(57)【要約】本発明は、抗体またはその断片の少なくとも１つのＣＤＲ内に取り込まれた少なくとも１つの異種性アミノ酸配列を含む当該抗体またはその断片に関し、該少なくとも１つの異種性アミノ酸配列は、Ｎ−末端リンカー配列（Ｎｉｌｓ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）およびＣ−末端リンカー配列（Ｃｔｌｓ）を含む。該少なくとも１つのＣＤＲ領域の少なくとも一部は、そこに取り込まれた該少なくとも１つの異種性アミノ酸配列によって置換されていてもよい。本発明は、さらに、治療方法において使用するためのこれら抗体またはその断片、これら抗体またはその断片を含む組成物、これら抗体またはその断片をコードする核酸または核酸の混合物、これら核酸またはこれら核酸の混合物を含む宿主細胞およびこれら抗体またはその断片を産生する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体またはその断片の少なくとも１つのＣＤＲ領域内に取り込まれた少なくとも１つの異種性アミノ酸配列を含む前記抗体またはその断片であって、前記少なくとも１つの異種性アミノ酸配列が、Ｎ末端リンカー配列（Ｎｔｌｓ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）およびＣ末端リンカー配列（Ｃｔｌｓ）を含み、ここで、前記少なくとも１つのＣＤＲ領域の少なくとも一部が、その中に取り込まれた前記少なくとも１つの異種性アミノ酸配列によって置換されていてもよく、ここで、
ａ）  少なくとも１２個のアミノ酸残基が、
ｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ１内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ２５と前記ＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間；
ｉｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ２内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５１と前記ＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間；
ｉｉｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ３内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ９２と前記ＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間；
ｉｖ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ１内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ２６と前記ＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間；
ｖ）    前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ２内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ４９と前記ＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間；および／または
ｖｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ３内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔに従うアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ８８と前記ＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間
に存在し、かつ
ｂ）  少なくとも９個のアミノ酸残基が、
ｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ１内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ３５ａと前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基の間；
ｉｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ２内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５７と前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基の間；
ｉｉｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ３内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ１０６と前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基の間；
ｉｖ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ１内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ  ３２と前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基の間；
ｖ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ２内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ５７と前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基の間；および／または
ｖｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ３内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ９８と前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基の間
に存在する、前記抗体またはその断片。
【請求項２】
ＡＮＰが、配列番号２３の配列を有するヒトＡＮＰおよびそれと少なくとも８０％の配列同一性を有するペプチドからなる群から選択される、請求項１記載の抗体またはその断片。
【請求項３】
請求項１または２に記載の抗体またはその断片であって、
ａ）  前記Ｎｔｌｓが、
ｉ）  ＧＳリンカー配列；
ｉｉ）  ＰＮリンカー配列；
ｉｉｉ）     ヒトＩｇＧ抗体スカホールドの一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、特にヒトＩｇＧ抗体のｆａｂドメインスカホールドの一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、特に配列番号１、２または４のいずれか１つの配列または配列番号１、２または４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；
ｉｖ）  配列番号６の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；
ｖ）    配列番号７の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；
ｖｉ）  配列番号９の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；
ｖｉｉ）     配列番号１１の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；
ｖｉｉｉ）   配列番号１３の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；
ｉｘ）  配列番号１５の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；
ｘ）    配列番号２１の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を共する配列；または
ｘｉ）  それらいずれかの組合せ
を含み、
ｂ）  前記Ｃｔｌｓが、
ｉ）  ＧＳリンカー配列；
ｉｉ）  ＰＮリンカー配列；
ｉｉｉ）     ヒトＩｇＧ抗体スカホールドの一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、特に、ヒトＩｇＧ抗体のｆａｂドメインスカホールドの一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、特に、配列番号１、３、または５のいずれか１つの配列または配列番号１、３、または５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；
ｉｖ）  配列番号６の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を共有する配列；
ｖ）    配列番号８の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を共有する配列；
ｖｉ）  配列番号１０の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；
ｖｉｉ）     配列番号１２の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；
ｖｉｉｉ）   配列番号１４の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；
ｉｘ）  配列番号１５の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；
ｘ）    配列番号２０の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；
ｘｉ）  配列番号２２の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；または
ｘｉｉ）     それらいずれかの組合せ
を含む、前記抗体またはその断片。
【請求項４】
請求項３に記載の抗体またはその断片であって、
ｉ）    前記Ｎｔｌｓおよび前記ＣｔｌｓがそれぞれＧＳリンカー配列を含むか；
ｉｉ）  前記Ｎｔｌｓおよび前記ＣｔｌｓがそれぞれＰＮリンカー配列を含むか；
ｉｉｉ）     前記Ｎｔｌｓおよび前記Ｃｔｌｓが、それぞれ、ヒトＩｇＧ抗体スカホールドの一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列、特に、ヒトＩｇＧ抗体のｆａｂドメインスカホールドの一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、特に、前記Ｎｔｌｓは、配列番号１、２または４のいずれか１つの配列、または配列番号１、２または４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、前記Ｃｔｌｓは、配列番号１、３または５のいずれか１つの配列、または配列番号１、３または５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含むか；
ｉｖ）  前記Ｎｔｌｓおよび前記Ｃｔｌｓが、それぞれ、配列番号６の配列、またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むか；
ｖ）    前記Ｎｔｌｓが、配列番号７の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、前記Ｃｔｌｓが、配列番号８の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むか；
ｖｉ）  前記Ｎｔｌｓが、配列番号９の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、前記Ｃｔｌｓが、配列番号１０の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むか；
ｖｉｉ）     前記Ｎｔｌｓが、配列番号１１の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、前記Ｃｔｌｓが、配列番号１２の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むか；
ｖｉｉｉ）   前記Ｎｔｌｓが、配列番号１３の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、前記Ｃｔｌｓが、配列番号１４の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むか；
ｉｘ）  前記Ｎｔｌｓおよび前記Ｃｔｌｓが、それぞれ、配列番号１５の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むか；
ｘ）    前記Ｎｔｌｓが、配列番号９の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、前記Ｃｔｌｓが、配列番号２０の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含むか；または
ｘｉ）  前記Ｎｔｌｓが、配列番号２１の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、前記Ｃｔｌｓが、配列番号２２の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む、前記抗体またはその断片。
【請求項５】
前記Ｎｔｌｓが、そのＣ末端にアンカーエレメントＡ１をさらに含み、かつ／または、前記Ｃｔｌｓが、そのＮ末端にアンカーエレメントＡ２をさらに含み、ここで、Ａ１および／またはＡ２は、主にグリシンおよび／またはセリン残基を含み、特に、Ａ１および／またはＡ２のアミノ酸残基の少なくとも６０％がグリシンおよびセリン残基から選択される、請求項１から４のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
【請求項６】
請求項１から５のいずれか１項に記載の抗体またはその断片であって、
ｉ）    前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ１内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ２５とＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間；
ｉｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ２内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５１とＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間；
ｉｉｉ）     前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ３内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ９２とＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間；
ｉｖ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ１内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ２６とＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間；
ｖ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ２内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ４９とＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間；および／または
ｖｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ３内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ８８とＡＮＰの最初のアミノ酸残基の間
に存在するアミノ酸伸長が、配列番号２６から３８のいずれか１つの配列または配列番号２６から３８のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み；かつ、
ｉ）    前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ１内へ取り込まれる場合には、前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ３５ａの間；
ｉｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ２内へ取り込まれる場合には、前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５７の間；
ｉｉｉ）     前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ３内へ取り込まれる場合には、前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ１０６の間；
ｉｖ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ１内へ取り込まれる場合には、前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ  ３２の間；
ｖ）    前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ２内へ取り込まれる場合には、前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ５７の間；および／または
ｖｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ３内へ取り込まれる場合には、前記ＡＮＰの最後のアミノ酸残基とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ９８の間
に存在するアミノ酸伸長が、配列番号３９から５１のいずれか１つの配列または配列番号３９から５１のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、前記抗体またはその断片。
【請求項７】
前記Ｎｔｌｓおよび／または前記Ｃｔｌｓが、少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０個で、かつ、３０、２８、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０個までのアミノ酸残基を含む、請求項１から６のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
【請求項８】
請求項１から７のいずれか１項に記載の抗体またはその断片であって、
ｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ１内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ２５とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ３５ａの間；
ｉｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ２内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５１とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５７の間；
ｉｉｉ）     前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ３内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ９２とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ１０６の間；
ｉｖ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ１内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ２６とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ  ３２の間；
ｖ）    前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ２内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ４９とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ５７の間；および／または
ｖｉ）  前記異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ３内へ取り込まれる場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ８８とＫａｂａｔによるＬＣ  ｒｅｓ９８の間
に存在するアミノ酸伸長が、配列番号５２から６４のいずれか１つの配列または配列番号５２から６４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含む、前記抗体またはその断片。
【請求項９】
少なくとも１つのさらなるナトリウム利尿ペプチドを含み、特に、前記ＡＮＰおよび前記少なくとも１つのさらなるナトリウム利尿ペプチドが少なくとも２つの別々のＣＤＲ領域内に取り込まれ、さらに特に、前記少なくとも１つのさらなるナトリウム利尿ペプチドがＡＮＰ、ＢＮＰおよびＣＮＰ、最も特にＢＮＰおよびＣＮＰから選択される、請求項１から８のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１０】
ヒト抗体もしくはヒト化抗体またはその断片であり、特にクラスＩｇＧである、請求項１から９のいずれか１項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれか１項に記載の抗体またはその断片であって、
（ｉ）  軽鎖が、配列番号６６のアミノ酸配列を含んでいるかまたは配列番号６６のアミノ酸配列からなり、かつ、重鎖が、配列番号６７〜７９のいずれか１つのアミノ酸配列を含んでいるかまたは配列番号６７〜７９のいずれか１つのアミノ酸配列からなるか；または
（ｉｉ）  重鎖が、配列番号６５のアミノ酸配列を含んでいるかまたは配列番号６５のアミノ酸配列からなり、かつ、軽鎖が、配列番号８０および８１のいずれか１のアミノ酸配列を含んでいるか、または配列番号８０および８１のいずれか１のアミノ酸配列からなる
前記抗体またはその断片。
【請求項１２】
Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ジアボディ；単一ドメイン抗体（Ｄａｂ）；線状抗体；単鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）；およびジスルフィド安定化Ｆｖ抗体断片（ｄｓＦｖ）からなる群より選択される、請求項１から１１のいずれか１項に記載の抗体断片。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の抗体またはその断片を含み、さらに、薬学的に許容可能な担体を含んでいてもよい組成物。
【請求項１４】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の抗体またはその断片をコードする核酸または核酸の混合物。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸または核酸の混合物を含む宿主細胞。
【請求項１６】
抗体またはその断片を産生する方法であって、該抗体またはその断片の発現に適した条件下で、請求項１５に記載の宿主細胞を培養する工程を含む、前記方法。
【請求項１７】
治療方法に使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【請求項１８】
心血管疾患もしくは障害、腎疾患もしくは障害、肺疾患もしくは障害、骨格疾患もしくは障害、眼疾患もしくは障害、血栓塞栓性疾患もしくは障害または線維性疾患もしくは障害、小人症、軟骨形成不全症または他のｃＧＭＰ関連および／またはナトリウム利尿ペプチド応答性障害の治療に使用するための、請求項１から１２のいずれか一項に記載の抗体またはその断片。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、抗体またはその断片の少なくとも１つのＣＤＲ領域内に取り込まれた少なくとも１つの異種性アミノ酸配列を含む抗体またはその断片に関し、ここで、少なくとも１つの異種性アミノ酸配列は、Ｎ末端リンカー配列（Ｎｔｌｓ）、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）およびＣ末端リンカー配列（Ｃｔｌｓ）を含む。任意に、少なくとも１つのＣＤＲ領域の少なくとも一部が、その中に取り込まれた少なくとも１つの異種性アミノ酸配列によって置換される。ＣＤＲＨ１内の前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  （重鎖）  ｒｅｓ２５とＡＮＰの第1アミノ酸残基との間；ＣＤＲＨ２内の前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５１とＡＮＰの第1アミノ酸残基との間；  ＣＤＲＨ３内の前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ９２とＡＮＰの第1アミノ酸残基との間；ＣＤＲＬ１内の前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  （軽鎖）  ｒｅｓ２６とＡＮＰの第1アミノ酸残基との間；  ＣＤＲＬ２内の前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ４９とＡＮＰの第1アミノ酸残基の間；および／またはＣＤＲＬ３内の前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ８８とＡＮＰの第1アミノ酸残基との間には、少なくとも１２個のアミノ酸残基が存在する。さらに、ＣＤＲＨ１内の前記異種性アミノ酸配列の組み込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ３５ａ；ＣＤＲＨ２内の前記異種性アミノ酸配列の組み込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５７；ＣＤＲＨ３内の前記異種性アミノ酸配列の組み込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ１０６；ＣＤＲＬ１内の前記異種性アミノ酸配列の組み込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ３２；ＣＤＲＬ２内の前記異種性アミノ酸配列の組み込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ５７；および／またはＣＤＲＬ３内の前記異種性アミノ酸配列の組み込みの場合の、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ９８とＡＮＰの最後のアミノ酸残基との間には少なくとも９アミノ酸残基が存在する。本発明はさらに、このような抗体またはその断片を治療方法に使用するためのこのような抗体またはその断片、このような抗体またはその断片を含む組成物、核酸またはそのような抗体またはその断片をコードする核酸の混合物、このような核酸またはそのような混合物を含む宿主細胞、ならびにこのような抗体またはその断片を産生するための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ナトリウム利尿ペプチドは、神経体液性作用を有する３つの構造的に関連したペプチドのファミリーである。心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）は、システイン残基７と２３の間のジスルフィド架橋により形成される中心環構造を含む２８アミノ酸のペプチドである。ヒトＡＮＰは心房筋細胞において１５３アミノ酸長前駆ホルモンとして発現される。シグナルペプチドの切断によりプロホルモン型が生じ、その後さらに切断されて成熟ＡＮＰとＮＴ−ｐｒｏＡＮＰとして知られるＮ末端レムナントになる。ＡＮＰと同様に、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）およびＣ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）も前駆体蛋白質から産生され、中心環構造を構成する。ＡＮＰは主に左右心房の心筋細胞によって産生・放出されるが、ＢＮＰは主に心室の心筋細胞によって産生される。ＣＮＰは血管の内皮細胞によって合成される。これらの部位とは別に、ナトリウム利尿ペプチドは、体の他の部位、例えば、脳、腎臓および副腎においても、より少量産生される。ナトリウム利尿ペプチドは、ＮＰＰＡ、ＮＰＰＢ、ＮＰＰＣの３つの別々の遺伝子によってコードされている。３つのペプチドのアミノ酸配列は哺乳類で高度に保存されている（Ｐｏｔｔｅｒら、Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９；（１９１）：３４１−６６）。しかしながら、切断、アミノ酸交換ならびにキメラ融合（例えば、ＣＤ−ＮＰ  （ＭｃＫｉｅら、Ｃｕｒｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  Ｒｅｐ．  ２０１０  Ｓｅｐ；  ７（３）：  ９３−９））のようなナトリウム利尿ペプチドの有意な配列修飾は、細胞受容体を活性化または結合し、関連する生理学的作用を誘発し得る強力なナトリウム利尿ペプチドをもたらすことが記載されている。
【０００３】
ナトリウム利尿ペプチドは、ＮＰＲ−Ａ、ＮＰＲ−Ｂ、ＮＰＲ−Ｃという３種類の膜結合型受容体に結合し、その生物学的作用を仲介する。ＡＮＰとＢＮＰはＮＰＲ−Ａに最大の親和性をもって結合する。対照的に、ＣＮＰはＮＰＲ−Ｂ受容体に最も高い親和性をもっている。ＮＰＲ‐ＡとＮＰＲ‐Ｂは（粒子状）グアニル酸シクラーゼドメイン（ｐＧＣ）を含み、その酵素活性は（細胞内）環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の増加を引き起こす。セカンドメッセンジャーとして、ｃＧＭＰは多様な細胞過程を調節する。ＮＰＲ−Ｃ受容体はグアニル酸シクラーゼ活性を示さず、ナトリウム利尿ペプチドと結合することができ、エンドサイトーシスによる分解につながるため、“クリアランス”受容体とも呼ばれる。ｃＡＭＰの調節を介したＮＰＲ−Ｃ受容体のさらなるシグナル伝達機能が記載されている（Ａｎａｎｄ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  ２００５  Ｊｕｎ；  ２６  （６）：  １０４４−５９）。
【０００４】
心臓ホルモンであるＡＮＰおよびＢＮＰは、例えば過剰な血漿量のために、心室および心房の伸張時に排泄される。血管平滑筋の弛緩を介して血管拡張作用を発揮し、血圧の低下につながる。腎臓では、ＡＮＰは通常、尿排泄の増加（利尿）のほか、尿中のナトリウムイオン濃度の増加（ナトリウム利尿）を引き起こす。ＡＮＰは、多くの心血管疾患で過剰に活性化されるレニン‐アンジオテンシン‐アルドステロン系（ＲＡＡＳ）の代償性拮抗物質を構成すると考えられている。また、ＡＮＰは交感神経系に対する抑制効果をはじめとする他の神経体液性効果を発揮するとともに、圧反射に対する複雑な調節効果を発揮する（Ｗｏｏｄｓら、  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００４  Ｎｏｖ；  ３１  （１１）：  ７９１−４）。ＡＮＰについては、ＢＮＰおよびＣＮＰと同様に、抗炎症、抗肥大および抗線維化作用が、異なる疾患の動物モデルにおいて実証されている（例えば、Ｋｎｏｗｌｅｓら、２００１、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：  ９７５−９８４；  Ｄａｈｒｏｕｊら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２０１３  Ｊａｎ；  ３４４（１）：９６−１０２；  Ｂａｌｉｇａら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４年７月；  １７１  （１４）：  ３４６３−７５；  Ｍｉｔａｋａら．Intensive Care Med Exp. ２０１４年１２月、２（１）：２８;Ｗｅｒｎｅｒら、Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１６年３月；  １１１（２）：２２；Kimuraら、Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ．２０１６年２月１９日；  １７：  １９）。ＣＮＰによるＮＰＲ−Ｂの活性化は、骨成長（Ｙａｓｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｌｃｉｕｍ．２００９  Ｊｕｌ；  １９（７）：１００３−８）および血管内皮の完全性（Ｍｏｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１４  Ｓｅｐ；  １２４（９）：４０３９−５１）において重要な役割を果たしている。
【０００５】
ナトリウム利尿ペプチドおよびその受容体の広範囲な生理学的作用により、創薬における魅力的な標的となっている（Ｌｕｍｓｄｅｎら、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．  ２０１０；  １６（３７）：  ４０８０−８；  Ｂｕｇｌｉｏｎｉら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．２０１６；  ６７：  ２２９−４３）。例えば、ナトリウム利尿ｃＧＭＰ系は、様々な病態生理学的条件下で抑制され、その結果、高血圧、細胞増殖の増加、線維症、炎症、内皮機能不全、糖尿病、メタボリックシンドローム、アテローム性動脈硬化症、心不全、心筋梗塞、肺高血圧症、眼および腎疾患、骨疾患、脳卒中および／または性機能不全が生じる可能性がある。
【０００６】
ナトリウム利尿ペプチドの治療的使用のための主要なハードルは、臓器において数分しかないごく短い血漿半減期である  （Ｈｕｎｔら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  １９９４  Ｊｕｎ；  ７８（６）：  １４２８−３５；  Ｋｉｍｕｒａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００７年７月；  ６３（７）：  ６９９−７０２）。ＮＰＲ‐Ｃ受容体によるエンドサイトーシスに加えて、ナトリウム利尿ペプチドは酵素ネプリリシン（ＮＥＰ）とインシュリン分解酵素（ＩＤＥ）により効率的に蛋白分解される。投与されたナトリウム利尿ペプチドの短期の生物学的作用により、主に急性適応にそれらの治療的使用が制限されてきた。例えば、組み換えカルペリチド（ＡＮＰ）およびネシリチド（ＢＮＰ）の注入は、各国で急性非代償性心不全の治療に承認されている。
【０００７】
慢性疾患の治療は、血漿半減期の増加、より高い蛋白質分解安定性および作用時間の延長を伴うＮＰＲ−ＡおよびＮＰＲ−Ｂアゴニストの提供によって、大いに促進されるであろう。
【０００８】
近年、いくつかのナトリウム利尿ペプチド誘導体および変異体、例えばＣＤ−ＮＰ  （ＭｃＫｉｅら、Ｃｕｒｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  Ｒｅｐ．２０１０  Ｓｅｐ；  ７（３）：９３−９）、ＺＤ１００／  ＭＡＮＰ  （ＭｃＫｉｅら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２０１０  Ｄｅｃ；  ５６（６）：１１５２−９）、ＰＬ−３９９４（Ｅｄｅｌｓｏｎら、Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１３  Ａｐｒ；  ２６（２）：２２９−３８）、Ｕｌａｒｉｔｉｄｅ  （Ａｎｋｅｒら、Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．２０１５  Ｍａｒ  ２１；  ３６（１２）：７１５−２）、ＡＮＸ−０４２（Ｐａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００９  Ｊｕｌ．７；  １０６（２７）：１１２８２−７およびＢＭＮ−１１１（Ｗｅｎｄｔら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ２０１５  Ａｐｒ；３５３（１）：  １３２−４９）が報告されている。ＣＤ−ＮＰの半減期は約１８．５分である（Ｌｅｅら、ＢＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７，  ７（Ｓｕｐｐｌ  Ｉ）：  Ｐ３８）。さらなるＡＮＰおよびＣＮＰ誘導体が、それぞれＵＳ  ９，１９３，７７７およびＥＰ  ２  ４３２  ４８９  Ａに開示されている。
【０００９】
さらに、Ｆｃ融合、アルブミン融合およびＰＥＧ化ナトリウム利尿ペプチドを含むナトリウム利尿ペプチド融合が記載されている。ナトリウム利尿ペプチド−Ｆｃ融合物は、例えば、ＵＳ  ２０１０／０３１０５６１、ＷＯ  ２００８／１５４２２６、ＷＯ  ２０１０／１１７７６０、ＷＯ  ２００６／１０７１２４、ＷＯ  ２００８／１３６６１１およびＷＯ  ２００８／０７９９９５に開示されている。ナトリウム利尿ペプチド−アルブミン融合体はＵＳ  ７，５２１，４２４およびＵＳ  ２０１４／０１４８３９０に開示され、ＰＥＧ化ナトリウム利尿ペプチドはＵＳ  ２０１４／０１４８３９０に開示されている。
【００１０】
ＷＯ  ２００５／０６０６４２は、ヒト破傷風トキソイド特異的抗体のＣＤＲＨ３領域に両末端に２つのランダム化フランジングアミノ酸を有するＡＮＰまたはＢＮＰを挿入して得られたＡＮＰおよびＢＮＰペプチド移植（ｅｎｇｒａｆｔｅｄ）抗体ライブラリーの作製について記載している。同様に、ＷＯ  ２００５／０８２００４は、２Ｇ１２抗体の元のＣＤＲＨ３領域全体を、両側の２つのランダムなアミノ酸残基に挟まれたＡＮＰ模倣ペプチドで置換することによって得られたＡＮＰ模倣移植抗体ライブラリーの作製を開示する。ＷＯ  ２００５／０６０６４２およびＷＯ  ２００５／０８２００４のいずれも、特定のナトリウム利尿ペプチド移植抗体を具体的に開示しておらず、ましてやこのような抗体を機能的に特徴付けることは何ら行っていない。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】ＵＳ  ９，１９３，７７７およびＥＰ  ２  ４３２  ４８９  Ａ
【特許文献２】ＵＳ  ２０１０／０３１０５６１
【特許文献３】ＷＯ  ２００８／１５４２２６、ＷＯ  ２０１０／１１７７６０
【特許文献４】ＷＯ  ２００６／１０７１２４
【特許文献５】ＷＯ  ２００８／１３６６１１
【特許文献６】ＷＯ  ２００８／０７９９９５
【特許文献７】ＵＳ  ７，５２１，４２４
【特許文献８】ＵＳ  ２０１４／０１４８３９０
【特許文献９】ＵＳ  ２０１４／０１４８３９０
【特許文献１０】ＷＯ  ２００５／０６０６４２
【特許文献１１】ＷＯ  ２００５／０８２００４
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｐｏｔｔｅｒら、Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００９；（１９１）：３４１−６６
【非特許文献２】ＭｃＫｉｅら、Ｃｕｒｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  Ｒｅｐ．  ２０１０  Ｓｅｐ；  ７（３）：  ９３−９）
【非特許文献３】Ａｎａｎｄ−Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ，  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ．  ２００５  Ｊｕｎ；  ２６  （６）：  １０４４−５９
【非特許文献４】Ｗｏｏｄｓら、  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００４  Ｎｏｖ；  ３１  （１１）：  ７９１−４
【非特許文献５】Ｋｎｏｗｌｅｓら、２００１、Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．１０７：  ９７５−９８４
【非特許文献６】Ｄａｈｒｏｕｊら、Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．２０１３  Ｊａｎ；  ３４４（１）：９６−１０２
【非特許文献７】Ｂａｌｉｇａら、Ｂｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２０１４年７月；  １７１  （１４）：  ３４６３−７５
【非特許文献８】Ｍｉｔａｋａら．Intensive Care Med Exp. ２０１４年１２月、２（１）：２８
【非特許文献９】Ｗｅｒｎｅｒら、Ｂａｓｉｃ  Ｒｅｓ  Ｃａｒｄｉｏｌ．２０１６年３月；  １１１（２）：２２
【非特許文献１０】Kimuraら、Ｒｅｓｐｉｒ  Ｒｅｓ．２０１６年２月１９日；  １７：  １９
【非特許文献１１】Ｙａｓｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｃｌｉｎ．  Ｃａｌｃｉｕｍ．２００９  Ｊｕｌ；  １９（７）：１００３−８
【非特許文献１２】Ｍｏｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．、  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２０１４  Ｓｅｐ；  １２４（９）：４０３９−５１
【非特許文献１３】Ｌｕｍｓｄｅｎら、Ｃｕｒｒ  Ｐｈａｒｍ  Ｄｅｓ．  ２０１０；  １６（３７）：  ４０８０−８
【非特許文献１４】Ｂｕｇｌｉｏｎｉら、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．２０１６；  ６７：  ２２９−４３
【非特許文献１５】Ｈｕｎｔら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ．  １９９４  Ｊｕｎ；  ７８（６）：  １４２８−３５
【非特許文献１６】Ｋｉｍｕｒａら、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２００７年７月；  ６３（７）：  ６９９−７０２）
【非特許文献１７】ＭｃＫｉｅら、Ｃｕｒｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｆａｉｌ  Ｒｅｐ．２０１０  Ｓｅｐ；  ７（３）：９３−９
【非特許文献１８】ＭｃＫｉｅら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓｉｏｎ．２０１０  Ｄｅｃ；  ５６（６）：１１５２−９
【非特許文献１９】Ｅｄｅｌｓｏｎら、Ｐｕｌｍ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１３  Ａｐｒ；  ２６（２）：２２９−３８
【非特許文献２０】Ａｎｋｅｒら、Ｅｕｒ  Ｈｅａｒｔ  Ｊ．２０１５  Ｍａｒ  ２１；  ３６（１２）：７１５−２）
【非特許文献２１】Ｐａｎら、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００９  Ｊｕｌ．７；  １０６（２７）：１１２８２−７
【非特許文献２２】Ｗｅｎｄｔら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｅｘｐ  Ｔｈｅｒ．  ２０１５  Ａｐｒ；３５３（１）：  １３２−４９
【非特許文献２３】Ｌｅｅら、ＢＭＣ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２００７，  ７（Ｓｕｐｐｌ  Ｉ）：  Ｐ３８
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
発明の目的
先行技術を考慮して、天然に存在する野生型ナトリウム利尿ペプチドと比較して、血清中で安定性が増加した新規ナトリウム利尿ペプチド受容体アゴニストを提供することが本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【００１４】
発明の概要
上記の目的は、独立クレームの教示によって達成される。本発明者らは、生物学的に活性なペプチドの取り込みにかなりの立体配座拘束を課すことになる免疫グロブリンＣＤＲ領域の短さおよび高い配列保存性にもかかわらず、ナトリウム利尿ペプチドアミノ酸配列を免疫グロブリン分子またはその断片のＣＤＲ領域の１つに組み込むことにより、天然型ナトリウム利尿ペプチドと比較して血清中の安定性が有意に増大した生物学的に活性なナトリウム利尿ペプチド変異体を得ることができることを驚くべきことに見出した。しかし、免疫グロブリンＣＤＲ領域内に取り込まれたナトリウム利尿ペプチドの活性はかなり変動することが示された。本発明者らは、生物学的に活性なナトリウム利尿ペプチド変種を生み出す組込みを成功させる決定的要因は、組込天然ペプチドと該組込天然ペプチドからの最も近いＣＤＲ構造接合Ｎ末端およびＣ末間のアミノ酸残基の数であることを発見した。ナトリウムペプチドと近隣のＣＤＲフレームワークとの間に存在するＮ末端とＣ末端の隣接アミノ酸残基が一定数未満の場合では、生物学的活動をまったくまたは劇的に減少させたナトリウムペプチド免疫グロブリン融合構築物のみが得られた。取り込まれたナトリウム利尿ペプチドに隣接する特異的なリンカー配列は、高いペプチド活性、良好な発現レベルおよび／または低いタンパク質断片化レベルを達成するために特に有利であることが見出された。
【００１５】
したがって、第１の態様において、本発明は、抗体またはその抗体の少なくとも１つのＣＤＲ領域内に取り込まれた少なくとも１つの異種性アミノ酸配列を含む抗体またはその断片に関し、ここで、少なくとも１つの異種性アミノ酸配列は、Ｎ末端リンカー配列（Ｎｔｌｓ）、ナトリウム利尿ペプチドおよびＣ末端リンカー配列（Ｃｔｌｓ）を含み、ここで、少なくとも１つのＣＤＲ領域の一部は、その中に取り込まれた少なくとも１つの異種性アミノ酸配列によって置換されていてもよく、ここで、
ａ）    ｉ）  ＣＤＲＨ１内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ２５（配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｓ２５に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基；
ｉｉ）     ＣＤＲＨ２内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５１（配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｉ５１に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基；
ｉｉｉ）   ＣＤＲＨ３内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ９２（配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｃ９６に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基；
ｉｖ）  ＣＤＲＬ１内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ２６  （配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これはｒｅｓ  Ｓ２５に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基；
ｖ）  ＣＤＲＬ２内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ４９（配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これはｒｅｓ  Ｙ５１に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基；および／または
ｖｉ）  ＣＤＲＬ３内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ８８（配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これはｒｅｓ  Ｃ９０に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基；  
の間に少なくとも１２個のアミノ酸残基が存在し、ここで、
ｂ）  ナトリウム利尿ペプチドの最後のアミノ酸残基と
ｉ）  ＣＤＲＨ１内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ  ３５ａ  （配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｍ３４に相当する）；
ｉｉ）  ＣＤＲＨ２内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５７（配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｔ５８に相当する）  ；
ｉｉｉ）  ＣＤＲＨ３内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ１０６（配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｇ１１１に相当する）；
ｉｖ）  ＣＤＲＬ１内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ  ３２（配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これはｒｅｓ  Ｄ３４に相当する）  ；
ｖ）  ＣＤＲＬ２内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ５７（配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これは、ｒｅｓ  Ｇ５９に相当する）  ；および／または
ｖｉ）  ＣＤＲＬ３内に前記異種性アミノ酸配列を取り込む場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ９８  （配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これはｒｅｓ  Ｆ１０２に相当する）  
の間に少なくとも９個のアミノ酸残基が存在する。
【００１６】
さらなる態様において、本発明は、治療のための方法において使用するためのかかる抗体またはその断片、かかる抗体またはその断片を含む組成物、かかる抗体またはその断片をコードする核酸の核酸または混合物、かかる核酸またはそのような混合物を含む宿主細胞、およびかかる抗体またはその断片を産生するための方法に関する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１：ラットにＴＰＰ−１０９９２およびＴＰＰ−５６６１を５ｍｇ／ｋｇ静脈内投与したときの平均血漿中濃度。
【図２】図２：マウスに５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した後のＴＰＰ−１２８９７の平均血漿中濃度。
【図３】図３：ＡＮＰ（Ａ−Ｃ）、ＴＰＰ−１０９９２（Ｄ−Ｆ）およびＴＰＰ−５６６１（Ｇ−Ｉ）の蛋白分解に対する安定性。
【図４】図４：ＢＮＰ（Ａ−Ｃ）とＴＰＰ−１１１５５（Ｄ−Ｆ）の蛋白分解に対する安定性。
【図５】図５：ＣＮＰ（Ａ−Ｃ）とＴＰＰ−１２８９７（Ｄ−Ｆ）の蛋白分解に対する安定性。
【図６】図６：  ＰＥ収縮大動脈輪におけるＡＮＰペプチドおよびＴＰＰ−１０９９２の血管拡張用量反応曲線
【図７】図７：  ＰＥ収縮大動脈輪におけるＡＮＰペプチドおよびＴＰＰ−５６６１の血管拡張用量反応曲線
【図８】図８：覚醒ラットにおけるＡＮＰの血行動態への影響。
【図９】図９：覚醒ラットにおける血行動態作用。
【図１０】図１０：覚醒ラットにおける血行動態作用。
【図１１】図１１：ＢＮＰ移植抗体構築物のｈＮＰＲＡ細胞上での活性。
【図１２】図１２：異なるヒトＩｇＧアイソタイプの例示的活性決定。
【図１３】図１３：化合物１１７ヒトＩｇＧ１（ＴＰＰ−５６６１）および化合物９ヒトＩｇＧ１（ＴＰＰ−１０２９４）ならびにそれらの非ヒトＩｇＧ１対応物の例示的活性決定。
【図１４】図１４：安定なｈＮＰＲＡ‐ＣＨＯ  ｋ１細胞に対する精製化合物試料の活性。
【図１５】図１５：  ＴＰＰ−１２８９９のＬＰＳ、ＩＬ−１βおよびトロンビンに対する保護作用による、リアルタイムインピーダンス計測により評価した内皮関門透過性誘導。
【図１６】図１６：ＴＰＰ−１３９９２の生存（Ａ）、体重増加（Ｂ）、尿蛋白／クレアチニン比（Ｃ）および左房重量（Ｄ）に対する治療効果（ｎ＝８〜１２（健常対照ｎ＝５）、平均値±標準誤差、Ｏｎｅ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｖｓ  ＴＰＰ−１０１５５（アイソタイプ特異的対照抗体））。
【図１７】図１７：ＴＰＰ−１０９９２のプラセボ０．１、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇ投与後の血行動態の評価。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
発明の詳細な説明
本発明は、以下の本発明の詳細な説明およびそこに含まれる例を参照することにより、より容易に理解することができる。
【００１９】
第１の態様において、本発明は、抗体またはその断片の少なくとも１つのＣＤＲ領域内に取り込まれた少なくとも１つの異種性アミノ酸配列を含む抗体またはその断片に関し、ここで、少なくとも１つの異種性アミノ酸配列は、Ｎ末端リンカー配列（Ｎｔｌｓ）、ナトリウム利尿ペプチドおよびＣ末端リンカー配列（Ｃｔｌｓ）を含み、ここで、少なくとも１つのＣＤＲ領域の少なくとも一部は、その中に取り込まれた少なくとも１つの異種性アミノ酸配列によって置換されていてもよい。
【００２０】
本発明者らは、天然に存在する野生型ナトリウム利尿ペプチドと比較して血清中の安定性が有意に増加した生物学的に活性なナトリウム利尿ペプチド変異体が、免疫グロブリン分子またはその断片のＣＤＲ領域の１つにナトリウム利尿ペプチドアミノ酸配列を組み込むことによって得られることを見出した。この所見は全く予想外であった。当技術分野でよく知られているように、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、ＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２において特に顕著である免疫グロブリンＣＤＲ領域の短い長さおよび高い配列保存は、生物学的に活性なペプチドの取り込みに対してかなりの立体配座拘束を課し、周囲の免疫グロブリン配列は取り込まれたペプチドの発現、フォールディングおよび／または生物学的活性に負の影響を及ぼす可能性がある。実際、本発明者らは、ナトリウム利尿ペプチド移植抗体が構築された正確な方法に依存して、免疫グロブリンＣＤＲ領域内に取り込まれたナトリウム利尿ペプチドの活性がかなり変化することを見出した。機能的な、すなわち生物学的に活性なナトリウム利尿ペプチド変異体を生じる取込み成功の決定因子は、取込まれたナトリウム利尿ペプチドと、取込まれたナトリウム利尿ペプチドからの最近接ＣＤＲ−フレームワーク結合Ｎ−末端およびＣ−末端との間のアミノ酸残基の数であることが示された。ナトリウム利尿ペプチドと隣接ＣＤＲ‐フレームワーク結合間において、Ｎ末端およびＣ末端隣接アミノ酸残基が一定数未満では、生物学的に活性なナトリウム利尿ペプチド免疫グロブリン融合構築物は得られなかった。
【００２１】
「組み込まれた（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）」、「挿入された（ｉｎｓｅｒｔｅｄ）」、「組み込まれた（ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ）」、「組み込まれた（）」、「移植された（ｅｎｇｒａｆｔｅｄ）」および「埋め込まれた（ｅｍｂｅｄｄｅｄ）」ならびに「取り込み（ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）」、「挿入（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）」、「組み込み（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ）」、「移植（ｅｎｇｒａｆｔｉｎｇ）」および「埋め込み（ｅｍｅｄｄｉｎｉｇ）」という用語は、本明細書では互換的に使用される。本発明の文脈の中で、これらの用語は、抗体または抗体断片の元の配列への異種配列の導入によるハイブリッド多核酸またはハイブリッドポリペプチドの生成を意味する。このような取り込みは、いかなる方法によっても行われ得る。典型的には、Ｎ末端およびＣ末端リンカー配列に挟まれたナトリウム利尿ペプチドを含む抗体またはその断片を、組換えＤＮＡ技術および本明細書に記載される発現によって作製する。
【００２２】
元の抗体または抗体断片配列のＣＤＲ領域に、Ｎ末端およびＣ末端リンカー配列に挟まれたナトリウム利尿ペプチドを取り込むと、前記ＣＤＲ領域の少なくとも一部が欠失することがある。例えば、ＣＤＲコード配列の一部が取り込まれた異種核酸配列によって置換されるように、Ｎ末端リンカー配列、ナトリウム利尿ペプチドおよびＣ末端リンカー配列を含む異種性アミノ酸配列をコードする核酸配列のクローニングを実施してもよい。特に他の実施形態では、ナトリウム利尿ペプチドを含む異種性アミノ酸配列の取り込みは、異種性アミノ酸配列が挿入されるＣＤＲ領域のアミノ酸残基の欠失をもたらさない。
【００２３】
本発明の文脈の中で、「異種性アミノ酸配列」という用語は、それが組み込まれる最初の「空の」抗体またはその断片に由来しないアミノ酸配列を指す。異種性アミノ酸配列を抗体またはその断片に移植することにより、異なる起源のアミノ酸配列からなる遺伝子操作された組換え抗体分子が得られる。
【００２４】
用語「ナトリウム利尿ペプチド」は、ナトリウム利尿、すなわち腎臓によるナトリウムの排泄を誘導することができるペプチドを指す。ナトリウム利尿ペプチドには、心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）、デンドロアスピスナトリウム利尿ペプチド（ＤＮＰ）およびウロジラチンがある。本発明の意味内のナトリウム利尿ペプチドは、いかなる起源のものであってもよい。ナトリウム利尿ペプチドには、野生型ナトリウム利尿ペプチドおよびその突然変異体のような天然ナトリウム利尿ペプチドならびに異なる種の相同ナトリウム利尿ペプチドが含まれる。しかしながら、この用語は、別個のナトリウム利尿ペプチドの操作されたキメラ変異体のような操作されたナトリウム利尿ペプチドも包含する。コドンの使い方は種間で異なることが知られている。したがって、標的細胞中で異種タンパク質を発現する場合、核酸配列を標的細胞のコドン使用に適応させることが必要であるか、または少なくとも有用であり得る。所与のタンパク質の誘導体を設計し構築する方法は、当業者に周知である。
【００２５】
特定の実施形態では、ナトリウム利尿ペプチドは、任意の種の野生型ナトリウム利尿ペプチドおよび任意のそのような野生型ナトリウム利尿ペプチドの機能的変異体から選択される。本発明の文脈の中で、「ナトリウム利尿ペプチドの機能的変異体」または「機能的ナトリウム利尿ペプチド変異体」という用語は、所与の種の野生型ナトリウム利尿ペプチドのような所与のアミノ酸配列および／または核酸配列をコードしているが、依然として機能的に活性である、天然型ナトリウム利尿ペプチド、特に野生型ナトリウム利尿ペプチドの生物学的機能を果たすナトリウム利尿ペプチド変異体の能力を指し、特に、「機能的に活性」とは、ナトリウム利尿ペプチド変異体がそのそれぞれの受容体に結合できることを意味する。ＮＰＲ−ＡおよびＮＰＲ−Ｂリガンドの場合、「機能的に活性な」とは、これらの受容体の一方または両方に結合することによって、（細胞内の）環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の増加を媒介する能力を意味する。
【００２６】
特定の実施形態では、機能的ナトリウム利尿ペプチド変異体は、任意の種の野生型ナトリウム利尿ペプチドの少なくとも約５０％、特に少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、および大部分、特に少なくとも約９０％まで、所定のナトリウム利尿ペプチドの１つまたは複数の生物学的機能を遂行することができ、ここで１つまたは複数の生物学的機能は、ナトリウム利尿ペプチドのそれぞれの受容体への結合および／または細胞内ｃＧＭＰの増加の誘導を含むが、これらに限定されない。
【００２７】
ナトリウム利尿ペプチドの機能的活性は、（細胞内）環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の増加を測定することを可能にするｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を含む任意の方法によって、または実施例３および５に記載された方法を含むｃＧＭＰによって調節される細胞プロセスの変化を測定することを可能にする任意の方法によって測定することができる。具体的な実施形態では、実施例３に記載の蛍光アッセイによって決定されるそのＥＣ５０価が５００  ｎＭ未満、より特に２５０  ｎＭ未満、より特に１５０  ｎＭ未満、より特に１００  ｎＭ未満、より特に５０  ｎＭ未満、最も特に２５  ｎＭ未満である場合、（非移植）ナトリウム利尿ペプチド変異体は機能的に活性であると考えられる。
【００２８】
このような機能性ナトリウム利尿ペプチド変異体を、本明細書に記載される免疫グロブリン分子またはその断片のＣＤＲ領域の１つに組み込むと、ナトリウム利尿ペプチド機能活性を有するナトリウム利尿ペプチド移植免疫グロブリンが得られ、実施例に示されるような非移植機能性ナトリウム利尿ペプチド変異体と比較して、血清中の安定性が有意に増加した。ナトリウム利尿ペプチド移植免疫グロブリンは、ｃＧＭＰによって調節される細胞過程の変化を評価することによって直接的または間接的に（細胞内）環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の増加を測定するいずれの方法においても、有意な正のシグナルを与えるならば、生物学的に活性（すなわち、機能的）であると考えられる。特に、ナトリウム利尿ペプチド移植免疫グロブリンの機能的活性は、実施例３および５に記載された方法により評価され得る。ナトリウム利尿ペプチド移植免疫グロブリンの場合、有意性は、典型的には、ｉ）空の免疫グロブリン骨格のような陰性試料、例えば構築物＃２０９、配列番号６５および配列番号６６を含む抗体、ＴＰＰ−５６５７、ｉｉ）陽性試料、例えば構築物＃１１７、配列番号６７および配列番号６６を含む抗体、ＴＰＰ−５６６１との比較、およびｉｉｉ）用量依存性に基づいて評価される。
【００２９】
本発明による機能性ナトリウム利尿ペプチド変異体は、参照ナトリウム利尿ペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含む任意の数の突然変異を含むことができるが、機能性ナトリウム利尿ペプチド変異体は、典型的には、中央の環ドメイン内のキー残基のような対応するナトリウム利尿ペプチドの鍵となる特徴を維持するであろう。ナトリウム利尿ペプチドの保存された残基は、例えば、Ｌｉｎｃｏｌｎ  Ｒ．  Ｐｏｔｔｅｒら（Ｈａｎｄｂ  Ｅｘｐ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ２００９；（１９１）：３４１−３６６）に記載されている。したがって、特定の実施形態において、機能性ナトリウム利尿ペプチド変異体は、以下に示す配列と少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を共有する：
【数１】
2021520801.tif 000002
式中Ｘ１とＸ５はＧまたはＳ；
Ｘ３はＲまたはＫ；
Ｘ６  はＡ  またはＳ  で、
Ｘ２，  Ｘ４，  Ｘ７  およびＸ８  は任意のアミノ酸である。
原則として、全ての型のナトリウム利尿ペプチドを、本明細書に記載される免疫グロブリンまたはその断片のＣＤＲ領域内に取り込むことができる。特に、本発明者らは、移植ナトリウム利尿ペプチドの十分な生物学的活性のための最小限の必要条件、および特に適当なＮ末端およびＣ末端アミノ酸配列の両方に関する１つのタイプのナトリウム利尿ペプチドの所見が、他のタイプのナトリウム利尿ペプチドに与えられる可能性があることを見出した。理論に拘束されることを望まないが、異なるナトリウム利尿ペプチド型の間で免疫グロブリン分子内にナトリウム利尿ペプチドをうまく埋め込むためのこれらの類似の必要条件は、ナトリウム利尿ペプチドファミリー内の構造的類似性および／または作用機序に起因する可能性があると仮定される。
【００３０】
特定の実施形態において、ナトリウム利尿ペプチドは、配列番号２３の配列を有するヒトＡＮＰ、配列番号２４の配列を有するヒトＢＮＰ、配列番号２５の配列を有するヒトＣＮＰ、および配列番号２３〜２５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくは少なくとも９８％の配列同一性を有するペプチドからなる群より選択される。ここでも、野生型ヒトナトリウム利尿ペプチドＡＮＰ、ＢＮＰおよびＣＮＰから逸脱する配列を有するナトリウム利尿ペプチドは、任意の天然起源、例えば、野生型ヒトナトリウム利尿ペプチドの突然変異型、または異なる種のホモログ、または操作されたナトリウム利尿ペプチドであってもよい。ペプチド変異体を設計し構築する方法は、当業者によく知られている。
【００３１】
そのような具体例において、配列番号２３〜２５のいずれか１つと少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または少なくとも９８％の配列同一性を有するナトリウム利尿ペプチドは、機能性ナトリウム利尿ペプチド変異体である。
【００３２】
参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列に関する「配列同一性のパーセント（％）」は、それぞれ、最大パーセント配列同一性を達成するために、必要であればギャップを導入した後に、それぞれ、参照ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列中の核酸またはアミノ酸残基と同一である候補配列中のそれぞれの核酸またはアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。保存的置換は配列同一性の一部とはみなされない。特定の実施形態では、候補配列および／または参照配列に導入された任意のギャップは、参照配列の残基の総量の５０％超、４０％超、３０％超、２５％超、２０％超、１５％超または１０％超までの総量であり得る。特定の実施形態において、パーセンテージ配列同一性は、候補または参照配列に何らかのギャップを導入することなく（すなわち、ギャップのないアラインメントを使用して）決定される。パーセントアミノ酸配列の同一性を決定する目的のためのアラインメントは、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ  （ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウエアのような公的に利用可能なコンピュータソフトウエアを用いて、当業者の技術の範囲内で様々な方法で達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、配列をアラインメントするための適切なパラメータを決定することができる。
【００３３】
所定の参照ナトリウム利尿ペプチド、例えば、配列番号２３のアミノ酸配列を有するヒトＡＮＰと所与のパーセンテージの配列同一性を共有するナトリウム利尿ペプチドは、参照ナトリウム利尿ペプチドと比較して、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失および／または置換を含む１つ以上の突然変異を含み得る。本発明の教示によれば、前記欠失、付加および／または置換されたアミノ酸は、連続したアミノ酸であってもよく、または参照ナトリウム利尿ペプチド、例えば、配列番号２３のアミノ酸配列を有するヒトＡＮＰと所与のパーセンテージの配列同一性を共有するナトリウム利尿ペプチドのアミノ酸配列の長さにわたって散在していてもよい。ＤＮＡレベルでは、所与の参照ナトリウム利尿ペプチドと所与の配列同一性のパーセンテージを共有するナトリウム利尿ペプチドをコードする核酸配列は、遺伝暗号の縮重により、より大きな程度に異なる可能性がある。
【００３４】
本発明の教示によれば、参照ナトリウム利尿ペプチドとの所定のアミノ酸配列同一性が伴う限り、任意の数のアミノ酸を付加、欠失、および／または置換することができる。特定の実施形態において、規定されたアミノ酸配列同一性が、ナトリウム利尿ペプチド変異体に付随し、ナトリウム利尿ペプチド変異体は生物学的に活性である、すなわち、機能的ナトリウム利尿ペプチド変異体である。好適には、所与の参照ナトリウム利尿ペプチド、例えば、配列番号２３に見出されるアミノ酸配列を有するヒトＡＮＰと所与のパーセンテージの配列同一性を共有するナトリウム利尿ペプチドの生物学的活性は、上記アッセイで測定される参照ナトリウム利尿ペプチドと比較して、９０％未満、８０％未満、７０％未満、６０％未満、５０％未満、２５％未満または１０％未満低下する。
【００３５】
本明細書中で使用される用語「抗体」は、免疫グロブリン分子、特に二量体免疫グロブリン分子を意味することを意図しており、４つのポリペプチド鎖−２つの重鎖（Ｈ鎖）および２つの軽鎖（Ｌ鎖）から成り、これらは典型的にジスルフィド結合により相互に連結されている。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書中でＶＨと略す）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３の３つのドメインを含むことができる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（ここではＶＬと略す）および軽鎖定常領域から構成される。Ｌ鎖定常領域は一つのドメイン（ＣＬ）から構成される。ＶＨおよびＶＬ領域はさらに、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域に細分化され、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存された領域と散在する。各ＶＨおよびＶＬは、典型的には、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、それらは、例えば、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に、アミノ末端からカルボキシ末端まで配置される。
【００３６】
本明細書で使用される用語「相補性決定領域」（ＣＤＲ；例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）は、抗原結合に必要な抗体可変ドメインのアミノ酸残基を指し、その存在が抗原結合に必要である。各可変ドメインは、典型的には、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として同定される３つのＣＤＲ領域を有している。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔによって定義されるような「相補性決定領域」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の凡そ残基２４−３４（ＣＤＲＬ１）、残基５０−５６（ＣＤＲＬ２）および残基８９−９７（ＣＤＲＬ３）ならびに重鎖可変ドメイン中の残基３１−３５（ＣＤＲＨ２）および残基９５−１０２（ＣＤＲＨ３）；（Ｋａｂａｔら、Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｌｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ  ＭＤ（１９９１））由来のアミノ酸残基、および／または「超可変ループ」（例えば、軽鎖可変ドメイン中の凡そ残基２６−３２  （ＣＤＲＬ１），  ５０−５２  （ＣＤＲＬ２）および９１−９６（ＣＤＲＬ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２（ＣＤＲＨ１）、５３−５５（ＣＤＲＨ２）および９６−１０１（ＣＤＲＨ３）  （ＣｈｏｔｈｉａおよびＬｅｓｋ；  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １９６：  ９０１〜９１７（１９８７））由来のアミノ酸残基を含み得る。いくつかの例では、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従って定義されたＣＤＲ領域および超可変ループの両方からのアミノ酸を含むことができる。
【００３７】
それらの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に依存して、完全抗体は異なる「クラス」に割り当てることができる。ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要クラス、ならびにこれらのいくつかは「サブクラス」（イソタイプ）にさらに分けることができる。「抗体」という用語は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡおよびＩｇＹを含む任意の一次クラスの免疫グロブリン分子、ならびに天然から単離されるか、または組換え手段によって調製される任意のサブクラスを含み、本発明で使用するための好ましいクラスの免疫グロブリンはＩｇＧである。用語「抗体」はまた、抗体ＣＤＲ挿入を天然抗体で見出されるものと同じ活性結合コンホメーションに向けることができるような他のタンパク質スカホールドにもおよび、ここで、これらキメラ蛋白質で観察される標的抗原の結合は、当該ＣＤＲが由来する天然抗体の結合活性に比肩して維持されるものである。
【００３８】
本発明の文脈において、抗体／免疫グロブリンの用語「断片」は、少なくとも１つのＣＤＲ領域を含む抗体／免疫グロブリンの任意の部分を指す。特に、本発明による抗体断片は、その中に取り込まれた生物学的に活性なペプチド、好ましくはナトリウム利尿ペプチドの血清半減期を増加させる能力を保持する。本発明による抗体断片には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、およびＦｖ断片；ジアボディ；単一ドメイン抗体（Ｄａｂ）；線状抗体；単一鎖抗体分子（ｓｃＦｖ）；およびジスルフィド安定化Ｆｖ抗体断片（ｄｓＦｖ）；ならびに抗体断片およびＶＬまたはＶＨドメインを含む断片から形成された多特異的抗体が含まれ、これらは完全な免疫グロブリンから調製されるか、または組換え手段によって調製される。
【００３９】
Ｆ（ａｂ’）２またはＦａｂは、ＣＨ１ドメインとＣＬドメインの間に起こる分子間ジスルフィド相互作用を最小限にするか、完全に除去するように操作され得る。本発明による抗体断片は、可変領域を単独で、またはヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＬドメインの全体または一部と組み合わせて含むことができる。また、ヒンジ領域、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３およびＣＬドメインを有する可変領域の任意の組合せを含む抗体断片も含まれる。
【００４０】
抗体またはその断片は、その中に取り込まれたナトリウム利尿ペプチドに安定性を付与するスカホールドを構成する。例えば、本明細書に記載される抗体のＣＤＲ領域内に取り込まれたナトリウム利尿ペプチドの血清半減期は、天然に存在するナトリウム利尿ペプチドの半減期と比較して増加し得る。
【００４１】
主として、ナトリウム利尿ペプチドを含む異種性アミノ酸配列は、任意の免疫グロブリン分子またはその断片内に取り込まれ得る。特に、任意の種（ヒト、ウシ、ネズミ、ラット、ブタ、イヌ、サメ、ラマおよびラクダを含むがこれらに限定されない）の免疫グロブリン、ならびに任意の一次クラスおよびサブクラスを本発明に従って使用することができる。しかしながら、治療的使用のためには、ヒト抗体またはヒト化抗体が望ましい。本発明の文脈の中で、用語「ヒト抗体」とは、ヒト免疫グロブリンのアミノ酸配列を有する抗体を指し、ヒト免疫グロブリンライブラリーから単離された抗体、ヒトＢ細胞から単離された抗体、または１以上のヒト免疫グロブリンならびに合成ヒト抗体に対してトランスジェニックな動物から単離された抗体を含む。特定の実施形態では、可変ドメインのアミノ酸軽鎖および重鎖配列は、それぞれヒト生殖細胞系配列ＬＶ  １−４０およびＨＶ  ３−２３に由来する（詳しい情報については実施例１を参照のこと）。
【００４２】
本発明の文脈内で、「ヒト化抗体」または「ヒト化抗体断片」という用語は、（ｉ）ヒト生殖細胞系配列に基づく抗体、または（ｉｉ）ヒト以外の源（例えば、異種免疫系を有するトランスジェニックマウス）に由来する抗体またはその断片を指し、抗体はヒト生殖細胞系配列に基づく；または（ｉｉ）キメラであり、ここで、可変ドメインは非ヒト由来に由来し、そして定常ドメインはヒト由来に由来するか、または（ｉｉｉ）  ＣＤＲ移植され、ここで、可変ドメインのＣＤＲは非ヒト由来であり、一方、可変ドメインの１つ以上のフレームワークはヒト由来であり、定常ドメイン（もしあれば）はヒト由来である。
【００４３】
本発明による抗体またはその断片は、単一特異性、二重特異性、三重特異性、またはより大きな多重特異性であり得る。
【００４４】
本発明の文脈において、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「〜を含むが、これに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｉｇ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」を意味する。この用語は、任意の記載された特徴、要素、整数、ステップまたは構成要素の存在を明記するように意図されているが、１つ以上の他の特徴、要素、整数、ステップ、構成要素またはそれらの群の存在または追加を排除しないように意図されている。「含む」という用語は、したがって、より限定的な用語「からなる」および「本質的にからなる」を含む。１つの実施形態において、この用語は、本願明細書において、特にクレームにおいて使用される場合に、用語「からなる」に置換され得る。
【００４５】
本発明との関連では、「約（ａｂｏｕｔ）」または「凡そ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、８０％〜１２０％以内を意味し、代替的には、与えられた値の９５％〜１０５％以内を含む９０％〜１１０％以内を意味する。
【００４６】
本発明による抗体またはその断片では、ａ）少なくとも１２個のアミノ酸残基が、
ｉ）  ＣＤＲＨ１内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ２５  （配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｓ２５に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基の間；
ｉｉ）  ＣＤＲＨ２内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５１（配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｉ５１に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基の間；
ｉｉｉ）  ＣＤＲＨ３内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ９２（配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｃ９６に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基の間；
ｉｖ）  ＣＤＲＬ１内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ２６  （配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これはｒｅｓ  Ｓ２５に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基の間；
ｖ）    ＣＤＲＬ２内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ４９（配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これはｒｅｓ  Ｙ５１に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基の間；および／または
ｖｉ）    ＣＤＲＬ３内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ８８（配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これはｒｅｓ  Ｃ９０に相当する）とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基の間；
に存在し、
ｂ）ナトリウム利尿ペプチドの最後のアミノ酸残基と
ｉ）  ＣＤＲＨ１内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ３５ａ  （配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｍ３４に相当する）の間；
ｉｉ）  ＣＤＲＨ２内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５７（配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｔ５８に相当する）の間；
ｉｉｉ）  ＣＤＲＨ３内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔ  によるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ１０６  （配列番号６５のアミノ酸配列を有する重鎖において、これはｒｅｓ  Ｇ１１１に相当する）の間；
ｉｖ）    ＣＤＲＬ１内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ  ３２（配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これはｒｅｓ  Ｄ３４に相当する）の間；
ｖ）  ＣＤＲＬ２内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ５７（配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これはｒｅｓ  Ｇ５９に相当する）の間；および／または
ｖｉ）  ＣＤＲＬ３内への異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ９８（配列番号６６のアミノ酸配列を有する軽鎖において、これはｒｅｓ  Ｆ１０２に対応する）の間
に少なくとも９個のアミノ酸残基が存在する。
【００４７】
上記のアミノ酸残基の名称は、異種性アミノ酸配列の取り込み前の元の免疫グロブリン分子中のアミノ酸位置を指す。本発明の文脈の中で、上記のアミノ酸残基は「参照アミノ酸」または「参照ａａ」と称される。これらの参照アミノ酸残基は、ＣＤＲフレームワーク接合部またはその近傍に存在するが、必ずしも標準的なＣＤＲ境界の定義に対応しているわけではない（標準的なＣＤＲ境界の定義は、ＣＤＲＨ１ではアミノ酸残基Ｓ２５とＷ３６；ＣＤＲＨ２ではＳ４９とＲ６７；ＣＤＲＨ３ではＫ９８とＷ１０８；ＣＤＲＬ１ではＣ２２とＷ３７；ＣＤＲＬ２ではＹ５１とＧ５９；ＣＤＲＬ３ではＣ９０とＦ１０２である。；ＪａｒａｓｃｈおよびＳｋｅｒｒａ，  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ２０１７  Ｊａｎ；  ８５（１）：６５−７１）。
【００４８】
挿入されたナトリウム利尿ペプチドからの最隣接参照ａａ  Ｎ末端＋前記参照ａａと挿入されたナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基との間に存在するアミノ酸伸長は、本明細書では「Ｎ末端配列」と呼ばれる。Ｎ末端配列はＮｔｌｓを含む。特定の実施形態では、Ｎ末端配列は、Ｎｔｌｓに隣接するＮ末端参照ａａを加えたものからなる。
【００４９】
挿入されたナトリウム利尿ペプチドの最後のアミノ酸残基と、挿入されたナトリウム利尿ペプチドに加えて前記参照ａａからの最も近接する参照ａａ  Ｃ末端との間に存在するアミノ酸伸長は、本明細書では「Ｃ末端配列」と呼ばれる。Ｃ末端配列はＣｔｌｓを含む。特定の実施形態では、Ｃ末端配列は、Ｃｔｌｓに隣接するＣ末端参照ａａを加えたものからなる。
【００５０】
特定の実施形態では、Ｎｔｌｓは、ＧＳリンカー配列；ＰＮリンカー配列；ヒトＩｇＧ抗体骨格の一部またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特にヒトＩｇＧ抗体のｆａｂドメイン骨格の一部またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特に配列番号１、２または４のいずれか１つの配列、または配列番号１、２または４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列；  配列番号  ６、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９または２１のいずれか１つの配列；または少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を共有する配列を含む。Ｎｔｌｓはまた、上記のアミノ酸配列の任意の組合せを含んでもよい。
【００５１】
特にそのような態様において、Ｎｔｌｓは、ＧＳリンカー配列；ＰＮリンカー配列；ヒトＩｇＧ抗体足場の一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特にヒトＩｇＧ抗体のファブドメイン足場の一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、より具体的には配列番号１、２もしくは４のいずれか１つの配列、または配列番号１、２もしくは４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列；配列番号６、７、９、１１、１３、１５もしくは２１のいずれか１つの配列；少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を配列番号６、７、９、１１、１３、１５もしくは２１のいずれか１つと共有する配列；またはそれらの任意の組合せを含む。
【００５２】
特定の実施形態では、Ｃｔｌｓは、ＧＳリンカー配列；ＰＮリンカー配列；ヒトＩｇＧ抗体骨格の一部またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特にヒトＩｇＧ抗体のｆａｂドメイン骨格の一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特に配列番号１、３または５のいずれか１つの配列、または配列番号１、３または５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列；  配列番号６、８、１０、１２、１４、１５、１７、１８、１９、２０または２２のいずれか１つの配列；または少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を共有する配列を含む。Ｃｔｌｓはまた、上記のアミノ酸配列の任意の組合せを含んでもよい。
【００５３】
特定の実施形態では、Ｃｔｌｓは、ＧＳリンカー配列；ＰＮリンカー配列；ヒトＩｇＧ抗体足場の一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特にヒトＩｇＧ抗体のＦａｂドメイン足場の一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、より具体的には配列番号１、３もしくは５のいずれか１つの配列、または配列番号１、３もしくは５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列；配列番号６、８、１０、１２、１４、１５、２０もしくは２２のいずれか１つの配列；少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を配列番号６、８、１０、１２、１４、１５、２０もしくは２２のいずれか１つと共有する配列；またはそれらの任意の組合せを含む。
【００５４】
特定の実施形態では、Ｎｔｌｓおよび／またはＣｔｌｓに含まれる配列と、配列番号１〜２２のいずれか１つとの間の配列同一性は、少なくとも６０％、特に少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％である。
【００５５】
本発明の文脈の中で、「ＧＳリンカー配列」という用語は、主にグリシンおよびセリン残基を含むペプチドリンカーを指す。特に、本発明によるＧＳリンカー配列のアミノ酸残基の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％は、グリシンおよびセリン残基から選択される。本発明によるＧＳリンカー配列は、例えば、合計で１〜３０個のアミノ酸残基を含み得る。特に、本発明によるＧＳリンカー配列は、グリシンまたはセリン以外の３、２または１個を超えるアミノ酸残基を含まない。
【００５６】
本発明の文脈において、用語「ＰＮリンカー配列」は、主にプロリンおよびアスパラギン残基を含むペプチドリンカーを指す。特に、本発明によるＰＮリンカー配列のアミノ酸残基の少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％または１００％は、プロリンおよびアスパラギン残基から選択される。本発明によるＰＮリンカー配列は、例えば、合計で１〜３０個のアミノ酸残基を含むことができる。特に、本発明によるＰＮリンカー配列は、プロリンまたはアスパラギン以外の３、２または１個を超えるアミノ酸残基を含まない。本発明によるＰＮリンカー配列中に存在し得る他のアミノ酸残基は、例えばリジンまたはグルタミン酸残基である。
【００５７】
具体的な実施形態では、リンカー配列は、Ｎｔｌｓおよび／またはＣｔｌｓに含まれ、ＧＳリンカー配列；ＰＮリンカー配列；ヒトＩｇＧ抗体スキャフォールドリンカー配列；ヒトＩｇＧファブドメインスキャフォールド配列；ヒトＩｇＧ抗体スキャフォールドリンカー配列、ヒトＩｇＧ  Ｆａｂドメインスキャフォールド配列または配列番号１〜５のいずれか１つの配列と少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列；および配列番号６〜２２のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を共有する配列は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基を含む。Ｎｔｌｓおよび／またはＣｔｌｓに含まれるリンカー配列は、例えば、最大３０、２８、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０個のアミノ酸残基を含むことができる。
【００５８】
ヒトＩｇＧ抗体スカホールドの配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を含むリンカーの場合、異種性アミノ酸配列が組み込まれるＣＤＲに隣接するスカホールド領域の配列を使用することが特に有利であり得る。例えば、Ｎｔｌｓおよび／またはＣｔｌｓは、異種性アミノ酸配列がＣＤＲＨ２ドメイン内に取り込まれる場合にフレームワーク領域ＦＲＨ２またはＦＲＨ３の一部であるアミノ酸配列を含むリンカーを含み得る。同様に、Ｎｔｌｓおよび／またはＣｔｌｓは、異種性アミノ酸配列がＣＤＲＬ２領域内に取り込まれる場合にフレームワーク領域ＦＲＬ２またはＦＲＬ３の一部であるアミノ酸配列を含むリンカーを含み得る。
【００５９】
特定の実施形態では、Ｎｔｌｓは、ＧＳリンカー配列；ＰＮリンカー配列；ヒトＩｇＧ抗体足場の一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特にヒトＩｇＧ抗体のＦａｂドメイン足場の一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、より具体的には配列番号１、２もしくは４のいずれか１つの配列、または配列番号１、２もしくは４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列；配列番号６、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９もしくは２１のいずれか１つの配列；少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を配列番号６、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９もしくは２１のいずれか１つと共有する配列；またはそれらの任意の組合せからなる。
【００６０】
特定の実施形態では、Ｃｔｌｓは、ＧＳリンカー配列；ＰＮリンカー配列；ヒトＩｇＧ抗体骨格の一部またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特にヒトＩｇＧ抗体のＦａｂドメイン骨格の一部またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列であるアミノ酸配列、特に配列番号１、３または５のいずれか１つの配列と少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列；  配列番号６、８、１０、１２、１４、１５、１７、１８、１９、２０または２２のいずれか１つの配列；少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を共有する配列；  配列番号６、８、１０、１２、１４、１５、１７、１８、１９、２０または２２のいずれか１つ；またはそのいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を共有する配列からなる。
【００６１】
特定の実施形態では、ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓの両方は、上記のリンカー配列の少なくとも１つ、またはそれらの任意の組合せを含む。原則として、上記のＮｔｌｓリンカー配列のいずれかを、上記のＣｔｌｓリンカー配列のいずれかと組み合わせることができる。特に、任意のリンカー配列をＧＳリンカーと組み合わせることができる。非限定的な例として、ＧＳ  Ｃｔｌｓリンカーは、配列番号６、９または１５のいずれか１つの配列を含むＮｔｌｓリンカー、または配列番号６、９または１５のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を共有する配列と結合され得る。さらに非限定的な例は、配列番号１５の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を共有する配列を含むＣｔｌｓリンカーと結合したＧＳ  Ｎｔｌｓリンカーである。
【００６２】
上記のリンカー配列は、Ｎ末端およびＣ末端隣接配列の十分な全長を考慮すると、良好なナトリウム利尿ペプチド活性を達成するために特に有利であることが証明されている。理論に拘束されることを望まないが、上記のリンカーペプチド伸長は、立体障害を最小限に抑えて、生物学的に活性なナトリウム利尿ペプチドをそのそれぞれの受容体に提示する際に、システムの好ましい状態に寄与するコンホメーション／フォールディングをもたらすと考えられる。
【００６３】
特定の実施形態では、ｉ）ＮｔｌｓはＧＳリンカー配列；ＰＮリンカー配列；配列番号２、４、９、１１、１３または１５の配列；配列番号２、４、９、１１、１３または１５と少なくとも６０％の配列同一性を共有する配列；またはそれらの任意の組合せ；およびｉｉ）ＣｔｌｓはＧＳリンカー配列；ＰＮリンカー配列；配列番号３、５、１２、１４、１５または２０の配列；配列番号３、５、１２、１４、１５または２０と少なくとも６０％の配列同一性を共有する配列；またはそれらの任意の組合せを含む。これらのリンカー配列は、高いナトリウム利尿ペプチド活性を達成するだけでなく、組換え発現において良好な発現レベルを達成し、発現時にタンパク質断片化を起こしにくいことから、特に有用であることが証明されている（表９参照）。
【００６４】
特定の実施形態では、ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓはそれぞれＧＳリンカー配列を含み；ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓはそれぞれPNリンカー配列を含み；ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓはそれぞれ、ヒトＩｇＧ抗体スカホールドの一部またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特に、ヒトIgG抗体のfabドメインスカホールドの一部またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列であるアミノ酸配列を含み、より特に、Ｎｔｌｓは、配列番号１、２または４のいずれか１つの配列または配列番号１、２または４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を含み、Ｃｔｌｓは配列番号１、３または５のいずれか１つの配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を含み；ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓはそれぞれ、配列番号６の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を共有する配列を含み；Ｎｔｌｓは、配列番号７の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは、配列番号８の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは、配列番号９の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは、配列番号１０の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは、配列番号１１の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは、配列番号１２の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは、配列番号１３の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは、配列番号１４の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；ＮｔｌｓとＣｔｌｓは、それぞれ、配列番号１５の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは、配列番号１６の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは、配列番号１７の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは、配列番号１７の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは、配列番号１８の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓは、それぞれ、配列番号１９の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは、配列番号９の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは、配列番号２０の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；または、Ｎｔｌｓは、配列番号２１の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは、配列番号２２の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００６５】
このような実施形態では、ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓはそれぞれＧＳリンカー配列を含み；ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓはそれぞれPNリンカー配列を含み；ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓはそれぞれ、ヒトＩｇＧ抗体スカホールドの一部またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特に、ヒトIgG抗体のfabドメインスカホールドの一部またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列のアミノ酸配列を含み、より特に、Ｎｔｌｓは配列番号１、２または４のいずれか１つの配列または配列番号１、２または４のいずれか１つの配列のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号１、３または５のいずれか１つの配列または配列番号１、３または５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列を含み；ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓはそれぞれ、配列番号６の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは配列番号７の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号８の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは配列番号９の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号１０の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは配列番号１１の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号１２の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは配列番号１３の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号１４の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓは、それぞれ、配列番号１５の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；
Ｎｔｌｓは配列番号９の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号２０の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；または、Ｎｔｌｓは配列番号２１の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号２２の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み。
【００６６】
具体的には、ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓはそれぞれＧＳリンカー配列を含み；ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓはそれぞれＰＮリンカー配列を含み；Ｎｔｌｓは配列番号２の配列またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号３の配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは配列番号４の配列またはそれらと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号５の配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列を含み；
Ｎｔｌｓは配列番号１１の配列またはそれらと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号１２の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；Ｎｔｌｓは配列番号１３の配列またはそれらと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号１４の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓは、それぞれ、配列番号１５の配列またはそれらと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み；または、Ｎｔｌｓは配列番号９の配列またはそれらと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ、Ｃｔｌｓは配列番号２０の配列またはそれと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列を含む。これらのリンカーの組合せは、表９に示されるように、高いナトリウム利尿ペプチド活性、組換え発現における良好な発現レベルおよび最小または無タンパク質断片化を達成するために特に有用であることが証明されている。
【００６７】
特定の実施形態では、Ｎｔｌｓは、そのＣ末端にアンカーエレメントＡ１をさらに含み、および／またはＣｔｌｓは、そのＮ末端にアンカーエレメントＡ２をさらに含み、ここで、Ａ１およびＡ２は、主にグリシンおよびセリン残基を含む。特定の実施形態において、Ａ１および／またはＡ２は、少なくとも１、２、３、４、または５アミノ酸残基を含む。Ａ１および／またはＡ２は、合計で１０、９、８、７、６または５までのアミノ酸残基を含み得る。特定の実施形態では、Ａ１および／またはＡ２のアミノ酸残基の少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、または１００％は、グリシンおよびセリン残基から選択される。特にＡ１および／またはＡ２は、グリシンまたはセリン以外の３、２または１個を超えるアミノ酸残基を含まない。
【００６８】
特定の実施形態において、Ｎｔｌｓは、ｉ）そのＣ末端におけるアンカーエレメントＡ１およびｉｉ）ＧＳリンカー配列；ＰＮリンカー配列；ヒトＩｇＧ抗体スカホールドの一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特にヒトＩｇＧ抗体のｆａｂドメインスカホールドの一部であるアミノ酸配列またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、より詳細には配列番号１、２または４のいずれか１つの配列または配列番号１、２または４のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；配列番号６、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９または２１のいずれか１つの配列；配列番号６、７、９、１１、１３、１５、１６、１７、１９または２１のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；またはそれらの任意の組み合わせ、からなる。
【００６９】
特定の実施形態では、Ｃｔｌｓは、ｉ）そのＮ末端のアンカーエレメントＡ２およびｉｉ）ＧＳリンカー配列；ＰＮリンカー配列；ヒトＩｇＧ抗体スカホールドの一部またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列、特に、ヒトＩｇＧ抗体のｆａｂドメインスカホールドの一部またはそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有する配列であるアミノ酸配列、特に、配列番号１、３または５のいずれか１つの配列または配列番号１、３または５のいずれか１つと少なくとも８０％の配列同一性を有する配列；  配列番号６、８、１０、１２、１４、１５、１７、１８、１９、２０または２２のいずれか１つの配列；  配列番号６、１０、１２、１５、１７、１８、１９、２０または２２のいずれか１つと少なくとも６０％の配列同一性を有する配列；またはそれらの任意の組み合わせ、からなる。
【００７０】
特定の実施形態では、Ｎｔｌｓおよび／またはＣｔｌｓは、総数で少なくとも３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸残基を含む。Ｎｔｌｓおよび／またはＣｔｌｓは、例えば、総数で３０、２８、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１または１０個までのアミノ酸残基を含むことができる。
【００７１】
特定の実施形態では、
ｉ）    ＣＤＲＨ１内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ２５とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基；
ｉｉ）    ＣＤＲＨ２内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５１とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基；
ｉｉｉ）    ＣＤＲＨ３内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ９２とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基；
ｉｖ）    ＣＤＲＬ１内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ２とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基；
ｖ）    ＣＤＲＬ２内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ４９とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基；および／または
ｖｉ）    ＣＤＲＬ３内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ８８とナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸残基
の間に存在するアミノ酸伸長は、配列番号２６〜３８のいずれか１つの配列、または配列番号２６〜３８のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。
【００７２】
特定の実施形態では、ナトリウム利尿ペプチドの最後のアミノ酸残基と
ｉ）  ＣＤＲＨ１内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ３５ａの間；
ｉｉ）  ＣＤＲＨ２内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５７の間；
ｉｉｉ）  ＣＤＲＨ３内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、ＫａｂａｔによるＨＣ  ｒｅｓ１０６の間；
ｉｖ）  ＣＤＲＬ１内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、ＫａｂａｔによるＬＣ  ｒｅｓ  ３２の間；
ｖ）  ＣＤＲＬ２内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、ＫａｂａｔによるＬＣ  ｒｅｓ５７の間；および／または
ｖｉ）  ＣＤＲＬ３内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、ＫａｂａｔによるＬＣ  ｒｅｓ９８
の間に存在するアミノ酸伸長は、配列番号  ３９〜５１のいずれか１つの配列、または配列番号  ３９〜５１のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。
【００７３】
特定の実施形態では、異種性アミノ酸配列は、Ｎｔｌｓ、ナトリウム利尿ペプチドおよびＣｔｌｓからなる。
【００７４】
特定の実施形態では、
ｉ）  ＣＤＲＨ１内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ２５とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ３５ａの間；
ｉｉ）  ＣＤＲＨ２内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５１とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ５７の間；
ｉｉｉ）  ＣＤＲＨ３内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ９２とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＨＣ  ｒｅｓ１０６の間；
ｉｖ）  ＣＤＲＬ１内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ２６とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ  ３２の間；
ｖ）  ＣＤＲＬ２内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ４９とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ５７の間；および／または
ｖｉ）  ＣＤＲＬ３内への前記異種性アミノ酸配列の取り込みの場合には、Ｋａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ８８とＫａｂａｔによるアミノ酸残基ＬＣ  ｒｅｓ９８の間、
に存在するアミノ酸伸長は、配列番号５２〜６４のいずれか１つの配列、または配列番号５２〜６４のいずれか１つと少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、または少なくとも９８％の配列同一性を有する配列を含む。
【００７５】
特定の態様において、抗体またはその断片は、少なくとも２つのナトリウム利尿ペプチドを含む。特定の実施形態では、両ナトリウム利尿ペプチドは、ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓをさらに含む異種性アミノ酸配列中に含まれ、本明細書に記載されるように、該抗体またはその断片のＣＤＲ領域内に取り込まれる。少なくとも２つのナトリウム利尿ペプチドは、２つの軽鎖または２つの重鎖の２つの対応するＣＤＲ領域内に取り込まれ得るか、または少なくとも２つのナトリウム利尿ペプチドは、２つの別々のＣＤＲ領域内に取り込まれ得る。少なくとも２つのナトリウム利尿ペプチドは同一であっても異なっていてもよい。そのような具体例において、抗体またはその断片は、少なくとも２つのＣＤＲ領域内に取り込まれる少なくとも２つの異なるナトリウム利尿ペプチドを含む。
【００７６】
抗体分子の二量体構造のために、免疫グロブリン分子の軽鎖または重鎖のいずれかをコードする核酸への異種性アミノ酸配列（Ｎｔｌｓ−ナトリウム利尿ペプチド−Ｃｔｌｓ）をコードする１つの核酸配列の挿入は、典型的には、２つの同一の軽鎖または２つの同一の重鎖の対応するＣＤＲ領域に位置する２つのナトリウム利尿ペプチドを担持する抗体タンパク質を生じる。しかしながら、核酸をコードする２つのナトリウム利尿ペプチドを、軽鎖および／または重鎖をコードする核酸配列の２つの異なるＣＤＲコード領域に挿入し、それによって二量体抗体の２つの対応するＣＤＲ対に位置する４つのナトリウム利尿ペプチドを有する抗体分子を得ることもまた想定される。また、Ｌ鎖および／またはＨ鎖が同一でない二量体免疫グロブリン分子も包含される。例えば、単一のナトリウム利尿ペプチドを担持する二量体抗体、ならびに２つのＬ鎖または２つのＨ鎖の２つの対応するＣＤＲ領域に２つの異なるナトリウム利尿ペプチドを担持する二量体抗体を包含する。
【００７７】
特定の実施形態では、ナトリウム利尿ペプチドは、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ２、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＨ３、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＨ３、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＬ１、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＬ２、ＣＤＲＨ１およびＣＤＲＬ３、ＣＤＲＨ２およびＣＤＲＬ１、またはＣＤＲＨ２およびＣＤＲＬ２に挿入される。特定の実施形態では、抗体またはその断片は、１つのＡＮＰおよび１つのＢＮＰ分子；１つのＡＮＰおよび１つのＣＮＰ分子；または１つのＢＮＰおよび１つのＣＮＰ分子を含む。
【００７８】
特定の実施形態では、ナトリウム利尿ペプチドは、抗体またはその断片の少なくとも１つのＣＤＲ領域内に取り込まれた少なくとも１つの異種性アミノ酸配列中に含まれ、抗体またはその断片はＡＮＰであり、抗体またはその断片は少なくとも１つのさらなるナトリウム利尿ペプチドを含む。特定の実施形態では、少なくとも１つのさらなるナトリウム利尿ペプチドはまた、ＮｔｌｓおよびＣｔｌｓをさらに含み、抗体またはその断片のＣＤＲ領域内に取り込まれた異種性アミノ酸配列中に含まれる。特定の実施形態では、ＡＮＰおよび少なくとも１つのさらなるナトリウム利尿ペプチドは、抗体またはその断片の２つの軽鎖または２つの重鎖のいずれかの２つの対応するＣＤＲ領域内に取り込まれる。特に他の実施形態では、ＡＮＰおよび少なくとも１つのさらなるナトリウム利尿ペプチドは、少なくとも２つの別々のＣＤＲ領域内に取り込まれる。特に、前記少なくとも１つのさらなるナトリウム利尿ペプチドは、ＡＮＰ、ＢＮＰおよびＣＮＰから選択され、より詳細にはＢＮＰおよびＣＮＰから選択される。
【００７９】
配列番号６５の配列を有する２つの重鎖と配列番号６６の配列を有する２つの軽鎖から構成されるナトリウム利尿ペプチドを含む異種性アミノ酸配列を有しない「空の」抗体分子は、ＴＰＰ−５６５７と呼ばれる。特定の実施形態では、配列番号６５の配列を有する２つの重鎖、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、および配列番号６６の配列を有する２つの軽鎖、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から構成される抗体分子は、ナトリウム利尿ペプチドを含む異種性アミノ酸配列が組み込まれる初期または親抗体として役立つ。このような具体例において、ナトリウム利尿ペプチドを含む異種性アミノ酸配列は、このような抗体分子の一方または両方の重鎖のＣＤＲ領域内に取り込まれる。
【００８０】
そのような具体例において、そのＣＤＲ地域の少なくとも１つ内に取り込まれた少なくとも１つの異種性アミノ酸配列を含む重鎖は、配列番号６７〜７９のいずれか１つの配列、または配列番号６７〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する。特定の実施形態では、本発明による抗体は、配列番号６７〜７９のいずれか１つの配列を有する２つの同一の重鎖、または配列番号６７〜７９のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、および配列番号６６の配列を有する２つの同一の軽鎖、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から構成される。
【００８１】
特に他の実施形態では、ナトリウム利尿ペプチドを含む異種性アミノ酸配列は、そのような抗体分子の一方または両方の軽鎖のＣＤＲ領域内に取り込まれる。特定の当該実施態様において、そのＣＤＲ領域のうちの少なくとも１つ内に組み込まれた少なくとも１つの異種性アミノ酸配列を含む軽鎖は、配列番号８０または８１のうちのいずれか１つと、配列番号８０または８１のうちのいずれか１つと、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を有する。特定の実施形態において、本発明による抗体は、配列番号８０または８１のいずれか１つの配列を有する２つの同一の軽鎖、または配列番号８０または８１のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列、および配列番号６５の配列を有する２つの同一の重鎖、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列から構成される。
【００８２】
以下の表は、本発明による例示的抗体の重鎖および軽鎖組成を示す。
表1:例示的なナトリウム利尿ペプチド移植抗体構築物
【表１】
2021520801.tif 000003
【００８３】
本発明の抗体またはその断片には、天然に存在する精製産物、化学合成手順の産物、および組換え技術により産生される産物が含まれる。その起源に応じて、本発明による抗体またはその断片は、グリコシル化または非グリコシル化され得る。
【００８４】
例えば、標準的な組換えＤＮＡ方法を使用して、重鎖および軽鎖をコードする核酸を調製および／または取得し、これらの核酸を発現ベクターに組み込み、そして組換え発現のためにベクターを宿主細胞に導入し得る（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ＦｒｉｔｓｃｈおよびＭａｎｉａｔｉｓ  （編），  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ；  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，  Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ（１９８９）；  Ａｕｓｕｂｅｌ，  Ｆ．  Ｍ．ら（編）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，  Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，  （１９８９）；  Ｇｏｅｄｄｅｌ，  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５（１９９０）；  およびＵＳ  ４，８１６，３９７  ｂｙ  Ｂｏｓｓ  ｅｔ  ａｌ．）
【００８５】
したがって、第２の局面において、本発明は、本発明による抗体またはその断片をコードする核酸または核酸の混合物に関する。これらの核酸配列は、哺乳動物発現のための特定の場合に最適化され得る。本発明のＤＮＡ分子は、本明細書に開示される配列に限定されるものではなく、その変異体も含む。
【００８６】
本発明はさらに、本発明による核酸配列の１つ以上を含む組換え核酸構築物を提供する。本発明による組換え核酸構築物は、例えば、本発明による抗体またはその断片をコードする核酸分子が挿入されたプラスミドのような核酸ベクターを含むことができる。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計は、宿主細胞の選択、所望のタンパク質発現レベル、および構成的または誘導的な発現が望まれるかどうかのような因子によって影響を受けることが理解される。
【００８７】
細菌使用のための有用な発現ベクターは、機能的プロモーターを有する作動可能な読み取り相における適当な翻訳開始および終止シグナルと共に、本発明による１つ以上の核酸配列を挿入することによって構築され得る。細菌発現ベクターは、典型的には、ベクターの維持を確実にし、望ましい場合には細菌宿主内で増幅を提供するために、１以上の表現型選択マーカーおよび複製起点を含む。細菌発現ベクターは、周知のクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ  ３７０１７）のような市販のプラスミドに由来する要素を含み得る。多くの細菌発現ベクターは、発現された抗体またはその断片の使用目的に応じて有利に選択され得る。例えば、このような抗体の大量が望まれる場合、容易に精製される抗体融合タンパク質の高レベル発現を媒介するベクターが望ましいと考えられる。
【００８８】
真核生物宿主細胞における抗体発現を意図した組換え核酸構築物は、真核生物細胞、好ましくはプロモーターおよびポリアデニル化シグナルにおけるオープンリーディングフレームの発現を制御することができる調節配列を含み得る。プロモーターおよびポリアデニル化シグナルは、好ましくは、抗体発現を意図する特定の細胞型内で機能的であるように選択される。適当なプロモーターの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのプロモーター、例えば、強力なＣＭＶ即初期プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えば、ＨＩＶ長期反復（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマおよびＲｏｕｓ  Ｓａｒｃｏｍａ  Ｖｉｒｕｓ  （ＲＳＶ）からのプロモーター、ＣＭＶ初期エンハンサー要素、プロモーター、ニワトリβアクチン遺伝子の第１エクソンおよび第１イントロンならびにウサギβグロビン遺伝子のスプライスアクセプターからなる合成ＣＡＧプロモーター、ならびにアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋クレアチンおよびメタロチオネインなどの哺乳動物遺伝子からのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、真核生物発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含む。本発明の文脈において、「ＣＭＶプロモーター」という用語は、強力な即初期サイトメガロウイルスプロモーターを指す。
【００８９】
適当なポリアデニル化シグナルの例としては、ウシ成長ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナルおよびＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９０】
さらに、組換え核酸配列は、１つ以上のエンハンサー配列を含むことができる。エンハンサーは、例えば、哺乳動物アクチン、ミオシン、ヘモグロビン、筋クレアチンまたはウイルスエンハンサーのエンハンサー、例えば、ＣＭＶ、ＲＳＶ、ＳＶ４０またはＥＢＶからのエンハンサーであり得る。ウイルス調節エレメント、およびその配列のさらなる記述については、例えば、ＳｔｉｎｓｋｉによるＵＳ  ５，１６８，０６２、ＢｅｌｌらによるＵＳ  ４，５１０，２４５、およびＳｃｈａｆｆｎｅｒらによるＵＳ  ４，９６８，６１５を参照されたい。
【００９１】
調節配列およびコドンは一般に種依存性であるため、タンパク質産生を最大にするために、調節配列およびコドンは、抗体発現を意図した種／細胞型において有効であるように選択されることが望ましい。当業者は、所定の対象種において機能的である組換えＤＮＡ分子を産生することができる。
【００９２】
哺乳動物の組換え発現ベクターはまた、複製起点および選択マーカーを含むことができる（例えば、ＵＳ  ４，３９９，２１６、ＵＳ  ４，６３４，６６５およびＵＳ  ５，１７９，０１７を参照のこと）。適当な選択マーカーは、Ｇ４１８、ピューロマイシン、ヒグロマイシン、ブラスチシジン、ゼオシン／ブレオマイシンまたはメトトレキサートのような薬物またはベクターが導入された宿主細胞上のグルタミンシンテターゼのような栄養要求性を利用する選択マーカーに対する耐性を付与する遺伝子を含む。例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子はメトトレキサートに対する耐性を付与し、ｎｅｏ遺伝子はＧ４１８に対する耐性を付与し、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ由来のｂｓｄ遺伝子はブラスティシジンに対する耐性を付与し、ピューロマイシンＮ−アセチルトランスフェラーゼはピューロマイシンに対する耐性を付与し、Ｓｈ  ｂｌｅ遺伝子産物はゼオシンに対する耐性を付与し、ヒグロマイシンに対する耐性は大腸菌のヒグロマイシン耐性遺伝子（ｈｙｇまたはｈｐｈ）により付与される。ＤＨＦＲまたはＧｌｕｔａｍｉｎｅ  Ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅのような選択可能なマーカーは、ＭＴＸおよびＭＳＸと併用した増幅技術にも有用である。
【００９３】
いくつかの実施形態において、重鎖および軽鎖をコードする核酸配列は、別々のベクターに挿入される。他の実施形態では、重鎖および軽鎖をコードする核酸配列を同じベクターに挿入する。さらに、重鎖および／または軽鎖の可変領域をコードする核酸配列は、例えば、全長抗体鎖、Ｆａｂ断片をコードする核酸配列、またはｓｃＦｖに変換することができる。ＶＬまたはＶＨをコードするＤＮＡ断片は、（２つのＤＮＡ断片によってコードされるアミノ酸配列がフレーム内にあるように）、例えば抗体定常領域または柔軟性リンカーをコードする別のＤＮＡ断片に作動的に連結することができる。一例として、ｓｃＦｖをコードするポリヌクレオチド配列を作製するために、ＶＨおよびＶＬをコードする核酸は、ＶＨおよびＶＬ配列が、可撓性リンカーによって結合されたＶＬおよびＶＨ領域を伴って、連続する一本鎖タンパク質として発現され得るように、可撓性リンカーをコードする別の断片に作動可能に連結され得る（例えば、Ｂｉｒｄら（１９８８）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；  Ｈｕｓｔｏｎら（１９８８）  Ｐｒｏｃを参照のこと）。Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；  ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  （１９９０）  ３４８：５５２−５５４）。ヒト重鎖および軽鎖定常領域の配列は当技術分野で公知であり（例えば、Ｋａｂａｔ，  Ｅ．  Ａ．、ｅｌ．（１９９１）  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、第５版、Ｕ．Ｓ．  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ、ＮＩＨ出版物Ｎｏ．９１−３２４２）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片を標準的なＰＣＲ増幅により得ることができる。
【００９４】
特定の実施形態では、ナトリウム利尿ペプチドを含む異種性アミノ酸配列が組み込まれた重鎖をコードする核酸配列は、配列番号８２または８３のいずれか１つの配列、または配列番号８２または８３のいずれか１つと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％または少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。特定のこのような実施形態では、軽鎖をコードする核酸配列は、配列番号８４の配列、またはそれと少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％もしくは少なくとも９５％の配列同一性を有する配列を含む。
【００９５】
第３の局面において、本発明は、本発明による核酸または核酸の混合物を含む宿主細胞に関する。本発明の文脈の中で、用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養」は、互換的に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指し、宿主細胞は、「形質転換体」、「形質転換細胞」、「トランスフェクション細胞」、「トランスフェクション細胞」、および「形質導入細胞」を含み、それらは、継代数に関係なく、一次形質転換／トランスフェクション／形質導入細胞およびそれに由来する子孫を含む。子孫は、親細胞に対する核酸含量において完全に同一ではなくてもよく、構成される外因性核酸は突然変異を含んでいてもよい。本明細書には、元来形質転換された細胞においてスクリーニングされた、または選択されたのと同じ機能または生物学的活性を有する突然変異体子孫が含まれる。
【００９６】
宿主細胞への発現ベクターのトランスフェクションは、エレクトロポレーション、ヌクレオフェクション、カルシウム−リン酸沈殿、リポフェクション、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ベースのトランスフェクションおよびＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションのようなポリカチオンベースのトランスフェクションのような標準的な技術を用いて実施することができる。
【００９７】
適当な宿主細胞は、原核細胞および真核細胞を含む。原核生物宿主細胞の例は、例えば細菌であり、限定されるわけではないが、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、およびＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の種々の種を含む。
【００９８】
真核生物宿主細胞の非限定的な例としては、酵母、昆虫および昆虫細胞、植物および植物細胞、トランスジェニック動物および哺乳動物細胞が挙げられる。抗体発現のための適当な哺乳動物宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ（例えばＲ．  Ｊ．  ＫａｕｆｍａｎおよびＰ．  Ａ．  Ｓｈａｒｐ  （１９８２）  Ｍｏｌ．Biol．１５９：６０１−６２１に記載されたＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用される、ＵｒｌａｕｂおよびＣｈａｓｉｎ、（１９８０）  Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０およびＵｒｌａｕｂら、Ｃｅｌｌ．１９８３  Ｊｕｎ；３３（２）：４０５−１２、に記載されているｄｈｆｒＣＨＯ細胞；およびＦａｎら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ．２０１２  Ａｐｒ；１０９（４）：１００７−１５に例示される他のノックアウト細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３細胞、ＨＫＢ１１細胞、ＢＨＫ２１細胞、ＣＡＰ細胞、ＥＢ６６細胞およびＳＰ２細胞を含む。
【００９９】
発現はまた、ＨＥＫ２９３、ＨＥＫ２９３Ｔ、ＨＥＫ２９３−ＥＢＮＡ、ＨＥＫ２９３Ｅ、ＨＥＫ２９３−６Ｅ、ＨＥＫ２９３−Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、ＨＫＢ１１、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ、２９３ＥＢＮＡＬＴ７５、ＣＨＯ  Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ、ＣＨＯＥＢＮＡＬＴ８５、ＣＨＯＳ−ＸＥ、ＣＨＯ−３Ｅ７またはＣＡＰ−Ｔ細胞（例えば、Ｄｕｒｏｃｈｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２００２  Ｊａｎ  １５；３０（２）：Ｅ９）などの発現系において一過性または半安定であってもよい。
【０１００】
第４の局面において、本発明は、本発明に従う宿主細胞を培養することを含む、抗体またはその断片を産生するためのプロセスに関する。特に、本発明の宿主細胞は、抗体またはその断片の発現に適した条件下で培養される。
【０１０１】
抗体発現は、構成的であっても、調節されていてもよい（例えば、誘導性）。誘導性抗体発現のために、本発明による宿主細胞は、典型的には、適切な細胞密度まで増殖された後、適切な手段（例えば、温度シフトまたはテトラサイクリン系と組み合わせたテトラサイクリンのような小分子誘導物質の添加または除去のような化学的誘導）による選択されたプロモーターの脱抑制／誘導、および宿主細胞のさらなる期間の培養によって、選択されたプロモーターの脱抑制／誘導が起こる。
【０１０２】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片を産生するための工程は、宿主細胞培養物から抗体またはその断片を回収する工程をさらに含む。細胞は、例えば、遠心分離によって回収され、物理的または化学的手段によって破壊され、抗体またはその断片は、得られた粗抽出物からさらに精製され得る。いくつかの実施形態において、発現ベクターは、発現された抗体またはその断片が、宿主細胞が増殖される培地中に分泌されるように設計される。その場合、標準的なタンパク質精製法を用いて、抗体またはその断片を培地から直接回収することができる。
【０１０３】
特定の実施形態において、本発明による方法は、回収された抗体またはその断片を精製する工程をさらに含む。特に、抗体は、例えば分析クロマトグラフィーによって、またはＳＤＳ−キャピラリーゲル電気泳動（例えば、カリパーＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸＩＩ、ＧＸ  ９０またはバイオラッドバイオアナライザー装置上）によって、９０％を超えるように精製され、より詳細には、精製は、少なくとも約９２．５％、９５％、９８％または９９％の抗体均一性をもたらす；または代替的に、抗体は、（２）Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クーマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いる還元または非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによる均一性まで、精製される。
【０１０４】
本発明による抗体またはその断片は、硫酸アンモニウムまたはエタノール沈殿、酸抽出、プロテインＡクロマトグラフィー、プロテインＧクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、アニオンまたはカチオン交換クロマトグラフィー、ホスホ−セルロースクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィーおよびレクチンクロマトグラフィーを含むが、これらに限定されない、よく知られた方法により、組換え細胞培養物から回収および精製することができる。高速液体クロマトグラフィー（「ＨＰＬＣ」）は、精製にも使用することができる（例えば、Ｃｏｌｌｉｇａｎ、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、またはＣｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ、ＮＹ、Ｎ．Ｙ．、（１９９７〜２００１）、例えば、第１、４、６、８、９、１０章）。
【０１０５】
第５の局面において、本発明は、本発明による抗体またはその断片を含む組成物に関する。特に、本発明による組成物は、治療方法に使用するのに適した医薬組成物であり、本発明による抗体またはその断片は、意図された目的、すなわち特定の病態の予防または治療を達成するのに有効な量で含まれる。
【０１０６】
前記組成物は、任意に、少なくとも１つの薬学的に許容可能な賦形剤をさらに含む。本発明の文脈において、「賦形剤」という用語は、薬剤の活性成分と並んで処方される天然または合成物質を指す。適切な賦形剤は、付着防止剤、結合剤、結合剤、崩壊剤、香料、香料、潤滑剤、滑走剤、収着剤、保存剤および甘味剤を含む。薬学的に許容される賦形剤の具体例は、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストロース、および水を含むが、これらに限定されない。本発明の文脈において、「薬学的に許容される」という用語は、生理学的に許容され、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に典型的には好ましくない反応を生じない、医薬組成物の分子実体および他の成分を指す。「薬学的に許容される」という用語は、哺乳動物、およびより詳細にはヒトに使用するために連邦または州の規制当局によって承認されたか、または米国薬局方または他の一般的に認識されている薬局に列挙されている。
【０１０７】
本発明による組成物は、１つ以上のさらなる治療活性剤をさらに含み得る。
薬学的組成物は、溶液、懸濁液、腸溶コーティングされたカプセル、凍結乾燥粉末、または意図される使用に適した任意の他の形態であり得る。
【０１０８】
経口投与のための医薬組成物は、経口投与に適した用量で、当技術分野で周知の医薬上許容される賦形剤を使用して製剤化することができる。このような賦形剤は、医薬組成物が、患者による摂取のために、錠剤、丸剤、糖衣錠、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして製剤化されることを可能にする。
【０１０９】
経口使用のための医薬調製物は、活性化合物と固体賦形剤との組み合わせ、任意に得られた混合物を粉砕し、顆粒の混合物を処理することによって、所望であれば適切な助剤を添加した後に、錠剤または糖衣錠コアを得ることによって得ることができる。適切な賦形剤は、ラクトース、スクロース、マンニトール、またはソルビトールを含む糖類；トウモロコシ、小麦、イネ、ジャガイモ、または他の植物由来のデンプン；メチル−セルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、またはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース；およびアラビアおよびトラガカントを含むガム；ならびにゼラチンおよびコラーゲンなどのタンパク質などの炭水化物またはタンパク質充填剤である。所望であれば、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸、またはその塩、例えばアルギン酸ナトリウムなどの崩壊剤または可溶化剤を添加してもよい。
【０１１０】
糖衣錠コアには、濃縮糖液のような適切なコーティングを設けることができ、濃縮糖液には、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコールおよび／または二酸化チタン、ラッカー溶液、ならびに適切な有機溶媒または溶媒混合物が含まれていてもよい。色素または色素は、製品の同定のため、または活性化合物の量、すなわち投与量の特徴を明らかにするために、錠剤またはドラジーコーティングに添加することができる。
【０１１１】
経口的に使用できる薬学的製剤には、ゼラチンで作られたプッシュフィットカプセル、ならびにゼラチンおよびグリセロールまたはソルビトールのようなコーティングで作られた軟らかく密封されたカプセルが含まれる。プッシュフィットカプセルは、ラクトースまたはデンプンのような充填剤または結合剤、タルクまたはステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、および任意に安定剤と混合された活性成分を含むことができる。柔らかいカプセルでは、活性化合物は、安定剤があるなしにかかわらず、脂肪油、液体パラフィン、液体ポリエチレングリコールのような適切な液体に溶解或いは懸濁される。
【０１１２】
非経口投与用の医薬製剤には、治療活性剤の水溶液が含まれる。注射のために、本発明の医薬組成物は、水溶液中、好ましくは、ハンクス溶液、リンゲル溶液、または生理学的に緩衝化された生理食塩水などの生理学的に適合性の緩衝液中に製剤化され得る。水性注射懸濁液には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトールまたはデキストランなど、懸濁液の粘度を高める物質が含まれることがある。さらに、活性剤の懸濁液は、適当な油性注射懸濁液として調製することができる。好適な親脂性溶媒またはビヒクルにはゴマ油のような脂肪油、またはオレイン酸エチルまたはトリグリセリドのような合成脂肪酸エステル、またはリポソームが包含される。任意に、懸濁液はまた、高度に濃縮された溶液の調製を可能にするために、治療活性剤の溶解度を増加させる適切な安定剤または剤を含有してもよい。
【０１１３】
局所投与または経鼻投与では、浸透すべき特定のバリアに適した浸透剤を製剤に使用する。このような浸透剤は、当技術分野で一般的に知られている。
【０１１４】
本発明の医薬組成物は、従来の混合、溶解、顆粒化、ドラジーメイク、レビゲーション、乳化、封入または凍結乾燥プロセスによって、当技術分野で公知の方法で製造することができる。
【０１１５】
医薬組成物は、塩として提供することができ、酸で形成することができ、これには、塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、コハク酸などが含まれるが、これらに限定されない。塩は、対応する遊離塩基形態である水性または他のプロトン性溶媒により溶けやすい傾向がある。他の場合では、好適な調製物は、使用前に緩衝液と併用されるｐＨ範囲４．５〜７．５で、１ｍＭ〜５０ｍＭのヒスチジン、０．１〜２％のスクロース、２〜７％のマンニトール中の凍結乾燥粉末であってもよい。
【０１１６】
製剤化および投与の技術に関する詳細は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  （Ｅｄ．  Ｍａａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．）の最新版に見出される。
【０１１７】
本発明による抗体またはその断片を含む医薬組成物の調製後、適当な容器に入れ、適応状態の治療のために標識することができる。本発明による抗体または断片の投与のために、そのような標識は、投与の量、頻度および方法を含むであろう。
【０１１８】
本発明はさらに、本発明による前記組成物の成分の１つまたは複数を充填した１つまたは複数の容器を含む医薬パックおよびキットを提供する。このような容器に関連する通知は、医薬品または生物学的製剤の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された様式によるものであり、人の管理のための当該製品の製造、使用または販売の当局による承認を反映するものである。
【０１１９】
第６の態様では、本発明は、治療のための方法に使用するための、本発明に従う抗体またはその断片、または本発明に従う組成物に関する。
特に、このような治療方法は、それを必要とする対象に、治療有効量の本発明による抗体またはその断片を投与することを含む。被験体は、ヒトまたはヒト以外の動物（例えば、ウサギ、ラット、マウス、イヌ、サルまたは他の下位霊長類）であってもよい。
【０１２０】
本発明の文脈の中で、用語「治療的有効量」は、単回投与として、または複数回投与計画に従って、単独で、または他の薬剤との併用で、本発明に記載される疾患および疾患のいずれかの疾患症状を予防または軽減するのに十分な本発明による抗体またはその断片の量と定義され、特定の実施形態では、前記「治療的有効量」は毒性学的に忍容可能である。実効線量の決定は、当業者の能力の範囲内で十分である。治療上有効な量の治療薬は、通常、年齢、体重、性別および病態、時間、投与の頻度および経路、薬物の組合せ、ならびに治療される障害の性質などの特定の患者特性に大きく依存する。抗体の一般的な投与量は、投与経路に依存して、０．１〜１００，０００マイクログラムであり、総投与量約１０ｇまでである。
【０１２１】
その決定のための一般的なガイダンスは、例えば、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ  ｏｎ  Ｈａｒｍｏｎｉｚａｔｉｏｎの出版物および「ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ」の第２７章および第２８章ｐｐ．  ４８４−５２８（第１８版、Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．  Ｇｅｎｎａｒｏ，  Ｅｄ．、Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．  Ｃｏ．、  １９９０）に見ることができる。より具体的には、治療上有効な量を決定することは、当該技術分野でよく知られており、前述の参考文献に見出されている方法を用いて決定することができる薬剤の毒性および有効性などの因子に依存するであろう。簡単に言えば、治療薬の治療的有効性および毒性は、細胞培養アッセイにおいて、または動物モデルにおいて、例えば、それぞれＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）およびＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）として決定され得る。ＥＤ５０とＬＤ５０の間の用量比が治療指数である。
【０１２２】
本発明による抗体またはその断片は、心血管、腎臓、肺、骨格、眼、血栓塞栓性および線維性疾患および障害、小人症、軟骨形成不全症ならびに他のｃＧＭＰ関連および／またはナトリウム利尿ペプチド応答性障害の治療および／または予防に適している。したがって、特定の実施形態では、抗体またはその断片は、これらの障害および疾患のいずれか１つまたはそれらの任意の組み合わせの治療および／または予防に使用する。
【０１２３】
従って、本発明による抗体またはその断片は、心血管障害、例えば、動脈性および肺性高血圧症、抵抗性および難治性高血圧症、急性および慢性心不全、冠動脈心疾患、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）、腫瘍関連および腫瘍性疾患、移植片対宿主病、鎌状赤血球症、安定および不安定狭心症、抹消および心血管疾患、不整脈、心房および心室の不整脈および伝導障害、例えば、Ｉ〜ＩＩＩ度の房室ブロック（ＡＢブロックＩ〜ＩＩＩ）、上室性頻脈性不整脈、心房粗動、心室粗動、心室性頻脈、トルサード・ド・ポワント頻脈、心房および心室性期外収縮、房室接合部性期外収縮、洞不全症候群、卒倒、房室結節再入頻拍、Ｗｏｌｆｆ−Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ−Ｗｈｉｔｅ症候群、急性冠症候群（ＡＣＳ）、自己免疫性心疾患（心膜炎、心内膜炎、大動脈炎、心筋症）、心原性ショック、敗血症性ショックおよびアナフィラキシーショックなどのショック、動脈瘤、ボクサー  心筋梗塞（心室性期外収縮（ＰＶＣ））の治療および／または予防、血栓塞栓疾患および心筋虚血、心筋梗塞、卒中、心肥大、一過性および虚血発作、子癇前症、炎症性心血管障害、冠動脈および末梢動脈の攣縮、肺水腫、腎浮腫または心不全に起因する浮腫、末梢循環障害、再潅流障害、動脈および静脈血栓症、微量アルブミン尿、心筋機能不全、内皮障害の治療および／または予防、再狭窄、例えば、血栓溶解療法、経皮経管血管形成術（ＰＴＡ）、経皮的冠動脈形成術（ＰＴＣＡ）、心臓移植およびバイパス手術後の再狭窄また、微小血管および大血管の障害（血管炎）、フィブリノーゲンおよび低密度リポ蛋白質（ＬＤＬ）の濃度の上昇、プラスミノーゲン活性化因子阻害剤１（ＰＡＩ−１）の濃度の上昇の予防、ならびに勃起不全および女性の性機能不全の治療および／または予防のための医薬において使用し得る。
【０１２４】
本発明に関連して、「心不全」という用語は、急性および慢性型の両方の心不全を含み、また、より具体的あるいは関連した疾患、例えば、急性非代償性心不全、右心不全、左心不全、全体的な心不全、虚血性心筋症、拡張型心筋症、肥大型心筋症、特発性心筋症、先天性心疾患、心臓弁欠損に関連する心不全、僧帽弁狭窄、大動脈弁狭窄、大動脈弁不全、三尖弁閉鎖狭窄、三尖弁閉鎖不全、肺動脈弁閉鎖狭窄、肺動脈弁閉鎖不全、複合心臓弁欠損、心筋炎、慢性心筋炎、急性心筋炎、ウイルス性心筋炎、糖尿病性心不全、アルコール性心筋症、心臓貯蔵障害、拡張期心不全、ならびに収縮期心不全、駆出率が保たれた心不全（ＨＦｐＥＦ）、駆出率が低下した心不全（ＨＦｒＥＦ）、および既存の慢性心不全の悪化の急性期（心不全の悪化）も含む。
【０１２５】
さらに、本発明による抗体またはその断片は、動脈硬化、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、脂質代謝障害、低リポ蛋白血症、脂質異常症、高トリグリセリド血症、高脂血症、高コレステロール血症、無βリポ蛋白血症、シトステロール弛緩症、黄色腫症、タンジエ病、脂肪蓄積症、肥満症および複合高脂血症およびメタボリックシンドロームの治療および／または予防にも使用することができる。
【０１２６】
本発明による抗体またはその断片は、微小循環障害、跛行、末梢および自律神経障害、糖尿病性微小血管障害、糖尿病性網膜症、四肢の糖尿病性潰瘍、壊疽、ＣＲＥＳＴ症候群、紅斑症、爪真菌症、リウマチ性疾患の一次および二次レイノー現象の治療および／または予防、ならびに創傷治癒促進のために追加的に使用することができる。
【０１２７】
本発明による抗体またはその断片はまた、泌尿器疾患、例えば良性前立腺症候群（ＢＰＳ）、良性前立腺過形成（ＢＰＨ）、良性前立腺肥大（ＢＰＥ）、膀胱頸部閉塞（ＢＯＯ）、下部尿路症候群（ＬＵＴＳ、Ｆｅｌｉｎｅ  Ｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｎｄｒｏｍｅ  （ＦＵＳ）を含む）、神経因性過活動膀胱（ＯＡＢ）および（ＩＣ）を含む泌尿生殖器系の障害、失禁（ＵＩ）、例えば混合性尿失禁、切迫性尿失禁、腹圧性尿失禁または溢流性尿失禁（ＭＵＩ、ＵＵＩ、ＳＵＩ、ＯＵＩ）、骨盤痛、男女泌尿生殖器系の器官の良性および悪性障害を治療するのに適している。
【０１２８】
本発明による抗体またはその断片はまた、腎障害、特に急性および慢性腎不全および急性および慢性腎不全の治療および／または予防にも適している。本発明に関連して、用語「腎不全」は、腎不全の急性および慢性の症状の両方を包含し、また、基礎的または関連性腎疾患、例えば、腎低灌流、透析内低血圧、、閉塞性尿路症、糸球体症、糸球体腎炎、急性糸球体腎炎、糸球体硬化症、尿細管間質性疾患、原発性および先天性腎疾患などの腎症、腎炎、腎移植拒絶および免疫複合体誘発性腎障害などの免疫性腎障害、毒性物質によって誘発される腎症、造影剤によって誘発される腎症、糖尿病性および非糖尿病性腎症、腎盂腎炎、腎嚢胞、腎硬化症、高血圧性腎硬化症、並びに、例えば、クレアチニンおよび／または水の排泄の異常な減少、尿素、窒素、カリウムおよび／またはクレアチニンの血中濃度の異常な上昇、腎酵素例えばグルタミルシンテターゼの活性の変化、尿浸透圧または尿量の変化、微量アルブミン尿の上昇、マクロアルブミン尿、糸球体および細動脈の病変、尿細管拡張、高リン血症、および／または透析の必要性などの診断的に特徴づけられるネフローゼ症候群を包含する。
【０１２９】
本発明はまた、腎不全の後遺症、例えば、肺水腫、心不全、尿毒症、貧血、電解質障害（例えば、高カリウム血症、低ナトリウム血症）および骨および炭水化物代謝の障害の治療および／または予防のための本発明による抗体またはその断片の使用を包含する。
さらに、本発明による抗体またはその断片は、喘息性疾患、肺動脈高血圧症（ＰＡＨ）および左心疾患を含む他の形態の肺高血圧症（ＰＨ）、ＨＩＶ、鎌状赤血球貧血、血栓塞栓症（ＣＴＥＰＨ）、サルコイドーシス、ＣＯＰＤまたは肺線維症関連肺高血圧症、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）、急性肺損傷（ＡＬＩ）、α−１−アンチトリプシン欠損症（ＡＡＴＤ）、肺線維症、肺気腫（例えば、タバコの煙によって誘発される肺気腫）、閉塞性細気管支炎症候群（ＢＯＳ）、嚢胞性線維症（ＣＦ）の治療および／または予防にも適している。
【０１３０】
本発明による抗体またはその断片は、ＮＯ／ｃＧＭＰ系の障害を特徴とする中枢神経系障害の制御にも適している。特に、軽度の認知障害、加齢に伴う学習および記憶障害、脳血管性認知症、脳卒中、脳卒中後に起こる認知症（脳卒中後認知症）、外傷後頭蓋脳外傷、学習および記憶の問題を有する小児における全般的集中障害、アルツハイマー病、レビー小体型認知症、ピック症候群を含む前頭葉の変性を伴う認知症、パーキンソン病、進行性核麻痺、皮質基底核変性症（ＡＬＳ）、ハンチントン病、脱髄、視床変性症、クロイツフェルト・ヤコブ認知症、ＨＩＶ認知症、認知症を伴う統合失調症またはコルサコフ精神病などの状況／症候群に関連して起こる知覚、集中力または記憶力の改善に適してい。また、不安、緊張および抑うつの状態、ＣＮＳ関連性機能障害および睡眠障害などの中枢神経系障害の治療および／または予防、ならびに食物、刺激剤および嗜癖性物質の摂取の病理学的障害の制御にも適している。
【０１３１】
本発明による抗体またはその断片は、さらに、脳血流を制御するのに適しており、したがって、片頭痛を制御するのに有効な薬剤を表している。また、脳卒中、脳虚血、頭蓋脳外傷等の脳梗塞（脳卒中）後遺症（Ａｐｏｐｌｅｘｉａ  ｃｅｒｅｂｒｉ）の予防やコントロールにも適している。痛みや耳鳴りの状態のコントロールにも使用することができる。
【０１３２】
さらに、本発明による抗体または断片は抗炎症作用を有し、したがって敗血症（ＳＩＲＳ）、多臓器不全（ＭＯＤＳ、ＭＯＦ）、腎臓の炎症性障害、慢性腸炎症（ＩＢＤ、クローン病、ＵＣ）、膵炎、腹膜炎、リウマチ性疾患、炎症性皮膚疾患および炎症性眼疾患の治療および／または予防のための抗炎症剤として使用することができる。
【０１３３】
さらに、本発明による抗体またはその断片は、自己免疫疾患の治療および／または予防にも使用することができる。
【０１３４】
抗体またはその断片はまた、内部臓器、例えば、肺、心臓、腎臓、生殖系、骨髄および特に肝臓の線維性障害の治療および／または予防、ならびに皮膚線維症および線維性眼障害の予防にも適している。本発明に関連して、線維性障害という用語は、特に以下の用語を含む：肝線維症、肝硬変、肺線維症、心内膜線維症、腎症、糸球体腎炎、間質性腎線維症、糖尿病に起因する線維性障害、子宮筋腫、子宮内膜症、骨髄線維症および類似の線維性障害、強皮症、モルフェア、ケロイド、肥厚性瘢痕化（外科的処置に続く）、ナエビ、糖尿病性網膜症、増殖性硝子体網膜症および結合組織の障害（例えば、サルコイドーシス）。
【０１３５】
本発明による抗体またはその断片は、例えば緑内障手術の結果として、術後瘢痕化を制御するのにも適している。
【０１３６】
本発明による抗体またはその断片は、同様に加齢および角化皮膚のために美容的に使用することができる。
【０１３７】
さらに、本発明による抗体またはその断片は、肝炎、新生物、骨粗鬆症、緑内障および胃不全麻痺の治療および／または予防に適している。
【０１３８】
本発明による抗体またはその断片はさらに、ナトリウム利尿ペプチドに反応する眼疾患、網膜障害、原発開放隅角緑内障（ＰＯＡＧ）を含む緑内障、閉塞隅角緑内障、および先天性／発達緑内障を含む緑内障、網膜症、眼外傷、視神経症、高眼圧症、眼圧上昇、糖尿病性網膜症、黄斑変性症（ＡＭＤ）、加齢性眼疾患、黄斑浮腫、強膜炎、ブドウ膜炎、ドライアイ、角膜上皮擦過傷、角膜潰瘍などの眼疾患の治療および／または予防に適している。
【０１３９】
さらに、本発明による抗体またはその断片は、ナトリウム利尿ペプチドに反応する骨および軟骨疾患、関節炎、軟骨組織の変性疾患、変形性関節症、軟骨変性、骨折、骨格形成異常、軟骨形成不全症、軟骨形成不全症、骨粗鬆症、骨形成不全症、骨Ｐａｇｅｔ病（ＰＤＢ）、代謝性骨疾患、加齢性骨疾患、骨髄炎、骨壊死、くる病、骨軟化症、成長板損傷および疾患、ならびに関節および骨置換関連欠損、マルファン症候群、スポーツ損傷、筋ジストロフィー、デュシェンヌ型筋ジストロフィーなどの骨および軟骨疾患の治療に適している。
【０１４０】
したがって、別の態様では、本発明は、疾患、特に上述の疾患の治療および／または予防のための本発明による抗体またはその断片の使用に関する。
【０１４１】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、心不全、狭心症、高血圧、肺高血圧、虚血、血管障害、腎不全、血栓塞栓性障害、線維性障害、骨格および骨障害、眼障害および動脈硬化の治療および／または予防のための方法において使用するためのものである。
【０１４２】
別の態様では、本発明は、疾患、特に前述の疾患の治療および／または予防のための薬剤の製造のための本発明による抗体またはその断片の使用に関する。
【０１４３】
特定の実施形態では、本発明は、心不全、狭心症、高血圧、肺高血圧症、虚血症、血管障害、腎不全、血栓塞栓性障害、線維性障害、認知症疾患、動脈硬化症、骨格および骨障害、眼障害、小人症、軟骨形成不全および勃起不全の治療および／または予防のための薬剤の製造のための本発明による抗体またはその断片の使用に関する。
【０１４４】
別の態様では、本発明は、本発明による少なくとも１つの抗体またはその断片の有効量を用いた、障害、特に上記の障害の治療および／または予防のための方法に関する。
【０１４５】
具体的な実施形態では、本発明は、本発明による有効量の少なくとも１つの抗体またはその断片を用いて、心不全、狭心症、高血圧、肺高血圧症、虚血症、血管障害、腎不全、血栓塞栓性障害、線維性障害、腫瘍および腫瘍性疾患、骨および骨障害、眼障害、小人症、軟骨無形成症および動脈硬化症の治療および／または予防のための方法に関する。
【０１４６】
本発明の抗体または本発明のフラグメントは、単一の医薬剤として、または１種以上の追加の治療剤と組み合わせて投与することができ、場合によっては抗体自体を修飾することができる。例えば、抗体またはその断片を、例えば、有効性、安定性および／または半減期をさらに増大させるために、化学的実体に結合させることができる。特に、本発明による抗体またはその断片は、ＰＥＧ化および／またはＨＥＳｙｌａｔｅｄであってもよい。
【０１４７】
したがって、特定の実施形態において、本発明による抗体またはその断片は、治療方法において、特に上記引用された目的のために、少なくとも１つの追加の治療剤と組み合わせて使用される。
【０１４８】
本発明はさらに、本発明による少なくとも１つの抗体またはその断片および少なくとも１つの追加の治療剤を含む医薬組合せを提供する。
【０１４９】
本発明の文脈の中で、用語「薬学的組合せ」は、当業者に知られているように使用され、そのような組合せが固定された組合せ、固定されていない組合せまたはキット・オブ・パーツであることが可能である。
【０１５０】
本発明の文脈内で、用語「固定された組合せ」は、当業者に知られているように使用され、例えば、本発明による１つ以上の抗体またはその断片などの第一の活性成分と、さらなる活性成分とが、１つの単位投薬量または１つの単一の実体、例えば、１つの投薬製剤中に一緒に存在する組合せとして定義され、「固定された組合せ」の一例は、第一の活性成分およびさらなる活性成分が、製剤中などの同時投与のための混合物中に存在する医薬組成物であり、「固定された組合せ」の別の例は、第一の活性成分およびさらなる活性成分が、混合物中に存在せずに１つの単位中に存在する医薬組合せである。従って、本発明は、少なくとも１つの抗体またはその断片、および少なくとも１つの追加の治療剤を含むこのような薬学的組成物を提供し、特に前述の疾患の治療および／または予防に使用する。
【０１５１】
本発明の文脈の中で、「固定されていない組合せ」および「キット・オブ・パーツ」という用語は、当業者に知られているように使用され、第一の活性成分およびさらなる活性成分が、例えば、別々の投薬製剤中に複数の単位で存在する組合せとして定義される。固定されていない組合せまたはキット−オブ−パーツの一例は、第一の活性成分およびさらなる活性成分が別々に存在する組合せである。
【０１５２】
固定されていない組合せまたはキット・オブ・パーツの成分を別々に、連続的に、同時的に、同時的に、または時系列的にずらすことが可能である。
【０１５３】
本発明による抗体またはその断片は、前記さらなる治療活性剤と同時に、前に、または後に投与することができる。本発明との関連において、「同時に」という用語は、本発明による抗体またはその断片、ならびに同日、より特に１２時間以内、より特に２時間以内の少なくとも１つのさらなる治療活性剤の投与を意味する。
【０１５４】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片および少なくとも１つのさらなる治療活性剤の投与は、８週間連続して、さらに特に１〜６週間連続して起こる。本発明による抗体またはその断片および少なくとも１つのさらなる治療活性剤は、同じ経路を介して、または異なる経路を介して投与され得る。
【０１５５】
本発明による抗体またはその断片は、例えば、同じ適応症治療群の既知の薬剤、例えば、高血圧、心不全、肺高血圧症、喘息、嚢胞性線維症、アコンゴ形成症、高リン酸血症、慢性腎疾患（ＣＫＤ）、軟部組織石灰化、慢性腎疾患関連石灰化、モーンケベルグ内側硬化症を含む中膜石灰化、アテローム性動脈硬化症、ＣＫＤ関連心肥大、ＣＫＤ関連腎ジストロフィー、閉経後骨粗鬆症、糖尿病ＩＩ、慢性腎疾患、加齢、副甲状腺機能低下症、ビタミンＫ欠乏症、ビタミンＫ拮抗薬凝固薬、川崎病、ＡＣＤＣ（ＣＤ７３欠乏による動脈石灰化）、ＧＡＣＩ  （乳児期の全身性動脈石灰化）、ＩＢＧＣ  （特発性基底核石灰化）、ＰＸＥ  （弾力性偽黄色腫）、関節リウマチ、シングルトン・メルテン症候群、Ｐサラセミア、石灰化、従属栄養性骨化、早産  胎盤の石灰化、子宮の石灰化、子宮筋腫の石灰化、熱帯熱、大動脈弁の縮小石灰化、石灰化に関連する疾患および／または症状の治療および／または予防のために使用される薬剤と組み合わせることができる。
【０１５６】
本発明による抗体またはその断片と結合される適切なさらなる治療剤の好適な例は以下のものである：
有機硝酸塩およびＮＯ供与体、例えばニトロプルシドナトリウム、ニトログリセリン、一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、モルシドミンまたはＳＩＮ−１、および吸入ＮＯ；
環状グアノシン一リン酸（ｃＧＭＰ）の分解を阻害する化合物、例えばホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）１、２および／または５の阻害剤、とりわけシルデナフィル、バルデナフィル、タダラフィル、ユデナフィル、デサンタフィル、アバナフィル、ミロデナフィル、ロデナフィルまたはＰＦ−００４８９７９１のようなＰＤＥ  ５阻害剤；
抗血栓剤、好ましい例として、血小板凝集阻害剤、抗凝固剤、またはプロフィブリン溶解性物質のグループからのもの；
降圧活性成分、好ましい例として、カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシンＡＩＩアンタゴニスト、ＡＣＥ阻害剤、ＮＥＰ阻害剤、血管ペプチダーゼ阻害剤、エンドセリンアンタゴニスト、レニン阻害剤、α受容体ブロッカー、β受容体ブロッカー、ミネラルコルチコイド受容体アンタゴニスト、ローキナーゼ阻害剤および利尿剤のグループからのもの；
抗不整脈薬、好ましい例として、ナトリウムチャネル遮断薬、β受容体遮断薬、カリウムチャネル遮断薬、カルシウム拮抗薬、Ｉｆチャネル遮断薬、ジギタリス、副交感神経遮断薬（迷走神経遮断薬）、交感神経刺激薬およびアデノシン、アデノシン受容体作動薬ならびにベルナカラントとしての他の抗不整脈薬のグループからのもの；
陽性変力作用薬、好ましい例として、心臓グリコシド（ドゴキシン）、βアドレナリン作動性およびドーパミン作動性作動薬、例えばイソプレナリン、アドレナリン、ノルアドレナリン、ドーパミンまたはドブタミン；
バソプレシン−レゼプター−アンタゴニスト、好ましい例として、コニバプタン、トルバプタン、リキシバプタン、モザバプタン、サタバプタン、ＳＲ−１２１４６３、ＲＷＪ  ６７６０７０またはＢＡＹ  ８６−８０５０、ならびにＷＯ  ２０１０／１０５７７０、ＷＯ２０１１／１０４３２２およびＷＯ  ２０１６／０７１２１２に記載されている化合物のグループからのもの；
脂質代謝を変化させる活性成分、好ましい例として、甲状腺受容体アゴニスト、ＰＣＳＫ９インヒビター、コレステロール合成インヒビター、例えば、ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼインヒビターまたはスクアレン合成インヒビター、ＡＣＡＴインヒビター、ＣＥＴＰインヒビター、ＭＴＰインヒビター、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γおよび／またはＰＰＡＲ−δアゴニスト、コレステロール吸収インヒビター、リパーゼインヒビター、ポリマー性胆汁酸吸着剤、胆汁酸再吸収インヒビターおよびリポタンパク質（ａ）アンタゴニストからのもの；
抗炎症剤、好ましい例として、グルコ−コルチコイド、例えば、プレドニゾロン、プレドニゾロン、メチルプレドニゾロン、トリアムシノロン、デキサメタゾン、ベクロメタゾン、ベタメタゾン、フルニソリッド、ブデソニドまたはフルチカソン、ならびに非ステロイド性抗炎症剤（ＮＳＡＩＤ）、好ましい例として、アセチルサリチル酸（アスピリン）、イブプロフェンおよびナプロキセン、５−アミノサリチル酸誘導体、ロイコトリエン拮抗剤、ＴＮＦ−α−阻害剤およびケモカイン−受容体拮抗剤、例えばＣＣＲ１、２および／または５阻害剤；
シグナル伝達カスケードを阻害する薬剤、例えば好ましくは、キナーゼ阻害剤、例えば、チロシンキナーゼおよび／またはセリン／トレオニンキナーゼ阻害剤；
細胞外マトリックスの分解および修飾を阻害する薬剤、例えば好ましくは、マトリックス−メタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）の阻害剤、例えば、キマーゼ、ストロメリシン、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼおよびアグリカナーゼの阻害剤（好ましくはＭＭＰ−１、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１およびＭＭＰ−１３のグループから）、ならびに例えばシベレスタットまたはＤＸ−８９０のようなメタロ−エラスターゼ（ＭＭＰ−１２）および好中球−エラスターゼ（ＨＮＥ）の阻害剤；
セロトニンの受容体への結合を遮断する薬剤、好ましくは例えば５−ＨＴ２ｂ受容体のアンタゴニスト；
抗線維化剤、好ましくは例えば、ニンテダニブ、ピルフェニドン、アデノシンＡ２ｂ受容体アンタゴニスト、スフィンゴシン−１−リン酸受容体３（Ｓ１Ｐ３）アンタゴニスト、オートタキシン阻害剤、リゾホスファチジン酸受容体１（ＬＰＡ−１）およびリゾホスファチジン酸受容体２（ＬＰＡ−２）アンタゴニスト、リシルオキシダーゼ（ＬＯＸ）阻害剤、リシルオキシダーゼ様２阻害剤、ＣＴＧＦ阻害剤、ＩＬ−１３アンタゴニスト、インテグリンアンタゴニスト、ＴＧＦ−βアンタゴニスト、ｗｎｔシグナル伝達阻害剤、ＣＣＲ２−アンタゴニスト；
気管支拡張薬として機能する薬剤、好ましくは例えば５−ＨＴ２ｂ受容体のアンタゴニスト；β２（“ベーター２”）−アドレナリン作動薬（短時間作用性および長時間作用性）、抗コリン薬およびテオフィリン；
サイトカインおよびケモカインのアンタゴニストである薬剤、好ましくは例えば、ＴＧＦ−β、ＣＴＧＦ、ＩＬ−１、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１３、ＩＬ−２５、ＩＬ−３３、ＴＳＬＰおよびインテグリンのアンタゴニスト；
有機硝酸塩およびＮＯ供与体、好ましくは例えばニトロプルシドナトリウム、ニトログリセリン、一硝酸イソソルビド、二硝酸イソソルビド、モルシドミンまたはＳＩＮ−１、ならびに吸入ＮＯ；
ＮＯ非依存性であるが、可溶性グアニル酸シクラーゼのヘム依存性刺激物質、例えば、ＷＯ  ００／０６５６８、ＷＯ  ００／０６５６９、ＷＯ  ０２／４２３０１、ＷＯ  ０３／０９５４５１、ＷＯ  ２０１１／１４７８０９、ＷＯ  ２０１２／００４２５８、ＷＯ  ２０１２／０２８６４７およびＷＯ  ２０１２／０５９５４９に記載されている化合物；
可溶性グアニル酸シクラーゼのＮＯ非依存性およびヘム非依存性アクチベーター、好ましくは例えば、ＷＯ  ０１／１９３５５、ＷＯ  ０１／１９７７６、ＷＯ  ０１／１９７７８、ＷＯ  ０１／１９７８０、ＷＯ  ０２／０７０４６２およびＷＯ  ０２／０７０５１０に記載された化合物；
ｃＧＭＰの合成を刺激する薬剤、例えばｓＧＣモジュレータ、好ましくは例えば、リオシグアト、シナシグアト、ベルイシグアト；
プロスタサイクリン−アナログまたはＩＰ受容体アゴニスト、好ましくは例えば、イロプロスト、ベラプロスト、トレプロスチニル、エポプロステノールまたはセレキシパグ；
エンドセリン受容体アンタゴニスト、好ましくは例えばボセンタン（Ｂｏｓｅｎｔａｎ）、ダルセンタン（Ｄａｒｕｓｅｎｔａｎ）、アンプリセンタン（Ａｍｂｒｉｓｅｎｔａｎ）または  シタキセンタン（Ｓｉｔａｘｓｅｎｔａｎ）；
可溶性エポキシドヒドロラーゼ（ｓＥＨ）、好ましくは例えばＮ，Ｎ’−ジ−シクロヘキシル尿素、１２−（３−アダマンタン−１−イル−ウレイド）−ドデカン酸または１−アダマンタン−１−イル−３−｛５−［２−（２−エトキシエトキシ）エトキシ］ペンチル｝−尿素を選択的に阻害する薬剤；
グルコース代謝と相互作用する薬剤、好ましくは例えば、インスリン、ビグアナイド、チアゾリジンジオン、スルホニルウレア、アカルボース、ＤＰＰ４阻害剤、ＧＬＰ−１アナログまたはＳＧＬＴ−１阻害剤；
ナトリウム利尿ペプチド、好ましくは例えば心房性ナトリウム利尿ペプチド（ＡＮＰ、カルペリチド）、脳性ナトリウム利尿ペプチド（ＢＮＰ、ネシリチド）、Ｃ型ナトリウム利尿ペプチド（ＣＮＰ）またはウロジラチン；
ナトリウム利尿ペプチド誘導体、好ましくは例えば、ボソリチド、センデリチド、ＰＬ  ３９９４；
心筋ミオシンの活性化剤、好ましくは例えばオメカムチブメカルビル（ＣＫ−１８２７４５２）；
カルシウム増感剤、好ましくは例えばレボシメンダン；
心臓のエネルギー代謝に影響を及ぼす薬剤、好ましくは例えば、エトモキシル、ジクロロアセタット、ラノラジンまたはトリメタジン、  （以前はＣＶＴ−３６１９として知られていた）  ＧＳ−９６６７、カパデノソンおよびネラデノソンのような完全または部分アデノシンＡ１受容体アゴニスト；
心拍数に影響を及ぼす薬剤、好ましくは例えばイバプラジン。
【０１５７】
抗血栓剤は、血小板凝集阻害剤のグループ、抗凝固剤またはプロフィブリン溶解物質からの化合物を意味すると理解されることが望ましい。
【０１５８】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、血小板凝集阻害剤と組み合わせて、好ましくは例えば、アスピリン、クロピドグレル、プラスグレル、チカグレロル、チクロピジンまたはジピリダモールとともに投与される。
【０１５９】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、好ましくは例えば、トロンビン阻害剤と組み合わせて、キシメラガトラン、ダビガトラン、メラガトラン、ビバリルジンまたはクレキサンとともに投与される。
【０１６０】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、好ましくは例えば、チロフィバンまたはアブシキシマブなどのＧＰＩＩｂ／ＩＩＩａアンタゴニストと組み合わせて投与される。
【０１６１】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、Ｘａ因子阻害剤、好ましくは例えば、リバーロキサバン、ＤＵ−１７６ｂ、アピキサバン、ベトリキサバン、オタミキサバン、フィデキサバン、ラザバン、レタキサバン、エリバキサバン、フォンダパリヌクス、ｉｄｒａｐａｒｉｎｕｘ、ＰＭＤ−３１１２、ダレキサバン（ＹＭ−１５０）、ＫＦＡ−１９８２、ＥＭＤ−５０３９８２、ＭＣＭ−１７、ＭＬＮ−１０２１、ＤＸ  ９０６５ａ、ＤＰＣ  ９０６、ＪＴＶ  ８０３、ＳＳＲ−１２６５１２またはＳＳＲ−１２８４２８と組み合わせて投与される。
【０１６２】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ヘパリンと組み合わせて、または低分子量（ＬＭＷ）ヘパリン誘導体と組み合わせて投与される。
【０１６３】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ビタミンＫアンタゴニスト、好ましくは例えば、クマリンと組み合わせて、投与される。
【０１６４】
降圧剤は、好ましくは、カルシウムアンタゴニスト、アンジオテンシンＡＩＩアンタゴニスト、ＡＣＥインヒビター、エンドセリンアンタゴニスト、レニンインヒビター、α受容体ブロッカー、β受容体ブロッカー、ミネラルコルチコイド受容体アンタゴニスト、ロキナーゼインヒビターおよび利尿薬の群からの化合物を意味すると理解される。
【０１６５】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、カルシウム拮抗薬、好ましくは例えば、ニフェジピン、アムロジピン、ベラパミルまたはジルチアゼムと組み合わせて、投与される。
【０１６６】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、α−１−受容体ブロッカー、好ましくは例えば、プラゾシンと組み合わせて投与される。
【０１６７】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、β受容体遮断薬、好ましくは例えば、プロプラノロール、アテノロール、チモロール、ピンドロール、アルプレノロール、オクスプレノロール、ペンブトロール、ブプラノロール、メチプラノロール、ナドロール、メピンドロール、カルアザロール、ソタロール、メトプロロール、ベタキソロール、ベタキソロール、セリプロロール、ビソプロロール、カルテオロール、エスモロール、ラベタロール、カルベタロール、アダプロロール、ランジオロール、ランジオロール、ネビボロール、エパノロールまたはブシンドロールと組み合わせて投与される。
【０１６８】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、アンジオテンシンＡＩＩアンタゴニスト、好ましくは例えば、ロサルタン、カンデサルタン、バルサルタン、テルミサルタンまたはエンブサルタン、またはデュアルアンジオテンシンＡＩＩアンタゴニスト／ネプリリジン−阻害剤、好ましくは例えば、ＬＣＺ６９６（バルサルタン／サクビトリル）と組み合わせて投与される。
【０１６９】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ＡＣＥ阻害剤、好ましくは例えば、エナラプリル、カプトプリル、リシノプリル、ラミプリル、デラプリル、ホシノプリル、キノプリル、ペリンドプリルまたはトランドプリルとともに投与される。
【０１７０】
特に実施例として、本発明に係る抗体またはその断片を、エンドセリン拮抗剤、好ましくは例えば、ボセンタン、ダルセンタン、アンブリセンタンまたはシタキシセンタンと組み合わせて投与する。
【０１７１】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、レニン阻害剤、好ましくは例えば、アリスキレン、ＳＰＰ−６００またはＳＰＰ−８００とともに投与される。
【０１７２】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ミネラルコルチコイド受容体アンタゴニスト、好ましくは例えばフィネロン、スピロノラクトンまたはエプレレノンとともに投与される。
【０１７３】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ループ利尿薬、例えばフロセミド、トレセミド、ブメタニドおよびピレタニドと、カリウム保持性利尿薬、例えばアミロリドおよびトリアムテレンと、アルドステロン拮抗薬、例えばスピロノラクトン、カンレノ酸カリウムおよびエプレレノンと、さらにはサイアザイド系利尿薬、例えばヒドロクロロチアジド、クロルタリドン、キシパミドおよびインダパミドと組み合わせて投与される。
【０１７４】
脂質代謝修飾物質は、好ましくは、ＣＥＴＰ阻害剤、甲状腺受容体アゴニスト、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤またはスクアレン合成阻害剤のようなコレステロール合成阻害剤、ＡＣＡＴ阻害剤、ＭＴＰ阻害剤、ＰＰＡＲ−α、ＰＰＡＲ−γおよび／またはＰＰＡＲ−δアゴニスト、コレステロール吸収阻害剤、高分子胆汁酸吸着剤、胆汁酸再吸収阻害剤、リパーゼ阻害剤およびリポタンパク質（ａ）アンタゴニストの群からの化合物を意味すると理解される。
【０１７５】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ＣＥＴＰ阻害剤、好ましくは例えば、ダルセトラピブ、アナセトラピブ、トルセトラピブ（ＣＰ−５２９  ４１４）、ＪＪＴ−７０５またはＣＥＴＰワクチン（Ａｖａｎｔ）とともに投与される。
【０１７６】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはそのフラグメントは、甲状腺受容体アゴニスト、好ましくは例えば、Ｄ−チロキシン、３，５，３’−トリヨードチロニン（Ｔ３）、ＣＧＳ  ２３４２５またはアキシチローム（ＣＧＳ  ２６２１４）とともに投与される。
【０１７７】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、スタチンのクラスからのＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ阻害剤、好ましくは例えば、ロバスタチン、シンバスタチン、プラバスタチン、フルバスタチン、アトルバスタチン、ロスバスタチンまたはピタバスタチンとともに投与される。
【０１７８】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、スクアレン合成阻害剤、好ましくは例えば、ＢＭＳ−１８８４９４またはＴＡＫ−４７５とともに投与される。
【０１７９】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ＡＣＡＴ阻害剤、好ましくは例えば、アバシミブ、メリナミド、パクチミブ、エフルシミブまたはＳＭＰ−７９７とともに投与される。
【０１８０】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ＭＴＰ阻害剤、好ましくは例えば、インプリタピド、ＢＭＳ−２０１０３８、Ｒ−１０３７５７またはＪＴＴ−１３０とともに投与される。
【０１８１】
特に実施例として、本発明に係る抗体またはその断片をＰＰＡＲ−ガンマ作動剤、好ましくは例えば、ピオグリタゾンまたはロシグリタゾンと併用して投与する。
【０１８２】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ＰＰＡＲ−デルタアゴニスト、好ましくは例えば、ＧＷ  ５０１５１６またはＢＡＹ  ６８−５０４２とともに投与される。
【０１８３】
具体的な実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、コレステロール吸収阻害剤、好ましくは例えば、エゼチミブ、チクエシドまたはパマクエシドと一緒に投与される。
【０１８４】
特定の実施形態において、本発明による抗体またはその断片は、リパーゼ阻害剤、好ましくは例えば、オルリスタットである。
【０１８５】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ポリマー性胆汁酸吸着剤、好ましくは例えば、コレスチラミン、コレスチポール、コレストルバム、コレスタゲルまたはコレスチミドとともに投与される。
【０１８６】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、胆汁酸再吸収阻害剤、好ましくは例えば、ＡＳＢＴ  （＝  ＩＢＡＴ）阻害剤、例えばＡＺＤ−７８０６、Ｓ−８９２１、ＡＫ−１０５、ＢＡＲＩ−１７４１、ＳＣ−４３５またはＳＣ−６３５とともに、投与される。
【０１８７】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、リポタンパク質（ａ）アンタゴニスト、好ましくは例えば、ゲムカベンカルシウム（ＣＩ−１０２７）またはニコチン酸とともに投与される。
【０１８８】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、リポタンパク質（ａ）アンタゴニスト、好ましくは例えば、ゲムカベンカルシウム（ＣＩ−１０２７）またはニコチン酸とともに投与される。
【０１８９】
具体的には、本発明に係る抗体またはそのフラグメントを、ｓＧＣモジュレーター、好ましくは例えば、リオシグアト、シナシグアトまたはベルイシグアトなどと併用して実施する。
【０１９０】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、グルコース代謝に影響を及ぼす薬剤、好ましくは例えば、インスリン、スルホニル尿素、アカルボース、ＤＰＰ４阻害剤、ＧＬＰ−１アナログまたはＳＧＬＴ−１阻害剤とともに投与される。
【０１９１】
特に実施例として、本発明に係る抗体またはその断片を、好ましくは例えば、ピルフェニドン、ニンテダニブまたはフレソリムマブと一緒に、ＴＧＦベータアンタゴニストと組み合わせて、投与する。
【０１９２】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ＣＣＲ２アンタゴニスト、好ましくは例えば、ＣＣＸ−１４０とともに投与される。
【０１９３】
特に実施例として、本発明に係る抗体またはその断片を、ＴＮＦａｌｐｈａ拮抗剤、好ましくは例えば、アダリムマブと併用して実施する。
【０１９４】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ガレクチン−３阻害剤、好ましくは例えば、ＧＣＳ−１００とともに投与される。
【０１９５】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、Ｎｒｆ−２阻害剤、好ましくは例えば、バルドキソロンとともに投与される。
【０１９６】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ＢＭＰ−７アゴニスト、好ましくは例えば、ＴＨＲ−１８４と組み合わせて投与される。
【０１９７】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ＮＯＸ１／４阻害剤、好ましくは例えば、ＧＫＴ−１３７８３１とともに投与される。
【０１９８】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ビタミンＤ代謝に影響を及ぼす薬剤、好ましくは例えば、カルシトリオール、アルファカルシドール、ドキセルカルシフェロール、マキサカルシトール、パリカルシトール、コレカルシフェロールまたはパラカルシトールとともに投与される。
【０１９９】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、細胞増殖抑制剤、好ましくは例えば、シクロホスファミドと組み合わせて投与される。
【０２００】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、免疫抑制剤、好ましくは例えば、シクロスポリンと組み合わせて投与される。
【０２０１】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、リン酸結合剤、好ましくは例えば、コレスチラン、セベラマー塩酸塩およびセベラマー炭酸塩、ランタンおよび炭酸ランタンとともに投与される。
【０２０２】
具体的な実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、腎近位尿細管ナトリウム−リン酸共輸送体、好ましくは例えば、ナイアシンまたはニコチンアミドと組み合わせて投与される。
【０２０３】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、副甲状腺機能亢進症の治療のためにカルシウム模倣薬と組み合わせて投与される。
【０２０４】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、鉄欠乏療法のための薬剤、好ましくは例えば、鉄製品とともに投与される。
【０２０５】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、高尿酸血症の治療のための薬剤、好ましくは例えば、アロプリノールまたはラスブリカーゼとともに投与される。
【０２０６】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、貧血の治療のための糖タンパク質ホルモン、好ましくは例えば、エリスロポエチンと組み合わせて投与される。
【０２０７】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、免疫療法のための生物学的製剤、好ましくは例えば、アバタセプト、リツキシマブ、エクリズマブまたはベリムマブとともに投与される。
【０２０８】
特定の実施形態において、本発明による抗体またはその断片は、心不全の治療のためにバソプレシンアンタゴニスト（バプタン類の群）  、好ましくは例えば、トルバプタン、コニバプタン、リキシバプタン、モザバプタン、サタバプタンまたはレルコバプタンと組み合わせて投与される。
【０２０９】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、Ｊａｋ阻害剤、好ましくは例えば、ルキソリチニブ、トファシチニブ、バリシチニブ、ＣＹＴ３８７、ＧＳＫ２５８６１８４、レスタウルチニブ、パクリチニブ（ＳＢ１５１８）またはＴＧ１０１３４８と組み合わせて投与される。
【０２１０】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、微小血栓の治療のためにプロスタサイクリン類似体と組み合わせて投与される。
【０２１１】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、アルカリ療法、好ましくは例えば、炭酸水素ナトリウムと組み合わせて投与される。
【０２１２】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ｍＴＯＲ阻害剤、好ましくは例えば、エベロリムスまたはラパマイシンとともに投与される。
【０２１３】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ＮＨＥ３阻害剤、好ましくは例えば、ＡＺＤ１７２２またはテナパノールとともに投与される。
【０２１４】
特定の実施形態では、本発明による抗体またはその断片は、ｅＮＯＳモジュレーター、好ましくは例えば、サプロプテリンとともに投与される。
【０２１５】
特定の実施形態において、本発明による抗体またはその断片は、ＣＴＧＦ阻害剤、好ましくは例えば、ＦＧ−３０１９と組み合わせて投与される。
【０２１６】
本発明による治療方法に使用するための抗体またはその断片は、１種以上の生理学的に許容可能な担体または賦形剤を用いて、任意の従来の方法で製剤化することができる。本発明による抗体またはその断片は、治療される障害のタイプに依存して変化し得る任意の適切な手段によって投与され得る。可能な投与経路には、経腸（例えば、経口）、非経口（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、心臓内、心室内、髄腔内、髄内、病変内）、肺内および鼻腔内投与が含まれる。さらに、本発明による抗体またはその断片は、例えば抗体またはその断片の用量を減らすことにより、パルス注入によって投与することができる。好適には、投与は、状態が急性であるか慢性であるかに部分的に依存して、注射、最も好適には静脈内注射または皮下注射によって行われる。投与される量は、個体の臨床症状、性別、年齢、および／または体重、他の薬物が投与されるかどうか、および他のものなどの様々な因子に依存するであろう。当業者は、投与経路が、治療される障害または状態に依存して変化するであろうことを認識するであろう。
【０２１７】
非経口投与の方法には、局所的、動脈内、腫瘍内、筋肉内、皮下、髄内、髄腔内、髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、または鼻腔内投与が含まれる。
【０２１８】
特定の実施形態では、治療のための方法は、抗体またはその断片、またはそれを含む医薬組成物の単回または複数回の投与を含む。投与の単回投与は、同じであっても異なっていてもよい。特に、治療のための方法は、本発明による抗体またはその断片の１、２、３、４、５または６回の投与を含み、好ましくは、複数回の投与が１〜６連続月以内に起こる。本発明による抗体またはその断片は、例えば、その半減期およびクリアランス速度に応じて、３〜４日ごと、週ごと、２週ごとに１回、または３週ごとに１回投与することができる。
【０２１９】
図面の簡単な説明
図１：ラットにＴＰＰ−１０９９２およびＴＰＰ−５６６１を５ｍｇ／ｋｇ静脈内投与したときの平均血漿中濃度。
図２：マウスに５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した後のＴＰＰ−１２８９７の平均血漿中濃度。
図３：ＡＮＰ（Ａ−Ｃ）、ＴＰＰ−１０９９２（Ｄ−Ｆ）およびＴＰＰ−５６６１（Ｇ−Ｉ）の蛋白分解に対する安定性。ＡＮＰ、ＴＰＰ−１０９９２およびＴＰＰ−５６６１活性を、安定ラットＡＮＰ受容体細胞株で直接（Ａ、Ｄ、Ｇ）、または０．６μｇ／ｍｌのＮＥＰ  （Ｂ、Ｅ、Ｈ）または０．６μｇ／ｍｌのＩＤＥ  （Ｃ、Ｆ、Ｉ）と３７℃で４時間インキュベート後に試験した。
図４：ＢＮＰ（Ａ−Ｃ）とＴＰＰ−１１１５５（Ｄ−Ｆ）の蛋白分解に対する安定性。ＢＮＰおよびＴＰＰ−１１１５５活性を、安定ラットＢＮＰ受容体細胞株に対して直接（Ａ、Ｄ）、または０．６μｇ／ｍｌのＮＥＰ  （Ｂ、Ｅ）または０．６μｇ／ｍｌのＩＤＥ  （Ｃ、Ｆ）と３７℃で４時間インキュベート後に試験した。
図５：ＣＮＰ（Ａ−Ｃ）とＴＰＰ−１２８９７（Ｄ−Ｆ）の蛋白分解に対する安定性。ＣＮＰおよびＴＰＰ−１１１５５活性を、安定なラットＣＮＰ受容体細胞株上で直接（Ａ、Ｄ）、または０．６μｇ／ｍｌのＮＥＰ  （Ｂ、Ｅ）または０．６μｇ／ｍｌのＩＤＥ  （Ｃ、Ｆ）と３７℃で４時間インキュベート後に試験した。
図６：  ＡＮＰペプチドおよびＴＰＰ−１０９９２は、ＰＥ収縮大動脈輪において血管拡張用量反応曲線を誘導した。フェニレフリン（１μＭ）により収縮した内皮無傷ラット大動脈輪におけるＡＮＰペプチド（オープンサークル）およびＴＰＰ‐１０９９２（クローズドサークル）に対する濃度‐応答曲線（０．０００１〜１０μＭ；  ｎ  ＝３ラット）。各組織のフェニレフリンによる収縮を１００％とし、それからの最大変化に対して実験値を算出した。ＡＮＰペプチドとＴＰＰ‐１０９９２の効力はそれぞれ−７．４と−６．７であった（ｌｏｇＥＣ５０値）。データは２実験の平均±  Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
図７：  ＡＮＰペプチドおよびＴＰＰ−５６６１は、ＰＥ収縮大動脈輪において血管拡張用量反応曲線を誘導した。フェニレフリン（１μＭ）により収縮した内皮無傷ラット大動脈輪におけるＡＮＰペプチド（オープンサークル）およびＴＰＰ‐５６６１（クローズドサークル）に対する濃度‐応答曲線（０．０００１〜１０μＭ；  ｎ  ＝３ラット）。各組織のフェニレフリンによる収縮を１００％とし、それからの最大変化に対して実験値を算出した。ＡＮＰペプチドとＴＰＰ‐５６６１の効力はそれぞれ−７．４と−６．５であった（ｌｏｇＥＣ５０値）。データは２実験の平均±  Ｓ．Ｅ．Ｍ．を表す。
図８：覚醒ラットにおけるＡＮＰの血行動態への影響。ラットＡＮＰを０時間で腹腔内投与した。ＡＮＰ  ５００μｇ投与により、平均動脈血圧（ＭＡＰ）は約２５％低下し、効果持続時間は６〜８時間前後であった。
図９：覚醒ラットにおける血行動態作用。ＴＰＰ−５６６１ＴＰＰ−５６６１を０時間後に腹腔内投与した。１５ｍｇ／ｋｇ投与により、平均動脈血圧（ＭＡＰ）が約２０％低下し、適用後２４〜４８時間で最大効果を示し、効果持続期間は６日を超えた。
図１０：覚醒ラットにおける血行動態作用。ＴＰＰ−１０９９２ＴＰＰ−１０９９２を０時間後に腹腔内投与した。３０ｍｇ／ｋｇ投与により、平均動脈血圧（ＭＡＰ）が約２０％低下し、適用後４８時間で最大の効果が認められ、効果持続期間は６日を超えた。
図１１：ＢＮＰ移植抗体構築物のｈＮＰＲＡ細胞上での活性。安定なｈＮＰＲＡ‐ＣＨＯ  ｋ１細胞に対する精製化合物試料の活性を、参照試料ＴＰＰ‐５６６１およびＴＰＰ‐５６５７との比較により評価した。試料は、四重項の希釈系列で試験した。
図１２：異なるヒトＩｇＧアイソタイプは、等しく適当な抗体骨格を提供する。化合物９、３３、６５、９１、１２７および１９１のＩｇＧ１（それぞれ、ＴＰＰ−１０２９４、ＴＰＰ−１０２７７、ＴＰＰ−１０２７９、ＴＰＰ−１０２８２、ＴＰＰ−１０２６９およびＴＰＰ−１０３５５）、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプの例示的活性決定。安定なｈＮＰＲＡ−ＣＨＯ  ｋ１細胞に対する精製化合物試料の活性を、参照化合物１１７ヒトＩｇＧ１  ＴＰＰ−５６６１および化合物２０９ヒトＩｇＧ１  ＴＰＰ−５６５７との比較により評価した。試料は、四重項の希釈系列で試験した。
図１３：異なる種に由来する同様に適したＩｇＧ抗体スカホールド。化合物１１７ヒトＩｇＧ１（ＴＰＰ−５６６１）および化合物９ヒトＩｇＧ１（ＴＰＰ−１０２９４）ならびにそれらの非ヒトＩｇＧ１対応物の例示的活性決。定安定なｈＮＰＲＡ‐ＣＨＯ  ｋ１細胞に対する精製化合物試料の活性を、参照試料化合物２０９ヒトＩｇＧ１（ＴＰＰ‐５６５７）との比較により評価した。試料は、四重項の希釈系列で試験した。
図１４：同様に適したヒトＩｇＧ抗体スカホールドは、異なる生殖系列配列に由来した。安定なｈＮＰＲＡ‐ＣＨＯ  ｋ１細胞に対する精製化合物試料の活性を、参照試料ＴＰＰ‐１０９９２との比較により評価した。試料は、四重項の希釈系列で試験した。
図１５：  ＴＰＰ−１２８９９のＬＰＳ、ＩＬ−１βおよびトロンビンに対する保護作用により、リアルタイムインピーダンス計測により評価した内皮関門透過性が誘導された。
図１６：ＴＰＰ−１３９９２の生存（Ａ）、体重増加（Ｂ）、尿蛋白／クレアチニン比（Ｃ）および左房重量（Ｄ）に対する治療効果（ｎ＝８〜１２（健常対照ｎ＝５）、平均値±標準誤差、Ｏｎｅ−Ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ  ｖｓ  ＴＰＰ−１０１５５（アイソタイプ特異的対照抗体））。
図１７：ＴＰＰ−１０９９２のプラセボ０．１、０．３および１．０ｍｇ／ｋｇ投与後の血行動態の評価。ＴＰＰ−１０９９２は、用量依存的かつ長期間持続する（＞５ｄ）血圧低下を示す。  ＊＊  ｐ＜０．０１、＊＊＊＊  ｐ＜０．０００１は、反復測定のための一元配置分散分析とそれに続くＴｕｋｅｙの多重比較検定を使用したプラセボ群との比較における有意差。
【０２２０】
実施例
［実施例１］
実施例１：候補ＴＰＰ−５６６１の構築
Ｎｔｌｓ、野生型ラットＡＮＰおよびＣｔｌｓを含む異種性アミノ酸配列の２つのＮ末端残基でＨＶ  ３−２３（配列番号８５）の２つのＣ末端残基を置換することによって、該異種性アミノ酸配列をＨＶ  ３−２３に融合させ、該異種性アミノ酸配列の９つのＣ末端残基でＩＧＨＪ１（配列番号８６）の９つのＮ末端残基を置換することによって、該異種性アミノ酸配列をＩＧＨＪ１に融合させることで、候補ＴＰＰ−５６６１を設計した。配列番号６７の対応する全長重鎖配列は、アミノ酸配列Ｃｏｎｓｔａｎｔ−Ｈ  （配列番号８７）をさらに含む。
【０２２１】
挿入ラットＡＮＰ  （ｒＡＮＰ）を有する配列番号６７の全長重鎖配列と、配列ＬＶ  １−４０（配列番号８８）、ＩＧＬＪ２（配列番号８９）およびＣｏｎｓｔａＮｔｌｓ  （配列番号９０）を組み合わせて構築された配列番号６６の全長軽鎖配列との対合により、完全なＩｇＧ候補ＴＰＰ−５６６１が得られる（表１参照）。
【０２２２】
以下に、完全長重鎖配列（配列番号６７）を示す；取り込まれた異種性アミノ酸配列（Ｎｔｌｓ−ｒＡＮＰ−Ｃｔｌｓ）を下線で示す；ＨＶ  ３−２３およびＩＧＨＪ１に由来する配列を太字で示す：
【数２】
2021520801.tif 000004
設計され合成された抗体構築物は、当技術分野でよく知られた方法に従ってクローニングされ、プラスミド特異的オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ配列決定によって確認された。
【０２２３】
［実施例２］
実施例２：抗体−ＣＤＲ内のＮＰの挿入は、血清半減期の増加をもたらす
ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態パラメータの測定
Ｗｉｓｔａｒ系雄性ラット（ｎ＝３）に５ｍｇ／ｋｇを静脈内投与したときのＴＰＰ−１０９９２（配列番号７６および配列番号６６）およびＴＰＰ−５６６１（配列番号６７および配列番号６６）の薬物動態パラメータが測定された。ＴＰＰ−１０９９２およびＴＰＰ−５６６１は尾静脈からボーラス注射として投与した。１４日（３３６時間）までの時間間隔で、あらかじめ埋め込まれたカテーテルを介して頸静脈から血液サンプルを採取した。得られたＥＤＴＡ−血漿を−２０℃でさらに分析するまで保存した。
【０２２４】
血漿サンプル中のＴＰＰ−１０９９２およびＴＰＰ−５６６１の定量は、抗ヒトＩｇＧ  ＥＬＩＳＡ  （酵素免疫測定法）フォーマットを用いて行った。薬物動態パラメータは、非コンパートメントデータ解析を用いて血漿中濃度時間プロファイルから算出した。
【０２２５】
静脈内投与後のＴＰＰ−１０９９２およびＴＰＰ−５６６１の平均血漿中濃度の経時的推移を図１に図示する。
【０２２６】
ＴＰＰ−１０９９２およびＴＰＰ−５６６１の平均クリアランスおよび終末半減期は、下表２のとおりであった。
【０２２７】
表２：ラットにＴＰＰ−１０９９２およびＴＰＰ−５６６１を５ｍｇ／ｋｇ静脈内投与したときの平均クリアランス（以下、「ＣＬ」）および終末半減期（以下、「ｔ１／２」）。
【表２】
2021520801.tif 000005
【０２２８】
ｉｎ  ｖｉｖｏ薬物動態パラメータの測定
雌Ｂａｌｂ／ｃマウス（ｎ＝３）に腹腔内投与した後、ＴＰＰ−１２８９７の薬物動態パラメータを測定した。適用後１５分から７２時間まで採血した。生成したＥＤＴＡ−血漿を−２０℃でさらに分析するまで保存した。血漿サンプル中のＴＰＰ−１２８９７の定量は、抗ヒトＩｇＧ  （Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ）  ＥＬＩＳＡフォーマットにより行った。
【０２２９】
薬物動態パラメータは、非コンパートメントデータ解析を用いて血漿中濃度時間プロファイルから算出した。
【０２３０】
経時的な腹腔内投与後のＴＰＰ−１２８９７の平均血漿中濃度を図２に図示する。
【０２３１】
ＴＰＰ−１２８９７の平均曲線下面積（ＡＵＣ）および終末相半減期を下記の表３に要約する。
【０２３２】
表３：マウスに５ｍｇ／ｋｇを腹腔内投与した後のＴＰＰ−１２８９７の平均曲線下面積（ＡＵＣ）および終末半減期（ｔ１／２）。
【表３】
2021520801.tif 000006
【０２３３】
［実施例３］
実施例３：ＮＰ移植抗体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ効力
【０２３４】
ＮＰＲ−Ａ受容体細胞株におけるＡＮＰ移植抗体の活性データ
既報（Ｗｕｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６９８：  １３１）のように、蛍光ベースのラットＡＮＰ受容体（ＮＰＲ−Ａ）細胞株を作製した。すなわち、蛍光ベースのラットＡＮＰ受容体（ＮＰＲ‐Ａ）細胞株を、ＣＮＧＡ２（ｃＧＭＰバイオセンサー）とラットＮＰＲ‐Ａをコードするプラスミド構築物で、蛍光カルシウムセンサー蛋白質ＧＣａＭＰ６を安定に発現するＣＨＯ細胞株を共トランスフェクトすることによって作製した。
【０２３５】
ＡＮＰ受容体ＧＣａＭＰ６細胞を、黒色の透明底３８４ウェルマイクロタイタープレート（２５００細胞／ウェル）上で１日間培養した。細胞培養液を取り出した後、レポーター細胞に、３７℃および５％  ＣＯ２で黒色マスキング色素を含むタイロード（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，４．８ｍＭ  ＮａＨＣＯＯＢ，ｐＨ  ７．４）を２０分間負荷した。内因性ホスホジエステラーゼによるｃＧＭＰ分解を防止するためにＩＢＭＸ  （０．２ｍＭ）を使用した。
【０２３６】
蛍光測定（３分、動態モード）はアゴニスト添加で直接開始した。受容体リガンドを黒色マスキング色素と０．１％  ＢＳＡを含むＴｙｒｏｄｅに添加した。測定はＦＬＩＰＲテトラ（登録商標）で行った。
【０２３７】
ＡＮＰ  （Ｂａｃｈｅｍ，  Ｈ−２１００）は、ＥＣ５０値０．２２  ｎＭで、ＮＰＲ−Ａ細胞株に対して濃度依存蛍光信号を刺激した。ＴＰＰ‐５６６１およびＴＰＰ‐１０９９２は、それぞれ１７  ｎＭおよび１８０  ｎＭのＥＣ５０でラットＡＮＰ受容体レポーター細胞株を刺激した。対照抗体構築物ＴＰＰ−５６５７は、ＮＰＲ−Ａ細胞株を有意に刺激しなかった（最大濃度４６０  ｎＭまで試験）。
【０２３８】
蛋白質分解に対する感受性を決定するために、３７°Ｃで０．６μｇ／ｍｌ中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ，  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１８２‐ＺＮＣ）または０．６μｇ／ｍｌインスリン分解酵素（ＩＤＥ，  Ｍｅｒｃｋ，４０７２４１‐５０ＵＧ）と共に４時間インキュベートした後に、受容体リガンドの活性も特徴付けた。
【０２３９】
図３は、タンパク質分解に対するＡＮＰ  （Ａ−Ｃ）、ＴＰＰ−１０９９２（Ｄ−Ｆ）およびＴＰＰ−５６６１（Ｇ−Ｉ）の安定性をグラフで示している。図３に示すように、ナトリウム利尿ペプチドＡＮＰ  （Ｂａｃｈｅｍ，  Ｈ−２１００）はＮＥＰとＩＤＥによる分解に対して高い感受性を示した。対照的に、ＴＰＰ‐５６６１とＴＰＰ‐１０９９２は、ＮＥＰとＩＤＥによる蛋白質分解に対して高い抵抗性を示した。
【０２４０】
ＮＰＲ−Ａ受容体細胞株におけるＢＮＰ移植抗体の活性データ
既報（Ｗｕｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  ６９８：  １３１））のように、蛍光ベースのラットＢＮＰ受容体（ＮＰＲ−Ａ）細胞株を作製した。すなわち、蛍光ベースのラットＢＮＰ受容体（ＮＰＲ‐Ａ）細胞株を、ＣＮＧＡ２（ｃＧＭＰバイオセンサー）とラットＮＰＲ‐Ａをコードするプラスミド構築物で、蛍光カルシウムセンサー蛋白質ＧＣａＭＰ６を安定に発現するＣＨＯ細胞株を共トランスフェクトすることにより作製した。
【０２４１】
ＢＮＰ受容体ＧＣａＭＰ６細胞を、黒色の透明底３８４ウェルマイクロタイタープレート（２５００細胞／ウェル）上で１日間培養した。細胞培養液を取り出した後、レポーター細胞に３７℃および５％  ＣＯ２で黒色マスキング色素を含むタイロード（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ，５ｍＭ  ＫＣｌ，２ｍＭ  ＣａＣｌ２，２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ，１ｍＭ  ＭｇＣｌ２，４．８ｍＭ  ＮａＨＣＯＯＢ，ｐＨ  ７．４）を２０分間負荷した。内因性ホスホジエステラーゼによるｃＧＭＰ分解を防止するためにＩＢＭＸ  （０．２ｍＭ）を使用した。
【０２４２】
蛍光測定（３分、動態モード）はアゴニスト添加で直接開始した。受容体リガンドを黒色マスキング色素と０．１％  ＢＳＡを含むタイロードに添加した。測定はＦＬＩＰＲテトラ（登録商標）で行った。
【０２４３】
ＢＮＰ  （Ｂａｃｈｅｍ，Ｈ‐５９６８）はＥＣ５０２．９  ｎＭでＮＰＲ‐Ａ細胞株の濃度依存性蛍光シグナルを刺激した。ＴＰＰ−９９０２，  ＴＰＰ‐１１１５３、ＴＰＰ‐１１５４、ＴＰＰ‐１１１５５、ＴＰＰ‐１１１５６およびＴＰＰ‐１１１５７はラットＢＮＰレセプターレポーター細胞株をそれぞれ２．３μＭ、＞１．９μＭ、７  ｎＭ、１２  ｎＭ、１．２μＭおよび１１  ｎＭのＥＣ５０値で刺激した。対照抗体構築物ＴＰＰ−５６５７は、ＮＰＲ−Ａ細胞株を有意に刺激しなかった（最大濃度４６０  ｎＭまで試験）。
【０２４４】
蛋白質分解に対する感受性を決定するために、３７℃で０．６μｇ／ｍｌ中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ，  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１８２‐ＺＮＣ）または０．６μｇ／ｍｌインスリン分解酵素（ＩＤＥ，  Ｍｅｒｃｋ，４０７２４１‐５０ＵＧ）と共に４時間インキュベートした後に、受容体リガンドの活性も特徴づけた。ナトリウム利尿ペプチドＢＮＰ  （Ｂａｃｈｅｍ，Ｈ‐５９６８）はＮＥＰとＩＤＥによる分解に対して高い感受性を示した。対照的に、ＴＰＰ‐１１１５５とＴＰＰ‐１１１５７は、ＮＥＰとＩＤＥによる蛋白質分解に対して高い抵抗性を示した。
【０２４５】
図４は、ＢＮＰ  （Ａ−Ｃ）とＴＰＰ−１１１５５（Ｄ−Ｆ）のタンパク分解に対する安定性をグラフで示したものである。
【０２４６】
ＮＰＲ−Ｂ受容体細胞株におけるＣＮＰ移植抗体の活性データ
蛍光ベースのラットＣＮＰ受容体（ＮＰＲ−Ｂ）レポーター細胞株を作製し、既報（Ｗｕｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ）に従って蛍光測定を行った。６９８：  １３１）．
【０２４７】
ＣＮＰ受容体細胞（２５００細胞／ウェル）を不透明な３８４ウェルマイクロタイタープレート上で１日間培養した。細胞培養液を除去した後、細胞を３７℃および５％  ＣＯ２で、Ｃａ２＋不含タイロード（１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＫＣｌ、２０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、４．８ｍＭ  ＮａＨＣＯＯＢ、ｐＨ  ７．４）中の２．５μｇ／ｍｌのセレンテラジンで３時間負荷した。受容体リガンドを０．１％  ＢＳＡを含むＣａ２＋不含タイロードで１０分間添加した。内因性ホスホジエステラーゼによるｃＧＭＰ分解を防止するためにＩＢＭＸ  （０．２ｍＭ）を使用した。カルシウムイオン（最終濃度３ｍＭ）を加える直前に、遮光箱中の電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラを用いて発光測定を、開始した。発光を５０秒間連続的にモニターした。
【０２４８】
ＣＮＰ  （Ｂａｃｈｅｍ，Ｈ‐１２９６）は０．０２４  ｎＭのＥＣ５０でラットＮＰＲ‐Ｂ細胞株の濃度依存性発光シグナルを刺激した。ＴＰＰ−９４６５、ＴＰＰ−１２３７７、ＴＰＰ−１２３７８、ＴＰＰ‐１２８９７とＴＰＰ‐１２８９９はラットＣＮＰ受容体レポーター細胞株を刺激し、ＥＣ５０はそれぞれ５．２  ｎＭ、４．１  ｎＭ、２５  ｎＭ、１０  ｎＭおよび３．２  ｎＭであった。ＴＰＰ‐１２３７４はラットＣＮＰ受容体レポーター細胞株を１５０  ｎＭのＥＣ５０で刺激し、ＴＰＰ‐１２３７５、ＴＰＰ‐１２３７６は活性の弱い指標を示したのみであった。
【０２４９】
蛋白質分解に対する感受性を決定するために、３７℃で０．６μｇ／ｍｌ中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ，  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，１１８２‐ＺＮＣ）または０．６μｇ／ｍｌインスリン分解酵素（ＩＤＥ，  Ｍｅｒｃｋ，４０７２４１‐５０ＵＧ）と共に４時間インキュベートした後に、受容体リガンドの活性も特徴づけた。
【０２５０】
ナトリウム利尿ペプチドＣＮＰ  （Ｂａｃｈｅｍ，Ｈ‐１２９６）とは対照的に、ＴＰＰ‐１２３７７，ＴＰＰ‐１２８９７およびＴＰＰ‐１２８９９はＮＥＰおよびＩＤＥによる蛋白質分解に対して高い抵抗性を示した。
【０２５１】
図５は、ＣＮＰ  （Ａ−Ｃ）とＴＰＰ−１２８９７（Ｄ−Ｆ）のタンパク分解に対する安定性をグラフで示したものである。
【０２５２】
摘出ラット大動脈輪で測定したＡＮＰ移植抗体の活性データ
すべての実験は施設のガイドラインに従って実施され、動物実験に関する地方委員会の承認を得た。雄Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（体重２５０〜３００ｇ）をペントバルビタールナトリウム（４０ｍｇ／ｋｇ腹腔内投与）で麻酔し、断頭により屠殺し、放血させた。胸部大動脈を切除し、１３０ｍＭ  ＮａＣｌ、１４．９ｍＭ  ＮａＨＣＯ３、５．５ｍＭ  デキストロース、４．７ｍＭ  ＫＣｌ、１．１８ｍＭ  ＫＨ２  ＰＯ４、１．１７ｍＭ  ＭｇＳＯ４７Ｈ２Ｏ、１．６ｍＭ  ＣａＣｌ  ２２Ｈ２Ｏの氷冷クレブス緩衝液に入れ、チルドクレブス液で満たしたシルガードペトリ皿で容器をピン止めし、脂肪と結合組織を洗浄し、長さ約３〜４ｍｍの環セグメントに切断した。９５％  Ｏ２と５％  ＣＯ２の混液で３７℃で連続的に気泡させたクレブス液を含む５０ｍｌチャンバー（ＡＤＩ器具）に大動脈輪を垂直に装着した。等尺性力の変化を、ＰｏｗｅｒＬａｂデータ取得システム（ソフトウェアＬａｂ  Ｃｈａｒｔ  ７．０）を用いて記録した。
【０２５３】
平衡期の後、大動脈輪に８０ｍＭのＫＣｌを負荷し、組織生存性をチェックした。次に、フェニレフリン  （ＰＥ、１μＭ）で前収縮させた血管におけるアセチルコリン（ＡＣｈ、１μＭ）に対する反応性を検証することにより、標本の内皮完全性を判定した。ウォッシュアウトおよび平衡化期間の後、フェニレフリン（ＰＥ、１μＭ）を用いて収縮を誘導し、その後、ナトリウム利尿ペプチドおよびナトリウム利尿ペプチド移植ＩｇＧを血管弛緩について評価した。参考としてラットＡＮＰペプチド（ＡＤＨ‐ＧＭ‐１００５７Ｔ，  Ｓａｎｔａｉ  Ｌａｂｓ）を用いた。
【０２５４】
図６に示すように、ＡＮＰペプチドとＴＰＰ−１０９９２の両方は、ＰＥ収縮大動脈輪において用量依存性血管拡張を誘導した。
【０２５５】
図７に示すように、ＡＮＰペプチドとＴＰＰ−５６６１の両方は、ＰＥ収縮大動脈輪において用量依存性血管拡張を誘導した。
【０２５６】
覚醒ラットで得られたＡＮＰ移植抗体の活性データ
ラジオテレメトリー（Ｄａｔａ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）により自由に動く意識下動物で血圧と心拍数をモニターした。これらの試験には体重２１０〜３００ｇの雌性高血圧自然発症ラット（ＳＨＲ／Ｎ  Ｃｒｌ  ＢＲ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）を用いた。全ての動物を２２〜２４℃の環境温度で個々のケージに収容し、標準的な実験用ラット固形飼料および水に自由にアクセスできる１２時間の明／暗サイクルで維持した。テレメーター（ＨＤ−１０、ＤＳＩ）埋め込みは、動物を血圧測定に使用する前に最低１４日間実施した。手術は無菌条件下で行った。腹壁を剃毛後、腹部正中切開を行い、腸骨分岐部と腎動脈の間の露出した下行大動脈に流体充填センサーカテーテルを上流に挿入した。ＤＳＩガイドラインにより、テレメトリーカテーテルの先端は腎動脈の尾側に位置し、組織接着剤によって固定されていた。発信器本体は閉腹前に腹膜内壁に貼付した。血管外科予防のために、抗菌剤（Ｏｘｙｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎ（登録商標）１０％、６０ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．、０．０６ｍｌ／１００ｇ体重、Ｂｅｔａ−Ｐｈａｒｍａ  ＧｍｂＨ  ＆  Ｃｏ．、ドイツ）とアナロジー剤を１回注入した（Ｒｉｍａｄｙｌ（登録商標）、４ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．、Ｐｆｉｚｅｒ、ドイツ）。ＤＳＩソフトウエアにより遠隔測定データ収集を行い、５分毎に繰り返す１０秒間の血行動態データをサンプリングした。データ収集は薬剤投与の少なくとも２時間前に開始し、測定サイクル終了後に終了した。データは、各群４匹以上の基礎値±  ＳＥＭの％で表す。各動物の基礎値は、物質処置前２時間（午前７時〜午前９時）に測定した値の平均として算出した。その後、データは処置後１５分から開始し、半時間ごとの平均値で表す。全動物にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解した被験物質を単回腹腔内（ｉｐ）適用した。薬剤投与は午前９時（０時間）に行った。
【０２５７】
図８にＡＮＰペプチドの血行力学的効果を、図９にＴＰＰ−５６６１の血行力学的効果を、図１０にＴＰＰ−１０９９２の血行力学的効果をグラフで示す。
【０２５８】
［実施例４］
実施例４：異なるＮＰ移植抗体構築物の作製
【０２５９】
ＣＤＲＨ３以外のＣＤＲ領域にナトリウム利尿ペプチドを取り込んだ構築物については、３残基伸長Ｌｅｕ  Ｔｈｒ  Ｇｌｙ  （ＩＧＨＤ７−２７＊０１）をＨＶ  ３−２３のＣ末端およびＩＧＨＪ１のＮ末端に融合させることにより、おそらく機能的に中立なＣＤＲＨ３を設計した（比較例１）。配列番号６５の対応する全長重鎖配列は、アミノ酸配列Ｃｏｎｓｔａｎｔ−Ｈ  （配列番号８７）をさらに含む。
【０２６０】
ナトリウム利尿ペプチド挿入のない配列番号６５の全長重鎖配列と実施例１に記載の配列番号６６の全長軽鎖配列とを対合させると、合成的でおそらく中立なＩｇＧネガティブコントロールＴＰＰ−５６５７が得られる。
【０２６１】
設計され合成された抗体構築物は、当技術分野でよく知られた方法に従ってクローニングされ、プラスミド特異的オリゴヌクレオチドを用いたＤＮＡ配列決定によって確認された。
【０２６２】
この抗体骨格から出発して、以下のＡＮＰ移植抗体構築物を作製した。
【０２６３】
表４：ＡＮＰ移植抗体構築物の設計
【表４】
2021520801.tif 000007
2021520801.tif 000008
2021520801.tif 000009
2021520801.tif 000010
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2021520801.tif 000012
2021520801.tif 000013
2021520801.tif 000014
2021520801.tif 000015
【０２６４】
表4 続き。:ANP移植抗体構築物の設計
【表５】
2021520801.tif 000016
2021520801.tif 000017
2021520801.tif 000018
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2021520801.tif 000021
2021520801.tif 000022
2021520801.tif 000023
2021520801.tif 000024
【０２６５】
さらに、抗体骨格TPP-5657から出発して、以下のBNP移植ヒトIgG1抗体構築物を作製した。
【０２６６】
表5:BNP移植抗体構築物のデザイン
【表６】
2021520801.tif 000025
【０２６７】
表５  ｃｏｎｔ．：ＢＮＰ移植抗体構築物の設計
【表７】
2021520801.tif 000026
【０２６８】
さらに、以下のＣＮＰ移植ヒトＩｇＧ１抗体構築物を作製した。
【０２６９】
表６：ＣＮＰ移植抗体構築物の設計
【表８】
2021520801.tif 000027
【０２７０】
表6 続き.:CNP移植抗体構築物のデザイン
【表９】
2021520801.tif 000028
【０２７１】
［実施例５］
実施例５：生成した構築物のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性
【０２７２】
全ての構築物を、当技術分野でよく知られた方法に従ってＨＥＫ２９３細胞で一時的に発現させ、約２ｘ１０６細胞／ｍｌの細胞密度、軽鎖および重鎖をコードする２つのプラスミドについて総ＤＮＡ濃度約１μｇ／ｍｌおよび発現のための５日間インキュベーションを標的とした。
【０２７３】
生化合物試料（ｒｃｓ）を培養液量０．４ｍｌで発現させ、遠心分離で分離した上清を直接試験に用いた。化合物濃度は、当該技術分野で周知の方法に従ってＩｇＧ−Ｆｃ定量ＥＬＩＳＡにより評価した。簡単に説明すると、４００ｎｇ／ｍｌから始まるヒト基準血清（Ｂｅｔｈｙｌ，  ＲＳ−１１０−４）の１：１５００希釈上清および２倍希釈系列を、抗ヒトＦｃ  ［Ｓｉｇｍａ  Ｉ２１３６］でコーティングしたブラックＭａｘｉｓｏｒｐ  ３８４マイクロタイタープレート（ＭＴＰ）に、１ｘコーティング緩衝液（Ｃａｎｄｏｒ，  １２１１２５）中１：４４０希釈で１時間、３７℃で固定化した。１００％  ＳＭＡＲＴ  Ｂｌｏｃｋ  （Ｃａｎｄｏｒ，  １１３１２５）抗ヒトＦｃ−ＨＲＰ  ［Ｓｉｇｍａ，  Ａ１７０］で遮断した後、１：１００００希釈で塗布し、ｒｃｓおよび参照試料中の抗体を検出した。表７および８の「μｇ／ｍｌ  ｒｃｓ」欄に示した化合物濃度の定量的評価には、参照試料の用量曲線を用いた。すべての試料を四重項に適用した。
【０２７４】
単離された化合物試料（ｉｃｓ）は、６ｍｌの発現培養物からのプロテイン−Ａを介する１段階精製によって、および当技術分野で周知の方法に従って生成された。８％  （ｖ／ｖ）１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣＬ  ｐＨ  ９．０を付加することで、アクリル類を無害化し、２８０ｎｍでの吸収により定量化し、１２５ｎＭの濃度に正規化した。
【０２７５】
精製化合物試料（ｐｃｓ）は、プロテイン‐Ａを介した２段階精製およびその後のＰＢＳ緩衝液中のＳＥＣにより、少なくとも３５ｍｌの発現培養から作製した。表７および表８のカラム「μｇ／ｍｌ  ｐｃｓ」に示す値は、分析用プロテインＡクロマトグラフィーにより測定した発現培養上清中の化合物濃度を指す。
【０２７６】
表７および８に示す全ての活性は、製造者の指示に従って実施されたｃＧＭＰ定量アッセイ（シスバイオ；  ６２ＧＭ２ＰＥＨ）を使用して、ヒトＮＰＲＡ  （ｈＮＰＲＡ）の異種過剰発現を有する細胞について測定した。要約すると、本アッセイは、（ナトリウム利尿ペプチド）試料を介するＮＰＲＡ刺激の結果として細胞によって産生されるｃＧＭＰと、クリプタート標識抗体への結合のためにｄ２標識されたｃＧＭＰとの競合に基づいて、緩衝溶液または細胞培養上清中のｃＧＭＰを定量する。試料ｃＧＭＰおよびｄ２標識ｃＧＭＰは、Ｃｒｙｐｔａｔｅ標識抗ｃＧＭＰ抗体上の限られた数の部位への結合について競合し、その結果、ＨＴＲＦ（登録商標）特異的蛍光シグナル（すなわち、エネルギー移動）は、試料中のｃＧＭＰの濃度に逆比例する。
【０２７７】
用量−反応曲線データはＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  （ｖｅｒｓｉｏｎ  ７．００  ｆｏｒ  Ｗｉｎｄｏｗｓ，  ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，  Ｌａ  Ｊｏｌｌａ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＵＳＡ）で解析し、ＥＣ５０はＹ＝Ｂｏｔｔｏｍ  ＋  （Ｔｏｐ−Ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０＾（（ＬｏｇＥＣ５０−Ｘ）＊ＨｉｌｌＳｌｏｐｅ））に従って、下、上および傾き（それぞれの実験のすべてのデータセットについて共有値）に制約を適用して適合させた。
【０２７８】
安定なｈＮＰＲＡ−ＣＨＯ  ｋ１細胞上の原料化合物試料活性を、陰性対照ＴＰＰ−５６５７および陽性試料、特にＴＰＰ−５６６１との比較によって最初に評価した。対照およびｒｃｓは、アッセイのダイナミックレンジにおける蛍光シグナル（ｓ）を目的とした相対希釈係数５で、２つの濃度において四重項で試験した。アッセイウインドウは不活性（ｍａｘ．  ｓｉｇｎａｌ，  ｓ＿ｍａｘ）および高活性試料（ｍｉｎ．  ｓｉｇｎａｌ，  ｓ＿ｍｉｎ）のシグナルの差として定義し、両化合物濃度について％における活性を１００＊（ｓ＿ｍａｘ−ｓ）／（ｓ＿ｍａｘ−ｓ＿ｍｉｎ）として計算した。表７の「活動性ｒｃｓ」と「ｓｔｄｅｖ活動性ｒｃｓ」の項目に示す値は、２つの濃度の結果の平均とそれぞれの標準偏差を表している。参照化合物ＴＰＰ−５６６１のシグナルの半分未満（３６％）のＲｃｓシグナルは、非活性（ｎ．ａ．）と評価された。
【０２７９】
安定なｈＮＰＲＡ‐ＣＨＯ  ｋ１細胞上のいくつかの生化合物試料の活性を、５倍希釈から開始する２．５倍希釈系列（８濃度）で参照試料ＴＰＰ‐５６６１と比較することにより再評価した。ｒｃｓの活動尺度としての「ｌｏｇＥＣ５０」フィット値を、デルタ「ｌｏｇＥＣ５０」＿ｃｏｍｐｏｕｎｄ−「ｌｏｇＥＣ５０」＿ＴＰＰ−５６６１を算出して基準となるｒｃｓ  ＴＰＰ−５６６１の対応値と関連付けて設定し、得られた値を表７の「ｒｅｌ．ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｃｓ」欄に記載した。特に、ｒｃｓ中の化合物濃度は考慮されず、従って、与えられた値は、等しい測定における化合物活性および濃度によって影響される。すべての試料を四重項に適用した。
【０２８０】
安定なｈＮＰＲＡ‐ＣＨＯ  ｋ１細胞に対する単離化合物試料の活性をＥＣ５０測定および参照試料ＴＰＰ‐５６６１との比較により評価した。標本は、８０ｎＭから０．１３ｎＭまでの２．５倍の希薄化系列でテストされた。ｉｃｓの活動尺度としてのｌｏｇＥＣ５０フィット値は、ｄｅｌｔａ  ｌｏｇＥＣ５０＿ｃｏｍｐｏｕｎｄ  −  ｌｏｇＥＣ５０＿ＴＰＰ−５６６１を算出して基準値ＴＰＰ−５６６１（−８．８）の対応値と関連付けて設定し、得られた値を表７の「ｒｅｌ．  ｌｏｇＥＣ５０  ｉｃｓ」欄に記載した。すべての試料を四重項に適用した。
【０２８１】
安定なｈＮＰＲＡ‐ＣＨＯ  ｋ１細胞に対する精製化合物試料の活性をＥＣ５０決定および参照試料ＴＰＰ‐５６６１との比較により複数の実験で評価した。試料は、少なくとも四重項で希釈系列で試験した。表７、欄「ｒｅｌ．  ｌｏｇＥＣ５０  ｐｃｓ  １、３および４」に記載された値は、２０または２５ｎＭから開始する５倍希釈系列（≧４濃度）に起因する。表７の「ｒｅｌ．  ｌｏｇＥＣ５０  ｐｃｓ  ２」の欄に記載されている値は、２５ｎＭから始まる１０倍希釈系列（４濃度）の結果である。表７に列挙されている値「ｒｅｌ．  ｌｏｇＥＣ５０  ｐｃｓ  ５，  ６，  ７，  ８，  ９」は、それぞれ４０〜２００ｎＭから始まる８または１２濃度の２．５倍の希薄化系列の結果である。ｐｃｓの活動性尺度としてのｌｏｇＥＣ５０フィット値は、デルタｌｏｇＥＣ５０＿ｃｏｍｐｏｕｎｄ−ｌｏｇＥＣ５０＿ＴＰＰ−５６６１を算出し、それぞれの実験における基準ＴＰＰ−５６６１の対応値（平均−９．２、標準偏差０．５）との関連で設定した。
【０２８２】
一過性ｈＮＰＲＡ−ＨＥＫ２９３細胞に対する精製化合物試料の活性を、ＥＣ５０測定および参照試料ＴＰＰ−５６６１との比較により３つの実験で評価した。標本は、１０００ｎＭから０．０１３ｎＭまでの５倍の希薄化系列でテストされた。ｐｃｓの活動性尺度としてのｌｏｇＥＣ５０フィット値は、デルタｌｏｇＥＣ５０＿ｃｏｍｐｏｕｎｄ−ｌｏｇＥＣ５０＿ＴＰＰ−５６６１を算出して、それぞれの実験における基準ＴＰＰ−５６６１の対応値（３実験の平均−９．０、標準偏差０．４）と関連付けて設定し、得られた値を表７の「ｒｅｌ．  ｌｏｇＥＣ５０＊  ｐｃｓ」欄に記載した。すべてのサンプルを重複して適用した。
【０２８３】
化合物の活性の要約された定性的評価を「定性的活性」の欄に示し、「平均ｒｅｌ．  ｌｏｇＥＣ５０」の欄に記載された値を与えられたｒｅｌの平均として計算した。ｌｏｇＥＣ５０値参照化合物ＴＰＰ−５６６１のＥＣ５０値＞５０倍を示し、平均相対ｌｏｇＥＣ５０＞１．７の化合物は、活性を示さない（−）と定性的に評価され、０．７〜１．７の相対ｌｏｇＥＣ５０を示す化合物は活性を示す（＋）と評価され、相対ｌｏｇＥＣ５０＜０．７を示す化合物は非常に高い活性を示す（＋＋）と評価され、相対ｌｏｇＥＣ５０が−０．７以下（＋＋＋）で最も高い活性が認められた。ｉｃｓまたはｐｃｓと確認されないｒｃｓで活性を示す化合物は統一された“  ｙ  ”で印を付け、また、発現量が非常に低い（“μｇ／ｍｌ  ｒｃｓ”欄の≦１μｇ／ｍｌ，“ｎ．ｅ．”）ために活性がないと評価された化合物（“活性  ｒｃｓ”欄の“ｎ．a．”）と考えられる化合物はそれに応じて印をつける。
【０２８４】
表７：心房性ナトリウム利尿ペプチド移植抗体構築物の発現レベルおよび活性
判定不能（ｎ．ｄ．）、活性なし（ｎ．ａ．）、発現なし（ｎ．ｅ．）、該当なし（ｎａ）
【表１０】
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【０２８５】
化合物＃１０４および＃１３５に関する決定的なデータは得られなかった。１２化合物（＃５４、＃６１、＃８９、＃１３９、＃１６２、＃１６８、＃１７０、＃１７１、＃１７２、＃１７３、＃１７６、＃１９６）は非常に低い発現レベル（ｒｃｓで≦１μｇ／ｍｌ）を示し、結果的に活性を示さなかった；化合物調製（ｐｃｓ）後に＃６１の活性を示した。７化合物（＃７、＃２４、＃７０、＃８３、＃９０、＃１５４、＃１６７）は発現量が非常に低いものの、ほとんどの場合ｒｃｓとして低活性を示し、＃２４および＃９０の活性は化合物製剤（ｐｃｓ）により確認された。化合物＃１８、＃２６、＃２９、＃９２、＃９６、＃１０１、＃１０４、＃１５８、＃１６４、＃１７９のｒｃｓでは活性は観察されなかったが、化合物＃１８、＃９２、＃１５８、＃１６４の活性はより高濃度（ｒｅｌ．  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｒｃｓ）を用いて示され、＃２６の活性の欠如がそれによって確認された。
【０２８６】
表８：脳性ナトリウム利尿ペプチド移植抗体構築物の発現レベルと活性
該当せず（ｎａ）
【表１１】
2021520801.tif 000036
【０２８７】
精製された化合物試料は、実施例3に記載されているように、安定なhNPRA-CHO k1細胞上で希釈系列中の四重項で試験された。BNP移植抗体構築物の活性を図11にグラフで示す。
【０２８８】
TPP-11156, TPP‐9902およびTPP‐11153は、TPP‐1154,TPP‐11155およびTPP‐11157とは対照的にhNPRA細胞に対して有意な活性を示した。TPP-1154、TPP-11155、TPP-11157についてはEC50<20nM、TPP-9902、TPP-11153、TPP-11156についてはEC50>1μMのrNPRAについて反対の結果が認められた(実施例3参照)。これは、TPP-11156、TPP-9902およびTPP-11153にヒトBNP配列が存在することにより説明でき、TPP-1154、TPP-11155およびTPP-11157はラットBNP配列を含む(表5参照)。他のすべてのヒトBNP移植抗体構築物とは対照的に、BNPに対するN末端およびC末端の付加アミノ酸数の少ないTPP‐18031およびTPP‐18032は、hNPRAに対して活性を示さなかった。
【０２８９】
［実施例６］
実施例６：特定のリンカー配列は、良好な均一性および発現レベルを達成するために特に有利である
【０２９０】
精製化合物試料（実施例５、表７、カラム「％純度ｐｃｓ」）の純度は、還元条件下で製造業者の指示（ＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ、カリパーライフサイエンス社）に従ってキャピラリーゲル電気泳動法により測定した。％における純度は、観察された全てのピークの合計に対するインタクトな軽鎖および重鎖に対応するピーク面積の合計として計算された。
【０２９１】
ＧＳリンカー配列、ＰＮリンカー配列または配列番号２、４、９、１１、１３または１５の配列、およびＧＳリンカー配列、ＰＮリンカー配列または配列番号３、５、１２、１４、１５または２０の配列を含むＣｔｌｓ配列は、高いナトリウム利尿ペプチド活性を達成するために特に有用であることが証明されている（ただし、少なくとも１２個のアミノ酸残基がそれぞれのＮ末端参照アミノ酸残基と挿入ナトリウム利尿ペプチドの最初のアミノ酸との間に存在することを条件とする）だけでなく、良好な発現レベル（例えば、化合物番号１８６、＃１９５および＃２０２で使用される配列とは対照的に）および（例えば、化合物６および７で使用される配列とは対照的に）低い不均一性（表９参照）も達成するためである。ＧＳリンカー配列を含むリンカー配列ならびにＰＮリンカー配列を含むリンカー配列では、平均して９８％の非常に良好な純度が観察された。配列番号２、３、４、５、９、１１、１２、１３、１４、１５および２０の配列を含むリンカーを有する化合物についても、同様に良好な値が観察された。特に、配列番号９の配列を有するＮｔｌｓは、配列番号２０の配列を有するＣｔｌｓとの組み合わせにおいてのみ、非常に良好な純度を有する化合物が生じた；配列番号１１の配列を有するＮｔｌｓと配列番号１２の配列を有するＣｔｌｓの組み合わせを有する化合物は、化合物＃１２６や＃１３５のように、配列番号１１がＮ末端においてＡｓｐ（Ｄ）に隣接し、Ｔｈｒ（Ｔ）およびＶａｌ（Ｖ）に隣接しない場合および配列番号１２ＶＮＨＬＲＳＥＫＬＴがＣ末端においてＧｌｙ（Ｇ）に隣接し、Ｔｙｒ（Ｔ）およびＰｈｅ（Ｆ）に隣接しない場合には非常に優れた純度のみを示した。      
【０２９２】
表９：抗体純度に対するＮｔｌｓおよびＣｔｌｓの影響（表７抜粋）
【表１２】
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【０２９３】
［実施例７］
実施例７：  ＩｇＧ１、ＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプは、等しく適当な抗体スカホールドを提供する
化合物９、３３、６５、９１、１２７および１９１（それぞれ、ヒトＩｇＧ１  ＴＰＰ−１０２９４、ＴＰＰ−１０２７７、ＴＰＰ−１０２７９、ＴＰＰ−１０２８２、ＴＰＰ−１０２６９およびＴＰＰ−１０３５５）を、異なるＩｇＧアイソタイプとして生成した。精製された化合物試料は、実施例３に記載されているように、安定なｈＮＰＲＡ−ＣＨＯ  ｋ１細胞上で希釈系列中の四重項で試験された。ＡＮＰを移植したヒトＩｇＧ２およびＩｇＧ４アイソタイプ構築物（例えば、化合物９  ＩｇＧ４  ＴＰＰ−１０９９２）の活性は、図１２にグラフで示されているように、対応するＩｇＧ１アイソタイプと類似している。
【０２９４】
［実施例８］
実施例８：ヒトおよび非ヒトＩｇＧは等しく適当な抗体骨格を提供する
化合物９（ヒトＩｇＧ１  ＴＰＰ‐１０２９４およびＩｇＧ４  ＴＰＰ‐１０９９２）および化合物１１７（ヒトＩｇＧ１  ＴＰＰ‐５６６５）を非ヒトＩｇＧアイソタイプとして作製した。精製された化合物試料は、実施例３に記載されているように、安定なｈＮＰＲＡ−ＣＨＯ  ｋ１細胞上で希釈系列中の四重項で試験された。ＡＮＰ移植ラットおよびマウスアイソタイプ構築物、例えば化合物９ラットＩｇＧ１  ＴＰＰ−１３９９２は、それらの対応するヒトＩｇＧアイソタイプと同様の活性を示した（図１３）。
【０２９５】
［実施例９］
実施例９：様々な生殖系列配列を含むヒトＩｇＧは、等しく適当な抗体スカホールドを提供する
さらに２２のＡＮＰ移植ＩｇＧ４抗体（化合物Ａ〜Ｓ）を構築した。各症例において、ＡＮＰはＣＤＲＨ１内に取り込まれた。これらの構築物の重鎖は、種々のＨＶおよびＣＤＲＨ３配列を含み、種々のラムダまたはカッパ軽鎖と対合した。化合物Ａ〜Ｓの構造を表１０および表１１に要約する。
【０２９６】
表１０：ＡＮＰ移植抗体構築物Ａ〜Ｓのデザイン
【表１３】
2021520801.tif 000041
【０２９７】
表１１：ＡＮＰ移植抗体構築物Ａ〜Ｓのデザイン
【表１４】
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様々な生殖系列配列を含むＩｇＧ骨格構築物Ａ〜Ｓの精製化合物試料を、実施例３に記載されているように、安定なｈＮＰＲＡ−ＣＨＯ  ｋ１細胞上で希釈系列で四重項で試験した。例示的な活性データを図１４に図示した。
【０２９８】
［実施例１０］
実施例１０：  ＣＮＰ移植ＩｇＧは、誘導された内皮バリア透過性に対して保護する
マイクロ電極（Ｅ‐Ｐｌａｔｅｓ）で覆われたマイクロタイターウェルプレートを利用して、ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅ  ＲＴＣＡシステムによるリアルタイムインピーダンス測定により内皮単層透過性をアッセイした。相対インピーダンス変化はｕｎｉｔｌｅｓｓ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｄｅｘ  （ＣＩ）値で表される。
【０２９９】
初代ヒト肺動脈内皮細胞（ＨＰＡＥＣ）をコラーゲン前被覆Ｅ‐Ｐｌａｔｅｓで低継代で播種した。一定のＣＩ値による厳密な単層および細胞関門形成後、ＨＰＡＥＣを化合物ＴＰＰ−１２８９９またはそれぞれの陰性対照抗体構築物ＴＰＰ−５６５７の示された濃度で前処理し、続いて破壊アゴニストＬＰＳ  （２００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（０．５ｎｇ／ｍｌ）、またはトロンビン（２Ｕ／ｍｌ）でＥＣ関門を損なう。ＣＩを１０分毎に記録し、細胞増殖および単層透過性への影響をモニタリングした。すべての細胞指標は、被験物質塗布前の最終記録点で正常化した（＝標準化ＣＩ）。
【０３００】
実験はｎ＝４で、それぞれ３つの技術的トリプリケーションで行った。結果は平均値±標準誤差で表した。データは一元配置分散分析に続いてＳｉｄａｋの多重事後検定を用いて統計的に分析した；ｐ値＜０．０５を有意とみなした。
【０３０１】
図１５は、Ｃｅｌｌ  Ｉｎｄｅｘ値で表した内皮単層透過性に対する作用をグラフで示したものである。図１５に示すように、ＴＰＰ−１２８９９によるヒト内皮単層培養の前処理は、誘導された内皮バリア透過性に対して用量依存的に保護した。これは適用されたバリア破壊剤とは無関係であった；両方とも、速効性および強効性トロンビンならびに長時間持続する炎症誘発性刺激ＬＰＳおよびＩＬ−１βの有意な効果が観察された。それぞれの陰性対照は影響を示さなかった。
【０３０２】
［実施例１１］
実施例１１：慢性心不全ラットモデル（ＴＧＲ（ｍＲｅｎＲ２）２７）におけるＡＮＰ移植ＩｇＧの長期効果
【０３０３】
ＴＧＲ（ｍＲｅｎＲ２）２７ラットモデルは、高血圧および内皮機能障害、ならびに末端器官障害を示す。８週齢の雄性レニン−トランスジェニックラット（Ｇａｎｔｅｎ  Ｄ．、Ｎａｔｕｒｅ．１９９０；  ３４４（６２６６）：５４１−４）を用いた。一酸化窒素合成酵素Ｌ‐ＮＡＭＥの非選択的阻害剤（Ｎω‐ニトロ‐Ｌ‐アルギニンメチルエステル）を、すべての試験群で飲水（２０ｍｇ／ｌ）を介して永続的に投与し、内皮機能障害を誘発した。ＴＰＰ−１３９９２，  実施例８で使用したＴＰＰ−１０２９４のラットＩｇＧ１対応物およびラットＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体であるＴＰＰ−１０１５５を、週１回、腹腔内投与した。体重および生存率を評価した。プラセボ群は溶媒（ＰＢＳ）で、健常対照群は離乳からカプトプリル食で処置した。食物と水は自由に与えられた。動物の行動および全身健康状態の毎日の観察を行った。実験終了時（１４週目）に、ラットを麻酔した。その後、ラットを放血させ、分析のために胸腔から心臓を除去した。試験終了時に尿を採取し、異なる尿パラメータ、例えば尿蛋白クレアチニン比を測定した。図１６は、生存、体重増加、尿蛋白／クレアチニン比および左心房重量に対するＴＰＰ−１３９９２の治療効果をグラフで示す。
【０３０４】
［実施例１２］
実施例１２：健常ビーグル犬におけるＡＮＰ移植ＩｇＧの血行動態への影響
【０３０５】
意識下遠隔測定ビーグル犬を用いた効力を裏付ける薬力学試験において、ＴＰＰ−１０９９２の単回皮下投与時の心血管系および心電図パラメータに及ぼす効果が検討された。
【０３０６】
遠隔測定装置（ＤＳＩ（登録商標）、ＵＳＡ）を外科的に埋め込み、血圧ならびに心拍数を測定し、その後、創閉鎖を可能にする回復期間を設けた。試験当日、連続的な血行動態測定のためにテレメトリーセンサーを作動させた。伝送された信号は、動物施設に位置するテレメトリー受信機によって収集された。収集されたデータはすべてデータ収集プログラムによって処理され、あらかじめ定義された１２時間にわたって平均化された。ＴＰＰ−１０９９２  ＮａＣｌの溶媒（０．９％）として、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇおよび１．０ｍｇ／ｋｇ体重を皮下注射した。
【０３０７】
その結果を図１７にグラフで示した。健康なイヌにおいて、ＴＰＰ−１０９９２は、１．０ｍｇ／ｋｇ  ｓ．ｃ．  （プラセボと比較して）で有意であった血圧の用量依存的かつ長期間持続する（＞５ｄ）低下を示した。心拍数への影響は認められなかった。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021520801.tif 000061
2021520801.tif 000062