(57)【要約】  IL12aと上記のIL12aに融合する第1因子を含有する第1ポリペプチド鎖、および、IL12bと上記のIL12bに融合する第2因子を含有する上記の第1ポリペプチド鎖と異なる第2ポリペプチド鎖を有し、ここで、上記の第1因子と上記の第2因子は、それぞれ独立してIL2、GMCSF、IL7、IL15、IL21およびFLT3Lからなる群から選ばれるタンパク質ヘテロ二量体およびその使用である。上記のタンパク質ヘテロ二量体は、腫瘍の治療に用いられる。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL12aと前記IL12aに融合する第1因子を含有する第1ポリペプチド鎖、および、IL12bと前記IL12bに融合する第2因子を含有する前記第1ポリペプチド鎖と異なる第2ポリペプチド鎖を有し、ここで、前記第1因子と前記第2因子は、それぞれ独立してIL2、GMCSF、IL7、IL15、IL21およびFLT3Lからなる群から選ばれる、
タンパク質ヘテロ二量体。
【請求項２】
前記第1因子は、前記第2因子と異なる、
請求項1に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項３】
前記第1因子と前記第2因子は、互いに異なって、それぞれIL2、IL7、IL15およびIL21からなる群から選ばれるサイトカイン群AとGMCSFおよびFLT3Lからなる群から選ばれるサイトカイン群Bから選ばれる、
請求項1〜2のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項４】
前記第1ポリペプチド鎖において、前記IL12aのC末端は、前記第1因子のN末端に直接的もしくは間接的に融合し、および/または、前記第1ポリペプチド鎖において、前記IL12aのN末端は、前記第1因子のC末端に直接的もしくは間接的に融合する、
請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項５】
前記第2ポリペプチド鎖において、前記IL12bのC末端は、前記第2因子のN末端に直接的もしくは間接的に融合し、および/または、前記第2ポリペプチド鎖において、前記IL12bのN末端は、前記第2因子のC末端に直接的もしくは間接的に融合する、
請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項６】
前記第1因子と前記第2因子は、
1）第1因子がIL2であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
2）第1因子がIL7であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
3）第1因子がIL15であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
4）第1因子がIL21であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
5）第1因子がIL2であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
6）第1因子がIL7であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
7）第1因子がIL15であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
8）第1因子がIL21であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
9）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL2であり；
10）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL7であり；
11）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL15であり；
12）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL21であり；
13）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL2であり；
14）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL7であり；
15）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL15であり；および
16）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL21である群から選ばれる、
請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項７】
前記IL12a、前記IL12b、前記第1因子と前記第2因子は、哺乳動物に由来する、
請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項８】
前記IL12a、前記IL12b、前記第1因子と前記第2因子は、同一の由来である、
請求項7に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項９】
前記第1ポリペプチド鎖は、例えばSEQ ID NO. 60〜65およびSEQ ID NO. 70〜73のいずれかで表される配列を有する、
請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項１０】
前記第2ポリペプチド鎖は、例えばSEQ ID NO. 66〜69およびSEQ ID NO. 74〜75のいずれかで表される配列を有する、
請求項1〜9のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項１１】
前記タンパク質ヘテロ二量体は、例えばSEQ ID NO. 18〜37のいずれかで表される配列を有する、
請求項1〜10のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項１２】
１種類または多種類の単離された核酸分子であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体をコードする、
核酸分子。
【請求項１３】
例えばSEQ ID NO. 38〜57のいずれかで表される配列を有する、
請求項12に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体をコードするヌクレオチド配列を有する、
発現ベクター。
【請求項１５】
請求項14に記載の発現ベクターを含む、
宿主細胞。
【請求項１６】
請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体、請求項11〜13に記載の核酸分子、請求項14に記載のベクターおよび/または請求項15に記載の宿主細胞、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む、
医薬組成物。
【請求項１７】
請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体を調製する方法であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体を発現可能な場合に、請求項15に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、
方法。
【請求項１８】
腫瘍を治療するための医薬品の調製における請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体および請求項16に記載の医薬組成物の用途。
【請求項１９】
前記腫瘍は、黒色腫を含む、
請求項18に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、腫瘍を治療する分野に関し、具体的に、タンパク質ヘテロ二量体およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は、深刻に人間健康に脅威を与えている疾患であって、近頃、免疫治療は、新たな療法の一つとして、腫瘍の治療における潜在力を大いに示した。サイトカイン（Cytokine）は、インビボで非常に重要な免疫シグナルであって、サイトカイン融合タンパク質技術は、現在、腫瘍免疫療法のもう一つのホットスポットになる。該方法は、これらのサイトカインが同一もしくは関連する機能活性を有するがそれぞれ作用ターゲットが違うことに応じて、遺伝子工学技術を用いて、2種または多種のサイトカインを融合するものである。しかし、現在、サイトカイン融合タンパク質技術による腫瘍治療の効果は、やはり物足りなく、いろんな改善が必要である。
【発明の概要】
【０００３】
本発明は、少なくとも抗腫瘍効果が良好の薬効を有するタンパク質ヘテロ二量体およびその使用を提供する。
【０００４】
一方で、本発明は、IL12aと上記のIL12aに融合する第1因子を含有する第1ポリペプチド鎖、および、IL12bと上記のIL12bに融合する第2因子を含有する上記の第1ポリペプチド鎖と異なる第2ポリペプチド鎖を有し、ここで、上記の第1因子と上記の第2因子は、それぞれ独立してIL2、GMCSF、IL7、IL15、IL21およびFLT3Lからなる群から選ばれるタンパク質ヘテロ二量体を提供する。
ある実施形態において、上記の第1因子は、上記の第2因子と異なる。
【０００５】
ある実施形態において、上記の第1因子と上記の第2因子は、互いに異なって、それぞれIL2、IL7、IL15およびIL21からなる群から選ばれるサイトカイン群AとGMCSFおよびFLT3Lからなる群から選ばれるサイトカイン群Bから選ばれる。
【０００６】
ある実施形態において、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのC末端は、上記の第1因子のN末端に直接的もしくは間接的に融合する。ある実施形態において、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのN末端は、上記の第1因子のC末端に直接的もしくは間接的に融合する。ある実施形態において、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのC末端は、上記の第2因子のN末端に直接的もしくは間接的に融合する。ある実施形態において、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのN末端は、上記の第2因子のC末端に直接的もしくは間接的に融合する。
ある実施形態において、上記の第1因子と上記の第2因子は、
1）第1因子がIL2であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
2）第1因子がIL7であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
3）第1因子がIL15であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
4）第1因子がIL21であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
5）第1因子がIL2であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
6）第1因子がIL7であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
7）第1因子がIL15であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
8）第1因子がIL21であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
9）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL2であり；
10）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL7であり；
11）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL15であり；
12）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL21であり；
13）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL2であり；
14）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL7であり；
15）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL15であり；および
16）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL21である群から選ばれる。
ある実施形態において、上記のIL12a、上記のIL12b、上記の第1因子と上記の第2因子は、哺乳動物に由来する。
ある実施形態において、上記のIL12a、上記のIL12b、上記の第1因子と上記の第2因子は、同一の由来である。
【０００７】
ある実施形態において、上記の第1ポリペプチド鎖は、例えばSEQ ID NO. 60〜65およびSEQ ID NO. 70〜73のいずれかで表される配列を有する。
【０００８】
ある実施形態において、上記の第2ポリペプチド鎖は、例えばSEQ ID NO. 66〜69およびSEQ ID NO. 74〜75のいずれかで表される配列を有する。
【０００９】
ある実施形態において、上記のタンパク質ヘテロ二量体は、例えばSEQ ID NO. 18〜37のいずれかで表される配列を有する。
【００１０】
他方で、本発明は、１種類または多種類の単離された核酸分子であって、上記のタンパク質ヘテロ二量体をコードする核酸分子を提供する。
【００１１】
ある実施形態において、上記の核酸分子は、例えばSEQ ID NO. 38〜57のいずれかで表される配列を有する。
【００１２】
他方で、本発明は、上記のタンパク質ヘテロ二量体をコードするヌクレオチド配列を有する発現ベクターを提供する。
【００１３】
他方で、本発明は、上記の発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００１４】
他方で、本発明は、上記のタンパク質ヘテロ二量体、上記の核酸分子、上記のベクターおよび/または上記の宿主細胞、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１５】
他方で、本発明は、上記のタンパク質ヘテロ二量体を調製する方法であって、上記のタンパク質ヘテロ二量体を発現可能な場合に、上記の宿主細胞を培養するステップを含む方法を提供する。
【００１６】
他方で、本発明は、腫瘍を治療するための医薬品の調製における上記のタンパク質ヘテロ二量体および上記の医薬組成物の用途を提供する。
ある実施形態において、上記の腫瘍は、黒色腫を含む。
【００１７】
当該技術分野における当業者であれば、本発明は、以降の詳細な記載からのその他の側面や利点の把握が容易であろう。以下の詳細な記載では、本発明の例示的実施形態しか表現して記載していない。当該技術分野における当業者にとって、本発明の詳細によって、本発明に係る趣旨や範囲を逸脱しない限り、公開されている具体的な実施形態を変更しても良い。それに応じて、本発明において、図面や明細書の記載は、限定的ではなく、あくまでも例示的なものである。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
本願に係る発明の具体的な特徴は、添付の請求項のように示されたものである。本発明に係る特徴やメリットは、以下詳しく記載されている例示的実施形態や図面を参照することによって、より確実的に把握されるだろう。図面に関しては、以下のように概略的に説明する。
【図１】図1は、上記の腫瘍増殖様子を示す。
【図２】図2は、上記のタンパク質ヘテロ二量体の構造模式図を示す。
【図３】図3は、上記のタンパク質ヘテロ二量体の発現様子を示す。
【図４】図4は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図５】図5は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図６】図6は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図７】図7は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図８】図8は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図９】図9は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図１０】図10は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図１１】図11は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図１２】図12は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図１３】図13は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図１４】図14は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図１５】図15は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図１６】図16は、上記のタンパク質ヘテロ二量体が腫瘍の退縮を誘導することを示す。
【図１７】図17は、上記のタンパク質ヘテロ二量体の構築を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、本願発明の実施形態を、特定の具体的実施例によって説明するが、当業者であれば、本明細書に公開された内容により、本願発明のその他のメリットや効果を容易に把握することができる。
【００２０】
本発明において、「融合タンパク質」という用語は、通常、2種類またはより多種類のポリペプチドからなるタンパク質を指す。上記の融合タンパク質において、上記のポリペプチドは、インビトロまたはインビボの活性など、生物学的特性でありうるか、もしくは、標的分子に対する結合、反応の触媒作用など、単純な化学特性または物理特性であってよい異なる特性を有してよい。上記の融合タンパク質において、上記のポリペプチドは、直接的に結合されるか、またはリンカー（例えば、ペプチドリンカー）またはスペーサー（spacer）を介して間接的に結合され、上記の融合タンパク質は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が枠内に該ポリペプチドと異なるもう1つのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する融合遺伝子によって発現されうる。上記の融合遺伝子は、組換え宿主細胞によって単一のタンパク質として発現されうる。
【００２１】
本発明において、「サイトカイン融合タンパク質」という用語は、通常、2種類以上のサイトカインを含む融合タンパク質を指す。上記のサイトカイン融合タンパク質は、遺伝子組換え技術により得られる。上記のサイトカイン融合タンパク質は、含まれるサイトカインの固有の生物学的活性を有するか、またはその中であるいくつかの活性を顕著に高めるか、あるいは、さらに生物学的活性の相補および協同効果によって、単一のサイトカインの簡単な調合の有しない複合生物学的機能を発揮するか、ひいては、いくつかの新たな構造および生物学的機能も生じうる。本発明において、上記のサイトカイン融合タンパク質は、タンパク質ヘテロ二量体でありうる。
【００２２】
本発明において、「タンパク質ヘテロ二量体」という用語は、2つの異なるポリペプチド鎖より構成される二量体である。本発明において、上記のタンパク質ヘテロ二量体は、下記の第2ポリペプチド鎖と異なり、IL12aおよび上記のIL12aに融合する第1因子を含みうる第1ポリペプチド鎖、および、IL12bおよび上記のIL12bに融合する第2因子を含みうる第2ポリペプチド鎖を含む。
【００２３】
本発明において、「サイトカイン」という用語は、通常、主に免疫細胞により分泌され、細胞機能を制御可能な低分子タンパク質を指す。上記のサイトカインは、細胞間相互作用、細胞成長および分化に重要な調節役割を果たす。例えば、上記のサイトカインは、インターロイキンおよびコロニー刺激因子からなる群から選ばれてよい。本発明において、上記のインターロイキンは、多種の細胞により産生され、多種の細胞の同一サイトカインに作用するものである。インターロイキンは、情報伝達、免疫細胞活性化と調節、T、B細胞活性化、増殖および分化の媒介、ならびに、炎症反応に重要な役割を果たす。例えば、上記のインターロイキンは、IL12、IL2、IL15、IL21およびIL7からなる群から選ばれる１種類または多種類でありうる。本発明において、上記のコロニー刺激因子は、異なる造血幹細胞を刺激することによって半固体培地で細胞コロニーを形成するサイトカインでありうる。上記のコロニー刺激因子は、成長段階の異なる造血幹細胞の増殖、分化を促進するのに役立つ。例えば、上記のコロニー刺激因子は、コロニー刺激因子の作用範囲にしたがって、それぞれ顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、マクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）および多能性コロニー刺激因子（multi-CSF、IL3）と呼ばれた。例えば、上記のコロニー刺激因子は、FMS関連チロシンキナーゼ3リガンド（FTL3L）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GMCSF）からなる群から選ばれる１種類または多種類でありうる。
【００２４】
本発明において、「IL12」という用語は、通常、インターロイキン-12を指す。本発明において、IL12は、IL-12と交換可能に使用される。IL12は、活性化型T細胞増殖を刺激すると共に、Th0細胞のTh1細胞への分化を促進し、また、CTLとNK細胞の細胞傷害活性を誘導して、IFN-γ、TNF-α、GM-CSFなどのサイトカインを分泌し、または、NK細胞、IL-2Rα受容体およびCD56分子の発現を促し、腫瘍細胞に対するADCC効果を増強させることができる。IL12は、ジスルフィド結合によりお互いに連結されるp40サブユニット（40kd）とp35サブユニット（35kd）を含有するヘテロ二量体である。例えば、マウスIL12（mIL12）のうち、p35サブユニットはSEQ ID NO: 1で表されるアミノ酸配列、p40サブユニットはSEQ ID NO: 2で表されるアミノ酸配列を有しうる。また、例えば、ヒトIL12（hIL12）のうち、p35サブユニットはSEQ ID NO: 9で表されるアミノ酸配列、p40サブユニットはSEQ ID NO: 10で表されるアミノ酸配列を有しうる。
【００２５】
本発明において、「IL2」という用語は、通常、インターロイキン-2を指す。IL2は、生体の免疫応答や抗ウイルス感染などに重要な役割を果たし、特異的抗原により起こされるT細胞増殖を刺激すると共に、T細胞を活性化させ、サイトカインの産生を促進し；NK細胞増殖を刺激し、NK細胞毒性の増強とサイトカインの産生を行い、LAK細胞産生を誘導し；そして、B細胞増殖および抗体分泌を促し；マクロファージを活性化させることができる。例えば、マウスIL2（mIL2）は、SEQ ID NO: 3で表されるアミノ酸配列を有しうる。また、例えば、ヒトサイトカインIL2（hIL2）は、SEQ ID NO: 11で表されるアミノ酸配列を有しうる。
【００２６】
本発明において、「IL15」という用語は、通常、インターロイキン-15を指す。IL15は、活性化される単核-マクロファージ、表皮細胞および線維芽細胞などの多種の細胞によって産生され、B細胞増殖と分化を誘導可能である。例えば、マウスIL15（mIL15）は、SEQ ID NO: 4で表されるアミノ酸配列を有しうる。また、例えば、ヒトIL15（hIL15）は、SEQ ID NO: 12で表されるアミノ酸配列を有しうる。
【００２７】
本発明において、「IL7」という用語は、通常、インターロイキン-7を指す。IL7は、主に胸腺および骨髄間質細胞により分泌され、相対分子質量が25000〜28000である糖タンパク質に属する。IL7およびその受容体媒介シグナル伝達経路は、主にJanusキナーゼ、シグナル伝達ならびに転写活性化因子、およびホスホイノシタイド3-キナーゼの三つの経路によって実現される。例えば、マウスIL7（mIL7）は、SEQ ID NO: 5で表されるアミノ酸配列を有しうる。また、例えば、ヒトIL7（hIL7）は、SEQ ID NO: 13で表されるアミノ酸配列を有しうる。
【００２８】
本発明において、「IL21」という用語は、通常、インターロイキン-21を指す。IL21は、活性化されるCD4+T細胞により分泌され、B細胞増殖の調節に関与し、IL21遺伝子が欠失する場合に、生体への細菌やウイルスによる感染がより容易になってしまう。研究によると、IL21は、Bcl-6タンパク質の制御によってIL2受容体タンパク質（CD25）の発現レベルを影響することを示した。例えば、マウスIL21（mIL21）は、SEQ ID NO: 6で表されるアミノ酸配列を有しうる。また、例えば、ヒトIL21（hIL21）は、SEQ ID NO: 14で表されるアミノ酸配列を有しうる。
【００２９】
本発明において、「FTL3L」という用語は、通常、FMS関連チロシンキナーゼ3リガンドを指す。FTL3Lは、非赤芽球系造血幹細胞の増殖および分化を調節し、プレBリンパ球、樹状細胞、NK細胞、細胞傷害性Tリンパ球の増殖、分化および成熟を促すような重要な抗腫瘍効果を含む。例えば、マウスFTL3L（mFTL3L）は、SEQ ID NO: 7で表されるアミノ酸配列を有しうる。また、例えば、ヒトFTL3L（hFTL3L）は、SEQ ID NO: 15で表されるアミノ酸配列を有しうる。
【００３０】
本発明において、「GMCSF」という用語は、通常、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子を指す。GMCSFは、顆粒球とマクロファージの増殖、分化と活性化を刺激し、造血機能を増強することができ；また、好中球、好酸球および単核球の多種の機能を増強することもできる。GMCSFは、免疫エフェクター細胞が細菌を貪食し、およびがん細胞を死滅させるなどの免疫活性を向上させると共に、腫瘍化学療法や骨髄移植による好中球減少の回復に有利である。例えば、マウスGMCSF（mGMCSF）は、SEQ ID NO: 8で表されるアミノ酸配列を有しうる。また、例えば、ヒトGMCSF（hGMCSF）は、SEQ ID NO: 16で表されるアミノ酸配列を有しうる。
【００３１】
本発明において、「核酸分子」という用語は、通常、その自然環境において分離されるか、または人工合成される任意の長さによって分離されるヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチドあるいはリボヌクレオチド、またはそれらのアナログを指す。本発明において、上記の核酸分子は、上記のタンパク質ヘテロ二量体をコードすることができ、SEQ ID NO. 38〜57のいずれかで表されるヌクレオチド配列を有する。
【００３２】
本発明において、「ベクター」という用語は、通常、適当な宿主で自己複製できる核酸分子を指す。上記のベクターは、挿入された核酸分子を宿主細胞中および/または宿主細胞間に運搬することができる。上記のベクターは、主にDNAあるいはRNAを細胞に挿入するためのベクター、主にDNAあるいはRNAを複製するためのベクター、および、主にDNAあるいはRNAを転写および/または翻訳するための発現ベクターを含む。上記のベクターは、さらに、前述した機能を多種類含むベクターを含む。上記のベクターは、適当な宿主細胞が導入される場合、ポリペプチドに転写して翻訳することができるポリヌクレオチドでありうる。上記のベクターは、通常、上記のベクターを含む適当な宿主細胞を培養することによって、所望の発現産物を産生することができる。
【００３３】
本発明において、「宿主細胞」という用語は、通常、本発明に記載の核酸分子からなるプラスミドもしくはベクターを含有可能か、既に含有中であり、または本発明に記載のタンパク質ヘテロ二量体を発現可能な単一細胞、細胞株または細胞培養物を指す。上記の細胞は、単一宿主細胞の子世代を含んでよい。子世代の細胞は、天然的、非予期的若しくは意図的な突然変異によって、形態またはゲノムについて本来の親細胞とかならずしも完全に同一ではないかもしれないが、本発明に記載のタンパク質ヘテロ二量体を発現すればよい。上記した宿主細胞は、本発明に記載のベクターを利用して、該宿主細胞をインビトロでトランスフェクトすることにより得られる。本発明において、本発明に記載のタンパク質ヘテロ二量体を発現可能な宿主細胞は、発現ベクターウイルスでB16(rtTA)腫瘍細胞または293A細胞をトランスフェクトすることによって得られる。
【００３４】
本発明において、「薬学的に許容可能な担体」という用語は、通常、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、親水ポリマー、アミノ酸、糖、キレート剤、対イオン、金属複合体および/または非イオン界面活性剤などを含みうる医薬組成物の画分の一つであることを指す。例えば、上記の薬学的に許容可能な担体は、例えば、澱粉、デキストリン、スクロース、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、カルボキシメチルセルロース、滑石粉、アルギン酸カルシウムゲル、キトサンおよびナノ粒子などからなる群から選ばれる賦形剤を含んでよい。例えば、上記の薬学的に許容可能な担体は、さらに、pH調節剤、浸透圧調整剤、可溶化剤および静菌剤からなる群から選ばれる。
【００３５】
本発明において、「腫瘍」という用語は、通常、細胞増殖や生存の制御不能によって代表的に特徴付けられる哺乳動物の生理状態を指すか、また記述する。例えば、腫瘍は、肺癌、食道がん、胃癌、結腸直腸癌、肝臓がん、乳がん、子宮頸癌、甲状腺がん、脳および中枢神経系がん、膵臓癌、口腔がん、鼻咽頭癌、頭頚部癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺がん、精巣がん、腎臓がん、膀胱がん、眼瞼腫瘍、白血病およびリンパ腫より構成される群から選ばれてよい。
【００３６】
タンパク質ヘテロ二量体
一方で、本発明は、IL12aと上記のIL12aに融合する第1因子を含有する第1ポリペプチド鎖、および、IL12bと上記のIL12bに融合する第2因子を含有する上記の第1ポリペプチド鎖と異なる第2ポリペプチド鎖を有し、ここで、上記の第1因子と上記の第2因子は、それぞれ独立してIL2、GMCSF、IL7、IL15、IL21およびFLT3Lからなる群から選ばれるタンパク質ヘテロ二量体を提供する。
【００３７】
本発明においては、上記の第1因子は、上記の第2因子と異なってもよい。本発明においては、上記のタンパク質ヘテロ二量体は、上記のサイトカイン、すなわち、IL12、IL2、GMCSF、IL7、IL15、IL21およびFLT3Lのうちの2種類または多種類を、遺伝子組換え技術によって融合したサイトカイン融合タンパク質でありうる。上記のタンパク質ヘテロ二量体は、そのサイトカインを構成する固有の生物学的活性を有してよく、また、さらに生物学的活性の相補および協同効果によって、単一のサイトカインの有しない生物学的機能を発揮するか、ひいては、いくつかの新たな構造および生物学的機能も生じうる。
【００３８】
本発明においては、上記の第1因子と上記の第2因子は、互いに異なって、それぞれIL2、IL7、IL15およびIL21からなる群から選ばれるサイトカイン群AとGMCSFおよびFLT3Lからなる群から選ばれるサイトカイン群Bから選ばれる。
【００３９】
例えば、第1因子はサイトカイン群AのIL2、かつ、第2因子はサイトカイン群BのGMCSFが選ばれ；または、第1因子はサイトカイン群AのIL7、かつ、第2因子はサイトカイン群BのGMCSFが選ばれ；または、第1因子はサイトカイン群AのIL15、かつ、第2因子はサイトカイン群BのGMCSFが選ばれ；または、第1因子はサイトカイン群AのIL21、かつ、第2因子はサイトカイン群BのGMCSFが選ばれ；または、第1因子はサイトカイン群AのIL2、かつ、第2因子はサイトカイン群BのFLT3Lが選ばれ；または、第1因子はサイトカイン群AのIL7、かつ、第2因子はサイトカイン群BのFLT3Lが選ばれ；または、第1因子はサイトカイン群AのIL15、かつ、第2因子はサイトカイン群BのFLT3Lが選ばれ；または、第1因子はサイトカイン群AのIL21、かつ、第2因子はサイトカイン群BのFLT3Lが選ばれ；または、第2因子はサイトカイン群AのIL2、かつ、第1因子はサイトカイン群BのGMCSFが選ばれ；または、第2因子はサイトカイン群AのIL7、かつ、第1因子はサイトカイン群BのGMCSFが選ばれ；または、第2因子はサイトカイン群AのIL15、かつ、第1因子はサイトカイン群BのGMCSFが選ばれ；または、第2因子はサイトカイン群AのIL21、かつ、第1因子はサイトカイン群BのGMCSFが選ばれ；または、第2因子はサイトカイン群AのIL2、かつ、第1因子はサイトカイン群BのFLT3Lが選ばれ；または、第2因子はサイトカイン群AのIL7、かつ、第1因子はサイトカイン群BのFLT3Lが選ばれ；または、第2因子はサイトカイン群AのIL15、かつ、第1因子はサイトカイン群BのFLT3Lが選ばれ；または、第2因子はサイトカイン群AのIL21、かつ、第1因子はサイトカイン群BのFLT3Lが選ばれてよい。
【００４０】
本発明においては、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのC末端は、上記の第1因子のN末端に直接的もしくは間接的に融合しうる。例えば、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのC末端は、IL2のN端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのC末端は、IL7のN端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのC末端は、IL15のN端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのC末端は、IL21のN端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのC末端は、GMCSFのN端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのC末端は、FLT3LのN端に直接的もしくは間接的に融合しうる。
【００４１】
本発明においては、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのN末端は、上記の第1因子のC末端に直接的もしくは間接的に融合しうる。例えば、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのN末端は、IL2のC端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのN末端は、IL7のC端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのN末端は、IL15のC端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのN末端は、IL21のC端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのN末端は、GMCSFのC端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第1ポリペプチド鎖において、上記のIL12aのN末端は、FLT3LのC端に直接的もしくは間接的に融合しうる。
【００４２】
本発明においては、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのC末端は、上記の第2因子のN末端に直接的もしくは間接的に融合しうる。例えば、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのC末端は、IL2のN端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのC末端は、IL7のN端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのC末端は、IL15のN端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのC末端は、IL21のN端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのC末端は、GMCSFのN端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのC末端は、FLT3LのN端に直接的もしくは間接的に融合しうる。
【００４３】
本発明においては、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのN末端は、上記の第2因子のC末端に直接的もしくは間接的に融合しうる。例えば、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのN末端は、IL2のC端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのN末端は、IL7のC端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのN末端は、IL15のC端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのN末端は、IL21のC端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのN末端は、GMCSFのC端に直接的もしくは間接的に融合し；または、上記の第2ポリペプチド鎖において、上記のIL12bのN末端は、FLT3LのC端に直接的もしくは間接的に融合しうる。
本発明においては、上記のタンパク質ヘテロ二量体は、以上の上記のサイトカイン全部の位置結合関係の任意の順列組合を含んでよい。
本発明においては、上記の第1因子と上記の第2因子は、
1）第1因子がIL2であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
2）第1因子がIL7であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
3）第1因子がIL15であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
4）第1因子がIL21であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
5）第1因子がIL2であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
6）第1因子がIL7であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
7）第1因子がIL15であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
8）第1因子がIL21であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
9）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL2であり；
10）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL7であり；
11）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL15であり；
12）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL21であり；
13）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL2であり；
14）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL7であり；
15）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL15であり；および
16）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL21である群から選ばれてよい。
【００４４】
本発明においては、上記のIL12aと上記の第1因子間、および/または上記のIL12bと上記の第2因子間は、C-ペプチドにより結合可能である。例えば、上記のC-ペプチドのアミノ酸配列は、例えばSEQ ID.17で表されてよい。
【００４５】
本発明においては、上記のIL12aと上記のIL12bは、ジスルフィド結合により共有結合しうる。本発明においては、上記の第1ポリペプチド鎖と上記の第2ポリペプチド鎖間は、IL12aとIL12b間におけるジスルフィド結合によって、上記のタンパク質ヘテロ二量体を結合して形成することができる。ある実施形態において、上記の第1ポリペプチド鎖と上記の第2ポリペプチド鎖をコードするヌクレオチド配列間は、自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んでよい。例えば、前述したヌクレオチド配列を有する発現ベクターが転写され、翻訳が完了後、上記の自己切断ペプチドの位置が切断されることによって、上記の第1ポリペプチド鎖と上記の第2ポリペプチド鎖を含むジスルフィドにより結合形成される上記のタンパク質ヘテロ二量体を構成する。ある実施形態において、発現ベクターを作成する場合に、上記の第1ポリペプチド鎖と上記の第2ポリペプチド鎖間は、2A自己切断ペプチドまたはフレキシブルアミノ酸リンカーペプチドにより結合される。例えば、上記の2A自己切断ペプチドのアミノ酸配列は例えばSEQ ID NO. 58、上記の2A自己切断ペプチドをコードするヌクレオチド配列は例えばSEQ ID NO. 59で表されてよい。また、例えば、上記のフレキシブルアミノ酸リンカーペプチドのアミノ酸配列は、例えばSEQ ID. 17で表されてよい。
【００４６】
ある実施形態において、上記の第1ポリペプチド鎖と上記の第2ポリペプチド鎖間は、上記のC-ペプチドを含んでよい。
【００４７】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL12aのC端は、IL2のN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、IL12bのC端は、GMCSFのN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL12a-IL2-IL12b-GMCSFタンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００４８】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL2のC端は、IL12aのN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、IL12bのC端は、GMCSFのN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL2-IL12a-IL12b-GMCSFタンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００４９】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL12aのC端は、IL2のN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、GMCSFのC端は、IL12bのN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL12a-IL2-GMCSF-IL12bタンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００５０】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL2のC端は、IL12aのN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、GMCSFのC端は、IL12bのN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL2-IL12a-GMCSF-IL12bタンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００５１】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL12aのC端は、GMCSFのN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、IL12bのC端は、IL2のN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL12a-GMCSF-IL12b-IL2タンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００５２】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL12aのC端は、IL7のN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、IL12bのC端は、GMCSFのN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL12a-IL7-IL12b-GMCSFタンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００５３】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL12aのC端は、IL15のN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、IL12bのC端は、GMCSFのN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL12a-IL15-IL12b-GMCSFタンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００５４】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL12aのC端は、IL21のN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、IL12bのC端は、GMCSFのN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL12a-IL21-IL12b-GMCSFタンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００５５】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL12aのC端は、IL2のN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、IL12bのC端は、FLT3LのN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL12a-IL2-IL12b-FLT3Lタンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００５６】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL12aのC端は、IL7のN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、IL12bのC端は、FLT3LのN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL12a-IL7-IL12b-FLT3Lタンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００５７】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL12aのC端は、IL15のN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、IL12bのC端は、FLT3LのN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL12a-IL15-IL12b-FLT3Lタンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００５８】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、IL12aのC端は、IL21のN端に融合して第1ポリペプチド鎖を形成し、かつ、IL12bのC端は、FLT3LのN端に融合して第2ポリペプチド鎖を形成することによって、IL12a-IL21-IL12b-FLT3Lタンパク質ヘテロ二量体を形成することができる。
【００５９】
本発明においては、上記のIL12a、上記のIL12b、上記の第1因子および上記の第2因子は、哺乳動物に由来してよい。例えば、上記の哺乳動物は、ヒト、マウス、ラット、サル、イヌ、ブタ、ヤギ、ウシならびにネコからなる群から選ばれてよい。本発明においては、上記の哺乳動物は、ヒト、マウスからなる群から選ばれてよい。例えば、上記のIL12a、IL12b、IL2、GMCSF、IL7、IL15、IL21およびFLT3Lは、マウスから選ばれてよく、上記のマウス由来IL12a、IL12b、IL2、GMCSF、IL7、IL15、IL21およびFLT3Lは、mIL12a、mIL12b、mIL2、mGMCSF、mIL7、mIL15、mIL21およびmFLT3Lと略称されてよい。例えば、上記のIL12a、IL12b、IL2、GMCSF、IL7、IL15、IL21およびFLT3Lは、ヒトから選ばれてよく、上記のヒト由来IL12a、IL12b、IL2、GMCSF、IL7、IL15、IL21およびFLT3Lは、hIL12a、hIL12b、hIL2、hGMCSF、hIL7、hIL15、hIL21およびhFLT3Lと略称されてよい。
【００６０】
本発明においては、上記のIL12a、上記のIL12b、上記の第1因子と上記の第2因子は、由来が同一であってよい。
【００６１】
本発明においては、上記の第1ポリペプチド鎖は、例えばSEQ ID NO. 60〜65およびSEQ ID NO. 70〜73のいずれかで表される配列を有してよい。
【００６２】
本発明においては、上記の第2ポリペプチド鎖は、例えばSEQ ID NO. 66〜69およびSEQ ID NO. 74〜75のいずれかで表される配列を有してよい。
本発明においては、上記のタンパク質ヘテロ二量体は、例えばSEQ ID NO. 18〜37のいずれかで表される配列を有してよい。
【００６３】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL12aのC端は、mIL2のN端に融合してmIL12a-mIL2第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 60で表される）を形成し、かつ、mIL12bのC端は、mGMCSFのN端に融合してmIL12b-mGMCSF第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 66で表される）を形成することによって、mIL12a-mIL2-mIL12b-mGMCSFタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 18で表される）を形成することができる。
【００６４】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL2のC端は、mIL12aのN端に融合してmIL2-mIL12a第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 61で表される）を形成し、かつ、mIL12bのC端は、mGMCSFのN端に融合してmIL12b-mGMCSF第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 66で表される）を形成することによって、mIL2-mIL12a-mIL12b-mGMCSFタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 19で表される）を形成することができる。
【００６５】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL12aのC端は、mIL2のN端に融合してmIL12a-mIL2第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 60で表される）を形成し、かつ、mGMCSFのC端は、mIL12bのN端に融合してmGMCSF-mIL12b第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 67で表される）を形成することによって、mIL12a-mIL2-mGMCSF-mIL12bタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 20で表される）を形成することができる。
【００６６】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL2のC端は、mIL12aのN端に融合してmIL2-mIL12a第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 61で表される）を形成し、かつ、mGMCSFのC端は、mIL12bのN端に融合してmGMCSF-mIL12b第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 67で表される）を形成することによって、mIL2-mIL12a-mGMCSF-mIL12bタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 21で表される）を形成することができる。
【００６７】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL12aのC端は、mGMCSFのN端に融合してmIL12a-mGMCSF第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 62で表される）を形成し、かつ、mIL12bのC端は、mIL2のN端に融合してmIL12b-mIL2第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 68で表される）を形成することによって、mIL12a-mGMCSF-mIL12b-mIL2タンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 22で表される）を形成することができる。
【００６８】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL12aのC端は、mIL7のN端に融合してmIL12a-mIL7第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 63で表される）を形成し、かつ、mIL12bのC端は、mGMCSFのN端に融合してmIL12b-mGMCSF第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 66で表される）を形成することによって、mIL12a-mIL7-mIL12b-mGMCSFタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 23で表される）を形成することができる。
【００６９】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL12aのC端は、mIL15のN端に融合してmIL12a-mIL15第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 64で表される）を形成し、かつ、mIL12bのC端は、mGMCSFのN端に融合してmIL12b-mGMCSF第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 66で表される）を形成することによって、mIL12a-mIL15-mIL12b-mGMCSFタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 24で表される）を形成することができる。
【００７０】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL12aのC端は、mIL21のN端に融合してmIL12a-mIL21第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 65で表される）を形成し、かつ、mIL12bのC端は、mGMCSFのN端に融合してmIL12b-mGMCSF第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 66で表される）を形成することによって、mIL12a-mIL21-mIL12b-mGMCSFタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 25で表される）を形成することができる。
【００７１】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL12aのC端は、mIL2のN端に融合してmIL12a-mIL2第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 60で表される）を形成し、かつ、mIL12bのC端は、mFLT3LのN端に融合してmIL12b-mFLT3L第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 69で表される）を形成することによって、mIL12a-mIL2-mIL12b-mFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 26で表される）を形成することができる。
【００７２】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL12aのC端は、mIL7のN端に融合してmIL12a-mIL7第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 63で表される）を形成し、かつ、mIL12bのC端は、mFLT3LのN端に融合してmIL12b-mFLT3L第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 69で表される）を形成することによって、mIL12a-mIL7-mIL12b-mFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 27で表される）を形成することができる。
【００７３】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL12aのC端は、mIL15のN端に融合してmIL12a-mIL15第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 64で表される）を形成し、かつ、mIL12bのC端は、mFLT3LのN端に融合してmIL12b-mFLT3L第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 69で表される）を形成することによって、mIL12a-mIL15-mIL12b-mFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 28で表される）を形成することができる。
【００７４】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、mIL12aのC端は、mIL21のN端に融合してmIL12a-mIL21第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 65で表される）を形成し、かつ、mIL12bのC端は、mFLT3LのN端に融合してmIL12b-mFLT3L第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 69で表される）を形成することによって、mIL12a-mIL21-mIL12b-mFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 29で表される）を形成することができる。
【００７５】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、hIL12aのC端は、hIL2のN端に融合してhIL12a-hIL2第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 70で表される）を形成し、かつ、hIL12bのC端は、hGMCSFのN端に融合してhIL12b-hGMCSF第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 74で表される）を形成することによって、hIL12a-hIL2-hIL12b-hGMCSFタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 30で表される）を形成することができる。
【００７６】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、hIL12aのC端は、hIL7のN端に融合してhIL12a-hIL7第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 71で表される）を形成し、かつ、hIL12bのC端は、hGMCSFのN端に融合してhIL12b-hGMCSF第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 74で表される）を形成することによって、hIL12a-hIL7-hIL12b-hGMCSFタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 31で表される）を形成することができる。
【００７７】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、hIL12aのC端は、hIL15のN端に融合してhIL12a-hIL15第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 72で表される）を形成し、かつ、hIL12bのC端は、hGMCSFのN端に融合してhIL12b-hGMCSF第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 74で表される）を形成することによって、hIL12a-hIL15-hIL12b-hGMCSFタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 32で表される）を形成することができる。
【００７８】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、hIL12aのC端は、hIL21のN端に融合してhIL12a-hIL21第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 73で表される）を形成し、かつ、hIL12bのC端は、hGMCSFのN端に融合してhIL12b-hGMCSF第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 74で表される）を形成することによって、hIL12a-hIL21-hIL12b-hGMCSFタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 33で表される）を形成することができる。
【００７９】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、hIL12aのC端は、hIL2のN端に融合してhIL12a-hIL2第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 70で表される）を形成し、かつ、hIL12bのC端は、hFLT3LのN端に融合してhIL12b-hFLT3L第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 75で表される）を形成することによって、hIL12a-hIL2-hIL12b-hFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 34で表される）を形成することができる。
【００８０】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、hIL12aのC端は、hIL7のN端に融合してhIL12a-hIL7第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 71で表される）を形成し、かつ、hIL12bのC端は、hFLT3LのN端に融合してhIL12b-hFLT3L第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 75で表される）を形成することによって、hIL12a-hIL7-hIL12b-hFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 35で表される）を形成することができる。
【００８１】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、hIL12aのC端は、hIL15のN端に融合してhIL12a-hIL15第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 72で表される）を形成し、かつ、hIL12bのC端は、hFLT3LのN端に融合してhIL12b-hFLT3L第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 75で表される）を形成することによって、hIL12a-hIL15-hIL12b-hFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 36で表される）を形成することができる。
【００８２】
例えば、上記のタンパク質ヘテロ二量体において、hIL12aのC端は、hIL21のN端に融合してhIL12a-hIL21第1ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 73で表される）を形成し、かつ、hIL12bのC端は、hFLT3LのN端に融合してhIL12b-hFLT3L第2ポリペプチド鎖（配列が、例えばSEQ ID NO. 75で表される）を形成することによって、hIL12a-hIL21-hIL12b-hFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体（配列が、例えばSEQ ID NO. 37で表される）を形成することができる。
【００８３】
本発明においては、上記のmIL12a-mIL2-mIL12b-mGMCSF、mIL2-mIL12a-mIL12b-mGMCSF、mIL12a-mIL2-mGMCSF-mIL12b、mIL2-mIL12a-mGMCSF-mIL12b、mIL12a-mGMCSF-mIL12b-mIL2、mIL12a-mIL7-mIL12b-mGMCSF、mIL12a-mIL15-mIL12b-mGMCSF、mIL12a-mIL21-mIL12b-mGMCSF、mIL12a-mIL2-mIL12b-mFLT3L、mIL12a-mIL7-mIL12b-mFLT3L、mIL12a-mIL15-mIL12b-mFLT3L、mIL12a-mIL21-mIL12b-mFLT3L、hIL12a-hIL2-hIL12b-hGMCSF、hIL12a-hIL7-hIL12b-hGMCSF、hIL12a-hIL15-hIL12b-hGMCSF、hIL12a-hIL21-hIL12b-hGMCSF、hIL12a-hIL2-hIL12b-hFLT3L、hIL12a-hIL7-hIL12b-hFLT3L、hIL12a-hIL15-hIL12b-hFLT3LおよびhIL12a-hIL21-hIL12b-hFLT3Lは、それぞれmIL12aIL2IL12bGMCSF、mIL2IL12aIL12bGMCSF、mIL12aIL2GMCSFIL12b、mIL2IL12aGMCSFIL12b、mIL12aGMCSFIL12bIL2、mIL12aIL7IL12bGMCSF、mIL12aIL15IL12bGMCSF、mIL12aIL21IL12bGMCSF、mIL12aIL2IL12bFLT3L、mIL12aIL7IL12bFLT3L、mIL12aIL15IL12bFLT3L、mIL12aIL21IL12bFLT3L、hIL12aIL2IL12bGMCSF、hIL12aIL7IL12bGMCSF、hIL12aIL15IL12bGMCSF、hIL12aIL21IL12bGMCSF、hIL12aIL2IL12bFLT3L、hIL12aIL7IL12bFLT3L、hIL12aIL15IL12bFLT3LおよびhIL12aIL21IL12bFLT3Lと順次に簡単に呼ばれてよい。前述したタンパク質ヘテロ二量体の構造は、例えば図2で表されてよい。
【００８４】
本発明においては、上記のタンパク質ヘテロ二量体は、腫瘍を治療するために用いられる。
【００８５】
他方で、本発明は、腫瘍を治療するために用いられる医薬品の調製における上記のタンパク質ヘテロ二量体の使用を提供する。
【００８６】
上記の腫瘍は、黒色腫、肺癌、食道がん、胃癌、結腸直腸癌、肝臓がん、乳がん、子宮頸癌、甲状腺がん、脳および中枢神経系がん、膵臓癌、口腔がん、鼻咽頭癌、頭頚部癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺がん、精巣がん、腎臓がん、膀胱がん、眼瞼腫瘍、白血病およびリンパ腫からなる群から選ばれてよい。
【００８７】
核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物および調製方法
他方で、本発明は、１種類または多種類の単離された核酸分子であって、上記のタンパク質ヘテロ二量体をコードすることができる核酸分子を提供する。例えば、上記の核酸分子は、例えばSEQ ID NO. 38-57のいずれかで表される配列を有しうる。例えば、上記のmIL12aIL2IL12bGMCSF、mIL2IL12aIL12bGMCSF、mIL12aIL2GMCSFIL12b、mIL2IL12aGMCSFIL12b、mIL12aGMCSFIL12bIL2、mIL12aIL7IL12bGMCSF、mIL12aIL15IL12bGMCSF、mIL12aIL21IL12bGMCSF、mIL12aIL2IL12bFLT3L、mIL12aIL7IL12bFLT3L、mIL12aIL15IL12bFLT3L、mIL12aIL21IL12bFLT3L、hIL12aIL2IL12bGMCSF、hIL12aIL7IL12bGMCSF、hIL12aIL15IL12bGMCSF、hIL12aIL21IL12bGMCSF、hIL12aIL2IL12bFLT3L、hIL12aIL7IL12bFLT3L、hIL12aIL15IL12bFLT3LおよびhIL12aIL21IL12bFLT3Lをコードするヌクレオチド配列は、それぞれがSEQ ID NO. 38、SEQ ID NO. 39、SEQ ID NO. 40、SEQ ID NO. 41、SEQ ID NO. 42、SEQ ID NO. 43、SEQ ID NO. 44、SEQ ID NO. 45、SEQ ID NO. 46、SEQ ID NO. 47、SEQ ID NO. 48、SEQ ID NO. 49、SEQ ID NO. 50、SEQ ID NO. 51、SEQ ID NO. 52、SEQ ID NO. 53、SEQ ID NO. 54、SEQ ID NO. 55、SEQ ID NO. 56およびSEQ ID NO. 57でありうる。
【００８８】
本発明において、上記の核酸分子は、腫瘍を治療するために用いられる。
【００８９】
他方で、本発明は、腫瘍を治療するために用いられる医薬品の調製における上記の核酸分子の使用を提供する。
【００９０】
上記の腫瘍は、黒色腫、肺癌、食道がん、胃癌、結腸直腸癌、肝臓がん、乳がん、子宮頸癌、甲状腺がん、脳および中枢神経系がん、膵臓癌、口腔がん、鼻咽頭癌、頭頚部癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺がん、精巣がん、腎臓がん、膀胱がん、眼瞼腫瘍、白血病およびリンパ腫からなる群から選ばれてよい。
【００９１】
他方で、本発明は、上記のタンパク質ヘテロ二量体をコードするヌクレオチド配列を有しうる発現ベクターを提供する。本発明においては、それぞれmIL12aIL2IL12bGMCSF、mIL2IL12aIL12bGMCSF、mIL12aIL2GMCSFIL12b、mIL2IL12aGMCSFIL12b、mIL12aGMCSFIL12bIL2、mIL12aIL7IL12bGMCSF、mIL12aIL15IL12bGMCSF、mIL12aIL21IL12bGMCSF、mIL12aIL2IL12bFLT3L、mIL12aIL7IL12bFLT3L、mIL12aIL15IL12bFLT3LおよびmIL12aIL21IL12bFLT3Lをコードするヌクレオチド配列を、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROヌクレオチド配列に挿入することによって、調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL2IL12bGMCSF-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL2IL12aIL12bGMCSF-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL2GMCSFIL12b-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL2IL12aGMCSFIL12b-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aGMCSFIL12bIL2-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL7IL12bGMCSF-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL15IL12bGMCSF-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL21IL12bGMCSF-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL2IL12bFLT3L-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL7IL12bFLT3L-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL15IL12bFLT3L-PGK-PUROおよびpLentis-PTRE-mIL12aIL21IL12bFLT3L-PGK-PUROを構築することができる。例えば、それぞれhIL12aIL2IL12bGMCSF、hIL12aIL7IL12bGMCSF、hIL12aIL15IL12bGMCSF、hIL12aIL21IL12bGMCSF、hIL12aIL2IL12bFLT3L、hIL12aIL7IL12bFLT3L、hIL12aIL15IL12bFLT3LおよびhIL12aIL21IL12bFLT3Lを、pLentis-CMV-MCS-IRES-PUROに挿入することによって、発現ベクターpLentis-CMV-hIL12aIL2IL12bGMCSF-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL7IL12bGMCSF-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL15IL12bGMCSF-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL21IL12bGMCSF-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL2IL12bFLT3L-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL7IL12bFLT3L-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL15IL12bFLT3L-IRES-PUROおよびpLentis-CMV-hIL12aIL21IL12bFLT3L-IRES-PUROを構築することができる。
【００９２】
本発明において、上記の発現ベクターは、腫瘍を治療するために用いられる。
【００９３】
他方で、本発明は、腫瘍を治療するために用いられる医薬品の調製における上記の発現ベクターの使用を提供する。上記の腫瘍は、黒色腫、肺癌、食道がん、胃癌、結腸直腸癌、肝臓がん、乳がん、子宮頸癌、甲状腺がん、脳および中枢神経系がん、膵臓癌、口腔がん、鼻咽頭癌、頭頚部癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺がん、精巣がん、腎臓がん、膀胱がん、眼瞼腫瘍、白血病およびリンパ腫からなる群から選ばれてよい。
【００９４】
本発明においては、例えばタンパク質をコードする遺伝子をベクターおよびプラスミドに挿入する方法またはプラスミドを宿主細胞に導入する方法などのベクターおよびプラスミドの構築方法は、当該技術分野における当業者にとって周知であり、また、Sambrook, J., Fritsch, E．F． and Maniais、T．(1989) Molecular Cloning： A Laboratory Manual、2nd edition、Cold spring Harbor Laboratory Pressを含めて、多数の刊行物に記載されている。
【００９５】
他方で、本発明は、上記の発現ベクターを有しうる宿主細胞を提供する。本発明においては、上記の宿主細胞は、上記の発現ベクターでB16(rtTA)腫瘍細胞をトランスフェクトすることによって調製されてよい。例えば、それぞれpLentis-PTRE-mIL12aIL2IL12bGMCSF-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL2IL12aIL12bGMCSF-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL2GMCSFIL12b-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL2IL12aGMCSFIL12b-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aGMCSFIL12bIL2-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL7IL12bGMCSF-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL15IL12bGMCSF-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL21IL12bGMCSF-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL2IL12bFLT3L-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL7IL12bFLT3L-PGK-PURO、pLentis-PTRE-mIL12aIL15IL12bFLT3L-PGK-PUROおよびpLentis-PTRE-mIL12aIL21IL12bFLT3L-PGK-PURO発現ベクターウイルスでB16(rtTA)腫瘍細胞をトランスフェクトすることによって、B16(rtTA)-mIL12aIL2IL12bGMCSF、B16(rtTA)-mIL2IL12aIL12bGMCSF、B16(rtTA)-mIL12aIL2GMCSFIL12b、B16(rtTA)-mIL2IL12aGMCSFIL12b、B16(rtTA)-mIL12aGMCSFIL12bIL2、B16(rtTA)-mIL12aIL7IL12bGMCSF、B16(rtTA)-mIL12aIL15IL12bGMCSF、B16(rtTA)-mIL12aIL21IL12bGMCSF、B16(rtTA)-mIL12aIL2IL12bFLT3L、B16(rtTA)-mIL12aIL7IL12bFLT3L、B16(rtTA)-mIL12aIL15IL12bFLT3LおよびB16(rtTA)-mIL12aIL21IL12bFLT3L宿主細胞が得られる。例えば、それぞれpLentis-CMV-hIL12aIL2IL12bGMCSF-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL7IL12bGMCSF-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL15IL12bGMCSF-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL21IL12bGMCSF-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL2IL12bFLT3L-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL7IL12bFLT3L-IRES-PUROおよびpLentis-CMV-hIL12aIL15IL12bFLT3L-IRES-PURO、pLentis-CMV-hIL12aIL21IL12bFLT3L-IRES-PURO発現ベクターウイルスで、293A細胞をトランスフェクトすることによって、293A-hIL12aIL2IL12bGMCSF、293A-hIL12aIL7IL12bGMCSF、293A-hIL12aIL15IL12bGMCSF、293A-hIL12aIL21IL12bGMCSF、293A-hIL12aIL2IL12bFLT3L、293A-hIL12aIL7IL12bFLT3L、293A-hIL12aIL15IL12bFLT3Lおよび293A-hIL12aIL21IL12bFLT3L宿主細胞が得られる。
【００９６】
本発明において、上記の宿主細胞は、腫瘍を治療するために用いられる。上記の腫瘍は、黒色腫、肺癌、食道がん、胃癌、結腸直腸癌、肝臓がん、乳がん、子宮頸癌、甲状腺がん、脳および中枢神経系がん、膵臓癌、口腔がん、鼻咽頭癌、頭頚部癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺がん、精巣がん、腎臓がん、膀胱がん、眼瞼腫瘍、白血病およびリンパ腫からなる群から選ばれてよい。
【００９７】
他方で、本発明は、腫瘍を治療するために用いられる医薬品の調製における上記の宿主細胞の使用を提供する。上記の腫瘍は、黒色腫、肺癌、食道がん、胃癌、結腸直腸癌、肝臓がん、乳がん、子宮頸癌、甲状腺がん、脳および中枢神経系がん、膵臓癌、口腔がん、鼻咽頭癌、頭頚部癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺がん、精巣がん、腎臓がん、膀胱がん、眼瞼腫瘍、白血病およびリンパ腫からなる群から選ばれてよい。
【００９８】
本発明は、腫瘍を治療するために用いられるタンパク質ヘテロ二量体、核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、医薬組成物を提供する。
【００９９】
必要な受験者に対して本発明に記載のタンパク質ヘテロ二量体、核酸分子、発現ベクター、宿主細胞および/または医薬組成物を投与するステップを含む腫瘍を治療する方法である。
【０１００】
上記の腫瘍は、黒色腫、肺癌、食道がん、胃癌、結腸直腸癌、肝臓がん、乳がん、子宮頸癌、甲状腺がん、脳および中枢神経系がん、膵臓癌、口腔がん、鼻咽頭癌、頭頚部癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺がん、精巣がん、腎臓がん、膀胱がん、眼瞼腫瘍、白血病およびリンパ腫からなる群から選ばれてよい。
【０１０１】
他方で、本発明は、上記のタンパク質ヘテロ二量体を発現可能な場合に、上記の宿主細胞を培養するステップを含む上記のタンパク質ヘテロ二量体を調製する方法を提供する。
【０１０２】
医薬組成物およびその使用
他方で、本発明は、上記のタンパク質ヘテロ二量体、上記の核酸分子、上記のベクターおよび/または上記の宿主細胞、ならびに薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物を提供する。
【０１０３】
上記の薬学的に許容可能な担体は、緩衝剤、酸化防止剤、防腐剤、低分子量ポリペプチド、タンパク質、親水ポリマー、アミノ酸、糖、キレート剤、対イオン、金属複合体および/または非イオン界面活性剤などを含んでよい。例えば、上記の薬学的に許容可能な担体は、例えば、澱粉、デキストリン、スクロース、乳糖、ステアリン酸マグネシウム、硫酸カルシウム、カルボキシメチルセルロース、滑石粉、アルギン酸カルシウムゲル、キトサンおよびナノ粒子などからなる群から選ばれる賦形剤を含んでよい。例えば、上記の薬学的に許容可能な担体は、さらに、pH調節剤、浸透圧調整剤、可溶化剤および静菌剤からなる群から選ばれる。
【０１０４】
本発明においては、上記の医薬組成物は、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位におけるin situ投与、吸入、直腸投与、膣内投与、経皮投与又は皮下貯蔵部による投与のために調製されることができる。
【０１０５】
本発明においては、上記の医薬組成物は、腫瘍を治療するために用いられる。上記の腫瘍は、黒色腫、肺癌、食道がん、胃癌、結腸直腸癌、肝臓がん、乳がん、子宮頸癌、甲状腺がん、脳および中枢神経系がん、膵臓癌、口腔がん、鼻咽頭癌、頭頚部癌、喉頭癌、骨癌、皮膚癌、卵巣癌、前立腺がん、精巣がん、腎臓がん、膀胱がん、眼瞼腫瘍、白血病およびリンパ腫からなる群から選ばれてよい。
【０１０６】
本発明においては、上記の医薬組成物は、腫瘍成長の抑制に用いられる。例えば、本発明の医薬組成物は、疾患の発展や進行を抑制または遅延するか、サイトカインの発現を促すことによって腫瘍の大きさを低減したり（ひいては、基本的に腫瘍を消去する）、及び/又は、疾患状態を低減及び/又は安定させることができる。
【０１０７】
本発明においては、上記の医薬組成物は、治療有効量の上記のタンパク質ヘテロ二量体、上記の核酸分子、上記のベクターおよび/または上記の宿主細胞を含んで良い。上記の治療有効量は、進行リスクをかかるまたは有する被験者の疾患や病気（例えばがん）及び/又はその任意の合併症を予防及び/又は治療（少なくとも一部治療）するための用量である。
【０１０８】
他方で、本発明は、上記のタンパク質ヘテロ二量体、上記の核酸分子、上記の発現ベクター、上記の宿主細胞および/または上記の医薬組成物を投与することが含まれる腫瘍の寛解または治療方法を提供する。
【０１０９】
本発明においては、上記の投与方法は、経口投与、静脈内投与、筋肉内投与、腫瘍部位におけるin situ投与、吸入、直腸投与、膣内投与、経皮投与又は皮下貯蔵部による投与を含んでよい。
【実施例】
【０１１０】
以下の実施例は、本発明の具体的請求項を説明するためのものに過ぎなく、いかなる形態で本明細書または請求項の範囲を限定するものではない。
【０１１１】
実施例
試薬：DMEM培地、1640培地、ウシ胎児血清は、lifetechnologies社から購入され、細胞培養瓶、培養プレートは、Corning社から購入され、ドキシサイクリン(DOX)は、上海生工バイオエンジニアリング有限会社から購入され、ピューロマイシン（Puromycin）、Blasticidinは、Chemicon社から購入され、制限エンドヌクレアーゼは、TakarAとNEB社から購入され、リガーゼは、NEB社から購入され、DNAポリメラーゼは、Takara社から購入され、プラスミド抽出キット、ゲル回収キットは、OmegaBiotech社から購入され、プライマーは、上海生工バイオエンジニアリング有限会社により合成され、遺伝子は、ジェンスクリプト南京株式会社により合成され、ELISAキットは、Boster社から購入された。サイトカインmIL12、mGMCSF、mFLT3L、mIL2、mIL15、mIL21、mIL7、hIL12、hGMCSF、hFLT3L、hIL2、hIL15、hIL21およびhIL7は、Peprotech社から購入された。
【０１１２】
実施例において、一部の試験結果が図1、4〜6を参照する。図1および図4〜16において、各折線は、それぞれ1匹のマウスのインビボ腫瘍の面積状況を表し、例えば、5本の折線は、１回実験された5匹のマウスのデータを表し、分数は、腫瘍が除去されたマウス/腫瘍が接種されたマウスの比率を表し、例えば10/10は、腫瘍が除去されたマウス/腫瘍が接種されたマウスが10/10=100%であることを表す。
【０１１３】
実施例1  調節タンパク質を発現する腫瘍細胞の調製
1.1  第1発現ベクターpLentis-CMV-rtTA-IRES-Bsdの構築
両端にBamHIとEcoRI部位を持つようにrtTA（GenBank: ALK44378.1）のDNA配列を合成し、合成産物をベクターpUC57に連結した。上記のrtTAが連結されたpUC57ベクターを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、rtTAが連結されているpUC57ベクタープラスミド6 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μl、およびEcoRI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後rtTA断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１１４】
EPチューブ中でベクターpLentis-CMV-IRES-Bsdを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-CMV-IRES-Bsdベクタープラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μl、およびEcoRI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-CMV-IRES-Bsdベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１１５】
pLentis-CMV-IRES-BsdをrtTAに連結し、システムは、例えば、pLentis-CMV-IRES-Bsd 2 μl、rtTA 2 μl、リガーゼバッファー 1 μl、T4DNAリガーゼ 0.5 μl、および水 4.5 μlを、室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、rtTA断片のpLentis-CMV-IRES-Bsdベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第1発現ベクターpLentis-CMV-rtTA-IRES-Bsd構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１１６】
1.2  第1発現ベクターpLentis-CMV-rtTA-IRES-Bsdのウイルスの調製
1）培養された293FT細胞を消化してカウント後、3×106細胞/ウェルを10 cmシャーレに敷き広げ、培養液の体積が10 mlであった。
2）翌日の夜に、細胞状態を観察し、細胞が良い状態の場合、トランスフェクトを行った。培養プレートにクロロキンを最終濃度が25 μMになるまで入れて、1つの試験管を取り出し、総体積が1045 μlになるように滅菌水および以下のプラスミド（5 μg pMD2.G＋15 μg pSPAX2＋20 μg pLentis-CMV-rtTA-IRES-Bsd）を加えて、次に、2 M CaCl2を155 μl加えて均一混合し、最後、2×HBSを1200 μl加えて滴下しながら振盪し、滴下完了後、混合物を細胞培養ウェルに速やかに入れて、軽く振って均一混合した。
3）三日目の朝に、細胞状態を観察すると共に、培地を10 ml新鮮なDMEM培地に変更した。
【０１１７】
4）五日目の朝に、細胞状態を観察すると共に、シャーレの上清を採取して、0.45 μmフィルターでろ過し、次に、高速遠心分離チューブに入れて、50000 gで2時間遠心分離し、注意深く上清を廃棄して、吸取紙で液体をできるだけ吸いきれ、次に、500 μl HBSSでペレットを再懸濁させて溶解してから2時間後、細管に分けて-70℃で保管することによって、第1発現ベクターpLentis-CMV-rtTA-IRES-Bsdのウイルスが得られた。
【０１１８】
1.3  第1発現ベクターpLentis-CMV-rtTA-IRES-BsdのウイルスによるB16腫瘍細胞のトランスフェクト
培養されたマウス黒色腫細胞B16を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、第1発現ベクターpLentis-CMV-rtTA-IRES-Bsdのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、この細胞に適合な濃度でブラストサイジン（blasticidin）を加えて、培地を二日に1回程度交換すると共に、ブラストサイジンの濃度を8 μg/mlに保持するように培養を続け、スクリーニングしてから一週間後、生存している細胞が、調節タンパク質を安定に発現する細胞であって、B16(rtTA)と呼ばれた。
【０１１９】
実施例2  緑色蛍光タンパク質（GFP）発現誘導による腫瘍増殖への影響
2.1  緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする調節可能な発現ベクターの構築
プライマーを用いて、GFP遺伝子を鋳型としてPCR反応によりGFP遺伝子を増幅させ、PCR条件が、PrimeStarHSDNApolymerase取扱説明書に従って行われた。PCRは、アガロースゲル電気泳動後、ゲル回収キットで回収され、次に、BamHIとEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、PCR回収産物30 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlとEcoRI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後GFP遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１２０】
調節可能な発現ベクターを酵素消化し、システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROプラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μlとEcoRI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後ベクター断片を回収して、次の使用に備えた。pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをGFPに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、GFP 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlと水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-GFP-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１２１】
2.2  GFPを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターのウイルスの調製方法と同じようにして、GFP発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-GFP-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０１２２】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-GFP-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシン（puromycin）を加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、GFPを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-GFPと呼ばれた。
【０１２３】
2.3  GFP調節発現による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-GFP細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウス（北京華阜康バイオテクノロジー株式会社から購入）の右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況を記録し、結果から、例えば図1に示されるように、腫瘍増殖に対するGFP発現誘導による阻害作用がなかったこと（ここで、各折線がそれぞれ1匹のマウスのインビボ腫瘍の面積状況を表す）を示した。
【０１２４】
実施例3  タンパク質ヘテロ二量体の設計
設計は、mIL2IL12aIL12bGMCSF、mIL12aIL2GMCSFIL12b、mIL2IL12aGMCSFIL12b、mIL12aGMCSFIL12bIL2、mIL12aIL7IL12bGMCSF、mIL12aIL15IL12bGMCSF、mIL12aIL21IL12bGMCSF、mIL12aIL2IL12bFLT3L、mIL12aIL7IL12bFLT3L、mIL12aIL15IL12bFLT3L、mIL12aIL21IL12bFLT3L、hIL12aIL2IL12bGMCSF、hIL12aIL7IL12bGMCSF、hIL12aIL15IL12bGMCSF、hIL12aIL21IL12bGMCSF、hIL12aIL2IL12bFLT3L、hIL12aIL7IL12bFLT3L、hIL12aIL15IL12bFLT3LおよびhIL12aIL21IL12bFLT3Lのタンパク質ヘテロ二量体を含む。前述したタンパク質ヘテロ二量体の構造は、図2に示すようであった。
【０１２５】
実施例4  mIL12aIL2IL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
4.1  mIL12aIL2IL12bGMCSF調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL12aIL2IL12bGMCSFコード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL12aIL2IL12bGMCSFプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL12aIL2IL12bGMCSF遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１２６】
mIL12aIL2IL12bGMCSFタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 18で表され、上記のmIL12aIL2IL12bGMCSFをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 38で表される。
【０１２７】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクタープラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１２８】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL12aIL2IL12bGMCSFに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL12aIL2IL12bGMCSF 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL2IL12bGMCSF-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１２９】
4.2  mIL12aIL2IL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターのウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL12aIL2IL12bGMCSF発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL2IL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０１３０】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL2IL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL12aIL2IL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL12aIL2IL12bGMCSFと呼ばれた。
【０１３１】
4.3  mIL12aIL2IL12bGMCSFの発現誘導効果に対するインビトロ検出
B16(rtTA)-mIL12aIL2IL12bGMCSF細胞を、5×104/ウェルでを24ウェルプレートに敷き広げてから24時間後、ウェルに100 ng/mlのドキシサイクリン（DOX）を加えて、72時間培養し続けた後、上清を採取した。マウスIL12p70 ELISAキットにより上清における融合タンパク質発現レベルを検出し、操作がキット取扱説明書に従って行われた。DOXが加えられないことで誘導されていないウェルを対照とした。図3に示されるように、mIL12aIL2IL12bGMCSF融合タンパク質は、DOXが加えられることによって発現が誘導された。
【０１３２】
4.4  mIL12aIL2IL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL12aIL2IL12bGMCSF細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況と腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=10/10になり、図4に示されるように、mIL12aIL2IL12bGMCSFがすべてのマウスにおいて腫瘍退縮を誘導することができる。
【０１３３】
実施例5  mIL2IL12aIL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
5.1  mIL2IL12aIL12bGMCSF調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL2IL12aIL12bGMCSFF遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL2IL12aIL12bGMCSFプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL2IL12aIL12bGMCSF遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１３４】
mIL2IL12aIL12bGMCSFタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 19で表され、上記のmIL2IL12aIL12bGMCSFをコードするヌクレオチド配列は、SEQ ID NO. 39であった。
【０１３５】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクタープラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１３６】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL2IL12aIL12bGMCSFに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL2IL12aIL12bGMCSF 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL2IL12aIL12bGMCSF-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１３７】
5.2  mIL2IL12aIL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL2IL12aIL12bGMCSF発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL2IL12aIL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスが得られた。
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL2IL12aIL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL2IL12aIL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL2IL12aIL12bGMCSFと呼ばれた。
【０１３８】
5.3  mIL2IL12aIL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL2IL12aIL12bGMCSF細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況と腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=10/10になり、例えば図5に示されるように、mIL2IL12aIL12bGMCSFがすべてのマウスにおいて腫瘍退縮を誘導することができる。
【０１３９】
実施例6  mIL12aIL2GMCSFIL12b発現誘導による腫瘍増殖への影響
6.1  mIL12aIL2GMCSFIL12b調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL12aIL2GMCSFIL12b遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL12aIL2GMCSFIL12bプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL12aIL2GMCSFIL12b遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１４０】
mIL12aIL2GMCSFIL12bタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 20で表され、上記のmIL12aIL2GMCSFIL12bをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 40で表される。
【０１４１】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクタープラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１４２】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL12aIL2GMCSFIL12bに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL12aIL2GMCSFIL12b 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL2GMCSFIL12b-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１４３】
6.2  mIL12aIL2GMCSFIL12bを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターのウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL12aIL2GMCSFIL12b発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL2GMCSFIL12b-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０１４４】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種しから24時間後、前述した第2調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL2GMCSFIL12b-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL12aIL2GMCSFIL12bを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL12aIL2GMCSFIL12bと呼ばれた。
【０１４５】
6.3  mIL12aIL2GMCSFIL12b発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL12aIL2GMCSFIL12b細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況および腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=10/10になり、例えば図6に示されるように、mIL12aIL2GMCSFIL12bがすべてのマウスにおいて腫瘍退縮を誘導することができる。
【０１４６】
実施例7  mIL2IL12aGMCSFIL12b発現誘導による腫瘍増殖への影響
7.1  mIL2IL12aGMCSFIL12b調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL2IL12aGMCSFIL12b遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL2IL12aGMCSFIL12bプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL2IL12aGMCSFIL12b遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１４７】
mIL2IL12aGMCSFIL12bタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 21で表され、上記のmIL2IL12aGMCSFIL12bをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 41で表される。
【０１４８】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROプラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μl、XhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１４９】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL2IL12aGMCSFIL12bに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL2IL12aGMCSFIL12b 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL2IL12aGMCSFIL12b-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１５０】
7.2  mIL2IL12aGMCSFIL12bを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL2IL12aGMCSFIL12b発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL2IL12aGMCSFIL12b-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０１５１】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2発現調節ベクターpLentis-PTRE-mIL2IL12aGMCSFIL12b-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL2IL12aGMCSFIL12bを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL2IL12aGMCSFIL12bと呼ばれた。
【０１５２】
7.3  mIL2IL12aGMCSFIL12b発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL2IL12aGMCSFIL12b細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況および腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=10/10になり、例えば図7に示されるように、mIL2IL12aGMCSFIL12bがすべてのマウスにおいて腫瘍退縮を誘導することができる。
【０１５３】
実施例8  mIL12aGMCSFIL12bIL2発現誘導による腫瘍増殖への影響
8.1  mIL12aGMCSFIL12bIL2調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL12aGMCSFIL12bIL2遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL12aGMCSFIL12bIL2プラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL12aGMCSFIL12bIL2遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１５４】
mIL12aGMCSFIL12bIL2タンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 22で表され、上記のmIL12aGMCSFIL12bIL2をコードするヌクレオチド配列は、SEQ ID NO. 42であった。
【０１５５】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROプラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１５６】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL12aGMCSFIL12bIL2に連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL12aGMCSFIL12bIL2 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aGMCSFIL12bIL2-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１５７】
8.2  mIL12aGMCSFIL12bIL2を調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL12aGMCSFIL12bIL2発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aGMCSFIL12bIL2-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０１５８】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aGMCSFIL12bIL2-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL12aGMCSFIL12bIL2を調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL12aGMCSFIL12bIL2と呼ばれた。
【０１５９】
8.3  mIL12aGMCSFIL12bIL2発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL12aGMCSFIL12bIL2細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況および腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=10/10になり、例えば図8に示されるように、結果から、mIL12aGMCSFIL12bIL2がすべてのマウスにおいて腫瘍退縮を誘導することができることを示した。
【０１６０】
実施例9  hIL12aIL2IL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
9.1  hIL12aIL2IL12bGMCSF調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにhIL12aIL2IL12bGMCSF遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、hIL12aIL2IL12bGMCSFプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後hIL12aIL2IL12bGMCSF遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１６１】
hIL12aIL2IL12bGMCSFタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 30で表され、上記のhIL12aIL2IL12bGMCSFをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 50で表される。
【０１６２】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROプラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１６３】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをhIL12aIL2IL12bGMCSFに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、hIL12aIL2IL12bGMCSF 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-hIL12aIL2IL12bGMCSF-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１６４】
9.2  hIL12aIL2IL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターウイルスの調製方法と同じようにして、上記のhIL12aIL2IL12bGMCSF発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-hIL12aIL2IL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０１６５】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2発現ベクターpLentis-PTRE-hIL12aIL2IL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、hIL12aIL2IL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-hIL12aIL2IL12bGMCSFと呼ばれた。
【０１６６】
9.3  hIL12aIL2IL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-hIL12aIL2IL12bGMCSF細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況および腫瘍除去率を記録し、例えば図9に示されるように、hIL12aIL2IL12bGMCSFがマウスの腫瘍増殖をある程度阻害することができる。
【０１６７】
実施例10  mIL12aIL7IL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
10.1  mIL12aIL7IL12bGMCSF調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL12aIL7IL12bGMCSF遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL12aIL7IL12bGMCSFプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL12aIL7IL12bGMCSF遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１６８】
mIL12aIL7IL12bGMCSFタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 23で表され、上記のmIL12aIL7IL12bGMCSFをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 43で表される。
【０１６９】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクタープラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μl、XhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１７０】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL12aIL7IL12bGMCSFに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL12aIL7IL12bGMCSF 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL7IL12bGMCSF-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１７１】
10.2  mIL12aIL7IL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL12aIL7IL12bGMCSF発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL7IL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０１７２】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL7IL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL12aIL7IL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL12aIL7IL12bGMCSFと呼ばれた。
【０１７３】
10.3  mIL12aIL7IL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL12aIL7IL12bGMCSF細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況および腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=10/10になり、例えば図10に示されるように、mIL12aIL7IL12bGMCSFがすべてのマウスにおいて腫瘍退縮を誘導することができる。
【０１７４】
実施例11  mIL12aIL15IL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
11.1  mIL12aIL15IL12bGMCSF調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL12aIL15IL12bGMCSF遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL12aIL15IL12bGMCSFプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL12aIL15IL12bGMCSF遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１７５】
mIL12aIL15IL12bGMCSFタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 24で表され、上記のmIL12aIL15IL12bGMCSFをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 44で表される。
【０１７６】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクタープラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１７７】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL12aIL15IL12bGMCSFに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL12aIL15IL12bGMCSF 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL15IL12bGMCSF-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１７８】
11.2  mIL12aIL15IL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL12aIL15IL12bGMCSF発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL15IL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０１７９】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL15IL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL12aIL15IL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL12aIL15IL12bGMCSFと呼ばれた。
【０１８０】
11.3  mIL12aIL15IL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL12aIL15IL12bGMCSF細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況および腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=8/10になり、例えば図11に示されるように、mIL12aIL15IL12bGMCSFがマウスの一部において腫瘍退縮を誘導することができる。
【０１８１】
実施例12  mIL12aIL21IL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
12.1  mIL12aIL21IL12bGMCSF調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL12aIL21IL12bGMCSF遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL12aIL21IL12bGMCSFプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL12aIL21IL12bGMCSF遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１８２】
mIL12aIL21IL12bGMCSFタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 25で表され、上記のmIL12aIL21IL12bGMCSFをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 45で表される。
【０１８３】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクタープラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μl、XhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１８４】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL12aIL21IL12bGMCSFに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL12aIL21IL12bGMCSF 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL21IL12bGMCSF-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１８５】
12.2  mIL12aIL21IL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL12aIL21IL12bGMCSF発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL21IL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０１８６】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL21IL12bGMCSF-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL12aIL21IL12bGMCSFを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL12aIL21IL12bGMCSFと呼ばれた。
【０１８７】
12.3  mIL12aIL21IL12bGMCSF発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL12aIL21IL12bGMCSF細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況および腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=10/10になり、例えば図12に示されるように、mIL12aIL21IL12bGMCSFがすべてのマウスにおいて腫瘍退縮を誘導することができる。
【０１８８】
実施例13  mIL12aIL2IL12bFLT3L発現誘導による腫瘍増殖への影響
13.1  mIL12aIL2IL12bFLT3L調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL12aIL2IL12bFLT3L遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL12aIL2IL12bFLT3Lプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL12aIL2IL12bFLT3L遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１８９】
mIL12aIL2IL12bFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 26で表され、上記のmIL12aIL2IL12bFLT3Lをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 46で表される。
【０１９０】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクタープラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１９１】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL12aIL2IL12bFLT3Lに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL12aIL2IL12bFLT3L 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL2IL12bFLT3L-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１９２】
13.2  mIL12aIL2IL12bFLT3Lを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL12aIL2IL12bFLT3L発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL2IL12bFLT3L-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０１９３】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL2IL12bFLT3L-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL12aIL2IL12bFLT3Lを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL12aIL2IL12bFLT3Lと呼ばれた。
【０１９４】
13.3  mIL12aIL2IL12bFLT3L発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL12aIL2IL12bFLT3L細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況および腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=9/10になり、例えば図13に示されるように、mIL12aIL2IL12bFLT3Lがマウスの一部において腫瘍退縮を誘導することができる。
【０１９５】
実施例14  mIL12aIL7IL12bFLT3L発現誘導による腫瘍増殖への影響
14.1  mIL12aIL7IL12bFLT3L調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL12aIL7IL12bFLT3L遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL12aIL7IL12bFLT3Lプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL12aIL7IL12bFLT3L遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１９６】
mIL12aIL7IL12bFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 27で表され、上記のmIL12aIL7IL12bFLT3Lをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 47で表される。
【０１９７】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROプラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０１９８】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL12aIL7IL12bFLT3Lに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL12aIL7IL12bFLT3L 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL7IL12bFLT3L-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０１９９】
14.2  mIL12aIL7IL12bFLT3Lを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL12aIL7IL12bFLT3L発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL7IL12bFLT3L-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０２００】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL7IL12bFLT3L-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL12aIL7IL12bFLT3Lを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL12aIL7IL12bFLT3Lと呼ばれた。
【０２０１】
14.3  mIL12aIL7IL12bFLT3L発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL12aIL7IL12bFLT3L細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況および腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=9/10になり、例えば図14に示されるように、mIL12aIL7IL12bFLT3Lがマウスの一部において腫瘍退縮を誘導することができる。
【０２０２】
実施例15  mIL12aIL15IL12bFLT3L発現誘導による腫瘍増殖への影響
15.1  mIL12aIL15IL12bFLT3L調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL12aIL15IL12bFLT3L遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL12aIL15IL12bFLT3Lプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL12aIL15IL12bFLT3L遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０２０３】
mIL12aIL15IL12bFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 28で表され、上記のmIL12aIL15IL12bFLT3Lをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 48で表される。
【０２０４】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクタープラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μl、XhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０２０５】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL12aIL15IL12bFLT3Lに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL12aIL15IL12bFLT3L 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL15IL12bFLT3L-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０２０６】
15.2  mIL12aIL15IL12bFLT3Lを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL12aIL15IL12bFLT3L発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL15IL12bFLT3L-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０２０７】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL15IL12bFLT3L-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL12aIL15IL12bFLT3Lを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL12aIL15IL12bFLT3Lと呼ばれた。
【０２０８】
15.3  mIL12aIL15IL12bFLT3L発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL12aIL15IL12bFLT3L細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況および腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=7/10になり、例えば図15に示されるように、mIL12aIL15IL12bFLT3Lがマウスの一部において腫瘍退縮を誘導することができる。
【０２０９】
実施例16  mIL12aIL21IL12bFLT3L発現誘導による腫瘍増殖への影響
16.1  mIL12aIL21IL12bFLT3L調節可能な発現ベクターの構築
両端にそれぞれBamHI、BglIIおよびXhoI、EcoRI酵素消化部位を持つようにmIL12aIL21IL12bFLT3L遺伝子コード配列を合成し、次に、BamHIまたはBglIIおよびXhoIまたはEcoRIで酵素消化を行い、酵素消化システムは、例えば、mIL12aIL21IL12bFLT3Lプラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後mIL12aIL21IL12bFLT3L遺伝子断片を回収して、次の使用に備えた。
【０２１０】
mIL12aIL21IL12bFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 29で表され、上記のmIL12aIL21IL12bFLT3Lをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 49で表される。
【０２１１】
調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROを酵素消化し、酵素消化システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROプラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μl、XhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０２１２】
pLentis-PTRE-MCS-PGK-PUROをmIL12aIL21IL12bFLT3Lに連結し、連結システムは、例えば、pLentis-PTRE-MCS-PGK-PURO 2 μl、mIL12aIL21IL12bFLT3L 2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4DNAリガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL21IL12bFLT3L-PGK-PURO構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングに送った。
【０２１３】
16.2  mIL12aIL21IL12bFLT3Lを調節可能に発現する細胞の調製
第1発現ベクターウイルスの調製方法と同じようにして、上記のmIL12aIL21IL12bFLT3L発現ベクターのウイルスを調製することによって、第2発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL21IL12bFLT3L-PGK-PUROのウイルスが得られた。
【０２１４】
培養されたB16(rtTA)腫瘍細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種してから24時間後、前述した第2調節可能な発現ベクターpLentis-PTRE-mIL12aIL21IL12bFLT3L-PGK-PUROのウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変え、細胞が満ちるまで培養し続けた後、培養フラスコに移して、最終濃度3 μg/mlでピューロマイシンを加えて、三日間培養し続けた後、生存している細胞が、mIL12aIL21IL12bFLT3Lを調節可能に発現する細胞であって、B16(rtTA)-mIL12aIL21IL12bFLT3Lと呼ばれた。
【０２１５】
16.3  mIL12aIL21IL12bFLT3L発現誘導による腫瘍増殖への影響
対数増殖期にあるB16(rtTA)-mIL12aIL21IL12bFLT3L細胞を消化して、HBSSで2×106個/mlに希釈し、1 mlの注射器を使って、50 μl/匹で8〜10週齢の合計10匹のC57BL/6雌マウスの右背側に注入し、腫瘍ができると2 g/Lのドキシサイクリン含有水で飼育しながら、マウス腫瘍増殖状況および腫瘍除去率を記録し、腫瘍が除去されたマウス数/マウスの総数=9/10になり、例えば図16に示されるように、mIL12aIL21IL12bFLT3Lがマウスの一部において腫瘍退縮を誘導することができる。
【０２１６】
実施例17  ヒトhIL12aIL2IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL7IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL15IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL21IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL2IL12bFLT3L、ヒトhIL12aIL7IL12bFLT3L、ヒトhIL12aIL15IL12bFLT3L、ヒトhIL12aIL21IL12bFLT3Lを発現する細胞の構築
17.1  標的遺伝子を調節可能に発現するベクターの構築
EPチューブ中でベクターpLentis-CMV-MCS-IRES-PUROを酵素消化し、そのシステムは、例えば、pLentis-CMV-MCS-IRES-PUROベクタープラスミド2 μg、酵素消化バッファー3 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が30 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを3.3 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後pLentis-CMV-MCS-IRES-PUROベクター断片を回収して、次の使用に備えた。
【０２１７】
5’端にBamHIまたはBglII酵素消化部位を付加すると共に、3’端にXhoIまたはEcoRI酵素消化部位を付加するように、ヒトhIL12aIL2IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL7IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL15IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL21IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL2IL12bFLT3L、ヒトhIL12aIL7IL12bFLT3L、ヒトhIL12aIL15IL12bFLT3LおよびヒトhIL12aIL21IL12bFLT3LのDNA配列を合成した。合成された標的遺伝子を持つプラスミドを酵素消化して、そのシステムは、例えば、プラスミド5 μg、酵素消化バッファー4 μl、BamHI 1 μlおよびXhoI 1 μlに、総体積が40 μlになるまで加水して、37℃で12時間静置した。EPチューブを取り出し、10×ローディングバッファーを4.4 μl加えて、1%アガロースゲルで電気泳動を行い、電気泳動後断片を回収して、次の使用に備えた。
【０２１８】
hIL12aIL2IL12bGMCSFタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 30で表され、上記のhIL12aIL2IL12bGMCSFをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 50で表される。
【０２１９】
hIL12aIL7IL12bGMCSFタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 31で表され、上記のhIL12aIL7IL12bGMCSFをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 51で表される。
【０２２０】
hIL12aIL15IL12bGMCSFタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 32で表され、上記のhIL12aIL15IL12bGMCSFをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 52で表される。
【０２２１】
hIL12aIL21IL12bGMCSFタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 33で表され、上記のhIL12aIL21IL12bGMCSFをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 53で表される。
【０２２２】
hIL12aIL2IL12bFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 34で表され、上記のhIL12aIL2IL12bFLT3Lをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 54で表される。
【０２２３】
hIL12aIL7IL12bFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 35で表され、上記のhIL12aIL7IL12bFLT3Lをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 55で表される。
【０２２４】
hIL12aIL15IL12bFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 36で表され、上記のhIL12aIL15IL12bFLT3Lをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 56で表される。
【０２２５】
hIL12aIL21IL12bFLT3Lタンパク質ヘテロ二量体のアミノ酸配列は、例えばSEQ ID NO. 37で表され、上記のhIL12aIL21IL12bFLT3Lをコードするヌクレオチド配列は、例えばSEQ ID NO. 57で表される。
【０２２６】
それぞれpLentis-CMV-MCS-IRES-PUROをヒトhIL12aIL2IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL7IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL15IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL21IL12bGMCSF、ヒトhIL12aIL2IL12bFLT3L、ヒトhIL12aIL7IL12bFLT3L、ヒトhIL12aIL15IL12bFLT3LおよびヒトhIL12aIL21IL12bFLT3Lに連結し、そのシステムは、例えば、pLentis-CMV-MCS-IRES-PUROベクター断片2 μl、遺伝子断片2 μl、リガーゼバッファー1 μl、T4 DNA リガーゼ0.5 μlおよび水4.5 μlであった。室温に置いて4時間連結した。次に、連結システムに対して大腸菌のコンピテント形質転換を行った。翌日、転換されたプレートからコロニーを選別して、LB培地に置いて37℃でシェーカー中で一晩培養後、プラスミド抽出キットで培養された細菌からプラスミドを抽出して、酵素消化によって、断片のベクターへの連結が成功したかどうかを同定し、次に、構築の成否を確認するため、正しいベクターをシーケンシングした。標的遺伝子を発現するベクターpLentis-CMV-hIL12aIL2IL12bGMCSF-IRES-PURO、ベクターpLentis-CMV-hIL12aIL7IL12bGMCSF-IRES-PURO、ベクターpLentis-CMV-hIL12aIL15IL12bGMCSF-IRES-PURO、ベクターpLentis-CMV-hIL12aIL21IL12bGMCSF-IRES-PURO、ベクターpLentis-CMV-hIL12aIL2IL12bFLT3L-IRES-PURO、ベクターpLentis-CMV-hIL12aIL7IL12bFLT3L-IRES-PURO、ベクターpLentis-CMV-hIL12aIL15IL12bFLT3L-IRES-PUROおよびベクターpLentis-CMV-hIL12aIL21IL12bFLT3L-IRES-PUROが得られた。
【０２２７】
17.2  標的遺伝子を調節可能に発現する細胞の調製
1）培養された293FT細胞を消化してカウント後、3×106個細胞/ウェルで10 cmのシャーレに敷き広げ、培養液の体積が10 mlであって、プレートが合計5枚であった。
2）翌日の夜に、細胞状態を観察し、細胞状態が良好な場合に、トランスフェクトを行った。培養プレートにクロロキンを最終濃度が25 μMになるまで入れて、1つの試験管を取り出し、総体積が1045 μlになるように滅菌水および以下のプラスミド（pMD2.G 6 μg＋pSPAX2 15 μg＋発現ベクター20 μg）を加えて、次に、2M CaCl2を155 μl入れて均一混合し、最後、2×HBSを1200 μl加えて滴下しながら振盪し、滴下完了後、混合物を細胞培養ウェルに速やかに入れて、軽く振って均一混合した。
3）三日目の朝に、細胞状態を観察すると共に、培地を10 ml新鮮なDMEM培地に変更した。
4）五日目の朝に、細胞状態を観察すると共に、シャーレの上清を採取して、0.45 μmフィルターでろ過し、次に、高速遠心分離チューブに入れて、50000 gで2時間遠心分離し、注意深く上清を廃棄して、吸取紙で液体をできるだけ吸いきれ、次に、200 μl HBSSでペレットを再懸濁させて溶解してから2時間後、細管に分けて-70℃で保管した。
【０２２８】
17.3  標的遺伝子を調節可能に発現する細胞の調製
培養された293A細胞を消化して、培養体積が1 mlになるように、105個細胞/ウェルで6ウェルプレートに接種した。24時間後、前述した標的遺伝子発現ウイルスを10 μl加えて、インキュベーター中で24時間培養し続けた後、上清を廃棄して新鮮な培地に変えて培養し続けた。細胞が満ちると、それを培養フラスコに移して、最終濃度の3 μg/mlのピューロマイシンを加えて、培地を二日に1回程度交換すると共に、ピューロマイシンの濃度を保持するように培養を続け、スクリーニングしてから一週間後、生存している細胞が、上記のサイトカインを安定に発現する細胞であって、それぞれ293A-hIL12aIL2IL12bGMCSF、293A-hIL12aIL7IL12bGMCSF、293A-hIL12aIL15IL12bGMCSF、293A-hIL12aIL21IL12bGMCSF、293A-hIL12aIL2IL12bFLT3L、293A-hIL12aIL7IL12bFLT3L、293A-hIL12aIL15IL12bFLT3L、293A-hIL12aIL21IL12bFLT3Lと呼ばれた。
【０２２９】
構築された発現細胞を、5×104個/ウェルで24ウェルプレートに敷き広げて96時間培養後、上清を採取して、ヒトIL12p70 ELISAキットで上清における融合タンパク質発現を検出し、操作が取扱説明書に従って行われた。図17に示されるように、これらの細胞は、いずれも多数のIL12p70を産生し、融合タンパク質を発現する細胞を構築することに成功した。
【０２３０】
以上、解釈又は例示による詳しい説明を記載したが、添付の請求項の範囲を限定するわけではない。当該技術分野における当業者にとっては、これまで本明細書に記載の実施形態に、多様な変更などがあることが明らかであり、且つ、添付の請求項および該当する実施形態の範囲に属する。
【図１】
2021532796.tif 000003
【図２】
2021532796.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
2021532796000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月29日(2021.3.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
IL12aと前記IL12aに融合する第1因子を含有する第1ポリペプチド鎖、および、IL12bと前記IL12bに融合する第2因子を含有する前記第1ポリペプチド鎖と異なる第2ポリペプチド鎖を有し、ここで、前記第1因子と前記第2因子は、それぞれ独立してIL2、GMCSF、IL7、IL15、IL21およびFLT3Lからなる群から選ばれる、
タンパク質ヘテロ二量体。
【請求項２】
前記第1因子は、前記第2因子と異なる、
請求項1に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項３】
前記第1因子と前記第2因子は、互いに異なって、それぞれIL2、IL7、IL15およびIL21からなる群から選ばれるサイトカイン群AとGMCSFおよびFLT3Lからなる群から選ばれるサイトカイン群Bから選ばれる、
請求項1〜2のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項４】
前記第1ポリペプチド鎖において、前記IL12aのC末端は、前記第1因子のN末端に直接的もしくは間接的に融合し、および/または、前記第1ポリペプチド鎖において、前記IL12aのN末端は、前記第1因子のC末端に直接的もしくは間接的に融合する、
請求項1〜3のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項５】
前記第2ポリペプチド鎖において、前記IL12bのC末端は、前記第2因子のN末端に直接的もしくは間接的に融合し、および/または、前記第2ポリペプチド鎖において、前記IL12bのN末端は、前記第2因子のC末端に直接的もしくは間接的に融合する、
請求項1〜4のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項６】
前記第1因子と前記第2因子は、
1）第1因子がIL2であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
2）第1因子がIL7であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
3）第1因子がIL15であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
4）第1因子がIL21であり、かつ、第2因子がGMCSFであり；
5）第1因子がIL2であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
6）第1因子がIL7であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
7）第1因子がIL15であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
8）第1因子がIL21であり、かつ、第2因子がFLT3Lであり；
9）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL2であり；
10）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL7であり；
11）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL15であり；
12）第1因子がGMCSFであり、かつ、第2因子がIL21であり；
13）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL2であり；
14）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL7であり；
15）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL15であり；および
16）第1因子がFLT3Lであり、かつ、第2因子がIL21である群から選ばれる、
請求項1〜5のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項７】
前記IL12a、前記IL12b、前記第1因子と前記第2因子は、哺乳動物に由来する、
請求項1〜6のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項８】
前記IL12a、前記IL12b、前記第1因子と前記第2因子は、同一の由来である、
請求項7に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項９】
前記第1ポリペプチド鎖は、例えばSEQ ID NO. 60〜65およびSEQ ID NO. 70〜73のいずれかで表される配列を有する、
請求項1〜8のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項１０】
前記第2ポリペプチド鎖は、例えばSEQ ID NO. 66〜69およびSEQ ID NO. 74〜75のいずれかで表される配列を有する、
請求項1〜9のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項１１】
前記タンパク質ヘテロ二量体は、例えばSEQ ID NO. 18〜37のいずれかで表される配列を有する、
請求項1〜10のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体。
【請求項１２】
１種類または多種類の単離された核酸分子であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体をコードする、
核酸分子。
【請求項１３】
例えばSEQ ID NO. 38〜57のいずれかで表される配列を有する、
請求項12に記載の核酸分子。
【請求項１４】
請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体をコードするヌクレオチド配列を有する、
発現ベクター。
【請求項１５】
請求項14に記載の発現ベクターを含む、
宿主細胞。
【請求項１６】
請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体、請求項12又は13に記載の核酸分子、請求項14に記載の発現ベクターおよび請求項15に記載の宿主細胞よりなる群から選択される少なくとも１種を含む、
組成物。
【請求項１７】
請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体を調製する方法であって、請求項1〜11のいずれか1項に記載のタンパク質ヘテロ二量体を発現可能な場合に、請求項15に記載の宿主細胞を培養するステップを含む、
方法。
【請求項１８】
腫瘍を治療するために使用される、請求項16に記載の組成物。
【請求項１９】
前記腫瘍は、黒色腫を含む、
請求項18に記載の組成物。
【国際調査報告】
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