(57)【要約】【課題】生物医学の分野に属し、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の低免疫原性腫瘍に対する悪い治療効果および抗ＣＤ４７治療の不十分なターゲティングの問題を解決するＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質。【効果】当該融合タンパク質は、ジスルフィド結合で連結されたＣＤ４７結合部分とＰＤ−Ｌ１結合部分で構成され、ＣＤ４７とＳＩＲＰαの結合を遮断できるだけでなく、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１の結合も遮断でき、マクロファージを活性化し腫瘍細胞を飲み込み、自然免疫における抗原提示を促進するだけでなく、後天性免疫において腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化を促進する役割を果たすこともでき、同時に、血液毒性を低下することもできる；当該融合タンパク質は、単独な抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＣＤ４７治療よりも優れた抗腫瘍効果と血液安全性を備え、融合タンパク質で治療した後に腫瘍が消失した動物には、同じ種類の腫瘍細胞に対する免疫をもたらす。【選択図】図２
2021511817.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二重機能融合タンパク質が、ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にし、ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１の両方の分子に結合できることを特徴とする二重機能融合タンパク質。
【請求項２】
上記の二重機能融合タンパク質が、ＣＤ４７分子に結合する部分は、ＳＩＲＰα変異体と抗体Ｆｃセグメントを連結してなるＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃペプチドセグメントである；ＰＤ−Ｌ１分子に結合する部分は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体的軽鎖ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−Ｌと重鎖ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−Ｈからなるものであることを特徴とする請求項１に記載の二重機能融合タンパク質。
【請求項３】
上記のＣＤ４７に結合する部分の抗体Ｆｃ区域及ＰＤ−Ｌ１に結合する部分の抗体は、いずれもＩｇＧ１サブタイプであることを特徴とする請求項２に記載の二重機能融合タンパク質。
【請求項４】
上記の二重機能融合タンパク質は、Ｋｎｏｂ−ｉｎ−Ｈｏｌｅ構造を有することを特徴とする請求項２又は３に記載の二重機能融合タンパク質。
【請求項５】
上記のＣＤ４７に結合する部分のＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃは、Ｋｎｏｂ−ｉｎ−Ｈｏｌｅ構造におけるＨｏｌｅ構造を有し、上記のＰＤ−Ｌ１に結合する部分の重鎖ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−Ｈは、Ｈｏｌｅと合わせるＫｎｏｂ構造を有することを特徴とする請求項４に記載の二重機能融合タンパク質。
【請求項６】
上記のＣＤ４７に結合する部分のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１である；上記のＰＤ−Ｌ１に結合する部分の軽鎖ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−Ｌのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２であり、重鎖ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−Ｈのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であることを特徴とする請求項５に記載の二重機能融合タンパク質。
【請求項７】
上記のＣＤ４７に結合する部分のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４である；上記のＰＤ−Ｌ１に結合する部分の軽鎖ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−Ｌのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５であり、重鎖ａｎｔｉ−ＰＤ−Ｌ１−Ｈのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６であることを特徴とする請求項５に記載の二重機能融合タンパク質。
【請求項８】
請求項１〜７のいずれか一つに記載の二重機能融合タンパク質の、腫瘍を予防・治療する医薬品の調製における応用。
【請求項９】
請求項１〜７のいずれか一つに記載の二重機能融合タンパク質の、免疫を調節する医薬品の調製における応用。
【請求項１０】
請求項１〜７のいずれか一つに記載の二重機能融合タンパク質の、ＣＤ４７を標的にする医薬品の血液毒性を低下する医薬品の調製における応用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬の分野に属し、詳しくは、ＣＤ４７分子とＰＤ−Ｌ１分子を標的にする組換え融合タンパク質に関わる。
【背景技術】
【０００２】
がん細胞の「免疫回避」は、腫瘍の発生、発展と薬剤耐性に関する主な機構と考えられる。一般的に、腫瘍が、直接又は間接にＴ細胞のシグナルを阻害することより、免疫系の除去から自身を守る。腫瘍の免疫チェックポイント療法（ｉｍｍｕｎｅ  ｃｈｅｎｋｐｏｉｎｔ  ｔｈｅｒａｐｙ）は、シグナルを共抑制または共刺激することなどの一連の経路で、Ｔ細胞の活性を調節することより、抗腫瘍の免疫応答を向上する治療方法である。
【０００３】
免疫チェックポイントは、免疫応答過程における共刺激と共抑制分子が、「オン」又は「オフ」という免疫応答シグナルを発信することにより、Ｔ細胞応答の振幅と持続時間を調節し、自己耐性を維持する上で重要な役割を果たし、自分の組織への損傷を防ぐ。これまでに発見されている免疫チェックポイント分子は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、ＣＤ４７／ＳＩＲＰα、ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０／ＣＤ８６などである。
【０００４】
（１）ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１
ＰＤ−１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｃｅｌｌ  Ｄｅａｔｈ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  １、プログラム細胞死タンパク質１）は、細胞表面受容体であり、Ｔ細胞とプレＢ細胞の表面に発現され、活性化されたＴ細胞には発現を向上させ、ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−Ｌ２の二つのリガンドと結合することをできる。ＰＤ−１は、負の調節機能を有する免疫チェックポイントタンパク質であり、Ｔ細胞の活性化を防止でき、自身免疫の低下と免疫耐受の促進には重要な役割を果たす。ＰＤ−１の機能が、二つの経路で達成し、一つは、リンパ節における抗原特異性Ｔ細胞のアポトーシスを促進すること、もう一つは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ、制御性Ｔ細胞ともいう）のアポトーシスを低下することである。
【０００５】
ＰＤ−Ｌ１（Ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ  Ｄｅａｔｈ−Ｌｉｇａｎｄ  １、プログラム死リガンド１）は、ＰＤ−１のリガンドの一つであり、膜貫通タンパク質に属し、主に胎盤、心臓、肝臓、肺、腎臓、骨格筋といくつかの造血組織といくつかの白血病細胞株に発現する。ＰＤ−Ｌ１とＰＤ−１が結合し、受容体リガンド複合体を形成した後に、抑制シグナル（ＩＬ−１０産生を誘導し、抗アポトーシス遺伝子ｂｃｌ−２をダウンレギュレートして抗原特異的Ｔ細胞のアポトーシスを促進し、リンパ節におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を阻害することなどを含む）を発信する。ＰＤ−Ｌ１は、いくつかの特別な場合（妊娠、組織移植、自己免疫疾患、肝炎など）における免疫系の抑制に関連する。ＰＤ−Ｌ１はＰＤ−１を強い親和性（ＫＤ値７７０ｎＭ）で結合できるだけでなく、ＣＤ８０を弱い親和性（ＫＤ値１．４μＭ）で結合することもできる。
【０００６】
ＰＤ−Ｌ１はさまざまな腫瘍細胞の表面に発現し、腫瘍細胞が免疫系の殺傷を回避できるようになることを見出したため、抗腫瘍免疫療法の標的として使用できる。
【０００７】
（２）ＣＤ４７／ＳＩＲＰα
ＣＤ４７（白血球分化抗原４７）はインテグリン関連タンパク質（インテグリン関連タンパク質、ＩＡＰ）とも呼ばれ、膜インテグリンを伴う膜貫通タンパク質であり、トロンボスポンジン−１（トロンボスポンジン−１、ＴＳＰ−１）およびシグナル調節タンパク質α（シグナル調節タンパク質α、ＳＩＲＰα）にも結合する。ＣＤ４７は、ヒト細胞で広く発現し、かつさまざまな腫瘍細胞で過剰発現し、細胞のアポトーシス、増殖、接着、遊走などのさまざまな細胞活動に関与している。
【０００８】
ＳＩＲＰαは、膜貫通受容体糖タンパク質であり、マクロファージ、樹状細胞などの骨髄細胞表面の免疫細胞に特異的に発現し、免疫に負の調節効果があり、ＣＤ４７と組み合わせると、食作用とＴ細胞活性化を阻害できる。
【０００９】
ＣＤ４７とＳＩＲＰαが組み合わると、「Ｄｏｎ'ｔ  ｅａｔ  ｍｅ」（私を食べないで）というシグナルを免疫系に発信し、この機構は、免疫系によって誤って殺されることから人体の正常な細胞を保護することができるが、腫瘍細胞が免疫回避の目的を達成するために利用される可能性もある。
【００１０】
現在、イピリムマブ（抗ＣＴＬＡ−４）、ニボルマブ（抗ＰＤ−１）、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ−１）、アテゾリズマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）、アベルマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）、デュルバルマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）、およびその他の免疫チェックポイント薬は、ヨーロッパおよびアメリカの医薬品局により販売が承認されている。
【００１１】
しかし、免疫チェックポイント薬には次のような問題がある：
ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路はＴ細胞のエフェクター段階にのみ作用するため、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１薬物効果には腫瘍抗原の提示が必要で、臨床的には、この治療法は低免疫原性腫瘍の約７０％には効果がないことが多く、化学療法、放射線療法、モノクローナル抗体薬と組み合わせる必要がある；さらに、がん細胞は、異なる経路または複数の経路を介して免疫回避を達成することがあるが、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を単に遮断するだけでは、一部のがん細胞の免疫回避に効果がない場合がある。
【００１２】
ＣＤ４７を標的とする抗体が、マクロファージを活性化し、Ｔ細胞抗原提示を増強するなどの機能を持ち、抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１と機能的に相補的である。ただし、ＣＤ４７の発現は厳密には腫瘍特異的ではなく、また、健康な赤血球の表面でも発現し、腫瘍細胞の表面でのＣＤ４７の発現は正常細胞の３．３倍しかないため、体内でのＣＤ４７抗体の使用は、貧血などの副作用を引き起こすことがよくある。副作用を軽減するために、ＣＤ４７に高い親和性を持つＳＩＲＰα変異体は、治療のために他の抗体と組み合わせてＦｃモノマーなしの形で免疫増強剤としてのみ使用できる。
【００１３】
免疫原性の低い重鎖に対する抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１薬の有効性を改善し、および／またはＣＤ４７を標的にする薬の血液毒性を低減できると、悪性腫瘍の治療効果を改善することには、非常に重要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１４】
本発明は、医薬品を提供し、当該医薬品が、抗腫瘍免疫の異なる段階で抗ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１および抗ＣＤ４７／ＳＩＲＰα免疫チェックポイント薬を組み合わせて、相乗効果を形成し、単一の薬物よりも高い効率と強い効果を生み出し、薬物の腫瘍細胞ターゲティングを改善し、血液毒性を低減し、既存の免疫チェックポイント薬の有効性または安全性の欠点を解決する。
【００１５】
具体的に、本発明が、ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能の融合タンパク質を提供し、ＰＤ−Ｌ１に結合しＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達経路を遮断するだけでなく、ＣＤ４７に結合しＣＤ４７／ＳＩＲＰαシグナル伝達経路を遮断することもでき、優れた癌細胞ターゲティングと細胞毒性を有し（たとえばＡＤＣＣ、ＣＤＣ）、既存の免疫チェックポイント薬の有効性または安全性の欠点を解決する。
【００１６】
本発明はさらに、ＣＤ４７を標的とする薬物の血液毒性を低減する方法を提供し、当該方法が、ＣＤ４７を標的とする薬物と赤血球との組み合わせによって引き起こされる貧血などの副作用を低減することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１７】
本発明の技術案は以下の通り：
ＣＤ４７分子に結合しつつ、ＰＤ−Ｌ１分子に結合できるＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１標的にする二重機能融合タンパク質。
【発明の効果】
【００１８】
本発明のＣＤ４７およびＰＤ−Ｌ１を標的とする二機能性融合タンパク質は、マクロファージを活性化し腫瘍細胞を飲み込み、初期の自然免疫における腫瘍抗原提示を改善する役割と、獲得免疫における腫瘍特異的Ｔ細胞活性化および増殖の促進に役割とを有しつつ、単一の抗ＣＤ４７薬よりも腫瘍細胞ターゲティングが良好で、血液毒性が少ない；動物実験によると、それが単独に抗ＰＤ−Ｌ１または抗ＣＤ４７を使用する治療より、優れた抗腫瘍効果と血液安全性を示し、ＩＡＢ治療後に腫瘍が消失した個人は、その後接種される同じタイプの腫瘍細胞に対する免疫力も有する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＩｇＧタイプの抗体の構造を示す模式図である。
【図２】ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質ＩＡＢの構造を示す模式図である。
【図３】ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質ＩＡＢの非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図である。
【図４】ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質ＩＡＢの還元性ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図である；
【図５】質量分析で測定されたＩＡＢの完全なタンパク質分子量及び主なグリコフォームを示す。
【図６】ＩＡＢ融合タンパク質と単一特異性抗ＰＤ−Ｌ１抗体ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'がＰＤ−Ｌ１と競合的結合することを示す。
【図７】ＩＡＢ融合タンパク質とＳＩＲＰαに高い親和力を持つ変異体Ｆｃ融合タンパク質が、ＣＤ４７と競合的結合することを示す。
【図８】ＩＡＢ融合タンパク質が、ＳＥＢで刺激されたＰＢＭＣ細胞のＩＬ−２放出量を向上することを示す。
【図９】フローサイトメトリーで測定されたＩＡＢ融合タンパク質が、インビトロでＲＡＷ２６４．７がＭＣ３８細胞を飲み込むことを促進することを示す。
【図１０】蛍光顕微鏡で測定されたＩＡＢ融合タンパク質が、マウス骨髄由来のマクロファージがＭＣ３８細胞を飲み込むことを促進することを示す。
【図１１】指標細胞法で測定されたＩＡＢ融合タンパク質のＡＤＣＣ効果を示す。
【図１２】１００ｍｇ／ｋｇ薬品を腹腔内注射した後に、マウス血清中の赤血球含有量を示す。
【図１３】１００ｍｇ／ｋｇ薬品を腹腔内注射した後に、マウス血液中のヘマトクリット含有量を示す。
【図１４】１００ｍｇ／ｋｇ薬品を腹腔内注射した後に、マウス血液中のヘモグロビン含有量を示す。
【図１５】ＩＡＢ融合タンパク質がＢａｌｂ／ｃマウスＭＣ３８腫瘍モデルを治療する実験結果を示す。
【図１６】ＩＡＢ融合タンパク質がＢａｌｂ／ｃマウス二次接種ＭＣ３８腫瘍細胞を予防する実験結果を示す。
【図１７】ＩＡＢが、ＭＣ３８担癌マウス（マクロファージ欠損タイプ）を治療する実験結果を示す。
【図１８】ＩＡＢが、ＭＣ３８担癌マウス（ＣＤ８＋Ｔ細胞欠損タイプ）を治療する実験結果を示す。
【図１９】フローサイトメトリーで検測されたＭＣ３８腫瘍細胞のＩＡＢタンパク質との結合能を示す。
【図２０】フローサイトメトリーで検測されたＨＬ６０白血病細胞のＩＡＢタンパク質との結合能を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
上述融合タンパク質（ＩＡＢと呼ばれる）は、ジスルフィド結合で連結する二つの部分で構成され（図２）、その一つの部分は、ＣＤ４７と結合でき、ＳＩＲＰαに高い親和力を持つ変異体（ＳＩＲＰα−ｍともいう）と抗体のＦｃ区域を連結してなる（ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃともいう）ものである；もう一つの部分は、ＰＤ−Ｌ１と結合でき、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖（ａｎｔｉ−ＰＤＬ１−Ｌともいう）と重鎖（ａｎｔｉ−ＰＤＬ１−Ｈともいう）をジスルフィド結合で連結してなるものである。
【００２１】
ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃとａｎｔｉ−ＰＤＬ１−Ｈこの二つのペプチド鎖には、各に含有する抗体Ｆｃ区域は、いずれもＩｇＧタイプであり、好ましくに、ＩｇＧ１サブタイプである；ＩＡＢ的組換え発現過程に不要な同種二量体を形成するために、ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃとａｎｔｉ−ＰＤＬ１−Ｈこの二つのペプチド鎖のＦｃ区域には、「ノブインホール」（Ｋｎｏｂ−ｉｎ−Ｈｏｌｅ）は導入される。「ノブインホール」は、以下のように達成できる：ａｎｔｉ−ＰＤＬ１−Ｈペプチド鎖のＦｃ区域に、ＩｇＧ固有配列に基づき、２個のアミノ酸突然変異（Ｔ３６６Ｗ、Ｓ３５４Ｃ）を導入し、突き出ているＫｎｏｂ構造を形成し、ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃペプチド鎖のＦｃ区域に、ＩｇＧ固有配列に基づき、４個のアミノ酸突然変異（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ）を導入し、凹んでいるＨｏｌｅ構造を形成し、立体障害で相同対合を防止する（上記Ｆｃ区域のアミノ酸突然変異サイトが、ＫａｂａｔのＥｕ番号付けシステム、すなわちＥｕ  ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ  ｓｃｈｅｍｅを使用する）。
【００２２】
より具体的に、ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃペプチド鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のアミノ酸配列を有する；ａｎｔｉ−ＰＤＬ１−Ｌペプチド鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のアミノ酸配列を有する、ａｎｔｉ−ＰＤＬ１−Ｈペプチド鎖が、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のアミノ酸配列を有する。
【００２３】
ＩＡＢは、遺伝子工学で改造されたＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞に発現されても良く、具体的に、ＩＡＢは、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に発現され、使用される発現ベクターは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）である；ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のヌクレオチド配列でコードされる；ａｎｔｉ−ＰＤＬ１−Ｌの軽鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５  のヌクレオチド配列でコードされ、ａｎｔｉ−ＰＤＬ１−Ｈは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６のヌクレオチド配列でコードされる；遺伝子組換え方法より、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６の配列をｐｃＤＮＡ３．１（＋）のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）に挿入し、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を構築された標的タンパク質のコード配列を含有する発現ベクターでトランスフェクションし、その後、スクリーニングし、安定にＩＡＢを発現する細胞株を得、ＩＡＢの発現に使用する。
【００２４】
上記のＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質は、腫瘍を予防・治療する医薬品と免疫を調節する医薬品の製造に使用されてもよい。
抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）とは、身体の免疫系が、抗原の刺激下でＢリンパ球から分化した形質細胞によって産生され、対応する抗原に特異的に結合することができる免疫グロブリンであり、また、インビトロで、ハイブリドーマや遺伝子工学および他の方法によって調製することができる。物理化学性質と生物学的な機能によって、抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤの五種類に分けられる。ＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）タイプの抗体は、血清の主要な抗体成分であり、血清免疫グロブリンの約７５％を占め、国内外の既存の抗体医薬品の主なタイプである。
【００２５】
一般に、一つの完全なＩｇＧタイプの抗体は、４つのペプチド鎖（図１）で構成され、ジスルフィド結合によって対称な２つの重鎖（Ｈｅａｖｙ  Ｃｈａｉｎ）と２つの軽鎖（Ｌｉｇｈｔ  Ｃｈａｉｎ）を含む。各軽鎖は可変領域ＶＬと定常領域ＣＬで構成され、重鎖は可変領域ＶＨと定常領域ＣＨで構成される。ＩｇＧタイプの抗体の重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３の３つの部分に分けられる。軽鎖および重鎖の可変領域ＶＬおよびＶＨは、抗原に結合する部分であり、重鎖のＣＨ２およびＣＨ３領域は、補体、Ｆｃ受容体、プロテインＡに結合する機能と、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞傷害）やＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）などの免疫効果を誘導する機能を持っている；ＣＨ２領域には、Ｎ結合型グリコシル化部位Ｎ２９７があり、当該サイトのグリコシル化修飾は、抗体の細胞傷害などに重要な影響を及ぼし、グリコシル化修飾を除去すると、ＡＤＣＣなどの細胞傷害機能が失われる可能性がある。軽鎖と重鎖は、ＣＬおよびＣＨ１領域のジスルフィド結合によって連結される；重鎖には、ＣＨ１とＣＨ２の間に伸縮・湾曲可能なヒンジ領域があり、抗体の２つの重鎖は、ヒンジ領域のジスルフィド結合によって連結される。抗体がパパインによって消化された後、２つのＦａｂ区域（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ、抗原結合フラグメント）と１つのＦｃ区域（ｆｒａｇｍｅｎｔ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｂｌｅ、結晶化可能なフラグメント）が形成され、Ｆａｂ区域は完全な軽鎖と重鎖のＶＨとＣＨ１を含み、Ｆｃ区域はＣＨ２とＣＨ３を含む。
【００２６】
ヒトＩｇＧには、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４の４つのサブタイプがある。その中でも、ＩｇＧ１は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果を誘発する強い能力と、長い血清半減期を有し、抗体薬に最もよく見られる抗体サブタイプである（たとえば、リツキシマブ（抗ＣＤ２０）、トラスツズマブ（抗ＨＥＲ２））；ＩｇＧ２とＩｇＧ４は、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ効果を誘発する弱い能力と、長い血清半減期を有して、シグナルの遮断・制御または中和を主な作用機構とする抗体医薬品の開発に使用できる（たとえば、ニボルマブ（抗ＰＤ−１）、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ−１））。
【００２７】
一つの抗体分子が２つの異なる抗原ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にすることを可能になるために、本発明は遺伝子工学技術を通じて抗体構造を改変し、抗体構造に似ている非対称融合タンパク質を構築した（図２）。融合タンパク質は、ＣＤ４７結合部分とＰＤ−Ｌ１結合部分で構成され、それらの二つの部分は、ジスルフィド結合で連結される；ただし、ＣＤ４７結合部分は、ＣＤ４７に高い親和力を持つＳＩＲＰα変異体（ＳＩＲＰα−ｍ）と抗体のＦｃ区域（主にＣＨ２とＣＨ３領域）を接続することによって形成され、ＰＤ−Ｌ１結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体の一つの重鎖と一つの軽鎖をジスルフィド結合で結合することによって形成される。
【００２８】
融合タンパク質のＳＩＲＰα変異体（ＳＩＲＰα−ｍ）は、内因性天然ＳＩＲＰαタンパク質よりもはるかに高い親和力でＣＤ４７抗原に結合できるために、クロファージの表面の天然のＳＩＲＰαと癌細胞の表面上のＣＤ４７抗原の結合をブロックし、癌細胞によるマクロファージの食作用の阻害および回避を解除することができる。
【００２９】
抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、癌細胞の表面に高いレベルで発現するＰＤ−Ｌ１に高い親和力で結合できるから、癌細胞表面のＰＤ−Ｌ１と活性化Ｔ細胞表面のＰＤ−１の結合をブロックし、癌細胞による活性化Ｔ細胞の阻害と回避を解除することができる。
【００３０】
また、ＰＤ−Ｌ１は癌細胞の表面で高いレベルで発現しているため、抗ＰＤ−Ｌ１ターゲティングはより強力で、ＣＤ４７の特異性が低いと抗ＣＤ４７治療の血液毒性という欠点を補足する；実験では、ＩＡＢの血液毒性は、ＳＩＲＰα−ｍとＦｃで構成される融合タンパク質よりもはるかに低く、安全性が高いことが示されている。
【実施例】
【００３１】
〔実施例１〕ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質ＩＡＢの構築、発現
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４（ＳＩＲＰα変異体と抗体Ｆｃ区域が連結してなる融合ペプチドフラグメントをコードし、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖが突然変異して形成したＨｏｌｅ構造を有するもの）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５（抗ＰＤ−Ｌ１抗体の軽鎖をコードするもの）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６（抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖をコードし、Ｔ３６６Ｗ、Ｓ３５４Ｃが突然変異して形成したＫｎｏｂ構造を有するもの）のヌクレオチド配列から、それぞれに相応するＤＮＡフラグメントを合成し、遺伝子工学技術でｐｃＤＮＡ３．１（＋）ベクターに挿入し、発現ベクターとするｐｃＤＮＡ３．１−ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ、ｐｃＤＮＡ３．１−ａｎｔｉＰＤＬ１−ＬとｐｃＤＮＡ３．１−ａｎｔｉＰＤＬ１−Ｈを構築し、リポソーム法で、３個の発現ベクターをＣＨＯ−Ｋ１にコトランスフェクトし、ホスト細胞に発現し、トランスフェクトされた細胞を、２０％ウシ胎児血清ＦＢＳを含むＤＭＥＭ完全培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）に２４時間培養し、その後、１ｍｇ／ｍｌ  Ｇ４１８抗生素を含む選択的培地に圧力スクリーニングし、続いて細胞を２週間培養した。限界希釈法でサブクローンスクリーニングを行った；Ｄｏｔ−Ｂｌｏｔ法で、細胞培養上清液における目標タンパク質の含有量（上清をニトロセルロースメンブレンにスポットし、ブロッキング後、西洋ワサビペルオキシダーゼＨＲＰで標識されたマウス抗ヒトＩｇ抗体を加え、ジアミノベンジジンＤＡＢで発色させた）を比較した後に、目標タンパク質とするＩＡＢの発現量が一番高いクローンをスクリーニングし、発現細胞株とした。
【００３２】
発現細胞株を、異なる割合のＤＭＥＭ完全培地とＣＨＯＭ−Ｂ１無血清培地（上海邁泰君奥生物技術有限会社）からなる混合培地に継代・培養し、完全培地の割合を１００％から世代ごとに０％まで低下し、その後、ＣＨＯＭ−Ｂ１無血清培地に続いて培養・継代した。細胞培養の体積が６Ｌまで拡大した時点で、継代を中止し、流加培養を行い、毎日に２ｇ／Ｌでグルコースを添加し、７日後上清を収集し、９０００ｒｐｍ、４℃で１０ｍｉｎ遠心し、沈殿を捨て、上清を０．２μmフィルムでろ過した後に、精製のために４℃に保存した。
【００３３】
〔実施例２〕ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質ＩＡＢの精製
Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａアフィニティークロマトグラフィーカラムで二重機能融合タンパク質ＩＡＢを精製し、１０倍カラム体積のバランス液（１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含む２０ｍＭリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．０）でカラムをバランスした後に、培養上清液をロードし、ロードしたから５〜１０倍カラム体積のバランス液で、導電率がバランスになるまで洗浄した。その後、溶離液（５０ｍＭクエン酸緩衝液、ｐＨ３．５）で溶離し、ＯＤ２８０が２００ｍＡＵより大きくなったから、溶離ピークを收集した。１Ｍ  Ｔｒｉｓで、目標タンパク質を含む溶離液のｐＨを６．５〜７．０に調整した後に、ゲル脱塩カラムで緩衝液（ｐＨ７．４リン酸塩緩衝液）を交換し、それから滅菌し、ろ過し、ＵＶ法でタンパク質濃度を検測した後に、将来の使用のために４℃に保存した。
【００３４】
〔実施例３〕ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動同定
精製された抗体サンプルを、それぞれに非還元（８％の分離ゲル）と還元（１２％の分離ゲル）の条件において、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）で完全なタンパク質分子量と還元分子量を検測し、試薬を調製・操作する方法について、《分子クローン実験指南》を参照し、電気泳動の結果を明細書図面の図３（非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）と図４（還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）に示す。
【００３５】
図３の非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図には、目標タンパク質とするＩＡＢの完全なタンパク質分子量は、約１２０ＫＤａである；図４の還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動図には、ＩＡＢタンパク質の重鎖（ａｎｔｉ−ＰＤＬ１−Ｈ）部分の分子量は、約５０ｋＤａであり、融合ペプチド鎖（ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ）部分の分子量は、約４０ｋＤａであり、軽鎖（ａｎｔｉ−ＰＤＬ１−Ｌ）部分は、２５ＫＤａであり、基本的に、理論的な期待に一致する；図４には、融合ペプチド鎖（ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ）が、分子量４０ＫＤ前後の二つのバンドを表し、この現象は、翻訳後修飾と空間構造が電気泳動に対する影響に関連している可能性がある。
【００３６】
〔実施例４〕液体クロマトグラフィータンデム質量分析法でＩＡＢの完全なタンパク質分子量及び主なグリコフォームを測定する
発現・精製されたＩＡＢ融合タンパク質を５０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3溶液へ脱塩し、ＵＶ法で脱塩されたタンパク質溶液を定量化した（５０ｍＭ  ＮＨ4ＨＣＯ3をブランクコントロールとして、消散係数は１．６０である）。脱塩されたタンパク質溶液を、５０ｍＭのＮＨ4ＨＣＯ3の添加で１ｍｇ／ｍＬまで希釈し、ロードした。
【００３７】
液相クロマトグラフィー条件：液相装置Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＵＰＬＣ  システム；クロマトグラフィーカラム仕様ＢＥＨ  ３００．４  Ｃ４  １．７ｕｍ，２．１×５０ｍｍ；カラム温度６０℃；サンプル室温度１５℃；流速０．４ｍＬ／ｍｉｎ；移動相Ａは、９９．９％水＋０．１％ギ酸；移動相Ｂは、９９．９％アセトニトリル＋０．１％ギ酸；ロード体積５μＬ；検測器ＥＳＩ−Ｑ−ＴＯＦ。
【００３８】
質量分析条件：質量分析装置Ｗａｔｅｒｓ；ソース温度１２０℃；キャピラリー電圧設定３０００Ｖ；第一コーン電圧設定４０Ｖ；第二コーン電圧設定４Ｖ；コーンガス速度５０Ｌ／Ｈ；取得時間範囲３〜１５ｍｉｎ；脱溶剤温度設定４００℃；質量設定範囲５００〜３０００ｍ／ｚ；収集質量範囲５００〜３０００ｍ／ｚ；スキャン時間１．０Ｓ。
【００３９】
測定結果として、図５を参照し、ＩＡＢの翻訳後修飾の主なグリコフォームが、−２ＫＧ０Ｆ（２）（分子量１１３７８５）、−２ＫＧ０ＦＧ１Ｆ（分子量１１３９４９）、−２ＫＧ１Ｆ（２）（分子量１１４１１４）、Ｇ０Ｇ２Ｆ（１１４２１６）であり、明らかな悪いグリコフォームがない。それらの分子量は、理論的な分子量（翻訳後修飾）と一致する。
【００４０】
〔実施例５〕コントロールとするＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'とａｎｔｉ−ＰＤＬ１'の調製と同定
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９（ＳＩＲＰαに高い親和力を持つ変異体ＳＩＲＰα−ｍとＩｇＧ１抗体Ｆｃ区域が連結してなる融合ペプチドフラグメントをコードするが、「Ｈｏｌｅ」構造を有しない）、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０（抗ＰＤ−Ｌ１抗体の重鎖をコードするが、「Ｋｎｏｂ」構造を有しなく、かつＮ２９７Ａの突然変異でＦｃ区域のグリコシル化修飾を除去した）のヌクレオチドから、相応するＤＮＡフラグメントを合成し、それぞれにｐｃＤＮＡ３．１ベクターに挿入し、発現ベクターとするｐｃＤＮＡ３．１−ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'とｐｃＤＮＡ３．１−ａｎｔｉＰＤＬ１−Ｈ'を構築した。
【００４１】
ｐｃＤＮＡ３．１−ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'を、実施例１と同じ方法で、ＣＨＯ−Ｋ１にトランスフェクトし、ホスト細胞を発現し、高い発現レベルを有する細胞株をスクリーニングし、実施例１、２におけるタンパク質の発現と精製方法で、コントロールとするＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ融合タンパク質を製造し、当該タンパク質は、ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'と名づけられ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７のアミノ酸配列を有する。
【００４２】
ｐｃＤＮＡ３．１−ａｎｔｉＰＤＬ１−Ｈ'と実施例１で製造されたｐｃＤＮＡ３．１−ａｎｔｉＰＤＬ１−Ｌを、実施例１と同じ方法で、ＣＨＯ−Ｋ１にコトランスフェクトし、ホスト細胞に発現し、高い発現レベルを有する細胞株をスクリーニングし、実施例１、２におけるタンパク質の発現と精製方法で、コントロールとする抗ＰＤ−Ｌ１抗体を製造し、当該抗体は、ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'と名づけられ、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のアミノ酸配列を有する。
【００４３】
〔実施例６〕ＩＡＢ融合タンパク質の抗原結合力を測定する
（１）競争ＥＬＩＳＡ法でＩＡＢとヒトＰＤ−Ｌ１の結合力を測定する
ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'はビオチン（Ｂｉｏｔｉｎ）で標識され、使用に備えた。組換え発現されたヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃ融合タンパク質を、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ3溶液（ｐＨ９．６）で５μｇ／ｍｌまで希釈し、１００μＬ／ウェルの量でマイクロプレートをコーティングし、洗浄し、ブロッキングした後に、ウェルごとにビオチンで標識されたａｎｔｉ−ＰＤＬ１'と勾配希釈された競争物を加え、競争物は、標識されないａｎｔｉ−ＰＤＬ１'或いは実施例２に製造されたＩＡＢタンパク質であり、競争物の濃度は、１μｇ／ｍｌから、二倍に希釈し、濃度ごとに三つのウェルを使用し、３７℃で１時間インキュベート後に、反応液を捨て、プレートを洗浄しアビジンで標識された西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ａｖｉｄｉｎｅ−ＨＲＰ）を加え、基質ＴＭＢと発色反応を行い、ＯＤ  ４５０ｎｍにおける吸光値を測定し、結果をプロットし、図６を参照する；図において、横軸は、競争物濃度（ｎｇ／ｍＬ）で、縦軸は、ＯＤ値で、中空三角形は、ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'の競争データで、黒丸は、ＩＡＢの競争データである。
【００４４】
【表１】
2021511817.tif 000003
【００４５】
（２）競争ＥＬＩＳＡ法でＩＡＢとヒトＣＤ４７の結合力を測定する
同じ方法でＩＡＢタンパク質とＣＤ４７の結合力を測定した；マイクロプレートをコーティングした抗原は、組換え・発現されたヒトＣＤ４７タンパク質であり、ビオチンで標識されたＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'と勾配希釈された競争物を加え、競争物は、標識されないＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'或いは実施例２に製造されたＩＡＢタンパク質であり、競争物の濃度は、１μｇ／ｍｌから、二倍に希釈し、濃度ごとに三つのウェルを使用し、インキュベート後に西洋ワサビペルオキシダーゼとＴＭＢで発色し、ＯＤ  ４５０ｎｍにおける吸光値を測定し、結果をプロットし、図７を参照する；図において、横軸は、競争物濃度（ｎｇ／ｍＬ）で、縦軸は、ＯＤ値で、中空三角形は、ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'の競争データで、黒丸は、ＩＡＢの競争データである。
【００４６】
【表２】
2021511817.tif 000004
【００４７】
図６と図７の結果より、融合タンパク質ＩＡＢが標的抗原とするＰＤ−Ｌ１とＣＤ４７の両方に結合活性を持ち、かつプロトタイプの抗体またはリガンドと同じ結合エピトープを認識し、競合的な結合能力があることを示している。ただし、ＩＡＢタンパク質と結合部位は「一価」であるため、その親和性（Ａｆｆｉｎｉｔｙ）は、プロトタイプの抗体またはリガンドの親和性よりも低くなる。ＩＡＢ（ＩＣ５０＝１１．７６）とＰＤ−Ｌ１の親和力は、ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'（ＩＣ５０＝０．９４８）よりほぼ１０倍に減少した；ＩＡＢ（ＩＣ５０＝２．８９７）とＣＤ４７の親和力はＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'（ＩＣ５０＝０．９１８）よりほぼ３倍に減少した。
【００４８】
（３）フローサイトメトリーでＩＡＢタンパク質とがん細胞の結合能を測定する
フローサイトメトリーでそれぞれにＩＡＢタンパク質とＭＣ３８細胞（マウス結腸がん細胞）、ＨＬ６０細胞（人白血病細胞）の結合状況を検測し、かつＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'、ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'をコントロールとし、検測結果について、図１９、図２０（二つの図には、点線はブランクコントロール、実線はＩＡＢタンパク質、短い破線はａｎｔｉ−ＰＤＬ１'、長い破線はＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'を表示する）を参照する。検測結果より、ＩＡＢタンパク質がＭＣ３８細胞およびＨＬ６０細胞の表面に結合できることを示している。
【００４９】
〔実施例７〕ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質ＩＡＢに媒介されるＴ細胞の活性化機能に対する研究
健康な人から２０ｍｌの静脈血を採取し、密度勾配遠心分離により末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離し、１０％ＦＢＳを含むＲＰＭＩ１６４０培地に再懸濁し、９６ウェル細胞培養プレートを１×１０＾５細胞／ウェルで広げ、異なる濃度（０．０１ｎｇ／ｍｌ、０．１ｎｇ／ｍｌ、１ｎｇ／ｍｌ、１０ｎｇ／ｍｌ、１００ｎｇ／ｍｌ）のブドウ球菌エンテロトキシンＢ（ＳＥＢ）と２０μｇ／ｍＬ関連タンパク質（ＩＡＢ、ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'或いはＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'）を含むＲＰＭＩ１６４０培地を各ウェルに添加し、３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターで７２時間インキュベートし、毎日顕微鏡を倒して細胞の状態を観察し、７２時間後、培養上清を採取し、ＥＬＩＳＡでＩＬ−２分泌量を測定した。実験結果を図８に示し、ＳＥＢがＰＢＭＣ細胞を活性化した後、ＩＬ−２の分泌量を増加し、特定の濃度範囲（０−１００ｎｇ／ｍＬ）のＳＥＢで用量依存曲線を示した。異なるＳＥＢ濃度で、ＩＡＢグループとａｎｔｉ−ＰＤＬ１'グループのＩＬ−２の量は、ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'よりも有意に高かった。ＩＡＢが、インビトロでＴ細胞を活性化する機能を持っていることを証明した。
【００５０】
〔実施例８〕ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質ＩＡＢに媒介されるＲＡＷ２６４．７の体外食作用に対する研究
２×１０6のマウス結腸がん細胞株ＭＣ３８を２０００μＬの５μＭ  ＣＳＦＥ（２−カルボキシフルオレセインジアセテートスクシンイミドエステル、リビング蛍光染料）溶液で３７°Ｃの暗所で２０分間インキュベートした後、１０ｍＬの完全培地を加えて５分間インキュベートし、溶液から未結合のＣＳＦＥを除去した。標識された腫瘍細胞を遠心分離によって収集し、完全培地に再懸濁し、濃度が１×１０6／ｍＬの腫瘍細胞懸濁液を作成した。
【００５１】
２４ウェルプレートの各ウェルに、濃度５×１０4細胞／ｍＬのマウスマクロファージＲＡＷ２６４．７（ＡＴＣＣ  ＴＩＢ−７１）懸濁液１ｍＬを加え、マクロファージが壁に付着したら、ウェルプレートの培地を捨て、無血清培地を加えて２時間インキュベートした後、ＣＦＳＥで標識された２×１０5腫瘍細胞を各ウェルに加え、同時に、最終濃度１０μｇ／ｍＬのＩＡＢタンパク質或いはコントロールとするＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'、ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'を添加し、静脈内ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ１、山東泰邦生物製品有限会社）を注射し、３７℃で２時間インキュベートした。
【００５２】
トリプシンでマクロファージを消化し、遠心分離によりマクロファージを収集し、ＰＢＳで２回洗浄し、血球計算盤でカウントした後、細胞密度を１×１０6細胞／ｍＬに調整し、１％ＦＢＳを含むＰＢＳバッファーに再懸濁した；細胞懸濁液を１００μＬ／チューブになるようにフロー分析チューブに加え、遠心し上清を捨て、フローチューブに１００μＬの蛍光標識抗体（ＰＥで標識された抗マウスＦ４／８０抗体）を加え、暗所で４５分間氷上でインキュベートし、１％ＦＢＳを含むＰＢＳバッファーで２回洗浄し、３００μＬのＰＢＳに懸濁し、装置で検測した。ＰＥ単一陽性細胞はマクロファージ、ＣＳＦＥ単一陽性細胞はＭＣ３８腫瘍細胞、ＰＥおよびＣＳＦＥ二重陽性細胞はＭＣ３８細胞を飲み込むマクロファージであり、異なるタンパク質下のマクロファージの飲み込み率が計算された。
【００５３】
実験結果を図９に示し、マクロファージ−腫瘍細胞共培養システムでは、陰性コントロール（ＩｇＧ１）とａｎｔｉ−ＰＤＬ１'を比較すると、共培養システムでのマクロファージ食作用効率はほぼ同じである（＜１０％）。陽性コントロール（ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'）とＩＡＢ融合タンパク質の場合、共培養システムでのマクロファージの食作用効率は大幅に向上でき、ＩＡＢ融合タンパク質の食作用能力（３６％）はＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'（４９％）よりも低い。同時に、ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'が、マクロファージの食作用を促進する能を有しない。
【００５４】
ＩＡＢ融合タンパク質の、マウス骨髄由来マクロファージの食作用を促進する能をさらに検証するために、マウス骨髄細胞を分離した後、マウス骨髄由来マクロファージを５０ｎｇ／ｍＬ  Ｍ−ＣＳＦで７〜１０日間誘導・培養することにより調製し、５×１０＾４のマウス骨髄由来マクロファージを２×１０＾５のＣＦＳＥで標識されたＭＣ３８腫瘍細胞と混合し、ＩＡＢ融合タンパク質、陰性コントロール（ＩｇＧ１）および陽性コントロールＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'を加え、３７℃で２時間インキュベートし、顕微鏡を倒して写真を撮り、画像に緑色の蛍光を含むマクロファージは、腫瘍細胞を飲み込んだマクロファージである。図１０に示すように、ＩｇＧ１を添加した陰性コントロールグループ（図１０ａ）では、マクロファージが壁に付着して増殖し、仮足を広げ、腫瘍細胞を包むマクロファージはほとんどなかった（緑色蛍光）。ＩＡＢの組み合わせ（図１０ｃ）と陽性コントロールグループＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'（図１０ｂ）では、マクロファージが腫瘍細胞を飲み込んだ（緑色蛍光）（黒い矢印で示す）状況がある。上記の結果より、ＩＡＢ融合タンパク質がインビトロでマクロファージが腫瘍細胞を飲み込むことを促進する能を有することを再度確認した。
【００５５】
〔実施例９〕ＡＤＣＣレポーター遺伝子実験
ルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するＦｃγＲＩＩＩａを発現するＪｕｒｋａｔ細胞（エフェクター細胞）およびＭＣ３８腫瘍細胞（標的細胞）とさまざまな濃度の試験抗体（ＩＡＢ融合タンパク質、陽性コントロールＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'、陰性コントロールａｎｔｉ−ＰＤＬ１'）を、８％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターで４時間インキュベートし、蛍光基質を添加し、蛍光測定値をＧｌｏｍａｘRプレート蛍光アッセイマイクロプレートリーダーで測定し、結果を図１１に示した。
【００５６】
図１１において、黒い四角はＩＡＢ融合タンパク質のデータ、黒丸はＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'のデータ、黒い三角形はａｎｔｉ−ＰＤＬ１'のデータである。図に示すデータより、ＩＡＢ融合タンパク質に一定のＡＤＣＣ効果があるが、同じ用量で、そのＡＤＣＣ効果は、ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'よりも低く、ノブインホール構造に関連している可能性がある。ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'は、抗体Ｆｃセグメントの保存されたグリコシル化サイトにＮ２９７Ａ突然変異が導入され、グリコシル化修飾がないため、ＡＤＣＣ効果を失った。
【００５７】
〔実施例１０〕ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質ＩＡＢの血液毒性実験
１５匹の健康なＢａｌｂ／ｃマウス（６〜８週間）を、体重（平均約２０ｇ）に応じてランダムに３グループ（グループあたり５匹）に分けた。マウスの各グループは、１００ｍｇ／ｋｇの用量で腹腔内薬物投与された（ＩＡＢ、ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'または静脈内ヒトＩｇＧ）、投与の２４時間後、約５００μＬの血液を眼窩からＥＰチューブに採取し、血液凝固を防ぐために１０μＬの１％ヘパリンナトリウムをすぐに添加した。サンプルは、マウスの血液分析のために「上海南部モデル動物研究センター」に送られた。プロトタイプ抗体とＩＡＢ融合タンパク質の血液毒性は、投与後のマウスの血液中の赤血球、ヘモグロビン、ヘマトクリット、血小板などの指標の変化をモニタリングすることで評価し、結果を図１２、図１３、および図１４に示した；結果より、ＩＡＢタンパク質を注射した実験グループの赤血球含有量（９．１×１０＾１２／Ｌ）、ヘマトクリット（４３．０％）、およびヘモグロビン（１３７．８ｇ／Ｌ）は、ヒトＩｇＧを注射したコントロールグループの赤血球含有量（９．４×１０＾１２／Ｌ）、ヘマトクリット（４２．５６％）、およびヘモグロビン（１４２．４ｇ／Ｌ）と有意差がなかったが、ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ注射グループには、血液毒性に影響された関連データは、赤血球含有量（６．８×１０＾１２／Ｌ）、ヘマトクリット（３５．０７％）、およびヘモグロビン（１２１．６ｇ／Ｌ）で、他の２つの群とは有意に異なっていた。
【００５８】
〔実施例１１〕ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質ＩＡＢのマウス体内抗腫瘍活性に関する研究
（１）ＩＡＢでＢａｌｂ／ｃマウスＭＣ３８腫瘍モデルを治療する：
合計４０匹のＢａｌｂ／ｃ雌マウス（６−８週間）に、ＭＣ３８腫瘍細胞を２×１０＾５で皮下接種した。６日目に腫瘍が大きすぎるか小さすぎるマウスを除外した後、腫瘍の体積（約１００ｍｍ3）に応じて、４つのグループ（各グループに８匹のマウス）に分け、７日目と１０日目に、腫瘍にＩＡＢ融合タンパク質、無関係なコントロール（ヒトＩｇＧ１）またはプロトタイプ抗体（ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'、ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'）を１０ｍｇ／ｋｇの用量で注射した。週に２回マウスの腫瘍形成を観察し、ノギスを使用し腫瘍の最大直径（長さ）と垂直距離（幅）を測定し、腫瘍の体積を計算する式は、体積＝０．５×長さ×幅2である。マウスの腫瘍体積が２０００ｍｍ3を超える場合、または腫瘍部位に広い範囲の潰瘍が出現した場合、マウスは頸椎脱臼法で殺され、通常２１日間観察された。試験結果は、図１５を参照。
【００５９】
実験結果より、無関係な抗体のコントロールグループ（ヒトＩｇＧ１の静脈内注射）は投与後に腫瘍が漸進的な成長を示した、２１日目の平均腫瘍体積は１４７２ｍｍ3であった。観察期間の終了（接種後２１日目）までに、コントロールグループとＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'治療グループのマウスは精神的に落ち込んで、体重を減らし、皮膚が収縮して行動が遅くなった。ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'およびＩＡＢ治療グループは、マウスの背部に様々なレベルの腫瘍の萎縮を示した。ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'治療グループのマウスの腫瘍平均体積は、２８９ｍｍ3である。ＩＡＢ治療グループのマウスの平均腫瘍体積は６７ｍｍ3で、一部のマウスには腫瘍が完全に消失しており、ＭＣ３８相同腫瘍モデルでは、ＩＡＢ融合タンパク質がプロトタイプ（ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'とＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'）よりも有意に優れた腫瘍抑制効果を示した。抗腫瘍効果の順番は：ＩＡＢ＞ａｎｔｉ−ＰＤＬ１'＞ＳＩＲＰα−ｍ−Ｆｃ'。結果は、同じ投与量と投与モードで、ＩＡＢ融合タンパク質が腫瘍抑制に対して「相乗効果」を持っていることを示唆している。
【００６０】
（２）ＩＡＢでＢａｌｂ／ｃマウス二次接種ＭＣ３８腫瘍モデルを予防する：
ＩＡＢ融合タンパク質治療グループの腫瘍が完全に消失したマウス（接種部位に触れると、腫瘍には触れられない）と、健康なＢａｌｂ／ｃマウスをＭＣ３８二次接種実験に使用した。新たに２×１０＾５の接種量に従って、マウスの元の接種部位の反対側にＭＣ３８腫瘍細胞を皮下に再接種した。週に２回マウスの腫瘍形成を観察し、ノギスを使用し腫瘍の最大直径（長さ）と垂直距離（幅）を測定し、腫瘍の体積を計算する式は、体積＝０．５×長さ×幅2である。マウスの腫瘍体積が２，０００ｍｍ3を超える場合、または腫瘍部位に広い範囲の潰瘍が出現した場合、マウスは頸椎脱臼法で殺され、通常２１日間観察された。試験結果は、図１６を参照。
【００６１】
実験結果より、ＭＣ３８細胞が陰性コントロールグループ（健康なＢａｌｂ／ｃマウス）に接種された後、皮下腫瘍が進行性の成長を示し、２１日目の担癌マウスの平均腫瘍体積は１４５３ｍｍ3であった；ただし、ＩＡＢ融合タンパク質で治癒したマウスにはＭＣ３８を接種した後に、２１日以内に接種部位に触れられる腫瘍は見つけられなかった（３０ｍｍ3未満）。１匹のマウスのみが１０日目に腫瘍成長の兆候を示したが、後期には自然に消失した。上記の結果は、治癒したマウスがＭＣ３８腫瘍適応性および自然免疫の阻害を解除した可能性があることを示唆し、適応免疫活性化後に生成された抗原特異的Ｔ細胞は、ＭＣ３８腫瘍細胞の二次腫瘍形成を阻害する可能性がある。
【００６２】
〔実施例１２〕ＣＤ４７とＰＤ−Ｌ１を標的にする二重機能融合タンパク質ＩＡＢの作用機構の研究
（１）ＭＣ３８担癌マウス（マクロファージ欠損タイプ）のＩＡＢ治療：
１５匹の６週齢Ｂａｌｂ／ｃ健康な雌マウスに、ＭＣ３８腫瘍細胞を２×１０＾５細胞の数に従って皮下接種し、６日目に、腫瘍の体積に従って平均に３つのグループに分け、各グループに５匹、すなわち実験グループ、コントロールグループ１、およびコントロールグループ２を配置した。実験グループには、２００μＬ／マウスのクロフゾン（英語名Ｃｌｏｐｈｏｓｏｍｅ、マクロファージ除去剤、上海邦律生物テクノロジー有限会社）を注射した後、１００μＬ／マウスのクロフルクソンを１日おきに注射し、ＩＡＢ融合タンパク質を１０ｍｇ／ｋｇの用量で７日目と１０日目に腫瘍に注射した；コントロールグループ１では、クロフルクソンの代わりにブラックリポソームをマウスに注射し、ＩＡＢ融合タンパク質を７および１０日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍に注射した；コントロールグループ２では、クロフゾンの代わりにブラックリポソームをマウスに注射し、無関係なヒトＩｇＧ抗体を７および１０日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量で腫瘍に注射した。週に２回各グループのマウスの腫瘍形成を観察し、ノギスを使用し腫瘍の最大直径（長さ）と垂直距離（幅）を測定し、腫瘍の体積を計算する式は、体積＝０．５×長さ×幅2である。マウスの腫瘍体積が２，０００ｍｍ3を超える場合、または腫瘍部位に広い範囲の潰瘍が出現した場合、マウスは頸椎脱臼法で殺され、通常２１日間観察された。試験結果は、図１７を参照。
【００６３】
実験結果では、マクロファージをクリアしなかったマウスに、無関係な抗体を注射した後（すなわち、コントロールグループ２）、皮下ＭＣ３８腫瘍は進行性の成長を示し、２０日目の担腫瘍マウスの平均腫瘍体積は１４１９ｍｍ3でした；マクロファージがクリアされていないマウスのＩＡＢ融合タンパク質（すなわち、コントロールグループ１）の投与後、マウスの皮下腫瘍の成長は効果的に抑制され、２０日目のマウスの平均腫瘍体積はわずか５５．８ｍｍ3であった。ＩＡＢ融合タンパク質をマクロファージがクリアされたグループのマウスに投与した後（すなわち、実験グループ）、腫瘍の成長は部分的に抑制されたが、２１日目の腫瘍体積は５８７ｍｍ3であり、その腫瘍抑制効果は健常マウス投与グループ（コントロールグループ１）よりも有意に低かった。上記の実験結果は、ＩＡＢ融合タンパク質の体内で瘍抑制効果が自然免疫細胞（マクロファージ）に一部依存していることを示唆している。
【００６４】
（２）ＭＣ３８担癌マウス（ＣＤ８＋Ｔ細胞欠損タイプ）のＩＡＢ治療：
各匹のＢａｌｂ／ｃマウスに抗ＣＤ８抗体または無関係のＩｇＧ抗体（２００μｇ／マウス／回）を週２回注射して、マウスのＣＤ８＋陽性Ｔ細胞をクリアした。
【００６５】
２×１０＾５の接種量で、ＣＤ８＋Ｔ細胞をクリアされた５匹のＢａｌｂ／ｃマウス（実験グループ）と６〜８週齢の１０匹の健康なＢａｌｂ／ｃマウスにＭＣ３８腫瘍細胞を皮下接種した（平均にコントロールグループ１、２に分けられた）。実験グループとコントロールグループ１には、７日目と１０日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＩＡＢ融合タンパク質を腫瘍に注射した；コントロールグループ２には、７日目と１０日目に１０ｍｇ／ｋｇの用量で無関係のヒトＩｇＧ抗体を腫瘍に注射した。週に２回各グループのマウスの腫瘍形成を観察し、ノギスを使用し腫瘍の最大直径（長さ）と垂直距離（幅）を測定し、腫瘍の体積を計算する式は、体積＝０．５×長さ×幅2である。マウスの腫瘍体積が２，０００ｍｍ3を超える場合、または腫瘍部位に広い範囲の潰瘍が出現した場合、マウスは頸椎脱臼法で殺され、通常２１日間観察された。試験結果は、図１８を参照。
【００６６】
実験結果では、ＣＤ８＋Ｔ細胞をクリアしなかったマウス（コントロールグループ２）に無関係な抗体を投与した後、ＭＣ３８腫瘍細胞の体積は徐々に増加し、２１日目の担癌マウスの平均腫瘍体積は１２６９ｍｍ3でした；ＣＤ８＋Ｔ細胞をクリアしなかったマウスにＩＡＢ融合タンパク質を投与した後（コントロールグループ１）、マウスの腫瘍成長は効果的に抑制され、２１日目のマウスの平均腫瘍体積はわずか６４．９ｍｍ3でした。ＣＤ８＋Ｔ細胞をクリアしたマウスにＩＡＢ融合タンパク質を投与したグループ（実験グループ）には、２１日目の腫瘍体積は７７７ｍｍ3であり、その腫瘍抑制効果は健常マウスＩＡＢ投与グループよりも有意に低かった。上記の実験結果は、ＩＡＢ融合タンパク質の体内での腫瘍抑制効果が適応免疫細胞（ＣＤ８＋Ｔ細胞）にも依存することを示唆している。
【図１】
2021511817.tif 000005
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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