ｃ６４６、４−メチルチオ−２−オキソ酪酸（ＭＴＯＢ）、ＨＩＰＰ誘導体、環状ペプチドＣＰ６１、ＮＳＣ９５３９７、２−（ヒドロキシイミノ）−３−フェニルプロパン酸ならびにその４−クロロおよび３−クロロ類似体、ＭＬＮ４９２４、ＡＳ１８４２８５６、ＪＩＢ−０４、ＥＰ−５６７６、Ｎ−オキサリルグリシン（ＮＯＧ）、ピリジン−２，４−ジカルボキシレート（２，４−ＰＤＣＡ）、プラジエノライドＢ、ＩＤＣ１６、ＣＢＬ０１３７、ジフォペイン、またはＲ１８を標的とする物質を含む。
【００３５】
本発明はまた、個々に図面に示される全てのさらなる特徴を包含するが、それらは、上記または下記に記載されていない場合がある。また、図面および明細書に記載される実施形態の単一の代替物ならびにその特徴の単一の代替物は、本発明の他の態様の主題から放棄され得る。
【００３６】
さらに、特許請求の範囲において、「含む」という語は他の要素またはステップを除外せず、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は複数形を除外しない。単一のユニットが、特許請求の範囲に記載されるいくつかの特徴の機能を果たすことができる。属性または値に関連する「本質的に」、「約」、「およそ」等の用語は特に、それぞれ正確な属性または正確な値も定義する。特許請求の範囲におけるいずれの参照符号も、範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００３７】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「化合物（ａ  ｃｏｍｐｏｕｎｄ」」への言及は、１つ以上の化合物を含む。
【００３８】
「治療」、「治療すること」等の用語は、一般的に、所望の薬理学的および／または生理学的効果を得ることを意味するために本明細書において使用される。効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に防止するという点では予防的であり得、かつ／または疾患および／もしくは疾患に起因する有害作用を部分的にもしくは完全に治癒するという点では治療的であり得る。本明細書で使用される「治療」という用語は、対象における疾患の任意の治療を包含し、（ａ）疾患を予防すること、（ｂ）疾患を抑制する、すなわちその発生を阻止すること、または（ｃ）疾患を緩和する、すなわち疾患の退行を引き起こすことを含む。
【００３９】
本発明の目的のための「患者」または「対象」は互換的に使用され、ヒトおよび他の動物の両方、特に哺乳動物、および他の生物を含むことを意味する。したがって、この方法は、ヒト治療および獣医学的用途の両方に適用可能である。好ましい実施形態において、患者または対象は哺乳動物であり、最も好ましい実施形態において、患者または対象はヒトである。
【００４０】
細胞ベースのスクリーニング方法は、以下のステップを含むシグナル伝達経路の阻害剤との併用薬物療法において、過剰に活性化されたシグナル伝達経路を特徴とする細胞を特徴とする癌の治療に有効な化合物を同定するために使用することができる：ａ）前記シグナル伝達経路に含まれるタンパク質をコードする遺伝子において活性化変異または増幅を有する細胞を提供するステップ；ｂ）前記細胞を前記シグナル伝達経路の阻害剤および試験化合物と接触させるステップ；ｃ）ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２からなる群から選択される耐性の獲得に関連する遺伝子の発現レベルを決定するステップ。第２の化学物質は、ＳＯＸ２の発現を阻害することが好ましい：ｄ）前記試験化合物にスコアを割り当てるステップであって、前記スコアは、ＳＯＸ２および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子の前記発現レベルが所定の閾値を下回る場合に高く、前記閾値は、前記シグナル伝達経路の前記阻害剤のみで処理された対照細胞におけるＳＯＸ２および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子の発現レベルに対応し、前記スコアは、ＳＯＸ２および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子の前記発現レベルが前記所定の閾値以上である場合に低い、ステップ。
【００４１】
ステップａ）では、複数の細胞を同時に使用することができる：前記複数の細胞は一緒にステップｂ）に供される；前記複数の細胞について、ＳＯＸ２および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子の平均発現レベルが決定される；ＳＯＸ２および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子の前記平均発現レベルが、前記シグナル伝達経路の前記阻害剤のみで処理された対照細胞におけるＳＯＸ２および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子の平均発現レベルより低い場合、高スコアが前記試験化合物に割り当てられる。
【００４２】
特に、ステップａ）では複数のセルを同時に使用することができる；前記複数の細胞は一緒にステップｂ）に供される；単一細胞は、前記ＳＯＸ２発現レベルおよび／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子が未処理の細胞について決定された発現レベルを超える場合に「ＳＯＸ２陽性」であると評価され、前記複数の細胞について「ＳＯＸ２陽性」細胞と全細胞との比が決定される；ｄ）前記試験化合物で処理された細胞について決定された前記比が、前記シグナル伝達経路の阻害剤のみで処理された対照細胞について決定された前記比を下回る場合、高いスコアが前記試験化合物に割り当てられる。
【００４３】
当業者は、ＳＯＸ２および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子の発現レベルを決定するのに適した方法をよく知っている。特定の一実施形態において、発現レベルは、タンパク質発現および／またはｍＲＮＡ発現を分析することによって決定される。しかしながら、ゲノム、トランスクリプトームおよび／またはプロテオームに由来する情報を使用する任意の方法が、本発明において使用され得る。例えば、発現レベルは（ＳＯＸ２および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子の）タンパク質レベルで決定することができ、標識、特に抗体媒介性染色を使用して直接可視化および定量化することができる。発現レベルはまた、インサイチュハイブリダイゼーションを用いた直接的な可視化により、（ＳＯＸ２および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子の）ｍＲＮＡレベルで決定することもできる。このような技術を使用して、個々の分子を定量化することができる。
【００４４】
特定の実施形態において、耐性の獲得に関連する遺伝子は、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２からなる群から選択される。
【００４５】
したがって、本発明内では、遺伝子発現レベルは、当該技術分野で既知の任意の技術、例えばポリヌクレオチド（ｍＲＮＡ転写産物）のハイブリダイゼーションに基づく方法、ポリヌクレオチドの配列決定またはポリヌクレオチドの増幅に基づく方法を使用して決定され得る。
【００４６】
試料中のｍＲＮＡ遺伝子転写物の定量化は、限定されないが、ノーザンブロット法、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮＡｓｅプロテアーゼアッセイ、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）およびリアルタイム定量ＰＣＴ  ｑＲＴ−ＰＣＲ等のＰＣＲに基づく方法を使用して行うことができる。あるいは、核酸二本鎖に結合特異性を有する抗体を使用してｍＲＮＡレベルを決定してもよい。該当するＲＮＡに対する特異的結合メンバー、例えば、該当するＲＮＡに特異的なｃＤＮＡもしくはオリゴヌクレオチドプローブ、または該当するｍＲＮＡに特異的な抗体を使用するマイクロアレイ技術：特異的結合メンバーは、基質上に播種されるかまたはアレイ化され、例えば、スライドガラスまたはマイクロチップ基質を使用することができる。特異的結合メンバーは、アドレス可能な位置で基板上に提供されてもよく、アドレス可能な位置の数は、例えば、少なくとも３、少なくとも１０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも１０００、または少なくとも１０，０００またはそれ以上と異なり得る。実施形態において、アドレス可能な位置の数は、１０００未満、１００未満、５０未満、１０未満、または５未満と異なり得る。そのような実施形態において、試料はアレイと接触させられ、アレイ化された特異的結合メンバーは、試料中の標的と検出可能な相互作用を形成することができる。相互作用は、適切な標識を使用して検出され得る。オリゴヌクレオチドプローブが利用される場合、適切な条件下で、オリゴヌクレオチドプローブは標的核酸配列に「ハイブリダイズ」して、相補的塩基配列を有する核酸分子との塩基対二本鎖を形成することができる。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション方法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さに応じて変化するであろう。
【００４７】
ストリンジェントなハイブリダイゼーションは、核酸が最小限のバックグラウンドで標的核酸に結合すると起こる。典型的には、ストリンジェントなハイブリダイゼーションを達成するために、Ｔｍ（分子の半分がそれらのパートナーから解離する融解温度）より約１℃〜約２０℃、より好ましくは５℃〜約２０℃低い温度が使用される。しかしながら、それはイオン強度および溶液のｐＨによってさらに定義される。適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者に既知であり、例示的なハイブリダイゼーション条件は、非常に高いストリンジェンシー（少なくとも９０％の同一性を共有する配列を検出）：６５℃で約１６時間、５×ＳＳＣでハイブリダイゼーション、高ストリンジェンシー（少なくとも８０％の同一性を共有する配列を検出）：６５℃で１６時間、５×〜６×ＳＳＣでハイブリダイゼーション、低ストリンジェンシー（少なくとも５０％の同一性を共有する配列を検出）：室温〜５５℃で２０〜３０分間、６×ＳＳＣでハイブリダイゼーションである。
【００４８】
非常にストリンジェントな洗浄条件の一例は、０．１５Ｍ  ＮａＣｌ、７２℃で約１５分間である。ストリンジェントな洗浄条件の一例は、０．２×塩化ナトリウムおよびクエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）を用いて６５℃で１５分間洗浄することである（ＳＳＣ緩衝液、例えば、８００ｍｌの蒸留水に１７５．３ｇのＮａＣｌおよび８８．９ｇのクエン酸ナトリウムを溶解することによって作成される２０×ＳＳＣの説明については、下記のＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌを参照されたい。ＨＣｌ（１Ｍ）でｐＨをｐＨ７．０に調整し、蒸留水で体積を１Ｌに調整する）。多くの場合、高ストリンジェンシー洗浄の前に低ストリンジェンシー洗浄が行われ、バックグラウンドのプローブシグナルが除去される。例えば１００ヌクレオチドを超える二本鎖の中程度のストリンジェンシー洗浄の一例は、４５℃で１５分間の１×ＳＳＣである。例えば１００ヌクレオチドを超える二本鎖の低ストリンジェンシー洗浄の一例は、４０℃で１５分間の４〜６×ＳＳＣである。短いプローブ（たとえば、約１０〜５０ヌクレオチド）の場合、ストリンジェントな条件は、典型的には約１．５Ｍ未満、より好ましくは約０．０１〜１．０Ｍの塩濃度、ｐＨ７．０〜８．３のＮａイオン濃度（または他の塩）を含み、温度は、典型的には少なくとも約３０℃であり、長いプローブ（例えば、＞５０ヌクレオチド）の場合は少なくとも約６０℃である。
【００４９】
ＰＣＲ法、例えば、ＲＴ−ＰＣＲならびにＰＣＴおよびＲＴ−ＰＣＲに使用される方法は、当業者に周知であろう。
【００５０】
一部の方法は、試料からのＲＮＡの単離を必要とする場合がある。そのような単離技術は当該技術分野で既知であり、Ｑｉａｇｅｎ等の製造業者から市販されているＲＮＡ単離キットを利用することができる。
【００５１】
タンパク質発現の測定    免疫組織化学（ＩＨＣ）およびＥＬＩＳＡは、タンパク質発現を検出するのに有用な技術である。抗体または抗体の結合断片（モノクローナルまたはポリクローナル）を、開示される方法およびキットに使用することができる。抗体は、抗体の直接標識によって、または標的に対して結合特異性を有する一次抗体に特異的な二次抗体を使用することによって検出することができる。二次抗体は、検出可能な部分で標識することができるか、またはハプテン（ビオチン等）にコンジュゲートすることができ、ハプテンは、検出可能に標識された同族のハプテン結合分子、例えばストレプトアビジン西洋ワサビペルオキシダーゼによって検出可能である。
【００５２】
抗体（特定の抗原、例えばＳＯＸ２および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子に対する結合特異性を有する抗体）の結合特異性は、（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，１２０：１４３４−１４４３に記載されるように）原発腫瘍の取り扱いを模倣したホルマリン固定パラフィン包埋細胞株の免疫組織化学分析と並行して、ウエスタンブロット法を使用して確立することができる。
【００５３】
あるいは、タンパク質は、アプタマー（例えば、特定の配列依存性形状を取り、高い親和性および特異性でＦＫＢＰＬタンパク質に結合する一本鎖核酸分子（ＤＮＡまたはＲＮＡ等））、鏡像アプタマー（ＳＰＩＥＧＥＬＭＥＲ（商標））、操作された非免疫グロブリン結合タンパク質、例えば、フィブロネクチン（ＡＤＮＥＣＴＩＮＳ（商標））、ＣＴＬＡ−１（ＥＶＩＢＯＤＩＥＳ（商標））、リポカリン（ＡＮＴＩＣＡＬＩＮＳ（商標））、プロテインＡドメイン（ＡＦＦＩＢＯＤＩＥＳ（商標））等を含む足場に基づく非免疫グロブリン結合タンパク質を用いて検出されてもよい。実施形態において、アプタマーは、１００未満のヌクレオチド、７５未満のヌクレオチド、５０未満のヌクレオチド、例えば、２５〜５０ヌクレオチド、１０〜５０ヌクレオチド、１０〜１００ヌクレオチドを含み得る。
【００５４】
特定の実施形態において、ＳＯＸ２タンパク質もしくはＳＯＸ２タンパク質の断片、またはＳＯＸ２タンパク質もしくはその断片に対して結合特異性を有する抗体を含むタンパク質配列を含むアレイが提供され得る。これらのタンパク質配列または抗体は、基質にコンジュゲートすることができる。タンパク質発現の変化は、例えば、検査される試料をアレイと接触させたときに、ＳＯＸ２タンパク質および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子に対する結合特異性で抗体に結合する試料中のＳＯＸ２タンパク質および／または耐性の獲得に関連する別の遺伝子のレベルを測定することによって、検出することができる。
【００５５】
特定の実施形態において、耐性の獲得に関連する遺伝子は、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２からなる群から選択される。
【００５６】
アレイおよびアレイフォーマットでの使用に適した基質は、当業者に既知であろう。
【００５７】
特定の実施形態において、ＩＨＣ試料は、盲検分析を提供するために、自動画像分析システムを使用して分析することができる。このために、スライド全体のデジタル画像は、最初にＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＸＴスライドスキャナー（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して２０×で取得することができる。次に、陽性ピクセルカウントアルゴリズム（Ａｐｅｒｉｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＳＯＸ２発現の定量的スコアリングモデルを開発することができる。組織マイクロアレイ由来データの統計分析は、傾向のためのｖ２検定、ＳＯＸ２発現の比較のためのフィッシャー直接検定およびマン・ホイットニー検定を用いて実行することができ、カプラン・マイヤープロットは生存分析に使用することができ、ログ・ランク検定を用いて曲線を比較する。Ｃｏｘ比例ハザード回帰を使用して、前述のように比例ハザード比を推定し、多変量解析を実行する。全ての計算はＳＰＳＳ  ｖ１１．０（ＳＰＳＳ，ＩＬ）で行うことができる。さらに、個別のマルチマーカー検査の生成を容易にするために、蛍光タグ付き抗体（重複しないフルオロフォアを担持する）、次いで、追加の関連バイオマーカーを同時に使用することができる。有利には、Ａｐｅｒｉｏから最近開発された蛍光走査システム、例えば、ＳｃａｎＳｃｏｐｅ  ＦＬシステムを使用することができる。このアッセイ方法は、従来の明視野イメージングで得られるものよりも定量的な分析を提供することにより、さらなる精巧さを提供する。理解されるように、ＳＯＸ２の発現、細胞内のＳＯＸ２の位置、またはＳＯＸ２の活性を検出する方法は、本明細書に記載または請求される本発明の方法のいずれかに関連して適用可能であり得る。
【００５８】
本発明の各態様の好ましい特徴および実施形態は、文脈が他のことを要求しない限り、変更すべきところは変更して、他の各態様と同様である。
【００５９】
２つの分子がかなりの数の相補的ヌクレオチドを共有し、例えば、ワトソン・クリック塩基対を形成することによって、鎖が互いに結合（ハイブリダイズ）したときに安定した二本鎖または三本鎖を形成する場合、核酸分子は別の核酸分子と相補的であると言われる。相補性は、２つの分子の特定の領域内の２つの核酸分子間の塩基対の割合のパーセンテージとして説明され得る。
【００６０】
接触とは、ある薬剤を別の薬剤に接近させて、両方の薬剤が互いに相互作用できるようにすることを意味する。例えば、抗体または他の結合メンバーを、試料中のタンパク質に接近させることができ、抗体がタンパク質に対して結合特異性を有する場合、抗体はタンパク質に結合する。あるいは、第１の核酸を第２の相補的核酸（標的配列を有するプライマー）に接近させることができ、結合が検出され得るか、または標的配列の増幅が起こり得るようにインキュベートされ得る。
【００６１】
検出とは、２つの薬剤、例えば２つのタンパク質または２つの核酸間の相互作用が存在するかまたは存在しないかを決定することを意味する。これは定量化を含み得る。検出は、例えば分光光度法、フローサイトメトリー、または顕微鏡法を使用して検出することができる薬剤（標識）の使用を含み得る。例示的な標識は、放射性同位元素（３Ｈ、１４Ｃ、１５Ｎ、３５Ｓ、９０Ｖ、９９Ｔｃ、１１１Ｌｎ、１２５Ｉ１または１３１Ｉ等）、フルオロフォア（フルオレセイン、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン等）、発色団、リガンド、化学発光剤、生物発光剤（ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または黄色蛍光タンパク質等）、検出可能な反応生成物を生成できる酵素（西洋ワサビペルオキシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、ベータガラクトシダーゼ等）およびそれらの組み合わせを含む。
【００６２】
特異的結合とは、ある結合パートナーと別の結合パートナー、例えばプライマーと標的配列、またはタンパク質特異的抗体とタンパク質との間の特定の相互作用を意味する。１つの結合パートナーと別の結合パートナーとの間の相互作用は、１つ以上、典型的には１つより多くの非共有結合によって媒介され得る。特異的結合を特徴付ける例示的な方法は、特異的結合曲線によるものである。
【００６３】
本発明の方法のさらなる実施形態において、方法は、前記シグナル伝達経路の前記阻害剤および前記試験化合物で処理された前記細胞において、細胞周期が決定され、特に細胞周期停止が検出されるステップを含み、前記細胞が細胞周期停止を受ける場合、高いスコアが前記試験化合物に割り当てられる。
【００６４】
本発明の方法の特定の実施形態において、シグナル伝達経路は、ＭＡＰＫまたはＥＧＦＲ経路である。本発明のこの実施形態において、癌は、ＭＡＰＫまたはＥＧＦＲ経路に含まれるタンパク質をコードする遺伝子における活性化変異または増幅、特にＮＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＨＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＭＥＫ、ＥＲＫ、ＲＯＳ、ＡＬＫ、ＭＥＴ、ＫＩＴまたはＥＧＦＲにおける活性化変異または増幅を有する癌細胞によって特徴付けられ得る。次いで、癌は、非黒色腫皮膚癌、食道胃腺癌、神経膠芽腫、膀胱癌、膀胱尿路上皮癌、食道胃癌、黒色腫、非小細胞肺癌、子宮内膜癌、子宮頸部腺癌、食道扁平上皮癌、乳癌、頭頸部扁平上皮癌、胚細胞腫瘍、小細胞肺癌、卵巣癌、軟部肉腫、肝細胞癌、結腸直腸腺癌、子宮頸部扁平上皮癌、胆管細胞癌、前立腺癌、上部尿路上皮癌、びまん性神経膠腫、結腸直腸癌、膨大部癌、副腎皮質癌、頭頸部癌、腎明細胞癌、肝胆道癌、神経膠腫、非ホジキンリンパ腫、中皮腫、唾液腺癌、腎非明細胞癌、その他の神経上皮腫瘍、褐色細胞腫、胸腺腫瘍、多発性骨髄腫、腎細胞癌、骨癌、膵癌、白血病、末梢神経系腫瘍、甲状腺癌、Ｂ細胞リンパ芽球性白血病、モノクローナルＢ細胞リンパ球増加症、リンパ腫、有毛細胞白血病、急性骨髄性白血病、ウィルムス腫瘍、特に黒色腫および非小細胞肺癌から選択され得る。本発明の方法の特定の実施形態において、ステップａで提供される細胞は、黒色腫細胞、またはＢＲＡＦ変異、特にＢＲＡＦ−Ｖ６００ＥもしくはＢＲＡＦ−Ｖ６００Ｋ変異を伴う非小細胞肺癌細胞、およびＥＧＦＲ変異、増幅、または過剰発現を伴う非小細胞肺癌細胞から選択される。
【００６５】
本発明の方法において、シグナル伝達経路の阻害剤は、例えば、ＥＧＦＲ経路の阻害剤（ＥＧＦＲｉ）およびＭＡＰＫ経路の阻害剤（ＭＡＰＫｉ）から選択することができ、特に前記ＭＡＰＫｉは、Ｂ−Ｒａｆ（ＢＲＡＦｉ）の阻害剤、ＭＥＫ（ＭＥＫｉ）の阻害剤、およびＥＲＫ（ＥＲＫｉ）の阻害剤から選択される。本発明内では、そのような阻害剤は、ベムラフェニブ、ダブラフェニブ、エンコラフェニブ、ＬＧＸ８１８、ＰＬＸ４７２０、ＴＡＫ−６３２、ＭＬＮ２４８０、ＳＢ５９０８８５、ＸＬ２８１もしくはＲＡＦ２６５であり得、前記ＭＥＫｉは、ＡＺＤ６２４４、トラメチニブ、セルメチニブ、コビメチニブ、ビニメチニブ、ＭＥＫ１６２、ＲＯ５１２６７６６、ＧＤＣ−０６２３、ＰＤ  ０３２５９０１、ＣＩ−１０４０もしくはＴＡＫ−７３３であり得、前記ＥＲＫｉは、ウリキセルチニブ、ＳＣＨ７７２９８４、ＸＭＤ８−９２、ＦＲ  １８０２０４、ＧＤＣ−０９９４、ＥＲＫ５−ＩＮ−１、ＤＥＬ−２２３７９、ＢＩＸ  ０２１８９、ＥＲＫ阻害剤（ＣＡＳ番号１０４９７３８−５４−６）、ＥＲＫ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号３３１６５６−９２−９）、ＧＤＣ−０９９４もしくはＶＴＸ１１ｅであり得るか、または前記ＥＧＦＲｉは、セツキシマブ、パニツムマブ、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズマブ、ゲフィチニブ、エルロチニブ、ラパチニブ、ＡＰ２６１１３、ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号８７９１２７−０７−８）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤（ＣＡＳ番号８８１００１−１９−０）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２阻害剤（ＣＡＳ番号１７９２４８−６１−４）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩ（ＢＩＢＸ１３８２、ＣＡＳ番号１９６６１２−９３−８）、ＥＧＦＲ阻害剤ＩＩＩ（ＣＡＳ番号７３３００９−４２−２）、ＥＧＦＲ／ＥｒｂＢ−２／ＥｒｂＢ−４阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ番号９４４３４１−５４−２）もしくはＰＫＣβＩＩ／ＥＧＦＲ阻害剤（ＣＡＳ番号１４５９１５−６０−２）であり得る。
【００６６】
本発明、特に本発明の方法の文脈において、「シグナル伝達経路に含まれるタンパク質」という用語は、細胞内で相互作用して、増殖、分化またはアポトーシス等の特定の細胞機能を制御する分子に関する。１つのシグナル伝達経路に含まれる分子は、協調的活性化カスケードの一部である。刺激を受けると、経路内の最初の分子が１つ以上の下流分子を活性化する。活性化は、活性化鎖の最後の分子が活性化され、細胞機能が実行されるまで伝えられる。ＭＡＰＫ経路に関して、これは、ＮＧＦ、ＮＲＧ、ＢＤＮＦ、ＮＴ３／４、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＰＤＧＦ、ＣＡＣＮ、ＴｒｋＡ／Ｂ、ＥＧＦＲ、ＦＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ、ＲＯＳ、ＡＬＫ、ＭＥＴ、ＫＩＴ、ＧＦＢ２、ＳＯＳ、ＨＲＡＳ、ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＲａｓＧＲＦ、ＲａｓＧＲＰ、ＣＮａｓＧＥＦ、ＰＫＣ、ＰＫＡ、Ｒａｐ１、Ｇ１２、Ｇａｐ１ｍ、ＮＦ１、ｐ１２０ＧＡＦ、ＲａｆＢ、ＡＲＡＦ、ＢＲＡＦ、ＣＲＡＦ、Ｍｏｓ、ＭＥＫ１、ＭＥＫ２、ＭＰ１、ＥＲＫ１、ＥＲＫ２、ＰＴＰ、ＭＫＰ、Ｔａｕ、ＳＴＭＮ１、ｃＰＬＡ２、ＭＮＫ１／２、ＲＳＫ２、ＣＲＥＢ、Ｅｌｋ−１、Ｓａｐ１ａ、ｃ−Ｍｙｃ、ＳＲＦ５およびｃ−ｆｏｓを含む群から選択される特定のリガンド、受容体、および下流転写因子に関する。
【００６７】
本発明の文脈における「活性化変異」という用語は、遺伝子産物の活性の増加をもたらす、遺伝子のヌクレオチド配列の変化に関する。増加した活性は、酵素活性の増強、半減期の延長、または遺伝子産物の過剰発現に起因し得る。
【００６８】
本発明の文脈における用語「ＳＯＸ２の転写制御下にある遺伝子」は、ＳＯＸ２が同じ細胞で発現されない場合の第１の発現レベル、およびＳＯＸ２が同じ細胞で発現される場合の第２の発現レベルを特徴とする遺伝子に関する。第１の発現レベルは２番目の発現レベルよりも低い。特定の実施形態において、耐性の獲得に関連する遺伝子は、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２からなる群から選択される。
【００６９】
特定の実施形態において、本発明は、癌患者において、患者が癌の治療に有効な化学物質または化合物に対する耐性を獲得するリスクがあるかどうかを決定する細胞ベースの方法を提供する。癌は、過剰に活性化されたシグナル伝達経路によって特徴付けられる細胞によって特徴付けられる。過剰活性化は、シグナル伝達経路で作用するタンパク質をコードする遺伝子の活性化変異または増幅によって引き起こされ得る。当業者は、シグナル伝達経路の過剰活性化が、ＮＦ１等のシグナル伝達経路の阻害剤をコードする遺伝子の阻害変異または欠失によっても引き起こされ得ることを認識している。これらの化合物は、それぞれの過剰に活性化されたシグナル伝達経路の阻害剤を含む併用薬物療法における癌の治療に有効である。
【００７０】
この点において、本発明者らは、驚くべきことに、変異ＢＲＡＦおよびＭＥＫの阻害剤（これ以降、集合的にＭＡＰＫ阻害剤、ＭＡＰＫｉと称される）が、薬物適用から数時間以内に黒色腫細胞に急性転写応答（すなわち適応耐性プログラム：ＡＲＰ）を誘導することを発見した。これらのＡＲＰは、ＳＯＸ２に依存する幹細胞性、軸索ガイダンス、およびＥＭＴ（上皮から間葉への移行）遺伝子の転写誘導に関与し、薬剤耐性細胞のプールの生成をもたらす（図１）。これらの薬剤耐性細胞は、長期的に獲得耐性の発生を引き起こし得る。薬剤耐性細胞の数は、幹細胞性のマスターレギュレーターであり、ＭＡＰＫｉ誘導性ＡＲＰの主要なドライバーであるＳＯＸ２のｓｉＲＮＡ媒介ノックダウンによって大幅に減少させることができる（図２）。結果として、臨床状況においてＭＡＰＫｉ誘導性ＳＯＸ２を鈍らせることによりＡＲＰの誘導を防止することは、獲得薬剤耐性を防止するための最高の治療的価値があり、したがって臨床で使用されるＭＡＰＫ阻害剤の耐久性を拡張する。
【００７１】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本発明が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、適切な方法および材料を以下に記載する。矛盾する場合、定義を含む本明細書が優先する。さらに、材料、方法、および例は、単なる例示であり、限定的であることを意図するものではない。
【００７２】
本発明の態様は、本発明の実施形態およびその多くの利点のより良い理解を提供する以下の例示的な非限定例によってさらに説明される。以下の実施例は、本発明の好ましい実施形態を示すために含まれる。以下の実施例で開示される技術は、本発明の実施において良好に機能するように本発明において使用される技術を表し、したがって、その実施のための好ましい様式を構成すると見なされ得ることが当業者によって理解されるべきである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更がなされ得、本発明の主旨および範囲から逸脱することなく、同様または類似の結果を依然として得ることができることを理解するはずである。
【００７３】
別段の指示がない限り、例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ，Ｒｕｓｓｅｌｌの「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ」、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＮＹ（２００１）に記載されているように、確立された組換え遺伝子技術の方法が使用された。
【００７４】
特許出願、製造業者のマニュアル、および科学出版物を含む多くの文書が本明細書に引用される。これらの文書の開示は、本発明の特許性に関連するとは見なされないが、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。より具体的には、全ての参考文書は、個々の文書が参照により具体的かつ個別に組み込まれていることが示されているかのように、参照により組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００７５】
【図１】ＲＮＡ−Ｓｅｑによって分析されたＭＡＰＫｉによる急性治療時の幹細胞性およびＥＭＴ特性の誘導を示す。（Ａ）Ａ３７５−Ｐ細胞をＰＬＸ４７２０（ＢＲＡＦｉ）またはＤＭＳＯで６時間処理し、ＲＮＡを単離してＲＮＡ−Ｓｅｑを行った。散布図は、正規化された最小存在量が≧０．５ＲＰＫＭである全ての遺伝子を示す。経路解析のために選択された差次的に発現する遺伝子（ＤＥＧ）は、転写変化の方向に応じて赤および青の点で表される（赤い遺伝子はＰＬＸ４７２０で誘導され、青い遺伝子はＰＬＸ４７２０で抑制される）。（Ｂ）分析されたＤＥＧの有意な濃縮を伴う上位５つの経路を示す棒グラフ。バーが長いほど、より強い有意性を示す。（Ｃ）ＰＬＸ４７２０（左の列）による処理時の上位の無秩序な遺伝子。ＰＬＸ４７２０によって誘導および抑制される上位の遺伝子は、個別のリストに示される。（Ｄ）指示された細胞株を１μＭ  ＰＬＸ４７２０または０．０１％  ＤＭＳＯ（０時間）で指示された時間処理し、幹細胞性／ＥＭＴに関連する選択された遺伝子の発現変化をｑＰＣＲにより確認した。全ての細胞株は、ＢＲＡＦ阻害時に同様の適応遺伝子プログラムを発現した。示されるデータは、独立した生物学的トリプリケートの平均±ＳＥＭを表す。（Ｅ）（Ｄ）に示されるのと同じ実験のウエスタンブロット分析。幹細胞性の特徴における主要なプレーヤーとして、ＳＯＸ２レベルを評価した。Ｐ−ＥＲＫ１／２レベルは陽性処理対照として機能した。総ＥＲＫ１／２レベルは負荷対照として機能した。（Ｆ）Ａ３７５−Ｐ細胞を１μＭ  ＰＬＸ４７２０、０．５μＭ  ＡＺＤ６２４４（ＭＥＫ１／２阻害剤）または０．０１％  ＤＭＳＯで示される時間処理し、ＳＯＸ２レベルをウエスタンブロット分析により評価した。ＢＲＡＦの阻害とＭＥＫ１／２の阻害が同様のＳＯＸ２レベルを誘導することに留意されたく、これが発癌性ＭＡＰＫ阻害の一般的な特徴であることが示唆される。（Ｇ）Ａ３７５−Ｐ細胞を、１μＭ  ＰＬＸ４７２０（ＢＲＡＦｉ）、０．５μＭ  ＡＺＤ６２４４（ＭＥＫｉ）、両方の薬物の組み合わせ、または０．０１％  ＤＭＳＯで示される時間処理し、ＳＯＸ２レベルをウエスタンブロット分析により評価した。ＢＲＡＦｉとＭＥＫｉはＳＯＸ２レベルに同等の効果があり、両方の薬物の組み合わせによりＳＯＸ２レベルがわずかに高くなることに留意されたい。（Ｈ）Ａ３７５−Ｐ細胞を１μＭ  ＰＬＸ４７２０（ＢＲＡＦｉ）、０．５μＭ  ＡＺＤ６２４４（ＭＥＫｉ）、両方の薬物の組み合わせ、または０．０１％  ＤＭＳＯで２４時間処理し、幹細胞性／ＥＭＴに関連する選択された遺伝子の発現変化をｑＰＣＲによって確認した。ＢＲＡＦｉとＭＥＫｉは転写産物レベルに同等の効果があり、転写産物の誘導では、両方の薬物の組み合わせがやや効率的であったことに留意されたい。全てのウエスタンブロットについて、少なくとも２つの独立した実験で個々の時点を評価した。代表的なデータが示される。
【図２】ＭＡＰＫｉによって誘導される抗増殖効果からのＳＯＸ２の保護効果を示す。（Ａ）Ａ３７５−Ｐ細胞に、ＳＯＸ２を標的とする１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡまたは陰性対照ｓｉＲＮＡをトランスフェクトした。次いで、細胞をＰＬＸ４７２０（ＢＲＡＦｉ）またはＤＭＳＯで４８時間処理した。採取の２時間前に、細胞を３ｕＭ  ＥｄＵでパルスし、循環細胞を標識した。ＥｄＵ陽性細胞はフローサイトメトリーを使用して検出した。ＢＲＡＦが活性（ＤＭＳＯ）の場合、ＳＯＸ２ノックダウンは細胞増殖に影響を与えないが、ＢＲＡＦｉ条件では薬剤耐性の循環細胞のプールを減少させることに留意された。代表的なデータが示される。（Ｂ）実験（Ａ）の定量化各条件について、ＳＯＸ２のｓｉＲＮＡノックダウン時の循環細胞のパーセンテージを陰性対照ｓｉＲＮＡに対して正規化した。示されるデータは、独立した生物学的トリプリケートの平均±ＳＥＭを表す。（Ｃ）ｐＴＲＩＰＺ−ＳＯＸ２ベクターで安定に形質導入されたＡ３７５−Ｐ細胞を、示される濃度のドキシサイクリンで３日間、または１μＭ  ＰＬＸ４７２０（ＰＬＸ）で２４時間処理した。ＳＯＸ２の過剰発現は、ウエスタンブロット分析により確認した。ラミンＡは負荷対照として機能した。個々の濃度を少なくとも２つの独立した実験で評価した。代表的な結果が示される。（Ｄ）Ａ３７５−Ｐ／ｐＴＲＩＰＺ対照または−ＳＯＸ２細胞を、０ｎｇ／ｍｌ（陰性コントロール）または５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで２４時間前処理し、その後ＤＭＳＯまたはＰＬＸ４７２０でさらに４８時間処理した。採取の２時間前に、細胞を３ｕＭ  ＥｄＵでパルスし、循環細胞を標識した。ＥｄＵ陽性細胞はフローサイトメトリーを使用して検出した。示されるデータは、ドキシサイクリンなしの条件における循環細胞のパーセンテージに正規化されている。独立した生物学的トリプリケートの平均±ＳＥＭが示される。（Ｅ）Ａ３７５−Ｐ／ｐＴＲＩＰＺ対照または−ＳＯＸ２細胞を、０ｎｇ／ｍｌ（陰性コントロール）または５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで２４時間前処理し、その後ＰＬＸ４７２０の連続希釈でさらに４日間処理した。細胞生存率をＰｒｅｓｔｏＢｌｕｅアッセイにより評価し、ＩＣ５０値を計算した。ドキシサイクリンはｐＴＲＩＰＺ対照細胞に影響を与えないが、ｐＴＲＩＰＺ−ＳＯＸ２細胞の生存曲線を右にシフトすることに留意されたく、ＳＯＸ２が過剰発現すると薬剤感受性が低下することが示唆される。ＩＣ５０値は生存曲線の上に記載される。示されるデータは、ＤＭＳＯ処理された細胞に対して正規化されている。エラーバーは、３つの独立した実験のＳＥＭを示す。（Ｆ）Ａ３７５−Ｐ／ｐＴＲＩＰＺ対照または−ＳＯＸ２細胞を、０ｎｇ／ｍｌ（陰性コントロール）または５０ｎｇ／ｍｌのドキシサイクリンで２４時間前処理し、その後ＤＭＳＯまたはＰＬＸ４７２０でさらに４８時間前処理した。生存シグナル伝達はウエスタンブロットによって評価した。Ｓ６ＫおよびＢＡＤを介した生存シグナル伝達はＰＬＸ４７２０によって抑制されるが、ＳＯＸ２がドキシサイクリン処理によって過剰発現されるとレスキューされる。
【図３】化合物ウェルの配置のヒートマップ表現。陰性：ＤＭＳＯ、陽性：５ｕＭ  エンチノスタット、ｃ：５μＭ試験化合物、ｒ１：１ｕＭエンチノスタット、ｒ３：３ｕＭ  エンチノスタット、ｒ１０：１０ｕＭエンチノスタット。
【図４】元の蛍光ｆｌ２およびｆｌ３、ならびにそれらの比ｙを示す対照ウェルの対数変換したシグナル。ｙ軸のスケーリングは、１％〜９９％分位点の間である。
【図５】正規化前（ｙ）および正規化後（正規化シグナル）の対照ウェルの対数変換したシグナル。ｙ軸のスケーリングは、１％〜９９％分位点の間である。
【図６】最初の４つのプレートの、行または列の番号に対する原シグナル。存在する場合、体系的な行または列の効果を特定することができる。
【図７】最初の４つのプレートの、行（Ａ、Ｃ）または列（Ｂ、Ｄ）の番号に対する正規化されたシグナル（Ａ、Ｂ）および形状補正を行ったシグナル（Ｃ、Ｄ）。体系的な行または列の効果はもはや確認されない。
【図８】対照および化合物の分布。（Ａ）経験的確率密度、（Ｂ）分位点−分位点プロット、（Ｃ）プレートごとのＭＡＤ対プレートごとの中央値。（Ｄ）Ｐ値分布（ＰＶＤ）。通常のＰＶＤは、２つの異なる形状を有し得る：（ｉ）ＤＥＧがない場合は均一（密度＝１のプラトー）。（ｉｉ）小さなｐ値のピークおよびｐ−＞１でのプラトー＜１：プラトー値はＤＥＧの割合に対応する。他の形状はいずれも不規則であり、感受性はモデルの仮定の違反を示す。
【図９】全てのウェルの火山プロットは、偽発見率（ＦＤＲ）の負の対数として表される検定の有意性と、倍率変化の対数として表される効果量との関係を示している。水平線はＦＤＲ＝０．０１に対応し、この線の下の化合物には「有意ではない」と見なされる。２つの垂直線は、活性における０．５の変化に対応し、この範囲外の化合物は「強い」と見なされる。
【００７６】
実施例１．耐性の獲得を決定する方法
１．腫瘍切片の調製とエクスビボ治療
過剰な腫瘍組織は、低温の無血清ＲＰＭＩ  １６２０  Ｇｌｕｔａｍａｘに４℃で最大２４時間保存してから処理した。大きな生検は最大直径約１ｃｍにトリミングした。
【００７７】
５０ｍｌファルコンチューブを４０ｍｌの目盛りで切断し、底部を廃棄した。短縮したファルコンチューブの蓋に生検を入れた。液体４％低温アガロース（ＳｅａＰｌａｑｕｅ  Ａｇａｒｏｓｅ、Ｌｏｎｚａ）で４５ｍｌの目盛りまでチューブを充填した。アガロースを氷上で固化させた。
【００７８】
固化してから、アガロースブロックをファルコンチューブから取り出し、長方形にトリミングした。組織生検の左側および右側のアガロースを約２ｍｍ残した。組織生検の上側および下側のアガロースを約５ｍｍ残して、切断プロセスの間に組織がアガロースから押し出されないようにした。
【００７９】
トリミングされたアガロースブロックを、シアノアクリレート接着剤を使用してビブラトーム（Ｌｅｉｃａ  ＶＴ１０００  Ｓ振動刃ミクロトーム）の検体ホルダーに接着し、室温で乾燥させた。乾燥してから、検体ホルダーをバッファトレイに嵌め込み、バッファトレイを氷浴トレイに取り付けた。バッファトレイに氷冷ＰＢＳを充填した。約０．３０ｍｍ／秒の速度および約０．７０ｍｍの振動振幅で、生検を厚さ４００μｍの切片に切断した。
【００８０】
１×抗生物質−抗真菌剤（Ｇｉｂｃｏ）および１０％ＦＣＳを含有する１ｍｌのＰＲＭＰ  １６２０  Ｇｌｕｔａｍａｘを６ウェルプレートの各ウェルに加えた。１つのＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサート（Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌセルカルチャーインサート、３０ｍｍ、親水性ＰＴＦＥ、０．４μｍ）を各ウェルに移した。いくつかの切片を１つのＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサートに移した。切片を加湿細胞培養インキュベーター（２１％Ｏ２、５％ＣＯ２）中に維持し、２４時間回復させた。
【００８１】
回復後、１ｍｌのＰＲＭＰ  １６２０  Ｇｌｕｔａｍａｘ（１×抗生物質−抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＣＳ）および０．０１％ＤＭＳＯ（対照生検用）または０．５μＭセルメチニブ（処理生検用）のいずれかを含む６ウェルプレートのウェルに移すことによりＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサートをすすいだ。
【００８２】
次いで、１ｍｌのＰＲＭＰ  １６２０  Ｇｌｕｔａｍａｘ（１×抗生物質−抗真菌薬（Ｇｉｂｃｏ）、１０％ＦＣＳ）および０．０１％ＤＭＳＯ（対照生検用）または０．５μＭセルメチニブ（処理生検用）のいずれかを含む新しいウェルにインサートを移した。生検を加湿細胞培養インキュベーターで１６時間〜４８時間インキュベートした。
【００８３】
２．腫瘍切片の遺伝子発現分析
遺伝子発現を分析するために、滅菌ピンセットを使用して腫瘍切片をＥｐｐｅｎｄｏｒｆセーフロック微量遠心チューブ（２．０ｍｌ、丸底）に移し、計量し、液体窒素で瞬間凍結し、さらに使用するまで−８０℃で保存した。組織の重量に応じてＲＮｅａｓｙ  ＭｉｎｉまたはＭｉｃｒｏ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、製造業者の指示に従ってＲＮＡを単離し、１０〜３０μｌのＲＮａｓｅ不含水で溶出し、−８０℃で保存した。ＲＮＡ濃度および純度は、ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して分光光度法で測定した。Ｈｉｇｈ−ｃａｐａｃｉｔｙ  ｃＤＮＡ逆転写キット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、製造業者の指示に従ってＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写した。２０μｌの反応物ごとに、Ｒｏｃｈｅ  ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０マルチウェルプレートで以下の混合物を調製した：３μｌの水、１μｌの５μＭフォワードプライマー、１μｌの５μＭリバースプライマー、１０μｌのＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｉ  Ｍａｓｔｅｒ（２×）またはＫＡＰＡ  ＳＹＢＲ（登録商標）ＦＡＳＴ  ｑＰＣＲキット、５μｌのｃＤＮＡ［５ｎｇ／μｌ］。試料を２通りピペッティングした。９６ウェルプレートを２０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、４５サイクルの標準ｑＲＴ−ＰＣＲプロトコルを使用してＬｉｇｈｔＣｙｌｃｅｒ  ４８０デバイス（Ｒｏｃｈｅ）で実行した。相対的遺伝子発現レベルは、ΔΔＣｔ法｛Ｌｉｖａｋ：２００１ｉｓ｝を使用して計算し、ＧＡＰＤＨ、ＴＢＰまたはＨＰＲＴに正規化した。
【００８４】
腫瘍切片がエクスビボでの短期セルメチニブ処理後に、同じ腫瘍生検からの対照処理切片と比較して、ＳＯＸ、Ｎａｎｏｇ、ＯＣＴ４、ＦＧＦ４、ＦＢＸ１５、ＦＯＸＰ４、ＫＬＦ９、ＣＤ２４、ＣＤ２７１、ＣＤ３６、ＩＴＬＮ２、ＴＮＦＳＦ１２、ＮＯＸ３、ＣＬＥＣ７Ａ、ＡＣＹＡＰ１、ＵＮＣ５Ｃ、ＵＮＣ５Ｄ、ＭＵＣ１６、ＶＡＶ３、ＦＯＸＤ３、ＶＧＬＬ３、ＡＬＰＰ、Ｃ３、Ｆ２Ｒ、ＥＮＰＰ２、ＥＴＶ４、ＮＴＮＧ１、ＮＴＲＫ２、ＲＯＢＯ１およびＲＯＢＯ２を含む群から選択される耐性の獲得に関連する遺伝子をより多く発現する患者は、セルメチニブベースの癌治療に対して耐性を示す可能性がある。
【００８５】
３．腫瘍切片の免疫組織化学的分析
組織切片への損傷を防ぐために、ニトロセルロース膜の小さなストリップを使用して、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサートから持ち上げた。次いで、組織切片を含むストリップを４％パラホルムアルデヒドに移した。２４時間後、ニトロセルロース膜が付着した腫瘍切片を７０％エタノールに移すか、または直接パラフィンに包埋し、標準プロトコルに従って切片化した。圧力鍋を使用して、ＥＤＴＡバッファ（ｐＨ９）（Ｄａｋｏ  Ｓ２３６７）中、９８℃で２０分間パラフィン切片を加熱した。切片をペルオキシダーゼブロック（Ｄａｋｏ  Ｓ２０２３）で１０分間ブロックし、希釈バッファ（Ｄａｋｏ  Ｓ２０２２）中で２ｕｇ／ｍｌに希釈した抗ＳＯＸ２抗体（ｓｃ３６５８２３）で１時間インキュベートし、二次抗体（Ｅｎｖｉｓｉｏｎマウス、Ｄａｋｏ  Ｋ４００１）で３０分間インキュベートした。全てのステップは室温で行った。核対比染色は、ギルヘマトキシリンＩＩ染色液（Ｍｅｒｃｋ  １０５１７５２５００）を使用して２秒間行った。脱水後、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ  Ｆｉｌｍ  Ｃｏｖｅｒｓｌｉｐｐｅｒ（Ｓａｋｕｒａ、４７４２）を使用してスライドをカバースリップで覆った。
【００８６】
腫瘍切片がエクスビボでの短期セルメチニブ処理後に、同じ腫瘍生検からの対照処理切片と比較してより多くのＳＯＸ２を発現する患者は、セルメチニブベースの癌治療に対して耐性を示す可能性がある。
【００８７】
実施例２．耐性阻害剤と組み合わせて癌の治療に使用するための化合物
１．スクリーニングおよび取得
１日目に、Ａ３７５細胞を、１ウェルあたり１４００細胞で、１０％ＦＣＳおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンを補充したＤＭＥＭ中の３８４ウェルプレートに播種した。プレートを加湿細胞培養インキュベーター（２１％Ｏ２、５％ＣＯ２）中に維持し、１６時間回復させた。２日目に、それぞれ、最終濃度１ｕＭおよび０．５ｕＭのＰＬＸ４７２０およびＡＺＤ６２４４で細胞を処理した。同時に、最終濃度５ｕＭのＦＤＡ承認済みの薬物のライブラリー（表１）で細胞を処理した。プレートを加湿細胞培養インキュベーター（２１％Ｏ２、５％ＣＯ２）中に維持し、２４時間回復させた。３日目に、プレートをＰＢＳで３回洗浄し、室温で１０分間、最終濃度２％のＰＦＡで固定した。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、最終濃度０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＰＢＳ中）とともに４℃で１０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、最終濃度０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ（ＰＢＳ中）とともに４℃で１０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、最終濃度１％のグリシン（ＰＢＳ中）とともに４℃で１０分間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、最終濃度０．８μｇ／ｍｌのＳｏｘ−２抗体（ＳａｎｔａＣｒｕｚ、Ｅ−４、ｓｃ−３６５８２３）（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０／ＰＢＳ中）とともに一晩インキュベートした。４日目に、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。プレートを最終濃度２μｇ／ｍｌの二次抗体（Ａ−１１０２９、ヤギ抗マウスａｌｅｘａ−４８８、２ｍｇ／ｍｌ）（ＣＭＦ−ＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０で希釈）とともに室温で１時間インキュベートした。プレートをＰＢＳで３回洗浄し、最終濃度６．７ｕｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウムおよび０．２ｍｇ／ｍｌのＲｎａｓｅ  Ａとともに室温で１時間インキュベートした。１時間後、ａｃｕｍｅｎ  ｃｅｌｌｅｓｔｉａ（ＴＴＰ  Ｌａｂｔｅｃｈ）でプレートを読み取った。このため、フルオロフォアを４８８ｎｍで励起し、ＦＬ３（核染色）およびＦＬ２（二次抗体）でシグナルを測定した。スクリーニングは１か月以内に重複して実行した。
【００８８】
２．前処理
プレート間の体系的な変動は、標準的な正規化手順によって取り除く（Ｍａｌｏ，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，２００６）。一般的な慣行に従って、アッセイの品質はＺ’値に基づいて評価する。プレートの調製中に、プレート内の行方向または列方向のストライプパターンとエッジ効果が発生する可能性がある。これらのパターンは、Ｔｕｃｋｅｙの中央値分散分析法（Ｔｕｋｅｙ，Ｒｅａｄｉｎｇ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ：Ａｄｄｉｓｏｎ−Ｗｅｓｌｅｙ，１９７７）を使用するか、またはｌｏｅｓｓ関数を使用して平滑化多項式を差し引くことにより除去される（Ｂｏｕｔｒｏｓ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００６）。
【００８９】
３．差次的活性分析
差次的活性は、Ｐｒｕｍｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ（Ｐｒｕｍｍｅｒ，Ｊ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｃｒｅｅｎ，２０１２）に概略が記載されたワークフローに従って分析した。端的に言えば、化合物の各単回投与測定について、その活性が陰性対照と区別できないというＮｕｌｌ仮説に対してＺ検定が行われる。これが有効であるためには、陰性対照の活動の分布が正常であることを確認する。分布の平均と分散は、各プレートについてロバストに推定され、適切な場合、連続するプレートの範囲にわたって平滑平均化される。
【００９０】
半自動ワークフローは、統計計算のためのＲ環境に実装される（Ｈｕｂｅｒ，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，２０１５）。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図２Ｆ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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