(57)【要約】  選択されたゲノム遺伝子座でのＤＮＡメチル化の変化に基づいて対象の肺癌を同定するための方法とキットが提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒト対象の肺癌を同定する方法であって、
（ａ）前記対象から得られた試料からのＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化にかけ、それにより制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、前記少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択され、それにより各遺伝子座の増幅産物を生成することと、
（ｃ）生成された各増幅産物のシグナル強度を決定することと、
（ｄ）前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の各々の前記増幅産物の前記シグナル強度間の比率を少なくとも１つの基準比率と比較して、肺癌が前記ヒト対象に存在するかどうかを決定することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記試料が血漿試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記対照遺伝子座が、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠く遺伝子座である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記少なくとも１つの基準比率が健常な基準比率を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの基準比率が肺癌基準比率を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ａ）が、単一のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを使用して実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼがＨｉｎＰ１ＩおよびＨｈａＩから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ステップ（ｂ）がリアルタイムＰＣＲを使用して実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記方法が、前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の前記増幅産物の検出を支援するための蛍光プローブを追加することをさらに含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記対照遺伝子座のそれぞれの前記増幅産物の前記シグナル強度間の前記比率が、各遺伝子座の定量化サイクル（Ｃｑ）を決定することと、２（Ｃｑ対照遺伝子座−Ｃｑ制限遺伝子座）を計算することとによって計算される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座が、配列番号４に示される遺伝子座、および任意選択的に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５、および配列番号６に示される遺伝子座の群から選択される少なくとも１つの追加の制限遺伝子座を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号６に示されるすべての遺伝子座を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
各々がヒト細胞株由来のＤＮＡを含む第１および第２の対照ＤＮＡを提供することであって、前記第１の対照ＤＮＡは、前記少なくとも１つの制限遺伝子座が大部分メチル化されているヒト細胞株からのＤＮＡを含み、前記第２の対照ＤＮＡは、前記少なくとも１つの制限遺伝子座のうちの１つ以上が大部分メチル化されていないヒト細胞株からのＤＮＡを含む、提供することと、
前記第１および第２の対照ＤＮＡを前記メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化することと、
前記第１および第２の対照ＤＮＡから前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記対照遺伝子座を増幅することと、をさらに含み
前記第１の対照ＤＮＡにおける前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の適切な増幅の検出は、ＤＮＡ増幅の成功を示し、前記第２の対照ＤＮＡにおける前記対照遺伝子座の正常な増幅と同時に起こる前記少なくとも１つの制限遺伝子座うちの１つ以上の低増幅または増幅の欠如は、ＤＮＡ消化の成功を示す、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座が大部分メチル化されている前記ヒト細胞株がＨＣＴ−１５である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
１つ以上の制限遺伝子座が大部分メチル化されていない前記ヒト細胞株がＡ６７３である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
前記対照遺伝子座が、配列番号７に示される遺伝子座である、請求項１に記
載の方法。
【請求項１７】
肺癌の疑いのあるヒト対象からのＤＮＡのメチル化比率を測定する方法であって、
（ａ）前記対象から得られた試料からのＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化にかけ、それにより制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、前記少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択され、それにより各遺伝子座の増幅産物を生成することと、
（ｃ）生成された各増幅産物のシグナル強度を決定することと
（ｄ）前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の各々の前記増幅産物の前記シグナル強度間の比率を計算し、それにより前記ヒト対象からのＤＮＡのメチル化比率を測定することと、を含む、方法。
【請求項１８】
前記試料が血漿試料である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ヒト対象の肺癌をスクリーニングする方法であって、
請求項１７に記載の方法に従って前記ヒト対象からのＤＮＡのメチル化比率を測定することと、
前記メチル化比率に基づいて、肺癌が前記ヒト対象に存在することを判定することと、を含む、方法。
【請求項２０】
ヒト対象の肺癌をスクリーニングする方法であって、
前記対象の試料からのＤＮＡに対して請求項１に記載の方法を実施することにより、肺癌が前記ヒト対象に存在するかどうかを同定することと、
前記対象が肺癌であると同定された場合に、生検による確定診断を実施することと、を含む方法。
【請求項２１】
ヒト対象の肺癌を同定するためのキットであって、
ヒト対象の試料からのＤＮＡを消化するための少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素と、
前記少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素による消化後の少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、を含み、前記少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される、キット。
【請求項２２】
前記試料が血漿試料である、請求項２１に記載のキット。
【請求項２３】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座および前記対照遺伝子座の増幅産物を検出するための複数のポリヌクレオチドプローブをさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２４】
コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータソフトウェアを使用して肺癌の同定を実施するための命令をさらに含み、前記コンピュータソフトウェアは、前記少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の、それらの増幅後のシグナル強度を決定するステップと、前記少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の各々のシグナル強度間のシグナル比率を計算するステップと、前記計算されたシグナル比率を少なくとも１つの基準比率と比較するステップと、前記比較に基づいて、前記ＤＮＡ試料が肺癌ＤＮＡか健常ＤＮＡかを出力するステップと、を実行するようにコンピュータプロセッサに指示する、請求項２１に記載のキット。
【請求項２５】
前記少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の、それらの増幅後のシグナル強度を決定するステップと、前記少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座のそれぞれのシグナル強度間のシグナル比率を計算するステップと、前記計算されたシグナル比率を少なくとも１つの基準比率と比較するステップと、前記比較に基づいて、ＤＮＡ試料が肺癌ＤＮＡか健常なＤＮＡかを出力するステップと、を実行するようにコンピュータプロセッサに指示するコンピュータソフトウェアを格納するコンピュータ可読媒体をさらに含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２６】
前記キットが単一のメチル化感受性エンドヌクレアーゼを含む、請求項２１に記載のキット。
【請求項２７】
前記メチル化感受性エンドヌクレアーゼがＨｉｎＰ１ＩおよびＨｈａＩから選択される、請求項２６記載のキット。
【請求項２８】
ヒト対象の肺癌を同定するためのシステムであって、
（ｉ）前記ヒト対象の試料からのＤＮＡを消化するための少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼと、
（ｉｉ）前記少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素による消化後の少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対であって、前記少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される、複数のプライマー対と、
（ｉｉｉ）コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータソフトウェアであって、前記少なくとも１つの制限遺伝子座と前記対照遺伝子座の、それらの増幅後のシグナル強度を決定するステップと、前記少なくとも１つの制限遺伝子座と前記対照遺伝子座の各々のシグナル強度間のシグナル比率を計算するステップと、前記計算されたシグナル比率を少なくとも１つの基準比率と比較するステップと、前記比較に基づいて、ＤＮＡ試料が肺癌ＤＮＡか健常なＤＮＡかを出力するステップと、を実行するようにコンピュータプロセッサに指示する、コンピュータソフトウェアと、を含むシステム。
【請求項２９】
前記試料が血漿試料である、請求項２８に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、対象における肺癌を、そこから由来する生物学的試料を分析することにより、同定するためのキットおよび方法に関する。より詳細には、本発明は、血漿試料からのＤＮＡを分析することによる肺癌の同定に関する。この方法は、正常なＤＮＡと肺癌ＤＮＡの間のＤＮＡメチル化の差異に基づいている。
【背景技術】
【０００２】
肺癌は、肺の細胞から発生する癌であり、最も一般的で深刻なタイプの癌の１つである。肺癌には主に２つのタイプ、すなわち、最も一般的なタイプである非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）と小細胞肺癌がある。ＮＳＣＬＣには、扁平上皮癌、腺癌、大細胞癌など、いくつかのサブタイプがある。
【０００３】
肺癌は通常、肺を介して、時には体の他の部分にも広がるまで、顕著な症状を引き起こさないため、肺癌の一般的な予後は不良である。効率的な早期発見法は転帰の改善につながるが、特に症状が現れる前の早期診断に使用できる肺癌の優れたスクリーニング法はない。
【０００４】
肺癌による死亡率を低減できるかどうかを判断するために、３つのスクリーニング検査が検討されている：胸部の低線量コンピュータ断層撮影（ＣＴ）スキャン、胸部Ｘ線、および喀痰細胞診である。検査された方法の中で、高リスクの個人（ヘビースモーカー）のための低線量ＣＴスクリーニングだけが、肺癌死亡率を減少させることが示された。ただし、ＣＴスキャンでは、低線量であっても胸部が放射線に曝される。さらに、低線量ＣＴスキャンでは、癌ではないことが判明した多くの異常が見出されるが、さらなるＣＴスキャンや追加の検査で確認する必要があり、その一部は侵襲的である。
【０００５】
肺癌の確定診断は、生検後の疑わしい組織の組織学的検査に基づいている。手順には、疑わしい組織をサンプリングするための気管支鏡検査またはＣＴガイド下生検が含まれる。
【０００６】
本発明の出願人に譲渡されたＷＯ２０１１／００１２７４およびＷＯ２０１１／０７０４４１は、増幅後のゲノム遺伝子座間のシグナル比率に基づいて、天然源からのＤＮＡを同定する方法、およびＤＮＡ試料を異なるタイプの組織にカテゴリー化する方法をそれぞれ開示する。
【０００７】
本発明の出願人に譲渡されたＷＯ２０１７／００６３１７は、選択されたゲノム遺伝子座におけるＤＮＡメチル化の変化に基づいて、対象における膀胱癌を同定するための方法およびキットを開示している。
【０００８】
非侵襲性であり、十分に訓練された病理学者を必要とせず、高い特異度と高い感度を特徴とする、スクリーニングおよび診断を必要とする対象の肺癌をスクリーニングおよび診断するための方法およびキットに対する満たされていない必要性がある。
【発明の概要】
【０００９】
本発明は、いくつかの態様によれば、血漿試料からのＤＮＡを分析することにより、肺癌の同定を必要とする対象における肺癌を同定するための方法およびキットを提供する。本発明の方法およびキットは、正常なＤＮＡと肺癌ＤＮＡとの間の選択されたゲノム遺伝子座におけるメチル化の差異に基づいている。
【００１０】
より具体的には、本発明の方法およびキットは、肺癌患者の血漿試料からのＤＮＡでは予想外に高度にメチル化され、健常者の血漿試料からのＤＮＡでは高度にメチル化されないことが判明した一連のゲノム遺伝子座を利用する。したがって、本明細書に開示される一連のゲノム遺伝子座は、所与の血漿試料が肺癌患者由来であるか健常者由来であるかを決定するために使用され得る。
【００１１】
本発明の方法およびキットによれば、検査対象の血漿試料からのＤＮＡは、メチル化されていない場合にのみその認識配列を切断する少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素で消化される。本明細書に開示される「制限遺伝子座」と示される一連のゲノム遺伝子座は、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素の認識配列を含むため、メチル化レベルに応じて切断（消化）され、メチル化が高いほど、酵素による消化が少なくなる。意外にも、健常者のＤＮＡ試料は、本明細書に開示された一連のゲノム遺伝子座で、癌患者のＤＮＡ試料よりも広範囲に切断される。したがって、本発明の制限遺伝子座が高度にメチル化されているＤＮＡ試料とこれらの遺伝子座が低いメチル化レベルを有するＤＮＡ試料との間の消化効率の差異は、その後の増幅および定量化のステップにおいて異なる増幅パターンを確立する。驚いたことに、増幅パターンの差異により、肺癌患者のＤＮＡと肺癌のない健常者のＤＮＡを区別できる。
【００１２】
本発明の方法およびキットによる増幅および定量化ステップは、消化されたＤＮＡからの少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の同時増幅を含む。対照遺伝子座は、消化ステップで使用されるメチル化感受性制限酵素によって切断されない遺伝子座であり得る。次に、増幅された遺伝子座のシグナル強度が決定され、各制限遺伝子座および対照遺伝子座のシグナル強度の間の比率が計算される。肺癌患者のＤＮＡと健常者のＤＮＡで異なるシグナル比率が生成され、肺癌の同定が可能になることが初めて開示された。
【００１３】
肺癌の同定は、検査対象からのＤＮＡに対して計算されたシグナル比率を、既知の供給源、すなわち正常人および／または癌患者における同じ制限および対照遺伝子座について決定された１つ以上の基準比率と比較することによって実行される。この比較に基づいて、検査試料は癌患者または健常者に由来するものとして識別される。本発明のキットおよび方法は、個々の遺伝子座それ自体のメチル化レベルの決定を必要としない点に注意すべきである。
【００１４】
本発明の方法およびキットは、血漿試料を検査することによって肺癌の同定を可能にし、したがって、疾患の非侵襲的な分子ベースのスクリーニングおよび診断を有利に提供する。請求される方法およびキットの別の利点は、血漿試料に含まれ得る腫瘍由来のＤＮＡの量が少ないにもかかわらず、血漿試料で同定を実施することができることである。本明細書に開示される方法およびキットにより肺癌を診断することによって付与されるさらなる利点は、診断の高い感度および特異度である。さらに、本明細書に記載された方法論は、使用者に依存しない客観的な結果をもたらす。
【００１５】
一態様によれば、本発明は、ヒト対象における肺癌を同定するための方法を提供し、この方法は、
（ａ）対照から得られた試料からのＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化にかけ、それにより制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、
（ｂ）前記制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、前記少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択され、それにより各遺伝子座の増幅産物を生成することと、
（ｃ）生成された各増幅産物のシグナル強度を決定することと、
（ｄ）前記少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の各々の増幅産物のシグナル強度間の比率を少なくとも１つの基準比率と比較して、肺癌がヒト対象に存在するかどうかを決定することと、を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、試料は血漿試料である。
【００１７】
いくつかの実施形態では、対照遺伝子座は、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼの認識配列を欠く遺伝子座である。
【００１８】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの基準比率は、健常な基準比率を含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの基準比率は、肺癌基準比率を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、単一のメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼを使用して実行される。いくつかの実施形態では、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＨｉｎＰ１ＩおよびＨｈａＩから選択される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）は、リアルタイムＰＣＲを使用して実行される。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）がリアルタイムＰＣＲを使用して実行される場合、方法は、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物の検出を支援するための蛍光プローブを追加することをさらに含む。いくつかの実施形態では、前記少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座のそれぞれの増幅産物のシグナル強度間の比率は、各遺伝子座の定量化サイクル（Ｃｑ）を決定し、２（Ｃｑ対照遺伝子座−Ｃｑ制限遺伝子座）を計算することにより、計算される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号４に示される遺伝子座、および任意選択的に、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号６に示される遺伝子座の群から選択される少なくとも１つの追加の制限遺伝子座を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号６に示されるすべての遺伝子座を含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、方法はさらに、
各々がヒト細胞株由来のＤＮＡを含む第１および第２の対照ＤＮＡを提供することであって、第１の対照ＤＮＡは、本明細書に開示される少なくとも１つの制限遺伝子座が大部分メチル化されているヒト細胞株からのＤＮＡを含み、第２の対照ＤＮＡは、本明細書に開示される少なくとも１つの制限遺伝子座のうちの１つ以上が大部分メチル化されていないヒト細胞株からのＤＮＡを含む、提供することと、
第１および第２の対照ＤＮＡをメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化することと、
第１および第２の対照ＤＮＡから、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座を増幅することと、を含み、
ここで、第１の対照ＤＮＡにおける少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の適切な増幅の検出は、ＤＮＡ増幅の成功を示し、第２の対照ＤＮＡにおける対照遺伝子座の正常な増幅と同時に起こる少なくとも１つの制限遺伝子座うちの１つ以上の低増幅または増幅の欠如は、ＤＮＡ消化が成功したことを示す。
【００２５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座が大部分メチル化されているヒト細胞株は、ＨＣＴ−１５である。
【００２６】
いくつかの実施形態では、１つ以上の制限遺伝子座が大部分メチル化されていないヒト細胞株は、Ａ６７３である。
【００２７】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つの制限遺伝子座が大部分メチル化されているヒト細胞株はＨＣＴ−１５であり、１つ以上の制限遺伝子座が大部分メチル化されていないヒト細胞株はＡ６７３である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、対照遺伝子座は、配列番号７に示される遺伝子座である。
【００２９】
別の態様によれば、本発明は、肺癌を有することが疑われるヒト対象からのＤＮＡのメチル化比率を測定する方法を提供し、この方法は、（ａ）対象から得られた試料からのＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化にかけ、それにより制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡを得ることと、（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および、配列番号６からなる群から選択され、それにより各遺伝子座の増幅産物を生成することと、（ｃ）生成された各増幅産物のシグナル強度を決定することと、（ｄ）前記少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の各々の増幅産物のシグナル強度間の比率を計算し、それによりヒト対象からのＤＮＡのメチル化比率を測定することと、を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、試料は血漿試料である。
【００３１】
さらに別の態様によれば、本明細書では、ヒト対象の肺癌をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、
上記のようにヒト対象からのＤＮＡのメチル化比率を測定ことと、このメチル化比率に基づいて肺癌が対象に存在することを判定することと、を含む。
【００３２】
さらに別の態様によれば、本明細書では、ヒト対象の肺癌をスクリーニングする方法を提供し、この方法は、
その対象の試料からのＤＮＡに対して肺癌を同定する本発明の方法を実施することにより、肺癌がヒト対象に存在するかどうかを同定することと、
対象が肺癌であると同定された場合、生検により肺癌の確定診断を実施することと、を含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、試料は血漿試料である。
【００３４】
さらなる態様によれば、本明細書では、ヒト対象の肺癌を同定するためのキットが提供され、このキットは、ヒト対象の試料からのＤＮＡを消化するための少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素と、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素による消化後の少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、を含み、少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、試料は血漿試料である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物を検出するための複数のポリヌクレオチドプローブをさらに含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、キットは、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータソフトウェアを使用して肺癌の同定を実施するための命令をさらに含み、コンピュータソフトウェアは、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の、それらの増幅後のシグナル強度を決定するステップと、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の各々のシグナル強度間のシグナル比率を計算するステップと、計算されたシグナル比率を少なくとも１つの基準比率と比較するステップと、この比較に基づいて、ＤＮＡ試料が肺癌ＤＮＡかまたは健康なＤＮＡかを出力するステップと、を実行するようにコンピュータプロセッサに指示する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の、それらの増幅後のシグナル強度を決定するステップと、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の各々のシグナル強度間のシグナル比率を計算するステップと、計算されたシグナル比率を少なくとも１つの基準比率と比較するステップと、この比較に基づいて、ＤＮＡ試料が肺癌ＤＮＡかまたは健康なＤＮＡかを出力するステップと、を実行するようにコンピュータプロセッサに指示するコンピュータソフトウェアを格納するコンピュータ可読媒体を、さらに含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、キットは、単一のメチル化感受性エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、メチル化感受性エンドヌクレアーゼは、ＨｉｎＰ１ＩおよびＨｈａＩから選択される。
【００４０】
さらなる態様によれば、本明細書では、ヒト対象の肺癌を特定するためのシステムが提供され、このシステムは、
（ｉ）ヒト対象の試料からのＤＮＡを消化するための少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼと、
（ｉｉ）少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素による消化後の少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対であって、少なくとも１つの制限遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される、複数のプライマー対と、
（ｉｉｉ）コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータソフトウェアであって、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の、それらの増幅後のシグナル強度を決定するステップと、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の各々のシグナル強度間のシグナル比率を計算するステップと、計算されたシグナル比率を少なくとも１つの基準比率と比較するステップと、この比較に基づいて、ＤＮＡ試料が肺癌ＤＮＡか健康なＤＮＡかを出力するステップと、を実行するようにコンピュータプロセッサに指示する、コンピュータソフトウェアと、を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、試料は血漿試料である。
【００４２】
本発明のこれらのおよびさらなる態様および特徴は、以下の詳細な説明、実施例および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１Ａ】健常者の試料における対照遺伝子座と２つの制限遺伝子座の増幅プロットの例を示す。
【図１Ｂ】肺癌患者の試料における対照遺伝子座と２つの制限遺伝子座の増幅プロットの例を示す。
【図２】本発明のいくつかの実施形態による、対象における肺癌を同定するための方法を説明するフローチャートである。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
本発明は、規定された遺伝子座におけるＤＮＡメチル化の変化の検出に基づく、血漿試料からのＤＮＡを使用する肺癌の同定に関する。
【００４５】
本発明は、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素によるＤＮＡの消化後に検査ＤＮＡ試料から同時増幅された選択された遺伝子座間のシグナル強度比率を計算することと、これらの比率を、既知の供給源、健康または肺癌に由来する複数のＤＮＡ試料から得られた１つ以上の基準比率と比較することと、を含む。この比較に基づいて、検査試料は癌患者または健常者に由来するものとして識別される。
【００４６】
本明細書で使用される「複数」という用語は、「少なくとも２つ」または「２つ以上」を指す。
【００４７】
本発明の方法は、非侵襲的で使用者に依存しない肺癌をスクリーニングおよび／または診断するための非常に高感度で特異的な手段を提供するので、特に有益である。驚くべきことに、本明細書に開示される方法およびキットは、血漿試料が少量の腫瘍由来のＤＮＡを含むという事実にもかかわらず、血漿中のＤＮＡに基づいて肺癌の正確な診断を提供する。
【００４８】
さらに、腫瘍由来ＤＮＡと正常ＤＮＡを区別するためのメチル化分析を利用して、特定のゲノム遺伝子座で実際のメチル化レベルを決定する必要がある従来の方法とは異なり、本明細書に記載される方法では絶対メチル化レベルを評価することを必要としない。したがって、本明細書に開示される方法は、メチル化レベルそれ自体の決定に関与する標準曲線および／または追加の面倒なステップの必要性を排除し、それにより、単純で費用効果の高い手順を提供する。メチル化を分析するための既知のアプローチに対する追加の利点は、本発明の方法によって得られるシグナル比率によって与えられ、それは同じ反応混合物中の同じＤＮＡ鋳型から（すなわち、同じ反応条件下で）増幅された遺伝子座間で計算される。これにより、鋳型ＤＮＡ濃度の変化、ＰＣＲ条件、阻害剤の存在など、様々な「ノイズ」要因の影響を受けなくなる。このようなノイズは、別個の増幅反応からのシグナルを比較することにより遺伝子座のメチル化レベルを定量化することに基づく既存の方法に内在する。
【００４９】
ヒトゲノムのメチル化は、５−メチルシトシンの形で発生し、ＣｐＧジヌクレオチドとも呼ばれるＣＧ配列の一部であるシトシン残基に限定される（他の配列の一部であるシトシン残基はメチル化されていない）。ヒトゲノムのＣＧジヌクレオチドにはメチル化されているものとそうでないものがある。さらに、メチル化は細胞と組織に特異的であるため、特定のＣＧジヌクレオチドは、特定の細胞でメチル化され、同時に別の細胞ではメチル化されないか、特定の組織でメチル化され、同時に別の組織でメチル化されないことがあり得る。ＤＮＡメチル化は、遺伝子転写の重要な調節因子である。
【００５０】
癌ＤＮＡのメチル化パターンは、正常なＤＮＡのメチル化パターンとは異なり、一部の遺伝子座は高メチル化されているが、他の遺伝子座は低メチル化されている。この異常なメチル化パターンは、血漿などの体液中の腫瘍由来ＤＮＡで検出でき、早期検出、コンパニオン診断、治療に対する反応のモニタリング、再発の検出、および予後のための、非侵襲的な「液体生検」タイプのアッセイの開発を促進する。ただし、体液には正常細胞のＤＮＡも大量に含まれているため、液体生検アッセイを効果的に行うには、非常に多数の正常のＤＮＡ分子のバックグラウンド対する腫瘍由来のＤＮＡを検出できる必要がある。本発明は、有利なことに、肺癌に関連する高メチル化ゲノム遺伝子座を検出するための方法を提供する。この方法は、メチル化感受性酵素によるＤＮＡの酵素消化、それに続く高メチル化標的遺伝子座と内部参照遺伝子座のリアルタイムＰＣＲ、および２つの遺伝子座から得られたシグナル間の比率の正確な定量に基づいている。本明細書に開示される方法は、肺癌を有する対象からの血漿試料を同定することにおいて、非常に感度が高いが特異的である。
【００５１】
いくつかの実施形態では、ヒト被験体における肺癌を同定する方法が提供され、この方法は、（ａ）対象から得られた血漿試料からのＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼにより消化させることと、（ｂ）制限エンドヌクレアーゼ処理されたＤＮＡから、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座を同時増幅し、この少なくとも１つの制限遺伝子座は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択され、それにより各遺伝子座の増幅産物を生成することと、（ｃ）生成された各増幅産物のシグナル強度を決定することと（ｄ）そのＤＮＡ試料中の制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比率を計算することと、（ｅ）肺癌比率に関する前記比率について、所定の閾値を超える高い確率スコアを検出し、それによりヒト対象の肺癌を同定することと、を含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、ヒト対象における肺癌を同定するための方法が提供され、この方法は、（ａ）対象から得られた血漿試料からのＤＮＡを少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼにより消化させることと、（ｂ）消化されたＤＮＡ試料中の少なくとも配列番号４に示される制限遺伝子座および対照遺伝子座を増幅し、この対照遺伝子座は、肺癌ＤＮＡおよび正常ＤＮＡにおいて同じ消化および増幅プロファイルを示す遺伝子座であり、それにより、そのＤＮＡ試料中の各遺伝子座の増幅産物を生成することと、（ｃ）生成された各増幅産物のシグナル強度を決定することと、（ｄ）そのＤＮＡ試料中の制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比率を計算することと、（ｅ）肺癌比率に関する前記比率について、所定の閾値を超える高い確率スコアを検出し、それによりヒト対象の肺癌を同定することと、を含む。
【００５３】
いくつかの実施形態では、肺癌比率に関するその比率の高確率スコアを検出することは、所定の閾値を超える確率スコアを検出することを含む。
【００５４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、検査ＤＮＡ試料のシグナル比率を計算することと、計算されたシグナル比率を対応する健康な基準比率、肺癌基準比率または両方と比較することと、比較に基づいて検査ＤＮＡ試料を肺癌ＤＮＡ試料として同定することと、を含む。
【００５５】
いくつかの実施形態では、肺癌比率に関して高確率スコアを検出することは、検査ＤＮＡ試料について計算された比率を対応する健康基準比率と比較することと、計算された比率が、比較に基づいて肺癌比率である（すなわち、肺癌を表す）確率を反映する確率スコアを割り当てることと、を含み、ここで、所定の閾値を超える高い確率スコアは、肺癌を示す。
【００５６】
さらなる実施形態では、肺癌比率に関して高い確率スコアを検出することは、検査ＤＮＡ試料について計算された比率を対応する肺癌基準比率と比較することと、計算された比率が比較に基づいて肺癌比率である確率を反映する確率スコアを割り当てることと、を含み、ここで、所定の閾値を超える高い確率スコアは、肺癌を示す。
【００５７】
さらに追加の実施形態では、肺癌比率に関して高確率スコアを検出することは、検査ＤＮＡ試料について計算された比率を対応する健康基準比率および対応する肺癌基準比率と比較することと、計算された比率は、比較に基づいて肺癌比率である確率を反映する確率スコアを割り当てることと、を含み、ここで、所定の閾値を超える高い確率スコアは、肺癌を示す。
【００５８】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の方法は、健康基準比率および肺癌基準比率のうちの少なくとも１つを提供することを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、方法は、検査試料について計算された比率を、肺癌患者および／または健常者において決定された複数の比率を含む基準スケールと比較することを含み、その確率スコアは、基準スケール内のその相対位置に基づいて前記計算された比率に割り当てられるスコアである。いくつかの実施形態では、比率の値が高いほど、それに割り当てられるスコアが高くなる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、方法は、配列番号４に示される制限遺伝子座および少なくとも１つの追加の制限遺伝子座を増幅することと、それにより少なくとも１つの追加の制限遺伝子座の増幅産物を生成することと、追加の各制限遺伝子座ついてステップ（ｃ）〜（ｄ）を繰り返すことと、を含む。いくつかの実施形態では、対応する肺癌基準比率に関する複数の比率について複数の確率スコアが得られ、各比率は、別個の制限遺伝子座および対照遺伝子座の間にある。いくつかの実施形態では、複合確率スコアが、複数の確率スコアに基づいて計算される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、複合スコアは、平均スコアであり得る。他の実施形態では、複合スコアは、複数の確率スコアの加重平均であってもよい。一部の実施形態では、複合スコアは、すべての確率スコアの合計であり得る。一般に、複合スコアは、すべての確率スコアを表す任意の数学的値または統計値を含むことができる。
【００６２】
いくつかの実施形態では、高い複合確率スコアを検出することにより、ヒト対象の肺癌を同定する。いくつかの実施形態では、高い複合確率スコアを検出することは、所定の閾値を超える複合確率スコアを検出することである。
【００６３】
「からのＤＮＡ」、「由来のＤＮＡ」、「内のＤＮＡ」などの用語は互いに置換可能であり、試料、例えば血漿試料から得られたＤＮＡ、試料から単離されたＤＮＡ、または試料そのまま、すなわちＤＮＡをそこで含む試料を指す。
【００６４】
本発明によれば、ＤＮＡは、生検の必要なしに、入手可能な試料から得られる。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは血漿または血清から得られる。他の実施形態では、ＤＮＡは気管支洗浄により得られる。
【００６５】
「肺癌」という用語は、肺の細胞から生じる悪性腫瘍を指す。肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）（サブタイプの扁平上皮癌、腺癌および大細胞癌）および小細胞肺癌を含めて本明細書で使用される。タイプに加えて、肺癌はまた、典型的には、例えば、生検染色および／またはイメージングに基づいて病期によって特徴付けられ、Ｉ期、ＩＩ期、ＩＩＩ期およびＩＶ期を含む。
【００６６】
いくつかの実施形態では、肺癌は非小細胞肺癌である。一部の特定の実施形態では、非小細胞肺癌は、扁平上皮癌である。さらなる特定の実施形態では、非小細胞肺癌は腺癌である。さらに追加の特定の実施形態では、非小細胞肺癌は大細胞癌である。他の実施形態では、肺癌は小細胞肺癌である。
【００６７】
本明細書で使用される「肺癌の同定」、「対象における肺癌の同定」および「対象が肺癌を有すると同定する」という用語は互いに置換可能であり、対象における、肺癌のスクリーニング、肺癌の存在の検出、肺癌の再発の検出、肺癌に対する感受性の検出、肺癌の治療に対する反応の検出、肺癌の治療効果の判定、肺癌の病期（重症度）の判定、肺癌の予後の判定および肺癌の早期診断のいずれか１つ以上を包含する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００６８】
本明細書で使用される「対象」という用語は、「個体」と互いに置換可能であり、ヒト対象を指す。対象は肺癌を疑われている可能性がある。いくつかの実施形態では、対象は、例えば、疾患の以前の病歴、遺伝的素因、および／または家族歴に基づいて、任意の１つ以上の発癌物質、職業上の危険、環境上の危険に曝された対象、および／または癌の疑わしい臨床徴候を示す対象は、肺癌を発症するリスクがあり得る。いくつかの実施形態では、対象は、例えば、咳、喀血、喘鳴、または息切れなどの呼吸器症状、体重減少、脱力感および発熱などの全身症状、胸部の痛み、骨の痛み、嚥下困難などの隣接する構造に癌塊が押し付けられることによる症状を含む、肺癌の少なくとも１つの症状または特徴を示し得る。他の実施形態では、対象は無症候性であり得る。
【００６９】
血漿試料の収集と処理
「血漿」という用語は、全血試料が血球を除去するための分離プロセスを受けた後に残る液体を指す。血漿試料は、例えば遠心分離および／または濾過によるものを含む、任意の分離方法を使用して全血から分離された試料であり得る。血漿試料は、従来の収集容器またはチューブを使用して収集することができる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ゲノムＤＮＡは、当技術分野で公知の方法に従って血漿試料から抽出されてもよい。例示的な手順は、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｆｏｕｒｔｈ  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，２０１２に記載されている。
【００７１】
ＤＮＡ消化
本発明の方法によれば、血漿試料からのＤＮＡは、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼ、例えば、１つ、２つ、３つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化を受ける。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７２】
いくつかの実施形態では、血漿試料から抽出されたＤＮＡ全体が消化ステップで使用される。いくつかの実施形態では、ＤＮＡは、消化を受ける前に定量されない。他の実施形態では、ＤＮＡは、その消化の前に定量化され得る。
【００７３】
本明細書で「制限酵素」と互いに置換可能に使用される「制限エンドヌクレアーゼ」は、制限部位として知られる、特定の認識ヌクレオチド配列またはその近くでＤＮＡを切断する酵素を指す。
【００７４】
「メチル化感受性」の制限エンドヌクレアーゼは、メチル化されていない場合にのみ、その認識配列を切断する制限エンドヌクレアーゼである（メチル化された部位は無傷のままである）。したがって、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによるＤＮＡ試料の消化の程度は、メチル化レベルに依存し、メチル化レベルが高いほど、切断から保護され、したがって消化が少なくなる。
【００７５】
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＡａｔＩＩ、Ａｃｃ６５Ｉ、ＡｃｃＩ、Ａｃｉｌ、ＡＣＩＩ、Ａｆｅｌ、Ａｇｅｌ、Ａｐａｌ、ＡｐａＬＩ、ＡｓｃＩ、ＡｓｉＳＩ、Ａｖａｌ、ＡｖａＩＩ、ＢａｅＩ、ＢａｎＩ、ＢｂｅＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｆｕＣＩ、ＢｇｌＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、ＢｓａＨＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＹＩ、ＢｓｉＥＩ、ＢｓｉＷＩ、ＢｓｌＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＤＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＦＩ、ＢｓｓＨＩＩ、ＢｓｓＫＩ、ＢｓｔＡＰＩ、ＢｓｔＢＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺｌ７Ｉ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｌａＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒｄＩ、ＥａｅＩ、ＥａｇＩ、Ｅａｇｌ−ＨＦ、ＥｃｉＩ、ＥｃｏＲＩ、ＥｃｏＲＩ−ＨＦ、ＦａｕＩ、Ｆｎｕ４ＨＩ、ＦｓｅＩ、ＦｓｐＩ、ＨａｅＩＩ、ＨｇａＩ、ＨｈａＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、Ｈｉｎｆｌ、ＨｉｎＰｌＩ、ＨｐａＩ、ＨｐａＩＩ、Ｈｐｙｌ６６ｉｉ、Ｈｐｙｌ８８ｉｉｉ、Ｈｐｙ９９Ｉ、ＨｐｙＣＨ４ＩＶ、ＫａｓＩ、ＭｌｕＩ、ＭｍｅＩ、ＭｓｐＡｌＩ、ＭｗｏＩ、ＮａｅＩ、ＮａｃＩ、ＮｇｏＮＩＶ、Ｎｈｅ−ＨＦＩ、ＮｈｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｏｔＩ、ＮｏｔＩ−ＨＦ、ＮｒｕＩ、Ｎｔ．ＢｂｖＣＩ、Ｎｔ．ＢｓｍＡＩ、Ｎｔ．ＣｖｉＰＩＩ、ＰａｅＲ７Ｉ、ＰｌｅＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｐＯＭＩ、ＰｖｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｒＩＩ、ＳａｃＩＩ、Ｓａｌｌ、ＳａｌＩ−ＨＦ、Ｓａｕ３ＡＩ、Ｓａｕ９６Ｉ、ＳｃｒＦＩ、ＳｆｉＩ、ＳｆｏＩ、ＳｇｒＡＩ、ＳｍａＩ、ＳｎａＢＩ、ＴｆｉＩ、ＴｓｃＩ、ＴｓｅＩ、ＴｓｐＭＩおよびＺｒａＩからなる群から選択され得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００７６】
いくつかの実施形態では、血漿試料からのＤＮＡは、１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化を受け得る。いくつかの特定の実施形態では、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＨｉｎＰ１Ｉであり得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ消化は、完全に消化するまで実施され得る。いくつかの実施形態では、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｉｎＰ１Ｉであり得、完全な消化は３７℃での酵素との１〜２時間のインキュベーション後に達成され得る。
【００７８】
いくつかの実施形態では、血漿試料は、１つのメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼによる消化を受け得る。いくつかの特定の実施形態では、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼは、ＨｈａＩであり得る。
【００７９】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ消化は、完全に消化するまで実施され得る。いくつかの実施形態では、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼはＨｈａＩであり得、完全な消化は３７℃での酵素との１〜２時間のインキュベーション後に達成され得る。
【００８０】
ゲノム遺伝子座の増幅
本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座」または「遺伝子座」という用語は互いに置換可能であり、染色体上の特定の位置にあるＤＮＡ配列を指す。特定の位置は、分子の位置によって、つまり染色体上の開始および終了塩基対の数によって同定できる。本明細書で使用される場合、これらの用語はまた、特定の位置のＤＮＡ配列を、５’および／または３’フランキング配列とともに包含し、前記ＤＮＡ配列のすぐ上流および／または下流の約５０塩基までである。
【００８１】
一部の実施形態では、５’フランキング配列は、１〜５０塩基を含み得る。追加の実施形態では、５’フランキング配列は１０〜４０塩基の間である。例えば、５’フランキング配列には、遺伝子座のすぐ上流に最大１０塩基、最大１５塩基、最大２０塩基、最大２５塩基、最大３０塩基、最大３５塩基、最大４０塩基、最大４５塩基、または最大５０塩基を含むことができる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８２】
一部の実施形態では、３’フランキング配列は、１〜５０塩基を含み得る。追加の実施形態では、３’フランキング配列は１０〜４０塩基の間である。例えば、３’フランキング配列には、遺伝子座のすぐ下流に最大１０塩基、最大１５塩基、最大２０塩基、最大２５塩基、最大３０塩基、最大３５塩基、最大４０塩基、最大４５塩基、または最大５０塩基を含むことができる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８３】
所与のゲノム位置にあるＤＮＡ配列のバリアントは、対立遺伝子と呼ばれる。遺伝子座の対立遺伝子は、相同染色体の同一部位に位置する。遺伝子座には、遺伝子配列ならびに他の遺伝的要素（遺伝子間配列など）が含まれる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「制限遺伝子座」は、方法で使用されるメチル化感受性制限酵素の認識配列を含む遺伝子座を説明するために使用される。
【００８５】
「対照遺伝子座」および「内部参照遺伝子座」は交換可能であり、消化工程で適用される制限酵素による消化が癌の存在または不在とは無関係である遺伝子座を説明するために本明細書で使用される。いくつかの実施形態では、対照遺伝子座は、肺癌ＤＮＡおよび正常ＤＮＡにおいて同じ消化および増幅プロファイルを示す遺伝子座である。いくつかの実施形態では、対照遺伝子座は、消化ステップで適用される制限酵素の認識配列を欠く遺伝子座である。有利には、対照遺伝子座は、内部遺伝子座、すなわち、分析されたＤＮＡ試料内の遺伝子座であり、したがって、外部／追加の対照試料の必要性を排除する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、１つの制限遺伝子座または複数の制限遺伝子座は、以下のように、配列番号１〜６に示される任意の１つ以上の遺伝子座を含む：
配列番号１は、第５番染色体上の４３０３０４７６位の制限遺伝子座に対応する（遺伝子間領域）。
配列番号２は、第２番染色体上の１７６７１２７６０位の制限遺伝子座に対応する（遺伝子間領域）。
配列番号３は、第１７番染色体上の４４１５１８３７位の制限遺伝子座に対応する（遺伝子間領域）。
配列番号４は、第１番染色体上の１６８９０７２６９位の制限遺伝子座に対応する（ＰＲＲＸ１遺伝子）。
配列番号５は、第７番染色体上の１５８６２９２９３位の制限遺伝子座に対応する（ＶＩＰＲ２遺伝子）。
配列番号６は、第７番染色体上の１５４８６０２６２位の制限遺伝子座に対応する（遺伝子間領域）。
予期せぬことに、配列番号１〜６に示される制限遺伝子座は、本発明の発明者らによって、肺癌患者の血漿由来のＤＮＡと健常者の血漿由来のＤＮＡとの間で特異的にメチル化されることが同定された。より具体的には、これらの遺伝子座は、正常な非癌性ＤＮＡと比較して、肺癌ＤＮＡ（肺腫瘍に由来するＤＮＡ）のメチル化を増加させている。
【００８７】
これらの遺伝子座の各々には、正常な非癌性ＤＮＡと比較して肺癌ＤＮＡでよりメチル化されているＣＧジヌクレオチドを含有する。有利には、特異的にメチル化されたＣＧジヌクレオチドは、メチル化感受性制限酵素の認識部位内に位置する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、これらの遺伝子座の各々は、メチル化感受性制限酵素の少なくとも１つの制限部位を含み得、ＣＧジヌクレオチドは、健常者の血漿からのＤＮＡよりも肺癌患者の血漿からのＤＮＡにおいてよりメチル化されており、肺癌患者の血漿では、健常者の血漿と比較して、この位置でより多くのＤＮＡ分子がメチル化されていることを意味する。いくつかの実施形態では、これらの遺伝子座の各々は、少なくとも１つのＨｉｎＰ１Ｉ制限部位（ＧＣＧＣ）を含有し得る。このようなメチル化感受性制限酵素は、メチル化されていない場合にのみ、その認識配列を切断する。したがって、制限部位のＣＧジヌクレオチドがメチル化されているＤＮＡ分子の割合が高いＤＮＡ試料は、ＣＧジヌクレオチドがメチル化されていないＤＮＡ分子の割合が高いＤＮＡ試料と比較して、消化の程度がより低くなる。本明細書に開示される方法に基づいて、メチル化感受性制限酵素によるＤＮＡ消化は、正常（健常）者からのＤＮＡと比較して、肺癌患者の血漿試料からのＤＮＡについてはそれほど広範囲ではない。驚くべきことに、消化効率の違いにより、その後の増幅および定量ステップで異なる増幅パターンが確立され、肺癌患者のＤＮＡと健常者のＤＮＡを区別できることが判明した。
【００８９】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜６に示される遺伝子座の各々は、追加のＣＧジヌクレオチドを含有することができ、そのメチル化状態はアッセイに関連性または影響を及ぼさず−制限酵素（例えばＨｉｎＰ１Ｉ）の認識配列におけるメチル化のみが関連する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、対照遺伝子座は配列番号７に示されるものであり、第７染色体上の１２１３８０８５４〜１２１３８０９１３位に対応する（遺伝子間領域）。
【００９１】
いくつかの実施形態では、内部参照遺伝子座とも呼ばれる対照遺伝子座は、制限酵素の認識配列を含有しない。いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料がメチル化感受性制限酵素で消化される場合、対照遺伝子座の配列は、そのメチル化状態に関係なく無傷のままである。
【００９２】
いくつかの実施形態では、対照遺伝子座の配列は、肺癌ＤＮＡおよび正常ＤＮＡにおいて同じ消化および増幅プロファイルを示す。
【００９３】
いくつかの実施形態では、対照遺伝子座は、配列番号７に示される遺伝子座を含む。メチル化感受性制限酵素による消化後の対照遺伝子座の増幅パターンは、メチル化の影響を受けない。
【００９４】
肺癌患者の血漿試料と健常者の血漿試料とを区別するために配列番号１〜６に示される制限遺伝子座を使用することの利点は、メチル化感受性制限酵素ＨｉｎＰ１Ｉを使用して以下に例示する。ＨｉｎＰ１Ｉでの消化後の配列番号１〜６の各々を含む制限遺伝子座および配列番号７を含む対照遺伝子座の増幅を、癌患者および健常者からの血漿ＤＮＡ中で実施した。各制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物間のシグナル比率の計算は、対照群と比較して、癌群でかなり高いシグナル比率（少なくとも一桁高い）を示した。
【００９５】
いくつかの実施形態では、方法は、ＤＮＡ試料の消化後に少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座を増幅することを含む。
【００９６】
本明細書で使用される場合、「少なくとも１つの（制限／対照）遺伝子座」は、単一の遺伝子座または複数の別個の遺伝子座を包含し得、その結果、「配列番号１で示される遺伝子座および配列番号２に示される遺伝子座を含む少なくとも１つの制限遺伝子座」などの句は、少なくともこれら２つの別個のゲノム遺伝子座が増幅されることを示す。
【００９７】
いくつかの実施形態では、方法は、配列番号１に示される配列を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座、ならびに任意選択で少なくとも１つの追加の制限遺伝子座を増幅することを含む。
【００９８】
いくつかの実施形態では、方法は、配列番号２に示される配列を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座、ならびに任意選択で少なくとも１つの追加の制限遺伝子座を増幅することを含む。
【００９９】
いくつかの実施形態では、方法は、配列番号３に示される配列を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座、ならびに任意選択で少なくとも１つの追加の制限遺伝子座を増幅することを含む。
【０１００】
いくつかの実施形態では、方法は、配列番号４に示される配列を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座、ならびに任意選択で少なくとも１つの追加の制限遺伝子座を増幅することを含む。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、方法は、配列番号５に示される配列を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座、ならびに任意選択で少なくとも１つの追加の制限遺伝子座を増幅することを含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、方法は、配列番号６に示される配列を含む制限遺伝子座および対照遺伝子座、ならびに任意選択で少なくとも１つの追加の制限遺伝子座を増幅することを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、方法は、配列番号４に示される配列を含む制限遺伝子座および配列番号７に示される配列を含む対照遺伝子座を増幅することを含む。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、方法は、複数の制限遺伝子座（すなわち、少なくとも２つの制限遺伝子座）および対照遺伝子座を増幅することを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、複数の制限遺伝子座は、配列番号１に示される配列を含む制限遺伝子座と、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの追加の制限遺伝子座とを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、複数の制限遺伝子座は、配列番号２に示される配列を含む制限遺伝子座と、配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの追加の制限遺伝子座とを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、複数の制限遺伝子座は、配列番号３に示される配列を含む制限遺伝子座と、配列番号１、配列番号２、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの追加の制限遺伝子座とを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、複数の制限遺伝子座は、配列番号４に示される配列を含む制限遺伝子座と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの追加の制限遺伝子座とを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、複数の制限遺伝子座は、配列番号５に示される配列を含む制限遺伝子座と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号６からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの追加の制限遺伝子座とを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、複数の制限遺伝子座は、配列番号６に示される配列を含む制限遺伝子座と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４および配列番号５からなる群から選択される配列を含む少なくとも１つの追加の制限遺伝子座とを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、複数の制限遺伝子座は、配列番号４として示される配列を含む遺伝子座を含み、配列番号１、２、３、５および６からなる群から選択される配列を含む１つ、２つ、３つ、４つ、５つの、追加の制限遺伝子座をさらに含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、複数の制限遺伝子座は、配列番号１〜６として示されるような配列を含む遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、複数の制限遺伝子座は、配列番号１〜６に示される制限遺伝子座からなる。いくつかの実施形態では、方法は、配列番号１〜６に示されるような複数の制限遺伝子座を増幅することを含む。
【０１１３】
本明細書中で使用される場合、「増幅」とは、関心のある１つ以上の特定の核酸標的のコピー数の増加を指す。当技術分野で周知のように、増幅は通常、ＤＮＡ鋳型、ポリメラーゼ（通常はＴａｑポリメラーゼ）、ｄＮＴＰ、プライマー、およびプローブ（必要に応じて）を補充した適切な緩衝液を含み得るＰＣＲ反応混合物の存在下で、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって実行される。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、任意の長さのヌクレオチドの多量体型、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドのいずれか、またはそれらの類似体が含まれる。本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語はまた、典型的には最大１００塩基までの長さのヌクレオチドの多量体型が含まれる。
【０１１５】
「増幅産物」は、増幅反応において生成および蓄積される特定の標的配列の核酸分子を集合的に指す。この用語は一般に、所与の一連の増幅プライマーを使用してＰＣＲによって生成された核酸分子を指す。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「プライマー」は、標的配列へのアニーリング（標的配列とのハイブリダイズ）することができ、それにより適切な条件下でＤＮＡ合成の開始点となり得る二本鎖領域を作製するオリゴヌクレオチドを定義する。「プライマー対」という用語は、本明細書では、いくつかのタイプの増幅プロセスのうちの１つ、好ましくはＰＣＲによって、選択した核酸配列を増幅する際に一緒に使用されるように選択される、一対のオリゴヌクレオチドを指す。当技術分野で一般に知られているように、プライマーは、選択された条件下で相補的配列に結合するように設計することができる。
【０１１７】
プライマーは、特定のアッセイ形式および特定のニーズに応じて、任意の適切な長さであり得る。一部の実施形態では、プライマーは、少なくとも１５ヌクレオチド長、好ましくは１９〜２５ヌクレオチド長を含み得る。プライマーは、選択された核酸増幅システムに特に適するように適合させることができる。当技術分野で一般に知られているように、オリゴヌクレオチドプライマーは、それらの標的配列とのハイブリダイゼーションの融点を考慮して設計することができる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ、前掲文献）。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、制限および対照遺伝子座は、各遺伝子座を特異的に増幅するために当技術分野で知られているように設計されたリバースおよびフォワードプライマーの対を使用して同じＤＮＡ試料（消化された試料）から増幅させることができる。いくつかの実施形態では、プライマーは、その５’および３’フランキング配列とともに遺伝子座を増幅するように設計され得る。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、５’フランキング配列は、１〜６０塩基を含み得る。追加の実施形態では、５’フランキング配列は１０〜５０塩基の間である。例えば、５’フランキング配列には、遺伝子座のすぐ上流に１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、または５０塩基を含むことができる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、３’フランキング配列は、１〜６０塩基を含み得る。追加の実施形態では、３’フランキング配列は１０〜５０塩基の間である。例えば、３’フランキング配列は、遺伝子座のすぐ下流に１０塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基、３０塩基、３５塩基、４０塩基、４５塩基、または５０塩基を含むことができる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、プライマーは、長さが６０〜１５０ｂｐの増幅産物を生成するように設計されてもよい。いくつかの特定の実施形態では、プライマーは、長さが７０〜１４０ｂｐの増幅産物を生成するように設計されてもよい。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、方法は、同じ反応混合物で２つ以上の標的配列（少なくとも１つの制限遺伝子座および１つの対照遺伝子座）の同時増幅である、多重増幅または共増幅として知られるプロセスを含む。このプロセスでは、複数のプライマー対の同時使用を必要とする。当技術分野で周知のように、プライマーは、増幅中に同じアニーリング温度で機能できるように設計することができる。いくつかの実施形態では、類似の融解温度（Ｔｍ）を有するプライマーが、本明細書で開示される方法で使用される。約３℃〜５℃の間のＴｍ変動は、プールで使用されるプライマーの許容範囲と見なされる。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、すべての制限遺伝子座および対照遺伝子座は、単一の反応混合物中で増幅され得る。他の実施形態では、例えば特定の機械の技術的制限のため、消化されたＤＮＡ試料はいくつかのアリコートに分割することができ、各々は、１つ以上の制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅のためのプライマー対が補充される。したがって、ＤＮＡ試料がいくつかのアリコートに分割されている場合でも、対照遺伝子座は各アリコートで増幅され、シグナル比率の計算は、一緒に、すなわち同じアリコートから増幅された対照遺伝子座および制限遺伝子座について実行される。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、方法は、消化および増幅ステップ（複数可）において、ヒト細胞株に由来する１つ以上の対照ＤＮＡを使用し得る。
【０１２５】
対照ＤＮＡは、消化および増幅プロセスの評価、例えば、消化および増幅ステップの有効性および品質のモニタリングに使用できる。いくつかの実施形態では、対照ＤＮＡおよび検査ＤＮＡ試料は、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素によって消化される。いくつかの実施形態では、対照ＤＮＡおよび検査ＤＮＡ試料は、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座のＰＣＲ増幅にかけられる。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、第１の対照ＤＮＡは、少なくとも１つの制限遺伝子座が大部分メチル化されているヒト細胞株からのＤＮＡを含む。いくつかの特定の実施形態では、第１の対照ＤＮＡは、ＨＣＴ−１５細胞株からのＤＮＡを含む。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、第２の対照ＤＮＡは、本明細書に開示される制限遺伝子座が大部分メチル化されていないヒト細胞株からのＤＮＡを含む。いくつかの特定の実施形態では、第２の対照ＤＮＡは、Ａ６７３細胞株からのＤＮＡを含む。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「大部分」は、制限遺伝子座が少なくとも７５％、好ましくは少なくとも９５％がメチル化された／メチル化されていないことを示す。
【０１２９】
第１の対照ＤＮＡでは、本明細書に開示される制限遺伝子座は、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化しても大部分無傷のままである。その後の増幅ステップでは、本明細書に開示される制限遺伝子座は十分に増幅される。本明細書に開示される対照遺伝子座はまた、第１の対照ＤＮＡにおいて十分に増幅される。
【０１３０】
したがって、第１の対照ＤＮＡにおける制限遺伝子座および対照遺伝子座の適切な増幅を検出することは、本発明の方法における増幅ステップが成功していることを示す。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「適切な増幅」とは、１００，０００単位を超える蛍光レベルを指す。
【０１３２】
第２の対照ＤＮＡでは、メチル化感受性制限エンドヌクレアーゼで消化すると、大部分メチル化されていない制限遺伝子座は広範囲に切断される。その後の増幅ステップでは、これらの制限遺伝子座は低増幅または増幅の欠如を示す。本明細書に開示される対照遺伝子座は、第２の対照ＤＮＡにおいて十分に増幅される。
【０１３３】
したがって、第２の対照ＤＮＡにおける対照遺伝子座の適切な増幅（上記で定義される）と同時に起こる１つ以上の制限遺伝子座の低増幅または増幅の欠如の検出は、本発明の方法における消化ステップが成功することを示す。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「低増幅または増幅の欠如」は、制限遺伝子座のＣｑと対照遺伝子座のＣｑとの間の少なくとも９サイクルのΔＣｑを指す。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ゲノム遺伝子座の増幅は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）としても知られるリアルタイムＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）を使用して実施され得、増幅産物の同時増幅および検出が実行される。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ＲＴ−ＰＣＲにおける増幅産物の検出は、ポリヌクレオチドプローブ、一般的には蛍光標識されたポリヌクレオチドプローブを使用して達成され得る。
【０１３７】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチドプローブ」または「オリゴヌクレオチドプローブ」は互いに置換可能であり、関心のある遺伝子座の核酸配列内、例えば制限遺伝子座または対照遺伝子座の配列内の特異的な部分配列に相補的な標識化ポリヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態では、検出は、レポーター分子とクエンチャー分子の組み合わせ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．）に基づくＴａｑＭａｎアッセイを使用することによって達成される。そのようなアッセイにおいて、ポリヌクレオチドプローブは、それらの５’末端に結合された蛍光部分（フルオロフォア）と、その３’末端に結合されたクエンチャーを有する。ＰＣＲ増幅中、ポリヌクレオチドプローブは鋳型上の標的配列に選択的にハイブリダイズし、ポリメラーゼが鋳型を複製するときに、ポリメラーゼの５’−ヌクレアーゼの活性によりポリヌクレオチドプローブも切断する。ポリヌクレオチドプローブが無傷である場合、クエンチャーと蛍光部分の間のごく近い接近は通常、低レベルのバックグラウンド蛍光をもたらす。ポリヌクレオチドプローブが切断されると、クエンチャーは蛍光部分から切り離され、蛍光強度が増加する。蛍光シグナルは増幅産物の量と相関し、すなわち増幅産物が蓄積するにつれてシグナルは増加する。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「選択的にハイブリダイズする」（ならびに「選択的ハイブリダイゼーション」、「特異的にハイブリダイズする」、および「特異的ハイブリダイゼーション」）は、ストリンジェントな条件下で核酸分子（プライマーまたはプローブなど）が、特定の相補的ヌクレオチド配列に優先的に結合する、二重化する（ｄｕｐｌｅｘｉｎｇ）、またはハイブリダイズすることを指す。「ストリンジェントな条件」という用語は、核酸分子がその標的配列に優先的にハイブリダイズし、他の非標的配列には、それよりも少ない程度でのみまたは全くハイブリダイズしない条件を指す。当該分野で周知であるように、核酸ハイブリダイゼーションに関連する「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、配列依存的であり、異なる条件下では異なる。
【０１３９】
ポリヌクレオチドプローブは長さが変化してよい。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、１５〜３０塩基を含み得る。追加の実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、２５〜３０塩基を含み得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、２０〜３０塩基、例えば、２０塩基、２１塩基、２２塩基、２３塩基、２４塩基、２５塩基、２６塩基、２７塩基、２８塩基、２９塩基、３０塩基を含み得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４０】
ポリヌクレオチドプローブは、鋳型のいずれかの鎖に結合するように設計できる。追加の考慮事項には、ポリヌクレオチドプローブのＴｍが含まれ、これは好ましくはプライマーのＴｍと適合性があるべきである。プライマーおよびプローブを設計するためにコンピュータソフトウェアを使用することができる。
【０１４１】
上記のように、本明細書で開示される方法は、同じ反応混合物中で２つ以上の標的配列（少なくとも１つの制限遺伝子座および１つの対照遺伝子座）の同時増幅を含み得る。並行して増幅される複数の標的配列を区別するために、異なる蛍光色で標識されたポリヌクレオチドプローブを使用することができる。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドプローブは、当技術分野で周知のフルオロフォア／クエンチャー対を形成し、例えば、ＦＡＭ−ＴＡＭＲＡ、ＦＡＭ−ＢＨＱ１、Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ−ＢＨＱ１、ＡＴＴＯ５５０−ＢＨＱ２およびＲＯＸ−ＢＨＱ２が含まれる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、色素の組み合わせは、選択したＲＴ−ＰＣＲサーモサイクラーに適合し得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、蛍光は各ＰＣＲサイクルの間にモニターされてもよく、サイクル数の関数としてプローブからの蛍光シグナルの変化を示す増幅プロットを提供する。
【０１４５】
リアルタイムＰＣＲに関しては、次の用語が使用される。
「定量化サイクル」（「Ｃｑ」）は、ソフトウェアによって自動的に、または使用者が手動で設定した、蛍光が閾値を超えて増加するサイクル数を指す。いくつかの実施形態では、閾値は、すべての遺伝子座について一定であってもよく、増幅および検出を実施する前に、事前に設定されてもよい。他の実施形態では、閾値は、増幅サイクル中にこの遺伝子座について検出された最大蛍光レベルに基づいて、実行後の各遺伝子座について別々に定義されてもよい。
【０１４６】
「閾値」とは、Ｃｑ測定に使用される蛍光の値を指す。いくつかの実施形態では、閾値は、ベースライン蛍光を超える値、および／またはバックグラウンドノイズを超える値であり得、増幅プロットの指数増殖期内にある値であり得る。
【０１４７】
「ベースライン」とは、蛍光の変化がほとんどないかまったくないＰＣＲの初期サイクルを指す。
【０１４８】
コンピュータソフトウェアを使用して、増幅プロットを分析し、ベースライン、閾値、Ｃｑを決定できる。
【０１４９】
少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素による消化後、酵素の認識部位のＣＧジヌクレオチドがメチル化されている遺伝子座は、ＤＮＡ分子が消化から保護されているため、高効率で増幅される。検出可能な増幅産物は、比較的少ない（低い）増幅サイクル数の後に示されるため、結果は比較的低いＣｑ値である。反対に、酵素の認識部位にあるＣＧジヌクレオチドがメチル化されていない遺伝子座は、消化ステップ中に広範囲に切断されるため、増幅および定量ステップでＣｑ値が高くなる（すなわち、比較的多数の増幅サイクルの後に検出可能な増幅産物が示される）。
【０１５０】
他の実施形態では、増幅産物の増幅および検出は、蛍光標識プライマーを使用する従来のＰＣＲと、それに続く増幅産物のキャピラリー電気泳動によって実施することができる。一部の実施形態では、増幅後、増幅産物はキャピラリー電気泳動によって分離され、蛍光シグナルが定量化される。いくつかの実施形態では、サイズ（ｂｐ）または注入からの時間の関数として蛍光シグナルの変化をプロットする電気泳動図を生成することができ、電気泳動図の各ピークは単一の遺伝子座の増幅産物に対応する。ピークの高さ（例えば、「相対蛍光単位」、ｒＦＵを使用して提供される）は、増幅された遺伝子座からのシグナルの強度を表すことができる。コンピュータソフトウェアを使用して、ピークを検出し、その増幅産物がキャピラリー電気泳動装置で実行された一連の遺伝子座の蛍光強度（ピーク高さ）を計算し、その後、シグナル強度間の比率を計算することができる。
【０１５１】
メチル化感受性制限酵素、例えばＨｉｎＰ１Ｉなど、で消化されたＤＮＡ試料に対し、酵素の認識部位のＣＧジヌクレオチドがメチル化されている遺伝子座は、電気泳動図で比較的強いシグナル（高いピーク）を生成する。反対に、酵素の認識部位のＣＧジヌクレオチドがメチル化されていない遺伝子座では、電気泳動図で比較的弱いシグナル（低いピーク）が生成される。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、プライマーの蛍光標識は、フルオレセイン、ＦＡＭ、リサミン、フィコエリトリン、ローダミン、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、ＦｌｕｏｒＸ、ＪＯＥ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＶＩＣおよびＲＯＸのうちの任意の１つを含む。
【０１５３】
シグナル比率
本明細書で使用される場合、「比率」または「シグナル比率」という用語は、（同じ反応混合物中の）単一のＤＮＡ試料における一対のゲノム遺伝子座の同時増幅、特に制限遺伝子座および対照遺伝子座の同時増幅から得られるシグナルの強度間の比率を指す。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「配列番号Ｘの比率」は、本明細書に詳述されるように制限酵素で消化されたＤＮＡ試料中この遺伝子座対の同時増幅後、配列番号Ｘに示される遺伝子座のシグナル強度と対照遺伝子座のシグナル強度との間の比率を指す。
【０１５５】
本明細書で使用される「シグナル強度」という用語は、遺伝子座の無傷なコピーの初期量に対応する遺伝子座特異的増幅産物の量を反映する尺度を指す。ただし、シグナル強度は、増幅産物／無傷な遺伝子座の実際の量を示さなくてもよく、増幅産物／無傷な遺伝子座の絶対量の計算を含まなくてもよい。したがって、増幅産物シグナルの比率を計算する場合、実際のＤＮＡ濃度またはＤＮＡメチル化レベル自体を計算する必要がないため、標準曲線や基準ＤＮＡを必要としなくてもよい。
【０１５６】
いくつかの例示的な実施形態では、増幅産物の増幅および検出はＲＴ−ＰＣＲによって実施され、特定の遺伝子座のシグナル強度がこの遺伝子座について計算されたＣｑによって表され得る。この場合のシグナル比率は、次の計算で表すことができる：２（対照遺伝子座のＣｑ−制限遺伝子座のＣｑ）。
【０１５７】
追加の例示的な実施形態では、増幅産物の検出は、特定の遺伝子座のシグナル強度がその対応するピークの相対蛍光単位（ｒｆｕｓ）の数であるキャピラリー電気泳動によって実施される。シグナル比率は、各制限遺伝子座のピークの高さを対照遺伝子座のピークの高さで割ることによって計算することができる。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中の制限遺伝子座と対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比率を計算することは、（ｉ）制限遺伝子座の増幅産物のシグナル強度を決定することと、（ｉｉ）対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度を決定することと、（ｉｉｉ）２つのシグナル強度の間の比率を計算することと、を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ＤＮＡ試料中の制限遺伝子座および対照遺伝子座の増幅産物のシグナル強度間の比率を計算することは、各遺伝子座のＣｑを決定することと、対照遺伝子座のＣｑと制限遺伝子座のＣｑとの差を計算することを含む。いくつかの実施形態では、計算することは、以下の式を適用することをさらに含む：２＾（対照遺伝子座のＣｑ−制限遺伝子座のＣｑ）。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、シグナル比率を計算することは、各制限遺伝子座および対照遺伝子座との間の複数のシグナル比率を計算することであり得る。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、シグナル比率を計算することは、配列番号１に示される制限遺伝子座および対照遺伝子座との間のシグナル比率を計算することであり得る。いくつかの実施形態では、シグナル比率を計算することは、配列番号２に示される制限遺伝子座および対照遺伝子座との間のシグナル比率を計算することであり得る。いくつかの実施形態では、シグナル比率を計算することは、配列番号３に示される制限遺伝子座および対照遺伝子座との間のシグナル比率を計算することであり得る。いくつかの実施形態では、シグナル比率を計算することは、配列番号４に示される制限遺伝子座および対照遺伝子座との間のシグナル比率を計算することであり得る。いくつかの実施形態では、シグナル比率を計算することは、配列番号５に示される制限遺伝子座および対照遺伝子座との間のシグナル比率を計算することであり得る。いくつかの実施形態では、シグナル比率を計算することは、配列番号６に示される制限遺伝子座および対照遺伝子座との間のシグナル比率を計算することであり得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、配列番号１〜６に示される遺伝子座の中の複数の遺伝子座が増幅され、この方法は、配列番号１〜６に示される遺伝子座の各々と対照遺伝子座との間の、例えば、配列番号１に示される遺伝子座および対照遺伝子座との間の、配列番号２に示される遺伝子座および対照遺伝子座との間などの、比率を計算することを含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、増幅産物のシグナル強度間の比率を計算するためにコンピュータソフトウェアが使用され得る。
【０１６４】
基準比率
「基準比率」または「基準シグナル比率」という用語は互いに置換可能に使用され、既知の供給源からのＤＮＡで決定されたシグナル強度比率を指す。制限遺伝子座および対照遺伝子座の所与の対の基準比率は、いくつかの方法で表すことができる。いくつかの実施形態では、所与の遺伝子座対の基準比率は、単一の比率であってよい。いくつかの実施形態では、所与の遺伝子座対の基準比率は、統計値、例えば、既知の供給源からの大量の一連のＤＮＡ試料から得られた大量の一連の基準比率の平均値、例えば癌患者の大規模な群において決定された平均値、または健常者の大規模な群において決定された平均値、であってもよい。
【０１６５】
他の実施形態では、所与の遺伝子座対の基準比率は、既知の供給源からの大量の一連のＤＮＡ試料におけるこの対の遺伝子座について決定された比率の分布のような、複数の比率であってよい。いくつかの実施形態では、基準比率は基準スケールであり得る。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、所与の遺伝子座対の基準スケールは、同じ基準供給源からの複数のＤＮＡ試料におけるこの対の遺伝子座について測定されたシグナル比率を含み得る。例えば、基準肺癌患者の基準スケールまたは基準健常者の基準スケール。他の実施形態では、所与の遺伝子座対の基準スケールは、健常者と病人の両方からのシグナル比率、すなわち、両方の供給源からの基準比率を組み合わせた単一のスケールを含み得る。一般に、単一のスケールが使用される場合、健常者からの値がスケールの一方の端に、例えばカットオフ値より下になるように、癌患者からの値はスケールのもう一方の端に、例えばカットオフ値より上になるように、値は分布される。いくつかの実施形態では、未知の供給源の検査ＤＮＡ試料について計算されたシグナル比率は、健康および／または癌の基準比率の基準スケールと比較することができ、確率スコアは、スケール内の相対位置に基づいて計算されたシグナル比率に割り当てられたスコアであってよい。いくつかの実施形態では、計算されたシグナル比率が高いほど、それに割り当てられるスコアが高くなり、したがって、肺癌に関する確率が高くなる。
【０１６７】
「肺癌基準比率」または「肺癌ＤＮＡにおける基準比率」という用語は、互いに置換可能で、肺癌患者の血漿試料からのＤＮＡにおける所与の制限遺伝子座と所与の対照遺伝子座との間で測定されるシグナル強度比率を指す。肺癌基準比率は、肺癌ＤＮＡ、すなわち肺癌患者の血漿試料からのＤＮＡにおけるシグナル強度比率を表す。肺癌基準比率は、上で詳述したように、単一の比率、統計値または複数の比率（例えば、分布）であり得る。
【０１６８】
用語「健康基準比率」、「正常基準比率」または健康なＤＮＡの基準比率」は、互いに置換可能で、正常人からの血漿試料中の所与の制限遺伝子座および所与の対照遺伝子座の間で測定されるシグナル強度比率を指す。「健常者」または「正常人」は、本明細書では、従来の診断方法によって決定される、検出可能な肺疾患または症状、および／または肺癌を含む肺関連疾患のない個人として定義される。健康基準比率は、正常なＤＮＡ、すなわち健常者の血漿試料からのＤＮＡにおけるシグナル強度比率を表する。健康基準比率は、上で詳述したように、単一の比率、統計値、または複数の比率（例えば、分布）であり得る。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、肺癌ＤＮＡからの基準比率の事前決定を含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、正常なＤＮＡからの基準比率の事前決定を含む。
【０１７０】
上記のように、シグナル比率は、例えば、キャピラリー電気泳動後にピークを測定すること、またはＲＴ−ＰＣＲ後にＣｑを計算することを含む、様々な方法によって決定することができる。肺癌を決定するために、基準比率および未知の供給源の検査試料について測定された比率は、本明細書に開示される方法を使用して得られることを理解するべきである。
【０１７１】
肺癌の決定
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、肺癌を同定するために、基準比率と比較した未知の供給源の血漿試料からのＤＮＡについて計算されたシグナル比率を評価することに基づく。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、計算されたシグナル比率は、ＤＮＡが肺癌ＤＮＡであることを示す。
【０１７３】
当業者は、検査試料について計算されたシグナル比率と対応する基準シグナル比率との比較が、様々な統計的手段を使用して、いくつかの方法で実行され得ることを理解するであろう。
【０１７４】
いくつかの実施形態では、所与の遺伝子座対について計算された検査シグナル比率を基準シグナル比率と比較することは、検査シグナル比率を単一の基準値と比較することを含む。単一の基準値は、癌患者または健常者の大集団からの基準シグナル比率について得られた平均値に対応し得る。他の実施形態では、所与の遺伝子座対について計算された検査シグナル比率を基準シグナル比率と比較することは、検査シグナル比率を、複数の基準シグナル比率の分布またはスケールと比較することを含む。
【０１７５】
既知の統計的手段は、所与の制限遺伝子座および対照遺伝子座との間で計算されたシグナル比率が肺癌基準比率または正常基準比率に対応するかどうかを決定するために、使用することができる。いくつかの実施形態では、計算された比率と肺癌基準比率とのごく近い近似値を検出することにより、対象が肺癌を有する対象として同定される。反対に、いくつかの実施形態では、計算された比率と正常基準比率とのごく近似値を検出することにより、対象が肺癌を患っていない対象として同定される。
【０１７６】
本発明の方法は、検査ＤＮＡ試料のシグナル比率が肺癌比率であるかどうか、すなわち、肺癌を示すかどうかの分析に基づく。いくつかの実施形態では、この方法は、計算されたシグナル比率をその対応する健康基準比率（すなわち、健常者の同じ遺伝子座対について決定されたシグナル比率）と比較して、計算されたシグナル比率が肺癌比率である可能性を反映するスコア（確率スコア）を取得することを含む。いくつかの実施形態では、この方法は、計算されたシグナル比率をその対応する肺癌基準比率（すなわち、肺癌の同じ遺伝子座対について決定されたシグナル比率）と比較して、計算されたシグナル比率が肺癌比率である可能性を反映するスコアを取得することを含む。計算されたシグナル比率と肺癌基準比率の近似が良いほど、スコア（確率スコア）が高くなり、計算されたシグナル比率が肺癌比率である可能性が高くなる。いくつかの実施形態では、確率スコアは、肺癌基準比率の分布内での計算されたシグナル比率の相対的位置に基づく。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、本方法は、対照遺伝子座に関して複数の制限遺伝子座について計算された複数のシグナル比率を、それらの対応する健康および／または肺癌基準比率と比較することを含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、シグナル比率のパターンは、統計的手段およびコンピュータ化されたアルゴリズムを使用して分析され、それが肺癌のパターンまたは正常で健康なパターンを表すかどうかを決定し得る。例示的なアルゴリズムは、例えば、本発明の出願人に譲渡されたＷＯ２０１１／０７０４４１に開示されている。アルゴリズムには、機械学習およびパターン認識アルゴリズムが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７９】
いくつかの例示的な実施形態において、計算された各比率（制限および対照遺伝子座の各対に対する）は、癌患者、癌に罹患していない個人、またはその両方からの大量の一連の血漿試料のからこの対について生成された基準比率のスケールと比較され得る。このスケールは、癌患者および／または正常人からの多数の試料における、制限遺伝子座および対照遺伝子座の対の間で計算されたシグナル比率を表すことができる。スケールは、閾値を示してもよく、以下「カットオフ」または「事前に定義された閾値」とも呼ばれ、それを超えると肺癌に対応する基準比率であり、それ以下は健常者に対応する基準比率であり、またはその逆順である。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、スケールの下部および／またはカットオフより下のより低い比率は、正常人（健康、すなわち、肺癌に罹患していない）の試料からのものであり得、スケールの上部および／または所定のカットオフを超えるより高い比率は、癌患者からのものであり得る。（各制限遺伝子座および対照遺伝子座の間の）各比率に対して、スケール内のその相対位置に基づいてスコアを与えることができ、（各遺伝子座の）個々のスコアを組み合わせて単一のスコアを与える。いくつかの実施形態では、個々のスコアを合計して単一のスコアを与えることができる。他の実施形態では、個々のスコアを平均して単一のスコアを与えることができる。いくつかの実施形態では、単一のスコアは、対象が癌を有しているかどうかを決定するために使用することができ、所定の閾値を超えるスコアは、肺癌を示す。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、スコアは、計算されたシグナル比率が肺癌比率である確率を反映する０〜１００の間の数であり、０は最も低い確率であり、１００は最も高い確率である。いくつかの実施形態では、閾値スコアが決定され、それに等しいまたそれを超えるスコアは肺癌を示す。閾値は、例えば、６０、７０または８０であり得る。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１８２】
追加の例示的な実施形態では、計算された各比率（各制限遺伝子座および対照遺伝子座の間の）について、それが肺癌ＤＮＡを表す確率は、対応する肺癌基準比率および／または正常基準比率との比較に基づいて決定されてもよく、スコア（確率スコア）を割り当てられてもよい。その結果、各比率（各遺伝子座の）に対して計算された個々の確率スコアが組み合わされて（合計または平均化されて）、複合スコアを与える。複合スコアは、対象が癌を有しているかどうかを決定するために使用することができ、所定の閾値を超える複合スコアは、肺癌を示す。
【０１８３】
したがって、いくつかの実施形態では、閾値またはカットオフスコアが決定され、それを上回る（または下回る）対象は、肺癌を有すると同定される。閾値スコアは、健常者の母集団と非健常者の母集団を区別する。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、閾値スコアを提供することを含む。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、閾値スコアを決定することは、健康であるかまたは肺癌を有している対象の大集団におけるシグナル比率を測定することを含む。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、閾値は統計的に有意な値である。多くの場合、統計的有意性は、２つ以上の母集団を比較し、信頼区間（ＣＩ）および／またはｐ値を決定することによって決定される。いくつかの実施形態では、統計的に有意な値は、約９０％、９５％、９７．５％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％および９９．９９％の信頼区間（ＣＩ）を指し、好ましいｐ値は約０．１、０．０５、０．０２５、０．０２、０．０１、０．００５、０．００１未満または０．０００１未満である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態によれば、閾値スコアのｐ値は最大で０．０５である。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、測定可能な値を指す場合、規定値から＋／−１０％、より好ましくは＋／−５％、さらにより好ましくは＋／−１％、よりさらに好ましくは＋／−０．１％の変動を包含することを意味する。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、方法は、所与の制限遺伝子座および対照遺伝子座との間で計算されたシグナル比率をその対応する正常／健康基準比率と比較して確率スコアを取得することをさらに含み、対応する健康基準比率に関して前記比率の低確率スコアを検出するは、対象が肺癌を有していることを示す。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、本明細書で開示される方法の感度は、少なくとも約７５％であり得る。いくつかの実施形態では、方法の感度は、少なくとも約８０％であり得る。いくつかの実施形態では、方法の感度は、少なくとも約８５％であり得る。いくつかの実施形態では、方法の感度は、少なくとも約９０％であり得る。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、本明細書で使用される診断アッセイの「感度」は、陽性であると診断された病人のパーセンテージ（「真の陽性」のパーセント）を指す。したがって、アッセイによって検出されない病人は「偽陰性」である。罹患しておらず、かつアッセイで陰性と判定された対象は、「真の陰性」と呼ばれる。診断アッセイの「特異度」は、１から偽陽性率を差し引いたものであり、「偽陽性」率は、陽性と診断された疾患のないものの割合として定義される。特定の診断方法は状態の確定診断を提供できないが、この方法が診断に役立つ陽性の指標を提供する場合はそれで十分である。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法の特異度は、少なくとも約６５％であり得る。いくつかの実施形態では、方法の特異度は少なくとも約７０％であり得る。いくつかの実施形態では、方法の特異度は少なくとも約７５％であり得る。いくつかの実施形態では、方法の特異度は少なくとも約８０％であり得る。
【０１９２】
肺癌の確定診断
いくつかの実施形態では、本発明の方法によるヒト対象における肺癌の同定後、対象は、肺癌の確定診断を受けることができる。肺癌の確定診断は、生検後の疑わしい肺組織の組織学的検査に基づいている。この手順では通常、気管支鏡検査またはＣＴガイド下生検を使用して、疑わしい肺組織をサンプリングする。
【０１９３】
肺癌の治療
いくつかの実施形態において、本発明の方法に従って肺癌を同定することと、前記対象に抗肺癌療法を施すことと、を含む、肺癌を治療するための方法が提供される。
【０１９４】
肺癌を治療する方法は、当技術分野で周知の、腫瘍を除去する手術、高周波アブレーション（ＲＦＡ）、放射線療法、化学療法、標的療法および免疫療法のうちの１つ以上を含むことができる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１９５】
キットとシステム
いくつかの実施形態では、ヒト対象における肺癌を同定するためのキットが提供される。いくつかの実施形態では、ヒト対象における肺癌を同定するためのシステムが提供される。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、キットおよびシステムは、本発明の方法による肺癌の同定のためのものである。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、キットは、ヒト対象の血漿試料からのＤＮＡを消化するための少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素と、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素による消化後の少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対と、を含み、少なくとも１つの制限遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の増幅産物を検出するための複数のポリヌクレオチドプローブをさらに含む。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、キットは、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータソフトウェアを使用して肺癌の同定を実施するための命令をさらに含み、コンピュータソフトウェアは、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の、それらの増幅後のシグナル強度を決定するステップと、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の各々のシグナル強度間のシグナル比率を計算するステップと、計算されたシグナル比率を少なくとも１つの基準比率と比較するステップと、この比較に基づいて、ＤＮＡ試料が肺癌ＤＮＡかまたは健康なＤＮＡかを出力するステップと、を実行するようにコンピュータプロセッサに指示する
【０２００】
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の、それらの増幅後のシグナル強度を決定するステップと、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の各々のシグナル強度間のシグナル比率を計算するステップと、計算されたシグナル比率を少なくとも１つの基準比率と比較するステップと、この比較に基づいて、ＤＮＡ試料が肺癌ＤＮＡかまたは健康なＤＮＡかを出力するステップと、を実行するようにコンピュータプロセッサに指示するコンピュータソフトウェアを格納するコンピュータ可読媒体を、さらに含む。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、システムは、ヒト対象の血漿試料からのＤＮＡを消化するための少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素と、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素による消化後の少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の同時増幅のための複数のプライマー対であって、この少なくとも１つの制限遺伝子座が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号６からなる群から選択される、複数のプライマー対と、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータソフトウェアと、を含み、このコンピュータソフトウェアは、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の、それらの増幅後のシグナル強度を決定するステップと、少なくとも１つの制限遺伝子座および対照遺伝子座の各々のシグナル強度間のシグナル比率を計算するステップと、計算されたシグナル比率を少なくとも１つの基準比率と比較するステップと、この比較に基づいて、ＤＮＡ試料が肺癌ＤＮＡかまたは健康なＤＮＡかを出力するステップと、を実行するようにコンピュータプロセッサに指示する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、本発明によるコンピュータソフトウェアは、リアルタイムＰＣＲ実行の入力パラメータまたは生データを受け取る。いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアは、リアルタイムＰＣＲの実行を分析してシグナル強度およびシグナル比率を決定するようにコンピュータプロセッサに指示する。
【０２０３】
コンピュータソフトウェアは、非一時的なコンピュータ可読媒体に格納されるプロセッサ実行可能命令を含む。コンピュータソフトウェアはまた、格納データを含み得る。コンピュータ可読媒体は、コンパクトディスク（ＣＤ）、磁気記憶装置、光学記憶装置、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、または任意の他の有形的表現媒体などの有形的コンピュータ可読媒体である。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つのメチル化感受性制限酵素と、少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の増幅のためのプライマー対と、少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座の増幅産物を検出するための手段と、肺癌の同定を実施するための取扱説明書と、を含む。いくつかの実施形態では、取扱説明書は、電子取扱説明書であってもよい。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、取扱説明書は、肺癌基準比率および／または健康基準比率を提供し得る。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、取扱説明書は、上記の方法ステップを実行するための指示を含み得る。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、取扱説明書は、シグナル比率（複数可）と肺癌基準比率（複数可）および／または健康基準比率（複数可）との間の相関を導く指示を含み得る。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、取扱説明書は、所与の制限遺伝子座の確率スコアを計算するための指示を提供することができる。いくつかの実施形態では、取扱説明書は、複数の確率スコアの合計スコアを計算するための指示を提供することができる。いくつかの実施形態では、取扱説明書は、肺癌を決定するための閾値スコアを提供してもよく、それを超えると、対象は肺癌を有すると同定される。他の実施形態では、取扱説明書は、肺癌を決定するための閾値スコアを提供してもよく、それを下回ると、対象は肺癌を有すると同定される。
【０２０９】
一部の実施形態では、キットは、単一のメチル化感受性エンドヌクレアーゼを含む。いくつかの実施形態では、メチル化感受性エンドヌクレアーゼはＨｉｎＰ１Ｉである。追加の実施形態では、メチル化感受性エンドヌクレアーゼはＨｈａＩである。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、キットは、コンピュータ可読媒体に格納されたコンピュータソフトウェアをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、コンピュータソフトウェアは、本明細書に開示される方法に従ってシグナル強度、シグナル比率および確率スコアのうちの少なくとも１つを計算し、所与のＤＮＡ試料が肺癌ＤＮＡ試料かまたは健康なＤＮＡ試料かを出力するようにコンピュータプロセッサに指示するコンピュータソフトウェアであり得る。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、キットは、ＨｉｎＰ１ＩまたはＨｈａＩと、本明細書に記載の少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座に相補的なプライマー対と、少なくとも１つの制限遺伝子座および少なくとも１つの対照遺伝子座に相補的な蛍光ポリヌクレオチドプローブと、を含む。
【０２１２】
配列番号１〜６に示される制限遺伝子座を増幅するための例示的なプライマーは、以下のように、配列番号８〜７９に示される：
遺伝子座１（配列番号１）
プライマーフォワード：
ＴＧＣＡＴＴＣＴＣＴＣＡＧＧＡＧＣＴＧＧ（配列番号８）
ＧＡＧＣＣＡＡＧＣＴＣＧＧＴＣＴＣＣＧ（配列番号９）
ＣＡＧＣＡＡＣＧＣＴＴＴＴＧＣＣＡＧＴＡＧ（配列番号１０）
ＴＣＴＡＡＴＧＣＧＧＡＧＣＴＧＧＣＧＧＴ（配列番号１１）
ＣＣＣＡＣＴＧＡＧＣＧＧＴＴＴＴＴＣＡＧＴ（配列番号１２）
ＣＧＴＴＴＣＣＣＧＴＡＣＧＣＧＧＡＧＴＣ（配列番号１３）
プライマーリバース：
ＧＴＴＴＴＡＡＴＧＴＧＴＴＧＴＧＡＣＡＧ（配列番号１４）
ＧＴＧＣＴＧＣＴＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧ（配列番号１５）
ＧＧＧＴＴＴＡＧＧＡＡＧＡＧＴＴＣＣＴＡＧＧＡ（配列番号１６）
ＴＡＣＴＡＧＴＴＧＧＣＡＣＡＧＡＧＧＣＴ（配列番号１７）
ＣＧＧＴＧＣＣＡＧＡＡＣＣＧＡＧＡＡＡＧ（配列番号１８）
ＡＣＣＧＴＴＣＴＧＣＡＣＣＧＴＡＡＡＡＣ（配列番号１９）
遺伝子座２（配列番号２）
プライマーフォワード：
ＣＧＧＡＡＴＡＧＧＧＴＴＴＧＣＡＡＡＴＣ（配列番号２０）
ＡＧＧＡＧＡＴＧＣＴＧＣＴＴＧＴＴＣＧＧ（配列番号２１）
ＧＴＴＧＡＡＧＣＴＴＴＴＡＡＴＡＣＡＴＧ（配列番号２２）
ＡＣＡＧＣＴＣＡＣＧＧＴＣＣＣＧＣＡＧ（配列番号２３）
ＧＣＣＣＧＣＣＡＣＡＣＡＣＣＣＧＣ（配列番号２４）
ＣＴＴＧＡＧＡＴＧＡＧＧＴＴＣＣＣＡＡＧＣ（配列番号２５）
プライマーリバース：
ＡＧＡＴＧＡＧＴＡＧＣＧＡＧＣＣＴＴＧＴＣ（配列番号２６）
ＣＧＴＧＣＴＴＴＧＣＣＧＡＴＣＧＡＡＴＴＣ（配列番号２７）
ＴＴＣＣＴＧＣＴＣＧＡＧＴＣＣＡＣＴＣＧ（配列番号２８）
ＣＧＧＧＴＧＴＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣＧＡ（配列番号２９）
ＣＧＡＧＣＣＴＴＧＡＣＧＧＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号３０）
ＣＧＧＡＧＧＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＡＴ（配列番号３１）
遺伝子座３（配列番号３）
プライマーフォワード：
ＴＴＴＣＣＴＣＣＧＣＣＡＣＣＧＡＧＴＡＧ（配列番号３２）
ＧＡＡＧＴＴＴＡＡＧＴＴＴＣＣＡＧＧＴＣＣ（配列番号３３）
ＡＴＴＴＧＣＧＡＡＧＴＴＴＡＡＧＴＴＴＣＣ（配列番号３４）
ＡＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＡＴＣＧＧＡＴＡＧ（配列番号３５）
ＴＣＧＧＣＡＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＴＡＧＣ（配列番号３６）
ＣＣＣＣＡＴＴＴＧＣＧＡＡＧＴＴＴＡＡＧ（配列番号３７）
プライマーリバース：
ＧＧＣＡＧＴＣＴＡＡＴＣＣＴＴＡＡＴＴＴ（配列番号３８）
ＡＴＴＴＴＡＡＴＡＡＴＣＡＧＧＡＴＡＡＡ（配列番号３９）
ＡＴＧＴＴＣＧＡＧＴＣＧＧＴＣＧＴＡＡＣＧ（配列番号４０）
ＧＴＡＣＡＣＡＡＡＣＧＡＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＡ（配列番号４１）
ＣＴＡＧＧＣＡＧＴＣＴＡＡＴＣＣＴＴＡＡＴ（配列番号４２）
ＡＴＡＣＴＡＧＣＴＡＡＧＧＣＣＧＡＴＧＡＴ（配列番号４３）
遺伝子座４（配列番号４）
プライマーフォワード：
ＣＴＣＴＣＴＧＣＴＧＴＡＧＣＧＡＣＧＣＣＡ（配列番号４４）
ＧＣＴＴＴＣＣＧＣＣＧＧＧＴＡＡＡＴＴＡＧ（配列番号４５）
ＴＴＴＧＧＴＴＡＴＡＧＴＧＧＴＧＴＧＧＴＣＴ（配列番号４６）
ＣＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＴＣＧＣＡＧＴＴＣＴ（配列番号４７）
ＴＣＣＴＣＣＴＴＧＣＣＴＴＣＴＴＴＣＧＣ（配列番号４８）
ＡＴＡＧＴＧＧＴＧＴＧＧＴＣＴＣＴＧＣＣＴＣ（配列番号４９）
プライマーリバース：
ＧＴＴＴＴＧＴＴＡＣＴＧＴＣＴＧＴＣＣＴ（配列番号５０）
ＴＣＣＴＧＣＣＡＧＧＴＧＴＣＴＡＣＡＴＧＴ（配列番号５１）
ＡＣＴＧＴＣＴＧＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＡＣＣＣ（配列番号５２）
ＴＧＡＡＧＧＣＡＧＧＡＴＡＧＧＴＡＣＣＡＧ（配列番号５３）
ＴＣＡＡＡＣＴＡＴＴＡＴＴＴＣＣＣＡＣＧＴＴ（配列番号５４）
ＡＣＡＴＧＴＴＴＣＣＡＴＴＡＡＧＡＴＧＣ（配列番号５５）
遺伝子座５（配列番号５）
プライマーフォワード：
ＣＣＴＧＡＣＧＴＴＣＣＴＧＧＡＡＴＡＴＧＣ（配列番号５６）
ＧＣＡＡＴＧＡＣＴＴＣＴＴＴＴＡＧＧＡＣＡ（配列番号５７）
ＴＧＡＡＡＧＣＡＧＣＡＴＴＡＡＣＣＧＴＧ（配列番号５８）
ＡＧＧＡＣＣＣＧＣＴＣＣＧＣＡＡＡＧＣ（配列番号５９）
ＡＣＣＣＴＣＧＡＧＧＧＡＧＧＡＡＡＧＣＣ（配列番号６０）
ＡＡＣＣＣＧＴＴＡＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＡＣ（配列番号６１）
プライマーリバース：
ＧＣＣＡＣＡＣＴＣＣＣＴＧＧＣＣＴＴＧ（配列番号６２）
ＧＣＧＧＧＧＣＴＣＧＡＧＣＣＡＣＡＣＴ（配列番号６３）
ＣＣＴＣＣＧＣＡＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧ（配列番号６４）
ＴＣＧＣＡＧＣＣＧＡＧＧＣＡＧＧＴＣＴ（配列番号：６５）
ＣＣＣＧＡＣＡＧＴＧＴＣＡＴＴＧＡＴＴＡＡＣ（配列番号６６）
ＣＣＴＣＣＧＣＡＧＣＴＧＧＧＡＧＧＣＴＧ（配列番号６７）
遺伝子座６（配列番号６）
プライマーフォワード：
ＣＴＣＧＧＧＧＡＣＴＧＣＴＡＣＴＴＴＧＣ（配列番号６８）
ＧＧＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＣＧＴＣＣＴＣＣ（配列番号６９）
ＡＴＡＴＴＣＣＴＧＴＡＡＴＧＴＡＴＴＴＡＡＡＴ（配列番号７０）
ＴＡＣＧＣＧＧＧＧＣＣＧＴＧＴＧＡＡＴ（配列番号７１）
ＧＧＴＣＡＡＧＴＧＴＣＡＣＧＴＣＣＴＣＣ（配列番号７２）
ＡＡＧＴＧＴＣＡＣＧＴＣＣＴＣＣＧＣＡＡ（配列番号７３）
プライマーリバース：
ＧＣＧＡＧＧＡＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣＡＴＴ（配列番号７４）
ＣＣＴＡＡＡＧＧＡＣＣＣＴＡＣＣＡＡＧＣ（配列番号７５）
ＧＴＧＣＣＴＧＡＡＣＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＴ（配列番号７６）
ＴＴＣＣＧＴＧＧＧＴＣＣＧＣＧＧＴＣＴ（配列番号７７）
ＡＴＣＡＧＡＡＡＧＡＣＣＡＴＴＡＧＧＡＴＣ（配列番号７８）
ＣＣＧＡＡＧＧＧＡＡＡＧＡＡＡＡＡＴＣＡＧ（配列番号７９）
【０２１３】
配列番号７に示される対照遺伝子座を増幅するための例示的なプライマーは、以下のように配列番号８０〜９１に示される：
対照遺伝子座（配列番号７）
プライマーフォワード：
ＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＴＡＡＣＴＴＴＴＣ（配列番号８０）
ＣＴＴＧＴＡＣＡＧＡＡＴＣＡＴＣＡＧＧＣＴＡＡ（配列番号８１）
ＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧＡＴＴＣ（配列番号８２）
ＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧＡＴＴＣＣＧＧＧ（配列番号８３）
ＣＡＡＡＧＡＡＡＧＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＡＣＴ（配列番号８４）
ＣＡＧＴＣＣＴＴＧＧＡＧＡＣＡＴＣＴＧＡＧＡＧＡ（配列番号８５）
プライマーリバース：
ＴＧＡＡＧＴＧＡＡＣＴＡＴＴＣＣＴＴＡＧＧＴＧ（配列番号８６）
ＧＴＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＴＧＡＡＡＴＡＡＴＧＣ（配列番号８７）
ＧＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＡＡＴＡＧＣＴＧＡＡＧＴＧＡＡＣＴ（配列番号８８）
ＴＧＡＣＡＡＣＣＡＡＴＧＡＧＴＡＧＣＡＡＡＡＡ（配列番号８９）
ＧＴＴＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡ（配列番号９０）
ＴＧＴＴＧＴＣＡＧＴＧＴＧＧＣＣＡＧＡＧＡ（配列番号９１）
【０２１４】
いくつかの実施形態では、キットは、各々が上記のヒト細胞株ＤＮＡを含む、第１の対照構築物および第２の対照構築物のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、キットは、上記の第１および第２の対照ＤＮＡの両方を含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、キットは、少なくとも１つのヌクレオチドプライマー対で満たされた１つ以上の容器を含む。いくつかの実施形態では、本発明のキットに含まれる各ヌクレオチドプライマー対は、配列番号１〜６に示される制限遺伝子座から選択される制限遺伝子座を含むゲノムの断片を選択的に増幅するように設計されたプライマーを含むことができる。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、キットは、上記の遺伝子座の組み合わせを選択的に増幅するためのプライマー対を含み得る。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、キットは、キット中のプライマーを使用して増幅された遺伝子座の増幅産物を検出するためのオリゴヌクレオチドプローブをさらに含み得る。各オリゴヌクレオチドプローブは、遺伝子座内の部分配列に相補的であり得、それにハイブリダイズでき得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドプローブは、蛍光標識されていてもよい。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、キットは、ＤＮＡ抽出、ＤＮＡ消化、遺伝子座増幅、および増幅産物の検出に必要な少なくとも１つの追加の成分、例えばＤＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドミックス、をさらに含み得る。
【０２１９】
いくつかの実施形態では、キットは、消化および増幅のための適切な反応緩衝液、ならびに肺癌の同定を実行するための書面によるプロトコルをさらに含み得る。書面によるプロトコルは、本明細書に開示されたステップのいずれかを実行するための指示を含み得、例えば、ＤＮＡ消化パラメータ、ＰＣＲサイクリングパラメータ、シグナル比率分析、および基準比率との比較を含むがこれらに限定されない。
【０２２０】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態をより完全に例示するために提示される。しかしながら、それらは決して本発明の広い範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、本明細書に開示された原理の多くの変形および修正を容易に考案することができる。
【実施例】
【０２２１】
例１−肺癌の検出のためのゲノム遺伝子座
６つのヒトゲノム遺伝子座は、肺癌または他の肺疾患を持たない個体の血漿からのＤＮＡと比較して、肺癌患者の血漿からのＤＮＡのメチル化が増加していると特定された（以下の表１、配列番号１〜６）。これらの遺伝子座は、肺癌患者の血漿からのＤＮＡと正常な個人（肺癌や他の肺疾患に罹患していない）のＤＮＡを区別できることがわかった。
【表１】
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【０２２２】
例２−ゲノム遺伝子座のパネルの試験
血漿試料は、１３３人の肺癌患者と、現在または過去の喫煙者である、５０歳以上の肺癌に罹患していない１２１人の健常者から取得された。肺癌患者集団のうち、４９人は扁平上皮癌、５０人は腺癌、２名は混合型の非小細胞肺癌、４人は他のタイプの非小細胞肺癌であった。１１人の患者に小細胞肺癌があり、さらに１７人の患者に組織型が不明な肺癌があった。非小細胞肺癌集団では、１８人の患者がステージＩの疾患、１７人の患者がステージＩＩの疾患、４９人の患者がステージＩＩＩの疾患、３２人の患者がステージＩＶの疾患であり、６人の患者の病期は不明であった。小細胞肺癌集団では、４人の患者に限局性疾患があり、７人に広範な疾患があった。
【０２２３】
ＱＩＡａｍｐ（登録商標）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ、ヒルデン、ドイツ）を使用して血漿試料からＤＮＡを抽出した。各試料から抽出されたＤＮＡは、図２に示すように処理された。手短に言えば、抽出されたＤＮＡをメチル化感受性制限エンドヌクレアーゼＨｉｎＰ１Ｉによる消化にかけた。消化反応（総量１００マイクロリットル）には、８０マイクロリットルの抽出ＤＮＡ（定量されていない）と消化緩衝液中のＨｉｎＰ１Ｉが含まれていた。消化は３７℃で２時間実施した。
【０２２４】
次に、消化されたＤＮＡ試料に対してリアルタイムＰＣＲを実施し、各ＤＮＡ試料で、上記の表１に詳述されている６つの制限遺伝子座と、配列番号７に示されている対照遺伝子座を増幅した（表１を参照）。対照遺伝子座は、ＨｉｎＰ１Ｉの認識配列を含まない遺伝子座であり、メチル化の状態に関係なく、ＤＮＡ試料が制限酵素で消化された場合、無傷なままである。この対照遺伝子座は、内部参照遺伝子座とも呼ばれ、ＨｉｎＰ１Ｉによる消化後のメチル化の影響を受けない増幅パターンを持っている。
【０２２５】
特に、各消化されたＤＮＡ試料は、１２マイクロリットルの消化されたＤＮＡを含む３つ（３）のアリコートに分けられた。各アリコートには、６つのうち２つの制限遺伝子座および対照遺伝子座を増幅するためのプライマー対が補充された（対照遺伝子座はすべてのアリコートで増幅される）。７７〜１３９塩基のアンプリコンが増幅された。
【０２２６】
各増幅反応（総量３０マイクロリットル）には、ｄＮＴＰと反応バッファーがさらに含まれていた。増幅中の増幅産物の検出を可能にするために、蛍光標識されたポリヌクレオチドプローブ（各遺伝子座に１つ）を反応に加えた。以下の蛍光標識を使用した：ＦＡＭ、ＪＯＥ、ＲＯＸ。リアルタイムＰＣＲ反応は、ＡＢＩ  ７５００  ＦａｓｔＤｘ機器で次のＰＣＲプログラムを使用して実施された：９５℃、１０分−＞４５Ｘ（９５℃、１５秒）−＞６０℃、１分。
【０２２７】
増幅に続いて、サイクル数の関数としてのプローブからの蛍光シグナルのレベルに関するデータを分析して、各遺伝子座の定量化サイクル（Ｃｑ）と各制限遺伝子座のΔＣｑ（制限遺伝子座のＣｑと対照遺伝子座のＣｑの差）を計算した。
【０２２８】
図１Ａと１Ｂは、癌患者の試料（図１Ａ）および健常者の試料（図１Ｂ）における、対照遺伝子座と２つの制限遺伝子座の例示的な定量ＰＣＲプロットを示している。制限遺伝子座のメチル化レベルが高く、ＨｉｎＰ１Ｉで消化したときにほとんど影響を受けていない癌患者の試料では、２つの制限遺伝子座が高効率で増幅されつまり、それらのＣｑと対照遺伝子座のＣｑの差（ΔＣｑ）は約３サイクルであった。制限遺伝子座が低いメチル化レベルで特徴付けられているため、ＨｉｎＰ１Ｉで消化したときに大幅にカットされた健康な試料では、増幅の効率は、対照遺伝子座に対する高いΔＣｑによって反映される、対照遺伝子座の増幅効率よりもはるかに低かった。図からわかるように、対照遺伝子座に対する制限遺伝子座のΔＣｑ値は、癌患者と健常者の間で異なる。
【０２２９】
各試料について、下記のように、制限遺伝子座１〜６（配列番号１〜６）の各々のシグナル強度と対照遺伝子座（配列番号７）のシグナル強度の間の比率を計算した：Ｃｑを各制限遺伝子座および対照遺伝子座について決定した。Ｃｑ値を、次の式で使用した。
２（対照遺伝子座のＣｑ−制限遺伝子座のＣｑ）
【０２３０】
計算は同じアリコートで同時増幅された制限遺伝子座および対照遺伝子座に対して実行されたことが理解されるべきである。
【０２３１】
対照遺伝子座に関し各制限遺伝子座について得られた数値は、この制限遺伝子座および対照遺伝子座との間のシグナル比率（メチル化比率を反映する）を表す。
【０２３２】
全体として、６つのシグナル比率が各試料について計算された。表２は、健常者からの１０個の血漿試料と肺癌患者からの１０個の試料について計算されたシグナル比率の例を示している。表からわかるように、癌試料に対して計算されたシグナル比率は、健常試料に対して計算されたシグナル比率よりも大幅に高くなっている（最大で数桁高い）。
【０２３３】
次に、各試料の各遺伝子座のスコア（確率スコア）を計算し、このスコアは、最高のシグナル比率が「１００」、最低のシグナル比率が「０」となるように、基準比率に対して正規化されたシグナル比率である。
【０２３４】
次に、各試料で得られた６つのスコアを、０〜１００の数であり、６つの制限遺伝子座のパネルでの試料の全体的な相対メチル化レベルを反映する「ＥｐｉＳｃｏｒｅ」と呼ばれる１つのスコアに結合した。
【０２３５】
表２は、シグナル比率とＥｐｉＳｃｏｒｅの例を示し、より高いＥｐｉＳｃｏｒｅが肺癌と相関していることを示し（一連の試料全体について、Ｋｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ適合度仮説検定によるとＰ＝２．４４・１０−２５）、肺癌患者の血漿試料と正常／健常者の血漿試料とを区別することにおいて本発明の方法を使用する利点を強調している。
【０２３６】
ＥｐｉＳｃｏｒｅが７０（以前の一連の試料からの情報に基づいて決定された閾値）以上の場合、試料は「肺癌」として分類され、ＥｐｉＳｃｏｒｅが７０未満の場合、「健康」として分類した。
【表２】
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【０２３７】
肺癌の同定に関する感度、特異度およびＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）は、配列番号４に示される遺伝子座および遺伝子座１〜６の組み合わせについて計算された。データを表３に要約する。
【表３】
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【０２３８】
特定の実施形態の前述の説明は、本発明の一般的な性質を完全に明らかにするので、他の人は、現在の知識を適用することにより、過度の実験なしに、および一般的な概念から逸脱することなく、このような特定の実施形態の様々な用途に容易に修正および／または適合でき、したがって、そのような適合および変更は、開示された実施形態の均等物の意味および範囲内で理解されるべきであり、そのように意図されている。本明細書で使用される表現または用語は、説明を目的としたものであり、限定を目的としたものではないことを理解されたい。開示された様々な化学構造および機能を実施するための手段、材料、およびステップは、本発明から逸脱することなく、様々な代替形態をとることができる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【国際調査報告】
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