(57)【要約】  ＣＴＬＡ−４結合ドメインおよび２つ以上のＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合構築体は、そのような構築体を使用するための方法とともに記載される。かかる構築体を構成するポリペプチドも記載される。それらの構築体中に含まれるＦｃドメイン単量体は、ホモ二量体形成またはヘテロ二量体形成を促進するアミノ酸置換を含み得る。【選択図】図１
2021532085.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬＡ４結合ドメインと、リンカーによって第２のＦｃドメインに結合された第１のＦｃドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体であって、前記第１および第２のＦｃドメインの各々が、ヘテロ二量体化選択性モジュールまたはホモ二量体化選択性モジュールのいずれかを含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２】
ＣＴＬＡ結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第２のリンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意選択の第３のリンカー；ならびにヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む任意選択の第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも２つのＦｃドメイン単量体が、ヘテロ二量体化選択性モジュールまたはホモ二量体化選択性モジュールのいずれかを含む、ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が各々、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２のＩｇＧ１ドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第１のＩｇＧ１ドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
改変された突起を形成する変異を含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、１、２、または３つの逆電荷変異をさらに含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記改変された突起を形成する変異および前記逆電荷変異が、ＣＨ３ドメイン内にある、請求項２〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記変異が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記変異が、単一アミノ酸変化である、請求項２〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、
2021532085.tif 000073
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、グリシンスペーサーである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０、または１２〜３０個のグリシン残基からなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、２０個のグリシン残基からなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含む、請求項２〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
Ｉ２５３位の各アミノ酸変異が、Ｉ２５３Ａである、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含む、請求項２〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
Ｒ２９２位の各アミノ酸変異が、Ｒ２９２Ｐである、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有する、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000074
を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000075
を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000076
を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000077
を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000078
を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000079
を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000080
を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000081
を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記単一アミノ酸置換が、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択される、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、前記ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記２つまたは４つの逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択される、請求項５、６、および９〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記ＶＨドメインが、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％または９８％同一である、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含む、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
前記第１または第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合される請求項２〜５６のいずれか一項に記載のポリペプチドの２つのコピーを含む、ポリペプチド複合体。
【請求項５８】
ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドに結合される請求項２〜５６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第２のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第１、第２、または第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内のシステイン残基と前記第２のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合される、
ポリペプチド複合体。
【請求項５９】
前記第２のポリペプチド単量体が、改変された空洞を形成する変異を含む、請求項５８に記載のポリペプチド複合体。
【請求項６０】
前記改変された空洞を形成する前記変異が、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａからなる群から選択される、請求項５９に記載のポリペプチド複合体。
【請求項６１】
前記第２のポリペプチドが、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
【請求項６２】
ＣＴＬＡ４結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第２のリンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意選択の第３のリンカー；ならびにヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む任意選択の第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも１つのＦｃドメイン単量体が、１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、ポリペプチド。
【請求項６３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａおよび表４ＢＡおよび表４Ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第２のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第１のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
表４から選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、同一のＣＨ３ドメインを有する、請求項６２〜７１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
表４から選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異が、ＣＨ３ドメインにある、請求項６２〜７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
前記変異が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項７３に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
前記変異が各々、単一アミノ酸変化である、請求項６２〜７３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、
2021532085.tif 000082
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７２に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、グリシンスペーサーである、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０、または１２〜３０個のグリシン残基からなる、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、２０個のグリシン残基からなる、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含む、請求項６２〜７９に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項８０に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
Ｉ２５３位の各アミノ酸変異が、Ｉ２５３Ａである、請求項８１に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含む、請求項６２〜８２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項８３に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
Ｒ２９２位の各アミノ酸変異が、Ｒ２９２Ｐである、請求項８４に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項６２〜８５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有する、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000083
を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000084
を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000085
を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000086
を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９４】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000087
を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９５】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000088
を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000089
を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９７】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000090
を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９８】
前記単一アミノ酸置換が、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択される、請求項９０〜９７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９９】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１００】
前記単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、前記ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異である、請求項９９に記載のポリペプチド。
【請求項１０１】
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項９９に記載のポリペプチド。
【請求項１０２】
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項１０３】
前記２つまたは４つの逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択される、請求項６５、６６、および６９〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項１０３に記載のポリペプチド。
【請求項１０７】
前記ＶＨドメインが、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１０８】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１０９】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％または９８％同一である、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１０】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１１】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１２】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含む、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１７】
前記第１または第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合される請求項２〜５６のいずれか一項に記載のポリペプチドの２つのコピーを含む、ポリペプチド複合体。
【請求項１１８】
ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドに結合される請求項６２〜１１６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第２のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第１、第２、または第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内のシステイン残基と前記第２のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合される、
ポリペプチド複合体。
【請求項１１９】
前記第２のポリペプチド単量体が、１、２、または３つの逆電荷変異を含む、請求項１１８に記載のポリペプチド複合体。
【請求項１２０】
前記第２のポリペプチド単量体が、表４から選択される１、２、または３つの逆電荷変異を含み、かつポリペプチド中の表４から選択される１、２、または３つの逆電荷変異に対して相補的である、請求項１１９に記載のポリペプチド複合体。
【請求項１２１】
前記第２のポリペプチドが、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
【請求項１２２】
ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、第２のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、任意選択の第３のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む任意選択の第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも１つのＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、ポリペプチド。
【請求項１２３】
前記第１のＩｇＧ１単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインをさらに含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２４】
前記第１のＩｇＧ１単量体のアミノ末端にｓｃＦｖをさらに含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２５】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２６】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２７】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２８】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が各々、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２９】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１３０】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２のＩｇＧ１ドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１３１】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第１のＩｇＧ１ドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１３２】
改変された突起を形成する変異を含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、１、２、または３つの逆電荷変異をさらに含む、請求項１２２〜１３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３３】
前記改変された突起を形成する変異および前記逆電荷変異が、前記ＣＨ３ドメイン内にある、請求項１２２〜１３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３４】
ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、第２のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、任意選択の第３のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む任意選択の第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも１つのＦｃドメイン単量体が、１、２、または３つの逆電荷アミノ酸修飾を含む、ポリペプチド。
【請求項１３５】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインをさらに含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３６】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端にｓｃＦｖをさらに含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３７】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表６中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３８】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４から選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３９】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４０】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が各々、表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４１】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａまたは表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第３のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４２】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａまたは表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第２のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４３】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａまたは表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第１のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４４】
表４Ａまたは４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、同一のＣＨ３ドメインを有する、請求項１３４〜１４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４５】
表４から選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異が、ＣＨ３ドメインにある、請求項１３４〜１４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４６】
前記変異が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４７】
前記変異が各々、単一アミノ酸変化である、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４８】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、
2021532085.tif 000091
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４９】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０、または１２〜３０個のグリシン残基からなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５０】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、２０個のグリシン残基からなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５１】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５２】
ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項１５１に記載のポリペプチド。
【請求項１５３】
Ｉ２５３位の各アミノ酸変異が、Ｉ２５３Ａである、請求項１５２に記載のポリペプチド。
【請求項１５４】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５５】
ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項１５４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５６】
Ｒ２９２位の各アミノ酸変異が、Ｒ２９２Ｐである、請求項１５５に記載のポリペプチド。
【請求項１５７】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５８】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５９】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有する、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６０】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６１】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000092
を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６２】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000093
を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６５】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000094
を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000095
を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６７】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000096
を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６８】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000097
を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６９】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000098
を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７０】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000099
を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７１】
前記単一アミノ酸置換が、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択される、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７２】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７３】
前記単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、前記ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異である、請求項９９に記載のポリペプチド。
【請求項１７４】
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項１７３に記載のポリペプチド。
【請求項１７５】
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７６】
前記２つまたは４つの逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択される、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７８】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７９】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８０】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％または９８％同一である、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８１】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８２】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列のセットを含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８３】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセット由来のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８４】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、表２に記載の抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインと、を含み、前記ＶＨドメイン配列および前記ＶＬドメイン配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列と少なくとも９５％または９８％同一である、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８５】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８６】
ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインと、ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインと、をさらに含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８７】
請求項２〜１８７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１８８】
請求項１８７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１８９】
請求項１８７に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１９０】
請求項１８８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９１】
請求項１８９または請求項１９０に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドを発現させる条件下で培養することを含む、請求項２〜１８７のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生する方法。
【請求項１９２】
抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１８９に記載の宿主細胞。
【請求項１９３】
抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１９０に記載の宿主細胞。
【請求項１９４】
抗体ＶＬドメインおよび抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１８９に記載の宿主細胞。
【請求項１９５】
抗体ＶＬドメインおよび抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１９０に記載の宿主細胞。
【請求項１９６】
１０個以下の単一アミノ酸修飾を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１８９に記載の宿主細胞。
【請求項１９７】
１０個以下の単一アミノ酸修飾を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１９０に記載の宿主細胞。
【請求項１９９】
前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、前記ＣＨ３ドメイン内に１０、８、６、または４つ以下の単一アミノ酸修飾を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１９６または１９７に記載の宿主細胞。
【請求項２００】
請求項２〜１８６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項２０１】
前記ポリペプチドの４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％未満が、Ｆｃドメイン単量体上に少なくとも１つのフコース修飾を有する、請求項２００に記載の薬学的組成物。
【請求項２０２】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第３のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成する、請求項１に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０３】
前記単一Ｆｃドメイン構築体が抗体である、請求項１または２０２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第３のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成する、組成物。
【請求項２０５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドもしくは前記第３のポリペプチドに結合されるか、または前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドに結合される、請求項２０４に記載の組成物。
【請求項２０６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、および前記第３のポリペプチドに結合される、請求項２０４に記載の組成物。
【請求項２０７】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第３のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０８】
前記生物活性が、Ｆｃ受容体媒介性エフェクター機能である、請求項２０７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０９】
前記Ｆｃ受容体媒介性エフェクター機能が、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣ活性である、請求項２０８に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合するスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第３のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１１】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドもしくは前記第３のポリペプチドに結合されるか、または前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドに結合される、請求項２０２、２０７、または２１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１２】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、および前記第３のポリペプチドに結合される、請求項２０２、２０７、または２１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、Ｆａｂである、請求項１および２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１、第２、または第３のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、請求項２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項２１４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、前記ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインが、前記第１、第２、または第３のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、請求項２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１７】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１８】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、前記ＶＬドメインを含む第４のポリペプチドを含む、請求項２１７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１９】
前記ＶＨドメインが、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２０】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２１】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％同一である、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２２】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一である、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２７】
ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含み、
前記ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインが、リンカーを介して前記第１のポリペプチドまたは前記第２のポリペプチドのＮ末端に結合している、
請求項１および２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２８】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項２０２〜２２７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２９】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項２０２〜２２８のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３０】
前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する、請求項２０２〜２２８のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３１】
前記二量体形成選択性モジュールが、前記Ｆｃドメイン単量体の一方の前記ＣＨ３ドメイン内に改変された空洞と、前記Ｆｃドメイン単量体の他方の前記ＣＨ３ドメイン内に改変された突起と、を含み、前記改変された空洞および前記改変された突起が、Ｆｃドメイン単量体の空洞内突起対（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ  ｐａｉｒ）を形成するように配置されている、請求項２２８または２２９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３２】
前記改変された突起が、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｆ、およびＦ４０５Ｗからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含み、前記改変された空洞が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、およびＴ３９４Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む、請求項２３１に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３３】
前記Ｆｃドメイン単量体の一方がＹ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含み、前記Ｆｃドメイン単量体の他方がＴ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含む、請求項２２８または２２９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３４】
前記二量体形成選択性モジュールが、前記ドメイン単量体の一方の前記ＣＨ３ドメイン内に負に荷電したアミノ酸と、前記Ｆｃドメイン単量体の他方の前記ＣＨ３ドメイン内に正に荷電したアミノ酸と、を含み、前記負に荷電したアミノ酸および前記正に荷電したアミノ酸が、Ｆｃドメインの形成を促進するように配置されている、請求項２２８または２２９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３５】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｄ３９９Ｋと、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅのいずれかとを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３６】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ３９２ＤおよびＤ３９９Ｋを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３７】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３８】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｄを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３９】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ３９２ＥおよびＤ３９９Ｋを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４０】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４１】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４２】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４３】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４４】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒを含み、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４５】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｅ３５７Ｋまたは３５７Ｒを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４６】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含み、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４７】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４８】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーが、結合である、請求項１および２０２〜２４７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４９】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーが、スペーサーである、請求項１および２０２〜２４７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５０】
前記スペーサーが、配列
2021532085.tif 000100
を有するポリペプチドを含む、請求項２４９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５１】
前記スペーサーが、グリシンスペーサーである、請求項２４９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５２】
前記スペーサーが、４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン残基からなる、請求項２５１に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５３】
前記スペーサーが、２０個のグリシン残基からなる、請求項２５２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、リンカーにより前記Ｆｃドメイン単量体に結合される、請求項１および２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５５】
前記リンカーが、スペーサーである、請求項２５４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５６】
前記Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つが、Ｉ２５３位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、請求項１および２０２〜２５５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５７】
Ｉ２５３位の前記アミノ酸修飾が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項２５６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５８】
Ｉ２５３位の各アミノ酸修飾が、Ｉ２５３Ａである、請求項２５７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５９】
前記Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つが、Ｒ２９２位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、請求項１および２０２〜２５８のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６０】
Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項２５９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６１】
Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾が、Ｒ２９２Ｐである、請求項２６０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６２】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの１つ以上が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む、請求項１および２０２〜２６１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６３】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む、請求項２６２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６４】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのものである、請求項２６２または２６３に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６５】
前記第１、第２、第３、および第４のポリペプチドの各々内のＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異している、請求項１および２０２〜２６４のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６６】
前記第１、第２、第３、および第４のポリペプチドのうちの１つ以上が、Ｃ末端リシンを欠く、請求項１および２０２〜２６５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６７】
前記第１、第２、第３、および第４のポリペプチドが各々、Ｃ末端リシンを欠く、請求項２６６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６８】
リンカーによって前記ポリペプチドのうちの１つ以上のＮ末端またはＣ末端に結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む、請求項１および２０２〜２６７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第３のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
【請求項２７０】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも７５％が、前記第１のＦｃドメイン、前記第２のＦｃドメイン、および前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを含む、請求項２６９に記載の細胞培養培地。
【請求項２７１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が構造的に同一であり、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、細胞培養培地。
【請求項２７２】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも７５％が構造的に同一である、請求項２７１に記載の細胞培養培地。
【請求項２７３】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項２６９〜２７２のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項２７４】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも１００ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項２６９〜２７３のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項２７５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
（３）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項２７６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドおよび／または前記第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、組成物。
【請求項２７７】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、請求項２７６に記載の組成物。
【請求項２７８】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含み、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ３７０ＤおよびＥ３５７Ｋを含む、請求項２７７に記載の組成物。
【請求項２７９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメイン、前記第２の抗原結合ドメイン、および前記第３の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、組成物。
【請求項２８０】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、請求項２７９に記載の組成物。
【請求項２８１】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含み、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ３７０ＤおよびＥ３５７Ｋを含む、請求項２８０に記載の組成物。
【請求項２８２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、組成物。
【請求項２８３】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が各々、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が各々、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項２８２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、組成物。
【請求項２８５】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が各々、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が各々、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項２８４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｖｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のリンカー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第４のＦｃドメインを形成し、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第５のＦｃドメインを形成する、組成物。
【請求項２８７】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が各々、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第７のＦｃドメイン単量体が各々、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第８のＦｃドメイン単量体が各々、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第９のＦｃドメイン単量体が各々、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第６のＦｃドメイン単量体および前記第１０のＦｃドメイン単量体が各々、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項２８６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドおよび／または前記第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第１および第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドおよび／または前記第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第１および第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合するスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドおよび／または前記第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドおよび／または前記第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、細胞培養培地。
【請求項２９２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
（３）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
（５）前記第２のポリペプチドおよび／または第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、前記第１および第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項２９３】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、請求項２８８、２８９、２９０、２９１、または２９２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第１、第２、および第３の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第１、第２、および第３の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合するスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメイン、前記第２の抗原結合ドメイン、および前記第３の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９７】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメイン、前記第２の抗原結合ドメイン、および前記第３の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、細胞培養培地。
【請求項２９８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
（３）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
（５）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
（６）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、前記第１および第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項２９９】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、請求項２９４、２９５、２９６、２９７、または２９８に記載の組成物。
【請求項３００】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のスペーサー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０３】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
【請求項３０４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
（３）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
（５）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項３０５】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が各々、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が各々、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項３００、３０１、３０２、３０３、または３０４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０７】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のスペーサー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
【請求項３１０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
（３）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
（５）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項３１１】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が各々、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が各々、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項３０６、３０７、３０８、３０９、または３１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｖｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のリンカー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第４のＦｃドメインを形成し、前記第６のＦｃドメイン単量体および前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第５のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１３】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｖｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のリンカー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第４のＦｃドメインを形成し、前記第６の単量体および前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第５のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のスペーサー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｖｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のスペーサー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のスペーサー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第４のＦｃドメインを形成し、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第５のＦｃドメインを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のスペーサー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｖｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のスペーサー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のスペーサー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第４のＦｃドメインを形成し、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第５のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
【請求項３１６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のスペーサー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第２のポリペプチドであって、
ｖｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のスペーサー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のスペーサー
を含む、第２のポリペプチドと、
（３）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
（５）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
（６）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
（７）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第４のＦｃドメインを形成し、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第５のＦｃドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項３１７】
先行する請求項のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合構築体を投与することを含む、癌を治療するための方法であって、
前記癌が、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、頭頚部癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、中皮腫、尿路上皮癌、尿路上皮癌、膠芽腫、卵巣癌、前立腺癌、高グレードの中枢神経系悪性腫瘍、肝臓癌、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される、方法。
【請求項３１８】
先行する請求項のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合構築体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項３１９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第１および第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第３および第４のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと
を含み、
第１および第３のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第４および第６のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３２０】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項３１９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２１】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項３１９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２２】
前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３１９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２３】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３１９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２４】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３１９〜３２３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２５】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３１９〜３２３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２６】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３１９〜３２３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２７】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３２４〜３２６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３２８】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３１９〜３２３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２９】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３１９〜３２３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３０】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３２８に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３１】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３２９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第１および第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチド、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第３および第４のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第２のポリペプチド、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体および第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第４のポリペプチドと
を含み、
第１および第３のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第４および第６のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３３３】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第１および第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第３および第４のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと
を含み、
第１および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第３および第６のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第４のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３３４】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項３３３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３５】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項３３３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３６】
前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３３３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３７】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３３３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３８】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３９】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４０】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４１】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３４２】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４３】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４４】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３４２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４５】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３４３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第７のポリペプチドと、
ｈ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第８のポリペプチドと
を含み、
第１および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第４および第８のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃ単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３４７】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項３４６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４８】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項３４６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４９】
前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３４６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５０】
前記第７のポリペプチドおよび前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３４６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５１】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一であり、前記第７のポリペプチドおよび前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３４６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５２】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５３】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５４】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５５】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３５６】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５７】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第７のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第８のＦｃドメイン単量体が、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第９のＦｃドメイン単量体が、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第６のＦｃドメイン単量体および前記第１０のＦｃドメイン単量体が、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５８】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３５７に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５９】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３５８に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体および第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと
を含み、
第１および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第４および第８のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃ単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３６１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第７のポリペプチドと、
ｈ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第８のポリペプチドと
を含み、
第１および第４のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第５および第８のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃ単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３６２】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項３６１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６３】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項３６１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６４】
前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３６１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６５】
前記第７のポリペプチドおよび前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３６１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６６】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一であり、前記第７のポリペプチドおよび前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３６１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６７】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６８】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６９】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７０】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３７１】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７２】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第７のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第５のＦｃドメイン単量体および前記第８のＦｃドメイン単量体が、前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第９のＦｃドメイン単量体が、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第６のＦｃドメイン単量体および前記第１０のＦｃドメイン単量体が、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７３】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３７１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７４】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３７２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体および第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと
を含み、
第１および第４のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第５および第８のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃ単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３７６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインを含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインを含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと
を含み、
第１および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第３および第６のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第４のＦｃドメイン単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３７７】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項２０２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７８】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項２０２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７９】
前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項２０２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８０】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項２０２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８１】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８２】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８３】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８４】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３８５】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８６】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８７】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３８５に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８８】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３８６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体および第３のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインを含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体および第４のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと、
ｇ）第３のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第７のポリペプチドと、
ｈ）第４のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第８のポリペプチドと
を含み、
第１および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第３および第６のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第４のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第３のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインは一緒に、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第４のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成し、第３のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインは一緒になって、第３のＦａｂを形成し、第４のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３９０】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項３８９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９１】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項３８９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９２】
前記第５のポリペプチド、前記第６のポリペプチド、前記第７のポリペプチド、および前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３８９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９３】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチド、前記第６のポリペプチド、前記第７のポリペプチド、および前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３８９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９４】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９５】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９６】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９７】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３９８】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９９】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項４００】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３９８に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項４０１】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３９９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項４０２】
各リンカーが、
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からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか３、またはそれからなる、請求項３１９〜４０１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０３】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＩ２５３位に置換を含む、請求項３１９〜４０１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０４】
ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸置換が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項４０３に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０５】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＲ２９２位に置換を含む、請求項３１９〜４０１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０６】
ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸置換が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項４５に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０５】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択される置換を含む、請求項３１９〜４０１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０５】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項３１９〜４０１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）は、免疫応答の重要な負の調節因子である。それはＴ細胞上での活性化により誘導され、制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞上で構成的に発現される。そのリガンドＢ７．１およびＢ７．２との相互作用を通して、ＣＴＬＡ−４は、細胞の増殖および機能的活性を低減する。抗原への慢性曝露は、癌において一般的であるように、Ｔ細胞上のＣＴＬＡ−４の保持発現を駆動し、腫瘍細胞を応答できないようにして攻撃し、それにより腫瘍促進環境を支持する。Ｔｒｅｇの抑制活性に起因して、腫瘍中のそれらの存在が十分な抗腫瘍免疫応答を開始することをさらに防ぐこともまた十分に確立されている。ＣＴＬＡ−４／Ｂ７．１およびＢ７．２相互作用の遮断は、Ｔ細胞の機能的逆転または再活性化をもたらす。
【０００２】
Ｙｅｒｖｏｙ（登録商標）（イピリムマブ）は、転移性黒色腫の治療に認証されたＣＴＬＡ−４に対するＩｇＧ１  ｍＡｂである。事前臨床および臨床データは、イピリムマブの作用の主要なメカニズムのうちの２つが、Ｆ（ａｂ）ドメインによるＣＴＬＡ−４の遮断、およびＦｃドメインによる抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の誘導であることを示している。ＡＤＣＣは、ＣＴＬＡ−４発現Ｔｒｅｇの殺傷ならびにおそらくＣＴＬＡ−４発現腫瘍細胞の殺傷をもたらすと考えられる。
【発明の概要】
【０００３】
開示の概要
本開示は、ＣＴＬＡ４結合ドメインを、少なくとも２つのＦｃドメインと組み合わせて、固有の生物活性を有する新たな治療薬を生成するための組成物および方法を特徴とする。
【０００４】
いくつかの例では、本開示は、ＣＴＬＡ４結合ドメイン（例えば、既知の治療用ＣＴＬＡ４抗体のＣＴＬＡ４結合ドメイン）を少なくとも２つのＦｃドメインと組み合わせて、新規の治療薬を生成することを企図する。かかる構築体を生み出すために、本開示は、少なくとも２つ、例えば、複数のＦｃドメインを有する構築体を組み立て、かつそれらのホモ二量体形成およびヘテロ二量体形成を制御して、限定された数のポリペプチド由来の別個のサイズの分子を組み立てるための様々な方法を提供する。これらの構築体の特性により、実質的に均質な薬学的組成物の効率的な生成が可能となる。薬学的組成物の安全性、有効性、均一性、および信頼性を確実にするためには、薬学的組成物においてそのような均質性があることが望ましい。
【０００５】
第１の態様では、本開示は、強化されたエフェクター機能を含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＣＴＬＡ４結合ドメインと、リンカーにより第２のＦｃドメインに結合された第１のＦｃドメインとを含み、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一ＦｃドメインとＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている。
【０００６】
第２の態様では、本開示は、ＣＴＬＡ４結合ドメインと、リンカーにより第２のＦｃドメインに結合された第１のＦｃドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴とする。
【０００７】
第３の態様では、本開示は、ＣＴＬＡ４結合ドメインと、リンカーにより第２のＦｃドメインに結合された第１のＦｃドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一ＦｃドメインおよびＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む。
【０００８】
第４の態様では、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴としており、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成する。
【０００９】
第４の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドもしくは第３のポリペプチドに結合されるか、または第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドに結合され、あるいはＣＴＬＡ４結合ドメインは、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドに結合される。
【００１０】
第５の態様では、本開示は、強化されたエフェクター機能を含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一ＦｃドメインおよびＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、エフェクター機能が強化されている。
【００１１】
第５の態様のいくつかの実施形態では、単一Ｆｃドメイン構築体は、抗体である。
【００１２】
第６の態様では、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴とする。第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一ＦｃドメインおよびＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む。
【００１３】
第６の態様のいくつかの実施形態では、生物活性は、ＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、および／またはＣＤＣ活性（例えば、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰ活性、ＡＤＣＣおよびＣＤＣ活性、ＡＤＣＰおよびＣＤＣ活性、またはＡＤＣＣ、ＡＤＣＰ、およびＣＤＣ活性）などのＦｃ受容体媒介性エフェクター機能である。
【００１４】
第７の態様では、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合するスペーサーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成する。
【００１５】
本開示の第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドもしくは第３のポリペプチドに結合されるか、または第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドに結合され、あるいはＣＴＬＡ４結合ドメインは、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドに結合される。
【００１６】
本開示の第１、第２、第３、および第４の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＦａｂまたはＦａｂのＶＨである。
【００１７】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、結合ドメインは、第１、第２、または第３のポリペプチドのアミノ酸配列の一部であり、いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【００１８】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインは、第１、第２、または第３のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＬドメインをさらに含み、いくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＶＬドメインを含む第４のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含み、ＶＨドメインは、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨドメインは、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、またはＶＨドメインは、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む。
【００１９】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、もしくは少なくとも９９．５％同一であるか、またはＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列のセットを含む。
【００２０】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含み、ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインは、リンカーによって第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＮ末端に結合している。
【００２１】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は、第１のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００２２】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は、第２のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００２３】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、Ｆｃドメイン単量体の一方のＣＨ３ドメイン内に改変された空洞と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に改変された突起とを含み、改変された空洞および改変された突起は、Ｆｃドメイン単量体の空洞内突起対（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ  ｐａｉｒ）を形成するように配置されている。いくつかの実施形態では、改変された突起は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｆ、およびＦ４０５Ｗから選択される少なくとも１つの修飾を含み、改変された空洞は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、およびＴ３９４Ｓから選択される少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体の一方が、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含み、Ｆｃドメイン単量体の他方が、Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含む。
【００２４】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、ドメイン単量体の一方のＣＨ３ドメイン内に負に荷電したアミノ酸と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に正に荷電したアミノ酸とを含み、負に荷電したアミノ酸および正に荷電したアミノ酸は、Ｆｃドメインの形成を促進するように配置されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３９９Ｋと、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅのいずれかとを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ３９２ＤおよびＤ３９９Ｋを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｅを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｄを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ３９２ＥおよびＤ３９９Ｋを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｅを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、第３と第４のポリペプチドは各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第３および第４のポリペプチドは各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｅ３５７Ｋまたは３５７Ｒを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含むか、または第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含む。
【００２５】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、同一のアミノ酸配列を有する。
【００２６】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、結合である。
【００２７】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、スペーサーである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列
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を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、２０個のグリシン残基からなるスペーサーである。
【００２８】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、リンカーによりＦｃドメイン単量体に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、スペーサーである。
【００２９】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つは、Ｉ２５３位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｉ２５３位の各アミノ酸修飾は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙから選択される。いくつかの実施形態では、Ｉ２５３位の各アミノ酸修飾は、Ｉ２５３Ａである。
【００３０】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つは、Ｒ２９２位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾は、Ｒ２９２Ｐである。
【００３１】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のうちの１つ以上が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は各々、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのものである。
【００３２】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、第４、第５、第６、および第７のポリペプチドの各々内のＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異している。
【００３３】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、第４、第５、第６、および第７のポリペプチドのうちの１つ以上が、Ｃ末端リシンを欠く。いくつかの実施形態では、第４、第５、第６、および第７のポリペプチドは各々、Ｃ末端リシンを欠く。
【００３４】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、リンカーによってポリペプチドのうちの１つ以上のＮ末端またはＣ末端に結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む。
【００３５】
第８の態様では、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が構造的に同一であり、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌ、１０ｍｇ／Ｌ、２５ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌ、７５ｍｇ／Ｌ、または１００ｍｇ／Ｌの濃度で培養培地中に存在する、細胞培養培地を特徴とする。
【００３６】
本開示の第８の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも７５％、少なくとも８５％、または少なくとも９５％が、構造的に同一である。
【００３７】
第９の態様では、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地を特徴としており、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成する。
【００３８】
本開示の第９の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも７５％、少なくとも８５％、または少なくとも９５％は、第１のＦｃドメイン、第２のＦｃドメイン、およびＣＴＬＡ４結合ドメインを含む。
【００３９】
第１０の態様では、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法を特徴としており、方法は、（１）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む第１のポリペプチドと、（２）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、（３）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、（４）ＣＴＬＡ４結合ドメインとを発現する宿主細胞を培養することであって、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、ＣＴＬＡ４結合ドメインが、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、細胞培養上清中のＦｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、構造的に同一である、培養することと、ｂ）細胞培養上清からＦｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと、を含む。
【００４０】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドもしくは第３のポリペプチドに結合されるか、または第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドに結合され、あるいはＣＴＬＡ４結合ドメインは、第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、および第３のポリペプチドに結合される。
【００４１】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＦａｂまたはＶＨである。
【００４２】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、第１、第２、または第３のポリペプチドのアミノ酸配列の一部であり、いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【００４３】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインを含み、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインは、第１、第２、または第３のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＬドメインをさらに含み、いくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＶＬドメインを含む第４のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含み、ＶＨドメインは、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨドメインは、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、またはＶＨドメインは、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む。
【００４４】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、もしくは少なくとも９９．５％同一であるか、またはＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列のセットを含む。
【００４５】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含み、ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインは、リンカーによって第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＮ末端に結合している。
【００４６】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は、第１のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００４７】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は、第２のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００４８】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、Ｆｃドメイン単量体の一方のＣＨ３ドメイン内に改変された空洞と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に改変された突起とを含み、改変された空洞および改変された突起は、Ｆｃドメイン単量体の空洞内突起対を形成するように配置されている。いくつかの実施形態では、改変された突起は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｆ、およびＦ４０５Ｗから選択される少なくとも１つの修飾を含み、改変された空洞は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、およびＴ３９４Ｓから選択される少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体の一方が、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含み、Ｆｃドメイン単量体の他方が、Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含む。
【００４９】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、ドメイン単量体の一方のＣＨ３ドメイン内に負に荷電したアミノ酸と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に正に荷電したアミノ酸とを含み、負に荷電したアミノ酸および正に荷電したアミノ酸は、Ｆｃドメインの形成を促進するように配置されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３９９Ｋと、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅのいずれかとを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ３９２ＤおよびＤ３９９Ｋを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｅを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｄを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ３９２ＥおよびＤ３９９Ｋを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｅを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、第３と第４のポリペプチドは各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第３および第４のポリペプチドは各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｅ３５７Ｋまたは３５７Ｒを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含むか、または第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含む。
【００５０】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、同一のアミノ酸配列を有する。
【００５１】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、結合である。
【００５２】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、スペーサーである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列
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を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、２０個のグリシン残基からなるスペーサーである。
【００５３】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、リンカーによりＦｃドメイン単量体に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、スペーサーである。
【００５４】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つは、Ｉ２５３位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｉ２５３位の各アミノ酸修飾は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙから選択される。いくつかの実施形態では、Ｉ２５３位の各アミノ酸修飾は、Ｉ２５３Ａである。
【００５５】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つは、Ｒ２９２位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾は、Ｒ２９２Ｐである。
【００５６】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のうちの１つ以上が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は各々、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのものである。
【００５７】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および第４のポリペプチドの各々内のＮ末端Ａｓｐは、Ｇｌｎに変異している。
【００５８】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および第４のポリペプチドのうちの１つ以上が、Ｃ末端リシンを欠く。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および第４のポリペプチドは各々、Ｃ末端リシンを欠く。
【００５９】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、リンカーによってポリペプチドのうちの１つ以上のＮ末端またはＣ末端に結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む。
【００６０】
本開示の第１１の態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は、第１のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は、第２のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。
【００６１】
本開示の第１１の態様のいくつかの実施形態では、第１のＣＴＬＡ４結合ドメインは、第１のポリペプチドに結合され、第２のＣＴＬＡ４結合ドメインは、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドに結合される。
【００６２】
本開示の第１１の態様のいくつかの実施形態では、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ３７０ＤおよびＥ３５７Ｋを含む。
【００６３】
本開示の第１２の態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は、第１のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は、第２のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第２のポリペプチドおよび第３のポリペプチドは、異なるアミノ酸配列を有する。
【００６４】
本開示の第１２の態様のいくつかの実施形態では、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３９９ＫおよびＫ４０９Ｄを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含む。
【００６５】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、第１のまたはＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＦａｂまたはＶＨドメインである。本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、第１および第２のＣＴＬＡ４結合ドメインは、Ｆａｂである。本開示の第９の態様のいくつかの実施形態では、第１、第２、および第３のＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＦａｂまたはＶＨドメインである。
【００６６】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、第１または第２のＣＴＬＡ４結合ドメインは、ｓｃＦｖである。本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、第１および第２のＣＴＬＡ４結合ドメインは、ｓｃＦｖである。本開示の第９の態様のいくつかの実施形態では、第１、第２、および第３のＣＴＬＡ４結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【００６７】
本開示の第１１の態様のいくつかの実施形態では、第１または第２のＣＴＬＡ４ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＨドメインとＣＨ１ドメインは、第１、第２、または第３のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＬドメインをさらに含み、いくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＶＬドメインを含む第４のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含み、ＶＨドメインは、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨドメインは、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、またはＶＨドメインは、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む。
【００６８】
本開示の第１２の態様のいくつかの実施形態では、第１、第２、または第３のＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインは、第１、第２、または第３のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＬドメインをさらに含み、いくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＶＬドメインを含む第４のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含み、ＶＨドメインは、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨドメインは、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、またはＶＨドメインは、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む。
【００６９】
本開示の第１１の態様のいくつかの実施形態では、第１または第２のＣＴＬＡ４結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、もしくは少なくとも９９．５％同一であるか、またはＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列のセットを含む。
【００７０】
本開示の第１２の態様のいくつかの実施形態では、第１、第２、または第３のＣＴＬＡ４結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、もしくは少なくとも９９．５％同一であるか、またはＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列のセットを含む。
【００７１】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含み、ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインは、リンカーによって第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＮ末端に結合している。
【００７２】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は、第１のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００７３】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は、第２のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００７４】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、Ｆｃドメイン単量体の一方のＣＨ３ドメイン内に改変された空洞と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に改変された突起とを含み、改変された空洞および改変された突起は、Ｆｃドメイン単量体の空洞内突起対を形成するように配置されている。いくつかの実施形態では、改変された突起は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｆ、およびＦ４０５Ｗから選択される少なくとも１つの修飾を含み、改変された空洞は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、およびＴ３９４Ｓから選択される少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体の一方が、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含み、Ｆｃドメイン単量体の他方が、Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含む。
【００７５】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、ドメイン単量体の一方のＣＨ３ドメイン内に負に荷電したアミノ酸と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に正に荷電したアミノ酸とを含み、負に荷電したアミノ酸および正に荷電したアミノ酸は、Ｆｃドメインの形成を促進するように配置されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３９９Ｋと、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅのいずれかとを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ３９２ＤおよびＤ３９９Ｋを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｅを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｄを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ３９２ＥおよびＤ３９９Ｋを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｅを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、第３と第４のポリペプチドは各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第３および第４のポリペプチドは各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｅ３５７Ｋまたは３５７Ｒを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含むか、または第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含む。
【００７６】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、結合である。
【００７７】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、スペーサーである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列
2021532085.tif 000005
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、２０個のグリシン残基からなるスペーサーである。
【００７８】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインのうちの１つ以上は、リンカーによりＦｃドメイン単量体に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、スペーサーである。
【００７９】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つは、Ｉ２５３位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｉ２５３位の各アミノ酸修飾は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙから選択される。いくつかの実施形態では、Ｉ２５３位の各アミノ酸修飾は、Ｉ２５３Ａである。
【００８０】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つは、Ｒ２９２位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾は、Ｒ２９２Ｐである。
【００８１】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のうちの１つ以上が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は各々、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのものである。
【００８２】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および第４のポリペプチドの各々内のＮ末端Ａｓｐは、Ｇｌｎに変異している。
【００８３】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および第４のポリペプチドのうちの１つ以上が、Ｃ末端リシンを欠く。いくつかの実施形態では、第１、第２、第３、および第４のポリペプチドは各々、Ｃ末端リシンを欠く。
【００８４】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、リンカーによってポリペプチドのうちの１つ以上のＮ末端またはＣ末端に結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む。
【００８５】
第１３の態様では、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカーを含む第２のポリペプチドと、ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、ｄ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、または第４のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴としており、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、第４のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成する。
【００８６】
本開示の第１３の態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、第１のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は各々、第２のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第４のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は各々、第４のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００８７】
第１４の態様では、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカーを含む第２のポリペプチドと、ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、ｅ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、または第４のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴としており、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第１のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、第３のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成する。
【００８８】
本開示の第１４の態様のいくつかの実施形態では、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、第２のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は各々、第１のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第３のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は各々、第３のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００８９】
第１５の態様では、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、ｉｖ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー、ならびにｖ）第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、ｉｖ）第４のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のリンカー、ならびにｖ）第５のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のリンカーを含む第２のポリペプチドと、ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、ｇ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、第４のポリペプチド、第５のポリペプチド、または第６のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む組成物を特徴としており、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第１のＦｃドメイン単量体および第７のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、第４のＦｃドメイン単量体および第８のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、第３のＦｃドメイン単量体および第９のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第４のＦｃドメインを形成し、第６のＦｃドメイン単量体および第１０のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第５のＦｃドメイン単量体を形成する。
【００９０】
本開示の第１５の態様のいくつかの実施形態では、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は各々、第２のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第７のＦｃドメイン単量体は各々、第１のＦｃドメイン単量体と第７のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第４のＦｃドメイン単量体および第８のＦｃドメイン単量体は各々、第４のＦｃドメイン単量体と第８のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第３のＦｃドメイン単量体および第９のＦｃドメイン単量体は各々、第３のＦｃドメイン単量体と第９のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第６のＦｃドメイン単量体および第１０のＦｃドメイン単量体は各々、第６のＦｃドメイン単量体と第１０のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【００９１】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＦａｂまたはＶＨドメインである。
【００９２】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、１つ以上のポリペプチドのアミノ酸配列の一部であり、いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ｓｃＦｖである。
【００９３】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインは、第１、第２、または第３のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＬドメインをさらに含み、いくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＶＬドメインを含む第４のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨドメインは、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含み、ＶＨドメインは、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨドメインは、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、または少なくとも９９．５％同一であるか、またはＶＨドメインは、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む。
【００９４】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列に対し、少なくとも９５％同一、少なくとも９７％同一、少なくとも９９％同一、もしくは少なくとも９９．５％同一であるか、またはＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨおよびＶＬの配列のセットを含む。
【００９５】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含み、ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインは、リンカーによって第１のポリペプチドまたは第２のポリペプチドのＮ末端に結合している。
【００９６】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、Ｆｃドメイン単量体の一方のＣＨ３ドメイン内に改変された空洞と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に改変された突起とを含み、改変された空洞および改変された突起は、Ｆｃドメイン単量体の空洞内突起対を形成するように配置されている。いくつかの実施形態では、改変された突起は、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｆ、およびＦ４０５Ｗから選択される少なくとも１つの修飾を含み、改変された空洞は、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、およびＴ３９４Ｓから選択される少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体の一方が、Ｙ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含み、Ｆｃドメイン単量体の他方が、Ｔ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含む。
【００９７】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、ドメイン単量体の一方のＣＨ３ドメイン内に負に荷電したアミノ酸と、Ｆｃドメイン単量体の他方のＣＨ３ドメイン内に正に荷電したアミノ酸とを含み、負に荷電したアミノ酸および正に荷電したアミノ酸は、Ｆｃドメインの形成を促進するように配置されている。いくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３９９Ｋと、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅのいずれかとを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ３９２ＤおよびＤ３９９Ｋを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｅを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｄを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ３９２ＥおよびＤ３９９Ｋを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｅを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、第３と第４のポリペプチドは各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第３および第４のポリペプチドは各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｅ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体の各々は、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｅ３５７Ｋまたは３５７Ｒを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含むか、または第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドは各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含む。
【００９８】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、結合である。
【００９９】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、スペーサーである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列
2021532085.tif 000006
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、２０個のグリシン残基からなるスペーサーである。
【０１００】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、リンカーによりＦｃドメイン単量体に結合される。いくつかの実施形態では、リンカーは、スペーサーである。
【０１０１】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つは、Ｉ２５３位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｉ２５３位の各アミノ酸修飾は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙから選択される。いくつかの実施形態では、Ｉ２５３位の各アミノ酸修飾は、Ｉ２５３Ａである。
【０１０２】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つは、Ｒ２９２位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙから選択される。いくつかの実施形態では、Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾は、Ｒ２９２Ｐである。
【０１０３】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のうちの１つ以上が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は各々、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのものである。
【０１０４】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドの各々内のＮ末端Ａｓｐは、Ｇｌｎに変異している。
【０１０５】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、ポリペプチドのうちの１つ以上が、Ｃ末端リシンを欠く。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは各々、Ｃ末端リシンを欠く。
【０１０６】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、リンカーによってポリペプチドのうちの１つ以上のＮ末端またはＣ末端に結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む。
【０１０７】
第１６の態様では、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第１のポリペプチドに結合された第１のＣＴＬＡ４結合ドメインと、ｅ）第２のポリペプチドおよび／または第３のポリペプチドに結合された第２のＣＴＬＡ４結合ドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、第１および第２のＣＴＬＡ４結合ドメインは、異なる抗原に結合し、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一ＦｃドメインおよびＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、エフェクター機能が強化されている。
【０１０８】
第２６の態様では、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、ならびにｖｉ）第３のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカーを含む第２のポリペプチドと、ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、ポリペプチドに結合された第１のＣＴＬＡ４結合ドメインと、ｄ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、または第４のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、第４のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一ＦｃドメインおよびＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、エフェクター機能が強化されている。
【０１０９】
第２７の態様では、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、ならびにｖｉ）第３のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカーを含む第２のポリペプチドと、ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、ｅ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、または第４のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、第４のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単一ＦｃドメインおよびＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む。
【０１１０】
第２８の態様では、本開示は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のスペーサーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、ならびにｖｉ）第３のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のスペーサーを含む第２のポリペプチドと、ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、ｅ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、または第４のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴としており、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、第４のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成する。
【０１１１】
第２９の態様では、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群を含む細胞培養培地を特徴としており、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％は、ａ）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカーを含む第１のポリペプチドと、ｂ）ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、ならびにｖｉ）第３のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカーを含む第２のポリペプチドと、ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、ｅ）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、または第４のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを含み、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、第４のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成する。
【０１１２】
第３０の態様では、本開示は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法を特徴としており、方法は、ａ）（１）ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、ならびにｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体および第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカーを含む第１のポリペプチドと、（２）ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、ならびにｖｉ）第３のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカーを含む第２のポリペプチドと、（３）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、（４）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、（５）第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、第３のポリペプチド、または第４のポリペプチドに結合されたＣＴＬＡ４結合ドメインとを発現する宿主細胞を培養することであって、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、第４のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、細胞培養上清中のＦｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、構造的に同一である、培養することと、ｂ）細胞培養上清からＦｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することとを含む。
【０１１３】
本開示の第２６、第２７、第２８、第２９、および第３０の態様のいくつかの実施形態では、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は各々、第１のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は各々、第２のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、第４のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は各々、第４のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む。
【０１１４】
本開示のすべての態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、低減されたフコシル化を有する。したがって、いくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を含む組成物中のＦｃドメイン単量体の４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、または５％未満がフコシル化されている。
【０１１５】
本開示のすべての態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ３ドメイン中に最大１０個（９、８、７、６、５、４、３、２、または１つ）の単一アミノ酸変化を有する図２４Ａのアミノ酸配列（配列番号４３）を含む。
【０１１６】
本開示のすべての態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ３ドメイン中に最大１０個（９、８、７、６、５、４、３、２、または１つ）の単一アミノ酸変化を有する図２４Ｂのアミノ酸配列（配列番号４５）を含む。
【０１１７】
本開示のすべての態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ３ドメイン中に最大１０個（９、８、７、６、５、４、３、２、または１つ）の単一アミノ酸変化を有する図２４Ｃのアミノ酸配列（配列番号４７）を含む。
【０１１８】
本開示のすべての態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ３ドメイン中に最大１０個（９、８、７、６、５、４、３、２、または１つ）の単一アミノ酸変化を有する図２４Ｄのアミノ酸配列（配列番号４２）を含む。
【０１１９】
本開示のすべての態様のいくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃドメイン単量体がポリペプチドのカルボキシ末端にある場合、Ｆｃドメイン単量体は、Ｋ４４７を含まない。他の実施形態では、例えば、Ｆｃドメイン単量体がポリペプチドのカルボキシ末端にない場合、Ｆｃドメイン単量体は、Ｋ４４７を含む。
【０１２０】
本開示のすべての態様のいくつかの実施形態では、例えば、Ｆｃドメイン単量体がリンカーのアミノ末端にある場合、Ｆｃドメイン単量体は、Ｅ２１６〜Ｃ２２０（両端を含む）のヒンジ部分を含まないが、Ｄ２２１〜Ｌ２３５（両端を含む）のヒンジ部分を含む。他の実施形態では、例えば、Ｆｃドメイン単量体がＣＨ１ドメインのカルボキシ末端にある場合、Ｆｃドメイン単量体は、Ｅ２１６〜Ｌ２３５（両端を含む）のヒンジ部分を含む。本開示のすべての態様のいくつかの実施形態では、ヒンジドメイン、例えば、ポリペプチドのアミノ末端にあるヒンジドメインは、ＥＵの２２１位にＡｓｐからＧｌｎへの変異を有する。
【０１２１】
上述されるように、本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、２つ以上のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドなどのポリペプチドから組み立てられ、かかるポリペプチドは、本開示の一態様である。
【０１２２】
第４１の態様では、本開示は、ＣＴＬＡ４結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第２のリンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意選択的に第３のリンカー；ならびに任意選択的にヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドを特徴としており、少なくとも１つのＦｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含む。
【０１２３】
第４１の様々な実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、抗体重鎖可変ドメインを含み、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメインを含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、２または４つの逆電荷変異を含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、２または４つの逆電荷変異を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方は、改変された突起を形成する変異を含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、この場合において当該第一のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、第二のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体がそれぞれ改変された突起を形成する変異を含む；ポリペプチドは、第三のリンカーと第三のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方はそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、２または４つの逆電荷変異を含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方はそれぞれ、改変された突起を形成する変異を含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、２または４つの逆電荷変異を含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方はそれぞれ、突起を形成する変異を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、２または４つの逆電荷変異を含む。
【０１２４】
第４１の態様の様々な実施形態では、改変された突起を形成する変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、１、２、または３つの逆電荷変異をさらに含み、改変された突起を形成する変異および逆電荷変異は、ＣＨ３ドメイン内にあり、これらの変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、これらの変異は、単一アミノ酸変化であり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、
2021532085.tif 000007
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０、または１２〜３０個のグリシン残基からなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、２０個のグリシン残基からなり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択され、Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａであり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択され、Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐであり、各Ｆｃドメイン単量体は独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有し、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000008
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000009
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000010
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000011
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
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を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
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を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000014
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000015
を含み、単一アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択され、Ｆｃドメイン単量体は各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択され、２つまたは４つの逆電荷変異は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択され；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ｓｃＦｖであり；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＬドメインをさらに含み；ＶＨドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のセットを含み；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＨドメ��ンおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる。
【０１２５】
第１または第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合された上述のポリペプチドの２つのコピーを含むポリペプチド複合体も記載される。
【０１２６】
ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドに結合された上述のポリペプチドを含むポリペプチド複合体も記載され、ポリペプチドと第２のポリペプチドは、ポリペプチドの第１、第２、または第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン内のシステイン残基と第２のポリペプチドのヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合される。
【０１２７】
複合体の様々な実施形態では、第２のポリペプチド単量体は、改変された空洞を形成する変異を含み、改変された空洞を形成する変異は、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａからなる群から選択され、第２のポリペプチドは、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０１２８】
第４２の態様では、本開示は、ＣＴＬＡ４結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第２のリンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意選択的に第３のリンカー；ならびに任意選択的にヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドを特徴としており、少なくとも１つのＦｃドメイン単量体は、１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む。
【０１２９】
第４２の態様の様々な実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、抗体重鎖可変ドメインを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメインを含み；第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂのものから選択される２つの逆電荷変異のセットまたは表４Ａおよび４Ｂのものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み；第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４ａおよび４ｂのものから選択される２つの逆電荷変異のセットまたは表４Ａおよび４Ｂのものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み；第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方は、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み；ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体はそれぞれ、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み；ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方はそれぞれ、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂのものから選択される２つの逆電荷変異のセットまたは表４Ａおよび４Ｂのものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み；ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方はそれぞれ、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第２のＩｇＧ１ドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂのものから選択される２つの逆電荷変異のセットまたは表４Ａおよび４Ｂのものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み；ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方はそれぞれ、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第１のＩｇＧ１ドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂのものから選択される２つの逆電荷変異のセットまたは表４Ａおよび４Ｂのものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み；表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、同一のＣＨ３ドメインを有し；表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異は、ＣＨ３ドメイン内にあり；変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり；変異はそれぞれ、単一アミノ��変化であり；変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４６位（両端を含む）の配列内にあり；変異は、単一アミノ酸変化であり；第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、
2021532085.tif 000016
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０、または１２〜３０個のグリシン残基からなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、２０個のグリシン残基からなり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択され、Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａであり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択され、Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐであり、各Ｆｃドメイン単量体は独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有し、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000017
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000018
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000019
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000020
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000021
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000022
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000023
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000024
を含み、単一アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択され、Ｆｃドメイン単量体は各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択され、２つまたは４つの逆電荷変異は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択され；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ｓｃＦｖであり；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＬドメインをさらに含み；ＶＨドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のセットを含み；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＨドメ��ンおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる。
【０１３０】
第１または第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合された上述のポリペプチドのうちのいずれかの２つのコピーを含むポリペプチド複合体も記載される。
【０１３１】
ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドに結合された上述のポリペプチドを含むポリペプチド複合体も記載され、ポリペプチドと第２のポリペプチドは、ポリペプチドの第１、第２、または第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメイン内のシステイン残基と第２のポリペプチドのヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合される。様々な実施形態では、第２のポリペプチド単量体は、１、２、または３つの逆電荷変異を含み、第２のポリペプチド単量体は、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷変異を含み、ポリペプチド内の表４Ａおよび表４Ｂ選択される１、２、または３つの逆電荷変異に対して相補的であり、第２のポリペプチドは、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０１３２】
第４３の態様では、本開示は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、第２のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、任意選択の第３のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む任意選択の第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含むポリペプチドであって、少なくとも１つのＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、ポリペプチドを特徴とする。
【０１３３】
第４３の態様の様々な実施形態では、ポリペプチドは、第１のＩｇＧ１単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインまたは第１のＩｇＧ１単量体のアミノ末端にｓｃＦｖをさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、２つまたは４つの逆電荷変異を含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、改変された突起を形成する変異を含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、２つまたは４つの逆電荷変異を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方は、改変された突起を形成する変異を含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は各々、改変された突起を形成する変異を含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方は各々、改変された突起を形成する変異を含み、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、２つまたは４つの逆電荷変異を含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方は各々、改変された突起を形成する変異を含み、第２のＩｇＧ１ドメイン単量体は、２つまたは４つの逆電荷変異を含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方は各々、改変された突起を形成する変異を含み、第１のＩｇＧ１ドメイン単量体は、２つまたは４つの逆電荷変異を含む。
【０１３４】
第４３の態様の様々な実施形態では、改変された突起を形成する変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、１、２、または３つの逆電荷変異をさらに含み、改変された突起を形成する変異および逆電荷変異は、ＣＨ３ドメイン内にあり、変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、変異は、単一アミノ酸変化であり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、
2021532085.tif 000025
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０、または１２〜３０個のグリシン残基からなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、２０個のグリシン残基からなり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択され、Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａであり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択され、Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐであり、各Ｆｃドメイン単量体は独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有し、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000026
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000027
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000028
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000029
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000030
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000031
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000032
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000033
を含み、単一アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択され、Ｆｃドメイン単量体は各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択され、２つまたは４つの逆電荷変異は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択される。
【０１３５】
第４４の態様では、本開示は、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、第２のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、任意選択の第３のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む任意選択の第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含むポリペプチドであって、少なくとも１つのＦｃドメイン単量体が、１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、ポリペプチドを特徴とする。
【０１３６】
第４４の態様の様々な実施形態では、ポリペプチドは、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインまたは第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端にｓｃＦｖをさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４ａおよび表４ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方は、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第２のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第１のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ａおよび表４ＢＢ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、同一のＣＨ３ドメインを有し、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異は���ＣＨ３ドメイン内にあり、変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、変異は各々、単一アミノ酸変化であり、変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４６位（両端を含む）の配列内にあり、変異は、単一アミノ酸変化であり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、
2021532085.tif 000034
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは独立して、４〜３０、４〜２０、８〜３０、８〜２０、１２〜２０、または１２〜３０個のグリシン残基からなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、２０個のグリシン残基からなり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択され、Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａであり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択され、Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐであり、各Ｆｃドメイン単量体は独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有し、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000035
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000036
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000037
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000038
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000039
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000040
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000041
を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000042
を含み、単一アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択され；Ｆｃドメイン単量体の各々は独立して、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み；単一アミノ酸置換のうちの最大で６つが、ＣＨ３ドメイン中の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり；単一アミノ酸置換は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のセットを含み；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含み；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む。
【０１３７】
また、第４１、第４２、第４３、および第４４の態様の前述のポリペプチドのいずれかをコードする核酸分子が記載される。
【０１３８】
また、前述のポリペプチドのいずれかをコードする核酸を含む発現ベクター；核酸または発現ベクターを含有する宿主細胞；抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子（例えば、抗体ＶＬドメインと抗体ＣＬドメインとを含むポリペプチドをコードする核酸分子）をさらに含有する宿主細胞；抗体ＶＬドメインと抗体ＣＬドメインとを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含有する宿主細胞；１０個以下の単一アミノ酸変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含有する宿主細胞；１０個以下の単一アミノ酸変異を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含有する宿主細胞も記載される。様々な実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、ＣＨ３ドメイン中に１０、８、６、または４つ以下の単一アミノ酸変異を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のいずれかのアミノ酸配列を含む。
【０１３９】
本明細書に記載のポリペプチドまたはポリペプチド複合体のうちのいずれかを含む薬学的組成物も記載される。様々な実施形態では、ポリペプチドの４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％未満が、少なくとも１つのフコースを有する。
【０１４０】
本開示の第４１、第４２、第４３、および第４４の態様のポリペプチドは、本明細書に記載の様々なＦｃ抗原結合ドメイン構築体の構成要素として有用である。ゆえに、第１〜第４０の態様のうちのいずれかのポリペプチド、例えば、ＣＴＬＡ４結合ドメインを含み得るものは、本開示の第４１、第４２、第４３、および第４４の態様のうちのいずれかのポリペプチドを含み得るか、またはそれからなり得る。
【０１４１】
本開示のすべての態様における使用に有用な他のポリペプチドには、１、２、または３つの空洞を形成する変異（例えば、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ：Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ：Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ：Ｔ３９４Ｓ、Ｆ４０５Ｔ、Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ：Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３６４Ｈ：Ｆ４０５Ａから選択される）を有するＦｃドメイン単量体を含む（例えば、８、６、５、４、または３つ以下の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる）ポリペプチドが含まれる。これらのポリペプチドは、任意選択的に、表４Ａまたは表４Ｂからの１、２、または３つの逆電荷変異を含み得る。
【０１４２】
本開示のすべての態様では、Ｆｃドメイン単量体の一部または全部（例えば、１０、８、６、または４つ以下の単一アミノ酸置換（例えば、ＣＨ３ドメイン内のみ）を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含むＦｃドメイン単量体）は、他のアミノ酸置換または改変に加えて、Ｅ３４５ＫおよびＥ４３Ｇアミノ酸置換のうちの一方または両方を含むことができる。Ｅ３４５ＫおよびＥ４３Ｇアミノ酸置換は、Ｆｃドメイン多量体形成を増加させることができる。
【０１４３】
本明細書に記載されるＣＴＬＡ結合構築体を含む組成物により、癌、例えば、黒色腫または転移性黒色腫を治療するための方法もまた記載される。
【０１４４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第１および第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む、第１のポリペプチド、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第３および第４のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む、第２のポリペプチド、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと、
第１および第３のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第４および第６のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体も記載される。
【０１４５】
様々な実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチドおよび第６のポリペプチドの配列は同一であり、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチドおよび第６のポリペプチドの配列は同一であり、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧのアミノ酸配列と比較して最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体は各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換は、ＣＨ３ドメイン内のみにあり、第１のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体は、第１のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は、第２のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第４のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は、第４のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、ホモ二量体形成を促進する置換は、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択され、ヘテロ二量体形成を促進する置換は、表３中の置換から選択される。
【０１４６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第１および第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む、第１のポリペプチド、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第３および第４のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む、第２のポリペプチド、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体および第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第４のポリペプチドと、
第１および第３のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第４および第６のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体も記載される。
【０１４７】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第１および第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む、第１のポリペプチド、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第３および第４のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー、を含む、第２のポリペプチド、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと、
第１および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第３および第６のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第４のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体も記載される。
【０１４８】
様々な実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチドおよび第６のポリペプチドの配列は同一であり、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチドおよび第６のポリペプチドの配列は同一であり、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体は各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換は、ＣＨ３ドメイン内のみにあり、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は、第２のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第１のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は、第１のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第３のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は、第４のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、ホモ二量体形成を促進する置換は、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択され、ヘテロ二量体形成を促進する置換は、表３中の置換から選択される。
【０１４９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第７のポリペプチドと、
ｈ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第８のポリペプチドとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体もまた記載され、
第１および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第４および第８のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃドメイン単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する。
【０１５０】
様々な実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチドおよび第６のポリペプチドの配列は同一であり、第７のポリペプチドおよび第８のポリペプチドの配列は同一であり、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチドおよび第６のポリペプチドの配列は同一であり、第７のポリペプチドおよび第８のポリペプチドの配列は同一であり、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体は独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換は、ＣＨ３ドメイン内のみにあり、第２のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は、第２のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第１のＦｃドメイン単量体および第７のＦｃドメイン単量体は、第１のＦｃドメイン単量体と第７のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第４のＦｃドメイン単量体および第８のＦｃドメイン単量体は、第４のＦｃドメイン単量体と第８のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第３のＦｃドメイン単量体および第９のＦｃドメイン単量体は、第３のＦｃドメイン単量体と第９のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第６のＦｃドメイン単量体および第１０のＦｃドメイン単量体は、第６のＦｃドメイン単量体と第１０のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、ホモ二量体形成を促進する置換は、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択され、ヘテロ二量体形成を促進する置換は、表３中の置換から選択される。
【０１５１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体および第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体もまた記載され、
第１および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第４および第８のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃドメイン単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する。
【０１５２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第７のポリペプチドと、
ｈ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第８のポリペプチドとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体もまた記載され、
第１および第４のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第５および第８のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃドメイン単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する。
【０１５３】
様々な実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチドおよび第６のポリペプチドの配列は同一であり、第７のポリペプチドおよび第８のポリペプチドの配列は同一であり、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチドおよび第６のポリペプチドの配列は同一であり、第７のポリペプチドおよび第８のポリペプチドの配列は同一であり、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体は各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換は、ＣＨ３ドメイン内のみにあり、第１のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は、第１のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第２のＦｃドメイン単量体および第７のＦｃドメイン単量体は、第２のＦｃドメイン単量体と第７のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第５のＦｃドメイン単量体および第８のＦｃドメイン単量体は、第５のＦｃドメイン単量体と第８のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第３のＦｃドメイン単量体および第９のＦｃドメイン単量体は、第３のＦｃドメイン単量体と第９のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第６のＦｃドメイン単量体および第１０のＦｃドメイン単量体は、第６のＦｃドメイン単量体と第１０のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、ホモ二量体形成を促進する置換は、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択され、ヘテロ二量体形成を促進する置換は、表３中の置換から選択される。
【０１５４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体および第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体もまた記載され、
第１および第４のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第５および第８のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃドメイン単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する。
【０１５５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインを含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインを含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと、
第１および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第３および第６のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第４のＦｃドメイン単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体も記載される。
【０１５６】
様々な実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチドおよび第６のポリペプチドの配列は同一であり、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチドおよび第６のポリペプチドの配列は同一であり、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体は各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換は、ＣＨ３ドメイン内のみにあり、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は、第２のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第１のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は、第１のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第３のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は、第３のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、ホモ二量体形成を促進する置換は、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択され、ヘテロ二量体形成を促進する置換は、表３中の置換から選択される。
【０１５７】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体を結合するリンカーを含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体および第３のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインを含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体および第４のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと、
ｇ）第３のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第７のポリペプチドと、
ｈ）第４のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第８のポリペプチドとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体もまた記載され、
第１および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第３および第６のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第４のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第３のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインは一緒に、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第４のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成し、第３のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインは一緒になって、第３のＦａｂを形成し、第４のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する。
【０１５８】
様々な実施形態では、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチド、第６のポリペプチド、第７のポリペプチド、および第８のポリペプチドの配列は同一であり、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドの配列は同一であり、第３のポリペプチドおよび第４のポリペプチドの配列は同一であり、第５のポリペプチド、第６のポリペプチド、第７のポリペプチド、および第８のポリペプチドの配列は同一であり、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体の各々のＣＨ３ドメインは、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、Ｆｃドメイン単量体は各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換は、ＣＨ３ドメイン内のみにあり、第２のＦｃドメイン単量体および第４のＦｃドメイン単量体は、第２のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第１のＦｃドメイン単量体および第５のＦｃドメイン単量体は、第１のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、第３のＦｃドメイン単量体および第６のＦｃドメイン単量体は、第３のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、ホモ二量体形成を促進する置換は、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択され、ヘテロ二量体形成を促進する置換は、表３中の置換から選択される。
【０１５９】
様々な実施形態では、各リンカーは、
2021532085.tif 000043
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか３、またはそれからなり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＩ２５３位に置換を含み、ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸置換は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択され、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＲ２９２位に置換を含み、ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸置換は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択され、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択される置換を含み、各Ｆｃドメイン単量体のヒンジは独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０１６０】
３３３３３３
【０１６１】
定義：
本明細書に記載される場合、「Ｆｃドメイン単量体」という用語は、少なくともヒンジドメイン、ならびに第２および第３の抗体定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）、またはそれらの機能性断片（例えば、少なくともヒンジドメインまたはその機能性断片、ＣＨ２ドメインまたはその機能性断片、およびＣＨ３ドメインまたはその機能性断片）（例えば、（ｉ）別のＦｃドメイン単量体と二量体形成してＦｃドメインを形成し、そして（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合することができる断片）を含むポリペプチド鎖を指す。好ましいＦｃドメイン単量体は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。したがって、Ｆｃドメイン単量体、例えば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、Ｅ３１６〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｐ３１７〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３１８〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３１８〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｓ３１９〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｃ３２０〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｄ３２１〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３２２〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｔ３２３〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３２３〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｈ３２４〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｔ３２５〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、またはＣ３２６〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７にわたることができる。Ｆｃドメイン単量体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤを含む、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプとすることが可能である（例えば、ＩｇＧ）。さらに、Ｆｃドメイン単量体は、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）であり得る（例えば、ヒトＩｇＧ１）。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、本明細書に記載される実施例において使用される。ヒトＩｇＧ１の完全ヒンジドメインは、ＥＵナンバリングＥ３１６〜Ｐ２３０またはＬ２３５にわたり、ＣＨ２ドメインは、Ａ２３１またはＧ２３６〜Ｋ３４０にわたり、ＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１〜Ｋ４４７にわたる。ヒンジドメインの最後のアミノ酸の位置については異なる見解がある。それは、Ｐ２３０またはＬ２３５のいずれかである。本明細書の多くの実施例において、ＣＨ３ドメインはＫ３４７を含まない。ゆえにＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１〜Ｇ４４６であってもよい。本明細書の多くの実施例において、ヒンジドメインは、Ｅ２１６〜Ｌ２３５を含み得る。これは、例えば、ヒンジがＣＨ１ドメインまたはＣＴＬＡ−４結合ドメインに対してアミノ末端であるときに当てはまる。例えばヒンジがポリペプチドのアミノ末端であるときなどのいくつかの事例では、ＥＵナンバリング２２１のＡｓｐは、Ｇｌｎに変異される。Ｆｃドメイン単量体は、抗原認識領域、例えば可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として機能することが可能である、免疫グロブリンの部分を何も含まない。Ｆｃドメイン単量体は、野生型（例えば、ヒト）Ｆｃドメイン単量体配列からの変更を１０程度（例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４のアミノ酸置換、付加、または欠失）含有することが可能であり、該変更は、ＦｃドメインとＦｃ受容体との間の相互作用を変える。Ｆ���ドメイン単量体は、野生型Ｆｃドメイン単量体配列（例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４のアミノ酸置換、付加または欠失）からの変更（例えば、単一アミノ酸置換）を１０程度含有することが可能であり、当該変更は、Ｆｃドメイン単量体間の相互作用を変える。特定の実施形態では、以下のヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン配列と比較して、ＣＨ３ドメイン上に、最大で１０、８、６または５つの単一アミノ酸置換が存在する：
2021532085.tif 000044
。好適な変更の例は、この技術分野で既知である。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「Ｆｃドメイン」という用語は、Ｆｃ受容体を結合することが可能である２つのＦｃドメイン単量体による二量体を指す。野生型Ｆｃドメインでは、２つのＦｃドメイン単量体が２つのＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用、ならびに二量体形成している２つのＦｃドメイン単量体のヒンジドメイン間に形成される１つ以上のジスルフィド結合によって二量体形成する。
【０１６３】
本開示において、「Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体」という用語は、本明細書に記載のＦｃドメインを少なくとも２つ形成し、少なくとも１つの「抗原結合ドメイン」を含む会合したポリペプチド鎖を指す。本明細書に記載されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、同一または異なる配列を有するＦｃドメイン単量体を含むことが可能である。例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、３つのＦｃドメインを有することが可能であり、そのうちの２つがＩｇＧ１またはＩｇＧ１に由来するＦｃドメイン単量体を含み、３つ目がＩｇＧ２またはＩｇＧ２に由来するＦｃドメイン単量体を含む。別の非限定的な例において、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、３つのＦｃドメインを有することができ、そのうちの２つは「空洞に突起が挿入された対（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ  ｐａｉｒ）」を含み、３つ目は「空洞に突起が挿入された対」を含まない。Ｆｃドメインは、例えばＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩａ、ＦｃγＲＩＩｂ、ＦｃγＲＩＩＩａ、ＦｃγＲＩＩＩｂ、またはＦｃγＲＩＶであるＦｃ受容体と結合する最小限の構造を形成する。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「抗原結合ドメイン」という用語は、標的分子に特異的に結合することができるペプチド、ポリペプチド、または会合したポリペプチドのセットを指す。いくつかの実施形態では、「抗原結合ドメイン」は、抗体により結合される抗体に、特異性をもって結合する抗体の最小配列である。当技術分野で既知の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Ｓｕｒｆａｃｅ  ｐｌａｓｍｏｎ  ｒｅｓｏｎａｎｃｅ）または様々な免疫アッセイ（例えば、ウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡ）を使用して、抗原に対する抗体の特異性を評価することができる。いくつかの実施形態では、「抗原結合ドメイン」は、抗体の可変ドメインまたは相補性決定領域（ＣＤＲ）、例えば、表１に記載される抗体の１つ以上のＣＤＲ、表２に記載される抗体の１つ以上のＣＤＲ、または表２に記載される抗体のＶＨドメインおよび／もしくはＶＬドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを、任意選択的にＶＬドメインとともに含み得る。他の実施形態では、抗原（例えば、ＣＴＬＡ−４）結合ドメインは、抗体のＦａｂ断片またはｓｃＦｖである。したがって、ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含むか、またはそれからなる「ＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン」と、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むか、またはそれからなる「ＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメイン」とを含み得る。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、フィブロネクチン系の結合タンパク質（例えば、フィブロネクチンＩＩＩ型ドメイン（ＦＮ３）モノボディ）などの標的に特異的に結合する合成的に改変されたペプチドであってもよい。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、「相補性決定領域」（ＣＤＲ）という用語は、抗体の可変ドメインのアミノ酸残基を指し、その存在はＣＴＬＡ４結合に必須である。各可変ドメインは通常、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３、ならびにＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３として識別される３つのＣＤＲ領域を有する。各相補性決定領域は、Ｋａｂａｔにより規定される場合の「相補性決定領域」からのアミノ酸残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中のおよそ２４−３４残基（ＣＤＲ−Ｌ１）、５０−５６残基（ＣＤＲ−Ｌ２）、および８９−９７残基（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の３１−３５残基（ＣＤＲ−Ｈ１）、５０−６５残基（ＣＤＲ−Ｈ２）、および９５−１０２残基（ＣＤＲ−Ｈ３）；Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１））、および／または「超可変ループ（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ  ｌｏｏｐ）」からのそれら残基（すなわち、軽鎖可変ドメイン中のおよそ２６−３２残基（ＣＤＲ−Ｌ１）、５０−５２残基（ＣＤＲ−Ｌ２）、および９１−９６残基（ＣＤＲ−Ｌ３）、ならびに重鎖可変ドメイン中の２６−３２残基（ＣＤＲ−Ｈ１）、５３−５５残基（ＣＤＲ−Ｈ２）、および９６−１０１残基（ＣＤＲ−Ｈ３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））を含んでもよい。いくつかの事例では、相補性決定領域は、Ｋａｂａｔに従い規定されるＣＤＲ領域と、超可変ループの両方からのアミノ酸を含み得る。
【０１６６】
「フレームワーク領域（Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｒｅｇｉｏｎｓ）」（以下、ＦＲ）は、ＣＤＲ残基以外のそれら可変ドメイン残基である。各可変ドメインは通常、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、およびＦＲ４として識別される４つのＦＲを有する。ＣＤＲがＫａｂａｔに従い規定される場合、軽鎖ＦＲ残基はおよそ１−２３残基（ＬＣＦＲ１）、３５−４９残基（ＬＣＦＲ２）、５７−８８残基（ＬＣＦＲ３）、および９８−１０７残基（ＬＣＦＲ４）に位置付けられ、重鎖ＦＲ残基は重鎖残基中、およそ１−３０残基（ＨＣＦＲ１）、３６−４９残基（ＨＣＦＲ２）、６６−９４残基（ＨＣＦＲ３）、および１０３−１１３残基（ＨＣＦＲ４）に位置付けられる。ＣＤＲが超可変ループ由来のアミノ酸残基を含む場合、軽鎖ＦＲ残基は、軽鎖中、およそ１−２５残基（ＬＣＦＲ１）、３３−４９残基（ＬＣＦＲ２）、５３−９０残基（ＬＣＦＲ３）、および９７−１０７残基（ＬＣＦＲ４）に位置付けられ、重鎖ＦＲ残基は、重鎖残基中、およそ１−２５残基（ＨＣＦＲ１）、３３−５２残基（ＨＣＦＲ２）、５６−９５残基（ＨＣＦＲ３）、および１０２−１１３残基（ＨＣＦＲ４）に位置付けられる。いくつかの事例では、ＣＤＲが、Ｋａｂａｔに規定されるＣＤＲと、超可変ループの両方からのアミノ酸を含む場合、ＦＲ残基は、適切に調整されるであろう。
【０１６７】
「Ｆｖ」断片は、完全な抗原認識および結合の部位を含有する抗体断片である。この領域は、緊密に会合した１つの重鎖可変ドメインと１つの軽鎖可変ドメインの二量体からなり、例えばｓｃＦｖにおいては共有結合性であり得る。この構造において、各可変ドメインの３つのＣＤＲが相互作用して、ＶＨ−ＶＬ二量体の表面上のＣＴＬＡ４結合部位を画定する。
【０１６８】
「Ｆａｂ」断片は、軽鎖の可変ドメインと定常ドメイン、および重鎖の可変ドメインと第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、一般的にヒンジシステインによりそのカルボキシ末端近傍で共有結合されるＦａｂ断片の対を含む。
【０１６９】
「一本鎖Ｆｖ」または「ｓｃＦｖ」抗体断片は、単一ポリペプチド鎖中に抗体のＶＨドメインとＶＬドメインを含む。一般的に、ｓｃＦｖは、ＶＨドメインおよびＶＬドメインの間にポリペプチドリンカーをさらに含み、それによりｓｃＦｖはＣＴＬＡ４結合のための所望の構造を形成することができるようになる。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「抗体定常ドメイン」という用語は、抗体の定常領域ドメイン（例えば、ＣＬ抗体定常ドメイン、ＣＨ１抗体定常ドメイン、ＣＨ２抗体定常ドメイン、またはＣＨ３抗体定常ドメイン）に相当するポリペプチドを指す。
【０１７１】
本明細書で使用される場合、「促進する」という用語は、例えば他の別個のＦｃドメイン単量体に対するよりも、互いに高い結合親和性を有する２つのＦｃドメイン単量体でＦｃドメインを形成することを支持するといったように、促すことおよび支持することを意味する。本明細書に記載されるように、結合してＦｃドメインを形成する２つのＦｃドメイン単量体は、それらの各ＣＨ３抗体定常ドメインの界面において適合可能なアミノ酸改変（例えば、改変された突起および改変された空洞、ならびに／または静電的ステアリング変異）を有することが可能である。適合可能なアミノ酸改変は、こうしたアミノ酸改変を有さない、または適合しないアミノ酸改変をもつ他のＦｃドメイン単量体よりも、こうしたＦｃドメイン単量体同士での選択的な相互作用を促進するまたは支持する。これは、相互作用する２つのＣＨ３抗体定常ドメインの界面におけるアミノ酸改変に起因して、Ｆｃドメイン単量体が、アミノ酸改変を有さない他のＦｃドメイン単量体に対するよりも互いに対して高い親和性を有することを理由に起こる。
【０１７２】
本明細書で使用される場合、「二量体形成選択性モジュール」という用語は、２つのＦｃドメイン単量体間の好都合な対形成を促進するＦｃドメイン単量体の配列を指す。「相補的」な二量体形成選択性モジュールは、２つのＦｃドメイン単量体の互いに対する選択的な相互作用を促進するまたは支持する二量体形成選択性モジュールである。相補的な二量体形成選択性モジュールは、同一の配列または異なる配列を有することが可能である。例示的な相補的な二量体形成選択性モジュールが本明細書に記載される。
【０１７３】
本明細書で使用される場合、「改変された空洞（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｃａｖｉｔｙ）」という用語は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、本来のアミノ酸残基よりも低分子量の側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されることによって、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に形成された三次元の空洞を指す。「本来のアミノ酸残基」という用語は、野生型のＣＨ３抗体定常ドメインの遺伝コードによってコードされた天然のアミノ酸残基を指す。
【０１７４】
本明細書で使用される場合、「改変された突起（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ）」という用語は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基のうちの少なくとも１つが、本来のアミノ酸残基よりも高分子量の側鎖を有する異なるアミノ酸残基で置換されることによって、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に形成された三次元の突起を指す。「本来のアミノ酸残基」という用語は、野生型のＣＨ３抗体定常ドメインの遺伝コードによってコードされた天然のアミノ酸残基を指す。
【０１７５】
「空洞に突起が挿入された対」という用語は、第１のＦｃドメイン単量体がそのＣＨ３抗体定常ドメイン内に改変された空洞を含む一方で、第２のＦｃドメイン単量体がそのＣＨ３抗体定常ドメイン内に改変された突起を含むものである２つのＦｃドメイン単量体を含んだＦｃドメインを説明するものである。空洞に突起が挿入された対においては、第１のＦｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された突起は、該突起が第２のＦｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された空洞と、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の界面における二量体の正常な会合を有意に邪魔することなく相互作用するように配置される。
【０１７６】
本明細書で使用される場合、「ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」という用語は、２つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指し、これらの２つのＦｃドメイン単量体は、これらの２つのＦｃドメイン単量体の好ましい形成を促進する異なる逆電荷変異（例えば、表４Ａおよび表４Ｂ中の変異を参照）を含む。３つのＦｃドメイン、すなわち１つのカルボキシル末端の「幹」Ｆｃドメインと、２つのアミノ末端の「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃ構築体において、アミノ末端の「枝」Ｆｃドメインのそれぞれが、ヘテロ二量体のＦｃドメイン（「枝ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」とも称される）であってもよい。
【０１７７】
本明細書で使用される場合、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の群に関連する「構造的に同一」という用語は、同じポリペプチド配列が同じ比率および構成で組み立てられた構築体を指し、例えばグリコシル化などのいずれの翻訳後修飾も指していない。
【０１７８】
本明細書で使用される場合、「ホモ二量体Ｆｃドメイン」という用語は、２つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、当該２つのＦｃドメイン単量体は、同一の逆電荷の変異（例えば、表５および６の変異を参照）を含有する。３つのＦｃドメイン、すなわち１つのカルボキシル末端の「幹」Ｆｃドメインと、２つのアミノ末端の「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃ構築体において、カルボキシ末端の「幹」Ｆｃドメインは、ホモ二量体のＦｃドメイン（「幹ホモ二量体Ｆｃドメイン」とも称される）であってもよい。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、「ヘテロ二量体形成選択性モジュール」という用語は、適合するヘテロ二量体形成選択性モジュールを有する２つのＦｃドメイン単量体の好ましいヘテロ二量体形成を促進するために、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内に作製することが可能である、改変された突起、改変された空洞および特定の逆電荷のアミノ酸置換を指す。ヘテロ二量体形成選択性モジュールを含有するＦｃドメイン単量体が結合して、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成し得る。ヘテロ二量体形成選択性モジュールの例を、表３および４に示している。
【０１８０】
本明細書で使用される場合、「ホモ二量体形成選択性モジュール」という用語は、Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成を促進してホモ二量体Ｆｃドメインを形成するＣＨ３ドメイン間の界面において電荷をもつ残基の環の範囲内の少なくとも２つの位置におけるＦｃドメイン単量体内の逆電荷の変異を指す。ホモ二量体形成選択性モジュールの例を、表４および５に示している。
【０１８１】
本明細書で使用される場合、「連結する」という用語は、化学的複合体化、組換え手段ならびに例えばペプチド結合、ジスルフィド結合およびアミド結合である化学結合を含む手段によって、２以上の成分、要素、成分または例えばポリペプチドであるタンパク質ドメインを組み合わせるまたは付加することを説明するために用いる。例えば、２つの単一ポリペプチドを結合して、化学的複合体化、化学結合、ペプチドリンカーまたはその他の共有結合手段を介して、１つの隣接し合うタンパク質構造を形成することが可能である。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＣＴＬＡ４結合ドメインおよびＦｃドメイン単量体の両方をコードする連続的な核酸配列から発現されることにより、Ｆｃドメイン単量体に結合される。他の実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ペプチドリンカーを介してＦｃドメイン単量体に結合され、ペプチドリンカーのＮ末端は、例えば、ペプチド結合などの化学結合を介して、ＣＴＬＡ４結合ドメインのＣ末端に結合され、ペプチドリンカーのＣ末端は、例えば、ペプチド結合などの化学結合を介して、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端に結合される。
【０１８２】
本明細書で使用される場合、「会合した（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ）」という用語は、ポリペプチド（または１つの単一ポリペプチド内の配列）が、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）を形成するように配置されるような、例えば水素結合、疎水性相互作用またはイオン性相互作用などのポリペプチド（または１つの単一ポリペプチド内の配列）間の相互作用を記載するために使用される。例えば、いくつかの実施形態では、例えば２つのＦｃドメイン単量体をそれぞれ含む２つのポリペプチドと、１つのＦｃドメイン単量体をそれぞれ含む２つのポリペプチドの４つのポリペプチドが会合して、３つのＦｃドメインを有するＦｃ構築体が形成される（例えば、図５０および５１に図示するとおり）。４つのポリペプチドは、それらの各Ｆｃドメイン単量体を介して会合することが可能である。ポリペプチド間の会合は、共有結合相互作用を含まない。
【０１８３】
本明細書で使用される場合、「リンカー」という用語は、２つの要素間、例えばタンパク質ドメイン間の結合を指す。リンカーは、共有結合またはスペーサーとすることが可能である。「結合」という用語は、化学結合、例えばアミド結合もしくはジスルフィド結合、または、例えば化学的複合体化である化学反応により形成される任意の種類の結合を指す。「スペーサー」という用語は、２つのポリペプチドもしくはポリペプチドドメインドメイン間に空間および／または柔軟性をもたらす２つのポリペプチドまたはポリペプチドドメイン間に生じる部分（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマー）またはアミノ酸配列（例えば３〜２００アミノ酸、３〜１５０アミノ酸、または３〜１００アミノ酸の配列）を指す。アミノ酸スペーサーは、ポリペプチドの一次配列の一部（例えば、ポリペプチド骨格を介して、離間したポリペプチドまたはポリペプチドドメインに連結されるような）である。例えばＦｃドメインを形成する２つのヒンジ領域または２つのＦｃドメイン単量体の間におけるジスルフィド結合の形成は、リンカーとは考えない。
【０１８４】
本明細書で使用される場合、「グリシンスペーサー」という用語は、２つのＦｃドメイン単量体を直列に連結する、グリシンのみを含有するリンカーを指す。グリシンスペーサーは、少なくとも４、８、または１２個のグリシン（例えば、４〜３０、８〜３０、または１２〜３０個のグリシン、例えば、１２〜３０個、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のグリシン）を含有し得る。いくつかの実施形態では、グリシンスペーサーは、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）の配列を有する。
【０１８５】
本明細書で使用される場合、「アルブミン結合ペプチド」という用語は、血清アルブミンに対する親和性および血清アルブミンを結合する機能を有する１２〜１６のアミノ酸のアミノ酸配列を指す。アルブミン結合ペプチドは、例えばヒト、マウスまたはラットである様々な起源のものとすることが可能である。本開示のいくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドが、Ｆｃドメイン単量体のＣ末端に融合され、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の血清半減期が増加する。アルブミン結合ペプチドは、直接またはリンカーを介して、Ｆｃドメイン単量体のＮ末端またはＣ末端と融合することが可能である。
【０１８６】
本明細書で使用される場合、「精製用ペプチド」という用語は、ポリペプチドの精製、単離または同定に用いることが可能である任意の長さのペプチドを指す。精製用ペプチドは、ポリペプチドに連結して、例えば細胞溶解混合物からの、ポリペプチドの精製および／またはポリペプチドの単離を支援し得る。いくつかの実施形態では、精製用ペプチドは、精製用ペプチドに対して特異的な親和性を有する別の部分と結合する。いくつかの実施形態では、精製用ペプチドと特異的に結合するこうした部分は、基剤、樹脂またはアガロースビーズなどの固相支持体に付加する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に結合され得るペプチドの精製例を、本明細書においてさらに詳細に記載する。
【０１８７】
本明細書で使用される場合、「多量体」という用語は、本明細書に記載の会合したＦｃ構築体またはＦｃ抗原結合ドメイン構築体を少なくとも２つ含む分子を指す。
【０１８８】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」という用語は、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド、およびその断片または部分を指し、またゲノム由来もしくは合成由来のＤＮＡまたはＲＮＡを指し、それは一本鎖または二本鎖であり、センス鎖またはアンチセンス鎖を表し得る。単一のポリヌクレオチドが、単一のポリペプチドに翻訳される。
【０１８９】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、モノマーがアミド結合を介して共に連結するアミノ酸残基であるような単一のポリマーを説明している。ポリペプチドは、天然、組換えまたは合成的に産生されるかのいずれかである任意のアミノ酸配列を包含することを意図する。
【０１９０】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸位置」という用語は、タンパク質またはタンパク質ドメイン内のアミノ酸の位置番号を指す。アミノ酸位置は、指示された場合（例えば、ＣＤＲおよびＦＲ領域について）、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，ｅｄ  ５，１９９１））を使用して番号付け、そうでない場合は、ＥＵナンバリングを使用した。
【０１９１】
図２４Ａ〜２４Ｄは、ＥＵナンバリングシステムを使用して番号付けされたヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインを示す。
【０１９２】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸改変」という用語は、参照配列（例えば、野生型の、非変異の、または改変されていないＦｃ配列）と比較して、Ｆｃ構築体の薬物動態（ＰＫ）および／または薬力学（ＰＤ）の性質、血中半減期、エフェクター機能（例えば、細胞溶解（例えば、抗体依存性細胞介在性傷害（ＡＤＣＣ）および／または補体依存細胞傷害活性（ＣＤＣ））、貪食（例えば、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣＣ））、免疫活性化およびＴ細胞活性化）、Ｆｃ受容体（例えば、Ｆｃ−ガンマ受容体（ＦｃγＲ）（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩＩｂ（ＣＤ３２ｂ）、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）および／またはＦｃγＲＩＩＩｂ（ＣＤ１６ｂ））、Ｆｃ−アルファ受容体（ＦｃαＲ）、Ｆｃ−イプシロン受容体（ＦｃεＲ）および／または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ））に対するアフィニティー、補体カスケードに関与するタンパク質（例えば、Ｃ１ｑ）に対するアフィニティー、翻訳後修飾（例えば、グリコシル化、シアリル化）、凝集性（例えば、二量体（例えば、ホモ二量体および／またはヘテロ二量体）および／または多量体を形成する能力）、および生物物理学的性質（例えば、ＣＨ１およびＣＬ間の相互作用を変える、安定性を変える、ならびに／または、温度および／もしくはｐＨに対する感度を変える）に対して効果を発揮し、そして免疫学的疾患および炎症性疾患の治療有効性の改善を促進し得る、Ｆｃドメインのポリペプチド配列の変更を指す。アミノ酸改変は、アミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸改変は、１つのアミノ酸の改変である。他の実施形態では、アミノ酸改変は、複数の（例えば２つ以上）アミノ酸の改変である。アミノ酸改変は、アミノ酸の置換、欠失および／または挿入の組み合わせを含み得る。アミノ酸改変の解説には、Ｆｃポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の点変異（例えば、１つのヌクレオチドを別のヌクレオチドと交換）、挿入および欠失（例えば１つ以上のヌクレオチドの付加および／または除去）などの、遺伝的（すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡ）変更が含まれる。
【０１９３】
特定の実施形態では、Ｆｃ構築体内またはＦｃ抗原結合ドメイン構築体内の少なくとも１つ（例えば、少なくとも１、２または３つ）のＦｃドメイン単量体がアミノ酸改変（例えば、置換）を含む。いくつかの事例では、少なくとも１つのＦｃドメイン単量体が、１つ以上（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、または２０以下）のアミノ酸改変（例えば、置換）を含む。
【０１９４】
本明細書で使用される場合、「パーセント（％）同一性」という用語は、候補配列、例えば本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体中のＦｃドメイン単量体の配列のアミノ酸（または核酸）残基であって、配列を整列させて、必要であれば最大のパーセント同一性を達成するようにしてギャップを導入した後で（すなわち、最適なアラインメントのために候補配列および参照配列の一方または両方においてギャップを導入することが可能であり、比較目的のために非相同の配列は無視することが可能である）、野生型のＦｃドメイン単量体の配列などの参照配列のアミノ酸（または核酸）残基に対して一致している、候補配列のアミノ酸（または核酸）残基の百分率を指すものである。パーセント同一性の決定のためのアラインメントは、この分野の技術の範囲内である種々の方法で、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮまたはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどの公に利用可能であるコンピュータソフトウェアを用いて達成することが可能である。当業者は、比較している配列の全長にわたって最大のアラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメント測定用の適切なパラメータを決定することが可能である。いくつかの実施形態では、所与の参照配列との、該参照配列でのまたは該参照配列に対する、所与の候補配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性（あるいは、所与の参照配列との、該参照配列でのまたは該参照配列に対する、特定のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性を有するまたは含む、所与の候補配列と表すことがある）は、以下のとおりに計算される：
１００×（分数であるＡ／Ｂ）
式中、Ａは候補配列および参照配列のアラインメント内で同一として採点されたアミノ酸（または核酸）残基の数であり、Ｂは参照配列内のアミノ酸（または核酸）残基の総数である。候補配列の長さが参照配列の長さと等しくない場合のいくつかの実施形態では、参照配列に対する候補配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性は、候補配列に対する参照配列のパーセントアミノ酸（または核酸）配列同一性と等しくないはずである。
【０１９５】
特定の実施形態では、候補配列との比較のために整列させた参照配列は、候補配列の全長または候補配列の連続したアミノ酸（または核酸）残基の選択された部分にわたって、候補配列が５０％〜１００％の同一性（例えば、５０％〜１００％、６０％〜１００％、７０％〜１００％、８０％〜１００％、９０％〜１００％、９２％〜１００％、９５％〜１００％、９７％〜１００％、９９％〜１００％、または９９．５％〜１００％の同一性）を呈することを示し得る。比較目的のために整列させた候補配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、例えば、少なくとも４０％、例えば、少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％である。候補配列内のある位置が参照配列内の対応する位置と同じアミノ酸（または核酸）残基によって占有されている場合、それらの分子はその位置で同一である。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＦｃ構築体（例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、野生型のＦｃドメイン単量体の配列（配列番号４２）と、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％または９９．５％同一）である配列を有することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＦｃ構築体（例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、配列番号４４、４６、４８、および５０〜５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）の配列を有し得る。特定の実施形態では、Ｆｃ構築体中のＦｃドメイン単量体は、配列番号４８、５２および５３の配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有することができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、本明細書にさらに記載される配列番号１〜３６（例えば、配列番号１７、１８、２６、および２７）のうちのいずれか１つの配列と、少なくとも７５％同一（少なくとも７５％、７７％、７９％、８１％、８３％、８５％、８７％、８９％、９１％、９３％、９５％、９７％、９９％、９９．５％または１００％同一）である配列を有し得る。
【０１９８】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」という用語は、タンパク質をそれらの対応する核酸から発現するのに必要であるような、例えばオルガネラである、必要な細胞成分を含むビヒクルを指す。核酸は典型的に、この技術分野で既知の従来の技術（形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入など）によって宿主細胞内に導入されることが可能である核酸ベクター中に含まれる。宿主細胞は、例えば細菌細胞である原核細胞、または、例えば哺乳動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）である真核細胞とすることができる。本明細書で記載される場合、宿主細胞は、所望のドメインをコードするポリペプチドを１つ以上発現させるために使用され、それらポリペプチドはその後組み合わされて、所望のＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成させることができる。
【０１９９】
本明細書で使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、活性成分のみならず、活性成分を投与方法に好適であるようにさせることが可能である、１つ以上の賦形剤および希釈剤を含有する薬用製剤または薬学的製剤を指す。本開示の薬学的組成物は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体と適合可能な薬剤的に許容される成分を含む。該薬学的組成物は典型的に、静脈投与または皮下投与のために水性形態である。
【０２００】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドまたはＦｃ構築体の「実質的に均質な群」は、組成物（例えば、細胞培養培地または薬学的組成物）中のポリペプチドまたはＦｃ構築体のうちの少なくとも５０％が、非還元ＳＤＳゲル電気泳動またはサイズ排除クロマトグラフィーにより決定された場合に、同数のＦｃドメインを有する群である。ポリペプチド、またはＦｃ構築体の実質的に均質な群は、精製前、または、プロテインＡもしくはプロテインＧ精製後、または、任意のＦａｂもしくはＦｃ特異的なアフィニティークロマトグラフィー単独の後で、得ることができる。種々の実施形態では、組成物中のポリペプチドまたはＦｃ構築体のうちの少なくとも５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％または８５％が、同数のＦｃドメインを有する。他の実施形態では、組成物中のポリペプチドのまたはＦｃ構築体のうちの最大で８５％、９０％、９２％または９５％が、同数のＦｃドメインを有する。
【０２０１】
本明細書で使用される場合、「薬剤的に許容される担体」という用語は、薬学的組成物中の賦形剤または希釈剤を指す。薬学的に許容される担体は、製剤の他の成分と適合可能でなければならず、そしてレシピエントに対し有害であってはならない。本開示において、薬剤的に許容される担体は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に対し、十分な薬剤的安定性を与えなければならない。担体の性質は、投与形態によって異なる。例えば、経口投与では、固形担体が好ましく、静脈内投与では概して、水溶液担体（例えば、ＷＦＩおよび／または緩衝液）が用いられる。
【０２０２】
本明細書で使用される場合、「治療効果量」は、例えば薬剤投与量である、対象もしくは患者において所望の生物学的な効果の誘導に、または、本明細書に記載の状態または障害を有する患者の治療に有効である量を指す。本明細書においては、「治療効果量」が、単回投与または任意の投薬もしくは経路での摂取、単独でまたは他の治療薬剤と組み合わせての摂取のいずれでも、所望の治療効果をもたらす量として解釈できるということも理解されたい。
【０２０３】
本明細書で使用される場合、断片という用語、および部分という用語は、相互交換可能に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【０２０４】
【図１】２つのＦｃドメインおよびＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１）の説明図である。各Ｆｃドメインは、２つのＦｃドメイン単量体の二量体である。Ｆｃドメイン単量体のうちの２つ（１０６および１０８）がそのＣＨ３抗体定常ドメイン内に突起を含有する一方で、他の２つのＦｃドメイン単量体（１１２および１１４）は、そのＣＨ３抗体定常ドメイン内の隣接する位置に空洞を含有する。この構築体は、３つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成されている。第１のポリペプチド（１０２）は、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１１０）に直列に連続して、スペーサーによりＮ末端上で連結される、２つの突起含有Ｆｃドメイン単量体（１０６および１０８）を含む。ＶＬ含有ドメイン（１０４）は、ＶＨドメインに結合される。第２および第３のポリペプチド（１１２および１１４）は各々、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。
【図２】３つのＦｃドメインおよびＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２）の説明図である。この構築体は、４つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成されている。第１のポリペプチド（２０２）は、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（２１２）に直列に連続して、スペーサーによりＮ末端上で連結される、３つの突起含有Ｆｃドメイン単量体（２０６、２０８、および２１０）を含む。ＶＬ含有ドメイン（２０４）は、ＶＨドメインに結合される。第２、第３、および第４のポリペプチド（２１４、２１６、および２１８）は各々、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。
【図３】２つのＦｃドメインおよび２つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体３）の説明図である。この構築体は、３つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成されている。第１のポリペプチド（３０２）は、直列に連続してスペーサーによって連結された２つの突起含有Ｆｃドメイン単量体（３０４および３０６）を含有する。第２および第３のポリペプチド（３２０および３２２）の各々は、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（３１６および３１８）に直列にＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（３１０および３１４）を含む。ＶＬ含有ドメイン（３０８および３１２）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図４】３つのＦｃドメインおよび３つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体４）の説明図である。この構築体は、４つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成されている。第１のポリペプチド（４０２）は、直列に連続してスペーサーによって連結された３つの突起含有Ｆｃドメイン単量体（４０４、４０６、および４０８）を含有する。第２、第３、および第４のポリペプチド（４２８、４３０、および４３２）の各々は、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（４２２、４１６、および４１０）に直列にＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（４２６、４２０、および４１４）を含む。ＶＬ含有ドメイン（４２４、４１８、および４１２）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図５】２つのＦｃドメインおよび３つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体５）の説明図である。この構築体は、３つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成されている。第１のポリペプチド（５０２）は、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（５１０）に直列に連続して、スペーサーによりＮ末端上で連結される、２つの突起含有Ｆｃドメイン単量体（５０８および５０６）を含む。第２および第３のポリペプチド（５２４および５２６）の各々は、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（５１２および５１８）に直列にＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（５１６および５２２）を含む。ＶＬ含有ドメイン（５０４、５１４、および５２０）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図６】３つのＦｃドメインおよび４つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体６）の説明図である。この構築体は、４つのＦｃ単量体含有ポリペプチドから形成されている。第１のポリペプチド（６０２）は、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（６１２）に直列に連続して、スペーサーによりＮ末端上で連結される、３つの突起含有Ｆｃドメイン単量体（６０６、６０８、および６１０）を含む。第２、第３、および第４のポリペプチド（６３２、６３４、および６３６）の各々は、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（６１６、６２２、および６２８）に直列にＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（６１８、６２４、および６３０）を含む。ＶＬ含有ドメイン（６０４、６１６、６２２、および６２８）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図７】３つのＦｃドメインおよび２つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体７）の説明図である。このＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、２つのＦｃドメイン単量体（７０６および７１８）の二量体を含み、これらのＦｃドメイン単量体はいずれもＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をそれらのＣＨ３−ＣＨ３界面に含有し、これらの２つのＦｃドメイン単量体間で好ましい静電相互作用を促進する。この構築体は、４つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成されている。２つのポリペプチド（７０２および７２４）はそれぞれ、ＷＴ配列とは異なる荷電アミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含むＦｃドメイン単量体（７０６および７１８）、およびＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（７１２および７１４）へと直列に連続してスペーサーによりＮ末端上で連結される、突起含有Ｆｃドメイン単量体（７１０および７２０）を含む。第３および第４のポリペプチド（７０８および７２２）は各々、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（７０４および７１６）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図８】３つのＦｃドメインおよび２つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体８）の説明図である。構築体は、４つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（８０２および８２８）は各々、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をそれらのＣＨ３−ＣＨ３界面に含有するＦｃドメイン単量体（８１０および８１６）に直列に連続してスペーサーによって連結された突起含有Ｆｃドメイン単量体（８１４および８２０）を含有する。第３および第４のポリペプチド（８０４および８２６）はそれぞれ、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（８１２および８１８）に直列にＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（８０８および８２４）を含む。ＶＬ含有ドメイン（８０６および８２２）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図９】３つのＦｃドメインおよび４つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体９）の説明図である。構築体は、４つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（９０２および９３６）はそれぞれ、ＷＴ配列とは異なる荷電アミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含むＦｃドメイン単量体（９１０および９２４）、およびＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（９０８および９２０）へと直列に連続してスペーサーによりＮ末端上で連結される、突起含有Ｆｃドメイン単量体（９１８および９２８）を含む。第３および第４のポリペプチド（９０４および９３４）は、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（９１２および９２６）に直列に連続してＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（９１６および９３２）を含む。ＶＬ含有ドメイン（９０６、９１４、９２２、および９３０）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図１０】５つのＦｃドメインおよび２つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１０）の説明図である。構築体は、６つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（１００２および１０３２）はそれぞれ、別の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１０１４および１０２８）、ＷＴ配列とは異なる荷電アミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含むＦｃドメイン単量体（１００８および１０２２）、およびＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１００６および１０１８）へと直列に連続してスペーサーによりＮ末端上で連結される、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１０１６および１０３０）を含む。第３、第４、第５、および第６のポリペプチド（１０１２、１０１０、１０２６、および１０２４）は各々、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（１００４および１０２０）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図１１】５つのＦｃドメインおよび４つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１１）の説明図である。構築体は、６つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（１１０２および１１４８）は、別の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１１２０および１１３０）と、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３界面に含有するＦｃドメイン単量体（１１２４および１１２６）とに直列に連続してスペーサーによって連結された突起含有Ｆｃドメイン単量体（１１１８および１１３２）を含有する。第３、第４、第５、および第６のポリペプチド（１１０６、１１０４、１１４４、および１１４６）はそれぞれ、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１１１２、１１２２、１１３８、および１１２８）に直列に連続してＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（１１１６、１１１０、１１３４、および１１４０）を含む。ＶＬ含有ドメイン（１１０８、１１１４、１１３５、および１１４２）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図１２】５つのＦｃドメインおよび６つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１２）の説明図である。構築体は、６つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（１２０２および１２５６）は、別の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１２２６および１２２８）、ＷＴ配列とは異なる荷電アミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含むＦｃドメイン単量体（１２１０および１２４４）、およびＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１２５０および１２４８）へと直列に連続してスペーサーによりＮ末端上で連結される、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１２２４および１２３０）を含む。第３、第４、第５、および第６のポリペプチド（１２０６、１２０４、１２５４、および１２５２）はそれぞれ、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１２１８、１２１２、１２３６、および１２４２）に直列に連続してＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（１２２２、１２１６、１２３２、および１２３８）を含む。ＶＬ含有ドメイン（１２０８、１２１４、１２２０、１２３４、１２４０、および１２４６）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図１３】３つのＦｃドメインおよび２つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１３）の説明図である。構築体は、４つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（１３０２および１３２４）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１３１２および１３１６）、およびＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１３１０および１３１４）へと直列に連続してスペーサーによりＮ末端上で連結される、ＷＴ配列とは異なる荷電アミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含むＦｃドメイン単量体（１３０８および１３１８）を含む。第３および第４のポリペプチド（１３０６および１３２０）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（１３０４および１３２２）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図１４】３つのＦｃドメインおよび２つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１４）の説明図である。構築体は、４つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（１４０４および１４２６）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１４１４および１４１８）に直列に連続してスペーサーによって連結されたＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３界面に含有するＦｃドメイン単量体（１３０８および１３１８）を含有する。第３および第４のポリペプチド（１４０２および１４２８）はそれぞれ、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１４０８および１４１６）に直列に連続してＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（１４１０および１４２２）を含む。ＶＬ含有ドメイン（１４０６および１４２４）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図１５】３つのＦｃドメインおよび４つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１５）の説明図である。構築体は、４つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（１５０２および１５３６）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１５１８および１５２２）、およびＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１５１４および１５３２）へと直列に連続してスペーサーによりＮ末端上で連結される、ＷＴ配列とは異なる荷電アミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含むＦｃドメイン単量体（１５１２および１５２４）を含む。第３および第４のポリペプチド（１５０４および１５３４）は、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１５０８および１５３０）に直列に連続してＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（１５１０および１５２６）を含む。ＶＬ含有ドメイン（１５０６、１５１６、１５２０、および１５２８）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図１６】５つのＦｃドメインおよび２つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１６）の説明図である。構築体は、６つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（１６０２および１６３２）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１６１２および１６２２）、第２の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１６１４および１６２０）、およびＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１６１６および１６１８）へと直列に連続してスペーサーによりＮ末端上で連結される、ＷＴ配列とは異なる荷電アミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含むＦｃドメイン単量体（１６１０および１６２４）を含む。第３、第４、第５、および第６のポリペプチド（１６０８、１６０６、１６２６、および１６２８）は各々、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（１６０４および１６３０）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図１７】５つのＦｃドメインおよび４つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１７）の説明図である。この構築体は、６つのＦｃ単量体含有ポリペプチドから形成されている。２つのポリペプチド（１７０２および１７４８）は、Ｎ末端に、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１７２０および１７３０）と、第２の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１７２２および１７２８）とに直列に連続してスペーサーによって連結されたＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３界面に含有するＦｃドメイン単量体（１７１８および１７３２）を含有する。第３、第４、第５、および第６のポリペプチド（１７０６、１７０４、１７４６、および１７４４）は、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１７１２、１７２４、１７３８、および１７２６）に直列に連続してＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（１７１６、１７１０、１７３４、および１７４０）を含む。ＶＬ含有ドメイン（１７０８、１７１４、１７３６、および１７４２）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図１８】５つのＦｃドメインおよび６つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１８）の説明図である。構築体は、６つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（１８０２および１８５６）は、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１８２０および１８３６）、第２の突起含有Ｆｃドメイン単量体（１８２２および１８３４）、およびＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１８２６および１８３０）へと直列に連続してスペーサーによりＮ末端上で連結される、ＷＴ配列とは異なる荷電アミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含むＦｃドメイン単量体（１８１８および１８３８）を含む。第３、第４、第５、および第６のポリペプチド（１８０６、１８０４、１８５４、および１８５２）はそれぞれ、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１８１２、１８２８、１８４４、および１８５０）に直列に連続してＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（１８１６、１８１０、１８４０、および１８４６）を含む。ＶＬ含有ドメイン（１８０８、１８１４、１８２４、１８３２、１８４２、および１８４８）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図１９】５つのＦｃドメインおよび２つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体１９）の説明図である。構築体は、６つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（１９０２および１９３２）は、ＷＴ配列とは異なる荷電アミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含むＦｃドメイン単量体（１９０８および１９２６）、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１９１６および１９１８）、およびＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（１９１４および１９２０）へと直列に連続してスペーサーによりＮ末端上で連結される、突起含有Ｆｃドメイン単量体（１９１２および１９３０）を含む。第３および第４のポリペプチド（１９１０および１９２８）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有し、第５および第６のポリペプチド（１９０６および１９２４）は、空洞含有Ｆｃドメイン単量体を含有する。ＶＬ含有ドメイン（１９０４および１９２２）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図２０】５つのＦｃドメインおよび４つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２０）の説明図である。構築体は、６つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（２００２および２０４８）は、Ｎ末端に、ＷＴ配列とは異なる電荷のアミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３界面に含有するＦｃドメイン単量体（２０１２および２０３０）と、突起含有Ｆｃドメイン単量体（２０４０および２０３８）とに直列に連続してスペーサーによって連結された突起含有Ｆｃドメイン単量体（２０２０および２０２２）を含有する。第３、第４、第５、および第６のポリペプチド（２００６、２００４、２０４６、および２０４４）はそれぞれ、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（２０１４、２０４２、２０２８、および２０３６）に直列に連続してＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２０１８、２０１０、２０２４、および２０３２）を含む。ＶＬ含有ドメイン（２００８、２０１６、２０２６、および２０３４）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図２１】５つのＦｃドメインおよび６つのＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体（構築体２１）の説明図である。構築体は、６つのＦｃドメイン単量体含有ポリペプチドから形成される。２つのポリペプチド（２１０２および２１５６）は、ＷＴ配列とは異なる荷電アミノ酸をＣＨ３−ＣＨ３の接合面で含むＦｃドメイン単量体（２１１２および２１３０）、別の突起含有Ｆｃドメイン単量体（２１４４および２１４２）、およびＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（２１４８および２１３８）へと直列に連続してスペーサーによりＮ末端上で連結される、突起含有Ｆｃドメイン単量体（２１２０および２１２２）を含む。第３、第４、第５、および第６のポリペプチド（２１０６、２１０４、２１５４、および２１５２）はそれぞれ、ＶＨドメインを含むＣＴＬＡ４結合ドメイン（２１１４、２１５０、２１２８、および２１３６）に直列に連続してＮ末端上で結合される空洞含有Ｆｃドメイン単量体（２１１８、２１１０、２１２４、および２１３２）を含む。ＶＬ含有ドメイン（２１０８、２１１６、２１２６、２１３４、２１４０、および２１４６）は、各ＶＨドメインに結合される。
【図２２】Ｂ細胞を標的とする様々な抗ＣＤ２０構築体を用いたＣＤＣアッセイ、ＡＤＣＰアッセイ、およびＡＤＣＣアッセイの結果を示す３つのグラフである。第１のグラフは、Ｓ３Ｙ  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体がＣＤＣを媒介し得ることを示す。中央のグラフは、ＳＡＩ  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体およびＳ３Ｙ  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の両方が、ＡＤＣＰ  ＦｃγＲＩＩａレポーターアッセイにおいて１００倍超増強された効力を呈することを示す。第３のグラフは、ＳＡＩ  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体およびＳ３Ｙ  Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、フコシル化ｍＡｂと比較して増強されたＡＤＣＣ活性および脱フコシル化ｍＡｂと同様の活性を呈することを示す。
【図２３】ＣＴＬＡ４結合ドメインがＦｃ構築体のＦｃドメインに結合され得る３つの例示的な方法の概略図である。パネルＡは、ＣＴＬＡ４結合ドメインの重鎖構成要素が、Ｆｃ鎖の融合タンパク質として発現され得、軽鎖構成要素が、別個のポリペプチドとして発現され得ることを示す。パネルＢは、長鎖Ｆｃの融合タンパク質として発現されるｓｃＦｖを示す。パネルＣは、別個に発現され、外因的に付加され、化学結合によりＦｃ抗原結合ドメイン構築体に結合された重鎖構成要素および軽鎖構成要素を示す。
【図２４】図２４Ａは、ＥＵナンバリングを用いたヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（配列番号４３）を示す。ヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、そしてＣＨ３領域は下線付きである。図２４Ｂは、ＥＵナンバリングを用いるヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（配列番号４５）を示す。両端を含むＥ２１６〜Ｃ２２０を欠いたヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、そしてＣＨ３領域は下線付きであり、Ｋ４４７を欠く。図２４Ｃは、ＥＵナンバリングを用いるヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（配列番号４７）を示す。ヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、そしてＣＨ３領域は下線付きであり、そして４４７Ｋを欠く。図２４Ｄは、ＥＵナンバリングを用いるヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列（配列番号４２）を示す。両端を含むＥ２１６〜Ｃ２２０を欠いたヒンジ領域は二重下線によって示され、ＣＨ２ドメインは下線が無く、そしてＣＨ３領域は下線付きである。
【図２５】抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｃ構築体のＣＤＣ活性の分析の結果を示す。
【図２６】抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｃ構築体のＡＤＣＰ活性の分析の結果を示す。
【図２７】抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｃ構築体のＡＤＣＣ活性の分析の結果を示す。
【図２８】抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｃ構築体および抗ＣＴＬＡ４抗体による一次ヒト制御性Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性殺傷の分析の結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【０２０５】
詳細な説明
多くの治療用抗体は、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ：ａｎｔｉｂｏｄｙ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｐｈａｇｏｃｙｔｏｓｉｓ）、および補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ：ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ）など、Ｆｃドメインのエフェクター機能を介して自然免疫系の因子をリクルートすることにより機能する。いくつかの事例では、本開示は、治療薬、例えば、既知の治療用抗体を含む既知の単一ＦｃドメインのＣＴＬＡ４結合ドメインを、少なくとも２つのＦｃドメインと組み合わせて、固有の生物活性を有する新規の治療薬を生成することを企図する。いくつかの事例では、本明細書に開示される新規治療剤は、例えば既知の治療用抗体などの既知のＦｃドメイン含有治療剤を越える生物活性を有する。少なくとも２つのＦｃドメインの存在により、エフェクター機能を強化することができ、そして例えばＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣと組み合わされたＡＤＣＣなどの複数のエフェクター機能が活性化され、それにより治療用分子の有効性が上昇する。一貫した生物学的機能を有する生成物を生成するために、Ｆｃドメインの数の制御は、決定的である。本開示は、Ｆｃドメインをコードするペプチドのホモ二量体形成およびヘテロ二量体形成を制御して、限定された数のポリペプチド鎖から別個のサイズの分子を組み立てるＦｃ改変ツールのセットを特徴とする。国際公開第ＷＯ／２０１５／１６８６４３号、同第ＷＯ２０１７／１５１９７１号、同第ＷＯ２０１７／２０５４３６号、および同第ＷＯ２０１７／２０５４３４号は、２つ以上のＦｃドメインを有する分子を組み立てるためのＦｃ改変ツールおよび方法を開示しており、これらは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。改変ツールは、製造結果を著しく改善する構造特徴（例えば、グリシンリンカー）を含む。これらの構築体の特性により、実質的に均質な薬学的組成物の効率的な生成が可能となる。薬学的組成物の安全性、有効性、均一性、および信頼性を確実にするためには、薬学的組成物においてそのような均質性があることが望ましい。薬学的組成物に高度の均質性をもたせることにより、望ましくない物質（例えば、分解産物、および／または凝集産物または多量体）によって引き起こされる薬学的製品の凝集または分解の可能性も最小限に抑えられ、望ましくない物質によって引き起こされるオフターゲットおよび有害な副作用も制限される。
【０２０６】
本明細書で詳細に記載されるように、本発明者らは、２つのＦｃドメイン単量体を直列に連続して結合するためにグリシン残基のみを含むスペーサーの使用、末端リシン残基が取り除かれたポリペプチド配列の使用、およびヘテロ二量体形成選択性モジュールの２つのセットである（ｉ）異なる逆電荷変異を有するヘテロ二量体形成選択性モジュールおよび（ｉｉ）改変された空洞および突起を有するヘテロ二量体形成選択性モジュールの使用を含むアプローチを使用して、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のＦｃドメイン構成要素を改変することにより、組成物の均質性を改善した。
【０２０７】
本発明者らは、リンカーによって分離された複数のＦｃ配列を含む１つの長鎖ペプチドおよび単一のＦｃ配列を含む短鎖の複数のコピーを使用して、Ｆｃドメインが直列に連結された一連のＦｃ抗原結合ドメイン構築体を設計した（Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１〜６、図１〜図６）。ヘテロ二量体形成変異を各Ｆｃ配列に導入して、より短いまたはより大きい複合体の形成を最小限に抑えた所望の直列立体配置への組み立てを確実にした。任意の数のＦｃドメインをこの方法で直列に接続することができ、それにより、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上のＦｃドメインを有する構築体の作製が可能となった。Ｎ個のＦｃドメインを有するペプチドに関しては、そのような構築体は、ＣＴＬＡ４結合ドメインがそれぞれ長ペプチド鎖、短ペプチド鎖、またはその両方に導入されるかどうかに応じて、１〜Ｎ＋１個のＣＴＬＡ４結合ドメインとともに調製され得る。
【０２０８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１〜６（図１〜図６）において、ＦｃドメインをこれらのＦｃドメイン間の単一の分岐点に連結した。これらの構築体は、リンカーによって分離された複数のＦｃ配列を含む長鎖ペプチドの２つのコピーを含み、そこで、分岐Ｆｃ配列がホモ二量体形成変異を含み、非分岐Ｆｃドメインがヘテロ二量体形成変異を含む。長鎖のヘテロ二量体形成変異に対して相補的な変異を有する単一のＦｃ配列を含む短鎖の複数コピーが、多量体Ｆｃ足場を完成させるために使用される。ヘテロ二量体形成Ｆｃドメインは、分岐ＦｃドメインのＣ末端（例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体７〜１２、図７〜図１２）、Ｎ末端（例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１３〜１８、図１３〜図１８）、またはそれらの両方（例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１９〜２１、図１９〜図２１）に連結され得る。直列の複数のＦｃドメインは、分岐Ｆｃドメインのいずれかの末端に連結され得る。ＣＴＬＡ４結合ドメインは、長ペプチド鎖に導入されてもよく、それにより組み立てられたタンパク質分子当たり、２つのＣＴＬＡ４結合ドメインが生じる。あるいは、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、短ペプチド鎖に導入されてもよく、それにより組み立てられたタンパク質分子当たり、Ｎ−１個のＣＴＬＡ４結合ドメインが生じ、Ｎは、組み立てられたタンパク質分子中のＦｃドメインの数である。ＣＴＬＡ４結合ドメインが、短ペプチド鎖および長ペプチド鎖の両方に導入された場合、その結果得られる組み立てられたタンパク質分子は、Ｎ＋１個のＣＴＬＡ４結合ドメインを含む。
【０２０９】
モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＦｃドメインに対するこれまでの改変の試みは、Ｆｃドメイン内に変異を作製してＦｃγＲＩＩＩａへの結合を強化し、ひいては抗体依存性細胞媒介性細胞傷害性（ＡＤＣＣ）応答を増強すること、およびＦｃドメインを脱フコシル化してＦｃγＲＩＩＩａへの結合を強化し、ひいてはＡＤＣＣ応答を増強することを含んだ。
【０２１０】
ＦｃγＲＩＩＩａへの結合を強化するためにＦｃドメイン中に変異を有する抗体、またはＦｃドメインの脱フコシル化を有する抗体と比較して、本開示に開示されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、予想外にも、複数のクラスのＦｃγ受容体へのより強い結合と、複数の細胞傷害経路の強化された活性を特徴とする。本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、それらの対応するフコシル化、および脱フコシル化された親モノクローナル抗体と比較して、ＦｃγＲＩＩａとＦｃγＲＩＩＩａの両方への結合を強化させることができる（実施例４６を参照）。さらに、本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、予想外にも、ＡＤＣＣ経路反応の強化に加えて、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）経路、および／または抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）経路を介在する能力を特徴とする（実施例４７を参照）。
【０２１１】
Ｉ．Ｆｃドメイン単量体
Ｆｃドメイン単量体は、ヒンジドメイン、ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＣＨ３抗体定常ドメインの少なくとも一部分（例えば、任意のアミノ酸置換を有するヒトＩｇＧ１ヒンジ、ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＣＨ３抗体定常ドメイン）を含む。Ｆｃドメイン単量体は、免疫グロブリン抗体アイソタイプＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤのものとすることが可能である。Ｆｃドメイン単量体はまた、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のものとしてもよい。Ｆｃドメイン単量体はまた複合型であってもよく、例えば、ヒンジおよびＩｇＧ１からのＣＨ２およびＩｇＡからのＣＨ３による複合型、または、ヒンジおよびＩｇＧ１からのＣＨ２であるがＩｇＧ３からのＣＨ３による複合型であってもよい。Ｆｃドメイン単量体の二量体は、白血球表面上にある受容体である、例えばＦｃγＲＩＩＩａであるＦｃ受容体と結合することが可能なＦｃドメイン（本明細書でさらに規定される）である。本開示では、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインが、ＣＨ３−ＣＨ３抗体定常ドメインの界面におけるアミノ酸置換を含有して、それらの相互による会合を促進し得る。他の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、例えばアルブミン結合ペプチドまたは精製用ペプチドである、Ｎ末端またはＣ末端に付加するさらなる部分を含む。本開示では、Ｆｃドメイン単量体は、例えばＶＨ、ＶＬ、相補性決定領域（ＣＤＲ）または超可変領域（ＨＶＲ）である、いずれの種類の抗体可変領域も含有しない。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、配列番号４２の配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）中のＦｃドメイン単量体は、配列番号４４、４６、４８、および５０〜５３のうちのいずれか１つの配列と少なくとも９５％同一（例えば、少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）の配列を含み得る。ある特定の実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中のＦｃドメイン単量体は、配列番号４８、５２、および５３のうちのいずれか１つの配列に対し、少なくとも９５％同一（少なくとも９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有することができる。
2021532085.tif 000045
2021532085.tif 000046
【０２１３】
ＩＩ．Ｆｃドメイン
本明細書で規定するように、Ｆｃドメインは、ＣＨ３抗体定常ドメイン間の相互作用によって二量体形成する２つのＦｃドメイン単量体を含む。Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、例えばＦｃ−ガンマ受容体（すなわち、Ｆｃγ受容体（ＦｃγＲ））、Ｆｃ−アルファ受容体（すなわち、Ｆｃα受容体（ＦｃαＲ））、Ｆｃ−イプシロン受容体（すなわち、Ｆｃε受容体（ＦｃεＲ））および／または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する最小限の構造を形成する。いくつかの実施形態では、本開示のＦｃドメインは、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ））および／またはＦｃγＲＩＶおよび／または胎児性Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に結合する。
【０２１４】
ＩＩＩ．ＣＴＬＡ４結合ドメイン
抗原結合ドメインは、標的分子に特異的に結合する１つ以上のペプチドまたはポリペプチドを含む。ＣＴＬＡ４結合ドメインは、抗体のＣＴＬＡ４結合ドメインを含み得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、抗体または抗体構築体の断片、例えば、標的抗原に結合する抗体の最小部分であってもよい。ＣＴＬＡ４結合ドメインは、フィブロネクチン系の結合タンパク質（例えば、ＦＮ３モノボディ）などの標的に特異的に結合する合成的に改変されたペプチドであってもよい。
【０２１５】
断片の抗原結合（Ｆａｂ）断片は、標的抗原に結合する抗体上の領域である。この領域は、重鎖および軽鎖それぞれの１つの定常ドメインと１つの可変ドメインから構成される。Ｆａｂ断片は、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１およびＣＬドメインを含む。可変ドメインのＶＨおよびＶＬはそれぞれ、単量体のアミノ末端で、相補性決定領域（ＣＤＲ）が３つの１セットを含有する。Ｆａｂ断片は、免疫グロブリン抗体アイソタイプのＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤのものであり得る。またＦａｂ断片単量体は、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４）のものであってもよい。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ断片は、免疫グロブリンのプロテアーゼ処置（例えばペプシン）後の第２の同一Ｆａｂ断片に共有結合的に付加され、Ｆ（ａｂ’）２断片を形成してもよい。いくつかの実施形態では、Ｆａｂは、例えばドメイン間のリンカーを用いて融合される可変ドメインと定常ドメインの両方を含む単一ポリペプチドとして発現されてもよい。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、Ｆａｂ断片の一部のみがＣＴＬＡ４結合ドメインとして使用され得る。いくつかの実施形態では、Ｆａｂの軽鎖構成要素（ＶＬ＋ＣＬ）のみ、またはＦａｂの重鎖構成要素（ＶＨ＋ＣＨ）のみが使用される場合がある。いくつかの実施形態では、Ｆａｂ可変領域のＶＨ鎖とＶＬ鎖の融合タンパク質である一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）が使用される場合がある。他の実施形態では、相補的な軽鎖ポリペプチドと一緒にＣＴＬＡ４結合領域の対を形成する直列のＦｄ断片（ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨ−ＣＨ１）の対を含む直鎖抗体が使用され得る。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、本開示のＣＴＬＡ４結合ドメインは、表１に列記される標的または抗原に関して、以下の表１にさらに詳細に提供されるように、列記される標的または抗原に関して表１に列記されるＣＤＲ配列のうちの１、２、３、４、５、または６つすべてを含む。
【０２１８】
（表１）ＣＤＲ配列
2021532085.tif 000047
【０２１９】
（表２）ＶＨおよびＶＬ配列
2021532085.tif 000048
【０２２０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図１の１１０／１０４）は、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図２の２１２／２０４）は、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図３の３０８／３１６および３１２／３１８）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２３】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図４の４１０／４１２、４１６／４１８、および４２２／４２４）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体５のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図５の５１０／５０４、５１２／５１４、および５１８／５２０）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体６のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図６の６１２／６０４、６１４／６１６、６２０／６２２、および６２６／６２８）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体７のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図７の７１２／７１４および７１４／７１６）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２７】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体８のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図８の８１２／８０６および８１８／８２２）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体９のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図９の９０８／９０６、９２０／９２２、９１２／９１４、および９２６／９３０）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２２９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１０のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図１０の１００６／１００４および１０１８／１０２０）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１１のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図１１の１１１２／１１１４、１１２２／１１０８、１１２８／１１４２、および１１３８／１１３６）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１２のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図１２の１２１８／１２２０、１２１２／１２１４、１２５０／１２０８、１２４８／１２４６、１２４２／１２４０、および１２３６／１２３４）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１３のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図１３の１３１０／１３０４および１３１４／１３２２）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３３】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１４のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図１４の１４０８／１４０６および１４１６／１４２４）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１５のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図１５の１５０８／１５０６、１５１４／１５１６、１５３２／１５２０、および１５３０／１５２８）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１６のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図１６の１６１６／１６０４および１６１８／１６３０）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１７のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図１７の１７１２／１７１４、１７２４／１７０８、１７２６／１７４２、および１７３８／１７３６）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３７】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１８のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図１８の１８１２／１８１４、１８２８／１８０８、１８２６／１８２４、１８３０／１８３２、１８５０／１８４８、および１８４４／１８４２）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１９のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図１９の１９１４／１９０４および１９２０／１９２２）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２３９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２０のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図２０の２０１４／２０１６、２０４２／２００８、２０３６／２０３４、および２０２８／２０２６）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２１のＣＴＬＡ４結合ドメイン（図２１の２１１４／２１１６、２１５０／２１０８、２１４８／２１４６、２１３８／２１４０、２１３６／２１３４、および２１２８／２１２６）はそれぞれ、表１に列記される抗体のうちのいずれか１つの３つの重鎖および３つの軽鎖のＣＤＲ配列を含み得る。
【０２４１】
ＩＶ．二量体形成選択性モジュール
本開示において、二量体形成選択性モジュールは、２つのＦｃドメイン単量体の好ましい対形成を促進してＦｃドメインを形成する、Ｆｃドメイン単量体内の構成要素または選択アミノ酸を含む。詳細には、二量体形成選択性モジュールは、２つのＦｃドメイン単量体の相互作用するＣＨ３抗体定常ドメイン間の界面に位置するアミノ酸置換を含む、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインの部分である。二量体形成選択性モジュールにおいては、アミノ酸置換が、それら置換に選択されたアミノ酸の適合性の結果として、２つのＣＨ３抗体定常ドメインの好ましい二量体形成を行う。好ましいＦｃドメインの最終形態は、二量体形成選択性モジュールをもたないＦｃドメイン単量体で、または二量体形成選択性モジュール内に適合しないアミノ酸置換をもつＦｃドメイン単量体で形成される他のＦｃドメインに対して選択的である。この種のアミノ酸置換は、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（登録商標）Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓなどのこの技術分野で周知の従来の分子クローニング技術を用いて行うことが可能である。
【０２４２】
いくつかの実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に（本明細書でさらに説明される「ホール」の）改変された空洞を含む。他の実施形態では、二量体形成選択性モジュールは、ＣＨ３抗体定常ドメイン内に改変された突起（または本明細書でさらに説明される「ノブ」）を含む。Ｆｃドメインを選択的に形成するために、適合性の二量体形成選択性モジュールを有する２つのＦｃドメイン単量体（例えば、一方が改変された空洞を含むＣＨ３抗体定常ドメインであり、他方が改変された突起を含むＣＨ３抗体定常ドメインである）とを組み合わせて、Ｆｃドメイン単量体の空洞内突起（「ノブアンドホール」）対を形成する。改変された突起および改変された空洞は、ヘテロ二量体形成選択性モジュールの例であり、それらは、適合するヘテロ二量体形成選択性モジュールを有する２つのＦｃドメイン単量体の好ましいヘテロ二量体形成を促進するために、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内に作製することが可能である。表３は、好適な変異を列記する。
【０２４３】
他の実施形態では、ヘテロ二量体形成は、正に荷電したアミノ酸置換を含む二量体形成選択性モジュールを有するＦｃドメイン単量体および負に荷電したアミノ酸置換を含む二量体形成選択性モジュールを有するＦｃドメイン単量体の使用によって達成され、これらが選択的に組み合わさって、荷電したアミノ酸の好ましい静電ステアリング（本明細書でさらに説明される）によりＦｃドメインを形成することができる。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、以下の正に荷電したアミノ酸置換および負に荷電したアミノ酸置換：Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅのうちの１つを含み得る。一実施例では、正電荷をもつアミノ酸置換、例えばＤ３５６ＫまたはＥ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換、例えばＫ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。別の実施例では、Ｅ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３７０Ｄを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。いくつかの実施形態では、逆電荷のアミノ酸置換を、ヘテロ二量体形成選択性モジュールとして用い得るものであって、異なるが適合する逆電荷のアミノ酸置換を含有する２つのＦｃドメイン単量体が結合して、ヘテロ二量体Ｆｃドメインを形成する。表３は、ヘテロ二量体形成を促進するための様々な逆荷電二量体形成選択性モジュールを列記する。
【０２４４】
ノブおよびホール変異および静電ステアリング変異以外に、ヘテロ二量体形成を促進するために用いられ得る追加のタイプの変異が存在する。これらの変異も表３に列記されている。
【０２４５】
他の実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体が、ＣＨ３ドメイン間の界面における電荷をもつ残基の環内の少なくとも２つの位置において、同一の逆電荷の変異を含有するホモ二量体形成選択性モジュールを含む。ホモ二量体形成選択性モジュールは、Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成を促進してホモ二量体Ｆｃドメインを形成する、逆電荷のアミノ酸置換である。２つのＦｃドメイン単量体内の残基の２以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したＦｃドメイン単量体は同じ変異の配列のＦｃドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではＦｃドメイン単量体に対する相補性はより小さい。一実施形態では、Ｆｃドメインは、二重変異体である、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｄ／Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３５６Ｋ／Ｋ４３９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ／Ｄ３９９Ｋ、Ｋ３９２Ｅ／Ｄ３９９Ｋ、Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０ＤまたはＤ３５６Ｋ／Ｋ４３９Ｅを含むＦｃ単量体を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、例えばＫ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ／Ｅ３５７Ｋ／Ｋ３７０Ｅである二重変異体の任意の対を結合した四重変異体を含むＦｃドメイン単量体を含む。表４Ａおよび４Ｂは、ホモ二量体形成を促進する様々な選択性を列挙する。
【０２４６】
さらなる実施形態では、（ｉ）少なくとも１つの逆電荷の変異と、（ｉｉ）少なくとも１つの改変された空洞または少なくとも１つの改変された突起とを含有するＦｃドメイン単量体を、（ｉ）少なくとも１つの逆電荷の変異と、（ｉｉ）少なくとも１つの改変された突起または少なくとも１つの改変された空洞とを含有する他のＦｃドメイン単量体と選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成することができる。例えば、反転した電荷の変異Ｋ３７０Ｄと、改変された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖとを含有するＦｃドメイン単量体と、反転した電荷の変異Ｅ３５７Ｋと、改変された突起Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗとを含有する他のＦｃドメイン単量体とを選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成する。
【０２４７】
こうしたＦｃドメインの形成は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内の適合するアミノ酸置換によって促される。ＣＨ３−ＣＨ３界面において、２つの二量体形成選択性モジュールが適合しないアミノ酸置換を含有する場合、例えば、改変された空洞を両方が含有する、改変された突起を両方が含有する、または、同じ電荷をもつアミノ酸を両方が含有する場合は、ヘテロ二量体Ｆｃドメインの形成は促されない。
【０２４８】
さらに、画成されたＦｃドメイン単量体によるＦｃドメインの形成を促進するために用いる他の方法には、ヘテロ二量体の形成を可能にする、ロイシンジッパーの単量体α−へリックスのＦｃドメイン単量体それぞれに対するＣ末端融合を含むＬＵＺ−Ｙアプローチ（米国特許出願公開第ＷＯ２０１１０３４６０５号）のみならず、ＩｇＡおよびＩｇＧ  ＣＨ３配列の交互セグメントをそれぞれが含むヘテロ二量体のＦｃドメイン単量体によりＦｃドメインを生成する、ストランド交換改変ドメイン（ＳＥＥＤ（ｓｔｒａｎｄ−ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ｄｏｍａｉｎ））体のアプローチ（Ｄａｖｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ．２３：１９５−２０２，２０１０）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２４９】
Ｖ．改変された空洞および改変された突起
改変された空洞および改変された突起の使用（すなわち、「ノブイントゥホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」ストラテジー）は、Ｃａｒｔｅｒおよびその協同研究者（Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．９：６１７−６１２，１９９６、Ａｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２７０：２６−３５，１９９７、Ｍｅｒｃｈａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：６７７−６８１，１９９８）によって記述されている。ノブとホールとの相互作用は、ヘテロ二量体形成を支持するが、一方、ノブ間およびホール間の相互作用は、立体的な不一致および好ましい相互作用の損失に起因してホモ二量体形成を妨げる。「ノブイントゥホール」技術は、米国特許第５，７３１，１６８号にも開示されている。
【０２５０】
本開示では、改変された空洞および改変された突起は、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体の調製に使用される。改変された空洞は、あるタンパク質中の本来のアミノ酸が、より低分子量の側鎖をもつ異なるアミノ酸で置換されたときに形成される空隙である。改変された突起は、あるタンパク質中の本来のアミノ酸が、より高分子量の側鎖をもつ異なるアミノ酸で置換されたときに形成される突起である。詳細には、置換されようとするアミノ酸は、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメイン内にあり、２つのＦｃドメイン単量体の二量体形成に関与する。いくつかの実施形態では、一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された空洞は、もう一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された突起を収納するように形成されるため、両ＣＨ３抗体定常ドメインが、２つのＦｃドメイン単量体の二量体形成を促進するまたは支持する二量体形成選択性モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択性モジュール）（上記に記載した）として機能する。他の実施形態では、一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された空洞は、もう一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸をより良好に収納するように形成されている。さらに他の実施形態では、一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の改変された突起は、もう一方のＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸とのさらなる相互作用を形成するように形成されている。
【０２５１】
改変された空洞は、チロシンまたはトリプトファンなどのより長い側鎖を含有するアミノ酸を、アラニン、バリンまたはトレオニンなどのより短い側鎖を含有するアミノ酸で置換することによって構築することが可能である。詳細には、一部の二量体形成選択性モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択性モジュール）（上記でさらに記載した）は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内にＹ４０７Ｖ変異などの改変された空洞を含有する。同様に、改変された突起は、より短い側鎖を含有するアミノ酸を、より長い側鎖を含有するアミノ酸で置換することによって構築することが可能である。詳細には、一部の二量体形成選択性モジュール（例えば、ヘテロ二量体形成選択性モジュール）（上記でさらに記載した）は、ＣＨ３抗体定常ドメイン内にＴ３６６Ｗ変異などの改変された突起を含有する。本開示では、改変された空洞および改変された突起はまた、ヘテロ二量体形成を促進する、ＣＨ３ドメイン間のジスルフィド結合改変と組み合わされる。一実施例では、改変された空洞Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含有するＦｃドメイン単量体は、改変された突起Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含有する他のＦｃドメイン単量体と選択的に結合して、Ｆｃドメインを形成することができる。別の実施例では、Ｙ３４９Ｃを追加することで改変された空洞を含有するＦｃドメイン単量体と、Ｓ３５４Ｃを追加することで改変された突起を含有するＦｃドメイン単量体が選択的に組み合わされて、Ｆｃドメインを形成してもよい。ジスルフィド結合改変または構造的計算のいずれかと組み合わせた（ＨＡ−ＴＦ混合）、他の改変された空洞および改変された突起を表３に示すが、これらに限定されない。
【０２５２】
ＣＨ３抗体定常ドメイン内の本来のアミノ酸残基を異なるアミノ酸残基で置換することは、本来のアミノ酸残基をコードする核酸を変更することによって達成することが可能である。置換することが可能である本来のアミノ酸残基の数の上限は、界面における十分な相互作用を維持したままにすることを考えれば、ＣＨ３抗体定常ドメインの界面における残基の総数である。
【０２５３】
改変された空洞と改変された突起を、静電的ステアリングを用いて組み合わせる
静電的ステアリングを、ノブ−イン−ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎ−ｈｏｌｅ）技術と組み合わせて、例えば２つの異なるポリペプチド中のＦｃドメイン単量体間でのヘテロ二量体形成を有利にすることができる。以下にさらに詳細に記載するが、静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の有益な静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングを使用して、ホモ二量体形成またはヘテロ二量体形成のいずれかを促進することができ、後者の場合にはノブ−イン−ホール技術と組み合わせることが有益な場合がある。ヘテロ二量体形成の場合、異なっているが、適合性のある変異を、ヘテロ二量体形成されるＦｃドメイン単量体の各々に導入する。ゆえに、Ｆｃドメイン単量体を改変して、以下の正電荷をもつアミノ酸置換、および負電荷をもつアミノ酸置換のうちの１つを含ませることができる：Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅ。例えば１つのＦｃドメイン単量体、例えば空洞（Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖ）を有するＦｃドメイン単量体も、Ｋ３７０Ｄ変異を含むことができ、そして他のＦｃドメイン単量体、例えば突起（Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ）を有するＦｃドメイン単量体もＥ３５７Ｋを含むことができる。
【０２５４】
より一般的には、以下の空洞変異のいずれか（または変異の組み合わせ）：Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ｔ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ：Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ：Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３６６Ｓ：Ｌ３６８Ａ：Ｙ４０７Ｖ：Ｙ３４９Ｃ、およびＳ３３６４Ｈ：Ｆ４０５は、表３の静電ステアリング変異と組み合わせることができ、以下の突起変異のうちのいずれか（または変異の組み合わせ）：Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｆ４０５Ｗ、Ｔ３６６Ｙ：Ｆ４０５Ａ、Ｔ３６６Ｗ：Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ：Ｓ３５４Ｃ、およびＹ３４９Ｔ：Ｔ３９４Ｆは、表３の静電ステアリング変異と組み合わせることができる。
【０２５５】
ＶＩ．静電的ステアリング
静電的ステアリングは、より高次のタンパク質分子の形成を制御する、ペプチド、タンパク質ドメインおよびタンパク質内の反対の電荷をもつアミノ酸間の好ましい静電的相互作用の利用である。静電的ステアリングの効果を用いて、二重特異性抗体の生成の際のヘテロ二量体形成に有利に、ホモ二量体の形成を低減するように抗体ドメインの相互作用を変える方法が、米国特許出願公開第２０１４−００２４１１１号に開示されている。
【０２５６】
本開示では、静電的ステアリングを用いて、Ｆｃドメイン単量体の二量体形成およびＦｃ抗原結合ドメイン構築体の形成を制御する。特に、静電的ステアリングを用いてＦｃドメイン単量体の二量体形成を制御することは、ＣＨ３−ＣＨ３界面を形成する１つ以上のアミノ酸残基が、正電荷をもつかまたは負電荷をもつアミノ酸残基で置換されるため、導入された特定の電荷をもつアミノ酸に応じて、相互作用は静電的に好ましくなるかまたは好ましくないものとなる。いくつかの実施形態では、リシン、アルギニンまたはヒスチジンなど、界面の正電荷をもつアミノ酸が、アスパラギン酸またはグルタミン酸などの負電荷をもつアミノ酸で置換される。他の実施形態では、界面の負電荷をもつアミノ酸が、正電荷をもつアミノ酸で置換される。電荷をもつアミノ酸は、相互作用するＣＨ３抗体定常ドメインの一方または両方に導入され得る。相互作用するＣＨ３抗体定常ドメインに電荷をもつアミノ酸を導入することによって、二量体形成選択性モジュール（上記においてさらに説明した）が形成されるが、それは電荷をもつアミノ酸間の相互作用の結果としての静電的ステアリング効果で制御されるとおりに、Ｆｃドメイン単量体の二量体を選択的に形成することが可能である。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、静電的ステアリング効果で制御されるとおりにＦｃドメイン単量体の二量体を選択的に形成することが可能である、反転した電荷を含む二量体形成選択性モジュールを形成するために、２つのＦｃドメイン単量体は、ヘテロ二量体形成またはホモ二量体形成を経て選択的に形成され得る。
【０２５８】
Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成
Ｆｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成は、表３に含まれるが、それらに限定されない電荷残基対などの２つのＦｃドメイン単量体に異なるが適合性の変異を導入することによって促進され得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメイン単量体は、以下の正に荷電したアミノ酸置換および負に荷電したアミノ酸置換：Ｄ３５６Ｋ、Ｄ３５６Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ４３９ＤおよびＫ４３９Ｅのうちの１つを含み得る。一実施例では、正電荷をもつアミノ酸置換、例えばＤ３５６ＫまたはＥ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、負電荷をもつアミノ酸置換、例えばＫ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。別の実施例では、Ｅ３５７Ｋを含有するＦｃドメイン単量体と、Ｋ３７０Ｄを含有するＦｃドメイン単量体とが選択的に結合して、電荷をもつアミノ酸の好ましい静電的ステアリングを経てＦｃドメインを形成する。
【０２５９】
例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体では、３つＦｃドメインのうちの２つが、静電ステアリング効果によって促進されるように、２つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成され得る。「ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」という用語は、２つのＦｃドメイン単量体のヘテロ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指し、これらの２つのＦｃドメイン単量体は、これらの２つのＦｃドメイン単量体の好ましい形成を促進する異なる逆電荷変異（ヘテロ二量体形成選択性モジュール）（例えば、表４Ａおよび表４Ｂ中の変異を参照）を含む。３つのＦｃドメイン、すなわち、１つのカルボキシル末端「幹」Ｆｃドメインおよび２つのアミノ末端「枝」Ｆｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体では、アミノ末端「枝」Ｆｃドメインは各々、ヘテロ二量体Ｆｃドメイン（「枝ヘテロ二量体Ｆｃドメイン」とも呼ばれる）（例えば、図１中、Ｆｃドメイン単量体１０６および１１４またはＦｃドメイン単量体１１２および１１６によって形成されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン、図２中、Ｆｃドメイン単量体２０６および２１４またはＦｃドメイン単量体２１２および２１６によって形成されるヘテロ二量体Ｆｃドメイン）であり得る。枝へテロ二量体Ｆｃドメインは、Ｅ３５７Ｋを含むＦｃドメイン単量体およびＫ３７０Ｄを含む別のＦｃドメイン単量体によって形成され得る。
【０２６０】
（表３）Ｆｃヘテロ二量体形成方法
2021532085.tif 000049
2021532085.tif 000050
2021532085.tif 000051
注記：すべての残基はＥＵナンバリングスキームに従って番号付けされている（Ｅｄｅｌｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，６３：７８−８５，１９６９）
【０２６１】
Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成
Ｆｃドメイン単量体のホモ二量体形成は、対称的であるように両Ｆｃドメイン単量体内に、同一の静電的ステアリング変異（ホモ二量体形成選択性モジュール）を導入することによって、促進することが可能である。いくつかの実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体が、ＣＨ３ドメイン間の界面における電荷をもつ残基の環内の少なくとも２つの位置において、同一の逆電荷の変異を含有するホモ二量体形成選択性モジュールを含む。２つのＦｃドメイン単量体内の残基の２以上の相補的な対の両要素の電荷が反転していることによって、変異したＦｃドメイン単量体は同じ変異の配列のＦｃドメイン単量体に対して相補性を維持するが、こうした変異なしではＦｃドメイン単量体に対する相補性はより小さい。Ｆｃドメイン単量体に導入されてそのホモ二量体形成を促進し得る静電ステアリング変異が表４Ａおよび表４Ｂに示されるが、これらに限定されない。一実施形態では、Ｆｃドメインは、二重逆電荷変異体（表４Ａおよび表４Ｂ）、例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋを各々含む、２つのＦｃドメイン単量体を含む。別の実施形態では、Ｆｃドメインは、四重逆電荷変異体（表４Ａおよび表４Ｂ）、例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ／Ｋ３７０Ｄ／Ｅ３５７Ｋを各々含む、２つのＦｃドメイン単量体を含む。
【０２６２】
例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体において、３つのうち１つのＦｃドメインは、静電的ステアリング効果により促進される場合、２つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成され得る。「ホモ二量体Ｆｃドメイン」という用語は、２つのＦｃドメイン単量体のホモ二量体形成によって形成されるＦｃドメインを指すものであって、当該２つのＦｃドメイン単量体は、同一の逆電荷の変異（例えば、表５および６の変異を参照）を含有する。３つのＦｃドメイン、すなわち１つのカルボキシル末端の「幹」Ｆｃドメインと、２つのアミノ末端の「枝」Ｆｃドメインとを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体において、カルボキシ末端の「幹」Ｆｃドメインは、ホモ二量体のＦｃドメイン（「幹ホモ二量体Ｆｃドメイン」とも称される）となり得る。幹ホモ二量体Ｆｃドメインは、二重変異体Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋをそれぞれ含有する２つのＦｃドメイン単量体によって形成され得る。
【０２６３】
（表４Ａ）Ｆｃホモ二量体化方法−各鎖中の２つの変異
2021532085.tif 000052
【０２６４】
（表４Ｂ）Ｆｃホモ二量体化方法−各鎖中の４つの変異
2021532085.tif 000053
2021532085.tif 000054
【０２６５】
ＶＩＩ．リンカー
本開示では、ポリペプチドまたはタンパク質ドメインおよび／または会合する非タンパク質部分間における結合または接続を説明するために、リンカーを用いる。いくつかの実施形態では、リンカーは、少なくとも２つのＦｃドメイン単量体間の結合または接続であり、それに対してリンカーが、第１のＦｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインのＣ末端を、第２のＦｃドメイン単量体のヒンジドメインのＮ末端に対して、２つのＦｃドメイン単量体が互いに直列に連結するように接続するものである。他の実施形態では、リンカーは、Ｆｃドメイン単量体とそれに付加されるその他のタンパク質ドメインとの間の結合である。例えばリンカーは、Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインのＣ末端を、アルブミン結合ペプチドのＮ末端に付加させることが可能である。
【０２６６】
リンカーは、例えばペプチド結合である単純な共有結合、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）ポリマーである合成ポリマー、または、例えば化学的複合体化である化学反応で形成した任意の種類の結合とすることが可能である。リンカーがペプチド結合である場合は、一方のタンパク質ドメインのＣ末端におけるカルボン酸基が、縮合反応でもう一方のタンパク質ドメインのＮ末端におけるアミノ酸と反応して、ペプチド結合を形成することが可能である。詳細には、ペプチド結合は、この技術分野で周知の従来の有機化学反応を経る合成手段により、または、宿主細胞からの自然な産生により形成することが可能であるものであって、例えば２つのＦｃドメイン単量体である、直列にしたタンパク質両方のＤＮＡ配列をコードするポリヌクレオチド配列を、宿主細胞内の、例えばＤＮＡポリメラーゼおよびリボソームである、必要な分子機械（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）によって両方のタンパク質をコードする隣接し合うポリペプチドへと直接転写または翻訳されることが可能である。
【０２６７】
リンカーが合成ポリマー、例えばＰＥＧポリマーである場合においては、該ポリマーは、各端部が反応性の化学官能基で官能化されて、２つのタンパク質の接続端にある末端アミノ酸と反応することが可能である。
【０２６８】
リンカー（上記に示したペプチド結合は除く）が化学反応により形成される場合においては、例えばアミン、カルボン酸、エステル、アジドまたはこの技術分野で通常用いられる他の官能基である化学官能基が、一方のタンパク質のＣ末端と、もう一方のタンパク質のＮ末端とのそれぞれに対して合成的に付加することが可能である。この２つの官能基はその後、合成化学手段を経て反応して化学結合を形成することによって、２つのタンパク質をひとつに接続することが可能である。こうした化学的複合体化の手順は、当業者にとってルーチンである。
【０２６９】
スペーサー
本開示では、２つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、３〜２００のアミノ酸（例えば、３〜２００、３〜１８０、３〜１６０、３〜１４０、３〜１２０、３〜１００、３〜９０、３〜８０、３〜７０、３〜６０、３〜５０、３〜４５、３〜４０、３〜３５、３〜３０、３〜２５、３〜２０、３〜１５、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２００、５〜２００、６〜２００、７〜２００、８〜２００、９〜２００、１０〜２００、１５〜２００、２０〜２００、２５〜２００、３０〜２００、３５〜２００、４０〜２００、４５〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００または１８０〜２００のアミノ酸）を含むアミノ酸スペーサーとすることが可能である。いくつかの実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、少なくとも１２のアミノ酸、例えば、１２〜２００のアミノ酸（例えば、１２〜２００、１２〜１８０、１２〜１６０、１２〜１４０、１２〜１２０、１２〜１００、１２〜９０、１２〜８０、１２〜７０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４または１２〜１３のアミノ酸）（例えば、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００または１９０〜２００のアミノ酸）を含有するアミノ酸スペーサーである。いくつかの実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のリンカーは、１２〜３０のアミノ酸（例えば、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のアミノ酸）を含有するアミノ酸スペーサーである。好適なペプチドスペーサーはこの分野において既知であり、例えば、グリシンおよびセリンなどのフレキシブルなアミノ酸残基を含有するペプチドリンカーを含む。ある実施形態では、スペーサーは、例えばＧＳ、ＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）、ＧＧＳＧ（配列番号２）またはＳＧＧＧ（配列番号３）の、複数のモチーフまたは繰り返しモチーフであるモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、例えばＧＳ、ＧＳＧＳ（配列番号４）、ＧＳＧＳＧＳ（配列番号５）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号６）、ＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７）またはＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号８）である、ＧＳのモチーフを含む２〜１２のアミノ酸を含有することが可能である。他のある実施形態では、スペーサーは、例えばＧＧＳ、ＧＧＳＧＧＳ（配列番号９）、ＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１０）およびＧＧＳＧＧＳＧＧＳＧＧＳ（配列番号１１）である、ＧＧＳのモチーフを含む３〜１２のアミノ酸を含有することが可能である。さらに他の実施形態では、スペーサーは、例えばＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１２）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１３）、ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１４）またはＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧ（配列番号１５）である、ＧＧＳＧ（配列番号２）のモチーフを含む４〜２０のアミノ酸を含有することが可能である。他の実施形態では、スペーサーは、例えばＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１６）またはＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７）である、ＧＧＧＧＳ（配列番号１）のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、ＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１８）である。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、グリシン残基のみを含有し、例えば、少なくとも４つのグリシン残基（例えば、４〜２００、４〜１８０、４〜１６０、４〜１４０、４〜４０、４〜１００、４〜９０、４〜８０、４〜７０、４〜６０、４〜５０、４〜４０、４〜３０、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６または４〜５のグリシン残基）（例えば、４〜２００、６〜２００、８〜２００、１０〜２００、１２〜２００、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００、または１９０〜２００のグリシン残基）を含有する。ある実施形態では、スペーサーは、４〜３０のグリシン残基（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のグリシン残基）を有する。いくつかの実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、グリコシル化（例えば、Ｏ−結合型グリコシル化、Ｏ−グリコシル化とも称する）されていないものであり得るか、または、例えば１つ以上のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、ＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１８）と比較して、低減されたレベルのグリコシル化（例えば、低減されたレベルのＯ−グリコシル化）（例えば、キシロース、マンノース、シアル酸、フコース（Ｆｕｃ）および／またはガラクトース（Ｇａｌ）などのグリカン（例えば、キシロース）による低減したレベルのＯ−グリコシル化）を有し得る。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、Ｏ−グリコシル化（例えば、Ｏ−キシロシル化）されていないものであり得るか、または、例えば１つ以上のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、ＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１８））と比較して、低減されたレベルのＯ−グリコシル化（例えば、低減されたレベルのＯ−キシロシル化）を有し得る。
【０２７２】
いくつかの実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、タンパク質分解を受けないものであり得るか、または、例えば１つ以上のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、ＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１８））と比較して、低減されたタンパク質分解速度を有し得る。
【０２７３】
ある実施形態では、スペーサーは、例えばＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２０）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２１）、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２２）またはＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２３）である、ＧＧＧＧ（配列番号１９）のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、例えばＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２５）またはＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２６）である、ＧＧＧＧＧ（配列番号２４）のモチーフを含有することが可能である。ある実施形態では、スペーサーは、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）である。
【０２７４】
他の実施形態では、スペーサーはまた、グリシンおよびセリン以外のアミノ酸を含有すること、例えばＧＥＮＬＹＦＱＳＧＧ（配列番号２８）、ＳＡＣＹＣＥＬＳ（配列番号２９）、ＲＳＩＡＴ（配列番号３０）、ＲＰＡＣＫＩＰＮＤＬＫＱＫＶＭＮＨ（配列番号３１）、ＧＧＳＡＧＧＳＧＳＧＳＳＧＧＳＳＧＡＳＧＴＧＴＡＧＧＴＧＳＧＳＧＴＧＳＧ（配列番号３２）、ＡＡＡＮＳＳＩＤＬＩＳＶＰＶＤＳＲ（配列番号３３）またはＧＧＳＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３４）を含有することも可能である。
【０２７５】
本開示におけるある実施形態では、１２アミノ酸ペプチドスペーサーまたは２０アミノ酸ペプチドスペーサーを用いて、２つのＦｃドメイン単量体、それぞれ配列ＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳ（配列番号３５）およびＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１８）からなる１２アミノ酸ペプチドスペーサーおよび２０アミノ酸ペプチドスペーサーが直列に接続される。他の実施形態では、配列ＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＳ（配列番号３６）からなる１８アミノ酸ペプチドスペーサーを用いることができる。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、上述の配列番号１〜３６のいずれか１つの配列に対し、少なくとも７５％同一（例えば、少なくとも７７％、７９％、８１％、８３％、８５％、８７％、８９％、９１％、９３％、９５％、９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。特定の実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、配列番号１７、１８、２６、および２７のいずれか１つの配列に対し、少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、または９９．５％同一）である配列を有し得る。特定の実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、配列番号１８または２７の配列に対し、少なくとも８０％同一（例えば、少なくとも８２％、８５％、８７％、９０％、９２％、９５％、９７％、９９％、または９９．５％）である配列を有し得る。
【０２７７】
特定の実施形態では、Ｆｃドメイン単量体のヒンジのアミノ末端と、同じポリペプチド内にあるＦｃ単量体のカルボキシ末端との間のリンカー（すなわち、リンカーは、第１のＦｃドメイン単量体のＣＨ３抗体定常ドメインのＣ末端を、第２のＦｃドメイン単量体のヒンジドメインのＮ末端に接続し、これにより、２つのＦｃドメイン単量体は、互いに直列に結合される）は、共有結合ではなく３つ以上のアミノ酸（例えば、３〜２００個のアミノ酸（例えば、３〜２００、３〜１８０、３〜１６０、３〜１４０、３〜１２０、３〜１００、３〜９０、３〜８０、３〜７０、３〜６０、３〜５０、３〜４５、３〜４０、３〜３５、３〜３０、３〜２５、３〜２０、３〜１５、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２００、５〜２００、６〜２００、７〜２００、８〜２００、９〜２００、１０〜２００、１５〜２００、２０〜２００、２５〜２００、３０〜２００、３５〜２００、４０〜２００、４５〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、もしくは１８０〜２００個のアミノ酸）を有するスペーサー、または１２〜２００個のアミノ酸（例えば、１２〜２００、１２〜１８０、１２〜１６０、１２〜１４０、１２〜１２０、１２〜１００、１２〜９０、１２〜８０、１２〜７０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、もしくは１２〜１３個のアミノ酸）など、少なくとも１２個のアミノ酸（例えば、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００、もしくは１９０〜２００個のアミノ酸））を含有するアミノ酸スペーサーである。
【０２７８】
スペーサーは、Ｆｃドメイン単量体のヒンジドメインのＮ末端と、ＣＴＬＡ−４結合ドメインのカルボキシ末端との間に存在し得（例えば、ＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインのＣＨ１ドメインまたはＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインのＣＬドメイン）、それにより、ドメインが、３つ以上のアミノ酸（例えば、３〜２００個のアミノ酸（例えば、３〜２００、３〜１８０、３〜１６０、３〜１４０、３〜１２０、３〜１００、３〜９０、３〜８０、３〜７０、３〜６０、３〜５０、３〜４５、３〜４０、３〜３５、３〜３０、３〜２５、３〜２０、３〜１５、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜２００、５〜２００、６〜２００、７〜２００、８〜２００、９〜２００、１０〜２００、１５〜２００、２０〜２００、２５〜２００、３０〜２００、３５〜２００、４０〜２００、４５〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、または１８０〜２００個のアミノ酸））のスペーサー、または少なくとも１２個のアミノ酸、例えば、１２〜２００個のアミノ酸（例えば、１２〜２００、１２〜１８０、１２〜１６０、１２〜１４０、１２〜１２０、１２〜１００、１２〜９０、１２〜８０、１２〜７０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１２〜３０、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１２〜１５、１２〜１４、または１２〜１３個のアミノ酸）（例えば、１４〜２００、１６〜２００、１８〜２００、２０〜２００、３０〜２００、４０〜２００、５０〜２００、６０〜２００、７０〜２００、８０〜２００、９０〜２００、１００〜２００、１２０〜２００、１４０〜２００、１６０〜２００、１８０〜２００、または１９０〜２００個のアミノ酸）を含むアミノ酸スペーサーによって結合される。
【０２７９】
ＶＩＩＩ．血清タンパク質結合ペプチド
血清タンパク質をペプチドに結合することで、タンパク質薬剤の薬物動態を向上させることが可能であり、特にここに記載するＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、血清タンパク質結合ペプチドと融合し得る。
【０２８０】
一例として、ここに記載の方法および組成物に用いることが可能であるアルブミン結合ペプチドは、概して、この技術分野において既知である。一実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列ＤＩＣＬＰＲＷＧＣＬＷ（配列番号３７）を含む。いくつかの実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、配列番号３７の配列と、少なくとも８０％同一（例えば、８０％、９０％または１００％同一）である配列を有する。
【０２８１】
本開示では、アルブミン結合ペプチドは、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体内の特定のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に付加され得る。一実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、ＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ構築体中の１つ以上のポリペプチドのＣ末端に付加され得る。別の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、ＣＴＬＡ４結合ドメインを含むＦｃ構築体中で直列に連続して連結された２つのＦｃドメイン単量体をコードするポリペプチドのＣ末端に融合され得る。さらに別の実施形態では、アルブミン結合ペプチドは、直列に接続した２つのＦｃドメイン単量体をコードするポリペプチド内の第２のＦｃドメイン単量体と連結するＦｃドメイン単量体Ｃ末端（例えば、図１のＦｃドメイン単量体１１４および１１６、図２のＦｃドメイン単量体２１４および２１６）に付加することが可能である。アルブミン結合ペプチドは、例えば化学的複合体化である化学的手段を介して、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体と遺伝的に融合、または、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に付加されることが可能である。所望であれば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体とアルブミン結合ペプチドとの間にスペーサーを挿入することが可能である。学説には拘束されないが、本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体中にアルブミン結合ペプチドが含まれることで、血清アルブミンと治療用タンパク質との結合を介して、治療用タンパク質の滞留延長がもたらされ得ることが期待される。
【０２８２】
ＶＩＩＩ．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体
概して、本開示は、２〜１０個のＦｃドメインおよび１つ以上のＣＴＬＡ４結合ドメインが付加されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴とする。これらは、Ｆｃ受容体の１つの野生型Ｆｃドメイン（例えばＦｃγＲＩＩＩａ）よりも高い結合アフィニティーおよび／またはアビディティを有し得る。この開示は、Ｆｃドメインの２つのＦｃドメイン単量体が互いと二量体を選択的に形成して、それによって望まない多量体または凝集の形成を回避するように、相互作用する２つのＣＨ３抗体定常ドメインの界面においてアミノ酸を改変する方法を開示する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、偶数のＦｃドメイン単量体を含み、Ｆｃドメイン単量体の各対がＦｃドメインを形成する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、４つのＦｃドメイン単量体の二量体から形成される最小で２つの機能性Ｆｃドメインと、１つのＣＴＬＡ４結合ドメインとを含む。ＣＴＬＡ４結合ドメインは、例えば、リンカー、スペーサー、ペプチド結合、化学結合、または化学的部分で、Ｆｃドメインに結合され得る。
【０２８３】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、多くの方法で組み立てることができる。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、非対称の直列Ｆｃドメインから組み立てられ得る（図１〜６）。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単独で分岐したＦｃドメインから組み立てられ得、この分岐点は、Ｎ末端Ｆｃドメインにある（図７〜１２）。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単独で分岐したＦｃドメインから組み立てられ得、この分岐点は、Ｃ末端Ｆｃドメインにある（図１３〜１８）。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、単独で分岐したＦｃドメインから組み立てられ得、この分岐点は、Ｎ末端ＦｃドメインにもＣ末端Ｆｃドメインにもない（図１９〜２１）。
【０２８４】
ＣＴＬＡ４結合ドメインは、多くの方法でＦｃ抗原結合ドメイン構築体に結合され得る。ＣＴＬＡ４結合ドメインは、Ｆｃ鎖の融合タンパク質として発現され得る。ＣＴＬＡ４結合Ｆａｂの重鎖構成要素は、Ｆｃ鎖の融合タンパク質として発現され得、軽鎖構成要素は、別個のポリペプチドとして発現され得る（図２３、パネルＡ）。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖは、ＣＴＬＡ４結合ドメインとして使用される。ｓｃＦｖは、Ｆｃ長鎖の融合タンパク質として発現され得る（図２３、パネルＢ）。いくつかの実施形態では、長鎖構成要素および軽鎖構成要素は別個に発現され、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に外因的に付加される。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは別個に発現され、後に化学結合を用いてＦｃ抗原結合ドメイン構築体に結合される（図２３、パネルＣ）。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のＦｃポリペプチドは、Ｃ末端リシン残基を欠く。いくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中のすべてのＦｃポリペプチドは、Ｃ末端リシン残基を欠く。いくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のＦｃポリペプチドのＣ末端リシンの非存在は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）の群の均質性を向上させ得る。例えば少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の均質性を有する３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体の群。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体中の第１、第２、第３、第４、第５、または第６のポリペプチド（例えば、図１のポリペプチド１０２、１１２、および１１４、図２の２０２、２１４、２１６、および２１８、図３の３０２、３２０、および３２２、図４の４０２、４２８、４３０、および４３２、図５の５０２、５２４、および５２６、図６の６０２、６３２、６３４、および６３６、図７の７０２、７０８、７２２、および７２４、図８の８０２、８０４、８２６、および８２８、図９の９０２、９０４、９３４、および９３６、図１０の１００２、１０１０、１０１２、１０２４、１０２６、および１０３２、図１１の１１０２、１１０４、１１０６、１１４４、１１４６、および１１４８、図１２の１２０２、１２０４、１２０６、１２５２、１２５４、および１２５６、図１３の１３０２、１３０６、１３２０、および１３２４、図１４の１４０２、１４０４、１４２６、および１４２８、図１５の１５０２、１５０４、１５３４、および１５３６、図１６の１６０２、１６０６、１６０８、１６２６、１６２８、および１６３２、図１７の１７０２、１７０４、１７０６、１７４４、１７４６、および１７４８、図１８の１８０２、１８０４、１８０６、１８５２、１８５４、および１８５６、図１９の１９０２、１９０６、１９１０、１９２４、１９２８、および１９３２、図２０の２００２、２００４、２００６、２０４４、２０４６、および２０４８、図２１の２１０２、２１０４、２１０６、２１５２、２１５４、および２１５６）のうちの１つ以上のＮ末端Ａｓｐは、Ｇｌｎに変異し得る。
【０２８７】
本明細書の実施例に記載の例示的なＦｃ抗原結合ドメイン構築体について、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１〜２１は、それぞれ、ノブおよびホールサブユニットにＥ３５７ＫとＫ３７０Ｄの電荷対を含み得る。
【０２８８】
本明細書に記載される例示的Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１〜２１）のうちのいずれか１つは、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一ＦｃドメインおよびＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能を強化することができるか、または単一ＦｃドメインおよびＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含み得る。
【０２８９】
ＩＸ．宿主細胞およびタンパク質の産生
本開示では、宿主細胞は、本明細書に記載のポリペプチドまたは構築体を、それらの対応する核酸から発現するのに必要であるような、例えばオルガネラである、必要な細胞成分を含むビヒクルを指す。核酸は、この技術分野で既知の従来の技術（形質転換、トランスフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、直接の微量注入など）によって宿主細胞内に導入されることが可能である核酸ベクター中に含まれ得る。宿主細胞は、哺乳動物起源、細菌起源、真菌起源または虫起源のものとすることが可能である。哺乳動物宿主細胞には、ＣＨＯ（またはＣＨＯ誘導細胞株、例えばＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＸＢ１１  ＣＨＯ−ＤＧ４４）、マウス宿主細胞（例えば、ＮＳ０、Ｓｐ２／０）、ＶＥＲＹ、ＨＥＫ（例えば、ＨＥＫ２９３）、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＭＤＣＫ、２９３、３Ｔ３、Ｗ１３８、ＢＴ４８３、Ｈｓ５７８Ｔ、ＨＴＢ２、ＢＴ２０およびＴ４７Ｄ、ＣＲＬ７Ｏ３ＯならびにＨｓＳ７８Ｂｓｔの細胞が含まれるが、これらに限定されない。また、タンパク質構築体の発現を調節する、または所望の特定の手法でタンパク質産物を修飾およびプロセシングする、宿主細胞を選択することが可能である。様々な宿主細胞が、タンパク質産物の翻訳後プロセシングおよび修飾に関する特性および特異的な機序を有する。適切な株化細胞または宿主系を選択して、発現されたタンパク質の正確な修飾およびプロセシングを確実にすることが可能である。
【０２９０】
タンパク質産物の、それらの対応するＤＮＡプラスミド構築体からの発現および分泌のために、宿主細胞が、プロモータ、エンハンサー、配列、転写ターミネーター、ポリアデニル化部位および選択可能な標識を含む、この技術分野で既知である適切な発現制御要素によって制御されるＤＮＡで、トランスフェクトまたは形質転換され得る。治療用タンパク質の発現方法は、この技術分野で既知である。例えば、Ｐａｕｌｉｎａ  Ｂａｌｂａｓ，Ａｒｇｅｌｉａ  Ｌｏｒｅｎｃｅ（ｅｄｓ．）Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ｒｅｖｉｅｗｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ），Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ  ｅｄ．２００４  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｌｙ  ２０，２００４）、Ｖｌａｄｉｍｉｒ  Ｖｏｙｎｏｖ  ａｎｄ  Ｊｕｓｔｉｎ  Ａ．Ｃａｒａｖｅｌｌａ（ｅｄｓ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；２ｎｄ  ｅｄ．２０１２  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｕｎｅ  ２８，２０１２）を参照されたい。
【０２９１】
Ｘ．脱フコシル化
各Ｆｃ単量体は、Ａｓｎ  ２９７においてＮグリコシル化部位を含む。グリカンは、所与のＦｃ単量体上で多数の異なる形態では存在し得る。本明細書に記載される抗体または抗原結合Ｆｃ構築体を含有する組成物において、グリカンは、非常に異種であり得、存在するグリカンの性質は、数ある中でも、抗体または抗原結合Ｆｃ構築体を産生するために使用される細胞の種類、細胞の増殖条件（増殖培地を含む）、および産生後の精製によって決まり得る。種々の場合において、本明細書に記載される構築体を含有する組成物は、少なくともある程度まで脱フコシル化される。例えば、組成物中に存在するグリカン（例えば、Ｆｃグリカン）の少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％が、フコース残基を欠いている。したがって、グリカンの５％〜６０％、５％〜５０％、５％〜４０％、１０％〜５０％、１０％〜５０％、１０％〜４０％、２０％〜５０％、または２０％〜４０％が、フコース残基を欠いている。少なくともある程度まで脱フコシル化される組成物は、１，３，４−トリ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−２−フルオロ−Ｌ−フコース阻害剤の存在下で抗体を産生する細胞を培養することによって産生され得る。本明細書に記載される構築体およびポリペプチドの比較的脱フコシル化された形態は、ＦＵＴ８の発現が低減されたか、または発現しない細胞で発現すること、およびベータ−１，４−マンノシル−糖タンパク質４−ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミン転移酵素（ＧｎＴ−ＩＩＩ）を過剰発現する細胞で発現することを含む、種々の他の方法を使用して産生され得る。
【０２９２】
ＸＩ．精製
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、タンパク質精製分野において既知の任意の方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー（例えばプロテインＡアフィニティー）およびサイズ排除カラムクロマトグラフィー）、遠心分離、溶解度差、またはタンパク質の精製に関するその他の標準技術によって、精製することが可能である。例えば、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、プロテインＡカラムなどのアフィニティーカラムを、適切に選択し、クロマトグラフィーカラム、濾過、限外濾過、塩析および透析手順と組み合わせることとによって、単離および精製することが可能である（例えば、Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｓｃａｌｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ｕｗｅ  Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ（ｅｄ．）Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，２００９、およびＳｕｂｒａｍａｎｉａｎ（ｅｄ．）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ−Ｖｏｌｕｍｅ  Ｉ−Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ／Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（２００４）を参照）。
【０２９３】
いくつかの事例では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、１つ以上の精製用ペプチドに連結して、例えば全細胞溶解混合物からの、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の精製および単離を促進することが可能である。いくつかの実施形態では、精製用ペプチドは、精製用ペプチドに対して特異的な親和性を有する別の部分と結合する。いくつかの実施形態では、精製用ペプチドと特異的に結合するこうした部分は、基剤、樹脂またはアガロースビーズなどの固相支持体に付加する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に結合され得る精製用ペプチドの例としては、ヘキサヒスチジンペプチド、ＦＬＡＧペプチド、ｍｙｃペプチドおよび赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ヘキサヒスチジンペプチド（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３８））は、マイクロモル親和性をもつニッケル官能性アガロースアフィニティーカラムと結合する。いくつかの実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３９）を含む。いくつかの実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、直列にした、整数倍にした配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ、例えば３×ＤＹＫＤＤＤＤＫを含む。いくつかの実施形態では、ｍｙｃペプチドは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号４０）を含む。いくつかの実施形態では、ｍｙｃペプチドは、直列にした、整数倍にした配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ、例えば３×ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬを含む。いくつかの実施形態では、ＨＡペプチドは、配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４１）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡペプチドは、直列にした、整数倍にした配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ、例えば３×ＹＰＹＤＶＰＤＹＡを含む。ＦＬＡＧ、ｍｙｃまたはＨＡの精製用ペプチドに対して特異的に認識かつ結合する抗体は、この技術分野で周知であり、しばしば市販されている。これらの抗体により機能化された固相支持体（例えば、基剤、樹脂またはアガロースビーズ）を用いて、ＦＬＡＧ、ｍｙｃまたはＨＡペプチドを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することができる。
【０２９４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に関し、精製方法としてプロテインＡカラムクロマトグラフィーを採用することができる。プロテインＡリガンドは、Ｆｃ領域を介してＦｃ抗原結合ドメイン構築体と相互作用する。このために、プロテインＡクロマトグラフィーは、大半の宿主細胞タンパク質を除去することができる高度に選択的な捕捉方法となる。本開示では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、実施例２に記載されるようにプロテインＡカラムクロマトグラフィーを使用して精製され得る。
【０２９５】
ＸＩＩ．薬学的組成物／製剤
本開示は、本明細書に記載の１つ以上のＦｃ抗原結合ドメイン構築体を含む薬学的組成物を特徴とする。一実施形態では、薬学的組成物は、構造が同一または実質的に同一であるＦｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な群を含む。様々な例において、薬学的組成物は、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１〜４２のいずれか１つの実質的に均質な群を含む。
【０２９６】
例えば本明細書に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体（例えば、３つのＦｃドメインを有するＦｃ抗原結合ドメイン構築体）などの本開示の治療用タンパク質構築体を、薬学的組成物内に組み込むことが可能である。治療用タンパク質を含む薬学的組成物は、当業者に既知である方法によって調製することが可能である。薬学的組成物は、水または他の薬剤的に許容される液体の滅菌溶液または懸濁液を含む注射製剤で非経口投与することが可能である。例えば薬学的組成物は、注射用蒸留水（ＷＦＩ）、生理食塩水、乳化剤、懸濁剤、サーファクタント、安定剤、希釈剤、結合剤、賦形剤などの薬剤的に許容されるビヒクルまたは溶媒とＦｃ抗原結合ドメイン構築体とを好適に組み合わせて、次いで通常許容される薬務で求められる単位用量形態で混合することによって、調製することが可能である。薬学的製剤に含まれる活性成分の量は、指定される範囲内で好適な用量が与えられるようなものとする。
【０２９７】
注射用の滅菌組成物は、従来の薬務に従って、担体として注射用蒸留水を用いて調製することが可能である。例えば、グルコースと、Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール、塩化ナトリウムなどの他の添加とを含有する生理食塩水または等張液を、任意選択的に、好適な可溶化剤、例えばこの技術分野で通常知られる、エタノールなどのアルコールおよびプロピレングリコールまたはポリエチレングリコールなどのポリアルコール、およびポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０などの非イオン性界面活性剤と組み合わせて、注射用水溶液として用いることができる。治療用タンパク質産物の調製方法は、この技術分野で既知であり、例えば、Ｂａｎｇａ（ｅｄ．）Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ａｎｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（２ｄ  ｅｄ．）Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ  Ｇｒｏｕｐ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００６）を参照されたい。
【０２９８】
ＸＩＩＩ．使用法および投薬量
本明細書に記載される構築体は、ＣＴＬＡ４を標的とし、ＣＴＬＡ４に標的化された抗体により治療される障害を治療するために使用され得る。構築体は、例えば、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、頭頚部癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、中皮腫、尿路上皮癌、尿路上皮癌、膠芽腫、卵巣癌、前立腺癌、高グレードの中枢神経系悪性腫瘍、肝臓癌、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫を治療するのに有用であり得る。
【０２９９】
薬学的組成物は、投与形態と互換性のある手法で、治療効果があるような量で投与されて、症状の改善または治療をもたらす。薬学的組成物は、例えば静脈内投与形態、皮下投与形態、摂取可能な溶液、薬剤放出カプセルなどの経口投与形態である、種々の投与形態で投与される。個々の対象に適切な用量は、治療目的、投与経路、および患者の状態に依存する。概して、組換えタンパク質は、１〜２００ｍｇ／ｋｇ、例えば１〜１００ｍｇ／ｋｇ、例えば２０〜１００ｍｇ／ｋｇで投与される。したがって、最適な治療効果を得るために求められるとおりに、医療提供者が、用量を誂えて、決定し（ｔｉｔｅｒ）、投与経路を調整することが必要となる。
【０３００】
ヒトの治療に加えて、構築体は、イヌおよびネコなどのコンパニオンアニマル、ならびに他の獣医学的対象を治療するために使用され得る。
【０３０１】
ＸＩＶ．補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）
本開示に記載されるＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、様々なＦｃ受容体介在性エフェクター機能を活性化することができる。免疫系の構成要素の１つは、補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）システムである。これは自然免疫系の一部であり、抗体と貪食細胞の能力を強化し、外来性病原体を除去する。古典的補体経路、副補体経路、そしてレクチン経路の３つの生化学的経路が、補体系を活性化する。それら経路すべてが、複雑な活性化とシグナル伝達カスケードのセットを伴っている。
【０３０２】
古典的補体経路では、ＩｇＧまたはＩｇＭが補体活性化のトリガーを引く。抗原に抗体が結合した後、それら抗体にＣ１ｑタンパク質が結合し、Ｃ１複合体を形成させる。この複合体がＣ１ｓエステラーゼを生成し、これがＣ４およびＣ２タンパク質を、Ｃ４ａとＣ４ｂ、およびＣ２ａとＣ２ｂに切断して、活性化する。次いで、Ｃ２ａ断片とＣ４ｂ断片が、Ｃ３転換酵素と呼ばれるタンパク質複合体を形成し、Ｃ３をＣ３ａとＣ３ｂに切断して、シグナルを増幅させ、膜侵襲複合体を形成させる。
【０３０３】
本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、免疫系によるＣＤＣ活性を強化することができる。
【０３０４】
ＣＤＣは、細胞（例えば、Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ）またはＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４）が連続希釈された抗体、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体、またはＩＶＩｇでコーティングされる比色分析アッセイを使用することによって評価され得る。すべてのウェルにヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ社）を２５％ｖ／ｖで添加し、３７℃で２時間インキュベートしてもよい。細胞を、ＷＳＴ−１細胞増殖試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ社）を添加した後で、３７℃で１２時間インキュベートしてもよい。次いでプレートを振とう機に２分間置き、４５０ｎｍの吸光度を測定してもよい。
【０３０５】
ＸＶ．抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）
本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を強化することもできる。ＡＤＣＣは能動免疫系の一部であり、抗体は外来病原体の表面抗原に結合し、それらを死に至らしめる。ＡＤＣＣには、抗体によるナチュラルキラー（ＮＫ）細胞の活性化が含まれる。ＮＫ細胞はＦｃ受容体を発現し、これが例えばＩｇＧおよびＩｇＭなどの抗体のＦｃ部分に結合する。抗体が病原体に感染した標的細胞の表面に結合すると、その後に引き続いてＮＫ細胞に結合し、活性化させる。ＮＫ細胞は、例えばＩＦＮ−γなどのサイトカイン、例えばパーフォリンおよびグランザイムなどのタンパク質を放出する。パーフォリンは、カルシウムの存在下で多量体形成する孔形成サイトリシンである。グランザイムは、標的細胞中でプログラム化細胞死を誘導するセリンプロテアーゼである。ＮＫ細胞に加えて、マクロファージ、好中球、および好酸球もＡＤＣＣを介在することができる。
【０３０６】
ＡＤＣＣは、発光アッセイを使用して評価してもよい。ヒト初代ＮＫエフェクター細胞（Ｈｅｍａｃａｒｅ社）を溶解させ、５ｘ１０５／ｍＬで、リンパ球増殖培地−３（Ｌｏｎｚａ社）中、３７℃で一晩、そのままの状態にさせておく。次の日、ヒトリンパ芽球様細胞株（例えば、Ｒａｊｉ標的細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８６）またはＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４）を回収し、アッセイ培地（フェノールレッドフリーのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳΔ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））中に再懸濁させ、様々な濃度の対象の各プローブの存在下で３０分間、３７℃で播種する。次いで休ませたＮＫ細胞を回収し、アッセイ培地中に再懸濁させ、抗体でコーティングされた細胞、例えば、抗ＣＤ２０でコーティングされたＲａｊｉ細胞または抗ＣＴＬＡ４でコーティングされたＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４細胞を含むプレートに添加する。エフェクター細胞と標的細胞の最終比率を５：１（５ｘ１０４ＮＫ細胞：１ｘ１０４  Ｒａｊｉ細胞）として、３７℃で６時間、プレートをインキュベートする。
【０３０７】
ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）細胞傷害アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を使用して、ＡＤＣＣ活性を決定する。ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）アッセイは、発光性ペプチド基質を使用して、膜の完全性が失われた細胞、例えば、溶解したＲａｊｉ細胞またはＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４によって放出される死細胞プロテアーゼ活性を測定する。６時間のインキュベーション期間後、調製された試薬（基質）をプレートの各ウェルに加え、室温で１５分間オービタルプレート振盪機上に置く。発光は、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  Ｆ５プレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ社）を使用して測定される。データは、対照条件（ＮＫ細胞＋Ｒａｊｉ（またはＨＥＫ−ＣＴＬＡ４）のみ）からの読取値を、試験条件からの読み取り値から差し引いて、バックグラウンドを除去した後に分析される。
【０３０８】
ＸＶＩ．抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）
本開示のＦｃ抗原結合ドメイン構築体は、免疫系による抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性を強化することもできる。ＡＤＣＰは抗体オプソニン化としても知られており、このプロセスによって、病原体は、貪食細胞による摂食と除去の目印を付けられる。貪食細胞は、有害な外来病原体と、死んだ細胞または死にゆく細胞を摂食することによって身体を保護する細胞である。このプロセスは、病原体関連分子パターン（ＰＡＭＰＳ）によって活性化され、ＮＦ−κＢの活性化へと繋がっていく。次いで例えばＣ３ｂと抗体などのオプソニンが標的病原体に付加され得る。標的がオプソニンでコーティングされると、Ｆｃドメインは、そのＦｃ受容体を介して貪食細胞を引き付ける。次いで貪食細胞がその細胞を包み込み、摂食された物質のファゴソームが、リソソームと融合する。次いで、結果としてできたファゴリソソームが、細胞物質をタンパク質分解的に消化する。
【０３０９】
ＡＤＣＰは、生物発光アッセイを使用して評価してもよい。抗体依存性細胞介在性貪食（ＡＤＣＰ）は、治療用抗体の重要な作用機序である。ＡＤＣＰは、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、およびＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）を介して、単球、マクロファージ、好中球および樹状細胞により介在されることができる。３つすべての受容体が、ＡＤＣＰを生じさせる抗体認識、免疫受容体のクラスタリングおよびシグナル伝達事象に関与し得る。しかし、阻害実験から、ＦｃγＲＩＩａがこのプロセスに関与する主要Ｆｃγ受容体であることが示唆されている。
【０３１０】
ＦｃγＲＩＩａ−Ｈ  ＡＤＣＰレポーターバイオアッセイは、生物発光細胞系アッセイであり、これを使用して、ＦｃγＲＩＩａに特異的に結合および活性化する抗体、ならびにＦｃドメインを有する他の生物物質の有効性と安定性を測定することができる。アッセイは、アミノ酸１３１位でヒスチジン（Ｈ）を含む低アフィニティーヒトＦｃγＲＩＩａ−Ｈバリアント、およびＮＦＡＴ−応答要素（ＮＦＡＴ−ＲＥ）により駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株からなる。
【０３１１】
標的細胞および関連抗体と共培養したとき、抗体のＦｃドメインは、ＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞と結合し、ＦｃγＲＩＩａシグナル伝達およびＮＦＡＴ−ＲＥ−媒介性ルシフェラーゼ活性が生じる。生物発光シグナルを検出し、ルシフェラーゼアッセイおよび標準光度計を用いて定量する。
【実施例】
【０３１２】
以下の実施例は、本明細書において特許請求される方法および化合物をどのように実施するか、作製するか、そして評価するかについて、当分野の当業者に完全な開示と解説を提供する目的で提示されており、本発明者らが、その開示とみなす範囲を限定する意図はない。
【０３１３】
実施例１．ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体７の設計および精製
タンパク質発現
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、フォールディング効率を増加させ、望ましくない高分子量オリゴマーおよび多量体を生成し得るサブユニットの非制御会合を最小限に抑え、実質的に均質な（例えば、少なくとも８５％、９０％、９５％、９８％、または９９％均質な）薬学的用組成物を生成するように設計される。これら目標を念頭に、分岐点がＮ末端Ｆｃドメインにある単独で分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製した。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体７（ＣＴＬＡ−４）は、各々、２つの別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＴＬＡ−４長鎖Ｆｃ（配列番号ＺＺ１）の２つのコピーおよび短鎖Ｆｃ（配列番号ＺＺ２）の２つのコピー）と、抗ＣＴＬＡ−４軽鎖ポリペプチド（配列番号ＺＺ３）の２つのコピーとを含む。長鎖Ｆｃは、Ｅ３５７Ｋ電荷変異ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体を、電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）Ｆｃドメイン単量体（ホモ二量体化を促進する）と、抗ＣＴＬＡ−４  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）とともに直列で連続してＮ末端で含む（構築体７（ＣＴＬＡ−４））。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄ電荷変異、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進するため）を含有する。抗ＣＴＬＡ−４軽鎖はまた、ｓｃＦｖの一部として長鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現される得る。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。表５のアミノ酸配列は、３つの別個のプラスミド（１つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは短鎖Ｆｃをコードする）によりコードされた。
【０３１４】
（表５）構築体７（ＣＴＬＡ−４）配列
2021532085.tif 000055
【０３１５】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製した。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３）で溶出した。溶出液を１Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）の添加によって素早く中和し、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過した。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取した。カラムを５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６）（緩衝液Ａ）で予め平衡化し、試料を、５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６）（緩衝液Ｂ）を溶出緩衝液として使用した段階勾配で溶出した。イオン交換後、標的画分を、接線流濾過システム上で１０ｋＤａカットオフポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用してＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換した。試料をおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過した。
【０３１６】
非還元ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
試料を、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で、９５℃で１０分間変性させた。試料を、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で泳動させた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。
【０３１７】
実施例２．ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体１３の設計および精製
タンパク質発現
分岐点がＣ末端Ｆｃドメインにある単独で分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製した。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１３（ＣＴＬＡ−４）は、各々、２つの別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＴＬＡ−４長鎖Ｆｃの２つのコピー（配列番号ＺＺのいずれか１つ、および短鎖Ｆｃ（配列番号ＺＺ）の２つのコピー）と、抗ＣＴＬＡ−４軽鎖ポリペプチド（配列番号ＺＺ）の２つのコピーとを含む。長鎖Ｆｃは、電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）Ｆｃドメイン単量体（ホモ二量体化を促進する）を、Ｅ３５７Ｋ電荷変異ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体とともに、直列に連続して含み、Ｎ末端で抗ＣＴＬＡ−４  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体１３（ＣＴＬＡ−４））を含む。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄ電荷変異、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進するため）を含有する。抗ＣＴＬＡ−４軽鎖ならびに抗ＣＴＬＡ−４  ＶＨおよびＣＨ１は、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂから取られる。ＣＴＬＡ−４軽鎖はまた、ｓｃＦｖの一部として長鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現され得る。他の型の構築体１３は、抗ＣＴＬＡ−４重鎖とともに作製され得、各型は、長鎖Ｆｃポリペプチド中のＦｃドメイン単量体間に異なる大きさのグリシンスペーサー（Ｇ４、Ｇ１０、Ｇ１５、またはＧ２０リンカー）を保有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。以下の構築体の各々のアミノ酸配列は、３つの別個のプラスミド（１つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは短鎖Ｆｃをコードする）によりコードされた。
【０３１８】
（表６）構築体１３（ＣＴＬＡ−４）配列
2021532085.tif 000056
2021532085.tif 000057
【０３１９】
実施例３．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された非分岐構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１（図１）は、２つの別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃおよび短鎖Ｆｃの２つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、直列に連続して２つのＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含み、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）（ヘテロ二量体化を促進する）を導入することによって作製される改変された突起を有する。ＣＴＬＡ−４結合ドメインは、長鎖Ｆｃと同じアミノ酸配列の一部として発現されてもよい（例えば、ｓｃＦｖを形成するため）。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）（ヘテロ二量体化を促進する）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体を含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。本実施例では、かつＦｃ抗原結合ドメイン構築体２〜４２についての以下の実施例の各々では、細胞は、抗体可変軽鎖を発現する第３のプラスミドを含有し得る。
【０３２０】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製する。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離させる。溶出液を１Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）の添加によって素早く中和し、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過する。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取する。カラムを５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６）（緩衝液Ａ）で予め平衡化し、試料を、５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６）（緩衝液Ｂ）を溶出緩衝液として使用した段階勾配で溶出する。イオン交換後、標的画分を、接線流濾過システム上で１０ｋＤａカットオフポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用してＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換する。試料をおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過する。
【０３２１】
試料を、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で、９５℃で１０分間変性させた。試料を、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で泳動させる。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクマシーブルー染色で可視化する。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化する。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行う。
【０３２２】
実施例４．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された非分岐構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２（図２）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃおよび短鎖Ｆｃの３つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインと直列に連続して３つのＦｃドメイン単量体を含み、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体を含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３２３】
実施例５．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体３（図３）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃおよび短鎖Ｆｃの２つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、直列に連続して２つのＦｃドメイン単量体を含み、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３２４】
実施例６．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４（図４）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃおよび短鎖Ｆｃの３つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、直列に連続して３つのＦｃドメイン単量体を含み、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３２５】
実施例７．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体５の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体５（図５）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃおよび短鎖Ｆｃの２つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインと直列に連続して２つのＦｃドメイン単量体を含み、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３２６】
実施例８．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体６の設計および精製
非対称直列Ｆｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体６（図６）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃおよび短鎖Ｆｃの３つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインと直列に連続して３つのＦｃドメイン単量体を含み、各Ｆｃドメイン単量体は、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３２７】
実施例９．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体７の設計および精製
分岐点がＮ末端Ｆｃドメインにある単独で分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製した。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体７（図７）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの２つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４Ａおよび４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体と直列に連続して、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体を含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３２８】
実施例１０．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体８の設計および精製
分岐点がＮ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体８（図８）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの２つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４Ａおよび４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体と直列に連続して、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有するＦｃドメイン単量体を含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３２９】
実施例１１．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体９の設計および精製
分岐点がＮ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体９（図９）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの２つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４Ａおよび４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体と直列に連続して、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３３０】
実施例１２．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１０の設計および精製
分岐点がＮ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体は、以下に記載されるように作製される。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１０（図１０）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの４つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、直列に連続して２つのＦｃドメイン単量体およびＮ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインを含み、各Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体と直列に連続して、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体を含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３３１】
実施例１３．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１１の設計および精製
分岐点がＮ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１１（図１１）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの４つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、直列に連続して２つのＦｃドメイン単量体を含み、各Ｆｃドメイン単量体は、Ｎ末端で、表４Ａおよび４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体と直列に連続して、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、ならびに任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、抗原結合ドメインとをＮ末端で含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３３２】
実施例１４．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１２の設計および精製
分岐点がＮ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１２（図１２）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの４つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、直列に連続して２つのＦｃドメイン単量体およびＮ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインを含み、各Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体と直列に連続して、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、ならびに任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体と、抗原結合ドメインとをＮ末端で含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３３３】
実施例１５．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１３の設計および精製
分岐点がＣ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１３（図１３）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの２つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有するＦｃドメイン単量体と直列に連続して、表４Ａまたは４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体を含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３３４】
実施例１６．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１４の設計および精製
分岐点がＣ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１４（図１４）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの２つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、Ｎ末端で、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有するＦｃドメイン単量体と直列に連続して、表４Ａまたは４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体を含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３３５】
実施例１７．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１５の設計および精製
分岐点がＣ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１５（図１５）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの２つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有するＦｃドメイン単量体と直列に連続して、表４Ａまたは４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３３６】
実施例１８．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１６の設計および精製
分岐点がＣ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１６（図１６）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの４つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、各々が表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する、２つのＦｃドメイン単量体と直列に連続して、表４Ａまたは４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体を含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３３７】
実施例１９．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１７の設計および精製
分岐点がＣ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１７（図１７）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの４つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、Ｎ末端で、各々が表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する、２つのＦｃドメイン単量体と直列に連続して、表４Ａまたは４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体を含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３３８】
実施例２０．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１８の設計および精製
分岐点がＣ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１８（図１８）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの４つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、各々が表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する、２つのＦｃドメイン単量体と直列に連続して、表４Ａまたは４Ｂから選択される逆電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦＣドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３３９】
実施例２１．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１９の設計および精製
分岐点がＮ末端またはＣ末端Ｆｃドメインのいずれにもない、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１９（図１９）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの４つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４Ａまたは４Ｂから選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、ならびに表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する別のＦｃドメイン単量体とともに直列に連続して、少なくとも１つの表３から選択される突起形成変異（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、ならびに任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することにより作製される改変空洞を有するＦｃドメイン単量体を含有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３４０】
実施例２２．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２０の設計および精製
分岐点がＣ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２０（図２０）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの４つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４Ａまたは４Ｂから選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、ならびに表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する別のＦｃドメイン単量体とともに直列に連続して、少なくとも１つの表３から選択される突起形成変異（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有するＦｃドメイン単量体をＮ末端で含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３４１】
実施例２３．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２１の設計および精製
分岐点がＣ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体２１（図２１）は、２つの別個のＦｃ単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃの２つのコピーおよび短鎖Ｆｃの４つのコピー）および軽鎖ポリペプチドを含有する。長鎖Ｆｃは、表４Ａまたは４Ｂから選択される逆電荷変異（例えば、Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）を有するＦｃドメイン単量体、表３から選択される少なくとも１つの突起形成変異（例えば、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａおよび４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有する別のＦｃドメイン単量体とともに直列に連続して、少なくとも１つの表３から選択される突起形成変異（例えばＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｅ３５７Ｋ）を導入することによって作製される改変された突起を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。短鎖Ｆｃは、表３から選択される少なくとも１つの空洞形成変異（例えば、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ変異）、および任意選択的に表４Ａまたは４Ｂから選択される１つ以上の逆電荷変異（例えば、Ｋ３７０Ｄ）を導入することによって作製される改変された空洞を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端でＣＴＬＡ−４結合ドメインとを含む。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。短鎖Ｆｃおよび長鎖Ｆｃのアミノ酸配列は、２つの別個のプラスミドによってコードされる。発現されたタンパク質は、実施例３にあるように精製される。
【０３４２】
実施例２４．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体によるＣＤＣ、ＡＤＣＰ、およびＡＤＣＣの活性化
親ｍＡｂおよび様々なＦｃ抗原結合ドメイン構築体によるＣＤＣ、ＡＤＣＰ、およびＡＤＣＣ経路の活性化を試験するために３つのアッセイを使用した。抗ＣＤ２０モノクローナル抗体であるＧａｚｙｖａ（オビヌツズマブ）由来のＣＤＲを含有する４つの構築体を作製した。フコシル化ｍＡｂおよび脱フコシル化ｍＡｂの両方を作製し、Ｓ３Ｙ（実施例２に記載の構築体１３の構造、図１３）およびＳＡＩ（実施例１に記載の構築体７の構造、図７）Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体も作製した。ＣＤＣアッセイを以下のとおり行った。
１．抗ＣＤ２０  ＣＤＣアッセイで使用される標的細胞は、Ｒａｊｉリンパ芽球様ヒトＢ細胞株（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８６）である。Ｒａｊｉ細胞を遠心分離により懸濁培養液から除去し、６×１０５細胞／ｍＬでＸ−ＶＩＶＯ  １５培地中に再懸濁した。
２．Ｒａｊｉ細胞を、１ウェル当たり１００μＬ（６×１０４細胞／ウェル）の体積で９６ウェル平底アッセイプレートに移した。
３．抗ＣＤ２０モノクローナル抗体（ｍＡｂ）およびＦｃ構築体の各々を、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５培地中で３．３３μＭに希釈した。次いで、１．５ｍｌポリプロピレンチューブ中で、抗ＣＤ２０  ｍＡｂおよびＦｃ構築体の各々を用いて、連続１：３希釈を行い、１１点の希釈シリーズを得た。
４．抗ＣＤ２０  ｍＡｂおよびＦｃ構築体の各希釈を、アッセイプレート中の適切なウェルに、５０μｌ／ウェルで移した。
５．抗ＣＤ２０  ｍＡｂおよびＦｃ構築体を移した後ただちに、５０μｌの正常なヒト血清補体をアッセイプレート中の各ウェルに移した。
６．アッセイプレートを３７℃および５％ＣＯ２で２時間インキュベートした。
７．２時間インキュベーションした後、２０μＬのＷＳＴ−１増殖試薬をアッセイプレートの各ウェルに添加した。
８．プレートを３７℃および５％ＣＯ２のインキュベーターに１４時間戻した。
９．１４時間のインキュベーション後、プレートを、プレート振盪器上で１分間振盪し、分光光度計を使用して、６００ｎｍの補正を用いて、４５０ｎｍで直ちにウェルの吸光度を決定した。
標的細胞がＲａｊｉ（図２２、左のパネル）であるＣＤＣアッセイにおいて、Ｓ３Ｙ（構築体１３（ＣＤ２０））構築体は、細胞傷害を介在することができたが、他の構築体は介在しなかった。
【０３４３】
ＡＤＣＰアッセイを以下のとおり行った。
ＦｃγＲＩＩａ−Ｈ  ＡＤＣＰレポーターバイオアッセイコンプリートキット（Ｐｒｏｍｅｇａカタログ番号Ｇ９９０１）は、ＦｃγＲＩＩａに特異的に結合して活性化するＦｃドメインを有する抗体および他の生物学的物質の効力および安定性を測定するために使用され得る細胞ベースの生物発光アッセイである。このアッセイは、アミノ酸１３１位にヒスチジン（Ｈ）を含有する高親和性ヒトＦｃｇＲＩＩａ−ＨバリアントおよびＮＦＡＴ−応答要素（ＮＦＡＴ−ＲＥ）によって駆動されるルシフェラーゼレポーターを発現する遺伝子改変Ｊｕｒｋａｔ  Ｔ細胞株からなる。標的細胞および関連抗体と共培養されると、ＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞はその抗体のＦｃドメインに結合し、ＦｃγＲＩＩａのシグナル伝達およびＮＦＡＴ−ＲＥ媒介性ルシフェラーゼ活性がもたらされる。生体発光シグナル信号を検出し、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムおよび標準蛍光度計を使用して定量した。抗ＣＤ２０  ＡｂおよびＦｃ構築体（構築体７（ＣＤ２０）または構築体１３（ＣＤ２０））の濃度を上げてＲａｊｉ（ＣＤ２０＋）標的細胞およびＦｃと共にインキュベートした。抗ＣＤ２０  ＡｂおよびＦｃ構築体の濃度を上げて、図４７の真ん中のパネルで指定される濃度で、Ｒａｊｉ（ＣＤ２０＋）標的細胞およびＦｃγＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞とともにインキュベートした（２：１  Ｅ：Ｔ比。およそ３５，０００個のエフェクター細胞：１５，０００個の標的細胞）。３７℃で６時間インキュベーションを継続した。Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）。試薬を添加し、発光をＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ計器で測定した。データは、図２２の中央のパネルにおいて指定された濃度のＲＩＩａ−Ｈエフェクター細胞（２：１  Ｅ：Ｔ比、およそ３５，０００個のエフェクター細胞：１５，０００個の標的細胞）、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して４ＰＬ曲線に適合させた。３７℃で６時間インキュベーションを継続した。Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）試薬を添加し、発光をＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ計器で測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、データを４ＰＬ曲線に適合させた（図２２、中央のパネル）。ＳＡＩ構築体（構築体７（ＣＤ２０））およびＳ３Ｙ構築体（構築体１３（ＣＤ２０））の両方が、ｍＡｂと比較して１００倍超増強された効力を示した。
【０３４４】
ＡＤＣＣアッセイを以下のとおり行った。
ヒト初代ＮＫエフェクター細胞（Ｈｅｍａｃａｒｅ）を解凍し、５×１０５／ｍＬでリンパ球増殖培地−３（Ｌｏｎｚａ）中３７℃で一晩静止させた。翌日、ヒトリンパ芽球様細胞株Ｒａｊｉ標的細胞（ＡＴＣＣ  ＣＣＬ−８６）を収集し、アッセイ培地（フェノールレッドフリーのＲＰＭＩ、１０％ＦＢＳΔ、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標））中に再懸濁し、様々な濃度の目的とする各プローブの存在下で、３７℃で３０分間プレーティングした。その後、静止させたＮＫ細胞を収集し、アッセイ培地中に再懸濁し、抗ＣＤ２０コーティングＲａｊｉ細胞を含有するプレートに添加した。プレートを、最終比率５：１のエフェクター細胞：標的細胞（５×１０４ＮＫ細胞：１×１０４Ｒａｊｉ細胞）で、３７℃で６時間インキュベートした。
【０３４５】
ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）細胞傷害性アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、ＡＤＣＣ活性を決定した。ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ（商標）アッセイは、発光性ペプチド基質を使用して、膜の完全性が失われた細胞、例えば溶解したＲａｊｉ細胞によって放出される死細胞プロテアーゼ活性を測定する。６時間のインキュベーション期間後、調製された試薬（基質）をプレートの各ウェルに添加し、オービタルプレート振盪機上に室温で１５分間置いた。発光を、ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  Ｆ５プレートリーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を使用して測定した。データを、対照条件（ＮＫ細胞＋Ｒａｊｉのみ）からの読み取り値を試験条件からの読み取り値から差し引いて、バックグラウンドを除去した後に分析した。（図２２、右のパネル）。ＳＡＩ構築体（構築体７（ＣＤ２０））およびＳ３Ｙ構築体（構築体１３（ＣＤ２０））の両方が、フコシル化ｍＡｂと比較して増強された細胞傷害性を示し、脱フコシル化ｍＡｂと同様の細胞傷害性を示した。
【０３４６】
実施例２５．Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を特徴解析するために使用される実験的アッセイ
ペプチドおよびグリコペプチドの液体クロマトグラフィー−ＭＳ／ＭＳ
タンパク質を、６Ｍのグアニジン（Ｓｉｇｍａ）中で１μｇ／μＬに希釈した。ジチオスレイトール（ＤＴＴ）を濃度１０ｍＭまで加えて、６５℃で３０分間、変性条件下でジスルフィド結合を減らした。氷冷後、サンプルを、暗闇中で１時間、３０ｍＭのヨードアセトアミド（ＩＡＭ）とともにインキュベートして、遊離チオールをアルキル化（カルバミドメチル化（ｃａｒｂａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌａｔｅ））した。その後タンパク質を、１０−ｋＤａ膜を介して２５ｍＭの炭酸水素アンモニウム緩衝液（ｐＨ７．８）中に透析し、ＩＡＭ、ＤＴＴおよびグアニジンを除去した。タンパク質は、Ｂａｒｏｃｙｃｌｅｒ（ＮＥＰ  ２３２０、Ｐｒｅｓｓｕｒｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）中で、トリプシンで消化した。圧力は、３７℃で、２０，０００ｐｓｉと周囲圧力との間を１時間に合計３０サイクルで循環させた。ペプチドのＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析は、Ｕｌｔｉｍａｔｅ  ３０００（Ｄｉｏｎｅｘ）クロマトグラフィーシステムとＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）質量分析計とで行った。ペプチドは、移動相として０．１％ＦＡ水溶液および０．１％ＦＡアセトニトリル溶液を用いて、ＢＥＨ  ＰｅｐＭａｐ（Ｗａｔｅｒｓ社）カラムで分離した。±１．５Ｄａの四重極分離幅（ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｗｉｄｔｈ）を有する二重荷電イオン（ｚ＝２）ｍ／ｚ  ８４２．５に基づいて、単独でキシロシル化されたリンカーペプチドを標的とした。
【０３４７】
インタクト質量分析
タンパク質を、７８．９８％水、２０％アセトニトリル、１％ギ酸（ＦＡ）、および０．０２％トリフルオロ酢酸からなる泳動緩衝液（ｒｕｎｎｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）中で２μｇ／μＬの濃度に希釈した。サイズ排除クロマトグラフィー分離を、直列に２．１×３５０ｍｍ、合計カラム長７００ｍｍの２つのＺｅｎｉｘ−Ｃ  ＳＥＣ−３００（Ｓｅｐａｘ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｎｅｗａｒｋ，ＤＥ）上で行った。タンパク質を、８０μＬ／分の流量で上述の泳動緩衝液を使用してＳＥＣカラムから溶出した。質量スペクトルを、ポジティブモードで動作させたＱＳＴＡＲ  Ｅｌｉｔｅ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）Ｑ−ＴｏＦ質量分光計で取得した。個々のサイズ画分下の中性質量を、クロマトグラフィーピークの全幅にわたるスペクトルを合計することによって、ベイズピークデコンボリューション（Ｂａｙｅｓｉａｎ  ｐｅａｋ  ｄｅｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎ）を使用してデコンボリュートした。
【０３４８】
キャピラリー電気泳動−ドデシル硫酸ナトリウム（ＣＥ−ＳＤＳ）アッセイ
サンプルを１ｍｇ／ｍＬに希釈して、ＨＴタンパク質発現変性緩衝液（ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ｄｅｎａｔｕｒｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ）（パーキンエルマー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）社）と混合した。混合物を４０℃で２０分間インキュベートした。サンプルを７０μＬの水で希釈して、９６ウェルプレートに移した。サンプルは、ＨＴ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＬａｂＣｈｉｐ（パーキンエルマー社）を備えたＣａｌｉｐｅｒ  ＧＸＩＩ機器（パーキンエルマー社）で分析した。蛍光強度を用いて、各サイズの変異体の相対存在度を計算した。
【０３４９】
非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ
試料を、Ｌａｅｍｍｌｉ試料緩衝液（４％ＳＤＳ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）中で、９５℃で１０分間変性させた。試料を、Ｃｒｉｔｅｒｉｏｎ  ＴＧＸ  ｓｔａｉｎ−ｆｒｅｅゲル（４〜１５％ポリアクリルアミド、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）上で泳動させた。タンパク質のバンドは、ＵＶ照射またはクマシーブルー染色で可視化した。ＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰイメージングシステム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）でゲルを画像化した。Ｉｍａｇｅｌａｂ  ４．０．１ソフトウェア（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を用いて、バンドの定量化を行った。
【０３５０】
実施例２６．ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体４の設計および精製
タンパク質発現
非対称直列Ｆｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体４（ＣＴＬＡ−４）はそれぞれ、２つの別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃ（配列番号６６）、および抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｃ鎖（配列番号６８）の３つのコピー）と、抗ＣＴＬＡ−４軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）の３つのコピーとを含む。長鎖Ｆｃは、直列に連続して３つのＦｃドメイン単量体を含有し、各Ｆｃドメイン単量体は、Ｅ３５７Ｋ電荷変異と、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体形成を促進するため）とを有する。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄ電荷変異ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの空洞形成変異（ヘテロ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端で抗ＣＴＬＡ−４  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体４（ＣＴＬＡ−４））とを含む。ＣＴＬＡ−４軽鎖はまた、ｓｃＦｖの一部として短鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現され得る。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。表７の各構築体の以下のアミノ酸配列は、３つの別個のプラスミド（１つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは長鎖Ｆｃをコードし、１つのプラスミドは短鎖Ｆｃ（抗ＣＴＬＡ−４）をコードする）によりコードされる。
【０３５１】
（表７）構築体４（ＣＴＬＡ４）配列
2021532085.tif 000058
【０３５２】
発現したタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用してプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより、細胞培養上清から精製する。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３）で溶出する。溶出液を１Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）の添加によって素早く中和し、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過する。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取する。カラムを５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６）（緩衝液Ａ）で予め平衡化し、試料を、５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６）（緩衝液Ｂ）を溶出緩衝液として使用した段階勾配で溶出する。イオン交換後、標的画分を、接線流濾過システム上で１０ｋＤａカットオフポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用してＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換する。試料をおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過する。
【０３５３】
実施例２７．ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体８の設計および精製
タンパク質発現
分岐点がＮ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体８（ＣＴＬＡ−４）はそれぞれ、２つの別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（長鎖Ｆｃ（配列番号６９）の２つのコピー、および抗ＣＴＬＡ−４短鎖Ｆｃ（配列番号６８）の２つのコピー）と、抗ＣＴＬＡ−４軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のコピーとを含む。長鎖Ｆｃは、逆電荷変異Ｋ４０９ＤおよびＤ３９９Ｋ（ホモ二量体形成を促進するため）を有するＦｃドメイン単量体に直列に連続して、Ｅ３５７Ｋ電荷変異と、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体形成を促進するため）とを有するＦｃドメイン単量体を含有する。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄ電荷変異ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの空洞形成変異（ヘテロ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端で抗ＣＴＬＡ−４  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体８（ＣＴＬＡ−４））とを含む。ＣＴＬＡ−４軽鎖はまた、ｓｃＦｖの一部として短鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現され得る。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされる。表８の各構築体の以下のアミノ酸配列は、３つの別個のプラスミド（１つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは長鎖Ｆｃをコードし、１つのプラスミドは短鎖Ｆｃ（抗ＣＴＬＡ−４）をコードする）によりコードされる。
【０３５４】
（表８）構築体８（ＣＴＬＡ４）配列
2021532085.tif 000059
【０３５５】
発現されたタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａ（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社）カラムを使用したプロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーにより細胞培養上清から精製する。捕捉されたＦｃ抗原結合ドメイン構築体を、リン酸緩衝生理食塩水で洗浄し（低塩洗浄）、１００ｍＭのグリシン（ｐＨ３）で溶出する。溶出液を１Ｍ  ＴＲＩＳ（ｐＨ７．４）の添加によって素早く中和し、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過する。Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用したイオン交換クロマトグラフィーによりタンパク質をさらに分取する。カラムを５０ｍＭのＭＥＳ（ｐＨ６）（緩衝液Ａ）で予め平衡化し、試料を、５０ｍＭのＭＥＳ、４００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６）（緩衝液Ｂ）を溶出緩衝液として使用した段階勾配で溶出する。イオン交換後、標的画分を、接線流濾過システム上で１０ｋＤａカットオフポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用してＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換する。試料をおよそ３０ｍｇ／ｍＬに濃縮し、０．２μｍフィルターに通して滅菌濾過する。
【０３５６】
実施例２８．ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体９の設計および精製
タンパク質発現
分岐点がＮ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体９（ＣＴＬＡ−４）は、２つの別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＴＬＡ−４長鎖Ｆｃ（配列番号５４）の２つのコピー、および抗ＣＴＬＡ−４短鎖Ｆｃ（配列番号６８）の２つのコピー）と、抗ＣＴＬＡ−４軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のコピーとを含む。長鎖Ｆｃは、逆電荷変異Ｋ４０９ＤおよびＤ３９９Ｋ（ホモ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体と直列に連続して、Ｅ３５７Ｋ電荷変異ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端で抗ＣＴＬＡ−４  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体９（ＣＴＬＡ−４））とを含む。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄ電荷変異ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖの空洞形成変異（ヘテロ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端で抗ＣＴＬＡ−４重鎖ドメイン（構築体９（ＣＴＬＡ−４））とを含む。ＣＴＬＡ−４軽鎖はまた、ｓｃＦｖの一部として長鎖Ｆｃおよび／または短鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現され得る。
【０３５７】
表９の各構築体の以下のアミノ酸配列は、３つの別個のプラスミド（１つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは短鎖Ｆｃ（抗ＣＴＬＡ−４）をコードする）によりコードされる。
【０３５８】
（表９）構築体９（ＣＴＬＡ−４）配列
2021532085.tif 000060
【０３５９】
実施例２９．ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体１０の設計および精製
タンパク質発現
分岐点がＮ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１０（ＣＴＬＡ−４）はそれぞれ、２つの別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＴＬＡ−４長鎖ｆｃ（配列番号７１）の２つのコピー、および短鎖Ｆｃ（配列番号６３）の４つのコピー）と、抗ＣＴＬＡ−４軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のコピーとをそれぞれ含む。長鎖Ｆｃは、直列に連続して２つのＦｃドメイン単量体を含み、各Ｆｃドメイン単量体は、逆電荷変異Ｋ４０９ＤおよびＤ３９９Ｋ（ホモ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体と直列に連続して、Ｅ３５７Ｋ電荷変異ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端で抗ＣＴＬＡ−４  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体１０（ＣＴＬＡ−４））とを有する。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄ電荷変異、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進するため）を含有する。抗ＣＴＬＡ−４軽鎖はまた、ｓｃＦｖの一部として長鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現される得る。表１０の各構築体の以下のアミノ酸配列は、３つの別個のプラスミド（１つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは短鎖Ｆｃをコードする）によりコードされる。
【０３６０】
（表１０）構築体１０（ＣＴＬＡ４）配列
2021532085.tif 000061
2021532085.tif 000062
【０３６１】
実施例３０．ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体１６の設計および精製
タンパク質発現
分岐点がＣ末端Ｆｃドメインにある、単独分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１６（ＣＴＬＡ−４）はそれぞれ、２つの別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＴＬＡ−４長鎖Ｆｃ（配列番号７３）の２つのコピー、および短鎖Ｆｃ（配列番号６３）の４つのコピー）と、抗ＣＴＬＡ−４軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）の３つのコピーとをそれぞれ含む。長鎖Ｆｃは、直列に、各々がＥ３５７Ｋ電荷変異ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体化を促進する）を有する、２つのＦｃドメイン単量体とともに直列に連続して逆電荷変異Ｋ４０９ＤおよびＤ３９９Ｋ（ホモ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端で抗ＣＴＬＡ−４  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体１０（ＣＴＬＡ−４））とを含む。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄ電荷変異、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進するため）を含有する。抗ＣＴＬＡ−４軽鎖はまた、ｓｃＦｖの一部として長鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現される得る。表１１の各構築体の以下のアミノ酸配列は、３つの別個のプラスミド（１つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは短鎖Ｆｃをコードする）によりコードされる。
【０３６２】
（表１１）構築体１６（ＣＴＬＡ４）配列
2021532085.tif 000063
2021532085.tif 000064
【０３６３】
実施例３１．ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体１９の設計および精製
タンパク質発現
分岐点がＣ末端ＦｃドメインにもＮ末端Ｆｃドメインにもない単独で分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製した。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１９（ＣＴＬＡ−４）は、２つの別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＴＬＡ−４長鎖Ｆｃ（配列番号７５）の２つのコピー、および短鎖Ｆｃ（配列番号６３）の４つのコピー）と、抗ＣＴＬＡ−４軽鎖ポリペプチド（配列番号４９）のコピーとをそれぞれ含む。長鎖Ｆｃは、Ｅ３５７Ｋ電荷変異ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体と直列に連続して、逆電荷変異Ｋ４０９ＤおよびＤ３９９Ｋ（ホモ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体と直列に連続して、Ｅ３５７Ｋ電荷変異ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体と、Ｎ末端で抗ＣＴＬＡ−４  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体１９（ＣＴＬＡ−４））とを含む。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄ電荷変異、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進するため）を含有する。抗ＣＴＬＡ−４軽鎖はまた、ｓｃＦｖの一部として長鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現される得る。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。表１２の各構築体の以下のアミノ酸配列は、３つの別個のプラスミド（１つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは短鎖Ｆｃをコードする）によりコードされた。
【０３６４】
（表１２）構築体１９（ＣＴＬＡ−４）配列
2021532085.tif 000065
【０３６５】
実施例３２．ヒトＣＴＬＡ−４を発現するＨＥＫ細胞におけるＣＤＣ
ヒトＣＴＬＡ−４遺伝子を安定的に発現するようトランスフェクトされたヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、および選択マーカーとして０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンにおいて培養した。細胞を回収し、ゲネテシン（ｇｅｎｅｔｅｃｉｎ）またはフェノールレッドを含まないＸ−Ｖｉｖｏ−１５培地（Ｌｏｎｚａ社）において希釈した。６ｘ１０５細胞／ｍＬの１００μＬのＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４細胞を、９６ウェル組織培養処理平底プレート（ＢＤ  Ｆａｌｃｏｎ）に播種した。Ｆｃ構築体およびＡｂを、Ｘ−Ｖｉｖｏ−１５培地中で３倍連続希釈した。４倍の最終濃度の５０μＬの希釈された構築体を、ウェルへ、標的細胞の上部に添加した。５０μＬ（２５％）の非希釈のヒト血清補体（Ｑｕｉｄｅｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、ウェルの各々に添加した。次いで、アッセイプレートを３７℃で２時間インキュベートした。２時間のインキュベーション後、２０μＬのＷＳＴ−１細胞増殖試薬（Ｒｏｃｈｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｃｏｒｐ）を、各ウェルに添加し、３７℃で一晩インキュベートした。翌朝、２〜５分間プレートアッセイプレートを振盪機に置いた。吸光度を、分光光度計（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  ＳＰＥＣＴＲＡｍａｘ  Ｍ２）で、６００ｎｍでの補正で、４５０ｎｍで測定した。
【０３６６】
１００％溶解対照としてトリトンＸ−１００界面活性剤（Ｐｒｏｍｅｇａ）で処理した試料と、０％細胞溶解対照として構築物を含まない細胞とを使用してデータを正規化した。
【０３６７】
表１３および図２５は、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｃ構築体で処理されたＣＴＬＡ−４でトランスフェクトされたＨＥＫ細胞のＣＤＣアッセイの結果を示す。
【０３６８】
（表１３）ＣＴＬＡ−４でトランスフェクトされたＨＥＫ細胞を含む抗ＣＴＬＡ−４構築体のＣＤＣ活性
2021532085.tif 000066
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
【０３６９】
実施例３３．抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｃ構築体による抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）活性化
ヒト単球を、ＣＤ１６除去（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を含まない陰性選択キットを使用して凍結した末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）から精製した。次いで、単離された単球を、６日間、５０ｎｇ／ｍＬのＭ−ＣＳＦ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で培養してＭ０マクロファージまで細胞を分化した。Ｍ０マクロファージを、Ｍ２ｃマクロファージまで（４８時間）最終分化のために、特殊光学９６ウェル平底組織培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  ３６１４）に、５０ｎｇ／ｍＬ  ＩＬ−１０（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の存在下で、１００μＬ中５０，０００細胞／ウェルでフェノールレッド不含ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中の１０％熱不活性化Ｓｕｐｅｒ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中に播種した。ヒトＣＴＬＡ−４遺伝子を安定的に発現するようトランスフェクトされたヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、および選択マーカーとして０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンにおいて培養した。ＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４細胞を、それらの培養フラスコから採取し、ｐＨｒｏｄｏ赤色細胞洗浄緩衝液（Ｅｓｓｅｎ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で一度洗浄し、次いで、ｐＨｒｏｄｏ赤色細胞標識試薬キット（Ｅｓｓｅｎ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で、３７℃で１時間２５０ｎｇ／ｍＬで、１×１０６／ｍＬで標識した。標識されたＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４標的細胞を、フェノールレッド不含ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）中の１０％熱不活性化Ｓｕｐｅｒ  Ｌｏｗ  ＩｇＧ  ＦＢＳ（ＨｙＣｌｏｎｅ）中に再懸濁し、次いで、５０μＬ中１０，０００細胞／ウェルで添加した。１０倍連続希釈液中（５０μＬ／ウェル）５０ｎｇ／ｍＬの最終濃度のＩＬ−１０および４倍の最終濃度の構築体を、２００μＬ／ウェルの最終体積のためにエフェクターおよび標的細胞に添加した。貪食を、生細胞画像化システム（Ｅｓｓｅｎ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３）を用いてｐＨｒｏｄｏ赤色蛍光強度の増加によって測定した。アッセイを、４倍対物を用いて、相および赤色蛍光のウェル当たり捕捉された１つの画像とともに、２つ組で行った。スキャンの回数を２４時間にわたり４５分毎に設定した。分析後、合計ＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４食作用を定量するために使用される測定基準は、合計赤体積分強度（ＲＣＵ×μｍ２／画像）である。結果を表１４および図２６に示す。
【０３７０】
（表１４）ＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４細胞を含む抗ＣＴＬＡ−４構築体のＡＤＣＰ活性
2021532085.tif 000067
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
【０３７１】
実施例３４．抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｃ構築体による抗体依存性細胞介在性細胞傷害（ＡＤＣＣ）の活性化
ヒトＣＴＬＡ−４遺伝子を安定的に発現するようトランスフェクトされたヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（ＣｒｏｗｎＢｉｏ）を、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、および選択マーカーとして０．５μｇ／ｍＬのピューロマイシンにおいて培養した。このアッセイにおいてＮＫ細胞（ＨｅｍａＣａｒｅ）をエフェクター細胞として使用し、非組織培養処理フラスコ（Ｆａｌｃｏｎ）内に一晩置いた。次いで、ＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４細胞を、３ｍＬのＡｃｃｕｔａｓｅ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を用いて５分間採取し、洗浄して、０．２×１０６細胞／ｍＬで再懸濁した。５０μＬのＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４細胞を、９６ウェル組織培養処理白色平底プレート（Ｃｏｓｔａｒ）の各ウェルに添加した。インキュベーション時間なしで、５倍連続希釈液中１１倍の最終濃度での１０μＬの構築体を各ウェルに添加した。直後に、１×１０６細胞／ｍＬの５０μＬのＮＫ細胞を各ウェルに添加した。インキュベーションを３７℃で５時間行った。５時間後、５０μＬのＣｙｔｏｔｏｘ  ｇｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を各ウェルに添加し、インキュベーションを３７℃で１５分間行った。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ  ＦＳ（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）上で発光を読み取った。結果を表１５および図２７に示す。
【０３７２】
（表１５）ＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４細胞を含む抗ＣＴＬＡ−４構築体のＡＤＣＣ活性
2021532085.tif 000068
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０リンカーを含んだ。
【０３７３】
実施例３５：Ｆｃ構築体中のＦｃドメインは、抗体中のＦｃドメインのものに対してＦｃガンマ受容体同様の結合を保持する
抗ＣＤ２０および抗ＣＴＬＡ４構築体を利用して、ホモ二量体化変異、ヘテロ二量体化変異、ポリペプチドリンカー、およびＦａｂドメインの様々な組み合わせが、Ｆｃガンマ受容体への結合に影響したかどうかを評価した。表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を利用して、ＣＤ６４（Ｆｃガンマ受容体Ｉ）への１：１結合を評価した。これらの構築体をチップ表面上に捕捉し、可溶性受容体への結合を測定して、１：１結合を確実にした。この形式では、結合価は、Ｆｃ機能の変化に最も敏感な読み取り値であり、速度定数および平衡定数は、Ｆｃドメインのサブセットの変化に鈍感である。
【０３７４】
細胞培養
ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。抗体を２つの異なるプラスミド（１つのプラスミドが重鎖をコードし、第２のプラスミドが軽鎖をコードした）から発現させた。Ｆｃ構築体は、３つの別個のプラスミドから発現され、ほとんどの場合、１つのプラスミドは抗体軽鎖をコードし、１つのプラスミドはアミノ末端Ｆｃに結合されたＣＨ１−ＶＨ  ＦＡＢ部分を含む長鎖Ｆｃをコードし、３つ目のプラスミドは短鎖Ｆｃをコードした。例外はＳ３ＡおよびＳ３ＷのＦｃ構築体であった。Ｓ３Ｗの場合、１つのプラスミドが抗体軽鎖をコードし、第２のプラスミドが２つのＦｃドメインを含む長鎖をコードし、第３のプラスミドがＣＨ１−ＶＨ  ＦＡＢ部分を含む単一のＦｃ鎖をコードした。Ｓ３Ａの場合、１つのプラスミドが抗体軽鎖をコードし、第２のプラスミドがアミノ末端Ｆｃに結合したＣＨ１−ＶＨ  ＦＡＢ部分を含む長鎖Ｆｃをコードし、１つのプラスミドが同様にＣＨ１−ＶＨ  ＦＡＢ部分を含む短鎖Ｆｃをコードした。
【０３７５】
タンパク質精製
発現したタンパク質を、Ｐｏｒｏｓ  ＭａｂＣａｐｔｕｒｅ  Ａカラムを用いて、プロテインＡ系のアフィニティーカラムクロマトグラフィーによって細胞培養上清から精製した。捕捉したＦｃ構築体を、ロードした後にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、ｐＨ７．０）で洗浄し、中間洗浄緩衝液の５０ｍＭのクエン酸緩衝液（ｐＨ５．５）でさらに洗浄して、さらなるプロセスに関する不純物を除去した。結合したＦｃ構築体物質を、１００ｍＭのグリシン、ｐＨ３で溶離し、１ＭのＴＲＩＳ  ｐＨ７．４を添加することによって溶離液をすばやく中和し、次いで遠心分離して、０．２μｍのフィルターを通して減菌濾過する。
【０３７６】
タンパク質は、Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ樹脂を用いて、イオン交換クロマトグラフィーによってさらに分取した。カラムは、５０ｍＭのＭＥＳ、ｐＨ６（緩衝液Ａ）で予め平衡化して、サンプルは、ロードのために平衡用緩衝液で希釈した（１：３）。溶離緩衝液として５０ｍＭのＭＥＳ（１００％  Ａ）から、４００ｍＭの塩化ナトリウム、ｐＨ６（１００％  Ｂ）の１２〜１５ＣＶの線形勾配を使用して、サンプルを溶離した。溶離中に収集したすべての画分を、分析サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって分析し、標的の画分をプールして、精製されたＦｃ構築体物質を精製した。
【０３７７】
イオン交換の後、プールされた材料を、接線流濾過システム上で、３０ｋＤａをカットオフするポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜カートリッジを使用して、１倍ＰＢＳ緩衝液に緩衝液交換した。サンプルをおよそ１０〜１５ｍｇ／ｍＬに濃縮して、０．２μｍフィルターを通して滅菌濾過した。
【０３７８】
物理化学的分析
分析用サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を、ポストプロテインＡ、プールされたイオン交換画分、および精製された最終物質の純度評価に使用した。
【０３７９】
精製された物質を、１倍ＰＢＳを使用して１ｍｇ／ｍＬに希釈し、Ｚｅｎｉｘ  ＳＥＣ−３００（４．６×３００ｍｍ、３μｍ、３００Å、Ｓｅｐａｘ、カタログ番号２１３３００−４６３０）を分析カラムとして使用して、ＵＶ＆ＦＬＤ検出器を備えたＡｇｉｌｅｎｔ  １２００システムで分析した。
【０３８０】
カラムを、分析前に０．３ｍＬ／分で１時間、０．０５ｗ／ｖ％のアジ化ナトリウム緩衝液を用いて、１００ｍＭのリン酸ナトリウム、２００ｍＭのアルギニン、３００ｍＭの塩化ナトリウム（ｐＨ６．７）で平衡化した。注入量はおよそ１０〜１５ｕＬであり、カラム温度は  ３００℃であり、ＵＶ検出は２８０ｎｍであり、ＦＬＤは励起２８０ｍｍおよび発光３３０ｎｍであり、総実行時間は１５分間であった。
【０３８１】
サイズ純度の結果を表１６に示す。すべての物質が、低レベルの高位種（ＨＯＳ）のみを示した。
【０３８２】
（表１６）Ｆｃ結合アッセイに使用された構築体のサイズ純度
2021532085.tif 000069
【０３８３】
結合分析
結合実験を、ＣＭ３シリーズＳセンサーチップを使用してＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００計器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で行った。ＦｃｇＲ結合の結合価分析のために、天然プロテインＡを直接アミン結合により固定化した。リガンドを泳動緩衝液中で希釈し、捕捉した。ヒト組換えＣＤ３２ａまたはＣＤ６４（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）の６点希釈系列を捕捉したリガンド上に流した。各リガンドの結合価を以下のように計算した。
リガンドの結合価＝Ｒｍａｘ／［（ＭＷ分析物／ＭＷリガンド）×リガンド捕捉レベル］
【０３８４】
抗ＣＤ２０構築体へのＣＤ６４結合の分析の結果を表１７に示す。いずれの場合でも、ＣＤ６４結合価はＦｃドメインの数に等しく、すべてのＦｃドメインがＣＤ６４への結合に機能したことを示す。Ｓ３Ｙ−ＡＡ−ＯＢＩおよびＳ３Ｙ−ＡＡ−ＡＶＥと配列が同一であるが、Ｆａｂドメインを欠く対照化合物はそれらの構築体と同等にＣＤ６４に結合し、Ｆａｂドメインの包含がＦｃ受容体への結合を変化させなかったことを示す。
【０３８５】
（表１７）特定の抗ＣＤ２０構築体の原子価
2021532085.tif 000070
【０３８６】
実施例３６：Ｆｃ構築体は、細胞表面Ｆｃガンマ受容体により貪欲に結合する
構築体の細胞表面ＣＤ３２ａへの相対的結合を、抗ＣＤ２０構築体を使用して、時間分解蛍光共鳴エネルギー移動（ＴＲ−ＦＲＥＴ）アッセイ（ＣｉｓＢｉｏ）で評価した。アッセイ試薬を製造業者の指示に従って調製した。Ｆｒｅｅｄｏｍ  ＥＶＯｗａｒｅ  １５０自動液体ハンドラー（Ｔｅｃａｎ）を使用して試料毎に１０点３倍連続希釈系列を生成し、これを、標識受容体を有する細胞に添加した。その後、標識競合抗体を添加し、プレートを室温でインキュベートした。ＰＨＥＲＡｓｔａｒ蛍光リーダー（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ  Ｇｍｂｈ）を使用して、アッセイプレートを６６５ｎｍおよび６２０ｎｍで読み取った。対数変換試料濃度を対応するＨＴＲＦシグナル比（６６５ｎｍ／６２０ｎｍ）に対してプロットした。４パラメータ非線形回帰分析（最小二乗適合）をＸＹ−プロットに行って非標識試料のＥＣ５０を計算し、ＥＣ５０はＦｃガンマ受容体に対する試料の親和性に反比例した。
【０３８７】
ＴＲ−ＦＲＥＴにより決定されたＣＤ３２ａへの競合結合の測定値を、表１８に要約する。ＩＣ５０値の減少によって反映されるように、Ｆｃドメインの数の増加により、ＣＤ３２ａについて免疫グロブリンと競合する構築体の能力が大いに高まった。Ｓ３Ｙ−ＡＡ−ＯＢＩおよびＳ３Ｙ−ＡＡ−ＡＶＥと配列が同一であるが、Ｆａｂドメインを欠く対照化合物はそれらの構築体と同等に細胞表面ＣＤ３２ａについて競合し、Ｆａｂドメインの包含がＦｃ受容体への結合を変化させなかったことを示す。
【０３８８】
（表１８）特定の抗ＣＤ２０構築体のＦｃ受容体結合
2021532085.tif 000071
【０３８９】
実施例３７：抗原結合は、抗ＣＴＬＡ４  Ｆｃ構築体において保存される
抗原結合を、ＳＰＲを使用して評価した。組み換え型、ヒスチジンタグ付きのＣＴＬＡ−４（９０４９−Ｂ７  Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質を、以前に固定化した抗６Ｘ  Ｈｉｓ抗体を使用してセンサ上で捕捉した。同族抗体およびＦｃ構築体の希釈系列は、センサ上を通過し、それは分析物注射の間に低ｐＨのグリシン溶液で再生成された。結合を、１：１ラングミュア相互作用モデルを使用して計算した。
【０３９０】
抗ＣＴＬＡ−４構築体の結合を表１９に示す。すべての試験した化合物のＳＥＣによる純度は、８６％以上であった。Ｆｃ構築体は、１：１の結合を支持したアッセイにおいて対応するモノクローナル抗体のものと同程度の抗原結合を有していた。
【０３９１】
（表１９）ある特定の抗ＣＴＬＡ４  Ｆｃ構築体によるＣＴＬＡ−４結合
2021532085.tif 000072
【０３９２】
実施例３８：抗ＣＴＬＡ４  Ｆｃ構築体は、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂと比較して一次ヒト制御性Ｔ細胞の強化されたＡＤＣＣを媒介する
その結果が図２８に示される、抗ＣＴＬＡ−４  Ｆｃ構築体およびＣＴＬＡ４抗体による一次ヒト制御性Ｔ細胞のＮＫ細胞媒介性殺傷の分析は、Ｓ３Ｙ−ＡＡ−ＣＴＬＡ４  Ｆｃ構築体が、同じＦａｂドメインを有する抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂよりも優れていることを示した。
【０３９３】
実施例３９：抗ＣＴＬＡ４  Ｆｃ構築体は、Ｆｃ受容体に結合する。
Ｆｃ受容体結合の分析により、抗ＣＴＬＡ４  Ｆｃ構築体１３（実施例２、表６）がＦｃ受容体に結合することがわかった。
【０３９４】
他の実施形態
この明細書中に記載したすべての公開公報、特許および特許出願は、あたかも独立の公開公報または特許出願それぞれが特別にかつ個別に示されて参照によって組み入れられるかのように、同じ程度まで参照することによってここに組み入れるものとする。
【０３９５】
この開示について、その特定の実施形態に関連して説明したが、さらなる変形が可能であることと、この出願は、概してこの開示の原則に従い、かつ、この開示が関係する技術分野の範囲内で既知または通例である範囲にあり、先に述べた本質的な特徴に応用することができるような、この開示からの逸脱を含んだ、この開示の任意のバリエーション、使用または適応を網羅することを意図し、請求項の範囲に従うものであることとが理解されるであろう。
【０３９６】
他の実施形態は、特許請求の範囲の範囲内とする。
【図１】
2021532085.tif 000102
【図２】
2021532085.tif 000103
【図３】
2021532085.tif 000104
【図４】
2021532085.tif 000105
【図５】
2021532085.tif 000106
【図６】
2021532085.tif 000107
【図７】
2021532085.tif 000108
【図８】
2021532085.tif 000109
【図９】
2021532085.tif 000110
【図１０】
2021532085.tif 000111
【図１１】
2021532085.tif 000112
【図１２】
2021532085.tif 000113
【図１３】
2021532085.tif 000114
【図１４】
2021532085.tif 000115
【図１５】
2021532085.tif 000116
【図１６】
2021532085.tif 000117
【図１７】
2021532085.tif 000118
【図１８】
2021532085.tif 000119
【図１９】
2021532085.tif 000120
【図２０】
2021532085.tif 000121
【図２１】
2021532085.tif 000122
【図２２】
2021532085.tif 000123
【図２３】
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【図２４】
2021532085.tif 000125
【図２５】
2021532085.tif 000126
【図２６】
2021532085.tif 000127
【図２７】
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【図２８】
2021532085.tif 000129
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月16日(2021.4.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＴＬＡ４結合ドメインと、リンカーによって第２のＦｃドメインに結合された第１のＦｃドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体であって、前記第１および第２のＦｃドメインの各々が、ヘテロ二量体化選択性モジュールまたはホモ二量体化選択性モジュールのいずれかを含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２】
ＣＴＬＡ結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第２のリンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意選択の第３のリンカー；ならびにヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む任意選択の第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも２つのＦｃドメイン単量体が、ヘテロ二量体化選択性モジュールまたはホモ二量体化選択性モジュールのいずれかを含む、ポリペプチド。
【請求項３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項７】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項８】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が各々、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項９】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２のＩｇＧ１ドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第１のＩｇＧ１ドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
改変された突起を形成する変異を含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、１、２、または３つの逆電荷変異をさらに含む、請求項２〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
前記改変された突起を形成する変異および前記逆電荷変異が、ＣＨ３ドメイン内にある、請求項２〜１２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記変異が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項１３に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記変異が、単一アミノ酸変化である、請求項２〜１３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、
2021532085.tif 000130
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、グリシンスペーサーである、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが独立して、４〜３０（配列番号２２０）、４〜２０（配列番号２２３）、８〜３０（配列番号２２１）、８〜２０（配列番号２２４）、１２〜２０（配列番号２２５）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなる、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含む、請求項２〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２１】
ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項２０に記載のポリペプチド。
【請求項２２】
Ｉ２５３位の各アミノ酸変異が、Ｉ２５３Ａである、請求項２１に記載のポリペプチド。
【請求項２３】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含む、請求項２〜２２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２４】
ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項２３に記載のポリペプチド。
【請求項２５】
Ｒ２９２位の各アミノ酸変異が、Ｒ２９２Ｐである、請求項２４に記載のポリペプチド。
【請求項２６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２６）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項２〜２５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２７】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有する、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２８】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有する、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項２９】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有する、請求項２６に記載のポリペプチド。
【請求項３０】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000131
（配列番号２２９）を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３１】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000132
（配列番号２２９）を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３２】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000133
（配列番号２２９）を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３３】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000134
（配列番号２２９）を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３４】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000135
（配列番号２３０）を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３５】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000136
（配列番号２３０）を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000137
（配列番号２３０）を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３７】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000138
（配列番号２３０）を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３８】
前記単一アミノ酸置換が、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択される、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項３９】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項２〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４０】
前記単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、前記ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４１】
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項３９に記載のポリペプチド。
【請求項４２】
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項４３】
前記２つまたは４つの逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択される、請求項５、６、および９〜２９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
前記ＶＨドメインが、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％または９８％同一である、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５１】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５２】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項４５に記載のポリペプチド。
【請求項５５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含む、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる、請求項２〜４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５７】
前記第１または第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合される請求項２〜５６のいずれか一項に記載のポリペプチドの２つのコピーを含む、ポリペプチド複合体。
【請求項５８】
ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドに結合される請求項２〜５６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第２のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第１、第２、または第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内のシステイン残基と前記第２のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合される、
ポリペプチド複合体。
【請求項５９】
前記第２のポリペプチド単量体が、改変された空洞を形成する変異を含む、請求項５８に記載のポリペプチド複合体。
【請求項６０】
前記改変された空洞を形成する前記変異が、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３９４Ｗ／Ｙ４０７Ａ、Ｔ３６６Ｗ／Ｔ３９４Ｓ、Ｔ３６６Ｓ／Ｌ３６８Ａ／Ｙ４０７Ｖ／Ｙ３４９Ｃ、Ｓ３６４Ｈ／Ｆ４０５Ａからなる群から選択される、請求項５９に記載のポリペプチド複合体。
【請求項６１】
前記第２のポリペプチドが、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項５８〜６０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
【請求項６２】
ＣＴＬＡ４結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；第２のリンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体；任意選択の第３のリンカー；ならびにヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む任意選択の第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも１つのＦｃドメイン単量体が、１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、ポリペプチド。
【請求項６３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６５】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６６】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａおよび表４ＢＡおよび表４Ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６７】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６８】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項６９】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７０】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第２のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７１】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第１のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７２】
表４から選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、同一のＣＨ３ドメインを有する、請求項６２〜７１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７３】
表４から選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異が、ＣＨ３ドメインにある、請求項６２〜７２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７４】
前記変異が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項７３に記載のポリペプチド。
【請求項７５】
前記変異が各々、単一アミノ酸変化である、請求項６２〜７３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７６】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、
2021532085.tif 000139
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項７２に記載のポリペプチド。
【請求項７７】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、グリシンスペーサーである、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７８】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが独立して、４〜３０（配列番号２２０）、４〜２０（配列番号２２３）、８〜３０（配列番号２２１）、８〜２０（配列番号２２４）、１２〜２０（配列番号２２５）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなる、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項７９】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなる、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項８０】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含む、請求項６２〜７９に記載のポリペプチド。
【請求項８１】
ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項８０に記載のポリペプチド。
【請求項８２】
Ｉ２５３位の各アミノ酸変異が、Ｉ２５３Ａである、請求項８１に記載のポリペプチド。
【請求項８３】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含む、請求項６２〜８２のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８４】
ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項８３に記載のポリペプチド。
【請求項８５】
Ｒ２９２位の各アミノ酸変異が、Ｒ２９２Ｐである、請求項８４に記載のポリペプチド。
【請求項８６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２６）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項６２〜８５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８７】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有する、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項８８】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有する、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項８９】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有する、請求項８６に記載のポリペプチド。
【請求項９０】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000140
（配列番号２２９）を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９１】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000141
（配列番号２２９）を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９２】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000142
（配列番号２２９）を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９３】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000143
（配列番号２２９）を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９４】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000144
（配列番号２３０）を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９５】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000145
（配列番号２３０）を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000146
（配列番号２３０）を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９７】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000147
（配列番号２３０）を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９８】
前記単一アミノ酸置換が、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択される、請求項９０〜９７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９９】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項６２〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１００】
前記単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、前記ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異である、請求項９９に記載のポリペプチド。
【請求項１０１】
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項９９に記載のポリペプチド。
【請求項１０２】
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項６２に記載のポリペプチド。
【請求項１０３】
前記２つまたは４つの逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択される、請求項６５、６６、および６９〜８９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含む、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項１０３に記載のポリペプチド。
【請求項１０７】
前記ＶＨドメインが、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１０８】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１０９】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％または９８％同一である、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１０】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１１】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１２】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一である、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項１０５に記載のポリペプチド。
【請求項１１５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含む、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる、請求項６２〜１０３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１７】
前記第１または第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合される請求項２〜５６のいずれか一項に記載のポリペプチドの２つのコピーを含む、ポリペプチド複合体。
【請求項１１８】
ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドに結合される請求項６２〜１１６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第２のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第１、第２、または第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内のシステイン残基と前記第２のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合される、
ポリペプチド複合体。
【請求項１１９】
前記第２のポリペプチド単量体が、１、２、または３つの逆電荷変異を含む、請求項１１８に記載のポリペプチド複合体。
【請求項１２０】
前記第２のポリペプチド単量体が、表４から選択される１、２、または３つの逆電荷変異を含み、かつポリペプチド中の表４から選択される１、２、または３つの逆電荷変異に対して相補的である、請求項１１９に記載のポリペプチド複合体。
【請求項１２１】
前記第２のポリペプチドが、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載のポリペプチド複合体。
【請求項１２２】
ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、第２のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、任意選択の第３のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む任意選択の第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも１つのＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、ポリペプチド。
【請求項１２３】
前記第１のＩｇＧ１単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインをさらに含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２４】
前記第１のＩｇＧ１単量体のアミノ末端にｓｃＦｖをさらに含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２５】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２６】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２７】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１２８】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が各々、改変された突起を形成する変異を含む、
請求項２に記載のポリペプチド。
【請求項１２９】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１３０】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第２のＩｇＧ１ドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１３１】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第１のＩｇＧ１ドメイン単量体が、２つまたは４つの逆電荷変異を含む、
請求項１２２に記載のポリペプチド。
【請求項１３２】
改変された突起を形成する変異を含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、１、２、または３つの逆電荷変異をさらに含む、請求項１２２〜１３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３３】
前記改変された突起を形成する変異および前記逆電荷変異が、前記ＣＨ３ドメイン内にある、請求項１２２〜１３１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３４】
ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、第２のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、任意選択の第３のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ２ドメイン、およびＣＨ３ドメインを含む任意選択の第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも１つのＦｃドメイン単量体が、１、２、または３つの逆電荷アミノ酸修飾を含む、ポリペプチド。
【請求項１３５】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインをさらに含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３６】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端にｓｃＦｖをさらに含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３７】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表６中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３８】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４から選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１３９】
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４０】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が各々、表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４１】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａまたは表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第３のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４２】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａまたは表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第２のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４３】
第３のリンカーと、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および前記第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａまたは表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第１のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含む、
請求項１３４に記載のポリペプチド。
【請求項１４４】
表４Ａまたは４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含む前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、同一のＣＨ３ドメインを有する、請求項１３４〜１４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４５】
表４から選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異が、ＣＨ３ドメインにある、請求項１３４〜１４３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４６】
前記変異が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４７】
前記変異が各々、単一アミノ酸変化である、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４８】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、
2021532085.tif 000148
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１４９】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが独立して、４〜３０（配列番号２２０）、４〜２０（配列番号２２３）、８〜３０（配列番号２２１）、８〜２０（配列番号２２４）、１２〜２０（配列番号２２５）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５０】
前記第２のリンカーおよび前記任意選択の第３のリンカーが、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５１】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５２】
ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項１５１に記載のポリペプチド。
【請求項１５３】
Ｉ２５３位の各アミノ酸変異が、Ｉ２５３Ａである、請求項１５２に記載のポリペプチド。
【請求項１５４】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５５】
ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項１５４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５６】
Ｒ２９２位の各アミノ酸変異が、Ｒ２９２Ｐである、請求項１５５に記載のポリペプチド。
【請求項１５７】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２６）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５８】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有する、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５９】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有する、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６０】
前記第１のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有する、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６１】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000149
（配列番号２２９）を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６２】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000150
（配列番号２２９）を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６５】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000151
（配列番号２２９）を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６６】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ２ドメインが同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000152
（配列番号２２９）を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６７】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000153
（配列番号２３０）を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６８】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000154
（配列番号２３０）を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６９】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000155
（配列番号２３０）を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７０】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ３ドメインが独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000156
（配列番号２３０）を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７１】
前記単一アミノ酸置換が、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択される、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７２】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７３】
前記単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、前記ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異である、請求項９９に記載のポリペプチド。
【請求項１７４】
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にある、請求項１７３に記載のポリペプチド。
【請求項１７５】
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択される、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７６】
前記２つまたは４つの逆電荷変異が、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択される、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７８】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７９】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８０】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％または９８％同一である、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８１】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８２】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列のセットを含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８３】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセット由来のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３配列を含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８４】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、表２に記載の抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインと、を含み、前記ＶＨドメイン配列および前記ＶＬドメイン配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列と少なくとも９５％または９８％同一である、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８５】
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表２に記載の抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項１２３、１２４、１３５、および１３６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８６】
ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインと、ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインと、をさらに含む、請求項１２２〜１４５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１８７】
請求項２〜１８７のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする、核酸分子。
【請求項１８８】
請求項１８７に記載の核酸分子を含む、発現ベクター。
【請求項１８９】
請求項１８７に記載の核酸分子を含む、宿主細胞。
【請求項１９０】
請求項１８８に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
【請求項１９１】
請求項１８９または請求項１９０に記載の宿主細胞を、前記ポリペプチドを発現させる条件下で培養することを含む、請求項２〜１８７のいずれか一項に記載のポリペプチドを産生する方法。
【請求項１９２】
抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１８９に記載の宿主細胞。
【請求項１９３】
抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１９０に記載の宿主細胞。
【請求項１９４】
抗体ＶＬドメインおよび抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１８９に記載の宿主細胞。
【請求項１９５】
抗体ＶＬドメインおよび抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１９０に記載の宿主細胞。
【請求項１９６】
１０個以下の単一アミノ酸修飾を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１８９に記載の宿主細胞。
【請求項１９７】
１０個以下の単一アミノ酸修飾を有するＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、請求項１９０に記載の宿主細胞。
【請求項１９９】
前記ＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、前記ＣＨ３ドメイン内に１０、８、６、または４つ以下の単一アミノ酸修飾を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項１９６または１９７に記載の宿主細胞。
【請求項２００】
請求項２〜１８６のいずれか一項に記載のポリペプチドを含む、薬学的組成物。
【請求項２０１】
前記ポリペプチドの４０％、３０％、２０％、１０％、５％、２％未満が、Ｆｃドメイン単量体上に少なくとも１つのフコース修飾を有する、請求項２００に記載の薬学的組成物。
【請求項２０２】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第３のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成する、請求項１に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０３】
前記単一Ｆｃドメイン構築体が抗体である、請求項１または２０２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第３のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成する、組成物。
【請求項２０５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドもしくは前記第３のポリペプチドに結合されるか、または前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドに結合される、請求項２０４に記載の組成物。
【請求項２０６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、および前記第３のポリペプチドに結合される、請求項２０４に記載の組成物。
【請求項２０７】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第３のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０８】
前記生物活性が、Ｆｃ受容体媒介性エフェクター機能である、請求項２０７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２０９】
前記Ｆｃ受容体媒介性エフェクター機能が、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣ活性である、請求項２０８に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合するスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第３のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１１】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドもしくは前記第３のポリペプチドに結合されるか、または前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドに結合される、請求項２０２、２０７、または２１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１２】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、および前記第３のポリペプチドに結合される、請求項２０２、２０７、または２１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、Ｆａｂである、請求項１および２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１、第２、または第３のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、請求項２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ｓｃＦｖである、請求項２１４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、前記ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインが、前記第１、第２、または第３のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、請求項２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１７】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１８】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、前記ＶＬドメインを含む第４のポリペプチドを含む、請求項２１７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２１９】
前記ＶＨドメインが、表１に記載のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列のセットを含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２０】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２１】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３配列を除き、表２に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも９５％同一である、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２２】
前記ＶＨドメインが、表２に記載の抗体のＶＨ配列を含む、請求項２１６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２３】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含む、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含む、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２５】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン、ならびに表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％同一である、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２６】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、請求項１および２０２〜２１５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２７】
ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインをさらに含み、
前記ＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインが、リンカーを介して前記第１のポリペプチドまたは前記第２のポリペプチドのＮ末端に結合している、
請求項１および２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２８】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項２０２〜２２７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２２９】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項２０２〜２２８のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３０】
前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する、請求項２０２〜２２８のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３１】
前記二量体形成選択性モジュールが、前記Ｆｃドメイン単量体の一方の前記ＣＨ３ドメイン内に改変された空洞と、前記Ｆｃドメイン単量体の他方の前記ＣＨ３ドメイン内に改変された突起と、を含み、前記改変された空洞および前記改変された突起が、Ｆｃドメイン単量体の空洞内突起対（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ  ｐａｉｒ）を形成するように配置されている、請求項２２８または２２９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３２】
前記改変された突起が、Ｓ３５４Ｃ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｆ、およびＦ４０５Ｗからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含み、前記改変された空洞が、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、Ｙ４０７Ｖ、Ｙ４０７Ｔ、Ｙ４０７Ａ、Ｆ４０５Ａ、およびＴ３９４Ｓからなる群から選択される少なくとも１つの修飾を含む、請求項２３１に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３３】
前記Ｆｃドメイン単量体の一方がＹ４０７ＶおよびＹ３４９Ｃを含み、前記Ｆｃドメイン単量体の他方がＴ３６６ＷおよびＳ３５４Ｃを含む、請求項２２８または２２９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３４】
前記二量体形成選択性モジュールが、前記ドメイン単量体の一方の前記ＣＨ３ドメイン内に負に荷電したアミノ酸と、前記Ｆｃドメイン単量体の他方の前記ＣＨ３ドメイン内に正に荷電したアミノ酸と、を含み、前記負に荷電したアミノ酸および前記正に荷電したアミノ酸が、Ｆｃドメインの形成を促進するように配置されている、請求項２２８または２２９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３５】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｄ３９９Ｋと、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅのいずれかとを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３６】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ３９２ＤおよびＤ３９９Ｋを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３７】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３８】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｄを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２３９】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ３９２ＥおよびＤ３９９Ｋを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４０】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４１】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｄ３５６ＫおよびＫ４３９Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４２】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４３】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗを含み、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４４】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ３５７ＫまたはＥ３５７Ｒを含み、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４５】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、Ｋ３７０ＤまたはＫ３７０Ｅを含み、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｅ３５７Ｋまたは３５７Ｒを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４６】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含み、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４７】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、Ｄ３９９ＫまたはＤ３９９Ｒを含み、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドが各々、Ｋ４０９ＤまたはＫ４０９Ｅを含む、請求項２３４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４８】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーが、結合である、請求項１および２０２〜２４７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２４９】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーが、スペーサーである、請求項１および２０２〜２４７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５０】
前記スペーサーが、配列
2021532085.tif 000157
を有するポリペプチドを含む、請求項２４９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５１】
前記スペーサーが、グリシンスペーサーである、請求項２４９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５２】
前記スペーサーが、４〜３０（配列番号２２０）、８〜３０（配列番号２２１）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなる、請求項２５１に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５３】
前記スペーサーが、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなる、請求項２５２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５４】
前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、リンカーにより前記Ｆｃドメイン単量体に結合される、請求項１および２０２〜２１２のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５５】
前記リンカーが、スペーサーである、請求項２５４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５６】
前記Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つが、Ｉ２５３位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、請求項１および２０２〜２５５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５７】
Ｉ２５３位の前記アミノ酸修飾が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項２５６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５８】
Ｉ２５３位の各アミノ酸修飾が、Ｉ２５３Ａである、請求項２５７に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２５９】
前記Ｆｃドメインのうちの少なくとも１つが、Ｒ２９２位に少なくとも１つのアミノ酸修飾を含む、請求項１および２０２〜２５８のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６０】
Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項２５９に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６１】
Ｒ２９２位の各アミノ酸修飾が、Ｒ２９２Ｐである、請求項２６０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６２】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの１つ以上が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む、請求項１および２０２〜２６１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６３】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ２抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ３抗体定常ドメインを含む、請求項２６２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６４】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４からなる群から選択されるサブタイプのものである、請求項２６２または２６３に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６５】
前記第１、第２、第３、および第４のポリペプチドの各々内のＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異している、請求項１および２０２〜２６４のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６６】
前記第１、第２、第３、および第４のポリペプチドのうちの１つ以上が、Ｃ末端リシンを欠く、請求項１および２０２〜２６５のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６７】
前記第１、第２、第３、および第４のポリペプチドが各々、Ｃ末端リシンを欠く、請求項２６６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６８】
リンカーによって前記ポリペプチドのうちの１つ以上のＮ末端またはＣ末端に結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む、請求項１および２０２〜２６７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２６９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、または前記第３のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第２のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
【請求項２７０】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも７５％が、前記第１のＦｃドメイン、前記第２のＦｃドメイン、および前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを含む、請求項２６９に記載の細胞培養培地。
【請求項２７１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が構造的に同一であり、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも０．１ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、細胞培養培地。
【請求項２７２】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも７５％が構造的に同一である、請求項２７１に記載の細胞培養培地。
【請求項２７３】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも１０ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項２６９〜２７２のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項２７４】
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも１００ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、請求項２６９〜２７３のいずれか一項に記載の細胞培養培地。
【請求項２７５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
（３）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項２７６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドおよび／または前記第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、組成物。
【請求項２７７】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、請求項２７６に記載の組成物。
【請求項２７８】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含み、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ３７０ＤおよびＥ３５７Ｋを含む、請求項２７７に記載の組成物。
【請求項２７９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメイン、前記第２の抗原結合ドメイン、および前記第３の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、組成物。
【請求項２８０】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、請求項２７９に記載の組成物。
【請求項２８１】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ３５７ＫおよびＫ３７０Ｄを含み、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ３７０ＤおよびＥ３５７Ｋを含む、請求項２８０に記載の組成物。
【請求項２８２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、組成物。
【請求項２８３】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が各々、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が各々、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項２８２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、組成物。
【請求項２８５】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が各々、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が各々、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項２８４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｖｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のリンカー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第４のＦｃドメインを形成し、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第５のＦｃドメインを形成する、組成物。
【請求項２８７】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が各々、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第７のＦｃドメイン単量体が各々、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第８のＦｃドメイン単量体が各々、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第９のＦｃドメイン単量体が各々、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第６のＦｃドメイン単量体および前記第１０のＦｃドメイン単量体が各々、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項２８６に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドおよび／または前記第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第１および第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２８９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドおよび／または前記第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第１および第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合するスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドおよび／または前記第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドおよび／または前記第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメインおよび前記第２の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、細胞培養培地。
【請求項２９２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
（３）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
（５）前記第２のポリペプチドおよび／または第３のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、前記第１および第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項２９３】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、請求項２８８、２８９、２９０、２９１、または２９２に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第１、第２、および第３の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第１、第２、および第３の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合するスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメイン、前記第２の抗原結合ドメイン、および前記第３の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項２９７】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
ｃ）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第１の抗原結合ドメイン、前記第２の抗原結合ドメイン、および前記第３の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、細胞培養培地。
【請求項２９８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第３のＦｃドメイン単量体を含む第２のポリペプチドと、
（３）第４のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）前記第１のポリペプチドに結合された第１の抗原結合ドメインと、
（５）前記第２のポリペプチドに結合された第２の抗原結合ドメインと、
（６）前記第３のポリペプチドに結合された第３の抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記ＣＴＬＡ４結合ドメインが、前記第１のポリペプチド、第２のポリペプチド、または第３のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、前記第１および第２の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項２９９】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第２のポリペプチドおよび前記第３のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、請求項２９４、２９５、２９６、２９７、または２９８に記載の組成物。
【請求項３００】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のスペーサー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０３】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
【請求項３０４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
（３）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
（５）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項３０５】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が各々、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が各々、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が各々、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項３００、３０１、３０２、３０３、または３０４に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０７】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０８】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のスペーサー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３０９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
【請求項３１０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第２のポリペプチドであって、
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
（３）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
（５）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、または前記第４のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項３１１】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が各々、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が各々、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が各々、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、請求項３０６、３０７、３０８、３０９、または３１０に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｖｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のリンカー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第４のＦｃドメインを形成し、前記第６のＦｃドメイン単量体および前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第５のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１３】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のリンカー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｖｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のリンカー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第４のＦｃドメインを形成し、前記第６の単量体および前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第５のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ４結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１４】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のスペーサー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｖｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のスペーサー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のスペーサー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第４のＦｃドメインを形成し、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第５のＦｃドメインを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３１５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のスペーサー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｖｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のスペーサー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のスペーサー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第４のＦｃドメインを形成し、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第５のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
【請求項３１６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（１）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第２のＦｃドメイン単量体を結合する第１のスペーサー、および
ｖ）前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体を結合する第２のスペーサー
を含む、第１のポリペプチドと、
（２）第２のポリペプチドであって、
ｖｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体を結合する第３のスペーサー、および
ｘ）前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体を結合する第４のスペーサー
を含む、第２のポリペプチドと、
（３）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
（４）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
（５）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
（６）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
（７）前記第１のポリペプチド、前記第２のポリペプチド、前記第３のポリペプチド、前記第４のポリペプチド、前記第５のポリペプチド、または前記第６のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第１のＦｃドメインを形成し、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第２のＦｃドメインを形成し、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第３のＦｃドメインを形成し、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第４のＦｃドメインを形成し、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第５のＦｃドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも５０％が構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
【請求項３１７】
先行する請求項のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合構築体を投与することを含む、癌を治療するための方法であって、
前記癌が、黒色腫、非小細胞肺癌、腎細胞癌、頭頚部癌、小細胞肺癌、胃癌、食道癌、中皮腫、尿路上皮癌、尿路上皮癌、膠芽腫、卵巣癌、前立腺癌、高グレードの中枢神経系悪性腫瘍、肝臓癌、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、およびびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される、方法。
【請求項３１８】
先行する請求項のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合構築体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項３１９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第１および第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第３および第４のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと
を含み、
第１および第３のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第４および第６のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３２０】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項３１９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２１】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項３１９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２２】
前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３１９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２３】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３１９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２４】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３１９〜３２３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２５】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３１９〜３２３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２６】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３１９〜３２３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２７】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３２４〜３２６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３２８】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第３のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第３のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３１９〜３２３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３２９】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３１９〜３２３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３０】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３２８に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３１】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３２９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３２】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第１および第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチド、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第３および第４のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第２のポリペプチド、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体および第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第４のポリペプチドと
を含み、
第１および第３のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第４および第６のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３３３】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第１および第２のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）前記第３および第４のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと
を含み、
第１および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第３および第６のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第４のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３３４】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項３３３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３５】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項３３３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３６】
前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３３３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３７】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３３３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３８】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３３９】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４０】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４１】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３４２】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４３】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３３３〜３３７のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４４】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３４２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４５】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３４３に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第７のポリペプチドと、
ｈ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第８のポリペプチドと
を含み、
第１および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第４および第８のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃ単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３４７】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項３４６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４８】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項３４６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３４９】
前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３４６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５０】
前記第７のポリペプチドおよび前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３４６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５１】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一であり、前記第７のポリペプチドおよび前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３４６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５２】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５３】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５４】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５５】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３５６】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５７】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第７のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第４のＦｃドメイン単量体および前記第８のＦｃドメイン単量体が、前記第４のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第９のＦｃドメイン単量体が、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第６のＦｃドメイン単量体および前記第１０のＦｃドメイン単量体が、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３４６〜３５１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５８】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３５７に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３５９】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３５８に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６０】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体および第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと
を含み、
第１および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第４および第８のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第５のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃ単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３６１】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体を含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体を含む第６のポリペプチドと、
ｇ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第７のポリペプチドと、
ｈ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第８のポリペプチドと
を含み、
第１および第４のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第５および第８のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃ単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３６２】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項３６１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６３】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項３６１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６４】
前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項３６１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６５】
前記第７のポリペプチドおよび前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３６１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６６】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一であり、前記第７のポリペプチドおよび前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３６１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６７】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６８】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３６９】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７０】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３７１】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７２】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第７のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第７のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第５のＦｃドメイン単量体および前記第８のＦｃドメイン単量体が、前記第５のＦｃドメイン単量体と前記第８のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第９のＦｃドメイン単量体が、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第９のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第６のＦｃドメイン単量体および前記第１０のＦｃドメイン単量体が、前記第６のＦｃドメイン単量体と前記第１０のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３６１〜３６６のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７３】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３７１に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７４】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３７２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７５】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第２のＦｃドメイン単量体と第３のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第５のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第６のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、
ｖ）第４のＦｃドメイン単量体と第５のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー、および
ｖｉ）第５のＦｃドメイン単量体と第６のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第７のＦｃドメイン単量体を含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第８のＦｃドメイン単量体を含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第９のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第１０のＦｃドメイン単量体および第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと
を含み、
第１および第４のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第２および第７のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第５および第８のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第３および第９のＦｃドメイン単量体は一緒に、第４のＦｃドメインを形成し、第６および第１０のＦｃ単量体は一緒に、第５のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３７６】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第３のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体および第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインを含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインを含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと
を含み、
第１および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第３および第６のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第４のＦｃドメイン単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒になって、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３７７】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項２０２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７８】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項２０２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３７９】
前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項２０２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８０】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチドおよび前記第６のポリペプチドの配列が同一である、請求項２０２に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８１】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８２】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８３】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８４】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３８５】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８６】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３７６〜３８０のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８７】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３８５に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８８】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３８６に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３８９】
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第１のポリペプチドであって、
ｉ）第１のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第２のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）第１のＦｃドメイン単量体と第２のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第１のポリペプチドと、
ｂ）第２のポリペプチドであって、
ｉ）第３のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第４のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第２のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメイン、ならびに
ｉｖ）第３のＦｃドメイン単量体と第４のＦｃドメイン単量体を結合するリンカー
を含む、第２のポリペプチドと、
ｃ）第５のＦｃドメイン単量体および第３のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインを含む第３のポリペプチドと、
ｄ）第６のＦｃドメイン単量体および第４のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第４のポリペプチドと、
ｅ）第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第５のポリペプチドと、
ｆ）第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第６のポリペプチドと、
ｇ）第３のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第７のポリペプチドと、
ｈ）第４のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインを含む第８のポリペプチドと
を含み、
第１および第５のＦｃドメイン単量体は一緒に、第１のＦｃドメインを形成し、第３および第６のＦｃドメイン単量体は一緒に、第２のＦｃドメインを形成し、第２および第４のＦｃ単量体は一緒に、第３のＦｃドメインを形成し、第１のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第３のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインは一緒に、第１のＦａｂを形成し、第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第４のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成し、第３のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第１のＣＴＬＡ−４重鎖結合ドメインは一緒になって、第３のＦａｂを形成し、第４のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインおよび第２のＣＴＬＡ−４軽鎖結合ドメインは一緒に、第２のＦａｂを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項３９０】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一である、請求項３８９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９１】
前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一である、請求項３８９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９２】
前記第５のポリペプチド、前記第６のポリペプチド、前記第７のポリペプチド、および前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３８９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９３】
前記第１のポリペプチドおよび前記第２のポリペプチドの配列が同一であり、前記第３のポリペプチドおよび前記第４のポリペプチドの配列が同一であり、前記第５のポリペプチド、前記第６のポリペプチド、前記第７のポリペプチド、および前記第８のポリペプチドの配列が同一である、請求項３８９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９４】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９５】
前記Ｆｃドメイン単量体の各々の前記ＣＨ３ドメインが、ヒトＩｇＧ１のアミノ酸配列と比較して、最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９６】
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大１０、８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９７】
前記単一アミノ酸置換が、前記ＣＨ３ドメイン内のみにある、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン単量体。
【請求項３９８】
前記第２のＦｃドメイン単量体および前記第４のＦｃドメイン単量体が、前記第２のＦｃドメイン単量体と前記第４のＦｃドメイン単量体との間のホモ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項３９９】
前記第１のＦｃドメイン単量体および前記第５のＦｃドメイン単量体が、前記第１のＦｃドメイン単量体と前記第５のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含み、前記第３のＦｃドメイン単量体および前記第６のＦｃドメイン単量体が、前記第３のＦｃドメイン単量体と前記第６のＦｃドメイン単量体との間のヘテロ二量体形成を促進する最大８、７、６、５、４、３、２、または１つの単一アミノ酸置換を含む、請求項３８９〜３９３のいずれか一項に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項４００】
ホモ二量体形成を促進する前記置換が、表４Ａおよび表４Ｂ中の置換から選択される、請求項３９８に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項４０１】
ヘテロ二量体形成を促進する前記置換が、表３中の置換から選択される、請求項３９９に記載のＦｃ抗原ドメイン構築体。
【請求項４０２】
各リンカーが、
2021532085.tif 000158
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか３、またはそれからなる、請求項３１９〜４０１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０３】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＩ２５３位に置換を含む、請求項３１９〜４０１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０４】
ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸置換が独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択される、請求項４０３に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０５】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＲ２９２位に置換を含む、請求項３１９〜４０１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０６】
ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸置換が独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択される、請求項４５に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０５】
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択される置換を含む、請求項３１９〜４０１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【請求項４０５】
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２６）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、請求項３１９〜４０１のいずれか一項に記載のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２７】
本開示の第４、第５、第６、および第７の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、スペーサーである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列
2021532085.tif 000159
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、４〜３０（配列番号２２０）、８〜３０（配列番号２２１）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなるスペーサーである。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５２】
本開示の第９および第１０の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、スペーサーである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列
2021532085.tif 000160
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、４〜３０（配列番号２２０）、８〜３０（配列番号２２１）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなるスペーサーである。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００７７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００７７】
本開示の第１１および第１２の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、スペーサーである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列
2021532085.tif 000161
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、４〜３０（配列番号２２０）、８〜３０（配列番号２２１）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなるスペーサーである。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
本開示の第１３、第１４、および第１５の態様のいくつかの実施形態では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の１つ以上のリンカーは、スペーサーである。いくつかの実施形態では、スペーサーは、配列
2021532085.tif 000162
を有するポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、スペーサーは、グリシンスペーサー、例えば、４〜３０（配列番号２２０）、８〜３０（配列番号２２１）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなるスペーサー、例えば、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなるスペーサーである。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２４】
第４１の態様の様々な実施形態では、改変された突起を形成する変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、１、２、または３つの逆電荷変異をさらに含み、改変された突起を形成する変異および逆電荷変異は、ＣＨ３ドメイン内にあり、これらの変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、これらの変異は、単一アミノ酸変化であり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、
2021532085.tif 000163
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは独立して、４〜３０（配列番号２２０）、４〜２０（配列番号２２３）、８〜３０（配列番号２２１）、８〜２０（配列番号２２４）、１２〜２０（配列番号２２５）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択され、Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａであり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択され、Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐであり、各Ｆｃドメイン単量体は独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２６）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有し、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有し、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000164
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000165
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000166
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000167
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000168
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000169
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000170
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000171
（配列番号２３０）を含み、単一アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択され、Ｆｃドメイン単量体は各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択され、２つまたは４つの逆電荷変異は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択され；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ｓｃＦｖであり；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＬドメインをさらに含み；ＶＨドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のセットを含み；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含み；ＣＴＬＡ４結合ド��インは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１２９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１２９】
第４２の態様の様々な実施形態では、ＣＴＬＡ４結合ドメインは、抗体重鎖可変ドメインを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、抗体軽鎖可変ドメインを含み；第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂのものから選択される２つの逆電荷変異のセットまたは表４Ａおよび４Ｂのものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み；第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４ａおよび４ｂのものから選択される２つの逆電荷変異のセットまたは表４Ａおよび４Ｂのものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み；第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方は、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み；ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体はそれぞれ、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み；ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方はそれぞれ、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂのものから選択される２つの逆電荷変異のセットまたは表４Ａおよび４Ｂのものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み；ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方はそれぞれ、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第２のＩｇＧ１ドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂのものから選択される２つの逆電荷変異のセットまたは表４Ａおよび４Ｂのものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み；ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方はそれぞれ、表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第１のＩｇＧ１ドメイン単量体は、表４Ａおよび４Ｂのものから選択される２つの逆電荷変異のセットまたは表４Ａおよび４Ｂのものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み；表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、同一のＣＨ３ドメインを有し；表４Ａおよび４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異は、ＣＨ３ドメイン内にあり；変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり；変異はそれぞれ、単一アミノ��変化であり；変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４６位（両端を含む）の配列内にあり；変異は、単一アミノ酸変化であり；第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、
2021532085.tif 000172
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは独立して、４〜３０（配列番号２２０）、４〜２０（配列番号２２３）、８〜３０（配列番号２２１）、８〜２０（配列番号２２４）、１２〜２０（配列番号２２５）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択され、Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａであり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択され、Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐであり、各Ｆｃドメイン単量体は独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２６）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有し、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有し、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000173
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000174
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000175
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000176
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000177
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000178
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000179
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000180
（配列番号２３０）を含み、単一アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択され、Ｆｃドメイン単量体は各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択され、２つまたは４つの逆電荷変異は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択され；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ｓｃＦｖであり；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＶＬドメインをさらに含み；ＶＨドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のセットを含み；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列とＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインとを含み、ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含み；ＣＴＬＡ４結合ドメインは、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ１抗体定常ドメインを含み；ＣＴＬＡ４結合ド��インは、ＶＨドメインおよびＣＨ１ドメインを含み、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３４】
第４３の態様の様々な実施形態では、改変された突起を形成する変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、１、２、または３つの逆電荷変異をさらに含み、改変された突起を形成する変異および逆電荷変異は、ＣＨ３ドメイン内にあり、変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、変異は、単一アミノ酸変化であり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、
2021532085.tif 000181
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは独立して、４〜３０（配列番号２２０）、４〜２０（配列番号２２３）、８〜３０（配列番号２２１）、８〜２０（配列番号２２４）、１２〜２０（配列番号２２５）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択され、Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａであり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択され、Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐであり、各Ｆｃドメイン単量体は独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２６）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有し、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有し、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000182
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000183
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000184
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000185
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000186
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000187
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000188
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000189
（配列番号２３０）を含み、単一アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択され、Ｆｃドメイン単量体は各々独立して、最大１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４２、４３、４５、および４７のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み、単一アミノ酸置換のうちの最大６つが、ＣＨ３ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり、単一アミノ酸置換は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、およびＴ３９４Ｆからなる群から選択され、２つまたは４つの逆電荷変異は、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒから選択される。
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１３６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１３６】
第４４の態様の様々な実施形態では、ポリペプチドは、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ１ドメインまたは第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端にｓｃＦｖをさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、表４ａおよび表４ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方は、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体、および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第１のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第２のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、ポリペプチドは、第３のリンカーおよび第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体をさらに含み、第２のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体および第３のＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含み、第１のＩｇＧ１ドメイン単量体が、表４Ａおよび表４Ｂ中のものから選択される２つの逆電荷変異のセット、または表４Ａおよび表４ＢＢ中のものから選択される４つの逆電荷変異のセットを含み、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異を含むＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、同一のＣＨ３ドメインを有し、表４Ａおよび表４Ｂから選択される１、２、または３つの逆電荷アミノ酸変異は���ＣＨ３ドメイン内にあり、変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり、変異は各々、単一アミノ酸変化であり、変異は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４６位（両端を含む）の配列内にあり、変異は、単一アミノ酸変化であり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、
2021532085.tif 000190
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、グリシンスペーサーであり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは独立して、４〜３０（配列番号２２０）、４〜２０（配列番号２２３）、８〜３０（配列番号２２１）、８〜２０（配列番号２２４）、１２〜２０（配列番号２２５）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン残基からなり、第２のリンカーおよび任意選択の第３のリンカーは、２０個のグリシン残基（配列番号２３）からなり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＩ２５３位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸変異は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択され、Ｉ２５３位の各アミノ酸変異は、Ｉ２５３Ａであり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つは、ＥＵのＲ２９２位に単一アミノ酸変異を含み、ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸変異は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択され、Ｒ２９２位の各アミノ酸変異は、Ｒ２９２Ｐであり、各Ｆｃドメイン単量体は独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２６）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有し、第１のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬ（配列番号２２８）を有し、第２のＦｃドメイン単量体および第３のＦｃドメイン単量体のヒンジ部分は、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）を有し、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは独立して、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000191
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000192
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、２つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000193
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ２ドメインは同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000194
（配列番号２２９）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、１０個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000195
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、８つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000196
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、６つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000197
（配列番号２３０）を含み、各Ｆｃドメイン単量体のＣＨ３ドメインは独立して、５つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000198
（配列番号２３０）を含み、単一アミノ酸置換は、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択され；Ｆｃドメイン単量体の各々は独立して、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４５、および最大で１０個の単一アミノ酸置換を有する配列番号４５のうちのいずれかのアミノ酸配列を含み；単一アミノ酸置換のうちの最大で６つが、ＣＨ３ドメイン中の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異であり；単一アミノ酸置換は、ＥＵのＧ３４１位〜ＥＵのＫ４４７位（両端を含む）の配列内にあり；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３のセットを含み；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み；ＶＨドメインは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含み、ＶＨ配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列を含み；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表１に記載されるＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列のセットを含み；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を含み；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、およびＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメインと、表２に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含み、ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列は、ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３、ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、およびＣＤＲ−Ｌ３の配列を除き、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも９５％または９８％同一であり；ＶＨドメインまたはｓｃＦｖは、表２に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む。
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５９】
様々な実施形態では、各リンカーは、
2021532085.tif 000199
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか３、またはそれからなり、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＩ２５３位に置換を含み、ＥＵのＩ２５３位の各アミノ酸置換は独立して、Ｉ２５３Ａ、Ｉ２５３Ｃ、Ｉ２５３Ｄ、Ｉ２５３Ｅ、Ｉ２５３Ｆ、Ｉ２５３Ｇ、Ｉ２５３Ｈ、Ｉ２５３Ｉ、Ｉ２５３Ｋ、Ｉ２５３Ｌ、Ｉ２５３Ｍ、Ｉ２５３Ｎ、Ｉ２５３Ｐ、Ｉ２５３Ｑ、Ｉ２５３Ｒ、Ｉ２５３Ｓ、Ｉ２５３Ｔ、Ｉ２５３Ｖ、Ｉ２５３Ｗ、およびＩ２５３Ｙからなる群から選択され、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、ＥＵのＲ２９２位に置換を含み、ＥＵのＲ２９２位の各アミノ酸置換は独立して、Ｒ２９２Ｄ、Ｒ２９２Ｅ、Ｒ２９２Ｌ、Ｒ２９２Ｐ、Ｒ２９２Ｑ、Ｒ２９２Ｒ、Ｒ２９２Ｔ、およびＲ２９２Ｙからなる群から選択され、Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも１つが、Ｔ３６６Ｙ、Ｔ３６６Ｗ、Ｔ３９４Ｗ、Ｔ３９４Ｙ、Ｆ４０５Ｗ、Ｆ４０５Ａ、Ｙ４０７Ａ、Ｓ３５４Ｃ、Ｙ３４９Ｔ、Ｔ３９４Ｆ、Ｋ４０９Ｄ、Ｋ４０９Ｅ、Ｋ３９２Ｄ、Ｋ３９２Ｅ、Ｋ３７０Ｄ、Ｋ３７０Ｅ、Ｄ３９９Ｋ、Ｄ３９９Ｒ、Ｅ３５７Ｋ、Ｅ３５７Ｒ、Ｄ３５６Ｋ、およびＤ３５６Ｒからなる群から選択される置換を含み、各Ｆｃドメイン単量体のヒンジは独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２６）およびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬ（配列番号２２７）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６１】
定義：
本明細書に記載される場合、「Ｆｃドメイン単量体」という用語は、少なくともヒンジドメイン、ならびに第２および第３の抗体定常ドメイン（ＣＨ２およびＣＨ３）、またはそれらの機能性断片（例えば、少なくともヒンジドメインまたはその機能性断片、ＣＨ２ドメインまたはその機能性断片、およびＣＨ３ドメインまたはその機能性断片）（例えば、（ｉ）別のＦｃドメイン単量体と二量体形成してＦｃドメインを形成し、そして（ｉｉ）Ｆｃ受容体に結合することができる断片）を含むポリペプチド鎖を指す。好ましいＦｃドメイン単量体は、アミノ末端からカルボキシ末端へ、ＩｇＧ１ヒンジ、ＩｇＧ１  ＣＨ２ドメインおよびＩｇＧ１  ＣＨ３ドメインの少なくとも一部分を含む。したがって、Ｆｃドメイン単量体、例えば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体は、Ｅ３１６〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｐ３１７〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３１８〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３１８〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｓ３１９〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｃ３２０〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｄ３２１〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３２２〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｔ３２３〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｋ３２３〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｈ３２４〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、Ｔ３２５〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７、またはＣ３２６〜Ｇ４４６もしくはＫ４４７にわたることができる。Ｆｃドメイン単量体は、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＡまたはＩｇＤを含む、任意の免疫グロブリン抗体アイソタイプとすることが可能である（例えば、ＩｇＧ）。さらに、Ｆｃドメイン単量体は、ＩｇＧサブタイプ（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４）であり得る（例えば、ヒトＩｇＧ１）。ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメイン単量体が、本明細書に記載される実施例において使用される。ヒトＩｇＧ１の完全ヒンジドメインは、ＥＵナンバリングＥ３１６〜Ｐ２３０またはＬ２３５にわたり、ＣＨ２ドメインは、Ａ２３１またはＧ２３６〜Ｋ３４０にわたり、ＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１〜Ｋ４４７にわたる。ヒンジドメインの最後のアミノ酸の位置については異なる見解がある。それは、Ｐ２３０またはＬ２３５のいずれかである。本明細書の多くの実施例において、ＣＨ３ドメインはＫ３４７を含まない。ゆえにＣＨ３ドメインは、Ｇ３４１〜Ｇ４４６であってもよい。本明細書の多くの実施例において、ヒンジドメインは、Ｅ２１６〜Ｌ２３５を含み得る。これは、例えば、ヒンジがＣＨ１ドメインまたはＣＴＬＡ−４結合ドメインに対してアミノ末端であるときに当てはまる。例えばヒンジがポリペプチドのアミノ末端であるときなどのいくつかの事例では、ＥＵナンバリング２２１のＡｓｐは、Ｇｌｎに変異される。Ｆｃドメイン単量体は、抗原認識領域、例えば可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）として機能することが可能である、免疫グロブリンの部分を何も含まない。Ｆｃドメイン単量体は、野生型（例えば、ヒト）Ｆｃドメイン単量体配列からの変更を１０程度（例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４のアミノ酸置換、付加、または欠失）含有することが可能であり、該変更は、ＦｃドメインとＦｃ受容体との間の相互作用を変える。Ｆ���ドメイン単量体は、野生型Ｆｃドメイン単量体配列（例えば、１〜１０、１〜８、１〜６、１〜４のアミノ酸置換、付加または欠失）からの変更（例えば、単一アミノ酸置換）を１０程度含有することが可能であり、当該変更は、Ｆｃドメイン単量体間の相互作用を変える。特定の実施形態では、以下のヒトＩｇＧ１  ＣＨ３ドメイン配列と比較して、ＣＨ３ドメイン上に、最大で１０、８、６または５つの単一アミノ酸置換が存在する：
2021532085.tif 000200
（配列番号２３０）。好適な変更の例は、この技術分野で既知である。
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
本明細書で使用される場合、「グリシンスペーサー」という用語は、２つのＦｃドメイン単量体を直列に連結する、グリシンのみを含有するリンカーを指す。グリシンスペーサーは、少なくとも４（配列番号１９）、８（配列番号２０）、または１２個（配列番号２１）のグリシン（例えば、４〜３０（配列番号２２０）、８〜３０（配列番号２２１）、または１２〜３０個（配列番号２２２）のグリシン、例えば、１２〜３０個（配列番号２２２）、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０個のグリシン（配列番号２２０））を含有し得る。いくつかの実施形態では、グリシンスペーサーは、ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ（配列番号２７）の配列を有する。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２１９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２１９】
（表２）ＶＨおよびＶＬ配列
2021532085.tif 000201
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７０】
いくつかの実施形態では、２つのＦｃドメイン単量体間のスペーサーは、グリシン残基のみを含有し、例えば、少なくとも４つのグリシン残基（例えば、４〜２００（配列番号２３４）、４〜１８０（配列番号２３５）、４〜１６０（配列番号２３６）、４〜１４０（配列番号２３７）、４〜４０（配列番号２３８）、４〜１００（配列番号２３９）、４〜９０（配列番号２４０）、４〜８０（配列番号２４１）、４〜７０（配列番号２４２）、４〜６０（配列番号２４３）、４〜５０（配列番号２４４）、４〜４０（配列番号２３８）、４〜３０（配列番号２２０）、４〜２０（配列番号２２３）、４〜１９（配列番号２４５）、４〜１８（配列番号２４６）、４〜１７（配列番号２４７）、４〜１６（配列番号２４８）、４〜１５（配列番号２４９）、４〜１４（配列番号２５０）、４〜１３（配列番号２５１）、４〜１２（配列番号２５２）、４〜１１（配列番号２５３）、４〜１０（配列番号２５４）、４〜９（配列番号２５５）、４〜８（配列番号２５６）、４〜７（配列番号２５７）、４〜６（配列番号２５８）または４〜５（配列番号２５９）のグリシン残基）（例えば、４〜２００（配列番号２３４）、６〜２００（配列番号２６０）、８〜２００（配列番号２６１）、１０〜２００（配列番号２６２）、１２〜２００（配列番号２６３）、１４〜２００（配列番号２６４）、１６〜２００（配列番号２６５）、１８〜２００（配列番号２６６）、２０〜２００（配列番号２６７）、３０〜２００（配列番号２６８）、４０〜２００（配列番号２６９）、５０〜２００（配列番号２７０）、６０〜２００（配列番号２７１）、７０〜２００（配列番号２７２）、８０〜２００（配列番号２７３）、９０〜２００（配列番号２７４）、１００〜２００（配列番号２７５）、１２０〜２００（配列番号２７６）、１４０〜２００（配列番号２７７）、１６０〜２００（配列番号２７８）、１８０〜２００（配列番号２７９）、または１９０〜２００（配列番号２８０）のグリシン残基）を含有する。ある実施形態では、スペーサーは、４〜３０（配列番号２２０）のグリシン残基（例えば、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９または３０のグリシン残基（配列番号２２０））を有する。いくつかの実施形態では、グリシン残基のみを含有するスペーサーは、グリコシル化（例えば、Ｏ−結合型グリコシル化、Ｏ−グリコシル化とも称する）されていないものであり得るか、または、例えば１つ以上のセリン残基を含有するスペーサー（例えば、ＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧＳＧＧＧ（配列番号１８）と比較して、低減されたレベルのグリコシル化（例えば、低減されたレベルのＯ−グリコシル化）（例えば、キシロース、マンノース、シアル酸、フコース（Ｆｕｃ）および／またはガラクトース（Ｇａｌ）などのグリカン（例えば、キシロース）による低減したレベルのＯ−グリコシル化）を有し得る。
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９３】
いくつかの事例では、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体は、１つ以上の精製用ペプチドに連結して、例えば全細胞溶解混合物からの、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の精製および単離を促進することが可能である。いくつかの実施形態では、精製用ペプチドは、精製用ペプチドに対して特異的な親和性を有する別の部分と結合する。いくつかの実施形態では、精製用ペプチドと特異的に結合するこうした部分は、基剤、樹脂またはアガロースビーズなどの固相支持体に付加する。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体に結合され得る精製用ペプチドの例としては、ヘキサヒスチジン（配列番号３８）ペプチド、ＦＬＡＧペプチド、ｍｙｃペプチドおよび赤血球凝集素（ＨＡ）ペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。ヘキサヒスチジン（配列番号３８）ペプチド（ＨＨＨＨＨＨ（配列番号３８））は、マイクロモル親和性をもつニッケル官能性アガロースアフィニティーカラムと結合する。いくつかの実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３９）を含む。いくつかの実施形態では、ＦＬＡＧペプチドは、直列にした、整数倍にした配列ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号３９）、例えば３×ＤＹＫＤＤＤＤＫ（配列番号２８１）を含む。いくつかの実施形態では、ｍｙｃペプチドは、配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号４０）を含む。いくつかの実施形態では、ｍｙｃペプチドは、直列にした、整数倍にした配列ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号４０）、例えば３×ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ（配列番号２８２）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡペプチドは、配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４１）を含む。いくつかの実施形態では、ＨＡペプチドは、直列にした、整数倍にした配列ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号４１）、例えば３×ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ（配列番号２８３）を含む。ＦＬＡＧ、ｍｙｃまたはＨＡの精製用ペプチドに対して特異的に認識かつ結合する抗体は、この技術分野で周知であり、しばしば市販されている。これらの抗体により機能化された固相支持体（例えば、基剤、樹脂またはアガロースビーズ）を用いて、ＦＬＡＧ、ｍｙｃまたはＨＡペプチドを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することができる。
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１４】
（表５）構築体７（ＣＴＬＡ−４）配列
2021532085.tif 000202
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１７】
実施例２．ＣＴＬＡ−４結合ドメインを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体１３の設計および精製
タンパク質発現
分岐点がＣ末端Ｆｃドメインにある単独で分岐したＦｃドメインから形成された構築体を、以下に記載されるように作製した。Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体１３（ＣＴＬＡ−４）は、各々、２つの別個のＦｃドメイン単量体含有ポリペプチド（抗ＣＴＬＡ−４長鎖Ｆｃの２つのコピー（配列番号ＺＺのいずれか１つ、および短鎖Ｆｃ（配列番号ＺＺ）の２つのコピー）と、抗ＣＴＬＡ−４軽鎖ポリペプチド（配列番号ＺＺ）の２つのコピーとを含む。長鎖Ｆｃは、電荷変異（Ｋ４０９Ｄ／Ｄ３９９Ｋ変異）Ｆｃドメイン単量体（ホモ二量体化を促進する）を、Ｅ３５７Ｋ電荷変異ならびにＳ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ突起形成変異（ヘテロ二量体化を促進する）を有するＦｃドメイン単量体とともに、直列に連続して含み、Ｎ末端で抗ＣＴＬＡ−４  ＶＨおよびＣＨ１ドメイン（ＥＵの１〜２２０位）（構築体１３（ＣＴＬＡ−４））を含む。短鎖Ｆｃは、Ｋ３７０Ｄ電荷変異、ならびにＹ３４９Ｃ、Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、およびＹ４０７Ｖ空洞形成変異（ヘテロ二量体形成を促進するため）を含有する。抗ＣＴＬＡ−４軽鎖ならびに抗ＣＴＬＡ−４  ＶＨおよびＣＨ１は、抗ＣＴＬＡ４  ｍＡｂから取られる。ＣＴＬＡ−４軽鎖はまた、ｓｃＦｖの一部として長鎖ＦｃのＮ末端に融合されて発現され得る。他の型の構築体１３は、抗ＣＴＬＡ−４重鎖とともに作製され得、各型は、長鎖Ｆｃポリペプチド中のＦｃドメイン単量体間に異なる大きさのグリシンスペーサー（Ｇ４（配列番号１９）、Ｇ１０（配列番号２５）、Ｇ１５（配列番号２６）、またはＧ２０（配列番号２３）リンカー）を保有する。ＤＮＡ配列は、哺乳動物細胞での発現に最適化され、ｐｃＤＮＡ３．４哺乳動物発現ベクター内にクローニングされた。ＤＮＡプラスミド構築体はリポソームを介して、ヒト胎生腎（ＨＥＫ）２９３細胞にトランスフェクトされた。以下の構築体の各々のアミノ酸配列は、３つの別個のプラスミド（１つのプラスミドは軽鎖（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは長鎖Ｆｃ（抗ＣＴＬＡ−４）をコードし、１つのプラスミドは短鎖Ｆｃをコードする）によりコードされた。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１８】
（表６）構築体１３（ＣＴＬＡ−４）配列
2021532085.tif 000203
2021532085.tif 000204
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５１】
（表７）構築体４（ＣＴＬＡ４）配列
2021532085.tif 000205
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５４】
（表８）構築体８（ＣＴＬＡ４）配列
2021532085.tif 000206
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５８】
（表９）構築体９（ＣＴＬＡ−４）配列
2021532085.tif 000207
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６０】
（表１０）構築体１０（ＣＴＬＡ４）配列
2021532085.tif 000208
2021532085.tif 000209
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６２】
（表１１）構築体１６（ＣＴＬＡ４）配列
2021532085.tif 000210
2021532085.tif 000211
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６４】
（表１２）構築体１９（ＣＴＬＡ−４）配列
2021532085.tif 000212
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３６８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３６８】
（表１３）ＣＴＬＡ−４でトランスフェクトされたＨＥＫ細胞を含む抗ＣＴＬＡ−４構築体のＣＤＣ活性
2021532085.tif 000213
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０（配列番号２３）リンカーを含んだ。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７０】
（表１４）ＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４細胞を含む抗ＣＴＬＡ−４構築体のＡＤＣＰ活性
2021532085.tif 000214
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０（配列番号２３）リンカーを含んだ。
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７２】
（表１５）ＨＥＫ−ＣＴＬＡ−４細胞を含む抗ＣＴＬＡ−４構築体のＡＤＣＣ活性
2021532085.tif 000215
１別段の記載がない限り、すべての構築体はＧ２０（配列番号２３）リンカーを含んだ。
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０３】
本明細書で使用される場合、断片という用語、および部分という用語は、相互交換可能に使用され得る。
[本発明1001]
ＣＴＬＡ4結合ドメインと、リンカーによって第2のＦｃドメインに結合された第1のＦｃドメインとを含むＦｃ抗原結合ドメイン構築体であって、前記第1および第2のＦｃドメインの各々が、ヘテロ二量体化選択性モジュールまたはホモ二量体化選択性モジュールのいずれかを含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1002]
ＣＴＬＡ結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；第2のリンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；任意選択の第3のリンカー；ならびにヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む任意選択の第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも2つのＦｃドメイン単量体が、ヘテロ二量体化選択性モジュールまたはホモ二量体化選択性モジュールのいずれかを含む、ポリペプチド。
[本発明1003]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1004]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1005]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含み、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1006]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1007]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第2のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1008]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が各々、改変された突起を形成する変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1009]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1010]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第2のＩｇＧ1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1011]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第1のＩｇＧ1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1012]
改変された突起を形成する変異を含む前記ＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷変異をさらに含む、本発明1002〜1011のいずれかのポリペプチド。
[本発明1013]
前記改変された突起を形成する変異および前記逆電荷変異が、ＣＨ3ドメイン内にある、本発明1002〜1012のいずれかのポリペプチド。
[本発明1014]
前記変異が、ＥＵのＧ341位〜ＥＵのＫ447位（両端を含む）の配列内にある、本発明1013のポリペプチド。
[本発明1015]
前記変異が、単一アミノ酸変化である、本発明1002〜1013のいずれかのポリペプチド。
[本発明1016]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、
2021532085.tif 000216
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1017]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、グリシンスペーサーである、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1018]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1019]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1020]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、ＥＵのＩ253位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1002〜1019のいずれかのポリペプチド。
[本発明1021]
ＥＵのＩ253位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ253Ａ、Ｉ253Ｃ、Ｉ253Ｄ、Ｉ253Ｅ、Ｉ253Ｆ、Ｉ253Ｇ、Ｉ253Ｈ、Ｉ253Ｉ、Ｉ253Ｋ、Ｉ253Ｌ、Ｉ253Ｍ、Ｉ253Ｎ、Ｉ253Ｐ、Ｉ253Ｑ、Ｉ253Ｒ、Ｉ253Ｓ、Ｉ253Ｔ、Ｉ253Ｖ、Ｉ253Ｗ、およびＩ253Ｙからなる群から選択される、本発明1020のポリペプチド。
[本発明1022]
Ｉ253位の各アミノ酸変異が、Ｉ253Ａである、本発明1021のポリペプチド。
[本発明1023]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、ＥＵのＲ292位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1002〜1022のいずれかのポリペプチド。
[本発明1024]
ＥＵのＲ292位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ292Ｄ、Ｒ292Ｅ、Ｒ292Ｌ、Ｒ292Ｐ、Ｒ292Ｑ、Ｒ292Ｒ、Ｒ292Ｔ、およびＲ292Ｙからなる群から選択される、本発明1023のポリペプチド。
[本発明1025]
Ｒ292位の各アミノ酸変異が、Ｒ292Ｐである、本発明1024のポリペプチド。
[本発明1026]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、本発明1002〜1025のいずれかのポリペプチド。
[本発明1027]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1028]
前記第1のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有する、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1029]
前記第1のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、本発明1026のポリペプチド。
[本発明1030]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000217
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1031]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000218
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1032]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、2つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000219
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1033]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000220
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1034]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000221
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1035]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000222
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1036]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000223
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1037]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000224
を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1038]
前記単一アミノ酸置換が、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、Ｔ394Ｆ、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｒからなる群から選択される、本発明1030〜1037のいずれかのポリペプチド。
[本発明1039]
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1002〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1040]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、前記ＣＨ3ドメイン内の逆電荷変異であるか、または改変された突起を形成する変異である、本発明1039のポリペプチド。
[本発明1041]
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ341位〜ＥＵのＫ447位（両端を含む）の配列内にある、本発明1039のポリペプチド。
[本発明1042]
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも1つが、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、およびＴ394Ｆからなる群から選択される、本発明1002のポリペプチド。
[本発明1043]
前記2つまたは4つの逆電荷変異が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｒから選択される、本発明1005、1006、および1009〜1029のいずれかのポリペプチド。
[本発明1044]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ｓｃＦｖである、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1045]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含む、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1046]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、本発明1043のポリペプチド。
[本発明1047]
前記ＶＨドメインが、表1に記載のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1048]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1049]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3配列を除き、表2に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも95％または98％同一である、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1050]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1051]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表1に記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1052]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1053]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含むＶＨドメイン、ならびに表2に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3を含むＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を除き、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1054]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、本発明1045のポリペプチド。
[本発明1055]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ1抗体定常ドメインを含む、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1056]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含み、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる、本発明1002〜1043のいずれかのポリペプチド。
[本発明1057]
前記第1または第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合される本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドの2つのコピーを含む、ポリペプチド複合体。
[本発明1058]
ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含むＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドに結合される本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第2のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第1、第2、または第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内のシステイン残基と前記第2のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合される、
ポリペプチド複合体。
[本発明1059]
前記第2のポリペプチド単量体が、改変された空洞を形成する変異を含む、本発明1058のポリペプチド複合体。
[本発明1060]
前記改変された空洞を形成する前記変異が、Ｙ407Ｔ、Ｙ407Ａ、Ｆ405Ａ、Ｔ394Ｓ、Ｔ394Ｗ／Ｙ407Ａ、Ｔ366Ｗ／Ｔ394Ｓ、Ｔ366Ｓ／Ｌ368Ａ／Ｙ407Ｖ／Ｙ349Ｃ、Ｓ364Ｈ／Ｆ405Ａからなる群から選択される、本発明1059のポリペプチド複合体。
[本発明1061]
前記第2のポリペプチドが、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1058〜1060のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1062]
ＣＴＬＡ4結合ドメイン；リンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；第2のリンカー；ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体；任意選択の第3のリンカー；ならびにヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む任意選択の第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも1つのＦｃドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、ポリペプチド。
[本発明1063]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、抗体重鎖可変ドメインを含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1064]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、抗体軽鎖可変ドメインを含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1065]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4Ａ中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4Ｂ中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含み、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4Ａおよび表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1066]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4Ａおよび表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4Ａおよび表4ＢＡおよび表4Ｂ中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4Ｂ中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1067]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第2のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表4Ａおよび表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1068]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が各々、表4Ａおよび表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1069]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表4Ａおよび表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4Ａ中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4Ｂ中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1070]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表4Ａおよび表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第2のＩｇＧ1ドメイン単量体が、表4Ａ中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4Ｂ中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1071]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表4Ａおよび表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第1のＩｇＧ1ドメイン単量体が、表4Ａ中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4Ｂ中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1062のポリペプチド。
[本発明1072]
表4から選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む前記ＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、同一のＣＨ3ドメインを有する、本発明1062〜1071のいずれかのポリペプチド。
[本発明1073]
表4から選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異が、ＣＨ3ドメインにある、本発明1062〜1072のいずれかのポリペプチド。
[本発明1074]
前記変異が、ＥＵのＧ341位〜ＥＵのＫ447位（両端を含む）の配列内にある、本発明1073のポリペプチド。
[本発明1075]
前記変異が各々、単一アミノ酸変化である、本発明1062〜1073のいずれかのポリペプチド。
[本発明1076]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、
2021532085.tif 000225
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、本発明1072のポリペプチド。
[本発明1077]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、グリシンスペーサーである、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1078]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1079]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1080]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、ＥＵのＩ253位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1062〜1079のポリペプチド。
[本発明1081]
ＥＵのＩ253位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ253Ａ、Ｉ253Ｃ、Ｉ253Ｄ、Ｉ253Ｅ、Ｉ253Ｆ、Ｉ253Ｇ、Ｉ253Ｈ、Ｉ253Ｉ、Ｉ253Ｋ、Ｉ253Ｌ、Ｉ253Ｍ、Ｉ253Ｎ、Ｉ253Ｐ、Ｉ253Ｑ、Ｉ253Ｒ、Ｉ253Ｓ、Ｉ253Ｔ、Ｉ253Ｖ、Ｉ253Ｗ、およびＩ253Ｙからなる群から選択される、本発明1080のポリペプチド。
[本発明1082]
Ｉ253位の各アミノ酸変異が、Ｉ253Ａである、本発明1081のポリペプチド。
[本発明1083]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、ＥＵのＲ292位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1062〜1082のいずれかのポリペプチド。
[本発明1084]
ＥＵのＲ292位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ292Ｄ、Ｒ292Ｅ、Ｒ292Ｌ、Ｒ292Ｐ、Ｒ292Ｑ、Ｒ292Ｒ、Ｒ292Ｔ、およびＲ292Ｙからなる群から選択される、本発明1083のポリペプチド。
[本発明1085]
Ｒ292位の各アミノ酸変異が、Ｒ292Ｐである、本発明1084のポリペプチド。
[本発明1086]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、本発明1062〜1085のいずれかのポリペプチド。
[本発明1087]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1088]
前記第1のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1089]
前記第1のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、本発明1086のポリペプチド。
[本発明1090]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000226
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1091]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000227
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1092]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000228
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1093]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000229
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1094]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000230
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1095]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000231
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1096]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000232
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1097]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000233
を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1098]
前記単一アミノ酸置換が、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、Ｔ394Ｆ、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｒからなる群から選択される、本発明1090〜1097のいずれかのポリペプチド。
[本発明1099]
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1062〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1100]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、前記ＣＨ3ドメイン内の逆電荷変異である、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1101]
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ341位〜ＥＵのＫ447位（両端を含む）の配列内にある、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1102]
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも1つが、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、およびＴ394Ｆからなる群から選択される、本発明1062のポリペプチド。
[本発明1103]
前記2つまたは4つの逆電荷変異が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｒから選択される、本発明1065、1066、および1069〜1089のいずれかのポリペプチド。
[本発明1104]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ｓｃＦｖである、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1105]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含む、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1106]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、本発明1103のポリペプチド。
[本発明1107]
前記ＶＨドメインが、表1に記載のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1108]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1109]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3配列を除き、表2に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも95％または98％同一である、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1110]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1111]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表1に記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1112]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1113]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含むＶＨドメイン、ならびに表2に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3を含むＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を除き、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも95％または98％同一である、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1114]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、本発明1105のポリペプチド。
[本発明1115]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ1抗体定常ドメインを含む、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1116]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含み、ＶＬドメインおよびＣＬドメインを含むポリペプチドに結合して、Ｆａｂを形成することができる、本発明1062〜1103のいずれかのポリペプチド。
[本発明1117]
前記第1または第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジ内のシステイン残基間のジスルフィド結合によって結合される本発明1002〜1056のいずれかのポリペプチドの2つのコピーを含む、ポリペプチド複合体。
[本発明1118]
ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含むＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドに結合される本発明1062〜1116のいずれかのポリペプチドを含む、ポリペプチド複合体であって、
前記ポリペプチドと前記第2のポリペプチドが、前記ポリペプチドの前記第1、第2、または第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジドメイン内のシステイン残基と前記第2のポリペプチドの前記ヒンジドメイン内のシステイン残基との間のジスルフィド結合によって結合される、
ポリペプチド複合体。
[本発明1119]
前記第2のポリペプチド単量体が、1、2、または3つの逆電荷変異を含む、本発明1118のポリペプチド複合体。
[本発明1120]
前記第2のポリペプチド単量体が、表4から選択される1、2、または3つの逆電荷変異を含み、かつポリペプチド中の表4から選択される1、2、または3つの逆電荷変異に対して相補的である、本発明1119のポリペプチド複合体。
[本発明1121]
前記第2のポリペプチドが、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1118〜1120のいずれかのポリペプチド複合体。
[本発明1122]
ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、第2のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、任意選択の第3のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む任意選択の第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも1つのＦｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、ポリペプチド。
[本発明1123]
前記第1のＩｇＧ1単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ1ドメインをさらに含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1124]
前記第1のＩｇＧ1単量体のアミノ末端にｓｃＦｖをさらに含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1125]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含み、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1126]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、改変された突起を形成する変異を含み、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1127]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第2のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、改変された突起を形成する変異を含む、本発明1122のポリペプチド。
[本発明1128]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が各々、改変された突起を形成する変異を含む、
本発明1002のポリペプチド。
[本発明1129]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1130]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第2のＩｇＧ1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1131]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、改変された突起を形成する変異を含み、前記第1のＩｇＧ1ドメイン単量体が、2つまたは4つの逆電荷変異を含む、
本発明1122のポリペプチド。
[本発明1132]
改変された突起を形成する変異を含む前記ＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷変異をさらに含む、本発明1122〜1131のいずれかのポリペプチド。
[本発明1133]
前記改変された突起を形成する変異および前記逆電荷変異が、前記ＣＨ3ドメイン内にある、本発明1122〜1131のいずれかのポリペプチド。
[本発明1134]
ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、第2のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、任意選択の第3のリンカーと、ヒンジドメイン、ＣＨ2ドメイン、およびＣＨ3ドメインを含む任意選択の第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と
を含む、ポリペプチドであって、
少なくとも1つのＦｃドメイン単量体が、1、2、または3つの逆電荷アミノ酸修飾を含む、ポリペプチド。
[本発明1135]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端に抗体重鎖可変ドメインおよびＣＨ1ドメインをさらに含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1136]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体のアミノ末端にｓｃＦｖをさらに含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1137]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4Ａ中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表6中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含み、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1138]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4から選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、表4Ａ中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4Ｂ中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1139]
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第2のＩｇＧ定常ドメイン単量体の両方が、表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、本発明1134のポリペプチド。
[本発明1140]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体、および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が各々、表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1141]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表4Ａまたは表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第3のＩｇＧ1ドメイン単量体が、表4Ａ中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4Ｂ中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1142]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第1のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表4Ａまたは表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第2のＩｇＧ1ドメイン単量体が、表4Ａ中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4Ｂ中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1143]
第3のリンカーと、第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体と、を含み、
前記第2のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体および前記第3のＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体の両方が各々、表4Ａまたは表4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含み、前記第1のＩｇＧ1ドメイン単量体が、表4Ａ中のものから選択される2つの逆電荷変異のセット、または表4Ｂ中のものから選択される4つの逆電荷変異のセットを含む、
本発明1134のポリペプチド。
[本発明1144]
表4Ａまたは4Ｂから選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異を含む前記ＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、同一のＣＨ3ドメインを有する、本発明1134〜1143のいずれかのポリペプチド。
[本発明1145]
表4から選択される1、2、または3つの逆電荷アミノ酸変異が、ＣＨ3ドメインにある、本発明1134〜1143のいずれかのポリペプチド。
[本発明1146]
前記変異が、ＥＵのＧ341位〜ＥＵのＫ447位（両端を含む）の配列内にある、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1147]
前記変異が各々、単一アミノ酸変化である、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1148]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、
2021532085.tif 000234
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1149]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが独立して、4〜30、4〜20、8〜30、8〜20、12〜20、または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1150]
前記第2のリンカーおよび前記任意選択の第3のリンカーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1151]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、ＥＵのＩ253位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1152]
ＥＵのＩ253位の各アミノ酸変異が独立して、Ｉ253Ａ、Ｉ253Ｃ、Ｉ253Ｄ、Ｉ253Ｅ、Ｉ253Ｆ、Ｉ253Ｇ、Ｉ253Ｈ、Ｉ253Ｉ、Ｉ253Ｋ、Ｉ253Ｌ、Ｉ253Ｍ、Ｉ253Ｎ、Ｉ253Ｐ、Ｉ253Ｑ、Ｉ253Ｒ、Ｉ253Ｓ、Ｉ253Ｔ、Ｉ253Ｖ、Ｉ253Ｗ、およびＩ253Ｙからなる群から選択される、本発明1151のポリペプチド。
[本発明1153]
Ｉ253位の各アミノ酸変異が、Ｉ253Ａである、本発明1152のポリペプチド。
[本発明1154]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの少なくとも1つが、ＥＵのＲ292位に単一アミノ酸変異を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1155]
ＥＵのＲ292位の各アミノ酸変異が独立して、Ｒ292Ｄ、Ｒ292Ｅ、Ｒ292Ｌ、Ｒ292Ｐ、Ｒ292Ｑ、Ｒ292Ｒ、Ｒ292Ｔ、およびＲ292Ｙからなる群から選択される、本発明1154のいずれかのポリペプチド。
[本発明1156]
Ｒ292位の各アミノ酸変異が、Ｒ292Ｐである、本発明1155のポリペプチド。
[本発明1157]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ヒンジが独立して、ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬおよびＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬからなる群から選択されるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1158]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1159]
前記第1のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1160]
前記第1のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬを有し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体の前記ヒンジ部分が、アミノ酸配列ＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬを有する、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1161]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが独立して、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000235
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1162]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の欠失または置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000236
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1165]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、2つ以下の単一アミノ酸の置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000237
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1166]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ2ドメインが同一であり、アミノ酸配列
2021532085.tif 000238
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1167]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、10個以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000239
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1168]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、8つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000240
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1169]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、6つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000241
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1170]
各Ｆｃドメイン単量体の前記ＣＨ3ドメインが独立して、5つ以下の単一アミノ酸置換を伴う、アミノ酸配列
2021532085.tif 000242
を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1171]
前記単一アミノ酸置換が、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｆ405Ａ、Ｙ407Ａ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、Ｔ394Ｆ、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｒからなる群から選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1172]
前記Ｆｃドメイン単量体が各々独立して、最大10個の単一アミノ酸置換を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1173]
前記単一アミノ酸置換のうちの最大6つが、前記ＣＨ3ドメイン内の逆電荷変異である、本発明1099のポリペプチド。
[本発明1174]
前記単一アミノ酸置換が、ＥＵのＧ341位〜ＥＵのＫ447位（両端を含む）の配列内にある、本発明1173のポリペプチド。
[本発明1175]
前記改変された突起を形成する変異のうちの少なくとも1つが、Ｔ366Ｙ、Ｔ366Ｗ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｙ、Ｆ405Ｗ、Ｓ354Ｃ、Ｙ349Ｔ、およびＴ394Ｆからなる群から選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1176]
前記2つまたは4つの逆電荷変異が、Ｋ409Ｄ、Ｋ409Ｅ、Ｋ392Ｄ、Ｋ392Ｅ、Ｋ370Ｄ、Ｋ370Ｅ、Ｄ399Ｋ、Ｄ399Ｒ、Ｅ357Ｋ、Ｅ357Ｒ、Ｄ356Ｋ、およびＤ356Ｒから選択される、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1178]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表1に記載のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1179]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表2に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1180]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3の配列を除き、表2に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも95％または98％同一である、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1181]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表2に記載の抗体のＶＨ配列を含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1182]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表1に記載のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1183]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表2に記載の抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセット由来のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3配列を含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1184]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含むＶＨドメインと、表2に記載の抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3を含むＶＬドメインと、を含み、前記ＶＨドメイン配列および前記ＶＬドメイン配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を除き、表2に記載の抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列と少なくとも95％または98％同一である、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1185]
前記ＶＨドメインまたはｓｃＦｖが、表2に記載の抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、本発明1123、1124、1135、および1136のいずれかのポリペプチド。
[本発明1186]
ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインと、ＩｇＧ  ＣＨ1抗体定常ドメインと、をさらに含む、本発明1122〜1145のいずれかのポリペプチド。
[本発明1187]
本発明1002〜1187のいずれかのポリペプチドをコードする、核酸分子。
[本発明1188]
本発明1187の核酸分子を含む、発現ベクター。
[本発明1189]
本発明1187の核酸分子を含む、宿主細胞。
[本発明1190]
本発明1188の発現ベクターを含む、宿主細胞。
[本発明1191]
本発明1189または本発明1190の宿主細胞を、前記ポリペプチドを発現させる条件下で培養することを含む、本発明1002〜1187のいずれかのポリペプチドを産生する方法。
[本発明1192]
抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1193]
抗体ＶＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1194]
抗体ＶＬドメインおよび抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1195]
抗体ＶＬドメインおよび抗体ＣＬドメインを含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1196]
10個以下の単一アミノ酸修飾を有するＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1189の宿主細胞。
[本発明1197]
10個以下の単一アミノ酸修飾を有するＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体を含むポリペプチドをコードする核酸分子をさらに含む、本発明1190の宿主細胞。
[本発明1199]
前記ＩｇＧ1  Ｆｃドメイン単量体が、前記ＣＨ3ドメイン内に10、8、6、または4つ以下の単一アミノ酸修飾を有する配列番号42、43、45、および47のうちのいずれかのアミノ酸配列を含む、本発明1196または1197の宿主細胞。
[本発明1200]
本発明1002〜1186のいずれかのポリペプチドを含む、薬学的組成物。
[本発明1201]
前記ポリペプチドの40％、30％、20％、10％、5％、2％未満が、Ｆｃドメイン単量体上に少なくとも1つのフコース修飾を有する、本発明1200の薬学的組成物。
[本発明1202]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第2のＦｃドメインを形成する、本発明1001のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1203]
前記単一Ｆｃドメイン構築体が抗体である、本発明1001または1202のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1204]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第2のＦｃドメインを形成する、組成物。
[本発明1205]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドもしくは前記第3のポリペプチドに結合されるか、または前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドに結合される、本発明1204の組成物。
[本発明1206]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、および前記第3のポリペプチドに結合される、本発明1204の組成物。
[本発明1207]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ4結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1208]
前記生物活性が、Ｆｃ受容体媒介性エフェクター機能である、本発明1207のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1209]
前記Ｆｃ受容体媒介性エフェクター機能が、ＡＤＣＣおよびＡＤＣＰおよび／またはＣＤＣ活性である、本発明1208のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1210]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合するスペーサー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第2のＦｃドメインを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1211]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、前記第1のポリペプチドおよび前記第2のポリペプチドもしくは前記第3のポリペプチドに結合されるか、または前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドに結合される、本発明1202、1207、または1210のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1212]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、および前記第3のポリペプチドに結合される、本発明1202、1207、または1210のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1213]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、Ｆａｂである、本発明1001および1202〜1212のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1214]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、前記第1、第2、または第3のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、本発明1202〜1212のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1215]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ｓｃＦｖである、本発明1214のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1216]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインを含み、前記ＶＨドメインおよびＣＨ1ドメインが、前記第1、第2、または第3のポリペプチドのアミノ酸配列の一部である、本発明1202〜1212のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1217]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、ＶＬドメインをさらに含む、本発明1216のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1218]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、前記ＶＬドメインを含む第4のポリペプチドを含む、本発明1217のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1219]
前記ＶＨドメインが、表1に記載のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3配列のセットを含む、本発明1216のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1220]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体の配列を含むＶＨドメインのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含む、本発明1216のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1221]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含み、前記ＶＨ配列が、前記ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3配列を除き、表2に記載の抗体のＶＨ配列と少なくとも95％同一である、本発明1216のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1222]
前記ＶＨドメインが、表2に記載の抗体のＶＨ配列を含む、本発明1216のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1223]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表1に記載されるＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列のセットを含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1224]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットからのＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1225]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列のＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、およびＣＤＲ−Ｈ3を含むＶＨドメイン、ならびに表2に記載される抗体のＶＬ配列のＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3を含むＶＬドメインを含み、前記ＶＨドメイン配列およびＶＬドメイン配列が、ＣＤＲ−Ｈ1、ＣＤＲ−Ｈ2、ＣＤＲ−Ｈ3、ＣＤＲ−Ｌ1、ＣＤＲ−Ｌ2、およびＣＤＲ−Ｌ3の配列を除き、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列に対し、少なくとも95％同一である、本発明1001および1202〜1215のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1226]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、表2に記載される抗体のＶＨ配列およびＶＬ配列のセットを含む、本発明1001および1202〜1215のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1227]
ＩｇＧ  ＣＬ抗体定常ドメインおよびＩｇＧ  ＣＨ1抗体定常ドメインをさらに含み、
前記ＩｇＧ  ＣＨ1抗体定常ドメインが、リンカーを介して前記第1のポリペプチドまたは前記第2のポリペプチドのＮ末端に結合している、
本発明1001および1202〜1212のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1228]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、本発明1202〜1227のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1229]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、本発明1202〜1228のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1230]
前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが、同一のアミノ酸配列を有する、本発明1202〜1228のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1231]
前記二量体形成選択性モジュールが、前記Ｆｃドメイン単量体の一方の前記ＣＨ3ドメイン内に改変された空洞と、前記Ｆｃドメイン単量体の他方の前記ＣＨ3ドメイン内に改変された突起と、を含み、前記改変された空洞および前記改変された突起が、Ｆｃドメイン単量体の空洞内突起対（ｐｒｏｔｕｂｅｒａｎｃｅ−ｉｎｔｏ−ｃａｖｉｔｙ  ｐａｉｒ）を形成するように配置されている、本発明1228または1229のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1232]
前記改変された突起が、Ｓ354Ｃ、Ｔ366Ｗ、Ｔ366Ｙ、Ｔ394Ｗ、Ｔ394Ｆ、およびＦ405Ｗからなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含み、前記改変された空洞が、Ｙ349Ｃ、Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、Ｙ407Ｖ、Ｙ407Ｔ、Ｙ407Ａ、Ｆ405Ａ、およびＴ394Ｓからなる群から選択される少なくとも1つの修飾を含む、本発明1231のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1233]
前記Ｆｃドメイン単量体の一方がＹ407ＶおよびＹ349Ｃを含み、前記Ｆｃドメイン単量体の他方がＴ366ＷおよびＳ354Ｃを含む、本発明1228または1229のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1234]
前記二量体形成選択性モジュールが、前記ドメイン単量体の一方の前記ＣＨ3ドメイン内に負に荷電したアミノ酸と、前記Ｆｃドメイン単量体の他方の前記ＣＨ3ドメイン内に正に荷電したアミノ酸と、を含み、前記負に荷電したアミノ酸および前記正に荷電したアミノ酸が、Ｆｃドメインの形成を促進するように配置されている、本発明1228または1229のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1235]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が各々、Ｄ399Ｋと、Ｋ409ＤまたはＫ409Ｅのいずれかとを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1236]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ392ＤおよびＤ399Ｋを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1237]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ357ＫおよびＫ370Ｅを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1238]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が各々、Ｄ356ＫおよびＫ439Ｄを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1239]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ392ＥおよびＤ399Ｋを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1240]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ357ＫおよびＫ370Ｄを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1241]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が各々、Ｄ356ＫおよびＫ439Ｅを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1242]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が各々、Ｓ354ＣおよびＴ366Ｗを含み、前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、Ｙ349Ｃ、Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、およびＹ407Ｖを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1243]
前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、Ｓ354ＣおよびＴ366Ｗを含み、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が各々、Ｙ349Ｃ、Ｔ366Ｓ、Ｌ368Ａ、およびＹ407Ｖを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1244]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ357ＫまたはＥ357Ｒを含み、前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、Ｋ370ＤまたはＫ370Ｅを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1245]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が、Ｋ370ＤまたはＫ370Ｅを含み、前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、Ｅ357Ｋまたは357Ｒを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1246]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ409ＤまたはＫ409Ｅを含み、前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、Ｄ399ＫまたはＤ399Ｒを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1247]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が、Ｄ399ＫまたはＤ399Ｒを含み、前記第3のポリペプチドおよび前記第4のポリペプチドが各々、Ｋ409ＤまたはＫ409Ｅを含む、本発明1234のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1248]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の1つ以上のリンカーが、結合である、本発明1001および1202〜1247のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1249]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体中の1つ以上のリンカーが、スペーサーである、本発明1001および1202〜1247のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1250]
前記スペーサーが、配列
2021532085.tif 000243
を有するポリペプチドを含む、本発明1249のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1251]
前記スペーサーが、グリシンスペーサーである、本発明1249のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1252]
前記スペーサーが、4〜30、8〜30、または12〜30個のグリシン残基からなる、本発明1251のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1253]
前記スペーサーが、20個のグリシン残基からなる、本発明1252のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1254]
前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、リンカーにより前記Ｆｃドメイン単量体に結合される、本発明1001および1202〜1212のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1255]
前記リンカーが、スペーサーである、本発明1254のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1256]
前記Ｆｃドメインのうちの少なくとも1つが、Ｉ253位に少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、本発明1001および1202〜1255のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1257]
Ｉ253位の前記アミノ酸修飾が独立して、Ｉ253Ａ、Ｉ253Ｃ、Ｉ253Ｄ、Ｉ253Ｅ、Ｉ253Ｆ、Ｉ253Ｇ、Ｉ253Ｈ、Ｉ253Ｉ、Ｉ253Ｋ、Ｉ253Ｌ、Ｉ253Ｍ、Ｉ253Ｎ、Ｉ253Ｐ、Ｉ253Ｑ、Ｉ253Ｒ、Ｉ253Ｓ、Ｉ253Ｔ、Ｉ253Ｖ、Ｉ253Ｗ、およびＩ253Ｙからなる群から選択される、本発明1256のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1258]
Ｉ253位の各アミノ酸修飾が、Ｉ253Ａである、本発明1257のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1259]
前記Ｆｃドメインのうちの少なくとも1つが、Ｒ292位に少なくとも1つのアミノ酸修飾を含む、本発明1001および1202〜1258のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1260]
Ｒ292位の各アミノ酸修飾が独立して、Ｒ292Ｄ、Ｒ292Ｅ、Ｒ292Ｌ、Ｒ292Ｐ、Ｒ292Ｑ、Ｒ292Ｒ、Ｒ292Ｔ、およびＲ292Ｙからなる群から選択される、本発明1259のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1261]
Ｒ292位の各アミノ酸修飾が、Ｒ292Ｐである、本発明1260のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1262]
前記Ｆｃドメイン単量体のうちの1つ以上が、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ2抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ3抗体定常ドメインを含む、本発明1001および1202〜1261のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1263]
前記Ｆｃドメイン単量体が各々、ＩｇＧヒンジドメイン、ＩｇＧ  ＣＨ2抗体定常ドメイン、およびＩｇＧ  ＣＨ3抗体定常ドメインを含む、本発明1262のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1264]
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2ａ、ＩｇＧ2ｂ、ＩｇＧ3、およびＩｇＧ4からなる群から選択されるサブタイプのものである、本発明1262または1263のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1265]
前記第1、第2、第3、および第4のポリペプチドの各々内のＮ末端Ａｓｐが、Ｇｌｎに変異している、本発明1001および1202〜1264のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1266]
前記第1、第2、第3、および第4のポリペプチドのうちの1つ以上が、Ｃ末端リシンを欠く、本発明1001および1202〜1265のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1267]
前記第1、第2、第3、および第4のポリペプチドが各々、Ｃ末端リシンを欠く、本発明1266のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1268]
リンカーによって前記ポリペプチドのうちの1つ以上のＮ末端またはＣ末端に結合されたアルブミン結合ペプチドをさらに含む、本発明1001および1202〜1267のいずれかのＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1269]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、または前記第3のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて第2のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
[本発明1270]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも75％が、前記第1のＦｃドメイン、前記第2のＦｃドメイン、および前記ＣＴＬＡ4結合ドメインを含む、本発明1269の細胞培養培地。
[本発明1271]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が構造的に同一であり、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも0．1ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、細胞培養培地。
[本発明1272]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも75％が構造的に同一である、本発明1271の細胞培養培地。
[本発明1273]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも10ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、本発明1269〜1272のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1274]
前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、少なくとも100ｍｇ／Ｌの濃度で前記培養培地中に存在する、本発明1269〜1273のいずれかの細胞培養培地。
[本発明1275]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（1）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
（2）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
（3）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
（4）抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第3のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が、構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
[本発明1276]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第2のポリペプチドおよび／または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、組成物。
[本発明1277]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、本発明1276の組成物。
[本発明1278]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ357ＫおよびＫ370Ｄを含み、前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ370ＤおよびＥ357Ｋを含む、本発明1277の組成物。
[本発明1279]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、組成物。
[本発明1280]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、本発明1279の組成物。
[本発明1281]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が各々、Ｅ357ＫおよびＫ370Ｄを含み、前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が各々、Ｋ370ＤおよびＥ357Ｋを含む、本発明1280の組成物。
[本発明1282]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体を結合する第2のリンカー
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第6のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第4のＦｃドメイン単量体と前記第6のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第3のＦｃドメインを形成する、組成物。
[本発明1283]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が各々、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が各々、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第4のＦｃドメイン単量体および前記第6のＦｃドメイン単量体が各々、前記第4のＦｃドメイン単量体と前記第6のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、本発明1282のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1284]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体を結合する第2のリンカー
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第6のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第6のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第3のＦｃドメインを形成する、組成物。
[本発明1285]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が各々、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が各々、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第3のＦｃドメイン単量体および前記第6のＦｃドメイン単量体が各々、前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第6のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、本発明1284のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1286]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の実質的に均質な集団を含む組成物であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、
ｉｉｉ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｉｖ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のリンカー、および
ｖ）前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体を結合する第2のリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｖｉ）第4のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉ）第5のＦｃドメイン単量体、
ｖｉｉｉ）第6のＦｃドメイン単量体、
ｉｘ）前記第4のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体を結合する第3のリンカー、および
ｘ）前記第5のＦｃドメイン単量体と前記第6のＦｃドメイン単量体を結合する第4のリンカー
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第7のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第8のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）第9のＦｃドメイン単量体を含む第5のポリペプチドと、
ｆ）第10のＦｃドメイン単量体を含む第6のポリペプチドと、
ｇ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、前記第4のポリペプチド、前記第5のポリペプチド、または前記第6のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第7のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第4のＦｃドメイン単量体と前記第8のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第3のＦｃドメインを形成し、前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第9のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第4のＦｃドメインを形成し、前記第6のＦｃドメイン単量体と前記第10のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第5のＦｃドメインを形成する、組成物。
[本発明1287]
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が各々、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第7のＦｃドメイン単量体が各々、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第7のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第4のＦｃドメイン単量体および前記第8のＦｃドメイン単量体が各々、前記第4のＦｃドメイン単量体と前記第8のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第3のＦｃドメイン単量体および前記第9のＦｃドメイン単量体が各々、前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第9のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第6のＦｃドメイン単量体および前記第10のＦｃドメイン単量体が各々、前記第6のＦｃドメイン単量体と前記第10のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、本発明1286のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1288]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第2のポリペプチドおよび／または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記第1および第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ4結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1289]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第2のポリペプチドおよび／または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記第1および第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ4結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1290]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合するスペーサー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第2のポリペプチドおよび／または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1291]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第2のポリペプチドおよび／または前記第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第1の抗原結合ドメインおよび前記第2の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、細胞培養培地。
[本発明1292]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（1）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
（2）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
（3）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
（4）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
（5）前記第2のポリペプチドおよび／または第3のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第3のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、前記第1および第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が、構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
[本発明1293]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、本発明1288、1289、1290、1291、または1292のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1294]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記第1、第2、および第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ4結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1295]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記第1、第2、および第3の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ4結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1296]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合するスペーサー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1297]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
ｃ）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
ｅ）前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
ｆ）前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第1の抗原結合ドメイン、前記第2の抗原結合ドメイン、および前記第3の抗原結合ドメインが異なる抗原に結合する、細胞培養培地。
[本発明1298]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（1）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第2のＦｃドメイン単量体を結合させるリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
（2）第3のＦｃドメイン単量体を含む第2のポリペプチドと、
（3）第4のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
（4）前記第1のポリペプチドに結合された第1の抗原結合ドメインと、
（5）前記第2のポリペプチドに結合された第2の抗原結合ドメインと、
（6）前記第3のポリペプチドに結合された第3の抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記ＣＴＬＡ4結合ドメインが、前記第1のポリペプチド、第2のポリペプチド、または第3のポリペプチドに結合され、それによりＦｃ抗原結合ドメイン構築体を形成し、前記第1および第2の抗原結合ドメインが、異なる抗原に結合し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が、構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
[本発明1299]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、前記第2のポリペプチドおよび前記第3のポリペプチドが異なるアミノ酸配列を有する、本発明1294、1295、1296、1297、または1298の組成物。
[本発明1300]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体を結合する第2のリンカー
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第6のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記第4のＦｃドメイン単量体および前記第6のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第3のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ4結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1301]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体を結合する第2のリンカー
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第6のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記第4のＦｃドメイン単量体および前記第6のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第3のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ4結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1302]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のスペーサー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体を結合する第2のスペーサー
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第6のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第4のＦｃドメイン単量体と前記第6のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第3のＦｃドメインを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1303]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体を結合する第2のリンカー
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第6のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第4のＦｃドメイン単量体と前記第6のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第3のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
[本発明1304]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（1）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
（2）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体を結合する第2のリンカー
を含む、第2のポリペプチドと、
（3）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
（4）第6のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
（5）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を発現する宿主細胞を培養することであって、
前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第4のＦｃドメイン単量体と前記第6のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第3のＦｃドメインを形成し、細胞培養上清中の前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が構造的に同一である、培養することと、
ｂ）前記細胞培養上清から前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を精製することと
を含む、方法。
[本発明1305]
前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第3のＦｃドメイン単量体が各々、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第3のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が各々、前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含み、
前記第4のＦｃドメイン単量体および前記第6のＦｃドメイン単量体が各々、前記第4のＦｃドメイン単量体と前記第6のＦｃドメイン単量体との間の二量体形成を促進する相補的な二量体形成選択性モジュールを含む、本発明1300、1301、1302、1303、または1304のＦｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1306]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体を結合する第2のリンカー
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第6のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記第3のＦｃドメイン単量体および前記第6のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第3のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）アッセイ、抗体依存性細胞貪食（ＡＤＣＰ）アッセイ、および／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）アッセイにおいて、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ4結合ドメインを有する構築体と比較して、エフェクター機能が強化されている、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1307]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体を結合する第2のリンカー
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第6のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のＦｃドメイン単量体および前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第1のＦｃドメインを形成し、前記第1のＦｃドメイン単量体および前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第2のＦｃドメインを形成し、前記第3のＦｃドメイン単量体および前記第6のＦｃドメイン単量体が組み合わされて、第3のＦｃドメインを形成し、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体が、単一Ｆｃドメインおよび前記ＣＴＬＡ4結合ドメインを有する構築体では呈されない生物活性を含む、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1308]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体であって、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のスペーサー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体を結合する第2のスペーサー
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第6のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第6のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第3のＦｃドメインを形成する、Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体。
[本発明1309]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体の集団を含む細胞培養培地であって、前記Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体のモル基準で少なくとも50％が、
ａ）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
ｂ）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量体、および
ｖｉ）前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体を結合する第2のリンカー
を含む、第2のポリペプチドと、
ｃ）第5のＦｃドメイン単量体を含む第3のポリペプチドと、
ｄ）第6のＦｃドメイン単量体を含む第4のポリペプチドと、
ｅ）前記第1のポリペプチド、前記第2のポリペプチド、前記第3のポリペプチド、または前記第4のポリペプチドに結合された抗原結合ドメインと
を含み、
前記第2のＦｃドメイン単量体と前記第4のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第1のＦｃドメインを形成し、前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第5のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第2のＦｃドメインを形成し、前記第3のＦｃドメイン単量体と前記第6のＦｃドメイン単量体が組み合わさって第3のＦｃドメインを形成する、細胞培養培地。
[本発明1310]
Ｆｃ抗原結合ドメイン構築体を製造する方法であって、
ａ）（1）第1のポリペプチドであって、
ｉ）第1のＦｃドメイン単量体、
ｉｉ）第2のＦｃドメイン単量体、および
ｉｉｉ）前記第1のＦｃドメイン単量体と前記第2のＦｃドメイン単量体を結合する第1のリンカー
を含む、第1のポリペプチドと、
（2）第2のポリペプチドであって、
ｉｖ）第3のＦｃドメイン単量体、
ｖ）第4のＦｃドメイン単量뷤膀臣袂臣㲳甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾†隽뷯覼觥風곧㎬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤銂뗧袐臣讂곧㊬臣ꪃ菣ꮂ菣㲼甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾銂郥肂胣견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†볯㎈볯견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤銂郥肂곧㎬臣鶃菣骃菣膃菣ꢁ胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾袼覼곧㚬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽苣ꮐ苣견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†볯㖈볯趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣뺁臣꾁觥風곧㒬臣鶃菣骃菣膃菣ꮁ뗧袐臣貂臣鞊軥邵郥覃菣ꒂ菣ꢁ⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†苣몙迧馁苣뾮룤내菨銂鿥誤臣讂臣ꢁ臣芁臣ꚁ胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾†趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤ꢁ觥風곧㒬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣蒵臣袐苣閁臣ꚁ곧ㆬ臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣銂뷥邈臣膀觥風곧ㆬ臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤貁뗧뾁郥辂臣ꎁ臣견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃苣ꊽ裦鞁胣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤ꢁ觥風곧㚬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣蒵臣袐苣閁臣ꚁ곧㎬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣銂뷥邈臣膀듧麃鿥誤룤薸룤꺁觥風볯莽諦龎뗧袐菣ꆃ苣뎃꟦覯뷤꺁菣ꮃ鿥隺臣醰臣辁臣节〵볯貁꟦ꂀ髧ꮁ郥肸臣芁苣膀鿥誤臣讂臣ꢁ臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†뷯覼觥風듧麃鿥誤룤薸臣覂觥風볯莽諦龎뗧袐菣ꆃ苣뎃꟦覯뷤銂닧붣臣讂臣ꢁ臣㲨甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰銂郥肂胣릖돦芀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢겜駧躘㌱ㄱ㱝甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤誁苣뎁觥風곧㒬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣蒐胣膀觥風곧㊬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤ꢁ臣鎖臣貺蟩鎽뷥邈苣莿胩馁苣뢛ꏨ蒚臣貺蟩鎽뷥邈臩麊胦ꊃ苣ꖃ菣ꮃ苣ꮐ臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†觥風곧ㆬ臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣袂臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤貁郥薀胣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤ꢁ觥風곧㖬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣꺁雩꺁뫤辇뷤ꊽ裦銂뿤늀臣讂鯧鲣髧ꪁ뫤辇뷤ꊽ裦뢁諦Ꞁ菣뢂菣벃菣銂郥뾁胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤誁苣뎁觥風곧㚬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣蒐胣膀觥風곧㎬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥��뷤ꢁ臣鎖臣貺蟩鎽뷥邈苣莿胩馁苣뢛ꏨ蒚臣貺蟩鎽뷥邈臩麊胦ꊃ苣ꖃ菣ꮃ苣ꮐ苣膀鳦몙飦ㆎ〳膀㌱㜰胣ㆁ〳膀㌱㤰胣뺁臣꾁㌱〱臣ꚼ뷯鞊軥邵郥覃菣ꒂ菣讧꿧鎽胣㲂甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰嬾鳦몙飦ㆎㄳ崲⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†볯莽諦龎뗧袐菣ꆃ苣뎃꟦覯뷤ꞁ臣ꎁ臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†뷯覼곧ㆬ臣鶃菣骃菣膃菣ꞁ臣ꎁ臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯覼곧ㆬ臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾†覽뷯覼곧㊬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾†覽뷯覽볯견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯隽볯趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤ꢁ觥風곧㊬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽苣邵郥馁苣견꺁菣뎃苣벃胣誁苣뎁⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯覼觥風곧㊬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤銂뗧袐臣讂곧㊬臣ꪃ菣ꮂ菣㲼甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾銂郥肂胣견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†뷯覼곧㊬臣鶃菣骃菣膃菣ꞁ臣ꎁ臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯覽뷯覼곧㒬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾†隽뷯覽볯견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯覽뷯覽볯견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯颽볯趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤ꢁ觥風곧㖬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽苣邵郥馁苣견꺁菣뎃苣벃胣誁苣뎁⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯覼觥風곧㖬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤銂뗧袐臣讂곧㒬臣ꪃ菣ꮂ菣㲼甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾銂郥肂胣견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†뷯覼곧㞬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽苣ꮐ苣견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†뷯覼곧㢬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽苣ꮐ苣견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†뷯覼곧㦬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽苣ꮐ苣견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†뷯覼곧ㆬ꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤銂郥肂곧㚬臣鶃菣骃菣膃菣ꢁ胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾螽볯趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣趉꣨견꺁菣ꪃ菣��鞃菣覃胣뺁臣꾁觥風곧㚬臣鶃菣骃菣膃菣ꮁ뗧袐臣貂臣鞊軥邵郥覃菣ꒂ菣ꢁ⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢苣ꮐ臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†觥風곧㊬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣袂臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤貁뗧뾁郥辂臣貂臣膀곧ㆬ臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣銂뷥邈臣膀觥風곧ㆬ臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣袂臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤貁뗧뾁郥辂臣貂臣膀곧㊬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣銂뷥邈臣膀觥風곧㒬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣袂臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤貁뗧뾁郥辂臣貂臣膀곧㎬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣銂뷥邈臣膀觥風곧㎬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣袂臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤貁뗧뾁郥辂臣貂臣膀곧㒬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣銂뷥邈臣膀觥風곧㚬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣袂臣趉꣨견〱臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣蒵臣袐苣閁苣ꚁ胣견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃苣ꊽ裦鞁胣趉꣨ꚼ뷯鞊軥邵郥覃菣ꒂ菣讧꿧鎽臣膀諦鎽뻤颭胦내菨랂껥袼볯꒼볯ꎼ볯ꊂ菣뮂苣膀諦鎽뻤颭胦내菨ꪲꏩ袼볯꒼볯낼볯ꊂ菣뮂苣膀臣袂臣込臣龁臣鲣뷤鶾귥Ꞁ듧麃若뎮볯ꎼ볯ꎼ볯ꊂ菣뮂苣ꮁ臣蒁臣膀跥肸볯莽菣ꆃ苣뎃臣袂臣趉꣨ꎼ볯겼볯㒡뗧袐菣ꆃ苣뎃苣覜臣讂꟦覯뷤ꢁ꿦莼臣ꚁ胣ꢂ菣Ꞃ苣뾂菣龩菨貁볥隌臣貂臣蒁苣膀볯莽諦龎뗧袐菣ꆃ苣뎃꟦覯뷤芀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢겜駧躘㌱㌱㱝甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾ꚼ뷯鞊軥邵郥覃菣ꒂ菣讧꿧鎽臣芁臣ꚁ胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾膽볯견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣芁臣ꚁ胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾†覽볯견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯覽볯견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯覽뷯覼곧㎬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾†覽뷯覼觥風곧ㆬ臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤銂뗧袐臣讂곧ㆬ臣ꪃ菣ꮂ菣膀臣袂臣㲳甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾†隽볯趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤ꢁ觥風곧㎬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽苣邵郥馁苣견꺁菣뎃苣벃⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†苣ꮐ苣膀곧ㆬ臣鶃菣骃菣膃菣ꢁ胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾芽볯견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣芁臣ꚁ胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾†隽뷯覼곧㒬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾†隽뷯覽볯견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨��⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯覽뷯覽볯견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯颽볯趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤ꢁ觥風곧㖬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽苣邵郥馁苣견꺁菣뎃苣벃胣誁苣뎁⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢††뷯覼觥風곧㖬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤銂뗧袐臣讂곧㒬臣ꪃ菣ꮂ菣㲼甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾銂郥肂胣견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†뷯覼곧㞬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽苣ꮐ苣견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†뷯覼곧㢬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽苣ꮐ苣견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†뷯覼곧㦬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽苣ꮐ苣견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†뷯覼곧ㆬ꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤銂郥肂곧㚬臣鶃菣骃菣膃菣ꢁ胣㲁甯㰾牢ਾ甼砠汭獮樺㵰栢瑴㩰⼯睷⹷灪⹯潧樮≰‾螽볯趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣趉꣨견꺁菣ꪃ菣鞃菣覃胣뺁臣꾁觥風곧㚬臣鶃菣骃菣膃菣ꮁ뗧袐臣貂臣鞊軥邵郥覃菣ꒂ菣ꢁ⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢苣ꮐ臣膀⼼㹵戼㹲㰊⁵浸湬㩳灪∽瑨灴⼺眯睷樮潰朮⹯灪㸢†觥風곧㊬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣袂臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤貁뗧뾁郥辂臣貂臣膀곧ㆬ臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣銂뷥邈臣膀觥風곧ㆬ臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣袂臣趉꣨견꺁볯莽菣ꆃ苣뎃跥辇뷤貁뗧뾁郥辂臣貂臣膀곧㊬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣銂뷥邈臣膀觥風곧㒬臣ꚼ뷯覃菣ꒂ菣颍蟩鎽臣袂臣趉꣨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