(57)【要約】  本発明は、甲状腺腫瘍の良悪性の程度を検出するためのグレード分類モデルおよびその応用を提供し、前記モデルがインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量およびインプリンティング遺伝子総発現量を計算することによって、甲状腺腫瘍におけるインプリンティング遺伝子の変化をグレードに分類する。本発明の前記検出モデルおよび装置は、直感的な方法で甲状腺腫瘍患者の組織および細胞サンプルにおけるインプリンティング遺伝子発現を表現し、インプリンティング遺伝子へのin situマーキング方法を通じて、インプリンティング（刷り込み）遺伝子の変化を客観的、直感的、早期、正確に検出し、定量的なモデルを提供することができ、甲状腺腫瘍の診断に大きく貢献する。
2021531833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
甲状腺腫瘍におけるインプリンティング遺伝子総発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量の変化を計算することによって、インプリンティング遺伝子の発現状況についてグレード分類を行う甲状腺腫瘍に用いられるインプリンティング遺伝子グレード分類モデルであって、
前記インプリンティング遺伝子は、Ｚ１、Ｚ１１またはＺ１６のうちいずれかまたは少なくとも２つの組み合わせであり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１がGnasであり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１１がGrb10であり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１６がSnrpn/Snurfであるモデル。
【請求項２】
前記モデルのインプリンティング遺伝子を計算するための方法は、次の通りであり、
Ｚ１、Ｚ１１またはＺ１６のうちいずれかを計算し、好ましくはＺ１またはＺ１６を計算し、より好ましくはＺ１を計算する請求項１に記載のモデル。
【請求項３】
前記モデルのインプリンティング遺伝子を計算するための方法は、Ｚ１、Ｚ１１またはＺ１６の任意の２つのインプリンティング遺伝子の組み合わせを計算し、好ましくはＺ１およびＺ１６の組み合わせまたはＺ１およびＺ１１の組み合わせを計算する請求項１または２に記載のモデル。
【請求項４】
前記インプリンティング遺伝子は、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０またはＺ１３のうちいずれかまたは少なくとも２つの組み合わせであり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３は、Peg10であり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ４はIgf2r、前記インプリンティング遺伝子Ｚ５はMest、前記インプリンティング遺伝子Ｚ６はPlagl1、前記インプリンティング遺伝子Ｚ８はＤｃｎ、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１０はGatm、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１３はSgceである請求項１〜３のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項５】
前記モデルのインプリンティング遺伝子を計算するための方法は、インプリンティング遺伝子の組み合わせを計算し、Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６の１０つのインプリンティング遺伝子の組み合わせを計算する請求項１〜４のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項６】
インプリンティング遺伝子総発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量を計算するための式は、以下の通りであり、
総発現量＝（ｂ＋ｃ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
通常インプリンティング遺伝子発現量＝ｂ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
インプリンティング遺伝子消失の遺伝子発現量（ＬＯＩ）＝ｃ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
インプリンティング遺伝子コピー数異常の遺伝子発現量（ＣＮＶ）＝ｄ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
ここで、ａは細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内にマーカーがなく、インプリンティング遺伝子が発現されていない細胞核であることを示し、ｂは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に１つの赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子が存在する細胞核であることを示し、ｃは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に２つの赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子が消失している細胞核であることを示し、ｄは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に２つ以上の赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子コピー数が異常な細胞核であることを示す、
ことを特徴とする請求項１〜５のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項７】
前記インプリンティング遺伝子消失発現量、前記インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および前記インプリンティング遺伝子総発現量は、５つのグレードに分けられる請求項１〜６のいずれか一項に記載のモデル。
【請求項８】
前記５つのグレードは、Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６の１０つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量およびインプリンティング遺伝子総発現量をそれぞれ５つのグレードに分類し、
前記Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量を分ける５つのグレードは、次の通りであり、
グレード０：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１２％未満、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１％未満または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が２５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードI：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１２〜２０％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が２５〜３５％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２０〜２５％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が３５〜４５％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２５〜３０％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３〜５％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が４５〜６０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIV：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、３０％超、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が５％超または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が６０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
前記Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量を分ける５つのグレードは、次の通りであり、
グレード０：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１０％未満、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５％未満または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が１５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードI：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１０〜１５％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５〜１％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が１５〜２０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１５〜２０％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が２０〜３０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２０〜２５％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が３０〜４０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIV：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２５％超、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３％超または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が４０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせである、
請求項７に記載のモデル。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか一項に記載のモデルを用い、
（１）被験サンプルを取得するためのサンプリングユニットと、
（２）インプリンティング遺伝子配列に基づいて特異的プライマーを設計するためのプローブ設計ユニットと、
（３）ステップ（２）のプローブと被験サンプルを、その場でin situハイブリダイズさせるための検出ユニットと、
（４）顕微鏡イメージングでインプリンティング遺伝子の発現状況を解析するための解析ユニットと、
を含む甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を検出するための装置であって、
前記解析ユニットは、請求項１〜８のいずれかに記載のモデルを介してインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量を計算することで、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量のグレードによって甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定する装置。
【請求項１０】
請求項１〜８のいずれかに記載のモデルまたは請求項９に記載の装置を用いて、
（１）被験サンプルを取得するステップと、
（２）インプリンティング遺伝子配列に基づいて特異的プライマーを設計するステップと、
（３）前記ステップ（２）のプローブと被験サンプルを、その場でin situハイブリダイズさせるステップと、
（４）顕微鏡イメージングでインプリンティング遺伝子の発現状況を解析することで、甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を診断するステップと、
を含む甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を検出するための方法であって、
前記解析ユニットは、請求項１〜８のいずれかに記載のモデルを介してインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量を計算することで、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量のグレードによって甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を診断する方法。
【請求項１１】
前記ステップ（１）の前記被験サンプルは、ヒトの組織および／または細胞に由来する請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記被験サンプルは、組織のパラフィン切片および／または甲状腺穿刺細胞塗抹標本である請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記in situハイブリダイゼーションは、RNAscope in situハイブリダイゼーション方法を用いる請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記RNAscope in situハイブリダイゼーション方法は、シングルチャネルまたはマルチチャネルの発色キット或いはシングルチャネルまたはマルチチャネルの蛍光キットを使用し、好ましくはシングルチャネル赤色／茶色の発色キットまたはマルチチャネル蛍光キットを使用する請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の判定は、良性腫瘍、甲状腺癌の増殖能、早期甲状腺癌、進行甲状腺癌および末期甲状腺癌に分類される請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を診断した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が均しくグレードIよりも小さく、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIである場合、良性腫瘍であり、
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を診断した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６うち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIであることのうちいずれか状況である場合、甲状腺癌の増殖能と判定され、
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を診断した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIIであることのうちいずれか状況である場合、早期甲状腺癌であり、
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を診断した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIVであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIVであることのうちいずれか状況である場合、進行甲状腺癌であり、
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を診断した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIVであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIVである場合、末期甲状腺癌である、
請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
甲状腺腫瘍検出における請求項１〜８のいずれか一項に記載のモデルおよび／または請求項９に記載の装置の使用。
【請求項１８】
甲状腺腫瘍治療薬の調製または機器における請求項１〜８のいずれか一項に記載のモデルおよび／または請求項９に記載の装置の用途。
【請求項１９】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度は、良性腫瘍、甲状腺癌の増殖能、早期甲状腺癌、進行甲状腺癌および末期甲状腺癌に分類される請求項１７または１８に記載の用途。
【請求項２０】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が均しくグレードIよりも小さく、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIである場合、良性腫瘍であり、
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIであることのうちいずれか状況である場合、甲状腺癌の増殖能と判定され、
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIIであることのうちいずれか状況である場合、早期甲状腺癌と判定され、
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIVであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIVであることのうちいずれか状況である場合、進行甲状腺癌であり、
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIVであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIVである場合、末期甲状腺癌である、
請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子診断分野などのバイオテクノロジー分野に関し、特に、グレード分類モデルおよびその応用、甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を検出するためのグレード分類モデルおよびその応用、甲状腺腫瘍の良性度・悪性度検出における１セットのインプリンティング遺伝子のグレード分類モデルおよびそれで構成される装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
世界保健機関の統計によると、甲状腺癌の新規症例は、２０１２年に世界中で２９８，１００人、中国で約９０，０００人、米国で約２５，５２０人であった。ほとんどの甲状腺癌の分化度が高く、予後良好であり、５年生存率が９５％以上であるが、腫瘍が非常に小さい時期に転移する甲状腺癌もある。なお、低分化型甲状腺癌は、致命的であり、生存期間の中央値が４ヶ月〜５年の範囲である。甲状腺癌の現在の病理診断の難しさには、濾胞性甲状腺腺腫（FTA）と濾胞性甲状腺癌（FTC）との鑑別、および甲状腺の好酸性細胞腫瘍（HCT）の良性、悪性の判定が含まれ、現在唯一のBRAF遺伝子検出は、甲状腺乳頭癌の検出にのみ使用でき、FTCとHCTとの診断にとって効果が薄い。中国では過去１０年間で甲状腺癌の発症率は、４．６倍に増加し、現在も伸びで続けている。現在、毎年約１０万人の甲状腺癌の新規患者がいて、うち診断が難しい濾胞性甲状腺癌および甲状腺の好酸性細胞腫瘍は、約１０％を占め、３〜４倍の疑われる症例を加えると、毎年約４〜５万の症例を明確に診断する必要があると予測され、さらに世界中の患者を加算すると、この数字が１０万以上になるため、より精度の高い検出技術の開発が急務となっている。
【０００３】
良性・悪性細胞に対する従来の病理診断は、細胞の大きさ、形態、浸潤性および周囲細胞組織の間の関係に基づくものとする。これは、細胞（癌）の変化の早期発見には大きな限界があるため、細胞分子レベルでの癌診断方法はかつて研究のホットスポットになっていた。分子生物学分野での研究の継続的深化につれ、ますます多くの分子検出技術が癌の診断に活用されてきた。
【０００４】
癌の発生は、時間の経過とともに蓄積されたエピジェネティックな変化と遺伝子変異によって引き起こされる制御不可能な細胞の成長／分裂である。従来の病理診断は、細胞と組織の大きさ、形態および構造的変化に基づいて甲状腺腫瘍の良悪性を判定している。分子生物学の発展と進化に伴い、甲状腺癌の検出に益々多くの分子検出技術が応用されている。癌の進展過程から解析すると、分子的側面（エピジェネティクスと遺伝学）での変化は、細胞の形態と組織構造の変化よりもはるかに早い。したがって、分子生物学的検出は、癌の早期検出に対してより敏感である。
【０００５】
上記の原因によれば、現在の甲状腺癌の診断では、患者の検体に基づいて、細胞側面に存在する甲状腺癌分子マーカーの変化を解析し、これをもってより正確な事前診断および診断情報を提供するための新しい検出システムと検出モデルが必要である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を検出するためのインプリンティング遺伝子のグレード分類モデルと診断方法およびその応用を提供することを目的とする。
【０００７】
本出願では、上記目的を達成するために、次の発明を提供する。
本発明は、甲状腺腫瘍に用いられるインプリンティング遺伝子グレード分類モデルを提供し、前記モデルは甲状腺癌におけるインプリンティング遺伝子総発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量の変化を計算することによって、インプリンティング遺伝子の発現状況についてグレード分類を行う。
ここで、前記インプリンティング遺伝子は、Ｚ１、Ｚ１１またはＺ１６のうちいずれかまたは少なくとも２つの組み合わせであり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１がGnasであり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１１がGrb10であり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１６がSnrpn/Snurfである。
【０００８】
前記インプリンティング（刷り込み）消失は、インプリンティング（刷り込み）遺伝子内の元々サイレント状態であった対立遺伝子が活性化（脱メチル化）されることをいい、癌の最も一般的で初期発生するエピジェネティックな変化であり、かつこの特性は病理学的マーカーとして使用できる。対照的に、健康な細胞の検出では、刷り込みの消失の割合は非常に低く、前記インプリンティング遺伝子と刷り込み遺伝子は同じ概念を持っているため、同じことを意味し、置き換えることができる。
【０００９】
本発明者らは、Ｚ１、Ｚ１１およびＺ１６のうちいずれかのインプリンティング遺伝子の甲状腺腫瘍におけるインプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量を計算することによって、甲状腺癌に対する診断感度が６４．３％以上に達することができることを見出した。
【００１０】
本明細書の一実施例において、予備検出でインプリンティング遺伝子が１つだけ検出された場合、Ｚ１、Ｚ１１およびＺ１６のうちいずれかのインプリンティング遺伝子を検出することができる。
【００１１】
本明細書の一実施例において、予備検出でインプリンティング遺伝子が１つだけ検出された場合、Ｚ１またはＺ１１のうちいずれかのインプリンティング遺伝子を検出することができる。
【００１２】
本明細書の一実施例において、予備検出でインプリンティング遺伝子が１つだけ検出された場合、Ｚ１を検出することができる。
【００１３】
本発明者らは、インプリンティング遺伝子Ｚ１が単独で検出された場合、甲状腺癌に対する診断感度が８４．８％以上に達することができ、インプリンティング遺伝子Ｚ１１が単独で検出された場合、甲状腺癌に対する診断感度が６６．７％以上に達することができ、インプリンティング遺伝子Ｚ１６が単独で検出された場合、甲状腺癌に対する診断感度が６４．３％以上に達することができることを見出した。
【００１４】
本明細書の一実施例において、前記モデルのインプリンティング遺伝子を計算するための方法は、インプリンティング遺伝子の２つのインプリンティング遺伝子の組み合わせが検出された場合、前記組み合わせがＺ１、Ｚ１１およびＺ１６の任意の２つであり得、好ましくはＺ１とＺ１１の組み合わせ、Ｚ１とＺ１６の組み合わせである。
【００１５】
本発明者らは、２つ以上のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子総発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量を計算することによって、感度をさらに向上させ、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ１１およびＺ１６のうちの任意の２つの組み合わせを検出すると、甲状腺癌に対する診断感度が８４．６％以上に達することができ、インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の組み合わせを検出すると、甲状腺癌に対する診断感度が９２．９％以上に達することができ、インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１１の組み合わせを検出すると、甲状腺癌に対する診断感度が９７．５％以上に達することができることを見出した。
【００１６】
本明細書の一実施例において、前記インプリンティング遺伝子は、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０またはＺ１３のうちいずれかまたは少なくとも２つの組み合わせであり、ここで、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３は、Ｐｅｇ１０であり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ４はIgf2r、前記インプリンティング遺伝子Ｚ５はMest、前記インプリンティング遺伝子Ｚ６はPlagl1、前記インプリンティング遺伝子Ｚ８はDcn、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１０はGatm、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１３はSgceである。
【００１７】
本発明者らは、Ｚ１、Ｚ１１およびＺ１６遺伝子検出の使用を踏まえ、さらにＺ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１３遺伝子を追加して復合診断を行うと、検出の精度が向上するだけでなく、かつ診断の補助としてその他のプローブを追加すると偽陽性の出現を防ぎ、検出の精度をさらに向上させて、すべての甲状腺腫瘍サンプルの正確なグレード分類および判断を実現できる。
【００１８】
本明細書の一実施例において、前記モデルのインプリンティング遺伝子を計算するための方法は、インプリンティング遺伝子の組み合わせを計算することであり、すなわちＺ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６遺伝子の組み合わせを計算する。
【００１９】
前記インプリンティング遺伝子消失は、細胞をヘマトキシリンで染色した後の細胞核内に２つの赤色／茶色のマーカーがあることを意味し、前記インプリンティング遺伝子コピー数異常が細胞をヘマトキシリンで染色した後の細胞核内に２つ以上の赤色／茶色マーカーがあることを意味し、前記コピー数異常が癌細胞における遺伝子の異常複製により、この遺伝子が三倍体またはさらに高い倍数体として発現した。
【００２０】
本明細書の一実施例において、インプリンティング遺伝子総発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量を計算するための式は、以下の通りである。
総発現量＝（ｂ＋ｃ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
通常インプリンティング遺伝子発現量＝ｂ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
インプリンティング遺伝子消失の遺伝子発現量（LOI）＝ｃ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
インプリンティング遺伝子コピー数異常の遺伝子発現量（CNV）＝ｄ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
ここで、ａは細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内にマーカーがなく、インプリンティング遺伝子が発現されていない細胞核であることを示し、ｂは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に１つの赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子が存在する細胞核であることを示し、ｃは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に２つの赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子が消失している細胞核であることを示し、ｄは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に２つ以上の赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子コピー数が異常な細胞核であることを示す。
【００２１】
本明細書の一実施例において、前記ヘマトキシリン染色後のマーカーは、赤色または茶色から選択されるが、これらに限定されず、他の色で染色されたマーカーもインプリンティング遺伝子総発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量の計算に使用されることもできる。
【００２２】
本明細書の一実施例において、プローブをその場でハイブリダイズさせること、およびHemotoxy（ヘマトキシリン）核染色によりシグナルを増幅し、４０ｘまたは６０ｘの顕微鏡下で、各細胞核内のインプリンティング遺伝子の存在、インプリンティング遺伝子の消失またはコピー数異常を判断し、インプリンティング遺伝子消失遺伝子発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量を計算することによって、該サンプルの腫瘍良性度・悪性度を判定し、切片がわずか１０μｍであるため、顕微鏡で見た細胞核は２０％程度あり、不完全な細胞核であり、すなわち一部偽陰性の可能性がある。
【００２３】
本明細書の一実施例において、インプリンティング遺伝子総発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量は、５つのグレードに分けられ、サンプル内の各プローブ発現の最も陽性の領域で少なくとも１２００個の細胞を数え、Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６の１０つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量およびインプリンティング遺伝子総発現量を５つのグレードに分ける。
【００２４】
本明細書の一実施例において、Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量を分ける５つのグレードは、次の通りであり、
グレード０：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１２％未満、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１％未満または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が２５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードI：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１２〜２０％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が２５〜３５％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２０〜２５％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が３５〜４５％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２５〜３０％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３〜５％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が４５〜６０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIV：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、３０％超、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が５％超または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が６０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量は、互いに独立している。
【００２５】
本明細書の一実施例において、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量を分ける５つのグレードは、次の通りであり、
グレード０：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１０％未満、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５％未満または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が１５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードI：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１０〜１５％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５〜１％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が１５〜２０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１５〜２０％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が２０〜３０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２０〜２５％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が３０〜４０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIV：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２５％超、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３％超または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が４０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量は、互いに独立している。
【００２６】
本明細書の一実施例において、本発明は、甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を検出するための装置を提供し、前記装置が上記モデルを用い、
（１）被験サンプルを取得するためのサンプリングユニットと、
（２）インプリンティング遺伝子配列に基づいて特異的プライマーを設計するためのプローブ設計ユニットと、
（３）ステップ（２）のプローブと被験サンプルを、その場でハイブリダイズさせるための検出ユニットと、
（４）顕微鏡イメージングでインプリンティング遺伝子の発現状況を解析するための解析ユニットと、
を含み、
ここで、前記解析ユニットは、第１の態様に記載のモデルを介してインプリンティング遺伝子総発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量を計算することで、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量のグレードによって甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定する。
【００２７】
前記インプリンティング遺伝子消失は、細胞をヘマトキシリンで染色した後の細胞核内に２つの赤色／茶色のマーカーがあることを意味し、前記インプリンティング遺伝子コピー数異常が細胞をヘマトキシリンで染色した後の細胞核内に２つ以上の赤色／茶色マーカーがあることを意味し、前記コピー数異常が癌細胞における遺伝子の異常複製により、この遺伝子が三倍体またはさらに高い倍数体として発現した。
【００２８】
前記ヘマトキシリン染色後のマーカーは、赤色または茶色から選択されるが、これらに限定されず、他の色で染色されたマーカーもインプリンティング遺伝子総発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量の計算に使用されることもできる。
【００２９】
検出装置は、細胞および組織レベルでの甲状腺腫瘍のインプリンティング（刷り込み）遺伝子の変化を腫瘍の良性度および悪性度を判定し、早期甲状腺腫瘍の患者に最も有利な治療機会を提供するために用いられる。
本明細書の一実施例において、本発明は、前記モデルまたは前記装置を用いて、
（１）被験サンプルを取得するステップと、
（２）インプリンティング遺伝子配列に基づいて特異的プライマーを設計するステップと、
（３）ステップ（２）のプローブと被験サンプルを、その場でハイブリダイズさせるステップと、
（４）顕微鏡イメージングでインプリンティング遺伝子の発現状況を解析することで、甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を診断するステップと、
を含む甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を検出するための方法を提供し、
ここで、前記解析ユニットは、前記モデルを介してインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量を計算することで、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量のグレードによって甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を診断する。
【００３０】
本明細書の一実施例において、ステップ（１）の前記被験サンプルは、ヒトの組織および／または細胞に由来する。
【００３１】
前記被験サンプルは、ＲＮＡが直ちに固定処理を行われば実現可能性があり、当業者がニーズに応じて選択でき、ここで特に限定されない。本発明の前記被験サンプルは、組織のパラフィン切片、甲状腺穿刺細胞塗抹標本のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせが挙げられる。
【００３２】
組織のパラフィン切片の具体的操作ステップは、ヒト腫瘍組織のサンプルを取得し、直ちに１０％中性ホルマリンで固定し、パラフィンに包埋し、厚さ１０μｍに切断し、正に帯電したガラススライドを使用して組織スライドを作製することであり、厚さはわずか１０μｍであるため、顕微鏡で見た細胞核の一部が不完全であるため、一部偽陰性の遺伝子消失が出る。
【００３３】
甲状腺穿刺細胞塗抹標本の具体的操作ステップは、穿刺によってヒト細胞を取得し、直ちに１０％中性ホルマリンで固定することである。
【００３４】
穿刺生検は、患者に与える侵襲が少なく、サンプリング過程が簡単であり、血液循環特性と比較して、穿刺生検も位置付けることができ、穿刺生検は、実験サンプルとして特別な利点がある。
【００３５】
本明細書の一実施例において、前記被験サンプルは、甲状腺穿刺細胞塗抹標本である。
【００３６】
本明細書の一実施例において、前記インプリンティング遺伝子は、Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６であり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１は、Gnasであり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３はPeg10であり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ４はIgf2rであり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ５はMestであり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ６はPlagl1であり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ８はDcnであり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１０はGatmであり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１１はGrb10であり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１３はSgceであり、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１６はSnrpn/Snurfである。
【００３７】
前記インプリンティング遺伝子Ｚ１（Gnas）、Ｚ３（Peg10）、Ｚ４（Igf2r）、Ｚ５（Mest）、Ｚ６（Plagl1）、Ｚ８（Dcn）、Ｚ１０（Gatm）、Ｚ１１（Grb10）、Ｚ１３（Sgce）、Ｚ１６（Snrpn/Snurf）は、正常な腫瘍細胞や組織において異なる程度の発現があり、悪性病変が発生すると、発現量とインプリンティング状態が明らかに変化する。
【００３８】
前記プローブは、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３、およびＺ１６、すなわちGnas、Peg10、Igf2r、Mest、Plagl1、Dcn、Gatm、Grb10、Sgce、およびSnrpn/Snurfに基づいて設計されたものであり、具体的に各遺伝子のイントロンからプローブとして部分配列を選択し、具体的にプローブはAdvanced Cell Diagnosticsによって設計された。
【００３９】
本明細書の一実施例において、前記in situハイブリダイゼーションは、RNAscope in situハイブリダイゼーション方法を用いる。
【００４０】
本明細書の一実施例において、前記RNAscope in situハイブリダイゼーション方法は、シングルチャネルまたはマルチチャネルの発色キット或いはシングルチャネルまたはマルチチャネルの蛍光キットを使用し、好ましくはシングルチャネル赤色／茶色の発色キットまたはマルチチャネル蛍光キットを使用する。
【００４１】
前記マルチチャネル発色キットまたはマルチチャネル蛍光キットには、２チャンネル以上の発色キットまたは蛍光キットが含まれ、前記２チャンネルの発色キットまたはマルチチャネルの蛍光キットが２つのインプリンティング遺伝子プローブまたはインプリンティング遺伝子およびその他の遺伝子の共発現、さらに複数のインプリンティング遺伝子と非インプリンティング遺伝子の包括的な発現を使用できる。
【００４２】
本明細書の一実施例において、前記モデルにおけるインプリンティング遺伝子総発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量を計算するための式は、以下の通りであり、
総発現量＝（ｂ＋ｃ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
通常インプリンティング遺伝子発現量＝ｂ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
インプリンティング遺伝子消失の遺伝子発現量（LOI）＝ｃ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
インプリンティング遺伝子コピー数異常の遺伝子発現量（CNV）＝ｄ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
ここで、ａは細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内にマーカーがなく、インプリンティング遺伝子が発現されていない細胞核であることを示し、ｂは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に１つの赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子が存在する細胞核であることを示し、ｃは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に２つの赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子が消失している細胞核であることを示し、ｄは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に２つ以上の赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子コピー数が異常な細胞核であることを示す。
【００４３】
前記ヘマトキシリン染色後のマーカーは、赤色または茶色から選択されるが、これらに限定されず、他の色で染色されたマーカーもインプリンティング遺伝子発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量の計算に使用されることもできる。
【００４４】
プローブをその場でハイブリダイズさせること、およびHemotoxy（ヘマトキシリン）核染色によりシグナルを増幅し、４０ｘまたは６０ｘの顕微鏡下で、各細胞核内のインプリンティング遺伝子の存在、インプリンティング遺伝子の消失またはコピー数異常を判断し、インプリンティング遺伝子消失遺伝子発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量およびインプリンティング遺伝子総発現量を計算することによって、該サンプルの腫瘍良性度・悪性度を判定し、切片がわずか１０μｍであるため、顕微鏡で見た細胞核は２０％程度あり、不完全な細胞核であり、すなわち一部偽陰性の可能性がある。
【００４５】
本明細書の一実施例において、インプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量およびインプリンティング遺伝子総発現量は、５つのグレードに分けられる。
【００４６】
前記５つのグレードがサンプル内の各プローブ発現の最も陽性の領域で少なくとも１２００個の細胞を数え、Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６の１０つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量をそれぞれ分類する。
【００４７】
本明細書の一実施例において、前記Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量を分ける５つのグレードは、次の通りであり、
グレード０：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１２％未満、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１％未満または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が２５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードI：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１２〜２０％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が２５〜３５％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２０〜２５％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が３５〜４５％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２５〜３０％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３〜５％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が４５〜６０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIV：前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量は、３０％超、前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が５％超または前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６の総発現量が６０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
前記インプリンティング遺伝子Ｚ１とＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量は、互いに独立している。
【００４８】
前記Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量を分ける５つのグレードは、次の通りであり、
グレード０：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１０％未満、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５％未満または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が１５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードI：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１０〜１５％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５〜１％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が１５〜２０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、１５〜２０％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が２０〜３０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIII：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２０〜２５％、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が３０〜４０％のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
グレードIV：前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量は、２５％超、前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３％超または前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３の総発現量が４０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種の組み合わせであり、
前記インプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１およびＺ１３のインプリンティング遺伝子消失発現量、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量および総発現量は、互いに独立している。
【００４９】
本明細書の一実施例において、甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の判定は、良性腫瘍、甲状腺癌の増殖能、早期甲状腺癌、進行甲状腺癌および末期甲状腺癌に分類され、
本明細書の一実施例において、甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が均しくグレードIよりも小さく、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIである場合、良性腫瘍であり、
【００５０】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６うち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIであることのうちいずれか状況である場合、甲状腺癌の増殖能と判定され、
【００５１】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIIであることのうちいずれか状況である場合、早期甲状腺癌であり、
【００５２】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIVであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIVであることのうちいずれか状況である場合、進行甲状腺癌であり、
【００５３】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIVであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIVである場合、末期甲状腺癌である。
【００５４】
本明細書の一実施例において、本発明は、甲状腺腫瘍検出における前記モデルまたは前記装置の使用を提供する。
【００５５】
本明細書の一実施例において、本発明は、甲状腺癌治療薬の調製または機器における前記モデルまたは前記装置の用途を提供する。
【００５６】
本明細書の一実施例において、甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の判定は、良性腫瘍、甲状腺癌の増殖能、早期甲状腺癌、進行甲状腺癌および末期甲状腺癌に分類される。
【００５７】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が均しくグレードIよりも小さく、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIである場合、良性腫瘍であり、
【００５８】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIであることのうちいずれか状況である場合、甲状腺癌の増殖能と判定され、
【００５９】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIIであることのうちいずれか状況である場合、早期甲状腺癌と判定され、
【００６０】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIVであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIVであることのうちいずれか状況である場合、進行甲状腺癌であり、
【００６１】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIVであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIVである場合、末期甲状腺癌である。
【００６２】
従来技術と比較して、本明細書の実施例において、前記検出モデルおよび装置を利用し、直感的な方法で甲状腺腫瘍患者サンプルにおけるインプリンティング遺伝子発現を表現し、インプリンティング遺伝子へのｉｎ  ｓｉｔｕマーキング方法を通じて、インプリンティング（刷り込み）遺伝子の変化を客観的、直感的、早期、正確に検出し、定量的なモデルを提供することができ、分子病理学的診断に大きく貢献する。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
図１は、本発明のヘマトキシリンで染色された細胞核の甲状腺癌の病理切片であり、ここで、ａは細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内にマーカーがなく、インプリンティング遺伝子が発現されていないことを示し、ｂは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に１つの赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子が存在することを示し、ｃは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に２つの赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子が消失していることを示し、ｄは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に２つ以上の赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子コピー数が異常であることを示す。
【００６４】
図２（ａ）は、グレード０甲状腺腫瘍の病理切片における１０つの遺伝子発現状況を示し、図２（ｂ）は、グレードI甲状腺癌の病理切片における１０つの遺伝子発現状況を示し、図２（ｃ）は、グレードII甲状腺癌の病理切片における１０つの遺伝子発現状況を示し、図２（ｄ）は、グレードIII甲状腺癌の病理切片における１０つの遺伝子発現状況を示し、図２（ｅ）は、グレードIV甲状腺癌の病理切片における１０つの遺伝子発現状況を示す。
【００６５】
図３（ａ）は、甲状腺癌のインプリンティング消失に対するインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ１１およびＺ１６の強度を示し、図３（ｂ）は、甲状腺癌のコピー数異常に対するインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ１１およびＺ１６の強度を示し、図３（ｃ）は、甲状腺癌の総発現量に対するインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ１１およびＺ１６の強度を示し、図３（ｄ）は、甲状腺癌のインプリンティング消失に対するインプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０およびＺ１３の強度を示し、図３（ｅ）は、甲状腺癌のコピー数異常に対するインプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０およびＺ１３の強度を示し、図３（ｆ）は、甲状腺癌の総発現量に対するインプリンティング遺伝子Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０およびＺ１３の強度を示し、ここで、ＬＯＩは、インプリンティング遺伝子消失の遺伝子発現量であり、ＣＮＶがインプリンティング遺伝子コピー数異常の遺伝子発現量であり、ＴＥがインプリンティング遺伝子の総発現量である。
【００６６】
図４（ａ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ１のインプリンティング消失、コピー数異常および総発現量の強度を示し、図４（ｂ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ１１のインプリンティング消失、コピー数異常および総発現量の強度を示し、図４（ｃ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ１６のインプリンティング消失、コピー数異常および総発現量の強度を示し、図４（ｄ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ３のインプリンティング消失、コピー数異常および総発現量の強度を示し、図４（ｅ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ４のインプリンティング消失、コピー数異常および総発現量の強度を示し、図４（ｆ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ５のインプリンティング消失、コピー数異常および総発現量の強度を示し、図４（ｇ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ６のインプリンティング消失、コピー数異常および総発現量の強度を示し、図４（ｈ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ８のインプリンティング消失、コピー数異常および総発現量の強度を示し、図４（ｉ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ１０のインプリンティング消失、コピー数異常および総発現量の強度を示し、図４（ｊ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ１３のインプリンティング消失、コピー数異常および総発現量の強度を示し、ここで、ＬＯＩは、インプリンティング遺伝子消失の遺伝子発現量であり、ＣＮＶがインプリンティング遺伝子コピー数異常の遺伝子発現量であり、ＴＥがインプリンティング遺伝子の総発現量である。
【００６７】
図５（ａ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ１が４１例の甲状腺癌の病理切片に応用された場合、インプリンティング消失とコピー数異常の分布範囲およびグレード分類基準を示し、図５（ｂ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ１１が４１例の甲状腺癌の病理切片に応用された場合、インプリンティング消失とコピー数異常の分布範囲およびグレード分類基準を示し、図５（ｃ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ１６が４１例の甲状腺癌の病理切片に応用された場合、インプリンティング消失とコピー数異常の分布範囲およびグレード分類基準を示し、図５（ｄ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ３が４１例の甲状腺癌の病理切片に応用された場合、インプリンティング消失とコピー数異常の分布範囲およびグレード分類基準を示し、図５（ｅ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ４が４１例の甲状腺癌の病理切片に応用された場合、インプリンティング消失とコピー数異常の分布範囲およびグレード分類基準を示し、図５（ｆ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ５が４１例の甲状腺癌の病理切片に応用された場合、インプリンティング消失とコピー数異常の分布範囲およびグレード分類基準を示し、図５（ｇ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ６が４１例の甲状腺癌の病理切片に応用された場合、インプリンティング消失とコピー数異常の分布範囲およびグレード分類基準を示し、図５（ｈ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ８が４１例の甲状腺癌の病理切片に応用された場合、インプリンティング消失とコピー数異常の分布範囲およびグレード分類基準を示し、図５（ｉ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ１０が４１例の甲状腺癌の病理切片に応用された場合、インプリンティング消失とコピー数異常の分布範囲およびグレード分類基準を示し、図５（ｊ）は、インプリンティング遺伝子Ｚ１３が４１例の甲状腺癌の病理切片に応用された場合、インプリンティング消失とコピー数異常の分布範囲およびグレード分類基準を示し、ここで、LOIは、インプリンティング遺伝子消失の遺伝子発現量であり、ＣＮＶがインプリンティング遺伝子コピー数異常の遺伝子発現量であり、ＴＥがインプリンティング遺伝子の総発現量である。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
本発明が講じた技術的手段およびその効果をさらに説明するため、以下は添付図面を参照しつつ具体的実施形態を通じて本発明の技術的手段をさらに説明するが、本発明は実施例の範囲に限定されない。
【００６９】
ゲノムインプリンティングは、エピジェネティクスにおける遺伝子調節の方法である。その特徴は、特定の親由来の対立遺伝子をメチル化することにより、特定の遺伝子の一方の対立遺伝子のみが発現され、他方はサイレント状態になることである。この種の遺伝子は、刷り込み（インプリンティング）遺伝子と呼ばれる。刷り込み消失は、刷り込み遺伝子の脱メチル化により、サイレント状態であった対立遺伝子が活性化され、遺伝子発現を開始するエピジェネティックな変化である。多数の研究により、この現象（刷り込み消失）は様々な種類の癌に一般的に存在し、細胞および組織の形態の変化よりも早く発生することが示されている。同時に、健康な細胞において、癌細胞とは対照的に、刷り込み消失の割合は極めて低くなっている。このため、刷り込み遺伝子のメチル化状態は、病理学的マーカーとして特定の分子検出技術を通じて細胞の異常状態を解析することができる。
【００７０】
本発明の検出モデルおよび装置は、直感的な方法で甲状腺腫瘍患者サンプルにおけるインプリンティング遺伝子発現を表現し、インプリンティング遺伝子へのin ituマーキング方法を通じて、インプリンティング（刷り込み）遺伝子の変化を客観的、直感的、早期、正確に検出し、定量的なモデルを提供することができ、甲状腺腫瘍の診断に大きく貢献し、
本発明の検出装置は、甲状腺腫瘍患者の手術前の穿刺生検を通じて、甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定することができるため、手術および精密な治療に根拠を提供する。これは細胞分子分野における甲状腺腫瘍診断の革新的なブレークスルーであり、
本発明は、甲状腺腫瘍のタイプを正確に判断することができ、インプリンティング遺伝子の複合検出を通じて、甲状腺腫瘍の悪性度について明確なグレード分類を行い、甲状腺癌の早期かつ明確な診断を大幅に向上し、特に早期スクリーニングおよび癌の術後訪問（特に再発が疑われる患者のフォローアップ・訪問）に使用すると、時間を稼ぎ、患者の命を救うことに大きく貢献することができ、
本発明は、甲状腺の好酸性細胞腫瘍（HCT）の良性、悪性を分子レベルから正確に鑑別することができ、現在の組織細胞形態学が甲状腺の好酸性細胞腫瘍の良性、悪性を鑑別することが難しいという問題に解決手段を提供し、同時に濾胞性甲状腺腺腫（FTA）と濾胞性甲状腺癌（FTC）を鑑別することもでき、世界の形態学的診断の難しさを解決する。
【００７１】
本発明の検出方法は、免疫組織化学的方法とは異なり、偽陽性および他の負の影響を低減するだけでなく、甲状腺腫瘍関連のインプリンティング遺伝子消失部位の発見を通じて遺伝子を沈黙させ、ノックアウトし、再配列することができる標的薬または技術方法が後の治療および投薬を導くために使用できる。
【実施例１】
【００７２】
甲状腺癌のインプリンティング遺伝子の解析
前記インプリンティング遺伝子の検出方法は、次のステップを含む。すなわち、
（１）甲状腺癌の組織細胞切片（１０ミクロン）を取得し、ＲＮＡ分解を防ぐため、１０％中性ホルマリン溶液に入れて固定し、固定時間は２４時間で、パラフィンに包埋（FFPE）し、ガラススライドが正電荷で取り外し、切片を４０℃のオーブンで３時間以上焼くステップ、
（２）RNASCopeのサンプル処理方法に従ってサンプル内の内因性ペルオキシダーゼ活性をブロッキングし、透過性を高め、RNA分子を露出させるステップ、
（３）インプリンティング遺伝子配列に基づいて特異的プライマーを設計するプローブ設計ステップ、
前記プローブは、インプリンティング遺伝子Ｚ１（Gnas）、Ｚ３（Peg10）、Ｚ４（Igf2r）、Ｚ５（Mest）、Ｚ６（Plagl1）、Ｚ８（Dcn）、Ｚ１０（Gatm）、Ｚ１１（Grb10）、Ｚ１３（Sgce）およびＺ１６（Snrpn/Snurf）に基づいて設計されたものであり、具体的に各遺伝子のイントロンからプローブとして部分配列を選択し、具体的にプローブはAdvanced Cell Diagnosticsによって設計された。
【００７３】
（４）ステップ（３）のプローブと被験サンプルをキットによってRNA SCopein situハイブリダイゼーションを実施するステップ、
（５）シグナル増幅およびヘマトキシリン染色を行い、顕微鏡イメージングでインプリンティング遺伝子の発現状況を解析するステップ、
前記モデルにおけるインプリンティング遺伝子総発現量、インプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量を計算するための式は、以下の通りであり、
総発現量＝（ｂ＋ｃ＋ｄ）／（ａ＋ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
通常インプリンティング遺伝子発現量＝ｂ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
インプリンティング遺伝子消失の遺伝子発現量（LOI）＝ｃ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
インプリンティング遺伝子コピー数異常の遺伝子発現量（CNV）＝ｄ／（ｂ＋ｃ＋ｄ）×１００％、
ここで、ａ、ｂ、ｃ、ｄは、図１に示ように、ａは細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核内にマーカーがなく、インプリンティング遺伝子が発現されていない細胞核であることを示し、ｂは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に１つの赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子が存在する細胞核であることを示し、ｃは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に２つの赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子が消失している細胞核であることを示し、ｄは、細胞をヘマトキシリンで染色した後、細胞核に２つ以上の赤色／茶色マーカーがあり、インプリンティング遺伝子コピー数が異常な細胞核であることを示す。
【００７４】
図２（ａ）〜図２（ｅ）から分かるように、グレード０からグレードIVまでのサンプルにおいて、インプリンティング消失（核内に２つのシグナル点がある）およびコピー数異常（核内に３つ以上のシグナル点がある）の細胞の割合は、悪性度の増加とともに徐々に増加する。
【実施例２】
【００７５】
甲状腺穿刺生検サンプルのインプリンティング遺伝子の解析
前記甲状腺穿刺生検サンプルは、疑わしい病変組織を穿刺で取り出し、１０％中性ホルマリン溶液で２４時間以上固定し、その他の検出方法が実施例１と同じである。
【００７６】
図３（ａ）〜図３（ｆ）から分かるように、各遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３、Ｚ１６の甲状腺癌に対する感受性または甲状腺癌の発現に対応するインプリンティング消失の強度および状況は、異なる。
【００７７】
具体的に各インプリンティング遺伝子の甲状腺癌に対する感受性は、図４（ａ）〜図４（ｊ）に示されている。図４（ａ）〜図４（ｃ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ１のインプリンティング消失および発現量の増加は、悪性ポテンシャルが現れ始め、早期甲状腺癌で急速に非常に高いレベルに増加し、進行・末期甲状腺癌で維持し続け、インプリンティング遺伝子Ｚ１のインプリンティングコピー数異常は、悪性ポテンシャルで急速に非常に高いレベルに上昇し、早期甲状腺癌から末期甲状腺癌にかけて維持し続け、インプリンティング遺伝子Ｚ１１のインプリンティング消失、コピー数異常および発現量の増加は、悪性ポテンシャル段階で低いレベルで、早期甲状腺癌段階から進行甲状腺癌段階にかけてゆっくりと増加し、末期甲状腺癌段階で急速に非常に高いレベルに上昇し、インプリンティング遺伝子Ｚ１６のインプリンティング消失、コピー数異常および発現量の増加は、悪性ポテンシャルから進行甲状腺癌段階にかけて急速に増加し、末期甲状腺癌段階で非常に高いレベルを維持し、
【００７８】
図４（ｄ）〜図４（ｊ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ３のインプリンティング消失およびコピー数異常は、悪性ポテンシャルおよび早期甲状腺癌段階で有意に増加せず、進行甲状腺癌でゆっくりと増加し、末期甲状腺癌では上昇速度が増加し、より高いレベルに達し、インプリンティング遺伝子Ｚ３の発現量増加が悪性ポテンシャル段階で現れ始め、甲状腺癌の進展過程でゆっくりと上昇し、末期甲状腺癌段階でまだ低いであり、インプリンティング遺伝子Ｚ４のインプリンティング消失およびコピー数異常は、甲状腺癌の進展過程でゆっくりと上昇し、末期甲状腺癌段階でまだ低いであり、インプリンティング遺伝子Ｚ４の発現量増加は、悪性ポテンシャル段階で現れ始め、早期甲状腺癌で有意に増加せず、進行甲状腺癌で急速に上昇するが、末期甲状腺癌段階でより高い感受性に達し、インプリンティング遺伝子Ｚ５のインプリンティング消失およびコピー数異常は、進行期甲状腺癌段階で現れ始め、末期甲状腺癌段階でレベルがそれほど高くはなく、インプリンティング遺伝子Ｚ５の発現量増加が早期甲状腺癌段階で現れ始め、甲状腺癌の進展過程で徐々に上昇し、末期甲状腺癌段階でレベルがそれほど高くはなく、インプリンティング遺伝子Ｚ６のインプリンティング消失は、進行甲状腺癌段階で現れ始め、末期甲状腺癌である程度上昇するが、レベルがそれほど高くはなく、インプリンティング遺伝子Ｚ６のコピー数異常が甲状腺癌の増殖能段階で現れ始め、早期と進行甲状腺癌で安定したままであり、末期甲状腺癌段階で急速に比較的高いレベルに上昇し、インプリンティング遺伝子Ｚ６の発現量増加が早期甲状腺癌段階で現れ始め、進行甲状腺癌段階で安定したままであり、末期甲状腺癌段階では急速に比較的高いレベルに上昇し、インプリンティング遺伝子Ｚ８のインプリンティング消失は、進行甲状腺癌段階で急速に上昇し、末期甲状腺癌段階で比較的高いレベルに上昇し、インプリンティング遺伝子Ｚ８のコピー数異常が進行甲状腺癌段階で急速に比較的高いレベルに上昇し、末期甲状腺癌で非常に高いレベルに上昇し続け、インプリンティング遺伝子Ｚ８の発現量増加が末期甲状腺癌段階で現れ始め、かつ比較高いレベルに達し、インプリンティング遺伝子Ｚ１０のインプリンティング消失、コピー数異常および発現量増加は、末期甲状腺癌段階で現れ始め、かつ非常に高いレベルに達し、インプリンティング遺伝子Ｚ１３のインプリンティング消失は、早期甲状腺癌段階で現れ始め、進行甲状腺癌および末期甲状腺癌段階でゆっくりと上昇し、インプリンティング遺伝子Ｚ１３のコピー数異常が早期甲状腺癌段階で現れ始め、進行甲状腺癌段階でゆっくりと上昇し、末期甲状腺癌段階では急速に上昇すると共に比較的高いレベルに達し、インプリンティング遺伝子Ｚ１３の発現量増加が悪性ポテンシャル段階で現れ始め、早期と進行甲状腺癌段階で有意に上昇せず、末期甲状腺癌段階で急速に比較的高いレベルに上昇する。
【実施例３】
【００７９】
甲状腺腫瘍サンプル４１例のインプリンティング遺伝子の解析
穿刺生検細胞サンプルを含む４１例の甲状腺癌患者の組織を取得し、検出方法は、実施例１と同じである。
【００８０】
図５（ａ）〜図５（ｊ）から分かるように、甲状腺腫瘍組織サンプル４１例における１０つのプローブのインプリンティング消失およびコピー数異常の割合は、低いものから高いものへの分布を示し、異なるプローブの分布傾向に基づいて、図内の破壊で示したグレード分類基準を算出し、各プローブのインプリンティング消失およびコピー数異常を低から高の５つグレードに分けることができる。
【００８１】
具体的グレード分類は、次の通りであり、
図５（ａ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ１について、インプリンティング遺伝子消失発現量が１２％未満、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１％未満またはインプリンティング遺伝子総発現量が２５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのは、グレード０であり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１２〜２０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％またはインプリンティング遺伝子総発現量が２５〜３５％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２０〜２５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％またはインプリンティング遺伝子総発現量が３５〜４５％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２５〜３０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３〜５％またはインプリンティング遺伝子総発現量が４５〜６０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が３０％超、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が５％超またはインプリンティング遺伝子総発現量が６０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIVであり、
【００８２】
図５（ｂ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ１１について、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０％未満、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５％未満またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのは、グレード０であり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０〜１５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５〜１％またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５〜２０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１５〜２０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％またはインプリンティング遺伝子総発現量が２０〜３０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２０〜２５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％またはインプリンティング遺伝子総発現量が３０〜４０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２５％超、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３％超またはインプリンティング遺伝子総発現量が４０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIVであり、
【００８３】
図５（ｃ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ１６について、インプリンティング遺伝子消失発現量が１２％未満、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１％未満またはインプリンティング遺伝子総発現量が２５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのは、グレード０であり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１２〜２０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％またはインプリンティング遺伝子総発現量が２５〜３５％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２０〜２５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％またはインプリンティング遺伝子総発現量が３５〜４５％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２５〜３０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３〜５％またはインプリンティング遺伝子総発現量が４５〜６０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が３０％超、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が５％超またはインプリンティング遺伝子総発現量が６０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIVであり、
【００８４】
図５（ｄ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ３について、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０％未満、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５％未満またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのは、グレード０であり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０〜１５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５〜１％またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５〜２０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１５〜２０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％またはインプリンティング遺伝子総発現量が２０〜３０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２０〜２５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％またはインプリンティング遺伝子総発現量が３０〜４０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２５％超、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３％超またはインプリンティング遺伝子総発現量が４０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIVであり、
【００８５】
図５（ｅ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ４について、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０％未満、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５％未満またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのは、グレード０であり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０〜１５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５〜１％またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５〜２０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１５〜２０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％またはインプリンティング遺伝子総発現量が２０〜３０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２０〜２５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％またはインプリンティング遺伝子総発現量が３０〜４０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２５％超、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３％超またはインプリンティング遺伝子総発現量が４０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIVであり、
【００８６】
図５（ｆ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ５について、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０％未満、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５％未満またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのは、グレード０であり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０〜１５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５〜１％またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５〜２０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１５〜２０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％またはインプリンティング遺伝子総発現量が２０〜３０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２０〜２５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％またはインプリンティング遺伝子総発現量が３０〜４０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２５％超、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３％超またはインプリンティング遺伝子総発現量が４０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIVであり、
【００８７】
図５（ｇ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ６について、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０％未満、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５％未満またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのは、グレード０であり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０〜１５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５〜１％またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５〜２０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１５〜２０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％またはインプリンティング遺伝子総発現量が２０〜３０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２０〜２５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％またはインプリンティング遺伝子総発現量が３０〜４０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２５％超、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３％超またはインプリンティング遺伝子総発現量が４０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIVであり、
【００８８】
図５（ｈ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ８について、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０％未満、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５％未満またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのは、グレード０であり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０〜１５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５〜１％またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５〜２０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１５〜２０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％またはインプリンティング遺伝子総発現量が２０〜３０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２０〜２５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％またはインプリンティング遺伝子総発現量が３０〜４０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２５％超、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３％超またはインプリンティング遺伝子総発現量が４０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIVであり、
【００８９】
図５（ｉ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ１０について、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０％未満、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５％未満またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのは、グレード０であり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０〜１５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５〜１％またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５〜２０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１５〜２０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％またはインプリンティング遺伝子総発現量が２０〜３０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２０〜２５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％またはインプリンティング遺伝子総発現量が３０〜４０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２５％超、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３％超またはインプリンティング遺伝子総発現量が４０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIVであり、
【００９０】
図５（ｊ）から分かるように、インプリンティング遺伝子Ｚ１３について、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０％未満、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５％未満またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５％未満のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのは、グレード０であり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１０〜１５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が０．５〜１％またはインプリンティング遺伝子総発現量が１５〜２０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が１５〜２０％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が１〜２％またはインプリンティング遺伝子総発現量が２０〜３０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２０〜２５％、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が２〜３％またはインプリンティング遺伝子総発現量が３０〜４０％のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子消失発現量が２５％超、インプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が３％超またはインプリンティング遺伝子総発現量が４０％超のうちいずれか１種または少なくとも２種であるのはグレードIVである。
【００９１】
甲状腺腫瘍サンプル６１例の包括的な解析から次の通りに得られる。
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度の判定は、良性腫瘍、甲状腺癌の増殖能、早期甲状腺癌、進行甲状腺癌および末期甲状腺癌に分類され、
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のインプリンティング遺伝子消失発現量およびインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量が均しくグレードIよりも小さく、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIである場合、良性腫瘍であり、
【００９２】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６うち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIであることのうちいずれか状況である場合、甲状腺癌の増殖能と判定され、
【００９３】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIIであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIIであることのうちいずれか状況である場合、早期甲状腺癌であり、
【００９４】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIIIであり、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIIIであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIVであり、かつインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち１つ以下のインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIVであることのうちいずれか状況である場合、進行甲状腺癌であり、
【００９５】
甲状腺腫瘍の良性度・悪性度を判定した結果は、インプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子消失発現量がグレードIVであり、またはインプリンティング遺伝子Ｚ１、Ｚ３、Ｚ４、Ｚ５、Ｚ６、Ｚ８、Ｚ１０、Ｚ１１、Ｚ１３およびＺ１６のうち少なくとも２つのインプリンティング遺伝子のインプリンティング遺伝子コピー数異常発現量がグレードIVである場合、末期甲状腺癌である。
【００９６】
以上をとりまとめると、本発明の検出モデルおよび装置は、直感的な方法で甲状腺腫瘍患者サンプルにおけるインプリンティング遺伝子発現を表現し、インプリンティング遺伝子へのin situマーキング方法を通じて、インプリンティング（刷り込み）遺伝子の変化を客観的、直感的、早期、正確に検出し、定量的なモデルを提供することができ、甲状腺腫瘍の診断に大きく貢献する。
【００９７】
出願人は、本発明が上記実施例を通じて本発明の詳細な方法を説明することを表明するが、本発明は上記詳細な方法に限定されず、すなわち本発明の実施が上記詳細な方法に依存しなければならないことを意味しない。当業者は、本発明の改善、本発明の製品の各原料の均等範囲内での置換および補助成分の添加、具体的形態の選択などが、本発明の保護および開示の範囲内に網羅されることを理解すべきである。
【図１】
2021531833.tif 000003
【図２（ａ）−（ｅ）】
2021531833.tif 000004
【図３（ａ）−（ｂ）】
2021531833.tif 000005
【図３（ｃ）−（ｄ）】
2021531833.tif 000006
【図３（ｅ）−（ｆ）】
2021531833.tif 000007
【図４（ａ）−（ｂ）】
2021531833.tif 000008
【図４（ｃ）−（ｄ）】
2021531833.tif 000009
【図４（ｅ）−（ｆ）】
2021531833.tif 000010
【図４（ｇ）−（ｈ）】
2021531833.tif 000011
【図４（ｉ）−（ｊ）】
2021531833.tif 000012
【図５（ａ）】
2021531833.tif 000013
【図５（ｂ）】
2021531833.tif 000014
【図５（ｃ）】
2021531833.tif 000015
【図５（ｄ）】
2021531833.tif 000016
【図５（ｅ）】
2021531833.tif 000017
【図５（ｆ）】
2021531833.tif 000018
【図５（ｇ）】
2021531833.tif 000019
【図５（ｈ）】
2021531833.tif 000020
【図５（ｉ）】
2021531833.tif 000021
【図５（ｊ）】
2021531833.tif 000022
【国際調査報告】
2021531833.tif 000023
2021531833.tif 000024
2021531833.tif 000025
2021531833.tif 000026
2021531833.tif 000027
2021531833.tif 000028