(57)【要約】  本発明は、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を高効率で徐放的に送達し、優れた効率で傷を治療できる医薬組成物に関する。【選択図】図１４
2021531321.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を担持した多孔性シリカ粒子を含み、
前記多孔性シリカ粒子は、下記数式１の吸光度の比が１／２となるｔが２４以上である、傷治療用の医薬組成物。
[数式１]
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度である。）
【請求項２】
前記多孔性シリカ粒子は、直径５ｎｍ未満の気孔を有するシリカ粒子を１２０℃〜１８０℃で２４時間〜９６時間膨張剤と反応させ、前記直径５ｎｍ未満の気孔を膨張させるステップと、前記気孔が膨張されたシリカ粒子を４００℃以上の温度で３時間以上か焼するステップとを含んで製造されたものである、請求項１に記載の傷治療用の医薬組成物。
【請求項３】
前記多孔性シリカ粒子の平均直径は、１５０ｎｍ〜１，０００ｎｍであり、そのＢＥＴ表面積は２００ｍ２／ｇ〜７００ｍ２／ｇであり、気孔のｇ当たりの体積は０．７ｍｌ〜２．２ｍｌである、請求項１に記載の傷治療用の医薬組成物。 
【請求項４】
前記ポリペプチドは、ラクトフェリン、上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子または血管内皮細胞成長因子である、請求項１に記載の傷治療用の医薬組成物。 
【請求項５】
前記ラクトフェリンタンパク質は、配列番号１の配列からなるものである、請求項４に記載の傷治療用の医薬組成物。 
【請求項６】
前記上皮細胞成長因子は配列番号２の配列、前記肝細胞成長因子は配列番号３の配列、前記血管内皮細胞成長因子は配列番号４の配列からなるものである、請求項４に記載の傷治療用の医薬組成物。
【請求項７】
前記物質は、配列番号１の配列をコードする遺伝子が担持されたプラスミドである、請求項１に記載の傷治療用の医薬組成物。 
【請求項８】
前記多孔性シリカ粒子は、前記上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチドを担持したものであり、当該粒子は、外部表面または気孔内部が中性のｐＨで陰電荷を帯びるものである、請求項１に記載の傷治療用の医薬組成物。 
【請求項９】
前記多孔性シリカ粒子は、前記上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチドをコードする遺伝子が担持されたプラスミドを担持したものであり、当該粒子は、外部表面または気孔内部が中性のｐＨで陽電荷を帯びるものである、請求項１に記載の傷治療用の医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、優れた傷治療効果を有する医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物送達システムとは、医薬品の副作用を最小限に抑え、効能及び効果を極大化し、必要な量の薬物、例えば、タンパク質、核酸又はその他の低分子などを効率よく送達する医薬技術を意味する。新薬開発に必要なコストと時間を軽減する効果を有する前記技術は、最近になってナノテクノロジーと結合し、医薬系において新たな付加価値を創出する先端技術の一分野として位置づけられている。米国と日本などの技術先進国では、去る８０年代後半から、製薬会社などの企業を中心に新薬開発とともに薬物送達システムの開発に全力を注いでいる。
【０００３】
これまでは、ウイルス遺伝子、組換えタンパク質、リポソーム（liposome）、陽イオン性高分子、並びに様々な形態のナノ粒子とナノ物質が、動物細胞内への薬物送達に使用されてきた。しかし、多くの陽イオン性リポソームと陽イオン性高分子は、細胞に強い毒性を示すため、臨床に適用するには不適当であることが判明した。また、核酸の安定な細胞膜透過のために、核酸の主鎖を化学的に変形する方法も試みられた。しかし、この方法は、高コストで長時間かかり、労働集約的な工程を必要とするため、臨床への適用には適していない。意味のある試みとして、量子ドット、磁性粒子又は金ナノ粒子を含む様々な形態のナノ粒子を用いる薬物送達システム（drug delivery system、ＤＤＳ）が開発されている。しかし、これらの粒子は、細胞に毒性を示し、核酸などの生体高分子を導入するのに容易でない構造を有し、また細胞内への導入効率も低いという欠点があった。
【０００４】
細胞内における生理活性物質の機能の研究または細胞内送達のためには、効率の良い送達システムが必要である。しかしながら、広範な生理活性物質を送達できる汎用的な送達システム、多量の薬物を収容及び送達できるシステム、薬物を徐放的に放出するシステムの開発は、まだ不十分な状況である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、優れた傷治療効果を有する医薬組成物を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
１．上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を担持した多孔性シリカ粒子を含み、
前記多孔性シリカ粒子は、下記数式１の吸光度の比が１／２となるｔが２４以上である、傷治療用の医薬組成物。
[数式１] 
Ａｔ／Ａ０ 
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した前記多孔性シリカ粒子の吸光度である。） 
【０００７】
２．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は、直径５ｎｍ未満の気孔を有するシリカ粒子を１２０℃〜１８０℃で２４時間〜９６時間膨張剤と反応させ、前記直径５ｎｍ未満の気孔を膨張させるステップと、前記気孔が膨張されたシリカ粒子を４００℃以上の温度で３時間以上か焼するステップとを含んで製造されたものである、傷治療用の医薬組成物。
【０００８】
３．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子の平均直径は、１５０ｎｍ〜１，０００ｎｍであり、そのＢＥＴ表面積は２００ｍ２／ｇ〜７００ｍ２／ｇであり、気孔のｇ当たりの体積は０．７ｍｌ〜２．２ｍｌである、傷治療用の医薬組成物。 
【０００９】
４．前記項目１において、前記ポリペプチドは、ラクトフェリン、上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子または血管内皮細胞成長因子である、傷治療用の医薬組成物。 
【００１０】
５．前記項目４において、前記ラクトフェリンタンパク質は、配列番号１の配列からなるものである、傷治療用の医薬組成物。 
【００１１】
６．前記項目４において、前記上皮細胞成長因子は配列番号２の配列、前記肝細胞成長因子は配列番号３の配列、前記血管内皮細胞成長因子は配列番号４の配列からなるものである、傷治療用の医薬組成物。 
【００１２】
７．前記項目１において、前記物質は、配列番号１の配列をコードする遺伝子が担持されたプラスミドである、傷治療用の医薬組成物。 
【００１３】
８．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は、前記上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチドを担持したものであり、当該粒子は、外部表面または気孔内部が中性のｐＨで陰電荷を帯びるものである、傷治療用の医薬組成物。 
【００１４】
９．前記項目１において、前記多孔性シリカ粒子は、前記上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチドをコードする遺伝子が担持されたプラスミドを担持したものであり、当該粒子は、外部表面または気孔内部が中性のｐＨで陽電荷を帯びるものである、傷治療用の医薬組成物。 
【発明の効果】
【００１５】
本発明の組成物は、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を高効率で徐放的に送達し、優れた効率で傷を治療することができる。
【００１６】
本発明の組成物は、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を徐放的に放出し、体内の上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を長時間維持することができる。これにより、優れた薬効を示すことができる。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の顕微鏡写真である。
【図２】図２は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の顕微鏡写真である。
【図３】図３は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の製造工程における小気孔粒子の顕微鏡写真である。
【図４】図４は、本発明の一実施形態による小気孔粒子の顕微鏡写真である。
【図５】図５は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の気孔直径別の顕微鏡写真である。ＤＤＶ（Degradable Delivery Vehicle）は、実施例の粒子であり、括弧内の数字は粒子の直径を、下付き文字の数字は気孔の直径を意味する。例えば、ＤＤＶ（２００）１０は、粒子直径が２００ｎｍ、気孔直径が１０ｎｍである実施例の粒子を意味する。
【図６】図６は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の生分解性を確認できる顕微鏡写真である。
【図７】図７は、一つの例示による円筒状の透過膜を備えたチューブである。
【図８】図８は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の時間経過による吸光度の減少の結果である。
【図９】図９は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の時間経過による粒径別の吸光度の減少の結果である。
【図１０】図１０は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の時間経過による気孔直径別の吸光度の減少の結果である。
【図１１】図１１は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の時間経過による環境のｐＨ別の吸光度の減少の結果である。
【図１２】図１２は、本発明の一実施形態に係る多孔性シリカ粒子の時間経過による吸光度の減少の結果である。
【図１３】図１３は、本発明の一実施形態に基づいてラクトフェリンタンパク質又はそれをコードする遺伝子が担持された多孔性シリカ粒子のＶＥＧＦ発現増加の結果である。
【図１４】図１４は、本発明の一実施形態に基づいてラクトフェリンタンパク質又はそれをコードする遺伝子が担持された多孔性シリカ粒子の細胞増殖誘導の結果である。
【図１５】図１５は、本発明の一実施形態に基づいてラクトフェリンタンパク質又はそれをコードする遺伝子が担持された多孔性シリカ粒子の細胞増殖および血管形成誘導の結果である。
【図１６】図１６は、本発明の一実施形態に基づいてラクトフェリンタンパク質又はそれをコードする遺伝子が担持された多孔性シリカ粒子の創傷治癒の結果である。
【図１７】図１７は、本発明の一実施形態に基づいてラクトフェリンタンパク質又はそれをコードする遺伝子が担持された多孔性シリカ粒子の創傷治癒の結果である。
【図１８】図１８は、本発明の一実施形態に基づいてラクトフェリンタンパク質又はそれをコードする遺伝子が担持された多孔性シリカ粒子の創傷治癒の結果である。
【図１９】図１９は、本発明の一実施形態に基づいてラクトフェリンタンパク質又はそれをコードする遺伝子が担持された多孔性シリカ粒子の創傷治癒の結果である。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
本発明の具体的な説明において用語の具体的な意味を定義するが、これは当業界の通常の技術者に理解される意味として受け入れられるものであるだけで、下記に定義された特定の意味に限定しようとする意図ではない。
【００１９】
本発明の傷治療用の医薬組成物は、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を担持した多孔性シリカ粒子を含む。
【００２０】
上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチドは、上皮細胞または内皮細胞成長促進能を有するものであれば制限なく使用でき、例えば、ラクトフェリン、細胞成長因子などであってもよい。細胞成長因子は、具体的には上皮細胞成長因子、肝細胞成長因子または血管内皮細胞成長因子であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００２１】
上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチドは、投与対象と同一種に由来するものであってよいが、これに限定されるものではない。他種に由来するものであっても、配列間の類似性によって同一／類似の機能を果たすことができるものであれば使用できる。例えばラクトフェリンの場合には、投与対象がヒトであれば、ヒト由来の配列番号１のアミノ酸配列を含むものであってもよく、具体的には、配列番号１の配列からなるものであってもよい。また、例えば、上皮細胞成長因子の場合には配列番号２のアミノ酸配列を、肝細胞成長因子の場合には配列番号３のアミノ酸配列を、血管内皮細胞成長因子の場合には配列番号４のアミノ酸配列を含むものであってもよく、具体的には、前記配列からなるものであってもよい。
【００２２】
上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチドの活性または発現を増加させる物質は、その活性または発現を増加できるものであれば、その種類を制限せず、例えば、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチドをコードする遺伝子が担持されたプラスミドであってもよい。
【００２３】
プラスミドとしては、当分野で公知のものを制限なく使用することができる。具体例としては、ラクトフェリン遺伝子を担持したプラスミドは配列番号５の塩基配列を、上皮細胞成長因子を担持したプラスミドは配列番号６の塩基配列を、肝細胞成長因子を担持したプラスミドは配列番号７の塩基配列を、血管内皮細胞成長因子を担持したプラスミドは配列番号８の塩基配列を含むものであってもよく、具体的には前記配列からなるものであってもよい。
【００２４】
投与対象は、ヒトを含むあらゆる哺乳類であってもよく、具体的にはヒトであってもよいが、これに限定されるものではない。
【００２５】
本発明において、用語「傷（wound）」は、組織が切られたり（cut）、裂けたり（torn）、壊れたり（broken）、焼けたり（burned）、外傷を負ったり（traumatized）、そのような損傷を誘発する障害または疾患から発生したりする人体に対する損傷（injury）を意味する。前記傷は、表面が開放された開放性傷（open wound）、または表面が開放されていない閉鎖性傷（closed wound）でもある。前記傷の一例は、皮膚の開放性傷でもある。前記傷は、病変（lesion）、できもの（sore）、懐死（necrosis）及び潰瘍（ulcer）を含んでもよい。前記懐死は、感染、損傷または梗塞から生成される死んだ組織に係わるものでもある。前記潰瘍は、懐死組織の脱皮によって生成された、器官または組織の表面の局所的な欠陥またはくぼみでもある。
【００２６】
前記傷の一例は、皮膚の表皮（epidermis）；真皮（dermis）；表皮及び真皮；または表皮、真皮及び皮下脂肪層が損傷された傷でもある。
【００２７】
また、前記傷の例は、創傷、肥大傷、ケロイド、切れ（cut）、切開（incisions）（例：手術的切開）、擦過傷（abrasions）、裂傷または引き裂き（lacerations）、骨折（fracture）、打撲傷（contusions）、火傷（burns）または切断（amputations）を含んでもよい。
【００２８】
前記創傷治療は、皮膚損傷の進行の抑制、皮膚損傷の軽減、または皮膚損傷の除去を意味する。前記創傷は、具体的には、火傷、潰瘍、外傷、外科的手術（post−surgical）、出産、慢性創傷（chronic wound）または皮膚炎（dermatitis）による損傷でもある。
【００２９】
本発明による多孔性シリカ粒子は、シリカ（ＳｉＯ２）素材の粒子であり、ナノサイズの粒径を有する。
【００３０】
本発明の多孔性シリカナノ粒子は、多孔性の粒子であり、ナノサイズの気孔を有し、その表面（外部表面）及び／又は気孔内部に上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を担持することができる。
【００３１】
本発明の多孔性シリカ粒子は、生分解性の粒子であり、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を担持し、体内に投与されたときに体内で生分解され、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を放出することができる。本発明の多孔性シリカ粒子は、体内で徐々に分解され、担持している上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を徐放的に放出させることができる。例えば、下記数式１の吸光度の比が１／２となるｔは、２４以上である。
【００３２】
[数式１] 
Ａｔ／Ａ０ 
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、 
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
前記懸濁液のｐＨは７．４であり、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。） 
【００３３】
前記数式１は、多孔性シリカ粒子が体内と同様の環境でどの程度の速度で分解されるかを意味するものである。
【００３４】
前記の数式１での吸光度Ａ０、Ａｔは、例えば図７に示すように、円筒状の透過膜に多孔性シリカ粒子および懸濁液を入れ、透過膜の外部にも同じ懸濁液を入れて測定したものであり得る。
【００３５】
本発明の多孔性シリカ粒子は、生分解性であり、懸濁液中で徐々に分解され得る。直径５０ｋＤａは約５ｎｍに相当するものであり、生分解された多孔性シリカ粒子は、直径５０ｋＤａの透過膜を通過することができる。円筒状の透過膜は、６０ｒｐｍの水平攪拌下にあるので、懸濁液を均一に混合することができ、分解された多孔性シリカ粒子は、透過膜の外部に放出され得る。
【００３６】
前記数式１での吸光度は、例えば、透過膜の外部の懸濁液が新しい懸濁液に入れ替わる環境下で測定したものであり得る。懸濁液は、持続的に入れ替わるものであってもよく、一定期間ごとに入れ替わるものであってもよい。前記一定期間は、定期的または不定期的な期間であってもよい。たとえば、１時間〜１週間の範囲内で、１時間おき、２時間おき、３時間おき、６時間おき、１２時間おき、２４時間おき、２日おき、３日おき、４日おき、７日おき等に入れ替えることができるが、これらに限定されるものではない。
【００３７】
前記「吸光度の比が１／２となる」ということは、ｔ時間後の吸光度が初期吸光度の半分になるということであり、これは多孔性シリカ粒子の約半分が分解されたことを意味する。
【００３８】
前記懸濁液は緩衝溶液であってもよく、具体例としては、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）およびＳＢＦ（疑似体液）からなる群より選択される１種以上であってもよく、より具体的にはＰＢＳであってもよい。
【００３９】
本発明の前記数式１の吸光度の比が１／２となるｔは２４以上であり、例えばｔは２４〜１２０であってもよく、例えば、前記範囲内で２４〜９６、２４〜７２、３０〜７０、４０〜７０、５０〜６５などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４０】
本発明の多孔性シリカ粒子は、前記数式１の吸光度の比が１／５となるｔが、例えば７０〜１４０であってもよく、例えば、前記範囲内で８０〜１４０、８０〜１２０、８０〜１１０、７０〜１４０、７０〜１２０、７０〜１１０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４１】
本発明の多孔性シリカ粒子は、前記数式１の吸光度の比が１／２０となるｔが、例えば１３０〜２２０であってもよく、例えば、前記範囲内で１３０〜２００、１４０〜２００、１４０〜１８０、１５０〜１８０などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４２】
本発明の多孔性シリカ粒子は、測定される吸光度が０．０１以下となるｔが、例えば、２５０以上、３００以上、３５０以上、４００以上、５００以上、１，０００以上などであってもよく、その上限は２，０００であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４３】
本発明の多孔性シリカ粒子における前記数式１の吸光度の比とｔは、高い量の相関関係を有するものであり、例えば、ピアソン相関係数が０．８以上であってもよく、例えば０．９以上、０．９５以上であってもよい。
【００４４】
前記数式１のｔは、多孔性シリカ粒子が体内と同様の環境でどの程度の速度で分解されるかを意味するものである。これは、例えば多孔性シリカ粒子の表面積、粒径、気孔直径、表面及び／又は気孔内部の置換基、表面の緻密さの程度などを調節することによって調節できる。
【００４５】
例えば、粒子の表面積を増加させてｔを減少させるか、表面積を減少させてｔを増加させることができる。表面積は、粒子の直径、気孔の直径を調節することによって調節できる。また、表面及び／又は気孔内部に置換基を位置させ、多孔性シリカ粒子が環境（溶媒など）に直接露出することを減らしてｔを増加させることができる。また、多孔性シリカ粒子に上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を担持させ、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質と多孔性シリカ粒子間の親和度を増加させ、多孔性シリカ粒子が環境に直接露出することを減らしてｔを増加させることができる。また、粒子の製造時に表面をより緻密に製造してｔを増加させることもできる。前記に数式１のｔを調節できる様々な例を示したが、それらに限定されるものではない。
【００４６】
本発明の多孔性シリカ粒子は、例えば球状粒子であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００４７】
本発明の多孔性シリカ粒子は、平均粒径が例えば１５０ｎｍ〜１，０００ｎｍであってもよく、例えば、前記範囲内で１５０ｎｍ〜８００ｎｍ、１５０ｎｍ〜５００ｎｍ、１５０ｎｍ〜４００ｎｍ、１５０ｎｍ〜３００ｎｍ、１５０ｎｍ〜２００ｎｍであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明の多孔性シリカ粒子は、平均気孔直径が例えば１ｎｍ〜１００ｎｍであってもよく、例えば、前記範囲内で５ｎｍ〜１００ｎｍ、７ｎｍ〜１００ｎｍ、７ｎｍ〜５０ｎｍ、１０ｎｍ〜５０ｎｍ、１０ｎｍ〜３０ｎｍ、７ｎｍ〜３０ｎｍであってもよいが、これらに限定されるものではない。前記のような大きな直径を持って多量の上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を担持することができ、サイズの大きい上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の担持も可能である。
【００４９】
本発明の多孔性シリカ粒子は、ＢＥＴ表面積が、例えば２００ｍ２／ｇ〜７００ｍ２／ｇであってもよい。例えば、前記範囲内で２００ｍ２／ｇ〜７００ｍ２／ｇ、２００ｍ２／ｇ〜６５０ｍ２／ｇ、２５０ｍ２／ｇ〜６５０ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ〜７００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ〜６５０ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ〜６００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ〜５５０ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ〜５００ｍ２／ｇ、３００ｍ２／ｇ〜４５０ｍ２／ｇなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５０】
本発明の多孔性シリカナノ粒子は、気孔のｇ当たりの体積が例えば０．７ｍｌ〜２．２ｍｌであってもよい。例えば、前記範囲内で０．７ｍｌ〜２．０ｍｌ、０．８ｍｌ〜２．２ｍｌ、０．８ｍｌ〜２．０ｍｌ、０．９ｍｌ〜２．０ｍｌ、１．０ｍｌ〜２．０ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。ｇ当たりの体積が小さすぎると、分解速度が速くなりすぎることがあり、大きすぎると、製造が困難であるか、完全な形状を有しないことがある。
【００５１】
本発明の多孔性シリカ粒子は、外部表面及び／又は気孔内部に親水性置換基及び／又は疎水性置換基が存在し得る。例えば、表面及び気孔内部の両方に親水性置換基のみが存在するか、疎水性置換基のみが存在してもよく、表面または気孔内部の一方のみに親水性置換基が存在するか、疎水性置換基が存在してもよい。また、表面に親水性置換基が、気孔内部に疎水性置換基が存在してもよく、その逆の場合も可能である。
【００５２】
本発明の多孔性シリカ粒子に担持された上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の放出は、主にナノ粒子の分解によって行われる。このため、前記置換基の調節により上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の放出環境に対する多孔性シリカ粒子の相互作用を調節し、ナノ粒子自体の分解速度を調節して、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の放出速度を調節することができる。また、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質は、ナノ粒子から拡散して放出させることもできるが、前記置換基の調節により上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質のナノ粒子への結合力を調節し、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の放出を調節することができる。
【００５３】
また、難溶性（疎水性）の上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質との結合力を強化するために、気孔内部に疎水性置換基が存在し、使用、製剤化のし易さなどの側面で粒子の表面に親水性置換基が存在するようにするなどの処理も可能である。
【００５４】
親水性置換基としては、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、カルボニル基、スルフヒドリル基、ホスフェート基、チオール基、アンモニウム基、エステル基、イミド基、チオイミド基、ケト基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、ポリエチレングリコール基などが挙げられる。疎水性置換基としては、例えば、置換または非置換のＣ１〜Ｃ３０のアルキル基、置換または非置換のＣ３〜Ｃ３０のシクロアルキル基、置換または非置換のＣ６〜Ｃ３０のアリール基、置換または非置換のＣ２〜Ｃ３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ１〜Ｃ３０のエステル基、及びハロゲン含有基などが挙げられる。
【００５５】
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、外部表面及び／又は気孔内部が陽電荷及び／又は陰電荷に帯電されたものであってもよい。例えば、表面及び気孔内部の両方が陽電荷に帯電されるか、陰電荷に帯電されてもよく、表面または気孔内部の一方のみが陽電荷に帯電されるか、陰電荷に帯電されてもよい。また、表面が陽電荷、気孔内部が陰電荷に帯電されてもよく、その逆の場合も可能である。具体的には、多孔性シリカ粒子がポリペプチドを担持した場合には、外部表面及び／又は気孔内部が陰電荷に帯電されたものであってもよく、ポリペプチドをコードする遺伝子が担持されたプラスミドを担持した場合には、外部表面及び／又は気孔内部が陽電荷に帯電されたものであってもよい。
【００５６】
前記帯電は、例えば、陽イオン性置換基または陰イオン性置換基が存在することによって行われたものであり得る。
【００５７】
前記陽イオン性置換基は、例えば、塩基性基としてアミノ基、その他の窒素含有基などであってもよく、前記陰イオン性置換基は、例えば、酸性基としてカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、スルホン酸基（−ＳＯ３Ｈ）、チオール基（−ＳＨ）などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００５８】
同様に、前記帯電によって前記置換基の調節により上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の放出環境に対する多孔性シリカ粒子の相互作用を調節し、ナノ粒子自体の分解速度を調節して、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の放出速度を調節することができる。また、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質は、ナノ粒子から拡散されて放出させることもできるが、前記置換基の調節により上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質のナノ粒子への結合力を調節し、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の放出を調節することができる。
【００５９】
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、その表面及び／又は気孔内部に前記の他に上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の担持、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の標的細胞への移動、その他の目的のための物質の担持、又はその他の追加置換基の結合などのための置換基が存在してもよく、それに結合された抗体、リガンド、細胞透過性のペプチドまたはアプタマーなどをさらに含んでいてもよい。
【００６０】
前述した表面及び／又は気孔内部の置換基、電荷、結合物質などは、例えば、表面改質によって付加することができる。
【００６１】
表面改質は、例えば、導入しようとする置換基を有する化合物を粒子と反応させて行うことができ、前記化合物は、例えば、Ｃ１〜Ｃ１０のアルコキシ基を有するアルコキシシランであってもよいが、これに限定されるものではない。前記アルコキシシランは、前記アルコキシ基を１つ以上有するものであり、例えば１〜３つを有することができ、アルコキシ基の結合していない部位に導入しようとする置換基があるか、又はそれで置換された置換基があってもよい。
【００６２】
本発明の多孔性シリカ粒子は、例えば、小気孔の粒子の製造および気孔拡張工程を経て製造したものであってもよく、必要に応じて、か焼（calcination）工程、表面改質工程などをさらに経て製造したものであってもよい。か焼及び表面改質工程をすべて経た場合は、か焼後に表面改質されたものであってもよい。
【００６３】
前記小気孔の粒子は、例えば、平均気孔直径が１ｎｍ〜５ｎｍの粒子であってもよい。
【００６４】
前記小気孔の粒子は、溶媒に界面活性剤とシリカ前駆物質を入れて攪拌及び均質化して得ることができる。
【００６５】
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ−ブチロラクトン、１，３−ジメチル−イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ−エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ−メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ−ジオキサン、Ｐ−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはメタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００６６】
前記溶媒において、水と有機溶媒の混合溶媒の使用時の割合は、例えば、水と有機溶媒を１：０．７〜１．５の体積比、例えば１：０．８〜１．３の体積比で使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００６７】
前記界面活性剤は、例えば、ＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＡＢｒ（臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム）、ＴＭＰｒＣｌ（塩化ヘキサデシルトリメチルピリジニウム）、ＴＭＡＣｌ（塩化テトラメチルアンモニウム）などであってもよく、具体的にはＣＴＡＢを使用することができる。
【００６８】
前記界面活性剤は、例えば、溶媒１リットル当たりに１ｇ〜１０ｇ、例えば、前記範囲内で１ｇ〜８ｇ、２ｇ〜８ｇ、３ｇ〜８ｇなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【００６９】
前記シリカ前駆物質は、溶媒に界面活性剤を添加して攪拌した後に添加することができる。シリカ前駆物質は、例えば、ＴＭＯＳ（テトラメチルオルソシリケート）であってもよいが、これに限定されるものではない。
【００７０】
前記攪拌は、例えば１０分〜３０分間行うことができるが、これに限定されるものではない。
【００７１】
前記シリカ前駆物質は、例えば溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ〜５ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ〜４ｍｌ、０．５ｍｌ〜３ｍｌ、０．５ｍｌ〜２ｍｌ、１ｍｌ〜２ｍｌなどの量で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【００７２】
必要に応じて、触媒として水酸化ナトリウムをさらに使用することができるが、これは溶媒に界面活性剤を添加した後、シリカ前駆物質の添加前に撹拌しながら添加することができる。
【００７３】
前記水酸化ナトリウムは、例えば、１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液を基準で溶媒１リットル当たりに０．５ｍｌ〜８ｍｌ、例えば、前記範囲内で０．５ｍｌ〜５ｍｌ、０．５ｍｌ〜４ｍｌ、１ｍｌ〜４ｍｌ、１ｍｌ〜３ｍｌ、２ｍｌ〜３ｍｌなどであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７４】
前記シリカ前駆物質の添加後に溶液を攪拌して反応させることができる。攪拌は、例えば２時間〜１５時間行うことができ、例えば、前記範囲内で３時間〜１５時間、４時間〜１５時間、４時間〜１３時間、５時間〜１２時間、６時間〜１２時間、６時間〜１０時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。攪拌時間（反応時間）が短すぎると、結晶核生成（nucleation）が不足することがある。
【００７５】
前記攪拌の後には、溶液を熟成（aging）させることができる。熟成は、例えば、８時間〜２４時間行うことができ、例えば、前記範囲内で８時間〜２０時間、８時間〜１８時間、８時間〜１６時間、８時間〜１４時間、１０時間〜１６時間、１０時間〜１４時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７６】
その後、反応産物を洗浄及び乾燥して多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。
【００７７】
前記未反応物質の分離は、例えば、遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。遠心分離は、例えば６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、例えば、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００７８】
前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができ、具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【００７９】
前記有機溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ−ブチロラクトン、１，３−ジメチル−イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ−エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ−メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ−ジオキサン、Ｐ−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００８０】
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、例えば、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００８１】
前記洗浄は、遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
【００８２】
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば、２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【００８３】
前記乾燥は、例えば２０℃〜１００℃で行うことができるが、これらに限定されず、真空状態で行うこともできる。
【００８４】
その後、前記で得られた多孔性シリカ粒子の気孔を拡張する。気孔の拡張は、気孔膨張剤を用いて行うことができる。
【００８５】
前記気孔膨張剤としては、例えば、トリメチルベンゼン、トリエチルベンゼン、トリプロピルベンゼン、トリブチルベンゼン、トリペンチルベンゼン、トリヘキシルベンゼン、トルエン、ベンゼンなどを使用でき、具体的にはトリメチルベンゼンを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００８６】
また、前記気孔膨張剤としては、例えばＮ，Ｎ−ジメチルヘキサデシルアミン（N，N−dimethylhexadecylamine、DMHA）を使用できるが、これに限定されるものではない。
【００８７】
前記気孔の拡張は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子を気孔膨張剤と混合し、加熱して反応させて行うことができる。
【００８８】
前記溶媒は、例えば、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用でき、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【００８９】
前記多孔性シリカ粒子は、例えば、溶媒１リットル当たりに１０ｇ〜２００ｇ、例えば、前記範囲内で１０ｇ〜１５０ｇ、１０ｇ〜１００ｇ、３０ｇ〜１００ｇ、４０ｇ〜１００ｇ、５０ｇ〜１００ｇ、５０ｇ〜８０ｇ、６０ｇ〜８０ｇなどの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【００９０】
前記多孔性シリカ粒子は、溶媒中に均一に分散されているものであってもよく、例えば、溶媒に多孔性シリカ粒子を添加して超音波分散したものであってもよい。混合溶媒を使用する場合には、第１の溶媒に多孔性シリカ粒子を分散した後、第２の溶媒を添加したものであってもよい。
【００９１】
前記気孔膨張剤は、例えば、溶媒１００体積部に対して１０〜２００体積部、前記範囲内で１０〜１５０体積部、１０〜１００体積部、１０〜８０体積部、３０〜８０体積部、３０〜７０体積部などの割合で添加できるが、これらに限定されるものではない。
【００９２】
前記反応は、例えば１２０℃〜１９０℃で行うことができる。例えば、前記範囲内で１２０℃〜１９０℃、１２０℃〜１８０℃、１２０℃〜１７０℃、１３０℃〜１７０℃、１３０℃〜１６０℃、１３０℃〜１５０℃、１３０℃〜１４０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【００９３】
前記反応は、例えば６時間〜９６時間行うことができる。例えば、前記範囲内で３０時間〜９６時間、３０時間〜９６時間、３０時間〜８０時間、３０時間〜７２時間、２４時間〜８０時間、２４時間〜７２時間、３６時間〜９６時間、３６時間〜８０時間、３６時間〜７２時間、３６時間〜６６時間、３６時間〜６０時間、４８時間〜９６時間、４８時間〜８８時間、４８時間〜８０時間、４８時間〜７２時間、６時間〜９６時間、７時間〜９６時間、８時間〜８０時間、９時間〜７２時間、９時間〜８０時間、６時間〜７２時間、９時間〜９６時間、１０時間〜８０時間、１０時間〜７２時間、１２時間〜６６時間、１３時間〜６０時間、１４時間〜９６時間、１５時間〜８８時間、１６時間〜８０時間、１７時間〜７２時間などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００９４】
前記例示した範囲内で時間および温度を調節して、反応が過剰せずに十分に行われるようにすることができる。例えば、反応温度が低くなると反応時間を増やしたり、反応温度が高くなると反応時間を短くしたりすることができる。反応が十分でないと、気孔の拡張が十分でないことがあり、反応が進行しすぎると、気孔の過剰拡張により粒子が崩壊することがある。
【００９５】
前記反応は、例えば、段階的に昇温して行うことができる。具体的には、常温から前記温度まで０．５℃／分〜１５℃／分の速度で段階的に昇温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分〜１５℃／分、３℃／分〜１５℃／分、３℃／分〜１２℃／分、３℃／分〜１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００９６】
前記反応は、攪拌下で行うことができる。例えば１００ｒｐｍ以上の速度で攪拌することができ、具体的には１００ｒｐｍ〜１，０００ｒｐｍの速度で行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【００９７】
前記反応後は、反応液を徐々に冷却することができ、例えば、段階的に減温して冷却することができる。具体的には、前記温度から常温まで０．５℃／分〜２０℃／分の速度で段階的に減温して行うことができ、例えば、前記範囲内で１℃／分〜２０℃／分、３℃／分〜２０℃／分、３℃／分〜１２℃／分、３℃／分〜１０℃／分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【００９８】
前記冷却後に反応産物を洗浄および乾燥し、気孔が拡張された多孔性シリカ粒子を得ることができる。必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。
【００９９】
前記未反応物質の分離は、例えば、遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。遠心分離は、例えば６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、例えば、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１００】
前記洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上、１０回以下、例えば、３回、４回、５回、６回、７回、８回などであってもよい。
【０１０１】
前記有機溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができ、具体的にはアルコール、より具体的にはエタノールを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１０２】
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、例えば、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１０３】
前記洗浄は遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液を、そのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
【０１０４】
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、例えば、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【０１０５】
前記乾燥は、例えば２０℃〜１００℃で行うことができるが、これに限定されるものではなく、真空状態で行うこともできる。
【０１０６】
その後、得られた粒子は、か焼することができる。か焼は、粒子を加熱してその表面および内部のシラノール基を除去して粒子の反応性を下げ、より緻密な構造にし、気孔を満たす有機物を除去する工程であり、例えば４００℃以上の温度に加熱することができる。その上限は特に限定されず、例えば、１，０００℃、９００℃、８００℃、７００℃等であってもよい。加熱は、例えば、３時間以上、４時間以上などで行うことができる。その上限は特に限定されず、例えば、２４時間、１２時間、１０時間、８時間、６時間、５時間などであってもよい。より具体的には、４００℃〜７００℃で３時間〜８時間、具体的には５００℃〜６００℃で４時間〜５時間行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【０１０７】
気孔を満たす有機物を除去することにより、残存有機物によって示される細胞毒性、泡の発生などの問題を防止することができる。
【０１０８】
その後、得られた多孔性シリカ粒子は、表面改質することができる。表面改質は、表面及び／又は気孔内部に行うことができる。粒子表面と気孔内部は、同じように表面改質してもよく、異なるように表面改質してもよい。
【０１０９】
前記表面改質により粒子が帯電されるようにするか、または親水性及び／又は疎水性の性質を持つようにすることができる。
【０１１０】
より具体的には、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の効果的な担持のために、アミノ基、アミノアルキル基、アルキルアミノ基、窒素原子を含むヘテロ環芳香族化合物基、シアン基及びグアニジン基からなる群より選択される少なくとも一つの置換基を有するようにして、前記多孔性シリカ粒子の表面改質を行うことができる。
【０１１１】
表面改質は、例えば、導入しようとする親水性、疎水性、陽イオン性、陰イオン性などの置換基を有する化合物を粒子と反応させて行うことができる。前記化合物は、例えばＣ１〜Ｃ１０のアルコキシ基を有するアルコキシシランであってもよいが、これに限定されるものではない。
【０１１２】
前記アルコキシシランは、前記アルコキシ基を１個以上有するものであり、例えば１〜３個有することができ、アルコキシ基が結合していない部位に導入しようとする置換基があるか、又はそれで置換された置換基があってもよい。
【０１１３】
前記アルコキシシランを多孔性シリカ粒子と反応させると、シリコン原子と酸素原子との共有結合が形成され、アルコキシシランが多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部と結合することができる。前記アルコキシシランは、導入しようとする置換基を有しているので、当該置換基を多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部に導入することができる。
【０１１４】
前記反応は、溶媒に分散した多孔性シリカ粒子をアルコキシシランと反応させて行うことができる。
【０１１５】
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、γ−ブチロラクトン、１，３−ジメチル−イミダゾリジノン、メチルエチルケトン、シクロヘキサノン、シクロペンタノン、４−ヒドロキシ−４−メチル−２−ペンタノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレン、テトラメチルベンゼンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル、ジエチレングリコールモノエチルエーテル、ジエチレングリコールモノメチルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、プロピレングリコールモノメチルエーテル、プロピレングリコールモノエチルエーテル、ジプロピレングリコールジエチルエーテル、トリエチレングリコールモノエチルエーテルなどのグリコールエーテル類（セロソルブ）；その他ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ，Ｎ−ジエチルアセトアミド、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、ジエチルホルムアミド（ＤＥＦ）、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡｃ）、Ｎ−メチルピロリドン（ＮＭＰ）、Ｎ−エチルピロリドン（ＮＥＰ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン、Ｎ，Ｎ−ジメチルメトキシアセトアミド、ジメチルスルホキシド、ピリジン、ジメチルスルホン、ヘキサメチルホスホアミド、テトラメチル尿素、Ｎ−メチルカプロラクタム、テトラヒドロフラン、ｍ−ジオキサン、Ｐ−ジオキサン、１，２−ジメトキシエタンなどを使用でき、具体的にはトルエンを使用できるが、これらに制限されるものではない。
【０１１６】
前記陽電荷での帯電は、例えばアミノ基、アミノアルキル基などの窒素含有基などの塩基性基を有するアルコキシシランと反応させて行うことができる。具体的には、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（N−［3−（Trimethoxysilyl）propyl］ethylenediamine）、Ｎ１−（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（N1−（3−Trimethoxysilylpropyl）diethylenetriamine）、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（（3−Aminopropyl）trimethoxysilane）、Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］アニリン（N−［3−（Trimethoxysilyl）propyl］aniline）、トリメトキシ［３−（メチルアミノ）プロピル］シラン（Trimethoxy［3−（methylamino）propyl］silane）、３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン（3−（2−Aminoethylamino）propyldimethoxymethylsilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１１７】
前記陰電荷での帯電は、例えばカルボキシ基、スルホン酸基、チオール基、メチルホスホネート基、ホスホネート基などの酸性基を有するアルコキシシランと反応させて行うことができる。具体的には、（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（（3−Mercaptopropyl）trimethoxysilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１１８】
前記親水性の性質は、親水性基、例えば、ヒドロキシ基、カルボキシ基、アミノ基、カルボニル基、スルフヒドリル基、ホスフェート基、チオール基、アンモニウム基、エステル基、イミド基、チオイミド基、ケト基、エーテル基、インデン基、スルホニル基、ポリエチレングリコール基などを有するアルコキシシランと反応させて持たせることができる。具体的には、 Ｎ−［３−（トリメトキシシリル）プロピル］エチレンジアミン（N−［3−（Trimethoxysilyl）propyl］ethylenediamine）、Ｎ１−（３−トリメトキシシリルプロピル）ジエチレントリアミン（N1−（3−Trimethoxysilylpropyl）diethylenetriamine）、（３−アミノプロピル）トリメトキシシラン（（3−Aminopropyl）trimethoxysilane）、（３−メルカプトプロピル）トリメトキシシラン（（3−Mercaptopropyl）trimethoxysilane）、トリメトキシ［３−（メチルアミノ）プロピル］シラン（Trimethoxy［3−（methylamino）propyl］silane）、 ３−（２−アミノエチルアミノ）プロピルジメトキシメチルシラン（3−（2−Aminoethylamino）propyldimethoxymethylsilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１１９】
前記疎水性の性質は、疎水性置換基、例えば、置換または非置換のＣ１〜Ｃ３０のアルキル基、置換または非置換のＣ３〜Ｃ３０のシクロアルキル基、置換または非置換のＣ６〜Ｃ３０のアリール基、置換または非置換のＣ２〜Ｃ３０のヘテロアリール基、ハロゲン基、Ｃ１〜Ｃ３０のエステル基、ハロゲン含有基などを有するアルコキシシランと反応させて持たせることができる。具体的には、トリメトキシ（オクタデシル）シラン（Trimethoxy（octadecyl）silane）、トリメトキシ−ｎ−オクチルシラン（Trimethoxy−n−octylsilane）、トリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）、イソブチル（トリメトキシ）シラン（Isobutyl（trimethoxy）silane）、トリメトキシ（７−オクテン−１−イル）シラン（Trimethoxy（7−octen−1−yl）silane）、トリメトキシ（３，３，３−トリフルオロプロピル）シラン（Trimethoxy（3，3，3−trifluoropropyl）silane）、トリメトキシ（２−フェニルエチル）シラン（Trimethoxy（2−phenylethyl）silane）、ビニルトリメトキシシラン（Vinyltrimethoxysilane）、シアノメチル（Cyanomethyl）、［３−（トリメトキシシリル）プロピル］トリチオカーボネート（［3−（trimethoxysilyl）propyl］trithiocarbonate）、（３−ブロモプロピル）トリメトキシシラン（（3−Bromopropyl）trimethoxysilane）などを使用できるが、これらに限定されるものではない。
【０１２０】
そのほか、前記表面改質により難溶性（疎水性）の上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質との結合力を強化するために、気孔内部に疎水性置換基が存在し、使用、製剤化のし易さなどの側面で粒子の表面に親水性置換基が存在するようにするなどの処理も可能であり、表面に他の上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を結合するための置換基が存在してもよい。
【０１２１】
また、前記表面改質は、複合的に行うこともできる。例えば、外部表面または気孔内部に２回以上の表面改質を行うこともできる。具体的な例として、アミノ基が導入されたシリカ粒子にカルボキシル基を含む化合物をアミド結合で結合して陽電荷に帯電した粒子を、他の表面特性を持つように変化させることができるが、これに限定されるものではない。
【０１２２】
前記多孔性シリカ粒子のアルコキシシランとの反応は、例えば、加熱下で行うことができる。加熱は、例えば８０℃〜１８０℃、例えば、前記範囲内で８０℃〜１６０℃、８０℃〜１５０℃、１００℃〜１６０℃、１００℃〜１５０℃、１１０℃〜１５０℃などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【０１２３】
前記多孔性シリカ粒子のアルコキシシランとの反応は、例えば４時間〜２０時間、例えば、前記範囲内で４時間〜１８時間、４時間〜１６時間、６時間〜１８時間、６時間〜１６時間、８時間〜１８時間、８時間〜１６時間、８時間〜１４時間、１０時間〜１４時間などで行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【０１２４】
前記反応温度、時間、そして表面改質に使用される化合物の量などは、表面改質しようとする程度によって選択できる。上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の親水性、疎水性、電荷の程度によって反応条件を変えて多孔性シリカ粒子の親水性、疎水性、電荷の程度を調節することにより、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の放出速度を調節することができる。例えば、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質が中性のｐＨで強い陰電荷を帯びる場合には、多孔性シリカ粒子が強い陽電荷を帯びるようにするために、反応温度を高くしたり、反応時間を長くしたり、化合物の処理量を増やすことができるが、これらに制限されるものではない。
【０１２５】
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、例えば、小気孔の粒子の製造、気孔の拡張、表面改質、気孔内部の改質工程を経て製造されたものであってもよい。
【０１２６】
前記小気孔の粒子の製造および気孔拡張工程は前述通りの工程によって行うことができ、小気孔の粒子の製造後、そして気孔拡張工程の後に洗浄及び乾燥工程を行うことができる。
【０１２７】
必要に応じて、洗浄の前に未反応物質の分離を先行することができる。未反応物質の分離は、例えば遠心分離で上澄み液を分離して行うことができる。
【０１２８】
前記遠心分離は、例えば６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、具体的には、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１２９】
前記小気孔の粒子の製造後の洗浄は、先に例示した範囲内の方法／条件で行うことができるが、これらに限定されるものではない。
【０１３０】
前記気孔拡張後の洗浄は、先の例示よりは緩和された条件で行うことができる。例えば、洗浄を３回以内行うことができるが、これに限定されるものではない。
【０１３１】
前記表面改質と気孔内部改質のそれぞれは、前述の工程によって行うことができる。表面改質と気孔内部改質の順に工程を行うことができ、前記両工程の間に粒子の洗浄工程をさらに行うことができる。
【０１３２】
前記小気孔の粒子の製造および気孔拡張の後に洗浄をより緩和された条件で行う場合、気孔内部には粒子製造、気孔拡張に使用された界面活性剤などの反応液が満たされているため、表面改質時に気孔内部が改質されずに、表面だけが改質され得る。その後、粒子を洗浄すると、気孔内部の反応液が除去され得る。
【０１３３】
前記表面改質工程と気孔内部改質工程との間の粒子の洗浄は、水及び／又は有機溶媒で行うことができる。具体的には、溶媒ごとに溶解できる物質が異なるので、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、具体的には、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【０１３４】
前記洗浄は遠心分離下で行うことができ、例えば６，０００〜１０，０００ｒｐｍで行うことができる。その時間は、例えば３分〜６０分、具体的には、前記範囲内で３分〜３０分、３分〜３０分、５分〜３０分などであってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１３５】
前記洗浄は遠心分離をせずに、フィルタで粒子をろ過して行うこともできる。フィルタは、多孔性シリカ粒子の直径以下の気孔を有するものであってもよい。反応液をそのようなフィルタでろ過すると、粒子だけがフィルタの上に残り、そのフィルタの上に水及び／又は有機溶媒を注ぎ、洗浄することができる。
【０１３６】
前記洗浄時には、水と有機溶媒を１回または数回交互に使用してもよく、水または有機溶媒単独で１回または数回洗浄してもよい。前記数回は、例えば２回以上１０回以下、具体的には、３回以上１０回以下、４回以上８回以下、４回以上６回以下などであってもよい。
【０１３７】
前記乾燥は、例えば２０℃〜１００℃で行うことができるが、これに限定されるものではなく、真空状態で行うこともできる。
【０１３８】
上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質は、多孔性シリカ粒子の表面及び／又は気孔内部に担持することができる。担持は、例えば、溶媒中の多孔性シリカ粒子と上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を混合して行うことができる。
【０１３９】
前記溶媒は、水及び／又は有機溶媒であってもよい。有機溶媒としては、例えば、１，４−ジオキサンなどのエーテル類（特に環状エーテル類）；クロロホルム、塩化メチレン、四塩化炭素、１，２−ジクロロエタン、ジクロロエチレン、トリクロロエチレン、ペルクロロエチレン、ジクロロプロパン、塩化アミル、１，２−ジブロモエタンなどのハロゲン化炭化水素類；アセトン、メチルイソブチルケトン、シクロヘキサノンなどのケトン類；ベンゼン、トルエン、キシレンなどの炭素系芳香族類；Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジブチルホルムアミド、Ｎ，Ｎ−ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドンなどのアルキルアミド類；メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノールなどのアルコール類；などを使用することができる。
【０１４０】
また、前記溶媒として、ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水）、ＳＢＦ（疑似体液）、Borate−buffered saline、Tris−buffered salineなどを使用することもできる。
【０１４１】
前記多孔性シリカ粒子に担持された上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質は、延長された時間をかけて段階的に放出され得る。このような遅い放出は、連続性または非連続性、線形または非線形であってもよく、多孔性シリカ粒子の特徴及び／又はそれと上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質との相互作用に起因して異なり得る。
【０１４２】
前記多孔性シリカ粒子に担持された上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質は、多孔性シリカ粒子が生分解されながら放出されるが、本発明に係る多孔性シリカ粒子は徐々に分解され、担持された上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質が徐放的に放出されるようにすることができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子の表面積、粒径、気孔直径、表面及び／又は気孔内部の置換基、表面の緻密さの程度などを調節することで調節できるが、これらに限定されるものではない。
【０１４３】
また、前記多孔性シリカ粒子に担持された上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質は、多孔性シリカ粒子から離脱して拡散しながらも放出できる。これは多孔性シリカ粒子と上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の放出環境との関係に影響を受けるものであるところ、これを調整して、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の放出を調節することができる。例えば、表面改質によって多孔性シリカ粒子の上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質との結合力を強化または弱化させることによって調節することができる。
【０１４４】
より具体的な例として、担持される上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質が難溶性（疎水性）である場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部が疎水性置換基を有することにより、多孔性シリカ粒子と上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質との結合力が増加し得る。これにより、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が疎水性置換基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
【０１４５】
本明細書で「難溶性」とは、（水に対して）不溶性（insoluble）、実質的に不溶性（practically insoluble）、またはごくわずかの可溶性（only slightly soluble）を含む意味である。これは「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ」１８ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（USP、Remington、Mack Publishing Company発行）に定義されている用語である。
【０１４６】
前記難溶性の物質は、例えば１気圧、２５℃での水溶解度が１０ｇ／Ｌ未満、具体的には５ｇ／Ｌ未満、より具体的には１ｇ／Ｌ未満であってもよいが、これらに限定されるものではない。
【０１４７】
担持される上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質が水溶性（親水性）である場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部が親水性置換基を有することにより、多孔性シリカ粒子と上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質との結合力が増加し得る。これにより、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が親水性置換基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
【０１４８】
水溶性物質は、例えば１気圧、２５℃での水溶解度が１０ｇ／Ｌ以上であってもよいが、これに限定されるものではない。
【０１４９】
担持される上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質が電荷を帯びる場合には、粒子の表面及び／又は気孔内部がその逆の電荷に帯電することにより、多孔性シリカ粒子と上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質との結合力が増加し得る。これにより、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子が酸性基または塩基性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
【０１５０】
具体的には、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質が中性のｐＨで陽電荷を帯びるものであれば、粒子の表面及び／又は気孔内部が中性のｐＨで陰電荷に帯電するものであってよい。これにより、多孔性シリカ粒子と上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質との結合力が増加して、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子がカルボキシ基（−ＣＯＯＨ）、スルホン酸基（−ＳＯ３Ｈ）などの酸性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
【０１５１】
また、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質が中性のｐＨで陰電荷を帯びるものであれば、粒子の表面及び／又は気孔内部が陽電荷に帯電するものであってもよい。これにより、多孔性シリカ粒子と上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質との結合力が増加して、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を徐放的に放出することができる。これは例えば、多孔性シリカ粒子がアミノ基、その他窒素含有基などの塩基性基を有するアルコキシシランで表面改質されたものであってもよい。
【０１５２】
上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質は、必要な治療の種類、放出環境、使用される多孔性シリカ粒子に依存して、例えば７日〜１年またはそれ以上の期間にわたって放出され得る。
【０１５３】
また、本発明の多孔性シリカ粒子は、生分解性で１００％分解され得るので、これに担持された上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質は、１００％放出され得る。
【０１５４】
本発明の組成物は、傷治療効果を有するものである。この効果は担持された上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を体内に安定的に送達し、ターゲットに徐放的に放出して、血管内皮成長因子（ＶＥＦＧ）などの因子などの発現を促進することにより達成される効果であり得る。
【０１５５】
本発明の組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことができ、担体と共に製剤化することができる。本発明で用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せず投与化合物の生物学的活性及び特性を阻害しない担体または希釈剤を意味する。液状溶液に製剤化される組成物における薬学的に許容可能な担体は、滅菌および生体に適したものであり、食塩水、滅菌水、リンガー液、緩衝食塩水、アルブミン注射液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール及びこれらの成分のうち１つの成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液及び静菌剤などの他の通常の添加剤を添加することができる。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤及び潤滑剤を付加的に添加し、水溶液、懸濁液、乳濁液などの注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。
【０１５６】
本発明の組成物は、いずれの剤型にも適用可能であり、経口用または非経口用の剤形に製造することができる。本発明の薬学的剤形は、口腔（oral）、直腸（rectal）、鼻腔（nasal）、局所（topical；頬及び舌下を含む）、皮下、膣（vaginal）または非経口（parenteral；筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与に適したもの、あるいは吸入（inhalation）または注入（insufflation）による投与に適した形態を含む。
【０１５７】
本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与する。有効容量は、患者の疾患の種類、重症度、薬物の活性、薬物に対する敏感度、投与時間、投与経路、排出割合、治療期間、同時使用される薬物を含む要素、及びその他の医学分野でよく知られている要素によって決定できる。本発明の薬学的組成物は、個々の治療剤として投与しても、他の治療剤と併用して投与してもよい。また、従来の治療剤と順次または同時に投与することができ、単一または多重投与することができる。前記の要素をすべて考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
【０１５８】
本発明の組成物の投与量は、患者の体重、年齢、性別、健康状態、食物、投与時間、投与方法、排泄率および疾患の重症度などによってその範囲が非常に多様である。適正な投与量は、例えば、患者の体内に蓄積された薬物の量及び／又は使用される本発明の送達体の具体的な効能程度によって異なり得る。例えば、体重１ｋｇ当たりに０．０１μｇ〜１ｇであってもよい。日、週、月、または年の単位期間に、単位期間当たりの一回または数回に分けて投与してもよく、若しくはインフュージョンポンプを用いて長期間連続して投与してもよい。反復投与の回数は、薬物の体内滞在時間、体内薬物濃度などを考慮して決定する。疾患の治療経過によっては、治療された後でも再発防止のために組成物を投与することができる。
【０１５９】
本発明の組成物は、傷治療に関連して同一または類似の機能を示す有効成分を１種以上、または有効成分の溶解性及び／又は吸収性を維持／増加させる化合物をさらに含有することができる。また必要に応じて、抗炎症剤、抗ウイルス剤、及び／又は免疫調節剤などをさらに含むことができる。
【０１６０】
また、本発明の組成物は、哺乳動物に投与された後、活性成分の迅速、持続または遅延放出を提供できるように、当業界で公知の方法を用いて剤形化することができる。剤形は、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌粉末の形態であってもよい。
【０１６１】
また、本発明は傷治療方法に関するものである。
【０１６２】
本発明の傷治療方法は、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を担持した多孔性シリカ粒子を個体に投与することを含む。
【０１６３】
上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質は、前述した範囲内のものであってもよい。
【０１６４】
多孔性シリカ粒子は、先に例示した範囲内のものであってもよく、先に例示した範囲内の方法／条件などで製造されたものであってもよい。
【０１６５】
個体は、ヒトを含む哺乳類であってもよく、具体的にはヒトであってもよい。
【０１６６】
前記上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質は、組成物の形態で前述した範囲内の方法で剤形化することができる。
【０１６７】
投与方法は、限定されず、例えば、口腔（oral）、直腸（rectal）、鼻腔（nasal）、局所（topical；頬及び舌下を含む）、皮下、膣（vaginal）または非経口（parenteral；筋肉内、皮下及び静脈内を含む）投与、あるいは吸入（inhalation）または注入（insufflation）による投与などの方法であってもよい。
【０１６８】
また、本発明は、上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質を担持した多孔性シリカ粒子の傷治療用の医薬組成物の製造のための用途に関するものである。
【０１６９】
上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質は、前述した範囲内のものであってもよい。
【０１７０】
多孔性シリカ粒子は、先に例示した範囲内のものであってもよく、先に例示した範囲内の方法／条件などで製造されたものであってもよい。
【０１７１】
以下、本発明を具体的に説明するために実施例を挙げて詳細に説明することにする。以下、本発明の多孔性シリカ粒子は、「ＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬまたはＤＤＶ」と略称することがある。
【０１７２】
実験方法 
実施例１．多孔性シリカ粒子（ＤＤＶまたはＤｅｇｒａｄａＢＡＬＬ）
１．多孔性シリカ粒子の製造 
（１）多孔性シリカ粒子の製造 
１）小気孔粒子の製造 
２Ｌ丸底フラスコに蒸留水（ＤＷ）の９６０ｍｌとＭｅＯＨの８１０ｍｌを入れた。前記フラスコにＣＴＡＢを７．８８ｇ入れた後、攪拌しながら１Ｍ ＮａＯＨの４．５２ｍｌを素早く入れた。１０分間攪拌して均一な混合液を得た後、ＴＭＯＳの２．６ｍｌを入れた。６時間攪拌して均一に混合した後、２４時間熟成し、反応液を得た。
【０１７３】
その後、前記反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノール及び蒸留水で交互に５回洗浄した。
【０１７４】
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、１．５ｇの粉末状の小気孔多孔性シリカ粒子（気孔平均直径２ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
【０１７５】
２）気孔の拡張 
１．５ｇの小気孔多孔性シリカ粒子の粉末をエタノール１０ｍｌに添加して超音波分散し、水１０ｍｌ、ＴＭＢ（trimethyl benzene）１０ｍｌを添加して超音波分散し、分散液を得た。 
【０１７６】
その後、前記分散液をオートクレーブに入れて１６０℃、４８時間反応させた。
【０１７７】
反応は２５℃で開始し、１０℃／分の速度で昇温して行った。その後、オートクレーブ内で１〜１０℃／分の速度で徐々に冷却した。
【０１７８】
冷却した反応液を２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
【０１７９】
その後７０℃のオーブンで乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１０〜１５ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
【０１８０】
３）か焼 
前記２）で製造された多孔性シリカ粒子をガラスバイアル（ｖｉａｌ）に入れて５５０℃で５時間加熱し、反応終了後、常温まで徐々に冷却して粒子を製造した。
【０１８１】
（２）多孔性シリカ粒子の製造 
気孔拡張時の反応条件を１４０℃、７２時間に変更した以外は、前記１−１−（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【０１８２】
（３）多孔性シリカ粒子の製造（１０Ｌスケール） 
５倍大きな容器を使用し、各物質をいずれも５倍の容量で使用した以外は、実施例１−１−（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。 
【０１８３】
（４）多孔性シリカ粒子の製造（粒径３００ｎｍ） 
小気孔粒子の製造時に蒸留水９２０ｍｌ、メタノール８５０ｍｌを使用した以外は、１−１−（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【０１８４】
（５）多孔性シリカ粒子の製造（粒径５００ｎｍ） 
小気孔粒子の製造時に蒸留水８００ｍｌ、メタノール１，０１０ｍｌ、ＣＴＡＢ １０．６ｇを使用した以外は、１−１−（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【０１８５】
（６）多孔性シリカ粒子の製造（粒径１，０００ｎｍ） 
小気孔粒子の製造時に蒸留水６２０ｍｌ、メタノール１，３８０ｍｌ、ＣＴＡＢ ７．８８ｇを使用した以外は、１−１−（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【０１８６】
（７）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径４ｎｍ） 
気孔拡張時にＴＭＢを２．５ｍｌ使用した以外は、１−１−（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【０１８７】
（８）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径７ｎｍ） 
気孔拡張時にＴＭＢを４．５ｍｌ使用した以外は、１−１−（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【０１８８】
（９）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径１７ｎｍ） 
気孔拡張時にＴＭＢを１１ｍｌ使用した以外は、１−１−（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【０１８９】
（１０）多孔性シリカ粒子の製造（気孔直径２３ｎｍ） 
気孔拡張時にＴＭＢを１２．５ｍｌ使用した以外は、１−１−（１）の方法と同様にして多孔性シリカ粒子を製造した。
【０１９０】
（１１）多孔性シリカ粒子の製造（二重改質） 
１）小気孔粒子の製造 
実施例１−１−（１）−１）の方法と同様にして小気孔粒子を製造した。
【０１９１】
２）気孔の拡張 
実施例１−１−（１）−２）の方法と同様にして小気孔粒子をＴＭＢと反応させ、冷却し、遠心分離して上澄み液を除去した。その後、実施例１−１−（１）−２）と同じ条件で遠心分離し、エタノール及び蒸留水で交互に３回洗浄した。その後、実施例１−１−（１）−２）と同じ条件で乾燥し、粉末状の多孔性シリカ粒子（気孔直径１０〜１５ｎｍ、粒径２００ｎｍ）を得た。
【０１９２】
３）表面改質 
気孔が拡張された多孔性シリカ粒子０．８ｇ〜１ｇを５０ｍｌのトルエンに分散した後、（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3−aminopropyl）triethoxysilane）を５ｍｌ入れて１２０℃で還流したまま１２時間加熱した。この過程は、前述の洗浄過程および乾燥過程を経た後、１ｍｌのトリエチレングリコール（PEG3，2−[2−（2−methoxyethoxy）ethoxy] acetic acid）と、１００ｍｇのＥＤＣ（1−Ethyl−3−（3−dimethylaminopropyl）carbodiimide）と、２００ｍｇのＮ−ヒドロキシコハク酸イミド（N−Hydroxysuccinimide，ＮＨＳ）を３０ｍｌのＰＢＳに分散して常温で攪拌したまま１２時間反応する。その後、生成物は、前記の洗浄及び乾燥過程を経る。
【０１９３】
気孔内部に、前のステップの反応液が残っているため、気孔内部は改質されない。
【０１９４】
４）気孔内部の洗浄 
表面改質された粒子粉末８００ｍｇを２Ｍ ＨＣｌ／エタノール４０ｍｌに溶かし、１２時間強く撹拌下で還流した。
【０１９５】
その後、冷却された反応液を１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
【０１９６】
その後、７０℃のオーブンで乾燥して粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。
【０１９７】
５）気孔内部の改質 
ｉ）後述する実施例１−２−（２）−１）の方法と同様にして気孔内部にプロピル基を導入した。
ｉｉ）後述する実施例１−２−（２）−２）の方法と同様にして気孔内部にオクチル基を導入した。
【０１９８】
２．多孔性シリカ粒子の表面改質 
（１）陽電荷での帯電 
１）粒径３００ｎｍの粒子 
実施例１−１−（４）の多孔性シリカ粒子を（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3−Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて、陽電荷に帯電させた。
【０１９９】
具体的には、１００ｍＬ丸底フラスコにおいて、１００ｍｇの多孔性シリカ粒子を１０ｍＬのトルエンに洗浄器（bath sonicator）で分散させた。その後、１ｍＬのＡＰＴＥＳを添加し、４００ｒｐｍで攪拌し、１３０℃で攪拌して１２時間反応させた。
【０２００】
反応後、常温まで徐々に冷却し、１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離して上澄み液を除去し、２５℃で１０分間８，０００ｒｐｍで遠心分離し、エタノールおよび蒸留水で交互に５回洗浄した。
【０２０１】
その後、７０℃のオーブンで乾燥し、表面および気孔内部にアミノ基を有する粉末状の多孔性シリカ粒子を得た。
【０２０２】
２）粒径２００ｎｍの粒子 
ｉ）実施例１−１−（１）の多孔性シリカ粒子を（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3−Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、ＡＰＴＥＳを０．４ｍｌ添加し、反応時間を３時間とした以外は、実施例１−２−（１）−１）の方法と同様にして改質した。
ｉｉ）実施例１−１−（９）の多孔性シリカ粒子を（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3−Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、それ以外は、実施例１−２−（１）−１）の方法と同様にして改質した。
ｉｉｉ）実施例１−１−（１０）の多孔性シリカ粒子を（３−アミノプロピル）トリエトキシシラン（（3−Aminopropyl）triethoxysilane，ＡＰＴＥＳ）と反応させて陽電荷に帯電させ、それ以外は、実施例１−２−（１）−１）の方法と同様にして改質した。
【０２０３】
（２）疎水性基の導入 
１）プロピル基 
前記実施例１−１−（１）の多孔性シリカ粒子をトリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）と反応させて、表面および気孔内部にプロピル基を導入し、ＡＰＴＥＳの代わりにトリメトキシ（プロピル）シラン（Trimethoxy（propyl）silane）を０．３５ｍｌ添加し、１２時間反応させた以外は、前記実施例１−２−（１）の方法と同様にして改質した。
【０２０４】
２）オクチル基 
前記実施例１−１−（１）の多孔性シリカ粒子をトリメトキシ−ｎ−オクチルシラン（Trimethoxy−n−octylsilane）と反応させて、表面および気孔内部にプロピル基を導入し、ＡＰＴＥＳの代わりにトリメトキシ−ｎ−オクチルシラン（Trimethoxy−n−octylsilane）を０．５ｍｌ添加し、１２時間反応させた以外は、前記実施例１−２−（１）の方法と同様にして改質した。
【０２０５】
（３）陰電荷での帯電 
１）カルボキシル基 
前記実施例１−１−（１）の多孔性シリカ粒子を無水コハク酸（succinic anhydride）と反応させて陰電荷に帯電させ、トルエンの代わりにＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）を使用し、ＡＰＴＥＳの代わりに８０ｍｇの無水コハク酸（succinic anhydride）を添加して２４時間常温で攪拌し反応させ、洗浄時に蒸留水の代わりにＤＭＳＯを使用した以外は、前記実施例１−２−（１）−１）の方法と同様にして改質した。
【０２０６】
２）チオール基 
ＡＰＴＥＳの代わりにＭＰＴＥＳの１．１ｍＬを使用した以外は、前記実施例１−２−（１）−１）の方法と同様にして改質した。
【０２０７】
３）スルホン酸基 
前記実施例１−２−（３）−２）の多孔性シリカナノ粒子１００ｍｇを、１Ｍ硫酸水溶液１ｍＬと３０％過酸化水素水２０ｍＬに分散して常温で攪拌し、酸化反応を誘導してチオール基をスルホン酸基に酸化した。その後、実施例１−２−（１）−１）の方法と同様にして洗浄および乾燥した。
【０２０８】
４）メチルホスホネート基 
ＡＰＴＥＳの代わりにＴＨＭＰの３ｍｌを、トルエンの代わりに蒸留水の１０ｍｌを使用し、塩酸溶液１．５ｍｌを加えた以外は、前記実施例１−２−（１）−１）の方法と同様にして改質した。 
【０２０９】
３．粒子の形成及び気孔拡張の確認 
実施例１−１−（１）〜（３）の粒子の小気孔粒子、製造された多孔性シリカ粒子を顕微鏡で観察し、小気孔粒子が均一に生成されているか、気孔が十分に拡張されて多孔性シリカ粒子が均一に形成されているかを確認した（図１〜４）。
【０２１０】
図１は、実施例１−１−（１）の多孔性シリカ粒子の写真、図２は、実施例１−１−（２）の多孔性シリカ粒子の写真であり、気孔が十分に拡張された球状の多孔性シリカ粒子が均一に生成されていることを確認することができる。
【０２１１】
図３は、実施例１−１−（１）の小気孔粒子の写真、図４は、実施例１−１−（１）と１−１−（３）の小気孔粒子の比較写真であり、球状の小気孔粒子が均一に生成されたことを確認することができる。
【０２１２】
４．ＢＥＴ表面積及び気孔の体積の算出 
実施例１−１−（１）の小気孔粒子、実施例１−１−（１）、（７）、（８）、（１０）の多孔性シリカ粒子の表面積と気孔体積を算出した。表面積はBrunauer−Eｍｍett−Teller（ＢＥＴ）の方法により算出し、気孔サイズの分布はBarrett−Joyner−Halenda（BJH）方法により算出した。
【０２１３】
前記各粒子の顕微鏡写真を図５に示し、算出結果を下記表１に示す。
【０２１４】
【表１】
2021531321.tif 000003
【０２１５】
５．生分解性の確認 
実施例１−１−（１）の多孔性シリカ粒子の生分解性を確認するために、３７℃、ＳＢＦ（ｐＨ７．４）における生分解の程度を０時間、１２０時間、３６０時間に顕微鏡で観察し、それを図６に示す。
【０２１６】
これを参照すると、多孔性シリカ粒子が生分解され、３６０時間経過後はほぼすべてが分解されたことを確認することができる。
【０２１７】
６．吸光度比の測定
時間別に下記数式１による吸光度比を測定した。
【０２１８】
[数式１] 
Ａｔ／Ａ０
（式中、Ａ０は、前記多孔性シリカ粒子１ｍｇ／ｍｌの懸濁液５ｍｌを直径５０ｋＤａの気孔を有する円筒状の透過膜に入れて測定した多孔性シリカ粒子の吸光度であり、
前記透過膜の外部には、前記透過膜と接し、前記懸濁液と同じ溶媒１５ｍｌが位置し、前記透過膜の内外部は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌され、
Ａｔは、前記Ａ０の測定時からｔ時間経過後に測定した多孔性シリカ粒子の吸光度である。） 
【０２１９】
具体的には、多孔性シリカ粒子粉末５ｍｇをＳＢＦ（ｐＨ７．４）５ｍｌに溶かした。その後、５ｍｌの多孔性シリカ粒子溶液を、図７に示す直径５０ｋＤａの気孔を有する透過膜に入れた。外部膜に１５ｍｌのＳＢＦを添加し、外部膜のＳＢＦは１２時間ごとに入れ替えた。多孔性シリカ粒子の分解は、３７℃で６０ｒｐｍで水平攪拌して行った。
【０２２０】
その後、紫外・可視分光法（UV−vis spectroscopy）によって吸光度を測定し、λ＝６４０ｎｍで分析した。
【０２２１】
（１）吸光度比の測定 
実施例１−１−（１）の多孔性シリカ粒子の吸光度比を前記方法に従って測定し、その結果を図８に示す。
これを参照すると、吸光度比が１／２となるｔは約５８時間であり、非常にゆっくりと分解されることが確認できた。
【０２２２】
（２）粒径別 
実施例１−１−（１）、（５）、（６）の多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定し、その結果を図９に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、粒径の増加によってｔが減少することが分かる。
【０２２３】
（３）気孔の平均直径別 
実施例１−１−（１）、（９）の多孔性シリカ粒子、そしてコントロールとして実施例１−１−（１）の小気孔多孔性シリカ粒子の吸光度を前記数式１により測定し、その結果を図１０に示す（懸濁液と溶媒としては、ＳＢＦを使用した。）。
これを参照すると、実施例の多孔性シリカ粒子は、コントロールに比べてｔが非常に大きいことが確認できる。
【０２２４】
（４）ｐＨ別 
実施例１−１−（４）の多孔性シリカ粒子のｐＨ別吸光度を測定した。吸光度は、ＳＢＦで、そしてｐＨ２、５及び７．４のＴｒｉｓで測定し、その結果を図１１に示す。
これを参照すると、ｐＨ別にｔの差はあるが、いずれも吸光度の比が１／２となるｔは２４以上であった。
【０２２５】
（５）帯電 
実施例１−２−（１）−１）の多孔性シリカ粒子の吸光度を測定し、その結果を図１２に示す（懸濁液と溶媒としては、トリス（Ｔｒｉｓ，ｐＨ７．４）を使用した。）。
これを参照すると、陽電荷に帯電した粒子も吸光度の比が１／２となるｔは２４以上であった。
【０２２６】
７．上皮または内皮細胞成長促進能を有するポリペプチド；若しくはその活性または発現を増加させる物質の担持
（１）ラクトフェリンタンパク質としては、配列番号１の配列からなるタンパク質を用いた。粒子としては、表面にメチルホスホネート基が導入された実施例１−２−（３）−４）の粒子を使用した。
【０２２７】
１ｘＰＢＳの２００μＬ中に前記多孔性シリカ粒子の粉末４０μｇと前記タンパク質４μｇを混合した後、室温で１時間インキュベートした。後述するラクトフェリンタンパク質の担持には、前記と同じ粒子を使用した。
【０２２８】
（２）プラスミドＤＮＡは、ｐＣＭＶベクターからプロモーター部分を増幅し、ＫａｎａＲ２−ＣｏｌＥ１−ＣＭＶプロモーター部分を準備した。ＬＴＦを暗号化する部分はｈｕｍａｎ ｃｄｎａ ｌｉｂｒａｒｙから、ＰＣＲにより増幅して約３ｋｂ程度の長さのＬＴＦ ＯＲＦを準備した（ｐＬＥＭ−ｈＬＴＦ−１０１、配列番号２）。
【０２２９】
粒子としては、表面および気孔内部にアミノ基が導入された実施例１−２−（１）−１）の粒子を使用した。
【０２３０】
前記多孔性シリカ粒子１０μｇと０．２５μｇの前記ＬＴＦ ＯＲＦを１ｘＰＢＳの条件で混合した後、常温で３０分間置いて積載した。後述するラクトフェリンプラスミドの担持には、前記と同じ粒子を使用した。
【０２３１】
実施例２．傷治療効果の確認
（１）ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現量の評価 
１）ラクトフェリンタンパク質の使用 
Ｃ２Ｃ１２細胞を１２−ウェルプレートに５．０×１０４細胞だけシード（seeding）した後、２４時間培養した。その後、無血清（Serum−free）培地で１２時間ｐｒｅ−ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ処理を行った。０．１％ＦＢＳ含有培地に入れ替えた後、２００μｇ／ｍｌのＬＴＦタンパク質を細胞に処理した。時間に応じて（０、１、２、３、６、１２、２４、４８時間）細胞をトリゾール（trizol）処理してｍＲＮＡを抽出し、ＰＣＲによりＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現量を確認した。
【０２３２】
２）ラクトフェリンプラスミドを担持した粒子の使用 
Ｃ２Ｃ１２細胞を１２−ウェルプレートに５．０×１０４細胞だけシード（seeding）した後、２４時間培養した。その後、無血清（Serum−free）培地で１２時間ｐｒｅ−ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ処理を行った。ＬＴＦプラスミドＤＮＡの１μｇをＤＤＶ２０μｇに担持したＬＴＦ ｐＤＮＡ＠ＤＤＶ複合体を無血清（Serum−free）条件で細胞に４時間処理した。
【０２３３】
その後、１ｘＰＢＳで細胞を２回洗浄し、培地を０．１％ＦＢＳ含有培地に入れ替えた後、時間順に（０、４、８、１２、２４、４８時間）細胞をトリゾール（trizol）処理してｍＲＮＡを抽出し、ＰＣＲによりＬＴＦ、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現量を確認した。
【０２３４】
その結果、Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＬＴＦ（ｒＬＴＦ、ラクトフェリンタンパク質）をＣ２Ｃ１２細胞株に処理したときは、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現量が６時間後に高いレベルで発現誘導されたが、その後に徐々に減少する様相を見せた。
【０２３５】
しかし、ＤＤＶに担持したＬＴＦ ｐｌａｓｍｉｄ ＤＮＡ（ｐＬＴＦ）をＣ２Ｃ１２細胞株に形質感染したときは、ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの発現量が４時間後から増加する様相を見せ、４８時間後も継続して高いレベルで発現誘導される様相を見せた（図１３）。
【０２３６】
（２）細胞増殖誘導の評価 
ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を１２−ウェルプレートに５．０×１０４細胞だけシード（seeding）した後、２４時間培養した。ＬＴＦ ｐＤＮＡ １．０μｇをＤＤＶ ２０．０μｇに担持してＬＴＦ ｐＤＮＡ＠ＤＤＶ複合体を作成した後、無血清（Serum−free）条件で細胞に４時間処理した（ｍｏｃｋは、ＬＴＦ ｐＤＮＡ １．０μｇのみを細胞に処理した。）。その後、１ｘＰＢＳで細胞を１回洗浄し、培地を１％ＦＢＳ含有培地に入れ替えた後、４８時間培養した。４８時間後、ＨＥＫ−２９４Ｔ細胞を培養していた培地を回収した。
【０２３７】
ＨＴ−１０８０細胞を９６−ウェルプレートに２．０×１０３細胞だけシード（seeding）した後、２４時間培養した。その後、無血清（Serum−free）培地で１２時間ｐｒｅ−ｓｔａｒｖａｔｉｏｎ処理を行った。細胞をそれぞれ無血清（Serum−free）培地、１０％ＦＢＳ培地、１％ＦＢＳ培地＋Ｍｏｃｋ ＨＥＫ−２９４Ｔ細胞から回収した培地、１％ＦＢＳ培地＋５０％ＬＴＦ ｐＤＮＡ ＤＤＶを処理したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から回収した培地、２５％ＬＴＦ ｐＤＮＡ ＤＤＶを処理したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞から回収した培地を処理する。
【０２３８】
それぞれ２４、４８、７２、９６時間経過した後の細胞の増殖率を、１０％ＣＣＫ−８溶液を細胞に処理し、１時間インキュベートした後、４５０ｎｍの波長での吸光により比較する。
【０２３９】
その結果、１％ＦＢＳが添加された培養でＨＴ−１０８０細胞株は増殖率が非常に低かったが、条件培地（conditioned medium）を添加したＨＴ−１０８０細胞株は、１０％ＦＢＳを添加した培養液の条件と類似した形で細胞増殖が誘導された（図１４）。
【０２４０】
図１４のバーグラフは、左から順に２４、４８、７２、９６時間を示す。
【０２４１】
（３）細胞増殖の誘導および血管形成誘導の評価 
（１）ＨＴ−１０８０細胞 
ＤＤＶに担持したラクトフェリンタンパク質をＨＴ−１０８０細胞に処理し、細胞の増殖程度を確認した。 
【０２４２】
ＨＴ−１０８０細胞を９６−ウェルプレートに３．０×１０３細胞だけシード（seeding）した後、２４時間培養した。細胞を１ｘＰＢＳで１回洗浄した後、それぞれＦＢＳ−ｆｒｅｅ培地、１０％ＦＢＳ培地、１％ＦＢＳ＋ラクトフェリンタンパク質を担持したＤＤＶ（０、１２．５、２５、５０、１００、２００、４００μｇ／ｍｌ）、 ＦＢＳ−ｆｒｅｅ培地＋ラクトフェリンタンパク質を担持したＤＤＶ（０、１２．５、２５、５０、１００、２００、４００μｇ／ｍｌ）をそれぞれ細胞に処理し、４８時間培養した。４８時間後、１ｘＰＢＳで細胞を１回洗浄した後、１０％ＣＣＫ−８溶液を処理し、１時間培養した。その後、４５０ｎｍの波長での吸光を確認し、細胞の増殖程度を確認した。
【０２４３】
（２）ＰＡＭ−２１２細胞 
ＤＤＶに担持したＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＬＴＦ ｐｒｏｔｅｉｎをＰＡＭ−２１２細胞に処理し、細胞の増殖程度を確認した。 
【０２４４】
ＰＡＭ−２１２細胞を９６−ウェルプレートに２．０×１０３細胞だけシード（seeding）した後、２４時間培養した。細胞を１ｘＰＢＳで１回洗浄した後、それぞれＦＢＳ−ｆｒｅｅ培地、１０％ＦＢＳ、１％ＦＢＳ＋ラクトフェリンタンパク質（１００μｇ／ｍｌ）、１％ＦＢＳ＋ラクトフェリンタンパク質を担持したＤＤＶ（１００μｇ／ｍｌ）、１％ＦＢＳを細胞に処理した。それぞれ４８、９６時間に１ｘＰＢＳで細胞を１回洗浄し、１０％ＣＣＫ−８溶液を細胞に処理した後、１時間培養した。そして、４５０ｎｍの波長での吸光を確認し、細胞の増殖程度を確認した。
【０２４５】
（３）ＨＵＶＥＣ細胞 
ＤＤＶに担持したＶＥＧＦタンパク質、ラクトフェリンタンパク質をＨＵＶＥＣ細胞に処理し、細胞が血管形態に誘導される効果を確認した。 
【０２４６】
ＨＵＶＥＣ細胞を９６−ウェルプレートに１．５×１０４細胞だけシードした後、ビヒクル（vechicle）、ＶＥＦＧタンパク質を担持したＤＤＶ（４０ｎｇ／ｍｌ、ラクトフェリンタンパク質を担持した粒子と同じ粒子）、ラクトフェリンタンパク質を担持したＤＤＶ（２０μｇ／ｍｌ）をそれぞれ細胞に処理し、４時間培養した。４時間後、細胞が血管形態のような網目構造に誘導された程度を顕微鏡で確認した。
【０２４７】
その結果、ラクトフェリンタンパク質をＤＤＶに担持して送達したとき、細胞増殖効果が優れていることを確認することができる（図１５）。
【０２４８】
（４）創傷治癒効果の確認
１）創傷治癒の動物モデルの製造 
実験動物（ネズミ目、Ｃ５７ＢＬ／６）の背中を除毛し、生体検査用パンチ（直径５ ｍｍ）で創傷を誘発した。
【０２４９】
その後、創傷周辺の皮膚に準備した組成物（５０μｌ）を注射し、観察と管理のために傷周辺に円形のシリコンカバー（外径：３０ｍｍ、内径：５ｍｍ）を覆って外科手術用糸で縫合した。創傷部の感染を防止するために、テガダームフィルムを創傷部に貼り付け、創傷部を圧迫包帯で包んだ。
【０２５０】
２）効果の確認 
ｉ）創傷を誘導した実験動物に１ｘＰＢＳ、ラクトフェリンタンパク質を担持したＤＤＶ（５００μｇ）、ＬＴＦ ｐＤＮＡ（２５μｇ）、ＤＤＶ（５００μｇ）、ＬＴＦ ｐＤＮＡを担持したＤＤＶ（２５μｇ）を創傷周辺の皮膚に注射した。傷は２日に一回ずつ観察し、傷の修復程度を確認した。
【０２５１】
ラクトフェリンを担持したＤＤＶの場合には創傷治癒効果が増加した。中でも、ｐＬＴＦを担持したＤＤＶの創傷治癒効果が最も優れていた（図１６）。
【０２５２】
ｉｉ）創傷を誘導した実験動物に１ｘＰＢＳ、ラクトフェリンタンパク質を担持したＤＤＶ（５００μｇ）、ＬＴＦ ｐＤＮＡ（２５μｇ）、ＤＤＶ（５００μｇ）、ＬＴＦ ｐＤＮＡを担持したＤＤＶ（２５μｇ）、ＥＧＦ ｐＤＮＡを担持したＤＤＶ（２５μｇ）、ＨＧＦ ｐＤＮＡを担持したＤＤＶ（２５μｇ）を創傷周辺の皮膚に注射した。傷は２日に一回ずつ観察し、傷の修復程度を確認した。傷の修復程度を画像解析プログラム（Image J）を用いて、（撮影当日の創傷のサイズ／初期の創傷のサイズ）×１００（％）により創傷の回復程度を比較した。
【０２５３】
ラクトフェリンを担持したＤＤＶの場合には創傷治癒効果が増加した。中でも、ｐＬＴＦを担持したＤＤＶの創傷治癒効果が最も優れていた（図１７）。
【０２５４】
ｉｉｉ）創傷を誘導した実験動物に１ｘＰＢＳ、ラクトフェリンタンパク質を担持したＤＤＶ（１ｍｇ）を創傷周辺の皮膚に注射した。傷は２日に一回ずつ観察し、傷の修復程度を確認した。傷の修復程度を画像解析プログラム（Image J）を用いて、（撮影当日の創傷のサイズ／初期の創傷のサイズ）×１００（％）により創傷の回復程度を比較した。
【０２５５】
ラクトフェリンを担持したＤＤＶの場合には、創傷治癒効果が増加した（図１８）。
【０２５６】
ｉｖ）組織病理学的な検査
ラクトフェリンタンパク質、ラクトフェリンｐＤＮＡを担持したＤＤＶを創傷治癒の動物モデルの患部周辺に皮内注射し、１４日後に創傷の組織病理結果から創傷治療効果の増大を確認した。
【０２５７】
実験を行った動物を安楽死した後、創傷部の皮膚を回収し、４％ＰＦＡで組織を固定した。組織をｆｒｏｚｅｎ ｂｌｏｃｋにし、７ｍｍの厚さに切片して染色を行った後、ガラススライドに乗せて顕微鏡で観察した。
【０２５８】
その結果、ラクトフェリンタンパク質またはｐＤＮＡを担持したＤＤＶの場合に創傷治癒効果が増加し、特に、ｐＤＮＡを担持したＤＤＶの効果が優れていた（図１９）。
【図１】
2021531321.tif 000004
【図２】
2021531321.tif 000005
【図３】
2021531321.tif 000006
【図４】
2021531321.tif 000007
【図５】
2021531321.tif 000008
【図６】
2021531321.tif 000009
【図７】
2021531321.tif 000010
【図８】
2021531321.tif 000011
【図９】
2021531321.tif 000012
【図１０】
2021531321.tif 000013
【図１１】
2021531321.tif 000014
【図１２】
2021531321.tif 000015
【図１３】
2021531321.tif 000016
【図１４】
2021531321.tif 000017
【図１５】
2021531321.tif 000018
【図１６】
2021531321.tif 000019
【図１７】
2021531321.tif 000020
【図１８】
2021531321.tif 000021
【図１９】
2021531321.tif 000022
【配列表】
2021531321000001.app
【国際調査報告】
2021531321.tif 000023
2021531321.tif 000024
2021531321.tif 000025
2021531321.tif 000026