(57)【要約】本発明は、とりわけ、酵素補充療法を使用した異染性白質ジストロフィー病（ＭＬＤ）の治療方法および組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を含む組成物を提供する。本発明に従って精製された組換えＡＳＡタンパク質は、組換えＡＳＡタンパク質の生物学的利用性、改善された標的化、および／または改善された有効性を促進することができる、グリカンマップ（例えば、閾値量のマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質））などの明確な特性を特徴とする。【選択図】図１４
2021508322.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を治療する方法であって、前記方法が、治療を必要とする対象に、精製された組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）タンパク質を含む治療有効用量の製剤をくも膜下腔内投与することを含み、
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質、シアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、およびハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）に対応する１つ以上のピークを含むプロテオグリカンマップを特徴とし、
前記製剤の投与が、ＭＬＤの少なくとも１つの症状の進行の安定化または低減をもたらす、方法。
【請求項２】
前記治療有効用量が、１００ｍｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記治療有効用量が、１５０ｍｇである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記製剤が、週１回投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記対象が、遅発性乳児型ＭＬＤを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記ＭＬＤの進行の安定化または低減が、粗大運動機能分類（ＧＭＦＣ−ＭＬＤ）における変化を使用して測定される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記製剤の投与が、前記対象において、２年間の治療で、ＧＭＦＣ−ＭＬＤレベルにおけるベースラインから４つ以下、３つ以下、または２つ以下のレベルの変化をもたらす、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記製剤の投与が、２年間の治療でＧＭＦＣ−ＭＬＤスコアの維持をもたらす、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＭＦＣ−ＭＬＤスコアの維持が、２年間の治療で、ＧＭＦＣ−ＭＬＤにおけるベースラインから２つ以下のレベルの変化である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ベースラインが、前記製剤の初回投与前のＧＭＦＣ−ＭＬＤの評価スコアである、請求項７〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＭＬＤの進行の安定化または低減が、粗大運動機能尺度（ＧＭＦＭ−ＭＬＤ）における変化を使用して測定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記製剤の投与が、２年間の治療でＧＭＦＭ−ＭＬＤスコアの維持をもたらす、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＧＭＦＭ−ＭＬＤスコアが、４０超で維持される、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＭＬＤの進行の安定化または低減が、脳脊髄液のスルファチドレベルによって測定される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＭＬＤの進行の安定化または低減が、脳のＮ−アセチルアスパラギン酸／クレアチン比（ＮＡＡ／ｃｒ）によって測定される、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＬＤの進行の安定化または低減が、表出性言語機能分類−ＭＬＤレベル（ＥＬＦＣ−ＭＬＤ）を使用して測定される、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記対象が、ベースラインＧＭＦＣ−ＭＬＤレベル１〜２を有する、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、ベースラインＧＭＦＣ−ＭＬＤレベル３を有する、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記対象が、ベースラインＧＭＦＣ−ＭＬＤレベル４を有する、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象が、発症前である、請求項５〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記対象が、１８ヶ月齢未満である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記対象が、アルバータ乳幼児運動スケールを用いて評価される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ｒｈＡＳＡタンパク質が、配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
遅発性乳児型ＭＬＤを治療する方法であって、前記方法が、
配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する精製された組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）タンパク質を含む製剤を、前記対象に投与することを含み、
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質、シアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、およびハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）に対応する１つ以上のピークを含むプロテオグリカンマップを特徴とし、
前記製剤が、週１回の間隔で、１５０ｍｇの用量で、くも膜下腔内投与される、方法。
【請求項２５】
前記製剤が、約１５０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記精製された組換えＡＳＡタンパク質が、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）に対応する全精製された組換えＡＳＡタンパク質の少なくとも約２３％を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記精製された組換えＡＳＡタンパク質の前記プロテオグリカンマップが、
約１５％〜約２５％の中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質）、
約３５％〜約４５％のシアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、
約２３％〜約３３％のマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、
約１％〜約１０％のＮ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、および
約５％〜約１５％のハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）を含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記精製された組換えＡＳＡタンパク質の前記プロテオグリカンマップが、
約１８％〜約２２％の中性ＡＳＡタンパク質、
約３７％〜約４１％のシアル酸ＡＳＡタンパク質、
約２６％〜約２９％のＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、
約４％〜約６％のキャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、および
約７％〜約９％のハイブリッドＡＳＡタンパク質を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する精製された組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）タンパク質を含む組成物であって、前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質、シアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、またはハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）から選択される１つ以上のプロテオグリカン種を特徴とする、組成物。
【請求項３０】
前記全精製された組換えＡＳＡタンパク質の少なくとも約２３％が、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）に対応する、請求項２９に記載の組成物。
【請求項３１】
配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）タンパク質を含む組成物であって、
前記全精製された組換えＡＳＡタンパク質の少なくとも約２３％が、プロテオグリカンマップを特徴とするマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）に対応し、
前記組成物が、約１５０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する、組成物。
【請求項３２】
前記Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の含有量の少なくとも約２６％である量で存在する、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３３】
前記Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の含有量の少なくとも約２８％の量で存在する、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３４】
前記Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の含有量の約２０％〜約３３％の量で存在する、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質）、シアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、もしくはハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、
約２３％〜約３３％のマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、
約１５％〜約２５％の中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質）、
約３５％〜約４５％のシアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、
約１％〜約１０％のＮ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、および
約５％〜約１５％のハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）を含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項３７】
中性ＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約１６％〜約２２％の量で存在する、請求項２９〜３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
中性ＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約２０％〜約２５％の量で存在する、請求項２９〜３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
シアル酸ＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約３５％〜約４０％の量で存在する、請求項２９〜３８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
シアル酸ＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約３７％〜約４２％の量で存在する、請求項２９〜３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約３％〜約５％の量で存在する、請求項２９〜４０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４２】
キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約４％〜約６％の量で存在する、請求項２９〜４１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４３】
キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約４．５％〜約５．５％の量で存在する、請求項２９〜４２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
ハイブリッドＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約７％〜約１０％の量で存在する、請求項２９〜４３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４５】
ハイブリッドＡＳＡタンパク質が、前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約７．５％〜約８．５％の量で存在する、請求項２９〜４４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、
約１６％〜約２３％の中性ＡＳＡタンパク質、
約３７％〜約４２％のシアル酸ＡＳＡタンパク質、
約２３％〜約２７％のＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、
約４％〜約８％のキャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、および
約７％〜約１０％のハイブリッドＡＳＡタンパク質を含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項４７】
前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、
約２０％〜約２３％の中性ＡＳＡタンパク質、
約３５％〜約３９％のシアル酸ＡＳＡタンパク質、
約２６％〜約３２％のＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、
約３％〜約５％のキャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、および
約７％〜約９％のハイブリッドＡＳＡタンパク質を含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項４８】
前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、
約１８％〜約２２％の中性ＡＳＡタンパク質、
約３７％〜約４１％のシアル酸ＡＳＡタンパク質、
約２６％〜約２９％のＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、
約４％〜約６％のキャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、および
約７％〜約９％のハイブリッドＡＳＡタンパク質を含む、請求項３０または３１に記載の組成物。
【請求項４９】
前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約４５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項２９〜４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約３４ｍｇ／ｍＬ、または約２８ｍｇ／ｍＬ〜約３２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約２５ｍｇ／ｍＬ、約２６ｍｇ／ｍＬ、約２７ｍｇ／ｍＬ、約２８ｍｇ／ｍＬ、約２９ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３１ｍｇ／ｍＬ、約３２ｍｇ／ｍＬ、約３３ｍｇ／ｍＬ、または約３４ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５２】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約５０〜約１３０Ｕ／ｍＬの比活性を有する、請求項２９〜５１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約７０〜約１００Ｕ／ｍｇの比活性を有する、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５４】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約８０〜約９０Ｕ／ｍｇの比活性を有する、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５５】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約７５〜約９５Ｕ／ｍｇの比活性を有する、請求項５２に記載の組成物。
【請求項５６】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約１４０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する、請求項２９〜５５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５７】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約１００ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約８０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約６０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する、請求項５６に記載の組成物。
【請求項６０】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約１００ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）を含有する、請求項２９〜５９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約５０ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤを含有する、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約１０ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤを含有する、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６３】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、約５ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤ、約４ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤ、約３ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤ、約２ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤ、または約１ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤを含有する、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６４】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、配列番号１と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項２９〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、配列番号１と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、配列番号１と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６７】
前記精製されたｒｈＡＳＡタンパク質が、配列番号１と同一であるアミノ酸配列を有する、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６８】
約０．００１％〜約０．０１％のポリソルベート２０（Ｐ２０）を含む、請求項２９〜６７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６９】
請求項２９〜６８のいずれか一項に記載の組成物および生理学的に許容可能な担体を含む、製剤。
【請求項７０】
前記製剤が、静脈内投与に好適である、請求項６９に記載の製剤。
【請求項７１】
前記製剤が、くも膜下腔内投与に好適である、請求項６９に記載の製剤。
【請求項７２】
前記製剤が、皮下投与に好適である、請求項６９に記載の製剤。
【請求項７３】
組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製する方法であって、前記方法が、
１つ以上のクロマトグラフィー工程を実施することによって、不純な調製物から組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製することと、
前記１つ以上のクロマトグラフィー工程からの溶出物をプールすることと、
任意に、前記プールした溶出物のｐＨを、約６．０〜約８．０のｐＨに調整することと、
任意に、前記プールした溶出物または前記ｐＨ調整した溶出物を、限外濾過および／または透析濾過に供することと、
精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を含む溶出物を得ることと、
前記精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を含む溶出物に、界面活性剤を添加することと、を含む、方法。
【請求項７４】
前記プールした溶出物のｐＨを約６．０〜約８．０のｐＨに調整する前記工程を含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記ｐＨ調整した溶出物を限外濾過および／または透析濾過に供する前記工程を含む、請求項７４に記載の方法。
【請求項７６】
前記界面活性剤の添加が、前記精製された組換えＡＳＡタンパク質を含む溶出物の低温保存の前に起こる、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記界面活性剤が、約０．０００１％（ｖ／ｖ）〜約０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項７３〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記界面活性剤が、約０．００１％（ｖ／ｖ）〜約０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記界面活性剤が、ポリソルベート２０（Ｐ２０）である、請求項７３〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記１つ以上のクロマトグラフィー工程を実施する工程が、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、フェニルクロマトグラフィーである疎水性相互作用クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーを、その順序で実施することを含む、請求項７３〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記陰イオン交換クロマトグラフィーが、ＴＭＡＥ樹脂を用いたカラムを使用する、請求項８０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１９日に出願された米国特許仮出願第６２／６０７，８３１号、２０１７年１２月２０日に出願された同第６２／６０８，５６９号、２０１８年２月２日に出願された同第６２／６２５，８１４号、および２０１８年１１月１３日に出願された同第６２／７６０，５９７号に対する優先権を主張するものであり、これらの仮出願の各々の全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
異染性白質ジストロフィー病（ＭＬＤ）は、酵素アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）の欠乏に起因する常染色体劣性疾患である。ヒトのＡＲＳＡ遺伝子によってコードされるＡＳＡは、セレブロシド３硫酸またはスフィンゴ脂質３−Ｏ−スルホガラクトシルセラミド（スルファチド）をセレブロシドおよび硫酸塩に分解する酵素である。酵素の非存在下では、スルファチドは神経系（例えば、ミエリン鞘、ニューロンおよびグリア細胞）に蓄積し、内臓器官においてはそれほどではない。これらの分子的および細胞的事象の結果は、臨床的に重度の運動および認知機能不全を伴うＣＮＳおよびＰＮＳ内の進行性脱髄および軸索喪失である。
【０００３】
この障害の明確な臨床的特徴は、中枢神経系（ＣＮＳ）変性であり、認知障害（例えば、精神遅滞、神経障害、および失明）をもたらす。
【０００４】
ＭＬＤは、低年齢児において顕在化し得（遅発性乳児型）、罹患した幼児は、典型的には生後わずか１年後に（例えば、生後約１５〜２４ヶ月で）症状を呈し始め、一般的には５歳を過ぎて生存しない。ＭＬＤは、幼児において顕在化し得（若年型）、罹患した幼児は、典型的には約３〜１０歳までに認知障害を呈し、寿命は（例えば、症状の発現後１０〜１５年の範囲内で）異なり得る。ＭＬＤは、成人において顕在化し得（成人発症型）、あらゆる年齢（例えば、典型的には１６歳以降）の個体に現れる可能性があり、疾患の進行は大きく異なり得る。
【０００５】
酵素補充療法（ＥＲＴ）は、外因性置換ＡＳＡ酵素、特に組換えアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）（例えば、組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ））をＭＬＤ患者に投与することを含む、ＭＬＤを治療するための認可療法である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、とりわけ、酵素補充療法のための精製された組換えＡＳＡタンパク質を含む組成物、およびその調製方法を提供する。
【０００７】
実施例の項に説明されるように、本明細書に説明される特定のプロセスを使用して精製された例示的な組換えＡＳＡタンパク質は、米国および多くの他の国々における市場の純度要件に適合する。
【０００８】
加えて、本発明に従って精製された組換えＡＳＡタンパク質は、組換えＡＳＡタンパク質の生物学的利用性、改善された標的化、および／または改善された有効性を促進することができる、グリカンマップ（例えば、閾値量のマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質））などの明確な特性を特徴とする。
【０００９】
一態様では、本発明は、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を治療する方法を提供し、方法は、治療を必要とする対象に、精製された組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）タンパク質を含む治療有効用量の製剤をくも膜下腔内投与することを含み、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質、シアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、およびハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）に対応する１つ以上のピーク（すなわち、種）を含むプロテオグリカンマップを特徴とし、製剤の投与は、ＭＬＤの少なくとも１つの症状の進行の安定化または低減をもたらす。
【００１０】
一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡの治療有効用量は、１００ｍｇである。
【００１１】
一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡの治療有効用量は、１５０ｍｇである。
【００１２】
一実施形態では、製剤は、週１回投与される。
【００１３】
一実施形態では、対象は、遅発性乳児型ＭＬＤを有する。
【００１４】
一実施形態では、ＭＬＤの進行の安定化または低減は、粗大運動機能分類（ＧＭＦＣ−ＭＬＤ）における変化を使用して測定される。
【００１５】
一実施形態では、製剤の投与は、遅発性乳児型ＭＬＤを有する対象において、２年間の治療で、ＧＭＦＣ−ＭＬＤレベルにおけるベースラインから４つ以下、３つ以下、または２つ以下のレベルの変化をもたらす。
【００１６】
一実施形態では、製剤の投与は、２年間の治療でＧＭＦＣ−ＭＬＤスコアの維持をもたらす。
【００１７】
一実施形態では、ＧＭＦＣ−ＭＬＤスコアの維持は、２年間の治療で、ＧＭＦＣ−ＭＬＤにおけるベースラインから２つ以下のレベルの変化である。
【００１８】
一実施形態では、ベースラインは、製剤の初回投与前のＧＭＦＣ−ＭＬＤの評価スコアである。
【００１９】
一実施形態では、ＭＬＤの進行の安定化または低減は、粗大運動機能尺度（ＧＭＦＣ−ＭＬＤ）における変化を使用して測定される。
【００２０】
一実施形態では、製剤の投与は、２年間の治療でＧＭＦＭ−ＭＬＤスコアの維持をもたらす。
【００２１】
一実施形態では、ＧＭＦＭ−ＭＬＤスコアは、４０超で維持される。
【００２２】
一実施形態では、ＭＬＤの進行の安定化または低減は、脳脊髄液のスルファチドレベルによって測定される。
【００２３】
一実施形態では、ＭＬＤの進行の安定化または低減は、脳のＮ−アセチルアスパラギン酸／クレアチン比（ＮＡＡ／ｃｒ）によって測定される。
【００２４】
一実施形態では、ＭＬＤの進行の安定化または低減は、表出性言語機能分類−ＭＬＤレベル（ＥＬＦＣ−ＭＬＤ）によって測定される。
【００２５】
一実施形態では、対象は、ベースラインＧＭＦＣ−ＭＬＤレベル１〜２を有する。
【００２６】
一実施形態では、対象は、ベースラインＧＭＦＣ−ＭＬＤレベル３を有する。
【００２７】
一実施形態では、対象は、ベースラインＧＭＦＣ−ＭＬＤレベル４を有する。
【００２８】
一実施形態では、対象は、発症前である。一実施形態では、発症前の対象は、１８ヶ月齢未満である。一実施形態では、発症前の対象は、アルバータ乳幼児運動スケールを用いて評価される。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ｒｈＡＳＡタンパク質は、配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００３０】
一態様では、本発明は、遅発性乳児型ＭＬＤを治療する方法を提供し、方法は、配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する精製された組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）タンパク質を含む製剤を、対象に投与することを含み、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質、シアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、およびハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）に対応する１つ以上のピーク（すなわち、種）を含むプロテオグリカンマップを特徴とし、製剤は、週１回の間隔で、１５０ｍｇの用量で、くも膜下腔内投与される。
【００３１】
一実施形態では、製剤は、約１５０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する。
【００３２】
いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）に対応する全精製された組換えＡＳＡタンパク質の少なくとも約２３％を含む。
【００３３】
一実施形態では、精製された組換えＡＳＡタンパク質のプロテオグリカンマップは、約１５％〜約２５％の中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質）、約３５％〜約４５％のシアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、約２３％〜約３３％のマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、約１％〜約１０％のＮ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、および約５％〜約１５％のハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）を含む。
【００３４】
一実施形態では、精製された組換えＡＳＡタンパク質のプロテオグリカンマップは、約１８％〜約２２％の中性ＡＳＡタンパク質、約３７％〜約４１％のシアル酸ＡＳＡタンパク質、約２６％〜約２９％のＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、約４％〜約６％のキャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、および約７％〜約９％のハイブリッドＡＳＡタンパク質を含む。
【００３５】
一実施形態では、製剤の投与により、最小限の有害作用（ＡＥ）が生じる。
【００３６】
一態様では、本発明は、プロセス効率の改善（例えば、薬物原料（ＤＳ）または医薬品（ＤＰ）の調製のための工程の総数の削減）によって、あるいは有益な特性を有する組成物（例えば、改善された生物学的利用性、標的化、または有効性を有し得る、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）の閾値集団を有する精製された組換えＡＳＡタンパク質を含む組成物）、または保存（例えば、低温保存）に対して改善された安定性を有し得るか、またはＤＳもしくはＤＰの調製に関して改善されたプロセス効率をもたらし得る、界面活性剤（例えば、ポリソルベート２０（Ｐ２０））を含むＤＳ組成物の調製を可能にすることによって、コストおよび時間の削減などの利点を提供することができる、組換えＡＳＡタンパク質を精製するための新しいプロセスを提供する。
【００３７】
一態様では、本発明は、配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）タンパク質を含む組成物を提供し、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質、シアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、またはハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）から選択される１つ以上のプロテオグリカン種を特徴とする。いくつかの実施形態では、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質含有量の少なくとも約２３％の量で存在する。
【００３８】
一実施形態では、本発明は、配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）タンパク質を含む組成物を提供し、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質含有量の少なくとも約２３％の量で、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）として存在し、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、約１５０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する。
【００３９】
一態様では、本発明は、配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列を有する、精製された組換えヒトアリールスルファターゼＡ（ｒｈＡＳＡ）タンパク質を含む組成物を提供し、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の少なくとも約２３％は、プロテオグリカンマップを特徴とするマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）に対応し、組成物は、約１５０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する。
【００４０】
一実施形態では、Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質含有量の少なくとも約２６％の量で組成物中に存在する。一実施形態では、Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質含有量の少なくとも約２８％の量で存在する。一実施形態では、Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質含有量の約２０％〜約３３％の量で組成物中に存在する。
【００４１】
一実施形態では、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質）、シアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、もしくはハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００４２】
一実施形態では、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約２３％〜約３３％のマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、約１５％〜約２５％の中性組換えＡＳＡタンパク質（中性ＡＳＡタンパク質）、約３５％〜約４５％のシアリル化組換えＡＳＡタンパク質（シアル酸ＡＳＡタンパク質）、約１％〜約１０％のＮ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）、および約５％〜約１５％のハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（ハイブリッドＡＳＡタンパク質）を含む。
【００４３】
一実施形態では、中性ＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約１６％〜約２２％の量で存在する。
【００４４】
一実施形態では、中性ＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約２０％〜約２５％の量で存在する。
【００４５】
一実施形態では、シアル酸ＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約３５％〜約４０％の量で存在する。
【００４６】
一実施形態では、シアル酸ＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約３７％〜約４２％の量で存在する。
【００４７】
一実施形態では、キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約３％〜約５％の量で存在する。
【００４８】
一実施形態では、キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約４％〜約６％の量で存在する。
【００４９】
一実施形態では、キャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約４．５％〜約５．５％の量で存在する。
【００５０】
一実施形態では、ハイブリッドＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約７％〜約１０％の量で存在する。
【００５１】
一実施形態では、ハイブリッドＡＳＡタンパク質は、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質の約７．５％〜約８．５％の量で存在する。
【００５２】
一実施形態では、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約１６％〜約２３％の中性ＡＳＡタンパク質、約３７％〜約４２％のシアル酸ＡＳＡタンパク質、約２３％〜約２７％のＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、約４％〜約８％のキャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、および約７％〜約１０％のハイブリッドＡＳＡタンパク質を含む。一実施形態では、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約２０％〜約２３％の中性ＡＳＡタンパク質、約３５％〜約３９％のシアル酸ＡＳＡタンパク質、約２６％〜約３２％のＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、約３％〜約５％のキャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、および約７％〜約９％のハイブリッドＡＳＡタンパク質を含む。
【００５３】
一実施形態では、全精製された組換えＡＳＡタンパク質は、約１８％〜約２２％の中性ＡＳＡタンパク質、約３７％〜約４１％のシアル酸ＡＳＡタンパク質、約２６％〜約２９％のＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、約４％〜約６％のキャッピングされたＭ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質、および約７％〜約９％のハイブリッドＡＳＡタンパク質を含む。
【００５４】
一実施形態では、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約２０ｍｇ／ｍＬ〜約４５ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態では、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約２５ｍｇ／ｍＬ〜約３４ｍｇ／ｍＬ、または約２８ｍｇ／ｍＬ〜約３２ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。一実施形態では、全精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約２５ｍｇ／ｍＬ、約２６ｍｇ／ｍＬ、約２７ｍｇ／ｍＬ、約２８ｍｇ／ｍＬ、約２９ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３１ｍｇ／ｍＬ、約３２ｍｇ／ｍＬ、約３３ｍｇ／ｍＬ、または約３４ｍｇ／ｍＬの濃度で存在する。
【００５５】
一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約５０〜約１３０Ｕ／ｍＬの比活性を有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約７０〜約１００Ｕ／ｍｇの比活性を有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約８０〜約９０Ｕ／ｍｇの比活性を有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約７５〜約９５Ｕ／ｍｇの比活性を有する。
【００５６】
一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約１４０ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約１００ｎｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約８０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約６０ｎｇ／ｍｇ未満のＨＣＰを含有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約１００ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）を含有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約５０ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤを含有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約１０ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤを含有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、約５ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤ、約４ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤ、約３ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤ、約２ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤ、または約１ｐｇ／ｍｇ未満のＨＣＤを含有する。
【００５７】
一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、配列番号１と少なくとも８０％同一のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、配列番号１と少なくとも９０％同一のアミノ酸配列を有する。一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、配列番号１と少なくとも９５％同一のアミノ酸配列を有する。
【００５８】
一実施形態では、精製されたｒｈＡＳＡタンパク質は、配列番号１と同一のアミノ酸配列を有する。
【００５９】
一実施形態では、組成物は、約０．００１％〜約０．０１％のポリソルベート２０（Ｐ２０）を含む。一態様では、本発明は、上記で詳述された組成物および生理学的に許容可能な担体を含む製剤を提供する。一実施形態では、製剤は、静脈内投与に適している。
【００６０】
一実施形態では、製剤は、くも膜下腔内投与に適している。一実施形態では、製剤は、皮下投与に適している。
【００６１】
一態様では、本発明は、組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製する方法を提供し、この方法は、１つ以上のクロマトグラフィー工程を実施することによって、不純な調製物から組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を精製することと、１つ以上のクロマトグラフィー工程からの溶出物をプールすることと、任意に、プールした溶出物のｐＨを約６．０〜約８．０のｐＨに調整することと、任意に、プールした溶出物またはｐＨ調整した溶出物を限外濾過および／または透析濾過に供することと、精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を含む溶出物を得ることと、精製された組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質を含む溶出物に、界面活性剤を添加することと、を含む。
【００６２】
一実施形態では、方法は、プールした溶出物のｐＨを約６．０〜約８．０のｐＨに調整する工程をさらに含む。一実施形態では、ｐＨ調整した溶出物を限外濾過および／または透析濾過に供すること。
【００６３】
一実施形態では、界面活性剤の前述の添加は、精製された組換えＡＳＡタンパク質を含む溶出物の低温保存の前に起こる。
【００６４】
一実施形態では、前述の界面活性剤は、約０．０００１％（ｖ／ｖ）〜約０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態では、前述の界面活性剤は、約０．００１％（ｖ／ｖ）〜約０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度で存在する。一実施形態では、前述の界面活性剤は、ポリソルベート−２０（Ｐ２０）である。
【００６５】
一実施形態では、１つ以上のクロマトグラフィー工程を実施する工程は、陰イオン交換クロマトグラフィー、混合モードクロマトグラフィー、フェニルクロマトグラフィーである疎水性相互作用クロマトグラフィー、および陽イオン交換クロマトグラフィーを、その順序で実施することを含む。いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＴＭＡＥ樹脂を用いたカラムを使用する。
【図面の簡単な説明】
【００６６】
図面を一緒に構成する以下に記載の図は、例示のみを目的とし、限定するためのものではない。
【００６７】
【図１Ａ−１Ｃ】図１Ａ〜１Ｆは、プロセスＡまたはプロセスＢ  ｒｈＡＳＡで処置したＭＬＤマウスにおけるＬＡＭＰ−１の免疫組織化学染色の代表的画像であり、プロセスＡ（ｉｉｉ、ｖ）もしくはプロセスＢ（ｉｖ、ｖｉ）、または対照（ｉｉ）からｒｈＡＳＡ０．０４ｍｇまたは０．２１ｍｇで処置した免疫寛容ＭＬＤマウスの（Ａ）脊髄、（Ｂ）小脳、（Ｃ）海馬采、（Ｄ）大脳脚、（Ｅ）大脳皮質、および（Ｆ）線条体の白質における対応する形態計測的分析を伴う。未処置のＣ５７／Ｂ１６マウスは、ＷＴ対照（ｉ）としての機能を果たした。ＬＡＭＰ−１、リソソーム関連膜タンパク質−１；ＭＬＤ、異染性白質ジストロフィー；ＮＳ、有意ではない；ｒｈＡＳＡ、組換えヒトアリールスルファターゼＡ；ＷＴ、野生型。
【図１Ｄ−１Ｆ】図１Ａ〜１Ｆは、プロセスＡまたはプロセスＢ  ｒｈＡＳＡで処置したＭＬＤマウスにおけるＬＡＭＰ−１の免疫組織化学染色の代表的画像であり、プロセスＡ（ｉｉｉ、ｖ）もしくはプロセスＢ（ｉｖ、ｖｉ）、または対照（ｉｉ）からｒｈＡＳＡ０．０４ｍｇまたは０．２１ｍｇで処置した免疫寛容ＭＬＤマウスの（Ａ）脊髄、（Ｂ）小脳、（Ｃ）海馬采、（Ｄ）大脳脚、（Ｅ）大脳皮質、および（Ｆ）線条体の白質における対応する形態計測的分析を伴う。未処置のＣ５７／Ｂ１６マウスは、ＷＴ対照（ｉ）としての機能を果たした。ＬＡＭＰ−１、リソソーム関連膜タンパク質−１；ＭＬＤ、異染性白質ジストロフィー；ＮＳ、有意ではない；ｒｈＡＳＡ、組換えヒトアリールスルファターゼＡ；ＷＴ、野生型。
【図２Ａ】図２Ａおよび２Ｂは、幼若カニクイザルにおける単回の６．０ｍｇのくも膜下腔内投与後の（図２Ａ）血清および（図２Ｂ）ＣＳＦにおけるプロセスＡおよびプロセスＢｒｈＡＳＡの濃度−時間曲線を示す。
【図２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、幼若カニクイザルにおける単回の６．０ｍｇのくも膜下腔内投与後の（図２Ａ）血清および（図２Ｂ）ＣＳＦにおけるプロセスＡおよびプロセスＢｒｈＡＳＡの濃度−時間曲線を示す。
【図３】図３Ａおよび３Ｂは、ラットにおけるプロセスＡおよびプロセスＢ  ｒｈＡＳＡの生体分布を示す。雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットにおける（図３Ａ）プロセスＡおよび（図３Ｂ）プロセスＢ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡ  ０．６２ｍｇの単回のくも膜下腔内投与の４時間後の、放射活性の組織分布を示す、代表的な全身オートラジオルミノグラム。
【図４】雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（ｎ＝２およびｎ＝３）における単回のくも膜下腔内投与後のプロセスＡおよびプロセスＢ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡ  ０．６２ｍｇの尿、糞便、および総排泄プロファイルを示す。
【図５】ｒｈＡＳＡの非盲検、用量漸増安全性評価の用量漸増および延長研究デザインを示す。ＣＳＦ、脳脊髄液；ＧＭＦＭ−８８、粗大運動機能尺度−８８；ＩＤＤＤ、くも膜下腔内薬物送達デバイス；ＩＴ、くも膜下腔内；ＭＬＤ、異染性白質ジストロフィー；ｒｈＡＳＡ、組換えヒトアリールスルファターゼＡ。
【図６】ＣＳＦ、ＣＮＳ、および血清中のｒｈＡＳＡ濃度ならびにＣＳＦスルファチド濃度に対する効果のための臨床ＰＫモデルを示す。ＣＬ、薬物クリアランス；ＣＭＴ、コンパートメント；ＣＮＳ、中枢神経系；ＣＳＦ、脳脊髄液；ｋｉｎ、スルファチドの形成速度；ｋｏｕｔ、スルファチドの枯渇速度定数、Ｋｔｒａｎｓ、通過速度定数；ＰＫ／ＰＤ、薬物動態学／薬力学；ＱＣＳＦ、コンパートメント間クリアランス；ｒｈＡＳＡ、組換えヒトアリールスルファターゼＡ。
【図７Ａ−７Ｂ】図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、ＣＳＦ中の集団および個別の予測ｒｈＡＳＡ濃度、ＳＣＦ中のスルファチド濃度、およびＧＭＦＭ−８８合計スコアのそれぞれの適合度プロットを示す。
【図７Ｃ】図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃは、ＣＳＦ中の集団および個別の予測ｒｈＡＳＡ濃度、ＳＣＦ中のスルファチド濃度、およびＧＭＦＭ−８８合計スコアのそれぞれの適合度プロットを示す。
【図８】用量レジメンおよびベースライン年齢による、脳脊髄液（ＣＳＦ）（左パネル）および中枢神経系（ＣＮＳ）（右パネル）中の代表的なシミュレーションされたｒｈＡＳＡトラフ濃度を示す。シナリオ１：１週間おきに１００ｍｇ；シナリオ２：毎週１００ｍｇを１２週間（初期毎週投与）、次いで１週間おきに１００ｍｇ；シナリオ３：毎週１５０ｍｇを１２週間（初期毎週投与）、次いで１週間おきに１５０ｍｇ；シナリオ４：毎週年齢調整された投与量を１２週間（初期毎週投与）、次いで１週間おき（シナリオ４：８０ｍｇ、８ヶ月未満；１２０ｍｇ、８〜３０ヶ月未満；１５０ｍｇ、３０ヶ月以上）。
【図９】投与シナリオによるシミュレーションされた個別レベルの予測ＧＭＦＭ−８８合計スコアを示す。４つの投与シナリオは次を含んだ：シナリオ１、１週間おきに（ＥＯＷ）１００ｍｇ；シナリオ２、毎週（ＥＷ）１００ｍｇを１２週間、次いで１００ｍｇ  ＥＯＷ；シナリオ３、毎週１５０ｍｇを１２週間、次いで１５０ｍｇ  ＥＯＷ；シナリオ４、毎週年齢調整された投与量を１２週間、次いでＥＯＷ（８０ｍｇ、８ヶ月未満；１２０ｍｇ、８〜３０ヶ月未満；１５０ｍｇ、３０ヶ月以上）。
【図１０】ｒｈＡＳＡの非盲検、用量漸増安全性評価の用量漸増および延長研究デザインを示す。より高用量への漸増を進める判断は、コホートの全ての患者が以前の用量の少なくとも２回の投与を受けた後のＤＳＭＢレビューに基づいていた。ＤＳＭＢ、データ安全性監視委員会；ＥＯＳ、研究終了；ＥＯＷ、１週間おき；ＧＭＦＭ−８８、粗大運動機能尺度−８８；ＩＤＤＤ、くも膜下腔内薬物送達デバイス；ＭＬＤ、異染性白質ジストロフィー；ＭＲＩ、磁気共鳴映像法；ｒｈＡＳＡ、組換えヒトアリールスルファターゼＡ。
【図１１】処置に対するレスポンダーおよび非レスポンダーとして特定された患者に対する、研究期間にわたる患者年齢による個別のＧＭＦＭ−８８合計スコアを示す。
【図１２】処置に応答した利用可能なデータを有する患者に対する、ベースラインおよび４０週目における個別のＭＬＤ重症度スコアを示す。
【図１３】処置に応答した利用可能なデータを有する患者に対する、ベースラインおよび４０週目における前頭頭頂白質の個別のＮ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）／クレアチン比を示す。
【図１４】経時的な脳脊髄液中のｒｈＡＳＡの平均（±ＳＤ）濃度を示す。
【図１５】コホート１（プロセスＡ：１０ｍｇ）、コホート２（プロセスＡ：３０ｍｇ）、コホート３（プロセスＡ：１００ｍｇ）、コホート４（プロセスＢ：１００ｍｇ）の経時的な観察された平均ＧＭＦＭ−８８合計スコアを示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図１６】コホート１（プロセスＡ：１０ｍｇ）、コホート２（プロセスＡ：３０ｍｇ）、コホート３（プロセスＡ：１００ｍｇ）、コホート４（プロセスＢ：１００ｍｇ）の平均ＣＳＦスルファチドレベルおよびＣＳＦリゾスルファチドレベルのそれぞれを示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。ＣＳＦスルファチド（０．１１３μｇ／ｍＬ）およびＣＳＦリゾスルファチド（０．０２７７ｎｇ／ｍＬ）の正常上限は、白質ジストロフィーを有していないが、脊椎穿刺を受けていた（したがって他の神経学的状態を有する可能性がある）、６０名の幼児からのＣＳＦ試料から観察される最高濃度である。ＣＳＦ、脳脊髄液；ＬＬＯＱ／２、定量下限。
【図１７】図１７Ａおよび１７Ｂは、右前頭白質における（図１７Ａ）ＮＡＡ／クレアチン比および（図１７Ｂ）コリン／クレアチン比の経時的なベースラインからの平均変化を示す。ベースラインデータは、１６名の患者に利用可能であり、研究終了データは、１２名の患者に利用可能であった。エラーバーは、平均からの標準偏差を表す。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、右前頭頭頂白質における（図１８Ａ）ＮＡＡ／クレアチン比および（図１８Ｂ）コリン／クレアチン比の経時的なベースラインからの平均変化を示す。エラーバーは、平均からの標準偏差を表す。
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、頭頂後頭白質における（図１９Ａ）ＮＡＡ／クレアチン比および（図１９Ｂ）コリン／クレアチン比の経時的なベースラインからの平均変化を示す。エラーバーは、平均からの標準偏差を表す。
【図２０】図２０Ａおよび２０Ｂは、正中後頭灰白質における（図２０Ａ）ＮＡＡ／クレアチン比および（図２０Ｂ）コリン／クレアチン比の経時的なベースラインからの平均変化を示す。エラーバーは、平均からの標準偏差を表す。
【図２１】経時的な平均の総ＭＬＤ重症度スコアを示す。エラーバーは、平均の標準誤差を表す。
【図２２】ｒｈＡＳＡの臨床研究からの同胞ペア患者の月齢による個別のＧＭＦＭ−８８合計スコアを示す。
【発明を実施するための形態】
【００６８】
定義
本発明をより容易に理解するために、ある特定の用語を最初に以下に定義する。以下の用語および他の用語の追加の定義は、明細書全体を通して定められている。
【００６９】
およそまたは約：本明細書で使用される場合、対象となる１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、記述された参照値に類似する値を指す。ある特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、特に明記しない限り、または文脈からそうでないことが明らかでない限り（そのような数が可能値の１００％を超える場合を除く）、記述された参照値のいずれかの方向（より大きいかまたは小さい）で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ未満の値の範囲を指す。
【００７０】
生物学的に活性である：本明細書で使用される場合、「生物学的に活性である」という句は、生物系において、特に生物において活性を有する任意の薬剤の特性を指す。例えば、生物に投与されたときに、その生物に対して生物学的効果を有する薬剤は、生物学的に活性であると考えられる。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、そのタンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの部分は、典型的には「生物学的に活性な」部分と呼ばれる。
【００７１】
陽イオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）：本明細書で使用される場合、「陽イオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）」という用語は、リソソームへの輸送を予定しているゴルジ体内で酸加水分解酵素前駆体上のマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）タグに結合する細胞受容体を指す。マンノース−６−リン酸に加えて、ＣＩ−ＭＰＲは、ＩＧＦ−ＩＩを含む他のタンパク質にも結合する。ＣＩ−ＭＰＲは、「Ｍ６Ｐ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＣＩ−ＭＰＲ／ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、「ＩＧＦ−ＩＩ受容体」、または「ＩＧＦ２受容体」としても知られている。これらの用語およびその略語は、本明細書では互換的に使用される。
【００７２】
クロマトグラフィー：本明細書で使用される場合、「クロマトグラフィー」という用語は、混合物を分離するための技術を指す。典型的には、混合物は、「移動相」と呼ばれる流体中に溶解され、これは「固定相」と呼ばれる別の材料を保持する構造を介して混合物を運ぶ。カラムクロマトグラフィーは、固定床が管、すなわちカラム内にある分離技術である。
【００７３】
希釈剤：本明細書で使用される場合、「希釈剤」という用語は、再構成された製剤の調製に有用な薬学的に許容可能な（例えば、ヒトへの投与のための安全で非毒性の）希釈物質を指す。例示的な希釈剤としては、滅菌水、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、滅菌生理食塩水、リンガー溶液、またはデキストロース溶液が挙げられる。
【００７４】
溶出：本明細書で使用される場合、「溶出」という用語は、溶媒で洗浄することによってある材料を別の材料から抽出するプロセスを指す。例えば、イオン交換クロマトグラフィーでは、溶出は、装填された樹脂を洗浄して捕捉されたイオンを除去するプロセスである。
【００７５】
溶出物：本明細書で使用される場合、「溶出物」という用語は、典型的には溶出の結果としての、移動相「担体」とクロマトグラフィーから現れる分析物材料の組み合わせを指す。
【００７６】
酵素補充療法（ＥＲＴ）：本明細書で使用される場合、「酵素補充療法（ＥＲＴ）」という用語は、欠損酵素を提供することによって酵素欠乏を矯正する任意の治療戦略を指す。いったん投与されると、酵素は細胞によって取り込まれ、リソソームに輸送され、酵素は、酵素欠乏によりリソソームに蓄積した物質を除去するように作用する。典型的には、リソソーム酵素補充療法が有効であるためには、治療用酵素は、貯蔵欠陥が明らかである標的組織内の適切な細胞のリソソームに送達される。組換えアリールスルファターゼＡをＭＬＤのＥＲＴの薬物として精製および調製するために、本明細書に記載される精製プロセスが使用され得る。
【００７７】
平衡化する、または平衡化：本明細書で使用される場合、クロマトグラフィーに関連した「平衡化する」または「平衡化」という用語は、第１の液体（例えば、緩衝液）を別の液体と平衡を保つ状態にして、一般に液体（例えば、緩衝液）の構成成分の安定かつ均等な分布を達成するプロセスを指す。例えば、いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーカラムは、所望の液体（例えば、緩衝液）の１つ以上のカラム体積をカラムに通すことによって平衡化されてもよい。
【００７８】
改善する、増加させる、または低減する：本明細書で使用される場合、「改善する」、「増加させる」、もしくは「低減する」という用語、または文法的等価物は、本明細書に記載される処置の開始前の同じ個体における測定値、または本明細書に記載される処置の非存在下での対照個体（もしくは複数の対照個体）における測定値など、ベースライン測定に関連する値を示す。「対照個体」は、処置されている個体とほぼ同じ年齢である、治療されている個体と同じ形態のリソソーム蓄積症に罹患している個体である（治療された個体および対照個体（複数可）における疾患の段階が同等であることを確実にするため）。
【００７９】
不純物：本明細書で使用される場合、「不純物」という用語は、限定された量の液体、気体、または固体内の物質を指し、これは標的物質または化合物の化学組成とは異なる。不純物は混入物とも呼ばれる。
【００８０】
装填：本明細書で使用される場合、「装填」という用語は、クロマトグラフィーにおいて、試料含有液体または固体をカラムに添加することを指す。いくつかの実施形態では、カラムに装填された試料の特定の構成成分は、次いで、装填された試料がカラムを通過する際に捕捉される。いくつかの実施形態では、カラムに装填された試料の特定の構成成分は、装填された試料がカラムを通過する際に、カラムによって捕捉されないか、またはカラムを「通って流れる」。
【００８１】
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」は一般に、ペプチド結合によって互いに付着した少なくとも２つのアミノ酸の鎖である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも３〜５個のアミノ酸を含んでもよく、その各々は、少なくとも１つのペプチド結合によって他のアミノ酸に付着している。当業者であれば、ポリペプチドが時に、「非天然」アミノ酸、またはそれにもかかわらずポリペプチド鎖に任意に組み込まれ得る他の実体を含むことを理解するであろう。
【００８２】
プール：本明細書で使用される場合、クロマトグラフィーに関連した「プール」という用語は、カラムを一緒に通過した流体の１つ以上の画分を組み合わせることを指す。例えば、いくつかの実施形態では、クロマトグラフィーによって分離された試料の所望の構成成分を含有する１つ以上の画分（例えば、「ピーク画分」）は、一緒に「プールされ」、単一の「プール」画分を生成することができる。
【００８３】
補充酵素：本明細書で使用される場合、「補充酵素」という用語は、治療される疾患における欠乏または欠損酵素の少なくとも一部を補充するように作用することができる任意の酵素をいう。いくつかの実施形態では、「補充酵素」という用語は、治療されるリソソーム蓄積症における欠乏または欠損リソソーム酵素を少なくとも部分的に補充するように作用することができる任意の酵素を指す。いくつかの実施形態では、補充酵素（例えば、ｒｈＡＳＡ）は、哺乳動物リソソーム中の蓄積された物質を低減することができるか、または１つ以上のリソソーム蓄積症（例えば、ＭＬＤ）の症状から救うか、またはそれを改善することができる。本発明に適した補充酵素は、野生型または修飾リソソーム酵素の両方を含み、組換えおよび合成方法を使用して産生され得るか、または天然源から精製され得る。補充酵素は、組換え、合成、遺伝子活性化、または天然酵素であり得る。
【００８４】
可溶性：本明細書で使用される場合、「可溶性」という用語は、治療薬が均質な溶液を形成する能力を指す。いくつかの実施形態では、治療薬が投与され、それが標的作用部位に輸送される溶液中の治療薬の溶解性は、標的作用部位への治療有効量の治療薬の送達を可能にするのに十分である。いくつかの要因が治療薬の溶解性に影響を与える可能性がある。例えば、タンパク質の溶解性に影響を及ぼし得る関連因子には、イオン強度、アミノ酸配列、および他の共可溶化剤または塩（例えば、カルシウム塩）の存在が含まれる。いくつかの実施形態では、本発明による治療薬は、その対応する医薬組成物に可溶性である。
【００８５】
安定性：本明細書で使用される場合、「安定な」という用語は、治療薬（例えば、組換え酵素）が、その治療効果（例えば、その意図される生物活性および／または生理化学的完全性の全てもしくは大部分）を長期間にわたって維持する能力を指す。治療薬の安定性、およびそのような治療薬の安定性を維持するための医薬組成物の能力は、長期間（例えば、少なくとも１、３、６、１２、１８、２４、３０、３６ヶ月、またはそれ以上）にわたって評価され得る。製剤の文脈において、安定な製剤は、その中の治療薬が、保存時およびプロセス中（凍結／解凍、機械的混合、および凍結乾燥など）にその物理的および／または化学的完全性ならびに生物活性を本質的に保持する製剤である。タンパク質の安定性については、高分子量（ＨＭＷ）凝集体の形成、酵素活性の損失、ペプチドフラグメントの生成、および電荷プロファイルのシフトによって測定され得る。
【００８６】
ウイルス処理：本明細書で使用される場合、「ウイルス処理」という用語は、ウイルスが試料から単に除去される（例えば、ウイルス濾過）「ウイルス除去」か、またはウイルスが試料中に残るが、非感染型である「ウイルス不活性化」を指す。いくつかの実施形態では、ウイルス除去は、とりわけ、ナノ濾過および／またはクロマトグラフィー技術を利用し得る。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化は、とりわけ、溶媒不活性化、洗浄剤不活性化、低温殺菌、酸性ｐＨ不活性化、および／または紫外線不活性化を利用し得る。
【００８７】
詳細な説明
本発明は、とりわけ、酵素補充療法のための精製された組換えＡＳＡ（ｒｈＡＳＡ）タンパク質を含む方法および組成物を提供する。本発明は、より高い治療有効性のための用量漸増を支持するために、ｒｈＡＳＡが安全であり、かつ乳児および幼児の耐容性が良好である所見に少なくとも部分的に基づいている。本発明は部分的に、運動機能を改善するための、またはＡＳＡ欠乏対象における運動機能の進行性の低下を少なくとも遅らせるもしくは停止させるための、ＭＬＤを治療するための改善された組換えｒｈＡＳＡ治療用量および投与間隔に関する。
【００８８】
一態様では、本発明は、ＭＬＤを治療する方法に関し、ＭＬＤの進行を遅らせるまたは停止させるために好適な投与間隔で治療有効用量のｒｈＡＳＡを投与する工程を含む。
【００８９】
いくつかの実施形態では、治療有効用量は、１００ｍｇ以上である。いくつかの実施形態では、好適な投与間隔は、１週間おきに１回である。いくつかの実施形態では、好適な投与間隔は、週１回である。いくつかの実施形態では、方法は、１週間おきに（ＥＯＷ）１００ｍｇ以上の用量でのｒｈＡＳＡを含む製剤の投与を含む。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＳＡを含む製剤は、１週間に（ＥＷ）１回１００ｍｇ以上の用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＳＡを含む製剤は、ＥＯＷに１回１５０ｍｇの用量で対象に投与される。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＳＡを含む製剤は、ＥＷに１回１５０ｍｇの用量で対象に投与される。
【００９０】
いくつかの実施形態では、対象は、１００ｍｇの用量を投与される前のある継続期間、少なくとも１０ｍｇの用量を投与されている。いくつかの実施形態では、対象は、１００ｍｇの用量を投与される前のある継続期間、少なくとも３０ｍｇの用量を投与されている。いくつかの実施形態では、対象は、ある継続期間１００ｍｇの用量を投与されており、次いで１００ｍｇのｒｈＡＳＡを投与され続けた。いくつかの実施形態では、継続期間は、２０週間、３０週間、３５週間、または４０週間である。いくつかの実施形態では、継続期間は、４０週間である。
【００９１】
いくつかの実施形態では、少なくとも１００ｍｇの用量を投与された対象は、１０ｍｇを用いた以前の処置に対するレスポンダーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１００ｍｇの用量を投与された対象は、３０ｍｇを用いた以前の処置に対するレスポンダーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１００ｍｇの用量を投与された対象は、１０ｍｇを用いた以前の処置に対する非レスポンダーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１００ｍｇの用量を投与された対象は、３０ｍｇを用いた以前の処置に対する非レスポンダーである。いくつかの実施形態では、少なくとも１００ｍｇの用量を投与された対象は、１０ｍｇを用いた以前の処置に対して何の有害作用（ＡＥ）も示さなかった。いくつかの実施形態では、少なくとも１００ｍｇの用量を投与された対象は、３０ｍｇを用いた以前の処置に対して何のＡＥも示さなかった。いくつかの実施形態では、少なくとも１００ｍｇの用量を投与された対象は、１００ｍｇを用いた以前の処置に対して何のＡＥも示さなかった。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ｒｈＡＳＡを含む製剤は、ＥＷに１回１００ｍｇ以上の用量を１２週間投与され、続いてＥＯＷに投与される。いくつかの実施形態では、ｒｈＡＳＡを含む製剤は、ＥＷに１回１５０ｍｇの用量を１２週間投与され、続いてＥＯＷに投与される。いくつかの実施形態では、対象は、投与による有害作用を示さない。
【００９３】
本発明は、ｒｈＡＳＡの治療用途が、より幅広いＭＬＤ、特に遅発性乳児型ＭＬＤの治療において有効であるという所見に基づいている。一態様では、本発明は、遅発性乳児型ＭＬＤを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、遅発性乳児型ＭＬＤを有する対象にｒｈＡＳＡを含む製剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、遅発性乳児型ＭＬＤを有する対象に、好適な投与間隔でｒｈＡＳＡを含む治療有効用量の製剤を投与して、遅発性乳児型ＭＬＤの進行を遅らせるまたは停止させることを含む。いくつかの実施形態では、方法は、くも膜下腔内投与を含む。いくつかの実施形態では、遅発性乳児型ＭＬＤを治療するための治療有効用量は、１５０ｍｇである。いくつかの実施形態では、遅発性乳児型ＭＬＤを治療するための好適な投与間隔は、週１回である。
【００９４】
いくつかの実施形態では、遅発性乳児型ＭＬＤを有する対象は、７２ヶ月齢以下である。いくつかの実施形態では、遅発性乳児型ＭＬＤを有する対象は、４８ヶ月齢以下である。いくつかの実施形態では、遅発性乳児型ＭＬＤを有する対象は、２４ヶ月齢以下である。いくつかの実施形態では、遅発性乳児型ＭＬＤを有する対象は、１８ヶ月齢以下である。対象は、粗大運動機能分類（ＧＭＦＣ）によって決定されるように、運動機能に基づいて選択および分類される。
【００９５】
いくつかの実施形態では、方法は、遅発性乳児型ＭＬＤを有する対象に、ＥＷに１回１５０ｍｇの用量でｒｈＡＳＡを含む製剤をくも膜下腔内投与することを含む。いくつかの実施形態では、投与を少なくとも２年間継続した。
【００９６】
ｒｈＡＳＡを含む製剤を用いて遅発性乳児型ＭＬＤを治療するための対象選択は、年齢、疾患状態、および運動機能特性化に基づくいくつかの要因を含む。いくつかの実施形態では、治療は、早期症候性の対象に行われる。いくつかの実施形態では、早期症候性の遅発性乳児型ＭＬＤを有する対象は、１８〜４８ヶ月齢である。いくつかの実施形態では、早期症候性の遅発性乳児型ＭＬＤを有する対象は、ＭＬＤにおける粗大運動機能分類［ＧＭＦＣ−ＭＬＤ］レベル１〜２を有する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、遅発性乳児型ＭＬＤの治療は、中期症候性の対象に行われる。いくつかの実施形態では、進行性症候性の対象を含む対象は、１８〜７２ヶ月齢である。いくつかの実施形態では、進行性症候性の対象を含む対象は、ＧＭＦＣ  ＭＬＤレベル４を有する。
【００９８】
いくつかの実施形態では、遅発性乳児型ＭＬＤの治療は、発症前または最小症候性対象に行われる。いくつかの実施形態では、発症前または最小症候性対象は、１８ヶ月齢以下、または同じＡＳＡ対立遺伝子構成を有する参加者の発症前の同胞である。一実施形態では、発症前の対象は、アルバータ乳幼児運動スケール（Ｐｉｐｅｒ  Ｍ  ａｎｄ  Ｄａｒｒａｈ  Ｊ，“Ｍｏｔｏｒ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ  Ｉｎｆａｎｔ，”Ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ  Ｆｅｂｒｕａｒｙ  ９，１９９４，ｐａｇｅｓ  ２２２；ＩＳＢＮ：９７８０７２１６４３０７６，Ｓａｕｎｄｅｒｓ）を用いて評価される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、本発明は、ＭＬＤを有する対象に投与するための精製されたｒｈＡＳＡ組成物を提供する。
【０１００】
異染性白質ジストロフィー病（ＭＬＤ）の治療
本発明の組成物および方法は、ＣＮＳへの送達によって、ＭＬＤに罹患しているかまたはＭＬＤにかかりやすい個体を効果的に治療するために使用され得る。ＭＬＤを治療するための本発明のある特定の方法は一般に、治療有効用量で、かつ（運動機能低下を示す）ＧＭＦＣ−ＭＬＤレベルによって測定されるような運動機能不全の進行を安定化するまたは遅らせるのに十分な治療期間の投与間隔で、組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）酵素を、治療を必要としている対象にくも膜下腔内投与する工程を含む。本開示で提供される多くの方法によれば、組換えアリールスルファターゼＡの投与に伴う重篤な副作用は、対象において観察されない。
【０１０１】
運動機能
いくつかの実施形態では、ＭＬＤ患者における神経学的障害は、運動機能、例えば、粗大運動機能の低下を特徴とする。いくつかの実施形態では、治療効力は、１つ以上の運動機能に関連する尺度を含む。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、治療有効用量で、かつベースラインに対して１つ以上の運動機能の低下を改善、安定化、または低減するのに十分な治療期間の投与間隔で、組換えアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）酵素を、治療を必要としている対象にくも膜下腔内投与する工程を含む、異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）を治療する方法が提供される。いくつかの実施形態では、組換えＡＳＡ酵素の投与はさらに、１つ以上の認知機能、適応機能、および／または実行機能の低下の改善、安定化、または低減をもたらす。
【０１０３】
１つ以上の運動機能は、例えば、粗大運動機能を含み得る。粗大運動機能は、任意の適切な方法によって評価され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、粗大運動機能は、例えば、粗大運動機能尺度−８８（ＧＭＦＭ−８８）総生スコアもしくはパーセンテージまたは粗大運動機能分類（ＧＭＦＣ）などの、粗大運動機能尺度を使用する運動機能のベースラインからの変化として測定される。
【０１０４】
粗大運動機能尺度−８８（ＧＭＦＭ−８８）
いくつかの実施形態では、ＭＬＤ患者における神経学的障害は、粗大運動機能の低下を特徴とする。粗大運動機能は、任意の適切な方法によって評価され得ることが理解されるであろう。例えば、いくつかの実施形態では、粗大運動機能は、粗大運動機能尺度−８８（ＧＭＦＭ−８８）総生スコアを使用する運動機能のベースラインからの変化として測定される。いくつかの実施形態では、治療される対象は、４０％を超えるベースラインＧＭＦＭ−８８スコアを有する。いくつかの実施形態では、治療される対象は、４０％未満のベースラインＧＭＦＭ−８８スコアを有する。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って組換えＡＳＡ酵素を投与すると、投与なしで典型的に観察されるよりも運動機能の低下が小さくなる。例えば、いくつかの実施形態において、本発明の方法による組換えＡＳＡ酵素の投与は、ＧＭＦＭ−８８スコアの１０％、２０％、３０％、４０％、または５０％未満の低下をもたらす。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、治療される対象は、３５のベースラインＧＭＦＭ−８８スコアを有する。いくつかの実施形態では、治療される対象は、３５を超えるベースラインＧＭＦＭ−８８スコアを有する。いくつかの実施形態において、治療される対象は、４０のベースラインＧＭＦＭ−８８スコアを有する。いくつかの実施形態では、治療される対象は、４０を超えるベースラインＧＭＦＭ−８８スコアを有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って組換えＡＳＡ酵素を投与すると、ベースラインに対して運動機能が維持される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って組換えＡＳＡ酵素を投与すると、ＧＭＦＭ−８８スコアによって測定されるように運動機能が維持される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って組換えＡＳＡ酵素を投与すると、運動機能の実質的な安定化、例えばＧＭＦＭ−８８スコアなどのスコアの実質的な安定化がもたらされる。「実質的な安定化」とは、ある期間にわたって、例えば治療期間にわたっておよび／または治療の不在下で減少または悪化が通常予想される期間にわたって、減少または悪化がないことを意味する。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って組換えＡＳＡ酵素を投与すると、運動機能の改善、例えばＧＭＦＭ−８８スコアなどのスコアの改善がもたらされる。
【０１０９】
任意の特定の対象について、個々の必要性および酵素補充療法の投与を管理または監督する者の専門的判断に従って、特定の投与レジメンが経時的に調整されるべきであり、本明細書に記載の投与量範囲が、単なる例示であって、請求される本発明の範囲または実施を限定するものではないことがさらに理解されるべきである。
【０１１０】
粗大運動機能分類（ＧＭＦＣ−ＭＬＤ）
粗大運動機能分類（ＧＭＦＣ−ＭＬＤ）は、ＭＬＤにおける粗大運動機能の標準化された評価のためのツールとして使用され得る。ＧＭＦＣ−ＭＬＬＤは、正常（レベル０）から全粗大運動機能の喪失（レベル６）までの全ての臨床的に関連する段階を表す７つのレベルからなる。いくつかの実施形態ではでは、ＧＭＦＣ−ＭＬＤを使用して粗大運動機能が測定される。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、治療される対象は、２以下のベースラインＧＭＦＣレベル（立ち上がり、補助されながら歩行する能力）を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って組換えＡＳＡ酵素を投与すると、ＧＭＦＣレベルによって評価されるように、ベースラインに対して運動機能が維持される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って組換えＡＳＡ酵素を投与すると、２以下のＧＭＦＣレベルが維持される。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って組換えＡＳＡ酵素を投与すると、ベースラインから２年まで、２以下のＧＭＦＣ−ＭＬＤレベルの増加（運動機能低下を示す）をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って組換えＡＳＡ酵素を投与すると、ベースラインから２年まで、３以下のＧＭＦＣ−ＭＬＤレベルの増加（運動機能低下を示す）をもたらす。いくつかの実施形態では、本発明の方法に従って組換えＡＳＡ酵素を投与すると、ＧＭＦＣ−ＭＬＤの２レベル以下のベースラインからの変化として評価される粗大運動機能の維持をもたらす。
【０１１３】
治療的投与
精製された組換えＡＳＡタンパク質は、既知の方法に従ってＭＬＤ患者に投与されてもよい。例えば、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、静脈内、皮下、筋肉内、非経口的、経皮、または経粘膜的（例えば、経口的もしくは経鼻的）に送達され得る。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、組換えＡＳＡまたはそれを含有する医薬組成物は、静脈内投与によって対象に投与される。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、組換えＡＳＡまたはそれを含有する医薬組成物は、くも膜下腔内投与によって対象に投与される。本明細書で使用される場合、「くも膜下腔内投与」または「くも膜下腔内注射」という用語は、脊柱管（脊髄を取り囲むくも膜下腔内空間）への注射を指す。バーホール穿刺または大槽穿刺または腰椎穿刺などを介した側脳室注射が挙げられるが、これらに限定されない様々な技法が使用され得る。いくつかの実施形態では、本発明による「くも膜下腔内投与」または「くも膜下腔内送達」は、腰部範囲または腰部領域を介するＩＴ投与または送達、すなわち腰部ＩＴ投与または送達を指す。本明細書で使用される場合、「腰部領域」または「腰部範囲」という用語は、第３腰椎と第４腰椎との間の範囲（下背）、より包括的には脊柱のＬ２−Ｓ１領域を指す。いくつかの実施形態では、組換えＡＳＡまたはそれを含有する医薬組成物は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれるＰＣＴ国際公開第ＷＯ２０１１／１６３６４８号および同第ＷＯ２０１１／１６３６５０号に記載されるように、くも膜下腔内投与によって対象に投与される。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、組換えＡＳＡまたはそれを含有する医薬組成物は、皮下（すなわち皮膚下）投与によって対象に投与される。そのような目的のために、注射器を使用して製剤が注射されてもよい。しかしながら、注射デバイス（例えば、Ｉｎｊｅｃｔ−ｅａｓｅデバイスおよびＧｅｎｊｅｃｔデバイス）、注射ペン（ＧｅｎＰｅｎなど）、無針デバイス（例えば、ＭｅｄｉＪｅｃｔｏｒおよびＢｉｏＪｅｃｔｏｒ）、ならびに皮下パッチ送達システムなどの製剤投与用の他のデバイスが使用可能である。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、くも膜下腔内投与は、他の投与経路（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、非経口、経皮、または経粘膜（例えば、経口もしくは経鼻））と併用され得る。
【０１１８】
本発明は、本明細書に記載の組換えＡＳＡまたはそれを含有する医薬組成物の治療有効量の単回投与ならびに複数回投与を企図している。組換えＡＳＡまたはそれを含有する医薬組成物は、対象の状態（例えば、リソソーム蓄積症）の性質、重症度、および程度に応じて規則的な間隔で投与され得る。いくつかの実施形態では、治療有効量の組換えＡＳＡまたはそれを含有する医薬組成物が、規則的な間隔で（例えば、年１回、６ヶ月に１回、５ヶ月に１回、３ヶ月に１回、隔月（２ヶ月に１回）、毎月（月１回）、隔週（２週間に１回）、毎週、毎日、または連続して）、周期的に投与され得る。
【０１１９】
ＣＮＳ送達
本明細書に記載の様々な安定した製剤は一般に、治療薬のＣＮＳ送達に適していると考えられる。本発明による安定した製剤は、実質内、脳内、脳室内（ＩＣＶ）、くも膜下腔内（例えば、ＩＴ−腰椎、ＩＴ−大槽）投与、ならびにＣＮＳおよび／またはＣＳＦに直接または間接的に注射するための任意の他の技法および経路が挙げられるが、これらに限定されない様々な技法および経路によるＣＮＳ送達に使用され得る。用語「大槽」は、頭蓋骨と脊柱の頂部との間の開口部を介した小脳の周囲および下の空間を指す。典型的には、大槽を介する注入は、「大槽送達」とも呼ばれる。
【０１２０】
くも膜下腔内送達
いくつかの実施形態において、補充酵素は、本明細書に記載の製剤中でＣＮＳに送達される。いくつかの実施形態では、治療を必要としている対象の脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与することによって、補充酵素がＣＮＳに送達される。いくつかの実施形態において、くも膜下腔内投与は、ＣＳＦ中に所望の補充酵素（例えば、ＡＳＡタンパク質）を送達するために使用される。本明細書で使用される場合、くも膜下腔内投与（くも膜下腔内注射とも呼ばれる）は、脊柱管（脊髄を取り囲むくも膜下腔内空間）への注射を指す。腰椎穿刺を含むが、これに限定されない様々な技術を使用することができる。例示的な方法は、Ｌａｚｏｒｔｈｅｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇｅｒｙ，１４３−１９２に記載され、この内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１２１】
本発明によると、脊柱管を取り囲む任意の領域に酵素が注射され得る。いくつかの実施形態では、酵素は、腰部範囲に注射される。本明細書で使用される場合、「腰部領域」または「腰部範囲」という用語は、第３腰椎と第４腰椎との間の範囲（下背）、より包括的には脊柱のＬ２−Ｓ１領域を指す。典型的には、腰部領域または腰部範囲を介するくも膜下腔内注射は、「腰髄腔内送達」または「腰髄腔内投与」とも呼ばれる。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、治療用タンパク質、例えば、組換えアリールスルファターゼＡは、例えば、第３腰椎と第４腰椎との間（下背）、より包括的には脊柱のＬ２−Ｓ１領域に送達される腰髄腔内投与によって送達される。本発明による腰髄腔内投与または送達が、遠位脊柱管へのより良好でより効果的な送達を提供する点で、腰髄腔内投与または送達は、大槽送達と区別され、一方、大槽送達は、とりわけ、典型的には遠位の脊柱管に良好に送達しないと考えられる。
【０１２３】
くも膜下腔内送達用デバイス
本発明によるくも膜下腔内送達のために、様々なデバイスが使用され得る。いくつかの実施形態では、くも膜下腔内投与用デバイスは、流体アクセスポート（例えば、注射ポート）と、流体アクセスポートと流体連通している第１の流れオリフィスおよび脊髄に挿入するように構成された第２の流れオリフィスを有する中空体（例えば、カテーテル）と、脊髄への中空体の挿入を確実にするための固定機構とを含む。非限定的な例として、適切な固定機構は、中空体の表面に取り付けられた１つ以上のノブと、１つ以上のノブ上で調節可能な縫合リングとを含み、中空体（例えば、カテーテル）が脊髄から滑り落ちるのを防止する。様々な実施形態において、流体アクセスポートはリザーバを含む。いくつかの実施形態では、流体アクセスポートは、機械的ポンプ（例えば、注入ポンプ）を備える。いくつかの実施形態では、埋め込み型カテーテルは、リザーバ（例えば、ボーラス送達用）または注入ポンプのいずれかに接続される。流体アクセスポートは、埋め込まれても外部にあってもよい。
【０１２４】
いくつかの実施形態では、くも膜下腔内投与は、腰椎穿刺（すなわち、低速ボーラス）またはポート−カテーテル送達システム（すなわち、注入もしくはボーラス）のいずれかによって行われ得る。いくつかの実施形態では、カテーテルは、腰椎の薄層の間に挿入され、先端は、包膜空間を所望のレベル（一般にはＬ３−Ｌ４）にねじ込まれる。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、くも膜下腔内投与は、埋め込み型髄腔内薬物送達デバイス（ＩＤＤＤ）への間欠的または連続的なアクセスによるものである。
【０１２６】
静脈内投与と比較して、くも膜下腔内投与に適した単回投与量は、典型的には小さい。典型的には、本発明によるくも膜下腔内送達は、対象の頭蓋内圧と同様にＣＳＦの組成物のバランスを維持する。いくつかの実施形態において、くも膜下腔内送達は、対象からのＣＳＦの対応する除去なしに行われる。いくつかの実施形態では、適切な単回投与量は、例えば、約１０ｍｌ、８ｍｌ、６ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、１．５ｍｌ、１ｍｌまたは０．５ｍｌ未満であり得る。いくつかの実施形態では、適切な単回投与量は、約０．５〜５ｍｌ、０．５〜４ｍｌ、０．５〜３ｍｌ、０．５〜２ｍｌ、０．５〜１ｍｌ、１〜３ｍｌ、１〜５ｍｌ、１．５〜３ｍｌ、１〜４ｍｌ、または０．５〜１．５ｍｌである。いくつかの実施形態では、本発明によるくも膜下腔内送達は、最初に所望量のＣＳＦを除去する工程を含む。いくつかの実施形態では、約１０ｍｌ未満（例えば、約９ｍｌ、８ｍｌ、７ｍｌ、６ｍｌ、５ｍｌ、４ｍｌ、３ｍｌ、２ｍｌ、１ｍｌ未満）のＣＳＦが、くも膜下腔内投与の前にまず除去される。そのような場合、適切な単回投与量は、例えば、約３ｍｌ、４ｍｌ、５ｍｌ、６ｍｌ、７ｍｌ、８ｍｌ、９ｍｌ、１０ｍｌ、１５ｍｌ、または２０ｍｌを超えてもよい。
【０１２７】
個体への治療用組成物または製剤のくも膜下腔内投与のための他のデバイスは、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２１７，５５２号に記載されている。代替的に、薬物は、例えば、単回注射または連続注入によってくも膜下腔内投与することができる。投薬治療は、単回投与または複数回投与の形態であってもよいことを理解されたい。
【０１２８】
注射のために、本発明の製剤は液体溶液中に製剤化することができる。さらに、酵素は、固体形態で処方され、使用直前に再溶解または懸濁されてもよい。凍結乾燥形態も含まれる。注射は、例えば、酵素のボーラス注射または連続注入（例えば、注入ポンプを使用する）の形態であり得る。
【０１２９】
非くも膜下腔内送達法
治療的酵素、例えば、組換えアリールスルファターゼＡは、非くも膜下腔内手段、例えば対象の脳への側脳室注射によって投与され得る。注射は、例えば、対象の頭蓋骨に形成された穿頭孔を通して行うことができる。別の実施形態において、酵素および／または他の医薬製剤は、外科的に挿入されたシャントを通して、対象の脳室に投与される。例えば、より大きな側脳室に注射を行うことができる。いくつかの実施形態では、第３および第４のより小さい心室への注入を行うこともできる。
【０１３０】
代替的に、医薬組成物は、対象の大槽または腰部領域への注射によって投与することができる。
【０１３１】
ある種の装置を使用して、治療用組成物の投与を行うことができる。例えば、所望の酵素を含有する製剤は、髄膜癌腫症のためにくも膜下腔内に投与するために一般的に使用されているオマヤ（Ｏｍｍａｙａ）リザーバを用いて薬物を投与することができる（Ｌａｎｃｅｔ  ２：９８３−８４，１９６３）。より具体的には、この方法では、前庭ホーンに形成された穴に心室チューブを挿入し、頭皮の下に設置されたオマヤ（Ｏｍｍａｙａ）リザーバに接続し、リザーバを皮下に穿刺して、置換された特定の酵素をくも膜下腔内に送達し、貯留槽に入れる。
【０１３２】
徐放／持続送達
本発明の方法の別の実施形態では、薬学的に許容される製剤は、本発明で使用される酵素または他の医薬組成物の対象への持続放出、例えば、薬学的に許容される製剤が対象に投与された後、少なくとも１、２、３、４週間またはそれ以上の長い期間の「徐放」を提供する。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、「持続送達」という用語は、投与後のある期間、好ましくは少なくとも数日、１週間、または数週間にわたるインビボでの本発明の医薬製剤の継続的送達を指す。組成物の持続送達は、例えば経時的な酵素の継続的な治療効果（例えば、酵素の持続送達は、対象における保存顆粒の継続された減少した量によって示され得る）によって実証され得る。代替的に、酵素の持続送達は、経時的なインビボでの酵素の存在を検出することによって実証され得る。
【０１３４】
標的組織への送達
上述のように、本発明の驚くべき重要な特徴の１つは、本発明の方法および組成物を用いて投与される治療薬、特に補充酵素が脳表面を効果的かつ広範囲に拡散し、深い脳領域を含む脳の様々な層または領域に浸透する。さらに、本発明の発明的な方法および組成物は、腰部を含む様々な組織、ニューロンまたは脊髄の細胞に治療薬（例えば、ＡＳＡ酵素）を効果的に送達するが、これは、ＩＣＶ注入などの既存のＣＮＳ送達方法によって標的とすることは困難である。さらに、本発明の発明的な方法および組成物は、十分な量の治療薬（例えば、ＡＳＡ酵素）を血流および種々の末梢器官および組織に送達する。
【０１３５】
したがって、いくつかの実施形態では、治療用タンパク質（例えば、ＡＳＡ酵素）は、対象の中枢神経系に送達される。いくつかの実施形態において、治療用タンパク質（例えば、ＡＳＡ酵素）は、脳、脊髄、および／または末梢器官の標的組織の１つ以上に送達される。本明細書で使用される場合、「標的組織」という用語は、治療されるリソソーム蓄積症または欠損したリソソーム酵素が通常発現される任意の組織により影響を受ける任意の組織を指す。いくつかの実施形態では、標的組織は、リソソーム蓄積症に罹患しているか、または罹患しやすい患者において、例えば組織の細胞リソソームに保存されている検出可能または異常に高い量の酵素基質がある組織を含む。いくつかの実施形態では、標的組織には、疾患に関連する病態、症状、または特徴を呈する組織が含まれる。いくつかの実施形態では、標的組織には、欠損リソソーム酵素が正常に高レベルで発現される組織が含まれる。本明細書で使用される場合、標的組織は、脳標的組織、脊髄標的組織および／または末梢標的組織であり得る。例示的な標的組織を以下に詳細に記載する。
【０１３６】
脳標的組織
一般に、脳は異なる領域、層および組織に分けることができる。例えば、髄膜組織は、脳を含む中枢神経系を包む膜系である。髄膜には、硬膜、くも膜下腔、および軟部を含む３つの層が含まれる。一般に、髄膜および脳脊髄液の主要な機能は、中枢神経系を保護することである。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、髄膜の１つ以上の層に送達される。
【０１３７】
脳は、大脳、小脳、および脳幹を含む３つの主要な細分を有する。大半の他の脳構造の上に位置し、皮質層で覆われている大脳半球。大脳の下には脳幹があり、大脳が付いている柄に似ている。脳の後ろ、脳の下、脳幹の背後には、小脳がある。
【０１３８】
脳の中線付近および中脳より上に位置する間脳は、背側視床、メタサラマス、視床下部、視床上部、腹側視床および視蓋前野を含む。中脳（ｍｉｄｂｒａｉｎ）とも呼ばれる中脳（ｍｅｓｅｎｃｅｐｈａｌｏｎ）は、視蓋、テグメンタム（ｔｅｇｕｍｅｎｔｕｍ）、心室中胚葉および大脳脚（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｐｅｄｕｎｃｅｌ）、赤核、および脳神経ＩＩＩ核を含む。中脳は、視覚、聴覚、運動制御、睡眠／覚醒、覚醒、温度調節に関連する。
【０１３９】
脳を含む中枢神経系の組織の領域は、組織の深さに基づいて特徴付けることができる。例えば、ＣＮＳ（例えば、脳）組織は、表面組織または浅い組織、中深部組織および／または深部組織として特徴付けることができる。
【０１４０】
本発明によると、治療用タンパク質（例えば、補充酵素）は、対象において治療される特定の疾患に関連する任意の適切な脳標的組織に送達され得る。いくつかの実施形態において、本発明による治療用タンパク質（例えば、補充酵素）は、表面または浅い脳の標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、中深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、深部脳標的組織に送達される。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質は、表面または浅脳標的組織、中深部脳標的組織、および／または深部脳標的組織の組み合わせに送達される。いくつかの実施形態において、本発明による治療用タンパク質は、脳の外表面の少なくとも４ｍｍ、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍ、１０ｍｍまたはそれよりも下の（または内部の）深部脳組織に送達される。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば、酵素）は、大脳の１つ以上の表面組織または浅い組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅い組織は、大脳の表面から４ｍｍ以内に位置する。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅い組織は、皮質組織、大脳皮質リボン組織、海馬、Ｖｉｒｃｈｏｗ  Ｒｏｂｉｎ空間、ＶＲ空間内の血管、海馬、脳の下表面上の視床下部の部分、視神経および管、嗅球および突起、およびそれらの組み合わせから選択される。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば、酵素）は、大脳の１つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化表面または浅い組織は、大脳の表面の４ｍｍ（例えば、５ｍｍ、６ｍｍ、７ｍｍ、８ｍｍ、９ｍｍまたは１０ｍｍ）下に（または内部に）位置される。いくつかの実施形態では、大脳の標的化された深部組織には、大脳皮質リボンが含まれる。いくつかの実施形態では、大脳の標的組織は、１つ以上の間脳（例えば、視床下部、視床、前十字、副甲状腺など）、後脳、大脳基底核、基底核、尾状核、被殻、扁桃体、淡蒼球、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば、酵素）は、小脳の１つ以上の組織に送達される。特定の実施形態では、小脳の標的化された１つ以上の組織は、分子層の組織、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、小脳の小斑点、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、治療薬（例えば、酵素）は、プルキンエ細胞層の組織、顆粒細胞層の組織、深部小脳白質組織（例えば、顆粒細胞層に対して深い）および深部小脳核組織を含むが、これらに限定されない小脳の１以上の深部組織に送達される。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、治療薬（例えば、酵素）は、脳幹の１つ以上の組織に送達される。いくつかの実施形態では、脳幹の標的化された１つ以上の組織には、脳幹白質組織および／または脳幹核組織が含まれる。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば、酵素）は、限定されないが、灰白質、白質、脳室周囲領域、髄膜、新皮質、小脳、大脳皮質の深部組織、分子層、尾状核／被殻領域、中脳、脳橋または髄質の深部およびその組み合わせを含む種々の脳組織に送達される。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、治療薬（例えば、酵素）は、ニューロン、グリア細胞、血管周囲細胞および／または髄膜細胞を含むが、これに限定されない脳の様々な細胞に送達される。いくつかの実施形態では、治療用タンパク質は深部白質の乏突起膠細胞に送達される。
【０１４７】
脊髄
一般に、脊髄の領域または組織は、組織の深さに基づいて特徴付けることができる。例えば、脊髄組織は、表面組織または浅い組織、中深部組織および／または深部組織として特徴付けることができる。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、治療薬（例えば、酵素）は、脊髄の１つ以上の表面または浅い組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面または浅い組織は、脊髄の表面から４ｍｍ以内に位置する。いくつかの実施形態では、脊髄の標的化表面または浅い組織は、ピア物質および／または白質の管を含む。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、治療薬（例えば、酵素）は、脊髄の１つ以上の深部組織に送達される。いくつかの実施形態では、脊髄の標的深部組織は、脊髄の表面から４ｍｍ内側に位置する。いくつかの実施形態において、脊髄の標的化された深部組織は、脊髄灰白質および／または上衣細胞を含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、治療薬（例えば、酵素）は、脊髄のニューロンに送達される。
【０１５１】
末梢標的組織
本明細書で使用される場合、末梢器官または組織とは、中枢神経系（ＣＮＳ）の一部ではない任意の器官または組織をいう。末梢標的組織には、血液系、肝臓、腎臓、心臓、内皮、骨髄および骨髄由来細胞、脾臓、肺、リンパ節、骨、軟骨、卵巣および精巣が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本発明による治療用タンパク質（例えば、補充酵素）は、末梢標的組織の１つ以上に送達される。
【０１５２】
生体内分布およびバイオアベイラビリティ
種々の実施形態では、一旦標的組織に送達されると、治療薬（例えば、ＡＳＡ酵素）が細胞内に局在化される。例えば、治療薬（例えば、酵素）は、標的細胞（例えば、プルキンエ細胞などのニューロン）のエクソン、軸索、リソソーム、ミトコンドリアまたは液胞に局在化され得る。例えば、いくつかの実施形態では、くも膜下腔内に投与された酵素は、酵素が血管周囲腔内を移動するような転位動態を示す（例えば、脈動補助対流機構によって）。さらに、投与されたタンパク質または酵素とニューロフィラメントとの関連に関する能動的軸索輸送機構は、中枢神経系のより深部の組織へのクモ膜下投与タンパク質または酵素の分布に寄与し、またはそうでなければ促進する。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば、ＡＳＡ酵素）は、本明細書に記載の様々な標的組織において治療的または臨床的に有効なレベルまたは活性を達成することができる。本明細書で使用される場合、治療上または臨床上有効なレベルまたは活性は、標的組織に治療効果を与えるのに十分なレベルまたは活性である。治療効果は、客観的（すなわち、何らかの試験またはマーカーによって測定可能）または主観的（すなわち、対象が効果を示しまたは感じる）であり得る。例えば、治療的または臨床的に有効なレベルまたは活性は、標的組織における疾患に関連する症状を改善するのに十分な酵素レベルまたは活性（例えば、ＧＡＧ貯蔵）であり得る。
【０１５４】
治療有効用量および投与間隔
治療有効量は、複数の単位用量を含み得る投薬レジメンで一般的に投与される。任意の特定の治療用タンパク質について、治療有効（および／または有効な投与レジメン内の適切な単位投与量）は、例えば、投与経路に応じて、他の医薬品と組み合わせて変化し得る。また、特定の患者に対する特定の治療有効（および／または単位用量）は、治療される障害および障害の重篤度；使用される特定の医薬品の活性；使用される特定の組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康状態、性別および食事；投与時間、投与経路、および／または使用される特定の融合タンパク質の排泄または代謝速度；治療の持続時間；医学分野でよく知られているような類似の因子を含む様々な因子に依存し得る。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約６０ｍｇ、６５ｍｇ、７０ｍｇ、７５ｍｇ、８０ｍｇ、８５ｍｇ、９０ｍｇ、９５ｍｇ、１００ｍｇ、１０５ｍｇ、１１０ｍｇ、１１５ｍｇ、１２０ｍｇ、１２５ｍｇ、１３０ｍｇ、１３５ｍｇ、１４０ｍｇ、１４５ｍｇ、１５０ｍｇ、１５５ｍｇ、１６０ｍｇ、１６５ｍｇ、１７０ｍｇ、１７５ｍｇ、１８０ｍｇ、１８５ｍｇ、１９０ｍｇ、１９５ｍｇ、または約２００ｍｇ以上である。特定の実施形態では、治療有効用量は、約１５０ｍｇ以上である。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約５００ｍｇ、４５０ｍｇ、４００ｍｇ、３５０ｍｇ、３００ｍｇ、２５０ｍｇ２００ｍｇ、または１５０ｍｇ未満である。特定の実施形態では、治療有効用量は約２００ｍｇ未満である。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約１０〜２００ｍｇ、約２０〜２００ｍｇ、約３０〜２００ｍｇ、約４０〜２００ｍｇ、約５０〜２００ｍｇ、約１６０〜２００ｍｇ、約７０〜２００ｍｇ、約８０〜２００ｍｇ、約９０〜２００ｍｇ、約１００〜２００ｍｇ、約１２５〜２００、約１５０〜２００、約５０〜３００ｍｇ、約７５〜３００ｍｇ、約１００〜３００ｍｇ、約１５０〜３００、または約１０〜５０ｍｇの範囲である。いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約１００ｍｇ〜約２００ｍｇの範囲である。
【０１５６】
一部の実施形態では、治療有効用量は、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜５００ｍｇ／ｋｇ脳重量、例えば、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜４００ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜３００ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜２００ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜１００ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜９０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜８０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜７０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜６０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜５０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜４０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜３０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜２５ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ〜脳重量２０ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜１５ｍｇ／ｋｇ脳重量、約０．００５ｍｇ／ｋｇ脳重量〜１０ｍｇ／ｋｇ脳重量の範囲である。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、治療有効用量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約０．５ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約１．０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約３ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約５ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約１０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約１５ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約２０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約３０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約４０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約５０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約６０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約７０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約８０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約９０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約１００ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約１５０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約２００ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約２５０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約３００ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約３５０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約４００ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約４５０ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きく、約５００ｍｇ／ｋｇ脳重量より大きい。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、治療有効用量はまた、ｍｇ／ｋｇ体重によって定義されてもよい。当業者が理解するように、脳重量および体重を相関させることができる。Ｄｅｋａｂａｎ  ＡＳ．“Ｃｈａｎｇｅｓ  ｉｎ  ｂｒａｉｎ  ｗｅｉｇｈｔｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｐａｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｌｉｆｅ：ｒｅｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｂｒａｉｎ  ｗｅｉｇｈｔｓ  ｔｏ  ｂｏｄｙ  ｈｅｉｇｈｔｓ  ａｎｄ  ｂｏｄｙ  ｗｅｉｇｈｔｓ，”Ａｎｎ  Ｎｅｕｒｏｌ  １９７８；４：３４５−５６。したがって、いくつかの実施形態では、投与量は、表２に示すように変換することができる。
【表２】
2021508322.tif 000003
【０１５９】
いくつかの実施形態では、治療有効用量はまた、ＣＳＦのｍｇ／１５ｃｃによって定義されてもよい。当業者であれば分かるように、脳重量および体重に基づく治療有効用量は、ＣＳＦのｍｇ／１５ｃｃに変換することができる。例えば、成人のＣＳＦの量は約１５０ｍＬである（Ｊｏｈａｎｓｏｎ  ＣＥ，ｅｔ  ａｌ．“Ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  ｆｌｕｉｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ：Ｎｅｗ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ  ｉｎ  ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｄｉｓｅａｓｅ，”Ｃｅｒｅｂｒｏｓｐｉｎａｌ  Ｆｌｕｉｄ  Ｒｅｓ．２００８  Ｍａｙ  １４；５：１０）。したがって、成人に対する０．１ｍｇ〜５０ｍｇのタンパク質の単回用量の注射は、成人における約０．０１ｍｇ／１５ｃｃのＣＳＦ（０．１ｍｇ）〜５．０ｍｇ／１５ｃｃのＣＳＦ（５０ｍｇ）用量であろう。
【０１６０】
任意の特定の対象について、個々の必要性および酵素補充療法の投与を管理または監督する者の専門的判断に従って、特定の投与レジメンが経時的に調整されるべきであり、本明細書に記載の投与量範囲が、単なる例示であって、請求される本発明の範囲または実施を限定するものではないことがさらに理解されるべきである。
【０１６１】
特定の実施形態では、組換えアリールスルファターゼＡ酵素は、ある投与間隔、例えば定期的間隔で投与される。例えば、投与間隔は、１週間に１回、２週間に１回、または１ヶ月に１回であり得る。
【０１６２】
特定の実施形態では、組換えアリールスルファターゼＡ酵素は、治療期間にわたって投与される。治療期間は、予め決定することができ、または、本明細書で論じる治療効力の可能性のある有害症状および／または証拠を含むが、これに限定されない治療に対する患者の応答に応じて調整することができる。例えば、治療期間は、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月、少なくとも１２ヶ月、少なくとも２４ヶ月、またはそれ以上であり得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、対象は、ある治療期間にわたって治療を受け、それらが治療または代替治療を受けない一定期間を経て、再び別の治療期間を経ると考えられる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば、補充酵素）は、標的組織中の対応するリソソーム酵素の正常レベルまたは活性の少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％である酵素レベルまたは活性を達成することができる。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば、補充酵素）は、対照またはベースライン（例えば、内在性レベルまたは処置を伴わない活性）と比較して、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍または１０倍増加した酵素レベルまたは活性を達成し得る。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば、補充酵素）は、標的組織において、少なくとも約１０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、２０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、４０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、６０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、７０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、８０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、９０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、１００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、１５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、２００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、２５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、３００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、３５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、４００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、４５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、５００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、５５０ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、または６００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇの酵素レベルまたは活性の増加を達成し得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、本発明による発明的な方法は、腰部を標的化するのに特に有用である。いくつかの実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば、補充酵素）は、少なくとも約５００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、６００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、７００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、８００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、９００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、１０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、１５００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、２０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、３０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、４０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、５０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、６０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、７０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、８０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、９０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇ、または１０，０００ｎｍｏｌ／ｈｒ／ｍｇの腰部における酵素レベルまたは活性の増加を達成することができる。
【０１６６】
一般に、本発明に従って送達される治療薬（例えば、補充酵素）は、ＣＳＦおよび脳、脊髄および末梢器官の標的組織において十分に長い半減期を有する。いくつかの実施形態において、本発明に従って送達される治療薬（例えば、補充酵素）は、少なくともおよそ３０分、４５分、６０分、９０分、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、２５時間、３０時間、３５時間、４０時間、最大３日間、最大７日間、最大１４日間、最大２１日間、または最大１ヶ月の半減期を有し得る。いくつかの実施形態において、いくつかの実施形態において、本発明に従って送達される治療薬（例えば、補充酵素）は、投与後の１２時間、２４時間、３０時間、３６時間、４２時間、４８時間、５４時間、６０時間、６６時間、７２時間、７８時間、８４時間、９０時間、９６時間、１０２時間、または１週間後にＣＳＦまたは血流において検出可能なレベルまたは活性を保持し得る。検出可能なレベルまたは活性は、当該分野で公知の様々な方法を用いて決定され得る。
【０１６７】
特定の実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば、補充酵素）は、投与後の対象のＣＮＳ組織および細胞において少なくとも３０μｇ／ｍｌの濃度を達成する（例えば、医薬組成物を対象の髄腔内に投与した後、１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分、またはそれ未満）。特定の実施形態では、本発明に従って送達される治療薬（例えば、補充酵素）は、対象の標的組織または細胞（例えば、脳組織またはニューロン）において、そのような対象への投与後に、少なくとも２０μｇ／ｍｌ、少なくとも１５μｇ／ｍｌ、少なくとも１０μｇ／ｍｌ、少なくとも７．５μｇ／ｍｌ、少なくとも５μｇ／ｍｌ、少なくとも２．５μｇ／ｍｌ、少なくとも１．０μｇ／ｍｌ、または少なくとも０．５μｇ／ｍｌの濃度で達成する（例えば、このような医薬組成物を対象にくも膜下腔内投与した後、１週間、３日、４８時間、３６時間、２４時間、１８時間、１２時間、８時間、６時間、４時間、３時間、２時間、１時間、３０分、またはそれ未満）。
【０１６８】
治療製剤
組換えＡＳＡまたはそれを含有する医薬組成物は、医薬組成物を調製するために生理学的に許容可能な担体または賦形剤と調製され得る。担体および治療薬は、滅菌され得る。製剤は、投与様式に適したものであるべきである。
【０１６９】
好適な薬学的に許容される担体として、以下に限定されないが、水、塩溶液（例えば、ＮａＣｌ）、食塩水、緩衝食塩水、アルコール、グリセロール、エタノール、アラビアゴム、植物油、ベンジルアルコール、ポリエチレングリコール、ゼラチン、炭水化物（ラクトース、アミロース、またはデンプンなど）、糖（マンニトール、スクロース、またはその他など）、デキストロース、ステアリン酸マグネシウム、タルク、珪酸、粘性パラフィン、香油、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドンなど、およびこれらの組み合わせが挙げられる。医薬製剤は、必要に応じて、活性化合物と有害な反応を起こさないか、またはそれらの活性を妨げない助剤（例えば、潤滑剤、防腐剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼす塩類、緩衝剤、着色料、香味料、および／または芳香剤など）と混合され得る。いくつかの実施形態では、静脈内投与に適した水溶性担体が使用される。
【０１７０】
所望に応じて、組成物または薬剤は、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。組成物は、溶液、懸濁液、乳濁液、錠剤、丸剤、カプセル剤、徐放性製剤、または粉末であり得る。組成物はまた、従来の結合剤および担体（トリグリセリドなど）を用いて座薬としても製剤化され得る。経口製剤は、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン、サッカリンナトリウム、セルロース、炭酸マグネシウムなどの標準的な担体を含み得る。
【０１７１】
組成物または薬剤は、ヒトに対する投与に適した医薬組成物として、慣行的な手順に従って製剤化され得る。例えば、一部の実施形態では、静脈内投与用の組成物は、無菌等張水性緩衝溶液であるのが典型的である。必要に応じて、組成物はまた、可溶化剤、および注射部位の痛みを軽減するための局所麻酔薬を含んでもよい。一般的に、成分は、例えば凍結乾燥粉末または無水濃縮物として、活性作用剤の量を提示するアンプルまたはサシェ（ｓａｃｈｅｔｔｅ）などの密封容器に、別々に、または単位剤形の形態で混合されて供給される。組成物を注入によって投与しようとする場合、無菌医薬品グレードの水、食塩水、またはデキストロース／水を含有する注入瓶を用いて調剤することができる。組成物を注射によって投与する場合、注射用の無菌水か、または食塩水のアンプルを供給することができ、投与に先立って成分を混合できるようにする。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡは、１５４ｍＭのＮａＣｌ、または０．９％  ＮａＣｌおよび１０〜５０ｍＭのリン酸ナトリウムｐＨ６．５〜８．０もしくはリン酸ナトリウム、グリシン、マンニトール、または対応するカリウム塩などの等張溶液中で製剤化される。実施形態において、製剤の浸透圧は、約２５０〜約３５０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ（例えば、約２５５〜約３２０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、約２６０〜約３１０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ、または約２８０〜約３００ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ）である。
【０１７３】
別の実施形態では、ＡＳＡは、以下のような生理学的緩衝液中で製剤化される：
ａ）以下を含有する製剤緩衝液Ｉ（ｍＭで）：Ｎａ２ＨＰＯ４（３．５０〜３．９０）、ＮａＨ２ＰＯ４（０〜０．５）、グリシン（２５〜３０）、マンニトール（２３０〜２７０）、および注射用水、または
ｂ）以下を含有する製剤緩衝液ＩＩ（ｍＭで）：トリス−ＨＣｌ（１０）、グリシン（２５〜３０）、マンニトール（２３０〜２７０）、および注射用水。
【０１７４】
本明細書の方法によって精製されるアリールスルファターゼＡは、異染性白質ジストロフィーに罹患している、および／または診断されている対象における末梢神経系の細胞内または中枢神経系内のスフィンゴ脂質３−Ｏ−スルホガラクトシルセラミド（ガラクトシルスルホファチド）レベルを低減するための薬剤として使用され得る。ＡＳＡの投与は、運動学習スキルの障害の減少、または神経運動伝導速度および／もしくは神経伝導振幅の増加につながる。本明細書で使用される場合、用語「治療有効量」は、主として、本発明の医薬組成物に含まれる治療薬の総量に基づいて決定される。一般に、治療有効量は、対象に対して意義のある利益を得る（例えば、基礎疾患または症状を治療する、調節する、治癒する、予防する、および／または寛解させる）のに十分な量である。例えば、治療有効は、リソソーム酵素レセプターまたはその活性を調節してそのようなリソソーム蓄積症またはその症状を治療するのに十分な量などの、所望の治療および／または予防効果を達成するのに十分な量であり得る（例えば、本発明の組成物の対象への投与後の「ゼブラボディ」または細胞性空胞化の存在または発生の減少または排除）。一般に、治療薬を必要とする対象に投与される治療薬（例えば、組換えリソソーム酵素）の量は、対象の特徴に依存するであろう。このような特徴には、対象の状態、疾患重篤度、全般的健康、年齢、性別および体重が含まれる。当業者は、これらおよび他の関連因子に応じて適切な用量を容易に決定することができるであろう。さらに、最適な投薬量範囲を同定するために、客観的および主観的アッセイの両方を任意に用いることができる。
【０１７５】
実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質の特有の特徴（例えば、閾値量のマンノース−６リン酸化組換えＡＳＡタンパク質を有する精製された組換えＡＳＡタンパク質などの特有のグリカンマップ）ならびに宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）の特有の最大レベル、宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）の特有の最大レベル、および／または特定の比活性などの他の特性は、精製された組換えＡＳＡタンパク質を含む組成物の所望の特性（例えば、保存安定性の改善、治療特性の改善など）をもたらすことができる。
【０１７６】
実施形態において、本発明は、クロマトグラフィー後の限外濾過／透析濾過の単一工程のみを伴うプロセスを使用して、不純調製物（例えば、ＡＳＡ含有細胞培養培地などの未処理の生体材料）から組換えＡＳＡタンパク質を精製する方法を提供する。実施形態において、この単一工程ＵＦ／ＤＦプロセスは、クロマトグラフィー工程から溶出物をプールし、プールした溶出物のｐＨを約６．０以上に調整することによって達成される。いくつかの実施形態では、この簡略化されたプロセスは、組換えＡＳＡタンパク質の大規模産生を促進するために、高装填容量クロマトグラフィー工程と組み合わされる。
【０１７７】
本発明の様々な態様は、以下の小節でさらに詳細に説明される。小節の使用は、本発明を限定することを意味するものではない。各小節は、本発明の任意の態様に適用することができる。本出願において、「または」の使用は、他に記載がない限り、「および／または」を意味する。
【０１７８】
アリールスルファターゼＡ
アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ、ＡＲＳＡ、またはセレブロシド−スルファターゼ）は、セレブロシド３−スルフェート（またはスルファチド）を、セレブロシドおよびスルフェートに分解する酵素である。具体的には、ガラクトシルスルファチドは通常、３−Ｏ−硫酸結合の加水分解によって代謝されて、リソソーム酵素アリールスルファターゼＡ（ＥＣ  ３．１．６．８）（Ａｕｓｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９６４，９３，１５Ｃ−１７Ｃ）とサポシンＢと呼ばれるスフィンゴ脂質アクチベータータンパク質の組み合わされた作用を通してガラクトセレブロシドを形成する。アリールスルファターゼＡの欠乏は、遅発性乳児型、幼若型、および成人型の異染性白質ジストロフィー（ＭＬＤ）患者からの全ての組織において生じる。本明細書で使用される場合、アリールスルファターゼＡタンパク質は、「ＡＳＡ」または「ＡＲＳＡ」と呼ばれ、サポシンＢは「Ｓａｐ−Ｂ」と呼ばれる。
【０１７９】
アリールスルファターゼＡは、低い等電点を有する酸性糖タンパク質である。ｐＨ６．５を超えると、酵素は、およそ１００ｋＤａの分子量を有するモノマーとして存在する。ＡＳＡは、酸性条件下（約５．０以下のｐＨ）で４８０ｋＤａ八量体として存在するが、中性ｐＨレベルで二量体に分解する。ヒト尿では、酵素は、６３および５４ｋＤａの２つの非同一のサブユニットからなる（Ｌａｉｄｌｅｒ  ＰＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９８５，８２７，７３−８３）。ヒト肝臓、胎盤、および線維芽細胞から精製されたアリールスルファターゼＡはまた、５５〜６４ｋＤａとわずかに異なるサイズの２つのサブユニットからなる（Ｄｒａｐｅｒ  ＲＫ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９７６，１７７，５２５−５３８、Ｗａｈｅｅｄ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ  Ｚ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８２，３６３，４２５−４３０、Ｆｕｊｉｉ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９９２，１５  １１２２，９３−９８）。他のリソソーム酵素の場合と同様に、アリールスルファターゼＡは、グリコシル化前駆体として膜結合型リボソーム上で合成される。次いで、小胞体およびゴルジを通過し、そのＮ結合型オリゴ糖が複合型のリン酸化および硫酸化オリゴ糖の形成で処理される（Ｗａｈｅｅｄ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９８５，８４７，５３−６１，Ｂｒａｕｌｋｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍｕｎ．１９８７，１４３，１７８−１８５）。正常培養線維芽細胞では、６２ｋＤａの前駆体ポリペプチドが産生され、これはマンノース６−リン酸受容体結合（Ｂｒａｕｌｋｅ  Ｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９０，２６５，６６５０−６６５５）を介して、酸性プレリソソームエンドソーム（Ｋｅｌｌｙ  ＢＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．１９８９，４８，７１−７８）に移行する。
【０１８０】
本明細書に記載される方法は、任意の源から、例えば、組織または培養細胞（例えば、アリールスルファターゼＡを組換えにより産生するヒト細胞（例えば、線維芽細胞））からアリールスルファターゼＡを精製するために使用され得る。哺乳動物などのヒトおよび他の動物が挙げられるが、これらに限定されない任意の起源のアリールスルファターゼＡは、本明細書に記載される方法によって産生され得る。
【０１８１】
ヒトアリールスルファターゼＡシグナルペプチドの長さ（１８アミノ酸）は、コンセンサス配列およびシグナル配列のための特定のプロセシング部位に基づいている。したがって、推定ヒトＡＳＡ  ｃＤＮＡ（ＥＭＢＬ  ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｊ０４５９３およびＸ５２１１５１）から、シグナルペプチドの切断が残基番号１８（Ａｌａ）の後の全ての細胞において起こり、ヒトアリールスルファターゼＡの成熟型をもたらす。本明細書で使用される場合、組換えアリールスルファターゼＡは、「ｒＡＳＡ」と略される。ヒトアリールスルファターゼＡの成熟型を含むアリールスルファターゼＡの成熟型は、「ｍＡＳＡ」と呼ばれ、成熟組換えヒトＡＳＡは、「ｍｒｈＡＳＡ」と呼ばれる。
【０１８２】
ヒト尿（Ｌｕｉｊｔｅｎ  ＪＡＦＭ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ．１９７８，３，２１３）、白血球（Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃｉｎｅ．１９７５，  ２３，１１６−１１９、Ｍａｎｏｗｉｔｚ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｅｄ  Ｍｅｔａｂ  Ｂｉｏｌ．１９８８，３９，１１７−１２０）、血小板（Ｐｏｒｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．１９９２，２８７，９７９−９８３）、培養線維芽細胞（Ｗａｈｅｅｄ  Ａ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｏｐｐｅ  Ｓｅｙｌｅｒｓ  Ｚ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８２，３６３，４２５−４３０、Ｓｔｅｖｅｎｓ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９７６，４４５，６６１−６７１、Ｆａｒｒｅｌｌ  ＤＦ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９７９，２９，１６−２０）、および肝臓（Ｓｔｅｖｅｎｓ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１９７６，４４５，６６１−６７１、Ｆａｒｒｅｌｌ  ＤＦ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ．１９７９，２９，１６−２０、Ｓａｒａｆｉａｎ  ＴＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｍｅｄ．１９８５，３３，３７２−３８０）からの酵素調製物の電気泳動および等電点電気泳動に関して、アリールスルファターゼＡの複数の型が実証されている。エンドグリコシダーゼＨ、シアリダーゼ、およびアルカリホスファターゼを用いた処置は、電気泳動パターンの分子サイズおよび複雑性を低減し、これは、アリールスルファターゼＡの電荷不均一性のほとんどが酵素の炭水化物含有量の変動によるものであることを示唆する。
【０１８３】
アリールスルファターゼＡの活性部位は、必須ヒスチジン残基（Ｌｅｅ  ＧＤ  ａｎｄ  Ｖａｎ  Ｅｔｔｅｎ  ＲＬ，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９７５，１７１，４２４−４３４）と、２つ以上のアルギニン残基（Ｊａｍｅｓ  ＧＴ，Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ．１９７９，９７，５７−６２）とを含有する。多くの陰イオンは、ミリモル範囲以下の濃度での酵素の阻害剤である。
【０１８４】
ヒトアリールスルファターゼＡ遺伝子構造が説明されている。本明細書で使用される場合、この遺伝子は「ＡＲＳＡ」と呼ばれる。しかしながら、「ＡＲＳＡ」は、場合によってはアリールスルファターゼＡタンパク質も指し得る。ＡＲＳＡ遺伝子は、染色体２２（２２ｑｌ３．３１−ｑｔｅｒ）の長腕の端部付近に位置し、３．２ｋｂにおよび（Ｋｒｅｙｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９１，６２７−６３１）、５０７アミノ酸酵素単位を指定する８つのエクソンからなる（Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８９，２６４，１２５２−１２５９）。２．１、３．７、および４．８ｋｂのメッセンジャーＲＮＡが線維芽細胞で検出されており、２．１−ｋｂメッセージは、細胞によって生成された活性アリールスルファターゼＡの大部分に明らかに寄与する（Ｋｒｅｙｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９１，６２７−６３１）。ＡＲＳＡ配列は、ＥＭＢＬ  ＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号Ｘ５２１１５０で寄託されている。公開されたｃＤＮＡとＡＲＳＡのコード部分との間の差異は、Ｋｒｅｙｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９１，６２７−６３１）によって記載されている。Ｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９８９，２６４，１２５２−１２５９）によって最初に記載されているｃＤＮＡ配列およびＫｒｅｙｓｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９９０，１９１，６２７−６３１）によって記載されているｃＤＮＡ配列は、それぞれ次のアクセッション番号Ｊ０４５９３およびＸ５２１１５１で、ＥＭＢＬ  ＧｅｎＢａｎｋに寄託されている。
【０１８５】
いくつかの多型および４０を超える疾患関連突然変異がＡＲＳＡ遺伝子で同定されている（Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．１９９４，４，２３３−２４２、Ｂａｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．１９９５，６，１７０−１７６、Ｄｒａｇｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｍｕｔａｔ．１９９７，９，２３４−２４２）。ＡＲＳＡ遺伝子における疾患関連突然変異は、ＭＬＤの臨床表現型と非常に相関する２つの広い群に分類され得る。１つの群（Ｉ）は、活性酵素、免疫反応性タンパク質を産生せず、培養動物細胞株に導入されたときにＡＳＡ活性を発現しない。もう１つの群（Ａ）は、培養細胞内で少量の交差反応性材料および低レベルの機能性酵素を生成する。群（Ｉ）の突然変異に対してホモ接合性であるか、またはこの群からの２つの異なる突然変異を有する個体は、遅発性乳児型ＭＬＤを発現する。１つの群の（Ｉ）型および１つの群の（Ａ）型の突然変異を有するほとんどの個体が若年発症型を発症する一方で、２つの群の（Ａ）型の突然変異を有する個体は一般に、成人型ＭＬＤを発症する。比較的頻繁に見つかった突然変異もあったが、単一の家族においてのみ検出された突然変異もあった。多くの家族のメンバーを通して特定の突然変異を追跡することは可能であるが、一般的な担体スクリーニングはまだ実現可能ではない。
【０１８６】
上記の疾患関連突然変異に加えて、いくつかの多型がＡＲＳＡ遺伝子において同定されている。ＭＬＤ患者の一部の臨床的に正常な親および一般集団においても、極めて低いＡＳＡ活性が見つかっている。このいわゆる偽欠乏ＡＳＡは、ＡＲＳＡ遺伝子の共通多型と関連付けられている（Ｇｉｅｓｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９１，１３，２２２−２２７）。
【０１８７】
組換えＡＳＡタンパク質
本明細書で使用される場合、「組換えＡＳＡタンパク質」という用語は、天然に存在するアリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）タンパク質の少なくとも部分的活性を置換すること、またはＡＳＡ欠乏に関連する１つ以上の表現型もしくは症状から救うことができる任意の分子または分子または一部分を指す。本明細書で使用される場合、「組換えＡＳＡ酵素」および「組換えＡＳＡタンパク質」という用語ならびに文法的等価物は、互換的に使用される。いくつかの実施形態では、成熟ヒトＡＳＡタンパク質と実質的に同様または同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドである組換えＡＳＡタンパク質を精製するために、本発明が使用される。
【０１８８】
典型的には、ヒトＡＳＡは、成熟形態にプロセシングされる前駆体分子として産生される。このプロセスは、一般に、１８アミノ酸シグナルペプチドを除去することによって起こる。典型的には、前駆体形態は、５０７個のアミノ酸を含む完全長前駆体または完全長ＡＳＡタンパク質とも呼ばれる。Ｎ末端１８アミノ酸は切断され、４８９アミノ酸の長さの成熟型が得られる。したがって、Ｎ末端１８アミノ酸は一般に、ＡＳＡタンパク質活性のために必要とされないことが企図される。典型的な野生型または天然に存在するヒトＡＳＡタンパク質の成熟型（配列番号１）および完全長前駆体（配列番号２）のアミノ酸配列を表１に示す。
【表１】
2021508322.tif 000004
【０１８９】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号１）である。いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または相同体であり得る。例えば、成熟ヒトＡＳＡタンパク質のホモログまたは類似体は、実質的なＡＳＡタンパク質活性を保持し、一方、野生型または天然に存在するＡＳＡタンパク質（例えば、配列番号１）と比較して、１つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む改変された成熟ヒトＡＳＡタンパク質であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号１）に実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号１）と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号１に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、成熟ヒトＡＳＡタンパク質のフラグメントまたは部分を含有する。
【０１９０】
あるいは、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、完全長ＡＳＡタンパク質である。いくつかの実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質は、完全長ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体であり得る。例えば、完全長ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体は、野生型または天然に存在する完全長ＡＳＡタンパク質（配列番号２）と比較して、実質的なＡＳＡタンパク質活性を保持しながら、１つ以上のアミノ酸置換、欠失および／または挿入を含む修飾完全長ヒトＡＳＡタンパク質であり得る。したがって、いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、完全長ヒトＡＳＡタンパク質（配列番号２）に実質的に相同である。いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号２と実質的に同一である。いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、配列番号２に対して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上同一であるアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、本発明の実施形態によって精製された組換えＡＳＡタンパク質は、完全長ヒトＡＳＡタンパク質のフラグメントまたは部分を含有する。本明細書で使用される場合、完全長ＡＳＡタンパク質は典型的には、シグナルペプチド配列を含む。
【０１９１】
ヒトＡＳＡタンパク質の相同体または類似体は、当業者に既知のポリペプチド配列の改変方法（そのような方法をまとめた参考文献において見られるものなど）に従って調製され得る。いくつかの実施形態では、アミノ酸の保存的置換は、以下の群内のアミノ酸の間で行われる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ、（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ、（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ、（ｄ）Ａ、Ｇ、（ｅ）Ｓ、Ｔ、（ｆ）Ｑ、Ｎ、および（ｇ）Ｅ、Ｄ。いくつかの実施形態では、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われる箇所でタンパク質の相対的電荷またはサイズ特性を改変しないアミノ酸置換を指す。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、組換えＡＳＡタンパク質は、細胞の取り込みおよび／またはリソソーム標的化を促進するために、標的細胞の表面上の受容体に結合する部分を含有してもよい。例えば、そのような受容体は、マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）残基に結合する陽イオン非依存性マンノース−６−リン酸受容体（ＣＩ−ＭＰＲ）であり得る。さらに、ＣＩ−ＭＰＲは、ＩＧＦ−ＩＩを含む他のタンパク質にも結合する。いくつかの実施形態では、組換えＡＳＡタンパク質は、タンパク質の表面上にＭ６Ｐ残基を含有する。特に、組換えＡＳＡタンパク質は、ＣＩ−ＭＰＲに対してより高い結合親和性を有するビス−リン酸化オリゴ糖を含有し得る。いくつかの実施形態では、適切な酵素は、酵素あたり約平均して少なくとも約２０％のビス−リン酸化オリゴ糖を含む。他の実施形態では、適切な酵素は、酵素あたり約１０％、１５％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％のビスリン酸化オリゴ糖を含み得る。
【０１９３】
いくつかの実施形態では、組換えＡＳＡ酵素は、標的細胞の表面上の受容体に結合することが可能であるリソソーム標的化部分に融合され得る。適切なリソソーム標的化部分は、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７、およびその変異体、その相同体またはフラグメントであり得る（野生型成熟ヒトＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＲＡＰ、ｐ９７ペプチド配列と少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％同一の配列を有するこれらのペプチドを含む）。リソソーム標的化部分は、Ｎ末端、Ｃ末端、または内部でＡＳＡタンパク質または酵素にコンジュゲートまたは融合されてもよい。
【０１９４】
組換えアリールスルファターゼＡの精製
本発明の実施形態は、アリールスルファターゼＡ（「ＡＳＡ」）、特に組換えヒトＡＳＡ（「ｒｈＡＳＡ」）原薬の産生のための精製プロセスを含む。
【０１９５】
精製されたＡＳＡ原薬を産生するために、任意に本明細書に記載される修飾を全体的または部分的に用いた様々な技法が使用され得る。
【０１９６】
例えば、例示的な精製プロセスは、以下の工程のうちの１つ以上（例えば、これらの工程のうちの１、２、３、４、５、６、または７つ全て）を含む：
・ｒｈＡＳＡ未精製バルク（ＵＰＢ）の解凍およびプール化。
・限外濾過および透析濾過（「ＵＦＤＦ」または「捕捉ＵＦＤＦ」）を介したＵＰＢの捕捉および濾過。
・濾過後、捕捉された材料は、クロマトグラフィー精製の前にウイルス不活性化され得る。
・４つのクロマトグラフィーカラム：陰イオン交換カラム（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ  ＨｉＣａｐ樹脂カラム）、セラミックヒドロキシアパタイトタイプＩ（ＨＡ）カラム、疎水性相互作用カラム（ＨＩＣ；例えば、フェニルセファロースＦＦカラム）、および陽イオン交換（例えば、ＳＰ）カラムの連続的使用を含むプロセス。
・ＳＰ溶出物のプール化およびプールした溶出物のｐＨ調整（例えば、約５．５〜約６．５のｐＨへの調整（例えば、約６．０）。
・得られるｐＨ調整陽イオン交換溶出物は次いで、ウイルス濾過され、最終目標タンパク質濃度を達成するために単一濃縮および透析濾過工程が後に続く。
・溶出物へのポリソルベート２０（Ｐ２０）の添加（例えば、凍結保存の前に）。
【０１９７】
本明細書で使用される場合、「混入物」は、所望のポリペプチド生成物、例えば、アリールスルファターゼＡ（ＡＳＡ）とは異なる材料である。混入物は、所望のポリペプチドの変異体（例えば、所望のポリペプチドの脱アミド化変異体もしくはアミノ−アスパラギン酸変異体）または別の分子、例えば、ポリペプチド、核酸、およびエンドトキシンであってもよい。
【０１９８】
本明細書で使用される場合、ポリペプチドと１つ以上の混入物を含む組成物または試料からポリペプチドを「精製」することは、組成物または試料から少なくとも１つの混入物を（完全にまたは部分的に）除去することによる、組成物または試料中のポリペプチドの純度の増加を意味する。
【０１９９】
「精製工程」は、組成物の総重量に基づいて、少なくとも約２０重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、９９重量％、９９．５重量％、９９．６重量％、９９．７重量％、９９．８重量％、または９９．９重量％の対象となるポリペプチドを含む組成物をもたらす精製プロセス全体の一部であり得る。
【０２００】
アリールスルファターゼＡの純度は、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ウエスタンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色、逆相ＨＰＬＣ、およびサイズ排除ＨＰＬＣのうちの１つ以上によって測定され得る。
【０２０１】
例えば、本明細書に記載される組成物および方法で使用されるアリールスルファターゼＡは、特有のグリカンマップ（例えば、本明細書に記載される例示的なグリカンマップのいずれか）によっても説明され得る。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、精製されたアリールスルファターゼＡの比活性は、例えば、本明細書に記載される方法によって決定されるように、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、７０Ｕ／ｍｇ、８０Ｕ／ｍｇ、９０Ｕ／ｍｇ、１００Ｕ／ｍｇ、１１０Ｕ／ｍｇ、１２０Ｕ／ｍｇ、１３０Ｕ／ｍｇ、１４０Ｕ／ｍｇである。いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡは、例えば、本明細書に記載される方法によって決定されるように、約５０〜２００Ｕ／ｍｇ（例えば、約５０〜１９０Ｕ／ｍｇ、５０〜１８０Ｕ／ｍｇ、５０〜１７０Ｕ／ｍｇ、５０〜１６０Ｕ／ｍｇ、５０〜１５０Ｕ／ｍｇ、５０〜１４０Ｕ／ｍｇ、５０〜１３０Ｕ／ｍｇ、５０〜１２０Ｕ／ｍｇ、５０〜１１０Ｕ／ｍｇ、５０〜１００Ｕ／ｍｇ、６０〜１４０Ｕ／ｍｇ、６０〜１３０Ｕ／ｍｇ、６０〜１２０Ｕ／ｍｇ、６０〜１１０Ｕ／ｍｇ、６０〜１００Ｕ／ｍｇ、７０〜１４０Ｕ／ｍｇ、７０〜１３０Ｕ／ｍｇ、７０〜１２０Ｕ／ｍｇ、７０〜１１０Ｕ／ｍｇ、７０〜１００Ｕ／ｍｇ、８０〜１４０Ｕ／ｍｇ、８０〜１３０Ｕ／ｍｇ、８０〜１２０Ｕ／ｍｇ、８０〜１１０Ｕ／ｍｇ、８０〜１００Ｕ／ｍｇ、９０〜１４０Ｕ／ｍｇ、９０〜１３０Ｕ／ｍｇ、９０〜１２０Ｕ／ｍｇ、９０〜１１０Ｕ／ｍｇ、９０〜１００Ｕ／ｍｇ、１００〜１４０Ｕ／ｍｇ、１００〜１３０Ｕ／ｍｇ、１００〜１２０Ｕ／ｍｇ、１００〜１１０Ｕ／ｍｇ、１１０〜１４０Ｕ／ｍｇ、１１０〜１３０Ｕ／ｍｇ、１１０〜１２０Ｕ／ｍｇ、１２０〜１４０Ｕ／ｍｇ、１２０〜１３０Ｕ／ｍｇ、または１３０〜１４０Ｕ／ｍｇ）の範囲の比活性を有する。
【０２０３】
精製プロセスのための出発物質は、任意の不純調製物である。例えば、不純調製物は、ＡＳＡタンパク質を産生する細胞（例えば、哺乳動物細胞）またはＡＳＡタンパク質を含有する生細胞溶解物から分泌される組換えＡＳＡタンパク質を含有する、未処理細胞培養培地であってもよい。いくつかの実施形態では、不純調製物は、部分的に処理された細胞培地または細胞溶解物であり得る。例えば、細胞培地または細胞溶解物は濃縮され、希釈され、ウイルス不活性化、ウイルス処理、またはウイルス除去で処理され得る。いくつかの実施形態では、ウイルス除去は、とりわけ、ナノ濾過および／またはクロマトグラフィー技術を利用し得る。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化は、とりわけ、溶媒不活性化、洗浄剤不活性化、低温殺菌、酸性ｐＨ不活性化、および／または紫外線不活性化を利用し得る。細胞培地または細胞溶解物はまた、宿主細胞タンパク質および／または核酸（例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡ）のレベルを低減するために、プロテアーゼ、ＤＮａｓｅ、および／またはＲＮａｓｅで処理され得る。いくつかの実施形態では、未処理または部分的に処理された生体材料（例えば、細胞培地または細胞溶解物）は、所望の温度（例えば、２〜８℃、−４℃、−２５℃、−７５℃）である期間にわたって凍結および保存され、次いで精製のために解凍され得る。本明細書で使用される場合、不純調製物は、出発物質または装填材料とも呼ばれる。
【０２０４】
本明細書に記載される精製方法は、以下の工程：深層濾過、ウイルス不活性化、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー、および／または陽イオン交換クロマトグラフィー）、混合モードクロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、限外濾過／透析濾過、ならびにウイルス除去濾過のうちの１つ以上を含むことができるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される精製方法は、親和性クロマトグラフィーをさらに含む。
【０２０５】
クロマトグラフィー工程では、クロマトグラフィーカラムに充填されるときに使用される樹脂の適切な体積は、カラムの寸法、すなわち、カラムの直径および樹脂の高さに反映され、例えば、適用溶液中のタンパク質の量および使用される樹脂の結合能力に応じて異なる。しかしながら、工業規模でＡＳＡの産生および精製を得るために、産生プロセスならびに精製プロセスの規模を増大させることは、本開示の範囲内である。したがって、カラムサイズ、直径、および流速などのパラメータは、そのような大規模産生の速度および効率を順守するために増加し得る。いくつかの実施形態では、カラムの直径は、約５０〜１００ｍｍの範囲であり、体積は、約１００〜３００ｍＬの範囲であり、流速は、約４０〜４００ｃｍ／時間（例えば、約１００ｃｍ／時間〜１５０ｃｍ／時間）または約５〜１００ｍＬである。
【０２０６】
限界濾過−捕捉
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される精製方法は、灌流バイオリアクタから産生されるＡＳＡ（例えば、ヒト組換えＡＳＡ）を捕捉するための上流限外濾過の１つ以上の工程を含む。本明細書で使用される場合、限外濾過は、溶解した分子（タンパク質、ペプチド、核酸、炭水化物、および他の生体分子）の濃縮および脱塩化、緩衝液の交換、ならびに全体の分別に使用され得る、０．００１〜０．１μｍの大きさのフィルタ孔径を有する膜濾過を指す。本発明の実施形態で使用するための限外濾過の方法は、接線流限外濾過またはクロスフロー濾過を含む。
【０２０７】
本明細書で使用される場合、接線流濾過および限外濾過は、一部分が膜を通過する間に（透過物）、残りの部分（未透過物）が供給リザーバに再循環して戻されるように、供給流が膜面に平行に通る配置を指す。いくつかの実施形態では、接線流限外濾過フィルタの孔径は、組換えＡＳＡがフィルタを通して透過することを可能にするように選択される。他の実施形態では、孔径は、フィルタを通過する供給物中に実質的に全てのＡＳＡを保持するように選択される。別の箇所で述べられているように、ＡＳＡは、酸性条件下（約５．０以下のｐＨ）で４８０ｋＤａ八量体として存在するが、中性ｐＨレベルで二量体に分解する。したがって、供給物のｐＨは、フィルタ膜上にＡＳＡを保持するか、またはそれが透過物として通過することを可能にするように、適切な孔径の選択と組み合わせて調整されてもよい。
【０２０８】
孔径は、少なくとも１０ｋＤａ、少なくとも２０ｋＤａ、少なくとも３０ｋＤａ、少なくとも４０ｋＤａ、少なくとも５０ｋＤａ、少なくとも６０ｋＤａ、少なくとも７０ｋＤａ、少なくとも８０ｋＤａ、少なくとも９０ｋＤａで、少なくとも１００ｋＤａ、少なくとも３００ｋＤａ、少なくとも４００ｋＤａ、または少なくとも５００ｋＤａの分子量カットオフで選択され得る。例えば、少なくとも１０ｋＤａの孔径のフィルタは、およそ１１ｋＤａ以上の分子量を有するタンパク質の大部分を供給物中に保持する。別の例として、少なくとも４００ｋＤａの孔径のフィルタは、４００ｋＤａよりも高い分子量を有するタンパク質の大部分を保持する。いくつかの実施形態では、供給保持速度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上である。同様に、孔径は、特定のサイズの透過物の分離のために選択され得る。例えば、少なくとも５００ｋＤａの孔径のフィルタは、５００ｋＤａ未満の分子量を有するタンパク質の大部分が透過することを可能にする。いくつかの実施形態では、透過速度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、またはそれ以上である。
【０２０９】
濾過領域または容量はまた、本明細書に開示されるプロセスで使用するために最適化され得る。濾過領域の選択に影響を与える考慮事項には、堅牢性、コスト、供給流速（すなわち、クロスフロー速度）、膜差圧、透過物流束速度、プラント適合、およびスループットが含まれる。いくつかの実施形態では、透過物流束は、約５０〜１００リットル／メートル２／時間（「ＬＭＨ」）である。いくつかの実施形態では、供給流量は、約２５０〜６００ＬＭＨ（両端値を含む）である。いくつかの実施形態では、供給流量は、約２５０〜３５０ＬＭＨ（両端値を含む）である。いくつかの実施形態では、供給流量は、約１７５〜２４５ＬＭＨ（両端値を含む）である。いくつかの実施形態では、供給流量は、約１７０〜２３０ＬＭＨ（両端値を含む）である。いくつかの実施形態では、供給流量は、約１２０〜１６０ＬＭＨ（両端値を含む）である。いくつかの実施形態では、供給流量は、約１５〜３０ＬＭＨ（両端値を含む）である。いくつかの実施形態では、供給流量は、約１１〜２１ＬＭＨ（両端値を含む）である。いくつかの実施形態では、濾過領域は、約０．０２ｍ２、約０．１４ｍ２、約０．７または約３．５ｍ２である。特定の実施形態では、膜差圧は、約５５〜６０ｐｓｉ（両端値を含む）である。いくつかの実施形態では、膜差圧は、約１５〜２５ｐｓｉ（両端値を含む）である。いくつかの実施形態では、膜差圧は、約１０〜２０ｐｓｉ（両端値を含む）である。いくつかの実施形態では、膜差圧は、約５〜１５ｐｓｉである。
【０２１０】
本発明の実施形態で使用するための限外濾過フィルタは、ポリエーテルスルホンおよび安定化セルロースを含むがこれらに限定されない、当業者に既知の膜材料を含んでもよい。
【０２１１】
本発明の実施形態で使用するための１つの例示的なフィルタカセットは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＥＣＯ（登録商標）である。本発明の実施形態で使用するための別の模範的フィルタカセットは、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＨＹＤＲＯＳＡＲＴ（登録商標）３０ｋＤ標準膜である。本発明の実施形態で使用するためのさらなる例示的なフィルタカセットは、Ｃｕｎｏ深層フィルタＺＢである。本発明のいくつかの実施形態では、Ｃｕｎｏ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓ深層フィルタが使用される。
【０２１２】
深層濾過
本明細書に記載される精製方法は、深層濾過の１つ以上の工程を含むことができる。深層フィルタは、媒体の表面上ではなく媒体全体にわたって粒子を保持するために、多孔性濾過媒体を使用する様々なフィルタである。これらは、傾斜密度を有する濾過媒体を含み、これは、より小さい粒子がフィルタの表面のより大きい開放面積を透過して、フィルタの中心により近いより小さい開口部においてのみ捕捉される一方で、よりお大きい粒子がフィルタの表面付近で捕捉されることを可能にする。特定の実施形態は、上流回収段階の間のみ（すなわち、後続のクロマトグラフィー精製工程の前に）深層濾過工程を用いるが、他の実施形態は、精製の１つ以上の追加的な段階の間に深層フィルタを用いる。本発明のいくつかの実施形態では、Ｃｕｎｏ  Ｚｅｔａ  Ｐｌｕｓの深層フィルタが使用される。
【０２１３】
深層濾過の後には任意に、０．４５ミクロン（±２μｍ）の濾過が続いて、微粒子を除去し、下流処理の準備のためのバイオバーデンを低減し得る。
【０２１４】
ウイルス不活性化
本明細書に記載される精製方法は、ウイルス不活性化の１つ以上の工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化は、溶媒および／または洗浄剤を含む。溶媒または洗浄剤は、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート８０、トリ−ｎ−ブチル−リン酸（ＴｎＢＰ）、またはそれらの組み合わせを含むことができる。ウイルス不活性化は、溶媒または洗浄剤における３〜２４時間のインキュベーションを伴い得る。別の実施形態では、ウイルス不活性化は、例えば、Ｐｌａｎｏｖａ（商標）フィルタを使用することによるウイルス濾過を含む。
【０２１５】
これらの方法が、感染性ウイルスを実質的に含まず、「ウイルス安全性製品」と示され得る酵素の調製物を生じさせることが意図されることが理解される。さらに、様々な方法が独立してまたは組み合わせて使用され得ることが企図される。
【０２１６】
ウイルス不活性化は、酵素を含む溶液に１つ以上の「ウイルス不活性化剤」を添加することによって達成され得る。いくつかの実施形態では、ウイルス不活性化工程がクロマトグラフィー精製工程の前（すなわち、第１のクロマトグラフィーカラムに不純調製物を装填する前）に実施されて、薬剤が、医薬品として使用される場合に、または生成物が医薬品の調製のために使用される場合に、製品の安全性を損なういかなる量もしくは濃度でも最終生成物に存在していないことを確実にし、他の実施形態は、精製の１つ以上の追加の段階の間に深層フィルタを用いる。例えば、いくつかの実施形態では、本発明による発明的方法は、最後のクロマトグラフィーカラムの後にウイルス除去の工程をさらに含む。
【０２１７】
「ウイルス不活性化剤」という用語は、脂質エンベロープウイルスならびに非脂質エンベロープウイルスを不活性化するために使用され得る薬剤（例えば、洗浄剤）または方法を示すことを意図する。「ウイルス不活性化剤」という用語は、それが適切な場合はいつでも、そのような薬剤および／または方法の組み合わせ、ならびにそのような薬剤または方法の１つのタイプのみの両方を包含するものとして理解されるべきである。
【０２１８】
典型的なウイルス不活性化剤は、洗浄剤および／または溶媒であり、最も典型的には洗浄剤−溶媒混合物である。ウイルス不活性化剤は任意に、１つ以上の溶媒と１つ以上の洗浄剤の混合物であることが理解されるべきである。幅広い種類の洗浄剤および溶媒がウイルス不活性化に使用され得る。洗浄剤は、非イオン性洗浄剤およびイオン性洗浄剤からなる群から選択されてもよく、実質的に非変性であるように選択される。典型的には、非イオン性洗浄剤は、その後の精製工程でのｒＡＳＡ調製物からの洗浄剤の後続の除去を促進するために使用される。好適な洗浄剤は、例えば、Ｓｈａｎｂｒｏｍ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，３１４，９９７号および米国特許第４，３１５，９１９号に記載されている。典型的な洗浄剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００およびＴｗｅｅｎ  ２０またはＴｗｅｅｎ  ８０の商標で販売されているものである。ウイルス不活性化剤で使用するための好ましい溶媒は、例えば、Ｎｅｕｒａｔｈ  ａｎｄ  Ｈｏｒｏｗｉｔｚの米国特許第４，７６４，３６９号に記載されているように、ジ−またはトリ−アルキルホスフェートである。典型的な溶媒は、トリ（ｎ−ブチル）リン酸（ＴｎＢＰ）である。本発明の実施のための特に好ましいウイルス不活性化剤はＴｗｅｅｎ  ８０であるが、代替的に、他の薬剤または薬剤の組み合わせが使用され得る。典型的な薬剤は、ＡＳＡ含有溶液中のＴｗｅｅｎ−８０の濃度が約０．５〜４．０重量％の範囲内である、好ましくは約１重量％の濃度であるような体積で添加される。次いで、ＴｎＢＰが、ＡＳＡ含有試料の新しい体積に基づいて計算された０．３％の最終濃度になるように添加され得る。
【０２１９】
ウイルス不活性化工程は、エンベロープウイルスを不活性化し、実質的にウイルス安全性ｒｈＡＳＡ含有溶液をもたらす条件下で行われる。一般に、そのような条件は、４〜３７℃、例えば、１９〜２８℃、２３〜２７℃、典型的には約２５℃の温度、および検証研究によって効果的であることが見出されたインキュベーション時間を含む。一般に、１〜２４時間、好ましくは１０〜１８時間、例えば、約１４時間のインキュベーション時間が、十分なウイルス不活性化を確実にするのに十分である。しかしながら、適切な条件（温度およびインキュベーション時間）は、用いられるウイルス不活性化剤、ｐＨ、ならびに溶液のタンパク質濃度および脂質含有量によって決まる。
【０２２０】
ウイルス安全性製品を生産するために、メチレンブルーの添加、および紫外線光を用いた放射線による後続の不活性化など、ウイルスを除去または不活性化するための他の方法も用いられ得ることが企図される。
【０２２１】
本明細書に記載される精製方法は、ウイルス除去濾過の１つ以上の工程を含むことができる。典型的には、ウイルス濾過は、クロマトグラフィーの１つ以上の工程によって、酵素の精製後に実施される。いくつかの実施形態では、ウイルス濾過工程は、滅菌フィルタを通した精製工程の結果であるＡＳＡ含有溶液の通過、続いてナノフィルタを通る滅菌濾過溶液の通過によって実施される。「滅菌フィルタ」とは、感染を伝播する、および／または引き起こすことが可能な全ての微生物を実質的に除去するフィルタを意味する。フィルタは、約０．１ミクロンの孔径を有することが一般的であるが、孔径は、約０．０５〜０．３ミクロンの範囲であり得る。精製プロセスで実施されるような試料のウイルス濾過を、試料を洗浄剤と接触させることで置き換えるか、またはそれと組み合わせることが実行可能であり得る。
【０２２２】
本発明のいくつかの実施形態は、ウイルス不活性化および／または濾過の少なくとも２つの工程を含む。例えば、カラムクロマトグラフィー前のウイルス不活性化は、全てのクロマトグラフィー工程が完了した後の組み合わされたウイルス除去であり得る。クロマトグラフィー後のウイルス除去は、限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）（例えば、接線流限外濾過）の１つ以上の工程の前または後に行われ得る。特定の例では、溶出物は、クロマトグラフィー精製の最終工程（例えば、陽イオン交換（ＳＰ）クロマトグラフィー）から得られ、溶出物プールのｐＨは、約５．５、約６．０、約６．５、または約７．０であり、その後にウイルス濾過が続く。したがって、特定の実施形態では、ＵＦＤＦの単一工程に先立って、ウイルス濾過（例えば、Ｐｌａｎｏｖａ（商標）フィルタを使用した）がある。他の例では、溶出物は、クロマトグラフィー精製の最終工程（例えば、陽イオン交換（ＳＰ）クロマトグラフィー）から得られ、ｐＨ調整なしのＵＦＤＦの第１の工程、続いてウイルス濾過、およびＵＦＤＦの第２の工程に供される。
【０２２３】
特定の実施形態では、ｐＨ調整陽イオン交換溶出物プールは、Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎフィルタ上でウイルス濾過される。いくつかの実施形態では、ｐＨ調節陽イオン交換溶出物のウイルス濾過後の投入に対する収率は、Ａ２８０吸光度によって評価されるように、約９０〜１００％、すなわち、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上である。したがって、いくつかの実施形態では、本質的にウイルス濾過中に組換えＡＳＡは失われない。約６．０へのｐＨ調整により、ＡＳＡの八量体（直径が約２０ｎｍである）が二量体形態に分解することを可能にすることを検証しているため、ウイルス濾過の収率は有意である。したがって、ウイルスフィルタの孔径は、二量体形態のみが濾過されること（すなわち、八量体形態がフィルタによって保持され得るか、またはウイルスフィルタの目詰まりを引き起こし得ること）を確実にするように選択され得る。例えば、２０ｎｍの孔径のウイルスフィルタは、ＡＳＡの八量体形態を保持するが、二量体形態は保持しない。
【０２２４】
親和性クロマトグラフィー
本明細書に記載される精製方法は、親和性クロマトグラフィー（例えば、免疫親和性クロマトグラフィー、固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー、および／または固定化リガンド親和性クロマトグラフィー）の１つ以上の工程を含むことができる。
【０２２５】
簡潔に述べると、親和性クロマトグラフィーは、例えば、受容体と配位子、抗原と抗体、または酵素と基質との間などの高度に特異的な相互作用に依存するクロマトグラフィー技術である。当業者によって知られるように、本明細書に記載される精製方法の親和性クロマトグラフィー工程で用いられる選択的分子は、選択的分子によって利用され得る組換えにより産生されたＡＳＡの様々な特性（例えば、３次元構造、グリコシル化など）に基づいてもよい。親和性クロマトグラフィー工程で利用され得る例示的な選択的分子（または捕捉試薬）としては、プロテインＡ、プロテインＧ、抗体、金属イオン（例えば、ニッケル）、特異的基質、リガンド、または抗原が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の親和性クロマトグラフィー工程に適した選択的分子は、抗アリールスルファターゼＡ抗体（例えば、抗ヒトアリールスルファターゼＡ抗体）を利用する。好適な抗アリールスルファターゼＡ抗体は、商業的に、または非ヒト動物（例えば、ヒトタンパク質に対する抗体を産生するためのマウス、ラット、ウサギ、ニワトリ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、もしくは他の好適な動物）の免疫化によって得られ得る。
【０２２６】
一般に、対象となる分子（例えば、組換えＡＳＡ）は、選択的分子との相互作用を通して固体または固定相上に捕捉されるか、または選択的分子との相互作用を通して捕捉されるが、他の望ましくない分子は、選択的分子（複数可）によって結合されないため、捕捉されない。次いで、固体媒体は混合物から除去され、任意に洗浄されてもよく、対象となる分子は、溶出によって封入から放出される。いくつかの実施形態では、親和性カラムは、勾配を通してイオン強度を変化させることによって溶出されてもよい。例えば、塩濃度、ｐＨ、ｐＩ、およびイオン強度が、分離するために、または分離する勾配を形成するために使用され得る。
【０２２７】
いくつかの実施形態では、親和性クロマトグラフィーによって精製することを容易にするために、組換えＡＳＡタンパク質がタグ付きで産生されてもよい。当業者によって知られるように、タンパク質タグは、例えば、とりわけ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ヘキサヒスチジン（Ｈｉｓ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）を含んでもよい。いくつかの実施形態では、レクチンは、試料内の構成成分を分離するための親和性クロマトグラフィーで使用される。例えば、特定のレクチンは、特定の炭水化物分子に特異的に結合し、糖タンパク質を非グリコシル化タンパク質から、またはある糖型を別の糖型から分離するために使用され得る。
【０２２８】
イオン交換クロマトグラフィー
本明細書に記載される精製方法は、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィーおよび／または陽イオン交換クロマトグラフィー）の１つ以上の工程を含むことができる。
【０２２９】
当業者によって知られるように、イオン交換体（例えば、陰イオン交換体および／または陽イオン交換体）は、マトリクスならびに付着した荷電基に対する様々な材料に基づいてもよい。例えば、以下のマトリクスが使用されてもよく、言及される材料は、多かれ少なかれ架橋され得る：アガロースベース（ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＣＬ−６Ｂ、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、およびＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅなど）、セルロースベース（ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＣＥＬ（登録商標）など）、デキストランベース（ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標））など）、シリカベース、および合成ポリマーベース。
【０２３０】
イオン交換樹脂は、既知の方法に従って調製され得る。典型的には、樹脂がその対イオンに結合することを可能にする平衡緩衝液は、ポリペプチドと１つ以上の混入物とを含む試料または組成物を樹脂上に装填する前に、イオン交換樹脂に通され得る。好都合には、平衡緩衝液は、ローディング緩衝液と同じであり得るが、これは必要ではない。
【０２３１】
本発明の任意の実施形態では、カラムが再利用され得るように、イオン交換樹脂は、ポリペプチドの溶出後に再生緩衝液で再生され得る。一般に、再生緩衝液の塩濃度および／またはｐＨは、実質的に全ての混入物および対象となるポリペプチドがイオン交換樹脂から溶出されるようなものであり得る。一般に、再生緩衝液は、イオン交換樹脂から混入物およびポリペプチドを溶出するために非常に高い塩濃度を有する。
【０２３２】
陰イオン交換クロマトグラフィー
本発明の実施形態は、例えば、アリールスルファターゼＡ（例えば、組換えアリールスルファターゼＡなど）の試料を提供することと、陰イオン交換クロマトグラフィー、例えば、本明細書に記載される陰イオン交換クロマトグラフィーに対する試料を供することと、を含む。陰イオン交換樹脂については、マトリクスに共有結合された荷電基は、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）、四級アミノエチル（ＱＡＥ）、および／または四級アンモニウム（Ｑ）であり得る。いくつかの実施形態では、用いられる陰イオン交換樹脂は、Ｑセファロースカラムである。陰イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＸＬ、ＣＡＰＴＯ（商標）Ｑ、  ＤＥＡＥ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ  ＧＩＧＡＣＡＰ（登録商標）Ｑ、ＦＲＡＣＴＯＧＥＬ（登録商標）ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル、四級アンモニア樹脂）、ＥＳＨＭＵＮＯ（商標）Ｑ、ＮＵＶＩＡ（商標）Ｑ、またはＵＮＯＳＰＨＥＲＥ（商標）Ｑを使用して実施され得る。他の交換体が本発明の範囲内で使用され得、四級アミン樹脂または「Ｑ樹脂」（例えば、ＣＡＰＴＯＴＭ−Ｑ、Ｑ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、ＱＡＥ  ＳＥＰＨＡＤＥＸ（登録商標））；ジエチルアミノエタン（ＤＥＡＥ）樹脂（例えば、ＤＥＡＥ−ＴＲＩＳＡＣＲＹＬ（登録商標）、ＤＥＡＥ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）、ベンゾイル化ナフトイル化ＤＥＡＥ、ジエチルアミノエチルＳＥＰＨＡＣＥＬ（登録商標））；ＡＭＢＥＲＪＥＴ（登録商標）樹脂；ＡＭＢＥＲＬＹＳＴ（登録商標）樹脂；ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）樹脂（例えば、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）ＩＲＡ−６７、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）強塩基性、ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標）弱塩基性）、コレスチラミン樹脂、ＰｒｏＰａｃ（登録商標）樹脂（例えば、ＰＲＯＰＡＣ（登録商標）ＳＡＸ−１０、ＰＲＯＰＡＣ（登録商標）ＷＡＸ−１０、ＰＲＯＰＡＣ（登録商標）ＷＣＸ−１０）；ＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）樹脂（例えば、ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−ＮＰＲ；ＴＳＫｇｅｌ  ＤＥＡＥ−５ＰＷ）；およびＡＣＣＬＡＩＭ（登録商標）樹脂が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３３】
実施形態において、陰イオン交換クロマトグラフィーは、ＦＲＦＯＧＥＨＥＬ（登録商標）ＴＭＡＥ（トリメチルアミノエチル、四級アンモニア樹脂）を使用して実施される。
【０２３４】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を陰イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約２３℃以下、約１８℃以下、または約１６℃以下、例えば約２３℃、約２０℃、約１８℃、または約１６℃で実施される。
【０２３５】
陰イオン交換クロマトグラフィーのための典型的な移動相は、水、アセトニトリル、有機アルコール、例えば、メタノール、エタノール、およびイソプロパノール、または２−（Ｎ−モルホリノ）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）を含有する溶液などの比較的極性の溶液を含む。したがって、特定の実施形態では、移動相は、約０％、１％、２％、４％、６％、８％、１０％、１２％、１４％、１６％、１８％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または約１００％の極性溶液を含む。特定の実施形態では、移動相は、分離の過程中の任意の所与の時点で、約１％〜約１００％、約５％〜約９５％、約１０％〜約９０％、約２０％〜約８０％、約３０％〜約７０％、または約４０％〜約６０％の極性溶液を含む。
【０２３６】
特定の実施形態では、ｒｈＡＳＡは、約２３Ｕ／Ｌ樹脂以下、例えば、約１９Ｕ／Ｌ樹脂以下、約１５Ｕ／Ｌ樹脂以下、または約１２Ｕ／Ｌ樹脂以下、例えば、約１２Ｕ／Ｌ樹脂〜約１５Ｕ／Ｌ樹脂、または約１５Ｕ／Ｌ樹脂〜約１９Ｕ／Ｌ樹脂の結合能力で装填される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料は、少なくとも約４．５ｇ／Ｌ樹脂（例えば、少なくとも約５ｇ／Ｌ樹脂、６ｇ／Ｌ樹脂、７ｇ／Ｌ樹脂、８ｇ／Ｌ樹脂、９ｇ／Ｌ樹脂、１０ｇ／Ｌ樹脂、１１ｇ／Ｌ樹脂、１２ｇ／Ｌ樹脂、１３ｇ／Ｌ樹脂、１４ｇ／Ｌ樹脂、または１５ｇ／Ｌ樹脂）の結合能力で陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料は、約４．５〜２０ｇ／Ｌ樹脂の範囲（例えば、約５〜２０ｇ／Ｌ樹脂、５〜１９ｇ／Ｌ樹脂、５〜１８ｇ／Ｌ樹脂、５〜１７ｇ／Ｌ樹脂、５〜１６ｇ／Ｌ樹脂、５〜１５ｇ／Ｌ樹脂、７．５〜２０ｇ／Ｌ樹脂、７．５〜１９ｇ／Ｌ樹脂、７．５〜１８ｇ／Ｌ樹脂、７．５〜１７ｇ／Ｌ樹脂、７．５〜１６ｇ／Ｌ樹脂、７．５〜１５ｇ／Ｌ樹脂、１０〜２０ｇ／Ｌ樹脂、１０〜１９ｇ／Ｌ樹脂、１０〜１８ｇ／Ｌ樹脂、１０〜１７ｇ／Ｌ樹脂、１０〜１６ｇ／Ｌ樹脂、または１０〜１５ｇ／Ｌ樹脂の範囲）の結合能力で陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填される。
【０２３７】
ＡＳＡと混入物（複数可）とを含む水溶液は、ポリペプチドおよび混入物が陰イオン交換樹脂に結合するような塩濃度および／またはｐＨを有するローディング緩衝液を使用して、移動相として陰イオン樹脂上に装填され得る。次いで、樹脂は、１つ以上のカラム体積のローディング緩衝液、続いて、塩濃度が増加した１つ以上のカラム体積の洗浄緩衝液で洗浄され得る。最後に、ＡＳＡは、塩濃度を増加させる溶出緩衝液によって溶出され得る。任意に、酵素の溶出はまた、ｐＨを徐々にまたは段階的に減少させることによって媒介され得る。ＡＳＡ活性を含む画分が収集され、さらなる精製のために組み合わされ得る。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填することは、ローディング緩衝液を用いて実施される。一実施形態では、ローディング緩衝液は、塩化ナトリウムを含有しない。別の実施形態では、ローディング緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、ローディング緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約１ｍＭ〜約２５ｍＭ、例えば、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、または約５ｍＭ〜約１０ｍＭである。いくつかの実施形態では、移動相中の塩濃度は、勾配である（例えば、線形または非線形勾配）。いくつかの実施形態では、移動相中の塩濃度は一定である。いくつかの実施形態では、移動相中の塩濃度は、段階的に増加または減少し得る。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を陰イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填することは、約５〜約９、例えば、約６〜約８、例えば、約７のｐＨで実施される。
【０２３９】
いくつかの実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを洗浄することは、１つ以上の洗浄緩衝液を用いて実施される。例えば、陰イオン交換カラムを洗浄することは、２つ以上の（例えば、第１および第２の）洗浄工程を含むことができ、各々は異なる洗浄緩衝液を使用する。一実施形態では、洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含有しない。別の実施形態では、洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、洗浄緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、例えば、約５０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ、または約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ、例えば、約８０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２０ｍＭ、または約１４０ｍＭである。陰イオン交換クロマトグラフィーカラムを洗浄することは、約５〜約９、例えば、約６〜約８、例えば、約７のｐＨで実施される。
【０２４０】
一実施形態では、溶出緩衝液は、リン酸ナトリウムを含有する。例えば、溶出緩衝液のリン酸ナトリウム濃度は、約２０ｍＭ〜約５０ｍＭ、例えば、約２５ｍＭ〜約４５ｍＭ、例えば、約３０ｍＭ、約３５ｍＭ、または約４０ｍＭである。別の実施形態では、溶出緩衝液は、塩化ナトリウムを含有しない。さらに別の実施形態では、溶出緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、溶出緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭ、例えば、約２４０ｍＭ〜約２８０ｍＭである。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡを陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出することは、約５〜約９、例えば、約６〜約８、例えば、約７のｐＨで実施される。
【０２４１】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡを陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出することは、溶出ピーク収集の１つ以上の工程を含む。例えば、溶出ピーク収集は、例えば、２８０ｎＭでの分光測光法によって決定されるように、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、例えば、上昇側で約１００ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、上昇側で約２００ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約１００ｍＡＵ、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約２００ｍＡＵ、または上昇側で約１００ｍＡＵから下降側で約１００ｍＡＵで開始する。
【０２４２】
多数の異なる緩衝液が、装填、洗浄、および溶出工程で使用され得ることは当業者に明らかである。しかしながら、典型的には、カラムは、０．０５Ｍ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．０を含む緩衝液の１〜１０カラム洗浄で平衡化され得る。便宜上、試料は、精製プロセスの前の工程からの緩衝液中に装填され得るか、または試料は、ローディング緩衝液を使用して装填され得る。カラムは、平衡化に使用される１〜１０カラム体積の緩衝液、続いて０．０２ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ、０．１２Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含む洗浄緩衝液で洗浄され得る。別の方法として、カラムは、陰イオン交換クロマトグラフィーに関して本明細書に記載される任意の他任意の平衡、装填、および洗浄緩衝液で平衡化、装填、および洗浄され得る。試料は、０．０２ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ、０．２６Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含む緩衝液中で溶出され得る。あるいは、試料は、陰イオン交換クロマトグラフィーに関して本明細書に記載される任意の他の溶出緩衝液中で溶出され得る。
【０２４３】
本明細書に記載されるローディング緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液は、１つ以上の緩衝剤を含むことができる。例えば、緩衝剤は、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜５ｍＭ、約５ｍＭ〜１０ｍＭ、約１０ｍＭ〜５０ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。
【０２４４】
陰イオン交換クロマトグラフィーの収率、活性、および純度は異なり得る。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡ活性収率は、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８５％、例えば、約８５％〜約９９％、または約９０％〜約９９％である。いくつかの実施形態では、タンパク質収率（ＡＵまたは吸光度単位）は、例えば、２８０ｎｍでの分光光度法によって決定されるように、約１０％〜５０％、例えば、約２０％〜約３５％、または約２５％〜約３０％である。いくつかの実施形態（例えば、以下に記載されるＴＭＡＥカラムを使用する実施形態）では、溶出プールタンパク質活性収率（ＡＵまたは吸光度単位）は、例えば、２８０ｎｍでの分光光度法によって決定されるように、約７０％〜４００％、例えば、約８０％〜約３９０％、または約９０％〜約３５０％、または約１００％〜約１５０％、少なくとも９５％超である。いくつかの実施形態（例えば、以下に記載されるＴＭＡＥカラムを使用する実施形態）では、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）対数減少値（ＬＲＶ）は、約０．５〜約１．１、例えば、約０．６〜０．９、または約０．７〜０．８である。いくつかの実施形態（例えば、以下に記載されるＴＭＡＥカラムを使用する実施形態）では、純度は、キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定されるように、少なくとも７５％、例えば、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、またはそれ以上である。好ましい実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーの後の活性収率、ＨＣＰ  ＬＲＶ、および純度（キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ  ＰＡＧＥによって決定されるような）は、それぞれ少なくとも約９０％、少なくとも約０．６、および少なくとも約８０％である。
【０２４５】
本発明の好ましい実施形態では、高装填容量を有する陰イオン交換カラムが使用される。本発明の特定の実施形態では、カラムは、約３〜２０ｇ／Ｌ（すなわち、約５〜１５ｇ／Ｌ、約１０〜１５ｇ／Ｌ、約１０〜２０ｇ／Ｌ）の装填範囲を特徴とする。いくつかの実施形態では、装填容量は、４．３ｇ／Ｌを有意に超える（例えば、約１０ｇ／Ｌ、１２．５ｇ／Ｌ、１５ｇ／Ｌ、１７．５ｇ／Ｌ、または２０ｇ／Ｌ超）。特定の実施形態では、樹脂の結合能力は、約７５〜１００ＡＵ／Ｌ（例えば、約７５ＡＵ／Ｌ、約８０ＡＵ／Ｌ、約８５ＡＵ／Ｌ、約９０ＡＵ／Ｌ、約９５ＡＵ／Ｌ）である。特定の実施形態では、装填容量は、約８０ＡＵ／Ｌを超える。いくつかの実施形態では、高装填容量カラムは、ＴＭＡＥカラムである。特定の実施形態では、カラムは、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ（登録商標）ＴＭＡＥカラム、Ｎｕｖｉａ  Ｑカラム、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗカラム、Ｃａｐｔｏ  Ｑカラム、Ｑｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬカラム、Ｅｓｈｍｕｎｏ  Ｑカラム、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑカラム、またはＧｉＧａｃａｐ  Ｑカラムからなる群から選択される。
【０２４６】
本発明の特定の実施形態では、ＴＭＡＥカラムは、ｐＨ７．０で約２０ｍＭのＭＥＳ−Ｔｒｉｓと１０００ｍＭのＮａＣｌとを含む緩衝液で予め平衡化される。特定の実施形態では、カラムは、ｐＨ７．０で５０ｍＭのＭＥＳ−Ｔｒｉｓを含む緩衝液で平衡化される。いくつかの実施形態では、ＴＭＡＥカラムの装填流速は、約７５〜１２５ｃｍ／時間（すなわち、約７５〜１１５ｃｍ／時間、約７５〜１１０ｃｍ／時間、約７５〜１０５ｃｍ／時間、約７５〜１００ｃｍ／時間、約８５〜１１５ｃｍ／時間、約８５〜１１０ｃｍ／時間、約８５〜１０５ｃｍ／時間、約８５〜１００ｃｍ／時間、約９５〜１１５ｃｍ／時間、約９５〜１１０ｃｍ／時間、約９５〜１０５ｃｍ／時間、約９５〜１００ｃｍ／時間、約１００〜１２０ｃｍ／時間、約１００〜１１５ｃｍ／時間、約１００〜１１０ｃｍ／時間、約１００ｃｍ／時間）である。装填条件は、本明細書に記載されるようにＡ２８０吸光度によって最適化および評価されてもよい。
【０２４７】
ＴＭＡＥカラム（例えば、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥカラム）を利用する特定の実施形態では、装填中に、１５ｇ／Ｌを超える装填能力でさえ、フロースルー中の生成物が失われることはほとんどない。フロースルー損失を最小限に抑えながら装填容量を増加させる能力は、精製方法論において著しい改善である。本発明の特定の実施形態では、フロースルー生成物損失の量は、装填の３０％未満（例えば、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、または約５％未満）である。
【０２４８】
いくつかの実施形態では、装填後、ＴＭＡＥカラムは少なくとも１回洗浄される。特定の実施形態では、カラムは２回洗浄される。第１または第２の洗浄緩衝液は、最適化されたレベルの塩化ナトリウムを含み得る。いくつかの実施形態では、第１または第２の洗浄緩衝液中の塩化ナトリウムの量は、約５０〜１５０ｍＭ（例えば、約５０〜１４０ｍＭ、約５０〜１３０ｍＭ、約５０〜１２０ｍＭ、約５０〜１１０ｍＭ、約５０〜１００ｍＭ、約５０〜９０ｍＭ、約５０〜８０ｍＭ、約８０〜１５０ｍＭ、約８０〜１４０ｍＭ、約８０〜１３０ｍＭ、約８０〜１２０ｍＭ、約８０〜１１０ｍＭ、約８０〜１００ｍＭ、約８０〜９０ｍＭ、約８０ｍＭ、または約１２０ｍＭ）である。いくつかの実施形態では、第１の洗浄緩衝液は、ｐＨ７．０で５０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓを含む。いくつかの実施形態では、第２の洗浄緩衝液は、ｐＨ７．０で２０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ  ＮａＣｌを含む。洗浄条件、特に第２の洗浄条件のさらなる最適化は、本発明の実施形態内に包含される。例えば、第２の洗浄液の塩濃度を増加させることは、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）対数減少値（ＬＲＶ）および全体純度を改善し得るが、活性およびＡ２８０収率の両方の収率を減少させる可能性がある。本明細書に記載されるように、純度、活性、および収率の最適な組み合わせを提供するために、特定の洗浄条件は、以下に記載される溶出条件とバランスが取れていなければならない。
【０２４９】
本発明の実施形態では、ＴＭＡＥカラムに結合された組換えＡＳＡは、溶出緩衝液で溶出される。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液中の塩化ナトリウムの量が最適化される。特定の実施形態では、溶出緩衝液中の塩化ナトリウムの量は、約１５０〜３００ｍＭ（例えば、約１５０〜２９０ｍＭ、約１５０〜２８０ｍＭ、約１５０〜２７０ｍＭ、約１５０〜２６０ｍＭ、約１５０〜２５０ｍＭ、約１５０〜２４０ｍＭ、約１５０〜２３０ｍＭ、約１５０〜２２０ｍＭ、約１５０〜２１０ｍＭ、約１７０〜２９０ｍＭ、約１７０〜２８０ｍＭ、約１７０〜２７０ｍＭ、約１７０〜２６０ｍＭ、約１７０〜２５０ｍＭ、約１７０〜２４０ｍＭ、約１７０〜２３０ｍＭ、約１７０〜２２０ｍＭ、約１７０〜２１０ｍＭ、約１８０〜２９０ｍＭ、約１８０〜２８０ｍＭ、約１８０〜２７０ｍＭ、約１８０〜２６０ｍＭ、約１８０〜２５０ｍＭ、約１８０〜２４０ｍＭ、約１８０〜２３０ｍＭ、約１８０〜２２０ｍＭ、約１８０〜２１０ｍＭ、約１８０、約２２０、または約２６０）である。特定の例では、溶出緩衝液は、ｐＨ７．０で５０ｍＭ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓおよび１Ｍ  ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、溶出後のＡ２８０収率は、装填の６０％を超える（例えば、約６０％、約７０％、約８０％、またはそれ以上）。溶出条件のさらなる最適化は、本発明の実施形態内に包含される。例えば、溶出塩濃度（すなわち、導電率）の増加は、より良好な収率を提供するが、より不十分な純度およびＨＣＰ除去をもたらす。上述のように、純度、活性、および収率の最適な組み合わせを提供するために、特定の洗浄条件は、溶出条件とバランスが取れていなければならない。
【０２５０】
陽イオン交換クロマトグラフィー
いくつかの実施形態では、方法はさらに、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィー、例えば、本明細書に記載されるようなスルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換クロマトグラフィーに供することを含む。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料は、陽イオン交換クロマトグラフィーの前に陰イオン交換クロマトグラフィーに供される。典型的な実施形態において、陽イオン交換クロマトグラフィーは、スルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換クロマトグラフィーを含むが、他の陽イオンクロマトグラフィー膜または樹脂、例えば、ＭＵＳＴＡＮＧ（商標）Ｓ膜、Ｓ−ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）樹脂、またはＢｌｕｅ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）樹脂が使用され得る。いくつかの実施形態では、方法はさらに、例えば、限外濾過および／または透析濾過によって、例えば、接線流限外濾過によって、アリールスルファターゼＡの試料を濃縮および／または濾過することを含む。陽イオン交換クロマトグラフィーは、例えば、本明細書に記載されるような最適化された温度で実施されて、標的結合を増強および／または不純物結合を減少させることができる。例えば、陽イオン交換クロマトグラフィーは、約２３℃、１８℃、１６℃、またはそれ以下の温度で実施され得る。
【０２５１】
一実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーは、スルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換クロマトグラフィーを含む。別の実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーは、研磨工程である。陽イオン交換クロマトグラフィー（例えば、スルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換クロマトグラフィー）は、例えば、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＳＰ−６５０、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）ＳＰ−５５０、ＴＳＫＧＥＬ（登録商標）ＳＰ−３ＰＷ、ＴＳＫＧＥＬ（登録商標）ＳＰ−５ＰＷ、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、ＳＰ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）ＸＬ、ＳＡＲＴＯＢＩＮＤ（登録商標）Ｓ膜、ＰＯＲＯＳ（登録商標）ＨＳ５０、ＵＮＯＳＰＨＥＲＥ（商標）Ｓ、およびＭＡＣＲＯＣＡＰ（商標）Ｓのうちの１つ以上を使用して実施され得る。
【０２５２】
アリールスルファターゼＡと混入物（複数可）とを含む水溶液は、ポリペプチドおよび混入物が陽イオン交換樹脂に結合するような塩濃度および／またはｐＨを有するローディング緩衝液を使用して、陽イオン樹脂上に装填され得る。次いで、樹脂は、１つ以上のカラム体積の平衡緩衝液またはローディング緩衝液、任意に続いて、塩濃度が増加した１つ以上のカラム体積の洗浄緩衝液で洗浄され得る。最後に、アリールスルファターゼＡは、溶出緩衝液中で溶出され得る。アリールスルファターゼＡ活性を含む画分が収集され、さらなる精製のために組み合わされ得る。
【０２５３】
典型的な実施形態では、ローディング緩衝液、洗浄緩衝液、および／または溶出緩衝液のＮａＣｌ濃度および／またはｐＨは、標的結合を増強および／または不純物結合を減少させるように、例えば、本明細書に記載されるように最適化され得る。いくつかの実施形態では、ローディング緩衝液中のＮａＣｌ濃度は、約２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、ローディング緩衝液は、約４．５、４．３、４．０、またはそれ以下のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液中のＮａＣｌ濃度は、約２０ｍＭ、１５ｍＭ、１０ｍＭ、またはそれ以下である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液中のＮａＣｌ濃度は、約５５ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭ、またはそれ以下である。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオンクロマトグラフィーカラム（例えば、スルホプロピル（ＳＰ）陽イオン交換カラム）上に装填することと、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを洗浄することと、アリールスルファターゼＡをカラムから溶出することと、を含む。いくつかの実施形態では、カラムは、３、例えば５〜１０カラム体積の０．０１ＭのＮａＡｃ、０．０１ＭのＮａＣｌ、０．０３Ｍの酢酸、ｐＨ４．２を用いて平衡化され得る。
【０２５５】
いくつかの実施形態では、試料は、精製プロセスの前の工程からの緩衝液中に装填され得るか、または試料は、ローディング緩衝液を使用して装填され得る。一実施形態では、ローディング緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、ローディング緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約１ｍＭ〜約２５ｍＭ、例えば、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、例えば、５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、または約２０ｍＭである。別の実施形態では、ローディング緩衝液は、酢酸ナトリウムを含有する。例えば、ローディング緩衝液の酢酸ナトリウム濃度は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、例えば、約２０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約６０Ｍｍである。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填することは、約３．０〜約６．０、例えば、約４．０〜約５．０、例えば、約４．０、約４．３、または約４．５のｐＨで実施される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料は、約１５ＡＵ／Ｌ樹脂以下、例えば、約１４ＡＵ／Ｌ樹脂以下、または約１２ＡＵ／Ｌ樹脂以下、例えば、約１０ＡＵ／Ｌ樹脂〜約１４ＡＵ／Ｌ樹脂、または約１０ＡＵ／Ｌ樹脂〜約１２ＡＵ／Ｌ樹脂の結合能力で陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填される。
【０２５６】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを洗浄することは、１つ以上の洗浄緩衝液を用いて実施される。例えば、陽イオン交換カラムを洗浄することは、２つ以上の（例えば、第１および第２の）洗浄工程を含むことができ、各々は異なる洗浄緩衝液を使用する。カラムは、平衡化に使用される１〜１０カラム体積の緩衝液で洗浄され得る。別の方法として、カラムは、陽イオン交換クロマトグラフィーに関して本明細書に記載される任意の他任意の平衡、装填、および洗浄緩衝液で平衡化、装填、および洗浄され得る。一実施形態では、洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、洗浄緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約１ｍＭ〜約２５ｍＭ、例えば、約５ｍＭ〜約２０ｍＭ、または約１０ｍＭ〜約１５ｍＭ、例えば、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約１５ｍＭ、または約２０ｍＭである。別の実施形態では、洗浄緩衝液は、酢酸ナトリウムを含有する。例えば、ローディング緩衝液の酢酸ナトリウム濃度は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、例えば、約２０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約６０Ｍｍである。いくつかの実施形態では、陽イオン交換クロマトグラフィーカラムを洗浄することは、約３．０〜約６．０、例えば、約４．０〜約５．０、例えば、約４．０、約４．３、または約４．５のｐＨで実施される。
【０２５７】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡを陰イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出することは、溶出緩衝液を用いて実施される。一実施形態では、溶出緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、溶出緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約２５ｍＭ〜約７５ｍＭ、例えば、約４５ｍＭ〜約６０ｍＭ、例えば、約４５ｍＭ、約５０ｍＭ、約５５ｍＭ、または約５５ｍＭである。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡを陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出することは、約３．０〜約６．０、例えば、約４．０〜約５．０、例えば、約４．０、約４．３、または約４．５のｐＨで実施される。したがって、１つの特定の例として、試料は、０．０２Ｍ  ＮａＡｃ、０．０５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ４．５を含む緩衝液中で溶出され得る。あるいは、試料は、陽イオン交換クロマトグラフィーに関して本明細書に記載される任意の他の溶出緩衝液中で溶出され得る。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡを陽イオン交換クロマトグラフィーカラムから溶出することは、溶出ピーク収集の１つ以上の工程を含む。例えば、溶出ピーク収集は、例えば、２８０ｎＭでの分光測光法によって決定されるように、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、例えば、上昇側で約１００ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、上昇側で約２００ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約１００ｍＡＵ、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約２００ｍＡＵ、または上昇側で約１００ｍＡＵから下降側で約１００ｍＡＵで開始する。収集された溶出ピークはプールされ得る。
【０２５９】
本明細書に記載されるローディング緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液は、１つ以上の緩衝剤を含むことができる。例えば、緩衝剤は、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜５ｍＭ、約５ｍＭ〜１０ｍＭ、約１０ｍＭ〜５０ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。
【０２６０】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約２３℃以下、約１８℃以下、または約１６℃以下、例えば、約２３℃、約２０℃、約１８℃、または約１６℃の温度で実施される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約２３℃〜約１６℃、例えば、約２３℃、約２０℃、約１８℃、または約１６℃の温度で実施され、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填することは、約４．５〜約４．３、例えば、約４．５、約４．４、または約４．３のｐＨで実施される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約２３℃で実施され、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填することは、ｐＨ約４．５で実施される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約２３℃で実施され、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填することは、ｐＨ約４．３で実施される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約１８℃で実施され、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填することは、ｐＨ約４．５で実施される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーに供することは、約１８℃で実施され、アリールスルファターゼＡの試料を陽イオン交換クロマトグラフィーカラム上に装填することは、ｐＨ約４．３で実施される。
【０２６１】
陽イオン交換クロマトグラフィー後の収率は異なり得る。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡ活性収率は、少なくとも約７５％、例えば、少なくとも約８０％、例えば、約８０％〜約１０５％である。いくつかの実施形態では、タンパク質収率（ＡＵまたは吸光度単位）は、例えば、２８０ｎｍでの分光光度法によって決定されるように、約６５％〜１００％、例えば、約７０％〜約９５％である。
【０２６２】
陽イオン交換クロマトグラフィー後の純度および活性は、大幅に改善される。いくつかの実施形態では、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）対数減少値（ＬＲＶ）は、約１．０〜約２．５、例えば、約１．５〜約２．０または約１．７〜約１．９である。精製されたアリールスルファターゼＡの比活性は、例えば、本明細書に記載される方法によって決定されるように、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇ〜約１４０Ｕ／ｍｇ、例えば、少なくとも約７０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約１００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約１２０Ｕ／ｍｇであり得る。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡは、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％に精製される。アリールスルファターゼＡの純度は、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ウエスタンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色、逆相ＨＰＬＣ、およびサイズ排除ＨＰＬＣのうちの１つ以上によって測定され得る。特定の実施形態では、ローディング緩衝液の塩濃度を減少させ、そのｐＨを低下させることは、陽イオン交換カラムへのＡＳＡの結合を増強するが、不純物結合には影響を与えない。言い換えれば、上記のような塩濃度およびｐＨの最適なバランスは、純度に悪影響を与えることなく、陽イオン交換クロマトグラフィー後の収率を増加させることができる。
【０２６３】
いくつかの実施形態では、陽イオン交換溶出物プールのｐＨは調整され得る。特定の実施形態では、ｐＨは、ウイルス濾過の直前に調整される。陽イオン交換溶出物（例えば、ＳＰ溶出物）は、０．２５Ｍのリン酸ナトリウム、１．３３Ｍの塩化ナトリウム、０．３４Ｍのクエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０を含むｐＨ調整緩衝液を使用して、約５．５、約６．０、約６．５、または約７．０にｐＨ調整され得る。特定の実施形態では、ｐＨ調整ＳＰ溶出物プールは、Ｐｌａｎｏｖａ  ２０Ｎフィルタ上でウイルス濾過される。いくつかの実施形態では、ｐＨ調節陽イオン交換溶出物のウイルス濾過後の投入に対する収率は、Ａ２８０吸光度によって評価されるように、約９０〜１００％、すなわち、約９０％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上である。約６．０へのｐＨ調整により、ＡＳＡの八量体（直径が約２０ｎｍである）が二量体形態に分解することを可能にすることを検証しているため、ウイルス濾過の収率は有意である。したがって、ウイルスフィルタの孔径は、二量体形態のみが濾過されること（すなわち、八量体形態がフィルタによって保持され得るか、またはウイルスフィルタの目詰まりを引き起こし得ること）を確実にするように選択され得る。例えば、２０ｎｍの孔径のウイルスフィルタは、ＡＳＡの八量体形態を保持するが、二量体形態は保持しない。
【０２６４】
混合モードクロマトグラフィー
本明細書に記載される精製方法は、混合モードクロマトグラフィーの１つ以上の工程を含むことができる。混合モードクロマトグラフィーは、典型的には液体クロマトグラフィーで異なる分子の混合物を分解するために、いくつかの分離モードが適用される、クロマトグラフィーのタイプである。例えば、混合モード分離は、同時にイオン交換および逆相特性を有する組み合わせ相を含むことができる。２つ以上の相互作用タイプを有するこれらの固定相は、複数のカラム製造元から入手可能である。
【０２６５】
一態様では、本開示は、試料からアリールスルファターゼＡを精製する方法を特徴とし、方法は、例えば、アリールスルファターゼＡ（例えば、組換えアリールスルファターゼＡ）の試料を提供することと、アリールスルファターゼＡの試料を混合モードクロマトグラフィー、例えば、セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトタイプＩまたはタイプＩＩクロマトグラフィーを含む方法など、例えば、本明細書に記載される混合モードクロマトグラフィーに供することと、を含む。いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーは、ＣＨＴ（商標）Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  Ｉ  Ｍｅｄｉａ、ＣＨＴ（商標）Ｃｅｒａｍｉｃ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ  Ｔｙｐｅ  ＩＩ  Ｍｅｄｉａ、  ＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）ＨＴ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ、およびＢＩＯ−ＧＥＬ（登録商標）ＨＴＰ  Ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅのうちの１つ以上を使用して実施される。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を混合モードクロマトグラフィーに供することは、アリールスルファターゼＡの試料を混合モードクロマトグラフィーカラム（例えば、ＨＡクロマトグラフィー）上に装填することと、混合モードクロマトグラフィーカラムを洗浄することと、アリールスルファターゼＡをカラムから溶出することと、を含む。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を混合モードクロマトグラフィーに供することは、約２３℃以下、約１８℃以下、または約１６℃以下、例えば約２３℃、約２０℃、約１８℃、または約１６℃で実施される。
【０２６７】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を混合モードクロマトグラフィーカラム上に装填することは、ローディング緩衝液を用いて実施される。一実施形態では、ローディング緩衝液は、リン酸ナトリウムを含有する。例えば、ローディング緩衝液のリン酸ナトリウム濃度は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約５ｍＭ〜約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約２ｍＭ、または約５ｍＭである。別の実施形態では、ローディング緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、ローディング緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約１００ｍＭ〜約４００ｍＭ、例えば、約２００ｍＭ〜約３００ｍＭ、例えば、２２０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２６０ｍＭ、または約２８０ｍＭである。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を混合モードクロマトグラフィーカラム上に装填することは、約５〜約９、例えば、約６〜約８、例えば、約７のｐＨで実施される。
【０２６９】
いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーは、セラミックヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーを含む。ヒドロキシアパタイト（ＨＡＰ）は通常、リン酸カルシウムの結晶形態を指す。ＨＡＰの機構は、樹脂上の負に帯電したタンパク質カルボキシル基と正に帯電したカルシウムイオン、および樹脂上の正に帯電したタンパク質アミノ基と負に帯電したリン酸イオンとの間の非特異的な相互作用を伴う。塩基性タンパク質または酸性タンパク質は、緩衝液のｐＨを調整することによってカラム上に選択的に吸着され得、溶出は、緩衝液の塩濃度を変化させることによって達成され得る。この場合もやはり、多数の緩衝液組成ならびに緩衝液の組み合わせが用いられ得ることが明らかである。しかしながら、典型的には、カラムは、０．００１Ｍ  ＮａＰＯ４、０．０２Ｍ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ、０．２６Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含む緩衝液の１〜１０カラム洗浄で平衡化され得る。便宜上、試料は、精製プロセスの前の工程からの緩衝液中に装填され得るか、または試料は、ローディング緩衝液を使用して装填され得る。カラムは、平衡化に使用される１〜１０カラム体積の緩衝液、続いて０．００５Ｍ  ＮａＰＯ４、０．０２Ｍ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ、０．２６Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を含む洗浄緩衝液で洗浄され得る。別の方法として、カラムは、混合モードクロマトグラフィーに関して本明細書に記載される任意の他任意の平衡、装填、および洗浄緩衝液で平衡化、装填、および洗浄され得る。試料は、０．０４Ｍ  ＮａＰＯ４、ｐＨ７．０を含む緩衝液中で溶出され得る。任意に、カラムは、１〜１０カラム体積の０．４ＭのＮａｐＯ４、ｐＨ１２で洗浄することによって除去され得る。あるいは、試料は、混合モードクロマトグラフィーに関して本明細書に記載される任意の他の溶出緩衝液中で溶出され得る。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーカラムを洗浄することは、１つ以上の洗浄緩衝液を用いて実施される。例えば、混合モードクロマトグラフィーカラムを洗浄することは、２つ以上の（例えば、第１および第２の）洗浄工程を含むことができ、各々は異なる洗浄緩衝液を使用する。
【０２７１】
一実施形態では、洗浄緩衝液は、リン酸ナトリウムを含有する。例えば、洗浄緩衝液のリン酸ナトリウム濃度は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ〜約５ｍＭ、約５ｍＭ〜約１０ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、または約１０ｍＭである。別の実施形態では、洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、洗浄緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、例えば、約１００ｍＭ〜約５００ｍＭ、または約２００〜約４００ｍＭ、例えば、約２２０ｍＭ、約２４０ｍＭ、約２６０ｍＭ、または約２８０ｍＭである。
【０２７２】
混合モードクロマトグラフィーカラムを洗浄することは、約５〜約９、例えば、約６〜約８、例えば、約７のｐＨで実施される。
【０２７３】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡを混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出することは、約５〜約９、例えば、約６〜約８、例えば、約７のｐＨで実施される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡを混合モードクロマトグラフィーカラムから溶出することは、溶出ピーク収集の１つ以上の工程を含む。例えば、溶出ピーク収集は、例えば、２８０ｎＭでの分光測光法によって決定されるように、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、例えば、上昇側で約１００ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、上昇側で約２００ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約１００ｍＡＵ、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約２００ｍＡＵ、または上昇側で約１００ｍＡＵから下降側で約１００ｍＡＵで開始する。
【０２７４】
本明細書に記載されるローディング緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液は、１つ以上の緩衝剤を含むことができる。例えば、緩衝剤は、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜５ｍＭ、約５ｍＭ〜１０ｍＭ、約１０ｍＭ〜５０ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、混合モードクロマトグラフィーによるＡＳＡの精製は、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）による精製の後に続く。しかしながら、これらの工程は、逆順序で実施され得ることが企図される。
【０２７６】
混合モードクロマトグラフィー後の収率は異なり得る。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡ活性収率は、少なくとも約８０％、例えば、少なくとも約９０％、例えば、約８０％〜約１１５％である。いくつかの実施形態では、タンパク質収率（ＡＵまたは吸光ユニット）は、例えば、２８０ｎｍでの分光光度法によって決定されるように、約３０％〜８０％、例えば、約３５％〜約７５％、または約５０％〜約７０％ある。
【０２７７】
混合モードクロマトグラフィー後の純度は、大幅に改善される。いくつかの実施形態では、精製されたアリールスルファターゼＡの比活性は、例えば、本明細書に記載される方法によって決定されるように、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇ〜約１４０Ｕ／ｍｇ、例えば、少なくとも約７０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約１００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約１２０Ｕ／ｍｇである。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡは、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％に精製される。アリールスルファターゼＡの純度は、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ウエスタンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色、逆相ＨＰＬＣ、およびサイズ排除ＨＰＬＣのうちの１つ以上によって測定され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）対数減少値（ＬＲＶ）は、約０．３〜約０．６、例えば、約０．４から０．５である。
【０２７８】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
本明細書に記載される精製方法は、アリールスルファターゼＡの試料を疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）に供することを含むことができる。一実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、フェニルクロマトグラフィーを含む。一実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、ブチルクロマトグラフィーまたはオクチルクロマトグラフィーを含む。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料をＨＩＣに供することは、約２３℃以下、約１８℃以下、または約１６℃以下、例えば約２３℃、約２０℃、約１８℃、または約１６℃で実施される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料は、ＨＩＣ前に混合モードクロマトグラフィーに供される。
【０２７９】
疎水性相互作用クロマトグラフィーは、極性または非極性の環境に対して所与の分子の引力を利用し、タンパク質の観点から、この傾向は、タンパク質の露出した外側表面上の残基の疎水性または親水性によって左右される。したがって、タンパク質は、疎水性マトリクス、典型的には鎖長が２〜１８炭素のアルキルリンカーアームを有する不活性支持体に対するそれらの異なる引力の程度に基づいて分画される。固定相は、親水性ポリマー骨格（例えば、架橋Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）、デキストリン、またはアガロース）に付着した小さい非極性基（ブチル、オクチル、またはフェニル）からなる。したがって、ＨＩＣカラムは典型的には、ブチルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラムまたはフェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラム、最も典型的にはフェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）カラムである。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、疎水性相互作用クロマトグラフィーは、Ｐｈｅｎｙｌ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｐｈｅｎｙｌ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（低サブ）、またはＰｈｅｎｙｌ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）６  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（高サブ）のうちの１つ以上を使用するフェニルクロマトグラフィーを含む。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料を疎水性相互作用クロマトグラフィーに供することは、アリールスルファターゼＡの試料をＨＩＣカラム上に装填することと、ＨＩＣカラムを洗浄することと、アリールスルファターゼＡをカラムから溶出することと、を含む。ＨＩＣにおける装填、洗浄、および溶出は基本的に、イオン交換クロマトグラフィーに関して上述したものと同じ原理に従うが、イオン交換クロマトグラフィーで使用されるものとほぼ反対の条件が適用される場合が多い。したがって、ＨＩＣプロセスは、疎水性部位を露出させるためにタンパク質を分解する高塩ローディング緩衝液の使用を伴う。タンパク質は、カラム上の疎水性リガンドによって保持され、減少している塩濃度を含有する緩衝液の勾配に曝露される。塩濃度が減少すると、タンパク質は、その天然構造に戻り、最終的にはカラムから溶出する。あるいは、タンパク質はＰＥＧで溶出されてもよい。
【０２８２】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料をＨＩＣカラム上に装填することは、ローディング緩衝液を用いて実施される。一実施形態では、ローディング緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、ローディング緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約０．５Ｍ〜約２．５Ｍ、例えば、約１Ｍまたは約１．５Ｍである。別の実施形態では、ローディング緩衝液は、リン酸ナトリウムを含有する。例えば、ローディング緩衝液のリン酸ナトリウム濃度は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、例えば、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約７５ｍＭである。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料をＨＩＣカラム上に装填することは、約５〜約７、例えば、約５．５〜約６．５、例えば、約５．５、約６．０、または約６．５のｐＨで実施される。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡの試料は、約１２ＡＵ／Ｌ樹脂以下、例えば、約１０ＡＵ／Ｌ樹脂以下、約９ＡＵ／Ｌ樹脂以下、約７ＡＵ／Ｌ樹脂以下、または約５ＡＵ／Ｌ樹脂以下、例えば、約５ＡＵ／Ｌ樹脂〜約９ＡＵ／Ｌ樹脂、または約５ＡＵ／Ｌ樹脂〜約７ＡＵ／Ｌ樹脂の結合能力でＨＩＣカラム上に装填される。
【０２８３】
ＨＩＣ中の固相としてのフェニルＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）の使用は、本開示において典型的である。この場合もやはり、正確な条件ならびに装填、洗浄、および溶出プロセスに使用される緩衝液および緩衝液の組み合わせに関して言えば、多数の異なる可能性が存在することが容易に明らかである。典型的な実施形態では、カラムは、０．０５Ｍ  ＮａＰＯ４、１Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を含む緩衝液中で平衡化され得る。便宜上、試料は、精製プロセスの前の工程からの緩衝液中に装填され得るか、または試料は、ローディング緩衝液を使用して装填され得る。
【０２８４】
いくつかの実施形態では、ＨＩＣカラムを洗浄することは、１つ以上の洗浄緩衝液を用いて実施される。例えば、ＨＩＣカラムを洗浄することは、２つ以上の（例えば、第１および第２の）洗浄工程を含むことができ、各々は異なる洗浄緩衝液を使用する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、洗浄緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約１００ｍＭ〜約１．５Ｍ、例えば、約２５０ｍＭ〜約１Ｍ、例えば、約２５０ｍＭ、約５００ｍＭ、約７５０ｍＭ、または約１Ｍである。別の実施形態では、洗浄緩衝液は、リン酸ナトリウムを含有する。例えば、ローディング緩衝液のリン酸ナトリウム濃度は、約１０ｍＭ〜約１００ｍＭ、例えば、約２５ｍＭ、約５０ｍＭ、または約７５ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＨＩＣカラムを洗浄することは、約５〜約７、例えば、約５．５〜約６．５、例えば、約５．５、約６．０、または約６．５のｐＨで実施される。例えば、洗浄は、平衡緩衝液の１〜２カラム洗浄、続いて１〜５カラム体積の０．０２Ｍ  ＭＥＳ、０．０５Ｍ  ＮａＰＯ４、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５を使用して実施され得る。別の方法として、カラムは、ＨＩＣに関して本明細書に記載される任意の他任意の平衡、装填、および洗浄緩衝液で平衡化、装填、および洗浄され得る。
【０２８５】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡをＨＩＣカラムから溶出することは、溶出緩衝液を用いて実施される。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、塩化ナトリウムを含有する。例えば、溶出緩衝液の塩化ナトリウム濃度は、約３０ｍＭ〜約１００ｍＭ、例えば、約４５ｍＭ〜約８５ｍＭ、例えば、約５０ｍＭ、約６０ｍＭ、約７０ｍＭ、または約８０ｍＭである。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡをＨＩＣカラムから溶出することは、約５〜約９、例えば、約６〜約８、例えば、約７のｐＨで実施される。例えば、アリールスルファターゼＡは、０．０２Ｍ  ＭＥＳ−Ｔｒｉｓ、０．０６Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０を使用して溶出され得る。あるいは、試料は、ＨＩＣに関して本明細書に記載される任意の他の溶出緩衝液中で溶出され得る。
【０２８６】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡをＨＩＣカラムから溶出することは、溶出ピーク収集の１つ以上の工程を含む。例えば、溶出ピーク収集は、例えば、２８０ｎＭでの分光測光法によって決定されるように、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、例えば、上昇側で約１００ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、上昇側で約２００ｍＡＵから下降側で約５０ｍＡＵ、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約１００ｍＡＵ、上昇側で約５０ｍＡＵから下降側で約２００ｍＡＵ、または上昇側で約１００ｍＡＵから下降側で約１００ｍＡＵで開始する。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、ＨＩＣによるアリールスルファターゼＡの精製は、イオン交換クロマトグラフィー（例えば、陰イオン交換クロマトグラフィー）による精製の後に続く。しかしながら、これらの工程は、逆順序で実施され得ることが企図される。
【０２８８】
本明細書に記載されるローディング緩衝液、洗浄緩衝液、および溶出緩衝液は、１つ以上の緩衝剤を含むことができる。例えば、緩衝剤は、ＴＲＩＳ、ＨＥＰＥＳ、ＭＯＰＳ、ＰＩＰＥＳ、ＳＳＣ、ＭＥＳ、リン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、またはそれらの組み合わせであり得る。緩衝剤の濃度は、約１ｍＭ〜約５００ｍＭ、例えば、約１０ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、約１ｍＭ〜５ｍＭ、約５ｍＭ〜１０ｍＭ、約１０ｍＭ〜５０ｍＭ、または約５０ｍＭ〜約１００ｍＭ、例えば、約１ｍＭ、約５ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、または約５０ｍＭである。
【０２８９】
ＨＩＣ後の収率は異なり得る。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡ活性収率は、少なくとも約６０％、例えば、少なくとも約７０％、例えば、約７０％〜約１００％である。いくつかの実施形態では、タンパク質収率（ＡＵまたは吸光度単位）は、例えば、２８０ｎｍでの分光光度法によって決定されるように、約４５％〜１００％、例えば、約５０％〜約９５％、または約５５％〜約９０％である。
【０２９０】
ＨＩＣの純度は、大幅に改善される。いくつかの実施形態では、精製されたアリールスルファターゼＡの比活性は、例えば、本明細書に記載される方法によって決定されるように、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇ〜約１４０Ｕ／ｍｇ、例えば、少なくとも約７０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約１００Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約１２０Ｕ／ｍｇである。
【０２９１】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡは、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％に精製される。アリールスルファターゼＡの純度は、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ウエスタンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色、逆相ＨＰＬＣ、およびサイズ排除ＨＰＬＣのうちの１つ以上によって測定され得る。いくつかの実施形態では、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）対数減少値（ＬＲＶ）は、約０．６〜約１．２、例えば、約０．７から０．９５である。
【０２９２】
限界濾過／透析濾過
本明細書に記載される精製方法は、下流限外濾過および／または透析濾過の１つ以上の工程を含むことができる。いくつかの実施形態では、方法はさらに、例えば、限外濾過および／または透析濾過によって、例えば、接線流限外濾過によって、アリールスルファターゼＡの試料を濃縮および／または濾過することを含む。
【０２９３】
限外濾過は、圧力勾配によって駆動される膜分離プロセスを指し、膜は、液体の構成成分をそれらの溶媒和サイズおよび構造の関数として分画する。透析濾過は、未透過物が水で希釈され、再び限外濾過されて、可溶性透過物構成要素の濃度を低減し、保持された構成成分の濃度を増加させる、特殊なタイプの限外濾過プロセスである。限外濾過は、透析濾過と組み合わされて限外濾過／透析濾過（ＵＦＤＦ）精製工程になる場合が多い。
【０２９４】
本発明の実施形態は、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも３つ、またはそれ以上の下流ＵＦＤＦ精製工程を利用する。１つ以上の透析濾過は、ＵＦＤＦ工程（例えば、ＵＦＤＦＤＦ）内で起こってもよい。いくつかの実施形態では、前の精製工程の量と比較して、下流ＵＦＤＦ後のタンパク質収率（ＡＵまたは吸光度単位）は、例えば、２８０ｎｍでの分光光度法によって決定されるように、約９０％〜１０５％、例えば、約９５％〜約１００％、例えば、約９７％〜約９９％ある。いくつかの実施形態では、本質的にＵＦＤＦ中にタンパク質は失われない。
【０２９５】
本発明のいくつかの実施形態では、下流ＵＦＤＦは、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）および／または逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）によって決定されるように、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、またはそれ以上に純粋であるｒＡＳＡをもたらす。いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡは、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、少なくとも約９９．５％、少なくとも約９９．６％、少なくとも約９９．７％、少なくとも約９９．８％、または少なくとも約９９．９％に精製される。アリールスルファターゼＡの純度は、例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）ウエスタンブロット、ＳＤＳ−ＰＡＧＥクマシー染色、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色、逆相ＨＰＬＣ、およびサイズ排除ＨＰＬＣのうちの１つ以上によって測定され得る。ｒＡＳＡの比活性は、例えば、以下に記載されるようなスルファターゼ放出アッセイによって決定されるように、少なくとも約６０Ｕ／ｍｇ〜約１００Ｕ／ｍｇ、例えば、少なくとも約６５Ｕ／ｍｇ、少なくとも約９０Ｕ／ｍｇ、少なくとも約７０Ｕ／ｍｇ、または少なくとも約９０Ｕ／ｍｇである。
【０２９６】
いくつかの実施形態では、アリールスルファターゼＡは、接線流濾過によって、酸性環境中の混入物からのそれらのサイズに従った分離によって精製される。アリールスルファターゼＡは、低ｐＨで八量体を形成し、理論上の分子量は４８０ｋＤａであり、したがって、比較的開いた膜によって保持される一方で、混入物のほとんどがこの膜を通る（Ｓｏｍｍｅｒｌａｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．，２９７；１２３−１３０、Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ｃｅｌｌ，８２  ２７１−２７８、Ｌｕｋａｔｅｌａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３７，３６５４−３６６４）。
【０２９７】
典型的な実施形態では、透析濾過緩衝液は、０．０１Ｍのリン酸−クエン酸ナトリウム、０．１３７ＭのＮａＣｌ、ｐＨ６．０を含む。
【０２９８】
いくつかの実施形態では、このプロセスの出発物質は、プロセスの前の工程でクロマトグラフィーカラムから溶出されるアリールスルファターゼＡの懸濁液であるため、この懸濁液中のｐＨは、０．２〜１ＭのＮａ−酢酸、ｐＨ４．５を添加することによって４〜５に調整される。次いで、透析濾過は、当業者に周知の方法で、Ｎａ−酢酸、ｐＨ４．０〜５．５の１〜１０緩衝液体積に対して実施される。濾過は、２０〜４５０ｋＤａの範囲の公称重量カットオフ値を有するいくつかの異なるフィルタタイプの適用で実施され得るが、１００〜３００ｋＤａの範囲のカットオフ値を有するフィルタを使用することが典型的である。アリールスルファターゼＡ含有溶液のさらなる処理のために、ｐＨは、トリス塩基をおよそ２０〜５０ｍＭの最終濃度まで添加することによって、７〜８の範囲内の値に調整される。
【０２９９】
上記のような酸性接線流濾過の代替として、混入物からのＡＳＡの分離は、本質的に同じ条件および緩衝液の組成を使用して酸性ゲル濾過を用いて得られ得る。濾過は、ゲル濾過カラムを通して低ｐＨで実施され、これは、低ｐＨの溶液、例えば、ｐＨ４〜５の０．２〜０．９ＭのＮａ−酢酸溶液で平衡化されている。オプションとして、アリールスルファターゼＡの溶液は、ゲル濾過の前に、２０〜５０ｋＤａのフィルタを通した接線流濾過によって濃縮され得る。濃度の程度は、アリールスルファターゼＡが約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約５０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約５ｍｇ／ｍＬに濃縮され得るように大幅に異なり得る。
【０３００】
いくつかの実施形態では、試料プールは、Ｂｉｏｍａｘ  Ａ−スクリーン、３０ｋＤａに対して濃縮される。透析濾過は、２０ｍＭのＮａ−酢酸、ｐＨ５．４〜５．７の３〜５カラム洗浄に対して実施される。
【０３０１】
実施形態において、ポリソルベート−２０（Ｐ２０）などの界面活性剤が、低温保存の前に精製されたＡＳＡタンパク質を含む組成物に添加される。実施形態において、組成物は、約０．０００１％（ｖ／ｖ）〜約０．０１％（ｖ／ｖ）、約０．００１％（ｖ／ｖ）〜約０．０１％（ｖ／ｖ）、約０．００１％（ｖ／ｖ）、約０．００２％（ｖ／ｖ）、約０．００３％（ｖ／ｖ）、約０．００４％（ｖ／ｖ）、約０．００５％（ｖ／ｖ）、約０．００６％（ｖ／ｖ）、約０．００７％（ｖ／ｖ）、約０．００８％（ｖ／ｖ）、約０．００９％（ｖ／ｖ）、または約０．０１％（ｖ／ｖ）の濃度でＰ２０などの界面活性剤を含む。
【０３０２】
精製されたＡＳＡタンパク質の特性化
精製された組換えＡＳＡタンパク質は、様々な方法を使用して特徴付けられ得る。
【０３０３】
純度
精製された組換えＡＳＡタンパク質の純度は典型的には、最終生成物中に存在する様々な不純物（例えば、宿主細胞タンパク質または宿主細胞ＤＮＡ）のレベルによって測定される。
【０３０４】
例えば、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）のレベルは、ＥＬＩＳＡまたはＳＤＳ−ＰＡＧＥによって測定され得る。いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、１５０ｎｇ  ＨＣＰ／ｍｇ未満のＡＳＡタンパク質（例えば、１４０、１３０、１２０、１１０、１００、９０、８０、７０、６０、５０、４０、３０、３０、２０、１０ｎｇ  ＨＣＰ／ｍｇ未満のＡＳＡタンパク質）を含有する。実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、約１００、約８０、または約６０ｎｇ  ＨＣＰ／ｍｇのＡＳＡを含有する。
【０３０５】
いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、約１５０ｐｇ／ｍｇ、１４０ｐｇ／ｍｇ、１３０ｐｇ／ｍｇ、１２０ｐｇ／ｍｇ、１１０ｐｇ／ｍｇ、１００ｐｇ／ｍｇ、９０ｐｇ／ｍｇ、８０ｐｇ／ｍｇ、７０ｐｇ／ｍｇ、６０ｐｇ／ｍｇ、５０ｐｇ／ｍｇ、４０ｐｇ／ｍｇ、３０ｐｇ／ｍｇ、２０ｐｇ／ｍｇ、または１０ｐｇ／ｍｇ未満の宿主細胞ＤＮＡ（ＨＣＤ）を含有する。実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、約５０、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、約２、または約１ｐｇ  ＨＣＤ／ｍｇ未満のＡＳＡタンパク質を含有する。
【０３０６】
いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、クマシーブリリアントブルー染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されたとき、０．０５％、０．０１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のアッセイ対照よりも大きい強度を有する新たな帯域を有しない。
【０３０７】
いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、ＨＣＰに対するウェスタンブロッティングを用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されたとき、１５ｋＤａ  ＨＣＰ帯域アッセイ対照よりも大きい強度を有する帯域、および０．０５％、０．０１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、０．５％、または１．０％のアッセイ対照よりも大きい強度を有する新たな帯域を有しない。実施形態において、３つ以上のＨＣＰ帯域は検出されない。
【０３０８】
いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、銀染色を用いたＳＤＳ−ＰＡＧＥに供されたとき、０．０５％、０．０１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．４５％、または０．５％のアッセイ対照よりも大きい強度を有する新たな帯域を有しない。
【０３０９】
いくつかの実施形態では、宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）対数減少値（ＬＲＶ）は、約０．３〜約０．６、例えば、約０．４から０．５である。様々なアッセイ対照、特に、ＦＤＡなどの規制当局に受け入れられるものが使用され得る。
【０３１０】
精製された組換えＡＳＡタンパク質の純度はまた、サイズ排除クロマトグラフィー−高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ−ＨＰＬＣ）、キャピラリー電気泳動−ＳＤＳ  ＰＡＧＥ（ＣＥ−ＳＤＳ  ＰＡＧＥ）、および／または逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）のうちの１つ以上によって決定されてもよい（例えば、オクタデシル（Ｃ１８）結合シリカのカラムを使用して、かつ対イオンとしてＴＦＡを用いて酸性ｐＨで実施される）。本発明のいくつかの実施形態では、クロマトグラムの主要ピークは、ＡＳＡである。分解能を増加させるために変更または最適化され得るパラメータには、勾配条件、有機修飾剤、対イオン、温度、カラム孔径および粒径、溶媒組成、ならびに流速が含まれる。純度レベルは、当業者に既知のように、主ピークの割合によって識別され得る。例えば、純度は、観察された主ピークおよび副ピークを積分し、全面積の主ピークの割合を計算することによって決定され得る。
【０３１１】
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって精製されたＡＳＡの純度は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣの主ピークの割合によって決定されるように、９５％以上（例えば、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上）である。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって精製されたＡＳＡの純度は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣの主ピークの割合によって決定されるように、９７％以上（例えば、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上）である。
【０３１２】
本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって精製されたＡＳＡの純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣの主ピークの割合によって決定されるように、９７％以上（すなわち、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上）である。本発明のいくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法によって精製されたＡＳＡの純度は、ＲＰ−ＨＰＬＣの主ピークの割合によって決定されるように、９８％以上（すなわち、約９８％、約９９％、またはそれ以上）である。
【０３１３】
比活性
精製された組換えＡＳＡタンパク質はまた、機能的および／または生物学的活性を評価することによって特徴付けられ得る。組換えＡＳＡ組成物の酵素活性は、当該技術分野において既知の方法を使用して決定されてもよい。典型的には、方法は、硫酸放出アッセイとして既知である、合成基質からの硫酸の除去を検出することを伴う。酵素活性アッセイの一例は、イオンクロマトグラフィーの使用を伴う。この方法は、基質から組換えＡＳＡによって酵素的に放出される硫酸イオンの量を定量化する。基質は、天然基質または合成基質であってもよい。場合によっては、基質は、硫酸ヘパリン、硫酸デルマタン、またはそれらの機能的等価物である。典型的には、放出された硫酸イオンは、導電率検出器を用いたイオンクロマトグラフィーによって分析される。この例では、結果は、Ｕ／ｍｇのタンパク質として表されてもよく、１単位は、基質から１時間当たり１μｍｏｌｅの硫酸イオンを放出するのに必要な酵素の量として定義される。いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡは、少なくとも約５０Ｕ／ｍｇ、６０Ｕ／ｍｇ、７０Ｕ／ｍｇ、８０Ｕ／ｍｇ、９０Ｕ／ｍｇ、１００Ｕ／ｍｇ、１１０Ｕ／ｍｇ、１２０Ｕ／ｍｇ、１３０Ｕ／ｍｇ、１４０Ｕ／ｍｇの比活性を有する。いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡは、約５０〜２００Ｕ／ｍｇ（例えば、約５０〜１９０Ｕ／ｍｇ、５０〜１８０Ｕ／ｍｇ、５０〜１７０Ｕ／ｍｇ、５０〜１６０Ｕ／ｍｇ、５０〜１５０Ｕ／ｍｇ、５０〜１４０Ｕ／ｍｇ、５０〜１３０Ｕ／ｍｇ、５０〜１２０Ｕ／ｍｇ、５０〜１１０Ｕ／ｍｇ、５０〜１００Ｕ／ｍｇ、６０〜２００Ｕ／ｍｇ、６０〜１９０Ｕ／ｍｇ、６０〜１８０Ｕ／ｍｇ、６０〜１７０Ｕ／ｍｇ、６０〜１６０Ｕ／ｍｇ、６０〜１５０Ｕ／ｍｇ、６０〜１４０Ｕ／ｍｇ、６０〜１３０Ｕ／ｍｇ、６０〜１２０Ｕ／ｍｇ、６０〜１１０Ｕ／ｍｇ、６０〜１００Ｕ／ｍｇ、７０〜２００Ｕ／ｍｇ、７０〜１９０Ｕ／ｍｇ、７０〜１８０Ｕ／ｍｇ、７０〜１７０Ｕ／ｍｇ、７０〜１６０Ｕ／ｍｇ、７０〜１５０Ｕ／ｍｇ、７０〜１４０Ｕ／ｍｇ、７０〜１３０Ｕ／ｍｇ、７０〜１２０Ｕ／ｍｇ、７０〜１１０Ｕ／ｍｇ、７０〜１００Ｕ／ｍｇ、８０〜２００Ｕ／ｍｇ、８０〜１９０Ｕ／ｍｇ、８０〜１８０Ｕ／ｍｇ、８０〜１７０Ｕ／ｍｇ、８０〜１６０Ｕ／ｍｇ、８０〜１５０Ｕ／ｍｇ、８０〜１４０Ｕ／ｍｇ、８０〜１３０Ｕ／ｍｇ、８０〜１２０Ｕ／ｍｇ、８０〜１１０Ｕ／ｍｇ、８０〜１００Ｕ／ｍｇ、９０〜２００Ｕ／ｍｇ、９０〜１９０Ｕ／ｍｇ、９０〜１８０Ｕ／ｍｇ、９０〜１７０Ｕ／ｍｇ、９０〜１６０Ｕ／ｍｇ、９０〜１５０Ｕ／ｍｇ、９０〜１４０Ｕ／ｍｇ、９０〜１３０Ｕ／ｍｇ、９０〜１２０Ｕ／ｍｇ、９０〜１１０Ｕ／ｍｇ、９０〜１００Ｕ／ｍｇ、１００〜２００Ｕ／ｍｇ、１００〜１９０Ｕ／ｍｇ、１００〜１８０Ｕ／ｍｇ、１００〜１７０Ｕ／ｍｇ、１００〜１６０Ｕ／ｍｇ、１００〜１５０Ｕ／ｍｇ、１００〜１４０Ｕ／ｍｇ、１００〜１３０Ｕ／ｍｇ、１００〜１２０Ｕ／ｍｇ、１００〜１１０Ｕ／ｍｇ、１１０〜２００Ｕ／ｍｇ、１１０〜１９０Ｕ／ｍｇ、１１０〜１８０Ｕ／ｍｇ、１１０〜１７０Ｕ／ｍｇ、１１０〜１６０Ｕ／ｍｇ、１１０〜１５０Ｕ／ｍｇ���１１０〜１４０Ｕ／ｍｇ、１１０〜１３０Ｕ／ｍｇ、１１０〜１２０Ｕ／ｍｇ、１２０〜２００Ｕ／ｍｇ、１２０〜１９０Ｕ／ｍｇ、１２０〜１８０Ｕ／ｍｇ、１２０〜１７０Ｕ／ｍｇ、１２０〜１６０Ｕ／ｍｇ、１２０〜１５０Ｕ／ｍｇ、１２０〜１４０Ｕ／ｍｇ、１２０〜１３０Ｕ／ｍｇ、１３０〜２００Ｕ／ｍｇ、１３０〜１９０Ｕ／ｍｇ、１３０〜１８０Ｕ／ｍｇ、１３０〜１７０Ｕ／ｍｇ、１３０〜１６０Ｕ／ｍｇ、１３０〜１５０Ｕ／ｍｇ、または１３０〜１４０Ｕ／ｍｇ）の範囲の比活性を有する。実施形態において、精製された組換えＡＳＡの比活性は、約５０〜約１３０Ｕ／ｍｇ、約７０〜約１００Ｕ／ｍｇ、約８０〜約９０Ｕ／ｍｇ、または約７５〜約９５Ｕ／ｍｇである。
【０３１４】
別の実施例では、組換えＡＳＡ組成物の酵素活性は、４−メチルウンベリフェリル−硫酸（４−ＭＵＦ−硫酸）基質からの硫酸の除去を測定して、蛍光メチルウンベリフェロンを形成することによって決定され得る。この例では、４−ＭＵＦの標準を使用して酵素活性（ｍＵ／ｍＬで）を計算するために、試験試料によって発せられた蛍光シグナルが使用され得る。活性の１ミリ単位は、３７℃において１分で４−ＭＵＦ−硫酸を４−ＭＵＦに変換するために必要な酵素の量として定義される。次いで、酵素活性をタンパク質濃度で割ることによって比活性が計算され得る。
【０３１５】
いくつかの実施形態では、活性は、５１５ｎｍの光を吸収する最終生成物であるパラ−ニトロカテコール（ｐＮＣ）を有する、合成の発色性基質であるパラ−ニトロカテコール硫酸（ｐＮＣＳ）の加水分解によって決定される。以下の方程式を使用して、μｍｏｌのｐＮＣＳ加水分解／分×ｍＬ（＝単位／ｍＬ）の酵素活性を計算することができる：
Ｖｔｏｔ（ｍＬ）×ΔＡ＝単位／ｍＬ（１）
εＭ／１０００×Ｖｓａｍｐｌｅ（ｍＬ）×インキュベーション時間（分）、式中、
ΔＡ＝試料の吸光度−ブランクの吸光度
Ｖｔｏｔ（ｍＬ）＝ｍＬでの合計反応体積（この場合は０．１５ｍＬ）
Ｖｓａｍｐｌｅ（ｍＬ）＝ｍＬでの添加された試料体積（この場合は０．０５ｍＬ）
εＭ＝生成物ｐＮＣのモル吸光係数であり、この場合は１２  ４００Ｍ−１  ｃｍ−１である。
【０３１６】
方程式１は以下のように簡略化され得る：
ΔＡ×（０．１５／（１２  ４００／１０００×０．０５×３０））＝Ｘμｍｏｌ／（分×ｍＬ）（＝単位／ｍＬ）（１）
【０３１７】
μｍｏｌの消費されたｐＮＣ／（分×ｍｇ）（＝単位／ｍｇ）で比活性を計算するためには、方程式１は、試料のタンパク質濃度で割られる：
方程式１／タンパク質濃度（ｍｇ／ｍＬ）＝Ｙμモル／（分×ｍｇ）＝単位／ｍｇ（２）
【０３１８】
いずれの例でも、組換えＡＳＡ組成物のタンパク質濃度は、タンパク質濃度を決定するために当該技術分野において既知の任意の好適な方法によって決定されてもよい。場合によっては、タンパク質濃度は、紫外線光吸光度アッセイによって決定される。そのような吸光度アッセイは典型的には、約２８０ｎｍの波長（Ａ２８０）で行われる。
【０３１９】
いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡは、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ〜１００．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ〜５０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ〜４０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ〜３０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ〜２０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ〜１０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４．０×１０３ｍＵ／ｍｇ〜８．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４．０×１０３ｍＵ／ｍｇ〜１０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４．５×１０３ｍＵ／ｍｇ〜１０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ〜１０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約５．５×１０３ｍＵ／ｍｇ〜１５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、または約４．０×１０３ｍＵ／ｍｇ〜２０．０×１０３ｍＵ／ｍｇの範囲の４−メチルウンベリフェロン基質上での比活性を有する。いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡは、約１．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約２．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約３．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約１５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約２０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約２５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約３０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約３５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約４５．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、約５０．０×１０３ｍＵ／ｍｇ、またはそれ以上の４−メチルウンベリフェロン基質上での比活性を有する。
【０３２０】
電荷プロファイル
精製された組換えＡＳＡは、タンパク質に関連付けられた電荷プロファイルによって特徴付けられ得る。典型的には、タンパク質電荷プロファイルは、典型的にはタンパク質の表面上に存在する残基側鎖電荷のパターンを反映する。電荷プロファイルは、タンパク質上でイオン交換（ＩＥＸ）クロマトグラフィー（例えば、ＨＰＬＣ）アッセイを実施することによって決定され得る。いくつかの実施形態では、「電荷プロファイル」は、交換イオンを含む移動相のカラムに添加した後のある時点での、イオン交換カラムから溶出するタンパク質の量を表す値のセットを指す。
【０３２１】
典型的には、好適なイオン交換カラムは、陰イオン交換カラムである。例えば、電荷プロファイルは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）システムを使用する強陰イオン交換（ＳＡＸ）クロマトグラフィーによって決定され得る。一般に、組換えＡＳＡは、強陰イオン交換カラムの固定された正の電荷に吸着し、所定の流速の移動相を使用してイオン強度を増加させる勾配は、カラムから組換えＡＳＡ種を、正に帯電したカラムとのそれらのイオン相互作用の強度に比例して溶出する。より負に帯電した（より酸性の）ＡＳＡ種は、あまり負に帯電していない（より少ない酸の）ＡＳＡ種よりも遅く溶出する。溶出物中のタンパク質の濃度は、紫外線光吸光度（２８０ｎｍで）によって検出される。
【０３２２】
いくつかの実施形態では、組換えＡＳＡは、２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣｌ中約ｐＨ８．０で、Ｍｉｎｉ  Ｑ  ＰＥカラムの固定された正の電荷に吸着し、０．８ｍＬ／分の流速の２０ｍＭ  ＴＲＩＳ−ＨＣＬ、１Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ８．０からなる移動相を使用してイオン強度を増加させる勾配は、カラムから組換えＡＳＡ種を、正に帯電したカラムとのそれらのイオン相互作用の強度に比例して溶出する。
【０３２３】
いくつかの実施形態では、電荷プロファイルは、吸光度単位対ＨＰＬＣカラムからの溶出後の時間のクロマトグラムによって示され得る。クロマトグラムは、１つ以上のピークのセットを含んでもよく、セットの各のピークは、同様の表面電荷を有する組成物の組換え型ＡＳＡの部分集団を同定する。
【０３２４】
グリカンマッピング
いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、典型的にはグリカンマッピングと称されるそのプロテオグリカン組成によって特徴付けられ得る。いかなる理論に束縛されることも望まないが、枝分かれ構造の形状および複雑性を伴うグリカン結合は、インビボクリアランス、リソソーム標的化、生物学的利用度、および／または有効性に影響を及ぼし得ると考えられる。
【０３２５】
グリカンマップは、通例、酵素消化法およびそれに続くクロマトグラフィー分析によって測定され得る。種々の酵素を酵素消化法に用いることができ、酵素には、好適であるグリコシラーゼ、ペプチダーゼ（例えば、エンドペプチダーゼ、エキソペプチダーゼ）、プロテアーゼ、およびホスファターゼが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、好適な酵素はアルカリホスファターゼである。一部の実施形態では、好適な酵素はノイラミニダーゼである。グリカン（例えば、ホスホグリカン）は、クロマトグラフィー分析によって検出され得る。例えば、ホスホグリカンは、パルスアンペロメトリック検出を備えた高速陰イオン交換クロマトグラフィー（ＨＰＡＥ−ＰＡＤ）か、またはサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって検出され得る。グリカンマップ上の各ピークによって表されるグリカン（例えば、ホスホグリカン）の量は、当該技術分野において既知の方法および本明細書に開示される方法に従って、グリカン（例えば、ホスホグリカン）の標準曲線を使用して計算され得る。
【０３２６】
実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、中性組換えＡＳＡタンパク質（群Ａ）、シアリル化組換えＡＳＡタンパク質（群Ｂ）、マンノース−６リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（群Ｃ）、Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（群Ｅ）、もしくはハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（群Ｅ）、またはそれらの任意の組み合わせを含む種として存在する。実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、中性組換えＡＳＡタンパク質（群Ａ）、シアリル化組換えＡＳＡタンパク質（群Ｂ）、マンノース−６リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（群Ｃ）、Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（群Ｅ）、およびハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質（群Ｅ）として存在する。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、本発明による精製された組換えＡＳＡタンパク質は、中性（ピーク群１）、モノ−シアリル化（ピーク群２）、キャッピングされたマンノース−６−リン酸化（ピーク群３）、ジ−シアリル化（ピーク群４）、モノ−マンノース−６−リン酸化（ピーク群５）、ハイブリッド（ピーク群６）、およびジ−マンノース−６−リン酸化（ピーク群７）ＡＳＡタンパク質をそれぞれ示す、少なくとも７つのピーク群を含む、グリカンマップによって特徴付けられる。
【０３２８】
群（例えば、群Ａ〜Ｅまたはピーク群１〜７のいずれか）に対応するグリカンの相対量は、既定の参照標準における対応するピーク群の面積に対するピーク群の面積に基づいて決定され得る。
【０３２９】
実施形態において、群Ａ（中性組換えＡＳＡタンパク質）は、参照標準における対応するピーク群の面積に対して約１５〜約２５％（例えば、約１６％〜約２２％または約２０％〜約２５％）の範囲のピーク群の面積を有し得る。実施形態において、中性組換えＡＳＡタンパク質のピーク群の面積は、例示的な範囲の各終点に対していずれかの方向に約１％〜約１０％の変動（例えば、例示的な範囲の各終点に対して約１％〜約５％の変動）を有する、実施例３の例示的な製剤のいずれかの範囲特性である。
【０３３０】
実施形態において、群Ｂ（シアリル化組換えＡＳＡタンパク質）は、参照標準における任意の対応するピーク群の面積に対して約３５〜約４５％（例えば、約３５％〜約４２％または約３７％〜約４２％）の範囲のシアリル化組換えＡＳＡタンパク質種のピーク群の総面積を有し得る。実施形態において、シアリル化組換えＡＳＡタンパク質のピーク群の総面積は、例示的な範囲の各終点に対していずれかの方向に約１％〜約１０％の変動（例えば、例示的な範囲の各終点に対して約１％〜約５％の変動）を有する、実施例３の例示的な製剤のいずれかの範囲特性である。
【０３３１】
実施形態において、群Ｃ（マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質）は、参照標準における任意の対応するピーク群の面積に対して約２０〜約３０％（例えば、約２０％〜約２６％、約２５％〜約２８％、または約２７％〜約３２％）の範囲のマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質種のピーク群の総面積を有し得る。実施形態において、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質のピーク群の総面積は、例示的な範囲の各終点に対していずれかの方向に約１％〜約１０％の変動（例えば、例示的な範囲の各終点に対して約１％〜約５％の変動）を有する、実施例３の例示的な製剤のいずれかの範囲特性である。
【０３３２】
実施形態において、群Ｄ（Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質）は、参照標準における任意の対応するピーク群の面積に対して約１〜約１０％（例えば、約３％〜約５％、約４％〜約６％、または約４．５％〜約５．５％）の範囲のＮ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質種のピーク群の総面積を有し得る。実施形態において、Ｎ−アセチル−グルコサミンマンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質のピーク群の総面積は、例示的な範囲の各終点に対していずれかの方向に約１％〜約１０％の変動（例えば、例示的な範囲の各終点に対して約１％〜約５％の変動）を有する、実施例３の例示的な製剤のいずれかの範囲特性である。
【０３３３】
実施形態において、群Ｅ（ハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質）は、参照標準における任意の対応するピーク群の面積に対して約５〜約１５％（例えば、約７％〜約１０％、約７％〜約９％、または約７．５％〜約８．５％）の範囲のハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質のピーク群の面積を有し得る。実施形態において、ハイブリッド組換えＡＳＡタンパク質のピーク群の総面積は、例示的な範囲の各終点に対していずれかの方向に約１％〜約１０％の変動（例えば、例示的な範囲の各終点に対して約１％〜約５％の変動）を有する、実施例３の例示的な製剤のいずれかの範囲特性である。
【０３３４】
グリカンマッピング用の種々の参照標準が当該技術分野で知られており、本発明の実施に用いることができる。
【０３３５】
精製された組換えＡＳＡタンパク質（例えば、マンノース−６−リン酸化組換えＡＳＡタンパク質（Ｍ６Ｐ  ＡＳＡタンパク質）の閾値集団を有する精製された組換えＡＳＡタンパク質を含む組成物）のグリコシル化パターンは、タンパク質の生物学的利用性、標的化、または有効性に影響を与える場合があることが企図されている。
【０３３６】
ペプチドマッピング
いくつかの実施形態では、アミノ酸組成、翻訳後修飾、および／または細胞処理、例えば、シグナルペプチドの切断および／またはグリコシル化を特徴付けるために、ペプチドマッピングが使用され得る。典型的には、組換えタンパク質は、制御された切断またはランダムな切断のいずれかを通して別々のペプチドフラグメントに分解されて、パターンまたはペプチドマップを生成し得る。場合によっては、精製されたＡＳＡタンパク質は、解析的分析の前に、最初に酵素消化に供され得る。消化は、解析的分析の前に、ペプチダーゼ、グリコシドヒドロラーゼ、ホスファターゼ、リパーゼ、もしくはプロテアーゼ、および／またはそれらの組み合わせを使用して実施され得る。ペプチドの構造組成は、当該技術分野において周知の方法を使用して決定され得る。例示的な方法としては、質量分析法、核磁気共鳴（ＮＭＲ）、またはＨＰＬＣが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３３７】
金属分析
いくつかの実施形態では、精製された組換えＡＳＡタンパク質は、金属分析によって特徴付けられ得る。精製された原薬中の微量金属を分析する様々な方法が当該技術分野において既知であり、本発明を実施するために使用され得る。
【０３３８】
いくつかの実施形態では、残留リンが測定され、参照試料と比較される。いかなる理論に束縛されることも望まないが、残留リンが原薬のｐＨの維持に寄与すると仮定される。本発明のいくつかの実施形態では、残留リンは、約１０〜５０ｐｐｍ（すなわち、約１０〜４５ｐｐｍ、約１０〜４０ｐｐｍ、約１０〜３０ｐｐｍ、約２０〜５０ｐｐｍ、約２０〜４５ｐｐｍ、約２０〜４０ｐｐｍ、約２０〜３０ｐｐｍ、約３０〜５０ｐｐｍ、約３０〜４０ｐｐｍ）である。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って精製された組換えＡＳＡのｐＨ範囲は、約５〜７（すなわち、約５．５〜７．０、約５．５〜６．５、約５．５〜６．０、約６．０〜７．０、約６．０〜６．５、約６．０〜６．４、約６．０〜６．３、約６．０〜６．２、約６．０〜６．１、約６．１〜６．２）である。
【０３３９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法に従って精製された組換えＡＳＡは、カルシウムを含有する。いかなる理論に束縛されることも望まないが、ＡＳＡの活性部位に存在するカルシウムイオンが酵素活性に必要であり得ると仮定される。本発明のいくつかの実施形態では、カルシウムは、約１〜２０ｐｐｍ（すなわち、約１〜１５ｐｐｍ、約１〜１０ｐｐｍ、約５〜１５ｐｐｍ、約５〜１０ｐｐｍ、約１０〜２０ｐｐｍ、約１０〜１５ｐｐｍ、約１０〜１４ｐｐｍ、約１０〜１３ｐｐｍ、約１０〜１２ｐｐｍ）のレベルで存在する。
【実施例】
【０３４０】
実施例１．例示的なプロセス
精製された組換えＡＳＡタンパク質を、本明細書に記載される例示的なプロセスに従って調製した。表３は、精製された組換えＡＳＡタンパク質の調製のための例示的なプロセスの特定の具体的な特徴を明示する。実施形態において、組換えＡＳＡタンパク質を精製するためのプロセスは、表３に記載の特徴のうちの１つ以上を含む。
【表３】
2021508322.tif 000005
【０３４１】
実施例２．例示的な製剤
精製されたＡＳＡタンパク質を含む組成物を、本明細書に記載されるように調製した。表４は、本明細書に記載される例示的なプロセスに従って調製したときの、精製されたＡＳＡタンパク質を含む組成物の特有の特徴を提供する。実施形態において、精製された組換えＡＳＡタンパク質を含む組成物は、表４に記載の特徴のうちの１つ以上によって特徴付けられる。数値範囲が提供される実施形態では、例示的な範囲の各境界は、約１％〜約２０％（例えば、約１％〜約１５％、約１％〜約１０％、約１％〜約７．５％、約１％〜約５％、または約１％〜約２．５％）異なり得る。
【表４】
2021508322.tif 000006
【０３４２】
実施例３：比較性研究
非臨床比較性プログラムにおけるプロセスＡ  ｒｈＡＳＡと比較した、プロセスＢ  ｒｈＡＳＡの活性、安全性、および薬物動態の評価としての非臨床比較性プログラム（表５）。全ての用量をくも膜下腔内投与した。薬力学比較性を、リソソーム関連膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ−１）の免疫組織化学的染色を使用して、免疫寛容ＭＬＤマウスにおいて評価した。薬物動態比較性を、６．０ｍｇ（１００ｍｇ／ｋｇの脳重量と同等）のプロセスＡまたはプロセスＢ  ｒｈＡＳＡが１回投与された幼若カニクイザルにおいて評価した。生体分布を、ラットにおける定量的全身オートラジオグラフィーによって比較した。プロセスＢ  ｒｈＡＳＡの潜在的毒性を、幼若カニクイザルにおける１８．６ｍｇの用量でのｒｈＡＳＡの反復投与によって評価した。
【表５】
2021508322.tif 000007
【０３４３】
薬力学比較性
免疫寛容ＭＬＤマウスは、注射されたｒｈＡＳＡに対して免疫学的に耐性にする、ヒトＡＳＡの非活性変異体をコードする安定的に組み込まれた導入遺伝子コードを有するＡＳＡノックアウト（ＡＳＡ−／−）である。動物を、６つの群：未処置（ｎ＝６）；ビヒクル（１５４ｍＭ  ＮａＣｌ、０．００５％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０、ｎ＝４）；０．０４ｍｇ（ｎ＝９）および０．２１ｍｇ（ｎ＝１０）のプロセスＡ  ｒｈＡＳＡ；０．０４ｍｇ（ｎ＝１０）および０．２１ｍｇ（ｎ＝１０）のプロセスＢ  ｒｈＡＳＡのうちの１つに割り当てた。１、８、１５、および２１または２２日目に、動物にくも膜下腔内投与した。７匹の未処置のＣ５７／Ｂ１６マウスの群は、野生型対照としての役割を果たした。ｒｈＡＳＡの最終投与の２４時間後に動物を屠殺した。
【０３４４】
組織学的分析は、リソソーム関連膜タンパク質−１（ＬＡＭＰ−１）の免疫組織化学的染色、リソソーム蓄積症の検出のため、および疾患状態の指標として使用されるリソソームタンパク質マーカーを伴った。マウス脳および脊髄のＬＡＭＰ−１免疫染色を、ウサギポリクローナル抗ＬＡＭＰ−１抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ２４１７０、ロット番号ＥＲ１２７４０２−２、１：４００、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）およびＢｏｎｄ（商標）Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｒｅｆｉｎｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｌｅｉｃａ、カタログ番号ＤＳ９８００、Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して、５μｍパラフィン切片で実施した。ＬＡＭＰ−１シグナルを、３，３−ジアミノベンジジンで染色し、続いてヘマトキシリンで対比染色することによって得た。一次抗体を、陰性対照のためにアイソタイプＩｇＧによって置き換えた。ＬＡＭＰ−１染色されたスライドのデジタル画像を作成し、ＩｍａｇｅＳｃｏｐｅソフトウェアを用いたＡｐｅｒｉｏスキャナー（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ  Ｉｎｃ．，Ｂｕｆｆａｌｏ  Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ，ＵＳＡ）を使用して分析した。相対的染色陽性を、次の方程式：陽性（％）＝（ＬＡＭＰ−１陽性ピクセル数／合計ピクセル数）×１００を使用して得た。マン−ホイットニー検定を使用して各組織に対して、ビヒクルおよび未処置の動物の統計比較を実施した。この評価に基づいて（全ての組織に対して群間でｐ＞０．０１）、データを単一の群（以下、対照と称される）に組み合わせた。データを対照群に正規化し、テューキーの多重比較検定を用いた一元配置分散分析を使用して、統計比較を実施した。ｐ＜０．０１の比較は、統計的に有意と見なされた。
【０３４５】
プロセスＡおよびプロセスＢ  ｒｈＡＳＡの比活性は、それぞれ８９Ｕ／ｍｇおよび１０６Ｕ／ｍｇであり、両方とも十分にアッセイの目標範囲内であった。２つの材料の比較は、最大の変化がＭ６Ｐおよびシアル酸含有量であり、比活性が類似していたことを示した。
【０３４６】
図１Ａ〜１Ｆに示されるように、免疫寛容ＭＬＤマウスにおけるＬＡＭＰ−１染色を、脊髄、小脳白質、および海馬采、ならびに大脳脚、大脳皮質、および線条体に対してマウスにおいて実施した。前の研究からプロセスＡ材料を用いた処置によって影響を受けることが示された領域を評価に選択した。プロセスＡ  ｒｈＡＳＡ対プロセスＢ  ｒｈＡＳＡが投与された動物間で、脊髄、小脳白質、および海馬采におけるＬＡＭＰ−１染色の統計的に有意な差は観察されなかった。同様に、プロセスＡ  ｒｈＡＳＡとプロセスＢ  ｒｈＡＳＡとの間で、大脳脚において染色の統計的差異は観察されなかったが、大脳皮質および線条体においては差異が観察された。試験した２回の投与のうちの１つのみに対して統計的有意性が達成されたため、これらの差異は散在的であり、生物学的に関連性はないと見なされた。
【０３４７】
対照動物と比較すると、脊髄（０．２１ｍｇ投与群、ｐ＜０．０００１、図１Ａ）、小脳白質（０．０４ｍｇおよび０．２１ｍｇ投与群、ｐ＜０．０１、図１Ｂ）、大脳脚（０．０４ｍｇおよび０．２１ｍｇ投与群、図１Ｄ）、ならびに海馬采（０．０４ｍｇ投与群、ｐ＜０．０１、図１Ｃ）において、プロセスＡ  ｒｈＡＳＡおよびプロセスＢ  ｒｈＡＳＡの両方でのＬＡＭＰ−１染色の統計的に有意な減少があった。ＬＡＭＰ−１染色の統計的に有意な減少はまた、大脳皮質（０．０４ｍｇおよび０．２１ｍｇ投与群、ｐ≦０．０００１、図１Ｅ）ならびに線条体（０．０４ｍｇ投与群、ｐ＝０．０００５、図１Ｆ）においても、プロセスＢ  ｒｈＡＳＡで生じた。
【０３４８】
薬物動態比較性
第１段階では、動物を、プロセスＡ  ｒｈＡＳＡ  ６．０ｍｇ（ｎ＝６［雄３匹、雌３匹］）群またはプロセスＢ  ｒｈＡＳＡ  ６．０ｍｇ（ｎ＝６［雄３匹、雌３匹］）群のいずれかの体重に基づいて無作為化した。皮下アトロピン硫酸塩（０．０１ｍｇ／ｋｇ）を用いた前処理の後に髄腔内腰椎カテーテルを外科的に埋め込み、続いて、筋肉内ケタミン塩酸塩（８ｍｇ／ｋｇ）ならびにおよそ１Ｌ／分の酸素および２％イソフルラン下で麻酔を行った。ｒｈＡＳＡの用量を、１ｍＬの用量体積で、埋め込まれた髄腔内腰椎カテーテルを介して投与した。６．０ｍｇの用量は、カニクイザルにおける６０ｇの脳重量に正規化したときに、脳重量の１００ｍｇ／ｋｇと同等であった。この用量は、遅発性乳児型ＭＬＤを有する幼児における第１／２相臨床研究で投与したｒｈＡＳＡの最高用量に基づいた。その臨床研究では、投与した最高用量は１００ｍｇであり、（治験参加者の年齢群について決定した）１ｋｇの脳重量に正規化したときに、脳重量の１００ｍｇ／ｋｇと同等であった。
【０３４９】
少なくとも８日間の洗浄期間後に開始した第２相では、動物が第１相においてＡ  ｒｈＡＳＡを投与されていた場合、プロセスＢ  ｒｈＡＳＡを投与し、逆に動物が第１相においてプロセスＢ  ｒｈＡＳＡを投与されていた場合、プロセスＡ  ｒｈＡＳＡを投与した。動物を、ｒｈＡＳＡの最後の投与の最大２４時間後に人道的に安楽死させた。
【０３５０】
体重、食料消費、および臨床パラメータをモニタリングし、血液およびＣＳＦ試料を投与前、および予め指定された間隔で投与後に採取した。酵素結合免疫吸着アッセイを使用して、血清およびＣＳＦ中のｒｈＡＳＡの濃度を測定した。幼若カニクイザルサルの血清およびＣＳＦ中のｒｈＡＳＡレベルの定量化は、ＧＬＰ検証ＥＬＩＳＡアッセイ法を使用して達成された。マイクロタイタープレートをウサギ由来抗ｒｈＡＳＡポリクローナル抗体（ＳＨ０４０）でコーティングした。試料および標準を用いたインキュベーションの後、マイクロタイタープレートを洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート抗ＡＳＡマウスモノクローナル抗体（クローン１９−１６−３）を全てのウェルに添加した。サル血清に対する定量下限は３９．１ｎｇ／ｍＬであり、ＣＳＦに対しては１９．５ｎｇ／ｍＬであり、各方法に対する定量上限は１２５０ｎｇ／ｍＬであった。
【０３５１】
幼若カニクイザルにおける単回の６．０ｍｇのくも膜下腔内投与後の血清（図２Ａ）およびＣＳＦ（図２Ｂ）におけるｒｈＡＳＡの濃度−時間曲線は、プロセスＡおよびプロセスＢ  ｒｈＡＳＡを使用したときに同様であった。プロセスＡおよびプロセスＢ  ｒｈＡＳＡは、最大血漿濃度（Ｃｍａｘ）、曝露（時間０から最後の測定［ＡＵＣｌａｓｔ］までの濃度−時間曲線下面積）、およびクリアランスを含む、それらの薬物動態パラメータの観点から同様であった（表６）。
【表６】
2021508322.tif 000008
【０３５２】
生体分布比較性
研究は、［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡの単回のくも膜下腔内投与後の定量的全身オートラジオグラフィー（ＱＷＢＡ）およびガンマカウンティングを使用した。組織分布を評価するために、くも膜下腔内ポートを埋め込んだ２８匹のラットを無作為化し、これにより、各々は、プロセスＡ（１４匹の動物）またはプロセスＢ（１４匹の動物）のいずれかを使用して製造した［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡ  ０．６２ｍｇの用量を投与した。投与後の７つの時点（投与のおよそ１、４、１２、２４、４８、９６、および１６８時間後）の各々において、各投与群から２匹のラットを安楽死させ、ＱＷＢＡ用に処置し、選択した組織に対して放射線濃度（ｒａｄｉｏｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を決定した。安楽死前に、心臓穿刺を介してイソフルラン麻酔をかけた動物から血液試料を採取した。薬物動態パラメータを評価するために、全血、血漿、および組織のアリコートを、ガンマカウンティングを使用して総放射能について分析した。ｒｈＡＳＡ排泄パターンを評価するために、６匹の雄のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラットを、プロセスＡ（３匹の動物）またはプロセスＢ（３匹の動物）のいずれかを使用して製造した［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡ  ０．６２ｍｇを投与した群に割り当てた。ラットを、［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡの投与後１６８時間の間に、尿および便の別々の採取のために個々の代謝ケージに収容した。
【０３５３】
血漿試料のトリクロロ酢酸沈殿は、１２５Ｉのおよそ３３％がｒｈＡＳＡに結合していなかったことを示した。代表的な全身オートラジオルミノグラムは、単回のくも膜下腔内０．６２ｍｇ用量の投与の４時間後の、雄のＳｐｒａｇｕｅ  ＤａｗｌｅｙラットにおけるプロセスＡ（図３Ａ）およびプロセスＢ（図３Ｂ）［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡの分布を示した。プロセスＡおよびプロセスＢ  ｒｈＡＳＡのＣｍａｘおよびＡＵＣｌａｓｔ、ならびに異なる組織におけるプロセスＢ  ｒｈＡＳＡ対プロセスＡ  ｒｈＡＳＡの比率が、表６に示される。［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡの計算された細孔濃度（Ｃｍａｘ）は甲状腺で見られ、未結合のヨウ素の取り込みに起因する可能性が高い。これに下垂体、脊髄、および肝臓が続き、これらは全て同様のレベルを有した（表７）。［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡの最低濃度は、脂肪、精巣、筋肉、および眼で生じた（表７）。視覚的に検査したとき、脊髄における明らかな濃度は、隣接するＣＳＦおよび髄膜の濃度に対して非常に低く、脊髄内の計算値が過大評価された可能性があることを示唆する。高濃度の１２５Ｉおよび小さい定量化面積を有する領域に近接することは、脊髄値の過大評価の一因となった可能性がある。
【表７】
2021508322.tif 000009
【０３５４】
プロセスＢ  ｒｈＡＳＡのＣｍａｘ値は、脳、脊髄、および肺に対してプロセスＡ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡのものよりもおよそ１．５倍高く（最高比）、腎臓、副腎、胃、および膵臓に対してプロセスＡ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡのものよりもおよそ０．２〜０．６倍低かった（最低比、表５）。曝露の差（ＡＵＣｌａｓｔ）は、プロセスＢ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡ対プロセスＡ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡに対してそれぞれ２．２７および２．１９の比率を有した皮膚および副腎を除いて、全ての組織に対して２倍未満であった（表５）。血漿中の終末消失相半減期は、プロセスＡ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡで３７．２時間、プロセスＢ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡで４２．５時間であった。
【０３５５】
尿および便における排泄プロファイルを、図４に示されるように評価した。排泄パターンは、プロセスＡ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡおよびプロセスＢ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡの両方に対して同様であった。ほとんどのプロセスＡおよびプロセスＢ生成物は、尿（それぞれ７６％および７１％）中で排泄され、ｒｈＡＳＡが主に腎排出を介して全身的に除去されたことを示し、両方の生成物に対して便中で約６％が排泄された。死体において回収された投与用量の割合は、プロセスＡ生成物に対して６％であり、プロセスＢ生成物に対して８％であり、大部分は甲状腺、ＣＳＦ、および髄膜に位置した。プロセスＡ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡまたはプロセスＢ［１２５Ｉ］−ｒｈＡＳＡを投与した動物に対して、総回収率（全ての排泄物および死体の組み合わせ）は、それぞれ９０％〜８３％であった。
【０３５６】
毒性
くも膜下腔内ポートカテーテルをメルキシカム（０．２ｍｇ／ｋｇ）、続いてケタミン塩酸塩（５ｍｇ／ｋｇ）およびメデトミジン（０．０６ｍｇ／ｋｇ）で前処理した後に、外科的に埋め込んだ。ｒｈＡＳＡの用量を、くも膜下腔内ポートカテーテルシステムを使用して低速ボーラス送達によって投与した。動物に、０．６ｍＬの用量体積で、プロセスＢ  ｒｈＡＳＡ  １８．６ｍｇ（ｎ＝８［雄４匹、雌４匹］）またはビヒクル対照（ＮａＣｌ  １５４ｍＭ、０．００５％ポリソルベート２０、ｐＨ６．０；ｎ＝８［雄４匹、雌４匹］）のいずれかを２週間毎に１１週間にわたって投与した。１８．６ｍｇの実現可能な最大用量のｒｈＡＳＡがこの研究で使用され、幼若カニクイザルサルにおける最大耐容量（０．６ｍＬ）およびプロセスＢ  ｒｈＡＳＡ製剤の濃度（３１．０ｍｇ／ｍＬ）に基づいた。
【０３５７】
評価は、臨床検査（体重；食料消費；身体、心臓血管［心電図および血圧］、神経学的および眼科的評価）、ならびに病理学検査（血清化学；血液学；凝固；尿分析；ＣＳＦ細胞数およびＣＳＦ化学）を含んだ。プロセスＢ  ｒｈＡＳＡの抗原性を血清およびＣＳＦで評価した。身体検査および神経学的検査を、投与前段階中に２回（手術前および手術後５日以上）、および投与段階の１、５、および９週目の間に１回（投与のおよそ２４時間後）、ならびに剖検前に１回、非鎮静下の動物に実施した。心電図検査を、投与前段階中（手術後）、および投与段階の１１週目（投与に近い時間および投与の３時間後）に、無麻酔の一時的に拘束された動物に対して実施した。全ての動物を、最終投与の２４時間後に人道的に安楽死させた。組織の完全なセットを採取したが、プロセスＡを用いた元の研究で特定された標的組織のみ（すなわち、脊髄および後根神経節）を病理組織学的評価に供した。
【０３５８】
プロセスＢ  ｒｈＡＳＡのくも膜下腔内投与は、幼若カニクイザルサルの耐容性が良好であり、臨床検査、神経学的検査、または病理学的検査に対する薬物関連効果はなかった。
【０３５９】
１８．６ｍｇのプロセスＢ  ｒｈＡＳＡを幼若カニクイザルサルに２週間毎に１１週間、くも膜下腔内投与すること（合計で６回の投与）は、観察可能な有害作用レベルではなかった。プロセスＢ  ｒｈＡＳＡの投与は、次の領域：脳および脊髄の周囲の髄膜領域；脳および脊髄の血管周囲領域；脊髄の管周囲（中心管に隣接した）領域；ならびに脊髄神経根の周囲の神経周膜／神経上膜領域における好酸球による浸潤と関連付けられた。これらのプロセスＢ  ｒｈＡＳＡに関連した変化のいずれも、神経系の機能を改変することが合理的に予想される重症度を有さず、形態学のみに基づいて、これらのプロセスＢ  ｒｈＡＳＡに関連した変化のいずれも、有害作用と見なされなかった。脊髄における浸潤の存在は、くも膜下腔内空間に投与されたタンパク質を有する動物において予想されるものと一致した。
【０３６０】
プロセスＢ  ｒｈＡＳＡの平均濃度は、２日目に血清中で５４４ｎｇ／ｍＬおよびＣＳＦ中で２１８５ｎｇ／ｍＬであった。１１週目には、血清中で３７ｎｇ／ｍＬおよびＣＳＦ中で１７１ｎｇ／ｍＬであった（図２）。全てのｒｈＡＳＡ投与動物は、１０週目までに抗薬物抗体を発生させ、血清中でＣＳＦ中よりも高い抗薬物抗体レベルが観察された（それぞれ平均３９１，４６２ｎｇ／ｍＬ対７，３８３ｎｇ／ｍＬ）。抗薬物抗体は、免疫組織化学および組織ＥＬＩＳＡ（データ非表示）によって確認されたように、標的組織に対するｒｈＡＳＡ曝露に影響を及ぼさなかった。
【０３６１】
実施例４：  ＭＬＤ患者における組換えヒトアリールスルファターゼＡの薬物動態／薬力学プロファイル
ＭＬＤ患者におけるくも膜下腔内投与後、ｒｈＡＳＡの薬物動態／薬力学（ＰＫ／ＰＤ）プロファイルを調査した。脳脊髄液（ＣＳＦ）中のスルファチドレベルに対するｒｈＡＳＡの効果、およびｒｈＡＳＡを投与したＭＬＤ患者における粗大運動機能尺度−８８（ＧＭＦＭ−８８）の合計スコアの変化を使用して、その臨床効果を評価し、最適投与レジメンを決定した。
【０３６２】
全ての患者に、くも膜下腔内薬物送達装置（ＩＤＤＤ）を介して最大３３８週間にわたって１週間おきにｒｈＡＳＡを投与した。コホート１、２、および３の患者は、元の用量漸増研究における登録時に１２歳未満であり、それぞれ１０、３０、および１００ｍｇのｒｈＡＳＡを投与された。コホート４の患者は、登録時に８歳未満であり、改訂されたプロセスを使用して製造された１００ｍｇのｒｈＡＳＡを投与された。全ての患者に、留置ＩＤＤＤを介してＩＴ投与によって送達された、ｐＨ６．０の１５４ｍＭの化ナトリウムと０．００５％ポリソルベート２０とを含有する等張水溶液中で３０ｍｇ／ｍＬのｒｈＡＳＡで製剤化された薬物生成物を投与した。いくつかの有効性評価基準の結果は、ｒｈＡＳＡが疾患進行の遅延と関連している可能性があることを示す。
【０３６３】
用量漸増研究を完了した患者は、延長研究を通して、ＩＤＤＤを介して１週間おきにｒｈＡＳＡの投与を継続することができた。血清ｒｈＡＳＡ濃度を、最初のｒｈＡＳＡ投与後、および処置の３８週目に評価した。コホート４の患者には、改訂されたプロセスを使用して製造されたｒｈＡＳＡを投与した。血液試料を、ＩＴ注射の前１時間以内、ならびに０．５、１、２、４、８、１２、２４、および４８時間後に採取した。ＣＳＦ中のｒｈＡＳＡ濃度を、用量漸増研究中に２週間毎または４週間毎、ならびに延長研究において５２〜１０４週目を通して３ヶ月毎、および１０４〜３３８週目を通して年２回、評価した。ＧＭＦＭ−８８観察を、用量漸増研究において０、１６、２４、ならびに延長研究において５２〜１０４週目を通して３ヶ月毎、および１０４〜３３８週目を通して年２回、評価した。
【０３６４】
評価は、治療下で発現した有害事象（ＡＥ）；血清化学；１２誘導心電図（ＥＣＧ）所見；バイタルサイン；身体検査；脳脊髄液（ＣＳＦ）中の細胞計数、血糖、およびタンパク質レベル；ならびにＣＳＦおよび血清中の抗ｒｈＡＳＡ抗体を含んだ。ＡＥは、治験薬の初回投与またはデバイス埋め込み手術（いずれか早く行われた方）の時間と研究中の最後のフォローアップ日との間に起こった全ての有害事象として定義された。フォローアップ評価を、延長研究に登録しなかった患者に対して、最後のｒｈＡＳＡ注射の４週間後または最後のＩＤＤＤの除去の２週間後のいずれか遅く行われた方で行った。延長に登録した個人については、研究終了時訪問時（４０週目）にフォローアップ評価を行った。
【０３６５】
血清およびＣＳＦ試料を最初に、捕捉および検出のそれぞれのためにビオチン化ｒｈＡＳＡおよびスルホタグ化ｒｈＡＳＡを利用した電気化学発光架橋免疫測定法（Ｍｅｓｏ  Ｓｃａｌｅ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，ＬＬＣ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，ＭＤ）を使用して、抗薬物抗体（ＡＤＡ）についてスクリーニングした。ＡＤＡ陽性試料を、同じ架橋免疫測定法を使用するリガンド競合結合によって確認し、その後、基質として４−ニトロカテコール硫酸を用いたアリールスルファターゼＡ活性アッセイを使用して、抗体力価および中和活性について評価した。
【０３６６】
投与後のＦＣＳおよび血清中のｒｈＡＳＡの薬物動態評価、ならびに運動機能のベースラインからの変化を評価した。０週目（初回投与）および３８週目（最後の投与）において患者から血清およびＣＳＦ試料を採取した。検証済み酵素結合免疫吸着測定法を使用してｒｈＡＳＡ濃度を決定した。運動機能のベースラインからの変化を、ＧＭＦＭ−８８合計スコア（０〜１００％）を使用して評価した。追加のエンドポイントは、次を含んだ：タンデム質量分析検出を用いた液体クロマトグラフィーによって評価したＣＳＦスルファチドおよびリゾスルファチドレベル；プロトン磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）によって評価した脳の深部白質および灰白質におけるＮ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）／クレアチンおよびコリン／クレアチンレベル、脳磁気共鳴画像法に基づいた総ＭＬＤ重症度スコアのベースラインからの変化；ならびに神経電気検査を介して評価した末梢神経機能。ＣＳＦスルファチドおよびＣＳＦリゾスルファチドの正常上限は、脊椎穿刺を受けていた（したがって他の神経学的状態を有する可能性がある）、６０名の幼児からの試料中で観察される最高濃度に基づき、それぞれ（０．１１３μｇ／ｍＬ）および（０．０２７７ｎｇ／ｍＬ）として定義された。各患者は、脳の連続測定ＭＲＩを有した。ＭＲＩの視覚的スコアリング方法に基づいて、総ＭＬＤ重症度スコア（範囲：０〜３４）を各時点において各個人について計算し、より高いスコアは、より重度の脳関与を示した。神経電気検査を介した末梢神経機能の評価も実施した。集団平均および標準偏差（ＳＤ）が適切な年齢範囲において利用可能であった場合、神経伝導速度、振幅、遠位潜時、およびＦ波潜時を測定し、ｚスコアに変換した。
【０３６７】
ｒｈＡＳＡでの処置は耐容性良好であり、死亡、有害事象（ＡＥ）による中断、および生命を脅かすＡＥは報告されなかった。ＩＴ  ｒｈＡＳＡは、高い免疫原性の可能性を有しているようには見えず、１０名の患者が血清中で処置によって誘発された抗体を発生させなかったが、血清抗体応答とＡＥとの間の相関関係はなかった。
【０３６８】
ｒｈＡＳＡの濃度は、ＩＴ投与後の血清中でゆっくりと増加し（平均ｔｍａｘ範囲５．１〜１８．２時間）、観察された最大血清濃度（Ｃｍａｘ）および血清濃度−時間曲線下面積は、用量との関連で増加した。ｒｈＡＳＡ濃度は一般に、ＣＳＦ中で用量依存的に増加し、測定可能な濃度は、投与前の各訪問において検出され、ｒｈＡＳＡが投与間の２週間全体を通して、ＣＳＦ中で持続することを示唆している。用量コホートによるｒｈＡＳＡの平均ＣＳＦ濃度および治療週が図１４に示される。薬物動態の結果は、プロセスＡまたはプロセスＢのいずれかを使用して製造した１００ｍｇ  ｒｈＡＳＡを投与した患者において類似していた。
【０３６９】
ベースラインからの平均ＧＭＦＭ−８８合計スコアの減少は、４つのコホートの各々でｒｈＡＳＡ処置後に観察された（図１５）。２つの１００ｍｇコホート（コホート３および４）のベースラインと比較したＧＭＦＭ−８８合計スコアの４０週目の平均（ＳＤ）の低下は、類似していた（それぞれ−１９．０［１６．１２］対−２２．６［２５．４８］）。しかしながら、これらの減少は、１０ｍｇおよび３０ｍｇコホート（コホート１および２；それぞれ−２９．２［２４．４５］および−２７．７［１７．７６］）で観察されたものほど顕著ではなかった。経時的なＧＭＦＭ−８８合計スコアのベースラインからの変化が表８に要約される。全ての患者で観察された粗大運動機能の減少は、ｒｈＡＳＡ用量レベルが増加するにつれてより小さい減少の傾向を示した。１００ｍｇのｒｈＡＳＡを投与した患者（コホート３；プロセスＡ）において、ＭＬＤ重症度スコアは、安定したままであった。
【表８】
2021508322.tif 000010
【０３７０】
ＣＳＦスルファチドレベルをＣＮＳ中の薬物活性の指標として評価した。図１６Ａに示されるように、平均ＣＳＦスルファチドレベルは、コホート３および４において研究終了までに正常上限を下回った（それぞれ０．０７［０．０３］および０．０８［０．０３］）。平均ＣＳＦリゾスルファチドレベルの減少も、経時的に全てのコホートで観察された（図１６Ｂ）。平均ＣＳＦリゾスルファチドレベルは、コホート３において２週目、コホート４において４週目から、およびコホート２において１２週目から一貫して正常上限未満であった。このデータは、ｒｈＡＳＡがＣＮＳにおいて活性であることを示唆する。
【０３７１】
ＮＡＡは、成熟ニューロンおよび軸索の数および／または密度の代替的尺度として使用され得、神経障害において、ＮＡＡ濃度の減少は、神経および軸索の傷害および損失と関連している。ＮＡＡ／クレアチン比の変化を、患者におけるＭＬＤ重症度の指標として評価した（図１７Ａ）。右前頭白質において、ＮＡＡ／クレアチン比は、ベースラインから研究終了まで減少したが、これは、１０ｍｇで処置した患者（コホート１）と比較して、３０ｍｇまたは１００ｍｇのｒｈＡＳＡで処置した患者に関してあまり顕著ではなかった（図１７Ａ）。同様の結果が右前頭頭頂白質および頭頂後頭白質において見られた（図１８Ａおよび図１９Ａ）。灰白質におけるＮＡＡ／クレアチン比およびｒｈＡＳＡ用量が図２０Ａに示される。
【０３７２】
コリン／クレアチン比も全てのコホートで評価した。コリンレベルは、ＭＬＤ患者において上昇することが示されており、脱髄に関連する膜の代謝回転の増加に起因し得る。右前頭白質、右前頭頭頂白質、および頭頂後頭白質において、コリン／クレアチン比は、最低用量で処置した患者（１０ｍｇ、コホート１）におけるベースラインと比較して、一貫して増加していたが、３０ｍｇまたは１００ｍｇで処置した患者（コホート２〜４、図１７Ｂ、１８Ｂ、および１９Ｂ）においては明らかな傾向がなかった。正中後頭灰白質において、コリン／クレアチン比は、コホート１および２では可変であったが、コホート３においてベースラインと比較して減少し、コホート４では安定したままであった（図２０Ｂ）。
【０３７３】
平均総ＭＬＤ重症度スコアは、経時的に１０ｍｇ、３０ｍｇ、および１００ｍｇの（Ｂ）ｒｈＡＳＡで処置した患者において増加し、疾患進行を示す（図２１）。ベースラインからの最大増加は、１０ｍｇ  ｒｈＡＳＡを投与した患者において明らかであった（コホート１、平均変化、１１．０）。対照的に、平均総ＭＬＤ重症度スコアは、１００ｍｇの（Ａ）ｒｈＡＳＡで処置した患者（コホート３）において安定したままであり、ＣＮＳにおける疾患の安定化を示す可能性がある（図２１）。
【０３７４】
全てのコホートのベースラインにおいて、正中運動母指球（ｍｅｄｉａｎ  ｍｏｔｏｒ  ｔｈｅｎａｒ）の神経伝導能力の有意な低下が観察された（表９）。同様の結果が感覚神経（データ非表示）でも見られた。神経機能は、後の時点で４つのコホートにおいて悪化しているようには見えなかった。
【表９−１】
2021508322.tif 000011
【表９−２】
2021508322.tif 000012
【０３７５】
いくつかの研究は、ＭＬＤを含む神経障害患者におけるＣＮＳ中の代謝産物レベルの変化も報告している。例えば、ＮＡＡ濃度の減少は神経および軸索の傷害および損失と関連付けられ、一方でコリンレベルは、ＭＬＤ患者では上昇することが示されている。予想されるように、ＮＡＡ／クレアチン比は一般に、脳白質において経時的に減少したことが分かった。しかしながら、これは１０ｍｇまたは３０ｍｇほど１００ｍｇの用量では顕著ではなく、最高用量でのニューロン損傷がより少ないことを示す可能性がある。さらに、脳の白質におけるコリン／クレアチン比は、最低用量で処置した患者（１０ｍｇ、コホート１）においてベースラインと比較して一貫して増加したが、結果は、より高い用量で処置した患者においてより可変であった。我々の研究において、乳酸、ミオ−イノシトール、およびグルタミン＋グルタメートを含む他の代謝産物のレベルの明らかな傾向は何も観察されなかった。代謝産物レベルの分析は、ｒｈＡＳＡ処置の影響を明確に確立するために、より多くの患者および脳の異なる領域において実施される必要があり得る。
【０３７６】
全体として、これらの所見は、ＩＴ  ｒｈＡＳＡ処置が、特に１００ｍｇ  ＥＯＷの用量で、ＣＮＳにおける疾患安定化と関連付けられ得ることを示している。しかしながら、小さい試料サイズは、結果が慎重によって解釈されるべきであることを意味する。特に、各時点で利用可能なデータを有する患者数は一部のパラメータについて異なり、ＭＬＤ患者におけるｒｈＡＳＡの長期有効性を確立するために、さらなる研究がより長期間にわたって、かつより多くの患者において必要とされる。さらに、患者とコホートとの間の登録における年齢には変動があり、これは、異なる投与群間の処置応答の比較に影響を与える可能性がある。同様に、ＭＲＳを介して得られた代謝産物レベルのデータは、患者の年齢を考慮に入れるために正規化されなかった。
【０３７７】
これらの制限にもかかわらず、我々の所見は、ＭＬＤを有する幼児におけるＩＴ  ｒｈＡＳＡが一般に、忍容性良好であることを実証している。経時的な運動機能の一般的な低下があったが、特に最高用量でｒｈＡＳＡを投与した患者において疾患進行が軽減する証拠があった。延長研究は、ｒｈＡＳＡ処置に関連する長期安全性、免疫原性、および臨床結果を評価するために進行中であり、より高用量でのｒｈＡＳＡの後の臨床段階研究は、近日中に患者募集を開始する。これらの研究からの結果は、投与を誘導し、ｒｈＡＳＡが将来のＭＬＤ患者の潜在的治療と見なされ得るかどうかを確立するのに役立つことが期待される。
【０３７８】
実施例５：ＭＬＤ患者における組換えヒトアリールスルファターゼＡのモデリングおよびシミュレーション
実施例４に記載された臨床研究からのデータを、ＭＬＤ患者における組換えヒトアリールスルファターゼＡの薬物動態（ＰＤ）および薬力学（ＰＤ）モデリングおよびシミュレーションに使用した。図５に記載されるように、ＰＫ分析について、全ての患者に少なくとも１回のｒｈＡＳＡ用量を投与し、ｒｈＡＳＡ濃度を血清またはＣＳＦ中で少なくとも１回測定した。ＰＫ／ＰＤ分析について、全ての患者が、ＰＫ分析から利用可能なＰＫパラメータ推定値、および利用可能な少なくとも１つのＣＳＦスルファチドまたはＧＭＦＭ−８８合計スコア測定値を有する。ｒｈＡＳＡの血清濃度およびＣＳＦ濃度に基づいた集団ＰＫモデルを図６に示されるように開発した。ｒｈＡＳＡの排除を、分布、ＶＣＳ、およびＶＣＳＣの体積、ならびにコンパートメント間クリアランス、ＱＣＳＦと共に、中枢神経系（ＣＮＳ）における２つのコンパートメントモデルによって表した。ＣＳＦからのｒｈＡＳＡのクリアランスおよび血清中のその遅延した出現を特徴付けるために、仮説的な通過コンパートメントを使用した。
【０３７９】
ＣＳＦ中で測定したスルファチド濃度に対するｒｈＡＳＡの効果、およびｒｈＡＳＡとＧＭＦＭ−８８合計スコアへの曝露−応答（Ｅ−Ｒ）関係を含むＰＫ／ＰＤ関係をモデリングした。ＰＫ／ＰＤ関係のＰＫ駆動因子は、ＣＳＦおよびＣＮＳにおける患者特異的で時間が連続的なＰＫプロファイルであった。ＰＤ効果を順次にモデリングし、全てのＰＫ関連パラメータをＰＤパラメータの推定中に固定した。ＣＳＦスルファチド測定時間経過を間接的応答ＰＫ／ＰＤモデルを使用して特徴付け、ｒｈＡＳＡをスルファチドの消失を強化するものとしてモデリングした。ＣＮＳコンパートメントにおける集団ＰＫモデル予測ｒｈＡＳＡ濃度を、ＰＤ応答の駆動因子として使用した。ＧＭＦＭ−８８合計スコアへのｒｈＡＳＡ曝露のＥ−Ｒ関係を、モデル予測を０〜１００％の範囲内にあるように制約するためのロジットリンク関数によって制約されたベータ−回帰モデルを使用して評価した。
【０３８０】
集団ＰＫ、ＰＫ／ＰＤ、およびＥ−Ｒモデルを使用して、予測されるｒｈＡＳＡ濃度−時間プロファイルのプロファイルおよびＧＭＦＭ−８８合計スコアをシミュレーションした。２５０個を無作為に各年齢群から均一にサンプリングし、７５０の患者プロファイルをシミュレーションした。全てのデータアセンブリ、プロット、および要約表を、Ｒ（ｖ３．３以上；Ｌｕｃｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｗｉｎｄｏｎ，ＵＫ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用して準備した。集団ＰＫ、ＰＫ／ＰＤ、およびＥ−Ｒモデルリング分析およびシミュレーションを、ＮＯＮＭＥＭソフトウェア（ｖ７．３以上；ＩＣＯＮ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｅｌｌｉｃｏｔｔ  Ｃｉｔｙ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して実施した。
【０３８１】
図８に示されるように、４つの異なる投与シナリオを使用した。シナリオ１は、１週間おきに１００ｍｇを含み、シナリオ２は、毎週１００ｍｇを１２週間（初期毎週投与）、次いで１週間おきに１００ｍｇを含み、シナリオ３は、毎週１５０ｍｇを１２週間（初期毎週投与）、次いで１週間おきに１５０ｍｇを含み、シナリオ４は、毎週年齢調整された投与量を１２週間（初期毎週投与）、次いで１週間おき（シナリオ４：８０ｍｇ、８ヶ月未満；１２０ｍｇ、８〜３０ヶ月未満；１５０ｍｇ、３０ヶ月以上）を含んだ。全てのデータアセンブリ、プロット、および要約表を、Ｒ（ｖ３．３以上；Ｌｕｃｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｗｉｎｄｏｎ，ＵＫ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｐｒｏｊｅｃｔ．ｏｒｇ）を使用して準備した。２５０個を無作為に各年齢群から均一にサンプリングし、７５０の患者プロファイルをシミュレーションした。集団ＰＫ、ＰＫ／ＰＤ、およびＥ−Ｒモデルリング分析およびシミュレーションを、ＮＯＮＭＥＭソフトウェア（ｖ７．３以上；ＩＣＯＮ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｅｌｌｉｃｏｔｔ  Ｃｉｔｙ，ＭＤ，ＵＳＡ）を使用して実施した。
【０３８２】
患者（ｎ＝２４）は、４つのコホートに均等に分布していた。ベースラインにおいて、平均患者年齢は４４．９（標準偏差［ＳＤ］、２２．８；範囲、１９．０〜１０７．０）ヶ月であり、平均重量は１５．４（ＳＤ、４．１４；範囲、１０．５〜２４．８）ｋｇであった。
【０３８３】
ＶＣＳＦ（７６．１％  ＲＳＥ）、ＶＣＮＳ（１２１％  ＲＳＥ）、およびＫｔｒａｎｓ（４０．２％  ＲＳＥ）の比例係数を除いて、固定効果を良好な精度で推定した。推定個人間変動の精度は不十分であった。モデルは、脳組織および全身循環へのｒｈＡＳＡの急速な分布を示唆した。ＣＮＳ中のｒｈＡＳＡの分布半減期中央値は１．０２（範囲、０．３９４〜１．６６）時間であり、ＣＳＦから血清への分布の半減期中央値は１．１９（範囲、０．５５５〜２．０９）時間であった。しかしながら、ＣＮＳ中のｒｈＡＳＡの終末相半減期中央値は、およそ２０日（４７７［範囲、２５６〜１０１０］時間）であった（表１０）。１．１９（範囲、０．５５５〜２．０９）時間の通過速度定数中央値（通過半減期として表現される）は、ＣＳＦ生理学的代謝回転（約６時間）と一致する。
【表１０】
2021508322.tif 000013
【０３８４】
ＣＳＦ中のスルファチドの濃縮に依存的な減少（モデル推定ＥＣ５０：３．５９の急なヒルスロープで１８４ｎｇ／ｍＬのｒｈＡＳＡ）、および粗大運動機能の喪失の濃度依存的な阻害（モデル推定ＩＣ５０：脳組織において、０．５５４の緩やかなヒルスロープで１２０ｎｇ／ｍＬのｒｈＡＳＡ）が観察された。ＣＳＦ中の集団および個別の予測ｒｈＡＳＡ濃度、ＳＣＦ中のスルファチド濃度、およびＧＭＦＭ−８８合計スコアのそれぞれの適合度プロットが、図７Ａ、Ｂ、およびＣのそれぞれに示される。３つのモデル全てが、観察されたｒｈＡＳＡ濃度の合理的な特性化を示し、モデルの精度は異なり、これは研究に含まれる少数の患者によって引き起こされた可能性がある。４つのシミュレーションされた投与シナリオについて、ＣＳＦおよびＣＮＳ中のシミュレーションされた投与前トラフｒｈＡＳＡ濃度中央値が図８に示される。
【０３８５】
１週間おきに１００ｍｇでは（シナリオ１）、ＰＫ定常状態を達成するためにおよそ１６週間かかり、４７７時間のｒｈＡＳＡ消失半減期中央値と一致する。１２週間にわたって毎週投与し、続いて１週間おきに投与する１００ｍｇまたは１５０ｍｇでは（シナリオ２および３）、シナリオ１と比較して、より高いｒｈＡＳＡのトラフ濃度がＣＳＦおよびＣＮＳ中で達成された。年齢ベースの投与シナリオ（シナリオ４）は、３つの年齢群全てについて、経時的にｒｈＡＳＡのより一貫した定常状態トラフ濃度を示した。しかしながら、８ヶ月未満の患者は、シナリオ２および３のように、毎週の投与段階中にｒｈＡＳＡの同じ高トラフ濃度を達成しなかった。
【０３８６】
ＧＭＦＭ−８８合計スコアのシミュレーションは、一部の患者において予想される経時的な安定化を示し（図９）、これは、観察された臨床研究結果と一致する。シナリオ１〜３は、全ての群の患者が処置への早期の応答を示すことを予測した。シナリオ３は、１２ヶ月および２４ヶ月のそれぞれにおいてＧＭＦＭ−８８合計スコアが３５または５０を超える患者の最大数を予測した。年齢ベースの投与レジメン（シナリオ４）は、３０ヶ月を超える群よりも、８ヶ月未満および８〜３０ヶ月未満の群においてより少ない患者が処置に応答することを予測した。
【０３８７】
ＩＤＤＤを介したｒｈＡＳＡの送達は、ＣＳＦ中のスルファチドのレベルを低下させ、ＭＬＤ患者において用量および曝露依存的に運動機能喪失の速度を遅くし得る。ファーマコメトリックモデリングアプローチを使用して、集団ＰＫ、ＰＫ／ＰＤ、およびＧＭＦＭ−８８合計スコアとのＥ−Ｒ関係を予測した。全ての場合において、モデルは、ｒｈＡＳＡを投与した患者において観察された測定値の良好な特性化を提供した。少数の患者、ＣＳＦ中のｒｈＡＳＡ濃度において観察された変動性、およびＣＳＦ濃度が投与前時点においてのみ観察されたことを考えると、モデル間の精度は異なった。しかしながら、モデルは、ｒｈＡＳＡの脳組織および全身循環への急速な分布を示唆したが、ＣＮＳからの遅い終末消失半減期は示唆しなかった。
【０３８８】
実施例６：遅発性乳児型異染性白質ジストロフィーを有する幼児における組換えヒトアリールスルファターゼＡのくも膜下腔内送達のレスポンダーおよび非レスポンダーの分析。
図１０に示されるように、患者に、くも膜下腔内薬物送達装置（ＩＤＤＤ）を介して０〜３８週の間１週間おきにｒｈＡＳＡを投与した。コホート１（ｎ＝６）には１０ｍｇ  ｒｈＡＳＡを投与し、コホート２（ｎ＝６）には３０ｍｇ  ｒｈＡＳＡを投与し、コホート３（ｎ＝６）には１００ｍｇ  ｒｈＡＳＡを投与し、コホート４（ｎ＝６）には、改訂された製造プロセスを使用して産生された１００ｍｇ  ｒｈＡＳＡを投与した。
【０３８９】
コホート１〜４の適格性基準は、ＭＬＤの画定診断（ＡＳＡ欠乏に基づく、白血球中のアッセイを使用した評価、および尿中のスルファチド濃度の上昇）；３０ヶ月齢以前のＭＬＤ症状の最初の発現；スクリーニング検査時に存在するＭＬＤの神経学的兆候；スクリーニング時の歩行（片手が支えられた状態で１０歩前に歩くことが可能）を含んだ。コホート１〜３に含まれる患者も、スクリーニング時に１２歳未満であった。コホート４の患者に対する追加の適格性基準は、スクリーニング時に少なくとも４０およびベースライン時に少なくとも３５の粗大運動機能尺度−８８（ＧＭＦＭ−８８）合計スコア、ならびにスクリーニング時の８歳未満を含んだ。
【０３９０】
最初の用量のｒｈＡＳＡを投与する前に、各患者に、ＩＤＤＤ（ＰＯＲＴ−Ａ−ＣＡＴＨ（登録商標）ＩＩ［Ｓｍｉｔｈｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＡＳＤ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ  Ｐａｕｌ，ＭＮ，ＵＳＡまたはＳＯＰＨ−Ａ−ＰＯＲＴ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｓ［Ｓｏｐｈｙｓａ，Ｏｒｓａｙ，Ｆｒａｎｃｅ］）を外科的に埋め込んだ。ＩＤＤＤの位置を手術後に確認した。運動機能の指標を提供するＧＭＦＭ−８８合計スコア（０〜１００％）（Ｂｊｏｒｎｓｏｎ  ＫＦ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｐｈｙｓ  Ｔｈｅｒ  １９９８；１０：４３−７）を使用して、コホート３および４からの患者において処置応答を事後評価した。
【０３９１】
レスポンダーを、３５以上のベースラインＧＭＦＭ−８８合計スコア、およびベースラインと比較して研究終了時に維持された（１０以下のＧＭＦＭ−８８合計スコアの減少）または増加したＧＭＦＭ−８８合計スコアを有する個人として定義した。非レスポンダーを、この基準を満たさなかった個人として定義した。評価した他の主要な結果は、脳脊髄液（ＣＳＦ）中のスルファチド濃度の変化、ＭＬＤ−ＭＲＩ重症度スコアを得るためのＥｉｃｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．と同様のスコアリング方法  （Ｇｉｕｇｌｉａｎｉ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．ＪＩＥＭＳ  ２０１７；５：３１４：Ａ６９９）を使用して、脳の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって測定される、ＭＬＤ重症度の変化、磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）によって評価される、脳の白質におけるＮ−アセチルアスパラギン酸（ＮＡＡ）のレベルの変化を含んだ。図２２は、ｒｈＡＳＡの臨床研究からの同胞ペア患者の月齢による個別のＧＭＦＭ−８８合計スコアを示す。バイオマーカーおよび運動反応は、共に改善するように見えた。さらに、ＣＳＦスルファチドおよびＮＡＳ  ＮＡＡレベルは、共に改善するように見えた。運動反応は、ＣＳＦ中の蓄積スルファチドの用量依存的減少と関連付けられた。
【０３９２】
１００ｍｇのｒｈＡＳＡを投与したＮＣＴ０１５１００２８に登録された１２名の患者のうち、４名の個人（コホート３から２名およびコホート４から２名）をレスポンダーと特定した。コホート３および４の残りの８名の患者を、非レスポンダーとして特定した。図１１は、１２名の患者における経時的なＧＭＦＭ−８８合計スコアを示す。４名のレスポンダーについての人口統計およびベースライン特性が表１１に示される。
【表１１】
2021508322.tif 000014
【０３９３】
レスポンダー１、２および３は、１ヶ月後に正常上限（０．１１３μｇ／ｍＬ）を下回るＣＳＦスルファチド濃度を有し、レスポンダー４について利用可能なＣＳＦスルファチド濃度に関するフォローアップ情報はなかった。研究終了時（４０週目）、ＣＳＦスルファチド濃度は、レスポンダー１、２、および３のそれぞれにおいて０．０２９４μｇ／ｍＬ、０．０４８９μｇ／ｍＬ、および０．０６５３μｇ／ｍＬであると報告された。
【０３９４】
８名の非レスポンダーのうち、１名の患者は、１ヶ月後に正常上限を下回るＣＳＦスルファチド濃度を有した。残りの患者では、８〜３６週間後にＣＳＦスルファチド濃度は正常上限を下回った。コホート１からの１名の個人も、研究終了までにスルファチドレベルを正規化することなく、事後のレスポンダー基準を満たした。
【０３９５】
ベースラインから４０週目までのＭＬＤ−ＭＲＩ重症度スコアは、レスポンダーのうちの２名において減少し、レスポンダーのうちの１名において増加した（図１２）。研究終了時のＭＬＤ−ＭＲＩ重症度スコアに関する情報は、レスポンダー４については利用可能ではなかった。４名のレスポンダーのうちの２名が、ベースライン時に１．０以上の前頭頭頂白質のＮＡＡ／クレアチン比を有した。ベースラインデータが利用可能であった８名の非レスポンダーのいずれも、ベースライン時に１．０以上のＮＡＡ／クレアチン比を有した。
【０３９６】
前頭頭頂白質のＮＡＡ／クレアチン比は、レスポンダーのうちの１名においてベースラインと比較して４０週目に増加し、ベースライン時および４０週目に利用可能なデータを有した他の２名のレスポンダーにおいて      安定したままであった（図１３）。
【０３９７】
１００ｍｇ  ｒｈＡＳＡを投与した１２名の患者のうち４名を処置に応答したと特定し、年齢およびベースライン特性はレスポンダー間で異なった。これらの所見は、最高用量を投与した患者のサブセットにおける疾患安定化の傾向を示し、ＬＩ−ＭＬＤ患者のためのｒｈＡＳＡによるくも膜下腔内療法の開発を支持する。処置応答に影響を与える要因には、ＣＳＦ  ｒｈＡＳＡ濃度、ベースラインＮＡＡ／クレアチン比、ＮＡＡ／クレアチン比の安定化、罹病期間、年齢、およびＣＳＦスルファチドレベルの正規化にかかる時間が含まれ得る。
【０３９８】
実施例７：遅発性乳児型異染性白質ジストロフィー患者におけるくも膜下腔内投与された組換えヒトアリールスルファターゼＡ
ＭＬＤにおけるリソソーム酵素アリールスルファターゼＡの欠乏は、スルファチドとして集合的に既知の硫酸化スフィンゴ糖脂質の蓄積をもたらす。これらは、中枢および末梢の両方において軸索のミエリン絶縁鞘を維持する細胞で蓄積し、かつそれに対して毒性である。組換えヒトアリールスルファターゼＡのＩＴ投与は、神経系の細胞に蓄積されたスルファチドを加水分解するのに十分であり得、さらなる蓄積を遅くするかまたは防止することができ、これは運動系の利益につながるはずである。例えば、ＩＴ送達を通した直接的なＣＮＳ投与を使用して、ＭＬＤ患者を効果的に治療することができる。この例は、遅発性乳児期ＭＬＤ患者における１５０ｍｇ  ｒｈＡＳＡの週１回のくも膜下腔内投与の有効性を評価するために設計された多施設、非盲検、適合歴史的対照臨床研究を示す。この研究は、１５０ｍｇのＩＴ投与したｒｈＡＳＡが、遅発性乳児期ＭＬＤを有する小児対象において運動機能不全を安定化するかまたは遅らせる可能性を調査する。
【０３９９】
ｒｈＡＳＡの安全性および忍容性、ならびにＳＯＰＨ−Ａ−ＰＯＲＴ  Ｍｉｎｉ  Ｓくも膜下腔内薬物送達装置を介したその送達を評価するために、およそ３５名の患者が登録される。疾患進行の速度および重症度は、遅発性乳児型ＭＬＤにおいて文書で十分に裏付けられている。遅発性乳児型ＭＬＤの定義の際立った特徴は、疾患症状の発症が若年齢であることであり、遅発性乳児型ＭＬＤ患者の大多数が１８ヶ月齢の前に最初の運動機能不全を示す。登録時の年齢および運動機能不全の程度に基づいて、４つの処置群が含まれる：  
・Ａ群−早期症候性（１８〜４８ヶ月；ＭＬＤにおける粗大運動機能分類［ＧＭＦＣ−ＭＬＤ］レベル１〜２；ｎ＝１６）、
・Ｂ群−中期症候性（１８〜７２ヶ月；ＧＭＦＣ−ＭＬＤレベル３；ｎ≦８）、
・Ｃ群−進行性症候性（１８〜７２ヶ月、ＧＭＦＣ  ＭＬＤレベル４；ｎ≦８）、および
・Ｄ群−発症前または最小症候性（１８ヶ月未満；同じＡＳＡ対立遺伝子構造を有する参加者の発症前同胞；ｎ＝３）。
【０４００】
症状発症は、Ａ〜Ｃ群において３０ヶ月前でなければならない。全ての対象に、１５０ｍｇのＩＴ  ｒｈＡＳＡの週１回用量を１０５週間投与する。研究は、疾患進行を測定するためのＧＭＦＣ−ＭＬＤおよびＧＭＦＭ−８８合計スコアを使用して、粗大運動機能に対する治療レジメンの安全性および有効性を評価する。Ｄ群対象を、アルバータ乳幼児運動スケール（Ｐｉｐｅｒ  ａｎｄ  Ｄａｒｒａｈ，１９９４）で評価する。主要エンドポイントは、ベースラインから２年までに２以下のＧＭＦＣ−ＭＬＤレベルの増加（運動機能の低下を示す）があるＡ群の幼児の割合である。二次エンドポイントは、粗大運動機能尺度−８８合計スコアが２年で４０を超えるＡ群の幼児の割合である。
【０４０１】
他の二次エンドポイントは、ＧＭＦＣ−ＭＬＤを使用した粗大運動機能の低下の時間経過に対するｒｈＡＳＡのＩＴ投与の効果の評価；ＧＭＦＭ−８８を使用した粗大運動機能の低下の時間経過に対するｒｈＡＳＡのＩＴ投与の効果の評価；表出性言語機能分類（ＥＬＦＣ−ＭＬＤ）を使用した表出性言語に対するｒｈＡＳＡのＩＴ投与の効果の評価；脳脊髄液（ＣＳＦ）バイオマーカー（すなわち、スルファチドレベル）に対するｒｈＡＳＡのＩＴ投与の効果の評価；および脳の陽子磁気共鳴分光（ＭＲＳ）、特に、白質におけるＮ−アセチルアスパラギン酸／クレアチン（ＮＡＡ／Ｃｒ）に対するｒｈＡＳＡのＩＴ投与の効果の評価を含む。結果を、ＭＬＤを有する幼児における傾向スコアマッチング、歴史的対照データと比較する。
【０４０２】
ＩＴ  ｒｈＡＳＡの安全性および忍容性は、治療下で発現した有害事象（ＴＥＡＥ）の発生、臨床実験室試験（血清化学、血液学、および尿分析）およびバイタルサイン、ＭＬＤの兆候および症状の文書化を含む身体検査、１２誘導心電図（ＥＣＧ）、ＣＳＦ検査パラメータ（化学および細胞係数を含む）、ＭＬＤ対象のＣＳＦおよび血清ならびにＳＯＰＨ−Ａ−ＰＯＲＴ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｓデバイスにおける抗ｒｈＡＳＡ抗体の存在および活性に基づく。
【０４０３】
ＩＴ  ｒｈＡＳＡ投与の効果の追加的評価は、血清および尿バイオマーカー（すなわち、スルファチドレベル）、脳の磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）によって測定される重症度スコア、脳のＭＲＩに基づいた体積分析、嚥下内視鏡検査（ＦＥＥＳ）によって評価される嚥下能力、神経電気検査（ＥＮＧ）による神経伝導、ならびにバテル発達インベントリ（ＢＤＩ−２ＮＵ）を使用する伝達および認知に基づき得る。ＭＬＤを有する幼児における介護者の負担および対象の健康関連の生活の質を、介護者影響質問票（ＣＩＱ）によって評価される介護者の負担、および乳幼児の生活の質質問票−９７項目（ＩＴＱＯＬ−９７）によって評価される健康関連の生活の質（ＨＲＱＯＬ）を評価することによって調査する。
【０４０４】
主要有効性エンドポイントを、ＧＭＦＣ−ＭＬＤの２以下のレベルのベースラインからの変化として評価される、２年（１０６週目）での粗大運動機能の維持として定義する。Ａ群における主要な二次有効性エンドポイントは、４０を超えるＧＭＦＭ−８８合計スコアとして評価される、２年（１０６週目）での粗大運動機能の維持である。ｒｈＡＳＡの有効性を、適合歴史的対照の対照とＡ群の登録対象の比較によって評価する。これらの未処置ＭＬＤ対象（すなわち、治験薬または療法を受けていない対象）からのデータは、進行中の白質ジストロフィーの国際指針（ＧＬＩＡ−ＭＬＬＤ）の自然史研究に由来する。以前の治験においてｒｈＡＳＡに曝露したＭＬＤ対象からの追加的な適合歴史的対照データも使用され得る。ＧＬＩＡ−ＭＬＤおよび以前のＳｈｉｒｅの研究からの適合歴史的対照は、少なくともベースラインおよび１つのベースライン後の粗大運動機能評価のデータを有しなければならない。これらの対照は、本研究の登録対象と非常に類似した選択／除外基準、および同様の時点で同等の有効性評価を有した。
【０４０５】
本明細書においていくつかの発明的実施形態が記述され、例示されてきたが、当業者は、本明細書に記載される機能を実施および／または結果を得るためのさまざまな手段および／または構造を容易に展開することができ、かかる変形および／または変更の各々は、本明細書に記載の発明の実施形態の範囲内であると見なされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載されるすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が、例示的であり、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が本発明の教示が使用される特定の用途または用途に依存することを容易に理解するであろう。当業者は、ただの日常的な実験を使用して、本明細書に記載される特定の本発明の実施形態の多くの同等物を認識するか、または確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は、例証としてのみ提示され、添付した請求項の範囲内で、本発明の実施形態が特に記載され特許請求の範囲で特に記載されているものよりも実施され得ることを理解するべきである。本開示の発明的実施形態は、本明細書に記載される個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法を対象とする。さらに、こうした特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、２つ以上のこうした特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の任意の組み合わせが、本開示の本発明の範囲内に含まれる。
【図１Ａ−１Ｃ】
2021508322.tif 000015
【図１Ｄ−１Ｆ】
2021508322.tif 000016
【図２Ａ】
2021508322.tif 000017
【図２Ｂ】
2021508322.tif 000018
【図３】
2021508322.tif 000019
【図４】
2021508322.tif 000020
【図５】
2021508322.tif 000021
【図６】
2021508322.tif 000022
【図７Ａ−７Ｂ】
2021508322.tif 000023
【図７Ｃ】
2021508322.tif 000024
【図８】
2021508322.tif 000025
【図９】
2021508322.tif 000026
【図１０】
2021508322.tif 000027
【図１１】
2021508322.tif 000028
【図１２】
2021508322.tif 000029
【図１３】
2021508322.tif 000030
【図１４】
2021508322.tif 000031
【図１５】
2021508322.tif 000032
【図１６】
2021508322.tif 000033
【図１７】
2021508322.tif 000034
【図１８】
2021508322.tif 000035
【図１９】
2021508322.tif 000036
【図２０】
2021508322.tif 000037
【図２１】
2021508322.tif 000038
【図２２】
2021508322.tif 000039
【配列表】
2021508322000001.app
【国際調査報告】
2021508322.tif 000040
2021508322.tif 000041
2021508322.tif 000042