(57)【要約】  本発明は医薬技術分野に属し、ＳＵＭＯ抑制剤を含有する組成物を提供し、組成物はＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤を含有する。高活性化状態下の肝星状細胞においては、ＦＸＲアゴニストは肝星状細胞の活性化を抑制する効果を有しない。本発明は、ＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤を配合した後、高活性化状態の肝星状細胞においてもその活性化を抑制することができる。肝線維症症状を有する個体では、その肝星状細胞はすでに活性化状態にあり、ＦＸＲアゴニストを単独で使用して良好な抗線維化効果を生み出すことができない。本発明によって提供されるＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤の組成物は肝星状細胞の活性化を著しく抑制し、コラーゲン線維の沈着を低減し、よって、肝線維症に抵抗することができる。【選択図】図７−１
2021511316.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤を含有することを特徴とするＳＵＭＯ抑制剤を含有する組成物。
【請求項２】
前記ＦＸＲアゴニストはオベチコール酸、ＧＷ４０６４およびＷＡＹ−３６２４５０のうちの１種又は複数種を含有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記ＳＵＭＯ抑制剤は、スペクチノマイシンおよび／またはイチョウ酸を含有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
抗肝線維症薬物の調製に使用される、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項５】
肝線維症の症状に対抗する薬物の調製における、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項６】
肝星状細胞の活性化を抑制するための薬物の調製における、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項７】
コラーゲン線維沈着を低減するための薬物の調製における、請求項１から請求項３のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項８】
前記薬物の剤型は独立して、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤または注射剤を含有することを特徴とする請求項４から請求項７のいずれか一項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医学の技術分野、特にＳＵＭＯ抑制剤を含有する組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
肝疾患、特にウイルス性肝炎、脂肪肝疾患、肝線維症および肝癌は、世界中で高い発生率のままで減少しない。たとえば、欧米の通常の成人の非アルコール性脂肪肝の発生率は２０〜３３％であり、肥満者での発生率は６０〜９０％であり、中国の通常の成人での発生率は約１５％である。（Ｆａｎ  Ｊ  Ｇ，Ｆａｒｒｅｌｌ  Ｇ  Ｃ．Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｉｎ  Ｃｈｉｎａ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００９，５０（１）：２０４−１０）。肝線維症（Ｆｉｂｒｏｓｉｓ）は一種の病理学的状態であり、肝線維性結合組織の移行性沈着を指す。肝線維症は、慢性ウイルス性肝炎、代謝障害、慢性アルコール性／非アルコール性脂肪肝などの慢性肝疾患が、さらに肝硬変に進行する中間的一環である。肝線維症は、慢性肝疾患に共通する重要な特徴であり、且つ２５％〜４０％の慢性肝疾患の患者は、最終的には肝硬変または肝癌を発症する。近年の研究では、肝線維症は可逆性疾患であり、肝硬変は不可逆性疾患であることが示されている。したがって、肝線維症の抑制、防止、逆転は、さまざまな慢性肝疾患の治療における中心的一環である。肝星状細胞（ＨｅｐａＴｉｃ  ＳＴｅｌｌａＴｅ  Ｃｅｌｌｓ，ＨＳＣｓ）は、肝線維症の発症を媒介する最も重要な細胞である。正常な肝臓においては、ＨＳＣｓが静止している状態にある。病理学的要因によって刺激されると、ＨＳＣｓは増殖能力を備えた線維芽細胞表現型に活性化される。当該表現型のＨＳＣｓ細胞は、大量の線維化因子とコラーゲン繊維を分泌し、最終的に肝臓の線維症と肝硬変の発症を引き起こす。したがって、ＨＳＣｓは肝線維症の発症と進展の決定因子であり、ＨＳＣｓ活性化の抑制は肝線維症の治療と回復のための重要な戦略である。
【０００３】
抗肝線維症薬の研究開発は、肝臓薬の現在の研究開発のホットスポットであり、一定の研究の進歩を遂げている。肝線維症の予防と治療に関連して現在報告されている治療薬は、主に次のカテゴリに分類される。１）漢方薬とその抽出物、例えばウコン、レスベラトロール、シリビニン、ペルゴピンとその塩（公告番号ＣＮ１０１３２７２１Ｂ）である。２）化学薬品とその製剤，例えばピルフェニドンとクレアチニンの組成物（公告番号ＣＮ１０３５５０２４２Ｂ）、クレスタノン（Ｃｌｅｉｓｔａｎｏｎｅ）誘導体（公告番号ＣＮ１０４０９５８５７Ｂ）である。３）生物学的薬剤であり、組換えタンパク質や遺伝子薬剤などを含み、前者にはＴＧＦβ１抑制ペプチド（公告番号  ＣＮ１２０３０９１Ｃ）、ＩＬ−４（公告番号ＣＮ１０１３１８０１３Ｂ）、モノクローナル抗体ＨＡｂ１８ＧＣ２及びその重鎖及び軽鎖の可変縮遺伝子削除及びポリペプチド（公告番号ＣＮ１００５８６９６０Ｃ）が含まれる。遺伝子薬物には、肝臓細胞核因子１α遺伝子（公告番号ＣＮ１０２５５２９３５Ｂ）、肝細胞産生遺伝子を発現する遺伝子薬物（出願番号  ２００６１０１４５５２３．０）、ヒト肝細胞増殖因子遺伝子（公告番号ＣＮ１１４２２７２Ｃ）などが含まれる。治療薬はたくさんあるが、今のところ肝線維症の特効薬は見つかっていない。したがって、確実かつ効果的な抗肝線維症薬の探求は、将来の開発の方向である。
【０００４】
ファルネソイドＸ受容体（Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，ＦＸＲ）別名ＮＲ１Ｈ４（Ｎｕｃｌｅａｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｓｕｂｆａｍｉｌｙ  １，Ｇｒｏｕｐ  Ｈ，Ｍｅｍｂｅｒ  ４）は、核受容体スーパーファミリーの一員である。１９９５年にクローン化されて以来、当該受容体の機能はますます認識されてきた。ＦＸＲは胆汁酸、脂質、糖代謝などの生理学的プロセスで重要な役割を果たすだけでなく、さまざまな病理学的プロセスを調節する作用を有する。ＦＸＲはＦＸＲ−ＦＧＦ１５／１９のシグナル経路を通じて胆汁酸の肝臓再生効果を仲介する。ＦＸＲはＦＸＲ／ＮＦ−κＢのネガティブフィードバックループを通じて抗炎症効果を発揮する（Ｗａｎｇ  Ｙ  Ｄ，Ｃｈｅｎ  Ｗ  Ｄ，Ｗａｎｇ  Ｍら、Ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ａｎｔａｇｏｎｉｚｅｓ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｆａｃｔｏｒ  ｋａｐｐａＢ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｉＮＦｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ，２００８，４８（５）：１６３２−４３）。ＦＸＲはＣＲＥＢ−ＣＲＴＣ２複合体形成をブロックし、且つ下流のオートファジー関連遺伝子発現を抑制することにより、抗オートファジー効果を発揮する（Ｓｅｏｋ  Ｓ，Ｆｕ  Ｔ，Ｃｈｏｉ  ＳＥら、Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｕｔｏｐｈａｇｙ  Ｂｙ  ａｎ  ＦＸＲ−ＣＲＥＢ  ａｘｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ２０１４；５１６：１０８―Ｕ２７４）。さらに、ＦＸＲは肝腫瘍の形成と密接に関連している。ＦＸＲ−／−マウスは１５か月の通常飼育後に自然発生的に肝腫瘍を発症したが、同じ月齢の野生型マウスは同様な変化が見られない（Ｙａｎｇ  Ｆ，Ｈｕａｎｇ  Ｘ，Ｙｉ  Ｔら、Ｓｐｏｎｔａｎｅｏｕｓ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａＢｓｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｂｉｌｅ  ａｃｉｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００７；６７：８６３−８６７）。上記の研究は、ＦＸＲが肝疾患の発症と進展に密接に関連していることを示している。ＦＸＲアゴニストは肝臓保護と抗線維症薬の主要な研究戦略であり、関連する特許出願は多数あり（Ｗａｎｇ  Ｈ，Ｈｅ  Ｑ，Ｗａｎｇ  Ｇら、ＦＸＲ  ｍｏｄｕｌａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｅｎｔｅｒｏｈｅｐａｔｉｃ  ａｎｄ  ｍｅｔａＢｏｌｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｐａｔ．２０１８  Ｎｏｖ；２８（１１）：７６５−７８２）、例えばＣＮ２０１２１０４８２９８２．３（出願番号）はアルテヌシン類化合物及びその薬学的に許容される塩のＦＸＲ媒介性疾患の治療薬物の調製における使用を提供し、ＣＮ２０１１８００６７３４６．８とＣＮ２０１０８００４３２８３．８（出願番号）はＦＸＲ活性調節剤の薬物組成物への使用を開示しており、いずれも認可されている。オベチコール酸（ＯＢｅｔｉｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ，  ＯＣＡ）は強力なＦＸＲアゴニストとして、その抗ＮＡＳＨ有効性は臨床第ＩＩＩ期試験を完了したばかりであり、結果としてＯＣＡを１日２５ｍｇ服用しているグループ中の２１．０％患者の線維症の症状が改善され（プラセボ群１０．６％の患者が改善）、ＯＣＡが肝線維化に対して一定の改善���治療作用があることを示している。しかし、その抗肝線維症活性を如何にさらに高めるかは重要な科学的問題である。また、抗原性胆汁性肝硬変（ＰＢＣ）の薬として２０１６年５月すでに米国のＦＤＡによって承認され市場に出ており（Ｍａｒｋｈａｍ  Ａ，Ｋｅａｍ  ＳＪ．ＯＢｅｔｉｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ：Ｆｉｒｓｔ  ＧｌｏＢａｌ  Ａｐｐｒｏｖａｌ．Ｄｒｕｇｓ．２０１６  Ａｕｇ；７６（１２）：１２２１−６）、ＦＸＲをターゲットとして売り出されて成功した最初の薬品となる。
【０００５】
一部の初期動物実験の結果は、ＯＣＡなどのＦＸＲアゴニストが肝線維症に著しい効果があることを示しており、その作用のメカニズムは、ＦＸＲアゴニストがＨＳＣ細胞中のＦＸＲシグナル経路を活性化することによってＨＳＣ細胞の活性化を抑制できることである（Ｆｉｏｒｕｃｃｉ  Ｓ，Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ  Ｅ，Ｒｉｚｚｏ  Ｇら、Ｔｈｅ  ｎｕｃｌｅａｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＳＨＰ  ｍｅｄｉａｔｅｓ  ｉｎｈｉＢｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  Ｂｙ  ＦＸＲ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｃｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉＢｒｏｓｉｓ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２００４  Ｎｏｖ；１２７（５）：１４９７−５１２．Ｆｉｏｒｕｃｃｉ  Ｓ１，Ｒｉｚｚｏ  Ｇ，Ａｎｔｏｎｅｌｌｉ  Ｅら、Ａ  ｆａｒｎｅｓｏｉｄ  ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｓｍａｌｌ  ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ  ｐａｒｔｎｅｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｃａｓｃａｄｅ  ｍｏｄｕｌａｔｅｓ  ｔｉｓｓｕｅ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ  ｉｎｈｉＢｉｔｏｒ−１  ａｎｄ  ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｉｖｅｒ  ｆｉＢｒｏｓｉｓ．Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２００５  Ａｕｇ；３１４（２）：５８４−９５）。ただし、最近の研究では、ＦＸＲアゴニストは活性化されたＨＳＣ細胞のＦＸＲシグナル経路に作用せず、且つＨＳＣ細胞の活性化に改善作用がないことが分かっている（Ｋｏｗｄｌｅｙ  ＫＶ，  Ｌｕｋｅｔｉｃ  Ｖ，Ｃｈａｐｍａｎ  Ｒら、Ａ  ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｏＢｅｔｉｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１８  Ｍａｙ；６７（５）：１８９０−１９０２）。また、最近の２つの臨床試験の結果は、プラセボと比較して、ＯＣＡなどのＦＸＲアゴニストがＰＢＣ患者の肝線維症の指標に顕著な改善がないことを示している。（Ｎｅｖｅｎｓ  Ｆ，Ａｎｄｒｅｏｎｅ  Ｐ，Ｍａｚｚｅｌｌａ  Ｇら、Ａ  ＰｌａｃｅＢｏ−Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ＯＢｅｔｉｃｈｏｌｉｃ  Ａｃｉｄ  ｉｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂｉｌｉａｒｙ  Ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ．Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ．２０１６  Ａｕｇ  １８；３７５（７）：６３１−４３；Ｋｏｗｄｌｅｙ  ＫＶ，Ｌｕｋｅｔｉｃ  Ｖ，Ｃｈａｐｍａｎ  Ｒら、Ａｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｏＢｅｔｉｃｈｏｌｉｃ  ａｃｉｄ  ｍｏｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｐｒｉｍａｒｙ  Ｂｉｌｉａｒｙ  ｃｈｏｌａｎｇｉｔｉｓ．Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１８  Ｍａｙ；６７（５）：１８９０−１９０２）。ＮＡＳＨ患者の肝線維症症状に一定の改善作用があるが、その効果は限定的である（ＯＣＡでの改善率２１．０％に対してプラセボ１０．６％）。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
本発明の目的は、ＳＵＭＯ抑制剤を含有する組成物を提供することであり、組成物はＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤を含み、肝星状細胞の高活性化を顕著に抑制し、コラーゲン線維沈着を低減し、よって肝線維症を顕著に抵抗する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本発明はＳＵＭＯ抑制剤を含有する組成物を提供し、組成物はＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤を含有する。
【０００８】
好ましくは、ＦＸＲアゴニストはオベチコール酸、ＧＷ４０６４とＷＡＹ−３６２４５０のうちの１種又は複数種を含有するがこれに限定されない。
【０００９】
好ましくは、ＳＵＭＯ抑制剤はスペクチノマイシンおよび／またはイチョウ酸を含有するがこれらに限定されない。
【００１０】
本発明はまた、抗肝線維症薬の調製における上記技術解決方式に記載する組成物の使用を提供する。
【００１１】
本発明はまた、肝線維症の症状に対抗する薬物の調製における上記技術解決方式に記載する組成物の使用を提供する。
【００１２】
本発明はまた、肝星状細胞の活性化を抑制するための薬物の調製における上記技術解決方式に記載する組成物の使用を提供する。
【００１３】
本発明はまた、コラーゲン線維沈着を低減するための薬物の調製における上記技術解決方式に記載する組成物の使用を提供する。
【００１４】
好ましくは、薬物の剤型は独立して錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤または注射剤が含まれる。
【００１５】
本発明はＳＵＭＯ抑制剤を含有する組成物を提供し、組成物はＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤を含有する。
肝星状細胞の高活性化状態下においては、ＦＸＲアゴニストは肝星状細胞の活性化を抑制する効果を有しない。本発明は、ＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤を配合した後、高活性化された肝星状細胞においてもＦＸＲシグナル経路を活性化させることができ、肝星状細胞の活性化を抑制し、コラーゲン線維沈着を低減し、よって、肝線維症に抵抗することができる。
【００１６】
さらに、本発明の重要な意義は、健康な人の場合、肝星状細胞が静止状態にあり、ＦＸＲアゴニストに対して反応性を有することにある。一方、線維症の患者の場合、肝星状細胞がすでに活性化状態にあり、その時当該細胞がＦＸＲアゴニストに対する反応性が低下または失われ、ＦＸＲアゴニストが活性化状態の肝星状細胞の活性化を抑制できないため、患者の肝臓が線維症の症状を示した際、ＦＸＲアゴニストを服用しても抗肝線維症の薬理活性を生み出すことはできない。本発明は、活性化した肝星状細胞のＦＸＲアゴニストに対する応答性の喪失メカニズムを説明したうえ、革新的な組み合わせ方法を提案する。即ちＳＵＭＯ抑制剤とＦＸＲアゴニストを含有する組成物の抗肝線維症薬の調製における使用である。活性化した肝星状細胞は当該複合体に対して依然として良好な反応性を有し、同時に当該複合体は活性化状態の肝星状細胞の活性化を著しく抑制することができるため、肝線維症患者の場合、当該組成物を服用すると依然として肝星状細胞の活性化を抑制でき、コラーゲン線維の沈着を低減し、良好な抗肝線維症の薬理効果が生じる。したがって、当該組成物は、線維症症状を有する患者には重要な実用的価値および使用価値を有する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１−１】図１は、静止状態と活性化状態ＨＳＣｓのＦＸＲ転写活性の差異分析図である。図１−１は、静止状態（溶媒）と活性化状態（ＴＧＦ−β）のＨＳＣｓ細胞における、ＯＣＡによるＦＸＲのｍＲＮＡレベルの分析である。
【図１−２】図１−２は、静止状態（溶媒）と活性化状態（ＴＧＦ−β）のＨＳＣｓ細胞における、ＯＣＡによるＳｈｐのｍＲＮＡレベルの分析である。
【図１−３】図１−３は、静止状態（溶媒）と活性化状態（ＴＧＦ−β）のＨＳＣｓ細胞における、ＧＷ４０６４によるＦＸＲのｍＲＮＡレベルの分析である。
【図１−４】図１−４は、静止状態（溶媒）と活性化状態（ＴＧＦ−β）のＨＳＣｓ細胞における、ＧＷ４０６４によるＳｈｐのｍＲＮＡレベル分析である。
【図１−５】図１−５は、静止状態（溶媒）と活性化状態（ＴＧＦ−β）のＨＳＣｓ細胞における、ＷＡＹ−３６２４５０によるＦＸＲのｍＲＮＡレベルの分析である。
【図１−６】図１−６は、静止状態（溶媒）と活性化状態（ＴＧＦ−β）のＨＳＣｓ細胞における、ＷＡＹ−３６２４５０によるＳｈｐのｍＲＮＡレベルの分析である。＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１，＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【図２】図２は、ＨＳＣｓ活性化後のＦＸＲタンパク質のＳＵＭＯ化のレベルの分析である。＊＊＊Ｐ＜  ０．００１；
【図３】図３は、ＳＵＭＯ抑制剤ＳＰおよびＧＡによる活性化ＨＳＣｓにおけるＦＸＲタンパク質のＳＵＭＯ化レベルの分析である。＊＊＊Ｐ＜０．００１，＃＃Ｐ＜０．０１，＃＃＃Ｐ＜０．００１である。
【図４−１】図４は、ＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤の併用が活性化状態ＨＳＣｓのＦＸＲ転写活性に与える効果である。図４−１は、ＯＣＡとＳＰの併用が活性化したＨＳＣｓ細胞のＦＸＲに対するｍＲＮＡレベルの分析である。
【図４−２】図４−２は、ＯＣＡとＳＰの併用による活性化ＨＳＣｓ細胞におけるＳｈｐのｍＲＮＡレベルの分析である。
【図４−３】図４−３は、ＧＷ４０６４とＳＰの併用による活性化ＨＳＣｓ細胞におけるＦＸＲのｍＲＮＡレベルの分析である。
【図４−４】図４−４は、ＧＷ４０６４とＳＰの併用による活性化ＨＳＣｓ細胞におけるＳｈｐのｍＲＮＡレベルの分析である。
【図４−５】図４−５は、ＷＡＹ−３６２４５０とＳＰの併用による活性化ＨＳＣｓ細胞におけるＦＸＲのｍＲＮＡレベルの分析である。
【図４−６】図４−６は、ＷＡＹ−３６２４５０とＳＰの併用による活性化ＨＳＣｓ細胞におけるＳｈｐのｍＲＮＡレベルの分析である。
【図４−７】図４−７は、ＯＣＡとＧＡの併用による活性化ＨＳＣｓ細胞におけるＦＸＲのｍＲＮＡレベルの分析である。
【図４−８】図４−８は、ＯＣＡとＧＡの併用による活性化ＨＳＣｓ細胞におけるＳｈｐのｍＲＮＡレベルの分析である。ｎｓ  Ｐ＞０．０５，＊Ｐ＜０．０５，＊＊Ｐ＜０．０１である。
【図５−１】図５は、ＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤の併用のＨＳＣｓの活性化に対する影響である。図５−１は、ＯＣＡとＳＰの併用によるＡｃｔａ−２  ｍＲＮＡの発現レベルの分析である。
【図５−２】図５−２は、ＧＷ４０６４とＳＰの併用によるＡｃｔａ−２  ｍＲＮＡの発現レベルの分析である。
【図５−３】図５−３は、ＷＡＹ−３６２４５０とＳＰの併用によるＡｃｔａ−２  ｍＲＮＡの発現レベルの分析である。
【図５−４】図５−４は、ＯＣＡとＧＡの併用によるＡｃｔａ−２  ｍＲＮＡの発現レベルの分析である。ｎｓＰ＞０．０５，＊Ｐ＜０．０５である。
【図６−１】図６は、ＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤の併用の、ＣＣｌ４誘発性肝線維症状態下での肝臓ＦＸＲ及びその転写活性に対する効果である。図６−１は、ＦＸＲ  ｍＲＮＡ発現レベルの分析である。
【図６−２】図６−２は、Ｓｈｐ  ｍＲＮＡ発現レベルの分析である。＊Ｐ＜０．０５である。
【図７−１】図７は、ＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤の併用の、ＣＣｌ４誘発性肝線維症に対する効果である。図７−１は、Ａｃｔａ−２  ｍＲＮＡ発現レベルの分析である。＊＊Ｐ＜０．０１である。
【図７−２】図７−１は、肝臓のＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色である。
【００１８】
備考：本発明の全ての図におけるＰ＜０．０５は、統計学的な差異を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下、実施例および図面を参照して本発明をさらに説明する。
【００２０】
本発明はＳＵＭＯ抑制剤を含有する組成物を提供し、組成物はＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤を含有する。本発明はＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤の質量比に特に限定せず、任意の質量比を用いることができる。
【００２１】
本発明において、好ましいＦＸＲアゴニストは、オベチコール酸、ＧＷ４０６４とＷＡＹ−３６２４５０のうちの１種又は複数種を含有するがこれに限定されず、複数種とは具体的には２種以上である。本発明において、ＦＸＲアゴニストが２種以上である場合、各組は任意の質量で混合される。本発明は、ＦＸＲアゴニストに対して上記３種類に限定せず、その由来も特に限定しないが、好ましくは天然由来、半合成又は化学合成の各種ＦＸＲアゴニストを含有する。
【００２２】
本発明において、ＳＵＭＯ抑制剤は、好ましくは、スペクチノマイシンおよび／またはイチョウ酸を含有するがこれらに限定されない。本発明において，ＳＵＭＯ抑制剤は、好ましくは、スペクチノマイシンとイチョウ酸を含有する場合、スペクチノマイシンとイチョウ酸が任意の質量比で混合される。本発明は、ＳＵＭＯ抑制剤に対して上記２種類に限定せず、その由来も特に限定しないが、好ましくは天然由来、半合成又は化学合成の各種ＳＵＭＯ抑制剤を含有する。
【００２３】
本発明において、高度に活性化した肝星状細胞はＦＸＲアゴニストに対する反応性を失い、且つＦＸＲアゴニストは肝星状細胞の活性化を抑制する作用を持たないが、ＳＵＭＯ抑制剤は、高度に活性化した肝星状細胞のＦＸＲアゴニストに対する反応性を大幅に高め、ＦＸＲアゴニストが肝星状細胞の高活性化を抑制する作用を大幅に高めることができる。肝線維症症状を有する個体では、その肝星状細胞はすでに活性化状態にあり、ＦＸＲアゴニストを単独で使用して良好な抗線維化効果を生み出すことができないが、本発明によって提供されるＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤の組成物は肝星状細胞の活性化を著しく抑制し、コラーゲン線維の沈着を低減し、よって、肝線維症に抵抗することができる。
【００２４】
本発明はまた、抗肝線維症薬の調製における上記技術解決方式に記載する組成物の使用を提供する。
【００２５】
本発明はまた、肝線維症の症状に対抗する薬物の調製における上記技術解決方式に記載する組成物の使用を提供する。
【００２６】
本発明はまた、肝星状細胞の活性化を抑制するための薬物の調製における上記技術解決方式に記載する組成物の使用を提供する。
【００２７】
本発明はまた、コラーゲン線維沈着を低減するための薬物の調製における上記技術解決方式に記載する組成物の使用を提供する。
【００２８】
本発明において、薬物の剤型は、独立して、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤または注射剤を含有するのが好ましい。本発明は上記剤型の調製方法に対して特に限定せず、従来調製に対応剤型の調製方法と対応する補助材料を採用して調製してもよい。
【００２９】
本発明において、前記組成物の服用方法は、経口服用、静脈注射、静脈注入、筋肉注射など、および各種服用方法の組み合わせを含有するのが好ましい。
【００３０】
以下は、実施例を参照して本発明により提供するＳＵＭＯ抑制剤を含有する組成物および使用の詳細な説明をするが、それらは本発明の保護範囲を限定するものではないと理解される。
【００３１】
（実施例１）
（ＨＳＣｓ細胞活性化後のＦＸＲアゴニストに対する反応低下の原因の分析）
（１  実験材料実験材料）
本発明で使用されるＨＳＣ−Ｔ６細胞株は、中南大学の細胞バンクから購入した。
本発明で使用されるオベチコール酸（ＯＣＡ）、ＧＷ４０６４及びＷＡＹ−３６２４５０はＭＣＥ社から購入し、ＴＧＦ−β組換えタンパク質はＲ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、逆転写キットはＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社から購入し、Ｔｒｉｚｏｌ  ＲＮＡｉｓｏ  ｐｌｕｓはＴＡＫＡＲＡ社から購入し、使用したプライマーはＬｉｆｅ  Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社によって合成され、ＳＵＭＯ化ＥＬＩＳＡ検出キットはＥｐｉｇｅｎｔｅｋ社から購入し、その他の試薬はすべて市販の供給元から購入できる。
【００３２】
（２  実験方法）
（２．１    ＨＳＣ−Ｔ６細胞株の培養とモデリング）
ＨＳＣ−Ｔ６細胞株を適切な密度まで培養した後、ＴＧＦ−β（１０ｍｇ／ｍｌ）、ＯＣＡ（５μＭ）、ＧＷ４００６４（５μＭ）又はＷＡＹ−３６２４５０（５μＭ）を含有する薬を含んだ低血清培地を交換して１２時間インキュベートした後、細胞を収集する。
【００３３】
（２．２    リアルタイム定量ＰＣＲ）
（２．２．１    細胞サンプル総ＲＮＡを抽出）
１）ＰＢＳ使用して細胞を洗浄後、８００μｌ  Ｔｒｉｚｏｌ試薬を加え、ピペッティングを繰り返した後、ＥＰチューブに移し、室温で５分間置く。
【００３４】
２）１６０μｌクロロホルムを加え、１５秒間激しく振動し、室温で５分間置いた後１２０００Ｇで１５分間遠心分離する。サンプルは３つの層に分かれており、黄色有機相である下層、無色水相である上層と中間層である。
【００３５】
３）上層水相３００μｌを新しいチューブに慎重に移し、３００μｌのイソプロパノールを加え、逆さまにして混合し、室温で１０分間置いた後、１２０００Ｇで１０分間遠心分離して上清を廃棄する。
【００３６】
４）事前に冷却した７５％エタノール１．０ｍｌでＲＮＡを洗浄沈殿させ、それから１２０００Ｇで５分間遠心分離し、上清を廃棄して総ＲＮＡを取得し、１０μｌのＤＥＰＣ水で再溶解し、定量した後０．５μｇ／μｌまで希釈する。
【００３７】
（２．２．２逆転写）
説明書に記載された系の比率に基づいてＲＮＡ溶液とキットの成分を総体積が２０μｌの系に調製し、且つプログラム温度を設定して逆転写を行い、具体的な比率は表１に示す。
【００３８】
【表１】
2021511316.tif 000003
【００３９】
逆転写の使用条件は以下の通りである。
ステージ１：逆転写、３７℃、１５分間である。
ステージ２：変性、８５℃、５秒間である。
【００４０】
（２．２．３  ＰＣＲ）
ＰＣＲの系は表２に示す。
【００４１】
【表２】
2021511316.tif 000004
【００４２】
ＰＣＲの使用条件は以下の通りである。
ステージ１：予測変性、９５℃、１分間である。
ステージ２：ＰＣＲ反応は９５℃、１５秒間、次に例えば６０℃、３０秒間を４０サイクル、次に７２℃、３０秒間である。
ステージ３：融解曲線分析、６５〜９５℃であり、０．５℃／５秒である。
【００４３】
測定待つ遺伝子プライマー配列は表３に示す。
【００４４】
【表３】
2021511316.tif 000005
【００４５】
（２．３  ＳＵＭＯ化ＥＬＩＳＡ検出キット）
ＥＬＩＳＡ検出キットの説明書に基づいて細胞核タンパク質を抽出した後、１つの抗体と細胞サンプルの核タンパク質をプレートウェルの中で共に室温で６０分間インキュベートし、説明書に基づき、続いて、ＳＵＭＯ特異的検出抗体を追加し、さらに色増感剤を添加して発色させ、その後、６５５ｎｍの吸光度を迅速に読み取り、相対的定量分析を行う。
【００４６】
（３  実験結果）
（３．１  活性化したＨＳＣｓがＦＸＲアゴニストに対応する反応性の低下）
体外培養のＨＳＣｓ細胞では、細胞ＴＧＦ−β１に刺激を与えることにより、ＨＳＣｓ細胞の活性化を促す。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲの結果（図１）に基づき、高度な活性化状態を示す体外モデリングＨＳＣ−Ｔ６細胞株において、ＦＸＲ活性化剤がＦＸＲ下流標的遺伝子能力の減少を制御する現象が存在する。静止状態の細胞において、ＦＸＲアゴニストＯＣＡ、ＧＷ４０６４及びＷＡＹ−３６２４５０は、ＦＸＲ標的遺伝子ＳｈｐのｍＲＮＡレベルアップを顕著に誘導することができる（図１−２、図１−４、図１−６）。高活性化状態において、ＦＸＲアゴニストＯＣＡ、ＧＷ４０６４及びＷＡＹ−３６２４５０は、いずれもＦＸＲ下流標的遺伝子ＳｈｐのｍＲＮＡレベルを顕著に高めることができない（図１−２、図１−４、図１−６）。
【００４７】
（３．２  活性化したＨＳＣｓにおけるＦＸＲタンパク質のＳＵＭＯ化レベルの上昇）
ＳＵＭＯ化レベルのＥＬＩＳＡキットの検出（図２）によると、モデリング後に高度に活性化したＨＳＣ細胞におけるＦＸＲタンパク質ＳＵＭＯ化レベルは培養時間の経過に従って徐々に上昇する。
【００４８】
（実施例２）
（ＳＵＭＯ抑制剤が体外ＨＳＣｓにおけるＦＸＲ通路に対する作用）
（１  実験材料）
ＳＵＭＯ抑制剤スペクチノマイシン（Ｓｐｅｃｔｉｎｏｍｙｃｉｎ，ＳＰ）とイチョウ酸（Ｇｉｎｋｇｏｌｉｃ  ａｃｉｄ，ＧＡ）はＭＣＥ社から購入する。
その他の実験材料は実施例１と同じである。
【００４９】
（２実験方法）
（２．１  ＨＳＣ−Ｔ６細胞株の培養とモデリング）
具体的な方法は、実施例１の２．１の部分と同じである。
【００５０】
（２．２    ＲＴ−ＰＣＲ）
具体的な方法は、実施例１の２．２の部分と同じである。
【００５１】
（２．３  ＳＵＭＯ化ＥＬＩＳＡ検出キット）
具体的な方法は、実施例１の２．３の部分と同じである。
【００５２】
（３  実験結果）
（３．１    ＳＵＭＯ抑制剤は活性化したＨＳＣｓ細胞中のＦＸＲタンパク質のＳＵＭＯ化レベルを抑制することができる。）
ＳＵＭＯ化ＥＬＩＳＡキットの検出により，ＳＵＭＯ化抑制剤ＳＰとＧＡはＨＳＣｓ細胞内のＦＸＲタンパク質のＳＵＭＯ化レベルを大幅に低減できることがわかった（図３）。
【００５３】
（３．２    ＳＵＭＯ抑制剤は活性化したＨＳＣｓ細胞のＦＸＲアゴニストに対する反応性を高めることができる。）
実施例１では、活性化したＨＳＣｓ細胞において、ＦＸＲアゴニストＯＣＡ、ＧＷ４０６４およびＷＡＹ−３６２４５０はＦＸＲシグナル経路に対する制御作用を失い、Ｓｈｐ遺伝子に対する誘導作用の喪失として現れることが分かった。この部分の研究では、ＳＵＭＯ抑制剤の存在下でＦＸＲアゴニストのＦＸＲシグナル経路に対する制御作用を調べるつもりである。ＲＴ−ＰＣＲの相対的な定量結果（図４）によると、活性化したＨＳＣｓ細胞において、ＳＵＭＯ阻害剤ＳＰの投与条件下でＦＸＲアゴニストＯＣＡ、ＧＷ４０６４とＷＡＹ−３６２５０がＦＸＲ下流標的遺伝子Ｓｈｐに対する誘導作用が顕著に強化されたことが分かった（図４−２、４−４および４−６）。さらに、ＳＵＭＯ抑制剤ＧＡを投与する条件下では、ＦＸＲアゴニストＯＣＡのＳｈｐに対する誘導作用も顕著に強化された（図４−８）。
【００５４】
（３．３    ＳＵＭＯ抑制剤は、ＦＸＲアゴニストによるＨＳＣｓ細胞活性化の抑制作用を強化することができる。）
上記の結果は、ＳＵＭＯ抑制剤が活性化したＨＳＣｓ細胞におけるＦＸＲのＳＵＭＯ化レベルを抑制できることにより、ＦＸＲアゴニストＯＣＡ、ＧＷ４０６４とＷＡＹ−３６２４５０のＦＸＲ下流シグナル経路に対する制御作用が強化されることを示した。次に、ＳＵＭＯ抑制剤のＦＸＲアゴニスト抗ＨＳＣｓ活性化作用を調べるつもりである。同様にＲＴ−ＰＣＲの相対的な定量結果（図５）によると、活性化したＨＳＣｓ細胞にＳＰを投与した後、ＦＸＲアゴニストＯＣＡ、ＧＷ４０６４とＷＡＹ３６２５０の投薬群の肝星状細胞の繊維化関連遺伝子Ａｃｔａ  ２の発現が顕著に低下した。活性化したＨＳＣｓ細胞にＧＡを投与した後、ＦＸＲアゴニストＯＣＡがＡｃｔａ２の発現を顕著に抑制することができる。上記結果で分かったのは、ＳＵＭＯ抑制剤ＳＰとＧＡはＦＸＲタンパク質ＳＵＭＯ化レベルを低下させることができ、  ＦＸＲアゴニストＯＣＡ、ＧＷ４０６４とＷＡＹ−３６２４５０が繊維化関連遺伝子発現の減少を有利に制御し、それにより抗繊維化の薬効を高めることである。
【００５５】
（実施例３）
（ＳＵＭＯ抑制剤がマウス肝線維症状態でＦＸＲ経路に対する作用）
（１  実験材料）
実験マウス（Ｃ５７ＢＬ／６）は揚州大学比較医学センターから購入する。
ＣＣｌ４は上海凌峰化学試薬社から、鉱物油はＳｉｇｍａ−ＡｌｄＲｉｃｈ社から購入する。
他の実験材料は実施例１と同じである。
【００５６】
（２  実験方法）
（２．１    ＳＵＭＯ抑制剤とＯＣＡの併用がＣＣｌ４誘導するマウス肝線維症に対する作用。）
動物を１週間適応に飼育した後、マウスをランダムに５つのグループに分け、各グループに８匹ずつ、合計４０匹である。それぞれ対照群、モデル群、ＯＣＡ単剤投与群、ＳＰ単剤投与群、ＯＣＡ＋ＳＰ併用投与群に分け、そのうちモデル群には腹腔内注射によりＣＣｌ４（２０％、鉱物油に溶解）を投与し、対照群には体積に対応する量の溶媒（鉱物油）を投与し、週２回４週間投与する。モデリング後３週目からＯＣＡを腹腔内の胃に投薬し、投与量は１．５ｍｇ／ｋｇであり、１日１回、２週間続けた。また、ＳＰ併用のＯＣＡ投与群は１週目からＳＰの皮下注射投薬を行い、投与量は２００ｍｇ／ｋｇであり、１日１回とする。投与周期が終了した後マウスを殺し、肝臓を分離して後に使用するために保管する。
【００５７】
（２．２    ＲＴ−ＰＣＲ）
具体的には実施例１の２．２と同じである。
【００５８】
（２．３    肝臓病理解析）
一部の肝臓組織を４％パラホルムアルデヒドの中で固定した後、武漢谷歌生物科技株式会社（武漢、中国）に送り、二重盲検分析検出を行い、検出項目はＳｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色分析である。
【００５９】
（３  実験結果）
（３．１    ＳＵＭＯ抑制剤ＳＰはＯＣＡが繊維化マウスＦＸＲ経路に対する制御作用を強化する）
ＲＴ−ＰＣＲ実験により肝臓組織におけるＦＸＲ下流遺伝子のｍＲＮＡの相対発現を調べたところ（図６）、ＯＣＡ治療性投与群マウスの肝臓組織ＦＸＲ下流遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、ＳＰとの併用後に一定の回復を示した。ＲＴ−ＰＣＲ実験により肝臓組織におけるＦＸＲ下流遺伝子のｍＲＮＡの相対発現を調べたところ（図６）、ＯＣＡ治療性投与群マウスの肝臓組織ＦＸＲ下流遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、ＳＰとの併用後に一定の回復を示した。これは、ＳＵＭＯ化抑制剤はＦＸＲアゴニストであるＯＣＡが、繊維化マウスのＦＸＲ経路の励起作用を強化できることを示す。
【００６０】
（３．２    ＳＵＭＯ抑制剤ＳＰはＯＣＡ抗肝線維症薬の効果を強化できる）
ＲＴ−ＰＣＲ実験による肝臓組織繊維化関連遺伝子の発現の調べ及び肝臓病理学的分析の染色結果に基づき、ＳＰ併用のＯＣＡ投与群のＯＣＡ抗繊維化薬の効果が顕著に向上したことが分かった。ＲＴ−ＰＣＲの結果により、肝臓組織における主要な繊維化遺伝子Ａｃｔａ２の発現は併用群（ＳＰ＋ＯＣＡ）において顕著な低下を示し、単剤投与群との相対的な効果が顕著である（図７−１）。また、Ｓｉｒｉｕｓ  Ｒｅｄ染色の結果は、対照群の肝臓に比較的に少量の赤色コラーゲン線維のみが染色され、モデル群及びＯＣＡ単剤投与群の切片のいずれにおいても肝臓毒性により大量の赤色コラーゲン線維が含まれ、ＯＣＡ併用のＳＰ投薬を採用した後に、肝臓における赤色コラーゲン線維が減少することを示す（図７−２）。
【００６１】
以上の実施例により、高活性化状態の肝星状細胞がＦＸＲアゴニストに対する反応性を失い、且つＦＸＲアゴニストは肝星状細胞の活性化を抑制する作用を有しないと結論付けられる。本発明においてＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤を配合した後、高活性化状態の肝星状細胞はＦＸＲアゴニストに対する反応性を回復し、且つ肝星状細胞の高活性化作用を抑制し、コラーゲン線維沈着を低減し、よって抗肝線維症を抵抗することができる。
【００６２】
以上の説明は本発明の好ましい実施形態にすぎない。本技術分野における当業者であれば、本発明の原理から逸脱しない前提で、いくつかの改善及び修正を加えることができるが、これらの改善および修正は、本発明の保護の範囲内と見なされる。
【００６３】
（付記）
（付記１）
ＦＸＲアゴニストとＳＵＭＯ抑制剤を含有することを特徴とするＳＵＭＯ抑制剤を含有する組成物。
【００６４】
（付記２）
前記ＦＸＲアゴニストはオベチコール酸、ＧＷ４０６４およびＷＡＹ−３６２４５０のうちの１種又は複数種を含有することを特徴とする付記１に記載の組成物。
【００６５】
（付記３）
前記ＳＵＭＯ抑制剤は、スペクチノマイシンおよび／またはイチョウ酸を含有することを特徴とする付記１に記載の組成物。
【００６６】
（付記４）
抗肝線維症薬物の調製に使用される、付記１から付記３のいずれか一つに記載の組成物の使用。
【００６７】
（付記５）
肝線維症の症状に対抗する薬物の調製における、付記１から付記３のいずれか一つに記載の組成物の使用。
【００６８】
（付記６）
肝星状細胞の活性化を抑制するための薬物の調製における、付記１から付記３のいずれか一つに記載の組成物の使用。
【００６９】
（付記７）
コラーゲン線維沈着を低減するための薬物の調製における、付記１から付記３のいずれか一つに記載の組成物の使用。
【００７０】
（付記８）
前記薬物の剤型は独立して、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、丸剤、散剤または注射剤を含有することを特徴とする付記４から付記７のいずれか一つに記載の使用。
【図１−１】
2021511316.tif 000006
【図１−２】
2021511316.tif 000007
【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
2021511316.tif 000010
【図１−６】
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【図２】
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【図３】
2021511316.tif 000013
【図４−１】
2021511316.tif 000014
【図４−２】
2021511316.tif 000015
【図４−３】
2021511316.tif 000016
【図４−４】
2021511316.tif 000017
【図４−５】
2021511316.tif 000018
【図４−６】
2021511316.tif 000019
【図４−７】
2021511316.tif 000020
【図４−８】
2021511316.tif 000021
【図５−１】
2021511316.tif 000022
【図５−２】
2021511316.tif 000023
【図５−３】
2021511316.tif 000024
【図５−４】
2021511316.tif 000025
【図６−１】
2021511316.tif 000026
【図６−２】
2021511316.tif 000027
【図７−１】
2021511316.tif 000028
【図７−２】
2021511316.tif 000029
【配列表】
2021511316000001.app
【国際調査報告】
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2021511316.tif 000032
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2021511316.tif 000034
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