(57)【要約】  本発明は、配列番号1の配列により表すゲノム配列を含む、ヒトメタニューモウイルス株に由来する弱毒ウイルス株であって、上記株の病原性を減弱する配列番号1の上記配列の1つ又は複数の遺伝子改変を含む弱毒ウイルス株に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号1の配列によって表されるゲノム配列を含む、ヒトメタニューモウイルス株に由来する弱毒ウイルス株であって、前記弱毒株が、前記株の病原性を減弱する配列番号1の前記配列の1つ又は複数の遺伝子改変を含む、弱毒ウイルス株。
【請求項２】
配列番号1の配列の改変が、SHタンパク質をコードする遺伝子の不活化を含むことを特徴とする、請求項1に記載の弱毒ウイルス株。
【請求項３】
前記株が、配列番号2の配列を含むことを特徴とする、請求項2に記載の弱毒ウイルス株。
【請求項４】
配列番号1の配列の改変が、Gタンパク質をコードする遺伝子の不活化を含むことを特徴とする、請求項1に記載の弱毒ウイルス株。
【請求項５】
前記株が、配列番号3の配列を含むことを特徴とする、請求項4に記載の弱毒ウイルス株。
【請求項６】
配列番号1の配列の改変が、Gタンパク質及びSHタンパク質をコードする2つの遺伝子の不活化を含むことを特徴とする、請求項1に記載の弱毒ウイルス株。
【請求項７】
その配列が、少なくとも1つの外来遺伝子、特には、ウイルス抗原をコードする遺伝子を含む、請求項1から6のいずれか一項に記載の弱毒ウイルス株。
【請求項８】
ヒトメタニューモウイルスの標的細胞における少なくとも1つの外来遺伝子の発現ベクターとしての、請求項7に記載の弱毒ウイルス株のin vitroでの使用。
【請求項９】
医薬としての使用のための、請求項1から7のいずれか一項に記載の弱毒ウイルス株。
【請求項１０】
ニューモウイルス科のウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のための、請求項1から7のいずれか一項に記載の弱毒ウイルス株。
【請求項１１】
ヒトメタニューモウイルスによる感染症を予防及び/又は治療するための、請求項10に記載の使用のための弱毒ウイルス株。
【請求項１２】
オルトニューモウイルス、例えば、ヒト呼吸器合胞体ウイルスによる感染症を予防及び/又は治療するための、請求項10に記載の使用のための弱毒ウイルス株。
【請求項１３】
ウイルスによる感染症の予防及び/又は治療における使用のための、請求項7に記載の弱毒ウイルス株であって、前記ウイルスの少なくとも1つのウイルス抗原が、前記弱毒ウイルス株により発現される、弱毒ウイルス株。
【請求項１４】
薬学的に許容されるビヒクルに、請求項1から7のいずれか一項に記載の少なくとも1つの弱毒ウイルス株、及び任意選択でアジュバントを含むワクチン組成物。
【請求項１５】
吸入による投与が意図される医薬品形態であることを特徴とする、請求項14に記載のワクチン組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新たなヒトメタニューモウイルス(metapneumovirus)株から遺伝子改変したウイルス株に関する。
【０００２】
本発明は、ニューモウイルス(Pneumoviridae)科のウイルスによる感染症の予防的又は治療的処置におけるその使用のための、病原性を減弱する改変株、並びに上記改変ウイルス株を含むワクチン組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
緒言
下気道の急性感染症は、世界的規模において罹患及び死亡の主要因のうちの1つである。5歳未満の小児では特に、評価した国によっては、下気道の急性感染症は死亡の最大15%超に相当し、このため、世界保健機関によれば、死亡率の第2の要因である。
【０００４】
下気道の急性感染症の大多数は、単純な感冒から重篤な肺炎に及ぶ可変性の病態と関連し、とりわけ、ウイルス、例えば、次の科に属するものにより生じる:
(i)オルトミクソウイルス(Orthomyxoviridae)科のウイルス(とりわけ、インフルエンザウイルスを含む)、
(ii)パラミクソウイルス(Paramyxoviridae)科のウイルス、
(iii)アデノウイルス(Adenoviridae)科のウイルス、
(iv)ピコルナウイルス(Picornaviridae)科のウイルス、
(v)コロナウイルス(Coronaviridae)科のウイルス、並びに
(vi)とりわけ、ヒト呼吸器合胞体ウイルス及びヒトメタニューモウイルスを含む、ニューモウイルス科のウイルス。
【０００５】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス(hRSV)及びヒトメタニューモウイルス(hMPV)は、気道の急性感染症、例えば、細気管支炎、気管支炎又は肺炎の原因となるウイルスである。これらは、5歳未満の幼児、高齢者及び免疫抑制者(immuno-depressed persons)のリスク集団に主に影響する。
【０００６】
hRSVは、1歳未満の乳児における細気管支炎及び肺炎の主要な病原因子であり、6か月未満で発症率が増加する。成人では、hRSVによる感染症は、高齢の対象を除いて、まれであり、良性である。伝染は、呼吸器経路により本質的に生じ、ウイルスは、気道において複製する。
【０００７】
hRSVは、1957年に単離された。これは、マイナス極性の1本鎖RNAを有し、「エンベロープ」型であり、らせん対称のカプシドを有するウイルスである。これは、ニューモウイルス科のオルトニューモウイルス(Orthopneumovirus)属に属する。
【０００８】
hMPVは、乳児の細気管支炎及び肺炎によく見られ、1〜3歳の間の小児において特に重症となる。
【０００９】
小児におけるhMPVによる感染症の主な症状は、鼻漏、咳嗽、呼吸促拍、又は代わりに発熱を含む。また、hMPVは、上気道の感染症を生じ、耳感染症と関連し得るが、非呼吸器系の症状、例えば、下痢、嘔吐及び紅斑の発症は、よりまれである。hMPVは、ヒト呼吸樹の線毛細胞を優先的に標的とする。
【００１０】
hMPVによる感染症は、宿主生体の肺における組織病理学的改変を誘導し、特に、次の生理学的作用をもたらす:
-  呼吸上皮レベルの損傷、
-  粘液の過剰生成、並びに
-  炎症促進性サイトカイン及びケモカインの重要な分泌に関連する、特には、間質性肺組織レベルの急性炎症。
【００１１】
成人における呼吸性病態では、hMPVは、気道の急性感染症を有する成人又は高齢者の5〜10%において、及び市中感染した慢性の肺性病態又は肺炎の憎悪を有する成人の3〜5%において同定されている。
【００１２】
hMPVは、単離され、2001年にオランダにおいて初めて記載された(van den Hoogenら、2001)。翌年、北米在住の患者におけるhMPVのいくつかの株が、単離された(Peretら、2002)。hMPVは、マイナスの1本鎖RNAを有するウイルスであり、ニューモウイルス科のメタニューモウイルス属に属する。
【００１３】
hMPVによる感染性合併症のために入院する小児の平均年齢は、6〜12か月、すなわち、0〜3か月の間に主に生じるhRSVにより引き起こされる感染性合併症よりも後である。
【００１４】
しかし、hMPVの疫学は、hRSVの疫学との多数の共通点を有する:
-  すべての大陸に存在し、
-  年間分布が主に冬及び春であり、hRSVの分布と重複し、
-  唾液滴によっても伝染が、ほぼ確実に生じる。
【００１５】
hRSV及びhMPVウイルスによる感染症に対して効率的及び特異的な予防的又は治療的方法は、今日、市場に存在しないが、積極的な研究が、進行中である(Mazurら、2018)。
【００１６】
治療では、望ましくない作用を免れないリバビリン、又は非常に高価な静注免疫グロブリンは、hMPV又はhRSVによる感染症の重症例において時折、使用し得る。他の種類の治療、例えば、融合阻害ペプチド、硫酸化グリコサミノグリカン、干渉RNA及び特定の免疫調節物質の使用は、現在、開発中である。
【００１７】
通常及び広く支持される今日の臨床方法は、患者を呼吸補助下に置きながら(酸素投与又は人工呼吸)、気管支拡張剤、コルチコステロイド及び/又は細菌重複感染を予防若しくは治療するための抗菌剤を患者に投与することによる、特には、感染症の症状の治療からなる。
【００１８】
特にhMPVに感染した集団が乳児、幼児及び高齢者である場合のワクチン接種に関しては、安全及び有効なワクチンを迅速に有することが重要であり、これにより、このような年齢範囲において劇的な影響を有する重度の呼吸性発作が減少する。
【００１９】
したがって、hRSV及びhMPVに対するワクチンの開発は、健康上の主要な課題だけでなく現実の社会経済的問題をも表し、このような感染症と関連する高い治療コスト及び入院を削減する目的、並びに細菌重複感染の文脈における抗菌剤の使用を減少させ、これにより耐性の出現を制限する目的を有する。
【００２０】
従来技術
以下の表1、2及び3では、野生hMPV株から弱毒生ワクチンを得るために開発中の種々の方法を列挙する。
【００２１】
ウイルス株、特には、合胞体(ウイルス感染後に融合する隣接細胞)のウイルス株は、野生型(WT)ウイルスと比較して複製能の低下を示す場合、及び/又はこのようなウイルス株により感染症の大流行の形成がより制限される場合にin vitroで弱毒化されたものと考えられる。in vivoでの弱毒ウイルス株は、野生ウイルス株よりも、低い最大負荷で複製し、及び/又は(体重減少、炎症プロファイル又は病理組織学的損傷に関して)それほど重度ではない病態を誘導する。
【００２２】
【表１】
2021531783.tif 000002
【００２３】
用語「Vero」は、種々のウイルスを試験するための細胞培養において広く使用される、アフリカミドリザル腎細胞株を表す。
【００２４】
用語「LLC-MK2」は、種々のウイルスによる感染試験に使用される、アカゲザル腎細胞に由来する細胞株を表す。
【００２５】
記号
【化１】
2021531783.tif 000003
は、使用する細胞がウイルス感染しやすいことを示す。
【００２６】
以下の略語は、in vivoでの試験モデルに使用する:Mはマウス、Hはハムスター、CRはコットンラット、CMは、カニクイザル、AGMはアフリカミドリザル、Chはチンパンジー、Rhはアカゲザル、及びSCIDは重症複合免疫不全。
【００２７】
【表２】
2021531783.tif 000004
【００２８】
試験したすべての弱毒ウイルス株は、亜群A2の野生株CAN97-83に由来する。
【００２９】
【表３】
2021531783.tif 000005
【００３０】
国際公開第2005/014626号は、次の種類:CAN97-83、CAN98-75及びHMPV00-1により表す、いくつかのhMPV株に関する。この出願では、CAN97-83と表され、病原性を減弱するように遺伝子改変した、組換えhMPV株について記載している。提唱された改変は、G及び/又はSHタンパク質をコードする遺伝子の全欠失に特に関する。改変ウイルス株は、ニューモウイルスによる感染症を予防又は治療するために、ヒト治療において使用し得る。野生株又はこれらの弱毒株をハムスターへ投与すると、CAN97-83 hMPVによる後の感染からこれらを防御することが可能となる。しかし、国際公開第2005/014626号では、完全な防御特性に言及しておらず、特に、処置動物の体重の監視は行われていない。同一の実験結果は、表2に引用する科学論文に記載されている。
【００３１】
同一の弱毒株により、次いで、サル動物モデルについてのin vivoでの結果を得た。SH、G及びM2-2遺伝子を欠失した組換えウイルス株は、サルの気道において複製を続け、その上、CAN97-83野生ウイルス株と同様に中和抗体の産生を誘導した。
【００３２】
他の単離hMPV株は、米国特許第8,841,433号に記載されており、ワクチンの調製のためのその使用も提唱されている。
【００３３】
弱毒生ウイルス株の使用に基づくワクチンは、多数の利点を有する。
【００３４】
一方、弱毒生ウイルスから生成したワクチンは、増殖能力をかなり低下させたウイルスから強力な免疫応答を誘導する利点を有し、これにより、自然感染を模倣すると同時に病態の発症を回避することが可能となる。このような弱毒株の開発において、弱毒と免疫原性との理想的なバランスを見出すことが重要である。
【００３５】
他方、このようなワクチンは、鼻腔内経路により投与し、これにより、野生ウイルスの自然侵入経路を模倣し、これにより、感染症に対する生理学的応答と非常に類似する免疫応答を誘導し得る。
【００３６】
加えて、このワクチン接種戦略は、不活化ワクチンによる場合のように、炎症反応の悪化を生じない。最終的に、アジュバントの追加は、一般には必要ではない。
【００３７】
したがって、これは、リスク集団、例えば、幼児及び乳児における予防のための最適なワクチン戦略である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００３８】
【特許文献１】国際公開第2005/014626号
【特許文献２】米国特許第8,841,433号
【非特許文献】
【００３９】
【非特許文献１】van den Hoogenら、2001
【非特許文献２】Peretら、2002
【非特許文献３】Mazurら、2018
【非特許文献４】Herfst, of Graafら2008
【非特許文献５】Wei, Zhangら2014
【非特許文献６】Yu, Liら2012
【非特許文献７】Liu, Shuら2013
【非特許文献８】Zhang, Weiら2014
【非特許文献９】Biacchesi, Skiadopoulosら2004
【非特許文献１０】Biacchesi, Phamら2005
【非特許文献１１】Buchholz, Biacchesiら2005
【非特許文献１２】Schickli, Kaurら2008
【非特許文献１３】Pham, Biacchesiら2005
【非特許文献１４】Karron, San Mateoら2017
【非特許文献１５】Tang, Schickliら2003
【非特許文献１６】Tang, Mahmoodら2005
【非特許文献１７】Russell, Jonesら2017
【非特許文献１８】Huckら、2006
【非特許文献１９】Hamelinら、2010
【非特許文献２０】Aertsら、2015a
【非特許文献２１】Hamelinら、2007
【非特許文献２２】Duboisら、2017
【非特許文献２３】Aertsら、2015b
【非特許文献２４】Biachesiら、2004
【発明の概要】
【００４０】
本発明の対象は、配列番号1の配列により表すゲノム配列を含む、ヒトメタニューモウイルスの特定の臨床株rC-85473に由来する弱毒ウイルス株であって、上記株の病原性を減弱する配列番号1の上記配列の1つ又は複数の遺伝子改変を含む弱毒ウイルス株である。
【００４１】
本発明による弱毒ウイルス株は、特に、それぞれΔG rC-85473及びΔSH rC-85473と表す組換えウイルスを生成するようにG及びSHアクセサリータンパク質のうちの1つをコードする少なくとも1つの遺伝子の不活化又は欠失により改変した組換え株である。
【００４２】
より詳細には、本発明の対象は、配列番号1の配列により表すゲノム配列を含む、ヒトメタニューモウイルスの臨床株に由来する弱毒ウイルス株であって、アクセサリーGタンパク質をコードする遺伝子の不活化、及びアクセサリーSHタンパク質をコードする遺伝子の不活化から選択される少なくとも1つの遺伝子改変を含む弱毒ウイルス株である。
【００４３】
このような株は、in vitro(LLC-MK2細胞株)及びex vivo(気液界面において培養した再構成ヒト呼吸上皮)細胞モデルにおける感染力及びウイルス複製に関して、並びにhMPVによるマウス感染モデルにおけるウイルス病態形成及びワクチン防御特性に関して特徴づけられる。
【００４４】
実験の節に示す結果は、類似の方法で改変し、またG又はSH遺伝子を欠失させるが、hMPVの別の臨床株(CAN98-75)に由来するウイルス株の結果と比較して、このようなウイルス株ΔG rC-85473及びΔSH rC-85473の特異的性質を強調する。
【００４５】
ウイルスΔG又はΔSH rC-85473は、特に、次を有する:
(i)その部分に対して非常に病原性の組換えウイルスΔSH CAN98-75とは異なる、マウスモデルにおける弱毒ウイルス特性、
(ii)更に、増殖性がはるかに低い組換えウイルスCAN98-75とは異なる、細胞系(参照株LLC-MK2)への結合及び懸濁における、複製能の保存、
(iii)ウイルスΔG又はΔSH C-85473が、著しい防御特性:感染マウスの100%生存、わずかな体重減少、相同ウイルス株(C-85473、血清型A)及び少なくとも1つの異種株(CAN98-75、血清型B)に対する中和抗体応答の誘導、並びに非免疫化対照群において致死率50%を生じる野生hMPV(rC-85473株)による感染曝露(infectious challenge)に相対する、感染動物における肺病態形成の減少を有利に有すること。
【００４６】
この弱毒ウイルス株は、少なくとも1つの外来遺伝子、特には、ウイルス抗原、とりわけ、ヒト呼吸器合胞体ウイルス(hRSV)に由来するウイルス抗原、特には、F融合タンパク質をコードする遺伝子の発現ベクターとしてin vivo、ex vivo及びin vitroで使用し得る。
【００４７】
また、本発明は、医薬としてのその使用のため、特には、ニューモウイルス科のウイルスによる感染症の予防及び/又は治療のための、この弱毒ウイルス株に関する。
【００４８】
最終的には、本発明はまた、薬学的に許容されるビヒクルに、少なくとも1つの弱毒ウイルス株、例えば、上に定義する弱毒ウイルス株、及び任意選択でアジュバントを含む、ワクチン組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１Ａ】臨床株C-85473及びCAN98-75から生成した組換えhMPVを示す図である。臨床株C-85473から逆遺伝技術(reverse genetics)により生成し、GFP(緑色蛍光タンパク質)をコードする配列をこの3'末端にクローニングした、組換えウイルスのゲノムの模式図である。rC-85473ウイルスは、GFP遺伝子に加えて発現する野生株C-85473のゲノムを含む。C-85473株に由来する組換えウイルスのゲノム及び欠失したSH(ΔSH-rC-85473)又はG(ΔG-rC-85473)遺伝子は、下に表す。遺伝子改変ウイルスは、機能性及び複製可能であり、例えば、0.01の感染多重度(MOI)でこのようなウイルスに感染させたLLC-MK2細胞の画像により示され、感染後3日に蛍光顕微鏡により観察される。
【図１Ｂ】臨床株C-85473及びCAN98-75から生成した組換えhMPVを示す図である。臨床株CAN98-75から逆遺伝技術により生成し、GFP(緑色蛍光タンパク質)をコードする配列をクローニングした、組換えウイルスのゲノムの模式図である。rCAN98-75ウイルスは、GFP遺伝子に加えて発現する野生株CAN98-75のゲノムをこの3'末端に含む。CAN98-75株に由来する組換えウイルスのゲノム及び欠失したSH(ΔSH-rCAN98-75)又はG(ΔG-rCAN98-75)遺伝子は、下に表す。遺伝子改変ウイルスは、機能性及び複製可能であり、例えば、0.01MOIでこのようなウイルスに感染させたLLC-MK2細胞の画像により示され、感染後3日に蛍光顕微鏡により観察される。
【図２Ａ】rC-85473及びrCAN98-75ウイルス株並びにこれらに由来する株のin vitroでの複製能を示す図である。組換えウイルスrCAN98-75(黒色の円)、ΔSH-rCAN98-75(黒色の四角)及びΔG-rCAN98-75(黒色の三角)により0.01の感染多重度(MOI)でLLC-MK2細胞を感染させた後7日間毎日採取した細胞上清においてTCID50/mlにより評価したウイルス負荷を示す。
【図２Ｂ】rC-85473及びrCAN98-75ウイルス株並びにこれらに由来する株のin vitroでの複製能を示す図である。組換えウイルスrC-85473(黒色の円)、ΔSH-rC-85473(黒色の四角)及びΔG-rC-85473(黒色の三角)により0.01の感染多重度でLLC-MK2細胞を感染させた後7日間毎日採取した細胞上清においてTCID50/mlにより評価したウイルス負荷を示す。**p<0.01及び***p<0.001(2元配置分散分析統計試験)。
【図３Ａ】BALB/cマウスの感染による組換えhMPV rCAN98-75及びrC-85473のin vivoでの特性決定:体重曲線及び感染後5日の肺ウイルス負荷を示す図である。BALB/cマウスは、鼻腔内滴下によりOptiMem培養培地(「偽」陰性対照、黒色の三角)又は2.5×105FFUの組換えウイルスrCAN98-75(黒色の円)、ΔSH-rCAN98-75(灰色の四角)及びΔG-rCAN98-75(灰色の三角)を用いて感染させた。マウスの体重及び生存を14日間毎日監視した。
【図３Ｂ】BALB/cマウスの感染による組換えhMPV rCAN98-75及びrC-85473のin vivoでの特性決定:体重曲線及び感染後5日の肺ウイルス負荷を示す図である。感染後5日に、1群(陰性対照群を除く)あたりマウス5匹を安楽死させて、肺のTCID50/グラムによる肺感染ウイルス負荷を測定した。
【図３Ｃ】BALB/cマウスの感染による組換えhMPV rCAN98-75及びrC-85473のin vivoでの特性決定:体重曲線及び感染後5日の肺ウイルス負荷を示す図である。BALB/cマウスは、鼻腔内滴下によりOptiMem培養培地(「偽」陰性対照、黒色の菱形)又は5×105TCID50の組換えウイルスrC-85473(黒色の円)、ΔSH-rC-85473(灰色の四角)及びΔG-rC-85473(灰色の三角)を用いて感染させた。マウスの体重及び生存を14日間毎日監視した。
【図３Ｄ】BALB/cマウスの感染による組換えhMPV rCAN98-75及びrC-85473のin vivoでの特性決定:体重曲線及び感染後5日の肺ウイルス負荷を示す図である。感染後5日に、1群(陰性対照群を除く)あたりマウス5匹を安楽死させて、肺のTCID50/グラムによる肺感染ウイルス負荷を測定した。統計試験:各ウイルスを「偽」条件と比較するための2元配置分散分析試験。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。
【図４Ａ】BALB/cマウス感染曝露モデルにおける組換えhMPV  ΔG-rC-85473及びΔSH-rC-85473のin vivoでの防御特性を示す図である。免疫化プロトコール(上)に続いて感染曝露プロトコール(下)の図である。致死量は、1×106TCID50に相当する。
【図４Ｂ】BALB/cマウス感染曝露モデルにおける組換えhMPV  ΔG-rC-85473及びΔSH-rC-85473のin vivoでの防御特性を示す図である。rC-85473(黒色の円)、ΔSH-rC-85473(灰色の四角)若しくはΔG-rC-85473(灰色の三角)、又は非免疫化(「偽」、黒色の三角)ウイルス株により免疫化したマウスの感染曝露を示す。免疫化後21日に、マウスは、鼻腔内滴下により致死量(1×106TCID50)の野生ウイルスrC-85473を用いて感染させた。これらの体重を14日間毎日監視した。
【図４Ｃ】BALB/cマウス感染曝露モデルにおける組換えhMPV  ΔG-rC-85473及びΔSH-rC-85473のin vivoでの防御特性を示す図である。免疫化マウスの種々の群のマウスの曝露後生存曲線を示す。「偽」非免疫化マウスは、わずかに50%の生存を有し、組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473又はΔG-rC-85473により免疫化したマウスは、100%の生存を有する。
【図４Ｄ】BALB/cマウス感染曝露モデルにおける組換えhMPV  ΔG-rC-85473及びΔSH-rC-85473のin vivoでの防御特性を示す図である。感染曝露5日後(すなわち、免疫化後26日目)に、各群あたりマウス4匹を安楽死させて、肺のTCID50/gによるこれらの肺感染ウイルス負荷を測定した。「nd」は、検出不可能を示す。
【図４Ｅ】BALB/cマウス感染曝露モデルにおける組換えhMPV  ΔG-rC-85473及びΔSH-rC-85473のin vivoでの防御特性を示す図である。感染曝露5日後(すなわち、免疫化後26日目)に、各群あたりマウス4匹を安楽死させて、RTqPCR(Ngene社)によりこれらの肺感染ウイルス負荷を測定した。統計試験:各ウイルスを偽条件と比較するための2元配置分散分析。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。
【図５Ａ】組換えウイルスrC-85473及びrCAN98-75並びにそれらの欠失バージョンのin vitroでの細胞結合能を示す図である。rCAN98-75ウイルス(円)並びにその弱毒形態ΔSH-rCAN98-75(四角)及びΔG-rCAN98-75(三角)による、結合時間の関数としての感染LLC-MK2細胞の百分率を示す。
【図５Ｂ】組換えウイルスrC-85473及びrCAN98-75並びにそれらの欠失バージョンのin vitroでの細胞結合能を示す図である。rC-85473ウイルス(円)並びにその弱毒形態ΔSH-rC-85473(四角)及びΔG-rC-85473(三角)による、結合時間の関数としての感染LLC-MK2細胞の百分率を示す。
【図６Ａ】気液界面において培養した再構成ヒト呼吸上皮3Dモデルにおける組換えウイルスrC-85473及びrCAN98-75のex vivoでの複製能を示す図である。培養中のヒト呼吸上皮モデルを組換えウイルスrCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75及びΔG-rCAN98-75(上段の写真)並びに組換えウイルスrC-85473(白色)、ΔSH-rC-85473(濃灰色)及びΔG-rC-85473(判定不可能)(下段の写真)に感染させた。
【図６Ｂ】気液界面において培養した再構成ヒト呼吸上皮3Dモデルにおける組換えウイルスrC-85473及びrCAN98-75のex vivoでの複製能を示す図である。組換えウイルスrCAN98-75(WT、白色)、ΔSH-rCAN98-75(濃灰色)及びΔG-rCAN98-75(淡灰色)(点線の左)又は組換えウイルスrC-85473(WT)、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473(点線の右)により感染させた上皮の頂端表面(apical surface)において測定した子孫ウイルスの定量(ウイルスゲノムの定量による)を示す。
【図６Ｃ】気液界面において培養した再構成ヒト呼吸上皮3Dモデルにおける組換えウイルスrC-85473及びrCAN98-75のex vivoでの複製能を示す図である。組換えウイルスrCAN98-75(WT、白色)、ΔSH-rCAN98-75及びΔG-rCAN98-75(点線の左)又は組換えウイルスrC-85473(WT、白色)、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473(点線の右)により感染させた上皮内に存在するウイルスゲノムの定量を示す。
【図７Ａ】気液界面において培養した再構成ヒト呼吸上皮3DモデルにおけるrC-85473組換えウイルスによる感染により誘導されたサイトカイン及びケモカインの分泌を示す図である。再構成ヒト呼吸上皮(MucilAir(登録商標)HAE、Epithelix社)をMOI 0.1の組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473に感染させた。感染の5日後、いくつかのサイトカイン及びケモカインの量をLuminex技術(BioPlex Proキットアッセイ、BioRad社)により感染上皮の基本培地から測定する。ケモカインMCP-1、IP-10、RANTES、IL-8、Tリンパ球誘引G-CSF、単球/マクロファージ、好酸球及び/又は好中球を示す。
【図７Ｂ】気液界面において培養した再構成ヒト呼吸上皮3DモデルにおけるrC-85473組換えウイルスによる感染により誘導されたサイトカイン及びケモカインの分泌を示す図である。再構成ヒト呼吸上皮(MucilAir(登録商標)HAE、Epithelix社)をMOI 0.1の組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473に感染させた。感染の5日後、いくつかのサイトカイン及びケモカインの量をLuminex技術(BioPlex Proキットアッセイ、BioRad社)により感染上皮の基本培地から測定する。炎症促進性サイトカインIFN-γ及びTNF-αの定量を示す。
【図７Ｃ】気液界面において培養した再構成ヒト呼吸上皮3DモデルにおけるrC-85473組換えウイルスによる感染により誘導されたサイトカイン及びケモカインの分泌を示す図である。再構成ヒト呼吸上皮(MucilAir(登録商標)HAE、Epithelix社)をMOI 0.1の組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473に感染させた。感染の5日後、いくつかのサイトカイン及びケモカインの量をLuminex技術(BioPlex Proキットアッセイ、BioRad社)により感染上皮の基本培地から測定する。T及びBリンパ球の分化を刺激するサイトカインIL-7の定量を示す。
【図７Ｄ】気液界面において培養した再構成ヒト呼吸上皮3DモデルにおけるrC-85473組換えウイルスによる感染により誘導されたサイトカイン及びケモカインの分泌を示す図である。再構成ヒト呼吸上皮(MucilAir(登録商標)HAE、Epithelix社)をMOI 0.1の組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473に感染させた。感染の5日後、いくつかのサイトカイン及びケモカインの量をLuminex技術(BioPlex Proキットアッセイ、BioRad社)により感染上皮の基本培地から測定する。組織修復に関与する増殖因子FGFを示す。統計試験:ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473ウイルスをrC-85473ウイルスと比較するための1元配置分散分析。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。
【図８Ａ】組換えhMPV rC-85473により感染させた不死化マウスマクロファージのモデルにおける炎症促進性サイトカインIL-1β及びTNF-αのin vitroでのウイルス誘導分泌を示す図である。MOI 0.1の組換えウイルスrC-85473(黒色)、ΔSH-rC-85473(濃灰色)又はΔG-rC-85473(淡灰色)による不死化マウスマクロファージ細胞株(野生マウスの骨髄に由来するBMDM株)の感染後2日間毎日採取した細胞上清におけるFFU/mlによるウイルス負荷の評価を示す。
【図８Ｂ】組換えhMPV rC-85473により感染させた不死化マウスマクロファージのモデルにおける炎症促進性サイトカインIL-1β及びTNF-αのin vitroでのウイルス誘導分泌を示す図である。MOI 0.1の組換えウイルスrC-85473(黒色)、ΔSH-rC-85473(濃灰色)又はΔG-rC-85473(淡灰色)による不死化マウスマクロファージの感染後2日間毎日採取した細胞上清からELISA試験により評価した炎症促進性サイトカインTNF-αの量を、非感染「偽」不死化マウスマクロファージ(白色)と比較して示す。
【図８Ｃ】組換えhMPV rC-85473により感染させた不死化マウスマクロファージのモデルにおける炎症促進性サイトカインIL-1β及びTNF-αのin vitroでのウイルス誘導分泌を示す図である。MOI 0.1の組換えウイルスrC-85473(黒色)、ΔSH-rC-85473(濃灰色)又はΔG-rC-85473(淡灰色)による不死化マウスマクロファージの感染後2日間毎日採取した細胞上清からELISA試験により評価した炎症促進性サイトカインIL-1βの量を、非感染「偽」不死化マウスマクロファージ(白色)と比較して示す。統計試験:ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473ウイルスをrC-85473ウイルスと比較するための2元配置分散分析。*p<0.05及び**p<0.01。
【図９Ａ】組換えhMPV rC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473によるBALB/cマウスの感染5日後のin vivoでの感染部位における肺炎症及び免疫細胞の動員(ΔG-rC-85473に対して特異的な肺炎症)を示す図である。rC-85473(黒色)、ΔSH-rC-85473(濃灰色)、ΔG-rC-85473(淡灰色)ウイルスに感染させたか又は「偽」非感染のBALB/cマウスの肺の気管支/気管支内、気管支周囲、血管周囲、間質内、胸膜及び肺胞内組織の炎症の強度の評価に従って算出した累積的肺病理組織スコアを示す。
【図９Ｂ】組換えhMPV rC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473によるBALB/cマウスの感染5日後のin vivoでの感染部位における肺炎症及び免疫細胞の動員(ΔG-rC-85473に対して特異的な肺炎症)を示す図である。感染の5日後にrC-85473及びΔSH-rC-85473ウイルスに感染させたBALB/cマウスの肺のライセートからの、免疫標識により判定した免疫細胞のフローサイトメトリーによる表現型決定(抗CD45、抗CD11b、抗CD170、抗Ly6C、抗Ly6G、抗CD11c、抗CD115、抗B220、抗CD3ε、抗CD4、抗CD8a)を示す。動員された免疫細胞は、4つのカテゴリー:CD8+ Tリンパ球(CD8+ T細胞)、CD4+ Tリンパ球(CD4+ T細胞)、単球/マクロファージ、及び好中球に分類する。統計試験:ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473ウイルスをrC-85473ウイルスと比較するための1元配置分散分析。**p<0.01及び***p<0.001。
【図１０Ａ】組換えhMPV  ΔG-C-85473及びΔSH-C-85473により免疫化したBALB/cマウスモデルにおけるin vivoでの2次免疫応答の感染曝露後の特性決定を示す図である。図4Aに記載するようにWT rC-85473ウイルスによる感染曝露1及び/又は5日後に、いくつかのサイトカイン及びケモカインの量をLuminex技術(BioPlex Proキットアッセイ、BioRad社)により肺ライセートから測定する。図10A〜図10Gでは、次を表す:-  黒色により、rC-85473ウイルスによって免疫化されているBABL/cマウスの群、-  濃灰色により、ΔSH-C-85473ウイルスによって免疫化した群、-  淡灰色により、ΔG-C-85473ウイルスによって免疫化した群、及び-  表される場合、白色により、いわゆる「偽」非免疫化群。病理組織学的解析又はサイトカイン分泌/細胞動員の解析についてそれぞれN=2又は3マウス/群。統計試験:各群を相互に比較するための2元配置分散分析。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。感染曝露の1及び5日後の炎症促進性サイトカインIL-6及びIFN-γの定量を示す。
【図１０Ｂ】組換えhMPV  ΔG-C-85473及びΔSH-C-85473により免疫化したBALB/cマウスモデルにおけるin vivoでの2次免疫応答の感染曝露後の特性決定を示す図である。図4Aに記載するようにWT rC-85473ウイルスによる感染曝露1及び/又は5日後に、いくつかのサイトカイン及びケモカインの量をLuminex技術(BioPlex Proキットアッセイ、BioRad社)により肺ライセートから測定する。図10A〜図10Gでは、次を表す:-  黒色により、rC-85473ウイルスによって免疫化されているBABL/cマウスの群、-  濃灰色により、ΔSH-C-85473ウイルスによって免疫化した群、-  淡灰色により、ΔG-C-85473ウイルスによって免疫化した群、及び-  表される場合、白色により、いわゆる「偽」非免疫化群。病理組織学的解析又はサイトカイン分泌/細胞動員の解析についてそれぞれN=2又は3マウス/群。統計試験:各群を相互に比較するための2元配置分散分析。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。感染曝露の1及び5日後の抗炎症性サイトカインIL-10の定量を示す。
【図１０Ｃ】組換えhMPV  ΔG-C-85473及びΔSH-C-85473により免疫化したBALB/cマウスモデルにおけるin vivoでの2次免疫応答の感染曝露後の特性決定を示す図である。図4Aに記載するようにWT rC-85473ウイルスによる感染曝露1及び/又は5日後に、いくつかのサイトカイン及びケモカインの量をLuminex技術(BioPlex Proキットアッセイ、BioRad社)により肺ライセートから測定する。図10A〜図10Gでは、次を表す:-  黒色により、rC-85473ウイルスによって免疫化されているBABL/cマウスの群、-  濃灰色により、ΔSH-C-85473ウイルスによって免疫化した群、-  淡灰色により、ΔG-C-85473ウイルスによって免疫化した群、及び-  表される場合、白色により、いわゆる「偽」非免疫化群。病理組織学的解析又はサイトカイン分泌/細胞動員の解析についてそれぞれN=2又は3マウス/群。統計試験:各群を相互に比較するための2元配置分散分析。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。感染曝露の1及び5日後の、免疫細胞の活性化及び分化を刺激する誘引サイトカインG-CSF、MCP-1、MIP-1α及びMIP-1βの定量を示す。
【図１０Ｄ】組換えhMPV  ΔG-C-85473及びΔSH-C-85473により免疫化したBALB/cマウスモデルにおけるin vivoでの2次免疫応答の感染曝露後の特性決定を示す図である。肺組織内に浸潤した免疫細胞の表現型決定(抗CD45、抗Ly6G、抗CD11b、抗CD170/シグレックF、抗Ly6C、抗CD11c、抗F4/80、抗B220、抗CD3ε、抗CD4及び抗CD8a)をフローサイトメトリーによる免疫標識により肺ライセートから判定する。図10A〜図10Gでは、次を表す:-  黒色により、rC-85473ウイルスによって免疫化されているBABL/cマウスの群、-  濃灰色により、ΔSH-C-85473ウイルスによって免疫化した群、-  淡灰色により、ΔG-C-85473ウイルスによって免疫化した群、及び-  表される場合、白色により、いわゆる「偽」非免疫化群。病理組織学的解析又はサイトカイン分泌/細胞動員の解析についてそれぞれN=2又は3マウス/群。統計試験:各群を相互に比較するための2元配置分散分析。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。感染曝露の1及び5日後の、BABL/cマウスの肺組織内に浸潤したCD8+及びCD4+ Tリンパ球の定量を示す。
【図１０Ｅ】組換えhMPV  ΔG-C-85473及びΔSH-C-85473により免疫化したBALB/cマウスモデルにおけるin vivoでの2次免疫応答の感染曝露後の特性決定を示す図である。肺組織内に浸潤した免疫細胞の表現型決定(抗CD45、抗Ly6G、抗CD11b、抗CD170/シグレックF、抗Ly6C、抗CD11c、抗F4/80、抗B220、抗CD3ε、抗CD4及び抗CD8a)をフローサイトメトリーによる免疫標識により肺ライセートから判定する。図10A〜図10Gでは、次を表す:-  黒色により、rC-85473ウイルスによって免疫化されているBABL/cマウスの群、-  濃灰色により、ΔSH-C-85473ウイルスによって免疫化した群、-  淡灰色により、ΔG-C-85473ウイルスによって免疫化した群、及び-  表される場合、白色により、いわゆる「偽」非免疫化群。病理組織学的解析又はサイトカイン分泌/細胞動員の解析についてそれぞれN=2又は3マウス/群。統計試験:各群を相互に比較するための2元配置分散分析。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。感染曝露の1及び5日後の、BABL/cマウスの肺組織内に浸潤したBリンパ球の定量を示す。
【図１０Ｆ】組換えhMPV  ΔG-C-85473及びΔSH-C-85473により免疫化したBALB/cマウスモデルにおけるin vivoでの2次免疫応答の感染曝露後の特性決定を示す図である。肺組織内に浸潤した免疫細胞の表現型決定(抗CD45、抗Ly6G、抗CD11b、抗CD170/シグレックF、抗Ly6C、抗CD11c、抗F4/80、抗B220、抗CD3ε、抗CD4及び抗CD8a)をフローサイトメトリーによる免疫標識により肺ライセートから判定する。図10A〜図10Gでは、次を表す:-  黒色により、rC-85473ウイルスによって免疫化されているBABL/cマウスの群、-  濃灰色により、ΔSH-C-85473ウイルスによって免疫化した群、-  淡灰色により、ΔG-C-85473ウイルスによって免疫化した群、及び-  表される場合、白色により、いわゆる「偽」非免疫化群。病理組織学的解析又はサイトカイン分泌/細胞動員の解析についてそれぞれN=2又は3マウス/群。統計試験:各群を相互に比較するための2元配置分散分析。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。感染曝露の1及び5日後の、BABL/cマウスの肺組織内に浸潤したマクロファージ及び好中球の定量を示す。
【図１０Ｇ】組換えhMPV  ΔG-C-85473及びΔSH-C-85473により免疫化したBALB/cマウスモデルにおけるin vivoでの2次免疫応答の感染曝露後の特性決定を示す図である。累積的肺病理組織スコアを、ホルムアルデヒドで固定したマウスの肺の気管支/気管支内、気管支周囲、血管周囲、間質内、胸膜及び肺胞内組織の炎症の強度の評価に従って算出する。図10A〜図10Gでは、次を表す:-  黒色により、rC-85473ウイルスによって免疫化されているBABL/cマウスの群、-  濃灰色により、ΔSH-C-85473ウイルスによって免疫化した群、-  淡灰色により、ΔG-C-85473ウイルスによって免疫化した群、及び-  表される場合、白色により、いわゆる「偽」非免疫化群。病理組織学的解析又はサイトカイン分泌/細胞動員の解析についてそれぞれN=2又は3マウス/群。統計試験:各群を相互に比較するための2元配置分散分析。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。感染曝露の5日後の累積的肺病理組織スコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
ヒトメタニューモウイルス(hMPV)ウイルス株
hMPVは、2001年にニューモウイルス科の形成部分として同定された。
【００５１】
hMPVのゲノム機構は、hRSVに類似している。これは、N、P、M、F、M2(M2-1及びM2-2)、SH、G及びLタンパク質をコードするいくつかのORF(オープンリーディングフレーム)に細分される。一般的ゲノム構造は、図1A及び図1BのrC-8543及びrCAN98-75ウイルスを表す。
【００５２】
ニューモウイルス科のメンバーウイルスは、F、G及びSHタンパク質と表す3つの糖タンパク質をこれらの表面に発現する。
【００５３】
種々のhMPV亜群間で高度に保存されるF融合糖タンパク質は、ウイルスの標的細胞への侵入、及び合胞体、言い換えれば、ウイルスによる感染の後の個々の細胞の融合により得られる大型多核細胞の形成に関与する。また、F糖タンパク質は、hRSV及びhMPVウイルスの主要な抗原であり、中和抗体産生の誘導を可能とすると考えられる。
【００５４】
Gタンパク質は、II型膜タンパク質であり、このC末端は、細胞の外側にある。このタンパク質は、ウイルス成分の集合及びin vitroでの複製に必須ではない。hRSVでは、このタンパク質をコードする遺伝子の欠失が、マウスの気道の感染において株の病原性を減弱させることがわかっている。
【００５５】
また、SHタンパク質は、II型膜タンパク質であり、ウイルス生活環(viral cycle)におけるこの機能は、未知である。hRSVの場合では、SHタンパク質をコードする遺伝子の欠失により、in vitroで複製可能な組換えウイルスが生成され、この病原性は、マウスの上気道において減弱されるが、上記気道の下部においては減弱されない。
【００５６】
臨床hMPV株の遺伝子解析により、表面結合(G)及び融合(F)糖タンパク質の配列の可変性に主に基づいて、2つの主要な群(血清型A及びB)及び4つの「非主要な」亜群(A1、A2、B1及びB2)の定義が可能となった。次いで、このような群が、亜株、例えば、A2a及びA2bに更に細分され得ることがわかった(Huckら、2006)。
【００５７】
広く研究されたウイルス株の中でも、血清型A1に属するNL00-1株、血清型A2に属するCAN97-83株、及び血清型B2に属するCAN98-75株を引用することができる。
【００５８】
本発明は、rC-85473と表し、カナダの患者試料から単離され、論文に特に引用された、ヒトメタニューモウイルスのウイルス株に基づく(Hamelinら、2010)。
【００５９】
Mタンパク質と組み合わせた、この株のFタンパク質の使用は、ワクチン戦略として提唱されている(Aertsら、2015a)。
【００６０】
ホルマリンを用いた処理によって不活化した、不活化生ワクチン株としての、このウイルス株rC-85473の使用が、論文に記載されている(Palwithinoら、2015)。また、熱不活化バージョンのrC-85473株が、試験されている(Hamelinら、2007)。
【００６１】
より最近では、この株の強力な融合能が、このFタンパク質のタンパク質配列に基づいて、詳細に研究されている(Duboisら、2017)。
【００６２】
rC-85473株のF遺伝子及びM遺伝子の配列は、それぞれアクセス番号KM408076.1及びKM408077.1によりGenBankに引用されている。
【００６３】
ヌクレオチド13394個を含む、このウイルス株rC-85473の全ゲノム配列は、本明細書において初めて開示し、参照配列番号1により、添付の配列リストに表す。
【００６４】
以下の表4は、このrC-85473株と他の3つのヒトメタニューモウイルスのウイルス株:CAN97-83、CAN98-75及びNL00-1との同一性の百分率を示す。
【００６５】
【表４】
2021531783.tif 000006
【００６６】
NL00-1株により観察された高い配列相同性に関しては、このrC-85473株が、亜群A1のメンバーであると結論づけられ得る。
【００６７】
rC-85473株は、高い頻度/高い感染の程度で標的細胞に侵入可能となる、かなりの膜融合能により特徴づけられる。この株のこのかなりの膜融合能により、特に伸長した合胞体の生成が可能となる。合胞体は、巨大な多核細胞である。rC-85473ウイルスは、in vitroで細胞融合を誘導して、非常に多数の細胞核からなる、このような非常に伸長した合胞体の形成を生じる、高い能力を有する。
【００６８】
他の公知のhMPV株の中でも特異的なアミノ酸である、Fタンパク質のHRA機能ドメインのアミノ酸5つが、部分的に、この高膜融合表現型の原因であることがわかっている(Aertsら、2015b; Duboisら、2017)。
【００６９】
本発明の好ましい実施形態によれば、rC-85473株に由来する弱毒ウイルス株のFタンパク質のペプチド配列は、Duboisら、2017に記載されているようなHRA機能ドメインのこのようなアミノ酸5つを含む。
【００７０】
本発明の好ましい実施形態によれば、rC-85473株に由来する弱毒ウイルス株のFタンパク質のペプチド配列は、改変せず、これにより、Duboisら、2017に記載されているようなrC-85473株のFタンパク質のペプチド配列と同一である。
【００７１】
逆遺伝技術
逆遺伝技術により、核酸配列、DNA又はRNAから、及び適切な宿主細胞、機能性カプシド形成ウイルスからの、この生成が可能となる。
【００７２】
したがって、ヒトメタニューモウイルスの組換えrC-85473株は、患者から単離したC-85473と表す臨床株から得た。
【００７３】
hMPVに適用した第1の逆遺伝系は、2004年に記載された(Biachesiら、2004)。また、この技術は、論文に記載されている(Aertsら、2015b)。
【００７４】
組換えhMPVの生成が可能となる、この技術の原理は、T7バクテリオファージのRNAポリメラーゼを構成的に発現するように改変したハムスター腎細胞株(BHK-21)の使用に基づく(BHK-T7又はBSR-T7/5細胞)。
【００７５】
ゲノムエレメントは、5つのプラスミドエレメント:hMPVのアンチゲノムをコードする1つのプラスミド及び転写機構のウイルスタンパク質をコードする4つの「サテライト」プラスミドに分布する(L、P、N及びM2-1)。
【００７６】
アンチゲノムプラスミドhMPV及び4つの「サテライト」プラスミドのこのような細胞における同時トランスフェクション後、ウイルスゲノム鎖に相当するRNA鎖(マイナスRNA鎖)は、このプロモーター由来のT7ポリメラーゼにより転写される。
【００７７】
また、hMPVのウイルス転写に関与する4つのタンパク質は、トランスフェクトした宿主細胞により発現して、活性RNA依存性RNAポリメラーゼ(RdRP)複合体を構成する。したがって、この機能性ウイルスポリメラーゼは、マトリックス鎖の転写により、ゲノムRNAをウイルスmRNAに転写し、次いで、これをウイルスゲノムRNAの新たな分子に複製する。
【００７８】
したがって、ゲノムRNAによるウイルスタンパク質の翻訳及び集合により、トランスフェクトしたBHK-T7細胞の細胞質膜から感染性hMPV粒子が出芽することが可能となる。次いで、組換えウイルスの増幅が、感染許容な、共培養におけるLLC-MK2細胞(ATCC CCL-7)の追加の結果、可能となり得る。
【００７９】
したがって、市販のこのような改変細胞によって、特定のウイルス株のゲノム配列から組換えウイルスを生成することが可能である。
【００８０】
rC-85473株に由来する弱毒ウイルス株
本発明は、配列番号1の配列により表すゲノム配列を含む、ヒトメタニューモウイルス株に由来する弱毒ウイルス株であって、上記株の病原性を減弱する配列番号1の上記配列の1つ又は複数の遺伝子改変を含む弱毒ウイルス株に関する。
【００８１】
本出願では、用語「ウイルス」及び「ウイルス株」は、これまでに同定したような特定のウイルス株を表すのに無差別に使用する。
【００８２】
本発明における意味では、「由来株」は、「原株」といわれるウイルス株のゲノムへの遺伝子改変の導入により得られた組換えウイルス株を意味すると理解される。原株は、有利には、野生株、例えば、臨床単離株である。
【００８３】
原株に導入する遺伝子改変は、すべて、上記原株のゲノムの同一性を改変するのではなく、上記原株の病原性を減弱する目的を有する。
【００８４】
特には、このような遺伝子改変は、ウイルスの複製に必須ではないタンパク質、換言すれば、「アクセサリータンパク質」、例えば、SH及びGタンパク質をコードする遺伝子のみに関係する。この遺伝子改変弱毒株では、原株rC-85473のFタンパク質のペプチド配列は、改変せず、これにより原株と同一のペプチド配列を有する。
【００８５】
ウイルス株の病原性は、所与の生体におけるウイルスの増殖の迅速性の程度に相当し、このため、この侵入速度に相当する。したがって、「病原性の減弱」は、生体におけるウイルスの侵入速度の低下を意味すると理解される。
【００８６】
この弱毒は、ウイルス株の複製能の低下、及び/又は標的細胞に感染するこの能力の低下、及び/又は代わりに、生体のウイルス感染により誘導された病態の低下の形態を取り得る。
【００８７】
したがって、「弱毒ウイルス株(attenuated virus strain)」は、本発明における意味では、原株の病原性と比較して病原性が低下した、言い換えれば、原ウイルス株の病原性未満の組換えウイルスを意味すると理解される。
【００８８】
ウイルス株の病原性を測定するために、例えば、in vitroでの複製能試験(TCID50/ml滴定又は定量的PCRにより測定)、in vitro及びex vivoでの細胞変性作用(cytopathic effects)の進化の顕微鏡観察による監視又は病態の臨床徴候の監視、in vivo感染モデルにおける肺病理組織学的観察並びに肺ウイルス負荷の測定のような、in vitro、ex vivo又はin vivoでの試験を実行し得る。
【００８９】
野生株及び弱毒株の生理学的作用を比較するために、ウイルスの宿主生体の肺及び/又は他の免疫系のレベルで改変された種々の生理学的パラメーターを測定/判定することも可能である。
【００９０】
本出願の実施例7、8及び9に記載するように、次のウイルス誘導作用を評価して弱毒ウイルス株の生理学的作用を比較し、相互又は野生ウイルス株のいずれかで比較し得る:
-  (上皮の細胞及び/又はマクロファージによる)炎症促進性サイトカインの分泌、
-  ケモカインの分泌、
-  増殖因子の分泌、
-  肺炎症のレベル(スコアは組織の炎症の強度の評価により算出する)、及び
-  in vivoで感染部位に動員された免疫細胞の表現型決定。
【００９１】
このような種々の測定により、各ウイルス株の生理学的作用をより正確な方法で理解し、弱毒生ウイルスワクチンの開発に最も適し得るような特性に応じて選択することが可能となる。
【００９２】
その弱毒を獲得するためにウイルス株に導入する遺伝子改変
本発明は、配列番号1の配列により表すゲノム配列を含む、ヒトメタニューモウイルス株に由来する弱毒ウイルス株であって、上記株の病原性を減弱する配列番号1の上記配列の1つ又は複数の遺伝子改変を含む弱毒ウイルス株に関する。
【００９３】
「上記株の病原性を減弱する遺伝子改変」は、当業者に周知の、ウイルスの複製に必須ではないタンパク質をコードする遺伝子に対する遺伝子改変を意味すると理解される。このようなタンパク質の中でも、上記のG及びSHタンパク質は、特に公知である。
【００９４】
換言すれば、本出願は、配列番号1の配列により表すゲノム配列を含む、ヒトメタニューモウイルス株に由来する弱毒ウイルス株であって、病原性を減弱するように遺伝子改変されている、言い換えれば、導入した遺伝子変異が、ウイルスの複製に必須ではないタンパク質をコードする遺伝子に特異的に導入されている弱毒ウイルス株に関する。
【００９５】
ウイルス株の病原性の減弱が可能となる種々の遺伝子改変は、当業者に公知である。このような改変は、原株rC-85473のゲノムに導入し得る。
【００９６】
遺伝子改変は、本発明における意味では、原ヌクレオチド配列のすべての改変、例えば、1つ又は複数のヌクレオチドの欠失、1つ又は複数のヌクレオチドの付加、及び1つ又は複数のヌクレオチドの置換を表す。このような改変は、遺伝子リーディングフレームの移動が可能となるか、或いはコード配列の中間に終止コドンを、又は1つ若しくは複数のコード配列のすべて若しくは部分の欠失を導入する、すべての改変を特に含む。
【００９７】
ウイルス株の病原性の減弱を意図する遺伝子改変の中でも、遺伝子改変により、培養中のウイルスの複製に必須ではないタンパク質をコードする1つ又は複数の遺伝子を不活化するか又は欠失をもさせることが可能となることが特に知られている。
【００９８】
例えば、ヒトメタニューモウイルスの弱毒ウイルス株は、アクセサリーSH、G及びM2-2タンパク質をコードする遺伝子の不活化、特には、欠失により得ている。
【００９９】
しかし、弱毒株が由来する原ウイルス株の特性に応じて、弱毒ウイルス株の機能特性は、非常に異なることがあり、株の病原性は、原ゲノムと行った遺伝子改変との両方に依存する。
【０１００】
本発明の第1の態様によれば、本発明による弱毒ウイルス株は、配列番号1の配列の改変が、SHタンパク質をコードする遺伝子の不活化を含む点において特徴づけられる。
【０１０１】
特には、本発明による弱毒ウイルス株は、上記株の病原性を減弱する配列番号1の配列の遺伝子改変が、SHタンパク質をコードする遺伝子の不活化からなる点において特徴づけられる。
【０１０２】
本発明における意味では、遺伝子の不活化は、遺伝子産物がもはや発現しないか、又は非活性形態で発現するような方法で、この遺伝子を改変し、このタンパク質の活性が存在しないような小量で発現することを表す。遺伝子のこの不活化は、当業者に周知のあらゆる技術により行われ得る。
【０１０３】
特には、遺伝子の不活化は、遺伝子への点変異の導入、遺伝子のコード配列の部分的若しくは全欠失、又は代わりに、遺伝子プロモーターの改変により得られ得る。このような種々の遺伝子改変は、当業者に周知の分子生物学的技術のいずれか1つにより行われる。
【０１０４】
本発明における意味では、「遺伝子の欠失」は、特に、
-  コード配列の少なくとも50%、60%、70%、80%、90%又は95%の部分的欠失を含む場合、
-  コード配列の100%の完全欠失を含む場合、
その遺伝子のコード配列のかなりの部分をウイルス株のゲノムから除去することを意味すると理解される。
【０１０５】
好ましい実施形態によれば、本発明による弱毒ウイルス株では、SHタンパク質をコードする遺伝子は、完全に欠失させる、言い換えれば、SHタンパク質のすべて(100%)のコード配列が、配列番号1の原配列から除去されている。
【０１０６】
特には、上記ウイルス株は、配列番号2に表すようなヌクレオチド配列を含む。より詳細には、上記ウイルス株の配列は、配列番号2に表すようなヌクレオチド配列からなる。
【０１０７】
実施例において例示するように、ΔSH-rC-85473と表すこの弱毒株は、次の特性を有する。
-  培養中の細胞についてのin vitroでの感染及び複製が、正常である(原株の特性との差がない)。
-  組換えウイルスΔSH-rC-85473によるマウスのin vivoでの感染のみが、原株による感染とは異なり、非常にわずかな体重減少を誘導し、感染マウスの生存が100%であるが、この弱毒ウイルスは、肺組織において複製する。
-  この弱毒株によるマウスのin vivoでの事前免疫化により、致死量の野生ウイルスrC-85473により曝露されたマウスの100%が防御される。また、この防御は、曝露5日後の肺における感染性ウイルスrC-85473が検出されないこと、並びに感染曝露後D+21の血清の、同属ウイルス株(C-85473、血清型A)及び少なくとも1つの異種株(CAN98-75、血清型B)に対してマイクロ中和負荷が高いことにより例示される。
-  in vitroでの培養中LLC-MK2細胞への結合能及び細胞感染能が、ΔSH-rCAN98-75ウイルスのものと比較して(感染細胞の約40%)、弱毒ウイルスΔSH-rC-85473について、はるかに良好である(感染細胞の約60%)。
-  この弱毒株による呼吸上皮モデルのex vivoでの感染により、野生株により誘導された量と等価又はこれ未満の量のサイトカイン及びケモカインの分泌が誘導されるが、炎症応答は、野生株により誘導された応答と比較して減少する(図7A、図7B)。
-  この弱毒株によるマクロファージのin vitroでの感染により、炎症促進性サイトカインの分泌が誘導されるが、動態は、野生株によりウイルス誘導された動態とは異なる(図8B、図8C)。
-  肺組織のin vivoでのウイルス誘導炎症が、この弱毒株による感染後に、野生株による場合よりも有意に減少するが(図9A)、免疫細胞の動員は、やはり確実となる(図9B)。
【０１０８】
本発明の第2の態様によれば、本発明による弱毒ウイルス株は、配列番号1の配列の改変が、Gタンパク質をコードする遺伝子の不活化を含む点において特徴づけられる。
【０１０９】
特には、本発明による弱毒ウイルス株は、上記株の病原性を減弱する配列番号1の配列の遺伝子改変が、Gタンパク質をコードする遺伝子の不活化からなる点において特徴づけられる。
【０１１０】
好ましい実施形態によれば、本発明による弱毒ウイルス株では、Gタンパク質をコードする遺伝子は、完全に欠失させる、言い換えれば、Gタンパク質のすべて(100%)のコード配列が、配列番号1の原配列から除去されている。
【０１１１】
特には、上記ウイルス株は、配列番号3に表すようなヌクレオチド配列を含む。より詳細には、上記ウイルス株の配列は、配列番号3に表すようなヌクレオチド配列からなる。
【０１１２】
実施例において例示するように、ΔG-rC-85473と表すこの弱毒株は、次の特性を有する。
-  in vitroでのLLC-MK2細胞モデルでは、培養中の細胞についての感染及び複製が、正常である(原株の特性との差がない)。
-  この組換えウイルスΔG-rC-85473により感染したマウスのin vivoでの感染のみが、非常にわずかな体重減少を誘導し、感染マウスの生存が100%であるが、このウイルスは、肺組織において複製する。
-  この弱毒株によるマウスのin vivoでの事前免疫化により、致死量の野生ウイルスrC-85473により曝露されたマウスの100%が防御される。また、この防御は、曝露後D+5の肺において感染性ウイルス及び野生ゲノムrC-85473が検出されないこと、並びに感染曝露後D+21の血清の、同属ウイルス株(C-85473、血清型A)及び少なくとも1つの異種株(CAN98-75、血清型B)に対してマイクロ中和負荷が高いことにより例示される。
-  in vitroでの培養中LLC-MK2細胞への結合能及び細胞感染能が、ΔG-rCAN98-75ウイルスのものと比較して(感染細胞の20%未満)、弱毒ウイルスΔG-rC-85473について、はるかに良好である(感染細胞の約60%)。
-  この弱毒株による呼吸上皮モデルのex vivoでの感染により、野生株により誘導された量よりも有意に低い量のサイトカイン及びケモカインの分泌が誘導される(図7)。
-  この弱毒株によるマクロファージのin vitroでの感染により、野生株によりウイルス誘導された分泌と同様にTNF-αの分泌が誘導されるが、IL-1βの分泌のみが非常にわずかに誘導される(図8B、図8C)。
-  肺組織のin vivoでのウイルス誘導炎症が、この弱毒株による感染後に、野生株による場合又は弱毒ΔSH-rC-85473株による場合よりも有意に減少する(図9A)。
【０１１３】
本発明の第3の態様によれば、本発明による弱毒ウイルス株は、配列番号1の配列の改変が、Gタンパク質及びSHタンパク質をコードする2つの遺伝子の不活化を含む点において特徴づけられる。
【０１１４】
特には、本発明による弱毒ウイルス株は、上記株の病原性を減弱する配列番号1の配列の遺伝子改変が、一方はSHタンパク質及び他方はGタンパク質をコードする2つの遺伝子の不活化からなる点において特徴づけられる。
【０１１５】
特定の実施形態によれば、2つの遺伝子の不活化は、G及びSHタンパク質をコードする一方若しくは他方又は2つの遺伝子の完全欠失に相当する。
【０１１６】
加えて、rC-85437株の病原性の減弱が可能となる他の任意の遺伝子改変が、配列番号1の配列により表す、上記株のゲノムに導入可能であることが理解される。
【０１１７】
rC-85473ウイルス株のゲノムへの外来遺伝子の導入
本発明の態様によれば、本発明による弱毒ウイルス株のヌクレオチド配列は、少なくとも1つの外来遺伝子の導入により遺伝子改変し得る。
【０１１８】
したがって、本発明による弱毒ウイルス株は、少なくとも1つの外来遺伝子を含むゲノム配列を有する。この外来遺伝子は、特に、ウイルス抗原をコードする遺伝子であり得る。
【０１１９】
本発明における意味では、「ウイルス抗原」は、個体の免疫系が、異物として認識し、特異的抗体の産生及び/又は細胞免疫応答の刺激により上記個体における応答を生じる、ウイルスにより発現されるタンパク質エレメント又は別の性質のエレメントを意味すると理解される。
【０１２０】
ウイルス抗原は、特に、少なくとも1つのインフルエンザウイルスにより、又は少なくとも1つのニューモウイルス科ウイルス、例えば、hRSVにより、又は少なくとも1つのパラミクソウイルス科ウイルス、例えば、パラインフルエンザウイルスにより発現される抗原から選択され得る。
【０１２１】
特には、上記ウイルス抗原は、hRSVのFタンパク質のすべて又は部分、及びインフルエンザ又はパラインフルエンザウイルスのヘマグルチニンのすべて又は部分から選択され得る。
【０１２２】
この弱毒ウイルス株により、患者への投与の間に、発現したウイルス抗原とhMPVの両方に対する多重免疫応答を生じさせることが可能となる。
【０１２３】
単回投与後に、いくつかのウイルスに対する複合的免疫応答を得ることが可能となる、このような株は、非常に有利である。
【０１２４】
加えて、少なくとも1つの外来遺伝子を含む、このような弱毒ウイルス株は、ヒトメタニューモウイルスの標的細胞における少なくとも1つの外来遺伝子の発現ベクターとしてin vivo、ex vivo又はin vitroで使用し得る。
【０１２５】
「ヒトメタニューモウイルスの標的細胞」は、ウイルスにより感染しやすい、個体の気道の上皮細胞を表す。また、この発現は、上記ウイルスのin vitroでの複製が可能となる、すべての細胞株を表す。
【０１２６】
医薬としてのその使用のための弱毒ウイルス株
また、本発明は、医薬としてのその使用のための、上に定義するような弱毒ウイルス株に関する。
【０１２７】
実際、この株は、特に、ウイルス感染症の治療又は予防のために使用し得る。
【０１２８】
用語「治療する」は、ヒト又は動物生体における、ウイルスによる感染症と闘うことを表す。本発明による少なくとも1つの組成物の投与の結果、生体におけるウイルス感染のレベル(感染負荷)が、低下するはずであり、好ましくは、ウイルスは、生体から完全に消滅するはずである。また、用語「治療する」は、ウイルス感染と関連する症状(呼吸器症候群、腎不全、発熱等)を減弱することを表す。
【０１２９】
本発明における意味では、用語「予防する」は、ヒト又は動物生体における感染症の発症リスクを回避するか、又は少なくとも低下させることを表す。本発明による少なくとも1つの弱毒ウイルス株の投与の結果、上記生体のヒト又は動物細胞は、それほど感染許容状態ではなくなり、これにより上記ウイルスにより感染しない最適な状態となる。
【０１３０】
より詳細には、本発明は、ニューモウイルス科のウイルスによる感染症を予防及び/又は治療するためのその使用のための、上に定義するような弱毒ウイルス株に関する。
【０１３１】
この弱毒ウイルス株が、好ましくは、上記株の懸濁及びその投与に適する、薬学的に許容されるビヒクルを含む、ワクチン組成物に組み込むことが理解される。
【０１３２】
上記ワクチン組成物は、ヒト又は動物生体の免疫系を特異的方法で刺激することが可能となる、本発明による少なくとも1つの弱毒ウイルス株を含む。
【０１３３】
したがって、このワクチン組成物は、抗原、言い換えれば、その記憶を保持する生体における特異的免疫応答を誘導する化合物の役割を果たす、少なくとも1つの弱毒生ウイルス株を含む。
【０１３４】
このようなワクチン組成物は、予防ワクチンとして使用し、言い換えれば、病原性ウイルスによる生体の感染前に特異的免疫応答を刺激することを意図し得る。
【０１３５】
また、このようなワクチン組成物は、治療ワクチンとして使用し、言い換えれば、上記病原性ウイルスによる生体の感染と同時に特異的免疫応答を刺激することを意図し得る。
【０１３６】
また、本発明は、これまでに記載したような少なくとも1つの弱毒ウイルス株を、このようなウイルスにより感染しやすい個体に投与する工程を含む、ヒトにおけるニューモウイルス科のウイルスによる感染症を予防及び/又は治療するための方法に関する。
【０１３７】
また、本発明は、これまでに記載したような少なくとも1つの弱毒ウイルス株を含む少なくとも1つのワクチン組成物を、このようなウイルスにより感染しやすい個体に投与する工程を含む、ヒトにおけるニューモウイルス科のウイルスによる感染症を予防及び/又は治療するための方法に関する。
【０１３８】
本発明の特定の実施形態によれば、感染症は、ヒトメタニューモウイルスによる感染症である。
【０１３９】
本発明の別の特定の実施形態によれば、感染症は、オルトニューモウイルス、例えば、ヒト呼吸器合胞体ウイルス(hRSV)による感染症である。
【０１４０】
また、本発明は、その配列が、ウイルス抗原をコードする少なくとも1つの外来遺伝子を含む、弱毒ウイルス株であって、少なくとも1つのウイルス抗原が、上記弱毒ウイルス株により発現されるウイルスによる感染症を予防及び/又は治療するためのその使用のための、弱毒ウイルス株に関する。
【０１４１】
特定の実施形態によれば、外来ウイルス抗原としてhRSVのFタンパク質を含む、本発明による弱毒ウイルス株は、hRSVによる感染症を予防及び/又は治療するために使用し得る。
【０１４２】
別の特定の実施形態によれば、外来ウイルス抗原としてインフルエンザウイルスのヘマグルチニンを含む、本発明による弱毒ウイルス株は、インフルエンザウイルスによる感染症を予防及び/又は治療するために使用し得る。
【０１４３】
少なくとも1つの弱毒ウイルス株を含む医薬組成物
また、本発明は、薬学的に許容されるビヒクルに、本発明による少なくとも1つの弱毒ウイルス株、及び任意選択でアジュバントを含む、ワクチン組成物に関する。
【０１４４】
本発明によれば、用語「薬学的に許容されるビヒクル」は、ビヒクル又は賦形剤、言い換えれば、本明細書において考えられる感染症に対する特異的作用を有しない化合物を表す。このようなビヒクル又は賦形剤は、薬学的に許容され、これらが、著しい有害作用又は望ましくない禁制的作用のリスクもなく、個体又は動物に投与され得ることを示す。
【０１４５】
本発明によるワクチン組成物が、有効量の少なくとも1つの弱毒ウイルス株を含むことが理解される。「有効量」は、本発明における意味では、投与される生体における免疫反応を引き起こすのに十分な弱毒ウイルス株の量を意味すると理解される。
【０１４６】
本発明に従って使用するワクチン組成物は、経口、舌下、吸入、皮下、筋肉内又は静脈内投与に適する。
【０１４７】
本発明の特定の実施形態によれば、本発明によるワクチン組成物は、吸入による投与を意図する医薬品形態である点において特徴づけられる。
【０１４８】
吸入は、気道による吸収を表す。これは特に、気体、微小滴又は懸濁液中の粉末の形態の特定の物質の、治療目的のための化合物の吸収のための方法である。
【０１４９】
吸入、言い換えれば、鼻腔及び/又は頬側経路による医薬又は獣医学的組成物の投与は、当業者に周知である。
【０１５０】
吸入による2つの種類の投与が、著明である:
-  組成物が粉末の形態である場合のガス注入による投与、及び
-  組成物がエアロゾル(懸濁液)の形態、又は溶液、例えば、加圧した水溶液の形態である場合の噴霧による投与。そのため、噴霧器又はスプレーの使用を医薬又は獣医学的組成物の投与に推奨する。
【０１５１】
したがって、本明細書において考えられる医薬品形態は、粉末、液滴の水性懸濁液、又は加圧した溶液から有利に選択される。
【０１５２】
ワクチン接種する個体の集団は、主に小児科集団である、言い換えれば、18歳未満の個体、より詳細には、5歳未満の幼児、及び乳児からなる。実際、ニューモウイルス科のウイルスは、免疫が、より年長の個体ほど強力ではない傾向を有する、このような個体に主に感染する。
【０１５３】
また、本発明は、ニューモウイルス科のウイルスによる感染症を予防及び/又は治療するためのその使用のための、上記のようなワクチン組成物に関する。
【実施例】
【０１５４】
(実施例1)
臨床株C-85473及びCAN98-75.1Aから生成した組換えhMPV
図1A及び図1Bに表す遺伝子構造を、GFP(緑色蛍光タンパク質)の発現によりウイルスが検出可能であるように調製して、組換え参照株rC-85473及びrCAN98-75に導入した。遺伝子改変は、これらの病原性を減弱するように意図した:
-  SHタンパク質をコードする遺伝子の欠失(ΔSH)、
-  Gタンパク質をコードする遺伝子の欠失(ΔG)。
【０１５５】
このような遺伝子構造の全配列は、配列番号4(GFP rC-85473)、配列番号5(GFP  ΔSH-rC-85473)、配列番号6(GFP  ΔG-rC-85473)及び配列番号8(GFP rCAN98-75)に示す。rCAN98-75に由来し、GFPと連結されたウイルス株の配列は表さないが、提示する他の遺伝子構造に基づいて当業者に利用可能である。
【０１５６】
0.01の感染多重度(MOI)で感染させたLLC-MK2細胞の写真が示すように、ウイルスは、GFPにより可視であり、次の生成組換えウイルス:ΔSH-rCAN98-75、ΔG-rCAN98-75、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473は、機能性及び複製可能である。細胞は、感染後3日に蛍光顕微鏡により観察する。
【０１５７】
写真は、組換えウイルスrCAN98-75が、組換えウイルスrC-85473ほど感染性でも複製可能でもないと思われることを示唆し、蛍光強度は低く、合胞体は大きさが縮小する。
【０１５８】
(実施例2)
組換えウイルスrC-85473及びrCAN98-75のin vitroでの複製能
LLC-MK2細胞に、次の組換えウイルスを0.01の感染多重度で別々に感染させた:
-  rCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75及びΔG-rCAN98-75(図2A)、
-  rC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473(図2B)。
【０１５９】
細胞上清を、7日間毎日3つ組で採取し、次いで、これらのウイルス負荷をTCID50/mlにより評価した。2元配置分散分析統計試験を実行して、各欠失組換えウイルス(ΔSH及びΔG)を野生組換えウイルスと比較した。
【０１６０】
図2A及び図2Bは、得られた結果を示し、弱毒組換えウイルスについての複製能及び産生能は、原株、CAN98-75又はC-85473の性質に応じて異なる。
【０１６１】
組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473は、rCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75及びΔG-rCAN98-75ウイルスよりもはるかに良好な複製能及び産生能を有する。ΔSH-rCAN98-75及びΔG-rCAN98-75ウイルスは、最も効率的ではないが、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473ウイルスは、LLC-MK2細胞の培養において最も良好な産生能を有する。
【０１６２】
以下の表では、各組換えウイルスrCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75及びΔG-rCAN98-75(表5)並びにrC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473(表6)について生成及び濃縮したウイルスストックの平均負荷を表す。
【０１６３】
ウイルス負荷は、50%の細胞組織が感染により破壊される場合の最終ウイルス希釈度を表すか、又は可視の細胞変性作用(50%組織培養感染量)を示す「TCID50」単位で計数する。
【０１６４】
【表５】
2021531783.tif 000007
【０１６５】
【表６】
2021531783.tif 000008
【０１６６】
このようなウイルス負荷により、前述の結果、すなわち、C-85437に由来する弱毒ウイルス株が、原株のものと比較して低下しない良好な複製能を有することが確認される。
【０１６７】
(実施例3)
BALB/cマウスウイルス感染モデルにおける組換えhMPV rCAN98-75及びrC-85473のin vivoでの特性決定
BALB/cマウスに鼻腔内滴下により以下を用いて感染させた:
-  OptiMem培養培地(偽)、又は
-  GFPを発現する2.5×105蛍光焦点単位(Fluorescent Focal Units)(FFU)の組換えウイルス:rCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75及びΔG-rCAN98-75、又は
-  GFPを発現しない5×105TCID50のウイルス:rC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473。
【０１６８】
使用した2つのウイルス用量は、等価である(野生ウイルスにより、感染後のマウスにおいて等価な作用が生じる)。
【０１６９】
マウスの体重及び生存は、14日間毎日監視した(マウス10匹の平均体重±SEM)。
【０１７０】
加えて、感染5日後に、1群あたりマウス5匹を安楽死させて、肺感染ウイルス負荷をTCID50により測定した。
【０１７１】
統計試験を行って(2元配置分散分析)、各ウイルスを偽条件と比較した。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。
【０１７２】
図3A及び図3Bは、rCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75及びΔG-rCAN98-75ウイルスにより得られた結果を示し、図3C及び図3Dは、rC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473ウイルスにより得られた結果を示す。
【０１７３】
このような結果は、組換えウイルスΔSH-rC-85473又はΔG-rC-85473のみにより、非常にわずかな体重減少が誘導されることを示し、実際、このような群のマウスが、非感染群のマウスのように挙動する。
【０１７４】
その上、肺ウイルス負荷(図3D)は、rC-85473ウイルスにより感染させた群において観察したものと類似し、欠失弱毒ウイルスが肺で複製したことを示す。
【０１７５】
結果は、組換えウイルスΔSH-rCAN98-75及びΔG-rCAN98-75と異なり、ΔSH-rCAN98-75ウイルスにより、非常に大きな体重減少が誘導されるが(図3A)、ΔG-rCAN98-75ウイルスのみにより、肺におけるこの低い複製能のために(図3B)、非常にわずかな体重減少が誘導される(図3A)。
【０１７６】
(実施例4)
野生ウイルスrC-85473による感染曝露後のBALB/cマウスモデルにおける組換えhMPV  ΔG-rC-85473及びΔSH-rC-85473のin vivoでの防御特性
免疫化及び感染曝露プロトコールは、図4Aに示す。
【０１７７】
BALB/cマウスは、鼻腔内滴下によりOptiMem培養培地(「偽」陰性対照)又は5×105TCID50の組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473若しくはΔG-rC-85473を用いて免疫化した。
【０１７８】
免疫化後21日に、マウスに鼻腔内滴下により致死量(1×106TCID50)の野生ウイルスrC-85473を感染させた(感染曝露)。
【０１７９】
マウスの体重及び生存を14日間毎日監視した(マウス10匹の平均体重±SEM、図4B)。
【０１８０】
マウスの生存を、種々の群のマウスについて(偽は50%生存を有し、組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473又はΔG-rC-85473により免疫化した群は100%生存を示す)曝露後14日間毎日監視した。結果は、図4Cに示す。
【０１８１】
感染曝露5日後(すなわち、免疫化後26日目)に、各群マウス4匹を安楽死させて、これらの肺感染ウイルス負荷をTCID50(図4D)及びRTqPCR(N遺伝子、図4E)により測定した。
【０１８２】
統計試験:各ウイルスを偽条件と比較するための2元配置分散分析。*p<0.05、**p<0.01及び***<0.001。
【０１８３】
このような結果により、組換えウイルスΔSH-rC-85473又はΔG-rC-85473のみが、非常にわずかな体重減少を誘導し(この群のマウスが、非感染群のマウスのように挙動する)、このような実験条件では、致死量の野生ウイルスrC-85473により曝露されたマウスの100%を防御することが確認される。また、この防御は、曝露後D+5の肺において感染性ウイルス及び野生ゲノムrC-85473(nd)が検出されないこと、並びに組換えウイルスΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473により事前に免疫化したマウスの、曝露後D+21の血清のマイクロ中和負荷が高いこと(>160)により例示される。
【０１８４】
下の表7は、D+20(感染曝露1日前)及びD+42(感染曝露21日後)の種々の群のマウスから採取した血清により実行したマイクロ中和試験の結果を示す。
【０１８５】
56℃で30分間の不活化及び血清の希釈後、これらを100TCID50(言い換えれば、TCDI50/mlにより判定する場合の100感染単位)のrC-85473ウイルス又はrCAN98-75ウイルスとともに37℃で2時間インキュベートした。次いで、この混合物をLLC-MK2細胞に適用して、中和負荷を判定した。
【０１８６】
中和抗体負荷は、血清+ウイルス混合物とともにインキュベートしたLLC-MK2細胞が細胞変性作用を示さず、言い換えれば、感染に対して陰性であると考えられる(2度繰り返して実行した試験に基づく)場合の最大希釈の血清により判定する。
【０１８７】
【表７】
2021531783.tif 000009
【０１８８】
図は、特異的抗体負荷によりウイルス感染が効率的に中和される場合の(マイクロ中和負荷)試験した血清の希釈を表す。
【０１８９】
5又は10の結果は、1次免疫応答(ウイルスとの最初の遭遇)を表す。160以上の結果は、最大免疫応答に特有であり、生体が、ウイルスにこれまでに既に遭遇し、これにより免疫化されたことを示す。
【０１９０】
原株rC-85473に由来するウイルス株により、弱毒株による事前免疫化後のhMPV C-85473(血清型A)及び少なくともCAN98-75(血清型B)ウイルスに対する良好な中和液性応答を得ることが可能となる。
【０１９１】
(実施例5)
組換えウイルスrC-85473及びrCAN98-75のin vitroでの細胞結合能
LLC-MK2細胞に以下を感染させた(t=0):
-  rCAN98-75ウイルス並びにその弱毒形態ΔSH-rCAN98-75及びΔG-rCAN98-75(図5A)
-  rC-85473ウイルス並びにその弱毒形態ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473(図5B)。
【０１９２】
細胞は、0.5、1、2又は3時間氷上で感染させて、ウイルスを細胞に結合させる時間を変更した後、洗浄し、次いで、37℃で24時間インキュベートした。
【０１９３】
感染後24時間に測定した感染細胞の百分率は、割り当てられた時間内(0.5、1、2又は3時間)で細胞に結合可能なウイルスの量を表す。
【０１９４】
結果は、培養中のLLC-MK2細胞への種々の結合能(及びこれによる感染能)を、組換えウイルスについて、これらのゲノムCAN98-75又はC-85473の起原に応じて示す。
【０１９５】
結果は、弱毒ウイルスΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473についてのはるかに良好な細胞結合能及び感染能を(感染細胞の約60%)、ΔSH-rCAN98-75(40%)及びΔG-rCAN98-75(感染細胞の20%未満)ウイルスのものと比較して示す。
【０１９６】
(実施例6)
気液界面において培養した再構成ヒト呼吸上皮3Dモデルにおける組換えウイルスrC-85473及びrCAN98-75のex vivoでの複製能
気液界面における培養により維持した再構成ヒト呼吸上皮(MucilAir(登録商標)HAE、Epithelix社)を供給元Epithelix社の指示に従って使用して、このようなex vivoでの実験を行った。
【０１９７】
図6Aに示す写真は、組換えウイルスrCAN98-75が、組換えウイルスrC-85473ほど感染性でも複製可能でもないと思われることを示す(蛍光強度が低く、感染部位の大きさが縮小する)。
【０１９８】
上皮におけるウイルスゲノムの定量の結果(図6C)により、複製が非常に弱いΔG-rCAN98-75ウイルスとは異なり、組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473、並びに組換えウイルスrCAN98-75及びΔSH-rCAN98-75の複製能が確認される。
【０１９９】
上皮の頂極表面(apical pole)のウイルスゲノムの定量の結果(図6B)により、組換えウイルスrCAN98-75、ΔSH-rCAN98-75、ΔG-rCAN98-75、rC-85473及びΔSH-rC-85473の生成が示される。
【０２００】
一方、ΔG-rC-85473ウイルスのゲノムは、検出されず、子孫ウイルスの生成がないことを示す。仮説は、ΔG-rC-85473ウイルスが、この複雑で多重層の(pluri-stratified)ex vivo系において感染させた細胞表面において出芽する能力を失った可能性があるということである。
【０２０１】
このような差は、発明者らの弱毒生ワクチン候補ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473の防御についてのhMPVウイルス株に関する種々の起原の組換えウイルス間の種々の特性に着目すると、本質的に、本発明の独創的特性を支持し得る。
【０２０２】
(実施例7)
気液界面において培養した再構成ヒト呼吸上皮3Dモデルにおける、組換えウイルスrC-85473による感染により誘導されたサイトカイン及びケモカインの分泌
気液界面における培養により維持した再構成ヒト呼吸上皮(MucilAir(登録商標)HAE、Epithelix社)を供給元Epithelix社の指示に従って使用して、このようなex vivoでの実験を行った。
【０２０３】
感染上皮の基本培地において分泌された、選択したサイトカイン及びケモカインの定量は、評価した組換えウイルスrC-85473に応じて異なる細胞応答の誘導を反映する(図7)。
【０２０４】
a)ΔG-rC-85473ウイルスにより、野生株rC-85473と比較して、有意に低い量の種々の試験したサイトカイン及びケモカインの分泌が、炎症促進性サイトカインTNF-αを除いて誘導される。このような結果は、図6に示す結果と一致し、再構成ヒト呼吸上皮におけるこのウイルスの感染力が、野生株の感染力と比較して有意に低下することを示す。
【０２０５】
b)ΔSH-rC-85473ウイルスにより、再構成ヒト呼吸上皮モデルにおけるこの感染能及び複製能が、野生組換えウイルスrC-85473のものと比較して上昇していても(図6)、野生ウイルスによりウイルス誘導された量と比較して、評価したサイトカイン及びケモカインのパネル以下の量の分泌が誘導される。
【０２０６】
分泌されたケモカインMCP-1、IP-10、RANTES、IL-8、G-CSF並びに炎症促進性サイトカインIFN-γ及びTNF-αのレベルは、このΔSH-rC-85473ウイルスにより感染した上皮細胞が、宿主の自然免疫応答及び適応応答を生じさせるのに必要な、Tリンパ球、単球/マクロファージ、好酸球及び/又は好中球免疫細胞を動員可能であることを示すように思われる。
【０２０７】
加えて、ΔSH-rC-85473ウイルスは、不活性リンパ球の活性T及びBリンパ球への分化を誘導するサイトカインであるIL-7、並びに有機組織の修復に関与する増殖因子であるFGFの分泌を、野生ウイルスrC-85473と類似する量で生じる。
【０２０８】
したがって、ΔSH-rC-85473ウイルスにより感染させると、上皮細胞の感染に対する1次防御応答を生じさせることができ、その上、野生ウイルスにより誘導された応答と比較した宿主の炎症応答の減少と関連する。
【０２０９】
したがって、このような差は、rC-85473株、好ましくは、弱毒ΔSH-rC-85473株に由来する組換えウイルスの弱毒生ワクチンとしての使用を支持する。
【０２１０】
(実施例8)
不死化マウスマクロファージモデルにおける組換えhMPV rC-85473のin vitroでのウイルス複製並びに炎症促進性サイトカインIL-1β及びTNF-αの分泌
マウスマクロファージの不死化株を使用して、組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473による複製能及び炎症促進性サイトカインの誘導能を評価した。
【０２１１】
マクロファージは、感染部位(この場合では、呼吸上皮)に動員された免疫系の第1の細胞の部分を形成する。マクロファージは、宿主の自然応答及び適応応答の刺激に対する炎症応答に寄与する。
【０２１２】
マクロファージは、組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473により感染させ、2日間毎日これらの細胞上清を採取した。結果は、図8に示す。
【０２１３】
a)FFU/mlにより測定したウイルス負荷により、ΔSH-rC-85473ウイルスでは、野生組換えウイルスと比較して、マクロファージにおける複製能が低下したが、ΔG-rC-85473ウイルスでは、野生ウイルスと類似するウイルス複製を示すことが実証される(図8A)。2元配置分散分析統計試験を実行して、ΔSH-rC-85473欠失ウイルスの複製の動態を野生組換えウイルスの動態と比較した。
【０２１４】
b)次いで、炎症促進性サイトカインTNF-α(図8B)及びIL-1β(図8C)の分泌を、感染マクロファージの上清において測定した。
【０２１５】
ΔSH-rC-85473ウイルスでは、野生ウイルスrC-85473のプロファイルとは有意に異なるサイトカインプロファイルがもたらされ、このような2つのサイトカインに関して、感染後2日に分泌のピークを伴う野生ウイルスと比較して早い感染後1日後の分泌のピークを有する。
【０２１６】
ΔG-rC-85473ウイルスにより、感染から最初の2日間に、サイトカインTNF-αの分泌は野生ウイルスと匹敵するレベルで誘導されるが、サイトカインIL-1βの分泌は誘導されない。
【０２１７】
このような結果は、ΔSH-rC-85473ウイルスが、マウスマクロファージに感染し、特に、炎症促進性サイトカインの分泌を生じさせる能力を、動態の改変にかかわらず保存することを実証する。
【０２１８】
ΔG-rC-85473ウイルスは、再構成ヒト呼吸上皮モデルにおいて観察されたように、マウスマクロファージに効率的に感染するが、炎症促進性サイトカインの分泌の誘導は弱い。
【０２１９】
(実施例9)
組換えhMPV rC-85473、ΔG-rC-85473及びΔSH-rC-85473によるBABL/cマウスの感染5日後に誘導されるin vivoでの感染部位における肺炎症及び免疫細胞の動員
BALB/cマウスに鼻腔内滴下により以下を用いて感染させた:
-  OptiMem(偽)培養培地、
-  5×105TCID50の組換えウイルスrC-85473、ΔSH-rC-85473又はΔG-rC-85473。
【０２２０】
感染の5日後に、1群あたりマウス5匹を安楽死させ、これらの肺を採取して、病理組織学的解析及び感染から生じる炎症スコアの測定を行った(図9A)。
【０２２１】
統計試験を実行して(2元配置分散分析)、各条件を相互に比較した。*p<0.05、**p<0.01及び***p<0.001。
【０２２２】
図9Aは、野生ウイルスrC-85473により、感染マウスにおいて強力な肺炎症が誘導されるが、弱毒株による病態の重症度の低下がこれまでに図3において実証されたと同様に、ΔSH-rC-85473及びΔG-rC-85473ウイルスにより、野生ウイルスよりも有意に少ない炎症が生じることを示す。
【０２２３】
その上、感染5日後に、1群あたりマウス5匹を安楽死させ、これらの肺を採取して、感染後に肺組織内に浸潤したCD4+、CD8+リンパ球、好中球及びマクロファージ免疫細胞の絶対的定量を行った(図9B)。
【０２２４】
統計試験を実行して(1元配置分散分析)、ΔSH-rC-85473の条件をrC-85473の条件と比較した。**p<0.01。
【０２２５】
図9Bは、種々の集団の免疫細胞(CD4+ T、CD8+ T、好中球及びマクロファージ)が、rC-85473及びΔSH-rC-85473ウイルスの接種の5日後に感染部位において動員されるが、特に、CD4+リンパ球に関して、弱毒株ではより少ない量が動員されることを実証する。
【０２２６】
したがって、マウスモデルにおいてウイルスにより誘導された病態の減弱(図3)及び感染上皮細胞によるサイトカインの分泌の減少(図7)と一致して、ΔSH-rC-85473ウイルスにより、肺炎症の減少が生じると思われ、その上、感染部位における種々の免疫細胞の効率的動員が確実となる。
【０２２７】
このような種々の結果(図7〜図9)は、これらの感染後の生理学的作用に関する、野生組換えrC-85473と欠失ウイルスとの間の種々の特性を示す。
【０２２８】
弱毒株ΔSH-rC-85473は、この特性に関して、(i)上皮及びマクロファージ細胞による炎症性サイトカイン及びケモカインの分泌、(ii)in vivoでの肺炎症の誘導、並びに(iii)免疫細胞の感染器官へのin vivoでの浸潤の点から、弱毒生ワクチンの開発に特に有望であると思われる。実際、この弱毒株による宿主の感染は、効率的な1次免疫応答(野生ウイルスにより観察された応答と等価)と炎症応答の減少の両方と関連する。
【０２２９】
(実施例10)
組換えhMPV rΔG-C-85473及びΔSH-C-85473により免疫化したBALB/cマウスモデルにおける感染曝露後の、サイトカイン/ケモカインの分泌、in vivoでの感染部位における免疫細胞の動員、並びに肺炎症
ウイルス感染後、感染した上皮細胞(図7を参照)及び常在免疫細胞(図8)によるサイトカイン及びケモカインの分泌の結果、炎症及び免疫の複合的応答を感染部位において生じさせる。第1に、自然応答のエフェクター細胞(非特異的)が、次いで第2に、適応応答のエフェクター細胞(特異的)が、動員及び活性化される。感染個体を事前に免疫化又はワクチン接種した場合、適応応答が、いっそう急速であり、重要及び特異的であれば、記憶応答もより効率的となる。この実施例において記載するのは、2次応答と呼ばれる、この免疫応答の特性決定である。
【０２３０】
BALB/cマウスは、鼻腔内滴下によりOptiMem培養培地(「偽」陰性対照)又は5×105TCID50の組換えウイルスrC-85473、ΔSH-C-85473若しくはΔG-C-85473を用いて免疫化した。
【０２３１】
免疫化後21日に、マウスに致死量(1×106TCID50)の野生ウイルスrC-85473を鼻腔内滴下により感染させた(感染曝露)。免疫化及び感染曝露プロトコールは、図4Aに示す。
【０２３２】
感染曝露1又は5日後(すなわち、免疫化後それぞれ22又は26日目)に、各群のマウス3匹を安楽死させて、肺組織において分泌されたサイトカイン及びケモカインの分泌を定量した。結果は、図10A、図10B及び図10Cに示す。このような結果は、BALB/cマウスの免疫化に使用した組換えウイルスrC-85473に応じて異なる、局所的免疫応答の誘導を実証する。
-  ΔG-C-85473及びΔSH-C-85473ウイルスにより免疫化した群は、WT rC-85473ウイルスにより免疫化した群よりも炎症促進性サイトカインIL-6及びケモカインMCP-1の強力な分泌を、感染曝露1日後に急速に示す。
-  加えて、ΔSH-C-85473ウイルスにより免疫化した群はまた、WTウイルス及び/又はΔG-C-85473ウイルスにより免疫化した群と比較して、抗炎症性サイトカインIL-10並びにケモカインG-CSF及びMIP-1βの分泌の有意な増加を示す。
【０２３３】
5日後、試験したすべてのサイトカイン/ケモカインは、曝露後1日目に測定したレベルと比較して激減した。これは、曝露により誘導されたサイトカインの吸収及び炎症応答を実証する。
【０２３４】
このような結果は、弱毒ウイルスΔG-C-85473、特には、ΔSH-C-85473で免疫化すると、相当する非弱毒WTウイルスによる免疫化によって誘導された応答と異なるサイトカイン応答が局所的に生じることを示唆する。
【０２３５】
感染部位における免疫細胞の動員を評価するために、肺組織内に浸潤して感染と闘う免疫細胞の主な集団の量を測定した。結果は、図10D、図10E及び図10Fに示す。
【０２３６】
したがって、Tリンパ球(CD8+細胞傷害性及びCD4+ヘルパー)及びBリンパ球の動員が、感染曝露5日後に、WT rC-85473ウイルスにより免疫化した群及びΔG-C-85473ウイルスにより免疫化した群と比較して(Bリンパ球について特異的に有意差あり、図10E)、ΔSH-C-85473ウイルスによる免疫化後に有意に増加する。
【０２３７】
動員されたマクロファージ及び好中球の集団は、試験した種々のウイルス間で有意差を示さない(図10F)。
【０２３８】
ΔG-C-85473ウイルスにより免疫化したマウスの群は、WTウイルスにより免疫化した群のものと類似する細胞動員プロファイルを示し、ΔG-C-85473ウイルスが、野生ウイルス(WT)と同様に免疫応答の誘導に効率的であることを示唆する。反対に、マウスをΔSH-C-85473ウイルスにより事前に免疫化した場合、感染曝露に応答する適応免疫応答は、より重要であり、その上、バランスを維持するが、自然応答は、影響するとは思われず、ΔSH-C-85473ウイルスが、より効率的には記憶免疫応答を誘導しないことを示唆する。
【０２３９】
最終的に、曝露5日後に、1群あたりマウス2匹を安楽死させて、免疫化及び「偽」非免疫化の各群の曝露から生じる肺炎症スコアを測定した。結果は、図10Gに示す。
【０２４０】
集団の死亡率50%に相当するWT rC-85473ウイルスの致死的接種の使用により予想したように[図4Cを参照]、偽免疫化群の累積炎症スコアは、非常に高い。これまでのように、WT rC-85473又はΔG-C-85473ウイルスにより免疫化した群の炎症スコアは、相互にまさに同等であり、このような群のマウスがいかなる死亡をも示していなくても、炎症スコアは偽免疫化群と比較してわずかに低下する[図4C]。
【０２４１】
図10の結果は、ΔSH-C-85473ウイルスにより免疫化したマウスでは、感染曝露後に炎症応答が非常に減少することを示し、この群において肺発作が減少することを示唆する。同様に、感染の間に、肺の機能性が保存される。
【０２４２】
したがって、弱毒ウイルスΔSH-C-85473は、2次感染に応答して、量及び質においてより良好な、免疫細胞の肺性動員を可能にすることができ、これにより感染宿主の生理病理学及び肺炎症の制限に寄与する。また、宿主のより効率的なこの応答は、hMPVウイルスに対するより良い記憶免疫応答を反映する。
【０２４３】
結論として、この弱毒ウイルスΔSH-C-85473は、以下の特性を有する:
(i)試験した他のウイルスよりも大量の炎症促進性、抗炎症性サイトカイン及びケモカインを誘導する、
(ii)感染部位における免疫細胞(CD8+/CD4+ Tリンパ球及びBリンパ球)の、より重要であるがバランスの取れた動員を可能とする、
(iii)その上、肺炎症の制限をもたらす。
【０２４４】
【表８】
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【０２４５】
参考文献
特許
WO 2005/014626
US 8,841,433
本文中の引用の順序による、書誌的参考文献
（参考文献）
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１０Ｅ】
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【図１０Ｆ】
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【図１０Ｇ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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