(57)【要約】  本開示は、腫瘍特異的標的抗原と結合するためのキメラ抗原受容体に関する。本キメラ抗原受容体は、親タンパク質抗体又はそのフラグメントから進化させた少なくとも１つの抗原特異的標的領域を含み、且つ異常条件下での分析における活性と比較した正常生理条件での分析における活性の低下を含む。キメラ抗原受容体の製造方法もまた提供される。
2021536256.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍特異的標的抗原と結合するためのキメラ抗原受容体であって、
ｉ．  親タンパク質または野生型タンパク質またはそのドメインから進化した少なくとも１つの抗原特異的標的領域であって、正常生理条件での分析における抗原特異的標的領域の活性が、正常生理条件から逸脱した異常条件での分析における活性と比較して、活性が低下している少なくとも１つの抗原特異的標的領域、
ｉｉ．  膜貫通型ドメイン；および
ｉｉｉ．  細胞内シグナル伝達ドメイン
を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項２】
腫瘍特異的標的抗原が、Ａｘｌ、ＲＯＲ２およびＣＤ２２から選択される、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記少なくとも１つの抗原特異的標的領域が、抗体、抗体のフラグメント、一本鎖抗体、二価一本鎖抗体またはダイアボディ、リガンド、リガンドの受容体結合ドメイン、受容体、受容体のリガンド結合ドメイン、およびアフィボディから選択される、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４】
腫瘍特異的標的抗原がＡｘｌであり、少なくとも１つの抗原特異的標的領域が配列番号９〜１２から選択されるアミノ酸配列を有する一本鎖抗体である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項５】
腫瘍特異的標的抗原がＲＯＲ２であり、少なくとも１つの抗原特異的標的領域が配列番号１５のアミノ酸配列を有する一本鎖抗体である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項６】
正常生理条件と異常条件が、温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化ストレス、電解質濃度、有機小分子濃度、無機分子濃度、細胞型、栄養素利用性から選択される同一の条件である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項７】
正常生理条件が、哺乳類である対象の血漿中の正常生理ｐＨであり、異常条件が、腫瘍微小環境中のｐＨである、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項８】
正常生理ｐＨが７．０より高く約７．８までの範囲にある、請求項７に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項９】
正常生理ｐＨが約７．２から約７．６の範囲にある、請求項８に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１０】
異常ｐＨが６．０から７．０未満の範囲である、請求項７に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１１】
異常ｐＨが６．０から約６．８の範囲にある、請求項１０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１２】
細胞外スペーサードメインまたは少なくとも１つの共刺激性ドメインをさらに含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１３】
細胞外スペーサードメインが、抗体のＦｃフラグメント、抗体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１２に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１４】
少なくとも１つの抗原特異的標的領域が、正常生理条件での同じ活性に対する異常条件での活性の比が少なくとも約２である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１５】
少なくとも１つの抗原特異的標的領域が、リンカーで連結された２つの抗原特異的標的領域からなる、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１６】
２つの抗原特異的標的領域が、それぞれ異なる標的抗原または同じ標的抗原の異なるエピトープと結合する、請求項１５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１７】
膜貫通ドメインが、Ｉ型膜貫通タンパク質の人工的な疎水性配列および膜貫通ドメイン、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、およびＣＤ１５４からなる群から選択される、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１８】
細胞内シグナル伝達ドメインが、ヒトＣＤ３ゼータ鎖の細胞質シグナル伝達ドメイン、ＦｃｙＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を有する細胞質受容体、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄからなる群から選択される、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項１９】
ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ１３４、ＤａｐｌＯ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ  ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、およびＢ７−Ｈ３の共刺激性ドメインからなる群から選択される共刺激性ドメインをさらに含む、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項２０】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、発現ベクター。
【請求項２１】
発現ベクターが、レンチウイルスベクター、ガンマレトロウイルスベクター、フォアミーウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、遺伝子工学的に操作されたハイブリッドウイルス、およびトランスポゾン媒介ベクターからなる群から選択される、請求項２０に記載の発現ベクター。
【請求項２２】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む、遺伝子操作された細胞傷害性細胞。
【請求項２３】
少なくとも１つの抗原特異的標的領域、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を製造する方法であって、
ｉ．  親タンパク質、野生型タンパク質、またはそのドメインをコードするＤＮＡを、１つ以上の進化技術を用いて進化させ、変異体ＤＮＡを作成すること、
ｉｉ．  変異体ＤＮＡを発現させて、変異体ポリペプチドを得ること、
ｉｉｉ．  変異体ポリペプチドを、正常生理条件下での分析と、正常生理条件から逸脱した異常条件下での分析に供すること；および
ｉｖ．  工程（ｉｉ）で発現させた変異体ポリペプチドから、正常生理条件での分析における活性が、異常条件での分析における活性と比較して、低下を示す少なくとも１つの抗原特異的標的領域を選択することにより、
腫瘍特異的標的抗原と特異的に結合する親タンパク質または野生型タンパク質またはそのドメインから、少なくとも１つの抗原特異的標的領域を生成する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願データ
本出願は、２０１８年８月２日に出願された米国特許出願第１６／０５３１６６号の一部継続部分であり（現在係属中）、これは順に、現在放棄された米国特許出願第１５／０５２，４８７号の分割であり、これは順に、国際出願第これは、２０１５年８月２７日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ１５／４７１９７の一部継続出願であり、アメリカ合衆国を指定しており、さらに、２０１４年８月２８日に出願された米国仮出願第６２／０４３０６７号（現在は失効）の利益を主張しており、これらすべての出願は、その全体が参照により本明細書に援用される。
【０００２】
本開示は、タンパク質進化の分野に関する。具体的には、本開示は、親または野生型タンパク質から条件的活性型キメラ抗原受容体を生成する方法に関する。本条件的活性型キメラ抗原受容体は、野生型正常生理条件では可逆的又は不可逆的に不活性化されるが、異常条件では活性である。
【背景技術】
【０００３】
タンパク質、特に酵素の種々の特性を進化させる可能性について記載している文献は多数ある。例えば、高温など、異なる条件で動作が安定するように酵素を進化させてもよい。高温で活性が向上する状況では、その向上のかなりの部分は、一般にＱ１０法則（酵素の場合に１０℃の上昇で代謝回転が二倍になると推定される）によって説明されるより高い速度論的活性によるものであり得る。
【０００４】
加えて、その正常な動作条件でタンパク質を不安定化させる天然の突然変異の例がある。ある種の変異体は低温では活性であるものの、そのレベルは親または野生型タンパク質と比較して低いものであり得る。これもまた、典型的にはＱ１０又は同様の法則によって導かれるとおりの活性の低下によって説明される。
【０００５】
条件的に活性化される有用な分子を生成することが望ましい。例えば、野生型動作条件では事実上不活性であるが、野生型動作条件以外では野生型動作条件と同等又はそれより良好なレベルで活性であるか、又はある種の微小環境で活性化又は不活性化されるか、又は時間の経過に伴い活性化又は不活性化される分子を生成することが望ましい。温度に加え、タンパク質を進化させ又は最適化し得る他の条件としては、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化的ストレス及び電解質濃度が挙げられる。進化させる際に最適化し得る他の望ましい特性としては、化学的抵抗性、及びタンパク質分解抵抗性が挙げられる。
【０００６】
分子を進化させ、又は操作するための戦略が多数発表されている。しかしながら、タンパク質が野生型動作条件では不活性又は事実上不活性（１０％未満の活性、好ましくは１％未満の活性）となる一方で、野生型動作条件以外の条件ではその対応する親または野生型タンパク質と同等か又はそれより良好な活性を維持するように操作し、又は進化させるためには、不安定化させる突然変異が、その不安定効果を打ち消すことのない、活性を増加させる突然変異と共存する必要がある。不安定化により、Ｑ１０などの標準法則によって予測される効果を超えてタンパク質の活性が低下するであろうことが予想される。従って、対応する親または野生型タンパク質にとって正常な動作条件下では不活性化される一方で、例えば低温では効率的に働くタンパク質を進化させることが可能になれば、予期せぬ新規クラスのタンパク質が作り出される。
【０００７】
癌の治療にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が用いられている。米国特許出願公開第２０１３／０２８０２２０号明細書は、腫瘍抗原を含めた２つ以上の抗原に特異的なキメラ抗原受容体をコードする改良された細胞を提供する方法及び組成物を開示している。キメラ抗原受容体を発現する細胞は、細胞療法に用いることができる。かかる細胞療法は任意の医学的状態に好適であり得るが、具体的な実施形態では、固形腫瘍が関わる癌を含め、癌の細胞療法である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、正常生理条件では不活性又は低活性であるが、異常生理条件では活性な、操作された条件的活性型キメラ抗原受容体を提供する。
【０００９】
本出願全体を通じて、様々な刊行物が著者及び日付によって参照される。これらの刊行物の開示は、本明細書に説明及び特許請求される開示の日付時点における当業者に公知のとおりの当該分野の技術水準をより十全に説明するため、本明細書によって全体として参照により本出願に援用される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】本発明の一実施形態におけるキメラ抗原受容体の概略図を示す。ＡＳＴＲは抗原特異的標的領域であり、Ｌはリンカーであり、ＥＳＤは細胞外スペーサードメインであり、ＴＭは膜貫通ドメインであり、ＣＳＤは共刺激ドメインであり、及びＩＳＤは細胞内シグナル伝達ドメインである。
【００１１】
【図２】実施例１の条件的活性型抗体が二価又は一価抗体として発現しても、ｐＨ６．０未満及びｐＨ７．４超でこれらの抗体の当該の選択性に有意な変化はないことを示す。
【図３】実施例１の条件的活性型抗体が二価又は一価抗体として発現しても、ｐＨ６．０未満及びｐＨ７．４超でこれらの抗体の当該の選択性に有意な変化はないことを示す。
【００１２】
【図４】実施例２の条件的活性型抗体が凝集しないことを示すサイズ排除クロマトグラフのプロファイルである。
【００１３】
【図５】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって計測したときの実施例２の条件的活性型抗体のオン及びオフ速度を示す。
【００１４】
【図６】Ａ〜Ｂは、実施例２のＳＰＲ分析によって計測したときの条件的活性型抗体の選択性を示す。
【００１５】
【図７Ａ】ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的抗原Ｘ１を発現しないＣＨＯ細胞の集団に何ら効果を及ぼさなかったことを示す。この例のＣＡＲ−Ｔ細胞中のＣＡＲ分子は標的抗原Ｘ１に対する抗体を含んだが、この抗体は条件的活性型ではなかった（比較例Ａ）。
【００１６】
【図７Ｂ】ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的抗原Ｘ１を発現するＣＨＯ−６３細胞の集団を減少させたことを示す。これらのＣＡＲ−Ｔ細胞は、図７Ａに示すデータの生成に使用したものと同じ細胞である（比較例Ａ）。
【００１７】
【図８Ａ】ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的抗原Ｘ１を発現しないＣＨＯ細胞の集団に何ら効果を及ぼさなかったことを示す。この実施例３のＣＡＲ−Ｔ細胞中のＣＡＲ分子は、標的抗原Ｘ１に対する条件的活性型抗体を含んだ。
【００１８】
【図８Ｂ】実施例３で試験したとおり、ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的抗原Ｘ１を発現するＣＨＯ−６３細胞の集団を減少させたことを示す。これらのＣＡＲ−Ｔ細胞は、図８Ａに示すデータの生成に使用したものと同じ細胞である。
【００１９】
【図９】Ａ〜Ｂは、実施例３に記載されるとおり、ＣＡＲ−Ｔ細胞が標的抗原Ｘ１と結合することによって誘導されるサイトカイン放出を示す。
【００２０】
【図１０】標的抗原Ｘ２に対する条件的活性型抗体を示す。
【００２１】
【図１１】Ａ〜Ｂは、実施例４に記載されるとおり、標的抗原Ｘ２を発現するダウディ細胞へのＣＡＲ−Ｔ細胞の結合によって誘導される細胞傷害効果及び標的抗原Ｘ２を発現しないＨＥＫ２９３細胞上のＣＡＲ−Ｔ細胞によって誘導される細胞傷害効果を示す。
【００２２】
【図１２】Ａ〜Ｂは、実施例５に記載されるとおり、ＣＡＲ−Ｔ細胞が標的抗原Ｘ１と結合することによって誘導されるサイトカイン放出を示す。
【００２３】
【図１３】Ａ〜Ｂは、実施例５に記載されるとおり、ＣＡＲ−Ｔ細胞が標的抗原Ｘ２と結合することによって誘導されるサイトカイン放出を示す。
【００２４】
【図１４】ＣＡＲ−Ｔ細胞の構築に好適な標的抗原Ｘ３に対する条件的活性型抗体を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
一態様では、本発明は、腫瘍特異的標的抗原と結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。キメラ抗原受容体は、親タンパク質またはそのドメインから進化した少なくとも１つの抗原特異的標的領域を含んでいる。ＣＡＲはさらに、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインを含んでいる。少なくとも１つの抗原特異的標的領域は、正常生理条件での分析における活性が、異常条件での分析における活性と比較して低下している。
【００２６】
別の態様において、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターを提供する。本発現ベクターは、レンチウイルスベクター、γレトロウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、遺伝子工学的に操作されたハイブリッドウイルス、及びトランスポゾン媒介性ベクターから選択される。
【００２７】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体をコードするポリヌクレオチド配列を含む遺伝子操作された細胞傷害性細胞を提供する。この細胞傷害性細胞はＴ細胞であってもよく、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、及びエフェクターメモリーＴ細胞から選択され得る。
【００２８】
さらに別の態様において、本発明は、本発明のキメラ抗原受容体、発現ベクター、及び／又は遺伝子操作された細胞傷害性細胞と、薬学的に受容可能な賦形剤とを含む医薬組成物を提供する。
【００２９】
さらに別の態様では、本発明は、少なくとも１つの抗原特異的標的領域、膜貫通ドメインおよび細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体を製造する方法を提供する。方法は、腫瘍特異的標的抗原と特異的に結合する親タンパク質またはそのドメインから、少なくとも１つの抗原特異的標的領域を生成する工程を含む。これらには、（ｉ）親タンパク質または野生型タンパク質またはそのドメインをコードするＤＮＡを、１つ以上の進化技術を用いて進化させ、変異体ＤＮＡを作成する工程、（ｉｉ）変異体ＤＮＡを発現させて、変異体ポリペプチドを得る工程、（ｉｉｉ）変異体ポリペプチドを、正常生理条件での分析および異常条件での分析に供する工程、および（ｉｖ）工程（ｉｉｉ）で発現させた変異体ポリペプチドから、異常条件での分析における活性とを比較して、正常生理条件での分析における活性の低下を示す少なくとも１つの抗原特異的標的領域を選択する工程が含まれる。
【００３０】
定義
本明細書に提供される実施例の理解を容易にするために、特定のしばしば登場する方法及び／又は用語は以下に記載される。
【００３１】
測定量と関連して本明細書で使用される用語「約」は、測定を行い、測定の目的に相応の注意レベルと使用される測定機器の精度を行使する当業者によって期待される測定量における通常の変動に関連するものである。特に明記しない限り、「約」は、与えられた値の＋／−１０％の変動に関連する。
【００３２】
用語「薬剤」は、化学化合物、化学化合物の混合物、空間的に局所化された化合物の配列（例えば、ＶＬＳＩＰＳペプチド配列、ポリヌクレオチド配列、及び／又はコンビナトリアル小分子配列）、生体高分子、バクテリオファージペプチドディスプレイライブラリー、バクテリオファージ抗体（例えばｓｃＦＶ）ディスプレイライブラリー、ポリソームペプチドディスプレイライブラリー、又は、バクテリア、植物、菌類又は動物（特に哺乳類）の細胞又は組織のような生体材料からつくられる抽出物を示すのに用いられる。薬剤は、本明細書の以下に記載されているスクリーニング分析に含まれることにより条件的活性型生物学的治療酵素として潜在的酵素活性のために評価される。薬剤は、以下の本明細書の以下に記載されているスクリーニング分析に含まれることにより条件的活性型生物学的治療酵素として潜在的活性のために評価される。
【００３３】
本明細書で使用される用語「アミノ酸」は、アミノ基（−ＮＨ2）及びカルボキシル基（−ＣＯＯＨ）を含む任意の有機化合物である、好適には、自由群又はペプチドの部分として縮合後のどちらでも結合する。「アルファ−アミノ酸を形成する２０種の自然にエンコードされたポリペプチド」は従来技術において知られており、アラニン（ａｌａ又はＡ）、アルギニン（ａｒｇ又はＲ）、アスパラギン（ａｓｎ又はＮ）、アスパラギン酸（ａｓｐ又はＤ）、システイン（ｃｙｓ又はＣ）、グルタミン酸（ｇｌｕ又はＧ）、ヒスチジン（ｈｉｓ又はＨ）、イソロイシン（ｉｌｅ又はＩ）、ロイシン（ｌｅｕ又はＬ）、リシン（ｌｙｓ又はＫ）、メチオニン（ｍｅｔ又はＭ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ又はＦ）、プロリン（Ｐｒｏ又はＰ）、セリン（ｓｅｒ又はＳ）、スレオニン（ｔｈｒ又はＴ）、トリプトファン（ｔｉｐ又はＷ）、チロシン（ｔｙｒ又はＹ）及びバリン（ｖａｌ又はＶ）に関連するものである。
【００３４】
用語「増幅」は、本明細書で使用されるとき、ポリヌクレオチドのコピー数が増加することを意味する。
【００３５】
用語「抗体」は、本明細書で使用されるとき、インタクトな免疫グロブリン分子、並びにＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、及びＳＣＡフラグメントなど、抗原のエピトープとの結合能を有する免疫グロブリン分子のフラグメントを指す。これらの抗体フラグメントは、その由来である抗体の抗原（例えばポリペプチド抗原）に選択的に結合するいくらかの能力を保持しているものであり、当該技術分野において周知の方法を用いて作製することができ（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，前掲を参照）、以下のとおり、さらに説明される。抗体は、イムノアフィニティークロマトグラフィーによる抗原の調製分量の単離に使用することができる。かかる抗体の他の様々な用途は、疾患（例えば新生物形成）の診断及び／又はステージ判定、並びに、例えば、新生物形成、自己免疫疾患、ＡＩＤＳ、心血管疾患、感染症などの疾患を治療するための治療適用である。キメラ抗体、ヒト様抗体、ヒト化抗体又は完全ヒト抗体が、ヒト患者への投与に特に有用である。
【００３６】
Ｆａｂフラグメントは抗体分子の一価抗原結合フラグメントからなり、全抗体分子を酵素パパインで消化して、インタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなるフラグメントを生じさせることによって作製し得る。
【００３７】
抗体分子のＦａｂ’フラグメントは、全抗体分子をペプシンで処理し、続いて還元して、インタクトな軽鎖と重鎖の一部分とからなる分子を生じさせることによって得られ得る。このように処理した抗体分子１つにつき２つのＦａｂ’フラグメントが得られる。
【００３８】
抗体の（Ｆａｂ’）２フラグメントは、続く還元なしに全抗体分子を酵素ペプシンで処理することによって得られ得る。（Ｆａｂ’）２フラグメントは、２つのジスルフィド結合によって一体に保持された２つのＦａｂ’フラグメントの二量体である。
【００３９】
Ｆｖフラグメントは、２本の鎖として発現した軽鎖の可変領域と重鎖の可変領域とを含む遺伝子操作されたフラグメントとして定義される。
【００４０】
用語「抗原」又は「Ａｇ」は、本明細書で使用されるとき、免疫応答を誘発する分子として定義される。この免疫応答には、抗体産生、又は特異的免疫適格細胞の活性化の一方、又は両方が含まれ得る。当業者は、事実上全てのタンパク質又はペプチドを含めた任意の巨大分子が抗原として働き得ることを理解するであろう。さらに、抗原は組換えＤＮＡ又はゲノムＤＮＡに由来することができる。当業者は、従って、免疫応答を誘発するタンパク質をコードするヌクレオチド配列又は部分ヌクレオチド配列を含む任意のＤＮＡが、この用語が本明細書において用いられるとおりの「抗原」をコードすることを理解するであろう。さらに、当業者は、抗原が遺伝子の完全長ヌクレオチド配列によってコードされることに限られる必要はないことを理解するであろう。本発明には、限定はされないが、２つ以上の遺伝子の部分ヌクレオチド配列の使用が含まれ、及びこれらのヌクレオチド配列が、所望の免疫応答を誘発するため様々な組み合わせで配置されることは容易に明らかである。さらに、当業者は、抗原が「遺伝子」によってコードされる必要は全くないことを理解するであろう。抗原が生体試料から生成され、合成されてもよく、又はそれに由来してもよいことは容易に明らかである。かかる生体試料としては、限定はされないが、組織試料、腫瘍試料、細胞又は生体液を挙げることができる。
【００４１】
「抗原欠損エスケープバリアント」は、本明細書で使用されるとき、標的抗原の発現の低下又は欠失を呈する細胞を指し、この抗原は本発明のＣＡＲによって標的化される。
【００４２】
用語「自己免疫疾患」は、本明細書で使用されるとき、自己免疫応答に起因する障害として定義される。自己免疫疾患は、自己抗原に対する不適切で過剰な応答の結果である。自己免疫疾患の例としては、限定はされないが、特に、アジソン病、円形脱毛症（ａｌｏｐｅｃｉａ  ｇｒｅａｔａ）、強直性脊椎炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性耳下腺炎、クローン病、糖尿病（１型）、栄養障害型表皮水疱症、精巣上体炎、糸球体腎炎、グレーブス病、ギラン・バレー（Ｇｕｉｌｌａｉｎ−Ｂａｒｒ）症候群、橋本病、溶血性貧血、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、乾癬、リウマチ熱、関節リウマチ、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、脊椎関節症、甲状腺炎、脈管炎、白斑、粘液水腫、悪性貧血、潰瘍性大腸炎が挙げられる。
【００４３】
用語「自家」は、本明細書で使用されるとき、後に材料を再導入するのと同じ個体から得られた任意の材料を指す。例えば、患者からのＴ細胞は単離され、遺伝子操作されてＣＡＲを発現し、次に患者に再導入され得る。
【００４４】
用語「Ｂ細胞関連疾患」は、本明細書で使用されるとき、Ｂ細胞免疫不全症、Ｂ細胞に関連する自己免疫疾患及び／又は過剰な／制御されない細胞増殖（リンパ腫及び／又は白血病を含む）を含む。本発明の二重特異性ＣＡＲを治療手法に用い得るかかる疾患の例としては、限定はされないが、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、糖尿病、関節リウマチ（ＲＡ）、反応性関節炎、多発性硬化症（ＭＳ）、尋常性天疱瘡、セリアック病、クローン病、炎症性腸疾患、潰瘍性大腸炎、自己免疫性甲状腺疾患、Ｘ連鎖無ガンマグロブリン血症（Ｘ−ｌｉｎｋｅｄ  ａｇａｍｍａｇｌｏｂｕｌｉｎａｅｍｉｓ）、プレＢ急性リンパ芽球性白血病、全身性エリテマトーデス、分類不能型免疫不全症、慢性リンパ性白血病、選択的ＩｇＡ欠損症及び／又はＩｇＧサブクラス欠損症に関連する疾患、Ｂ系列リンパ腫（ホジキンリンパ腫及び／又は非ホジキンリンパ腫）、胸腺腫を伴う免疫不全症、一過性低ガンマグロブリン血症及び／又は高ＩｇＭ症候群、並びにウイルス媒介性Ｂ細胞疾患、例えば、ＥＢＶ媒介性リンパ増殖性疾患、及びＢ細胞が病態生理に関与する慢性感染症が挙げられる。
【００４５】
用語「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」は、たとえ尿素（６０ダルトン）などの極めて小さい分子であっても脳への分子の輸送を制限する緊密な障壁を作り出す、脳毛細血管内皮細胞膜内にタイトジャンクションによって形成される末梢循環と脳及び脊髄との間の生理的障壁を指す。脳内の血液脳関門、脊髄内の血液脊髄関門、及び網膜内の血液網膜関門は、中枢神経系（ＣＮＳ）内の連続的な毛細血管障壁であり、本明細書ではまとめて「血液脳関門」又は「ＢＢＢ」と称される。ＢＢＢにはまた血液脳脊髄液関門（脈絡叢）も包含され、この関門は毛細血管内皮細胞よりむしろ上衣細胞を含む。
【００４６】
用語「癌」及び「癌性」は、本明細書で使用されるとき、典型的には制御されない細胞成長によって特徴付けられる哺乳動物における生理的状態を指し、又はそれを記述する。癌の例としては、限定はされないが、Ｂ細胞リンパ腫（ホジキンリンパ腫及び／又は非ホジキンリンパ腫）、脳腫瘍、乳癌、結腸癌、肺癌、肝細胞癌、胃癌、膵癌、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、尿路癌、甲状腺癌、腎癌、癌腫、黒色腫、頭頸部癌、脳癌、及び限定はされないがアンドロゲン依存性前立腺癌及びアンドロゲン非依存性前立腺癌を含めた前立腺癌が挙げられる。
【００４７】
用語「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」又は「ＣＡＲｓ」は、本明細書で使用されるとき、細胞傷害性細胞、例えばＴ細胞、ＮＫ細胞及びマクロファージに抗原特異性をグラフトする操作された受容体を指す。本発明のＣＡＲは、少なくとも１つの抗原特異的標的領域（ＡＳＴＲ）と細胞外スペーサードメイン（ＥＳＤ）と膜貫通ドメイン（ＴＭ）と１つ又はそれ以上の共刺激ドメイン（ＣＳＤ）と細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）とを含み得る。ある実施形態では、ＥＳＤ及び／又はＣＳＤは任意選択である。別の実施形態において、ＣＡＲは、２つの異なる抗原又はエピトープに特異的な二重特異性ＣＡＲである。ＡＳＴＲが標的抗原に特異的に結合すると、ＩＳＤが細胞内シグナル伝達を活性化する。例えば、ＩＳＤは、抗体の抗原結合特性を利用して、ＭＨＣの制限を受けない形でＴ細胞特異性及び反応性を選択の標的にリダイレクトすることができる。ＭＨＣの制限を受けない抗原認識により、ＣＡＲを発現するＴ細胞は抗原プロセシングと独立した抗原認識能を得るため、従って主要な腫瘍エスケープ機構を回避する。さらに、Ｔ細胞で発現するとき、ＣＡＲは有利には、内因性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）α鎖及びβ鎖と二量化しない。
【００４８】
用語「共発現する」は、本明細書で使用されるとき、２つ以上の遺伝子の同時の発現を指す。遺伝子は、例えば単一タンパク質又は単一ポリペプチド鎖としてのキメラタンパク質をコードする核酸であってもよい。例えば、本発明のＣＡＲを治療対照（例えばトランケート型上皮成長因子（ＥＧＦＲｔ））と共発現させてもよく、ここでＣＡＲは第一ポリヌクレオチド鎖によってコードされ、治療対照は第二ポリヌクレオチド鎖によってコードされる。ある実施形態では、第一及び第二ポリヌクレオチド鎖は、切断可能なリンカーをコードする核酸配列によって連結されている。或いは、ＣＡＲ及び治療対照は、リンカーを介して連結されていない、代わりに例えば２つの異なるベクターによってコードされる２つの異なるポリヌクレオチドによってコードされる。
【００４９】
本明細書で使用される用語「相同」とは、種間に関して進化的及び機能的である遺伝子配列を意味する。例えば、限定はされないが、ヒトの遺伝子において、ヒトＣＤ４遺伝子はマウス３ｄ４遺伝子と相同遺伝子であり、これら２つの遺伝子の配列及び構造は、高い相同性を示し、及び、両遺伝子はＭＨＣクラスＩＩを制限された抗原認識によるＴ細胞活性化の信号を送る際に機能するタンパク質をエンコードする。
【００５０】
用語「条件的活性型生物学的タンパク質」は、１つ以上の正常生理条件下で親または野生型タンパク質よりも活性が高い又は低い親または野生型タンパク質のバリアント、又は変異体を指す。この条件的活性型タンパク質はまた、体の特定の領域で活性を呈し、及び／又は異常な、或いは許容的な生理的条件下で活性の増加又は低下を呈する。用語「正常生理条件」は、本明細書で使用されるとき、対象にとって投与部位における又は作用部位の組織若しくは器官における正常範囲内と見なし得る温度、ｐＨ、浸透圧、重量オスモル濃度、酸化的ストレス、電解質濃度、有機小分子、例えば、グルコース、乳酸、ピルビン酸塩、栄養成分、他の代謝産物などの濃度、別の分子、例えば、酸素、炭酸塩、リン酸塩、及び二酸化炭素などの濃度、並びに細胞型、及び栄養素利用性のうちの１つを指す。
【００５１】
一実施形態では、正常生理条件は哺乳類である対象の血漿中の正常生理ｐＨであり、７．０より高く約７．８まで、または約７．２から約７．８まで、または約７．２から約７．６まで、または約７．３から約７．６まで、または約７．３から約７．５までの範囲内にある。異常条件は腫瘍微小環境のｐＨであり、約６．０から７．０未満、または約６．２から約６．９、または約６．０から約６．８、または約６．２から約６．８、または約６．４から約６．８、または約６．４から約６．６の範囲内である。
【００５２】
用語「異常条件」は、本明細書で使用されるとき、当該の条件について通常認められている範囲から外れる条件を指す。一態様において、条件的活性型生物学的タンパク質は、事実上正常生理条件では不活性であるが、異常条件では、それが由来する親または野生型タンパク質と等しいか又はそれより良好なレベルで活性である。例えば、一態様において、進化させた条件的活性型生物学的タンパク質は事実上体温で不活性であるが、それより低い温度では活性である。別の態様において、条件的活性型生物学的タンパク質は正常生理条件で可逆的又は不可逆的に不活性化される。更なる態様において、親または野生型タンパク質は治療用タンパク質である。別の態様において、条件的活性型生物学的タンパク質は、薬物、又は治療剤として使用される。更に別の態様において、このタンパク質は、例えば肺通過後など、高度に酸素化した血液中又は腎臓に見られるより低いｐＨ環境では活性がより高いか、又はより低い。
【００５３】
「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシン、カルボン酸側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びトレオニン、アミドを含む側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミン、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファン、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、アルギニン、及びヒスチジン、及び、含硫側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンである。好適な保存的アミノ酸置換群は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リシン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００５４】
用語「対応する」は、本明細書において、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全て又は一部に対して相同である（つまり、厳密に進化的に関連がなくても同一である）、又は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列と同一であることを意味する。これと対比的に、用語「相補的」は、本明細書において、相補的配列が参照ポリヌクレオチド配列の全て又は一部に対して相同であることを意味する。例えば、ヌクレオチド配列が「ＴＡＴＡＣ」は参照「ＴＡＴＡＣ」に対応し、参照配列「ＧＴＡＴＡ」に対して相補的である。
【００５５】
用語「共刺激リガンド」は、本明細書で使用されるとき、抗原提示細胞上（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞など）の分子であって、Ｔ細胞上のコグネイト共刺激分子に特異的に結合し、それによって、例えばペプチドを担持したＭＨＣ分子とのＴＣＲ／ＣＤ３複合体の結合により提供される一次シグナルに加えて、限定はされないが、増殖、活性化、分化などを含めたＴ細胞応答を媒介するシグナルを提供する分子を含む。共刺激リガンドには、限定はされないが、ＣＤ７、Ｂ７−１（ＣＤ８０）、Ｂ７−２（ＣＤ８６）、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、４−１ＢＢＬ、ＯＸ４０Ｌ、誘導性共刺激リガンド（ＩＣＯＳ−Ｌ）、細胞間接着分子（ＩＣＡＭ）、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ８３、ＨＬＡ−Ｇ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＨＶＥＭ、リンホトキシンβ受容体、３／ＴＲ６、ＩＬＴ３、ＩＬＴ４、ＨＶＥＭ、Ｔｏｌｌリガンド受容体に結合するアゴニスト又は抗体及びＢ７−Ｈ３と特異的に結合するリガンドが含まれ得る。共刺激リガンドにはまた、特に、限定はされないが、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、及びＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなど、Ｔ細胞上に存在する共刺激分子と特異的に結合する抗体も包含される。
【００５６】
用語「共刺激分子」は、本明細書で使用されるとき、共刺激リガンドと特異的に結合して、それによりＴ細胞による共刺激応答、例えば、限定はされないが増殖を媒介するＴ細胞上のコグネイト結合パートナーを指す。共刺激分子としては、限定はされないが、ＭＨＣクラス１分子、ＢＴＬＡ及びＴｏｌｌリガンド受容体が挙げられる。
【００５７】
用語「共刺激シグナル」は、本明細書で使用されるとき、ＴＣＲ／ＣＤ３ライゲーションなどの一次シグナルとの組み合わせでＴ細胞増殖及び／又は鍵分子の上方制御若しくは下方制御をもたらすシグナルを指す。
【００５８】
用語「細胞傷害性細胞」は、本明細書で使用されるとき、侵入微生物、腫瘍細胞又は他の罹患組織細胞に傷害を与え、又はそれを破壊することのできる細胞を意味する。この用語は、数ある細胞型の中でも特に、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、活性化ＮＫ細胞、好中球、Ｔ細胞、好酸球、好塩基球、Ｂ細胞、マクロファージ及びリンホカイン活性化キラー（ＬＡＫ）細胞を含むことが意図される。細胞傷害性細胞は、抗体、受容体、リガンド又はそのフラグメント／誘導体を介して標的細胞に結合することにより安定複合体を形成し、細胞傷害性細胞を刺激して標的細胞を破壊する。
【００５９】
細胞傷害性細胞にはまた、限定はされないが、ナチュラルキラーＴ細胞（Ｈｅｃｚｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎｖａｒｉａｎｔ  ＮＫＴ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｖｉｄｅ  ａ  ｎｏｖｅｌ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓａｆｅ  ａｎｄ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，”Ｂｌｏｏｄ，ｖｏｌ．１２４，ｐｐ．２８２４−２８３３，２０１４）及び顆粒球を含めた、腫瘍溶解能を有する他の免疫細胞も含まれ得る。さらに、細胞傷害性細胞には、限定はされないが、マクロファージ及び顆粒球、幹細胞及び／又は前駆細胞特性を有する細胞、例えば、限定はされないが、造血幹／前駆細胞（Ｚｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ＨＩＶ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒｏｍ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，”Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．，ｖｏｌ．２３，ｐｐ．１３５８−１３６７，２０１５）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、臍帯血幹細胞、及び人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）（Ｔｈｅｍｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｎｅｗ  ｃｅｌｌ  ｓｏｕｒｃｅｓ  ｆｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，”Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．，ｖｏｌ．１６，ｐｐ．３５７−３６６，２０１５）を含めた、貪食能を有する免疫細胞が含まれ得る。加えて、細胞傷害性細胞には、ｉＰＳＣ由来Ｔ細胞（ＴｉＰＳＣ）（Ｔｈｅｍｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ｆｒｏｍ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．３１，ｐｐ．９２８−９３３，２０１３）又はｉＰＳＣ由来ＮＫ細胞などの「合成細胞」が含まれる。
【００６０】
用語「分解有効」量は、基質を酵素に接触させない場合と比較したとき、基質の少なくとも５０％を処理するのに必要な酵素の量を指す。
【００６１】
用語「ディレクショナルライゲーション」は、ポリヌクレオチドの５’末端及び３’末端が好ましいライゲーション方向を特定するのに十分に異なるライゲーションを指す。例えば、２つの平滑末端を有する他の点では未処置且つ未消化のＰＣＲ産物は、典型的には、その多重クローニング部位において平滑末端を生じるように消化されたクローニングベクターにライゲーションするとき、好ましいライゲーション方向を有しない；従って、このような状況下では典型的にはディレクショナルライゲーションが示されることはない。対照的に、典型的には、５’ＥｃｏＲ  Ｉ処理末端及び３’ＢａｍＨ  Ｉを有する消化ＰＣＲ産物が、ＥｃｏＲ  Ｉ及びＢａｍＨ  Ｉで消化される多重クローニング部位を有するクローニングベクターにライゲーションされるとき、ディレクショナルライゲーションが示される。
【００６２】
用語「遺伝子修飾された細胞傷害性細胞によって標的化される疾患」は、本明細書で使用されるとき、その遺伝子修飾細胞が治療上有益な結果をもたらすために罹患細胞を標的にするか、それとも健常細胞を標的にするかに関わらず、いかなる形であれ任意の疾患に関与する任意の細胞を本発明の遺伝子修飾細胞によって標的化することを包含する。遺伝子修飾細胞には、限定はされないが、遺伝子修飾Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージが含まれる。遺伝子修飾細胞は本発明のＣＡＲを発現し、ＣＡＲは、標的細胞の表面上に発現する抗原のいずれかを標的化し得る。標的化され得る抗原の例としては、限定はされないが、Ｂ細胞上に発現する抗原；癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、及び芽細胞腫上に発現する抗原；様々な免疫細胞上に発現する抗原；及び様々な血液疾患、自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患に関連する細胞上に発現する抗原が挙げられる。標的化され得る他の抗原が当業者には明らかであり、本発明の代替的実施形態に関連して本発明のＣＡＲにより標的化され得る。
【００６３】
用語「遺伝子修飾細胞」、「リダイレクト細胞」、「遺伝子操作細胞」又は「修飾細胞」は、本明細書で使用されるとき、本発明のＣＡＲを発現する細胞を指す。
【００６４】
用語「ＤＮＡシャフリング」は、実質的に相同ではあるが、同一ではない配列間での組換えを示すために本明細書において使用され、実施形態によっては、ＤＮＡシャフリングは、ｃｅｒ／ｌｏｘ及び／又はｆｌｐ／ｆｒｔシステムなどを介してのように、非相同組換えを介しての乗換えを含むことがある。
【００６５】
用語「薬剤」又は「薬剤分子」は、ヒト又は動物の体に投与された際に、ヒト又は動物の体に有益な効果を有する物質を含む治療剤を意味する。好適には、当該薬剤は、１つ又はそれ以上の症状、病気、又は、ヒト又は動物の体における異常条件を治療する、治す又は緩和する、又は、ヒト又は動物の体の健康を増進させることができるものである。
【００６６】
「有効量」は、若干の期間にわたって投与された者の生存生物における条件を治療する又は防止する、例えば、所望の投薬期間の間に治療的な効果を提供するのに有効的である、条件的活性型生物学的タンパク質又はフラグメントの量のことである。
【００６７】
用語「電解質」は、血液又は電荷を運搬する他の体液内の鉱物を定義するために本明細書で使用される。例えば、一態様において、正常生理条件及び異常条件は、「電解質濃度」の条件であることがある。一態様において、試験される電解質濃度は、イオン化されたカルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、塩化物、重炭酸塩、及びリン酸塩濃度の１つ又はそれ以上から選択される。例えば、一態様において、血清カルシウムの通常範囲は、８．５〜１０．２ｍｇ／ｄＬである。この態様において、異常血清カルシウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清塩化物は１リットルあたり９６〜１０６ミリグラム当量（ｍＥｑ／Ｌ）である。この態様において、異常血清塩化物濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清マグネシウム濃度の通常範囲は１．７〜２．２ｍｇ／ｄＬである。この態様において、異常血清マグネシウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清リン酸塩の通常範囲は、２．４〜４．１ｍｇ／ｄＬである。この態様において、異常血清リン酸塩濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清又は血液のナトリウムの通常範囲は１３５〜１４５ｍＥｑ／Ｌである。この態様において、異常血清又は血液ナトリウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。他の実施例で、一態様において、血清又は血液カリウムの通常範囲は、３．７〜５．２ｍＥｑ／Ｌである。この態様において、異常血清又は血液カリウム濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。さらなる態様において、血清重炭酸塩の通常範囲は２０〜２９ｍＥｑ／Ｌである。この態様において、異常血清又は血液重炭酸塩濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。異なる態様において、重炭酸塩レベルは、血液における酸性の通常レベル（ｐＨ）を示すために使用されることがある。用語「電解質濃度」は、組織、又は、血液又は血漿以外の体液における特定の電解質濃度を定義するためにも使用されることがある。この場合において、正常生理条件は、その組織又は体液において臨床的通常範囲であるように考慮される。この態様において、異常組織又は体液電解質濃度は、通常範囲の上又は下から選択されることがある。
【００６８】
本明細書で使用される用語「抗原決定基」は、酵素ポリペプチドのような抗原上の抗原性決定要素に関連する。そして、酵素特異抗体のような抗体の抗原結合部位が結合する。抗原決定基は通常、アミノ酸又は当側鎖のような分子の化学表面活性分属からなり、及び、特異３次元構造性質も特異的な電荷性を有することがある。本明細書で使用されているように、「抗原決定基」は、抗原のその部分又は抗体の本体と結合する可変領域と相互に作用する結合相互佐用を形成することができる他の巨大分子を意味する。典型的には、このような結合相互作用は、１つ又はそれ以上のＣＤＲのアミノ酸残基との分子間作用として明らかにされる。
【００６９】
本明細書で使用されるとき、用語「進化」、又は「進化している」は、１つ以上の突然変異誘発方法を用いて、新規ポリペプチドをコードする新規ポリヌクレオチドを生成することを指し、この新規ポリペプチドはそれ自体が改良された生物学的分子であり、及び／又は別の改良された生物学的分子の生成に寄与する。詳細な非限定的態様において、本開示は、親又は野生型タンパク質からの条件的活性型生物学的タンパク質の進化に関する。一態様において、例えば、進化は、米国特許出願公開第２００９／０１３０７１８号明細書に開示される非確率的ポリヌクレオチドキメラ化及び非確率的部位特異的点突然変異誘発の両方を実施する方法に関する。より詳細には、本開示は、正常生理条件では親又は野生型酵素親分子と比較して活性の低下を呈するが、１つ以上の異常条件下では親又は野生型酵素の抗原特異的標的領域と比較して活性の亢進を呈する条件的活性型生物学的酵素を進化させる方法を提供する。
【００７０】
用語「フラグメント」、「誘導体」及び「相似器官」は、参照ポリペプチドを参照する際に、少なくとも１つの、少なくとも本質的に参照ポリペプチドと同じ生理機能又は活性を保有するポリペプチドを有する。さらに、用語「フラグメント」、「誘導体」及び「相似器官」は、著しく高い活性を有する成熟した酵素を生成するために開裂により修飾され得る低活性前駆タンパク質のような「前形態」分子によって例示される。
【００７１】
本明細書で使用される用語「遺伝子」はポリペプチド鎖の生成において含まれるＤＮＡセグメントを意味し、個々のコーディングセグメント（エキソン）間に介在配列（ニトロン）と同様にコーディング領域（リーダー及びトレーダー）を先行する、及び、続く領域を含む。
【００７２】
本明細書で使用される用語「非相同」は、一本鎖核酸配列が、他の一本鎖核酸配列又はその相補的配列にハイブリダイズできないことを意味する。したがって、非相同な部分は、ポリヌクレオチド又はポリヌクレオチドが、他の核酸又はポリヌクレオチドにハイブリダイズできない配列における部分又は領域を有することを意味する。このような領域又は部分は例えば変異の部分である。
【００７３】
本明細書で使用される用語「相同」又は「相同」は、一本鎖核酸配列が相補的な一本鎖核酸配列にハイブリダイズできることを意味する。ハイブリダイゼーションの程度は、配列間の同一性の量、及び、後述するような温度及び塩濃度のようなハイブリダイゼーション条件を含む要因の数によることがある。好適には、同一の領域が約５ｂｐより大きく、さらに好適には、同一の領域が１０ｂｐよりも大きい。
【００７４】
本開示の利益は「産業的応用」（又は産業的工程）にまで及び、用語は、非商業的な産業的応用（例えば、非営利機関での正医学的調査）と同様に、適切な商業的な産業的（又は単に産業的な）応用を含むために用いられる。関連する応用には、診断、医学、農業、製造及び学究的世界の分野を含む。
【００７５】
用語「免疫細胞」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、抗原提示細胞、Ｂ細胞、好塩基球、細胞傷害性Ｔ細胞、樹状細胞、好酸球、顆粒球、ヘルパーＴ細胞、白血球、リンパ球、マクロファージ、マスト細胞、メモリー細胞、単球、ナチュラルキラー細胞、好中球、食細胞、形質細胞及びＴ細胞を含めた哺乳類免疫系の細胞を指す。
【００７６】
用語「免疫応答」は、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、自然免疫、体液性免疫、細胞性免疫、免疫、炎症反応、獲得（適応）免疫、自己免疫及び／又は過剰反応免疫を含めた免疫を指す。
【００７７】
用語「単離されている」は、本明細書で使用されるとき、材料がその元の環境（例えば、それが天然に存在する場合には自然環境）から取り出されていることを意味する。例えば、生きている動物が持つ天然に存在するポリヌクレオチド又は酵素は単離されていないが、自然系内で共存する材料の一部又は全てから分離されている同じポリヌクレオチド又は酵素は、単離されている。かかるポリヌクレオチドはベクターの一部であってもよく、及び／又はかかるポリヌクレオチド又は酵素は組成物の一部であってもよく、かかるベクター又は組成物がその自然環境の一部でない点でなおも単離されている。
【００７８】
本明細書で使用される用語「分離された核酸」は核酸、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ分子を定義するのに用いられる。ＤＮＡ又はＲＮＡ分子のような核酸は、それが誘導される有機体の自然発生遺伝子において存在するときに通常直接に隣接する５’及び３’隣接配列に、直接隣接しない。従って、用語は、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、異種細胞の遺伝子内（又は異種細胞の遺伝子ではあるが、自然は生のものとは異なる部位）に組み込まれた核酸、及び、例えばＰＣＲ増幅又は制限酵素消化によってつくられたＤＮＡフラグメント、又は、生体外転写でつくられたＲＮＡ分子のような分離された分子として存在する核酸のように、ベクター内に組み込まれる核酸を言い表す。この用語はまた、例えば溶融タンパク質の製造において用いることができる付加的タンパク質をエンコードする交雑遺伝子の一部を形成する組換え核酸も意味する。
【００７９】
用語「レンチウイルス」は、本明細書で使用されるとき、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）の属を指す。レンチウイルスは、レトロウイルスの中でも、非分裂細胞を感染させることができる点でユニークである；レンチウイルスは宿主細胞のＤＮＡに多量の遺伝情報を送達することができ、従ってレンチウイルスは、最も効率的な遺伝子デリバリーベクター送達方法の一つである。ＨＩＶ、ＳＩＶ、及びＦＩＶは、全てレンチウイルスの例である。レンチウイルスに由来するベクターは、インビボで高い遺伝子導入レベルを実現するための手段を提供する。
【００８０】
用語「リガンド」は、本明細書で使用されるとき、特定の受容体によって認識される分子、例えばランダムペプチド又は可変セグメント配列を指す。当業者は認識するであろうとおり、分子（又は巨大分子複合体）は受容体及びリガンドの両方であり得る。一般に、より小さい分子量を有する結合パートナーがリガンドと称され、より大きい分子量を有する結合パートナーが受容体と称される。
【００８１】
用語「ライゲーション」は、本明細書で使用されるとき、２つの二本鎖核酸フラグメントの間におけるリン酸ジエステル結合の形成過程を指す（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８２）．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ．，ｐ．１４６；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，２nd  Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９８９）。特に提供されない限り、ライゲーションは、ライゲーションする０．５マイクログラムの略等モル量のＤＮＡフラグメント当たり１０単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ（「リガーゼ」）とする公知の緩衝液及び条件を用いて達成し得る。
【００８２】
用語「リンカー」又は「スペーサー」は、本明細書で使用されるとき、２つの分子、例えばＤＮＡ結合タンパク質及びランダムペプチドをつなぐ分子又は分子群であって、例えば、ランダムペプチドがＤＮＡ結合タンパク質からの立体障害を最小限として受容体に結合することができるように、それらの２つの分子を好ましい配置に置く働きをする分子又は分子群を指す。「リンカー」（Ｌ）又は「リンカードメイン」又は「リンカー領域」は、本明細書で使用されるとき、本発明のＣＡＲの任意のドメイン／領域を一体に連結する約１〜１００アミノ酸長のオリゴペプチド又はポリペプチド領域を指す。リンカーは、隣接するタンパク質ドメイン同士が互いに自由に動くことができるように、グリシン及びセリンなどの可動性の残基で構成されてもよい。２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないようにすることが望ましい場合、より長いリンカーが用いられ得る。リンカーは切断可能又は切断不可能であってもよい。切断可能リンカーの例としては、２Ａリンカー（例えばＴ２Ａ）、２Ａ様リンカー又はその機能的等価物、及びこれらの組み合わせが挙げられる。一部の実施形態において、リンカーとしては、ピコルナウイルス２Ａ様リンカー、ブタテッショウウイルスのＣＨＹＳＥＬ配列（Ｐ２Ａ）、トセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルス（Ｔ２Ａ）又はこれらの組み合わせ、バリアント及び機能的等価物が挙げられる。当業者には他のリンカーが明らかであり、本発明の代替的な実施形態に関連して用いることができる。
【００８３】
用語「哺乳類細胞表面ディスプレイ」は、本明細書で使用されるとき、スクリーニング目的で（例えば、磁気ビーズと蛍光活性化細胞選別との組み合わせによって特異的抗原結合に関してスクリーニングすることによる）、タンパク質又は抗体、又は抗体の一部分を哺乳類宿主細胞表面に発現させて提示する技法を指す。一態様では、ＤｕＢｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開第２００９／０１３６９５０号明細書にあるとおり、哺乳類発現ベクターを使用して免疫グロブリンを分泌型及び細胞表面結合型の両方として同時に発現させる。別の態様では、この技法が、Ｇａｏ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許出願公開第２００７／０１１１２６０号明細書にあるとおり、細胞で発現すると細胞膜上に提示される抗体又は抗体フラグメントのライブラリをコードするウイルスベクターのスクリーニングに用いられる。哺乳類細胞上の全ＩｇＧ表面ディスプレイが公知である。例えば、Ａｋａｍａｔｓｕｕ  ｅｔ  ａｌ．は、ＩｇＧ分子をその抗原結合親和性及び生物学的活性に基づき直接単離するのに好適な哺乳類細胞表面ディスプレイベクターを開発した。エプスタイン・バーウイルス由来のエピソームベクターを使用して抗体ライブラリが細胞表面上に全ＩｇＧ分子として提示され、磁気ビーズと蛍光活性化細胞選別との組み合わせによって特異的抗原結合に関してスクリーニングされた。選別された細胞から所望の結合特性を有する抗体をコードするプラスミドが回収され、可溶性ＩｇＧの産生に好適な形態に変換された。Ａｋａｍａｔｓｕｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．３２７，ｐａｇｅｓ  ４０−５２，２００７を参照のこと。Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．は、親和性成熟のための単鎖Ｆｖ抗体の細胞表面ディスプレイに、一過性のタンパク質発現に広く用いられているヒト胎児腎臓２９３Ｔ細胞を使用した。親和性がやや低いＷＴ抗体を発現する大過剰の細胞から、より高い親和性を有するまれな変異体抗体を発現する細胞が、シングルパスの細胞選別によって２４０倍エンリッチされた。さらに、固有の抗体ホットスポットをランダム化するコンビナトリアルライブラリの１回の選択後に、ＣＤ２２に対する結合親和性が増加した、高度にエンリッチされた変異体が得られた。Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＣＤ２２  Ｆｖ  ｗｉｔｈ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｂｙ  Ｆｖ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｏｎ  ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，ｖｏｌ．１０３，ｐａｇｅｓ  ９６３７−９６４２，２００６を参照のこと。
【００８４】
抗原に特異的なＢ細胞もまた使用することができる。かかるＢ細胞は、ヒトドナーの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から直接単離し得る。このＢ細胞プールから組換え抗原特異的単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）ライブラリを作成し、シンドビスウイルス発現系を使用することにより哺乳類細胞表面ディスプレイによってスクリーニングする。陽性クローンから重鎖（ＨＣ）及び軽鎖（ＬＣ）の可変領域（ＶＲ）を単離し、全ＩｇＧ又はＦａｂフラグメントとして組換え完全ヒト抗体を産生することができる。このようにして、モデルウイルス抗原のＱβウイルス様粒子（ＶＬＰ）を結合するいくつかの超変異高親和性抗体、並びにニコチンに特異的な抗体を単離することができる。Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｙ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｐｌａｙ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，ｖｏｌ．１０５，ｐａｇｅｓ  １４３３６−１４３４１，２００８を参照のこと。
【００８５】
酵母細胞表面ディスプレイもまた本発明において使用することができ、例えば、Ｋｏｎｄｏ  ａｎｄ  Ｕｅｄａ，“Ｙｅａｓｔ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｄｉｓｐｌａｙ，”Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．６４，ｐａｇｅｓ  ２８−４０，２００４を参照されたく、これは、例えば、酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）を使用した細胞表面エンジニアリングシステムについて記載している。酵母Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現用のいくつかの代表的なディスプレイシステムが、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ  ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ，”ＴＲＥＮＤＳ  ｉｎ  Ｂｉｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ  ４５−５２，２００３に記載されている。また、Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ，“Ｙｅａｓｔ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｄｉｓｐｌａｙ  ｆｏｒ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ  ｌｉｂｒａｒｉｅｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５，ｐａｇｅｓ  ５５３，１９９７。
【００８６】
用語「製造する」は、本明細書で使用されるとき、治療用タンパク質の少なくとも第Ｉ相臨床試験を可能にするのに十分な分量、又は診断用タンパク質の規制当局の承認に十分な分量でタンパク質を作製することを指す。
【００８７】
本明細書で使用されるとき、用語「微小環境」は、組織又は体において、組織の他の領域又は体の他の領域と恒常的又は一時的な物理的又は化学的違いを有する任意の部分又は領域を意味する。
【００８８】
本明細書で使用されるとき、用語「進化させる分子特性」には、ポリヌクレオチド配列を含む分子、ポリペプチド配列を含む分子、及び部分的にポリヌクレオチド配列を含み、且つ部分的にポリペプチド配列を含む分子への言及が含まれる。進化させる分子特性の特に関連性のある（但し何ら限定するものではない）例としては、温度；塩分；浸透圧；ｐＨ；酸化的ストレス、及びグリセロール濃度、ＤＭＳＯ濃度、界面活性剤濃度、及び／又は反応環境において接触する任意の他の分子種に関する等、特定の条件におけるタンパク質活性が挙げられる。進化させる分子特性のさらなる特に関連性のある（但し何ら限定するものではない）例としては、安定性−例えば、貯蔵中に直面し得るような特定の環境に特定の時間曝露した後に存在する残留分子特性の量が挙げられる。
【００８９】
用語「突然変異」は、本明細書で使用されるとき、野生型核酸配列の配列の変化又はペプチドの配列の変化を意味する。かかる突然変異は、転移又は転換などの点突然変異であり得る。突然変異は欠失、挿入又は重複であり得る。
【００９０】
用語「多重特異性抗体」は、本明細書で使用されるとき、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合親和性を有する抗体である。多重特異性抗体は完全長抗体又は抗体フラグメント（例えばＦ（ａｂ’）2二重特異性抗体）として調製することができる。操作された抗体は、２つ、３つ又はそれ以上（例えば４つ）の抗原に結合し得る（例えば、米国特許出願公開第２００２／０００４５８７  Ａ１号明細書を参照）。１つの条件的活性型抗体が多重特異性となるように操作されてもよく、又は２つの抗体が、２つの抗原に結合するヘテロ二量体を含むように操作されてもよい。多重特異性抗体はまた、多機能性でもあり得る。
【００９１】
本明細書で使用されるとき、縮重「Ｎ，Ｎ，Ｇ／Ｔ」ヌクレオチド配列は、３２個の可能なトリプレットを表し、ここで「Ｎ」はＡ、Ｃ、Ｇ又はＴであり得る。
【００９２】
用語「自然発生」は、本明細書で使用されているように、対象が自然においてみられるという事実に関連して適用されるものである。例えば、自然において原料から分離され得る有機体（ウイルスを含む）に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列で、実験室内で人によって意図的に修飾されたのではないものは自然発生である。一般的に、用語「自然発生」は、種において典型的であるように、非病理学的な（病気ではない）個体において存在するような対象に関連する。
【００９３】
本明細書で使用されるように、「正常生理条件」又は「野生型操作条件」は、対象への投与の部位又は作用部位での通常範囲内で考慮される温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス及び電解質濃度の条件である。
【００９４】
本明細書で使用されるように、「核酸分子」は、一本鎖又は二本鎖であるかによって、それぞれ少なくとも一塩基又は一塩基対からなる。さらに、核酸分子は、非限定ではあるが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、遺伝子核酸、非遺伝子核酸、自然発生及び非自然発生核酸、及び合成核酸など核酸分子の群などのような分子を含むヌクレオチドの任意の群にのみ、又はキメラ的に属することができる。これは、非限定的な実施例として、ミトコンドリア、リボソームＲＮＡ、及び、１つ又はそれ以上の自然発生の成分と自然発生ではない成分からキメラ的になる核酸分子のような任意の細胞小器官に関連した核酸を含む。
【００９５】
加えて、「核酸分子」は、限定はされないがアミノ酸及び糖類によって例示されるとおりの１つ以上の非ヌクレオチドベースの成分を一部に含み得る。従って、例として、限定されないが、一部がヌクレオチドベースであり、且つ一部がタンパク質ベースであるリボザイムは、「核酸分子」と見なされる。
【００９６】
用語「〜をコードする核酸配列」又は「〜のＤＮＡコード配列」又は「〜をコードするヌクレオチド配列」は、本明細書で使用されるとき、プロモーターなどの適切な調節配列の制御下に置かれたとき転写及び翻訳されて酵素になるＤＮＡ配列を指す。「プロモーター」は、細胞においてＲＮＡポリメラーゼに結合して、下流（３’方向）コード配列の転写を開始する能力を有するＤＮＡ調節領域である。プロモーターはＤＮＡ配列の一部である。この配列領域は、その３’末端に開始コドンを有する。プロモーター配列は、バックグラウンドを上回る検出可能なレベルで転写の開始に必要な最小数のエレメントであるところの塩基を含む。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼが配列に結合し、開始コドン（プロモーターを有する３’末端）で転写が始まった後、転写は３’方向に下流に進む。プロモーター配列内には、転写開始部位（好都合にはヌクレアーゼＳ１でマッピングすることによって定義される）並びにＲＮＡポリメラーゼの結合に関与するタンパク質結合ドメイン（コンセンサス配列）が見られる。
【００９７】
用語「オリゴヌクレオチド」（又は同義語として「オリゴ」）は、一本鎖ポリデオキシヌクレオチド又は化学的に合成され得る２つの相補的なポリデオキシヌクレオチド鎖のいずれかを指す。かかる合成オリゴヌクレオチドは５’リン酸を有することも、又は有しないこともある。有しないものは、キナーゼの存在下でＡＴＰによってリン酸を加えなければ別のオリゴヌクレオチドにライゲーションしない。合成オリゴヌクレオチドは、脱リン酸化されていないフラグメントにライゲーションする。
【００９８】
本明細書で使用されるように、用語「操作可能な状態で結合」は、機能的関係性におけるポリヌクレオチド要素の結合を意味する。核酸は、他の核酸配列と機能的関係性におかれた際に「操作可能な状態で結合」である。例えば、それがコーディング配列の転写に影響を及ぼす場合、プロモーター又はエンハンサーはコーディング配列に操作可能な状態で結合される。操作可能な状態で結合は、結合されているＤＮＡ配列が、典型的には隣接しており、及び、２つのタンパク質コーディング領域を接合するのに必要な場合、隣接し、リーディングフレーム内にあることを意味する。
【００９９】
ＲＮＡポリメラーゼが単一ｍＲＮＡにおいて２つのコーディング配列を転写するときに、コーディング配列は、他のコーディング配列に「操作可能な状態で結合」し、両方のコーディング配列に由来したアミノ酸を有する単一ポリペプチド内に翻訳される。発現された配列が所望のタンパク質をつくるために最終的に処理される限り、コーディング配列は、互いに隣接する必要はない。
【０１００】
本明細書で使用されるように、用語「親のポリヌクレオチドセット」は１つ又はそれ以上の異なるポリヌクレオチド種からなる。通常、この用語は、好適には親のセットの突然変異生成により得られる子孫ポリヌクレオチドセットを参照するのに用いられ、この場合において、用語「親の」、「起動」及び「テンプレート」は、互換性がある。
【０１０１】
用語「患者」又は「対象」は、治療の目的となる、ヒトのような例えば哺乳類などの動物を意味する。対象又は患者には男性でも女性でもあり得る。
【０１０２】
本明細書で使用されるとき、用語「生理条件」は、生存生物に適合する、及び／又は生存培養酵母細胞又は哺乳類細胞において細胞内に典型的に存在する温度、ｐＨ、浸透圧、イオン強度、粘度、及び同様の生化学的パラメータを指す。例えば、典型的な実験室培養条件下で成長する酵母細胞の細胞内条件は、生理条件である。インビトロ転写カクテルに好適なインビトロ反応条件は、概して生理条件である。一般に、インビトロ生理条件は、５０〜２００ｍＭのＮａＣｌ又はＫＣｌ、ｐＨ６．５〜８．５、２０〜４５℃及び０．００１〜１０ｍＭの二価陽イオン（例えばＭｇ++"、Ｃａ++）；好ましくは、約１５０ｍＭのＮａＣｌ又はＫＣｌ、ｐＨ７．２〜７．６、５ｍＭの二価陽イオンを含み、多くの場合に０．０１〜１．０％非特異的タンパク質（例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））を含む。非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、ＮＰ−４０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）が、通常約０．００１〜２％、典型的には０．０５〜０．２％（ｖ／ｖ）で存在することも多くある。詳細な水溶液条件は、実施者が従来方法により選択し得る。一般的な指針として、以下の緩衝水溶液条件を適用することができる：１０〜２５０ｍＭのＮａＣｌ、５〜５０ｍＭのトリスＨＣｌ、ｐＨ５〜８、任意選択で二価陽イオン及び／又は金属キレート剤及び／又は非イオン性界面活性剤及び／又は膜画分及び／又は消泡剤及び／又はシンチラントの添加。正常生理条件は、患者の正常範囲内と見なし得る、患者又は対象の生体内の投与部位又は作用部位における温度、ｐＨ、浸透圧、オスモル濃度、酸化的ストレス及び電解質濃度の条件を指す。
【０１０３】
標準規定（５’〜３’）は二本鎖ポリヌクレオチドの配列を記載するために本明細書において用いられる。
【０１０４】
用語「個体群」は、ポリヌクレオチド、ポリヌクレオチドの部分又はタンパク質のような組成物の収集を意味する。「混合された個体群」は、核酸又はタンパク質の同じ属ではある（つまり関連している）が、その配列において異なり（つまり同一ではない）従ってその生理的知的活性において異なる組成物の収集である。
【０１０５】
「代用形」を有する分子とは、参照代用形分子との比較において、異なる性質（例えば活性の増加）を有するより成熟した分子形態を得るために、１つ又はそれ以上の共有結合及び非共有結合化学的修飾（例えば、グリコシル化、タンパク質分解開裂、二量体化又はオリゴマー化、温度による誘発又はｐＨによって誘発された高次構造的変化、補助因子との会合など）の任意の組み合わせを途中で経た分子を意味する。２つ又はそれ以上の化学的修飾（例えば、２つのタンパク質分解開裂、又はタンパク質分解開裂及び非グリコシル化）が成熟した分子の製造への途中で区別されることができるときに、参照前駆体分子は、「前駆代用形」分子と称される。
【０１０６】
本明細書で使用されるとき、用語「受容体」は、所与のリガンドに親和性を有する分子を指す。受容体は天然に存在する分子又は合成分子であり得る。受容体は改変されていない状態で用いられてもよく、又は他の種との凝集体として用いられてもよい。受容体は、結合メンバーと直接、或いは特異的結合物質を介して、共有結合的又は非共有結合的に結合することができる。受容体の例としては、限定はされないが、特定の抗原決定基（ウイルス、細胞、又は他の材料などにあるもの）との反応性を示すモノクローナル抗体を含めた抗体及び抗血清、細胞膜受容体、複合糖質及び糖タンパク質類、酵素、及びホルモン受容体が挙げられる。
【０１０７】
用語「減少的再集合」は、本明細書で使用されるとき、反復配列によって媒介される欠失（及び／又は挿入）イベントを通じて生じる分子の多様性の増加を指す。
【０１０８】
本明細書で使用される用語「制限部位」は、制限酵素の作用の発現に必要な認識配列を意味し、接触開裂の部位を含む。開裂の部位は、低い曖昧性配列（つまり、制限部位の発生の頻度の主要な決定要素を含む配列）からなる制限部位の部分において含まれること、又は含まれないことがあると認められる。酵素（例えば制限酵素）がポリヌクレオチドを「開裂する」というのは、制限酵素がポリヌクレオチドの開裂を触媒する又は容易にすることを意味すると理解されている。
【０１０９】
本明細書で使用されるとき、用語「一本鎖抗体」は、概してスペーサーペプチドを介して連結された、ポリペプチド連鎖におけるＶＨドメインとＶＬドメインとを含むポリペプチドを指し、これはアミノ末端及び／又はカルボキシ末端に追加的なアミノ酸配列を含み得る。例えば、一本鎖抗体は、コードポリヌクレオチドに連結するための係留セグメントを含み得る。例として、ｓｃＦｖは一本鎖抗体である。一本鎖抗体は、概して、免疫グロブリンスーパーファミリーの遺伝子によって実質的にコードされる（例えば、Ｔｈｅ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ，Ａ．Ｆ．Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ａ．Ｎ．Ｂａｒｃｌａｙ，ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇｅｎｅｓ，Ｔ．Ｈｏｎｊｏ，Ｆ．Ｗ．Ａｌｔ，ａｎｄ  ＴＨＥ．Ｒａｂｂｉｔｓ，ｅｄｓ．，（１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ  ｐｒｅｓｓ：Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．，ｐｐ．３６１−３６８を参照）、最も多くの場合にはげっ歯類、非ヒト霊長類、トリ、ブタ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、又はヒト重鎖又は軽鎖遺伝子配列によってコードされる、少なくとも１０連続アミノの１つ又はそれ以上のポリペプチドセグメントからなるタンパク質である。機能性一本鎖抗体は、概して特異的標的分子、典型的には受容体又は抗原（エピトープ）との結合特性を保持するために十分な免疫グロブリンスーパーファミリー遺伝子産物の一部分を含有する。
【０１１０】
一対の分子（例えば、抗体−抗原対及びリガンド−受容体対）のメンバーは、それらが他の非特異的分子と比べて高い親和性で互いに結合する場合、互いに「特異的に結合する」と言われる。例えば、非特異的タンパク質に対する結合と比べてそれがより効率的に結合する抗原に対して産生される抗体は、抗原に特異的に結合すると記載することができる。
【０１１１】
用語「刺激」は、本明細書で使用されるとき、刺激分子（例えば、ＴＣＲ／ＣＤ３複合体）がそのコグネイトリガンドに結合し、それにより、限定はされないがＴＣＲ／ＣＤ３複合体を介したシグナル伝達など、シグナル伝達イベントが媒介されることによって生じる一次応答を意味する。刺激は、ＴＧＦ−βの下方制御、及び／又は細胞骨格構造の再編成など、ある種の分子の発現の変化を媒介し得る。
【０１１２】
用語「刺激分子」は、本明細書で使用されるとき、抗原提示細胞上に存在するコグネイト刺激リガンドと特異的に結合するＴ細胞上の分子を意味する。
【０１１３】
用語「刺激性リガンド」は、本明細書で使用されるとき、抗原提示細胞上（例えば、樹状細胞、Ｂ細胞など）に存在するときＴ細胞上のコグネイト結合パートナー（本明細書では「刺激分子」と称される）と特異的に結合して、それにより、限定はされないが、活性化、免疫応答の惹起、増殖などを含めた、Ｔ細胞による一次応答を媒介することのできるリガンドを意味する。刺激性リガンドは当該技術分野において周知であり、特に、ペプチドを担持したＭＨＣクラスＩ分子、抗ＣＤ３抗体、スーパーアゴニスト抗ＣＤ２８抗体、及びスーパーアゴニスト抗ＣＤ２抗体を包含する。
【０１１４】
用語「標的細胞」は、本明細書で使用されるとき、疾患に関与する細胞であって、且つ本発明の遺伝子修飾細胞傷害性細胞（限定はされないが、遺伝子修飾Ｔ細胞、ＮＫ細胞、及びマクロファージを含む）によって標的化され得る細胞を指す。他の標的細胞が当業者には明らかであり、本発明の代替的な実施形態に関連して用いられ得る。
【０１１５】
用語「Ｔ細胞」と「Ｔリンパ球」とは互換性があり、本明細書では同義語として用いられる。例としては、限定はされないが、ナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、エフェクターメモリーＴ細胞及びこれらの組み合わせが挙げられる。
【０１１６】
用語「形質導入」は、本明細書で使用されるとき、ウイルスベクターを使用した細胞への外来核酸の導入を指す。「トランスフェクション」は、本明細書で使用されるとき、組換えＤＮＡ技術を使用した細胞への外来核酸の導入を指す。用語「形質転換」は、宿主細胞への「外来性」（すなわち外因的な、又は細胞外の）遺伝子、ＤＮＡ又はＲＮＡ配列の導入を意味し、従って宿主細胞は導入された遺伝子又は配列を発現して、導入された遺伝子又は配列によってコードされるタンパク質又は酵素などの所望の物質を産生することになる。導入された遺伝子又は配列はまた、「クローニングされた」又は「外来性の」遺伝子又は配列と呼ばれることもあり、開始、停止、プロモーター、シグナル、分泌、又は他の配列など、細胞の遺伝機構によって用いられる調節又は制御配列を含み得る。遺伝子又は配列は、非機能性配列又は機能不明の配列を含み得る。導入されたＤＮＡ又はＲＮＡを受け入れて発現する宿主細胞は「形質転換」されており、「形質転換体」又は「クローン」である。宿主細胞に導入されるＤＮＡ又はＲＮＡは、宿主細胞と同じ属又は種の細胞、又は異なる属又は種の細胞を含め、任意の供給源に由来することができる。
【０１１７】
用語「治療する」は、（１）状態、疾患又は条件の臨床的又は潜在的症状に苦しむ、又はそれらに罹患しやすいが、状態の臨床的又は潜在的症状、疾患又は条件をまだ経験していない又は示していない動物において進行する状態、疾患又は条件の臨床的症状の出現を防止する又は遅延させること、（２）状態、疾患又は条件を阻害すること（つまり、疾患又は維持療法の場合においてはそれらの逆戻り又は、少なくとも１つの臨床的又は潜在性症状の進行を抑制し、減少させ、又は遅延させること）及び／又は（３）状態を楽にすること（つまり、状態、疾患、又は条件又は臨床又は潜在性症状の少なくとも１つの後退を引き起こすこと）を含む。治療される患者の利点は、統計学的にも有意であり、又は、少なくとも患者又は医師に少なくとも認知可能である。
【０１１８】
「腫瘍」は、本明細書で使用されるとき、悪性か良性かに関わらず、あらゆる新生物性細胞成長及び増殖、並びにあらゆる前癌性及び癌性細胞及び組織を指す。
【０１１９】
本明細書で使用されるとき、用語「腫瘍微小環境」は、悪性過程が生き残り、及び／又は拡大し、及び／又は広がるための構造的及び／又は機能的環境を作り出すエレメントを含めた、腫瘍環境のあらゆるエレメントを指す。
【０１２０】
本明細書で使用されているように、用語「可変性セグメント」は、ランダム、擬似ランダム、又は定義された仁配列からなる発生期のペプチドの部分を意味する。「可変性セグメント」は、ランダム、擬似ランダム、又は定義された仁配列からなる発生期のペプチドの部分を意味する。可変性セグメントはバリアント及びインバリアント残基位置の両方からなることがあり、及び、バリアント残基位置における変異残基の度合いは、限定されることがあり、両方の選択肢は、実行者の裁量で選択される。典型的には可変性セグメントは、長さにおいて約５〜２０アミノ酸残基（例えば８〜１０）であり、しかし、可変性セグメントはそれより長いこともあり、及び、抗体フラグメント、タンパク質結合核酸、受容体タンパク質などのような抗体タンパク質又は受容体タンパク質からなることもある。
【０１２１】
「ベクター」、「クローニングベクター」及び「発現ベクター」は、本明細書で使用されるとき、宿主細胞にポリヌクレオチド配列（例えば外来性遺伝子）を導入して宿主を形質転換し、導入された配列の発現（例えば転写及び翻訳）を促進することができる媒体を指す。ベクターには、プラスミド、ファージ、ウイルス等が含まれる。
【０１２２】
本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、ポリヌクレオチドがいかなる突然変異も含まないことを意味する。「野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）タンパク質」、「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）タンパク質」、「野生型（ｗｉｌｄ−ｔｙｐｅ）生物学的タンパク質」、又は「野生型（ｗｉｌｄ  ｔｙｐｅ）生物学的タンパク質」は、自然から単離することのできる、自然中に見られる活性レベルで活性な、且つ自然中に見られるアミノ酸配列を含むタンパク質を指す。用語「親分子」及び「標的タンパク質」もまた、野生型タンパク質を指す。「野生型タンパク質」は好ましくは、より高い結合親和性、又は酵素活性など、何らかの所望の特性を有し、これは、種々の温度又はｐＨ環境におけるより良好な安定性、又は向上した選択性及び／又は溶解度を含めた所望の特性に関してタンパク質のライブラリをスクリーニングすることによって得られ得る。
【０１２３】
例えば「ワーキング試料」にあるような用語「ワーキング」は、単に人が作業している試料である。同様に、例えば「ワーキング分子」は、人が作業している分子である。
【０１２４】
例示を目的として、様々な例示的実施形態を参照することにより、本発明の原理を説明する。本明細書には本発明の特定の実施形態が具体的に説明されるが、当業者は、同じ原理を他のシステム及び方法において同様に適用可能であり、用い得ることを容易に認識するであろう。本発明の開示される実施形態を詳細に説明する前に、本発明は、その適用が示される任意の特定の実施形態の詳細に限定されないことが理解されるべきである。加えて、本明細書で使用される用語法は、限定ではなく、説明を目的とするものである。さらに、いくつかの方法は、本明細書に特定の順序で提示される工程を参照して記載されるが、多くの場合、当業者が理解し得るとおり、これらの工程は任意の順序で実施することができる；従って新規方法は、本明細書に開示される特定の工程順に限定されない。
【０１２５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、文脈上特に明確に指示されない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には複数形の参照が含まれることに留意しなければならない。さらに、用語「ａ」（又は「ａｎ」）、「１つ又はそれ以上」及び「少なくとも１つ」は、本明細書では同義的に用いられ得る。用語「〜を含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「〜を含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「〜を有する（ｈａｖｉｎｇ）」及び「〜で構成される（ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ  ｆｒｏｍ）」もまた、同義的に用いられ得る。
【０１２６】
本開示は、標的抗原と結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、親または野生型タンパク質又はそのドメインから進化させた、且つ異常条件下での分析における活性と比較した正常生理条件での分析における低下した活性を有する少なくとも１つの抗原特異的標的領域と；膜貫通ドメインと；細胞内シグナル伝達ドメインとを含むキメラ抗原受容体に関する。一部の実施形態において、キメラ抗原受容体は、細胞外スペーサードメイン又は少なくとも１つの共刺激ドメインをさらに含む。標的抗原は、腫瘍特異的抗原であってもよく、Ａｘｌ、ＲＯＲ２またはＣＤ２２であってもよい。
【０１２７】
本発明のＣＡＲは、（１）正常生理条件で可逆的又は不可逆的に低下する標的抗原に対するその親和性、及び（２）条件的活性型抗原特異的標的領域を有しない同じＣＡＲとの比較で、親和性の増加、のうちの少なくとも一方を有しうる。これらのＣＡＲは、腫瘍微小環境又は滑液など、異常条件が存在する疾患部位に細胞傷害性細胞を導くことができる。これらの特性の結果として、ＣＡＲは、正常組織に対するその低親和性を理由としながら、細胞傷害性細胞を疾患部位に優先的に導くことができる。かかるＣＡＲは副作用が劇的に低下し、より高用量の治療薬の使用が可能となるため、治療有効性が高まり得る。ＣＡＲは、対象の体内にある期間がより短い又は限られていることが必要な新規治療薬の開発に特に有効である。有益な利用の例としては、高投薬量での全身治療、並びに高濃度での局所治療が挙げられる。
【０１２８】
本キメラ抗原受容体は、正常生理条件で親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較して標的抗原に対する結合親和性の低下を有する抗原特異的標的領域を含み得る。
【０１２９】
キメラ抗原受容体は、異常条件下での分析において親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較して活性の増加を有し、且つ正常生理条件で親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較して標的抗原に対する結合親和性の低下を有する抗原特異的標的領域を含み得る。
【０１３０】
前述のキメラ抗原受容体のいずれかにおいて、本抗原特異的標的領域はまた、異常条件下での分析において親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較して選択性の増加も有し得る。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、抗原特異的標的領域は、正常生理条件での同じ活性に対する異常条件での活性の比が、少なくとも約１．１、または少なくとも約１．２、または少なくとも約１．４、または少なくとも約１．６、または少なくとも約１．８、または少なくとも約２、または少なくとも約２．５、または少なくとも約３、または少なくとも約５、または少なくとも約７、または少なくとも約８、または少なくとも約９、または少なくとも約１０、または少なくとも約１５、または少なくとも約２０である。
【０１３２】
本ＣＡＲ分子は、２つの抗原特異的標的領域を接続するリンカーを含む（図１）。このリンカーは、ＣＡＲ−Ｔ細胞上の２つの抗原特異的標的領域が標的抗原との結合において向上した又は最適な活性を呈するように２つの抗原特異的標的領域を配向する（Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，「キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞による養子療法の設計及び実施（Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）」，Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．２５７，ｐｐ．１２７−１４４，２０１４）。従ってこのリンカーは、好ましくは２つの抗原特異的標的領域の標的抗原への向上した又は最適な結合を可能にする特異的コンホメーションをとることが可能であり、これによりＣＡＲ−Ｔ細胞の有効性が増加する。
【０１３３】
一部の実施形態において、リンカーは１８〜２５アミノ酸のＧｌｙ−Ｓｅｒタンデムリピートであり得る（Ｇｒａｄａ，「ＴａｎＣＡＲ：癌免疫療法の新規二重特異性キメラ抗原受容体（ＴａｎＣＡＲ：Ａ  Ｎｏｖｅｌ  Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）」，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，ｖｏｌ．２，ｅ１０５，２０１３）。この可動性リンカーは、標的抗原との結合に２つの抗原特異的標的領域の向上した又は最適な提示となるよう多くの異なるコンホメーションをとることが可能である。
【０１３４】
一部の実施形態において、このリンカーは正常生理条件と異常条件とで異なるコンホメーションをとることが可能である。特に、このリンカーは、異常条件で、標的抗原への結合に２つの抗原特異的標的領域の提示が向上した又は最適な第１のコンホメーションを有し、一方、同じリンカーが、正常生理条件では、異常条件下でのリンカーの第１のコンホメーションと比べて標的抗原への結合に２つの抗原特異的標的領域の提示の有効性が低い第２のコンホメーションを有する。かかるリンカーは、２つの抗原特異的標的領域が正常生理条件よりも異常条件でより高い結合活性で標的抗原に結合することを可能にする「条件的リンカー」と呼ぶことができる。従って、かかる条件的リンカーを含むＣＡＲ−Ｔ細胞は、異常条件では、正常生理条件での同じＣＡＲ−Ｔ細胞よりも高活性である。
【０１３５】
異なるｐＨでコンホメーションが変化するタンパク質が、以前、例えばＤｉ  Ｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（「タンパク質におけるｐＨ依存的コンホメーション変化及び実験的ｐＫ（ａ）に対するその効果：ニトロフォリン４のケース（ｐＨ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｎ  ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  ｐＫ（ａ）ｓ：ｔｈｅ  ｃａｓｅ  ｏｆ  Ｎｉｔｒｏｐｈｏｒｉｎ  ４）」，ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｂｉｏｌ．，ｖｏｌ．８，ｅ１００２７６１，２０１２）に記載されている。更に、異なる温度でコンホメーションが異なるタンパク質が、Ｃａｌｄｗｅｌｌ，「オオムギ根細胞膜エンリッチミクロソームにおける温度誘導性タンパク質コンホメーション変化（Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｂａｒｌｅｙ  ｒｏｏｔ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｅｎｒｉｃｈｅｄ  ｍｉｃｒｏｓｏｍｅｓ）」，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．，ｖｏｌ．８４，ｐｐ．９２４−９２９，１９８９に記載されている。ｐＨ及び／又は温度の影響を受ける抗体のコンホメーションについて、Ｇａｎｄｈｉ，「ｐＨ及び温度がヒト化モノクローナル抗体のコンホメーション変化に及ぼす効果（Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐＨ  ａｎｄ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｏｎ  ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ  ｃｈａｎｇｅｓ  ｏｆ  ａ  ｈｕｍａｎｉｚｅｄ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）」，米国ロードアイランド大学（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｒｈｏｄｅ  Ｉｓｌａｎｄ）修士論文に考察されている。
【０１３６】
本発明の範囲内には、ＣＡＲ分子に使用する条件的リンカーを選択することが含まれる。条件的リンカーは、異常条件で、標的抗原への結合に２つの抗原特異的標的領域の提示が向上した又は最適な第１のコンホメーションをとり、正常生理条件で、標的抗原への結合に２つの抗原特異的標的領域の提示が準最適な第２のコンホメーションをとることができる。一部の実施形態において、正常生理条件ではリンカーのコンホメーションが準最適であることにより、異常条件でこのリンカーの向上した又は最適なコンホメーションを有するＣＡＲ分子の結合活性の約９０％、又は約８０％、又は約７０％、又は約６０％、又は約５０％、又は約４０％、又は約３０％、又は約２０％、又は約１０％、又は約５％未満の標的抗原に対する結合活性を有するＣＡＲ分子が生じる。
【０１３７】
条件的リンカーは、２Ａリンカー、２Ａ様リンカー、ピコルナウイルス２Ａ様リンカー、ブタテッショウウイルスの２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、及びトセア・アシグナ（Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａ）ウイルスの２Ａペプチド（Ｔ２Ａ）、並びにこれらのバリアント及び機能等価物から選択される出発リンカーから生成されてもよい。この出発リンカーを進化させて変異体タンパク質を作製する；次に変異体タンパク質を正常生理条件での分析及び異常条件での分析に供する。これらの変異体タンパク質から、選択のタンパク質が（ａ）異常条件で標的抗原への結合に２つの抗原特異的標的領域の提示が向上した又は最適な第１のコンホメーションを有する条件的リンカー、及び（ｂ）正常生理条件で標的抗原への結合に２つの抗原特異的標的領域の提示が準最適な条件的リンカーの第２のコンホメーションを呈することに基づき、条件的リンカーを有するタンパク質が選択される。
【０１３８】
本ＣＡＲ分子はまた、２つの抗原特異的標的領域を膜貫通ドメインと接続させる細胞外スペーサードメインも含み、次には膜貫通ドメインがＴ細胞の内部にある共刺激ドメイン及び細胞内シグナル伝達ドメインに接続する（図１）。細胞外スペーサードメインは、好ましくは抗原特異的標的領域が標的細胞上の標的抗原を認識して結合するのを補助することが可能である（Ｈｕｄｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，「キメラ抗原受容体の非シグナル伝達細胞外スペーサードメインがインビボ抗腫瘍活性の決め手となる（Ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐａｃｅｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｓ  ｄｅｃｉｓｉｖｅ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３，ｐｐ．１２５−１３５，２０１５）。一部の実施形態において、細胞外スペーサードメインは可動性ドメインであり、そのため抗原特異的標的領域が腫瘍細胞などの細胞上の標的抗原の特異的構造及び密度を最適に認識するための構造を有することが可能となる（Ｈｕｄｅｃｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，「キメラ抗原受容体の非シグナル伝達細胞外スペーサードメインがインビボ抗腫瘍活性の決め手となる（Ｔｈｅ  ｎｏｎ−ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｓｐａｃｅｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｉｓ  ｄｅｃｉｓｉｖｅ  ｆｏｒ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）」，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．，ｖｏｌ．３，ｐｐ．１２５−１３５，２０１５）。細胞外スペーサードメインの可動性により、細胞外スペーサードメインは多くの異なるコンホメーションをとることができる。
【０１３９】
一部の実施形態において、細胞外スペーサードメインは正常生理条件と異常条件とで異なるコンホメーションをとることが可能である。特に、細胞外スペーサードメインは、異常条件で、標的抗原への結合に２つの抗原特異的標的領域の提示が向上した又は最適な第１のコンホメーションを有し、一方、同じ細胞外スペーサードメインが、正常生理条件では、標的抗原への結合に２つの抗原特異的標的領域の提示が準最適な第２のコンホメーションを有する。かかる細胞外スペーサードメインは、２つの抗原特異的標的領域が正常生理条件よりも異常条件でより高い結合活性で標的抗原に結合することを可能にするため、「条件的細胞外スペーサードメイン」と呼ぶことができる。従って、条件的細胞外スペーサードメインにより、ＣＡＲ−Ｔ細胞は異常条件で、正常生理条件での同じＣＡＲ−Ｔ細胞よりも高活性であり得る。
【０１４０】
本発明の範囲内には、ＣＡＲ分子に使用する条件的細胞外スペーサードメインを選択することが含まれる。一部の実施形態において、正常生理条件では細胞外スペーサードメインのコンホメーションが準最適であることにより、異常条件で同じ細胞外スペーサードメインの最適なコンホメーションを有するＣＡＲ分子の約９０％、又は約８０％、又は約７０％、又は約６０％、又は約５０％、又は約４０％、又は約３０％、又は約２０％、又は約１０％、又は約５％未満の標的抗原に対する結合活性を有するＣＡＲ分子が生じる。
【０１４１】
細胞外スペーサードメイン及び膜貫通ドメインを含む領域のユビキチン化抵抗性形態がＣＡＲ−Ｔ細胞シグナル伝達を増強し、ひいては抗腫瘍活性を増大させ得ることが発見されている（Ｋｕｎｉｉ  ｅｔ  ｌａ．，「ユビキチン化に抵抗性のＴ細胞を活性化するためのリンカーを発現するリダイレクトヒトＴ細胞の機能増強（Ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ｌｉｎｋｅｒ  ｆｏｒ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈａｔ  ｉｓ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｔｏ  ｕｂｉｑｕｉｔｙｌａｔｉｏｎ）」，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．２４，ｐｐ．２７−３７，２０１３）。この領域内で、細胞外スペーサードメインはＣＡＲ−Ｔ細胞の外側にあり、従って異なる条件に露出しており、条件的にユビキチン化抵抗性にし得る可能性がある。
【０１４２】
本発明の範囲内には、細胞外スペーサードメインが条件的にユビキチン化抵抗性であることが含まれる。特に、ＣＡＲ分子の細胞外スペーサードメインは、正常生理条件よりも異常条件でユビキチン化抵抗性が高い。従って、条件的にユビキチン化抵抗性の細胞外スペーサードメインを有するＣＡＲ−Ｔ細胞は、正常生理条件でのその細胞傷害性と比べて異常条件で細胞傷害性が増強されることになる。
【０１４３】
条件的にユビキチン化抵抗性の細胞外スペーサードメインは、異常なｐＨ又は異常な温度でユビキチン化抵抗性が高く、且つ正常な生理的ｐＨ又は正常な生理的温度でユビキチン化抵抗性が低くなるように選択されてもよい。一実施形態において、条件的にユビキチン化抵抗性の細胞外スペーサードメインは、腫瘍微小環境のｐＨでユビキチン化抵抗性が高く、且つｐＨ７．２〜７．６のヒト血漿のｐＨなど、正常な生理的ｐＨでユビキチン化抵抗性が低い。
【０１４４】
条件的細胞外スペーサードメインを作製するため、抗体のＦｃフラグメント、抗体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、及び抗体のＣＨ３領域から選択される出発タンパク質フラグメントを進化させて変異体タンパク質を作製する。この変異体タンパク質を正常生理条件での分析及び異常条件での分析に供する。条件的細胞外スペーサードメインは、（ａ）異常条件で抗原特異的標的領域がより高い結合活性で標的抗原に結合する第１のコンホメーションを有し、且つ正常生理条件で抗原特異的標的領域が異常条件におけるよりも低い結合活性で標的抗原に結合する条件的細胞外結合ドメインの第２のコンホメーションを有する条件的細胞外スペーサードメインを呈する変異体タンパク質、又は（ｂ）異常条件で正常生理条件よりもユビキチン化抵抗性が高いタンパク質から選択される。
【０１４５】
前述のキメラ抗原受容体のいずれかは、この抗原受容体を含有するタンパク質が親又は野生型タンパク質又はそのドメインと比較して発現レベルの増加を有するように構成され得る。
【０１４６】
代替的実施形態において、本発明は、標的抗原と結合するためのキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であって、親又は野生型タンパク質又はそのドメインから進化させた、且つ異常条件下での分析において親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較して選択性の増加を有する少なくとも１つの抗原特異的標的領域と；膜貫通ドメインと；細胞内シグナル伝達ドメインとを有するキメラ抗原受容体を提供する。一部の実施形態において、キメラ抗原受容体は、細胞外スペーサードメイン又は少なくとも１つの共刺激ドメインをさらに含む。
【０１４７】
本開示はまた、（ａ）正常生理条件での分析における親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較した活性の低下、及び（ｂ）異常条件下での分析における親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較した活性の増加、のうちの少なくとも一方を有する条件的活性型タンパク質を生成するため親又は野生型タンパク質又はそのドメインを進化させる方法にも関する。条件的活性型タンパク質は、ＣＡＲとなるように操作することができる。
【０１４８】
本方法によって作製されるキメラ抗原受容体は、正常生理条件で親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較して標的抗原に対する結合親和性の低下を有する抗原特異的標的領域を含み得る。
【０１４９】
本方法によって作製されるキメラ抗原受容体は、異常条件下での分析において親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較して活性の増加を有し、且つ正常生理条件で親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較して標的抗原に対する結合親和性の低下を有する抗原特異的標的領域を含み得る。
【０１５０】
本方法によって作製される前述のキメラ抗原受容体のいずれかにおいて、抗原特異的標的領域はまた、異常条件下での分析において親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較して選択性の増加も有し得る。
【０１５１】
本方法によって作製される前述のキメラ抗原受容体のいずれかは、この抗原受容体を含有するタンパク質が親又は野生型タンパク質又はそのドメインと比較して発現レベルの増加を有するように構成され得る。
【０１５２】
本方法の代替的実施形態において、標的抗原と結合するための本方法によって作製されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、親又は野生型タンパク質又はそのドメインから進化させた、且つ異常条件下での分析において親又は野生型タンパク質又はそのドメインの抗原特異的標的領域と比較して選択性の増加を有する少なくとも１つの抗原特異的標的領域と；膜貫通ドメインと；細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。一部の実施形態において、キメラ抗原受容体は、細胞外スペーサードメイン又は少なくとも１つの共刺激ドメインをさらに含む。
【０１５３】
キメラ抗原受容体
哺乳動物、特にヒトの免疫系は、罹患組織及び／又は病原体を標的化して破壊する細胞傷害性細胞を有する。これらの細胞傷害性細胞を使用して腫瘍などの望ましくない組織（即ち標的組織）を除去することは、有望な治療手法である。除去の標的とし得る他の組織としては、腺（例えば前立腺）過形成、疣贅、及び望ましくない脂肪組織が挙げられる。しかしながら、この比較的新しい治療手法は、これまでのところ限られた成功しか収めていない。例えば、Ｔ細胞を使用した腫瘍の標的化及び破壊は、癌細胞が表面抗原の発現を低下させて新しい療法に適応することによりこの療法の有効性が低下し得るため、長期的利益が比較的少ない。癌細胞は、腫瘍特異的Ｔ細胞に応答した検出を逃れるため脱分化することさえある。Ｍａｈｅｒ，“Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｕｓｉｎｇ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｅｎｇｒａｆｔｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ，”ＩＳＲＮ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２０１２，ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ２７８０９３，２０１２。
【０１５４】
キメラ抗原受容体を発現する細胞傷害性細胞は、これらの細胞傷害性細胞の特異性及び感受性を大幅に改善し得る。例えば、ＣＡＲを発現するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）は、ＣＡＲを使用して、ＣＡＲに特異的に結合する細胞表面抗原を発現する腫瘍細胞へとＴ細胞を導く能力を有する。かかるＣＡＲ−Ｔ細胞は細胞傷害剤をより選択的に腫瘍細胞に送達することができる。ＣＡＲ−Ｔ細胞は標的分子を直接認識することができ、従って典型的にはヒト白血球抗原（ＨＬＡ）などの多型性を呈する要素による制限を受けない。このＣＡＲによる標的化戦略の利点は三点から成る。第一に、ＣＡＲ−Ｔ細胞機能がＨＬＡ状態に依存しないため、原則として、同じ標的表面抗原を発現する腫瘍を有するあらゆる患者で同じＣＡＲベースの手法を用いることができる。第二に、抗原プロセシング及び提示機構の改変は腫瘍細胞の一般的な特質であり、免疫エスケープを促進し得る。しかしながら、これがＣＡＲ−Ｔ細胞に対する無防備をもたらす。第三に、このシステムを使用して、タンパク質、炭水化物、及び糖脂質を含めた様々な巨大分子を標的化することができる。
【０１５５】
本発明のキメラ抗原受容体は、少なくとも１つの抗原特異的標的領域（ＡＳＴＲ）と膜貫通ドメイン（ＴＭ）と細胞内シグナル伝達ドメイン（ＩＳＤ）とを含むキメラ人工タンパク質である。一部の実施形態において、ＣＡＲは、細胞外スペーサードメイン（ＥＳＤ）及び／又は共刺激ドメイン（ＣＳＤ）をさらに含み得る。図１を参照のこと。
【０１５６】
ＡＳＴＲは、タンパク質、炭水化物、及び糖脂質を含む特定の標的抗原に結合するためのＣＡＲの細胞外領域である。一部の実施形態において、ＡＳＴＲは、抗体、特に一本鎖抗体、又はそのフラグメントを含む。ＡＳＴＲは、完全長重鎖、Ｆａｂフラグメント、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）フラグメント、二価一本鎖抗体又はダイアボディを含むことができ、これらの各々が標的抗原に特異的である。
【０１５７】
ＡＳＴＲはまた、標的抗原を認識してそれに結合するための別のタンパク質機能ドメインも含み得る。標的抗原は、受容体又はリガンドとして働くなど、他の生物学的機能を有し得るため、或いはＡＳＴＲは、抗原と特異的に結合するための機能ドメインを含み得る。機能ドメインを有するタンパク質のいくつかの例としては、連結サイトカイン（これは、サイトカイン受容体を担持する細胞の認識につながる）、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）、天然に存在する受容体由来のリガンド結合ドメイン、例えば腫瘍細胞上の受容体に対する可溶性タンパク質／ペプチドリガンドが挙げられる。当業者は理解するであろうとおり、事実上、所与の抗原と高親和性で結合する能力を有するほぼどの分子もＡＳＴＲに使用することができる。
【０１５８】
一実施形態において、本発明のＣＡＲは、少なくとも２つの異なる抗原又は同じ抗原上の２つのエピトープを標的化する少なくとも２つのＡＳＴＲを含む。ある実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも３つ又はそれ以上の異なる抗原又はエピトープを標的化する３つ以上のＡＳＴＲを含む。ＣＡＲに複数のＡＳＴＲが存在するとき、ＡＳＴＲはタンデムに配置されてもよく、且つリンカーペプチドによって隔てられていてもよい（図１）。
【０１５９】
一実施形態において、ＡＳＴＲは、標的抗原に特異的な、且つ抗原特異性を付与するのにＶHドメイン単独で十分な場合（「シングルドメイン抗体」）、ＶH、ＣＨ１、ヒンジ、並びにＣＨ２及びＣＨ３（Ｆｃ）Ｉｇドメインを有する完全長ＩｇＧ重鎖を含む。完全に活性なＡＳＴＲの作成にＶH及びＶLドメインの両方が必要な場合、ＶH含有ＣＡＲ及び完全長λ軽鎖（ＩｇＬ）が両方ともに同じ細胞傷害性細胞に導入されて、活性ＡＳＴＲが作成される。別の実施形態において、ＣＡＲの各ＡＳＴＲは、各々が異なる標的抗原に特異的な少なくとも２つの一本鎖抗体可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を含む。ｓｃＦｖは、一方の可変ドメイン（ＶH又はＶL）のＣ末端が他方の可変ドメイン（それぞれＶL又はＶH）のＮ末端にポリペプチドリンカーを介して係留されているものであり、抗原結合性又は結合特異性を大きく妨げることなしに開発されている（Ｃｈａｕｄｈａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ａｎｔｉ−Ｔａｃ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａ  ｔｏｘｉｎ，”Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ｖｏｌ．８７，ｐａｇｅ  ９４９１，１９９０；Ｂｅｄｚｙｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａ  ｈｉｇｈ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉ−ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ，”Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，ｖｏｌ．２６５，ｐａｇｅ  １８６１５，１９９０）。これらのｓｃＦｖは、天然抗体の重鎖及び軽鎖に存在する定常領域（Ｆｃ）を欠いている。少なくとも２つの異なる抗原に特異的なｓｃＦｖは、タンデムに配置される。ある実施形態では、ＡＳＴＲと膜貫通ドメインとの間に細胞外スペーサードメインが連結され得る。
【０１６０】
別の実施形態において、ｓｃＦｖフラグメントは重鎖の定常ドメインの全て又は一部分に融合していてもよい。さらなる実施形態において、ＣＡＲのＡＳＴＲは二価（ｄｉｖａｌｅｎｔ）（又は二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ））の一本鎖可変フラグメント（ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｂｉ−ｓｃＦｖ）を含む。ｄｉ−ｓｃＦＶを含むＣＡＲでは、各々抗原に特異的な２つのｓｃＦｖが一体に連結されて、２つのＶH領域及び２つのＶL領域を含む単一のペプチド鎖を形成する（Ｘｉｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｔｕｍｏｒ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉ−ＭＵＣ−１  ｍｕｌｔｉｍｅｒ：ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｄｉ−ｓｃＦｖ  ｕｎｐａｉｒｅｄ  ｃｙｓｔｅｉｎｅ  ｌｏｃａｔｉｏｎ  ｏｎ  ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ，”Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ｖｏｌ．１９，ｐａｇｅｓ  ３５９−３６７，２００６；Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｒｅｖｉｖａｌ  ｏｆ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，”Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２２，ｐａｇｅｓ  ２３８−２４４，２００４）。
【０１６１】
さらに別の実施形態において、ＡＳＴＲはダイアボディを含む。ダイアボディでは、ｓｃＦｖは、２つの可変領域が一緒になって折り畳まれるには短過ぎるためｓｃＦｖの二量化を駆動するリンカーペプチドを伴い作成される。さらに短いリンカー（１又は２アミノ酸）は、三量体、いわゆるトリアボディ又はトリボディの形成につながる。テトラボディもまたＡＳＴＲに使用し得る。
【０１６２】
ＣＡＲに２つ以上のＡＳＴＲが存在するとき、ＡＳＴＲは、オリゴペプチド若しくはポリペプチドリンカー、Ｆｃヒンジ又は膜ヒンジ領域を介して単一のポリペプチド鎖上で互いに共有結合的に結合される。
【０１６３】
ＣＡＲによって標的化される抗原は、腫瘍、腺（例えば前立腺）過形成、疣贅、及び望ましくない脂肪組織など、除去の標的となる組織の細胞の表面上又は内部に存在する。表面抗原はＣＡＲのＡＳＴＲによってより効率的に認識及び結合されるが、細胞内抗原もまたＣＡＲによって標的化され得る。一部の実施形態において、標的抗原は、好ましくは、癌、炎症性疾患、ニューロン障害、糖尿病、心血管疾患、又は感染性疾患に特異的である。標的抗原の例には、様々な免疫細胞、癌腫、肉腫、リンパ腫、白血病、胚細胞腫瘍、芽細胞腫、並びに様々な血液疾患、自己免疫疾患、及び／又は炎症性疾患に関連する細胞によって発現される抗原が含まれる。
【０１６４】
ＡＳＴＲによって標的化され得る癌に特異的な抗原としては、４−ＩＢＢ、５Ｔ４、腺癌抗原、αフェトプロテイン、Ａｘｌ、ＢＡＦＦ、Ｂリンパ腫細胞、Ｃ２４２抗原、ＣＡ−１２５、炭酸脱水酵素９（ＣＡ−ＩＸ）、Ｃ−ＭＥＴ、ＣＣＲ４、ＣＤ１５２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２００、ＣＤ２２、ＣＤ２２１、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ３３、ＣＤ４、ＣＤ４０、ＣＤ４４  ｖ６、ＣＤ５１、ＣＤ５２、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ８０、ＣＥＡ、ＣＮＴ０８８８、ＣＴＬＡ−４、ＤＲ５、ＥＧＦＲ、ＥｐＣＡＭ、ＣＤ３、ＦＡＰ、フィブロネクチンエクストラドメイン−Ｂ、葉酸受容体１、ＧＤ２、ＧＤ３ガングリオシド、糖タンパク質７５、ＧＰＮＭＢ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＧＦ、ヒト散乱因子受容体キナーゼ、ＩＧＦ−１受容体、ＩＧＦ−Ｉ、ＩｇＧｌ、ＬＩ−ＣＡＭ、ＩＬ−１３、ＩＬ−６、インスリン様成長因子Ｉ受容体、インテグリンα５β１、インテグリンανβ３、ＭＯＲＡｂ−００９、ＭＳ４Ａ１、ＭＵＣ１、ムチンＣａｎＡｇ、Ｎ−グリコリルノイラミン酸、ＮＰＣ−１Ｃ、ＰＤＧＦ−Ｒ  ａ、ＰＤＬ１９２、ホスファチジルセリン、前立腺癌細胞、ＲＡＮＫＬ、ＲＯＮ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、ＳＣＨ  ９００１０５、ＳＤＣ１、ＳＬＡＭＦ７、ＴＡＧ−７２、テネイシンＣ、ＴＧＦβ２、ＴＧＦ−β、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、腫瘍抗原ＣＴＡＡ１６．８８、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ２又はビメンチンの１つ又はそれ以上が挙げられる。
【０１６５】
ＡＳＴＲによって標的化され得る炎症性疾患に特異的な抗原としては、ＡＯＣ３（ＶＡＰ−１）、ＣＡＭ−３００１、ＣＣＬ１１（エオタキシン−１）、ＣＤ１２５、ＣＤ１４７（ベイシジン）、ＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌ）、ＣＤ２、ＣＤ２０、ＣＤ２３（ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体のａ鎖）、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＩＦＮ−ａ、ＩＦＮ−γ、ＩｇＥ、ＩｇＥ  Ｆｃ領域、ＩＬ−１、ＩＬ−１２、ＩＬ−２３、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−６受容体、インテグリンａ４、インテグリンα４β７、ラマ・グラマ（Ｌａｍａ  ｇｌａｍａ）、ＬＦＡ−１（ＣＤ１  ｌａ）、ＭＥＤＩ−５２８、ミオスタチン、ＯＸ−４０、ｒｈｕＭＡｂ  β７、スクレロスシン（ｓｃｌｅｒｏｓｃｉｎ）、ＳＯＳＴ、ＴＧＦβ１、ＴＮＦ−ａ又はＶＥＧＦ−Ａの１つ又はそれ以上が挙げられる。
【０１６６】
本発明のＡＳＴＲによって標的化され得るニューロン障害に特異的な抗原としては、βアミロイド又はＭＡＢＴ５１０２Ａの１つ又はそれ以上が挙げられる。本発明のＡＳＴＲによって標的化され得る糖尿病に特異的な抗原としては、Ｌ−Ｉβ又はＣＤ３の１つ又はそれ以上が挙げられる。本発明のＡＳＴＲによって標的化され得る心血管疾患に特異的な抗原としては、Ｃ５、心臓ミオシン、ＣＤ４１（インテグリンα−ｌｉｂ）、フィブリンＩＩ、β鎖、ＩＴＧＢ２（ＣＤ１８）及びスフィンゴシン−１−リン酸の１つ又はそれ以上が挙げられる。
【０１６７】
本発明のＡＳＴＲによって標的化され得る感染性疾患に特異的な抗原としては、炭疽毒素、ＣＣＲ５、ＣＤ４、クランピング因子Ａ、サイトメガロウイルス、サイトメガロウイルス糖タンパク質Ｂ、エンドトキシン、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、Ｂ型肝炎表面抗原、Ｂ型肝炎ウイルス、ＨＩＶ−１、Ｈｓｐ９０、インフルエンザＡ型ヘマグルチニン、リポタイコ酸、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、狂犬病ウイルス糖タンパク質、呼吸器合胞体ウイルス及びＴＮＦ−ａの１つ又はそれ以上が挙げられる。
【０１６８】
標的抗原のさらなる例としては、癌細胞上に特異的な又は増幅された形で見られる表面タンパク質、例えばＩＬ−１４受容体、Ｂ細胞リンパ腫のＣＤ１９、ＣＤ２０及びＣＤ４０、種々の癌のルイスＹ及びＣＥＡ抗原、乳癌及び結腸直腸癌のＴａｇ７２抗原、肺癌のＥＧＦ−Ｒ、ヒト乳癌及び卵巣癌で増幅されることが多い葉酸結合タンパク質及びＨＥＲ−２タンパク質、又はウイルスタンパク質、例えばＨＩＶのｇｐ１２０及びｇｐ４１エンベロープタンパク質、Ｂ型及びＣ型肝炎ウイルスからのエンベロープタンパク質、ヒトサイトメガロウイルスの糖タンパク質Ｂ及び他のエンベロープ糖タンパク質、並びにカポジ肉腫関連ヘルペスウイルスなどのオンコウイルスからのエンベロープタンパク質が挙げられる。他の潜在的な標的抗原としては、リガンドがＨＩＶ  ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質であるＣＤ４、及び他のウイルス受容体、例えばヒトライノウイルスの受容体であるＩＣＡＭ、及びポリオウイルスの関連受容体分子が挙げられる。
【０１６９】
別の実施形態において、本ＣＡＲは、癌治療細胞、例えばＮＫ細胞及び本明細書で言及する他の細胞が会合する抗原を標的化して、免疫エフェクター細胞として働くことによりそれらの癌治療細胞を活性化させ得る。この一例は、ＣＤ１６Ａ抗原を標的化して、ＮＫ細胞を会合させることによりＣＤ３０を発現する悪性病変と闘わせるＣＡＲである。二重特異性四価ＡＦＭ１３抗体は、この効果を送達し得る抗体の例である。この種の実施形態のさらなる詳細については、例えば、Ｒｏｔｈｅ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉ−ＣＤ３０／ＣＤ１６Ａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ  ＡＦＭ１３  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｌａｐｓｅｄ  ｏｒ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  Ｈｏｄｇｋｉｎ  ｌｙｍｐｈｏｍａ，”Ｂｌｏｏｄ，２５  Ｊｕｎｅ  ２０１５，Ｖｌ．１２５，ｎｏ．２６，ｐｐ．４０２４−４０３１を参照することができる。
【０１７０】
一実施形態では、ＡＳＴＲは、Ａｘｌ、ＲＯＲ２およびＣＤ２２から選択される腫瘍特異的抗原を標的とする。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、ＡＳＴＲは、がん抗原Ａｘｌを標的とする一本鎖抗体であり、配列番号２〜５から選択されるヌクレオチド配列、または配列番号９〜１２から選択されるアミノ酸配列を有していてもよい。癌抗原Ａｘｌを標的とするこれらの一本鎖抗体は、配列番号６または７のヌクレオチド配列、または配列番号１３または１４のアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域を含んでいる。このがん抗原Ａｘｌを標的とした一本鎖抗体は、ｐＨ６．０のＡｘｌに対する結合活性が、ｐＨ７．４のＡｘｌに対する結合活性と比較して高くなっている。
【０１７２】
別の実施形態では、ＡＳＴＲは、がん抗原ＲＯＲ２を標的とする一本鎖抗体であり、配列番号１６のヌクレオチド配列、または配列番号１５のアミノ酸配列を有していてもよい。このがん抗原ＲＯＲ２を標的とした一本鎖抗体は、ｐＨ６．０でのＲＯＲ２への結合活性が、ｐＨ７．４でのＲＯＲ２への結合活性と比較して増加している。
【０１７３】
ＡｘｌやＲＯＲ２を標的にした一本鎖抗体は、膜貫通ドメインや細胞内シグナル伝達ドメインと連結してＣＡＲ構造を作るのに適している。
【０１７４】
ＣＡＲの細胞外スペーサードメインは、ＡＳＴＲと膜貫通ドメインとの間に位置する親水性領域である。一部の実施形態において、このドメインは、ＣＡＲに適切なタンパク質フォールディングを促進する。細胞外スペーサードメインはＣＡＲの任意選択の構成要素である。細胞外スペーサードメインは、抗体のＦｃフラグメント、抗体のヒンジ領域、抗体のＣＨ２領域、抗体のＣＨ３領域、人工スペーサー配列又はこれらの組み合わせから選択されるドメインを含み得る。細胞外スペーサードメインの例としては、ＣＤ８ａヒンジ、３個のグリシン（Ｇｌｙ）程の大きさしかないものであり得るポリペプチドで作られた人工スペーサー、並びにＩｇＧ（ヒトＩｇＧ４など）のＣＨ１及びＣＨ３ドメインが挙げられる。
【０１７５】
ＣＡＲの膜貫通ドメインは、細胞傷害性細胞の細胞膜に架かる能力を有する領域である。膜貫通ドメインは、例えばＩ型膜貫通タンパク質などの膜貫通タンパク質の膜貫通領域、人工疎水性配列又はこれらの組み合わせから選択される。膜貫通ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体のα鎖、β鎖又はζ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４の膜貫通領域が挙げられる。合成膜貫通ドメインは、フェニルアラニンとトリプトファンとバリンとのトリプレットを含み得る。任意選択で、短い、好ましくは２〜１０アミノ酸長のオリゴペプチド又はポリペプチドリンカーが、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成し得る。グリシン−セリンダブレットが、膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間の特に好適なリンカーを提供する。
【０１７６】
本発明のＣＡＲはまた、細胞内シグナル伝達ドメインも含む。細胞内シグナル伝達ドメインはエフェクター機能シグナルを伝達し、細胞傷害性細胞にその特化した機能、すなわち標的細胞の阻害及び／又は破壊を果たすよう指図する。細胞内シグナル伝達ドメインの例としては、Ｔ細胞受容体複合体のζ鎖又はその相同体のいずれか、例えば、η鎖、ＦｃｓＲｌｙ及びβ鎖、ＭＢ  １（Ｉｇａ）鎖、Ｂ２９（Ｉｇ）鎖等、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＣＤ３ポリペプチド（Δ、δ及びε）、ｓｙｋファミリーチロシンキナーゼ（Ｓｙｋ、ＺＡＰ  ７０等）、ｓｒｃファミリーチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ、Ｆｙｎ、Ｌｙｎ等）及びＴ細胞形質導入に関与する他の分子、例えばＣＤ２、ＣＤ５及びＣＤ２８が挙げられる。具体的には、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζ鎖、ＦｃｙＲＩＩＩ、ＦｃｓＲＩ、Ｆｃ受容体の細胞質尾部、細胞質受容体を担持する免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）及びこれらの組み合わせであり得る。
【０１７７】
ＣＡＲに用いられる細胞内シグナル伝達ドメインには、いくつかのタイプの様々な他の免疫シグナル伝達受容体、例えば、限定はされないが、ＣＤ３、Ｂ７ファミリー共刺激、及び腫瘍壊死因子受容体（ＴＮＦＲ）スーパーファミリー受容体を含む第１世代、第２世代、及び第３世代Ｔ細胞シグナル伝達タンパク質の細胞内シグナル伝達ドメインが含まれ得る（Ｐａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｒｅ  ａｌｌ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｃｒｅａｔｅｄ  ｅｑｕａｌ？”Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｏｎｃｏｌ．，ｖｏｌ．３３，ｐｐ．６５１−６５３，２０１５）。加えて細胞内シグナル伝達ドメインには、ＮＫ及びＮＫＴ細胞によって使用されるシグナル伝達ドメイン（Ｈｅｒｍａｎｓｏｎ、ｅｔ  ａｌ．，“Ｕｔｉｌｉｚｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｔｏ  ｄｉｒｅｃｔ  ｎａｔｕｒａｌ  ｋｉｌｌｅｒ  ｃｅｌｌ  ａｃｔｉｖｉｔｙ，”Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．６，ｐ．１９５，２０１５）、例えば、ＮＫｐ３０（Ｂ７−Ｈ６）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎ  ＮＫｐ３０−ｂａｓｅｄ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ，”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１８９，ｐｐ．２２９０−２２９９，２０１２）、及びＤＡＰ１２（Ｔｏｐｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“ＤＡＰ１２−ｂａｓｅｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ＮＫ  ｃｅｌｌ  ｔｕｍｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，”Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１９４，ｐｐ．３２０１−３２１２，２０１５）、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＤＡＰ１０、及びＣＤ３ｚのシグナル伝達ドメインなどが含まれる。加えて、細胞内シグナル伝達ドメインにはまた、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むヒト免疫グロブリン受容体、例えば、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩＡ、ＦｃγＲＩＩＣ、ＦｃγＲＩＩＩＡ、ＦｃＲＬ５のシグナル伝達ドメインも含まれる（Ｇｉｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  ＦｃγＲｓ  ｔｏ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｗｉｔｈ  Ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｆｒｏｍ  Ｈｕｍａｎ  Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  Ａｎｉｍａｌ  Ｓｔｕｄｉｅｓ，”Ｆｒｏｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．５，ｐ．２５４，２０１４）。
【０１７８】
一部の実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＴＣＲζ、ＦｃＲγ、ＦｃＲβ、ＣＤ３γ、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、又はＣＤ６６ｄの細胞質シグナル伝達ドメインを含む。ＣＡＲの細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを含むことが特に好ましい。
【０１７９】
本発明のＣＡＲは共刺激ドメインを含んでもよく、これは、ＣＡＲを発現する細胞傷害性細胞の細胞増殖、細胞生存及びメモリー細胞の発生を増進する働きを有する。本発明のＣＡＲは、ＴＮＦＲスーパーファミリーのタンパク質、ＣＤ２８、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ１３４（ＯＸ４０）、ＤａｐｌＯ、ＣＤ２７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１  ｌａ／ＣＤ１８）、Ｌｃｋ、ＴＮＦＲ−Ｉ、ＰＤ−１、ＴＮＦＲ−ＩＩ、Ｆａｓ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ  ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、又はこれらの組み合わせの共刺激ドメインから選択される１つ又はそれ以上の共刺激ドメインを含み得る。ＣＡＲが２つ以上の共刺激ドメインを含む場合、これらのドメインは、任意選択でリンカーによって隔てられて、タンデムに配置され得る。共刺激ドメインは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に位置し得る細胞内ドメインである。
【０１８０】
一部の実施形態において、本発明のＣＡＲの２つ以上の構成要素は１つ又はそれ以上のリンカーによって隔てられている。例えば、少なくとも２つのＡＳＴＲを含むＣＡＲでは、それらの２つのＡＳＴＲがリンカーによって隔てられていてもよい。リンカーは、約１〜１００アミノ酸長のオリゴペプチド又はポリペプチド領域である。一部の実施形態において、リンカーは、例えば、５〜１２アミノ酸長、５〜１５アミノ酸長又は５〜２０アミノ酸長であり得る。リンカーは、隣接するタンパク質ドメイン同士が互いに自由に動くことができるように、グリシン及びセリンなどの可動性の残基で構成されてもよい。より長いリンカー、例えば１００アミノ酸より長いものが本発明の代替的な実施形態に関連して使用されてもよく、例えば２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないように選択され得る。本発明で使用し得るリンカーの例としては、限定はされないが、２Ａリンカー（例えばＴ２Ａ）、２Ａ様リンカー又はその機能的等価物が挙げられる。
【０１８１】
条件的活性型抗原特異的標的領域
ＣＡＲは、上記で考察した種々のドメインを全て共に融合して融合タンパク質を形成することによって生成されるキメラタンパク質である。ＣＡＲは、典型的には、ＣＡＲの種々のドメインをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターによって生成される。標的細胞上の抗原を認識してそれと結合する働きをする本発明のＡＳＴＲは、条件的活性型である。具体的には、ＡＳＴＲは、対応する親又は野生型タンパク質のＡＳＴＲと比較して、標的抗原との結合に関して正常生理条件では低活性又は不活性であり、異常条件では活性である。本発明は、親又は野生型タンパク質又はその結合ドメイン（親又は野生型ＡＳＴＲ）から条件的活性型ＡＳＴＲを生成する方法を提供する。
【０１８２】
本発明におけるＡＳＴＲは、タンパク質ライブラリを作成し、且つ標的抗原に対して所望の結合親和性を有するタンパク質に関してそのライブラリをスクリーニングすることによって発見し得るため、少なくとも全体又は一部を標的抗原に対するその結合ドメインに使用することが好適な野生型タンパク質。野生型タンパク質は、ｃＤＮＡライブラリをスクリーニングすることにより発見し得る。ｃＤＮＡライブラリは、宿主細胞のコレクションに挿入されたクローニングされたｃＤＮＡ（相補ＤＮＡ）フラグメントの組み合わせであり、一緒になって生物のトランスクリプトームのある一部を構成するものである。ｃＤＮＡは完全に転写されたｍＲＮＡから作製され、従って生物の発現タンパク質のコード配列を含む。ｃＤＮＡライブラリの情報は、標的抗原に対して所望の結合親和性を有するタンパク質に関してライブラリをスクリーニングすることによる、所望の特性を有するタンパク質の発見に強力且つ有用なツールである。
【０１８３】
野生型タンパク質が抗体である一部の実施形態において、野生型抗体は、抗体ライブラリを作成してスクリーニングすることにより発見し得る。抗体ライブラリは、ポリクローナル抗体ライブラリ又はモノクローナル抗体ライブラリのいずれであってもよい。標的抗原に対するポリクローナル抗体ライブラリは、その抗原を動物に直接注射することによるか、又はその抗原を非ヒト動物に投与することによって作成し得る。このように得られた抗体は、その抗原に結合するポリクローナル抗体のライブラリに相当する。モノクローナル抗体ライブラリの調製には、連続細胞株培養によって産生される抗体をもたらす任意の技法を用いることができる。例としては、ハイブリドーマ法、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法が挙げられる（例えば、Ｃｏｌｅ（１９８５）ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照）。一本鎖抗体の作成について記載される技法（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照）は、一本鎖抗体ライブラリの作製に適合させることができる。
【０１８４】
野生型抗体を発見するための抗体ライブラリの作成及びスクリーニング方法は他にもある。例えば、完全ヒト抗体ディスプレイライブラリを利用することができる。かかるライブラリは、１つ又は複数の宿主細胞の表面上に提示された抗体の集合である。好ましくは、抗体ライブラリは、それが多種多様な抗原との結合能を有する点でヒト抗体レパートリーを代表する。抗体は細胞の表面上に提示されるため、ライブラリにおける各抗体の（アビディティに起因する）有効親和性は増加する。ファージディスプレイライブラリなどの他の一般的なライブラリタイプ（スクリーニング及び同定の目的上、抗体のアビディティがあまり望ましくない）と異なり、本発明における細胞表面ディスプレイによって提供される超アビディティは望ましい。細胞表面ディスプレイライブラリでは、スクリーニング又は選択工程において、結合親和性が低い、中程度の、及び高い抗体の同定、並びに免疫原性がない及び弱いエピトープの同定が可能となる。
【０１８５】
親分子からの進化した分子の生成
親又は野生型タンパク質、又はその結合ドメイン（親又は野生型ＡＳＴＲ）が突然変異誘発のプロセスを受けると変異体ポリペプチドの集団が産生され、次にそれをスクリーニングすることにより、親又は野生型ＡＳＴＲとの比較において異常条件では標的抗原に対する結合親和性が増強した、且つ任意選択で、正常生理条件では標的抗原に対する結合親和性が実質的に同じか、又は低い変異体ＡＳＴＲを同定することができる。
【０１８６】
任意の化学的合成又は組換え突然変異誘発方法を用いて変異体ポリペプチド集団を生成し得る。本発明の実施には、特に指示されない限り、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えＤＮＡ、及び免疫学の従来技術を用いることができ、それらの技術は当該分野の技術の範囲内にある。かかる技法は文献に十分に説明されている。例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ  ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ：１９８９）；ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  Ｉ  ａｎｄ  ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ  ｅｄ．，１９８５）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ  ｅｄ．，１９８４）；Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．米国特許第４，６８３，１９５号明細書；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  Ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ＆  Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ  ｅｄｓ．１９８４）；Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌｓ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，１９８７）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ａｎｄ  Ｅｎｚｙｍｅｓ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６）；Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  Ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；ｔｈｅ  ｔｒｅａｔｉｓｅ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  Ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｈ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｂｓ  ｅｄｓ．，１９８７，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｓ．１５４  ａｎｄ  １５５（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．），Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｍａｙｅｒ  ａｎｄ  Ｗａｌｋｅｒ，ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｌｏｎｄｏｎ，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  Ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅｓ  ｌ−ＩＶ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９８６）；Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）を参照のこと。
【０１８７】
本開示は、条件的活性型の変異体ポリペプチドをコードする核酸変異体を生成する方法を提供し、この方法は、（ｉ）１つ以上のヌクレオチドを異なるヌクレオチドに置換すること（このヌクレオチドは天然又は非天然ヌクレオチドを含む）；（ｉｉ）１つ以上のヌクレオチドを欠失させること、（ｉｉｉ）１つ以上のヌクレオチドを付加すること、又は（ｉｖ）これらの任意の組み合わせによって核酸を修飾する工程を含む。一態様において、非天然ヌクレオチドはイノシンを含む。別の態様において、本方法は、修飾核酸によってコードされたポリペプチドを酵素活性の変化に関して分析する工程であって、それにより酵素活性が変化したポリペプチドをコードする１つ又は複数の修飾核酸を同定する工程をさらに含む。一態様において、工程（ａ）の修飾は、ＰＣＲ、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、アセンブリＰＣＲ、セクシャルＰＣＲ突然変異誘発、インビボ突然変異誘発、カセット突然変異誘発、再帰的アンサンブル突然変異誘発、指数関数的アンサンブル突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発、遺伝子リアセンブリ、遺伝子部位飽和突然変異誘発、リガーゼ連鎖反応、インビトロ突然変異誘発、リガーゼ連鎖反応、オリゴヌクレオチド合成、任意のＤＮＡ生成技術及びこれらの任意の組み合わせによって作られる。別の態様において、本方法は、修飾工程の少なくとも１つの反復をさらに含む。
【０１８８】
この方法はさらに、２つ又はそれ以上の核酸からポリヌクレオチドを製造するための方法を提供する。この方法は、次の（ａ）〜（ｃ）からなる。（ａ）２つ又はそれ以上の核酸間で同一の領域及び多様な領域を同定する工程。そこにおいて、この核酸の少なくとも１つは、本開示の核酸からなる。（ｂ）２つ又はそれ以上の核酸の少なくとも２つの配列に対応するオリゴヌクレオチドのセットを提供する工程。及び（ｃ）ポリメラーゼでオリゴヌクレオチドを延長し、それにより、ポリヌクレオチドを製造する工程。
【０１８９】
任意の突然変異誘発の技術は、本開示の様々な実施形態において使用されることがある。確率的又はランダムな突然変異誘発は、予定されていない突然変異を有する一連の子孫分子を得るために、親分子が変異する（修飾される又は変えられる）状況によって例証される。従って、生体外確率的突然変異誘発反応は、例えば、その製造が意図されたものではない、特に予定されていない製造物である。むしろ、得られる変異の正確な性質に関して、従って、生成される製造物に関して、不確定、従ってランダムである。確率的突然変異誘発は、エラープローンＰＣＲ及び確率的シャフリングのような、変異がランダム又は予定されていない方法において示される。バリアント形態は、第一バリアント形態のエラープローンＰＣＲのようなエラープローン転写や、プルーフリーディング活性が欠けるポリメラーゼの使用（Ｌｉａｏ（１９９０）Ｇｅｎｅ  ８８：１０７−１１１参照）によって、又は、変異株（変異宿主細胞は以下にさらに詳細に議論されており、これは一般的によく知られている）において第一形態の複製によって作成することができる。突然変異誘発因子株は、不整合な修復の機能において欠損される任意の変異体を含むことができる。これらは、ｍｕｔＳ、ｍｕｔＴ、ｍｕｔＨ、ｍｕｔＬ、ｏｖｒＤ、ｄｃｍ、ｖｓｒ、ｕｍｕＣ、ｕｍｕＤ、ｓｂｃＢ、ｒｅｃＪなどの変異体遺伝子産物を含む。欠損は、遺伝子突然変異、対立遺伝子交換、微小化合物又は発現されたアンチセンスＲＮＡ又は他の技術によって得られる。欠損は、記述された遺伝子又は任意の有機体における相同遺伝子であることがある。
【０１９０】
他の突然変異誘発方法としては、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発技術、エラープローンポリメラーゼ連鎖反応（エラープローンＰＣＲ）及びカセット突然変異誘発が挙げられ、ここでは親ポリヌクレオチドの特定の領域が、合成的に突然変異を誘発されたオリゴヌクレオチドに置き換えられる。このような場合、親配列の特定の部位の周りにいくつもの突然変異部位が生成される。
【０１９１】
オリゴヌクレオチド指定突然変異において、短い配列は、合成的に突然変異を誘発されたオリゴヌクレオチドと置換される。オリゴヌクレオチド指定突然変異において、ポリヌクレオチドの短い配列は、制限酵素消化を使用する合成ポリヌクレオチドから除かれ、様々な塩基がもとの配列から変更された合成ポリヌクレオチドと置換される。ポリヌクレオチド配列は化学的突然変異誘発によって変更されることもある。化学的突然変異ゲ原は、例えば、重亜硫酸ナトリウム、亜硝酸、ヒドロキシルアミン、ヒドラジン、又はギ酸を含む。ヌクレオチド前駆体と類似の他の薬剤は、ニトロソグアニジン、５−ブロモウラシル、２−アミノプリン、又はアクリジンを含む。一般的に、これらの薬剤は、それにより配列を変位させるヌクレオチド前駆体の代わりにＰＣＲ反応に加えられる。プロフラビン、アクリフラビン、キナクリンなどのような薬剤の挿入が使用されることもある。ポリヌクレオチド配列のランダムな突然変異誘発は、Ｘ線又は紫外線照射によって得られることがある。一般的に、突然変異誘発されたプラスミドポリヌクレオチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）内に導入され、交雑プラスミドのプール又はライブラリーとして伝播される。
【０１９２】
エラープローンＰＣＲは、長い配列にわたってランダムに点突然変異の低レベルを導入するための低忠実度重合条件を使用する。未知の配列のフラグメントの混合物において、エラープローンＰＣＲは、混合物を突然変異誘発するのに用いられることがある。
【０１９３】
カセット突然変異誘発において、単一テンプレートの配列遮断は、典型的にはランダム配列によって（部分的に）置換される。Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  Ｊ  Ｆ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ  Ｒ  Ｔ：タンパク質配列の情報内容のプローブとしての組み合わせカセット突然変異誘発。Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１（４８６１）：５３−５７，１９８８。
【０１９４】
或いは、非確率的又は非ランダムな遺伝子突然誘発の任意の技術も本開示の様々な実施形態において使用することができる。非確率的突然変異誘発は、１つ又はそれ以上の予め決定された変異を有する分子を得るために、親分子が変異される（修飾される、又は、変化される）状況によって例証される。ある程度の量におけるバックグラウンド製造物の存在が、分子プロセシングの起こる多くの反応において実在し、及び、バックグラウンド製造物の存在が、予定されていない製造物を有する突然変異誘発工程の非確率的性質から減じないことはよく理解されている。部位−飽和突然変異誘発及び合成結紮リアセンブリは、遺伝子突然変異誘発技術の例であり、そこにおいて意図された製造物の正確な化学的構造は、予定されたものである。
【０１９５】
部位−飽和点突然変異誘発の１つの方法は、米国特許出願公開第２００９／０１３０７１８号明細書に記載されている。この方法は、テンプレートポリヌクレオチドのコドンに対応する一連の変性プライマーを提供し、及び、変性プライマーに対応する配列を含む子孫ポリヌクレオチドを製造するためのポリメラーゼ伸長を実行する。子孫ポリヌクレオチドは、直接的進化において発現され、及び、スクリーニングされる。具体的には、これは、一連の子孫ポリペプチドを製造するための方法であって、工程（ａ）テンプレートポリペプチド配列をエンコードするコドンの複数からそれぞれなるテンプレートポリペプチドのコピーを提供する工程、及び（ｂ）テンプレートポリヌクレオチドの各コドンにおいて、（１）一連の変性プライマーを提供する工程、そこにおいて、各プライマーはテンプレートポリヌクレオチドのコドンに対応する変性コドンからなり、少なくとも１つの隣接配列は、テンプレートポリヌクレオチドのコドンに隣接する配列に相同である、（２）プライマーがテンプレートポリヌクレオチドのコピーにアニール可能な条件を提供する工程、及び、（３）テンプレートに沿ったプライマーからのポリメラーゼ伸長反応を実行する工程、の（１）〜（３）の工程を実行し、それによって子孫ポリヌクレオチドを提供し、それぞれがアニールされたプライマーの変性コドンに対応する配列を含み、それによって一連の子孫ポリヌクレオチドを製造する。部位飽和突然変異誘発法とは、核酸の直接進化に関連し、進化した核酸を含むクローンをスクリーニングして、その結果、目的の結合活性を得る方法である。
【０１９６】
部位飽和突然変異誘発は、概して、１）１つ以上の祖先又は親世代鋳型から、少なくとも１つの点突然変異、付加、欠失、及び／又はキメラ化を実現するように突然変異を誘発された１つ又は複数の分子（ポリヌクレオチド配列を含む分子、ポリペプチド配列を含む分子、及び部分的にポリヌクレオチド配列を含み、且つ部分的にポリペプチド配列を含む分子を含む）の子孫世代を調製し；２）標的抗原に対する所望の結合親和性に関して１つ又は複数の子孫世代分子を−好ましくはハイスループット方法を用いて−スクリーニングし；３）任意選択で親及び／又は子孫世代分子に関する構造及び／又は、及び機能情報を入手及び／又はカタログ化し；及び４）任意選択で工程１）〜３）のいずれかを反復する方法に関する。
【０１９７】
部位飽和突然変異誘発において、生成された（例えば、親ポリヌクレオチドテンプレートから）「コドン部位飽和突然変異誘発」と称されるポリヌクレオチドの子孫世代は、全てのコドン（又は同じアミノ酸をエンコードする変性コドンの全系統）が各コドン位置で表れるように、それぞれが、３つ以上の隣接点突然変異（つまり、新しいコドンからなる異なる塩基）の少なくとも１組を有する。このポリヌクレオチドの子孫世代に対応する、及び、このポリヌクレオチドの子孫世代によってエンコードされるのは、それぞれ少なくとも１つの単一アミノ酸点突然変異を有する、生成された一連の子孫ポリペプチドである。好適な態様において、生成された「アミノ酸部位飽和突然変異誘発」と称される一例は、ポリペプチドに沿った各アミノ酸位置及び全アミノ酸位置でアルファアミノ酸置換を形成する、自然にエンコードされる１９のポリペプチドのそれぞれにおける変異体ポリペプチドである。この収量は−親ポリペプチドに沿った各アミノ酸位置及び全アミノ酸位置−もとのアミノ酸を含む２０の異なる子孫ポリペプチドの全て、又は、付加アミノ酸が、２０の自然にエンコードされたアミノ酸の代わりに、又は付加されてのどちらかで使用される場合、潜在的に２１以上の異なる子孫ポリペプチドである。
【０１９８】
他の突然変異誘発技術は、組換えを含んで用いられることがあり、より具体的には、部分的相同の領域を含むポリヌクレオチド配列の生体内再集合の方法によって、ポリペプチドをエンコードするポリヌクレオチドを調製するための方法、少なくとも１つのポリヌクレオチドを形成するためのポリヌクレオチドをアセンブリする方法、有用な性質を有するポリペプチドの製造のためにポリヌクレオチドをスクリーニングする方法を含む。
【０１９９】
他の態様において、突然変異誘発技術は、分子を組換えるため、及び／又は配列及び相同領域を有する反復又は連続した配列の範囲の煩雑さを減らす縮小した方法を伝達するため、細胞の本来の性質を利用する。
【０２００】
様々な突然変異誘発技術は、生物学的活性交雑ポリペプチドをエンコードする交雑ポリペプチドを生成するための方法を提供するため、単独で、又は組み合わせて用いられることがある。これら及び他の目的を達成することにおいて、本開示の一態様に従って、適当な宿主細胞内にポリペプチドを導入し、交雑ポリペプチドを製造するための条件下で宿主細胞を成長させる方法が設けられている。
【０２０１】
キメラ遺伝子は、制限酵素によって生成される互換性のある粘着末端を使用する２つのポリヌクレオチドフラグメントを接合することによってつくられる。ここにおいて、各フラグメントは、別々の祖先（親）分子に由来する。他の実施例は、単一部位突然変異誘発されたポリペプチドのためにエンコードする単一子孫ポリヌクレオチドを生成するための親ポリヌクレオチドにおいて、単一コドン位置の突然変異誘発（つまり、コドン置換、付加、欠失を得るため）である。
【０２０２】
さらに、生体内部位特異的組換え系は、生体内組換えのランダムな方法と同様に、遺伝子の交雑の生成、及び、相同であるが、プラスミド上で切断された遺伝子間の組換えの生成のために利用される。突然変異誘発はまた、重複拡張及びＰＣＲによっても報告された。
【０２０３】
非ランダムな方法は、点突然変異及び／又はキメラ化のより大きい数を得るために使用し、例えば、総合的又は包括的な方法は、テンプレート分子において特異的構造群（例えば、特異的単一アミノ酸位置又は２つ又はそれ以上のアミノ酸位置からなる配列）に機能的に属するために、及び突然変異の特異的な群化を分類し、比較するために、特定の突然変異の群化において全ての分子種を生成するために用いられる。
【０２０４】
本開示において、親又は野生型タンパク質から変異体ポリペプチドの新規集団（ライブラリ）を生成するため、これら又は他の進化方法のいずれを用いることもできる。
【０２０５】
進化分子の発現
進化工程から生成された変異体ポリヌクレオチドは、変異体ポリペプチドの産生（発現）のため、既発表のプロトコルに従いアガロースゲルでサイズ分画され、発現ベクターに挿入され、及び適切な宿主細胞にトランスフェクトされても、又はされなくてもよい。発現は、ルーチンの分子生物学的技術を用い得る。従って、発現工程は様々な公知の方法を用いることができる。
【０２０６】
例えば、簡潔に言えば、進化工程から生成された変異体ポリヌクレオチドを、次に標準的な分子生物学的技術を用いて消化し、プラスミドＤＮＡなどの発現ベクターにライゲーションする。次に標準的なプロトコルを用いてベクターを細菌又は他の細胞に形質転換する。これは、ハイスループット発現及びスクリーニング用の９６ウェルトレイなどのマルチウェルトレイの個々のウェルで行うことができる。このプロセスを各変異体ポリヌクレオチドについて繰り返す。
【０２０７】
このようにして選抜され単離されたポリヌクレオチドは、適切な宿主細胞に導入される。適切な宿主細胞は、遺伝子組換え及び／又は減少的再集合を促進することができる任意の細胞である。選抜されたポリヌクレオチドは、好ましくは、適切な制御配列を含むベクターに既にあるものである。宿主細胞は、哺乳細胞等の高等真核細胞であり、又は酵母細胞等の下等真核細胞であっても良く、又は好ましくは宿主細胞は、細菌細胞等の原核細胞であってもよい。宿主細胞へのコンストラクトの導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、又はエレクトロポレーションによって遂行されることができる（例えば、Ｅｃｋｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，１９８６，Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ＲＮＡ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，８３：５３７２−５３７６）。
【０２０８】
使用可能な発現ベクターの代表例として、ウイルス粒子、バキュロウイルス、ファージ、プラスミド、ファージミド、コスミド、フォスミド、細菌人工染色体、ウイルスＤＮＡ（例えば、ワクシニア、アデノウイルス、ｆｏｕｌ  ｐｏｘ  ｖｉｒｕｓ、仮性狂犬病、及びＳＶ４０派生物）ｐｌに基づく人工染色体、酵母プラスミド、酵母人工染色体、及び特定の目的宿主に特異的な任意の他のベクター（例えば桿菌、アスペルギルス、及び酵母）が言及され得る。従って、例えば、ＤＮＡは、ポリペプチドを発現するための様々な発現ベクターのいずれか一つに含まれ得る。このようなベクターは、染色体性のＤＮＡ配列、非染色体性のＤＮＡ配列、及び合成ＤＮＡ配列を含む。多数の適切なベクターは当業者に周知であり、市販されている。例として以下のベクターを挙げる。細菌性：ｐＱＥベクター（Ｑｉａｇｅｎ）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔプラスミド、ｐＮＨベクター、ラムダＺＡＰベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）；ｐｔｒｃ９９ａ、ρＫＫ２２３−３、ｐＤＲ５４０、ｐＲＩＴ２Ｔ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）；真核性：ｐＸＴｌ、ρＳＧ５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ｐＳＶＫ３、ｐＢＰＶ、ｐＭＳＧ、ｐＳＶＬＳＶ４０（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）。しかしながら、それらが宿主において複製可能であり且つ生存可能である限り、他のいかなるプラスミドも又は他のベクターも使用可能である。低コピー数ベクター又は高コピー数ベクターが、本発明において使用されることができる。
【０２０９】
発現ベクターにおける変異体ポリヌクレオチド配列は、ＲＮＡ合成を導くための適切な発現制御配列（プロモーター）と操作可能に連結される。特定の名づけられた細菌プロモーターは、ｌａｄ、ｌａｃＺ、Ｔ３、Ｔ７、ｇｐｔ、ラムダＰＲ、ＰＬ、及びｔｒｐを含む。真核生物プロモーターは、前初期ＣＭＶ、ＨＳＶチミジンキナーゼ、初期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来のＬＴＲ、及びマウスメタロチオネイン−１を含む。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者の水準の範囲内にある。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含む。このベクターは、発現を増幅するための適切な配列を含んでもよい。プロモーター領域は、選択可能なマーカーを有するクロラムフェニコールトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）ベクター、又は他のベクターを使用して、任意の所望の遺伝子から選択されることができる。加えて、発現ベクターは、真核細胞培養に対するジヒドロ葉酸還元酵素又はネオマイシン耐性等、又は大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるテトラサイクリン又はアンピシリン耐性等の、形質転換された宿主細胞の選抜のための表現型の特徴を提供するために、好ましくは、１若しくはそれ以上の選択可能なマーカー遺伝子を含む。
【０２１０】
真核生物ＤＮＡ転写は、発現ベクターにエンハンサー配列を挿入することによって増加させ得る。エンハンサーは、プロモーターによる転写を増加させる１０〜３００ｂｐのシス作用配列である。エンハンサーは、転写ユニットの５’側又は３’側のいずれにあるときも、転写を有効に増加させることができる。エンハンサーはまた、イントロン内又はコード配列それ自体の中に位置する場合も有効である。典型的には、ＳＶ４０エンハンサー、サイトメガロウイルスエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーを含めたウイルスエンハンサーが用いられる。マウス免疫グロブリン重鎖エンハンサーなど、哺乳類系由来のエンハンサー配列もまたよく用いられる。
【０２１１】
哺乳類発現ベクター系はまた、典型的には選択可能なマーカー遺伝子も含む。好適なマーカーの例としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（ＤＨＦＲ）、チミジンキナーゼ遺伝子（ＴＫ）、又は薬剤耐性を付与する原核生物遺伝子が挙げられる。最初の２つのマーカー遺伝子については、成長培地にチミジンを添加しなければ成長することができない変異細胞株の使用が好ましい。次に、非補足培地で成長する能力によって形質転換細胞を同定することができる。マーカーとして有用な原核生物薬剤耐性遺伝子の例としては、Ｇ４１８、ミコフェノール酸及びハイグロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。
【０２１２】
目的のＤＮＡセグメントを含有する発現ベクターは、細胞産生宿主のタイプに応じた周知の方法によって宿主細胞に移入することができる。例えば、原核生物宿主細胞には塩化カルシウムトランスフェクションがよく利用され、一方、リン酸カルシウム処理、リポフェクション、又は電気穿孔は真核生物宿主細胞に用いられ得る。哺乳類細胞産生宿主の形質転換に用いられる他の方法としては、ポリブレン、プロトプラスト融合、リポソーム、電気穿孔、及びマイクロインジェクションの使用が挙げられる（一般に、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，前掲を参照）。
【０２１３】
適切な宿主に発現ベクターが導入されると、導入された変異体ポリヌクレオチド配列が高度に発現して変異体ポリペプチドが産生されるように、宿主が好適な条件下に維持される。発現ベクターは典型的には、エピソームとして、或いは宿主染色体ＤＮＡの一体部分として、宿主生物において複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列で形質転換された細胞の検出を可能にするため、選択マーカー、例えばテトラサイクリン又はネオマイシンを含み得る（例えば、米国特許第４，７０４，３６２号明細書を参照のこと）。
【０２１４】
従って、本願発明の他の態様においては、変異体ポリヌクレオチドは、減少的再集合の方法によって生成されることができる。方法は、連続的な配列（オリジナルのコード配列配列）、適切なベクターへのそれらの挿入、及び適切な宿主細胞へのその後のそれらの導入を含むコンストラクトの生成を含む。個々の分子同一性の再集合は、相同領域を有するコンストラクトにおける連続的な配列間での、又は擬似繰り返し単位間での組合せ方法によって発生する。再集合方法は、複雑さ及び反復配列の範囲を再結合させ及び／又は減少させ、新しい分子種の生成をもたらす。さまざまな処理を、再集合の割合を増強させるために適用することができる。これらは、紫外線処理又はＤＮＡ損害性化学薬品、及び／又は増強した水準の「遺伝的不安定性」を示す宿主細胞株の使用を含むことができる。したがって、再集合方法は、それら自身の進化を導くために、相同組換え又は準反復配列の自然の特性を含むことができる。
【０２１５】
細胞はその後増殖し、「減少的再集合」は達成される。減少的再集合方法の割合は、必要に応じて、ＤＮＡ損傷の導入によって刺激され得る。インビボでの再集合は「遺伝子組換え」とまとめて呼ばれる「分子間の」方法に向けられ、これは細菌においては、「ＲｅｃＡ依存性」の現象として通常観察される。本発明は、配列を組換え且つ再集合させるための宿主細胞の遺伝子組換え方法、又は欠損によって細胞における準反復配列の複雑性を減少させるための縮小方法を調節する細胞の能力に依存することができる。「縮小再集合」のこの方法は、「分子内の」、ＲｅｃＡ非依存性の方法によって生じる。最終結果は、すべての可能な組合せへの分子の再集合である。
【０２１６】
一態様において、宿主生物又は細胞は、グラム陰性菌、グラム陽性菌又は真核生物を含む。本開示の別の態様において、グラム陰性菌は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、又は蛍光菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ）を含む。本開示の別の態様において、グラム陽性菌は、ストレプトミセス・ディベルサ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｉｖｅｒｓａ）、ラクトバチルス・ガセリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｇａｓｓｅｒｉ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ラクトコッカス・クレモリス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｃｒｅｍｏｒｉｓ）、又はバチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）を含む。本開示の別の態様において、真核生物は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｌｙｍｏｒｐｈａ）、又はアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）を含む。適切な宿主の代表例として、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、ネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）；真菌細胞、例えば、酵母；昆虫細胞、例えば、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）Ｓ２及びスポドプテラ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ）Ｓｆ９；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ又はＢｏｗｅｓメラノーマ；アデノウイルス；及び植物細胞を挙げることができる。適切な宿主の選択は、本明細書の教示から当業者の範囲内にあると見なされる。
【０２１７】
酵母などの真核微生物に加えて、哺乳類組織細胞培養物もまた、本発明の変異体ポリペプチドの発現に使用し得る（Ｗｉｎｎａｃｋｅｒ，“Ｆｒｏｍ  Ｇｅｎｅｓ  ｔｏ  Ｃｌｏｎｅｓ，”ＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎ．Ｙ．，Ｎ．Ｙ．（１９８７）を参照）。真核細胞は、インタクトな免疫グロブリンの分泌能を有するいくつもの好適な宿主細胞株が当該技術分野において開発されているため好ましく、ＣＨＯ細胞株、様々なＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、骨髄腫細胞株、Ｂ細胞又はハイブリドーマが含まれる。これらの細胞の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサー（Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．８９，ｐａｇｅ  ４９，１９８６）、及び必須のプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、及び転写終結配列を含み得る。好ましい発現制御配列は、免疫グロブリン遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。
【０２１８】
一実施形態において、真核生物宿主細胞は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３、ＩＭ９、ＤＳ−１、ＴＨＰ−１、Ｈｅｐ  Ｇ２、ＣＯＳ、ＮＩＨ  ３Ｔ３、Ｃ３３ａ、Ａ５４９、Ａ３７５、ＳＫ−ＭＥＬ−２８、ＤＵ  １４５、ＰＣ−３、ＨＣＴ  １１６、Ｍｉａ  ＰＡＣＡ−２、ＡＣＨＮ、ジャーカット、ＭＭ１、Ｏｖｃａｒ  ３、ＨＴ  １０８０、Ｐａｎｃ−１、Ｕ２６６、７６９Ｐ、ＢＴ−４７４、Ｃａｃｏ−２、ＨＣＣ  １９５４、ＭＤＡ−ＭＢ−４６８、ＬｎＣＡＰ、ＮＲＫ−４９Ｆ、及びＳＰ２／０細胞株；及びマウス脾細胞及びウサギＰＢＭＣから選択される。一態様において、哺乳類宿主細胞（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｈｏｉｓｔ  ｃｅｌｌ）は、ＣＨＯ又はＨＥＫ２９３細胞株から選択される。具体的な一態様において、哺乳類宿主細胞はＣＨＯ−Ｓ細胞株である。別の具体的な態様において、哺乳類系はＨＥＫ２９３細胞株である。別の実施形態において、真核生物宿主は酵母細胞系である。一態様において、真核生物宿主は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）酵母細胞又はピキア属（ｐｉｃｃｈｉａ）酵母細胞から選択される。
【０２１９】
別の実施形態において、哺乳類宿主細胞は開発業務受託機関又は医薬品製造受託機関によって商業的に作成されてもよい。例えば、組換え抗体又は他のタンパク質については、Ｌｏｎｚａ（Ｌｏｎｚａ  Ｇｒｏｕｐ  Ｌｔｄ、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）が、ベクターを作成し、ＧＳ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（商標）技術をＣＨＯＫ１ＳＶ又はＮＳ０細胞産生宿主のいずれかと共に用いてこれらの産物を発現させることができる。目的のポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、プロモーターの活性化、形質転換体の選択又は遺伝子の増幅のため適宜改良した従来の栄養培地で培養することができる。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用に選択された宿主細胞で以前使用したものであり、当業者には明らかであろう。
【０２２０】
上記で考察したとおり、条件的活性型ＡＳＴＲの発現最適化は、用いるベクター（ベクター成分、例えば、プロモーター、スプライス部位、５’及び３’末端及びフランキング配列）の最適化、宿主細胞の遺伝子修飾による遺伝子欠失及び再構成の低減、関連性のある遺伝子をインビボ又はインビトロで進化させる方法による宿主細胞遺伝子活性の進化、関連性のある遺伝子を進化させることによる宿主グリコシル化酵素の最適化によって、及び／又は染色体ワイドな宿主細胞突然変異誘発及び発現能が増進した細胞を選択するための選択戦略によって達成することができる。
【０２２１】
タンパク質発現は様々な周知の方法によって誘導されることができ、多くの遺伝系がタンパク質発現の誘導のために公表されている。例えば、適切な系については、誘導剤品の追加によってタンパク質発現が誘導される。細胞はその後、遠心分離によってペレットにされ、上澄みが取り除かれる。ペリプラズムタンパク質は、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ及びリソチームを有する細胞を培養することによって高められ得る。遠心分離後、新規なタンパク質を含む上澄みは、アッセイ前に新しいマルチウェルトレイに移され、保存される。
【０２２２】
細胞は一般的には遠心分離によって採取され、物理的又は化学的手段によって分離され、そして得られたクルードの抽出物は更なる精製のために保持される。タンパク質の発現のために使用される微生物細胞は、凍結融解サイクル、音波処理、機械分離、又は細胞溶解剤の使用を含む任意の都合のよい方法によって分離されることができる。このような方法は当業者に周知である。発現したポリペプチド又はそのフラグメントは、硫酸アンモニウム又はエタノール沈殿、酸抽出、陰イオン又は陽イオン交換クロマトグラフィ、ホスホセルロースクロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、アフィニティークロマトグラフィ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィ、及びレクチンクロマトグラフィを含む方法によって、組換え細胞培養物から回収され、精製され得る。タンパク質のリフォールディング過程が、必要に応じて、ポリペプチドの構造を仕上げる際に用いられることができる。必要に応じて、高性能液体クロマトグラフィ（ＨＰＬＣ）が、最終的な精製過程のために使用されることができる。条件的活性型ＡＳＴＲのスクリーニングは、好都合なハイスループットスクリーニング又は選択プロセスを利用可能であることによって促進され得る。細胞表面ディスプレイ発現及びスクリーニング技術（例えば、上記に定義するとおりの）を用いて、条件的活性型ＡＳＴＲに関して変異体タンパク質をスクリーニングすることができる。
【０２２３】
可逆的又は非可逆的な変異を同定するためのスクリーニング
望ましい分子の同定は、許容型の条件及び野生型の条件におけるタンパク質活性を測定することによって、非常に直接的に達成される。最も高い活性の比（許容型／野生型）を示す変異体を、次いで選択し、標準的な方法を用いて個々の変異を組み合わせることで、点変異の並べ替え（ｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）を生成することが出来る。次いで、この組み合わせた並べ替えタンパク質ライブラリーから、許容型と野生型の活性に最も大きい差を示すタンパク質をスクリーニングする。
【０２２４】
上清の活性を、様々な方法、例えば、蛍光アッセイなどのハイスループットな活性アッセイを使ってスクリーニングして、希望する特性（温度、ｐＨなど）に感受性をもつ、タンパク質変異体を同定することが可能である。例えば、時間的感受性の変異体をスクリーニングするためには、個々の変異体ごとに、低い温度（２５℃など）と、元のタンパク質が機能する温度（３７℃など）とにおいて、商業的に利用可能な基質を用いて、酵素活性又は抗体活性の測定を行う。スクリーニングは、特に血清及びＢＳＡなど、種々の培地で行うことができる。反応は、初めは９６ウェル分析など、マルチウェル分析フォーマットで実施し、１４ｍｌチューブフォーマットなど、別のフォーマットを用いて確認することができる。
【０２２５】
一態様においては、本方法はさらに、候補の条件的生理活性をテストする前に、少なくとも一つの核酸又はポリペプチドを改変する工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、宿主細胞又は宿主生物におけるポリペプチドの発現の上昇をテストする工程を有するものである。さらなる態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約ｐＨ３〜約ｐＨ１２のｐＨ範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。さらなる態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約ｐＨ５〜約ｐＨ１０のｐＨ範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。さらなる態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約ｐＨ６〜約ｐＨ８のｐＨ範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。さらなる態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約ｐＨ６．７〜約ｐＨ７．５のｐＨ範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約４℃〜約５５℃の温度範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約１５℃〜約４７℃の温度範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約２０℃〜約４０℃の温度範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、約２５℃〜約３７℃の温度範囲内における酵素活性をテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、通常の浸透圧下での酵素活性と、（正方向又は負方向に）異常な浸透圧下での酵素活性とをテストする工程を有するものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、通常の電解質濃度下での酵素活性と、（正方向又は負方向に）異常な電解質濃度下での酵素活性とをテストする工程を有するものである。テストされる電解質濃度は、カルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、塩素、重炭酸、及びリン酸の濃度から選択されるものである。別の態様においては、テストする工程（ｃ）はさらに、安定した反応産物をもたらす酵素活性をテストする工程を有するものである。
【０２２６】
別の態様においては、本開示は、酵素活性を持つ本開示のポリペプチド又はそのフラグメントに特異的に結合する、精製抗体を提供するものである。一態様においては、本開示は、酵素活性を持つポリペプチドに特異的に結合する抗体のフラグメントを提供するものである。
【０２２７】
抗体及び抗体ベースのスクリーニング方法
本開示は、本開示の酵素に特異的に結合する、単離された抗体又は組換え抗体を提供する。これらの抗体を用いて、本開示の酵素、又は関連するポリペプチドの酵素を、単離、同定、又は定量化することが出来る。これらの抗体を用いて、本開示の範囲内の他のポリペプチド、又は他の関連する酵素を単離することが出来る。抗体は、酵素の活性部位に結合するように設計することが出来る。従って、本開示は、本開示の抗体を用いて、酵素を抑制する方法を提供する。
【０２２８】
抗体は、免疫沈降、染色、及び免疫親和性カラムなどで用いることが出来る。必要な場合、特定の抗原をエンコードする核酸配列は、免疫処置とそれに続くポリペプチド又は核酸の単離、増幅又はクローニング、並びに本開示のアレイへのポリペプチドの固定化によって生成することが出来る。或いは、本開示の方法を用いて、細胞によって生産された抗体の構造を改変することが可能であり、抗体を改変し、例えば抗体の親和性を上昇又は低下させることが可能である。さらに、抗体を作成又は改変する能力を、本開示の方法により細胞中に設計された表現型とすることが出来る。
【０２２９】
免疫処置、抗体の作製及び単離（ポリクローナル及びモノクローナル）の方法は、当業者に公知であり、科学文献及び特許文献に記載されている。例えば、Ｃｏｌｉｇａｎ，ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ，Ｗｉｌｅｙ／Ｇｒｅｅｎｅ，ＮＹ（１９９１）；Ｓｔｉｔｅｓ（ｅｄｓ．）ＢＡＳＩＣ  ＡＮＤ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ（７ｔｈ  ｅｄ．）Ｌａｎｇｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ，Ｃａｌｉｆ．（“Ｓｔｉｔｅｓ”）；Ｇｏｄｉｎｇ，ＭＯＮＯＣＬＯＮＡＬ  ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ：ＰＲＩＮＣＩＰＬＥＳ  ＡＮＤ  ＰＲＡＣＴＩＣＥ（２ｄ  ｅｄ．）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８６）；Ｋｏｈｌｅｒ（１９７５）“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ”，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５；Ｈａｒｌｏｗ（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ．を参照のこと。抗体はまた、例えば、従来的な動物を用いたインビボの方法に加えて、組換え抗体の結合部位を発現するファージディスプレイライブラリーを用いることで、インビトロで作製することも可能である。例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ（１９９７）“Ｄｅｓｉｇｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｌｉｂｒａｒｙ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｈｉｇｈ−ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ”，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：６２−７０；及びＫａｔｚ（１９９７）“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ａｎｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｌｉｇａｎｄｓ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｄ  ｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｂｙ  ｐｈａｇｅ  ｄｉｓｐｌａｙ”，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｂｉｏｍｏｌ．Ｓｔｒｕｃｔ．２６：２７−４５．を参照のこと。
【０２３０】
ポリペプチド又はペプチドを用いて、特異的に本開示のポリペプチド、例えば酵素に結合する抗体を作製することが出来る。結果得られる抗体は、ポリペプチドを単離又は精製するため、或いはポリペプチドが生体サンプルの中に存在するかどうかを決定するために、免疫親和性クロマトグラフィーの手法の中で用いられてもよい。そうした手法においては、抽出物などのタンパク質調製物、又は生体サンプルを、本開示のポリペプチドの中の１つに特異的に結合することが出来る抗体と接触させる。
【０２３１】
免疫親和性手法においては、抗体を、ビーズ又はその他のカラム基材などの、固体支持体に結合させる。タンパク質調製物を、本開示のポリペプチドの中の１つに特異的に抗体が結合する条件下で、抗体と接触するように置く。洗浄を行い、非特異的に結合したタンパク質を除去した後、特異的に結合したポリペプチドを溶出する。
【０２３２】
生体サンプル中のタンパク質の、抗体対する結合能力を、当業者に公知の様々な手法を用いて決定することが出来る。例えば、蛍光物質、酵素ラベル、放射性同位体などの、検出可能な標識を用いて抗体を標識することによって、結合能を決定してもよい。或いは、表面にそうした検出可能な標識を持つ二次抗体を用いて検出することによって、サンプルに対する抗体の結合能を決定してもよい。特定のアッセイとしては、ＥＬＩＳＡアッセイ、サンドイッチアッセイ、ラジオイムノアッセイ、及びウェスタンブロットが含まれる。
【０２３３】
本開示のポリペプチドに対して製作されるポリクローナル抗体は、動物へのポリペプチドの直接注射か、又は非ヒト動物へのポリペプチドの投与によって、得ることが出来る。そうして得られた抗体を、次いでポリペプチドそれ自体に結合させる。この方法においては、ポリペプチドのフラグメントのみをエンコードする配列さえ、未変性の全長ポリペプチドに結合する可能性のある抗体を作成するのに用いることが出来る。次いで、そうした抗体を用いて、ポリペプチドを発現する細胞からポリペプチドを単離することが出来る。
【０２３４】
モノクローナル抗体を調整するために、継代培養細胞株によって生産される抗体を提供する、任意の手法を用いることが出来る。例として、ハイブリドーマ法、トリオーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法、及びＥＢＶハイブリドーマ法（例えば、Ｃｏｌｅ（１９８５）ｉｎ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，Ｉｎｃ．，ｐｐ．７７−９６を参照のこと）が含まれる。
【０２３５】
単鎖抗体を作製するために記載された手法（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号明細書を参照のこと）を、本開示のポリペプチドに対する単鎖抗体を作製するために適応することが出来る。或いは、トランスジェニックマウスを用いて、ポリペプチド又はそのフラグメントに対するヒト化抗体を発現させてもよい。本開示のポリペプチドに対して製作される抗体を用いて、他の生物及びサンプル由来の類似のポリペプチド（例えば、酵素）をスクリーニングすることが出来る。そうした手法においては、生物由来のポリペプチドを抗体と接触させ、抗体と特異的に結合するポリペプチドを検出する。上述した手法から任意のものを、抗体の結合を検出するために用いてもよい。
【０２３６】
スクリーニング方法、及び「オンライン」モニタリング装置
本開示の方法の実施においては、様々な装置及び方法を本開示のポリペプチド及び核酸と併せて使用することが出来る。その装置及び方法には、例えば、酵素活性によるペプチドのスクリーニングするためのもの、酵素活性に対してアクチベーター又はインヒビターなどの潜在モジュレーターとなる化合物のスクリーニングするためのもの、本開示のポリペプチドに結合する抗体のためのもの、本開示の核酸にハイブリダイズする核酸のためのもの、本開示のポリペプチドを発現する細胞をスクリーニングするためのものなどが挙げられる。
【０２３７】
アレイ又は「バイオチップ」
本開示の核酸又はポリペプチドは、アレイに固定化又は適用することが出来る。アレイを用いることで、組成物（例えば、小分子、抗体、核酸など）のライブラリーに対して、本開示の核酸又はポリペプチドに結合する能力、又はそれらの活性を調整する能力によって、スクリーニング又はモニターすることが出来る。例えば、本開示の一態様においては、モニターされるパラメーターは酵素遺伝子の転写発現である。ある細胞の転写産物の、１つ又は複数、或いは全てを、その細胞の転写産物或いは細胞の転写産物の代表的又は相補的な核酸を有するサンプルを、アレイ又は「バイオチップ」に固定化した核酸にハイブリダイズすることで、測定することが可能である。マイクロチップ上の核酸の「アレイ」を用いることで、転写産物の一部又は全部を同時に定量化する事が出来る。或いは、ゲノム核酸を有するアレイを用いることで、本開示の方法によって作られた、新たに設計された株の遺伝子型を決定することも出来る。ポリペプチド「アレイ」を用いることで、同時に複数のタンパク質を定量化することも出来る。本開示は、任意の既知の「アレイ」とともに実施することが可能であって、この「アレイ」は、「マイクロアレイ」又は「核酸アレイ」又は「ポリペプチドアレイ」又は「抗体アレイ」又は「バイオチップ」又はそれらの変型とも見なされる。アレイは一般的に、複数の「スポット」又は「標的要素」であって、それぞれの標的要素は、規定の量の１つ又は複数の生体分子、例えば、オリゴヌクレオチドを有するものであり、サンプル分子、例えばｍＲＮＡ転写産物に特異的に結合する基質表面の規定の領域に、固定化されているものである。
【０２３８】
本開示の方法の実施においては、以下の文献中に記載されているような、任意の既知のアレイ及び／又はアレイを作成及び使用する方法が、それらの全体又は一部、或いはそれらの変型について援用され得る。例えば、米国特許第６，２７７，６２８号明細書；同第６，２７７，４８９号明細書；同第６，２６１，７７６号明細書；同第６，２５８，６０６号明細書；同第６，０５４，２７０号明細書；同第６，０４８，６９５号明細書；同第６，０４５，９９６号明細書；同第６，０２２，９６３号明細書；同第６，０１３，４４０号明細書；同第５，９６５，４５２号明細書；同第５，９５９，０９８号明細書；同第５，８５６，１７４号明細書；同第５，８３０，６４５号明細書；同第５，７７０，４５６号明細書；同第５，６３２，９５７号明細書；同第５，５５６，７５２号明細書；同第５，１４３，８５４号明細書；同第５，８０７，５２２号明細書；同第５，８００，９９２号明細書；同第５，７４４，３０５号明細書；同第５，７００，６３７号明細書；同第５，５５６，７５２号明細書；同第５，４３４，０４９号明細書；例えば、国際公開第９９／５１７７３号パンフレット；国際公開第９９／０９２１７号パンフレット；国際公開第９７／４６３１３号パンフレット；国際公開第９６／１７９５８号パンフレットも参照のこと；例えば、Ｊｏｈｎｓｔｏｎ（１９９８）“Ｇｅｎｅ  ｃｈｉｐｓ：Ａｒｒａｙ  ｏｆ  ｈｏｐｅ  ｆｏｒ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ”，Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．８：Ｒ１７１−Ｒ１７４；Ｓｃｈｕｍｍｅｒ（１９９７）“Ｉｎｅｘｐｅｎｓｉｖｅ  Ｈａｎｄｈｅｌｄ  Ｄｅｖｉｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ａｒｒａｙｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１０８７−１０９２；Ｋｅｒｎ（１９９７）“Ｄｉｒｅｃｔ  ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌａｒｇｅ−ｉｎｓｅｒｔ  ｇｅｎｏｍｉｃ  ｃｌｏｎｅｓ  ｏｎ  ｈｉｇｈ−ｄｅｎｓｉｔｙ  ｇｒｉｄｄｅｄ  ｃＤＮＡ  ｆｉｌｔｅｒ  ａｒｒａｙｓ”，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ２３：１２０−１２４；Ｓｏｌｉｎａｓ−Ｔｏｌｄｏ（１９９７）“Ｍａｔｒｉｘ−Ｂａｓｅｄ  Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｂｉｏｃｈｉｐｓ  ｔｏ  Ｓｃｒｅｅｎ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｉｍｂａｌａｎｃｅｓ”，Ｇｅｎｅｓ，Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓ  ＆  Ｃａｎｃｅｒ  ２０：３９９−４０７；Ｂｏｗｔｅｌｌ（１９９９）“Ｏｐｔｉｏｎｓ  Ａｖａｉｌａｂｌｅ−Ｆｒｏｍ  Ｓｔａｒｔ  ｔｏ  Ｆｉｎｉｓｈ￣ｆｏｒ  Ｏｂｔａｉｎｉｎｇ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｄａｔａ  ｂｙ  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｕｐｐ．２１：２５−３２も参照のこと。米国特許出願公開第２００１００１８６４２号明細書；米国特許出願公開第２００１００１９８２７号明細書；米国特許出願公開第２００１００１６３２２号明細書；米国特許出願公開第２００１００１４４４９号明細書；米国特許出願公開第２００１００１４４４８号明細書；米国特許出願公開第２００１００１２５３７号明細書；米国特許出願公開第２００１０００８７６５号明細書も参���のこと。
【０２３９】
キャピラリーアレイ
ＧＩＧＡＭＡＴＲＩＸ（商標）（Ｄｉｖｅｒｓａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）などのキャピラリーアレイを、本開示の方法において用いることが出来る。本開示の核酸又はポリペプチドを、キャピラリーアレイを含むアレイに対して固定化又は適用することが出来る。アレイを用いることで、組成物（例えば、小分子、抗体、核酸など）のライブラリーに対して、本開示の核酸又はポリペプチドに結合する能力、又はそれらの活性を調整する能力によって、スクリーニング又はモニターすることが出来る。キャピラリーアレイは、サンプルを保持且つスクリーニングするためのもう一つのシステムを提供する。例えば、サンプルスクリーニング装置は、隣接したキャピラリーアレイとして形成される複数のキャピラリーを含むことが出来、ここで各キャピラリーは少なくとも１つの、サンプルを保持する管腔を形成する壁を有するものである。装置は、さらに、アレイ中の隣接したキャピラリーの間に配置される間質材を含み得るものであって、その間質剤の中に、１つまた複数の参照指標が形成されているものである。サンプルをスクリーニングするためのキャピラリーは、キャピラリーアレイに結合するように適合されたものであって、サンプルを保持するための管腔を形作る第一の壁と、サンプルを励起するために管腔に与えられる励起エネルギーをフィルターするフィルター材から形成される第二の壁を含み得るものである。ポリペプチド又は核酸、例えばリガンドを、キャピラリーアレイの少なくとも一部のキャピラリーの第一成分に、導入することが出来る。キャピラリーアレイの各キャピラリーは、少なくとも１つの、第一成分を保持する管腔を形作る壁を有することが出来る。キャピラリー中の第一成分の後ろに、気泡を導入することが出来る。第二成分をキャピラリーに導入することが可能であり、ここでこの第二成分は気泡によって第一成分と分離される。対象サンプルは、検出可能粒子で標識された第一液として、キャピラリーアレイ中の一つのキャピラリーに導入され、このキャピラリーアレイ中の各キャピラリーは、第一液と検出可能粒子とを保持するための管腔を形作る少なくとも１つの壁を有するものであって、少なくとも一つの壁は、検出可能粒子を結合させるための結合材料で被覆されている。本方法は、さらに、結合した検出可能粒子が保持されているキャピラリーチューブから第一液を除去する工程と、そのキャピラリーに第二液を導入する工程とを含むものである。キャピラリーアレイは、管腔を形作る少なくとも一つの外壁を有する、複数の個々のキャピラリーを含むものである。外壁は、互いに融合した１つ又は複数の壁であってもよい。同様に、壁は、その壁が液体又はサンプルを保持する管腔を形成する限り、円筒形、四角形、六角形、又はその他の幾何学的形態の管腔を形作ることができる。キャピラリーアレイ中のキャピラリーは、平面構造を形成するように近接して互いに支え合うことが出来る。キャピラリーは、隣同士を融合（例えば、ここではキャピラリーはガラス製）、接着、粘結、又は固定することによって、互いに結合することが出来る。キャピラリーアレイは、任意の数、例えば１００〜４，０００，０００の、個々のキャ��ラリーから形成することが可能である。キャピラリーアレイは、約１００，０００又はそれより多くの、互いに結合した個々のキャピラリーを持つ、マイクロタイタープレートを形成することが出来る。
【０２４０】
条件的活性型抗体の操作
条件的活性型抗体は、多重特異性条件的活性型抗体を生成するように操作し得る。多重特異性抗体は、国際公開第２０１３／１７０１６８号パンフレットに記載されるとおりの、多エピトープ特異性を有する抗体であり得る。多重特異性抗体には、限定はされないが、ＶHＶL単位が多エピトープ特異性を有する重鎖可変ドメイン（ＶH）及び軽鎖可変ドメイン（ＶL）を含む抗体、各ＶHＶL単位が異なるエピトープに結合する２つ以上のＶL及びＶHドメインを有する抗体、各単一可変ドメインが異なるエピトープに結合する２つ以上の単一可変ドメインを有する抗体、及び１つ又はそれ以上の抗体フラグメントを含む抗体並びに共有結合的又は非共有結合的に連結されている抗体フラグメントを含む抗体が含まれる。
【０２４１】
二重特異性抗体を含めた多重特異性抗体を構築するため、少なくとも１つの遊離スルフヒドリル基を有する抗体フラグメントが入手される。抗体フラグメントは完全長条件的活性型抗体から入手されてもよい。条件的活性型抗体を酵素消化すると、抗体フラグメントを生じさせることができる。例示的酵素消化方法としては、限定はされないが、ペプシン、パパイン及びＬｙｓ−Ｃが挙げられる。例示的抗体フラグメントとしては、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ダイアボディ（Ｄｂ）；タンデムダイアボディ（ｔａＤｂ）、線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．，ｖｏｌ．８，ｐａｇｅｓ  １０５７−１０６２（１９９５）を参照）；１アーム抗体、単一可変ドメイン抗体、ミニボディ（Ｏｌａｆｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．Ｄｅｓｉｇｎ  ＆  Ｓｅｌ．，ｖｏｌ．１７，ｐａｇｅｓ  ３１５−３２３）、一本鎖抗体分子、Ｆａｂ発現ライブラリによって作製されるフラグメント、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体、相補性決定領域（ＣＤＲ）、及びエピトープ結合フラグメントが挙げられる。抗体フラグメントはまた、ＤＮＡ組換え技術を用いて作製されてもよい。抗体フラグメントをコードするＤＮＡをプラスミド発現ベクター又はファージミドベクターにクローニングし、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で直接発現させてもよい。抗体酵素消化方法、ＤＮＡクローニング及び組換えタンパク質発現方法は、当業者に周知である。
【０２４２】
抗体フラグメントは従来技術を用いて精製してもよく、遊離チオール基を生成するため還元に供され得る。遊離チオール基を有する抗体フラグメントは架橋剤、例えばビスマレイミドと反応し得る。かかる架橋された抗体フラグメントを精製し、次に遊離チオール基を有する第二抗体フラグメントと反応させる。２つの抗体フラグメントが架橋された最終産物が精製される。特定の実施形態において、各抗体フラグメントはＦａｂであり、２つのＦａｂがビスマレイミドを介して連結した最終産物は、本明細書ではビスマレイミド−（チオ−Ｆａｂ）２、又はビス−Ｆａｂと称される。かかる多重特異性抗体及び抗体類似体は、ビス−Ｆａｂを含め、多数の抗体フラグメントの組み合わせ、又は天然抗体の構造的バリアント又は特定の抗体／フラグメントの組み合わせを迅速に合成するために利用することができる。
【０２４３】
多重特異性抗体は、多重特異性抗体に追加的な機能性部分が付加され得るように修飾架橋剤と合成することができる。修飾架橋剤は任意のスルフヒドリル反応性部分の結合を可能にする。一実施形態では、Ｎ−スクシンイミジル−Ｓ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）がビスマレイミドに結合してビスマレイミドアセチルチオアセテート（ＢＭａｔａ）を形成する。マスクされたチオール基の脱保護後、スルフヒドリル反応性（又はチオール反応性）部分を有する任意の官能基を多重特異性抗体に結合し得る。
【０２４４】
例示的チオール反応性試薬としては、多機能性リンカー試薬、捕捉、すなわちアフィニティー標識試薬（例えばビオチン−リンカー試薬）、検出標識（例えばフルオロフォア試薬）、固相固定化試薬（例えばＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、ポリスチレン、又はガラス）、又は薬物−リンカー中間体が挙げられる。チオール反応性試薬の一例は、Ｎ−エチルマレイミド（ＮＥＭ）である。修飾架橋剤を有するかかる多重特異性抗体又は抗体類似体は、薬物部分試薬又は他の標識とさらに反応させてもよい。多重特異性抗体又は抗体類似体と薬物−リンカー中間体との反応は、それぞれ多重特異性抗体−薬物コンジュゲート又は抗体類似体−薬物コンジュゲートをもたらす。
【０２４５】
多重特異性抗体を作製するための他の技法もまた本発明において用いることができる。それらの技法について記載している文献としては、以下が挙げられる：（１）異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組換え共発現に関して、Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．３０５，ｐａｇｅ  ５３７（１９８３））、国際公開第９３／０８８２９号パンフレット、及びＴｒａｕｎｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅ  ３６５５（１９９１）；（２）「ノブ・イン・ホール」操作に関して、米国特許第５，７３１，１６８号明細書；（３）静電ステアリング効果を操作することによる抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子の作製に関して、国際公開第２００９／０８９００４Ａ１号パンフレット；（４）２つ以上の抗体又はフラグメントの架橋結合に関して、米国特許第４，６７６，９８０号明細書、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，ｖｏｌ．２２９，ｐａｇｅ  ８１（１９８５）；（５）ロイシンジッパーを使用した二重特異抗体の作製に関して、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１４８，ｐａｇｅｓ  １５４７−１５５３（１９９２）；（６）「ダイアボディ」技術を用いた二重特異性抗体フラグメントの作製に関して、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，ｖｏｌ．９０，ｐａｇｅｓ  ６４４４−６４４８（１９９３）；（７）単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体の使用に関して、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．１５２，ｐａｇｅ  ５３６８（１９９４）；（８）三重特異性抗体の調製に関して、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）；及び（９）「オクトパス抗体」又は「デュアル可変ドメイン免疫グロブリン」（ＤＶＤ）を含めた、３つ以上の機能性抗原結合部位を有する操作された抗体に関して、米国特許出願公開第２００６／００２５５７６Ａ１号明細書及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２５，ｐａｇｅｓ  １２９０−１２９７（２００７）。
【０２４６】
本発明の多重特異性抗体はまた、国際公開第２０１１／１０９７２６号パンフレットに記載されるとおり生成することもできる。
【０２４７】
一実施形態では、血液脳関門（ＢＢＢ）を通過するための条件的活性型抗体を操作して多重特異性抗体（例えば二重特異性抗体）が作製される。この多重特異性抗体は、ＢＢＢ−Ｒに結合する第一抗原結合部位と脳抗原に結合する第二抗原結合部位とを含む。少なくとも、ＢＢＢ−Ｒに対する第一抗原結合部位は、条件的活性型である。脳抗原は、脳で発現する抗原であり、抗体又は小分子によって標的化され得る。かかる抗原の例としては、限定なしに、以下が挙げられる：β−セクレターゼ１（ＢＡＣＥ１）、アミロイドβ（Ａβ）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）、ヒト上皮成長因子受容体２（ＨＥＲ２）、タウ、アポリポタンパク質Ｅ４（ＡｐｏＥ４）、α−シヌクレイン、ＣＤ２０、ハンチンチン、プリオンタンパク質（ＰｒＰ）、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）、パーキン、プレセニリン１、プレセニリン２、γセクレターゼ、デスレセプター６（ＤＲ６）、アミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、ｐ７５ニューロトロフィン受容体（ｐ７５ＮＴＲ）、及びカスパーゼ６。一実施形態において、抗原はＢＡＣＥ１である。
【０２４８】
ＢＢＢは、ＢＢＢ受容体（ＢＢＢ−Ｒ）によって媒介される内因性の輸送系を有し、ＢＢＢ−Ｒは、ＢＢＢを通る巨大分子の輸送を可能にする特異的受容体である。例えば、ＢＢＢ−Ｒに結合することのできる抗体は、この内因性輸送系を用いることでＢＢＢを通って輸送され得る。かかる抗体は、ＢＢＢを通り抜ける内因性のＢＢＢ受容体媒介性の輸送系を使用することによりＢＢＢを通って薬物又は他の作用物質を輸送するための輸送手段として働き得る。かかる抗体は、ＢＢＢ−Ｒに対して高親和性を有する必要はない。米国特許出願公開第２０１２／０１７１１２０号明細書に記載されるとおり、ＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低い条件的活性型抗体でない抗体が、高親和性抗体より高い効率でＢＢＢを通過するものとして記載されている。
【０２４９】
抗体を操作して脳に入る別の方法は、中枢神経系リンパ管を介して脳に送達されるように抗体を操作することである。従って、抗体は、リンパ管を通って中枢神経系に移動するＴ細胞などの免疫細胞、又は滑液若しくは脳脊髄液に結合するか、又はそれを模倣するように操作することができる。中枢神経系のリンパ管の詳細については、例えば、Ｌｏｕｖｅａｕ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｆｅａｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ  ｌｙｍｐｈａｔｉｃ  ｖｅｓｓｅｌｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  ５２３，ｐｐ．３３７−３４１，１６  Ｊｕｌｙ  ２０１５及び本願の出願日現在で公的に利用可能である。
【０２５０】
従来の抗体と異なり、条件的活性型抗体は、ＢＢＢを通過するためＢＢＢ−Ｒに対して低親和性を有する必要はなく、脳の内部に留まる。条件的活性型抗体は、ＢＢＢの血液側でＢＢＢ−Ｒに対して高親和性を有し、且つＢＢＢの脳側で親和性がほとんど又は全くないものであり得る。薬物コンジュゲートなどの薬物は条件的活性型抗体にカップリングすることにより、抗体と共にＢＢＢを通って脳内へと輸送され得る。
【０２５１】
ＢＢＢ−Ｒは脳内皮細胞上に発現する膜貫通受容体タンパク質であり、血液脳関門を通じて分子を輸送する能力を有する。ＢＢＢ−Ｒの例としては、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）、インスリン受容体、インスリン様成長因子受容体（ＩＧＦ−Ｒ）、低密度リポタンパク質受容体、例えば限定なしに、低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１（ＬＲＰ１）及び低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質８（ＬＲＰ８）、及びヘパリン結合上皮成長因子様成長因子（ＨＢ−ＥＧＦ）が挙げられる。本明細書における例示的ＢＢＢ−Ｒは、トランスフェリン受容体（ＴｆＲ）である。ＴｆＲは、脊椎動物における鉄の取り込みに関与する２つのジスルフィド結合したサブユニット（各々の見かけの分子量約９０，０００）で構成される膜貫通糖タンパク質（分子量約１８０，０００）である。
【０２５２】
一部の実施形態において、本発明は、ＢＢＢ−Ｒに対する親抗体又は野生型抗体から生成される条件的活性型抗体を提供する。この条件的活性型抗体は、ＢＢＢの血液側ではＢＢＢ−Ｒに結合し、ＢＢＢの脳側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性が親抗体又は野生型抗体より低い。一部の他の実施形態において、この条件的活性型抗体は、ＢＢＢの血液側では野生型抗体又は親抗体と比べてＢＢＢ−Ｒに対する親和性を有し、ＢＢＢの脳側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性を有しない。
【０２５３】
血漿は、脳細胞外液（ＥＣＦ）と大きく異なる体液である。Ｓｏｍｊｅｎ（“Ｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｒａｉｎ：Ｎｏｒｍａｌ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｓｅｉｚｕｒｅｓ，ａｎｄ  Ｓｔｒｏｋｅ，”Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２００４，ｐａｇｅｓ  １６  ａｎｄ  ３３）及びＲｅｄｚｉｃ（“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｂｒａｉｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｂａｒｒｉｅｒｓ：ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ，”Ｆｌｕｉｄｓ  ａｎｄ  Ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＮＳ，ｖｏｌ．８：３，２０１１）によって考察されるとおり、脳細胞外液は血漿と比べてＫ+が大幅に少なく、Ｍｇ2+及びＨ+が多い。血漿と脳ＥＣＦとのイオン濃度の違いにより、これらの２つの体液に浸透圧及び重量オスモル濃度の著しい違いがもたらされる。表１は、血漿及び脳ＥＣＦの両方の共通イオンの濃度（ミリモル単位）を示す。
【表１】
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【０２５４】
脳ＥＣＦはまた、血漿と比べて含有する乳酸塩が大幅に多く、血漿と比べてグルコースが大幅に少ない（Ａｂｉ−Ｓａａｂ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｉｋｉｎｇ  Ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｇｌｕｃｏｓｅ  ａｎｄ  Ｌａｃｔａｔｅ  Ｌｅｖｅｌｓ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｂｒａｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  Ｐｌａｓｍａ  ｉｎ  Ｃｏｎｓｃｉｏｕｓ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｕｂｊｅｃｔｓ：Ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  Ｈｙｐｅｒｇｌｙｃｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｈｙｐｏｇｌｙｃｅｍｉａ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｒｅｂｒａｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｆｌｏｗ  ＆  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，ｖｏｌ．２２，ｐａｇｅｓ  ２７１−２７９，２００２）。
【０２５５】
従って、ｐＨ、様々な物質の濃度（ラクトース、グルコース、Ｋ＋、Ｍｇ２＋など）、浸透圧及び重量オスモル濃度など、ＢＢＢの両側で異なるいくつかの生理条件がある。ｐＨの生理条件に関して、ヒト血漿はヒト脳ＥＣＦより高いｐＨを有する。Ｋ＋濃度の生理条件に関して、脳ＥＣＦはヒト血漿より低いＫ＋濃度を有する。Ｍｇ２＋濃度の生理条件に関して、ヒト脳ＥＣＦはヒト血漿より大幅に多いＭｇ２＋を有する。浸透圧の生理条件に関して、ヒト脳ＥＣＦはヒト血漿と異なる浸透圧を有する。一部の実施形態において、脳ＥＣＦの生理条件は、特定の神経障害を有する患者の脳ＥＣＦの組成、ｐＨ、浸透圧及び重量オスモル濃度であってもよく、これは一般集団の脳ＥＣＦの生理条件と異なり得る。
【０２５６】
従って本発明は、ＢＢＢ−Ｒに対するテンプレート抗体をコードするＤＮＡを進化させて変異体ＤＮＡライブラリを作成する方法を提供する。次にこの変異体ＤＮＡライブラリを発現させると、変異体抗体が得られる。これらの変異体抗体は、少なくとも１つの血漿生理条件下でＢＢＢ−Ｒに結合し、且つ脳ＥＣＦ中の少なくとも１つの脳生理条件下でテンプレート抗体と比較してＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低いか、又はそれを有しない条件的活性型抗体に関してスクリーニングされる。従って、選択された変異体抗体は、血漿側ではＢＢＢ−Ｒに対して低親和性又は高親和性を有し、脳ＥＣＦ側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低いか、又はそれを有しない。この選択された変異体抗体は、ＢＢＢを通って輸送するための条件的活性型抗体として有用である。
【０２５７】
かかる条件的活性型抗体は、ＢＢＢの通過及び脳ＥＣＦへの滞留に有利である。脳側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性が低いため、テンプレート抗体と比べ、条件的活性型抗体がＢＢＢを通って脳から出て血液中へと輸送し戻される速度は低下する（又はそのようなことはなくなる）。
【０２５８】
一部の他の実施形態において、本発明は、ＢＢＢ−Ｒに対するテンプレート抗体をコードするＤＮＡを進化させて変異体ＤＮＡライブラリを作成する方法を提供する。次にこの変異体ＤＮＡライブラリを発現させると、変異体抗体が得られる。これらの変異体抗体は、少なくとも１つの血漿生理条件下でＢＢＢ−Ｒに結合し、且つ少なくとも１つの脳生理条件下でＢＢＢ−Ｒに対する親和性がほとんど又は全くない条件的活性型抗体に関してスクリーニングされる。従って、選択された変異体抗体は、血漿側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性を有し、且つ脳ＥＣＦ側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性がほとんど又は全くない。この選択された変異体抗体が、条件的活性型抗体である。
【０２５９】
かかる条件的活性型抗体は、ＢＢＢの通過及び脳ＥＣＦへの滞留に有利である。血漿側でＢＢＢ−Ｒに結合した後、条件的活性型抗体はＢＢＢを通って輸送され、及び脳ＥＣＦ側ではＢＢＢ−Ｒに対する親和性がほとんど乃至全くなく、これはつまり、条件的活性型抗体が脳から運び出される可能性が低いことを意味する。
【０２６０】
ＢＢＢ−Ｒに対する条件的活性型抗体の親和性は、その最大半数阻害濃度（ＩＣ５０）によって計測することができ、ＩＣ５０は、ＢＢＢ−Ｒに対する既知のＢＢＢ−Ｒリガンドの結合を５０％阻害するためにどのくらいの抗体が必要かの尺度である。一般的な手法は、競合ＥＬＩＳＡ分析（ａｓｓｙ）などの競合的結合分析を実施することである。ＴｆＲ（ＢＢＢ−Ｒ）に関するＩＣ５０を計測する例示的競合ＥＬＩＳＡ分析は、漸増濃度の抗ＴｆＲ抗体がＴｆＲとの結合についてビオチン化ＴｆＲAと競合するものである。抗ＴｆＲ抗体競合ＥＬＩＳＡは、ＰＢＳ中２．５μｇ／ｍｌの精製マウスＴｆＲ細胞外ドメインでコートしたＭａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｅｐｔｕｎｅ、Ｎ．Ｊ．）において４℃で一晩実施し得る。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、ＰＢＳ中のＳｕｐｅｒｂｌｏｃｋブロッキング緩衝液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｈｕｄｓｏｎ、Ｎ．Ｈ．）を使用してブロックする。各個別の抗ＴｆＲ抗体のタイトレーション（１：３段階希釈）をビオチン化抗ＴｆＲA（０．５ｎＭ最終濃度）と組み合わせて、室温で１時間プレートに加える。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、プレートにＨＲＰ−ストレプトアビジン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ）を加え、室温で１時間インキュベートする。プレートをＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０で洗浄し、プレートに結合したビオチン化抗ＴｆＲAをＴＭＢ基質（ＢｉｏＦＸ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｏｗｉｎｇｓ  Ｍｉｌｌｓ）を使用して検出する。
【０２６１】
高いＩＣ５０は、ＢＢＢ−Ｒの既知のリガンドの結合を阻害するためにより多くの条件的活性型抗体が必要であり、従って当該のＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性が比較的低いことを示す。逆に、低いＩＣ５０は、既知のリガンドの結合を阻害するために必要な条件的活性型抗体がより少なくてすみ、従って当該のＢＢＢ−Ｒに対する抗体の親和性が比較的高いことを示す。
【０２６２】
一部の実施形態において、血漿中のＢＢＢ−Ｒからの条件的活性型抗体のＩＣ５０は、約１ｎＭ〜約１００μＭ、又は約５ｎＭ〜約１００μＭ、又は約５０ｎＭ〜約１００μＭ、又は約１００ｎＭ〜約１００μＭ、又は約５ｎＭ〜約１０μＭ、又は約３０ｎＭ〜約１μＭ、又は約５０ｎＭ〜約１μＭであり得る。
【０２６３】
滑液に対する条件的活性型生物学的タンパク質
関節疾患は、工業先進国における身体障害及び早期退職の主な原因である。関節疾患は多くの場合に関節の損傷をもたらし、これは修復が困難である。滑液は、ヒト又は動物の体の関節（例えば、膝、股関節部、肩）の滑膜腔において向かい合う関節表面の軟骨と滑膜との間に見られる体液である。滑液は軟骨に栄養を供給し、また関節の潤滑剤としても働く。軟骨及び滑膜の細胞は、関節表面間の潤滑剤として働く体液を分泌する。ヒト滑液は約８５％の水を含む。これは血漿の透析液に由来し、この透析液それ自体は、水、溶解したタンパク質、グルコース、凝固因子、無機イオン、ホルモン等から成る。アルブミン及びグロブリンなどのタンパク質が滑液中に存在し、関節領域の潤滑において重要な役割を果たすと考えられる。ヒト滑液中には、α−１−酸性糖タンパク質（ＡＧＰ）、α−１−アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）及びルブリシンなどの糖タンパク質を含め、いくつかの他のタンパク質もまた見られる。
【０２６４】
滑液は、体の他の部分と極めて異なる組成を有する。従って、滑液は、血漿などの体の他の部分とは異なる生理条件を有する。例えば、滑液は約１０ｍｇ／ｄＬ未満のグルコースを有するが、ヒト血漿の平均正常グルコース値は約１００ｍｇ／ｄＬであり、１日を通じて７０〜１００ｍｇ／ｄＬの範囲内で変動する。加えて、タンパク質などの大型分子が滑膜を通過して滑液中に入ることは容易でなく、従って滑液の全タンパク質レベルは血漿タンパク質レベルの約３分の１である。また、ヒト滑液のｐＨはヒト血漿のｐＨより高いことも分かっている（Ｊｅｂｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｎ  ｔｈｅ  ｖｉｓｃｏｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｐＨ  ｏｆ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｐＨ  ｏｆ  ｂｌｏｏｄ，”Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｏｎｅ  ａｎｄ  Ｊｏｉｎｔ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，ｖｏｌ．４１  Ｂ，ｐａｇｅｓ  ３８８−４００，１９５９；Ｆａｒｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｙｄｒｏｇｅｎ  ｉｏｎ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｓｙｎｏｖｉａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｉｎ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｉｄ  Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ，”Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｒｈｅｕｍａｔｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ  ９９−１０４，１９８５）。
【０２６５】
従って、滑液は、血漿中の生理条件など、体の他の部分の生理条件と異なるいくつかの生理条件を有する。滑液は、体の他の部分、特に血漿と比べてｐＨが高い。滑液は、血漿などの体の他の部分と比べてグルコースの濃度が低い。滑液はまた、血漿などの体の他の部分と比べてタンパク質の濃度も低い。
【０２６６】
関節疾患を治療するため、滑液に抗体を導入することによっていくつかの抗体が用いられている。例えば、傷害された関節の滑液は、骨関節炎の進行に影響を及ぼす多くの因子を含有することが知られている（例えば、Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ，ｅｔ  ａｌ，“Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｉｎ  Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｐａｔｈｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，”Ｂｉｏｒｈｅｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．３９，ｐａｇｅｓ  ２３７−２４６，２００２を参照）。インターロイキン−１（ＩＬ−Ｉ）及び腫瘍壊死因子−α（ＴＮＦ−α）などのサイトカインは、活性化した滑膜細胞によって産生されるものであり、マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）遺伝子発現を上方制御することが知られている。ＭＭＰが上方制御されると、関節におけるマトリックス及び非マトリックスタンパク質の分解（ｄｅｇｒｅｄａｔｉｏｎ）が引き起こされる。サイトカインを中和する抗体は、骨関節炎の進行を止めることができる。
【０２６７】
抗体を薬物として使用することは、関節疾患の治療に有望な戦略である。例えば、関節疾患の中で群を抜いて高い罹患率を有する骨関節炎を治療するため、抗体（アグレカン又はアグリカナーゼに対する抗体など）が開発されている（国際公開第１９９３／０２２４２９Ａ１号パンフレット）。関節炎など、炎症性、自己免疫性、神経変性又は悪性疾患／障害である関節疾患の診断又は治療に、アセチル化高移動度グループボックス１（ＨＭＧＢ１）に対する抗体が開発されている。この抗体は、滑液中のアセチル化形態のＨＭＧＢ１を検出するために使用し得る（国際公開第２０１１／１５７９０５Ａ１号パンフレット）。関節の結合組織及び軟骨の損傷を治療するため、別の抗体（ＣＤ２０抗体）もまた開発されている。
【０２６８】
しかしながら、これらの抗体の抗原は、多くの場合に、重要な生理学的機能を担う体の他の部分で発現する。これらの抗原に対する抗体は、関節疾患の治療に有効であるものの、体の他の部分におけるこれらの抗原の正常な生理学的機能もまた著しく妨げ得る。従って、患者に重度の副作用が起こり得る。このように、副作用を低減するため、滑液中ではより高い親和性でそれらの抗原（タンパク質又は他の巨大分子）に優先的に結合し得る一方、体の他の部分では同じ抗原に結合しないか、又は弱く結合するのみである療法薬、例えばサイトカイン又は他の抗原に対する抗体を開発することが望ましい。
【０２６９】
かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、条件的活性型抗体であり得る。一部の実施形態において、本発明はまた、抗体以外のタンパク質である条件的活性型生物学的タンパク質も提供する。例えば、本発明によって、滑液中で免疫応答を優先的に調節するための、体の他の部分では免疫応答に対する効果が低いか、又はないものであり得る条件的活性型免疫調節因子が開発され得る。
【０２７０】
条件的活性型生物学的タンパク質は、条件的活性型サイトカインシグナル伝達サプレッサー（ＳＯＣＳ）であり得る。これらのＳＯＣＳの多くはＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路の阻害に関与する。条件的活性型サイトカインシグナル伝達サプレッサーは、滑液中ではサイトカインシグナル伝達を優先的に抑制し得る一方、体の他の部分ではサイトカインシグナル伝達を抑制しないか、又は抑制の程度が低い。
【０２７１】
一部の実施形態において、本発明は、親又は野生型生物学的タンパク質に由来する条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。条件的活性型生物学的タンパク質は、血漿などの体の特定の部分における少なくとも１つの生理条件下で親又は野生型生物学的タンパク質より低い活性を有し、滑液における少なくとも１つの生理条件下で親又は野生型生物学的タンパク質より高い活性を有する。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、滑液中で優先的に機能し得るが、体の他の部分には作用せず、又は作用の程度が低い。結果的に、かかる条件的活性型生物学的タンパク質は副作用が低減され得る。
【０２７２】
一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質は、滑液中にあるか、又は滑液に曝露される抗原に対する抗体である。かかる抗原は、関節疾患における免疫応答／炎症に関与する任意のタンパク質であってもよく、しかし抗原は多くの場合にサイトカインである。条件的活性型抗体は、体の他の部分（血漿など）における少なくとも１つの生理条件下では抗原に対する親和性が同じ抗原に対する親又は野生型抗体と比べて低いが、滑液の少なくとも１つの生理条件下では抗原に対する親和性は親又は野生型抗体より高い。かかる条件的活性型抗体は、体の他の部分では抗原に弱く結合するか、又は全く結合しないが、滑液中では抗原に結合し、例えば強く緊密に結合し、又はより強く結合し得る。
【０２７３】
腫瘍に対する条件的活性型生物学的タンパク質
固形腫瘍の癌細胞は、その周囲に腫瘍微小環境を形成して癌細胞の成長及び転移を支援する能力を有する。腫瘍微小環境は、周囲血管、免疫細胞、線維芽細胞、他の細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス、並びに新生物形質転換を促進し、腫瘍成長及び浸潤を支援し、腫瘍を宿主免疫から保護し、治療抵抗性を助長し、及び潜伏転移が発育するためのニッチを提供することのできる機械的キューを含めた、腫瘍が存在する細胞環境である。腫瘍及びその周囲微小環境は密接に関係し、常に相互作用している。腫瘍は、細胞外シグナルを放出し、腫瘍血管新生を促進し、及び末梢性免疫寛容を誘導することによってその微小環境に影響を与え得る一方、微小環境における免疫細胞が癌性細胞の成長及び進化に影響を及ぼし得る。Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．“Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｃｏｍｐｌｅｘｉｔｙ：Ｅｍｅｒｇｉｎｇ  Ｒｏｌｅｓ  ｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｖｏｌ．，７２，ｐａｇｅｓ  ２４７３−２４８０，２０１２を参照のこと。
【０２７４】
腫瘍微小環境は、多くの場合に低酸素である。腫瘍塊が増加するに従い、腫瘍の内部が成長して既存の血液供給からさらに離れ、腫瘍微小環境に酸素を完全に供給することが困難になる。腫瘍環境における酸素分圧は、局所進行固形腫瘍の５０％超で５ｍｍＨｇ未満であり、対して血漿中では約４０ｍｍＨｇの酸素分圧である。対照的に、体の他の部分は低酸素でない。低酸素環境はヌクレオチド除去修復及びミスマッチ修復経路の下方制御を介して遺伝的不安定性につながり、これは癌の進行に関連する。低酸素はまた、低酸素誘導因子１α（ＨＩＦ１−α）の上方制御も引き起こし、ＨＩＦ１−αは血管新生を誘導し、予後不良及び転移に関連する遺伝子の活性化に関連する。Ｗｅｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，”Ｓｕｒｇｉｃａｌ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ  １７２−１７７，２０１２及びＢｌａｇｏｓｋｌｏｎｎｙ，“Ａｎｔｉａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｔｈｅｒａｐｙ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．５，ｐａｇｅｓ  １３−１７，２００４を参照のこと。
【０２７５】
加えて、腫瘍細胞は、酸素を必要としない乳酸発酵によって生成されるエネルギーに頼る傾向がある。そのため腫瘍細胞は、酸素を必要とする通常の好気的呼吸を使用することが少ない。乳酸発酵を使用する結果、腫瘍微小環境は酸性となり（ｐＨ６．５〜６．９）、これは典型的に中性又は弱塩基性のいずれかである体の他の部分と対照的である。例えば、ヒト血漿は約７．４のｐＨを有する。Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｃｉｄｉｔｙ  Ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｂｙ  ｔｈｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｄｒｉｖｅｓ  Ｌｏｃａｌ  Ｉｎｖａｓｉｏｎ，”Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌ．７３，ｐａｇｅｓ  １５２４−１５３５，２０１３を参照のこと。腫瘍微小環境においては、体の他の部分に位置する細胞と比較して、増殖癌細胞の栄養素要求が比較的高いため栄養素の利用可能性も低い。
【０２７６】
さらに、腫瘍微小環境はまた、体の他の部分にはあまり見られない多くの特徴的な細胞型も含有する。これらの細胞型には、内皮細胞及びその前駆体、周皮細胞、平滑筋細胞、線維芽細胞、癌関連線維芽細胞、筋線維芽細胞、好中球、好酸球、好塩基球、マスト細胞、Ｔ及びＢリンパ球、ナチュラルキラー細胞及び抗原提示細胞（ＡＰＣ）、例えばマクロファージ及び樹状細胞が含まれる（Ｌｏｒｕｓｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｔｕｍｏｒ  ｍｉｃｒｏｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｃｏｎｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｔｏ  ｔｕｍｏｒ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｔｏｗａｒｄ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，”Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，ｖｏｌ．１３０，ｐａｇｅｓ  １０９１−１１０３，２００８）。
【０２７７】
従って、腫瘍微小環境は、血漿中における生理条件など、体の他の部分の生理条件と異なる少なくともいくつかの生理条件を有する。腫瘍微小環境は、体の他の部分、特に血漿（ｐＨ７．４）と比べてｐＨ（酸性）が低い。腫瘍微小環境は、血漿などの体の他の部分と比べて酸素濃度が低い。また、腫瘍微小環境は、体の他の部分、特に血漿と比べて栄養素の利用可能性も低い。腫瘍微小環境はまた、体の他の部分、特に血漿にはあまり見られないいくつかの特徴的な細胞型も有する。
【０２７８】
ある種の制癌薬には、腫瘍微小環境内に侵入して、そこで癌細胞に作用することのできる抗体が含まれる。抗体ベースの癌療法は十分に確立されており、血液系悪性病変及び固形腫瘍患者の治療に関して最も成功している重要な戦略の一つになっている。ヒト癌細胞が発現する細胞表面抗原であって、正常組織と比較して癌細胞で過剰発現するか、突然変異するか、又は選択的に発現する細胞表面抗原は多岐にわたる。これらの細胞表面抗原は、抗体癌療法の優れた標的である。
【０２７９】
抗体が標的とし得る癌細胞表面抗原は、いくつかの異なる種類に分類される。造血分化抗原は、通常分化クラスター（ＣＤ）分類に関連付けられる糖タンパク質であり、ＣＤ２０、ＣＤ３０、ＣＤ３３及びＣＤ５２が含まれる。細胞表面分化抗原は、正常細胞及び腫瘍細胞の両方の表面上に見られる多様な一群の糖タンパク質及び炭水化物である。成長及び分化シグナル伝達に関与する抗原は、多くの場合に成長因子及び成長因子受容体である。癌患者において抗体の標的となる成長因子には、ＣＥＡ２、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ；ＥＲＢＢ１としても知られる）１２、ＥＲＢＢ２（ＨＥＲ２としても知られる）１３、ＥＲＢＢ３（文献１８）、ＭＥＴ（ＨＧＦＲとしても知られる）１９、インスリン様成長因子１受容体（ＩＧＦ１Ｒ）２０、エフリン受容体Ａ３（ＥＰＨＡ３）２１、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）関連アポトーシス誘導リガンド受容体１（ＴＲＡＩＬＲ１；ＴＮＦＲＳＦ１０Ａとしても知られる）、ＴＲＡＩＬＲ２（ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂとしても知られる）及び核内因子κＢの受容体アクチベーターリガンド（ＲＡＮＫＬ；ＴＮＦＳＦ１１としても知られる）２２が含まれる。血管新生に関与する抗原は、通常、新しい微小血管系の形成を補助するタンパク質又は成長因子であり、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦ受容体（ＶＥＧＦＲ）、インテグリンαＶβ３及びインテグリンα５β１が含まれる（文献１０）。腫瘍間質及び細胞外マトリックスは、腫瘍にとって不可欠な支持構造である。治療標的となる間質性及び細胞外マトリックス抗原には、線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）及びテネイシンが含まれる。Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ  ２７８−２８７，２０１２を参照のこと。
【０２８０】
抗体に加えて、他の生物学的タンパク質もまた、癌の治療において有望となっている。例としては、腫瘍抑制因子、例えば、網膜芽細胞腫タンパク質（ｐＲｂ）、ｐ５３、ｐＶＨＬ、ＡＰＣ、ＣＤ９５、ＳＴ５、ＹＰＥＬ３、ＳＴ７、及びＳＴ１４が挙げられる。腫瘍サイズを縮小させるため、癌細胞においてアポトーシスを誘導する一部のタンパク質もまた腫瘍に導入し得る。腫瘍においてアポトーシスを誘導することのできる機構は少なくとも２つある：腫瘍壊死因子によって誘導される機構及びＦａｓ−Ｆａｓリガンドによって媒介される機構。これらの２つのアポトーシス機構のいずれかに関与するタンパク質の少なくとも一部を、治療のため腫瘍に導入し得る。
【０２８１】
癌幹細胞は、特定の癌試料に見られるあらゆる細胞型を生じる能力を有する癌細胞であり、従って腫瘍形成性である。癌幹細胞は、自己再生して複数の細胞型へと分化する幹細胞プロセスを通じて腫瘍を生じさせ得る。癌幹細胞は腫瘍において特徴的な集団として存在し続け、新たな腫瘍を生じさせることによって再発及び転移を引き起こすと考えられる。癌幹細胞を標的とする特異的療法の開発は、癌患者、特に転移性疾患患者の生存及びクオリティ・オブ・ライフを向上させ得る。
【０２８２】
これらの腫瘍治療薬は、多くの場合に、腫瘍以外の体の他の部分における正常な生理学的機能を妨げる。例えば、腫瘍においてアポトーシスを誘導するタンパク質はまた、体の他の何らかの部分においてもアポトーシスを誘導し、ひいては副作用を引き起こし得る。抗体を使用して腫瘍を治療する実施形態において、抗体の抗原はまた、正常な生理学的機能を果たす体の他の部分においても発現し得る。例えば、腫瘍血管成長を止めるモノクローナル抗体ベバシズマブ（血管内皮成長因子を標的化する）。この抗体はまた、体の他の部分における血管成長及び修復も阻止し得るため、出血、創傷治癒不良、血餅、及び腎臓損傷を引き起こし得る。より有効性の高い腫瘍治療には、主に又は専ら腫瘍を標的化することに集中する条件的活性型生物学的タンパク質の開発が極めて望ましい。
【０２８３】
一部の実施形態において、本発明は、腫瘍治療候補であり得る親又は野生型生物学的タンパク質から生成される条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。この条件的活性型生物学的タンパク質は、血漿など、腫瘍微小環境以外の体の部分における少なくとも１つの生理条件下で親又は野生型生物学的タンパク質より低い活性を有し、一方、腫瘍微小環境における少なくとも１つの生理条件下で親又は野生型生物学的タンパク質より高い活性を有する。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、腫瘍を治療するため腫瘍微小環境にある癌細胞に優先的に作用することができ、従って副作用を引き起こしにくい。生物学的タンパク質が腫瘍細胞の表面上の抗原（抗原が腫瘍微小環境に曝露している）に対する抗体である実施形態において、条件的活性型抗体は、体の他の部分、例えば非腫瘍微小環境では抗原に対する親和性が親又は野生型抗体より低く、一方、腫瘍微小環境では抗原に対する親和性が親又は野生型抗体より高い。かかる条件的活性型抗体は、体の他の部分では抗原に弱く結合し得るか、又は全く結合せず、しかし、腫瘍微小環境では抗原により高い結合性を有し、又は強力且つ緊密に結合する。
【０２８４】
一部の実施形態において、条件的活性型抗体は、免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体であり、免疫チェックポイントの阻害をもたらす。かかる条件的活性型抗体は、（１）その条件的活性型抗体が由来する親又は野生型抗体と比較した、腫瘍微小環境における免疫チェックポイントタンパク質に対する結合親和性の増加、及び（２）その条件的活性型抗体が由来する親又は野生型抗体と比較した、非腫瘍微小環境における免疫チェックポイントタンパク質に対する結合親和性の低下、のうちの少なくとも一方を有する。
【０２８５】
免疫チェックポイントは、自己寛容を維持し、且つ抗原刺激、すなわち外来性の分子、細胞及び組織に対する免疫応答の持続時間及び程度を調節する免疫系の内因性阻害経路として機能する。Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ  ２５２−２６４，２０１２を参照のこと。１つ又はそれ以上のチェックポイントタンパク質を抑制することによる免疫チェックポイントの阻害は、免疫系、特にＴ細胞の過剰な活性化を引き起こし、ひいては免疫系が誘導されて腫瘍を攻撃し得る。本発明に好適なチェックポイントタンパク質としては、ＣＴＬＡ４並びにそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６、ＰＤ１並びにそのリガンドＰＤＬ１及びＰＤＬ２、Ｔ細胞免疫グロブリン及びムチンタンパク質−３（ＴＩＭ３）及びそのリガンドＧＡＬ９、Ｂ及びＴリンパ球アテニュエーター（ＢＴＬＡ）及びそのリガンドＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス侵入メディエーター）、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）などの受容体、リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３）及びアデノシンＡ２ａ受容体（Ａ２ａＲ）、並びにリガンドＢ７−Ｈ３及びＢ７−Ｈ４が挙げられる。さらなる好適な免疫チェックポイントタンパク質が、Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ  ２５２−２６４，２０１２及びＮｉｒｓｃｈｌ  ＆  Ｄｒａｋｅ，Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ，ｖｏｌ．１９，ｐａｇｅｓ  ４９１７−４９２４，２０１３に記載されている。
【０２８６】
ＣＴＬＡ−４及びＰＤ１は、最もよく知られている免疫チェックポイントタンパク質の２つである。ＣＴＬＡ−４は、Ｔ細胞活性化経路を下方制御し得る（Ｆｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．６９（２）：６０９−６１５，２００９；及びＷｅｂｅｒ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ，５８：８２３−８３０，２００９）。ＣＴＬＡ−４を遮断すると、Ｔ細胞活性化及び増殖が増大することが示されている。ＣＴＬＡ−４の阻害薬としては、抗ＣＴＬＡ−４抗体が挙げられる。抗ＣＴＬＡ−４抗体はＣＴＬＡ−４に結合してＣＴＬＡ−４とそのリガンドＣＤ８０又はＣＤ８６との相互作用を遮断し、それによりＣＴＬＡ−４とそのリガンドとの相互作用によって誘発される免疫応答の下方制御を遮断する。
【０２８７】
チェックポイントタンパク質ＰＤ１は、感染に対する炎症反応が起こったときに末梢組織におけるＴ細胞の活性を抑制し、自己免疫を抑えることが知られている。インビトロでＰＤ１を遮断すると、特異的抗原標的によるか、又は混合リンパ球反応における同種細胞による刺激に応答したＴ細胞増殖及びサイトカイン産生が増強され得る。ＰＤ１発現と免疫応答低下との間の強い相関は、ＰＤ１の阻害機能、すなわち免疫チェックポイントの誘導によって生じることが示された（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，１２：２５２−２６４，２０１２）。ＰＤ１の遮断は、ＰＤ１又はそのリガンドＰＤＬ１又はＰＤＬ２に結合する抗体を含め、種々の機構によって達成することができる。
【０２８８】
これまでの研究において、いくつかのチェックポイントタンパク質（ＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＰＤ−Ｌ１）に対する抗体が発見されている。これらの抗体は、免疫チェックポイントを阻害して、それにより腫瘍を攻撃するため免疫系、特にＴ細胞を過剰に活性化させることにより、腫瘍の治療に有効となる（Ｐａｒｄｏｌｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．１２，ｐａｇｅｓ  ２５２−２６４，２０１２）。しかしながら、活性化過剰のＴ細胞はまた、宿主細胞及び／又は組織も攻撃し得るため、患者の体に付随的損傷をもたらし得る。従って、免疫チェックポイントを阻害するこれらの公知の抗体の使用に基づく治療法は管理が難しく、患者のリスクが重大な懸念事項である。例えば、ＦＤＡが承認済みのＣＴＬＡ−４に対する抗体は、その高い毒性のため黒枠警告を有する。
【０２８９】
本発明は、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体を提供することにより、活性化過剰のＴ細胞による付随的損傷の問題に対処する。これらの条件的活性型抗体は、腫瘍微小環境において免疫チェックポイントを優先的に活性化する。同時に、非腫瘍微小環境、例えば正常な生体組織における免疫チェックポイントは、条件的活性型抗体によって阻害されないか、又は阻害が少なく、従って非腫瘍微小環境では体に対する付随的損傷の可能性が低減される。この目標は、非腫瘍微小環境と比べて腫瘍微小環境においてより高活性となるように条件的活性型抗体を操作することによって達成される。
【０２９０】
一部の実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体は、非腫瘍微小環境における免疫チェックポイントタンパク質との結合活性に対する腫瘍微小環境における同じ免疫チェックポイントタンパク質との結合活性の比が、少なくとも約１．１、又は少なくとも約１．２、又は少なくとも約１．４、又は少なくとも約１．６、又は少なくとも約１．８、又は少なくとも約２、又は少なくとも約２．５、又は少なくとも約３、又は少なくとも約５、又は少なくとも約７、又は少なくとも約８、又は少なくとも約９、又は少なくとも約１０、又は少なくとも約１５、又は少なくとも約２０であり得る。抗体の結合活性を計測するための典型的な分析は、ＥＬＩＳＡ分析である。
【０２９１】
高免疫原性腫瘍、例えば悪性黒色腫は、免疫系の操作によって達成される活性化過剰の免疫系に対して最も脆弱である。従って、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体は、かかる高免疫原性腫瘍の治療に特に有効であり得る。しかしながら、他のタイプの腫瘍もまた活性化過剰の免疫系に対して脆弱である。
【０２９２】
一部の実施形態において、免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体は併用療法で用いられ得る。例えば、併用療法は、腫瘍細胞表面分子（腫瘍特異性抗原）に対する条件的活性型抗体と免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体とを含み得る。一実施形態において、腫瘍細胞表面分子に対する条件的活性型抗体の結合活性と免疫チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体の結合活性との両方が単一のタンパク質に存在してもよく、すなわち、本明細書に開示されるとおりの二重特異性条件的活性型抗体であってもよい。一部のさらなる実施形態において、併用療法は、腫瘍細胞表面分子（腫瘍特異性抗原）に対する条件的活性型抗体と２つ以上の異なる免疫チェックポイントタンパク質に対する２つ以上の条件的活性型抗体とを含み得る。一実施形態において、これらの結合活性の全てが単一のタンパク質に存在してもよく、すなわち、本明細書に開示されるとおりの多重特異性抗体であってもよい。
【０２９３】
条件的活性型抗体は、その条件的活性型抗体が由来する親又は野生型抗体の活性と比較して、同じ腫瘍細胞表面分子又はチェックポイントタンパク質に対し腫瘍微小環境においてより高活性であるため、これらの併用療法は、有効性の増強及び毒性の大幅な低下の両方をもたらし得る。これらの条件的活性型抗体、特に免疫チェックポイントタンパク質に対する抗体の毒性の低下は、強力な抗体、例えば本明細書に記載されるとおりのＡＤＣ抗体、並びにより高用量の抗体の安全な使用を可能にし得る。
【０２９４】
一部の実施形態において、チェックポイントタンパク質に対する条件的活性型抗体はプロドラッグ形態であってもよい。例えば、条件的活性型抗体は、開裂されて薬物形態に変わる前は所望の薬物活性を有しないプロドラッグであり得る。プロドラッグは、かかる開裂を触媒する酵素が腫瘍微小環境に優先的に存在するか、又は条件的活性型抗体が非腫瘍微小環境（ｍｉｃｒｏｅｖｉｒｏｎｍｅｎｔ）における開裂部位への到達し易さと比較して腫瘍微小環境では開裂部位に到達し易くなるかのいずれかの理由により、腫瘍微小環境で優先的に開裂し得る。
【０２９５】
腫瘍幹細胞を含めた幹細胞ニッチに対する条件的活性型生物学的タンパク質
幹細胞は体の幹細胞ニッチと呼ばれる環境に存在し、幹細胞ニッチは組織生理学の基本的な単位を成し、生物の要求に対する幹細胞の応答を媒介するシグナルを統合する。しかしニッチは、幹細胞又は他の標的に異常機能を課すことによって病理もまた誘導し得る。幹細胞とそれらのニッチとの間の相互作用により、組織の持続及び幹細胞療法の最終設計に必要な動的システムが作り出される（Ｓｃａｄｄｅｎ，“Ｔｈｅ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｔｉｔｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４４１，ｐａｇｅｓ  １０７５−１０７９，２００６）。脊椎動物における一般的な幹細胞ニッチには、生殖細胞系列幹細胞ニッチ、造血幹細胞ニッチ、毛包幹細胞ニッチ、腸幹細胞ニッチ、及び心血管幹細胞ニッチが含まれる。
【０２９６】
幹細胞ニッチは、体の他の部分（例えば血漿）と異なる特殊化した環境である（Ｄｒｕｍｍｏｎｄ−Ｂａｒｂｏｓａ，“Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，Ｔｈｅｉｒ  Ｎｉｃｈｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ：Ａｎ  Ａｇｉｎｇ  Ｎｅｔｗｏｒｋ，”Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，ｖｏｌ．１８０，ｐａｇｅｓ  １７８７−１７９７，２００８；Ｆｕｃｈｓ，“Ｓｏｃｉａｌｉｚｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  Ｎｅｉｇｈｂｏｒｓ：Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｎｉｃｈｅ，”Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１１６，ｐａｇｅｓ  ７６９−７７８，２００４）。幹細胞ニッチは低酸素であり、酸化的ＤＮＡ損傷が低下している。酸素レベルを直接計測することにより、一般に骨髄が血漿と比較して事実上低酸素である（約１％〜２％Ｏ２）ことが明らかになっている（Ｋｅｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｙｐｏｘｉａ−Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ，ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ，”Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．１２９，ｐａｇｅｓ  ４６５−４７２，２００７；Ｍｏｈｙｅｌｄｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｘｙｇｅｎ  ｉｎ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｎｉｃｈｅ，”Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，ｖｏｌ．７，ｐａｇｅｓ  １５０−１６１，２０１０）。加えて、幹細胞ニッチは、ニッチ内で幹細胞特性を調節するためいくつかの他の因子：細胞外マトリックス成分、成長因子、サイトカイン、及び環境の生理化学的性質の因子、例えば、ｐＨ、イオン強度（例えばＣａ2+濃度）及び代謝産物を有しなければならない。
【０２９７】
従って、幹細胞ニッチは、血漿中の生理条件など、体の他の部分の生理条件と異なる少なくともいくつかの生理条件を有する。幹細胞ニッチは、体の他の部分、特に血漿と比べて酸素濃度が低い（１〜２％）。ｐＨ及びイオン強度を含めた幹細胞ニッチの他の生理条件もまた、体の他の部分と異なり得る。
【０２９８】
幹細胞療法は、疾患又は傷害を治療するため新規の成体幹細胞を損傷組織に導入するインターベンショナルな戦略である。この戦略は、幹細胞が自己再生して、分化能の程度が様々な続く子孫を生じる能力に依存する。幹細胞療法は、拒絶反応及び副作用のリスクを最小限に抑えつつ体の罹患及び損傷範囲を取り替えることが潜在的に可能な、組織再生の大きな潜在的可能性をもたらす。従って、幹細胞の再生及び分化に影響を及ぼすため幹細胞ニッチに薬物（生物学的タンパク質（例えば抗体）又は化学的化合物）を送達することは、幹細胞療法の重要な部分である。
【０２９９】
幹細胞ニッチが哺乳動物における幹細胞の再生及び／又は分化にどのように影響を及ぼすかに関するいくつかの例がある。第一の例は皮膚におけるもので、ここではβ−１インテグリンが原始細胞上で差次的に発現し、且つマトリックス糖タンパク質リガンドとの相互作用を介した幹細胞集団の制約的な局在化に関与することが知られている。第二に、神経系においては、テネイシンＣが存在しないことにより脳室下帯の神経幹細胞の数及び機能が変化する。テネイシンＣは、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ２）及び骨形成タンパク質４（ＢＭＰ４）に対する幹細胞感受性を調節して幹細胞性向の増加をもたらすものと思われる。第三に、別のマトリックスタンパク質、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐを含有するシアロタンパク質、オステオポンチン（ＯＰＮ）は、現在、造血幹細胞調節に寄与することが実証されている。ＯＰＮは、造血幹細胞ＣＤ４４、並びにα４及びα５β１インテグリン上にあることが知られるいくつかの受容体と相互作用する。ＯＰＮ産生は、特に骨芽細胞の活性化によって著しく変化し得る。ＯＰＮ欠損動物は、ＯＰＮがないことによって刺激条件下で超生理学的な幹細胞増大が生じるため、ＨＳ細胞数が増加している。従って、ＯＰＮは、恒常条件下又は刺激下で幹細胞の数を制限する造血幹細胞数の制約因子として働くものと思われる。Ｓｃａｄｄｅｎ，“Ｔｈｅ  ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ  ｎｉｃｈｅ  ａｓ  ａｎ  ｅｎｔｉｔｙ  ｏｆ  ａｃｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ，ｖｏｌ．４４１，ｐａｇｅｓ  １０７５−１０７９，２００６を参照のこと。
【０３００】
Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．“Ａｕｔｏｃｒｉｎｅ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂａｓｅｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｔｒａｎｓｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，ｖｏｌ．１１０，ｐａｇｅｓ  ８０９９−８１０４，２０１３）は、抗体を使用して幹細胞分化に影響を及ぼす方法を開示している。この抗体は、顆粒球コロニー刺激因子受容体のアゴニストである。細胞を活性化して所定の経路に沿って分化させる天然の顆粒球コロニー刺激因子と異なり、この単離アゴニスト抗体はヒト骨髄系統ＣＤ３４＋骨髄細胞を神経前駆細胞に分化転換させた。Ｍｅｌｉｄｏｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（“Ｓｅｌｅｃｔｉｎｇ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｔｈａｔ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ，”Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ，ｖｏｌ．１１０，ｐａｇｅｓ  １７８０２−１７８０７，２０１３）もまた、抗体を使用してＦＧＦ４とその受容体ＦＧＦＲ１βとの間の相互作用に干渉し、ひいてはオートクリンＦＧＦ４媒介性胚性幹細胞分化を遮断する方法を開示している。
【０３０１】
幹細胞分化におけるリガンド／受容体の機能の理解により、幹細胞分化を調節し、又はさらには指図するため生物学的タンパク質を利用してこれらのリガンド／受容体に干渉する戦略が可能となっている。遺伝子修飾されていないヒト幹細胞の分化を幹細胞ニッチへの抗体の投与によって制御可能であることにより、幹細胞ベースの療法の新規エキソビボ又はインビボ手法がもたらされ得る。一部の実施形態において、本発明は、癌幹細胞を含め、幹細胞ニッチに侵入して幹細胞又は腫瘍の発育を調節する能力を有する親又は野生型生物学的タンパク質から生成される条件的活性型生物学的タンパク質を提供する。この条件的活性型生物学的タンパク質は、体の他の部分における少なくとも１つの生理条件下では親又は野生型生物学的タンパク質より低い活性を有し、一方、幹細胞ニッチ、例えば癌幹細胞環境における少なくとも１つの生理条件下では親又は野生型生物学的タンパク質より高い活性を有する。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は副作用を生じにくく、幹細胞ニッチで優先的に作用して幹細胞の再生及び分化を調節する。一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質は抗体である。かかる条件的活性型抗体は、体の他の部分ではその抗原に弱く結合し、又は全く結合せず、しかし幹細胞ニッチでは抗原に強く緊密に結合し得る。
【０３０２】
本発明の滑液、腫瘍微小環境及び幹細胞ニッチに対する条件的活性型生物学的タンパク質は、親又は野生型生物学的タンパク質をコードするＤＮＡを進化させて変異体ＤＮＡライブラリを作成する方法によって生成される。次にこの変異体ＤＮＡライブラリを発現させると、変異体タンパク質が得られる。この変異体タンパク質は、滑液、腫瘍微小環境、及び幹細胞ニッチからなる群から選択される体の第一部分の少なくとも１つの生理条件下で親又は野生型生物学的タンパク質より高い活性を有し、且つ体の第一部分と異なる体の第二部分における少なくとも１つの生理条件下で親又は野生型生物学的タンパク質より低い活性を有する条件的活性型生物学的タンパク質に関してスクリーニングされる。体の第二部分は血漿であってもよい。かかる選択された変異体生物学的タンパク質が、体の第一部分では高い活性を有するが体の第二部分では低い活性を有する条件的活性型生物学的タンパク質である。
【０３０３】
条件的活性型生物学的タンパク質が作用することが意図されない体の他の部分では条件的活性型生物学的タンパク質の活性はより低いため、かかる条件的活性型生物学的タンパク質は親又は野生型タンパク質の副作用を低下させるのに有利である。例えば、条件的活性型生物学的タンパク質を腫瘍微小環境に導入することが意図される場合、腫瘍微小環境以外の体の部分で条件的活性型生物学的タンパク質の活性が低いということは、かかる条件的活性型生物学的タンパク質が腫瘍微小環境以外の体の部分で正常な生理学的機能に干渉する可能性が低いことを意味する。同時に、条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍微小環境では活性が高く、これにより条件的活性型生物学的タンパク質は腫瘍の治療における有効性がより高いものとなる。
【０３０４】
副作用が低いため、この条件的活性型生物学的タンパク質は、親又は野生型生物学的タンパク質と比較して大幅に高い用量のタンパク質を安全に使用することが可能である。サイトカイン又は成長因子に対する抗体は体の他の部分におけるサイトカイン又は成長因子の正常な生理学的機能を妨げ得るため、これはサイトカイン又は成長因子に対する抗体について特に有益である。副作用が低い条件的活性型生物学的タンパク質を使用することにより、より高用量を用いてより高い有効性を達成し得る。
【０３０５】
滑液、腫瘍微小環境、又は幹細胞ニッチの１つにおいて作用する条件的活性型生物学的タンパク質はまた、新規薬物標的の使用も可能にし得る。従来の生物学的タンパク質を療法薬として使用すると、許容できない副作用が生じ得る。例えば、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）の阻害は腫瘍成長の抑制に極めて有効であり得る。しかしながら、ＥＧＦＲを阻害する薬物はまた、皮膚及び胃腸（ＧＩ）管における成長も抑制し得る。この副作用のため、ＥＧＦＲは腫瘍薬標的として不適となる。腫瘍微小環境においてのみＥＧＦＲに高親和性で結合するが、体の任意の他の部分では全く又は極めて低い親和性でしか結合しない条件的活性型抗体を使用すると、副作用を大幅に低減すると同時に腫瘍成長を抑制し得る。この場合、条件的活性型抗体を使用することにより、ＥＧＦＲが有効な新規腫瘍薬標的となり得る。
【０３０６】
別の例では、関節損傷の修復において多くの場合にサイトカインの抑制が有益である。しかしながら、体の他の部分におけるサイトカインの抑制はまた、体の免疫応答も抑制し、免疫不全を引き起こし得る。従って、滑液中のサイトカインは、関節損傷治療用の従来の抗体薬の開発に理想的な標的ではない。しかしながら、滑液中ではサイトカインに優先的に結合する一方で、体の他の部分では同じサイトカインに全く又は弱くしか結合しない条件的活性型抗体を使用することにより、免疫不全の副作用を劇的に低減することができる。従って、条件的活性型抗体を使用することにより、滑液中のサイトカインが関節損傷の修復に好適な標的となり得る。
【０３０７】
炎症を起こし易い器官／組織のための条件的活性型生物学的タンパク質
一部の実施形態において、条件的活性型生物学的タンパク質は、リンパ節、扁桃、アデノイド、及び副鼻腔など、炎症を起こし易い器官又は組織で優先的に作用するように設計される。炎症を起こし易い更なる器官及び組織については、Ｇｒａｙ’ｓ  Ａｎａｔｏｍｙ  ｂｙ  Ｈｅｎｒｙ  Ｇｒａｙ，４１st  ｅｄｉｔｉｏｎ，２０１５、発行者Ｅｌｓｅｖｉｅｒなどの解剖学のテキストブックを参照し得る。
【０３０８】
これらの器官及び組織は、典型的には、一旦炎症を起こすと少なくとも１つの異常条件を呈する。例えば、これらの炎症を起こした器官及び組織は、例えばヒト血漿などの体の他の部分の正常生理条件と比較して、浸透圧が高くなり、及び／又は１つ以上のイオンの濃度が低くなり得る。更に、かかる炎症を起こした器官及び組織では、ヒト血漿などの体の他の部分の正常生理条件と比較したとき、小分子、乳酸、サイトカイン及び白血球の濃度が高くなり得る。
【０３０９】
一部の実施形態では、本発明により、炎症範囲で直面する１つ以上の異常条件から選択される異常条件と、ヒト血漿中の正常生理条件とを用いて条件的活性型生物学的タンパク質が作製され得る。従ってかかる条件的活性型生物学的タンパク質は、炎症状態の器官／組織で親又は野生型生物学的タンパク質の活性と比べて高い活性を有し、及びヒト血漿中で親又は野生型生物学的タンパク質の活性と比べて低い活性を有し得る。かかる条件的活性型生物学的タンパク質は、体の炎症を起こした領域で優先的に作用し得るが、炎症が起きていない体の領域では活性をほとんど又は全く有しないことになる。
【０３１０】
条件的活性型ウイルス粒子
ウイルス粒子は、長年、タンパク質、核酸分子、化学的化合物又は放射性同位元素を標的細胞又は組織に輸送するための送達媒体として使用されている。送達媒体として一般的に用いられているウイルス粒子としては、レトロウイルス、アデノウイルス、レンチウイルス、ヘルペスウイルス、及びアデノ随伴ウイルスが挙げられる。ウイルス粒子は、多くの場合にリガンド−受容体結合系において、標的細胞の標的タンパク質として働く細胞タンパク質との特異的結合のための認識タンパク質として働く表面タンパク質を介してその標的細胞を認識する（Ｌｅｎｔｚ，“Ｔｈｅ  ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ｅｖｅｎｔ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｖｉｒｕｓ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ａｎｔｉｖｉｒａｌ  ａｇｅｎｔｓ，”Ｊ．ｏｆ  Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．７１，ｐａｇｅｓ  ７５１−７６５，１９９０）。例えば、ウイルス認識タンパク質は、標的細胞上の受容体に対するリガンドであり得る。リガンドと受容体との間の特異性により、ウイルス粒子が標的細胞を特異的に認識して、そこにその内容物を送達することが可能となる。
【０３１１】
野生型ウイルスから人工ウイルス粒子を作る技法は当業者に周知である。送達媒体として公知の人工ウイルス粒子には、レトロウイルス（例えば、国際公開第９０／０７９３６号パンフレット；国際公開第９４／０３６２２号パンフレット；国際公開第９３／２５６９８号パンフレット；国際公開第９３／２５２３４号パンフレット；米国特許第５，２１９，７４０号明細書；国際公開第９３／１１２３０号パンフレット；国際公開第９３／１０２１８号パンフレット；米国特許第４，７７７，１２７号明細書；英国特許第２，２００，６５１号明細書；欧州特許第０  ３４５  ２４２号明細書；及び国際公開第９１／０２８０５号パンフレットを参照のこと）、アルファウイルス（例えば、シンドビスウイルスベクター、セムリキ森林ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２４６）、ベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ  ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ  ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ  ＶＲ  １２４９；ＡＴＣＣ  ＶＲ−５３２））、及びアデノ随伴ウイルス（例えば、国際公開第９４／１２６４９号パンフレット、国際公開第９３／０３７６９号パンフレット；国際公開第９３／１９１９１号パンフレット；国際公開第９４／２８９３８号パンフレット；国際公開第９５／１１９８４号パンフレット及び国際公開第９５／００６５５号パンフレットを参照のこと）をベースとするものが含まれる。
【０３１２】
概して、人工ウイルス粒子は、ウイルス粒子への外来性認識タンパク質の挿入、多くの場合に組換え技術による天然認識タンパク質の置換によって構築される。外来性認識タンパク質は、例えば、抗体、受容体、リガンド又はコラーゲン結合ドメインであり得る。本発明は、正常生理条件では細胞に対する結合が不活性又は低活性であり、且つ異常条件では細胞に対する結合が活性又は高活性である条件的活性型認識タンパク質を提供する。従って条件的活性型認識タンパク質は、罹患組織及び／又は疾患部位の標的細胞に対しては当該部位における異常条件の存在に基づき優先的に結合し、且つ正常生理条件が存在する正常組織の細胞との結合は回避し、又はごく最小限であり得る。条件的活性型認識タンパク質はウイルス粒子の表面上に発現し、提示され得る。
【０３１３】
一部の実施形態において、本発明は、親又は野生型認識タンパク質を進化させて、条件的活性型認識タンパク質に関してスクリーニングする方法を提供する。条件的活性型認識タンパク質は、正常生理条件下では親又は野生型認識タンパク質と比べて細胞に対する結合活性が低く、異常条件下では親又は野生型認識タンパク質と比べて細胞に対する結合活性が高い。かかる条件的活性型認識タンパク質を周知の組換え技術によってウイルス粒子に挿入すると、条件的活性型ウイルス粒子が生成され得る。
【０３１４】
別の実施形態において、本発明は、条件的活性型認識タンパク質を含む条件的活性型ウイルス粒子を提供し、条件的活性型認識タンパク質は、条件的活性型ウイルス粒子が罹患組織又は疾患部位の標的細胞を認識してそれに結合するが、正常組織の細胞は認識及び結合しないことを可能にする。かかる条件的活性型ウイルス粒子はウイルス粒子内の療法薬を疾患組織又は疾患部位に優先的に送達することができる一方、この条件的活性型ウイルス粒子は正常組織の細胞にはより少ない療法薬を送達するか、又は送達しない。
【０３１５】
一部の実施形態において、疾患部位における標的細胞は、健常な、又は特定の疾患若しくは病状に罹患していない体の他の部分におけるｐＨ又は温度と比較して異常なｐＨ（例えば、ｐＨ６．５）又は異常な温度を有する領域又は微小環境の内部にある。この実施形態において、条件的活性型認識タンパク質は、正常な生理的ｐＨ又は温度では親又は野生型認識タンパク質と比べて標的細胞の標的タンパク質との結合活性が低く、異常なｐＨ又は温度では親又は野生型認識タンパク質と比べて標的細胞の標的タンパク質との結合活性が高い。このように、この認識タンパク質は異常なｐＨ又は温度が起こる部位に優先的に結合し、それによって治療を疾患部位に送達し得る。
【０３１６】
一実施形態において、ウイルス粒子は本発明の条件的活性型抗体、特に抗体の可変領域（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆｖ）を含み得る。かかる条件的活性型抗体は、正常組織を含む部位で起こり得る正常生理条件下では親又は野生型抗体より低い親和性で、及び疾患部位又は罹患組織で起こり得る異常条件下では親又は野生型抗体より高い親和性で、標的細胞の標的タンパク質（抗原として）に結合し得る。条件的活性型抗体は、本発明の方法に従い親又は野生型抗体から誘導し得る。
【０３１７】
ある実施形態では、標的細胞上の標的タンパク質には、例えば多くの腫瘍において細胞表面上で過剰発現するチロシンキナーゼ成長因子受容体が含まれる。例示的チロシンキナーゼ成長因子は、ＶＥＧＦ受容体、ＦＧＦ受容体、ＰＤＧＦ受容体、ＩＧＦ受容体、ＥＧＦ受容体、ＴＧＦ−α受容体、ＴＧＦ−β受容体、ＨＢ−ＥＧＦ受容体、ＥｒｂＢ２受容体、ＥｒｂＢ３受容体、及びＥｒｂＢ４受容体である。
【０３１８】
条件的活性型ＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質
新規ゲノム操作ツールの一形態としてＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質、特にＣＲＩＳＰＲと呼ばれるものが発見されており、これらによれば、研究者は遺伝子にマイクロサージェリーを施して、染色体上の正確な位置にあるＤＮＡ配列を精密且つ容易に変化させることが可能になる（ゲノム編集、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃａｓ９  ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．１０，ｐａｇｅｓ  ９５７−９６３，２０１３）。例えば、鎌状赤血球貧血は単一塩基突然変異によって引き起こされ、これはＤＮＡ／ＲＮＡ修飾タンパク質を使用して修正し得る可能性がある。この技術は、染色体の小片を、一塩基対の変更による場合であっても、精密に欠失させ、又は編集し得る（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｐａｇｅｓ  ４６７−４７７，２０１１）。
【０３１９】
ＣＲＩＳＰＲによるゲノム編集は、細胞に複数の遺伝子変化を迅速且つ同時に作製する能力を有する。多くのヒトの病気は、心疾患、糖尿病、及び神経系疾患を含め、複数の遺伝子における突然変異の影響を受ける。このＣＲＩＳＰＲベースの技術は、疾患を引き起こす突然変異を復帰させ、これらの疾患を治癒し、又は少なくともこれらの疾患の重症度を低減し得る可能性を有する。ゲノム編集は、ゲノムＤＮＡの切断についてＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質（酵素ファミリー）に頼る。典型的には、Ｃａｓタンパク質は、小さいガイドＲＮＡによってゲノム内の標的領域に案内され、ここでガイドＲＮＡは標的領域と一致している。Ｃａｓタンパク質は配列特異性がほとんど又は全くないため、ガイドＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質が正確なゲノム編集を達成するための指示者として働く。一実施形態では、１つのＣａｓタンパク質を複数のガイドＲＮＡと共に使用して、複数の遺伝子突然変異を同時に修正し得る。
【０３２０】
多くのＣａｓタンパク質が存在する。例としては、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３’、Ｃａｓ３’’、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ６ｅ、Ｃａｓ６ｆ、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８ａ１、Ｃａｓ８ａ２、Ｃａｓ８ｂ、Ｃａｓ８ｃ、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１０ｄ、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、及びＣｓｆ４が挙げられる（（Ｍａｋａｒｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．９，ｐａｇｅｓ  ４６７−４７７，２０１１）。
【０３２１】
ゲノム編集を行うには、Ｃａｓタンパク質が標的細胞に侵入する必要がある。対象の細胞は、細胞内部において異なる細胞内ｐＨを有し得る。罹患組織の一部の細胞は異常な細胞内ｐＨを有する。例えば、一部の腫瘍細胞は約７．１２〜７．６５のアルカリ性の細胞内ｐＨを有する傾向があり、一方、正常組織の細胞は６．９９〜７．２０の範囲の中性の細胞内ｐＨを有する。Ｃａｒｄｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｔｈｅ  ｒｏｌｅ  ｏｆ  ｄｉｓｔｕｒｂｅｄ  ｐＨ  ｄｙｎａｍｉｃｓ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｎａ（＋）／Ｈ（＋）ｅｘｃｈａｎｇｅｒ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ，”Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．５，ｐａｇｅｓ  ７８６−７９５，２００５を参照のこと。慢性低酸素では、罹患組織の細胞は約７．２〜７．５の細胞内ｐＨを有し、これもまた正常組織の細胞内ｐＨより高い（Ｒｉｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｈｒｏｎｉｃ  ｈｙｐｏｘｉａ  ｅｌｅｖａｔｅｓ  ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  Ｎａ＋／Ｈ＋  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｉｎ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ａｒｔｅｒｉａｌ  ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｅｌｌｓ，”Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ−Ｌｕｎｇ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８９，ｐａｇｅｓ  Ｌ８６７−Ｌ８７４，２００５）。さらに、虚血細胞では、細胞内ｐＨは典型的に６．５５〜６．６５の範囲であり、これは正常組織の細胞内ｐＨより低い（Ｈａｑｂｅｒｇ，“Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ  ｄｕｒｉｎｇ  ｉｓｃｈｅｍｉａ  ｉｎ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｔｏ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ，ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ，ｔｉｓｓｕｅ  ｌａｃｔｉｃ  ａｃｉｄ  ａｎｄ  ＡＴＰ，”Ｐｆｌｕｇｅｒｓ  Ａｒｃｈ．，ｖｏｌ．４０４，ｐａｇｅｓ  ３４２−３４７，１９８５）。罹患組織における異常な細胞内ｐＨのさらなる例が、Ｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  Ｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐＨ，”Ｃｈｅｍ  Ｒｅｖ．，ｖｏｌ．１１０，ｐａｇｅｓ  ２７０９−２７２８，２０１０において考察されている。
【０３２２】
本発明は、親又は野生型Ｃａｓタンパク質から条件的活性型Ｃａｓタンパク質を作製する方法を提供し、ここで条件的活性型Ｃａｓタンパク質は、（１）正常細胞内部の正常生理条件下で親又は野生型Ｃａｓタンパク質の活性と比べて低下した酵素活性、及び（２）上記で考察した罹患細胞の１つなどの標的細胞内部の異常条件下で親又は野生型Ｃａｓタンパク質の活性と比べて増加した酵素活性、のうちの少なくとも一方を有する。一部の実施形態において、正常生理条件はほぼ中性の細胞内ｐＨであり、異常条件は、中性より高いか、又はそれより低い異なる細胞内ｐＨである。ある実施形態では、異常条件は、７．２〜７．６５の細胞内ｐＨ又は６．５〜６．８の細胞内ｐＨである。
【０３２３】
一部の実施形態において、条件的活性型Ｃａｓタンパク質は、本発明の条件的活性型ウイルス粒子を使用して標的細胞に送達し得る。条件的活性型ウイルス粒子は、条件的活性型Ｃａｓタンパク質と、Ｃａｓタンパク質がゲノムＤＮＡを編集することになる位置にＣａｓタンパク質を導くための少なくとも１つのガイドＲＮＡとを含む。
【０３２４】
多重特異性抗体は、多重特異性抗体が結合し得る標的（抗原）の全て又はほとんどを含有する優先的標的組織において高い選択性を有する。例えば、二重特異性抗体は、抗原のうち一方のみを発現し得る非標的細胞と比較して、その二重特異性抗体によって認識される抗原の両方を発現する標的細胞により高い選好性を示すことにより、標的細胞に対する選択性を提供する。従って、この系のダイナミズムに起因して、平衡状態ではより多くの二重特異性抗体が非標的細胞と比べて標的細胞に結合する。
【０３２５】
本明細書において操作される多重特異性抗体、又はそれらの抗原認識フラグメントは、本発明のキメラ抗原受容体のＡＳＴＲとして使用し得る。
【０３２６】
細胞傷害性細胞の操作
スクリーニング工程によって条件的活性型ＡＳＴＲが同定されると、個々のドメインをコードするポリヌクレオチド配列をライゲートして単一のポリヌクレオチド配列（ＣＡＲ遺伝子、これは条件的活性型ＣＡＲをコードする）を形成することにより、キメラ抗原受容体をアセンブルし得る。個々のドメインには、条件的活性型ＡＳＴＲ、ＴＭ、及びＩＳＤが含まれる。一部の実施形態において、ａｂ  ＥＳＤ及びＣＳＤを含めた他のドメインもまたＣＡＲに導入され得る（図１）。条件的活性型ＣＡＲが二重特異性ＣＡＲである場合、ＣＡＲ遺伝子は、例えば、Ｎ末端からＣ末端の向きに以下の構成：Ｎ末端シグナル配列−ＡＳＴＲ１−リンカー−ＡＳＴＲ２−細胞外スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。一実施形態において、かかるＣＡＲ遺伝子は２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。
【０３２７】
或いは、条件的活性型ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｎ末端からＣ末端の向きに以下の構成：Ｎ末端シグナル配列−ＡＳＴＲ１−リンカー−ＡＳＴＲ２−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。ある実施形態では、かかるＣＡＲは２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。ＣＡＲが３つ以上のＡＳＴＲを含む場合、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列は、Ｎ末端からＣ末端の向きに以下の構成：Ｎ末端シグナル配列−ＡＳＴＲ１−リンカー−ＡＳＴＲ２−リンカー−（抗原特異的標的領域）n−膜貫通ドメイン−共刺激ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメインであってもよい。かかるＣＡＲは細胞外スペーサードメインをさらに含み得る。各ＡＳＴＲはリンカーによって隔てられていてもよい。ある実施形態では、かかるＣＡＲは２つ以上の共刺激ドメインを含み得る。
【０３２８】
条件的活性型ＣＡＲは発現ベクターによって細胞傷害性細胞に導入される。本発明の条件的活性型ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターもまた、本明細書に提供される。好適な発現ベクターとしては、レンチウイルスベクター、γレトロウイルスベクター、フォーミーウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、アデノウイルスベクター、遺伝子工学的に操作されたハイブリッドウイルス、ネイキッドＤＮＡ、例えば限定はされないが、トランスポゾン媒介性ベクター、例えばＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ、Ｐｉｇｇｙｂａｋ、及びインテグラーゼ、例えばＰｈｉ３１が挙げられる。一部の他の好適な発現ベクターとしては、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）及びレトロウイルス発現ベクターが挙げられる。
【０３２９】
アデノウイルス発現ベクターはアデノウイルスをベースとし、これはゲノムＤＮＡへの組み込み能力が低く、しかし宿主細胞のトランスフェクション効率は高い。アデノウイルス発現ベクターは、（ａ）発現ベクターのパッケージングの補助、及び（ｂ）宿主細胞におけるＣＡＲ遺伝子の最終的な発現に十分なアデノウイルス配列を含む。アデノウイルスゲノムは３６ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡであり、ここでは本発明の発現ベクターを作製するため外来性ＤＮＡ配列（ＣＡＲ遺伝子など）が挿入されて、アデノウイルスＤＮＡの大きいフラグメントを置換し得る（Ｇｒｕｎｈａｕｓ  ａｎｄ  Ｈｏｒｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ  ａｓ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｓｅｍｉｎａｒｓ  Ｖｉｒｏｌ．，ｖｏｌ．３，ｐａｇｅｓ  ２３７−２５２，１９９２）。
【０３３０】
別の発現ベクターはアデノ随伴ウイルスをベースとし、これはアデノウイルスカップリングシステムを利用するものである。このＡＡＶ発現ベクターは宿主ゲノムへの組込み頻度が高い。これは非分裂細胞さえ感染させることができ、従って例えば組織培養又はインビボでの哺乳類細胞への遺伝子送達に有用となる。ＡＡＶベクターは、感染力に関して広い宿主域を有する。ＡＡＶベクターの作成及び使用に関する詳細は、米国特許第５，１３９，９４１号明細書及び同第４，７９７，３６８号明細書に記載される。
【０３３１】
レトロウイルス発現ベクターは、宿主ゲノムに組み込まれ、多量の外来性遺伝物質を送達し、広域の種及び細胞型を感染させ、及び特定の細胞株にパッケージングされる能力を有する。レトロウイルスベクターは、核酸（例えば、ＣＡＲをコードするもの）をウイルスゲノムの特定の位置に挿入して複製欠損のウイルスを作製することによって構築される。レトロウイルスベクターは幅広い種類の細胞型を感染させることができるが、ＣＡＲ遺伝子の組込み及び安定発現には宿主細胞の分裂が必要である。
【０３３２】
レンチウイルスベクターはレンチウイルスに由来し、これは、一般的なレトロウイルス遺伝子ｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、調節又は構造上の機能を有する他の遺伝子を含有する複合的レトロウイルスである（米国特許第６，０１３，５１６号明細書及び同第５，９９４，１３６号明細書）。レンチウイルスのいくつかの例としては、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２）及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクターはＨＩＶ病原性遺伝子の多重弱毒化によって作成されており、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆを欠失させることで、ベクターが生物学的に安全にされている。レンチウイルスベクターは非分裂細胞を感染させる能力を有し、インビボ及びエキソビボの両方でのＣＡＲ遺伝子の遺伝子導入及び発現に使用することができる（米国特許第５，９９４，１３６号明細書）。
【０３３３】
条件的活性型ＣＡＲ遺伝子を含む発現ベクターは、当業者に公知の任意の手段によって宿主細胞に導入することができる。発現ベクターは、必要であれば、トランスフェクション用のウイルス配列を含み得る。或いは、発現ベクターは、融合、電気穿孔、微粒子銃、トランスフェクション、リポフェクションなどによって導入されてもよい。宿主細胞は発現ベクターの導入前に培養下で成長及び拡大させてもよく、続いてベクターの導入及び組込みに適切な処理が行われ得る。次に宿主細胞を拡大し、ベクターに存在するマーカーによってスクリーニングする。使用し得る様々なマーカーには、ｈｐｒｔ、ネオマイシン耐性、チミジンキナーゼ、ハイグロマイシン耐性等が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「細胞」、「細胞株」、及び「細胞培養物」は同義的に用いられ得る。一部の実施形態において、宿主細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞及びＮＫＴ細胞である。
【０３３４】
別の態様において、本発明はまた、本発明の条件的活性型ＣＡＲを含んでそれを安定に発現する遺伝子操作された細胞傷害性細胞も提供する。一実施形態において、遺伝子操作細胞としては、治療的に関連性のある子孫を生じる能力を有するＴリンパ球（Ｔ細胞）、ナイーブＴ細胞（ＴN）、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞（ＴCM）、エフェクターメモリー細胞（ＴEM））、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージが挙げられる。別の実施形態において、遺伝子操作細胞は自己細胞である。好適なＴ細胞の例としては、ＣＤ４+／ＣＤ８-、ＣＤ４-／ＣＤ８+、ＣＤ４-／ＣＤ８-又はＣＤ４+／ＣＤ８+Ｔ細胞が挙げられる。Ｔ細胞は、ＣＤ４+／ＣＤ８-及びＣＤ４-／ＣＤ８+細胞の混合集団又は単一のクローンの集団であってもよい。本発明のＣＤ４+Ｔ細胞はまた、標的抗原を発現する細胞（例えばＣＤ２０+及び／又はＣＤ１９+腫瘍細胞）とインビトロで共培養すると、ＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α及び他のＴ細胞エフェクターサイトカインも産生し得る。本発明のＣＤ８+Ｔ細胞は、標的抗原を発現する細胞を溶解させ得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＡ+  ＣＤ６２Ｌ+ナイーブ細胞、ＣＤ４５ＲＯ  ＣＤ６２Ｉ７セントラルメモリー細胞、ＣＤ６２Ｌ"エフェクターメモリー細胞又はこれらの組み合わせのうちの任意の１つ又はそれ以上であり得る（Ｂｅｒｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｖｉｒｕｓ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ，”Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，ｖｏｌ．２１，ｐａｇｅｓ  ２２４−２３２，２００９）。
【０３３５】
遺伝子操作された細胞傷害性細胞は、本発明のＣＡＲ遺伝子を含む発現ベクターを宿主細胞に安定にトランスフェクトすることによって作製し得る。発現ベクターを使用して細胞傷害性細胞を遺伝子操作するさらなる方法には、化学的形質転換方法（例えば、リン酸カルシウム、デンドリマー、リポソーム及び／又はカチオン性ポリマーの使用）、非化学的形質転換方法（例えば、電気穿孔、光学的形質転換、遺伝子エレクトロトランスファー及び／又は流体力学的デリバリー）及び／又は粒子ベースの方法（例えば、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、遺伝子銃の使用及び／又はマグネトフェクション）が含まれる。再配列されていない組み込まれた単一のベクターの存在を示し且つ条件的活性型ＣＡＲを発現するトランスフェクト細胞が、エキソビボで拡大され得る。
【０３３６】
発現ベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子ボンバードメント、マイクロインジェクション、電気穿孔などが挙げられる。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞の作製方法は当該技術分野において周知である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）を参照のこと。発現ベクターを宿主細胞に導入するための化学的方法としては、コロイド分散系、例えば、巨大分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、及び脂質ベースのシステム、例えば、水中油型エマルション、ミセル、混合ミセル、及びリポソームが挙げられる。
【０３３７】
ＣＡＲ遺伝子を含有する発現ベクターを宿主細胞に導入した後、ＣＡＲ遺伝子が発現し、そのようにして標的抗原に結合することのできるＣＡＲ分子が作製されることになる。作製されたＣＡＲ分子は膜貫通ドメインを有するため膜貫通タンパク質になる。次に宿主細胞がＣＡＲ−Ｔ細胞などのＣＡＲ細胞に変換されることになる。ＣＡＲ分子を含む操作された細胞傷害性細胞、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞を作製する方法については、例えば、（Ｃａｒｔｅｌｌｉｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，「癌免疫療法のためのキメラ抗原受容体が操作されたＴ細胞（Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ）」，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２０１０，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ９５６３０４，２０１０；及びＭａ  ｅｔ  ａｌ．，「操作されたＴ細胞の特異性及び活性を制御するための多目的戦略（Ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ）」，ＰＮＡＳ，ｖｏｌ．１１３，Ｅ４５０−Ｅ４５８，２０１６）に記載されている。
【０３３８】
望ましい条件的活性型ＣＡＲを発現させるための細胞傷害性細胞の遺伝子修飾前か、それとも遺伝子修飾後かに関わらず、例えば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書；同第６，５３４，０５５号明細書；同第６，９０５，６８０号明細書；同第６，６９２，９６４号明細書；同第５，８５８，３５８号明細書；同第６，８８７，４６６号明細書；同第６，９０５，６８１号明細書；同第７，１４４，５７５号明細書；同第７，０６７，３１８号明細書；同第７，１７２，８６９号明細書；同第７，２３２，５６６号明細書；同第７，１７５，８４３号明細書；同第５，８８３，２２３号明細書；同第６，９０５，８７４号明細書；同第６，７９７，５１４号明細書；同第６，８６７，０４１号明細書；及び米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に記載されるような方法を用いて細胞を活性化し、数を拡大することができる。例えば、本発明のＴ細胞は、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤及びＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドが結合している表面に接触させることにより拡大し得る。詳細には、Ｔ細胞集団は、表面に固定化された抗ＣＤ３抗体、又はその抗原結合フラグメント、又は抗ＣＤ２抗体に接触させることによるか、又はカルシウムイオノフォアと共にプロテインキナーゼＣアクチベーター（例えば、ブリオスタチン）に接触させることにより刺激し得る。Ｔ細胞の表面上のアクセサリー分子の共刺激には、そのアクセサリー分子と結合するリガンドが用いられる。例えば、Ｔ細胞は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体に接触させることができる。ＣＤ４+Ｔ細胞又はＣＤ８+Ｔ細胞のいずれの増殖を刺激するにも、抗ＣＤ３抗体及び抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ、Ｂｅｓａｎｃｏｎ，Ｆｒａｎｃｅ）が挙げられ、これらは、当該技術分野において一般に知られている他の方法と同様に、本発明において使用することができる（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）。
【０３３９】
様々な実施形態において、本発明は、薬学的に受容可能な賦形剤と本発明の条件的活性型ＣＡＲの治療有効量とを含む医薬組成物を提供する。この組成物中の条件的活性型ＣＡＲは、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド、ＣＡＲを含むタンパク質又はＣＡＲタンパク質を発現する遺伝子修飾細胞のうちの任意の１つ又はそれ以上であり得る。ＣＡＲタンパク質は薬学的に受容可能な塩の形態であってもよい。薬学的に受容可能な塩とは、例えば、ナトリウム、カリウム、カルシウムなどの塩、及びプロカイン、ジベンジルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、メチルグルカミン、タウリンなどのアミン塩、並びに塩酸塩などの酸付加塩、及び塩基性アミノ酸などを含めた、製薬工業において治療的タンパク質の塩として使用し得る塩を指す。
【０３４０】
薬学的に受容可能な賦形剤としては、概して安全で非毒性の望ましい医薬組成物の調製において有用な任意の賦形剤を挙げることができ、動物への使用並びにヒト医薬品としての使用が許容される賦形剤が挙げられる。かかる賦形剤は、固体、液体、半固体、又はエアロゾル組成物の場合には気体であり得る。ある種の賦形剤は薬学的に受容可能な担体を含み、これは組成物を増強し若しくは安定化させ、又は組成物の調製を促進するために添加され得るものである。液体担体としては、シロップ、ピーナッツ油、オリーブ油、グリセリン、生理食塩水、アルコール及び水が挙げられる。固体担体としては、デンプン、ラクトース、硫酸カルシウム、二水和物、白土、ステアリン酸マグネシウム又はステアリン酸、タルク、ペクチン、アカシア、寒天及びゼラチンが挙げられる。担体はまた、徐放材料、例えばモノステアリン酸グリセリル又はジステアリン酸グリセリルを単独で、又はワックスと共に含み得る。
【０３４１】
薬学的に受容可能な担体は、一部には、投与される詳細な組成物によって決まるとともに、組成物の投与に用いられる詳細な方法によっても決まる。従って、本発明の医薬組成物の好適な製剤は多種多様である。例えば緩衝生理食塩水など、種々の水性担体が用いられ得る。これらの溶液は無菌であり、概して望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、従来の周知の滅菌技術によって滅菌され得る。組成物は、ｐＨ調整剤及び緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなど、生理条件を近似するため適宜薬学的に受容可能な補助物質を含有し得る。これらの製剤中のＣＡＲの濃度は幅広く異なり得るとともに、主に液量、粘度、及び体重に基づき、選択された詳細な投与方法及び患者の必要性に従い選択されることになる。
【０３４２】
様々な実施形態において、本発明に係る医薬組成物は、任意の好適な投与経路による送達用に製剤化され得る。「投与経路」は、限定はされないが、エアロゾル、経鼻、経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、吸入、経粘膜、経皮、非経口、植込み型ポンプ、持続注入、局所適用、カプセル及び／又は注射を含めた、当該技術分野において公知の任意の投与経路を指し得る。
【０３４３】
本発明に係る医薬組成物は、経口投与用にカプセル化され、錠剤化され、又はエマルション若しくはシロップ中に調製されてもよい。医薬組成物は、錠剤形態については粉砕、混合、顆粒化、及び圧縮（必要な場合）；又は硬ゼラチンカプセル形態については粉砕、混合及び充填が関わる従来の製薬技術に従い作製される。液体担体が用いられる場合、製剤は、シロップ、エリキシル剤、エマルション又は水性若しくは非水性懸濁液の形態であり得る。かかる液体製剤は直接経口投与されてもよく、又は軟ゼラチンカプセルに充填されてもよい。
【０３４４】
医薬組成物は、（ａ）液状溶液、例えば、水、生理食塩水又はＰＥＧ  ４００などの希釈剤中に懸濁された有効量のパッケージングされた核酸；（ｂ）各々が液体、固体、顆粒又はゼラチンとしての所定量の活性成分を含有するカプセル、サシェ又は錠剤；（ｃ）適切な液体中の懸濁液；及び（ｄ）好適なエマルションとして製剤化され得る。特に、好適な剤形としては、限定はされないが、錠剤、丸薬、散剤、糖衣剤、カプセル、液剤、ロゼンジ、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液等が挙げられる。
【０３４５】
固形製剤は、例えば、ラクトース、スクロース、マンニトール、又はソルビトールなどの糖類；トウモロコシ、コムギ、コメ、ジャガイモ、又は他の植物由来のデンプン；メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｐｙｈｎｅｔｈｙｌ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ）、及びナトリウムカルボキシメチルセルロースなどのセルロース；並びにアラビア及びトラガカントを含めたゴム；及びタンパク質、例えばゼラチン及びコラーゲンを含めた、炭水化物又はタンパク質充填剤などの好適な固体賦形剤を含む。架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、又はアルギン酸ナトリウムなどのその塩など、崩壊剤又は可溶化剤が添加されてもよい。錠剤形態は、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、コーンスターチ、ジャガイモデンプン、トラガカント、微結晶性セルロース、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム（ｃｒｏｓｃａｎｎｅｌｌｏｓｅ  ｓｏｄｉｕｍ）、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及び他の賦形剤、着色料、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、湿潤剤、保存剤、香味剤、色素、崩壊剤、及び薬学的に受容可能な担体のうちの１つ以上を含み得る。
【０３４６】
液体懸濁剤は、水性懸濁剤の製造に適する賦形剤との混合物中に、条件的活性型ＣＡＲを有する。そのような賦形剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガカントガム及びアラビアガムのような懸濁化剤、及び天然に存在するホスファチド（例えばレシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えばポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えばヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸及びヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えばポリエチレンソルビトールモノオレート）、又はエチレンオキシドと脂肪酸及び無水ヘキシトールから誘導された部分エステルとの縮合生成物（例えばポリオキシエチレンソルビタンモノオレート）のような核酸剤又は湿潤剤を含むことが出来る。液体懸濁剤はまた、エチル又はｎ−プロピル−ｐ−ヒドロキシベンゾエートなどの１つ又は複数の保存剤、１つ又は複数の着色剤、１つ又は複数の香味料、並びにスクロース、アスパルテーム又はサッカリンなどの１つ又は複数の甘味料を含有することが出来る。製剤は浸透圧について調整されてもよい。
【０３４７】
トローチ剤形は、活性成分を通常、スクロース及びアカシア又はトラガカントといった香味料中に有し、また、香錠剤は、ゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア乳剤、ゲル剤などの、不活性基材中に活性成分を有し、これらの活性成分に加え当該技術分野で既知の担体を有することが出来る。条件的活性型ＣＡＲは、経口投与されるとき、消化から保護されていなければならないと理解されている。これは、一般的には、条件的ＣＡＲを、酸性的及び酵素的な加水分解への耐性を付与する組成物と複合体を作ることによって、或いは条件的活性型ＣＡＲを、リポソームなどの適切な耐性を持つ担体中に包装することによって、達成される。タンパク質を消化から保護する方法は、当該技術分野において公知である。医薬組成物は、例えば、リポソーム中に、又は活性成分を徐放出来るようにする製剤中に、封入することが出来る。
【０３４８】
本医薬組成物は、吸入による投与のため、エアロゾル製剤として製剤化されてもよい（例えばそれらは「噴霧」することができる）。エアロゾル製剤は、加圧された許容可能な噴射剤、例えば、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの中に置かれ得る。直腸投与に好適な製剤には、例えば、坐剤基剤と共にパッケージング核酸からなる坐薬が含まれる。好適な坐剤基剤としては、天然若しくは合成トリグリセリド又はパラフィン炭化水素が挙げられ、加えて、例えば、液体トリグリセリド、ポリエチレングリコール、及びパラフィン炭化水素を含む基剤とパッケージング核酸との組み合わせからなるゼラチン直腸カプセルを使用することも可能である。
【０３４９】
本医薬組成物は、例えば、関節内（ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒ）（関節内（ｉｎ  ｔｈｅ  ｊｏｉｎｔｓ））、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、及び皮下経路によるなど、非経口投与用に製剤化されてもよく、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、及び溶質を含有し得る水性及び非水性の等張性滅菌注射溶液、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含み得る水性及び非水性の滅菌懸濁液を含んでもよく、この発明の実施において、組成物は、例えば、静脈内注入によって、経口的に、局所的に、腹腔内に、膀胱内に又はくも膜下腔内に投与することができる。一態様において、非経口投与方法は、ＣＡＲタンパク質又は遺伝子操作された細胞傷害性細胞を含む組成物に好ましい投与方法である。組成物は、好都合には単位剤形で投与されてもよく、例えばＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｅａｓｔｏｎ  Ｐａ．，１８th  Ｅｄ．，１９９０に記載されるとおりの、製薬技術分野で周知の方法のいずれかによって調製されてもよい。静脈内投与用の製剤は、滅菌水又は生理食塩水、ポリエチレングリコールなどのポリアルキレングリコール類、植物由来の油、水素化ナフタレンなど、薬学的に受容可能な担体を含有し得る。
【０３５０】
本医薬組成物は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｌｅｂｅｌｌａｒ）、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、腟、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、又は経皮から選択される少なくとも１つの方法によって投与され得る。本方法は、任意選択で、条件的活性型ＣＡＲの前、それと同時、又はその後に、検出可能標識又はレポーター、ＴＮＦアンタゴニスト、抗リウマチ薬、筋弛緩薬、麻薬、非ステロイド系抗炎症薬（ＮＳＡＫ））、鎮痛薬、麻酔薬、鎮静薬、局所麻酔薬、神経筋遮断薬、抗菌薬、抗乾癬薬、コルチコステロイド（ｃｏｒｔｉｃｏｓｔｅｒｉｏｄ）、アナボリックステロイド、エリスロポエチン、免疫化、免疫グロブリン、免疫抑制薬、成長ホルモン、ホルモン補充薬、放射性医薬品、抗うつ薬、抗精神病薬、刺激薬、喘息薬、βアゴニスト、吸入ステロイド薬、エピネフリン又はその類似体、細胞傷害性薬剤又は他の抗癌剤、メトトレキサートなどの代謝拮抗薬、又は抗増殖剤のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１つの化合物又はタンパク質の有効量を含む少なくとも１つの組成物を投与する工程をさらに含むことができる。
【０３５１】
本発明の遺伝子操作された細胞傷害性細胞又は医薬組成物で治療される癌の種類としては、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、及び特定の白血病又はリンパ性悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、及び悪性疾患、例えば、肉腫、癌腫、及び黒色腫が挙げられる。癌は非固形腫瘍（血液腫瘍など）又は固形腫瘍であってもよい。成人腫瘍／癌及び小児腫瘍／癌もまた含まれる。
【０３５２】
血液癌は、血液又は骨髄の癌である。血液癌（又は血行性癌）の例としては、白血病、例えば、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病並びに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性及び赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性型及び高悪性度型）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、ヘアリー細胞白血病及び骨髄形成異常が挙げられる。
【０３５３】
固形腫瘍は、通常は嚢胞又は液体領域を含まない異常な組織塊である。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。固形腫瘍の異なるタイプは、それを形成する細胞のタイプにちなんで命名される（肉腫、癌腫、及びリンパ腫など）。肉腫及び癌腫など、固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、及び他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性腫瘍、膵癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭癌、褐色細胞腫、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞癌、胆管癌、絨毛癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、精巣腫瘍、セミノーマ、膀胱癌、黒色腫、及びＣＮＳ腫瘍（神経膠腫（脳幹神経膠腫及び混合性神経膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても知られる）、星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫及び脳転移など）が挙げられる。
【０３５４】
本発明はまた、少なくとも１つのＣＡＲタンパク質、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列、又はＣＡＲを発現する宿主細胞を含む医療器具も提供し、この器具は、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｌｅｂｅｌｌａｒ）、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、腟、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、又は経皮から選択される少なくとも１つの方法によって少なくとも１つの条件的活性型ＣＡＲを投与するのに好適である。
【０３５５】
更なる態様において、本発明は、第１の容器内にある凍結乾燥形態の少なくとも１つのＣＡＲタンパク質、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列、又はＣＡＲを発現する宿主細胞と、滅菌水か、滅菌緩衝用水か、又は水性希釈剤中のフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム、アルキルパラベン、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム及びチメロサール、又はこれらの混合物からなる群から選択される少なくとも１つの保存剤かを含む任意選択の第２の容器とを含むキットを提供する。一態様において、このキットにおいては、第１の容器中の条件的活性型ＣＡＲ又は特定の部分若しくはバリアントの濃縮物が、第２の容器の内容物で約０．１ｍｇ／ｍｌ〜約５００ｍｇ／ｍｌの濃度に再構成される。別の態様において、第２の容器には等張剤が更に含まれる。別の態様において、第２の容器には生理的に許容可能な緩衝剤が更に含まれる。一態様において、本開示は、少なくとも１つの野生型タンパク質が媒介する病態を治療する方法であって、それを必要としている患者に、キットで提供され且つ投与前に再構成される製剤を投与する工程を含む方法を提供する。
【０３５６】
また、溶液又は凍結乾燥形態の少なくとも１つのＣＡＲタンパク質、ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド配列、又はＣＡＲを発現する宿主細胞を含む容器と包装材料とを含むヒト医薬用途又は診断用途の製品も提供される。この製品は、任意選択で、非経口、皮下、筋肉内、静脈内、関節内（ｉｎｔｒａｒｔｉｃｕｌａｒ）、気管支内、腹腔内、嚢内、軟骨内、洞内、腔内、小脳内（ｉｎｔｒａｃｅｌｅｂｅｌｌａｒ）、脳室内、結腸内、頸管内、胃内、肝内、心筋内、骨内、骨盤内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、直腸内、腎臓内、網膜内、脊髄内、滑液嚢内、胸腔内、子宮内、膀胱内、ボーラス、腟、直腸、頬側、舌下、鼻腔内、又は経皮送達装置又はシステムの構成要素として容器を有することを含み得る。
【０３５７】
一部の実施形態において、本発明は、対象から細胞傷害性細胞を回収する工程と、本発明のＣＡＲ遺伝子を細胞傷害性細胞に導入することによって細胞傷害性細胞を遺伝子操作する工程と、遺伝子操作された細胞傷害性細胞を対象に投与する工程とを含む方法を提供する。一部の実施形態において、細胞傷害性細胞は、Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、及びマクロファージから選択される。一実施形態において、細胞傷害性細胞はＴ細胞である。
【０３５８】
一実施形態において、Ｔ細胞は対象から得られる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水、脾臓組織、及び腫瘍を含めたいくつもの供給源から得ることができる。本発明の特定の実施形態では、当該技術分野で利用可能なあらゆるＴ細胞株を使用し得る。本発明の特定の実施形態では、Ｔ細胞は、対象から採取された血液から、Ｆｉｃｏｌｌ（商標）分離など、当業者に公知のあらゆる技法を用いて得ることができる。
【０３５９】
好ましい一実施形態では、個体の循環血液からの細胞はアフェレーシスによって得られる。アフェレーシス産物は典型的には、リンパ球、例えばＴ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、及び血小板を含有する。一実施形態において、アフェレーシスによって収集された細胞は、洗浄して血漿画分を除去し、続く処理工程のため細胞を適切な緩衝液又は培地中に入れることができる。本発明の一実施形態において、細胞はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で洗浄する。代替的実施形態において、洗浄溶液はカルシウムを含まず、且つマグネシウムを含まなくてもよく、又は全てではないにしろ多くの二価カチオンを含まなくてもよい。この場合もまた、意外にも、カルシウムの非存在下における初期活性化工程が活性化の増大につながる。当業者であれば容易に理解するとおり、洗浄工程は、半自動「フロースルー」遠心機（例えば、Ｃｏｂｅ  ２９９１細胞処理機、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、又はＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を製造者の指示に従い使用するなど、当業者に公知の方法によって達成し得る。洗浄後、細胞は、種々の生体適合性緩衝液、例えば、Ｃａ2+不含、Ｍｇ2+不含ＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、又は緩衝液含有若しくは不含の別の生理食塩水中に再懸濁し得る。或いは、アフェレーシス試料の望ましくない成分を除去し、細胞を培養培地中に直接再懸濁してもよい。
【０３６０】
別の実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解して、例えばＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配で遠心するか、又は向流遠心エルトリエーションによって単球を枯渇させることにより、末梢血から単離される。ＣＤ３+、ＣＤ２８+、ＣＤ４+、ＣＤ８+、ＣＤ４５ＲＡ+、及びＣＤ４５ＲＯ+Ｔ細胞などの特定の一部のＴ細胞集団をポジティブ又はネガティブ選択法によってさらに単離することができる。例えば、ネガティブ選択によるＴ細胞集団のエンリッチメントは、ネガティブ選択される細胞にユニークな表面マーカーに対する抗体と組み合わせて達成することができる。一つの方法は、ネガティブ選択される細胞上に存在する細胞表面マーカーに対するモノクローナル抗体のカクテルを使用するネガティブ磁気免疫粘着又はフローサイトメトリーによる細胞分取及び／又は選択である。ネガティブ選択によってＣＤ４+細胞をエンリッチするには、モノクローナル抗体カクテルは典型的には、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、及びＣＤ８に対する抗体を含む。特定の実施形態では、典型的にＣＤ４+、ＣＤ２５+、ＣＤ６２Ｌhi、ＧＩＴＲ+、及びＦｏｘＰ３+を発現する調節性Ｔ細胞をエンリッチするか又はポジティブ選択することが望ましい場合もある。
【０３６１】
例えば、一実施形態において、Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）コンジュゲートビーズ、例えばＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ｔと共に、所望のＴ細胞のポジティブ選択に十分な時間にわたってインキュベートすることにより単離される。一実施形態において、この時間は約３０分である。さらなる実施形態において、この時間は３０分〜３６時間又はそれ以上、及びそれらの間にある全ての整数値の範囲である。さらなる実施形態において、この時間は少なくとも１、２、３、４、５、又は６時間である。さらに別の好ましい実施形態において、この時間は１０〜２４時間である。好ましい一実施形態において、インキュベーション時間は２４時間である。白血病患者からのＴ細胞の単離には、２４時間など、より長いインキュベーション時間を用いると、細胞収率が高まり得る。より長いインキュベーション時間は、腫瘍組織又は免疫不全者からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の単離など、他の細胞型と比較したときＴ細胞が少ない任意の状況でＴ細胞を単離するために用い得る。さらに、より長いインキュベーション時間を用いると、ＣＤ８＋Ｔ細胞の捕捉効率が高まり得る。従って、単純に、Ｔ細胞をＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合させる時間を短縮又は延長することにより、及び／又はビーズとＴ細胞の比を増加又は減少させることにより（本明細書にさらに記載されるとおり）、培養開始時又はプロセス中の他の時点で一部のＴ細胞集団の優先的な正又は負の選択を行うことができる。加えて、ビーズ又は他の表面上の抗ＣＤ３及び／又は抗ＣＤ２８抗体の比率を増加又は減少させることにより、培養開始時又はプロセス中の他の時点で一部のＴ細胞集団の優先的な正又は負の選択を行うことができる。当業者であれば、本発明の文脈で複数の選択ラウンドも用い得ることを認識するであろう。特定の実施形態において、選択手順を実施し、活性化及び拡大プロセスに「選択されなかった」細胞を使用することが望ましい場合もある。「選択されなかった」細胞もまた、さらなる選択ラウンドに供することができる。
【０３６２】
得られた細胞傷害性細胞は、次に本明細書に記載されるとおり遺伝子操作される。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチド（典型的には発現ベクターに位置する）は、細胞傷害性細胞がＣＡＲを発現、好ましくは安定に発現するように細胞傷害性細胞に導入される。ＣＡＲをコードするポリヌクレオチドは、典型的には細胞傷害性細胞宿主ゲノムに組み込まれる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドの導入によって組込みが生じる必要はなく、むしろ導入されたポリヌクレオチドが一過性に維持されるだけで十分であり得る。このようにして短期的な効果を得ることができ、ここで細胞傷害性細胞は宿主に導入され、次に所定の時間後、例えば細胞が特定の治療部位に移動できた後に作動し得る。
【０３６３】
細胞傷害性細胞及び治療される疾患の性質に応じて、遺伝子操作された細胞傷害性細胞は多種多様な方法で対象、例えば哺乳動物に導入され得る。遺伝子操作された細胞傷害性細胞は腫瘍の部位に導入され得る。一実施形態において、遺伝子操作された細胞傷害性細胞は癌まで進み、又は癌まで進むように修飾される。用いられる遺伝子操作された細胞傷害性細胞の数は、状況、導入の目的、細胞の寿命、用いるプロトコルなど、いくつもの要因に依存することになる。例えば、投与回数、細胞の増殖能力、及び組換え構築物の安定性。遺伝子操作された細胞傷害性細胞は、目的の部位又はその近傍に注入される分散液として適用され得る。細胞は生理学的に許容可能な媒体中にあり得る。
【０３６４】
治療方法は、ＣＡＲに対する細胞応答、細胞傷害性細胞によるＣＡＲの発現効率、及び適宜、発現したＣＡＲの分泌レベル、活性、対象の特定の必要性（これらは時間及び状況に応じて変わり得る）、遺伝子操作された細胞傷害性細胞の損失に起因する細胞活性の損失速度又は個々の細胞の発現活性など、多くの変動要因の影響を受けることが理解されなければならない。従って、各個別の患者について、全体としての集団に投与し得る普遍的な細胞があったとしても、その者に適切な投薬量について各患者がモニタされることが予想され、そのような患者をモニタする業務は当該技術分野においてルーチンである。
【０３６５】
以下の例は本開示の方法を例示するものであり、限定するものではない。当業者には明らかな、現場で通常直面する種々の条件及びパラメータの他の好適な変更及び適合は、本開示の範囲内である。
【実施例】
【０３６６】
実施例１：Ａｘｌに対するｓｃＦｖ条件的活性型抗体の生成
薬物標的抗原Ａｘｌに対する２つの条件的活性型一本鎖抗体（ＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−４及びＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−６）を野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、配列番号１３又は１４、とのホモ二量体として発現させ（図２〜図３の二価抗体ＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−４−０１、配列番号９、及びＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−６−０１、配列番号１０、が得られた）、並びにノブ・イン・ホールシステムのヘテロ二量体として発現させて一価ｓｃＦｖを得た（図２〜図３の一価抗体ｓｃＦｖ  ＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−４−０２、配列番号１１、及びＣＡＢ−ｓｃＦｖ−６３．９−６−０２、配列番号１２、が得られた）。
【０３６７】
ｐＨ６．０及びｐＨ７．４での薬物標的抗原Ａｘｌに対するこれらの抗体の結合親和性をＥＬＩＳＡ分析によって計測した。図２に示されるとおり、これらのｓｃＦｖ抗体はｐＨ６．０及びｐＨ７．４の両方で薬物標的抗原Ａｘｌに親和性を示し、これらの親和性は完全二価抗体と同等であった。さらに、図３に示されるとおり、ｐＨ７．４と比べたｐＨ６．０でのこれらのｓｃＦｖ抗体の選択性もまた、完全二価抗体と同等であった。この例では、本発明の条件的活性型抗体がｓｃＦｖ抗体又は完全二価抗体のいずれとしても同等の親和性及び選択性を有することが実証された。従って、本発明の条件的活性型抗体は、本発明のＣＡＲ−ＴプラットフォームにおいてＣＡＲをコードするＤＮＡ分子に単一ＤＮＡ鎖として挿入し得る。
【０３６８】
実施例２：ＣＡＲ−Ｔ細胞を構築するための標的抗原Ａｘｌに対するｓｃＦｖ抗体
本発明の一実施形態において、選択性及び親和性、並びにｐＨ６．０及びｐＨ７．４の両方での発現レベルに関して同時にスクリーニングすることにより、薬物標的抗原Ａｘｌに対する条件的活性型抗体を生成した。血清中にはスクリーニングに関して偽陽性を生じ得るヒト抗体があったため、スクリーニングは血清中でＦＬＡＧタグを使用して行った。スクリーニング緩衝液はカーボネート緩衝液（リンゲル標準緩衝液を含むがＰＢＳとは異なるクレブス緩衝液）であった。生成された条件的活性型抗体は、両方ともに野生型抗体との比較において、ｐＨ６．０で薬物標的抗原Ａｘｌに対してより高い親和性を有するが、同じ薬物標的抗原Ａｘｌに対してｐＨ７．４では親和性がより低いことが分かった。さらに、これらの条件的活性型抗体は全て、以下の表２に示すとおり（列「クローン」は抗体を示し、及び発現レベル「ｍｇ／ｍｌ」が２番目の列に示される）、高い発現レベルを有する。
【０３６９】
これらの抗体のクローンを依頼発現レベル（「注文量」、予想発現レベル）と共にサービス提供者に送った。しかしながら、これらの抗体の実際の発現レベル（「納品量」）は極めて高く、予想発現レベルを超えていた。
【表２】
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【０３７０】
図４に例としてＢＡＰ０６３．９−１３−１抗体を使用して示すとおり、条件的活性型抗体は緩衝液中で凝集を示さなかった。ＢＡＰ０６３．９−１３−１抗体はサイズ排除クロマトグラフィーによって分析した。図４では唯１つのピークが検出され、抗体の凝集がほとんど又は全くないことが実証された。
【０３７１】
条件的活性型抗体はまた、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）も用いて分析し、薬物標的抗原Ａｘｌに対するそのオン及びオフ速度を計測した。ＳＰＲ分析は、条件的活性型抗体のオン及びオフ速度を計測することが知られている。ＳＰＲ分析は重炭酸塩の存在下で実施した。条件的活性型抗体のインビボでの（動物及びヒトにおける）オン及びオフ速度は、条件的活性型抗体にとって極めて重要な特徴である。
【０３７２】
条件的活性型抗体は、陰性対照（ＢＡＰ０６３  １０Ｆ１０、これはｐＨ６．０及びｐＨ７．４の両方で同様のオン速度を有する）との比較において、ｐＨ６．０でオン速度が速く、ｐＨ７．４ではより遅いオン速度であることが観察された（図５）。加えて、室温から６０℃に温度を上げても、ＳＰＲ分析結果が大幅に変わることはない（図５）。ＳＰＲ分析はまた、これらの条件的活性型抗体がｐＨ７．４と比較したときｐＨ６．０で極めて選択的であることも示した（図６Ａ〜図６Ｂは例として１つの抗体を示す）。
【０３７３】
条件的活性型生物学的抗体について、表３に要約する。これらの抗体のうちの２つはｓｃＦｖとして発現させたもので（ＢＡＰ０６３．９−１３．３及びＢＡＰ０６３．９−４８．３）、これらは直ちにＣＡＲ−ＴプラットフォームでＣＡＲに挿入し得る状態であった。抗体を６０℃で１時間インキュベートしたが、抗体の多くの親和性は変化しなかった（「熱安定性」）。ＳＰＲを用いたｐＨ６．０及びｐＨ７．４での結合活性の計測データを報告する２つの列において（表３の最後２つのカラム）、「ＢＡＰ０６３．６−ｈｕｍ１０Ｆ１０−ＦＬＡＧ」（陰性対照、表３の第２列）との比較を行った。これらの抗体の選択性は、２つの最終カラムのデータ間の差により決定し得る。２つのｓｃＦｖ抗体は極めて高い選択性（ｐＨ７．４で０％に対し、ｐＨ６で７５％及び５０％）を有した。
【０３７４】
【表３】
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比較例Ａ：標的抗原Ａｘｌに対する非条件的活性型抗体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞
標的抗原Ａｘｌに対する非条件的活性型ｓｃＦｖ抗体を使用して、標的抗原Ａｘｌ又は細胞表面上に標的抗原Ａｘｌを発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−Ａｘｌ）に結合するＣＡＲ−Ｔ細胞を構築した、図７Ａ〜図７Ｂ。非条件的活性型抗体をＣＡＲ分子のＡＳＴＲとして使用し、このＣＡＲ分子をＴ細胞に挿入して、標的抗原Ａｘｌに結合するＣＡＲ−Ｔ細胞を構築した。
【０３７５】
比較として、標的抗原Ａｘｌを発現しないＣＨＯ細胞を、（１）ＣＡＲ分子で形質導入していないＴ細胞、（２）標的抗原Ａｘｌに結合しないＣＡＲ分子で形質導入したＴ細胞、及び（３）標的抗原Ａｘｌに対する非条件的活性型抗体を有するＣＡＲ分子で形質導入したＴ細胞で処理した（図７Ａ）。ＣＨＯ細胞集団は細胞インデックスによって示し（図７ＡのＹ軸）、ここでは細胞インデックスの低下がＣＡＲ−Ｔ細胞による細胞傷害（細胞死滅）を示す。
【０３７６】
図７Ａを参照すると、Ｔ細胞を加える前は、ＣＨＯ細胞は成長を示した。標的抗原Ａｘｌに結合するＣＡＲ−Ｔ細胞を加えた後、細胞インデックスは初めは低下し、Ｔ細胞の非特異的な細胞傷害が示唆された。しかしながら、その後間もなくＣＨＯ細胞は成長を再開した。更に重要なことには、３つの処理間の違いは有意でなく、標的抗原Ａｘｌに対する非条件的活性型抗体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞には標的抗原Ａｘｌを発現しないＣＨＯ細胞に対する有意な細胞傷害性がないことが示された。
【０３７７】
次に標的抗原Ａｘｌを発現するＣＨＯ細胞を上記と同じように、（１）ＣＡＲ分子で形質導入していないＴ細胞、（２）標的抗原Ａｘｌに結合しないＣＡＲ分子で形質導入したＴ細胞、及び（３）標的抗原Ａｘｌに対する非条件的活性型抗体を有するＣＡＲ分子で形質導入したＴ細胞で処理した（図７Ｂ）。Ｔ細胞を加えた後、標的抗原Ａｘｌに対する非条件的活性型抗体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞で処理することにより細胞インデックスは有意に低下するが、他の２つの処理によっては低下せず、標的抗原Ａｘｌに対する非条件的活性型抗体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞による、標的抗原Ａｘｌを発現するＣＨＯ−Ａｘｌ細胞に対する細胞傷害性が示される。
【０３７８】
実施例３：標的抗原Ａｘｌに対する条件的活性型ｓｃＦｖ抗体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞
標的抗原Ａｘｌに対する条件的活性型ｓｃＦｖ抗体を使用してＣＡＲ分子を構築した。Ｔ細胞をこのＣＡＲ分子で形質導入して、Ｔ細胞がＣＡＲ分子を発現するようにした（ＣＡＲ−Ｔ細胞）。標的抗原Ａｘｌを発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−６３細胞）又は標的抗原Ａｘｌを発現しない普通のＣＨＯ細胞（ＣＨＯ細胞）を別々にＣＡＲ−Ｔ細胞で処理した。非形質導入Ｔ細胞（ＣＡＲ分子を有しない）を対照として使用した（図８Ａ〜図８Ｂ）。
【０３７９】
図８Ａを参照すると、標的抗原Ａｘｌを発現しないＣＨＯ細胞がＣＡＲ−Ｔ細胞及び非形質導入Ｔ細胞で処理された。これらの２つの処理の間に有意な差はなく、ＣＨＯ細胞に対してＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害性がないことが示された。標的抗原Ａｘｌを発現するＣＨＯ細胞（ＣＨＯ−６３）を同様に処理した図８Ｂを参照すると、標的抗原Ａｘｌに対する条件的活性型抗体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞は非形質導入Ｔ細胞と比較してＣＨＯ−６３細胞集団を有意に減少させた。これにより、標的抗原Ａｘｌに対する条件的活性型抗体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞がＣＨＯ−６３細胞に対して細胞傷害性であることが示された。
【０３８０】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、標的抗原Ａｘｌに結合した後、細胞傷害を誘導した。この効果は、サイトカインのインターフェロンγ（ＩＮＦｇ）及びＩＬ２のレベルの計測によって確認された。サイトカインデータは図９Ａ〜図９Ｂに示す。図９Ａにおいては、標的抗原Ａｘｌを有するＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＨＯ−６３細胞への結合が、非形質導入Ｔ細胞と比較して、観察されたサイトカインレベルの増加によって示されるとおりのＩＮＦｇの有意な放出を引き起こした。同様に、図９Ｂにおいては、標的抗原Ａｘｌを有するＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＨＯ−６３細胞への結合が、非形質導入Ｔ細胞と比較して、観察されたサイトカインレベルの増加によって示されるとおりのＩＬ２の有意な放出を引き起こした。
【０３８１】
実施例４：標的抗原ＲＯＲ２に対する条件的活性型ｓｃＦｖ抗体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞
標的抗原ＲＯＲ２に対する条件的活性型ｓｃＦｖ抗体を作製した。標的抗原ＲＯＲ２に対するそれらの結合活性をＥＬＩＳＡアッセイ（ｅｓｓａｙ）を用いて計測した（図１０）。
【０３８２】
図１０に示すｓｃＦｖ抗体のうちの１つ、ｓｃＦｖ−１１６１０１を使用してＣＡＲ分子を構築し、ＣＡＲ−Ｔ細胞を作製した（１１６１０１  ＣＡＲ−Ｔ）。構築したＣＡＲ−Ｔ細胞を使用して、標的抗原ＲＯＲ２を発現するダウディ細胞を標的化した。陰性対照は、ＣＡＲ分子で形質導入していないＴ細胞（非形質導入Ｔ細胞）及び標的抗原ＲＯＲ２との結合能を有しないＣＡＲ分子で形質導入したＣＡＲ−Ｔ細胞（非ＲＯＲ２  ｓｃＦｖ  ＣＡＲ−Ｔ）であった。結果は図１１Ａに示す。これらの処理におけるＴ細胞の数とダウディ細胞の数との比は１０：１であった。ダウディ細胞上の標的抗原ＲＯＲ２を標的化するｓｃＦｖ抗体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞（１１６１０１  ＣＡＲ−Ｔ）は、図１１Ａにおけるより高い死細胞／生細胞比によって示されるとおり、ダウディ細胞の有意な細胞死を誘導した。
【０３８３】
ダウディ細胞の処理に使用したのと同じＴ細胞でＨＥＫ２９３細胞を処理した。結果は図１１Ｂに示す。ＨＥＫ２９３細胞は細胞表面上に標的抗原ＲＯＲ２を発現しないため、標的抗原ＲＯＲ２を標的化するｓｃＦｖ抗体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞（１１６１０１  ＣＡＲ−Ｔ）は陰性対照と比較したときＨＥＫ２９３細胞において有意な細胞死を誘導しなかった（図１１Ｂ）。
【０３８４】
実施例５：実施例１〜４の標的抗原Ａｘｌ及びＲＯＲ２に対する抗体を有するＣＡＲ−Ｔ細胞のサイトカイン放出
この例では、ＣＡＲ−Ｔ細胞と標的抗原の結合によって誘導されるサイトカイン放出を計測した。図１２Ａ〜図１２Ｂは、標的抗原Ａｘｌに対する条件的活性型ｓｃＦｖ抗体を含有するＣＡＲ−Ｔ細胞が、標的抗原Ａｘｌを発現するＣＨＯ−６３細胞に結合した後のＩＮＦｇ及びＩＬ２放出を示す。ＣＡＲ−Ｔ細胞をこれらのＣＨＯ−６３細胞で２４時間処理した後、ＩＮＦｇ及びＩＬ２の両方のサイトカインレベルの有意な増加があり、同じＣＡＲ−Ｔ細胞を使用して標的抗原Ａｘｌを発現しないＣＨＯ細胞を処理した対照と比較したＩＮＦｇ及びＩＬ２の両方のサイトカインの放出が示された。更に、ＣＡＲ分子で形質導入していないＴ細胞及び標的抗原Ａｘｌと結合しなかったＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＮＦｇ及びＩＬ２サイトカインの有意な放出をもたらさなかった。
【０３８５】
図１３Ａ〜図１３Ｂは、標的抗原ＲＯＲ２に対する条件的活性型ｓｃＦｖ抗体を含有するＣＡＲ−Ｔ細胞が、両方ともに標的抗原ＲＯＲ２を発現するラージＢ細胞及びダウディ細胞と結合した後のＩＮＦｇ及びＩＬサイトカインレベルを示す。ラージＢ細胞及びダウディ細胞をＣＡＲ−Ｔ細胞で２４時間処理した後、同じＣＡＲ−Ｔ細胞を使用して標的抗原ＲＯＲ２を発現しないＨＥＫ２９３細胞を処理した対照と比較して、ＩＮＦｇ及びＩＬ２サイトカインレベルの有意な増加が観察された。更に、ＣＡＲ分子で形質導入していないＴ細胞及び標的抗原ＲＯＲ２と結合しなかったＣＡＲ−Ｔ細胞ではサイトカインレベルの有意な増加はなく、これによりＩＮＦｇ及びＩＬ２サイトカインの有意な放出を誘導できなかったことが示された。
【０３８６】
実施例６：標的抗原ＣＤ２２に対する条件的活性型ｓｃＦｖ抗体
標的抗原ＣＤ２２に対する５つの条件的活性型ｓｃＦｖ抗体を選択した。選択した条件的活性型ｓｃＦｖ抗体はｐＨ７．４よりもｐＨ６．０でより高活性である。これらの条件的活性型ｓｃＦｖ抗体を使用して、標的抗原ＣＤ２２を発現する細胞に結合するＣＡＲ−Ｔ細胞を構築し得る。
【０３８７】
しかしながら、前述の説明に本発明の多くの特徴及び利点が本発明の構造及び機能の詳細と共に示されているとしても、本開示は例示的なものに過ぎず、詳細、特に要素の形状、サイズ及び配置の点で、添付の特許請求の範囲を表現している用語の広義の一般的な意味によって示される最大限の範囲まで本発明の原理内で変更を行い得ることが理解されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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