(57)【要約】  本開示は、哺乳動物細胞または細胞群におけるスフィンゴ脂質代謝タンパク質の発現を達成するための、酸性セラミダーゼなどのスフィンゴ脂質代謝タンパク質をコードする修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）の使用に関する。（ｍｏｄＲＮＡ）からのタンパク質の発現により、細胞死または老化につながる細胞内の高レベルのセラミドが減少する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞死および／または細胞老化を阻害し、かつ／または哺乳動物細胞もしくは哺乳動物細胞群の生存を促進する方法であって、前記１つまたは複数の細胞を、スフィンゴ脂質代謝タンパク質をコードする修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記スフィンゴ脂質代謝タンパク質が、（１）セラミダーゼ；（２）スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）；（３）スフィンゴシン−１−リン酸受容体（ＳＩＰＲ）、または（１）、（２）、および（３）の組み合わせ、（１）と（２）との組み合わせ、（１）と（３）との組み合わせ、もしくは（２）と（３）との組み合わせからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記哺乳動物細胞または哺乳動物細胞群が、初代細胞、幹細胞、および配偶子からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記哺乳動物細胞または哺乳動物細胞群が、心臓細胞、筋肉細胞、上皮細胞、内皮細胞、卵母細胞、精子、および胚からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
（１）セラミダーゼをコードするｍｏｄＲＮＡ、（２）スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）をコードするｍｏｄＲＮＡ、（３）スフィンゴシン−１−リン酸受容体（ＳＩＰＲ）をコードするｍｏｄＲＮＡ、または（１）、（２）、および（３）の組み合わせ、（１）と（２）との組み合わせ、（１）と（３）との組み合わせ、もしくは（２）と（３）との組み合わせ、ならびに薬学的に許容される担体を含む、組成物。
【請求項６】
前記スフィンゴ脂質代謝タンパク質が、セラミダーゼである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法、または請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記セラミダーゼが、酸性セラミダーゼである、請求項６に記載の方法または組成物。
【請求項８】
前記酸性セラミダーゼが、配列番号１または配列番号７のヌクレオチド配列を有する、請求項７に記載の方法または組成物。
【請求項９】
前記セラミダーゼが、アルカリ性セラミダーゼである、請求項１もしくは２に記載の方法、または請求項５に記載の組成物。
【請求項１０】
前記アルカリ性セラミダーゼが、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、または配列番号１７のヌクレオチド配列を有する、請求項１もしくは２に記載の方法または請求項５に記載の組成物。
【請求項１１】
前記セラミダーゼが中性セラミダーゼである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法または請求項４に記載の組成物。
【請求項１２】
前記アルカリ性セラミダーゼが、配列番号６、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、または配列番号１２のヌクレオチド配列を有する、請求項１もしくは２に記載の方法または請求項５に記載の組成物。
【請求項１３】
前記スフィンゴ脂質代謝タンパク質が、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）である、請求項１もしくは２に記載の方法または請求項５に記載の組成物。
【請求項１４】
前記ＳＰＨＫが配列番号２のヌクレオチド配列を有する、請求項１もしくは２に記載の方法または請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記スフィンゴ脂質代謝タンパク質がＳ１ＰＲ２である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法または請求項４に記載の組成物。
【請求項１６】
前記Ｓ１ＰＲ２が配列番号３のヌクレオチド配列を有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞または細胞群が、セラミダーゼをコードするｍｏｄＲＮＡおよびスフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）をコードするｍｏｄＲＮＡと接触する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１８】
前記細胞または細胞群が、セラミダーゼをコードするｍｏｄＲＮＡ、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）をコードするｍｏｄＲＮＡ、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体（ＳＩＰＲ）をコードするｍｏｄＲＮＡと接触する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１９】
前記細胞または細胞群が、セラミダーゼをコードするｍｏｄＲＮＡおよびスフィンゴシン−１−リン酸受容体（ＳＩＰＲ）をコードするｍｏｄＲＮＡと接触する、請求項１または２に記載の方法。
【請求項２０】
前記セラミダーゼが酸性セラミダーゼ（ＡＣ）である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
この出願は、２０１８年３月７日に提出された米国仮出願番号６２／６３９，６９１および２０１８年６月２９日に提出された米国仮出願番号６２／６９２，１８５の利益を主張する。
【シーケンスリスト】
【０００２】
本出願は、２０１８年３月１日に作成されたシーケンスリストを収容し；ＡＳＣＩＩ形式のファイルは、３７１００３９ＡＷＯ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔと指定され、サイズは、３２．４キロバイトである。このファイルは、参照によりその全体が本出願に組み込まれる。
【技術分野】
【０００３】
本開示は、概して、細胞のロバスト性および生存を改善するためのスフィンゴ脂質代謝タンパク質の使用に関する。具体的には、ｍｏｄＲＮＡからのスフィンゴ脂質代謝タンパク質の発現は、細胞死を阻害し、正常な細胞機能を促進し、細胞の生存を延長する。
【背景技術】
【０００４】
様々なタイプのストレスが、細胞死につながる伝達シグナルを開始する可能性がある。この経路は、スフィンゴ脂質代謝に関与し、主に細胞死につながる可能性があるセラミドのレベルが上昇する。細胞死経路の開始を防止するためにセラミドのレベルのバランスをとる以前の方法は、セラミド合成に焦点を合わせてきた。
【０００５】
本技術の適用の一例は、体外受精（ＩＶＦ）などの生殖技術で使用するための卵母細胞および胚の生存を改善することである。初代卵母細胞が形成されるプロセスである卵母細胞形成は、出産前または出産直後のいずれかに完了し、その後追加の初代卵母細胞は作成されない。したがって、ヒトでは、初代卵母細胞は、妊娠期間の約２０週間でその最大の発達に達する。
【０００６】
通常の生理学的条件下では、これらの卵母細胞の８５〜９０％が、胎児または出生後の生活の中のある時点でアポトーシスに屈し；出産時には、形成された約７００万個のうち、約１〜２００万個の卵母細胞が残る。さらに、雌の生殖期中は、受精が成功しない限り、排卵した卵母細胞は、アポトーシスに特徴的な分子変化を受ける。臨床的には、残りの卵母細胞の予備が使い果たされると（平均して、これは５０歳前後の女性で発生する）、閉経は、卵巣の老化の直接的な結果として起こる。
【０００７】
まだ妊娠を望む高齢の生殖年齢の女性にとって、体外受精（ＩＶＦ）の将来性は、卵母細胞の予備力の低下に対する解決策を提供することができる。しかしながら、生殖補助医療技術（ＡＲＴ）の主な課題は、卵母細胞および胚の生存をｉｎ  ｖｉｔｒｏで維持するために必要な自然環境を模倣することである。
【０００８】
とりわけ、生殖に影響を与える細胞および生物のエージングとセラミドとの関連をサポートするいくつかの研究がある。セラミドは、細胞の増殖、分化、アポトーシス、接着、および遊走を媒介する生物活性脂質である。高レベルの細胞性セラミドは、アポトーシスを誘発する可能性があるが、セラミド１リン酸およびスフィンゴシン１リン酸などのセラミド代謝産物は、細胞の生存および増殖に関連する。
【０００９】
細胞の生存を促進する能力も治療上重要であり得る。例えば、急性心筋梗塞（ＭＩ）では、患者の血液中の脂質レベルを合併症のリスクを予測するのに役立てることができる。特に、高レベルのセラミドは、再発性事象および死亡率の高い確率に関連付けられる。
【００１０】
スフィンゴ脂質代謝タンパク質を発現するためのｍＲＮＡとして酸性セラミダーゼを送達するための方法が検討されてきた。しかしながら、遺伝子送達法としての未修飾外因性ＲＮＡの使用は、細胞外でのその不安定性および細胞にトランスフェクトされたときにそれが誘発する強い自然免疫応答のために効果的ではない。
【００１１】
したがって、必要なのは、細胞内でスフィンゴ脂質代謝酵素の短期的な発現を達成して細胞死を阻害し、生存を開始し、かつ老化から細胞を救い、それによって細胞の質および細胞の生存を促進できるＲＮＡ送達法である。
【発明の概要】
【００１２】
開示された技術は、ストレス関連事象後およびエージング中の細胞の運命を調節するためのスフィンゴ脂質代謝タンパク質の送達および使用に基づく。本開示は、セラミドシグナル伝達経路を操作して、細胞死および／または細胞老化を阻害し、細胞生存を開始し、かつスフィンゴ脂質代謝タンパク質をコードする修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）の投与によりｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで培養された細胞寿命を延長するための方法を提供する。
【００１３】
一態様では、本開示は、細胞死および／または細胞老化を阻害し、細胞または細胞群の生存を改善する方法であって、スフィンゴ脂質代謝タンパク質をコードする修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）を前記細胞または細胞群に投与することを含む、方法に関する。いくつかの実施形態では、スフィンゴ脂質代謝タンパク質は、（１）セラミダーゼ、（２）スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）、（３）スフィンゴシン−１−リン酸受容体（Ｓ１ＰＲ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、この方法は、（１）、（２）、および（３）をコードするｍｏｄＲＮＡの組み合わせと細胞または細胞群を接触させることを伴う。一実施形態では、投与は、細胞によってセラミダーゼ、ＳＰＨＫ、および／またはＳ１ＰＲに翻訳されるｍｏｄＲＮＡまたは複数のｍｏｄＲＮＡに十分な期間、前記細胞または細胞群をｍｏｄＲＮＡと接触させることによるものである。別の実施形態では、投与は、細胞、細胞群、または組織／器官へのｍｏｄＲＮＡの注入によるものである。
【００１４】
一実施形態では、酸化ストレスの結果として細胞が維持する場合がある損傷に加えて、虚血、再灌流傷害、または心筋梗塞などのストレス関連事象を受けているまたは受けた細胞は、前記方法から利益を得られ得る。
【００１５】
ｍｏｄＲＮＡと接触する細胞は、哺乳動物細胞であり、心臓細胞、例えば、心筋細胞、筋肉細胞、皮膚細胞、耳の有毛細胞、眼球細胞、配偶子、卵母細胞、精子細胞、受精卵、および胚を含み得るが、これらに限定されない。
【００１６】
関連する態様では、本開示は、卵母細胞および／または胚をｉｎ  ｖｉｔｒｏでロバスト性および品質を改善する方法であって、前記卵母細胞または胚を、（１）セラミダーゼをコードするｍｏｄＲＮＡ、（２）スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）をコードするｍｏｄＲＮＡ、（３）スフィンゴシン−１−リン酸受容体（Ｓ１ＰＲ）をコードする修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）、または（１）、（２）、および（３）の任意の組み合わせと接触させることを含む、方法に関する。
【００１７】
さらに別の関連する態様では、本開示は、セラミダーゼをコードする１つ以上のｍｏｄＲＮＡ、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）をコードするｍｏｄＲＮＡ、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体（Ｓ１ＰＲ）をコードするｍｏｄＲＮＡを含む組成物に関する。
【００１８】
一実施形態では、ｍｏｄＲＮＡは、酸性セラミダーゼ、中性セラミダーゼ、および塩基性セラミダーゼから選択されるセラミダーゼをコードする。
【００１９】
一実施形態では、ｍｏｄＲＮＡは、酸性セラミダーゼをコードし、配列番号１のオリゴヌクレオチド配列を有する。別の実施形態では、ＡＣをコードするｍｏｄＲＮＡは、配列番号６のオリゴヌクレオチド配列を有する。別の実施形態では、細胞は、配列番号２のオリゴヌクレオチド配列を有するスフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）をコードするｍｏｄＲＮＡと接触する。別の実施形態では、スフィンゴ脂質代謝分子は、Ｓ１ＰＲであり、それをコードするオリゴヌクレオチドは、配列番号３の配列を有する。
【００２０】
一態様では、本開示は、前記細胞を、（１）セラミダーゼをコードするｍｏｄＲＮＡ、（２）スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）をコードするｍｏｄＲＮＡ、（３）スフィンゴシン−１−リン酸受容体（Ｓ１ＰＲ）をコードする修飾ＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）、または（１）、（２）、および（３）の任意の組み合わせと接触させることを含む細胞の質／生存を改善する方法に関する。
【００２１】
（１）セラミダーゼ、（２）スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）、（３）スフィンゴシン−１−リン酸受容体（Ｓ１ＰＲ）をコードするｍｏｄＲＮＡの任意の組み合わせを含む組成物も、本開示に包含される。
【００２２】
本開示はまた、細胞内でアポトーシス細胞死を防止し、生存を促進するために、（１）セラミダーゼをコードするｍｏｄＲＮＡ；（２）スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）をコードするｍｏｄＲＮＡ、（３）スフィンゴシン−１−リン酸受容体（ＳＩＰＲ）をコードするｍｏｄＲＮＡ、または（１）、（２）、もしくは（３）の組み合わせを含む組成物の使用に関する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ−１Ｅ】ＭＩ後のマウス心臓における細胞死の動態およびスフィンゴ脂質代謝酵素の発現の特徴を示す図である。心臓は、偽手術マウスから、またはＭＩの４時間、１、２、４および２８日後に採取した。Ａ）ＴＵＮＥＬ染色を使用して、未処理のＭＩの１、２、４、および２８日後に心臓細胞のＤＮＡ断片化を評価した。トロポニン−Ｉ免疫染色を使用して、心筋細胞と非心筋細胞とを区別した。Ｂ）結紮の４時間後および２４時間後の偽心臓におけるスフィンゴ脂質シグナル伝達経路トランスクリプトームのデンドグラム。Ｃ）１８ｓ  ｒＲＮＡに対する酸性セラミダーゼ（ＡＣ）、Ｓｐｈｋ１、およびＳ１ＰＲ２のｍＲＮＡレベルを定量的ＰＣＲによってＭＩ発生の初期段階のＬＶで評価し、Ｄ）ＡＣおよびＳｐｈｋ１のタンパク質レベルは、ウエスタンブロットによってＭＩ発生の初期段階のＬＶで評価した。Ｅ）ＭＩ発生の初期段階におけるＭＩ後のＬＶのＡＣ活性。
【００２４】
【図２Ａ−２Ｃ】新生児ラット心筋細胞における無酸素症誘導アポトーシスに対するスフィンゴ脂質代謝酵素の影響を示す図である。初代心筋細胞を２〜３日齢のラット心臓から分離した。分離の２日後、細胞をＡＣ、Ｓｐｈｋ１、およびＳ１ＰＲ２をコードするｍｏｄＲＮＡでトランスフェクトし、Ａ）トランスフェクションの１８時間後、細胞を固定して免疫染色し、タンパク質の過剰発現が成功したことを確認した、またはＢ）無酸素状態に４８時間移行してからＡｎｎｅｘｉｎ  ５およびＤＡＰＩで染色して、個々の遺伝子、またはＣ）心筋細胞のアポトーシスレベルに対する遺伝子の組み合わせの影響を評価した。
【００２５】
【図３Ａ−３Ｂ】ＭＩの４８時間後のマウス心臓のＬＶにおけるアポトーシスに対するスフィンゴ脂質代謝酵素の影響を示す図である。Ｌｕｃ、ＡＣ、Ｓｐｈｋ１、およびＳ１ＰＲ２をコードするｍｏｄＲＮＡを、ＭＩ誘導時にマウス心臓または偽心臓に注入した。Ａ）偽心臓への注入の２４時間後、心臓を採取、固定、免疫染色して、タンパク質の過剰発現の成功を確認した、またはＢ）梗塞した心臓への注入の４８時間後、心臓を採取、固定、ＴＵＮＥＬ用に染色して、単一の遺伝子または複数の遺伝子の組み合わせを心筋に注入した後のＬＶのアポトーシスのレベルを評価した。
【００２６】
【図４Ａ−４Ｇ】ＭＩ後の心臓機能およびリモデリングに対するＡＣ、Ｓｐｈｋ１、およびＡＣとＳｐｈｋ１との組み合わせの影響を示す図である。Ｌｕｃ、ＡＣ、Ｓｐｈｋ１、またはＡＣとＳｐｈｋ１との組み合わせをコードするｍｏｄＲＮＡを、ＭＩ誘導時にマウス心臓に注入した。％分画短縮ＬＶＩＤｄおよびＬＶＩＤｓは、ＭＩの２日後および２８日後に測定した。ＭＩの２９日後に心臓を採取し、瘢痕サイズ測定のために固定した。Ａ）ＭＩの２８日後の％分画短縮。Ｂ）ＭＩの２８日〜２日後の％分画短縮のデルタ。Ｃ）左心室内部寸法−拡張期（ＬＶＩＤｄ）。Ｄ）左心室内部寸法−収縮期（ＬＶＩＤｓ）。Ｅ）マッソンの三重染色、およびＦ）左心室面積の％瘢痕面積。Ｇ）ＭＩ後９０日の生存曲線。
【００２７】
【図５Ａ−５Ｅ】ＭＩ後のマウス心臓における細胞死の動態およびスフィンゴ脂質代謝酵素発現の特徴付けを示す図である。Ａ）結紮の４時間後および２４時間後の偽心臓におけるスフィンゴ脂質代謝遺伝子トランスクリプトームのデンドグラム。Ｂ）４時間および２４時間のスフィンゴ脂質代謝遺伝子トランスクリプトームおよびスフィンゴ脂質シグナル伝達経路トランスクリプトームの火山プロット。Ｃ）偽心臓およびＬＶにおけるＭＩの２４時間後のプロカスパーゼおよび切断カスパーゼのタンパク質レベル。Ｄ）ＭＩの４時間および２４時間後の偽心臓におけるＳｐｈｋ１およびＢ−アクチンのタンパク質レベル。Ｅ）ＭＩの４時間および２４時間後の偽心臓におけるＳ１ＰＲ２およびＢ−アクチンのタンパク質レベル。
【００２８】
【図６Ａ−６Ｂ】Ａ）ヒトＨＥＫ２９３細胞におけるＡＣ、Ｓｐｈｋ１、およびＳ１ＰＲ２の過剰発現を示す図である。Ｂ．誘導多能性幹細胞におけるＡＣ過剰発現は、ＣＭを誘導し、無酸素状態で４８時間後の細胞死に影響を与えた。
【００２９】
【図７−７Ｃ】ＭＩの２４時間後のタンパク質発現酵素活性およびアポトーシスに対するＡＣ過剰発現の影響を示す図である。Ａ）ＭＩの２４時間後のマウスＬＶにおけるＡＣ活性。Ｂ）対照マウスまたは１００μｇのＡＣ  ｍｏｄＲＮＡで処理されたマウスにおけるＭＩの２４時間後のカスパーゼ３発現およびＡＣ発現。Ｃ）ＭＩの２４時間後のＤＮＡ断片化に対するＡＣ過剰発現の影響
【００３０】
【図８−８Ｄ】ＭＩ後の心臓機能およびリモデリングに対するＡＣ、Ｓｐｈｋ１、およびＡＣ＋Ｓｐｈｋ１の組み合わせの影響を示す図である。Ａ）ＭＩの２日後のＬＶの％分画短縮。Ｂ）ＭＩの２８日後の瘢痕サイズと％ＦＳとの相関。  Ｃ）ＷＧＡ染色で評価したＭＩの２８日後の心筋細胞面積。  Ｄ）ＣＤ３１免疫染色で評価したＭＩの２８日後のＬＶにおける管腔構造の数。
【００３１】
【図９Ａ−９Ｄ】外れ値を含む心臓機能パラメータを示す図である。Ａ）ＭＩの２日後のＬＶの％分画短縮。Ｂ）ＭＩの２日後〜ＭＩの２８日後までの％ＦＳ変化  Ｃ）ＭＩの２９日後の％瘢痕サイズおよびＤ）ＭＩの２８日後の左心室内部寸法収縮期。
【００３２】
【図１０】ＬＶにおける虚血および再灌流傷害後の瘢痕サイズに対するＡＣｖ２過剰発現の影響を示す図である。
【００３３】
【図１１−１１Ｄ】ＡＣ、Ｓ１ＰＲ、およびＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡがｍｏｄＲＮＡ送達後にタンパク質に首尾よく翻訳されたことを示す図である。（Ａ）ＰＮ胚に５０ｎｇのＡＣ  ＭｏｄＲＮＡまたはＳ１Ｐ  ＲＭｏｄＲＮＡを注入し、２４時間後に収集した（２細胞期）。タンパク質をウエスタンブロット分析を使用して検出した。（ａ）ヒトＡＣ前駆体（５５ｋＤａ）を明らかにするマウス抗ヒトＡＣ  ＩｇＧ；（ｂ）マウス抗ヒトＳ１ＰＲ  ＩｇＧ；（ｃ）ウサギ抗ヒトアクチンＩｇＧを使用して、ウエスタンブロット分析を実行した。（Ｂ）ＰＮ胚に５０ｎｇのＧＦＰ  ＭｏｄＲＮＡを注入し、４日目のＧＦＰタンパク質発現について光学顕微鏡（左パネル）および蛍光顕微鏡（右パネル）で分析した。（Ｃ）マウスの精子を、１００ｎｇ／μｌの裸のＧＦＰ  ＭｏｄＲＮＡと３７℃のＣＯ２インキュベーターで１時間インキュベートした。インキュベーション後、精子をＧＦＰタンパク質発現について蛍光顕微鏡で分析した。（Ｄ）マウスの精子を、１００ｎｇ／μｌの裸のＧＦＰ  ＭｏｄＲＮＡと３７℃のＣＯ２インキュベーターで１時間インキュベートした。インキュベーション後、精子をＩＶＦのためにＣ５７ＢＬ／６卵とインキュベートした。７日目の胚（胚盤胞）を、ＧＦＰタンパク質発現について光学顕微鏡（左パネル）および蛍光顕微鏡（右パネル）で分析した。
【００３４】
【図１２Ａ−１２Ｆ】ウエスタンブロット分析を使用してタンパク質が検出されたことを示す図である。ＡＣおよびＳＰＨＫ１  ｍｏｄＲＮＡをｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのｍｏｄＲＮＡ送達後にタンパク質に正常に翻訳した。ＲＮＡｉＭＡＸ−リポフェクタミンを使用して、細胞および心臓にｍｏｄＲＮＡをトランスフェクト／注入し、２４時間後に収集した。
【００３５】
【図１３Ａ−１３Ｂ】新生児ラット心筋細胞およびマウス心臓におけるＡＣおよびＳＰＨＫ１修飾ｍＲＮＡの発現を実証する免疫蛍光分析の結果を示す図である。
【００３６】
【図１４Ａ−１４Ｂ】ｉｎ  ｖｉｖｏでの卵巣への注入後のＧＦＰ修飾ｍＲＮＡの発現を実証する免疫蛍光分析の結果を示す図である。マウスの卵巣にトランスフェクション緩衝液（対照）またはＧＦＰ  ｍｏｄＲＮＡを注入した。注入の２４時間後に卵巣を摘出し、ＧＦＰ発現について蛍光顕微鏡で分析した。ＧＦＰは、直接注入後に卵巣に発現する。
【００３７】
【図１５Ａ−１５Ｈ】ＡＣ  ｍｏｄＲＮＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏでの血清飢餓ＭＢＤ−ｍｂ−２３１ヒト乳癌細胞株モデルにおける細胞死を防止することを示す図である。細胞は、ｉＭＡＸ−ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用してｍｏｄＲＮＡでトランスフェクトし、４８時間培養して、蛍光顕微鏡で分析した。ＡＣは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの乳癌細胞モデルへの送達後のアポトーシス活性化を低減した。
【００３８】
【図１６Ａ−１６Ｂ】心筋梗塞の直後のＡＣ  ｍｏｄＲＮＡ送達が、ｉｎ  ｖｉｖｏでのアポトーシス活性化を防止することを示す図である。（Ａ）マウスにＬｕｃまたはＡＣ  ｍｏｄＲＮＡを注入し、ＭＩを起こした。傷害の２４時間後、心臓を摘出し、溶解し、タンパク質をウエスタンブロット分析により分析した（対照レーン、ＭＩなし）。ＡＣは、カスパーゼ３の発現によって評価されたアポトーシスを阻害した。ＡＣはまた、より高いＡＣ発現がある場合にＴＮＦアルファを減少させることができる。（Ｂ）マウスにＬｕｃ対照またはＡＣ  ｍｏｄＲＮＡを注入し、心筋梗塞を起こした。傷害の８時間後、心臓を摘出し、溶解し、タンパク質をウエスタンブロット分析により分析した。ＡＣおよびＳＨＰＫ１は、アポトーシス中にｋａｓｐａｓ３によるＰＡＲＰの切断を阻害する。
【００３９】
【図１７】新生児ラットＣＭにおける無酸素症誘導アポトーシスに対する生存促進遺伝子の影響を示す図である。
【００４０】
【図１８】永久的なＭＩの２日後のアポトーシスに対するＡＣの影響を示す図である。
【００４１】
【図１９】ＭＩ直後のＡＣおよびＳＨＰＫ１  ｍｏｄ  ＲＮＡ送達が心臓心臓瘢痕サイズを有意に減少させることを示す図である。マウスにＬｕｃ対照またはＡＣ  ｍｏｄＲＮＡを注入してＭＩを受けさせ、傷害の１か月後、心臓を摘出し、灌流し、固定し、赤が健康な組織を示し、青が瘢痕組織を示す瘢痕形成（マッソンの三重染色）のために染色した。ＡＣまたはＳＰＨＫ１  ｍｏｄＲＮＡ送達により、心臓の瘢痕サイズが有意に減少した。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
本明細書に引用されるすべての特許、公開された出願、および他の参考文献は、参照により本出願に組み込まれる。
【００４３】
以下の説明では、専門用語の使用に関して特定の規則に従う。一般に、本明細書で使用される用語は、それらが当業者に知られているため、それらの用語の意味と一貫して解釈されることが意図されている。一部の定義は、読者の便宜のためにのみ提供される。
【００４４】
「細胞または細胞群」という用語は、懸濁液中または単層中のいずれかの単一細胞および複数細胞を包含することが意図されている。組織全体も細胞群を構成する。
【００４５】
「細胞質」または「細胞の質」という用語は、細胞生存率のレベル、および正常な細胞機能および期待される寿命を有する同じ型の正常な健康な細胞に対して測定される細胞の細胞機能、細胞死ではなく生存のためにプログラムされた細胞の質を指す。胚質は、高い妊娠率の付与および／または健康な子孫をもたらすという点で胚が成功裏に実行する能力であり、体外受精後の特定の時点で主に顕微鏡評価によって評価される。胚プロファイリングは、前核の数、細胞数、細胞の規則性、断片化の程度を含むがこれらに限定されない、当業者に既知の様々なパラメータの定性化および／または定量化による胚質の推定である。胚質の推定は、体外受精における胚選択での選択肢を導く。
【００４６】
老化と併せて使用される場合の「阻害する」または「阻害」という用語は、本開示のスフィンゴ脂質代謝タンパク質が老化を逆転させ、それにより正常または正常に近い機能に戻る能力を含む。
【００４７】
「ストレス」、「ストレス関連事象」、または「細胞ストレス」という用語は、極端な温度、毒素への曝露、機械的損傷、無酸素症、および騒音などの環境ストレッサーに応答して細胞が受ける広範な分子変化を指す。
【００４８】
本明細書で使用される「ロバスト性」という用語は、強くて良好な状態の品質または状態を指す。
【００４９】
遺伝子の送達方法を選ぶことにより、発現期間を具体的な状況に合わせることができる。例えば、「短期間の発現」という用語は、数週間ではなく数日間の持続期間にわたる所望のタンパク質の発現を指す。したがって、例えば、遺伝子送達法としてのｍｏｄＲＮＡの使用は、選択されたスフィンゴ脂質代謝タンパク質の一過性発現を最大約１１または１２日間達成する。例えば、ＩＶＦの前の卵母細胞および胚の生存率および品質を高めるには、短い持続期間の迅速な一過性発現で十分な場合がある。
【００５０】
「ｍｏｄＲＮＡ」という用語は、目的の遺伝子の発現に使用できる合成修飾ＲＮＡを指す。ｍｏｄＲＮＡで行われた化学修飾、例えば、プソイドウリジンからウリジンへの置換は、分子を安定化させ、転写を高める。さらに、免疫系を活性化できる細胞へのタンパク質薬剤の直接送達とは異なり、ｍｏｄＲＮＡの送達は、免疫への影響なしに達成することができる。ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現のためのｍｏｄＲＮＡの使用は、例えば、ＷＯ２０１２／１３８４５３にさらに詳細に記載されている。
【００５１】
スフィンゴ脂質（Ｓｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄ）代謝タンパク質
一実施形態では、本開示の方法に有用なｍｏｄＲＮＡ組成物は、以下のスフィンゴ脂質代謝タンパク質：セラミダーゼ（酸性、中性、またはアルカリ性）、スフィンゴシンキナーゼ（ＳＰＨＫ）、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体（Ｓ１ＰＲ）をコードするｍｏｄＲＮＡを個別にまたは異なる組み合わせのいずれかで含み得る。一実施形態では、スフィンゴ脂質代謝タンパク質は、セラミダーゼである。
【００５２】
セラミダーゼは、セラミドから脂肪酸を切断してスフィンゴシン（ＳＰＨ）を産生する酵素であり、これはスフィンゴシンキナーゼによってリン酸化されて、スフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）を形成する。セラミダーゼは、セラミドの加水分解をレギュレートして細胞死を防止することができる唯一の酵素であり、ＳＨＰＫは、スフィンゴシン（セラミド加水分解生成物）からスフィンゴシン１リン酸（Ｓ１Ｐ）を合成して細胞の生存を開始できる唯一の酵素である。Ｇタンパク質共役受容体Ｓ１ＰＲは、脂質シグナル伝達分子Ｓ１Ｐを結合して、細胞増殖、生存、および転写活性化を誘導する。
【００５３】
現在、７つの異なる遺伝子によってコードされている７つのヒトセラミダーゼが、クローニングされている：
・酸性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ１）−細胞生存に関連する；
・中性セラミダーゼ（ＡＳＡＨ２、ＡＳＡＨ２Ｂ、ＡＳＡＨ２Ｃ）−炎症性サイトカインから保護する；
・アルカリ性セラミダーゼ１（ＡＣＥＲ１）−ＳＰＨおよびＳ１Ｐの生成を制御することにより細胞分化を媒介する；
・アルカリ性セラミダーゼ２（ＡＣＥＲ２）−細胞の増殖および生存に重要である；ならびに
・アルカリ性セラミダーゼ３（ＡＣＥＲ３）。
コード配列のヌクレオチド配列を以下の表１に示す。
【００５４】
Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｓｅｕｄｏｕｒｉｄｉｎｅ  Ｉｎｔｏ  ｍＲＮＡ  Ｙｉｅｌｄｓ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  Ｎｏｎｉｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｖｅｃｔｏｒ  Ｗｉｔｈ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００８；１６（１１）：１８３３−１８４０、参照により本明細書に組み込まれる）による発見は、ウリジンおよびシチジンをそれぞれプソイドウリジンおよび５−メチルシチジンで置換すると、外因性ＲＮＡから誘発される免疫応答が大幅に減少し、治療用タンパク質の一過性発現が達成される新しい種類の遺伝子送達の段階が設定されたことである。
【００５５】
修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）は、比較的新しい遺伝子送達システムであり、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで使用して、細胞の不均質な集団で治療用タンパク質の一過性発現を達成することができる。特異的な修飾ヌクレオシドを組み込むことで、抗ウイルス応答および自然免疫応答を誘発することなくｍｏｄＲＮＡを効率的に翻訳できる。本開示では、ｍｏｄＲＮＡは、「生存遺伝子」の短期のロバストな遺伝子発現を送達するのに効果的であることが示され、遺伝子治療の分野におけるその使用が拡大している。治療用タンパク質の送達のためのｍｏｄＲＮＡの合成用段階的プロトコルは、例えば、Ｋｏｎｄｒａｔ  ｅｔ  ａｌのＳｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｍＲＮＡ  ｆｏｒ  Ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｃａｒｄｉａｃ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｐｐ．１２７−１３８  ２０１６に開示され、この内容は、参照により本明細書の本開示に組み込まれる。
【００５６】
比較的初期の技術であるｍｏｄＲＮＡの使用は、疾患の治療としてかなりの可能性を秘めている。例えば、ヒト血管内皮成長因子Ａをコードする合成修飾ＲＮＡの送達は、マウス心筋梗塞モデルにおける内因性心臓前駆細胞の拡大および誘導分化をもたらす（Ｚａｎｇｉ  ｅｔ  ａｌのＭｏｄｉｆｉｅｄ  ｍＲＮＡ  ｄｉｒｅｃｔｓ  ｔｈｅ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｈｅａｒｔ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｎｆａｒｃｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１，８９８−９０７（２０１３））。別の例では、糖尿病性ニューロパシーは、神経成長因子をコードする遺伝子を送達する能力によって軽減され得る。さらに、ゲノム編集技術、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、または転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）の登場により、トランスフェクションは、一過性かつ細胞特異的な方法で送達された場合、より安全になる。
【００５７】
本方法の一実施形態では、スフィンゴ脂質代謝タンパク質をコードする遺伝子送達分子は、ｍｏｄＲＮＡである。例えば、プラスミド、ウイルス、またはｍＲＮＡを使用して、外因性タンパク質の発現を達成するための様々な遺伝子送達方法が存在するが、特定の状況では、ｍｏｄＲＮＡは、遺伝子送達ツールとしていくつかの利点を与える。
【００５８】
タンパク質に対する遺伝子送達の利点は、特定の期間の間、タンパク質の内因性発現を達成する能力であり、したがって、スフィンゴ脂質代謝酵素への長時間の曝露である。
【００５９】
ｍｏｄＲＮＡ送達の利点の１つは、目的の遺伝子の翻訳前に核への局在または転写を必要としないことである。目的のタンパク質の翻訳前にｍＲＮＡを転写する必要がないため、目的のタンパク質の発現効率が高くなる。
【００６０】
Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．は、ｍＲＮＡのプソイドウリジンによるウリジン置き換え（したがって、修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）という名前）により、ｍＲＮＡの二次構造が変化し、自然免疫系を回避し、ＲＮａｓｅによるｍｏｄＲＮＡの認識が低下することを２００８年に示した。加えて、ヌクレオチドのこれらの変化は、我々の体内で自然に発生しており、未修飾ｍＲＮＡと比較してｍｏｄＲＮＡの翻訳を強化する。
【００６１】
本発明は、１つ以上のスフィンゴ脂質代謝タンパク質をコードするｍｏｄＲＮＡを含むｍｏｄＲＮＡ「サバイバルカクテル」の投与が、異なる細胞型、組織、および胚においてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのアポトーシス率を低下させたという観察に基づく（図１〜１９）。
【００６２】
ｍｏｄＲＮＡは、最適化された５’ＵＴＲおよび３’ＵＴＲシーケンス、アンチリバースカップアナログ（ＡＲＣＡ）、および１つ以上の自然に修飾されたヌクレオチドを有する合成ｍＲＮＡである。最適化されたＵＴＲシーケンスにより、翻訳効率が向上する。ＡＲＣＡは、ＲＮＡの安定性を高め、翻訳効率を向上させ、自然に修飾されたヌクレオチドは、ＲＮＡの安定性を高め、細胞の自然免疫応答（ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ）を減らし、ｍＲＮＡの翻訳効率を向上させる。この組み合わせにより、最小限の免疫応答でタンパク質のより高くより長い発現を仲介する優れたｍＲＮＡが生成される。修飾ｍＲＮＡは、安全で局所的な一過性であり、心臓への高発現遺伝子送達法である。Ｋａｒｉｋｏ  ｅｔ  ａｌ．は、ｍＲＮＡのプソイドウリジンによるウリジン置き換え（したがって、修飾ｍＲＮＡ（ｍｏｄＲＮＡ）という名前）により、ｍＲＮＡの二次構造が変化し、自然免疫系を回避し、ＲＮａｓｅによるｍｏｄＲＮＡの認識が低下することを２００８年に示している。加えて、ヌクレオチドのこれらの変化は、我々の体内で自然に発生しており、未修飾ｍＲＮＡと比較してｍｏｄＲＮＡの翻訳を強化する。
【００６３】
ｍｏｄＲＮＡは、生理学的酵素をコードするため、セラミダーゼの発現は、毒性作用がほとんどまたはまったくないはずである。加えて、細胞をセラミダーゼｍｏｄＲＮＡでトランスフェクトすると、生存に必要な活性セラミダーゼタンパク質の自律的制御を可能にする酵素の前駆体（不活性型）が増加する。さらに、セラミド代謝の制御は、セラミダーゼの唯一の既知の生物学的機能であり；セラミダーゼの操作は、他の細胞シグナル伝達に影響を与えるべきではない。加えて、すべての組織でＡＣ酵素（ＣＯＥＡＣ）を継続的に過剰発現するマウスモデルの作成は、ＡＣの過剰発現による毒性または腫瘍形成効果の欠如を実証している。
【００６４】
第三に、メッセンジャーＲＮＡ修飾により、ｍｏｄＲＮＡは自然免疫系およびＲＮａｓｅによる検出を回避可能である。その観察に基づいて、ｍｏｄＲＮＡは、短期的な遺伝子送達のための安全で効果的なツールとして使用することができる。ｍｏｄＲＮＡの薬物動態分析は、最大７日間、パルス様のタンパク質発現を示す。
【００６５】
スフィンゴ脂質代謝タンパク質の心筋細胞への影響
無酸素条件下での新生児ラット心筋細胞（ｎｒＣＭ）の生存率に対するこれらの遺伝子の影響を調べた。ヒトＡＣ、Ｓｐｈｋ１、およびＳ１ＰＲ２をコードする合成ｍｏｄＲＮＡを使用した。ｍｏｄＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現動態およびその免疫原性の低下（Ｓｕｌｔａｎａ  ２０１７）により、ｍｏｄＲＮＡは、心筋梗塞などの急性状態における遺伝子発現の役割を研究するための理想的なベクターになっている。まず、Ｈｅｋ２９３細胞（図６Ａ）またはｎｒＣＭ（図２Ａ）の標的タンパク質の発現レベルに対するｍｏｄＲＮＡトランスフェクションの影響を確認した。どちらの場合も、トランスフェクトしたｍｏｄＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルは、対照細胞と比較してトランスフェクトした細胞で上昇した。ｎｒＣＭでアポトーシスを誘導するために、細胞をトランスフェクションの１８時間後に無酸素状態に移した。無酸素状態で４８時間後、アポトーシス細胞の数は、４４％増加したが、ＡＣまたはＳｐｈｋ１の過剰発現により、アポトーシス細胞のレベルが対照と比較してそれぞれ２２％および２７％減少した（図２Ｂ）。Ｓ１ＰＲ２の過剰発現は、アポトーシスのレベルを１０％減少させたが、この減少は、統計的に有意ではなかった（図２Ｂ）。
【００６６】
細胞を遺伝子の組み合わせでトランスフェクトすると、相加効果が観察された。ＡＣおよびＳｐｈｋ１の過剰発現は、アポトーシス細胞の数を４８％減少させ、ＡＣおよびＳ１ＰＲ２を一緒に過剰発現させると、アポトーシスを３３％減少させた。驚くべきことに、Ｓｐｈｋ１をＳ１ＰＲ２と組み合わせたり、ＡＣ、Ｓｐｈｋ１、およびＳ１ＰＲ２を組み合わせたりしても、アポトーシスのレベルは低下しなかった（図２Ｃ）。
【００６７】
筋梗塞後のＬＶにおける細胞死に対するＡＣ、Ｓｐｈｋ１、およびＳ１ＰＲ２の影響を研究するために、左前下行動脈の結紮によって心臓を梗塞させた。ＬＡＤを結紮した直後に、対照遺伝子または目的の遺伝子をコードする１００μｇのｍｏｄＲＮＡを左心室の心筋に注入した。４８時間後、心臓を採取して、ＤＮＡ断片化のレベルを測定した。驚くべきことに、ＬＡＤ結紮直後の左心室でのＡＣの過剰発現は、Ｌｕｃ  ｍｏｄＲＮＡで処理された心臓と比較して、左心室で断片化されたＤＮＡを有する細胞の数を５４％減少させた。Ｓｐｈｋ１の過剰発現は、ＤＮＡ断片化を２９％削減し、Ｓ１ＰＲ２は、ＭＩの４８時間後のＬＶにおけるＤＮＡの断片化を防止しなかった（図３Ｂ）。遺伝子の組み合わせがＬＡＤ結紮の直後にＬＶに注入された場合、ＡＣとＳｐｈｋ１との組み合わせのみが５９％の低減という穏やかな相加効果を示した。ＡＣ＋Ｓ１ＰＲ２は、ＤＮＡ断片化を２１％削減し、ＡＣ＋Ｓｐｈｋ１＋Ｓ１ＰＲ２は、ＤＮＡ断片化を２２％削減する。予想外に、Ｓｐｈｋ１およびＳ１ＰＲ２の過剰発現は、対照と比較してＭＩ後のＤＮＡ断片化を３０％誘導した（図３Ｂ）。
【００６８】
ＡＣおよびＳｐｈｋ１の有益な効果とこれら２つの遺伝子の組み合わせた発現との相加効果により、心臓のリモデリングおよびＭＩ後の機能に対するその効果を研究するようになった。この目的のために、本発明者らは、ＡＣ、Ｓｐｈｋ１、ＡＣ＋Ｓｐｈｋ１、またはＬｕｃを直接ＬＶに注入し、ＭＩ後の異なる時点での左心室内部寸法拡張期（ＬＶＩＤｄ）、左心室内部寸法収縮期（ＬＶＩＤｓ）、および分画短縮％（％ＦＳ）を比較した。実験の最後（ＭＩの２９日後）に心臓を採取し、ＷＧＡおよびＣＤ３１で免疫染色して、心筋細胞の平均面積およびＬＶ内の血管数を評価した。瘢痕のサイズを測定するために、マッソンの三色染色を心臓の切片に実行した。ＭＩの２日後、測定されたすべてのパラメータでグループ間に有意差はなかった（図８Ａ）。しかしながら、ＡＣ  Ｓｐｈｋ１またはＡＣ＋Ｓｐｈｋ１で処理されたマウスにおけるＬＶのＭＩ  ％ＦＳの２８日後は、対照マウスにおける３８．８％と比較して、それぞれ４６．４％、４５％、および４６．１％であった（図９Ａ）。ＡＣ  Ｓｐｈｋ１またはＡＣ＋Ｓｐｈｋ１で処理されたマウスのＬＶＩＤｓは、対照マウスよりも低かった−処理されたマウスの対照ＬＶＩＤｄの２．０２ｍｍと比較して、１．６５ｍｍ、１．７２ｍｍ、および１．５７ｍｍは、それぞれ対照と比較してＬＶＩＤｄの軽度の減少を示したＡＣで処理されたマウスを除いて、対照マウスのＬＶＩＤｄと有意に異ならなかった（図４Ｃおよび４Ｄ）。これらの結果は、急性ＭＩ中にＬＶにＡＣまたはＳｐｈｋ１を注入すると、対照と比較して、処理されたマウスの心臓機能が良好になることを示している。
【００６９】
ＡＣおよびＳｐｈｋ１が心臓機能に及ぼす有益な効果に従って、ＭＩの２９日後で瘢痕サイズの有意な減少が見られた。ＡＣ、Ｓｐｈｋ１、またはＡＣ＋Ｓｐｈｋ１で処理したマウスでは、瘢痕面積は、対照マウスでの２３．３％と比較してＬＶ面積の１４．２％、１６．７％、１６．１％であった（図４Ｄおよび図９Ｃ）。
【００７０】
全体として、これらのデータは、ＡＣをｉｎ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｔｒｏの卵母細胞および胚環境の重要な構成要素として特定し、補助受精の結果を高めるための新規の技術を提供する。
【００７１】
表１は、本方法のｍｏｄＲＮＡによりコードされるヌクレオチド配列を含有する。
【表１】
2021516956.tif 000002
2021516956.tif 000003
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【００７２】
ラット心筋における細胞死の減少
マウスの心筋梗塞（ＭＩ）の結果として、心臓のスフィンゴ脂質の代謝およびシグナル伝達に関与する遺伝子の発現だけでなく、細胞死の動態を特徴付けるために、心臓を左前下行動脈（ＬＡＤ）の結紮によって梗塞させ、結紮後の異なる時点で採取した。
【００７３】
細胞死の評価のために、心臓は、ＭＩの１、２、４、および２８日後に偽手術マウスから採取した。ＴＵＮＥＬ染色を使用して、心臓細胞のＤＮＡ断片化を評価した。トロポニンＩ免疫染色を使用して、心筋細胞と非心筋細胞とを区別した（図１Ａ）。最高レベルのＤＮＡ断片化は、ＭＩの２４時間後に見られ、ＬＶの全細胞の９±２％が断片化されたＤＮＡを有し、ＣＭの１５±３％、および非ＣＭの４±０．２％であった。ＭＩの２日後のＤＮＡ断片化のレベルは、ＣＭおよび非ＣＭの両方で低下し、ＭＩの２８日後の基礎レベルに達し、対照マウスの心臓のレベルに匹敵する、全細胞の０．１±０．１％、ＣＭの０．０７±０．０８％、および非ＣＭの０．１２±０．１％であった。ＭＩの２４時間後に切断カスパーゼ３イムノブロッティングにより、梗塞領域に高レベルのアポトーシスが確認された（図５Ｃ）。
【００７４】
スフィンゴ脂質の代謝およびシグナル伝達経路の部分的なトランスクリプトームは、偽手術マウスまたはＭＩの４時間後および２４時間後のマウスの心臓で研究した。本発明者らは、部分的に重複する２つの遺伝子セット：ＫＥＧＧ  ＰＡＴＨＷＡＹ  ｍａｐ００６００に基づくスフィンゴ脂質代謝遺伝子およびＫＥＧＧ  ＰＡＴＨＷＡＹ  ｍａｐ０４０７１に基づくスフィンゴ脂質シグナル伝達経路遺伝子に焦点を当てた［１１］。結紮の４時間後のスフィンゴ脂質代謝トランスクリプトームでは、２つの遺伝子が２倍を超えて有意にアップレギュレートされ、１つが−２倍未満ダウンレギュレートされた。ＭＩの２４時間後、１０個の遺伝子が２倍を超えて有意にアップレギュレートされ、２つが−２倍未満ダウンレギュレートされた。４９個の遺伝子のうち合計１２個の遺伝子（図示せず）。結紮の４時間後のスフィンゴ脂質シグナル伝達経路のトランスクリプトームでは、５つの遺伝子が２倍を超えて有意にアップレギュレートされ、２つが−２倍未満ダウンレギュレートされた。ＭＩの２４時間後、２８個の遺伝子が２倍を超えて有意にアップレギュレートされ、１０個が−２倍未満ダウンレギュレートされ、８２個の遺伝子のうち合計３８個になった（図１Ｂおよび図５）。
【００７５】
両方のトランスクリプトームのデンドログラム（図１Ｂおよび図５Ａ）は、対照グループおよびＭＩの４時間後のグループが一緒にクラスター化されていることを示しているが、ＭＩの２４時間後のグループは、別個のグループとしてクラスター化されており、これは、スフィンゴ脂質の代謝およびシグナル伝達経路に関連する遺伝子発現の主な変化は、ＭＩの４時間超後に発生することを示唆している。
【００７６】
ＭＩ後の細胞死および心臓機能に対するセラミド代謝産物の役割を研究するために、本発明者らは、セラミドの分解およびＳ１Ｐ合成を強化することにより、セラミド代謝およびシグナル伝達経路を変更することを選んだ。まず、本発明者らは、このプロセスに関与する主な遺伝子のＲＮＡ−ｓｅｑ  ＤＡＴＡ、すなわち：独立した実験からの心臓のｑＰＣＲおよびウエスタンブロット分析による、酸性セラミダーゼ（ＡＣ）、スフィンゴシンキナーゼ１（Ｓｐｈｋ１）、およびスフィンゴシン−１−リン酸受容体２（Ｓ１ＰＲ２）を確認する。ＲＮＡｓｅｑ分析の結果と一致して、ＡＣ  ｍＲＮＡの相対レベルは、有意に変化しなかった（図１Ｂ）。ＡＣ前駆体のレベルは、変化しなかったが、ＡＣαサブユニットおよびβサブユニットのレベルは、梗塞の進行中に徐々に増加した（図１Ｃ）。αおよびβサブユニットの増加は、ＡＣの活性レベルの増加を伴う（図１Ｄ）。Ｓｐｈｋ１のｍＲＮＡレベルは、それぞれ４時間および２４時間の６倍および３５倍に増加した。ウエスタンブロット分析は、ＭＩの４時間後および２４時間後のＳｐｈｋ１タンパク質のレベルの劇的な増加を示した（図１Ｂ、１Ｃ、および図１Ｄ）。Ｓ１ＰＲ２  ｍＲＮＡの相対レベルは、ＭＩの４時間後に５０％減少し、２４時間後に正常に戻る。Ｓ１ＰＲ２のレベルは、ＭＩの４時間後または２４時間後に変化していなかった（図１Ｂおよび図４Ｅ）。
【００７７】
次に、本発明者らは、無酸素条件下での新生児ラット心筋細胞（ｎｒＣＭ）の生存率に対するこれらの遺伝子の影響を確認した。この目的のために、本発明者らは、ヒトのＡＣ、Ｓｐｈｋ１、およびＳ１ＰＲ２をコードする合成ｍｏｄＲＮＡを使用した。ｍｏｄＲＮＡによってコードされるタンパク質の発現動態およびその免疫原性の低下（Ｓｕｌｔａｎａ  ２０１７）により、ｍｏｄＲＮＡは、心筋梗塞などの急性状態での遺伝子発現の役割を研究するための理想的なベクターになっている。まず、本発明者らは、Ｈｅｋ２９３細胞（補足図２Ａ）またはｎｒＣＭ（図２Ａ）の標的タンパク質の発現レベルに対するｍｏｄＲＮＡトランスフェクションの効果を確認した。どちらの場合も、トランスフェクトしたｍｏｄＲＮＡによってコードされるタンパク質のレベルは、対照細胞と比較してトランスフェクトした細胞で上昇した。ｎｒＣＭでアポトーシスを誘導するために、細胞をトランスフェクションの１８時間後に無酸素状態に移した。無酸素状態で４８時間後、アポトーシス細胞の数は、４４％増加したが、ＡＣまたはＳｐｈｋ１の過剰発現により、アポトーシス細胞のレベルが対照と比較してそれぞれ２２％および２７％減少した（図２Ｂ）。Ｓ１ＰＲ２の過剰発現は、アポトーシスのレベルを１０％減少させたが、この減少は、統計的に有意ではなかった（図２Ｂ）。
【００７８】
細胞を遺伝子の組み合わせでトランスフェクトすると、相加効果が観察された。ＡＣおよびＳｐｈｋ１の過剰発現は、アポトーシス細胞の数を４８％減少させ、ＡＣおよびＳ１ＰＲ２を一緒に過剰発現させると、アポトーシスを３３％減少させる。驚くべきことに、Ｓｐｈｋ１をＳ１ＰＲ２と組み合わせたり、ＡＣ、Ｓｐｈｋ１、およびＳ１ＰＲ２を組み合わせたりしても、アポトーシスのレベルは、低下しなかった（図２Ｃ）。
【００７９】
筋梗塞後のＬＶにおける細胞死に対するＡＣ、Ｓｐｈｋ１、およびＳ１ＰＲ２の影響を研究するために、左前下行動脈の結紮によって心臓を梗塞させた。ＬＡＤを結紮した直後に、対照遺伝子または目的の遺伝子をコードする１００μｇのｍｏｄＲＮＡを左心室の心筋に注入した。４８時間後、心臓を採取して、ＤＮＡ断片化のレベルを測定した。驚くべきことに、ＬＡＤ結紮直後の左心室でのＡＣの過剰発現は、Ｌｕｃ  ｍｏｄＲＮＡで処理された心臓と比較して、左心室で断片化されたＤＮＡを有する細胞の数を５４％減少させた。Ｓｐｈｋ１の過剰発現は、ＤＮＡ断片化を２９％削減し、Ｓ１ＰＲ２は、ＭＩの４８時間後のＬＶにおけるＤＮＡの断片化を防止しなかった（図３Ｂ）。遺伝子の組み合わせがＬＡＤ結紮の直後にＬＶに注入された場合、ＡＣとＳｐｈｋ１との組み合わせのみが５９％の低減という穏やかな相加効果を示した。ＡＣ＋Ｓ１ＰＲ２は、ＤＮＡ断片化を２１％削減し、ＡＣ＋Ｓｐｈｋ１＋Ｓ１ＰＲ２は、ＤＮＡ断片化を２２％削減する。予想外に、Ｓｐｈｋ１およびＳ１ＰＲ２の過剰発現は、対照と比較してＭＩ後のＤＮＡ断片化を３０％誘導した（図３Ｂ）。
【００８０】
ＡＣおよびＳｐｈｋ１の有益な効果とこれら２つの遺伝子の組み合わせた発現との相加効果により、心臓のリモデリングおよびＭＩ後の機能に対するその効果を研究するようになった。この目的のために、本発明者らは、ＡＣ、Ｓｐｈｋ１、ＡＣ＋Ｓｐｈｋ１、またはＬｕｃを直接ＬＶに注入し、ＭＩ後の異なる時点での左心室内部寸法拡張期（ＬＶＩＤｄ）、左心室内部寸法収縮期（ＬＶＩＤｓ）、および分画短縮％（％ＦＳ）を比較した。実験の最後（ＭＩの２９日後）に心臓を採取し、ＷＧＡおよびＣＤ３１で免疫染色して、心筋細胞の平均面積およびＬＶ内の血管数を評価した。瘢痕のサイズを測定するために、マッソンの三色染色を心臓の切片に実行した。ＭＩの２日後、測定されたすべてのパラメータでグループ間に有意差はなかった（図８Ａ）。しかしながら、ＡＣ  Ｓｐｈｋ１またはＡＣ＋Ｓｐｈｋ１で処理されたマウスにおけるＬＶのＭＩ  ％ＦＳの２８日後は、対照マウスにおける３８．８％と比較して、それぞれ、４６．４％、４５％、および４６．１％であった（図９Ａ）。ＡＣ  Ｓｐｈｋ１またはＡＣ＋Ｓｐｈｋ１で処理されたマウスのＬＶＩＤｓは、対照マウスよりも低かった−処理されたマウスの対照ＬＶＩＤｄの２．０２ｍｍと比較して、１．６５ｍｍ、１．７２ｍｍ、および１．５７ｍｍは、それぞれ、対照と比較してＬＶＩＤｄの軽度の減少を示したＡＣで処理されたマウスを除いて、対照マウスのＬＶＩＤｄと有意に異ならなかった（図４ＣおよびＤ）。これらの結果は、急性ＭＩ中にＬＶにＡＣまたはＳｐｈｋ１を注入すると、対照と比較して、処理されたマウスの心臓機能が良好になることを示している。
【００８１】
ＡＣおよびＳｐｈｋ１が心臓機能に及ぼす有益な効果に従って、本発明者らは、ＭＩの２９日後で瘢痕サイズにおける有意な減少を見出した。ＡＣ、Ｓｐｈｋ１、またはＡＣ＋Ｓｐｈｋ１で処理したマウスでは、瘢痕面積は、対照マウスでの２３．３％と比較して、ＬＶ面積の１４．２％、１６．７％、１６．１％であった（図４Ｄおよび図９Ｃ）。
【００８２】
ＷＧＡ染色ではＣＭ肥大の兆候は見られず、ＣＤ３１免疫染色ではＬＶの管腔構造の数に違いは、認められなかった（図８ＣおよびＤ）。
【００８３】
ＡＣおよびＳｐｈｋ１の発現が、初期段階でのアポトーシスの予防または梗塞発生後の心臓再生の促進により心臓機能を改善するかどうかを判断するために、本発明者らは、ＭＩの２８日後の％ＦＳとＭＩの２日後の％ＦＳとを比較する。驚くべきことに、本発明者らは、ＡＣで処理したマウスの心臓機能が、ＭＩの２日後での心臓機能と比較して、ＭＩの２８日後で平均１．５％改善されたことを見出した。対照的に、対照マウスの％ＦＳは、９％減少した。Ｓｐｈｋ１およびＡＣ＋Ｓｐｈｋ１で処理したマウスでは、％ＦＳがそれぞれ０．８％および０．３％と非常に穏やかに減少した（図９Ｂ）。
【００８４】
時折、注入されたＲＮＡの一部またはすべてが心筋ではなくＬＶにこぼれ、細胞トランスフェクションの効率の低下につながるという事実を考慮して、本発明者らは、適切に注入されておらず、外れ値として分類できると思われる心臓を除外した後、注入の結果を調べることを決定した。本発明者らは、ＡＣグループの２つの外れ値およびＡＣ＋Ｓｐｈｋ１グループの１つの外れ値を特定した。これらの心臓を統計から除外した後、ＡＣ心臓の％ＦＳでの改善は、平均５．３％であり、ＡＣ＋Ｓｐｈｋ１心臓では、平均２．７％の改善があった（図４Ｂ）。外れ値を除外した後のＡＣおよびＡＣ＋Ｓｐｈｋ１の％ＦＳは、それぞれ４８．６および４７．６に増加し（図４Ａ）、ＡＣおよびＡＣ＋Ｓｐｈｋ１の瘢痕サイズは、それぞれ１２．４および１４．５に減少した（図４Ｅ）。
【００８５】
ＡＣ  ｍｏｄＲＮＡで処理されたマウスの生存率は、対照マウスの生存率よりも有意に高かった。ＡＣ処理されたマウスの１００％は、ＭＩ後９０日生存したが、対照ｍｏｄＲＮＡで処理したマウスの生存率は、６０％であった。Ｓｐｈｋ１またはＡＣ＋Ｓｐｈｋ１で処理したマウスの生存率は、８０％であった（図４Ｆ）。
【００８６】
生殖補助医療技術における細胞質および生存率の改善
細胞死の役割は、生殖の分野ほど有意ではない。排卵された卵母細胞は、受精が成功しない限り、細胞死に特徴的な分子変化を起こす。通常の生理学的条件下では、卵母細胞の８５〜９０％が、胎児または出産後の生活のある時点で細胞死に屈する。臨床的には、残りの卵母細胞の予備が使い果たされると（平均して、これは５０歳前後の女性で発生する）、閉経は、卵巣の老化の直接的な結果として起こる。生殖補助医療技術（ＡＲＴ）の主な課題は、卵母細胞および胚の生存を維持するために必要な自然環境を模倣することである。
【００８７】
したがって、細胞質および生存率を高める能力は、卵母細胞が表層反応を受けて受精した受精卵におけるタンパク質発現を誘発する能力などの独特の特徴を有する生殖細胞において特に興味深い。
【００８８】
ヒト胚の形成は、精子細胞による卵母細胞の受精から始まる。これにより、母方および父方のゲノムのそれぞれのコピーを１つ持つ接合子が生じる。複数の精子による受精を防止するために、卵は、表層反応を受け；単一の精子が卵母細胞の外膜を何とか貫通すると、卵母細胞は、永久的な不透過性のバリアを発生させる。
【００８９】
受精卵に含有される遺伝情報の発現は、受精卵が数回分裂した後にのみ始まる。
【００９０】
シグナル伝達脂質、セラミド、ならびにその代謝酵素と細胞および生体のエージングとの関連をサポートするいくつかの研究がある。セラミドの細胞内レベルは、細胞培養およびエージングなどのストレス関連のシグナル伝達中に増加したことが報告されている。セラミダーゼ、例えば、酸性セラミダーゼ（ＡＣ）は、セラミドをスフィンゴシンと遊離脂肪酸とに加水分解するために必要である。スフィンゴシンは、セラミドの効果を打ち消し、細胞の生存を促進するもう１つの重要なシグナル伝達脂質であるスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）に急速に変換される。したがって、ＡＣは、細胞内のセラミドおよびＳ１Ｐのレベルをレギュレートする「レオスタット」であり、そのため、死と生存との間の複雑で繊細なバランスに関係する。
【００９１】
本発明者らは、以前に、ＡＣ発現が卵母細胞の成熟および初期胚発生中に注意深くレギュレートされることを示した（Ｅｌｉｙａｈｕ，ｅｔ  ａｌ，２０１０）。また、本発明者らは、マウスのＡＣ機能が完全に「ノックアウト」すると、２細胞期と８細胞期との間に胚を死に導くことも見出した（Ｅｌｉｙａｈｕ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，２００７）。加えて、本発明者らの以前の出版物（Ｅｌｉｙａｈｕ，ＦＡＳＥＢ  Ｊ，２０１０）は、セラミド代謝酵素ＡＣが発現し、この環境の必須構成要素であるヒト卵丘細胞および卵胞液で活性であること、およびこの酵素のレベルが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたヒト胚の品質と正に相関することを示した。これらの観察は、体外受精（ＩＶＦ）の結果を著しく改善する卵母細胞および胚培養の新しいアプローチにつながった。
【００９２】
開示された方法は、卵の品質を改善する機会を提供する。まず、女性が体外受精サイクルに失敗したり、高い母年齢で体外受精を受けることを検討している場合、多くの場合、おそらく卵の質が悪いと言われる。不妊治療を成功させるには、なぜ卵の質がそれほど重要なのであろうか？  答えは、高品質の卵が高品質の胚を産生するという単純な事実に帰着する：胚質の９５％は、卵子に由来する。胚は、妊娠を成功させるために、発達の初期段階を生存するのに十分に強くなければならない。
【００９３】
女性が年をとるにつれて、高品質の卵を産生する彼女の卵巣の能力は、低下し始める。これは、卵巣予備能低下（ＤＯＲ）として知られる状態であり、４０歳以上の女性の不妊症の最も一般的な原因である。卵の質が悪いため（結果として胚質が悪いため）、これらの女性は、自分で妊娠することが困難である。これらの女性の不妊治療の成功率も低く、ドナー卵を使用する意思がない限り、多くの場合、不妊治療センターでの治療を拒否される。本明細書に開示された方法は、卵の数および質を改善することに向けられたこれらの女性のための治療計画を提供する。
【００９４】
セラミドは、ネズミおよびヒトの心筋細胞を含む異なる細胞型［７］でのアポトーシス細胞死を誘導することが示されている［１４、１５］。一方、セラミド分解の産物のうちの１つであるスフィンゴシンは、リン酸化されて、細胞生存および心臓保護の主要な因子であるスフィンゴシン１リン酸を生じさせることができる［１６、１７］。
【００９５】
この開示では、本発明者らは、虚血性心臓におけるセラミドレベルを低下させるために、以前に記載されたアプローチとは異なる戦略について記載する。セラミド合成を標的とする代わりに、本発明者らは、酸性セラミダーゼの過剰発現によるセラミド分解の増加の影響を研究する。この戦略により、本発明者らは、セラミドレベルを下げるだけでなく、生存促進分子スフィンゴシン１リン酸の主なビルディングブロックであるスフィンゴシンのリザーバーも増やすことができる。本発明者らは、ＡＣをコードするｍｏｄＲＮＡがｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでＡＣの高発現レベルを媒介することを見出した。この過剰発現は、ＭＩ後の心臓での酵素活性の増加およびｉｎ  ｖｉｔｒｏの無酸素条件下でのアポトーシス細胞のレベルの減少を伴うだけでなく、ＭＩの１日後および２日後のマウスの左心室における断片化ＤＮＡを含む細胞の数を減らした。本発明者らは、対照遺伝子で処理したマウスと比較して、ＡＣ処理した心臓の心臓におけるカスパーゼ３のレベルの低下も観察した。ＭＩの２８日後で、ＡＣで処理された心臓の機能は、％ＦＳ  ＬＶＩＤｄおよびＬＶＩＤｓの点で有意に良好であった。ＭＩの２８日後の％ＦＳとＭＩの２日後の％ＦＳとを比較すると、本発明者らは、ＡＣ処理された心臓での良好な再生能力を意味する有意な改善を観察した。細胞死の減少および心臓機能の良好と一致して、ＡＣ処理したマウスの平均瘢痕サイズは、Ｌｕｃ対照マウスの瘢痕サイズよりも有意に小さかった。本発明者らは、ＭＩの１日後および２日後でアポトーシスが減少し、ＭＩの２８日後で良好な心臓機能を観察しただけでなく、ＡＣ  ｍｏｄＲＮＡで処理されたマウスの生存率は、長期生存アッセイで対照マウスの生存率よりも有意に高く、これは、急性ＭＩの結果として生じる初期の事象での本発明者らの介入の長期的な影響を示唆している。
【００９６】
酸性セラミダーゼは、セラミドのスフィンゴシンと遊離脂肪酸とへの加水分解を触媒する［１８］。スフィンゴシンがミトコンドリアのセラミドチャネルを分解できることが報告されているが、これは、スフィンゴシン［１９、２０］の抗アポトーシス特性の存在を示唆し、他の証拠は、アポトーシスまたは壊死性細胞死の実行におけるスフィンゴシンの積極的な役割を裏付けている［２１］。さらに、スフィンゴシンは、適切な心臓機能で重要な役割を果たしている筋（小）小胞体Ｃａ（２＋）−ＡＴＰａｓｅ（ＳＥＲＣＡ）の活動を阻害することにより、細胞カルシウムのホメオスタシスを乱すことができることがＢｅｎａｉｍ  ｅｔ  ａｌ［２２］によって示唆された［２３、２４］。Ｓｐｈｋ１およびＳｐｈｋ２という２つの遺伝子が、スフィンゴシンキナーゼをコードする。これは、スフィンゴシンのＳ１Ｐへのリン酸化を触媒し、心臓保護特性を有することが示されている［２５］。Ｄｕａｎ  ｅｔ  ａｌは、ラット心臓におけるＳｐｈｋ１のアデノウイルス媒介性の過剰発現が、処理された心臓を虚血および再灌流傷害から保護できることを報告した［２６］。本発明者らのトランスクリプトーム分析は、Ｓｐｈｋ１の発現レベルがＭＩの４時間後および２４時間後でそれぞれ１２および６７倍に上昇していることを示している。独立した実験でＳｐｈｋ１レベルを分析したｑＰＣＲでも同様の傾向が見られた。これには、ウエスタンブロット分析で測定したＳｐｈｋ１タンパク質レベルの有意な上昇が伴った。スフィンゴシンシグナル伝達の経路分析は、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＲ、ＴＲＡＤＤ、およびＴＲＡＦ２を含むＴＮＦシグナル伝達経路のすべての構成要素のアップレギュレーションを示した。興味深いことに、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌは、ＴＲＡＦ２がＳｐｈｋ１と相互作用できること、およびこの相互作用がＴＲＡＦ２の抗アポトーシス活性に必要であることを示した［２７］。最近、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌがＴＲＡＦ２の心臓保護的役割を報告した［２８］。この文脈においてＳｐｈｋ１とＴＲＡＦ２との相互作用の役割を調べることは興味深い。この研究では、分離された新生児ラット心筋細胞へのＳｐｈｋ１のｍｏｄＲＮＡ媒介送達により、細胞が無酸素環境に移された４８時間後に、トランスフェクトされた細胞のアポトーシスのレベルが低下した。新生児ラット心筋細胞におけるＳｐｈｋ１と酸性セラミダーゼとの組み合わせ発現は、心筋細胞の生存におけるセラミドおよびスフィンゴシンの分解、ならびにＳ１Ｐ合成の重要性を実証する相加効果があった。Ｓｐｈｋ１が梗塞した心臓で過剰発現した場合、本発明者らは、ＭＩの４８時間後、ＭＩの２８日後で左心室の断片化されたＤＮＡを含む核の部分に有意でない減少を観察し、％ＦＳは、Ｌｕｃ対照と比較して、Ｓｐｈｋ１処理したマウスで適度に良好であった。Ｓｐｈｋ１マウスの平均瘢痕サイズは、対照マウスの平均瘢痕サイズよりも小さかったが、その差は、有意ではなかった。Ｓｐｈｋ１処理したマウスの生存率は、対照マウスの生存率よりも高かったが、その差は、有意ではなかった。
【００９７】
分離された心筋細胞におけるＡＣとＳｐｈｋ１との組み合わせ発現によって達成された相加効果とは対照的に、ｉｎ  ｖｉｖｏでは、本発明者らは、ＭＩの２日後の細胞死またはＭＩの２８日後の心臓機能および瘢痕サイズに関して、本発明者らがマウスをＡＣで処理したときに観察した影響に対する複合発現のいかなる利点も察しなかった。これだけでなく、ＡＣおよびＳｐｈｋ１で処理したマウスの生存率は、ＡＣのみで処理したマウスの生存率よりも有意に低くはなかった。上記の観察は、心臓のスフィンゴシンを分解し、高ＡＣレベルの存在下でも毒性レベルより低いレベルでそれを保つために、急性ＭＩ中のＳｐｈｋ１の高内因性レベルが十分であることを示唆している。ＭＩ後のＳｐｈｋ１のレベルは、劇的に増加したが、Ｓｐｈｋ２のレベルは、ＭＩの４時間後で適度に減少し、ＭＩの２４時間後で１．５倍未満増加した。本発明者らの未発表のデータは、Ｓｐｈｋ２の過剰発現がストレス条件下でｉｎ−ｖｉｔｒｏおよびｉｎ−ｖｉｖｏの細胞死を低減できることを示したが、この効果は、Ｓｐｈｋ１細胞生存のプラス効果よりも有意ではなかった。
【００９８】
スフィンゴシン１リン酸は、５つのＧタンパク質共役型受容体のファミリー：Ｓ１ｐｒ１〜５を活性化することにより、細胞にその活性を発揮する。心臓で最も豊富な２つの受容体、すなわちＳ１ｐｒ１と３およびレベルは、ＭＩ後、中程度であるが有意に上昇する。対照的に、ＭＩの４時間後のＳ１ｐｒ２のレベルは、低下し、ＭＩの２４時間後のレベルは、正常に戻る。心臓保護におけるＳ１ｐｒ１およびＳ１ｐｒ３の役割は、十分に確立されている［２５］が、心臓機能におけるＳ１ｐ２の役割は、あまり明確ではない。または結果は、細胞および心臓におけるＳ１ｐ２の過剰発現が細胞生存に無視された影響を与えることを示唆している。
【００９９】
細胞老化
老化は、現代の苦しみ、病気、および死の主要な原因である。老化、または生物学的エージングは、機能特性のゆっくりとした低下である。老化とは、細胞の老化または生物全体の老化のいずれかを指し得る。エージングなどの誘導された老化に加えて、酸化ストレス、傷害、騒音曝露、および細胞への他の損傷源などの種々のストレス条件を含む非常に広範な概念であるストレス誘発性老化がある。これらのストレスは、細胞内経路を介して作用し、非増殖状態を誘導する。１９６０年代にＨａｙｆｌｉｃｋおよびＭｏｏｒｈｅａｄによって記述された細胞老化は、長い培養後の細胞の不可逆的な停止である。テロメアの短縮は、ヒト線維芽細胞の複製老化を促進する重要なメカニズムである。細胞周期停止とは別に、老化細胞は、遺伝子発現、ＣＤＫ１活性の組み合わせ、ヘテロクロマチン形成、（スフィンゴ脂質代謝）を含む代謝、エピジェネティクス、および老化関連分泌表現型（ＳＡＳＰ）として知られる明確な分泌プロファイルの点で劇的な変化を経験することが示されている（Ｃｏｐｐ’ｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。ＳＡＳＰは、老化細胞が免疫システムと連通し、潜在的に自身のクリアランス（例えば、炎症促進性サイトカイン）を促進し、細胞および組織の恒常性および機能の破壊に寄与する方法である（ＳｈａｙおよびＷｒｉｇｈｔ，２０１０年）。「慢性」のＳＡＳＰは、隣接する若い細胞に老化を誘導し、組織の機能障害に寄与し得ることが示されている（Ａｃｏｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、Ｊｕｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。老化細胞もミトコンドリア機能障害を示す（Ｐａｓｓｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１００】
心筋梗塞（ＭＩ）によって引き起こされる心臓の酸化ストレス誘導性老化は、心筋細胞死または老化を誘発する可能性がある（Ｈｕｉｔｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。さらに、老化は、２型糖尿病（Ｐａｌｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、アテローム性動脈硬化症（Ｇｏｒｅｎｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）、多発性硬化症（ＭＳ）（Ｏｏｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１９）、および他の慢性疾患などの慢性的な悪化する病状に有害な影響を与える可能性がある。
【０１０１】
スフィンゴ脂質の関与は、エージングおよび老化のレギュレーションについて複数の生物および細胞型で研究されており、特に、誘導された細胞老化のためのセラミドおよびスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）は、生存へのそれらの影響とは区別される。有意で広範囲の証拠は、ストレス刺激によるレギュレーション、ｐ５３、成長停止への参加、ＳＡＳＰ、および老化反応の他の側面を含む、組織の老化につながるエージングおよび臓器傷害におけるスフィンゴ脂質酵素と経路の重要な役割を定義する（Ｔｒａｙｓｓａｃ  ｅｔ  ａｌ．，２０１８）。酸性セラミダーゼは、リン酸化してＳ１Ｐを形成できる生成物にセラミドを加水分解することにより、セラミド対Ｓ１Ｐのレベルのバランスをとることができる唯一のタンパク質である。本発明は、アポトーシスからの細胞の保護におけるその役割に加えて、ＡＣの投与が、異なる細胞型および組織においてｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの老化率を低下させたというさらなる発見に基づく。
【０１０２】
冠状動脈の閉塞は、心筋への血液の供給を減少させ、梗塞リスク領域内および虚血性境界帯の周囲に動的な影響を引き起こす。梗塞リスク領域の組織は、数分以内に明確な代謝変化を示す。リスク領域組織のほぼ全体が、６時間の重度の低灌流中に不可逆的に傷害を受ける。一方、境界帯組織は、非虚血性血管床における局所的な血流の４５〜８０％を含む、より大きな側副灌流による中程度の代謝変化のみを示す。虚血性境界帯組織は、梗塞の外側縁からのものであり、約２ｍｍの幅であり、心外膜下に沿って幅が増加する。経時的に、側副血流が改善されるため、境界帯の心外膜マージンが広がる。境界帯領域の組織は、老化している、または老化し始めている。
【０１０３】
実施例
マウス
すべての動物の手順は、マウント・サイナイ・アイカーン医科大学の施設ケアおよび使用委員会で承認されたプロトコルに基づいて実行した。ＣＦＷマウス系統の雄および雌を心筋梗塞後の心臓機能の研究に使用した。手術前に、マウスをケタミン１００ｍｇ／ｋｇおよびキシラジン１０ｍｇ／ｋｇカクテルで麻酔した。
【０１０４】
タンパク質発現アッセイでは、６０μｌのクエン酸スクロース緩衝液（ｓｕｌｔａｎａ  ２０１７）に１００μｇのＬｕｃ、Ｓｐｈｋ１、またはＳ１ｐｒ２  ｍｏｄＲＮＡを胸部手術で心筋に直接注入した。ＭＩをＬＡＤの永久結紮により誘導した。左胸部を剃毛して滅菌した。挿管後、左開胸術により心臓を露出させた。ＬＡＤを結紮するために縫合糸を配置した。必要に応じて、ＬＡＤ結紮直後に１００μｇのｍｏｄＲＮＡを梗塞境界帯に注入した。開胸術および皮膚を重ねて縫合した。胸腔から過剰な空気を取り除き、通常の呼吸が確立されたらマウスを換気から外した。偽手術マウスからの心臓は、ＬＡＤ結紮せずに開胸手術の直後に収集した。
【０１０５】
ｍｏｄＲＮＡの合成
プラスミドテンプレートで生成されたクリーンなＰＣＲ産物は、ｍＲＮＡのテンプレートとして機能した。ＭｏｄＲＮＡは、Ａｎｔｉ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｃａｐ  Ａｎａｌｏｇ、３’−Ｏ−Ｍｅ−ｍ７Ｇ（５’）ｐｐｐ（５’）Ｇ（６  ｍＭ、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、グアノシン三リン酸（１．５ｍＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、アデノシン三リン酸（７．５ｍＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、シチジン三リン酸（７．５ｍＭ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、Ｎ１−メチルプソイドウリジン−５’−三リン酸（７．５ｍＭ、ＴｒｉＬｉｎｋ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）のカスタムリボヌクレオシドブレンドを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写した。ｍＲＮＡは、Ｍｅｇａｃｌｅａｒキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して精製し、南極ホスファターゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）で処理して；次いで、Ｍｅｇａｃｌｅａｒキットを使用して再度それを精製した。ｍＲＮＡをＮａｎｏｄｒｏｐ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で定量し、エタノールおよび酢酸アンモニウムで沈殿させ、１０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌおよび１ｍＭのＥＤＴＡに再懸濁した。
【０１０６】
ｍｏｄＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクション
心筋細胞において
製造元の指示に従って、ｎＧＦＰ、ＡＣ、Ｓｐｈｋ１、またはＳ１ｐｒ２をコードするｍＲＮＡの（２４ウェルプレートの）ウェルあたり２．５μｇをＲＮＡｉＭＡＸ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と複合体化し、新生児ラットまたはｈＰＳＣ由来のＣＭにトランスフェクトした。免疫蛍光染色では、トランスフェクションの１８時間後に細胞を４％のＰＦＡで１０分間固定したＰＢＳで１回洗浄し、ＰＢＳで３回洗浄した。ウエスタンブロット分析のために、細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで溶解緩衝液（Ｓｉｇｍａ）で溶解した。無酸素誘導アポトーシスの場合、細胞を４８時間無酸素チャンバーに移し、ＦＡＣＳ分析のためにトリプシン０．２５％（Ｓｉｇｍａ）で採取した。
【０１０７】
精子および卵母細胞において
マウスの精子および卵母細胞を５０〜２００ｎｇ／マイクロリットルの裸のＡＣ  ｍｏｄＲＮＡで培養培地に処理した。いくつかの実施形態では、１００ｎｇ／μｌを使用した。前核（ＰＮ）胚に、細胞質内注入によってｍｏｄＲＮＡを注入することができる。いくつかの実施形態では、胚に５０〜１００ｎｇのｍｏｄＲＮＡを注入した。
【０１０８】
ｈＰＳＣの分化
心筋梗塞研究後の心臓機能については、ｈＰＳＣ（Ｈ９）を前述のように心臓系統に沿って分化した。簡単に言うと、ｈＰＳＣをＥ８培地で維持し、４〜５日ごとにマトリゲルコーティングプレートに継代した。胚体（ＥＢ）を生成するために、ｈＰＳＣを１ｍｇ／ｍｌのコラゲナーゼＢ（Ｒｏｃｈｅ）で３０分間、または細胞がプレートから解離するまで処理した。細胞を収集し、１，３００ｒｐｍで３分間遠心分離し、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）、２ｍｍｏｌ／ＬのＬ−グルタミン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、４ｘ１０のモノチオグリセロール（ＭＴＧ、Ｓｉｇｍａ）、５０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、および１５０ｍｇ／ｍＬのトランスフェリン（Ｒｏｃｈｅ）を含有する分化培地で穏やかにピペッティングすることにより、５０〜１００細胞の小さなクラスターに再懸濁した。分化培地には、２ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４および３ｍｍｏｌのチアゾビビン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を追加した（０日目）。ＥＢを５％のＣＯ２、５％のＯ２、および９０％のＮ２中の３７℃で６ウェル超低付着プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で維持した。１日目に、培地を２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および２０ｎｇ／ｍＬのＡｃｔｉｖｉｎ  Ａ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を追加した分化培地に交換した。４日目に、培地を５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）および５ｍｍｏｌ／Ｌ  ＸＡＶ（Ｓｔｅｍｇｅｎｔ）を追加した分化培地に交換した。８日後、培地を５日ごとに、追加なしの分化培地に交換した。
【０１０９】
新生児ラットＣＭ分離
新生児ラットの心室ＣＭを、生後３〜４日のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ研究所）から分離した。本発明者らは、ＢＰＳ中で０．１％のコラゲナーゼＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた複数回の消化を使用した。各消化後、上清をウマ血清（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に収集した。全細胞懸濁液を１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を廃棄し、０．１ｍＭのアスコルビン酸（Ｓｉｇｍａ）、０．５％のインスリン−トランスフェリン−セレン（１００ｘ）、ペニシリン（１００Ｕ／ｍＬ）、およびストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を含むＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）に細胞を再懸濁した。ほとんどの非筋細胞が皿に付着し、筋細胞が懸濁液中に残るまで、細胞をプラスチック培養皿に９０分間プレーティングした。次いで、筋細胞を２４ウェルプレートに１ｘ１０細胞／ウェルで播種した。新生児ラットＣＭを５％のウマ血清を含有するＤＭＥＭで４８時間インキュベートした。インキュベーション後、上記のように細胞にｍｏｄＲＮＡをトランスフェクトした。
【０１１０】
リアルタイムｑＰＣＲ分析
製造元の指示に従い、ＲＮｅａｓｙミニキット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して全ＲＮＡを分離し、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ逆転写酵素（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して逆転写した。Ｍａｓｔｅｒｃｙｃｌｅｒ  ｒｅａｌｐｌｅｘ  ４  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ（Ｅｐｐｅｎｄｏｆｆ）で、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ（Ｑｕａｎｔｉｔｅｃｔ（商標）ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ）を使用してリアルタイムｑＰＣＲ分析を実行した。データは、必要に応じて１８ｓｒＲＮＡ発現に正規化した（内因性対照）。遺伝子発現の倍数変化は、ｄｄＣＴ法によって判定した。ＰＣＲプライマー配列を表２に要約する。
【表２】
2021516956.tif 000010
【０１１１】
ウエスタンブロット
解凍すると、心臓溶解物は、還元条件下で１２％のプレキャストＮｕｐａｇｅ  Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）およびＭＥＳランニング緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分離に供して、セミドライトランスファー装置およびＮｕｐａｇｅ−ＭＯＰＳトランスファー緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、ニトロセルロースメンブレン（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上に移した。膜を５％のドライミルクを含有するＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎでブロックし、４℃で特異的一次抗体と一晩インキュベートし、ＴＢＳ／Ｔｗｅｅｎで洗浄して、ホースラディッシュペルオキシダーゼにコンジュゲートしたウサギまたはヤギ抗体と室温で１時間インキュベートした。検出は、強化化学ルミネッセンス（ＥＣＬ）検出システム（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）によって実行した。分子量については、事前に染色されたタンパク質標準（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍｓｈｉｒｅ，ＵＫ）を使用した判定であった。
【０１１２】
免疫組織化学
マウス心臓を採取し、灌流緩衝液（ＰＢＳｘ１中２ｇ／ｌのブタンジオン、モノキシム、および７．４ｇ／ｌの  ＫＣｌ）ならびに４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）を使用して灌流した。心臓を４％のＰＦＡ／ＰＢＳで一晩シェーカーで固定し、次いでＰＢＳで１時間洗浄し、３０％のスクロース／ＰＢＳで４℃で一晩インキュベートした。凍結する前に、心臓をＯＣＴに３０分間マウントし、−８０℃で凍結した。１０μＭの心臓の横断切片をクリオスタットで作製した。凍結切片をＰＢＳＴ中で洗浄し、ＰＢＳＴ中の５％のロバ血清で１時間ブロックした。切片を、トロポニンＩ、Ｓｐｈｋ１、Ｓ１ｐ２ための一次抗体を使用して４℃で一晩インキュベートした。蛍光標識には二次抗体を使用した（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。ＴＵＮＥＬ染色は、製造元の推奨に従って実行した（Ｉｎ−Ｓｉｔｕ細胞死検出キット、フルオレセイン、Ｃａｔ＃１１６８４７９５９１０、Ｒｏｃｈｅ）。染色された切片は、Ｚｅｉｓｓ  Ｓｌｉｄｅ  Ｓｃａｎｎｅｒ  Ａｘｉｏ  ＳｃａｎまたはＺｅｉｓｓマイクを使用して画像化した。心臓切片におけるＴＵＮＥＬの定量は、ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して実行した。細胞免疫細胞化学のために、Ｈｅｋ２９３および分離されたＣＭを、４％のＰＦＡと共にカバーガラス上に室温で１０分間固定した。ＰＢＳ中の０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００を用いて室温で１０分間透過処理した後、細胞をＰＢＳ中の５％のＤｏｎｋｅｙ血清＋０．１％のＴＲＩＴＯＮ（登録商標）Ｘ１００で３０分間ブロックした。カバーガラスを湿度チャンバー内で一次抗体と室温で１時間インキュベートした後、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ５５５にコンジュゲートした対応する二次抗体、および核の可視化のためのＨｏｅｃｈｓｔ  ３３３４２染色（すべてＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ製）とインキュベートした。蛍光画像は、２０倍の倍率でＺｅｉｓｓ蛍光顕微鏡で撮影した。
【０１１３】
生殖補助研究のための方法
マウスの卵母細胞および精子の収集
動物に関与するすべての実験は、適切な施設内動物管理および使用委員会のガイドラインによって承認され、厳密に実行した。７〜８週齢の１２９−ＳＶＩＭＪおよびＣ５７−Ｂｌａｃｋ／６雌マウス（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）に、１０  ＩＵの妊娠馬血清性腺刺激ホルモン（ＰＭＳＧ；Ｓｙｎｃｒｏ−ｐａｒｔ、Ｓａｎｏｆｉ，Ｆｒａｎｃｅ）、その後、４８時間後に１０  ＩＵのヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ；Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を用いて過剰排卵させた。成熟およびエージングさせたＭＩＩ卵母細胞を、ｈＣＧの注入後それぞれ１６時間または４６時間に卵管膨大部から収集した。卵丘細胞は、Ｍ２培地（Ｓｉｇｍａ）中の４００  ＩＵ／ｍｌの高度に精製されたヒアルロニダーゼ（Ｈ−３６３１；Ｓｉｇｍａ）への短時間の曝露によって取り除いた。１０週齢のマウスからの精巣上体の精子を、同じ系統からの卵母細胞のＩＶＦに使用した。
【０１１４】
マウス受精および胚培養
Ｖｉｔｒｏｆｅｒｔ溶液（Ｖｉｔｒｏｌｉｆｅ，Ｇｏｔｅｂｏｒｇ，Ｓｗｅｄｅｎ）内の受精精子のマイクロドロップを調製し、約１０個の卵母細胞を各精子マイクロドロップに置いた。受精プロセスは、５％のＣＯ２および９５％の空気の加湿雰囲気で３７℃で６時間実行した。ＩＶＦ後、接合子をシンプレックスカリウム最適化培地（ＫＳＯＭ，Ｃｈｅｍｉｃｏｎ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ  ＭＡ）で３回洗浄し、５％のＣＯ２および９５％の空気の加湿雰囲気で３７℃でさらに２０〜４８時間培養した。接合子の卵割を観察し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養全体を通して記録した。
【０１１５】
ヒトの配偶子の収穫、評価、および培養
（Ａ）卵母細胞
女性患者は、組換え卵胞刺激ホルモン（ｒＦＳＨ）の投与、その後のゴナドトロピン放出ホルモン（ＧｎＲＨ）拮抗薬の併用投与により、承認および制御された卵巣刺激を受ける。具体的には、ｒＦＳＨは、サイクルの１／２に等しい日から開始して管理した。ＧｎＲＨ拮抗薬は、６日目に、または卵胞の直径が１２ｍｍのときに、前の卵胞が１２ｍｍ以上を超えるか、エストラジオールレベルが４５０ｐｇ／ｍｌを超えるまで添加した。このプロトコルは、１７〜１８ｍｍの少なくとも２つの卵胞が観察されるまで継続した。この時点で、排卵は、Ｏｖｉｔｒｅｌｌｅ（ＬＨ）およびＤｅｃａｐｅｐｔｉｄｅ（ＧｎＲＨアナログ）のダブルトリガー投与によって誘導した。卵子のピックアップは、その後３６〜３８時間実行した。
【０１１６】
１００μｇ／μｌのＡＣ  ｍｏｄＲＮＡの存在下で、卵丘−卵母細胞複合体を受精培地（ＬｉｆｅＧｌｏｂａｌ）に分離した。
【０１１７】
（Ｂ）精子
【０１１８】
精子サンプルの数、運動性、形態について評価し、すべてのパラメータを記録した。検証後の精子をＭｕｌｔｉｐｕｒｐｏｓｅ  Ｈａｎｄｌｉｎｇ／ｍｅｄｉｕｍ（登録商標）（ＭＨＭ（登録商標）、Ｉｒｖｉｎｅ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）とインキュベートし、半分で２つに分け；研究グループとして、半分を培地中の１００μｇ／μｌのＡＣ  ｍｏｄＲＮＡの存在下で１時間インキュベートし、残りの半分を対照用の培地中にＡＣ  ｍｏｄＲＮＡの非存在下でインキュベートした。１時間のインキュベーション後、精子サンプルの数、運動性、および形態について２回目の評価を実施した。値は、ＡＣ  ｍｏｄＲＮＡで処理する前に得られた値と比較した。
【０１１９】
インキュベーションおよび評価の後、配偶子を承認された一般的なプロトコルで処理した。卵母細胞は、配偶者の精子パラメータおよびルーチンのプロトコルに従って、ＩＣＳＩ（細胞質内精子注入）によって授精または注入した。授精後、ＩＶＦ／ＩＣＳＩで日常的に行われているように、ＩＣＳＩ卵母細胞をＧｌｏｂａｌ培地（Ｌｉｆｅ  Ｇｌｏｂａｌの培養用培地）に移した。すべての胚を培養し、統合されたＥｍｂｒｙｏＳｃｏｐｅ（商標）タイムラプスモニタリングシステム（ＥＭＢＲＹＯＳＣＯＰＥ（商標），ＵｎｉｓｅｎｓｅＦｅｒｔｉｌｉＴｅｃｈ，Ｖｉｔｒｏｌｙｆｅ  Ｄｅｎｍａｒｋ）で受精時から最大５日目までの胚発生をモニタリングした。ＥＭＢＲＹＯＳＣＯＰＥ（商標）は、培養条件を乱すことなく胚発生を継続的にモニタリングする可能性を提供する。胚のスコアリングおよびタイムラプスモニタリングによる選択は、画像分析専用に開発されたソフトウェア（ＥｍｂｒｙｏＶｉｅｗｅｒワークステーション；ＵｎｉｓｅｎｓｅＦｅｒｔｉｌｉｔｅｃｈ  Ａ／Ｓ）を用いて、各胚のタイムラプス画像の分析によって実行した。以下のように、受精のタイミングと相関して観察された細胞分裂の正確なタイミングを実証するために、胚の形態および発生事象を記録した：１）前核フェージング（ｔＰｎｆ）、２）２割球への卵割（ｔ２）、３）３割球（ｔ３）、４）４割球（ｔ４）など、８割球（ｔ８）胚に到達するまで、５）圧縮（ｔＭ）、および６）胞胚形成の開始、の時間。加えて、同時性および卵割の持続期間も測定した。内細胞塊および栄養外胚葉の組成を含む胚盤胞の形態を、ガードナー胚盤胞の等級付けスケールに従って評価した。
【０１２０】
着床前遺伝子スクリーニング（ＰＧＳ）は、移すための正倍数体胚を選択するために、染色体マイクロアレイ分析（ＣＭＡ）によって実行する。このため、栄養外胚葉生検を５日目に実行する。その後、胚盤胞および生検胚は、ガラス化によって凍結する。栄養外胚葉サンプルからのＤＮＡは、以前に説明されているように（Ｆｒｕｍｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）およびＣＭＡに供する。正倍数体であることが分かった胚は、後続のサイクルで解凍し、着床および妊娠のために母親の子宮に移される。
【０１２１】
受精後、ＡＣの存在下で形成されたマウスおよびウシの胚の数も改善し（約４０から８８％に）、約５倍の健康な出産につながった。有意により高度な胚盤胞を形成し、形態学的に無傷の孵化した胚の数が約２４から７０％に増加した（Ｅｌｉｙａｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【０１２２】
ＩＶＦプロトコル中、胚培養は、最長７日間続けることができ、特にエージングした卵母細胞によって産生された初期胚では、胚が生存する可能性は低い。表３に示すように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでエージングしたマウスの卵母細胞（高齢の女性の卵母細胞のモデルとして機能する）は、ＡＣ治療後に健康な胚に成長する可能性が高くなる（受精率が０．０２％から２５．２％に増加）（Ｅｌｉｙａｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。胚の遺伝子活性化機構は、まだ完全に機能していないため、胚を培養で長期間生存させることは非常に困難である。
培養での胚生存を延長する取り組みの一環として、本発明者らは、スフィンゴ脂質代謝タンパク質である酸性セラミダーゼをコードするｍｏｄＲＮＡの有効量を投与することにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養した胚のアポトーシス死を防止するための方法を開発した。本開示は、ｍｏｄＲＮＡが胚移植および着床後でも少なくとも１０日間酵素発現を供給できるという観察に基づいて、組換えタンパク質ではなくｍｏｄＲＮＡを使用することを説明する。通常、ヒトのＩＶＦプロトコル中に胚は、３〜５日目に移植され、移植後の胚を組換えタンパク質に曝露することは不可能である。加えて、すべての胚は、統合されたＥｍｂｒｙｏＳｃｏｐｅ（商標）タイムラプスモニタリングシステム（ＥｍｂｒｙｏＳｃｏｐｅ（商標）、ＵｎｉｓｅｎｓｅＦｅｒｔｉｌｉＴｅｃｈ、Ｖｉｔｒｏｌｙｆｅ  Ｄｅｎｍａｒｋ）で受精時から最長５日目まで培養される。ＥｍｂｒｙｏＳｃｏｐｅ（商標）は、培養条件を乱すことなく胚発生を継続的にモニタリングする可能性を提供する。組換えタンパク質の使用は、２４〜４８時間ごとに培地をリフレッシュするために培養条件の破壊を必要とする。
【０１２３】
初期のマウス胚へのｍｏｄＲＮＡ「サバイバルカクテル」注入により、形成された胚盤胞の数（表３）ならびにＩＶＦおよび胚注入中の生産児の数（表４）が劇的に改善されることが予備結果で実証された。
【表３】
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【０１２４】
ＡＣ  ＭｏｄＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養される胚の質を改善する。マウスの精子を１００ｎｇ／μｌの裸のＡＣ  ＭｏｄＲＮＡと３７℃のＣＯ２インキュベーターで１時間インキュベートした。インキュベーション後、精子をＣ５７ＢＬ／６  Ｍｌｌ卵の標準授精（ＩＶＦ）に使用した。＊（Ｐ＜０．００３）。
【表４】
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【０１２５】
ＡＣ  ＭｏｄＲＮＡは、出生率を改善する。マウスの精子を１００ｎｇ／μｌの裸のＡＣ  ＭｏｄＲＮＡと３７℃のＣＯ２インキュベーターで１時間インキュベートした。インキュベーション後、精子をＣ５７ＢＬ／６  Ｍｌｌ卵の標準授精（ＩＶＦ）に使用した。次いで、両方のグループのすべての胚を偽妊娠した雌のレシピエントに移植し、出生率を記録した。表４に示すように、ＡＣ  ＭｏｄＲＮＡ処理グループの移植された２〜４細胞胚の出生率（８／８６、１９％）は、処理なしの場合（８／８６、９％）よりも高く、これは、移植または発達に対するＡＣ  ＭｏｄＲＮＡ治療の効果が有害ではないことを示している。ｒＡＣ処理された胚に由来する児を、最長１か月間追跡し、すべて正常な外観および運動機能を示した（データは示さない）。＊（Ｐ＜０．０５）。
【０１２６】
ＡＣ  ｍｏｄＲＮＡの生存効果を、１）精子パラメータ、２）１〜５日目の胚の形態および形態動態、３）胚盤胞倍数性、ならびに４）妊娠率に基づいて評価する。
【０１２７】
全体として、これらのデータは、ＡＣをｉｎ  ｖｉｖｏ／ｉｎ  ｖｉｔｒｏの卵母細胞および胚環境の重要な構成要素して特定し、補助受精の結果を高めるための新規の技術を提供する。
REFERENCES
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ−１Ｅ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ−２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ−４Ｄ】
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【図４Ｅ−４Ｇ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ−５Ｅ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ−７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ−８Ｂ】
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【図８Ｃ−８Ｄ】
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【図９Ａ−９Ｄ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１２Ａ−１２Ｂ】
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【図１２Ｃ−１２Ｆ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ−１４Ｂ】
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【図１５Ａ−１５Ｆ】
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【図１５Ｇ−１５Ｈ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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