(57)【要約】  システム、方法、及び非一時コンピューター可読媒体は、宿主細胞で機能を可能にする候補生物学的配列を同定する。実施形態は、酵素などの複数の生物学的配列と、反応触媒作用などの１つ以上の機能と、を関連付ける予測モデルにアクセスし、予測モデルを用いて、複数の生物学的配列の１つ以上の候補配列が所望の機能を可能にすることを予測し、且つプロセッサーを用いて、信頼性閾値を満たす候補配列をフィルター候補配列として分類する。
2021536049.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞内で機能を可能にする候補生物学的配列を同定するためのコンピューター実装方法であって、
ａ）複数の生物学的配列を１つ以上の機能に関連付ける予測モデルを用いて、前記複数の生物学的配列の１つ以上の候補配列が所望の機能を可能にすることを予測することと、
ｂ）プロセッサーを用いて、信頼性閾値を満たす候補配列をフィルター候補配列として分類することであって、
ｉ）前記フィルター候補配列の１つ以上の第１のフィルター候補配列を処理することが、１つ以上の対応する分子の生成をもたらしうる、分類することと、
ｃ）前記フィルター候補配列を表すデータを返すことと、
を含む方法。
【請求項２】
ａ）前記フィルター候補配列の少なくとも１つが所望の機能を可能にするかに関する経験的データを得ることと、
ｂ）前記経験的データを用いて前記予測モデルをリファインすることと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予測モデルが機械学習を利用する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分類することが、前記信頼性閾値を満たす前記候補配列の多様化セットを前記フィルター候補配列として分類することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記多様化セットを前記フィルター候補配列として分類することが、
ａ）前記信頼性閾値を満たす複数の候補配列を複数のクラスターの各クラスターにクラスター化することと、
ｂ）前記複数のクラスターの少なくとも２つのクラスターの各々から少なくとも１つの候補配列を前記多様化セット内に含まれるとして同定することと、
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分類することが、
ａ）前記信頼性閾値を満たすが前記所望の機能とは異なる機能を可能にする可能性がより高い候補配列をフィルター候補配列として分類しないことと、
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
分類しないことが、前記信頼性閾値を満たすが前記所望の機能とは異なる機能を所与の許容性内で可能にする可能性がより高い候補配列をフィルター候補配列として分類しないことを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的配列が酵素アミノ酸配列であり、且つ前記所望の機能が酵素触媒反応である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的配列が酵素アミノ酸配列を含み、且つ前記１つ以上の酵素機能が１つ以上の反応経路に沿った１つ以上の酵素触媒反応であり、各反応経路が分子を生成する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的配列が、酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、且つ前記所望の機能が酵素触媒反応である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
処理することが、前記１つ以上の第１のフィルター候補配列の少なくとも１つに対応する少なくとも１つのヌクレオチド配列を工学操作により前記宿主細胞に導入すること含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記予測モデルが配列アライメントに少なくとも部分的に基づく、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記予測モデルが、次のモデル：隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、人工ニューラルネットワーク、又はダイナミックベイジアンネットワークの少なくとも１つに少なくとも部分的に基づく、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の第１のフィルター候補配列に関する情報を遺伝子作製システムに提供することをさらに含み、前記宿主細胞が前記１つ以上の第１のフィルター候補配列を用いて前記１つ以上の分子を生成できるように前記遺伝子作製システムが操作可能である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の第１のフィルター候補配列の少なくとも１つを用いて前記１つ以上の分子の少なくとも１つを生成することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の分子がバイオリーチャブル分子である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記機能が転写機能又は輸送機能の１つである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の分子が前記フィルター候補配列の１つ以上である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記フィルター候補配列の１つが酵素アミノ酸配列を含み、且つ処理することが、前記酵素アミノ酸配列を用いて反応を触媒することを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の分子が、１つ以上のバイオリーチャブル分子であると予測された１つ以上の分子を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の分子が、
ａ）少なくとも１つのプロセッサーを用いて、反応を触媒するために利用できることがそれ自体示唆された１つ以上の対応する触媒により反応が触媒されることが示唆されるかに少なくとも部分的に基づいて、反応を選択することであって、反応セットが前記選択された反応を含む、選択することと、
ｂ）少なくとも１つのプロセッサーにより実施される１つ以上の処理工程の各処理工程で、前記宿主細胞に対する出発代謝物と前の処理工程で発生した代謝物とを表すデータを前記反応セットの１つ以上の反応に従って処理して、前記１つ以上の分子を表すデータを発生することと、
により予測される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
選択することが、工学操作により生物に導入されること又は生物を成長させる成長培地から取り込まれることが可能であることがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により触媒されることが示唆される反応を選択することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
選択することが、１つ以上のアミノ酸配列又は１つ以上の遺伝子配列に対応することがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により触媒されることが示唆される反応を選択することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
選択することが、反応を触媒するのに利用可能であることがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により反応が触媒されることが少なくとも１つのデータベースで示唆されるかに少なくとも部分的に基づいて反応を選択することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、微生物、植物、若しくは動物の組織を起源とするか、又は単細胞生物若しくは多細胞生物の一部である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞内で機能を可能にする候補生物学的配列を同定するためのシステムであって、
１つ以上のプロセッサーと、
命令を記憶する１つ以上のメモリーと、
を含み、前記１つ以上のプロセッサーの少なくとも１つにより実行されたとき、システムを介して、
ａ）複数の生物学的配列を１つ以上の機能に関連付ける予測モデルを用いて、前記複数の生物学的配列の１つ以上の候補配列が所望の機能を可能にすることを予測し、
ｂ）プロセッサーを用いて、信頼性閾値を満たす候補配列をフィルター候補配列として分類し、
ｉ）前記フィルター候補配列の１つ以上の第１のフィルター候補配列を処理することが、１つ以上の対応する分子の生成をもたらしうるとともに、
ｃ）前記フィルター候補配列を表すデータを返す、
システム。
【請求項２７】
前記１つ以上のメモリーの少なくとも１つが命令を記憶し、前記１つ以上のプロセッサーの少なくとも１つにより実行されたとき、システムを介して、
ａ）前記フィルター候補配列の少なくとも１つが前記所望の機能を可能にするかに関する経験的データを得、且つ
ｂ）前記経験的データを用いて前記予測モデルをリファインする、
請求項２６に記載のシステム。
【請求項２８】
前記予測モデルが機械学習を利用する、請求項２６又は２７に記載のシステム。
【請求項２９】
分類することが、前記信頼性閾値を満たす前記候補配列の多様化セットを前記フィルター候補配列として分類することを含む、請求項２６〜２８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３０】
前記多様化セットを前記フィルター候補配列として分類することが、
ａ）前記信頼性閾値を満たす複数の候補配列を複数のクラスターの各クラスターにクラスター化することと、
ｂ）前記複数のクラスターの少なくとも２つのクラスターの各々から少なくとも１つの候補配列を多様化セット内に含まれるとして同定することと、
を含む、請求項２９に記載のシステム。
【請求項３１】
分類することが、
ａ）前記信頼性閾値を満たすが前記所望の機能とは異なる機能を可能にする可能性がより高い候補配列をフィルター候補配列として分類しないことと、
をさらに含む、請求項２６〜３０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３２】
分類しないことが、前記信頼性閾値を満たすが前記所望の機能とは異なる機能を所与の許容性内で可能にする可能性がより高い候補配列をフィルター候補配列として分類しないことを含む、請求項３１に記載のシステム。
【請求項３３】
前記生物学的配列が酵素アミノ酸配列であり、且つ前記所望の機能が酵素触媒反応である、請求項２６〜３２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３４】
前記生物学的配列が酵素アミノ酸配列を含み、且つ前記１つ以上の酵素機能が１つ以上の反応経路に沿った１つ以上の酵素触媒反応であり、各反応経路が分子を生成する、請求項２６〜３３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３５】
前記生物学的配列が、酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、且つ前記所望の機能が酵素触媒反応である、請求項２６〜３４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３６】
処理することが、前記１つ以上の第１のフィルター候補配列の少なくとも１つに対応する少なくとも１つのヌクレオチド配列を工学操作により前記宿主細胞に導入すること含む、請求項２６〜３５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３７】
前記予測モデルが配列アライメントに少なくとも部分的に基づく、請求項２６〜３６のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３８】
前記予測モデルが、次のモデル：隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、人工ニューラルネットワーク、又はダイナミックベイジアンネットワークの少なくとも１つに少なくとも部分的に基づく、請求項２６〜３７のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項３９】
前記１つ以上のメモリーの少なくとも１つが命令を記憶し、前記１つ以上のプロセッサーの少なくとも１つにより実行されるとき、システムを介して前記１つ以上の第１のフィルター候補配列に関する情報を遺伝子作製システムに提供し、前記遺伝子作製システムが操作可能であるとき、前記宿主細胞を介して前記１つ以上の第１のフィルター候補配列を使用し、前記１つ以上の分子を生成する反応経路を可能にする、請求項２６〜３８のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４０】
前記１つ以上のメモリーの少なくとも１つが命令を記憶し、前記１つ以上のプロセッサーの少なくとも１つにより実行されるとき、前記１つ以上の第１のフィルター候補配列の少なくとも１つを用いて前記１つ以上の分子の少なくとも１つの生成を引き起こす、請求項２６〜３９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４１】
前記１つ以上の分子がバイオリーチャブル分子である、請求項２６〜４０のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４２】
前記機能が転写機能又は輸送機能の１つである、請求項２６〜４１のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４３】
前記１つ以上の分子が前記フィルター候補配列の１つ以上である、請求項２６〜４２のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４４】
前記フィルター候補配列の１つが酵素アミノ酸配列を含み、且つ処理することが、前記酵素アミノ酸配列を用いて反応を触媒することを含む、請求項２６〜４３のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４５】
前記１つ以上の分子が、１つ以上のバイオリーチャブル分子であると予測された１つ以上の分子を含む、請求項２６〜４４のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４６】
前記１つ以上の分子が、
ａ）反応を触媒するために利用できることがそれ自体示唆された１つ以上の対応する触媒により反応が触媒されることが示唆されるかに少なくとも部分的に基づいて、反応を選択することであって、反応セットが前記選択された反応を含む、選択することと、
ｂ）１つ以上の処理工程の各処理工程で、前記宿主細胞に対する出発代謝物と前の処理工程で発生した代謝物とを表すデータを前記反応セットの１つ以上の反応に従って処理して、前記１つ以上の分子を表すデータを発生することと、
により予測される、請求項２６〜４５のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項４７】
選択することが、工学操作により生物に導入されること又は生物を成長させる成長培地から取り込まれることが可能であることがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により触媒されることが示唆される反応を選択することを含む、請求項４６に記載のシステム。
【請求項４８】
選択することが、１つ以上のアミノ酸配列又は１つ以上の遺伝子配列に対応することがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により触媒されることが示唆される反応を選択することを含む、請求項４６に記載のシステム。
【請求項４９】
選択することが、反応を触媒するのに利用可能であることがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により反応が触媒されることが少なくとも１つのデータベースで示唆されるかに少なくとも部分的に基づいて反応を選択することを含む、請求項４６に記載のシステム。
【請求項５０】
前記宿主細胞が、微生物、植物、若しくは動物の組織を起源とするか、又は単細胞生物若しくは多細胞生物の一部である、請求項２６〜４９のいずれか一項に記載のシステム。
【請求項５１】
宿主細胞内で機能を可能にする候補生物学的配列を同定するための命令を記憶している１つ以上の非一時コンピューター可読媒体であって、前記命令が、１つ以上のコンピューティングデバイスにより実行されたとき、前記１つ以上のコンピューティングデバイスの少なくとも１つを介して、
ａ）複数の生物学的配列を１つ以上の機能に関連付ける予測モデルを用いて、前記複数の生物学的配列の１つ以上の候補配列が所望の機能を可能にすることを予測し、
ｂ）プロセッサーを用いて、信頼性閾値を満たす候補配列をフィルター候補配列として分類し、
ｉ）前記フィルター候補配列の第１のフィルター候補配列を処理することが、分子の生成をもたらしうるとともに、
ｃ）前記フィルター候補配列を表すデータを返す、
１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項５２】
命令を記憶しており、前記命令が実行されたとき、前記１つ以上のコンピューティングデバイスの少なくとも１つを介して、
ａ）前記フィルター候補配列の少なくとも１つが前記所望の機能を可能にするかに関する経験的データを得、且つ
ｂ）前記経験的データを用いて前記予測モデルをリファインする、
請求項５１に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項５３】
前記予測モデルが機械学習を利用する、請求項５１又は５２に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項５４】
分類することが、前記信頼性閾値を満たす前記候補配列の多様化セットを前記フィルター候補配列として分類することを含む、請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項５５】
前記多様化セットを前記フィルター候補配列として分類することが、
ａ）前記信頼性閾値を満たす複数の候補配列を複数のクラスターの各クラスターにクラスター化することと、
ｂ）前記複数のクラスターの少なくとも２つのクラスターの各々から少なくとも１つの候補配列を多様化セット内に含まれるとして同定することと、
を含む、請求項５４に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項５６】
分類することが、
ａ）前記信頼性閾値を満たすが前記所望の機能とは異なる機能を可能にする可能性がより高い候補配列をフィルター候補配列として分類しないこと、
をさらに含む、請求項５１〜５５のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項５７】
分類しないことが、前記信頼性閾値を満たすが前記所望の機能とは異なる機能を所与の許容性内で可能にする可能性がより高い候補配列をフィルター候補配列として分類しないことを含む、請求項５６に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項５８】
前記生物学的配列が酵素アミノ酸配列であり、且つ前記所望の機能が酵素触媒反応である、請求項５１〜５７のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項５９】
前記生物学的配列が酵素アミノ酸配列を含み、且つ前記１つ以上の酵素機能が１つ以上の反応経路に沿った１つ以上の酵素触媒反応であり、各反応経路が分子を生成する、請求項５１〜５８のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項６０】
前記生物学的配列が、酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、且つ前記所望の機能が酵素触媒反応である、請求項５１〜５９のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項６１】
処理することが、前記１つ以上の第１のフィルター候補配列の少なくとも１つに対応する少なくとも１つのヌクレオチド配列を工学操作により前記宿主細胞に導入すること含む、請求項５１〜６０のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項６２】
前記予測モデルが配列アライメントに少なくとも部分的に基づく、請求項５１〜６１のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項６３】
前記予測モデルが、次のモデル：隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、人工ニューラルネットワーク、又はダイナミックベイジアンネットワークの少なくとも１つに少なくとも部分的に基づく、請求項５１〜６２のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項６４】
命令を記憶しており、前記命令が実行されたとき、前記１つ以上のコンピューティングデバイスの少なくとも１つを介して、前記１つ以上の第１のフィルター候補配列に関する情報を遺伝子作製システムに提供し、前記遺伝子作製システムが操作可能であるとき、前記宿主細胞を介して前記１つ以上の第１のフィルター候補配列を使用し、前記１つ以上の分子を生成する反応経路を可能にする、請求項５１〜６３のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項６５】
命令を記憶しており、前記命令が実行されたとき、前記１つ以上のコンピューティングデバイス少なくとも１つを介して、前記１つ以上の第１のフィルター候補配列の少なくとも１つを用いて、前記１つ以上の分子の少なくとも１つの生成を引き起こす、請求項５１〜６４のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項６６】
前記１つ以上の分子がバイオリーチャブル分子である、請求項５１〜６５のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項６７】
前記機能が転写機能又は輸送機能の１つである、請求項５１〜６６のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項６８】
前記１つ以上の分子が前記フィルター候補配列の１つ以上である、請求項５１〜６７のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項６９】
前記フィルター候補配列の１つが酵素アミノ酸配列を含み、前記分子がバイオリーチャブル分子であり、且つ処理することが前記酵素アミノ酸配列を用いて反応を触媒することを含む、請求項５１〜６８のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項７０】
前記１つ以上の分子が１つ以上のバイオリーチャブル分子であると予測されたを１つ以上の分子を含む、請求項５１〜６９のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項７１】
前記１つ以上の分子が、
ａ）反応を触媒するために利用できることがそれ自体示唆された１つ以上の対応する触媒により反応が触媒されることが示唆されるかに少なくとも部分的に基づいて、反応を選択することであって、反応セットが前記選択された反応を含む、選択することと、
ｂ）１つ以上の処理工程の各処理工程で、前記宿主細胞に対する出発代謝物と前の処理工程で発生した代謝物とを表すデータを前記反応セットの１つ以上の反応に従って処理して、前記１つ以上の分子を表すデータを発生することと、
により予測される、請求項５１〜７０のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項７２】
選択することが、工学操作により生物に導入されること又は生物を成長させる成長培地から取り込まれることが可能であることがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により触媒されることが示唆される反応を選択することを含む、請求項７１に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項７３】
選択することが、１つ以上のアミノ酸配列又は１つ以上の遺伝子配列に対応することがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により触媒されることが示唆される反応を選択することを含む、請求項７１に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項７４】
選択することが、反応を触媒するのに利用可能であることがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により反応が触媒されることが少なくとも１つのデータベースで示唆されるかに少なくとも部分的に基づいて反応を選択することを含む、請求項７１に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【請求項７５】
前記宿主細胞が、微生物、植物、若しくは動物の組織を起源とするか、又は単細胞生物若しくは多細胞生物の一部である、請求項５１〜７４のいずれか一項に記載の１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本願は、２０１８年８月１５日出願の米国仮特許出願第６２／７６４，８１９号、２０１８年８月２１日出願の米国仮特許出願第６２／７２０，８１１号、２０１８年８月１５日出願の米国仮特許出願第６２／７６４，８６１号、及び２０１８年８月２１日出願の米国仮特許出願第６２／７２０，８３９号（それらはすべてその全体が本明細書に組み込まれる）に基づく利益を主張する。
【０００２】
[0002]  本願は、２０１８年２月１４日出願のＰ．Ｃ．Ｔ．国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０１８２３４号（「ＢＰＴ  ＰＣＴ出願」）及び２０１７年２月１５日出願の米国仮特許出願第６２／４５９，５５８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に関する。
【０００３】
政府利益の記載
[0003]  本発明は、ＤＡＲＰＡにより付与された契約番号ＨＲ００１１−１５−９−００１４に基づいて米国政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明に関する一定の権利を有する。
【０００４】
配列リスト
[0004]  本願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子申請された配列リスト（その全体が本願をもって参照により組み込まれる）を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピー（２０１９年８月１２日作成）は、名称ＺＹＭ０１１ＷＯＰＣ０１＿ＳＬ．ｔｘｔ及びサイズ３９，２５３バイトである。
【０００５】
分野
[0005]  本開示は、一般的には、細胞の遺伝子工学操作を改善する方法、特定的には、アルゴリズムにより選択された天然又は異種のタンパク質（たとえば酵素）セット又は遺伝子配列セットを用いて特定細胞で生成可能な分子を同定する方法に関する。
【背景技術】
【０００６】
背景
[001]  生物学者、化学者、材料科学者、及び関連分野の他の者は、細胞のゲノムの修飾などにより細胞から所望の表現型特性を有する所望の分子を生成するためにバイオ工学操作を利用する。かかる細胞自体は、単細胞生物（たとえば細菌）であっても多細胞宿主生物の構成部分若しくは多細胞宿主生物あってもよく、天然に見いだされる突然変異型細胞であってもよい。しかしながら、細胞内でバイオマスの一部として分子を生成可能にすることには限界が存在する。一般に、広範な手動介入を必要とすることなく遺伝子修飾を介して発生しうるバイオリーチャブル（bioreachable（生体到達可能））分子の最大可能プールを決定する問題に直面する。この問題は、ＢＰＴ  ＰＣＴ出願で扱われた。
【０００７】
[0006]  本明細書及びＢＰＴ  ＰＣＴ出願に記載の実施形態は、候補バイオリーチャブル分子及びその形成をもたらす反応セットを同定しうる。しかしながら、その後、細胞を工学操作して分子を作製するプロセスは、典型的には、１つ又は複数の所与の反応の酵素触媒機能に対応する１つ以上の遺伝子を挿入、欠失、又はレギュレートすることにより宿主細胞の代謝を改変することを必要とする。必要な機能を有するタンパク質配列（たとえば酵素）又はそうしたタンパク質配列をコードする根底にあるＤＮＡ配列を多くのすべてのそれらの既知及び予測変異体から選択する処理は、多くの場合、スケーリング困難なエラープローンプロセスである。
【０００８】
[0007]  RAVEN Toolboxなどの現在のアプローチは、対象特定ゲノムに所望の酵素活性が存在するかを予測する。ツールボックスは、ゲノムスケールモデルを再構築する目的でゲノムに存在する代謝活性セットを予測するように設計される。しかしながら、個別反応活性に対して単一宿主細胞に固有の酵素を同定することに制限される。Selenzymeなどの代替アプローチは、本明細書に記載のように必要な／所望の機能を有する信頼性又は配列多様性の合理的サンプリングに基づく候補酵素のスコアリングを含まない。
【０００９】
[0008]  ＢＰＴ  ＰＣＴ出願に記載のバイオリーチャブル予測ツールの実施形態は、バイオリーチャブル分子を予測するとともにそうした予測分子を達成する反応経路を予測する。化学者又は他の科学者は、自身の知識及び直観を用いてそうした経路に沿った反応を触媒するのに最適な酵素候補を手動選択しうる。しかしながら、かかる実施形態のＢＰＴは、複数の反応を各々含有する多数の経路（たとえば、１０反応さらにはそれ以上を各々含有する１０経路）を予測しうるので、最適酵素の手動決定は、時間がかかるとともにエラープローンである。さらに、酵素の手動アノテーションは、誤りを含む可能性があり、他の場合には、所望の程度に触媒反応産物の発現をもたらさないおそれもある。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
開示の概要
[0009]  本開示の実施形態は、従来技術の欠点を克服するように実現可能標的分子と反応触媒とを予測するバイオリーチャブル予測ツールを提供する。特定的には、本開示の実施形態のバイオリーチャブル予測ツールは、宿主細胞に特異的な実現可能標的分子と、分子の生成を可能にするように又は改善するように所与の宿主内で発現可能な酵素セット（天然及び異種でありうる）と、を予測する。
【００１１】
[0010]  実現可能標的分子をもたらすとしてバイオリーチャブル予測ツールが同定する各同定反応経路（すなわち系統）に対して、ツールはまた、本開示の実施形態に従って、ＢＰＴにより同定された反応経路の各反応を触媒する天然又は異種候補酵素セットも同定しうる。本開示の実施形態は、所与の機能を可能にする多くの潜在的候補配列の合理的サンプリングを可能にするスケーラブルアルゴリズムアプローチを提供する。
【００１２】
[0011]  ツールは、少なくとも次の：１）酵素が特定標的反応を触媒する証拠が存在するか又は２）所望の機能以外の機能に関連するいずれの他のモデルよりも有意に良好に所望の機能に対するモデルにその配列がマッチするかの一方又は両方に基づいて、特定反応を触媒する候補酵素セットを同定しうる。
【００１３】
[0012]  実施形態では、ツールは、次のリファインメント：１）酵素が特定細胞内で追加の非所望の機能的挙動を誘発しない証拠が存在するか又は２）酵素が特定宿主内で他の非所望の機能的挙動を誘発しないことをモデルが高確率で予測したか（非所望の機能的挙動としては、限定されるものではないが非標的反応の触媒作用が挙げられうる）の一方又は両方に基づいて、特定反応の触媒作用に対する候補酵素選択セットをさらにリファインしうる。
【００１４】
[0013]  次いで、天然又は異種候補酵素セット内の各酵素は、所望の標的分子を生成可能であるとして同定された特定反応経路（系統）の各反応を触媒するように工学操作により１つ以上の宿主細胞に導入しうる。実施形態では、ツールはまた、所要の触媒活性の存在下で依然として信頼性を維持したまま候補酵素同定セットが互いに進化多様性であることも確保しうる。
【００１５】
[0014]  本開示の実施形態は、宿主細胞内で機能を可能にする候補生物学的配列を同定するためのシステム、方法、及び非一時コンピューター可読媒体を提供する。実施形態は、複数の生物学的配列を１つ以上の機能に関連付ける予測モデルにアクセスし、予測モデルを用いて、複数の生物学的配列の１つ以上の候補配列が所望の機能を可能にすることを予測し、且つプロセッサーを用いて、信頼性閾値を満たす候補配列をフィルター候補配列として分類する。フィルター候補配列の第１のフィルター候補配列を処理することは、分子の生成をもたらしうる。本開示の実施形態は、遺伝子作製システムに第１のフィルター候補配列に関する情報を提供しうる。この場合、遺伝子作製システムは、第１のフィルター候補配列を用いて反応経路により分子の生成を可能にするように操作可能である。
【００１６】
[0015]  実施形態では、分類することは、信頼性閾値を満たす候補配列多様化セットをフィルター候補配列として分類することを含む。多様化セットをフィルター候補配列として分類することは、信頼性閾値を満たす複数の候補配列を複数のクラスターの各クラスターにクラスター化することと、複数のクラスターの少なくとも２つのクラスターの各々から少なくとも１つの候補配列を多様化セット内に含まれるとして同定することと、を含みうる。分類することは、信頼性閾値を満たすが所望の機能とは異なる機能を可能にする可能性がより高い候補配列をフィルター候補配列として分類しないことをさらに含みうる。分類しないことは、信頼性閾値を満たすが所望の機能とは異なる機能を所与の許容性内で可能にする可能性がより高い候補配列をフィルター候補配列として分類しないことを含みうる。
【００１７】
[0016]  実施形態は、フィルター候補配列の少なくとも１つが所望の機能を可能にするかに関する経験的データを得るとともに、経験的データを用いて予測モデルをリファインする。予測モデルは、経験的データでトレーニングしうる機械学習を利用しうる。
【００１８】
[0017]  生物学的配列は、酵素アミノ酸配列でありうるとともに、所望の機能は、酵素触媒反応でありうる。生物学的配列は、酵素アミノ酸配列でありうるとともに、１つ以上の酵素機能は、各反応経路が分子を生成する１つ以上の反応経路に沿った１つ以上の酵素触媒反応でありうる。生物学的配列は、酵素をコードするヌクレオチド配列でありうるとともに、所望の機能は、酵素触媒反応でありうる。
【００１９】
[0018]  予測モデルは、少なくとも部分的に配列アライメントに基づきうる。予測モデルは、少なくとも部分的に次のモデル：隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、人工ニューラルネットワーク、又はダイナミックベイジアンネットワークの少なくとも１つに基づきうる。
【００２０】
[0019]  分子は、バイオリーチャブル分子でありうる。機能は、転写機能又は輸送機能の１つでありうる。分子は、フィルター候補配列の１つでありうる。フィルター候補配列の１つは、酵素アミノ酸配列（この分子はバイオリーチャブル分子である）を含みうるとともに、処理することは、酵素アミノ酸配列を用いて反応を触媒することを含む。
【００２１】
[0020]  分子は、バイオリーチャブル分子であると予測された分子でありうるとともに、宿主細胞に対して出発代謝物を特定する出発代謝物セットを得ることと、反応を特定する出発反応セットを得ることと、出発反応セットから１つ以上の反応をフィルター反応セットに含めることと、少なくとも１つのプロセッサーにより実施される１つ以上の処理工程の各処理工程で、出発代謝物と前の処理工程で発生した代謝物とを表すデータをフィルター反応セットの１つ以上の反応に従って処理して、１つ以上の候補バイオリーチャブル分子を表すデータを発生することと、によりバイオリーチャブル分子であると予測されうる。
【００２２】
[0021]  宿主細胞は、微生物、植物、若しくは動物の組織を起源としうるか、又は単細胞生物若しくは多細胞生物の一部でありうる。
【００２３】
[0022]  本開示の実施形態は、宿主細胞に対して出発代謝物を特定する出発代謝物セットを得、反応を特定する出発反応セットを得、１つ以上の対応する触媒により触媒されることが示唆される１つ以上の反応を出発反応セットからフィルター反応セットに含め、先行実施形態のいずれか１つの系を用いて１つ以上の対応する触媒の１つ以上に対応するフィルター候補配列を同定し、少なくとも１つのプロセッサーにより実施される１つ以上の処理工程の各処理工程で、出発代謝物と前の処理工程で発生した代謝物とを表すデータをフィルター反応セットの１つ以上の反応に従って処理して、１つ以上の実現可能標的分子を表すデータを発生し、且つ１つ以上の実現可能標的分子を表すデータを出力として提供するようにしうる。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
図面の簡単な説明
【図１】[0023]図１は、本開示の実施形態に係るバイオリーチャブル予測ツールを実現するためのシステムを例示する。
【図２】[0024]図２は、本開示の実施形態に係るバイオリーチャブル予測ツールの操作を例示するフロー図である。
【図３】[0025]図３は、本開示の実施形態に係る厳密及び緩和酵素配列検索を実現するための擬似コードを例示する。
【図４】[0026]図４は、本開示の実施形態のバイオリーチャブル予測ツールにより作成しうる報告の例を例示する。
【図５】[0027]図５は、本開示の実施形態のバイオリーチャブル予測ツールにより作成しうる反応系統追跡の報告の仮説例を例示する。
【図６】[0028]図６は、本開示の実施形態に係るクラウドコンピューティング環境を例示する。
【図７】[0029]図７は、本開示の実施形態に係る非一時コンピューター可読媒体（たとえばメモリー）に記憶された命令を実行するために使用しうるコンピューターシステムの例を例示する。
【図８】[0030]図８は、本開示の実施形態のバイオリーチャブル予測ツールにより作成しうるタイプの単一経路の例を例示する。この例では、宿主細胞への単一酵素工程の追加により分子チラミンがリーチャブルであると予測された。この経路は、実用に供され、チラミンを生成するように工学操作により宿主細胞に導入された。この経路の評価スコアは、反応図に含まれる。
【図９】[0031]図９は、本開示の実施形態のバイオリーチャブル予測ツールにより作成しうるタイプの２つの識別可能経路の例を例示する。この例では、両経路は、バイオリーチャブル分子（Ｓ）−２，３，４，５−テトラヒドロジピコリネート（ＴＨＤＰ）を発生可能であるとしてバイオリーチャブル予測ツールにより同定された。２つの経路は、還元等価タイプ（ＮＡＤＨ対ＮＡＤＰＨ）を使用する点が異なる。これら経路の一方は、実用に供され、ＴＨＤＰを生成するように工学操作により宿主細胞に導入された。各経路の評価スコアは、反応図に含まれる。
【図１０】[0032]図１０は、本開示の実施形態のバイオリーチャブル予測ツールにより作成しうるタイプのより複雑な多経路予測の例を例示する。各経路の評価スコアは、反応図に含まれる。
【図１１Ａ】[0033]図１１Ａは、本開示の実施形態のバイオリーチャブル予測ツールにより作成しうるスコアリングブレイクダウンの例を例示する。この場合には、示された評価データは、分子（Ｓ）−２，３，４，５−テトラヒドロジピコリネート（ＴＨＤＰ）に至る経路を予測するプロセス時に発生された。
【図１１Ｂ】[0033]図１１Ｂは、本開示の実施形態のバイオリーチャブル予測ツールにより作成しうるスコアリングブレイクダウンの例を例示する。（図１１Ｂは、図１１Ａのボトムに添付される。）この場合には、示された評価データは、分子（Ｓ）−２，３，４，５−テトラヒドロジピコリネート（ＴＨＤＰ）に至る経路を予測するプロセス時に発生された。
【図１２】[0034]図１２は、本開示の実施形態の操作を例示するフロー図である。
【図１３Ａ】[0035]図１３Ａは、本開示の実施形態に係る、チロシンデカルボキシラーゼ活性を可能にする少なくとも１つの配列を同定する例を例示する。図１３Ａは、配列番号１〜６をそれぞれ出現順に開示する。
【図１３Ｂ】[0035]図１３Ｂは、本開示の実施形態に係る、チロシンデカルボキシラーゼ活性を可能にする少なくとも１つの配列を同定する例を例示する。図１３Ｂは、配列番号７〜１０をそれぞれ出現順に開示する。
【図１３Ｃ】[0035]図１３Ｃは、本開示の実施形態に係る、チロシンデカルボキシラーゼ活性を可能にする少なくとも１つの配列を同定する例を例示する。
【図１３Ｄ】[0035]図１３Ｄは、本開示の実施形態に係る、チロシンデカルボキシラーゼ活性を可能にする少なくとも１つの配列を同定する例を例示する。
【図１３Ｅ】[0035]図１３Ｅは、本開示の実施形態に係る、チロシンデカルボキシラーゼ活性を可能にする少なくとも１つの配列を同定する例を例示する。
【図１３Ｆ】[0035]図１３Ｆは、本開示の実施形態に係る、チロシンデカルボキシラーゼ活性を可能にする少なくとも１つの配列を同定する例を例示する。
【図１３Ｇ】[0035]図１３Ｇは、本開示の実施形態に係る、チロシンデカルボキシラーゼ活性を可能にする少なくとも１つの配列を同定する例を例示する。
【図１３Ｈ】[0035]図１３Ｈは、本開示の実施形態に係る、チロシンデカルボキシラーゼ活性を可能にする少なくとも１つの配列を同定する例を例示する。
【発明を実施するための形態】
【００２５】
詳細な説明
[0036]  本説明は、各種実施形態例が示される添付の図面を参照して行われる。しかしながら、多くの異なる実施形態例が使用されうるので、本説明は、本明細書に示される実施形態例に限定されるものと解釈されるべきではない。むしろ、これらの実施形態例は、本開示が徹底して完全なものとなるように提供される。模範的実施形態に対する各種修正は、当業者であれば容易に分かるであろう。また、本明細書に定義される一般的原理は、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく他の実施形態及び用途に適用されうる。そのため、本開示は、示された実施形態に限定されることが意図されるものではなく、本明細書に開示される原理及び特徴に一致する最も広い範囲が付与されるべきである。
【００２６】
[0037]  本発明者らは、実現可能標的分子を予測する従来の方法が以下の障壁を抱えていると認識している。
【００２７】
[0038]  １）生物学的パーツの欠如。これは、生物学的に発生可能な化学物質に関する偽陽性予測の単一最大原因である。いくつかの従来の方法は、既存の反応データベースを利用してグルコースのようなフィードストックからすべての既知の代謝反応を介して進み、すべてのパスが工学操作可能であると仮定する。しかしながら、多くの反応は、工学操作により宿主細胞に導入可能な遺伝子パーツに対応しない。典型的には、反応は酵素により触媒される。既存のデータベース中の反応は、その触媒酵素に従って十分に特徴付けられうるが、そうした酵素の多くは、そのシーケンスされたアミノ酸を有していない。つまり、酵素と関連遺伝子配列との間に確立された相関が存在しない。遺伝子配列なしでは、所要の酵素を生成するように宿主ゲノムを修飾することができない。事実上、十分に特徴付けられた酵素反応のおおよそ２５〜５０％は、既知の関連遺伝子配列を有していないので、そうした酵素は、工学操作目的の生物学的パーツとして有用でない。これらのデータベースは、十分に特徴付けられていない多くの反応を含むので、全生物学的データベース中の遺伝子不在反応のパーセントは、さらに高くなる可能性がある。本発明者らは、いくつかの場合には、酵素−ナノ粒子コンジュゲートなどの酵素以外の触媒を利用しうることに注目している。たとえば、Vertgel AA, et al., Enzyme-nanoparticle conjugates for biomedical applications, Methods Mol. Bio. 2011; 679: 165-82;Johnson PA, et al., Enzyme nanoparticle fabrication: magnetic nanoparticle synthesis and enzyme immobilization, Methods Mol. Biol. 2011; 679: 183-91（それらはすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。その場合、そうした触媒を工学操作により宿主細胞に導入するのに必要なパーツは、既知であってもなくてもよい。
【００２８】
[0039]  ２）不適正経路追跡。多くの試みられる解法は、分子間経路を任意に追跡しようとするものである。これは、標的分子の炭素骨格の形成を適正に追跡できない可能性がある。通常の例を挙げると、標的分子を生成する反応へのパスがグルタミンから追跡されうるともに、その場合、その標的分子を形成するパスのパーツとしてグルタミンが挙げられるであろう。しかしながら、ほとんどの場合、グルタミンは、窒素基を供与し炭素を供与しないので、この追跡は誤った方向に導かれ、標的分子を作製可能であることを示唆しない（他の誤りとしては、ＡＴＰなどの他のユビキタス分子又は水などの無機分子を介する接続を追跡することが挙げられる）。こうしたタイプの経路追跡の誤りはまた、使用不能なほど多数の予測経路をもたらす（あたかも地図用途で、２〜３つのきわめて直接的且つ有用なパスの代わりに、San Franciscoを通るすべての可能な道路ルートが許容されるがごとく）。
【００２９】
[0040]  ３）二方向反応の仮定。誤りの他の有意な源は、反応の熱力学／方向を説明できないことである。熱力学は、いくつかの反応が一方向にのみ進行可能であることを決定付ける。しかしながら、分子Ａを分子Ｂに分解するにすぎない反応は、従来の手段によると、多くの場合、どちらかの方向に進行するように予測されるので、分子ＡがＢから合成可能であると不適正に予測されるであろう。特定例として、いくつかの細菌は、有機クロライドなどのハロゲン化化合物を分解するが、ハロゲン化化合物を形成するように逆方向に進行できない。多くの生物学的反応は、一方向にのみ進行することが劇的に有利であるので、反応方向性を説明できないことはまた、偽陽性予測を作成するであろう。
【００３０】
[0041]  ４）他の誤り。すべての宿主が同一の代謝経路セットを維持するとは限らないので、あらゆる標的分子を生成するようにあらゆる宿主を工学操作できるとは限らないか、又は同一の修飾セット若しくは成功尤度を用いてあらゆる標的分子を生成するようにあらゆる宿主を工学操作できるとは限らない。
【００３１】
[0042]  本開示の実施形態は、従来の方法の限界を克服する。本開示の実施形態は、出発拘束条件セット（たとえば、特定宿主細胞、反応工程数、許容される遺伝子シーケンス酵素による反応のみか）を仮定して、生物学的に発生できる可能性の高いあらゆる化学物質を標的アグノスティックに提供しうる。これは、実現可能標的化学物質リストである「バイオリーチャブルリスト」を作成する。こうした標的化学物質及びその関連構造は、その生成に必要な生物学を考慮する必要なく分子の化学的有用性を精査可能な専門化学者に提供可能である。特定標的分子を選択した後、その式及び反応経路を遺伝子作製システムに提供して、選択された標的分子を生成するように宿主細胞の遺伝子配列を修飾しうる。
【００３２】
[0043]  本開示の実施形態のバイオリーチャブル予測ツールは、宿主細胞に対して出発代謝物を特定する出発代謝物セットを得る。実施形態では、出発代謝物セットは、コア代謝物を特定し、コア代謝物は、特定条件下で非工学操作宿主により生成される少なくとも１つのデータベースにより示唆される代謝物を含む。実施形態では、宿主は、遺伝子修飾に付されていない。
【００３３】
[0044]  実施形態では、バイオリーチャブル予測ツールは、反応を特定する出発反応セットを得る。実施形態では、ツールは、少なくとも１つのデータベースで１つ以上の対応する触媒（たとえば、宿主細胞内で起こりうる１つ以上の反応を触媒するために利用できる可能性が高いことがそれ自体示唆される酵素）により触媒されることが示唆される１つ以上の反応を出発反応セットからフィルター反応セットに含める。
【００３４】
[0045]  工学操作により触媒を宿主内に導入することによるか（たとえば、宿主ゲノムの改変、プラスミドの添加によるか）又は宿主を成長させる成長培地からの触媒の取込みを介するかのどちらかにより、触媒を宿主に導入しうることを示唆するものと、たとえば、公的又は独自のデータベースから、バイオリーチャブル予測ツールが情報を判断した場合、触媒は、宿主細胞内で反応「を触媒するために利用できる」可能性が高い。
【００３５】
[0046]  より具体的には、本開示は、宿主細胞が触媒（たとえば酵素タンパク質）を生成するように宿主細胞のゲノムが修飾されたとき（たとえば、パーツの生成をコードしたプラスミドの挿入を含めて、遺伝子の挿入、欠失、置換えを介して）、「工学操作」により宿主細胞に導入されるとして触媒などのパーツを参照する。しかしながら、パーツ自体が遺伝子物質（たとえば、酵素として作用する核酸配列）を含む場合、そのパーツを「工学操作」により宿主細胞に導入することは、そのパーツ自体を具現化するように宿主ゲノムを修飾することを意味する。
【００３６】
[0047]  工学操作によりパーツを宿主に導入可能であることを示唆するものとバイオリーチャブル予測ツールが情報を判断した場合、パーツは、宿主細胞に導入するために「工学操作に利用できる」可能性が高い。たとえば、実施形態によれば、ＢＰＴツールによりにアクセスされる公的又は独自のデータベース中のアノテーションにより示唆されるように、酵素が工学操作により宿主に導入可能であることが分かった場合、ツールは、酵素が工学操作により宿主に導入するために利用できる可能性が高いことを示唆するものと情報を判断するであろう。少なくとも１つのアミノ酸配列が（いずれかの宿主内で）反応を触媒することが知られている（たとえば、以上のデータベースの１つに見いだされる）証拠が存在する場合、当業者であれば、アミノ酸配列をコードするように使用される対応する遺伝子配列を導出し、それに応じて宿主ゲノムを修飾することが可能であろう。利用できる可能性の高いパーツが酵素である場合、ツールは、分子の作製に必要な反応を触媒する可能性がきわめて高いものと予測された酵素配列セットを選択可能であり、この場合、酵素配列は、タンパク質アミノ酸配列として又は遺伝子的にＤＮＡ若しくはＲＮＡとして表されうるとともに、天然又は異種でありうる。これとの関連では及び特許請求の範囲では、「可能性が高い」とは、そうでないものよりも起こりうること、すなわち、５０％超の尤度を有することを意味する。
【００３７】
[0048]  バイオリーチャブル分子の予測をもたらす１つ以上の処理工程の各処理工程では、バイオリーチャブル予測ツールは、フィルター反応セットの１つ以上の反応に従って、出発代謝物と前の処理工程で発生した代謝物とを表すデータを処理して、１つ以上の実現可能標的分子を表すデータを発生する。ツールは、１つ以上の実現可能標的分子を表すデータを出力として提供する。
【００３８】
[0049]  実施形態では、バイオリーチャブル予測ツールは、対応する触媒が宿主細胞内で１つ以上の反応を触媒するために利用できるか、たとえば、１つ以上の反応を触媒するために工学操作による宿主細胞への導入に利用できるか、に関する信頼度を決定する。信頼度は、たとえば、少なくとも第１の信頼度又は第１の信頼度よりも高い第２の信頼度を含みうる。ツールは、少なくとも１つのデータベースで、宿主細胞内で１つ以上の反応を触媒するために第２の信頼度で利用できるとそれ自体判断された、たとえば、１つ以上の反応を触媒するために工学操作による宿主細胞への導入に第２の信頼度で利用できると判断された、１つ以上の対応する触媒により触媒されることが示唆される１つ以上の反応を、出発反応セットからフィルター反応セットに、を含めうる。
【００３９】
[0050]  本開示の実施形態では、バイオリーチャブル予測ツールは、実現可能標的分子の１つ以上を生成する困難の指標を発生する。困難の指標は、熱力学的性質、１つ以上の実現可能標的分子に対する反応経路長、又は実現可能標的分子の１つ以上に至る１つ以上の第１の反応経路に沿った１つ以上の対応する反応を触媒するために触媒が利用できるかに関する信頼度に基づきうる。
【００４０】
[0051]  本開示の実施形態では、特定処理工程で１つ以上の実現可能標的分子を表すデータを発生した後且つその次の処理工程の前に、バイオリーチャブル予測ツールは、特定処理工程で１つ以上の実現可能標的分子を表すデータの発生に関連付けられたいずれかの反応をフィルター反応セットから取り出す。
【００４１】
[0052]  実施形態では、ツールは、各実現可能標的分子をもたらす１つ以上の反応経路（すなわち系統）の記録を発生する。実施形態では、記録を発生することは、ユビキタス代謝物からの記録反応経路に含めないことを含む。実施形態では、ツールは、実現可能標的分子を表すデータを発生する工程の記録を発生する。実施形態では、ツールは、出発代謝物セットから各実現可能標的分子までの最短反応経路の記録を発生する。
【００４２】
[0053]  単一宿主細胞を仮定して実現可能標的分子を決定する代わりに、所与の実現可能標的分子を生成するために１つ以上の宿主細胞を同定することが望ましいこともある。たとえば、顧客は、標的分子を生成するためにツールのユーザーに複数の宿主内で最適な宿主細胞を決定するように要求しうる。実施形態では、バイオリーチャブル予測ツールは、複数の宿主細胞に対して実施され、複数の宿主細胞の各宿主細胞に対して本明細書に記載の方法のいずれかに従って１つ以上の実現可能標的分子（バイオリーチャブル候補分子）を表すデータを発生する。かかる実施形態では、所与の実現可能標的分子に対して、ツールは、複数の宿主細胞の中から少なくとも１つの基準、たとえば、所与の宿主細胞内で所与の実現可能標的分子を生成するために必要であると予測される所与の宿主細胞又は所与の処理工程数により生成される実現可能標的分子の所与の予測収率を満たす少なくとも１つの宿主細胞を決定する。ツールは、少なくとも１つの基準を満たすと判断された宿主細胞を表すデータを出力として提供する。
【００４３】
[0054]  以上の実施形態に対して記載されるように、ツールは、たとえば、各宿主細胞により生成される各標的分子をもたらす１つ以上の反応経路（すなわち系統）の熱力学的性質を含めて、記録を発生しうる。複数の宿主細胞に対してツールを実施する以上の実施形態に基づいて、ツールは、宿主細胞、標的分子、及び系統の間の関連をライブラリーとしてデータベースに記憶しうるとともに、これらは、収率、処理工程数、反応経路の反応を触媒する触媒の利用可能性などのパラメーターを特定するアノテーションを含みうる。
【００４４】
[0055]  実施形態では、ツールがかかるライブラリーにアクセスする場合、ツールは、所与の実現可能標的分子を生成するために複数の宿主細胞の同定を行う必要はない。その代わりに、かかる実施形態では、ツールは、宿主、標的分子、及び反応の間の関連に関するアノテーションデータを含みうる系統をライブラリーから使用しうる。ツールは、たとえば、公的若しくは独自のデータベースから又はライブラリーから、少なくとも１つの標的宿主細胞内で標的分子の生成をもたらす少なくとも１つの反応経路の反応を触媒すると予測されるすべての触媒が、すべてのかかる反応を触媒するために利用できる可能性が高いという証拠に少なくとも部分的に基づいて、１つ以上の宿主細胞の中から少なくとも１つの標的宿主細胞を同定しうる。実施形態では、ツールは、標的分子を生成するために必要であると予測される反応経路内で閾値未満の反応工程数を必要とする標的宿主に基づいて標的宿主を決定しうる。
【００４５】
[0056]  いくつかの反応酵素は、既知の関連アミノ酸配列又は遺伝子配列を有していないこともある（「オーファン酵素」）。かかる場合には、ツールは、その代わりにオーファン酵素をバイオ探査してそのアミノ酸配列及び最終的にはその遺伝子配列を予測しうるとともに、新たにシーケンスされた酵素を工学操作により宿主細胞に導入して１つ以上の反応を触媒するようにしうる。ツールは、新たにシーケンスされた酵素に対応する反応をバイオリーチャブル分子探索で使用されるフィルター反応データのメンバーとして含めうる。
【００４６】
[0057]  実施形態では、バイオリーチャブル予測ツールは、実現可能標的分子をもたらす反応経路の１つ以上の反応に関連付けられた１つ以上の遺伝子配列の指標を遺伝子作製システムなどの「工場」に提供する。実施形態では、遺伝子作製システムは、指定遺伝子配列を具現化して宿主のゲノムに導入することにより標的分子作製用の工学操作ゲノムを生成する。実施形態では、ツールは、工場に工場用の１つ以上の触媒の指標を提供して、標的分子の生成のために宿主細胞の成長培地に１つ以上の触媒を導入する。
【００４７】
[0058]  実施形態では、バイオリーチャブル予測ツールは、１つ以上の反応が自発的であるかに少なくとも部分的に基づいて、その方向性に少なくとも部分的に基づいて、１つ以上の反応が輸送反応であるかに少なくとも部分的に基づいて、又は１つ以上の反応がハロゲン化合物を発生するかに少なくとも部分的に基づいて、出発反応セットからの反応をフィルター反応セットに含む。
【００４８】
[0059]  本開示の実施形態では、バイオリーチャブル予測ツールは、宿主細胞に対して出発代謝物を特定する出発代謝物セットを得るとともに、宿主に特異的な反応を特定する出発反応セットを得る。本開示の実施形態では、バイオリーチャブル予測ツールは、少なくとも１つのデータベースで自発的であることが示唆される１つ以上の反応をフィルター反応セットに含む。１つ以上の処理工程の各処理工程では、ツールは、フィルター反応セットの１つ以上の反応に従って出発代謝物と前の処理工程で発生したいずれかの代謝物とを表すデータを処理して、各工程で１つ以上の実現可能標的分子を表すデータを発生する。実施形態では、ツールは、１つ以上の実現可能標的分子を表すデータを出力として提供する。
【００４９】
[0060]  システム設計
[0061]  図１は、本開示の実施形態の分散システム１００を例示する。ユーザーインターフェース１０２は、テキストエディターやグラフィカルユーザーインターフェース（ＧＵＩ）などのクライアント側インターフェースを含む。ユーザーインターフェース１０２は、ラップトップコンピューターやデスクトップコンピューターなどのクライアント側コンピューティングデバイス１０３に常駐しうる。クライアント側コンピューティングデバイス１０３は、インターネットなどのネットワーク１０６を介して１つ以上のサーバー１０８に結合される。
【００５０】
[0062]  サーバー１０８は、分子、反応、及び配列データの１つ以上のコーパスを含みうる１つ以上のデータベース１１０にローカル又はリモートで結合される。反応データは、すべての既知の代謝反応のセットに対応しうる。実施形態では、反応データは、ユニバーサルである。すなわち、宿主特異的でない。
【００５１】
[0063]  分子データは、代謝物（基質又は産物のどちらかとして反応データに含まれる反応に関与する反応剤）に関するデータを含む。実施形態では、代謝物に関するデータは、特定宿主細胞内で生成されることが当技術分野で公知のコア代謝物などの宿主特異的代謝物に関するデータを含む。いくつかの実施形態では、いくつかのコア代謝物は、本発明者らにより集められた経験的証拠を介して特定宿主により生成されると判定された。こうした宿主特異的代謝物セットは、宿主細胞のメタボロミクス解析などの各種方法を介して、又はある特定の成長条件下で不可欠な酵素コード遺伝子を同定してそうした遺伝子によりコードされる酵素により生成される代謝物の存在を推測することにより、同定された。分子データは、宿主細胞、成長培地特性、分子がコア代謝物、前駆体、ユビキタス、又は無機であるかなどの多くの特徴を表すアノテーションでタグ付けされうる。
【００５２】
[0064]  UniProtなどのデータベース１１０はまた、宿主を成長させる成長培地からの触媒の取込みを介して触媒が宿主細胞に導入されうるかに関するデータを含みうる。
【００５３】
[0065]  配列データは、工学操作による宿主細胞への反応の導入のために、反応が酵素や遺伝子の配列などの配列に対応することが知られている可能性が高いかに関して反応データセットの反応にアノテートするように反応アノテーションエンジン１０７用のデータを含みうる。たとえば、配列データは、対応するアミノ酸配列が知られている可能性が高い酵素により反応が触媒されるかに関して反応データ中の反応にアノテートするためのデータを含みうる。その場合には、次いで、当技術分野で公知の方法を介して、酵素をコードする遺伝子配列を決定可能である。実施形態では、実現可能標的分子を決定する目的で、反応アノテーションエンジン１０７は、配列データ自体を知る必要はないが、触媒に対する配列が存在することが知られている可能性が高いかのみ知る必要がある。以下に記載の反応アノテーションエンジン１０７は、関連コード配列を有することが示唆される反応を触媒する酵素に対する配列データを含むUniProtなどのデータベースからの配列データを編集しうる。配列データはまた、両トレインモデルに対する酵素選択工程で使用されうるとともに、可能な予測配列の供給源を提供しうる。
【００５４】
[0066]  実施形態では、サーバー１０８は、反応アノテーションエンジン１０７とバイオリーチャブル予測エンジン１０９とを含み、それらのエンジンは、一緒に又は個別に、本開示の実施形態のバイオリーチャブル予測ツールを形成する。代替的に、アノテーションエンジン１０７、予測エンジン１０９、又はその両方に対するソフトウェア及び関連ハードウェアは、サーバー１０８の代わりにクライアント１０３にローカルに常駐しうるか、又はクライアント１０３及びサーバー１０８の両方に分散されうる。データベース１１０は、UniProt、PDB、Brenda、BKMR、MNXrefなどの公的データベース、さらにはユーザー又は他の者により作成されたカスタムデータベース、たとえば、ユーザー又はサードパーティーコントリビューターにより実施された合成生物学実験を介して発生された分子及び反応を含むデータベースを含みうる。データベース１１０は、クライアント１０３に対してローカル若しくはリモートでありうるか、又はローカル及びリモートの両方に分散されうる。いくつかの実施形態では、アノテーションエンジン１０７は、クラウドベースサービスとして動作しうるとともに、予測エンジン１０９は、クライアントデバイス１０３上でローカルに動作しうる。実施形態では、いずれかのローカルに常駐するエンジンにより使用されるデータは、クライアントデバイス１０３上のメモリーに記憶されうる。
【００５５】
[0067]  システム操作
[0068]  出発代謝物リストと出発反応データセットとを得る。
【００５６】
[0069]  バイオリーチャブル予測プロセスへの入力は、出発代謝物リスト、出発反応リスト、宿主細胞などの情報と、宿主に対する燃料レベル（たとえば、最少又は富栄養成長培地）などのベースライン条件と、温度などの環境条件と、を含む。アノテーションエンジン１０７は、データベース１１０からの関連アノテーションと一緒に代謝物データ及び反応データをアセンブルしうる。
【００５７】
[0070]  ユーザーインターフェース１０２を介して、ユーザーは、出発代謝物リスト及び出発反応リストに対する情報を得るためにデータベース１１０を特定しうる。たとえば、反応及び宿主特異的代謝物は、KEGG、Uniprot、BKMR、MNXrefなどの公的データベースから得られうる。（本明細書及び特許請求の範囲での「代謝物」、「反応」などへの参照は、多くの場合、事実上、物理的オブジェクトやプロセスそれ自体ではなくそうした物理的オブジェクト又はプロセスを表すデータを意味することは、考察の文脈から当業者であれば分かるであろう。）
【００５８】
[0071]  出発代謝物リスト
[0072]  図２を参照して、実施形態では、反応アノテーションエンジン１０７は、所与の成長条件下で特定時間又は特定時間インターバルで宿主細胞の成長時に存在すると予想される化学化合物（出発産物、中間産物、及び最終産物）のリストを含む宿主特異的出発代謝物ファイルをデータベース１１０から得るか又はそれ自体でアグリゲートする（２０２）。デフォルト成長条件は、最少成長培地でありうる。なぜなら、これは出発代謝物を選択する最も保守的なアプローチであるからである。実施形態では、反応アノテーションエンジン１０７は、代謝物ファイルを出発代謝物リストとして予測エンジン１０９に提供しうる。
【００５９】
[0073]  実施形態では、反応アノテーションエンジン１０７は、宿主細胞又は類似の細胞に対する成長データに基づいて出発代謝物を決定又はテンプレート（類似の微生物から）しうる。このアプローチは、RASTシステムなどのシステムで微生物のゲノムにアノテートするために又はBioCycデータベースコレクションで代謝経路を予測するために用いられるアプローチに類似している。このアプローチは、所与の宿主細胞に対してゲノムアノテーションを用いてどの代謝経路が存在するかの最良の推測を行い、次いで、そうした経路ですべての構成反応及びその代謝物の存在を仮定する。BioCycデータベースの場合には、既存のゲノムアノテーションを用いて個別酵素（ひいてはその反応）の推定存在を同定する。次いで、ルールベースシステムを用いてそれらの置換基反応（のいくつか）の存在に基づいて全代謝経路の存在を推測する。
【００６０】
[0074]  宿主細胞に特異的な出発代謝物リストを有することは、本開示の実施形態の識別出発点である。他の従来のアプローチは、作製可能な標的について一般的な予測を行うが、本開示の実施形態のこのカスタマイズ可能な工程は、宿主細胞の生物学的な差に基づいてどの標的分子が作製可能であるか（又はそれがいかに作製可能であるか）について不適正な予測を行う問題を回避する。
【００６１】
[0075]  実施形態では、ユーザーは、宿主細胞や成長培地などのパラメーターを用いてデータベース又はデータセットにクエリーを行うことに基づいて、いくつかの実施形態ではそうしたデータベースと関連モデル細胞データベース又は特異的代謝物の存在の他の指標とのクロスインデクシングを介して、MNXref、KEGG、BKMRなどの既存のデータベース又はデータセットから出発代謝物を検索するように、反応アノテーションエンジン１０７に指示しうる。これまで、特定工業用宿主に対して、譲受人は、２００〜３００程度の代謝物で典型的出発代謝物ファイルを作成してきた。以上に述べたように、公的データベース中の代謝物を表すデータオブジェクト及びアノテーションエンジン１０７により形成されたリストは、宿主細胞、成長培地タイプ、代謝物がコア代謝物、前駆体、無機、又はユビキタスであるかなどのメタデータを含むアノテーションを含みうる。
【００６２】
[0076]  コア代謝物は、成長培地の富栄養度などの所与のベースライン条件に対して遺伝子非修飾細胞内に天然に見いだされる出発代謝物（たとえば基質）、中間代謝物、及び最終代謝物である。Ｅ．コリ（E. coli）のような微生物のバイオマス中の各コア代謝物（たとえばアミノ酸）は、１１前駆体代謝物の１つから細胞のコア代謝で発生されうるとともに、どんな炭素入力が遺伝子非修飾細胞に提供されるにせよ基本的に発生されうる。実施形態では、ユーザーは、MNXref、KEGG、ChEBI、Reactomeなどのデータベースからその前駆体依存性でタグ付けされた選ばれたコア化合物の出発代謝物セットを選択しうる。
【００６３】
[0077]  名称から示唆されるように、アンモニウムなどの無機代謝物は炭素を含まないので、代謝の新たな産物に炭素原子を付与することはできない。それゆえ、反応アノテーションエンジン１０７は、出発代謝物セットから無機代謝物を除外しうる。
【００６４】
[0078]  いくつかの代謝物はユビキタスである。すなわち、それらは多くの反応に見いだされる。それらは、ＡＴＰやＮＡＤＰのような分子を含む。典型的には、ユビキタス分子は、標的産物に炭素を付与しないので、標的への代謝経路のいずれのパーツでもないであろう。それゆえ、反応アノテーションエンジン１０７は、出発代謝物セットからユビキタス代謝物を除外しうる。ユビキタス分子は、専門家の評価に基づいてアノテーションに手動で指定可能であるか、又は何の分子が特定閾値数を超えて反応に関与するかを決定することにより同定可能である。一ヒューリスティック法では、典型的コア代謝物入力サイズ（たとえば３００）を超える数で反応セットに出現するすべての分子にフラグを立てる。たとえば、一データセットでは、ＡＴＰはおおよそ３１，０００反応のうち２，４１５反応に出現し、ＮＡＤＨは２，０００反応に出現し、ＮＡＤＰＨは３，１０７反応に出現するので、それらをコア代謝物数を超えた位置に置き、それらすべてに「ユビキタス」タグを立てる。
【００６５】
[0079]  出発反応データセット
[0080]  反応アノテーションエンジン１０７は、実現可能標的分子（２０４）の予測の基礎として出発反応データセットを得る。ユーザーは、出発反応データセットをいかに構築するかを特定しうるか、又はユーザーは、公的データベース１１０又は独自データベース１１０、たとえば、ユーザー又は他の者により事前に形成されたカスタムデータベースからデータを直接得るようにアノテーションエンジン１０７に指示しうる。一実施形態では、アノテーションエンジン１０７は、MNXrefのMetaNetx反応ネームスペース（ＭＮＸ）から全反応セット（おおよそ３０，０００反応）をインポートしうる。他の実施形態では、アノテーションエンジン１０７は、MetaCyc及びKEGG又は他の公的若しくは私的データベースから反応セット（おおよそで２２，０００の完全な反応）をインポートしマージしうる。
【００６６】
[0081]  実施形態では、反応アノテーションエンジン１０７は、データベース１１０から得られる情報を選択的にアグリゲートすることにより出発反応データセットを構築しうる。たとえば、BKMRは、反応が自発的であるかの情報を提供する。アノテーションエンジン１０７は、対応する反応に対してBKMR反応ＩＤをMNXref中のＩＤにマッピングする既知のマッピングを使用しうる。他の例では、BKMR及びそのＩＤの代わりにKEGG又はMetaCyc及びそれらのＩＤを利用しうる。こうした関連を用いて、次いで、反応アノテーションエンジン１０７は、BKMRからの対応する自発反応タグと共にMNXrefからの既存のアノテーション（たとえば、コア、ユビキタス）を用いて、データベース１１０にカスタム反応リストを作成しうる。同様に、対応するＩＤのマッピングを介して、アノテーションエンジン１０７は、MNXref中の反応とUniProt中のアノテーションとを関連付けて、反応が輸送反応であるか又は反応基質若しくは産物がハロゲンを含有するかに対するタグを得て、データベース１１０中のカスタム反応リストの反応に対するアノテーションに組み込みうる。（ほとんどのハロゲン関連反応は化学物質の分解に関係するので、ハロゲン化化合を同定することは、誤った方向に進行する反応を同定するヒューリスティック法である。）
【００６７】
[0082]  こうした方針に沿って、反応アノテーションエンジン１０７は、データベース全体にわたり関連ＩＤを用いてデータベースからのデータをアグリゲートし、カスタムアノテーションと共に、たとえば、タグの中でもとくに、反応が自発的であるか、熱力学に基づいて一方向にのみ進行するか、ハロゲンを含有するか（方向性の決定に関連する）、ユビキタス代謝物を含有するか、輸送反応であるか、非平衡であるか（すなわち、化学反応の両側が元素バランスを維持しないため、原データベースに反応が不適正に記述されていることが示唆され、無視されるべきである）、利用可能なデータベースに不完全に特徴付けられているか、酵素が既知のアミノ酸配列若しくは酵素をコードする遺伝子配列に関連付けられるインジケーターでタグ付けされた酵素に関連付けられているか、又は原酵素により触媒され、膜貫通ドメインを有する可能性が高いかなどと共に、出発反応セットを記憶するデータベース１１０を構築しうる。そのため、ユーザーは、アノテーションエンジン１０７を介して、たとえば、MNXrefデータベース中のおおよそ３０，０００反応のすべてにアノテーションを割り当てうる。以下に記載されるように、次いで、ユーザーは、各アノテーション特徴又はそれらのいずれかの組合せに対して、このマスターファイルをフィルターし個別リストにするための基準を構成しうる。
【００６８】
[0083]  バイオリーチャブル分子予測
[0084]  図２のフロー図を参照して、以下で本開示の実施形態の予測エンジン１０９の操作の例を説明する。予測エンジン１０９は、任意に選択された宿主細胞内で遺伝子工学操作などを介してどの化学物質が形成可能であるかを予測する。予測エンジン１０９は、出発代謝物ファイルと、出発反応データセットと、配列データベースと、を入力として採用しうる。配列データベースは、触媒化合物（たとえば酵素）に対するアミノ酸配列又は触媒化合物をコードする遺伝子配列を記憶しうる。本開示の実施形態は、配列データベースを用いて各反応に対してアミノ酸配列又は遺伝子配列の存在又は不在を決定する。かかる実施形態では、配列データベースは、利用可能な酵素又は遺伝子パーツを触媒が有するか否かがタグ付けされている限り、配列自体を含む必要はない。バイオリーチャブル候補分子のリストと共に、予測エンジン１０９は、出発代謝物から各分子の生成をもたらす反応の特定宿主細胞「系統」（反応経路）に対して、たとえば、いくつかの実施形態では宿主のコア代謝物を生成する。
【００６９】
[0085]  特定的には、予測は、いくつかのパラメーターに基づいて、たとえば、反応を触媒するために触媒を利用できる可能性が高いこと（たとえば、工学操作による宿主細胞への導入に遺伝子パーツを利用できる可能性が高いこと、又は宿主細胞を成長させる成長培地からの取込みを介する宿主細胞への導入に触媒を利用できる可能性が高いこと）、許容される最大反応工程数（出発代謝物から開始される）、許容されるパーツ又は化学反応のタイプ、及び他の選択可能な特徴に基づいて、調整可能である。予測エンジン１０９はまた、コア代謝物から各標的分子への潜在的パスを予測することにより、標的分子へのアプローチ及び標的分子設計の困難さを予測するのを支援する。
【００７０】
[0086]  フィルター反応データセット
[0087]  実施形態では、予測エンジン１０９は、フィルター・検証反応データセット（ＲＤＳ）を作成する。反応アノテーションエンジン１０７により特徴付けられた反応を用いて、予測エンジン１０９は、所望の検証レベルまで、たとえば、反応酵素に対するコード配列が存在する信頼レベルまで、反応をフィルターしうる（２０６）。これは、予測確度を微調整したり偽陽性予測の一次源を制御したりする工程である。上述した例では、本発明者らは、MNXrefのMetaNetx反応ネームスペース（ＭＮＸ）から全反応セット（おおよそ３０，０００反応）をインポート且つアノテートすることにより、１つのバイオリーチャブルリストに対するＲＤＳを発生した。KEGG、Reactome、MetaCycなどの他の公的に利用可能な反応データベースに対して類似のアプローチを適用可能である。
【００７１】
[0088]  本発明者らの経験によれば、最も普及している公的データベース中の反応の２５〜５０％は、いずれの既知の関連生物学的パーツも有していない可能性がある。たとえば、反応を触媒する酵素のアミノ酸配列又はそれに付随する遺伝子配列は知られていない可能性がある。酵素配列情報なしでは、バイオリアクターは、そうした酵素を利用する反応を実施できないであろうから、反応情報は工学操作目的に役立たない。経路内のただ１つの酵素が既知の遺伝子配列を欠如していたとしても、工学操作により全経路を宿主に導入することはできない。
【００７２】
[0089]  こうした欠点に対処するために、予測エンジン１０９は、公的に利用可能な酵素データ又はカスタム酵素データを用いた一連の検証試験を介して反応をフィルターしうる。公的データベースの１つは、大きなオープンアクセスの確実に管理されたUniProtである。他のものとしては、RCSBタンパク質データバンク（PDB）及びGenBankが挙げられる。MNXref、UniProt、Brenda、PDBなどのいくつかの公的データベースでは、反応は、触媒する反応に基づく酵素に対する数値分類である酵素委員会（Enzyme Commission）（EC）番号でタグ付けされうる。UniProtやPDBなどのいくつかのデータベースでは、触媒酵素をコードする遺伝子配列が知られている反応に対してのみEC番号タグが記憶される。KEGGやMetaCycなどの他のデータベースは、遺伝子配列が知られていない酵素に対するEC番号を含む。
【００７３】
[0090]  そのため、データベースに依存して、EC番号は、既知の酵素遺伝子配列の存在を示唆することもしないこともある。EC番号を有する反応のおおよそ２０〜２５％は、関連酵素コード配列を有していない。いくつかの場合には、EC番号は、複数の特定化学変換にアノテートするために用いられるので（EC番号と化学反応との間に一対多の関係が存在する）、EC番号に関連付けられた酵素配列の存在は、そのECに関連付けられたあらゆる反応が妥当な関連配列を有することを意味しない。そのため、酵素活性に関するECタグの存在は、その酵素に対する遺伝子配列の存在の信頼できる一般的インジケーターではないが、その酵素に対する配列が合理的に存在する可能性が高いかの判断をある特定のデータベースに適用可能である。いくつかのデータベースはまた、所与のアミノ酸配列により明確に触媒されることが知られる特定化学反応を明示的に記載する個別領域（たとえば、UniProt中の「触媒活性」領域）を有する（そのため、酵素触媒をコードする既知の遺伝子配列を有する）。かかる反応は、本明細書では、「明確にシーケンスされた」としてアノテートされたという。
【００７４】
[0091]  予測エンジン１０９は、宿主細胞内で反応を触媒するために触媒が利用できるか（たとえば、反応を触媒するために工学操作による宿主細胞への導入に利用できるか）に関する信頼度を決定しうる。たとえば、酵素コード配列が知られている確実性の差に基づいて、予測エンジン１０９は、いくつかの実施形態では、反応データセット中のアノテーションと対比して酵素コード配列に対して「厳密」検索又は「緩和」検索を実行しうる。厳密検索では、予測エンジン１０９は、たとえば、明確にシーケンスされたとしてアノテートされた反応のみを選択しうる。
【００７５】
[0092]  実施形態では、予測エンジン１０９は、以下の実施形態に記載のように、反応を触媒するために触媒が利用できるかに関する信頼度、配列（たとえば、酵素アミノ酸配列、ヌクレオチド配列）が宿主細胞内で所望の機能を可能にする信頼度（たとえば期待値）を因子として組み込みうる。
【００７６】
[0093]  緩和検索では、予測エンジン１０９は、たとえば、既知の酵素コード配列に関連付けられたEC番号を有するとしてアノテートされた反応、又はMetaCycなどのデータベースから導出されるアノテーションから配列データベース中で「明確にシーケンスされた」としてアノテートされた（ブール非排他的ＯＲ）反応を選択しうる。予測エンジン１０９は、いずれかの遺伝子又はアミノ酸配列がどちらかの信頼レベルで反応に見いだされるかを記録する。たとえば、予測エンジン１０９は、緩和検索を満たすが厳密検索を満たさないことを示唆するタグで反応にアノテートしうる。
【００７７】
[0094]  図３は、MNXrefやUniProtなどのデータベースに対して本開示の実施形態に係る厳密及び緩和酵素配列検索を実現するための模範的擬似コードを例示する。擬似コードは、酵素に対する配列が存在するかを決定するヒューリスティック法により用いられるロジックを記述する。この実施形態は、４つの信頼レベルを提供する。コードは、反応データセットアノテーションが少なくとも１つのEC番号を含むかを最初に決定することを示す。その場合には、コードは、EC番号に関して配列データベースを検索することを要求する。厳密検索が行われている場合、コードは、明確にシーケンスされた反応に関して配列データベースを検索することを要求する。緩和検索が行われている場合、コードは、関連EC番号を有する反応に対して緩和アノテーションタグをＴＲＵＥに設定する。
【００７８】
[0095]  反応データセットアノテーションが（ａ）EC番号を含まないと初期工程が決定した場合、又は（ｂ）（以上に述べた通り）EC配列検索が配列データベース中にEC番号を見いだして厳密検索が行われている場合、コードは、明確にシーケンスされた反応に関して配列データベースを検索することを要求する。その検索が明確にシーケンスされた反応を見いだした場合、コードは、その反応に対して厳密及び緩和アノテーションの両方にＴＲＵＥを設定する。そうでなければ、コードは、その反応に対して両方のアノテーションにＦＡＬＳＥを設定する。
【００７９】
[0096]  要するに、このヒューリスティック法の出力は、各反応：厳密及び緩和に対する２つのアノテーションタグである。このヒューリスティック法は、以下に記載のように４つの信頼レベルを提供する。
厳密＝ＴＲＵＥ  →  配列が存在するきわめて高い信頼性
厳密＝ＦＡＬＳＥ  →  配列が存在しない中程度の信頼性（いくつかの偽陰性を予想）
緩和＝ＴＲＵＥ  →  配列が存在する中程度の信頼性（いくつかの偽陽性を予想）。
緩和＝ＦＡＬＳＥ  →  配列が存在しないきわめて高い信頼性
【００８０】
[0097]  緩和検索を行うと２０％未満の偽陽性率をもたらすが、UniProt中の触媒活性領域に対して厳密検索を行うと有意な偽陰性率をもたらすことを、本発明者らは見いだした。そのため、緩和検索側でわずかに誤りを生じるほうが良いかもしれない。「緩和」及び「厳密」タグは、配列ベースフィルタリングを扱うわずか２つの潜在的方法である。バイオリーチャブル予測ツールは、標的活性に適切なモチーフを有する配列の存在を同定するなどのより寛大な方法又はMetaCycなどの厳重に管理されたデータベース中の文献で直接支持される活性−配列関係の存在を必要とするなどのより厳密な方法を含めて、いずれの配列ベースタギング（ひいてはフィルタリング）アプローチにも適用可能である。
【００８１】
[0098]  配列ベースフィルタリングの代わりに又はそれに加えて、予測エンジン１０９は、アノテーションエンジン１０７に関連して以上で考察されたアノテーション、たとえば、反応の方向性又は反応が自発反応であるか輸送反応であるか若しくはハロゲンを含有するかのいずれかの組合せに基づいて、反応をフィルターしうる（すなわち、選択するように又は選択しないようにしうる）。予測エンジン１０９は、ユーザーインターフェース１０２を介するユーザー構成又はデフォルト設定に基づいてフィルタリングを実施しうる。実施形態では、予測エンジン１０９は、シミュレートされた代謝経路に沿って異なる反応工程で異なるフィルターを適用しうる。デフォルト設定の例として、反応が緩和基準に基づくシーケンスを有すること、すべての輸送反応を除外すること、反応がシーケンスを有する場合はハロゲンを含有する反応のみを含めること、以上の属性にかかわらずすべての自発反応を含めること、が挙げられうる。
【００８２】
[0099]  反応が自発的である場合、自発反応を触媒する酵素を生成するように宿主ゲノムを工学操作する必要なく、反応は自動的に起こるであろう。所与の宿主に対して反応は所与の条件下で起こることが知られているので、予測エンジン１０９は、自発反応生成物が生成されることを予測可能である。
【００８３】
[00100]  以上に述べたように、無機分子は炭素を付与しないので、ユビキタス分子は標的代謝物に炭素を付与する可能性が低い。そのため、出発代謝物として使用されるものからユビキタス分子及び無機分子を除外することにより、予測エンジン１０９が実現可能標的分子を予測して妥当な代謝経路を辿る高い信頼レベルがヒューリスティックに提供される。それゆえ、予測エンジン１０９は、反応が制限されるユビキタス分子も無機分子も処理しない。すなわち、それらはそれらが関与する反応に常に利用可能であると仮定される。
【００８４】
[00101]  代謝物予測
[00102]  図２を参照して、予測エンジン１０９は、フィルターＲＤＳ中の反応に従って処理される入力代謝物の基質を仮定して、ステップワイズシミュレーションを実施しどの代謝物が形成されるかを予測しうる（２０８）。（化学反応は、入力「基質」（たとえば分子セット）に作用して化学産物を生成する。）本開示の実施形態の予測エンジン１０９の操作は、以下のように記述しうる。
【００８５】
[00103]  工程０：  最初に、コア代謝物のみがシミュレート宿主細胞内に存在する。それらはその次の工程の反応に対する現在の基質を形成する。
【００８６】
[00104]  工程１：  予測エンジン１０９は、工程０からのコア代謝物がフィルター反応セット（ＲＤＳ）内の化学反応式のいずれかの一方の側にマッチするか、且つ反応が所与の方向に行われうるか（方向／熱力学アノテーションに基づく）を決定し、それにより、反応が反応式（２０８）の他方の側で化学物質を生成するように発生するかを決定する。予測エンジン１０９は、発生した反応（２１０）によりいずれかの新たな代謝物が生成されるかを決定する。
【００８７】
[00105]  新たな代謝物が予測されなかったと予測エンジン１０９が決定した場合（２１０）、予測エンジン１０９は予測プロセスを終了し結果を報告する（２１２）。
【００８８】
[00106]  逆に言えば、新たな代謝物が形成されたと予測エンジン１０９が決定した場合（２１０）、予測エンジン１０９は、新たな代謝物を基質プールに追加する（２１４）。更新された基質プールは、この時点でコア代謝物と工程１からの新たに予測された代謝物とを含む。
【００８９】
[00107]  予測エンジン１０９は、各工程で代謝物と発生した反応とを記録するとともに、発生した反応をフィルターＲＤＳから除去する（工程２１６）。この除去は、後続工程で同一反応が発生するのを防止し、それにより、後続工程で反応及びその得られる代謝物が存在するとして同定されるのを回避する。各反応は、プロセスの全工程を通じて１回のみシミュレートされる。これは、代謝物に達する最短路（最小工程数）に一般に重点を置く工学操作最良規範に適合する（同一代謝物へのより長い経路は典型的には最適未満である）。各工程内の代謝物及び反応と共に、予測エンジン１０９は、代謝物が作製される（すなわち、作製されると予測された）工程を記録する。その工程は、代謝物を発生する代謝路長を表す。代謝物が識別可能反応を介して形成される場合、複数の工程の産物として出現しうることに留意されたい。この事実からは、同一代謝物が識別可能反応により達成される場合、予測エンジンによる有用識別可能経路の同定が可能になる。
【００９０】
[00108]  工程２：  次いで、予測エンジン１０９は工程２０８に戻り、この時点で更新された代謝物基質プールをフィルターＲＤＳに対して行う入力として用いて（発生した反応はこの時点で除去される）、新たな代謝物を生成するようにいずれかの反応が発生するかを予測する。
【００９１】
[00109]  複数回の繰返しの後、代謝物プールは成長するが、利用可能な反応プールは縮小する。最終的には、フィルターＲＤＳ内に残留する反応を発生可能な代謝物がこれ以上残っていないので、プロセスは飽和状態となりうる。本発明者らによる実験では、すべての繰返しの後、おおよそ１０，０００フィルター反応は数千の代謝物をもたらしうる。代替的に、予測の停止及び結果の報告（２１２）の前に、許容反応工程数を特定するように予測エンジン１０９を構成しうる。反応工程数に対する制限は、実世界の工学操作を反映し、典型的にはサイクル数を制限するであろう。
【００９２】
[00110]  図４及び５は、本開示の実施形態により作成しうる報告の例を例示する。図４は、各処理工程に対して、発生された代謝物（バイオリーチャブル名）、その化学式、代謝物タイプ（たとえば、コア、前駆体、反応により生成されたバイオリーチャブル候補）、周知のデータベースで用いられるＩＤなどのユニーク反応ＩＤにより表される代謝物反応系統（発生した反応の左（「Ｌ」）側か右（「Ｒ」）側かも示す）、最も近いコア代謝物から候補バイオリーチャブル分子を生成するのに必要な反応工程数、及び各候補バイオリーチャブル分子に対する最も近いコア代謝物名を示す。工程０の分子のみは、出発代謝物リストに由来することに留意されたい（たとえば、コア、前駆体）。
【００９３】
[00111]  図５は、反応系統追跡の仮説例を例示する。ステップワイズに反応は以下の通りである。
【００９４】
[00112]  工程１：  Ａ＋Ｂ←→Ｃ＋Ｄ
【００９５】
[00113]  工程２：  Ｃ＋Ｂ←→Ｅ＋Ｆ
【００９６】
[00114]  工程３：  Ｄ＋Ｅ←→Ｇ＋Ｈ
【００９７】
[00115]  この例の属性としては、工程で発生された代謝物がコアであるか、代謝物が見いだされる工程、工程数の距離により測定したときに発生された代謝物に最も近いコア代謝物、及び代謝物を生成するために発生された化学反応を表す反応系統が挙げられる。代謝物Ａはコア代謝物であり、Ｂは工程０で宿主のバイオマス中に存在する前駆体代謝物である。そのため、それらは反応系統を有していない。
【００９８】
[00116]  Ｃ及びＤは、反応系統中の反応Ａ＋Ｂにより工程１で生成されるとして示される（原反応）。Ｃ及びＤの両方に最も近いコアはＡである。Ｃ及びＤは、コアＡ及びＢと共に基質に追加される。
【００９９】
[00117]  Ｅ及びＦは、反応Ｃ＋Ｂにより工程２で生成されるとして示される。Ｅ及びＦの両方に最も近いコアはＡである。Ｅ及びＦは、コアＡ及びＢ並びにバイオリーチャブル産物Ｃ及びＤと共に基質に追加される。
【０１００】
[00118]  Ｇ及びＨは、反応Ｄ＋Ｅにより工程３で生成されるとして示される。Ｇ及びＨの両方に最も近いコアはＡである。
【０１０１】
[00119]  本開示の実施形態はまた、以下のように各代謝物に対する経路（反応の「系統」シーケンスとしても知られる）も出力しうる。
【０１０２】
[00120]  Ｃ：  Ａ＋Ｂ→
【０１０３】
[00121]  Ｄ：  Ａ＋Ｂ→
【０１０４】
[00122]  Ｅ：  Ａ＋Ｂ；Ｃ＋Ｂ→
【０１０５】
[00123]  Ｆ：  Ａ＋Ｂ；Ｃ＋Ｂ→
【０１０６】
[00124]  Ｇ：  Ａ＋Ｂ；Ｃ＋Ｂ；Ｄ＋Ｅ→
【０１０７】
[00125]  Ｈ：  Ａ＋Ｂ；Ｃ＋Ｂ；Ｄ＋Ｅ→
【０１０８】
[00126]  経路フィルタリング。実施形態では、宿主細胞、標的分子、及び所与の標的分子をもたらす経路の反応系統を仮定して、予測エンジン１０９は、路長（たとえば、出発代謝物から標的分子への反応処理工程数）などの所与のパラメーターに基づいて経路を選択的にフィルターして経路を同定しうる。予測エンジン１０９は、同定された反応経路を表すデータを出力として提供しうる。
【０１０９】
[00127]  宿主細胞選択。単一宿主細胞を仮定して実現可能標的分子を決定する代わりに、所与の実現可能標的分子を生成するために１つ以上の宿主細胞を同定することが望ましいこともある。実施形態では、予測エンジン１０９は、以上に記載の方法に従って、わずか１つの宿主細胞だけでなく複数の宿主細胞に対しても実現可能標的分子を表すデータを発生する。かかる実施形態では、所与の実現可能標的分子に対して、予測エンジン１０９は、複数の宿主細胞の中から少なくとも１つの基準を満たす少なくとも１つの宿主細胞を決定する。たとえば、反応系統データを用いて、予測エンジン１０９は、宿主細胞で所与の実現可能標的分子を生成するために必要であると予測される処理工程数に基づいて宿主細胞を選択しうる。他の一例として、予測エンジン１０９は、宿主細胞により生成される実現可能標的分子の予測収率に基づいて宿主細胞を選択しうる。予測収率は、各潜在的宿主に対する個別モデルに基づくフラックスバランス解析（ＦＢＡ）、単純元素収率モデリング、及び前駆体ベースパーセント収率推定を含めて、いくつかの方法で導出しうる。予測エンジン１０９は、少なくとも１つの基準を満たすと判断された宿主細胞を表すデータを出力として提供する。
【０１１０】
[00128]  以上の実施形態に対して記載されるように、予測エンジン１０９は、各宿主細胞により生成される各標的分子をもたらす１つ以上の反応経路（すなわち系統）の記録を発生しうる。複数の宿主細胞に対してツールを実施する以上の実施形態に基づいて、反応アノテーションエンジン１０７は、宿主細胞、標的分子、及び系統の間の関連をライブラリーとしてデータベースに記憶しうるとともに、これらは、収率、処理工程数、反応経路の反応を触媒する触媒の利用可能性などのパラメーターを特定するアノテーションを含みうる。代替的に、ライブラリーは、サードパーティーから得られうる。
【０１１１】
[00129]  実施形態では、予測エンジン１０９がかかるライブラリーにアクセスする場合、ツールは、所与の実現可能標的分子を生成するために複数の宿主細胞の同定を行う必要はない。その代わりに、かかる実施形態では、予測エンジン１０９は、宿主、標的分子、及び反応の間の関連に関するアノテーションデータを含みうる系統をライブラリーから使用しうる。予測エンジン１０９は、たとえば、ライブラリーから又は公的若しくは独自データベースから、少なくとも１つの標的宿主細胞内で標的分子の生成をもたらす少なくとも１つの反応経路の反応を触媒すると予測されるすべての触媒が、少なくとも１つの反応経路ですべてのかかる反応を触媒するために利用できる可能性が高いという証拠に少なくとも部分的に基づいて、１つ以上の宿主細胞の中から少なくとも１つの標的宿主細胞を同定しうる。実施形態では、予測エンジン１０９は、標的分子を生成するために必要であると予測される反応経路内で閾値未満の反応工程数を必要とする標的宿主に基づいて標的宿主を決定しうる。
【０１１２】
[00130]  バイオ探査。いくつかの反応酵素は、ＥＣ番号を有しうるとともに十分に特徴付けられうるが（その反応体及び産物が知られている）、既知の関連アミノ酸配列又は遺伝子配列を有していないこともある（「オーファン酵素」）。かかる場合には、予測エンジン１０９は、オーファン酵素をバイオ探査してそのアミノ酸配列及び最終的にはその遺伝子配列を予測しうるとともに、新たにシーケンスされた酵素を工学操作により宿主細胞に導入して１つ以上の反応を触媒するようにしうる。次いで、予測エンジン１０９は、新たにシーケンスされた酵素に対応する反応をフィルター反応データのメンバーとして指定しうる。実施形態では、予測エンジン１０９は、当技術分野で公知の技術を用いてオーファン酵素をバイオ探査する。たとえば、１つのチームは、配列を同定するために質量分析ベース解析及び計算方法（配列類似性ネットワーク及びオペロンコンテキスト解析を含む）を適用することにより、少数のオーファン酵素に対するアミノ酸配列を決定した。次いで、チームは、新たに決定された配列を用いて、より多くのこれまで特徴付けられていない又はミスアノテートされたタンパク質の触媒機能をより正確に予測した。Ramkissoon KR, et al. (2013) Rapid Identification of Sequences for Orphan Enzymes to Power Accurate Protein Annotation, PLoS ONE 8(12): e84508. doi:10.1371/journal. pone.0084508、そのほかにShearer AG, et al. (2014) Finding Sequences for over 270 Orphan Enzymes. PLoS ONE 9(5): e97250. doi:10.1371/journal. pone.0097250、Yamada T, et al., Prediction and identification of sequences coding for orphan enzymes using genomic and metagenomic neighbours genomic and metagenomic neighbours, Molecular Systems Biology 8:581（３つすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）も参照されたい。
【０１１３】
[00131]  ゲノム工学操作。本開示の実施形態は、宿主細胞内で機能を可能にする生物学的配列を同定し、同定された生物学的配列を宿主細胞で使用可能にして（たとえば、工学操作による宿主細胞ゲノムへの配列の導入により）分子を生成する。バイオリーチャブル予測ツールは、顧客などのサードパーティーでありうる化学者、材料科学者などにバイオリーチャブル候補分子（実現可能標的分子）のリストを提供しうる。標的分子のそうした選択に基づいて、ユーザーは、各選択標的分子をもたらす反応経路の反応を触媒するために使用される酵素又は他の触媒に対する遺伝子配列の指標を遺伝子作製システムに提供するようにツールに指示しうる。次いで、遺伝子作製システムは、指定遺伝子配列を宿主のゲノム内で具現化し（たとえば、挿入、置換え、欠失を介して）、それにより実現可能標的分子作製用の工学操作ゲノムを生成しうる。実施形態では、遺伝子作製システムは、当技術分野で公知のシステム及び技術により、又は「工学操作ヌクレオチド配列の改善された大量生産用の微生物株設計システム及び方法」という名称の２０１６年４月２７日出願、２０１７年１１月２日公開の係属中米国特許出願第１５／１４０，２９６号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載の工場２１０により、実現しうる。その出願に記載されるように、遺伝子作製システムは、Gibson and Golden Gateアセンブリープロトコルなどの公知の技術を利用して入力設計に基づいてＤＮＡ配列をアセンブルしうる。ＤＮＡ構築物は、ベース株への挿入用のプラスミドを形成するために典型的には環化される。次いで、遺伝子作製システムでは、ベース株は、アセンブルされたプラスミドが摂取後に挿入されるように調製される。入力情報は、作製の開始時、中間時、及び終了時に利用する技術を含みうる。たとえば、多くの検査プロトコルは、鋳型配列と２つのプライマー配列とを必要とするＰＣＲ増幅工程を含む。当技術分野で公知のように、遺伝子作製システムは、一部又は全部でロボット自動化を用いて実現しうる。実施形態では、宿主内での遺伝子配列の具現化に加えて又はその代わりに、予測エンジン１０９は、工場に工場用の１つ以上の触媒の指標を提供して、標的分子の生成のために宿主細胞の成長培地に１つ以上の触媒を導入する。
【０１１４】
[00132]  対象産物の生成。本開示の実施形態は、周知の技術を用いて天然ゲノム又は工学操作ゲノムを有するベース株から実現可能標的分子又は他の対象産物を生成する。本開示の実施形態によれば、生物は、発酵用フィードストックを含有するバイオリアクターに移送される。制御条件下で、生物は、アセンブルＤＮＡに基づいて所望の対象産物（たとえば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコール）を発酵により生成する。
【０１１５】
[00133]  糖化合物を発酵して最終産物にする細菌及び酵母さらには光合成（光栄養藻類）又は発酵（従属栄養藻類）を介する微細藻類を含めて、さまざまなタイプの微生物は、工業バイオ技術のプラットフォーム生物として機能可能である。
【０１１６】
[00134]  細菌又は他の細胞は、所望の生合成反応又は選択のために必要に応じて改変された従来の栄養培地で培養可能である。温度、ｐＨなどの培養条件は、発現用として選択された宿主細胞で使用するのに好適なものであり、当業者には明らかであろう。細菌、植物、動物（哺乳動物を含む）、及び古細菌起源の細胞を含めて、細胞の培養及び生成のために、多くの参照文献が利用可能である。たとえば、Sambrook, Ausubel (all supra), as well as Berger, Guide to Molecular Cloning Techniques, Methods in Enzymology volume 152 Academic Press, Inc., San Diego, CA、及びFreshney (1994) Culture of Animal Cells, a Manual of Basic Technique, third edition, Wiley-Liss, New York並びにそこに引用されている参照文献、Doyle and Griffiths (1997) Mammalian Cell Culture: Essential Techniques John Wiley and Sons, NY、Humason (1979) Animal Tissue Techniques, fourth edition W.H. Freeman and Company、及びRicciardelle et al., (1989) In Vitro Cell Dev. Biol. 25: 1016-1024（それらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。植物細胞培養及び再生については、Payne et al. (1992) Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems John Wiley & Sons, Inc. New York, N.Y.、Gamborg and Phillips (eds) (1995) Plant Cell, Tissue and Organ Culture, Fundamental Methods Springer Lab Manual, Springer-Verlag (Berlin Heidelberg N.Y.)、Jones, ed. (1984) Plant Gene Transfer and Expression Protocols , Humana Press, Totowa, N.J. and Plant Molecular Biology (1993) R. R. D. Croy, Ed. Bios Scientific Publishers, Oxford, U.K. ISBN 0 12 198370 6（それらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）。細胞培養培地全般については、Atlas and Parks (eds.) The Handbook of Microbiological Media (1993) CRC Press, Boca Raton, Fla.に記載されている（参照により本明細書に組み込まれる）。細胞培養についての追加情報は、Sigma-Aldrich, Inc (St Louis, Mo.) (“Sigma-LSRCCC”)のLife Science Research Cell Culture Catalogue、及びたとえば、同様にSigma-Aldrich, Inc (St Louis, Mo.) (“Sigma-PCCS”)のThe Plant Culture Catalogue及び補遺（それらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）などの利用可能な商用文献に見いだされる。
【０１１７】
[00135]  使用される培養培地は、それぞれの株の要件を好適に満たすべきである。各種微生物用の培養培地の説明は、“Manual of Methods for General Bacteriology” of the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)（参照により本明細書に組み込まれる）に存在する。
【０１１８】
[00136]  合成細胞は、所望の有機化合物を生成する目的で、連続培養されうるか、又はバッチプロセス（バッチ培養）若しくはフェドバッチプロセス若しくは繰返しフェドバッチプロセスで不連続培養されうる。既知の培養方法に関する一般的性質の概要は、Chmiel (BioprozeBtechnik. 1 : Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991))の書籍又はStorhas (Bioreaktoren and periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994))の書籍（それらはすべて参照により本明細書に組み込まれる）で入手可能である。
【０１１９】
[00137]  古典的バッチ発酵は、培地の組成が発酵の開始時に設定され発酵時に人工的改変に付されない閉システムある。パッチシステムの変法は、フェドバッチ発酵である。この変法では、基質は、発酵の進行に伴って漸進的に添加される。カタボライト抑制が細胞の代謝を阻害する可能性が高いとき及び培地中に限られた量の基質を有することが望ましいとき、フェドバッチシステムが有用である。バッチ発酵及びフェドバッチ発酵は一般的であり、当技術分野で周知である。
【０１２０】
[00138]  連続発酵は、規定発酵培地がバイオリアクターに連続添加されるとともに所望の対象バイオ分子産物の処理及び採取のために等量の馴化培地が同時除去されるシステムである。細胞が主に対数期成長状態にある場合、連続発酵は、一般的には、培養を一定の高密度に維持する。連続発酵は、一般的には、培養を定常期成長又は対数／定常後期成長に維持する。連続発酵システムは、定常状態成長条件を維持するように努める。
【０１２１】
[00139]  連続発酵プロセスのために栄養素及び成長因子をモジュレートする方法さらには産物形成速度を最大化する技術は、工業微生物学技術分野で周知である。
【０１２２】
[00140]  たとえば、細胞培養用の炭素源のリストには、限定されるものではないが、糖及び炭水化物、たとえば、グルコース、スクロース、ラクトース、フルクトース、マルトース、モラセス、シュガービート加工又はサトウキビ加工に由来するスクロース含有溶液、デンプン、デンプン加水分解物、セルロースなど、油脂、たとえば、ダイズ油、ヒマワリ油、ラッカセイ油、ヤシ脂肪など、脂肪酸、たとえば、パルミチン酸、ステアリン酸、リノール酸など、アルコール、たとえば、グリセロール、メタノール、エタノールなど、及び有機酸、たとえば、酢酸、乳酸などが含まれる。
【０１２３】
[00141]  窒素源のリストには、限定されるものではないが、有機窒素含有化合物、たとえば、ペプトン、酵母抽出物、肉抽出物、麦芽エキス、コーンスティープリカー、ダイズ粉、及びウレア、又は無機化合物、たとえば、硫酸アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、及び硝酸アンモニウムが含まれる。窒素源は、単独で又は混合物として使用可能である。
【０１２４】
[00142]  可能なリン源のリストには、限定されるものではないが、リン酸、リン酸二水素カリウム、若しくはリン酸水素二カリウム、又は対応するナトリウム含有塩が含まれる。
【０１２５】
[00143]  培養培地は、そのほか、たとえば、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、鉄などの金属の塩化物又は硫酸塩の形態の塩、たとえば、硫酸マグネシウム、硫酸鉄などを含みうる。
【０１２６】
[00144]  最終的には、上述した物質のほか、必須成長因子、たとえば、ホモセリンなどのアミノ酸、及びたとえば、チアミン、ビオチン、パントテン酸などのビタミンが利用されうる。
【０１２７】
[00145]  いくつかの実施形態では、培養のｐＨは、限定されるものではないが、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、アンモニア、若しくは水性アンモニア、又は酸性化合物、たとえば、リン酸若しくは硫酸を含めて、いずれかの酸又は塩基又は緩衝塩により、好適に制御可能である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、一般的には６．０〜８．５、好ましくは６．５〜８の値に調整される。
【０１２８】
[00146]  培養は、たとえば、脂肪酸ポリグリコールエステルなどの消泡剤を含みうる。培養は、たとえば、抗生物質などの好適な選択性物質を添加することにより、培養のプラスミドが安定化するように改変しうる。
【０１２９】
[00147]  培養は、好気的又は嫌気的条件下で行いうる。好気的条件を維持するために、酸素又は酸素含有ガス混合物たとえば空気などが培養に導入される。同様に、過酸化水素が富化された液体を使用することが可能である。発酵は、適宜、昇圧で、たとえば０．０３〜０．２ＭＰａの昇圧で行われる。培養の温度は、通常は２０℃〜４５℃、好ましくは２５℃〜４０℃、とくに好ましくは３０℃〜３７℃である。バッチ又はフェドバッチプロセスでは、回収に十分な量の所望の対象産物（たとえば有機化学化合物）が形成されるまで、培養を継続しうる。この目標は、通常、１０時間〜１６０時間以内で達成されうる。連続プロセスでは、より長い培養時間が可能である。微生物の活性は、発酵培地中及び／又は前記微生物の細胞内に対象産物の濃縮（蓄積）をもたらす。
【０１３０】
[00148]  経路予測例
[00149]  予測エンジン１０９は、本開示の実施形態に従って、標的分子を達成するように経路の反応を触媒するために又は工学操作により宿主に導入するために利用できる可能性の高い触媒を利用する反応のあらゆる経路を予測しうる。予測エンジン１０９はまた、定性的情報又は予測エンジン１０９により作成されうるスコアなどの定量的情報に基づいて分子の作製を試みるために、予測された経路の中から選択するように使用されうる。
【０１３１】
[00150]  反応ラベル及びカテゴリー
[00151]  反応セットは、本特許の他の箇所に記載されるようにフィルター及びラベルすることが可能である。たとえば、反応は、利用可能な遺伝子配列を有する可能性が高いことを示唆するために「シーケンス緩和」とラベル可能であるか、又は遺伝子が天然に存在するが実験的に特徴付ける必要があることを示唆するために「特徴付けオーファン」とラベル可能である。同様に、反応は、その物質及びエネルギー収支又は他の形質を反映するようにラベル可能である。
【０１３２】
[00152]  そのほか、バイオリーチャブル予測ツールは、熱力学的データに基づいてどの方向に反応が起こる可能性が高いかを計算しうる。
【０１３３】
[00153]  標的分子を発生する反応の処理時、反応アノテーションエンジン１０７は、反応による標的分子の生成が熱力学的に有利な方向に起こるか又は熱力学的に不利な方向に起こるかのフラグを立てることが可能である。
【０１３４】
[00154]  次いで、これらの熱力学的結果及びすべての他の反応ラベルは、バイオリーチャブル予測ツールの所与のランにより生成された分子及び系統にタグを付けるために、反応アノテーションエンジン１０７により使用可能である。たとえば、１つの熱力学的に不利な反応と、反応を触媒する酵素を生成する既知の遺伝子の欠如した２つの反応と、を含有する５工程系統は、以下のようにラベル可能である。
【０１３５】
[00155]  路長：  ５
【０１３６】
[00156]  不利な反応：  １
【０１３７】
[00157]  遺伝子の欠如した反応：  ２
【０１３８】
[00158]  次いで、これらのラベルは、各反応にスコアを付けるために予測エンジン１０９により使用されうる。それらはまた、出力のサブセクションをソートし操作するために使用可能であり、所与の宿主に対して所与の分子の工学操作性について直接洞察を与える。
【０１３９】
[00159]  以下に詳述される実施例では、バイオリーチャブル予測ツールは、標的分子を同定するために及びそうした標的分子を達成するために使用しうる予測経路を表示するために使用された。
【０１４０】
[00160]  経路の生成及び評価に組み込まれた熱力学的データは、グループ寄与法を用いて発生されたが、いくつかの代謝データベースからも導出された。
【０１４１】
[00161]  予測エンジン１０９は、本明細書に記載のスコアリング法を用いて作成された関連スコアを各潜在的経路に割り当てうる。これらのスコアを用いて、標的分子を工学操作により作製するためにどの経路形態を試みるかの決定を通知することが可能である。
【０１４２】
[00162]  実施形態では、予測エンジン１０９は、１００ポイントの最適スコアから始めて、困難又は設計失敗のリスクを加える経路特徴のポイントを減算しうる。たとえば、路長は設計リスクに相関し、合計スコアは路長の増加に伴って低減されうる。たとえば、予測エンジン１０９は、路長の追加工程ごとにスコアから１ポイント以上減算しうる。
【０１４３】
[00163]  チラミン
[00164]  図８は、本開示の実施形態に従って予測エンジン１０９により同定されたチラミン生成経路を例示する。チラミンの場合には、１つの反応工程（Ｒ１）からなる単一経路が予測された。示された経路は、熱力学的データに基づいて可逆的であると計算された反応に依存するので、チラミンの発生に必要とされる方向に操作可能であることを意味する。
【０１４４】
[00165]  経路図では、黒矢印は、所望の分子（ここではチラミン）を生成する経路の反応に必要とされる反応方向を表す。白矢印は、反応に対して計算された熱力学的方向を表す。所要の反応方向と計算された反応方向とがマッチする場合、経路は真実味がある。
【０１４５】
[00166]  この単一経路には、他の箇所に記載のメトリックにより１００ポイントのスコアが付けられる。
【０１４６】
[00167]  （Ｓ）−２，３，４，５−テトラヒドロジピコリン酸（ＴＨＤＰ）
【０１４７】
[00168]  図９に示されるように、バイオリーチャブル予測ツールは、本開示の実施形態に従って、ＴＨＤＰを発生する２つの可能な二工程経路を予測した。両経路は、これらの実施形態では９７ポイントの同一スコアを達成する。
【０１４８】
[00169]  経路は、同一の第１の反応（Ｒ１）を共有し、第２の反応（Ｒ２又はＲ３）では異なる。この場合には、これらの反応は、どの形態の還元性補因子を使用するかが異なる（たとえば、ＮＡＤＨ対ＮＡＤＰＨ）。経路には同一のスコアが付けられるが、この補因子差は工学操作目的に関連するので、バイオリーチャブル予測ツールのこの実施形態では設計決定の指針を得るのに役立てるように表示される。典型的には、一方の補因子（ＮＡＤＨ又はＮＡＤＰＨのどちらか）は、各所与の宿主細胞内にかなり豊富に存在する。そのため、実施形態では、当業者は、より豊富な補因子を利用してＴＨＤＰを生成する経路を選択しうる。他の実施形態では、予測エンジン１０９は、工学操作性に及ぼす補因子の影響に関する情報をデータベースから取り出しそれを考慮して標的分子スコアを計算することにより、経路補因子をヒトが精査する必要性を回避する。
【０１４９】
[00170]  仮説分子「Ｆ」に対する予測経路例
【０１５０】
[00171]  他の一例では、バイオリーチャブル分子「Ｆ」に対して、バイオリーチャブル予測ツールは、図１０に例示されるように３つの潜在的経路を予測する。
【０１５１】
[00172]  第１の経路は、二工程の長さであり、低信頼性オーファン反応（Ｒ２）を含み、５８ポイントのスコアをもたらす。低信頼性オーファン反応とは、広範な特定研究活動をしないでも対応するＤＮＡ配列が容易に利用可能である可能性が低いオーファン酵素により触媒される反応のことである。そのため、オーファン酵素に対して多くのポイントが差し引かれる。
【０１５２】
[00173]  第２の経路は、三工程の長さであり、真核生物遺伝子のみを利用可能な１つの反応（Ｒ４）を含み、９２ポイントのスコアをもたらす。全経路長及びＲ４に対する遺伝子の調達制限が理由で、ポイントが差し引かれる。
【０１５３】
[00174]  第３の経路もまた、三工程の長さであり、他の三工程反応と同様に２つの反応（Ｒ３及びＲ４）を有する。それはまた、真核生物遺伝子のみを利用可能な１つの反応（Ｒ４）と、工学操作酵素を必要とする他の１つの反応（Ｒ５）と、を有し、８２ポイントのスコアをもたらす。そのほか、この経路は、出発コア代謝物の代替セット（Ａ＋Ｂの代わりにＫ＋Ｌ）を有し、これは経路スコアに影響を及ぼさないが、どの経路が特定の宿主及び用途に最も適しているかを決定するときに考慮すべきである。
【０１５４】
[00175]  この例では、バイオリーチャブル予測ツールの予測エンジン１０９からのスコアリング出力は、単一路長を超えてクリティカルな工学操作情報を提供する。最短経路（＃１）が最良でありうるという直観にもかかわらず、各反応に関してアノテーションエンジン１０７により及びフィルタリング又は処理でバイオリーチャブル予測ツールにより収集された情報から、より長い経路（＃２及び＃３）が技術者にはより実現可能であることが示される。たとえば、反応アノテーションエンジン１０７は、いくつかの反応用の触媒が高リスクカテゴリー（たとえば、低信頼性オーファン、工学操作酵素）でのみ利用可能であると決定しうるとともに、予測エンジン１０９は、短い経路がこうした高リスクカテゴリーに依存し、一方、長い経路が依存しないことから、長い経路が技術者にはより実現可能であると決定しうる。
【０１５５】
[00176]  テトラヒドロジピコリン酸のスコアリング表
【０１５６】
[00177]  本開示の実施形態によれば、予測エンジン１０９は、標的分子を生成する困難にスコアを付けるようにそれが発生する情報を使用する。（逆に言えば、スコアは、分子を生成する容易さの指標として見られうる。）このスコアは、本明細書では、「分子スコア」、「標的分子スコア」、又は「全経路スコア」と同義である。
【０１５７】
[00178]  例として、図１１Ａ及び１１Ｂは、一緒になって、予測エンジン１０９がどのようにテトラヒドロジピコリン酸（ＴＨＤＰ）の生成にスコアを付けうるか例示する表を提供する。実施形態では、全経路スコアリングプロセスは、表に示されるように、経路スコア、パーツスコア、産物スコアなどの成分によりブレイクダウンされ、たとえば、３０％、６０％、１０％として加重される。示された評価データは、分子（Ｓ）−２，３，４，５−テトラヒドロジピコリン酸（ＴＨＤＰ）に至る経路を予測するプロセス時に発生された。
【０１５８】
[00179]  経路成分スコアは、経路の相対工学操作実現可能性を表す。実施形態では、それは以下の２つの要素を含む。
【０１５９】
[00180]  路長  −  経路の反応工程数。これは、本開示の実施形態に従って、予測エンジン１０９によりバイオリーチャブル予測の固有部分として計算される。
【０１６０】
[00181]  遺伝子数  −  経路に必要とされると予測された遺伝子の数。これは、反応アノテーションエンジン１０７による反応フィルタリングの一部分としてデータベースにクエリーを行うことにより同定される。
【０１６１】
[00182]  反応及び酵素は、必ずしも１：１の関係にあるとは限らないので（たとえば、単一反応は、ときには２種の遺伝子を必要とするツーパーツ酵素により触媒される）、予測エンジン１０９は、経路を工学操作する際に予測される困難の因子として両方の要素を加えうる。
【０１６２】
[00183]  バイオリーチャブル予測ツールにより予測された図９に示される両系統では、ＴＨＤＰは、所望の宿主細胞内で二工程経路を必要とする。これは、２対１工程経路の困難の中程度の増加に基づく適切なスコア差引きをもたらす。
【０１６３】
[00184]  この場合には、経路反応工程当たりの遺伝子の数（反応がとにかく遺伝子を有する可能性が高いかを決定する同一評価プロセスを介して特定可能である）もまた、控えめなペナルティーをもたらす。
【０１６４】
[00185]  パーツ成分スコア
[00186]  パーツスコアは、個別経路パーツの相対工学操作実現可能性を表す。実施形態では、それは、評価されている経路の反応で工学操作による宿主への触媒の導入に必要とされるパーツ（たとえば遺伝子）を見いだす際に予測される困難に基づく。
【０１６５】
[00187]  実施形態では、パーツを見いだす能力に影響を及ぼしうる可能性のある特徴としては、以下のものが挙げられる：
[00188]  ＞１００既知酵素配列  −  反応フィルタリング工程時に反応に対して見いだされた１００以上の配列（たとえば、少なくとも１つのデータベースで反応を触媒する酵素に対応することが示唆される１００以上のアミノ酸配列）
[00189]  ＜１００既知酵素配列  −  酵素配列が見いだされたが、反応フィルタリング工程時に１００未満が同定された
[00190]  高信頼性オーファン／低信頼性オーファン  −  酵素配列が反応フィルタリング工程時に公的データベースに見いだされなかったが、そうした配列の同定が相対的に容易（高信頼性）又は困難（低信頼性）であることを示唆する関連証拠が見いだされた
[00191]  工学操作酵素  −  反応フィルタリング工程時にこの反応に関連付けられた酵素のみが、反応を行うように工学操作されたにすぎない（このデータは、データベース検索で見いだしうる）。これは、典型的には、天然で触媒する反応とは異なる反応を触媒するように突然変異された天然酵素を意味する。こうした工学操作酵素は、限られた範囲のドナー細胞に由来する１つ又は少数の配列に限定されるおそれがあるので、新規な経路に使用するのが困難なこともある。かかる工学操作酵素は、BRENDAなどの公的データベースに見いだしうる
[00192]  遺伝子分類学的起源  −  同様に反応フィルタリング工程時に同定され（酵素配列が観測されたと仮定する）、この成分は、その分子に対して予測された経路の反応のうち「最悪の場合」（最大のペナルティー）により候補バイオリーチャブル分子を分類し、ペナルティーは、工業プラットフォーム細胞の指定源から酵素を発現する困難に関するこれまでの経験的データに基づく
[00193]  個別反応が知られていないときの経路に対する遺伝子利用可能性  −  いくつかの場合には、経路はデータセット中の代役反応を用いて定義され、これら反応は、個別遺伝子クラスター又は細胞にプログラムでリンク可能であり、個別反応が未知の経路は、工学操作リスク及び困難の有意な増加を表すので、大きなペナルティーが割り当てられる。
【０１６６】
[00194]  これらの特徴要素はすべて、各反応を触媒する酵素に対する配列データの存在、不在、及び存在量に関する情報が蓄積されているので、反応アノテーションエンジン１０７により同定される。
【０１６７】
[00195]  ＴＨＤＰの場合には、両方の経路反応に遺伝子が豊富に存在するので、ペナルティーを生じない。その代わりに、たとえば、低信頼性オーファンにより反応が触媒される場合、ＴＨＤＰは、有意なペナルティーを生じるであろう。
【０１６８】
[00196]  産物成分スコア
[00197]  産物スコアは、本開示の実施形態では、標的分子スコアへの最小全体コントリビューターである。産物スコアは、細胞内の産物の持続、細胞からの移出、及び培地中の維持の際の困難に影響を及ぼす因子を表す。実施形態では、それは、分子の予想される毒性、移出性、及び安定性の評価を表す。この実施形態に記載の特定の特徴としては、以下のものが挙げられる。
【０１６９】
[00198]  毒性  −  分子が１つ以上の宿主細胞に対して毒性であると予想されうる程度。この情報は、抗微生物剤データベース（又は一般的カテゴリーの宿主細胞に対して毒性情報を収集した他のデータベース）にクエリーを行うことから導出可能である。
【０１７０】
[00199]  移出  −  分配係数データに対する化学データベースにクエリーを行うことにより又は内部実験データにクエリーを行うことにより予測された。
【０１７１】
[00200]  安定性  −  安定性課題は、化学データベースにクエリーを行うことにより同定される。
【０１７２】
[00201]  スコア概要
[00202]  表のボトムに、全体スコア及びカテゴリースコアをまとめる。それはまた、いずれかのフラグ−経路工学操作に対して特定のリスク回避を必要とする領域をハイライトする。ＴＨＤＰは、偶然にもフラグを有していない。経路の反応工程に１つ以上の遺伝子が欠落している場合、フラグ例となるであろう（たとえば、高又は低信頼性オーファン）。
【０１７３】
[00203]  アルゴリズム酵素選択
[00204]  外観
[00205]  アルゴリズム生物学的配列選択を含む本開示の実施形態は、反応を触媒する候補として酵素を選択するアルゴリズムコンピューター実装アプローチを提供する。このアプローチは、実質的に最適酵素を決定するのに必要とされる時間を削減し、ヒューマンエラーを排除する。それはまた、選択配列セットの実験的検証の結果として発生された経験的データに基づくその予測モデルのリファインメントを介してツールの予測確度の継続的改善を可能にする。
【０１７４】
[00206]  膨大なデータセットを扱う能力が理由で、アルゴリズム生物学的配列選択を利用する実施形態は、潜在的候補配列の指数関数的増加を引き起こすおそれがある。本開示の実施形態は、クラスタリング又は代替経路排除（又はその両方）を実施して選択候補配列をリファインすることにより、配列空間の多様性を維持しつつ、この課題に対処する。
【０１７５】
[00207]  さらに、本開示の実施形態は、配列の機能人的アノテーションに依拠する手動アプローチよりも所望の機能に統計的に類似した配列の同定を可能にする。
【０１７６】
[00208]  より一般的には、本開示の実施形態は、宿主細胞内で所望の機能の遂行を可能にする配列を選択しうる。酵素のほか、かかる配列は、たとえば、トランスポーター、転写因子、及び反応を触媒する酵素などのタンパク質をコードする核酸配列を含みうる。酵素反応のほか、機能は、遺伝子転写／翻訳、膜を通る分子の輸送、及び分子の安定化又は分解などの細胞プロセスの促進又はレギュレーションを含みうる。
【０１７７】
[00209]  本開示の実施形態は、さまざまな細胞内で同一又は類似の機能を可能にすることが知られる又はそう考えられる配列に基づいて、宿主細胞内で機能を可能にする候補生物学的配列を同定する。細胞は、たとえば、さまざまな種に見いだされうる。他の場合には、同一種で同一機能を遂行するさまざまな配列であるが、科学者が他方ではなく一方の目的に望ましいことを見いだしうるさまざまな属性を呈しうる。
【０１７８】
[00210]  用語解説
[00211]  生物学的配列とは、ヌクレオチド又はアミノ酸の配列のことである。
【０１７９】
[00212]  明確にするために、とくに本明細書に指定がない限り、「分子」という用語は、個別の単離された分子ではなく、あるタイプの分子（たとえば、特定のタイプのタンパク質分子）を意味する。
【０１８０】
[00213]  同様に、明確にするために、とくに本明細書に指定がない限り、「細胞」という用語は、個別の単離された細胞ではなく、あるタイプの細胞を意味する。
【０１８１】
[00214]  とくに本明細書に指定がない限り、「実際バイオリーチャブル」分子、「実際的バイオリーチャブル」分子、及び「バイオリーチャブル」分子という用語は、本明細書では同義的に用いられ、in vivoで、in vitroで、さもなければ１つ以上の生物学的プロセス（たとえば、バイオ触媒作用、転写、翻訳）を用いて生成可能な分子を意味する。
【０１８２】
[00215]  とくに本明細書に指定がない限り、「候補バイオリーチャブル分子」又は同義的に「バイオリーチャブル候補分子」という用語は、バイオリーチャブル分子である可能性が高い分子を意味する。実施形態では、候補バイオリーチャブル分子は、出発代謝反応及び代謝物のセットに基づいてバイオリーチャブル分子であると予測された分子（たとえば、１つ以上の所与の宿主細胞内のもの）でありうる。実施形態では、候補バイオリーチャブル分子は、バイオリーチャブルであることがまだ確認されていないバイオリーチャブル分子の可能性が高いものでありうる。実施形態では、候補バイオリーチャブル分子は、候補又は実際バイオリーチャブル分子に対してデータベース（たとえばデータベース１１０）に記憶されたものであるが実際にバイオリーチャブルであるとデータベース中でまだ同定されていない分子でありうる。実施形態では、候補バイオリーチャブル分子は、生物学的系（たとえば、単一生物又は共同体の複数の生物又は組織型）で合成又は単離される証拠を有する分子（たとえば、データベース中で同定されたもの）である。バイオリーチャブル候補分子は、たとえば、以上のセクションに記載の実施形態を用いて実現可能標的分子であると予測されたことからバイオリーチャブルであると推定された分子でありうる。実施形態では、「候補バイオリーチャブル分子」という用語は、以上に記載の本開示の実施形態により予測された実現可能標的分子を含む。
【０１８３】
[00216]  「推定バイオリーチャブル分子」という用語は、実際バイオリーチャブル分子又は候補バイオリーチャブル分子を参照するものとする。
【０１８４】
[00217]  操作
[00218]  本開示の実施形態では、予測エンジン１０９は、宿主細胞内で機能を可能にする候補生物学的配列を同定するためのプログラムコードを含む。予測エンジン１０９は、複数の生物学的配列を１つ以上の機能に関連付ける予測モデルにアクセスし、予測モデルを用いて、宿主細胞内で複数の生物学的配列の１つ以上の候補配列が所望の機能を可能にすることを予測し、且つ信頼性閾値を満たす候補配列をフィルター候補配列として分類しうる。実施形態では、生物学的配列は、反応を触媒する酵素である（機能は酵素触媒反応である）。予測エンジン１０９は、遺伝子作製システムに第１のフィルター候補配列に関する情報を提供しうるとともに、それにより、遺伝子作製システムが第１のフィルター候補配列を用いて、たとえばバイオリーチャブル分子でありうる分子を生成するようにしうる。
【０１８５】
[00219]  図１２は、本開示の実施形態の操作を例示するフロー図である。とくに指定がない限り、これらの操作は、予測エンジン１０９に常駐するソフトウェアにより実施されうる。以下の説明は酵素アミノ酸配列の同定に関するが、同一のアプローチは、以下に述べるように他の配列の同定に使用されうる。
【０１８６】
[00220]  本開示の実施形態によれば、予測エンジン１０９は、以下の操作を実施しうる。
【０１８７】
[00221]  工程１  １２０２：  予測モデルを得る
[00222]  予測エンジン１０９は、所望の機能を遂行することが高信頼度で物理的に検証又は予測された酵素のインスタンスでトレーニングされた１つ又は複数のモデルを発生しうる（又は内部若しくは外部データベースから検索しうる）。機能の例としては、チロシンからチラミンへの転換を触媒する酵素であるチロシンデカルボキシラーゼや複合多糖中のα結合の加水分解を触媒する酵素であるα−アミラーゼなどの酵素活性が挙げられる。
【０１８８】
[00223]  酵素の代わりに、本開示の実施形態は、対象酵素をコードする核酸配列を同定しうる。さらに、かかるモデルにより表される機能は、代謝反応の酵素に限定されるものではなく、たとえば、ＤＮＡ又はタンパク質の二本鎖の分離に関与するＤＮＡヘリカーゼなどの機能、及び他の非触媒型の機能、たとえば、転写因子、トランスポーター、構造タンパク質、さらにはペプチドに翻訳されないヌクレオチド配列、たとえば、トランスファーＲＮＡ及び低分子非コードＲＮＡの機能も意味しうる。そのほか、１つ又は複数のモデルは、系統発生、オーソロジー、配列類似性、酵素サブユニット、タンパク質形態などの多様化情報を抽出する各機能活性に対して発生可能である。
【０１８９】
[00224]  ここでの「モデル」という用語は、長短期記憶モデル（ＬＳＴＭ）に基づくものなどのリカレントニューラルネットワークさらにはその派生形及び一般化形、及び他の機械学習ベースのモデルを含めて、隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、ダイナミックベイジアンネットワーク、人工ニューラルネットワーク（ＡＮＮ）などの統計モデルに限定されるものではない。
【０１９０】
[00225]  予測モデルの例として、工程１では、予測エンジン１０９は、多重配列アライメント（ＭＳＡ）の統計モデルであるＨＭＭに依拠しうる。バイオインフォマティクスでは、配列アライメントは、配列間の機能、構造、及び／又は進化の関係の結果でありうる類似性の領域を同定するために、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質などの配列を配置する方法である。進化生物学では、保存配列は、種にわたる（オルソロガス配列）又はゲノム内（パラロガス配列）の核酸（ＤＮＡ及びＲＮＡ）又はタンパク質の類似又は同一の配列である。保存は、配列が自然選択により維持されてきたことを示唆する。アミノ酸配列は、タンパク質又はドメインの構造又は機能を維持するように保存可能である。
【０１９１】
[00226]  以上の実施形態の反応経路出力の一部分でありうる反応（機能）に対するタンパク質アミノ酸配列を見いだす例として、予測エンジン１０９は、反応を触媒する酵素トレーニングセットをデータベース１１０から取り出しうる。各酵素は、さまざまな種に見いだされうる。しかしながら、酵素のあらゆるアミノ酸が機能の遂行に重要であるとは限らない。同一機能を遂行するさまざまな酵素配列中でアミノ酸が同一位置を占有する観測頻度（アミノ酸が「保存される」程度）は、アミノ酸がその機能の遂行を可能にする尤度に相関する。これは、ＭＳＡを用いて所望の機能を遂行する他の酵素配列を同定するための基準である。ＭＳＡモデルを利用する予測エンジン１０９は、配列が所望の機能を可能にする信頼度の尺度（配列の保存に基づく）と共に出力配列を提供する。
【０１９２】
[00227]  保存配列は、BLAST、HMMER、Infernalなどのツールを用いて相同性検索により同定しうる。相同性検索ツールは、入力として個別核酸若しくはタンパク質配列を受け取るか、又は既知の関連配列の多重配列アライメントから発生された統計モデルを使用しうる。構造情報も組み込むプロファイルＨＭＭやＲＮＡ共分散モデルなどの統計モデルは、より関連の薄い配列を検索するときに役立ちうる。次いで、入力配列は、関連のある個体又は他の種からの配列データベースに対してアライメントされる。次いで、得られたアライメントは、アライメントにより発生されたマッチングアミノ酸又は塩基の数及びギャップ又は欠失の数に基づいてスコアが付けられる。許容可能保存的置換は、PAMやBLOSUMなどの置換行列を用いて同定しうる。高スコアのアライメントは、相同配列からのものと見なされる。次いで、配列の保存は、広範な系統発生学的範囲にわたるきわめて類似したホモログの検出により推測されうる。
【０１９３】
[00228]  保存配列の同定は、タンパク質や遺伝子などの配列の機能を発見及び予測するために使用可能である。タンパク質ドメインやモチーフなどの既知の機能を有する保存配列はまた、配列の機能を予測するために使用可能である。保存タンパク質ドメイン又はモチーフのデータベース、たとえば、Pfam及びConserved Domain Databaseは、予測タンパク質の機能ドメイン又はモチーフにアノテートするために使用可能である。
【０１９４】
[00229]  入力例及び出力例
[00230]  入力工程１：  化学反応式「Ｌ−チロシン⇔チラミン＋ＣＯ２」により表されうる「チロシンデカルボキシラーゼ」などの予測経路／系統からの酵素活性／反応、及びこの酵素活性を有する／この反応を触媒すると考えられる配列トレーニングセット（たとえば、科学出版物、公的若しくは内部データベースからの実験データに基づくもの、又は所要の活性の実験的証拠を有する配列との相同性に基づく計算予測）。
【０１９５】
図１３Ａ〜Ｈは、本開示の実施形態に係る、HMMERツールを用いてチロシンデカルボキシラーゼ活性を可能にする少なくとも１つの配列を同定する予言的実施例を例示する。当業者であれば、とりわけEddy, et al., HMMER User’s Guide: Biological sequence analysis using profile hidden Markov models, Version 3.1b2; February 2015（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を考慮して、これらの図をどのように解釈するかは理解されよう。
【０１９６】
[00232]  図１３Ａは、チロシンデカルボキシラーゼ活性に関して触媒する酵素トレーニングセットを含有するFASTAファイル例のスニペットを例示する。ファイルは、反応活性をコードする酵素トレーニングセットのアミノ酸配列を含有する。表示されたアノテーションは、市販のデータベースから導出されたものであるので、ファイル中のアノテーションは、トリプトファンデカルボキシラーゼなど、チロシンデカルボキシラーゼ以外の活性を示唆することに留意されたい。しかしながら、本開示の実施形態は、かかる配列が、事実上、チロシンデカルボキシラーゼ活性を可能にすると判断した。そのため、開示の実施形態は、そのままでは不適正な公的に利用可能なデータベース中のアノテーションの適正記録を可能にする。
【０１９７】
出力工程１：  配列内のユニット（たとえばアミノ酸）が所望の機能に関連付けられる信頼度（たとえば、期待値、ユニットが配列内の所与の位置で保存される確率）のインジケーターを含めて、トレーニングセット中に存在する配列の多重配列アライメント及びこのアライメントに対応するモデル（又は複数のモデル）。図１３Ｂは、チロシンデカルボキシラーゼ反応をコードする酵素トレーニングセットのかかる多重配列アライメントを示す出力ファイルのスニペットを示す。「＞」記号に続く識別子（たとえばB8GDM7）は、酵素配列を同定し、その下のテキストは、対応する配列を示す。この例では、アミノ酸配列に「−」により示唆されるように、スペースは、特定酵素配列が酵素トレーニングセット中のすべての酵素のコンセンサスアライメントにアライメントしない位置の指標となる。コンセンサスアライメントは、酵素トレーニングセット中のすべての配列にわたる類似性及び／又は同一性を介して、保存される最適サブ配列により決定される。
【０１９８】
[00234]  図１３Ｃは、図１３Ｂに示される多重配列アライメントファイルから構築された隠れマルコフモデルの出力ファイルのスニペットを示しており（HMMERツールを用いた）、当業者であれば、配列内のアミノ酸が所望のチロシンデカルボキシラーゼ活性（機能）に関連付けられる信頼度を決定可能である。図１３Ｄは、チロシンデカルボキシラーゼ活性に関する同一統計モデルの絵図を示しており、各アミノ酸アノテーションの高さは、その位置の特定アミノ酸（ｘ軸上に表される）が全酵素の所望の機能に関連付けられる傾向を表す。
【０１９９】
[00235]  工程２  １２０４：  配列データベースとモデルとのマッチング
[00236]  予測エンジン１０９は、原データベース（たとえば、Uniprot、KEGG、NCBI、JGI GOLD、又はヌクレオチド配列若しくはタンパク質配列の独自データベース）中のあらゆる配列と、工程１で発生されたモデルと、を比較することにより、工程１でトレーニングされたモデルを用いて、対象の機能を可能にする候補配列に関して検索を実施しうる。このプロセスに使用可能なツールの例は、HMMsearch、HMMscan、又はLSTMモデルによる検索用として設計されたリカレントニューラルネットワークである。
【０２００】
[00237]  入力例及び出力例
[00238]  入力工程２：  所望の機能を有する信頼される配列セットでトレーニングされたモデル及び配検索列データベース。
【０２０１】
[00239]  出力工程２：  原データベースのサイズに基づいて、予測エンジン１０９は、工程１で生成されるモデルに有意にマッチする（高確率スコアを有する）２、３〜１００，０００（わずか１つの反応に対して）の範囲内の配列セットを出力しうる。図１３Ｅは、候補配列とチロシンデカルボキシラーゼに対するＨＭＭモデルとを比較した後の配列ヒットの出力ファイル例のスニペットを示す。このファイル例では、チロシンデカルボキシラーゼのＨＭＭにマッチするデータベースからの特定酵素配列の信頼性は、Ｅ値メトリックにより計数される。酵素のＥ値が低いほど、モデルへのマッチの統計学的信頼度は高い。
【０２０２】
[00240]  図１３Ｆは、検索データベースからの配列の識別子と、Ｅ値の昇順にソートされたチロシンデカルボキシラーゼＨＭＭモデルへのマッチのＥ値と、を抽出する、図１３Ｅのraw出力ファイルからの候補配列の処理表の例を示す。この例では、酵素配列Ｑ７ＸＨＬ３は、最も低いＥ値を有するので、チロシンデカルボキシラーゼ活性を可能にする可能性が最も高いアミノ酸配列として位置付けられる。
【０２０３】
[00241]  本開示の実施形態は、こうした潜在的に膨大なデータセットのサイズを低減するためにさらなるリファインメントを提供する。
【０２０４】
[00242]  工程３  １２０５：  マッチング配列のフィルタリング
[00243]  予測エンジン１０９は、ユーザーにより決定されうる閾値パラメーター（たとえば、期待値（Ｅ値）や有意性の閾値などの最小確率スコア）に基づいて、又は他の場合には意図された目的及び検索の精度と範囲との間のトレードオフに基づいて、工程２からの候補配列を分類しうる。たとえば、工程２が低信頼度で所望の機能を可能にする多数の配列をもたらすと仮定する。かかる場合には、予測エンジン１０９が第１の閾値を満たさない配列を除外してより高い信頼性を有するより管理可能な数の候補配列をもたらすように、ユーザーは、第１の信頼性閾値を調整しうる。第１の信頼性閾値を満たす（工程３を切り抜ける）候補配列は、図１２に示され以下で説明されるパスＩをワークフローが辿る場合、「フィルター候補配列」ということがある。パスＩＩ又はパスＩＩＩをとる場合、任意選択的工程３（ｂ）又は３（ｄ）から工程４に入る候補配列は、それぞれ、「フィルター候補配列」ということがある。
【０２０５】
[00244]  たとえば、トレーニングセットのサイズ、配列データベースのサイズ、及び工程２で見いだされる候補配列の数、さらには他の因子に依存して、ユーザーは、最小信頼度を、たとえば、期待値を１Ｅ−１０＊程度の寛大さ若しくはそれ以上に（精度を犠牲にすることにより検索の範囲を拡張するように）又は逆に範囲の低減に注意して精度を増加させるように１Ｅ−５０＊＊程度の厳密さ若しくはそれ以下に設定しうる。
【０２０６】
[00245]  ＊ランダムに発生された１００億（１０１０）配列のうち１つが推定され、ｅ値１Ｅ−１０を有する候補配列よりも所与のモデルへのより良好なマッチとなりうる。
【０２０７】
[00246]  ＊＊ランダムに発生された１０５０配列のうち１つが推定され、ｅ値１Ｅ−５０を有する候補配列よりも所与のモデルへのより良好なマッチとなりうる。
【０２０８】
[00247]  入力例及び出力例
[00248]  入力工程３：  対象の機能を表すモデルにマッチする１つ以上の配列
【０２０９】
[00249]  出力工程３：  対象の機能を表すモデルにマッチするとともにユーザー定義の最小の第１の信頼性閾値を満たす（フィルター）候補配列サブセット。
【０２１０】
[00250]  工程４  １２０６：  予測モデルのリファインメント
[00251]  工程３で第１の信頼性閾値を満たす候補配列は、モデルによる予測通り所望の機能を触媒するかを経験的に確認するために、合成及び試験を行いうる。（以下に記載の任意選択的パスＩＩ及びＩＩＩから得られる候補配列に対しても、同一の操作を実施しうる。）この試験は、in vitro酵素アッセイとして、又は限定されるものではないが染色体内組込み若しくは複製プラスミドを介する宿主内への配列の組込みにより、実施可能である。特定実験条件下で所望の機能を生じた配列に対して、予測エンジン１０９は、結果をモデルデータベース（たとえばデータベース１１０）に記録しうる。所望の機能を検出可能でなかった配列に対しても、予測エンジン１０９は、結果をデータベース１１０に記録しうる。予測エンジン１０９は、これらの記録を用いてこの機能を表すモデルに対するトレーニング配列セットを「陽性」及び「陰性」トレーニングセット／例として拡張しうる／リファインしうる。
【０２１１】
[00252]  本開示の実施形態によれば、予測エンジン１０９は、各反応（たとえば、特定の推定バイオリーチャブル分子をもたらす経路で）に対して工程１〜４（及び工程３（ａ）〜（ｄ）、そうした選択肢が選択される範囲内で）を繰り返し、結果をデータベース１１０に記憶する。
【０２１２】
[00253]  実験環境の変化（たとえば、宿主細胞又は成長培地の変化）は、経験的アウトカムを変化させうる。たとえば、すべての配列がすべての可能な条件で所望の機能を生成するとは限らない。予測エンジン１０９は、こうした結果をデータベース１１０に記録し、宿主と実験条件との同一の組合せを用いた後続検索で陰性例が除外されるようにしうる。
【０２１３】
[00254]  実験的に検証されるように選択される配列の数は、利用可能なスループットにより制限されうる。高スループット工場様現場では、原理的には、同一機能に対して多くの配列を同時に試験しうる。観測された陽性及び陰性アウトカムに基づくフィードバックループを介するモデルの「再トレーニング」は、選択−試験−再トレーニングのサイクルによりモデルの予測力及び精度を向上させる（図１２のパスＩ、ＩＩ、及びＩＩＩの一部分として例示される）。この目的では、自動高スループット実験は、大きな一貫したトレーニングセットを生成可能であるので、偶発的誤差及び生物学的変動性に対してロバストな一貫した方式で再トレーニングを可能にする。
【０２１４】
[00255]  入力例及び出力例
[00256]  入力工程４：  検証される候補配列
[00257]  出力工程４：  予測モデルを更新するためにデータベースに記録された実験的検証結果
[00258]  任意選択的工程３（ａ）及び３（ｂ）１２０８：  クラスタリング
【０２１５】
[00259]  図１２を参照して、以上に記載の工程１、２、３、及び４は、「パスＩ」と表示された矢印を辿る。図１２はまた、本開示の実施形態に従ってフィルター候補配列をさらにリファインするために実施されうる任意選択的パスＩＩ及びＩＩＩも例示する。パスＩＩ及びＩＩＩから得られる候補配列は、パスＩからのものと同じように、本開示の実施形態に従って工程４に付される。
【０２１６】
[00260]  パスＩＩは、工程３（ａ）及び３（ｂ）を含む１２０８。実施形態では、予測エンジン１０９は、第１の信頼性閾値を満たす候補配列を多様化するために、工程４の前に、追加の工程３（ａ）及び３（ｂ）を行いうる（たとえば、ユーザーが選択すれば）。
【０２１７】
[00261]  工程３（ａ）１２０８：  予測エンジン１０９は、第１の信頼性閾値を満たす候補配列に対して統計的クラスタリング（たとえば、配列類似性又は／ｔ分布確率的近傍埋込み）を実施しうる。予測エンジン１０９は、どの配列が十分に類似して同一クラスターに出現するかを記録しうる。たとえば、ＣＤ−ＨＩＴクラスタリングアルゴリズムを用いて、予測エンジン１０９は、３８％〜９９％の配列同一性閾値を超える場合に配列が同一のクラスターに属するとみなしうる。この値は、ユーザーが候補最終フィルターセットに含めることができる配列間の最大同一度を反映するユーザー定義パラメーターである。左側の表で、図１３Ｇは、チロシンデカルボキシラーゼに対するすべてのＨＭＭ配列ヒットのクラスタリングから得られるraw出力ファイルのスニペットを示す。ＨＭＭ配列ヒットはすべて、７０％の配列同一性閾値例を用いてクラスター化される。図は、そのクラスター内に入るすべての配列クラスター番号及び配列識別子を列挙するファイルのスニペットを示す。（このスニペットでは、配列識別子の全リストは、アステリスクにより示唆されるようにトランケートされている。）このようにして、ユーザーは、その数がすべての候補を試験する実験能力を超えたとき、候補配列を一様に探索する課題に対処可能である。
【０２１８】
[00262]  任意選択的工程３（ｂ）１２０８：  クラスターからの配列の選択
[00263]  予測エンジン１０９は、各クラスターから１つ以上の配列を選択しうる。選択される配列の数は、クラスターの数に依存しうる。一方、クラスターの数は、ユーザー定義の配列同一性閾値さらにはクラスタリング前の候補配列セット内の全体的「配列多様性」に依存する。各クラスターからの特定候補配列の選択は、信頼度（たとえば、対応するモデルへのマッチのｅ値）により通知されうる。これにより、配列多様化セットが各機能／反応に対して選択されるだけでなく、所望の機能の最高尤度を有する候補が優先されることが保障される。図１３Ｇ（右側の表）は、サブ選択配列の処理表出力例を示す。ただし、クラスタリング工程３（ａ）後、最低ｅ値を有する配列のみが各クラスターから選択される。表は、そうした酵素の識別子と、チロシンデカルボキシラーゼに対するＨＭＭへの配列マッチングのｅ値と、図の左側の表の出力ファイルの解析により発生されるそれが属するクラスター番号と、を示す。右側の表は、ｅ値の昇順（すなわち信頼性の降順）にソートされた配列を示す。
【０２１９】
[00264]  任意選択的工程３（ｃ）及び３（ｄ）１２０８：  代替機能への親和性を有する候補配列の除外
[00265]  パスＩＩＩは、工程３（ｃ）及び３（ｄ）を含む１２１０。実施形態では、予測エンジン１０９は、第１の信頼性閾値を満たす候補配列が望ましくない機能を表す尤度を減少させるために、工程４の前に、追加の工程３（ｃ）及び３（ｄ）を行いうる（たとえば、ユーザーが選択すれば）。実施形態では、工程３（ｃ）及び３（ｄ）は、第１の信頼性閾値を満たす候補配列の信頼性スコアが第２の閾値超又は未満の場合にのみ選択しうる。
【０２２０】
[00266]  任意選択的工程３（ｃ）：  他の機能に対するモデルデータセットの作成
[00267]  実施形態では、予測エンジン１０９は、たとえば、対応する機能を遂行することが経験的に観測されている少なくとも１つの配列に関連付けられるすべてのKEGGオーソロジーグループなど、モデルを構築可能なすべての既知機能を表す予測モデルのデータベースを作製しうる。
【０２２１】
[00268]  任意選択的工程３（ｄ）：  代替機能への親和性を有する候補配列の除外
[00269]  実施形態では、予測エンジン１０９は、第１の信頼性閾値を満たすが所与の許容性内（たとえば、０．５〜１、この場合、１は、代替機能の可能性に対する許容性がないことを示す）で所望の機能とは異なる機能を可能にする可能性がより高い候補配列をフィルター候補配列として分類するのを防止しうる。そうするために、予測エンジン１０９は、工程３から得られる各候補配列（第１の信頼性閾値たとえば０．８を満たす）と、工程３（ｃ）でデータベースに記憶されたモデルの各々と、を比較して（たとえば、HMMscanを用いて）、所望の機能以外のいずれかの機能に対してより高い信頼性スコアを有する配列を見いだし除外しうる（許容性パラメーターを仮定する）。図１３Ｈは、さまざまな反応活性アレイを表す他の隠れマルコフモデルと対比してクラスター化ヒットをフィルターする出力ファイル例のスニペットを示す。この例では、モデル識別子は、特定反応活性を表すKEGGオーソロジーグループを表す。各同定配列に対して、図は、異なる活性のスキャニングデータベース中のHMMに配列がマッチする期待値を示す。他の活性のものと対比した所望の活性（TYDCトレーニングとして示されるチロシンデカルボキシラーゼ）への同定配列の期待値スコアは、所望の活性に対して配列がどれくらい特異的であるかを定量する。たとえば、配列Ｑ７ＸＨＬ３では、所望のチロシンデカルボキシラーゼ活性は、最小ｅ値を有する活性ではないので、試験するべき最良の候補配列ではない可能性がある。
【０２２２】
[00270]  ユーザー定義許容性パラメーターは、候補配列が所望の機能を生成する信頼性が、望ましくない機能を生成する信頼性未満にどの程度低下するのを許容するかに対して制限を課すために使用されうる。予測エンジン１０９は、所与の候補配列が所望の機能を可能にする信頼性と、データベースに記憶されたいずれかの他の既知機能を候補配列が可能にする信頼レベルと、をそれらの予測モデルに従って比較しうる。この許容性パラメーターは、候補配列がさまざまな信頼度で複数の機能（モデルにより表される）にマッチすると予測されうる場合及び所望の機能を表すモデルが候補配列に対するベストマッチ級の１つである（たとえベストマッチでないとしても）ことを確認したい場合にユーザーが対処できるようにする。たとえば、この許容性は、（すべてのモデルのデータベースと比較したときに見いだされる最低ｅ値のlog）を（所望の機能を表すモデルと比較したときのｅ値のlog）で除算した比でありうる。その場合、ベストマッチングモデルが所望の機能を表すものでもあれば、比は１であろう。すべての他の場合、１未満の比は、所望の機能を有する所与の候補配列に関して信頼性低下を示し、ベストマッチング（たとえば、最低ｅ値を有するもの）であるモデルにより表される機能を示さない。
【０２２３】
[00271]  実験データに基づく例
[00272]  図１２、パスＩＩＩに本質的に例示される配列選択プロセスを用いて（すなわち、フィードバック学習を除くすべての工程）、タンパク質配列のメタゲノムコレクションから３つの対象酵素機能に対して４８〜７２候補配列を選択した。同様に、対象の低分子エクスポーター機能に対して７２候補配列を選択した。とくに、４つの機能はすべて、選択配列が試験された微生物に固有であったが、標的分子の生成又は細胞からの移出が限定的でありうるという仮定に基づいて興味深く思われた。
【０２２４】
[00273]  選択タンパク質配列の各々をコードＤＮＡ配列に逆翻訳し、合成し、そしてすでに対象分子のきわめて有効な工業プロデューサーであった微生物のゲノムに挿入した。特定分子の製造の改善のために、２つの対象表現型：（１）グラム／Ｌ／時単位の製造スピード、（２）グラム／グラム単位の全基質→産物変換効率に関して、これらの改変微生物を試験した。３つの酵素機能及び１つのエクスポーター機能のうち２つを表す多重配列は、２つの対象表現型の少なくとも１つで１％超の統計的に有意な改善をもたらした。かかる高度最適化工業使用微生物では、他方に有害な影響を及ぼすことなく表現型の一方を改善するなんらかの変化を観測するのは稀であろう。それにもかかわらず、複数の候補配列は、かかる改善を付与した。表現型改善を測定するために、アルゴリズム選択配列の各々を工学操作により個別に宿主微生物に導入し、次いで、得られた表現型改善を評価した。
【０２２５】
[00274]  この実験は、機能的アノテーションをなんら用いることなく、予測タンパク質配列のみからなる大きなメタゲノムからでさえも、酵素及びエクスポーター機能に関してきわめて有効な候補配列を見いだすための図１２により例示されたワークフローの有用性を実証した。この例の改善は、本開示の実施形態のフィードバック学習なしで得られた。そのため、フィードバック学習を用いれば、さらに大きな改善を伴って配列の予測がもたらされると予想されよう。
【０２２６】
[00275]  機械学習
[00276]  本開示の実施形態は、機械学習（「ＭＬ」）技術を適用して、所与のパラメーター（配列）と観測アウトカム（たとえば機能）との関係を学習しうる。このフレームワークでは、実施形態は、ディシジョンツリーなどの標準的ＭＬモデルを用いて、特徴重要性を決定しうる。一般的には、機械学習は、限られた数のラベル付きデータ例を用いる情報タスク（たとえば分類又は回帰）の遂行で、遂行基準、たとえば、パラメーター、技術、又は他の特徴の最適化を行い、次いで、未知データで同一タスクを遂行することとして記述しうる。線形回帰を利用するアプローチなどの教師あり機械学習では、機械（たとえば、コンピューティングデバイス）は、たとえば、パターン、カテゴリー、統計的関係、又はデータのトレーニングにより呈示される他の属性を同定することにより、学習する。次いで、学習の結果を用いて、新たなデータが同一のパターン、カテゴリー、統計的関係、又は他の属性を呈するかを予測する。
【０２２７】
[00277]  本開示の実施形態は、教師なし機械学習を利用しうる。代替的に、いくつかの実施形態は、少量のラベル付きデータ及び多量の非ラベル付きデータを用いて半教師あり機械学習を利用しうる。実施形態はまた、最関連特徴サブセットを選択して機械学習モデルの遂行を最適化する特徴選択を利用しうる。選択される機械学習アプローチのタイプに依存して、線形回帰の代わりに又はそれに加えて、実施形態は、たとえば、ロジスティック回帰、ニューラルネットワーク、サポートベクトルマシン（ＳＶＭ）、ディシジョンツリー、隠れマルコフモデル、ベイジアンネットワーク、グラムシュミット、強化ベース学習、階層的クラスタリングを含むクラスターベース学習、遺伝的アルゴリズム、及び当技術分野で公知のいずれかの他の好適な学習機械を利用しうる。特定的には、実施形態は、分類自体と共に分類確率を提供するためにロジスティック回帰を利用しうる。たとえば、Shevade, A simple and efficient algorithm for gene selection using sparse logistic regression, Bioinformatics, Vol. 19, No. 17 2003, pp. 2246- 2253、Leng, et ah, Classification using functional data analysis for temporal gene expression data, Bioinformatics, Vol. 22, No. 1, Oxford University Press (2006), pp. 68-76（それらはすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０２２８】
[00278]  実施形態は、機械学習タスク、とくに深層ニューラルネットワーク（ＤＮＮ）として知られる形態のタスクを遂行する際に普及が進行してきているグラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）又はテンソル処理ユニット（ＴＰＵ）加速アーキテクチャーを利用しうる。本開示の実施形態は、ＧＰＵベース機械学習、たとえば、GPU-Based Deep Learning Inference: A Performance and Power Analysis, NVidia Whitepaper, November 2015、Dahl, et al, Multi-task Neural Networks for QSAR Predictions, Dept. of Computer Science, Univ. of Toronto, June 2014 (arXiv: 1406.1231 [stat.ML])（それらはすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載のものを利用しうる。本開示の実施形態に適用可能な機械学習技術はまた、参照文献の中でもとくに、Libbrecht, et al, Machine learning applications in genetics and genomics, Nature Reviews: Genetics, Vol. 16, June 2015、Kashyap, et al, Big Data Analytics in Bioinformatics: A Machine Learning Perspective, Journal of Latex Class Files, Vol. 13, No. 9, Sept. 2014、Prompramote, et al., Machine Learning in Bioinformatics, Chapter 5 of Bioinformatics Technologies, pp. 117-153, Springer Berlin Heidelberg 2005（それらはすべてその全体が参照により本明細書に組み込まれる）に見いだしうる。
【０２２９】
[00279]  コンピューターシステム実現
[00280]  図６は、本開示の実施形態に係るクラウドコンピューティング環境６０４を例示する。本開示の実施形態では、図１の反応アノテーションエンジン１０７及び予測エンジン１０９用のソフトウェア６１０は、たとえば、複数のユーザーが反応にアノテートできるように、且つ本開示の実施形態に係るバイオリーチャブル分子を予測できるように、クラウドコンピューティングシステム６０２に実装しうる。図７に例示されるようなクライアントコンピューター６０６は、インターネットなどのネットワーク６０８を介してシステムにアクセスする。システムは、図７に例示されるタイプの、１つ以上のプロセッサーを使用する１つ以上のコンピューティングシステムを利用しうる。クラウドコンピューティングシステム自体は、ネットワーク６０８を介してクライアントコンピューター６０６にバイオリーチャブル予測ツールソフトウェア６１０をインターフェースするためにネットワークインターフェース６１２を含む。ネットワークインターフェース６１２は、クライアントコンピューター６０６のクライアントアプリケーションからシステムソフトウェア６１０へのアクセスを可能にするためにアプリケーションプログラミングインターフェース（ＡＰＩ）を含みうる。特定的には、ＡＰＩを介して、クライアントコンピューター６０６は、アノテーションエンジン１０７及び予測エンジン１０９にアクセスしうる。
【０２３０】
[00281]  サービス（ＳａａＳ）ソフトウェアモジュール６１４としてのソフトウェアは、クライアントコンピューター６０６へのサービスとしてバイオリーチャブル予測ツールシステムソフトウェア６１０を提供する。クラウド管理モジュール６１６は、クライアントコンピューター６０６によりシステム６１０へのアクセスを管理する。クラウド管理モジュール６１６は、複数のユーザーにサービスを提供するために、マルチテナントアプリケーション、バーチャリゼーション、又は当技術分野で公知の他のアーキテクチャーを利用するクラウドアーキテクチャーを可能にしうる。
【０２３１】
[00282]  図７は、本開示の実施形態に係る非一時コンピューター可読媒体（たとえばメモリー）に記憶されたプログラムコードを実行するために使用しうるコンピューターシステムの例を例示する。コンピューターシステムは、アプリケーションに依存してヒトユーザー又は他のコンピューターシステムにインターフェースするために使用しうる入出力サブシステム８０２を含む。Ｉ／Ｏサブシステム８０２は、たとえば、キーボード、マウス、グラフィカルユーザーインターフェース、タッチスクリーン、又は他の入力用インターフェース、及びたとえば、ＬＥＤ又は他のフラットスクリーンディスプレイ、又はアプリケーションプログラムインターフェース（ＡＰＩ）をはじめとする他の出力用インターフェースを含みうる。アノテーションエンジン１０７や予測エンジン１０９などの本開示の実施形態の他の要素は、コンピューターシステム８００のようなコンピューターシステムを用いて実現しうる。
【０２３２】
[00283]  プログラムコードは、非一時媒体、たとえば、二次メモリー８１０のパーシステントストレージ、又はメインメモリー８０８、又はその両方に記憶されうる。メインメモリー８０８は、揮発性メモリー、たとえば、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）、又は不揮発性メモリー、たとえば、リードオンリーメモリー（ＲＯＭ）、さらには命令及びデータへのより速いアクセスのためのさまざまなレベルのキャッシュメモリーを含みうる。二次メモリーは、ソリッドステートドライブ、ハードディスクドライブ、光ディスクなどのパーシステントストレージを含みうる。１つ以上のプロセッサー８０４は、１つ以上の非一時媒体からプログラムコードを読み込み、コードを実行して本明細書の実施形態により遂行される本方法をコンピューターシステムにより達成可能にする。プロセッサーは、ソースコードを取り込み、ソースコードを解釈又は編集してプロセッサー８０４のハードウェアゲートレベルで理解可能なマシンコードにすることは、当業者であれば理解されよう。プロセッサー８０４は、計算負荷が高いタスクを取り扱うためにグラフィック処理ユニット（ＧＰＵ）を含みうる。
【０２３３】
[00284]  プロセッサー８０４は、ネットワークインターフェースカード、WiFiトランシーバーなどの１つ以上の通信インターフェース８０７を介して外部ネットワークと通信しうる。バス８０５は、Ｉ／Ｏサブシステム８０２、プロセッサー８０４、周辺デバイス８０６、通信インターフェース８０７、メモリー８０８、及びパーシステントストレージ８１０に通信結合する。本開示の実施形態は、この代表的アーキテクチャーに限定されるものではない。代替実施形態は、さまざまな配置及びタイプのコンポーネント、たとえば、入出力コンポーネント用及びメモリーサブシステム用の個別バスを利用しうる。
【０２３４】
[00285]  本開示の実施形態の要素の一部又は全部及びそれらに付随する操作は、コンピューターシステム８００のように１つ以上のプロセッサーと１つ以上のメモリーシステムとを含む１つ以上のコンピューターシステムにより完全に又は部分的に実現されうることは、当業者であれば理解されよう。特定的には、バイオリーチャブル予測ツール及びいずれかの他の自動システム又は本明細書に記載のデバイスの要素は、コンピューター実装されうる。いくつかの要素及び機能は、ローカルに実現されうるとともに、他のものは、さまざまなサーバーを介してネットワークにより分散方式で、たとえば、クライアント−サーバー方式で実現されうる。特定的には、サーバー側操作は、図６に示されるように、サービス（SaaS）方式としてソフトウェアで複数のクライアントに利用できるようにしうる。
【０２３５】
[00286]  本開示では、本明細書に記載のいくつかの実施形態又は特徴と、本明細書に記載の他の実施形態又は特徴と、を組み合わせうることを明示的に開示しないこともあるが、本開示は、当業者であれば実用可能と思われるいずれのかかる組合せも記述されていると読み取るべきである。とくに本明細書に指定がない限り、「include（〜を含む）」という用語は、「限定されるものではないが、〜を含む」を意味するものとし、「or（又は）」という用語は、「and/or（及び／又は）」のように非排他的「or（又は）」を意味するものとする。
【０２３６】
[002]  いくつかの実施形態では、本明細書に記載の操作のいくつかは、人的介入により、又は自動と手動との組合せ手段を介して、実施されうることは、当業者であれば分かるであろう。操作が完全自動化されていない場合、本開示の実施形態の適切なコンポーネントは、たとえば、それ自体の操作能力を介して結果を発生するのではなく、人的操作遂行の結果を受け取ることもある。
【０２３７】
[003]  本明細書で引用された参照文献、論文、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願はすべて、あらゆる目的でそれらの全体が参照により組み込まれる。しかしながら、本明細書で引用された参照文献、論文、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願はいずれも、それらの言及が正当な先行技術を構成したり、世界のいずれかの国の共通一般知識の一部を形成したり、本質的事項を開示したりするものではなく、そのように見なされるべきでもない。
【０２３８】
[004]  以下の特許請求の範囲では、「請求項ｘから始まる先行請求項のいずれか一項」を挙げた請求項ｎは、請求項ｘから始めて直前の請求項（請求項ｎ−ｌ）で終わる請求項のいずれか一項を参照する。たとえば、「請求項２８から始まる先行請求項のいずれか一項に記載のシステム」を挙げた請求項３５は、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載のシステムを参照する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１３Ｅ】
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【図１３Ｆ】
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【図１３Ｇ】
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【図１３Ｈ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年3月19日(2021.3.19)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
宿主細胞内で機能を可能にする候補生物学的配列を同定するための方法であって、
ａ）複数の生物学的配列を１つ以上の機能に関連付ける予測モデルを用いて、前記複数の生物学的配列の１つ以上の候補配列が所望の機能を可能にすることを予測することと、
ｂ）プロセッサーを用いて、信頼性閾値を満たす候補配列をフィルター候補配列として分類することであって、
ｉ）前記フィルター候補配列の１つ以上の第１のフィルター候補配列を処理することが、１つ以上の対応する分子の生成をもたらしうる、分類することと、
ｃ）前記フィルター候補配列を表すデータを返すことと、
を含む方法。
【請求項２】
ａ）前記フィルター候補配列の少なくとも１つが所望の機能を可能にするかに関する経験的データを得ることと、
ｂ）前記経験的データを用いて前記予測モデルをリファインすることと、
をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記予測モデルが機械学習を利用する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
分類することが、前記信頼性閾値を満たす前記候補配列の多様化セットを前記フィルター候補配列として分類することを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記多様化セットを前記フィルター候補配列として分類することが、
ａ）前記信頼性閾値を満たす複数の候補配列を複数のクラスターの各クラスターにクラスター化することと、
ｂ）前記複数のクラスターの少なくとも２つのクラスターの各々から少なくとも１つの候補配列を前記多様化セット内に含まれるとして同定することと、
を含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
分類することが、
ａ）前記信頼性閾値を満たすが前記所望の機能とは異なる機能を可能にする可能性がより高い候補配列をフィルター候補配列として分類しないことと、
をさらに含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
分類しないことが、前記信頼性閾値を満たすが前記所望の機能とは異なる機能を所与の許容性内で可能にする可能性がより高い候補配列をフィルター候補配列として分類しないことを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記生物学的配列が酵素アミノ酸配列であり、且つ前記所望の機能が酵素触媒反応である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記生物学的配列が酵素アミノ酸配列を含み、且つ前記１つ以上の酵素機能が１つ以上の反応経路に沿った１つ以上の酵素触媒反応であり、各反応経路が分子を生成する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記生物学的配列が、酵素をコードするヌクレオチド配列を含み、且つ前記所望の機能が酵素触媒反応である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
処理することが、前記１つ以上の第１のフィルター候補配列の少なくとも１つに対応する少なくとも１つのヌクレオチド配列を工学操作により前記宿主細胞に導入すること含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記予測モデルが配列アライメントに少なくとも部分的に基づく、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記予測モデルが、次のモデル：隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）、人工ニューラルネットワーク、又はダイナミックベイジアンネットワークの少なくとも１つに少なくとも部分的に基づく、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記１つ以上の第１のフィルター候補配列に関する情報を遺伝子作製システムに提供することをさらに含み、前記宿主細胞が前記１つ以上の第１のフィルター候補配列を用いて前記１つ以上の分子を生成できるように前記遺伝子作製システムが操作可能である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の第１のフィルター候補配列の少なくとも１つを用いて前記１つ以上の分子の少なくとも１つを生成することをさらに含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記１つ以上の分子がバイオリーチャブル分子である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記機能が転写機能又は輸送機能の１つである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記１つ以上の分子が前記フィルター候補配列の１つ以上である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記フィルター候補配列の１つが酵素アミノ酸配列を含み、且つ処理することが、前記酵素アミノ酸配列を用いて反応を触媒することを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記１つ以上の分子が、１つ以上のバイオリーチャブル分子であると予測された１つ以上の分子を含む、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記１つ以上の分子が、
ａ）反応を触媒するために利用できることがそれ自体示唆された１つ以上の対応する触媒により反応が触媒されることが示唆されるかに少なくとも部分的に基づいて、反応を選択することであって、反応セットが前記選択された反応を含む、選択することと、
ｂ）１つ以上の処理工程の各処理工程で、前記宿主細胞に対する出発代謝物と前の処理工程で発生した代謝物とを表すデータを前記反応セットの１つ以上の反応に従って処理して、前記１つ以上の分子を表すデータを発生することと、
により予測される、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
選択することが、工学操作により生物に導入されること又は生物を成長させる成長培地から取り込まれることが可能であることがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により触媒されることが示唆される反応を選択することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
選択することが、１つ以上のアミノ酸配列又は１つ以上の遺伝子配列に対応することがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により触媒されることが示唆される反応を選択することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
選択することが、反応を触媒するのに利用可能であることがそれ自体示唆される１つ以上の対応する触媒により反応が触媒されることが少なくとも１つのデータベースで示唆されるかに少なくとも部分的に基づいて反応を選択することを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
前記宿主細胞が、微生物、植物、若しくは動物の組織を起源とするか、又は単細胞生物若しくは多細胞生物の一部である、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
宿主細胞内で機能を可能にする候補生物学的配列を同定するためのシステムであって、
１つ以上のプロセッサーと、
前記１つ以上のプロセッサーの少なくとも１つにより実行されたとき、システムを介して、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法を実施する命令を記憶する１つ以上のメモリーと、
を含む、
システム。
【請求項２７】
宿主細胞内で機能を可能にする候補生物学的配列を同定するための命令を記憶している１つ以上の非一時コンピューター可読媒体であって、前記命令が、１つ以上のコンピューティングデバイスにより実行されたとき、前記１つ以上のコンピューティングデバイスの少なくとも１つを介して、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法を実施する命令である、１つ以上の非一時コンピューター可読媒体。
【国際調査報告】
2021536049.tif 000024
2021536049.tif 000025