(57)【要約】本発明は、センスオリゴヌクレオチド鎖及びアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖により構成される、ヒトｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる小分子活性化ＲＮＡを提供する。その前記センス鎖又はアンチセンス鎖は、ヒトｐ２１遺伝子プロモーター標的遺伝子配列のうちの長さが１６‐３５ヌクレオチドである連続的フラグメントのいずれと、７５％以上の相同性を有する。そのうち、ヒトｐ２１遺伝子の標的配列が配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２に示される配列からなる組により選ばれる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
小分子活性化ＲＮＡのその１本の鎖が配列番号５、６、７、８、９、１０、１１および１２からなる群から選択される核酸配列における長さ１６〜３５ヌクレオチドである任意の連続的フラグメントと少なくとも７５％の相同性又は相補性を有し、小分子活性化ＲＮＡがヒトｐ２１遺伝子プロモーターの配列を標的とすることによりｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる、小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項２】
前記小分子活性化ＲＮＡがセンス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖を含み、前記センス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖が二本鎖核酸構造が形成される相補領域を含み、前記センス核酸鎖又はアンチセンス核酸鎖が、ヒトｐ２１プロモーターの配列のうちの長さ１６〜３５ヌクレオチドである任意の連続的フラグメントと７５％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上或いは１００％の相同性を有する、請求項１に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項３】
前記センス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖が異なる二本の核酸鎖にある、請求項２に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項４】
前記センス核酸鎖及びアンチセンス核酸鎖が同一の核酸鎖にあり、ヘアピン型一本鎖核酸分子を形成し、センス鎖及びアンチセンス鎖の相補領域は、二本鎖核酸構造を形成する、請求項２に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項５】
前記小分子活性化ＲＮＡの少なくとも１本の鎖は長さ０〜６ヌクレオチドの３'突出を有する、請求項３に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項６】
前記小分子活性化ＲＮＡの２本の鎖は共に長さ２〜３ヌクレオチドの３'突出を有する、請求項５に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項７】
前記センス核酸鎖又はアンチセンス核酸鎖の長さ１６〜３５ヌクレオチドである、請求項２〜６の何れか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項８】
前記センス核酸鎖又はアンチセンス核酸鎖が、配列番号１３〜３０、３５〜４６、５９〜６２、６７〜７４、７７〜８０、８５〜９６、１０３〜１０８、１１１〜１１８、１２１〜１３２、１３９〜１４０、１４７〜１８０、１８５〜１８６、１８９〜１９０、１９５〜１９８、２０１〜２０２、２０９〜２１２、２１５〜２１８、２２５〜２４０、２４３〜２４６、２４９〜２５８、２６１〜２６２、２６５〜２７０、２７５〜２８０、２８３〜３００、３０３〜３０８、３１７〜３２０、３２３〜３２４、３２９〜３４８、３５１〜３５２、３５７〜３５８、３６１〜３６６、３７１〜３９２、３９９〜４００、４０５〜４１２、４１５〜４１６、４１９〜４２４、４２９〜４３２、４３９〜４４２、４４７〜４５０、４５３〜４５８、４６３〜４６８からなる群から選択される核酸配列と少なくとも７５％の相同性を有する、請求項１に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項９】
前記センス核酸鎖又はアンチセンス核酸鎖の配列が、配列番号１３〜３０、３５〜４６、５９〜６２、６７〜７４、７７〜８０、８５〜９６、１０３〜１０８、１１１〜１１８、１２１〜１３２、１３９〜１４０、１４７〜１８０、１８５〜１８６、１８９〜１９０、１９５〜１９８、２０１〜２０２、２０９〜２１２、２１５〜２１８、２２５〜２４０、２４３〜２４６、２４９〜２５８、２６１〜２６２、２６５〜２７０、２７５〜２８０、２８３〜３００、３０３〜３０８、３１７〜３２０、３２３〜３２４、３２９〜３４８、３５１〜３５２、３５７〜３５８、３６１〜３６６、３７１〜３９２、３９９〜４００、４０５〜４１２、４１５〜４１６、４１９〜４２４、４２９〜４３２、４３９〜４４２、４４７〜４５０、４５３〜４５８、４６３〜４６８からなる群から選択される、請求項８に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項１０】
前記小分子活性化ＲＮＡの少なくとも１個のヌクレオチドが化学修飾を有するヌクレオチドであり、前記化学修飾は、
（１）前記小分子活性化ＲＮＡのヌクレオチド配列のヌクレオチドを繋げるホスホジエステル結合に対する修飾、
（２）前記小分子活性化ＲＮＡのヌクレオチド配列におけるリボースの２'‐ＯＨに対する修飾、
（３）前記小分子活性化ＲＮＡのヌクレオチド配列における塩基に対する修飾、又は
（４）前記小活性化核酸分子のヌクレオチド配列における少なくとも１個のヌクレオチドがロックド核酸であること
の少なくとも１つから選択される、請求項１〜９の何れか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項１１】
前記ｐ２１遺伝子の発現を少なくとも１０％活性化又はアップレギュレーションさせる、請求項１〜１０の何れか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項１２】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡの、細胞におけるｐ２１遺伝子の表現を活性化又はアップレギュレーションさせるための製剤の製造における使用。
【請求項１３】
前記小分子活性化ＲＮＡは、前記細胞に直接導入される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記細胞が、哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒト細胞であり、より好ましくはヒト腫瘍細胞である、請求項１３に記載の使用。
【請求項１５】
前記細胞が人体に存在する、請求項１４に記載の使用。
【請求項１６】
前記人体がｐ２１タンパク質の発現の不足による腫瘍に罹る患者であり、腫瘍への治療を図るために前記小活性化核酸分子が有効量で投与され、前記腫瘍は、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌が好ましい、請求項１５に記載の使用。
【請求項１７】
標的部位は、配列番号５〜１２からなる群から選択される任意の連続的な１６〜３５ヌクレオチド配列である、単離されたｐ２１遺伝子小分子活性化ＲＮＡ標的部位。
【請求項１８】
前記細胞に請求項１〜１１の何れか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡを投与する方法を含む、細胞におけるｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる方法。
【請求項１９】
前記小分子活性化ＲＮＡは前記細胞に直接導入される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記細胞が哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒト細胞であり、より好ましくはヒト腫瘍細胞であり、さらに好ましくはヒトの膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌細胞である、請求項１８又は１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項２２】
薬学的に許容される担体が、リポソーム、高分子ポリマー又はポリペプチドである、ことを特長とする、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
請求項１〜１１の何れか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡの、又は請求項２１又は２２に記載の組成物の、ｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる製剤の製造における使用、好ましくは腫瘍又は良性増殖性病変を治療するための製剤の製造における使用であり、より好ましくは前記腫瘍が膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に関し、具体的には、標的遺伝子プロモーター配列を利用する二本鎖小分子ＲＮＡによる遺伝子発現のアップレギュレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
二本鎖小核酸分子は、化学合成されたオリゴリボヌクレオチド（例えば、小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ））と天然に存在するオリゴリボヌクレオチド（例えば、マイクロリボヌクレオチド（ｍｉＲＮＡ））とを含み、タンパク質コード遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター配列）を配列特異的にターゲッティングすることにより、転写及びエピジェネリックレベルで遺伝子の発現レベルをアップレギュレート可能であることが証明され、このような現象は、ＲＮＡの活性化と言われている（ＲＮＡａ）(Li,Okino et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:17337-17342; Janowski,Younger et al.(2007) Nat Chem Biol 3:166-173; Place,Li et al.(2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:1608-1613; Huang,Place et al.(2012) Nucleic Acids Res 40:1695-1707; Li (2017) Adv Exp Med Biol 983:1-20)。研究によれば、ＲＮＡの活性化は、カエノラブディティス・エレガンスからヒトへの進化的保存の内因性分子メカニズムである(Huang,Qin et al.(2010) PloS One 5:e8848; Seth,Shirayama et al.(2013) Dev Cell 27:656-663;Turner,Jiao et al.(2014) Cell Cycle 13:772-781)。
【０００３】
どのようにヒト細胞の内因性遺伝子又はタンパク質の発現を安全かつ選択的に増強するかは、依然として遺伝子治療の分野の大きな課題である。従来のウィルス型遺伝子治療システムは、その固有の欠陥を有しており、宿主ゲノムを変化させたり、免疫反応を起こせたりするなどの副作用がある。ＲＮＡ活性化は、ゲノムを変化せずに内因性遺伝子の発現を活性化させることができるという利点を有し、一種の代表的な内因性遺伝子の発現を活性化させる新しい策略であり、疾病治療において巨大な応用価値を有する。
【０００４】
ｐ２１WAF1/CIP1（ＣＤＫＮ１Ａとも言われ、以下、ｐ２１という）遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤であり、重要な腫瘍抑制遺伝子である(Harper, Adami et al. (1993) Cell 75:805‐816; Fang, Igarashi et al. (1999) Oncogene 18:2789‐2797)。研究によれば、異所性ベクターによるp２１の過剰発現又は内因性ｐ２１の活性化による転写は、腫瘍細胞や体内腫瘍の成長を効率よく抑制できる(Harper,Adami et al. (1993) Cell 75:805-816; Eastham,Hall et al. (1995) Cancer Res 55:5151-5155; Wu,Bellas et al. (1998) J Exp Med 187:1671-1679; Harrington,Spitzweg et al. (2001) J Urol 166:1220-1233)。そのため、ｐ２１遺伝子を標的として活性化させる方法は、例えば癌などの多くの疾病の治療に幅広く応用される可能性がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、その１本の鎖が配列番号５、６、７、８、９、１０、１１および１２からなる群から選択される核酸配列のうちの長さが１６〜３５ヌクレオチドである連続的フラグメントのいずれと少なくとも７５％の相同性又は相補性を有し、標的ヒトｐ２１遺伝子プロモーター配列によりｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる、ことを特徴とする小分子活性化ＲＮＡを提供する。
【０００６】
本発明の実施例において、前記ヒトｐ２１遺伝子の標的遺伝子が配列番号５〜１２に示される配列からなる組により選ばれる。そのうち、前記ヒトｐ２１遺伝子プロモーター配列がそれぞれ転写開始部位（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ｓｔａｒｔ ｓｉｔｅ， ＴＳＳ）より上流の-８９３〜-８０１ ｂｐ（配列番号５）、-７１７〜-６３２ ｂｐ（配列番号６）、-５８５〜-５５１ ｂｐ（配列番号７）、-５５４〜-５０４ ｂｐ（配列番号８）、-５１４〜-４８５ ｂｐ（配列番号９）、-４４２〜-４０５ ｂｐ（配列番号１０）、-３５２〜-３１３ ｂｐ（配列番号１１）、-３２５〜-２６０ ｂｐ（配列番号１２）にある。
【０００７】
一実施例において、前記小分子活性化ＲＮＡは、二本鎖核酸構造が形成される相補領域を有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を備える。そのうち、センス鎖又はアンチセンス鎖が、ヒトｐ２１遺伝子プロモーター配列のうちの長さが１６〜３５ヌクレオチドである連続的フラグメントのいずれと７５％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上或いは１００％の相同性を有する。
【０００８】
一実施例において、前記に示されるように、前記センス鎖及びアンチセンス鎖が異なる二本の核酸鎖にある。前記センス鎖及びアンチセンス鎖が同一の核酸鎖にあり、ヘアピン型一本鎖核酸分子である。そのうち、センス鎖及びアンチセンス鎖の相補領域には、二本鎖核酸構造が形成されている。
【０００９】
具体的な一実施例において、前記小分子活性化ＲＮＡにおける少なくとも１本の鎖は長さが０〜６ヌクレオチドである３'突出末端を有する。前記小分子活性化ＲＮＡにおける２本の鎖は共に長さが２〜３ヌクレオチドである３'突出末端を有する。
【００１０】
一実施例において、前記センス鎖又はアンチセンス鎖は長さが１６〜３５ヌクレオチドである。例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、又は３５ヌクレオチドである。
【００１１】
具体的な一実施例において、前記センス鎖又はアンチセンス鎖が、配列番号１３〜３０、３５〜４６、５９〜６２、６７〜７４、７７〜８０、８５〜９６、１０３〜１０８、１１１〜１１８、１２１〜１３２、１３９〜１４０、１４７〜１８０、１８５〜１８６、１８９〜１９０、１９５〜１９８、２０１〜２０２、２０９〜２１２、２１５〜２１８、２２５〜２４０、２４３〜２４６、２４９〜２５８、２６１〜２６２、２６５〜２７０、２７５〜２８０、２８３〜３００、３０３〜３０８、３１７〜３２０、３２３〜３２４、３２９〜３４８、３５１〜３５２、３５７〜３５８、３６１〜３６６、３７１〜３９２、３９９〜４００、４０５〜４１２、４１５〜４１６、４１９〜４２４、４２９〜４３２、４３９〜４４２、４４７〜４５０、４５３〜４５８、４６３〜４６８に示される配列と少なくとも７５％、例えば、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、１００％の相同性を有する。
【００１２】
具体的な一実施例において、前記センス鎖又はアンチセンス鎖配列が、配列番号１３〜３０、３５〜４６、５９〜６２、６７〜７４、７７〜８０、８５〜９６、１０３〜１０８、１１１〜１１８、１２１〜１３２、１３９〜１４０、１４７〜１８０、１８５〜１８６、１８９〜１９０、１９５〜１９８、２０１〜２０２、２０９〜２１２、２１５〜２１８、２２５〜２４０、２４３〜２４６、２４９〜２５８、２６１〜２６２、２６５〜２７０、２７５〜２８０、２８３〜３００、３０３〜３０８、３１７〜３２０、３２３〜３２４、３２９〜３４８、３５１〜３５２、３５７〜３５８、３６１〜３６６、３７１〜３９２、３９９〜４００、４０５〜４１２、４１５〜４１６、４１９〜４２４、４２９〜４３２、４３９〜４４２、４４７〜４５０、４５３〜４５８、４６３〜４６８のヌクレオチド配列のいずれに示される。
【００１３】
本発明は、１）標的遺伝子プロモーター配列を鋳型とし、１９個の塩基を含む配列を標的部位として選定するステップと、２）ステップ１）で取得した標的部位配列と７５％以上の相同性を有するＲＮＡ配列を合成して、センスオリゴヌクレオチド鎖を取得するステップと、３）配列をステップ２）で取得したセンスオリゴヌクレオチド鎖と相補させるステップと、４）ＲＮＡアニール緩衝液にてステップ２）で取得したセンスオリゴヌクレオチド鎖とステップ３）で取得したアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を同じモル数で混合しながら加熱したのち、室温まで自然冷却させることにより、二本鎖の小分子活性化ＲＮＡを取得した（そのうち、ヒトｐ２１遺伝子プロモーター配列が配列番号５、６、７、８、９、１０、１１、１２に示される配列からなる組により選ばれる）ステップと、を備えることを特徴とする、前記何れか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡの製造方法をさらに提供する。
一実施例において、前記小分子活性化ＲＮＡにおける少なくとも１個のヌクレオチドが化学修飾を有するヌクレオチドであり、前記化学修飾は、
（１）前記小分子活性化ＲＮＡのヌクレオチド配列のヌクレオチドを繋げるホスホジエステル結合に対する修飾と、
（２）前記小分子活性化ＲＮＡのヌクレオチド配列におけるリボースの２'‐ＯＨに対する修飾と、
（３）前記小分子活性化ＲＮＡのヌクレオチド配列における塩基に対する修飾と、
（４）前記小活性化核酸分子のヌクレオチド配列における少なくとも１個のヌクレオチドがロックド核酸であること、などの少なくとも１つから選ばれる。
【００１４】
一実施例において、前記ｐ２１遺伝子の発現を少なくとも１０％、例えば、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、８０％、１００％、２００％以上活性化又はアップレギュレーションさせる。
【００１５】
本発明は、小分子活性化ＲＮＡの、細胞におけるｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせるための製剤の製造における使用をさらに提供する。前記小分子活性化ＲＮＡは、前記細胞に直接導入されるもの、或いは、当該小分子活性化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が細胞に導入された後に細胞に発生されたものである。前記細胞が哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒト細胞であり、より好ましくはヒト腫瘍細胞である。当該ヒト細胞が単離したヒト細胞株のものであってもよく、人体に存在するものであってもよい。
【００１６】
一実施例において、前記人体がｐ２１タンパク質の発現の不足による腫瘍に罹る患者であり、腫瘍への治療を図るために前記小活性化核酸分子が有効量で投与される。前記腫瘍は、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌が好ましい。
【００１７】
また、本発明は、分離したｐ２１遺伝子小分子活性化ＲＮＡ標的部位をさらに提供する。そのうち、前記標的部位は、配列番号５〜１２から選ばれる配列のいずれにおける連続的な１６〜３５ヌクレオチド配列である。
【００１８】
さらに、本発明は、細胞におけるヒトｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる方法を開示した。そのうち、前記方法は、受検者又は細胞に前記何れか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡを投与する方法を含む。前記小分子活性化ＲＮＡは、細胞に直接導入されるものであってもよく、当該小分子活性化ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が細胞に導入された後に細胞に発生されたものであってもよい。前記細胞が哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒト細胞であり、より好ましくはヒト腫瘍細胞であり、さらに好ましくはヒトの膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌細胞である。
【００１９】
本発明は、前記に示される小分子活性化ＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含む組成物をさらに開示した。そのうち、薬学的に許容される担体が、リポソーム、高分子ポリマー又はポリペプチドである。
【００２０】
本発明は、前記に示される小分子活性化ＲＮＡ又は前記に示される組成物の、ｐ２１遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる薬物の製造における使用、を開示した。当該応用は、抗腫瘍又は良性増殖性病変の薬物の製造における使用が好ましい。前記腫瘍は、膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌又は結腸直腸癌がより好ましい。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】図１は、ｐ２１遺伝子プロモーター配列の、転写開始部位（ＴＳＳ）上流‐１０００ｂｐからＴＳＳ下流３ｂｐまでを示すものである。ＴＳＳは、湾曲した矢印で示される。
【図２】図２は、ｐ２１遺伝子プロモーターにおける小分子活性化ＲＮＡのホットスポット領域の選別を示すものである。図１に示すｐ２１プロモーター配列に対して、４３９個の二本鎖ＲＮＡ分子を設計して化学合成し、ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞にそれぞれトランスフェクションした。７２時間後、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０方法でｐ２１遺伝子ｍＲＮＡレベルを分析した。（Ａ）は、４３９個の二本鎖ＲＮＡ分子（Ｘ軸）のそれぞれによる対照処理に対するｐ２１ ｍＲＮＡレベルの倍数変化（Ｙ軸）を示すものである。Ｘ軸における二本鎖ＲＮＡ分子は、ｐ２１遺伝子のＴＳＳに対する位置（最上流のＲＡＧ‐８９８から最下流のＲＡＧ‐１７７まで）に従ってソートする。図中に、８個のホットスポット（ｈｏｔｓｐｏｔ）領域（薄い灰色の長方形枠）を示した。（Ｂ）は、（Ａ）のデータを二本鎖ＲＮＡ分子の誘導によるｐ２１ ｍＲＮＡの発現の倍数変化の大きさに従って低いものから高いものまでソートするものである。（Ａ）及び（Ｂ）における破線は、２倍誘導を示す。
【図３】図３は、ホットスポット領域１〜８におけるｐ２１遺伝子に対する二本鎖ＲＮＡ分子の活性化作用を示すものである。
【図４】図４は、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０の実験結果を検証するためにＲＴ‐ｑＰＣＲ法によってｐ２１遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析することを示すものである。（Ａ）は、４３９個の二本鎖ＲＮＡ分子をそれらのｐ２１ ｍＲＮＡ発現の誘導活性の大きさに従って４つの領域（群）に分け、各群から５個の二本鎖ＲＮＡ分子をランダムに選択して、それぞれ１０ ｎＭの濃度でＰＣ３細胞にトランスフェクションした。７２時間後、細胞総ＲＮＡを抽出して逆転写した後、ＲＴ‐ｑＰＣＲ法を用いてｐ２１遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析したことを示すものである。（Ｂ）は、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０（Ｘ軸）及びＲＴ‐ｑＰＣＲ（Ｙ軸）方法によって、二本鎖ＲＮＡ分子で誘導されたｐ２１遺伝子のｍＲＮＡ相対レベルの相関性を検出することを示すものである。
【図５】図５は、小分子活性化ＲＮＡによるｐ２１ ｍＲＮＡの発現の誘導作用及びＫＵ‐７細胞の増殖の抑制作用を示すものである。図示された３個の小分子活性化ＲＮＡは、それぞれ１０ ｎＭでＫＵ‐７細胞を７２時間トランスフェクションした。そのうち、（Ａ）は、ＲＴ−ｑＰＣＲによるｐ２１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの分析を示すものである。（Ｂ）は、ＣＣＫ-８方法による細胞活力の評価を示すものである。ｓａＲＮＡ処理群の細胞活力は、対照処理群（Ｍｏｃｋ）の細胞活力に対する百分率で示される。（Ｃ）は、トランスフェクション終了時の代表的な細胞画像（１００×）を示すものである。
【図６】図６は、小分子活性化ＲＮＡによるｐ２１  ｍＲＮＡの発現の誘導作用及びＨＣＴ１１６細胞の増殖の抑制作用を示すものである。図示された３個の小分子活性化ＲＮＡは、それぞれ１０ｎＭでＨＣＴ１１６細胞を７２時間トランスフェクションした。（Ａ）は、ＲＴ-ｑＰＣＲによるｐ２１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの分析を示すものである。（Ｂ）は、ＣＣＫ-８方法による細胞活力の評価を示し、ｓａＲＮＡ処理群の細胞活力は、対照処理群（Ｍｏｃｋ）の細胞活力に対する百分率で示される。（Ｃ）は、トランスフェクション終了時の代表的な細胞画像（１００×）を示すものである。
【図７】図７は、小分子活性化ＲＮＡによるｐ２１  ｍＲＮＡの発現の誘導作用及びＨｅｐＧ２細胞の増殖の抑制作用を示すものである。図示された３個の小分子活性化ＲＮＡは、それぞれ１０ｎＭでＨｅｐＧ２細胞を７２時間トランスフェクションした。そのうち、（Ａ）は、ＲT-ｑＰＣＲによるｐ２１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの分析を示すものである。（Ｂ）は、ＣＣＫ-８方法による細胞活力の評価を示し、ｓａＲＮＡ処理群の細胞活力は、対照処理群（Ｍｏｃｋ）の細胞活力に対する百分率で示される。（Ｃ）は、トランスフェクション終了時の代表的な細胞画像（１００×）を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
以下、具体的な説明によって本発明をさらに説明する。
なお、特に断らない限り、本明細書において用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における一般的な技術者が通常理解できる意味と同じ意味を有する。
本願において、単数形となる「１個(a)」、「この(this)」は、特に明記しない限り、その複数形も含む。
【００２３】
定義
本明細書で使用される「相補」という用語は、２本のオリゴヌクレオチド鎖が互いに塩基対を形成する能力を意味する。塩基対は、通常、逆方向に平行となるオリゴヌクレオチド鎖におけるヌクレオチドユニット同士の水素結合により形成される。相補的オリゴヌクレオチド鎖は、Ｗａｔｓｏｎ‐Ｃｒｉｃｋ方式で塩基対合してもよく（例えば、Ａ‐Ｔ、Ａ‐Ｕ、Ｃ‐Ｇ）、又は、二本鎖体の形成を許可するいずれの方式（例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型又は逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対合）で塩基対合してもよい。「１００％対合」又は「完全相補」とは、１００％の相補性を有し、すなわち、２本の鎖のヌクレオチドユニットが全て水素結合で互いに接合していることを意味する。
【００２４】
完全相補又は１００％対合は、二本鎖オリゴヌクレオチド分子の二本鎖領域における第１オリゴヌクレオチド鎖からの各ヌクレオチドユニットが第２オリゴヌクレオチド鎖と「ミスマッチ」無しに水素結合を形成できることを意味する。不完全相補とは、二本鎖のヌクレオチドユニットが全て水素結合で互いに接合することができないことを意味する。例えば、二本鎖領域の長さが２０ヌクレオチドである２本のオリゴヌクレオチド鎖に対しては、各鎖における２つの塩基対のみが互いに水素結合で接合することが可能であると、オリゴヌクレオチド鎖は１０％の相補性を有する。同じ実施例では、各鎖における１８個の塩基対が互いに水素結合で接合することが可能であると、オリゴヌクレオチド鎖は９０％の相補性を有する。基本的相補性とは、約７９％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上の相補性を意味する。
【００２５】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語とは、ヌクレオチドのポリマーをいい、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの一本鎖又は二本鎖分子、規則的や不規則的に交互するデオキシリボース部分及びリボース部分を含むオリゴヌクレオチド鎖、ならびにこれらの種類のオリゴヌクレオチドの修飾及び天然又は非天然に存在する骨格を含むが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２個以上の修飾され又は修飾されていないリボヌクレオチド及び/又はその類似体を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド鎖」及び「オリゴヌクレオチド配列」という用語は、互いに置き換えることが可能であり、５０個以下の塩基を有する短鎖のヌクレオチドの総称である（ヌクレオチドがデオキシリボ核酸ＤＮＡ又はリボ核酸ＲＮＡを含む）。本発明において、オリゴヌクレオチド鎖の長さは、１７〜３０ヌクレオチドのいずれかの長さであってもよい。
【００２８】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、１本のポリペプチド鎖のコード又は１本の機能ＲＮＡの転写に必要な全てのヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」は、宿主細胞に対して内因性、あるいは完全又は部分的に組換えられた遺伝子であってもよい（例えば、コーディングプロモーターを導入した外因性オリゴヌクレオチド及びコード配列、又は内因性コード配列に隣接する異種プロモーターを宿主細胞に導入したもの）。例えば、「遺伝子」は、エクソン及びイントロンで構成される核酸配列を含む。タンパク質をコードする配列は、例えば、開始コドンと終止コドンとの間のオープンリーディングフレームにおけるエクソンに含まれる配列であり、本発明では、「遺伝子」は、他の遺伝子がコード配列又は非コード配列を含むか否かを問わず、例えばプロモーター、エンハンサー等のような遺伝子制御配列及び本分野で知られている他の遺伝子の転写、発現又は活性を制御する他の全ての配列を含むことができる。１つの場合、例えば、「遺伝子」は、例えばプロモーターやエンハンサー等の制御配列を含む機能性核酸の説明に用いることができる。組換え遺伝子の発現は、一種又は多種の異種制御配列により制御することができる。
【００２９】
本明細書で用いられる「標的遺伝子」は、生体内に天然に存在する核酸配列、組換え遺伝子、ウイルス又は細菌配列、染色体又は染色体外及び/又は細胞及び/又はその染色質を一時的又は安定的にトランスフェクション又は混入したものである。標的遺伝子は、タンパク質コード遺伝子であってもよいし、非タンパク質コード遺伝子であってもよい（例えば、マイクロＲＮＡ遺伝子、長鎖非コードＲＮＡ遺伝子）。標的遺伝子は、通常、プロモーター配列を含み、プロモーター配列と同一性（相同性とも言われる）を有する小分子活性化ＲＮＡを設計することにより、標的遺伝子に対するアップレギュレートを実現することができ、標的遺伝子の発現のアップレギュレーションとして表現される。「標的遺伝子プロモーター配列」とは、標的遺伝子の非コード配列を意味し、本発明において「標的遺伝子プロモーター配列と相補する」における標的遺伝子プロモーター配列とは、当該配列のコード鎖（非鋳型鎖とも言われる）、すなわち、当該遺伝子コード配列と同一の核酸配列である。「標的配列」は、標的遺伝子プロモーター配列のうちの小分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと相同又は相補的な配列フラグメントを意味する。
【００３０】
本明細書で使用される「センス鎖」及び「センスオリゴヌクレオチド鎖」という用語は、互いに置き換えることが可能であり、小分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖は、小分子活性化ＲＮＡの二本鎖体のうちの標的遺伝子のプロモーター配列のコード鎖と同一性を有する第１リボ核酸鎖を意味する。
【００３１】
本明細書で使用される「アンチセンス鎖」及び「アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖」という用語は、互いに置き換えることが可能であり、小分子活性化ＲＮＡのアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖は、小分子活性化ＲＮＡの二本鎖体のうちのセンスオリゴヌクレオチド鎖と相補的な第２リボ核酸鎖を意味する。
【００３２】
本明細書で使用される「コード鎖」は、標的遺伝子における転写が不可能な１本のＤＮＡ鎖を指し、該鎖のヌクレオチド配列は、転写により生成されたＲＮＡの配列と一致する（ＲＮＡではＵでＤＮＡにおけるTを置換した）。本発明に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖ＤＮＡ配列のコード鎖は、標的遺伝子ＤＮＡコード鎖と同一のＤＮＡ鎖に存在するプロモーター配列を意味する。
【００３３】
本明細書で使用される「鋳型鎖」とは、標的遺伝子の二本鎖ＤＮＡのうちコード鎖に相補的な他本の鎖であって、鋳型としてＲＮＡに転写可能な鎖を意味し、当該鎖は、転写したＲＮＡ塩基と相補的なものである（Ａ-Ｕ，Ｇ-Ｃ）。転写過程において、ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型鎖に結合し、鋳型鎖の３'−＞５'方向に沿って移動し、５'−＞３'方向に従ってＲＮＡの合成を触媒する。本発明に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖ＤＮＡ配列の鋳型鎖は、標的遺伝子ＤＮＡ鋳型鎖と同一のＤＮＡ鎖に存在するプロモーター配列を意味する。
【００３４】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、タンパク質をコードしない核酸配列を意味し、タンパク質コード又はＲＮＡコード核酸配列と位置的に関連付けることによりそれらの転写に対して調節作用を果たす。通常、真核プロモーターは、１００〜５，０００個の塩基対を含むが、この長さの範囲は、本明細書で使用される「プロモーター」を限定する趣旨ではない。プロモーター配列は、一般的にタンパク質コード又はＲＮＡコード配列の５'末端に位置するが、エキソン及びイントロン配列に存在する場合もある。
【００３５】
本明細書で使用される「転写開始部位」という用語は、遺伝子の鋳型鎖に転写開始を標識するためのヌクレオチドを意味する。転写開始部位は、プロモータ領域の鋳型鎖に出現することができる。１つの遺伝子は、１つ以上の転写開始部位を有することができる。
【００３６】
本明細書で使用される「同一性」又は「相同性」という用語は、小分子活性化ＲＮＡのうちの１本のオリゴヌクレオチド鎖（センス鎖又はアンチセンス鎖）が標的遺伝子のプロモータ配列のある領域のコード鎖又は鋳型鎖と少なくとも75%の類似性を有することを意味する。
【００３７】
本明細書で使用される「突出」、「ｏｖｅｒｈａｎｇ」、「垂下」は、互いに置き換えることができ、オリゴヌクレオチド鎖の末端（５'又は３'）における塩基対合しないヌクレオチドであり、二本鎖オリゴヌクレオチドのうちの１本の鎖からはみ出した他の鎖で産生されるものである。二本鎖体の３'及び/又は５'末端からはみ出した一本鎖領域は、「突出」と称される。
【００３８】
本明細書で使用される「遺伝子活性化」又は「活性化遺伝子」は、互いに置き換えることが可能であり、遺伝子転写レベル、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、酵素活性、メチル化状態、染色質状態又は形態、翻訳レベル、又はそれらの細胞又は生物システムにおける活性又は状態を測定することにより、ある核酸の転写、翻訳又は発現、あるいは活性の増加を測定することを意味する。これらの活動又は状態は、直接的又は間接的に測定することができる。また、「遺伝子活性化」、「活性化遺伝子」は、このような活性化のメカニズムによらず、核酸配列に相関する活性が増加したことを意味し、例えば、調節配列として調節作用を発揮したり、ＲＮＡに転写されたり、タンパク質に翻訳されてタンパク質の発現を増加したりする。
【００３９】
本明細書で使用される「小分子活性化ＲＮＡ」、「ｓａＲＮＡ」、「小活性化核酸分子」は、互いに置き換えることが可能であり、遺伝子発現を促進できるリボ核酸分子であり、標的遺伝子の非コード核酸配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）と配列同一性を有するリボヌクレオチド配列を含む第１リボ核酸鎖（アンチセンス鎖やアンチセンスオリゴヌクレオチド鎖ともいい）、及び第１鎖と相補的なヌクレオチド配列を含む第２リボ核酸鎖（センス鎖、センスストランドやセンスオリゴヌクレオチド鎖ともいい）からなる。そのうち、前記第１鎖と第２鎖により二本鎖体が形成される。小分子活性化ＲＮＡは、合成され又はベクターで発現されるとともに二本鎖領域のヘアピン構造を形成できる一本鎖ＲＮＡ分子で構成されてもよい。そのうち、第１領域は、遺伝子のプロモーター標的配列と配列同一性を有する核酸配列を含み、第２領域に含まれる核酸配列は、第１領域と相補的なものである。小分子活性化ＲＮＡ分子の二本鎖体領域の長さは、通常は約１０個〜約５０個の塩基対、約１２個〜約４８個の塩基対、約１４個〜約４６個の塩基対、約１６個〜約４４個の塩基対、約１８個〜約４２個の塩基対、約２０個〜約４０個の塩基対、約２２個及び約３８個の塩基対、約２４個及び約３６個の塩基対、約２６個及び約３４個の塩基対、約２８個及び約３２個の塩基対であり、通常、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個の塩基対である。また、「ｓａＲＮＡ」、「小分子活性化ＲＮＡ」、「小活性化核酸分子」には、リボヌクレオチド部分以外の核酸も含まれ、修飾されたヌクレオチド又はその類似物が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００４０】
本明細書で使用される「ホットスポット」という用語は、長さが少なくとも３０ ｂｐである遺伝子プロモーター領域を意味する。これらの領域では、機能性小活性化核酸分子標的の凝集が現われ、即ち、これらのホットスポット領域を標的とする小活性化核酸分子の少なくとも６０％は、標的遺伝子ｍＲＮＡの発現が１．５倍以上になるまで誘導することができる。
【００４１】
本明細書で使用される「ｐ２１」という用語は、ｐ２１WAF1/CIP1遺伝子を意味し、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子とも呼ばれ、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤であり、一種の重要な腫瘍抑制遺伝子でもあり、「標的遺伝子」とも呼ばれる。ｐ２１を過剰発現し、又は内因性ｐ２１の転写を活性化することにより、腫瘍細胞及び生体内腫瘍の成長を効果的に抑制することができる。
【００４２】
本明細書で使用される「合成」とは、オリゴヌクレオチドの合成方式を意味し、例えば化学合成、人体外転写、ベクター表現などのＲＮＡを合成可能な任意の方式が含まれる。本発明に提供される小活性化核酸分子の製造方法は、配列設計と配列合成を含む。前記小活性化核酸分子配列の合成は、化学合成の方法を採用してもよく、核酸合成を専門事業とするバイオテクノロジー会社に依頼してもよい。一般的に、前記化学合成の方法は、（１）オリゴリボヌクレオチドの合成ステップ、（２）脱保護ステップ、（３）精製分離ステップ、（４）脱塩及びアニールステップ、を備える。例えば、本発明にかかる二本鎖ＲＮＡ分子、例えばｓａＲＮＡの化学合成の具体的なステップは下記の通りである。
【００４３】
（１）オリゴリボヌクレオチドの合成
自動ＤＮＡ／ＲＮＡ合成機（例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＥＸＰＥＤＩＴＥ８９０９）にて１ミクロモルＲＮＡの合成を設置するとともに、１サイクルのカップリングタイムを１０‐１５分に設置する。固相連結の５'‐Ｏ‐パラジメトキシトリチル‐チミジン支持物を開始剤とし、１回目のサイクルで固相支持物に塩基を連結し、ｎ回目（１９≧ｎ≧２）のサイクルでｎ‐１回目のサイクルで連結された塩基に更に塩基を連結する。このように、全ての核酸配列の合成を完了するまでサイクルを繰り返す。
【００４４】
（２）脱保護
ｓａＲＮＡに連結された固相支持物を試験管に入れ、更にこの試験管にエタノール／アンモニア水溶液（体積比１：３）を１ｍＬ入れた後に、栓をした状態で２５‐７０℃のインキュベータに置き、２‐３０時間インキュベーションする。ｓａＲＮＡの固相支持物が含む溶液をろ過してろ過液を集め、再蒸留水で固相支持物を２回溶出して（１回１ｍＬ）ろ過液を集める。集めた溶出液を合わせて、真空条件で１‐１２時間乾燥させる。その後、テトラブチルアンモニウムフルオリドのテトラヒドロフラン溶液（１Ｍ）を１ｍＬ入れて、室温で４‐１２時間静置し、更にＮ-ブタノールを２ｍＬ入れて、高速遠心分離により沈殿物を集め、ｓａＲＮＡ一本鎖の粗生成物を得た。
【００４５】
（３）精製分離
取得したｓａＲＮＡの粗生成物を１モル／ｍＬ濃度の２ｍＬ酢酸アンモニウム水溶液に溶解させた後に、高圧液体クロマトグラフ逆相Ｃ１８カラムにて分離して、精製したｓａＲＮＡ一本鎖生成物を得た。
【００４６】
（４）脱塩及びアニール
サイズ排除ゲルろ過法で塩分を除去し、センス鎖及びアンチセンス鎖のオリゴリボ核酸一本鎖を同じモル比で１‐２ｍＬの緩衝液（１０ ｍＭ Ｔｒｉｓ，ｐＨ＝７．５‐８．０，５０ ｍＭ ＮａＣｌ）に混ぜる。この溶液を９５℃まで加熱した後、室温までゆっくりと冷却させて、ｓａＲＮＡが含む溶液を得た。
【００４７】
材料及び方法
細胞培養及びトランスフェクション
細胞株ＲＴ４、ＫＵ‐７、Ｔ２４、Ｊ８２、ＴＣＣＳＵＰ及びＨＴ‐１１９７が改良されたＭｃＣｏｙ'ｓ ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）に培養された。細胞株５６３７、ＰＣ３及びＢｅｌ‐７４０２がＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）に培養された。ＵＭ‐ＵＣ‐３細胞株が基礎培地（Ｇｉｂｃｏ）に培養された。全ての培地は、１０％の子ウシ血清（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１％のペニシリン/ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有する。細胞を５％ ＣＯ2、３７℃の条件下で培養した。メーカーの説明に従い、ＲＮＡｉＭａｘ （Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ， Ｃａｒｌｓｂａｄ， Ｃａ）を用いて１０ ｎＭ（特に断らない限り）濃度で実験中に設計された二本鎖ＲＮＡ分子をトランスフェクションした。
【００４８】
ＲＮＡ分離及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
細胞を２‐３×１０5個の細胞／ウェルで６ウェルプレートに接種し、オリゴヌクレオチド二本鎖体をリバーストランスフェクションした。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、その説明書に従って細胞総ＲＮＡを抽出した。ｇＤＮＡ  Ｅｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｌｇａ，Ｊａｐａｎ）を含むＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキットを用いてＲＮＡ（１μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。ｑＰＣＲは、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｌｇａ，Ｊａｐａｎ）試薬を用い、９５℃で３秒間、６０℃で３０秒間である反応条件で４０サイクル増幅した。ＧＡＰＤＨを内部参照とする。全てのプライマー配列を表１に示す。
表１．ｑＲＴ-ＰＣＲ分析のプライマー配列
【表１】
2021520220.tif 000002
【００４９】
細胞増殖測定
細胞を２‐４×１０3個の細胞／ウェルで９６ウェルプレートに敷き、一晩培養して、オリゴヌクレオチド二本鎖体をトランスフェクションした。３日間トランスフェクションした後、ＣＣＫ８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用い、その説明書に従って細胞増殖の検出を行った。実験手順を簡単に説明すると、１０μL  ＣＣＫ８溶液を各ウェルに入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ箇所での吸光度を測定した。
【００５０】
ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０分析
細胞を９６ウェルプレートに敷いてオリゴヌクレオチド二本鎖体をトランスフェクションし、７２時間トランスフェクションした後、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０キット（ＡｆｆｙＭｅｔｒｉｘ）を用いて目標遺伝子ｍＲＮＡレベルを定量的に検出した。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０キットは、交雑技術に基づく方法であり、遺伝子特異的プローブを用いてｍＲＮＡレベルを直接定量するものである。実験手順を簡単に説明すると、分解液を添加してトランスフェクション後の細胞を分解させ、細胞分解物をＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）及びＨＰＲＴ１（ハウスキーピング遺伝子）プローブを内包する捕捉ウェルプレートに入れ、５５℃で一晩交雑した。交雑信号を増強するために、１００μL相当の緩衝液（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０キットから提供）に２．０  ＰＲeＡＭＰ、２．０  ＡＭＰ及び２．０ Ｌａｂｌｅ  Ｐｒｏｂｅと順番に交雑した。全ての交雑はいずれも５０‐５５℃で１時間振盪する。最後に、洗浄した後、２．０ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを加えて室温で５分間インキュベートした。その後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  ＰＲOプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、スイス）を用いて光信号を検出した。
【００５１】
統計分析
結果は、平均値±標準偏差として表される。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて一元配置分散分析を行い、その後Ｔｕｋｅｙ'ｓ ｔ検定を行って統計分析を行った。統計学的有意性の基準は、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、及び***Ｐ＜０．００１と設定した。
【実施例】
【００５２】
以下、実施例によって本発明をさらに説明する。また、実施例は単に本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲又は内容を何ら制限するものではないと解釈されるべきである。
【００５３】
実施例１：ｐ２１遺伝子プロモーター領域を標的とする機能性小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）の選別
ｐ２１遺伝子の発現を活性化できる機能性小分子活性化ＲＮＡを選別するために、ｐ２１遺伝子の１ kｂプロモーター配列をＵＣＳＣ Ｇｅｎｏｍｅデータベースから検索して得た（図１）。転写開始部位（ＴＳＳ）の上流の-１ｋｂ箇所からサイズが１９ ｂｐの標的部位を選定し、１ ｂｐずつ移動するようにＴＳＳ部位へ移動して、合計９８２個の標的配列を得た。標的配列に対して、ＧＣ含有量が６５％超え又は３５％未満であり、かつ、５個以上の連続する同一のヌクレオチドを含む標的配列を排除するようにフィルタ処理を行った。フィルタリング後、残りの４３９個の標的配列は候補として選別プロセスに入る。これらの候補配列により、対応する二本鎖ＲＮＡ分子を化学合成する。そのうち、当該実験で使用される二本鎖ＲＮＡ分子のセンス鎖及びアンチセンス鎖の長さが共に２１ヌクレオチドであり、前記二本鎖ＲＮＡ分子、例えば二本鎖ｓａＲＮＡの第１リボ核酸鎖（センス鎖）の５'領域の１９ヌクレオチドがプロモーター標的配列と１００％の同一性を有し、その３'末端がｄＴｄＴ突出を含む。第２リボ核酸鎖の５'領域の１９ヌクレオチドが第１リボ核酸鎖の３'領域配列の１９ヌクレオチドと完全相補となっており、その３'末端がｄＴｄＴ突出を含む。
【００５４】
前記二本鎖ＲＮＡ分子を１０ ｎＭの最終濃度でＰＣ３前立腺癌細胞にトランスフェクションし、７２時間後、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０キットを用いてｐ２１遺伝子ｍＲＮＡレベルを検出した。ブランク対照処理されたｐ２１ ｍＲＮＡレベルに対する各二本鎖ＲＮＡ分子の倍数変化を算出して図２に示す。該研究において、全ての二本鎖ＲＮＡ分子によるｐ２１遺伝子ｍＲＮＡの倍数変化は、０．６６（抑制）から８．１２（誘導）までの範囲を含む（図２Ｂ）。３６１個（８２．２％）の二本鎖ＲＮＡ分子は、ｐ２１の発現を１．０１〜８．１２倍誘導し、７４個（１６．９％）の二本鎖ＲＮＡ分子は、抑制作用（０．９９〜０．６６倍）を示し、４個の二本鎖ＲＮＡ分子（０．９％）は、ｐ２１遺伝子ｍＲＮＡレベルに対して影響を与えない（１．０倍）。
【００５５】
選別された４３９個の二本鎖ＲＮＡ分子のうち、１３２個の二本鎖ＲＮＡ分子（３０．１％）がｐ２１ ｍＲＮＡを少なくとも２倍まで誘導でき、２２９個（５２．４％）の二本鎖ＲＮＡ分子がｐ２１ ｍＲＮＡを少なくとも１．５倍まで誘導できる。これらのｐ２１ ｍＲＮＡの発現を１０％以上誘導できる二本鎖ＲＮＡ分子はｓａＲＮＡであり、即ち、機能を有するｓａＲＮＡである。これらの機能を有するｓａＲＮＡは、ｐ２１プロモーター領域全体にわたって分散される。しかし、８個の遊離した領域には、機能性小分子活性化ＲＮＡの凝集が見られ、これらの領域は「ホットスポット」と呼ばれる。ホットスポット領域の定義は、１つの領域内に少なくとも１０個の小分子活性化ＲＮＡが含まれ、そのうち、少なくとも６０％の小分子活性化ＲＮＡは、ｐ２１  ｍＲＮＡ発現を１．５倍以上に達するように誘導することができる（図２（Ａ）及び図３）。ホットスポット１〜８の標的配列及び対応する小分子活性化ＲＮＡ配列をそれぞれ表２及び表３に示す。
【００５６】
表２  ｐ２１プロモーターのホットスポット領域の標的配列
【表２】
2021520220.tif 000003
【００５７】
表３ ｐ２１プロモーターのホットスポット領域にある設計された二本鎖ＲＮＡ分子
【表３】
2021520220.tif 000004
2021520220.tif 000005
2021520220.tif 000006
2021520220.tif 000007
2021520220.tif 000008
2021520220.tif 000009
2021520220.tif 000010
2021520220.tif 000011
2021520220.tif 000012
2021520220.tif 000013
2021520220.tif 000014
2021520220.tif 000015
【００５８】
これらのホットスポットでは、ホットスポット領域１と対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の-８９３ ｂｐ〜-８０１ ｂｐであり、その配列が、配列番号９３に示すものであり、この領域には４４個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され（表３及び図３（Ａ））、それぞれは、ＲＡＧ-８３４、ＲＡＧ-８４５、ＲＡＧ-８９２、ＲＡＧ-８４６、ＲＡＧ-８２１、ＲＡＧ-８８４、ＲＡＧ-８６４、ＲＡＧ-８４３、ＲＡＧ-８５４、ＲＡＧ-８４４、ＲＡＧ-８８７、ＲＡＧ-８３８、ＲＡＧ-８５８、ＲＡＧ-８３５、ＲＡＧ-８７６、ＲＡＧ-８７０、ＲＡＧ-８５３、ＲＡＧ-８８１、ＲＡＧ-８２８、ＲＡＧ-８７２、ＲＡＧ-８４１、ＲＡＧ-８３１、ＲＡＧ-８２９、ＲＡＧ-８２０、ＲＡＧ-８２２、ＲＡＧ-８６８、ＲＡＧ-８４９、ＲＡＧ-８６２、ＲＡＧ-８６５、ＲＡＧ-８９３、ＲＡＧ-８４８、ＲＡＧ-８２４、ＲＡＧ-８６６、ＲＡＧ-８４０、ＲＡＧ-８７５、ＲＡＧ-８８０、ＲＡＧ-８７１、ＲＡＧ-８８８、ＲＡＧ-８８５、ＲＡＧ-８９４、ＲＡＧ-８３３、ＲＡＧ-８２５、ＲＡＧ-８８９、ＲＡＧ-８２３である。
【００５９】
ホットスポット領域２（表３、図３（Ｂ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の-７１７〜-６３２ ｂｐであり、その配列が、配列番号９４に示すものであり、この領域には３１個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-６９３、ＲＡＧ-６９２、ＲＡＧ-６８８、ＲＡＧ-６９６、ＲＡＧ-６９４、ＲＡＧ-６８７、ＲＡＧ-６９１、ＲＡＧ-６９０、ＲＡＧ-６８９、ＲＡＧ-６８２、ＲＡＧ-６８６、ＲＡＧ-６６２、ＲＡＧ-６９５、ＲＡＧ-６５４、ＲＡＧ-６５８、ＲＡＧ-６８５、ＲＡＧ-７０４、ＲＡＧ-７１４、ＲＡＧ-７０５、ＲＡＧ-６６１、ＲＡＧ-６５６、ＲＡＧ-６９８、ＲＡＧ-６９７、ＲＡＧ-６５７、ＲＡＧ-７１５、ＲＡＧ-６５２、ＲＡＧ-６５１、ＲＡＧ-６５０、ＲＡＧ-７１６、ＲＡＧ-７１７、ＲＡＧ-７１１である。
【００６０】
ホットスポット３（表３、図３（Ｃ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の‐５８５ ｂｐ〜‐５５１ ｂｐであり、その配列が、配列番号９５に示すものであり、この領域には、９個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-５８０、ＲＡＧ-５７７、ＲＡＧ-５６９、ＲＡＧ-５７６、ＲＡＧ-５７０、ＲＡＧ-５７４、ＲＡＧ-５８５、ＲＡＧ-５７９、ＲＡＧ-５８４である。
【００６１】
ホットスポット４（表３、図３（Ｄ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の‐５５４ ｂｐ〜‐５０５ ｂｐであり、その配列が配列番号９６に示すものであり、この領域には、１７個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-５２４、ＲＡＧ-５５３、ＲＡＧ-５３７、ＲＡＧ-５２６、ＲＡＧ-５５４、ＲＡＧ-５２３、ＲＡＧ-５３４、ＲＡＧ-５４３、ＲＡＧ-５２５、ＲＡＧ-５３５、ＲＡＧ-５４６、ＲＡＧ-５４５、ＲＡＧ-５４２、ＲＡＧ-５３１、ＲＡＧ-５２２、ＲＡＧ-５２９、ＲＡＧ-５５２である。
【００６２】
ホットスポット５（表３、図３（Ｅ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の‐５１４ ｂｐ〜‐４８５ ｂｐであり、その配列が、配列番号９７に示すものであり、この領域には、９個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-５０３、ＲＡＧ-５０４、ＲＡＧ-５０５、ＲＡＧ-５０６、ＲＡＧ-５０７、ＲＡＧ-５０８、ＲＡＧ-５０９、ＲＡＧ-５１０、ＲＡＧ-５１１、ＲＡＧ-５１２、ＲＡＧ-５１３、ＲＡＧ-５１４である。
【００６３】
ホットスポット６（表３、図３（Ｆ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の‐４４２ ｂｐ〜‐４０５ ｂｐであり、その配列が、配列番号９８に示すものであり、この領域には、１２個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-４２７、ＲＡＧ-４３０、ＲＡＧ-４３１、ＲＡＧ-４２３、ＲＡＧ-４２５、ＲＡＧ-４３３、ＲＡＧ-４３５、ＲＡＧ-４３４、ＲＡＧ-４３９、ＲＡＧ-４２６、ＲＡＧ-４２８、ＲＡＧ-４４２である。
【００６４】
ホットスポット７（表３、図３（Ｇ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の‐３５２ ｂｐ〜‐３１３ ｂｐであり、その配列が、配列番号９９に示すものであり、この領域には、１３個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-３３５、ＲＡＧ-３５１、ＲＡＧ-３５２、ＲＡＧ-３３１、ＲＡＧ-３４４、ＲＡＧ-３４２、ＲＡＧ-３４１、ＲＡＧ-３３３、ＲＡＧ-３４５、ＲＡＧ-３４６、ＲＡＧ-３３６、ＲＡＧ-３３２、ＲＡＧ-３４３である。
【００６５】
ホットスポット８（表３、図３（Ｈ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の‐３２５ ｂｐ〜‐２６０ ｂｐであり、その配列が、配列番号１００に示すものであり、この領域には、１８個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-２９４、ＲＡＧ-２８５、ＲＡＧ-２８６、ＲＡＧ-２９２、ＲＡＧ-２９１、ＲＡＧ-２８４、ＲＡＧ-２７９、ＲＡＧ-２８０、ＲＡＧ-３２５、ＲＡＧ-２９３、ＲＡＧ-３２２、ＲＡＧ-３２１、ＲＡＧ-２８１、ＲＡＧ-２８９、ＲＡＧ-２７８、ＲＡＧ-２８３、ＲＡＧ-２８２、ＲＡＧ-２９５である。
【００６６】
ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０の検出結果を検証するために、４３９個の二本鎖ＲＮＡ分子を、ｐ２１ ｍＲＮＡ発現の活性化活性に基づいて４つの群（ｂｉｎ）に分け、各群から５つの二本鎖ＲＮＡ分子をランダムに選び、それぞれをＰＣ３細胞に１０ ｎＭの濃度でトランスフェクションした。７２時間後、細胞総ＲＮＡを抽出して逆転写した後、ＲＴ‐ｑＰＣＲ法を用いてｐ２１遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析した。２種類の方法で得られたｐ２１遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルは、顕著な相関性を示す（Ｒ2=０．８２）（図４）。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０法で得られた全ての機能性ｓａＲＮＡは、いずれもＲＴ‐ｑＰＣＲ方法により真の機能性小分子活性化ＲＮＡであると検証され、そのうちのいくつかの機能性ｓａＲＮＡは、ＲＴ‐ｑＰＣＲ分析においてより強いｐ２１ ｍＲＮＡの発現誘導力を示す（表４）。
【００６７】
表４．  ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０方法に対する検証
【表４】
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【００６８】
以上のように、上記データからは、ｐ２１プロモーター領域における多数の特定部位は、ｓａＲＮＡ標的配列としてｐ２１発現を誘導することができ、そのうちの一部の領域はより高い感受性を持ち、それと対応するｓａＲＮＡがｐ２１発現を活性化させる可能性がより大きいことが示された。
【００６９】
実施例２：ｓａＲＮＡによるｐ２１遺伝子ｍＲＮＡの発現の誘導及び癌細胞の増殖の抑制
ｐ２１ ｓａＲＮＡによるｐ２１遺伝子ｍＲＮＡ発現の誘導作用及び癌細胞増殖の抑制作用をさらに評価するために、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ ２．０によって選別したｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１‐４３１、ＲＡＧ１‐５５３、ＲＡＧ１‐６８８）を癌細胞株ＫＵ‐７（膀胱癌）、ＨＣＴ１１６（結腸癌）及びＨｅｐＧ２（肝細胞癌）にトランスフェクションした。その結果、上記の全ての細胞株において、ｓａＲＮＡは、いずれもｐ２１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを少なくとも２倍に誘導するとともに細胞増殖を抑制することができ、ｓａＲＮＡを介するｐ２１の誘導による効果が示された。具体的には、ＲＡＧ１‐４３１、ＲＡＧ１‐５５３、ＲＡＧ１‐６８８をそれぞれＫＵ７細胞にトランスフェクションし、それぞれがｐ２１ ｍＲＮＡ発現を１４．０、３６．９、３１．９倍誘導し、ブランク処理に対する活着率が７１．７％、６０．７％、６７．４％であった（図５）。ＲＡＧ１‐４３１、ＲＡＧ１‐５５３、ＲＡＧ１‐６８８をそれぞれＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクションし、それぞれがｐ２１ ｍＲＮＡ発現を２．３、３．５及び２．４倍誘導し、ブランク処理に対する活着率が４５．３％、２２．５％、３８．５％であった（図６）。ＲＡＧ１‐４３１、ＲＡＧ１‐５５３、ＲＡＧ１‐６８８をそれぞれＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションし、それぞれがｐ２１ ｍＲＮＡ発現を２．２、３．３及び２．０倍を誘導し、相対ブランク処理による活着率が７６．７％、６４．９％、７９．９％であった（図７）。
【００７０】
関連参照
本明細書に引用された各特許文献及び科学文献の全ての開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
等価
本発明は、その基本的な特徴から逸脱することなく他の具体的な形態で実施することができる。したがって、上記の実施例は、例示的なものであって、本発明を限定するものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記の明細書ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｄ】
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【図３Ｅ−Ｈ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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