(57)【要約】本開示は、明条件、暗条件、または限定された明条件において、一次炭素源として外来性有機炭素源を用いて藻類を増殖させることを提供する。また、暗条件または限定された明条件において増殖する藻類種における組換えタンパク質の発現のための発現カセットも提供する。2021503283.tif 000008
2021503283.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
藻類種を、好気性条件下で、少なくとも1つの外来性有機炭素源の存在下で増殖させる工程を含む、藻類種の高密度培養物を生産するための方法であって、該藻類種が増殖のためのエネルギー源として有機炭素源を用いることができる、方法。
【請求項２】
前記藻類種が、クラミドモナス属（Chlamydomonas）種である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
正味の酸素消費および正味のCO2産生が存在する、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
少なくとも1つの外来性炭素源のうちの1つが、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、グリセロール、糖蜜、デンプン、セルロース、アセタート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
クラミドモナス属種を、光の存在下で増殖させる、請求項4記載の方法。
【請求項６】
クラミドモナス属種を、限定された明条件において増殖させる、請求項4記載の方法。
【請求項７】
クラミドモナス属種を、暗所において増殖させる、請求項4記載の方法。
【請求項８】
クラミドモナス属種を、少なくとも30 g/L、少なくとも35 g/L、少なくとも40 g/L、少なくとも45 g/L、少なくとも50 g/L、少なくとも55 g/L、少なくとも60 g/L、少なくとも65 g/L、少なくとも70 g/L、少なくとも75 g/L、少なくとも80 g/L、少なくとも85 g/L、少なくとも90 g/L、少なくとも95 g/L、少なくとも100 g/L、少なくとも105 g/L、少なくとも110 g/L、少なくとも115 g/L、少なくとも120 g/L、または少なくとも125 g/Lの密度まで増殖させる、請求項2〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
培養物を、高密度発酵槽において増殖させる、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
外来性の空気または酸素が、増殖工程中に供給される、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
クラミドモナス属種が、クラミドモナス・ラインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii）、クラミドモナス・ディソモス（Chlamydomonas dysomos）、クラミドモナス・ムンダン（Chlamydomonas mundane）、クラミドモナス・デバリアナ（Chlamydomonas debaryana）、クラミドモナス・モエブシィ（Chlamydomonas moewusii）、クラミドモナス・キュレウス（Chlamydomonas culleus）、クラミドモナス・ノクチガマ（Chlamydomonas noctigama）、クラミドモナス・オーラタ（Chlamydomonas aulata）、クラミドモナス・アプラナタ（Chlamydomonas applanata）、クラミドモナス・マルバニィ（Chlamydomonas marvanii）、およびクラミドモナス・プロボシゲラ（Chlamydomonas proboscigera）のうちの1つまたは複数である、請求項2〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１２】
クラミドモナス属種が、クラミドモナス・ラインハーディである、請求項2〜10のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
以下の工程を含む、クラミドモナス属種の培養物から組換えタンパク質を蓄積するための方法：
(a) 組換えタンパク質を発現することができる組換えクラミドモナス属種の1つまたは複数の細胞を提供する工程； 
(b)該1つまたは複数の細胞を、好気性条件下で、少なくとも1つの外来性有機炭素源の存在下で増殖させて、組換えクラミドモナス属種の培養物を産生する工程であって、該クラミドモナス属種が増殖のためのエネルギー源として有機炭素源を用いる、工程；および
(c) 組換えタンパク質を培養物から収集する工程。
【請求項１４】
少なくとも1つの外来性炭素源のうちの1つが、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、グリセロール、糖蜜、デンプン、セルロース、アセタート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
クラミドモナス属種を、光の存在下で増殖させる、請求項13〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
クラミドモナス属種を、限定された明条件において増殖させる、請求項13〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
クラミドモナス属種を、暗所において増殖させる、請求項13〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
外来性の空気または酸素が培養物の増殖中に供給される、請求項13〜17のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
クラミドモナス属種の培養物を、少なくとも30 g/L、少なくとも35 g/L、少なくとも40 g/L、少なくとも45 g/L、少なくとも50 g/L、少なくとも55 g/L、少なくとも60 g/L、少なくとも65 g/L、少なくとも70 g/L、少なくとも75 g/L、少なくとも80 g/L、少なくとも85 g/L、少なくとも90 g/L、少なくとも95 g/L、少なくとも100 g/L、少なくとも105 g/L、少なくとも110 g/L、少なくとも115 g/L、少なくとも120 g/L、または少なくとも125 g/L乾燥細胞重量の密度まで増殖させる、請求項13〜18のいずれか一項記載の方法。
【請求項２０】
クラミドモナス属種を、高密度発酵槽において増殖させる、請求項13〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
クラミドモナス属種が、クラミドモナス・ラインハーディ、クラミドモナス・ディソモス、クラミドモナス・ムンダン、クラミドモナス・デバリアナ、クラミドモナス・モエブシィ、クラミドモナス・キュレウス、クラミドモナス・ノクチガマ、クラミドモナス・オーラタ、クラミドモナス・アプラナタ、クラミドモナス・マルバニィ、およびクラミドモナス・プロボシゲラのうちの1つまたは複数である、請求項13〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
クラミドモナス属種が、クラミドモナス・ラインハーディである、請求項13〜20のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３】
培養物が液体培地および細胞を含み、組換えタンパク質が液体培地から収集される、請求項13〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
培養物が液体培地および細胞を含み、組換えタンパク質が培養物の細胞から収集される、請求項13〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５】
組換えタンパク質が、葉緑体において発現される、請求項13〜24のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
関心対象の組換え遺伝子の発現が、内在性葉緑体ゲノムの16Sプロモーターを用いて駆動される、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
クラミドモナス属培養の生産性（培養物1リットル（L）当たりのクラミドモナス属バイオマスのグラム（g））が、少なくとも約0.3 g/L/時間、少なくとも約0.5 g/L/時間、少なくとも約0.6 g/L/時間、少なくとも約0.9 g/L/時間、少なくとも約1.5 g/L/時間、または少なくとも約2 g/L/時間である、請求項2〜26のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
外来性有機炭素源におけるクラミドモナス属バイオマスの変換効率が、少なくとも約0.3 gバイオマス/g炭素源、少なくとも約0.4 gバイオマス/g炭素源、少なくとも約0.5 gバイオマス/g炭素源、少なくとも約0.6 gバイオマス/g炭素源、または少なくとも約0.7 gバイオマス/g炭素源である、請求項2〜27のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９】
クラミドモナス属培養物のクラミドモナス属バイオマスの総タンパク質含量が、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、または少なくとも約70％である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
収集の時のクラミドモナス属培養物が、少なくとも約0.3 gバイオマス/リットル/時間の生産率、および培養物1リットル当たり50 gバイオマスの密度を有する、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
5'非翻訳領域（5'UTR）に融合した藻類16Sプロモーターと組換えタンパク質をコードする核酸分子とを含む発現カセットであって、該5'UTRが、psbM、psaA、psaB、psbI、psbK、clpP、rpl14、rps7、rps14、およびrps19 5'UTRからなる群より選択される、発現カセット。
【請求項３２】
暗条件または限定された明条件において増殖する藻類種における組換えタンパク質の発現を提供する、請求項31記載の発現カセット。
【請求項３３】
前記藻類種が、クラミドモナス属種である、請求項32記載の発現カセット。
【請求項３４】
前記5'UTRが、SEQ ID NO: 12〜20および21からなる群より選択される配列を含むか、または、SEQ ID NO: 12〜20および21からなる群より選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む、請求項31〜33のいずれか一項記載の発現カセット。
【請求項３５】
前記16Sプロモーターが、クラミドモナス属種由来の16Sプロモーターである、請求項31〜34のいずれか一項記載の発現カセット。
【請求項３６】
前記16Sプロモーターが、SEQ ID NO: 1であるか、または、SEQ ID NO: 1に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列である、請求項31〜34のいずれか一項記載の発現カセット。
【請求項３７】
SEQ ID NO: 2〜10および11からなる群より選択される配列を含むか、または、SEQ ID NO: 2〜10および11からなる群より選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む、請求項31記載の発現カセット。
【請求項３８】
藻類において組換えタンパク質を発現させる方法であって、
(a) 5'非翻訳領域（5'UTR）に融合した藻類16Sプロモーターと組換えタンパク質をコードする核酸分子とを含む発現カセットを、藻類中に導入する工程、および
(b) 該藻類を暗条件または限定された明条件下で増殖させる工程
を含み、該5'UTRが、psbM、psaA、psaB、psbI、psbK、clpP、rpl14、rps7、rps14、およびrps19 5'UTRからなる群より選択される、方法。
【請求項３９】
前記藻類が、クラミドモナス属種である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
組換えタンパク質が葉緑体において発現される、請求項38記載の方法。
【請求項４１】
前記5'UTRが、SEQ ID NO: 12〜20および21からなる群より選択される配列を含む、請求項38〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
前記16Sプロモーターが、藻類の葉緑体ゲノムの内在性16Sプロモーターである、請求項38〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
前記16Sプロモーターが、SEQ ID NO: 1であるか、または、SEQ ID NO: 1に対して少なくとも80％の同一性を有する配列である、請求項38〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
発現カセットが、SEQ ID NO: 2〜10および11からなる群より選択される配列を含むか、または、SEQ ID NO: 2〜10および11からなる群より選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む、請求項38〜41のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、2017年11月17日に出願された米国特許仮出願第62/587,694号および2018年2月2日に出願された米国特許仮出願第62/625,619号の、米国特許法（35 U.S.C.）第119条（e）の下での優先権の恩典を主張し、その各々の内容は全体が参照により組み入れられる。
【０００２】
配列表
本出願は、ASCII形式で電子的に提出されており、その全体が参照により本明細書に組み入れられる配列表を含有する。2018年11月13日に作成された前記ASCIIコピーは、20498-202027_SL.txtという名称であり、サイズが16キロバイトである。
【０００３】
発明の分野
本開示は、藻類を増殖させるための方法であって、そのような藻類の生産に関連する収率の改善、効率の増加、およびコストの低減を提供する方法に関する。本開示は、暗条件および限定された明条件において藻類を増殖させるための方法に関する。本開示はまた、一次炭素源として外来性有機炭素源を用いて藻類を増殖させるための方法にも関する。
【背景技術】
【０００４】
背景情報
人口の増大および食糧源の必要の増加とともに、藻類は、農業生産の既存の手段を補う潜在能力を有する生物としてますます探究されている。藻類は、伝統的な農業の代替を提供し、繁殖するために適している土地および気候を必要としない。伝統的な農業の困難を乗り越えるために、藻類は、完全な封じ込めにおいて増殖させることができ、それによって、栄養素に富む土壌または理想的な天気の必要を排除することができる。その代わりに、最適な増殖条件を保証するために、栄養素を藻類培養物に供給し、温度を調節することができる。完全な封じ込めにおいて藻類を増殖させることによって、過剰な栄養素の適用およびそれらの栄養素に起因する有害な流出を回避することができる。
【０００５】
商業的に増殖させ、ヒトおよび動物の健康食品チェーンにおいて使用されている多くの藻類がある。しかし、ヒトおよび動物の栄養摂取のために商業的に使用できる株として本格的に考えるのに必要な要求を、すべての藻類が満たしているわけではない。藻類が商業的に使用できるかどうかを判定することに寄与するいくつかの要因は、藻類が高い生産力価を達成することができるかどうか、および生産プロセスが対費用効果高く行えるかどうかである。現在まで、多くの藻類を、閉じられた発酵容器において増殖させており、これは、大きな設備投資が要求されることおよび発酵槽の運転に高いエネルギーコストが付随することの両方の点で、生産のコストを増加させる。これらの出費を乗り越えるためには、経済的実行可能性を達成するように、バイオマス力価をより高い密度に押し進める、またはインプットのコストを減少させる、生産方法における飛躍的進歩が必要とされる。
【０００６】
1つの特定の藻類の属であるクラミドモナス属（Chlamydomonas）は、光合成および他の生化学的プロセスを理解するためのモデル生物として、長く研究されてきた。クラミドモナス属は、アセタートで従属栄養的に増殖することができる；しかし、炭素源として糖で増殖する機構が欠如している。この糖で増殖できないことは、記録されており、繰り返し実証されている。アセタートのコストは、様々な糖（例えば、フルクトース、スクロース、グルコース、ガラクトース）のコストよりも有意に高く、それによって、クラミドモナス属の生産のコストは激しく増加する。クロレラ属（Chlorella）などの他の緑藻類の属とは異なり、クラミドモナス属は、細胞の外部から細胞中への糖の一次輸送を促進するヘキソース輸送体が欠如している。クラミドモナス属はまた、サイトゾルに局在化し、そこでグルコースをリン酸化して、ペントースリン酸経路における鍵となる代謝物であるグルコース-6-リン酸にするように機能する、ヘキソースキナーゼも欠如している。クラミドモナス属はまた、グルコース-6-リン酸を様々な代謝物に変換し、それらが次いで、藻類が増殖し、分裂するエネルギーを生成するために用いられる、サイトゾル局在化ペントースリン酸経路が欠如している。クラミドモナス属がその炭素の一次供給源として糖を用いる産業に受け入れられないことが、産業用生産株として見逃されている理由である。
【０００７】
クラミドモナス属の別の特徴は、増殖に必要とされるものを超えて、多量の栄養素を摂取できることである。いくつかの他の藻類が、これをある程度まで経験するが、クラミドモナス属は、典型的に、その栄養素の摂取がずっとより豊富である。これは、バイオマス組成に基づいて培地を設計する従来の培地配合表およびアプローチが、最適に満たない増殖、および多くの場合は阻害レベルの栄養素をもたらすことを意味する。さらに、葉緑素を含有しない、かつ現在まで従属栄養的発酵で商業化されている淡海水株または海水株、例えば、クリプテコジニウム属（Crypthecodinium）、シゾキトリウム属（Schizochytrium）、およびスラウストキトリウム属（Thraustochytrium）と比較して、クラミドモナス属は、その栄養素および環境調節要求がかなり異なる淡水藻類である。クラミドモナス属の大部分の野生型株は、他の緑藻類と比較して、葉緑素を天然で産生し、したがって、光の非存在下でさえも緑色を有する。さらに、多くの場合、緑藻類の培養法は、典型的には、特に接種培養中の1つまたは複数の段階で、いくらかの光インプットを含む。クロレラ属などの他の緑藻は、キチン細胞壁を有して、鞭毛を必要とせず、これは、産業的発酵において堅牢性を増大させることができる。クラミドモナス属の別の独特の特徴は、有性分裂および無性分裂の両方ができることである。これらの理由のすべては、リアクターにおいて高い性能および魅力的な組成物を達成するために、従来のアプローチおよび既存のプロトコールを通してはクラミドモナス属で以前に乗り越えられてきていない、非常に独特の一連の課題をもたらす。
【発明の概要】
【０００８】
概要
効率を改善し、コストを減少させ、かつ藻類によって産生されるバイオマスおよびタンパク質の収率を改善する、藻類を増殖させるための方法が、本明細書において提供される。暗条件または遮光条件における増殖条件中に、藻類を増殖させるため、および組換えタンパク質を含む藻類によって産生されるタンパク質を蓄積するための方法が、本明細書に含まれる。そのような条件には、増殖する（proliferate）ために外来性有機炭素源を必要とする条件において細胞を増殖させることが含まれる。様々な態様において、方法は、藻類培養物に、フルクトース、スクロース、グルコース、またはアセタートなどの外来性有機炭素源を投与することを含む。方法は、タンパク質および/もしくは組換えタンパク質を藻類細胞の内部に蓄積すること、または分泌経路を通したタンパク質および/もしくは組換えタンパク質の輸送によって、タンパク質および/もしくは組換えタンパク質を培地に蓄積することを含む。
【０００９】
また、クラミドモナス属などの緑藻類が、その一次炭素源として糖で増殖することを可能にする方法も、本明細書において提供される。これは、藻類バイオマスを生産するために必要とされるインプットのコストを有意に減少させると考えられる。緑藻類を高密度まで増殖させるために必要なインプットのコストの有意な減少を結果としてもたらす、クラミドモナス属を生産するための改善された方法が、本明細書において提供される。追加的に、その一次炭素源として糖で増殖することができない既存のクラミドモナス属を、接合によって糖で増殖することができるものに改変する方法が、本明細書に含まれる。
【００１０】
したがって、1つの局面において、本発明は、藻類種の高密度培養物を生産するための方法を提供する。方法は、藻類種を、好気性条件下で、少なくとも1つの外来性有機炭素源の存在下で増殖させる工程を含み、該藻類種は、増殖のためのエネルギー源として有機炭素源を用いることができる。様々な態様において、正味の酸素消費および正味のCO2産生が存在する。様々な態様において、藻類種は、クラミドモナス・ラインハーディ（Chlamydomonas reinhardtii）、クラミドモナス・ディソモス（Chlamydomonas dysomos）、クラミドモナス・ムンダン（Chlamydomonas mundane）、クラミドモナス・デバリアナ（Chlamydomonas debaryana）、クラミドモナス・モエブシィ（Chlamydomonas moewusii）、クラミドモナス・キュレウス（Chlamydomonas culleus）、クラミドモナス・ノクチガマ（Chlamydomonas noctigama）、クラミドモナス・オーラタ（Chlamydomonas aulata）、クラミドモナス・アプラナタ（Chlamydomonas applanata）、クラミドモナス・マルバニィ（Chlamydomonas marvanii）、クラミドモナス・プロボシゲラ（Chlamydomonas proboscigera）、およびこれらの任意の組み合わせなどの、クラミドモナス属種である。様々な態様において、少なくとも1つの外来性炭素源は、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、グリセロール、糖蜜、デンプン、セルロース、アセタート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００１１】
様々な態様において、クラミドモナス属種を、光の存在下で、限定された明条件において、または暗所において増殖させる。様々な態様において、クラミドモナス属種を、少なくとも30 g/L、少なくとも35 g/L、少なくとも40 g/L、少なくとも45 g/L、少なくとも50 g/L、少なくとも55 g/L、少なくとも60 g/L、少なくとも65 g/L、少なくとも70 g/L、少なくとも75 g/L、少なくとも80 g/L、少なくとも85 g/L、少なくとも90 g/L、少なくとも95 g/L、少なくとも100 g/L、少なくとも105 g/L、少なくとも110 g/L、少なくとも115 g/L、少なくとも120 g/L、または少なくとも125 g/Lの密度まで増殖させる。様々な態様において、培養物を、高密度発酵槽において増殖させる。様々な態様において、外来性の空気または酸素が、増殖工程中に供給される。
【００１２】
別の局面において、本発明は、クラミドモナス属種の培養物から組換えタンパク質を蓄積するための方法を提供する。方法は、組換えタンパク質を発現することができる組換えクラミドモナス属種の1つまたは複数の細胞を提供する工程、該1つまたは複数の細胞を、好気性条件下で、少なくとも1つの外来性有機炭素源の存在下で増殖させて、組換えクラミドモナス属種の培養物を産生する工程であって、該クラミドモナス属種が増殖のためのエネルギー源として有機炭素源を用いる、工程、および、組換えタンパク質を培養物から収集する工程を含む。様々な態様において、正味の酸素消費および正味のCO2産生が存在する。様々な態様において、藻類種は、クラミドモナス・ラインハーディ、クラミドモナス・ディソモス、クラミドモナス・ムンダン、クラミドモナス・デバリアナ、クラミドモナス・モエブシィ、クラミドモナス・キュレウス、クラミドモナス・ノクチガマ、クラミドモナス・オーラタ、クラミドモナス・アプラナタ、クラミドモナス・マルバニィ、クラミドモナス・プロボシゲラ、およびこれらの任意の組み合わせなどの、クラミドモナス属種である。様々な態様において、少なくとも1つの外来性炭素源は、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、グリセロール、糖蜜、デンプン、セルロース、アセタート、およびこれらの任意の組み合わせからなる群より選択される。
【００１３】
様々な態様において、クラミドモナス属種を、光の存在下で、限定された明条件において、または暗所において増殖させる。様々な態様において、クラミドモナス属種を、少なくとも30 g/L、少なくとも35 g/L、少なくとも40 g/L、少なくとも45 g/L、少なくとも50 g/L、少なくとも55 g/L、少なくとも60 g/L、少なくとも65 g/L、少なくとも70 g/L、少なくとも75 g/L、少なくとも80 g/L、少なくとも85 g/L、少なくとも90 g/L、少なくとも95 g/L、少なくとも100 g/L、少なくとも105 g/L、少なくとも110 g/L、少なくとも115 g/L、少なくとも120 g/L、または少なくとも125 g/Lの密度まで増殖させる。様々な態様において、培養物は、液体培地および細胞を含み、組換えタンパク質は、液体培地から、培養物の細胞から、またはその両方から収集される。
【００１４】
本明細書に記載される方法のいずれかの様々な態様において、組換えタンパク質は、葉緑体において発現される。様々な態様において、関心対象の組換え遺伝子の発現は、内在性葉緑体ゲノムの16Sプロモーターを用いて駆動される。様々な態様において、クラミドモナス属培養の生産性（培養物1リットル（L）当たりのクラミドモナス属バイオマスのグラム（g））は、少なくとも約0.3 g/L/時間、少なくとも約0.5 g/L/時間、少なくとも約0.6 g/L/時間、少なくとも約0.9 g/L/時間、少なくとも約1.5 g/L/時間、または少なくとも約2 g/L/時間である。様々な態様において、外来性有機炭素源におけるクラミドモナス属バイオマスの変換効率は、少なくとも約0.3 gバイオマス/g炭素源、少なくとも約0.4 gバイオマス/g炭素源、少なくとも約0.5 gバイオマス/g炭素源、少なくとも約0.6 gバイオマス/g炭素源、または少なくとも約0.7 gバイオマス/g炭素源である。様々な態様において、クラミドモナス属培養物のクラミドモナス属バイオマスの総タンパク質含量は、少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、または少なくとも約70％である。様々な態様において、収集の時のクラミドモナス属培養物は、少なくとも約0.3 gバイオマス/リットル/時間の生産率、および培養物1リットル当たり50 gバイオマスの密度を有する。
【００１５】
別の局面において、本発明は、発現カセットを提供する。発現カセットは、5'非翻訳領域（5'UTR）に融合した藻類16Sプロモーターと、組換えタンパク質をコードする核酸分子とを含み、該5'UTRは、psbM、psaA、psaB、psbI、psbK、clpP、rpl14、rps7、rps14、およびrps19 5'UTRからなる群より選択される。様々な態様において、発現カセットは、暗条件または限定された明条件において増殖する、クラミドモナス属種などの藻類種における組換えタンパク質の発現を提供する。様々な態様において、5'UTRは、SEQ ID NO: 12〜20および21からなる群より選択される配列を含むか、または、SEQ ID NO: 12〜20および21からなる群より選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む。様々な態様において、16Sプロモーターは、クラミドモナス属種由来の16Sプロモーターである。様々な態様において、16Sプロモーターは、SEQ ID NO: 1であるか、または、SEQ ID NO: 1に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列である。様々な態様において、発現カセットは、SEQ ID NO: 2〜10および11からなる群より選択される配列を含むか、または、SEQ ID NO: 2〜10および11からなる群より選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む。
【００１６】
別の局面において、本発明は、藻類において組換えタンパク質を発現させる方法を提供する。方法は、5'非翻訳領域（5'UTR）に融合した藻類16Sプロモーターと、組換えタンパク質をコードする核酸分子とを含む発現カセットを、藻類中に導入する工程、および、該藻類を暗条件または限定された明条件下で増殖させる工程を含み、該5'UTRは、psbM、psaA、psaB、psbI、psbK、clpP、rpl14、rps7、rps14、およびrps19 5'UTRからなる群より選択される。様々な態様において、藻類種は、クラミドモナス・ラインハーディ、クラミドモナス・ディソモス、クラミドモナス・ムンダン、クラミドモナス・デバリアナ、クラミドモナス・モエブシィ、クラミドモナス・キュレウス、クラミドモナス・ノクチガマ、クラミドモナス・オーラタ、クラミドモナス・アプラナタ、クラミドモナス・マルバニィ、クラミドモナス・プロボシゲラ、およびこれらの任意の組み合わせなどの、クラミドモナス属種である。
【００１７】
様々な態様において、5'UTRは、SEQ ID NO: 12〜20および21からなる群より選択される配列を含むか、または、SEQ ID NO: 12〜20および21からなる群より選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む。様々な態様において、16Sプロモーターは、クラミドモナス属種由来の16Sプロモーターである。様々な態様において、16Sプロモーターは、SEQ ID NO: 1であるか、または、SEQ ID NO: 1に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列である。様々な態様において、発現カセットは、SEQ ID NO: 2〜10および11からなる群より選択される配列を含むか、または、SEQ ID NO: 2〜10および11からなる群より選択される配列に対して少なくとも80％の配列同一性を有する配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
特許請求される発明のこれらのおよび他の特徴、局面、および利点は、以下の説明、添付の特許請求の範囲、および付随する図面に関連して、より良好に理解されるようになるであろう。
【００１９】
【図１】暗条件または限定された明条件において組換えタンパク質の発現を達成するために用いられる、例示的な分子構築物を示す絵図である。
【図２】暗条件または遮光条件においてタンパク質蓄積を駆動するために用いられる、16Sプロモーター（SEQ ID NO: 1）とpsbM 5'非翻訳領域（SEQ ID NO: 17）との合成融合物のDNA配列（SEQ ID NO: 7）の図示である。
【図３】暗条件または遮光条件においてタンパク質蓄積を駆動するために用いられる、16Sプロモーター（SEQ ID NO: 1）とpsaA 5'非翻訳領域（SEQ ID NO: 12）との合成融合物のDNA配列（SEQ ID NO: 2）の図示である。
【図４】暗条件または遮光条件においてタンパク質蓄積を駆動するために用いられる、16Sプロモーター（SEQ ID NO: 1）とpsaB 5'非翻訳領域（SEQ ID NO: 13）との合成融合物のDNA配列（SEQ ID NO: 3）の図示である。
【図５】暗条件または遮光条件においてタンパク質蓄積を駆動するために用いられる、16Sプロモーター（SEQ ID NO: 1）とpsbI 5'非翻訳領域（SEQ ID NO: 15）との合成融合物のDNA配列（SEQ ID NO: 5）の図示である。
【図６】暗条件または遮光条件においてタンパク質蓄積を駆動するために用いられる、16Sプロモーター（SEQ ID NO: 1）とpsbK 5'非翻訳領域（SEQ ID NO: 16）との合成融合物のDNA配列（SEQ ID NO: 6）の図示である。
【図７】暗条件または遮光条件においてタンパク質蓄積を駆動するために用いられる、16Sプロモーター（SEQ ID NO: 1）とrpl14 5'非翻訳領域（SEQ ID NO: 20）との合成融合物のDNA配列（SEQ ID NO: 8）の図示である。
【図８】暗条件または遮光条件においてタンパク質蓄積を駆動するために用いられる、16Sプロモーター（SEQ ID NO: 1）とclpP 5'非翻訳領域（SEQ ID NO: 14）との合成融合物のDNA配列（SEQ ID NO: 4）の図示である。
【図９】暗条件または遮光条件においてタンパク質蓄積を駆動するために用いられる、16Sプロモーター（SEQ ID NO: 1）とrps7 5'非翻訳領域（SEQ ID NO: 19）との合成融合物のDNA配列（SEQ ID NO: 9）の図示である。
【図１０】暗条件または遮光条件においてタンパク質蓄積を駆動するために用いられる、16Sプロモーター（SEQ ID NO: 1）とrps14 5'非翻訳領域（SEQ ID NO: 20）との合成融合物のDNA配列（SEQ ID NO: 10）の図示である。
【図１１】暗条件または遮光条件においてタンパク質蓄積を駆動するために用いられる、16Sプロモーター（SEQ ID NO: 1）とrps19 5'非翻訳領域（SEQ ID NO: 21）との合成融合物のDNA配列（SEQ ID NO: 11）の図示である。
【図１２】16Sプロモーターおよび様々な5'非翻訳領域の遺伝子調節中の、暗条件下での組換えflagタグ付加タンパク質の蓄積を実証する、ウェスタンブロットおよびELISAからの結果を示す絵図である。
【図１３】組換えウシオステオポンチンの発現を駆動する16SプロモーターおよびpsbM 5'UTRで形質転換された藻類培養物の、経時的なオステオポンチンタンパク質の蓄積を示すグラフ図である。
【図１４】外来性有機炭素源でのクラミドモナス属株の増殖を示す絵図である。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
本明細書および添付の特許請求の範囲において用いられる場合、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」、および「その（the）」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の言及を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、本開示を読んだ時などに当業者に明らかになるであろう、1つもしくは複数の方法、および/または本明細書に記載されるタイプの工程を含む。
【００２１】
「含む（comprising）」という用語は、「含む（including）」、「含有する」、または「特徴とする」と互換的に用いられ、包括的または開放型の言語であり、追加的な、列挙されていない要素または方法工程を排除しない。「からなる」という句は、特許請求の範囲において特定されていない任意の要素、工程、または成分を排除する。「から本質的になる」という句は、特許請求の範囲を、特定された材料または工程、ならびに特許請求される発明の基本的なおよび新規の特徴に物質的に影響を及ぼさないものに限定する。本開示は、これらの句の各々の範囲に対応する、本発明の組成物および方法の態様を企図する。したがって、列挙される要素または工程を含む組成物または方法は、組成物または方法が、それらの要素または工程から本質的になるかまたはそれからなる特定の態様、ならびに、それらの要素または工程が含まれ、かつまた追加的な要素または工程を含んでもよい態様を企図する。
【００２２】
別段の定義がない限り、本明細書において用いられるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野における当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を、本発明の実施または試験において用いることができるが、好ましい方法および材料を次に記載する。
【００２３】
本明細書において用いられる藻類とは、非維管束藻類を指し、微細藻類として分類される生物を含み得る。本開示において、微細藻類および藻類という用語は互換的に用いられることが、注意されるべきである。本明細書において開示される方法を実施するために用いられ得る微細藻類の属の非限定的な例には、原核緑色植物門（Prochlorophyta）、紅藻植物門（Rhodophyta）、緑藻植物門（Chlorophyta）、不等毛植物門（Heterokontophyta）、黄緑藻植物門（Tribophyta）、灰色植物門（Glaucophyta）、クロララクニオン植物（Chlorarachniophytes）、ユーグレナ植物門（Euglenophyta）、ユーグレナ藻類（Euglenoids）、ハプト植物門（Haptophyta）、黄金色植物門（Chrysophyta）、クリプト植物門（Cryptophyta）、クリプト藻類（Cryptomonads）、渦鞭毛植物門（Dinophyta）、渦鞭毛虫類（Dinoflagellata）、プリネシウム植物門（Pyrmnesiophyta）、珪藻植物門（Bacillariophyta）、黄緑色植物門（Xanthophyta）、真正眼点植物門（Eustigmatophyta）、ラフィド藻門（Raphidophyta）、および褐藻植物門（Phaeophyta）が含まれる。様々な態様において、本明細書に記載される方法を実施するために用いられる藻類は、クラミドモナス属のものである。様々な態様において、開示される方法を実施する際に用いられる藻類は、クラミドモナス・ラインハーディ（C. ラインハーディ）である。
【００２４】
ある範囲の値が提供される場合、その範囲の上限と下限の間の、文脈上明らかに別段の指示がない限り下限の単位の10分の1までの各介在値もまた、具体的に開示されていると理解される。述べられている範囲における任意の述べられている値または介在値と、その述べられている範囲における任意の他の述べられている値または介在値との間の各々のより小さな範囲が包含される。これらのより小さな範囲の上限および下限は、独立して範囲に含まれるかまたは除外されることができ、述べられる範囲における任意の具体的に除外される限界に従って、より小さな範囲にいずれかの限界が含まれるか、いずれの限界も含まれないか、または両方の限界が含まれる各範囲もまた包含される。述べられる範囲が限界の一方または両方を含む場合、それらの含まれる限界のいずれかまたは両方を除外した範囲もまた含まれる。
【００２５】
「暗」または「遮光」という用語は、150マイクロアインシュタイン未満である条件を意味する。
【００２６】
「明条件」とは、正味のO2産生およびCO2産生が存在する条件を意味する。
【００２７】
「限定された明るさ」という用語は、藻類培養物による正味の正の二酸化炭素（CO2）産生および酸素（O2）放出が存在する条件を意味する。
【００２８】
「光合成」または「光独立栄養藻類」とは、エネルギーの供給源として光子の捕捉を用い、無機炭素を固定することができる藻類を指す。よって、光合成藻類は、代謝炭素の供給源として光の存在下で無機炭素を用いることができる。
【００２９】
本明細書において用いられる場合、「従属栄養藻類」とは、エネルギー源として光子の捕捉を用いないが、その代わりに有機炭素源に頼る藻類を指す。
【００３０】
「混合栄養藻類」とは、増殖を支持するために光子の捕捉および無機炭素固定を用いることができるが、光の非存在下ではエネルギー源として有機炭素を用い得る藻類を意味する。したがって、混合栄養藻類は、光合成藻類および従属栄養藻類の両方の代謝特性を有する。
【００３１】
糖には、別段の指定がない限り、すべての単糖類、二糖類、オリゴ糖類、および多糖類が含まれる。単糖類の非限定的な例は、フルクトース、グルコース、およびガラクトースである。二糖類の非限定的な例は、ラクトース、マルトース、およびスクロースである。オリゴ糖類の非限定的な例は、フラクトオリゴ糖およびガラクトオリゴ糖である。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、「発現カセット」とは、1つまたは複数の遺伝子およびその発現を調節する1つまたは複数の制御配列を含むDNAの一部を指す。各々の成功した形質転換において、発現カセットは、1つまたは複数の遺伝子によってコードされるRNAおよび/またはタンパク質を作るように細胞の機構を方向づける。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、「遺伝子」という用語は、機能を有する分子をコードするデオキシリボヌクレオチド配列を意味する。「構造遺伝子」とは、制御因子以外のRNAまたはタンパク質をコードする遺伝子を指すが、それでもなお、「遺伝子」の定義内に包含される。「遺伝子」はまた、遺伝子が完全長mRNAの長さに対応するように、5'末端および3'末端の両方にコード領域に隣接して位置する非翻訳配列を含んでもよい。コード領域の5'に位置し、mRNA上に存在する配列を、5'非翻訳（non-translated）配列（あるいは、5'非翻訳（untranslated）領域（5'UTR））と呼ぶ。コード領域の3'または下流に位置し、mRNA上に存在する配列を、3'非翻訳配列と呼ぶ。「遺伝子」という用語は、遺伝子のcDNAおよびゲノム型の両方を包含する。
【００３４】
藻類生産のための増殖条件および方法
藻類においてタンパク質を蓄積するための方法が、本明細書において提供される。いくつかの態様において、蓄積されるタンパク質は、1つまたは複数の天然に存在するタンパク質である。いくつかの態様において、蓄積されるタンパク質は、組換えタンパク質などの異種タンパク質である。いくつかの態様において、蓄積されるタンパク質は、細胞内に蓄積される。いくつかの態様において、タンパク質は、藻類が増殖する培養培地中に蓄積される。タンパク質を蓄積するための方法のいくつかの態様において、藻類を、暗い従属栄養条件において増殖させる。タンパク質を蓄積するための方法のいくつかの態様において、藻類を、限定された明るさの混合栄養条件において増殖させる。これらの方法は、藻類細胞に対する光照射の必要がない、タンパク質の蓄積を促進する遺伝子ツールおよび生産プロセスを含む。また、好気性従属栄養培養の条件下で、藻類を高密度まで増殖させるため、および藻類によって発現されるタンパク質を蓄積するための方法も、本明細書において提供される。
【００３５】
本明細書において開示される方法を実施するために用いられ得る微細藻類の属の非限定的な例には、原核緑色植物門、紅藻植物門、緑藻植物門、不等毛植物門、黄緑藻植物門、灰色植物門、クロララクニオン植物、ユーグレナ植物門、ユーグレナ藻類、ハプト植物門、黄金色植物門、クリプト植物門、クリプト藻類、渦鞭毛植物門、渦鞭毛虫類、プリネシウム植物門、珪藻植物門、黄緑色植物門、真正眼点植物門、ラフィド藻門、および褐藻植物門が含まれる。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法を実施するために用いられる藻類は、クラミドモナス属のものである。本明細書における方法での使用のための例示的なクラミドモナス属種には、クラミドモナス・ラインハーディ、クラミドモナス・ディソモス、クラミドモナス・ムンダン、クラミドモナス・デバリアナ、クラミドモナス・モエブシィ、クラミドモナス・キュレウス、クラミドモナス・ノクチガマ、クラミドモナス・オーラタ、クラミドモナス・アプラナタ、クラミドモナス・マルバニィ、クラミドモナス・シュードコクム（Chlamydomonas pseudococum）、クラミドモナス・シュードグロウ（Chlamydomonas pseudoglou）、クラミドモナス・スノー（Chlamydomonas sno）、またはクラミドモナス・プロボシゲラが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの態様において、開示される方法を実施する際に用いられる藻類は、クラミドモナス・ラインハーディ（C. ラインハーディ）である。
【００３６】
いくつかの態様において、本明細書における方法での使用のためのクラミドモナス属の株を含むがそれに限定されない藻類の株を創出するために、接合が使用される。接合は、2つの接合型、例えば、クラミドモナス属の接合型マイナス株および接合型ポジティブ株を遺伝的に交雑させることによって達成することができる。接合の非限定的な例において、クラミドモナス属の接合型マイナス株は、娘細胞にそのミトコンドリアゲノムを供与し、接合型ポジティブ株は、同じ娘細胞にその葉緑体プラスチドゲノムを供与する。有性生殖を刺激するために、クラミドモナス属の細胞を窒素飢餓状態にすると、クラミドモナス属種は、接合の工程後に接合子を形成する。接合していないクラミドモナス属は、接合していない細胞を選択的に死滅させるクロロホルムへの曝露によって除去することができる。次いで、窒素に富む培地の添加によって、接合子を再繁殖させることができる。いくつかの例において、接合しているクラミドモナス属は、接合子の形成の前に鞭毛を有する。藻類を接合させるための他の方法が、当技術分野において利用可能であり、本明細書に記載される方法で使用することができる。
【００３７】
暗条件および限定された明条件における増殖
本明細書における方法のいくつかの態様において、藻類を、光合成を可能にしない条件下で増殖させる（例えば、生物を、光の非存在下で増殖させてもよい）。いくつかの態様において、藻類を、150マイクロアインシュタイン未満である「暗」または「遮光」条件において増殖させる。いくつかの態様において、本開示の実施において用いられる藻類は、混合栄養性または従属栄養性であり得る。
【００３８】
（天然にまたは選択によって）微生物が光合成をできない増殖条件において、方法は、光および光合成の非存在下での増殖を支持するために、必要な栄養素を藻類に提供することを含む。例えば、生物がその中で（またはその上で）増殖する培養培地に、有機炭素源、窒素源、リン源、ビタミン、金属、脂質、核酸、微量栄養素、および/または任意の生物特異的な必要物を含む、任意の必要とされる栄養素を補給してもよい。有機炭素源には、アセタート、単純糖質（例えば、グルコース、スクロース、ラクトース）、複合糖質（例えば、デンプン、グリコーゲン）、タンパク質、および脂質を含むがそれらに限定されない、宿主生物が代謝することができる任意の炭素の供給源が含まれる。当業者は、すべての生物が特定の栄養素を十分に代謝できるわけではないこと、および、適切な栄養素ミックスを提供するためには、栄養素混合物を生物によって改変する必要があり得ることを認識しているであろう。
【００３９】
様々な態様において、藻類を、光の非存在下で増殖させる。光の非存在下での高密度藻類培養物の生産のための例示的な方法は、IMPROVED METHOD FOR GROWING ALGAEという題名のWO201838960として公開されているPCT/US2017/046831において見出すことができ、これはその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４０】
本明細書における方法のいくつかの態様において、タンパク質は、藻類細胞の内部に蓄積する。この蓄積は、葉緑体、ミトコンドリア、サイトゾル、小胞体、またはペリプラズム腔において起こり得る。いくつかの態様において、そのようなオルガネラまたは細胞空間に蓄積されるタンパク質は、1つまたは複数の組換えタンパク質である。本明細書における方法のいくつかの態様において、タンパク質は、培養培地中の細胞の外部に蓄積される。いくつかの態様において、培養培地に蓄積されるタンパク質は、1つまたは複数の組換えタンパク質である。
【００４１】
いくつかの態様において、組換えタンパク質は、藻類細胞に蓄積し、重量により全細胞の約0.01％〜全細胞の約20％である。他の態様において、組換えタンパク質は、藻類培養物の重量の約20％、約19％、約18％、約17％、約16％、約15％、約14％、約13％、約12％、約11％、約10％、約9％、約8％、約7％、約6％、約5％、約4％、約3％、約2％、約1％、約0.1％、または約0.01％を占める。いくつかの態様において、組換えタンパク質は、細胞の外部に蓄積し、重量により全細胞の約0.01％〜全細胞の約20％である。他の態様において、組換えタンパク質は、藻類培養物の重量の約20％、約19％、約18％、約17％、約16％、約15％、約14％、約13％、約12％、約11％、約10％、約9％、約8％、約7％、約6％、約5％、約4％、約3％、約2％、約1％、約0.1％、または約0.01％として培地に蓄積する。
【００４２】
いくつかの態様において、本明細書における方法は、藻類の高密度かつ高生産性の培養物を提供する。いくつかの態様において、培養の生産性（培養物1リットル（L）当たりの藻類バイオマスのグラム（g））は、少なくとも約0.3 g/L/時間、少なくとも約0.5 g/L/時間、少なくとも約0.6 g/L/時間、少なくとも約0.9 g/L/時間、少なくとも約1.5 g/L/時間、または少なくとも約2 g/L/時間である。いくつかの態様において、提供された外来性有機炭素源の藻類のバイオマスへの変換効率は、少なくとも約0.3 gバイオマス/g炭素源、少なくとも約0.4 gバイオマス/g炭素源、少なくとも約0.5 g バイオマス/g炭素源、少なくとも約0.6 gバイオマス/g炭素源、または少なくとも約0.7 gバイオマス/g炭素源である。いくつかの態様において、外来性有機炭素源の存在下で増殖する藻類は、高タンパク質藻類バイオマスを生産する。いくつかの態様において、高タンパク質バイオマスは、総バイオマス重量当たり少なくとも約20％、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約45％、少なくとも約50％、少なくとも約55％、少なくとも約60％、または少なくとも約70％のタンパク質である。
【００４３】
いくつかの態様において、本明細書における方法は、所望のアミノ酸含量（総タンパク質含量当たりのアミノ酸画分として表現される）を有する藻類バイオマスを生産する。いくつかの態様において、藻類バイオマスは、総タンパク質含量の少なくとも約5％のリジン画分を有する。いくつかの態様において、藻類バイオマスは、総タンパク質含量の少なくとも約2％のメチオニン画分を有する。いくつかの態様において、藻類バイオマスは、総タンパク質含量の少なくとも約4％のスレオニン画分を有する。いくつかの態様において、藻類バイオマスは、総タンパク質含量の少なくとも約2％のトリプトファン画分を有する。いくつかの態様において、藻類バイオマスは、総タンパク質含量の少なくとも約5％のバリン画分を有する。
【００４４】
いくつかの態様において、本明細書における方法は、規定されたpHおよび/または規定された温度の条件において藻類の生産培養物を増殖させることを含む。いくつかの態様において、生産培養物は、好気的に約2.0〜10.0のpHである。いくつかの態様において、生産培養物のpHは、約2.0、約2.5、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、約9.0、約9.5、または約10.0で維持される。いくつかの態様において、生産培養物は、約5℃〜約50℃の温度で増殖する。いくつかの態様において、温度は、約5℃〜約10℃、約10℃〜約15℃、約15℃〜約20℃、約20℃〜約25℃、約25℃〜約30℃、約30℃〜約35℃、約30℃〜約40℃、約35℃〜約40℃、約40℃〜約45℃、または約45℃〜約50℃である。したがって、いくつかの態様において、温度は、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、もしくは40℃であるか、または約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、もしくは約40℃である。
【００４５】
炭素源
また、1つまたは複数の外来性有機炭素源が、エネルギー源および/または炭素の供給源としての使用のために藻類培養物に提供される、藻類を増殖させるための方法も、本明細書において提供される。本明細書における方法で提供され得るそのような外来性有機炭素源には、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、グリセロール、糖蜜、デンプン、セルロース、アセタート、およびこれらの任意の組み合わせが含まれるが、それらに限定されない。いくつかの態様において、方法は、藻類の高密度培養物の好気性従属栄養培養を含み、該培養物は、1つの外来性有機炭素源または外来性有機炭素源の組み合わせを用いて増殖する。いくつかの態様において、方法は、藻類の高密度培養物の好気性従属栄養培養を含み、該培養物は、外来性有機炭素源として1つの糖または糖の組み合わせを用いて増殖する。いくつかの態様において、グリセロールおよびアセタートなどの他の外来性炭素源の組み合わせ、または糖および非糖外来性有機炭素源の組み合わせが、方法において使用される。
【００４６】
いくつかの態様において、藻類は、約10 g/L〜約300 g/L乾燥細胞重量の標的密度を達成するために、1つまたは複数の外来性有機炭素源を用いて増殖させる。ある特定の態様において、培養物は、少なくとも約10 g/L、少なくとも約25 g/L、少なくとも約50 g/L、少なくとも約60 g/L、少なくとも約70 g/L、少なくとも約80 g/L、少なくとも約90 g/L、少なくとも約100 g/L、少なくとも約110 g/L、少なくとも約120 g/L、少なくとも約130 g/L、少なくとも約140 g/L、少なくとも約150 g/L、少なくとも約160 g/L、少なくとも約170 g/L、少なくとも約180 g/L、少なくとも約190 g/L、または少なくとも約200 g/L乾燥細胞重量の標的密度を達成する。他の態様において、標的密度は、約50 g/L〜約75 g/L、約75 g/L〜約100 g/L、約100 g/L〜約125 g/L、約125 g/L〜約150 g/L、約150 g/L〜約175 g/L、または約175 g/L〜約200 g/L乾燥細胞重量である。ある特定の態様において、生産培養物は、収集の前に約25 g/L、約30 g/L、約35 g/L、約40 g/L、約45 g/L、約50 g/L、約55 g/L、約65 g/L、約70 g/L、約75 g/L、約80 g/L、約85 g/L、約90 g/L、約95 g/L、約100 g/L、約105 g/L、約110 g/L、約115 g/L、約120 g/L、約125 g/L、約130 g/L、約135 g/L、約140 g/L、約145 g/L、約150 g/L、約155 g/L、約160 g/L、約165 g/L、約170 g/L、約175 g/L、約180 g/L、約185 g/L、約190 g/L、約195 g/L 、または約200 g/L乾燥細胞重量の密度まで増殖する。いくつかの態様において、標的密度または濃度には、生産培養の開始後約96時間以内に達する。いくつかの態様において、標的密度または濃度には、生産培養の開始後約96時間、約120時間、約150時間、約175時間、約200時間、約220時間、または約250時間以内に達する。いくつかの態様において、標的密度または濃度には、生産培養の開始後約250時間以内に達する。
【００４７】
いくつかの態様において、本明細書に記載される方法で増殖する藻類は、クラミドモナス属種である。外来性炭素源で増殖させる方法において用いられるクラミドモナス属種は、外来性有機炭素源での従属栄養増殖もしくは混合栄養増殖ができる任意の種、または、結果として生じた株が外来性有機炭素源で増殖する能力を受け継ぐように、そのような増殖能力を有するクラミドモナス属と接合することができる任意の種であることができる。いくつかの態様において、選択される種は、炭素源として1つまたは複数の糖で増殖する能力を有する。本明細書における方法での使用のための例示的なクラミドモナス属種には、クラミドモナス・ラインハーディ、クラミドモナス・ディソモス、クラミドモナス・ムンダン、クラミドモナス・デバリアナ、クラミドモナス・モエブシィ、クラミドモナス・キュレウス、クラミドモナス・ノクチガマ、クラミドモナス・オーラタ、クラミドモナス・アプラナタ、クラミドモナス・マルバニィ、クラミドモナス・シュードコクム、クラミドモナス・シュードグロウ、クラミドモナス・スノー、またはクラミドモナス・プロボシゲラが含まれるが、それらに限定されない。
【００４８】
いくつかの態様において、1つまたは複数の糖で増殖するクラミドモナス属種は、異種または外来性の遺伝子を含有しない野生型の種である。他の態様において、1つまたは複数の糖で増殖するクラミドモナス属種は、組換えであり、かつ/または少なくとも1つの異種もしくは外来性の遺伝子を含有する。いくつかの態様において、異種または外来性の遺伝子は、クラミドモナス属以外の種由来である。他の態様において、異種または外来性の遺伝子は、クラミドモナス属種由来である。
【００４９】
いくつかの態様において、1つまたは複数の糖などの1つまたは複数の有機外来性炭素源で増殖させる方法において用いられるクラミドモナス属種は、その一次炭素源として有機炭素源では以前に増殖することができなかったクラミドモナス属に由来し、本明細書における方法は、それによってクラミドモナス属種が、別の株の藻類との接合、交配、交雑、またはプロトプラスト融合を通して、その一次炭素源として糖などの有機炭素源で増殖する機構を受け継ぐ、そのような能力を提供することを含む。
【００５０】
様々な態様において、外来性有機炭素源として藻類によって消費されている糖などの有機炭素源は、基礎培地において見出される。様々な態様において、炭素源として藻類によって消費されている糖などの有機炭素源は、フィード培地において供給されている。
【００５１】
明条件
本明細書における方法のいくつかの態様において、藻類は、明るさが限定されている条件において増殖し、藻類培養物は、正味の正のCO2産生およびO2放出を有する。様々な態様において、生産培養物は、明るさが限定された条件下で増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、グルコース、フルクトース、スクロース、マルトース、グリセロール、糖蜜、デンプン、セルロース、アセタート、およびこれらの任意の組み合わせなどの有機炭素源である。
【００５２】
様々な態様において、生産培養物は、明るさが限定された条件において増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、糖以外の何か、例えばアセタートまたはグリセロールである。いくつかの態様において、限定された明条件において増殖する藻類培養物は、クラミドモナス属種である。いくつかの態様において、限定された明条件において増殖する藻類培養物は、クラミドモナス・ラインハーディである。
【００５３】
様々な態様において、生産培養物は、明条件において増殖し、そこでは、糖が依然として藻類培養物によって消費されて代謝されており、正味のO2産生およびCO2産生が存在する。様々な態様において、生産培養物は、明条件下で増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が糖である。様々な態様において、生産培養物は、明条件において増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、糖以外の何か、例えばアセタートまたはグリセロールである。様々な態様において、生産培養物は、明条件において増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、糖および非糖炭素源の組み合わせである。いくつかの態様において、そのような明条件において増殖する藻類培養物は、クラミドモナス属種である。いくつかの態様において、そのような明条件において増殖する藻類培養物は、クラミドモナス・ラインハーディである。
【００５４】
様々な態様において、藻類生産培養物は、暗所において増殖し、そこでは、1つまたは複数の糖などの外来性炭素源が、代謝エネルギーを生成するために用いられる唯一の炭素源である。様々な態様において、生産培養物は、暗所において増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が糖である。様々な態様において、生産培養物は、暗所において増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、糖以外の何か、例えばアセタートまたはグリセロールである。様々な態様において、生産培養物は、暗所において増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、糖および非糖炭素源の組み合わせである。いくつかの態様において、暗所において増殖する藻類培養物は、クラミドモナス属種である。いくつかの態様において、暗所において増殖する藻類培養物は、クラミドモナス・ラインハーディである。
【００５５】
いくつかの態様において、生産培養物は、混合栄養的に成長し、そこでは、活動的な光合成および外来性炭素源の消費が存在する。様々な態様において、生産培養物は、混合栄養的に増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が糖である。様々な態様において、生産培養物は、混合栄養的に増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、糖以外の何か、例えばアセタートまたはグリセロールである。様々な態様において、生産培養物は、混合栄養的に増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、糖および非糖炭素源の組み合わせである。いくつかの態様において、混合栄養的に増殖する藻類培養物は、クラミドモナス属種である。いくつかの態様において、混合栄養的に増殖する藻類培養物は、クラミドモナス・ラインハーディである。
【００５６】
本明細書における方法のいくつかの態様において、暗条件、限定された明条件、明条件、および/または1つもしくは複数の外来性炭素源を伴う増殖条件下での、クラミドモナス属藻類の1つまたは複数の種の培養が提供され、そこでは、培養の密度が、24時間当たり約50％〜約300％、約50％〜約100％、約100％〜約150％、約150％〜約200％、約200％〜約250％、または約250％〜約300％の速度で増加する。
【００５７】
別の局面において、暗条件、限定された明条件、明条件、および/または1つもしくは複数の炭素源を伴う増殖条件下で培養することができるクラミドモナス属藻類の1つまたは複数の種の培養が提供され、そこでは、培養の密度が、24時間当たり少なくとも約50％、少なくとも約75％、少なくとも約100％、少なくとも約125％、少なくとも約150％、少なくとも約175％、少なくとも約200％、少なくとも約225％、少なくとも約250％、少なくとも約275％、または少なくとも約300％増加する。
【００５８】
また、定常状態の条件下で培養することができるクラミドモナス属藻類の1つまたは複数の種の藻類培養物も提供され、該培養物は、少なくとも約50 g/L、少なくとも約60 g/L、少なくとも約70 g/L、少なくとも約80 g/L、少なくとも約90 g/L、少なくとも約100 g/L、少なくとも約110 g/L、少なくとも約120 g/L、少なくとも約130 g/L、少なくとも約140 g/L、少なくとも約150 g/L、少なくとも約160 g/L、少なくとも約170 g/L、少なくとも約180 g/L、少なくとも約190 g/L、または少なくとも約200 g/L乾燥細胞重量の藻類の密度を有し、定常状態は、培養物における藻類の濃度が、24時間当たり約0.1％〜約500％増加する状態として定義される。
【００５９】
本明細書における方法のいくつかの態様において、そのように培養される藻類は、葉緑素を産生する。いくつかの態様において、生産中の藻類の葉緑素含量は、少なくとも約1％、少なくとも約2％、少なくとも約5％、少なくとも約10％、または少なくとも約20％である。
【００６０】
培養法
本明細書において開示されるように、藻類を培養するための方法は、培養物の効率、衛生、および/または生産特性を改善する条件の提供を含むことができる。そのような条件には、培養物の栄養素含量、pH、露光、密度、および他の特徴のモニタリングおよび/または調節が含まれる。
【００６１】
いくつかの態様において、藻類培養物に、外来性炭素有機源が提供される。いくつかの態様において、外来性炭素源は、窒素フィードに対して固定された比で、藻類培養物に提供される。様々な態様において、窒素フィードは、固定されたpHを維持するように調整することができる。
【００６２】
いくつかの態様において、外来性有機炭素源は、藻類培養のための発酵（生産）期間を通して提供される。いくつかの態様において、外来性有機炭素源は、発酵期間の一部の間提供される。いくつかの態様において、外来性有機炭素源は、培養培地中の溶存酸素濃度における変化に応答して添加される。いくつかの態様において、外来性有機炭素源は、約0.9〜約1.1の呼吸商を維持するように添加される。いくつかの態様において、培養培地中の溶存酸素濃度は、バイオマスが少なくとも約20 g/L、少なくとも約30 g/L、少なくとも約40 g/L、または少なくとも約50 g/Lの密度に達した後、発酵中に約1％よりも下、約3％よりも下、または約5％よりも下で維持される。
【００６３】
培養物に対する栄養素、外来性有機炭素源、ミネラル、および/または酸素の提供における調整は、例えば、バイオリアクターにおけるオンライン測定によって、培養物中の濃度のリアルタイム測定に応答して行うことができる。そのような調整はまた、培養物からの濃度のオフライン測定に応答して行うこともできる。
【００６４】
藻類を培養するため、例えばクラミドモナス属種を培養するための例示的な条件には、少なくとも約0.5 g/Lのバイオマス密度で生産（発酵）培養を開始することが含まれる。発酵の開始時に、総ブロス（培養培地）伝導率/細胞培養物の密度の比は、1 g/Lの細胞培養物に対して約1 mS/cm/mLよりも下、約5 mS/cm/mLよりも下、約10 mS/cm/mLよりも下、約15 mS/cm/mLよりも下、または約20 mS/cm/mLよりも下である。いくつかの例において、総ブロス伝導率は、発酵を通して約5 mS/cm/mlよりも下、約10 mS/cm/mlよりも下、約15 mS/cm/mlよりも下、または約20 mS/cm/mlよりも下で維持される。いくつかの態様において、溶存酸素は、バイオマスが少なくとも約20 g/L、少なくとも約30 g/L、少なくとも約40 g/L、または少なくとも約50 g/Lに達した後、発酵中に約1％よりも下、約3％よりも下、または約5％よりも下で維持される。
【００６５】
いくつかの態様において、発酵中に、一部が取り出されるかまたは収集された後にいくらかの培養物が発酵槽に残ってもよく、次いで、新鮮な培地を添加して新たな発酵を開始することができるような、半連続モードの操作が使用される。半連続モードのいくつかの態様において、最大で約5％、約10％、約15％、約20％、約30％、約40％、約50％、約60％、約70％、約80％、または約90％のブロスが、発酵槽に残され、新鮮な培地を添加するかまたはフィードして、その後の発酵を開始する。いくつかの態様において、発酵中に、ブロス（細胞を伴う）が収集されると同時にブロス（培養培地）がリアクター中にフィードされるような、連続モードの操作が使用される。
【００６６】
いくつかの態様において、クラミドモナス属種の高密度培養物を生産するように、藻類を、好気条件下、外来性有機炭素源の存在下で培養し、結果として生じた培養物は、正味の酸素消費およびCO2産生を有する。いくつかの例において、総バイオマス密度が少なくとも約60 g/Lである場合、正味の酸素消費およびCO2産生が起こる。
【００６７】
発現カセット
別の局面において、本開示は、関心対象の遺伝子が、暗条件または明るさが限定された条件において増殖する藻類において発現されることを可能にする、発現カセットを提供する。様々な態様において、本発明の発現カセットは、関心対象のタンパク質をコードする核酸配列を、宿主細胞（すなわち、藻類細胞）における核酸分子の発現に適している形態で含むことができ、これは、発現カセットが、発現されるべき核酸配列に機能的に連結している、発現のために用いられる藻類細胞に基づいて選択され得る、1つまたは複数の制御エレメントを含むことを意味する。本明細書において用いられる場合、「機能的に連結される」とは、関心対象のヌクレオチド配列が、ベクターが宿主細胞中に導入された時に宿主細胞におけるヌクレオチド配列の発現（例えば、転写および翻訳）を可能にする様式で、制御エレメントに連結されることを意味するように意図される。
【００６８】
「制御エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（IRES）、および他の発現調節エレメントを含むように意図される。そのような制御エレメントは、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。制御エレメントには、多くのタイプの宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を方向づけるもの、およびある特定の宿主細胞においてのみヌクレオチド配列の発現を方向づけるもの（例えば、細胞特異的制御配列）が含まれる。
【００６９】
本明細書において用いられる場合、「プロモーター」とは、RNAポリメラーゼをDNAに結合するように方向づけること、およびRNA合成を開始することによって転写の開示を媒介する、概して遺伝子の上流に位置する制御DNA配列として定義される。プロモーターは、構成的活性プロモーター（すなわち、構成的に活性/「オン」状態にあるプロモーター）であることができ、誘導性プロモーター（すなわち、活性/「オン」または不活性/「オフ」のその状態が、外部刺激、例えば、特定の化合物またはタンパク質の存在によって調節されるプロモーター）であってもよく、空間的に制限されたプロモーター（すなわち、転写調節エレメント、エンハンサーなど）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーターなど）であってもよく、および時間的に制限されたプロモーター（すなわち、プロモーターが、胚発生の特定の段階中または生物学的プロセスの特定の段階中に「オン」状態または「オフ」状態にある）であってもよい。本発明の発現カセットにおいて有用な例示的な制御エレメントは、藻類16Sプロモーターである。
【００７０】
本明細書において用いられる場合、「5'非翻訳領域」または「5'-UTR」（リーダー配列またはリーダーRNAとしても知られる）とは、開始コドンからすぐ上流であり、転写産物の翻訳の制御に重要であるmRNAの領域を指す。非翻訳と呼ばれるが、5'UTRまたはその一部は、時には翻訳されてタンパク質産物になる。この産物は、次に、mRNAの主要なコード配列の翻訳を制御することができる。本明細書において用いられる場合、「3'非翻訳領域」または「3'-UTR」とは、翻訳終結コドンの直後に続くメッセンジャーRNA（mRNA）のセクションを指す。mRNA分子は、DNA配列から転写され、その後タンパク質に翻訳される。
【００７１】
したがって、本発明は、5'非翻訳領域（5'UTR）に融合した藻類16Sプロモーターと、関心対象の組換えタンパク質をコードする核酸分子とを含む発現カセットを提供し、該5'UTRは、psbM、psaA、psaB、psbI、psbK、clpP、rpl14、rps7、rps14、およびrps19 5'UTRからなる群より選択される。そのような発現カセットは、暗条件または限定された明条件下で増殖した時に、藻類が関心対象の組換えタンパク質を発現するように、藻類（すなわち、藻類細胞）中に導入され得る。
【００７２】
組換えおよび外来性（異種）タンパク質の生産
本明細書において提供されるように、暗条件、限定された明条件、明条件、および/または1つもしくは複数の外来性有機炭素源を伴う条件における藻類の増殖のための方法を、異種タンパク質を生産するために用いることができる。いくつかの態様において、異種タンパク質は、ネイティブではない外来性遺伝子の発現から産生される。いくつかの態様において、異種タンパク質は、例えば、当技術分野において利用可能な組換え核酸技術を通して藻類中に導入される核酸から産生される、組換えタンパク質である。
【００７３】
いくつかの態様において、異種タンパク質は、少なくとも1つのネイティブではない外来性遺伝子を発現する少なくとも1つのクラミドモナス属種の実質的に純粋な培養物を増殖培地に接種することによって、産生される。方法は、約0.01〜約250 g/Lの、少なくとも1つの天然ではない外来性遺伝子を発現する少なくとも1つのクラミドモナス属種を含有する実質的に純粋な培養物を含む接種物を生産培養に接種することを含む。本明細書における方法によって生産することができる異種タンパク質の非限定的な例には、治療用タンパク質、ワクチン、栄養タンパク質、酵素、抗体、乳タンパク質、鉄結合タンパク質、およびヘム結合タンパク質が含まれる。
【００７４】
いくつかの態様において、異種タンパク質を生産するための生産培養物は、好気的に約2.0〜約10.0のpHで増殖する。いくつかの態様において、生産培養物のpHは、約2.0、約2.5、約3.0、約3.5、約4.0、約4.5、約5.0、約5.5、約6.0、約6.5、約7.0、約7.5、約8.0、約8.5、約9.0、約9.5、または約10.0で維持される。いくつかの態様において、pHは、ある特定のpH（設定点）で、培養物に提供される外来性有機炭素源の提供が、開始されるかまたは停止される。いくつかの態様において、外来性有機炭素源の提供は、pHが約7.5を超える時に開始し、外来性有機炭素源の提供は、pHが約6.8よりも下に低下した後に中断される。
【００７５】
いくつかの態様において、生産培養物は、約5℃〜約50℃の温度で増殖する。いくつかの態様において、温度は、約5℃〜約10℃、約10℃〜約15℃、約15℃〜約20℃、約20℃〜約25℃、約25℃〜約30℃、約30℃〜約35℃、約30℃〜約40℃、約35℃〜約40℃、約40℃〜約45℃、または約45℃〜約50℃である。いくつかの態様において、温度は、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、もしくは40℃であるか、または約30℃、約31℃、約32℃、約33℃、約34℃、約35℃、約36℃、約37℃、約38℃、約39℃、もしくは約40℃である。
【００７６】
様々な態様において、異種タンパク質を発現する生産培養物は、明るさが限定されている条件において増殖する。様々な態様において、異種タンパク質を発現する生産培養物は、明るさが限定された条件下で増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が糖である。様々な態様において、異種タンパク質を発現する生産培養物は、明るさが限定された条件において増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、糖以外の何か、例えばアセタートまたはグリセロールである。様々な態様において、異種タンパク質を発現する生産培養物は、明条件において増殖し、そこでは、糖が依然として藻類培養物によって消費されて代謝される。様々な態様において、異種タンパク質を発現する生産培養物は、明条件下で増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が糖である。様々な態様において、異種タンパク質を発現する生産培養物は、明条件において増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、糖以外の何か、例えばアセタートまたはグリセロールである。様々な態様において、異種タンパク質を発現する藻類生産培養物は、暗所において増殖し、そこでは、糖が、代謝エネルギーを生成するために用いられる唯一の炭素源である。様々な態様において、異種タンパク質を発現する生産培養物は、暗所において増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が糖である。様々な態様において、異種タンパク質を発現する生産培養物は、暗所において増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、糖以外の何か、例えばアセタートまたはグリセロールである。様々な態様において、異種タンパク質を発現する藻類培養物は、混合栄養的に増殖する。様々な態様において、異種タンパク質を発現する生産培養物は、混合栄養的に増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が糖である。様々な態様において、異種タンパク質を発現する生産培養物は、混合栄養的に増殖し、そこでは、エネルギーのために用いられる外来性有機炭素源が、糖以外の何か、例えばアセタートまたはグリセロールである。
【００７７】
いくつかの態様において、異種タンパク質の生産のための標的濃度は、少なくとも約65 g/Lまたは少なくとも約70 g/Lである。他の態様において、標的濃度は、少なくとも約75 g/L、少なくとも約80 g/L、少なくとも約90 g/L、少なくとも約95 g/L、少なくとも約100 g/L、少なくとも約105 g/L、少なくとも約110 g/L、少なくとも約115 g/L、少なくとも約120 g/L、少なくとも約125 g/L、少なくとも約130 g/L、少なくとも約135 g/L、少なくとも約140 g/L、少なくとも約145 g/L、少なくとも約150 g/L、少なくとも約155 g/L、少なくとも約160 g/L、少なくとも約165 g/L、少なくとも約170 g/L、少なくとも約175 g/L、少なくとも約180 g/L、少なくとも約185 g/L、少なくとも約190 g/L、少なくとも約195 g/L、または少なくとも約200 g/Lである。
【００７８】
いくつかの態様において、組換えタンパク質は、藻類葉緑体において発現される。例えば、関心対象の組換え遺伝子は、内在性葉緑体ゲノムの16Sプロモーターを用いて駆動される。様々な態様において、関心対象の組換え遺伝子は、クラミドモナス属種由来の16Sプロモーターを用いて駆動される。様々な態様において、関心対象の組換え遺伝子は、SEQ ID NO: 1に示される16Sプロモーターを用いて駆動される。いくつかの例において、プロモーターを、ネイティブではない非翻訳領域と合成で組み合わせることができる。使用され得る例示的な非翻訳領域には、以下の遺伝子：psbE、psbI、psbK、rpL14、rpoB-2、atpF、clpP、petA、petB、petG、psaA、psaB、rps18、rps19、tufA、ycF4、rps14、またはrps7のいずれかの5'UTRが含まれる。いくつかの態様において、関心対象の組換えタンパク質をコードする外来性DNA構築物は、当技術分野において利用可能な任意の技法を用いて、藻類の葉緑体ゲノム中に、例えば、クラミドモナス属種の葉緑体中に組み換えられる。
【００７９】
増殖容器
本明細書において開示される方法を実施するのに有用な微細藻類は、陸上で、例えば、池、水路において、または、閉鎖されているかもしくは部分的に閉鎖されているバイオリアクター系において増殖させることができる。藻類はまた、直接水中で、例えば、海洋、海、湖、川、貯水池などにおいて増殖させることもできる。様々な態様において、藻類を、種々の体積の培養系で増殖させてもよい。様々な態様において、藻類を、例えば、小規模の実験系で増殖させることができる。小規模の実験系とは、約6リットル未満の体積における培養を指す。様々な態様において、小規模の実験培養は、約1リットル、約2リットル、約3リットル、約4リットル、または約5リットルであってもよい。他の態様において、小規模の実験培養は、1リットル未満であってもよい。さらに他の態様において、小規模の実験培養は、100ミリリットル以下であってもよい。様々な態様において、培養は、10ミリリットル以下であってもよい。様々な態様において、培養は、5ミリリットル以下であってもよい。さらに他の態様において、培養は、1ミリリットル以下であってもよい。
【００８０】
あるいは、培養系は、大規模の培養であってもよく、ここで、大規模の培養とは、約6リットルよりも多い、約10リットルよりも多い、または約20リットルよりも多い体積における培養物の増殖を指す。大規模の増殖はまた、約50リットル以上、約100リットル以上、または約200リットル以上の体積における培養物の増殖であることもできる。大規模の増殖は、例えば、池、コンテナ（container）、容器、または他の区域における培養物の増殖であることができ、ここで、培養物を含有する池、コンテナ、容器、または区域は、例えば、面積が、少なくとも約5平方メートル、少なくとも約10平方メートル、少なくとも約200平方メートル、少なくとも約500平方メートル、少なくとも約1,500平方メートル、少なくとも約2,500平方メートル、またはそれよりも大きい。
【００８１】
本開示は、さらに、非常に大規模の培養系での藻類の生産を提供する。非常に大規模の液体培養系は、約10,000〜約20,000リットルであり得る。様々な態様において、非常に大規模の培養系は、約10,000〜約40,000リットルまたは約10,000〜約80,000リットルであり得る。他の態様において、非常に大規模の培養系は、約10,000〜約100,000リットルまたは約10,000〜約150,000リットルであり得る。さらに他の態様において、培養系は、約10,000〜約200,000リットルまたは約10,000〜約250,000リットルであり得る。本開示はまた、約10,000〜約500,000リットルまたは約10,000〜約600,000リットルの培養系も含む。本開示は、さらに、約10,000〜約1,000,000リットルの培養系を提供する。
【００８２】
様々な態様において、培養系は、天然または人工いずれかの池であってもよい。ある特定の態様において、人工池はレースウェイ池であってもよい。レースウェイ池においては、藻類、水、および栄養素が、「レーストラック」の周りを循環する。パドルホイールなどの原動力の手段が、レーストラックにおける液体に対して一定の動きを提供し、選択された頻度で生物が液体の表面に循環されて戻ることを可能にする。パドルホイールはまた、撹拌の供給源を提供し、系に酸素添加する。CO2注入システムを通して、CO2が、光合成のための供給原料として培養系に添加されてもよい。これらのレースウェイ池は、例えば、建物または温室に閉じ込められていることができ、または、屋外に位置することができる。様々な態様において、屋外レースウェイ培養系は、カバーで閉じられていてもよく、または環境に曝されていてもよい。
【００８３】
あるいは、微細藻類を、バイオリアクターなどの閉鎖された構造物において増殖させることができ、そこでは、環境が、開放系または半閉鎖系におけるよりも厳しい調節下にある。光バイオリアクターは、いくつかのタイプの光源を組み込んで、リアクター中に光子エネルギーインプットを提供するバイオリアクターである。「バイオリアクター」という用語は、環境に近接し、かつ環境とのガスおよび汚染物質の直接の交換がない系を指すことができる。したがって、バイオリアクターは、液体細胞浮遊培養の調節されたバイオマス産生のために設計された、閉じられた、光バイオリアクターの場合は照明される、培養容器と説明することができる。バイオリアクターの例には、ガラスコンテナ、ステンレススチールコンテナ、プラスチックチューブ、タンク、プラスチックスリーブ、およびバッグが含まれるが、それらに限定されない。光バイオリアクターの場合、用いることができる光源の例には、蛍光灯、LED、および自然の日光が含まれ得るが、それらに限定されない。これらの系は閉鎖されているため、生物が増殖するために必要とするすべて（例えば、二酸化炭素、栄養素、水、および光）を、バイオリアクター中に導入しなければならない。
【００８４】
バイオリアクターは、設置して維持するコストにもかかわらず、開放系を上回るいくつかの利点を有する。それらは、例えば、汚染を阻止するかもしくは最小化し、単作の純粋生物培養（1種のみの生物からなる培養）を可能にし、培養条件（例えば、pH、光、二酸化炭素、および温度）にわたってより良好な調節を提供し、水の蒸発を阻止し、ガス放出による二酸化炭素喪失を低下させ、かつより高い細胞濃度を可能にすることができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法は、高密度発酵槽において行われる。
【００８５】
収集
微細藻類は、（より大きい体積の培養系の大多数でのように）連続的に収集することができ、または（例えば、ポリエチレンバッグ培養でのように）一度に一バッチを収集することができる。バッチ収集は、例えば、栄養素、生物（例えば、微細藻類）、および水とともに設置し、そこで、バッチが収集されるまで生物を増殖させる。連続収集では、藻類マスの一部を、例えば、連続的に、毎日、または固定された時間間隔のいずれかで収集することができる。
【００８６】
藻類培養物の収集は、ろ過、バッチ遠心分離、または連続遠心分離を含むがそれらに限定されない、当技術分野において公知の任意の方法によって達成され得る。いくつかの態様において、生産培養物は、培養の開始後約96時間以内に、収集密度に達する。いくつかの態様において、生産培養物は、培養の開始後約96時間、約120時間、約150時間、約175時間、約200時間、約220時間、または約250時間以内に、収集密度に達する。いくつかの態様において、生産培養物は、培養の開始の約250時間以内に、収集密度に達する。
【００８７】
いくつかの態様において、藻類は、収集後に、例えば、噴霧乾燥、リング乾燥、パドル乾燥、トレイ乾燥、太陽光もしくは日光での乾燥、真空乾燥、または凍結乾燥によって乾燥される。したがって、様々な態様において、収集された藻類は、例えば、約15％以下の水分含量まで乾燥され得る。さらに他の態様において、方法は、さらに、少なくとも1つの治療用タンパク質を藻類から単離する工程に含む。
【００８８】
収集は、1つまたは複数の異種タンパク質を含むタンパク質の生産に関する場合、当技術分野において公知の任意の方法によって達成することができる。例えば、タンパク質は、藻類培養物由来の全バイオマスとして、分画されたバイオマスとして、または藻類細胞にとって外部の培地から、収集されてもよい。タンパク質は、所望であれば、当技術分野において公知の生化学的手段、物理学的手段、および親和性手段によって、さらに精製することができる。
【実施例】
【００８９】
実施例1
暗条件または限定された明条件における組換えタンパク質の発現のための分子構築物
発現カセットのライブラリーを、設計して構築した。各カセットは、psaA（SEQ ID NO: 12）、psaB（SEQ ID NO: 13）、clpP（SEQ ID NO: 14）、psbI（SEQ ID NO: 15）、psbK（SEQ ID NO: 16）、psbM（SEQ ID NO: 17）、rpl14（SEQ ID NO: 18）、rps7（SEQ ID NO: 19）、rps14（SEQ ID NO: 20）、またはrps19（SEQ ID NO: 21）遺伝子のうちの1つ由来の5'非翻訳領域を有していた。各5'非翻訳領域の配列を、C. ラインハーディ葉緑体ゲノムから増幅した。各々の増幅された5'非翻訳領域を、16Sプロモーター（SEQ ID NO: 1）の下流に別々にライゲーションした。5'非翻訳領域は、各発現カセットにおいて関心対象の遺伝子のための挿入部位の上流に位置づけられた。これらの発現カセットの各々により、関心対象の遺伝子が、暗条件または明るさが限定された条件において発現されることが可能になる。
2021503283.tif 000003
2021503283.tif 000004
2021503283.tif 000005
2021503283.tif 000006
2021503283.tif 000007
【００９０】
発現カセットを、さらに、追加的なエレメントを含むように設計して構築した。組換えタンパク質（RP）をコードする関心対象の遺伝子を、rbcL葉緑体遺伝子の3'非翻訳領域の上流にクローニングした。ベクターはまた、psbDプロモーターおよび5'-UTR、apaVIカナマイシン耐性遺伝子、ならびに第2のrbcL 3'-UTRを含む選択カセットも含有していた。選択カセットにより、DNA構築物で形質転換された藻類が、抗生物質であるカナマイシンを含有する培地上で生存することが可能になる。DNA構築物はまた、5'領域および3'領域上に相同性を含有し、これにより、構築物が、psbH遺伝子およびpsbN遺伝子の上流のC. ラインハーディ葉緑体ゲノムのサイレント部位中に組み込まれることが可能になる。上記の構築物を、図2〜11に示す。
【００９１】
実施例2
組換えタンパク質の蓄積
組換えタンパク質（RP）のための関心対象の遺伝子を、以下の発現構築物において多様なプロモーターの調節下に置いた：
psbAプロモーターおよびUTR（陽性対照）
16SプロモーターおよびpsaA 5'-UTR（SEQ ID NO: 2）、
16SプロモーターおよびpsaB 5'-UTR（SEQ ID NO: 3）、
16SプロモーターおよびclpP 5'UTR（SEQ ID NO: 4）、
16S-プロモーターおよびpsbI 5'UTR（SEQ ID NO: 5）、
16S-プロモーターおよびpsbK 5'-UTR（SEQ ID NO: 6）、
16S-プロモーターおよびpsbM 5'-UTR（SEQ ID NO: 7）、
16S-プロモーターおよびrpl14 5'-UTR（SEQ ID NO: 8）、
16S-プロモーターおよびrps7 5'-UTR（SEQ ID NO: 9）、
16S-プロモーターおよびrps14 5'-UTR（SEQ ID NO: 10）、ならびに
16S-プロモーターおよびrps19-UTR（SEQ ID NO: 11）。
陰性対照は、明所で増殖した野生型対照株であり、陽性対照は、RPの発現を駆動するpsbAプロモーターおよびUTRで形質転換された藻類の株であった。構築物の各々は、タンパク質コード領域のN末端で融合したFLAGタグを含んでいた。16S-プロモーターを有する構築物の各々で、C. ラインハーディを形質転換した。
【００９２】
次いで、各々の形質転換された株を、暗所において増殖させて、暗条件または明るさが限定された条件におけるタンパク質蓄積を可能にするその能力を判定した。ひとたび定常期まで増殖したら、細胞を、遠心分離によってスピンダウンした。細胞を、トリス緩衝生理食塩水、pH 8.0において超音波処理によって溶解した。次いで、20μgの各可溶性タンパク質溶解物を、ゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜に移した。次いで、ニトロセルロース膜を抗FLAG抗体で探索して、暗所においてタンパク質の発現および蓄積を提供する、各発現構築物の能力を判定した。酵素結合免疫吸着アッセイを用いて、総可溶性タンパク質（TSP）の割合としてRPのパーセントを決定した。結果を、図12に示す。この実施例において用いたRPは、ウシオステオポンチンである。
【００９３】
実施例3
暗条件におけるタンパク質の蓄積
ウシオステオポンチンの上流に16S-プロモーターおよびpsbM 5'-UTRを含んだ発現構築物で形質転換された細胞を、暗い発酵条件において増殖させた。アセタートを、暗所において従属栄養的に増殖することを可能にする基質として用いた。組換えウシオステオポンチンの蓄積を、様々な時間間隔で、酵素結合免疫吸着アッセイによってモニターした。4回の発酵ランにおけるタンパク質蓄積の結果を、図13に示す。
【００９４】
実施例4
外来性有機炭素源での増殖
C. ラインハーディ藻類の株を、外来性炭素源であるアセタート、デキストロース、フルクトース、およびグルコースを含有する培地で活動させ始めた。株は、暗条件下で、0〜約220時間の時点で増殖が観察された。THN76およびTHN78の2つの株が、デキストロース、フルクトース、およびスクロースで増殖する能力を実証した。これらの2つの株はまた、より遅い増殖速度ではあるが、アセタートでもいくらかの増殖を示した。比較すると、148時間の増殖後に、試験した株の残りであるTHN6、THN56、THN62、THN68、564、および1171は、デキストロース、フルクトース、およびグルコースでの増殖を示さなかった。株THN6、THN62、および564は、炭素源としてアセタートで増殖した。ITS1およびITS2の遺伝子シーケンシングによって、株をクラミドモナス属と再確認した。増殖結果を、図14に示す。
【００９５】
本発明を、上記に関連して説明してきたが、改変物および変形物が本発明の精神および範囲内に包含されることが、理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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