(57)【要約】  キラルアミン化合物の不斉合成に有用な改変トランスアミナーゼポリヌクレオチドのアミノ酸配列、ならびに産業関連条件下でのその調製プロセスおよび反応プロセスが提供される。また、改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列、改変トランスアミナーゼポリペプチドを発現することができる改変宿主細胞、および改変トランスアミナーゼポリペプチドを使用してキラルアミン化合物を生成する方法も提供される。他の酵素と比較して、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、より良好な触媒活性および安定性を有し、合成プロセスにおいてキラルアミン生成物によって阻害されない。キラルアミン化合物の調製のための改変ポリペプチドの使用は、より高い単位活性をもたらし、良好な産業用途の展望を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変トランスアミナーゼポリペプチドであって、適切な反応条件下で、アセトフェノンを、配列番号２よりも高い触媒活性および／または安定性を有するＲ−（＋）−α−フェニルエチルアミンに変換することができる、配列番号２に対して少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、トランスアミナーゼポリペプチド。
【請求項２】
前記適切な反応条件が、約１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌのアセトフェノン、約０．５Ｍ〜約２．０Ｍのイソプロピルアミン、約５０μＭ〜５ｍＭのピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）、約７．０〜１１．０のｐＨ、約１０〜６０℃の温度を含む、請求項１に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
【請求項３】
前記アミノ酸配列が、３、４、９、１８、１９、３１、３６、４０、４１、４７、５０、５３、５４、５６、５９、６０、６１、６２、７２、７８、８６、９８、１０１、１１３、１１４、１１５、１１６、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１４１、１４３、１４８、１５３、１５５、１５６、１５９、１６２、１６７、１７３、１７４、１７５、１８１、１８２、１８６、１８７、１８８、１９０、１９１、１９４、１９９、２０９、２１４、２１９、２２６、２３５、２４０、２４３、２４４、２５２、２５３、２６２、２６６、２７１、２７２、２７３、２７５、２７８、２８１、２８７、２９１、３０２、３０７、３１２、および３２３から選択される１つ以上のアミノ酸残基に配列番号２の配列とは異なるアミノ酸配列を含み、番号付けが、配列番号２を参照し、前記ポリペプチドが、トランスアミナーゼ活性を有する、請求項１〜２に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
【請求項４】
前記トランスアミナーゼの前記アミノ酸配列が、以下のアミノ酸残基の１つ以上を含み、
Ｘ３が、Ｔであるか、
Ｘ４が、Ｉであるか、
Ｘ９が、Ａであるか、
Ｘ１８が、ＨもしくはＩであるか、
Ｘ１９が、ＴもしくはＡであるか、
Ｘ３１が、Ｗであるか、
Ｘ３６が、Ｆであるか、
Ｘ４０が、ＹもしくはＴであるか、
Ｘ４１が、Ｅであるか、
Ｘ４７が、Ｐであるか、
Ｘ５０が、Ａであるか、
Ｘ５３が、Ｔ、Ｐ、Ａ、Ｒ、Ｇ、Ｎ、Ｓ、Ｆ、もしくはＬであるか、
Ｘ５４が、Ａであるか、
Ｘ５６が、Ａ、Ｖ、もしくはＳであるか、
Ｘ５９が、ＳもしくはＴであるか、
Ｘ６０が、Ｔであるか、
Ｘ６１が、Ｆであるか、
Ｘ６２が、Ｒ、Ｈ、Ｎ、もしくはＡであるか、
Ｘ７２が、Ｇであるか、
Ｘ７８が、Ｌであるか、
Ｘ８６が、Ｃであるか、
Ｘ９８が、Ｋであるか、
Ｘ１０１が、ＶもしくはＨであるか、
Ｘ１１３が、ＭもしくはＷであるか、
Ｘ１１４が、Ｇであるか、
Ｘ１１５が、Ｋ、Ｈ、Ｙ、もしくはＦであるか、
Ｘ１１６が、Ｉであるか、
Ｘ１２２が、Ｔであるか、
Ｘ１２３が、ＳもしくはＩであるか、
Ｘ１２４が、Ｓであるか、
Ｘ１２５が、ＤもしくはＮであるか、
Ｘ１２６が、Ｑ、Ｎ、Ｄ、Ｗ、Ｇ、もしくはＨであるか、
Ｘ１２７が、Ｆ、Ｋ、Ｓ、もしくはＰであるか、
Ｘ１２８が、ＲもしくはＮであるか、
Ｘ１２９が、ＮもしくはＱであるか、
Ｘ１３０が、Ｑ、Ｅ、もしくはＡであるか、
Ｘ１４１が、ＱもしくはＴであるか、
Ｘ１４３が、ＳもしくはＲであるか、
Ｘ１４８が、Ｌであるか、
Ｘ１５３が、ＤもしくはＫであるか、
Ｘ１５５が、Ｓ、Ｉ、もしくはＲであるか、
Ｘ１５６が、Ｌ、Ｉ、もしくはＲであるか、
Ｘ１５９が、Ｓであるか、
Ｘ１６２が、Ｖであるか、
Ｘ１６７が、Ｖであるか、
Ｘ１７３が、Ｄであるか、
Ｘ１７４が、ＳもしくはＩであるか、
Ｘ１７５が、ＹもしくはＧであるか、
Ｘ１８１が、ＹもしくはＦであるか、
Ｘ１８２が、Ｍであるか、
Ｘ１８６が、Ｆであるか、
Ｘ１８７が、Ｉ、Ｎ、もしくはＲであるか、
Ｘ１８８が、Ｒであるか、
Ｘ１９０が、Ｍであるか、
Ｘ１９１が、Ｖであるか、
Ｘ１９４が、Ｋ、Ｌ、Ｒ、Ｅ、Ｎ、Ｖ、Ｄ、Ｉ、もしくはＧであるか、
Ｘ１９９が、Ｋ、Ｑ、もしくはＥであるか、
Ｘ２０９が、Ｈであるか、
Ｘ２１４が、ＣもしくはＰであるか、
Ｘ２１９が、ＩもしくはＬであるか、
Ｘ２２６が、Ｌであるか、
Ｘ２３５が、Ｅであるか、
Ｘ２４０が、Ｄ、Ｓ、もしくはＱであるか、
Ｘ２４３が、Ｆであるか、
Ｘ２４４が、Ｅであるか、
Ｘ２５２が、Ｐであるか、
Ｘ２５３が、Ｖであるか、
Ｘ２６２が、Ｔ、Ａ、もしくはＦであるか、
Ｘ２６６が、Ａであるか、
Ｘ２７１が、Ｃであるか、
Ｘ２７２が、Ｔであるか、
Ｘ２７３が、Ｓであるか、
Ｘ２７５が、Ｇであるか、
Ｘ２７８が、Ｖであるか、
Ｘ２８１が、Ｖであるか、
Ｘ２８７が、Ｋであるか、
Ｘ２９１が、Ｇであるか、
Ｘ３０２が、Ｍであるか、
Ｘ３０７が、Ｎであるか、
Ｘ３１２が、ＡもしくはＮであるか、または
Ｘ３２３が、Ｄであり、
前記番号付けが、配列番号２を参照する、請求項３に記載のトランスアミナーゼポリペプチド。
【請求項５】
以下の（ａ）または（ｂ）のポリペプチドである、改変ポリペプチド：
（ａ）配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチド、
（ｂ）（ｉ）（ａ）に列挙される前記アミノ酸配列のうちの１つに対する少なくとも８０％の配列同一性、および（ｉｉ）（ａ）に列挙される前記１つのアミノ酸配列に対して、１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失、付加、または挿入を有するアミノ酸配列を含む、トランスアミナーゼ活性を有するポリペプチド。
【請求項６】
適切な反応条件下で、アセトフェノンを、配列番号２の触媒活性および／または安定性よりも高い触媒活性および／または安定性を有するＲ−（＋）−α−フェニルエチルアミンに変換することができる、改変トランスアミナーゼポリペプチド。
【請求項７】
化学結合または物理吸着法によって固体材料に固定化されたポリペプチドであって、請求項１〜６のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチドから選択される、ポリペプチド。
【請求項８】
請求項１〜６のいずれかに記載のポリペプチドをコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項９】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、または３９９である、請求項８に記載のポリヌクレオチド。
【請求項１０】
請求項８または９に記載のポリヌクレオチドを含む、発現ベクター。
【請求項１１】
プラスミド、コスミド、バクテリオファージ、またはウイルスベクターを含む、請求項１０に記載の発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０〜１１のいずれか一項に記載の発現ベクターを含む宿主細胞であって、好ましくはＥ．ｃｏｌｉである、宿主細胞。
【請求項１３】
トランスアミナーゼポリペプチドを調製する方法であって、請求項１２に記載の宿主細胞を培養するステップと、前記培養物からトランスアミナーゼポリペプチドを得るステップと、を含む、方法。
【請求項１４】
請求項１２に記載の宿主細胞を培養することによって、または請求項１３に記載の方法によって得ることができるトランスアミナーゼ触媒であって、前記トランスアミナーゼ触媒が、トランスアミナーゼポリペプチドを含有する細胞もしくは培養液、またはそれで処理された物品を含み、前記物品が、形質転換細胞の前記培養物から得られる抽出物、前記抽出物からトランスアミナーゼを単離もしくは精製することによって得られる単離生成物、または形質転換細胞、その抽出物、もしくは前記抽出物の単離生成物を固定化することによって得られる固定化生成物を指す、トランスアミナーゼ触媒。
【請求項１５】
式（Ｉ）の化合物を調製するプロセスであって、
【化１】
2021508435.tif 000111
式（Ｉ）の前記アミン生成物が、＊でマークされたキラル中心に示される、示された立体化学配置を有し、式（Ｉ）の前記アミン生成物が、他の異性体に対して鏡像体過剰であり、
Ｒ１が、任意選択的に置換もしくは非置換のアリールもしくはヘテロアリール、または任意選択的に置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ８ヒドロカルビルであり、
Ｒ２が、任意選択的に置換または非置換のＣ１−Ｃ６ヒドロカルビル、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、および−Ｉなど）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒ’または−ＳＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＯＲ’、−ＣＯ２Ｒ’または−ＣＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、ＣＦ３であり、式中、各Ｒ’が、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）ヒドロカルビルから独立して選択され、前記プロセスが、ケトン基質をアミン生成物に変換する適切な反応条件下で、アミン供与体および式（ＩＩ）の前記ケトン基質、
【化２】
2021508435.tif 000112
を、請求項１〜７のいずれかに記載のトランスアミナーゼポリペプチドと接触させることを含む、プロセス。
【請求項１６】
式（Ｉ）の前記キラルアミン生成物が、
【化３】
2021508435.tif 000113
であり、
式中、Ｒ２が、任意選択的に置換または非置換のＣ１−Ｃ６ヒドロカルビル、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、および−Ｉなど）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒ’または−ＳＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＯＲ’、−ＣＯ２Ｒ’または−ＣＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、ＣＦ３であり、式中、各Ｒ’が、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）ヒドロカルビルから独立して選択され、Ｒ３またはＲ４が、Ｃ１−Ｃ４ヒドロカルビル、−Ｈ、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、および−Ｉなど）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒ’または−ＳＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＯＲ’、−ＣＯ２Ｒ’または−ＣＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、ＣＦ３であり、式中、各Ｒ’が、
−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）ヒドロカルビルから独立して選択され、Ｒ３またはＲ４がまた、
【化４】
2021508435.tif 000114
であってもよく、構造式（ＩＩ）の前記ケトン基質が、
【化５】
2021508435.tif 000115
である、請求項１５に記載のプロセス。
【請求項１７】
式（Ｉ）の前記キラルアミン生成物が、
【化６】
2021508435.tif 000116
であり、
式中、Ｒ２およびＲ３が、請求項１６に定義されたとおりである、請求項１５または１６に記載のプロセス。
【請求項１８】
式（Ｉ）の前記キラルアミン生成物が、
【化７−１】
2021508435.tif 000117
【化７−２】
2021508435.tif 000118
である、請求項１５〜１７に記載のプロセス。
【請求項１９】
式Ａ２  Ｒ−（＋）−α−フェニルエチルアミンの化合物を調製するプロセスであって、
【化８】
2021508435.tif 000119
前記プロセスが、適切な有機溶媒中、アミン供与体の存在下、式Ａ１の化合物を式Ａ２の化合物に変換する適切な反応条件下で、式Ａ１の化合物アセトフェノン
【化９】
2021508435.tif 000120
を、請求項１〜７のいずれか一項に記載のトランスアミナーゼポリペプチドと接触させることを含む、プロセス。
【請求項２０】
前記キラルアミン生成物が、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の鏡像体過剰で存在する、請求項１５〜１９のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２１】
前記反応溶媒が、水、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、酢酸イソプロピル、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、またはジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）を含む、請求項１５〜２０のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２２】
前記反応条件が、１０℃〜６０℃の温度を含む、請求項１５〜２１のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２３】
前記反応条件が、ｐＨ７．０〜ｐＨ１１．０を含む、請求項１５〜２２のいずれか一項に記載のプロセス。
【請求項２４】
前記ケトン基質が、１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの負荷で存在する、請求項１５〜２３のいずれか一項に記載のプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物工学の分野、具体的には改変トランスアミナーゼポリペプチドおよびそれらの用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
キラルアミンは、ファインケミカル、製薬、健康、農業、および材料産業で広く使用されている一種の重要な化合物である。特に製薬産業では、セファロスポリン、神経薬、心血管治療薬、降圧薬、抗感染薬、およびワクチンなどの様々な薬物の調製における中間体として、キラルアミンがしばしば使用される。シタグリプチンは、抗糖尿病経口薬ジャヌビアの主成分であり、それは、Ｒ鏡像異性立体中心を有するアミンである。キラルアミン化合物を調製するための従来の方法は一般に、極端な条件（高温、高圧など）下での反応を伴う。また、高いキラル純度を有する生成物を得るためには、面倒な分割ステップまたは再結晶化ステップが必要であり、これは、大量の廃棄物を発生させ、高いコストおよび汚染をもたらす。これにより、キラルアミンを調製するためのより効率的な方法の発見が促され、トランスアミナーゼの出現により、研究者らは糸口を見出すことができた。トランスアミナーゼは、その高い選択性、高い変換率、および軽度の反応条件のために、産業によって支持されている。トランスアミナーゼは、アミン供与体からケトン基質へのアミノ基の転移を触媒して、キラルアミン生成物およびケトン副生成物をもたらすことができる（スキーム１）。この反応には、補因子としてピリドキサールリン酸（ＰＬＰ）が必要である。
【０００３】
トランスアミナーゼは、キラルアミン化合物の合成における非常に良好な用途が期待されるが、自然界に見出される野生型トランスアミナーゼは、しばしば活性が不十分であるか、または不十分な安定性もしくは不十分な立体選択性を有するか、または所望の基質を受け入れることができないか、または基質および／もしくは生成物阻害を有する。したがって、工業生産において野生型トランスアミナーゼを直接適用することはしばしば可能ではない（Ｆｅｉ  Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｐｅｒ  Ｂｅｒｇｌｕｎｄ，Ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ  ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ：ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｇｒｅｅｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２０１７，１９，３３３−３６０）。近年では、タンパク質改変技術の台頭により、特定のキラルアミン化合物の合成のためのプロセス要件を満たすために、定向進化技術によってトランスアミナーゼの性能を改善することができる。本発明は、出発点として野生型トランスアミナーゼ、およびモデル生成物としてＲ−（＋）−α−フェニルエチルアミン（Ｒ−ＰＥＡと称される）を使用して、高い活性、高い安定性、高い立体選択性、および／またはより広範な基質を有する、一連の改変トランスアミナーゼポリペプチドを開発した。
【０００４】
Ｒ−ＰＥＡは、重要な化学中間体であり、その誘導体は、製薬、化学、乳化剤、および染料産業における広範囲の用途を有する。それは、特定のラセミ酸、アルコール、エステルなどを分割するために使用することができ、また、特定のキラル物質の合成のための助剤または原材料としても使用することができる。したがって、それは、Ｒ−ＰＥＡの合成を研究および改善することが非常に重要である。Ｒ−ＰＥＡの調製には、天然資源からの抽出およびラセミ分割などが含まれる。天然物からの生物学的に活性なキラル化合物の直接的な抽出が最も直接的な方法であるが、天然原材料は限られており、コストがかかる。最も一般的に使用される方法は、分割によってラセミα−フェニルエチルアミンからＲ−ＰＥＡを単離することであり、これは、最大５０％の理論収率をもたらす。化学合成法と比較して、トランスアミナーゼを使用する生体触媒合成法は、分割することなく、より高い収率および光学純度を可能にするだけでなく、穏やかな反応条件、より低いコスト、およびより少ない環境汚染も有する。
【０００５】
スキームの簡単な説明
【化１】
2021508435.tif 000002
スキーム１は、トランスアミナーゼの触媒反応を描写する。
【化２】
2021508435.tif 000003
スキーム２は、アセトフェノンのＲ−（＋）−α−フェニルエチルアミン（Ｒ−ＰＥＡ）へのトランスアミナーゼ触媒反応を描写する。
【０００６】
発明の内容
１．概要
本発明は、アキラルケトンからのアミノ基転移によってキラルアミン化合物を不斉合成すること、および特にＲ−（＋）−α−フェニルエチルアミンを不斉合成すること（スキーム２）ができる、高い立体選択性、高い触媒活性、および良好な安定性を有する改変トランスアミナーゼポリペプチドを提供する。本発明はまた、改変トランスアミナーゼポリペプチドの遺伝子配列、遺伝子を含有する組換え発現ベクター、改変株およびそれらの効率的な生成方法、ならびに改変ポリペプチドを使用するキラルアミン化合物の不斉合成のための反応プロセスも提供する。
【０００７】
第１の態様では、本発明は、改変トランスアミナーゼポリペプチドを提供する。これらの改変ポリペプチドは、特定の数のアミノ酸残基の置換、挿入、または欠失を含む、定向進化の作成プロセスを通して、野生型トランスアミナーゼから誘導される。野生型トランスアミナーゼは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓに由来し、そのアミノ酸配列は、配列番号２として示される。この野生型トランスアミナーゼは、低い活性および不良な安定性を示し、フェニルエチルアミンは、この酵素を阻害する。本発明者らによって測定されるように、配列番号２のトランスアミナーゼを使用する反応（スキーム２）において、２ｇ／Ｌのアセトフェノン負荷および１０ｇ／Ｌのトランスアミナーゼ負荷（０．５Ｍのイソプロピルアミン、０．１ｍＭのＰＬＰ、１０％（ｖ／ｖ）のメタノール、ｐＨ９．０、３０℃）では、Ｒ−ＰＥＡの変換率は、１５％以下であり、６時間の反応後にそれ以上のＲ−ＰＥＡは形成されなかった。Ｒ−ＰＥＡは、配列番号２の野生型トランスアミナーゼに対して非常に強力な阻害効果を有する。この反応において、Ｒ−ＰＥＡ濃度が０．５ｇ／Ｌ以上である場合、配列番号２のトランスアミナーゼは、アセトフェノンのＲ−ＰＥＡへの変換時に阻害される。
【０００８】
本発明で提供される改変トランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２に対応する野生型トランスアミナーゼよりも高い活性および／または安定性を有し、非常に高い立体選択性でキラルアミン化合物を不斉合成することができ、特に高い効率でのアセトフェノンのＲ−ＰＥＡへの変換（スキーム２）を触媒することができるか、または高濃度のＲ−ＰＥＡの存在下で、本発明で提供される改変トランスアミナーゼポリペプチドは、低い阻害でアセトフェノンのＲ−ＰＥＡへの変換を依然として触媒することができる。これらの改変トランスアミナーゼポリペプチドは、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ９、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ３１、Ｘ３６、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ４７、Ｘ５０、Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５６、Ｘ５９、Ｘ６０、Ｘ６１、Ｘ６２、Ｘ７２、Ｘ７８、Ｘ８６、Ｘ９８、Ｘ１０１、Ｘ１１３、Ｘ１１４、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１２２、Ｘ１２３、Ｘ１２４、Ｘ１２５、Ｘ１２６、Ｘ１２７、Ｘ１２８、Ｘ１２９、Ｘ１３０、Ｘ１４１、Ｘ１４３、Ｘ１４８、Ｘ１５３、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５９、Ｘ１６２、Ｘ１６７、Ｘ１７３、Ｘ１７４、Ｘ１７５、Ｘ１８１、Ｘ１８２、Ｘ１８６、Ｘ１８７、Ｘ１８８、Ｘ１９０、Ｘ１９１、Ｘ１９４、Ｘ１９９、Ｘ２０９、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２２６、Ｘ２３５、Ｘ２４０、Ｘ２４３、Ｘ２４４、Ｘ２５２、Ｘ２５３、Ｘ２６２、Ｘ２６６、Ｘ２７１、Ｘ２７２、Ｘ２７３、Ｘ２７５、Ｘ２７８、Ｘ２８１、Ｘ２８７、Ｘ２９１、Ｘ３０２、Ｘ３０７、Ｘ３１２、Ｘ３２３から選択される１つ以上の残基位置で、配列番号２の配列とは異なるアミノ酸配列を含んでもよい。いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、以下の特徴のうちの少なくとも１つを含むアミノ酸配列を含む（これらの特徴は、配列番号２の参照配列に対するアミノ酸残基の置換である）：Ｓ３Ｔ、Ｍ４Ｉ、Ｓ９Ａ、Ｌ１８Ｈ、Ｌ１８Ｉ、Ｅ１９Ｔ、Ｅ１９Ａ、Ｙ３１Ｗ、Ｌ３６Ｆ、Ｓ４０Ｙ、Ｓ４０Ｔ、Ｄ４１Ｅ、Ｌ４７Ｐ、Ｇ５０Ａ、Ｈ５３Ｔ、Ｈ５３Ｐ、Ｈ５３Ａ、Ｈ５３Ｒ、Ｈ５３Ｇ、Ｈ５３Ｎ、Ｈ５３Ｓ、Ｈ５３Ｆ、Ｈ５３Ｌ、Ｓ５４Ａ、Ｌ５６Ａ、Ｌ５６Ｖ、Ｌ５６Ｓ、Ｄ５９Ｓ、Ｄ５９Ｔ、Ｖ６０Ｔ、Ｉ６１Ｆ、Ｓ６２Ｒ、Ｓ６２Ｈ、Ｓ６２Ｎ、Ｓ６２Ａ、Ｄ７２Ｇ、Ｉ７８Ｌ、Ｒ８６Ｃ、Ｎ９８Ｋ、Ａ１０１Ｖ、Ａ１０１Ｈ、Ｆ１１３Ｍ、Ｆ１１３Ｗ、Ｖ１１４Ｇ、Ｅ１１５Ｋ、Ｅ１１５Ｈ、Ｅ１１５Ｙ、Ｅ１１５Ｆ、Ｖ１１６Ｉ、Ｌ１２２Ｔ、Ｔ１２３Ｓ、Ｔ１２３Ｉ、Ｇ１２４Ｓ、Ｖ１２５Ｄ、Ｖ１２５Ｎ、Ｒ１２６Ｑ、Ｒ１２６Ｎ、Ｒ１２６Ｄ、Ｒ１２６Ｗ、Ｒ１２６Ｇ、Ｒ１２６Ｈ、Ｇ１２７Ｆ、Ｇ１２７Ｋ、Ｇ１２７Ｓ、Ｇ１２７Ｐ、Ｓ１２８Ｒ、Ｓ１２８Ｎ、Ｋ１２９Ｎ、Ｋ１２９Ｑ、Ｐ１３０Ｑ、Ｐ１３０Ｅ、Ｐ１３０Ａ、Ｌ１４１Ｑ、Ｌ１４１Ｔ、Ｌ１４３Ｓ、Ｌ１４３Ｒ、Ｖ１４８Ｌ、Ｎ１５３Ｄ、Ｎ１５３Ｋ、Ｌ１５５Ｓ、Ｌ１５５Ｉ、Ｌ１５５Ｒ、Ｈ１５６Ｌ、Ｈ１５６Ｉ、Ｈ１５６Ｒ、Ｅ１５９Ｓ、Ｉ１６２Ｖ、Ｒ１６７Ｖ、Ａ１７３Ｄ、Ｆ１７４Ｓ、Ｆ１７４Ｉ、Ｄ１７５Ｙ、Ｄ１７５Ｇ、Ｌ１８１Ｙ、Ｌ１８１Ｆ、Ｑ１８２Ｍ、Ｌ１８６Ｆ、Ｔ１８７Ｉ、Ｔ１８７Ｎ、Ｔ１８７Ｒ、Ｋ１８８Ｒ、Ｌ１９０Ｍ、Ｆ１９１Ｖ、Ｍ１９４Ｋ、Ｍ１９４Ｌ、Ｍ１９４Ｒ、Ｍ１９４Ｅ、Ｍ１９４Ｎ、Ｍ１９４Ｖ、Ｍ１９４Ｄ、Ｍ１９４Ｉ、Ｍ１９４Ｇ、Ｔ１９９Ｋ、Ｔ１９９Ｑ、Ｔ１９９Ｅ、Ｎ２０９Ｈ、Ｓ２１４Ｃ、Ｓ２１４Ｐ、Ｖ２１９Ｉ、Ｖ２１９Ｌ、Ｉ２２６Ｌ、Ｒ２３５Ｅ、Ｋ２４０Ｄ、Ｋ２４０Ｓ、Ｋ２４０Ｑ、Ｉ２４３Ｆ、Ｄ２４４Ｅ、Ｄ２５２Ｐ、Ｉ２５３Ｖ、Ｑ２６２Ｔ、Ｑ２６２Ａ、Ｑ２６２Ｆ、Ｓ２６６Ａ、Ｍ２７１Ｃ、Ｃ２７２Ｔ、Ｔ２７３Ｓ、Ａ２７５Ｇ、Ｉ２７８Ｖ、Ｉ２８１Ｖ、Ｑ２８７Ｋ、Ｄ２９１Ｇ、Ｗ３０２Ｍ、Ｅ３０７Ｎ、Ｐ３１２Ａ、Ｐ３１２Ｎ、Ｇ３２３Ｄ。または、上記の差異に加えて、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２１、２２、２３、２４、２５、またはそれ以上のアミノ酸残基の挿入または欠失を含む。
【０００９】
より具体的には、いくつかの実施形態では、配列番号２よりも改善された改変トランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００に対応する配列を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００の参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含む。
【００１１】
２つのアミノ酸配列または２つのヌクレオチド配列間の同一性は、当該技術分野で一般的に使用されるアルゴリズムによって得ることができ、ＮＣＢＩ  ＢｌａｓｔｐおよびＢｌａｓｔｎソフトウェアを使用することによって、またはＣｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用することによって、デフォルトパラメータに従って計算することができる（Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２２（２２）：４６７３−４６８０，１９９４）。例えば、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗアルゴリズムを使用すると、配列番号２〜配列番号７２のアミノ酸配列同一性は、８８．２％である。
【００１２】
別の態様では、本発明は、改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を提供する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、改変トランスアミナーゼポリペプチドの発現のための１つ以上の制御配列を有する発現ベクターの一部であり得る。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９に対応する配列を含んでもよい。
【００１３】
当業者に既知であるように、ヌクレオチドコドンの縮重のために、アミノ酸配列の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００をコードするポリヌクレオチド配列は、配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１、１４３、１４５、１４７、１４９、１５１、１５３、１５５、１５７、１５９、１６１、１６３、１６５、１６７、１６９、１７１、１７３、１７５、１７７、１７９、１８１、１８３、１８５、１８７、１８９、１９１、１９３、１９５、１９７、１９９、２０１、２０３、２０５、２０７、２０９、２１１、２１３、２１５、２１７、２１９、２２１、２２３、２２５、２２７、２２９、２３１、２３３、２３５、２３７、２３９、２４１、２４３、２４５、２４７、２４９、２５１、２５３、２５５、２５７、２５９、２６１、２６３、２６５、２６７、２６９、２７１、２７３、２７５、２７７、２７９、２８１、２８３、２８５、２８７、２８９、２９１、２９３、２９５、２９７、２９９、３０１、３０３、３０５、３０７、３０９、３１１、３１３、３１５、３１７、３１９、３２１、３２３、３２５、３２７、３２９、３３１、３３３、３３５、３３７、３３９、３４１、３４３、３４５、３４７、３４９、３５１、３５３、３５５、３５７、３５９、３６１、３６３、３６５、３６７、３６９、３７１、３７３、３７５、３７７、３７９、３８１、３８３、３８５、３８７、３８９、３９１、３９３、３９５、３９７、３９９に限定されない。本発明の改変トランスアミナーゼポリペプチドのポリヌクレオチド配列はまた、アミノ酸配列の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００をコードする任意の他のポリヌクレオチド配列であってもよい。
【００１４】
別の態様では、本開示は、改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードする配列を含むポリヌクレオチド、改変トランスアミナーゼポリペプチドを発現することができる発現ベクターおよび宿主細胞を提供する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌宿主細胞であり得る。宿主細胞は、本明細書に記載の改変トランスアミナーゼを発現および単離するために使用することができるか、または代替的には基質を生成物に変換するための反応に直接使用することもできる。
【００１５】
いくつかの実施形態では、全細胞、粗抽出物、単離酵素、または精製酵素の形態の改変トランスアミナーゼは、単独で、または樹脂への固定化などの固定化された形態で使用することができる。
【００１６】
本開示はまた、本明細書に開示される改変トランスアミナーゼポリペプチドを使用して、式（ＩＩ）のケトン基質を式（Ｉ）のキラルアミン化合物に変換するプロセスも提供し、
【化３】
2021508435.tif 000004
式（Ｉ）のアミン生成物は、＊でマークされたキラル中心に示される、示された立体化学配置を有し、式（Ｉ）のアミン生成物は、他の異性体に対して鏡像体過剰であり、
Ｒ１は、任意選択的に置換もしくは非置換のアリールもしくはヘテロアリール、または任意選択的に置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ８ヒドロカルビル、あるいは
【化４】
2021508435.tif 000005
であり、
Ｒ２は、任意選択的に置換または非置換のＣ１−Ｃ６ヒドロカルビル、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、および−Ｉなど）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒ’または−ＳＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＯＲ’、−ＣＯ２Ｒ’または−ＣＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、ＣＦ３であり、
式中、各Ｒ’は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）ヒドロカルビルから独立して選択され、プロセスは、ケトン基質をアミン生成物に変換する適切な反応条件下で、式（ＩＩ）のケトン基質およびアミン供与体をトランスアミナーゼポリペプチドと接触させることを含み、トランスアミナーゼポリペプチドは、本明細書に記載の改変トランスアミナーゼポリペプチドである。いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し、配列番号２と比較して、より高い変換率で、構造式（ＩＩ）のケトン基質を式（Ｉ）のアミン生成物に変換することができる。
【００１７】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のアミン生成物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の鏡像体過剰で存在する。
【００１８】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のアミン生成物は、以下のものであり、
【化５】
2021508435.tif 000006
式中、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４ヒドロカルビル、−Ｈ、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、および−Ｉなど）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒ’または−ＳＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲＲ’、−ＯＲ’、−ＣＯ２Ｒ’または−ＣＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、ＣＦ３であり、式中、各Ｒ’は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）ヒドロカルビルから独立して選択され、Ｒ３はまた、
【化６】
2021508435.tif 000007
であってもよく、Ｒ２は、上記で定義されるとおりであり、式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化７】
2021508435.tif 000008
【００１９】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環のパラ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環のメタ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してオルトである。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してパラおよびメタの両方である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してパラおよびオルトの両方である。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してメタおよびオルトの両方である。
【００２０】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のアミノ生成物は、以下であり、
【化８】
2021508435.tif 000009
式中、Ｒ４は、上記のＲ３と同じように定義され、Ｒ３およびＲ２は、上記で定義されるとおりであり、式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化９】
2021508435.tif 000010
【００２１】
いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環のメタ位にある。いくつかの実施形態では、Ｒ３は、フェニル環に対してオルトである。
【００２２】
いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、鏡像体過剰の式Ａ２の化合物、Ｒ−ＰＥＡの生成プロセスにおいて使用することができる。
【化１０】
2021508435.tif 000011
【００２３】
これらの実施形態では、生成プロセスは、適切な有機溶媒中、アミン供与体の存在下、式Ａ１の化合物を式Ａ２の化合物に変換するための適切な反応条件下で、式Ａ１の化合物
【化１１】
2021508435.tif 000012
を、本明細書に開示される改変トランスアミナーゼポリペプチドと接触させることを含む。
【００２４】
上記のプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物または式Ａ２の化合物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の鏡像体過剰で存在する。
【００２５】
この方法で使用するための改変トランスアミナーゼポリペプチドの特定の実施形態は、発明を実施するための形態においてさらに提供される。上記のプロセスに使用することができる改変トランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２、３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００に対応するアミノ酸配列から選択される１つ以上の配列を含んでもよい。
【００２６】
本明細書に開示される改変ポリペプチドを使用する式（Ｉ）の化合物または式Ａ２の化合物の調製のためのプロセスはいずれも、アミン供与体、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、補因子負荷、圧力、および反応時間範囲を含むがこれらに限定されない、様々な適切な反応条件下で行うことができる。例えば、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物または式Ａ２の化合物の調製を行うことができ、適切な反応条件は、（ａ）約１ｇ／Ｌ〜２００ｇ／Ｌの基質化合物（例えば、式（ＩＩ）または式Ａ１の化合物）、（ｂ）約０．１ｇ／Ｌ〜５０ｇ／Ｌの改変ポリペプチド、（ｃ）約１０ｇ／Ｌ〜３００ｇ／Ｌのアミン供与体付加、（ｄ）約０．１ｍＭ〜５ｍＭのＰＬＰ補因子、（ｅ）０％（ｖ／ｖ）〜約６０％（ｖ／ｖ）の有機溶媒（ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、酢酸イソプロピル、メタノール、エタノール、またはプロパノールを含むがこれらに限定されない）、（Ｆ）約７．０〜約１１．０のｐＨ、および（ｇ）約１０℃〜約６０℃の温度を含む。
【００２７】
２  詳細
２．１  定義
別途明示的に定義されない限り、本開示で使用される技術用語および科学用語は、当業者によって一般的に理解されている意味を有する。
【００２８】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質化、ミリストイル化、ユビキチン化など）に関係なく、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書で互換的に使用される。この定義は、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸との混合物を含む。
【００２９】
「改変トランスアミナーゼ」、「改変トランスアミナーゼポリペプチド」、「改善されたトランスアミナーゼポリペプチド」、および「改変ポリペプチド」は、本明細書で互換的に使用される。
【００３０】
「細胞」または「湿細胞」は、実施例２および実施例６に示される調製手順で得られる湿細胞を含む、ポリペプチドまたは改変ポリペプチドを発現する宿主細胞を指す。
【００３１】
「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、本明細書で互換的に使用される。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「補因子」は、触媒反応において酵素と組み合わせて機能する非タンパク質化合物を指す。本明細書で使用される場合、「補因子」は、ビタミンＢ６ファミリー化合物ピリドキサール−５’−リン酸（ＰＬＰ）、ピリドキシン（ピリドキソールまたはＰＮ）、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）、ピリドキシンリン酸（ＰＮＰ）、およびピリドキサミンリン酸（ＰＭＰ）を包含することが意図され、これらはまた、補酵素とも称される。
【００３３】
「ピリドキサールリン酸」、「ＰＬＰ」、「ピリドキサール−５’−リン酸」、「ＰＹＰ」、および「Ｐ５Ｐ」は、トランスアミナーゼ反応において補酵素として作用する化合物を指すために本明細書で互換的に使用される。
【００３４】
「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸の一部分（例えば、遺伝子）を指す。
【００３５】
「天然に存在する」または「野生型」は、天然に見られる形態を指す。例えば、天然に存在するかまたは野生型のポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の源から単離することができ、手作業により意図的に修飾されていない、生物に存在する配列である。
【００３６】
例えば、細胞、核酸、またはポリペプチドに関して使用される場合、「組換え」または「改変」または「天然に存在しない」は、さもなければ天然には存在しないであろう様式で修飾されているか、またはそれと同一であるが、合成材料からおよび／もしくは組換え技術を使用する操作によって生成もしくは誘導される、材料または材料の本来もしくは本来の形態に対応する材料を指す。
【００３７】
「配列同一性」および「相同性」は、ポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列間の比較を指すために本明細書で互換的に使用され（「配列同一性」は一般に、パーセンテージとして表される）、比較ウィンドウにわたって最適に整列された２つの配列を比較することによって決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の一部分は、２つの配列の最適な整列のための参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基が両方の配列に出現する位置の数を決定することによって計算してもよいし、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップと整列されて、一致する位置の数を求め、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で除し、その結果に１００を乗じて、配列同一性のパーセンテージを求めてもよい。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを理解するであろう。比較のための配列の最適な整列は、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２の局所相同性アルゴリズムによって、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３の相同性整列アルゴリズムによって、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：２４４４の類似検索法によって、これらアルゴリズムのコンピュータ実装（ＧＣＧ  ＷｉｓｃｏｎｓｉｎパッケージのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または目視検査（一般に、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＦＭ  Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ａ  Ｊｏｉｎｔ  Ｖｅｎｔｕｒｅ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｉｎｃ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，（１９９５Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）（Ａｕｓｕｂｅｌ）を参照されたい）によって実行することができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの例は、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムであり、それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９７７，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３８９−３４０２に記載されている。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを通して公的に入手可能である。このアルゴリズムは、データベース配列内の同じ長さのワードと整列させたときに、ある正の値の閾値スコアＴと一致するかまたはそれを満たす、クエリ配列内の長さＷの短いワードを特定することによって、高スコア配列対（ＨＳＰ）を最初に特定することを伴う。Ｔは、近隣ワードスコア閾値と称される（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、上記参照）。これらの最初の近隣ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すための検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。その後、累積整列スコアを増加させることができる限り、ワードヒットは、各配列に沿って両方向に拡張される。ヌクレオチド配列の場合、累積スコアは、パラメータＭ（一致する残基の対に対するリワードスコア：常に＞０）およびＮ（不一致残基に対するペナルティースコア：常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列の場合、スコアリングマトリックスを使用して、累積スコアが計算される。累積整列スコアがその達成された最大値から量Ｘだけ減少した場合、１つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積によって累積スコアがゼロ以下になる場合、またはいずれかの配列の末端に到達した場合、各方向へのワードヒットの拡張は、中断される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムのパラメータＷ、Ｔ、およびＸは、整列の感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、およびデフォルト値として両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列の場合、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ８９：１０９１５を参照されたい）。配列整列および配列同一性％の例示的な決定は、提供されるデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ，Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
【００３８】
「参照配列」は、配列比較のための基準として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、完全長遺伝子またはポリペプチド配列の断片であってもよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０のヌクレオチド長もしくはアミノ酸残基長、少なくとも２５の残基長、少なくとも５０の残基長、または核酸もしくはポリペプチドの完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは各々、（１）２つの配列間で類似する配列（すなわち、完全な配列の一部分）を含む場合があり、（２）２つの配列間で異なる配列をさらに含む場合があるため、２つ（またはそれ以上）のポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、配列類似性の局所領域を特定および比較することによって行われる。いくつかの実施形態では、「参照配列」は、野生型配列に限定されることは意図されず、改変または変更された配列を含んでもよい。例えば、「配列番号２に基づく、Ｘ４０に対応する残基にスレオニンを有する参照配列」は、セリンである配列番号２のＸ４０位の対応する残基がスレオニンに変更された参照配列を指す。
【００３９】
「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０の連続したヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントを指し、配列を、少なくとも２０の連続したヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較することができ、比較ウィンドウ内の配列の一部分が、２つの配列の最適な整列のための（付加または欠失を含まない）参照配列と比較して、２０％以下の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る。比較ウィンドウは、２０の連続した残基よりも長くてもよく、任意選択的に３０、４０、５０、１００、またはそれ以上の残基を含む。
【００４０】
所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈において、「に対応する」、「に関して」、または「と比較して」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較される場合の、特定の参照の残基の番号付けを指す。換言すると、所与の配列の残基数または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数値的な位置によってではなく、参照配列に対して指定される。例えば、改変トランスアミナーゼなどの所与のアミノ酸配列は、ギャップを導入して、２つの配列間の残基の一致を最適化することによって、参照配列と整列させることができる。これらの場合、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の番号付けは、それらが整列された参照配列に対して行われる。
【００４１】
「アミノ酸の差異」または「残基の差異」は、参照配列の対応する位置におけるアミノ酸残基と比較した、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。アミノ酸の差異の位置は一般に、本明細書では「Ｘｎ」と称され、ｎは、残基の差異が基づいている参照配列内の対応する位置を指す。例えば、「配列番号２と比較したＸ４０位における残基の差異」は、配列番号２の４０位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の差異を指す。したがって、配列番号２の参照ポリペプチドが４０位にセリンを有する場合、「配列番号２と比較したＸ４０位における残基の差異」は、配列番号２の４０位に対応するポリペプチドの位置におけるセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換を指す。本明細書のほとんどの例では、位置における特定のアミノ酸残基の差異は、「ＸｎＹ」として示され、「Ｘｎ」は、前述のように対応する位置を特定し、「Ｙ」は、改変ポリペプチドに見出されるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチドにおけるものとは異なる残基）の一文字識別子である。いくつかの例では（例えば、表１では）、本開示はまた、慣例的な表示法「ＡｎＢ」によって示される特定のアミノ酸の差異も提供し、Ａは、参照配列内の残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列内の残基位置の番号であり、Ｂは、改変ポリペプチドの配列内の残基置換の一文字識別子である。いくつかの例では、本開示の改変ポリペプチドは、参照配列と比較して、１つ以上のアミノ酸残基の差異を含んでもよく、これは、参照配列と比較して、残基の差異が存在する特定の位置の一覧によって示される。いくつかの実施形態では、改変ポリペプチドの特定の残基位置に２つ以上のアミノ酸残基が使用されてもよく、使用され得る様々なアミノ酸残基は、「／」によって分離される（例えば、Ｘ４０Ｔ／Ｘ３９Ｙ）。
【００４２】
「欠失」は、参照ポリペプチドから１つ以上のアミノ酸を除去することによるポリペプチドの修飾を指す。欠失は、改変トランスアミナーゼの酵素活性を保持しながら、かつ／または改変トランスアミナーゼの改善された特性を保持しながら、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、１０個以上のアミノ酸、１５個以上のアミノ酸、または２０個以上のアミノ酸、酵素のアミノ酸の総数の１０％まで、または参照酵素を構成するアミノ酸の総数の２０％までを除去することを含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を伴い得る。様々な実施形態では、欠失は、連続的なセグメントを含んでもよく、不連続的であってもよい。
【００４３】
「挿入」は、参照ポリペプチドから１つ以上のアミノ酸を付加することによるポリペプチドの修飾を指す。いくつかの実施形態では、改善された改変トランスアミナーゼは、天然に存在するトランスアミナーゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入、および他の改変トランスアミナーゼポリペプチドへの１つ以上のアミノ酸の挿入を含む。アミノ酸は、ポリペプチドの内部部分に挿入されてもよく、カルボキシル末端またはアミノ末端に挿入されてもよい。本明細書で使用される場合、挿入は、当該技術分野で既知の融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の連続的なセグメントであってもよく、天然に存在するポリペプチドまたは改変ポリペプチドの１つ以上のアミノ酸によって分離されてもよい。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「断片」は、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が配列内の対応する位置と同一であるポリペプチドを指す。断片は、少なくとも１０アミノ酸長、少なくとも２０アミノ酸長、少なくとも５０アミノ酸長、またはそれ以上、かつ完全長トランスアミナーゼポリペプチドの最大７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、および９９％までであり得る。
【００４５】
「単離されたポリペプチド」は、天然においてそれが関連付けられる他の物質、例えば、タンパク質、脂質、およびポリヌクレオチドなどから実質的に分離されたポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞またはインビトロ合成）から除去または精製されたポリペプチドを含む。改変トランスアミナーゼポリペプチドは、細胞内、細胞培養培地中に存在し得るか、または溶解物または単離された調製物などの様々な形態で調製され得る。そのため、いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであってもよい。
【００４６】
「キラル中心」は、４つの異なる基を接続する炭素原子を指す。
【００４７】
「立体選択性」は、化学反応または酵素反応において、ある立体異性体が他の立体異性体よりも優先的に形成されることを指す。立体選択性は、ある立体異性体の形成が、他の立体異性体よりも優先されて、偏り得るが、１つの立体異性体のみが形成されて、完全であり得る。立体異性体が鏡像異性体である場合、立体選択性は、鏡像選択性と称される。それはしばしば、「鏡像体過剰」（略してｅｅ）として報告される。当該技術分野では、割合（典型的にはパーセンテージ）は一般に、以下の式、［主要鏡像異性体−非主要鏡像異性体］／［主要鏡像異性体＋非主要鏡像異性体］に従って、そこから導き出される鏡像体過剰（すなわち、ｅｅ）として報告される。
【００４８】
「立体異性体」、「立体異性形態」、および類似の表現は、それらの空間での原子の配向の差異のみから生じる全ての異性体を指すために本明細書で互換的に使用される。それには、鏡像異性体、および２つ以上のキラル中心を有し、互いの鏡像ではない化合物（すなわち、ジアステレオマー）が含まれる。
【００４９】
「改善された酵素特性」は、野生型トランスアミナーゼまたは別の改善された改変トランスアミナーゼなどの参照トランスアミナーゼと比較して、特定の目的のためにより良好なまたはより望ましい酵素特性を指す。改善された酵素特性は、本開示の改変トランスアミナーゼポリペプチドによって示される。改善が期待される酵素特性は、酵素活性（基質変換のパーセンテージとして表すことができる）、熱安定性、溶媒安定性、ｐＨ活性特徴、補因子要件、阻害剤に対する耐性（例えば、基質または生成物阻害）、立体特異性、および立体選択性を含むが、これらに限定されない。
【００５０】
「変換」は、基質の対応する生成物への酵素的変換を指す。「変換率」または「変換」は、特定の条件下で一定期間内に生成物に変換される基質のパーセンテージを指す。したがって、トランスアミナーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、基質の生成物への「変換率」として表すことができる。
【００５１】
「熱安定性」は、一定期間（０．５〜２４時間）にわたって昇温（例えば、３０〜６０℃）に曝露された後に類似の活性（例えば、５０％超〜１００％）を保持するトランスアミナーゼポリペプチドを意味する。
【００５２】
「溶媒安定性」は、一定期間（例えば、０．５〜２４時間）にわたって様々な溶媒（エタノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に曝露された後に類似の活性（例えば、５０％超〜１００％）を維持するトランスアミナーゼポリペプチドを指す。
【００５３】
「適切な反応条件」は、本開示のトランスアミナーゼポリペプチドが基質を所望の生成化合物に変換することができる、生体触媒反応系における条件（例えば、酵素負荷、基質負荷、補因子負荷、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒など）を指す。例示的な「適切な反応条件」が、本開示に提供され、実施例によって説明される。
【００５４】
「アミン供与体」は、トランスアミナーゼポリペプチドによって受け入れられ、アミノ基を供給することができる化合物を指す。典型的なアミン供与体には、アラニンなどのアミノ酸、またはイソプロピルアミンなどのアミン化合物が含まれる。
【００５５】
「ヒドロカルビル」は、直鎖または分岐鎖の脂肪族炭化水素鎖を指す。記号「Ｃ」の後の下付きの数字は、特定の鎖が含有し得る炭素原子の数を特定する。例えば、「Ｃ１−Ｃ８」は、１〜８個の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖のヒドロカルビル基を指す。ヒドロカルビル基は、１つ以上の置換基で任意選択的に置換されてもよい。「アリール」は、６〜約２０個の炭素原子の一価の芳香族炭化水素基を意味する。「ヘテロアリール」および「ヘテロ芳香族」は、親芳香族環系の炭素原子の１つ以上がヘテロ原子（Ｏ、Ｎ、またはＳ）で置き換えられているアリール基を指す。「置換された」は、特定の基を修飾するために使用される場合、特定の基の１つ以上の水素原子が各々互いに独立して、同一または異なる置換基によって置き換えられることを意味する。「置換ヒドロカルビル、アリール、またはヘテロアリール」は、１つ以上の水素原子が他の置換基によって置き換えられたヒドロカルビル、アリール、またはヘテロアリール基を指す。「任意選択的な」または「任意選択的に」は、記載の事象または状況が生じても、生じなくてもよいことを意味し、例えば、「任意選択的に置換されたアリール」は、置換されていても、置換されていなくてもよいアリール基を指す。この説明は、置換アリール基および非置換アリール基の両方を含む。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「化合物」は、本明細書で開示される化合物によって示される構造式および／または化学名に包含される任意の化合物を指す。化合物は、それらの化学構造および／または化学名によって特定することができる。化学構造および化学名が矛盾する場合、化学構造が、化合物の同一性を決定する。特に記載されないかまたは別途指示されない限り、本明細書に記載の化学構造は、記載の化合物の全ての可能な異性体形態を包含する。
【００５７】
２．２  改変トランスアミナーゼ
以下の表１は、本発明によって開発された改変トランスアミナーゼポリペプチドを例示する。各行は、特定の改変トランスアミナーゼポリペプチドのポリヌクレオチド配列番号およびアミノ酸配列番号、ならびに配列番号２と比較した残基の差異を示す。例示される各改変トランスアミナーゼポリペプチドの触媒性能のレベル（Ｒ−ＰＥＡの活性、安定性、選択性、および阻害効果を組み合わせた、反応における全体的な性能）を「＋」で示し、その特定の意味を表２に示す。
【表１−１】
2021508435.tif 000013
【表１−２】
2021508435.tif 000014
【表１−３】
2021508435.tif 000015
【表１−４】
2021508435.tif 000016
【表１−５】
2021508435.tif 000017
【表１−６】
2021508435.tif 000018
【表１−７】
2021508435.tif 000019
【表１−８】
2021508435.tif 000020
【表１−９】
2021508435.tif 000021
【表１−１０】
2021508435.tif 000022
【表１−１１】
2021508435.tif 000023
【表１−１２】
2021508435.tif 000024
【表１−１３】
2021508435.tif 000025
【表１−１４】
2021508435.tif 000026
【表１−１５】
2021508435.tif 000027
【表１−１６】
2021508435.tif 000028
【表１−１７】
2021508435.tif 000029
【表２】
2021508435.tif 000030
【００５８】
表１に列挙されるアミノ酸配列（すなわち、配列番号２〜３９６の偶数配列識別子）は各々、３２３個のアミノ酸残基を含有する。配列番号３９８または配列番号４００のアミノ酸配列は、配列番号２と比較して、アミノ酸残基の欠失および置換によって引き起こされる異なる数のアミノ酸を有し、配列番号３９８または配列番号４００によって表される改変トランスアミナーゼポリペプチドは、より良好な触媒性能を示し、その変換は、表２に示される「＋＋＋＋＋」の反応条件下で、配列番号２の変換よりも少なくとも５００倍高い。表２に記載の酵素粉末は、１単位重量当たり等量の改変トランスアミナーゼポリペプチドを含有する。
【００５９】
２．３  改変トランスアミナーゼポリペプチドの生成に使用することができるポリヌクレオチド、制御配列、発現ベクター、および宿主細胞
別の態様では、本開示は、本明細書に記載のトランスアミナーゼ活性を有する改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ポリヌクレオチドは、改変ポリペプチドを発現することができる組換えポリヌクレオチドを生成するように遺伝子発現を制御する１つ以上の異種調節配列に連結することができる。改変トランスアミナーゼをコードする異種ポリヌクレオチドを含む発現構築物を、適切な宿主細胞に導入して、対応する改変トランスアミナーゼポリペプチドを発現させることができる。当業者には明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性、および様々なアミノ酸に対応するコドンの知識により、目的のタンパク質配列をコードする全ての可能なポリヌクレオチドの説明が提供される。同じアミノ酸が選択可能または同義のコドンによってコードされる遺伝暗号の縮重により、極めて多数のポリヌクレオチドの生成が可能になり、その全てが、本明細書に開示される改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードする。したがって、特定のアミノ酸配列を決定すると、当業者は、タンパク質のアミノ酸配列を変更しない様式で単に１つ以上のコドンを修飾するだけで、任意の数の異なるポリヌクレオチドを生成することができる。この点に関して、本開示は、表１に列挙される例示的な改変ポリペプチドのアミノ酸配列を含む本明細書に開示されるポリペプチドのいずれかについて、および参照により組み込まれる配列表の配列番号４〜４００の偶数配列識別子として開示されるポリペプチドのいずれかについて、可能なコドン選択に基づいて組み合わせを選択することによって作製することができる、ポリヌクレオチドのありとあらゆる可能な変更を特に企図しており、それらは全て、具体的に開示または公開されるものと考えられる。
【００６０】
様々な実施形態では、コドンは、好ましくは、組換えタンパク質が産生される宿主細胞に適応するように選択される。例えば、細菌にとって好ましいコドンを使用して、細菌において遺伝子を発現させ、酵母にとって好ましいコドンを使用して、酵母において遺伝子を発現させ、哺乳動物にとって好ましいコドンを使用して、哺乳動物細胞において遺伝子を発現させる。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４〜４００の偶数配列識別子である参照配列と少なくとも約８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードし、ポリペプチドは、トランスアミナーゼ活性、および本明細書に記載の改善された特性（例えば、配列番号２のポリペプチドと比較して、増加した活性で化合物Ａ１を化合物Ａ２に変換する能力）のうちの１つ以上を有する。
【００６２】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、前述の同一性のパーセンテージを有し、かつ配列番号２と比較して、１つ以上のアミノ酸残基の差異を有する、アミノ酸配列を含む改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードする。いくつかの実施形態では、本開示は、トランスアミナーゼ活性を有する改変ポリペプチドを提供し、改変ポリペプチドは、以下の位置、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ９、Ｘ１８、Ｘ１９、Ｘ３１、Ｘ３６、Ｘ４０、Ｘ４１、Ｘ４７、Ｘ５０、Ｘ５３、Ｘ５４、Ｘ５６、Ｘ５９、Ｘ６０、Ｘ６１、Ｘ６２、Ｘ７２、Ｘ７８、Ｘ８６、Ｘ９８、Ｘ１０１、Ｘ１１３、Ｘ１１４、Ｘ１１５、Ｘ１１６、Ｘ１２２、Ｘ１２３、Ｘ１２４、Ｘ１２５、Ｘ１２６、Ｘ１２７、Ｘ１２８、Ｘ１２９、Ｘ１３０、Ｘ１４１、Ｘ１４３、Ｘ１４８、Ｘ１５３、Ｘ１５５、Ｘ１５６、Ｘ１５９、Ｘ１６２、Ｘ１６７、Ｘ１７３、Ｘ１７４、Ｘ１７５、Ｘ１８１、Ｘ１８２、Ｘ１８６、Ｘ１８７、Ｘ１８８、Ｘ１９０、Ｘ１９１、Ｘ１９４、Ｘ１９９、Ｘ２０９、Ｘ２１４、Ｘ２１９、Ｘ２２６、Ｘ２３５、Ｘ２４０、Ｘ２４３、Ｘ２４４、Ｘ２５２、Ｘ２５３、Ｘ２６２、Ｘ２６６、Ｘ２７１、Ｘ２７２、Ｘ２７３、Ｘ２７５、Ｘ２７８、Ｘ２８１、Ｘ２８７、Ｘ２９１、Ｘ３０２、Ｘ３０７、Ｘ３１２、Ｘ３２３から選択される残基の差異を有する配列番号２の参照配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する組み合わせを含む。
【００６３】
いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号３〜３９９の奇数配列識別子を有する配列を含む。
【００６４】
いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載のポリペプチドをコードするが、ヌクレオチドレベルでは、ポリヌクレオチドは、本明細書に記載の改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードする参照ポリヌクレオチドと約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、参照ポリヌクレオチドは、配列番号３〜３９９の奇数配列識別子を有する配列から選択される。
【００６５】
様々な様式で改変ポリペプチドの発現を可能にするように、改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドを操作することができ、これは、発現を改善するためのコドン最適化による配列のさらなる修飾、追加の制御配列を伴うまたは伴わない適切な発現要素への挿入、ならびに改変ポリペプチドの発現および産生に適した宿主細胞への形質転換を含む。
【００６６】
発現ベクターに応じて、単離されたポリヌクレオチドをベクターに挿入する前に、単離されたポリヌクレオチドを操作することが望ましいか、または必要な場合がある。組換えＤＮＡ法を使用して、ポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技術は、当該技術分野で周知である。ガイダンスは、以下、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ、およびＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ａｕｓｕｂｅｌ．Ｆ．ｅｔ  ａｌ．，ＩＳＢＮ：９７８−０−４７１−５０３３８−５に提供される。
【００６７】
別の態様では、本開示はまた、導入される宿主の種類に応じて、改変トランスアミナーゼポリペプチドまたはその変異体をコードするポリヌクレオチド、ならびにプロモーターおよびターミネーターなどの１つ以上の発現調節領域、複製起点などを含む、組換え発現ベクターにも関する。代替として、本開示の核酸配列は、核酸配列または該配列を含む核酸構築物を適切な発現ベクターに挿入することによって発現させることもできる。発現ベクターの生成において、コード配列は、コード配列が発現に適した制御配列に連結されるようにベクター内に位置する。
【００６８】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に便利に使用することができ、かつポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意のベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は一般に、ベクターと導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線状プラスミドまたは閉環状プラスミドであり得る。発現ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体の複製とは無関係である、染色体外実体として存在するベクターであってもよく、例えば、プラスミド、染色体外要素、ミニ染色体、または人工染色体である。ベクターは、自己複製を保証するためのツールを含有し得る。代替として、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体とともに複製するベクターであってもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入される全ＤＮＡを一緒に含む、単一のベクターもしくはプラスミドまたは２つ以上のベクターもしくはプラスミドが使用されてもよい。
【００６９】
本開示の実施形態に有用な多くの発現ベクターが市販されている。例示的な発現ベクターは、改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをプラスミドｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１（Ｎｏｖａｇｅｎ）に挿入することによって調製することができる。
【００７０】
別の態様では、本開示は、本開示の改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供する。ポリヌクレオチドは、宿主細胞内でのトランスアミナーゼポリペプチドの発現のための１つ以上の制御配列に連結される。本開示の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現のための宿主細胞は、当該技術分野で周知であり、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ  ＫＮＫ１６８、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞などの細菌細胞；酵母細胞などの真菌細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）；ショウジョウバエＳ２およびスポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３、およびＢｏｗｅｓメラノーマ細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞を含むが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）である。上記の宿主細胞は、野生型であっても、宿主細胞のゲノム中に保有される野生型トランスアミナーゼ遺伝子のノックアウトなどのゲノム編集による改変細胞であってもよい。上記の宿主細胞に適した培地および増殖条件は、当該技術分野で周知である。
【００７１】
改変トランスアミナーゼの発現に使用されるポリヌクレオチドは、当該技術分野で既知の様々な方法によって細胞に導入され得る。技術は、とりわけ、電気穿孔、生体粒子衝突、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合を含む。ポリヌクレオチドを細胞に導入する異なる方法は、当業者には明らかである。
【００７２】
２．４  改変トランスアミナーゼポリペプチドを生成するプロセス
改変トランスアミナーゼは、トランスアミナーゼをコードするポリヌクレオチドを突然変異誘発および／または定向進化に供することによって開発することができる。定向進化技術の説明は、「Ｂｉｏｃａｔａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，ａｎｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ」（２００９Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  Ａｓｉａ（Ｐｔｅ）Ｌｔｄ．ＩＳＢＮ：９７８−０−４７０−８２３１４−９）に見出すことができる。
【００７３】
改変ポリペプチドの配列が既知である場合、コード化ポリヌクレオチドは、既知の合成方法に従って標準的な固相法によって調製することができる。いくつかの実施形態では、約１００塩基までの断片を別個に合成し、その後（例えば、酵素的もしくは化学的連結法またはポリメラーゼ媒介法により）連結して、任意の所望の連続した配列を形成することができる。例えば、本開示のポリヌクレオチドおよびオリゴヌクレオチドは、自動合成法において典型的に実践されるように、例えば、Ｂｅａｕｃａｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９８１，Ｔｅｔ  Ｌｅｔｔ２２：１８５９−６９またはＭａｔｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｏｐｌｅ，１９８４，ＥＭＢＯＪ．３：８０１−０５に記載の古典的なホスホルアミダイト法を使用する化学合成によって調製することができる。ホスホルアミダイト法によれば、オリゴヌクレオチドは、合成され、精製され、アニーリングされ、連結され、例えば、自動ＤＮＡ合成機において、適切なベクターにクローニングされる。加えて、本質的にあらゆる核酸が、様々な商業的供給源のいずれかから入手可能である。
【００７４】
いくつかの実施形態では、本開示はまた、改変トランスアミナーゼポリペプチドを調製または生成するプロセスも提供し、このプロセスは、ポリペプチドの発現に適した培養条件下で、改変ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を培養することを含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチドを調製するプロセスは、ポリペプチドを単離することをさらに含む。改変ポリペプチドは、適切な細胞内で発現させて、タンパク質精製のための周知の技術のいずれか１つ以上を使用して宿主細胞および／または培養培地から単離（または回収）することができ、タンパク質精製のための技術は、とりわけ、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離、およびクロマトグラフィーを含む。
【００７５】
２．５  改変トランスアミナーゼおよびそれを用いて調製される化合物を使用する方法
別の態様では、本明細書に記載の改変トランスアミナーゼポリペプチドは、アミン供与体の存在下で、ケトン化合物をキラルアミン化合物に変換することができる。本開示はまた、本明細書に開示される改変トランスアミナーゼポリペプチドを使用して、広範囲の化合物（Ｉ）またはそれらの構造類似体を調製するプロセスも提供する。いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、式（Ｉ）の化合物を調製するプロセスに使用することができる。
【化１２】
2021508435.tif 000031
【００７６】
式（Ｉ）のアミン生成物は、＊でマークされたキラル中心に示された立体化学配置を有し、式（Ｉ）のアミン生成物は、他の異性体に対して鏡像体過剰であり、式中、
Ｒ１は、任意選択的に置換もしくは非置換のアリールもしくはヘテロアリール、または任意選択的に置換もしくは非置換のＣ１−Ｃ８ヒドロカルビルであり、あるいはそれは、
【化１３】
2021508435.tif 000032
であってもよく、
Ｒ２は、任意選択的に置換または非置換のＣ１−Ｃ６ヒドロカルビル、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、および−Ｉなど）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒ’または−ＳＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＯＲ’、−ＣＯ２Ｒ’または−ＣＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、ＣＦ３であり、式中、各Ｒ’は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）ヒドロカルビルから独立して選択される。本明細書のプロセスは、ケトン基質をアミン生成物に変換するのに適した反応条件下で、式（ＩＩ）のケトン基質、
【化１４】
2021508435.tif 000033
およびアミン供与体を、トランスアミナーゼポリペプチドと接触させることを含み、トランスアミナーゼポリペプチドは、本明細書に記載の改変トランスアミナーゼポリペプチドである。
【００７７】
いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有し、配列番号２よりも高い変換で式（ＩＩ）の化合物を式（Ｉ）の化合物に変換することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の鏡像体過剰で存在する。
【００７９】
上記のように、本開示のプロセスにおいて有用なトランスアミナーゼポリペプチドは、アセトフェノンをＲ−ＰＥＡに変換する能力によって特徴付けることができる。したがって、本明細書に開示されるプロセスの実施形態のいずれにおいても、このプロセスを実行することができ、トランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号２よりも良好な触媒性能でアセトフェノンをＲ−ＰＥＡに変換することができ、配列番号２と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の配列同一性を有する。
【００８０】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化１５】
2021508435.tif 000034
式中、Ｒ３は、Ｃ１−Ｃ４ヒドロカルビル、−Ｈ、ハロゲン（−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、および−Ｉなど）、−ＮＯ２、−ＮＯ、−ＳＯ２Ｒ’または−ＳＯＲ’、−ＳＲ’、−ＮＲ’Ｒ’、−ＯＲ’、−ＣＯ２Ｒ’または−ＣＯＲ’、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’、−ＳＯ２ＮＨ２または−ＳＯＮＨ２、−ＣＮ、ＣＦ３であり、各Ｒ’は、−Ｈまたは（Ｃ１−Ｃ４）ヒドロカルビルから独立して選択され、
Ｒ３はまた、
【化１６】
2021508435.tif 000035
であってもよく、Ｒ２は、上記で定義されるとおりであり、式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化１７】
2021508435.tif 000036
【００８１】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化１８】
2021508435.tif 000037
式中、Ｒ４は、上記で定義されるようにＲ３であり、Ｒ３およびＲ２は、上記で定義されるとおりであり、そして式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化１９】
2021508435.tif 000038
【００８２】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化２０】
2021508435.tif 000039
式中、Ｒ３は、上記で定義されるとおりであり、式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化２１】
2021508435.tif 000040
【００８３】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化２２】
2021508435.tif 000041
式中、Ｒ３は、上記で定義されるとおりであり、式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化２３】
2021508435.tif 000042
【００８４】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化２４】
2021508435.tif 000043
式中、Ｒ３は、上記で定義されるとおりであり、式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化２５】
2021508435.tif 000044
【００８５】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化２６】
2021508435.tif 000045
式中、Ｒ３は、上記で定義されるとおりであり、式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化２７】
2021508435.tif 000046
【００８６】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化２８】
2021508435.tif 000047
式中、Ｒ３は、上記で定義されるとおりであり、式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化２９】
2021508435.tif 000048
【００８７】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化３０】
2021508435.tif 000049
式中、Ｒ３は、上記で定義されるとおりであり、式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化３１】
2021508435.tif 000050
【００８８】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化３２】
2021508435.tif 000051
式中、Ｒ２およびＲ３は、上記で定義されるとおりであり、構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化３３】
2021508435.tif 000052
【００８９】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化３４】
2021508435.tif 000053
式中、Ｒ２は、上記で定義されるとおりであり、式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化３５】
2021508435.tif 000054
【００９０】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化３６】
2021508435.tif 000055
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化３７】
2021508435.tif 000056
【００９１】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化３８】
2021508435.tif 000057
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化３９】
2021508435.tif 000058
【００９２】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化４０】
2021508435.tif 000059
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化４１】
2021508435.tif 000060
【００９３】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化４２】
2021508435.tif 000061
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化４３】
2021508435.tif 000062
【００９４】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化４４】
2021508435.tif 000063
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化４５】
2021508435.tif 000064
【００９５】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化４６】
2021508435.tif 000065
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化４７】
2021508435.tif 000066
【００９６】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化４８】
2021508435.tif 000067
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化４９】
2021508435.tif 000068
【００９７】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化５０】
2021508435.tif 000069
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化５１】
2021508435.tif 000070
【００９８】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化５２】
2021508435.tif 000071
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化５３】
2021508435.tif 000072
【００９９】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化５４】
2021508435.tif 000073
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化５５】
2021508435.tif 000074
【０１００】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化５６】
2021508435.tif 000075
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化５７】
2021508435.tif 000076
【０１０１】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化５８】
2021508435.tif 000077
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化５９】
2021508435.tif 000078
【０１０２】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化６０】
2021508435.tif 000079
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化６１】
2021508435.tif 000080
【０１０３】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化６２】
2021508435.tif 000081
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化６３】
2021508435.tif 000082
【０１０４】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化６４】
2021508435.tif 000083
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化６５】
2021508435.tif 000084
【０１０５】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化６６】
2021508435.tif 000085
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化６７】
2021508435.tif 000086
【０１０６】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化６８】
2021508435.tif 000087
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化６９】
2021508435.tif 000088
【０１０７】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化７０】
2021508435.tif 000089
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化７１】
2021508435.tif 000090
【０１０８】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化７２】
2021508435.tif 000091
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化７３】
2021508435.tif 000092
【０１０９】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化７４】
2021508435.tif 000093
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化７５】
2021508435.tif 000094
【０１１０】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化７６】
2021508435.tif 000095
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化７７】
2021508435.tif 000096
【０１１１】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化７８】
2021508435.tif 000097
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化７９】
2021508435.tif 000098
【０１１２】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化８０】
2021508435.tif 000099
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化８１】
2021508435.tif 000100
【０１１３】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化８２】
2021508435.tif 000101
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化８３】
2021508435.tif 000102
【０１１４】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化８４】
2021508435.tif 000103
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化８５】
2021508435.tif 000104
【０１１５】
このプロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）のキラルアミン生成物は、以下であり、
【化８６】
2021508435.tif 000105
構造式（ＩＩ）のケトン基質は、以下である。
【化８７】
2021508435.tif 000106
【０１１６】
いくつかの実施形態では、上記のプロセスで生成される式（Ｉ）のアミン生成物は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、もしくは９９％、またはそれ以上の鏡像体過剰で存在する。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、鏡像体過剰の式Ａ２の化合物、Ｒ−ＰＥＡを調製するプロセスにおいて使用することができる。
【化８８】
2021508435.tif 000107
【０１１８】
これらの実施形態では、プロセスは、アミン供与体の存在下、適切な反応条件下で、式Ａ１の化合物
【化８９】
2021508435.tif 000108
を、本明細書に開示される改変トランスアミナーゼポリペプチドと接触させることを含む。
【０１１９】
上記プロセスのいくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物または式Ａ２の化合物は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の鏡像体過剰で生成される。
【０１２０】
上記のプロセスで使用するための改変トランスアミナーゼポリペプチドの特定の実施形態は、発明を実施するための形態においてさらに提供される。上記のプロセスにおいて使用することができる改変トランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２  ３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２１】
本明細書に記載され、実施例に例示されるように、本開示は、ｐＨ、温度、緩衝液、溶媒系、基質負荷、ポリペプチド負荷、および反応時間を含むがこれらに限定されない、本明細書のプロセスに使用され得る様々な適切な反応条件を企図する。本明細書に記載の改変トランスアミナーゼポリペプチドを使用して、基質化合物を生成化合物に生体触媒的に変換する方法を行うための追加の適切な反応条件は、改変トランスアミナーゼポリペプチドを、反応物質の様々な濃度、ｐＨ、温度、溶媒条件の実験反応条件下で、基質化合物と接触させることを含むがこれらに限定されない、ルーチン実験によって容易に最適化することができ、生成化合物は、例えば、本明細書に提供される実施例に記載の方法を使用して検出される。
【０１２２】
前述のように、本開示のプロセスに使用するためのトランスアミナーゼ活性を有する改変ポリペプチドは一般に、配列番号４〜４００の偶数配列のいずれか１つから選択される参照アミノ酸配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２３】
反応混合物中の基質化合物の負荷は、例えば、所望の生成化合物の量、酵素活性に対する基質濃度の影響、反応条件下での酵素の安定性、および基質から生成物への変換率を考慮に入れて、変動し得る。このプロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも０．５ｇ／Ｌ、少なくとも約１ｇ／Ｌ、少なくとも約５ｇ／Ｌ、少なくとも約１０ｇ／Ｌ、少なくとも約１５ｇ／Ｌ、少なくとも約２０ｇ／Ｌ、少なくとも約１００ｇ／Ｌ、少なくとも約１５０ｇ／Ｌ、少なくとも約２００ｇ／Ｌ、少なくとも約２５０ｇ／Ｌ、少なくとも約３００ｇ／Ｌ、少なくとも約３５０ｇ／Ｌ、少なくとも約４００ｇ／Ｌ、またはさらにはそれ以上の基質（ＩＩ）もしくは基質Ａ１の負荷を含む。本明細書に提供される基質負荷の値は、化合物（ＩＩ）またはＡ１の分子量に基づいているが、化合物（ＩＩ）またはＡ１の等モル量の様々な水和物および塩もプロセスに使用され得ることも企図される。
【０１２４】
本明細書に記載のプロセスでは、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、ケトン基質およびアミン供与体からのキラルアミン生成物の形成を触媒する。いくつかの実施形態では、反応条件におけるアミン供与体には、アラニン、イソプロピルアミン（２−アミノプロパンとしても知られる）、フェニルアラニン、グルタミン、ロイシン、もしくは３−アミノ酪酸から選択されるアミノ酸化合物、またはメチルベンジルアミンなどのキラルもしくはアキラルアミンが含まれ、アミン供与体はまた、実施形態で使用される塩（例えば、アラニン塩酸塩、アラニン酢酸塩、イソプロピルアミン塩酸塩、イソプロピルアミン酢酸塩など）の形態であってもよい。いくつかの実施形態では、アミン供与体は、イソプロピルアミンである。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、ケトン基質の負荷の少なくとも１モル当量の負荷で存在する、アミン供与体、特にイソプロピルアミンを含む。いくつかの実施形態では、イソプロピルアミンは、約０．１Ｍ〜約４．０Ｍ以上の負荷で存在する。
【０１２５】
スキーム１またはスキーム２に示されるように、トランスアミナーゼ触媒反応は、可逆的であり、いくつかの実施形態では、開示される改変トランスアミナーゼポリペプチドはまた、式（Ｉ）または式Ａ２のキラルアミン化合物を、それぞれ式（ＩＩ）または式Ａ１の化合物に変換することもできる。
【０１２６】
この反応のいくつかの実施形態では、反応条件は、適切なｐＨを含み得る。上記のように、酸もしくは塩基、適切な緩衝液、または緩衝液と添加される酸もしくは塩基との組み合わせを使用することによって、所望のｐＨまたは所望のｐＨ範囲を維持することができる。反応混合物のｐＨは、反応前および／または反応中に制御することができる。いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約７〜約１１の溶液ｐＨを含む。いくつかの実施形態では、反応条件は、約７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、または１１の溶液ｐＨを含む。
【０１２７】
本明細書のプロセスの実施形態では、例えば、より高い温度での反応速度の増加、および十分な反応期間における酵素の活性を考慮に入れて、反応条件に適切な温度を使用することができる。したがって、いくつかの実施形態では、適切な反応条件は、約１０℃〜約６０℃、約２５℃〜約５０℃、約２５℃〜約４０℃、または約２５℃〜約３０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、適切な反応温度は、約２５℃、３０℃、３５℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、または６０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度は、反応全体を通して特定の温度に維持され得る。いくつかの実施形態では、酵素反応中の温度は、反応過程における温度プロファイルにわたって調整され得る。
【０１２８】
改変トランスアミナーゼを使用するプロセスは一般に、溶媒中で実行される。適切な溶媒は、水、水性緩衝液、有機溶媒、ならびに／または一般に水性溶媒および有機溶媒を含む共溶媒系を含む。水溶液（水または水性共溶媒系）は、ｐＨ緩衝化または非緩衝化され得る。いくつかの実施形態では、改変トランスアミナーゼポリペプチドを使用するプロセスは一般に、有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、酢酸イソプロピル、酢酸エチル、酢酸ブチル、１−オクタノール、ヘプタン、オクタン、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテル（ＭＴＢＥ）、トルエンなど）、イオン液（例えば、１−エチル４−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムテトラフルオロボレート、および１−ブチル−３−メチルイミダゾリウムヘキサフルオロリン酸など）を含む水性共溶媒系で実行される。水性共溶媒系の有機溶媒成分は、水性成分と混和性であり、単一の液相を提供してもよく、水性成分と部分的に混和性または非混和性であり、２つの液相を提供してもよい。例示的な水性共溶媒系は、水および１つ以上の有機溶媒を含む。一般に、水性共溶媒系の有機溶媒成分は、トランスアミナーゼを完全に不活性化しないように選択される。適切な共溶媒系は、本明細書に記載のものなどの酵素活性アッセイを利用して、候補溶媒系において定義された目的の基質を用いて特定の改変トランスアミナーゼの酵素活性を測定することによって、容易に特定することができる。プロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、総反応体積の約１％〜ほぼ１００％（ｖ／ｖ）、約１％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約２％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約５％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約１０％〜約６０％（ｖ／ｖ）、約１０％〜約５０％（ｖ／ｖ）、または約１０％〜約４０％（ｖ／ｖ）の濃度のＤＭＳＯを含む水性共溶媒を含む。このプロセスのいくつかの実施形態では、適切な反応条件は、少なくとも約１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、または６０％（ｖ／ｖ）の濃度のＤＭＳＯを含む水性共溶媒を含む。
【０１２９】
適切な反応条件は、基質化合物のその対応する生成化合物への生体触媒変換を可能にする反応パラメータの組み合わせを含み得る。したがって、このプロセスのいくつかの実施形態では、反応パラメータの組み合わせは、（ａ）約１０ｇ／Ｌ〜約２００ｇ／Ｌの基質負荷、（ｂ）約１ｇ／Ｌ〜約５０ｇ／Ｌの改変ポリペプチド濃度、（ｃ）約７．０〜１１．０のｐＨ、および（ｄ）約１０℃〜６０℃の温度を含む。いくつかの実施形態では、上記のプロセスは、約１Ｍ〜約２Ｍのイソプロピルアミンの存在下、約１０％〜約４０％のＤＭＳＯとともに、約３０℃〜約５０℃の温度、７．０〜１０．０のｐＨで、１０ｇ／Ｌ以上の負荷でのケトン基質を、本明細書に記載の５ｇ／Ｌ以上の改変トランスアミナーゼポリペプチドと接触させることを含む一方で、ケトン基質の少なくとも７０％、８０％、９０％、またはそれ以上が、キラルアミン生成物に変換され、キラルアミン生成物は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上の鏡像体過剰で生成される。いくつかの実施形態では、商業的な反応を行うことができるトランスアミナーゼポリペプチドは、配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２、１４４、１４６、１４８、１５０、１５２、１５４、１５６、１５８、１６０、１６２、１６４、１６６、１６８、１７０、１７２、１７４、１７６、１７８、１８０、１８２、１８４、１８６、１８８、１９０、１９２、１９４、１９６、１９８、２００、２０２、２０４、２０６、２０８、２１０、２１２、２１４、２１６、２１８、２２０、２２２、２２４、２２６、２２８、２３０、２３２、２３４、２３６、２３８、２４０、２４２、２４４、２４６、２４８、２５０、２５２、２５４、２５６、２５８、２６０、２６２、２６４、２６６、２６８、２７０、２７２、２７４、２７６、２７８、２８０、２８２、２８４、２８６、２８８、２９０、２９２、２９４、２９６、２９８、３００、３０２、３０４、３０６、３０８、３１０、３１２、３１４、３１６、３１８、３２０、３２２  ３２４、３２６、３２８、３３０、３３２、３３４、３３６、３３８、３４０、３４２、３４４、３４６、３４８、３５０、３５２、３５４、３５６、３５８、３６０、３６２、３６４、３６６、３６８、３７０、３７２、３７４、３７６、３７８、３８０、３８２、３８４、３８６、３８８、３９０、３９２、３９４、３９６、３９８、４００から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１３０】
例示的な反応条件は、表２および実施例７に提供される条件を含む。
【０１３１】
本明細書に記載の反応を実行する際、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、部分的に精製されたもしくは精製された形態で、改変トランスアミナーゼポリペプチドをコードする遺伝子で形質転換された全細胞、ならびに／またはそのような細胞の細胞抽出物および／もしくは溶解物として、反応混合物に添加されてもよい。改変トランスアミナーゼまたは細胞抽出物、その溶解物、および単離された酵素をコードする遺伝子で形質転換された全細胞は、固体（例えば、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥など）または半固体（例えば、湿細胞の粗ペースト）を含む多種多様な異なる形態で使用することができる。細胞抽出物または細胞溶解物は、凍結乾燥の前に、沈殿（例えば、硫酸アンモニウム、ポリエチレンイミン、または熱処理など）、続いて脱塩手順（例えば、限外濾過および透析など）によって部分的に精製することができる。酵素調製物のいずれも、グルタルアルデヒドなどの既知の架橋剤を使用する架橋、または固相材料（樹脂など）への固定化によって安定化させることができる。
【０１３２】
本明細書に記載の反応のいくつかの実施形態では、反応は、本明細書に記載の適切な反応条件下で行われ、改変トランスアミナーゼポリペプチドは、固体支持体に固定化される。反応を実行するために改変トランスアミナーゼ酵素を固定化するのに有用な固体支持体は、エポキシ官能基を有するポリメタクリレート、アミノエポキシ官能基を有するポリメタクリレート、ポリメタクリレート、スチレン／ＤＶＢコポリマー、またはオクタデシル官能基を有するポリメタクリレートなどのビーズまたは樹脂を含むが、これらに限定されない。例示的な固体支持体は、キトサンビーズ、Ｅｕｐｅｒｇｉｔ  Ｃ、ならびにＳＥＰＡＢＥＡＤの以下の異なる種類、ＥＣ−ＥＰ、ＥＣ−ＨＦＡ／Ｓ、ＥＸＡ２５２、ＥＸＥ１１９およびＥＸＥ１２０を含む、ＳＥＰＡＢＥＡＤ（Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ）を含むが、これらに限定されない。
【０１３３】
改変ポリペプチドが分泌ポリペプチドの形態で発現されるいくつかの実施形態では、分泌ポリペプチドを含有する培養培地を、本明細書のプロセスに使用することができる。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、固体反応物（例えば、酵素、塩など）は、粉末（例えば、凍結乾燥、噴霧乾燥など）、溶液、乳液、および懸濁液などを含む様々な異なる形態で反応に提供されてもよい。反応物は、当業者に既知の方法および機器を使用して、容易に凍結乾燥または噴霧乾燥することができる。例えば、タンパク質溶液の少量のアリコートを−８０℃で凍結し、その後予備冷却した凍結乾燥チャンバに添加し、続いて真空を適用してもよい。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、反応物の添加の順序は、重要ではない。反応物は、同時に溶媒に同時に添加されてもよいか（例えば、単相溶媒、二相水性共溶媒系など）、または代替として、いくつかの反応物が、別個に添加されてもよく、いくつかが、異なる時点で添加されてもよい。例えば、トランスアミナーゼおよび基質は、最初に溶媒に添加されてもよく、その後有機溶媒が添加され、混合されてもよい。代替として、水相への添加前に、基質を有機溶媒中で予備混合することもできる。
【０１３６】
本開示の異なる特徴および実施形態が、以下の代表的な実施例において例示され、これらは、例示的であり、限定的ではないことが意図される。
【実施例】
【０１３７】
以下の実施例は本発明をさらに例示するが、本発明はそれに限定されない。以下の実施例では、条件が特定されていない実験方法は、一般的に使用される条件で、または供給業者の提案に従って実行された。
【０１３８】
実施例１：遺伝子クローニングおよび発現ベクターの構築
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓに由来する野生型トランスアミナーゼのアミノ酸配列は、ＮＣＢＩから取得することができ、その後対応する核酸を、供給業者が当該技術分野における従来の技術を使用して合成し、発現ベクターｐＡＣＹＣ−Ｄｕｅｔ−１にクローニングした。組換え発現プラスミドを、４２℃および９０秒間の熱ショックの条件下で、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換した。形質転換物を、クロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレート上に播種し、その後３７℃で一晩インキュベートした。組換え形質転換体を得た。
【０１３９】
実施例２：振盪フラスコを使用するトランスアミナーゼポリペプチドの発現
実施例１で得た組換えＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）形質転換体を、２５０ｍＬの三角フラスコ内のクロラムフェニコールを含有する５０ｍＬのＬＢ培地（ペプトン１０ｇ／Ｌ、酵母抽出物粉末５ｇ／Ｌ、塩素化ナトリウム１０ｇ／Ｌ、ｐＨ７．０±０．２、２５℃）に播種し、その後振盪インキュベーター内で、３０℃、２５０ｒｐｍで一晩培養した。この一晩培養物のＯＤ６００が２に到達したとき、それを、２５０ｍＬのＴＢ培地（トリプトン１２ｇ／Ｌ、酵母エキス２４ｇ／Ｌ、リン酸水素二ナトリウム９．４ｇ／Ｌ、リン酸水素二カリウム２．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．２±０．２、３０℃）を含有する１．０Ｌのフラスコ内で、５％（ｖ／ｖ）の播種量で継代培養した。ラクトースを、６ｇ／Ｌの最終濃度でＴＢ培地に添加して、発現を誘導し、この発現培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍの振盪インキュベーター内に一晩入れた。約２０時間後、発現培養物を遠心分離し、遠心分離後に湿細胞を収集し、ＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で２回洗浄し、その後使用するまで−２０℃で保存することができる。細胞を破壊するために、得られた湿細胞を５０ｍＬのＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で再懸濁し、懸濁液を氷浴に入れ、５分間超音波処理した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３Ｒ遠心分離機を使用して、４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって、得られた細胞溶解物を清澄化した。清澄化した細胞溶解物を、−２０℃で凍結し、酵素粉末へと凍結乾燥した。得られたトランスアミナーゼ酵素粉末は、使用するまで−２０℃で保存することができる。
【０１４０】
実施例３：トランスアミナーゼ変異体ライブラリーの構築
ここでは、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅキット（供給業者：Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用した。突然変異誘発プライマーの配列設計は、キットの指示に従って行った。部位飽和変異誘発ライブラリーの構築は、以下のとおりである。ＰＣＲ反応は、１０μｌの５×緩衝液、１μｌの１０ｍＭのｄＮＴＰ、１μｌのプラスミドＤＮＡテンプレート（５０ｎｇ／μｌ）、各々０．７５μｌ（１０ｕＭ）の上流および下流プライマー、０．５μｌの高忠実度酵素、ならびに３６μｌのｄｄＨ２Ｏからなり、ＰＣＲプライマーは、変異位置にＮＮＫコドンを有する。
【０１４１】
ＰＣＲ増幅ステップ：（１）９８℃で３分間の前変性、（２）９８℃で１０秒間の変性、（３）７２℃で３分間のアニーリングおよび伸長、（２）〜（３）のステップを２５回繰り返し、（５）７２℃で１０分間の伸長、（６）４℃まで冷却し、２μｌのＤｐｎＩをＰＣＲ生成物に添加し、３７℃で一晩消化させることによってプラスミドテンプレートを除去した。消化されたＰＣＲ生成物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテント細胞に形質転換し、クロラムフェニコールを含有するＬＢ寒天プレートに播種して、部位飽和変異誘発ライブラリーを得た。
【０１４２】
実施例４：トランスアミナーゼ変異体ライブラリーの高処理スクリーニング
トランスアミナーゼ変異体ライブラリーの発現を、振盪フラスコ内で発現条件を小型化することによって９６ウェルプレートで行い（フラスコから９６ウェルプレートに培養規模を比例的に減少させた）、特定の操作手順は、以下のとおりであった。酵素変異体ライブラリーの単一クローンを、ＬＢ寒天プレートから取り出し、９６ウェルの浅型プレートの２００μＬ／ウェルのＬＢ培地（クロラムフェニコールを含有）に播種し、１８０ｒｐｍの振盪機内、３０℃および８０％の湿度で１８〜２０時間一晩培養した。浅型プレート培養物のＯＤ６００が約２．０である場合、この培養物を２０μＬ取って、９６ウェルの深型ウェルプレートの新鮮な４００μＬ／ウェルのＴＢ培地（クロラムフェニコールを含有）を播種し、２５０ｒｐｍの振盪機内、３０℃および８０％の湿度で培養した。深型ウェル培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８に到達したとき、ＩＰＴＧを１ｍＭの最終濃度で添加して、発現を誘導し、３０℃で１８〜２０時間一晩発現させた。最後に、発現培養物を４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離して、９６ウェルプレートに湿細胞を収集し、これは使用するまで−２０℃で保存することができる。
【０１４３】
酵素変異体ライブラリーのスクリーニングアッセイは、アセトフェノンをＲ−ＰＥＡに変換するトランスアミナーゼ反応に基づいており、これは、以下のように示される。
上記で得られた湿細胞を含有する９６ウェルプレートに、２００μＬ／ウェルの細胞溶解緩衝液を添加し、プレートを密封し、７００ｒｐｍのプレート振盪機に１時間入れて、細胞を破壊し、その後４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。細胞溶解物の上清を収集した。反応緩衝液［０．４ｍＭのＰＬＰ、６ＭのＩＰＭ、０．１ＭのＴＥＯＡ、ｐＨ９．０（２５℃）］の原液を調製し、これを、液体ハンドラーを使用して、５０μＬ／ウェルで新鮮なアッセイプレート（９６深型ウェルプレート）に移し、メタノール中、アセトフェノンの原液を調製し、これを、５０μＬ／ウェルでアッセイプレートに移し、最後に、上記で得られた細胞溶解物の上清を、１００μＬ／ウェルでアッセイプレートに移し、これにより、総反応体積は、約２００μＬ／ウェルであり、最終反応設定は、約［０．１ｍＭのＰＬＰ、１．５ＭのＩＰＭ、５０ｇ／Ｌのアセトフェノン、２５％ｖ／ｖのメソナール］である。アッセイプレートを、アルミニウムフィルムで熱融着し、振盪機に入れ、３０℃、２００ｒｐｍで２０時間反応させた。反応後、４００μＬのＡＣＮ（アセトニトリル）をアッセイプレートの各ウェルに添加して、反応を停止させた（８００ｒｐｍで１時間振盪）。反応停止後、ＨＰＬＣ分析のために反応物から試料を採取し、各ウェルの変換を測定した。
【０１４４】
実施例５：ＨＰＬＣ分析方法
ＨＰＬＣを使用する高処理分析法は、以下のとおりである。分析カラムは、ＬＰ−Ｃ１８  １５０＊４．６ｍｍ、移動相は、０．４％の過塩素酸水溶液（ｐＨ１．５）：アセトニトリル＝５５：４５、流量は、２．２ｍＬ／分、カラム温度は、４０℃、検出波長は、２２０ｎｍ、分析時間は、２．５分、アセトフェノンの保持時間は、２．３４分、Ｒ−ＰＥＡの保持時間は、０．９７分である。
【０１４５】
α−フェニルエチルアミンのキラル分析：分析カラムは、ＣＲＯＷＮＰＡＫ  ＣＲ−Ｉ（＋）１５０＊４．６ｍｍ、移動相は、０．８％の過塩素酸水溶液（ｐＨ１）：アセトニトリル＝７０：３０、流量は、０．５ｍＬ／分である。カラム温度は、３０℃である。検出波長は、２１０ｎｍ、分析時間は１０分、アセトフェノンの保持時間は、４．５３分、Ｒ−（＋）−α−フェニルエチルアミンの保持時間は、５．８２分、Ｓ−（−）−α−フェニルエチルアミンの保持時間は、８．６２分である。
【０１４６】
実施例６：改変トランスアミナーゼおよび酵素粉末調製物の発現のための発酵プロセス
標的改変トランスアミナーゼの遺伝子を担持するプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）の単一コロニーを、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含有する５０ｍＬのＬＢブロス（５．０ｇ／Ｌの酵母抽出物ＬＰ００２１、１０ｇ／ＬのトリプトンＬＰ００４２、１０ｇ／Ｌの塩化ナトリウム）に播種した。細胞を、３０℃の振盪機内、２５０ｒｐｍで振盪しながら、少なくとも１６時間培養した。培養物のＯＤ６００が３．５〜４．５に到達したとき、培養物を使用して、発酵槽に播種した。
【０１４７】
０．４Ｌの増殖培地を含有する１．０Ｌの発酵槽を、１２１℃で３０分間滅菌した。発酵槽に上記の培養物を播種した。発酵槽の温度は、３７℃に維持した。発酵槽内の培地を、２００〜８００ｒｐｍで撹拌し、空気を発酵容器に０．４〜０．８Ｌ／分で供給して、溶存酸素レベルを３０％以上の飽和に維持した。２５〜２８％ｖ／ｖの水酸化アンモニウムを添加することによって、培養物をｐＨ７．０に維持した。５００ｇ／Ｌのデキストロースグルコース一水和物、１２ｇ／Ｌの塩化アンモニウム、および５ｇ／Ｌの硫酸マグネシウム七水和物を含有する供給溶液を供給することによって、細胞増殖を維持した。培養物のＯＤ６００が２５±５℃に到達した後、発酵槽の温度を低下させ、３０℃に維持し、イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を０．３ｍＭの最終濃度まで添加することによって、トランスアミナーゼの発現を誘導した。その後、発酵プロセスを、さらに１６時間続けた。発酵プロセスが完了した後、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３Ｒ遠心分離機を４℃で１０分間、８０００ｒｐｍで使用して、細胞を採取した。採取した細胞を、下流の回収プロセスに直接使用するか、または−２０℃で凍結保存した。
【０１４８】
６ｇの湿細胞を、２５０ｕＭのピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）を含有する３０ｍＬの１００ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５、４℃）中に再懸濁した。トランスアミナーゼは、８００バールのホモジナイザーを使用する２回の破壊によって、細胞から放出された。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｍｕｌｔｉｆｕｇｅ  Ｘ３Ｒ遠心分離機を使用して、４℃、８０００ｒｐｍで１０分間遠心分離することによって、得られた細胞溶解物を清澄化した。清澄化した上清を、酵素粉末へと凍結乾燥した。トランスアミナーゼ酵素粉末は、−２０℃で凍結保存した。
【０１４９】
実施例７  改変トランスアミナーゼポリペプチドによるＲ−ＰＥＡの不斉合成のための反応プロセス
以下は、５０ｍＬの反応体積での代表的な反応プロセスである。イソプロピルアミンの原液：８ｍＬのトリエタノールアミン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９）を、６．９ｍＬのイソプロピルアミンと混合し、その後塩酸を添加して、ｐＨを９に調整し、これが２０ｍＬになるまでトリエタノールアミン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９）を補給した。２５０ｍＬの反応容器に、０．２５ｇの酵素粉末（配列番号３９０）、１７．０７ｍＬのトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９）、２０ｍＬのイソプロピルアミンの上記の原液、５００ｕＬの１０ｍＭのピリドキサールリン酸溶液、１０ｍＬのメタノールを添加し、撹拌した。混合後、２．４３ｍＬのアセトフェノンを、反応容器に添加した。反応の温度を、水浴で３０℃に維持し、撹拌速度は、２００ｒｐｍであり、反応容器に陰圧を印加して、生成されたアセトンを除去した。２４時間後、アセトフェノンのＲ−ＰＥＡへの変換は、８０％以上であり、生成物Ｒ−ＰＥＡのｅｅ値は、９９％以上であった。
【０１５０】
実施例８  改変トランスアミナーゼポリペプチドによって触媒される（Ｒ）−（＋）−α−（１−ナフチル）エチルアミンの合成のための反応プロセス
【化９０】
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イソプロピルアミンの原液：８ｍＬのトリエタノールアミン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８）を、６．９ｍＬのイソプロピルアミンと混合し、その後塩酸を添加して、ｐＨを８に調整し、これが２０ｍＬになるまでトリエタノールアミン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ８）を補給した。２５０ｍＬの反応容器に、１５０ｍｇの酵素粉末（配列番号３５２）、３８ｍＬのトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ８）、６．５ｍＬのイソプロピルアミンの上記の原液、５００ｕＬの１０ｍＭのピリドキサールリン酸溶液を添加し、撹拌した。混合後、ＤＭＳＯ中に溶解させたα−アセトナフトンの溶液を、１０％のＤＭＳＯおよび２０ｇ／Ｌの基質α−アセトナフトンの最終濃度になるまで反応容器に添加した。反応の温度を、水浴で３０℃に維持し、撹拌速度は、４００ｒｐｍであり、反応容器に陰圧を印加して、生成されたアセトンを除去した。２４時間後、α−アセトナフトンの（Ｒ）−（＋）−α−（１−ナフチル）エチルアミンへの変換は、７０％以上であり、生成物（Ｒ）−（＋）−α−（１−ナフチル）エチルアミンのｅｅ値は、９９．５％以上であった。
【０１５１】
実施例９  改変トランスアミナーゼポリペプチドによって触媒される（Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）酪酸メチルエステルの合成のための反応プロセス
【化９１】
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イソプロピルアミンの原液：８ｍＬのトリエタノールアミン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）を、６．９ｍＬのイソプロピルアミンと混合し、その後塩酸を添加して、ｐＨを９．５に調整し、これが２０ｍＬになるまでトリエタノールアミン緩衝液（０．１Ｍ、ｐＨ９．５）を補給した。２５０ｍＬの反応容器に、２５０ｍｇの酵素粉末（配列番号８０）、３８ｍＬのトリエタノールアミン緩衝液（ｐＨ９．５）、６．５ｍＬのイソプロピルアミンの上記の原液、５００ｕＬの１０ｍＭのピリドキサールリン酸溶液を添加し、撹拌した。混合後、ＤＭＳＯ中に溶解させた３−オキソ−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）酪酸メチルエステルの溶液を、１０％のＤＭＳＯ、２ｇ／Ｌの基質３−オキソ−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）酪酸メチルエステルの最終濃度になるまで反応容器に添加した。反応の温度を、水浴で３０℃に維持し、撹拌速度は、４００ｒｐｍである。２４時間後、３−オキソ−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）酪酸メチルエステルの（Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）酪酸メチルエステルへの変換は、５０％以上であり、生成物（Ｒ）−３−アミノ−４−（２，４，５−トリフルオロフェニル）酪酸メチルエステルのｅｅ値は、９９％以上であった。
【０１５２】
本発明の上記の内容を閲読した後、当業者は、本発明に様々な修正または変更を加えることができることを理解されたい。また、これらの同等の形態も、本発明の添付の特許請求の範囲内に含まれる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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