(57)【要約】  本発明は、ＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システム及びＳＴＥＤ光学顕微鏡を提供し、照明システムは、照明光源と光学素子からなる照明光路とを含み、照明光路は、光路伝送方向に沿って順に設置される第１のフィルタ、第２のフィルタ、偏光ビームスプリッタ、第１の１／４波長板、第１のダイクロイックシート素子、光路長遅延ユニット、位相板、第２のダイクロイックシート素子、及び第２の１／４波長板を含み、照明光源から発せられた光ビームは、照明光路の伝送によって２束の同軸の光ビームに分割され、第１の光ビームは、顕微物鏡形成第１のスポットに入射され、第２の光ビームは、顕微物鏡に入射されて第２のスポットが形成され、第１のスポットと第２のスポットの中心は重合される。本発明は、励起光、損失光、及び共焦点検知光路の同軸の入力と出力を実現するために、一体化された集積光学モジュール設計を用い、同時に各素子の互いの幾何学的関係の物理的な調整、及び機械的調整機構の固有の温度と振動の不安定性が回避され、ＳＴＥＤ機器の信頼性を向上させる。
2021516794.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
照明光源と光学素子からなる照明光路とを含み、前記照明光源から発せられた光ビームは、前記照明光路を経てからサンプル表面に合焦して照射されサンプルにおける蛍光物質を励起して蛍光を放出させるＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムであって、
前記照明光路は、光路伝送方向に沿って順に設置される第１のフィルタ、第２のフィルタ、偏光ビームスプリッタ、第１の１／４波長板、第１のダイクロイックシート素子、光路長遅延ユニット、位相板、第２のダイクロイックシート素子、及び第２の１／４波長板を含み、
前記照明光源から発せられた光ビームが、前記第１のフィルタ、第２のフィルタによってフィルタリングされた後に、一定波長の第１の光ビームと第２の光ビームを取得し、
前記第１の光ビームと前記第２の光ビームとは、それぞれ前記偏光ビームスプリッタによって分光された後に、直線偏光が形成されて反射されてから、前記第１の１／４波長板と  前記第１のダイクロイックシート素子に順に入射され、
前記第１の光ビームは、前記第１の１／４波長板を経てから、円偏光が形成され、前記第１のダイクロイックシート素子によって反射された後に、再び前記第１の１／４波長板を経てから直線偏光が形成され、そして順に前記偏光ビームスプリッタによって透過され、前記第２のダイクロイックシート素子によって反射され、前記第２の１／４波長板により円偏光に変換された後に、顕微結像システムの顕微物鏡に入射され収束され、前記顕微物鏡の焦点面には、第１のスポットが形成され、
前記第２の光ビームは、前記第１の１／４波長板を経てから、円偏光が形成され、前記第１のダイクロイックシート素子によって透過された後に、前記光路長遅延ユニットと前記位相板に入射され、
前記第２の光ビームは、前記位相板によって反射された後に、順に前記光路長遅延ユニットによって出射され、前記第１のダイクロイックシート素子によって透過され、前記第１の１／４波長板により直線偏光に変換され、前記偏光ビームスプリッタによって透過され、前記第２のダイクロイックシート素子によって反射され、前記第２の１／４波長板により円偏光に変換された後に、顕微結像システムの顕微物鏡に入射され収束され、前記顕微物鏡の焦点面には、第２のスポットが形成され、
前記第１のスポットの中心と前記第２のスポットの中心とが重合される、ことを特徴とするＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システム。
【請求項２】
前記第１の光ビームは、励起光であり、
前記第１のスポットは、中実スポットであり、
前記第２の光ビームは、前記第１の光ビームに対する損失光であり、
前記第２のスポットは、中空スポットである、ことを特徴とする請求項１に記載のＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システム。
【請求項３】
前記第１のフィルタは、中性フィルタであり、前記照明光源が放出する総レーザーの強度を調整するためのものであり、
前記第２のフィルタは、デュアルバンドパスフィルタであり、一定波長の前記第１の光ビームと前記第２の光ビームをフィルタリングするとともに、前記第１の光ビームの強度と前記第２の光ビームの強度を調整し、
前記第１のフィルタと前記第２のフィルタが、光路に沿って同軸に配置される、ことを特徴とする請求項２に記載のＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システム。
【請求項４】
前記偏光ビームスプリッタは、入射された光ビームを互いに垂直な偏光方向の２束の直線偏光に分離でき、それをそれぞれ反射及び透過させる、ことを特徴とする請求項２に記載のＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システム。
【請求項５】
前記第１の１／４波長板は、入射された前記第１の光ビームと第２の光ビームを直線偏光から円偏光に変換でき、入射された前記第１の光ビームと第２の光ビームを円偏光から直線偏光に変換することもでき、
前記第２の１／４波長板は、直線偏光を円偏光に変換できる、ことを特徴とする請求項２に記載のＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システム。
【請求項６】
前記第１のダイクロイックシート素子は、選択的な透過誘電体膜であり、
前記誘電体膜は、前記光路長遅延ユニットの入射端にメッキされ、
前記誘電体膜は、入射された前記第１の光ビームを反射できるとともに、入射された前記第２の光ビームを透過でき、
前記第２のダイクロイックシート素子は、ダイクロイックシートであり、
前記ダイクロイックシートは、入射された前記第１の光ビームと第２の光ビームをいずれも反射できるとともに、前記サンプルが放出する蛍光を透過できる、ことを特徴とする請求項２に記載のＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システム。
【請求項７】
前記光路長遅延ユニットは、前記第２の光ビームを光学的に遅延させることができる、ことを特徴とする請求項２に記載のＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システム。
【請求項８】
前記位相板は、反射型位相板であり、前記光路長遅延ユニットの遠端に設置され、
前記第２の光ビームは、前記光路長遅延ユニットに入った後に、前記位相板に入射されて反射されてから、元の光路に沿って前記光路長遅延ユニットの入射端に戻ることができるとともに、
前記位相板は、入射された前記第２の光ビームの波面を調製できる、ことを特徴とする請求項７に記載のＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システム。
【請求項９】
前記照明光源と前記第１のフィルタとの間には、前記照明光源から発せられた光ビームをエキスパンドして整形するエキスパンド鏡がさらに設けられる、ことを特徴とする請求項１に記載のＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システム。
【請求項１０】
請求項１から請求項９の何れかに記載のＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムを含み、
前記ＳＴＥＤ光学顕微鏡は、顕微結像システムと蛍光検知システムをさらに含み、
前記顕微結像システムは、顕微物鏡を含み、
前記照明光源から発せられた光ビームは、前記照明システムの照明光路を経てから、２束の同軸の第１の光ビームと第２の光ビームに分割され、
前記第１の光ビームと前記第２の光ビームは、それぞれ前記顕微物鏡によって収束されてから、サンプルに照射され前記サンプルにおける蛍光物質を励起して蛍光を放出させ、
前記蛍光は、前記顕微物鏡によって収束されてから、前記蛍光検知システムに入って検出され、
前記第１の光ビームの光軸と前記第２の光ビームの光軸は、いずれも前記蛍光検知システムの検知光路の光軸と同軸である、ことを特徴とするＳＴＥＤ光学顕微鏡。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、顕微結像の技術分野に関し、特にＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システム及びＳＴＥＤ光学顕微鏡に関する。
【背景技術】
【０００２】
ライフサイエンス分野の顕微鏡結像研究の約80％は光学顕微鏡を今も使用しており、ライフサイエンスの進展には光学顕微鏡の発達も伴うと言える。しかし、光学回折限界の存在により、光学顕微鏡の空間分解能は波長の約半分程度に制限され、このような分解能は生物学者による細胞内構造の詳細な研究を著しく妨げている。STED（激放射損失顕微鏡、Stimulated Emission Depletion-STED）は、１束のSTED光を使用してシェル形のスポットを形成し、励起光の回折スポットの周囲の蛍光分子を激放射により枯渇させて非放射状態に変換することにより、50nmを超える空間分解能が実現される。プレノプティック設置を用いるため、画像取得時間は伝統的な共焦点顕微鏡と同じであり、サンプルの準備に特別な要求がないため、生きた細胞の細胞内構造のリアルタイムイメージングと動的追跡を実現できる。
【０００３】
超解像STED蛍光顕微鏡の発明から、それは生物学および生命医学の科学研究で広く使用される。しかし、実際のアプリケーションでは、STED顕微鏡の構造は複雑であり、励起スポットとSTEDシェル形のスポットの間で高精度かつ長期間の安定したアライメント（ナノレベル）を達成することは困難である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、上記の欠陥及び不足の少なくとも一つを解决し、この目的は、以下の技術案によって実現される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明は、照明光源と光学素子からなる照明光路とを含み、前記照明光源から発せられた光ビームは、前記照明光路を経てからサンプル表面に合焦して照射されサンプルにおける蛍光物質を励起して蛍光を放出させるＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムであって、前記照明光路は、光路伝送方向に沿って順に設置される第１のフィルタ、第２のフィルタ、偏光ビームスプリッタ、第１の１／４波長板、第１のダイクロイックシート素子、光路長遅延ユニット、位相板、第２のダイクロイックシート素子、及び第２の１／４波長板を含み、前記照明光源から発せられた光ビームが、前記第１のフィルタ、第２のフィルタによってフィルタリングされた後に、一定波長の第１の光ビームと第２の光ビームを取得し、前記第１の光ビームと前記第２の光ビームとは、それぞれ前記偏光ビームスプリッタによって分光された後に、直線偏光が形成されて、反射されてから、前記第１の１／４波長板と前記第１のダイクロイックシート素子に順に入射され、前記第１の光ビームは、前記第１の１／４波長板を経てから、円偏光が形成され、前記第１のダイクロイックシート素子によって反射された後に、再び前記第１の１／４波長板を経てから、直線偏光が形成され、そして前記偏光ビームスプリッタによって順に透過され、前記第２のダイクロイックシート素子に反射され、前記第２の１／４波長板により円偏光に変換された後に、顕微結像システムの顕微物鏡に入射され収束され、前記顕微物鏡の焦点面には、第１のスポットが形成され、前記第２の光ビームは、前記第１の１／４波長板を経てから、円偏光が形成され、前記第１のダイクロイックシート素子によって透過された後に、前記光路長遅延ユニットと前記位相板に入射され、前記第２の光ビームは、前記位相板によって反射された後に、順に前記光路長遅延ユニットによって出射され、前記第１のダイクロイックシート素子によって透過され、前記第１の１／４波長板により直線偏光に変換され、前記偏光ビームスプリッタによって透過され、前記第２のダイクロイックシート素子によって反射され、前記第２の１／４波長板により円偏光に変換された後に、顕微結像システムの顕微物鏡に入射され収束され、前記顕微物鏡の焦点面には、第２のスポットが形成され、前記第１のスポットの中心と前記第２のスポットの中心とが重合されるＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムを提供する。
【０００６】
更には、前記第１の光ビームは、励起光であり、前記第１のスポットは、中実スポットであり、前記第２の光ビームは、前記第１の光ビームに対する損失光であり、前記第２のスポットは、中空スポットである。
【０００７】
更には、前記第１のフィルタは、中性フィルタであり、前記照明光源が放出する総レーザーの強度を調整するためのものであり、前記第２のフィルタは、デュアルバンドパスフィルタであり、一定波長の前記第１の光ビームと前記第２の光ビームをフィルタリングするとともに、前記第１の光ビームの強度と前記第２の光ビームの強度を調整し、前記第１のフィルタと前記第２のフィルタが、光路に沿って同軸に配置される。
更には、前記偏光ビームスプリッタは、入射された光ビームを互いに垂直な偏光方向の２束の直線偏光に分離でき、それをそれぞれ反射及び透過させる。
【０００８】
更には、前記第１の１／４波長板は、入射された前記第１の光ビームと第２の光ビームを直線偏光から円偏光に変換でき、入射された前記第１の光ビームと第２の光ビームを円偏光から直線偏光に変換することもでき、前記第２の１／４波長板は、直線偏光を円偏光に変換できる。
【０００９】
更には、前記第１のダイクロイックシート素子は、選択的な透過誘電体膜であり、前記誘電体膜は、前記光路長遅延ユニットの入射端にメッキされ、前記誘電体膜は、入射された前記第１の光ビームを反射できるとともに、入射された前記第２の光ビームを透過でき、前記第２のダイクロイックシート素子は、ダイクロイックシートであり、前記ダイクロイックシートは、入射された前記第１の光ビームと第２の光ビームをいずれも反射できるとともに、前記サンプルが放出する蛍光を透過できる。
【００１０】
更には、前記光路長遅延ユニットは、前記第２の光ビームを光学的に遅延させることができる。
【００１１】
更には、前記位相板は、反射型位相板であり、前記光路長遅延ユニットの遠端に設置され、前記第２の光ビームは、前記光路長遅延ユニットに入った後に、前記位相板に入射されて反射されてから、元の光路に沿って前記光路長遅延ユニットの入射端に戻ることができるとともに、前記位相板は、入射された前記第２の光ビームの波面を調製できる。
【００１２】
更には、前記照明光源と前記第１のフィルタとの間には、前記照明光源から発せられた光ビームをエキスパンドして整形するエキスパンド鏡がさらに設けられる。
【００１３】
本発明は、上記のＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムを含み、前記ＳＴＥＤ光学顕微鏡は、顕微結像システムと蛍光検知システムをさらに含み、前記顕微結像システムは、顕微物鏡を含み、前記照明光源から発せられた光ビームは、前記照明システムの照明光路を経てから、２束の同軸の第１の光ビームと第２の光ビームに分割され、前記第１の光ビームと前記第２の光ビームは、それぞれ前記顕微物鏡によって収束されてから、サンプルに照射され前記サンプルにおける蛍光物質を励起して蛍光を放出させ、前記蛍光は、前記顕微物鏡によって収束されてから、前記蛍光検知システムに入って検出され、前記第１の光ビームの光軸と前記第２の光ビームの光軸は、いずれも前記蛍光検知システムの検知光路の光軸と同軸であるＳＴＥＤ光学顕微鏡をさらに提供する。
【００１４】
更には、前記顕微結像システムの出射端と前記蛍光検知システムの間には、前記蛍光をフィルタリングするするための第３のフィルタがさらに設けられる。
【００１５】
本発明の利点は、以下のようになる。
（１）本発明が提供するＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムは、一体化された集積設計により、各ユニットデバイスの互いの幾何学的関係の物理的な調整、及び機械的調整機構の固有の温度と振動不安定性が回避され、ＳＴＥＤ機器設備は、様々な環境で長期間確実に動作できる。
【００１６】
（２）本発明は、光学冷間加工と光学メッキ膜により、レーザー光源から適切な波長の励起光と損失光をフィルタリングでき、光学メッキ膜は、両者の相対強度の調整制御がさらに実現され、中性フィルタは、全光強度の調整制御が実現される。
【００１７】
（３）本発明は、偏光ビームスプリッタと波長板を組み合わせて使用することにより、光路をコンパクトにし、より少ない光学素子により光ビームのステアリングと光ビームの偏光状態の制御を実現することに有利であり、そして、各主要光学素子は、端面に貼付によって一体化された集積モジュールに組合せ、デバイス体積を縮小しながら、デバイスは温度と環境振動に敏感ではなく、信頼性が向上する。
【００１８】
（４）本発明は、二元光学加工プロセスにより、光路長遅延ユニットに位相板が加工され、損失光に対して反射型の位相調整の制御を行い、ＳＴＥＤ技術に重要な励起光と厳密に同心である一定の時間遅延を有する位相調製光ビーム（損失光は、物鏡によって収束されてからシェル形のスポットが形成され）を発生できる。
【００１９】
以下の好ましい実施形態の詳細な説明を読むことにより、様々な他の利点および利益が当業者に明らかになる。図面は、好ましい実施形態を例示する目的でのみ使用され、本発明を限定するものと見なされない。また、図面全体において、同じ符号は同じ部材を示すために使用される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】本発明の実施例が提供するＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムの構造概念図である。
【図２】以往の共焦点顕微鏡で４０ｎｍ蛍光ミクロスフェアのサンプルを照射することにより得られた共焦点結像図である。
【図３】本発明の実施例が提供するＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムは、４０ｎｍ蛍光ミクロスフェアのサンプルを照射して図２の同じ領域で得られたＳＴＥＤ結像図である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、添付図面を参照して、本発明の例示的な実施形態をより詳細に説明する。図面は本開示の例示的な実施形態を示しているが、本開示は様々な形態で実現することができ、ここで説明した実施形態によって限定されるべきではないことを理解されたい。それどころか、これらの実施形態は、本開示のより完全な理解を可能にするとともに当業者に本開示の範囲を完全に伝えるために提供される。
【００２２】
図１には、本発明の実施態様が提供するＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムの構造概念図を示す。この照明システムは、ＳＴＥＤ光学顕微鏡に適用し、ＳＴＥＤ光学顕微鏡は、照明システム１０、顕微結像システム２０、及び蛍光検知システム３０を含む。照明システム１０から発せられた光ビームは、顕微結像システム２０の顕微物鏡によって合焦されてから、サンプル表面に照射され、サンプルにおける蛍光物質を励起して蛍光を放出させることができ、サンプルの蛍光は、さらに前記顕微物鏡によって収束されてから蛍光検知システム３０に入射されて検出される。
【００２３】
図１に示されたように、本発明が提供するＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムは、照明光源と光学素子からなる照明光路とを含み、本実施例において、照明光源は、レーザ１であり、複数の波長のレーザーや複数のレーザーの組合せを放出できる。レーザ１から発せられたレーザー光ビームは、照明光路を経てからサンプル表面に合焦して照射され、照明光路は、光路伝送方向に沿って順に設置される第１のフィルタ２１、第２のフィルタ２２、偏光ビームスプリッタ３、第１の１／４波長板４１、第１のダイクロイックシート素子５１、光路長遅延ユニット６、位相板７、第２のダイクロイックシート素子５２、及び第２の１／４波長板４２を含み、照明光源１から発せられた光ビームが、第１のフィルタ２１、第２のフィルタ２２によってフィルタリングされた後に、第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２という２束の光を取得し、第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２とは、それぞれ偏光ビームスプリッタ３によって分光された後に、第１の１／４波長板４１に入射されて円偏光が形成されてから、第１のダイクロイックシート素子５１に入射される。第１のダイクロイックシート素子５１に入射された第１の光ビーム１０１は、反射されてから、順に第１の１／４波長板４１によって直線偏光が形成され、偏光ビームスプリッタ３に透過され、第２のダイクロイックシート素子５２に反射され、第２の１／４波長板４２により円偏光に変換された後に、顕微物鏡に入射され収束され、物鏡の焦点面には、第１のスポットが形成され、第１のダイクロイックシート素子５１に入射された第２の光ビーム１０２は、透過されてから、光路長遅延ユニット６に入射されて光学的に遅延させ、第２の光ビーム１０２は、光路長遅延ユニット６の遠端に設置される位相板７によって反射されてから、順に光路長遅延ユニット６によって出射され、第１のダイクロイックシート素子５１に透過され、第１の１／４波長板４１によって直線偏光が形成され、偏光ビームスプリッタ３に透過され、第２のダイクロイックシート素子５２に反射され、第２の１／４波長板４２によって円偏光に変換された後に、顕微物鏡にも入射され収束され、物鏡の焦点面には、第２のスポットが形成され、第１のスポットの中心と第２のスポットの中心とが重合される。図１において、図面を鮮鋭させる理由から、第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２を垂直にズレさせ、実際には、各光ビームは通常、可能な限り厳密に同軸である。
【００２４】
第１の光ビーム１０１は、励起光であり、蛍光を励起してサンプルを蛍光結像するためのものである。第２の光ビーム１０２は、第１の光ビーム１０１に対する損失光であり、蛍光を抑制し、第１のスポットの周辺領域で蛍光放出状態にある蛍光物質を脱励起して、この周辺領域に蛍光を発生しない。
【００２５】
第１のフィルタ２１は、中性フィルタであり、第１のフィルタ２１は光ビームをフィルタリングすることができ、照明光源１から発せられた総レーザーの強度を調整する。第２のフィルタ２２は、デュアルバンドパスフィルタであり、波長に適合する第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２をフィルタリングし、２束の光の強度を調整する。好ましい実施において、第２のフィルタ２２は、光学メッキ膜を用いて、励起光と損失光の両者の相対強度を調整して制御する。
【００２６】
レーザ１と第１のフィルタ２１の間には、エキスパンド鏡８が設けられ、エキスパンド鏡８は、レーザー光ビームをエキスパンド及び整形できる。第１のフィルタ２１と第２のフィルタ２２が、光路に沿って同軸に配置されレーザ１の光軸に重合され、エキスパンド鏡８の軸線も、レーザ１の光軸に重合される。
【００２７】
偏光ビームスプリッタ３は、入射された光を互いに垂直な偏光方向の２束の直線偏光に分離でき、それをそれぞれ反射及び透過させる。第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２という２束の光ビームは、それぞれ偏光ビームスプリッタ３を経てから直線偏光が形成され、Ｐ偏光ビームは透過後に廃棄され、Ｓ偏光ビームは反射されてから、順に第１の１／４波長板４１と第１のダイクロイックシート素子５１に入射される。
【００２８】
第１の１／４波長板４１と第２の１／４波長板４２は、光ビームの偏光状態を調整するためのものであり、第１の１／４波長板４１は、入射された第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２を直線偏光から円偏光に変換でき、入射された第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２を円偏光から直線偏光に変換もできる。第２の１／４波長板は、第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２を直線偏光から円偏光に変換できる。
【００２９】
第１のダイクロイックシート素子５１は、選択的な透過誘電体膜であり、この誘電体膜は、入射された第１の光ビーム１０１を反射できるとともに、第２の光ビーム１０２を透過できる。第２のダイクロイックシート素子５２は、選択的な透過ダイクロイックシートであり、このダイクロイックシートは、入射された第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２をいずれも反射できるとともに、サンプルが放出する蛍光を透過できる。好ましい実施において、第１のダイクロイックシート素子５１の誘電体膜が光路長遅延ユニット６の入射端の表面にメッキされ、光路システム全体の体積を縮小して光学素子の配置をより合理的にコンパクトするだけでなく、温度、振動等の環境要因による顕微鏡への影響も低減できる。
【００３０】
光路長遅延ユニット６は、両端が厳密に平行である光学ガラスであり、その長さは、遅延に適した第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２を発生するように、実際の必要に応じて設計できる。位相板７は、反射型位相板であり、光路長遅延ユニット６の遠端に設置され光路長遅延ユニット６の光軸（位相板７の中心線が光路長遅延ユニット６の光軸と重合する）に垂直であり、損失光波面と光路長を調製して、顕微物鏡の焦点面にシェル形の焦点スポットを発生するためのものである。二元光学加工プロセスにより、位相板７に損失光に対して反射型の位相調整の制御を行い、ＳＴＥＤ技術に重要な、励起光と厳密に同心である、一定の時間遅延を有する位相調製光ビーム（損失光は、物鏡によって収束されてからシェル形のスポットが形成され）を発生できる。
【００３１】
具体的な実施において、光路長遅延ユニット６と位相板７は、一体型構造でも、分割型構造でもよい。好ましい実施において、光路長遅延ユニット６と位相板７を一体型構造として設置し、光路長遅延ユニット６の出射端の表面に位相板７が加工され、集積化設計により、光学素子の配置をよりコンパクトにしながら、温度、振動等の外境界環境による光路への影響も低減され、光学システムの信頼性が向上する。
【００３２】
第１の光ビーム１０１は、第１の１／４波長板４１を経てから円偏光に変換され、第１のダイクロイックシート素子５１によって反射されてから、再び第１の１／４波長板４１を経て直線偏光が形成され、偏光ビームスプリッタ３に入射して透過される。第２の光ビーム１０２は、第１の１／４波長板４１を経てから円偏光に変換され、再び第１のダイクロイックシート素子５１によって透過されてから、光路長遅延ユニット６に入って光学的に遅延させ、光路長遅延ユニット６の遠端に設置された位相板７に入射され、第２の光ビーム１０２は、位相板７によって波面を調製して反射された後に、元の光路に沿って光路長遅延ユニット６の入射端に戻り、第１のダイクロイックシート素子５１を経て第１の１／４波長板４１に透過されて直線偏光に変換され、再び偏光ビームスプリッタ３によって透過されてから、偏光ビームスプリッタ３で第１の光ビーム１０１と再結合する。第１の光ビーム１０１が光路長遅延ユニット６を介せず、第２の光ビーム１０２が光路長遅延ユニット６を介するため、両者の間には、一定のパルス時間遅延を生じるとともに、再結合された第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２は同軸である。
【００３３】
再結合された第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２は、それぞれ第２のダイクロイックシート素子５２によって反射されてから、再び第２の１／４波長板４２によって直線偏光から円偏光に変換され、そして顕微結像システムに入って、合焦物鏡により収束されサンプルに照射され、同心のスポットが形成される。第１の光ビーム１０１が収束してサンプルに照射され、中実スポットが形成される。第２の光ビーム１０２が収束してサンプルに照射され、中空スポットが形成される。第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２とは、波長が異なり、照明光路による同軸伝送を通過した後に、サンプル表面を励起して蛍光を発出させ、上記中実スポットは、上記の中空スポットと重なり、中実スポットは、サンプル上の蛍光物質を励起して蛍光を発出させるが、中空スポットがこの蛍光物質の周辺から発せられた蛍光を抑制し、このようにして、回折限界未満の中間の一つの点のみが蛍光を放出して観察される。励起された蛍光は、第３のフィルタ９によってフィルタリングされた後に、蛍光検出システム３０によって受け取られて検出される。
【００３４】
第１の１／４波長板４１は、偏光ビームスプリッタ３によって反射された光ビームを直線偏光から円偏光に変換し、２回目に入射された円偏光を直線偏光に変換させてから偏光ビームスプリッタ３に入射され透過され、光路の順調な伝送が実現される。第２の１／４波長板４２を用いて、顕微結像システムに入った励起光を円偏光として設置し、より高い蛍光励起効率、及びより良いシェル形の焦点スポットを取得できる。
【００３５】
本実施例において、偏光ビームスプリッタ３は、第１の１／４波長板４１と連通し、第１のダイクロイックシート素子５１を光路長遅延ユニット６の表面にメッキすることにより、励起光、損失光の偏光属性、光路の伝送路径を調整して制御する。第２のダイクロイックシート素子５２は、第２の１／４波長板４２と連通することにより、再結合された励起光、損失光の偏光状態を調整し、光線の伝播方向を変える。偏光ビームスプリッタ３と波長板を組み合わせて使用することにより、光路をコンパクトにし、より少ない光学素子により光ビームのステアリングと光ビームの偏光状態の制御を実現することに有利であり、そして各主要光学素子は、端面に貼付によって一体化された集積モジュールに組合せ、デバイス体積を縮小しながら、デバイスは、温度と環境振動に敏感ではなく、信頼性が向上する。
【００３６】
第３のフィルタ９は、蛍光バンドパスフィルタであり、顕微結像システム２０と蛍光検出システム３０の間に設置され、サンプルが放出する蛍光は、第３のフィルタ９によって蛍光以外の他の光（散乱された第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２を含み）をフィルタリングした後、蛍光検知システム３０に入ってデータを収集する。本実施態様において、第３のフィルタ９を第２のダイクロイックシート素子５２の側に設置するとともに、第２のダイクロイックシート素子５２を蛍光を透過できるレンズとして設置し、サンプルが放出する蛍光は、検出するために蛍光検出システム３０に直接入ることが保証される。
【００３７】
図２には、伝統的な共焦点顕微鏡により直径４０ｎｍの蛍光ミクロスフェアのサンプルに対して共焦点結像試験を行って得られた結像図を示し、図３には、上記のＳＴＥＤ光学顕微鏡により直径４０ｎｍの蛍光ミクロスフェアのサンプルに対して図２の同じ領域で受激放射ディプリーション（ＳＴＥＤ）顕微結像試験を行って得られた結像図を示す。図面から、伝統的な共焦点結像（図２の破線のボックス内）では、ナノミクロスフェアを解像できないことが分かるが、本発明のＳＴＥＤ超解像結像（図３の虚線のボックス内）は、３つの蛍光ミクロスフェアを鮮鋭的に識別でき、蛍光ミクロスフェア顕微結像の半値全幅は、５０ｎｍ未満であると測定される。上記の比較から、本発明が提供するＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムによれば、結像の解像率を大幅に向上させ、超解像結像の効果を取得できることが分かる。
【００３８】
本発明は、上記の照明システムを含むＳＴＥＤ光学顕微鏡をさらに提供する。このＳＴＥＤ光学顕微鏡は、顕微結像システム２０と蛍光検知システム３０をさらに含み、顕微結像システム２０は、前記顕微物鏡を含み、照明光源から発せられた光ビームは、上記照明システムの照明光路によって２束の同軸の第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２に分割され、第１の光ビーム１０１と第２の光ビーム１０２は、それぞれ顕微物鏡によって収束された後に、サンプルに照射されサンプルにおける蛍光物質を励起して蛍光を放出させ、蛍光は、顕微物鏡によって収束された後に、蛍光検知システム３０に入って検出される。第１の光ビーム１０１、第２の光ビーム１０２、及び蛍光検知システム３０の検知光路の光軸は、同軸であり、上記顕微物鏡の焦平面は、第１の光ビーム１０１、第２の光ビーム１０２、及び蛍光検知システムの検知光路の光軸に対して、いずれも垂直である。
【００３９】
本発明が提供するＳＴＥＤ光学顕微鏡に用いる照明システムは、一体化された集積光学モジュール設計により、励起光、損失光、及び共焦点検知光路の同軸の入力と出力が実現でき、励起スポットとＳＴＥＤシェル形のスポットの高精度で長期間の安定したアライメントが実現され、同時に各ユニットデバイスの互いの幾何学的関係の物理的な調整、及び機械的調整機構の固有の温度と振動不安定性が回避でき、ＳＴＥＤ機器設備は、様々な環境で長期間にわたって信頼性が高く安定して作動することができる。
【００４０】
なお、本発明の説明において、「第１」および「第２」という用語は、あるエンティティまたはオペレーションを別のエンティティまたはオペレーションから区別するためにのみ使用され、これらのエンティティまたはオペレーション間の何れのこのような実際の関係や順序を必ずしも必要または暗黙ではない。
【００４１】
上記は、本発明の好ましい具体的な実施形態にすぎないが、本発明の保護範囲はこれに限定されず、本発明に開示された技術的範囲内で当業者によって容易に想到され得るあらゆる変更または置換は、本発明の保護範囲に含まれるべきである。したがって、本発明の保護範囲は、特許請求の範囲の保護範囲に従うべきである。
【符号の説明】
【００４２】
１０  照明システム
２０  顕微結像システム
３０  蛍光検知システム
１  レーザ
２１  第１のフィルタ
２２  第２のフィルタ
３  偏光ビームスプリッタ
４１  第１の１／４波長板
４２  第２の１／４波長板
５１  第１のダイクロイックシート素子
５２  第２のダイクロイックシート素子
６  光路長遅延ユニット
７  位相板
８  エキスパンド鏡
９  第３のフィルタ
１０１  第１の光ビーム
１０２  第２の光ビーム
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【国際調査報告】
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