(57)【要約】  ＡＦＰ抗原に由来する短いペプチドＦＭＮＫＦＩＹＥＩに特異的に結合することができるＴ  細胞受容体（ＴＣＲ）であって、前記抗原の短いペプチドＦＭＮＫＦＩＹＥＩは、ＨＬＡ  Ａ０２０１と複合体を形成し、一緒に細胞表面に提示される。前記ＴＣＲをコードする核酸分子、前記核酸分子を含むベクター、および前記ＴＣＲを形質導入する細胞。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）であって、
前記ＴＣＲは、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合することができ、好ましくは、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＶＮＳＧＧＳＮＹＫＬＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＳＳＬＦＧＱＧＲＥＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）であることを特徴とする、前記ＴＣＲ。
【請求項２】
前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
α  ＣＤＲ１−  ＤＳＡＩＹＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）
α  ＣＤＲ２−  ＩＱＳＳＱＲＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）
α  ＣＤＲ３−  ＡＶＮＳＧＧＳＮＹＫＬＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）であり、および／または
前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域は、
β  ＣＤＲ１−  ＳＧＨＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）
β  ＣＤＲ２−  ＦＱＮＥＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）
β  ＣＤＲ３−  ＡＳＳＬＦＧＱＧＲＥＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）であることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項３】
ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項４】
前記ＴＣＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含むことを特徴とする
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項５】
前記ＴＣＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含むことを特徴とする、
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項６】
前記ＴＣＲは、αβヘテロダイマーであり、ＴＣＲのα鎖定常領域ＴＲＡＣ＊０１およびＴＣＲβ鎖定常領域ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を含むことを特徴とする、
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項７】
前記ＴＣＲのα鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７であることを特徴とする、
請求項６に記載のＴＣＲ。
【請求項８】
前記ＴＣＲは、可溶性であることを特徴とする、
請求項１〜５のいずれか１項に記載のＴＣＲ。
【請求項９】
前記ＴＣＲは、一本鎖であることを特徴とする、
請求項８に記載のＴＣＲ。
【請求項１０】
前記ＴＣＲは、ペプチドリンカーを介してα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとを結合することによって形成されることを特徴とする、
請求項９に記載のＴＣＲ。
【請求項１１】
前記ＴＣＲは、α鎖可変領域の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１または９４番目のアミノ酸位置、および／またはα鎖Ｊ遺伝子の短いペプチドの最後から３番目、最後から５番目または最後から７番目のアミノ酸位置に一つまたは複数の突然変異があり、および／または前記ＴＣＲは、β鎖可変領域の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１または９４番目のアミノ酸位置、および／またはβ鎖Ｊ遺伝子の短いペプチドの最後から２番目、最後から４番目または最後から６番目のアミノ酸位置に一つまたは複数の突然変異があり、ここで、アミノ酸の位置番号は、ＩＭＧＴ（国際免疫遺伝学情報システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ））に記載された位置番号によることを特徴とする、
請求項１０に記載のＴＣＲ。
【請求項１２】
前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２を含み、および／または前記ＴＣＲのβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４を含むことを特徴とする、
請求項１１に記載のＴＣＲ。
【請求項１３】
前記ＴＣＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０であることを特徴とする、
請求項１２に記載のＴＣＲ。
【請求項１４】
前記ＴＣＲは、（ａ）膜貫通ドメインを除くＴＣＲのα鎖の全部または一部、および（ｂ）膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、
（ａ）および（ｂ）は、それぞれ機能的可変ドメインを含むか、または機能的可変ドメインを含み、前記ＴＣＲ鎖の定常ドメインの少なくとも一部をさらに含むことを特徴とする、
請求項８に記載のＴＣＲ。
【請求項１５】
システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖定常ドメインとβ鎖定常ドメインとの間に人工的なジスルフィド結合を形成することを特徴とする、
請求項１４に記載のＴＣＲ。
【請求項１６】
前記ＴＣＲにおいて人工的なジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１の  Ｐｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、および
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０から選択される一つまたは複数の部位を置換することを特徴とする、
請求項１５に記載のＴＣＲ。
【請求項１７】
前記ＴＣＲのα鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８であることを特徴とする、
請求項１６に記載のＴＣＲ。
【請求項１８】
前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれることを特徴とする、
請求項１４に記載のＴＣＲ。
【請求項１９】
前記ＴＣＲにおいて人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、または
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸から選択される一つまたは複数の部位を置換することを特徴とする、
請求項１８に記載のＴＣＲ。
【請求項２０】
前記ＴＣＲは、α鎖可変ドメイン、β鎖可変ドメインおよび膜貫通ドメインを除くβ鎖定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖定常ドメインを含まなく、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインとβ鎖とは、ヘテロダイマーを形成することを特徴とする、
請求項１８または１９に記載のＴＣＲ。
【請求項２１】
前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ−末端またはＮ−末端にコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が結合されることを特徴とする、
請求項１に記載のＴＣＲ。
【請求項２２】
前記Ｔ細胞受容体に結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療薬、ＰＫ修飾部分またはこれらの物質のいずれかの組み合わせであり、好ましくは、前記治療薬は、抗−ＣＤ３−抗体であることを特徴とする、
請求項２１に記載のＴＣＲ。
【請求項２３】
多価ＴＣＲ複合体であって、
少なくとも二つのＴＣＲ分子を含み、ＴＣＲ分子の少なくとも一つは、上記請求項のいずれか１項に記載の前記ＴＣＲであることを特徴とする、前記多価ＴＣＲ複合体。
【請求項２４】
核酸分子であって、
前記核酸分子は、上記請求項のいずれか１項に記載のＴＣＲ分子をコードする核酸配列またはその相補的配列を含むことを特徴とする、前記核酸分子。
【請求項２５】
ＴＣＲα鎖可変ドメインをコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項２４に記載の核酸分子。
【請求項２６】
ＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のヌクレオチド配列を含む。ことを特徴とする、
請求項２４または２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
ＴＣＲのα鎖をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のヌクレオチド配列を含み、および／またはＴＣＲβ鎖をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、
請求項２４に記載の核酸分子。
【請求項２８】
ベクターであって、
前記ベクターは、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の核酸分子を含み、好ましくは、前記ベクターは、ウイルスベクターであり、より好ましくは、前記ベクターは、レンチウイルスベクターであることを特徴とする、前記ベクター。
【請求項２９】
単離された宿主細胞であって、
前記宿主細胞は、請求項２５に記載のベクターを含むかまたは染色体に外因性の請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の核酸分子が組み込まれたことを特徴とする、前記単離された宿主細胞。
【請求項３０】
細胞であって、
前記細胞は、請求項２４〜２７のいずれか１項に記載の核酸分子または請求項２８に記載のベクターで形質導入され、好ましくは、前記細胞は、Ｔ細胞または幹細胞であることを特徴とする、前記細胞。
【請求項３１】
医薬組成物であって、
前記組成物は、薬学的に許容されるベクターおよび請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項２３に記載のＴＣＲ複合体、または請求項３０に記載の細胞を含むことを特徴とする、前記医薬組成物。
【請求項３２】
請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＴ細胞受容体、または請求項２３に記載のＴＣＲ複合体または請求項３０に記載の細胞の用途であって、
腫瘍または自己免疫疾患を治療する薬物の調製に使用され、好ましくは、前記腫瘍は、ＡＦＰ抗原陽性であり、より好ましくは、前記腫瘍は、肝細胞癌であることを特徴とする、前記用途。
【請求項３３】
疾患を治療する方法であって、
治療を必要とする対象に適切な量の請求項１〜２２のいずれか１項に記載のＴＣＲ、請求項２３に記載のＴＣＲ複合体、請求項３０に記載の細胞または請求項３１に記載の医薬組成物を投与する段階を含み、
好ましくは、前記腫瘍は、ＡＦＰ抗原陽性であり、より好ましくは、前記腫瘍は、肝細胞癌であることを特徴とする、前記疾患を治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＡＦＰ抗原に由来する短いペプチドを識別することができるＴＣＲに関し、本発明は、前記ＴＣＲを形質導入することによって得られたＡＦＰ特異的Ｔ細胞、およびＡＦＰ関連疾患の予防及び治療におけるそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
αフェトプロテインとも呼ばれるＡＦＰ（αＦｅｔｏｐｒｏｔｅｉｎ）は、胚発生時に発現するタンパク質である、胚血清の主成分である。胚発育過程において、ＡＦＰは、卵黄嚢と肝臓とで比較的に高い発現レベルを有し、その後、阻害される。肝細胞癌において、ＡＦＰの発現が活性化される（Butterfield et al. J Immunol.,2001,Apr 15;166(8):5300-8）。ＡＦＰは、細胞内で生成された後、小分子ポリペプチドに分解され、ＭＨＣ（主要組織適合遺伝子複合体）分子と結合して複合体を形成し、細胞表面に提示される。ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）は、ＡＦＰ抗原に由来する短いペプチドであり、ＡＦＰ関連疾患の治療の標的である。
【０００３】
Ｔ細胞養子免疫療法は、標的細胞抗原に対して特異性を有する反応性Ｔ細胞を患者の体内に移し、標的細胞に対して作用できるようにすることである。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞表面の膜タンパク質であり、対応する標的細胞表面の抗原の短いペプチド識別することができる。免疫システムにおいて、抗原の短いペプチドの特異的ＴＣＲと短いペプチド−主要組織適合遺伝子複合体（ｐＭＨＣ複合体）の結合により、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との直接的な物理的接触を引き起こし、次に、Ｔ細胞とＡＰＣとの他の細胞膜表面分子が相互作用し、一連の後続の細胞信号伝達と他の生理学的反応を引き起こし、従って、異なる抗原特異的Ｔ細胞がその標的細胞に免疫効果発揮することができる。従って、当業者は、ＡＦＰ抗原の短いペプチドに対して特異性を有するＴＣＲを単離し、および当該ＴＣＲをＴ細胞に形質導入して、ＡＦＰ抗原の短いペプチド対して特異性を有するＴ細胞を得、従って、それらが細胞免疫治療において作用を発揮するようにすることに専念している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
本発明の目的は、ＡＦＰ抗原の短いペプチドを識別するＴ細胞受容体を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の第１の様態は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を提供し、前記ＴＣＲは、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合することができる。
【０００６】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＶＮＳＧＧＳＮＹＫＬＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインのＣＤＲ３のアミノ酸配列は、ＡＳＳＬＦＧＱＧＲＥＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、
α  ＣＤＲ１−  ＤＳＡＩＹＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、
α  ＣＤＲ２−  ＩＱＳＳＱＲＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、
α  ＣＤＲ３−  ＡＶＮＳＧＧＳＮＹＫＬＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）であり、および／または
前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインの三つの相補性決定領域は、
β  ＣＤＲ１−  ＳＧＨＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
β  ＣＤＲ２−  ＦＱＮＥＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
β  ＣＤＲ３−  ＡＳＳＬＦＧＱＧＲＥＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）である。
【０００７】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＴＣＲα鎖可変ドメインとＴＣＲβ鎖可変ドメインとを含み、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、および／または前記ＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。
【０００８】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、αβヘテロダイマーであり、ＴＣＲのα鎖定常領域ＴＲＡＣ＊０１およびＴＣＲβ鎖定常領域ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１を含む。
【０００９】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、可溶性である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、一本鎖である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、ペプチドリンカーを介してα鎖可変ドメインとβ鎖可変ドメインとを結合することによって形成される。
【００１０】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖可変領域の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１または９４番目のアミノ酸位置、および／またはα鎖Ｊ遺伝子の短いペプチドの最後から３番目、最後から５番目または最後から７番目のアミノ酸位置に一つまたは複数の突然変異があり、および／または前記ＴＣＲは、β鎖可変領域の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１または９４番目のアミノ酸位置、および／またはβ鎖Ｊ遺伝子の短いペプチドの最後から２番目、最後から４番目または最後から６番目のアミノ酸位置に一つまたは複数の突然変異があり、ここで、アミノ酸の位置番号は、ＩＭＧＴ（国際免疫遺伝学情報システム（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ））に記載された位置番号による。
【００１１】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２を含み、および／または前記ＴＣＲのβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４を含む。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３０である。
【００１２】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、（ａ）膜貫通ドメインを除くＴＣＲのα鎖の全部または一部、および（ｂ）膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含み、
（ａ）および（ｂ）は、それぞれ機能的可変ドメインを含むか、または機能的可変ドメインおよび前記ＴＣＲ鎖の定常ドメインの少なくとも一部を含む。
別の好ましい例において、システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖定常ドメインとβ鎖定常ドメインとの間に人工的なジスルフィド結合を形成する。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲにおいて人工的なジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４；
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１の  Ｐｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、および
【００１３】
ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０から選択される一つまたは複数の部位を置換する。
【００１４】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２６であり、および／または前記ＴＣＲのβ鎖アミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２８である。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間には、人工的な鎖間ジスルフィド結合が含まれる。
別の好ましい例において、前記ＴＣＲにおいて人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、
ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、または
【００１５】
ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸から選択される一つまたは複数の部位を置換する。
【００１６】
別の好ましい例において、前記ＴＣＲは、α鎖可変ドメイン、β鎖可変ドメインおよび膜貫通ドメインを除くβ鎖定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖定常ドメインを含まなく、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインとβ鎖とは、ヘテロダイマーを形成する
別の好ましい例において、前記ＴＣＲのα鎖および／またはβ鎖のＣ−末端またはＮ−末端にコンジュゲート（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）が結合される。
【００１７】
別の好ましい例において、前記Ｔ細胞受容体に結合するコンジュゲートは、検出可能なマーカー、治療薬、ＰＫ修飾部分またはこれらの物質のいずれかの組み合わせである。好ましくは、前記治療薬は、抗−ＣＤ３−抗体である。
【００１８】
本発明の第２の様態は、多価ＴＣＲ複合体を提供し、少なくとも二つのＴＣＲ分子を含み、ＴＣＲ分子の少なくとも一つは、本発明の第１の様態に記載のＴＣＲである。
本発明の第３の様態は、核酸分子を提供し、前記核酸分子は、本発明の第１の様態に記載のＴＣＲ分子をコードする核酸配列またはその相補的配列を含む。
【００１９】
別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＴＣＲα鎖可変ドメインをコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３のヌクレオチド配列を含む。
【００２０】
別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５のヌクレオチド配列を含む。
【００２１】
別の好ましい例において、前記核酸分子は、ＴＣＲのα鎖をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４のヌクレオチド配列を含み、および／またはＴＣＲβ鎖をコードするＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８のヌクレオチド配列を含む。
【００２２】
本発明の第４の様態は、ベクターを提供し、前記ベクターは、本発明の第３の様態に記載の核酸分子を含み、好ましくは、前記ベクターは、ウイルスベクターであり、より好ましくは、前記ベクターは、レンチウイルスベクターである。
【００２３】
本発明の第５の様態は、単離された宿主細胞を提供し、前記宿主細胞は、本発明の第４の様態に記載のベクターを含むかまたはゲノムに外因性の組み込まれた本発明の第３の様態に記載の核酸分子が組み込まれた。
【００２４】
本発明の第６の様態は、細胞を提供し、前記細胞は、本発明の第３の様態に記載の核酸分子または本発明の第４の様態に記載のベクターで形質導入され、好ましくは、前記細胞は、Ｔ細胞または幹細胞である。
【００２５】
本発明の第７の様態は、医薬組成物を提供し、前記組成物は、薬学的に許容されるベクターおよび本発明の第１の様態に記載のＴＣＲ、本発明の第２の様態に記載のＴＣＲ複合体、本発明の第３の様態に記載の核酸分子、本発明の第４の様態に記載のベクター、または本発明の第６の様態に記載の細胞を含む。
【００２６】
本発明の第８の様態は、腫瘍または自己免疫疾患を治療する薬物の調製に使用される本発明の第１の様態に記載のＴ細胞受容体、または本発明の第２の様態に記載のＴＣＲ複合体、本発明の第３の様態に記載の核酸分子、本発明の第４の様態に記載のベクター、または本発明の第６の様態に記載の細胞の用途を提供する。
【００２７】
本発明の第９の様態は、治療を必要とする対象に適切な量の本発明の第１の様態に記載のＴ細胞受容体、または本発明の第２の様態に記載のＴＣＲ複合体、本発明の第３の様態に記載の核酸分子、本発明の第４の様態に記載のベクター、または本発明の第６の様態に記載の細胞、または本発明の第７の様態に記載の医薬組成物を投与する段階を含む、疾患を治療する方法を提供し、
好ましくは、前記疾患は、腫瘍であり、好ましくは、前記腫瘍は、肝細胞癌である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の範囲内で、本発明の上記の各技術的特徴と以下（例えば、実施例）に具体的に説明される各技術的特徴との間を、互いに組み合わせることにより、新しいまたは好ましい技術的解決策を構成することができることに理解されたい。スペースに限りがあるため、ここでは繰り返さない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１ａ】図１ａは、それぞれＴＣＲα鎖可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【図１ｂ】図１ｂは、ＴＣＲα鎖可変ドメインヌクレオチド配列を示す。
【図１ｃ】図１ｃは、ＴＣＲのα鎖アミノ酸配列を示す。
【図１ｄ】図１ｄは、ＴＣＲのα鎖ヌクレオチド配列を示す。
【図１ｅ】図１ｅは、リーダー配列を有するＴＣＲのα鎖アミノ酸配列を示す。
【図１ｆ】図１ｆは、リーダー配列を有するＴＣＲのα鎖ヌクレオチド配列を示す。
【図２ａ】図２ａは、ＴＣＲβ鎖可変ドメインアミノ酸配列を示す。
【図２ｂ】図２ｂは、ＴＣＲβ鎖可変ドメインヌクレオチド配列を示す。
【図２ｃ】図２ｃは、ＴＣＲβ鎖アミノ酸配列を示す。
【図２ｄ】図２ｄは、ＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列を示す。
【図２ｅ】図２ｅは、リーダー配列を有するＴＣＲβ鎖アミノ酸配列を示す。
【図２ｆ】図２ｆは、リーダー配列を有するＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列を示す。
【図３】図３は、モノクローナル細胞のＣＤ８＋およびテトラマー−ＰＥの二重陽性染色結果を示す。
【図４ａ】図４ａは、可溶性ＴＣＲのα鎖のアミノ酸配列を示す。
【図４ｂ】図４ｂは、ヌクレオチド配列を示す。
【図５ａ】図５ａは、それぞれ可溶性ＴＣＲβ鎖のアミノ酸配列を示す。
【図５ｂ】図５ｂは、ヌクレオチド配列を示す。
【図６】図６は、精製後に得られた可溶性ＴＣＲのゲル図を示す。最左端のレーンは、還元性接着剤であり、中央のレーンは、分子量マーカー（ｍａｒｋｅｒ）であり、右のレーンは、非還元性接着剤である。
【図７ａ】図７ａは、一本鎖ＴＣＲのアミノ酸配列を示す。
【図７ｂ】図７ｂは、ヌクレオチド配列を示す。
【図８ａ】図８ａは、一本鎖ＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図８ｂ】図８ｂは、ヌクレオチド配列を示す。
【図９ａ】図９ａは、一本鎖ＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を示す。
【図９ｂ】図９ｂは、ヌクレオチド配列を示す。
【図１０ａ】図１０ａは、一本鎖ＴＣＲリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）のアミノ酸配列を示す。
【図１０ｂ】図１０ｂは、ヌクレオチド配列を示す。
【図１１】図１１は、精製後に得られた可溶性一本鎖ＴＣＲのゲル図を示す。左のレーンは、分子量マーカー（ｍａｒｋｅｒ）であり、右のレーンは、非還元性接着剤である。
【図１２】図１２は、本発明の可溶性ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との結合のＢＩＡｃｏｒｅ動態学マップを示す。
【図１３】図１３は、本発明の可溶性一本鎖ＴＣＲとＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との結合のＢＩＡｃｏｒｅ動態学マップを示す。
【図１４】図１４は、得られたＴ細胞クローンのＥＬＩＳＰＯＴ活性化機能検証の結果を示す。
【図１５】図１５は、本発明のＴＣＲを形質導入したエフェクター細胞のＥＬＩＳＰＯＴ活性化機能検証の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
広範囲にわたる詳細な研究の結果、本発明者らは、ＡＦＰ抗原の短いペプチドＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：９）に特異的に結合することができるＴＣＲを発見し、前記抗原の短いペプチドＦＭＮＫＦＩＹＥＩは、ＨＬＡ  Ａ０２０１と複合体を形成し、一緒に細胞表面に提示することができる。本発明は、前記ＴＣＲをコードする核酸分子および前記核酸分子を含むベクターを提供する。また、本発明は、本発明のＴＣＲを形質導入する細胞をさらに提供する。
【００３１】
用語
ＭＨＣ分子は、免疫グロブリンスーパーファミリーのタンパク質であり、クラスＩまたはクラスＩＩのＭＨＣ分子であり得る。従って、抗原の提示に対して特異性を有し、異なる個体は、異なるＭＨＣを有し、タンパク質抗原の異なる短いペプチドをそれぞれのＡＰＣ細胞表面に提示することができる。ヒトＭＨＣは、通常ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ複合体と呼ばれる。
【００３２】
Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）に提示する特異性抗原ペプチドの唯一の受容体である。免疫システムにおいて、抗原の特異的ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との結合は、Ｔ細胞と抗原提示細胞（ＡＰＣ）との間の直接的な物理的接触を引き起こした後、Ｔ細胞とＡＰＣとの他の細胞膜表面分子が相互作用し、一連の後続の細胞信号伝達および他の生理学的反応を引き起こすことにより、異なる抗原特異的Ｔ細胞が標的細胞に対して免疫効果を発揮することができる。
【００３３】
ＴＣＲは、α鎖／β鎖またはγ鎖／δ鎖がヘテロダイマーの形式で存在する細胞膜表面の糖タンパク質である。Ｔ細胞の９５％において、ＴＣＲヘテロダイマーは、α鎖とβとで構成され、Ｔ細胞の５％は、γ鎖とδ鎖とで構成されるＴＣＲを有する。天然のαβヘテロ二量体化ＴＣＲは、α鎖とβ鎖とを有し、α鎖とβ鎖とは、αβヘテロ二量体化ＴＣＲのサブユニットを構成する。大まかに言って、αとβとの各鎖は、可変領域、結合領域および定常領域を含み、β鎖は、通常可変領域と結合領域との間に短い多変領域をさらに含むが、当該多変領域は、通常結合領域の一部としてみなされる。各可変領域は、フレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ）に埋め込まれた三つのＣＤＲ（相補性決定領域）であるＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３を含む。ＣＤＲ領域は、ＴＣＲとｐＭＨＣ複合体との結合を決定し、ここで、ＣＤＲ３は、超可変領域と呼ばれる可変領域と結合領域とから再結合される。ＴＣＲのα鎖とβ鎖とは、一般にそれぞれ二つの「ドメイン」、つまり可変ドメインと定常ドメインとを有すると見なされ、可変ドメインは、結合された可変領域と結合領域とで構成される。ＴＣＲの定常ドメインの配列は、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）の公開データベースで見つかることができ、例えば、ＴＣＲ分子のα鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＡＣ＊０１」であり、ＴＣＲ分子のβ鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＢＣ１＊０１」または「ＴＲＢＣ２＊０１」である。加えて、ＴＣＲのα鎖とβ鎖とは、膜貫通領域と細胞質領域とを含み、細胞質領域は、非常に短い。
本発明において、「本発明のポリペプチド」、「本発明のＴＣＲ」、「本発明のＴ細胞受容体」という用語は、交換可能に使用される。
【００３４】
天然の鎖間ジスルフィド結合および人工の鎖間ジスルフィド結合
天然のＴＣＲの膜近位領域のＣα鎖とＣβ鎖との間には、一つのグループのジスルフィド結合が存在し、本発明では、「天然の鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。本発明において、天然の鎖間ジスルフィド結合とは位置が異なる人工的に導入された鎖間共有ジスルフィド結合は、「人工鎖間ジスルフィド結合」と呼ばれる。
【００３５】
ジスルフィド結合の位置を容易に説明するために、本発明におけるＴＲＡＣ＊０１およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１アミノ酸配列の位置番号は、Ｎ端からＣ端まで順番に位置番号を付け、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１において、Ｎ端からＣ端までの順番の順序の６０番目のアミノ酸は、Ｐ（プロリン）であると、本発明では、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＰｒｏ６０と表現することができ、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸と表現することもでき、例えば、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１において、Ｎ端からＣ端までの順次的順序の６１番目のアミノ酸は、Ｑ（グルタミン）であると、本発明では、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｎ６１と表現することができ、ＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸と表現することもでき、他は、類推によって推測することができる。本発明において、可変領域のＴＲＡＶとＴＲＢＶとのアミノ酸配列の位置番号は、ＩＭＧＴに記載の位置番号に従って番号が付けられる。例えば、ＴＲＡＶの特定のアミノ酸について、ＩＭＧＴに記載された位置番号が４６であると、本発明においてＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸と表現され、他は、類推によって推測することができる。本発明において、他のアミノ酸の配列位置番号について特別な指示がある場合、特別な指示に従う。
【００３６】
本発明の詳細な説明
ＴＣＲ分子
抗原プロセシングの過程において、抗原は、細胞内で分解された後、ＭＨＣ分子によって細胞表面に運ばれる。Ｔ細胞受容体は、抗原提示細胞表面のペプチド−ＭＨＣ複合体を識別することができる。従って、本発明の第１の様態は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合することができるＴＣＲ分子を提供する。好ましくは、前記ＴＣＲ分子は、単離または精製される。当該ＴＣＲのα鎖と、β鎖とは、それぞれ三つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する。
本発明の好ましい実施形態において、前記ＴＣＲのα鎖は、
α  ＣＤＲ１−  ＤＳＡＩＹＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、
α  ＣＤＲ２−  ＩＱＳＳＱＲＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、
α  ＣＤＲ３−  ＡＶＮＳＧＧＳＮＹＫＬＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、および／または
前記ＴＣＲβ鎖の可変ドメインの三つの相補性決定領域は、
β  ＣＤＲ１−  ＳＧＨＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
β  ＣＤＲ２−  ＦＱＮＥＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
β  ＣＤＲ３−  ＡＳＳＬＦＧＱＧＲＥＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）であるアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。
【００３７】
本発明のＣＤＲ領域の前記アミノ酸配列は、任意の適切なフレームワーク領域に札乳されて、キメラＴＣＲを調製することができる。フレームワーク領域が本発明のＴＣＲのＣＤＲ領域と交換性がある限り、当業者は、本発明に開示されたＣＤＲ領域に基づいて対応する機能を有するＴＣＲ分子を設計または合成することができる。従って、本発明のＴＣＲ分子は、上記α鎖および／またはβ鎖のＣＤＲ領域配列および任意の適切なフレームワーク領域を含むＴＣＲ分子を指す。本発明のＴＣＲα鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列であり、および／または本発明のＴＣＲβ鎖可変ドメインは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５と少なくとも９０％、好ましくは９５％、より好ましくは９８％の配列同一性を有するアミノ酸配列である。
【００３８】
本発明の好ましい例において、本発明のＴＣＲ分子は、α鎖とβ鎖とから構成されるヘテロダイマーである。具体的には、一方で、前記ヘテロ二量体化ＴＣＲ分子のα鎖は、可変ドメインと定常ドメインとを含み、前記α鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、前記α鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）を含む。好ましくは、前記ＴＣＲ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、前記ＴＣＲ分子のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１である。一方で、前記ヘテロ二量体化ＴＣＲ分子のβ鎖は、可変ドメインと定常ドメインとを含み、前記β鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、上記β鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）およびＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を含む。好ましくは、前記ＴＣＲ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、前記ＴＣＲ分子のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５である。
【００３９】
本発明の好ましい例において、本発明のＴＣＲ分子は、α鎖の一部または全部および／またはβ鎖の一部または全部から構成される一本鎖ＴＣＲ分子である。一本鎖ＴＣＲ分子の説明しついては、Ｃｈｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１，１２６５４−１２６５８を参照することができる。文献によると、当業者は、本発明のＣＤＲｓ領域を含む一本鎖ＴＣＲ分子を容易に構築することができる。具体的には、前記一本鎖ＴＣＲ分子は、Ｖα、ＶβおよびＣβを含み、好ましくは、Ｎ端からＣ端までの順序に従って結合される。
【００４０】
前記一本鎖ＴＣＲ分子のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、前記α鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）およびＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ  ：１２）を含む。好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子のα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１である。前記一本鎖ＴＣＲ分子のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、上記β鎖のＣＤＲ１（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、ＣＤＲ２（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）およびＣＤＲ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）を含む。好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列を含む。より好ましくは、前記一本鎖ＴＣＲ分子のβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：５である。
【００４１】
本発明の好ましい例において、本発明のＴＣＲ分子の定常ドメインは、ヒト定常ドメインである。当業者は、関連する本またはＩＭＧＴ（国際免疫遺伝学情報システム）の公開データベースを参照することにより、ヒト定常ドメインのアミノ酸配列を知るか、または得ることができる。例えば、本発明のＴＣＲ分子のα鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＡＣ＊０１」であり得、ＴＣＲ分子のβ鎖の定常ドメイン配列は、「ＴＲＢＣ１＊０１」または「ＴＲＢＣ２＊０１」であり得る。ＩＭＧＴのＴＲＡＣ＊０１に記載されたアミノ酸配列の５３番目の位置は、Ａｒｇであり、ここでは、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＡｒｇ５３を表示し、他は、類推によって推測することができる。好ましくは、本発明のＴＣＲ分子のα鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３であり、および／またはβ鎖のアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７である。
【００４２】
天然に存在するＴＣＲは、膜貫通領域によって安定化された膜タンパク質である。抗原同定分子としての免疫グロブリン（抗体）と同様に、ＴＣＲも、診断や治療のために開発されることができ、この場合、可溶性ＴＣＲ分子を得る必要がある。可溶性ＴＣＲ分子は、膜貫通領域を含まない。可溶性ＴＣＲは、幅広い用途を有し、ＴＣＲとｐＭＨＣとの相互作用を研究するだけでなく、感染症を検出するための師団ツールや自身免疫疾患のマーカーとしても使用することができる。類似的に、可溶性ＴＣＲを使用して、特異的抗原を提示する細胞に治療薬（例えば、細胞毒素化合物または免疫刺激性化合物）を送達することができ、また、可溶性ＴＣＲを他の分子（例えば、抗−ＣＤ３−抗体）と結合して、Ｔ細胞を特定の抗原を提示する標的細胞にリダイレクトすることもできる。本発明は、ＡＦＰ抗原の短いペプチドに対して特異性を有する可溶性ＴＣＲも得る。
【００４３】
可溶性ＴＣＲを得るために、一方で、本発明のＴＣＲは、そのα鎖とβ鎖との定常ドメインの残基の間に人工的なジスルフィド結合を導入するＴＣＲであり得る。システイン残基は、前記ＴＣＲのα鎖とβ鎖との定常ドメインの間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成する。システイン残基は、天然のＴＣＲの適切な部位の他のアミノ酸残基を置換して、人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成することができる。例えば、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７のシステイン残基を置換してジスルフィド結合を形成する。システイン残基を導入してジスルフィド結合を形成する他の部位は、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ７７、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ１７、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｓｐ５９、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＳｅｒ１５およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ１５、ＴＲＡＣ＊０１エクソン１の  Ａｒｇ５３およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５４、  ＴＲＡＣ＊０１エクソン１の  Ｐｒｏ８９およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＡｌａ１９、またはＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｙｒ１０およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＧｌｕ２０であり得る。つまり、システイン残基は、上記α鎖とβ鎖との定常ドメインの任意の部位のグループを置換する。天然のジスルフィド結合を失う目的を達成するためのシステイン残基を含まないように、本発明のＴＣＲ定常ドメインの一つまたは複数のＣ末端で、最大５０個、または最大３０個、または最大１５個、または最大１０個、または最大８個またはもっと少ないアミノ酸を切り詰めることができ、天然のジスルフィド結合を形成するシステイン残基を別のアミノ酸へ突然変異させることによっても上記目的を達成することができる。
【００４４】
上記のように、本発明のＴＣＲは、そのα鎖とβ鎖との定常ドメインの残基の間に導入された人工的なジスルフィド結合を含むことができる。定常ドメインの間に上記導入された人工的なジスルフィド結合を含むか、または含まないことにかかわらず、本発明のＴＣＲは、すべてＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列を含むことができることに留意されたい。ＴＣＲのＴＲＡＣ定常ドメイン配列およびＴＲＢＣ１またはＴＲＢＣ２定常ドメイン配列は、ＴＣＲに存在する天然のジスルフィド結合によって結合されることができる。
【００４５】
可溶性ＴＣＲを得るために、一方で、本発明のＴＣＲは、その疎水性コア領域に突然変異が発生するＴＣＲを含み、これらの疎水性コア領域の突然変異は、好ましくは、例えば、公開番号ＷＯ２０１４／２０６３０４の特許文書に記載されたように、本発明の可溶性ＴＣＲの安定性を改善することができる突然変異である。このようなＴＣＲは、（α鎖および／またはβ鎖）可変領域アミノ酸の１１、１３、１９、２１、５３、７６、８９、９１、９４番目、および／またはα鎖Ｊ遺伝子（ＴＲＡＪ）の短いペプチドアミノ酸の最後から３番目、最後から５番目、最後から７番目、および／またはβ鎖Ｊ遺伝子（ＴＲＢＪ）の短いペプチドアミノ酸の最後から２番目、４番目、６番目の可変ドメイン疎水性コア位置で突然変異させることができ、ここで、アミノ酸配列の位置番号は、国際免疫遺伝学情報システム（ＩＭＧＴ）に記載された位置番号による。当業者は、上記国際免疫遺伝学情報システムを知り、当該データベースに従って、ＩＭＧＴにおける異なるＴＣＲのアミノ酸残基の位置番号を得ることができる。
【００４６】
本発明において、疎水性コア領域で突然変異が発生するＴＣＲは、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを結合する柔軟なペプチド鎖から構成される安定的な可溶性一本鎖ＴＣＲであり得る。本発明における柔軟なペプチド鎖は、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを結合するのに適した任意のペプチド鎖であり得ることに留意されたい。本発明の実施例４で構築された一本鎖可溶性ＴＣＲの場合、そのα鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３２であり、コードされたヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３であり、β鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３４であり、コードされたヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５である。
【００４７】
また、安定性の観点から、特許文書２０１６８０００３５４０．２は、ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を導入することにより、ＴＣＲの安定性を顕著に向上させることができる。従って、本発明の高親和性ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を含むことができる。具体的には、前記ＴＣＲのα鎖可変領域とβ鎖定常領域との間に人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成するシステイン残基は、ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸、ＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、ＴＲＡＶの４６番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６１番目のアミノ酸、またはＴＲＡＶの４７番目のアミノ酸およびＴＲＢＣ１＊０１またはＴＲＢＣ２＊０１エクソン１の６０番目のアミノ酸を置換する。好ましくは、このようなＴＣＲは、（i）膜貫通ドメインを除くＴＣＲのα鎖の全部または一部、および（ii）膜貫通ドメインを除くＴＣＲβ鎖の全部または一部を含むことができ、ここで、（i）および（ii）は、それぞれＴＣＲ鎖の可変ドメインおよび少なくとも定常ドメインの一部を含み、α鎖とβ鎖とは、ヘテロダイマー形成する。より好ましくは、このようなＴＣＲは、α鎖可変ドメインおよびβ鎖可変ドメインならびに膜貫通ドメインを除くβ鎖定常ドメインの全部または一部を含むが、α鎖定常ドメインを含まなく、前記ＴＣＲα鎖可変ドメインとβ鎖とは、ヘテロダイマーを形成する。
【００４８】
本発明のＴＣＲは、多価複合体の形態で提供することもできる。本発明の多価ＴＣＲ複合体は、例えば、ｐ５３の四量体化ドメインを使用して、テトラマーを生成することができる二つ、三つ、四つまたはそれ以上の本発明のＴＣＲを結合させることによって形成されるポリマーを含むか、または本発明の複数のＴＣＲを別の分子と結合させることによって形成された複合体を含むことができる。本発明のＴＣＲ複合体は、インビトロまたはインビボで特定の抗原を提示する細胞を追跡または標的化するために使用することができ、そのような用途を有する他の多価ＴＣＲ複合体の中間体を生成するために使用することもできる。
【００４９】
本発明のＴＣＲは、単独で使用することができ、共有結合または他の方法で、好ましくは、共有結合でコンジュゲートと結合することができる。前記コンジュゲートは、検出可能なマーカー（診断目的とし、ここで、前記ＴＣＲは、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体を提示する細胞の存在を検出する）、治療薬、ＰＫ（プロテインキナーゼ）修飾部分あるいは、これらの物質の任意の組み合わせ結合またはカップリングを含む。
【００５０】
診断目的で使用される検出可能なマーカーは、蛍光または発光マーカー、放射性マーカー、ＭＲＩ（磁気共鳴画像）またはＣＴ（電子コンピューターＸ線断層撮影技術）造影剤、または検出可能な生成物を生成することができる酵素を含むが、これらに限定されない。
【００５１】
本発明のＴＣＲと結合またはカップリングすることができる治療薬は、（１）放射性核種（Ｋｏｐｐｅら，２００５，癌転移レビュー（Ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ  ｒｅｖｉｅｗｓ）２４，５３９）、（２）生物学的毒性（Ｃｈａｕｄｈａｒｙら，１９８９，自然（Ｎａｔｕｒｅ）３３９，３９４、Ｅｐｅｌら，２００２，癌免疫学および免疫治療（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５１，５６５）、（３）ＩＬ−２等のサイトカイン（Ｇｉｌｌｉｅｓら，１９９２，米国国立科学アカデミーの学術誌（ＰＮＡＳ）８９，１４２８、Ｃａｒｄら，２００４，癌免疫学および免疫治療（Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ）５３，３４５、Ｈａｌｉｎら，２００３，癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）６３，３２０２）、（４）抗体Ｆｃフラグメント（Ｍｏｓｑｕｅｒａら，２００５，免疫学ジャーナル（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  Ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）１７４，４３８１）、（５）抗体ｓｃＦｖフラグメント（Ｚｈｕら，１９９５，癌国際ジャーナル（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ）６２，  ３１９）、（６）金ナノ粒子／名のロッド（Ｌａｐｏｔｋｏら，２００５，癌コミュニケーション（Ｃａｎｃｅｒ  ｌｅｔｔｅｒｓ  ）２３９，３６、Ｈｕａｎｇら，２００６，米国化学会誌（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ）１２８，２１１５）、（７）ウイルス粒子（Ｐｅｎｇら，２００４，遺伝子治療（Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ）１１，１２３４）、（８）リポソーム（Ｍａｍｏｔら，２００５，癌研究（Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）６５，１１６３１）、（９）ナノ磁性粒子、（１０）プロドラッグ活性化酵素（例えば、ＤＴ−ジアホラーゼ（ＤＴＤ）またはビフェニル加水分解酵素様タンパク質（ＢＰＨＬ））、（１１）化学療法剤（例えば、シスプラチン）または任意の形態のナノ粒子等を含むが、これらに限定されない。
【００５２】
また、本発明のＴＣＲは、一つを超える種に由来する配列を含むハイブリッドＴＣＲであり得る。例えば、研究によると、マウスＴＣＲは、ヒトＴＣＲよりもＴ細胞でより効果的に発現することができることが示される。従って、本発明のＴＣＲは、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを含むことができる。この方法の欠点は、免疫応答を引き起こす可能性があることである。従って、養子Ｔ細胞治療に使用する場合、マウスＴ細胞を発現する移植を可能にする免疫抑制の調節スキームが必要される。
【００５３】
本明細書におけるアミノ酸の名称は、国際的に使用される単一の英字または三つの英字で表示され、単一の英字と三つの英字のアミノ酸の名称の対応関係は、Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｖａｌ（Ｖ）等のとおりである。
【００５４】
核酸分子
本発明の第２の様態は、本発明の第１の様態のＴＣＲ分子またはその一部をコードする核酸分子を提供し、前記一部は、一つまたは複数のＣＤＲ、α鎖および／またはβ鎖の可変ドメイン、およびα鎖および／またはβ鎖であり得る。
本発明の第１の様態のＴＣＲ分子のα鎖ＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は、
α  ＣＤＲ１−  ｇａｔａｇｃｇｃｔａｔｔｔａｃａａｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６）、
α  ＣＤＲ２−  ａｔｔｃａｇｔｃａａｇｔｃａｇａｇａｇａｇ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７）、
α  ＣＤＲ３−  ｇｃｔｇｔｇａａｔａｇｔｇｇａｇｇｔａｇｃａａｃｔａｔａａａｃｔｇａｃａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８）であり、
本発明の第１の様態のＴＣＲ分子のβ鎖ＣＤＲ領域をコードするヌクレオチド配列は、
β  ＣＤＲ１−  ｔｃｇｇｇｔｃａｔｇｔａｔｃｃ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９）、
β  ＣＤＲ２−  ｔｔｃｃａｇａａｔｇａａｇｃｔｃａａ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０）、
β  ＣＤＲ３−  ｇｃｃａｇｃａｇｃｔｔａｔｔｃｇｇｇｃａｇｇｇａｃｇｇｇａａａａａｃｔｇｔｔｔ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１）である。
【００５５】
従って、本発明のＴＣＲのα鎖をコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１７およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８を含み、および／または本発明のＴＣＲβ鎖をコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２０およびＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２１を含む。
【００５６】
本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、一本鎖または二本鎖であり得、当該核酸分子は、ＲＮＡ  またはＤＮＡであり得、イントロンを含むか、または含まないことができる。好ましくは、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、イントロンを含まないが、本発明のポリペプチドをコードするすることができ、例えば、本発明のＴＣＲα鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含み、および／または本発明のＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６を含む。あるいは、本発明のＴＣＲα鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３３を含み、および／または本発明のＴＣＲβ鎖可変ドメインをコードする本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３５を含む。より好ましくは、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４および／またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８を含む。あるいは、本発明の核酸分子のヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１である。
【００５７】
遺伝暗号の縮重により、異なるヌクレオチド配列は、同じポリペプチドをコードすることができることは理解しなければならない。従って、本発明のＴＣＲをコードする核酸配列は、本発明の図面に示される核酸配列と同じであるか、または縮重された変異体であり得る。本発明の一つの例を説明すると、「縮重された変異体」は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を有するタンパク質配列をコードするが、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の配列とは異なる核酸配列を指す。
【００５８】
ヌクレオチド配列は、コドン最適化されることができる。異なる細胞によって具体的なコドンの使い方が異なり、細胞の種類に応じて、配列のコドンを変更して発現量を増やすことができる。哺乳動物の細胞および他の多くの生物のコドン選択リストは、当業者によく知られている。
【００５９】
本発明の核酸分子の全長配列またはそのフラグメントは、通常、ＰＣＲ増幅法、組換え胞または人工的合成法によって得ることができるが、これらに限定されない。現在、本発明のＴＣＲ（またはそのフラグメント、またはその誘導体）をコードするＤＮＡ配列は、化学合成によって完全に得ることができる。次に、当該ＤＮＡ配列は、当技術分野で知られている様々な既存のＤＮＡ分子（またはベクター等）および細胞に導入されることができる。ＤＮＡは、コード鎖または非コード鎖であり得る。
【００６０】
ベクター
本発明は、発現ベクター、即ち、インビボまたはインビトロで発現することができる構築物を含む、本発明の核酸分子を含むベクターに関する。一般に使用されるベクターは、細菌プラスミド、バクテリオファージおよび動植物ウイルスを含む。
【００６１】
ウイルス送達システムは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターおよびバキュロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【００６２】
好ましくは、ベクターは、本発明のヌクレオチドをＴ細胞等の細胞に移して、当該細胞がＡＦＰ抗原に特異的なＴＣＲを発現することができる。理想的には、当該ベクターは、Ｔ細胞で高レベルで継続的に発現することができる。
【００６３】
細胞
本発明は、本発明のベクターまたはコード配列を使用して遺伝子工学によって作成された宿主細胞に関する。前記宿主細胞は、本発明のベクターを含むか、または染色体に本発明の核酸分子が組み込まれる。宿主細胞は、原核細胞および大腸菌、酵母細胞およびＣＨＯ細胞等の真核細胞から選択される。
【００６４】
また、本発明は、本発明のＴＣＲを発現する単離された細胞、特にＴ細胞を含む。当該Ｔ細胞は、被験者から単離されたＴ細胞に由来するすることができるか、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）グループの一部等の被験者から単離された混合細胞グループであり得る。例えば、当該細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されることができ、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞またはＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞であり得る。当該細胞は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞／ＣＤ８＋細胞毒性Ｔ細胞の混合グループに存在することができる。一般に、当該細胞は、抗体（例えば、抗−ＣＤ３または抗−ＣＤ２８の抗体）で活性化され、トランスフェクションをより受け入れやすくすることができ、例えば、本発明のＴＣＲ分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを用いてトランスフェクションを行う。
【００６５】
選択的に、本発明の細胞は、幹細胞であるか、または造血幹細胞（ＨＳＣ）等の幹細胞に由来することができる。幹細胞の表面は、ＣＤ３分子を発現しないため、ＨＳＣへの遺伝子導入は、細胞表面でのＴＣＲの発言を引き起こさない。しかし、幹細胞が胸腺に移動するリンパ球前駆細胞（ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ）に分化する場合、ＣＤ３分子の発現により、胸腺細胞表面に導入されたＴＣＲ分子の発現が開始される。
【００６６】
本発明のＴＣＲをコードするＤＮＡまたはＲＮＡによるＴ細胞トランスフェクション（例えば、Ｒｏｂｂｉｎｓら，（２００８）Ｊ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８０：６１１６−６１３１）に適した多くの方法がある。本発明のＴＣＲを発現するＴ細胞は、養子免疫治療に使用することができる。当業者は、養子治療に適した多くの方法を知ることができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ８（４）：２９９−３０８）。
【００６７】
ＡＦＰ抗原関連疾患
本発明は、ＡＦＰ特異的Ｔ細胞を被験者に養子移入する段階を含む、被験者におけるＡＦＰ関連疾患を治療および／または予防する方法に関する。当該ＡＦＰ特異性Ｔ細胞は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体を識別することができる。
【００６８】
本発明のＡＦＰ特異的Ｔ細胞は、ＡＦＰ抗原の短いペプチドＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体を提示する任意のＡＦＰ関連疾患を治療するに使用されることができる。肝細胞癌を含むが、これらに限定されない。
【００６９】
治療方法
治療は、ＡＦＰ抗原関連疾患を患う患者または志願者からＴ細胞を単離し、本発明のＴＣＲを上記Ｔ細胞に導入した後、これらの遺伝子操作された細胞を治療にために患者の体内に注入することによって実施されることができる。従って、本発明は、本発明のＴＣＲを発現する単離されたＴ細胞を含む、ＡＦＰ関連疾患を治療する方法を提供し、好ましくは、当該Ｔ細胞は、患者自身に由来し、患者の体内に移される。一般に、（１）患者のＴ細胞の単離、（２）本発明の核酸分子または本発明のＴＣＲ分子をコードすることができる核酸分子によるＴ細胞のインビトロ形質導入、（３）患者の体内に注入された遺伝子操作されたＴ細胞を含む。単離、トランスフェクションおよび再注入される細胞の数は、医師によって決定されることができる。
【００７０】
本発明の主な利点は次のとおりである。
（１）本発明のＴＣＲは、ＡＦＰ抗原の短いペプチド複合体ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１に結合することができ、同時に、本発明のＴＣＲを形質導入する細胞を特異的に活性化することができる。
【００７１】
以下、本発明は、具体的実施例と併せてさらに説明される。これらの実施例は、本発明を説明するためにのみ使用され、本発明の範囲を限定するものではないことを理解されたい。以下の実施例における具体的な条件を示さない実験方法は、通常、一般的な条件、例えば、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら，分子クローニング：実験マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版）（２００１）ＣＳＨＬ出版社）に記載の条件、メーカーよって提案された条件に従う。特に明記されない限り、パーセンテージと部数とは、重量で計算される。以下の実施例で使用される実験材料および試薬は、特に明記しない限り、商業チャネルから入手することができる。
【００７２】
実施例１．ＡＦＰ抗原の短いペプチド特異性Ｔ細胞のグローニング
合成短いペプチドＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．：９、北京サイバーソン遺伝子技術会社）を使用して、遺伝子型がＨＬＡ−Ａ０２０１である健康なボランティアの末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を刺激した。ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ短いペプチドを、ビオチンマーカーを有するＨＬＡ−Ａ０２０１で再生し、ｐＨＬＡ半数体を調製する。これらの半数体は、ＰＥマーカーのストレプトアビジン（ＢＤ会社）と組み合わされてＰＥマーカーのテトラマーを形成し、当該テトラマーおよび抗−ＣＤ８−ＡＰＣ二重陽性細胞が選択される。選択された細胞を増幅し、前記方法に従って二次選択を行い、次に、限界希釈法を使用して単一クローンを行う。モノクローナル細胞をテトラマーで染色し、スクリーニングされた二重陽性クローンは、図３に示されるようである。様々なレベルでスクリーニングされた二重陽性クローンは、さらなる機能テストを満たす必要がある。
【００７３】
ＥＬＩＳＰＯＴ実験を通じて、当該Ｔ細胞クローンの機能および特異性をさらに検出する。当業者は、ＥＬＩＳＰＯＴ実験を使用して細胞機能を検出する方法をよく知っている。本実施例のＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ実験で使用されるエフェクター細胞は、本発明で得られたＴ細胞クローンであり、標的細胞は、本発明の短いペプチドをロードしたＴ２細胞であり、対照グループは、他の短いペプチドをロードしたＴ２細胞および任意の短いペプチドをロードしないＴ２細胞である。
【００７４】
まず、ＥＬＩＳＰＯＴプレートを準備し、ＥＬＩＳＰＯＴ実験の段階は次のとおりである。次の順序で試験の各成分をＥＬＩＳＰＯＴプレートに加える。４０μｌのＴ２細胞５×１０５細胞／ｍｌ（即ち、２００００Ｔ２細胞／ウェル）、４０μｌのエフェクター細胞（２０００Ｔ細胞クローン／ウェル）の後、２０μｌの特異的な短いペプチドを実験グループに加え、２０μｌの非特異的な短いペプチドを対照グループに加え、２０μｌの培地（試験培地）をブランクグループに加え、二つの複製ウェルを設置する。次に、一晩インキュベートする（３７℃，５％ＣＯ２）。その後、プレートを洗浄し、二次検出および発色を行い、プレートを１時間乾燥させ、イムノスポットプレートリーダー（ＥＬＩＳＰＯＴ  ＲＥＡＤＥＲ  ｓｙｓｔｅｍ、ＡＩＤ会社）を使用して、メンブレンに形成されたスポットを数える。図１４に示されたように、実験結果によると、得られた特定の抗原特異的なＴ細胞クローンは、本発明の短いペプチドをロードしたＴ２細胞に対して特異的な反応を有し、他の無関係なものをロードするペプチドおよび短いペプチドをロードしないＴ２細胞に対してほぼ反応がない。
【００７５】
実施例２．ＡＦＰ抗原の短いペプチド特異的なＴ細胞クローンを得るためのＴＣＲ遺伝子およびベクターの構築
Ｑｕｉｃｋ−ＲＮＡ（商標）  ＭｉｎｉＰｒｅｐ（ＺＹＭＯ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用して、実施例１で選択された抗原の短いペプチドＦＭＮＫＦＩＹＥＩ特異性、ＨＬＡ−Ａ０２０１制限性Ｔ細胞クローンのトータルＲＮＡを抽出する。ｃＤＮＡの合成は、ｃｌｏｎｔｅｃｈのＳＭＡＲＴ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キットを使用し、使用されるプライマーは、ヒトＴＣＲ遺伝子のＣ端保存領域で設計される。配列をＴベクター（ＴＡＫＡＲＡ）にクローンし、シーケンシングする。当該配列は、イントロンを含まない相補的な配列であることに注意されたい。シーケンシング後、当該二重陽性クローンによって発現されたＴＣＲのa鎖およびb鎖の配列構造は、それぞれ図１および図２に示されとおりであり、図１ａ、図１ｂ、図１ｃ、図１ｄ、図１ｅおよび図１ｆは、それぞれＴＣＲα鎖可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲα鎖可変ドメインのヌクレオチド配列、ＴＣＲのα鎖アミノ酸配列、ＴＣＲのα鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列を有するＴＣＲのα鎖アミノ酸配列およびリーダー配列を有するＴＣＲのα鎖ヌクレオチド配列であり、図２ａ、図２ｂ、図２ｃ、図２ｄ、図２ｅおよび図２ｆは、それぞれＴＣＲβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列、ＴＣＲβ鎖可変ドメインのヌクレオチド配列、ＴＣＲβ鎖アミノ酸配列、ＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列、リーダー配列有するＴＣＲβ鎖アミノ酸配列およびリーダー配列を有するＴＣＲβ鎖ヌクレオチド配列である。
鑑定によると、α鎖は、
α  ＣＤＲ１−  ＤＳＡＩＹＮ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１０）、
α  ＣＤＲ２−  ＩＱＳＳＱＲＥ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１）、
α  ＣＤＲ３−  ＡＶＮＳＧＧＳＮＹＫＬＴ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含み、
β鎖は、
β  ＣＤＲ１−  ＳＧＨＶＳ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３）、
β  ＣＤＲ２−  ＦＱＮＥＡＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４）、
β  ＣＤＲ３−  ＡＳＳＬＦＧＱＧＲＥＫＬＦ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１５）のアミノ酸配列を有するＣＤＲを含む。
【００７６】
オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐ）ＰＣＲすることにより、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の全長遺伝子をレンチウイルス発現ベクターｐＬｅｎｔｉ（ａｄｄｇｅｎｅ）にクローンする。具体的には、オーバーラップＰＣＲを使用して、ＴＣＲのα鎖およびＴＣＲβ鎖の全長遺伝子を結合して、ＴＣＲのα−２Ａ−ＴＣＲβフラグメントを得る。レンチウイルス発現ベクターおよびＴＣＲα−２Ａ−ＴＣＲβを消化して、結合して、ｐＬｅｎｔｉ−ＴＲＡ−２Ａ−ＴＲＢ−ＩＲＥＳ−ＮＧＦＲプラスミドを得る。対照として、同時にｅＧＦＰを発現するレンチウイルスベクターｐＬｅｎｔｉ−ｅＧＦＰも構築する。その後、２９３Ｔ／１７を使用して偽ウイルスをパッケージ化する。
【００７７】
実施例３．ＡＦＰ抗原の短いペプチド特異的な可溶性ＴＣＲの発現、リフォールディングおよび精製
可溶性ＴＣＲ分子を得るために、本発明のＴＣＲ分子のα鎖およびβ鎖は、それぞれその可変ドメインおよび定常ドメインの一部のみを含むことができ、α鎖およびβ鎖の定常ドメインにそれぞれ一つのシステイン残基を導入して、人工的な鎖間ジスルフィド結合を形成し、システイン残基を導入した位置は、それぞれＴＲＡＣ＊０１エクソン１のＴｈｒ４８およびＴＲＢＣ２＊０１エクソン１のＳｅｒ５７であり、そのα鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図４ａおよび図４ｂに示され、そのβ鎖のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図５ａおよび図５ｂに示される。「分子クローニング：実験マニュアル」（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版，ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら）に記載の標準的な方法を通じて、上記ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の標的遺伝子配列を合成した後、それぞれ発現ベクターｐＥＴ２８ａ＋（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）に挿入し、上流と下流とのクローニングサイトは、それぞれＮｃｏＩおよびＮｏｔＩである。挿入されたフラグメントは、シーケンシングによって確認される。
【００７８】
ＴＣＲα鎖およびβ鎖の発現ベクターは、それぞれ化学形質転換法により発現細菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に毛室転換され、細菌は、ＬＢ培養液で増殖し、ＯＤ６００＝０．６で最終濃度０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導され、ＴＣＲのα鎖およびβ鎖の発現後に形成された封入体を、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｏｖａｇｅｎｅ）で抽出し、ＢｕｇＢｕｓｔｅｒ溶液で繰り返し洗浄し、最後に、封入体を６Ｍの塩酸グアニジン、１０ｍＭのジチオスレイトール（ＤＴＴ）、１０ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）および２０ｍＭのトリス（Ｔｒｉｓ）（ｐＨ  ８．１）に溶解する。
【００７９】
溶解後のＴＣＲのα鎖およびβ鎖は、５Ｍの尿素、０．４Ｍのアルギニン、２０ｍＭのトリス（ｐＨ８．１）、３．７ｍＭのシスタミン（ｃｙｓｔａｍｉｎｅ）および６．６ｍＭのβ‐メルカポエチルアミン（β−ｍｅｒｃａｐｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ）（４℃）に１：１の質量比ですばやく混合され、最終濃度は、６０ｍｇ／ｍＬである。混合後、溶液を１０倍量の脱イオン水に入れて透析し（４℃）、１２時間後、脱イオン水を緩衝液（２０ｍＭのトリス，ｐＨ  ８．０）に変え、４℃で１２時間透析を続ける。透析後の溶液を０．４５μＭのフィルターメンブレンでろ過し、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ，５ｍｌ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製する。溶出されたピークに正常に再生されたαおよびβダイマーを含まれるＴＣＲは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによって確認された。次に、ＴＣＲは、ゲルろ過クロマトグラフィー（ＨｉＰｒｅｐ  １６／６０，Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ  Ｓ−１００  ＨＲ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を通じてさらに精製された。精製後のＴＣＲの純度は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって９０％以上であることを確認され、濃度は、ＢＣＡ法によって確認された。本発明により得られた可溶性ＴＣＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル画像は、図６に示されたようである。
【００８０】
実施例４．ＡＦＰ抗原の短いペプチド特異的な可溶性一本鎖ＴＣＲの生成
特許文書ＷＯ２０１４／２０６３０４の記載によると、部位特異的突然変異の方法を使用して、実施例２のＴＣＲのα鎖およびβ鎖の可変ドメインを、一つの柔軟な短いペプチド（ｌｉｎｋｅｒ）によって結合された安定的で可溶性の一本鎖ＴＣＲ分子に構築した。当該一本鎖ＴＣＲ分子のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図７ａおよび図７ｂに示される。そのα鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図８ａおよび図８ｂに示され、そのβ鎖可変ドメインのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図９ａおよび図９ｂに示され、そのリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）配列のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は、それぞれ図１０ａおよび図１０ｂに示される。
【００８１】
標的遺伝子をＮｃｏIとＮｏｔIとで二重消化した後、ＮｃｏIとＮｏｔIとで二重消化されたｐＥＴ２８ａベクターに結合する。結合産物をＥ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換し、カナマイシンを含むＬＢプレートにコーティングし、３７℃で一晩逆培養し、ＰＣＲスクリーニング用の陽性クローンを選択し、陽性組換え単位に対してシーケンシングし、配列が正しいことを確認した後、組換えプラスミドを抽出し、発現のためにＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質転換した。
【００８２】
実施例５．ＡＦＰ抗原の短いペプチド特異的な可溶性一本鎖ＴＣＲの発現、再生および精製
実施例４で調製された組換えプラスミドｐＥＴ２８ａ−テンプレート鎖を含むすべてのＢＬ２１（ＤＥ  ３）コロニーを、カナマイシンを含むＬＢ培地に接種し、３７℃でＯＤ６００が０．６〜０．８になるまで培養し、最終濃度が０．５ｍＭになるようにＩＰＴＧを加え、３７℃で４時間インキュベートし続ける。５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離して細胞ペレットを回収し、Ｂｕｇｂｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｍｅｒｃｋ）で細胞ペレットを溶解し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し手封入体を回収し、再びＢｕｇｂｕｓｔｅｒ（Ｍｅｒｃｋ）で洗浄して細胞破片および膜成分を除去し、６０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、封入体を収集する。封入体を緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０，８Ｍの尿素）に溶解し、高速で遠心分離して不溶性物質を除去し、上清液をＢＣＡ法で定量した後、分注して−８０℃で保存する。
【００８３】
溶解した５ｍｇの一本鎖ＴＣＲ封入体タンパク質に、２．５ｍＬの緩衝液（６ＭのＧｕａ−ＨＣｌ，５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ  ８．１，１００ｍＭのＮａＣｌ，１０ｍＭの  ＥＤＴＡ）を加え、最終濃度が１０ｍＭになるまでＤＴＴを加え、３７℃で３０分間処理する。注射器を使用して、１２５ｍＬの再生緩衝液（１００ｍＭのトリス−ＨＣｌ，ｐＨ  ８．１，０．４ＭのＬ−アルギニン，５Ｍの尿素，２ｍＭのＥＤＴＡ，６．５ｍＭのβ−ｍｅｒｃａｐｔｈｏｅｔｈｙｌａｍｉｎｅ，１．８７ｍＭのシスタミン）に、前記処理後の一本鎖ＴＣＲを滴下し、４℃で１０分間撹拌した後、再生溶液をカットオフが４ｋＤａであるセルロース膜透析バッグに入れ、透析バッグを１Ｌの予冷水に入れ、４℃で一晩ゆっくりと撹拌する。１７時間後、透析溶液を１Ｌの予冷緩衝液（２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０）に変更し、４℃で８時間透析を続けた後、透析溶液を同じ新鮮な緩衝液に変更し、一晩透析を続ける。１７時間後、サンプルを０．４５μｍのフィルターメンブレンでろ過し、真空脱気した後、陰イオン交換カラム（ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に通過し、２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０で調製した０〜１ＭのＮａＣｌ線形勾配溶離液でタンパク質を精製し、収集された溶離成分をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、一本鎖ＴＣＲを含む成分を濃縮した後、さらにゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ７５  １０／３００，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で精製し、ターゲット成分もＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析する。
【００８４】
ＢＩＡｃｏｒｅ分析に使用される溶離成分は、ゲルろ過法でさらにテストされる。条件は次のとおりである。クロマトグラフィーカラムＡｇｉｌｅｎｔ  Ｂｉｏ  ＳＥＣ−３（３００  Ａ，φ７．８×３００ｍＭ）、移動相は、１５０ｍＭのリン酸塩緩衝液、流速は、０．５ｍＬ／ｍｉｎであり、カラム温度は、２５℃であり、ＵＶ検出波長は、２１４ｎｍである。
本発明で得られた可溶性一本鎖ＴＣＲのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル図は、図１１に示されたようである。
【００８５】
実施例６．結合の特性化
ＢＩＡｃｏｒｅ分析
本実施例は、本発明の可溶性ＴＣＲ分子がＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に特異的に結合することができることを証明した。
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００リアルタイム分析システムを使用して、実施例３と実施例５とで得られたＴＣＲ分子およびＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体の結合活性を検出する。抗ストレプトアビジン抗体（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）をカップリング緩衝液（１０ｍＭの酢酸ナトリウム緩衝液，ｐＨ  ４．７７）に加えた後、抗体を事前にＥＤＣとＮＨＳとで活性化したＣＭ５チップに流して、抗体をチップ表面に固定し、最後に、エタノールアミン塩酸溶液で反応してない活性化表面を密封して、カップリングプロセスを完了し、カップリングレベルは、約１５０００ＲＵである。
【００８６】
抗体でコーティングされたチップの表面に低濃度のストレプトアビジンを流した後、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体を検出チャネルに流し、別のチャネルを参照チャネルとして流し、０．０５ｍＭのビオチンを１０μＬ／ｍｉｎの流速で２分間チップに流し、ストレプトアビジンの残りの結合部位を密閉する。
前記ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体の調製プロセスは、次のとおりである。
【００８７】
ａ．精製
重鎖または軽鎖の発現を誘導するＥ．  ｃｏｌｉ菌溶液を１００ｍＬ収集し、８０００ｇ、４℃で１０分間遠心分離した後、１０ｍＬのＰＢＳを細菌を１回洗浄し、次に、５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔｓ（Ｍｅｒｃｋ）で激しく振とうして細菌を再懸濁し、回転させながら室温で２０分間インキュベートした後、６０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を捨てて封入体を収集する。
【００８８】
前記封入体を５ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘに再懸濁し、回転させながら室温で５分間インキュベートし、１０倍希釈した３０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒを加え、よく混合し、６０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、上清を捨て、１０倍希釈した３０ｍＬのＢｕｇＢｕｓｔｅｒを加えて封入体を再懸濁し、よく混合し、６０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、２回繰り返し、３０ｍＬの２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ｐＨ  ８．０を加えて封入体を再懸濁し、よく混合し、６０００ｇ、４℃で１５分間遠心分離し、最後に２０ｍＭトリス−ＨＣｌ  ８Ｍ尿素で封入体を溶解し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで封入体の純度を検出し、ＢＣＡキットで濃度を測定する。
【００８９】
ｂ．再生
合成された短いペプチドＦＭＮＫＦＩＹＥＩ（北京サイバイシェン遺伝子技術会社）をＤＭＳＯに２０ｍｇ／ｍｌの濃度になるまで溶解した。軽鎖と重鎖との封入体を、８Ｍ尿素、２０ｍＭトリス  ｐＨ  ８．０、１０ｍＭＤＴＴで溶解し、再生前に、３Ｍ塩酸グアニジン、１０ｍＭ酢酸ナトリウム、１０ｍＭＥＤＴＡを加えてさらに変性する。ＦＭＮＫＦＩＹＥＩペプチドを２５ｍｇ／Ｌ（最終濃度）で再生緩衝液（０．４ＭＬ−アルギニン、１００ｍＭトリス  ｐＨ  ８．３、２ｍＭＥＤＴＡ、０．５ｍＭ酸化型グルタチオン、５ｍＭ還元型グルタチオン、０．２ｍＭＰＭＳＦ、４℃まで冷却し）に加えた後、順序に２０ｍｇ／Ｌの軽鎖および９０ｍｇ／Ｌの重鎖（最終濃度、重鎖は、８時間／回で３回に分けて加え）を加え、再生は、４℃で少なくとも三日で完了し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで再生が成功したかどうかを検出する。
【００９０】
ｃ．再生後の精製
透析用として１０倍量の２０ｍＭトリス  ｐＨ  ８．０を使用して、再生緩衝液を交換し、緩衝液を少なくとも２回交換して、溶液のイオン強度を十分に低下させる。透析後、タンパク質溶液を０．４５μｍの酢酸セルロースフィルターメンブレンでろ過した後、ＨｉＴｒａｐ  Ｑ  ＨＰ（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー（ＧＥ  Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｍｐａｎｙ））陰イオン交換カラム（５ｍＬベッドボリューム）にロードする。Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を使用して、２０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．０で調製した０〜４００ｍＭ  ＮａＣｌ線形勾配溶液でタンパク質を溶離し、ｐＭＨＣは、２５０ｍＭ  ＮａＣｌで溶離され、ピーク成分を収集し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで純度を検出した。
【００９１】
ｄ．ビオチン化
精製したｐＭＨＣ分子をＭｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブで濃縮し、同時に、緩衝液を２０ｍＭ  トリス  ｐＨ  ８．０に交換し多後、ビオチン化試薬０．０５  Ｍ  Ｂｉｃｉｎｅ  ｐＨ  ８．３、１０ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭｍｇＯＡｃ、５０μＭ  Ｄ−Ｂｉｏｔｉｎ、１００μｇ／ｍｌ  ＢｉｒＡ酵素（ＧＳＴ−ＢｉｒＡ）を加え、室温で混合物一晩インキュベートし、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでビオチン化が完了したかどうかを検出する。
【００９２】
ｅ．ビオチン化後の複合体の精製
Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブでマーカー後のビオチン化ｐＭＨＣ分子を１ｍＬに濃縮し、ゲルろ過クロマトグラフィーを使用してビオチン化ｐＭＨＣを精製し、Ａｋｔａ精製器（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）を使用して、ろ過したＰＢＳを使用してＨｉＰｒｅｐＴＭ  １６／６０  Ｓ２００  ＨＲカラム（ＧＥゼネラルエレクトリックカンパニー）で事前平衡化し、１ｍＬの濃縮後のビオチン化ｐＭＨＣ分子をロードした後、ＰＢＳで１ｍＬ／分間の流速で溶離する。ビオチン化ｐＭＨＣ分子は、約５５ｍＬで単一のピークとして溶離される。タンパク質を含む成分を合わせ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ限外ろ過チューブで濃縮し、ＢＣＡ法（Ｔｈｅｒｍｏ）でタンパク質濃度を測定し、タンパク質酵素阻害剤ｃｏｃｋｔａｉｌ（Ｒｏｃｈｅ）を加えて、ビオチン化ｐＭＨＣ分子を分注して、−８０℃で保存する。
【００９３】
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して、ダイナミクスパラメーターを計算することにより、得られた本発明の可溶性ＴＣＲ分子および本発明によって構築された可溶性一本鎖ＴＣＲ分子とＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体との結合の動態学マップは、それぞれ図１２および図１３に示されたようである。マップによると、本発明で得られた可溶性ＴＣＲ分子および可溶性一本鎖ＴＣＲ分子の両方は、ＦＭＮＫＦＩＹＥＩ−ＨＬＡ  Ａ０２０１複合体に結合することができることを示す。同時に、上記方法を使用して、本発明の可溶性ＴＣＲ分子および他のいくつかの無関係な抗原の短いペプチドおよびＨＬＡ複合体との結合活性を検出し、結果は、本発明のＴＣＲ分子が他の無関係な抗原に結合しなかったことを示す。
【００９４】
実施例７．本発明のＴＣＲを形質導入するＴ細胞の活性化実験
本発明のＴＣＲ標的遺伝子を含むレンチウイルスベクターを構築し、Ｔ細胞を形質導入し、ＥＬＩＳＰＯＴ機能検証試験を実施する。
ＥＬＩＳＰＯＴスキーム
以下の試験を実施して、標的細胞特異性に対する本発明のＴＣＲで形質導入されたＴ細胞の活性化反応を証明した。ＥＬＩＳＰＯＴ試験で検出されたＩＦＮ−γ生成量をＴ細胞活性化の読み出し値として使用した。
試薬
試験培地：１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ会社，カタログ番号１６０００−０４４）、ＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ会社、カタログ番号Ｃ１１８７５５００ｂｔ）
洗浄緩衝液（ＰＢＳＴ）：０．０１Ｍ  ＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ２０
ＰＢＳ（Ｇｉｂｃｏ会社、カタログ番号Ｃ１００１０５００ＢＴ）
ＰＶＤＦ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ９６ウェルプレート（メルクミリポア（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、カタログ番号ＭＳＩＰＳ４５１０）
【００９５】
ヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ＰＶＤＦ−酵素キット（ＢＤ）は、必要とする他のすべての試薬（捕捉および検出抗体、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液）を含む。
【００９６】
方法
標的細胞の調製
本実験で使用される標的細胞は、特異的短いペプチドをロードしたＴ２細胞である。実験培地で標的細胞を調製する。標的細胞の濃度を２．０×１０５細胞／ｍｌに調整し、ウェルあたり１００μｌを摂取して２．０×１０４細胞／ウェルを得る。
【００９７】
エフェクター細胞の調製
本実験におけるエフェクター細胞（Ｔ細胞）は、本発明のＡＦＰ抗原の短いペプチドの特異的なＴＣＲをトランスフェクション下ＣＤ８＋  Ｔ細胞であり、同じボランティアからのトランスフェクションされてない本発明のＴＣＲのＣＤ８＋  Ｔ細胞を対照グループとして使用する。抗ＣＤ３／ＣＤ２８コーティングビーズ（Ｔ細胞増幅産物、ライフテクノロジー（ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））でＴ細胞を刺激し、ＡＦＰ抗原の短いペプチドの特異的なＴＣＲ遺伝子を保有するレンチウイルスで形質導入し、形質導入後９〜１２日まで５０ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２と１０ｎｇ／ｍｌ  ＩＬ−７とを含む１０％ＦＢＳを含む１６４０培地で増幅し、次に、これらの細胞を試験培地に入れ、室温で１０分間３００ｇで遠心分離して洗浄する。次に、細胞を、所望の最終濃度の２倍で試験培地に再懸濁する、陰性対照エフェクター細胞も同様に処理する。
【００９８】
短いペプチド溶液の調製
ＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートの短いペプチドの最終濃度を０．１μｇ／ｍｌにするために、対応する短いペプチドを対応する標的細胞（Ｔ２）実験グループに加え、次に、勾配希釈し、対照グループは希釈せず、最高の短いペプチド濃度で直接試験する。
【００９９】
ＥＬＩＳＰＯＴ
製造業者の説明書に従って、ウェルプレートを次のように準備する。抗ヒトＩＦＮ−γ捕捉抗体をプレートあたり１０ｍｌの滅菌ＰＢＳで１：２００に希釈した後、１００μｌの希釈捕捉抗体を各ウェルに均等に加える。ウェルプレートを４℃で一晩インキュベートする。インキュベートした後、ウェルプレートを洗浄して過剰な捕捉抗体を除去する。１０％ＦＢＳを含む１００μｌ／ウェルのＲＰＭＩ  １６４０培地を加え、ウェルプレートを密閉するために、ウェルプレートを室温で２時間インキュベートする。次に、培地をウェルプレートから洗い流し、ＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートを神の上でフリックして軽くたたくことにより、残りの洗浄緩衝液をすべて除去する。
次に、次の順序で試験の各成分をＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートに加える。
１００μｌの標的細胞２＊１０５細胞／ｍｌ（合計で約２＊１０４標的細胞／ウェルを得る）。
１００μｌのエフェクター細胞（１＊１０４の対照エフェクター細胞／ウェルおよびＡＦＰ  ＴＣＲ陽性Ｔ細胞／ウェル）。
すべてのウェルは、重複して調製され追加される。
【０１００】
次に、ウェルプレートを一晩インキュベートし、（３７℃／５％  ＣＯ２）、翌日、培地を捨て、ウェルプレートを再蒸留水で２回洗浄し、洗浄緩衝液で３回洗浄し、ペーパータオルに置いて、軽くたたいて、残りの洗浄緩衝液を除去する。次に、検出抗体を１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで１：２００に希釈し、１００μｌ／ウェルで各ウェルに加える。ウェルプレートを室温で２時間インキュベートし、洗浄緩衝液で３回洗浄し、ウェルプレートをペーパータオルで軽くたたいて過剰な洗浄緩衝液を除去する。
【０１０１】
ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで１：１００に希釈し、１００μｌの希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを各ウェルに加え、ウェルプレートを室温で１時間インキュベートする。次に、洗浄緩衝液で４回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄し、ウェルプレートをペーパータオルで軽くたたいて過剰な洗浄緩衝液とＰＢＳとを除去する。洗浄後、キットによって提供されるＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を１００μｌ／ウェルで加えて現像する。現像期間中に、光から保護するためにスズ箔でウェルプレートを覆い、５〜１５分間静置する。この期間中に、反応が終了する最適な時間を確定するために、現像ウェルプレートのスポットを定期的にチェックする。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を除去し、ウェルプレートを再蒸留水で洗い流して、現像反応を停止し、スピンドライした後、ウェルプレートの底部を除去し、各ウェルが完全に乾くまでウェルプレートを室温で乾燥し、イムノスポットプレートリーダー（ＣＴＬ、細胞技術会社（Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ））を使用して、ウェルプレートの底膜に形成されたスポットを数える。
【０１０２】
結果
ＥＬＩＳＰＯＴ実験（上記のように）を使用して、ＡＦＰ抗原の短いペプチドＦＭＮＫＦＩＹＥＩをロードする標的細胞に反応する、本発明のＴＣＲで形質導入されたＴ細胞のＩＦＮ−γ放出を試験した。グラフパッドプリズム（ｇｒａｐｈｐａｄ  ｐｒｉｓｍ）６を使用して、各ウェルで観察されたＥＬＳＰＯＴスポットの数を製図する。
【０１０３】
図１５に示されたように、実験結果によると、本発明のＴＣＲを形質導入するＴ細胞（エフェクター細胞）は、その特異的な短いペプチドをロードする標的細胞に対して良好な活性化反応を有するが、他のＴＣＲを形質導入するＴ細胞（エフェクター細胞）は、対応する標的細胞に対して活性化反応をほとんど有さない。
【０１０４】
本発明で言及されたすべての文書は、あたかも各文書が個別に参照として引用されたかのように、本出願における参照として引用される。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も、本出願の添付の請求範囲によって限られる範囲に含まれる。
【図１ａ】
2021531834.tif 000002
【図１ｂ】
2021531834.tif 000003
【図１ｃ】
2021531834.tif 000004
【図１ｄ】
2021531834.tif 000005
【図１ｅ】
2021531834.tif 000006
【図１ｆ】
2021531834.tif 000007
【図２ａ】
2021531834.tif 000008
【図２ｂ】
2021531834.tif 000009
【図２ｃ】
2021531834.tif 000010
【図２ｄ】
2021531834.tif 000011
【図２ｅ】
2021531834.tif 000012
【図２ｆ】
2021531834.tif 000013
【図３】
2021531834.tif 000014
【図４ａ】
2021531834.tif 000015
【図４ｂ】
2021531834.tif 000016
【図５ａ】
2021531834.tif 000017
【図５ｂ】
2021531834.tif 000018
【図６】
2021531834.tif 000019
【図７ａ】
2021531834.tif 000020
【図７ｂ】
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【図８ａ】
2021531834.tif 000022
【図８ｂ】
2021531834.tif 000023
【図９ａ】
2021531834.tif 000024
【図９ｂ】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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