(57)【要約】  サイトカインおよび新規ＣＤ４７抗体またはその免疫学的に活性のある断片を含む融合タンパク質、ならびに病気の治療または食作用もしくは血小板凝集の抑制に使用できる、前記融合タンパク質を含む薬剤組成物を提供する。これらの融合タンパク質は、ヒトにおいて低い免疫原性を有し、赤血球の枯渇または赤血球凝集を低レベルでまたはまったく引き起こさない。【選択図】なし
2021502324.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片およびサイトカインを含む、融合タンパク質であって、
前記モノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、ヒトＣＤ４７に結合し、前記モノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、前記モノクローナル抗体またはその断片と前記サイトカインとの間のリンカーの有無にかかわらずＮ−末端で前記サイトカインと融合する、融合タンパク質。
【請求項２】
前記モノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、および配列番号：７７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の可変重（ＶＨ）鎖配列；ならびに
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、および配列番号：７８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の可変軽（ＶＬ）鎖配列
を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、ＶＨ／ＶＬ対を含み、前記ＶＨ／ＶＬ対は、配列番号：１および配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４、配列番号：５および配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０、配列番号：１１および配列番号：１２、配列番号：１３および配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：２２、配列番号：２３および配列番号：２４、配列番号：２５および配列番号：２６、配列番号：２７および配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０、配列番号：３１および配列番号：３２、配列番号：３３および配列番号：３４、配列番号：３５および配列番号：３６、配列番号：３７および配列番号：３８、配列番号：３９および配列番号：４０、配列番号：４１および配列番号：４２、配列番号：４３および配列番号：４４、配列番号：４５および配列番号：４６、配列番号：４７および配列番号：４８、配列番号：４９および配列番号：５０、配列番号：５１および配列番号：５２、配列番号：５３および配列番号：５４、配列番号：５５および配列番号：５６、配列番号：５７および配列番号：５８、配列番号：５９および配列番号：６０、配列番号：６１および配列番号：６２、配列番号：６３および配列番号：６４、配列番号：６５および配列番号：６６、配列番号：６７および配列番号：６８、配列番号：６９および配列番号：７０、配列番号：７１および配列番号：７２、配列番号：７３および配列番号：７４、配列番号：７５および配列番号：７６、ならびに配列番号：７７および配列番号：７８からなる群より選択されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の対と少なくとも９５％同一のＶＨおよびＶＬ鎖配列を含む、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、ＶＨ／ＶＬ対を含み、前記ＶＨ／ＶＬ対は、配列番号：１および配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４、配列番号：５および配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０、配列番号：１１および配列番号：１２、配列番号：１３および配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：２２、配列番号：２３および配列番号：２４、配列番号：２５および配列番号：２６、配列番号：２７および配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０、配列番号：３１および配列番号：３２、配列番号：３３および配列番号：３４、配列番号：３５および配列番号：３６、配列番号：３７および配列番号：３８、配列番号：３９および配列番号：４０、配列番号：４１および配列番号：４２、配列番号：４３および配列番号：４４、配列番号：４５および配列番号：４６、配列番号：４７および配列番号：４８、配列番号：４９および配列番号：５０、配列番号：５１および配列番号：５２、配列番号：５３および配列番号：５４、配列番号：５５および配列番号：５６、配列番号：５７および配列番号：５８、配列番号：５９および配列番号：６０、配列番号：６１および配列番号：６２、配列番号：６３および配列番号：６４、配列番号：６５および配列番号：６６、配列番号：６７および配列番号：６８、配列番号：６９および配列番号：７０、配列番号：７１および配列番号：７２、配列番号：７３および配列番号：７４、配列番号：７５および配列番号：７６、ならびに配列番号：７７および配列番号：７８からなる群より選択されるＶＨおよびＶＬ鎖配列を有する、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、キメラまたはヒト化である、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、ヒトＣＤ４７がシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）と相互作用することを防止する、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、ＣＤ４７発現細胞のマクロファージが介する食作用を促進する、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、有意なレベルの赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさない、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
前記単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさない、請求項２に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記サイトカインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）、造血成長因子、インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン−１７受容体、または単量体糖たんぱく質を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記サイトカインは、前記単量体糖たんぱく質であり、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である、請求項１０に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記モノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、リンカーなしで、または（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）６、（ＧＳ）９、ＩＧＤ（Ｆ３０）、ＩＧＤ（Ｆ６４）、ＩＧＤ（Ｒ３０）、ＩＧＮ（Ｒ６４）、ＩＧＤ（Ｒ３０−Ｃｙｓ）、およびＩＧＤ（Ｒ６４−Ｃｙｓ）からなる群から選択されるリンカーで前記サイトカインと融合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記融合タンパク質、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
ヒトＣＤ４７とヒトＳｉＲＰαとの間の相互作用を阻害する。
【請求項１５】
前記融合タンパク質は、小分子治療薬またはマーカーをさらに含み、
前記小分子治療薬またはマーカーは、前記モノクローナル抗体もしくはその免疫学的に活性のある断片、または前記サイトカインとコンジュゲートする、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記小分子治療薬は、抗癌または抗炎症剤であり、前記マーカーは、バイオマーカーまたは蛍光マーカーである、請求項１６に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質および製薬上許容できる担体を含む薬剤組成物。
【請求項１８】
病気を処置する必要のあるヒト患者の病気の処置方法であって、
前記方法は、治療上有効な量の請求項１〜１６のいずれか１項に記載の融合タンパク質または請求項１７に記載の薬剤組成物を前記患者に投与することを有し；前記病気は、癌、線維症、食作用の阻害に関連する病気、または血小板凝集に関連する病気である、方法。
【請求項１９】
前記癌は、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、大腸癌、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大型顆粒リンパ球白血病、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、骨髄腫、単球性白血病、Ｂ細胞白血病、Ｔ細胞白血病、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞由来リンパ腫、子宮内膜癌、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、および固形腫瘍からなる群より選択され；前記線維症は、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、喘息、嚢胞性線維症、気管支炎、および喘息からなる群より選択され；前記食作用の阻害に関連する病気は、心血管疾患であり；前記血小板凝集に関連する病気は、グランツマン血小板無力症(Glanzmann Thrombasthenia)、出血時間延長、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）、フォン・ヴィレブランド病（ｖＷＤ）である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記心血管疾患は、アテローム性動脈硬化症、発作、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、および静脈血栓症からなる群より選択される、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、２０１８年１１月１０日に提出された国際出願番号ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１１０５１７の優先権を主張し、その内容は全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＣＤ４７(Cluster of Differentiation 47)は、１９８０年代にヒト卵巣癌で腫瘍抗原として最初に同定された。それから、ＣＤ４７は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、膀胱癌、や他の固形腫瘍などの複数のヒト腫瘍タイプで発現することが見出された。高レベルのＣＤ４７により、癌細胞はより高レベルのカルレティキュリン−優勢の前−食作用シグナル(dominant pro-phagocytic signal)を有するにもかかわらず食作用がなくなる。
【０００３】
インテグリン結合タンパク質(integrin-associated protein)（ＩＡＰ）、卵巣癌抗原ＯＡ３、Ｒｈ関連抗原及びＭＥＲ６としても知られているが、ＣＤ４７は、免疫グロブリンスーパーファミリーに属するマルチスパンニング膜貫通型受容体(multi-spanning transmembrane receptor)である。その発現および活性は、数多くの病気や疾患とかかわりがある。ＣＤ４７は、１つのＩｇ様ドメイン及び５つの膜貫通領域(membrane spanning region)を有する広範に発現する膜貫通型糖タンパク質であり、シグナル調節タンパク質α(signal-regulatory-protein α)（ＳＩＲＰα）のＮＨ２−末端Ｖ様ドメインを介して結合するＳＩＲＰαの細胞リガンドとして機能する。ＳＩＲＰαは、マクロファージ、顆粒球、骨髄樹状細胞（ＤＣ）、肥満細胞、及び造血幹細胞等のこれらの前駆細胞などの骨髄性細胞で主に発現する。
【０００４】
マクロファージは、食作用により病原体やダメージを受けたまたは老齢の血流の細胞を取り除く。細胞表面のＣＤ４７は、マクロファージ上のレセプターである、ＳＩＲＰαと相互作用して、正常な健常細胞の食作用を阻害する。ＳＩＲＰαは、マクロファージによって宿主細胞の食作用を阻害し、宿主標的細胞で発現するＣＤ４７によるマクロファージ上のＳＩＲＰαのライゲーションにより、食作用をネガティブに調節するＳＨＰ−１によって仲介される阻害シグナルを生じさせる。
【０００５】
ＣＤ４７が正常細胞の食作用を阻害する役割を維持すると、その移行期の直前または移行期中に造血幹細胞（ＨＳＣ）や前駆細胞で一時的にアップレギュレートされ、これらの細胞でのＣＤ４７のレベルによりインビボで飲み込まれる可能性が決定されるという証拠がある。
【０００６】
ＣＤ４７はまたその構造により、骨髄性白血病等の、数多くの癌でアップレギュレートされる。骨髄性白血病細胞系でのＣＤ４７の過剰発現は、食作用を避けさせることによってその病原性を増加させる。ＣＤ４７のアップレギュレーションは炎症によるモビリゼーション(mobilization)中の正常なＨＳＣへの保護を提供するための重要なメカニズムであり、白血病前駆細胞(leukemic progenitor)がマクロファージを殺すことを避けるためにこの能力を吸収する(co-opt)と結論つけた。
【０００７】
特定のＣＤ４７抗体が食作用を回復させてアテローム性動脈硬化症を防止することが示された。例えば、Kojima et al., Nature, Vol. 36, 86-90 (Aug. 4, 2016)を参照。本発明は、ヒトでの免疫原性が低く、赤血球の枯渇(red blood cell depletion)のレベルが低いまたはない新規なＣＤ４７抗体またはその免疫学的に活性のある断片を提供する。当業者にはよく知られているように、このような抗体は、「抗ＣＤ４７抗体」とほとんど同じ意味で呼ばれる。
【０００８】
サイトカインは、細胞シグナル伝達において重要である、広くてルーズなカテゴリーの低分子タンパク質（〜５−２０ｋＤａ）である。それらの放出は、それらの周囲の細胞の挙動に影響を与える。サイトカインは、免疫調節剤として自己分泌シグナル伝達、傍分泌シグナル伝達および内分泌シグナル伝達に関与していると言える。それらのホルモンとの明確な区別は、まだ進行中の研究の一部である。サイトカインは、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子を含むが、一般的にはホルモンや成長因子を含まない（用語が多少重複しているにもかかわらず）。サイトカインは、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および肥満細胞のような免疫細胞、ならびに内皮細胞、線維芽細胞、および様々な間質細胞を含む広範囲の細胞によって産生される；所与のサイトカインは、複数の種類の細胞によって産生され得る。それらは、受容体を介して作用し、免疫系において特に重要である；サイトカインは、体液性免疫応答と細胞性免疫応答との間のバランスを調整し、それらは、特定の細胞集団の成熟、増殖、および応答性を制御する。いくつかのサイトカインは、他のサイトカインの作用を複雑な方法で増強または阻害する。それらは、健康および疾患、特に感染に対する宿主の応答、免疫応答、炎症、外傷、敗血症、癌および生殖において重要である。
【０００９】
サイトカインである顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）は、骨髄の再構成のために臨床的に使用されている先天的かつ適応的な免疫応答を高めるための周知の免疫刺激剤である。それは、マクロファージを特異的に活性化し、マクロファージ表現型をＭ２からＭ１にシフトさせることができる。
【００１０】
ＣＤ４７抗体といかなる種類のサイトカインとの融合タンパク質は、今日まで報告されておらず、示唆さえされていない。
【発明の概要】
【００１１】
発明の要約
一態様では、本発明は、ヒトＣＤ４７に結合する単離モノクローナル抗体およびその免疫学的に活性のある断片を提供する。簡略して表現するために、上記ＣＤ４７に結合する単離モノクローナル抗体およびその免疫学的に活性のある断片を、以降では「ＣＤ抗体」と称する。本発明のＣＤ４７抗体は、ＣＤ４７の発現、活性および／またはシグナル伝達、またはＣＤ４７とＳＩＲＰαとの相互作用を、調節する、例えば、遮断する、阻害する、抑制する、拮抗する、中和する、または干渉することが可能である。非常に驚くべきことに、本発明のＣＤ４７抗体は、通常、有意なレベルのヒト赤血球の枯渇または赤血球凝集を引き起こさず、驚くべきことに、多くの場合において、ヒト赤血球の枯渇または赤血球凝集を全く引き起こさない。さらに、本発明のＣＤ４７抗体は、強力な抗腫瘍活性を示した。
【００１２】
実施形態によっては、本発明のＣＤ４７抗体は、それぞれ、（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、および配列番号：７７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％）同一の可変重（ＶＨ）鎖配列；ならびに（ｂ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、および配列番号：７８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％）同一の可変軽（ＶＬ）鎖配列を有する。
【００１３】
他の実施形態によっては、本発明のＣＤ４７抗体は、それぞれ、配列番号：１および配列番号：２（即ち、１Ａ１）、配列番号：３および配列番号：４（即ち、１Ｆ８）、配列番号：５および配列番号：６（即ち、２Ａ１１）、配列番号：７および配列番号：８（即ち、２Ｃ２）、配列番号：９および配列番号：１０（即ち、２Ｄ７）、配列番号：１１および配列番号：１２（即ち、２Ｇ４）、配列番号：１３および配列番号：１４（即ち、２Ｇ１１）、配列番号：１５および配列番号：１６（即ち、６Ｆ４）、配列番号：１７および配列番号：１８（即ち、５Ｈ１）、配列番号：１９および配列番号：２０（即ち、５Ｆ６）、配列番号：２１および配列番号：２２（即ち、１Ｆ３）、配列番号：２３および配列番号：２４（即ち、２Ａ４）、配列番号：２５および配列番号：２６（即ち、２Ｂ１２）、配列番号：２７および配列番号：２８（即ち、１３Ａ１１）、配列番号：２９および配列番号：３０（即ち、１５Ｅ１）、配列番号：３１および配列番号：３２（即ち、１３Ｈ３）、配列番号：３３および配列番号：３４（即ち、１４Ａ８）、配列番号：３５および配列番号：３６（即ち、１６Ｈ３）、配列番号：３７および配列番号：３８（即ち、１Ａ１）、配列番号：３９および配列番号：４０（即ち、１Ａ１−Ａ）、配列番号：４１および配列番号：４２（即ち、１Ａ１−Ｑ）、配列番号：４３および配列番号：４４（即ち、１Ａ２）、配列番号：４５および配列番号：４６（即ち、１Ａ８）、配列番号：４７および配列番号：４８（即ち、１Ｂ１）、配列番号：４９および配列番号：５０（即ち、１Ｂ２）、配列番号：５１および配列番号：５２（即ち、１Ｈ３）、配列番号：５３および配列番号：５４（即ち、１Ｈ３−Ｑ）、配列番号：５５および配列番号：５６（即ち、１Ｈ３−Ａ）、配列番号：５７および配列番号：５８（即ち、２Ａ２）、配列番号：５９および配列番号：６０（即ち、２Ａ３）、配列番号：６１および配列番号：６２（即ち、２Ａ６）、配列番号：６３および配列番号：６４（即ち、２Ａ１０）、配列番号：６５および配列番号：６６（即ち、２Ｂ１）、配列番号：６７および配列番号：６８（即ち、２Ｃ６）、配列番号：６９および配列番号：７０（即ち、２Ｅ７）、配列番号：７１および配列番号：７２（即ち、２Ｅ９）、配列番号：７３および配列番号：７４（即ち、２Ｆ１）、配列番号：７５および配列番号：７６（即ち、２Ｆ３）、ならびに配列番号：７７および配列番号：７８（即ち、３４Ｃ５）からなる群より選択される１対のＶＨおよびＶＬアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％、９５％、９６、９７％、９８％、９９％、または９９．５％）同一の１対のＶＨ／ＶＬ鎖配列を有する。
【００１４】
場合によっては、本発明のＣＤ４７抗体は、それぞれ、配列番号：１および配列番号：２（即ち、１Ａ１）、配列番号：３および配列番号：４（即ち、１Ｆ８）、配列番号：５および配列番号：６（即ち、２Ａ１１）、配列番号：７および配列番号：８（即ち、２Ｃ２）、配列番号：９および配列番号：１０（即ち、２Ｄ７）、配列番号：１１および配列番号：１２（即ち、２Ｇ４）、配列番号：１３および配列番号：１４（即ち、２Ｇ１１）、配列番号：１５および配列番号：１６（即ち、６Ｆ４）、配列番号：１７および配列番号：１８（即ち、５Ｈ１）、配列番号：１９および配列番号：２０（即ち、５Ｆ６）、配列番号：２１および配列番号：２２（即ち、１Ｆ３）、配列番号：２３および配列番号：２４（即ち、２Ａ４）、配列番号：２５および配列番号：２６（即ち、２Ｂ１２）、配列番号：２７および配列番号：２８（即ち、１３Ａ１１）、配列番号：２９および配列番号：３０（即ち、１５Ｅ１）、配列番号：３１および配列番号：３２（即ち、１３Ｈ３）、配列番号：３３および配列番号：３４（即ち、１４Ａ８）、配列番号：３５および配列番号：３６（即ち、１６Ｈ３）、配列番号：３７および配列番号：３８（即ち、１Ａ１）、配列番号：３９および配列番号：４０（即ち、１Ａ１−Ａ）、配列番号：４１および配列番号：４２（即ち、１Ａ１−Ｑ）、配列番号：４３および配列番号：４４（即ち、１Ａ２）、配列番号：４５および配列番号：４６（即ち、１Ａ８）、配列番号：４７および配列番号：４８（即ち、１Ｂ１）、配列番号：４９および配列番号：５０（即ち、１Ｂ２）、配列番号：５１および配列番号：５２（即ち、１Ｈ３）、配列番号：５３および配列番号：５４（即ち、１Ｈ３−Ｑ）、配列番号：５５および配列番号：５６（即ち、１Ｈ３−Ａ）、配列番号：５７および配列番号：５８（即ち、２Ａ２）、配列番号：５９および配列番号：６０（即ち、２Ａ３）、配列番号：６１および配列番号：６２（即ち、２Ａ６）、配列番号：６３および配列番号：６４（即ち、２Ａ１０）、配列番号：６５および配列番号：６６（即ち、２Ｂ１）、配列番号：６７および配列番号：６８（即ち、２Ｃ６）、配列番号：６９および配列番号：７０（即ち、２Ｅ７）、配列番号：７１および配列番号：７２（即ち、２Ｅ９）、配列番号：７３および配列番号：７４（即ち、２Ｆ１）、配列番号：７５および配列番号：７６（即ち、２Ｆ３）、ならびに配列番号：７７および配列番号：７８（即ち、３４Ｃ５）からなる群より選択される１対のＶＨおよびＶＬ鎖配列を有する。
【００１５】
本発明のＣＤ４７抗体は、キメラまたはヒト化抗体であってもよい。これらは、ヒトＣＤ４７がＳＩＲＰαと相互作用することを防止するまたは有意に抑制することができる、またはＣＤ４７発現細胞のマクロファージが介する食作用(macrophage-mediated phagocytosis)を促進する。
【００１６】
本発明のＣＤ４７抗体は、有意な(significant)または顕著な(noticeable)レベルの赤
血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさず、多くの場合、赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさない。
【００１７】
他の態様では、本発明は、単離された二重特異性モノクローナル抗体を提供する。このような単離された二重特異性モノクローナル抗体は、それぞれ、第１のアームおよび第２のアームを有し、前記第１のアームはヒトＣＤ４７に結合する上記したような第１のモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片を有し、さらに前記第２のアームはヒトＣＤ４７に結合しない第２のモノクローナル抗体を有する。
【００１８】
実施形態によっては、単離された二重特異性モノクローナル抗体の第２のアームは、癌細胞に結合する。
【００１９】
他の実施形態によっては、二重特異性モノクローナル抗体はヒトＣＤ４７とヒトＳＩＲＰαとの相互作用を阻害する。
【００２０】
さらに融合タンパク質は、本発明の範囲内であり、それぞれ単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片およびサイトカインを含み、モノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片がヒトＣＤ４７と結合し、モノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、モノクローナル抗体またはその断片と前記サイトカインとの間のリンカーの有無にかかわらずＮ−末端で前記サイトカインと融合する
いくつかの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、
配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、および配列番号：７７からなる群から選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の可変重（ＶＨ）鎖配列；ならびに
配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、および配列番号：７８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９５％同一の可変軽（ＶＬ）鎖配列
を含む。
【００２１】
いくつかの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、ＶＨ／ＶＬ対を含み、前記ＶＨ／ＶＬ対は、
配列番号：１および配列番号：２（すなわち、１Ａ１）、配列番号：３および配列番号：４（すなわち、１Ｆ８）、配列番号：５および配列番号：６（すなわち、２Ａ１１）、配列番号：７および配列番号：８（すなわち、２Ｃ２）、配列番号：９および配列番号：１０（すなわち、２Ｄ７）、配列番号：１１および配列番号：１２（すなわち、２Ｇ４）、配列番号：１３および配列番号：１４（すなわち、２Ｇ１１）、配列番号：１５および配列番号：１６（すなわち、６Ｆ４）、配列番号：１７および配列番号：１８（すなわち、５Ｈ１）、配列番号：１９および配列番号：２０（すなわち、５Ｆ６）、配列番号：２１および配列番号：２２（すなわち、１Ｆ３）、配列番号：２３および配列番号：２４（すなわち、２Ａ４）、配列番号：２５および配列番号：２６（すなわち、２Ｂ１２）、配列番号：２７および配列番号：２８（すなわち、１３Ａ１１）、配列番号：２９および配列番号：３０（すなわち、１５Ｅ１）、配列番号：３１および配列番号：３２（すなわち、１３Ｈ３）、配列番号：３３および配列番号：３４（すなわち、１４Ａ８）、配列番号：３５および配列番号：３６（すなわち、１６Ｈ３）、配列番号：３７および配列番号：３８（すなわち、１Ａ１）、配列番号：３９および配列番号：４０（すなわち、１Ａ１−Ａ）、配列番号：４１および配列番号：４２（すなわち、１Ａ１−Ｑ）、配列番号：４３および配列番号：４４（すなわち、１Ａ２）、配列番号：４５および配列番号：４６（すなわち、１Ａ８）、配列番号：４７および配列番号：４８（すなわち、１Ｂ１）、配列番号：４９および配列番号：５０（すなわち、１Ｂ２）、配列番号：５１および配列番号：５２（すなわち、１Ｈ３）、配列番号：５３および配列番号：５４（すなわち、１Ｈ３−Ｑ）、配列番号：５５および配列番号：５６（すなわち、１Ｈ３−Ａ）、配列番号：５７および配列番号：５８（すなわち、２Ａ２）、配列番号：５９および配列番号：６０（すなわち、２Ａ３）、配列番号：６１および配列番号：６２（すなわち、２Ａ６）、配列番号：６３および配列番号：６４（すなわち、２Ａ１０）、配列番号：６５および配列番号：６６（すなわち、２Ｂ１）、配列番号：６７および配列番号：６８（すなわち、２Ｃ６）、配列番号：６９および配列番号：７０（すなわち、２Ｅ７）、配列番号：７１および配列番号：７２（すなわち、２Ｅ９）、配列番号：７３および配列番号：７４（すなわち、２Ｆ１）、配列番号：７５および配列番号：７６（すなわち、２Ｆ３）、ならびに配列番号：７７および配列番号：７８（すなわち、３４Ｃ５）からなる群より選択されるＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の対と少なくとも９５％同一のＶＨおよびＶＬ鎖配列を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、ＶＨ／ＶＬ対を含み、前記ＶＨ／ＶＬ対は、
配列番号：１および配列番号：２（すなわち、１Ａ１）、配列番号：３および配列番号：４（すなわち、１Ｆ８）、配列番号：５および配列番号：６（すなわち、２Ａ１１）、配列番号：７および配列番号：８（すなわち、２Ｃ２）、配列番号：９および配列番号：１０（すなわち、２Ｄ７）、配列番号：１１および配列番号：１２（すなわち、２Ｇ４）、配列番号：１３および配列番号：１４（すなわち、２Ｇ１１）、配列番号：１５および配列番号：１６（すなわち、６Ｆ４）、配列番号：１７および配列番号：１８（すなわち、５Ｈ１）、配列番号：１９および配列番号：２０（すなわち、５Ｆ６）、配列番号：２１および配列番号：２２（すなわち、１Ｆ３）、配列番号：２３および配列番号：２４（すなわち、２Ａ４）、配列番号：２５および配列番号：２６（すなわち、２Ｂ１２）、配列番号：２７および配列番号：２８（すなわち、１３Ａ１１）、配列番号：２９および配列番号：３０（すなわち、１５Ｅ１）、配列番号：３１および配列番号：３２（すなわち、１３Ｈ３）、配列番号：３３および配列番号：３４（すなわち、１４Ａ８）、配列番号：３５および配列番号：３６（すなわち、１６Ｈ３）、配列番号：３７および配列番号：３８（すなわち、１Ａ１）、配列番号：３９および配列番号：４０（すなわち、１Ａ１−Ａ）、配列番号：４１および配列番号：４２（すなわち、１Ａ１−Ｑ）、配列番号：４３および配列番号：４４（すなわち、１Ａ２）、配列番号：４５および配列番号：４６（すなわち、１Ａ８）、配列番号：４７および配列番号：４８（すなわち、１Ｂ１）、配列番号：４９および配列番号：５０（すなわち、１Ｂ２）、配列番号：５１および配列番号：５２（すなわち、１Ｈ３）、配列番号：５３および配列番号：５４（すなわち、１Ｈ３−Ｑ）、配列番号：５５および配列番号：５６（すなわち、１Ｈ３−Ａ）、配列番号：５７および配列番号：５８（すなわち、２Ａ２）、配列番号：５９および配列番号：６０（すなわち、２Ａ３）、配列番号：６１および配列番号：６２（すなわち、２Ａ６）、配列番号：６３および配列番号：６４（すなわち、２Ａ１０）、配列番号：６５および配列番号：６６（すなわち、２Ｂ１）、配列番号：６７および配列番号：６８（すなわち、２Ｃ６）、配列番号：６９および配列番号：７０（すなわち、２Ｅ７）、配列番号：７１および配列番号：７２（すなわち、２Ｅ９）、配列番号：７３および配列番号：７４（すなわち、２Ｆ１）、配列番号：７５および配列番号：７６（すなわち、２Ｆ３）、ならびに配列番号：７７および配列番号：７８（すなわち、３４Ｃ５）またはそれらと少なくとも９５％（例えば少なくとも９５％）同一である組み合わせからなる群より選択されるＶＨおよびＶＬ鎖配列を含む。
【００２３】
さらにいくつかの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、キメラまたはヒト化である。
【００２４】
さらにいくつかの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、ヒトＣＤ４７がシグナル調節タンパク質α（ＳＩＲＰα）と相互作用することを防止する。
【００２５】
さらにいくつかの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、有意なレベルの赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさない。
【００２６】
さらにいくつかの実施形態において、単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさない
さらにいくつかの実施形態において、サイトカインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）、造血成長因子、インターフェロン、腫瘍壊死因子、インターロイキン−１７受容体、または単量体糖たんぱく質を含む。
【００２７】
さらにいくつかの実施形態において、サイトカインは、単量体糖たんぱく質であり、顆粒球単球コロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。
【００２８】
さらにいくつかの実施形態において、モノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、リンカーなしで、または（Ｇ４Ｓ）３、（Ｇ４Ｓ）６、（ＧＳ）９、ＩＧＤ（Ｆ３０）、ＩＧＤ（Ｆ６４）、ＩＧＤ（Ｒ３０）、ＩＧＮ（Ｒ６４）、ＩＧＤ（Ｒ３０−Ｃｙｓ）、およびＩＧＤ（Ｒ６４−Ｃｙｓ）からなる群から選択されるリンカーでサイトカインと融合する。
【００２９】
さらにいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ヒトＣＤ４７とヒトＳＩＲＰαとの間の相互作用を抑制する。
【００３０】
さらにいくつかの実施形態の融合タンパク質において、単離されたモノクローナル抗体またはその免疫学的に活性のある断片は、ＣＤ４７発現細胞のマクロファージが介する食作用を促進する。
【００３１】
さらにいくつかの実施形態において、融合タンパク質は、小分子治療薬またはマーカーをさらに含み、前記小分子治療薬またはマーカーは、モノクローナル抗体もしくはその免疫学的に活性のある断片、またはサイトカインとコンジュゲートする。前記小分子治療薬は、抗癌または抗炎症剤でもよく；前記マーカーは、バイオマーカーまたは蛍光マーカーでもよい。
【００３２】
さらに他の態様では、本発明は、それぞれが上述の本発明の融合タンパク質の一、および製薬上許容できる担体または賦形剤を含む薬剤組成物を提供する。
【００３３】
本明細書に使用される、「製薬上許容できる担体または賦形剤」ということばは、通常、安全で、無毒であり、生物学的等の点で望ましくないものではない薬剤組成物または製剤を調製するのに使用される担体または賦形剤を意味する。使用される担体または賦形剤は、一般的に、ヒト患者または他の哺乳動物への投与に適するものである。組成物を作製するにあたり、活性成分は、一般的に、担体または賦形剤と混合する、上記で希釈する、または上記で包まれる。担体または賦形剤が希釈剤として機能する場合には、抗体の活性成分のベヒクル、担体、または媒質として作用する、固体、半固体、または液体材料であってもよい。
【００３４】
病気を処置する必要のあるヒト患者の病気の処置方法であって、前記方法は、治療上有効な量の本発明の融合タンパク質、または本発明の薬剤組成物を前記患者に投与することを有し、上記病気は、癌、線維症、または食作用の阻害に関連する病気である方法もまた、本発明の範囲に含まれる。場合によっては、上記癌は、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、大腸癌、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病（ＨＣＬ）、Ｔ細胞前リンパ球性白血病（Ｔ−ＰＬＬ）、大型顆粒リンパ球白血病、成人Ｔ細胞白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、骨髄腫、単球性白血病、Ｂ細胞由来白血病(B-cell derived leukemia)、Ｔ細胞由来白血病(T-cell derived leukemia)、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞由来リンパ腫、子宮内膜癌、腎臓癌、黒色腫、前立腺癌、甲状腺癌、子宮頸癌、胃癌、肝臓癌、および固形腫瘍からなる群より選択されてもよく；上記線維症は、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、喘息、嚢胞性線維症、気管支炎、および喘息からなる群より選択されてもよい。固形腫瘍の例としては、例えば、子宮内膜癌、甲状腺癌、子宮頸癌、胃癌、乳房腫瘍、卵巣腫瘍、肺腫瘍、膵臓腫瘍、前立腺腫瘍、メラノーマ腫瘍、大腸腫瘍、肺腫瘍、頭頸部腫瘍、膀胱腫瘍、食道腫瘍、肝臓腫瘍、および腎臓腫瘍、ならびに神経芽細胞由来ＣＮＳ腫瘍(neuroblastic-derived CNS tumor)が挙げられる。上記食作用の阻害に関連する病気は、心血管疾患（例えば、アテローム性動脈硬化症、発作、高血圧性心疾患、リウマチ性心疾患、心筋症、心臓不整脈、先天性心疾患、心臓弁膜症、心臓炎、大動脈瘤、末梢動脈疾患、または静脈血栓症）であってもよい。
【００３５】
本明細書に使用される、「有効な量」ということばは、患者に投与されると、本明細書に記載されるような、ＣＤ４７に依存するシグナル伝達に関連する病気の治療、予後または診断を行うのに十分なまたは必要であるＣＤ４７抗体の量を意味する。単独でまたは組み合わせて使用される際の、本明細書で提供される抗体の治療上有効な量は、抗体の相対活性（例えば、ＣＤ４７を発現する癌細胞のマクロファージが介する食作用の促進）によっておよび処置される患者や病気の状態、患者の体重や年齢、病状の重篤度、投与形態などによって異なり、当業者によって容易に決定できる。
【００３６】
本明細書に使用される、本発明で記載の抗体（例えばＣＤ４７抗体）に先行する「単離された」ということばは、抗体が他の細胞材料を実質的に含まないことを意味する。一実施形態では、単離された抗体は、同種の他のタンパク質を実質的に含まない。他の実施形態では、単離された抗体は、異なる種の細胞によって発現され、異なる種の他のタンパク質を実質的に含まない。タンパク質は、当該分野において既知のタンパク質精製技術を用いて、単離によって天然に関連する(naturally associated)成分（または抗体を製造するのに使用される細胞発現システムと関連する成分）を実質的に含まないようにされてもよい。一実施形態では、本発明の抗体、または抗原結合断片は、単離される。
【００３７】
本明細書に使用される、「生物分子(biological molecule)」ということばは、合成抗体（モノクローナルまたは二重特異性抗体）、ペプチド、および生体模倣分子(biomimetic molecule)を包含することを意味する。「生体模倣分子」ということばは、タンパク質またはヌクレオチド等の天然の大きな化合物の構造または特性と同様のまたは似ている構造または特性を有するように設計または開発され、例えば、少なくとも３，０００、少なくとも５，０００、または少なくとも１０，０００の分子量を有する分子を意味する。
【００３８】
本明細書で挙げられる参考文献はすべて、全体を参考で引用される。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
図面の簡単な説明
【図１】図１は、単量体ＣＤ４７−ＥＣＤに結合するＣＤ４７抗体の用量依存反応を示す。
【図２ａ】図２ａおよび図２ｂは、二量体ＣＤ４７−ＥＣＤに結合するＣＤ４７抗体の用量依存反応を示す。
【図２ｂ】図２ａおよび図２ｂは、二量体ＣＤ４７−ＥＣＤに結合するＣＤ４７抗体の用量依存反応を示す。
【図３ａ】図３ａ、図３ｂおよび図３ｃは、ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を遮断するＣＤ４７抗体の用量依存反応を示す。
【図３ｂ】図３ａ、図３ｂおよび図３ｃは、ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を遮断するＣＤ４７抗体の用量依存反応を示す。
【図３ｃ】図３ａ、図３ｂおよび図３ｃは、ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を遮断するＣＤ４７抗体の用量依存反応を示す。
【図４ａ】図４ａおよび図４ｂは、ＣＤ４７＋Ｒａｊｉ細胞に結合するＣＤ４７抗体の用量依存反応を示し；さらに、図４ｃ、図４ｄおよび図４ｅは、Ｂｉｏｃｏｒｅ分析によって測定される、ＣＤ４７抗体の結合キネティクスおよびデータを示す。
【図４ｂ】図４ａおよび図４ｂは、ＣＤ４７＋Ｒａｊｉ細胞に結合するＣＤ４７抗体の用量依存反応を示し；さらに、図４ｃ、図４ｄおよび図４ｅは、Ｂｉｏｃｏｒｅ分析によって測定される、ＣＤ４７抗体の結合キネティクスおよびデータを示す。
【図４ｃ】図４ａおよび図４ｂは、ＣＤ４７＋Ｒａｊｉ細胞に結合するＣＤ４７抗体の用量依存反応を示し；さらに、図４ｃ、図４ｄおよび図４ｅは、Ｂｉｏｃｏｒｅ分析によって測定される、ＣＤ４７抗体の結合キネティクスおよびデータを示す。
【図４ｄ】図４ａおよび図４ｂは、ＣＤ４７＋Ｒａｊｉ細胞に結合するＣＤ４７抗体の用量依存反応を示し；さらに、図４ｃ、図４ｄおよび図４ｅは、Ｂｉｏｃｏｒｅ分析によって測定される、ＣＤ４７抗体の結合キネティクスおよびデータを示す。
【図４ｅ】図４ａおよび図４ｂは、ＣＤ４７＋Ｒａｊｉ細胞に結合するＣＤ４７抗体の用量依存反応を示し；さらに、図４ｃ、図４ｄおよび図４ｅは、Ｂｉｏｃｏｒｅ分析によって測定される、ＣＤ４７抗体の結合キネティクスおよびデータを示す。
【図５ａ】図５ａおよび図５ｂは、ＣＤ４７抗体を用いたヒトＭΦによる腫瘍細胞の食作用を示す。
【図５ｂ】図５ａおよび図５ｂは、ＣＤ４７抗体を用いたヒトＭΦによる腫瘍細胞の食作用を示す。
【図６ａ】図６ａ〜６ｃは、ＣＤ４７抗体によって引き起こされる(triggered)様々なヒト血液癌細胞系のマクロファージが介する食作用(macrophage-mediated phagocytosis)を示す。
【図６ｂ】図６ａ〜６ｃは、ＣＤ４７抗体によって引き起こされる(triggered)様々なヒト血液癌細胞系のマクロファージが介する食作用(macrophage-mediated phagocytosis)を示す。
【図６ｃ】図６ａ〜６ｃは、ＣＤ４７抗体によって引き起こされる(triggered)様々なヒト血液癌細胞系のマクロファージが介する食作用(macrophage-mediated phagocytosis)を示す。
【図７ａ】図７ａおよび図７ｂは、ＣＤ４７抗体を用いたＲＢＣ凝集アッセイでの赤血球（ＲＢＣ）−不足特性(red blood cells (RBC)-sparing properties)を示す。
【図７ｂ】図７ａおよび図７ｂは、ＣＤ４７抗体を用いたＲＢＣ凝集アッセイでの赤血球（ＲＢＣ）−不足特性(red blood cells (RBC)-sparing properties)を示す。
【図８ａ】図８ａ、図８ｂ、図８ｃ、および図８ｄは、異なるより高い量でのＣＤ抗体によりＲＢＣに結合するおよびＲＢＣ凝集を誘導する活性を示す。
【図８ｂ】図８ａ、図８ｂ、図８ｃ、および図８ｄは、異なるより高い量でのＣＤ抗体によりＲＢＣに結合するおよびＲＢＣ凝集を誘導する活性を示す。
【図８ｃ】図８ａ、図８ｂ、図８ｃ、および図８ｄは、異なるより高い量でのＣＤ抗体によりＲＢＣに結合するおよびＲＢＣ凝集を誘導する活性を示す。
【図８ｄ】図８ａ、図８ｂ、図８ｃ、および図８ｄは、異なるより高い量でのＣＤ抗体によりＲＢＣに結合するおよびＲＢＣ凝集を誘導する活性を示す。
【図９ａ】図９ａ、図９ｂ、図９ｃ、および図９ｄは、ＣＤ４７抗体のＲＢＣ−結合活性を示す。
【図９ｂ】図９ａ、図９ｂ、図９ｃ、および図９ｄは、ＣＤ４７抗体のＲＢＣ−結合活性を示す。
【図９ｃ】図９ａ、図９ｂ、図９ｃ、および図９ｄは、ＣＤ４７抗体のＲＢＣ−結合活性を示す。
【図９ｄ】図９ａ、図９ｂ、図９ｃ、および図９ｄは、ＣＤ４７抗体のＲＢＣ−結合活性を示す。
【図１０ａ】図１０は、ＣＤ４７抗体によって誘導される複数のヒト血液サンプルでの赤血球凝集の結果を示す。
【図１０ｂ】図１０は、ＣＤ４７抗体によって誘導される複数のヒト血液サンプルでの赤血球凝集の結果を示す。
【図１１】図１１は、血小板の表面マーカーとして染色されるＣＤ６１を用いた、ＣＤ４７抗体およびＳＩＲＰα−Ｉｇ融合のヒト血小板結合活性を示す。
【図１２ａ】図１２は、インビトロでのＣＤ４７抗体およびＳＩＲＰα−Ｉｇ融合によって誘導されるカニクイザル(cyno)赤血球凝集の試験結果を示す。
【図１２ｂ】図１２は、インビトロでのＣＤ４７抗体およびＳＩＲＰα−Ｉｇ融合によって誘導されるカニクイザル(cyno)赤血球凝集の試験結果を示す。
【図１３】図１３は、ＣＤ４７抗体およびコントロールによる食作用およびＡＭＬ細胞結合の試験結果を示す。
【図１４ａ】図１４ａおよび図１４ｂは、ルシフェラーゼ−Ｒａｊｉ異種移植マウスのＣＤ４７抗体およびコントロールによる処置の有効性を示す。
【図１４ｂ】図１４ａおよび図１４ｂは、ルシフェラーゼ−Ｒａｊｉ異種移植マウスのＣＤ４７抗体およびコントロールによる処置の有効性を示す。
【図１５ａ】図１５は、ＣＤ４７抗体およびコントロールによって誘導される腫瘍を有するマウスにおけるマクロファージの極性化を示す。
【図１５ｂ】図１５は、ＣＤ４７抗体およびコントロールによって誘導される腫瘍を有するマウスにおけるマクロファージの極性化を示す。
【図１６ａ】図１６は、様々なヒト癌タイプのＰＤＸサンプルを用いたＣＤ４７発現プロフィールを示す。
【図１６ｂ】図１６は、様々なヒト癌タイプのＰＤＸサンプルを用いたＣＤ４７発現プロフィールを示す。
【図１６ｃ】図１６は、様々なヒト癌タイプのＰＤＸサンプルを用いたＣＤ４７発現プロフィールを示す。
【図１７ａ】図１７は、カニクイザル(cynomolgus monkey)の製剤安全研究(safety pharm study)（血液学）の結果を示す。
【図１７ｂ】図１７は、カニクイザル(cynomolgus monkey)の製剤安全研究(safety pharm study)（血液学）の結果を示す。
【図１７ｃ】図１７は、カニクイザル(cynomolgus monkey)の製剤安全研究(safety pharm study)（血液学）の結果を示す。
【図１７ｄ】図１７は、カニクイザル(cynomolgus monkey)の製剤安全研究(safety pharm study)（血液学）の結果を示す。
【図１７ｅ】図１７は、カニクイザル(cynomolgus monkey)の製剤安全研究(safety pharm study)（血液学）の結果を示す。
【図１８ａ】図１８は、異なるエピトープによる、抗体１Ｆ８および５Ｆ９ならびに抗体１Ｆ８および２Ａ１のＣＤ４７の結合での競合、ならびに５Ｆ９／ＣＤ４７コンプレックスおよび１Ｆ８／ＣＤ４７コンプレックスの構造を示す。
【図１８ｂ】図１８は、異なるエピトープによる、抗体１Ｆ８および５Ｆ９ならびに抗体１Ｆ８および２Ａ１のＣＤ４７の結合での競合、ならびに５Ｆ９／ＣＤ４７コンプレックスおよび１Ｆ８／ＣＤ４７コンプレックスの構造を示す。
【図１８ｃ】図１８は、異なるエピトープによる、抗体１Ｆ８および５Ｆ９ならびに抗体１Ｆ８および２Ａ１のＣＤ４７の結合での競合、ならびに５Ｆ９／ＣＤ４７コンプレックスおよび１Ｆ８／ＣＤ４７コンプレックスの構造を示す。
【図１８ｄ】図１８は、異なるエピトープによる、抗体１Ｆ８および５Ｆ９ならびに抗体１Ｆ８および２Ａ１のＣＤ４７の結合での競合、ならびに５Ｆ９／ＣＤ４７コンプレックスおよび１Ｆ８／ＣＤ４７コンプレックスの構造を示す。
【図１８ｅ】図１８は、異なるエピトープによる、抗体１Ｆ８および５Ｆ９ならびに抗体１Ｆ８および２Ａ１のＣＤ４７の結合での競合、ならびに５Ｆ９／ＣＤ４７コンプレックスおよび１Ｆ８／ＣＤ４７コンプレックスの構造を示す。
【図１９ａ−ｂ】図１９ａ、図１９ｂ、図１９ｃ、図１９ｄ、図１９ｅ、図１９ｆ、図１９ｇ、および図１９ｈは、それぞれ、ＲＢＣコングリゲーション(congregation)、ヘモグロビン、血小板、およびリンパ球に関するＣＤ４７抗体１３Ｈ３の効果を示す。
【図１９ｃ】図１９ａ、図１９ｂ、図１９ｃ、図１９ｄ、図１９ｅ、図１９ｆ、図１９ｇ、および図１９ｈは、それぞれ、ＲＢＣコングリゲーション(congregation)、ヘモグロビン、血小板、およびリンパ球に関するＣＤ４７抗体１３Ｈ３の効果を示す。
【図１９ｄ】図１９ａ、図１９ｂ、図１９ｃ、図１９ｄ、図１９ｅ、図１９ｆ、図１９ｇ、および図１９ｈは、それぞれ、ＲＢＣコングリゲーション(congregation)、ヘモグロビン、血小板、およびリンパ球に関するＣＤ４７抗体１３Ｈ３の効果を示す。
【図１９ｅ−ｆ】図１９ａ、図１９ｂ、図１９ｃ、図１９ｄ、図１９ｅ、図１９ｆ、図１９ｇ、および図１９ｈは、それぞれ、ＲＢＣコングリゲーション(congregation)、ヘモグロビン、血小板、およびリンパ球に関するＣＤ４７抗体１３Ｈ３の効果を示す。
【図１９ｇ】図１９ａ、図１９ｂ、図１９ｃ、図１９ｄ、図１９ｅ、図１９ｆ、図１９ｇ、および図１９ｈは、それぞれ、ＲＢＣコングリゲーション(congregation)、ヘモグロビン、血小板、およびリンパ球に関するＣＤ４７抗体１３Ｈ３の効果を示す。
【図１９ｈ】図１９ａ、図１９ｂ、図１９ｃ、図１９ｄ、図１９ｅ、図１９ｆ、図１９ｇ、および図１９ｈは、それぞれ、ＲＢＣコングリゲーション(congregation)、ヘモグロビン、血小板、およびリンパ球に関するＣＤ４７抗体１３Ｈ３の効果を示す。
【図２０】図２０は、組換ＣＤ４７−ＥＣＤへの３４Ｃ５の強力な結合親和性を示す。
【図２１】図２１は、ＣＤ４７を有するＲａｊｉ細胞への３４Ｃ５の強力な結合親和性を示す。
【図２２】図２２は、３４Ｃ５が、０．３０ｎＭのＥＣ５０で、ＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合を効果的に遮断できたことを示す。
【図２３】図２３は、抗体３４Ｃ５がヒトＭΦによる腫瘍細胞の食作用を促進したことを示す。
【図２４】図２４は、抗体３４Ｃ５がインビトロでのＲＶＣ凝集を引き起こさなかったことを示す。
【図２５】図２５は、抗体３４Ｃ５がこの抗体濃度の減少に伴いＲＢＣへの結合を減少することを示す。
【図２６】図２６は、１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質がＩｇＧ対照処理群、１Ｆ８処理群、およびＧＭ−ＣＳＦ処理群と比較して、ＣＤ１４＋細胞中の食細胞の割合のより大きい相対倍率変化を引き起こしたことを示す。
【図２７】図２７は、融合タンパク質１Ｆ８−ＧＭＣＳＦがＣＤ４７抗体１Ｆ８自体よりもヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体に対して強い結合親和性を有したことを示す。
【図２８】図２８は、１Ｆ８−ＧＭＣＳＦがＧＭＣ−ＳＦ自体の誘導活性と同様の誘導活性を有したことを示す。
【図２９】図２９は、ＧＭＣＳＦと比較して、融合タンパク質１Ｆ８−ＧＭＣＳＦがＴＦ−１増殖を刺激するためのより強い能力を発揮したことを示す。
【図３０】図３０（ａ）、図３０（ｂ）、図３０（ｃ）および図３０（ｄ）は、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＣＤ８０の産生がＩｇＧ、１Ｆ８、ＧＭＣＳＦまたは１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質の存在下でのＭ１マクロファージの活性化により引き起こされたことを示した。
【図３１】図３１は、腫瘍体積の減少における５つの処置の各々の有効性を示し、１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質はそれらの中で最良の有効性を発揮したことを示す。
【図３２】図３２は、ＣＤ４７＋Ｒａｊｉ細胞への融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦの結合の用量依存的応答を示す。
【図３３ａ】図３３は、ＣＤ４７のＳＩＲＰ２４への結合を遮断する融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦの用量依存的応答を示す。
【図３３ｂ】図３３は、ＣＤ４７のＳＩＲＰ２４への結合を遮断する融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦの用量依存的応答を示す。
【図３４】図３４は、融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦを用いたヒトＭΦによる腫瘍細胞の食作用を示す。
【図３５】図３５は、融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦを用いたＲＢＣ凝集アッセイにおける赤血球（ＲＢＣ）節約特性を示す。
【図３６】図３６は、ＧＭＣＳＦ受容体に結合する融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦの用量依存的応答を示す。
【図３７】図３７は、ＳＴＡＴ５リン酸化の刺激における融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦの用量依存的応答を示す。
【図３８】図３８は、ＴＦ−１増殖の刺激における融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦの用量依存的応答を示す。
【図３９】図３９は、ルシフェラーゼ−Ｒａｊｉ異種移植マウスモデルに対する融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦおよび対照による治療の有効性を示す。
【図４０】図４０は、カニクイザルにおける２０ｍｇ／ｋｇの単回投与後の１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦの血清レベルの濃度−時間曲線である。
【図４１ａ】図４１ａおよび４１ｂは、カニクイザルにおける２０ｍｇ／ｋｇの１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦまたはＩｇＧの反復投与後のＲＢＣおよび血小板のレベルを示す。
【図４１ｂ】図４１ａおよび４１ｂは、カニクイザルにおける２０ｍｇ／ｋｇの１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦまたはＩｇＧの反復投与後のＲＢＣおよび血小板のレベルを示す。
【図４２ａ】図４２ａ、４２ｂおよび４２ｃは、カニクイザルにおける２０ｍｇ／ｋｇの１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦまたはＩｇＧの反復投与後のＷＢＣ、好中球および単球のレベルを示す。
【図４２ｂ】図４２ａ、４２ｂおよび４２ｃは、カニクイザルにおける２０ｍｇ／ｋｇの１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦまたはＩｇＧの反復投与後のＷＢＣ、好中球および単球のレベルを示す。
【図４２ｃ】図４２ａ、４２ｂおよび４２ｃは、カニクイザルにおける２０ｍｇ／ｋｇの１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦまたはＩｇＧの反復投与後のＷＢＣ、好中球および単球のレベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
発明の詳細な説明
本発明は、ヒトＣＤ４７がＳＩＲＰαと相互作用することを防止できる、またはＣＤ４７発現細胞のマクロファージが介する食作用を促進できる新規な単離されたモノクローナルＣＤ４７抗体を提供する。これらのＣＤ４７抗体は、有意な(significant)または顕著な(noticeable)レベルの赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさず、多くの場合、赤血球凝集または赤血球の枯渇を引き起こさない。
【００４１】
例としては、本発明のＣＤ４７抗体は、（ａ）配列番号：１、配列番号：３、配列番号：５、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７、配列番号：１９、配列番号：２１、配列番号：２３、配列番号：２５、配列番号：２７、配列番号：２９、配列番号：３１、配列番号：３３、配列番号：３５、配列番号：３７、配列番号：３９、配列番号：４１、配列番号：４３、配列番号：４５、配列番号：４７、配列番号：４９、配列番号：５１、配列番号：５３、配列番号：５５、配列番号：５７、配列番号：５９、配列番号：６１、配列番号：６３、配列番号：６５、配列番号：６７、配列番号：６９、配列番号：７１、配列番号：７３、配列番号：７５、および配列番号：７７からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％）同一の可変重（ＶＨ）鎖配列；ならびに（ｂ）配列番号：２、配列番号：４、配列番号：６、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８、配列番号：２０、配列番号：２２、配列番号：２４、配列番号：２６、配列番号：２８、配列番号：３０、配列番号：３２、配列番号：３４、配列番号：３６、配列番号：３８、配列番号：４０、配列番号：４２、配列番号：４４、配列番号：４６、配列番号：４８、配列番号：５０、配列番号：５２、配列番号：５４、配列番号：５６、配列番号：５８、配列番号：６０、配列番号：６２、配列番号：６４、配列番号：６６、配列番号：６８、配列番号：７０、配列番号：７２、配列番号：７４、配列番号：７６、および配列番号：７８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％）同一の可変軽（ＶＬ）鎖配列を有する。別の例としては、本発明のＣＤ４７抗体は、配列番号：１および配列番号：２、配列番号：３および配列番号：４、配列番号：５および配列番号：６、配列番号：７および配列番号：８、配列番号：９および配列番号：１０、配列番号：１１および配列番号：１２、配列番号：１３および配列番号：１４、配列番号：１５および配列番号：１６、配列番号：１７および配列番号：１８、配列番号：１９および配列番号：２０、配列番号：２１および配列番号：２２、配列番号：２３および配列番号：２４、配列番号：２５および配列番号：２６、配列番号：２７および配列番号：２８、配列番号：２９および配列番号：３０、配列番号：３１および配列番号：３２、配列番号：３３および配列番号：３４、配列番号：３５および配列番号：３６、配列番号：３７および配列番号：３８、配列番号：３９および配列番号：４０、配列番号：４１および配列番号：４２、配列番号：４３および配列番号：４４、配列番号：４５および配列番号：４６、配列番号：４７および配列番号：４８、配列番号：４９および配列番号：５０、配列番号：５１および配列番号：５２、配列番号：５３および配列番号：５４、配列番号：５５および配列番号：５６、配列番号：５７および配列番号：５８、配列番号：５９および配列番号：６０、配列番号：６１および配列番号：６２、配列番号：６３および配列番号：６４、配列番号：６５および配列番号：６６、配列番号：６７および配列番号：６８、配列番号：６９および配列番号：７０、配列番号：７１および配列番号：７２、配列番号：７３および配列番号：７４、配列番号：７５および配列番号：７６、ならびに配列番号：７７および配列番号：７８からなる群より選択されるアミノ酸配列と少なくとも９０％（例えば、少なくとも９５％）同一のＶＨ／ＶＬ鎖配列の組み合わせを有する。
【００４２】
本明細書に使用される、「抗体」ということばは、最も広い意味で使用され、具体的には、モノクローナル抗体（全長のモノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体(multi-specific antibody)（例えば、二重特異性抗体）、および所望の生物学的活性を示す限り抗体断片を包含する。「抗体」（または「Ａｂｓ」）および「免疫グロブリン」（または「Ｉｇ」）は、同様の構造特性を有する糖タンパク質である。抗体は特定の抗原への結合特異性を示す一方、免疫グロブリンは抗原特異性を持たない抗体および他の抗体様分子を包含する。後者の種類のポリペプチドは、例えば、リンパ系によって低レベルでおよび骨髄腫によって高レベルで産生される。
【００４３】
本明細書に使用される、「エピトープ」ということばは、抗体のパラトープが結合する抗原の抗原決定基を意味する。エピトープの決定基は、一般的に、アミノ酸または糖側鎖(sugar side chain)等の分子の化学的に活性のある表面基(surface grouping)から構成され、一般的に、特定の３次元構造特性、さらには特定のチャージ特性を有する。
【００４４】
本明細書に使用される、「天然の抗体および免疫グロブリン」ということばは、一般的に、２個の同じ軽（Ｌ）鎖および２個の同じ重（Ｈ）鎖から構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ４量体糖タンパク質である。各軽鎖は１つの共有ジスルフィド結合によって重鎖に連結する（「ＶＨ／ＶＬ対」とも称する）一方、ジスルフィド結合の数は異なる免疫グロブリンアイソタイプの重鎖間で異なる。各重鎖および軽鎖はまた、鎖内ジスルフィド架橋が一定間隔で存在する(has regularly spaced intrachain disulfide bridges)。各重鎖は、一方の末端に可変ドメイン、さらには数多くの定常ドメインを有する。
【００４５】
各軽鎖は、一方の末端に可変ドメイン（ＶＬ）および他方の末端に定常ドメインを有する；軽鎖の定常ドメインは重鎖の第１の定常ドメインと並列し(aligned with)、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと並列する。特定のアミノ酸残基が軽鎖及び重鎖の可変ドメインのインターフェースを形成すると考えられる。例えば、Clothia et al., J. Mol. Biol., 186:651 (1985); Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82:4592 (1985)を参照。
【００４６】
本明細書に使用される、「可変」ということばは、可変ドメインの特定の部分が抗体の中で配列がかなり異なり、その特定の抗原に関して各特定の抗体の結合および特異性で使用されるという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインで均一に分布しない。可変性は、軽鎖および重鎖可変ドメイン双方において相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域と呼ばれる３つのセグメントに集中する。可変ドメインのより高度に保存される部分をフレームワーク（ＦＲ）と称する。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインはそれぞれ、ループの連結を形成し、場合によっては、β−シート構造の部分を形成する、３つのＣＤＲによって連結される、β−シート構造をとる、４つのＦＲ領域を有する。各鎖のＣＤＲは、ＦＲ領域によってごく接近して一緒に保持され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。例えば、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, National Institute of Health, Bethesda, Md. (1991)を参照。定常ドメインは、抗原への抗体の結合に直接関与しないが、抗体に依存する細胞毒性への抗体の参加等の、様々なエフェクター機能を示す。興味のある可変領域配列としては、ＣＤ４７抗体の提供されるヒト化可変領域配列がある。例えば、１Ａ１は配列番号：１（重鎖）および配列番号：２（軽鎖）を含み、１Ｆ８は配列番号：３（重鎖）および配列番号：４（軽鎖）を含み、さらに２Ａ１１は配列番号：５（重鎖）および配列番号：６（軽鎖）を含む。
【００４７】
抗体をパパイン消化することにより、それぞれが１つの抗原結合部位を有する、「Ｆａｂ」と呼ばれる、２つの同じ抗原結合断片、およびその名前は容易に結晶化できることを指す、残りの「Ｆｃ」断片を生じる。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位(antigen-combining sites)を有し、抗原を架橋することが可能であるＦ（ａｂ’）２断片が得られる。「Ｆｖ」は、完全な抗原−認識及び結合部位を含む最小の抗体断片である。２本鎖Ｆｖ種(two-chain Fv species)では、この領域は、緊密な非共有結合した(in tight, non-covalent association)１つの重鎖および１つの軽鎖の可変ドメインのダイマーから構成される。１本鎖Ｆｖ種(single-chain Fv species)（ｓｃＦｖ）では、１つの重鎖及び１つの軽鎖の可変ドメインが、軽鎖及び重鎖が２鎖Ｆｖ種(two-chain Fv species)に類似する「ダイマー」構造で結合できるようにフレキシブルなペプチドリンカー(flexible peptide linker)によって共有結合され得る。各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬダイマーの表面で抗原結合部位を規定することがこの構成に含まれる。一括して、上記６個のＣＤＲが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかしながら、全結合部位に比して低い親和性ではあるが、１つの可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲだけを有する半分のＦｖ）が抗原を認識、結合できる。例えば、Pluckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994)を参照。
【００４８】
Ｆａｂ断片はまた、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域の１以上のシステインを含む重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に数個の残基を付加することによってＦａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する本明細書での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、もともとは、間にヒンジシステインを有するＦａｂ’対として製造された。抗体断片の他の化学的カップリングもまた知られている。
【００４９】
ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの免疫グロブリンの５つの主要なクラスがあり、これらのうちいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２にさらに分類できる。免疫グロブリンの異なるクラスに相当する重鎖定常ドメインは、それぞれ、α、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および３次元構造はよく知られている。
【００５０】
本明細書に使用される、「抗体断片」ということば、およびこのすべての文法上の異綴語(grammatical variants)は、完全な(intact)抗体の抗原結合部位または可変領域を有する完全な抗体の一部として規定され、この際、上記一部は完全な抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（即ち、抗体のアイソタイプによって、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）を含まない。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ(diabodies)；以下に制限されないが、（１）１本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）１個の軽鎖可変ドメインのみを含む１本鎖ポリペプチド、または会合する重鎖部分を含まない、軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含むこの断片、ならびに（３）１個の重鎖可変領域のみを含む１本鎖ポリペプチド、または会合する軽鎖部分を含まない、重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含むこの断片などの、隣接アミノ酸残基の１つの連続配列から構成される１次構造を有するポリペプチドである抗体断片（本明細書では、「１本鎖抗体断片」または「１本鎖ポリペプチド」と称する）；ならびに抗体断片から形成される多重特異性または多価構造がある。１以上の重鎖を有する抗体断片では、重鎖は、完全な抗体の非Ｆｃ領域で見出される定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧアイソタイプでのＣＨ１）を含んでいてもよい、および／または完全な抗体で見出されるヒンジ領域配列を含んでいてもよい、および／または重鎖のヒンジ領域配列もしくは定常ドメイン配列中で融合するもしくは中に位置するロイシンジッパー配列(leucine zipper sequence)を含んでいてもよい。
【００５１】
特記しない限り、本明細書で使用される「コンジュゲート(conjugate)」ということばは、１以上の抗体断片が１以上のポリマー分子に共有結合することにより形成される異種分子として規定され、この際、異種分子は水溶性であり、即ち、血液などの生理的な液体に可溶であり、さらに、異種分子は構造化された凝集体(structured aggregate)を含まない。興味のあるコンジュゲートは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。前記規定において、「構造化された凝集体(structured aggregate)」ということばは、（１）異種分子がミセルまたは他のエマルジョン構造を持たず、脂質二重層、小胞もしくはリポソームに固定されないように、球状もしくは球状シェル構造を有する水溶液での分子の凝集体；および（２）水相と接触した際に異種分子を溶液中に放出しない、クロマトグラフィービーズマトリックス等の、固体または不溶化形態の分子の凝集体を意味する。したがって、本明細書で規定される「コンジュゲート(conjugate)」ということばは、沈殿物(precipitate)、堆積物(sediment)、生体内分解性マトリックスまたは固体の水和時に水溶液中に異種分子を放出できる他の固体を包含する。
【００５２】
本明細書に使用される、「モノクローナル抗体」（ｍＡｂ）ということばは、実質的に均質な抗体集団から得られる抗体を意味し、即ち、上記集団を含む個々の抗体が少量で存在してもよい可能性のある天然の変異を除いて同じである。モノクローナル抗体は、かなり特異的であり、単一の抗原部位に対する(directed against)ものである。各ｍＡｂは、抗原の単一の決定基に対する(directed against)ものである。特異性に加えて、モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ培養物によって合成でき、他の免疫グロブリンが混入しないという点で好ましい。修飾語句である「モノクローナル」は、実質的に均質な抗体集団から得られるという抗体の特徴を示すものであり、抗体の製造が特定の方法による必要があるとは解されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、固定化Ｂ細胞もしくはそのハイブリドーマで作製されてもよい、または組換ＤＮＡ方法によって作製されてもよい。
【００５３】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、源となる種若しくは免疫グロブリンクラスもしくはサブクラスという称号にかかわらず、ＣＤ４７抗体の可変（超可変を含む）ドメインを定常ドメインでスプライシングする（例えば、「ヒト化」抗体）、または軽鎖を重鎖でスプライシングする、またはある種の鎖を他の種の鎖でスプライシングする、または異種タンパク質との融合によって製造されるハイブリッド及び組換抗体、さらには所望の生物学的活性を示す限り、抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ）を包含する。
【００５４】
本明細書におけるモノクローナル抗体は、詳細には、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種由来のまたは特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同じであるまたは上記配列と相同であるが、上記鎖の残りは他の種由来のまたは他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の相当する配列と同じであるまたは上記配列と相同である「キメラ」抗体（免疫グロブリン）、さらには所望の生物学的活性を示す限り、このような抗体の断片を包含する。
【００５５】
本明細書に使用される、「単離された」抗体は、自然環境の成分から同定および分離および／または回収されたものである。自然環境の混入成分は、抗体の診断または治療用途を妨げるような材料であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク様または非タンパク様溶質がある。実施形態によっては、抗体は、（１）ローリー法(Lowry method)によって測定される際に７５重量％を超える抗体となるように、および最も好ましくは８０重量％、９０重量％または９９重量％を超えるように、または（２）クマシー・ブルー、もしくは好ましくは銀染色を用いた還元もしくは非還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均質であるように、精製されるであろう。抗体の自然環境の少なくとも１成分は存在しないであろうため、単離された抗体は組換細胞内にin situで存在する抗体を包含する。しかしながら、通常、単離された抗体は少なくとも１精製工程によって調製されるであろう。
【００５６】
本明細書に使用される、「標識されたエピトープ(epitope tagged)」ということばは、「エピトープタグ(epitope tag)」に融合されたＣＤ４７抗体を意味する。上記エピトープタグポリペプチドは、これに対する抗体を作製できるエピトープを提供するのに十分な残基を有するが、ＣＤ４７抗体の活性を妨げるように十分短い。好ましくは、エピトープタグは、エピトープに特異的な抗体が他のエピトープと実質的に交差反応しないように十分固有である(unique)。適当なタグポリペプチドは、通常、少なくとも６アミノ酸残基を有し、一般的には約８〜５０アミノ酸残基（好ましくは約９〜３０残基）を有する。例としては、ｃ−ｍｙｃタグならびにこれに対する８Ｆ９、３Ｃ７、６Ｅ１０、Ｇ４、Ｂ７及び９Ｅ１０抗体（例えば、Evan et al., Mol. Cell. Biol., 5(12):3610-3616 (1985)参照）；ならびに単純ヘルペスウィルス(Herpes Simplex virus)糖タンパク質（ｇＤ）タグ及びその抗体（例えば、Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)）がある。
【００５７】
本明細書に使用される、「ラベル」ということばは、抗体に直接または間接的に結合する検出可能な化合物または組成物を意味する。ラベルは、それ自体検出可能であっても（例えば、放射性同位元素標識若しくは蛍光標識）または、酵素ラベルの場合には、検出可能な基質化合物若しくは組成物の化学的変化を触媒してもよい。
【００５８】
本明細書に使用される、「固相」ということばは、本発明の抗体が付着できる非水性マトリックスを意味する。本明細書に包含される固相の例としては、一部がもしくは全部がガラスで形成されるもの（例えば、多孔質ガラス(controlled pore glass)）、多糖（例えば、アガロース）、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンが挙げられる。特定の実施形態では、内容に応じて、固相は、アッセイプレートのウェルを有していてもよい；他の実施形態では、精製カラム（例えば、アフィニティクロマトグラフィーカラム）がある。このことばはまた、ばらばらの粒子の不連続固相を包含する。例えば、米国特許第４，２７５，１４９号を参照。
【００５９】
本発明はまた、これらのＣＤ４７抗体を含む薬剤組成物および上記ＣＤ４７抗体または薬剤組成物で患者の病気を処置する方法を提供する。
【００６０】
本明細書に使用される、「処置(treatment)」または「処置する(treating)」ということばは、病気（癌または線維症等）の治療のための処置および予防のための(prophylactic)または防止のための(preventative)手段双方を意味する。処置の必要なものとしては、すでにその病気にかかっているものおよびその病気を防ごうとするものがある。
【００６１】
癌の例としては、以下に制限されないが、卵巣癌、結腸癌、乳癌、肺癌、頭頸部癌、膀胱癌、大腸癌、膵臓癌、非ホジキンリンパ腫、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、黒色腫、平滑筋腫、平滑筋肉腫、神経膠腫、膠芽細胞腫、骨髄腫、単球性白血病、Ｂ細胞由来白血病(B-cell derived leukemia)、Ｔ細胞由来白血病(T-cell derived leukemia)、Ｂ細胞由来リンパ腫、Ｔ細胞由来リンパ腫、および固形腫瘍が挙げられる。線維症は、例えば、心筋梗塞、狭心症、変形性関節症、肺線維症、喘息、嚢胞性線維症、気管支炎、または喘息であってもよい。
【００６２】
本明細書に使用される、処置を目的とした「患者(subject)」ということばは、哺乳動物として分類される動物を指し、ヒト、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ等の、家畜動物、および動物園、競技(sports)、またはペット動物を包含する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
【００６３】
本発明のＣＤ４７抗体はまた、ＣＤ４７よる病気の治療の経過をモニターするのにインビトロでまたはインビボで使用できる。ゆえに、例えば、ＣＤ４７を発現する細胞、特にＣＤ４７を発現する癌細胞の数の増加または減少を測定することによって、病気を改善することを目的とする特定の治療レジメが有効であるかどうかを決定できる。
【００６４】
本発明のＣＤ４７抗体は、液相で利用できるまたは固相担体に結合できるイムノアッセイにインビボで使用されてもよい。加えて、これらのイムノアッセイでのＣＤ４７抗体は、様々な方法で検出可能なように標識されてもよい。本発明のモノクローナル抗体を利用できるイムノアッセイのタイプの例としては、フローサイトメトリー、例えば、ＦＡＣＳ、ＭＡＣＳ、免疫組織化学、直性または間接形式での競合及び非競合イムノアッセイがある。本発明のＣＤ４７抗体を用いた抗原の検出は、生理学的試料の免疫組織化学アッセイなどの、順形式(forward mode)、逆形式(reverse mode)、または同時形式(simultaneous mode)のいずれかで操作されるイムノアッセイを用いて行うことができる。当業者は、過度の実験をすることなく他のイムノアッセイ形式を知るであろう、または容易に認識できる。
【００６５】
本発明のＣＤ４７抗体は、多くの様々な担体に結合して、ＣＤ４７発現細胞の存在を検出するのに使用できる。既知の担体の例としては、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナイロン、アミラーゼ、天然及び変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロースならびに磁鉄鉱がある。上記担体の性質は、本発明の目的に応じて可溶性または不溶性のいずれであってもよい。当業者は、モノクローナル抗体に結合するための他の適当な担体を知っているであろう、または通常の実験を用いて、上記を確かめることができるであろう。
【００６６】
診断方法に使用される、治療方法におけるトレーサーとしての用途が見つかっているなど、当業者が知っている多くの様々な標識や標識方法が存在する。診断を目的として、標識は、本発明の抗体または、ＣＤＲ配列から構成されるもしくはＣＤＲ配列を有する断片などの、この断片に共有結合してもまたは非共有結合してもよい。本発明で使用できる標識のタイプの例としては、酵素、ラジオアイソトープ、蛍光化合物、コロイド金属、化学発光化合物、および生物発光化合物がある。当業者は、本発明のモノクローナル抗体に結合する他の適当な標識を知っているであろう、または通常の実験を用いて、上記を確かめることができるであろう。さらに、これらの標識の本発明のモノクローナル抗体への結合は、当業者に共通の標準的な技術を用いて行うことができる。
【００６７】
実施形態によっては、本発明のＣＤ４７抗体は、例えば、イメージングに使用される、ナノ粒子に結合する。使用できるナノ粒子としては、当該分野において既知のものがあり、例えば、以下に制限されないが、ラマン−シリカ−金−ナノ粒子(Raman-silica-gold-nanoparticle)（Ｒ−Ｓｉ−Ａｕ−ＮＰ）がある。上記Ｒ−Ｓｉ−Ａｕ−ＮＰは、狭いバンド分光特徴(narrow-band spectral signature)を有する、ラマン有機分子が金コアに吸着することで構成される。ラマン有機分子は変更されてもよいため、各ナノ粒子は自身の特徴を有することができ、これにより複数のナノ粒子がそれぞれ多量化によって同時に検出できる。完全なナノ粒子はシリカシェルに封入されて、ラマン有機分子を金ナノコアに保持する。Ｒ−Ｓｉ−Ａｕ−ＮＰの任意のポリエチレングリコール（ＰＥ）化(polyethylene glycol (PEG)-ylation)によって、そのバイオアベイラビリティが上がり、標的分子に結合する機能的「ハンドル(handle)」が提供される。例えば、Thakor et al (2011), Sci. Transl. Med., 3(79):79ra33; Jokerst et al. (2011) Small., 7(5):625-33; Gao et al. (2011) Biomaterials, 32(8):2141-8を参照。
【００６８】
本発明を目的として、インビボでまたはインビトロで、体液中にまたは組織に存在する際に本発明のＣＤ４７抗体によってＣＤ４７を検出してもよい。検出可能な量のＣＤ４７を含むサンプルであれば、使用できる。サンプルは、尿、唾液、脳脊髄液、血液、血清など液体、または組織、便などの固体もしくは半固体、または組織学的診断に一般的に使用されるもの等の固形組織であってもよい。
【００６９】
より高い感度を生じる可能のある他の標識技術としては、抗体を低分子量ハプテンにカップリングさせることからなるものがある。次に、これらのハプテンは、第２の反応によって特異的に検出できる。例えば、アビジンと反応する、ビオチン、または特異的な抗ハプテン抗体と反応できる、ジニトロフェノール、ピリドキサール、もしくはフルオレセインなどのハプテンを使用することが一般的である。
【００７０】
便宜上、本発明のＣＤ４７は、キット、即ち、診断アッセイを行うための指示書と所定量の試薬とのパッケージされた組み合わせ(packaged combination)中に提供されてもよい。抗体を酵素で標識する際には、キットは、酵素で必要とされる基質および補因子（例えば、検出可能な発色団またはフルオロフォアを提供する基質前駆体）を含むであろう。加えて、安定化剤、バッファー（例えば、ブロックバッファー(block buffer)またはリシスバッファー(lysis buffer)）等の、他の添加剤を含んでもよい。様々な試薬の相対量は、アッセイの感度を実質的に最適化する試薬の溶液における濃度となるように広範に変化しえる。特に、試薬は、溶解すると適当な濃度の試薬溶液となる賦形剤などの、一般的には凍結乾燥された、乾燥粉末として提供されてもよい。
【００７１】
１以上の本発明の抗体を含む治療製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で、任意の生理学的に許容できる担体、賦形剤または安定化剤と所望の純度を有する抗体を混合することによって貯蔵用に調製される（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)を参照）。抗体組成物は、医療行為によく適合するように処方、投薬(dosed)、および投与されるであろう。この際に考慮される因子としては、処置される特定の疾患、処置される特定の哺乳動物、個々の患者の病態、疾患の原因、薬剤のデリバリー部位、投与方法、投与のスケジュール、および医療従事者が知る他の因子がある。投与される抗体の「治療上有効な量」は、このような考えによって管理されるであろうし、ＣＤ４７関連病気を防ぐのに必要な最小量である。
【００７２】
治療用量は、少なくとも約０．０１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．０５μｇ／ｋｇ体重；少なくとも約０．１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約０．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約１μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約２．５μｇ／ｋｇ体重、少なくとも約５μｇ／ｋｇ体重であり、および約１００μｇ／ｋｇ体重以下であろう。このようなガイドラインは、例えば、抗体断片を使用する際、または抗体コンジュゲート(antibody conjugate)を使用する際には、活性剤の分子量に関して調節されることは当業者が理解するであろう。用量はまた、局所投与、例えば、鼻腔内、吸入などで、または全身投与、例えば、腹腔内（Ｉ．Ｐ．）、静脈内（Ｉ．Ｖ．）、皮内（Ｉ．Ｄ．）、筋肉内（Ｉ．Ｍ．）などによって異なってもよい。
【００７３】
本発明のＣＤ４７抗体は、活性を促進する、または治療効果を上げる１以上の薬剤と一緒に処方される必要はないが、必要であれば上記のように所望されてもよい。これらは、通常、前記で使用されるのと同様の用量および投与経路または従来使用される用量の約１〜９９％で使用される。
【００７４】
許容できる担体、賦形剤、または安定化剤は使用される用量や濃度でレシピエントにとって無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸やメチオニン等の抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；塩化ベンザルコニウム；フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリン等の、タンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリジン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストリン等の、単糖、二糖、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成カウンターイオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等の非イオン性界面活性剤がある。インビボ投与に使用される製剤は、滅菌されている必要がある。これは、滅菌濾過膜による濾過によって容易にできる。
【００７５】
ＣＤ４７抗体を含む活性成分はまた、例えば、コロイドドラッグデリバリーシステム（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル）においてまたはマクロエマルジョンにおいて、それぞれ、コアセルベーション技術によってまたは界面重合によって、調製されたマイクロカプセル、例えば、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルやポリ（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに封入されて(entrapped)もよい。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)に開示される。
【００７６】
本発明のＣＤ４７抗体または薬剤組成物は、非経口、皮下、腹腔内、肺内、及び鼻腔内等の、適当な手段によって投与されてもよい。非経口注入としては、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、または皮下投与がある。加えて、抗ＣＤ４７抗体は、特に抗体の用量を減らしながら、パルスインフィージョン(pulse infusion)によって適切に投与される。
【００７７】
病気の予防または処置を目的として、抗体の適切な用量は、上記したような、処置される病気のタイプ、病気の重篤度や経過、抗体が予防目的で投与されるか否か、以前の治療、患者の病歴や抗体に対する応答性、ならびに主治医の判断によって異なるであろう。抗体は、１回または一連の処置にわたって患者に適切に投与される。
【００７８】
本発明の他の実施形態では、上記疾患の処置に使用できる材料を含む製造社の製品(article of manufacture)が提供される。製造社の製品は、容器およびラベルを有する。適当な容器としては、例えば、ボトル、バイアル瓶、シリンジ、および試験管がある。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの様々な材料で形成されてもよい。容器は、症状を処置するのに効果的である組成物を収容し、滅菌アクセスポート(sterile access port)を有していてもよい（例えば、容器が、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって穿刺可能なストッパーを有するバイアル瓶であってもよい）。組成物中の活性剤はＣＤ４７抗体である。容器のラベルまたは容器に付着した(associated with)ラベルは、組成物が所定の症状を処置するのに使用することを示す。製造社の製品は、リン酸緩衝食塩水、リンガー溶液及びデキストロース溶液等の製薬上許容できるバッファーを含む第２の容器をさらに有していてもよい。製造社の製品は、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用のインストラクションの入った添付文書などの、商業上および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに有していてもよい。
【実施例】
【００７９】
以下の実施例は、本発明をどのように行い、使用するかの完全な開示、記載を当業者に提供できるように、記載するものであり、発明者が発明とみなす範囲を制限するものではなく、また、以下の実験がすべてであるまたはその実験のみを行ったことを表わすものではない。使用される数値（例えば、量、温度など）に関しては正確をきすために努力がなされたが、実験誤差や偏差は考慮されるべきである。特記しない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度はセ氏温度であり、圧力は大気圧または大気圧付近である。
【００８０】
本明細書で挙げられるすべての出版物や特許出願は、各出版物や特許出願が詳細にかつ個々に参考で組み込まれているように参考によって本明細書中に引用される。
【００８１】
本発明は、本発明者によって見出されたまたは報告された特定の実施形態の観点から本発明の実施に好ましい形態を含むよう記載される。本開示を照らして、本発明の範囲を逸脱しない限り特定の具体的な実施形態において数多くの修飾や変更ができると、当業者は理解するであろう。例えば、コドンのリダンダシー(codon redundancy)により、タンパク質配列に影響を与えずに基本的なＤＮＡ配列に変更を行うことができる。さらに、生物学的に機能が等価であるとの考えにより、種類または量において生物学的作用に影響を与えずにタンパク質の構造に変更を行うことができる。このような修飾はすべて添付の請求の範囲に含まれるものと解される。
【００８２】
ファージライブラリーの確立
ＣＤ４７は、細胞外Ｎ末端ＩｇＶドメイン、５つの膜貫通ドメイン(transmembrane domain)、および短いＣ末端細胞内テールを有する５０ｋＤａの膜レセプターである。ヒトＦｃまたはビオチン化ヒトＣＤ４７−ＩｇＶドメインタンパク質(ACROBiosystems)と結合した(conjugated with)ヒトＣＤ４７−ＩｇＶドメインタンパク質を、ファージライブラリーパンニング(phage library panning)用の抗原として使用した。
【００８３】
５０人を超える健常なヒト被験者の脾臓または骨髄から増幅した抗体遺伝子断片から構成されるファージミドベクターを用いて、ファージライブラリーを構築した。抗体フォーマットは、１本鎖可変断片（ＶＨ＋リンカー＋ＶＬ）である。ライブラリーサイズは１．１×１０１０であり、配列多様性を以下のようにして分析した。ライブラリーから選択し、さらに配列を決定した(sequenced)６２クローンについて、１６配列がトランケーション(truncation)、フレームシフトまたはアンバーコドン(amber codon)を有し；４６配列が全ＨＣＤＲ３配列が固有である全長ｓｃＦｖを有する。４６の全長ｓｃＦｖにおいて、１３配列がラムダ軽鎖を有し、３３配列がカッパ軽鎖を有する。
【００８４】
ファージパンニングおよびクローン選択
ヒトＣＤ４７−ＩｇＶドメインに特異的に結合するファージクローンを得るために、２つのファージパンニング方法を使用した。
【００８５】
１．ヒトＣＤ４７−ＩｇＶに対するファージライブラリーイムノチューブ(immunotube)パンニング
本方法において、上記したのと同様にして開発したファージライブラリーを、まず、カゼイン被覆イムノチューブ中で２時間インキュベートした。ヒトＣＤ４７−ＩｇＶ−Ｆｃ融合タンパク質を第１のパンニングラウンドで使用した。ＰＢＳＴで５〜２０回洗浄することによって、非結合ファージを除去した。結合ファージを新たに調製した１００ｍＭトリエチルアミン溶液で溶出させ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを添加することによって中和して、第１のアウトプットファージプールとした。この第１のアウトプットファージプールを、増幅を目的として大腸菌ＴＧ−１(E. Coli TG-1)細胞に感染させることにより回収した(rescue)後、抗原としてビオチン化ヒトＣＤ４７−ＩｇＶを用いた第２のパンニングラウンドを行った。結合ファージを同様の方法で溶出させ、第２のアウトプットファージプールとし、さらにこれを回収した後、抗原としてヒトＣＤ４７−ＩｇＶ−Ｆｃ融合タンパク質を用いた第３のパンニングラウンドを行った。さらに、結合ファージを第３のアウトプットファージプールとし、ビオチン化ヒトＣＤ４７−ＩｇＶを用いた第４のパンニングラウンドを行った。
【００８６】
２．ヒトＣＤ４７−ＩｇＶに対するファージライブラリー溶液パンニング
本第２の方法において、ファージライブラリーを、まず、カゼインブロック(casein-blocked)１００μＬ  ストレプトアビジン−磁気ビーズ(streptavdin-magnetic bead)中でインキュベートして、ストレプトアビジンビーズバインダーを消耗させた。ストレプトアビジン−磁気ビーズ及びＡＧ００８４−ｈｕＩｇＧ１／ｋをネガティブ消耗(negative depletion)に使用した。消耗したライブラリーを回収した後、抗原としてビオチン化ヒトＣＤ４７−ＩｇＶを用いた第２のパンニングラウンドを行い、さらに、カゼインブロックストレプトアビジン−磁気ビーズを用いてネガティブ消耗を行った。ＰＢＳＴで５〜２０回洗浄することによって、非結合ファージを除去した。結合ファージを新たに調製した１００ｍＭトリエチルアミン溶液で溶出させ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌバッファーを添加することによって中和した後、回収し、さらにヒトＣＤ４７−ＩｇＶ−Ｆｃ融合タンパク質を用いた第３のパンニングラウンドを行い、ＡＧ００８４−ｈｕＩｇＧ１／ｋを用いて消耗させた。さらに、結合ファージを第３のアウトプットファージプールとし、ビオチン化ヒトＣＤ４７−ＩｇＶを用いた第４のパンニングラウンドおよびカゼインブロックストレプトアビジン−磁気ビーズを用いたネガティブ消耗を行った。
【００８７】
このプロセス後、ヒトＣＤ４７−ＩｇＶドメインに特異的に結合する複数のファージクローンが得られ、これらを濃縮した(enriched)。次に、これを希釈し、播種して、３７℃で８時間生育させ、一晩抗カッパ抗体被覆フィルターに捕捉させた(capture)。ビオチン化ヒトＣＤ４７−ＩｇＶ（５０ｎＭ）及びＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎ−ＡＰコンジュゲート(NeutrAvidin-AP conjugate)（１：１０００希釈）をフィルターに塗布して、陽性に結合したファージクローンを検出した。陽性のファージプラークを選択して、１００μＬのファージ溶出バッファーに溶出させた。約１０〜１５μＬの溶出ファージを用いて、１ｍＬ  ＸＬ１ブルー細胞(XL1 blue cells)に感染させて、ファージシングルポイントＥＬＩＳＡ(Phage single point ELISA)（ＳＰＥ）のための高力価ファージ（ＨＴ）と作製した。フィルターリフトから選択した陽性シングルクローンをヒトＣＤ４７−ＩｇＶ−Ｆｃ融合タンパク質およびビオチン化ヒトＣＤ４７−ＩｇＶドメインタンパク質に結合させた。また、これらの陽性シングルクローンのＶＨおよびＶＬ遺伝子について配列を決定した。特有のＶＨ及びＶＬ遺伝子を有するすべての陽性ヒットを発現ベクターｐＦＵＳＥ２ｓｓ−ＣＬＩｇ−ｈｋ（軽鎖、InvivoGen, Cat No. pfuse2ss-hclk)およびｐＦＵＳＥｓｓ−ＣＨＩｇ−ｈＧ１（重鎖、InvivoGen, Cat No. pfusess-hchg1)にクローニングした。抗体をＨＥＫ２９３細胞で発現させ、プロテインＡプラスアガロース(Protein A Plus Agarose)で精製した。
【００８８】
ＣＤ４７抗体のアフィニティ成熟(Affinity maturation)
本発明のＣＤ４７抗体の結合親和性は、インビトロアフィニティ成熟によって、例えば、部位特異的ランダム突然変異(site-specific randomized mutation)によって、向上でき、これにより、本発明の範囲に含まれる変異配列が得られる。
【００８９】
例えば、本発明のＣＤ４７抗体である１Ｆ８のＢｉａＣｏｒｅ分析から、１．０４Ｅ−０３１／ｓの高い解離速度で２．８ｎＭの結合親和性（ＫＤ）が示され、これはインビトロアフィニティ成熟によって向上できた。１Ｆ８の重鎖及び軽鎖のＣＤＲ配列をよく分析することにより、ランダムに変異したＨＣＤＲ１およびＬＣＤＲ１領域内の数個の残基が同定された。したがって、ランダム突然変異ライブラリーを構築し、特定の残基に導入することにより、様々な新規な配列が得られる。このＣＤＲ突然変異ライブラリーを、平衡条件下で液相でビオチン化可溶性ＣＤ４７  ＥＣＤを用いてパンニングした。低抗原濃度での複数のパンニングラウンド後、濃縮したアウトプットバインダーを結合ＥＬＩＳＡ試験用に選択した後、全ＩｇＧに変換し、これをＢｉａＣｏｒｅ分析にかけて、オフ−レイト改良配列(off-rate improved sequence)用に特異的に選択する。このスクリーニングプロセスにより、本発明の抗体分子が臨床用途に全体的に最良の特性で構築できる。
【００９０】
実施例１  組換ＣＤ４７−ＥＣＤタンパク質に結合するファージクローンのＥＬＩＳＡによるスクリーニング
組換ヒトＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質(Acrobiosystems)を、室温（ＲＴ）で２時間、マイクロタイタープレートにリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）における２μｇ／ｍＬで被覆した。抗原を被覆した後、ウェルを、室温（ＲＴ）で１時間、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）でブロックした。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、単一のクローンから精製したファージをウェルに加えて、ＲＴで１時間、インキュベートした。結合ファージクローンを検出するために、Ｍ１３に対するＨＲＰ標識２次抗体(HRP conjugated secondary antibodies)(Jackson Immuno Research)を添加した後、蛍光発生基質(Roche)を添加した。すべてのインキュベーション工程間で、プレートのウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。蛍光をＴＥＣＡＮ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダー(TECAN Spectrafluor plate reader)で測定した。陽性のファージクローンを重鎖及び軽鎖遺伝子の配列決定用に選択した。
【００９１】
本発明の試験を行ったＣＤ４７抗体はすべて、組換ヒトＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質に対して良好な結合活性を示した。
【００９２】
実施例２  ＳＩＲＰαに対するＣＤ４７の相互作用を遮断する抗体のＥＬＩＳＡによる分析
組換ヒトＣＤ４７／マウスＦｃ融合タンパク質またはビオチン化ＣＤ４７タンパク質(Acrobiosystems)を、ＲＴで２時間、マイクロタイタープレートにＰＢＳにおける１μｇ／ｍＬで被覆した。抗原を被覆した後、ウェルを、ＲＴで１時間、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）でブロックした。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、ＰＢＳで希釈した抗体をウェルに加え（５μｇ／ｍＬ）、ＲＴで１時間、インキュベートした。結合抗体を検出するために、ヒトＦｃに対するＨＲＰ標識２次抗体(HRP conjugated secondary antibodies)(Jackson Immuno Research)を添加した後、蛍光発生基質(Roche)を添加した。すべてのインキュベーション工程間で、プレートのウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。蛍光をＴＥＣＡＮ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダー(TECAN Spectrafluor plate reader)で測定した。
【００９３】
本発明の試験を行ったＣＤ４７抗体はすべて、組換ヒトＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質及びビオチン化ＣＤ４７タンパク質に対して良好な結合活性を示した。
【００９４】
実施例３  ＳＩＲＰαに対するＣＤ４７の相互作用を遮断する抗体のＥＬＩＳＡによる分析
組換ヒトＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質(Acrobiosystems)を、４℃で１６時間、マイクロタイタープレートにＰＢＳにおける１μｇ／ｍＬで被覆した。ＲＴで１時間、ＰＢＳＴにおける１％  ＢＳＡでブロックした後、１μｇ／ｍＬのＳＩＲＰα−Ｈｉｓタンパク質を、ＲＴで１時間、ＣＤ４７抗体（１０μｇ／ｍＬ）の不存在下でまたは存在下で添加した。次に、プレートを３回洗浄し、ＲＴで１時間、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ２次抗体(HRP-conjugated anti-His secondary antibody)と共にインキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ溶液を３０分間各ウェルに加え、反応を２．０Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止し、ＯＤを４９０ｎｍで測定した。
【００９５】
本発明の試験を行ったＣＤ４７抗体はすべて、ＣＤ４７タンパク質−ＳＩＲＰα結合を効果的に遮断した。
【００９６】
実施例４  単量体ＣＤ４７−ＥＣＤに結合するＣＤ４７抗体の用量依存反応
直接結合および競合スクリーニング後、本発明のＣＤ４７抗体である１Ｆ８を、２つの既存の参照抗体と比較して、本試験に選んだ。ビオチン化ＣＤ４７タンパク質(Acrobiosystems)を、ＲＴで２時間、マイクロタイタープレートにＰＢＳにおける１μｇ／ｍＬで被覆した。抗原を被覆した後、ウェルを、ＲＴで１時間、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）でブロックした。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、異なる濃度のＣＤ４７抗体をウェルに添加して、ＲＴで１時間、インキュベートした。結合抗体を検出するために、ヒトＦｃに対するＨＲＰ標識２次抗体(HRP conjugated secondary antibodies)(Jackson Immuno Research)を添加した後、蛍光発生基質(Roche)を添加した。すべてのインキュベーション工程間で、プレートのウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。蛍光をＴＥＣＡＮ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダー(TECAN Spectrafluor plate reader)で測定した。
【００９７】
参照抗体である５Ｆ９及び２Ａ１を、Stanford University、Inhibrx LLC、およびCelgene Corp.の研究者によって開示される（例えば、ＵＳ  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ９，０１７，６７５  Ｂ２、ＵＳ  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ９，３８２，３２０、ＵＳ  Ｐａｔ．  Ｎｏ．  ９，２２１，９０８、米国特許出願公開第Ｎｏ．  ２０１４／０１４０９８９号及びＷＯ  ２０１６／１０９４１５を参照）のと同様にして、Ｈｕ５Ｆ９およびＣＣ−９０００２の配列に従って製造し、同じ研究に使用した。
【００９８】
図１に示されるように、すべての３種の抗体（１Ｆ８、５Ｆ９、及び２Ａ１）は、単量体ＣＤ４７−ＥＣＤに対して同様の結合活性を示した。
【００９９】
実施例５  二量体ＣＤ４７−ＥＣＤに結合するＣＤ４７抗体の用量依存反応
実施例４で使用した３種のＣＤ４７抗体（即ち、１Ｆ８、５Ｆ９、及び２Ａ１）を本研究でも使用した。
【０１００】
ＣＤ４７／マウスＦｃ融合タンパク質(Acrobiosystems)を、ＲＴで２時間、マイクロタイタープレートにＰＢＳにおける１μｇ／ｍＬで被覆した。抗原を被覆した後、ウェルを、ＲＴで１時間、１％  ＢＳＡを含むＰＢＳ／０．０５％  Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）でブロックした。ウェルをＰＢＳＴで洗浄した後、異なる濃度の抗ＣＤ４７抗体をウェルに添加して、ＲＴで１時間、インキュベートした。結合抗体を検出するために、ヒトＦｃに対するＨＲＰ標識２次抗体(Jackson Immuno Research)を添加した後、蛍光発生基質(Roche)を添加した。すべてのインキュベーション工程間で、プレートのウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。蛍光をＴＥＣＡＮ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダーで測定した。
【０１０１】
同様に、図２ａに示されるように、３種の試験した抗体である１Ｆ８、５Ｆ９、及び２Ａ１において、これらはすべて、二量体ＣＤ４７−ＥＣＤに対して同様の結合活性を示した。
【０１０２】
他の結合研究を行い、本発明の２種の抗体、即ち、１Ｆ８及び１３Ｈ３の組換ＣＤ４９−ＥＣＤへの結合親和性を比較した。図２ｂに示されるように、これらの２種の抗体もまた、容量に依存して同様の結合活性を示し、この際、ＥＣ５０は、１Ｆ８では０．０３８ｎＭであり、１３Ｈ３では０．０４５ｎＭであった。
【０１０３】
実施例６  ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合を遮断するＣＤ４７抗体の用量依存反応
３種のＣＤ４７抗体（即ち、１Ｆ８、５Ｆ９、及び２Ａ１）を本研究でも使用した。
【０１０４】
組換ＣＤ４７−Ｆｃ融合タンパク質(Acrobiosystems)を、４℃で１６時間、マイクロタイタープレートにＰＢＳにおける１μｇ／ｍＬで被覆した。ＲＴで１時間、ＰＢＳＴにおける１％  ＢＳＡでブロックした後、１μｇ／ｍＬのＳＩＲＰα−Ｈｉｓタンパク質を、ＲＴで１時間、異なる濃度の抗ＣＤ４７抗体の不存在下でまたは存在下で添加した。次に、プレートを３回洗浄し、ＲＴで１時間、ＨＲＰ標識抗Ｈｉｓ２次抗体と共にインキュベートした。洗浄後、ＴＭＢ溶液を３０分間各ウェルに加え、反応を２Ｍ  Ｈ２ＳＯ４で停止し、ＯＤを４９０ｎｍで測定した。
【０１０５】
再度、図３ａに示されるように、３種の抗体はすべて、ＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合の遮断において同様の活性を示した。
【０１０６】
他の結合研究を行い、本発明の２種のＣＤ４７抗体である１Ｆ８及び１３Ｈ３のＣＤ４７のＳＩＲＰαへの結合の遮断能を比較した。図３ｂ及び図３ｃに示されるように、これらの２種の抗体もまた、容量に依存して同様の遮断活性を示し、この際、ＩＣ５０は、１Ｆ８では０．７８ｎＭであり、１３Ｈ３では０．２０ｎＭであった。
【０１０７】
実施例７  ＣＤ４７＋ Ｒａｊｉ細胞に結合するＣＤ４７抗体の用量依存反応
３種のＣＤ４７抗体（即ち、１Ｆ８、５Ｆ９、及び２Ａ１）を本研究にも使用した。
【０１０８】
表面でヒトＣＤ４７を内生的に発現するＲａｊｉ細胞を、４℃で３０分間、異なる濃度の１Ｆ８、５Ｆ９及び２Ａ１抗体で染色した。次に、細胞をＰＢＳで３回洗浄した後、４℃で３０分間、ＡＰＣ標識抗ヒトＦｃ特異抗体(APC-labeled anti-human Fc specific antibody)(Invitrogen)と共にインキュベートした。結合をＦＡＣＳＣａｎｔｏ(Becton-Dickinson)を用いて測定した。
【０１０９】
図４ａに示されるように、３種の抗体すべてがＣＤ４７＋ Ｒａｊｉ細胞への結合にお
いて同様の活性を示し、さらに同様の用量依存パターンを示した。
【０１１０】
別の研究を行い、本発明の２種の抗体である１Ｆ８および１３Ｈ３のＣＤ４７保有Ｒａｊｉ細胞への結合能を比較した。図４ｂに示されるように、１３Ｈ３は、ＣＤ４７保有Ｒａｊｉ細胞への結合において１Ｆ８より強い親和性を発揮し、この際、ＥＣ５０は、１Ｆ８で２．９５ｎＭであり、１３Ｈ３で１．０６ｎＭであった。
【０１１１】
図４ｃ及び図４ｄは、それぞれ、Ｂｉｏｃｏｒｅ分析によって測定される、１Ｆ８および１３Ｈ３の結合キネティクスを示す；さらに図４ｅは、前記データを示す。
【０１１２】
実施例８  ヒトマクロファージ（ＭΦ）による腫瘍細胞の食作用の研究
３種のＣＤ４７抗体（即ち、１Ｆ８、５Ｆ９、及び２Ａ１）を本研究でも使用した。
【０１１３】
ＰＢＭＣをヒト血液から単離し、単球を６日間マクロファージに分化させた。この単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）をかき集め、２４ウェルディッシュに再播種し、２４時間接着させた。ＣＤ４７を内生的に発現するヒト腫瘍細胞系Ｒａｊｉを標的細胞として選択し、１０分間、１μＭ  ＣＦＳＥで標識した後、５：１の腫瘍細胞：食細胞の割合でＭＤＭに添加し、ＣＤ４７抗体を様々な用量で添加した。３時間インキュベートした後、取り込まれなかった標的細胞をＰＢＳで洗浄除去し、残った食細胞をかき集め、マクロファージマーカーＣＤ１４抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。ＣＤ１４＋細胞へのゲーティング(gating)によって食作用を測定した後、ＣＦＳＥ＋細胞の割合（％）を評価した。
【０１１４】
図５ａに示されるように、これらの３種の試験抗体はすべて（即ち、１Ｆ８、５Ｆ９、及び２Ａ１）は、ヒトＭΦによる腫瘍細胞の食作用の促進において同様の活性を示した。図６ａ、図６ｂ、および６ｃは、３種のＣＤ４７抗体によって引き起こされる(triggered)、３種の異なるヒト血液癌細胞系のマクロファージが介する食作用(macrophage-mediated phagocytosis)を示す。
【０１１５】
他の結合研究を行い、本発明の２種のＣＤ４７抗体である１Ｆ８及び１３Ｈ３のヒトＭΦによる腫瘍細胞の食作用の促進能を比較した。図５ｂに示されるように、１３Ｈ３および１Ｆ８は、同様の能力を示し、この際、１３Ｈ３が濃度によっては若干より強い食作用を示した。
【０１１６】
実施例９  ＲＢＣ凝集アッセイにおけるＲＢＣ−不足特性(RBC-sparing property)
ヒトＲＢＣをＰＢＳに１０％になるように希釈し、底の丸い９６ウェルプレートである力価のＣＤ４７抗体と共に(with a titration of CD47 antibodies)３７℃で２時間、インキュベートした。赤血球凝集の兆候が、赤血球凝集しないＲＢＣの点状赤色ドットと比較したヘーズとして現れる、沈降しないＲＢＣ(non-settled RBC)の存在によって示される（図７ａおよび図８ａ参照）。図７ｂ及び図８ｂのグラフは、ＩｇＧコントロールのものに対して正規化された、抗体の存在下でのＲＢＣペレットの領域を定量化することによって測定される「凝集係数(agglutination index)」で表わされる、赤血球凝集アッセイの定量化結果を示す。
【０１１７】
図７ａ、図７ｂ、図８ａ、および図８ｂに示されるように、ＣＤ４７抗体である５Ｆ９では０．１μｇ／μＬ以上の濃度ですでに有意なＲＢＣ凝集が示されたものの、ＣＤ４７抗体である１Ｆ８および２Ａ１では３０μｇ／μＬ以下（図７ａ及び図７ｂ）または１５０μｇ／ｍＬ以下（図８ａ及び図８ｂ）での試験濃度でＲＢＣ凝集が実質的に生じなかった。
【０１１８】
同様にして、図８ｃ及び図８ｄから、本発明のＣＤ４７抗体（即ち、１Ｆ８及び１３Ｈ３）では１５０μｇ／ｍＬ以下の試験濃度でＲＢＣ凝集が実質的に生じないことが示されたが、ＣＤ４７抗体である５Ｆ９では０．１μｇ／μＬ以上の濃度ですでに有意なＲＢＣ凝集が示された。
【０１１９】
実施例１０  ＲＢＣ結合アッセイ
ヒトＲＢＣに対するＣＤ４７抗体の結合をフローサイトメトリーによって試験した。ヒトＲＢＣをＣＤ４７抗体（１０μｇ／ｍＬ）と共に４℃で１時間インキュベートした後、ＡＰＣ標識２次抗体を４℃で３０分間添加した。
【０１２０】
図９ａ及び図９ｂに示されるように、驚くべきことに、本発明のＣＤ４７抗体である１Ｆ８は試験濃度ではＲＢＣに結合しなかったが、参考ＣＤ４７抗体である５Ｆ９及び２Ａ１は試験濃度でＲＢＣに結合した。
【０１２１】
同様にして、図９ｃ及び図９ｄから、１Ｆ８は試験濃度ではＲＢＣ結合が生じなかったが、１３Ｈ３のみが試験濃度で非常に低いＲＢＣ結合を生じたことが示される。
【０１２２】
実施例１１  ＲＢＣ凝集アッセイ
ＣＤ４７抗体の添加によるＲＢＣ凝集を分析するために、６人の男性及び６人の女性個体からＲＢＣを集めた。図１０ａ及び図１０ｂは、ＩｇＧコントロールまたは参考抗体のものに対して正規化された、抗体の存在下でのＲＢＣペレットの領域を測定することによって測定される「凝集係数(agglutination index)」で表わされる、赤血球凝集アッセイの滴定結果を示す。
【０１２３】
実施例１２  血小板結合アッセイ
ヒト血小板に対する本発明のＣＤ４７抗体の結合をフローサイトメトリーによって試験した。ヒト末梢全血を本発明の試験ＣＤ４７抗体（１０μｇ／ｍＬで）またはＳＩＲＰα−Ｉｇ融合タンパク質と共にインキュベートし、ＣＤ６１を血小板に対する表面マーカーとして染色した。ＣＤ６１陽性集団（血小板）でゲーティングし(gating)、さらにＣＤ４７またはＳＩＲＰα−Ｉｇ融合タンパク質の結合の割合（％）を試験することによって、ＣＤ４７抗体またはＳＩＲＰα−Ｉｇ融合タンパク質の結合を測定した。
【０１２４】
図１１に示されるように、本発明の試験ＣＤ４７抗体はヒト血小板に感知できるほどには結合しなかったが、ＳＩＲＰαタンパク質は結合した。
【０１２５】
実施例１３  カニクイザル(cyno)ＲＢＣ凝集アッセイ
オス及びメスのカニクイザル(cyno monkey)のＲＢＣをＰＢＳに１０％になるように希釈し、底の丸い９６ウェルプレートで所定の濃度のＣＤ４７抗体と共に３７℃で２時間、インキュベートした。図１２ａに示されるように、赤血球凝集の兆候が、赤血球凝集しないＲＢＣの点状赤色ドットと比較したヘーズとして現れる、沈降しないＲＢＣ(non-settled RBC)の存在によって示された。図１２ｂは、ＩｇＧコントロールのものに対して正規化された、抗体の存在下でのＲＢＣペレットの領域を測定することによって決定される「凝集係数(agglutination index)」で表わされる、赤血球凝集アッセイの滴定結果を示す。
【０１２６】
データから、本発明の試験ＣＤ４７抗体はインビトロでカニクイザルのＲＢＣ凝集を感知できるほどには誘導しなかったことが示される。
【０１２７】
実施例１４  ＣＤ４７抗体による初期ヒトＡＭＬ細胞の食作用
ＡＭＬ患者(AML-PB003F)の初期ＰＢＭＣ(Primary PBMC)を１μＭ  ＣＦＳＥで１０分間標識した後、５：１の腫瘍細胞：食細胞の割合でＭＤＭに添加し、所定のＣＤ４７抗体を様々な濃度で添加した。３時間インキュベート後、取り込まれない(non-phagocytosed)標的細胞をＰＢＳで洗い流し、残った食細胞をかきおとし、ＣＤ４７抗体で染色し、フローサイトメトリーによって分析した。食作用は、ＣＤ１４＋細胞でゲーティングし(gating)、さらにＣＦＳＥ＋細胞の割合（％）を評価することによって測定した。食作用を前記と同様にして測定した。
【０１２８】
図１３ａ〜１３ｈに示されるように、すべてが同様のアッセイで使用した参考ＣＤ４７抗体よりかなり高く、本発明の試験ＣＤ４７抗体はすべて有意なＡＭＬ結合能（７５％を超える）および食作用能(phagocytosis capabilities)（少なくとも３６％）を示した。
【０１２９】
実施例１５  ルシフェラーゼ−Ｒａｊｉ異種移植モデル（ＣＤＸ）を用いた１Ｆ８のインビボ有効性
ＮＳＧマウスに、尾静脈注射により１００万細胞／マウスの濃度でＲａｊｉ  Ｌｕｃ−ＥＧＦＰを移植した。マウスをインビボで撮像し、移植してから５日目に移植レベルを測定した。ＣＤ４７抗体（即ち、１Ｆ８、５Ｆ９、及び２Ａ１）の処置を、１０ｍｇ／ｋｇの用量で同日に開始した。すべてのマウスに腹腔内注射により１日おきに注射した。マウスを、ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ  ＩＩＩイメージングシステム(IVIS Lumina III imaging system)により以下の時点でインビボで撮像した：抗体処置の０日目、処置後２日目、処置後６日目、及び処置後９日目。インビボライブイメージングシステム(in vivo live imaging system)により生物発光輝度(bioluminescent radiance)を分析することによって、マウスの腫瘍成長を測定した。
【０１３０】
図１４ａに示されるように、生物発光輝度の分析から、本発明の試験ＣＤ４７抗体（即ち、１Ｆ８）で処置してからはじめの３日以内はマウスの腫瘍はほとんど成長せず、処置してから６日目から腫瘍は減少したことが示される。比較により、参考ＣＤ４７抗体で処置されたマウスの腫瘍は同様の処置期間中成長し続けた。
【０１３１】
同様にして、図１４ｂから、ＣＤ４７抗体である１３Ｈ３もまた、異なる試験濃度でＲａｊｉ異種移植モデルでインビボで有効であったことが示される。
【０１３２】
Ｒａｊｉ−異種移植研究の最後に、すべてのマウスを齧歯動物の安楽死(rodent euthanasia)を目的としてＣＯ２を使用することによって安楽死させた。４群のマウスの脾細胞を単離し、フローサイトメトリー分析によってＭ１マクロファージの割合（％）（Ｆ４／８０陽性マクロファージにおけるＣＤ８０陽性割合（％））およびＭ２マクロファージの割合（％）（Ｆ４／８０陽性マクロファージにおけるＣＤ２０６陽性割合（％））を分析した。
【０１３３】
図１５ａ〜１５ｂに示されるように、すべての試験ＣＤ４７抗体（１Ｆ８を含む)は、
腫瘍を有するマウスのマクロファージの極性化を誘導できた。
【０１３４】
実施例１６  様々なヒト癌タイプのＰＤＸサンプルを用いたＣＤ４７発現プロフィール
５４個のＰＤＸサンプル（７種のヒト癌タイプ）を、免疫−組織学染色によってＣＤ４７の発現について分析した。様々なＰＤＸサンプルにおけるＣＤ４７染色のレベルを形状(geometry)および染色強度によって採点した(score)。図１６ａ、図１６ｂおよび図１６ｃから、ＣＤ４７抗体による処置後に様々な発現レベルのＣＤ４７が示される。
【０１３５】
実施例１７  安全製剤研究（インビボでのカニクイザル(cyno)ＰＫ研究）
投薬を受けていない(Naive)カニクイザル(cyno monkey)の静脈内にベヒクル（ｎ＝２）、１Ｆ８（ｎ＝３、１５ｍｇ／ｋｇ）および５Ｆ９（ｎ＝３、１５ｍｇ／ｋｇ）を注入した。血液採取してから２４時間以内に、注射前に２回ならびに抗体投与してから３、６、１０、１４及び２１日目に、血液学（ＣＢＣ）を分析した。赤血球数(Erythrocyte count)（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、絶対網状赤血球数(Absolute Reticulocytes Counts)及び血小板数を含むＣＢＣパラメーターを試験した。結果を図１７ａ〜１７ｄに示すが、これから、１Ｆ８処置はカニクイザルの血液パラメーターに影響を及ぼさなかったことが示される。
【０１３６】
同様にして、投薬を受けていないカニクイザル（ｎ＝２）の静脈内に、２０ｍｇ／ｋｇの用量でＣＤ４７抗体である１３Ｈ３を注射した。様々な時点で、抗凝固剤を用いずに血液を静脈穿刺によってチューブに集めた。コーティング試薬としてＣＤ４７タンパク質を用いたＥＬＩＳＡによってＣＤ４７抗体である１３Ｈ３の血清レベルを測定した後、ＨＲＰ標識抗ヒトカッパ２次抗体(HRP-conjugated anti-human Kappa secondary antibody)を用いて検出した。カニクイザルの薬物動態パラメーターをＷｉｎｏｌｉｎによって分析し、図１７ｅ及び下記表に示す。
【０１３７】
【表１】
2021502324.tif 000003
【０１３８】
カニクイザルにおける抗体１３Ｈ３の安全製剤研究（血液学）
投薬を受けていない(Naive)カニクイザル(cyno monkey)の静脈内に抗体１３Ｈ３（２０ｍｇ／ｋｇ）を単回投与および繰り返し投与（毎週投与）で注入した。抗体投与してから所定の時期に、赤血球数(Erythrocyte count)（ＲＢＣ）、ヘモグロビン（ＨＧＢ）、血小板数及びリンパ球数を含む血液学（ＣＢＣ）パラメーターを試験した。
【０１３９】
図１９ａ、図１９ｂ、図１９ｃ、図１９ｄ、図１９ｅ、図１９ｆ、図１９ｇ、及び図１９ｈに、ＲＢＣコングリゲーション(congregation)、ヘモグロビン、血小板、およびリンパ球に対するＣＤ４７抗体である１３Ｈ３の効果を示す。
【０１４０】
実施例１８  抗体１Ｆ８の構造
ＣＤ４７抗体のエピトープビニングを、競合ＥＬＩＳＡによって評価した。ＣＤ４７  ＥＣＤタンパク質及び第１抗ＣＤ４７抗体を予めインキュベートして、ストレプトアビジン−ＨＲＰ抗体によって検出されるビオチン化第２抗ＣＤ４７抗体に添加した。第１抗ＣＤ４７抗体が第２抗体へのＣＤ４７  ＥＣＤの結合に対して競合した場合には、双方の抗体を同じまたは重複するエピトープビン(epitope bins)に入れた。競合しない場合には、非重複エピトープビン(non-overlapping epitope bin)に入れた。図１８ａ及び図１８ｂに示される結果から、本発明のＣＤ４７抗体である１Ｆ８は参考抗体５Ｆ９及び２Ａ１とは異なるエピトープを有することが示される。
【０１４１】
図１８ｃは、文献（例えば、J. Clin. Investigation, 126, 7: 2610-2620参照）で報告されるヒトＣＤ４７−ＥＣＤ（緑色）とのコンプレックスにおける参考Ａｂ  ５Ｆ９（上部）の結晶構造を示す。
【０１４２】
図１８ｄは、ヒトＣＤ４７−ＥＣＤ（緑色）とのコンプレックスにおける１Ｆ８−Ｆａｂ（上部）の結晶構造を示す。傾斜したヘッドツゥヘッド配向(tilted head to head orientation)を提示するＣＤ４７−ＳＩＲＰα及びＣＤ４７−５Ｆ９ダイアボディ(diabody)のコンプレックス構造とは異なり、ＣＤ４７−１Ｆ８  Ｆａｂのコンプレックス構造はよりまっすぐのヘッドツゥヘッド配向(straighter head to head orientation)をとる。残基Ｌ３、Ｖ２５、Ｔ２６、Ｎ２７、Ｍ２８、Ｅ２９、Ａ３０、Ｑ３１、Ｔ３４、Ｅ３５、Ｙ３７、Ａ５３、Ｌ５４、Ｌ７４、Ｋ７５、Ｇ７６、Ｔ９９、Ｅ１００、Ｌ１０１、Ｔ１０２及びＲ１０３を含み、このうちＬ３、Ｎ２７、Ｅ２９、Ｑ３１、Ｔ３４、Ｅ３５、Ｙ３７、Ａ５３、Ｔ９９、Ｅ１００、Ｌ１０１、Ｔ１０２及びＲ１０３はＳＩＲＰαとの相互作用にかかわりのあるＣＤ４７の１Ｆ８エピトープは、不連続でかつ広範囲であり、１Ｆ８のアンタゴニスト特性を説明する。また、このコンプレックス構造から、１Ｆ８のＶＨドメインがＣＤ４７への８個の水素結合及び４個の塩架橋(salt bridge)を形成し、１Ｆ８のＶＬドメインがＣＤ４７への８個の水素結合を形成することが明らかである。
【０１４３】
公開されているＣＤ４７−ＩｇＶ／抗体またはＳＩＲＰαコンプレックス構造とは異なり、すべてが同様のヘッドツゥヘッド配向(head-to-head orientation)で結合しているものの、１Ｆ８抗体はほとんどが標的の異なるエピトープに結合する。ＣＤ４７の１Ｆ８エピトープは、立体配座的に不連続であり、ＣＤ４７のＴＮＭＥＡＱループ（残基２６〜３１）、Ｔ３４、Ｅ３５、Ｌ７４、およびＬＴＲヒンジ（残基１０１〜１０３）を有する。多くの水素結合相互作用が抗体残基の側鎖とＣＤ４７の主鎖の酸素原子との間に形成される。また、塩架橋は、１Ｆ８のＲ１０３とＣＤ４７のＥ３５との間に形成される。また、適切な配向を保持するのに重要であるいくつかのファン・デル・ワールス接触(Van der Waals contacts)が観察される。抗体１Ｆ８のＶＨドメインがＣＤ４７のＴ３４、Ｅ３５およびＬＴＲ  ヒンジ（残基１０１〜１０３）への結合に主に関与する一方、ＶＫドメインがＴＮＭＥＡＱループ（残基２６〜３１）及びＬ７４と相互作用する。ＣＤ４７のこれらのエピトープは、５Ｆ９抗体及びＳＩＲＰαのものとは異なる。構造分析から、１Ｆ８抗体の２つの長いループ（残基２６〜３８および５２〜５９）がほとんど垂直な配向でＣＤ４７に結合するのを助け、これにより付近の細胞のＣＤ４７が抗体によって架橋されないように抗体を分離し、これによりほとんどの血液細胞の血球凝集を防止することが示唆される。
【０１４４】
図１８ｅは、５Ｆ９及び１Ｆ８とＣＤ４７との相互作用の比較を示す。
【０１４５】
１Ｆ８／ＣＤ４７のコンプレックス構造への参考抗体５Ｆ９／ＣＤ４７コンプレックス構造の重ね合わせから、ＣＤ４７の結合配向がこれらの２つのコンプレックスで非常に異なることが明らかである。双方の抗体は共にｈｅａｄ−ｔｏ−ｈｅａｄ結合配向を有するものの、ＣＤ４７は約１８０°水平に回転する。１Ｆ８／ＣＤ４７コンプレックスの構造は軽鎖ループ残基６１〜６４付近にＣＤ４７  Ｎ−末端ピログルタメートを有するが、５Ｆ９はＷ５２、Ｎ３２及びＷ１０１の３つの重鎖ループの中にＣＤ４７  Ｎ末端を有する。抗体１Ｆ８では、重鎖残基Ｔｒｐ３３及びＡｒｇ１０３が、ファン・デル・ワールス接触およびそれぞれ、ＣＤ４７のＬｅｕ１０１及びＧｌｕ３５との塩架橋を形成する。同じ位置で、抗体５Ｆ９の残基Ｔｙｒ１０１はファン・デル・ワールス接触を介してＣＤ４７のＮ−末端方向に向き、Ａｒｇ１０２はＣＤ４７のＧｌｕ１０４と水素結合を形成する。抗体１Ｆ８のループ残基Ａｓｎ３１、Ｔｒｐ３３、ならびにヒンジ残基Ａｒｇ５３及びＡｓｐ５６は、ドメイン間水素結合ネットワークを形成し、さらにＡｓｎ３１及びＡｒｇ５３はＣＤ４７のＬｅｕ１０１及びＴｈｒ３４の主鎖と水素結合を形成する。同じ界面で、５Ｆ９は、残基Ｔｙｒ５２がＣＤ４７のＬｅｕ３とのファン・デル・ワールス接触を形成する以外は、相互作用を形成しないように見える。ヒンジ（残基５２〜５６）は１Ｆ８（残基５２〜５９）より３残基短い。軽鎖では、Ｆａｂ  １Ｆ８及び５Ｆ９は双方とも、ループ（１Ｆ８ではＶ２９−Ｙ３８および５Ｆ９ではＶ１５２−Ｙ１５８）のＣＤ４７とのいくつかの重要な水素結合相互作用を有する。１Ｆ８の残基Ｙ９７及びＹ９８はループ（残基２６〜３８）を押しのけ(“push” away)、後者は１Ｆ８とＣＤ４７との間に、即ち、１Ｆ８のＡｒｇ３４とＣＤ４７のＬｅｕ７４の主鎖との間に、および１Ｆ８のＡｒｇ３６とＣＤ４７のＴｈｒ２６の主鎖との間に、２個の水素結合を形成する。しかしながら、５Ｆ９の残基Ｇｌｙ２１８及びＳｅｒ２１９（１Ｆ８のＴｙｒ９７及びＴｙｒ９８に相当する）により、５Ｆ９のループ（残基１４９〜１５８）がＣＤ４７と３つの水素結合（Ａｓｎ１５７−Ｌｙｓ３９、Ｔｙｒ１５９−Ｇｌｕ１０４及びＬｙｓ１７７−Ｔｈｒ９９で）を形成する。また、重鎖も同様にして、５Ｆ９のループ（残基１４９〜１５８）が１Ｆ８（残基２６〜３８）より３残基短い。１Ｆ８のこれらの関連するより長いループは、ＣＤ４７の結合配向に主として寄与する。
【０１４６】
実施例１９  ＣＤ４７抗体３４Ｃ５
抗ヒトＣＤ４７抗体を得るために、ＢＡＬＢ／Ｃ、Ｃ５７／ＢＬ６またはＳＪＬマウスを含む６〜８週齢の異なる種を組換ヒトＣＤ４７細胞外ドメインタンパク質で数ラウンド免疫処置した。免疫処置後、十分な力価の抗ＣＤ４７  ＩｇＧを有するマウスを、同じ抗原で追加免疫した後、融合した(fusion)。ハイブリドーマ上清について、ＥＬＩＳＡスクリーニングによってヒトＣＤ４７  ＥＣＤタンパク質との直接結合およびＣＤ４７へのＳＩＲＰα結合の競合を試験した。一連のスクリーニングアッセイにより、３４Ｃ５が上記したアッセイに従うヒト化およびさらにインビトロでの特性化(characterization)用に選択された。
【０１４７】
図２０及び図２１から、それぞれ、組換ＣＤ４７−ＥＣＤ（ＥＣ５０が０．２７ｎＭ）へのおよびＣＤ４７を有するＲａｊｉ細胞（ＥＣ５０が０．８３ｎＭ）への３４Ｃ５の強力な結合親和性が示される。
【０１４８】
図２２から、３４Ｃ５が、ＥＣ５０が０．３０ｎＭであり、ＳＩＲＰαへのＣＤ４７の結合を効果的に遮断できたことが示される。
【０１４９】
図２３から、抗体３４Ｃ５がヒトＭΦによる腫瘍細胞の食作用を促進したことが示される。
【０１５０】
図２４から、抗体３４Ｃ５がインビトロでのＲＢＣ凝集を引き起こさなかったことが示される。
【０１５１】
図２５から、抗体３４Ｃ５がこの抗体濃度の減少に従ってＲＢＣへの結合を減少させることが示される。
【０１５２】
実施例２０  融合タンパク質の調製
ヒトＧＭ−ＣＳＦサイトカインを、（ＧＧＧＧＳ）３、（ＧＧＧＧＳ）６、（ＧＧＧＧＳ）９、ＩＧＤ（Ｆ３０）、ＩＧＤ（Ｆ６４）、ＩＧＤ（Ｒ３０）、ＩＧＮ（Ｒ６４）、ＩＧＤ（Ｒ３０−Ｃｙｓ）、およびＩＧＤ（Ｒ６４−Ｃｙｓ）をを含む様々な長さのリンカーを介して、またはリンカーなしで抗ＣＤ４７抗体（１Ｆ８）の重鎖Ｃ末端に融合した。次に、軽鎖および重鎖発現ベクターをＣＨＯ細胞にコトランスフェクトした。一過性トランスフェクション後、融合タンパク質をタンパク質アフィニティークロマトグラフィーにより培地から精製した。
【０１５３】
実施例２１  融合タンパク質のためのリンカーのスクリーニング
以下の表は、リンカーなしの、またはいくつかの異なるリンカーのうちの１つを用いた、本発明の融合タンパク質のいくつかの例のアグレファット（ａｇｒｅｆａｔｓ）、メインピーク、フラグメント、および収率を示す。
【０１５４】
【表２】
2021502324.tif 000004
【０１５５】
実施例２２  融合タンパク質の組み換えＣＤ４７タンパク質への結合
本発明の融合タンパク質である１Ｆ８−ＧＭＣＳＦのビオチン化ヒトＣＤ４７−ＥＣＤタンパク質（１μｇ／ｍｌ＠１００μｌ）へのＥＬＩＳＡ結合の用量反応について試験を行った。この試験では、ビオチン化ＣＤ４７タンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をＰＢＳ中１μｇ／ｍｌでマイクロタイタープレート上に室温で２時間コーティングした。抗原をコーティングした後、ウェルを１％ＢＳＡを含むＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で１時間室温でブロックした。ＰＢＳＴでウェルを洗浄した後、異なる濃度の１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合分子をウェルに添加し、そして室温で１時間インキュベートした。結合抗体の検出のために、ヒトＦｃに対するＨＲＰ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、続いて蛍光発生基質（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。全てのインキュベーション工程の間に、プレートのウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＴＥＣＡＮ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダーで蛍光を測定した。ＣＤ４７抗体１Ｆ８自体を参照として使用した。
【０１５６】
データは、ＣＤ４７抗体１Ｆ８および融合タンパク質１Ｆ８−ＧＭＣＳＦが組み換えＣＤ４７タンパク質に対して同様の結合親和性を発揮したことを示している。
【０１５７】
実施例２３  融合タンパク質によるＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の遮断
ＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の遮断は、製造元のプロトコル（Ｃｉｓｂｉｏ）に従って行われた。簡単には、ＣＤ４７−ＳＩＲα結合アッセイは、ＨＴＲＦ（均一系時間分解蛍光）技術を利用してハイスループットフォーマットでＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の検出を可能にした。抗体作業溶液および希釈緩衝液中のＴａｇ１−ＣＤ４７／Ｔａｇ−２ＳＩＲＰαタンパク質を調製した。ＣＤ４７抗体または抗ＣＤ４７−ＧＭＣＳＦ融合分子を３８４ウェルプレートに添加し、続いてＴａｇ１−ＣＤ４７およびＴａｇ２−ＳＩＲＰαを添加した。混合物を２５℃で１５分間インキュベートし、コンジュゲートプレ混合物を添加した後さらに２５℃で１時間インキュベートした。次にプレートシーラーを取り除き、蛍光データをＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ  Ｅｎｖｉｓｉｏｎプレートリーダーで読み取った。
【０１５８】
データは、１Ｆ８の１．６ｎＭのＩＣ５０と比較して、１Ｆ８−ＧＭＣＳＦの１．３ｎＭのＩＣ５０であり、１Ｆ８−ＧＭＣＳＦが１Ｆ８自体よりも強い遮断能力を発揮したことを示した。
【０１５９】
実施例２４  融合タンパク質のＲＢＣ節約特性
ヒトＲＢＣをＰＢＳ中で１０％に希釈し、丸底９６ウェルプレート中に１Ｆ８または１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質を滴定して、３７℃で２時間インキュベートした。赤血球凝集の証拠は、非赤血球凝集ＲＢＣの点状の赤い点と比較して曇りとして現れ、沈殿していないＲＢＣの存在によって証明されるであろう。この研究の結果は、１Ｆ８および１Ｆ８−ＧＭＣＳＦの両方が必要を示す濃度でＲＢＣ凝集を誘導しなかったことを示した。
【０１６０】
実施例２５  融合タンパク質による腫瘍細胞の食作用の増加
ＰＢＭＣをヒト血液から単離し、単球を６日間でマクロファージに分化させた。単球由来マクロファージ（ＭＤＭ）を掻き取り、２４ウェルディッシュに再プレーティングし、２４時間付着させた。ＣＤ４７を内因的に発現するヒト腫瘍細胞株Ｒａｊｉを標的細胞として選択し、１０分間１μＭのＣＦＳＥで標識し、次いで食細胞あたり５：１の腫瘍細胞の比率でＭＤＭに添加した。１Ｆ８、ＧＭ−ＣＳＦタンパク質、または１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質を様々な用量で添加した。３時間インキュベートした後、非食作用性標的細胞をＰＢＳで洗い流し、残りの食細胞を掻き取り、マクロファージマーカーＣＤ１４抗体で染色し、フローサイトメトリーで分析した。食作用は、ＣＤ１４＋細胞をゲーティングし、次いでＣＦＳＥ＋細胞の割合を評価することによって測定した。
【０１６１】
図２６は、１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質が、ＩｇＧ対照処理群、１Ｆ８処理群、およびＧＭ−ＣＳＦ処理群と比較して、ＣＤ１４＋細胞中の食細胞の割合のより大きい相対倍率変化を引き起こしたことを示す。
【０１６２】
実施例２６  ヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体への融合タンパク質の結合
融合タンパク質１Ｆ８−ＧＭＣＳＦのヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体タンパク質（２μｇ／ｍｌ＠１００μｌ）へのＥＬＩＳＡ結合の用量反応を決定するために試験を行った。組み換えＧＭ−ＣＳＦ  Ｒアルファタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を室温で２時間マイクロタイタープレート上にＰＢＳ中２μｇ／ｍＬでコートした。抗原をコーティングした後、ウェルを室温で１時間１％ＢＳＡを含むＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）で１時間室温でブロックした。ＰＢＳＴでウェルを洗浄した後、異なる濃度の１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質をウェルに添加し、室温で１時間インキュベートした。結合抗体を検出するために、ヒトＦｃに対するＨＲＰ結合二次抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）を添加し、続いて蛍光発生基質（Ｒｏｃｈｅ）を添加した。全てのインキュベーション工程の間に、プレートのウェルをＰＢＳＴで３回洗浄した。ＴＥＣＡＮ  Ｓｐｅｃｔｒａｆｌｕｏｒプレートリーダーで蛍光を測定した。参照として、組み換えヒトＧＭ−ＣＳＦタンパク質を使用した。
【０１６３】
図２７は、融合タンパク質１Ｆ８−ＧＭＣＳＦが、ＣＤ４７抗体１Ｆ８自体よりもヒトＧＭ−ＣＳＦ受容体に対してより強い結合親和性を有していたことを示す。
【０１６４】
実施例２７  融合タンパク質によるＳＴＡＴ５活性化の誘導
ＣＤ１４陽性マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＣＤ１４＋単球をヒト末梢血から精製した。精製した単球を３７℃で３０分間、異なる濃度の融合タンパク質１Ｆ８−ＧＭＣＳＦで刺激した。インキュベーション後、細胞を集め、ＦＡＣＳ緩衝液（１×ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ）で洗浄し、２％ＰＦＡにより固定し、続いて氷冷メタノールを用いて細胞透過処理を行った。次いで、ＰＥ結合抗ｐＳＴＡＴ５抗体を４℃で３０分間のさらなるインキュベーションのために細胞に添加し、フローサイトメトリーによって分析した。ＭＦＩの倍率変化は、試験サンプルのＭＦＩ／ＩｇＧ対照処理のＭＦＩによって計算した。
【０１６５】
図２８は、１Ｆ８−ＧＭＣＳＦがＧＭＣ−ＳＦ自体の誘導活性と同様の誘導活性を有したことを示す。
【０１６６】
実施例２８  融合タンパク質によるＴＦ−１増殖の刺激
ＧＭＣＳＦ刺激の前に、ＴＦ−１細胞をＲＰＭＩ１６４０基本培地で洗浄し、一晩飢餓状態にした。２日目に、これらの飢餓細胞を収集し、次いで平底９６ウェルプレートの１ウェルあたり５０μＬ中に３×１０５細胞／ｍｌの濃度で播種した。異なる濃度の１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質をＴＦ−１細胞培養物に添加し、３７℃で７２時間インキュベートした。製造業者のプロトコルに従ってＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｓｓａｙにより細胞増殖を測定した。
【０１６７】
図２９は、ＧＭＣＳＦと比較して、融合タンパク質１Ｆ８−ＧＭＣＳＦがＴＦ−１増殖を刺激するためのより強い能力を発揮したことを示す。
【０１６８】
実施例２９  融合タンパク質によるＭ１マクロファージの活性化
ヒトインビトロ分化マクロファージを、マクロファージ当たり５：１の腫瘍細胞の比でＲａｊｉ細胞と共培養した。ＩｇＧ、１Ｆ８、ＧＭＣＳＦまたは１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質を培養物に添加し、８時間インキュベートした。インキュベーション後、培養上清をＬｕｍｉｎｅｘによるＩＬ−６、ＩＬ−１２およびＴＮＦ−αの産生について分析し、細胞をフローサイトメトリーによってＣＤ８０の発現について分析した。これら４つのパラメーターすべてがＭ１マクロファージ活性化の特徴的なマーカーであった。
【０１６９】
図３０（ａ）、図３０（ｂ）、図３０（ｃ）および図３０（ｄ）は、ＩＬ−６、ＩＬ−１２、ＴＮＦ−α、およびＣＤ８０の産生がＩｇＧ、１Ｆ８、ＧＭＣＳＦまたは１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質の存在下でのＭ１マクロファージの活性化により引き起こされたことを示した。
【０１７０】
実施例３０  Ｒａｊｉ異種移植片モデルにおける融合タンパク質のインビボでの有効性
Ｒａｊｉ細胞をＮＳＧマウスの皮下に移植し、１００ｍｍ３に成長させた。次いで、これらのマウスを、１週間に２回、マウス１匹あたり７０ｎｍｏｌのＩｇＧ、１Ｆ８単独、ＧＭＣＳＦ単独、１Ｆ８およびＧＭＣＳＦコンボ、１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質で処置した。精密キャリパーを用いて腫瘍サイズを二次元で測定した。
【０１７１】
図３１は、腫瘍体積の減少における５つの処置のそれぞれの有効性を示し、１Ｆ８−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質は、それらの中で最良の有効性を示した。
【０１７２】
実施例３１  融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦ
融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦを作製するために、ヒトＧＭ−ＣＳＦサイトカインを抗ＣＤ４７抗体（１３Ｈ３）の重鎖Ｃ末端に直接融合させた。次に、軽鎖および重鎖発現ベクターをＣＨＯ細胞にコトランスフェクトした。一過性導入後、融合タンパク質をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーにより培地から精製した。
【０１７３】
十分に適した融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦを上記アッセイに従ってインビトロの特性評価に適用した。
【０１７４】
以下の表は、ＣＤ４７抗体１３Ｈ３および融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦが、Ｂｉａｃｏｒｅ解析によって測定される同様の結合動態を発揮したことを示す。
【０１７５】
【表３】
2021502324.tif 000005
【０１７６】
図３２は、ＣＤ４７抗体１３Ｈ３および融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦがＣＤ４７を有するＲａｊｉ細胞に対して類似の結合親和性を示したことを示す。
【０１７７】
図３３ａおよび図３３ｂは、１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦがＣＤ４７−ＳＩＲＰα相互作用の遮断において１３Ｈ３自体と同程度の能力を発揮したことを示す。
【０１７８】
図３４は、１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質がヒトＭΦによる腫瘍細胞の食作用の促進において１３Ｈ３自体と比較して増強された活性を発揮したことを示す。
【０１７９】
図３５は、１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦがインビトロでのＲＢＣ凝集を引き起こさなかったことを示す。
【０１８０】
図３６は、１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦがヒトＧＭＣＳＦ受容体への結合において組み換えＧＭＣＳＦタンパク質と同程度の効力を発揮したことを示す。
【０１８１】
図３７は、１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦがＳＴＡＴ５活性化の誘導において組み換えＧＭＣＳＦタンパク質と同程度の効力を発揮したことを示す。
【０１８２】
図３８は、１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦがＴＦ−１増殖の刺激において組み換えＧＭ−ＣＳＦタンパク質と同程度の効力を発揮したことを示す。
【０１８３】
実施例３２  Ｒａｊｉ異種移植片モデルにおける融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦのインビボでの有効性
Ｒａｊｉ細胞をＮＳＧマウスの皮下に移植し、１００ｍｍ３に成長させた。次いで、これらのマウスを、１週間に２回、マウス１匹あたり７０ｎｍｏｌのＩｇＧ、１３Ｈ３単独、ＧＭＣＳＦ単独、１３Ｈ３およびＧＭＣＳＦコンボ、１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質で処置した。精密キャリパーを用いて腫瘍サイズを二次元で測定した。
【０１８４】
図３９は、腫瘍体積の減少における５つの処置のそれぞれの有効性を示し、１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦ融合タンパク質は、それらの中で最良の有効性を示した。
【０１８５】
実施例３３  カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ）における１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦのインビボでのＰＫ研究
未処置カニクイザル（ｎ＝２）に、融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦを２０ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射した。それらの血液は、異なる時点で抗凝固剤なしで静脈穿刺によってチューブに集められた。融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦの血清レベルをコーティング試薬としてＣＤ４７タンパク質を用いたＥＬＩＳＡにより測定し、続いて抗ＧＭＣＳＦ二次抗体で検出した。カニクイザルにおける２０ｍｇ／ｋｇの単回投与後の１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦの血清レベルの濃度−時間曲線を図４０に示す。薬物動態学的パラメーターをＷｉｎｏｌｉｎによって分析し、以下の表に示した。
【０１８６】
【表４】
2021502324.tif 000006
【０１８７】
実施例３４  カニクイザル（Ｃｙｎｏｍｏｌｇｕｓ  Ｍｏｎｋｅｙ）における１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦの安全性薬理学（ｓａｆｅｔｙ  ｐｈａｒｍ）研究（血液学）
未処置カニクイザルに、反復投与（週１回投与）の融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦ（２０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内注入した。融合タンパク質投与後の示された時点での赤血球（ＲＢＣ）、血小板および白血球（ＷＢＣ）、好中球および単球のカウントを含めて、血液学（ＣＢＣ）パラメーターを調べた。
【０１８８】
図４１ａ、４１ｂ、４２ａ、４２ｂおよび４２ｃは、ＲＢＣ、血小板、白血球、好中球および単球レベルに対する融合タンパク質１３Ｈ３−ＧＭＣＳＦの効果を示す。
【図１】
2021502324.tif 000007
【図２ａ】
2021502324.tif 000008
【図２ｂ】
2021502324.tif 000009
【図３ａ】
2021502324.tif 000010
【図３ｂ】
2021502324.tif 000011
【図３ｃ】
2021502324.tif 000012
【図４ａ】
2021502324.tif 000013
【図４ｂ】
2021502324.tif 000014
【図４ｃ】
2021502324.tif 000015
【図４ｄ】
2021502324.tif 000016
【図４ｅ】
2021502324.tif 000017
【図５ａ】
2021502324.tif 000018
【図５ｂ】
2021502324.tif 000019
【図６ａ】
2021502324.tif 000020
【図６ｂ】
2021502324.tif 000021
【図６ｃ】
2021502324.tif 000022
【図７ａ】
2021502324.tif 000023
【図７ｂ】
2021502324.tif 000024
【図８ａ】
2021502324.tif 000025
【図８ｂ】
2021502324.tif 000026
【図８ｃ】
2021502324.tif 000027
【図８ｄ】
2021502324.tif 000028
【図９ａ】
2021502324.tif 000029
【図９ｂ】
2021502324.tif 000030
【図９ｃ】
2021502324.tif 000031
【図９ｄ】
2021502324.tif 000032
【図１０ａ】
2021502324.tif 000033
【図１０ｂ】
2021502324.tif 000034
【図１１】
2021502324.tif 000035
【図１２ａ】
2021502324.tif 000036
【図１２ｂ】
2021502324.tif 000037
【図１３】
2021502324.tif 000038
【図１４ａ】
2021502324.tif 000039
【図１４ｂ】
2021502324.tif 000040
【図１５ａ】
2021502324.tif 000041
【図１５ｂ】
2021502324.tif 000042
【図１６ａ】
2021502324.tif 000043
【図１６ｂ】
2021502324.tif 000044
【図１６ｃ】
2021502324.tif 000045
【図１７ａ】
2021502324.tif 000046
【図１７ｂ】
2021502324.tif 000047
【図１７ｃ】
2021502324.tif 000048
【図１７ｄ】
2021502324.tif 000049
【図１７ｅ】
2021502324.tif 000050
【図１８ａ】
2021502324.tif 000051
【図１８ｂ】
2021502324.tif 000052
【図１８ｃ】
2021502324.tif 000053
【図１８ｄ】
2021502324.tif 000054
【図１８ｅ】
2021502324.tif 000055
【図１９ａ−ｂ】
2021502324.tif 000056
【図１９ｃ】
2021502324.tif 000057
【図１９ｄ】
2021502324.tif 000058
【図１９ｅ−ｆ】
2021502324.tif 000059
【図１９ｇ】
2021502324.tif 000060
【図１９ｈ】
2021502324.tif 000061
【図２０】
2021502324.tif 000062
【図２１】
2021502324.tif 000063
【図２２】
2021502324.tif 000064
【図２３】
2021502324.tif 000065
【図２４】
2021502324.tif 000066
【図２５】
2021502324.tif 000067
【図２６】
2021502324.tif 000068
【図２７】
2021502324.tif 000069
【図２８】
2021502324.tif 000070
【図２９】
2021502324.tif 000071
【図３０】
2021502324.tif 000072
【図３１】
2021502324.tif 000073
【図３２】
2021502324.tif 000074
【図３３ａ】
2021502324.tif 000075
【図３３ｂ】
2021502324.tif 000076
【図３４】
2021502324.tif 000077
【図３５】
2021502324.tif 000078
【図３６】
2021502324.tif 000079
【図３７】
2021502324.tif 000080
【図３８】
2021502324.tif 000081
【図３９】
2021502324.tif 000082
【図４０】
2021502324.tif 000083
【図４１ａ】
2021502324.tif 000084
【図４１ｂ】
2021502324.tif 000085
【図４２ａ】
2021502324.tif 000086
【図４２ｂ】
2021502324.tif 000087
【図４２ｃ】
2021502324.tif 000088
【配列表】
2021502324000001.app
【国際調査報告】
2021502324.tif 000089
2021502324.tif 000090
2021502324.tif 000091
2021502324.tif 000092
2021502324.tif 000093