(57)【要約】  本発明は、全ての必須アミノ酸を含み、アスパラギンを実質的に含まない、複数のアミノ酸を含む栄養製品、該製品を調製するプロセス、ならびにがんの処置などの治療適用におけるその方法および使用に関する。
2021502412.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
全ての必須アミノ酸を含み、アスパラギンを実質的に含まない、複数のアミノ酸を含む栄養製品。
【請求項２】
少なくとも１２種のアミノ酸を含む、請求項１に記載の栄養製品。
【請求項３】
グルタミン、グリシン、セリン、システイン、チロシンおよびアルギニンからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる非必須アミノ酸を実質的に含まない、請求項１または２に記載の栄養製品。
【請求項４】
１つもしくは複数の主要栄養素および／または１つもしくは複数の微量栄養素をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の栄養製品。
【請求項５】
２５ｍｇ／ｋｇ／日未満のレベルでメチオニンをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の栄養製品。
【請求項６】
１日平均総タンパク質消費量に基づく必須アミノ酸の少なくとも１日推奨摂取量を提供するように製剤化される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の栄養製品。
【請求項７】
固体または液体の形態にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の栄養製品。
【請求項８】
成分が水中に溶解または分散され、噴霧乾燥される、請求項１〜７のいずれか１項に記載の栄養製品を調製する方法。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の栄養製品または請求項８に従って生産された栄養製品と、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物。
【請求項１０】
がん細胞増殖の阻害剤、抗転移剤、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法剤および化学療法剤から選択される治療剤をさらに含む、請求項９に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
治療剤が血液中のアスパラギンレベルを低下させる、請求項１０に記載の医薬組成物。
【請求項１２】
治療剤がアスパラギン合成酵素阻害剤またはＬ−アスパラギナーゼである、請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
療法における使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の、もしくは請求項８に従って生産された栄養製品または請求項９〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
がんを有する対象における転移の遅延または阻害における使用のための薬剤であって、がんを有する対象の血液中のアスパラギンレベルを低下させる、使用のための薬剤。
【請求項１５】
ａ．請求項１〜７のいずれか１項に記載の栄養製品；
ｂ．請求項８に従って生産された栄養製品；
ｃ．請求項９〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物；
ｄ．アスパラギン合成酵素阻害剤；または
ｅ．Ｌ−アスパラギナーゼ
からなる群から選択される、請求項１４に記載の使用のための薬剤。
【請求項１６】
がんが、乳がん、結腸がん、頭頸部扁平上皮がん、腎明細胞がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択される、請求項１４または１５に記載の使用のための薬剤。
【請求項１７】
栄養製品または医薬組成物がＬ−アスパラギナーゼとの同時投与または連続投与のために製剤化される、請求項１５または１６に記載の使用のための薬剤。
【請求項１８】
栄養製品が、がん細胞増殖の阻害剤、抗転移剤、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法剤および化学療法剤から選択される治療剤と組み合わせて使用される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項１９】
対象が、対照または所定のレベルよりも高いアスパラギン合成酵素の発現レベルを有すると決定された、請求項１４〜１８のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項２０】
対象が、対照または所定のレベルよりも高い血清アスパラギンのレベルを有すると決定された、請求項１４〜１９のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項２１】
対象が固形腫瘍を有する、請求項１４〜２０のいずれか１項に記載の使用のための薬剤。
【請求項２２】
がんを有する対象における転移を遅延させる、または阻害するための薬剤の製造における化合物または組成物の使用であって、前記化合物または組成物は、対象の血液中の細胞外アスパラギンレベルを低下させる、使用。
【請求項２３】
化合物または組成物が、
ａ．請求項１〜７のいずれか１項に記載の栄養製品；
ｂ．請求項８に従って生産された栄養製品；
ｃ．請求項９〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物；
ｄ．アスパラギン合成酵素阻害剤；または
ｅ．Ｌ−アスパラギナーゼ
である、請求項２２に記載の使用。
【請求項２４】
がんが、乳がん、結腸がん、頭頸部扁平上皮がん、腎明細胞がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択される、請求項２２または２３に記載の使用。
【請求項２５】
栄養製品または医薬組成物が、Ｌ−アスパラギナーゼとの同時投与または連続投与のために製剤化される、請求項２３または２４に記載の使用。
【請求項２６】
栄養製品が、がん細胞増殖の阻害剤、抗転移剤、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法剤および化学療法剤から選択される治療剤と組み合わせて使用される、請求項２３〜２５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２７】
対象が、対照または所定のレベルよりも高いアスパラギン合成酵素の発現レベルを有すると決定された、請求項２２〜２６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２８】
対象が、対照または所定のレベルよりも高い血清アスパラギンのレベルを有すると決定された、請求項２２〜２７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項２９】
対象が固形腫瘍を有する、請求項２２〜２８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項３０】
対象におけるがんを処置する方法であって、治療有効量の薬剤を前記対象に投与することを含み、前記薬剤が、がんを有する対象の血液中のアスパラギンレベルを低下させる、方法。
【請求項３１】
薬剤が、
ａ．請求項１〜７のいずれか１項に記載の栄養製品；
ｂ．請求項８に従って生産された栄養製品；
ｃ．請求項９〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物；
ｄ．アスパラギン合成酵素阻害剤；または
ｅ．Ｌ−アスパラギナーゼ
を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
がんが、乳がん、結腸がん、頭頸部扁平上皮がん、腎明細胞がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
治療有効量の栄養製品または医薬組成物が、治療有効量のＬ−アスパラギナーゼと同時投与または連続投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
治療有効量の栄養製品が、がん細胞増殖の阻害剤、抗転移剤、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法剤および化学療法剤から選択される治療剤と組み合わせて投与される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３５】
対象が、対照または所定のレベルよりも高いアスパラギン合成酵素の発現レベルを有すると決定された、請求項３０に記載の方法。
【請求項３６】
対象が、対照または所定のレベルよりも高い血清アスパラギンのレベルを有すると決定された、請求項３０に記載の方法。
【請求項３７】
対象が固形腫瘍を有する、請求項３０に記載の方法。
【請求項３８】
栄養製品が対象のための唯一の栄養源である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３９】
処置が、少なくとも２４時間の期間にわたって、または治療のエンドポイントが観察されるまで投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４０】
薬剤が１日１〜６回投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
少なくとも１日推奨量の必須アミノ酸が、毎日の栄養製品の投与レジメンによって満たされる、請求項３１に記載の方法。
【請求項４２】
転移のリスクが高い腫瘍を有する患者または患者集団を同定するためのバイオマーカーとしての血清アスパラギンレベルの使用。
【請求項４３】
転移のリスクが高い腫瘍を有する患者または患者集団を同定するためのバイオマーカーとしてのアスパラギン合成酵素発現の使用。
【請求項４４】
転移の可能性が高いがんを有する対象を同定する方法であって、
ａ）対象から単離された生体試料中のアスパラギンのレベルを決定すること；
ｂ）生体試料中のアスパラギンのレベルと、対照試料またはアスパラギンの所定の参照レベルとを比較すること
を含み、
対照試料と比較した、または所定の参照レベルと比較した生体試料中のアスパラギンレベルの増加が、転移の可能性が高いことを示す、方法。
【請求項４５】
治療有効量の薬剤を前記対象に投与することをさらに含み、前記薬剤が、がんを有する対象の血液中のアスパラギンレベルを低下させる、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
薬剤が、
ａ．請求項１〜７のいずれか１項に記載の栄養製品；
ｂ．請求項８に従って生産された栄養製品；
ｃ．請求項９〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物；
ｄ．アスパラギン合成酵素阻害剤；または
ｅ．Ｌ−アスパラギナーゼ
である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
アスパラギンを実質的に含まない食事を供給した場合、またはＬ−アスパラギナーゼと共に投与した場合、がん処置に対する応答性または感受性の可能性が高い対象を同定する方法であって、
ａ）対象から単離された生体試料中のアスパラギンのレベルを決定すること；
ｂ）生体試料中のアスパラギンのレベルと、対照試料またはアスパラギンの所定の参照レベルとを比較すること
を含み、
対照試料と比較した、または所定の参照レベルと比較した生体試料中のアスパラギンのレベルの増加が、アスパラギンを実質的に含まない食事と組み合わせた場合、またはＬ−アスパラギナーゼと共に投与した場合、前記がん処置に対する応答性または感受性を示す、方法。
【請求項４８】
対象が、アスパラギンを実質的に含まない食事を供給された場合、またはＬ−アスパラギナーゼと共に投与された場合、がん処置に対する応答性または感受性の可能性が高いと同定された場合に、治療有効量の、請求項１〜７のいずれか１項に記載の栄養製品または請求項８に従って生産された栄養製品または請求項９〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物またはＬ−アスパラギナーゼを、化学療法剤と共に投与することをさらに含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
生体試料が血清である、請求項４４または４７に記載の方法。
【請求項５０】
がんを有する対象における転移の再発の可能性を決定する方法であって、
ａ）対象から単離された生体試料中のアスパラギン合成酵素のレベルを決定すること；
ｂ）生体試料中のアスパラギン合成酵素のレベルと、対照試料またはアスパラギンの所定の参照レベルとを比較すること
を含み、
対照試料と比較した、または所定の参照レベルと比較した生体試料中のアスパラギン合成酵素のレベルの増加が、転移の再発の可能性が高いことを示す、方法。
【請求項５１】
対象における上皮間葉移行を逆転させるか、またはがんを有する対象における上皮間葉移行を防止する方法であって、治療有効量の、請求項１〜７のいずれか１項に記載の栄養製品または請求項８に従って生産された栄養製品または請求項９〜１２のいずれか１項に記載の医薬組成物またはＬ−アスパラギナーゼを、それを必要とする対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、一般的には、がんを有する対象における、転移を遅延させるか、または阻害するための療法および処置に対する応答性の増大の分野に関する。より具体的には、本発明は、食事中のアスパラギンを減少させることにより、または転移を遅延させるか、もしくは阻害する、および／または上皮間葉移行を防止するための他の手段により、対象の血清中のアスパラギンのレベルを変化させることに関する。本発明はまた、がん転移の特定のリスクがあるがんを有する患者集団の同定および処置にも関する。
【背景技術】
【０００２】
がんは、細胞が未制御の増殖を受け、細胞増殖の正常な限界を超えて増殖し、分裂する疾患である。これらの細胞は、周囲の組織に侵入し、これを破壊し得る。さらに、がん細胞は、転移することがあり、それらは血液系またはリンパ系を介して体内の他の領域に拡散し得る。
【０００３】
がんの処置は、腫瘍を取り除くための外科手術、腫瘍サイズを減少させるための放射線療法、またはがんを処置するための薬物もしくは他の医薬を使用する薬物療法／化学療法を含んでもよい。がんの生存率は、がんの型に応じて変化する；しかしながら、転移したがんについては、生存率は特に低い。
例えば、乳がんで死亡する女性の大部分は、原発腫瘍によって殺されるのではなく、初期病変が除去された後に明らかとなる転移によって殺されるのである。細胞が転移に寄与するためには、それらは原発部位を離れ、血管系に進入し、血液中で生存し、次いで、浸出し、二次部位に定着しなければならない（Vanharanta et al. 2013）。乳房腫瘍不均一性のモデルの以前の研究により、血管擬態を必要とする非侵襲性機構を介して血管系に進入する能力を有する２つの４Ｔ１サブクローン株（４Ｔ１−Ｅおよび−Ｔ）が同定された（Wagenblast et al. 2015およびMiller at al. 1983）。しかしながら、これらの２つのクローンは、二次病変へのそれらの寄与において大きく異なっていた。
したがって、転移のドライバーを同定し、転移を遅延させるか、または阻害することができる薬剤を提供することが必要である。
【発明の概要】
【０００４】
本発明者らは驚くべきことに、原発腫瘍におけるアスパラギン合成酵素（ＡＳＮＳ）発現が後の転移性再発と強く相関すること、およびがんを有する対象におけるアスパラギン血清レベルの低下が転移を遅延させるか、または阻害することができることを発見した。さらに、本発明者らは驚くべきことに、食事またはその他の方法により、細胞外アスパラギンの利用可能性を低下させることが、転移を有利に遅延させる、または阻害することを示した。転移を遅延させる、または阻害する食事的手段は、有利には、現行のがん処置レジメンを補完することができる。
したがって、本発明の第１の態様では、全ての必須アミノ酸を含み、アスパラギンを実質的に含まない、複数のアミノ酸を含む栄養製品を提供する。好適には、栄養製品は、少なくとも１２種のアミノ酸を含んでもよい。
好適には、栄養製品は、グルタミン、グリシン、セリン、システイン、チロシンおよびアルギニンからなる群から選択される、少なくとも１つまたは複数のさらなる非必須アミノ酸を実質的に含まなくてもよい。
好適には、栄養製品は、１つもしくは複数の主要栄養素および／または１つもしくは複数の微量栄養素をさらに含んでもよい。
好適には、栄養製品は、例えば、２５ｍｇ／ｋｇ／日未満または２０ｍｇ／ｋｇ／日未満または１８ｍｇ／ｋｇ／日未満または１６ｍｇ／ｋｇ／日未満のレベルでメチオニンをさらに含んでもよい。
好適には、製品を、１日平均総タンパク質消費量に基づく必須アミノ酸の少なくとも１日推奨摂取量を提供するように製剤化することができる。
【０００５】
好適には、栄養製品は、固体または液体の形態にあってもよい。それを、食事代用品としての経口投与のために製剤化することができる。あるいは、それを静脈内送達することができる。
別の態様では、本発明は、成分が水中に溶解もしくは分散され、噴霧乾燥された本発明の栄養製品を調製するプロセスを提供する。
さらなる態様では、本発明は、本発明の栄養製品または本発明のプロセスに従って生産された栄養製品と、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
好適には、医薬組成物は、がん細胞増殖の阻害剤、抗転移剤、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法剤および化学療法剤から選択される治療剤をさらに含んでもよい。好適には、治療剤は、血液中のアスパラギンレベルを低下させることができる。
好適には、治療剤は、アスパラギン合成酵素阻害剤またはＬ−アスパラギナーゼであってもよい。
本発明はさらに、療法における使用のための、本発明の栄養製品または本発明に従って生産された栄養製品または本発明の医薬組成物を提供する。
【０００６】
さらなる態様では、本発明は、がんを有する対象における転移を遅延させるか、または阻害する際に使用するための薬剤であって、がんを有する対象の血液中のアスパラギンレベルを低下させる（すなわち、血液中のアスパラギンのバイオアベイラビリティ、例えば、細胞外レベルを低下させる）、薬剤を提供する。
【０００７】
好適には、薬剤を、
ａ．本発明の栄養製品；
ｂ．本発明のプロセスに従って生産された栄養製品；
ｃ．本発明の医薬組成物；
ｄ．アスパラギン合成酵素阻害剤；または
ｅ．Ｌ−アスパラギナーゼ
からなる群から選択することができる。
【０００８】
好適には、がんを、乳がん、結腸がん、頭頸部扁平上皮がん、腎明細胞がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択することができる。
好適には、薬剤は、Ｌ−アスパラギナーゼとの同時投与または連続投与のために製剤化することができる本発明の栄養製品または医薬組成物であってもよい。
好適には、薬剤（例えば、栄養製品）を、がん細胞増殖の阻害剤、抗転移剤、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法剤および化学療法剤から選択される治療剤と組み合わせて使用することができる。
好適には、対象は、対照または所定のレベルよりも高いアスパラギン合成酵素の発現レベルを有すると決定されていてもよい。好適には、アスパラギン合成酵素の発現レベルを、腫瘍試料中で決定することができる。
好適には、対象は、対照または所定のレベルよりも高い血清アスパラギンのレベルを有すると決定されていてもよい。
好適には、対照は、固形腫瘍を有してもよい。
別の態様では、本発明は、がんを有する対象における転移を遅延させる、または阻害するための薬剤の製造における化合物または組成物の使用であって、対象の血液中のアスパラギンレベルを低下させる（すなわち、血液中のアスパラギンのバイオアベイラビリティ、例えば、細胞外レベルを低下させる）、化合物または組成物の使用に関する。
【０００９】
好適には、化合物または組成物は、
ａ．本発明の栄養製品；
ｂ．本発明のプロセスに従って生産された栄養製品；
ｃ．本発明の医薬組成物；
ｄ．アスパラギン合成酵素阻害剤；または
ｅ．Ｌ−アスパラギナーゼ
であるか、またはそれを含んでもよい。
【００１０】
好適には、がんを、乳がん、結腸がん、頭頸部扁平上皮がん、腎明細胞がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択することができる。
好適には、栄養製品または医薬組成物を、Ｌ−アスパラギナーゼとの同時投与または連続投与のために製剤化することができる。
好適には、化合物または組成物（例えば、栄養製品）を、がん細胞増殖の阻害剤、抗転移剤、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法剤および化学療法剤から選択される治療剤と組み合わせて使用することができる。
好適には、対象は、対照または所定のレベルよりも高いアスパラギン合成酵素の発現レベルを有すると決定されていてもよい。
好適には、対象は、対照または所定のレベルよりも高い血清アスパラギンのレベルを有すると決定されていてもよい。
好適には、対照は、固形腫瘍を有してもよい。
さらなる態様では、本発明は、対象におけるがんを処置する方法であって、治療有効量の薬剤を前記対象に投与することを含み、前記薬剤が、がんを有する対象の血液中のアスパラギンレベルを低下させる（すなわち、血液中のアスパラギンのバイオアベイラビリティ、例えば、細胞外レベルを低下させる）、方法を提供する。
【００１１】
好適には、薬剤は、
ａ．本発明の栄養製品；
ｂ．本発明のプロセスに従って生産された栄養製品；
ｃ．本発明の医薬組成物；
ｄ．アスパラギン合成酵素阻害剤；または
ｅ．Ｌ−アスパラギナーゼ
を含んでもよい。
【００１２】
好適には、がんを、乳がん、結腸がん、頭頸部扁平上皮がん、腎明細胞がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択することができる。
好適には、治療有効量の薬剤（例えば、本発明の栄養製品または医薬組成物）を、治療有効量のＬ−アスパラギナーゼと同時投与または連続投与することができる。
好適には、治療有効量の薬剤（例えば、栄養製品）を、がん細胞増殖の阻害剤、抗転移剤、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法剤および化学療法剤から選択される治療剤と組み合わせて投与することができる。
好適には、対象は、対照または所定のレベルよりも高いアスパラギン合成酵素の発現レベルを有すると決定されていてもよい。
好適には、対象は、対照または所定のレベルよりも高い血清アスパラギンのレベルを有すると決定されていてもよい。
好適には、対照は、固形腫瘍を有してもよい。
好適には、栄養製品は、対象にとって唯一の栄養源であってもよい。
好適には、処置を、少なくとも２４時間の期間にわたって、または治療のエンドポイントが観察されるまで投与してもよい。
好適には、薬剤を、１日に１〜６回投与してもよい。
好適には、少なくとも１日推奨量の必須アミノ酸を、毎日、栄養製品の投与レジメンによって満たすことができる。
別の態様では、本発明は、転移のリスクが高い腫瘍を有する患者または患者集団を同定するためのバイオマーカーとしての血液（例えば、血清）アスパラギンレベルの使用を提供する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、転移のリスクが高い腫瘍を有する患者または患者集団を同定するためのバイオマーカーとしてのアスパラギン合成酵素発現の使用を提供する。好適には、発現レベルを、原発腫瘍中で決定することができる。
本発明はさらに、転移の可能性が高いがんを有する対象を同定する方法であって、
ａ）対象から単離された生体試料（例えば、血清）中のアスパラギンのレベルを決定すること；
ｂ）生体試料中のアスパラギンのレベルと、対照試料またはアスパラギンの所定の参照レベルとを比較すること
を含み、
対照試料と比較した、または所定の参照レベルと比較した生体試料中のアスパラギンレベルの増加が、転移の可能性が高いことを示す、方法を提供する。
好適には、方法は、治療有効量の薬剤を前記対象に投与することをさらに含んでもよく、前記薬剤は、がんを有する対象の血液中の細胞外アスパラギンレベルを低下させる。
【００１４】
好適には、薬剤は、
ａ．本発明の栄養製品；
ｂ．本発明のプロセスに従って生産された栄養製品；
ｃ．本発明の医薬組成物；
ｄ．アスパラギン合成酵素阻害剤；または
ｅ．Ｌ−アスパラギナーゼ
であってもよく、またはそれを含んでもよい。
【００１５】
本発明は、アスパラギンを実質的に含まない食事を供給した場合、またはＬ−アスパラギナーゼと共に投与した場合、がん処置に対する応答性または感受性の可能性が高い対象を同定する方法であって、
ａ）対象から単離された生体試料中のアスパラギンのレベルを決定すること；
ｂ）生体試料中のアスパラギンのレベルと、対照試料またはアスパラギンの所定の参照レベルとを比較すること
を含み、
対照試料と比較した、または所定の参照レベルと比較した生体試料中のアスパラギンのレベルの増加が、アスパラギンを実質的に含まない食事と組み合わせた場合、またはＬ−アスパラギナーゼと共に投与した場合、前記がん処置に対する応答性または感受性を示す、方法をさらに含む。
【００１６】
好適には、方法は、対象がアスパラギンを実質的に含まない食事を供給された場合、またはＬ−アスパラギナーゼと共に投与された場合、がん処置に対する応答性または感受性の可能性が高いと同定された場合に、治療有効量の、本発明の栄養製品または本発明に従って生産された栄養製品または本発明による医薬組成物またはＬ−アスパラギナーゼを、化学療法剤と共に投与することをさらに含んでもよい。
好適には、生体試料は、血液試料（例えば、血清）であってもよい。
本発明は、がんを有する対象における転移の再発の可能性を決定する方法であって、
ａ）対象から単離された生体試料中のアスパラギン合成酵素のレベルを決定すること；
ｂ）生体試料中のアスパラギン合成酵素のレベルと、対照試料またはアスパラギンの所定の参照レベルとを比較すること
を含み、
対照試料と比較した、または所定の参照レベルと比較した生体試料中のアスパラギン合成酵素のレベルの増加が、転移の再発の可能性が高いことを示す、方法をさらに提供する。
【００１７】
さらなる態様では、本発明は、対象における上皮間葉移行を逆転させるか、またはがんを有する対象における上皮間葉移行を防止する方法であって、治療有効量の、本発明の栄養製品または本発明のプロセスに従って生産された栄養製品または本発明の医薬組成物またはＬ−アスパラギナーゼを、それを必要とする対象に投与することを含む、方法を提供する。
これらの態様および他の態様は、詳細な説明に拡張される。
本明細書の記載および特許請求の範囲を通じて、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」およびそれらの変形は、「限定されるものではないが、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味し、それらは他の部分、添加物、成分、整数またはステップを排除することを意図するものではない（排除しない）。
【００１８】
本明細書の記載および特許請求の範囲を通じて、単数は、本文が別途必要としない限り、複数を包含する。特に、不定冠詞が使用される場合、本明細書は、本文が別途必要としない限り、複数ならびに単数を企図するものと理解されるべきである。
本発明の特定の態様、実施形態または例と共に記載される特徴、整数、特性、化合物、化学的部分または基は、それと不適合でない限り、本明細書に記載される任意の他の態様、実施形態または例にも適用可能であると理解されるべきである。
本明細書に記載の特許、科学文献および技術文献は、出願の時点で当業者には利用可能であった知識を確立するものである。本明細書で引用される発行された特許、公開され、係属中の特許出願、および他の刊行物の全開示は、あたかもそれぞれが具体的かつ個別的に参照により組み込まれると示されたのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合、本開示が優先するものとする。
本発明の様々な態様を、以下でさらに詳細に説明する。
本発明の実施形態を、添付の図面を参照して以下でさらに説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】図１は、転移のドライバーの同定を示す。ａ）細胞の混合物を異なる濃度で尾静脈に導入されたＮＳＧマウスの肺から抽出された４Ｔ１−Ｅおよび−Ｔ細胞の相対的割合。各バーは、試料または無関係のマウスもしくは試料を表す。ｂ）様々な疾患サブタイプを有する患者の原発腫瘍中の４Ｔ１−Ｅと比較した、４Ｔ１−Ｔ中で過剰発現されると同定された遺伝子の発現レベル（囲みの端部は、第一および第三四分位数であり、エラーバーは値ｑ３＋ｗ（ｑ３−ｑ１）およびｑ１−ｗ（ｑ３−ｑ１）（式中、ｗは１．５であり、ｑ１およびｑ３は第一および第三四分位数である）に拡張され、これはｃについても当てはまり、ＡＮＯＶＡのｐ値＜０．０００１である）。ｃ）無疾患生存者および肺に再発を有する患者における同じ遺伝子の発現レベル（順位和ｐ値＜０．０１）。ｄ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの侵入のドライバーならびにｉｎ  ｖｉｖｏでの溢出および定着を同定するためのＲＮＡｉスクリーニングのスキーム（ｓｈＲＮＡプールあたりｎ＝５のマウスまたはｎ＝２のマトリゲル６ウェル侵入チャンバー、経験的ベイズモデレイテッドｔ検定ＦＤＲを用いた遺伝子レベルヒットコール＜０．０５）。ｅ）ｄに記載されたＲＮＡｉスクリーンの各アームにおいて同定された遺伝子間の重複（超幾何学的検定のｐ値＜０．０００１）。
【図２】図２は、侵入および転移のドライバーとしてのアスパラギン合成酵素の検証を示す。ａ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、またはＡｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞を静脈内注射されたマウスの肺における転移の定量化（細胞株あたりｎ＝１０匹のマウス、囲みの端部は、第一および第三四分位数であり、エラーバーは値ｑ３＋ｗ（ｑ３−ｑ１）およびｑ１−ｗ（ｑ３−ｑ１）（式中、ｗは１．５であり、ｑ１およびｑ３は第一および第三四分位数である）に拡張され、これはｅ、ｆおよびｇについても当てはまり、順位和検定のｐ値＜０．００１である）。ｂ）ａに記載された肺の代表的な画像。ｃ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、およびＡｓｎｓを発現する細胞を２４時間前に適用した後のマトリゲルアッセイの収集ウェルの代表的な画像（細胞株あたりｎ＝３の侵入チャンバー）。ｄ）ａに記載された細胞の同所注射から得られる腫瘍体積（細胞株あたりｎ＝１０匹のマウス、エラーバーは第一および第三四分位数である）。ｅ）ｄに記載された腫瘍に対応する動物におけるＣＴＣの相対的存在量（細胞株あたりｎ＝４匹のマウス、順位和ｐ値＜０．０５）。ＣＴＣ存在量を、全血ゲノムＤＮＡに由来する、レトロウイルスｓｈＲＮＡ送達ベクターから発現されるｍＣｈｅｒｒｙについてｑＰＣＲによって測定した。ｆ）ｅに記載されたマウスに由来する、Ｈ＆Ｅ染色された肺切片における転移の定量化（順位和ｐ値＜０．０００２）。ｇ）ｆに記載された転移の直径。
【図３】図３は、細胞外アスパラギンの利用可能性が侵入および転移を誘導することを示す。ａ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、およびＡｓｎｓを発現する細胞に関する無細胞アスパラギンレベルのＨＰＬＣに基づく定量化（細胞株あたりｎ＝３回反復）。ｂ）示された非必須アミノ酸を添加した培養培地中での、マトリゲル侵入アッセイによって測定された、親４Ｔ１細胞侵入速度の定量化（ｎ＝５の侵入チャンバー、順位和ｐ値＜０．０１）。ｃ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、またはＡｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞を注射された動物における肺転移の定量化。それぞれの株について、半分の動物にはＰＢＳを投与したが、他の半分には、Ｌ−アスパラギナーゼを投与した（条件あたりｎ＝１０匹のマウス、エラーバーは、第一および第三四分位数であり、これはｅおよびｆにも当てはまり、それぞれの株に関するＬ−アスパラギナーゼ対対照について、およびそれぞれの薬物条件におけるＡｓｎｓをサイレンシングされた細胞対サイレンシングされていない細胞について、順位和ｐ値＜０．０００５である）。ｄ）ｃで表されたそれぞれの実験条件に由来する代表的なＨ＆Ｅ染色された肺切片。ｅ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、またはＡｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞を注射された動物における肺転移の定量化。動物に、実験期間にわたって、０％、０．６％または４％のアスパラギン含量を含む食事を投与した（条件あたりｎ＝１０匹のマウス、全ての食事にわたるＡｓｎｓをサイレンシングされた細胞対Ａｓｎｓを発現する細胞、０％対０．６％対４％の食事を用いたｓｈＲｅｎｉｌｌａ細胞、ならびに４％対０％の食事を用いたｓｈＡｓｎｓ−１および−２についての順位和ｐ値＜０．０００５、０．６％対０％または０．６％対４％の食事を用いたｓｈＡｓｎｓ−１およびｓｈＡｓｎｓ−２についての順位和ｐ値＜０．０５）。ｆ）Ｌ−アスパラギナーゼまたはＰＢＳを投与された動物の乳腺、血清および肺におけるアスパラギンレベルの質量分析による定量化（全代謝物ピーク面積によって正規化された相対的存在量、条件あたりｎ＞８個の組織切片、全ての組織にわたるＰＢＳ対Ｌ−アスパラギナーゼについての順位和ｐ値＜０．００５、乳腺対肺についての順位和ｐ値＜０．０５ならびに血清対肺および血清対乳腺についての順位和ｐ値＜０．０００５）。
【図４】図４は、アスパラギン利用可能性が上皮間葉移行を調節することを示す。ａ）Ａｓｎｓのサイレンシングによって誘導されるタンパク質対ＲＮＡレベルの発現変化のアミノ酸富化分析。負の相関を示すアミノ酸が、タンパク質レベルの変化が対応するＲＮＡレベルの変化によって予想されたものよりも小さいタンパク質中で富化される。正の相関は、アミノ酸が、タンパク質レベルの変化がＲＮＡ量の変化によって予測されたものを超える遺伝子中で富化されることを示す。ｂ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、およびＡｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞中のＥＭＴ−ｕｐタンパク質の相対的タンパク質存在量（細胞株あたりｎ＝３回反復、囲みの端部は、第一および第三四分位数であり、エラーバーは値ｑ３＋ｗ（ｑ３−ｑ１）およびｑ１−ｗ（ｑ３−ｑ１）（式中、ｗは１．５であり、ｑ１およびｑ３は第一および第三四分位数である）に拡張され、これはｃ、ｄおよびｈについても当てはまり、順位和ｐ値＜０．０５である）。ｃ）通常の培地およびアスパラギンを添加した培地中で増殖させた場合の親４Ｔ１細胞中のＥＭＴ−ｕｐタンパク質の相対的タンパク質存在量（細胞株あたりｎ＝３回反復、順位和ｐ値＜０．０５）。ｄ）親４Ｔ１細胞の同所注射に由来する肺転移対原発腫瘍におけるＥＭＴ−ｕｐおよびＥＭＴ−ｄｏｗｎ遺伝子の相対的発現レベル（ｎ＝４匹のマウス、ＥＭＴ−ｕｐ遺伝子についての符号順位ｐ値＜０．００１）。ｅ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、およびＡｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞に由来する同所腫瘍におけるＴｗｉｓｔ１およびＣｄｈ１に関するＩＨＣ染色の代表的な画像。ｆ）ｅに記載された、全てのＴｗｉｓｔ１染色の定量化（ｎ＝５個の腫瘍切片およびｎ＞５の肺転移、エラーバーは、１標準偏差を表し、これはｇについても当てはまり、それぞれ、Ａｓｎｓをサイレンシングされた腫瘍および転移対Ａｓｎｓを発現する腫瘍および転移について、順位和ｐ値＜０．０１および＜０．０５）。ｇ）ｅに記載された、全てのＣｄｈ１染色の定量化（ｎ＝５個の腫瘍切片およびｎ＝９の肺転移、それぞれ、Ａｓｎｓをサイレンシングされた腫瘍および転移対Ａｓｎｓを発現する腫瘍および転移について、順位和ｐ値＜０．０１および＜０．０５）。ｈ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、対Ａｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞に由来する腫瘍および肺から単離された細胞中でのＴｗｉｓｔ１、Ｃｄｈ１、ＥＭＴ−ｕｐおよびＥＭＴ−ｄｏｗｎ遺伝子の相対的発現レベル（条件あたりｎ＝２回反復、腫瘍におけるＥＭＴ−ｄｏｗｎ遺伝子についての符号順位ｐ値＜０．０５および肺におけるＥＭＴ−ｕｐ遺伝子についての符号順位ｐ値＜０．００１、Ｃｄｈ１およびＴｗｉｓｔ１は、両組織において示差的に発現された、ＤＥＳｅｑ  ＦＤＲ＜０．０５）。
【図５】図５は、患者データにおけるＡＳＮＳ発現レベルの一次分析を示す。４Ｔ１−Ｔ対−Ｅにおいて上方調節されると同定されたそれぞれの遺伝子について、予後値を、３つの異なるデータセットを使用して算出した。１つは、３人の患者で一致した基底腫瘍と転移の対における遺伝子発現測定値からなっていた（患者Ａ１、Ａ７およびＡ１１）。ここで、遺伝子を、発現がそれぞれの転移においてより高かった場合、進行と相関し、発現がそれぞれの原発腫瘍においてより高かった場合、負に相関すると分類した。他の２つのデータセットは、転帰が一致した原発腫瘍遺伝子発現プロファイルからなっていた。ＵＮＣ２５４患者データセットについて、再発部位は利用可能ではなく、遺伝子を、それらが１を超える有意な無再発生存ハザード比を有する場合、進行と正に相関し、これらの比が有意（ｃｏｘ  ｐ値＜０．０５）かつ１未満である場合、負に相関すると見なした。ＵＮＣ８５５データセットも再発部位の情報を有していたため、ここで、無再発生存ハザード比と肺の無再発生存（ＲＦＳおよびＬＲＦＳ）の両方を使用して、ＵＮＣ２５４データについて使用したものと同じ基準に基づいて遺伝子を進行と正または負に相関すると分類した。異なるデータセットにおいて測定したヒトオルソログを含む遺伝子を示す。
【図６】図６は、患者データにおけるＡＳＮＳ発現レベルの二次分析を示す。ａ）異なる疾患サブタイプを有する患者の原発腫瘍におけるアスパラギン合成酵素の発現レベル（囲みの端部は、第一および第三四分位数であり、エラーバーは値ｑ３＋ｗ（ｑ３−ｑ１）およびｑ１−ｗ（ｑ３−ｑ１）（式中、ｗは１．５であり、ｑ１およびｑ３は第一および第三四分位数である）に拡張され、これはｂについても当てはまり、ＡＮＯＶＡのｐ値＜０．０００１である）。ｂ）それぞれの対応する部位に再発を有しない患者における発現レベルと比較した、非特異的再発およびリンパ節、骨、脳、肝臓または肺での再発を有する患者の原発腫瘍におけるアスパラギン合成酵素の発現レベル（順位和ｐ値＜０．００５）。ｃ）３つのさらなる乳がん患者セット（ＭＤＡＣＣ、ＭＥＴＲＡＢＩＣおよびＴＣＧＡ）におけるＡＳＮＳの分析。生存プロットおよび関連統計値（ｃｏｘ  ｐ値＜０．００１）を示す。ｄ）ＴＣＧＡ  Ｐａｎ  Ｃａｎｃｅｒ実験データにおけるＡＳＮＳの分析。データセットに表される１０種の非乳固形腫瘍に関する生存プロットおよび関連統計値を示す（結腸、扁平上皮頭頸部、腎明細胞および子宮内膜がんに関するｃｏｘ  ｐ値＜０．０５）。ｅ）ＴＣＧＡ  Ｐａｎ  Ｃａｎｃｅｒデータセットに表される全腫瘍にわたるＡＳＮＳの分析（ｃｏｘ  ｐ値＜０．００１）。
【図７】図７は、侵入および転移のドライバーとしてのＡｓｎｓの一次検証を示す。ａ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、およびＡｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞のマトリゲル侵入能力の定量化（細胞株あたりｎ＝３回反復）。ｂ）およそ５０％の細胞を、ウミシイタケルシフェラーゼおよびアスパラギン合成酵素を標的とするｓｈＲＮＡを担持するｍＣｈｅｒｒｙを発現する構築物に感染させた後の、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性４Ｔ１−Ｔ細胞の定量化。細胞を、図２ｃに記載されるマトリゲル侵入アッセイを実施した２４時間増殖させた（細胞株あたりｎ＝３回反復）。ｃ）初期集団と比較した、Ａｓｎｓをサイレンシングされた、およびＡｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞のバイオレット細胞標識強度。細胞を、図２ｃに記載されるマトリゲル侵入アッセイを実施した２４時間増殖させた（細胞株あたりｎ＝３回反復）。ｄ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、およびＡｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞をＮＳＧマウスに同所的に注射した、図２ｄに記載される腫瘍の代表的なＨ＆Ｅ染色切片。ｅ）ｄに示された腫瘍を担持するマウスに由来する肺の代表的なＨ＆Ｅ染色切片。
【図８】図８は、侵入および転移のドライバーとしてのＡｓｎｓの二次検証を示す。ａ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、またはＡｓｎｓを発現する親４Ｔ１細胞の同所注射から得られる腫瘍の体積測定値（細胞株あたりｎ＝１０匹のマウス、囲みの端部は、第一および第三四分位数であり、エラーバーは値ｑ３＋ｗ（ｑ３−ｑ１）およびｑ１−ｗ（ｑ３−ｑ１）（式中、ｗは１．５であり、ｑ１およびｑ３は第一および第三四分位数である）に拡張され、これはｂについても当てはまる）。ｂ）ａに記載された腫瘍に対応する肺転移の定量化（順位和ｐ値＜０．００２）。ｃ）Ａｓｎｓの基底（空）発現または強制的（Ａｓｎｓ）発現を示す親４Ｔ１細胞の同所注射から得られる腫瘍の体積測定値（細胞株あたりｎ＝１０匹のマウス、囲みの端部は、第一および第三四分位数であり、エラーバーは値ｑ３＋ｗ（ｑ３−ｑ１）およびｑ１−ｗ（ｑ３−ｑ１）（式中、ｗは１．５であり、ｑ１およびｑ３は第一および第三四分位数である）に拡張され、これはｄ、ｆおよびｇについても当てはまる）。ｄ）ｃに記載された腫瘍に対応する肺転移の定量化（順位和ｐ値＜０．０２）。ｅ）ｄに記載された肺の代表的なＨ＆Ｅ染色切片。ｆ）ＡＳＮＳの基底（空）発現または強制的発現を示すＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の同所注射から得られる腫瘍の体積測定値（反復あたりｎ＝１０匹のマウス）。ｇ）ｆに記載された腫瘍に対応する肺転移の定量化（順位和ｐ値＜０．０２）。ｈ）ｆに記載されたＭＤＡ−ＭＢ−２３１由来細胞株に関するマトリゲル侵入の定量化（細胞株あたりｎ＝３個の侵入チャンバー）。ｉ）ｈに記載された侵入アッセイに関する収集ウェルの代表的な画像。
【図９】図９は、細胞外アスパラギン利用可能性が侵入および転移に影響することの一次検証を示す。ａ）無細胞アミノ酸の組成パーセンテージを、Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞およびＡｓｎｓを発現する細胞についてＨＰＬＣを用いて測定した。アミノ酸あたりのこれらのパーセンテージのｌｏｇ２倍数変化を示す（細胞株あたりｎ＝３回反復、経験的ベイズモデレイテッドｔ検定ＦＤＲ＜０．０５）。ｂ）およそ５０％の細胞を、ウミシイタケルシフェラーゼおよびＡｓｎｓを標的とするｓｈＲＮＡを担持するｍＣｈｅｒｒｙを発現する構築物に感染させた後の、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性４Ｔ１−Ｔ細胞の定量化。感染細胞を、Ｌ−アスパラギンまたはＤ−アスパラギン添加培地中で増殖させた後、ｍＣｈｅｒｒｙのパーセンテージを４８および９６時間で測定した（細胞株あたりｎ＝３回反復、エラーバーは、１標準偏差を表し、これはｃについても当てはまる）。ｃ）Ｌ−アスパラギンを添加した、および添加していない培地中でアッセイした場合の、Ａｓｎｓをサイレンシングされた、およびＡｓｎｓを発現する細胞に関するマトリゲル侵入の定量化。ｄ）培地に、ＤＭＥＭ培養培地中にはないそれぞれの非必須アミノ酸を添加した場合の親４Ｔ１細胞の無細胞アミノ酸パーセンテージのＨＰＬＣ定量化（細胞株あたりｎ＝３回反復）。ｅ）図３ｂに記載されたのと同じ条件下でのＭＤＡ−ＭＢ−２３１のマトリゲル侵入速度の定量化（条件あたりｎ＝５個の侵入チャンバー、順位和ｐ値＜０．００１）。ｆ）ｄに記載された培地条件で培養した場合のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の無細胞アミノ酸パーセンテージのＨＰＬＣ定量化（細胞株あたりｎ＝３回反復）。ｇ）図３ｂに記載されたマトリゲル侵入アッセイを行った２４時間にわたってアスパラギンを含まない培地およびアスパラギンを添加した培地中で増殖させた場合の、親４Ｔ１細胞のバイオレット細胞標識強度（細胞株あたりｎ＝３回反復）。ｈ）ｅに記載されたマトリゲル侵入アッセイを行った２４時間にわたってアスパラギンを含まない培地およびアスパラギンを添加した培地中で増殖させた場合の、ＭＤＡＭＢ−２３１細胞のバイオレット細胞標識強度（細胞株あたりｎ＝３回反復）。
【図１０】図１０は、細胞外アスパラギン利用可能性が侵入および転移に影響することの二次検証を示す。ａ）親４Ｔ１細胞の同所注射から得られる腫瘍体積。半分のマウスはＬ−アスパラギナーゼを受けたが、他の半分は同じ注射速度で等量のＰＢＳを受けた（条件あたりｎ＝１０匹のマウス、囲みの端部は、第一および第三四分位数であり、エラーバーは値ｑ３＋ｗ（ｑ３−ｑ１）およびｑ１−ｗ（ｑ３−ｑ１）（式中、ｗは１．５であり、ｑ１およびｑ３は第一および第三四分位数である）に拡張され、これはｂ、ｄ、ｅおよびｆについても当てはまる）。ｂ）ａ）に記載された動物において検出された肺転移の定量化（順位和ｐ値＜０．０００２）。ｃ）ａに記載された代表的なＨ＆Ｅ染色された肺切片。ｄ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、およびＡｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞をマウスに注射した、図３ｃおよび図３ｄに記載された肺転移に対応する腫瘍体積。半分のマウスはＬ−アスパラギナーゼを受けたが、他の半分は同じ注射速度で等量のＰＢＳを受けた（条件あたりｎ＝１０匹のマウス、Ｌ−アスパラギナーゼ処置マウスにおけるＡｓｎｓをサイレンシングされた細胞対Ａｓｎｓを発現する細胞についての順位和ｐ値＜０．０５）。ｅ）ＡＳＮＳをサイレンシングされた、およびＡＳＮＳを発現するＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞の同所注射、次いで、Ｌ−アスパラギナーゼまたはＰＢＳによる注射された動物の処置から得られる腫瘍体積（細胞株あたりｎ＝１０匹のマウス）。ｆ）ｅに記載された同所腫瘍に対応する肺転移（両方の処置下でのＡｓｎｓをサイレンシングされた細胞対Ａｓｎｓを発現する細胞に関する、およびそれぞれの細胞株についてのＰＢＳ対Ｌ−アスパラギナーゼ処置動物に関する順位和ｐ値＜０．０５）。
【図１１】図１１は、細胞外アスパラギン利用可能性が侵入および転移に影響することの三次検証を示す。ａ）０％、０．６％または４％のアスパラギン食を供給したマウス（食事あたりｎ＝５匹のマウス、囲みの端部は、第一および第三四分位数であり、エラーバーは値ｑ３＋ｗ（ｑ３−ｑ１）およびｑ１−ｗ（ｑ３−ｑ１）（式中、ｗは１．５であり、ｑ１およびｑ３は第一および第三四分位数である）に拡張され、これはｂ、ｄ、ｅおよびｈについても当てはまり、各食事間の順位和ｐ値＜０．０５）についての、無血清アミノ酸プール中のアスパラギン含量（％）。ｂ）Ａｓｎｓをサイレンシングされた、およびＡｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞を、０％、０．６％および４％アスパラギン食を供給したマウス（条件あたりｎ＝１０匹のマウス）に同所的に注射した、図３ｅに記載された肺転移に対応する同所腫瘍の体積。ｃ）ｂに記載されたマウスにも対応する、図３ｅについて記載された肺転移の代表的な画像。ｄ）０％、０．６％または４％アスパラギン食を供給したマウス（食事あたりｎ＝１０匹のマウス）への親４Ｔ１細胞の同所注射から得られる腫瘍の体積。ｅ）ｄに記載された動物の肺における転移の定量化（それぞれの食事間の順位和ｐ値＜０．０５）。ｆ）ｅに記載された肺のＨ＆Ｅ染色切片の代表的な画像。ｇ）２つのプライマー対を用いるｑＰＣＲによって測定された、Ｌ−アスパラギナーゼまたはＰＢＳで処置したマウスの乳腺、血清および肺におけるＡｓｎｓの相対的発現（条件あたりｎ＝４、エラーバーは１標準偏差に拡張され、組織間の順位和ｐ値＜０．０５である）。ｈ）ヒト乳房、肺および全血試料におけるＡＳＮＳに関する、１００万のマッピングされたリード数あたりの転写物１キロベースあたりのリード数（ＲＰＫＭ）の発現測定値（それぞれの組織についてｎ＞９０、組織間の順位和ｐ値＜０．０５）。
【図１２】図１２は、アスパラギン利用可能性がＥＭＴを調節することの一次検証を示す。ａ）遺伝子を、転写レベルの変化（Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞における変化のレベルに基づく遺伝子の上および下１０％、それぞれ、Ｇｅｎｅ−ｕｐおよびＧｅｎｅ−ｄｏｗｎ）およびアスパラギン含量（アスパラギン含量に基づく遺伝子の上および下１０％、それぞれ、Ａｓｐ−ｈｉｇｈおよび−ｌｏｗ、囲みの端部は、第一および第三四分位数であり、エラーバーは値ｑ３＋ｗ（ｑ３−ｑ１）およびｑ１−ｗ（ｑ３−ｑ１）（式中、ｗは１．５であり、ｑ１およびｑ３は第一および第三四分位数である）に拡張され、両方の個々の変数に関する順位和ｐ値＜０．００１であり、相互作用変数に関する順位和ｐ値＜０．０５である）により階層化する場合のＡｓｎｓをサイレンシングされた細胞と、Ａｓｎｓを発現する細胞との間のタンパク質レベルの変化。ｂ）Ａｓｎｓのサイレンシングによって誘導されるＲＮＡおよびタンパク質レベルの発現変化に基づく遺伝子のアミノ酸富化分析。負の相関を示すアミノ酸は、存在量がサイレンシングによって誘導される対応するＲＮＡまたはタンパク質レベルの変化と負に相関するものであるが、正の相関を示すものは、これらの発現変化と正に相関する。ｃ）マウスＥＭＴ−ｕｐタンパク質におけるアミノ酸富化。ｄ）ヒトＥＭＴ−ｕｐタンパク質におけるアミノ酸富化。ｅ）少なくとも１０のオルソログを担持するＯｒｔｈｏｌｏｇｏｕｓ  ＭＡｔｒｉｘデータベースに列挙された１２６種における上皮間葉促進タンパク質オルソログのアスパラギン富化分析（全ての種に関する符号順位ｐ値＜１．０ｘ１０-13および哺乳動物対他の種に関する順位和ｐ値＜９．０ｘ１０-9）。
【図１３】図１３は、アスパラギン利用可能性がＥＭＴを調節することの二次検証を示す。ａ）４Ｔ１−Ｔ細胞中でＡｓｎｓサイレンシングに応答して起こるＥＭＴ−ｕｐおよび−ｄｏｗｎ遺伝子における転写レベルの変化（条件あたりｎ＝２回反復、囲みの端部は、第一および第三四分位数であり、エラーバーは値ｑ３＋ｗ（ｑ３−ｑ１）およびｑ１−ｗ（ｑ３−ｑ１）（式中、ｗは１．５であり、ｑ１およびｑ３は第一および第三四分位数である）に拡張され、これはｂ、ｃ、ｆおよびｇについても当てはまり、ＥＭＴ−ｕｐ遺伝子に関する符号順位ｐ値＜０．００１である）。ｂ）アスパラギンを添加される親４Ｔ１細胞の培地に応答して起こるＥＭＴ−ｕｐおよび−ｄｏｗｎ遺伝子における転写レベルの変化（条件あたりｎ＝２回反復、ＥＭＴ−ｕｐ遺伝子に関する符号順位ｐ値＜０．００５）。ｃ）Ｔｇｆβをサイレンシングされた、およびＴｇｆβを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞の同所注射から得られる腫瘍の体積（細胞株あたりｎ＝１０匹のマウス）。ｄ）ｃに記載された腫瘍に由来する切片のＩＨＣ染色に基づくＴｗｉｓｔ１陽性領域のパーセント（細胞株あたりｎ＝５個の腫瘍切片、エラーバーは１標準偏差に拡張され、これはｅについても当てはまり、Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞対Ａｓｎｓを発現する細胞に関する順位和ｐ値＜０．０１である）。ｅ）ｃに記載された腫瘍に由来する切片のＩＨＣ染色に基づくＣｄｈ１陽性領域のパーセント（細胞株あたりｎ＝５個の腫瘍切片、Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞対Ａｓｎｓを発現する細胞に関する順位和ｐ値＜０．０１）。ｆ）ｃに記載された腫瘍から得られる転移の定量化（順位和ｐ値＜０．０５）。ｇ）Ｔｇｆβをサイレンシングされた細胞およびＴｇｆβを発現する細胞の静脈内注射から得られる転移の定量化（細胞株あたり１０匹のマウス、順位和ｐ値＜０．０５）。
【図１４】図１４は、アスパラギン利用可能性がＥＭＴを調節することの三次検証を示す。ａ）マウスに、Ａｓｎｓをサイレンシングされた、およびＡｓｎｓを発現する４Ｔ１−Ｔ細胞を同所注射した、図４ｆおよびｇに記載された肺に由来する切片上でのＴｗｉｓｔ１およびＣｄｈ１のＩＨＣ染色の代表的な画像。ｂ）ａに記載された腫瘍および肺における、ｑＰＣＲによって測定された相対的Ｔｗｉｓｔ１発現（細胞株あたりｎ＝２の腫瘍および肺、エラーバーは１標準偏差に拡張され、これはｃ、ｄ、ｅ、ｆおよびｇについても当てはまる）。ｃ）ａに記載された腫瘍および肺における、ｑＰＣＲによって測定された相対的Ｃｄｈ１発現（細胞株あたりｎ＝２の腫瘍および肺）。ｄ）ＰＢＳまたはＬ−アスパラギナーゼで処置された動物へのＡｓｎｓを発現する細胞およびＡｓｎｓをサイレンシングされた細胞の同所注射から得られる腫瘍におけるＴｗｉｓｔ１陽性領域の定量化（条件あたりｎ＝５個の腫瘍切片、順位和ｐ値＜０．０１）。ｅ）ｄに記載された０％、０．６％または４％のアスパラギンを供給した動物へのＡｓｎｓを発現する細胞およびＡｓｎｓをサイレンシングされた細胞の同所注射から得られる腫瘍におけるＣｄｈ１陽性領域の定量化（条件あたりｎ＝５個の腫瘍切片、順位和ｐ値＜０．０１）。ｆ）０％、０．６％または４％のアスパラギン食を供給したマウスへのＡｓｎｓを発現する細胞およびＡｓｎｓをサイレンシングされた細胞の同所注射から得られる腫瘍におけるＴｗｉｓｔ１陽性領域の定量化（条件あたりｎ＝５個の腫瘍切片、Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞とＡｓｎｓを発現する細胞との間および食事間の順位和ｐ値＜０．０１）。ｇ）ｆに記載された腫瘍におけるＣｄｈ１陽性領域の定量化（条件あたりｎ＝５個の腫瘍切片、Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞とＡｓｎｓを発現する細胞との間および食事間の順位和ｐ値＜０．０１）。ｈ）ａに記載された腫瘍および転移から単離した後の培養細胞の画像。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
本発明者らは驚くべきことに、アスパラギンを実質的に含まない食事が、がんなどの増殖性障害を有する対象において転移を遅延させるか、または阻害するのに有用であることを見出した。具体的には、マウスの食事からのアスパラギンの除去は、同所腫瘍からの転移を強く低減させた。理論によって束縛されることを望むものではないが、本発明者らは、アスパラギン制限が、上皮間葉移行を促進するタンパク質の産生を低減させ、これがアスパラギンの利用可能性が転移の進行を調節する１つの潜在的な機構であり得ることを示した。さらに、アスパラギン制限は、対象におけるがん幹細胞表現型を低減させ得る。
「バイオアベイラビリティ」とは、循環中に進入するアスパラギンの割合を意味する。
好適には、本発明は、がんに罹患している対象の通常の食事を、アスパラギンを実質的に含まない規定食に部分的または完全に置換することを含んでもよい。そのような食事は、潜在的には、本明細書に詳述される栄養製品の提供によって、または同時的もしくは連続的に投与することができる２つ以上の栄養補助食品によって達成することができる。潜在的には、そのような食事が依然としてアスパラギンを実質的に含まないように、現在入手可能な成分を使用して、適切な食品選択を介して、食事にさらに添加することができる。
好適には、栄養製品が必須アミノ酸の必要な１日摂取量を提供するように、それを製剤化することができる。当業者であれば、これを様々な方法によって達成することができ、それが栄養製品のための投与レジメンに依拠することを容易に認識できる。例えば、栄養製品が１日あたり単回用量で投与される場合、その用量は、必須アミノ酸の少なくとも１日推奨量を含むが、１日３回投与される場合、合わせた３回の投与は、必須アミノ酸の少なくとも１日推奨量を提供するであろう。
好適には、がん細胞をさらなる療法に対して感作するためのがん処置の前に、血清アスパラギンレベルを低下させる食事または他の薬剤を使用することができる。本発明者らは驚くべきことに、食事アスパラギン含量は、原発腫瘍における上皮間葉特徴と正に相関することを示した。がん細胞中のアスパラギンレベルを低下させることによって、上皮間葉移行（ＥＭＴ）を防止するか、または逆転させ、がん細胞の療法に対する感度を増大させることができる。
【００２１】
栄養製品
本発明の第１の態様では、全ての必須アミノ酸を含み、少なくともアスパラギンを実質的に含まない、複数のアミノ酸を含む栄養製品が提供される。
「必須アミノ酸」とは、メチオニン、ロイシン、フェニルアラニン、イソロイシン、バリン、リシン、トレオニン、ヒスチジンおよびトリプトファンを意味する。
【００２２】
「栄養製品」とは、所望のレベルのアミノ酸またはその塩もしくはエステルを、栄養製品を消費する対象に提供するために、食品中で使用されるか、または食品と共に使用もしくは消費される、１つまたは複数の必須アミノ酸またはその塩もしくはエステルを含む組成物を指す。これらの製品中の栄養成分は、ビタミン、ミネラル、ハーブまたは他のボタニカル、アミノ酸、ならびに酵素、臓器組織、腺、および代謝物などの物質を含んでもよい。本発明では、栄養製品を、単一の組成物中に、または組み合わさって、例えば、１日にわたって、全ての必須アミノ酸を提供する栄養補助食品の組合せの中に、全ての必須アミノ酸を含むように製剤化することができる。好適には、栄養補助食品は、アスパラギンを実質的に含まない。
【００２３】
一部の実施形態では、栄養製品は、食事の一部として対象によって消費される外因性アミノ酸の唯一の供給源である。好適には、一部の態様では、栄養製品は、対象の食事を実質的に、または単に置き換えることを意図するものであってもよい。したがって、一部の態様では、栄養製品は、対象のための完全食代用品であってもよい。
有利には、タンパク質などのアミノ酸の通常の供給源の消費の、本発明の栄養製品による置き換えにより、アスパラギンを実質的に含まない食事が得られる。これは、がんの対象に対して治療的利益を提供することができる。
【００２４】
本明細書で使用される場合、本発明の全ての態様によると、用語「対象」は、好ましくは、ヒト、獣医学的動物または農業用動物、家庭用動物またはペット、ならびに非ヒト霊長類、イヌおよびマウスなどの、通常は臨床研究に使用される動物を含む、哺乳動物を指す。より具体的には、本発明の対象は、ヒトであってもよい。
好適には、対象は、がん幹細胞表現型を有する細胞の集団を有してもよい。がん幹細胞は、当業界で公知であり、腫瘍再発に含まれるだけでなく、腫瘍原性、転移化および薬物耐性でもある。
好適には、栄養製品は、少なくとも９種のアミノ酸を含んでもよい。好適には、栄養製品は、少なくとも１０種または少なくとも１１種または少なくとも１２種または少なくとも１３種または少なくとも１４種または少なくとも１５種または少なくとも１６種または少なくとも１７種または１８種のアミノ酸を含んでもよい。好適には、栄養製品は、例えば、９〜１８種のアミノ酸または１２〜１８種のアミノ酸、または１２〜１７種のアミノ酸または１３〜１７種のアミノ酸または１４〜１７種のアミノ酸を含んでもよい。
好適には、栄養製品は、１つまたは複数のさらなる非必須アミノ酸を実質的に含まなくてもよい。栄養製品中に実質的に含まれなくてもよいさらなるアミノ酸は、２つ以上の下記アミノ酸：グリシン、セリン、システイン、チロシン、プロリンおよびアルギニンを含んでもよい（または本質的にそれからなってもよい、もしくはそれからなってもよい）。あるいは、栄養製品は、アスパラギンに加えて、以下のアミノ酸：グリシン、セリン、システイン、チロシン、プロリン、アルギニン、アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、およびグルタミンのうちの少なくとも２種または少なくとも３種または少なくとも４種または少なくとも５種または少なくとも６種を含まなくてもよい。
【００２５】
これに関連して、「本質的にそれからなる」とは、栄養製品が、本発明の栄養製品に対する重要な効果を有するさらなるアミノ酸を欠かないことを意味する。「重要な効果」とは、以下：ａ）健康な細胞とは反対にがんに対する特異性に対する有意な効果；ｂ）転移の遅延もしくは阻害に対する有意な効果；ｃ）がん細胞の毒性に対する有意な効果またはｄ）ａ）〜ｃ）の任意の組合せのうちの１つとして測定することができる有意な治療効果を意味する。一部の態様では、特定のアミノ酸を含む、および含まない栄養製品を比較し、アミノ酸の欠如が重要な効果を有するかどうかを決定することによって、これを測定することができる。
【００２６】
ＷＯ２０１７／１４４８７７は、セリンおよび／またはグリシンを実質的に含まない食事または栄養製品が、がん細胞の増殖および／または生存を低減するのに有用であることを開示する。本特許出願はまた、グリシン、セリンおよびシステインを実質的に含まない栄養製品が、結腸直腸がん（ＨＣＴ１１６およびＲＫＯなど）、肝臓がん（ＨｅｐＧ２）、骨肉腫（Ｕ２ＯＳ）および乳がん（ＭＤＡ  ＭＢ  ２３１）を含むいくつかのがん細胞株におけるがん細胞増殖の阻害およびがん細胞死の増加において有効である；グリシン、セリンおよびアルギニンを実質的に含まない栄養製品が驚くべきことに、結腸直腸がん細胞株（ＲＫＯおよびＨＣＴ１１６など）におけるがん細胞増殖の阻害および／またはがん細胞死の増加において有効である；グリシン、セリンおよびチロシンを実質的に含まない栄養製品が驚くべきことに、結腸直腸がん細胞株（ＲＫＯおよびＨＣＴ１１６など）におけるがん細胞増殖の阻害および／またはがん細胞死の増加において有効であり、食事がシステインを実質的に含まない場合、さらに有益な効果が生じることを示した。したがって、アスパラギンを実質的に含まないことに加えて、これらの非必須アミノ酸のいずれか１つまたは複数を実質的に含まないことが、本発明の栄養製品にとって有益である。
【００２７】
栄養製品は、２５ｍｇ／ｋｇ対象体重／日未満または２０ｍｇ／ｋｇ／日未満または１８ｍｇ／ｋｇ／日未満または１６ｍｇ／ｋｇ／日未満のレベルでメチオニンをさらに含んでもよい。
本発明の栄養製品を、本明細書で別途記述されない限り、１日平均総タンパク質消費量に基づく必須アミノ酸の少なくとも１日推奨摂取量を提供するように製剤化することができる。
１日平均総タンパク質消費量に基づく、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによる必須アミノ酸の１日推奨摂取量は、ヒスチジン１８ｍｇ／消費タンパク質１ｇ；イソロイシン２５ｍｇ／消費タンパク質１ｇ；ロイシン５５ｍｇ／消費タンパク質１ｇ、リシン５１ｍｇ／消費タンパク質１ｇ；メチオニンおよびシステインの組合せ２５ｍｇ／消費タンパク質１ｇ；フェニルアラニンおよびチロシンの組合せ４７ｍｇ／消費タンパク質１ｇ、トレオニン２７ｍｇ／消費タンパク質１ｇ、トリプトファン７ｍｇ／消費タンパク質１ｇおよびバリン３２ｍｇ／消費タンパク質１ｇである。チロシンおよびシステインは、非必須アミノ酸である。本発明の栄養製品がチロシンおよび／またはシステインのいずれかを実質的に含まない場合、栄養製品は、栄養製品が１日平均タンパク質消費量に基づいて、少なくとも２５ｍｇ／消費タンパク質１ｇの量のメチオニンおよび少なくとも４７ｍｇ／タンパク質１ｇの量のフェニルアラニンを提供するように製剤化されるように調整される。
【００２８】
好適には、システインが「制限された」栄養製品は、１日平均タンパク質消費量に基づいて１日推奨摂取量未満のシステインを提供するように製剤化されるよりも少ないものを提供するものである。例えば、システインが制限された栄養製品は、消費タンパク質１ｇあたり２０ｍｇ未満または消費タンパク質１ｇあたり１５ｍｇ未満または消費タンパク質１ｇあたり１０ｍｇ未満または消費タンパク質１ｇあたり５ｍｇ未満を提供するものであってもよい。
好適には、栄養製品を、消費タンパク質１グラムあたり、制限されたレベルの総非必須アミノ酸を提供するように製剤化することができる。例えば、非必須アミノ酸の合わせた１日摂取量は、消費タンパク質１グラムあたりの総非必須アミノ酸の１日推奨摂取量と比較して、少なくとも１種または少なくとも２種または少なくとも３種または少なくとも４種または少なくとも５種または少なくとも６種または少なくとも７種の非必須アミノ酸を実質的に含まない食事と同等であってよい。
医学研究所は、タンパク質が、例えば、成人の体重１キログラムあたり０．８グラム／日の割合で消費されることを推奨している。栄養製品を、製品の１日推奨消費量の中で体重１ｋｇあたり少なくとも０．８グラムのタンパク質を提供するように製剤化することができる。
【００２９】
好適には、本発明の栄養製品を、これらの上記の推奨レベルを提供するように製剤化することができる。例えば、１つまたは複数のアミノ酸を栄養製品中で製剤化して、１日平均総タンパク質消費量に基づいて１日平均摂取量の少なくとも２、３、４、５または６倍を提供することができる。
好適には、本発明の栄養製品中に存在するアミノ酸は、遊離形態、プロドラッグ形態のアミノ酸、塩またはアミノ酸エステルであってもよい。１つまたは複数のＮ末端またはＣ末端改変を有するアミノ酸、ならびにホモポリマー、ホモダイマー、ヘテロポリマーおよびヘテロダイマー形態も企図され得る。
好適には、栄養製品を、１日１回〜８回投与されるように製剤化することができる。好ましくは、１日１回〜４回である。したがって、栄養製品を、適切な単位剤形に製剤化することができる。
本発明の栄養製品は、１つまたは複数の主要栄養素および／または微量栄養素をさらに含んでもよい。
【００３０】
主要栄養素および提言された１日推奨量に関する指針を、２００２年９月にＩｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅによって公表されたDietary Reference Intakes for Energy, Carbohydrate, Fiber, Fat, Fatty Acids, cholesterol, protein and amino acidsに見出すことができる。
栄養製品の追加成分であってよい主要栄養素の非包括的一覧としては、炭水化物、繊維および脂肪（ｎ−６ポリ不飽和脂肪酸、ｎ−３ポリ不飽和脂肪酸、飽和およびトランス脂肪酸ならびにコレステロールなど）が挙げられる。
微量栄養素の非包括的一覧としては、ビタミンＡ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、ビタミンＫ、チアミン、リボフラビン、ナイアシン、ビタミンＢ６、葉酸、ビタミンＢ１２、パントテン酸、ビオチン、コリン、カルシウム、クロム、銅、フッ素、ヨウ素、鉄、マグネシウム、モリブデン、リン、セレン、亜鉛、カリウム、ナトリウム、および塩化物が挙げられる。好適には、栄養製品を、刊行物「Dietary Reference Intakes: RDA and AI for Vitamins and Elements」、NAS. IOM. Food and Nutrition Boardに詳述された許容または推奨１日摂取量中にこれらのものを提供するように製剤化することができる。
【００３１】
本明細書に記載される栄養製品は、余剰の１つまたは複数の他のアミノ酸によって企図されてもよい、一般に２つ以上の非必須アミノ酸の欠損の形態にあるアミノ酸の不均衡を含有する。例えば、実質的に含まないアミノ酸は、他のアミノ酸の平均存在量よりも少なくとも１０、１５、２０、３０、４５、５０、１００または１０００倍低いものであってもよい。果物、野菜およびある特定のナッツなどの、タンパク質は少ないが、他の栄養素に富む食品を、栄養士の推奨に従って消費し、食事によるアミノ酸摂取比率が意図される比率で保持されることを確認することができる。この食事（本発明の栄養製品、および任意に、アスパラギンを実質的に含まない他の栄養源を含む）は、単独で、または抗がん活性を有するものなどの薬物療法と組み合わせて消費されることが意図される。
一部の実施形態では、本発明の栄養製品は、本発明の栄養製品を一緒になって提供する２つ以上の栄養補助食品にわたって製剤化される。栄養補助食品によって提供される合わせた平均的食事が本発明の栄養製品を提供するように、これらのものを、前記対象に同時的または連続的に投与することができる。これは、対象の食事に変化をもたらすのに有利であり得る。
【００３２】
栄養製品を、再構成された、シェイク、濃縮液、ピル、バー、錠剤、カプセルまたは即時使用可能な製品であってよい、粉末、ゲル、溶液、懸濁液、ペースト、固体、液体、液体濃縮物、粉末の形態で提供することができる。栄養製品はまた、栄養補助食品が錠剤、ピル、カプセル、液体、エアロゾル、注射可能溶液、または他の薬学的に許容される製剤の形態にある場合、医薬組成物であってもよいと考えられる。好適には、栄養製品は、飲料であってもよい。好適には、飲料を、１日に２〜６回投与してもよい。
好適には、栄養製品は、天然に存在する食品でなくてもよい。
好適には、栄養製品は、特定のアミノ酸に対する追加の化合物を含んでもよい。好適には、そのような追加の化合物は、アミノ酸を実質的に含まないｄｅ  ｎｏｖｏ合成を補助しなくてもよい。
本明細書で使用される場合、アミノ酸を参照する「実質的に含まない」とは、そのアミノ酸を完全に含まない、またはほぼ含まない（微量など）ことを意味する。
投与は、静脈内経路によるものであってもよい。非経口投与を、ボーラスで、または輸注によって提供してもよい。
【００３３】
好適には、栄養製品は、
ａ）経管栄養製品（ＮＧ管を介して投与することができる鼻−胃栄養製品；ＮＪ管を介して投与することができる鼻−空腸栄養製品；もしくはＰＥＧ（経皮的内視鏡下胃瘻造設術）管栄養製品など）；
ｂ）非経口栄養製品（中心静脈投与によって、例えば、静脈カテーテル上の専用ルーメンを介して投与することができる）；または
ｃ）ＩＶ輸注製品
であってもよい。
好ましくは、投与は、食品または飲料としてのものであってもよい。
ある特定の実施形態では、本発明の食事または栄養製品は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間の期間にわたって、または治療のエンドポイントが観察されるまで、例えば、血清中のアスパラギンレベルが統計的に有意に低下するまで、もしくはがん細胞の上皮間葉（ＥＭＴ）表現型の減少が観察されるまで投与される。
【００３４】
本発明は、アミノ酸が水中に溶解もしくは分散され、噴霧乾燥された本発明の栄養製品を調製するプロセスをさらに提供する。
好適には、アミノ酸を、主要栄養素および微量栄養素などの追加の成分と混合することができる。ヒトまたは動物の消費にとって好適な結合剤、乳化剤または他の成分を、所望により添加してもよい。
医薬組成物
別の態様では、本発明は、本発明の栄養製品または本発明に従って生産された栄養製品と、薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤とを含む医薬組成物を提供する。
好適な医薬製剤の選択および調製のための従来の手順は、例えば、「Pharmaceuticals - The Science of Dosage Form Designs」, M. E. Aulton, Churchill Livingstone, 1988に記載されている。
本発明の組成物は、経口使用にとって好適な形態にあってもよい（例えば、錠剤、ロゼンジ剤、硬質または軟質カプセル、水性または油性懸濁液、乳液、分散性粉末または顆粒、シロップ剤またはエリキシル剤として）。
【００３５】
本発明の組成物を、当業界で周知の従来の薬学的賦形剤を使用する従来の手順によって取得することができる。したがって、経口使用について意図される組成物は、例えば、１つまたは複数の着色料、甘味料、香料および／または防腐剤を含有してもよい。
好適には、医薬組成物は、治療有効量の本発明の栄養製品を提供するように製剤化される。
ある状態の療法における使用のための「有効量」は、温血動物、特に、ヒトにおいて、症状を症候的に緩和する、または状態の進行を減速させるのに十分な量である。一部の態様では、「有効量」は、対象の血清中のアスパラギンレベルを低下させる、および／または転移を遅延させるか、もしくは阻害するのに十分な量である。
【００３６】
用語「治療有効量」は、投与された場合、対象における転移の発生を防止する、またはそれをある程度軽減するのに十分である化合物または組成物の量を包含する。用語「治療有効量」はまた、研究者、医師または臨床医によって求められる、細胞、組織、臓器、系、動物またはヒトの生物学的または医学的応答を惹起するのに十分なものである化合物または組成物の量も包含する。個々の事例における適切な「有効」量は、当業者であれば、日常的な実験を使用して決定することができる。任意の特定の患者のための特定の用量レベルおよび投与頻度は変化してもよく、用いられる特定の化合物の活性；その化合物のバイオアベイラビリティ、代謝安定性、排出速度および作用の長さ；化合物の投与の様式および時間；患者の年齢、体重、一般的健康、性別および食事；ならびに処置される特定の状態の重症度を含む様々な因子に依存することが理解されるであろう。
【００３７】
用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、状態、障害もしくは疾患、または状態、障害もしくは疾患と関連する１つもしくは複数の症状を軽減すること、または廃止することを包含し、状態、障害もしくは疾患自体の原因を軽減すること、または根絶することを包含する。ある特定の実施形態では、用語「処置する」、「処置すること」および「処置」は、状態、障害もしくは疾患、またはそれと関連する症状、またはその原因を軽減する、廃止する、または防止する目的での、化合物、医薬組成物または医薬剤形の対象への投与を指す。
好適には、本発明の医薬組成物は、がん細胞増殖の阻害剤、放射線療法剤、抗転移剤、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法剤、アミノ酸代謝／回転／相互変換の阻害剤、非必須アミノ酸生合成の阻害剤、アミノ酸輸送の阻害剤、アミノ酸分解を促進する酵素もしくは薬物またはアミノ酸を隔離する物質から選択される治療剤をさらに含んでもよい。
【００３８】
がん療法
一態様では、本発明は、薬剤における使用のための、本発明の栄養製品または本発明のプロセスに従って生産された栄養製品または本発明の医薬組成物を提供する。
例えば、本発明は、転移を遅延させるか、または阻害するのに使用するための、本発明の栄養製品または本発明のプロセスに従って生産された栄養製品または本発明の医薬組成物を提供する。
本明細書で使用される用語「転移」とは、元のがん性腫瘍の臓器に直接接続されていない、臓器または身体部位中でのがん性腫瘍の増殖を指す。転移を、元の腫瘍部位からのがん細胞の逸脱、および身体の他の部分へのがん細胞の遊走および／または侵入などの、いくつかの段階のプロセスと定義することもできる。したがって、本発明は、元のがん性腫瘍の臓器に直接接続されていない臓器もしくは身体部位中での１つもしくは複数のがん性腫瘍のさらなる増殖および／またはその増殖をもたらすプロセスにおける任意の段階を遅延させること、または阻害することを企図する。
【００３９】
本発明は、驚くべきことに、がんを有する対象のアスパラギンレベル（例えば、血清中の）を低下させることによって、転移を遅延させるか、または阻害することができることを示した。これに関して、本発明者らは、アスパラギン合成酵素のサイレンシングが、ｉｎ  ｖｉｖｏでの転移能力と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの侵入能力との両方を低減させることを示した。例えば、図２を参照されたい。細胞外アスパラギンレベル（すなわち、アスパラギンのバイオアベイラビリティ）を低下させるためのＬ−アスパラギナーゼによる処置は、４Ｔ１細胞を注射されたＮＳＧマウスにおける転移負荷の有意な減少をもたらすことが示され、さらに、食事からアスパラギンを枯渇させることも、動物における転移負荷の減少を誘導することが示された。
【００４０】
したがって、本発明は、がんを有する対象における転移の遅延または阻害における使用のための薬剤であって、がんを有する対象の血液中の細胞外アスパラギンレベルを低下させる、前記薬剤を提供する。さらなる態様では、本発明は、がんを有する対象における転移を遅延させる、または阻害するための薬剤の製造における化合物または組成物の使用であって、対象の血液中の細胞外アスパラギンレベルを低下させる化合物または組成物の使用を提供する。本発明はまた、対象におけるがんを処置する方法であって、治療有効量の薬剤を前記対象に投与することを含み、前記薬剤が、がんを有する対象の血液中の細胞外アスパラギンレベルを低下させる、方法も提供する。
【００４１】
当業者であれば、がんを有する対象の血液中のアスパラギンレベルを低下させることができる様々な薬剤、化合物および組成物に容易に気付くであろう。これらのものとしては、アスパラギン合成酵素阻害剤、Ｌ−アスパラギナーゼならびに本明細書に詳述される栄養製品が挙げられる。
【００４２】
アスパラギン合成酵素阻害剤は、当業界で公知であり、グアニジノコハク酸；オキサロ酢酸；Ｌ−システインスルホン酸；ジエチルアミノマロネート；Ｌ−アスパラギン酸を含有するジペプチド（Ｌ−アスパルチルグリシン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−ロイシン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−フェニルアラニン、Ｌ−アスパルチル−Ｌ−プロリン、Ｌ−α−アスパルチル−Ｌ−セリンおよびＬ−α−アスパルチル−Ｌ−バリン）；Ｎ−ｏ−ニトロフェニルスルフェニル−Ｌ−アスパラギン酸；Ｎ−ｏ−ニトロフェニルスルフェニル−Ｌ−グルタミン；Ｓ−アデノシル−Ｌ−メチオニン；Ｌ−ホモセリン−β−アデニレート；エタクリン酸；ムピロシン、ホスミドシン（ｐｈｏｓｍｉｄｏｓｉｎｅ）、β−アスパラギニルアデニレート、βＡｓｐＡＭＰ中間体のスルホンアミドアナログが挙げられる。療法における使用にとって好適である任意のアスパラギン合成酵素を、本発明において使用することができる。
【００４３】
全ての態様について、例示的ながんとしては、限定されるものではないが、副腎皮質癌、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、肛門直腸がん、肛門管がん、虫垂がん、小児小脳星細胞腫、小児大脳星細胞腫、基底細胞癌、皮膚がん（非黒色腫）、胆管がん、肝外胆管がん、肝内胆管がん、膀胱がん（ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、膀胱がん（ｕｒｉｎａｒｙ  ｂｌａｄｄｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、骨および関節のがん、骨肉腫および悪性線維性組織球腫、脳がん、脳腫瘍、脳幹グリオーマ、小脳星細胞腫、大脳星細胞腫／悪性グリオーマ、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視路視床下部グリオーマ、乳がん、気管支腺腫／気管支カルチノイド、カルチノイド腫瘍、消化管がん、神経系がん、神経系リンパ腫、中枢神経系がん、中枢神経系リンパ腫、子宮頸がん、小児がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性リンパ増殖性障害、結腸がん、結腸直腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、リンパ系新生物、菌状息肉腫、セザリー症候群、子宮内膜がん、食道がん、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管がん、眼がん、眼内黒色腫、網膜芽腫、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、胚細胞腫瘍、卵巣胚細胞腫瘍、妊娠性絨毛腫瘍グリオーマ、頭頸部がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼内黒色腫、眼がん、島細胞腫瘍（膵島）、カポジ肉腫、腎臓がん、腎がん、腎臓がん、喉頭がん、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、ヘアリー細胞白血病、口唇および口腔がん、肝臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、原発性中枢神経系リンパ腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、髄芽腫、黒色腫、眼内（眼）黒色腫、メルケル細胞癌、悪性中皮腫、中皮腫、転移性頸部扁平上皮がん、口腔がん、舌がん、多発性内分泌腫瘍症候群、菌状息肉腫、骨髄異形成症候群、骨髄異形成／骨髄増殖性疾患、慢性骨髄性白血病、急性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、慢性骨髄増殖性障害、上咽頭がん、神経芽腫、口腔がん、口腔がん、口腔咽頭がん、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣低悪性度腫瘍、膵がん、膵島細胞がん、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体芽細胞腫およびテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腫瘍、形質細胞新生物／多発性骨髄腫、胸膜肺芽腫、前立腺がん、直腸がん、腎盂尿管、移行上皮がん、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍、カポジ肉腫、軟部組織肉腫、子宮がん、子宮肉腫、皮膚がん（非黒色腫）、皮膚がん（黒色腫）、メルケル細胞皮膚癌、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮癌、胃がん、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣がん、咽喉がん、胸腺腫、胸腺腫および胸腺癌、甲状腺がん、腎盂尿管および他の泌尿器の移行細胞がん、妊娠性絨毛腫瘍、尿道がん、子宮内膜がん、子宮肉腫、子宮体がん、膣がん、外陰がん、ならびにウィルムス腫瘍が挙げられる。好適には、がんを、乳がん、結腸がん、頭頸部扁平上皮がん、腎明細胞がんおよび子宮内膜がんからなる群から選択することができる。
【００４４】
栄養製品は、システインを実質的に含まなくてもよい。好適には、システインを実質的に含まない食事は、肺がん、結腸直腸がんおよび乳がんなどの、外因性システインを熱心に消費するがんにおいて有用であり得る。好適には、システインを実質的に含まない食事は、ＭＴＡＰの発現が下方調節されるがんにおいて有用であり得る。
【００４５】
栄養製品は、セリンおよび／またはグリシンを実質的に含まなくてもよい。好適には、セリンおよび／またはグリシンを実質的に含まない食事は、肺がん、結腸直腸がんおよび乳がん、リンパ腫、結腸直腸がん、肝臓がん、骨肉腫および乳がんなどの、外因性セリンおよび／またはグリシンを熱心に消費するがんにおいて有用であり得る。
栄養製品は、アルギニンおよび／またはチロシンを実質的に含まなくてもよい。好適には、アルギニンを実質的に含まない食事は、結腸直腸がんなどのがんにおいて有用であり得る。
【００４６】
組合せ療法
対象の血液中のアスパラギンレベルを低下させる薬剤、化合物および組成物（本発明の栄養製品または医薬組成物など）を単独で使用して、治療効果（例えば、転移を遅延させること、または阻害すること）を提供することができる。好適には、本発明の栄養製品または医薬組成物を、がん細胞増殖の阻害剤、抗転移剤、免疫チェックポイント阻害剤、化学療法剤および／または放射線療法剤のうちの１つまたは複数と組み合わせて使用することもできる。
【００４７】
そのような化学療法は、以下のカテゴリーの抗がん剤：
（ｉ）抗増殖／抗新生物薬およびその組合せ、例えば、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチン、シクロホスファミド、窒素マスタード、ウラシルマスタード、ベンダムスチン、メルファラン、クロラムブシル、クロルメチン、ブスルファン、テモゾロミド（ｔｅｍｏｚｏｌａｍｉｄｅ）、ニトロソウレア、イホスファミド、メルファラン、ピポブロマン、トリエチレン−メラミン、トリエチレンチオホポラミン、カルムスチン、ロムスチン、ストレプトゾシン（ｓｔｒｏｐｔｏｚｏｃｉｎ）およびダカルバジン）；代謝拮抗物質（例えば、ゲムシタビンならびに抗葉酸剤、例えば、５フルオロウラシルおよびテガフルのようなフルオロピリミジン、ラルチトレキセド、メトトレキサート、ペメトレキセド、シトシンアラビノシド、フロクスウリジン、シタラビン、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、リン酸フルダラビン、ペントスタチン、ならびにゲムシタビンおよびヒドロキシウレア）；抗生物質（例えば、アドリアマイシン、ブレオマイシン、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、イダルビシン、マイトマイシン−Ｃ、ダクチノマイシンおよびミトラマイシンのようなアントラサイクリン）；抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビンデシンおよびビノレルビンのようなビンカアルカロイドならびにタキソールおよびタキソテールのようなタキソイドならびにポロキナーゼ阻害剤）；プロテアソーム阻害剤、例えば、カルフィルゾミブおよびボルテゾミブ；インターフェロン療法；およびトポイソメラーゼ阻害剤（例えば、エトポシドおよびテニポシドのようなエピポドフィロトキシン、アムサクリン、トポテカン、イリノテカン、ミトキサントロンならびにカンプトテシン）；ブレオマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、ａｒａ−Ｃ、パクリタキセル（Ｔａｘｏｌ（商標））、ナブパクリタキセル、ドセタキセル、ミトラマイシン、デオキシコホルマイシン、マイトマイシン−Ｃ、Ｌ−アスパラギナーゼ、インターフェロン（特に、ＩＦＮ−アルファ）、エトポシド、テニポシド、ＤＮＡ脱メチル化剤（例えば、アザシチジンまたはデシタビン）；およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤（例えば、ボリノスタット、ＭＳ−２７５、パノビノスタット、ロミデプシン、バルプロ酸、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）およびプラシノスタットＳＢ９３９）；
（ｉｉ）細胞増殖抑制剤、例えば、抗エストロゲン剤（例えば、タモキシフェン、フルベストラント、トレミフェン、ラロキシフェン、ドロロキシフェンおよびヨードキシフェン）、抗アンドロゲン剤（例えば、ビカルタミド、フルタミド、ニルタミドおよび酢酸シプロテロン）、ＬＨＲＨアンタゴニストまたはＬＨＲＨアゴニスト（例えば、ゴセレリン、ロイプロレリンおよびブセレリン）、プロゲストゲン（例えば、酢酸メゲストロール）、アロマターゼ阻害剤（例えば、アナストロゾール、レトロゾール、ボラゾールおよびエキセメスタン）およびフィナステリドなどの５*−リダクターゼの阻害剤；ならびにナベルベン、ＣＰＴ−ＩＩ、アナストラゾール、レトラゾール、カペシタビン、レロキサファム（ｒｅｌｏｘａｆｍｅ）、シクロホスファミド、イホスファミド、およびドロロキサフィン；
（ｉｉｉ）抗侵入剤、例えば、ダサチニブおよびボスチニブ（ＳＫＩ−６０６）、およびメタロプロテイナーゼ阻害剤、ウロキナーゼプラスミノゲンアクチベータ受容体機能の阻害剤またはヘパラナーゼに対する抗体；
（ｉｖ）増殖因子機能の阻害剤：例えば、そのような阻害剤としては、増殖因子抗体および増殖因子受容体抗体、例えば、抗ｅｒｂＢ２抗体トラスツズマブ［Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ（商標）］、抗ＥＧＦＲ抗体パニツムマブ、抗ｅｒｂＢ１抗体セツキシマブ、チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、表皮増殖因子ファミリーの阻害剤（例えば、ゲフィチニブ、エルロチニブ、６−アクリルアミド−Ｎ−（３−クロロ−４−フルオロフェニル）−７−（３−モルホリノプロポキシ）−キナゾリン−４−アミン（ＣＩ１０３３）、アファチニブ、バンデタニブ、オシメルチニブおよびロシレチニブなどのＥＧＦＲファミリーチロシンキナーゼ阻害剤、ラパチニブなどのｅｒｂＢ２チロシンキナーゼ阻害剤）ならびにＣＴＬＡ−４、４−ＩＢＢおよびＰＤ−Ｉなどの共刺激分子に対する抗体、またはサイトカイン（ＩＬ−１０、ＴＧＦ−ベータ）に対する抗体；肝細胞増殖因子ファミリーの阻害剤；インスリン増殖因子ファミリーの阻害剤；細胞アポトーシスのタンパク質調節因子のモジュレータ（例えば、Ｂｃｌ−２阻害剤）；イマチニブおよび／またはニロチニブ（ＡＭＮ１０７）などの血小板由来増殖因子ファミリーの阻害剤；セリン／トレオニンキナーゼの阻害剤（例えば、ファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤、ソラフェニブ、チピファルニブおよびロナファルニブなどのＲａｓ／Ｒａｆシグナル伝達阻害剤）、ＭＥＫおよび／またはＡＫＴキナーゼによる細胞シグナル伝達の阻害剤、ｃ−ｋｉｔ阻害剤、ａｂｌキナーゼ阻害剤、ＰＩ３キナーゼ阻害剤、Ｐｌｔ３キナーゼ阻害剤、ＣＳＦ−１Ｒキナーゼ阻害剤、ＩＧＦ受容体キナーゼ阻害剤；オーロラキナーゼ阻害剤およびサイクリン依存性キナーゼ阻害剤、例えば、ＣＤＫ２および／またはＣＤＫ４阻害剤；ＣＣＲ２、ＣＣＲ４またはＣＣＲ６アンタゴニスト；ならびにＷＯ２００６０４３０９０、ＷＯ２００９０７７７６６、ＷＯ２０１１０９２４６９またはＷＯ２０１５０７５４８３に記載のものなどのＲＡＦキナーゼ阻害剤；
（ｖ）血管内皮増殖因子の効果を阻害するものなどの抗血管新生剤［例えば、抗血管内皮細胞増殖因子抗体ベバシズマブ（Ａｖａｓｔｉｎ（商標））］；サリドマイド；レナリドミド；および例えば、ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ阻害剤、例えば、バンデタニブ、バタラニブ、スニチニブ、アキシチニブおよびパゾパニブ；
（ｖｉ）例えば、異常なｐ５３または異常なＢＲＣＡ１またはＢＲＣＡ２などの異常遺伝子を置き換えるための手法を含む、遺伝子療法手法；
（ｖｉｉ）例えば、アレムツズマブ、リツキシマブ、イブリツモマブチウキセタン（Ｚｅｖａｌｉｎ（登録商標））およびオファツムマブなどの抗体療法；インターフェロンαなどのインターフェロン；ＩＬ−２（アルデスロイキン）などのインターロイキン；インターロイキン阻害剤、例えば、ＩＲＡＫ４阻害剤；ＨＰＶワクチン、例えば、Ｇａｒｄａｓｉｌ、Ｃｅｒｖａｒｉｘ、ＯｎｃｏｐｈａｇｅおよびＳｉｐｕｌｅｕｃｅｌ−Ｔ（Ｐｒｏｖｅｎｇｅ）などの予防および処置ワクチンを含むがんワクチン；ｇｐ１００；樹状細胞に基づくワクチン（Ａｄ．ｐ５３  ＤＣなど）；ｔｏｌｌ様受容体モジュレータ、例えば、ＴＬＲ−７またはＴＬＲ−９アゴニスト；ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２およびＣＴＬ４−Ａモジュレータ（例えば、ニボルマブ）、抗体およびワクチン；他のＩＤＯ阻害剤（インドキシモッドなど）；抗ＰＤ−１モノクローナル抗体（ＭＫ−３４７５およびニボルマブなど）；抗ＰＤＬ１モノクローナル抗体（ＭＥＤＩ−４７３６およびＲＧ−７４４６など）；抗ＰＤＬ２モノクローナル抗体；および抗ＣＴＬＡ−４抗体（イピルムマブなど）；ならびに
（ｖｉｉｉ）細胞傷害剤、例えば、フルダリビン（フルダラ）、クラドリビン、ペントスタチン（Ｎｉｐｅｎｔ（商標））；
（ｉｘ）標的療法、例えば、ＰＩ３Ｋ阻害剤、例えば、イデラリシブおよびペリホシン；アポトーシスタンパク質阻害剤（ＩＡＰ）アンタゴニスト（ＩＡＰアンタゴニスト）としても知られる、ＳＭＡＣ（カスパーゼの第２のミトコンドリア由来アクチベータ）模倣体。これらの薬剤は、ＩＡＰ、例えば、ＸＩＡＰ、ｃｌＡＰ１およびｃｌＡＰ２を抑制し、それによって、細胞アポトーシス経路を再確立するように作用する。特定のＳＭＡＣ模倣体としては、ビリナパント（ＴＬ３２７１１、ＴｅｔｒａＬｏｇｉｃ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、ＬＣＬ１６１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＡＥＧ４０７３０（Ａｅｇｅｒａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、ＳＭ−１６４（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）、ＬＢＷ２４２（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、ＭＬ１０１（Ｓａｎｆｏｒｄ−Ｂｕｒｎｈａｍ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＡＴ−４０６（Ａｓｃｅｎｔａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ／Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｈｉｇａｎ）、ＧＤＣ−０９１７（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＡＥＧ３５１５６（Ａｅｇｅｒａ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）、およびＨＧＳ１０２９（Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ならびにユビキチンプロテアソーム系（ＵＰＳ）を標的とする薬剤、例えば、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、マリゾミブ（ＮＰＩ−００５２）、およびＭＬＮ９７０８；ならびに
（ｘｉｉ）キメラ抗原受容体、抗がんワクチンおよびアルギナーゼ阻害剤
のうちの１つまたは複数を含んでもよい。
【００４８】
用語「免疫チェックポイント」とは、抗腫瘍免疫応答を下方モジュレートまたは阻害することによって免疫応答を微調整するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上の分子群を指す。免疫チェックポイントタンパク質は当業界で周知であり、限定されるものではないが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−ＬＩ、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、およびＡ２ａＲ（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照されたい）が挙げられる。この用語はさらに、生物学的に活性なタンパク質断片、ならびに完全長免疫チェックポイントタンパク質をコードする核酸およびその生物学的に活性なタンパク質断片を包含する。一部の実施形態では、この用語は、本明細書に提供される相同性の説明に従う任意の断片をさらに包含する。
【００４９】
「免疫チェックポイント阻害剤」とは、免疫チェックポイント核酸および／またはタンパク質を阻害する薬剤を指す。１つまたは複数の免疫チェックポイントの阻害は、阻害的シグナル伝達を遮断するか、またはそうでなければ中和することによって、免疫応答を上方調節して、がんをより有効に処置することができる。免疫チェックポイントを阻害するのに有用な例示的な薬剤としては、免疫チェックポイントタンパク質、またはその断片に結合する、および／またはそれを不活化もしくは阻害することができる抗体、低分子、ペプチド、ペプチド模倣体、天然リガンド、および天然リガンドの誘導体；ならびに免疫チェックポイント核酸、またはその断片の発現および／または活性を下方調節することができる、ＲＮＡ干渉、アンチセンス、核酸アプタマーなどが挙げられる。免疫応答を上方調節するための例示的な薬剤としては、タンパク質とその天然の受容体との相互作用を遮断する１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体；非活性化形態の１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質（例えば、ドミナントネガティブポリペプチド）；１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質とその天然の受容体との相互作用を遮断する低分子またはペプチド；その天然の受容体に結合する融合タンパク質（例えば、抗体または免疫グロブリンのＦｃ部分に融合された免疫チェックポイント阻害タンパク質の細胞外部分）；免疫チェックポイント核酸の転写または翻訳を遮断する核酸分子などが挙げられる。そのような薬剤は、１つまたは複数の免疫チェックポイントとその天然の受容体（例えば、抗体）との相互作用を直接遮断して、阻害的シグナル伝達を防止し、免疫応答を上方調節することができる。あるいは、薬剤は、１つまたは複数の免疫チェックポイントタンパク質とその天然の受容体との相互作用を間接的に遮断して、阻害的シグナル伝達を防止し、免疫応答を上方調節することができる。例えば、安定化された細胞外ドメインなどの可溶型の免疫チェックポイントタンパク質リガンドは、その受容体に結合して、適切なリガンドに結合する受容体の有効濃度を間接的に低下させることができる。好適には、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−ＬＩ抗体、および抗ＣＴＬＡ−４抗体を、単独で、または組み合わせて使用して、免疫チェックポイントを阻害することができる。
【００５０】
用語「抗転移剤」は、がん細胞の転移を阻害する、低減する、または減少させる物質を意味する。抗転移剤としては、血管新生、組織因子活性、第ＶＩＩａ因子活性、または組織因子／第ＶＩＩａ因子複合体活性を阻害する、または低下させる物質が挙げられる。例としては、ＶＥＧ阻害剤、抗ＶＥＧＦ抗体（すなわち、ベバシズマブ、ＡＶＡＳＴＩＮ）、非抗凝固剤ヘパリン、低分子量ヘパリン（ＬＯＶＥＮＯＸなどのＬＭＷＨ）、抗組織因子抗体、ＣＲＡ−５（抗ｆＶＩＩａ）、ＢＭＳ２６２０８４、ＴＴＰ８８９、プロテインＣ、ＡＰＣ（ドロトレコジン）、ｓＴＭ、イドラパリヌクス、ＤＸ９０６５ａ、ＢＡＹ５９−７９３９、ＬＹ−５１．７７１７、ＢＭＳ−５６２２４７、ＤＵ−１７６ｂ、オタミキサバン、ラザキサバンおよびＮＡＰタンパク質が挙げられる。
【００５１】
好適には、本発明の組成物を、アミノ酸を枯渇させる１つまたは複数の治療的酵素と組み合わせて使用することができる。そのような治療的酵素を、本発明の組成物と相関させることができる。例えば、アルギニンを実質的に含まない組成物については、アルギナーゼなどの治療的酵素を使用することができる。
さらに、またはあるいは、本発明の組成物を、アミノ酸のｄｅ  ｎｏｖｏ合成の阻害に関与する１つまたは複数の化合物と組み合わせて使用することができる。そのような化合物を、本発明の組成物と相関させることができる。例えば、アスパラギンを実質的に含まない栄養製品を、アスパラギン合成酵素阻害剤と組み合わせて使用することができる。
本発明において使用される治療剤は、単一の薬剤または薬剤の組合せであってもよい。好ましい組合せは、異なる作用機構を有する薬剤を含むであろう。
【００５２】
ここで、使用される用語「組合せ」は、同時的な、別々の、または連続的な投与を指すと理解されるべきである。本発明の一態様では、「組合せ」は、同時的投与を指す。本発明の別の態様では、「組合せ」は、別々の投与を指す。本発明のさらなる態様では、「組合せ」は、連続的投与を指す。投与が連続的であるか、または別々である場合、第２の成分の投与の遅延は、組合せの有益な効果を失うなどするべきではない。
一態様では、血液中のアスパラギンレベルを低下させる薬剤、化合物または組成物（すなわち、薬剤）を、アスパラギンの血清レベルの低下またはＥＭＴ表現型の低減に関する所望の治療のエンドポイントを達成するための投薬レジメンで投与し、続いて、がん細胞増殖の阻害剤、抗転移剤、免疫チェックポイント阻害剤、放射線療法剤および化学療法剤から選択される治療剤を、がん細胞の成長または増殖に関する所望の治療のエンドポイントに達するまで、対象に投与する。
例えば、投薬レジメンの治療のエンドポイントは、
・血清中のアスパラギンの少なくとも１０％または少なくとも２０％または少なくとも２５％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも４５％または少なくとも５０％の減少；
・０．４％未満または０．３８％未満または０．３６％未満または０．３２％未満または０．３％未満である無血清アミノ酸プール中のアスパラギン含量（％）；
・少なくとも２０％または少なくとも３０％または少なくとも４０％または少なくとも５０％または少なくとも６０％または少なくとも７０％または少なくとも８０％または少なくとも９０％の腫瘍細胞集団中のｔｗｉｓｔ、ｅ−カドヘリンおよびｓｎａｉｌのうちの少なくとも１つまたは複数（例えば、少なくとも２つまたは３つ全部）の減少
をもたらし得る。
【００５３】
本明細書で使用される場合、用語「と組み合わせて投与される」および文法的等価物などは、単一の患者への選択された治療剤の投与を包含することを意味し、薬剤が同じか、もしくは異なる投与経路によって、または同じか、もしくは異なる時間に投与される処置レジメンを含むことが意図される。一部の実施形態では、本明細書に記載の化合物は、他の薬剤と同時投与される。これらの用語は、両方の薬剤および／またはその代謝物が同時に動物中に存在するような、２つ以上の薬剤の動物への投与を包含する。それらは、別々の組成物中での同時的投与、別々の組成物中での異なる時間での投与、および／または両方の薬剤が存在する組成物中での投与を含む。
【００５４】
本明細書に開示される薬剤を、皮内、皮下、経口、動脈内または静脈内などの任意の経路によって投与することができる。
組合せ処置を使用する一部の実施形態では、本発明の栄養製品または医薬組成物の量および他の薬学的に活性な薬剤の量は、組み合わせた場合、患者における標的障害を処置するのに治療的に有効である。これに関連して、組み合わせた量は、それらが、組み合わせた場合、障害の症状または他の有害な効果を低減する、または完全に軽減する；障害を治癒させる；障害の進行を逆転させる、完全に停止させる、または減速させる；転移を遅延させる、もしくは低減する、または障害悪化のリスクを低減するのに十分なものである場合、「治療有効量」である。典型的には、当業者であれば、そのような量を、例えば、本発明の化合物について本明細書に記載される用量範囲および他の薬学活性化合物の認可された、またはそうでなければ公開された用量範囲から出発することによって決定することができる。
【００５５】
本発明のさらなる態様によれば、がんの共同処置における使用のための、本明細書の以前に定義された本発明の栄養製品または医薬組成物および本明細書の以前に定義されたさらなる抗がん剤が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、がんに罹患しているヒトまたは動物の対象の処置のための方法であって、対象に、本明細書の以前に定義されたさらなる抗がん剤と同時的、連続的または別々に、治療有効量の本発明の栄養製品または医薬組成物を投与することを含む、方法が提供される。
本発明のさらなる態様によれば、がんの処置において、本明細書の以前に定義されたさらなる抗がん剤と同時的、連続的または別々に使用するための本発明の栄養製品または医薬組成物が提供される。
本発明の栄養製品または医薬組成物を、放射線療法と組み合わせて使用することもできる。好適な放射線療法処置としては、例えば、Ｘ線療法、陽子線療法または電子線療法が挙げられる。放射線療法はまた、放射性核種剤、例えば、１３１Ｉ、３２Ｐ、９０Ｙ、８９Ｓｒ、１５３Ｓｍまたは２２３Ｒａの使用を包含してもよい。そのような放射性核種療法は、周知であり、商業的に入手可能である。
本発明のさらなる態様によれば、放射線療法と共同したがんの処置における使用のための、本明細書の以前に定義された、本発明の栄養製品または医薬組成物またはその薬学的に許容される塩が提供される。
【００５６】
本発明のさらなる態様によれば、がんに罹患しているヒトまたは動物の対象の処置のための方法であって、対象に、放射線療法と同時的、連続的または別々に、治療有効量の本発明の栄養製品もしくは医薬組成物、またはその薬学的に許容される塩を投与することを含む、方法が提供される。
一態様では、それぞれの化学療法剤の用量（または化学療法剤の合わせた総量）は、少なくとも０．１ｇ／Ｋｇ患者体重／日、好ましくは少なくとも０．２ｇ／Ｋｇ／日または０．３ｇ／Ｋｇ／日または０．４ｇ／Ｋｇ／日または０．５ｇ／Ｋｇ／日と等価であってよい。好適には、化学療法剤の用量（または合わせた化学療法剤の組合せ）は、少なくとも１ｇ／Ｋｇ／日、好ましくは２ｇ／Ｋｇ／日と等価であってもよい。
さらに、別の態様では、本発明は、対象におけるがんを処置する方法であって、ａ）本発明の栄養製品およびｂ）化学療法剤の相乗的に有効な組合せを投与することを含む方法を提供する。
ある特定の実施形態では、アスパラギンを実質的に含まない食事は、栄養製品を含むか、またはそれからなる。
【００５７】
本発明に従って投与される治療剤の濃度は、投与される化合物の用量、用いられる化合物の薬物動態特性、および投与経路を含むいくつかの因子に応じて変化するであろう。薬剤を、単回用量で、または反復用量で投与することができる。処置を、患者の全体的な健康、ならびに選択された化合物の製剤および投与経路を含む、いくつかの因子に応じて、毎日またはより頻繁に投与してもよい。
好ましくは、前記がん処置は、治療有効量の前記治療剤の投与をさらに含む。本明細書で使用される用語「治療有効量」とは、特定の疾患または状態を処置または防止するのに十分である、投与される少なくとも１つの薬剤または化合物の量を指す。その結果は、疾患の兆候、症状、もしくは原因の低減および／もしくは軽減、または生物系の任意の他の所望の変化であってもよい。例えば、治療的使用のための「有効量」は、疾患における臨床的に有意な減少を提供するのに必要とされる、本明細書に開示される化合物を含む組成物の量である。任意の個々の事例における適切な「有効」量は、用量漸増試験などの技術を使用して決定することができる。
ある特定の実施形態では、食事は、少なくとも１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、少なくとも２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、９週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、１５週間、１６週間、１７週間、１８週間、１９週間、２０週間、２１週間、２２週間、２３週間、２４週間、２５週間、２６週間の期間にわたって、または治療のエンドポイントが観察されるまで投与される。
アスパラギンを実質的に含まない食事が栄養製品を含むか、またはそれからなる場合、栄養製品は、１日１〜１０回投与される。
【００５８】
階層化
本発明は、驚くべきことに、対象の原発腫瘍における上昇したレベルのアスパラギン合成酵素が、後の転移性再発と強く相関すること、およびがんを有する対象の血液中の上昇したアスパラギンレベルが、転移に寄与することを示した。
したがって、血清アスパラギンレベルまたはアスパラギン合成酵素発現（例えば、原発腫瘍中の）を、バイオマーカーとして使用して、転移のリスクが高い腫瘍を有する患者または患者集団を同定することができる。
【００５９】
したがって、本発明は、転移の可能性が高いがんを有する対象を同定する方法であって、
ａ）対象から単離された生体試料中のアスパラギンのレベルを決定すること；
ｂ）生体試料中のアスパラギンのレベルと、対照試料またはアスパラギンの所定の参照レベルとを比較すること
を含み、
対照試料と比較した、または所定の参照レベルと比較した生体試料中のアスパラギンレベルの増加が、転移の可能性が高いことを示す、方法を提供する。方法は、治療有効量の薬剤を前記対象に投与することをさらに含んでもよく、前記薬剤は、がんを有する対象の血液中の細胞外アスパラギンレベルを低下させる。
【００６０】
本発明はまた、アスパラギンを実質的に含まない食事を供給した場合、またはＬ−アスパラギナーゼと共に投与した場合、がん処置に対する応答性または感受性の可能性が高い対象を同定する方法であって、
ａ）対象から単離された生体試料中のアスパラギンのレベルを決定すること；
ｂ）生体試料中のアスパラギンのレベルと、対照試料またはアスパラギンの所定の参照レベルとを比較すること
を含み、
対照試料と比較した、または所定の参照レベルと比較した生体試料中のアスパラギンのレベルの増加が、アスパラギンを実質的に含まない食事と組み合わせた場合、またはＬ−アスパラギナーゼと共に投与した場合、前記がん処置に対する応答性または感受性を示す、方法も提供する。
【００６１】
本発明はまた、がんを有する対象における転移の再発の可能性を決定する方法であって、
ａ）対象から単離された生体試料中のアスパラギン合成酵素のレベルを決定すること；
ｂ）生体試料中のアスパラギン合成酵素のレベルと、対照試料またはアスパラギン合成酵素の所定の参照レベルとを比較すること
を含み、
対照試料と比較した、または所定の参照レベルと比較した生体試料中のアスパラギン合成酵素のレベルの増加が、転移の再発の可能性が高いことを示す、方法も提供する。
【００６２】
そのような方法は、治療有効量の薬剤を前記対象に投与することをさらに含んでもよく、前記薬剤は、がんを有する対象の血液中の細胞外アスパラギンレベルを低下させる。
本明細書で使用される用語「生体試料」および「対象から単離された試料」は、互換的に使用され、患者から単離された組織、細胞および生体液、ならびに患者内に存在する組織、細胞および液体を指す。試料は、尿試料、血液試料、血清試料、喀痰試料、糞便試料、体組織の生検、例えば、移植された腎臓組織の生検、脳脊髄液試料、精液試料または塗抹試料であってもよい。好ましい試料は、血清または血漿である。
本明細書で使用される場合、「参照レベル」または「対照」とは、正常レベルのアスパラギン／アスパラギン合成酵素発現を有する試料、例えば、がんを有しない、もしくはがんを有すると疑われない健康な対象に由来する試料またはアスパラギン合成酵素発現に関して、がんに罹患していない同じ対象の組織に由来する試料を指す。あるいは、参照レベル／所定のレベルは、所定のカットオフ値、すなわち、症状もしくは疾患またはその欠如を統計的に予測する診断スコアを生成するために使用することができる、参照データベースに由来するレベルであってよいか、または標準的な集団試料に基づく所定の参照レベルであってもよい。
【００６３】
本明細書で別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。例えば、Singleton and Sainsbury, Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2d Ed., John Wiley and Sons, NY (1 94)；およびHale and Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)は、本発明において使用される多くの用語の一般的な辞書を当業者に提供する。本明細書に記載のものと類似するか、または等価である任意の方法および材料は、本発明の実施において有用であるが、好ましい方法および材料を本明細書で説明する。したがって、直下で定義される用語は、全体として明細書を参照することによってより完全に説明される。また、本明細書で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、本文が別途明確に指摘しない限り、複数の指示対象を含む。別途指摘しない限り、それぞれ、核酸は、左から右に、５’から３’に向かって書かれる；アミノ酸配列は、左から右に、アミノからカルボキシの向きに書かれる。本発明は、記載された特定の方法、プロトコール、および試薬が、当業者によって使用される文脈に応じて変化してもよいため、これらに限定されないことが理解されるべきである。
【００６４】
本発明の態様は、以下の非限定例によって示される。
【実施例】
【００６５】
調査は、腫瘍細胞が血流に進入した後にその効果を発揮する、転移のドライバーを同定するために、４Ｔ１−Ｔを、他の４１Ｔクローンと比較して使用した。示差的発現と、焦点を当てたｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＲＮＡｉスクリーニングとの組合せにより、これらのクローンを識別する転移の候補となるドライバーが示され、次いで、これを、乳がん患者に由来する遺伝子発現データセットにおいて評価した。これらのうち、患者の原発腫瘍中でのアスパラギン合成酵素（Ａｓｎｓ）発現は、後の転移性再発と最も強く相関していた。Ａｓｎｓのサイレンシングは、ｉｎ  ｖｉｖｏでの転移能力と、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの侵入能力との両方を低下させた。逆に、細胞外アスパラギンの利用可能性の増大は、マウスおよびヒト乳がん細胞の侵入能力を増大させ、Ａｓｎｓ発現により促進される転移を強化した。Ｌ−アスパラギナーゼを用いる処置によって、またはさらには、食事制限によるマウスにおけるアスパラギン利用可能性の低下は、同所腫瘍からの転移を強く減少させた。アスパラギン利用可能性は、組織間で変化し、腫瘍進行の特定の段階に対する選択的効果を潜在的に説明する。アスパラギン制限は上皮間葉移行を促進するタンパク質の産生を減少させたが、単一のアミノ酸の利用可能性がどのように転移進行を調節することができるのかに関する１つの潜在的な機構を提供する。
【００６６】
４Ｔ１−ＴがＣＴＣ熟練クローン間でより高い転移能力を有するとの観察を検証するために、本発明者らは、同数の４Ｔ１−Ｅおよび−Ｔ細胞を混合し、これらの細胞を、尾静脈注射によって免疫不全レシピエント（ＮＯＤ−ＳＣＩＤ−ＩＩ２ｒｇ-/-（ＮＳＧ）マウス）の血流中に直接導入した。初期プールの配列決定により、２種のクローンが等しい存在量で存在することが示された（図１ａ）。しかしながら、細胞を肺から収獲した場合、クローンＴが優勢であり、その相対的表示は、注射された総細胞数と逆相関していた。
示差遺伝子発現分析により、４Ｔ１−Ｅと比較して４Ｔ１−Ｔ中でより高い発現を示す１９２個の遺伝子が同定された（データは提示しないが、２を超える倍数変化、ＦＤＲ＜０．０５であった）。その対応する遺伝子オントロジータームを、転移の拡散にとって重要なプロセスについて富化した（データは提示しないが、例えば、上皮細胞遊走の正の調節および運動の調節）（Ashburner et al 2000）。乳がん患者データのレトロスペクティブ分析により、セット内の遺伝子が、侵攻性の腫瘍サブタイプにおいてより高度に発現されることが示された（図１ｂ、ＢａｓａｌおよびＣｌａｕｄｉｎ−ｌｏｗ、ＡＮＯＶＡ  ｐ値＜０．０００１、Harrell et al 2012）。さらに、それらは無再発生存者と比較して、骨、脳および肺に後に再発した患者の原発腫瘍においてより高度に発現される（肺についての図１ｃ、順位和ｐ値＜０．０１）。
【００６７】
示差的に発現される遺伝子のこのセットが転移のドライバーを含有していたかどうかを決定するために、本発明者らは、２つのパラレルアームを用いてＲＮＡｉスクリーニングを実行した（図１ｄ）。合計で、１９２個の遺伝子を標的とする約５０個のｓｈＲＮＡの２６のプール（遺伝子１個あたり約６個のｓｈＲＮＡを累積的に構成する）を、４Ｔ１−Ｔ細胞に導入した（Knott et al. 2014）。それぞれのプールを、２つの別々の６ウェルマトリゲル侵入チャンバー上に播種したか、または尾静脈注射によって５回反復でＮＳＧマウスに導入した。２４時間後、マトリゲルを通って侵入した細胞を収集し、７日後、肺をマウスから収獲し、かん流して、血管系から残留ＣＴＣを排除した。高効率スクリーニングを使用して、本発明者らは、おそらく、ｓｈＲＮＡがこれらのプロセスにとって重要な遺伝子を標的としたため、侵入した細胞集団または肺転移中で枯渇したｓｈＲＮＡを同定した（経験的ベイズモデレイテッドｔ検定ＦＤＲ＜０．０５）。ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの候補を比較した場合、強い重複が観察された（図１ｅ、超幾何学検定のｐ値＜０．０００１）。少なくとも２つの対応するｓｈＲＮＡがスクリーニングの各アーム中で枯渇した場合、遺伝子を候補として分類した（データは提示しない）。
【００６８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏアッセイの両方においてスコア化された候補遺伝子のうち、アスパラギン合成酵素（Ａｓｎｓ）が、疾患進行とのその関連性を支持する最もロバストな臨床的証拠を有していた（図５）。ヒトオルソログＡＳＮＳの発現レベルは、２つの乳がん患者データセットにおける全身的および肺特異的再発を予測していた（ｃｏｘのｐ値＜０．００１）。また、一致した腫瘍および肺転移の小さい収集物を転写的にプロファイルした場合、ＡＳＮＳは二次病変においてより高度に発現されることが見出された。ＡＳＮＳは、侵攻性の腫瘍サブタイプにおいてより高度に発現され（Ｂａｓａｌ、Ｃｌａｕｄｉｎ−ｌｏｗおよびＨｅｒ２＋、図６ａ、ＡＮＯＶＡ  ｐ値＜０．０００１）、無再発生存者と比較して、リンパ節、脳、肝臓および肺に再発を有する患者においてより高度に発現される（図６ｂ、順位和ｐ値＜０．００５）。その後の分析により、ＡＳＮＳは、３つのさらなる乳がん患者データセットにおいて生存を予測するものとして同定された（拡張データ、図２ｃ、ｃｏｘ  ｐ値＜０．００１）。乳がんに加えて、ＡＳＮＳは、ＴＣＧＡ  Ｐａｎ−Ｃａｎｃｅｒデータセットに表される１０種の他の固形腫瘍のうちの４種において生存と負に相関する（図６ｄ、ｃｏｘ  ｐ値＜０．０５）。最後に、ＡＳＮＳはまた、固形腫瘍の全体的に予測的なバイオマーカーである（図６ｅ、ｃｏｘ  ｐ値＜０．００１）。
【００６９】
転移のドライバーとしてのＡｓｎｓを検証するために、本発明者らは、４Ｔ１−Ｔ細胞に、Ａｓｎｓを標的とする２つのｓｈＲＮＡ、またはウミシイタケルシフェラーゼを標的とする対照ｓｈＲＮＡを感染させ、これらの細胞をＮＳＧマウスに静脈内的に導入した（データは提示しない）。注射の９日後に肺を評価した場合、Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞を受けるこれらの動物は、転移負荷の有意な減少を示した（図２ａおよび図ｂ、順位和検定ｐ値＜０．００１）。Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞はまた、マトリゲルへの弱い侵入を示した（図２ｃおよび図７ａ）。Ａｓｎｓのサイレンシングは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖に影響した；しかしながら、この欠陥は、侵入アッセイにおいて観察されたものと比較して小さかった（拡張データ、図７ｂおよび図７ｃ）。
【００７０】
Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞を乳腺脂肪体に同所的に注射した場合、原発腫瘍形成の有意な変化は観察されなかった（図２ｄおよび図７ｄ）。しかしながら、対応するＣＴＣおよび肺転移は、Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞に由来する腫瘍については低減された（図２ｅ、図２ｆおよび図７ｅ、それぞれ、順位和ｐ値＜０．０５および＜０．０００２）。サイレンシングされた細胞によって開始される転移は、顕著により小さかった（図２ｇ）。この差異は統計的に有意でないと見なされたが、それは増殖が転移部位で影響されることを示唆する。同様の結果が、Ａｓｎｓをサイレンシングされた親４Ｔ１細胞について観察されたが、これは、Ａｓｎｓ依存性がこの単一のクローン株の特性ではないことを示している（図８ａおよび図８ｂ、順位和ｐ値＜０．００２）。親４Ｔ１集団中でのＡｓｎｓ発現の強化は、原発腫瘍増殖に影響しなかったが、対応する転移の数は有意に増加した（図８ｃ〜８ｅ、順位和ｐ値０．０２）。同様の転帰が、ヒト乳がん細胞株、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１におけるＡＳＮＳ発現の強化の際に観察された（図８ｆ〜８ｉ、ＡＳＮＳ発現強化対通常転移に関する順位和ｐ値＜０．０２）。
【００７１】
細胞内遊離アスパラギンの有意な減少が、４Ｔ１−Ｔ細胞中でのＡｓｎｓのサイレンシングの際に検出された（図３ａおよび図９ａ、経験的ベイズモデレイテッドｔ検定ＦＤＲ＜０．０５）。さらに、侵入し、増殖する能力は、培地にアスパラギンを添加した場合、Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞において増大した（図９ｂおよび図９ｃ）。したがって、本発明者らは、侵入を促進する能力が、ＤＭＥＭ培養培地中で欠いている非必須アミノ酸（アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸およびプロリン）のうちでユニークであるかどうかを問うた。本発明者らは、これらのアミノ酸のそれぞれ、ならびに陰性対照としてのグリシンを培地に別々に添加し、それぞれの条件で増殖した細胞の侵襲性をアッセイした。ＨＰＬＣにより、取込みのレベルが、アスパラギン酸とグルタミン酸を除いて、それぞれのアミノ酸について類似することが確認された（図９ｄ）。４Ｔ１細胞は、アスパラギン添加に対してユニークに応答し、侵襲性が約２倍増加した（図３ｂ、順位和ｐ値＜０．０１）。同様の転帰が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞について観察された（図９ｅおよび図９ｆ）。増殖は、いずれかの細胞株についてアスパラギン添加によって影響されなかった（図９ｇおよび図９ｈ、順位和ｐ値＜０．０１）。
【００７２】
これらのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイは、侵入が、生合成能力と局部環境との両方によって決定されるアスパラギン利用可能性によって影響されることを示した。したがって、本発明者らは、転移が細胞外アスパラギン利用可能性の低下によって影響され得るかどうかを問うた。アスパラギンの利用可能性のがん細胞への制限は、細胞外アスパラギンを減少させるために、細菌アスパラギン加水分解酵素であるＬ−アスパラギナーゼを使用して、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）（Richards et al. 1998、Richards et al. 2006）を有する患者を処置するために上手く使用される戦略である。Ｌ−アスパラギナーゼは、Ａｓｎｓ発現が原発部位での増殖のための要件ではないことを示す結果と一致して、固形腫瘍の処置にとって無効であることが証明された（Tallal et al. 1970）。疾患進行が全身アスパラギンレベルによって影響されるかどうかを決定するために、本発明者らは、親４Ｔ１細胞をＮＳＧマウスに同所的に注射し、半分の動物を６０ＵのＬ−アスパラギナーゼで週５回、１９日間にわたって処置し、血清アスパラギンを、ＨＰＬＣによって検出不可能なレベルまで低下させた（データは示さない）。原発腫瘍体積の有意差は検出されなかったが、転移負荷の有意な減少が、Ｌ−アスパラギン処置マウスにおいて観察された（図１０ａ〜ｃ、順位和ｐ値＜０．０００２）。
【００７３】
ＡＬＬ患者は、典型的には、ＴＥＬＡＭＬ１融合遺伝子について陽性または陰性であると分類される。陽性である患者は、Ｌ−アスパラギナーゼを含有する化学療法剤カクテルで処置した場合、高い応答率を示す（Ramakers-van Woerden et al. 2000、 Stams et al. 2005）。しかしながら、ＴＥＬＡＭＬ１陰性患者は、より耐性を得やすく、それは、高いＡＳＮＳレベルが療法後に観察されるこれらの患者におけるものであり、耐性を生合成産生によって達成することができることを示している。本発明のモデルでは、ＡＳＮＳをサイレンシングされた４Ｔ１細胞を、Ｌ−アスパラギン処置マウスに同所的に注射した場合、得られる転移はほぼ検出不可能であった（図３ｃおよび図ｄ、順位和Ｐ値＜０．０００５）。この場合、原発腫瘍体積の減少も観察された（拡張データ、図６ｄ、順位和ｐ値＜０．０５）。同様の結果が、ＡＳＮＳをサイレンシングされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞に関して観察された（図１０ｅおよび図１０ｆ、順位和ｐ値＜０．０５）。
【００７４】
細胞外アスパラギンの利用可能性を、Ｌ−アスパラギナーゼを用いた処置だけでなく、食事からアスパラギンを枯渇させることによっても操作することができる。ｓｈＲＮＡに感染した４Ｔ１−Ｔ細胞を、対照、低アスパラギン食または高アスパラギン食（それぞれ、０．６％、０％および４％）のいずれかを受けたマウスに同所的に注射した。ＨＰＬＣにより、血清アスパラギンレベルが、食事摂取と一致して有意に変化することが確認された（図１１ａ）。アスパラギン制限は、Ａｓｎｓ発現状態に関係なく、原発腫瘍増殖に影響しなかった（図１１ｂ）。対照的に、転移負荷は、Ａｓｎｓ発現状態に関係なく、低アスパラギン食を供給した動物において減少し、高アスパラギン食を与えた動物において増加した（図３ｅおよび図１１ｃ、順位和ｐ値＜０．０００５）。転移は、Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞を注射し、低アスパラギン食を供給したマウスにおいてほぼ検出不可能であった。同様の結果が、親４Ｔ１細胞を、これらの同じアスパラギン制御食を供給した動物に同所的に注射した場合に観察された（図１１ｄ〜ｆ、順位和ｐ値＜０．０５）。
【００７５】
質量分析による乳腺、血清および肺のメタボロミクス分析により、正常な生理的条件下で、アスパラギンレベルは乳腺において最も高く、血清において最も低いことが示された（図３ｆ、順位和ｐ値＜０．０００５）。アスパラギンは、Ｌ−アスパラギナーゼ処置動物の血清においてほぼ検出不可能であった。ｑＰＣＲ分析により、アスパラギン存在量はこれらの組織においてＡｓｎｓ発現レベルと相関することが決定された（図１１ｇ、順位和ｐ値＜０．０５）。乳腺における高いアスパラギン利用可能性は、Ａｓｎｓサイレンシングの影響または全体的なアスパラギンレベルの変化を緩衝化し、腫瘍増殖速度が維持される。しかしながら、血清中の低レベルにより、細胞はこれらの変化の影響を受けやすくなる。最後に、肺における中間レベルは、Ａｓｎｓサイレンシングの結果生じる、より小さい転移を説明することができる。ＡＳＮＳ発現レベルは、ヒト組織間で類似するパターンに従うが、ここで、肺における発現は、乳腺におけるものよりもわずかに高い（図１１ｈ）。
【００７６】
アスパラギン利用可能性が侵入および転移に影響し得る基礎となる機構を理解するために、本発明者らは、ＲＮＡレベルとタンパク質レベルの両方において、Ａｓｎｓサイレンシングによって誘導される発現変化を検査した。ＲＮＡ測定値は、タンパク質レベルの変化の最も強力な予測因子であった（図１２ａ、順位和ｐ値＜０．００１）。Ｌ−アスパラギナーゼ処置細胞中のアスパラギン残基での翻訳停止の以前の報告と一致して、本発明者らは、アスパラギン含量が対応するタンパク質レベルの変化を予測することも見出した（図１２ａ、順位和ｐ値＜０．００１、Loayza-Puch et al. 2016）。これは、対応するＲＮＡ測定値によって予測されたものから変化した、正規化されていない差異と変化との両方について当てはまった（図１２ｂおよび図４ａ、順位和ｐ値＜０．００１）。
【００７７】
Ａｓｎｓサイレンシング時に発現が減少したアスパラギン富化タンパク質のうち、本発明者らは、ヒトオルソログが、上皮間葉移行（ＥＭＴ）が誘導された場合に上方調節されると以前に同定された遺伝子の過剰表示を見出した（Taube et al. 2010）（図４ａ、図４ｂおよび図１２ｃ、ＥＭＴ−ｕｐタンパク質、超幾何学的ｐ値＜０．００５）。枯渇したタンパク質は、分析されたタンパク質プールよりも１８％高いアスパラギン含量を有するが、ＥＭＴ−ｕｐタンパク質の含量は２０％高い。これらの同じタンパク質の発現は、親４Ｔ１細胞の培地にアスパラギンを添加した場合に増加した（図４ｃ、符号順位ｐ値＜０．０５）。ヒトオルソログはまた、アスパラギンに富み（図１２ｄ、順位和ｐ値＜０．００１）、２番目に最も富化されたアミノ酸は、細胞内アスパラギン生合成のための基質であるアスパラギン酸である。さらに、アスパラギン富化は、ＥＭＴ−ｕｐタンパク質の全体的に保存された特性であり（図１２ｅ、符号順位ｐ値＜１．０ｘ１０-13）、そのレベルは哺乳動物において最も高い（順位和ｐ値＜９．０ｘ１０-9）。
【００７８】
ＥＭＴ−ｕｐ遺伝子はまた、Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞において転写レベルで下方調節された（図１３ａ、符号順位ｐ値＜０．００１）。さらに、２つのプロトタイプＥＭＴマーカー（Ｔｗｉｓｔ１およびＥ−カドヘリン）のｍＲＮＡレベルを変化させて、摂動ＥＭＴプログラム（ＤＥＳｅｑ、ＦＤＲ＜０．０５）を示した。ＥＭＴ−ｕｐ遺伝子はまた、親４Ｔ１細胞をアスパラギン添加培地中で増殖させた場合、そのｍＲＮＡレベルが増加した（図１３ｂ、符号順位ｐ値＜０．００５）。また、存在するデータの再分析により、ＡＳＮＳ転写を調節するＡＴＦ４を１倍体細胞中で欠失させた場合、ＥＭＴ−ｕｐ遺伝子の発現減少が示され、Ｌ−アスパラギナーゼ処置されたＡＴＦ４ノックアウトマウスに由来する肝臓細胞は、同様に処置されたＷＴマウスよりもそのＥＭＴプログラムにおいてより摂動した。総合して考えると、これらのデータは、アスパラギンのバイオアベイラビリティが、少なくとも部分的には、ＥＭＴの調節によって転移に影響し得ることを示唆していた。
【００７９】
ＥＭＴは、転移に強く関与していたが、その重要度は不明である。一致した親４Ｔ１腫瘍および肺転移の遺伝子発現プロファイルを比較した場合、ＥＭＴ−ｕｐ遺伝子は、二次病変において有意に増加することが見出された（図４ｄ、符号順位ｐ値＜０．００１）。対照的に、ＥＭＴが誘導された場合に下方調節される遺伝子（ＥＭＴ−ｄｏｗｎ遺伝子）は変化しなかった。このモデルにおけるＥＭＴの役割を機能的に検証するために、本発明者らは、本発明者らがＥＭＴの重要なドライバーであるＴｇｆ−βの発現をサイレンシングさせた４Ｔ１−Ｔ細胞を同所的に注射した。同所部位での増殖は、Ｔｇｆ−βのサイレンシングによって影響されなかった（図１３ｃ）。しかしながら、腫瘍切片のＩＨＣにより、Ｔｗｉｓｔ１およびＥ−カドヘリン（２つのプロトタイプＥＭＴマーカー）が、Ｔｇｆ−βをサイレンシングされた腫瘍において変化することが示された（図１３ｄおよび図１３ｅ、順位和ｐ値＜０．０１）。ＥＭＴの重要な役割と一致して、ＥＭＴが損傷した腫瘍を担持するマウスにおいては、より少ない転移が観察された（拡張データ９ｆ、順位和ｐ値＜０．０５）。Ｔｇｆ−βをサイレンシングされた細胞も、それらを静脈内注射した場合により少ない転移をもたらしたが、これは、ＥＭＴが、腫瘍細胞が血流に進入した後に転移において役割を果たすことを示している（図１３ｃ、順位和ｐ値＜０．０５）。
【００８０】
Ａｓｎｓをサイレンシングされた細胞に由来する腫瘍においては形態学的な差異は検出されなかったが、ＴｗｉｓｔおよびＥ−カドヘリンに関するＩＨＣ染色は、ＥＭＴがこれらの病変において摂動し、この同じパターンが対応する転移において観察されることを示唆する（図４ｅ〜ｇおよび図１４ａ）。これらの病変に由来する悪性細胞をＦＡＣＳにより単離し、ｑＰＣＲによって分析した場合、Ｔｗｉｓｔ１およびＥ−カドヘリンの発現レベルは、染色と一致する様式で変化することが見出された（図１４ｂおよび図１４ｃ、順位和ｐ値＜０．０５）。同様のパターンが、Ｌ−アスパラギナーゼで処置されたマウスの原発腫瘍においても観察された（図１４ｄおよび図１４ｅ）。そこで、サイレンシングは最も大きい影響を有していたが、Ｌ−アスパラギナーゼを使用する細胞外アスパラギンの枯渇は有意な発現変化を惹起した（順位和ｐ値＜０．０１）。食事アスパラギンも発現に影響し、アスパラギン含量は原発腫瘍中のＥＭＴ特徴と正に相関していた（図１４ｆおよび図１４ｇ、順位和ｐ値＜０．０１）。
【００８１】
これらの病変内の悪性細胞をより密接に検査するために、本発明者らは、腫瘍および肺転移から、６−ＴＧ選択によってｓｈＲＮＡに感染した４Ｔ１−Ｔ細胞を単離した。転移細胞は、Ａｓｎｓ発現状態に関係なく、間葉形態（伸長した形状および紡錘の形状）を示した（図１４ｈ）。しかしながら、原発腫瘍から単離されたＡｓｎｓをサイレンシングされた細胞は、より上皮に近い形態を示した。これらの細胞中で、ＥＭＴ−ｄｏｗｎ遺伝子は上方調節され、ＴｗｉｓｔおよびＥ−カドヘリン発現レベルも、摂動するＥＭＴプログラムと一致する様式で変化する（図４ｈ、符号順位ｐ値＜０．０５およびＤＥＳｅｑ  ＦＤＲ＜０．０５）。ＥＭＴ−ｕｐ遺伝子は、Ａｓｎｓをサイレンシングされた転移細胞において下方調節され、ＴｗｉｓｔおよびＥ−カドヘリンは、ここで同様に発現が変化する（順位和ｐ値＜０．００１およびＤＥＳｅｑ  ＦＤＲ＜０．０５）。
【００８２】
乳房腫瘍不均一性の我々のモデルは、転移進行の調節因子としてのアスパラギンバイオアベイラビリティを強く暗示した。高いＡＳＮＳ発現は多くの腫瘍型の予後不良のマーカーであるため、これもまたヒトがんにおいて関連する可能性が高い。本発明者らの知見の基礎となる１つの機構は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで観察することができる、アスパラギンバイオアベイラビリティとＥＭＴとの関連である可能性が高い。本発明者らの乳がんモデルでは、ゲート化ステップはおそらく、アスパラギンレベルが低く、Ｌ−アスパラギナーゼ処置または食事制限のいずれかによって強く影響される循環中で起こる。それにも拘わらず、本発明者らは、腫瘍進行と療法に対する応答の両方に影響し得る、原発部位および二次部位での上皮間葉様腫瘍細胞の比率に対する効果を見る。
【００８３】
実験方法
細胞培養物
マウス乳腺腫瘍細胞株４Ｔ１（ＡＴＣＣ）および任意の誘導クローン細胞株を、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）、ＭＥＭ非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）およびペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤＭＥＭ高グルコース中で培養した。ヒト乳腺腫瘍細胞株ＭＤＡＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ）を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、ＮＥＡＡおよびペニシリンストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加したＤＭＥＭ高グルコース中で培養した。４Ｔ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞株は、ＡＴＣＣによって試験および認証されたものであった。ウイルス産生のためのＰｌａｔｉｎｕｍ−Ａ（Ｃｅｌｌ  ＢｉｏＬａｂｓ）および２９３ＦＴ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）パッケージング細胞株を、１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）およびペニシリンストレプトマイシンを添加したＤＭＥＭ高グルコース中で培養した。全ての細胞株を、マイコプラズマ汚染について日常的に試験した。
【００８４】
ウイルス産生
レトロウイルスベクターを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ａ（Ｃｅｌｌ  ＢｉｏＬａｂｓ）細胞株を使用してパッケージングし、レンチウイルスベクターを、Wagenblast et al. 2015に以前に記載されたように２９３ＦＴ細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してパッケージングした。
【００８５】
動物試験
全てのマウス実験は、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって認可されたものであった。任意の方向で２０ｍｍの最大許容腫瘍サイズは決して超えなかった。全てのマウスの注射を、６〜８週齢のメスのＮＯＤ−ＳＣＩＤ−Ｉｌ２ｒｇ-/-（ＮＳＧ）マウス（ＪＡＸ）を用いて実行した。異なるクローン細胞株はレンチウイルスバーコードベクターに起因して可変的なＧＦＰレベルを有するため、Ｂａｌｂ／ｃマウスはこの試験では使用しなかった。尾静脈注射を、１００μｌのＰＢＳ中に再懸濁し、尾静脈を介して注射した、５ｘ１０5個のマウス乳腺腫瘍細胞を使用して実行した。同所注射を、１ｘ１０5個のマウス乳腺腫瘍細胞または５ｘ１０5個のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を使用して実施した。このために、細胞を、ＰＢＳと増殖因子を低減させたＭａｔｒｉｇｅｌ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）との１：１混合物中に再懸濁した。２０μｌの容量を、マウス乳腺腫瘍細胞については乳腺に４回注射し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞については４０μｌの容量を注射した。原発腫瘍体積を、式Ｖ＝１／２（ＬｘＷ2）（式中、Ｌは、原発腫瘍の長さであり、Ｗは幅である）を使用して測定した。Ｌ−アスパラギナーゼ試験のために、マウスに、腹腔内注射により、週あたり５回、６０ＵのＬ−アスパラギナーゼ２００μｌを投与した。Ｌ−アスパラギナーゼ調整食のために、マウスに、対照アミノ酸食（０．６％アスパラギン）、アスパラギン欠損食（０％アスパラギン）またはアスパラギンリッチ食（４％アスパラギン）を与えた。全ての食事は、等窒素であり、同様のカロリー密度を含有していた。標準的な統計検定を用いて有意性を呼び出すための十分な力を得るように試料サイズを選択した。そのようなｉｎ  ｖｉｖｏ実験において観察される変動を説明するために、マウス実験を、条件あたり１０匹の動物を用いて実施した。動物を、ランダムケージ選択によって処置群に割り当てた。
【００８６】
バーコード分析
４Ｔ１−Ｅおよび４Ｔ１−Ｔ細胞のバーコードを、Wagenblast et al. 2015に以前に記載されたように、増幅および配列決定した。
ｉｎ  ｖｉｖｏでのｓｈＲＮＡの肺スクリーニングおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏでの侵入スクリーニング
ｓｈＲＮＡを、Knott et al. 2014に記載されたＳｈｅｒｗｏｏｄアルゴリズムに基づいて予測した。約５０のｓｈＲＮＡのプールを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ−Ａ細胞中でパッケージングした。それぞれのプールについて、１０００万個の４Ｔ１−Ｔ細胞を、０．３の感染多重度（ＭＯＩ）で感染させた。感染した細胞を、５日間にわたって５００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンを用いて選択し、それぞれのプールを、尾静脈を介してそれぞれ５匹のマウスに注射した。注射前のプールを、注射の時点で収集して、それぞれのｓｈＲＮＡの等しい表示を検証した。７日後、マウスを犠牲にし、ＰＢＳでかん流して、肺から血液および非浸出細胞を除去した。肺を収獲し、フェノールクロロホルム抽出を使用してゲノムＤＮＡを単離した。注射前のプールのゲノムＤＮＡを、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して単離した。
【００８７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ侵入アッセイを、同時に実行した。それぞれのプールを、２個の６ウェルＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ侵入プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）上に播種した。６ｘ１０5個の細胞を、血清を含まない細胞培養培地中、各ウェルの頂部に播種した。細胞を、マトリゲルを介して、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含有する培地中に２４時間侵入させた。侵入した細胞を擦り取り、ＰＢＳで洗浄し、ＱＩＡａｍｐ  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用してゲノムＤＮＡを単離した。
ｓｈＲＮＡを、次世代シーケンシングのためにKnott et al. 2014に以前に記載された２段階ＰＣＲプロトコールを使用して増幅した。
【００８８】
第１のＰＣＲフォワードプライマー１：５−ＣＡＧ  ＡＡＴ  ＣＧＴ  ＴＧＣ  ＣＴＧ  ＣＡＣ  ＡＴＣ  ＴＴＧ  ＧＡＡ  ＡＣ−３（配列番号１）およびリバースプライマー１：５−ＣＴＧ  ＣＴＡ  ＡＡＧ  ＣＧＣ  ＡＴＧ  ＣＴＣ  ＣＡＧ  ＡＣＴ  ＧＣ−３（配列番号２）。
第２のＰＣＲフォワードプライマー２：５−ＡＡＴ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＧＣＧ  ＡＣＣ  ＡＣＣ  ＧＡＧ  ＡＴＣ  ＴＡＣ  ＡＣＴ  ＡＧＣ  ＣＴＧ  ＣＧＣ  ＡＣＧ  ＴＡＧ  ＴＧＡ  ＡＧＣ  ＣＡＣ  ＡＧＡ  ＴＧＴ  Ａ−３（配列番号３）およびリバースプライマー２：５−ＣＡＡ  ＧＣＡ  ＧＡＡ  ＧＡＣ  ＧＧＣ  ＡＴＡ  ＣＧＡ  ＧＡＴ  ＮＮＮ  ＮＮＮ  ＧＴＧ  ＡＣＴ  ＧＧＡ  ＧＴＴ  ＣＡＧ  ＡＣＧ  ＴＧＴ  ＧＣＴ  ＣＴＴ  ＣＣＧ  ＡＴＣ  ＴＣＴ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＧＣＧ  ＣＡＴ  ＧＣＴ  ＣＣＡ  ＧＡＣ  ＴＧＣ−３（配列番号４）。リバースプライマーは、多重化を可能にするバーコード（ＮＮＮＮＮＮ）を含有していた。
【００８９】
スクリーニングデータの分析
それぞれのスクリーニングプールを、Knott et al. 2014に記載されたように分析した。
遺伝子オントロジー富化分析
遺伝子オントロジー富化分析を、ＧＯｒｉｌｌａウェブポータルを使用して実施した。４Ｔ１−Ｅ細胞と比較して、４Ｔ１−Ｔ細胞中で過剰発現されると同定された遺伝子のＲｅｆｓｅｑ識別子を、前景として使用し、全Ｒｅｆｓｅｑ遺伝子一覧を背景として使用した。
【００９０】
発現サブタイプおよび再発分析
全ての臨床データ分析を、https://genome.unc.eduで公開されたデータとして利用可能なＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ「８５５患者セット」を使用して実施した。全データは、水平軸上に患者を、垂直軸上に遺伝子を整列させた初期マトリックスに由来するものであった。初期の正規化は、それぞれの患者の全体的な発現プロファイルが類似することを確保するための分位点正規化を含んでいた。この後、それぞれの遺伝子を、患者間でｚスコア正規化した。図１ｂについては、それぞれの遺伝子の平均発現レベルを、それぞれの患者サブタイプについて算出した。図１ｃについては、それぞれの遺伝子の平均発現レベルを、それぞれの二次部位に再発を有する、および有しない患者のそれぞれの遺伝子について算出した。図６ａについては、サブタイプによって階層化された、それぞれの患者におけるＡＳＮＳのレベルをプロットする。図６ｂについては、それぞれのボックスプロットは、それぞれの二次部位に再発を有する、および有しないそれぞれの患者におけるＡＳＮＳのレベルを表す。
【００９１】
個々のｉｎ  ｖｉｔｒｏ侵入アッセイ
細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの侵入能力を、６ウェルＢｉｏＣｏａｔ  Ｍａｔｒｉｇｅｌ侵入プレートを使用して測定した。親４Ｔ１細胞については、１ｘ１０6個の細胞を個々のウェル上に播種し、４Ｔ１−Ｔ細胞については、８ｘ１０5個の細胞を個々のウェル上に播種し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞については、個々のウェルあたり５ｘ１０5個の細胞を使用した。細胞を、血清を含まない培地中に再懸濁し、細胞を、５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）および５％ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）を含む培地中に侵入させた。図３ｂおよび図９ｅについては、４Ｔ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１００倍濃度の特定のアミノ酸（１ｘＮＥＡＡ中の濃度と比較して）を含有する培地中で、それぞれ、２日または３日にわたって培養した後、侵入アッセイを開始した。２４時間後、非侵入細胞を除去し、侵入ウェルをＰＢＳ中で洗浄し、２％グルタルアルデヒド中で２分間固定し、０．５％クリスタルバイオレットで１０分間染色した。ウェルを、蒸留したＨ2Ｏ中で洗浄し、空気乾燥し、Ｏｄｙｓｓｅｙ赤外線スキャナーを使用して走査した。シグナルを、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して定量した。
【００９２】
競合および増殖アッセイ
ｍＣｈｅｒｒｙ競合アッセイのために、ｓｈＲＮＡを形質導入したｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞を、形質導入されていない細胞と混合した。ｍＣｈｅｒｒｙ蛍光を、ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーター（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で定量した。増殖アッセイを、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して実行した。図３ｂおよび図９ｅについては、４Ｔ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１００倍濃度の特定のアミノ酸（１ｘＮＥＡＡ中の濃度と比較して）を含有する培地中で、それぞれ、２日または３日にわたって培養した後、増殖アッセイを開始した。細胞を、ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレットで染色した後、トリプシン処理し、培地中に再懸濁した。２４時間後、細胞を収集して、ＳＨ８００フローサイトメーター（Ｓｏｎｙ）を使用してスミレ色の蛍光強度を定量した。
【００９３】
腫瘍および肺転移細胞の単離
腫瘍および肺組織を、Wagenblast et al. 2015に以前に報告されたように収獲し、細断し、単一の細胞に消化した。細胞を、間質細胞を枯渇させるために６０μＭの６−チオグアニンを含有する４Ｔ１細胞培養培地中で増殖させたか、またはＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ細胞選別装置（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してｍＣｈｅｒｒｙ発現に基づいて直接選別した。
ＲＮＡｓｅｑライブラリーの調製
培養された４Ｔ１−Ｔ細胞に由来するＲＮＡｓｅｑライブラリーを、Wagenblast et al. 2015に以前に記載されたように２回調製した。それぞれの試料を、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＨｉＳｅｑ配列決定装置上で配列決定し、７６ｎｔの単一末端（ＳＥ）リードを得た。
【００９４】
ＲＮＡｓｅｑ分析
Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列決定リードを、ｂｏｗｔｉｅ２をデフォルトパラメータで使用して（Langmead at al. 2012）、マウスゲノム（ｍｍ１０）と整列させた。遺伝子に、ＨＴｓｅｑｃｏｕｎｔ（Anders et al. 2015）を使用して、計数を割り当てた。示差発現分析を、ＤＥＳｅｑ（Anders et al. 2010）を使用して実施した。
ｓｈＲＮＡノックダウンおよびｃＤＮＡ過剰発現試験
マウスおよびヒト細胞株に、それぞれ、レトロウイルスまたはレンチウイルス構築物を発現するｓｈＲＮＡを形質導入した。感染後、４Ｔ１−Ｔ細胞を、５００μｇ／ｍｌのヒグロマイシンを用いて５日間にわたって選択し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、２μｇ／ｍｌのピューロマイシンを用いて４日間にわたって選択した。レトロウイルス構築物を過剰発現するｃＤＮＡに感染した細胞株を、Ｇ４１８を用いて１週間にわたって選択した。親４Ｔ１細胞株を、６００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて選択し、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１５００μｇ／ｍｌのＧ４１８を用いて選択した。
【００９５】
ｃＤＮＡ過剰発現遺伝子：
マウスＡＳＮＳ：ＮＭ＿０１２０５５．１
ヒトＡＳＮＳ：ＮＭ＿００１６７３．２。
【００９６】
ｓｈＲＮＡノックダウン配列：
マウスｓｈＡｓｎｓ−１（配列番号５）：
ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＴＧＣＣＡＡＴＡＡＧＡＡＡＧＴＡＴＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＴＡＣＴＴＴＣＴＴＡＴＴＧＧＣＡＧＴＧＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ
マウスｓｈＡｓｎｓ−２（配列番号６）：
ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＣＴＡＴＧＡＡＧＴＴＴＴＧＧＡＴＴＴＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＡＡＴＣＣＡＡＡＡＣＴＴＣＡＴＡＧＴＧＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ
マウスｓｈＴｇｆｂ１−１（配列番号７）：
ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＴＧＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ
マウスｓｈＴｇｆｂ１−２（配列番号８）：
ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＡＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＣＴＴＣＡＡＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＴＴＧＡＡＧＡＡＣＡＴＡＴＡＴＡＴＡＣＴＧＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ
ヒトｓｈＡＳＮＳ−１（配列番号９）：
ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＡＧＣＴＡＡＡＧＧＴＣＴＴＧＴＴＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＡＣＡＡＧＡＣＣＴＴＴＡＧＣＴＴＣＴＧＡＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ
ヒトｓｈＡＳＮＳ−２（配列番号１０）：
ＴＧＣＴＧＴＴＧＡＣＡＧＴＧＡＧＣＧＣＡＧＣＡＡＴＧＡＣＡＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＴＡＧＴＧＡＡＧＣＣＡＣＡＧＡＴＧＴＡＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＴＧＴＣＡＴＴＧＣＴＴＴＧＣＣＴＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＡ。
【００９７】
ｑＲＴ−ＰＣＲ
ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して、細胞に由来する全ＲＮＡを精製し、ＤＮＡｓｅ処理した。全組織については、ＴＲＩｚｏｌ  Ｐｌｕｓ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡを単離した。組織溶解物を、Ｄｏｕｎｃｅホモジェナイザーを使用してホモジェナイズし、カラムホモジェナイザー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を通過させて粘度を低下させた。ＲＮＡの完全性（ＲＮＡ完全性スコア＞９）を、Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（ＲＮＡ  ｎａｎｏ  ｋｉｔ）上で測定した。ｃＤＮＡを、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｓｉｇｍａ）を使用して合成した。定量的ＰＣＲ分析を、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ  Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｅｐ  ｒｅａｌｐｌｅｘ上で実施した。全てのシグナルを、ΔＣｔ法を使用して定量し、Ｇａｐｄｈのレベルに対して正規化した。ｍＣｈｅｒｒｙ陽性のフローサイトメーターにより選別された腫瘍および肺転移細胞については、ＴａｑＭａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して、溶解した細胞から直接的にｃＤＮＡを生産した。定量的ＰＣＲ分析を、ＴａｑＭａｎプライマー／プローブセットを使用してＣＦＸ９６（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で実施し、全てのシグナルを上記のように定量した。
【００９８】
ｑＲＴ−ＰＣＲプライマー
マウスＡｓｎｓ（エクソン１〜２）（配列番号１１）：
５’−ＣＣＴ  ＣＴＧ  ＣＴＣ  ＣＡＣ  ＣＴＴ  ＣＴＣ  Ｔ−３’  ５’−ＧＡＴ  ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＣＧＣ  ＡＣＴ  ＣＡＧ  ＡＣＡ−３’
マウスＡｓｎｓ（エクソン６〜７）（配列番号１２）：
５’−ＣＣＡ  ＡＧＴ  ＴＣＡ  ＧＴＡＴＣＣ  ＴＣＴ  ＣＣＡ  Ｇ−３’  ５’−ＣＴＴ  ＣＡＴ  ＧＡＴ  ＧＣＴ  ＣＧＣＴＴＣ  ＣＡ−３’
マウスＴｇｆｂ１（エクソン１〜２）（配列番号１３）：
５’−ＣＣＧ  ＡＡＴ  ＧＴＣ  ＴＧＡ  ＣＧＴ  ＡＴＴ  ＧＡＡ  ＧＡ−３’  ５’−ＧＣＧ  ＧＡＣ  ＴＡＣ  ＴＡＴ  ＧＣＴ  ＡＡＡ  ＧＡＧ  Ｇ−３’マウスＴｇｆｂ１（エクソン３〜４）（配列番号１４）：
５’−ＧＴＴ  ＡＴＣ  ＴＴＴ  ＧＣＴ  ＧＴＣ  ＡＣＡ  ＡＧＡ  ＧＣ−３’  ５’−ＣＣＣ  ＡＣＴ  ＧＡＴ  ＡＣＧ  ＣＣＴ  ＧＡＧ−３’
マウスＧａｐｄｈ（エクソン２〜３）（配列番号１５）：
５’−ＡＡＴ  ＧＧＴ  ＧＡＡ  ＧＧＴ  ＣＧＧＴＧＴ  Ｇ−３’  ５’−ＧＴＧ  ＧＡＧＴＣＡ  ＴＡＣＴＧＧ  ＡＡＣ  ＡＴＧ  ＴＡＧ−３’
ヒトＡｓｎｓ（エクソン８〜９）（配列番号１６）：
５’−ＧＡＧＴＣＡ  ＧＡＣ  ＣＴＴ  ＴＧＴ  ＴＴＡ  ＡＡＧ  ＣＡ−３’  ５’−ＧＧＡ  ＧＴＧ  ＣＴＴ  ＣＡＡＴＧＴ  ＡＡＣ  ＡＡＧ  ＡＣ−３’
ヒトＡｓｎｓ（エクソン１２〜１３）（配列番号１７）：
５’−ＣＴＧ  ＧＡＴ  ＧＡＡ  ＧＴＣ  ＡＴＡＴＴＴ  ＴＣＣ  ＴＴＧ  Ｇ−３’  ５’−ＣＡＧ  ＡＧＡ  ＡＧＡＴＣＡ  ＣＣＡ  ＣＧＣＴＡＴ  Ｃ−３’
ヒトＧＡＰＤＨ（エクソン２〜３）（配列番号１８）：
５’−ＡＣＡ  ＴＣＧ  ＣＴＣ  ＡＧＡ  ＣＡＣ  ＣＡＴ  Ｇ−３’  ５’−ＴＧＴ  ＡＧＴ  ＴＧＡ  ＧＧＴ  ＣＡＡ  ＴＧＡ  ＡＧＧ  Ｇ−３’。
【００９９】
ＴａｑＭａｎプローブ：
マウスＡｓｎｓ：Ｍｍ００８０３７８５＿ｍ１
マウスＥ−カドヘリン（Ｃｄｈ１）：Ｍｍ０１２４７３５７＿ｍ１
マウスＴｗｉｓｔ１：Ｍｍ００４４２０３６＿ｍ１
マウスＧａｐｄｈ：Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１。
【０１００】
循環腫瘍細胞（ＣＴＣ）のためのｑＰＣＲ：
ＣＴＣを、Wagenblast et al. 2015に以前に記載されたように定量した。ゲノムＤＮＡを血液から単離し、レトロウイルスｓｈＲＮＡ送達ベクターから発現されるｍＣｈｅｒｒｙに対するｑＰＣＲアッセイを使用して定量した。
【０１０１】
ｍＣｈｅｒｒｙプローブおよびプライマー：
プライマー１：５’−ＧＡＣＴＡＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＴＣＣＴＴＣＣ−３’（配列番号１９）
プライマー２：５’−ＣＧＣＡＧＣＴＴＣＡＣＣＴＴＧＴＡＧＡＴ−３’（配列番号２０）
ＨＥＸプローブ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＴＴＣＡＡＧＴＧＧ／ＺＥＮ／ＧＡＧＣＧＣＧＴＧＡＴＧＡＡ／３ＩＡＢｋＦＱ／／−３’（配列番号２１）。
【０１０２】
ハウスキーピングプローブおよびプライマー：
プライマー１：５’−ＧＡＣＴＴＧＴＡＡＣＧＧＧＣＡＧＧＣＡＧＡＴＴＧＴＧ−３’（配列番号２２）
プライマー２：５’−ＧＡＧＧＴＧＴＧＧＧＴＣＡＣＣＴＣＧＡＣＡＴＣ−３’（配列番号２３）
ＨＥＸプローブ：５’−／５ＨＥＸ／ＣＣＧＴＧＴＣＧＣ／ＺＥＮ／ＴＣＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＴＡＴ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号２４）。
【０１０３】
肺転移の定量化
それぞれの肺について、５μｍの切片を調製し、標準的なＨ＆Ｅプロトコールを用いて染色した。肺転移負荷を、１つの切片上の個々の肺結節を計数することによって決定した。
Ｅ−カドヘリンおよびＴｗｉｓｔ１の分析：
免疫組織化学分析のために、原発腫瘍および肺を、Wagenblast et al. 2015に以前に記載されたようにプロセシングした。Ｅ−カドヘリン（２４Ｅ１０）ウサギｍＡｂ（３１９５、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）を、１：４００希釈率で使用し、Ｔｗｉｓｔ１（Ｔｗｉｓｔ２Ｃ１ａ）マウスｍＡｂ（ａｂ５０８８７、Ａｂｃａｍ）を、１：００の希釈率で使用した。ＥカドヘリンおよびＴｗｉｓｔ１のジアミノベンジジン染色（ＤＡＢ）およびヘマトキシリン染色を、ＩｍａｇｅＪ（ＮＩＨ）を使用して定量した。このために、画像を、Ruifrok et al. 2001に従って色解析し、Ｅ−カドヘリンおよびＴｗｉｓｔ１陽性染色の面積パーセントを測定した。
【０１０４】
ＨＰＬＣを使用した遊離アミノ酸の定量化
遊離アミノ酸を、培養細胞および血清中で定量した。培養細胞については、４Ｔ１およびＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を、１００倍濃度の特定のアミノ酸（１ｘＮＥＡＡ中の濃度と比較して）を含有する培地中で、それぞれ、２日または３日にわたって培養した。全ての培養細胞を、Ｄｏｕｎｃｅホモジェナイザーを使用してホモジェナイズした後、溶解物を濾過した。それぞれの試料を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）および蛍光検出器を使用して３回定量した。それぞれの反復物について、それぞれのアミノ酸のナノモル濃度を測定した。それぞれの３回反復物の平均を使用して、それぞれのアミノ酸のモルパーセント組成を算出した。
相対および絶対タンパク質定量のための等圧タグ（ｉＴＲＡＱ）を使用するプロテオミックプロファイリング
細胞を、氷冷ＰＢＳ中で洗浄し、Ross et al. 2004に以前に記載されたようにｉＴＲＡＱ定量プロテオミクスのために収獲した。３回の反復物を、それぞれの細胞株について使用した。
液体クロマトグラフィータンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）を使用する代謝物プロファイリング
代謝物抽出を、以前に記載されたように実施した（２６）。臓器組織試料を、乳腺については１．４ｍｍのセラミックビーズまたは肺については２．８ｍｍのセラミックビーズおよび予め冷やした８０％メタノール１ｍｌを予め充填した２ｍｌの溶解チューブ中に入れた。試料を、６５００Ｈｚで３回の３０秒サイクルおよび４分の停止時間でプログラムされたＰｒｅｃｅｌｌｙｓ２４ホモジェナイザー（Ｂｅｒｔｉｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用いてホモジェナイズした。各サイクルの終わりに、試料を、液体窒素中で簡易凍結し、ドライアイス上に置いた。血清試料（５０μｌ）の代謝物抽出を、−８０℃の８０％メタノール２００μｌを使用して実施した。１０分間遠心分離した後（１３．２ｋＲＰＭ、４℃）、上清を蒸発乾固させて、ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析を行うまで−８０℃で保存した。
【０１０５】
ドライダウンした抽出物を、２５μｌのＨＰＬＣ等級水中に再懸濁し、タンデム質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）にカップリングした親水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＬＩＣ）を使用して、１μｌを分析した。分析機器は、電子スプレーイオン源を備えたＱＴＲＡＰ６５００ハイブリッド三連四重極／線形イオントラップ質量分析計（ＳＣＩＥＸ）にカップリングしたＮｅｘｅｒａ  Ｘ２（Ｓｈｉｍａｄｚｕ）液体クロマトグラフィーからなっていた。生のＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳデータを、Ａｎａｌｙｓｔ  １．６．２（ＳＣＩＥＸ）を用いて獲得し、それぞれの代謝物のＬＣ−ＳＲＭ−ＭＳトレースのピーク面積を、ＭｕｌｔｉＱｕａｎｔ  １．１ソフトウェア（ＳＣＩＥＸ）を使用して積分した。代謝物の差異を、試料を全ピーク面積に対して正規化し、多重比較と共に一元配置分散分析を使用して各群の反復物を比較することによって分析した。
【０１０６】
アミノ酸組成分析
図４ａについて、転写レベルおよびタンパク質レベルの対数倍数変化を、同じ分布に分位点正規化した。次いで、ＲＮＡレベルの変化を、タンパク質レベルの変化から差し引いた。次いで、１０％の最高および最低後続値を有する遺伝子におけるアミノ酸表示を、順位和検定を使用して比較して、存在量が転写レベルの変化によって説明されないタンパク質レベルの変化と相関するアミノ酸を同定した。図１２ｂについて、アミノ酸表示を、同じ順位和検定を使用して、ＲＮＡおよびタンパク質発現の最大の増加／減少を示す遺伝子間で比較した。図１２ｃおよび図１２ｄについて、同じ分析を実施し、この時点で、他の全ての遺伝子と比較してＥＭＴの間に上方調節されると検出された遺伝子のタンパク質を比較した。図１２ｃの場合、ＥＭＴ−ｕｐ遺伝子は、ＥＭＴ−ｕｐヒト遺伝子のマウスオルソログであった。
図１２ｅについて、図１２ｄに記載されたプロ−ＥＭＴヒト遺伝子のオルソログであった最小で１０個の遺伝子を担持するそれぞれの生物を分析した。それぞれの生物について、それぞれのタンパク質のアスパラギンのパーセンテージを算出した。次いで、プロ−ＥＭＴタンパク質の中央アスパラギンパーセンテージの、残りの生物特異的タンパク質に対する比を算出することによって、それぞれの生物のアスパラギン富化レベルを算出した。富化の統計的有意性を、図１２ｃおよび図１２ｄについて記載されたように算出した。
【０１０７】
リボソームプロファイリング分析
分析のために、クオリティトリミングおよびリンカー除去を、ｃｕｔａｄａｐｔ１９を使用して実施した。ｂｏｗｔｉｅ２を使用して、汚染ＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡおよびｔＲＮＡ配列）１４にマッピングされるリードを除去した。続いて、ＳＴＡＲを使用して、長さ２９〜３３のリードを、ヒトトランスクリプトーム２０にマッピングした。リード長に基づいて各リードについてオフセットを補正し、１２および１５ヌクレオチド下流をＰおよびＡ部位とマーキングした。次いで、それぞれの遺伝子について、本発明者らは、全ての位置での事象数を算出し、各コドン、続いて、アミノ酸の計数を合計した。
【０１０８】
参考文献
2021502412.tif 000003
2021502412.tif 000004
2021502412.tif 000005
【図１ａ】
2021502412.tif 000006
【図１ｂ】
2021502412.tif 000007
【図１ｃ】
2021502412.tif 000008
【図１ｄ】
2021502412.tif 000009
【図１ｅ】
2021502412.tif 000010
【図２ａ】
2021502412.tif 000011
【図２ｂ】
2021502412.tif 000012
【図２ｃ】
2021502412.tif 000013
【図２ｄ】
2021502412.tif 000014
【図２ｅ】
2021502412.tif 000015
【図２ｆ】
2021502412.tif 000016
【図２ｇ】
2021502412.tif 000017
【図３ａ】
2021502412.tif 000018
【図３ｂ】
2021502412.tif 000019
【図３ｃ】
2021502412.tif 000020
【図３ｄ】
2021502412.tif 000021
【図３ｅ】
2021502412.tif 000022
【図３ｆ】
2021502412.tif 000023
【図４ａ】
2021502412.tif 000024
【図４ｂ】
2021502412.tif 000025
【図４ｃ】
2021502412.tif 000026
【図４ｄ】
2021502412.tif 000027
【図４ｅ】
2021502412.tif 000028
【図４ｆ】
2021502412.tif 000029
【図４ｇ】
2021502412.tif 000030
【図４ｈ】
2021502412.tif 000031
【図５】
2021502412.tif 000032
【図５−２】
2021502412.tif 000033
【図６ａ】
2021502412.tif 000034
【図６ｂ】
2021502412.tif 000035
【図６ｃ】
2021502412.tif 000036
【図６ｄ−１】
2021502412.tif 000037
【図６ｄ−２】
2021502412.tif 000038
【図６ｅ】
2021502412.tif 000039
【図７ａ】
2021502412.tif 000040
【図７ｂ】
2021502412.tif 000041
【図７ｃ】
2021502412.tif 000042
【図７ｄ】
2021502412.tif 000043
【図７ｅ】
2021502412.tif 000044
【図８ａ】
2021502412.tif 000045
【図８ｂ】
2021502412.tif 000046
【図８ｃ】
2021502412.tif 000047
【図８ｄ】
2021502412.tif 000048
【図８ｅ】
2021502412.tif 000049
【図８ｆ】
2021502412.tif 000050
【図８ｇ】
2021502412.tif 000051
【図８ｈ】
2021502412.tif 000052
【図８ｉ】
2021502412.tif 000053
【図９ａ】
2021502412.tif 000054
【図９ｂ】
2021502412.tif 000055
【図９ｃ】
2021502412.tif 000056
【図９ｄ】
2021502412.tif 000057
【図９ｅ】
2021502412.tif 000058
【図９ｆ】
2021502412.tif 000059
【図９ｇ】
2021502412.tif 000060
【図９ｈ】
2021502412.tif 000061
【図１０ａ】
2021502412.tif 000062
【図１０ｂ】
2021502412.tif 000063
【図１０ｃ】
2021502412.tif 000064
【図１０ｄ】
2021502412.tif 000065
【図１０ｅ】
2021502412.tif 000066
【図１０ｆ】
2021502412.tif 000067
【図１１ａ】
2021502412.tif 000068
【図１１ｂ】
2021502412.tif 000069
【図１１ｃ】
2021502412.tif 000070
【図１１ｄ】
2021502412.tif 000071
【図１１ｅ】
2021502412.tif 000072
【図１１ｆ】
2021502412.tif 000073
【図１１ｇ】
2021502412.tif 000074
【図１１ｈ】
2021502412.tif 000075
【図１２ａ】
2021502412.tif 000076
【図１２ｂ】
2021502412.tif 000077
【図１２ｃ】
2021502412.tif 000078
【図１２ｄ】
2021502412.tif 000079
【図１２ｅ−１】
2021502412.tif 000080
【図１２ｅ−２】
2021502412.tif 000081
【図１３ａ】
2021502412.tif 000082
【図１３ｂ】
2021502412.tif 000083
【図１３ｃ】
2021502412.tif 000084
【図１３ｄ】
2021502412.tif 000085
【図１３ｅ】
2021502412.tif 000086
【図１３ｆ】
2021502412.tif 000087
【図１３ｇ】
2021502412.tif 000088
【図１４ａ】
2021502412.tif 000089
【図１４ｂ】
2021502412.tif 000090
【図１４ｃ】
2021502412.tif 000091
【図１４ｄ】
2021502412.tif 000092
【図１４ｅ】
2021502412.tif 000093
【図１４ｆ】
2021502412.tif 000094
【図１４ｇ】
2021502412.tif 000095
【図１４ｈ】
2021502412.tif 000096
【配列表】
2021502412000001.app
【国際調査報告】
2021502412.tif 000097
2021502412.tif 000098
2021502412.tif 000099
2021502412.tif 000100