(57)【要約】  本明細書で提供されるのは、いくつかの態様において、例えば遺伝子治療で使用するための炎症を低減する阻害性オリゴヌクレオチドを含む組み換えウイルスゲノムである。【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療用ヌクレオチド配列と、核酸感知トール様受容体（ＴＬＲ）活性化および／またはシグナル伝達を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドとを含む組み換えウイルスゲノムを対象の筋肉組織に投与することを含む方法であって、組み換えウイルスゲノムは、筋肉組織における組み換えウイルスゲノムに対する炎症反応を阻害する、前記方法。
【請求項２】
ＴＬＲがＴＬＲ９であり、任意に少なくとも１の阻害性オリゴヌクレオチドがＴＬＲ９に結合し、および任意に少なくとも１の阻害性オリゴヌクレオチドがＴＬＲ９媒介シグナル伝達を活性化することなくＴＬＲ９に結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
組み換えウイルスゲノムが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘、天然痘ウイルス、Ｂ型肝炎、サイトメガロウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、サル痘ウイルス、帯状疱疹、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、またはヒトパルボウイルスＢ１９からのものである、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
組み換えウイルスゲノムが、組み換えＡＡＶウイルスゲノムである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
組み換えウイルスゲノムが一本鎖である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
組み換えウイルスゲノムが自己相補的である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
阻害性オリゴヌクレオチドが、治療用ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの（５’）上流に位置付けられ、および任意にインヒビターオリゴヌクレオチドが、組み換えウイルスゲノムの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置付けられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
阻害性オリゴヌクレオチドが、治療用核酸に連結されたポリＡテールの（３’）下流に位置付けられ、および任意にインヒビターオリゴヌクレオチドが、組み換えウイルスゲノムの３’ＵＴＲに位置付けられる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
組み換えウイルスゲノムが、核酸感知ＴＬＲ活性化および／またはシグナル伝達を阻害する少なくとも１の他の阻害性オリゴヌクレオチドをさらに含み、任意に阻害性オリゴヌクレオチドが、ウイルスゲノムの異なる場所にある、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
阻害性オリゴヌクレオチドの１つが、組み換えウイルスゲノムのセンス方向に配向され、および別の阻害性オリゴヌクレオチドが、組み換えウイルスゲノムのアンチセンス方向に配向される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
少なくとも１の阻害性オリゴヌクレオチドが、炎症性核酸に結合し、任意に阻害性オリゴヌクレオチドが、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも１の阻害性オリゴヌクレオチドが、ＣＣｘ（非Ｃ）（非Ｃ）ｘｘＧＧＧモチーフを含み、ここでｘは任意の核酸である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列と９０％〜１００％の同一性を共有するヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列と９０％〜１００％の同一性を共有するヌクレオチド配列の複数のタンデムリピート、任意に２〜４のタンデムリピートを含み、任意にヌクレオチド配列が、ポリＡリンカーによって互いに分離されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号３５（３ｘテロメア）のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号３９（３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８）のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号４０（３ｘ４０８４−Ｆ３ｘ２０８８）のヌクレオチド配列を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
阻害性オリゴヌクレオチドの１つが配列番号３９のヌクレオチド配列を含み、および阻害性オリゴヌクレオチドの１つが配列番号４０のヌクレオチド配列を含む、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１９】
阻害性オリゴヌクレオチドが、少なくとも１の、少なくとも２の、少なくとも３の、または少なくとも４のＴＴＡＧＧＧ（配列番号６１）モチーフ（単数または複数）を含む少なくとも１の阻害性オリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
対象が遺伝性障害を有する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
治療用ヌクレオチド配列が、治療用核酸、任意に治療用ＲＮＡまたは治療用ＤＮＡをコードし、またはヌクレオチド配列が、治療用タンパク質またはペプチドをコードする、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
組み換えウイルスゲノムが、対照の量よりも少なくとも２０％少ない量で投与され、任意に対照が、核酸感知ＴＬＲ活性化および／またはシグナル伝達を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドを含まない組み換えウイルスゲノムである、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
組み換えウイルスゲノムが、対照よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも１５倍大きいレベルで対象の細胞において発現する、任意に対照が、阻害性オリゴヌクレオチドを含まないウイルスゲノムの発現である、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
組み換えウイルスゲノムの投与が、対照よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、または少なくとも５０倍低い対象における炎症反応を誘発し、任意に対照が、阻害性オリゴヌクレオチドを含まないウイルスゲノムの発現である、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
治療用ヌクレオチド配列および配列番号２〜５、７、１０〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む阻害性オリゴヌクレオチドを含む、組み換えウイルスゲノム。
【請求項２６】
治療用ヌクレオチド配列および配列番号３５（３ｘテロメア）、配列番号３９（３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８）、および／または配列番号４０（３ｘ４０８４−Ｆ３ｘ２０８８）のヌクレオチド配列を含む阻害性オリゴヌクレオチドを含む、組み換えウイルスゲノム。
【請求項２７】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘、天然痘ウイルス、Ｂ型肝炎、サイトメガロウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、サル痘ウイルス、帯状疱疹、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、またはヒトパルボウイルスＢ１９からのものである、請求項２５または２６に記載の組み換えウイルスゲノム。
【請求項２８】
組み換えＡＡＶウイルスゲノムである、請求項２７に記載の組み換えウイルスゲノム。
【請求項２９】
一本鎖である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の組み換えウイルスゲノム。
【請求項３０】
自己相補的である、請求項２５〜２８のいずれか一項に記載の組み換えウイルスゲノム。
【請求項３１】
核酸感知ＴＬＲ活性化および／またはシグナル伝達を阻害する少なくとも１の他の阻害性オリゴヌクレオチドをさらに含み、任意に阻害性オリゴヌクレオチドが、ウイルスゲノムの異なる場所にある、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の組み換えウイルスゲノム。
【請求項３２】
阻害性オリゴヌクレオチドが、治療用ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの（５’）上流に位置付けられ、および任意にインヒビターオリゴヌクレオチドが、組み換えウイルスゲノムの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置付けられる、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の組み換えウイルスゲノム。
【請求項３３】
阻害性オリゴヌクレオチドが、治療用核酸に連結されたポリＡテールの（３’）下流に位置付けられ、および任意にインヒビターオリゴヌクレオチドが、組み換えウイルスゲノムの３’ＵＴＲに位置付けられる、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の組み換えウイルスゲノム。
【請求項３４】
阻害性オリゴヌクレオチドの１つが組み換えウイルスゲノムのセンス方向に配向され、および別の阻害性オリゴヌクレオチドが組み換えウイルスゲノムのアンチセンス方向に配向される、請求項３３に記載の組み換えウイルスゲノム。
【請求項３５】
請求項２５〜３４のいずれか一項に記載の組み換えウイルスゲノムを対象へ投与することを含む方法であって、組み換えウイルスゲノムが、対象における組み換えウイルスゲノムに対する炎症反応を阻害する、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１１月８日に提出された米国仮出願番号６２／５８３，４４９および２０１７年１２月６日に提出された米国仮出願番号６２／５９５，４３３の３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）下の利益を主張し、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
連邦政府による資金提供を受けた研究
本発明は、国立衛生研究所により授与された認可番号ＨＧ００８５２５下の政府の支援によってなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００２】
背景
ウイルスは進化して、感染した宿主による免疫監視を回避しながら、特定の細胞型への核酸送達が高度に効率的なものになる。これらの特性は、ウイルスを、遺伝子治療のための魅力的な遺伝子送達ビヒクル、またはベクターにする。レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、および単純ヘルペスウイルスを含むいくつかのタイプのウイルスは、遺伝子治療で使用するために実験室で改変されている（Robbins, PD et al. Pharmol Ther, 1998;80(1):35-47）。それにもかかわらず、ウイルスベクターは炎症反応を誘発することが示されている。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本明細書で提供されるのは、いくつかの態様において、所望の治療用分子（例として、目的の治療用遺伝子）の発現をブーストしながら、核酸媒介性炎症反応を阻害するウイルス分子治療ベクターである。本開示のベクターは、炎症促進性サイトカインのウイルス誘発性産生を防止する阻害性オリゴヌクレオチド配列にシスで連結された組み換えウイルスゲノムを包含する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、トール様受容体の核酸媒介性活性化を阻害し、および／または核酸媒介性トール様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達（例として、ＴＬＲ９）を阻害する。驚くべきことに、ウイルスゲノムに阻害性オリゴヌクレオチドを含めると、炎症反応が阻害されるだけでなく、必要に応じて、治療用ヌクレオチド配列の形質導入効率および／または有効性、および／または核酸によってコードされる発現産物の発現レベルも増加する。よって、治療的に有効である必要がある組み換えウイルスゲノムの量は、阻害性オリゴヌクレオチドを包含しない従来のウイルスベクター送達システムで必要な量よりも少ない。
【０００４】
よって、本開示のいくつかの側面は、治療用核酸（例として、遺伝子（例として、Ｃａｓ９）または遺伝子フラグメント（例として、目的の置換エクソン）をコードするＤＮＡおよび炎症促進性サイトカインの産生を阻害する阻害性オリゴヌクレオチド）を含む組み換えウイルスゲノムを提供する。本明細書では、いくつかの側面において、治療用核酸（例として、ＤＮＡ）および炎症促進性サイトカインの産生を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドを含む組み換えウイルスゲノムを対象に投与することを含む方法も提供される。いくつかの態様において、組み換えウイルスゲノムは筋肉内に投与される。他の態様において、組み換えウイルスゲノムは静脈内に投与される。いくつかの態様において、組み換えウイルスゲノムは目（例として、硝子体内）に投与される。
【０００５】
本開示の他の側面は、治療用ヌクレオチド配列と、核酸感知ＴＬＲ活性化および／またはシグナル伝達を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドとを含む組み換えウイルスゲノムを提供する。また、本明細書では、いくつかの側面において、治療用ヌクレオチド配列と、核酸感知ＴＬＲ活性化および／またはシグナル伝達を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドとを含む組み換えウイルスゲノムを対象に投与することを含む方法が提供される。
【０００６】
いくつかの態様において、ＴＬＲはＴＬＲ９である。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲに結合する。他の態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、炎症性核酸に結合する。いくつかの態様において、炎症性核酸は、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、ＣＣｘ（非Ｃ）（非Ｃ）ｘｘＧＧＧモチーフを含み、ここでｘは任意の核酸である。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
図面の簡単な記載
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｃは、in vitroでのＴＬＲ９活性化に対する例示的な阻害性オリゴヌクレオチドの影響を示すデータを含む。ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ９レポーター細胞を、示された濃度の示された構築物（ホスホロチオアート主鎖を有する一本鎖ＤＮＡ）で１８時間処理した。細胞上清の５０μｌ試料を１００μｌのＨＥＫ-Ｂｌｕｅ検出でインキュベートし、次いでプレートリーダーで６３９ｎｍの吸光度を分析した。示されているデータは、ｎ＝３の技術的複製の平均±ｓ．ｄ．である。図１Ａ：Ｘ軸に示された各配列に連結されたＴＬＲ９活性化核酸（ＯＤＮ２００６）は、ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ９レポーターシステムで試験された。図１Ａの左側のグラフは、０．５μＭの構築物を使用した結果を示す。図１Ａの右のグラフは、５μＭの構築物を使用した結果を示す。
【図１Ｂ−Ｃ】図１Ｂ：ＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーを通じてＸ軸上の示された各配列に連結されたＴＬＲ９活性化核酸（ＯＤＮ２００６）は、ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ９レポーターシステムで試験された。図１Ｃ：Ｘ軸に示された各配列に連結されたＴＬＲ９活性化核酸（ＯＤＮ２００６）は、ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ９レポーターシステムで試験された。
【０００８】
【図２】図２Ａ〜２Ｂは、連結された自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ゲノムによって誘発された炎症反応および感染したマウスにおけるＡＡＶ導入遺伝子の発現に対するテロメアオリゴヌクレオチドの３コピー（「３ｘテロメア」配列番号３５）の影響に関する筋肉組織データを示す。図２Ａ：ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、炎症促進性サイトカインの発現に対する示された構築物または対照生理食塩水の影響に関するデータを示す。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、四頭筋における筋肉内注射により示されたＡＡＶ２ウイルス（マウスあたり１０１１ｖｇ）を感染させた。２時間（ｈ）後、動物を安楽死させ、四頭筋の一部をｑＲＴ−ＰＣＲにより、示された遺伝子発現について分析した。生理食塩水注射は、各遺伝子について１倍の発現に設定された。示されているデータは、条件あたりｎ＝４または５のマウスの平均±ｓ．ｄ．である。図２Ｂ：ＧＦＰ発現に対する示されたＡＡＶベクターの影響に関するデータを示す。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、図２Ａと同様に、示されたＡＡＶ２ウイルスを感染させ、四頭筋の一部は、２８日後にｑＲＴ−ＰＣＲによってＧＦＰ遺伝子発現について分析された。ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ感染は、ＧＦＰの１倍の発現に設定された。示されているデータは、条件あたりｎ＝５のマウスである。各三角形は動物を表し、平均値が示されている。
【０００９】
【図３Ａ−Ｃ】図３Ａ〜３Ｃは、テロメアの３コピー（「３ｘテロメア」配列番号３５）およびｃ４１の３コピー（３Ｘｃ４１）のオリゴヌクレオチドの、感染したマウスにおける連結された自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）によって誘発された炎症反応に対する影響に関する肝臓組織データを含む。３つのパネルはすべて、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用して、炎症促進性サイトカインの発現に対する示された構築物または対照生理食塩水の影響に関するデータを示す。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＡＡＶ２ウイルス（マウスあたり１０１１ｖｇ）を尾静脈注射で感染させた。２時間後、動物を安楽死させ、肝臓の一部は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって示された遺伝子発現について分析された。生理食塩水注射は、各遺伝子について１倍の発現に設定された。図３Ａ：示されているデータは、条件あたりｎ＝３のマウスの平均±ｓ．ｄ．である。図３Ｂおよび３Ｃ：示されているデータは、条件あたりｎ＝４のマウスの平均±ｓ．ｄ．である。生理食塩水条件と比較した＊Ｐ＜０．０５（独立ｔ検定）。Ｎ．ｓ．：有意ではない（Ｐ＞０．０５）。
【図３Ｄ】図３Ｄは、感染したマウスにおける連結されたｓｃＡＡＶゲノムによって誘発された炎症反応に対する阻害性オリゴヌクレオチド配列または対照配列の影響に関する肝臓組織データを含む。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスを示されたＡＡＶ２ウイルスに感染させ、肝臓の一部は、ｑＲＴ−ＰＣＲによって示された遺伝子発現について分析された。示されているデータは、条件あたりｎ＝５のマウス（ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ-３ｘ対照のｎ＝３のマウスを除く）の平均±ｓ．ｄ．である。生理食塩水条件と比較した＊Ｐ＜０．０５（独立ｔ検定）。Ｎ．ｓ．：有意ではない（Ｐ＞０．０５）。
【図３Ｅ】図３Ｅは、感染したマウスにおけるｓｃＡＡＶ導入遺伝子発現に対するテロメアオリゴヌクレオチドの３コピー（「３ｘテロメア」配列番号３５）の影響に関する肝臓組織データを含む。成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、示されたＡＡＶ２ウイルス（マウスあたり１０１１ｖｇ）を尾静脈注射で感染させた。１４日後、動物を安楽死させ、肝臓の一部は、ｑＲＴ−ＰＣＲによってＧＦＰ遺伝子発現について分析された。ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ注射は、ＧＦＰの１倍の発現に設定された。示されているデータは、条件あたりｎ＝４のマウスである。各三角形は動物を表し、平均値が示されている。
【００１０】
【図４】図４は、ＧＦＰ（ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ）をコードする一本鎖ＡＡＶベクターの概略図である。２つの改変された形態が示される。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５ｘテロメアは、ＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーを有する５コピーのテロメアオリゴヌクレオチド（５Ｘ配列番号９）の挿入、これに続き、ＡＡＡＡＡリンカー（アンチセンス配向）を有する別の５コピーの逆相補配列をもつ。ｓｓＡＡＶ-ｅＧＦＰ-３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８は、ＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーを有する３コピーのテロメアオリゴヌクレオチド（３Ｘ配列番号９）の挿入、これに続き、ＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカー（アンチセンス配向）を有する３コピーのＩＮＨ-１８（３Ｘ配列番号５）の逆相補配列（「３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８ 配列番号３９」）をもつ。ＬｐＡ：ポリＡシグナル。
【００１１】
【図５】図５は、in vitroでのＨＥＫ２９３−ＴＬＲ９レポーター細胞における様々な阻害性オリゴヌクレオチドに対する炎症反応を示すグラフを含む。ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ９レポーター細胞は、０．０２μＭの示されたオリゴヌクレオチド（例１を参照）で１８時間処理された。細胞上清の５０μｌの試料は１５０μｌのＨＥＫ-Ｂｌｕｅ検出でインキュベートされ、プレートリーダーで６３０ｎｍの吸光度について分析された。細胞は、（１）ＣＧを含まないランダムな２４ヌクレオチド鎖（「対照」）、（２）ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）に融合されたＯＤＮ２００６（配列番号２６）（シス）、または（３）ＯＤＮ ２００６とＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧの同時投与（トランス）で処理された。示されているデータは、ｎ＝３の技術的複製の平均±ｓ．ｄ．である。
【００１２】
【図６】図６Ａ〜６Ｂは、in vitroでのＴＬＲ７およびＴＬＲ２活性化に対する例示的な阻害性オリゴヌクレオチドの影響を示すデータを含む。ＨＥＫ２９３-ＴＬＲ７またはＨＥＫ２９３-ＴＬＲ２レポーター細胞は、適切なＴＬＲ７刺激剤（１μｇ／ｍｌのガーディキモド）またはＴＬＲ２刺激剤（１００ｎｇ／ｍｌのＦＳＬ-２）とともに、高濃度の５μＭの示された構築物（ホスホロチオアート主鎖を有する一本鎖ＤＮＡ）の有無にかかわらず、１８時間処理された。図６Ａ〜６ＢにおけるＴＴＡＧＧＧは、ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）を指す。細胞上清の５０μｌの試料は、１００μｌのＨＥＫ-Ｂｌｕｅ検出でインキュベートし、次いでプレートリーダーで６３９ｎｍの吸光度について分析された。示されているデータは、ｎ＝３の技術的複製の平均±ｓ．ｄ．である。図６Ａは、ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ７レポーター細胞を使用した結果を示し、図６Ｂは、ＨＥＫ２９３-ＴＬＲ２レポーター細胞を使用した結果を示す。
【００１３】
【図７】図７Ａ〜７Ｅは、３コピーのテロメア配列（「３ｘテロメア」配列番号３５）のヒト因子ＩＸをコードする自己相補的ＡＡＶベクターへの取り込みの、肝臓組織におけるin vivoでの自然免疫応答および導入遺伝子発現に対する効果を示す。図７Ａは、ｓｃＡＡＶ−ＦＩＸ（本来の「野生型」ベクター、配列番号３３）およびｓｃＡＡＶ−ＦＩＸ−３ｘテロメア（配列番号３４）のベクター構成の概略図を示す。ＡＡＶベクターはＡＡＶ８カプシドにパッケージされた。図７Ｂおよび７Ｃは、示された用量で示されたベクターの静脈内投与の２時間後にｑＰＣＲによってアッセイされたマウス肝臓における自然免疫応答を示す。ＰＢＳ注射は、各遺伝子の１倍の発現に設定された。示されているデータは、条件あたりｎ＝５〜７の動物の平均±ｓ．ｅ．ｍ．である。両側マンホイットニー検定で＊ｐ＜０．０５、ＰＢＳ条件と比較。ｎｓ（有意ではない）、ｐ＞０．０５。図７Ｄおよび７Ｅは、示された時点におけるマウスの血漿中のヒト因子ＩＸレベルを示す。示されているデータは、条件あたりｎ＝５〜８の動物の平均±ｓ．ｄ．である。両側マンホイットニー検定で＊＊ｐ＜０．００５。ｎｓ（有意ではない）、ｐ＞０．０５。ＩＴＲ、逆方向末端反復；ＴＴＲ、トランスサイレチンプロモーター；ｈＦＩＸ、ヒト因子ＩＸ；ｂＧＨ、ウシ成長ホルモンのポリ（Ａ）シグナル；ＴＲＳ、末端分離部位。
【００１４】
【図８Ａ−Ｃ】図８Ａ〜８Ｄは、ＡＡＶ誘発性Ｔ細胞反応性およびＴ細胞浸潤に対する阻害性オリゴヌクレオチドの複数のコピー（テロメアの複数のコピー（配列番号９の複数のコピー）およびＩＮＨ-１８の複数のコピー（配列番号５の複数のコピー））の効果を示すデータを包含する。図８Ａは、マウスが筋肉内注射を介して示された用量のＡＡＶｒｈ３２．３３ベクター（一本鎖ＡＡＶ）を受け取ったデータを含み、２１日後、脾細胞はＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイに供され、ｒｈ３２．３３カプシドの免疫ドミナントエピトープに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を定量化した。各条件の中央の応答を有する動物のＥＬＩＳＰＯＴウェルの代表的な画像が示される。点線（５０ ＳＦＵ／１０６脾細胞）は、このアッセイにおける陽性Ｔ細胞応答のカットオフを示す。ｓｓＡＡＶ-ｅＧＦＰは、配列番号３６として提供される。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８は、配列番号３７として提供される。図８Ｂ〜８Ｃは、ＰＢＳおよび１×１０１０ｖｇ ｒｈ３２．３３ベクター２１ｄｐｉについて、筋肉切片（試料あたり４つのフィールドが検査される）におけるＣＤ８＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋グランザイムＢ＋Ｔ細胞の数を示す。
【図８Ｄ】（図８Ｄ）２１ｄｐｉでの筋肉切片における免疫組織化学染色によるＧＦＰ発現の代表的な画像。スケールバー、５０μｍ。示されているように、条件あたりｎ＝５〜１０の動物。両側マンホイットニー検定による＊ｐ＜０．０５および＊＊ｐ＜０．００５。ｎｓ（有意ではない）、ｐ＞０．０５。ＳＦＵ、スポット形成ユニット。
【００１５】
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｂは、ブタ研究で使用されるＡＡＶ８ベクターの特徴付けを示す。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰベクターは、配列番号３６として提供される。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８ベクターは、配列番号３７として提供される。図９Ａは、１×１０１０ｖｇ ＡＡＶ８ベクターの銀染色比較である。
【図９Ｂ】図９Ｂは、負に染色されたＡＡＶを示す一連の透過型電子顕微鏡画像であり、代表的な空の粒子が白い矢印で示されている。各ベクターの代表的な画像が示される。スケールバー：１００ｎｍ。
【００１６】
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｃは、改変ベクターが網膜下に注射されたブタの目における光受容体の病的状態および免疫応答を回避することを示す。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰは、配列番号３６として提供される。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８は、配列番号３７として提供される。図１０Ａは、網膜下注射の６週間後の網膜のＯＮＬの免疫組織化学画像を示す。錐体光受容体の外節は、抗赤緑錐体オプシン染色によって可視化された。スケールバー、１０μｍ。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、抗Ｉｂａ１染色により示される網膜におけるマイクログリアの増殖および活性化を示す。スケールバー、５０μｍ。
【図１０Ｃ】図１０Ｃは、抗ＣＤ８染色により示される網膜への細胞傷害性Ｔ細胞浸潤を示す。スケールバー、５０μｍ。各動物は識別番号で示され、２つの画像は各動物の処理された２つの目からのものである。ＯＮＬ、外核層；Ｉｂａ１、イオン化カルシウム結合アダプタータンパク質１。
【００１７】
【図１１】図１１は、阻害性オリゴヌクレオチドを含む改変ベクターが網膜下に注射されたブタの目の光受容体の病的状態を回避することを示す。網膜下注射後６週間の網膜の免疫組織化学的画像。錐体光受容体は、抗ヒト錐体アレスチン染色によって視覚化された。スケールバー、５０μｍ。各動物は識別番号で示され、２つの画像は各動物の処理された２つの目からのものである。ＡＡＶ８を注射した目で示されている領域はＧＦＰ＋であるが、各画像の右半分からのＧＦＰシグナルはデジタル的に削除され、アレスチン染色のより良好な視覚化を可能にした。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰは配列番号３６として提供される。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８は配列番号３７として提供される。
【００１８】
【図１２】図１２は、ＧＦＰ（ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ）をコードする一本鎖ＡＡＶベクターの概略図を示す。２つの改変された形態が示される。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（配列番号３７）は、ＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーを有する３コピーのテロメアオリゴヌクレオチド（３Ｘ配列番号９）の挿入をもち、これに続き、３'非翻訳領域（ポリＡシグナルと右ＩＴＲとの間）にＡＡＡＡＡリンカー（アンチセンス配向、すなわち、配列番号８のアンチセンス配向）を有する３コピーのＩＮＨ−１８（３Ｘ配列番号５）の逆相補配列をもつ。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−二重（配列番号３８）は、同じ挿入をもつが、さらにＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーを有する３コピーの４０８４−Ｆ（３Ｘ配列番号３）オリゴヌクレオチドの挿入をもち、これに続き、５'非翻訳領域（左ＩＴＲとプロモーターとの間）にＡＡＡＡＡリンカー（アンチセンス配向、すなわち、配列番号８のアンチセンス配向）を有する３コピーの２０８８（３Ｘ配列番号２）オリゴヌクレオチドの逆相補配列をもつ。ＬｐＡ：ポリＡシグナル。
【００１９】
【図１３】図１３は、ＧＦＰ（ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ）をコードする種々の一本鎖ＡＡＶベクターの概略図を示す。改変された形態が示される。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（配列番号４２）は、ＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーを有する３コピーのテロメアオリゴヌクレオチド（３Ｘ配列番号９）の挿入をもち、これに続き、３'非翻訳領域（ポリＡシグナルと右ＩＴＲとの間）にＡＡＡＡＡリンカー（アンチセンス配向、すなわち、配列番号８のアンチセンス配向）を有する３コピーのＩＮＨ−１８（３Ｘ配列番号５）の逆相補配列をもつ。ＷＰＲＥ：ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素。ＬｐＡ：ポリＡシグナル。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
最近の進歩にもかかわらず、遺伝子送達ビヒクルとしてのウイルスベクターの有効性は、一部には、ベクター誘発性炎症のために制限されていた。したがって、臨床的には、ウイルスベクターによる遺伝子治療は、しばしば免疫抑制剤による全身処置を含む。しかしながら、かかる免疫抑制性および抗炎症性の薬物は、処置中に患者の免疫系を危険にさらす可能性があり、患者はしばしば外来性の生物学的材料に対する（例として、ＡＡＶカプシドに対する）中和抗体またはＴ細胞を発達させ、将来の再投与を妨げるか、または形質導入された細胞の破壊をもたらす。
【００２１】
本明細書で提供されるのは、いくつかの態様において、実質的な炎症反応を誘導することなく、送達ビヒクルとして使用され得る組み換えウイルスゲノムである。いくつかの態様において、組み換えウイルスゲノムは、阻害性オリゴヌクレオチドの存在なしに誘導される場合よりも少ない炎症反応を誘導する。本開示の組み換えウイルスゲノムは、炎症促進性サイトカインの産生を阻害し、それにより炎症反応を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドを包含する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、例えば、ＴＬＲ活性化を阻害（防止）することおよび／またはＴＬＲシグナル伝達を阻害することにより、トール様受容体（ＴＬＲ）経路により誘発される炎症反応を阻害する。
【００２２】
ウイルスベクターに対する炎症反応
ウイルスベクターは、遺伝子治療の薬剤として実験的および臨床的モデルでしばしば研究されている。ウイルスベクターの最近の世代では、ウイルス遺伝子の大部分が除去されており、大きな運搬能力、減少した宿主免疫応答、および改善された遺伝子導入効率を有するベクターがもたらされる。しかしながら、アデノウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターなどのいくつかのウイルスベクターは、in vivoでの投与後の自然免疫応答を依然として活性化する。適応応答とは異なり、ウイルスベクターに対する自然応答は免疫学的記憶とは無関係であり、一般にパターン関連分子パターン（ＰＡＭＰ）と呼ばれる微生物の保存された機能の認識によって引き起こされる。この応答は、形質導入された組織の炎症をもたらし、ウイルスの形質導入効率を低下させ得る。ウイルス感染は、最終的に炎症性（炎症促進性）遺伝子の発現につながる細胞侵入に続く多くのシグナル伝達経路を活性化し得る。様々なサイトカイン、ケモカインおよび白血球接着分子は、これらのベクターの炎症特性の分子基盤を提供する広範な細胞型でウイルスベクターによって誘導される。Liu, Q. et al. Gene Therapy 2003;10:935-940を参照。
【００２３】
トール様受容体シグナル伝達経路
ウイルスベクターの（対象における）in vivo投与後に活性化されるシグナル伝達経路の１つは、トール様受容体（ＴＬＲ）シグナル伝達経路である。ＴＬＲは、病原体および損傷した細胞を検出する免疫パターン認識受容体である。例えば、ＴＬＲ９はよく知られており、ＴＬＲ９アミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋおよびＵｎｉｔＰｒｏｔＫＢなどの公的に利用可能な遺伝子データベースで見つけることができる。例えば、野生型ヒトＴＬＲ９のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢエントリーＱ９ＮＲ９６（ＴＬＲ９＿Ｈｕｍａｎ）として識別され得る。
【００２４】
ＴＬＲ９は一般に免疫細胞のエンドソーム膜に位置付けられる。ＴＬＲ９は、細胞に入った外来性核酸（炎症性核酸）を検出する例示的な核酸感知ＴＬＲである（例として、Takeda, K et al., Semin Immunol. 2004;16(1):3-9；Lee, J et al. Proc Natl Acad Sci USA. 2011;108(34):14055-60を参照）。ＴＬＲ９によって認識される核酸は、細菌、ウイルスまたは内在性の核酸にさえ由来するものを包含する。「核酸感知ＴＬＲ」は、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、および非メチル化ＣｐＧ（シトシン−リン酸−グアニン）モチーフを含むＤＮＡなどの核酸に結合し得るＴＬＲである。この結合は、典型的には、ＴＬＲのダイマー化およびＴＬＲシグナル伝達の活性化をもたらし、これは、炎症促進性サイトカインなどの炎症促進性分子の産生（発現および／または活性化）をもたらす。とりわけ、ＴＬＲ９は非メチル化ＣｐＧを有する核酸を認識する（Kumagai, Y, et al. Adv Drug Deliv Rev. 2008;60(7)795-804）。
【００２５】
本明細書に使用されるとき、そのように特定されない限り、「炎症性核酸」は、ＴＬＲシグナル伝達を活性化する（例として、ＴＬＲに結合してＴＬＲシグナル伝達を活性化する）核酸である。いくつかの態様において、炎症性核酸は、デオキシシチジル−デオキシグアノシン（ＣｐＧ）オリゴデオキシヌクレオチドを含む。ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドは、少なくとも１の非メチル化ＣｐＧモチーフを含み、免疫応答を活性化する配列である。例として、Krieg, AM et al. Nature. 1995; 374(6522):546-9を参照。いくつかの態様において、炎症性核酸（例として、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）は、（例として、ＴＬＲ９に結合することにより）ＴＬＲ９シグナル伝達を活性化する。例示的な炎症性核酸は、例１において提供される（ＯＤＮ ２００６）。
【００２６】
ＴＬＲシグナル伝達は、抗ウイルス分子および炎症促進性サイトカイン（Ｉ型インターフェロンおよびＮＦ−ｋＢ（ｐ２５−ＲｅｌＡ複合体）標的遺伝子を含む）の遺伝子発現によって特徴付けられる炎症反応をもたらす。したがって、ＴＬＲシグナル伝達は、炎症反応に対する阻害性オリゴヌクレオチドの影響を決定するための手段として使用され得る。いくつかの態様において、例えば、ＴＬＲシグナル伝達のレベルを反映するサイトカイン（例として、ＩＬ６、ＣＸＣＬ１０および／またはＴＮＦ）産生のレベルを決定することにより、ＴＬＲレポーター細胞株を使用して、オリゴヌクレオチドの阻害性質を評価することができる（例として、例１を参照）。例として、外来性ＤＮＡにおける非メチル化ＣｐＧモチーフの認識はＴＬＲ９を活性化し、ＴＬＲ９シグナル伝達はＩＬ６、ＣＸＣＬ１０、および／またはＴＮＦを含む炎症促進性サイトカインの発現の増加につながる。例として、Krieg AM Nat Rev Drug Discov. 2006;5(6):471-84を参照。いくつかの態様において、特定のサイトカインのレベルは、目的のサイトカインを標的とするプライマーを用いた定量的ＰＣＲを使用して測定される（例として、例３および４を参照）。サイトカインレベルを測定する追加の方法は、抗サイトカイン抗体を用いた酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）およびウェスタンブロット分析を包含する。
【００２７】
炎症反応の阻害は、ＴＬＲシグナル伝達の減少として測定され得る。例えば、対照と比較したサイトカイン活性レベルまたは発現レベルの減少（例として、２倍、５倍、１０倍、５０倍の減少）は、炎症反応の阻害（部分的または完全な阻害）を示し得る（例として、例３および４を参照）。
【００２８】
阻害性オリゴヌクレオチド
阻害性オリゴヌクレオチドは、別の核酸（ウイルスゲノム、一本鎖ＲＮＡ、または一本鎖ＤＮＡなど）と一緒にin vivoで送達されるとき、阻害性オリゴヌクレオチドの非存在下での炎症促進性サイトカインの産生と比較して、炎症促進性サイトカインの産生を阻害するオリゴヌクレオチドである。例として、Stunz, LL et al. Eur J Immunol. 2002;32(5):1212-22；Lenert, P et al. DNA Cell Biol. 2003;22(10):621-31；Lenert, P et al. Arthritis Res Ther. 2009;11(3):R79；Lenert, PS et al. Arthritis Res Ther. 2006;8(1):203；Kaminski, JJ et al. J Immunol. 2013;191(7):3876-83；Shirota, H et al. J Immunol. 2005;174(8):4579-83；Peter, M et al. Immunology. 2008;123(1):118-28を参照。本開示の阻害性オリゴヌクレオチドは、一緒に共有結合された少なくとも２のヌクレオチドを含み、いくつかの例において、ホスホジエステル結合（例として、ホスホジエステル「主鎖」）を含み得る。いくつかの例において、オリゴヌクレオチドは、ホスホロチオアート結合（例として、ホスホロチオアート主鎖）を含み得る。阻害性オリゴヌクレオチドの長さは変わり得るが、阻害性オリゴヌクレオチドの長さは、典型的には４〜２００ヌクレオチドであることが理解されるべきである。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、４〜１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、４〜１０、４〜２０、４〜３０、４〜５０、４〜６０、４〜７０、４〜８０、または４〜９０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、５〜１０、５〜２０、５〜３０、５〜５０、５〜６０、５〜７０、５〜８０、５〜９０、または５〜１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、６〜１０、６〜２０、６〜３０、６〜５０、６〜６０、６〜７０、６〜８０、６〜９０、または６〜１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、７〜１０、７〜２０、７〜３０、７〜５０、７〜６０、７〜７０、７〜８０、７〜９０、または７〜１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、８〜１０、８〜２０、８〜３０、８〜５０、８〜６０、８〜７０、８〜８０、８〜９０、または８〜１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、９〜１０、９〜２０、９〜３０、９〜５０、９〜６０、９〜７０、９〜８０、９〜９０、または９〜１００ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、１０〜１０、１０〜２０、１０〜３０、１０〜５０、１０〜６０、１０〜７０、１０〜８０、１０〜９０、または１０〜１００ヌクレオチドの長さを有する。阻害性オリゴヌクレオチドは、例えば、組み換えまたは合成により生成され得る。
【００２９】
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドを含むか、またはそれからなる。したがって、いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは阻害性ＤＮＡオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドはＲＮＡを包含しない。本明細書に提供されるとおりの阻害性オリゴヌクレオチドの定義は、短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）分子などのＲＮＡ干渉分子（ＲＮＡｉ）を特に除外することが理解されるべきである。
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、核酸感知ＴＬＲの活性化を阻害する。例えば、阻害性オリゴヌクレオチドは、分子スカベンジャーとして作用し、炎症性核酸に結合（およびこれを隔離）し、それにより、炎症性核酸がＴＬＲに結合してＴＬＲシグナル伝達を活性化するのを防ぎ得る。
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、ＴＬＲのダイマー化を防ぎ得る。
【００３０】
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、（下流分子への）ＴＬＲシグナル伝達を阻害する。例えば、阻害性オリゴヌクレオチドは、間接的または直接的にＴＬＲ（例として、ＴＬＲ９）に結合して、炎症促進性サイトカインのＴＬＲ媒介性産生（例として、炎症促進性サイトカイン活性および／または発現の誘導）を遮断し得る。例として、Lenert, PS Mediators Inflamm. 2010; 2010: 986596; Ohto, U et al. Nature. 2015;520(7549):702-5; Lee, J et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011;108(34):14055-60を参照。いくつかの態様において、インヒビターオリゴヌクレオチドは、受容体媒介性エンドサイトーシスまたは食作用について競合する。いくつかの態様において、インヒビターオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９輸送を阻害する。いくつかの態様において、インヒビターオリゴヌクレオチドは、機能的に活性な生成物へのＴＬＲ９プロセシングを阻害する。いくつかの態様において、インヒビターオリゴヌクレオチドは、エンドソームにおける主要なプロテアーゼのエンドソーム酸性化または活性を阻害する。いくつかの態様において、インヒビターオリゴヌクレオチドは、ＴＬＲ９の下流のシグナル伝達タンパク質を遮断する。
【００３１】
「阻害する」という用語は、完全（１００％）阻害および部分的（１００％未満）阻害を包含し、そうでなければ減少と呼ばれることが理解されるべきである。よって、阻害性オリゴヌクレオチドは、核酸感知ＴＬＲ活性化および／またはシグナル伝達を、対照（阻害性オリゴヌクレオチドの非存在下での核酸感知ＴＬＲ活性化および／またはシグナル伝達）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少し得る。
いくつかの態様において、本開示の阻害性オリゴヌクレオチドは、炎症促進性サイトカインの産生を阻害する。炎症促進性サイトカインの非限定的な例は、インターロイキン（例として、ＩＬ-１、ＩＬ-６、ＩＬ-１７およびＩＬ-１８）、インターフェロン（ＩＦＮ、例として、インターフェロンα（ＩＦＮα）、インターフェロンβ（ＩＦＮβ）、およびインターフェロンγ（ＩＦＮγ）を含む）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）（例として、ＴＮＦ−α）およびケモカイン（例として、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ５）を包含する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、ＩＬ−６、ＣＸＣＬ１０および／またはＴＮＦ産生を阻害する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、ＩＬ−６産生を阻害する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、ＣＸＣＬ１０産生を阻害する。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、ＴＮＦ産生を阻害する。本明細書で論じられるように、炎症性サイトカイン産生のレベルは、ウェスタンブロット分析、定量的ＰＣＲおよび／または酵素結合免疫吸着アッセイを使用して測定され得る。炎症反応を評価するための他のアッセイは知られており、本明細書で提供されるように使用され得る。
【００３２】
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、炎症促進性サイトカインの産生（活性および／または発現）を、対照（阻害性オリゴヌクレオチドの非存在下での炎症性サイトカイン産生）と比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％減少させる。
本開示の阻害性オリゴヌクレオチドは、阻害性オリゴヌクレオチドの抗炎症特性に寄与する種々のモチーフを包含し得る。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１のＣＣｘ（非Ｃ）（非Ｃ）ｘｘＧＧＧモチーフを含み、ここで、ｘは任意の核酸（例として、Ａ、Ｔ、ＣまたはＧ（ただし、特定されている場合はＣではない））である。例として、Ashman, RF et al. Int Immunol. 2011; 23(3):203-14を参照。少なくとも１のＣＣｘ（非Ｃ）（非Ｃ）ｘｘＧＧＧモチーフを含む阻害性オリゴヌクレオチドの非限定的な例は、ＯＤＮ ４２２８（例として、Ashman, RF et al. Int Immunol. 2011; 23(3):203-14を参照）、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、および配列番号２４を含む。
【００３３】
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、少なくとも１のＴＴＡＧＧＧモチーフ（配列番号６１）を含む。例えば、阻害性オリゴヌクレオチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０のＴＴＡＧＧＧモチーフを含み得る。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、２のＴＴＡＧＧＧモチーフを含む。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、３のＴＴＡＧＧＧモチーフを含む。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、４のＴＴＡＧＧＧモチーフを含む。少なくとも１のＴＴＡＧＧＧモチーフを含む例示的な阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号６および／または配列番号９によって識別されるものを包含する。
【００３４】
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列と同一である少なくとも１の配列を含む。
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号１によって識別されるヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号６と同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号９によって識別されるヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む。
【００３５】
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列の複数のタンデムリピートを含む。本明細書で使用されるとき、特に明記しない限り、タンデムリピートは相互に続く配列である。いくつかの例において、タンデムリピートは相互に直接隣り合っている場合がある（例として、ＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（下線が引かれた繰り返し配列））。いくつかの例において、タンデムリピートは、別の配列（例として、リンカー配列）によって分離されてもよい（例として、ＴＴＡＧＧＧ−リンカー−ＴＴＡＧＧＧ−リンカー−ＴＴＡＧＧＧ）。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、複数のタンデムリピート配列（例として、２、３、４または５のタンデムリピート）を含む。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号１の複数のタンデムリピート（例として、２、３、４または５のリピート）を含む。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号９の複数のタンデムリピート（例として、２、３、４または５のリピート）を含む。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号６の複数のタンデムリピート（例として、２、３、４または５のリピート）を含む。
【００３６】
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドにおける複数のタンデムリピート配列は、リンカーによって分離されている。リンカーは、センス方向またはアンチセンス方向に配向され得る。例として、リンカーがセンス方向にも配向されている複数のタンデムリピート配列を分離している場合、リンカーはセンス方向に配向され得る。ある態様において、リンカーは、アンチセンス方向にも配向されている複数のタンデムリピート配列を分離しているとき、アンチセンス方向に配向されている。
いくつかの態様において、リンカーは、ポリＡリンカー（一続きの「Ａ」ヌクレオチド）である。いくつかの態様において、ポリＡリンカーは、配列番号８によって識別される少なくとも１のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ポリＡリンカーは、配列番号８によって識別される２のヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、ポリＡリンカーは、配列番号８によって識別される３のヌクレオチド配列を含む。例えば、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列の３のタンデムリピートを有することができ、タンデムリピートの各々は、配列番号８によって識別されるリンカーによって分離され得る。ある態様において、リンカーは、配列番号８のアンチセンス配列（すなわち、アンチセンス方向に配向された配列番号８）である少なくとも１のヌクレオチド配列（例として、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０のヌクレオチド配列）を含む。
【００３７】
非限定的な例として、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号９または配列番号６の配列の３のタンデムリピートを有し得、タンデムリピートの各々は、配列番号８によって識別されるリンカーによって分離され得る。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、配列番号３５に対して少なくとも９０％（例として、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一である配列を含む。ある態様において、組み換えウイルスゲノムは一本鎖であり、治療用ヌクレオチド配列（例として、因子ＩＸ）の（５'）上流（例として、５'ＵＴＲ）に位置付けられる配列番号３５の配列を含む。ある態様において、組み換えウイルスゲノムは一本鎖であり、治療用ヌクレオチド配列（例として、因子ＩＸ）の（３'）下流（例として、３'ＵＴＲを含む、治療用核酸に連結されたポリＡテールの（３'）下流））に位置付けられる配列番号３５の配列を含む。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、配列番号３４に対して少なくとも９０％（例として、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一である配列を含む。
【００３８】
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列の組み合わせを含む。例えば、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列の少なくとも１のコピー（例として、１、２、３、４、５、６または７コピー）と組み合わせて、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列の少なくとも１のコピー（例として、１、２、３、４、５、６または７コピー）を包含し得る。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号９の３コピーおよび配列番号５（例として、配列番号３９）の３コピーを含む。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号３の３コピーおよび配列番号２の３コピーを含む。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号１の５コピーおよび配列番号９の３コピーを含む。下記の例８および例の材料および方法のセクションも参照。
【００３９】
例のセクションで論じられるように、単一の発現構築物（例として、ｓｓＡＡＶ）は、複数（例として、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１５、または少なくとも２０）のタイプの阻害性オリゴヌクレオチド、センス配向のあるタイプ（１以上のコピー、例として、２、３、４または５のタンデムコピー）、およびアンチセンス配向の別のタイプ（１以上のコピー、例として、２、３、４または５のタンデムコピー）を包含し得る。特定の理論に束縛されることなく、２つの異なるタイプの阻害性オリゴヌクレオチドを含めることにより、阻害性オリゴヌクレオチド間の自己アニーリングおよび不要なヘアピン構造の形成を防ぎ得る。いくつかの態様において、センス配向の阻害性オリゴヌクレオチドおよびアンチセンス方向の別の阻害性オリゴヌクレオチドを含む組み換え一本鎖ウイルスゲノムは、パッケージされた各ウイルスゲノムが正しい配向の少なくとも１の阻害性オリゴヌクレオチドを含む確率を増加させる。
【００４０】
非限定的な例として、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号９または配列番号６の配列の３のタンデムリピートおよび配列番号５の配列の３のタンデムリピートを有し得る。配列番号９または配列番号６の配列のタンデムリピートは、配列番号５の配列のタンデムリピートとは反対の方向に配向され得る。例えば、配列番号９または配列番号６の配列のタンデムリピートは、センス方向に配向されてもよく、配列番号５の配列のタンデムリピートは、アンチセンス方向に配向されてもよく、逆もまた同様である。配列番号９または配列番号６のタンデムリピートは、配列番号５の配列のタンデムリピートの（５'）上流または（３'）下流であり得る。タンデムリピートの各々（例として、配列番号５、６、９、またはそれらの任意の組み合わせのリピート）は、センスまたはアンチセンス方向に配向された配列番号８によって識別されるリンカーによって分離され得る。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、配列番号３９に対して少なくとも９０％（例として、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一である配列を含む。ある態様において、組み換えウイルスゲノムは一本鎖であり、治療用ヌクレオチド配列の（５'）上流（例として、５'ＵＴＲ）に位置付けられる配列番号３９の配列を含む。ある態様において、組み換えウイルスゲノムは一本鎖であり、治療用ヌクレオチド配列の（３'）下流（例として、治療用核酸に連結されたポリＡテールの（３'）下流（３'ＵＴＲを含む））に位置付けられる配列番号３９の配列を含む。
【００４１】
ある態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号３の配列の３のタンデムリピートおよび配列番号２の配列の３のタンデムリピートを有し得る。配列番号３の配列のタンデムリピートは配列番号２の配列のタンデムリピートの反対方向に配向され得る。例えば、配列番号３の配列のタンデムリピートはセンス方向に配向されてもよく、配列番号２の配列のタンデムリピートはアンチセンス方向に配向されてもよく、逆もまた同様である。配列番号３のタンデムリピートは、配列番号２の配列のタンデムリピートの（５'）上流または（３'）下流であり得る。タンデムリピートの各々（例として、配列番号２、３、またはそれらの任意の組み合わせのリピート）は、センスまたはアンチセンス方向に配向された配列番号８によって識別されるリンカーによって分離され得る。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、配列番号４０に対して少なくとも９０％（例として、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）同一である配列を含む。ある態様において、組み換えウイルスゲノムは一本鎖であり、治療用ヌクレオチド配列の（５'）上流（例として、５'ＵＴＲ）に位置付けられる配列番号４０の配列を含む。ある態様において、組み換えウイルスゲノムは一本鎖であり、治療用ヌクレオチド配列の（３'）下流（例として、治療用核酸に連結されたポリＡテールの（３'）下流（３'ＵＴＲを含む））に位置付けられる配列番号４０の配列を含む。
【００４２】
本開示は、本明細書に記載のものなどの任意の阻害性オリゴヌクレオチド、ならびに参照の阻害性オリゴヌクレオチド（例として、配列番号１、配列番号６、または配列番号９）とある程度の配列同一性（パーセント同一性）を共有する阻害性オリゴヌクレオチドの使用を包含することが理解されるべきである。パーセント同一性は、配列を比較することにより決定される、２以上のポリヌクレオチド（核酸）の配列間の関係を指す。同一性は、特定の数学モデルまたはコンピュータプログラム（例として、「アルゴリズム」）によって処理されたギャップアラインメント（存在する場合）によって、より小さい方の２以上の配列間の同一マッチのパーセントを測定する。関連分子の同一性は、既知の方法で容易に計算され得る。核酸配列に適用される「パーセント（％）同一性」は、配列をアラインメントさせてギャップ（必要に応じて、最大のパーセント同一性を達成するためのギャップ）を導入した後の、２番目の配列の核酸配列の残基と同一である候補核酸配列の核酸残基のパーセントとして定義される。同一性は、パーセント同一性の計算に依存するが、計算で導入されたギャップおよびペナルティのために値が異なる場合がある。特定の阻害性オリゴヌクレオチドのバリアントは、本明細書に記載され、当業者に知られている配列アラインメントプログラムおよびパラメータによって決定されるように、その特定の参照の阻害性オリゴヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％であるが１００％未満の配列同一性を有し得る。
したがって、いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％同一である少なくとも１の配列を含む。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列に対して少なくとも９０％同一である少なくとも１の配列を含む。
【００４３】
配列の比較および２の配列間のパーセント同一性の決定は、数学的アルゴリズムを使用して実行され得る。同一性を決定するための技法は、一般に入手可能なコンピュータプログラムに体系化されている。２の配列間の相同性を決定するための例示的なコンピュータソフトウェアは、ＧＣＧプログラムパッケージ（Devereux, J. et al. Nucleic Acids Research, 12(1): 387, 1984）、ＢＬＡＳＴスイート（Altschul, S. F. et al. Nucleic Acids Res. 25: 3389, 1997）、およびＦＡＳＴＡ（Altschul, S. F. et al. J. Molec. Biol. 215: 403, 1990）を含むが、これらの限定されない。他の技法は、以下を含む：スミスウォーターマンアルゴリズム（Smith, T.F. et al. J. Mol. Biol. 147: 195, 1981）；ニードルマンブンシュアルゴリズム（Needleman, S.B. et al. J. Mol. Biol. 48: 443, 1970）；および高速最適グローバル配列アラインメントアルゴリズム（Fast Optimal Global Sequence Alignment Algorithm（ＦＯＧＳＡＡ）（Chakraborty, A. et al. Sci Rep.3: 1746, 2013）。
【００４４】
組み換えウイルスゲノム
本開示は、（少なくとも１の）阻害性オリゴヌクレオチドがウイルスゲノムに含まれている組み換えウイルスゲノムを提供する。いくつかの態様において、２以上の阻害性オリゴヌクレオチドがウイルスゲノムに含まれる。複数の阻害性オリゴヌクレオチドは、（互いに対して）ウイルスゲノム全体の種々の場所に位置付けられ得る。ウイルスゲノムは、典型的には、治療用ヌクレオチド配列および阻害性オリゴヌクレオチドを包含する。阻害性オリゴヌクレオチドは、例えば、ウイルスゲノムの３'非翻訳領域（ＵＴＲ）に位置付けられ得る（例として、下記の例２のｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ-３ｘｃ４１およびｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ-３ｘテロメアを参照）。ある態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、治療用ヌクレオチド配列に対して（３'）下流にある。ある態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、治療用核酸に連結されたポリＡテールの（３'）下流に位置付けられる。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、ウイルスゲノムの５'ＵＴＲに位置付けられる。いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドは、治療用ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターの（５'）上流に位置付けられる。いくつかの例において、阻害性オリゴヌクレオチドは、治療用ヌクレオチド配列に対して（５'）上流に位置付けられる。非限定的な例として、組み換えウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列の（３'）下流（例として、治療用核酸に連結されたポリＡテールの（３'）下流（３'ＵＴＲを含む））に位置付けられる阻害性オリゴヌクレオチドおよび（５'）上流（例として、５'ＵＴＲ）に位置付けられる阻害性オリゴヌクレオチドを含み得る。驚くべきことに、プロモーターに対するウイルスゲノムにおける阻害性オリゴヌクレオチドの場所は、オリゴヌクレオチドの阻害機能に影響を与えない。組み換えウイルスゲノムは、炎症性核酸（例として、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）を含み得る。炎症性核酸はウイルスゲノムのどこにでも位置付けられ得る（例として、ウイルスのＩＴＲ、プロモーター、イントロン、導入遺伝子、５'ＵＴＲ、３'ＵＴＲなど）。例えば、治療用ヌクレオチド配列は、炎症性核酸（例として、ＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチド）を含み得る。
【００４５】
本開示の阻害性オリゴヌクレオチドは、ウイルスゲノムにおいてセンス方向および／またはアンチセンス方向に配向され得る。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、センス方向に、阻害性オリゴヌクレオチドの１、２、３、４、または５コピー（例として、配列番号９の１、２、３、４、または５コピー）を含む。いくつかの態様において、同じウイルスゲノムは、同じ阻害性オリゴヌクレオチドの１、２、３、４、または５コピー（例として、配列番号９の逆相補体の１、２、３、４、または５）またはアンチセンス方向の種々のオリゴヌクレオチド（例として、配列番号１または配列番号５の逆相補体）を含む。下記の例６および例の材料および方法のセクションも参照。
【００４６】
本明細書で提供される組み換えウイルスゲノムは、いくつかの態様において、目的の治療用ヌクレオチド配列（例として、治療用ＤＮＡ、治療用ＲＮＡ、および／またはヌクレオチド配列によってコードされる治療用タンパク質）を（対照へ）送達するために使用され得る。いくつかの態様において、本開示の組み換えウイルスゲノムは、遺伝子送達ベクターである。したがって、いくつかの態様において、治療用ヌクレオチド配列は、本明細書の他の場所で論じられているように、治療用タンパク質をコードする遺伝子である。
組み換えウイルスゲノムは、一般に、天然に存在しないウイルスゲノムである。ウイルスゲノムは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘、天然痘ウイルス、Ｂ型肝炎、サイトメガロウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、サル痘ウイルス、帯状疱疹、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、またはヒトパルボウイルスＢ１９からのものであり得る。他のウイルスゲノムは、本開示によって包含されている。
【００４７】
いくつかの態様において、ウイルスゲノムはＡＡＶゲノムである。ＡＡＶは、エンベロープのない小さなウイルスであり、長さが約５ｋｂの一本鎖の線形ＤＮＡゲノムをパッケージしており、遺伝子導入ビヒクルとしての使用に適合している（Samulski, RJ et al., Annu Rev Virol. 2014;1(1):427-51）。ＡＡＶのコーディング領域は、ＤＮＡ複製の起点として作用し、一次パッケージングシグナルとして作用する逆方向末端反復（ＩＴＲ）に隣接している（McLaughlin, SK et al. J Virol. 1988;62(6):1963-73；Hauswirth, WW et al. 1977;78(2):488-99）。プラス鎖およびマイナス鎖の両方がビリオンに等しくうまくパッケージされ、感染することができる（Zhong, L et al. Mol Ther. 2008;16(2):290-5；Zhou, X et al. Mol Ther. 2008;16(3):494-9；Samulski, RJ et al. J Virol. 1987;61(10):3096-101）。さらに、２のＩＴＲのうちの１に小さな欠失があると、自己相補的ベクターのパッケージングが可能になり、ウイルスのコーティングが外れた後にゲノムが自己アニーリングする。これは細胞のより効率的な形質導入をもたらすが、コーディング能力を半分に減少させる（McCarty, DM et al. Mol Ther. 2008;16(10):1648-56；McCarty, DM et al. Gene Ther. 2001;8(16):1248-54）。
いくつかの態様において、本開示の組み換えウイルスゲノムは、一本鎖ヌクレオチド配列を包含する。いくつかの態様において、ウイルスゲノムは自己相補的である。自己相補的ウイルスゲノムは、分子内二本鎖ヌクレオチド配列を形成するウイルスゲノムである。組み換えウイルスゲノムおよび自己相補的（ｓｃ）ウイルスゲノムを作製するための方法の例は、例２および下記の例の材料および方法のセクションに提供されている。
【００４８】
いくつかの態様において、ウイルスゲノムは、一本鎖ヌクレオチド配列（例として、ｓｓＡＡＶ）である。いくつかの態様において、一本鎖ウイルスゲノムは分子内二本鎖ヌクレオチド配列を形成しない。ある態様において、組み換えウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列の（３'）下流（例として、治療用核酸に連結されたポリＡテールの（３'）下流（ウイルスゲノムの３'ＵＴＲを含む））の阻害性オリゴヌクレオチドを含む一本鎖ウイルスゲノムである。ある態様において、組み換えウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列の（５'）上流（例として、ウイルスゲノムの５'ＵＴＲ）の阻害性オリゴヌクレオチドを含む一本鎖ウイルスゲノムである。非限定的な例として、治療用ヌクレオチド配列（例として、因子ＩＸ）の（５'）上流に位置付けられる阻害性オリゴヌクレオチドを含む一本鎖ウイルスゲノムは、配列番号３４として提供される。ある態様において、組み換えウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列の（５'）上流（例として、ウイルスゲノムの５'ＵＴＲ）の阻害性オリゴヌクレオチドおよび治療用ヌクレオチド配列の（３'）下流（例として、ウイルスゲノムの３'ＵＴＲ）の阻害性オリゴヌクレオチドを含む一本鎖ウイルスゲノムである。
【００４９】
非限定的な例として、組み換えウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列の（５'）上流に位置付けられる少なくとも２の種々の阻害性オリゴヌクレオチドおよび治療用ヌクレオチド配列の（３'）下流に位置付けられる少なくとも２の種々の阻害性オリゴヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの例において、すべての阻害性オリゴヌクレオチド配列は、組み換えウイルスゲノムにおいて異なる。例えば、組み換えウイルスゲノムは、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つの配列と少なくとも９０％同一である配列の種々の複数のタンデムリピートを各々含む阻害性オリゴヌクレオチドを含み得る。いくつかの例において、阻害性オリゴヌクレオチドは、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つの配列から選択される２の異なる配列の複数のタンデムリピートを含む。
【００５０】
いくつかの例において、組み換えウイルスゲノムは、１）治療用ヌクレオチド配列の（５'）上流（例として、５'ＵＴＲ）に位置付けられる配列番号３９に対して少なくとも９０％（例として、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一）である阻害性オリゴヌクレオチド配列、および２）治療用ヌクレオチド配列の（３'）下流（例として、３'ＵＴＲ）に位置付けられる配列番号４０に対して少なくとも９０％（例として、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または同一）である阻害性オリゴヌクレオチド配列を含む。代替的に、配列番号３９と少なくとも９０％同一である阻害性オリゴヌクレオチドは、治療用ヌクレオチド配列の（３'）下流（例として、３'ＵＴＲ）に位置付けられ得、配列番号４０と少なくとも９０％同一である阻害性オリゴヌクレオチドは、治療用ヌクレオチド配列の（５'）上流（例として、５'ＵＴＲ）に位置付けられ得る。
自己アニーリングが制限された一本鎖ウイルスゲノムを作製するための例示的な方法は、例８および下記の例の材料および方法のセクションに提供されている。
【００５１】
本開示の組み換えウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列を含み得る。治療用ヌクレオチド配列は、治療効果を与えるか、またはin vivoで投与されたときに対象に治療効果を与える分子（例として、タンパク質）をコードするヌクレオチド配列（例として、ＲＮＡまたはＤＮＡ）である。いくつかの態様において、治療用ヌクレオチド配列は、治療用ＲＮＡ配列（例として、ＲＮＡｉ分子）である。いくつかの態様において、治療用ヌクレオチド配列は、治療用ＤＮＡ配列（例として、標的に結合するＤＮＡアプタマー）である。いくつかの態様において、治療用ヌクレオチド配列は、治療用タンパク質またはペプチドをコードする。例えば、治療用ヌクレオチド配列は、対象に存在するタンパク質の改変（例として、変異または切断）バージョンを補償するため、または対象が欠如しているタンパク質を補償するために、野生型（非改変）タンパク質をコードし得る。治療用ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質の非限定的な例は、抗体、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカインおよび融合タンパク質を包含する。
【００５２】
いくつかの態様において、治療用ヌクレオチド配列は、疾患アレルを置き換えるように構成される。例えば、治療用ヌクレオチド配列は、非相同末端結合または相同組み換えを促進するように設計され得る。いくつかの態様において、治療用遺伝子配列は、プログラム可能なヌクレアーゼである。プログラム可能なヌクレアーゼの非限定的な例は、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、Ｃ２ｃ２、ジンクフィンガー、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、およびエフェクタードメインへのそれらの融合物を包含する。エフェクタードメインは、転写アクチベーター、転写リプレッサー、転位酵素、リコンビナーゼ、およびデアミナーゼを包含する。いくつかの態様において、治療用ヌクレオチド配列は、ガイドＲＮＡ（例として、遺伝子編集用）またはＤＮＡテンプレート（例として、相同組み換え用）をコードする。
【００５３】
いくつかの例において、治療用ヌクレオチド配列自体が治療用分子である。いくつかの態様において、ヌクレオチド配列は、分子標的（例として、タンパク質標的）に結合するＤＮＡアプタマーである。ＳＥＬＥＸ（指数的濃縮によるリガンドの系統的進化）と呼ばれるプロセスは、標的に強く結合するＤＮＡライブラリからオリゴヌクレオチドを選択するために頻繁に使用される（Zhou J et al. Ther Nucleic Acids. 2014;3:e169）。ＤＮＡアプタマーの例は、細胞タンパク質ヌクレオリンに結合し、抗がん剤として試験されたＡＳ１４１１（Bates PJ et al. Exp Mol Pathol. 2009;86(3):151-64；Soundararajan S et al. Cancer Res. 2008;68(7):2358-65）、およびフォンウィルブランド因子に結合して血小板との相互作用を阻害し、それにより抗血栓効果を誘導するＰＥＧ化ＤＮＡアプタマーであるＡＲＣ１７７９（Markus HS et al. Stroke. 2011;42(8):2149-53）を包含する。
【００５４】
ある態様において、治療用ヌクレオチド配列は、疾患遺伝子の発現を減少させることができる配列をコードする。いくつかの態様において、治療用ヌクレオチド配列は、疾患遺伝子をコードするｍＲＮＡに相補的である。非限定的な例として、治療用ヌクレオチド配列は、ガイドＲＮＡ（例として、ＣＲＩＳＰＲシステムでの使用のため）、ｓｉＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、またはショートヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）であり得る。いくつかの態様において、治療用ヌクレオチド配列は突然変異アレルを標的とする。
【００５５】
いくつかの態様において、組み換えウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む。プロモーターは、核酸配列の残りの転写の開始および速度が制御される、核酸配列の制御領域である。プロモーターはまた、ＲＮＡポリメラーゼおよび他の転写因子などの、調節タンパク質および分子が結合し得るサブ領域を含み得る。プロモーターは、それが制御する核酸配列の発現または転写を駆動する。プロモーターは、ヌクレオチド配列に対して正しい機能的な場所および配向にあり、その配列の転写開始および／または発現を制御（「駆動」）するとき、ヌクレオチド配列に「作動可能に連結」されていると考えられる。プロモーターは構成的または誘導的であり得る。誘導性プロモーターは、特定の因子の存在または不在によって調節される（例として、活性化または不活性化される）プロモーターである。
【００５６】
いくつかの例において、好適な宿主細胞株（例として、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨｅＬａ細胞およびＳｆ９昆虫細胞）は、日常的な慣行に従って、本明細書に開示される組み換えウイルスゲノムをコードするウイルス粒子を産生するために使用され得る。本明細書に記載のウイルスの構成要素、少なくとも１の治療用ヌクレオチド配列および少なくとも１の阻害性オリゴヌクレオチドをコードする１以上の発現ベクター（例として、ウイルスベクター）を好適な宿主細胞に導入し、次いで好適な条件下で培養して、ウイルス粒子を産生することができる。必要に応じて、ヘルパーウイルスを使用して、ウイルス粒子の複製および／またはアセンブリを促進することができる。代替的に、ウイルスゲノム複製および／またはウイルス粒子アセンブリのための不可欠なウイルスの構成要素の１以上を産生する宿主細胞株が使用され得る。細胞培養の上清は収集され得、そこに含まれるウイルス粒子は、日常的な方法論によって収集され得る。例として、ＡＡＶの産生方法は下記の材料および方法のセクションにおいて提供される。
【００５７】
本明細書で提供される組み換えウイルスゲノムは、静脈内、筋肉内、網膜下、硝子体内、髄腔内、実質内、および頭蓋内注射によって投与され得る。いくつかの態様において、組み換えウイルスゲノムは、筋肉内注射によって送達される。いくつかの態様において、組み換えウイルスゲノムは、静脈内注射によって送達される。
いくつかの態様において、組み換えウイルスゲノムは、肝臓、骨格筋、心筋、目（例として、網膜）、中枢神経系またはそれらの任意の組み合わせにおける細胞を形質導入するために使用される。
【００５８】
医薬組成物
いくつかの側面において、本開示は、本明細書に開示される組み換えウイルスゲノムのいずれかを含む組成物を提供する。いくつかの態様において、組成物は、薬学的に許容し得る賦形剤をさらに含む。薬学的に許容し得る賦形剤の非限定的な例は、水、生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールおよびそれらの組み合わせを包含する。賦形剤は、投与の様式およびルート、および標準的な医薬プラクティスに基づいて選択され得る。
いくつかの態様において、組み換えウイルスゲノムは、送達ビヒクル中に処方され得る。送達ビヒクルの非限定的な例は、ナノカプセルおよびナノスフェアなどのナノ粒子を包含する。例として、Sing, R et al. Exp Mol Pathol. 2009;86(3):215-223を参照。ナノカプセルは、しばしば薬物（例として、本開示の組み換えウイルスゲノム）をカプセル化するポリマーシェルから構成される。ナノスフェアは、しばしば薬物（例として、組み換えウイルスゲノム）が全体に分散している固体ポリマーマトリックスから構成される。いくつかの態様において、ナノ粒子は、リポソームなどの脂質粒子である。例として、Puri, A et al. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst. 2009;26(6):523-80を参照。「ナノ粒子」という用語は、マイクロカプセルおよびミクロスフェアなどのマイクロ粒子も包含する。
【００５９】
カプセル化された薬剤の送達のための粒子を作製するために開発された方法は、文献に記載されている（例えば、Doubrow, M., Ed., "Microcapsules and Nanoparticles in Medicine and Pharmacy," CRC Press, Boca Raton, 1992；Mathiowitz and Langer, J. Controlled Release 5:13-22, 1987；Mathiowitz et al. Reactive Polymers 6:275-283,1987；Mathiowitz et al. J. Appl. Polymer Sci. 35:755-774, 1988を参照されたい。これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）。
本明細書に開示される組み換えウイルスゲノムのいずれかを含む組成物などの医薬品の製剤および／または製造における一般的な考慮事項は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa (1990) において見つけられ得る（その全体が参照されることによって本明細書に組み込まれる）。
【００６０】
送達の方法
本明細書に開示される組み換えウイルスゲノムまたは組成物のいずれかを対象（例として、ヒト、マウス、ウサギ、ヤギ、ヒツジまたはブタなどの哺乳動物対象）に投与して、炎症反応を阻害（例として、炎症反応の誘導を阻害）し得る。いくつかの態様において、対象は遺伝子治療を必要としている。例えば、対象は、遺伝性障害（例として、染色体異常、および／または突然変異、切断、挿入および欠失を含む遺伝子欠陥を特徴とする）を有し得る。
【００６１】
対象は、疾患を有し得る、疾患を有している疑いがあり得る、または疾患のリスクがあり得る。いくつかの態様において、疾患は眼の疾患である。本明細書で使用される場合、「眼の疾患」または「目の疾患」は、目の疾患または状態（例として、網膜疾患）である。目に影響を与える状態の非限定的な例は、以下を包含する：外反症、ラゴフタルモス、ブレファロカラシス、眼瞼下垂、麦粒腫、黄色腫、皮膚炎、デモデックス、リーシュマニア症、ロイア症、オンコセルカ症、フテリア症、（単純ヘルペス）、ハンセン病、伝染性軟属腫、結核、イチゴ腫、帯状疱疹、膿痂疹、涙腺炎、エピフォラ、眼球外炎、結膜炎、強膜炎、角膜炎、角膜潰瘍／角膜擦過傷、雪失明／アークアイ、チゲソン表在性点状角膜症、角膜血管新生、フックス性ジストロフィー、円錐角膜、乾性角結膜炎、虹彩炎、虹彩、ブドウ膜炎、交感性眼炎、白内障、脈絡網膜炎、限局性脈絡網膜炎、脈絡網膜炎、脈絡膜炎、網膜炎、網膜脈絡膜炎、播種性脈絡網膜炎症、滲出性網膜症、後部毛様体炎、扁平上皮炎、脈絡網膜炎症、原田病、網脈絡膜炎症、脈絡膜、脈絡網膜瘢痕、網膜黄斑瘢痕、後極（炎症後）（外傷後）、太陽網膜症、脈絡膜変性、萎縮、硬化症、血管様筋、脈絡膜ジストロフィー、脈絡膜貧血、脈絡膜、乳輪、（乳頭周囲）、旋回性萎縮、脈絡膜、オルニチン血症、脈絡膜出血、脈絡膜出血、ＮＯＳ（特に指定されていない）、脈絡膜剥離、脈絡網膜、脈絡網膜炎症、感染性および寄生虫性疾患、脈絡網膜炎、梅毒、トキソプラズマ、結核、脈絡網膜、網膜剥離、視力障害、網膜分離症、高血圧性網膜症、糖尿病性網膜症、網膜症、未熟児網膜症、加齢性黄斑変性症、網膜症黄斑、黄斑変性、ブルズアイ黄斑症、網膜上膜、末梢網膜変性、遺伝性網膜ジストロフィー、網膜色素変性症、網膜出血、網膜層、中枢性漿液性網膜症、網膜剥離、網膜障害、黄斑浮腫、網膜黄斑、網膜障害、糖尿病網膜症、緑内障、視神経症、眼高血圧症、開放隅角緑内障、閉塞隅角緑内障、正常眼圧緑内障、開放隅角緑内障、隅角閉塞緑内障、フローター、レーバー遺伝性視神経症、視神経乳頭瘤、斜視、眼球麻痺、眼筋、進行性外眼筋麻痺、内斜視、外斜視、屈折異常、調節障害、遠視、近視、乱視、不同視、老眼、眼筋麻痺、弱視、レーバー先天性黒内障、暗点、遠視、色盲、色覚異常／盲目、夜盲、失明、河川盲目症、小眼球症／眼欠損症、レッドアイ、アーガイル・ロバートソン瞳孔、瞳孔、角膜真菌症、眼球乾燥症、および無虹彩。
【００６２】
ある態様において、疾患は筋肉に影響を与える。筋肉疾患の非限定的な例は、以下を包含する：バース症候群、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、筋緊張性ジストロフィー、顔面肩甲上腕筋型筋ジストロフィー、ミトコンドリア脳筋症、ＭＥＬＡＳ症候群、ＭＥＲＲＦ症候群、ＭＮＧＩＥ症候群、ミトコンドリア筋症、カーンズ・セイヤー症候群、筋肉痛、線維筋痛症、リウマチ性多発筋痛症、筋腫、筋炎、皮膚筋炎、神経筋疾患、カーンズ・セイヤー症候群、筋ジストロフィー、筋無力症、先天性筋無力症症候群、ランバートイートン筋無力症症候群、重症筋無力症、筋緊張症、先天性筋緊張症、脊髄性筋萎縮症、筋強縮、眼筋麻痺、および横紋筋融解症。
【００６３】
好適な投与ルートは、注射による非経口的、例えば、静脈内、皮下、筋肉内、髄腔内、腹腔内、実質内、皮内、胸骨内、関節内、頭蓋内、病変内、直腸内、膣内、鼻腔内、胃内、気管内、または肺内のものを包含する。代替的に、坐剤、経口製剤、経腸、経鼻、局所または経粘膜投与を含む他の投与様式が望ましい場合がある。経口製剤は、例えば、医薬品グレードのサッカリン、セルロース、炭酸マグネシウムなどの通常使用される初期成分を包含し得る。これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、徐放性製剤または粉末の形態をとり得る。
【００６４】
いくつかの態様において、阻害性オリゴヌクレオチドを含む組み換えウイルスゲノムは筋肉内に投与される。いくつかの態様において、筋肉内に投与される組み換えウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列および阻害性ヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルスゲノムを含む。いくつかの態様において、阻害性ヌクレオチド配列は、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、筋肉内に投与されるアデノ随伴ウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列および配列番号１の３のタンデムリピートを含む。いくつかの態様において、筋肉内に投与されるアデノ随伴ウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列および配列番号９の３のタンデムリピートを含む。いくつかの態様において、筋肉内に投与されるウイルスゲノムは、筋細胞において発現される。
【００６５】
いくつかの態様において、本開示の組み換えウイルスゲノムは、対象に静脈内投与される。いくつかの態様において、組み換えウイルスゲノムは、対象に腹腔内投与される。いくつかの態様において、静脈内または腹腔内に投与された組み換えウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列および阻害性ヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルスゲノムを含む。いくつかの態様において、阻害性ヌクレオチド配列は、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、静脈内または腹腔内に投与されるアデノ随伴ウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列および配列番号１の３のタンデムリピートを含む。いくつかの態様において、静脈内または腹腔内に投与されるアデノ随伴ウイルスゲノムは、治療用ヌクレオチド配列および配列番号９の３のタンデムリピートを含む。いくつかの態様において、静脈内または腹腔内に投与される組み換えウイルスゲノムは、対象の肝臓細胞において発現される。
【００６６】
炎症反応（例として、局所的または全身的）は、対象におけるサイトカイン活性および／または発現のレベルを測定することによって評価され得る。いくつかの態様において、ＩＬ−６、ＴＮＦ、インターフェロン（例として、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、およびＩＦＮγ）、および／またはＣＸＣＬ１０の発現および／または活性のレベルが測定される。典型的には、サイトカインの発現および／または活性のレベルは、炎症反応の程度と相関している。したがって、本開示の組み換えウイルスゲノム（治療用ヌクレオチド配列および阻害性オリゴヌクレオチドを含む）を受けた対象は、特定のサイトカインの減少または検出不能な発現および／または活性レベルを有し得、阻害性オリゴヌクレオチドを含まない組み換えウイルスゲノムを受けた対象と比較して、炎症反応の減少または非存在を示す。いくつかの態様において、比較のための対照炎症反応は、同じまたは実質的に同様の条件下で同じまたは実質的に同様のアッセイによって決定される阻害性オリゴヌクレオチドを含まないウイルスゲノムによって誘発される炎症反応である。アデノ随伴ウイルスの例示的な対照ウイルスゲノムは、下記の例２、３、４および５で使用されるｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ-３ｘ対照およびｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰを含む。
【００６７】
いくつかの態様において、本開示の組み換えウイルスゲノムは、対照よりも少なくとも２倍低い対象における炎症反応を誘発する。例えば、組み換えウイルスゲノムは、対照よりも少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２５倍または５０倍低い対象における炎症反応を誘発し得る。いくつかの態様において、組み換えウイルスゲノムは、対照よりも少なくとも１０％低い対象における炎症反応を誘発する。例えば、組み換えウイルスゲノムは、対照よりも少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、７０％、８０％または９０％低い対象における炎症反応を誘発し得る。いくつかの態様において、組み換えウイルスゲノムは、炎症反応が検出不能であるように、対照と比較して炎症反応の誘導を阻害し得る。いくつかの態様において、対照は、阻害性オリゴヌクレオチドを含まないウイルスゲノムによって対象において誘発される炎症反応である。
【００６８】
ある態様において、本開示の組み換えウイルスゲノムは、対照と比較して、対象の目におけるＡＡＶ誘発性の病的状態を低減する。いくつかの態様において、対照は、組織の損傷および形態の変化を含む、阻害性オリゴヌクレオチドを含まないウイルスゲノムによって臓器に誘発される病的状態である。例えば、本開示の組み換えウイルスゲノムは、錐体外節の喪失を低減し、錐体外節の短縮を低減し、または対照よりも小さく錐体外節の形態を変化させ得る。例えば、本開示の組み換えウイルスゲノムを受ける目は、錐体外節のより良好な保存を有し得、ウイルスゲノムを受けない目に形態学的により近いものに見えた。
目または目の組織の形態は、錐体アレスチン染色およびオプシン染色を含む、当該技術分野において知られている方法を使用して決定され得る。in vivo光干渉断層撮影（ＯＣＴ）ｂスキャンからの網膜画像を使用して、外側の網膜積層の損傷を決定し得る。非限定的な例として、光干渉断層撮影（ＯＣＴ）ｂスキャン上で様々なタイプの損傷（例として、網膜剥離、非重度の層状破壊、または重度の層状損傷）の長さが測定され得る（例として、例９を参照）。いくつかの例において、本開示の組み換えウイルスゲノムは、阻害性オリゴヌクレオチドなしのウイルスゲノムと比較して、重度の層状損傷の誘発が少ないか、または誘発しない。
【００６９】
いくつかの態様において、本開示の組み換えウイルスゲノム（したがって、組み換えウイルスゲノムの治療用ヌクレオチド配列）は、対照よりも少なくとも２倍高いレベルで対象の細胞において発現される。例えば、組み換えウイルスゲノムは、対照よりも少なくとも３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２５倍、または５０倍高いレベルで対象の細胞において発現され得る。いくつかの態様において、本開示の組み換えウイルスゲノムは、対照よりも少なくとも１０％高いレベルで対象の細胞において発現される。例えば、組み換えウイルスゲノムは、対照よりも少なくとも１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、７０％、８０％、または９０％高いレベルで対象の細胞において発現され得る。いくつかの態様において、対照は、阻害性オリゴヌクレオチドを含まないウイルスゲノムの発現レベルである。
【００７０】
いくつかの態様において、本開示の組み換えウイルスゲノムの治療有効量は、筋肉障害または肝臓障害などの遺伝性障害を処置するために対象に投与される。いくつかの態様において、治療有効量は、対象に治療効果を与えるのに必要な治療用ヌクレオチド配列（および／または組み換えウイルスゲノム）の量である。いくつかの態様において、治療有効量は、本開示の組み換えウイルスゲノム（治療用ヌクレオチド配列および阻害性ヌクレオチド配列を含む）の投与後の炎症反応の誘導を阻害するのに必要な阻害性オリゴヌクレオチドの量である。当業者に認識されているように、有効量は、投与のルート、賦形剤の使用、および他の活性剤との併用に応じて変化する。有効量は、例えば、対象の体重、性別、および年齢、ならびに対象の免疫系および／または遺伝的素因の強さを含む、処置される対象に依存する。好適な投薬量の範囲は、当業者により容易に決定可能である。本明細書に開示される組成物の有効量（したがって、投薬量および／または投薬スケジュール）はまた、ウイルスゲノムのタイプ、治療用ヌクレオチド配列のタイプ、および／または阻害性オリゴヌクレオチドのタイプに依存し得る。
【００７１】
いくつかの態様において、本開示の組み換えウイルスゲノムの治療有効量は、阻害性オリゴヌクレオチドを含まないウイルスゲノムの治療有効量よりも少なくとも２０％低い。例えば、本開示の組み換えウイルスゲノムの治療有効量は、阻害性オリゴヌクレオチドを含まないウイルスゲノムの治療有効量よりも少なくとも２５％、３０％、４０％、５０％または６０％（しかし１００％未満）低くてもよい。いくつかの態様において、減少した治療有効量での本開示の組み換えウイルスゲノムの投与は、コードされた治療用分子の発現を、阻害性オリゴヌクレオチド配列を含まないウイルスゲノムからの同じコードされた治療用分子の発現以上（例として、当該発現よりも少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％大きい）のレベルでもたらす。
【００７２】
追加の態様
本開示はまた、番号付けされた段落に包含される以下の追加の態様を提供する。
１．治療用ヌクレオチド配列と、核酸感知トール様受容体（ＴＬＲ）の活性化および／またはシグナル伝達を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドとを含む組み換えウイルスゲノムを対象に投与することを含む方法であって、組み換えウイルスゲノムが標的組織における組み換えウイルスゲノムに対する炎症反応を阻害する、前記方法。
２．標的組織が筋肉である、段落１の方法。
３．標的組織が肝臓である、段落１の方法。
４．ウイルスゲノムがアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）である、段落１の方法。
５．ＴＬＲがＴＬＲ９である、段落１〜４のいずれか１つの方法。
【００７３】
６．阻害性オリゴヌクレオチドがＴＬＲ９に結合する、段落１〜５のいずれか１つの方法。
７．阻害性オリゴヌクレオチドが、ＴＬＲ９媒介シグナル伝達を活性化することなくＴＬＲ９に結合する、段落６のいずれか１つの方法。
８．炎症性核酸がＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを含む、段落７の方法。
９．阻害性オリゴヌクレオチドがＣＣｘ（非Ｃ）（非Ｃ）ｘｘＧＧＧモチーフを含み、ｘが任意の核酸である、段落１〜７のいずれか１つの方法。
１０．阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、段落１〜７のいずれか１つの方法。
【００７４】
１１．阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、段落１０の方法。
１２．阻害性オリゴヌクレオチドがＴＴＡＧＧＧモチーフを含む、段落１〜７のいずれか１つの方法。
１３．阻害性オリゴヌクレオチドがＴＴＡＧＧＧモチーフの少なくとも２のタンデムリピートを含む、段落１２の方法。
１４．阻害性オリゴヌクレオチドがＴＴＡＧＧＧモチーフの少なくとも３のタンデムリピートを含む、段落１３の方法。
１５．阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号６または配列番号９によって識別されるヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、段落１４の方法。
【００７５】
１６．阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号１により識別されるヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、段落１１の方法。
１７．阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号１により識別されるヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列の複数のタンデムリピートを含む、段落１６の方法。
１８．タンデムリピート配列がポリＡリンカーによって互いに分離されている、段落１３〜１７のいずれか１つの方法。
１９．ウイルスゲノムが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘、天然痘ウイルス、Ｂ型肝炎、サイトメガロウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、サル痘ウイルス、帯状疱疹、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、またはヒトパルボウイルスＢ１９からのものである、段落１〜１８のいずれか１つの方法。
２０．ウイルスゲノムがＡＡＶゲノムである、段落１９の方法。
【００７６】
２１．阻害性オリゴヌクレオチドがウイルスゲノムの５’非翻訳領域に位置付けられる、段落１〜２０のいずれか１つの方法。
２２．組み換えウイルスゲノムが、対照よりも少なくとも２倍大きいレベルで対象の細胞において発現される、段落１〜２１のいずれか１つの方法。
２３．組み換えウイルスゲノムが、対照よりも少なくとも５倍大きいレベルで対象の細胞において発現される、段落２２の方法。
２４．組み換えウイルスゲノムが、対照よりも少なくとも１０倍大きいレベルで対象の細胞において発現される、段落２３の方法。
２５．組み換えウイルスゲノムが、対照よりも少なくとも１５倍大きいレベルで対象の細胞において発現される、段落２４の方法。
【００７７】
２６．組み換えウイルスゲノムの投与が、対照よりも少なくとも２倍低い対象における炎症反応を誘発する、段落１〜２５のいずれか１つの方法。
２７．組み換えウイルスゲノムの投与が、対照よりも少なくとも５倍低い対象における炎症反応を誘発する、段落２６の方法。
２８．組み換えウイルスゲノムの投与が、対照よりも少なくとも１０倍低い対象における炎症反応を誘発する、段落２７の方法。
２９．組み換えウイルスゲノムの投与が、対照よりも少なくとも５０倍低い対象における炎症反応を誘発する、段落２８の方法。
３０．対照が、阻害性オリゴヌクレオチドを含まないウイルスゲノムの発現である、段落２２〜２９のいずれか１つの方法。
【００７８】
３１．組み換えウイルスゲノムが筋肉内に投与される、段落１〜３０のいずれか１つの方法。
３２．組み換えウイルスゲノムが対象の筋肉細胞において発現される、段落３１の方法。
３３．組み換えウイルスゲノムが静脈内投与される、段落１〜３０のいずれか１つの方法。
３４．組み換えウイルスゲノムが対象の肝臓細胞において発現される、段落３３の方法。
３５．対象が遺伝子治療を必要としている、段落１〜３４のいずれか１つの方法。
【００７９】
３６．治療用ヌクレオチド配列が治療用分子をコードする、段落１〜３５のいずれか１つの方法。
３７．治療用分子が治療用ＲＮＡまたは治療用ＤＮＡである、段落３６の方法。
３８．治療用分子が治療用タンパク質またはペプチドである、段落３６の方法。
３９．治療有効量の組み換えウイルスゲノムを対象に投与して、遺伝性障害を処置する、段落３７または３８の方法。
４０．治療有効量が対照の治療有効量と比較して少なくとも２０％減少し、対照が核酸感知ＴＬＲ活性化および／またはシグナル伝達を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドを含まない組み換えウイルスゲノムである、段落３９の方法。
【００８０】
４１．治療用分子が、対照の発現レベル以上のレベルで対象の細胞において発現され、対照が、核酸感知ＴＬＲ活性化および／またはシグナル伝達を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドを含まないウイルスゲノムによってコードされる治療用分子である、段落４０の方法。
４２．治療用ヌクレオチド配列と、核酸感知トール様受容体（ＴＬＲ）活性化および／またはシグナル伝達を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドとを含む、組み換えウイルスゲノム。
４３．ＴＬＲが、ＴＬＲ３、ＴＬＲ７、ＴＬＲ８またはＴＬＲ９である、段落４２の組み換えウイルスゲノム。
４４．ＴＬＲがＴＬＲ９である、段落４３の組み換えウイルスゲノム。
４５．阻害性オリゴヌクレオチドがＴＬＲに結合する、段落４２〜４４のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
【００８１】
４６．阻害性オリゴヌクレオチドが炎症性核酸に結合する、段落４２〜４５のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
４７．炎症性核酸がＣｐＧオリゴデオキシヌクレオチドを含む、段落４６の組み換えウイルスゲノム。
４８．阻害性オリゴヌクレオチドがＣＣｘ（非Ｃ）（非Ｃ）ｘｘＧＧＧモチーフを含み、ｘが任意の核酸である、段落４２〜４７のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
４９．阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、段落４２〜４８のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
５０．阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含む、段落９の組み換えウイルスゲノム。
【００８２】
５１．阻害性オリゴヌクレオチドがＴＴＡＧＧＧモチーフを含む、段落４２〜４８のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
５２．阻害性オリゴヌクレオチドが、ＴＴＡＧＧＧモチーフの少なくとも２のタンデムリピートを含む、段落５１の組み換えウイルスゲノム。
５３．阻害性オリゴヌクレオチドが、ＴＴＡＧＧＧモチーフの少なくとも３のタンデムリピートを含む、段落５２の組み換えウイルスゲノム。
５４．阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号６または配列番号９によって識別されるヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む、段落５３の組み換えウイルスゲノム。
５５．阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号１により識別されるヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を含む、段落５０の組み換えウイルスゲノム。
【００８３】
５６．阻害性オリゴヌクレオチドが、配列番号１により識別されるヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列の複数のタンデムリピートを含む、段落５５の組み換えウイルスゲノム。
５７．タンデムリピート配列がポリＡリンカーによって互いに分離されている、段落５２〜５６のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
５８．ウイルスゲノムが、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、水痘、天然痘ウイルス、Ｂ型肝炎、サイトメガロウイルス、ＪＣポリオーマウイルス、ＢＫポリオーマウイルス、サル痘ウイルス、帯状疱疹、エプスタイン・バーウイルス、ヒトヘルペスウイルス７、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス、またはヒトパルボウイルスＢ１９からのものである、段落４２〜５７のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
５９．ウイルスゲノムがＡＡＶゲノムである、段落５８の組み換えウイルスゲノム。
６０．阻害性オリゴヌクレオチドが、ウイルスゲノムの３’非翻訳領域に位置付けられる、段落４２〜５９のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
【００８４】
６１．治療用ヌクレオチド配列が治療用分子をコードする、段落４２〜６０のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
６２．治療用分子が治療用ＲＮＡである、段落６１の組み換えウイルスゲノム。
６３．治療用分子が治療用タンパク質またはペプチドである、段落６１の組み換えウイルスゲノム。
６４．対象における状態を処置する方法であって、治療用ヌクレオチド配列と、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号９、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３または配列番号２４によって識別されるヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む阻害性オリゴヌクレオチドとを含む、組み換えアデノ随伴ウイルスゲノムの治療有効量を、筋肉内注射または静脈内注射によって対象に投与して、炎症反応を導くことなく対象において状態を処置することを含む、前記方法。
６５．治療用ヌクレオチド配列と、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列と同一であるヌクレオチド配列を含む阻害性オリゴヌクレオチドとを含む、組み換えアデノ随伴ウイルスゲノム。
【００８５】
６６．治療用核酸と、炎症性サイトカインの産生を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドとを含む組み換えウイルスゲノムを対象に投与することを含む、方法。
６７．治療用核酸と、炎症性サイトカインの産生を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドとを含む、組み換えウイルスゲノム。
６８．阻害性オリゴヌクレオチドがウイルスゲノムの３'非翻訳領域に位置付けられる、段落４２〜５９のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
６９．治療用分子が治療用ＤＮＡである、段落３７の方法。
７０．治療用ＤＮＡがアプタマーである、段落６９の方法。
【００８６】
７１．組み換えウイルスゲノムが、核酸感知ＴＬＲ活性化および／またはシグナル伝達を阻害する少なくとも１の他の阻害性オリゴヌクレオチドをさらに含む、段落１〜４１のいずれか１つの方法。
７２．阻害性オリゴヌクレオチドの１つがウイルスゲノムのセンス方向に配向され、別の阻害性オリゴヌクレオチドがウイルスゲノムのアンチセンス方向に配向される、段落７１の方法。
７３．阻害性オリゴヌクレオチドの各々が、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、段落７１または７２の方法。
７４．阻害性オリゴヌクレオチドの１つが配列番号９を含む、段落７１〜７３のいずれか１つの方法。
７５．阻害性オリゴヌクレオチドの１つが配列番号５を含む、段落７１〜７４のいずれか１つの方法。
【００８７】
７６．核酸感知ＴＬＲ活性化および／またはシグナル伝達を阻害する少なくとも１の他の阻害性オリゴヌクレオチドをさらに含む、段落４２〜６３のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
７７．阻害性オリゴヌクレオチドの１つがウイルスゲノムのセンス方向に配向され、別の阻害性オリゴヌクレオチドがウイルスゲノムのアンチセンス方向に配向される、段落７６の組み換えウイルスゲノム。
７８．阻害性オリゴヌクレオチドの各々が、配列番号１〜７、９〜２５、または２７〜３２のいずれか１つのヌクレオチド配列と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、段落７６または７７の組み換えウイルスゲノム。
７９．阻害性オリゴヌクレオチドの１つが配列番号９を含む、段落７６〜７８のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
８０．阻害性オリゴヌクレオチドの１つが配列番号５を含む、段落７６〜８０のいずれか１つの組み換えウイルスゲノム。
８１．治療用ヌクレオチド配列と、核酸感知トール様受容体（ＴＬＲ）活性化および／またはシグナル伝達を阻害する阻害性オリゴヌクレオチドとを含む組み換えウイルスゲノムを対象の目に投与することを含む方法であって、組み換えウイルスゲノムが目における組み換えウイルスゲノムに対する炎症反応を阻害し、任意に組み換えウイルスゲノムが硝子体内に投与される、前記方法。
【００８８】
例
例１：in vitroでのＴＬＲ９活性化に対するオリゴヌクレオチドの影響。
この例は、ＴＬＲ９阻害性オリゴヌクレオチドをＤＮＡに組み込むと、ＴＬＲ９を介した炎症を軽減できることを示すデータを提供する。阻害性オリゴヌクレオチドを、通常ＴＬＲシグナル伝達を活性化する短い核酸に共有結合させ、阻害性オリゴヌクレオチドが短い核酸によるＴＬＲ９活性化を遮断するかどうかを決定した。試験された阻害性オリゴヌクレオチドは以下を含んだ：ｃ４１オリゴヌクレオチド（配列番号１）、ＯＤＮ ２０８８（配列番号２）、ＯＤＮ ４０８４−Ｆ（配列番号３）、ＯＤＮ ＩＮＨ−１（配列番号４）、ＯＤＮ ＩＮＨ−１８（配列番号５）、ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）、Ｇ−ＯＤＮ（配列番号７）、ＯＤＮ ２１１４（配列番号１６）、ＯＤＮ ４０２４（配列番号１７）、ＯＤＮ ＩＮＨ−４（配列番号１８）、ＯＤＮ ＩＮＨ−１３（配列番号１９）、ＯＤＮ ポリ−Ｇ（配列番号２０）、ＯＤＮ ＧｐＧ（配列番号２１）、ＯＤＮ ＩＲＳ−８６９（配列番号２２）、ＯＤＮ ＩＲＳ-９５４（配列番号２３）およびＯＤＮ ２１１５８（配列番号２４）。ＯＤＮ対照（１５ｎｔ）およびＯＤＮ対照（２４ｎｔ）を対照として使用した。
【００８９】
ＴＬＲ９を強力に活性化することが知られているＣｐＧ含有オリゴヌクレオチドであるＯＤＮ ２００６の直後に対照または実験用オリゴヌクレオチドが続く（すなわち、ＯＤＮ ２００６は５’側にある）いくつかの１本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを生成した。すべてのオリゴヌクレオチドは、安定性を高めるためにホスホロチオアート主鎖で合成した。ＴＬＲ９を介した炎症を測定するためにＴＬＲ９を構成的に発現するＨＥＫ２９３ベースのレポーター細胞株を使用した。オリゴヌクレオチドを０．５μＭの低濃度で適用したとき、対照配列を含む両方のオリゴヌクレオチドは、ｍｏｃｋ処理と比較して確固たる炎症を誘発した（図１Ａ、左側）。対照的に、ＴＬＲ９阻害性オリゴヌクレオチドを含むすべてのオリゴヌクレオチドは、著しく減少した炎症を示した（図１Ａ、左側）。５μＭの高濃度で同様の傾向を観察した（図１Ａ、右側）。
【００９０】
ＯＤＮ ２００６と次の配列との間にＡＡＡＡＡリンカー（配列番号８）を有するオリゴヌクレオチドも試験し、同様の結果を炎症の減少で観察した（図１Ｂ）。これは、ＴＬＲ９阻害性配列が炎症性配列の遠位にあり得ることを示唆する。
ＯＤＮ ２００６および共有結合した配列の順序が逆になっているオリゴヌクレオチドを試験したところ、ＴＬＲ９阻害性オリゴヌクレオチドＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧを含むオリゴヌクレオチドも炎症を軽減することができた（図１Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ＤＮＡにおけるＴＬＲ９阻害性オリゴヌクレオチドの組み込みが炎症反応を阻害することを示す。
【００９１】
対照配列に共有結合されたＯＤＮ ２００６（シス）が同じ濃度で同時投与されたＯＤＮ ２００６および対照ＯＤＮ（トランス）と同等の炎症を引き起こす状態が特定され、ＯＤＮ ２００６−ＴＴＡＧＧＧ（配列番号２６および配列番号６の融合）が誘発された炎症の約８０％を遮断したが、ＯＤＮ ２００６（配列番号２６）およびＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６）の同時投与は誘発された炎症の約３５％を抑制するに過ぎなかったことが観察された（図５）。したがって、例えば、ＴＬＲ９阻害性配列を他の炎症性核酸に連結すること（シス）は、独立した分子としてＴＬＲ９阻害性配列を投与すること（トランス）よりも、炎症を防止するのにより有効であり得る。
ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧは、高濃度の５ｕＭでさえ、ＴＬＲ７刺激（図６Ａ）またはＴＬＲ２刺激（図６Ｂ）による炎症反応を減少させず、ＴＬＲ９に対するその特異性を支持した。
【００９２】
例２：自己相補的ＡＡＶベクターの改変。
阻害性オリゴヌクレオチドがはるかに大きなウイルスゲノムの文脈（すなわち、配列が両端ではるかに長い配列に共有結合される）で機能性を保持するかどうかは未知である。この可能性を試験するために、強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）をコードする自己相補的（ｓｃ）ＡＡＶベクターを使用し、細菌および哺乳動物のテロメアにそれぞれ由来するｃ４１オリゴヌクレオチド（３Ｘ配列番号１）またはテロメア（配列番号９）（Gursel, I et al. J Immunol. 2003;171(3):1393-400；Kaminski, JJ et al. J Immunol. 2013;191(7):3876-83；Shirota, H et al. J Immunol. 2005;174(8):4579-83；Li, Y et al. Vaccine. 2011;29(11):2193-8）の３コピーを、ベクターゲノムを内包するプラスミドに挿入した。ｓｃＡＡＶベクターは、ＴＬＲ９の活性化を駆動し、マウスの肝臓にさらなる炎症を誘導するのに、一本鎖（ｓｓ）ＡＡＶベクターよりも効率的であることが示されていることから、当該ベクターを使用した。ｃ４１オリゴヌクレオチドおよびテロメアオリゴヌクレオチドは強い二次構造を有すると予測されるため、阻害性オリゴヌクレオチドのコピー間にＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーを挿入した。加えて、３ｘｃ４１および３ｘテロメア配列は、ポリＡ配列の後ろおよび右逆方向末端反復（ＩＴＲ）の上流に配置されたため、ウイルスの侵入時にＤＮＡゲノムに存在するが、形質導入が成功すると後続のｍＲＮＡ転写産物からはなくなる（ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｃ４１およびｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘテロメア）。最終的に、ウイルスゲノムにおける阻害性オリゴヌクレオチドの場所が重要かどうかを決定するために、３ｘテロメアが左ＩＴＲとプロモーターとの間に位置付けられたベクターを生成した（ｓｃＡＡＶ−３ｘテロメア−ｅＧＦＰ）（データは示さず）。
【００９３】
例３：自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ゲノムによって誘発される炎症反応およびin vivoでのマウスの筋肉組織における導入遺伝子発現に対するテロメアオリゴヌクレオチドの３コピー（「３ｘテロメア」配列番号３５）の影響。
筋肉は遺伝子治療の重要な組織標的である。ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘテロメアは、テロメアオリゴヌクレオチドがヒトの配列に由来し、臨床での使用に好ましいものであり得るため、in vivoでの特性評価のために選択した。テロメアオリゴヌクレオチドの３コピー（「３ｘテロメア」配列番号３５）がＡＡＶによって誘発される炎症反応を防ぐことができるかどうかを決定するために、筋肉内注射により成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスの四頭筋に以下を送達した：対照の生理食塩水、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘテロメア（例２において記載）。文献と一致して、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰは投与２時間後の筋肉組織におけるＩｌ６およびＣｘｃｌ１０発現を増加させ（生理食塩水と比較しておよそ２０〜１００倍）、炎症を示した（図２Ａ）。対照的に、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘテロメアは、炎症性マーカーの増加をほとんどまたはまったく示さなかった（図２Ａ）。さらに、ＡＡＶ投与の２８日後、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘテロメアはｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰより１６．２ｘ高いＧＦＰの遺伝子発現を示し、増大した導入遺伝子の発現を示した（図２Ｂ）。したがって、ＡＡＶがコードする導入遺伝子に連結すると、テロメアオリゴヌクレオチドもウイルスゲノムの発現を増加させ得る。
【００９４】
例４：in vivoでのマウスの肝臓組織における自己相補的アデノ随伴ウイルス（ｓｃＡＡＶ）ゲノムにより誘発される炎症反応に対するテロメアおよびｃ４１オリゴヌクレオチドの影響。
ＡＡＶの静脈内送達は、遺伝子治療のために肝細胞を形質導入するためにしばしば使用される。以前の研究では、ＡＡＶを静脈内投与すると、マウスの肝臓におけるクッパー細胞（常在肝抗原提示細胞）がｓｃＡＡＶゲノムを感知し、１〜９時間後に炎症性免疫および自然免疫応答を駆動できることが示されている（Martino, AT et al., Blood. 2011;117(24):6459-68）。これらの応答は、ＴＮＦおよびＩＬ６などの炎症促進性サイトカインの誘導を包含する。加えて、好中球、マクロファージ、およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの免疫細胞は、ＡＡＶ投与の２時間後に肝臓に浸潤する。
【００９５】
改変ベクターが肝臓における炎症をin vivoで軽減できるかどうかを決定するために、ＰＢＳまたは同量のｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘテロメアを尾静脈注射で投与した。以前の研究と一致して、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰは肝臓においてＴｎｆおよびＩｌ６発現の増加を刺激し（生理食塩水と比較しておよそ３〜１０倍）、炎症を示した（図３Ａ）。対照的に、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘテロメアは、炎症性マーカーの増加をほとんどまたはまったく示さなかった（図３Ａ）。後続の実験でより多くのマウスを試験し、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰは生理食塩水と比較して統計的に有意な肝臓におけるＴｎｆ誘導を刺激したが、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘテロメアおよびｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｃ４１はそうではなく（図３Ｂ〜３Ｃ）、肝臓における炎症の誘発を回避するそれらの能力を示した。最終的に、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘ対照はｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰと比較して肝臓における炎症を防止することができないことが決定され、阻害性オリゴヌクレオチド配列が炎症の防止に役割を果たすことを示した（図３Ｄ）。
【００９６】
例５：肝臓組織におけるin vivoでのｓｃＡＡＶによる導入遺伝子発現に対するテロメアオリゴヌクレオチドの３コピーの影響。
改変ベクターもまた肝臓においてin vivoで導入遺伝子発現を増加させることができるかどうかを決定するために、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰまたはｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘテロメアを静脈内注射によってマウスに投与し、ＧＦＰ遺伝子発現を１４日後に肝臓で測定した。ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘテロメアによるＧＦＰの１０．６ｘ高い遺伝子発現が観察され（図３Ｅ）、改変ベクターもまた肝臓における導入遺伝子発現を増加させることを示唆した。
【００９７】
例６：ヒト因子ＩＸ（ＦＩＸ）をコードする自己相補的ＡＡＶベクターの改変、およびテロメアオリゴヌクレオチドの３コピーの肝臓組織におけるin vivoでの自然免疫応答および導入遺伝子発現に対する影響。
配列番号９の３コピーを、ヒトＦＩＸを発現する自己相補的ＡＡＶベクターのベクターゲノムを内包するプラスミドに挿入した（図７Ａ）。ＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーを阻害性オリゴヌクレオチドのコピー間に挿入した（図７Ａ）。３ｘテロメア配列は左逆方向末端反復（ＩＴＲ）の後、トランスサイレチン（ＴＴＲ）プロモーターの前に配置されたため、それらはウイルスの侵入中にＤＮＡゲノムに存在するが、形質導入が成功すると後続のｍＲＮＡ転写産物からはなくなる。改変ベクターが肝臓の炎症をin vivoで軽減できるかどうかを決定するために、ＰＢＳまたは同量のｓｃＡＡＶ−ＦＩＸまたはｓｃＡＡＶ−ＦＩＸ−３ｘテロメア（ＡＡＶ８カプシド中、各１ｘ１０１１ｖｇ、または各１ｘ１０１０ｖｇ）を尾静脈注射により投与した。以前の研究と一致して、ｓｃＡＡＶ−ＦＩＸは、投与２時間後の生理食塩水と比較して、肝臓におけるインターフェロン（Ｉｆｎｂ１およびＩｆｎａ１３）遺伝子発現の増加を刺激し、自然免疫応答を示した（図７Ｂ）。対照的に、ｓｃＡＡＶ−ＦＩＸ−３ｘテロメアは、インターフェロン発現の増加をほとんどまたはまったく示さなかった（図７Ｂ）。さらに、ｓｃＡＡＶ−ＦＩＸ−３ｘテロメア処置マウスは、１４日後および２８日後のｓｃＡＡＶ−ＦＩＸ処置と比較して、血漿中でより多くのヒトＦＩＸタンパク質を発現した（図７Ｄ）。ＡＡＶベクターの１０倍低い用量では、インターフェロン応答（図７Ｃ）または血漿中のヒトＦＩＸタンパク質発現の違い（図７Ｅ）をもたらさず、２つのベクターが本質的に異なる効力を有さず、インターフェロン応答の回避は導入遺伝子発現を高めることを示唆した。
【００９８】
例７：マウスにおけるin vivoでの改変された一本鎖ＡＡＶベクターの筋肉内注射。
ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰおよびｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（図４）をＡＡＶｒｈ３２．３３カプシドにパッケージし、マウスの四頭筋に筋肉内注射した。用量依存性の免疫応答は臨床使用で十分に評価されているが、ＡＡＶ（特に、より広く使用され、より大きなコーディング能力を有するｓｓＡＡＶベクター）投与時のマウスでは確固たる免疫応答は一般に観察されない。したがって、より臨床的に関係のある免疫原性状態は、ＡＡＶｒｈ３２．３３カプシド（以下、ｒｈ３２．３３と称される）および筋肉内送達を利用することにより、マウスでモデル化された。この組み合わせは、ｒｈ３２．３３カプシドに対する確固たるＣＤ８＋Ｔ細胞応答、筋肉への細胞傷害性Ｔ細胞の局所浸潤、および野生型マウスにおける経時的な導入遺伝子発現の低下につながることが示されている（Faust et al., J Clin Invest 123, 2994-3001 (2013)；Mays et al., J Immunol 182, 6051-6060 (2009)）。さらに、著者らは、Ｔｌｒ９−／−マウスがｒｈ３２．３３カプシドに対するＴ細胞応答の大幅な低下を示し、安定した導入遺伝子発現を維持したことを発見し、ＣｐＧモチーフのＡＡＶベクターゲノムを部分的に枯渇させることにより同様の利点が野生型マウスで観察された（Faust et al., J Clin Invest 123, 2994-3001 (2013)）。
【００９９】
１ｘ１０１０ｖｇの低用量では、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰはｒｈ３２．３３カプシドに対して一連のＣＤ８＋Ｔ細胞応答を駆動し、１０匹中７匹の動物が陽性のＴ細胞反応性を示した（図８Ａ）。対照的に、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８は、一本鎖ベクター用に設計された阻害性オリゴヌクレオチドを含み、ｒｈ３２．３３カプシドに対してＣＤ８＋Ｔ細胞応答をほとんど示さず（１０匹中１匹が陽性）、ＰＢＳ処理と統計的に異なるものではなかった（図８Ａ）。１ｘ１０１１ｖｇの高用量では、両方のベクターが非常に高いカプシドに向けられたＴ細胞応答（約８００〜１０００ＳＦＵ／１００万の脾細胞）を誘発した。統計的に有意ではないが、改変ベクターは、親ベクターよりもやや弱いＴ細胞カプシド応答を誘発し、阻害性オリゴヌクレオチドがＡＡＶ用量依存的な様式で機能するという考えと一致した（図８Ａ）。細胞傷害性Ｔ細胞浸潤は、筋肉内ＡＡＶ遺伝子治療を受けている患者の筋肉の生検で観察されている（Ferreira et al., Front Immunol 5, 82 (2014)；Flotte et al., Hum Gene Ther 22, 1239-1247 (2011)）。したがって、局所組織環境への免疫細胞の浸潤をさらに特徴付けした。確固たるＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤がｓｓＡＡＶ-ｅＧＦＰを注射した動物からの筋肉試料に観察され、およそ３分の１が活性化細胞傷害性Ｔ細胞のマーカーであるグランザイムＢ＋であったが、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８を注射した筋肉試料の８つすべてにＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤が観察されず、阻害性オリゴヌクレオチドの存在がカプシドに向けられたＴ細胞応答および浸潤を防止したことを強く示唆した（図８Ｂ〜８Ｃ）。改変ベクターは、免疫組織化学分析により、親ベクターと同等またはそれよりも高いＧＦＰ発現を示した（図８Ｄ）。
【０１００】
例８：一本鎖ＡＡＶベクターの改変。
一本鎖ＡＡＶベクター、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰを、各コピー間にＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーを有するテロメア配列の５コピー（５Ｘ配列番号９）を挿入し、これに続き、各コピー間にリンカーを有するアンチセンス方向のテロメア配列の別の５コピー（５Ｘ配列番号９）を挿入することによって改変し、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５ｘテロメアを得た（図４）。ウイルスゲノムのプラス鎖およびマイナス鎖の両方が同等にウイルス粒子にパッケージされる可能性が高いため、これにより、パッケージされた各ウイルスゲノムがテロメア配列の５コピー（５Ｘ配列番号９）を正しい配向で有するであろうことが保証される。ＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーを有するテロメア配列の３コピー（３Ｘ配列番号９）をもち、これに続き、リンカーを有するがアンチセンス方向のＩＮＨ−１８の３コピー（３Ｘ配列番号５）をもつ、ｓｓＡＡＶ-ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８もまた改変した（図４）。ＩＮＨ−１８（配列番号５）は、上記のオリゴヌクレオチドアッセイでＴＬＲ９を介した炎症の強力な阻害を示したため選択した（図１Ａ、右側）。さらに、センス方向にテロメア配列の３コピー（３Ｘ配列番号９）を有し、これに続き、アンチセンス方向にＩＮＨ-１８の３コピー（３Ｘ配列番号５）を有すると、ウイルスのパッケージングを妨げ得る相補性を介した自己アニーリングの可能性を回避できる。最終的に、ウイルスゲノムのプラス鎖およびマイナス鎖の両方が同等にウイルス粒子にパッケージされる可能性が高いため、この設計は、パッケージされた各ウイルスゲノムが正しい配向でテロメア配列の３コピー（３Ｘ配列番号９）または正しい配向でＩＮＨ-１８の３コピー（３Ｘ配列番号５）のいずれかを有するであろう可能性を増加させる。
【０１０１】
３つのベクターを精製ＡＡＶ８ウイルスとして生成し、ウイルスの総収量をウイルスゲノムのＰＣＲを介して測定した。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰおよびｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８は、３．９７ｘ１０１３ｖｇおよび３．６０ｘ１０１３ｖｇという同様の収量を示したが、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５ｘテロメアは、３．１１ｘ１０１２ｖｇという約１０倍低い収量を示した（表１）。表１は、三重トランスフェクションおよび精製後に生成された示されたＡＡＶ８ウイルスの収量を含み、収量は各ベクターで得られたウイルスゲノムの総量（ｖｇ）として示される。したがって、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−５ｘテロメアはパッケージングの問題を有し得、親ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰベクターと比較してより低いウイルス収量をもたらすが、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８は同等のウイルス収量を提供する。
【０１０２】
【表１】
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【０１０３】
例９：非近交系のブタにおけるin vivoでの改変された一本鎖ＡＡＶベクターの網膜下注射。
免疫細胞および免疫因子の侵入を制限する血液網膜障壁の存在が一部の理由となって、目はしばしば「免疫特権（immune-privileged）」のあるものと記載される。しかしながら、自然免疫応答および適応免疫応答は、用量依存的な重症度を伴う網膜下ＡＡＶ投与後の大規模な動物研究および臨床試験の両方で報告されている（Bainbridge et al., N Engl J Med 372, 1887-1897 (2015)；Ramachandran et al., Hum Gene Ther 28, 154-167 (2017)；Reichel et al., Mol Ther 25, 2648-2660 (2017)）。ＡＡＶを用いた網膜の免疫応答および病的状態を決定するために、ブタの目はヒトの目と同様のサイズと形態を共有することから、網膜下ＡＡＶブタモデルを使用した。（Sanchez et al., Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 249, 475-482 (2011)）。表２は、野生型ブタにおけるＡＡＶベクターの網膜下送達を評価する研究の設計を示す。６匹の野生型の雌ブタに、示されたＡＡＶ８ベクターの７５μｌ（１つの目あたり４ｘ１０１１ｖｇの用量）またはビヒクル対照を網膜下に注射した。動物は毎週の間隔で臨床検査を受け、２ｗｐｉおよび６ｗｐｉでＯＣＴイメージングを行い、６ｗｐｉで安楽死させた。ｗｐｉ、注射後の週；ＯＤ、右眼（右目）；ＯＳ、左眼（左目）；Ｎ．Ａ．、該当なし。
【０１０４】
ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰおよびｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８を使用し、ＡＡＶ８カプシドにパッケージした（図４、表２〜４および図９Ａ〜９Ｂ）。リムルス変形細胞溶解物アッセイを使用したＡＡＶ８ベクターのエンドトキシン試験は、両方のベクターがエンドトキシンフリー（＜１ ＥＵ／ｍｌ）であることを示した（表３）。完全な粒子のパーセンテージは、０．５％酢酸ウラニルでＡＡＶをネガティブ染色し、透過型電子顕微鏡で観察することによって決定した。空の粒子は、カプシドの中央に高電子密度の円を示す（図９Ｂに矢印で示した例）。空の粒子および完全な粒子の数を、各ベクトルの１０のランダム画像の電子顕微鏡写真から直接カウントした（表４）。１１８３個の粒子をｓｓＡＡＶ-ｅＧＦＰでカウントし、１２２１個の粒子をｓｓＡＡＶ-ｅＧＦＰ-３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８でカウントした。画像ごとの完全な粒子の平均パーセントを標準偏差とともに報告する。代表的な画像を、スケールバー（１００ｎｍ）とともに各ベクターについて示す（図９Ｂ）。
両アレルＲＰＥ６５突然変異関連網膜ジストロフィーの近年承認された遺伝子治療（ＬＵＸＴＵＲＮＡ（商標）、用量＝１つの目あたり１．５ｘ１０１１ｖｇ）および患者の目の炎症に１つの目あたり１ｘ１０１１ｖｇおよび１ｘ１０１２ｖｇを用いることを示す以前の報告に基づいて（Bainbridge et al., N Engl J Med 372, 1887-1897 (2015)；Xue et al., Nat Med. 2018 Oct;24(10):1507-1512；Dimopoulos et al., Am J Ophthalmol. 2018 Sep;193:130-142)）、１つの目あたり４ｘ１０１１ｖｇという中間用量を選択した。
【０１０５】
【表２】
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【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
【表４】
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【０１０８】
赤緑オプシン染色を使用すると、ＡＡＶを注射した非近交系のブタ５匹すべてについて、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰは、錐体外節の形態の著しい喪失、短縮、または変化をもたらし、高視力に重要である錐体光受容体におけるＡＡＶ誘発性病的状態を示唆した（図１０Ａ）。対照的に、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８を注射した反対側の目は、錐体外節の大幅により良好な保存を示し、未注射の、またはビヒクルを注射した目に近い形態を示した。これらの発見は、錐体光受容体全体を標識する錐体アレスチン染色を行うことによって確認した（図１１）。加えて、５匹の動物のうち２匹（動物２３５８５および２３５８６）において、錐体茎（cone pedicle）（双極細胞および水平細胞の樹状突起に光シグナルを転送するために重要な錐体光受容体のシナプス終末）の大幅な喪失または収縮がｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰで観察された。かかる喪失は、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８を注射した動物では観察されなかった（図１０Ａおよび図１１を参照）。
【０１０９】
外側の網膜積層への損傷についてのin vivo光干渉断層法（ＯＣＴ）ｂスキャンからの網膜画像。この例で使用されているように、ＯＣＴは光干渉断層法を示し、ＲＰＥは網膜色素上皮を示し、ＩＳ／ＯＳは内節／外節を示し、ｗｐｉは注射後の週を示す。ビヒクルで処理した目の代表的なＯＣＴ ｂスキャン測定と、左目にｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ（ＯＳ）を注射し、右目にｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（ＯＤ）を注射した２匹の異なるブタからの代表的なＯＣＴ ｂスキャン測定とを表５に示す。損傷のないエリアでは、最も外側の高反射バンド（各ｂスキャンの下部に位置付けられる、データは示さず）が脈絡膜／強膜を表す。内側に移動すると、次の高反射バンドはＲＰＥを表し、３番目のバンドは光受容体のＩＳ／ＯＳを表す（データは示さず）。重度の損傷は光受容体およびＲＰＥの両方の層が破壊されたエリアであり、非重度の損傷はこれらの層の一方または両方の高反射バンドが薄く、十分に明確でないエリアであった。重度の損傷は常に網膜切開を取り囲み、非重度の損傷は常に重度の損傷のエリアを取り囲んだ。キャリパー（caliper）の外側のエリアは、正常な網膜の積層を有した。各タイプの損傷の長さ（ｍｍ）を表５に示す。特定のタイプの損傷の長さの２つの値は、その特定のタイプの損傷を有する２つのエリアがあったことを示す。スケールバーを各ｂスキャンで対照として使用した（データは示さず）。眼底画像は、網膜上の各ｂスキャンの場所を示した（データは示さず）。２ｗｐｉ（左）および６ｗｐｉ（右）の画像を各目で使用して、損傷が注射後に時間とともに変化するかどうかを確認した。２ｗｐｉでは、ビヒクルで処理した目は、網膜下注射により生じた網膜剥離を有し、これは６ｗｐｉではより小さかった。すべての目のＧＦＰ＋領域（平均＝３０ｍｍ２）のほとんどでｂスキャンが利用可能であったことから、動物２３５８６および２３５８７のみを分析した。動物２３５８３は、ＧＦＰ＋領域のエリアが異常に小さく（各目に１．４ｍｍ２）、接種量全体が網膜下に沈着していないという懸念があったため除外した。
【０１１０】
【表５】
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【０１１１】
各タイプの損傷の程度についての概要データ（上記の表５の記載を参照）を、ビヒクルを網膜下に注射した目、または左目にｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ（ＯＳ）を注射し、右目にｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（ＯＤ）を注射した２匹のブタの眼底画像に示した（眼底画像は示さず）。各眼底画像に重ね合わせたのは、２ｗｐｉおよび６ｗｐｉでのＯＣＴ ｂスキャンから決定された重度および非重度の損傷のエリアである。正常な外側の網膜積層を有する網膜エリアを緑色で示す。重度の損傷は常に網膜切開を取り囲み、ＲＰＥおよび光受容体の内節／外節を表す高反射性外側網膜バンドの喪失として定義した。非重度の損傷は通常、重度の損傷の周囲のエリアで見つかり、外側の網膜高反射バンドが薄くなっている、および／またはより不明確であるエリアとして定義した。各眼杯の蛍光画像を使用し、次いでＧＦＰ＋境界を眼底画像に重ね合わせた。この分析は、損傷のエリアがＧＦＰ＋エリアに対応することを示した。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８を注射した目では、重度の損傷のエリアが２ｗｐｉと６ｗｐｉとの間で減少した（約８４％小さい）。対照的に、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰを注射した目では、重度の損傷を有するエリアは同じままである傾向があった。
【０１１２】
ＯＣＴによって測定した外側網膜層状病的状態は網膜の組織学と一致しており、阻害性オリゴヌクレオチド配列を含む改変ベクターは、網膜下に注射したブタの目の外側網膜層状病的状態を改善したことを見出した。ビヒクルを注射した目は、網膜切開部位の周囲にある同じようなサイズの重度の損傷エリアを取り囲む非重度の損傷の小さなエリアを示し、損傷のエリアは２ｗｐｉと６ｗｐｉとの間で減少した（例として、ビヒクル注射について２ｗｐｉ測定を６ｗｐｉ測定と比較：表５の２３５８８ＯＤおよび上記の眼底画像）。この目には、網膜下注射により生じた網膜剥離が認められた。２匹の動物（２３５８６および２３５８７）について、両目のほとんどのＧＦＰ＋領域でｂスキャンが利用可能であった場合、２ｗｐｉで２つの目の間に同様の損傷が観察された（例として、下記の表５）。しかしながら、６ｗｐｉでは、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８の両方の目で重度の損傷のエリアは大幅に減少したが、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰで処理した２つの目では減少しなかった（例として、表５の６ｗｐｉでの重度の層状損傷の測定）。
【０１１３】
これらのデータを合わせると、高用量のＡＡＶの網膜下投与が光受容体の病的状態を駆動し得、改変ベクターがかかる病的状態の誘導を大幅に減少させることが示される。
次に、網膜における免疫応答を調べた。マイクログリア細胞は網膜の常在自然免疫細胞であり、文献の様々な報告は、ＣＮＳマイクログリアがＣｐＧリガンドに応答し得ることを示唆している（Olson et al., J Immunol 173, 3916-3924 (2004)）。予想通り、未注射の目およびビヒクルを注射した目のＩｂａ１染色は、休止（resting）マイクログリアと一致して、外核層（ＯＮＬ）の外側に分岐した染色パターンを示した（図１０Ｂ）。Ｉｂａ１シグナルは、ＡＡＶを注射した目のすべてにおいて有意に増加することがわかり（図１０Ｂおよびデータは示さず）、マイクログリアの活性化および増殖を示唆するが、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰのみが動物２３５８５および２３５８６におけるＯＮＬへの確固たるマイクログリア浸潤を刺激し、これは反対側の目における改変ベクターでは見られなかった。さらに、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰを受けた同じ２つの目における外側および内側の網膜に細胞傷害性Ｔ細胞が浸潤するが、同じ動物または他のＡＡＶ処理動物の反対側のｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８の目には浸潤しないことがわかった（図１０Ｃおよびデータは示さず）。
【０１１４】
組織学および臨床検査（炎症スコア）を含むブタ研究の知見の概要は、表６に含まれる。網膜における免疫組織化学的染色を、研究の終点の６ｗｐｉで行った。硝子体炎（ＳＵＮ分類による目／網膜の炎症）を、２ｗｐｉから６ｗｐｉの毎週の間隔で追跡した。ＯＣＴイメージングをベースライン（注射の日）、２ｗｐｉおよび６ｗｐｉで行い、光受容体層への損傷のエリアを６ｗｐｉ（終点）について示す。
まとめると（表６における概要を参照）、阻害性オリゴヌクレオチドを運ぶ改変ベクターは、親ベクターと比較して、網膜において望ましくない自然免疫応答および適応免疫細胞応答の誘発を回避し得る。
【０１１５】
【表６】
2021502381.tif 000007
【０１１６】
例１０：一本鎖ＡＡＶベクターの改変および硝子体内投与の試験。
一本鎖ＡＡＶベクターｓｓＡＡＶ２−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ（配列番号４１）およびｓｓＡＡＶ２−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（配列番号４２）（図１４）をアフリカミドリザルの目に硝子体内投与した（１つの目あたり１つのベクター）。阻害性オリゴヌクレオチドを有する改変ベクターは、対照ベクターと比較して免疫応答を低下させた。例えば、硝子体内注射の２週間後、そのＯＳの目にｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲｅを受けた動物Ａ９８３は、眼科検査により目の炎症のいくつかの兆候を有したが、ビヒクルを注射したＯＤの目はそうではなかった（表７）。そのＯＳの目にｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８を受けた動物Ａ９８２は、目の炎症の兆候を有しなかった。
【０１１７】
【表７】
2021502381.tif 000008
【０１１８】
より具体的には、動物Ａ９８３では、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ（配列番号４１）（対照）を投与した目は、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（配列番号４２）を投与した動物Ａ９８２の目と比較して、臨床検査後により大きな炎症を示した。対照処置（配列番号４１）による目は、１１〜２０の細胞による中程度の前眼房細胞スコア、ちょうど検出可能な軽度の眼房水フレア（つまり、チンダル効果はほとんど識別できなかった；前眼房における光線の強度はレンズを通過するときのスリット光線の強度未満であった）、中程度のフィブリン鎖（大きなフィブリン鎖／クロット、または５超の小さなフィブリン鎖）、三次血管の軽度の注射、および虹彩充血スコアで観察される二次血管の最小から中程度の注射、中程度の水晶体包沈着、および軽度の水晶体混濁または液胞／水晶体線維間の裂け目を示し、眼底の詳細を見ることができた。対照的に、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（配列番号４２）投与による目では、かかる炎症の兆候を見ることができなかった。
【０１１９】
例１１：一本鎖ＡＡＶベクターの追加の改変およびマウスにおけるin vivoでの筋肉内注射による試験。
ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（ｒｈ３２．３３カプシドにパッケージ）は、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰと比較して減少した免疫応答を示し、これはＡＡＶ用量依存的な様式で生じる（図８Ａ）。したがって、免疫原性をさらに低減するために、４０８４−Ｆの３コピー（３Ｘ配列番号３）をＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーとともに追加し、これに続き、リンカーを有するが、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８の左ＩＴＲとプロモーター（５'非翻訳領域）との間のアンチセンス方向にある、２０８８の３コピー（３Ｘ配列番号２）を追加した（これをｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−二重と称する）。ｒｈ３２．３３カプシドにパッケージされたこのベクターは、筋肉内注射時にマウスにおける免疫応答のさらなる低下を示した。これにより、ベクターゲノムの様々な場所に阻害性オリゴヌクレオチドを挿入して免疫応答を低下させることができ、さらにより多くの阻害性オリゴヌクレオチドを組み合わせて使用することにより、免疫応答をさらに低下させることができる。
【０１２０】
材料および方法
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（雄、７〜９週齢）をJackson Laboratoryから購入した。
ＡＡＶベクター
この研究では自己相補的（ｓｃ）なものを使用した。自己相補的ベクターは、１つのＩＴＲにおいて末端分離配列を欠く。すべてのベクターゲノムは、ＡＡＶ２ ＩＴＲが隣接していた。ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰはCell Biolabs（VPK-430）から購入し、以前に記載されている（Gray, JT et al., Methods Mol. Biol. 2011; 807: 25-46）。ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターからの強化された緑色蛍光タンパク質（ｅＧＦＰ）を発現し、ＳＶ４０イントロンおよびＳＶ４０ポリＡ配列を含んだ。緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）に由来するｃ４１オリゴヌクレオチド（５'−ＴＧＧＣＧＣＧＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＣＴＧ−３'；配列番号１）および哺乳動物テロメアに由来するテロメアオリゴヌクレオチド（
【化１】
2021502381.tif 000009
；配列番号９；最初のＴヌクレオチドは機能のオプションである）の配列が記載されている（Gursel, I et al., J Immunol. 2003;171(3):1393-400；Kaminski, JJ et al., J Immunol. 2013;191(7):3876-83；Shirota, H et al., J Immunol. 2005;174(8):4579-83；Li, Y et al., Vaccine. 2011;29(11):2193-8）。テロメアオリゴヌクレオチド（Invivogen製、カタログコード：tlrl-ttag）は、公開された研究と比較して追加のＴ（太字）をもつため、配列に含まれた。この研究の過程で、Invivogenは、それらの製造したテロメアオリゴヌクレオチドにおける追加のＴを除去した（カタログコード：tlrl-ttag151）。加えて、対照（５'−ＧＣＴＡＧＡＴＧＴＴＡＧＣＧＴ−３'；配列番号３４）を、ＴＬＲ９の活性化を阻害しない陰性対照配列として使用した（Invivogen、カタログコード：tlrl-2088c）。
【０１２１】
ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰを改変するために、右ＩＴＲの５'すぐに見つかるユニークなＳｐｅＩ部位に配列を挿入した。サブクローニングを容易にするために、挿入した配列の５'すぐにユニークなＣｌａＩ部位を作成し、そうして配列のＣｌａＩ／ＳｐｅＩサブクローニングを可能にした。ｃ４１の３コピー、テロメアの３コピー、または対照オリゴヌクレオチドの３コピーを挿入し、ＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカーによって分離し、それぞれｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ-３ｘｃ４１、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ-３ｘテロメアおよびｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ-３ｘ対照を得た。代替的に、ＡＡＡＡＡリンカー（配列番号８）とともにテロメアの１コピーを挿入し、ｓｃＡＡＶ−ｅＧＦＰ-１ｘテロメアを得た（データは示さず）。
【０１２２】
自己相補的ベクターを、ＨＥＫ２９３細胞の三重トランスフェクションによってＡＡＶ２（Vigene Biosciences）にパッケージし、イオジキサノール勾配超遠心分離を使用して精製し、次いでＰＢＳでAmicon Ultra-15カラムを使用して５００ｕｌに濃縮した。精製したウイルスは、ＩＴＲおよびＡＡＶ標準に由来するプライマーを使用したｑＰＣＲによって力価測定した。ウイルスの最終的な収量は、０．５〜３ｘ１０１３ｖｇの範囲であった。
【０１２３】
ｓｃＡＡＶ．ＦＩＸ（Martino, AT et al. Blood 2011;117(24):6459-68）は、肝臓特異的トランスサイレチン（ＴＴＲ）マウスプロモーターの制御下でヒト因子ＩＸ（ＦＩＸ）を発現し、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリＡ配列を含んだ。ｓｃＡＡＶ．ＦＩＸを改変するために、ＴＴＲプロモーターの５'すぐに見つかるユニークなＫｐｎＩ部位に配列を挿入した。このベクターをマサチューセッツ目耳診療所（MEEI）のコア施設であるGene Transfer Vector Core（GTVC）によってＡＡＶ８にパッケージした。ウイルス力価をポリＡ配列に対するプライマーを使用したデジタルＰＣＲによって決定し、各ベクターの総収量をウイルス力価（ｖｇ／ｍｌ）を体積で乗算することによって計算した。
【０１２４】
一本鎖ＡＡＶベクターｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰは以前に記載されており（Xiong, W. et al., J Clin Invest., 2015;125(4):1433-45）、もともとハーバードDF/HCC DNA Resource Core（クローンＩＤ：EvNO00061595）から入手したものであった。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰは、ＣＭＶエンハンサー／プロモーター、ヒトβ-グロビンイントロン、ｅＧＦＰ、およびβ-グロビンポリＡ配列を含んでいた。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰを改変するために、ＫｐｎＩ−５ｘテロメア（センス）−５ｘテロメア（アンチセンス）−ＮｈｅＩを、右ＩＴＲに隣接するＸｂａＩ部位の５'すぐに挿入した。ここでも、テロメア配列（配列番号９）のコピー間のリンカーとしてＡＡＡＡＡ（配列番号８）を使用した。代替的に、ＫｐｎＩ−３ｘテロメア（センス）−３ｘＩＮＨ−１８（アンチセンス）−ＮｈｅＩを同じ部位に挿入し、同様にＡＡＡＡＡ（配列番号８）をテロメア配列（配列番号９）またはＩＮＨ−１８（配列番号５）のコピー間のリンカーとして使用した。テロメア（配列番号９）またはＩＮＨ−１８（配列番号５）のセンス配列およびアンチセンス配列の両方を追加した。これは、一本鎖ＡＡＶベクターがウイルスゲノムのプラス鎖またはマイナス鎖をパッケージングする同等の機会を有するためである。これにより、すべてのパッケージされたＡＡＶゲノムがテロメア配列（配列番号９）またはＩＮＨ−１８（配列番号５）のコピーを正しい配向で運ぶであろうことを保証する。最終的に、ＳｐｅＩ−３ｘ４０８４−Ｆ（センス）−３ｘ２０８８（アンチセンス）−ＳｐｅＩを、左ＩＴＲの後、ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８のプロモーターの前に見つかるユニークなＳｐｅＩ部位にさらに挿入し、このベクターをｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−二重と称した（図１２）。一本鎖ベクターを、マサチューセッツ目耳診療所（MEEI）のコア施設であるGene Transfer Vector Core（GTVC）によって、ＡＡＶ８（網膜下ブタ研究）またはＡＡＶｒｈ３２．３３（筋肉内マウス研究）にパッケージし、精製した。ウイルス力価をＣＭＶプロモーターに対するプライマーを使用したデジタルＰＣＲによって決定し、各ベクターの総収量をウイルス力価（ｖｇ／ｍｌ）を体積で乗算することによって計算した。ベクタープレップの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルで１ｘ１０１０ｖｇ（ウイルスゲノム）を実行して評価した。さらに、ベクタープレップは、リムルス変形細胞溶解物アッセイ（ToxinSensor Chromogenic LAL Endotoxin Assay Kit、Genscript）を使用して１ＥＵ／ｍｌ未満のエンドトキシンを有していた。親ベクターと＞２０の精製で対応する改変ベクターとの間でウイルス収量（ウイルス力価ｘ体積）に有意差は観察されず、記載した配列の挿入がウイルスのパッケージングを妨げないことを示唆した。
【０１２５】
異なる一本鎖ベクターｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥは、ＣＭＶプロモーターおよびｅＧＦＰ発現のためのウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節要素（ＷＰＲＥ）を含有する。ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥを改変するために、ＫｐｎＩ−３ｘテロメア（センス）−３ｘＩＮＨ−１８（アンチセンス）を、右ＩＴＲのすぐ上流のＸｈｏＩ部位の５'すぐに挿入した（図１３）。親ベクターおよび改変ベクターをＡＡＶ２にパッケージし、セシウム精製により精製した。
【０１２６】
ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ９レポーター細胞株
ヒトＴＬＲ９および誘導性ＳＥＡＰ（分泌型胚性アルカリホスファターゼ）レポーター遺伝子を安定的に発現するＨＥＫ２９３ベースのレポーター細胞株を得た（HEK-Blue hTLR9、Invivogen）。ＳＥＡＰ遺伝子は、５つのＮＦ−ｋＢおよびＡＰ-１結合部位に融合したＩＦＮ−β最小プロモーターの制御下にある。ＯＤＮ ２００６などのＴＬＲ９リガンドによる刺激は、ＮＦ−ｋＢとＡＰ−１を活性化し、よってＳＥＡＰの産生を誘導し、これに続いてＳＥＡＰを測定すると、炎症の量を決定できる。設計したすべての一本鎖ＤＮＡオリゴヌクレオチドを、安定性（ＩＤＴ）を高めるために、ホスホロチオアート主鎖で合成した。ＯＤＮ ２００６を、ヌクレオチドを介在させずに、またはＡＡＡＡＡ（配列番号８）リンカー配列を使用して、示された配列に直接連結した。ＯＤＮ対照（１５ｎｔ）およびＯＤＮ対照（２４ｎｔ）は、それぞれ、５'−ＴＣＣ ＴＧＡ ＧＣＴ ＴＧＡ ＡＧＴ−３'（配列番号４３）および５'−ＴＴＡ ＴＴＡ ＴＴＡ ＴＴＡ ＴＴＡ ＴＴＡ ＴＴＡ ＴＴＡ−３'（配列番号４４）であり、２つの制御配列を様々なＴＬＲ９阻害性オリゴヌクレオチドの長さのおおよその範囲に一致するように選択した。示された濃度のオリゴヌクレオチドを、９６ウェルの平底プレートのウェルあたり２００ｕｌのＤＭＥＭ増殖培地中の６ｘ１０４ ＨＥＫ２９３−ＴＬＲ９細胞と１８時間インキュベートし、５０ｕｌの培地を吸引し、１００ｕｌのＨＥＫ−Ｂｌｕｅ検出培地（Invivogen）で４〜６時間３７℃でインキュベートし、次いでプレートリーダーで６３９ｎｍの吸光度を読み取った。同様に、誘導性ＳＥＡＰレポーター遺伝子およびヒトＴＬＲ７（１ｘ１０５細胞）またはＴＬＲ２（６ｘ１０４細胞）（両方ともInvivogenからのもの）を安定的に発現するＨＥＫ２９３レポーター細胞株を、１μｇ／ｍｌのガーディキモドまたは１００ｎｇ／ｍｌのＦＳＬ−２（両方ともInvivogenからのもの）で、対照オリゴヌクレオチドまたはＴＬＲ９阻害性オリゴヌクレオチドを１８時間使用した場合と使用しない場合で、それぞれ刺激し、ＳＥＡＰ活性を測定した。
【０１２７】
in vivoでの筋肉研究
成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、５０μｌのＰＢＳまたはＡＡＶ２ウイルス（動物あたり１０１１ｖｇ、自己相補的ベクター）を四頭筋に筋肉内注射した。２時間後、動物を犠牲にし、四頭筋の一部をRNAlater溶液（Thermo Scientific）に保存した。肝臓の研究で記載されているように、筋肉組織をＲＮＡ抽出、逆転写、およびｑＰＣＲに供した。ＧＦＰ発現の研究では、四頭筋を２８日後に採取した。
【０１２８】
同様に、成体マウスの四頭筋に５０ｕｌ ＰＢＳまたはＡＡＶｒｈ３２．３３ウイルス（動物あたり１０１０または１０１１ｖｇ、一本鎖ベクター）を筋肉内注射した。２１日後、動物を犠牲にし、脾臓を採取し（下記のＥＬＩＳＰＯＴを参照）、筋肉組織を１０％ホルマリンで終夜固定し、７０％エタノールに移した。組織学では、筋肉試料をDF/HCC Specialized Histopathology Services（SHS）およびBeth Israel Deaconess Medical Center（BIDMC）の組織学コア施設で処理し、パラフィンに包埋し、ＣＤ８（１：５００、Ｄ４Ｗ２Ｚ、ＣＳＴ）およびグランザイムＢ（１：５００、ポリクローナル、カタログ番号AF1865、R&D）で染色した。抗体を、AlexaFluor 488 Tyramide（B40957、Thermo）またはAlexaFluor 647 Tyramide（B40958、Thermo）でタグ付けした。すべての免疫組織化学を、クエン酸抗原検索（citrate antigen retrieval）を有するLeica Biosystems Refine Detection Kitを使用して、Leica Bond自動染色プラットフォームで行った。筋肉切片はまた、ＩＨＣ色素原基質ＤＡＢ（３，３’-ジアミノベンジジン）を用いた免疫組織化学（ＩＨＣ）によってＧＦＰについて染色した。
【０１２９】
ＩＦＮ-γＴ細胞ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ＡＡＶｒｈ３２．３３一本鎖ベクターを筋肉内注射したＣ５７ＢＬ／６マウスから注射後２１日目に脾臓を採取した。脾臓を７０μｍのセルストレーナー（Fisher Scientific）に通し、解離した細胞をスピンダウンした。細胞ペレットを１ｍｌのＡＣＫ溶解バッファー（Life Technologies）で処理して、赤血球を溶解した。抗原刺激に応答してＩＦＮ−γを分泌する細胞の数を決定するために、製造業者の指示（R&D Systems）に基づいてＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用した。手短に言えば、９６ウェルプレートをＲＰＭＩ増殖培地で室温で２時間プレブロックし、ＰＢＳで２回すすいだ。５ｘ１０５脾細胞をＴ細胞培地（１０％熱不活化ＦＢＳ、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％Ｌ−グルタミン、１０ｍＭＨＥＰＥＳバッファー、０．１ｍＭ非必須アミノ酸、２ｍＭピルビン酸ナトリウムおよび１０-６Ｍベータメルカプトエタノールを補充したＤＭＥＭ）にウェルごとに播種した。当該培地を、２μｇ／ｍｌのＡＡＶｒｈ３２．３３カプシドのＣＤ８＋ｈ２-ｋｂ制限ドミナントエピトープ（ＳＳＹＥＬＰＹＷＭ、Genemed Synthesisから購入）とともに、または非特異的陽性対照としてＰＭＡ／イオノマイシンとともにインキュベートした。ＥＬＩＳＰＯＴプレートは、KS ELISpotソフトウェアバージョン4.9.16を備えた自動化されたElispotリーダーシステム（KS ELISpot reader、Zeiss、Thornwood、USA）を使用して、ブラインド方式（ZellNet Consulting, Inc., Fort Lee, NJ）で評価した。最適な読み取りパラメータの設定を含むプレート評価プロセスは、Elispotプレート評価に関する国際的なガイドラインに従った６。
【０１３０】
in vivoでの肝臓の研究
成体Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、１００ｕｌ ＰＢＳまたはＡＡＶ２ウイルス（動物あたり１０１１ｖｇ）またはＡＡＶ８ウイルス（１０１０または１０１１ｖｇ）を、前述のように尾静脈注射によって静脈内注射した（Martino, AT et al. Blood 2011;117(24):6459-68）。２時間後、動物を犠牲にし、肝臓の右中葉の一部をRNAlater溶液（Thermo Scientific）に保存した。ＲＮＡ抽出キット（OMEGA Bio-Tek）を使用して、機械的に破砕した肝臓試料１０〜３０ｍｇから全ＲＮＡを抽出した。同様の量のＲＮＡを、大容量RNA-to-cDNAキット（Thermo Scientific）を使用して逆転写し、同様の量のｃＤＮＡをTaqMan Fast Advanced Master Mix（Thermo Scientific）および市販の示された標的遺伝子（ＩＤＴ）用のＦＡＭレポーター色素を有する事前に設計されたプライマー／プローブを使用して定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）でアッセイした。各遺伝子の発現レベルは、ΔΔＣＴ法を使用してハウスキーピング遺伝子ＡｃｔｂまたはＧａｐｄｈに対して正規化することによって計算し、生理食塩水を注射したマウスと比較した倍レベルとして表した。すべてのｑＰＣＲ反応は、realplex4 Mastercycle（Eppendorf）で行った。ＧＦＰ発現研究では、肝臓を１４日後に採取した。ヒトＦＩＸ発現については、ＡＡＶ投与の１４日後および２８日後に血漿（ＥＤＴＡ）を取得し、希釈した血漿試料をヒト因子ＩＸに特異的なＥＬＩＳＡキット（ab188393、Abcam）を使用して分析することにより、ヒトＦＩＸ発現を定量した。ＰＢＳ注射マウスからの血漿は、ブランク対照のそれと同様のシグナルを示し、ヒト因子ＩＸに対するキットの特異性を示す。キットは少なくとも０．７８ｎｇ／ｍｌの感度を有した。
【０１３１】
飼育ブタにおけるＡＡＶの網膜下注射
ブタを使用するすべての実験プロトコルは、ルイビル大学で行われ、ルイビル大学施設内動物管理使用委員会によって承認され、目および視覚研究における動物の使用に関するＡＲＶＯ声明に準拠した。５０日齢の野生型飼育雌ブタ６匹を購入した（Oak Hill Genetics、Ewing Indiana）。ＡＡＶを網膜下腔に注射する外科手術は、ルイビル大学のＡＡＬＡＣ認定施設で１週間の順応期間を経て行われた。詳細は以前に公開されている７〜９。ケタミン（１０ｍｇ／ｋｇ）およびデクスメデトミジン（０．０４ｍｇ／ｋｇ）の静脈内投与により動物を鎮静させ、アトロピン（０．２５ｍｇ／ｋｇ）で処理した。気管内チューブを挿入し、それを通してイソフルレンを投与して麻酔の外科的平面を達成した（１〜３％）。耳の静脈に挿入されたＩＶラインを使用して、ＩＶ液（５％デキストロースを含むかまたは含まない、Lactated Ringers Solution；１０〜１５ｍＬ／ｋｇ／ｈ）を送達し、血圧および通常の血糖レベル（６０〜１４０ｍｇ／ｄＬ）を維持した。直腸温度計を用いて体温を３０分ごとにモニターし、加熱された処置台を介して維持した。心拍数および呼吸数および酸素飽和度を手順全体で１０分ごとに記録し、麻酔をこれらの生理学的パラメータの正常範囲を維持するように調整した。
【０１３２】
麻酔および無菌手術の準備の後、硝子体網膜手術アプローチを使用して、網膜下腔（網膜と目の背部の色素上皮との間）にアクセスし、ＡＡＶを含む接種物を最終製剤バッファー（ＦＦＢ）に入れるかまたはＦＦＢ単独（ビヒクル）のものとした。側方の眼角切開を、手術野での露出を増やすために行った。開瞼器の挿入後、２つの２５ｇ套管針（trocar）を縁の後方１．５ｍｍに（１つは上鼻腔に、もう１つは下鼻腔に）配置した。前眼房液穿刺を行い、注射量のための空間を作った。網膜を視覚化するのを助けるために、光導体を１つの套管針に挿入した。４１ゲージの網膜下カニューレの針を他の套管針に通し、局所的な網膜剥離（ブレブ）の作成に使用した後、接種物（約７５μｌ）を注射した。ＡＡＶ８．ＧＦＰ．ｉｏ２またはＡＡＶ８．ＧＦＰのいずれかを、３つの外科手術セッションの各々で２匹のブタ（４つの目）のＯＤまたはＯＳに注射した。注射後、光導体、針、および套管針を取り外した（セルフシール式）。側方の眼角切開を４〜０ナイロンで縫合して閉じた。抗生物質およびステロイド軟膏を外科手術の最後に局所的に配置した。
【０１３３】
注射後２週間（ｗｐｉ）から６ｗｐｉまで、完全な臨床検査により、麻酔をかけたブタにおいて毎週の間隔で網膜の健康状態を評価した。これは、目の前節を検査して角膜／レンズの損傷を特徴付ける細隙灯検査、眼底の健康状態を検査する間接検眼鏡検査、網膜の状態、その視神経、血管パターン、および外科的処置またはウイルス発現から生じた損傷の状態を記録するための眼底写真撮影を含んでいた。加えて、ＳＵＮ分類１０を使用して、各目を目／網膜の炎症についてスコアリングした。注射を行う網膜外科医は、試験品を知らされておらず、同様に、臨床検査および炎症のスコアリングを盲検で行った。
【０１３４】
外科手術および２ｗｐｉおよび６ｗｐｉに先立ち、目の光干渉断層法（ＯＣＴ；Bioptigen/Leica Biosciences）を行い、in vivoで網膜層を画像化した。瞳孔は拡張し、２．５％塩酸フェニレフリンおよび１％トロピカミドの局所適用により、遠近調節（accommodation）は弛緩した。蓋鏡（lid speculum）はまぶたを開いたままにし、角膜は人工涙液（Tears Again、OcuSoft, Inc、Richmond、TX）によって画像全体で濡れていた。ＯＣＴ ｂスキャンを使用して、網膜切開部位を特定し、低反射および高反射バンドの積層パターンを、軸方向および横方向の両方の寸法のエリアからの距離の関数として特徴付けた。２つのタイプの損傷を特定した。重度の損傷は、ＲＰＥおよび光受容体の内節／外節を表す高反射バンドが破壊されたエリアを表した。非重度の損傷は、これらの高反射バンドが存在するエリアであったが、損傷がなかったエリアよりも薄く、そのため明確性が低下した。これら２つのタイプの損傷の形状、場所、およびサイズを、ＯＣＴシステムに付属のソフトウェアを使用して測定した。具体的には、キャリパーを、眼底全体にわたるｂスキャンにおいて重度の損傷および隣接する非重度の損傷の全体にわたって配置し、それらのエリアを計算し、損傷の範囲全体で合計した。次いで、これらのエリアを、ＧＦＰ発現のエリアと比較して、眼底画像および損傷のエリアに重ね合わせた（以下を参照）。
【０１３５】
６ｗｐｉ（終点）でブタを麻酔し、Beuthanasia溶液（ペントバルビタールナトリウム３９０ｍｇ、フェニトインナトリウム５０ｍｇ／ｍｌ；１ｍＬ／５ｋｇ）で殺し、目を摘出した。角膜および水晶体を取り外し、眼杯を切開し、ＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドで１時間室温で固定し、次いでＰＢＳで洗浄した。全組織標本（wholemount）網膜を、低出力蛍光顕微鏡（Olympus MVX10）を使用して検査し、ＧＦＰ＋発現の領域を位置付け、画像を取得し、血管および視神経頭に対する眼底画像にプロットした。網膜を解剖して、組織学に使用した断片がすべてのＧＦＰ＋領域ならびにＧＦＰ-隣接領域を含むようにした。
【０１３６】
ブタの網膜組織を、ＰＢＳ中の３０％スクロースまでの段階的なスクロース溶液で凍結保護し、次いで３０％スクロースおよび最適切削温度（ＯＣＴ）化合物（optimal cutting temperature compound）（Tissue-Tek）の１：１混合物に包埋し、これに続き、Leica CM3050S（Leica Microsystems）で凍結切片を作成した。網膜組織の横断切片を２０μｍで切断した。免疫組織化学では、０．１％のTriton X-100を含むＰＢＳ中の５％ロバ血清（二次抗体がロバ由来の場合）または５％ヤギ血清（二次抗体がヤギ由来の場合）で組織切片を１時間室温で最初に遮断した。次いで、切片を、赤緑オプシン（１：６００、AB5405、EMD Millipore）、ヒト錐体アレスチン１１（１：１００００）、Ｉｂａ１（１：２００、ab5076、Abcam）およびＣＤ８（１：２００、MCA1223GA、Bio-Rad）に対する一次抗体を含むブロッキング溶液中、４℃で終夜染色した。これに続き、ヤギ抗ウサギ、ロバ抗マウス、またはロバ抗ヤギAlexaFluor 594標識二次抗体（111-585-144、715-585-150および705-586-147、すべてJackson ImmunoResearchから）をＰＢＳ中１：１０００で使用し、室温で２時間染色した。最後に、組織を４’，６-ジアミジノ-２-フェニルインドール（ＤＡＰＩ）で５分間染色し、Fluoromount-G（Southern Biotech）を使用してマウントした。スライドを、４０ｘ油浸対物レンズを備えたLSM710レーザー走査型共焦点顕微鏡（Zeiss）を使用して検査し、ZENソフトウェアおよびImageJを使用して画像処理を行った。ＡＡＶを注射した目からの切片については、網膜切開瘢痕（注射による光受容体への損傷がある場所）の近くではあるが、直接ではないＧＦＰ＋領域の画像を取得するように注意を払った。各動物の２つの目の画像を取得するときも、同様のレーザー設定を使用した。
【０１３７】
アフリカミドリザルにおけるＡＡＶの硝子体内注射
アフリカミドリザルは、片方の目に１００ｕｌのｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥまたはｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（両方ともＡＡＶ２カプシドにパッケージされている）の硝子体内注射を受け、もう片方の目にビヒクル対照（バッファー）を受けた。細隙灯検査および網膜検影法による眼科検査、ならびに眼底イメージング（カラー写真および蛍光写真の両方）を様々な時点で行った。硝子体のもやは、ヌッセンブラットスケールを使用して０〜４のスケールで等級付けし、前眼房細胞および眼房水フレアを、改変ハケットマクドナルドスコアリングシステムを使用して等級付けした。光干渉断層法（ＯＣＴ）も網膜を画像化するために行った。終了時に、動物を安楽死させ、目から眼房水を採取した。除核された目を４％パラホルムアルデヒドで固定し、これに続き、病的状態および細胞性免疫応答について切片および組織学的分析を行った。
【０１３８】
統計
独立両側スチューデントｔ検定を使用して、ほとんどの場合に２つの独立した実験群間の差を比較した。示されているように、両側マンホイットニー検定をいくつかのin vivo研究に使用した。＜０．０５のＰ値は統計的に有意であると考えられた。事前に指定された効果サイズは想定されておらず、一般に、各条件に対して３〜１０の複製または動物を使用した。
【０１３９】
配列
ｃ４１オリゴヌクレオチド配列：
ＴＧＧＣＧＣＧＣＡＣＣＣＡＣＧＧＣＣＴＧ（配列番号１）。
ＯＤＮ ２０８８：
ＴＣＣ ＴＧＧ ＣＧＧ ＧＧＡ ＡＧＴ（配列番号２）
ＯＤＮ４０８４−Ｆ：
ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ（配列番号３）
ＯＤＮ ＩＮＨ−１：
ＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧ（配列番号４）
ＯＤＮ ＩＮＨ−１８：
ＣＣＴ ＧＧＡ ＴＧＧ ＧＡＡ ＣＴＴ ＡＣＣ ＧＣＴ ＧＣＡ（配列番号５）
ＯＤＮ ＴＴＡＧＧＧ：
ＴＴ ＡＧＧ ＧＴＴ ＡＧＧ ＧＴＴ ＡＧＧ ＧＴＴ ＡＧＧ Ｇ（配列番号６）
Ｇ−ＯＤＮ：
ＣＴＣ ＣＴＡ ＴＴＧ ＧＧＧ ＧＴＴ ＴＣＣ ＴＡＴ（配列番号７）
リンカー配列
ＡＡＡＡＡ（配列番号８）
【０１４０】
テロメア：
ＴＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧＴＴＡＧＧＧ（配列番号９）
ＯＤＮ ４１３７：
ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＣＣ（配列番号１０）。
ＯＤＮ ４０３３：
ＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＴ（配列番号１１）。
ＯＤＮ ４１７１：
ＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧ（配列番号１２）。
ＯＤＮ ４３５２：
ＴＣＣＴＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧ（配列番号１３）。
ＯＤＮ ４１９１：
ＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧ（配列番号１４）。
ＯＤＮ ４３５１：
ＴＣＣＴＡＴＣＣＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧ（配列番号１５）。
ＯＤＮ ２１１４：
ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧＴ（配列番号１６）
ＯＤＮ ４０２４：
ＴＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＴ（配列番号１７）
【０１４１】
ＯＤＮ ＩＮＨ−４：
ＴＴＣＣＣＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ（配列番号１８）
ＯＤＮ ＩＮＨ−１３：
ＣＴＴＡＣＣＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＴＧＧＧＡＡ（配列番号１９）
ＯＤＮ ポリ−Ｇ：
ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２０）
ＯＤＮ ＧｐＧ：
ＴＧＡＣＴＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＧＡＧＡＴＧＡ（配列番号２１）
ＯＤＮ ＩＲＳ−８６９：
ＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号２２）
ＯＤＮ ＩＲＳ−９５４：
ＴＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＴＴＧＴ（配列番号２３）
【０１４２】
ＯＤＮ ２１１５８：
ＣＣＴＧＧＣＧＧＧＧ（配列番号２４）。
ＯＤＮスーパー：
ＣＣＴＣＡＡＴＡＧＧＧＴＧＡＧＧＧＧ（配列番号２５）。
ＯＤＮ ２００６：
Ｔｃｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔｔｔｇｔｃｇｔｔ（配列番号２６）。
ＯＤＮ ４３４８：
ＴＣＧＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧ（配列番号２７）。
ＯＤＮ ４３４９：
ＴＡＡＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧ（配列番号２８）。
ＯＤＮ ４３４７：
ＣＣＴＡＴＣＣＴＧＧＡＧＧＧＧＡＡＧ（配列番号２９）。
ＯＤＮ Ａ：
ＧＧＧＴＧＧＧＴＧＧＧＴＡＴＴＡＣＣＡＴＴＡ（配列番号３０）。
ＯＤＮ Ｂ：
ＴＧＧＧＣＧＧＴＴＣＡＡＣＣＴＴＣＡ（配列番号３１）。
ＯＤＮ Ｃ：
ＣＣＴＣＡＡＧＣＴＴＧＡＧＧＧＧ（配列番号３２）。
【０１４３】
ｓｃＡＡＶ−ＦＩＸ：
【化２−１】
2021502381.tif 000010
【化２−２】
2021502381.tif 000011
【０１４４】
ｓｃＡＡＶ−ＦＩＸ−３ｘテロメア（阻害性オリゴヌクレオチド（下線および太字））：
【化３】
2021502381.tif 000012
【０１４５】
「３ｘテロメア」オリゴ：
【化４】
2021502381.tif 000013
【０１４６】
ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ：
【化５−１】
2021502381.tif 000014
【化５−２】
2021502381.tif 000015
【０１４７】
ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（阻害性オリゴヌクレオチド（下線および太字））：
【化６−１】
2021502381.tif 000016
【化６−２】
2021502381.tif 000017
【０１４８】
ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−二重（阻害性オリゴヌクレオチド（下線および太字））：
【化７−１】
2021502381.tif 000018
【化７−２】
2021502381.tif 000019
【０１４９】
「３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８」オリゴ：
【化８】
2021502381.tif 000020
【０１５０】
「３ｘ４０８４−Ｆ３ｘ２０８８」オリゴ：
【化９】
2021502381.tif 000021
【０１５１】
ｓｓＡＡＶ−ｅＧＦＰ−ＷＰＲＥ：
【化１０】
2021502381.tif 000022
【０１５２】
ｓｓＡＡＶ−ＧＦＰ−ＷＰＲＥ−３ｘｔｅｌｏ３ｘＩＮＨ１８（阻害性オリゴヌクレオチド（下線および太字））：
【化１１】
2021502381.tif 000023
【０１５３】
ＴＴＡＧＧＧモチーフ：
ＴＴＡＧＧＧ（配列番号６１）
【０１５４】
本明細書に開示されているすべての参考文献、特許、および特許出願は、それぞれが引用されている主題に関して参照により組み込まれており、いくつかのケースにおいて文書全体を包含し得る。
本明細書および特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１の」を意味すると理解されるべきである。
反対に明確に示されていない限り、複数のステップまたは行為を包含する本明細書で請求される任意の方法では、方法のステップまたは行為の順序は、方法のステップまたは行為が列挙されている順序に必ずしも限定されないことも理解されたい。
【０１５５】
特許請求の範囲および上記の本明細書では、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「運ぶ（carrying）」、「有する（having）」、「含む（containing）」、「関与する（involving）」、「保持する（holding）」、「から構成される（composed of）」などのすべての移行句等は、オープンエンドとして、すなわち、限定することなく含むことを意味すると理解されるべきである。米国特許庁特許審査手続マニュアル第２１１１．０３項に規定されているように、「からなる」および「本質的にからなる」という移行句のみが、それぞれクローズドまたはセミクローズド移行句であるものとする。
数値に先行する「約」および「実質的に」という用語は、列挙された数値の±１０％を意味する。
値の範囲が提供される場合、範囲の上限と下限との間の各値は、本明細書で具体的に企図され、記載されている。
【図１Ａ】
2021502381.tif 000024
【図１Ｂ−Ｃ】
2021502381.tif 000025
【図２】
2021502381.tif 000026
【図３Ａ−Ｃ】
2021502381.tif 000027
【図３Ｄ】
2021502381.tif 000028
【図３Ｅ】
2021502381.tif 000029
【図４】
2021502381.tif 000030
【図５】
2021502381.tif 000031
【図６】
2021502381.tif 000032
【図７】
2021502381.tif 000033
【図８Ａ−Ｃ】
2021502381.tif 000034
【図８Ｄ】
2021502381.tif 000035
【図９Ａ】
2021502381.tif 000036
【図９Ｂ】
2021502381.tif 000037
【図１０Ａ】
2021502381.tif 000038
【図１０Ｂ】
2021502381.tif 000039
【図１０Ｃ】
2021502381.tif 000040
【図１１】
2021502381.tif 000041
【図１２】
2021502381.tif 000042
【図１３】
2021502381.tif 000043
【配列表】
2021502381000001.app
【国際調査報告】
2021502381.tif 000044
2021502381.tif 000045
2021502381.tif 000046