(57)【要約】  本発明は、破傷風毒素に対する完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体を記載する。本発明は、破傷風毒素に対する完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体を、ヒト天然抗体を同定し、開発するために特殊化された体系的なハイスループットプラットフォームを介して開発した。本発明に記載される中和モノクロナル抗体は、破傷風菌感染の予防、治療及び試験に用いることができる。本発明で開発された完全ヒト中和モノクロナル抗体は、破傷風毒素に対して高い親和性を有し、ならびに毒素に対して高い中和活性を有し、高い疾病予防効果を有する安全な使用を有し、外因性ウイルス汚染がなく、強力な産業的応用を有する種々のヒトグループに広く適用可能である。
2021508495.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
破傷風毒素に対する完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片であって、ここで、中和モノクロナル抗体は、３つのＣＤＲを有する少なくとも重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び３つのＣＤＲを有する少なくとも軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み：
ここで、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３は、配列番号１、２、３、９、１０、１１、１９、２０、２１、２７、２８、若しくは２９のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むか、又はその１つ以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するか、又はその８０％以上の配列ホモログを有し、及び同一又は類似した機能性を有するアミノ酸配列を含み；ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３は、配列番号４、５、６、１３、１４、１５、２３、２４、２５、３０、３１、若しくは３２のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むか、又はその１つ以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するか、又はその８０％以上の配列ホモログを有し、及び同一又は類似した機能性を有するアミノ酸配列を含み；
好ましくは、
ここで、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含み；ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含み；
ここで、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１に記載されるアミノ酸配列を含み；ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５に記載されるアミノ酸配列を含み；
ここで、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載されるアミノ酸配列を含み；ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含み；
ここで、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含み；ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含む、上記中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
ＶＨが、配列番号７、配列番号１７、配列番号２２、もしくは配列番号３３のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むか、又はその１つ以上のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を有するか、又はその８０％以上の配列ホモログを有し、及び同一又は類似した機能性を有するアミノ酸配列を含み；ならびにＶＬが、配列番号８、配列番号１８、配列番号２６、もしくは配列番号３４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むか、又はその１つ以上のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を有するか、又はその８０％以上の配列ホモログを有し、及び同一又は類似した機能性を有するアミノ酸配列を含み；
好ましくは、
ここで、ＶＨが、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含み；
ここで、ＶＨが、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列を含み；
ここで、ＶＨが、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含み；
ここで、ＶＨが、配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含み、ＶＬが、配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片が、破傷風毒素と免疫特異的に結合し、中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片が、１０−６Ｍよりも高い平衡解離定数で破傷風毒素又は破傷風菌（Clostridium tetani）から解離しない、請求項１又は２に記載の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
請求項１、２又は３に記載の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片をコードするヌクレオチド配列。
【請求項５】
請求項４に記載の配列を含む、組換え発現ベクター。
【請求項６】
宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションを介して、前記細胞が請求項５に記載の発現ベクターを含む組換え細胞。
【請求項７】
化学的又は生物学的標識に共有結合した、請求項１、２又は３に記載の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片を含む組成物であって、好ましくは、前記化学的標識は、同位体標識、免疫毒素標識、又は化学的薬物標識を含み、前記生物学的標識は、ビオチン標識、アビジン標識、酵素標識、蛍光標識、又は電子移動剤標識を含む、上記組成物。
【請求項８】
固形培地又は半固形培地にカップリングされた、請求項１、２又は３に記載の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片、及び／又は請求項７に記載の組成物を含むコンジュゲート。
【請求項９】
請求項１、２もしく３に記載の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片、及び／又は請求項７に記載の組成物、及び／又は請求項８に記載のコンジュゲートを含む組み合わせ組成物。
【請求項１０】
請求項１、２もしく３に記載の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片、及び／又は請求項７に記載の組成物、及び／又は請求項８に記載のコンジュゲート、及び／又は請求項９に記載の組み合わせ組成物を含む、試験製品。
【請求項１１】
請求項１、２又は３に記載の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片を使用する方法であって、
（１）試料中の破傷風毒素若しくは破傷風菌の存在又はレベルを測定するために；
（２）対象が破傷風毒素又は破傷風菌に感染しているかどうかを検出するために；又は
（３）破傷風毒素の毒性を中和するために使用する方法。
【請求項１２】
（１）請求項１、２又は３に記載の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片、及び／又は請求項７に記載の組成物、及び／又は請求項８に記載のコンジュゲート、及び／又は請求項９に記載の組み合わせ組成物を用いて破傷風毒素又は破傷風菌感染の試験製品を製造するための使用；
（２）請求項１、２又は３に記載の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片、及び／又は請求項７に記載の組成物、及び／又は請求項８に記載のコンジュゲート、及び／又は請求項９に記載の組み合わせ組成物を用いて破傷風毒素又は破傷風菌感染により誘発される疾患の予防薬又は治療薬を製造するための使用；あるいは
（３）請求項４に記載のヌクレオチド分子、請求項５に記載の組換え発現ベクター、又は請求項６に記載の組換え細胞を用いて、破傷風毒素又は破傷風菌感染により誘発される疾患の予防薬又は治療薬を製造するための使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、以下の中国特許出願の優先日を請求する：２０１７年１２月２９日に出願された「破傷風毒素に対する完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体及びその応用」と題さする中国特許出願第２０１１７１８６７３２６号；２０１７年１２月２９日に出願された「破傷風毒素に対する中和抗体の調製及びその応用」と題する中国特許出願第２０１７１１４８６６９３Ｘ号；２０１７年１２月２９日に出願された「破傷風毒素に対する完全天然型ヒト中和抗体」と題する中国特許出願第２０１７１１４８２９７９６号；及び２０１８年５月４日に出願された「破傷風毒素に対する中和抗体及びその応用」と題する中国特許出願第２０１８１０４２０７３０．５号。上記の中国特許出願はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
技術分野
本発明は、細胞免疫学及び遺伝子工学の分野に属し、破傷風毒素に対する完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００３】
破傷風は、創傷から体内に侵入し、嫌気的環境下で再生した後に破傷風菌（Clostridium tetani）が産生する神経毒によって引き起こされる筋攣縮を特徴とする急性疾患である。重篤な患者は、喉頭痙攣又は重度の二次肺感染により死亡することがある。新生児及び重篤な患者では、死亡率は２０〜５０％にも達する場合がある。世界では破傷風による死亡者は毎年約１００万人に上り、そのほとんどが未開発の国や地域で発生している。臨床的破傷風は、局所性破傷風、頭部破傷風、全身性破傷風、新生児破傷風の４種類に分類される。
【０００４】
破傷風菌は偏性嫌気性菌であり、芽胞は非常に硬く、喫水、熱、消毒剤に耐性であるが、ヨウ素溶液又は中性グルタールアルデヒド溶液に感受性であり、これらの試薬により短期間で死滅させることができる。破傷風菌は、溶血を引き起こす破傷風溶血毒素と、よく知られている破傷風毒素である破傷風痙攣毒素の２種類の外毒素を産生する。
【０００５】
破傷風毒素は破傷風菌によって産生、分泌されるタンパク質であり、１３１５個のアミノ酸からなり、分子量は１５０，７００Ｄａである。破傷風毒素の推定致死量は約０．２５ｎｇ／ｋｇである。破傷風毒素は、細菌細胞内の単鎖タンパク質として発現され、次に、タンパク質酵素によって軽鎖及び重鎖に切断され、ジスルフィド結合によって連結される。インビボでの機能によれば、破傷風毒素分子はＡ、Ｂ、Ｃの３つの領域に分けられる。すなわち、軽鎖断片はＡ断片、重鎖のＮ末端半分はＢ断片、重鎖の残り半分はＣ断片である。
【０００６】
一般的に、破傷風毒素のメカニズムは、結合、輸送、作用の３段階である。破傷風毒素のＣ断片は、一般にガングリオシドと考えられている毒素受容体に結合できることが研究によって示されている。Ｃ断片は、中枢神経系への逆行性軸索輸送の機能を有し、ワクチンの開発に使用されている。Ｂ断片は人工リン脂質二重層を介してイオンチャネルをつくり、毒素の活性断片を細胞内に輸送する。断片Ａは、タンパク質分解活性を有するＺｎプロテアーゼであり、膜タンパク質を分解することができ、神経伝達物質のタンパク質−小胞輸送に関連する。これにより神経伝達物質の放出が抑制され、興奮性インパルスが持続的に伝達され、激しい痙性麻痺の症状が現れる。しかしながら、破傷風毒素からのＣ断片の直接分離及び精製には多くの欠点がある：破傷風毒素の高い毒性、胞子による伝播の可能性、培養及び分離の複雑なプロセス、低い回収率及びある程度のリスク。
【０００７】
当初、破傷風毒素は免疫試薬として破傷風の予防・治療に使用されていたが、高感作など一部の副作用が認められた。２０世紀の６０年代に、ヨーロッパとアメリカの先進国はヒト破傷風免疫グロブリン（ＨＴＩＧ）を開発した。中国におけるＨＴＩＧの生産は８０年代に始まり、現在のＨＴＩＧの生産は市場からの要求に応えられず、主に馬血清からのＴＡＴが市場シェアの大部分を占めている。ヒト化ＨＴＩＧは、馬血清ＴＡＴの臨床使用に起因する感作反応などの副作用を克服し、破傷風の予防と治療を有意に改善した。しかしながあら、ヒトの血液は、コストが高く、外因性ウイルス汚染のリスクもある稀少な供給源であり、ＨＴＩＧの工業的生産及び臨床使用は、ほとんど制限されている。
【０００８】
現在、遺伝子組換え及びヒト化破傷風毒素を産生するためにマウスモノクロナル抗体を形質転換する報告があるが、これらはまだ実験段階にある。近年、遺伝子工学技術の急速な発展に伴い、遺伝子工学技術を用いてヒト化抗体を作製することが可能となっている。遺伝子工学を介して産生されたヒト化ヒト抗体は、異種血清によって引き起こされる感作反応を減少又は排除することができる。また、ヒト免疫グロブリン産生のためのヒト血液源が不十分であること、又はウイルス汚染の可能性の問題を解決することもできる。これが現在の研究の焦点となっている。
【発明の概要】
【０００９】
発明の説明
現在の技術の不足を改善するために、本発明の主な目的は、免疫原性又は外因性ウイルス汚染なしに、高親和性、高特異性及び高効率で、破傷風毒素及びその抗原結合断片に対する完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体を提供することであり、また、抗体、抗体の産生のための細胞系、ならびに診断、予防又は治療のための抗体の使用方法及び用途のコード化配列を提供することである。
【００１０】
一態様では、本発明は、破傷風毒素に対する完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片を提供し、ここで、中和モノクロナル抗体は、３つのＣＤＲを有する少なくとも重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、及び３つのＣＤＲを有する少なくとも軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み：
ここで、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３は、配列番号１、２、３、９、１０、１１、１９、２０、２１、２７、２８、若しくは２９のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むか、又はその１つ以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するか、又はその８０％以上の配列ホモログを有し、及び同一又は類似した機能性を有するアミノ酸配列を含み；ならびにＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２又はＣＤＲ３は、配列番号４、５、６、１３、１４、１５、２３、２４、２５、３０、３１、若しくは３２のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むか、又はその１つ以上のアミノ酸の置換、欠失もしくは挿入を有するか、又はその８０％以上の配列ホモログを有し、及び同一又は類似した機能性を有するアミノ酸配列を含み；
好ましくは、ここで、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１、配列番号２、及び配列番号３に記載されるアミノ酸配列を含み；ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号４、配列番号５、及び配列番号６に記載されるアミノ酸配列を含み；
ここで、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号９、配列番号１０、及び配列番号１１に記載されるアミノ酸配列を含み；ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、配列番号１３、配列番号１４、及び配列番号１５に記載されるアミノ酸配列を含む。ならびに、中和モノクロナル抗体のＶＨ構造ドメインは配列番号１２に示すアミノ酸配列を含み、中和モノクロナル抗体のＶＬ構造ドメインは配列番号１６に示すアミノ酸配列を含み；
ここで、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号１９、配列番号２０、及び配列番号２１に記載されるアミノ酸配列を含み；ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２３、配列番号２４、及び配列番号２５に記載されるアミノ酸配列を含み；
ここで、ＶＨのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号２７、配列番号２８、及び配列番号２９に示されるアミノ酸配列を含み；ＶＬのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、それぞれ、配列番号３０、配列番号３１、及び配列番号３２に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
さらに、中和モノクロナル抗体のＶＨ構造ドメインは、配列番号７、配列番号１７、配列番号２２、もしくは配列番号３３のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むか、又はその１つ以上のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を有するか、又はその８０％以上の配列ホモログを有し、及び同一又は類似した機能性を有するアミノ酸配列を含み；ならびに中和モノクロナル抗体のＶＬ構造ドメインは、配列番号８、配列番号１８、配列番号２６、もしくは配列番号３４のいずれか１つに記載されるアミノ酸配列を含むか、又はその１つ以上のアミノ酸の置換、欠失若しくは挿入を有するか、又はその８０％以上の配列ホモログを有し、及び同一又は類似した機能性を有するアミノ酸配列を含み；
好ましくは、
中和モノクロナル抗体のＶＨ構造ドメインは、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含み、中和モノクロナル抗体のＶＬ構造ドメインは、配列番号８に記載されるアミノ酸配列を含み；
ならびに、中和モノクロナル抗体のＶＨ構造ドメインは、配列番号１７に記載されるアミノ酸配列を含み、中和モノクロナル抗体のＶＬ構造ドメインは、配列番号１８に記載されるアミノ酸配列を含み；
ならびに、中和モノクロナル抗体のＶＨ構造ドメインは、配列番号２２に記載されるアミノ酸配列を含み、中和モノクロナル抗体のＶＬ構造ドメインは、配列番号２６に記載されるアミノ酸配列を含み；
ならびに、中和モノクロナル抗体のＶＨ構造ドメインは、配列番号３３に記載されるアミノ酸配列を含み、中和モノクロナル抗体のＶＬ構造ドメインは、配列番号３４に記載されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
さらに、本発明の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片は、破傷風毒素と免疫特異的に結合し、中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片は、１０−６Ｍよりも高い平衡解離定数で破傷風毒素又は破傷風クロストリジウムから解離しない。
【００１３】
好ましくは、本発明の中和モノクロナル抗体の重鎖型は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇ４、より好ましくはＩｇＧ１である。
【００１４】
好ましくは、本発明の中和モノクロナル抗体の軽鎖型はｋ又はｌである。
【００１５】
本発明の中和モノクロナル抗体は、可変領域のみならず定常領域も含む。
【００１６】
好ましくは、本発明の中和モノクロナル抗体の定常領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４のいずれかからのものである。
【００１７】
本発明の抗破傷風毒素抗体又はその抗原結合断片は、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄｓＦｖ、ｄｉａｂｏｄｙ、Ｆｄ又はＦｄ’断片を含む（これらに限定されない）ヒト化抗体が好ましい。
【００１８】
本発明の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片はまた、ペプチドアダプターを含み、好ましくは、ペプチドアダプターは約１〜５０個のアミノ酸を含む。
【００１９】
別の態様では、本発明は、コンジュゲート、及び本発明の上述の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片からなるコンジュゲート、ならびに本発明の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片）にコンジュゲートされた標識（例えば、試験可能な部分及び試薬を提供する。標識は、本発明の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片に共有結合的又は非共有結合的に直接コンジュゲートされる。また、標識は、１以上のアダプターを介して、本発明の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片に結合され得る。本発明の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片に標識を接合するための技術は、この分野の技術者に周知である。標識の試験可能な部分及び／又は試薬は、遊離酵素、補欠分子族、蛍光物質、生物発光物質、放射性物質、陽電子放出物質、及び非放射性常磁性金属イオンを含む。
【００２０】
別の態様において、本発明は、上述の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片、及び上述の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片に共有結合的に連結された化学的又は生物学的標識を含む組成物を提供する。
【００２１】
好ましくは、前記化学的標識は、同位体標識、免疫毒素標識、又は化学的薬物標識を含み、前記生物学的標識は、ビオチン標識、アビジン標識、酵素標識、蛍光標識、又は電子移動剤標識を含む。
【００２２】
別の態様において、本発明は、上述の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片、及び／又は上述のコンジュゲート、及び／又は固形若しくは半固形培地にカップリングされた上述の組成物を含む、コンジュゲートを提供する。
【００２３】
固形又は半固形培地の例には、酵素被覆プレート（ＥＬＩＳＡプレート）、磁性又は非磁性免疫球又は免疫顆粒、及び細胞分散剤が含まれる。細胞分散剤の例には、ポリ−ビニル−ピロリドン被覆コロイド状二酸化ケイ素、多糖類及びアミドトリゾ酸ナトリウム又はその誘導体が含まれる。
【００２４】
別の態様において、本発明は、上述の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片、及び／又は上述のコンジュゲート、及び／又は上述の組成物、及び／又は上述のコンジュゲートを含む組成物の組み合わせを提供する。
【００２５】
組成物の組み合わせは、組成物の薬物組み合わせ及び組成物の診断的組み合わせを含む。
【００２６】
組成物の上述の薬物組み合わせはまた、許容可能な薬学的アジュバントを含む。許容される薬学的アジュバントは、身体に対する有意な刺激性がほとんどなく、薬学的化合物の生物学的活性を排除する効果がないアジュバント又は希釈剤である。例としては、生理食塩水、滅菌水、リンゲル液、緩衝生理食塩水、グルコース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセリン、エタノール、又はそれらの２つ以上の混合物が挙げられる。必要に応じて、本発明に記載される組成物の薬物組み合わせは、酸化防止剤、緩衝剤、静菌剤、分散剤、界面活性剤、接着剤及び潤滑剤のような他の通常使用される添加剤を含んでもよい。また、溶液、懸濁液又はエマルジョン、丸剤、カプセル剤、顆粒剤又は錠剤のような注射用製剤のような異なる投与形態にすることもできる。
【００２７】
組成物の薬物組み合わせは、無菌であり、製造又は貯蔵において安定でなければならない。注射可能な溶液のための無菌粉末を製造する場合、好ましい方法は、真空乾燥又は凍結乾燥である。真空乾燥又は凍結乾燥は、薬学的化合物の活性を維持しながら、滅菌された濾過された溶液を粉末に変えることができる。場合により、薬学的に許容される賦形剤を、本発明の組成物の薬物組み合わせの溶液中に添加して、注射可能な単位投与形態を生成することができる。好ましくは、本発明において使用される薬学的に許容される賦形剤は、高薬物濃度に適しており、十分な流動性を維持することができ、必要であれば、薬物吸収を遅延させることができる。
【００２８】
いくつかの因子は、組成物の薬物組み合わせの活性成分の物理的及び化学的特性、症状の重篤度及び切迫性、ならびに活性成分の血中濃度と予想される薬物効果との関係を含む、最適な投与経路の選択に影響を与える。例えば、アジュバントは、本発明の中和モノクロナル抗体の調製中に添加され得、これは、抗体を迅速放出（放出制御アジュバントなど）から保護し得る。このようなアジュバントは、インプラント、パッチ、又はマイクロカプセルを含み得る。生分解性で生体適合性のポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリエステル又はポリラクチドを本発明で使用することができる。さらに、中和モノクロナル抗体は、生物活性の喪失から抗体を保護することができる化合物又は材料と混合することができ、又はそのような化合物又は材料と共に投与することができる。例えば、中和モノクロナル抗体は、リポソーム又は希釈剤のような適切なアジュバントと共に投与することができる。
【００２９】
本発明の組成物の薬物組み合わせの投与経路は、経口又は非経口投与であってもよい。好ましい経路は、静脈内注射であるが、これに限定されない。
【００３０】
経口投与形態は、錠剤、ロゼンジ、糖トローチ、水ベース又は油ベースの懸濁液、パワー、顆粒、エマルジョン、硬カプセル、軟カプセル、シロップ、丸剤、糖衣錠、液体、ゲル、又は軟膏であり得る。これらはまた、限定されるものではないが、造粒剤、崩壊化学剤、接着剤、潤滑剤、保存剤、着色剤、ブレンド剤又は甘味料、植物油又は鉱油、湿潤剤、及び増粘剤を含むいくつかの賦形剤を含んでもよい。
【００３１】
非経口投与形態は、注射又は潅流のための水ベース又は非水ベースの無菌等張溶液、又は懸濁液であってもよい。前記溶液又は懸濁液は、１，３−ブタンジオール、リンゲル溶液、ハンクス溶液、生理食塩液、油、脂肪酸、局所麻酔剤、保存剤、緩衝液、粘度又は溶解度を増加させる剤、水溶性抗酸化剤、油溶性抗酸化剤及び金属キレート剤のような、投与濃度及び投与量で被検者に毒性のない剤であってもよい。
【００３２】
前記薬物結合組成物はまた、抗体、低分子量化合物、有機化合物、無機化合物、酵素、又はポリヌクレオチドのような１種以上の他の治療剤を含んでもよい。
【００３３】
別の態様において、本発明は、上述の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片、及び／又はコンジュゲート、及び／又は組成物、及び／又は組成物の組み合わせを含む、試験製品を提供する。
【００３４】
本発明の試験製品は、破傷風毒素又は破傷風菌感染を検出するために使用することができる。具体的には、本発明の試験製品は、抗体を介して液体、細胞又は組織試料中の破傷風毒素のレベルを測定する。同時に、本発明の実施例で提供される試験製品は、測定された破傷風毒素レベルを対照レベルと比較することができる。破傷風毒素の測定値が対照値よりも高い場合は、破傷風毒素による感染が示唆される。好ましくは、細胞又は組織試料はヒト対象由来であり、試料は血液、尿、唾液、洗浄試料又はリンパ組織を含み得る。
【００３５】
別の態様において、本発明は、上述の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片をコードするＤＮＡ配列を提供する。
【００３６】
前記ＤＮＡ配列は、この技術分野の任意の公知の方法を用いて得ることができる。例えば、抗体のヌクレオチド配列が既知である場合、ＤＮＡ配列をコードする前記抗体は、化学的に合成されたオリゴヌクレオチドで組み立てることができる。
【００３７】
又は、ＤＮＡ分子をコードする前記抗体は、適切な供給源からのヌクレオチドから生成されてもよい。ＤＮＡ分子をコードする前記抗体のクローンを得ることができないが、前記抗体の配列が既知である場合、免疫グロブリンＤＮＡ分子は、化学的に合成することができ、又は前記配列とハイブリダイズすることができる３’−及び５’−プライマーを用いてＰＣＲによって増幅することができ、又は前記コード配列に特異的なオリゴヌクレオチドプローブを用いてクローニングを行って、例えばｃＤＮＡライブラリーからｃＤＮＡクローンをコードするｃＤＮＡクローンを単離することによって、前記コードＤＮＡ分子を得ることができる。次いで、ＰＣＲによって増幅されたＤＮＡ分子を、この分野の任意の公知の方法を用いて、複製可能なクローニングベクターにクローニングすることができる。
【００３８】
別の態様において、本発明は、上述のＤＮＡ分子を含む組換え発現ベクターを提供する。
【００３９】
前記組換え発現ベクターの構築のための発現ベクターは、限定されるものではないが、Ｃｅｌｌｔｒｉｏｎ  Ｉｎｃ．によるＭａｒｅｘ発現ベクター、広く入手可能なｐＣＤＮＡベクター、Ｆ、Ｒ１、ＲＰ１、Ｃｏｌ、ｐＢＲ３２２、ＴｏＬ、Ｔｉベクター、コスミドベクター、１ファージ、Ｍ１３ファージ、Ｍｕファージ、Ｐ１ファージ、Ｐ２２ファージ、Ｑｍファージ、Ｔ偶数ファージ、Ｔ２ファージ、Ｔ４ファージ、Ｔ７ファージ、植物ウイルスベクターを含むことができる。この分野の技術者に知られたいずれの発現ベクターも使用することができ、発現ベクターの選択は、選択された宿主細胞の特性に依存する。発現ベクターは、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ウイルス感染、ＤＥＡＥ−デキストラン誘導トランスフェクション、リポソームトランスフェクション又はエレクトロポレーショントランスフェクションによって（これらに限定されないが）、宿主細胞に導入することができる。この分野の技術者は、任意の発現ベクターを任意の宿主細胞に導入するのに適した方法を選択し、又は使用することができる。好ましくは、前記発現ベクターは、１つ以上の選択マーカーを含むが、これに限定されない、選択マーカーを含まないベクターを使用することもできる。マーカーの選択のための選択は、この分野の技術者によってよく知られているように選択された宿主細胞に依存するが、これはこの発明にとって重要ではない。
【００４０】
本発明のＤＮＡ分子の精製に有益であるために、タグ配列を発現ベクターに挿入することができる。タグ配列の例は、限定されるものではないが、６つのヒスチジンタグ、血球凝集素タグ、ｍｙｃタグ又はＦＬＡＧタグを含む。精製に有益であることがこの分野の技術者に知られている任意のタグを本発明で使用することができる。
【００４１】
別の態様において、本発明は、組換え細胞を提供し、前記組換え細胞は、上述の発現ベクターによる宿主細胞の形質転換又はトランスフェクションから生じる。
【００４２】
この分野の技術者に知られている任意の細胞を宿主細胞として用いることができる。本発明の宿主細胞は、限定されるものではないが、微生物、例えば、抗体をコードする配列を含有する組換えファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ又はコスミドＤＮＡで形質転換された細菌（すなわち、大腸菌、枯草菌）、サッカロミセス及びピキアなどの抗体をコードする配列を含む組換え酵母発現で形質転換された酵母、バキュロウイルスなどの組換えウイルス発現ベクターに感染した昆虫細胞系、抗体をコードする配列を含む組換えウイルス発現ベクター（ＣａＭＶ又はＴＭＶなど）に感染した植物細胞系（例えばＣａＭＶ又はＴＭＶ）、又は哺乳動物細胞ゲノム（メタロチオネインプロモーターなど）又は哺乳動物細胞ウイルス（アデノウイルス後期プロモーター又はポックスウイルス７．５Ｋプロモーターなど）由来のプロモーターに組換え発現ベクターをトランスフェクトした哺乳動物細胞系（ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞など）を含み得る。
【００４３】
別の態様では、本発明は、中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片を用いて、試料中の破傷風毒素又は破傷風菌の存在又はレベルを検出する方法を提供する。好ましい例において、中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片は、検出可能な標識を含む。別の好ましい例では、前記方法は、本発明の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片を検出するために、第２の抗体と結合された検出可能な標識を使用する。前記方法は、診断目的又は非診断目的であってもよい（例えば、試料は、患者からの試料の細胞試料であってもよい）。
【００４４】
別の態様において、本発明は、対象が破傷風毒素又は破傷風菌ムに感染しているかどうかを診断する方法を提供し、これには、対象試料中の破傷風毒素又は破傷風菌の存在の検出が含まれる。好ましい例において、中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片は、検出可能な標識を含む。別の好ましい例では、前記方法は、検出可能な標識結合第二抗体を使用して、本発明の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片を検出する。
【００４５】
別の態様では、本発明は、試料中の破傷風毒素の毒性を中和する方法を提供し、これには、試料を含む破傷風毒素を、本発明の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片と混合することが含まれる。前記方法は、診断目的又は非診断目的であってもよい（例えば、試料は、患者からの試料の細胞試料であってもよい）。
【００４６】
別の態様では、本発明は、破傷風毒素又は破傷風クロストリジウム感染の検出のための製品の製造のための、上記中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片、及び／又はコンジュゲート、及び／又は組成物、及び／又は複合体、及び／又は組成物の組み合わせの適用を提供する。
【００４７】
好ましくは、前記試験製品は、検出キット、ＥＬＩＳＡプレート、又はチップである。
【００４８】
別の態様では、本発明は、破傷風毒素又は破傷風菌感染によって引き起こされる疾患の、薬物又は薬物の生産、及び／又は予防又は治療のための、上述の中和モノクロナル抗体又はその抗原結合断片、及び／又はコンジュゲート、及び／又は組成物、及び／又はコンジュゲート、及び／又は組成物の組み合わせの適用を提供する。
【００４９】
別の態様では、本発明は、破傷風毒素又は破傷風菌感染によって引き起こされる疾患の予防又は治療のための、上述のＤＮＡ分子、組換え発現ベクター、薬物又は医薬の生産のための組換え細胞の適用を提供する。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、抗原を特異的に認識するレセプターとして作用するタンパク質分子として定義され、これには、断片が抗原結合領域を含む限り、抗体全体、抗体の二量体、三量体もしくは多量体、二重特異的抗体、キメラ抗体、組換え抗体又は操作抗体、及びそれらの断片を含む、特異的抗原と反応する免疫グロブリンが含まれる。
【００５１】
全抗体はＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ及びＩｇＧのタイプに属し、ＩｇＧはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４サブタイプを含み得る。抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖを含む抗原結合機能を有する領域である。Ｆａｂ断片は、軽鎖可変領域及び重鎖可変領域、軽鎖定常領域及び第１の重鎖定常領域（ＣＨ１ドメイン）、ならびに抗原結合部位を含む。Ｆａｂ’はヒンジ領域がＦａｂと異なる。重鎖ＣＨ１ドメインのｃ末端は少なくともシステイン残基を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体は、Ｆａｂ’断片のヒンジ領域に位置するシステイン残基間のジスルフィド結合の形成に起因する。Ｆｖ（可変断片）は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含有するのみである最小抗体断片である。二本鎖Ｆｖ（ｄｓＦｖ）は、ジスルフィド結合を介して軽鎖可変領域に結合した重鎖可変領域を含む。単一鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）は、通常、ペプチドアダプターを介して軽鎖可変領域に連結された重鎖可変領域を含む。このような抗体断片は、プロテアーゼの溶解（例えば、Ｆ（ａｂ’）２断片を得るために、全抗体をザイモリエイス処理するためのパパインなど）から生じ得る。好ましくは、抗体断片は、組換え遺伝子操作技術を用いて構築することができる。
【００５２】
用語「中和モノクロナル抗体」は、中和活性を有するモノクロナル抗体として定義される。モノクロナル抗体は、特異的な結合特異性及び特異的なエピトープに対する親和性を有する単一の分子組成を有する抗体である。典型的には、免疫グロブリンは重鎖及び軽鎖を含む。重鎖も軽鎖も定常領域と可変領域（領域はドメインとも呼ばれる）を含む。各軽鎖又は重鎖は、相補性決定領域（以降、「ＣＤＲ」）とも呼ばれる３つの可変領域によって分離された４つのフレームワーク領域を含む。ＣＤＲは主に抗原エピトープへの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、通常、Ｎ末端から連続して番号を付けられたＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３である。
【００５３】
本発明の中和モノクロナル抗体はまた、その機能的変異体を含み、前記機能的変異体は破傷風毒素又はその断片に結合することができ、前記サブタイプ又は破傷風毒素の断片に対して中和活性を有する。
【００５４】
より具体的には、このような機能性変異体は、本発明の中和モノクロナル抗体と基本的に類似した一次配列を有するが、本発明の中和モノクロナル抗体には見られない化学的又は生化学的修飾を有する誘導体を含み得る。前記修飾には、アセチル化、アシル化、ヌクレオチド又はヌクレオチド誘導体との共有結合、脂質又は脂質誘導体との共有結合、架橋、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、ヒドロキシル化、メチル化、酸化、ポリエチレングリコシル化、タンパク質加水分解及びリン酸化が含まれ得る。
【００５５】
場合により、機能性変異体は、以下の中和モノクロナル抗体を含み得る：親中和モノクロナル抗体のアミノ酸配列と比較して、アミノ酸の１以上の置換、挿入若しくは欠失、又はそれらの組み合わせを有するアミノ酸配列。さらに、機能性変異体は、そのＮ末端又はＣ末端又は両末端に切断されたアミノ酸配列を有し得る。機能性変異体は、親中和性モノクロナル抗体と比較して、同じ又は異なる、より高い又はより低い親和性を有し得るが、依然として破傷風毒素又はその断片に結合する。
例えば、本発明の機能性変異体は、破傷風毒素又はその断片との結合親和性が増加又は減少していてもよい。
【００５６】
好ましくは、修飾され得るアミノ酸配列は、限定されるものではないが、フレームワーク領域、高度可変領域、特にＣＤＲ３の可変領域を含む。
一般に、軽鎖及び重鎖は、３つの高度に可変な領域（３つのＣＤＲを含む）及びより保存された領域（いわゆるフレームワーク領域、ＦＲ）を含む。極めて可変性の高い領域は、ＣＤＲからのアミノ酸残基及び極めて可変性の高いループを含む。この分野の技術者は、アミノ酸配列を比較するために、Ｇａｐ又はＢｅｓｔｆｉｔのような周知のコンピュータアルゴリズムを使用して、同じ又は類似の残基を定義することができる。分子生物学において一般的に使用されるいくつかの方法（例えば、ＰＣＲ、オリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発、部位特異的突然変異誘発）は、親中和モノクロナル抗体又はその断片を修飾するために使用され得るか、又は別の選択肢は、有機合成によって機能的変異体を生成することである。
【００５７】
この分野の技術者はまた、本発明でカバーされる抗破傷風毒素抗体のアミノ酸配列の修飾、及び例として、抗体の改変結合親和性又は他の生物学的特性を理解する。抗破傷風毒素抗体のアミノ酸変異体は、抗破傷風毒素抗体コード配列に適当なヌクレオチド変化を導入することによって、又はペプチド合成によって生成することができる。そのような修飾は、（例えば）置換、残基の欠失又は挿入を含み得る。残基の欠失、挿入、置換、又はそれらの組み合わせは、機能的変異体の最終的な構築を完了し、その制限は最終的な構築物の要求された機能的特徴に依存する。アミノ酸の変化はまた、グリコシル化の数又は部位のような翻訳後プロセスを変化させ得る。
【００５８】
本発明の利点及び有益な効果は、以下の通りである。
【００５９】
本発明は、破傷風毒素に対する完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体を、ハイスループット完全天然型ヒトモノクロナル抗体系統的開発プラットフォームを介して開発する。
【００６０】
本発明で開発された破傷風毒素に対する完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体は、破傷風菌感染の予防及び治療に適用可能である。
【００６１】
本発明で開発された破傷風毒素に対する完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体は、破傷風菌感染の検出に適用可能である。
【００６２】
本発明において開発された完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体は、破傷風毒素と高い親和性を有し、高い中和活性を有し、高い有効性を有し、外因性のウイルス汚染がなく、かつ、高い産業的有用性を有するあらゆるタイプのヒトグループにおいて広く使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００６３】
【図１】及び精製の検出を示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥについてはＡ、ウエスタンブロットについてはＢに示す。
【図２】図２は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを用いたＴＲＮ００１２抗体の発現及び精製の検出を示し、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥについてはＡ、ウエスタンブロットについてはＢに示す。
【図３】図３は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを用いたＴＲＮ００１１抗体の発現及び精製の検出を示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥについてはＡ、ウエスタンブロットについてはＢに示す。
【図４】図４は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを用いたＴＲＮ１０１５抗体の発現及び精製の検出を示し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥについてはＡ、ウエスタンブロットについてはＢに示す。
【図５】図５は、ＥＬＩＳＡを用いたＴＲＮ００１０抗体の中和活性の測定結果を示す。
【図６】図６は、ＥＬＩＳＡを用いたＴＲＮ００１２抗体の中和活性の測定結果を示す。
【図７】図７は、ＥＬＩＳＡを用いたＴＲＮ００１１抗体の中和活性の測定結果を示す。
【図８】図８は、ＥＬＩＳＡを用いたＴＲＮ１０１５抗体の中和活性の測定結果を示す。
【図９】図９は、ＴＲＮ００１０抗体の親和性を測定するための結果を示す。
【図１０】図１０は、ＴＲＮ００２抗体の親和性を測定するための結果を示す。
【図１１】図１１は、ＴＲＮ００１１抗体の親和性を測定するための結果を示す。
【図１２】図１２は、ＴＲＮ１０１５抗体の親和性を測定するための結果を示す。
【図１３】図１３は、ＴＲＮ００１０抗体を有する動物に対する防御効果の結果を示す。
【図１４】図１４は、ＴＲＮ００１２抗体を有する動物に対する防御効果の結果を示す。
【図１５】図１５は、ＴＲＮ００１１抗体を有する動物に対する防御効果の結果を示す。
【図１６】図１６は、ＬＤ５０破傷風毒素の２０倍用量に対するＴＲＮ１０１５抗体の防御効果の結果を示す。
【図１７】図１７は、ＬＤ５０破傷風毒素の６０倍用量に対するＴＲＮ１０１５抗体の防御効果の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６４】
具体的な使用方法
以下では、さらに、図面及び実施例を用いて本発明を詳細に説明する。以下の実施例は、本発明のさらなる説明のためのものに過ぎず、本発明の範囲を限定するものではない。条件及び方法のいくつかは、詳細に開示されていなくてもよく、これらの条件及び方法は、一般に、Sambrook et al. of New York Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989によるMolecular Cloning、Lab Manual、または製造業者が推奨するものに記載されている。
【実施例】
【００６５】
実施例１．破傷風毒素に対するヒト中和モノクロナル抗体の調製
１．細胞の単離
１５００ＩＵ破傷風毒素を注射された健常志願者から血液サンプルを採取し、次に、Ｆｉｃｏｌｌを用いて単核細胞（ＰＢＭＣ）を単離した。細胞数を得た後、形質細胞をＢＤ  ＦＡＣＳｒｉａを用いてＦＡＣＳにより単離した。無傷の単一細胞を９６ウェルＰＣＲプレートに入れ、ウェルあたり１個の単一の記憶Ｂ細胞を用い、次に、将来使用するために−８０℃の冷凍庫に保存した。
【００６６】
２．抗体の可変領域に関する遺伝子の単離
重鎖及び軽鎖の各サブタイプ定常領域の０．５ｍＭプライマー及びＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素を、単一Ｂ細胞を用いて９６ウェルプレートに添加し、３７℃で１時間インキュベートした。ＰＣＲは、以下のパラメーター下で実施した：９３℃１５分；９５℃１分、５５℃１分、７２℃１分、３０サイクル；７２℃１０分；４℃５分。ｃＤＮＡ産物を−２０℃に保持した。
【００６７】
上記のｃＤＮＡを鋳型として使用して、抗破傷風毒素の完全天然型ヒト抗体遺伝子を増幅する。ＲＴ反応の生成物５ｍｌ、ＨｏｔＳｔａｒ  Ｔａｑ  Ｐｌｕｓポリメラーゼ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、ｄＮＴＰ、及び各サブタイプの重鎖及び軽鎖に対する０．５ｍｍの特異的プライマーを混合した。反応条件：９４℃５分でのプレ変性、続いて、９４℃×３０秒、５５℃×３０秒、７２℃×５０秒の条件での３５ＰＣＲサイクル、及び７分間の７２℃での最終伸長。ＰＣＲ産物は１％アガロースゲル電気泳動で同定した。
【００６８】
３．破傷風毒素に対する完全天然型ヒトモノクロナル抗体のための真核生物発現ベクターの構築
（１）検出ＰＣＲ結果のために１％アガロースゲル電気泳動で２ｍｌのＰＣＲ産物を採取した。ＴＡクローニング法を用いてｐｃＤＮＡ３．３（＋／−）発現ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社製）に、重鎖及び軽鎖の可変領域に関する遺伝子間の相補的対合を有する陽性ＰＣＲ産物を挿入し、完全天然型ヒト抗破傷風毒素モノクロナル抗体発現ベクターを構築した。
（２）上記発現ベクターを用いてＤＨ５ａコンピテント細胞を形質転換し、形質転換細胞をアンピシリン含有プレート上で３７℃で一晩培養した。
（３）特異的プライマーを用いたＰＣＲ確認のための１０個の単一コロニーを採取した。反応条件：９４℃で５分間のプレ変性、９４℃で３０秒間の変性、５５℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分間の伸長を２８サイクル、及び７２℃で５分間の最終伸長。
（４）１％アガロースゲル電気泳動の確認のために５ｍｌのＰＣＲ産物を採取し、陽性形質転換体を同定した。
【００６９】
結果は、構築された抗破傷風毒素モノクロナル抗体重鎖／軽鎖組換え発現ベクターの配列が正しいことを示した。
【００７０】
４．抗破傷風毒素の完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体の発現と同定
大腸菌ＤＨ５ａにおいて、陽性抗体重鎖及び軽鎖遺伝子を発現するプラスミドを増幅し、組換えプラスミドを迅速に単離した。２９３細胞を、ＰｏｌｙＦｅｃｔ  ＤＮＡトランスフェクションキットにより、製造業者の指示に従って、抗破傷風毒素完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体発現ベクターでトランスフェクトした。非トランスフェクション２９３細胞を対照とした。９６時間培養後、ＨＰＲ標識ヒツジ抗ヒトＩｇＧを用いたＥＬＩＳＡを用いて、抗破傷風毒素の完全天然型ヒト中和モノクロナル抗体の発現及び破傷風ワクチン（抗原）の特異的認識を検出した。
【００７１】
破傷風ワクチンを抗原として使用し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１０倍希釈抗原、１００ｍｌ／ウェル、４℃で一晩コーティングした。ブロッキング溶液を室温で２時間ブロッキングし、次いで一次抗体として一過性発現上清１００ｍｌと共に３７℃で２時間インキュベートし、二次抗体として１：２０００希釈ＨＲＰ／抗Ｈｉｓ−ｔａｇと共に３７℃で１時間インキュベートし、ウェルあたり物質カラー液体１００ｍｌを加え、室温で５分間光から離し、次いで２Ｍ硫酸との反応を停止し、４５０ｎｍ波長で検出した。
【００７２】
その結果、発現ベクタープラスミドをトランスフェクトした２９３細胞は天然型ヒト抗体を成功裏に発現し、抗体は破傷風ワクチン（抗原）を特異的に認識することができたが、一方、非トランスフェクト２９３細胞からの培養上清は破傷風ワクチン（抗原）を認識することができなかったため、一過性にトランスフェクトした２９３細胞は破傷風ワクチン（抗原）を特異的に認識する天然型ヒト抗破傷風毒素抗体を成功裏に発現した。
【００７３】
５．完全天然型抗破傷風中和モノクロナル抗体の製造及び精製
中和活性及び番号付きＴＲＮ００１０抗体重鎖及び軽鎖発現ベクター（重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号７に記載され、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号８に記載される）で陽性に同定された２９３細胞を同時トランスフェクションした。
【００７４】
中和活性及び番号付きＴＲＮ００１２抗体重鎖及び軽鎖発現ベクター（重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号１７に記載され、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号１８に記載される）で陽性に同定された２９３細胞を同時トランスフェクションした。
【００７５】
中和活性及び番号付きＴＲＮ００１１抗体重鎖及び軽鎖発現ベクター（重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号２２に記載され、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号２６に記載される）で陽性に同定された２９３細胞を同時トランスフェクションした。
【００７６】
中和活性及び番号付きＴＲＮ１０１５抗体重鎖及び軽鎖発現ベクター（重鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号３３に記載され、軽鎖の可変領域のアミノ酸配列は配列番号３４に記載される）で陽性に同定された２９３細胞を同時トランスフェクションした。
【００７７】
トランスフェクションの６〜８時間後に新鮮な培地に置き換え、８％ＣＯ２インキュベーター中で３７℃で９６時間連続インキュベートした。トランスフェクション上清を採取し、４０００ｒｐｍで１時間遠心した後、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーで精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロットを用いて抗体の発現及び純度を同定した。図１〜４に示すように、比較的純粋なタンパク質が得られ、融解後に抗体の重鎖及び軽鎖が明確に同定された。注：図１−４Ａ及び図１−４Ｂのレーン１は非融解タンパク質を表し、図１−４Ａ及び１−４Ｂのレーン２はタンパク質マーカーを表し、ならびに図１−４Ａ及び図１−４Ｂのレーン３は融解タンパク質を表す。
【００７８】
実施例２．中和モノクロナル抗体の中和活性の検出
破傷風ワクチンを抗原として使用し、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを１０倍希釈抗原、１００ｍｌ／ウェル、４℃で一晩コーティングした。ブロッキング溶液を室温で２時間ブロッキングし、次いで、精製抗体の一次抗体としての連続希釈を用いて３７℃で２時間インキュベートし、二次抗体として１：２０００希釈ＨＲＰ／抗Ｈｉｓ−ｔａｇを用いて３７℃で１時間インキュベートし、ウェルあたり物質カラー液体１００ｍｌを加え、室温で５分間光から離し、次いで２Ｍ硫酸との反応を停止し、４５０ｎｍ波長で検出した。
【００７９】
結果を図５〜８に示す。精製抗体を１０，０００倍以上に希釈したとき、抗体濃度は０．０００２ｍｇ／ｍｌと低かった。希釈された抗体は依然として抗原に結合することができ、その強い結合活性及び中和活性を示した。
【００８０】
実施例３．中和モノクロナル抗体の親和性の測定
ＣＭ５チップに結合された捕捉分子、次いで、チップのデキストラン表面を活性化した。カップリングの量はサンプリング時間によって制御され、最後に捕捉された分子でリガンドを捕捉した。調製した完全天然型のヒト抗破傷風毒素中和モノクロナル抗体をリガンドとして使用し、ＨＳ−ＥＢ緩衝希釈破傷風毒素を分析物として使用した。濃度が増加した分析物をチップを順序正しく通過させ、シグナルをそれぞれ記録した。各濃度の分析物を１サイクルチップと反応させ、各サイクルの後、チップを１０ｍｍｏｌ／Ｌグリシン−ＨＣｌ溶液で再生し、結合抗原なしで元の状態に戻した。破傷風毒素に対するモノクロナル抗体の結合親和性の速度論的分析を、ＢｉａＣｏｒｅ  Ｘ−１００システムソフトウェアを用いて行った。
【００８１】
結果を図９〜１２及び表１に示すが、破傷風毒素に対する本発明の中和モノクロナル抗体の平衡解離定数は１０−９ｍｏｌ未満であり、これは非常に高い親和性活性を有することを示す。
【００８２】
【表１】
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【００８３】
実施例４．抗破傷風毒素中和モノクロナル抗体の動物保護実験
（１）試験用抗破傷風毒素モノクロナル抗体の希釈
モノクロナル抗体を１００ｍｇ／ｍｌに希釈し、次いで３回連続希釈し、試験のために保存した。
（２）標準抗毒素の希釈
抗毒素生理食塩水標準液を等容量の中性グリセリンと混合し（１１６℃で１０分間滅菌）、次いで０．５ＩＵ／ｍｌ溶液に希釈し、等容量の毒素溶液と混合した後、０．４ｍｌ注射ごとに１０ＩＵ／１０を得た。抗毒素標準液の各取り込み量は、０．５ｍＬ以上とした。
（３）毒素の希釈
凍結乾燥粉末毒素を中国国立生物試験所から生理食塩水に溶解し、同量の中性グリセリン（１１６℃で１０分間滅菌）と混合した後、毒素溶液を希釈液で作用濃度に希釈した。
（４）致死量（ＬＤ５０）の中央値の決定
調製した毒素液を１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７に希釈し、それぞれ２ｍＬ以上希釈した。０．２ｍＬをとり、各群４匹ずつマウスに注射し、５日間観察した。実験データを用いてＬＤ５０を得るために計算した。実験群は、ＬＤ５０の２０倍又は６０倍に相当する量の毒素を用いるものとする。
（５）  抗体価の測定
希釈した抗毒素と段階希釈した抗体の等量を試験管にとり、等量の希釈毒素（ＬＤ５０の２０倍又は６０倍）と混和した。均等に混合した後、試験管プラグで密封し、３７℃で１時間反応させた後、直ちにマウスに注射した。１４０匹の健常マウスを採取し、この実験のために１群当たり４匹のマウスにグループ化した。混合物０．４ｍｌを１８〜２２ｇマウスの腹部に皮下注射した（陰性対照群については、０．２ｍｌの毒素＋０．２ｍｌのホウ酸緩衝生理食塩水を注射した；陽性対照群については、０．２ｍｌの毒素＋０．２ｍｌの抗毒素を注射した；及び実験群については、０．２ｍｌの毒素＋０．２ｍｌのモノクロナル抗体を注射した）。マウスの状態を毎日２回、１匹は朝、１匹は午後に観察し、マウスの病気と死亡を記録した。
【００８４】
結果を図１３〜１６に示す。ＬＤ５０破傷風毒素を２０倍攻撃した場合、陰性対照群のマウスは、１．８５ｍｇ／ｍｌのＴＲＮ００１０抗体を有する実験群のマウスを除いて、７日後に死亡し、他のすべての実験群のマウス（０．６２ｍｇ／ｍｌ、５．５６ｍｇ／ｍｌ、１６．６７ｍｇ／ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ）及び陽性対照群の全マウスが生存した。これは、０．６２ｍｇ／ｍｌという低用量モノクロナル抗体が１０ＵＩ／ｍｌの標準抗毒素に相当することを示している。モノクロナル抗体は、破傷風毒素の致死量攻撃から動物を保護することができ、標準抗毒素とほぼ同じ防御活性を有する。本発明のモノクロナル抗体の実際の用量は、標準抗毒素の用量よりもはるかに低く、その効果が抗毒素のそれよりも優れていることを示した。結果は、本発明のモノクロナル抗体が、マウスの体内の毒素を中和し、マウスを保護し、インビボ活性を有することを示す。
【００８５】
図１７に示すように、より高用量の破傷風毒素攻撃（ＬＤ５０の６０倍）下で、陰性対照群のマウスが２４時間以内に死亡した場合、低用量実験群のマウス（０．６２ｍｇ／ｍｌ、１．８５ｍｇ／ｍｌ）は７日以内に死亡し、中及び高用量実験群のマウス（５．５６ｍｇ／ｍｌ、１６．６７ｍｇ／ｍｌ、及び５０ｍｇ／ｍｌ）は全て７日以内に生存し、本発明のモノクロナル抗体が高用量の毒素攻撃を防御することができ、モノクロナル抗体がインビボ中和活性が極めて強いことを示す。
【００８６】
本明細書では、特定の使用方法のいくつかの例のみを説明するが、この分野の技術者は、これらが単なる例であることを理解すべきである。本発明の保護範囲は、特許請求の範囲に定義される。この分野の技術者は、本発明の原理及び本質から逸脱することなく、特定の使用方法の一部を変更又は変更することができ、かかる変更又は変更はすべて、本発明の保護の範囲に入る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月28日(2020.9.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】変更
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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