(57)【要約】  本発明は、式（１）の化合物、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ混合物およびそれらの薬学的に許容される塩に関する。また、本発明は、既存の薬物化合物で治療するのが困難な細菌感染症を治療することができる抗細菌薬化合物を対象とする。2021511364.tif 000031
2021511364.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）
【化１】
2021511364.tif 000029
（式中、
Ａは、以下：
【化２】
2021511364.tif 000030
から選択される任意に置換された複素環であり、
Ｚは、ＣＮまたはＦから選択され、
Ｘは、ＣＨまたはＮから選択され、ただし、ＺがＦである場合は常に、ＸはＣＨである）
の化合物、その単一の鏡像異性体、ラセミ混合物、ジアステレオマーの混合物、またはそれらの同位体変異体（isotopic variant）。
【請求項２】
以下：
１−（２−（４−（（（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリル；
２−オキソ−１−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリル；
２−オキソ−１−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリル；
６−（（（（１−（２−（７−フルオロ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）エチル）ピペリジン−４−イル）アミノ）メチル）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン；
６−（（（（１−（２−（７−フルオロ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）エチル）ピペリジン−４−イル）アミノ）メチル）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−３（４Ｈ）−オン；
４−（２−（４−（（（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリル；
３−オキソ−４−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリル；
３−オキソ−４−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリル；
１−（２−（４−（（（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−７−フルオロキノリン−２（１Ｈ）−オン、
から選択することができる請求項１に記載の式（１）の化合物。
【請求項３】
治療上有効かつ非毒性量の請求項１に記載の式（１）の化合物と、任意に１つまたは複数の薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含有する、医薬組成物。
【請求項４】
黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ニューモニア（Staphylococcus pneumonia）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、大腸菌、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumonia）または結核菌によって引き起こされる細菌感染の治療または予防に有用な新規化合物を提供する、請求項３に記載の医薬組成物。
【請求項５】
黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ニューモニア、エンテロコッカス・フェカーリス、大腸菌、アシネトバクター・バウマニ、肺炎桿菌または結核菌によって引き起こされる細菌感染症の治療または予防に適した、請求項１から４のいずれか一項に記載の式（１）の化合物、またはその医薬組成物の使用。
【請求項６】
細菌感染を治療する方法であって、それを必要とする患者に、有効量の請求項１または２に記載の式（１）の化合物、あるいはその好適な医薬組成物を投与すること、を含む、方法。
【請求項７】
アンフェニコール、β−ラクタム、テトラサイクリン、アミノグリコシド、キノロン、モチリン、マクロライド、アゾール、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコステロイドクラスの化合物またはそれらの薬学的に許容される塩から選択される１つまたは複数の薬学的活性剤と組み合わせた、請求項１または２に記載の式（１）の化合物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗細菌薬化合物または薬学的に許容される塩、溶媒和物、錯体、水和物、多形体、ラセミ混合物、光学活性形態、並びに細菌によって媒介される疾患または状態の治療のためのそれらの使用に関する。また、本発明は、既存の薬物化合物で治療するのが困難な細菌感染症を治療することができる抗細菌薬化合物を対象とする。さらに、本発明は、そのような化合物、それらの互変異性体、それらの合成に関与する新規中間体を調製する方法に関する。
【０００２】
【化１】
2021511364.tif 000003
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
抗菌薬耐性は世界的な問題であり、臨床および非臨床における抗菌薬耐性の増加率は世界的にヒトの健康に対する重大な脅威を有している。多剤耐性は、いくつかの病原体、例えば、黄色ブドウ球菌、肺炎レンサ球菌、クロストリジウム・ディフィシル（Clostridium difficile）および緑膿菌の間で一般的になっている。このうち、グラム陽性菌である黄色ブドウ球菌は、その効力と環境条件に適応する能力から、大きな懸念となっている。メチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）はよく知られた耐性株群であり、パンデミックの割合に達している。
【０００４】
あまり蔓延してはいないが、大腸菌ＮＤＭ−１（ニューデリーメタロＢラクタマーゼ１）または肺炎桿菌ＮＤＭ−１のいずれかのような抗生物質耐性グラム陰性株は、治療が非常に困難である。バンコマイシンやコリスチンのような高価な抗生物質だけが、これらの菌株に有効であることが多い。
【０００５】
細菌感染症の治療や予防に用いられる現在の抗菌薬は、効果が限られていることがわかっている。さらに、耐性発現の可能性が低下した強力な抗菌活性を有する新規化合物であって、現在利用可能な抗生物質による治療に抵抗する細菌感染症に対して改善された有効性を有する化合物、または標的微生物に対して選択性を有する化合物を同定する必要性が継続して存在する。世界保健機関は、ヒトの健康に対する３大脅威の１つとして抗菌薬耐性を認識している。この薬剤耐性の問題に取り組むためには、細菌の重要な経路を標的とする新しい化学型を開発しなければならない。
【０００６】
細菌のＩＩ型トポイソメラーゼはＤＮＡジャイレースとトポイソメラーゼＩＶ(TopoIV)を含み、これらはほとんどすべての原核細胞に同時に存在するヘテロ四量体酵素である。両酵素はＤＮＡ複製に必要であり、したがって細菌の細胞増殖と細胞分裂に必要である。
【０００７】
細菌のＩＩ型トポイソメラーゼは、特にフルオロキノロンクラスに属する化合物の、証明された抗細菌標的である。これらは、細菌感染症、特に院内感染や他のクラスの抗菌薬に対する耐性が疑われる感染症の治療に重要な役割を果たす広域抗菌薬である。フルオロキノロンは、ＤＮＡジャイレースおよびトポイソメラーゼＩＶを阻害することによって作用する。しかし、薬剤標的であるＤＮＡジャイレースやトポイソメラーゼＩＶの活性部位あるいは薬剤蓄積のいずれかを変える突然変異により、近年、フルオロキノロン系薬剤に対する耐性が出現した。さらに、キノロンに対する耐性は、キノロン標的を阻害から保護するＱｎｒタンパク質を産生するプラスミドによって媒介され得る（G.A. Jacoby、CID、2005:41、Suppl. 2、 SD120-S126）。抗菌化学療法におけるキノロンの長期的な治療の成功にかかわらず、細菌性病原体におけるキノロン誘導耐性の新しい形態は、絶えず生じており、抗菌治療におけるこれらの薬物の減少または完全な無効さえ示している。
【０００８】
新規細菌性トポイソメラーゼ阻害剤（ＮＢＴＩ）は、非キノロンＤＮＡジャイレースおよびトポイソメラーゼＩＶ阻害剤の新興クラスを表す。ＮＢＴＩ分子は、キノロン系薬剤が占めるＤＮＡジャイレース／トポイソメラーゼＩＶの触媒中心とは異なるが隣接する部位に結合する(J Antimicrob Chemother 71:1905-1913、2016）。したがって、ＮＢＴＩ化合物はフルオロキノロン耐性（ＦＱＲ）分離株に対して効力を保持する。ＮＢＴＩは、フルオロキノロンとは異なる触媒サイクルの相でＩＩ型トポイソメラーゼに結合することが示されている。どちらもタンパク質−ＤＮＡ複合体との相互作用を介して結合するが、切断された二本鎖ＤＮＡと結合した触媒チロシンで酵素に結合するフルオロキノロンとは対照的に、ＮＢＴＩはインタクトな切断されていないＤＮＡの存在下で酵素に結合する。インビトロ/インビボで良好な毒性プロファイルと洗浄毒性プロファイルを有するＮＢＴＩクラスの抗菌薬を開発するために、１０年以上にわたり医薬化学者によって多数の努力がなされてきたが、今日までＮＢＴＩクラスからの候補は市場に入っていない。多数の進行性ＮＢＴＩが、ｈＥＲＧ毒性と表される高い心毒性の可能性のため、臨床試験から中止された。唯一の候補（ジェポチダシン（Gepotidacin））は、ＡＢＳＳＳＩおよび淋病（Gonorohiae）の治療のために第２相臨床試験中である。
【０００９】
Vitas pharma社（国際公開第２０１８／１７２９２５号公報）の研究者は、３−ニトロ−４−メチルフェニル尾部片（tail piece）を有する例ＶＴ−０３−０００６５を報告した。化合物は、グラム陽性、黄色ブドウ球菌−ＡＴＣＣ２９２１３(ＭＩＣ: ０．２５μｇ／ｍｌ）に対して強力な活性を示したが、肺炎レンサ球菌（S.pnuemoniae）ＡＴＣＣ６３０１(ＭＩＣ: ４μｇ／ｍｌ）に対しては中等度の活性を示し、エンテロコッカス・フェカーリス （Enterococcus Faecalis）ＡＴＣＣ２９２１２、モラクセラ・カタラーリス（Moraxella catarrhalis）ＡＴＣＣ８１７６、大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２、肺炎桿菌（K. pneumonia）ＡＴＣＣ７００６０３から選択されたグラム陰性株に対しては、各株でＭＩＣ>３２μｇ／ｍｌで非効果的であった。
【００１０】
【化２】
2021511364.tif 000004
【００１１】
同じ特許出願において、二環性尾部片を有する２例のＶＴ−０３−０００４２およびVT−０３−０００４３がさらに報告された。これらの化合物はいずれも黄色ブドウ球菌−ＡＴＣＣ２９２３１、ＭＲＳＡ ＡＴＣＣ−３３５９１および大腸菌ＡＴＣＣ２５９２２に対して有効ではなく、３株ともＭＩＣ値は＞１６μｇ／ｍｌであった。
【００１２】
【化３】
2021511364.tif 000005
【００１３】
Glaxoの研究者らは、国際公開第２００８／００９７００号公報において化合物１５Ａを報告した。実施例５４は、結核菌に対して１μＭのＭＩＣ値を示した (Journal of Medicinal Chemistry 2014、57、4889-4905）。
【００１４】
【化４】
2021511364.tif 000006
【００１５】
新規なＮＢＴＩクラスの抗菌薬を発見するために多大な努力がなされているが、今日までに市場に参入したものはなかった。従って、広域スペクトルならびに治療困難なグラム陽性およびグラム陰性病原体に対して効果を発揮する新規で強力、安全かつ費用対効果の高い抗菌剤を開発する緊急の必要性がある。
【００１６】
本明細書では、種々のグラム陽性およびグラム陰性株に対して活性であり、グラム陽性またはグラム陰性細菌による感染原因によって発症する疾患または状態の治療に有用である、式（１）の新規な広域スペクトル抗細菌化合物を開示する。
【発明の概要】
【００１７】
発明の概要
本発明は、グラム陽性およびグラム陰性病原体に対して活性を有する化合物、並びに感染症の治療のための化合物の使用を提供する。新規化合物は、以下に示す一般式（１）によって定義される。本発明の化合物は、病原体の調節により、ヒトまたは動物の体の処置に有用である。したがって、本発明の化合物は、数多くの感染症の治療／軽減／調節または予防に適している。
【００１８】
【化５】
2021511364.tif 000007
【発明を実施するための形態】
【００１９】
好適な実施形態
本発明の主な目的は、一般式（１）の新規化合物、それらの互変異性体、それらの合成に関与する新規中間体、それらの薬学的に許容される塩、それらの薬学的に許容される溶媒和物、およびそれらを含有する医薬組成物、または治療感染症に適したそれらの混合物を提供することである。
【００２０】
一実施形態では、一般式（１）の新規化合物、それらの互変異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ混合物または同位体変異体、それらの合成に関与する新規中間体、それらの薬学的に許容される塩、薬学的に許容される溶媒和物、およびそれらを含有する医薬組成物の調製方法を提供する。
【００２１】
別の実施形態では、一般式（１）の化合物、それらの互変異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ混合物または同位体変異体、それらの薬学的に許容される塩、溶媒和物およびそれらの混合物を含有する医薬組成物であって、それらの製造において通常使用される薬学的に許容される担体、溶媒、希釈剤、賦形剤および他の媒体を有する、医薬組成物が提供される。
【００２２】
さらに別の実施形態では、治療効果的かつ非毒性量の式（１）の化合物、またはそれらの薬学的に許容される組成物を哺乳動物に投与することによる、感染症の治療のための本発明の新規化合物の使用が提供される。
【００２３】
さらに別の実施形態では、細菌感染からの治療または予防に適した式（１）の化合物の使用が提供される。
【００２４】
別の実施形態では、１つまたは複数の適切な薬学的活性剤と組み合わせた式（１）の化合物を提供する。
【００２５】
詳細な説明：
従って、本発明は、一般式（１）
【化６】
2021511364.tif 000008
（式中、
Ｚは、ＣＮまたはＦから選択され、
Ｘは、ＣＨまたはＮから選択され、ただし、ＺがＦである場合は常に、ＸはＣＨであり、
Ａは、以下：
【化７】
2021511364.tif 000009
から選択される任意に置換された複素環である）
の化合物、それらの互変異性体、鏡像異性体、ジアステレオマー、ラセミ混合物または同位体変異体、またはそれらの薬学的に許容される塩、溶媒和物、またはプロドラッグに関するものである。
【００２６】
特に有用な化合物は、以下から選択され得る：
１−（２−（４−（（（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリル；
２−オキソ−１−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリル；
２−オキソ−１−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリル；
６−（（（（１−（２−（７−フルオロ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）エチル）ピペリジン−４−イル）アミノ）メチル）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オン；
６−（（（（１−（２−（７−フルオロ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）エチル）ピペリジン−４−イル）アミノ）メチル）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−３（４Ｈ）−オン；
４−（２−（４−（（（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリル；
３−オキソ−４−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−６イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリル；
３−オキソ−４−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリル；
１−（２−（４−（（（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−７−フルオロキノリン−２（１Ｈ）−オン。
【００２７】
基上の好適な基および置換基は、明細書中のどこに記載されているものから選択してもよい。
【００２８】
用語「同位体変異体」は、このような化合物を構成する原子の１つまたは複数に非天然の割合の同位体を含む化合物を指し、これらに限定されるものではないが、以下のものを含む：水素（1 Ｈ）、重水素（2 Ｈ）、トリチウム（3 Ｈ）、炭素−１１（11Ｃ）、炭素−１２（12Ｃ）、炭素−１３（13 Ｃ）、炭素−１３（14Ｃ）、窒素−１３（13 Ｎ）、窒素−１４（14Ｎ）、窒素−１５（15 Ｎ）、酸素−１４（14Ｏ）、酸素−１５（15 Ｏ）、酸素−１６（16 Ｏ）、酸素−１７（17 Ｏ）、酸素−１８（18 Ｏ）、フッ素−１７（17 Ｆ）、フッ素−１８（18 Ｆ）、リン−３１（31Ｐ）、リン−３２（32Ｐ）、リン− ３３（33Ｐ）、硫黄−３２（32Ｓ）、硫黄−３３（33Ｓ）、硫黄−３４（34Ｓ）、硫黄−３５（35Ｓ）、硫黄−３６（36Ｓ）、塩素−３５（35Ｃｌ）、塩素−３６（31Ｃｌ）、塩素−３７（37Ｃｌ）、臭素−７９（79Ｂｒ）、臭素−８１（81Ｂｒ）、ヨウ素−１２３（123Ｉ）、ヨウ素−１２５（125Ｉ）、ヨウ素−１２７（127Ｉ）、ヨウ素−１２９（129Ｉ） 、及び ヨウ素−１３１（131Ｉ）。ある実施形態において、化合物の「同位体変異体」は、安定な形態、すなわち非放射性である。ある実施形態において、化合物の「同位体変異体」は、非天然の割合の１つまたは複数の同位体を含み、これらに限定されるものではないが、以下のものが含まれる：水素（1 Ｈ）、重水素（2 Ｈ）、炭素−１２（12Ｃ）、炭素−１３（13 Ｃ）、窒素−１４（14Ｎ）、窒素−１５（15 Ｎ）、窒素−１６（16 Ｏ）、酸素−１７（17 Ｏ）、酸素−１８（18 Ｏ）、フッ素−１７（17 Ｆ）、リン−３１（31Ｐ）、硫黄−３２（32Ｓ）、硫黄−３３（33Ｓ）、硫黄−３４（34Ｓ）、硫黄−３６（36Ｓ）、塩素−３５（35Ｃｌ）、塩素−３７（37Ｃｌ）、臭素−７９（79Ｂｒ）、臭素−８１ （81Ｂｒ）、及びヨウ素−１２７（127Ｉ）。 ある実施形態において、化合物の「同位体変異体」は、不安定な形態、すなわち放射性である。ある実施形態において、化合物の「同位体変異体」は、非天然の割合の１つまたは複数の同位体を含み、これらに限定されるわけではないが、以下のものを含む：トリチウム（3 Ｈ）、炭素−１１（11Ｃ）、炭素−１４（14Ｃ）、窒素−１３（13 Ｎ）、酸素−１４（14Ｏ）、酸素−１５（15 Ｏ）、フッ素−１８（18 Ｆ）、リン−３２（32Ｐ）、リン−３３（33Ｐ）、硫黄−３５（35Ｓ）、塩素−３６（36Ｃｌ）、ヨウ素−１２３（123Ｉ）、ヨウ素−１２５（125Ｉ）、ヨウ素−１２９（129Ｉ）およびヨウ素−１３１（131Ｉ）。本明細書で提供される化合物において、技術者の判断に従って実行可能な場合、任意の水素は、2 Ｈであり得、例えば、任意の炭素は、例えば、例えば、13 Ｃであり得、または任意の窒素は、例えば、15 Ｎであり得、任意の酸素は、18 Ｏであり得ることが理解されるであろう。特定の実施形態において、化合物の「同位体変異体」は、非天然の割合の重水素を含有する。
【００２９】
式（１）の化合物は、１つまたは複数の不斉中心を含むことができ、したがって、ラセミ体およびラセミ混合物、単一の鏡像異性体、ジアステレオマー混合物および個々のジアステレオマーとして生じることができる。本発明は、式（１）の化合物のこのようなすべての異性体形態を、単一種またはそれらの混合物として理解することを意味する。
【００３０】
本明細書記載の化合物のいくつかは、オレフィン性二重結合を含み、特記していなければ、Ｅ及びＺ幾何異性体を含むものとする。
【００３１】
本明細書に記載される化合物のいくつかは、水素の異なる付着点を伴って存在することができ、互変異性体と呼ばれる。このような例は、ケト−エノール互変異性体として知られるケトンおよびそのエノール形態であってもよい。個々の互変異性体ならびにそれらの混合物は、式（１）の化合物とともに包含される。
【００３２】
略語のリスト
ＡＣＮ：アセトニトリル
ＤＭＦ：ジメチルホルムアミド
ＤＣＭ：ジクロロメタン
ＥＤＣ：ジクロロエタン
ＥｔＯＨ：エタノール
ＴＦＡ：トリフルオロ酢酸
ＴＨＦ：テトラヒドロフラン
ＤＩＰＥＡ：ジイソプロピルエチアミン
ＥｔＯＡｃ：酢酸エチル
ｈ： 時間
ＨＣｌ：塩酸
ｍｉｎ：分
ＭｅＯＨ：メタノール
ＮａＢＨ3 ＣＮ：シアノホウ水素化ナトリウム
ＮａＢ（ＯＡｃ）3Ｈ：トリアセトキシホウ水素化ナトリウム
ＮａＢＨ4：水素化ホウ素ナトリウム
ｒｔまたはRT :室温（２５−３０℃）
ｔ Ret：保持時間
Ｃｓ2 ＣＯ3 ：炭酸セシウム
ＴＥＡ：トリエチルアミン
【００３３】
器具の詳細
マススペクトルは、LC-MS 2010-A Shimadzuで記録した。
ＮＭＲスペクトルは、Bruker Avanc 400MHzで記録した。
【００３４】
本発明の化合物は、有機合成分野の当業者に知られている従来の技術または当業者によって理解されるそれらに対する変形と共に、以下に記載する方法を用いて調製することができる。好ましい方法は、全ての記号が以前に定義されている以下に記載されたものを含むが、これらに限定されない。
【００３５】
一般的スキーム１：一般式（１）の化合物の合成
【００３６】
【化８】
2021511364.tif 000010
【００３７】
ＤＣＭ、ＡＣＮ、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨおよびこれらの組合せから選択される溶媒中で、ＮａＢＨ3 ＣＮ、ＮａＢ（ＯＡｃ）3 Ｈ、ＮａＢＨ4から選択される好適な還元剤の存在下での、４ーアミノ保護ピペリジン（３）によるアルデヒド誘導体（２）の還元アミノ化により、式（４）の化合物を得た。ジオキサンによる（４）のＢｏｃの脱保護ＨＣｌまたはＴＦＡ／ＤＣＭはアミン化合物（５）を生じた。ＤＣＭ、ＡＣＮ、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨおよびこれらの組合せから選択される溶媒中で、ＮａＢＨ3 ＣＮ、ＮａＢ（ＯＡｃ）3 Ｈ、ＮａＢＨ4の存在下での、好適なアルデヒド誘導体（６）による式（５）のアミン化合物の還元アミノ化により、式（１）の化合物を得た。
【００３８】
一般的スキーム２：一般式（１）の化合物の合成
【００３９】
【化９】
2021511364.tif 000011
【００４０】
代替的に、式（１）の化合物は、式（７）の化合物（式中、Ｌｇは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、ＯＭｓから選択された脱離基である）と、４−アミノ保護ピペリジン（３）（式中、Ｐｇは、Ｂｏｃ、ＣＢｚ、ピバリル（Pivalyl）から選択されたアミン保護基である）とを、Ｋ2 ＣＯ3、ＣＳ2 ＣＯ3，ＴＥＡ、ＤＩＥＡ、ＤＢＵから選択された塩基の存在下で、ＤＣＭ、ＥＤＣＭ、ＤＭＦ、ＡＣＮのような溶媒中で反応させて、式（４）の化合物を得ることによって調製することができる。ジオキサンを用いた（４）のＰｇ基の脱保護ＤＣＭ、ＥＤＣから選択した溶媒中のＨＣｌ、ＴＦＡ、ＨＣｌは式（５）のアミン誘導体を与えた。ＤＣＭ、ＡＣＮ、ＭｅＯＨ、ＥｔＯＨおよびこれらの組合せから選択される溶媒中で、ＮａＢＨ3 ＣＮ、ＮａＢ（ＯＡｃ）3 Ｈ、ＮａＢＨ4の存在下での、好適なアルデヒド誘導体（６）による式（５）のアミン化合物の還元アミノ化により、式（１）の化合物を得た。
【００４１】
式（２）および（７）の化合物は、参考文献国際公開第２００６／０２３４６７号公報およびJournal of Medicinal chemistry 55(15)、6916、2012に従って合成することができる。式（３）の化合物を市販の供給源から直接使用した。
【００４２】
本発明の一部を形成する薬学的に許容される塩は、当技術分野で公知の方法により、式（１）の化合物を適切な溶媒中で適切な酸で処理することによって調製することができる。
【００４３】
本発明は、以下の実施例によってさらに例示され、これは本発明のいくつかの好適な実施形態のいくつかを提供する。これらの例は、単に代表的な実施形態として提供されるものであり、いかなる方法においても本発明の範囲を制限すると解釈されるべきではない。
【実施例】
【００４４】
【表１】
2021511364.tif 000012
【００４５】
中間体の調製：
中間体Ａ１：２−オキソ−１−（２−オキソエチル）−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリルは、Journal of Medicinal chemistry 2012、55、6916-6933に報告されている手順に従って調製した。
【００４６】
中間体Ａ２：
ステップ１：３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリルの調製
３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリルは、国際公開第２０１４／０２４０５６号公報に報告された手順に従って調製した。
【００４７】
ステップＩＩ：４−アリル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリルの調製
３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリル（６５０ｍｇ、３．８０ｍｍｏｌ）およびＤＭＦ（６．５ｍｌ）を２５℃でｒｂフラスコに入れた。混合物を０〜５℃に冷却し、ＮａＨ（４０１ｍｇ、８．３５ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を２５℃で１０分間撹拌し、３−ヨードプロパ−１−エン（０．７６４ｍｌ、８．３５ｍｍｏｌ）を０〜５℃で添加した。反応混合物を２５℃で１０分間撹拌した。反応終了後、反応混合物を水（５０ｍｌ）で希釈し、水層をＥｔＯＡｃ（５０ml) X４で抽出した。有機層を合わせ、水とブライン溶液で洗浄した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥してろ過し、減圧下で濃縮して粗生成物を得、これをフラッシュカラムクロマトグラフィーを用いて精製した。カラム： １２ gm Redi Sep カラム、および移動相：ヘキサン中１０% ＥｔＯＡｃ
【００４８】
ステップIII :３−オキソ−４−（２−オキソエチル）−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリルの調製
４−アリル−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリル（３５０ｍｇ、１．６５７ｍｍｏｌ）、ジオキサン（３５ｍｌ）および水（１１ｍＬ）を丸底フラスコに入れた。これに過ヨウ素酸ナトリウム（１１７０ｍｇ、５．４７ｍｍｏｌ）を加え、続いて酸化オスミウム（ＶＩＩＩ）（２．１０６ｍｌ、０．３３１ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を２５℃で４時間撹拌した。反応終了後、混合物を水（２５ｍｌ）中でクエンチした。酢酸エチル（２０ｍｌ＊３）を添加して化合物を抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、減圧下で蒸発させて粗化合物を得た。移動相としてＤＣＭ中の２％メタノールを用いてフラッシュカラムクロマトグラフィーにより、標題化合物を精製した。[１５０ ｍｇ、４２％］
【００４９】
中間体Ａ３：２−（７−フルオロ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）アセトアルデヒドを、国際公開第２００８／００９７００号に報告された手順に従って調製した。
【００５０】
【表２】
2021511364.tif 000013
【００５１】
中間体Ｂ１： ２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−カルバルデヒドは、国際公開第２０１２／０４９５５５号公報で報告された方法に従って調製した。
【００５２】
中間体Ｂ２： ３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−６−カルバルデヒドを、国際公開第２０１０／１１１６２６号公報に報告された手順に従って調製した。
【００５３】
中間体Ｂ３： ３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−カルバルデヒドを、国際公開第２０１４／０５７４１５号公報に報告された手順に従って調製した。
【００５４】
好ましい実施形態の１つでは、黄色ブドウ球菌、スタフィロコッカス・ニューモニア（Staphylococcus pneumonia）、エンテロコッカス・フェカーリス（Enterococcus faecalis）、大腸菌、アシネトバクター・バウマニ（Acinetobacter baumannii）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumonia）または結核菌のような種々の細菌株によって引き起こされる感染症の治療のための本発明の新規化合物が提供される。
【００５５】
別の実施形態では、アンフェニコール、β−ラクタム、テトラサイクリン、アミノグリコシド、キノロン、モチリン、マクロライド、アゾール、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、グルココルチコステロイドクラスの化合物またはそれらの薬学的に許容される塩から選択される１つまたは複数の薬学的活性剤と組み合わせた、式（１）の化合物が提供される。
【００５６】
実施例１：１−（２−（４−（（（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリルの調製。
【００５７】
【化１０】
2021511364.tif 000014
【００５８】
ステップ１：ｔｅｒｔ−ブチル（１−（２−（７−シアノ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）エチル）ピペリジン−４−イル）カルバメートの合成
ＴＨＦ(３０ｍｌ）中の２−オキソ−１−（２−オキソエチル）−１、２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリル（０．７８０ｇ、３．６８ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、ｔｅｒｔ−ブチルピペリジン−４−イルカルバメート（０．８１１ｇ、４．０５ｍｍｏｌ）を２５℃で添加した。反応混合物を２時間還流した。混合物を１００Ｃまで冷やし、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（sodium triacetoxy borohydride）（２．３３９ｇ，１１．０４) mmolを加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、メタノール（１２ｍｌ）を反応混合物に添加し、次いで１６時間撹拌した。反応終了後、混合物を水中でクエンチした；化合物を酢酸エチル（２５ｍｌ＊２）で抽出した。合わせた有機層を水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、減圧下で蒸発して粗物質（crude mass）を得、これを酢酸エチル：ヘキサン（５０：５０）移動相を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。標題化合物をオフホワイトの固体として得た。(１．０ ｇｍ、２３％）
【００５９】
ステップ２：１−（２−（４−アミノピペリジン−１−イル）エチル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリルの合成
ｔｅｒｔ−ブチル（１−（２−（７−シアノ２−オキノキノリン−１（２Ｈ）−イル）エチル）ピペリジン−４−イル）カルバメート（１ｇ、２．５２ｍｍｏｌ）をｒｂフラスコに入れ、続いてＤＣＭ（８０ｍｌ）を入れた。これにＴＦＡ(６．０８ｍｌ、７９ｍｍｏｌ）を添加し、室温で混合物を１６時間撹拌した。反応終了後、有機揮発分を減圧下で除去した。得られた粗生成物を次の反応に直接使用した。(０．４ ｇｍ ５３．５％）
【００６０】
ステップ３：１−（２−（４−（（（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリルの合成
丸底フラスコに１−（２−（４−アミノピペリジン−１−イル）エチル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリル（０．２５０ｇ，０．８４４ｍｍｏｌ）とＴＨＦ(４０ｍｌ）を添加した。これに２，３−ジヒドロベンゾ（ｂ）（１，４）ジオキシン−６−カルバルデヒド（０．１２６ｇ、０．７６５ｍｍｏｌ）を添加し、混合物を７５℃で２時間加熱した。混合物を室温まで冷却し、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム（０．４８７ｇ、２．２９８ｍｍｏｌ）を添加した。混合物を室温で２時間撹拌した。反応終了後、混合物を水中でクエンチした。化合物を酢酸エチル（２５ｍｌ＊２）で抽出した。合わせた有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、減圧下で蒸発して粗生成物を得た。標題化合物をＤＣＭ：ＭｅＯＨを移動相としてシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。(１８０ ｍｇ、１７％）。1 H NMR (DMSO d6): 8.08 (1H, s), 8.00 (1H, d, J = 8.0 Hz ), 7.91 (1H, d, J = 8), 7.66 (1H, d, J = 1.2 Hz), 6.83 (1H, s), 6.79-6.77 (3H, m), 4.37 (2H,t, J = 8 Hz), 4.10 (4H, s), 3.60 (2H, s), 2.91-2.88 (2H, m), 2.09-2.03 (2H, m), 1.98 (3H, s), 1.90-1.77 (2H, m), 1.23-1.19 (2H, m). ESI-MS: 445.15 (M+H)+
【００６１】
実施例２：２−オキソ−１−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリルの調製
【００６２】
【化１１】
2021511364.tif 000015
【００６３】
１−（２−（４−（（（３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ピラノ［２，３−ｃ］ピリジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−２−オキソ−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリルは、実施例１に記載の手順と同様に調製したが、ステップＩＩＩにおける出発物質として、３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−６−カルボアルデヒドＢ２を使用した。標題化合物をスペクトル解析により特徴づけた。1 H NMR (DMSO d6): 10.67 (1H,s), 8.08 (1H, s), 8.00 (1H, d, J = 9.6 Hz), 7.91 (1H, d, J = 8 Hz), 7.66-7.64 (1H, m), 6.89-6.87 (3H, m), 6.78 (1H, d, J = 9.6), 4.52 (2H, s), 4.36 (2H, d, J = 6.8), 3.64 (2H, s), 3.17 (2H,s), 2.93-2.90 (2H, m), 2.02 (2H, t, J = 10.4 Hz), 1.80-1.77 (2H, m), 1.26-1.23 (3H, m). ESI-MS: 458.01 (M)+
【００６４】
実施例３：２−オキソ−１−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリルの調製。
【００６５】
【化１２】
2021511364.tif 000016
【００６６】
２−オキソ−１−（２−（４−（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−１，２−ジヒドロキノリン−７−カルボニトリルを、実施例１に記載の手順と同様に調製したが、ステップＩＩＩにおける出発物質として、３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−カルバルデヒドＢ３を使用した。標題化合物をスペクトル解析により特徴づけた。1 H NMR (DMSO d6): 10.52 (1H,s), 8.08 (1H, s), 8.00 (1H, d, J = 9.6 Hz), 7.91 (1H, d, J = 8.0 Hz), 7.65 (1H, dd, J1 = 1.2 Hz, J2 = 8.0 Hz), 7.25-7.23 (1H, m), 6.97-6.94 (2H, m), 6.78 (1H, d, J = 9.2 Hz), 4.37 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.70-3.60 (2H, m), 3.43 (2H, s), 2.93-2.91 (2H, m), 2.68-2.67 (1H, m), 2.04-1.99 (2H, m), 1.80-1.77 (2H, m), 1.26-1.23 (2H, m). ESI-MS: 473 (M)+
【００６７】
実施例４：６−（（（１−（２−（７−フルオロ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）エチル）ピペリジン−４−イル）アミノ）メチル）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オンの調製。
【００６８】
【化１３】
2021511364.tif 000017
【００６９】
６−（（（１−（２−（７−フルオロ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）エチル）ピペリジン−４−イル）アミノ）メチル）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−３（４Ｈ）−オンは、実施例１に記載の手順と同様に調製したが、ステップＩでは２−（７−フルオロ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）アセトアルデヒドＡ３を、ステップＩＩＩでは出発物質として３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−６−カルバルデヒドＢ２を使用した。標題化合物をスペクトル解析により特徴づけた。1 H NMR (DMSO d6): 10.67 (1H,s), 7.91 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.90-7.77 (1H, m), 7.40 (1H, dd, J1 = 2.0 Hz, J2 = 12.0 Hz), 7.16-7.11 (1H, m), 6.91-6.88 (3H, m), 6.56 (1H, d, J = 9.2 Hz), 4.53 (2H, s), 4.31 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.68 (2H, s), 2.94-2.92 (2H, m), 2.05-1.99 (2H, m), 1.20-1.79 (2H, m), 1.28-1.26 (2H, m). ESI-MS: 451.20 (Μ+Η)]+.
【００７０】
実施例５：６−（（（１−（２−（２−（７−フルオロ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）エチル）ピペリジン−４−イル）アミノ）メチル）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−３（４Ｈ）−オンの調製
【００７１】
【化１４】
2021511364.tif 000018
【００７２】
６−（（１−（２−（７−フルオロ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）エチル）ピペリジン−４−イル）アミノ）メチル）−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−３（４Ｈ）−オンは、実施例１で述べた手順と同様に調製したが、ステップＩでは２−（７−フルオロ−２−オキソキノリン−１（２Ｈ）−イル）アセトアルデヒドＡ３を、ステップＩＩＩでは出発物質として３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−カルバルアルデヒドＢ３を使用した。標題化合物をスペクトル解析により特徴づけた。1 H NMR (DMSO d6): 10.49 (1H,s), 7.91 (1H, d, J = 9.6 Hz), 7.79 (1H, dd, J1 = 6.8 Hz, J2 = 8.8 Hz), 740 (1H, dd, J1 = 2.0 Hz, J2 = 12.0 Hz), 7.30-7.20 (1H, m), 7.14 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.00-6.96 (2H, m), 6.56 (1H, d, J = 9.6 Hz), 4.12 (2H, t, J = 6.8 Hz), 3.43 (2H, s), 3.31 (2H, s), 2.95-2.89 (2H, m), 2.45-2.40 (1H, m), 2.03-1.99 (2H, m), 1.95-1.91 (2H, m), 1.20-1.16 (2H, m). ESI-MS: 467.17 (Μ+Η)+.
【００７３】
実施例６：３−オキソ−４−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリル
【００７４】
【化１５】
2021511364.tif 000019
【００７５】
３−オキソ−４−（２−（４−（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリルは、実施例１に記載の手順と同様に調製したが、ステップＩでは３−オキソ−４−（２−オキソエチル）−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリルＡ２を、ステップＩＩＩでは出発物質として３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］チアジン−６−カルボアルデヒドＢ３を使用した。標題化合物をスペクトル解析により特徴づけた。1 H NMR (DMSO d6): 10.50 (1H,s), 8.38 (1H, s), 8.21 (1H, d, J = 1.2 Hz), 7.98 (1H, d, J = 8.4 Hz), 7.78 (1H, dd, J1 = 1.6 Hz, J2 = 8.4 Hz), 7.23 (1H, d, J = 7.6 Hz), 6.62-6.35 (2H, m), 4.33 (2H, t, J = 6.4 Hz), 3.60-3.55 (2H, m), 3.42 (2H, s), 2.90-2.88 (2H, m), 2.04-1.99 (3H, m), 1.77-1.74 (2H, m), 1.24-1.19 (4H, m). ESI-MS: 475.17 (Μ+Η)+.
【００７６】
上記の方法を用いることにより、以下の例を同様の方法で調製することができる。
【００７７】
実施例７： ３−オキソ−４−（２−（４−（（（３−オキソ−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサジン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリル
【００７８】
【化１６】
2021511364.tif 000020
【００７９】
実施例８：４−（２−（４−（（（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−３−オキソ−３，４−ジヒドロキノキサリン−６−カルボニトリル
【００８０】
【化１７】
2021511364.tif 000021
【００８１】
実施例９：１−（２−（４−（（（２，３−ジヒドロベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキシン−６−イル）メチル）アミノ）ピペリジン−１−イル）エチル）−７−フルオロキノリン−２（１Ｈ）−オン
【００８２】
【化１８】
2021511364.tif 000022
【００８３】
抗菌活性：
式（１）の化合物は、その強力な抗細菌作用のため、興味深い。本明細書に開示される発明化合物の抗細菌効果を達成する能力は、下記の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）プロトコールに基づくアッセイを用いて、大腸菌 ＡＴＣＣ２５９２２、黄色ブドウ球菌 ＡＴＣＣ２９２１３のような細菌種の増殖を阻害する能力に関して評価され得る：
【００８４】
試験菌をMuellor Hinton Broth (M1657）-MHB中で増殖させ、粉末２５ｇを１０００ｍｌの蒸留水に溶解し、１５ポンド圧力（１２１℃）で２０分間のオートクレーブにより滅菌する。培地の無菌性は、３７℃で４８時間インキュベートしてチェックする。
【００８５】
−８０℃でグリセロールストックとして保存された細菌培養物をＬＢ寒天プレート上で継代培養し、単離コロニーを得る。各株の単一コロニーをＬＢブロスで培養する。光学濃度（６００ｎｍでのＯＤ）が０．８〜１になるまで、３７℃、２００ｒｐｍで培養液をインキュベートする。この対数期の培養液をＬＢブロスで５〜８×１０５ ＣＦＵ／ｍＬの細胞数に希釈し、ＭＩＣ実験の接種材料とする。
【００８６】
試験化合物をそれぞれの溶媒で希釈し、９６のウェルプレートに、１５０μlのMHB中、１６〜０．１２μｇ／ｍｌの最終濃度まで加えた。
【００８７】
ジメチルスルホキシドおよび培地の無菌性の影響をモニタリングするための対照を含む。プレートを３７℃で一晩、加湿したインキュベーター中でインキュベートした。翌朝、６００ ｎＭ波長の分光光度計を用いてプレートを読み取る。
【００８８】
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）は、濁度を示さないウェルを含む最低薬物濃度と定義される。代表的なグラム陽性（黄色ブドウ球菌）およびグラム陰性（大腸菌）病原体に対して測定された抗細菌活性（ＭＩＣ）を、表１に報告した。
【００８９】
式Ｉに属する例示化合物は強力な抗細菌活性を示した。
【００９０】
【表３】
2021511364.tif 000023
【００９１】
フルオロキノロン耐性株に対するＭＩＣ：
黄色ブドウ球菌 (ZYABL０６）のキノロン耐性臨床株に対して化合物をスクリーニングし、強力であることがわかった。
【００９２】
【化１９】
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【００９３】
化合物の標的特異性
ゲル電気泳動法を用いたトポイソメラーゼＩＩ／ＩＶ阻害の評価：トポイソメラーゼＩＩ/ＩＶ (１ユニット、Inspiralis）を、適切な緩衝液中のＤＮＡ(pHOT/kDNA、Topogen）およびＡＴＰの反応混合物に添加し、その後種々の濃度の試験化合物を添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。反応は停止緩衝液の添加により３０分後に終了した。得られたＤＮＡ(弛緩型、スーパーコイル型または脱カテナン型）をクロロホルム：イソアミルアルコール混合物を用いて抽出し、１％アガロースゲル電気泳動を用いて分離した。ゲルを臭化エチジウムで２０分間染色し、蒸留水で洗浄し、画像を取得してさらに分析を行った。画像からのバンド強度をImage Jソフトウェアを用いて測定し、半最大最小発育阻止濃度をGraphpad Prismを用いて推定した。
【００９４】
【表４】
2021511364.tif 000025
【００９５】
ｈＥＲＧ結合試験
FluxOR（商標）カリウムイオンチャネルアッセイ
タリウムはその濃度勾配を下って細胞内に流入し、細胞質内の蛍光を増加させる指示色素によりチャンネル活性が検出される。安定して発現しているhERG CHO細胞を、ｈＥＲＧ易罹患性（liability）について試験化合物でチェックする。細胞と共に２０分間インキュベートした化合物に、次いで刺激緩衝液を加え、ＴＥＣＡＮマルチモードリーダーで蛍光を測定した。被験物質がｈＥＲＧチャネルを阻害すると、タリウムが細胞内に流入することができなくなる。ビヒクル対照は、全ｈＥＲＧ応答として、アステミゾールによる処置は全ｈＥＲＧチャネル阻害として考えられ、これに基づいて、試験化合物のｈＥＲＧチャネル阻害が計算される。合成化合物は有意なｈＥＲＧ易罹患性を示さなかった。
【００９６】
【表５】
2021511364.tif 000026
【００９７】
広範な菌株パネルに対するＭＩＣ試験
実施例３は、以前に報告されたプロトコールに従って、既存の抗生物質に耐性である様々なグラム陽性およびグラム陰性株を用いて、ＭＩＣについてさらに評価された。
【００９８】
【表６】
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【００９９】
結核菌Ｈ３７Ｒｖ阻害アッセイ
各試験化合物の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定は、標準プロトコールに従い、９６ウェルの平底ポリスチレンマイクロタイタープレートで行った。実施例３は結核菌に対して強力な阻害を示した。
【０１００】
【表７】
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【国際調査報告】
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