(57)【要約】本発明は、サイトカイン受容体の第１の鎖の細胞外ドメインに構成的に結合する抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、およびサイトカイン受容体の第２の鎖の細胞内ドメインを含むキメラポリペプチドであって、細胞内で発現されると、サイトカイン受容体の内在性の第１の鎖に結合し、構成的サイトカインシグナル伝達を引き起こす、キメラポリペプチドを提供する。一局面において、上記サイトカイン受容体の上記第１の鎖がＩ型サイトカイン受容体γ鎖であり、上記サイトカイン受容体の上記第２の鎖がＩ型サイトカイン受容体α鎖またはβ鎖である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
サイトカイン受容体の第１の鎖の細胞外ドメインに構成的に結合する抗原結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
前記サイトカイン受容体の第２の鎖の細胞内ドメイン
を含むキメラポリペプチドであって、
細胞内で発現されると、前記サイトカイン受容体の内在性の前記第１の鎖に結合し、構成的サイトカインシグナル伝達を引き起こす、キメラポリペプチド。
【請求項２】
前記サイトカイン受容体の前記第１の鎖がＩ型サイトカイン受容体γ鎖であり、前記サイトカイン受容体の前記第２の鎖がＩ型サイトカイン受容体α鎖またはβ鎖である、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項３】
前記サイトカイン受容体の前記第１の鎖がＩ型サイトカイン受容体α鎖またはβ鎖であり、前記サイトカイン受容体の前記第２の鎖がＩ型サイトカイン受容体γ鎖である、請求項１に記載のキメラポリペプチド。
【請求項４】
前記Ｉ型サイトカイン受容体α鎖またはβ鎖が、以下：ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１３受容体およびＩＬ−１５受容体の１つ由来である、請求項２または３に記載のキメラポリペプチド。
【請求項５】
前記Ｉ型サイトカイン受容体α鎖またはβ鎖がＩＬ−７受容体α鎖である、請求項４に記載のキメラポリペプチド。
【請求項６】
前記抗原結合ドメインが、前記サイトカイン受容体の前記第１の鎖の前記細胞外ドメインに結合するｄＡｂまたはｓｃＦｖを含む、前記請求項のいずれかに記載のキメラポリペプチド。
【請求項７】
サイトカイン受容体の第１の鎖に会合した前記請求項のいずれかに記載のキメラポリペプチドを含む、構成的に活性のあるサイトカイン受容体。
【請求項８】
サイトカイン受容体の内在性の第１の鎖に会合した請求項１から６のいずれかに記載のキメラポリペプチドを含む、構成的に活性のあるサイトカイン受容体を含む細胞。
【請求項９】
キメラ抗原受容体または操作されたＴ細胞受容体も含む、請求項８に記載の細胞。
【請求項１０】
請求項１から６のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードする核酸配列。
【請求項１１】
請求項１から６のいずれかに記載のキメラポリペプチドをコードする第１の核酸配列およびキメラ抗原受容体または操作されたＴ細胞受容体をコードする第２の核酸を含む核酸構築物。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸配列または請求項１１に記載の核酸構築物を含むベクター。
【請求項１３】
請求項１０に記載の核酸配列、請求項１１に記載の核酸構築物、または請求項１２に記載のベクターを細胞に導入するステップを含む、請求項８または９に記載の細胞を作製するための方法。
【請求項１４】
細胞内で構成的サイトカインシグナル伝達を誘導するための方法であって、前記細胞内で請求項１から６のいずれかに記載のキメラポリペプチドを発現させるステップを含む方法。
【請求項１５】
細胞内で有害なサイトカインシグナル伝達をブロックするための方法であって、前記細胞内で請求項１から６のいずれかに記載のキメラポリペプチドを発現させるステップを含み、抗原結合ドメインが共通ガンマ鎖に構成的に結合し、１つまたは複数の有害なサイトカインが共通ガンマ鎖を含むサイトカイン受容体を通ってシグナルを送る、方法。
【請求項１６】
請求項８または９に記載の複数の細胞を含む医薬組成物。
【請求項１７】
疾患を処置および／または予防するための方法であって、請求項１６に記載の医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法。
【請求項１８】
（ｉ）被験体から細胞を含有する試料を単離するステップ、
（ｉｉ）前記細胞を、請求項１０に記載の核酸配列、請求項１１に記載の核酸構築物または請求項１２に記載のベクターで形質導入またはトランスフェクションするステップ、および
（ｉｉｉ）前記被験体に（ｉｉ）の細胞を投与するステップ
を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記疾患ががんである、請求項１７または１８に記載の方法。
【請求項２０】
疾患の処置および／または予防で使用するための、請求項１６に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、請求項８または９に記載の細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、細胞内で発現されると、構成的サイトカインシグナル伝達を引き起こすキメラポリペプチドに関する。本発明はまた、このようなキメラポリペプチドおよび必要に応じてキメラ抗原受容体または操作されたＴ細胞受容体を細胞表面で発現する細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
治療用モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、２重特異性Ｔ細胞エンゲージャーおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むいくつかの免疫治療剤が、がん処置で使用するために記載されてきた。
【０００３】
キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能に移植したタンパク質である。キメラ抗原受容体の通常の形態は、抗原認識アミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメイン全てがＴ細胞生存および活性化シグナルを伝達する複合細胞内ドメインに連結した、Ｉ型膜貫通ドメインタンパク質の形態である。
【０００４】
これらの分子の最も一般的な形態は、スペーサーおよび膜貫通ドメインを介してシグナル伝達細胞内ドメインに融合した、標的抗原を認識するモノクローナル抗体から得られた１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）の融合体である。このような分子は、その標的のｓｃＦｖによる認識に応答して、Ｔ細胞の活性化を引き起こす。Ｔ細胞がこのようなＣＡＲを発現すると、Ｔ細胞は標的抗原を発現する標的細胞を認識し死滅させる。いくつかのＣＡＲが腫瘍関連抗原に対して開発されており、このようなＣＡＲ発現Ｔ細胞を使用する養子移入アプローチは現在、様々ながんの処置のために臨床試験に入っている。
【０００５】
ＣＡＲＴ細胞の生着および増殖
ＣＡＲＴ細胞の機能は、患者内での細胞の生存および生着に左右される。ＡＬＬのような一部の状況では、最高９ヵ月のＣＡＲ−Ｔ細胞の生存が、再発の防止および持続した寛解の達成のために重要であると考えられる。
【０００６】
ＣＡＲＴ細胞の存続および生存は、サイトカインの投与によって増強することができる。ＣＡＲ−Ｔ細胞はまた、ｉｎ  ｓｉｔｕでサイトカインを分泌するように操作されたこともある。しかし、これらのアプローチ両方に関連した利点がある。例えば、サイトカインの全身投与は毒性であることがあり、サイトカインの構成的生成は、制御されていない増殖および形質転換を引き起こすことがある（Nagarkatti  et  al  (1994)  PNAS  91:7638-7642;  Hassuneh  et  al  (1997)  Blood  89:610-620）。
【０００７】
代わりのアプローチは、細胞を構成的サイトカイン受容体を有するように操作することである。例えば、ＷＯ２０１７／０２９５１２は、サイトカイン受容体細胞内ドメインを「Ｆａｂ」型細胞外ドメインに結合することによって作製された構成的に活性のあるサイトカインシグナル伝達キメラ膜貫通タンパク質について記載している（図２を参照のこと）。この構造は、抗体の天然の２量体形成成分、すなわち重鎖および軽鎖定常領域の２量体形成ドメインを使用している。キメラ膜貫通タンパク質は、細胞内ドメインとして２つの鎖、例えば、抗体軽κ鎖およびＩＬ２受容体共通γ鎖を含む第１のポリペプチド、ならびに抗体重鎖ＣＨ１およびＩＬ２受容体β鎖（構成的に活性のあるＩＬ２シグナル伝達分子を与える）またはＩＬ７受容体（構成的に活性のあるＩＬ７シグナル伝達分子を与える）のいずれかを含む細胞内ドメインを含む第２のポリペプチドを有する。
【０００８】
両方のポリペプチドが細胞内で発現すると、２つの鎖は会合して、キメラ膜貫通タンパク質を細胞表面で形成し、構成的サイトカイン（例えば、構成的ＩＬ−２またはＩＬ−７）シグナル伝達をもたらす。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際出願第２０１７／０２９５１２号
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｎａｇａｒｋａｔｔｉら、ＰＮＡＳ（１９９４）９１：７６３８〜７６４２
【非特許文献２】Ｈａｓｓｕｎｅｈら、Ｂｌｏｏｄ（１９９７）８９：６１０〜６２０
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明者らは、細胞で発現されると、構成的サイトカインシグナル伝達を引き起こすキメラポリペプチドを開発した。このポリペプチドは、細胞において内在性サイトカイン受容体に特異的に結合し、サイトカインがなくてもサイトカインシグナル伝達を引き起こす。
【００１２】
第１の態様では、本発明は、
サイトカイン受容体の第１の鎖の細胞外ドメインに構成的に結合する抗原結合ドメイン、
膜貫通ドメイン、および
サイトカイン受容体の第２の鎖の細胞内ドメイン
を含むキメラポリペプチドであって、
細胞内で発現されると、サイトカイン受容体の内在性の第１の鎖に結合し、構成的サイトカインシグナル伝達を引き起こす、キメラポリペプチドを提供する。
【００１３】
本発明の第１の態様の第１の実施形態では、サイトカイン受容体の第１の鎖はＩ型サイトカイン受容体γ鎖であり、サイトカイン受容体の第２の鎖はＩ型サイトカイン受容体α鎖またはβ鎖である。
【００１４】
本発明の第１の態様の第２の実施形態では、サイトカイン受容体の第１の鎖はＩ型サイトカイン受容体α鎖またはβ鎖であり、サイトカイン受容体の第２の鎖はＩ型サイトカイン受容体γ鎖である。
【００１５】
Ｉ型サイトカイン受容体α鎖またはβ鎖は、以下のＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１３受容体およびＩＬ−１５受容体の１つから選択することができる。
【００１６】
Ｉ型サイトカイン受容体α鎖またはβ鎖はＩＬ−７受容体α鎖であってもよい。
【００１７】
抗原結合ドメインは、サイトカイン受容体の第１の鎖の細胞外ドメインに結合するｄＡｂまたはｓｃＦｖを含むことができる。
【００１８】
第２の態様では、本発明は、サイトカイン受容体の第１の鎖に会合した本発明の第１の態様によるキメラポリペプチドを含む構成的に活性のあるサイトカイン受容体を提供する。
【００１９】
第３の態様では、本発明は、サイトカイン受容体の内在性の第１の鎖に会合した本発明の第１の態様によるキメラポリペプチドを含む構成的に活性のあるサイトカイン受容体を含む細胞を提供する。
【００２０】
この細胞は、キメラ抗原受容体または操作されたＴ細胞受容体も含む。
【００２１】
第４の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるキメラポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
【００２２】
第５の態様では、本発明は、本発明の第１の態様によるキメラポリペプチドをコードする第１の核酸配列およびキメラ抗原受容体または操作されたＴ細胞受容体をコードする第２の核酸を含む核酸構築物を提供する。
【００２３】
第６の態様では、本発明の第４の態様による核酸配列または本発明の第５の態様による核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００２４】
第７の態様では、本発明の第３の態様による細胞を作製する方法であって、本発明の第４の態様による核酸配列、本発明の第５の態様による核酸構築物または本発明の第６の態様によるベクターを細胞に導入するステップを含む方法を提供する。
【００２５】
第８の態様では、細胞内で構成的サイトカインシグナル伝達を誘導する方法であって、細胞内で本発明の第１の態様によるキメラポリペプチドを発現させるステップを含む方法を提供する。
【００２６】
第９の態様では、細胞内で有害なサイトカインシグナル伝達をブロックする方法であって、細胞内で本発明の第１の態様によるキメラポリペプチドを発現させるステップを含み、抗原結合ドメインが共通ガンマ鎖に構成的に結合しており、１つまたは複数の有害なサイトカインが共通ガンマ鎖を含むサイトカイン受容体を通ってシグナルを送る、方法を提供する。
【００２７】
第１０の態様では、本発明の第３の態様による複数の細胞を含む医薬組成物を提供する。
【００２８】
第１１の態様では、疾患を処置および／または予防する方法であって、本発明の第１０の態様による医薬組成物を被験体に投与するステップを含む方法を提供する。
【００２９】
この方法は、
（ｉ）被験体から細胞を含有する試料を単離するステップ、
（ｉｉ）細胞を、本発明の第４の態様による核酸配列、本発明の第５の態様による核酸構築物または本発明の第６の態様によるベクターで形質導入またはトランスフェクションするステップ、および
（ｉｉｉ）被験体に（ｉｉ）の細胞を投与するステップ
を含むことができる。
【００３０】
疾患はがんであってもよい。
【００３１】
第１２の態様では、疾患の処置および／または予防で使用するための、本発明の第１０の態様による医薬組成物を提供する。
【００３２】
第１３の態様では、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、本発明の第３の態様による細胞の使用を提供する。
【００３３】
本発明のキメラポリペプチドを含むサイトカイン受容体は、１個の組換えポリペプチド鎖のみを細胞内で発現させることが必要なので、ＷＯ２０１７／０２９５１２で記載された「Ｆａｂ」型の構成的に活性のある分子よりも有利である。本発明のサイトカイン受容体は構成的に活性のあるサイトカインシグナル伝達複合体を完成するために、細胞内の内在性サイトカイン受容体を利用する。
【００３４】
本発明のキメラポリペプチドは内在性サイトカイン受容体を「ハイジャックする」という事実は、通常は内在性受容体を通ってシグナルを伝えるその他の外部サイトカインシグナルが、少なくとも部分的にブロックされるという点でさらなる利点を与える。高レベルのある特定のサイトカインは有害であり得るので、これは細胞にとって有益であり得る。例えば、高レベルのＩＬ−２は、Ｔ細胞の調節性Ｔ細胞への分化を引き起こし得る。
【００３５】
図３ａで示した配置は、抗γＣｓｃＦｖ細胞外ドメインを含み、細胞は共通ガンマ鎖をコードするように操作されていないというさらなる利点を有する。共通ガンマ鎖のレトロウイルス発現は、以前にＸ−ＳＣＩＤ患者における白血病誘発と関連付けられていた。
【００３６】
図３ａで示した配置は、共通ガンマ鎖の過剰発現を回避する。細胞が野生型ガンマ鎖およびトランスジェニックガンマ鎖の両方を含むＦａｂ型系とは異なり、図３ａで示した系では、野生型ガンマ鎖のみが細胞内で発現する。ガンマ鎖は細胞によって生理学的に発現するので、天然では必要に応じて上方制御または下方制御される。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】図１は、様々なサイトカイン受容体の構造、サイトカインを産生する細胞型およびサイトカイン受容体を発現する細胞型をまとめて示した概略図である。
【図２】図２は、ＷＯ２０１７／０２９５１２に記載された構成的に活性のあるサイトカインシグナル伝達キメラ膜貫通タンパク質を例示している概略図である。キメラ膜貫通タンパク質は、２量体形成ドメインおよびサイトカイン受容体細胞内ドメインを含む。この複合体は、２量体形成ドメインが抗体型重鎖および軽鎖定常領域を含むので、「Ｆａｂ」型構造体を有している。これらのドメインの間の一定の２量体形成は、ＩＬ２受容体共通γ鎖とＩＬ−２受容体β鎖またはＩＬ−７受容体α鎖のいずれかとを引き合わせて、構成的サイトカインシグナル伝達を導く。
【図３】図３は、本発明の構成的に活性のあるサイトカイン受容体の例を例示している概略図である。（Ａ）キメラポリペプチドは、抗共通ガンマ鎖ｓｃＦｖ細胞外ドメインおよびＩＬ−７細胞内ドメインを含む。細胞内部で発現すると、抗γＣｓｃＦｖの内在性ガンマ鎖への結合は、構成的に活性のあるサイトカイン受容体を生成する。この配置では、細胞は１種のサイトカインシグナル、例えば、ＩＬ−７のみを受容する；（Ｂ）キメラポリペプチドは抗ＩＬ−受容体ｓｃＦｖ細胞外ドメインおよびγＣ細胞内ドメインを含む。細胞内部で発現すると、抗ＩＬＲｓｃＦｖの内在性ＩＬ−受容体鎖への結合は、構成的に活性のあるサイトカイン受容体を生成する。この配置では、細胞は多数のサイトカインシグナルを受容することができ、そのシグナル全てはγＣを通る。サイトカインシグナルは、サイトカイン受容体の生理学的発現によって調節される。
【図４】図４は、実施例１で作製し試験した２つのキメラポリペプチドの構築物の図である。（Ａ）この構築物は、マーカー遺伝子（ＲＱＲ８）ならびに抗γＣｓｃＦｖ細胞外ドメインおよびＩＬ−７受容体細胞内ドメインを含むキメラポリペプチドを同時発現する。（Ｂ）この構築物は、マーカー遺伝子（ＲＱＲ８）ならびに抗ＩＬ−７受容体ｓｃＦｖ細胞外ドメインおよびγＣ細胞内ドメインを含むキメラポリペプチドを同時発現する。「ＳＰ」−シグナルペプチド；「ＲＱＲ８」−選別−自殺遺伝子（sort-suicide  gene）ＲＱＲ８；「２Ａ」−ＦＮＤＶ由来２Ａペプチド切断部位；「ＨＡ−Ｔａｇ」−ヘマグルチニンタグ；抗γＣ／抗ＩＬ７ＲｓｃＦｖ−γＣ／ＩＬ７受容体に特異的に結合するｓｃＦｖ；「ＣＤ８ＳＴＫ」−ヒトＣＤ８ストークのスペーサー配列；「ＩＬ７Ｒ／γＣ」ＴＭ−ＩＬ７受容体／ガンマ鎖の膜貫通ドメイン；「ＩＬ７Ｒ／γＣ細胞内ドメイン」−ＩＬ７受容体またはガンマ鎖の細胞内ドメイン。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
キメラポリペプチド
キメラポリペプチドは、（ｉ）サイトカイン受容体の第１の鎖の細胞外ドメインに構成的に結合する抗原結合ドメイン、および（ｉｉ）サイトカイン受容体の第２の鎖の細胞内ドメインを含む分子である。
【００３９】
サイトカイン受容体およびシグナル伝達
多くの細胞機能は、サイトカイン受容体スーパーファミリーのメンバーによって調節されている。これらの受容体によるシグナル伝達は、ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）との会合に依存し、ヤヌスキナーゼは、リガンド結合を受容体複合体に動員されたシグナル伝達タンパク質のチロシンリン酸化と結び付ける。これらの中には、サイトカイン応答の多様性に寄与する転写因子のファミリーであるシグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）がある。
【００４０】
サイトカイン受容体がそのリガンドに結合すると、以下の細胞内シグナル伝達経路の１つまたは複数が惹起され得る：
（ｉ）ＪＡＫ−ＳＴＡＴ経路
（ｉｉ）ＭＡＰキナーゼ経路、および
（ｉｉｉ）ホスホイノシチド３−キナーゼ（ＰＩ３Ｋ）経路。
【００４１】
同じ経路が、本発明の構成的に活性のあるサイトカイン受容体によって惹起され得る。
【００４２】
ＪＡＫ−ＳＴＡＴ系は３つの主要な成分、（１）受容体、（２）ヤヌスキナーゼ（ＪＡＫ）、および（３）シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）からなる。
【００４３】
ＪＡＫは、チロシンキナーゼ活性を有し、細胞表面サイトカイン受容体に結合する。リガンドの受容体への結合は、ＪＡＫの活性化を誘発する。ヤヌスキナーゼは、キナーゼ活性が増加するにつれて、受容体のチロシン残基をリン酸化し、ホスホチロシン結合ＳＨ２ドメインを含有するタンパク質との相互作用のための部位を作り出す。これらのホスホチロシン残基に結合することができるＳＨ２ドメインを有するＳＴＡＴが受容体に動員され、それ自体ＪＡＫによってチロシンリン酸化される。次に、これらのホスホチロシンは、その他のＳＴＡＴのＳＨ２ドメインのための結合部位として作用し、それらの２量体形成を媒介する。異なるＳＴＡＴがヘテロまたはホモ２量体を形成する。活性化されたＳＴＡＴ２量体が細胞核内に蓄積し、それらの標的遺伝子の転写を活性化する。
【００４４】
サイトカイン受容体細胞内ドメイン
本発明のキメラポリペプチドは、内在性サイトカイン受容体鎖の存在下にあるとき「サイトカイン型」細胞シグナル伝達を引き起こす細胞内ドメインを含む。
【００４５】
細胞内ドメインは、サイトカイン受容体細胞内ドメインであってもよい。
【００４６】
細胞内ドメインは、Ｉ型サイトカイン受容体から得ることができる。Ｉ型サイトカイン受容体は、細胞膜に隣接した細胞外部分において共通のアミノ酸モチーフ（ＷＳＸＷＳ）を共有している。
【００４７】
細胞内ドメインは、ＩＩ型サイトカイン受容体から得ることができる。ＩＩ型サイトカイン受容体は、Ｉ型およびＩＩ型インターフェロンに結合するもの、ならびにインターロイキン−１０ファミリー（インターロイキン−１０、インターロイキン−２０およびインターロイキン−２２）のメンバーに結合するものを含む。
【００４８】
Ｉ型サイトカイン受容体は、
（ｉ）ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３およびＩＬ−２７の受容体などのインターロイキン受容体、
（ｉｉ）エリスロポエチン、ＧＭ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦの受容体などのコロニー刺激因子受容体、ならびに
（ｉｉｉ）ホルモン受容体およびプロラクチン受容体などのホルモン受容体／ニューロペプチド受容体を含む。
【００４９】
Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーは様々な鎖を含み、それらの一部はリガンド／サイトカイン相互作用に関与し、その他はシグナル伝達に関与する。例えば、ＩＬ−２受容体はα鎖、β鎖およびγ鎖を含む。
【００５０】
ＩＬ−２受容体共通ガンマ鎖（ＣＤ１３２としても公知である）は、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１３受容体およびＩＬ−１５受容体の間で共有されている。
【００５１】
ＩＬ−２
ＩＬ−２は、ＩＬ−２受容体に結合するが、ＩＬ−２受容体は、しばしば「鎖」、α、βおよびγと呼ばれる３つの異なるタンパク質の異なる組合せによって生じる３つの形態を有し、これらのサブユニットは、その他のサイトカインの受容体の一部でもある。ＩＬ−２Ｒのβおよびγ鎖は、Ｉ型サイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。
【００５２】
３つの受容体鎖は、様々な細胞型で別々に、および様々に発現し、様々な組合せおよび順番で集合して、低、中程度、および高親和性のＩＬ−２受容体を生じることができる。
【００５３】
α鎖は低親和性でＩＬ−２に結合し、βおよびγの組合せは一緒に、主として記憶Ｔ細胞およびＮＫ細胞上で中程度の親和性でＩＬ−２に結合する複合体を形成し、３つ全ての受容体鎖は、活性化Ｔ細胞および調節性Ｔ細胞上で高親和性（Ｋｄ約１０〜１１Ｍ）でＩＬ−２に結合する複合体を形成する。
【００５４】
３つのＩＬ−２受容体鎖は、細胞膜にまたがり、細胞の中へ伸展することによって、生化学的シグナルを細胞内部に送達する。アルファ鎖は、シグナル伝達には関与しないが、ベータ鎖はチロシンホスファターゼＪＡＫ１と複合体を形成する。同様に、ガンマ鎖は、ＪＡＫ３と呼ばれる別のチロシンキナーゼと複合体を形成する。これらの酵素は、ＩＬ−２がＩＬ−２Ｒの外部ドメインに結合することによって活性化する。
【００５５】
ＩＬ−２シグナル伝達は、初期のＴ細胞がまた抗原によって刺激されたとき、Ｔ細胞がエフェクターＴ細胞および記憶Ｔ細胞に分化するのを促進する。抗原選択Ｔ細胞クローンの数および機能の増大に左右される、Ｔ細胞免疫記憶の発生における役割によって、エフェクターＴ細胞および記憶Ｔ細胞は、長期的な細胞媒介性免疫において鍵となる役割も果たす。
【００５６】
本発明のキメラポリペプチドは、ＩＬ−２受容体β鎖またはＩＬ−２受容体（すなわち、共通）γ鎖の細胞内ドメインを含むことができる。
【００５７】
ＩＬ−２β鎖および共通γ鎖の細胞内ドメインのアミノ酸配列は、配列番号１および２として示す。
【化１】
2021503902.tif 000002
【００５８】
用語「から得られた」は、本発明のキメラポリペプチドの細胞内ドメインが内在性分子の野生型配列と同じ配列、またはＪＡＫ−１もしくはＪＡＫ−３と複合体を形成し、前述したシグナル伝達経路の１つを活性化する能力を保持しているそのバリアントを有することを意味する。
【００５９】
バリアント配列が、野生型配列の機能、すなわち、ＪＡＫ−１またはＪＡＫ−３との複合体を形成する能力、および、例えば、ＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する能力を保持している限り、「バリアント」配列は野生型配列（例えば、配列番号１または２）と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する。
【００６０】
２つのポリペプチド配列の間のパーセンテージ同一性は、http://blast.ncbi.nlm.nih.govで自由に利用可能なＢＬＡＳＴなどのプログラムによって容易に決定することができる。
【００６１】
ＩＬ−７
インターロイキン−７受容体は、２つの鎖、インターロイキン−７受容体α鎖（ＣＤ１２７）および共通γ鎖受容体（ＣＤ１３２）から成り立つ。共通γ鎖受容体は、インターロイキン−２、−４、−９および−１５を含む様々なサイトカインで共有されている。インターロイキン−７受容体は、ナイーブおよび記憶Ｔ細胞を含む様々な細胞型で発現している。
【００６２】
インターロイキン−７受容体は、リンパ球の発生、特に、Ｖ（Ｄ）Ｊ再結合において重要な役割を担っている。ＩＬ−７Ｒは、ＳＴＡＴ５およびヒストンアセチル化によって、Ｔ細胞受容体ガンマ遺伝子を含有するゲノムの領域の接近しやすさも制御する。マウスにおけるノックアウト研究から、アポトーシスのブロックは、Ｔリンパ球の分化および活性化中におけるこのタンパク質の本質的な機能であることが示唆される。
【００６３】
本発明のキメラポリペプチドは、ＩＬ−７受容体α鎖および／またはＩＬ−７受容体（すなわち、共通）γ鎖の細胞内ドメイン、またはそのバリアントを含むことができる。
【００６４】
ＩＬ−７α鎖の細胞内ドメインのアミノ酸配列を配列番号３として示す。
【化２】
2021503902.tif 000003
【００６５】
ＩＬ−１５
インターロイキン１５（ＩＬ−１５）は、ＩＬ−２と構造類似性を有するサイトカインである。ＩＬ−２のように、ＩＬ−１５は、ＩＬ−２／ＩＬ−１５受容体ベータ鎖（ＣＤ１２２）および共通ガンマ鎖（ガンマ−Ｃ、ＣＤ１３２）から構成される複合体に結合し、この複合体を通じてシグナルを伝える。ＩＬ−１５は、ウイルス感染後、単核食細胞（およびいくつかのその他の細胞）によって分泌される。ＩＬ−１５は、ナチュラルキラー細胞の細胞増殖を誘導する。
【００６６】
インターロイキン−１５受容体は、インターロイキン１５受容体アルファサブユニットからなり、共通ベータおよびガンマサブユニットをＩＬ−２受容体と共有する。
【００６７】
スペーサー
本発明のキメラポリペプチドは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインと連結し、細胞内ドメインからこの抗原結合ドメインを空間的に分離するスペーサーを含むことができる。可撓性のスペーサーは、抗原結合ドメインが抗原結合を可能にするために様々な方向に向くことを可能にする。
【００６８】
スペーサーは、キメラポリペプチドの抗原結合ドメインが、内在性サイトカイン受容体鎖に特異的に結合するために細胞膜から適切な距離に位置するように適切な長さであるべきである。
【００６９】
本発明の細胞がキメラポリペプチドおよびキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む場合、キメラポリペプチドおよびＣＡＲのスペーサーは異なっていてもよく、例えば、長さが異なっていてもよい。ＣＡＲのスペーサーは、キメラポリペプチドのスペーサーより長くてもよい。
【００７０】
スペーサー配列は、例えば、ＩｇＧ１Ｆｃ領域、ＩｇＧ１ヒンジまたはＣＤ８ストークまたは類似の長さおよび／もしくはドメインスペーシング特性を有する代替の配列を含むことができる。
【００７１】
ヒトＩｇＧ１スペーサーは、Ｆｃ結合モチーフを除去するために変化させてもよい。
【００７２】
これらのスペーサーのアミノ酸配列の例を以下に挙げる：
【化３】
2021503902.tif 000004
【００７３】
膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜にまたがるキメラポリペプチドの配列である。膜貫通ドメインは、疎水性アルファヘリックスを含んでいてもよい。膜貫通ドメインは、ＣＤ２８から得ることができ、良好な受容体安定性をもたらす。
【００７４】
あるいは、膜貫通ドメインは、サイトカイン受容体、例えば、細胞内ドメインが得られるのと同じサイトカインから得ることができる。
【００７５】
膜貫通ドメインは、例えば、ＩＬ−２Ｒ、ＩＬ−７ＲまたはＩＬ−１５Ｒから得ることができる。
【化４】
2021503902.tif 000005
【００７６】
抗原結合ドメイン
本発明のキメラポリペプチドの抗原結合ドメインは、サイトカイン受容体の細胞外ドメインに特異的に結合する。それは、共通ガンマ鎖またはαもしくはβ鎖、例えば、ＩＬ−７α鎖に結合することができる。
【００７７】
抗体、抗体模倣物およびＴ細胞受容体の抗原結合部位をベースにしたものを含む、数多くの抗原結合ドメインが当該分野では公知である。例えば、抗原結合ドメインは、モノクローナル抗体から得られた１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、標的抗原の天然の受容体から得られた結合ドメイン、標的リガンドに対して十分な親和性を有するペプチド、ラクダなどの単一ドメイン結合部分、Ｄａｒｐｉｎのような人工的な単一結合部分またはＴ細胞受容体から得られた１本鎖を含むことができる。
【００７８】
抗原結合ドメインを得ることができる適切な抗体は当該分野では公知である。例えば、参照により組み込まれるＵＳ６３２３０２７は、共通γ鎖に特異的に結合する抗体について記載している。
【００７９】
抗原結合ドメインは、共通γ鎖に結合するｓｃＦｖを含むことができる。抗原結合ドメインは、配列番号１１〜１３で示された軽鎖ＣＤＲおよび／または配列番号１４〜１６で示された重鎖ＣＤＲを含むことができる。
【化５】
2021503902.tif 000006
【００８０】
抗原結合ドメインは、配列番号１７で示されたＶＬドメインおよび／または配列番号１８で示されたＶＨドメインを含むことができる。
【化６】
2021503902.tif 000007
【００８１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明の細胞はまた、１つまたは複数のキメラ抗原受容体を含むことができる。ＣＡＲは、腫瘍関連抗原に特異的であってもよい。
【００８２】
古典的なＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（結合部分）を細胞内シグナル伝達ドメイン（細胞内ドメイン）に連結しているキメラＩ型膜貫通タンパク質である。この結合部分は、典型的にはモノクローナル抗体（ｍＡｂ）から得られた１本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様またはリガンドをベースにした抗原結合部位を含むその他の形式をベースにしていてもよい。膜貫通ドメインは、タンパク質を細胞膜中につなぎ止め、スペーサーを細胞内ドメインに連結する。
【００８３】
初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のいずれかの細胞内部分から得られた細胞内ドメインを有していた。結果として、これらの第１世代受容体は免疫学的シグナル１を伝達し、同族の標的細胞のＴ細胞による死滅を誘発するのに十分ではあったが、増殖して生存するようにＴ細胞を十分に活性化することはできなかった。この限界を克服するため、複合細胞内ドメインが構築され、Ｔ細胞共起刺激分子の細胞内部分のＣＤ３ζの細胞内部分への融合により、抗原認識後、活性化している共起刺激シグナルを同時に伝達することができる第２世代受容体がもたらされる。最も一般的に使用される共起刺激ドメインは、ＣＤ２８の共起刺激ドメインである。これは、Ｔ細胞増殖を誘発する、最も強力な共起刺激シグナル−すなわち免疫学的シグナル２を供給する。生存シグナルを伝達する密接に関連したＯＸ４０および４１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリー細胞内ドメインを含むいくつかの受容体も記載されたことがある。今では、活性化、増殖および生存シグナルを伝達することができる細胞内ドメインを有するよりいっそう強力な第３世代ＣＡＲが記載されている。
【００８４】
ＣＡＲをコードする核酸は、例えば、レトロウイルスベクターを使用してＴ細胞に移入することができる。このようにして、多数の抗原特異的Ｔ細胞を養子細胞移入のために作り出すことができる。ＣＡＲが標的抗原に結合すると、活性化しているシグナルの、標的抗原が発現しているＴ細胞への伝達がもたらされる。こうして、ＣＡＲは、標的化された抗原を発現している細胞に向けてＴ細胞の特異性および細胞傷害を方向付ける。
【００８５】
本発明の細胞は、１つまたは複数のＣＡＲを含んでいてもよい。
【００８６】
ＣＡＲ（複数可）は、抗原結合ドメイン、スペーサードメイン、膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインを含むことができる。細胞内ドメインは、Ｔ細胞活性化シグナルを伝達するドメインを含むかまたはこのドメインと会合することができる。
【００８７】
シグナルペプチド
キメラポリペプチドおよび／またはＣＡＲはシグナルペプチドを含むことができ、したがって、それらがＴ細胞などの細胞内で発現されると、新生タンパク質は小胞体、その後細胞表面へと方向付けられ、そこで発現する。
【００８８】
シグナルペプチドのコアは、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する疎水性アミノ酸の長いストレッチを含有していることがある。シグナルペプチドは、アミノ酸の正に荷電した短いストレッチから開始していることがあり、トランスロケーション中におけるポリペプチドの適切なトポロジーを強化する助けとなる。シグナルペプチドの末端に、典型的にはシグナルペプチダーゼによって認識され、切断されるアミノ酸のストレッチが存在する。シグナルペプチダーゼは、トランスロケーション中またはトランスロケーション完了後に切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生じることができる。遊離シグナルペプチドは、次に特異的プロテアーゼによって消化される。
【００８９】
シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあってもよい。
【００９０】
シグナルペプチドは、シグナルペプチドが依然としてＣＡＲの細胞表面発現を引き起こすように機能するならば、配列番号１９、２０もしくは２１で示された配列または５、４、３、２もしくは１個のアミノ酸変異（挿入、置換または付加）を有するそれらのバリアントを含むことができる。
【００９１】
配列番号１９：ＭＧＴＳＬＬＣＷＭＡＬＣＬＬＧＡＤＨＡＤＧ
配列番号１９のシグナルペプチドは小型で、高効率であり、ＴＣＲベータ鎖から得られる。末端グリシンの後で約９５％の切断をもたらし、シグナルペプチダーゼによる効率的な除去をもたらすと予測される。
【００９２】
配列番号２０：ＭＳＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ
配列番号２０のシグナルペプチドは、ＩｇＧ１から得られる。
【００９３】
配列番号２１：ＭＡＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ
配列番号２１のシグナルペプチドは、ＣＤ８ａから得られる。
【００９４】
ＣＡＲ細胞内ドメイン
細胞内ドメインは、膜の細胞内側に位置する古典的ＣＡＲの一部である。
【００９５】
細胞内ドメインは、古典的ＣＡＲのシグナル伝達部分である。抗原結合ドメインによる抗原認識の後、個々のＣＡＲ分子クラスター、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８は、シナプスから排除され、シグナルは細胞に伝達される。
【００９６】
ＣＡＲ細胞内ドメインは、細胞内シグナル伝達ドメインであり得るか、またはそれを含んでいてもよい。代替の実施形態では、本ＣＡＲの細胞内ドメインは、細胞質中に存在する細胞内シグナル伝達分子と相互作用することができ、シグナル伝達を導くことができる。
【００９７】
細胞内シグナル伝達ドメインまたは別個の細胞内シグナル伝達分子は、Ｔ細胞シグナル伝達ドメインであり得るか、またはそれを含んでいてもよい。
【００９８】
最も一般的に使用されるシグナル伝達ドメイン成分は、３個のＩＴＡＭを含有するＣＤ３−ゼータ細胞内ドメインの成分である。これは、抗原が結合した後、活性化シグナルをＴ細胞に伝達する。ＣＤ３−ゼータは、十分に適格な活性化シグナルを提供しないことがあり、さらなる共起刺激シグナル伝達を必要とすることがある。例えば、キメラＣＤ２８およびＯＸ４０は、ＣＤ３−ゼータと一緒に使用して増殖／生存シグナルを伝達することができるか、または３つ全てを一緒に使用することができる。
【００９９】
核酸
本発明はまた、本発明のキメラポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１００】
核酸は、構造：
ＡｇＢ−スペーサー−ＴＭ−ｅｎｄｏ
であって、式中、
ＡｇＢ１は、キメラポリペプチドの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
スペーサー１は、キメラポリペプチドのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＴＭ１は、キメラポリペプチドの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ｅｎｄｏ１は、キメラポリペプチドの細胞内ドメインをコードする核酸配列である構造を有することができる。
【０１０１】
核酸構築物
本発明はまた、本発明のキメラポリペプチドおよびＣＡＲをコードする核酸構築物を提供する。このような構築物は、構造：
ＣＰＡｇＢ−ＣＰスペーサー−ＣＰＴＭ−ＣＰｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲｅｎｄｏ
または
ＣＡＲＡｇＢ−ＣＡＲスペーサー−ＣＡＲＴＭ−ＣＡＲｅｎｄｏ−ｃｏｅｘｐｒ−ＣＰＡｇＢ−ＣＰスペーサー−ＣＰＴＭ−ＣＰｅｎｄｏ
であって、式中、
ＣＰＡｇＢは、キメラポリペプチドの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
ＣＰスペーサーは、キメラポリペプチドのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＣＰＴＭは、キメラポリペプチドの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ＣＰｅｎｄｏは、キメラポリペプチドの細胞内ドメインをコードする核酸配列であり、
ｃｏｅｘｐｒは、キメラポリペプチドおよびＣＡＲ両方の同時発現を可能にする核酸配列であり、
ＣＡＲＡｇＢは、ＣＡＲの抗原結合ドメインをコードする核酸配列であり、
ＣＡＲスペーサーは、ＣＡＲのスペーサーをコードする核酸配列であり、
ＣＡＲＴＭは、ＣＡＲの膜貫通ドメインをコードする核酸配列であり、
ＣＡＲｅｎｄｏは、ＣＡＲの細胞内ドメインをコードする核酸配列である構造を有することができる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」および「核酸」は、互いに同義であるものとする。
【０１０３】
数多くの異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝子コードの縮重の結果として、同じポリペプチドをコードすることができることは当業者によって理解されるだろう。さらに、当業者は、ポリペプチドを発現させる任意の特定の宿主生物のコドン利用を反映させるために、慣用的な技術を使用して、本明細書で記載したポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行うことができることを理解されたい。
【０１０４】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含むことができる。それらは１本鎖または２本鎖であってもよい。それらはまた、内部に合成または改変ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであってもよい。オリゴヌクレオチドに対するいくつかの異なる種類の改変が当該分野では公知である。これらには、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、分子の３’および／または５’末端へのアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が含まれる。本明細書で記載したような使用のため、ポリヌクレオチドは当該分野で利用可能な任意の方法によって改変することができることを理解されたい。このような改変は、目的のポリヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために実施することができる。
【０１０５】
ヌクレオチド配列に関連した用語「バリアント」、「ホモログ」または「誘導体」には、配列からの、または配列への１つ（または複数の）核酸の任意の置換、変更、改変、置き換え、欠失または付加が含まれる。
【０１０６】
上記の構造において、「ｃｏｅｘｐｒ」は、第１および第２両方のＣＡＲの同時発現を可能にする核酸配列である。ｃｏｅｘｐｒは、切断部位をコードする配列であってもよく、したがって、核酸構築物は切断部位（複数可）と結び付いたキメラポリペプチドおよびＣＡＲを生成する。切断部位は自己切断性であり得、したがって、ポリペプチドが生成されたとき、いかなる外部の切断活性も必要とせずに、個々のペプチドに直ちに切断される。
【０１０７】
切断部位は、キメラポリペプチドおよびＣＡＲが分離されるようになるのを可能にする任意の配列であってもよい。
【０１０８】
用語「切断」は、本明細書では便宜上使用されているが、切断部位はペプチドを古典的切断以外の機構によって個々の実体に分離させることができる。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下参照）については、「切断」活性を説明する様々なモデルが提案されている：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解または翻訳効果（Donnelly  et  al  (2001)  J.  Gen.  Virol.  82:1027-1041）。切断部位がタンパク質をコードする核酸配列の間に位置するとき、それらのタンパク質を別個の実体として発現させる限り、このような「切断」の正確な機構は、本発明の目的にとって重要ではない。
【０１０９】
切断部位は、例えば、フューリン切断部位、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であってもよく、または自己切断ペプチドをコードしてもよい。
【０１１０】
「自己切断ペプチド」とは、タンパク質および自己切断ペプチドを含むポリペプチドが生成されると、いかなる外部の切断活性をも必要とせずに、直ちに「切断され」るか、または明確に異なる個別の第１および第２のポリペプチドに分離されるように機能するペプチドを意味する。
【０１１１】
自己切断ペプチドは、アフトまたはカルディオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであってもよい。アフトまたはカルディオウイルスの主な２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端で「切断」する２Ａによって媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなどのアフトウイルスでは、２Ａ領域は約１８個のアミノ酸の短いセグメントであり、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存されたプロリン残基）と一緒に、それ自体のＣ末端での「切断」を媒介することができる自律エレメントを表す（上記Donelly  et  al  (2001)）。
【０１１２】
「２Ａ様」配列は、アフトまたはカルディオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスおよびＴｒｉｐａｎｏｓｏｍａｓ  ｓｐｐ内の反復配列および細菌の配列において見いだされたことがある（上記Donnelly  et  al  (2001)）。
【０１１３】
切断部位は、配列番号２２（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）で示した２Ａ様配列を含んでいてもよい。
【０１１４】
本発明は、本発明によるキメラポリペプチドおよび１つまたは複数のＣＡＲまたはＴＣＲを含むキットも提供する。
【０１１５】
操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）
本発明の細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えば、操作された、または非内在性ＴＣＲを発現することができる。
【０１１６】
ＴＣＲは、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合したペプチドとして抗原の断片を認識する役割を果たすＴ細胞の表面に見いだされる分子である。
【０１１７】
ＴＣＲは、２つの異なるタンパク質鎖から構成されるヘテロ２量体である。ヒトでは、Ｔ細胞の９５％においては、ＴＣＲはアルファ（α）鎖およびベータ（β）鎖（それぞれＴＲＡおよびＴＲＢによってコードされる）からなり、一方、Ｔ細胞の５％においては、ＴＣＲはガンマおよびデルタ（γ／δ）鎖（それぞれ、ＴＲＧおよびＴＲＤによってコードされる）からなる。
【０１１８】
ＴＣＲが抗原性ペプチドおよびＭＨＣ（ペプチド／ＭＨＣ）と係合すると、Ｔリンパ球はシグナル伝達によって活性化される。
【０１１９】
従来の抗体特異的標的抗原とは対照的に、ＴＣＲによって認識された抗原は、可能性のある細胞内タンパク質のアレイ全体を含むことができ、これらはプロセシングされてペプチド／ＭＨＣ複合体として細胞表面に輸送される。
【０１２０】
ベクターを使用してＴＲＡおよびＴＲＢ遺伝子、またはＴＲＧおよびＴＲＤ遺伝子を人工的に細胞に導入することによって、細胞が異種（すなわち、非天然）ＴＣＲ分子を発現するように操作することが可能である。例えば、操作されたＴＣＲの遺伝子は、自己由来Ｔ細胞に再導入したり、Ｔ細胞養子療法のために患者に移入し戻したりすることができる。
【０１２１】
本発明はまた、本発明の第１の態様によるＴＣＲおよびキメラポリペプチドを含む細胞を提供する。
【０１２２】
ベクター
本発明はまた、本発明の第１の態様によるキメラポリペプチドおよび必要に応じて１つまたは複数のＣＡＲまたはＴＣＲをコードする１つまたは複数の核酸配列を含むベクター、またはベクターのキットを提供する。このようなベクターは、本発明の第１の態様によるキメラポリペプチドを発現するように、宿主細胞に核酸配列（複数可）を導入するために使用することができる。
【０１２３】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンをベースにしたベクターまたは合成ｍＲＮＡであってもよい。
【０１２４】
ベクターは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞をトランスフェクトまたは形質導入することができ得る。
【０１２５】
サイトカイン受容体
サイトカイン受容体鎖に会合した本発明のキメラポリペプチドを含む構成的に活性のあるサイトカイン受容体も提供する。
【０１２６】
キメラポリペプチドは、サイトカイン受容体の第１の鎖に会合していてもよい。キメラポリペプチドは、その抗原結合ドメインを介してサイトカイン受容体鎖の細胞外ドメインに結合することができる。キメラポリペプチドに結合するサイトカイン受容体鎖は、内在性、すなわち、細胞によって天然にコードされるポリペプチドであってもよい。
【０１２７】
細胞
本発明は、本発明のキメラポリペプチドおよび必要に応じて１つまたは複数のＣＡＲまたはＴＣＲを含む細胞を提供する。
【０１２８】
細胞は、本発明の核酸またはベクターを含んでいてもよい。
【０１２９】
細胞は、上記で定義した構成的に活性のあるサイトカイン受容体を含んでいてもよい。
【０１３０】
細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞などの細胞溶解性免疫細胞であってもよい。
【０１３１】
Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫において中心的役割を担うリンパ球の１種である。Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在によって、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などのその他のリンパ球とは区別することができる。以下にまとめて示したように、様々な種類のＴ細胞が存在する。
【０１３２】
ヘルパーＴ細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞の形質細胞および記憶Ｂ細胞への成熟ならびに細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化を含む免疫学的プロセスにおいて、その他の白血球を補助する。ＴＨ細胞は、表面にＣＤ４を発現している。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面でＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原が提示されたとき活性化される。これらの細胞は、様々な種類の免疫応答を容易にする様々なサイトカインを分泌する、ＴＨ１、ＴＨ２、ＴＨ３、ＴＨ１７、Ｔｈ９またはＴＦＨを含むいくつかのサブタイプのうちの１つに分化することができる。
【０１３３】
細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルス感染細胞および腫瘍細胞を破壊し、移植拒絶反応にも関与する。ＣＴＬはそれらの表面にＣＤ８を発現している。これらの細胞は、全有核細胞の表面に存在するＭＨＣクラスＩと関連している抗原に結合することによって標的を認識する。調節性Ｔ細胞によって分泌されるＩＬ−１０、アデノシンおよびその他の分子によって、ＣＤ８＋細胞はアナジー状態に不活性化され、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を予防することができる。
【０１３４】
記憶Ｔ細胞は、感染が消散した後も長期間持続する抗原特異的Ｔ細胞のサブセットである。記憶Ｔ細胞は、同族抗原に再曝露されると迅速に大量のエフェクターＴ細胞に拡大し、こうして過去の感染に対して「記憶」を有する免疫系を提供する。記憶Ｔ細胞は、３つのサブタイプ、セントラル記憶Ｔ細胞（ＴＣＭ細胞）および２種類のエフェクター記憶Ｔ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）を含む。記憶細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれであってもよい。記憶Ｔ細胞は、典型的には細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現している。
【０１３５】
以前はサプレッサーＴ細胞として知られていた調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、免疫寛容の維持に非常に重要である。それらの主要な役割は、免疫反応の終末に向けてＴ細胞媒介性免疫を停止し、胸腺におけるネガティブ選択の過程を免れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。
【０１３６】
ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞の２つの主要なクラス、天然に存在するＴｒｅｇ細胞および適応性Ｔｒｅｇ細胞が記載されている。
【０１３７】
天然に存在するＴｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞としても公知である）は胸腺で生じ、ＴＳＬＰによって活性化された骨髄性（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方と発生するＴ細胞との間の相互反応に関連している。天然に存在するＴｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在によって、その他のＴ細胞から区別することができる。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、調節性Ｔ細胞発生を妨害し、致命的な自己免疫疾患ＩＰＥＸの原因となり得る。
【０１３８】
適応性Ｔｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても公知である）は、正常な免疫応答中に生じ得る。
【０１３９】
細胞は、ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）であってもよい。ＮＫ細胞は、先天免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ＭＨＣに依存しない方法で、ウイルス感染細胞からの生来のシグナルに対して迅速な応答を提供する。
【０１４０】
ＮＫ細胞（先天リンパ球系細胞の群に属している）は、大型顆粒リンパ球（ＬＧＬ）と定義され、ＢおよびＴリンパ球を生じる共通のリンパ球前駆細胞から分化した第３の種類の細胞を構成する。ＮＫ細胞は、骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺で分化して成熟し、次いで循環に入ることが公知である。
【０１４１】
本発明のキメラポリペプチドを発現する細胞は、上記で挙げた細胞型のいずれであってもよい。
【０１４２】
本発明の第１の態様によるＴまたはＮＫ細胞は、患者自身の末梢血（ファーストパーティ）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（セカンドパーティ）、または無関係なドナーの末梢血（サードパーティ）のいずれかからｅｘ  ｖｉｖｏで生じることができる。
【０１４３】
あるいは、本発明の第１の態様によるＴまたはＮＫ細胞は、誘導性前駆細胞または胚性前駆細胞のＴまたはＮＫ細胞へのｅｘ  ｖｉｖｏ分化から得ることができる。あるいは、溶解機能を保持し、治療薬として作用することができる不死化されたＴ細胞系を使用することができる。
【０１４４】
これらの実施形態全てにおいて、キメラポリペプチドを発現する細胞は、ウイルスベクターによる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡによるトランスフェクションを含む多くの手段の１つによって、キメラポリペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを導入することによって作り出される。
【０１４５】
本発明の細胞は、被験体由来のｅｘ  ｖｉｖｏ  ＴまたはＮＫ細胞であってもよい。ＴまたはＮＫ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料由来であってもよい。ＴまたはＮＫ細胞は、本発明の第１の態様によるキメラポリペプチドを提供する分子をコードする核酸で形質導入する前に、例えば、抗ＣＤ３モノクローナル抗体による処置によって、活性化および／または拡大することができる。
【０１４６】
本発明のＴまたはＮＫ細胞は、
（ｉ）被験体または上記に挙げたその他の供給源からのＴまたはＮＫ細胞を含有する試料の単離、および
（ｉｉ）キメラポリペプチドをコードする１つまたは複数の核酸配列によるＴまたはＮＫ細胞の形質導入またはトランスフェクションによって作製することができる。
【０１４７】
次に、ＴまたはＮＫ細胞は、抗原結合ポリペプチドの抗原結合ドメインの発現に基づいて精製、例えば、選択することができる。
【０１４８】
サイトカインシグナル伝達の誘導／ブロック
本発明は、細胞に構成的サイトカインシグナル伝達を誘導する方法であって、細胞内で上記で定義したキメラポリペプチドを発現させるステップを含む方法を提供する。キメラポリペプチドは、抗原結合ドメインを介して内在性サイトカイン受容体鎖に結合し、細胞表面で構成的に活性のあるサイトカイン受容体を形成する。
【０１４９】
本発明はまた、細胞内で本発明のキメラポリペプチドを発現することによって、細胞内で有害なサイトカインシグナル伝達をブロックする方法を提供する。キメラポリペプチドはサイトカイン受容体鎖に結合し、その他の内在性サイトカイン受容体の相手鎖との鎖のペアリングを妨害する。例えば、抗原結合ドメインが共通ガンマ鎖に構成的に結合する場合、細胞表面での以下の受容体、ＩＬ−２受容体、ＩＬ−４受容体、ＩＬ−７受容体、ＩＬ−９受容体、ＩＬ−１３受容体およびＩＬ−１５の１つまたは複数の濃度を低減させることができる。
【０１５０】
これによって、細胞内での有害なサイトカインシグナル伝達、例えば、過剰ＩＬ−２が媒介するシグナル伝達をブロックすることができる。
【０１５１】
医薬組成物
本発明はまた、本発明による複数の細胞を含有する医薬組成物に関する。
【０１５２】
医薬組成物は、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤をさらに含んでいてもよい。医薬組成物は、１つまたは複数のさらなる薬学的に活性のあるポリペプチドおよび／または化合物を必要に応じて含んでいてもよい。このような製剤は、例えば、静脈内注入に適した形態であってもよい。
【０１５３】
処置の方法
本発明は、本発明の細胞（例えば、前述の医薬組成物中の）を被験体に投与するステップを含む、疾患を処置および／または予防する方法を提供する。
【０１５４】
疾患を処置する方法は、本発明の細胞の治療的使用に関する。本明細書において、疾患に関連した少なくとも１つの症状を軽減、低減もしくは改善するために、および／またはその疾患の進行を減速、低減もしくはブロックするために、細胞を既存の疾患または状態を有する被験体に投与することができる。
【０１５５】
疾患を予防する方法は、本発明の細胞の予防的使用に関する。本明細書では、このような細胞は、疾患にまだ罹患していないか、および／または疾患のいかなる症状も示していない被験体に、疾患を予防するか、もしくは疾患の原因を弱めるため、またはその疾患に関連した少なくとも１つの症状を低減またはその発症を予防するために、投与することができる。被験体は、その疾患の素因を有し得るか、または疾患を発症する危険性があると考えられ得る。
【０１５６】
方法は、
（ｉ）ＴまたはＮＫ細胞を含有する試料を単離するステップ、
（ｉｉ）このような細胞を本発明によって提供された核酸配列またはベクターで形質導入またはトランスフェクトするステップ、
（ｉｉｉ）（ｉｉ）の細胞を被験体に投与するステップ
を含むことができる。
【０１５７】
ＴまたはＮＫ細胞を含有する試料は、例えば、前述のような被験体またはその他の供給源から単離することができる。ＴまたはＮＫ細胞は、被験体自身の末梢血（ファーストパーティ）、またはドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況において（セカンドパーティ）、または無関係なドナーの末梢血（サードパーティ）から単離することができる。
【０１５８】
本発明は、疾患の処置および／または予防において使用するための本発明のキメラポリペプチドを発現する細胞を提供する。
【０１５９】
本発明はまた、疾患を処置および／または予防するための医薬の製造における、本発明のキメラポリペプチドを発現する細胞の使用に関する。
【０１６０】
本発明の方法によって処置および／または予防される疾患は、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、黒色腫、非ホジキンリンパ腫、膵臓がん、前立腺がんおよび甲状腺がんなどのがん性疾患であってもよい。
【０１６１】
本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を死滅させることができる。標的細胞は、標的細胞の近傍の腫瘍分泌リガンドまたはケモカインリガンドの存在によって特徴付けることができる。標的細胞は、標的細胞表面での腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の発現と共に可溶性リガンドの存在によって特徴付けることができる。
【０１６２】
本発明の細胞および医薬組成物は、前述の疾患の処置および／または予防において使用するためであってもよい。
【０１６３】
本発明の細胞および医薬組成物は、前述の方法のいずれかにおいて使用するためであってもよい。
【０１６４】
本発明はここで、本発明の実施において当業者を支援するために役立つことを意図し、本発明の範囲を決して限定するものではない実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【０１６５】
（実施例１）
構成的に活性のあるサイトカインシグナル伝達をもたらす２つのキメラポリペプチドの設計および試験
図４で例示した構築物を使用して、２つのキメラポリペプチドを設計し試験した。第１の構築物は、抗γＣｓｃＦｖ細胞外ドメインおよびＩＬ−７受容体細胞内ドメインを含むキメラポリペプチドをコードする。第２の構築物は、抗ＩＬ−７受容体ｓｃＦｖ細胞外ドメインおよびγＣ細胞内ドメインを含むキメラポリペプチドをコードする。
【０１６６】
マーカーをコードする核酸（ＲＱＲ８）は、２Ａ−ペプチドをコードする配列によって分離されたこれら２つのポリペプチドのうちの１つをコードする核酸配列とインフレームでクローニングされる。
【０１６７】
マウス細胞系２Ｅ８（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−２３９（商標））は、細胞増殖のためにＩＬ７に依存している。ＩＬ−７シグナルがないと、細胞はアポトーシスを受ける。２Ｅ８細胞に、ＲＱＲ８と一緒に前述のキメラポリペプチドを発現するベクターを形質導入するか、または形質導入しないままにする（ＷＴ）。陽性対照として、３種類全ての細胞をマウスＩＬ７  １００Ｕ／ｍｌと同時培養する。３日および７日間の培養後に細胞増殖を評価する。
【０１６８】
試験した２つの構築物のアミノ酸配列を以下に示す。
【０１６９】
図４Ａで示した構築物の成分のアミノ酸配列
【化７−１】
2021503902.tif 000008
【化７−２】
2021503902.tif 000009
【０１７０】
図４Ｂで示した構築物の成分のアミノ酸配列
【化８−１】
2021503902.tif 000010
【化８−２】
2021503902.tif 000011
【０１７１】
（実施例２）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験
Ｔ細胞は、ＣＡＲまたはキメラポリペプチドと共にＣＡＲを同時発現する構築物のいずれかで形質導入する。形質導入されたＴ細胞は、外来性ＩＬ２の存在下または非存在下で、標的に対する異なるエフェクター比で培養する。Ｔ細胞の増殖および標的細胞の死滅を決定する。このようにして、キメラポリペプチドのＴ細胞の増殖および生存に対する寄与を測定することができる。
【０１７２】
（実施例３）
ｉｎ  ｖｉｖｏ試験
ＣＡＲまたはキメラポリペプチドと共にＣＡＲを同時発現する構築物で形質導入したＴ細胞を、腫瘍を有するＮＳＧマウスに投与する。各コホート内のマウスを異なる時点で屠殺し、腫瘍床またはリンパ節、脾臓および骨髄などのリンパ系組織内でのＴ細胞の生着／拡大を前記組織のフローサイトメトリーによって測定する。
【０１７３】
上記明細書で言及した全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれている。本発明の範囲および精神を逸脱することのない本発明の記載した方法および系の様々な改変および変更は、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、請求されている本発明はこのような特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、分子生物学または関連する分野の当業者には明らかな、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内にあるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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