(57)【要約】【課題】ＣＣケモカインレセプター４のＮ末端部分のアミノ酸配列を有する、組換えタンパク質又はその誘導体の提供。【解決手段】ＣＣＲ４のＮ末端タンパク質配列を解明し、ＣＣＲ４のＮ末端タンパク質構造を分析することで、ＣＣＲ４ Ｎ末端組換えタンパク質を効率的に合成できる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＣケモカインレセプター４のＮ末端部分のアミノ酸配列を有する、組換えタンパク質又はその誘導体。
【請求項２】
上記組換えタンパク質のアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示す、請求項１に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
【請求項３】
上記誘導体が、上記組換えタンパク質のコンカテマー、又は上記組換えタンパク質と免疫グロブリンＦｃ断片との融合タンパク質である、請求項１に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
【請求項４】
上記誘導体が上記組換えタンパク質の三量体コンカテマーであり、そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示す、請求項１に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
【請求項５】
上記誘導体が上記組換えタンパク質と免疫グロブリンＦｃ断片との融合タンパク質であり、そのアミノ酸配列がＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示す、請求項１に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体を含む、医薬組成物。
【請求項７】
ＣＣＲ４とＣＣＲ４のリガンドとの結合を阻害する薬物を製造するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は請求項６の医薬組成物の使用。
【請求項８】
ＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療又は予防に用いる薬物を製造するための、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は請求項６の医薬組成物の使用。
【請求項９】
上記ＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態が、１）全身性アレルギー反応又は過敏性反応などのアレルギー性疾患、２）クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎などの炎症性腸疾患、３）皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、皮膚筋炎、および蕁麻疹などの乾癬および炎症性皮膚疾患、５）血管炎、６）脊椎関節症、７）強皮症、８）アレルギー性喘息、運動誘発性喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患などの喘息および呼吸器アレルギー疾患、９）関節炎，多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、腎炎などの自己免疫疾患、１０）同種移植拒絶反応および移植片対宿主病などの移植拒絶反応、１１）皮膚Ｔ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病などの白血病、リンパ腫、および他の血液由来の癌、１２）アテローム性動脈硬化症、筋炎、神経変性疾患、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎などの悪い炎症を抑制する必要を有する他の疾患、１３）固形腫瘍および転移性腫瘍を含めた癌、例えば胃癌、肝癌、腎臓癌、腸癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、前立腺癌、神経系腫瘍を含む、請求項８に記載の使用。
【請求項１０】
上記ＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態が、癌である、請求項８に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はバイオ医薬の技術分野に係り、具体的に、ＣＣＲ４のＮ末端組換えタンパク質及びその誘導化合物や、組換えタンパク質抗体などの誘導体又は組成物が、単独で又は相関な用途を有する他の化合物又は組成物と組み合わせで、癌及びＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療、予防、抑制、改善への応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＣケモカインレセプター４（ＣＣ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ４，ＣＣＲ４）は、ＣＫＲ４、ＣＭＫＢＲ４、ＣｈｅｍＲ１３、Ｋ５−５などと呼ばれることもある。ＣＣケモカインレセプター４は、ＣＣケモカインレセプターファミリーに属し、３６０個のアミノ酸残基を有し、３番染色体のｐ２４−ｐ２１．３区域に位置している７回膜貫通型Ｇタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）であり、主として様々なリンパ球や組織に発現している。ＣＣＲ４の高発現は、多様な炎症性疾患、自己免疫疾患、血液腫瘍並びに悪性固形腫瘍の浸潤、移行、予後に相関している。ＣＣＲ４の高親和性リガンドとして知られているものは、胸腺と活性化調節ケモカイン（Ｔｈｙｍｕｓ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ＴＡＲＣ／ＣＣＬ１７）と、マクロファージ由来ケモカイン（ｍａｃｒｏｐｈａｇｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｃｈｅｍｏｋｉｎｅ，ＭＤＣ／ＣＣＬ２２）の２つがある。ＣＣＲ４は、主にＴｈ２細胞、Ｔｈ１７細胞および制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）表面に発現しているＣＣＲ４と、そのリガンドであるＣＣＬ２２／ＣＣＬ１７との結合で、異なるタイプのＴ細胞に対してケモタキシスを起こさせて免疫効果を機能している。例えば、Ｔｈ２細胞は、喘息と呼吸アレルギー性疾患などに重要な炎症促進役割を果たす。Ｔｈ１７細胞は、クローン病や潰瘍性大腸炎および自己免疫疾患などの炎症性腸疾患を惹起する。Ｔｒｅｇ細胞の表面にいるＣＣＲ４はそのリガンドであるＣＣＬ２２／ＣＣＬ１７に結合することで、Ｔｒｅｇ細胞に対してケモタキシスを起こさせ、免疫逃避を誘発して、悪い臨床転帰を招く。このため、ＣＣＲ４に標的化された化合物は、相関な疾患を治療するための新しい対策と期待される。
【０００３】
現在、ＣＣＲ４とＣＣＬ２２の晶体構造について報告は見つからなかったが、ＣＣＲ４とそのリガンドとの相互作用の分子機序も知られていない。二段階法モデルは、現在、ＧＰＣＲとリガンドに結合して活性化する機序として広く受け入れるものであり、その中、ＧＰＣＲのＮ末端がリガンドの認識過程中において大変重要な役割を果たすとみなされる。従って、ＣＣＲ４のＮ末端タンパク質配列を解明し、ＣＣＲ４のＮ末端タンパク質構造を分析することで、ＣＣＲ４ Ｎ末端組換えタンパク質を効率的に合成でき、さらに、その組換えタンパク質の役割の検討、及びその誘導化合物又は抗体の開発によって、ＣＣＲ４に標的化されるによりＣＣＬ２２／ＣＣＬ１７−ＣＣＲ４シグナル経路を競争的に阻害し、単独で又は相関な用途を有する他の化合物又は組成物と組み合わせで、癌及びＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療、予防、抑制、改善への応用が期待され、相関な疾患の免疫標的治療の新しい対策になって、良い臨床応用見込みを有する。前記癌及びＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態としては、炎症性疾患、例えば、アレルギー性疾患、炎症性腸炎、炎症性皮膚疾患、喘息、自己免疫疾患など、移植片拒絶、皮膚Ｔ細胞リンパ腫や、急性リンパ性白血病のような白血病、リンパ腫、および他の血液由来の癌などの血液腫瘍、および固形腫瘍および転移性疾患を含また癌、例えば、胃癌、肝癌、腎臓癌、腸癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、神経系腫瘍等を挙げられる。
【０００４】
今市販されている腫瘍治療用のＣＣＲ４モノクローナル抗体は、モガムリズマブ（ｍｏｇａｍｕｌｉｚｕｍａｂ）があり、皮膚Ｔ細胞性リンパ腫（ＣＴＣＬ）、菌状息肉症、セザリー症候群、非ホジキンリンパ腫などの疾患の治療又は研究にはいすれも良好な治療効果が出る。また、ＣＣＲ４レセプターアンタゴニストは、喘息、鼻炎、皮炎、血栓性疾患、自己免疫疾患などの疾患に関するリサーチにおいても良好な治療効果が出る。
【０００５】
これまで、ＣＣＲ４のＮ末端組換えタンパク質及びその誘導化合物や、組換えタンパク質抗体などの誘導体又は組成物を、単独で又は相関な用途を有する他の化合物又は組成物と組み合わせで、癌及びＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療、予防、抑制、改善のための使用は、報告されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明者らは、二段階法モデルによって、ＣＣＲ４のＮ末端タンパク質配列を解明し、ＣＣＲ４のＮ末端タンパク質構造を分析することで、ＣＣＲ４のＮ末端組換えタンパク質及びその誘導三量体タンパク質（Ｎ−ＣＣＲ４）３を効率的に合成できること、試験結果から、ＣＣＲ４のＮ末端組換えタンパク質およびその誘導三量体タンパク質は、ケモカインＣＣＬ２２に結合でき、Ｔｒｅｇの走化性を著しく抑制できるのを証明されることを見出した。
【０００７】
本発明により提供するケモカインレセプターＣＣＲ４のＮ末端組換えタンパク質及びその誘導化合物や、組換えタンパク質抗体などの誘導体又は組成物が、単独で又は相関な用途を有する他の化合物又は組成物と組み合わせで、癌及びＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療、予防、抑制、改善のための使用は、臨床応用に良い見込みを有する。
【０００８】
本発明の一つの態様は、ＣＣＲ４のＮ末端組換えタンパク質及びその誘導化合物や、組換えタンパク質抗体などの誘導体又は組成物が、単独で又は相関な用途を有する他の化合物又は組成物と組み合わせで、癌及びＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療、予防、抑制、改善のための使用を提供する。
【０００９】
本発明のもう一つの態様は、ＣＣＲ４のＮ末端組換えタンパク質及びその誘導化合物や、組換えタンパク質抗体などの誘導体又は組成物を提供している。本発明は、ＣＣＲ４のＮ末端組換えタンパク質（Ｎ−ＣＣＲ４）、その誘導化合物である二量体や三量体など複数連なＮ末端組換えタンパク質など（Ｎ−ＣＣＲ４）ｎ、その組換えタンパク質抗体である（Ｎ−ＣＣＲ４）ｎ−Ｆｃ、又は他の構造アナログなどの誘導化合物を含むが、これらに限定されない。
【００１０】
前記Ｎ−ＣＣＲ４のタンパク質配列は：
【００１１】
【化１】
2021508328.tif 000002
である。
【００１２】
【化２】
2021508328.tif 000003
前記（Ｎ−ＣＣＲ４）３のタンパク質配列は：
である。
【００１３】
【化３】
2021508328.tif 000004
前記（Ｎ−ＣＣＲ４）３−Ｆｃタンパク質配列は：
である。
【００１４】
もう一つの態様では、本発明のＣＣＲ４のＮ末端組換えタンパク質及びその誘導化合物や、組換えタンパク質抗体などの誘導体又は組成物は、単独で又は相関な用途を有する他の化合物又は組成物と組み合わせで用いることができる。
【００１５】
もう一つの態様では、本発明のＣＣＲ４のＮ末端組換えタンパク質及びその誘導化合物や、組換えタンパク質抗体などの誘導体又は組成物は、経口投与や、非経口投与、例えば、筋肉内、静脈内、皮下注射、又はインプラント、吸入、又は局所投与などの経路で投与ことができ、また、それらは、単独で又は組み合わせで、各投与経路に適した通常の非毒性な製薬上許容されるキャリア、アジュバント、担体が含まれる適切な剤量単位製剤として配合することもできる。
【００１６】
もう一つの態様では、併用する他の化合物又は組成物は、その慣用の経路と使用量で投与すればよいが、本発明の化合物又は組成物とは同時に又は順番で又は別々に投与し得る。本発明の化合物又は組成物と同時に又は順番で又は別々に投与し得る併用の治療剤としては、抗炎症系薬、ホルモン薬、免疫抑制剤、抗ヒスタミン薬などの従来の炎症性疾患治療薬、放射線療法や化学療法系薬などの従来の抗がん剤、従来の第一選択薬（シスプラチン、ビンクリスチン、ソラフェニブなど）、免疫チェックポイント阻害剤（ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、４−１ＢＢ、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌなど）および他の腫瘍免疫標的薬（ＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲ、ＥＧＦなど）などを含むが、これらに限定されない。
【００１７】
もう一つの態様では、本発明の化合物は、癌及びＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療、予防、抑制、改善に使用できる。
【００１８】
もう一つの態様では、上記治療には、１）全身性アレルギー反応又は過敏性反応などのアレルギー性疾患、２）クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎などの炎症性腸疾患、３）皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、皮膚筋炎、および蕁麻疹などの乾癬および炎症性皮膚疾患、５）血管炎、６）脊椎関節症、７）強皮症、８）アレルギー性喘息、運動誘発性喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患などの喘息および呼吸器アレルギー疾患、９）関節炎，多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、腎炎などの自己免疫疾患、１０）同種移植拒絶反応および移植片対宿主病などの移植拒絶反応、１１）皮膚Ｔ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病のような白血病、リンパ腫、および他の血液由来の癌、１２）アテローム性動脈硬化症、筋炎、神経変性疾患、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎などの悪い炎症を抑制する必要を有する他の疾患、１３）固形腫瘍および転移性腫瘍を含めた癌、例えば胃癌、肝癌、腎臓癌、腸癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、前立腺癌、神経系腫瘍などのを含むが、これらに限定されない。
【００１９】
もう一つの態様では、本発明の化合物は、癌及びＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療、予防、抑制、改善のために、併用し得る他の治療剤と同時に又は順番で又は別々に投与することができる。
【００２０】
もう一つの態様では、本発明は注射剤、錠剤、カプセル剤などの医薬組成物を提供する。
【００２１】
より詳細には、本発明は以下に示される発明を提供する。
【００２２】
１）．ＣＣケモカインレセプター４（ＣＣＲ４）のＮ末端部分のアミノ酸配列を有する、組換えタンパク質又はその誘導体。
２）．上記組換えタンパク質のアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示す、１）に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
３）．上記誘導体は、上記組換えタンパク質のコンカテマー、又は上記組換えタンパク質と免疫グロブリンＦｃ断片との融合タンパク質である、１）に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
４）．上記誘導体は上記組換えタンパク質の三量体であり、そのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示す、１）に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
５）．上記誘導体は上記組換えタンパク質と免疫グロブリンＦｃ断片との融合タンパク質であり、そのアミノ酸配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示す、１）に記載の組換えタンパク質又はその誘導体。
６）．１）〜５）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体を含む、医薬組成物。
７）．ＣＣＲ４とＣＣＲ４のリガンドとの結合を阻害する薬物を製造するための、１）〜５）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は６）に記載の医薬組成物の使用。
８）．ＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療又は予防に用いる薬物を製造するための、１）〜５）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は６）の医薬組成物の使用。
９）．上記ＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態が、１）全身性アレルギー反応又は過敏性反応などのアレルギー性疾患、２）クローン病、潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎などの炎症性腸疾患、３）皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、皮膚筋炎、および蕁麻疹などの乾癬および炎症性皮膚疾患、５）血管炎、６）脊椎関節症、７）強皮症、８）アレルギー性喘息、運動誘発性喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患などの喘息および呼吸器アレルギー疾患、９）関節炎，多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、糖尿病、腎炎などの自己免疫疾患、１０）同種移植拒絶反応および移植片対宿主病などの移植拒絶反応、１１）皮膚Ｔ細胞リンパ腫、急性リンパ性白血病のような白血病、リンパ腫、および他の血液由来の癌、１２）アテローム性動脈硬化症、筋炎、神経変性疾患、脳炎、髄膜炎、肝炎、腎炎などの悪い炎症を抑制する必要を有する他の疾患、１３）固形腫瘍および転移性腫瘍を含めた癌、例えば胃癌、肝癌、腎臓癌、腸癌、膵臓癌、肺癌、膀胱癌、乳癌、卵巣癌、子宮頸癌、黒色腫、甲状腺癌、前立腺癌、神経系腫瘍を含む、８）に記載の使用。
１０）．上記ＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態は癌である、８）に記載の使用。
１１）．１）〜５）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は６）に記載の医薬組成物の、ＣＣＲ４とＣＣＲ４のリガンドとの結合を阻害するための使用。
１２）．１）〜５）のいずれか１項に記載の組換えタンパク質又はその誘導体、又は６に記載の医薬組成物の、ＣＣＲ４シグナル伝達に係る疾患又は状態の治療又は予防のための使用。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】ＣＣＲ４のＮ末端タンパク質Ｎ−ＣＣＲ４の予測。
【図１Ｂ】ＣＣＲ４のＮ末端タンパク質Ｎ−ＣＣＲ４の予測。
【図１Ｃ】（Ｎ−ＣＣＲ４）３の精製。
【図１Ｄ】（Ｎ−ＣＣＲ４）３−Ｆｃの精製。
【図２】（Ｎ−ＣＣＲ４）３とＣＣＬ２２との相互作用に関する試験。
【図３】（Ｎ−ＣＣＲ４）３によるＴｒｅｇ細胞の走化性の抑制試験。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２４】
実施例１：ＣＣＲ４のＮ末端タンパク質Ｎ−ＣＣＲ４の予測
１．ＣＣＲ４のＮ末端タンパク質Ｎ−ＣＣＲ４は、ＣＣＲ４とＣＸＣＲ４タンパク質配列の疎水性アラインメント（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｂｉｏｉｎｆｏ．ｍｐｇ．ｄｅ／ＡｌｉｇｎＭｅ／ＡｌｉｇｎＭｅ＿ＭＳＡ．ｈｔｍｌ）、ＣＣＲ４タンパク質配列のギブスの自由エネルギーΔＧ（ΔＧ  ｐｒｅｄｉｃｔｏｒ  ｓｅｖｅｒ  ｖ  １．０，ｈｔｔｐ：／／ｄｇｐｒｅｄ．ｃｂｒ．ｓｕ．ｓｅ）によって予測したものである（図１Ａ、Ｂ）。
Ｎ−ＣＣＲ４タンパク質配列は：
【化４】
2021508328.tif 000005
である。
【００２５】
２．Ｎ−ＣＣＲ４誘導タンパク質（Ｎ−ＣＣＲ４）３の精製
（Ｎ−ＣＣＲ４）３のＤＮＡコドン最適化した配列は、制限酵素切断部位ＮｄｅＩとＢａｍＨＩにより、ｐＥＴ２２ｂ（＋）ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ、Ｃａｔ．Ｎｏ．６９７４４−３）にクローニングし、Ｔｒａｎｓｅｔｔａコンピテントセルへ（ＴｒａｎｓＧｅｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、商品番号：ＣＤ８０１−０１）形質転換した。菌液は、１：１００で新たなＬＢ培地に接種し、オーバーナイト振盪しながら培養した。菌液のＯＤ６００は０．６になった際、終濃度で１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（ａｍｒｅｓｃｏ，ｃａｔ：０４８７−１Ｇ）を加え、２５℃、２２０ｒｐｍ／ｍｉｎで１０時間誘導発現した。細胞はＰＢＳで再縣濁した後、高圧バクテリアブレーカー（ＪＮ−０２Ｃ低温超高圧連続フローセルディスラプター）で細胞粉砕し、ニッケルカラム（ＢＢＩ、商品番号Ｃ６００７９３）に結合して、１００ｍＭ  イミダゾール  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）を含むバッファーで溶出して精製し、２Ｌ  ＰＢＳで透析を両回行った。誘導前のｃｔｒｌサンプル、誘導後のｌｙｓサンプル、フロースルー液のＦｔサンプル，洗浄のｗサンプル、３０ｍＭ  イミダゾールで溶出したサンプル、１００ｍＭ  イミダゾールで溶出したサンプル、５００ｍＭ  イミダゾールで溶出したサンプルを用いて、１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥジェルに電気泳動し、検出した（図１Ｃ）。
【００２６】
（Ｎ−ＣＣＲ４）３タンパク質ＤＮＡのコドン最適化した配列は：
【化５】
2021508328.tif 000006
である。
【００２７】
（Ｎ−ＣＣＲ４）３タンパク質配列は：
【化６】
2021508328.tif 000007
である。
【００２８】
３．Ｎ−ＣＣＲ４誘導抗体（Ｎ−ＣＣＲ４）３−Ｆｃの精製
ネズミのκＩＩＩシグナルベプチド−（Ｎ−ＣＣＲ４）３−Ｆｃ  ＤＮＡ配列は、ＫｐｎＩとＢａｍＨＩを介してｐＣＥＰ４ベクターにクローニングした。ネズミのκＩＩＩシグナルベプチドは分泌シグナルペプチドであり、Ｆｃはヒト由来のＩｇＧ１  Ｆｃである。ＰＥＩ（上海起発生物試薬株式会社、商品番号２４７６５−２）で構築したプラスミドを、２９３ＦＴ細胞へトランスフェクションし、トランスフェクション後の３日目に上清を回収し、ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｐｒｅ−Ｐａｃｋｅｄ  Ｇｒａｖｉｔｙ  Ｃｏｌｕｍｎ（ＢＢＩ、商品番号Ｃ６００９５１）で精製した。溶出Ｅｌｕｔｉｏｎサンプルを用いて１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって検出した（図１Ｄ）。
【００２９】
（Ｎ−ＣＣＲ４）３−Ｆｃ  ＤＮＡ配列：
【化７】
2021508328.tif 000008
【００３０】
（Ｎ−ＣＣＲ４）３−Ｆｃタンパク質配列：
【化８】
2021508328.tif 000009
【００３１】
実施例２：（Ｎ−ＣＣＲ４）３とＣＣＬ２２との相互作用に関する試験
ＧＳＴ−プルダウン試験は2つのタンパク質の間の相互作用の有無を検証できるものであり、ＧＳＴ−プルダウン試験によって（Ｎ−ＣＣＲ４）３とＣＣＬ２２との相互作用の存在を検証した。
【００３２】
１．ＣＣＬ２２−ＧＳＴタンパク質の発現
ＣＣＬ２２  ＤＮＡ配列に対してコドン最適化して、酵素消化サイトであるＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩとＨｉｎｄＩＩＩを介して、ｐＥＴ２２ｂベクターへＣＣＬ２２およびＧＳＴをクローニングした。Ｔｒａｎｓｅｔｔａコンピテント細胞を形質転換した。菌液は、１：１００で新たなＬＢ培地に接種し、オーバーナイト振盪しながら培養した。菌液のＯＤ６００は０．６になった際、終濃度で１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（ａｍｒｅｓｃｏ，ｃａｔ：０４８７−１Ｇ）を加え、２０℃、２１０ｒｐｍ／ｍｉｎで１０時間誘導発現した。細胞はＰＢＳで再縣濁した後、高圧バクテリアブレーカーで細胞粉砕し、ＧＳＴ  アガロース（ＢＢＩ、商品番号Ｃ６０００３１）結合してオーバーナイトした。１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ（ａｍｒｅｓｃｏ、商品番号０２８１−５Ｇ）、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）バッファーを用いて１０倍のカラム体積で洗浄し、さらに、１０ｍＭ還元型グルタチオン（ＢＢＩ、商品番号７０−１８−８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）バッファーで溶出して精製し、２Ｌ  ＰＢＳでの透析を両回行った。
【００３３】
ＣＣＬ２２−ＧＳＴ  ＤＮＡ配列：
【化９】
2021508328.tif 000010
【００３４】
ＣＣＬ２２−ＧＳＴタンパク質配列：
【化１０】
2021508328.tif 000011
【００３５】
２．ＧＳＴタンパク質の発現
ｐＧＥＸ−６Ｐ−１プラスミド（ＧＥ、商品番号２７−４５９７−０１）は、Ｔｒａｎｓｅｔｔａコンピテント細胞に形質転換した。菌液は、１：１００で新たなＬＢ培地に接種し、オーバーナイト振盪しながら培養した。菌液のＯＤ６００は０．６になった際、終濃度で１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（Ａｍｒｅｓｃｏ，ｃａｔ：０４８７−１Ｇ）を加え、２５℃、２１０  ｒｐｍ／ｍｉｎで１０時間誘導発現した。細胞はＰＢＳで再縣濁した後、高圧バクテリアブレーカーで細胞粉砕し、ＧＳＴ  アガロース（ＢＢＩ、商品番号Ｃ６０００３１）と結合してオーバーナイトした。１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ（Ａｍｒｅｓｃｏ、商品番号０２８１−５Ｇ）バッファーを用いて１０倍のカラム体積で洗浄し、さらに、１０ｍＭ還元型グルタチオン（ＢＢＩ、商品番号７０−１８−８）、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ  ８．０）バッファーで溶出して精製し、２Ｌ  ＰＢＳで透析を両回行った。
【００３６】
３．ＧＳＴプルダウン
１２０ｎｇ  ＣＣＬ２２−ＧＳＴ、ＧＳＴタンパク質は、別々に３６０ｎｇ（Ｎ−ＣＣＲ４）３と混合し、それぞれに２０ｕｌ  ＧＳＴ  アガロースを加えて、液体が６００ｕｌになるようにＰＢＳを補充した。４℃で４時間回転結合した。ＰＢＳ＋０．１％トリトン−１００で３回、ＰＢＳで３回洗浄した。ｂｅａｄｓの表面のタンパク質は、３０ｕｌ  １ｘ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒに溶解され、３分間沸騰させ、高速遠心分離した。上清から１ｕｌを取って、１２％ＳＤＳ  ＰＡＧＥに付し、シルバーステイン（Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、快速シルバーステインキット、商品番号Ｐ００１７Ｓ）によって検出した。図２に示すように、（Ｎ−ＣＣＲ４）３とＣＣＬ２２の間には相互作用を存在している。
【００３７】
実施例３：（Ｎ−ＣＣＲ４）３によるＴｒｅｇ細胞の走化性の抑制試験
走化性試験は、従来、細胞の走化性移動のモデルを観測するものであり、本発明はそれにより（Ｎ−ＣＣＲ４）３によるＴｒｅｇ細胞の走化性の抑制作用を検証した。
【００３８】
Ｎａｉｖｅ  ＣＤ４＋Ｔリンパ球をソーティングし、ａｎｔｉ−ＣＤ３（２μｇ／ｍＬ）、ａｎｔｉ−ＣＤ２８（１μｇ／ｍＬ）、ＴＧＦβ（１  ｎｇ／ｍＬ）とＩＬ−２（４  ｎｇ／ｍＬ）を加えて、２日間刺激した。誘導したＴｒｅｇ細胞を回収し、２＊１０５／ウェルになるようにｔｒａｎｓｗｅｌｌの上のウェルに置いて、下のウェルに、腫瘍細胞のインキュベーション上清および０．０５μＭ、０．１μＭ、１μＭ（Ｎ−ＣＣＲ４）３組換えタンパク質、それぞれを加えた。４時間後、下のウェルのＴｒｅｇ細胞を回収し、カウントして統計解析した。図３に示すように、（Ｎ−ＣＣＲ４）３を加えることはＴｒｅｇ細胞の走化性移動を有意に抑制できる。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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