(57)【要約】  対象としてのリソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なる糖分解酵素および／またはマンノース−６−リン酸部分もしくはマンノース部分を有さない糖分解酵素を有効成分として含有する治療剤。
2021508312.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
有効成分として糖分解酵素を含む治療剤を投与するステップを含み、
前記糖分解酵素が、対象としてのリソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なり、前記患者のリソソームに蓄積する糖を分解する活性を有する、リソソーム蓄積症を治療するための方法。
【請求項２】
前記糖分解酵素がマンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分を有さない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記糖分解酵素が、前記患者のリソソームに蓄積する糖の切断部位の点で、前記リソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記糖分解酵素がエンド型である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記リソソーム蓄積症が、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、糖原病ＩＩ型、および糖タンパク質蓄積症からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記リソソーム蓄積症が、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病Ａ、サンフィリポ病Ｂ、サンフィリポ病Ｃ、サンフィリポ病Ｄ、モルキオ病Ａ、モルキオ病Ｂ、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症ＩＸ型、およびムコ多糖症プラス症候群からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記糖分解酵素が、グリコサミノグリカン分解酵素、グリコシダーゼ、およびペプチド：Ｎ−グリカナーゼからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記糖分解酵素が、ケラタナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ＰＮＧａｓｅＦ、およびエンドグリコシダーゼＨからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記糖分解酵素が微生物に由来する、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記微生物がバシラス属に属する微生物である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記患者がヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記糖分解酵素を生産するホスト細胞が微生物である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記治療剤が注射用製剤に製剤化されている、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
有効成分として糖分解酵素を含有するリソソーム蓄積症のための治療剤を製造するための方法であって：
糖分解酵素を生産する微生物の培養物を得るステップと；
前記培養物から糖分解酵素を回収するステップと；
任意に、回収された前記糖分解酵素を薬学的に許容される添加剤と混合することによって組成物を製剤化するステップと、を含む、方法。
【請求項１５】
前記微生物が、バシラスおよびエシェリキア属に属する微生物からなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
さらに、エンドトキシンが実質的に含有されない程度まで、前記回収された糖分解酵素中のエンドトキシンレベルを低下させるステップを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
担体と担体に固定化された糖分解酵素とを含み、
前記糖分解酵素が、対象としてのリソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なり、前記患者のリソソームに蓄積する糖を分解する活性を有する、リソソーム蓄積症のための治療デバイス。
【請求項１８】
請求項１７に記載の治療デバイスと；
リソソーム蓄積症患者から採取された血液を前記治療デバイスに輸送するための脱血側回路と；
前記治療デバイスに含まれる前記糖分解酵素と接触させられた血液を前記リソソーム蓄積症患者に輸送するための返血側回路と；
前記脱血側回路および前記返血側回路を通して血液を圧送するための血液ポンプと、を含む、リソソーム蓄積症を治療するための血液循環システム。
【請求項１９】
リソソーム蓄積症患者に由来する血液を糖分解酵素と接触させるステップと；
前記糖分解酵素と接触させられた血液を前記患者に輸送するステップと、を含み、
前記糖分解酵素が、前記患者の欠損タンパク質とは異なり、前記患者のリソソームに蓄積する糖を分解する活性を有する、リソソーム蓄積症を治療するための方法。
【請求項２０】
前記糖分解酵素がマンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分を有さない、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記糖分解酵素が、前記患者のリソソームに蓄積する糖の切断部位の点で、リソソーム蓄積症患者の前記欠損タンパク質とは異なる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記糖分解酵素がエンド型である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
前記リソソーム蓄積症が、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、糖原病ＩＩ型、および糖タンパク質蓄積症からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２４】
前記リソソーム蓄積症が、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病Ａ、サンフィリポ病Ｂ、サンフィリポ病Ｃ、サンフィリポ病Ｄ、モルキオ病Ａ、モルキオ病Ｂ、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症ＩＸ型、およびムコ多糖症プラス症候群からなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２５】
前記糖分解酵素が、グリコサミノグリカン分解酵素、グリコシダーゼ、およびペプチド：Ｎ−グリカナーゼからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記糖分解酵素が、ケラタナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ＰＮＧａｓｅＦ、およびエンドグリコシダーゼＨからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２７】
前記糖分解酵素が微生物に由来する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２８】
前記微生物がバシラス属に属する微生物である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記患者がヒトである、請求項１９に記載の方法。
【請求項３０】
前記糖分解酵素を生産するホスト細胞が微生物である、請求項１９に記載の方法。
【請求項３１】
前記治療剤が注射用製剤に製剤化されている、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本願は配列表を含有し、これはＡＳＣＩＩフォーマットで電子提出されており、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。２０１８年８月２７日に作成された前記ＡＳＣＩＩコピーは１１６２２７−０１０９＿ＳＬ．ｔｘｔと名付けられており、サイズは６５，２４５バイトである。
【０００２】
本発明は糖分解酵素を用いるリソソーム蓄積症の治療に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞内小器官としてのリソソーム内には、酵素の種々の種類が存在し、それらは生体内の種々の糖部分、例えばムコ多糖および複合糖質の分解を担う。ヒトを包含する哺乳動物の生体内に存在するリソソーム酵素の大部分はエキソ型酵素であり、それらは基質を末端から各構成単位で切断する。ほとんどの場合、糖部分の分解は段階的な一連のエキソ型酵素反応に基づいて達成される。
【０００４】
リソソーム蓄積症はリソソーム酵素の異常によって引き起こされる遺伝子疾患である。リソソーム蓄積症の始まりは、リソソーム酵素の低下した代謝活性によって引き起こされると推察され、例えば酵素欠損、機能不全、活性化メカニズムの異常などが原因であり、これがそれらの酵素の基質の蓄積に至り得る。リソソーム蓄積症のうち、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、糖原病ＩＩ型、糖タンパク質蓄積症などは、ムコ多糖または複合糖質などの糖がリソソーム内に蓄積する疾患として知られている。
【０００５】
リソソーム蓄積症を治療するための方法としては、酵素補充治療（ＥＲＴ）が知られている。ＥＲＴでは、患者のリソソーム内における低下した代謝活性が、患者の欠損酵素に対応する酵素を投与することによって補充される（特許文献１および非特許文献１）。生体内において、リソソームの内部は５またはより低いｐＨを有する酸性条件に維持されている。ＥＲＴによって補充される欠損酵素もまた酸性条件において至適に活性化される。これらの理由が原因で、補充される酵素にとってｐＨが至適であるリソソームの内部への酵素の送達は、ＥＲＴに重要であると従来考えられてきた。
【０００６】
哺乳動物の生体内でのリソソーム酵素を合成するプロセスの間において、高マンノース型糖鎖を持つアスパラギン残基を有するリソソーム酵素前駆体（すなわち、Ｎ−グリコシル化された酵素前駆体）が、Ｎ−アセチルグルコサミン−１−ホスホトランスフェラーゼの作用によってマンノース−６−リン酸で修飾される。マンノース−６−リン酸で修飾された酵素はゴルジ体においてマンノース−６−リン酸受容体と会合し、リソソームに輸送される（非特許文献２）。すなわち、酵素のマンノース−６−リン酸部分は酵素をリソソームに送達するためのタグである。リソソーム蓄積症の一種のゴーシェ病のＥＲＴによると、マンノース部分を有するβ−グルコセレブロシダーゼが用いられる。マンノースによるβ−グルコセレブロシダーゼの修飾もまた、リソソームへの移送のために企図される。すなわち、従来のＥＲＴでは、酵素がリソソームの内部で作用するように、マンノース−６−リン酸またはマンノースによる修飾によって、患者の欠損酵素をリソソームに移送することを促進することが不可欠である（特許文献１および非特許文献１）。ＥＲＴに用いられるマンノース−６−リン酸またはマンノースによって修飾された酵素は、哺乳類細胞内で酵素を発現することによって、あるいはマンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分を酵素に化学的に組み込むことによって従来生産される。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】国際公開第２０１２／０１２７１８号パンフレット
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】アニュアル・レビュー・オブ・ゲノミクス・アンド・ヒューマン・ジェネティクス（Annual Review of Genomics and Human Genetics）２０１２年，第１３巻：ｐ．３０７−３５
【非特許文献２】ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological Chemistry）１９８９年，第２６４巻（第２１号）ｐ．１２１１５−１２１１８
【発明の概要】
【０００９】
本発明によれば、糖分解酵素を用いてリソソーム蓄積症を治療するための薬剤、デバイス、および血液循環システムと、リソソーム蓄積症を治療するための薬剤を製造するための方法と、リソソーム蓄積症を治療するための方法とが提供される。
【００１０】
リソソーム蓄積症の症状を改善するためには、欠損酵素をリソソームに効率的に送達することとそこに蓄積した糖部分のクリアランスとによってリソソームにおける低下した代謝を再活性化することが、ＥＲＴにとって最も重要な点であると考えられてきた。
【００１１】
一方で、本発明は、患者の血液循環中に存在する蓄積した糖を低下させる治療でさえも、リソソーム蓄積症への改善されたまたはさらには優れた治療効果を示すことができるという驚くべき発見に少なくとも部分的に基づく。すなわち、本発明は、リソソーム蓄積症のための治療に関し、それによると、血液の糖含量が低下するように、蓄積した糖部分を含有する患者の血液が糖分解酵素と接触させられる。
【００１２】
１つの実施形態によれば、リソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質（例えば、欠損酵素、例えば遺伝子欠損した酵素または部分的に不活性な酵素）と同一ではない糖分解酵素が、患者に投与されるかまたは患者の血液と接触させられる。すなわち、通常のＥＲＴとは違って、糖分解酵素は、それが患者のリソソームに蓄積する糖を分解する活性を有する限り、リソソーム蓄積症患者の欠損酵素と同一であることを要求されない。
【００１３】
別の実施形態によれば、いかなるマンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分も有さない糖分解酵素が、患者に投与されるかまたは患者の血液と接触させられる。すなわち、糖分解酵素は、リソソーム蓄積症について改善されたまたはさらには優れた治療効果を示し得るが、リソソームにもまた送達されることは要求されない。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、リソソーム蓄積症患者の元々の欠損タンパク質とは異なる分解様式を有する糖分解酵素が、患者に投与されるかまたは患者の血液と接触させられる。
【００１５】
いくつかの実施形態によれば、リソソーム蓄積症患者の蓄積する糖部分を分解する活性を有する微生物に由来する糖分解酵素が、患者に投与されるかまたは患者の血液と接触させられる。好ましい実施形態においては、低下したエンドトキシンレベルを有する微生物に由来する糖分解酵素が用いられる。
【００１６】
いくつかの実施形態によれば、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、糖原病ＩＩ型、および糖タンパク質蓄積症からなる群から選択されるリソソーム蓄積症の患者に対して、
エンド型酵素が糖分解酵素として用いられる。好ましい実施形態によれば、ムコ多糖症（例えば、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病（Ａ、Ｂ、Ｃ、もしくはＤ）、モルキオ病（ＡもしくはＢ）、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症ＩＸ型、またはムコ多糖症プラス症候群）の患者に対して、グリコサミノグリカン分解酵素が糖分解酵素として用いられる。
【００１７】
有効成分として糖分解酵素を含有するリソソーム蓄積症を治療するための薬剤を製造するための方法と、糖分解酵素を用いる治療デバイスおよび血液循環システムと、リソソーム蓄積症を治療するための方法ともまた提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図１は、本発明の１つの態様に関する治療および治療方法のための血液循環システムを例示する例示的な図式である。
【図２Ａ】図２Ａは、ＰＢＳ（無処置群）またはケラタナーゼ（処置群）の単回静脈内投与後の、８週齢ＧＡＬＮＳ（Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−硫酸スルファターゼ。本願において下ではＧＡＬＮＳともまた言われる）ノックアウトマウスのケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルを示している（平均値±標準偏差）。
【図２Ｂ】図２Ｂは、ＰＢＳ（無処置群）またはケラタナーゼ（処置群）の単回静脈内投与後の、８週齢ＧＡＬＮＳノックアウトマウスのヘパラン硫酸非硫酸化型二糖の血清中レベルを示している（平均値±標準偏差）。
【図３Ａ】図３Ａは、ＰＢＳ（無処置群）またはケラタナーゼ（処置群）の反復静脈内投与後の、ＧＡＬＮＳノックアウトマウスのケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルを示している。ＰＢＳまたはケラタナーゼを、生後１日または２日、ならびに４および８週齢に投与した（平均値±標準偏差）。
【図３Ｂ】図３Ｂは、ＰＢＳ（無処置群）またはケラタナーゼ（処置群）の反復静脈内投与後の、ＧＡＬＮＳノックアウトマウスのヘパラン硫酸非硫酸化型二糖の血清中レベルを示している。ＰＢＳまたはケラタナーゼを、生後１日または２日、ならびに４および８週齢に投与した（平均値±標準偏差）。
【図４Ａ】図４Ａは、ＰＢＳの反復静脈内投与後の１２週齢マウスからの大腿骨骨端軟骨板の代表的な顕微鏡写真である（コントロール群）。ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）染色パラフィン切片。
【図４Ｂ】図４Ｂは、ＰＢＳの反復静脈内投与後の１２週齢マウスからの大腿骨骨端軟骨板の代表的な顕微鏡写真である（無処置群）。Ｈ＆Ｅ染色パラフィン切片。
【図４Ｃ】図４Ｃは、ケラタナーゼの反復静脈内投与後の１２週齢マウスからの大腿骨骨端軟骨板の代表的な顕微鏡写真である（処置群）。Ｈ＆Ｅ染色パラフィン切片。
【図５Ａ】図５Ａは、ＰＢＳの反復静脈内投与後の１２週齢マウスからの大腿骨骨端軟骨板の代表的な顕微鏡写真である（コントロール群）。トルイジンブルー染色樹脂切片。
【図５Ｂ】図５Ｂは、ＰＢＳの反復静脈内投与後の１２週齢マウスからの大腿骨骨端軟骨板の代表的な顕微鏡写真である（無処置）。トルイジンブルー染色樹脂切片。
【図５Ｃ】図５Ｃは、ケラタナーゼの反復静脈内投与後の１２週齢マウスからの大腿骨骨端軟骨板の代表的な顕微鏡写真である（処置群）。トルイジンブルー染色樹脂切片。
【図６】図６は、ＰＢＳ（無処置）またはケラタナーゼ（処置）の単回静脈内投与後の、４週齢ＧＡＬＮＳノックアウトマウスのケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルを示している（平均値±標準偏差、ｎ＝９、＊ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）。Ｎ．Ｄ．：不検出。
【図７Ａ】図７Ａは、ＰＢＳ（無処置）またはケラタナーゼ（処置）を注射したＧＡＬＮＳノックアウトマウスの肝臓におけるケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖レベルを示している（平均値±標準偏差、ｎ＝４、＊：ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）。
【図７Ｂ】図７Ｂは、ＰＢＳ（無処置）またはケラタナーゼ（処置）を注射したＧＡＬＮＳノックアウトマウスの肺におけるケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖レベルを示している（平均値±標準偏差、ｎ＝４）。
【図７Ｃ】図７Ｃは、ＰＢＳ（無処置）またはケラタナーゼ（処置）を注射したＧＡＬＮＳノックアウトマウスの脾臓におけるケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖レベルを示している（平均値±標準偏差、ｎ＝４、＊：ｐ＜０．０５、対応のないｔ検定）。
【図７Ｄ】図７Ｄは、ＰＢＳ（無処置）またはケラタナーゼ（処置）を注射したＧＡＬＮＳノックアウトマウスの心臓におけるケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖レベルを示している（平均値±標準偏差、ｎ＝４）。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明の代表的な実施形態が本願において以下で説明されるが、本発明はこれに限定されない。
【００２０】
本願において用いられる用語「ａ」または「ａｎ」は１つまたは１つよりも多くを意味するものとする。
【００２１】
本発明によれば、リソソーム蓄積症について、改善されたまたはさらに優れた治療効果が達成され得る。本発明による治療効果の例は、成長段階における関節の軟骨低形成症の有意な改善を包含し得る。本発明によれば、患者の生体内のリソソームへの糖分解酵素の送達が要求されない。それゆえに、この治療は、マンノース−６−リン酸受容体の欠損によって引き起こされるリソソームトラフィック活性の喪失または機能不全を有する者などの患者にとってさえも有効であろう。さらにその上、本発明は、糖が脳内リソソームに蓄積する対象にさえも適用可能であり得る。なぜなら、糖分解酵素そのものを脳に送達することは必要でないからである。それゆえに、髄腔内または脳室内投与などの侵襲的なレジメンは、かかるケースでさえも要求されない。
【００２２】
本願において用いられる用語「欠損タンパク質」は、その欠如または機能不全が原因で、リソソーム蓄積症患者のリソソーム内の基質の蓄積の原因が帰せられるタンパク質をいう。
【００２３】
本願において用いられる用語「欠損酵素」は、その欠如または機能不全が原因で、リソソーム蓄積症患者のリソソーム内の基質の蓄積の原因が帰せられる酵素をいう。
【００２４】
本願において用いられる、交換可能に用いられる用語「糖」および「糖部分」は、炭化水素、グリコサミノグリカン、ならびに複合糖質、例えば糖脂質および糖タンパク質を包含する。
【００２５】
リソソーム蓄積症の例は、特に限定されないが、ムコ多糖症（例えば、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病（Ａ、Ｂ、Ｃ、もしくはＤ）、モルキオ病（ＡもしくはＢ）、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症ＩＸ型、またはムコ多糖症プラス症候群）、スフィンゴリピドーシス（例えば、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ＧＭ２ガングリオシドーシス、ファブリー病、ファーバー病、ゴーシェ病、ニーマン・ピック病、およびクラッベ病）、糖原病ＩＩ型（ポンペ病）、ならびに糖タンパク質蓄積症（例えば、マンノシドーシス、フコシドーシス、およびガラクトシアリドーシス）を包含する。好ましい実施形態によれば、リソソーム蓄積症は、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病（Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）、モルキオ病（ＡおよびＢ）、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症ＩＸ型、ならびにムコ多糖症プラス症候群からなる群から選択される。
【００２６】
特に好ましい実施形態によれば、リソソーム蓄積症はモルキオ病（ムコ多糖症ＩＶ）で
ある。モルキオ病ＡおよびＢ型はそれぞれＧＡＬＮＳおよびβ−ガラクトシダーゼの欠損によって引き起こされることが公知である。モルキオ病の患者に蓄積するケラタン硫酸（ガラクトシルβ−（１→４）−Ｎ−アセチルグルコサミン二糖単位のβ−（１→３）反復から形成される）は、健康な者では次の（１）および（２）の反復反応によって非還元末端から分解される。
（１）Ｎ−アセチルガラクトサミン−６−スルファターゼ（本願において下ではＧＡＬＮＳともまた言われる）またはＮ−アセチルグルコサミン−６−スルファターゼによる、非還元末端糖残基からの６−Ｏ−硫酸基の脱硫酸化
（２）β−ガラクトシダーゼ（ＧＬＢ１）またはβ−ヘキソサミニダーゼ（ＨｅｘＡ）による、非還元末端糖残基を除去するための加水分解反応
【００２７】
糖分解酵素はエンド酵素またはエキソ酵素であり得る。好ましい実施形態によれば、糖分解酵素はエンド酵素である。
【００２８】
中性ｐＨ条件における糖分解活性の観点からは、微生物に由来する糖分解酵素が好ましい実施形態に従って用いられる。微生物の限定しない例は、バシラス、エシェリキア、シュードモナス、フラボバクテリウム、プロテウス、アルスロバクター、ストレプトコッカス、バクテロイデス、アスペルギルス、エリザベトキンギア、およびストレプトマイセス属に属する微生物を包含する。特に、高い糖分解活性の観点から、バシラス属の微生物に由来する糖分解酵素がより好ましい実施形態において用いられる。
【００２９】
本発明に用いられ得る糖分解酵素の例は、特に限定されないが、グリコサミノグリカン分解酵素、グリコシダーゼ、およびペプチド：Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅ）を包含する。
【００３０】
好ましい実施形態によれば、グリコサミノグリカン分解酵素（例えば、ケラタナーゼ、例えばケラタナーゼＩまたはケラタナーゼＩＩ；ヘパリナーゼ、例えばヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、またはヘパリナーゼＩＩＩ；ヘパリチナーゼ、例えばヘパリチナーゼＩＶ、ヘパリチナーゼＶ、ヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ、またはヘパリチナーゼＴ−ＩＶ；コンドロイチナーゼ、例えばコンドロイチナーゼＡＢＣ、コンドロイチナーゼＡＣ、コンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ、コンドロイチナーゼＢ、またはコンドロイチナーゼＣ；ヒアルロニダーゼ、例えば放線菌に由来するヒアルロニダーゼまたはストレプトコッカスに由来するヒアルロニダーゼ）；グルコシダーゼ（例えば、微生物に由来するβ−ガラクトシダーゼまたはα−ガラクトシダーゼ）；およびペプチド：Ｎ−グリカナーゼ（ＰＮＧａｓｅＦ、エンドグリコシダーゼＨ等）からなる群から選択される少なくとも１つが、糖分解酵素として用いられる。
【００３１】
１つの実施形態によれば、ケラタナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ＰＮＧａｓｅＦ、およびエンドグリコシダーゼＨからなる群から選択される少なくとも１つが、糖分解酵素として用いられる。
【００３２】
より好ましい実施形態によれば、ケラタナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、およびヒアルロニダーゼからなる群から選択される少なくとも１つが、糖分解酵素として用いられる。
【００３３】
ケラタナーゼの例は、バシラスｓｐ．Ｋｓ３６に由来するエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ（Hashimoto Shinichi, Morikawa Kiyoshi, Kikuchi Hiroshi, Yoshida
Keiichi, and Tokuyasu Kiyochika, Biochemistry, 60, 935 (1988)）およびバシラス  サーキュランス（Bacillus circulans）のＫｓＴ２０２に由来するエンド−β−Ｎ−アセ
チルグルコサミニダーゼ（Clinical Biochemistry 48 (2015) 796-802）を包含するバシ
ラス属の微生物に由来するケラタナーゼ；エシュキリア  フレンディ（Escherichia freundii）に由来するエンド−β−ガラクトシダーゼ（H.Nakagawa, T.Yamada, J-L.Chien, A.Gardas, M.Kitamikado, S-C.Li, Y-T.Li, J. Biol. Chem., 255, 5955 (1980)）を包含
するエシェリキア属の微生物に由来するケラタナーゼ；ならびにシュードモナスｓｐ．ＩＦＯ−１３３０９株に由来するエンド−β−ガラクトシダーゼ（K.Nakazawa, N.Suzuki, S.Suzuki, J. Biol. Chem., 250, 905 (1975)、K.Nakazawa, S.Suzuki, J. Biol. Chem.,
250, 912 (1975)）およびシュードモナス  レプチリボラ（Pseudomonas reptilivora）
によって生産されるエンド−β−ガラクトシダーゼ（特公昭５７−０４１２３６号）を包含するシュードモナス属の微生物に由来するケラタナーゼを包含するが、これらに限定されない。
【００３４】
ヘパリナーゼの例は、フラボバクテリウム  ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）などのフラボバクテリウム属の微生物に由来するヘパリナーゼ（米国特許第４４４３５４５号）；バシラスｓｐ．ＢＨ１００などのバシラス属の微生物に由来するヘパリナーゼ；およびバクテロイデス属の微生物に由来するヘパリナーゼ、例えばバクテロイデス  エガーシー（Bacteroides Eggerthii）に由来するヘパリナーゼＩ、ヘパリナーゼＩＩ、また
はヘパリナーゼＩＩＩ（Glycobiology., 21, 1454-1531 (2011)）を包含するが、これら
に限定されない。
【００３５】
ヘパリチナーゼの例は、フラボバクテリウム属の微生物に由来するヘパリチナーゼ、例えばフラボバクテリウムｓｐ．Ｈｐ２０６に由来するヘパリチナーゼＩＶまたはヘパリチナーゼＶ（特開平０２−０５７１８３号）；およびバシラス属の微生物に由来するヘパリチナーゼ、例えばバシラス  サーキュランス（Bacillus circulans）のＨｐＴ２９８に由来するヘパリチナーゼＴ−Ｉ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩ、ヘパリチナーゼＴ−ＩＩＩ、またはヘパリチナーゼＴ−ＩＶ（米国特許第５２９０６９５号）を包含するが、これらに限定されない。
【００３６】
コンドロイチナーゼの例は、プロテウス属の微生物に由来するコンドロイチナーゼ、例えばプロテウス  ブルガリス（Proteus vulgaris）に由来するコンドロイチナーゼＡＢＣ（T.Yamagata, H.Saito, O.Habuchi, S.Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968)、S.Suzuki, H.Saito, T.Yamagata, K.Anno, N.Seno, Y.Kawai, T.Furuhashi, J. Biol. Chem., 243, 1543 (1968)）；およびフラボバクテリウム（Flavobactericum）属の微生物に由来するコンドロイチナーゼ、例えばフラボバクテリウム  ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）に由来するコンドロイチナーゼＡＣ（T.Yamagata, H.Saito, O.Habuchi, S.Suzuki, J. Biol. Chem., 243, 1523 (1968)）、フラボバクテリウムｓｐ．Ｈｐ１０２に由来するコンドロイチナーゼＡＣＩＩＩ（Miyazono Hirofumi, Kikuchi Hiroshi, Yoshida Keiichi, Morikawa Kiyoshi, and Tokuyasu Kiyochika, Biochemistry, 61, 1023 (1989)）、フラボバクテリウム  ヘパリナム（Flavobacterium heparinum）に由来するコンドロイチナーゼＢ（Y. M. Michelacci, C. P. Dietrich, Biochem. Biophys. Res. Commun., 56, 973 (1974)）、またはフラボバクテリウムｓｐ．Ｈｐ１０２に由来するコンドロイチナーゼＣ（Miyazono Hirofumi, Kikuchi Hiroshi, Yoshida Keiichi, Morikawa Kiyoshi,
and Tokuyasu Kiyochika, Biochemistry, 61, 1023 (1989)）を包含するが、これらに限定されない。
【００３７】
ヒアルロニダーゼの例は、ストレプトマイセス  ヒアルロリチカス（Streptomyces hyalurolyticus）などのストレプトマイセス属の微生物に由来するヒアルロニダーゼ；およ
びストレプトコッカス  ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）などのストレプトコッカス属の微生物に由来するヒアルロニダーゼを包含するが、これらに限定されない。
【００３８】
β−ガラクトシダーゼの例は、アスペルギルス  オリザ（Aspergillus oryzae）などのアスペルギルス属の微生物に由来するβ−ガラクトシダーゼ；ストレプトコッカス  ニューモニエ（Streptococcus pneumoniae）などのストレプトコッカス属の微生物に由来するβ−ガラクトシダーゼ；および大腸菌（Escherichia coli）などのエシェリキア属の微生物に由来するβ−ガラクトシダーゼを包含するが、これらに限定されない。
【００３９】
α−ガラクトシダーゼの例は、アスペルギルス  オリザ（Aspergillus oryzae）などのアスペルギルス属の微生物に由来するα−ガラクトシダーゼ；および大腸菌（Escherichia coli）などのエシェリキア属の微生物に由来するα−ガラクトシダーゼを包含するが、これらに限定されない。
【００４０】
ＰＮＧａｓｅＦの例は、エリザベトキンギア  メニンゴセプチカ（Elizabethkingia meningoseptica）などのエリザベトキンギア属の微生物に由来するＰＮＧａｓｅＦ；およびフラボバクテリウム  メニンゴセプチカム（Flavobacterium meningosepticum）などのフラボバクテリウム属の微生物に由来するＰＮＧａｓｅＦを包含するが、これらに限定されない。
【００４１】
エンドグリコシダーゼＨの例は、ストレプトマイセス  プリカタス（Streptomyces plicatus）などのストレプトマイセス属の微生物に由来するエンドグリコシダーゼＨを包含
するが、これらに限定されない。
【００４２】
微生物はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）または製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）などの機関から得られ得る。市販の酵素製剤が糖分解酵素として用いられ得る。
【００４３】
微生物に由来する糖分解酵素は、微生物に存在する天然の酵素のものと同じアミノ酸配列を有し得る。さらに、糖分解酵素は、それが患者のリソソーム内の蓄積する糖部分の分解活性を有する限り、天然の酵素の配列中のアミノ酸の一部が置換、追加、挿入、および／または欠失させられたアミノ酸配列を有し得る。微生物に由来する糖分解酵素の限定しない例は、配列番号２のアミノ酸配列を有するバシラス  サーキュランス（Bacillus circulans）のＫｓＴ２０２に由来するケラタナーゼのＳｅｒ３５からＧｌｙ１５０２の部分的なポリペプチドを含有する酵素（Clinical Biochemistry 48 (2015) 796-802）、なら
びに前記部分的なポリペプチドのドメインＣ（Ｐｈｅ８１からＴｈｒ１９２）およびドメインＤ（Ａｌａ２２７からＡｌａ２９４）の少なくとも１つが配列番号２のアミノ酸配列からさらに欠失したポリペプチド鎖（Glycoconjugate Journal (2017), Volume 34, Issue 5, 643-649；ＤＯＩ１０．１００７／ｓ１０７１９−０１７−９７８６−３）、例えば配列番号３、４、または５のアミノ酸配列を有するポリペプチドを包含する。本発明の１つの実施形態によれば、８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、さらにはより好ましくは９５％以上、特に好ましくは９９％以上の同一性を配列番号１から５のいずれか１つのアミノ酸配列に対して有するアミノ酸配列を有し、患者のリソソーム内の蓄積する糖部分の分解活性を有するタンパク質が、糖分解酵素として用いられる。
【００４４】
好ましい実施形態によれば、微生物によって生産された糖分解酵素が用いられる。ホスト細胞として動物細胞を用いて生産された糖分解酵素と比較して、ホスト細胞として微生物を用いて生産された糖分解酵素は、より低いコストで、製造ロット間の一様な品質を有する酵素として提供され得る。糖分解酵素を生産するための微生物の好ましい例は、上に記載されているバシラスおよびエシェリキア属に属する微生物（例えば大腸菌）を包含する。ホスト細胞として微生物を用いて生産された糖分解酵素は、ホスト微生物の天然に産する酵素（すなわち、微生物そのものに由来する酵素）、または所望の酵素を生産するよ
うに遺伝子操作された微生物から得られた酵素であり得る。
【００４５】
１つの実施形態によれば、患者への投与後にリソソームに実質的に移送されない糖分解酵素が用いられる。用語「実質的に移送されない」は、本明細書の記載および技術水準の考慮によって、リソソームに移送する糖分解酵素の量が、投与される糖分解酵素の量全体と比較して、所望の応答の獲得に寄与しない量であるということを意味する。
【００４６】
糖分解酵素は、単一またはその２つ以上の組み合わせのどちらかで用いられ得る。２種類以上の糖が患者に蓄積しているケースでは、それらの糖の少なくとも１つを分解する活性を有する糖分解酵素が用いられる。代替的には、蓄積する糖のそれぞれの糖分解酵素の２つ以上が組み合わせで用いられ得る。
【００４７】
糖分解酵素は、従来公知の化学基、これに限定されないが、アセチル基、ポリアルキレン基（例えば、ポリエチレングリコール化）、アルキル基、アシル基、ビオチン、標識（例えば、蛍光材料、ルミネッセンス材料などによる標識）、リン酸基、および硫酸基が挙げられる、によって修飾されてもよい。
【００４８】
１つの態様に従うと、糖分解酵素としては、リソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なる、患者のリソソーム内の蓄積する糖部分の分解活性を有する酵素が用いられる。この実施形態においては、治療に用いられる糖分解酵素は欠損タンパク質とは異なるので、これは、ＥＲＴに用いられる酵素に対する中和抗体を有する患者にとってもまた有効である治療であり得る。
【００４９】
本願において用いられる用語「欠損タンパク質とは異なる」は、患者の欠損タンパク質に対するアミノ酸配列同一性が例えば９０％以上かつ１００％以下、８０％以上かつ１００％以下、７０％以上かつ１００％以下、６０％以上かつ１００％以下、または５０％以上かつ１００％以下である連続ポリペプチド鎖を有さないタンパク質をいう。糖分解酵素は、例えば９９％未満、好ましくは９０％未満、より好ましくは８５％未満、さらにはより好ましくは７０％未満、尚さらにはより好ましくは５０％未満、最も好ましくは３０％未満のアミノ酸配列同一性を患者の欠損タンパク質に対して有し得る。
【００５０】
本願において用いられる用語「欠損酵素とは異なる」は、患者の欠損酵素に対するアミノ酸配列同一性が例えば９０％以上かつ１００％以下、８０％以上かつ１００％以下、７０％以上かつ１００％以下、６０％以上かつ１００％以下、または５０％以上かつ１００％以下である連続ポリペプチド鎖を有さない酵素をいう。糖分解酵素は、例えば９９％未満、好ましくは９０％未満、より好ましくは８５％未満、さらにはより好ましくは７０％未満、尚さらにはより好ましくは５０％未満、最も好ましくは３０％未満のアミノ酸配列同一性を患者の欠損酵素に対して有し得る。アミノ酸同一性は例えばＣｌｕｓｔａｌＷを用いることによって評価され得る（Thompson, J.D., Higgins, D.G., and Gibson, T.J. (1994) Nucleic Acids Res. 22, 4673-4680）。
【００５１】
１つの実施形態によれば、切断部位がリソソーム蓄積症患者の欠損酵素と同一ではない分解酵素は、元々の欠損酵素とは異なる糖分解酵素として用いられ得る。すなわち、酵素は、リソソーム蓄積症患者の元々の欠損酵素のものとは異なるグリコシド結合において切断する能力がある。例えば、ケラタナーゼＩＩはケラタン硫酸（ＫＳ）上のＮ−アセチルグルコサミン−６−硫酸を認識し、エンド加水分解的な様式によって４ＧｌｃＮＡｃβ１−３ガラクトースの間でＫＳを加水分解する。それゆえに、ケラタナーゼＩＩの切断部位はＧＡＬＮＳ（そのコード遺伝子はモルキオＡ患者における劣性遺伝子である）またはβ−ガラクトシダーゼ（そのコード遺伝子はモルキオＢ患者における劣性遺伝子である）のものと同一ではない。
【００５２】
１つの実施形態によれば、対象としてのリソソーム蓄積症患者とは異なる生物種に由来する糖分解酵素が糖分解酵素として用いられる。好ましい実施形態によれば、リソソーム蓄積症患者はヒトであり、患者のリソソーム内の蓄積する糖部分を分解する能力がある微生物に由来する酵素が、治療の糖分解酵素として用いられる。
【００５３】
患者の欠損タンパク質とリソソーム内の蓄積する糖部分との間の関係性は各リソソーム蓄積症について既に周知である。欠損タンパク質とは異なる、蓄積する糖部分の分解活性を有する糖分解酵素の例が次の表に挙げられている。しかしながら、本発明の技術範囲はこれに限定されない。
【表１−１】
2021508312.tif 000003
【表１−２】
2021508312.tif 000004
【表２】
2021508312.tif 000005
【表３】
2021508312.tif 000006
【表４】
2021508312.tif 000007
【００５４】
１つの態様に従うと、マンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分を有さない酵素が糖分解酵素として用いられる。マンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分を有さない糖分解酵素は動物細胞によって生産されることが必要ではないので、かかる酵素は、バシラス属、大腸菌属などの微生物を用いることによって低コストで大量に生産され得る。
【００５５】
マンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分を有さない所望の糖分解酵素は、Ｎ−グリコシル化システムを有さないバシラス属または大腸菌属などの微生物を用いるタンパク質発現システムによって得られ得る（Process Biochemistry 47 (2012) 2097-2102を参照）。すなわち、本発明の１つの実施形態によれば、Ｎ−グリコシル化システムを有さない微生物（例えば、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃホスホトランスフェラーゼまたはその対応する触媒活性を有する酵素を有していない微生物）から生産される糖分解酵素が用いられる。この実施形態によれば、所望の糖分解酵素は、微生物の天然に産する酵素（すなわち、バシラス属に由来する酵素）として、または例えば本願において下に記載される遺伝子組換え微生物からの組換え体酵素として得られ得る。
【００５６】
上で言及されている糖分解酵素は公知の精製プロセスまたは公知の遺伝子組換え技術によって得られ得る。糖分解酵素を生産するための例示的な方法は；糖分解酵素を生産するための微生物および動物細胞からなる群から選択されるホスト細胞の培養物を得るステップと；培養物から糖分解酵素を回収するステップとを包含する。ホスト細胞によって生産される糖分解酵素は、ホスト細胞の天然に産する酵素（すなわち、ホスト細胞そのものに由来する酵素）、または所望の酵素を生産するように遺伝子操作されたホスト細胞からの酵素であり得る。
【００５７】
本発明の１つの実施形態は、有効成分として糖分解酵素、例えば上に記載されている糖分解酵素を含有するリソソーム蓄積症のための治療剤を製造するための方法に関し、方法は、糖分解酵素を生産する微生物の培養物を得るステップと、培養物から糖分解酵素を回収するステップと、任意に、回収された糖分解酵素を薬学的に許容される添加剤と混合することによって組成物を製剤化するステップとを包含する。糖分解酵素を生産するために用いられる微生物の例は、バシラス、エシェリキア、シュードモナス、フラボバクテリウム、プロテウス、アルスロバクター、ストレプトコッカス、バクテロイデス、アスペルギルス、エリザベトキンギア、またはストレプトマイセス属に属する微生物を包含するが、これに限定されない。好ましくは、微生物は、バシラス属の微生物およびエシェリキア属の微生物からなる群から選択される少なくとも１つである。当業者は通常の方法に従って微生物の培養条件（すなわち、培養培地成分、温度条件など）を決定することができるはずである。動物細胞を用いることによって糖分解酵素が生産される場合と比較して、微生物を用いて糖分解酵素を生産することによって、大量の酵素が低コストで生産され得る。微生物によって生産される糖分解酵素は、微生物の天然に産する酵素、または所望の酵素を生産するように遺伝子操作された微生物からの酵素であり得る。
【００５８】
糖分解酵素を製造するための方法は、標的糖分解酵素をコードする遺伝子を発現するための組換え体ベクターをホストに導入するステップを包含し得る。
【００５９】
ベクターについては、それに導入された遺伝子を発現することができる好適なベクター（例えば、ファージベクター、プラスミドベクターなど）（好ましくは、プロモーターのような制御配列を含有する）が用いられ得る。ベクターはホスト細胞に応じて好適に選択される。より具体的には、ホスト−ベクターシステムの例は、ｐＥＴシリーズ、ｐＴｒｃＨｉｓ、ｐＧＥＸ、ｐＴｒｃ９９、ｐＫＫ２３３−２、ｐＥＺＺ１８、ｐＢＡＤ、ｐＲＳＥＴ、およびｐＳＥ４２０のような原核細胞のための発現ベクターとの大腸菌の組み合わせ；ならびにｐＣＭＶシリーズ、ｐＭＥ１８Ｓシリーズ、およびｐＳＶＬシリーズのような哺乳類細胞のための発現ベクターとのＣＯＳ−７細胞およびＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞の組み合わせ；ならびに昆虫細胞、酵母、およびバシラス  サチリス（Bacillus
subtilis）からなる群から選択されるホスト細胞とそれらの細胞に対応する種々のベク
ターとの組み合わせを包含するが、これに限定されない。生産性および生産コストの観点からは、微生物（例えば大腸菌）が好ましい実施形態に従ってホスト細胞として用いられる。
【００６０】
さらに、ベクターについては、挿入された遺伝子によってコードされるタンパク質またはマーカーペプチドもしくはシグナルペプチドとの融合タンパク質を発現するように構築されたベクターもまた用いられ得る。ペプチドの例は、プロテインＡ、インスリンシグナル配列、Ｈｉｓタグ、ＦＬＡＧタグ、ＣＢＰ（カルモジュリン結合タンパク質）、およびＧＳＴ（グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ）を包含する。発現ベクターは、通常の方法に従って、標的ヌクレオチド配列がベクターに挿入され得るように、標的とされる配列を含有するポリヌクレオチドとベクターとを制限酵素によって処理することによって構築され得る。
【００６１】
ホスト細胞は通常の方法に従って発現ベクターによって形質転換され得る。例えば、トランスフェクションのための市販の試薬を用いる方法、またはＤＥＡＥ−デキストリン法、エレクトロポレーション法、もしくは遺伝子銃に基づく方法に従って、発現ベクターはホストに導入され得る。
【００６２】
当業者は、通常の方法に従って、糖分解酵素を生産するための微生物または動物細胞の培養条件（すなわち、培養培地、培養条件など）を決定するはずである。例えば、大腸菌
がホスト細胞として用いられるときには、培養培地は、ＬＢ培地などを主成分として用いることによって調製され得る。さらに、ＣＯＳ−７細胞がホスト細胞として用いられるときには、細胞は、約２％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清を含有するＤＭＥＭを用いることによって３７℃で培養され得る。
【００６３】
培養された生成物からの糖分解酵素は、生産されるべき糖分解酵素に応じてタンパク質の抽出および精製のための公知の方法によって回収され得る。例えば、糖分解酵素が培養培地（すなわち、培養培地の上清）に分泌される可溶性形態で生産される場合には、要求される場合には、培養培地が回収され、そのまま糖分解酵素として用いられるということが可能である。さらに、糖分解酵素が細胞質に分泌される可溶性形態でまたは不溶性形態（すなわち、膜結合形態）で生産される場合には、糖分解酵素は、例えば、窒素キャビテーションデバイス、ホモジナイゼーション、ガラスビーズミル法、ソニケーション法、浸透圧ショック法、凍結融解法、界面活性剤を用いる抽出、またはその組み合わせを用いることによって抽出され得る。糖分解酵素は、塩析、硫安分画、遠心、透析、限外濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、ゲル浸透クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、およびその組み合わせのような従来公知の手段によって精製され得る。
【００６４】
１つの実施形態において、糖分解酵素を製造するための方法は、エンドトキシンが実質的に含有されない程度まで、回収された糖分解酵素中のエンドトキシンレベルを低下させるステップを包含する。表現「エンドトキシンが実質的に含有されない」は、もたらされる酵素がリソソーム蓄積症の治療に用いられる材料として好適であるように、エンドトキシンの濃度が医学的に許容されるレベルを超えないということを意味する。１つの実施形態において、回収された糖分解酵素中のエンドトキシンレベルはクロマトグラフィー精製によって低下させられ得る。１つの実施形態において、エンドトキシンレベルは５０エンドトキシン単位／ｍｇタンパク質以下まで低下させられる。好ましい実施形態において、エンドトキシンレベルは１５エンドトキシン単位／ｍｇタンパク質以下まで低下させられる。エンドトキシンレベルは、第十六改正日本薬局方に記載されている方法に従って、例えばＥＮＤＯＳＰＥＣＹ（ＴＭ）（ＥＳ−５０Ｍ、生化学バイオビジネス製造）を用いることによって測定され得る。
【００６５】
回収された糖分解酵素は、要求される場合には、凍結乾燥のような公知の方法によって乾燥され得る。
【００６６】
本願において用いられる用語「治療」は、完全な治癒のみならず、疾患の症状の改善または快方、疾患進行の抑制（進行速度を維持することおよび低下させることを包含する）、ならびに疾患の防止をもまた包含する。本願において、防止は、低身長、精神発達遅滞、運動障害、肝脾腫、粗な顔貌、骨異常、関節形成不全、関節拘縮、四肢痛、関節痛、発汗障害、巨舌、難聴、呼吸器疾患、および／または神経障害のような障害に付随する種々の症状がまだ起こっていないときに、障害の種々の症状を前もって防止することを包含するが、これに限定されない。さらに、例えば、防止は、明瞭な器質的病変が認識されてはいないが身体および精神機能障害のような障害に付随する種々の症状の始まりを有するケースにおいて、器質的病変の始まりを前もって防止することと、それらの種々の症状のうちまだ見せられていない症状の進行を抑制することとを包含する。
【００６７】
本願において用いられる用語「有効成分として」は、成分の量が適当なリスク／ベネフィット比にとって好適であり、過剰な副作用（毒性、刺激など）なしに所望のアウトカムを得るために十分であるということを指示している。有効量は、投与の対象となるべき患者の症状、体格、年齢、性別などを包含する種々の因子に応じて変わり得る。しかしながら、当業者は、本願において後で記載される具体例および通常の技術知識の参照によって
有効量を決定する能力があるであろう。
【００６８】
本願において用いられる「患者」は、動物、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト、マウス、ラット、ハムスター、モルモット、ウサギ、イヌ、ネコ、およびウマ）、より好ましくはヒトをいう。
【００６９】
本発明の１つの態様は、有効成分として上に記載されている糖分解酵素を含有するリソソーム蓄積症のための治療剤に関する。
【００７０】
本発明のさらなる態様は、上記の治療剤を、これを必要とする患者に投与することを包含するリソソーム蓄積症のための治療方法に関する。
【００７１】
インビボまたはインビトロどちらかで治療剤を投与するための剤形および投与経路は、治療されるべき疾患またはその重症度に従って好適に選択され得る。例えば、糖分解酵素は、そのままで、または薬学的に許容される担体、基剤、および希釈剤などの他の添加剤（単数もしくは複数）との医薬組成物として（例えば、注射液、錠剤、カプセル、液体製剤、軟膏、もしくはゲル製剤として）、非経口的または経口的にどちらかで投与され得る。好ましい実施形態によれば、治療剤は注射液（例えば、静脈内注射、皮下注射、脊椎注射、筋肉内注射、皮下組織注射、腹腔内注射、および関節内注射）に製剤化される。
【００７２】
治療剤の有効成分としての糖分解酵素の配合量および用量は、投与方法、投与形態、製剤の使用の目的、患者の具体的な症状、患者の体重などに対応して個別に決定される。糖分解酵素の配合量および用量は、これに特に限定されないが、臨床用量の点では日あたり約１０ｎｇ／ｋｇから１００ｍｇ／ｋｇであり得る。薬剤は患者に単回または反復投与され得る。さらにその上、反復投与されるときには、投与の間隔は１から１０週間の間で変えられ得る。
【００７３】
本発明によれば、糖分解酵素は患者の生体内のリソソームに送達されることは必要ではない。実際に、本発明のいくつかの態様によれば、糖分解酵素は、リソソーム蓄積症を治療する目的で、患者に投与されるよりもむしろ患者の血液と接触させられるようにして用いられ得る。
【００７４】
本発明の１つの態様によれば、担体と担体に固定化された糖分解酵素とを包含するリソソーム蓄積症を治療するためのデバイスが提供される。
【００７５】
担体は、それが糖分解酵素を固定化し得、水および血液に不溶性である限り、特に限定されない。担体の形状は特に限定されず、ミクロ粒子、ビーズ、プレート（例えばマイクロプレートウェル）、チューブ、および膜（例えば、フィルター形態、中空糸形態、および平膜形態）を包含する。担体の材料の例は、アガロース、セルロース、セルロースエステル、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリ塩化ビニル、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド、およびシリカを包含するが、これに限定されない。
【００７６】
糖分解酵素は、物理吸着、共有結合、またはトラップなどの一般的な方法を用いて、物理的または化学的にどちらかで糖分解酵素を担体に結合することによって固定化され得る（固定化酵素，１９７５年，講談社刊，９から７５頁を参照）。
【００７７】
患者のリソソームに蓄積する糖が患者の血液を糖分解酵素と接触させることによって分解され得る限り、治療デバイスの実施形態は特に限定されない。治療デバイスの形状の例は、ミクロ粒子、ビーズ、プレート（例えばマイクロプレートウェル）、チューブ、およ
び膜（フィルター形態、中空糸形態、および平膜形態）を包含するが、これに限定されない。いくつかの実施形態によれば、治療デバイスは、糖分解酵素、例えば微粒子酵素が固定化されたカラムからなる。カラムの材料の例はポリカーボネート、ポリスチレン、ＡＢＳ樹脂、およびガラスを包含するが、これに限定されない。
【００７８】
本願において用いられる用語「血液」は、全血、血清、血漿、および血液成分を包含する未処理および処理済み血液を意味するものとする。
【００７９】
本発明の１つの態様は、上記の治療デバイスと、リソソーム蓄積症患者から採取された血液をデバイスに輸送するための脱血側回路と、治療デバイスに含有される糖分解酵素と接触させられた血液をリソソーム蓄積症患者に輸送するための返血側回路と、脱血側回路および返血側回路を通して血液を圧送するための血液ポンプとが提供された血液循環システムである。血液循環システムは２つ以上の血液ポンプを備え得る。本発明の１つの実施形態は、血液循環システムを用いてリソソーム蓄積症を治療するための方法に関する。
【００８０】
本発明の１つの態様はリソソーム蓄積症を治療するための方法であり、リソソーム蓄積症患者から採取された血液を糖分解酵素と接触させるステップと、糖分解酵素と接触させられた血液を患者に輸送するステップとを包含する。図１は、リソソーム蓄積症を治療するための血液循環システム（１００）を例示する模式的な図式である。しかしながら、本発明の実施形態は図１のモードに限定されない。
【００８１】
治療の血液循環システム（１００）に従うと、患者の血液は、血液ポンプ（３）の助けによって、脱血側回路（２ａ）を経て治療デバイス（１）に供給される。治療デバイス（１）に関しては、リソソーム蓄積症患者から採取された血液は治療デバイス（１）に含有される糖分解酵素との接触をさせられ、それにより、血液中の上昇した糖は糖分解酵素との接触時に分解させられる。糖分解酵素と接触させられた血液は、血液ポンプ（３）の助けによって、返血側回路（２ｂ）を経てリソソーム蓄積症患者に輸送される。血液回路（２）上には、動脈圧計、静脈圧計、および／または例示されていない医薬などを投与するための入り口が提供され得る。
【００８２】
リソソーム蓄積症の治療のためには、患者の全血または血漿が用いられ得る。
【００８３】
治療デバイスはインプラント型または体外型の循環装置のいずれでもあり得る。
【００８４】
（実施形態）
本願において下では、本発明の好ましい実施形態が例示されるが、本発明はこれに限定されない；
（１）有効成分として糖分解酵素を包含するリソソーム蓄積症のための治療剤であって、
糖分解酵素は、対象としてのリソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なり、患者のリソソームに蓄積する糖を分解する活性を有する。
（２）（１）に従う治療剤であって、糖分解酵素はマンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分を有さない。
（３）（１）または（２）に従う治療剤であって、糖分解酵素は、患者のリソソームに蓄積する糖の切断部位の点で、リソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なる。
（４）有効成分として糖分解酵素を包含するリソソーム蓄積症のための治療剤であって、糖分解酵素はマンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分を有さない。
（５）（１）から（４）のいずれか１つに従う治療剤であって、糖分解酵素はエンド型酵素である。
（６）（１）から（５）のいずれか１つに従う治療剤であって、リソソーム蓄積症は、
ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、糖原病ＩＩ型、および糖タンパク質蓄積症からなる群から選択される。
（７）（１）から（６）のいずれか１つに従う治療剤であって、リソソーム蓄積症は、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病Ａ、サンフィリポ病Ｂ、サンフィリポ病Ｃ、サンフィリポ病Ｄ、モルキオ病Ａ、モルキオ病Ｂ、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症ＩＸ型、およびムコ多糖症プラス症候群からなる群から選択される。
（８）（１）から（７）のいずれか１つに従う治療剤であって、糖分解酵素は、グリコサミノグリカン分解酵素、グリコシダーゼ、およびペプチド：Ｎ−グリカナーゼからなる群から選択される。
（９）（１）から（８）のいずれか１つに従う治療剤であって、糖分解酵素は、ケラタナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ＰＮＧａｓｅＦ、およびエンドグリコシダーゼＨからなる群から選択される少なくとも１つである。
（１０）（１）から（９）のいずれか１つに従う治療剤であって、糖分解酵素は微生物に由来する。
（１１）（１０）に従う治療剤であって、微生物はバシラス属に属する微生物である。
（１２）（１）から（１１）のいずれか１つに従う治療剤であって、患者はヒトである。
（１３）（１）から（１２）のいずれか１つに従う治療剤であって、糖分解酵素を生産するホスト細胞は微生物である。
（１４）（１）から（１３）のいずれか１つに従う治療剤であって、治療剤は注射用製剤に製剤化されている。
（１５）有効成分として糖分解酵素を含有するリソソーム蓄積症のための治療剤を製造するための方法であって、方法は：
糖分解酵素を生産する微生物の培養物を得るステップと；
培養物から糖分解酵素を回収するステップと；
任意に、回収された糖分解酵素を薬学的に許容される添加剤と混合することによって組成物を製剤化するステップと、
を包含する。
（１６）（１５）に従う方法であって、微生物は、バシラスおよびエシェリキア属に属する微生物からなる群から選択される。
（１７）（１５）または（１６）に従う方法であって、方法は、エンドトキシンが実質的に含有されない程度まで、回収された糖分解酵素中のエンドトキシンレベルを低下させるステップを包含する。
（１８）（１５）から（１７）のいずれか１つに従う方法であって、治療剤は（１）から（１４）のいずれか１つから選択される。
（１９）リソソーム蓄積症のための治療デバイスであって：
担体と担体に固定化された糖分解酵素とを包含し、
糖分解酵素は、対象としてのリソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なり、患者のリソソームに蓄積する糖を分解する活性を有する。
（２０）リソソーム蓄積症のための治療デバイスであって：
担体と担体に固定化された糖分解酵素とを包含し、
糖分解酵素はマンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分を有さない。
（２１）リソソーム蓄積症を治療するための血液循環システムであって：
（１９）または（２０）に従う治療デバイスと；
リソソーム蓄積症患者から採取された血液を治療デバイスに輸送するための脱血側回路と；
治療デバイスに含有される糖分解酵素と接触させられた血液をリソソーム蓄積症患者に輸送するための返血側回路と；
脱血側回路および返血側回路の内部の血液を圧送するための血液ポンプと、
を包含する。
（２２）リソソーム蓄積症を治療するための方法であって、（１）から（１４）のいずれか１つに従う治療剤を、これを必要とする患者に投与することを包含する。
（２３）リソソーム蓄積症を治療するための方法であって：
リソソーム蓄積症患者から採取された血液を糖分解酵素と接触させるステップと；
糖分解酵素と接触させられた血液を患者に輸送するステップと、を包含し、
糖分解酵素は、患者の欠損タンパク質とは異なり、患者のリソソームに蓄積する糖を分解する活性を有する。
（２４）（２３）に従う方法であって、糖分解酵素はマンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分を有さない。
（２５）（２３）または（２４）に従う方法であって、糖分解酵素は、患者のリソソームに蓄積する糖の切断部位の点で、リソソーム蓄積症患者の欠損タンパク質とは異なる。
（２６）（２３）から（２５）のいずれか１つに従う方法であって、糖分解酵素はエンド型である。
（２７）（２３）から（２６）のいずれか１つに従う方法であって、リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、糖原病ＩＩ型、および糖タンパク質蓄積症からなる群から選択される。
（２８）（２３）から（２７）のいずれか１つに従う方法であって、リソソーム蓄積症は、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病Ａ、サンフィリポ病Ｂ、サンフィリポ病Ｃ、サンフィリポ病Ｄ、モルキオ病Ａ、モルキオ病Ｂ、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症ＩＸ型、およびムコ多糖症プラス症候群からなる群から選択される。
（２９）（２３）から（２８）のいずれか１つに従う方法であって、糖分解酵素は、グリコサミノグリカン分解酵素、グリコシダーゼ、およびペプチド：Ｎ−グリカナーゼからなる群から選択される。
（３０）（２３）から（２９）のいずれか１つに従う方法であって、糖分解酵素は、ケラタナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ＰＮＧａｓｅＦ、およびエンドグリコシダーゼＨからなる群から選択される少なくとも１つである。
（３１）（２３）から（３０）のいずれか１つに従う方法であって、糖分解酵素は微生物に由来する。
（３２）（３１）に従う方法であって、微生物はバシラス属に属する微生物である。
（３３）（２３）から（３２）のいずれか１つに従う方法であって、患者はヒトである。
（３４）（２３）から（３３）のいずれか１つに従う方法であって、糖分解酵素を生産するホスト細胞は微生物である。
（３５）（２３）から（３４）のいずれか１つに従う方法であって、治療剤は注射用製剤に製剤化されている。
（３６）リソソーム蓄積症を治療するための方法であって：
リソソーム蓄積症患者から採取された血液を糖分解酵素と接触させるステップと；
糖分解酵素と接触させられた血液を患者に輸送するステップと、を包含し、
糖分解酵素はマンノース−６−リン酸部分またはマンノース部分を有さない。
（３７）（３６）に従う方法であって、糖分解酵素はエンド型である。
（３８）（３６）または（３７）に従う方法であって、リソソーム蓄積症は、ムコ多糖症、スフィンゴリピドーシス、糖原病ＩＩ型、および糖タンパク質蓄積症からなる群から選択される。
（３９）（３６）から（３８）のいずれか１つに従う方法であって、リソソーム蓄積症は、ハーラー病、シャイエ病、ハンター病、サンフィリポ病Ａ、サンフィリポ病Ｂ、サンフィリポ病Ｃ、サンフィリポ病Ｄ、モルキオ病Ａ、モルキオ病Ｂ、マロトー・ラミー病、スライ病、ムコ多糖症ＩＸ型、およびムコ多糖症プラス症候群からなる群から選択される
。
（４０）（３６）から（３９）のいずれか１つに従う方法であって、糖分解酵素は、グリコサミノグリカン分解酵素、グリコシダーゼ、およびペプチド：Ｎ−グリカナーゼからなる群から選択される。
（４１）（３６）から（４０）のいずれか１つに従う方法であって、糖分解酵素は、ケラタナーゼ、ヘパリナーゼ、ヘパリチナーゼ、コンドロイチナーゼ、ヒアルロニダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−ガラクトシダーゼ、ＰＮＧａｓｅＦ、およびエンドグリコシダーゼＨからなる群から選択される少なくとも１つである。
（４２）（３６）から（４１）のいずれか１つに従う方法であって、糖分解酵素は微生物に由来する。
（４３）（４２）に従う方法であって、微生物はバシラス属に属する微生物である。
（４４）（３６）から（４３）のいずれか１つに従う方法であって、患者はヒトである。
（４５）（３６）から（４４）のいずれか１つに従う方法であって、糖分解酵素を生産するホスト細胞は微生物である。
（４６）（３６）から（４５）のいずれか１つに従う方法であって、治療剤は注射用製剤に製剤化されている。
【実施例】
【００８５】
以下では、本発明の好ましい実施形態が例の参照によってより詳細に説明される。しかしながら、本発明の技術範囲は次の例に限定されない。
【００８６】
調製例
（酵素活性を測定するための方法）
酵素活性は、ケラタン硫酸の加水分解に従って生ずる末端還元糖の増大に基づいてパーク・ジョンソン法［J. Biol. Chem., 181, 149 (1949)］を用いることによって測定した
。すなわち、ウシ角膜に由来するケラタン硫酸の５０μｌ（２．４ｍｇ／ｍｌ）水溶液に、５０μｌの酵素溶液および１００μｌの０．２Ｍ酢酸緩衝液（ｐＨ６．０）を追加し、反応が３７℃で１５分間に渡って起こることを許した。２００μｌの炭酸−シアン化物溶液（５．３ｇの炭酸ナトリウムおよび０．６５ｇのシアン化カリウムを１０００ｍｌの水に溶解した）を反応溶液に追加することによって、反応を終了させた。それから、反応溶液に、２００μｌのフェリシアン化物溶液（１０００ｍｌの水に溶解した０．５ｇのフェリシアン化カリウム）を追加し、沸騰浴によって１５分間に渡って加熱した。水浴によって反応溶液を冷却した後に、１ｍｌの硫酸第二鉄溶液（１０００ｍｌの０．０５Ｎ硫酸に溶解した１．５ｇの硫酸鉄（ＩＩＩ）アンモニウム十二水和物および１ｇのドデシル硫酸ナトリウム）を追加し、次に混合した。反応が３７℃で１５分間に渡って起こることを許すことによって、測定溶液を得た。６９０ｎｍにおける吸光度を、分光光度計を用いて測定し、得られた吸光度をＡとしてとった。５０μｌの熱不活性化した酵素溶液を上記の酵素溶液の代わりに用いたこと以外は、上と同じ処理を実施することによって得られた吸光度をＡ０としてとった。さらにその上、１０ｎｍｏｌ／２００μｌのＮ−アセチルグルコサミン溶液を反応溶液の代わりに処理したこと以外は、上と同じ処理を実施することによって得られた吸光度をＡｓｔとしてとった。上記の条件において１分間に１μｍｏｌのガラクトースまたはＮ−アセチルグルコサミンに対応する還元糖を生産する酵素の量を、１単位として定義した（本願において下では、これは「単位」または「Ｕ」と略称され得る）。１ｍｌあたりの酵素単位数は次の等式に基づいて計算した。
【数１】
2021508312.tif 000008
【００８７】
（糖分解酵素の生産および精製）
Bacillus circulansのＫｓＴ２０２株を、サメ軟骨に由来する０．２（ｗ／ｖ）％ケラタン硫酸を追加したブレインハートインフュージョン斜面培地（２０（ｗ／ｖ）％ウシ脳加水分解物、２５（ｗ／ｖ）％ウシ心臓加水分解物、１（ｗ／ｖ）％ペプトン消化生成物、０．５（ｗ／ｖ）％ＮａＣｌ、０．２５（ｗ／ｖ）％リン酸二ナトリウム、および１．５（ｗ／ｖ）％寒天、ｐＨ７．２）によって継代培養した。
【００８８】
１．５％（ｗ／ｖ）ペプトン（極東製薬工業株式会社製造）、０．７５％（ｗ／ｖ）ビール酵母エキス（日本製薬株式会社製造）、０．７５％（ｗ／ｖ）ケラタン硫酸（サメ軟骨由来、生化学工業製造）、０．５％（ｗ／ｖ）Ｋ２ＨＰＯ４、０．０２％（ｗ／ｖ）ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、および０．００１５％（ｗ／ｖ）消泡剤（アデカノール（ＴＭ）ＬＧ１０９、旭電化工業製造）を含有する２０Ｌの培地（ｐＨ８．０）を調製した。培地を３０Ｌの体積を有するジャー発酵器に追加し、蒸気滅菌を１２１℃で２０分間に渡って実施した。それから、３７℃において１６時間に渡って振盪しながら同じ培地で継代培養したBacillus circulansのＫｓＴ２０２株の培養された培地の１Ｌ（５％（ｗ／ｖ））を、上で滅菌した新しい培地に無菌的な様式で接種した。それから、培養を１ｖｖｍ通気量で４５℃において２４時間に渡って攪拌（３００ｒｐｍ）しながら行った。細胞体を取り除くために、培養ブロスを連続固液分離機によって遠心し、およそ２０Ｌの細胞外液を得た。この細胞外液中に包含されるケラタナーゼの酵素力価は１１．６ｍＵ／ｍｌであった。さらにその上、Bacillus circulansのＫｓＴ２０２株（受託番号：ＦＥＲＭ  ＢＰ−５２８５）は、１９９４年９月５日に通商産業省工業技術院生命工学工業技術研究所（現在では、独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センター）にＦＥＲＭ  Ｐ−１４５１６の微生物受託番号で寄託した。さらにその上、１９９５年１１月６日に、これはブダペスト条約に基づき国際寄託機関に移管した。配列番号１は、Bacillus circulansのＫｓＴ２０２株に由来するケラタナーゼ（エンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ）の全長アミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＡＯ８８２７９．１）を指示している。
【００８９】
細胞外液からタンパク質を得るために、７０％飽和を与えるように硫酸アンモニウムを追加し、もたらされた沈殿を遠心によって回収した。得られた沈殿を２．５Ｌの１０ｍＭトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．５、緩衝液Ａ）中に溶解した。この溶液に、３５％飽和を与えるように硫酸アンモニウムを追加し、もたらされた沈殿を遠心によって取り除いた。上清に硫酸アンモニウムを追加して５５％飽和を与えた。それから、もたらされた沈殿を遠心によって回収した。５５％飽和による沈殿を２．５Ｌの緩衝液Ａ（ｐＨ７．５）中に溶解した。爾後に、酵素吸着を有するように、溶解した溶液が緩衝液Ａによって前もって平衡化したＤＥＡＥ−セルロースＤＥ５２（ワットマン製造）カラム（５．２ｃｍ×２４ｃｍ）を通過することを許した。カラムを１．５Ｌの緩衝液Ａによって洗浄した。それから、緩衝液Ａ中の塩化ナトリウム濃度を０Ｍから０．３Ｍに直線的に増大させて、酵素を溶出した。活性画分を回収し、硫酸アンモニウムを追加して５５％飽和を与えた。爾後に、もたらされた沈殿を遠心によって回収し、小量の１０ｍＭトリス酢酸緩衝液（ｐＨ７．５）中に溶解した。それから、溶解した溶液をＳｅｐｈａｃｒｙｌ（ＴＭ）Ｓ−３００（ＧＥヘルスケア製造）カラム（３．４ｃｍ×１１０ｃｍ）に載せ、それから、ゲル濾過クロマトグラフィーを、０．５Ｍ塩化ナトリウムを含有する５０ｍＭトリス酢酸緩衝液（ｐＨ
７．５）を用いることによって行った。活性画分をＵＫ−１０膜（アドバンテック東洋株式会社製造）による限外濾過によって濃縮し、およそ１００倍の量の緩衝液Ａに対して透析した。透析の内側の液体を、緩衝液Ａによって前もって平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール（ＴＭ）（東ソー株式会社製造）カラム（２．２ｃｍ×１５ｃｍ）にかけた。爾後に、カラムを、０．１ＭのＮａＣｌを含有する１５０ｍｌの緩衝液Ａによって洗浄した。それから、カラムを０．１Ｍから０．２ＭのＮａＣｌ直線勾配によって溶出して、精製された酵素を得た。酵素画分を限外濾過によって濃縮し、Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（ＴＭ）Ｓ−３００（ＧＥヘルスケア製造）カラム（２．２ｃｍ×１０１ｃｍ）に載せて、ゲル濾過クロマトグラフィーを実施した。４ＭのＮａＣｌ溶液を有するように、ＮａＣｌを酵素画分に追加した。それから、溶液を、４ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍＭトリス酢酸（ｐＨ７．５）によって前もって平衡化したフェニルセファロース（ＴＭ）（ＧＥヘルスケア製造）カラム（１．６ｃｍ×１５ｃｍ）にかけた。爾後に、カラムを４Ｍから０ＭのＮａＣｌ直線勾配によって溶出して、精製された酵素を得た。２９単位の酵素が得られ、比活性は２．０９Ｕ／ｍｇであった。タンパク質濃度は参照標準としてウシ血清アルブミンを用いるローリーアッセイによって測定した。
【００９０】
エンドトキシンレベルを低下させるために、上で得られた酵素を、０．１５ＭのＮａＣｌおよび０．１ｍＭのＣａＣｌ２を有する０．０２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液によって平衡化したＥｎｄｏＴｒａｐ（ＴＭ）ＨＤカラム（φ０．７ｃｍ×２．７ｃｍ、１ｍｌ、Ｈｙｇｌｏｓ社）にかけ、フロースルー画分を回収した。使用後に、カラムは、１ＭのＮａＣｌおよび２ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を有する３カラム体積（ＣＶ）の０．０２ＭのＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）によって再生した。フロースルー画分中のエンドトキシン濃度をＥＮＤＯＳＰＥＣＹ（ＴＭ）（ＥＳ−５０Ｍ、生化学バイオビジネス製造）によって測定した。このＥｎｄｏＴｒａｐカラム操作を反復して８回実施した。最後に回収されたフロースルー画分を濃縮し、緩衝液を膜式限外濾過によってリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に交換した。もたらされた溶液を０．２２μｍ濾過によって滅菌した。最終的な液体量は９ｍｌであり、活性は５０．０Ｕ／ｍｌであり、比活性は１１．５Ｕ／ｍｇタンパク質であり、エンドトキシンレベルは１２．８エンドトキシン単位／ｍｇタンパク質であった。タンパク質濃度は参照標準としてウシ血清アルブミンを用いるローリーアッセイによって測定した。
【００９１】
例１
（単回投与試験）
ＧＡＬＮＳホモノックアウトマウスを試験に用いた。８週齢ＧＡＬＮＳホモノックアウトマウスに、尾静脈からケラタナーゼを０．５Ｕ／ｍｌ、４μｌ／ｇ体重の用量で単回投与した（処置群）。対照として、ＰＢＳを同様に投与した（無処置群）。
【００９２】
血清サンプル（１００μｌ）を８（投与前）、９、１０、１１、および１５週齢の時点で浅側頭静脈から採取した。
【表５】
2021508312.tif 000009
【００９３】
（血清中ケラタン硫酸の定量）
血清中のケラタン硫酸およびヘパリン硫酸の定量は文献に記載されている方法に基づい
て実施した（Metabolites 2014, 4, 655-679）。簡略には、血清中のケラタン硫酸およびヘパリン硫酸をグリコサミノグリカン分解酵素の混合物によって消化し、生ずる二糖の量を定量した。ケラタンモノ硫酸化型二糖標準のガラクトースβ１→４Ｎ−アセチルグルコサミン−６−硫酸はＣａｒｂｏｓｙｎｔｈから購入した（製品コードＯＡ０９７０３）。非硫酸化型の不飽和ヘパラン二糖（デルタｄｉＨＳ−０Ｓ）標準は生化学工業から得た。より詳細な測定方法は本願において以下に記載されている。
【００９４】
血清サンプルを次の方法に従って前処理した。オメガ１０Ｋ膜フィルター（ＰＮ８０３４、ポール・コーポレーション製造）に、１０μｌの血清サンプルおよび９０μｌの５０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．０）を追加し、血清サンプル中の低分子量成分を１５分間の２，５００ｇにおける遠心によって取り除いた。膜フィルターを新たなリザーバープレートにセットし、未使用のウェルに、段階希釈された二糖標準の各１０μｌを追加した。１０μｌの内部コントロール（コンドロシン５μｇ／ｍｌ）、６０μｌの５０ｍＭトリス塩酸溶液（ｐＨ７．０）、および３つのグリコサミノグリカン分解酵素の各０．５ｍＵ／１０μｌを血清サンプルに追加した。これらの３つの酵素は、（ｉ）コンドロイチナーゼＡＢＣ（Proteus vulgaris由来、生化学工業製造）またはコンドロイチナーゼＢ（Flavobacterium heparinum由来、生化学工業製造）、（ｉｉ）ヘパリチナーゼ（Flavobacterium heparinum由来、生化学工業製造）、および（ｉｉｉ）ケラタナーゼＩＩ（バシラスｓｐ．由来、生化学工業製造）であり、５０ｍＭトリス塩酸緩衝液中に可溶化した。プレートを３７℃で１６時間に渡ってインキュベーションし、それから２，５００ｇで１５分間に渡って遠心した。リザーバープレート上に回収された測定サンプルはケラタン硫酸二糖の定量まで−２０℃で保存した。
【００９５】
ケラタン硫酸およびヘパラン硫酸二糖の検出のためには、６４６０トリプル四重極質量分析計（アジレント・テクノロジー製造）を有する１２１０インフィニティーＬＣシステムのＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを用いた。二糖の分離のためには、ｈｙｐｅｒｃａｒｂ（ＴＭ）カラム（Ｐ／Ｎ：３５００５−０５２１３０、φ２．０ｍｍ×５０ｍｍ、５μｍ粒子、サーモサイエンティフィック製造）を用いた。移動相は０．０２５％（ｖ／ｖ）アンモニア中の０から９０％（ｖ／ｖ）アセトニトリルの勾配溶出であった。ケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖は、負イオンモードに従って前駆体イオンを４６２．００かつ生成物イオンを９７．００で検出した。ヘパラン硫酸非硫酸化型二糖（デルタｄｉＨＳ−０Ｓ）は前駆体イオンを３７９．２９かつ生成物イオンを１７５．１０で検出した。
【００９６】
（結果）
図２Ａはケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルを示している。ケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルは、微生物に由来する糖分解酵素の単回静脈内投与によって２週間を超えて有意に減少した。
【００９７】
図２ＢはデルタｄｉＨＳ−０Ｓの血清中レベルを示している。デルタｄｉＨＳ−０Ｓの血清中レベルは糖分解酵素の静脈内投与によって影響されなかった。
【００９８】
例２
（反復投与試験）
ＧＡＬＮＳホモおよびヘテロノックアウトマウスを試験に用いた。生後１日または２日に、ホモノックアウトマウスに、８０ｍＵ／ｍｌ、２５μｌ／ｇ体重のケラタナーゼを浅側頭静脈から投与し、４および８週齢に０．５Ｕ／ｍｌ、４μｌ／ｇ体重のケラタナーゼを尾静脈から投与した（処置群）。ケラタナーゼの代わりに、ＰＢＳを同じ様式でＧＡＬＮＳホモおよびヘテロノックアウトマウスに投与した（それぞれ無処置群およびコントロール群）。
【表６】
2021508312.tif 000010
【００９９】
血清サンプル（１００μｌ）を８および１２週齢に尾静脈から採取した。１２週齢に、マウスを二酸化炭素暴露によって屠殺し、病理組織学用に膝関節を採取した。
【０１００】
（病理組織学）
膝関節のパラフィン包埋組織標本を下に記載されているように作製した。すなわち、採取された組織を１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン溶液によって固定した。次に、骨が軟化するまで、組織を脱灰液（ギ酸：１０％（ｖ／ｖ）中性緩衝ホルマリン：蒸留水＝１：１：１８（ｖ：ｖ：ｖ））によって脱灰した。脱灰完了後に、組織を硫酸ナトリウムの５％（ｗ／ｖ）水溶液によって一晩中和し、その後、流水中で１０時間ほど洗浄した。次に、組織を次の手順のようにパラフィン包埋および切片化した；組織を順に７０％（ｖ／ｖ）、８０％（ｖ／ｖ）、および９９％（ｖ／ｖ）のエタノール系列によって脱水した。次に、エタノールをキシレンに置換し、キシレンをさらにパラフィンワックスに置換した。次に、パラフィンワックス浸透組織をワックスブロックに包埋した。ミクロトームを用いて３μｍ厚切片を作製した。切片をヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）によって染色した。
【０１０１】
膝関節の樹脂包埋組織標本を下に記載されているように作製した。採取した組織を２％（ｖ／ｖ）グルタルアルデヒド／４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド／リン酸緩衝液によって固定した。次に、骨が軟化するまで、組織を脱灰液（５％（ｗ／ｖ）ＥＤＴＡ２Ｎａ、ｐＨ６．０から６．５）によって脱灰した。次に、組織を四酸化オスミウムによって固定し、加工し、Ｓｐｕｒｒ樹脂に包埋した。ウルトラミクロトームを用いて０．５μｍ厚切片を作製した。切片をトルイジンブルーによって染色した。
【０１０２】
（結果）
ケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルの結果が図３Ａに示されている。処置群のケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルは１２週齢において無処置群の３０％未満であった。逆に、図３Ｂに示されているように、デルタｄｉＨＳ−０Ｓの血清中レベルは有意に影響されなかった。
【０１０３】
１２週齢マウスからの大腿骨骨端軟骨板のＨ＆Ｅ染色組織が図４に示されている（元の倍率は４００×）。無処置群のマウス（図４Ｂ）は、コントロール群のマウス（図４Ａ）と比較して軟骨細胞の有意な肥大化および空胞化（矢頭）ならびに軟骨細胞の配列不整を示した。一方、処置群のマウスでは、軟骨細胞の肥大化および空胞化ならびに軟骨細胞の配列不整は無処置群のマウスと比較して抑制されていた（図４Ｃ）。
【０１０４】
１２週齢マウスからの大腿骨骨端軟骨板のトルイジンブルー染色組織が図５に示されている（元の倍率は８００×）。無処置群のマウス（図５Ｂ）はコントロール群のマウス（図５Ａ）と比較して軟骨細胞の有意な肥大化および空胞化（矢頭）を示した。一方、処置
群のマウスでは、軟骨細胞の肥大化および空胞化は無処置群のマウスと比較して抑制されていた（図５Ｃ）。
【０１０５】
例３−１
（酵素固定化カラムの調製）
１．５ｇのＣＮＢｒ活性化セファロース（ＴＭ）４Ｂ（ＧＥヘルスケア製造）が２．５ｍＭ塩酸中において膨潤することを許す。ガラスフィルター上において、セファロース（ＴＭ）４Ｂ樹脂を２００ｍｌの２．５ｍＭ塩酸によって数回洗浄し、最後に、０．１ＭのＮａＨＣＯ３および０．５ＭのＮａＣｌを含有する１００ｍｌの緩衝液Ｂ（ｐＨ８．３）によって洗浄する。２．４ｍｌの膨潤した樹脂に対して、上で得られたケラタナーゼの４ｍｇを追加し、４ｍｌの溶液Ｂによって懸濁する。懸濁液を低温（４℃）で２４時間に渡ってゆっくり攪拌する。ガラスフィルターによって通過分を取り除いた後に、樹脂を樹脂体積の１０倍の０．２Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）中に再懸濁する。懸濁液を低温（４℃）で２４時間に渡ってゆっくり攪拌する。それから、樹脂をカラムにパッキングし、３ＣＶの０．１Ｍ酢酸ナトリウムおよび０．５ＭのＮａＣｌ（ｐＨ４．０）によってコンディショニングする。爾後に、カラムを０．５ＭのＮａＣｌを有する３ＣＶの０．１Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）によって洗浄する。最後に、カラムを２５ｍｌのＰＢＳによって洗浄し、糖分解酵素固定化カラムを得る。
【０１０６】
例３−２
（Ｃ末端短縮型ケラタナーゼの調製）
Ｃ末端短縮型ケラタナーゼ遺伝子（配列番号２）をＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成し、６×Ｈｉｓタグ配列が発現構築物のＣ末端に追加され得るようにしてｐＥＴ２６ｂベクターのＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位にサブクローニングした。発現構築物を大腸菌ＢＬ２１Ｓｔａｒ（ＤＥ３）（サーモフィッシャーサイエンティフィック）に形質転換した。０．５から０．７のＯＤ６００まで、形質転換体を３０μｇ／ｍｌカナマイシンを有するＬＢ培地によって３７℃で培養した。０．４から１．０ｍＭの終濃度を与えるように、イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシドを培養物に追加し、培養物を振盪インキュベーター内において３ｈに渡って３７℃に保った。大腸菌細胞を遠心によって収穫し、１０ｍＭトリス塩酸、０．５ＭのＮａＣｌ、および１ｍＭフッ化フェニルメチルスルホニルを含有する液体中に再懸濁した。超音波処理および４℃における１５ｍｉｎの５０，０００×ｇでの遠心によって調製した大腸菌ライセートをＮｉ−セファロースカラムにかけ、酵素画分を直線勾配の０から３００ｍＭイミダゾールによって溶出した。酵素画分中のエンドトキシンを低下させるために、５％（ｖ／ｖ）のＴｒｉｔｏｎＸ−１１４を混合し、混合物を氷上で５ｍｉｎに渡って冷やした。それから、混合物を５ｍｉｎに渡って３７℃水浴中に保ち、次に５ｍｉｎの２，３００×ｇによって上相を回収した。エンドトキシンを低下させるためのこのステップを５回反復した。酵素溶液を限外濾過デバイス（アミコンウルトラ１５−１００Ｋ、メルクミリポア）によって濃縮し、ＰＢＳによって平衡化したＨｉｐｒｅｐ（ＴＭ）１６／６０ｓｅｐｈａｃｒｙｌカラム（ＧＥヘルスケア）に載せた。もたらされた溶液を０．２２μｍ濾過によって滅菌した。１１．３Ｕ／ｍｌの酵素活性および１．５Ｕ／ｍｇの比活性および０．００３エンドトキシン単位／ｍｇタンパク質のエンドトキシンレベルを有する５ｍｌの液体が最後に得られた。タンパク質濃度は参照標準としてウシ血清アルブミンを用いるマイクロＢＣＡアッセイによって測定した。
【０１０７】
（酵素固定化カラムの調製）
１ｇのＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケア製造）が２．５ｍＭ塩酸中において膨潤することを許した。ガラスフィルター上において、セファロース４Ｂ樹脂を２００ｍｌの２．５ｍＭ塩酸によって数回洗浄し、最後に、０．１ＭのＮａＨＣＯ３および０．５ＭのＮａＣｌを含有する１０ｍｌの緩衝液Ｂ（ｐＨ８．３）によって洗浄した。上で得られた1．０ｍｌの緩衝液Ｂ中のおよそ４．５ｍｇのケラタナーゼを１．０ｍｌの膨
潤した樹脂に懸濁した。代替的には、１．０ｍｌの膨潤した樹脂を１ｍｌの緩衝液Ｂ単独（コントロール）に、または１０ｍｇ／ｍＬウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する１ｍｌの緩衝液Ｂに懸濁した。懸濁液を常温で２時間に渡ってゆっくり攪拌した。使い捨て空カラム（ポリプレップ（ＴＭ）クロマトグラフィーカラム、バイオ・ラッド）を通過する画分を取り除いた後に、樹脂を１０ｍｌの０．２Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）中に再懸濁した。懸濁液を４℃で一晩ゆっくり攪拌した。それから、未固定化（コントロール）、ＢＳＡ固定化、またはケラタナーゼ固定化樹脂の各１ｍｌをそれぞれポリプレップ（ＴＭ）カラムにパッキングした（ベッド高２ｃｍ）。残存する自由なＣＮＢｒ基がブロッキングされ得るようにして、パッキングしたカラムを３ＣＶの緩衝液Ｂおよび０．２Ｍトリス塩酸（ｐＨ８．０）によって３回洗浄し、次に５ＣＶのＰＢＳによって洗浄した。このやり方で、コントロールカラム、ＢＳＡ固定化カラム、およびケラタナーゼ固定化カラムを得た。
【０１０８】
循環血液からのケラタン硫酸の量を減少させる効果を評価するために、カラムを３５℃にセットし、３ＣＶのウサギ血清（ＣＥＤＥＲＬＡＮＥ）によって平衡化した。それから、５ｍｇ／ｍｌのケラタン硫酸（サメ軟骨由来；生化学工業製造）を含有するウサギ血清をカラムにかけ、溶離液を４０ｃｍ／時間の流量で３つのチューブに１ｍｌ毎に逐次的に分画した。分画された血清を水によって１０倍希釈し、直ちに５ｍｉｎに渡って煮沸した。サンプルの各０．８ｍｌを遠心デバイス（オメガ１０Ｋを有するＮａｎｏｓｅｐ（ＴＭ）、ポールライフサイエンス）によって限外濾過し、フロースルー画分は捨てた。残留液を０．５ｍｌの水によって１回洗浄し、それから別のチューブに移し、水によって２５０μｌの体積に調節した。
【０１０９】
（固定化カラム溶離液中のケラタン硫酸の定量）
各カラムからの溶離液中のケラタン硫酸含量を定量した。簡略には、カラム溶離液の残留液をケラタナーゼＩＩによって消化し、生ずる二糖の量を次のように定量した。
【０１１０】
２５０μｌ残留液からの１００μｌ、４０μｌの０．１Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ６．０）、および１０μｌの１ｍＵケラタナーゼＩＩを混合し、３７℃で１６時間に渡ってインキュベーションした。消化されたオリゴ糖を、オメガ１０Ｋ（ポールライフサイエンス）を有するＮａｎｏｓｅｐ（ＴＭ）を用いてフロースルーとして分離した。それから、フロースルー画分の５μｌを、５μｌの１０μｇ／ｍＬガラクトース−６−硫酸（シグマ・アルドリッチ）溶液、１００ｍＭ重炭酸アンモニウムを有する５μｌの１Ｍギ酸アンモニウム、および６０μｌのアセトニトリルによって希釈した。
【０１１１】
ケラタン硫酸二糖の検出のためには、Ｘｅｖｏ−ＴＱ−ＸＳ質量分析計（ウォーターズ製造）を有するＡＣＱＵＩＴＹ−ＵＰＬＣ−ＩクラスシステムのＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムを用いた。二糖の分離のためには、ＡＣＱＵＩＴＹ−ＵＰＬＣ−ＢＥＨアミドカラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×１００ｍｍ（Ｐ／Ｎ：１８６００４８０１、ウォーターズ）を用いた。移動相は、１０ｍＭギ酸アンモニウムおよび１０μＭ重炭酸アンモニウムを含有する０．００４％（ｖ／ｖ）アンモニア中の５０から９０％（ｖ／ｖ）のアセトニトリルの勾配溶出であった。ケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖を、負イオンモードに従って前駆体イオンを４６２．０６８かつ生成物イオンを９７で検出した。
【表７】
2021508312.tif 000011
【０１１２】
例４
（マウス組織中のケラタン硫酸レベルの測定）
ＧＡＬＮＳホモノックアウトマウスを試験に用いた。４週齢ＧＡＬＮＳホモノックアウトマウスに尾静脈から０．５Ｕ／ｍｌ、４μｌ／ｇ体重の用量でケラタナーゼを単回投与した（処置群）。ケラタナーゼの代わりに、ＰＢＳを同じ様式で投与した（無処置群）。マウスを投与後２４時間に屠殺した。血清および組織サンプルを採取し、使用時まで冷凍保存した。凍結した組織をＳＫミル（凍結破砕器具、株式会社トッケン）によって破砕し、１２Ｕのテルモリシン（シグマ、Ｔ７９０２）によって、５ｍＭのＣａＣｌ２を有する２００ｍＭ酢酸アンモニウムｐＨ８．１中において７０℃で１６ｈに渡って消化した。可溶化したサンプルを２０，０００×ｇで１５ｍｉｎに渡って遠心し、上清を９体積の冷エタノールと混合し、それから−２０℃に１６ｈ保った。ケラタン硫酸を１５ｍｉｎの２０，０００×ｇにおける遠心によって沈殿させた。沈殿を３００μｌの蒸留水によって戻し、ケラタン硫酸レベルの測定に用いた。血清および組織サンプル中のケラタン硫酸の量を、例１に記載されている同じ様式でＬＣ−ＭＳ／ＭＳシステムによって測定した。
【０１１３】
（結果）
ケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルの結果が図６に示されている。処置群のケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の血清中レベルは無処置群よりも有意に低かった。
【０１１４】
数個の組織のケラタン硫酸モノ硫酸化型二糖の量が図７Ａから７Ｄに示されている。処置群の肝臓および脾臓のケラタン硫酸量は無処置群よりも有意に低かった。
【０１１５】
本明細書において引用される文書はそれらの全体が参照によって本願に組み込まれる。
【０１１６】
本発明を具体的な例および種々の実施形態との関連において記載したが、本発明の趣旨および範囲からの逸脱なしに、本願に記載されている実施形態の多くの改変および適合が可能であるということは当業者によって容易に理解されるはずである。本明細書は本発明、一般的には本発明の原理のいずれかの変形、使用、または適合をカバーすることが意図されており、本発明が関わる分野の公知および通例の慣行のうちに入る本開示からの逸脱を包含する。
【０１１７】
本願は、２０１７年９月８日出願の米国仮特許出願第６２／５５６，０７６号、２０１７年９月１１日出願の米国仮特許出願第６２／５５６，６４４号、および２０１８年１月１６日出願の米国仮特許出願第６２／６１７，９４０号の優先権の利益を請求し、これらの内容全体は参照によって本願に組み込まれる。
【符号の説明】
【０１１８】
１  治療デバイス
２  血液回路
２ａ  脱血側回路
２ｂ  返血側回路
３  血液ポンプ
１００  治療血液循環システム
［配列表］
＞ＡＡＯ８８２７９．１  エンド−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ［Bacillus
circulans］（配列番号１）
MSSRLKRKCSMLLTFTMIFQLLGLFLFKGEIVSASIRQDPTTGNYYKNVPLVGADFDDASNSNIVAKGTWDDNTAPLNTFFVDKGTATDGGFTTARITTVTDQVYEGGSLQFGDGSTYPINLNYKVDGLEVGATYRLSAYMKLFPGYPAKGGQFGVKNHDTANYTTGGETKSVNFSTVTADWKEYSVTFTPTYPHAKIFFWGSNNLPKVLVDKLRLEKVLEHPGPAAPAVTADDVNNIVVGIDETMEYNINGAGWVAYKEYAKPDLKGDLIVQIRVKETLNTLAGEVTTLTFTAQNDPAPGQPEQLLLKDGDFEAGAASVTTDTNVQNQFFSKNNQYEIVTGDTASGQYALKLRSPETIGYHKTDLKPSTKYQISFMAKVGSASQKLSFRISGYKNDNPYDLDNVMNYIEHTQMKNTGWSRFYYDLETGPSATSAFIDFSTAAGSTAWIDDVKLVEQGPADPPVTEPTLSRGSRLFLEKGLQIQSWVPTDVAYATRKWMKPPTAEEIVDLGLTTVQYNDAPNYSKTLHEEYKKLQQTNPSLPDLKWGVAFGPNANHLSSSYFDSETIAKHDPNKTGAPTEEQKARGFLTPDQLANVQNLNNIGFGDEEDYSDTLTQTLKEWFEVSKKHYPNVLVHHNEVGNTPPPTMSLISTFNENMLRKYMRTAKPDFITYDMYYFRENRQSSEVGGTVIPFYDDLNRYRKVASEGYDGSGLSPIPFGTYLQGWRTGPGAATYEKRGDGWYEITESQAYLSAFANWTFGAKWLSMFRWIEDTPGYLFSDYRPDEDGNWPKYHIYGQYKEMFRQSKNLGEHLIRINNKDVVIVPGQHMKDGQITKNNRPKDNPEWTKSGDRAFIDSLEISNLGKTNHSLKGDVFIGYFDPLPGIDTTQFFTSTAPKYFMLLNGLTSGQGLPAEEQTGSSYETRQEIKVTFDLSGGQARADQLRKVSRLTGELVAAPLKDLGNGKYEMTVVLGGGMADLYFWELGSLNTGNSKPVVADTPHDVRLTGDPKYAKNREIRDLTGKTVTVGWIKDTYSPVPQPLIHYNFSFTKDQNGKLQPMKNPDILSYFTRYYENTLWNKRVERIQKESNVKLEFVADIAWTKQELMDNIRKVKEGQTVDGMPDILIVPDEWTWSGLIQNEMILPASSFSEFDFTERKWNKSYKAMTTWKDQIYGMYAGPTMNSTGLFVNKALQASIGVTDDLMALQQNNAWDWNKLREVASAFQASANREGKYLLAGTDELFKQMVYANGAARGSVGGAMNQEFDLTSSSFREAAELYSELHAAGLIAAKPEGATDDWYVEQFSKNNILFLALPYQQTVDKLKFSYTNQDAVIEMKEGSFLGQPALIPTIVDAYETAYPDGIYKMAQGDWVFLMFPKGPSATGYAAMIDNPAYPVLLSSSANPADAAYVWNILSHEFEGVAYDRFLKLYLNQREVDKTTLKRIGLKEGVWDSYSGTGAWEQVIKPGVLPMLQAGVIDEAKLAELSVEAASYVTNNMTKPAQPGEEPGEEPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGEQPGAGNGSENQGGNEDQGGNGSQGGNGPKPEKIIVKPGELIAVEGKVTIVVPAGATEIVLPPQAAELPQQHKVELKTDRVTLEVPSGLLKKLASRIADKDVSISLKAAPLTAAQAKDAISKNKSVSPSAITLAGGVYDFKLSAAGANGSYAELSEFDQPITISLKIESGVNPEQVGIYYISGNGKLDYIGGEYRDGELAAEVTHFSQYAVLKVVKVFDDVPAGHWAEGVISKLTSRLMVDGTSETTFEPERVVTRAEFTALLARALKLTAGGTPTFADVKAGDWYADAVTAAVEAGIAEGKSAGQFEPQARITREEMVVMTMRAYNKAKDKGPSTGVEASFTDENQISAWAVEQVKAAAALQLIQGRAQGKFEPQGTATRAEAVQVIFNMLLK
//
＞Ｃ末端短縮型ケラタナーゼ［人工配列］（配列番号２）
SIRQDPTTGNYYKNVPLVGADFDDASNSNIVAKGTWDDNTAPLNTFFVDKGTATDGGFTTARITTVTDQVYEGGSLQFGDGSTYPINLNYKVDGLEVGATYRLSAYMKLFPGYPAKGGQFGVKNHDTANYTTGGETKSVNFSTVTADWKEYSVTFTPTYPHAKIFFWGSNNLPKVLVDKLRLEKVLEHPGPAAPAVTADDVNNIVVGIDETMEYNINGAGWVAYKEYAKPDLKGDLIVQIRVKETLNTLAGEVTTLTFTAQNDPAPGQPEQLLLKDGDFEAGAASVTTDTNVQNQFFSKNNQYEIVTGDTASGQYALKLRSPETIGYHKTDLKPSTKYQISFMAKVGSASQKLSFRISGYKNDNPYDLDNVMNYIEHTQMKNTGWSRFYYDLETGPSATSAFIDFSTAAGSTAWIDDVKLVEQGPADPPVTEPTLSRGSRLFLEKGLQIQSWVPTDVAYATRKWMKPPTAEEIVDLGLTTVQYNDAPNYSKTLHEEYKKLQQTNPSLPDLKWGVAFGPNANHLSSSYFDSETIAKHDPNKTGAPTEEQKARGFLTPDQLANVQNLNNIGFGDEEDYSDTLTQTLKEWFEVSKKHYPNVLVHHNEVGNTPPPTMSLISTFNENMLRKYMRTAKPDFITYDMYYFRENRQSSEVGGTVIPFYDDLNRYRKVASEGYDGSGLSPIPFGTYLQGWRTGPGAATYEKRGDGWYEITESQAYLSAFANWTFGAKWLSMFRWIEDTPGYLFSDYRPDEDGNWPKYHIYGQYKEMFRQSKNLGEHLIRINNKDVVIVPGQHMKDGQITKNNRPKDNPEWTKSGDRAFIDSLEISNLGKTNHSLKGDVFIGYFDPLPGIDTTQFFTSTAPKYFMLLNGLTSGQGLPAEEQTGSSYETRQEIKVTFDLSGGQARADQLRKVSRLTGELVAAPLKDLGNGKYEMTVVLGGGMADLYFWELGSLNTGNSKPVVADTPHDVRLTGDPKYAKNREIRDLTGKTVTVGWIKDTYSPVPQPLIHYNFSFTKDQNGKLQPMKNPDILSYFTRYYENTLWNKRVERIQKESNVKLEFVADIAWTKQELMDNIRKVKEGQTVDGMPDILIVPDEWTWSGLIQNEMILPASSFSEFDFTE
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//
＞ドメインＣ欠失ケラタナーゼ［人工配列］（配列番号３）
SIRQDPTTGNYYKNVPLVGADFDDASNSNIVAKGTWDDNTAPLNTFYPHAKIFFWGSNNLPKVLVDKLRLEKVLEHPGPAAPAVTADDVNNIVVGIDETMEYNINGAGWVAYKEYAKPDLKGDLIVQIRVKETLNTLAGEVTTLTFTAQNDPAPGQPEQLLLKDGDFEAGAASVTTDTNVQNQFFSKNNQYEIVTGDTASGQYALKLRSPETIGYHKTDLKPSTKYQISFMAKVGSASQKLSFRISGYKNDNPYDLDNVMNYIEHTQMKNTGWSRFYYDLETGPSATSAFIDFSTAAGSTAWIDDVKLVEQGPADPPVTEPTLSRGSRLFLEKGLQIQSWVPTDVAYATRKWMKPPTAEEIVDLGLTTVQYNDAPNYSKTLHEEYKKLQQTNPSLPDLKWGVAFGPNANHLSSSYFDSETIAKHDPNKTGAPTEEQKARGFLTPDQLANVQNLNNIGFGDEEDYSDTLTQTLKEWFEVSKKHYPNVLVHHNEVGNTPPPTMSLISTFNENMLRKYMRTAKPDFITYDMYYFRENRQSSEVGGTVIPFYDDLNRYRKVASEGYDGSGLSPIPFGTYLQGWRTGPGAATYEKRGDGWYEITESQAYLSAFANWTFGAKWLSMFRWIEDTPGYLFSDYRPDEDGNWPKYHIYGQYKEMFRQSKNLGEHLIRINNKDVVIVPGQHMKDGQITKNNRPKDNPEWTKSGDRAFIDSLEISNLGKTNHSLKGDVFIGYFDPLPGIDTTQFFTSTAPKYFMLLNGLTSGQGLPAEEQTGSSYETRQEIKVTFDLSGGQARADQLRKVSRLTGELVAAPLKDLGNGKYEMTVVLGGGMADLYFWELGSLNTGNSKPVVADTPHDVRLTGDPKYAKNREIRDLTGKTVTVGWIKDTYSPVPQPLIHYNFSFTKDQNGKLQPMKNPDILSYFTRYYENTLWNKRVERIQKESNVKLEFVADIAWTKQELMDNIRKVKEGQTVDGMPDILIVPDEWTWSGLIQNEMILPASSFSEFDFTERKWNKSYKAMTTWKDQIYGMYAGPTMNSTGLFVNKALQASIGVTDDLMALQQNNAWDWNKLREVASAFQASANREGKYLLAGTDELFKQMVYANGAARGSVGGAMNQEFDLTSSSFREAAELYSELHAAGLIAAKPEGATDDWYVEQFSKNNILFLALPYQQTVDKLKFSYTNQDAVIEMKEGSFLGQPALIPTIVDAYETAYPDGIYKMAQGDWVFLMFPKGPSATGYAAMIDNPAYPVLLSSSANPADAAYVWNILSHEFEGVAYDRFLKLYLNQREVDKTTLKRIGLKEGVWDSYSGTGAWEQVIKPGVLPMLQAGVIDEAKLAELSVEAASYVTNNMTKPAQPG
//
＞ドメインＤ欠失ケラタナーゼ［人工配列］（配列番号４）
SIRQDPTTGNYYKNVPLVGADFDDASNSNIVAKGTWDDNTAPLNTFFVDKGTATDGGFTTARITTVTDQVYEGGSLQFGDGSTYPINLNYKVDGLEVGATYRLSAYMKLFPGYPAKGGQFGVKNHDTANYTTGGETKSVNFSTVTADWKEYSVTFTPTYPHAKIFFWGSNNLPKVLVDKLRLEKVLEHPGPAQNDPAPGQPEQLLLKDGDFEAGAASVTTDTNVQNQFFSKNNQYEIVTGDTASGQYALKLRSPETIGYHKTDLKPSTKYQISFMAKVGSASQKLSFRISGYKNDNPYDLDNVMNYIEHTQMKNTGWSRFYYDLETGPSATSAFIDFSTAAGSTAWIDDVKLVEQGPADPPVTEPTLSRGSRLFLEKGLQIQSWVPTDVAYATRKWMKPPTAEEIVDLGLTTVQYNDAPNYSKTLHEEYKKLQQTNPSLPDLKWGVAFGPNANHLSSSYFDSETIAKHDPNKTGAPTEEQKARGFLTPDQLANVQNLNNIGFGDEEDYSDTLTQTLKEWFEVSKKHYPNVLVHHNEVGNTPPPTMSLISTFNENMLRKYMRTAKPDFITYDMYYFRENRQSSEVGGTVIPFYDDLNRYRKVASEGYDGSGLSPIPFGTYLQGWRTGPGAATYEKRGDGWYEITESQAYLSAFANWTFGAKWLSMFRWIEDTPGYLFSDYRPDEDGNWPKYHIYGQYKEMFRQSKNLGEHLIRINNKDVVIVPGQHMKDGQITKNNRPKDNPEWTKSGDRAFIDSLEISNLGKTNHSLKGDVFIGYFDPLPGIDTTQFFTSTAPKYFMLLNGLTSGQGLPAEEQTGSSYETRQEIKVTFDLSGGQARADQLRKVSRLTGELVAAPLKDLGNGKYEMTVVLGGGMADLYFWELGSLNTGNSKPVVADTPHDVRLTGDPKYAKNREIRDLTGKTVTVGWIKDTYSPVPQPLIHYNFSFTKDQNGKLQPMKNPDILSYFTRYYENTLWNKRVERIQKESNVKLEFVADIAWTKQELMDNIRKVKEGQTVDGMPDILIVPDEWTWSGLIQNEMILPASSFSEFDFTERKWNKSYKAMTTWKDQIYGMYAGPTMNSTGLFVNKALQASIGVTDDLMALQQNNAWDWNKLREVASAFQASANREGKYLLAGTDELFKQMVYANGAARGSVGGAMNQEFDLTSSSFREAAELYSELHAAGLIAAKPEGATDDWYVEQFSKNNILFLALPYQQTVDKLKFSYTNQDAVIEMKEGSFLGQPALIPTIVDAYETAYPDGIYKMAQGDWVFLMFPKGPSATGYAAMIDNPAYPVLLSSSANPADAAYVWNILSHEFEGVAYDRFLKLYLNQREVDKTTLKRIGLKEGVWDSYSGTGAWEQVIKPGVLPMLQAGVIDEAKLAELSVEAASYVTNNMTKPAQPG
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＞ドメインＣ，Ｄ欠失ケラタナーゼ［人工配列］（配列番号５）
SIRQDPTTGNYYKNVPLVGADFDDASNSNIVAKGTWDDNTAPLNTFQNDPAPGQPEQLLLKDGDFEAGAASVTTDTNVQNQFFSKNNQYEIVTGDTASGQYALKLRSPETIGYHKTDLKPSTKYQISFMAKVGSASQKLSFRISGYKNDNPYDLDNVMNYIEHTQMKNTGWSRFYYDLETGPSATSAFIDFSTAAGSTAWIDDVKLVEQGPADPPVTEPTLSRGSRLFLEKGLQIQSWVPTDVAYATRKWMKPPTAEEIVDLGLTTVQYNDAPNYSKTLHEEYKKLQQTNPSLPDLKWGVAFGPNANHLSSSYFDSETIA
KHDPNKTGAPTEEQKARGFLTPDQLANVQNLNNIGFGDEEDYSDTLTQTLKEWFEVSKKHYPNVLVHHNEVGNTPPPTMSLISTFNENMLRKYMRTAKPDFITYDMYYFRENRQSSEVGGTVIPFYDDLNRYRKVASEGYDGSGLSPIPFGTYLQGWRTGPGAATYEKRGDGWYEITESQAYLSAFANWTFGAKWLSMFRWIEDTPGYLFSDYRPDEDGNWPKYHIYGQYKEMFRQSKNLGEHLIRINNKDVVIVPGQHMKDGQITKNNRPKDNPEWTKSGDRAFIDSLEISNLGKTNHSLKGDVFIGYFDPLPGIDTTQFFTSTAPKYFMLLNGLTSGQGLPAEEQTGSSYETRQEIKVTFDLSGGQARADQLRKVSRLTGELVAAPLKDLGNGKYEMTVVLGGGMADLYFWELGSLNTGNSKPVVADTPHDVRLTGDPKYAKNREIRDLTGKTVTVGWIKDTYSPVPQPLIHYNFSFTKDQNGKLQPMKNPDILSYFTRYYENTLWNKRVERIQKESNVKLEFVADIAWTKQELMDNIRKVKEGQTVDGMPDILIVPDEWTWSGLIQNEMILPASSFSEFDFTERKWNKSYKAMTTWKDQIYGMYAGPTMNSTGLFVNKALQASIGVTDDLMALQQNNAWDWNKLREVASAFQASANREGKYLLAGTDELFKQMVYANGAARGSVGGAMNQEFDLTSSSFREAAELYSELHAAGLIAAKPEGATDDWYVEQFSKNNILFLALPYQQTVDKLKFSYTNQDAVIEMKEGSFLGQPALIPTIVDAYETAYPDGIYKMAQGDWVFLMFPKGPSATGYAAMIDNPAYPVLLSSSANPADAAYVWNILSHEFEGVAYDRFLKLYLNQREVDKTTLKRIGLKEGVWDSYSGTGAWEQVIKPGVLPMLQAGVIDEAKLAELSVEAASYVTNNMTKPAQPG
//
【図１】
2021508312.tif 000012
【図２Ａ】
2021508312.tif 000013
【図２Ｂ】
2021508312.tif 000014
【図３Ａ】
2021508312.tif 000015
【図３Ｂ】
2021508312.tif 000016
【図４Ａ】
2021508312.tif 000017
【図４Ｂ】
2021508312.tif 000018
【図４Ｃ】
2021508312.tif 000019
【図５Ａ】
2021508312.tif 000020
【図５Ｂ】
2021508312.tif 000021
【図５Ｃ】
2021508312.tif 000022
【図６】
2021508312.tif 000023
【図７Ａ】
2021508312.tif 000024
【図７Ｂ】
2021508312.tif 000025
【図７Ｃ】
2021508312.tif 000026
【図７Ｄ】
2021508312.tif 000027
【配列表】
2021508312000001.app
【国際調査報告】
2021508312.tif 000028