(57)【要約】  改変された免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座を含むゲノムを有するトランスジェニックニワトリが提供される。遺伝子座は、隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体を欠き、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤクラスター、ヒトＪセグメント、およびヒトＶＨ配列に基づく複数の上流偽遺伝子を含む。改変されたＩｇＨ遺伝子座はニワトリにおいてＶ（Ｄ）Ｊの組換えを経て、ニワトリは多様な免疫グロブリン重鎖を有する抗体を産生する。
2021516954.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変された内因性免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座を含むゲノムを含むトランスジェニックニワトリであって、前記改変された内因性免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座が、
（ａ）隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体を欠如し、かつ
（ｂ）作動可能な連結で、
（ｉ）免疫グロブリン重鎖遺伝子プロモーター、
（ｉｉ）ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３配列を含む可変ドメインのコード配列を含む生殖系列ヒトＶＨセグメント、
（ｉｉｉ）ヒトＤクラスター、
（ｉｖ）単一のヒトＪセグメント、
（ｖ）定常領域をコードする、（ｂ）（ｉｉ）の前記生殖系列ヒトＶＨセグメントの上流の複数の配列、
（ｖｉ）それぞれが（ｂ）（ｉｉ）の前記機能的なヒトＶＨセグメントと実質的に同じＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３配列と、偽遺伝子ごとに異なるＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列とを含む構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３の複数の偽遺伝子
を含み、
前記改変されたＩｇＨ遺伝子座は、前記ニワトリでＶ（Ｄ）Ｊ組換えを経て、
前記複数の生殖系列ヒトＶＨ偽遺伝子は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え後、遺伝子変換によってヌクレオチド配列を前記生殖系列ヒトＶＨセグメントに供与し、
前記ニワトリは多様な免疫グロブリン重鎖を含む抗体を産生する、
トランスジェニックニワトリ。
【請求項２】
（ｂ）（ｖｉ）の前記ＣＤＲ１およびＣＤＲ２の配列が、（ｂ）（ｉｉ）の前記機能的なヒトＶＨセグメントと同じファミリーにある異なるヒトＶＨセグメントのＣＤＲ１およびＣＤＲ２をコードする、請求項１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項３】
（ａ）の隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体の長さが、１０〜１２ｋｂの範囲である、請求項１または２のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項４】
（ｂ）（ｉ）の前記プロモーターが、ニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子プロモーターである、請求項１から３のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項５】
（ｂ）（ｉｉ）の前記生殖系列ヒトＶＨセグメントならびに（ｖｉ）の前記ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列が、前記ＶＨ３ファミリー、前記ＶＨ１ファミリーまたは前記ＶＨ４ファミリーに由来する、請求項１から４のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項６】
前記Ｄクラスターにおいて、システインの任意のコドンが、別のアミノ酸をコードするように変異されている、請求項１から５のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項７】
前記Ｄクラスターにおいて、システインの任意のコドンが変異して、チロシンまたはトリプトファンをコードする、請求項６に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項８】
前記Ｄクラスターの前記介在配列がニワトリ由来である、請求項１から７のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項９】
（ｂ）（ｖ）の前記複数の偽遺伝子が少なくとも１０の前記偽遺伝子を含む、請求項１から８のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１０】
（ｂ）（ｖ）の前記偽遺伝子が、（ｂ）（ｉｉ）の前記生殖系列ヒトＶＨセグメントに対して逆向きである、請求項１から９のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１１】
（ｂ）（ｖ）の定常領域をコードする前記複数の配列が前記ニワトリにとって内因性である、請求項１から１０のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１２】
前記改変された免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座の前記転写産物が、前記Ｊコード配列のコピーの３’末端を（ｂ）（ｖ）の前記定常領域コード配列のコピーの５’末端に結合するイントロンを含む、請求項１から１１のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１３】
前記ニワトリが、前記改変されたＩｇＨ遺伝子座についてホモ接合性である、請求項１から１２のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１４】
前記ニワトリが前記改変されたＩｇＨ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、前記相同染色体の前記ＩｇＨ遺伝子座がノックアウトされている、請求項１から１３のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１５】
前記ニワトリが前記改変されたＩｇＨ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、前記相同染色体の前記ＩｇＨ遺伝子座が野生型である、請求項１から１４のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１６】
前記ニワトリが前記改変されたＩｇＨ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、前記相同染色体の前記ＩｇＨ遺伝子座がその隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体を欠く、請求項１４に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１７】
前記ニワトリが前記改変されたＩｇＨ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、前記相同染色体の前記ＩｇＨ遺伝子座がＪ領域を欠く、請求項１４に記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１８】
前記ニワトリによって産生された前記抗体が、前記重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域において多様化されている、請求項１から１７のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【請求項１９】
その相同染色体の一方または両方においてその隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体を欠く、トランスジェニックニワトリ。
【請求項２０】
請求項１から１９のいずれかに記載の前記トランスジェニックニワトリに由来するＢ細胞。
【請求項２１】
（ａ）請求項１から２０のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリを抗原で免疫する工程、および
（ｂ）前記ニワトリから、前記抗原に特異的に結合する抗体を得る工程
を含む方法。
【請求項２２】
前記抗体がポリクローナルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記抗体がモノクローナルである、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
（ｃ）前記トランスジェニックニワトリのＢ細胞を使用してハイブリドーマを調製する工程、および
（ｄ）前記ハイブリドーマをスクリーニングして、前記抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを特定する工程
をさらに含む、請求項２１から２３のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
ＰＣＲを使用して、前記トランスジェニック動物のＢ細胞からの前記重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸を増幅し、前記増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させる工程をさらに含む、請求項２１から２４のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
請求項１から１９のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリによって産生される抗体。
【請求項２７】
方法であって
（ａ）前記隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体をニワトリの前記免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座から削除する工程、および
（ｂ）構築物を前記遺伝子座に挿入する工程を含み、前記構築物が、
（ｉ）免疫グロブリン重鎖遺伝子プロモーター、
（ｉｉ）ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３配列を含む可変ドメインのコード配列を含む生殖系列ヒトＶＨセグメント、
（ｉｉｉ）ヒトＤクラスター、
（ｉｖ）ヒトＪセグメント、および
（ｖｉ）それぞれが（ｂ）（ｉｉ）の前記機能的なヒトＶＨセグメントと実質的に同じＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３配列と、偽遺伝子ごとに異なるＣＤＲ１およびＣＤＲ２コード配列とを含む構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３の複数の偽遺伝子
を含み、
工程（ａ）および（ｂ）が任意の順序で行われる、
方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年３月２１日に提出された米国仮出願番号第６２／６４６，３１９号の利益を主張するものである。この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
すべての高等脊椎動物と同様に、ニワトリのＢ細胞の発生の重要なチェックポイントは、インフレームのＶ（Ｄ）Ｊ再配置であり、細胞の表面での機能的なＢ細胞受容体複合体の発現に至る（１〜３）。ニワトリでの再配置のプロセスでは、哺乳類と同じ組換えシグナル配列と酵素を利用して、Ｖ、Ｄ、Ｊ遺伝子を機能的なＶ領域に再結合する（４〜８）。ニワトリの主な違いは、ヒトにおいての多数の多様なＶ、Ｄ、Ｊ遺伝子ではなく、軽鎖と重鎖の両方の遺伝子座に１つだけの生殖系列Ｖ遺伝子と単一の生殖系列Ｊ遺伝子があり、重鎖には非常に類似したＤセグメントのクラスターがあることである（５、８）。したがって、再配置のプロセスは、最初のＢ細胞レパートリーでの配列多様性をほとんど生じない。不完全な結合とＶ−ＪおよびＶ−Ｄ−Ｊジャンクションでのエキソヌクレアーゼによるチューイングバックは、いくらかの多様性を生み出す可能性があるが、ニワトリＢ細胞はＴｄＴを発現しないため（９）、ＣＤＲ−Ｈ３にはＮの付加がなく、一般に、遺伝子再配置プロセスにより作り出される免疫グロブリンの多様性は最小限である（５、１０、１１）。
【０００３】
ニワトリは多様なレパートリーを調製するために、軽鎖および重鎖遺伝子座の上流偽遺伝子が配列供与体として機能し、発現した機能的なＶを変異させる遺伝子変換のプロセスを採用している（８、１１〜１３）。これらの偽遺伝子にはプロモーターまたは組換えシグナル配列が含まれていないため、それらを発現させることはできないが、それらの配列は様々な長さのセグメントにおいて単一の機能的なＶに組み込まれる。プール内の異なる偽遺伝子からの重複する遺伝子変換が複数回行われると、非常に多様なナイーブなレパートリーに至る。遺伝子変換に加えて、非テンプレートの体細胞超変異はレパートリーの多様性にも貢献している（１４〜１６）。ニワトリにおいてＶ（Ｄ）Ｊの再配置の制限があるにもかかわらず、ＣＤＲ−Ｈ３は、哺乳動物におけるそれに匹敵する長さと配列の多様性を示す（１、１７）。Ｖ（Ｄ）Ｊの再配置におけるニワトリ型Ｄの機能は、ほとんどのＤが単一のシステイン残基をコードし、Ｄ−Ｄ結合がこのため対のシステインをコードするため、抗原結合ループの安定化のためのＣＤＲ−Ｈ３内ジスルフィド架橋の実現にいっそう関連している可能性がある（１７）。ニワトリのＣＤＲ−Ｈ３の多様性は、再配置プロセス自体ではなく、遺伝子変換／体細胞超変異に起因する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
本開示は、ヒト型抗体を産生するトランスジェニックニワトリを提供する。
【０００５】
本開示は、とりわけ、改変された免疫グロブリン重鎖の免疫グロブリン遺伝子座を有するトランスジェニックニワトリを提供している。改変された遺伝子座は、内因性Ｖ−Ｄ−Ｊ領域を有さず、代わりに、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤクラスター、ヒトＪセグメントおよびヒトＶＨ配列に基づく複数の上流の偽遺伝子を有する。改変されたＩｇＨ遺伝子座はニワトリでＶ（Ｄ）Ｊの組換えを経て、上流の偽遺伝子とヒトＶＨセグメント間の遺伝子変換が起こり、ニワトリは多様な免疫グロブリン重鎖を有する抗体を産生し、これは長さの異なるＣＤＲ３を含む。
【０００６】
本発明のトランスジェニックニワトリは、組換え抗体を産生するように設計されている他のトランスジェニックニワトリを凌ぐ特定の利点を有し得る。例えば、本トランスジェニックニワトリのＩｇＨ遺伝子座には内因性Ｖ−Ｄ−Ｊ領域がなく、そのためＶ（Ｄ）Ｊの組換え中に（例えば、ニワトリのＤとヒトのＪとの間の組換えによって）ヒト型配列が除かれない。さらに、マウスでは、Ｖ−Ｄ−Ｊの領域には生殖能力に不可欠な遺伝子が含まれている（つまり、ａｄａｍ６ａ遺伝子およびａｄａｍ６ｂ遺伝子である。例えば、Marcello et al J.Biol.Chem.2011 286:13060-70ならびに米国特許第８，６９７，９４０号を参照）。ニワトリのゲノムの内因性Ｖ−Ｄ−Ｊ領域の完全な配列は現在不明である。そのため、ニワトリのゲノムの内因性Ｖ−Ｄ−Ｊ領域に必須遺伝子が含まれているか、隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体を欠くＩｇＨ遺伝子座を含むニワトリを調製できるかどうかは不明であった。さらに、トランスジェニックニワトリは、Ｖ（Ｄ）Ｊの組換え、遺伝子変換、および体細胞超変異の組み合わせが多様化の一因となる、多様化した免疫グロブリン重鎖を有する抗体を産生する。最後に、（ａ）重鎖ＣＤＲ３の多様性がかなりの量でＶ（Ｄ）Ｊの組換え（遺伝子変換のみとは対照的）を介して達成され、（ｂ）ニワトリのターミナルトランスフェラーゼの欠如がＤ遺伝子によってコードされるものに対してＣＤＲの長さを制限するため、ニワトリによって産生される抗体は短くなり、ニワトリ型抗体よりも「ヒト型」であると考えることができる（通常、ニワトリで選択されているＤ−Ｄ結合により、重鎖ＣＤＲ３が長い）。
【０００７】
野生型のニワトリでは、タンデムのＤ−Ｄ結合によって、またおそらく遺伝子変換によって、より長いＣＤＲ−Ｈ３が産生される。これは、配列の挿入、配列の削除、および単に配列の変更に使用できる。したがって、ターミナルトランスフェラーゼがなくても、ＣＤＲ−Ｈ３は依然長くなる可能性がある。本ニワトリでは、ＣＤＲ−Ｈ３は野生型のニワトリおよびヒトのＣＤＲ−Ｈ３よりも短く、Ｖ、Ｄ、Ｊをチューイングバックせずに単純に結合することで生じる１６〜２３のアミノ酸の理論上の範囲よりも短く、本ニワトリに長いＣＤＲを調製するＤ−Ｄ結合または他のメカニズムがないことを示唆している。本ニワトリから調製された抗体をヒトから得た抗体と比較すると、ＣＤＲ−Ｈ３は本ニワトリにおいて短い（平均の長さ＝１２、対してヒトでは１５〜１６）。
【０００８】
トランスジェニックニワトリの調製方法および使用方法、ならびにニワトリによって産生された抗体組成物も提供される。
【０００９】
本発明のいくつかの態様は、添付の図面と併せて以下の詳細な説明を読み取ると、この説明から最もよく理解され得る。一般的な慣行に従って、図面の様々な特徴は縮尺通りではないことを強調しておく。実際、様々な特徴の寸法は、明確にするために任意に拡大または縮小されている。図面には次の図が含まれている。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】ニワトリにおける事前再配置および再配置されたヒトＶＨセグメントの図を提示している。ＳｙｎＶＨ−Ｃ（事前再配置）およびＳｙｎＶＨ−ＳＤ（再配置）導入遺伝子と重鎖ノックアウト（ＩｇＨ−Ｊ  ＫＯ）のスケール図である。ヒト型配列は赤、ニワトリ型は青で示されている。最上行のＳｙｎＶＨ−Ｃ導入遺伝子は、ヒト偽遺伝子の上流のアレイを有する事前再配置されたヒトＶ領域（ｈＶＤＪ）からなる。ヒトＶ領域は下流のニワトリ定常領域に対してスプライスする（Ｃｍｕのみを示している）。ニワトリ生殖系列のＶ遺伝子およびＤ遺伝子、ならびに偽遺伝子のアレイは、ヒトＶ遺伝子の上流にある。ニワトリ偽遺伝子の正確なマッピングは示されていない（カッコで示されている）が、機能的なニワトリＶまでの距離は正確である。挿入事象の残りのｌｏｘＰ部位とａｔｔＲ部位が示されている。中央の行のＳｙｎＶＨ−ＳＤ導入遺伝子には、単一のヒト生殖系列ＶＨ３−２３遺伝子、単一のＪＨ６遺伝子、および２４個の固有のヒトＤが含まれている。すべての介在配列と組換え部位は、ニワトリ重鎖遺伝子座（青色で示す）に由来する。ヒト生殖系列Ｖ遺伝子の上流は、ヒト型に基づく偽遺伝子のアレイである。上流のニワトリ生殖系列のＶ遺伝子およびＤ遺伝子は削除されているが、ニワトリ偽遺伝子はまだ存在している。  最下行は、ニワトリ重鎖ノックアウトの構造（２１）である。この研究におけるトランスジェニックニワトリの遺伝子型は、ＳｙｎＶＨ−ＣまたはＳＤの「ノックイン」／ＩｇＨのノックアウトであった。単一のニワトリＪＨ遺伝子は、プロモーターのないｎｅｏ遺伝子に置き換えられた。ｎｅｏ遺伝子に隣接するａｔｔＰ部位は、ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤの構築物が挿入された後、Ｃｒｅ−ｌｏｘの組換えにより選択可能マーカーとプラスミドバックボーン配列が削除される。
【図２】Ａ〜Ｂは、トランスジェニックニワトリで観察されたシグナルペプチドの変化および生殖系列シグナルペプチド配列の整列の図を提示している。ＳｙｎＶＨ−ＳＤのシグナルペプチドはＳｙｎＶＨ−Ｃよりも疎水性が低く、変化して疎水性が高くなる。Ａは、トランスジェニックニワトリで観察されたシグナルペプチドの変化の図である。シグナルペプチドは、ニワトリシグナルペプチドのエクソンをヒトＶ領域のエクソンにスプライシングすることによって、またはＶ領域のエクソンの部分の遺伝子変換から、ニワトリ型配列に変えることができる。ヒトのシグナルペプチドは黄色、ニワトリはオレンジ色で示されている。各タイプのシグナルペプチドの平均疎水性（Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ、正規化なし）が示されている。Ｂは、ＷＴニワトリＶＨセグメント、ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤからの生殖系列シグナルペプチド配列の整列である。Ｖ領域のエクソンにコードされている４つのアミノ酸は赤色である。ＳｙｎＶＨ−ＳＤで疎水性残基に変異することが多いリジン残基を囲んでいる。平均疎水性は右に示されている。
【図３】ＣＤＲ−Ｈ３の長さを提示している。ＣＤＲ−Ｈ３の長さは、ＳｙｎＶＨ−ＳＤでより広い分布を示す。すべての配列（「未選択」、上の２つのパネル）から得たＣＤＲ−Ｈ３の長さは、ＩＭＧＴの位置１０５〜１１７に基づいて計算され、明確なＣＤＲ−Ｈ３（ＳｙｎＶＨ−Ｃの場合Ｎ＝３，０９９，３５５、ＳｙｎＶＨ−ＳＤの場合Ｎ＝１，０５０，３９８）を有するすべての配列の各々の長さの頻度に基づいてプロットされた。エラーバーはトリの間での変動を示す。ＳｙｎＶＨ−ＣはＮ＝６羽、ＳｙｎＶＨ−ＳＤはＮ＝３羽。平均とＳＤが得られる。下の２つのパネルは、ＰＧＲＮ固有のｍＡｂのＣＤＲ−Ｈ３の長さを示している。
【図４】ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤのアミノ酸の頻度を提示している。ＣＤＲ−Ｈ３のＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤのアミノ酸の頻度は、ほとんどのアミノ酸にとって類似したものである。Ｖ遺伝子またはＪ遺伝子（１０７〜１０９または１１１）によって寄与されない位置における、ＣＤＲ−Ｈ３の総アミノ酸含有量からの各アミノ酸の頻度である。各々のトリから得る上位１０００の固有の配列からの１２、１３、１４、および１５の残基の特異的なＣＤＲ−Ｈ３の長さを使用して頻度を計算し、次いでそれを平均した。エラーバーはトリの間での変動を示す。ＳｙｎＶＨ−ＣはＮ＝６羽、ＳｙｎＶＨ−ＳＤはＮ＝３羽。
【図５−１】ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤにおけるＣＤＲ−Ｈ３の配列多様性を示す。ＣＤＲ−Ｈ３の配列の多様性は、ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤで類似している。ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤの１２残基（上の２つのパネル）と１５残基（下の２つのパネル）の特定の長さについて、ＣＤＲ−Ｈ３のＩＭＧＴの位置１０５〜１１７の位置各々についてシャノンのエントロピーとアミノ酸分布を示す。配列は、各々のトリの上位１０００配列から抽出された。ＳｙｎＶＨ−Ｃは６羽、ＳｙｎＶＨ−ＳＤは３羽である。
【図５−２】ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤにおけるＣＤＲ−Ｈ３の配列多様性を示す。ＣＤＲ−Ｈ３の配列の多様性は、ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤで類似している。ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤの１２残基（上の２つのパネル）と１５残基（下の２つのパネル）の特定の長さについて、ＣＤＲ−Ｈ３のＩＭＧＴの位置１０５〜１１７の位置各々についてシャノンのエントロピーとアミノ酸分布を示す。配列は、各々のトリの上位１０００配列から抽出された。ＳｙｎＶＨ−Ｃは６羽、ＳｙｎＶＨ−ＳＤは３羽である。
【図５−３】ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤにおけるＣＤＲ−Ｈ３の配列多様性を示す。ＣＤＲ−Ｈ３の配列の多様性は、ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤで類似している。ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤの１２残基（上の２つのパネル）と１５残基（下の２つのパネル）の特定の長さについて、ＣＤＲ−Ｈ３のＩＭＧＴの位置１０５〜１１７の位置各々についてシャノンのエントロピーとアミノ酸分布を示す。配列は、各々のトリの上位１０００配列から抽出された。ＳｙｎＶＨ−Ｃは６羽、ＳｙｎＶＨ−ＳＤは３羽である。
【図５−４】ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤにおけるＣＤＲ−Ｈ３の配列多様性を示す。ＣＤＲ−Ｈ３の配列の多様性は、ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤで類似している。ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤの１２残基（上の２つのパネル）と１５残基（下の２つのパネル）の特定の長さについて、ＣＤＲ−Ｈ３のＩＭＧＴの位置１０５〜１１７の位置各々についてシャノンのエントロピーとアミノ酸分布を示す。配列は、各々のトリの上位１０００配列から抽出された。ＳｙｎＶＨ−Ｃは６羽、ＳｙｎＶＨ−ＳＤは３羽である。
【図６】ｓｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤにおけるＣＤＲ−Ｈ３の疎水性を示す。ＣＤＲ−Ｈ３の疎水性は、ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤで類似している。長さ１２〜１５残基（ＩＭＧＴの位置１０５〜１１７）のＣＤＲ−Ｈ３の正規化されたＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅスケール（３４、３５）に基づく平均疎水性が、各々のトリの上位１０００配列に対して計算された。各疎水性の頻度の値（０．１の増分にグループ化）がグラフに示されている。
【図７】ＮＧＳデータにおけるｍＡｂ配列の頻度を示す。ＮＧＳデータ内のｍＡｂ配列の頻度は、ＧＥＭスクリーニングによって特定された多くのｍＡｂが脾臓集団ではまれであることを示している。ＧＥＭスクリーンで特定された各抗原特異的ｍＡｂ配列の回数が、各々のトリのすべての配列データで検出された。示しているように、ｍＡｂは、トリと導入遺伝子、ＳｙｎＶＨ−ＣまたはＳｙｎＶＨ−ＳＤのいずれかでグループ化される。各々のトリから得たｍＡｂの数が、プロットの下に表示されている。データセット全体で５回以下配列されたｍＡｂは赤色で示され、ＧＥＭスクリーンでまれなｍＡｂが見出されたことを示している。
【図８】各構築物における機能的なＶ配列を有するヒト設計偽遺伝子の整列を示す。ＳｙｎＶＨ−Ｃの場合、多様なＣＤＲ−Ｈ１、２、および３配列が、ヒトＶＨ３−２３遺伝子でクエリされたＮＩＨ  ＥＳＴデータベースから取得された。生殖系列ＶＨ３−２３フレームワーク配列は、偽遺伝子の一部に含まれていたが、他のものは、生殖系列に対して９つの変更がある体細胞由来の配列である機能的なＶＨ配列（ＨｕＶＨ、最上行）と一致している。ＳｙｎＶＨ−ＳＤの場合、ＣＤＲ−Ｈ１および２は、ヒトＶＨ３ファミリーメンバーに由来し、ＶＨ３−２３フレームワークの足場に配置された。特定のＣＤＲ−Ｈ３配列は含まれていなかった。示されている配列は、偽遺伝子の間に配置されたスペーサーである。（ＨｕＶＨは配列番号６に示されている；ＳｙｎＶＨ４８は配列番号７に示されている；ＳｙｎＶＨ４９は配列番号８に示されている；ＳｙｎＶＨ３８は配列番号９に示されている；ＳｙｎＶＨ３９は配列番号１０に示されている；ＳｙｎＶＨ４０は配列番号１１に示されている；ＳｙｎＶＨ４１は配列番号１２に示されている；ＳｙｎＶＨ４２は配列番号１３に示されている；ＳｙｎＶＨ４３は配列番号１４に示されている；ＳｙｎＶＨ４４は配列番号１５に示されている；ＳｙｎＶＨ４５は配列番号１６に示されている；ＳｙｎＶＨ４６は配列番号１７に示されている；ＳｙｎＶＨ４７は配列番号１８に示されている；ＳｙｎＶＨ５０は配列番号１９に示されている；ＳｙｎＶＨ５１は配列番号２０に示されている；ＳｙｎＶＨ５２は配列番号２１に示されている；ＳｙｎＶＨ５３は配列番号２２に示されている；ＳｙｎＶＨ５４は配列番号２３に示されている；ＳｙｎＶＨ５５は配列番号２４に示されている；ＳｙｎＶＨ５６は配列番号２５に示されている；ＳｙｎＶＨ５７は配列番号２６に示されている；ＨｕＶＤＪは配列番号２７に示されている；ＳｙｎＶＨ５８は配列番号２８に示されている；ＳｙｎＶＨ５９は配列番号２９に示されている；ＳｙｎＶＨ６０は配列番号３０に示されている；ＳｙｎＶＨ６１は配列番号３１に示されている；ＳｙｎＶＨ６２は配列番号３２に示されている；ＳｙｎＶＨ６３は配列番号３３に示されている；ＳｙｎＶＨ６４は配列番号３４に示されている；ＳｙｎＶＨ６５は配列番号３５に示されている；ＳｙｎＶＨ７０は配列番号３６に示されている；ＳｙｎＶＨ７１は配列番号３７に示されている；ＳｙｎＶＨ７２は配列番号３８に示されている；ＳｙｎＶＨ７３は配列番号３９に示されている；ＳｙｎＶＨ７４は配列番号４０に示されている）。
【図９】ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤからの整列されたすべてのＶ領域の配列に対するシャノンのエントロピーを示す。各々のトリの上位１０００配列が含まれていた。ＣＤＲの名称（ＩＭＧＴ）が示されている。
【図１０】ＣＲＩＳＰＲでのターゲティングの戦略である。Ａは、ＣＲＩＳＰＲターゲティングに使用されるＰＧＣ株４７２−１３８に存在するニワトリＩｇＨ遺伝子座の図である。ＩｇＨ遺伝子座には、Ｄクラスターと定常領域の間に以前に取得したＪＨ遺伝子セグメントのノックアウト（ＪＨ−ＫＯ）が含まれており（Ｃμのみを示している）、これは選択可能なマーカーカセットに置き換えられた。ｇＲＮＡ１〜４は、単一の機能的なＶＨ領域（矢印で示されている）の上流の領域を標的にするように設計され、ｇＲＮＡ５はＥＧＦＰ遺伝子を標的にするように設計された。Ｂは、株４７２−１３８のＰＧＣが、ＥＧＦＰに特異的なＣａｓ９またはＣａｓ９／ｇＲＮＡ５を含む構築物を一時的にトランスフェクトした。培養９日後、フローサイトメトリーで細胞を緑色蛍光の喪失について分析した。
【図１１】ＰＧＣにおけるＩｇＨ  ＫＯ６ＢのＣＲＩＳＰＲ媒介性標的化である。Ａは、ＩｇＨ遺伝子座の詳細図である。ｇＲＮＡの設計に使用されたＩｇＨ  ＫＯ６Ｂの５’と３’の相同領域間の１２２ｂｐ配列が上部に示されている。ｇＲＮＡ１〜４の位置は配列の上に青い線で示され、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）は赤い線で示される。修復ベクターＩｇＨ  ＫＯ６Ｂ（下）には、黄色の５’および３’相同領域（ＨＲ）、単一のｌｏｘＰ部位（青い矢印）、およびハイグロマイシン選択カセット（オレンジ）が含まれている。５’および３’ターゲティングアッセイのプライマー結合部位の位置が、黒い矢印で示されている。ＪＨ−ＫＯの下流の選択可能なマーカーは、ｌｏｘＰが導入されたＥＧＦＰ（緑色の囲み）とｐｕｒｏ遺伝子（青色の囲み）、および反対方向のプロモーターのないｎｅｏ遺伝子（ピンク色の囲み）からなる。ｌｏｘＰ部位は青い矢印である。Ｂは、５’ターゲティングアッセイが、４つの異なるｇＲＮＡを、Ｃａｓ９およびＩｇＨ  ＫＯ６Ｂとともに４７２−１３８細胞に同時にトランスフェクションして得られた独立した非クローン細胞集団に対して行われた。各ｇＲＮＡトランスフェクションについて、３つのハイグロマイシン耐性集団を分析した。陽性コントロール（＋）は機能的なＶ領域のノックアウトを含むＤＴ４０細胞株であり［２２］、陰性コントロール（−）は親ＩｇＨ  ＫＯ６Ｂプラスミドであった。Ｃは、ｇＲＮＡ２で得られた９つの独立したクローンで実行された５’および３’ターゲティングアッセイ（１２のクローンがあったが、クローン４、７、１２はより増殖が遅く、現時点では検証されていない）。バンド強度の変動は、テンプレートのｇＤＮＡ量の変動によるものと思われる。これは、採取した細胞の数が正規化されていないためである。陰性コントロール（−）はＪＨ−ＫＯトランスジェニックトリからのゲノムＤＮＡであり、陽性コントロール（＋）はＢのｇＲＮＡ２実験からの細胞（Ｇ２）のプールであった。ＮＴは、テンプレートのコントロールがないことである。Ｄは、細胞株１７８３−１０キメラから野生型への繁殖から得られたＥＧＦＰ＋のトリに対して行われた同じ５’および３’ターゲティングアッセイである。
【図１２】ＣＲＩＳＰＲ標的化ｌｏｘＰ部位のＣｒｅ組換えである。Ａは、Ｃｒｅ組換え前後の標的ＩｇＨ遺伝子座の図である。ＣＲＩＳＰＲ標的化ｌｏｘＰ部位の上流にあるフォワードプライマーを、ＪＨ−ＫＯカセットのｌｏｘＰ部位の下流にある２つの異なるリバースプライマーと共に使用した。非組み換え対立遺伝子では、フォワードプライマーとリバースプライマーは染色体で約２８ｋｂ離れている。Ｃｒｅ組換え後、単一のｌｏｘＰ部位とプロモーターのないｎｅｏ遺伝子が残り、プライマーは１．６または２ｋｂ離れており、容易に増幅される。Ｂは組換え細胞のＰＣＲである。Ｃｒｅ＋：Ｃｒｅでトランスフェクションされた１７８３−９細胞のｇＤＮＡテンプレート。Ｃｒｅ−、親１７８３−９細胞。ＪＨ−ＫＯ、ヘテロ接合性ＪＨ−ＫＯのトリからのｇＤＮＡ；ＮＴＣ、テンプレートコントロールなし。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
「トランスジェニックニワトリ」という語句は、外来の核酸（すなわち、ニワトリに固有ではない組換え核酸）を含む細胞を含む動物を指す。外来の核酸は、一倍体生殖細胞の一部の潜在可能性のある例外を伴うニワトリのすべての細胞に存在するはずのものである。外来の核酸分子は「導入遺伝子」と呼ばれ、ニワトリ由来ではない１つまたは多くの遺伝子などを含み得る。トランスジェニックニワトリは、生殖系列で安定して外来の核酸を伝播することができる。
【００１２】
「イントロン」という用語は、大半の真核生物の多くの遺伝子配列の中ごろに見られるＤＮＡの配列を指す。これらのイントロン配列は転写されるが、ｍＲＮＡがタンパク質に翻訳される前に、プレｍＲＮＡ転写産物内から除去される。このイントロン除去のプロセスは、イントロンの両側にある配列（エクソン）を共にスプライスすることによって行われる。
【００１３】
「作動可能に連結された」という用語は、一方の機能が他方によって影響を受けるようにした、単一の核酸断片での核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターが、そのコード配列の発現に影響を与えることができる（すなわち、コード配列がプロモーターの転写制御下にある）場合、それはコード配列と作動可能に連結されている。同様に、イントロンがコード配列に作動可能に連結されている場合、イントロンはｍＲＮＡからスプライシングされて、コード配列の発現をもたらす。遺伝子変換の文脈において、一方の配列が遺伝子変換によって他方に配列を「供与」できる場合、２つの核酸配列は作動可能に連結されている。２つの配列が連結されておらず、一方が遺伝子変換を介して他方に配列を供与できる場合、つまり他に介入する遺伝子が他にない場合、供与する配列は他方の上流または下流にあり得、２つの配列は互いに近接できる。「連結されていない」とは、会合する遺伝要素が互いに密接に関連しておらず、一方の機能が他方に影響を与えないことを意味する。
【００１４】
「上流」および「下流」という用語は、転写の方向に関して使用される。
【００１５】
「偽遺伝子」という用語は、開始コドンおよび／または終止コドンを含んでも含まなくてもよいオープンリーディングフレームを含む未転写の核酸領域を説明するために使用される。アミノ酸配列は、オープンリーディングフレームのヌクレオチド配列がインシリコで翻訳されてアミノ酸配列を生成することができるという意味で、偽遺伝子によって「コード」され得る。重鎖および軽鎖免疫グロブリン遺伝子座の文脈では、偽遺伝子はプロモーター領域、組換えシグナル配列またはリーダー配列を含まない。
【００１６】
「ホモ接合性」という用語は、同一の対立遺伝子が相同染色体上の同じ遺伝子座に存在することを示す。対照的に、「ヘテロ接合性」は、異なる対立遺伝子が相同染色体上の同じ遺伝子座に存在することを示す。トランスジェニック動物は、導入遺伝子に関してホモ接合性またはヘテロ接合性であり得る。
【００１７】
遺伝子に関して「内因性」という用語は、遺伝子が細胞に固有であること、すなわち、遺伝子が非改変細胞のゲノムの特定の遺伝子座に存在することを示す。内因性遺伝子は、（自然に見られるような）野生型細胞のその遺伝子座に存在する野生型遺伝子であり得る。内因性遺伝子は、野生型遺伝子と同じゲノム内の遺伝子座に存在する場合、改変された内因性遺伝子である可能性がある。このような改変された内因性遺伝子の例は、外来の核酸が挿入される遺伝子である。内因性遺伝子は、核ゲノム、ミトコンドリアゲノムなどに存在する可能性がある。
【００１８】
「構築物」という用語は、特定のヌクレオチド配列の発現を目的として生成された、または他の組換えヌクレオチド配列の構築に使用される組換え核酸、一般的には組換えＤＮＡを指す。構築物は、ベクターまたはゲノムに存在することができる。
【００１９】
「組換え」という用語は、宿主細胞において自然に生じないポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。組換え分子は、自然に生じない方法で共に連結された、２つまたはそれ以上の自然に生じた配列を含み得る。組換え細胞は、組換えポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。細胞が組換え核酸を受け入れる場合、その核酸は細胞にとって「外因性」である。
【００２０】
「選択可能マーカー」という用語は、導入された核酸またはベクターを含有する宿主の容易な選択を可能にする、宿主で発現可能なタンパク質を指す。選択可能マーカーの例には、抗菌剤（例えば、ハイグロマイシン、ブレオマイシン、またはクロラムフェニコール）に対する耐性を与えるタンパク質、宿主細胞に栄養上の利点などの代謝上の利点を与えるタンパク質、ならびに細胞に機能的または表現型の利点（例えば、細胞分裂）を与えるタンパク質を含むがこれらに限定されない。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、遺伝子の核酸配列に基づいてポリペプチドが産生されるプロセスを指す。このプロセスには、転写と翻訳の両方が含まれる。
【００２２】
核酸配列を細胞に挿入することに関して「導入される」という用語は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の組み込みへの言及を含む。核酸配列は、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、またはミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれるか、自律レプリコンに変換されるか、一過性に発現される（例えば、トランスフェクトされたｍＲＮＡ）ことができる。
【００２３】
ある遺伝子座を別の遺伝子座で置き換えるという文脈において、「置き換える」という用語は、単一工程のプロトコルまたは複数の工程のプロトコルを指す。
【００２４】
「コード配列」という用語は、適切な調節要素の制御下に置かれた場合に、タンパク質の一部をコードする核酸配列を指す。本明細書で使用されるコード配列は、連続的なＯＲＦを有し得るか、ＯＲＦの一部であり得るか、イントロンまたは非コード配列の存在によって中断されたＯＲＦを有し得る。偽遺伝子は、転写されていないコード配列を含み得る。
【００２５】
「〜に逆向きに」という用語は、異なる鎖にあるコード配列を指す。例えば、転写された領域が偽遺伝子に対して逆方向にあると説明されている場合、転写された領域によってコードされたアミノ酸配列は上部または下部の鎖によってコードされ、偽遺伝子によってコードされたアミノ酸配列は転写される領域に対して他の鎖によってコードされる。
【００２６】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、本明細書では互換的に使用される。これらの用語は、当業者によってよく理解されており、抗原に特異的に結合する１つまたはそれ以上のポリペプチドからなるタンパク質を指す。抗体の１つの形態は、抗体の基本的な構造単位を構成する。この形態は四量体であり、抗体鎖の２つの同一の対からなり、各対は１つの軽鎖と１つの重鎖を有している。各対では、軽鎖と重鎖の可変領域が共に抗原との結合を担い、定常領域が抗体のエフェクター機能を担っている。
【００２７】
認識されている免疫グロブリンポリペプチドには、カッパおよびラムダの軽鎖と、アルファ、ガンマ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）、デルタ、イプシロン、ミューの重鎖または他の種の同等物が含まれる。全長免疫グロブリンの「軽鎖」（約２５ｋＤａまたは約２１４アミノ酸）は、ＮＨ２末端に約１１０アミノ酸の可変領域と、ＣＯＯＨ末端にカッパまたはラムダの定常領域を含む。全長の免疫グロブリンの「重鎖」（約５０ｋＤａまたは約４４６アミノ酸）は、同様に、可変領域（約１１６アミノ酸）および前述の重鎖定常領域、例えばガンマ（約３３０アミノ酸）の１つを含む。
【００２８】
「抗体」および「免疫グロブリン」という用語は、任意のアイソタイプの抗体または免疫グロブリン、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、およびＦｄ断片を含むがこれらに限定されない、抗原への特異的結合を保持する抗体の断片、キメラ抗体、ヒト化抗体、一本鎖抗体、および抗体の抗原結合部分および非抗体タンパク質を含む融合タンパク質を含む。抗体は、例えば、放射性同位元素、検出可能な産生物を産生する酵素、蛍光タンパク質などで検出可能に標識することができる。抗体はさらに、例えばビオチン（ビオチン−アビジン特異的結合対のメンバー）などの特異的結合対のメンバーなどの他の部分にコンジュゲートされてもよい。抗体はまた、ポリスチレンプレートまたはビーズなどを含むがこれらに限定されない固体支持体に結合され得る。この用語には、Ｆａｂ’、Ｆｖ、Ｆ（ａｂ’）２、およびまたは抗原への特異的結合を保持するその他の抗体断片、ならびにモノクローナル抗体およびポリクローナル抗体も含まれる。
【００２９】
抗体は、他の多様な形態、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、（Ｆａｂ’）２、および二機能性（すなわち、二重特異性）ハイブリッド抗体（例えば、Lanzavecchia et al.,Eur.J.Immunol.17,105(1987)）および一本鎖（例えばHuston et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,85,5879-5883(1988)およびBird et al.,Science,242,423-426(1988)、これらは参照により本明細書に組み込まれる）で存在している。（全体的には、Hood et al.,「Immunology」,Benjamin,N.Y.,2nd ed.(1984)、およびHunkapiller and Hood,Nature,323,15-16(1986)を参照）。
【００３０】
免疫グロブリン軽鎖または重鎖可変領域は、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域（ＦＲ）からなる。フレームワーク領域とＣＤＲの範囲は正確に定められている（Lefranc et al,IMGT,the international ImMunoGeneTics information system.Nucleic Acids Res.2009 vol.37（データベースでの刊行：D1006-12.Epub 2008 Oct 31を参照されたい；imgt.orgのワールドワイド・ウェブサイトを参照されたい。これは以降「ＩＭＧＴシステム」と称される）。本明細書で論じるすべての抗体アミノ酸配列の番号付けは、ＩＭＧＴシステムに準拠している。異なる軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種の中で比較的保存されている。抗体のフレームワーク領域、つまり構成する軽鎖と重鎖のフレームワーク領域を組み合わせたものは、ＣＤＲの配置と整列に役立つ。ＣＤＲは主に、抗原のエピトープへの結合を司る。
【００３１】
キメラ抗体は、その軽鎖および重鎖の遺伝子が、典型的には遺伝子工学によって、異なる種に属する抗体の可変領域および定常領域の遺伝子で構築されている抗体である。例えば、ニワトリまたはウサギのモノクローナル抗体から得る遺伝子の可変セグメントは、ガンマ１やガンマ３などのヒト定常セグメントに結合することができる。治療用キメラ抗体の例は、ニワトリまたはウサギの抗体から得る可変または抗原結合ドメイン、およびヒト抗体から得る定常またはエフェクタードメインで構成されるハイブリッドタンパク質である（例えば、Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ．受託番号ＣＲＬ  ９６８８の細胞によって作られた抗Ｔａｃキメラ抗体）。ただし、他の哺乳動物の種を使用することもできる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「ヒトフレームワーク」という用語は、ヒトの抗体のアミノ酸配列、例えば、抗体のヒト生殖系列配列のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一、例えば、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有するフレームワークを指す。特定の場合において、ヒトフレームワークは完全にヒトのフレームワークであり得、その場合、フレームワークは、例えば生殖系列抗体などのヒト抗体のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ヒト化抗体」または「ヒト化免疫グロブリン」という用語は、ヒトの抗体から得る対応する位置にあるアミノ酸で置換されている（例えば、フレームワーク領域、定常領域またはＣＤＲにおいて）１つまたはそれ以上のアミノ酸を含む非ヒト抗体を指す。一般に、ヒト化抗体は、同じ抗体の非ヒト化のものと比較して、ヒトである宿主において低減された免疫応答を生じると予想される。
【００３４】
本発明の方法によって設計および産生されたヒト化抗体は、抗原結合または他の抗体の機能に実質的に影響を及ぼさない追加の保存的アミノ酸置換を有し得ることが理解される。保存的置換とは、以下のｇｌｙ、ａｌａ；ｖａｌ、ｉｌｅ、ｌｅｕ；ａｓｐ、ｇｌｕ；ａｓｎ、ｇｌｎ；ｓｅｒ、ｔｈｒ；ｌｙｓ、ａｒｇ；およびｐｈｅ、ｔｙｒという群から得るものなどの意図された組み合わせである。同じ群に存在しないアミノ酸は、「実質的に異なる」アミノ酸である。
【００３５】
「特異的結合」という用語は、異なる分析物の均一な混合物中に存在する特定の分析物に優先的に結合する抗体の能力を指す。特定の実施形態では、特異的結合の相互作用は、サンプルの望ましい分析物と望ましくない分析物とを区別し、いくつかの実施形態では、約１０〜１００倍を超えるまたはそれ以上（例えば、約１０００倍を超える、または１０，０００倍を超える）である。
【００３６】
特定の実施形態では、抗体／分析物複合体に特異的に結合する場合の抗体と分析物との間の親和性は、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、または約１０−１２Ｍ未満またはそれ以下のＫＤ（解離定数）によって特徴付けられる。
【００３７】
抗体の重鎖または軽鎖の「可変領域」は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤ３、およびフレームワーク領域を含む鎖のＮ末端成熟ドメインである。抗体の重鎖と軽鎖の両方に可変ドメインが含まれている。すべてのドメイン、ＣＤＲ、および残基の番号は、配列のアラインメントと構造の知識に基づいて割り当てられる。フレームワークとＣＤＲ残基の特定と番号付けは、ＩＭＧＴシステムで定められている。
【００３８】
ＶＨは抗体の重鎖の可変ドメインである。ＶＬは抗体の軽鎖の可変ドメインである。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、単離された抗体の文脈で使用されている場合、精製前に抗体が関連している他の成分から少なくとも６０％遊離、少なくとも７５％遊離、少なくとも９０％遊離、少なくとも９５％遊離、少なくとも９８％遊離、さらに少なくとも９９％遊離している目的の抗体を指す。
【００４０】
「治療」、「治療すること」などの用語は、本明細書では、哺乳動物、例えば特にヒトまたはマウスにおけるいずれかの疾患または状態のいずれかの治療を指すために使用され、ａ）疾患の素因がある可能性があるが、それを有するとまだ診断されていない対象において、疾患、状態、あるいは疾患または状態の症状が生じるのを防ぐこと、ｂ）疾患、状態、または疾患もしくは状態の症状を阻害すること、例えば、その発生を停止すること、および／または患者におけるその発症もしくは発現を遅らせること、および／またはｃ）疾患または状態、または疾患または状態の症状を緩和すること、例えば、状態または疾患および／またはその症状の退行を引き起こすことを含む。
【００４１】
「対象」、「宿主」、「患者」、および「個体」という用語は、本明細書において互換的に使用され、診断または治療が望まれる任意の哺乳動物の対象、特にヒトを指す。その他の対象には、ウシ、イヌ、ネコ、モルモット、ウサギ、ラット、マウス、ウマなどが含まれ得る。
【００４２】
「自然な」抗体は、抗体の重鎖および軽鎖免疫グロブリンが、多細胞生物の免疫系によって自然に選択される抗体であり、例えば、ファージディスプレイなどにより作られる自然の対の抗体ではないものと反対である。そのため、特定の抗体には、いずれのウイルス（バクテリオファージＭ１３など）由来の配列も含まれていない。脾臓、リンパ節および骨髄は動物の自然の抗体を産生する組織の例である。
【００４３】
核酸配列を細胞に挿入する文脈での「導入される」という用語は、「トランスフェクション」または「形質転換」または「形質導入」を意味し、真核細胞または原核細胞への核酸配列の組み込みへの言及を含む。核酸配列は、細胞内に一過性に存在する場合もあれば、細胞のゲノム（例えば、染色体、プラスミド、色素体、ミトコンドリアＤＮＡ）に組み込まれ、自律したレプリコンに変換される場合もある。
【００４４】
「複数」という用語は、少なくとも２、少なくとも５、少なくとも１０、少なくとも２０、少なくとも５０、少なくとも１００、少なくとも２００、少なくとも５００、少なくとも１０００、少なくとも２０００、少なくとも５０００、または少なくとも１０，０００または少なくとも５０，０００またはそれ以上を指す。特定の場合において、複数は少なくとも１０から５０を含む。他の実施形態では、複数は少なくとも５０から１，０００であってもよい。
【００４５】
さらなる定義が本開示の他の場所にある場合もある。
例示的な実施形態の説明
【００４６】
免疫グロブリン重鎖免疫グロブリン遺伝子座が改変されたトランスジェニックニワトリが提示される。上記および以下でより詳細に説明されるように、改変された遺伝子座は、内因性Ｖ−Ｄ−Ｊ領域を有さず、代わりに、ヒトＶＨセグメント、ヒトＤクラスター、ヒトＪセグメントおよびヒトＶＨ配列に基づく複数の上流の偽遺伝子を有する。改変されたＩｇＨ遺伝子座はニワトリにおいてＶ（Ｄ）Ｊの組換えを経て、上流の偽遺伝子とヒトＶＨセグメント間の遺伝子変換が起こり、ニワトリは多様な免疫グロブリン重鎖を有する抗体を産生する。
【００４７】
本主題の発明をさらに説明する前に、本発明は、説明された特定の実施形態に限定されず、したがって当然ながら変動があり得ることを理解されたい。本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、限定することを意図するものではないことも理解されたい。
【００４８】
値の範囲が提示されている場合、文脈が別様に明確に指示しない限り、その範囲の上限と下限の間、およびその述べられた範囲のいずれかの他に述べられるまたは介入する各値は、下限の単位の１０分の１まで、本発明の範囲に含まれることが理解される。
【００４９】
他に定義されない限り、本明細書で使用されているすべての専門用語および科学用語は、本発明が属する当業者によって一般的に理解されているものと共通の意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または等価ないずれかの方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料をこれより記載する。本明細書で言及されるすべての刊行物は、刊行物が引用されることに関連する方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み入れられる。
【００５０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎｄ」、および「ｔｈｅ」は、文脈から明らかにそうでないと示されない限り、複数の指示対象を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「細胞」への言及は複数の細胞を含み、「候補薬剤」への言及は１つまたはそれ以上の候補薬剤、および当業者に公知のその同等物などへの言及を含む。さらに、特許請求の範囲は、いずれかの任意の要素を除外するように立案されてもよいことに留意されたい。このように、この声明は、クレーム要素の列挙、または「否定的な」制限の使用に関連して、「単独」、「唯一」などの排他的な用語を使用するための先行基準として機能することを意図している。
【００５１】
本明細書で論じられる刊行物は、それらが本願の出願日より前の開示であることだけのために提示されている。本明細書のいかなるものも、本発明が先行の発明によりそのような刊行物に先立つ権利を与えられないことを承認するものとして解釈されるべきではない。さらに、提示されている発行日は実際の発行日とは異なる場合があり、個別に確認する必要がある場合がある。
【００５２】
本明細書で引用されたすべての刊行物および特許は、あたかも個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように参照により本明細書に組み込まれ、刊行物が引用されている、関連する方法および／または材料を開示および説明するために、参照により本明細書に組み込まれる。いかなる刊行物の引用も、出願日より前のその開示に対するものであり、本発明が、先行の発明によりそのような刊行物に先立つ権利がないことを認めるものとして解釈されるべきではない。さらに、提示されている発行日は実際の発行日とは異なる場合があり、個別に確認する必要がある場合がある。
【００５３】
本開示を読んだ当業者には明らかなように、本明細書で説明および図示した個々の実施形態のそれぞれは、本発明の範囲または精神から逸脱することなく、他のいずれかのいくつかの実施形態の特徴から容易に分離または組み合わせることができる個別の構成要素および特徴を有する。いずれの列挙された方法も、列挙された事象の順序で、または論理的に可能な他のいずれかの順序で実行できる。
トランスジェニックニワトリとその調製方法
【００５４】
改変された内因性免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座を含むゲノムを含むトランスジェニックニワトリが提示される。この改変された遺伝子座は、図１に「ＳｙｎＶＨ−ＳＤ」として模式的に示されている。示されているように、改変された遺伝子座は、隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体を欠いている。この遺伝子座のこの配列は現在不明であるが、長さが１０〜１２ｋｂ（例えば、約１１ｋｂ）、または少なくとも１５ｋｂ（例えば、長さが１５ｋｂ〜２５ｋｂ、または長さが約２０ｋｂ）の範囲であると考えられている。以下の実施例のセクションで説明する結果に基づくと、野生型遺伝子座には、他の動物（マウスなど）とは異なり、（内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ配列以外の）いずれの必須遺伝子も含まれていない。内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域を削除すると、以下に説明するＶ−Ｄ−Ｊヒト配列とのＶ（Ｄ）Ｊの組換えが防止される。そのような組み換え事象は、遺伝子座の多くを除去し、そのことによってそれを不活性化する。内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域を削除すると、これらの事象の発生が防止される。
【００５５】
隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体が欠如していることに加えて、遺伝子座は、（ｉ）免疫グロブリン重鎖遺伝子プロモーター、例えば、ニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子プロモーター、（ｉｉ）生殖系列ヒトＶＨセグメント、この場合、生殖系列ヒトＶＨセグメントは、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３を含む可変ドメインのコード配列を含む、を作動可能な連結で含む。ＶＨセグメントは、当分野では、時に「生殖系列ＶＨ遺伝子」、「機能的なＶＨセグメント」または「生殖系列ＶＨ配列」と呼ばれる。偽遺伝子を除いて、一倍体ヒトゲノムには４０を超える生殖系列ＶＨセグメントがあると考えられており（例えば、Kohsaka et al,J.Clin.Invest.1996 98:2794-800を参照）、少なくとも７つのファミリーに分類できる（例えば、Schroeder et al International Immunology,2:41-50 1989を参照）。いくつかの実施形態では、ヒト生殖系列ＶＨセグメントは、例えば、ＶＨ３ファミリー、ＶＨ１ファミリーまたはＶＨ４ファミリーに由来し得る。そのようなセグメントは、重鎖ＣＤＲ３およびＦＲ４コード配列を欠いている。
【００５６】
図１に示すように、生殖系列のヒトＶＨセグメントの下流にある、改変遺伝子座には、（ｉｉｉ）ヒトＤクラスター（すなわち、ニワトリのゲノムからの配列（つまり、介在配列）と分離できる例えば一連の１０〜２７のヒト多様性（Ｄ）遺伝子セグメント、ならびに単一のヒト結合（Ｊ）セグメント（例えば、ヒト生殖系列の６つのＪセグメントの１つ。例えば、Li et al Blood 2004 103:4602-4409を参照）も含まれる。いくつかの実施形態では、Ｄセグメントのシステインの任意のコドンを変異させて、別のアミノ酸、例えばチロシンまたはトリプトファンをコードし、ニワトリによって産生される抗体（特に重鎖ＣＤＲ３領域において）においてジスルフィド結合を最小化することができる。変数（Ｖ）、多様性（Ｄ）、および結合（Ｊ）の遺伝子セグメントに隣接する組換えシグナル配列（ＲＳＳ）は、ニワトリ由来である可能性があるが、配列がほぼ同じであるため、ニワトリリコンビナーゼはヒトＲＲＳを認識するはずである。
【００５７】
Ｊセグメントの下流で、遺伝子座は、ニワトリに内因性であってもよい定常領域をコードする複数の配列を含む。遺伝子座には、Ｊセグメントの転写産物の３’末端を定常領域コード配列のコピーの５’末端に結合するイントロンが含まれている。示されるように、改変された遺伝子座はまた、生殖系列ヒトＶＨセグメントの上流に複数の偽遺伝子（例えば、少なくとも１０または１０〜３０の偽遺伝子）を含み、この場合、偽遺伝子は構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３のものであり、（ｉ）偽遺伝子のＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３セグメント（すなわち、抗体の重鎖ＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３配列を「コードする」配列）は、生殖系列ヒトＶＨセグメントの対応するセグメントとしてＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３セグメントと実質的に同じである（すなわち、少なくとも９５％同じまたは同一である配列を有する）配列をそれぞれ有し、また（ｉｉ）ＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列は、生殖系列ヒトＶＨセグメントと同じファミリーである異なるヒトＶＨセグメントによってコードされるＣＤＲ１およびＣＤＲ２をコードし得る。例えば、ヒト生殖系列ＶＨセグメントがＶＨ３ファミリーのメンバーである場合、偽遺伝子にはそのセグメントのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３配列と、ＶＨ３ファミリーの他のヒト生殖系列ＶＨセグメントのＣＤＲ１／ＣＤＲ２配列が含まれる。同様に、ヒト生殖系列ＶＨセグメントがＶＨ１ファミリーのメンバーである場合、偽遺伝子にはそのセグメントのＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３配列と、ＶＨ１ファミリーの他のヒト生殖系列ＶＨセグメントのＣＤＲ１／ＣＤＲ２配列などが含まれる。いくつかの実施形態では、偽遺伝子は、生殖系列ヒトＶＨセグメントに対して逆方向にある。生殖系列ヒトＶＨセグメントは、以下の配列から選択できる：ＶＨ１−１８、ＶＨ１−２、ＶＨ１−２４、ＶＨ１−３、ＶＨ１−４５、ＶＨ１−４６、ＶＨ１−５８、ＶＨ１−６９、ＶＨ１−８、ＶＨ２−２６、ＶＨ２−５、ＶＨ２−７０、ＶＨ３−１１、ＶＨ３−１３、ＶＨ３−１５、ＶＨ３−１６、ＶＨ３−２０、ＶＨ３−２１、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ３−３３、ＶＨ３−３５、ＶＨ３−３８、ＶＨ３−４３、ＶＨ３−４８、ＶＨ３−４９、ＶＨ３−５３、ＶＨ３−６４、ＶＨ３−６６、ＶＨ３−７、ＶＨ３−７２、ＶＨ３−７３、ＶＨ３−７４、ＶＨ３−９、ＶＨ４−２８、ＶＨ４−３１、ＶＨ４−３４、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−４、ＶＨ４−５９、ＶＨ４−６１、ＶＨ５−５１、ＶＨ６−１、およびＶＨ７−８１。異なる生殖系列配列の説明については、ＰＣＴ国際公開第２００５／００５６０４号を参照されたい。
【００５８】
上記のように、ヒト生殖系列ＶＨセグメントと偽遺伝子のＦＷセグメントは互いに同一であり得るが、ヒト生殖系列ＶＨセグメントと偽遺伝子のＣＤＲセグメントは異なり得、そのため、偽遺伝子と生殖系列配列のＣＤＲセグメント間で遺伝子変換が生じ得る。さらに、ＣＤＲは長さが異なり得る。特定の実施形態では、重鎖ＣＤＲ１は長さが６〜１２アミノ酸残基の範囲であってよく、重鎖ＣＤＲ２は長さが４〜１２アミノ酸残基の範囲であってよく、重鎖ＣＤＲ３は長さが３〜２５アミノ酸残基の範囲であってよい、ただしこれらの範囲以外の長さのＣＤＲを有する抗体が想定されている。
【００５９】
上記の構成と図１に示すように、改変されたＩｇＨ遺伝子座はニワトリでＶ（Ｄ）Ｊの組換えを経て、複数の生殖系列ヒトＶＨ偽遺伝子は、遺伝子変換により、Ｖ（Ｄ）Ｊの組換え後にヌクレオチド配列を生殖系列ヒトＶＨセグメントに（少なくとも生殖系列ヒトＶＨセグメントのＣＤＲ１およびＣＤＲ２コード配列へ）供与し、またニワトリは多様な免疫グロブリン重鎖を含む抗体を産生する。ニワトリによって産生される抗体は、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域で多様であり、重鎖ＣＤＲ３の長さの中央値は１１〜１３、例えば約１２残基である。ＣＤＲ３領域は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えおよび体細胞超変異によって選択されたＤセグメントによって多様化される。ニワトリにはＴｄＴがないため、重鎖ＣＤＲ３の長さがＤ遺伝子によってコードされる長さ、および／または遺伝子変換によって挿入できる長さに制限されており、そのため、重鎖ＣＤＲ３は野生型のニワトリと比べて比較的短く、ヒトの抗体と数個しかないＤ−Ｄ結合が観察された。
【００６０】
ニワトリは、改変されたＩｇＨ遺伝子座についてホモ接合性であるか、改変されたＩｇＨ遺伝子座についてヘテロ接合性であり得る。このニワトリが、改変されたＩｇＨ遺伝子座に対してヘテロ接合性である場合、相同染色体の内因性ＩｇＨ遺伝子座がノックアウトされる可能性がある。例えば、いくつかの実施形態では、相同染色体の内因性ＩｇＨ遺伝子座は、そのＪ領域またはその隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体を欠いている場合がある。ニワトリはまた、野生型ＩｇＨ遺伝子座のヘテロ接合性である場合もある。
【００６１】
特定の実施形態では、トランスジェニックニワトリはまた、ニワトリの軽鎖定常領域に連結された免疫グロブリン軽鎖Ｖ領域、またはヒトの軽鎖定常領域、例えば、ヒトの免疫グロブリン軽鎖に連結されたヒトＶ領域を発現でき、その結果、ニワトリによって産生される抗体が、ヒトＶ領域とニワトリの定常領域を有する完全にヒトまたはキメラの軽鎖となる。
【００６２】
特定の実施形態では、対象のトランスジェニック動物によって産生される抗体は、ニワトリ定常ドメイン、およびヒト型である可変ドメインを含み得る。内因性定常領域をこれらの実施形態で使用することができるので、抗体は依然としてクラススイッチングおよび親和性の成熟を経ることができ、これにより動物は正常な免疫系の発達ができ、正常な免疫応答を開始することができる。特定の実施形態では、トランスジェニックニワトリは、ＩｇＭ、ＩｇＹおよびＩｇＡをコードする重鎖遺伝子座に３つの内因性定常領域を有する。Ｂ細胞の発生の初期段階に、Ｂ細胞はＩｇＭを発現する。親和性の成熟が進むと、クラススイッチングにより定常領域がＩｇＹまたはＩｇＡに変換される。ＩｇＹは、成体と、卵黄に蓄積されたリザーブを介して約２００ｍｇのＩｇＹを受け取る新生のヒヨコの両方に、体液性免疫をもたらす。ＩｇＡは主にリンパ組織（脾臓、パイエル板、ハーダー腺など）と卵管に見出されるが、少量が卵に移行し、その後発生中の胚に取り込まれる。
【００６３】
上記のように、その相同染色体の一方または両方においてその隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体を欠くトランスジェニックニワトリも提供される。トランスジェニックニワトリ由来のＢ細胞も提供される。
【００６４】
トランスジェニックニワトリを調製する方法が提供される。特定の実施形態では、方法は、（ａ）隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体をニワトリの免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座から削除すること、および（ｂ）（ｉ）免疫グロブリン重鎖遺伝子プロモーター、（ｉｉ）ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３を含む可変ドメインのコード配列を含む生殖系列ヒトＶＨセグメント、（ｉｉｉ）ヒトＤクラスター、（ｉｖ）ヒトＪセグメント、および（ｖｉ）それぞれが（ｂ）（ｉｉ）の機能的なヒトＶＨセグメントと実質的に同じＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３コード配列と、ＣＤＲ１およびＣＤＲ２コード配列とを含む複数の偽遺伝子を含む構築物を遺伝子座に挿入することを含む。工程（ａ）と（ｂ）は任意の順序で実行できる。しかし、非コード配列（イントロン）は、内に含まれ得る内因性の調節要素を保存するために、内因性の構成で保持され得る。
【００６５】
対象のトランスジェニック動物が調製されると、抗原で動物を免疫することにより、その抗原に対する抗体を容易に得ることができる。様々な抗原を使用して、トランスジェニック宿主動物を免疫することができる。そのような抗原は、微生物、例えば、ウイルスおよび単細胞生物（細菌や真菌など）、生きている、弱毒化されている、または死んでいる、微生物の断片、または微生物から単離された抗原分子を含む。
【００６６】
一部の実施形態では、この方法は、（ａ）上記のトランスジェニックニワトリを抗原で免疫すること、および（ｂ）トランスジェニックニワトリから、抗原に特異的に結合する抗体、例えばポリクローナルまたはモノクローナル抗体を取得することを含み得る。いくつかの実施形態では、方法は、（ｃ）トランスジェニックニワトリのＢ細胞を使用してハイブリドーマを調製すること、および（ｄ）当該ハイブリドーマをスクリーニングして、抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを特定することを含み得る。この方法は、ＰＣＲを使用してトランスジェニック動物のＢ細胞から重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸を増幅し、当該の増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させることをさらに含み得る。また、モノクローナル抗体は、ＧＥＭアッセイ（米国特許第８０３００９５号および第８４１５１７３号；Izquierdo et al,2014）を使用して、ディープシーケンシングまたはその他いずれかのＢ細胞の調査技術（例えば、Abcelleraのウェブサイトを参照）によってトランスジェニックニワトリから回収することができる。
【００６７】
特定の実施形態では、トランスジェニックニワトリは、ＧＤ２、ＥＧＦ−Ｒ、ＣＥＡ、ＣＤ５２、ＣＤ２０、Ｌｙｍ−１、ＣＤ６、補体活性化受容体（ＣＡＲ）、ＥＧＰ４０、ＶＥＧＦ、腫瘍関連糖タンパク質ＴＡＧ−７２  ＡＦＰ（α−フェトプロテイン）、ＢＬｙＳ（ＴＮＦおよびＡＰＯＬ関連リガンド）、ＣＡ１２５（癌抗原１２５）、ＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ＣＤ２（Ｔ細胞表面抗原）、ＣＤ３（ＴＣＲに関連するヘテロマルチマー）、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ（インテグリンα−Ｌ）、ＣＤ１４（単球分化抗原）、ＣＤ２０、ＣＤ２２（Ｂ細胞受容体）、ＣＤ２３（低親和性ＩｇＥ受容体）、ＣＤ２５（ＩＬ−２受容体α鎖）、ＣＤ３０（サイトカイン受容体）、ＣＤ３３（骨髄細胞表面抗原）、ＣＤ４０（腫瘍壊死因子受容体）、ＣＤ４４ｖ６（白血球の接着を仲介）、ＣＤ５２（ＣＡＭＰＡＴＨ−１）、ＣＤ８０（ＣＤ２８およびＣＴＬＡ−４の共刺激因子）、補体成分Ｃ５、ＣＴＬＡ、ＥＧＦＲ、エオタキシン（サイトカインＡ１１）、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＬＡ−ＤＲ、ＨＬＡ−ＤＲ１０、ＨＬＡ  ＣｌａｓｓＩＩ、ＩｇＥ、ＧＰｉｉｂ／ｉｉｉａ（インテグリン）、インテグリンａＶβ３、インテグリンａ４β１およびａ４β７、インテグリンβ２、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６Ｒ（ＩＬ６受容体）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＫＤＲ（ＶＥＧＦＲ−２）、ルイジー、メソセリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１８、ＮＣＡＭ（神経細胞接着分子）、癌胎児性フィブロネクチン、ＰＤＧＦβＲ（ベータ血小板由来成長因子受容体）、ＰＭＳＡ、治療用の抗体を産生するための腎癌抗原Ｇ２５０、ＲＳＶ、Ｅ−セレクチン、ＴＧＦβ１、ＴＧＦβ２、ＴＮＦα、ＤＲ４、ＤＲ５、ＤＲ６、ＶＡＰ−１（血管接着タンパク質１）またはＶＥＧＦなどにより免疫され得る。
【００６８】
抗原は、アジュバントの有無にかかわらず、任意の便利な方法でトランスジェニックニワトリに投与することができ、所定のスケジュールに従って投与できる。
【００６９】
免疫後、免疫したトランスジェニック動物の血清を分画して、抗原に特異的な医薬品グレードのポリクローナル抗体を精製できる。トランスジェニックトリの場合、卵黄を分画することによって抗体を調製することもできる。濃縮した精製免疫グロブリン画分は、クロマトグラフィー（親和性、イオン交換、ゲルろ過など）、硫酸アンモニウムなどの塩、エタノールなどの有機溶媒、またはポリエチレングリコールなどのポリマーによる選択的沈殿によって取得できる。
【００７０】
モノクローナル抗体を調製するために、抗体産生細胞、例えば、脾臓細胞または他の細胞は、免疫化したトランスジェニック動物から単離することができ、またハイブリドーマの産生のために形質転換細胞株との細胞融合で使用するか、抗体をコードするｃＤＮＡを標準的な分子生物学的な技術でクローニングしたりトランスフェクト細胞で発現させたりする際に使用することができる。モノクローナル抗体を調製するための手順は、当分野で十分に確立されている。例えば、欧州特許出願第０  ５８３  ９８０号Ａ１、米国特許第４，９７７，０８１号、国際公開第９７／１６５３７号、および欧州特許第０  ４９１  ０５７号Ｂ１を参照されたい。これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。クローン化されたｃＤＮＡ分子からのモノクローナル抗体のインビトロでの産生は、Andris-Widhopf et al., J Immunol Methods 242:159(2000)およびBurton,Immunotechnology 1:87(1995)によって記載されており、その開示は本明細書に参照により組み込まれている。
【００７１】
抗体の組成およびスクリーニングの方法
抗体の組成が提供される。上記のように、抗体の重鎖および軽鎖可変ドメインは、動物の免疫系によって、自然に対になっている。そのような抗体は、特定の場合において、宿主細胞によって翻訳後に改変（例えば、グリコシル化）されることがあり、トランスジェニックニワトリの種に特徴的なグリコシル化パターンおよび組成を有し得る。
【００７２】
対象のトランスジェニックニワトリによって産生された抗体をスクリーニングして、目的の抗体を特定することができる。一般に、この方法は、上記の方法を使用してモノクローナル抗体を産生する複数のハイブリッド細胞を産生すること、およびアッセイの１つまたは様々な組み合わせを利用して複数のモノクローナル抗体をスクリーニングすることを伴う。一般に、これらのアッセイは機能的アッセイであり、以下のように、つまり抗体の結合親和性または特異性を検出するアッセイと、抗体がプロセスを阻害する能力を検出するアッセイとにグループ化できる。
【００７３】
抗原との特異的結合活性または阻害活性を有すると特定されたモノクローナル抗体は、目的のモノクローナル抗体と呼ばれている。
【００７４】
結合アッセイ
これらのアッセイで、抗体が基質に特異的に結合する能力について検証されている。抗体結合の文脈において「特異的に」という用語は、特定の抗原、すなわちポリペプチド、またはエピトープに対する抗体の高いアビディティおよび／または高い親和性での結合を指す。多くの実施形態で、特異的抗原は、抗体産生細胞が単離された動物の宿主を免疫するために使用される抗原（または抗原の断片または亜分画）である。抗原またはその断片に特異的に結合する抗体は、同じ抗体の他の抗原への結合よりも強い。ポリペプチドに特異的に結合する抗体は、弱いが検出可能なレベル（例えば、目的のポリペプチドに示される結合の１０％以下）で他のポリペプチドに結合することができる場合がある。そのような弱い結合、またはバックグラウンド結合は、例えば適切なコントロールを使用することによって、対象のポリペプチドへの特異的な抗体結合から容易に識別可能である。一般に、特異的な抗体は、１０−７Ｍ以上、例えば１０−８Ｍ以上（例えば、１０−９Ｍ、１０−１０、１０−１１など）の結合の親和性で抗原に結合する。一般に、１０−６Ｍ以下の結合の親和性の抗体は、現在使用されている従来型の方法論を使用して検出可能なレベルでは抗原に結合しないという点で、有用ではない。
【００７５】
典型的には、スクリーニングアッセイを実施する際、抗体産生宿主細胞のライブラリーによって産生された抗体サンプルは、各抗体を特定できるような方法で固体支持体に堆積される。例えば、プレートの番号とプレートでの位置、または抗体を産生した宿主細胞の培養の特定を可能にする別の識別子による方法で堆積される。
【００７６】
本発明の抗体は、当分野で公知の任意の方法によって免疫特異的結合についてスクリーニングされ得る。使用できるイムノアッセイには、いくつか例を挙げると、ウエスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降アッセイ、沈降素反応、ゲル拡散沈降素反応、免疫拡散アッセイ、凝集アッセイ、補体固定アッセイ、免疫放射測定アッセイ、蛍光イムノアッセイ、およびプロテインＡイムノアッセイなどの手法を使用した競合および非競合アッセイシステムが含まれるが、これらに限定されない。そのようなアッセイは日常的であり、当分野で周知である（例えば、Ausubel et al,eds,1994,Current Protocols in Molecular Biology,Vol.1,John Wiley&Sons,Inc.,New Yorkを参照、これは全体が参照により本明細書に組み込まれる）。例示的なイムノアッセイを以下に簡単に説明する（ただし、限定することを意図したものではない）。
【００７７】
免疫沈降プロトコルは一般に、タンパク質ホスファターゼおよび／またはプロテアーゼ阻害剤（例えば、ＥＤＴＡ、ＰＭＳＦ、アプロチニン、バナジン酸ナトリウム）を添加した溶解バッファー、例えばＲＩＰＡバッファー（１％ＮＰ−４０またはＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、１％デオキシコール酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、０．１５ＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．２での０．０１Ｍのリン酸ナトリウム、１％のＴｒａｓｙｌｏｌ）で細胞の集団を溶解すること、目的の抗体を細胞溶解物に添加すること、一定時間（例えば、１〜４時間）４℃でインキュベートすること、プロテインＡおよび／またはプロテインＧセファロースビーズを細胞溶解物に添加すること、４℃で約１時間またはそれ以上インキュベートすること、ビーズを溶解バッファーで洗浄すること、およびビーズをＳＤＳ／サンプルバッファーに再懸濁することを伴う。特定の抗原を免疫沈降させる目的の抗体の能力は、例えば、ウエスタンブロット分析によって評価することができる。当業者は、抗体の抗原への結合を増加させ、バックグラウンドを減少させるように改変することができるパラメーター（例えば、セファロースビーズで細胞溶解物を事前に清澄にすること）について精通している。
【００７８】
ウエスタンブロット分析は、一般にタンパク質のサンプルの調製、それに続くポリアクリルアミドゲルでのタンパク質のサンプルの電気泳動（例えば、抗原の分子量に応じて８％〜２０％のＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、および単離されたタンパク質のサンプルの、ポリアクリルアミドゲルから膜、例えば、ニトロセルロース、ＰＶＤＦ、またはナイロンへの移行を伴う。移行後、膜をブロッキング溶液（例えば、３％のＢＳＡを含むＰＢＳまたは脱脂乳）でブロックし、洗浄バッファー（例えば、ＰＢＳ−Ｔｗｅｅｎ  ２０）で洗浄し、ブロッキングバッファーで希釈した一次抗体（目的の抗体）でインキュベートする。このインキュベーション後、膜を洗浄バッファーで洗浄し、酵素基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼやアルカリホスファターゼ）、または放射性分子（例えば、３２Ｐまたは１２５Ｉ）にコンジュゲートする二次抗体（一次抗体、例えば抗ヒト抗体を認識する）でインキュベートし、さらに洗浄した後、抗原の存在を検出することができる。当業者は、検出されるシグナルを増加させ、バックグラウンドノイズを減少させるために改変され得るパラメーターに関して精通している。
【００７９】
ＥＬＩＳＡは、抗原を調製し、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェルを抗原でコーティングし、酵素基質（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼまたはアルカリ性ホスファターゼ）などの検出可能な化合物にコンジュゲートした目的の抗体をウェルに添加し、一定時間インキュベートし、抗原の存在を検出することを伴う。ＥＬＩＳＡでは、目的の抗体を検出可能な化合物にコンジュゲートする必要はなく、代わりに、検出可能な化合物にコンジュゲートした二次抗体（目的の抗体を認識する）をウェルに加えることができる。さらに、ウェルを抗原でコーティングする代わりに、抗体をウェルにコーティングしてもよい。この場合、コーティングされたウェルに目的の抗原を添加した後、検出可能な化合物にコンジュゲートした二次抗体を添加することができる。当業者は、検出されるシグナルを増加させるために改変され得るパラメーター、ならびに当分野で公知のＥＬＩＳＡの他のバリエーションについて精通している。
【００８０】
抗原に対する抗体の結合親和性および抗体−抗原の相互作用のオフレートは、競合結合アッセイにより判定することができる。競合結合アッセイの１つの例は、標識された抗原（３Ｈまたは１２５Ｉなど）を、目的の抗体で、標識されていない漸増量の抗原の存在下でインキュベートし、標識された抗原に結合した抗体を検出することを含むラジオイムノアッセイである。特定の抗原に対する目的の抗体の親和性および結合のオフレートは、スキャッチャードプロット分析によるデータから判定することができる。二次抗体との競合は、ラジオイムノアッセイを使用して判定することもできる。この場合、抗原は、標識されていない漸増量の二次抗体の存在下で、標識された化合物（例えば、３Ｈまたは１２５Ｉ）にコンジュゲートされる目的の抗体でインキュベートされる。
【００８１】
本発明の抗体は、抗原の発現を可能にするベクター、または当分野で一般に公知の技術を使用するベクターのみでトランスフェクトされた細胞（例えば、ＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞）に対する免疫細胞化学法を使用してスクリーニングすることができる。抗原トランスフェクト細胞に結合するがベクターのみのトランスフェクト細胞には結合しない抗体は、抗原特異的である。
【００８２】
しかし、特定の実施形態では、アッセイは抗原捕捉アッセイであり、抗体のアレイまたはマイクロアレイをこの目的で使用することができる。ポリペプチドのマイクロアレイを調製および使用する方法は当分野で公知である（例えば、米国特許第６，３７２，４８３号、第６，３５２，８４２号、第６，３４６，４１６号および第６，２４２，２６６号を参照）。
【００８３】
阻害物質のアッセイ
特定の実施形態では、アッセイは、第１の化合物と第２の化合物（例えば、２つの生体高分子化合物）の間の相互作用に対する抗体の特異的阻害を測定する、または反応（例えば酵素反応）を特異的に阻害する。相互作用阻害アッセイでは、１つの相互作用基質、通常は生体高分子化合物、例えばタンパク質、例えば受容体は、反応容器の固体支持体に結合することができる。抗体を反応容器に加え、続いて基質の検出可能な結合パートナー、通常は生体高分子化合物、例えばタンパク質、例えば受容体の放射性標識リガンドを加える。容器を洗浄した後、容器に存在する検出可能な結合パートナーの量を判定することにより、相互作用の阻害を測定することができる。相互作用の阻害は、抗体を含まないコントロールのアッセイと比較して、結合パートナーの結合が約２０％超、約５０％超、約７０％超、約８０％超、または約９０％超、または９５％超またはそれ以上減少した場合に発生する。
【００８４】
反応阻害アッセイにおいて、酵素は反応容器の固体支持体に結合され得る。通常、抗体を反応容器に加え、続いて酵素の基質を加える。多くの実施形態で、酵素と基質との間の反応の生成物は検出可能であり、一定の時間の後、反応は通常停止される。反応が停止した後、容器に存在する検出可能な反応生成物のレベルを測定することにより、反応阻害を測定することができる。反応の阻害は、抗体を含まないコントロールのアッセイと比較して、反応の速度が約２０％超、約５０％超、約７０％超、約８０％超、または約９０％超、または９５％超またはそれ以上減少した場合に発生する。
【００８５】
インビボのアッセイ
特定の実施形態では、モノクローナル抗体はインビボで検証される。一般に、方法は、対象のモノクローナル抗体を疾患または状態のために動物モデルに投与し、モデルの動物の疾患または状態に対するモノクローナル抗体の効果を判定することを含む。本発明のインビボのアッセイはコントロールを含み、この場合適切なコントロールは、モノクローナル抗体の非存在下のサンプルを含む。一般に、複数のアッセイ混合物は、様々な濃度に対する異なる応答を得るために、異なる抗体の濃度で並行して実行される。典型的には、これらの濃度の１つが陰性のコントロールとして機能する。つまり、濃度がゼロまたは検出レベル未満である。
【００８６】
対象のモノクローナル抗体は、動物モデルの疾患または状態の症状を調節する、すなわち抗体の非存在下でのコントロールと比較したときに、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、またはそれ以上増やすまたは減らすものである。一般に、目的のモノクローナル抗体は、対象の動物を、疾患または状態に罹患していない同等の動物にいっそう類似させる。本発明の方法および組成物を使用して特定された治療的価値を有するモノクローナル抗体は、「治療的」抗体と呼ばれる。
【００８７】
目的の抗体を発現するハイブリッド細胞は免疫グロブリン重鎖および軽鎖をコードする核酸を含むので、目的のモノクローナル抗体を発現する宿主細胞が特定されれば、目的のモノクローナル抗体をコードする核酸を特定することができる。したがって、対象の核酸は、当業者に公知の様々な方法によって特定することができる。同様の方法は、ハイブリドーマ技術を使用してモノクローナル抗体の産生における宿主細胞の培養を特定するために使用される（Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,First Edition(1988)Cold spring Harbor,N.Y.）。
【００８８】
例えば、目的のモノクローナル抗体を特定すると、目的の抗体を発現する宿主細胞は、すべての抗体サンプルについて、対応する宿主細胞培養物を列挙している「ルックアップ」テーブルを使用して特定され得る。特定の他の実施形態では、抗体ライブラリーのサンプル識別子、対応する発現カセットライブラリーのサンプル識別子、および／または宿主細胞識別子を含むルックアップテーブルを使用して、対象の核酸を特定することができる。
【００８９】
一度特定されると、目的のモノクローナル抗体をコードする核酸は、当業者によく知られている技術を使用して回収、特徴付けおよび操作することができる（Ausubel,et al,Short Protocols in Molecular Biology,3rd ed.,Wiley&Sons,(1995)、およびSambrook,et al,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Third Edition,(2001)Cold Spring Harbor,N.Y.）。
【００９０】
抗体の発現
目的のモノクローナル抗体を産生するいくつかの方法も、提供される。一般に、これらの方法は、目的のモノクローナル抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の産生に十分な条件下でインキュベートすることを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、目的のモノクローナル抗体を産生する方法は、目的のモノクローナル抗体の特定された発現カセットを、適切なベクターに移入し、組換えベクターを宿主細胞に移入してモノクローナル抗体の発現をもたらすことを含む。いくつかの実施形態では、対象の方法は、少なくとも可変ドメインをコードする配列を、特定された重鎖および軽鎖から、免疫グロブリン重鎖および軽鎖におけるそれらの発現に適したベクターに、移入することを含む。この時点で、適切な定常ドメインをコードする配列および／または他の抗体ドメインをコードする配列を、可変ドメインをコードする配列に、追加することができる。これらの核酸の改変はまた、対象の抗体のヒト化を可能にし得る。
【００９２】
対象のモノクローナル抗体は、当分野で公知である、抗体の合成のためのいずれかの方法によって、特に組換え発現技術によって、産生することができる。
【００９３】
対象のモノクローナル抗体、またはその断片、誘導体、もしくはアナログの組換えの発現は、通常、抗体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターの構築を必要とする。当業者に周知の方法を使用して、抗体コード配列ならびに適切な転写および翻訳を制御するシグナルを含む発現ベクターを、構築することができる。これらの方法には、例えば、インビトロの組換えＤＮＡの技術および合成技術が含まれる。したがって、本発明は、本発明の抗体分子をコードするヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【００９４】
発現ベクターは、従来の技術によって宿主細胞に移入され、次いでトランスフェクトされた細胞は、対象の抗体を産生するために培養される。ほとんどの実施形態では、重鎖と軽鎖の両方をコードするベクターを宿主細胞で共発現させて、免疫グロブリン分子全体の発現をもたらす。
【００９５】
対象のモノクローナル抗体を発現させるために、様々な宿主発現ベクターのシステムを利用することができる。これらは、微生物、例えば組み換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、または抗体コード配列を含むコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換される細菌（大腸菌、枯草菌など）；抗体コード配列を含む組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母（例えば、サッカロミセス、ピキア）；抗体コード配列を含む組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス）に感染した昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染した、または抗体コード配列を含む組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換された植物細胞系；または哺乳動物細胞のゲノム（例えば、メタロチオネインプロモーター）または哺乳動物のウイルス（例えば、アデノウイルス後期プロモーター；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモーター）に由来するプロモーターを含む組換え発現構築物を保持する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、３Ｔ３細胞など）を含むが、これらに限定されない。多くの実施形態では、細菌細胞、例えば大腸菌、および真核細胞が、組換え抗体分子全体の発現に使用される。例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）などの哺乳動物の細胞は、ヒトサイトメガロウイルスの主要な中間的な初期遺伝子プロモーター要素などのベクターと組み合わされており、抗体に対する効果的な発現システムである（Foecking et al.,Gene 45:101(1986);Cockett et al.,Bio/Technology 8:2(1990)）。
【００９６】
細菌のシステムでは、発現される抗体分子の意図される用途に応じて、いくつかの発現ベクターを選択することができる。例えば、抗体分子の医薬組成物を生成するために、そのようなタンパク質が大量に産生される場合、容易に精製される高レベルの融合タンパク質産生物を発現するよう方向づけるベクターが望ましい場合がある。そのようなベクターは、大腸菌発現ベクターｐＵＲ２７８（Ruther et al.,EMBO J.2:1791(1983)）、それにおいて抗体のコード配列は、ｌａｃ  Ｚコード領域とインフレームのベクターの中に個別に連結することができ、融合タンパク質が生成されるようにする；ｐＩＮベクター（Inouye&Inouye,Nucleic Acids Res.13:3101-3109(1985);Van Heeke&Schuster,J.Biol.Chem.24:5503-5509(1989)）；などを含むがそれだけには限定されない。また、ｐＧＥＸベクターが、外来ポリペプチドをグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるためにも使用できる。一般に、このような融合タンパク質は可溶性であり、マトリックスグルタチオン−アガロースビーズに吸着および結合させた後、遊離グルタチオンの存在下で溶出することにより、溶解細胞から簡単に精製できる。ｐＧＥＸベクターは、トロンビンまたは第Ｘａ因子プロテアーゼ切断部位を含むように設計されているため、クローン化された標的遺伝子産物をＧＳＴの部分から遊離させることができる。
【００９７】
昆虫のシステムでは、Ａｕｔｏｇｒａｐｈａ  ｃａｌｉｆｏｍｉｃａ核多角体病ウイルス（ＡｃＮＰＶ）が、抗体を発現させるためのベクターとして使用される。ウイルスはＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａの細胞で増殖する。抗体コード配列は、ウイルスの必須ではない領域（例えば、ポリヘドリン遺伝子）に個別にクローン化されることや、ＡｃＮＰＶプロモーター（例えば、ポリヘドリンプロモーター）の制御下に置かれることがある。
【００９８】
哺乳動物宿主細胞において、対象の抗体を発現させるために、複数のウイルスに基づく発現システムが利用され得る。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的の抗体コード配列は、アデノウイルス転写／翻訳制御複合体、例えば、後期プロモーターおよび三者リーダー配列に連結され得る。次いで、このキメラ遺伝子は、インビトロまたはインビボ組換えによって、アデノウイルスゲノムに挿入され得る。ウイルスゲノムの本質的ではない領域（例えば、領域Ｅ１またはＥ３）への挿入は、生存し、感染した宿主において抗体分子を発現することができる組換えウイルスをもたらす。（例えば、Logan&Shenk,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355-359(1984)を参照）。発現の効率は、適切な転写エンハンサー要素、転写ターミネーターなどを含めることによって向上させることができる（Bittner et al.,Methods in Enzymol.153:51-544(1987)を参照）。
【００９９】
組換え抗体を長期間、高収量で産生するために、安定した発現を使用できる。例えば、抗体分子を安定して発現する細胞株を遺伝子操作することができる。ウイルス複製の起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を免疫グロブリン発現カセットと選択可能マーカーで形質転換することができる。外来ＤＮＡの導入に続いて、遺伝子操作された細胞は濃縮培地で１〜２日間増殖させることができ、その後、選択培地に切り替えられる。組換えプラスミドの選択可能マーカーは、選択に対する耐性を与え、細胞がプラスミドを染色体に安定して組み込み、増殖して病巣を形成し、次にそれをクローン化して細胞株に拡大することができる。そのような遺伝子操作された細胞株は、抗体分子と直接的または間接的に相互作用する化合物のスクリーニングおよび評価において、特に有用であり得る。
【０１００】
いくつかの選択システムを使用でき、以下を含むがそれらに限定されず、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（Wigler et al.,Cell 11:223(1977)）、ヒポキサンチン−グアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Szybalska&Szybalski,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 48:202(1992)）、およびアデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Lowy et al.,Cell 22:817(1980)）の遺伝子は、それぞれｔｋ、ｈｇｐｒｔ、またはａｐｒｔの細胞で使用できる。また、代謝拮抗物質耐性は、次の遺伝子の選択の基礎として使用できる：メトトレキサートに対する耐性を与えるｄｈｆｒ（Wigler et al.,Natl.Acad.Sci.USA 77:357(1980);O'Hare et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1527(1981)）；ミコフェノール酸に対する耐性を付与するｇｐｔ（Mulligan&Berg,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:2072(1981)）；アミノグリコシドＧ−４１８への耐性を与えるｎｅｏ（Clinical Pharmacy 12:488-505;Wu and Wu,Biotherapy 3:87-95(1991)；Tolstoshev,Ann.Rev.Pharnacol.Toxicol.32:573-596(1993)；Mulligan,Science 260:926-932(1993)；およびMorgan and Anderson,Ann.Rev.Biochem.62:191-217(1993);TIB TECH 11(5):155-215(1993)）；および、ハイグロマイシンへの耐性を与えるｈｙｇｒｏ（Santerre et al.,Gene 30:147(1984)）。組換えＤＮＡ技術の分野で一般に公知の方法を日常的に適用して、所望の組換えクローンを選択することができ、そのような方法は、例えば、Ausubel et al.(eds.),Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,NY(1993)；Kriegler,Gene Transfer and Expression,A Laboratory Manual,Stockton Press,NY(1990)；および１２章と１３章において、Dracopoli et al.(eds),Current Protocols in Human Genetics,John Wiley&Sons,NY(1994);Colberre-Garapin et al.,J.Mol.Biol.150:1(1981)において記載されていいる。
【０１０１】
宿主細胞は、本発明の２つの発現ベクター、重鎖由来ポリペプチドをコードする第１のベクターおよび軽鎖由来ポリペプチドをコードする第２のベクターで同時にトランスフェクトされ得る。２つのベクターは、重鎖および軽鎖ポリペプチドの同等の発現を可能にする、異なる選択可能なマーカーおよび複製の起点を含み得る。あるいは、重鎖および軽鎖の両方のポリペプチドをコードし、発現することができる単一のベクターを使用することができる。
【０１０２】
本発明の抗体分子が生成されると、免疫グロブリン分子の精製のための当分野で公知のいずれかの方法、例えば、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、親和性、特にプロテインＡ後の特定の抗原に対する親和性、およびサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製のための他のいずれかの標準的な技術によって精製することができる。多くの実施形態では、抗体は細胞から培養培地に分泌され、培養培地から採取される。
【０１０３】
有用性
また、本発明の少なくとも１つの抗体を使用して、当分野で公知である、または本明細書に記載されているような、細胞、組織、器官、動物、または患者における少なくとも１つの抗原関連疾患を変えるまたは治療する方法が提供される。例えば、細胞、組織、器官、動物、または患者に治療有効量の抗体を投与または接触させることが挙げられる。本発明はまた、細胞、組織、器官、動物、または患者における少なくとも１つの抗原関連疾患を変えるまたは治療するための方法を提供しており、肥満、免疫関連疾患、心血管系疾患、感染症、悪性疾患または神経疾患のうちの少なくとも１つを含むが、これらに限定されない。
【０１０４】
典型的には、病的状態の治療は、１回の用量につき患者の１キログラムあたり少なくとも１つの抗体の少なくとも約０．０１〜５００ミリグラムの範囲、また好ましくは、単回または複数回の投与につき患者の１キログラムあたり少なくとも約０．１〜１００ミリグラムの抗体という範囲に、平均して達する、有効量または投薬量の少なくとも１つの抗体組成物を投与することによって達成され、組成物に含まれる活性剤の比活性に応じる。あるいは、有効血清濃度は、単回投与または複数回の投与につき０．１〜５０００ｎｇ／ｍｌの血清濃度を含むことができる。適切な投与量は医師に公知であり、当然ながら特定の病状、投与される組成物の比活性、および治療を受ける特定の患者次第である。場合によっては、所望の治療量を達成するために、反復投与、すなわち、特定の監視または計量された用量の反復個別投与を施す必要があり得、個々の投与は、所望の１日の用量または効果が達成されるまで繰り返される。
【０１０５】
また、対象の抗体は、特定の実施形態では、抗体が検出可能なマーカーにコンジュゲートされる診断で使用することも、検出可能なマーカーにコンジュゲートされる二次抗体と共に一次抗体として使用することもできる。検出可能なマーカーは、放射性および非放射性の標識を含み、当業者に周知である。一般的な非放射性標識には、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、蛍光分子などの検出可能な酵素が含まれる。蛍光分子は、ある波長の光を吸収し、別の波長で放出し、そのため、例えば蛍光顕微鏡による可視化が可能である。分光光度計、蛍光顕微鏡、蛍光プレートリーダー、およびフローソーターが周知であり、蛍光色素に共有結合させることで蛍光を発する特定の分子を検出するためによく使用される。蛍光色素、例えば緑色蛍光タンパク質、緑色蛍光タンパク質の赤方偏移変異体、アミノクマリン酢酸（ＡＭＣＡ）、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルコダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）、テキサスレッド、Ｃｙ３．０、およびＣｙ５．０が、有用な標識の例である。
【０１０６】
分子は、蛍光マーカーが使用されている場合、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）などの細胞単離戦略で使用できる。蛍光活性化細胞選別では、蛍光分子でタグ付けされた細胞は、電子的に、フローサイトメーターで選別され、例えばＢｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、カリフォルニア州）ＦＡＣＳ  ＩＶサイトメーターまたは同等の機器がある。蛍光分子は、特定の細胞表面抗原を認識する抗体である。抗体は蛍光マーカー、例えばフルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）またはフィコエリトリン（ＰＥ）にコンジュゲートされる。
【０１０７】
実施形態
実施形態１．トランスジェニックニワトリであって、
（ａ）隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体が欠如しており、また
（ｂ）作動可能な連結で、
（ｉ）免疫グロブリン重鎖遺伝子プロモーター、
（ｉｉ）ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３配列を含む可変ドメインのコード配列を含む生殖系列ヒトＶＨセグメント、
（ｉｉｉ）ヒトＤクラスター、
（ｉｖ）単一のヒトＪセグメント、
（ｖ）定常領域をコードする、（ｂ）（ｉｉ）の生殖系列ヒトＶＨセグメントの上流の複数の配列、
（ｖｉ）それぞれが
（ｂ）（ｉｉ）の機能的なヒトＶＨセグメントと実質的に同じＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３配列と、
偽遺伝子ごとに異なるＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列と
を含む構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３の複数の偽遺伝子
を含む
改変された内因性免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座を含むゲノムを含み、
改変されたＩｇＨ遺伝子座は、ニワトリでＶ（Ｄ）Ｊ組換えを経て、
複数の生殖系列ヒトＶＨ偽遺伝子は、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換え後、遺伝子変換によってヌクレオチド配列を生殖系列ヒトＶＨセグメントに供与し、
ニワトリは多様な免疫グロブリン重鎖を含む抗体を産生する、
トランスジェニックニワトリ。
【０１０８】
実施形態２．（ｂ）（ｉｉ）の機能的なヒトＶＨセグメントと同じファミリーにある異なるヒトＶＨセグメントのＣＤＲ１およびＣＤＲ２をコードする（ｂ）（ｖｉ）のＣＤＲ１およびＣＤＲ２の配列である、実施形態１に記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１０９】
実施形態３．（ａ）の隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体の長さが少なくとも１５ｋｂである、実施形態１から２のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１１０】
実施形態４．（ｂ）（ｉ）のプロモーターがニワトリ免疫グロブリン重鎖遺伝子プロモーターである、実施形態１から３のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１１１】
実施形態５．（ｂ）（ｉｉ）の生殖系列ヒトＶＨセグメントならびに（ｖｉ）のＣＤＲ１およびＣＤＲ２配列が、ＶＨ３ファミリー、ＶＨ１ファミリーまたはＶＨ４ファミリーに由来する、実施形態１から４のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１１２】
実施形態６．Ｄクラスターにおいて、システインの任意のコドンが、別のアミノ酸をコードするように変異されている、実施形態１から５のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１１３】
実施形態７．Ｄクラスターにおいて、システインの任意のコドンが変異して、チロシンまたはトリプトファンをコードする、実施形態６に記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１１４】
実施形態８．Ｄクラスターの介在配列がニワトリ由来である、実施形態１から７のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１１５】
実施形態９．（ｂ）（ｖ）の複数の偽遺伝子が少なくとも１０の偽遺伝子を含む、実施形態１から８のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１１６】
実施形態１０．（ｂ）（ｖ）の偽遺伝子が、（ｂ）（ｉｉ）の生殖系列ヒトＶＨセグメントに対して逆向きである、実施形態１から９のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１１７】
実施形態１１．（ｂ）（ｖ）の定常領域をコードする複数の配列がニワトリに内因性である、１から１０のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１１８】
実施形態１２．改変された免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座の転写産物が、Ｊコード配列のコピーの３’末端を（ｂ）（ｖ）の定常領域コード配列のコピーの５’末端に結合するイントロンを含む、実施形態１から１１のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１１９】
実施形態１３．ニワトリが、改変されたＩｇＨ遺伝子座についてホモ接合性である、実施形態１から１２のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１２０】
実施形態１４．ニワトリが改変されたＩｇＨ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、相同染色体のＩｇＨ遺伝子座がノックアウトされている、実施形態１から１３のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１２１】
実施形態１５．ニワトリが改変されたＩｇＨ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、相同染色体のＩｇＨ遺伝子座が野生型である、実施形態１から１４のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１２２】
実施形態１６．ニワトリが改変されたＩｇＨ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、相同染色体のＩｇＨ遺伝子座がその隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体を欠く、実施形態１４に記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１２３】
実施形態１７．ニワトリが改変されたＩｇＨ遺伝子座についてヘテロ接合性であり、相同染色体のＩｇＨ遺伝子座がＪ領域を欠く、実施形態１４に記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１２４】
実施形態１８．ニワトリによって産生された抗体が、重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３領域において多様化されている、実施形態１から１７のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリ。
【０１２５】
実施形態１９．その相同染色体の一方または両方においてその隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体を欠く、トランスジェニックニワトリ。
【０１２６】
実施形態２０．実施形態１から１９のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリに由来するＢ細胞。
【０１２７】
実施形態２１．
（ａ）実施形態１から２０のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリを抗原で免疫すること、および
（ｂ）当該ニワトリから、当該抗原に特異的に結合する抗体を得ること
を含む方法。
【０１２８】
実施形態２２：抗体がポリクローナルである、実施形態２１の方法。
【０１２９】
実施形態２３．抗体がモノクローナルである、実施形態２１に記載の方法。
【０１３０】
実施形態２４．
（ｃ）当該トランスジェニックニワトリのＢ細胞を使用してハイブリドーマを調製すること、および
（ｄ）当該ハイブリドーマをスクリーニングして、抗原に特異的に結合する抗体を産生するハイブリドーマを特定すること
をさらに含む、実施形態２１から２３のいずれかに記載の方法。
【０１３１】
実施形態２５．ＰＣＲを使用して、トランスジェニック動物のＢ細胞からの重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸を増幅し、当該増幅された核酸を使用して組換え抗体を発現させることをさらに含む、実施形態２１から２４のいずれかに記載の方法。
【０１３２】
実施形態２６．実施形態１から１９のいずれかに記載のトランスジェニックニワトリによって産生される抗体。
【０１３３】
実施形態２７．方法であって
（ａ）隣接する内因性ニワトリＶ−Ｄ−Ｊ領域全体をニワトリの免疫グロブリン重鎖（ＩｇＨ）遺伝子座から削除すること、および
（ｂ）（ｉ）免疫グロブリン重鎖遺伝子プロモーター、
（ｉｉ）ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、およびＦＲ３配列を含む可変ドメインのコード配列を含む生殖系列ヒトＶＨセグメント、
（ｉｉｉ）ヒトＤクラスター、
（ｉｖ）ヒトＪセグメント、および
（ｖｉ）それぞれが
（ｂ）（ｉｉ）の機能的なヒトＶＨセグメントと実質的に同じＦＲ１、ＦＲ２およびＦＲ３配列と、
偽遺伝子ごとに異なるＣＤＲ１およびＣＤＲ２コード配列と
を含む構造ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３の複数の偽遺伝子
を含む構築物を遺伝子座に挿入すること
を含み、
工程（ａ）および（ｂ）が任意の順序で行われる、
方法。
【実施例】
【０１３４】
以下の実施例は、本発明の特定の実施形態および態様を実証、またさらに例示するために提供され、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１３５】
実施例１
ＳｙｎＶＨ−ＳＤニワトリの調製
この研究では、トランスジェニックニワトリを遺伝子操作して、ヒト可変領域抗体レパートリーを産生した。医薬品の観点から、ニワトリで単一のＶフレームワークを使用すると、最適な製造および開発可能性の特性を有する好ましいフレームワークを選択できるため、利点がある。導入遺伝子は、生殖系列または生殖系列に近いフレームワーク配列を維持しながら、ＣＤＲに多様性が集中するように設計できる。戦略は、多様性を組み込むためのニワトリＢ細胞システムの利点を維持することであり、大きなヒトゲノム断片（複数のヒトＶ、Ｄ、およびＪ遺伝子を保有する）を挿入する代わりに、上流のヒトベースの偽遺伝子を含む単一のヒトフレームワークを使用し、ニワトリでは適切に規制されていなくてもよい。単一のヒトのフレームワークがいずれかの潜在的な標的に治療候補を供給するためには、導入遺伝子によって産生される多様性のレベルが十分でなければならない。トランスジェニックニワトリの２つの系統が産生された。１つは多様性を生み出すために完全に遺伝子変換／体細胞超変異に依存する、事前再配置された機能的なＶＨ領域を担持し、もう１つは機能的なＶＨ領域を作り出すために最初にＶ（Ｄ）Ｊ再配置を経て、それによりＣＤＲ−Ｈ３の多様性のレベルを潜在的に増加させ、遺伝子変換／体細胞超変異が続いた。
【０１３６】
材料および方法
事前再配置されるＶＨ領域の構築物、ＳｙｎＶＨ−Ｃは、先に説明した（１８）。Ｖ（Ｄ）Ｊ再配置構築物ＳｙｎＶＨ−ＳＤは、いくつかの部分の遺伝子合成とそれに続くライゲーションによって調製された。Ｖ、Ｄ、Ｊ領域は次のようにして組み立てた。ヒト生殖系列ＶＨ３−２３＊０１遺伝子が、使用された単一のＶ遺伝子であり、ＪＨ６遺伝子が、単一のＪ遺伝子であった。組換えシグナル配列とニワトリＤ遺伝子座由来の介在領域（これらのスペーサーはそれぞれ約１００〜２００ｂｐ）に、２４の非冗長のヒトＤを隣接させた。ヒトＤ２ファミリーのシステインコドンは、チロシン（７インスタンス）またはトリプトファン（２インスタンス）をコードするように変異されていた。再配置する要素をニワトリＶＨプロモーターでクローン化して重鎖の発現を促進し、内因性定常領域に対するスプライシングのためニワトリＪ−Ｃイントロンの短いセクションを含めた。ヒト偽遺伝子は、ヒト生殖系列ＶＨ３−２３遺伝子から得たＦＲと、ＶＨ３生殖系列遺伝子ファミリーから得たＣＤＲ１および２を含んでいた。１３の偽遺伝子が設計された。各偽遺伝子間のスペーサー配列は、ニワトリ偽遺伝子領域から得たものであったが、ニワトリＶ配列自体は含まれていなかった。ニワトリ重鎖遺伝子座を標的としたａｔｔＰ部位に挿入するためａｔｔＢ部位が含まれ（２１、２２）、後に標的ゲノムのｌｏｘＰ部位との組換えのためｌｏｘＰ部位が含まれていた。ＳｙｎＶＨ−ＳＤ構築物を重鎖ａｔｔＰ含有細胞にトランスフェクトした。これらの細胞では、ｌｏｘＰ部位は以前にＣＲＩＳＰＲ媒介ターゲティングによってニワトリＶＨセグメントの上流に挿入されていた（２２）。ＳｙｎＶＨ−ＳＤ導入遺伝子の挿入後、第２のｌｏｘＰ部位がＳｙｎＶＨ−ＳＤ導入遺伝子によって、第１のｌｏｘＰ部位と同じ向きで、ヒト偽遺伝子アレイのすぐ上流に導入された。Ｃｒｅ雌鶏に繁殖することで、ｌｏｘＰ部位間のすべてのＤＮＡが削除され、これには、ニワトリのＶＨ遺伝子とＤ遺伝子、およびトランスフェクションの間に使用される選択可能マーカーが含まれ、図１に示す構造に至った。軽鎖については、この研究で使用されたすべてのトランスジェニックニワトリが、構築物ＳｙｎＶＫ−ＣＫから得たヒトＶ−カッパ軽鎖を発現した（１８）。これらのトリの軽鎖と重鎖は、ヒトの可変領域とニワトリの定常領域からなっていた。重鎖遺伝子座では、導入遺伝子はすべてのケースでヘテロ接合性であり、他の対立遺伝子がノックアウトされ、遺伝子型ＩｇＨＳｙｎＶＨ／ＩｇＨＪＨ−ＫＯが得られた。軽鎖遺伝子座では、遺伝子型は常にＩｇＬＳｙｎＶＫ−ＣＫ／ＩｇＬＶＪＣ−ＫＯであった。
【０１３７】
ＳｙｎＶＨ−Ｃを有するニワトリを、記載されているように免疫した（１８）。ＳｙｎＶＨ−ＳＤのトリは、ＳｙｎＶＨ−Ｃのトリと同様のスケジュールで、ＰＧＲＮタンパク質、またはＤＮＡとＰＧＲＮタンパク質の組み合わせのいずれかで免疫された。
【０１３８】
脾臓のリンパ球を、フィコール密度遠心分離により調製した。脾臓のリンパ球（約１０７個）から得た総ＲＮＡは、ＲＮｅａｓｙ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して抽出した。プライマーｃｈＶＨ−Ｆ９（５’−ＣＡＣＣＡＧＴＣＧＧＣＴＣＣＧＣＡＡＣＣＡＴＧ−３’（配列番号１））とｃＩｇＹ−ＮＧＳ−Ｒ（５’−ＧＧＧＣＧＡＴＧＴＧＧＧＧＣＴＣＧＣ−３’（配列番号２））を使用して、ＯｎｅＳｔｅｐ  Ａｈｅａｄ（Ｑｉａｇｅｎ）較正版ポリメラーゼ反応で１０−１５ｎｇの総ＲＮＡを使用した。約４５０ｂｐのアンプリコンが取得され、ＡＢＭ（リッチモンド、ＢＣ、カナダ）で配列された。ＡＢＭは、ペアエンドマージ、クラスター分析、以前に特定されたｍＡｂ配列への配列のマッチング、およびＣＤＲ−Ｈ３の長さの判定を実行した。
【０１３９】
配列は、ＤＮＡｓｔａｒのソフトウェアを使用して整列および分析した。Ｅｘｃｅｌのマクロを、Ａｎｎｅｍａｒｉｅ  Ｈｏｎｅｇｇｅｒ（チューリッヒ大学）のウェブサイトからダウンロードし、アミノ酸の頻度の計算に使用した。
【０１４０】
動物実験は、リガンド製薬のＩＡＣＵＣ承認プロトコルに従って、ＩＡＣＵＣ委員会の監督下で行われた。
【０１４１】
結果
２つの異なるヒト重鎖導入遺伝子を有するニワトリ由来のヒトＶＨ配列を分析した。これらの導入遺伝子の１つであるＳｙｎＶＨ−Ｃには、事前再配置された機能的なＶ領域（１８）が含まれ、他方のＳｙｎＶＨ−ＳＤには、Ｂ細胞で再配置される生殖系列Ｖ、Ｄ、およびＪセグメントが含まれていた（図１）。ＳｙｎＶＨ−ＣのＶ領域はヒトライブラリーのスクリーニングから取得され、再配置されたＶＨ３−２３／Ｄ１／ＪＨ４領域を含有しており、これは生殖系列ＶＨ３−２３遺伝子に対する９つのフレームワーク（ＦＲ）の変化が伴っていた。ＳｙｎＶＨ−ＳＤ構築物には、単一の生殖系列Ｖ遺伝子、ＶＨ３−２３、ヒトＤエレメントすべて、および単一のＪＨ６遺伝子が含まれていた。Ｄ要素は、高度に保存された組換えシグナル配列を含む、ニワトリＤ遺伝子座からの介在配列によって分離された。構築物双方の他のすべての非コード配列（プロモーターとイントロン）は、最適な転写および転写後の調節のためのニワトリ重鎖遺伝子座に由来した。導入遺伝子の構築物は、遺伝子ターゲティングとインテグラーゼを介した挿入の組み合わせを介して、内因性重鎖遺伝子座に挿入された（１８、２２）。両方の導入遺伝子のヒトＶ領域は、内因性の下流のニワトリ定常領域にスプライスしている。
【０１４２】
両方の導入遺伝子が、機能的なヒトＶの遺伝子変換に関与できる上流のヒトベースの偽遺伝子を含んでいた（８、１１）。偽遺伝子は、主にＣＤＲに多様性を備えさせて設計した（図８）が、ＳｙｎＶＨ−Ｃ偽遺伝子のいくつかはフレームワークの変更も含んでいる。これらの偽遺伝子は、デノボで設計され、ヒトゲノムに存在するＶ遺伝子の偽遺伝子とは関係ない。偽遺伝子ＣＤＲの設計には２つの異なるアプローチが採用された。ＳｙｎＶＨ−Ｃでは、ＣＤＲは、発現配列（ＥＳＴ）のヒトの配列のデータベースで見出される自然発生のＣＤＲ配列に由来していた。３つのＣＤＲはすべて偽遺伝子に含まれており、各偽遺伝子の３’末端にはＣＤＲ３が含まれているが、ＦＲ４には拡張しておらず、ＣＤＲ３の境界を示す不変のＴｒｐ−１１８残基も含まれていない。１つの偽遺伝子のＣＤＲ３と次の偽遺伝子の始まり（ＦＲ１）の間に、１００ｂｐのスペーサー配列を配置した。ＳｙｎＶＨ−ＳＤでは、ＣＤＲは生殖系列ヒトＶＨ３ファミリーのメンバーであるＣＤＲ１および２に由来し、生殖系列Ｖ遺伝子にはＣＤＲ３が含まれていないため、偽遺伝子には特定のＣＤＲ３配列がなかった。ＦＲ３の下流にスペーサー配列が配置された。スペーサー配列は、ヒトＣＤＲ３に由来していなくても、遺伝子変換に使用される可能性のある多様な配列である（図８）。挿入後、ニワトリ偽遺伝子アレイはどちらの場合も依然上流に存在していた。ＳｙｎＶＨ−Ｃの場合、通常はＶＤＪ再配置を経る単一のニワトリ生殖系列ＶＨおよびＤクラスターは依然存在していたが、生殖系列ＪＨ領域がないため、これらは機能的なＶ領域に再結合できるはずがなく、下流のヒトＶ領域は完全に再配置される。ＳｙｎＶＨ−ＳＤの導入遺伝子では、ニワトリＶ遺伝子とＤ遺伝子が削除され（２２）、ニワトリ遺伝子がヒトＪＨ遺伝子と直接組換えられて、ヒトＶおよびＤ遺伝子を置換する可能性が排除された。両系統の鳥類のゲノムに存在する唯一のＪＨ領域は、ＳｙｎＶＨ導入遺伝子のヒトＪＨであった（図１）。
【０１４３】
重鎖Ｖ領域は、免疫された９羽のトリの脾臓のリンパ球集団から得たＮＧＳアンプリコン配列によって一括で配列された（免疫の詳細については、以下を参照されたい）。５’のＵＴＲのフォワードプライマーとＩｇＹ定常領域ＣＨ１ドメインのリバースプライマーを使用して、逆転写後にＶＨ領域をリンパ球ＲＮＡから増幅し、ＭｉＳｅｑ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ、カナダ）で配列した。ＶＨ領域を増幅するために使用されるプライマーは、それが発現された場合に、それらがヒトＶ領域またはニワトリＶ領域を増幅するように選択された。ヒト導入遺伝子において、ヒト型である唯一の配列は、Ｖ領域のコード配列である。すべての非コード配列（５’ＵＴＲ、イントロンなど）および定常領域コード配列は、両方のＳｙｎＶＨ構築物でニワトリ型の配列であった。ペアエンドの読み取りデータを組み立てて翻訳し、理論的なタンパク質配列を得た。各々のトリから得た読み取りデータ数、固有のヌクレオチドおよびタンパク質配列が表１に提示されている。各々のトリの最も一般的な配列は、それが見出された回数において約６７００〜８９，０００という範囲であった。一部の分析では、各サンプルからの上位１０００個の特に共通している固有の配列が使用された。これは、各サンプルからの総配列データの３４〜６２％を表している。
【０１４４】
表１．配列データ概略
６羽のＳｙｎＶＨ−Ｃと３羽のＳｙｎＶＨ−ＳＤのトリから得たサンプルは、鳥の番号順に列挙されている。固有のヌクレオチドおよびタンパク質配列の数と、２回以上（２Ｘ深度）配列された固有のペプチド配列の数が示される。最後の列には、上位１０００の配列で表される総配列数の読み取りデータの割合が提示されている。
【表１】
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【０１４５】
Ｖ領域とシグナルペプチドの使用
９羽のトリのＶＨ領域の分析は、発現された配列が予想どおり完全にヒト型であるか、任意のニワトリ型配列を含んでいるかどうかの判定から開始した（表２）。ＳｙｎＶＨ−ＳＤのＶ領域はすべてヒト型の配列であった。これは、ＳｙｎＶＨ−ＳＤの挿入の上流で内因性のニワトリＶ領域が削除されたためである。意外にも、ＳｙｎＶＨ−Ｃ導入遺伝子の配列の約５％がニワトリＶＨ領域であった。これらの配列は、ＣＤＲ３およびヒトＪ配列に融合されたニワトリＣＤＲ１〜２およびＦＲ１〜３で構成されていた。これ以外の可能性はない。なぜならば、トランスジェニックニワトリのゲノムに存在する唯一のＪＨ配列はＳｙｎＶＨ導入遺伝子のヒトＪであるためである。ＣＤＲ−Ｈ３はヒト型のように思われる、なぜならば、ニワトリＣＤＲ−Ｈ３にあると予想される非標準的なシステインがないためである（１７）。ＳｙｎＶＨの発現された抗体レパートリーにニワトリＶＨ配列の２つの潜在的な源が存在していた。ニワトリ偽遺伝子からの遺伝子変換であり、これは依然ヒト偽遺伝子の上流に存在している。または二次再配置型メカニズムによるニワトリの機能的なＶによるヒトの機能的なＶの遺伝子置換であり、これにおいてニワトリＶ遺伝子はＶ遺伝子の３’末端における潜在的な組換えシグナル配列を介してヒトＶ遺伝子で再配置した（２３〜２６）。これらのニワトリＶ領域は、導入遺伝子のヒトＦＲ３−ＣＤＲ３接合部でインフレーム融合し、それによってヒトＶ遺伝子を削除する二次再配置に由来する可能性が最も高いようである。遺伝子変換よりも遺伝子置換を支持する主な証拠は、シグナルペプチド配列はまたニワトリであったが、偽遺伝子はシグナルペプチド配列を含まず、そのため、ヒトシグナルペプチドをニワトリシグナルペプチド配列に変異させることができなかったということである。さらに、遺伝子変換により、発現されるＶ領域をニワトリＶ領域に置き換えることができる場合、上流の偽遺伝子も含むＳｙｎＶＨ−ＳＤ配列で、同じことが発生することが予想され得る。しかし、Ｖ置換はＳｙｎＶＨ−ＳＤで観察されなかった。機能的なニワトリＶおよびＤクラスターは、ＳｙｎＶＨ−ＳＤ導入遺伝子の上流で削除されているため、遺伝子置換の可能性はない。
【０１４６】
シグナルペプチドは、導入遺伝子構築物に導入された配列と常に合致するとは限らなかった。ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤ導入遺伝子の配列の８０〜９０％には、ヒトＶ配列に融合したヒトシグナルペプチドが含まれていたが、シグナルペプチドに配列の変動が見出された。シグナルペプチドの変化の３つのパターンが観察された。第１のパターンでは、無傷のニワトリシグナルペプチドエキソンが直接ヒトＶ領域のエキソンにインフレームスプライシングされた。これは、ＳｙｎＶＨ−ＳＤの約２０％、ＳｙｎＶＨ−Ｃの５％の配列で見出された（図２および表２）。ＳｙｎＶＨ−ＳＤでのシグナルペプチド変化の頻度が高いことは、そのような変化に選択があることを示唆している。ＳｙｎＶＨ−Ｃ、ＳｙｎＶＨ−ＳＤ、およびニワトリＶＨのシグナルペプチド配列の比較により、ＳｙｎＶＨ−ＳＤはＳｙｎＶＨ−ＣがＩｌｅを含む中央の疎水性ドメインにＬｙｓ残基を含み、そのことからこれはＳｙｎＶＨ−ＣシグナルペプチドまたはニワトリＶＨシグナルペプチドよりも疎水性が低くなり、効率の低いシグナルペプチドになることが示された。（２７）（図２）。ＳｙｎＶＨ−ＳＤシグナルペプチドは、ヒト生殖系列ＶＨ３−２３遺伝子と同一だが、ＳｙｎＶＨ−Ｃシグナルペプチドには、生殖系列と比較してＩｌｅ変異が含まれている。シグナルペプチドの変化の第２のパターンでは、最初のエクソンにコードされているシグナルペプチドの部分はヒト型であったが、Ｖエクソンにコードされているシグナルペプチドの４つのアミノ酸はニワトリ型であった（図２）。このパターンは、ＳｙｎＶＨ−ＳＤ配列の約１５％で観察されたが、ＳｙｎＶＨ−Ｃでは観察されなかった。この領域はニワトリ偽遺伝子の一部に存在するため（８）、遺伝子変換がシグナルペプチドのこの領域をニワトリに変異させる原因となった可能性がある。これらの例では、この領域のニワトリ由来の配列は、成熟したＶＨ領域の３番目のアミノ酸までわずかに拡張されている（以下を参照）。シグナルペプチドの変化の第３のパターンで、ＳｙｎＶＨ−ＳＤ配列は完全なヒトシグナルペプチドを保持したが、Ｌｙｓ残基に点変異をもたらし（図２）、それを疎水性残基（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、またはＭｅｔ）に変更した。このパターンは、ＳｙｎＶＨ−ＳＤ配列の約４０％で発生した。これらの３種類の変化はすべて、シグナルペプチドの疎水性を高めた。ＳｙｎＶＨ−ＳＤシグナルペプチドに対するこれらの異なるタイプの変化の高い出現率は、これらの変化に対する正の選択を強く示している。
【表２】
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【０１４７】
表２  ＳｙｎＶＨ−ＳＤではなくＳｙｎＶＨ−ＣがニワトリＶＨによる遺伝子置換を示したのに対し、両者はシグナルペプチドに変化があった。
ニワトリおよびヒトＶＨ領域の数（および各導入遺伝子の全配列のパーセンテージ）が示されている。６のＳｙｎＶＨ−Ｃサンプルと３のＳｙｎＶＨ−ＳＤサンプルから得たデータを組み合わせた（合計、ＳｙｎＶＨ−Ｃのトリから得た６０００の配列およびＳｙｎＶＨ−ＳＤのトリから得た３０００配列）。最初の列のセットには、ニワトリＶＨを含む配列が示され、ニワトリシグナルペプチド（Ｃｈ  ｓｉｇ  ｐｅｐ）またはヒトシグナルペプチド（Ｈｕ  ｓｉｇ  ｐｅｐ）を含む配列に分割されている。第２の列のセットには、シグナルペプチドの配列について同様に分割された、ヒトＶＨを有する配列がある。すべての配列にヒトＪＨがあった（右側の列）。いくつかの配列にＶＨ欠失があったため、ＶＨ領域の総数は配列の総数よりもわずかに少なくなる。
【０１４８】
ニワトリの偽遺伝子によるＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤでの遺伝子変換はまれである
ニワトリの偽遺伝子のアレイは、ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤの導入遺伝子双方の上流に依然存在している（図１）。ＳｙｎＶＨ−ＳＤでは、ニワトリの偽遺伝子は、ヒトの機能的なＶに非常に近接していてヒトの偽遺伝子のすぐ上流にあるが、ＳｙｎＶＨ−Ｃでは、ニワトリのＶおよびＤ遺伝子は、２つの偽遺伝子アレイの間にある。上記のように、ＦＲ１に隣接するシグナルペプチド配列はＳｙｎＶＨ−ＳＤで遺伝子変換を経ており、そのためニワトリ偽遺伝子によるヒトフレームワークのさらなる遺伝子変換が発生したかどうかを知ることは興味深いことであった。ＤＮＡレベルでは、ニワトリの生殖系列のＶＨセグメントは、導入遺伝子のＶ遺伝子と全体的に約６５％同一である。相同性の最も長いストレッチは１１ｂｐであり、１〜６ｂｐのミスマッチがＶ領域全体に広がっている。このレベルと相同性のパターンが遺伝子変換を可能にするのに十分であるかどうかは不明である。タンパク質の配列の変化につながる遺伝子変換の機能的に適切なレベルを判定するために、ニワトリ残基の置換の長いストレッチに関する証拠を求めてＦＲ１とＦＲ３をタンパク質レベルで分析した（ＦＲ２はニワトリとヒトの間で保存され過ぎているため、遺伝子変換事象を明確に検出することができない）。ＳｙｎＶＨ−ＣでのヒトＦＲ１およびＦＲ３の非常に低レベルの遺伝子変換（ＦＲ１で０．０７％、ＦＲ３で０．３％、５６５２配列）、およびＳｙｎＶＨ−ＳＤでのヒトＦＲ１およびＦＲ３の非常に低レベルの遺伝子変換（ＦＲ１で２％、ＦＲ３ではなし）が観察された（表３）。遺伝子変換の最も一般的な例は、配列の約１５％で発生したＳｙｎＶＨ−ＳＤのシグナルペプチドの変化であった。これは、配列変化が選択されている場合、遺伝子変換がより高い頻度で観察され得ることを示唆している。ヒトＦＲにおいてニワトリ偽遺伝子により遺伝子が変換される事象が低い頻度であることは、それらがまれな非選択事象であることを示唆している。ＳｙｎＶＨ−ＳＤのＦＲ１においてわずかに頻度が高い（２％）ことは、遺伝子の５’末端のシグナルペプチド領域で始まり、ＦＲ１に続く遺伝子変換事象が継続する結果である可能性がある。別の潜在可能性のある寄与因子は、ニワトリＶおよびＤクラスターがその導入遺伝子で削除されているため、ＳｙｎＶＨ−ＳＤのニワトリ偽遺伝子に対してヒトの機能的なＶの染色体において物理的近接性があることである可能性がある（図１）。これらのトリに由来する抗原特異的ｍＡｂ配列（下記を参照）では、どの配列にもニワトリ由来のＦＲ残基は見られず、これらのまれな遺伝子変換由来の配列は選択されていなかったか、抗原結合因子を産生する必要がなかったという考えを裏付けている。
【表３】
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【０１４９】
表３  ニワトリ偽遺伝子によるヒトＦＲの遺伝子変換はまれである。
各々のトリから得たヒト型配列で観察された遺伝子変換事象の数が提示されている。遺伝子変換は、ニワトリの配列である長い領域の配列（つまり、ＦＲ１全体）として定められる。ヌクレオチド配列ではなく、タンパク質の配列を分析した。分析されたヒト型配列の数は右に示されている。
ＮＤ：判定されていない。ニワトリＦＲ２は、ヒト導入遺伝子と１つ（ＳｙｎＶＨ−ＳＤ）または２つ（ＳｙｎＶＨ−Ｃ）のアミノ酸のみが異なり、遺伝子変換を明確に評価することはできなかった。
＊Ｖ領域のエクソンにおいてコードされたシグナルペプチドの部分とＦＲ１の最初の３つのアミノ酸であり、最初のエクソンにおいてコードされた部分ではない。
【０１５０】
ＣＤＲ３の長さの多様性
ＣＤＲ３の長さの多様性は、ＩＭＧＴの位置１０５〜１１７の２つの遺伝子型で分析された。ＳｙｎＶＨ−Ｃ配列では、範囲は３〜２２アミノ酸で、平均は１１．５６±２．０６であった（図３）。ＳｙｎＶＨ−Ｃの生殖系列のＣＤＲ−Ｈ３の長さは、これが事前再配置されているため、１１のコドンの固定した長さである。また、長さのいずれかの変化は、配列が削除または挿入された遺伝子変換または体細胞超変異の結果であり得る。５５％が１１残基よりも長い長さであるが、配列のわずか２７％が１１未満の長さであることから、これらのメカニズムはＣＤＲの長さを増加させる可能性がより高い。導入遺伝子ＳｙｎＶＨ−ＳＤの再配置では、ＣＤＲ−Ｈ３の平均の長さがわずかにより長く、分布がより広い（１１．８９±２．６８アミノ酸、範囲３〜２１。どちらの長さのデータのセットも正規分布に適合しない）ものであった（図３）。長めのＣＤＲ−Ｈ３はＳｙｎＶＨ−ＳＤでより頻繁にあり、ＳｙｎＶＨ−Ｃの３．６％と比較すると、長さ１５残基以上のＣＤＲの２３％であった。単一のＤが使用されている場合、ＳｙｎＶＨ−ＳＤの仮説上の長さの範囲は、コード配列のチューイングバックがない場合、１６〜２３コドンになる。これは、ほとんどの配列がＶ（Ｄ）Ｊ組換え中にチューイングバックすることまたは遺伝子変換／体細胞超変異から長さが減少することを示す。ｍＡｂ配列が制限されており、１つの抗原に対してのみであるが、ＣＤＲ−Ｈ３の長さは、ＳｙｎＶＨ−ＳＤについてはより長い長さに偏っており、一方でＳｙｎＶＨ−Ｃの頻度は、バルク配列と一致しているように思われる（図３）。
【０１５１】
ニワトリのＢ細胞はＴｄＴ活性を欠いているため（９）、Ｖ（Ｄ）Ｊの再配置中にヌクレオチドを追加することはできない。ＷＴのヒトとニワトリのレパートリーでは、ＣＤＲ−Ｈ３はここに示すものよりも長くなる傾向があり、平均ＣＤＲ−Ｈ３の長さは１５〜１６残基で、正規分布である（１７、２８、２９）。ＷＴニワトリでは、広い範囲のＣＤＲ−Ｈ３の長さは、単一のＤの使用（単一のＤを使用した場合、チューイングバックのない仮説上の長さの範囲は２０〜２２コドンになる）、タンデムＤ−Ｄ結合、エキソヌクレアーゼのトリミング、および遺伝子変換の組み合わせにより産生される（６、８、２９）。ＳｙｎＶＨ−ＳＤの導入遺伝子の再配置では、これらのメカニズムは、ＷＴニワトリ抗体と同じ長さのヒトＶ領域を産生するようには見えなかった。ニワトリＤは進展においてタンデムＤ−Ｄ結合を優先するように選択された可能性がある。これはニワトリに一般的であり、対の非標準システインを組み込んでＣＤＲ３内ジスルフィド架橋を形成するメカニズムである（以下を参照）。対照的に、Ｄ−Ｄ結合は通常、ヒト型レパートリー（２９〜３１）には見出されない。Ｄの使用について分析は行われなかったが、ヒト型配列で見出される、より限定されたＣＤＲ−Ｈ３の長さは、Ｄ−Ｄ結合が発生していないか、発生している場合は、ニワトリにおけるヒト型遺伝子のＤ−Ｄ結合によってもたらされた、より長いＣＤＲ−Ｈ３に対する選択があることを示唆する。
【０１５２】
ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤのアミノ酸含有量
ＣＤＲのアミノ酸含有量をＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤのデータセットで分析した（表４）。ニワトリＶ領域の配列は削除され、ヒトの配列のみ分析した。これらのデータセットは免疫されたトリに基づいているため、未処理のレパートリーを表すものではないが、２つの導入遺伝子によって産生されたレパートリーの特性は、免疫原であるヒトプログラニュリン（ＰＧＲＮ）がすべてのトリで同じであるため、互いに比較できる。ＣＤＲ−Ｈ１およびＨ２（ＩＭＧＴ定義が使用された）の場合、長さに関係なく、すべての配列が含まれていた。
【０１５３】
ＣＤＲ−Ｈ１では、ほとんどのアミノ酸は２つの導入遺伝子の配列で同様の頻度で表された。１つの例外はＴｒｐで、ＳｙｎＶＨ−Ｃには存在しなかったが、ＳｙｎＶＨ−ＳＤでは３．３％で見出され、すべてＩＭＧＴの位置３８にあった。考えられる説明は、Ｔｒｐが位置３８のＳｙｎＶＨ−ＳＤ偽遺伝子の３つにあるが、どのＳｙｎＶＨ−Ｃ偽遺伝子にもないことである。同様に、ＡｌａはＳｙｎＶＨ−Ｃ配列でより一般的であり、ＩＭＧＴの位置３８にある２０のＳｙｎＶＨ−Ｃ偽遺伝子のうち１５にＡｌａが存在することを反映している。ＡｓｐはＳｙｎＶＨ−ＳＤでより頻繁にあり、やはり最もあり得るのはＡｓｐを含む偽遺伝子からの遺伝子変換の結果であった（１６のうち７つはＣＤＲ１に少なくとも１つのＡｓｐを有している）。クローン選択は関連するアミノ酸の頻度を変える可能性があるが、ＰＧＲＮへの抗原結合に関与する残基の頻度を増加させるか、発現レベルなどの属性に影響を与えることにより、頻度の違いの少なくとも一部はそもそも変化の産生の速度の違いに起因するはずである。
【０１５４】
ＣＤＲ−Ｈ２では、アミノ酸の分布はまた２つの遺伝子型で非常に類似しており、やはりバイアスは通常、偽遺伝子のプールで見つかった残基に通常追跡できる。ＴｒｐはＳｙｎＶＨ−ＳＤでより頻繁であり、ＳｙｎＶＨ−ＳＤ偽遺伝子の２つはＩＭＧＴの位置５８にＴｒｐを含んでおり、一方でＳｙｎＶＨ−Ｃ偽遺伝子にはＴｒｐが含まれていない。ＴｒｐがＳｙｎＶＨ−Ｃの配列に存在する場合、体細胞超変異によってのみ引き起こされる可能性がある。
【０１５５】
ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤの導入遺伝子からのＣＤＲ−Ｈ３を比較するには、各導入遺伝子が異なるＪＨ生殖系列遺伝子を有しているため、ＪＨセグメントが寄与していない領域に分析を集中させる必要があった。ＳｙｎＶＨ−ＳＤで使用されるＪＨ６遺伝子には、５Ｔｙｒ残基の文字列が含まれており、このことからデータ内のアミノ酸の頻度がＴｙｒに偏り、結果として、ＣＤＲ全体が含まれている場合、他のアミノ酸の頻度が減少する（境界がＩＭＧＴの位置１０５〜１１７であるか１０７〜１１４であるかにかかわらず）。ＳｙｎＶＨ−ＣのＪ遺伝子はＪＨ４で、短く、Ｔｙｒ残基が２つだけ含まれている。したがって、特異的な長さのＣＤＲ−Ｈ３に焦点を当て、Ｄ領域によって通常寄与される位置（１２〜１４残基の長さでは１０７〜１０９位、１５残基では１０７〜１１１位）のアミノ酸含有量が計算された。それらの長さのＣＤＲ−Ｈ３におけるこれらの位置での各アミノ酸の平均頻度を図４および表４に示す。分析されたＣＤＲ−Ｈ３の部分では、アミノ酸含有量はＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤ配列の間で有意に異なり（χ２値２０４７、１９の自由度、ｐ＜０．０００１）、ＳｙｎＶＨ−Ｃと比較して、ＳｙｎＶＨ−ＳＤ配列の２０のアミノ酸の間でより均一に分布していたように思われる（図４）。（標準偏差はＳｙｎＶＨ−Ｃの方がＳｙｎＶＨ−ＳＤよりも４倍高かった）。２つの導入遺伝子で多くの残基が同様の頻度で見出されたが、わずかに注目すべき例外があった。最も顕著な違いは、セリン（ＳｙｎＶＨ−ＳＤの２．９％と比較してＳｙｎＶＨ−Ｃは１７．６％）とグルタミン（ＳｙｎＶＨ−ＳＤの６．３％と比較してＳｙｎＶＨ−Ｃは０．５％）であった。抗原接触部位の重要な構成要素であるチロシン（３２、３３）は、ＳｙｎＶＨ−Ｃ（２．０％）よりもＳｙｎＶＨ−ＳＤ（３．８％）で幾分高かった。ヒトＤ２ファミリーのメンバーに見出されるＣｙｓコドンは、主にＴｙｒをコードするようにＳｙｎＶＨ−ＳＤで変異され、それがレパートリーのＴｙｒの頻度を増加させた可能性がある。また、システイン含有量が、ＳｙｎＶＨ−ＳＤでより高くなる（詳細は下記を参照）。ヒスチジンの頻度は、ＳｙｎＶＨ−Ｃ（０．２６％）と比較してＳｙｎＶＨ−ＳＤ（５．８％）ではるかに高かったが、正電荷のアミノ酸（Ｋ、Ｒ、Ｈ）の全体的な頻度は類似していた（ＳｙｎＶＨ−ＳＤが１３．０％、ＳｙｎＶＨ−Ｃが１１．７％）。ＣＤＲ−Ｈ３では、アミノ酸の頻度のこれらの違いのいずれかを、偽遺伝子プールで利用可能な残基の違いまで追跡することはできなかった（図８）。Ｓｅｒ、Ｇｌｎ、およびＨｉｓの残基は、両方の偽遺伝子アレイのＣＤＲ−Ｈ３領域に見出すことができる。
【０１５６】
２つの導入遺伝子のＣＤＲ−Ｈ３のアミノ酸の変動を測定するために、シャノンのエントロピーを、長さ１２〜１５のコドンのＣＤＲ３のサブセットの各位置について計算した。長さ１２および１５の残基を図５に示す。１３および１４の残基は同様の結果を提示した。主にＤセグメント（１２残基のＣＤＲの１０７〜１０９位および１５残基のＣＤＲの１０７〜１１１位）が寄与するＣＤＲ−Ｈ３ループの部分では、２つの導入遺伝子の多様性が類似していた。したがって、遺伝子の再編成および遺伝子変換だけで、ＪＨによってコードされていない領域において同様のレベルの多様性をもたらし得る。ＪＨによってコード化された領域には、ＳｙｎＶＨ−ＳＤのＣＤＲ−Ｈ３の多様性が、特にＴｒｐ−１１８から得た５〜７残基の位置（図５Ａの長さ１２のＣＤＲ−Ｈ３の位置１１０、１１２、１１３など）で少なかった。これらの位置は、ＪＨ６によってコードされたチロシンのタンデムストレッチ内にあり、チロシン含有量は配列データのこれらの位置で高かった。ただし、チロシンをコードするＪＨ６遺伝子の他の位置は、ＳｙｎＶＨ−ＳＤのトリで体細胞変異していることがわかり、位置１１３や１１４のように非常に多様である可能性がある。位置１１２および１１２Ａでの多様性の欠如は、抗原結合におけるこれらの位置の関与の低下を反映し、体細胞変異の選択の圧力が低くなる可能性がある。ＳｙｎＶＨ−ＳＤ偽遺伝子の特定のＣＤＲ３配列の欠如も寄与因子である可能性があるが、これらの位置にも偽遺伝子供与体が欠如しているにもかかわらずＳｙｎＶＨ−Ｃと比較して位置１０８〜１１１および位置１１３〜１１４のばらつきは減少しなかった。
【０１５７】
ＦＲ領域の多様性のレベルを判定するために、Ｖ領域の全長にわたってシャノンのエントロピーを計算した（図９）。ＦＲ、特にＦＲ２の多様性はほとんどなかった。ＦＲの変動性は、ＳｙｎＶＨ−Ｃの場合よりもＳｙｎＶＨ−ＳＤの場合の方がいくらか低くなった。これは、ＳｙｎＶＨ−Ｃの偽遺伝子には幾分かのＦＲの変更が含まれているのに対して、ＳｙｎＶＨ−ＳＤの偽遺伝子には含まれていないため、予想され得る。ＳｙｎＶＨ−ＳＤのＦＲの何らかの変更は、テンプレート化されていない超変異によるものか、ニワトリ偽遺伝子によるものであるにちがいない。ＳｙｎＶＨ−ＳＤで観察されたＦＲ１の変動は部分的にニワトリ偽遺伝子に由来したが（前述のとおり）、全体的な変動のレベルはＦＲ１のＳｙｎＶＨ−Ｃの変動よりもかなり低かった。ＦＲ２は本質的に変動がなかった。
【０１５８】
ＳｙｎＶＨ−Ｃの機能的なＶ領域には、ＦＲ３のモチーフＲＬＦ（ＩＭＧＴの位置９０〜９２）が含まれる。これは、ＶＨ３−２３遺伝子に見られる生殖系列残基ＱＭＮと比較される体細胞変異を表す。ＳｙｎＶＨ−Ｃ偽遺伝子のいくつかは、それらの位置にＱＭＮ残基を含み、遺伝子変換による生殖系列ＦＲ３配列への復帰を可能にする。この復帰は９４％の配列で観察され、ＲＬＦモチーフが構造的に不利であり、レパートリーでＱＭＮ残基が選択されたことを強く示唆している。
【表４】
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表４  ＣＤＲ１〜３のアミノ酸の分布
ＩＭＧＴのＣＤＲ名称が使用された。ＣＤＲ−Ｈ３の場合、１２〜１５残基のＣＤＲの長さのアミノ酸の頻度が計算および平均化され、ＶおよびＪの遺伝子によってコードされた残基が削除された。６羽のＳｙｎＶＨ−Ｃのトリ（ｎ＝５６５２）および３羽のＳｙｎＶＨ−ＳＤのトリ（ｎ＝３０００）から得たヒトの配列のみを分析した。
【０１５９】
ＣＤＲ３の疎水性
ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤからの各ＣＤＲ−Ｈ３（ＩＭＧＴの位置１０５〜１１７）の平均疎水性は、アミノ酸疎水性の正規化されたＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅスケールに基づいて計算された（３４、３５）。長さ１２〜１５の残基のＣＤＲ−Ｈ３からのデータを組み合わせた（図６）。これらの値の平均は、ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤの両方に対してスケールの親水性の側にあり、範囲はヒトとマウスのレパートリーに対して以前に報告されたものと同様に表れている（３６〜３８）。ＳｙｎＶＨ−ＳＤのＣＤＲ−Ｈ３の平均値は、ＳｙｎＶＨ−Ｃと比較してわずかに疎水性にシフトしている（疎水性の値の平均の差は、２群で有意であった（対応のないＫｏｌｍｏｇｏｒｏｖ−Ｓｍｉｒｎｏｖ検定、ｐ＜０．０００１））。
【０１６０】
ＦＲおよびＣＤＲのシステイン含有量
低頻度の非標準的なシステイン残基が、ＳｙｎＶＨ−ＣおよびＳｙｎＶＨ−ＳＤ配列のＶ領域全体に散在し、単一の不対のシステイン、またはジスルフィド架橋を形成する潜在可能性のあるシステインの対として見出された（表５）。合計１２３の不対の個々のシステインが、２つの導入遺伝子の８６５２のＶＨ配列で見出された（表５）。これらの残基は、ＳｙｎＶＨ−ＣのＦＲ１を除いて、ＣＤＲ−Ｈ３を含むＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤの両方のすべてのＦＲおよびＣＤＲで見出された。不対のシステインの頻度は、ＷＴニワトリで観察された頻度よりも低かった（ＳｙｎＶＨとＷＴのＣＤＲ１、ＦＲ２、およびＣＤＲ２で、０．０８％、０．１３％、０．１７％対２．１％、０．８％、２．４％（１７））。
【０１６１】
ＣＤＲ−Ｈ３では、ＳｙｎＶＨ−Ｃ配列の総システイン含有量は０．０１％であり、ＳｙｎＶＨ−ＳＤでは２．０５％（表４）であり、ヒトで報告された１．２１％と比較された（２８）。したがって、ＣＤＲ−Ｈ３におけるシステインの出現は、ニワトリまたはヒトに由来するヒト配列間で類似している。不対のシステインに加えて、ジスルフィド架橋を形成できる少数の対になっているシステインも、両方の導入遺伝子のＣＤＲ−Ｈ３内で観察された（ＳｙｎＶＨ−Ｃの３配列、ＳｙｎＶＨ−ＳＤの１１０配列）（表４および表５）。ＳｙｎＶＨ−Ｃにはまた、ＣＤＲ−Ｈ２に対のシステインのインスタンスが６つあったが、ＳｙｎＶＨ−ＳＤにはなかった。これらの対のシステインは、潜在的なジスルフィド安定化ループを形成するが、ループ自体の配列には多様性がほとんどない。ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤからそれぞれ２つの固有の配列のみが見出された。これらの対のシステインはまれにしか発生せず、その後、系図内のクローン拡大によって広がったことを示している。ＳｙｎＶＨ−ＳＤがＳｙｎＶＨ−ＣよりもＣＤＲ−Ｈ３で潜在的なジスルフィドループのインスタンスを多く含んでいたことは印象的であった（ＳｙｎＶＨ−ＳＤ配列の３．７％は、ＳｙｎＶＨ−Ｃ配列の０．０５％と比較して潜在的なＣＤＲ３内のジスルフィドループを含んでいた）。ＳｙｎＶＨ−ＳＤ導入遺伝子は、原則としてより高いシステイン含有量を提供できるＤクラスターを有していたが、導入遺伝子は、生殖系列ヒトＤ２ファミリーメンバーに通常見られるＣｙｓコドンがすべて変異してＴｙｒまたはＴｒｐをコードするように設計された。ＳｙｎＶＨ−ＳＤ偽遺伝子の配列では、ＦＲ３の下流領域にＣｙｓコドンがいくらか含まれており、そのため、遺伝子変換（および体細胞超変異）によってシステインが追加されている可能性がある。ＳｙｎＶＨ−ＳＤ偽遺伝子の設計は、生殖系列ＶＨ３ファミリーのＣＤＲに基づいており、生殖系列Ｖ遺伝子にはＣＤＲ３が含まれていないため、偽遺伝子のＦＲ３の下流の領域は、単に偽遺伝子間のスペーサー配列であった。これらのスペーサーは、遺伝子変換に使用される場合、多様性の潜在的な供給源をもたらすことができる。
【０１６２】
ヒト由来の配列と同様に、ニワトリ由来のヒト配列のシステイン含有量は少なく、これは正常なニワトリの抗体のシステイン含有量とは、際立って対照的である（１７）。ＷＴニワトリでは、ニワトリ由来のヒト型配列の１．３％に比較して、非選択のＶＨクローンの５３％にＣＤＲ−Ｈ３の２つの非標準システインが含まれていた。これらの対になったシステインは、ニワトリＣＤＲ−Ｈ３の抗原結合構造を安定させる小さなループを形成できる。ここに提示されているヒト型配列では、システインは２〜４個のアミノ酸で区切られているが、一方で、一部の場合においてニワトリの抗体のループは、さらに長くなり得る（１７）。ニワトリＶＨ配列は、ＣＤＲ３に単一のシステインとＶＨ領域の他の場所に第２のシステインを含むことが多く、ＣＤＲ３からＶ領域の別の部分への潜在的なジスルフィド架橋を形成する（Ｗｕらのタイプ３〜６）。かような対のシステインは、ニワトリから得たヒト型配列では観察されなかった。両方の導入遺伝子からの８６５２のうち１つの配列のみが、Ｖ領域の異なる部分における２つの非標準システイン、ＦＲ２とＦＲ３のシステインを伴う単一のＳｙｎＶＨ−Ｃ配列を有していた。この特定のパターンはニワトリ型では見られなかった（１７）。
【表５】
2021516954.tif 000007
【０１６３】
表５  ＳｙｎＶＨ−ＣとＳｙｎＶＨ−ＳＤのトリでは、非標準的なシステイン含有量は低い
番号は、各々のトリから得た上位１０００の固有の配列で、単一の不対のＣｙｓ残基または２つの潜在的に対のＣｙｓ残基を含む固有の配列の数を示す（ヒトＶ領域のみを分析した；ＳｙｎＶＨ−Ｃに対して合計ｎ＝５６５２、ＳｙｎＶＨ−ＳＤに対してｎ＝３０００）。括弧内には、潜在的なループの配列が示されている。他の唯一の可能性のあるジスルフィドループは、ＦＲ２およびＦＲ３にＣｙｓ残基を含む単一のＳｙｎＶＨ−Ｃ配列であった。ＦＲ２とＦＲ４では、非標準のＣｙｓのすべてのインスタンスは、Ｔｒｐ−＞Ｃｙｓの変更のケースであり、単一のヌクレオチド置換によって発生する可能性がある。３つ以上の非標準システインのインスタンスは観察されなかった。
【０１６４】
ｍＡｂとＮＧＳのデータの比較
ＮＧＳのデータの源である脾臓リンパ球は、免疫化され、抗原特異的抗体の産生に使用されたトリに由来する。６羽のＳｙｎＶＨ−Ｃおよび３羽のＳｙｎＶＨ−ＳＤのトリを、検証する免疫原であるヒトのプログラニュリン（ＰＧＲＮ）で免疫した。抗原特異的ｍＡｂのパネルは、ＧＥＭアッセイで脾臓の細胞をスクリーニングすることにより、各々のトリから特定された（１８、３９）。ＥＬＩＳＡにより、ｍＡｂをＰＧＲＮへの結合として確認し、重鎖および軽鎖のＶ領域の配列が得られた。これらの全トリの軽鎖は、ヒトＶ−カッパ導入遺伝子によってもたらされた（１８）。トリは他の対立遺伝子に軽鎖と重鎖のノックアウトがあり、重鎖と軽鎖の両方の導入遺伝子がヘテロ接合性であった。したがって、トリにおいてヒトＶ領域抗体のみが産生されている。
【０１６５】
個々のトリから得た抗原特異的ｍＡｂの固有のＶＨ配列を、同じトリから得たＮＧＳのデータと比較した（合計１７７ｍＡｂ）。ＮＧＳのデータで各ｍＡｂが配列された回数を図７に示す。１７７ｍＡｂ配列はすべてＮＧＳのデータで見つかり、一致の程度は様々であった。ｍＡｂｓの７９（４５％）がＮＧＳのデータで５回以下シーケンシングされ、３７が１回だけシーケンシングされたため、ＧＥＭスクリーンでまれなｍＡｂを簡単に特定できることを示している。配列データのみに基づいてｍＡｂを選択することにすると、これらのまれなｍＡｂを見逃しやすい。その他は複数回、最大で約７０００回見出された。ｍＡｂ配列の約３分の１（６３／１７７）は、ＮＧＳのデータの固有のペプチド配列と完全に一致したが、残りの部分は、最も近い一致と比較していくらかの変化があった。これらの変化は、ＮＧＳのデータが脾臓のスナップショット、最大で約１０６個のＢ細胞（平均して、取得された各々のトリから得られた配列の総数）を表すという事実をおそらく反映しているが、それに対し、ｍＡｂは、約７ｘ１０６個のＢ細胞というより大きなサンプルサイズのＧＥＭスクリーンに由来していた。ＧＥＭスクリーンで取り上げられた単一の細胞の配列は、ＮＧＳのデータで正確な配列が見つからなかったとしても、ＮＧＳのデータの系図の配列に関連している可能性がある。逆転写またはライブラリーの準備によって導入された配列エラーはまた、要因である可能性がある。
【０１６６】
考察
ニワトリの遺伝子変換／体細胞超変異システムは、宿主に防御免疫を与えることができる多様なレパートリーを生み出すように発展した。組み合わせたメカニズムに由来する多様性の欠如は、ＣＤＲ−Ｈ３レパートリーの制限とは思われない。ヒト型可変領域をコードする２つの導入遺伝子が導入されたとき、一方は再配置ができないが、遺伝子変換および／または体細胞超変異によってその配列多様性を純粋に生じることを余儀なくされ、他方は再配置を経て、すべてのヒトＤを選択して組み合わせの多様性を作りだしたが、アミノ酸の多様性のレベルは類似していた。データセットは免疫化されたトリからのものであるため、免疫化からの特定の残基にいくらかの偏りがある可能性があるが、２つの導入遺伝子は、異なる多様性の生成の様式であるにもかかわらず、同様に振る舞った。ＣＤＲ１と２、およびＦＲでは、アミノ酸の頻度を両方の導入遺伝子のヒト偽遺伝子に見出される残基に関連付けることができたが、ＣＤＲ３の場合はできなかった。
【０１６７】
ＣＤＲ−Ｈ３の長さの範囲と平均も、事前再配置された導入遺伝子と再配置された導入遺伝子の両方で非常に似ていた。再配置の導入遺伝子が原則としてＤの使用の変動からはるかに広い範囲を生成できることを考えると、ＣＤＲ−Ｈ３の平均の長さが２つの導入遺伝子で非常に類似していたことは、印象的である。ニワトリにＴｄＴがないため、長さはＤ遺伝子によってコードされるもの、または遺伝子変換によって挿入できるものに制限される。このことは、通常のヒトのレパートリーと比較して短い長さがここで見られることを説明できる。遺伝子変換だけでは、ＴｄＴ活性での再配置（ヒトの場合など）またはＤ−Ｄ結合での再配置（ＷＴのニワトリの場合など）と同じくらい広範囲のＣＤＲ−Ｈ３の長さを生成できない場合がある。ＳｙｎＶＨ−ＳＤは、Ｄ−Ｄ結合またはさらに単一のＤ再配置によって、理論的に可能な長さの範囲を生成しなかった。ＣＤＲ−Ｈ３の長さに関する制約は、トランスジェニックニワトリの特定のＶ−カッパ軽鎖とのペアリング、そのようなヒトのＤ−Ｄ配列の潜在的に好ましくない構造的属性、またはヒトＳｙｎＶＨ−ＳＤ構築物において含まれなかったニワトリのＤ−Ｄ結合を促進する未知のシス作用性の配列に由来している可能性がある。範囲とＣＤＲ−Ｈ３の長さの平均は類似していたが、ＳｙｎＶＨ−ＳＤにはかなりの割合のより長いＣＤＲ−Ｈ３（１５残基以上）が含まれており、抗体発見プログラムの利点を表す可能性がある。追加された機能、例えば広範なエピトープカバレッジ、アゴニストまたはアンタゴニスト機能、および動態などのさらなる機会である可能性があるためである。格別長い（約６０アミノ酸）Ｈ３ドメインを有するウシ抗体は、おそらくウイルスの保存されているが閉塞しているエピトープに結合する能力のために、ＨＩＶの多くのクレードにわたる強力な中和剤である可能性があることが最近示された（４０）。
【０１６８】
非標準的ジスルフィド架橋など、ニワトリによく見られる構造は、ヒト型配列では非常にまれであった。レパートリーの発展中に利用できるヒト生殖系列と偽遺伝子は、そのような構造をコードしないため、それらを産生する明確なメカニズムはない。ニワトリで高い親和性のヒトの抗体を取得するには、これらの構造は必要ない。なぜならば、この研究で比較したｍＡｂは、０．１１ｎＭまでの範囲の親和性と、ＷＴニワトリと同様のエピトープ範囲を有していたためである（１８）。これらのデータは、新規のエピトープを認識するＷＴニワトリ由来のｍＡｂは、頻繁に存在しているが、ジスルフィド架橋を必要としないという観察によって裏付けられている（４１）。
【０１６９】
機能配列の選択は、ＳｙｎＶＨ−ＳＤの生殖系列ＶＨ３−２３シグナルペプチドおよびＳｙｎＶＨ−ＣのＦＲ３のＱＭＮモチーフに対して明らかに有効であった。生殖系列ＶＨ３−２３の遺伝子には、シグナルペプチドにリジン残基が含まれている。これは、ヒトの体細胞由来のＳｙｎＶＨ−Ｃシグナルペプチドで（Ｉｌｅに）変異された。Ｖ遺伝子の５’末端での遺伝子変換を含む、ニワトリにおけるＳｙｎＶＨ−ＳＤのシグナルペプチド配列を変異させるために、複数のメカニズムが働いた。この結果は、ニワトリ偽遺伝子の遺伝子変換が有用な目的を提供できる場合、それはヒト型の機能的なＶに作用できるということを示している。ニワトリ偽遺伝子からの遺伝子変換がヒトＶ領域に作用できるにもかかわらず、バルク配列ではヒトＦＲの遺伝子変換はほとんど観察されず、ｍＡｂの配列ではニワトリの遺伝子変換はまったく見出さなかった。遺伝子変換メカニズムの観点から、ニワトリ偽遺伝子は、ヒトの機能的なＶからの物理的な距離と相同性のレベルの低下のために、不利になる可能性がある（５、１１、１３）。これは、ニワトリの偽遺伝子による遺伝子変換の欠如を説明することができる。機能的見地から、ヒト偽遺伝子および体細胞の超変異によって達成可能な多様性は、抗原に結合することができる抗体を可能にするのに十分広範囲にわたるので、一般に、ニワトリ偽遺伝子によるさらなる変異を駆動する選択の圧力はない。
【０１７０】
実施例２
ＶＤＪノックアウトの調製
ガイドＲＮＡの設計：ニワトリの機能的重鎖Ｖの上流１５９ｂｐ領域をガイドＲＮＡの設計のためにＭＩＴサーバーで分析した。４つのガイドＲＮＡが選択され、合成されて、以下の野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（Ｈｏｒｉｚｏｎ）を含むＧＥ６ベクターに個別にクローニングされた：ｇＲＮＡ１、ＡＡＡＴＣＡＴＴＡＡＴＣＡＡＣＣＣＧＡＣ（配列番号４３）；ｇＲＮＡ２、ＡＡＣＡＣＧＡＣＴＣＣＧＧＧＣＣＴＡＧＡ（配列番号４４）；ｇＲＮＡ３、ＴＧＡＴＴＡＡＴＴＧＧＧＣＧＣＣＣＧＴＣ（配列番号４５）；ｇＲＮＡ４、ＡＴＴＴＡＡＴＧＧＣＣＧＴＣＴＡＧＧＣＣ（配列番号４６）。これらのｇＲＮＡには、予測される標的外の部位はほとんどなかった。いずれも公知のコード配列に存在していなかった。ＥＧＦＰに特異的なｇＲＮＡ５を含むコントロール構築物も調製した（ＡＡＧＴＴＣＧＡＧＧＧＣＧＡＣＡＣＣＣ（配列番号４７））。
【０１７１】
ターゲティングベクターＩｇＨ  ＫＯ６Ｂの設計：１１３３ｂｐおよび１０１１ｂｐの相同領域をＰＣＲ増幅し、オリジナルのＪＨ−ＫＯを保有するホモ接合型ノックアウトニワトリからクローニングした（Schusser et al Proc Natl Acad Sci USA.2013 110:20170-20175）。５’ＨＲは、プライマー５’−ＧＣＣＣＣＴＡＡＴＡＡＧＴＧＧＴＴＴＡＡＴＴＡＴＧ−３’（配列番号４８）および５’−ＴＣＴＧＣＧＣＴＧＡＧＴＴＣＴＴＴＧＡＴ−３’（配列番号４９）で増幅された、３’ＨＲは、プライマー５’−ＡＡＧＴＣＧＡＧＧＣＴＧＡＣＧＡＧＡＡＡ−３’（配列番号５０）および５’−ＣＴＴＴＴＣＣＣＣＡＣＣＡＡＡＴＴＴＣＡ−３’（配列番号５１）で増幅された。ホモ接合性ＤＮＡは、ホモロジー領域が、ＪＨ−ＫＯに対してヘテロ接合性であるターゲティングに使用される細胞で、ＪＨ−ＫＯを運ぶ対立遺伝子４７２−１３８に対して同系であることを確実にした。２つの対立遺伝子は、これらのＰＧＣを導出するために使用されるニワトリが非近交系であるため、多型である可能性がある。ＩｇＨ遺伝子座では、相同領域はｇＲＮＡの標的となる配列を含む１２２ｂｐのストレッチで区切られており、ｇＲＮＡが細胞にコトランスフェクトされたときに、標的ベクター自体ではなくゲノムのみを標的にすることを確実にする。相同領域は、ＰＧＣでの選択用のβグロビンＨＳ４絶縁ハイグロマイシン耐性遺伝子と、ＪＨ−ＫＯ選択可能マーカーカセットの下流のｌｏｘＰ部位と再結合するように設計されたｌｏｘＰ部位に隣接している。
【０１７２】
ターゲティングに使用する細胞：ＰＧＣ株４７２−１３８には、ＪＨ領域（Schusser et al Proc Natl Acad Sci USA.2013 110:20170-20175）がｌｏｘＰが導入された選択可能マーカーカセットに置き換えられた、以前にターゲティングされた重鎖遺伝子座が含まれている。細胞株は、ＪＨ−ＫＯ  ＰＧＣを注入された生殖系列キメラ雄鶏を野生型の雌鶏につがわせ、ステージ４〜８（ハンバーガーおよびハミルトン）のＥＧＦＰ陽性胚の生殖三日月環から細胞を培養することによって得られた。ＰＧＣは説明されているように培養された［６］。簡単に言うと、ＰＧＣはＫＯ−ＤＭＥＭ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で成長し、そのうち４０％がバッファローラットの肝細胞（ＢＲＬ、ＡＴＣＣ）で前処理され、７．５％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、２．５％照射のニワトリ血清、１Ｘの非必須アミノ酸、２ｍＭのグルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、０．１ｍＭのβ−メルカプトエタノール（すべてＬｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ製）、４ｎｇ／ｍｌの組換えヒト線維芽細胞成長因子、６ｎｇ／ｍｌの組換えマウス幹細胞因子（どちらもＲ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ製）で補足され、ＢＲＬ細胞の照射フィーダー層で増殖させた。細胞を週に３回、新しいフィーダー層に継代した。
【０１７３】
トランスフェクションと注入：ＥＧＦＰ遺伝子座の不活性化を検証するために、ＥＧＦＰ特異的ｇＲＮＡ５／Ｃａｓ９またはＣａｓ９単独の１５μｇを３ｘ１０６細胞に加え、Ｖバッファー（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ）で１００μｌの容量にした。細胞懸濁液を２ｍｍのキュベットに移し、３５０ボルト／１００μ秒の８つの方形波パルス（ＢＴＸ  ８３０エレクトロポレーター）にかけた。エレクトロポレーションの後、細胞を培地に再懸濁し、９日間培養して、細胞内の残りのＥＧＦＰを希釈した。Ａｔｔｕｎｅフローサイトメーター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、緑色蛍光の喪失について細胞を分析した。ＩｇＨ遺伝子座を標的とする安定したトランスフェクタントの場合、１５μｇの環状ｇＲＮＡ１、２、３または４／Ｃａｓ９および２．５、５または１５μｇの環状ＩｇＨ  ＫＯ６Ｂを５×１０６細胞に添加し、上記のようにトランスフェクトし、ハイグロマイシン耐性の照射ＢＲＬで蒔き、４８ウェルプレートで、ウェルあたり１０５細胞の密度で播種した。ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を含まない５μｇのＩｇＨ  ＫＯ６Ｂによるコントロールのトランスフェクションも行われた。３日後、４０μｇ／ｍｌのハイグロマイシンを添加して、ＩｇＨ  ＫＯ６Ｂが安定して組み込まれた細胞を選択した。安定したクローンが特定された後、細胞を拡大し、ＰＣＲによるＩｇＨ  ＫＯ６Ｂの組み込みを確認した。確認されたクローンは、ステージ１４〜１６（Ｈ＆Ｈ）でレシピエントのニワトリ胚に注入された。注入された胚を代理殻に移し、３７℃で孵化するまでインキュベートした。雛の性別は、Ｗ染色体のＰＣＲにより孵化後に判定された。
【０１７４】
ＩｇＨ  ＫＯ６Ｂによるターゲティングのスクリーニング：ハイグロマイシン耐性クローンをＩｇＨ  ＫＯ６ＢによるターゲティングのＰＣＲで分析した。５’アッセイの場合、フォワードプライマーはｃｈＶＨ−Ｆ５：５’−ＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴＧＡＴＧＧＡＡＧＡＡＴＧＴＡ−３’（配列番号５２）であり、リバースプライマーはＨＡ−Ｒ：５’−ＡＴＡＣＧＡＴＧＴＴＣＣＡＧＡＴＴＡＣＧＣＴＴ−３’（配列番号５３）であった。３’アッセイでは、フォワードプライマーはＫＯ  ６Ｂ−Ｆ：５’−ＧＣＴＧＡＡＣＴＡＧＡＡＴＧＣＡＴＣＡＡＧＣ−３’（配列番号５４）、リバースプライマーはｃｈＶＨ−Ｒ３３：５’−ＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＧＣＣＧＣＡＴＣＣＡ−３’（配列番号５５）であった。
【０１７５】
ＩｇＨ遺伝子座に挿入されたｌｏｘＰ部位のＣｒｅ組換え：ＣＲＩＳＰＲ標的化ｌｏｘＰ部位とＪＨ−ＫＯ  ｌｏｘＰ部位を運ぶ株１７８３−９の３×１０６細胞に、上記のように２０μｇのβ−アクチン−Ｃｒｅ発現構築物を一時的にトランスフェクトし、１０日間培養した。次に、Ｃｒｅトランスフェクションを繰り返して、切除した細胞の割合を増やし、４日後、最も外側の２つのｌｏｘＰ部位間でのＣｒｅ／ｌｏｘ組換えのＰＣＲ分析のために細胞を回収した。２つのＰＣＲアッセイを実施した。どちらも上流のＶＨ隣接領域に５’プライマーを使用した（ｃｈＶＨ−Ｆ３ａＢ：５’−ＧＡＴＧ  ＧＧＧＧＧＴＧＧＣＡＡＴＧＧＡＡＴＧＡＴ−３’（配列番号５６））。３’プライマーは、１．６ｋｂのアンプリコンを生成するＪＨ−ＫＯ（ｎｅｏ−Ｆ１：５’−ＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＡＣＧＴＴＧＴＣＡＣＴ−３’（配列番号５７））のｎｅｏ遺伝子、または２ｋｂのアンプリコンを生成する選択可能なマーカー（ｃｈＪＣ−Ｒ４５：５’−ＧＣＣＣＡＡＡＡＴＧＧＣＣＣＣＡＡＡＡＣ−３’（配列番号５８））の下流のＩｇＨ遺伝子座に位置する。
【０１７６】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を使用してＰＧＣゲノムを編集できるかどうかを検証するために、ＩｇＨ遺伝子座に挿入された強化版緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）導入遺伝子を不活性化するための実験が最初に行われた。ＥＧＦＰ遺伝子は、ＪＨ−ＫＯ  ＰＧＣ細胞株４７２−１３８のＪＨ遺伝子セグメントをノックアウトするために使用された選択可能なマーカーカセットの一部である（図１０、Ａ）。先に記述したＥＧＦＰに対するｇＲＮＡ（ｇＲＮＡ５）は、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼも運ぶＵ６発現ベクター（ＧＥ６）にクローニングされた。ＰＧＣは、Ｃａｓ９をコードする構築物を、ｇＲＮＡ５の有る場合およびｇＲＮＡ５のない場合で、一時的にトランスフェクトした。トランスフェクションの９日後、細胞の集団をフローサイトメトリーで分析したところ、Ｃａｓ９／ｇＲＮＡ５集団の細胞の約９％が、コントロールのトランスフェクションと比較してＥＧＦＰ発現を失っていた（図１０、Ｂ）。
【０１７７】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９で遺伝子組み換えトリを産生するには、ＰＧＣで産生された改変が生殖系列を介して次世代に渡されることが可能であるようにせねばならない。この目的のために、すべての細胞が所望の変異を保有するクローン集団が好ましい。薬剤選択戦略は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９と組み合わせて設計され、改変を有するクローンを選択して成長させた。ＪＨ−ＫＯ細胞の単一免疫グロブリン重鎖可変領域（ＶＨ）の上流の領域は、ＩｇＨ遺伝子座へのｌｏｘＰ部位の導入を標的とした。４つのガイドＲＮＡは、ＶＨの翻訳開始部位の約３００ｂｐ上流の部位でＣａｓ９によるゲノムの二本鎖切断を方向付けるように設計され（図１１、Ａ）、それぞれがＣａｓ９を使用してＧＥ６ベクターに個別にクローニングされた。Ｃａｓ９切断部位はすべて、供与体のターゲティングベクターＩｇＨ  ＫＯ６Ｂの相同領域から約５０ｂｐである。ＩｇＨ  ＫＯ６Ｂは、ハイグロマイシン選択カセットに隣接する約１ｋｂの短い相同領域で構築された（図１１、Ａ）。
【０１７８】
ニワトリＩｇＨ遺伝子座は、コンティグに編成されていない、ゲノムデータベース内の配列の短いストレッチのみからなるが、ＰＣＲプライマーを設計し、これらの短い相同領域を増幅するのに十分な固有の配列があった。相同領域は、ホモ接合性のＪＨ−ＫＯゲノムＤＮＡから増幅され、そのため、４７２−１３８細胞株にＪＨ−ＫＯを含む対立遺伝子に対して同系である。細胞株４７２−１３８の派生に使用されたトリが非近交系であったため、これらの細胞の他の対立遺伝子は多型である可能性がある。
【０１７９】
ＶＨに対する４つのｇＲＮＡを別々に環状ＩｇＨ  ＫＯ６Ｂで同時にトランスフェクトし、ハイグロマイシンで安定した形質転換体を選択した。トランスフェクションの最初のセットでは、線形化されたターゲティングベクターのみを使用した場合、通常４８ウェルプレートあたり約１〜１０のコロニーを生成するＤＮＡの量である５ｘ１０６細胞に対して、１５μｇの各プラスミド（ＩｇＨ  ＫＯ６ＢおよびｇＲＮＡ／Ｃａｓ９）を使用した。しかし、ＩｇＨ  ＫＯ６ＢをｇＲＮＡ／Ｃａｓ９と組み合わせて使用した場合、トランスフェクションは非常に効率的であったため、４つのトランスフェクションすべてのウェルにハイグロマイシン耐性細胞の複数のクローンが含まれていた。これらはクローン集団ではなかったが、各トランスフェクションから３つのウェルを収穫して、ＩｇＨ  ＫＯ６Ｂによるターゲティングを検証し、すべてが正しいターゲティング事象を含んでいた（図１１、Ｂ）。ｇＲＮＡが１、３、４の場合、ほとんどのウェルのウェルあたりのコロニー数はおそらく４〜５であり、ターゲティング効率は最低でも２０〜２５％であることを示していた（４〜５のうち陽性クローンが１つしかない場合）。ｇＲＮＡ２を使用した場合、ほとんどのウェルには約２〜３のクローンしかなかったため、約３３％の高い潜在的効率が示唆されたため、その後のトランスフェクションでｇＲＮＡ２を使用し、耐性コロニーの数を減らすために供与体ＩｇＨ  ＫＯ６Ｂの使用量を減らした。２．５μｇのＩｇＨ  ＫＯ６Ｂ＋ｇＲＮＡ２／Ｃａｓ９をトランスフェクションすると、４８ウェルプレートあたり１２のコロニーが得られ、そのうち９つはターゲティング用にスクリーニングされた。９つのクローン集団すべてが正しいターゲティングを有していた（図１１、Ｃ）。５μｇのＩｇＨ  ＫＯ６Ｂ＋ｇＲＮＡ２／Ｃａｓ９によるトランスフェクションでは、＞５０クローンが得られたが、ｇＲＮＡ／Ｃａｓ９を含まない５μｇのＩｇＨ  ＫＯ６Ｂによるコントロールのトランスフェクションでは２つのコロニーしか得られず、どちらも正しくターゲティングされていなかった（データ非掲載）。
【０１８０】
ＶＨ領域のターゲティングは、標的対立遺伝子のハイグロマイシン遺伝子に隣接して配置されたｌｏｘＰ部位を利用して、独立して確認された。下流のＪＨ−ＫＯ選択可能マーカーは、（ｌｏｘＰが導入された）ｌｏｘＰ部位に隣接し、ＶＨ  ｌｏｘＰ部位と同じ染色体上にあるべきである。ターゲティングが正しい場合、Ｃｒｅ組換えは介在ＤＮＡを切除し、単一のｌｏｘＰ部位とプロモーターのないｎｅｏ遺伝子を残すはずである（図１２、Ａ）。ＣＲＩＳＰＲ標的化クローン１７８３−９の細胞に、Ｃｒｅ発現構築物を２回連続して一時的にトランスフェクトし（切除により細胞のパーセンテージを高めるため）、細胞を２回目のトランスフェクション後４日間増殖させて組換えを可能にした。ｌｏｘＰ部位の外側にあるＰＣＲプライマーは予想されるサイズの産物を増幅したが、非組換え細胞ではプライマーは約２８ｋｂ離れており、産物は観察されなかった（図１２、Ｂ）。これは、ＣＲＩＳＰＲ標的化ＶＨ  ｌｏｘＰ部位が正しい位置と方向にあることを示している。
【０１８１】
５つの標的細胞株（１７８３−１、３、６、９、および１０）を胚に注入して、生殖系列キメラを調製した。雄のキメラを野生型の雌と交配し、生殖系列の子孫を、ＪＨ−ＫＯ選択可能マーカーカセットのＥＧＦＰ導入遺伝子を使用して、緑色の蛍光でスクリーニングした。５つの細胞株のうち４つは、生殖系列の子孫を様々な程度で伝播した。１つの細胞株１７８３−１０は、注入された細胞の１００％に近い伝播を伴う１つのキメラを含む、生殖系列伝播の高い率を示した。細胞株１７８３−１０の伝播から得られた４６のＥＧＦＰ陽性子孫を孵化させ、ＣＲＩＳＰＲ標的化ＩｇＨ  ＫＯ６Ｂと分類した。すべてのＥＧＦＰ陽性トリはＩｇＨ  ＫＯ６Ｂの挿入を含み、ＰＧＣクローンが正しい安定した組込みを含むことを確認した。
【０１８２】
参考文献
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【０１８３】
本発明は、好ましい実施形態に関して上記で説明されているが、それに限定されないことも当業者には理解されよう。上記の発明の様々な特徴および態様は、個別にまたは共に使用することができる。さらに、本発明は、特定の環境でのその実装の文脈で説明されてきたが、特定の適用について、当業者は、その有用性がそれに限定されず、本発明が、他のサンプルを調べることが望ましい環境と実装を任意の数で有利に利用できることを認識されよう。したがって、以下に記載される特許請求の範囲は、本明細書に開示される本発明の全範囲および精神を考慮して解釈されるべきである。
【図１】
2021516954.tif 000008
【図２】
2021516954.tif 000009
【図３】
2021516954.tif 000010
【図４】
2021516954.tif 000011
【図５−１】
2021516954.tif 000012
【図５−２】
2021516954.tif 000013
【図５−３】
2021516954.tif 000014
【図５−４】
2021516954.tif 000015
【図６】
2021516954.tif 000016
【図７】
2021516954.tif 000017
【図８】
2021516954.tif 000018
【図９】
2021516954.tif 000019
【図１０】
2021516954.tif 000020
【図１１】
2021516954.tif 000021
【図１２】
2021516954.tif 000022
【配列表】
2021516954000001.app
【国際調査報告】
2021516954.tif 000023
2021516954.tif 000024