(57)【要約】  本開示は、概して、リン酸化トレオニン２３１−タウタンパク質（ｐＴ２３１−タウ）と結合し、その活性を中和し得るコンホメーション特異的抗体に関する。本技術の抗体は、それを必要とする対象におけるシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するための方法において有用である。
2021502125.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１〜４もしくは７〜１４の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、および、配列番号４１、４２もしくは４５〜４８の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、を含む抗体。
【請求項２】
アミノ酸配列ＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳ（配列番号５６）を含むリン酸化トレオニン２３１−タウタンパク質のエピトープと結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
リン酸化トレオニン２３１−タウタンパク質のシス−コンホメーションと特異的に結合する、請求項１または２に記載の抗体。
【請求項４】
ヒト化抗体である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項５】
Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、ｓｃＦvおよびＦvからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体の抗原結合断片。
【請求項６】
ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭからなる群から選択されるアイソタイプを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体。
【請求項７】
請求項１または２に記載の抗体をコードする組換え核酸配列。
【請求項８】
請求項７に記載の組換え核酸配列を含む宿主細胞またはベクター。
【請求項９】
請求項１または２に記載の抗体および医薬上許容される担体を含む組成物。
【請求項１０】
それを必要とする対象におけるシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するための方法であって、対象に、配列番号１〜４もしくは７〜１４の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含み、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と特異的に結合して中和する抗体の有効量を投与することを含む方法。
【請求項１１】
抗体が、配列番号４１、４２もしくは４５〜４８の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
神経疾患が、タウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）または卒中である、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記タウオパチーが、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、前頭側頭葉変性症、リティコ−ボディグ病、タングル優位型認知症、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ピック病、大脳皮質基底核変性症およびアルツハイマー病ＡＤ）からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
対象が、前記タウオパチーの初期段階である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記タウオパチーの初期段階が、対象から得られたサンプルにおける、シスｐＴ２３１−タウのレベルの上昇またはシス：トランスｐＴ２３１−タウ比の増大によって決定される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
対象から得られたサンプルにおけるＣＳＦ  ｔ−タウのレベル、ｐＴ１８１−タウ、Αβ４２またはＡｐｏＥ４レベルを決定することをさらに含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記サンプルが、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水および脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記対象が、脳外傷の反復の病歴を有する、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１９】
抗体が、さらなる治療薬と別個に、逐次または同時に対象に投与される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項２０】
さらなる治療薬が、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンおよび塩化リチウムのうち１種以上である、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を用いる処置のために対象を選択する方法であって、
（ａ）参照サンプルにおいて観察されたものに対する、前記対象から得られたサンプルにおけるシスｐＴ２３１−タウタンパク質のレベルの増大またはシス：トランスｐＴ２３１−タウタンパク質比の増大を検出することと、
（ｂ）請求項１〜４のいずれか１項に記載の抗体を用いる処置のために前記対象を選択することと
を含む方法。
【請求項２２】
参照サンプルが、健常な対照対象から得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
対象から得られたサンプルが、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水および脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
それを必要とする対象におけるシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するためのキットであって、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と特異的に結合して中和する抗体と、抗体を使用するための説明書とを含み、抗体は、配列番号１〜４もしくは７〜１４の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、キット。
【請求項２５】
抗体が、配列番号４１、４２もしくは４５〜４８の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む、請求項２４に記載のキット。
【請求項２６】
サンプルにおいてシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質を検出するためのキットであって、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と特異的に結合する抗体と、抗体を使用するための説明書とを含み、抗体は、配列番号１〜４もしくは７〜１４の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む、キット。
【請求項２７】
抗体が、配列番号４１、４２もしくは４５〜４８の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む、請求項２６に記載のキット。
【請求項２８】
抗体が、１つ以上の検出可能な標識にカップリングされている、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項２９】
１つ以上の検出可能な標識が、放射性標識、蛍光標識または発色標識を含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質抗体と特異的に結合する二次抗体をさらに含む、請求項２６または２７に記載のキット。
【請求項３１】
二次抗体が、放射性標識、蛍光標識または発色標識からなる群から選択される少なくとも１つの検出可能な標識にカップリングされている、請求項３０に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月９日に出願された米国仮特許出願第６２／５８３，８５０号の利益および優先権を主張し、その開示内容は、ありとあらゆる目的のために参照により全文が本明細書に組み込まれる。
本技術は、概して、リン酸化トレオニン２３１−タウタンパク質（ｐＴ２３１−タウ）と特異的に結合するコンホメーション特異的抗体の調製およびその使用に関する。特に、本技術は、シス−ｐＴ２３１−タウ中和抗体およびシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の処置におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
以下の説明は、読者の理解を補助するために提供される。提供される情報または引用される参照文献のうち、本方法の先行技術であると承認されるものはない。
アルツハイマー病（ＡＤ）およびいくつかのその他の中枢神経系障害、例えば、前頭側頭型認知症、ピック病、大脳皮質基底核変性症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）および進行性核上性麻痺を有する患者の脳は、タウタンパク質を含む神経原線維タングル（ＮＦＴ）を含有する。この共通の病理学的特徴は、「タウオパチー」と呼ばれるこれらの種々の神経変性性疾患をもたらしている。タウ関連病理学は、ＡＤにおけるニューロンおよび記憶の進行性の喪失とよく相関している。ＡＤのタウオパチーにおける極めて早期の事象は、特に、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフでのタウ過剰リン酸化であり、これは、微小管破壊および神経毒性を引き起こす。タウ（ｐＴ２３１−タウ）中のリン酸化Ｔｈｒ２３１−Ｐｒｏモチーフは、２つの別個のシスおよびトランスコンホメーションで存在することがわかっている。ｐＴ２３１−タウタンパク質のシス−コンホメーションは、ＡＤ患者の脳において主に発現される。
ニューロン機能不全はタングル形成のかなり前に起こるので、主要な課題は、ＡＤにおけるタウオパチーおよび記憶喪失につながる早期病原性事象をもっぱら標的とする免疫療法の開発である。
【発明の概要】
【０００３】
本技術は、概して、リン酸化トレオニン２３１−タウタンパク質（ｐＴ２３１−タウ）活性と特異的に結合して中和するコンホメーション特異的抗体に関する。本技術の抗体は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するための方法において有用である。
一態様では、本技術は、配列番号１〜４もしくは７〜１４の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、および、配列番号４１、４２もしくは４５〜４８の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアント、を含む抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
別の態様では、本技術は、抗体の抗原結合断片を提供し、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖおよびＦｖからなる群から選択される。
上記の実施形態のいずれにおいても、抗体は、アミノ酸配列ＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳ（配列番号５６）を含むリン酸化トレオニン２３１−タウタンパク質のエピトープと結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、リン酸化トレオニン２３１−タウタンパク質（ｐＴ２３１−タウ）のシス−コンホメーションと特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＡ１、ＩｇＡ２、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４およびＩｇＭからなる群から選択されるアイソタイプを有する。
一態様では、本技術は、本明細書において開示される抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードする組換え核酸配列を提供する。さらに別の態様では、本技術は、本明細書において記載される抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードする組換え核酸を含む宿主細胞またはベクターを提供する。
一態様では、本技術は、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体および医薬上許容される担体を含む組成物を提供する。いくつかの実施形態では、組成物は、配列番号１〜４もしくは７〜１４の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含み、配列番号４１、４２もしくは４５〜４８の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含んでもよい抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を含む。
【０００４】
別の態様では、本技術は、それを必要とする対象におけるシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するための方法であって、対象に、配列番号１〜４もしくは７〜１４の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含み、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と特異的に結合して中和する抗体の有効量を投与することを含む方法を提供する。
方法の特定の実施形態では、抗体は、配列番号４１、４２もしくは４５〜４８の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む。
方法のいくつかの実施形態では、神経疾患は、タウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）または卒中である。さらなる実施形態では、タウオパチーは、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、前頭側頭葉変性症、リティコ−ボディグ病、タングル優位型認知症、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ピック病、大脳皮質基底核変性症およびアルツハイマー病（ＡＤ）からなる群から選択される。
【０００５】
特定の実施形態では、対象は、前記タウオパチーの初期段階である。一実施形態では、前記タウオパチーの初期段階は、対象から得られたサンプルにおける、シスｐＴ２３１−タウのレベルの上昇またはシス：トランスｐＴ２３１−タウ比の増大によって決定される。いくつかの実施形態では、方法は、対象から得られたサンプルにおけるＣＳＦ  ｔ−タウのレベル、ｐＴ１８１−タウ、Αβ４２またはＡｐｏＥ４レベルを決定することをさらに含む。特定の実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水および脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、対象は、脳外傷の反復の病歴を有する。
さらにまたはあるいは、方法のいくつかの実施形態では、抗体は、さらなる治療薬と別個に、逐次または同時に対象に投与される。いくつかの実施形態では、さらなる治療薬は、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンおよび塩化リチウムのうち１種以上である。
【０００６】
一態様では、本技術は、本明細書において開示される抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を用いる処置のために対象を選択する方法であって、（ａ）参照サンプルにおいて観察されたものに対する、前記対象から得られたサンプルにおける、シスｐＴ２３１−タウタンパク質のレベルの増大またはシス：トランスｐＴ２３１−タウタンパク質比の増大を検出することと、（ｂ）本明細書において開示される抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を用いる処置のために前記対象を選択することとを含む方法を提供する。いくつかの実施形態では、対象から得られるサンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水および脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群から選択される。
特定の実施形態では、参照サンプルは、健常な対照対象から得られる。
別の態様では、本技術は、それを必要とする対象におけるシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するためのキットであって、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と特異的に結合して中和する抗体と、抗体を使用するための説明書とを含むキットを提供し、抗体は、配列番号１〜４もしくは７〜１４の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む。キットのいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４１、４２もしくは４５〜４８の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む。
【０００７】
一態様では、本技術は、サンプルにおいてシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質を検出するためのキットであって、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と特異的に結合する抗体と、抗体を使用するための説明書とを含むキットを提供し、抗体は、配列番号１〜４もしくは７〜１４の重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを含む。キットのいくつかの実施形態では、抗体は、配列番号４１、４２もしくは４５〜４８の軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントをさらに含む。
特定の実施形態では、抗体は、１つ以上の検出可能な標識にカップリングされている。一実施形態では、１つ以上の検出可能な標識は、放射性標識、蛍光標識または発色標識を含む。
さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、キットは、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質抗体と特異的に結合する二次抗体をさらに含む。いくつかの実施形態では、二次抗体は、放射性標識、蛍光標識または発色標識からなる群から選択される少なくとも１つの検出可能な標識にカップリングされている。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】図１は、マウス抗体ＰＴ−１１３の重鎖免疫グロブリン可変（ＶＨ）ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。ＣＨ１配列の一部が、図中に含まれている。
【図２】図２は、マウス抗体ＰＴ−１１３の軽鎖免疫グロブリン可変（ＶＬ）ドメインのヌクレオチドおよびアミノ酸配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。Ｃκ配列の一部が、図中に含まれている。
【図３】図３は、一文字コードでの、その推定親生殖系列ＶセグメントＩＧＨＶ１Ｓ１２７＊０１およびＪＨ２セグメントのものとアラインされたマウスＰＴ−１１３抗体の成熟ＶＨドメインのアミノ酸配列を示す図である。残基番号は、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interests, NIH Publication No. 91-3242, U.S. Department of Health and Human Services (5th ed., 1991)に従って割り当てられている。ＰＴ−１１３  ＶＨドメインのＣＤＲ配列は下線が引かれている。アスタリスクは、ＰＴ−１１３  ＶＨとＩＧＨＶ１Ｓ１２７＊０１アミノ酸配列の間の相違を示す。
【図４】図４は、一文字コードでの、その推定親生殖系列ＶセグメントＩＧＫＶ１−１１０＊０２およびＪｋ１セグメントのものとアラインされたマウスＰＴ−１１３抗体の成熟ＶＬドメインのアミノ酸配列を示す図である。残基番号は、Kabat et al.(1991)に従って割り当てられている。ＰＴ−１１３ＶＬドメインのＣＤＲ配列は下線が引かれている。アスタリスクは、ＰＴ−１１３  ＶＬとＩＧＫＶ１−１１０＊０２アミノ酸配列の間の相違を示す。
【図５】図５は、推定されたアミノ酸配列とともの、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線が引かれた）によってフランキングされた合成マウスＰＴ−１１３ＶＨ遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸残基（Ｑ）は、二重下線が引かれている。Kabat et al.(1991)の定義に従うＣＤＲ配列は下線が引かれている。ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連続しているイントロン配列は、イタリック体である。
【図６】図６は、推定されたアミノ酸配列とともの、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位（下線が引かれた）によってフランキングされた合成マウスＰＴ−１１３ＶＬ遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。シグナルペプチド配列は、イタリック体である。成熟ＶＬドメインのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）は、二重下線が引かれている。Kabat et al.(1991)の定義に従うＣＤＲ配列は、下線が引かれている。ＥｃｏＲＩ部位に連続しているイントロン配列は、イタリック体である。
【図７】図７は、ｐＣｈＰＴ−１１３、ｐＨｕＰＴ−１１３Ａ、ｐＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ｐＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ｐＨｕＰＴ−１１３ＤおよびｐＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡベクター（まとめて発現ベクター）の模式的構造を示す図である。ＳａｌＩ部位から時計回りに進んで、プラスミドは、抗体重鎖遺伝子の転写を開始するための、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要前初期プロモーターおよびエンハンサー（ＣＭＶ−Ｐ）で始まる重鎖転写ユニットを含有する。ＣＭＶプロモーターに、ＶＨエキソン、介在するイントロンとともにＣＨ１、ヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３エキソンを含むヒトガンマ−１重鎖定常領域を含有するゲノム配列が続き、ＣＨ３エキソンに続いてポリアデニル化部位が続く。重鎖遺伝子配列後に、軽鎖転写ユニットは、ＣＭＶプロモーターで始まり、ＶＬエキソンならびに先行するイントロン部分とともにヒトカッパ鎖定常領域エキソン（ＣＬ）を含有するゲノム配列ならびにＣＬエキソンに続いてポリアデニル化部位が続く。軽鎖遺伝子に、次いで、ＳＶ４０初期プロモーター（ＳＶ４０−Ｐ）、ピューロマイシンに対する耐性のためのピューロマイシンＮ−アセチル−トランスフェラーゼ遺伝子（ｐｕｒｏ）およびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含有するセグメント（ＳＶ４０−Ａ）が続く。最後に、プラスミドは、細菌複製起点（ｐＵＣ  ｏｒｉ）およびベータ−ラクタマーゼ遺伝子（βラクタマーゼ）を含むプラスミドｐＵＣ１９の一部を含有する。ｐＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡでは、ＣＨ２領域は、位置２３４および２３５（Kabat et al.（１）のＥｕ番号付け）にＬｅｕからＡｌａへのアミノ酸置換を保持する。関連制限酵素部位の位置は、図に示されている。
【図８】図８は、マウスＰＴ−１１３ＶＨドメイン、４種のバーションのヒト化ＰＴ−１１３ＶＨ（ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ４）ドメインおよびヒトアクセプターＡＦ１７４０９２  ＶＨドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。配列の上の数字は、Kabat et al.(1991)に従う位置を示す。マウスＰＴ−１１３ＶＨドメインのＣＤＲ配列は下線が引かれている。ＡＦ１７４０９２ＶＨドメイン中のＣＤＲ残基は、図から省略されている。ＨｕＰＴ−１１３ＶＨ１、ＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ４中の下線が引かれた残基は、抗原結合部位の形成にとって重要な役割を果たすと予測され、したがって、対応するマウス残基がこれらの位置で保持された。
【図９】図９は、マウスＰＴ−１１３ＶＬドメイン、ヒト化ＰＴ−１１３ＶＬ（ＨｕＰＴ−１１３  ＶＬ１）ドメインおよびヒトアクセプターＭ９９６０８  ＶＬドメインのアミノ酸配列のアラインメントを示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。配列の上の数字は、Kabat et al.(1991)に従う位置を示す。マウスＰＴ−１１３ＶＬドメインのＣＤＲ配列は下線が引かれている。Ｍ９９６０８ＶＬドメイン中のＣＤＲ残基は、図から省略されている。ＨｕＰＴ−１１３  ＶＬ１を設計する場合にフレームワークアミノ酸置換は必要ではなかった。
【図１０】図１０は、推定されたアミノ酸配列とともの、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線が引かれた）によってフランキングされたＨｕＰＴ−１１３ＶＨ１遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸残基（Ｑ）は、二重下線が引かれている。Kabat et al.(1991)の定義に従うＣＤＲ配列は下線が引かれている。ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連続しているイントロン配列は、イタリック体である。
【図１１】図１１は、推定されたアミノ酸配列とともの、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線が引かれた）によってフランキングされたＨｕＰＴ−１１３ＶＨ２遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸残基（Ｑ）は、二重下線が引かれている。Kabat et al.(1991)の定義に従うＣＤＲ配列は下線が引かれている。ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連続しているイントロン配列は、イタリック体である。
【図１２】図１２は、推定されたアミノ酸配列とともの、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線が引かれた）によってフランキングされたＨｕＰＴ−１１３ＶＨ３遺伝子のヌクレオチド配列を示す。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸残基（Ｑ）は、二重下線が引かれている。Kabat et al.(1991)の定義に従うＣＤＲ配列は下線が引かれている。ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連続しているイントロン配列は、イタリック体である。
【図１３】図１３は、推定されたアミノ酸配列とともの、ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ部位（下線が引かれた）によってフランキングされたＨｕＰＴ−１１３ＶＨ４遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＨドメインのＮ末端アミノ酸残基（Ｑ）は、二重下線が引かれている。Kabat et al.(1991)の定義に従うＣＤＲ配列は下線が引かれている。ＨｉｎｄＩＩＩ部位に連続しているイントロン配列は、イタリック体である。
【図１４】図１４は、推定されたアミノ酸配列とともの、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位（下線が引かれた）によってフランキングされたＨｕＰＴ−１１３ＶＬ１遺伝子のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。シグナルペプチド配列はイタリック体である。成熟ＶＬドメインのＮ末端アミノ酸残基（Ｄ）は、二重下線が引かれている。Kabat et al.(1991)の定義に従うＣＤＲ配列は下線が引かれている。ＥｃｏＲＩ部位に連続しているイントロン配列は、イタリック体である。
【図１５】図１５は、一過性に発現されたＣｈＰＴ−１１３、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３ＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）抗体の、本明細書において開示されるｐＴ２３１−Ｄｍｐ−タウペプチドとの結合を示す図である。
【図１６】図１６は、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体のＳＤＳ  ＰＡＧＥ解析を示す図である。還元条件下、ＭＥＳバッファー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、４〜１２％  ＳＤＳ  ＰＡＧＥゲルで、抗体（各５μｇ）が流された。ＰａｇｅＲｕｌｅｒ  Ｐｒｅｓｔａｉｎｅｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌａｄｄｅｒ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）が分子量標準（レーン４）として使用された。レーン１、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１；レーン２、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）；レーン３、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）。ＨおよびＬは、それぞれ、各試験抗体の重鎖および軽鎖を表す。
【図１７】図１７は、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）重鎖および軽鎖ｃＤＮＡのＰＣＲ増幅およびシーケンシングに使用されるオリゴヌクレオチドの配列を示す図である。
【図１８】図１８は、ｐＣｈＰＴ−１１３構築物によってコードされるガンマ−１重鎖のコーディング領域（可変および定常領域）のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。終止コドンは、「・」によって表されている。
【図１９】図１９は、ｐＣｈＰＴ−１１３構築物によってコードされるカッパ軽鎖のコーディング領域（可変および定常領域）のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。終止コドンは、「・」によって表されている。
【図２０】図２０は、ｐＨｕＰＴ−１１３Ｄ構築物によってコードされるガンマ−１重鎖のコーディング領域（可変および定常領域）のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。終止コドンは、「・」によって表されている。
【図２１】図２１は、ｐＨｕＰＴ−１１３ＤおよびｐＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡ構築物によってコードされるカッパ軽鎖のコーディング領域（可変および定常領域）のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。終止コドンは、「・」によって表されている。
【図２２】図２２は、ｐＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡ構築物によってコードされるガンマ−１重鎖のコーディング領域（可変および定常領域）のヌクレオチド配列を示す図である。アミノ酸残基は、一文字コードで示されている。終止コドンは、「・」によって表されている。
【図２３】図２３は、マウスＰＴ−１１３  ＩｇＧ２ｂ抗体の、４種の異なるタウペプチドとの結合のＥＬＩＳＡ解析を示す図である。
【図２４】図２４は、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１抗体の、４種の異なるタウペプチドとの結合のＥＬＩＳＡ解析を示す図である。
【図２５】図２５は、種々の濃度の競合抗体の存在下での（ｉ）ビオチン化マウスＰＴ−１１３  ＩｇＧ２ｂおよび（ｉｉ）ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１抗体の、ｐＴｈｒ２３１−Ｄｍｐタウペプチドとの結合を示す図である。
【図２６Ａ】図２６Ａは、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体の、ｐＴｈｒ２３１−Ｄｍｐタウペプチドとの結合のＥＬＩＳＡ解析を示す図である。
【図２６Ｂ】図２６Ｂは、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体の、ｐＴｈｒ２３１−Ｐｒｏタウペプチドとの結合のＥＬＩＳＡ解析を示す図である。
【図２６Ｃ】図２６Ｃは、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体の、ｎｐ−Ｔｈｒ２３１−Ｐｒｏタウペプチドとの結合のＥＬＩＳＡ解析を示す図である。
【図２６Ｄ】図２６Ｄは、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体の、ｐＴｈｒ２３１−Ａｌａタウペプチドとの結合のＥＬＩＳＡ解析を示す図である。
【図２７Ａ】図２７Ａは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）構築物（配列番号１２８）の重鎖可変鎖のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２７Ｂ】図２７Ｂは、配列番号１２８によってコードされるアミノ酸配列（配列番号３９）を示す図である。
【図２７Ｃ】図２７Ｃは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）構築物（配列番号１２９）のカッパ軽鎖のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２７Ｄ】図２７Ｄは、配列番号１２９によってコードされるアミノ酸配列（配列番号５５）を示す図である。
【図２８Ａ】図２８Ａは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）構築物（配列番号１３０）の重鎖可変鎖のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２８Ｂ】図２８Ｂは、配列番号１３０によってコードされるアミノ酸配列（配列番号４０）を示す図である。
【図２８Ｃ】図２８Ｃは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）構築物（配列番号１２９）のカッパ軽鎖のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２８Ｄ】図２８Ｄは、配列番号１２９によってコードされるアミノ酸配列（配列番号５５）を示す図である。
【図２９Ａ】図２９Ａは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）構築物（配列番号１３１）の重鎖可変鎖のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２９Ｂ】図２９Ｂは、配列番号１３１によってコードされるアミノ酸配列（配列番号１３２）を示す図である。
【図２９Ｃ】図２９Ｃは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）構築物（配列番号１２９）のカッパ軽鎖のヌクレオチド配列を示す図である。
【図２９Ｄ】図２９Ｄは、配列番号１２９によってコードされるアミノ酸配列（配列番号５５）を示す図である。
【図３０Ａ】図３０Ａは、ＴＨＰ−１細胞におけるＣＤ１６の染色を示すヒストグラムプロットである。赤色の染色されていない細胞および青色の抗ＣＤ１６抗体によって染色された細胞。
【図３０Ｂ】図３０Ｂは、ＴＨＰ−１細胞におけるＣＤ３２の染色を示すヒストグラムプロットである。赤色の染色されていない細胞および青色の抗ＣＤ３２抗体によって染色された細胞。
【図３０Ｃ】図３０Ｃは、ＴＨＰ−１細胞におけるＣＤ６４の染色を示すヒストグラムプロットである。赤色の染色されていない細胞および青色の抗ＣＤ６４抗体によって染色された細胞。
【図３１Ａ】図３１Ａは、ＴＮＦα分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度および細胞数（ウェルあたり５，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、ウサギポリクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３１Ｂ】図３１Ｂは、ＴＮＦα分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度および細胞数（ウェルあたり５０，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、ウサギポリクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３１Ｃ】図３１Ｃは、ＩＬ−６分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度および細胞数（ウェルあたり５，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、ウサギポリクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３１Ｄ】図３１Ｄは、ＩＬ−６分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度および細胞数（ウェルあたり５０，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、ウサギポリクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３２Ａ】図３２Ａは、ＴＮＦα分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度（０．１μｇ／ｍｌコーティング）および細胞数（ウェルあたり５０，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、マウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３２Ｂ】図３２Ｂは、ＴＮＦα分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度（１０μｇ／ｍｌコーティング）および細胞数（ウェルあたり５０，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、マウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３２Ｃ】図３２Ｃは、ＴＮＦα分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度（０．１μｇ／ｍｌコーティング）および細胞数（ウェルあたり１５０，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、マウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３２Ｄ】図３２Ｄは、ＴＮＦα分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度（１０μｇ／ｍｌコーティング）および細胞数（ウェルあたり１５０，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、マウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３３Ａ】図３３Ａは、ＩＬ−６分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度（０．１ｍｇ／ｍｌコーティング）および細胞数（ウェルあたり５０，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、マウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３３Ｂ】図３３Ｂは、ＩＬ−６分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度（１０μｇ／ｍｌコーティング）および細胞数（ウェルあたり５０，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、マウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３３Ｃ】図３３Ｃは、ＩＬ−６分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度（０．１μｇ／ｍｌコーティング）および細胞数（ウェルあたり１５０，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、マウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３３Ｄ】図３３Ｄは、ＩＬ−６分泌によって測定されるようなＴＨＰ−１細胞の活性化に対する、オボアルブミン免疫複合体（ＩＣ）コーティング密度（１０μｇ／ｍｌコーティング）および細胞数（ウェルあたり１５０，０００個の細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、マウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体を含んでいた。
【図３４Ａ】図３４Ａは、ＦｃＲの活性化に対するオボアルブミンＩＣ濃度およびＪｕｒｋａｔ細胞数（ウェルあたり５０，００細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、オボアルブミンコーティングされたウェル（１０μｇ／ｍＬ）ならびにウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体両方の濃度の範囲から作製された。
【図３４Ｂ】図３４Ｂは、ＦｃＲの活性化に対するオボアルブミンＩＣ濃度およびＪｕｒｋａｔ細胞数（ウェルあたり１００，００細胞）の影響を示すグラフである。オボアルブミンＩＣは、オボアルブミンコーティングされたウェル（１０μｇ／ｍＬ）ならびにウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体両方の濃度の範囲から作製された。
【図３５】図３５は、各ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドコーティング濃度（１μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌおよび１００μｇ／ｍｌ）での、各抗体（ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ１−ＡＡ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１））の結合曲線を示すグラフである。
【図３６Ａ】図３６Ａは、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）またはＤＰＢＳで希釈されたｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドに応じたＴＨＰ−１細胞におけるＴＮＦαの分泌を示すグラフである。
【図３６Ｂ】図３６Ｂは、２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）またはＤＰＢＳで希釈されたｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドに応じたＴＨＰ−１細胞におけるＩＬ−６の分泌を示すグラフである。
【図３７】図３７は、１μｇ／ｍｌに２，２，２−トリフルオロエタノール（ＴＦＥ）またはＤＰＢＳのいずれかで希釈されたｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドでコーティングされたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａ活性化のレベルを示すグラフである。
【図３８Ａ】図３８Ａは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１；青色）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ；赤色）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４；緑色））各々と接触されたＴＨＰ−１細胞からのＴＮＦα放出の誘導を示すグラフである。
【図３８Ｂ】図３８Ｂは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１；青色）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ；赤色）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４；緑色））各々と接触されたＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−１β放出の誘導を示すグラフである。
【図３８Ｃ】図３８Ｃは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１；青色）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ；赤色）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４；緑色））各々と接触されたＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−６放出の誘導を示すグラフである。
【図３８Ｄ】図３８Ｄは、ビオチン化ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１；青色）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ；赤色）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４；緑色））各々と接触されたＴＨＰ−１細胞からのＴＮＦα放出の誘導を示すグラフである。
【図３８Ｅ】図３８Ｅは、ビオチン化ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１；青色）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ；赤色）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４；緑色））各々と接触されたＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−１β放出の誘導を示すグラフである。
【図３８Ｆ】図３８Ｆは、ビオチン化ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１；青色）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ；赤色）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４；緑色））各々と接触されたＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−６放出の誘導を示すグラフである。
【図３９】図３９は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１；青色）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ；赤色）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４；緑色）の、図３８Ａ〜Ｃから得たＥＣ５０値を示すグラフである。
【図４０】図４０は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４）を用いて処置されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａの活性化を示すグラフである。ウェルは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣを、１、１０または１００μｇ／ｍｌコートで用いてコーティングされた。
【図４１Ａ】図４１Ａは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１；青色）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ；赤色）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４；緑色））各々と接触されたＴＨＰ−１細胞からのＴＮＦα放出の誘導を示すグラフである。
【図４１Ｂ】図４１Ｂは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１；青色）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ；赤色）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４；緑色））と接触されたＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−１β放出の誘導を示すグラフである。
【図４１Ｃ】図４１Ｃは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１；青色）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ；赤色）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４；緑色））各々と接触されたＴＨＰ−１細胞からのＩＬ−６放出の誘導を示すグラフである。
【図４２】図４２は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１；青色）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ；赤色）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４；緑色））の、図４１Ａ〜Ｃから得たＥＣ５０値を示すグラフである。
【図４３】図４３は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４）を用いて処置されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａの活性化を示すグラフである。
【図４４Ａ】図４４Ａは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４）を用いて処置されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８の活性化を示すグラフである。ウェルは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣを、ＴＦＥ中１μｇ／ｍｌコートで用いてコーティングされた。増殖細胞が使用された。
【図４４Ｂ】図４４Ｂは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４）を用いて処置されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８の活性化を示すグラフである。ウェルは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣを、ＴＦＥ中１μｇ／ｍｌコートで用いてコーティングされた。解凍され、使用細胞が使用された。
【図４５Ａ】図４５Ａは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４）を用いて処置されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８の活性化を示すグラフである。ウェルは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣを、ＴＦＥ中１μｇ／ｍｌコートで用いてコーティングされた。解凍され、使用細胞が使用された。
【図４５Ｂ】図４５Ｂは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４）を用いて処置されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａ  Ｆ１５８の活性化を示すグラフである。ウェルは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣを、ＴＦＥ中１μｇ／ｍｌコートで用いてコーティングされた。解凍され、使用細胞が使用された。
【図４５Ｃ】図４５Ｃは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４）を用いて処置されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃγＲＩＩａ  Ｈ１３１の活性化を示すグラフである。ウェルは、天然ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドＩＣを、ＴＦＥ中１μｇ／ｍｌコートで用いてコーティングされた。解凍され、使用細胞が使用された。
【図４６】図４６は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）（ＩｇＧ１）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）（ＩｇＧ４）を用いて処置されたＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８の活性化を示すグラフである。ウェルは、ｐＴａｕを、ＤＢＰＳ中１０μｇ／ｍｌコートで用いてコーティングされた。
【図４７】図４７は、精製ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ−ＡＡ（ＩＩ）（ＩｇＧ−ＡＡ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
当然のことではあるが、本技術の実質的な理解を提供するために、本方法の特定の態様、様式、実施形態、変法および特徴がさまざまな詳細レベルで以下に説明される。
本開示は、概して、リン酸化トレオニン２３１−タウタンパク質（ｐＴ２３１−タウ）と特異的に結合し、その活性を中和するコンホメーション特異的抗体を提供する。本技術の抗体は、それを必要とする対象においてシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するための方法において有用である。したがって、本方法の種々の態様は、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の調製、特性決定および製造に関する。本技術の抗体は、単独で、またはタウオパチーを処置するためのさらなる治療薬と組み合わせて有用である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体は、検出可能な標識にカップリングされている。その他の実施形態では、キットは、検出可能な標識にカップリングされた二次抗体を含む。
【００１０】
本方法の実施では、分子生物学、タンパク質生化学、細胞生物学、免疫学、微生物学および組換えＤＮＡにおける多数の従来技術が使用される。例えば、Sambrook and Russell eds. (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd edition; the series Ausubel et al. eds. (2007) Current Protocols in Molecular Biology; the series Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); MacPherson et al. (1991) PCR 1: A Practical Approach (IRL Press at Oxford University Press); MacPherson et al. (1995) PCR 2: A Practical Approach; Harlow and Lane eds. (1999) Antibodies, A Laboratory Manual; Freshney (2005) Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 5th edition; Gait ed. (1984) Oligonucleotide Synthesis; U.S.  Patent No. 4,683,195; Hames and Higgins eds. (1984) Nucleic Acid Hybridization; Anderson (1999) Nucleic Acid Hybridization; Hames and Higgins eds. (1984) Transcription and Translation; Immobilized Cells and Enzymes (IRL Press (1986)); Perbal (1984) A Practical Guide to Molecular Cloning; Miller and Calos eds. (1987) Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Makrides ed. (2003) Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells; Mayer and Walker eds. (1987) Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London); and Herzenberg et al. eds (1996) Weir’s Handbook of Experimental Immunologyを参照のこと。ポリペプチド遺伝子発現産物（すなわち、遺伝子翻訳レベル）のレベルを検出および測定する方法は、本技術分野において周知であり、抗体検出および定量化技術などのポリペプチド検出法の使用を含む。(Strachan & Read, Human Molecular Genetics, Second Edition. (John Wiley and Sons, Inc., NY, 1999)も参照のこと）
【００１１】
別に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、一般に、この技術が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、内容が明らかに別のものを指示しない限り、複数の言及を含む。例えば、「細胞」への言及は、２つ以上の細胞の組合せなどを含む。一般に、本明細書において使用される命名法、ならびに細胞培養、分子遺伝学、有機化学、分析化学、および核酸化学における実験手順および以下に記載されるハイブリダイゼーションは、周知であり、当技術分野で一般に使用されている。本明細書に引用されたすべての参考文献は、個々の刊行物、特許、または特許出願があらゆる目的で参照によりその全体が具体的かつ個別に組み込まれた場合と同じ程度に、その全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【００１２】
本明細書において、数に関連して用語「約」は、一般に、別に記載されない限りまたは文脈から明らかでない限り、数のいずれかの方向（より多いまたはより少ない）で１％、５％または１０％の範囲内に入る数を含むように解釈される（このような数が、あり得る値の０％より少ないまたは１００％を超える場合を除く）。
本明細書において、対象への薬剤または薬物の「投与」は、その意図される機能を発揮するために対象へ化合物を導入または送達する任意の経路を含む。投与は、経口で、鼻腔内に、非経口的に（静脈内に、筋肉内に、腹膜内にまたは皮下に）、直腸性に、または局所的に含む任意の適した経路によって実施され得る。投与は、自己投与および別のものによる投与を含む。
「アジュバント」とは、免疫系の刺激を引き起こす１つ以上の物質を指す。これに関連して、アジュバントは、１つ以上のワクチン抗原または抗体に対する免疫応答を増強するために使用される。アジュバントは、対象に、ワクチンの投与の前、それと組み合わせて、またはその後に投与され得る。アジュバントとして使用される化学化合物の例として、アルミニウム化合物、オイル、ブロックポリマー、免疫刺激複合体、ビタミンおよびミネラル（例えば、ビタミンＥ、ビタミンＡ、セレンおよびビタミンＢ１２）、Ｑｕｉｌ  Ａ（サポニン）、細菌および真菌細胞壁構成成分（例えば、リポ多糖、リポタンパク質および糖タンパク質）、ホルモン、サイトカインおよび同時刺激因子が挙げられる。
【００１３】
本明細書において、用語「抗体」とは、例として、制限するものではないが、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ、それらの組合せおよび任意の脊椎動物、例えば、ヒト、ヤギ、ウサギおよびマウスなどの哺乳動物において、ならびにサメ免疫グロブリンなどの非哺乳動物種において免疫応答の際に産生される同様の分子を含む免疫グロブリンまたは免疫グロブリン様分子をまとめて指す。用語「抗体」は、その他の分子との結合を実質的に排除するほど、対象の分子（または対象の高度に同様の分子の群）と特異的に結合する無傷の免疫グロブリンおよび「抗体断片」または「抗原結合断片」を含む（例えば、生物学的サンプル中のその他の分子に対する結合よりも、少なくとも１０3Ｍ-1より大きい、少なくとも１０4Ｍ-1より大きいまたは少なくとも１０5Ｍ-1より大きい、対象の分子に対する結合定数を有する抗体および抗体断片）。用語「抗体」とはまた、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）、ヘテロコンジュゲート抗体（例えば、二重特異性抗体）などの遺伝子操作された形態も含む。Pierce Catalog and Handbook, 1994-1995 (Pierce Chemical Co., Rockford, Ill.); Kuby, J., Immunology, 3rd Ed., W.H. Freeman & Co., New York, 1997Pierce Catalog and Handbook、1994-1995 (Pierce Chemical Co.、Rockford、Ill.);Kuby, J., Immunology,3rd Ed.、W.H. Freeman & Co.、New York、1997.も参照のこと。
【００１４】
より詳しくは、抗体は、少なくとも軽鎖免疫グロブリン可変領域または重鎖免疫グロブリン可変領域を含み、抗原のエピトープを特異的に認識し、結合するポリペプチドリガンドを指す。抗体は重鎖および軽鎖から構成され、その各々が重鎖可変（ＶH）領域および軽鎖可変（ＶL）領域と呼ばれる可変領域を有する。まとめて、ＶH領域およびＶL領域は、抗体によって認識される抗原に結合することに関与している。通常、免疫グロブリンは、ジスルフィド結合によって相互接続された重（Ｈ）鎖および軽（Ｌ）鎖を有する。軽鎖、ラムダ（λ）およびカッパ（κ）の２つの種類がある。抗体分子の機能活性を決定する５種の主な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥがある。各重鎖および軽鎖は、定常領域および可変領域を含有する（領域はまた、「ドメイン」としても知られる）。組合せでは、重鎖および軽鎖可変領域は、抗原と特異的に結合する。軽鎖および重鎖可変領域は、３つの超可変領域によって中断された「フレームワーク」領域を含有し、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」とも呼ばれる。フレームワーク領域およびＣＤＲの程度は、定義されている（参照により本明細書に組み込まれるKabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Department of Health and Human Services, 1991を参照のこと）。Ｋａｂａｔデータベースは、現在オンラインで維持されている。種々の軽鎖または重鎖のフレームワーク領域の配列は、種内で比較的保存されている。成分軽鎖および重鎖の組み合わされたフレームワーク領域である抗体のフレームワーク領域は、主にβシートコンホメーションを採用し、ＣＤＲは、βシート構造と接続する、いくつかの場合には、βシート構造の一部を形成するループを形成する。したがって、フレームワーク領域は、鎖間、非共有結合相互作用によって正しい配向にＣＤＲを位置させるようにするスキャフォールドを形成するよう働く。
【００１５】
ＣＤＲは、主に、抗原のエピトープとの結合に関与する。各鎖のＣＤＲは、通常、Ｎ末端から出発して逐次番号づけられたＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ばれ、また通常、個々のＣＤＲが位置している鎖によって同定される。したがって、ＶH ＣＤＲ３は、それが見られる抗体の重鎖の可変ドメインに位置し、ＶL  ＣＤＲ１は、それが見られる抗体の軽鎖の可変ドメインに由来するＣＤＲ１である。シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と結合する抗体は、特定のＶH領域およびＶL領域配列、したがって、特定のＣＤＲ配列を有する。異なる特異性（すなわち、異なる抗原のための異なる組合せ部位）を有する抗体は、異なるＣＤＲを有する。抗体毎に異なるＣＤＲであるが、ＣＤＲ内の制限された数のアミノ酸位置のみが抗原結合に直接関与する。ＣＤＲ内のこれらの位置は、特異性決定残基（ＳＤＲ）と呼ばれる。
抗体の例として、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、組換え抗体、多重特異性抗体および抗体断片が挙げられる。抗体は、例えば、コンホメーション特異的抗体（例えば、Ｘａａがアミノ酸である、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのシスまたはトランスコンホメーションと結合する抗体）であり得る。抗体は、抗原と特異的に結合する。
【００１６】
本明細書において、用語「抗体関連ポリペプチド」とは、可変領域を単独で、または以下のポリペプチド要素：抗体分子のヒンジ領域、ＣＨ1、ＣＨ2およびＣＨ3ドメインのすべてもしくは一部と組み合わせて含み得る一本鎖抗体を含む、抗原結合性抗体断片を意味する。また、可変領域ならびにヒンジ領域、ＣＨ1、ＣＨ2およびＣＨ3ドメインの任意の組合せも本技術に含まれる。本方法において有用な抗体関連分子、例えば、それだけには限らないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2、Ｆｄ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、一本鎖抗体、ジスルフィド結合されたＦｖ（ｓｄＦｖ）およびＶLまたはＶHドメインのいずれかを含む断片。例として、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶL、ＶH、ＣLおよびＣＨ1ドメインからなる一価の断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）2断片、ヒンジ領域でジスルフィド橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片、（ｉｉｉ）ＶHおよびＣＨ1ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶLおよびＶHドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶHドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., Nature 341: 544-546, 1989)および（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。そのようなものとして、「抗体断片」は、全長抗体の一部、一般に、その抗原結合性または可変領域を含み得る。「抗体断片」の例として、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2およびＦｖ断片、ダイアボディー、線形抗体、一本鎖抗体分子および抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００１７】
本明細書において、用語「ダイアボディー」とは、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片を指し、断片は、同一ポリペプチド鎖中に軽鎖可変ドメイン（ＶL）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶH）含む（ＶHＶL）。同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには短すぎるリンカーを使用することによって、ドメインは、別の鎖の相補性ドメインと対形成させられ、２つの抗原結合部位が生成する。ダイアボディーは、例えば、ＥＰ４０４，０９７、ＷＯ９３／１１１６１および30 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA、90: 6444-6448 (1993)により十分に記載されている。
【００１８】
本明細書において、用語「一本鎖抗体」または「一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）」とは、Ｆｖ断片、ＶLおよびＶHの２つのドメインの抗体融合分子を指す。一本鎖抗体分子は、いくつかの個々の分子を有するポリマー、例えば、二量体、三量体またはその他のポリマーを含み得る。さらに、Ｆv断片、ＶLおよびＶHの２つのドメインは、別個の遺伝子によってコードされるが、それらは、ＶLおよびＶH領域が対形成して一価分子（一本鎖Ｆv（ｓｃＦv）として知られる）を形成する単一タンパク質鎖として作製されることを可能にする合成リンカーによって、組換え方法を使用してつなげられ得る。Bird et al. (1988) Science 242:423-426およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad Sci. USA 85:5879-5883。このような一本鎖抗体は、組換え技術または無傷の抗体の酵素的もしくは化学的切断によって調製され得る。
上記の抗体断片のいずれも、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、無傷の抗体と同一方法で結合特異性および中和活性についてスクリーニングされる。
本明細書において、「抗原」とは、抗体が選択的に結合し得る分子を指す。標的抗原は、タンパク質（例えば、抗原性ペプチド）、炭水化物、核酸、脂質、ハプテンまたはその他の天然に存在するもしくは合成化合物であり得る。標的抗原は、ポリペプチド（例えば、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフ（例えば、リン酸化または非リン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフ）を含有するポリペプチド）またはペプチド模倣物（例えば、Ｘａａ−ホモプロリンモチーフ（例えば、リン酸化または非リン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒホモプロリンモチーフ）を含有するポリペプチド）であり得る。抗原は、動物において免疫応答を生成するために動物に投与され得る。
【００１９】
「結合親和性」は、分子（例えば、抗体）およびその結合パートナー（例えば、抗原または抗原性ペプチド）の単一結合部位間の総合非共有結合相互作用の強度を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は、一般に、解離定数（Ｋd）によって表され得る。親和性は、本明細書において記載されるものを含む当技術分野で公知の標準方法によって測定され得る。低親和性複合体は、一般に抗原から容易に解離する傾向がある抗体を含有するのに対し、高親和性複合体は、一般に抗原と長期間結合したままである傾向がある抗体を含有する。
【００２０】
本明細書において、用語「生物学的サンプル」とは、生存細胞に由来するサンプル材料を意味する。生物学的サンプルは、対象から単離された、組織、細胞、細胞のタンパク質または膜抽出物および生物学的流体（例えば、腹水または脳脊髄液（ＣＳＦ））ならびに対象内に存在する組織、細胞および流体を含み得る。本技術の生物学的サンプルとして、それだけには限らないが、乳房組織、腎組織、子宮頸部、子宮内膜、頭部または頸部、胆嚢、耳下腺組織、前立腺、脳、下垂体腺、腎臓組織、筋肉、食道、胃、小腸、結腸、肝臓、脾臓、膵臓、甲状腺組織、心組織、肺組織、膀胱、脂肪組織、リンパ節組織、子宮、卵巣組織、副腎組織、精巣組織、扁桃腺、胸腺、血液、毛髪、頬側、皮膚、血清、血漿、ＣＳＦ、精液、前立腺液、精液、尿、糞便、汗、唾液、痰、粘液、骨髄、リンパおよび涙から採取されたサンプルが挙げられる。生物学的サンプルはまた、内臓の、または癌からの生検から得ることができる。生物学的サンプルは、診断もしくは研究のために対象から得ることができ、または対照として、もしくは基礎研究のために非罹患個体から得ることができる。サンプルは、例えば、静脈穿刺および外科的生検を含む標準方法によって得ることができる。特定の実施形態では、生物学的サンプルは、ニードル生検によって得られた乳房、肺、結腸または前立腺組織サンプルである。
本明細書において、用語「ＣＤＲグラフト抗体」とは、「アクセプター」抗体の少なくとも１つのＣＤＲが、望ましい抗原特異性を有する「ドナー」抗体に由来するＣＤＲ「グラフト」によって置き換えられている抗体を意味する。
【００２１】
本明細書において、用語「キメラ抗体」とは、ある種に由来するモノクローナル抗体のＦｃ定常領域（例えば、マウスＦｃ定常領域）が、組換えＤＮＡ技術を使用して、別の種の抗体に由来する  Ｆｃ定常領域（例えば、ヒトＦｃ定常領域）と置き換えられている抗体を意味する。全般的に、Robinson et al.、PCT/US86/02269; Akira et al.、欧州特許出願第１８４，１８７号； Taniguchi、欧州特許出願第１７１，４９６号； Morrison et al.、欧州特許出願第１７３，４９４号； Neuberger et al.、ＷＯ８６／０１５３３； Cabilly et al.米国特許第４，８１６，５６７号；Cabilly et al.、欧州特許出願第１２５，０２３号; Better et al., Science 240: 1041-1043, 1988; Liu et al.、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443, 1987; Liu et al., J. Immunol 139: 3521-3526, 1987; Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218, 1987; Nishimura et al., Cancer Res 47: 999-1005, 1987; Wood et al.、Nature 314: 446-449, 1885;およびShaw et al., J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559, 1988を参照のこと。
「コンホメーション特異的抗体」は、その相補性抗原の特定のコンホメーション（例えば、コンホメーション異性体または立体配座異性体）を認識し、特異的に結合する抗体またはその断片である。例えば、本明細書において記載されるように、コンホメーション特異的抗体は、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのシスコンホメーション（例えば、シスｐＴ２３１−タウ）と特異的に結合し得るが、ＸａａがセリンまたはトレオニンであるＸａａ−Ｐｒｏモチーフのトランスコンホメーション（例えば、トランスｐＴ２３１−タウ）とは特異的に結合しない。特定の実施形態では、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフは、リン酸化され得る（すなわち、ｐＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ）。この場合には、コンホメーション特異的抗体は、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのトランスコンホメーションに対してよりも、シスコンホメーションに対して例えば、少なくとも１０〜１００倍大きい親和性を有する。
【００２２】
本明細書において、用語「コンセンサスＦＲ」とは、コンセンサス免疫グロブリン配列中のフレームワーク（ＦＲ）抗体領域を意味する。抗体のＦＲ領域は、抗原と接触しない。
本明細書において、組成物の用語「有効量」または「治療上有効な量」とは、所望の治療効果を達成するのに十分な量、例えば、処置されている疾病、例えば、標的ポリペプチドと関連する疾患または医学的状態（例えば、タウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、卒中）と関連している症状の減少をもたらす量である。対象に投与される本技術の組成物の量は、疾患の種類および重症度ならびに個体の特徴、例えば、全身の健康状態、年齢、性別、体重および薬物に対する耐性に応じて変わる。疾患の程度、重症度および種類に応じて変わる。当業者ならば、これらおよびその他の因子に応じて適当な投与量を決定できる。本技術の組成物はまた、１つ以上のさらなる治療用化合物と組み合わせて投与され得る。いくつかの実施形態では、有効量とは、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の活性の中和において部分的または十分に有効である本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の量を指す。
【００２３】
本明細書において、用語「エフェクター細胞」とは、免疫応答の認知および活性化相とは対照的に、免疫応答のエフェクター相に関与する免疫細胞を意味する。例示的免疫細胞として、骨髄またはリンパ系起源の細胞、例えば、リンパ球（例えば、細胞溶解性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を含むＢ細胞およびＴ細胞）、キラー細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、単球、好酸球、好中球、多形核細胞、顆粒球、肥満細胞および好塩基球が挙げられる。エフェクター細胞は、特定のＦｃ受容体を発現し、特定の免疫機能を保持する。エフェクター細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を誘導し得る、例えば、ＡＤＣＣを誘導可能な好中球。例えば、ＦｃαＲを発現する単球、マクロファージ、好中球、好酸球およびリンパ球は、標的細胞の特異的死滅、免疫系のその他の構成成分に対する抗原を提示することまたは抗原を提示する細胞と結合することに関与している。
【００２４】
本明細書において、用語「エピトープ」とは、抗体との特異的結合を可能にするタンパク質決定基を意味する。エピトープは、普通、アミノ酸または糖側鎖などの分子の化学的に活性な表面基からなり、普通、特異的三次元構造特徴ならびに特異的電荷特徴を有する。コンホメーションおよび非コンホメーションエピトープは、変性溶媒の存在下で前者との結合は失われるが、後者との結合は失われない点で区別される。いくつかの実施形態では、シス−コンホメーションｐＴ２３１−タウタンパク質の「エピトープ」は、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体が特異的に結合するタンパク質の領域である。
エピトープと結合する抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載されるものなどの通常のクロスブロッキングアッセイを実施してもよい。このアッセイを使用して、抗タウ抗体が本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体と同一の部位またはエピトープと結合するか否かを決定できる。あるいは、またはさらに、当技術分野で公知の方法によってエピトープマッピングを実施してもよい。例えば、接触残基を同定するために、抗体配列をアラニンスキャニングなどによって突然変異させてもよい。異なる方法では、試験抗体を用いる、または試験抗体および特性決定されたもしくは公知のエピトープを有する抗体を用いる競合アッセイにおいてｐＴ２３１−タウタンパク質の異なる領域に対応するペプチドを使用してもよい。
本明細書において、「発現」は、適切な発現および機能のために必要な場合には以下のうち１つ以上を含む：遺伝子の前駆体ｍＲＮＡへの転写、成熟ｍＲＮＡを生成するための前駆体ｍＲＮＡのスプライシングおよびその他のプロセシング、ｍＲＮＡ安定性；成熟ｍＲＮＡのタンパク質への翻訳（コドン使用およびｔＲＮＡ利用能を含む）ならびに翻訳産物のグリコシル化および／またはその他の修飾。
【００２５】
本明細書において、「発現の上昇」は、対照または参照サンプルと比較した遺伝子発現またはタンパク質発現の増大（例えば、対照または正常参照サンプルと比較した、少なくとも２倍、約２倍〜約１５０倍、５倍〜１５０倍、５倍〜１００倍、１０倍〜１５０倍、１０倍〜１００倍、５０倍〜１５０倍、５０倍〜１００倍、７５倍〜１５０倍または７５倍〜１００倍の増大）を指す。「発現の減少」とは、対照または参照サンプルと比較した遺伝子発現またはタンパク質発現の全体的な低減（例えば、２０％もしくはそれより多い、５０％もしくはそれより多い、または７５％、８０％、８５％、９０％、９５％またはそれより多い）を指す。遺伝子発現またはタンパク質発現の増大または減少は、当技術分野で公知のまたは本明細書において記載される任意の有用な方法（例えば、ＥＬＩＳＡ）を使用して決定できる。治療的適用のために、「減少する」ことは、障害（例えば、タウオパチー、ＴＢＩまたは卒中）と関連するポリペプチドまたはタンパク質のレベルの低減を指し得る。診断的またはモニタリング適用のために、「減少させる」こととは、診断的またはモニタリングアッセイによって検出されるタンパク質または核酸のレベルの減少を指す。
【００２６】
本明細書において、用語「遺伝子」とは、プロモーター、エキソン、イントロンおよび発現を制御するその他の非翻訳領域を含む、ＲＮＡ産物の調節された生合成についてのすべての情報を含有するＤＮＡのセグメントを意味する。
本明細書において、用語、非ヒト（例えば、マウス）抗体の「ヒト化」形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域残基が、所望の特異性、親和性および能力を有するマウス、ラット、ウサギまたは非ヒト霊長類などの非ヒト種（ドナー抗体）由来の超可変領域残基によって置き換えられているヒト免疫グロブリンである。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体では、またはドナー抗体では見られない残基を含み得る。これらの修飾は、結合親和性などの抗体性能をさらに改善するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つの、通常、２つの可変ドメイン（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2またはＦｖ）の実質的にすべてを含み、超可変ループのすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサスＦＲ配列のものであるが、ＦＲ領域は、結合親和性を改善する１つ以上のアミノ酸置換を含み得る。ＦＲ中のこれらのアミノ酸置換の数は、通常、Ｈ鎖において６以下であり、Ｌ鎖において３以下である。ヒト化抗体はまた、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、通常、ヒト免疫グロブリンのものを含んでもよい。さらなる詳細については、Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988);およびPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。
【００２７】
本明細書において、用語「超可変領域」とは、抗原結合に関与している抗体のアミノ酸残基を指す。超可変領域は、一般に、「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」由来のアミノ酸残基（例えば、ＶL中のおよそ残基２４〜３４（Ｌ１）、５０〜５６（Ｌ２）および８９〜９７（Ｌ３）ならびにＶH中のおよそ３１〜３５Ｂ（Ｈ１）、５０〜６５（Ｈ２）および９５〜１０２（Ｈ３）（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)）ならびに／または「超可変ループ」由来のそれらの残基（例えば、ＶL中の残基２６〜３２（Ｌ１）、５０〜５２（Ｌ２）および９１〜９６（Ｌ３）ならびにＶH中の２６〜３２（Ｈ１）、５２Ａ〜５５（Ｈ２）および９６〜１０１（Ｈ３）（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）を含む。
【００２８】
本明細書において、用語「同一」または「同一性」パーセントは、以下に記載されるデフォルトパラメータを用いてＢＬＡＳＴもしくはＢＬＡＳＴ２．０配列比較アルゴリズムを使用して、または手作業によるアラインメントおよび目視検査、例えば、ＮＣＢＩウェブサイトによって測定されるような）、２個以上の核酸またはポリペプチド配列に関連して使用される場合、（比較ウィンドウまたは指定された領域にわたって最大対応を求めて比較され、アラインされた場合に、指定の領域（例えば、本明細書において記載される抗体をコードするヌクレオチド配列または本明細書において記載される抗体のアミノ酸配列）にわたって、同一であるか、または同一であるアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの指定のパーセンテージ（すなわち、約６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはより高い同一性）を有する、２つ以上の配列または部分配列を指す。このような配列は、次いで、「実質的に同一」であるといわれる。この用語はまた、試験配列の相補体を指す、またはそれに当てはまり得る。用語はまた、欠失および／または付加を有する配列ならびに置換を有するものを含む。いくつかの実施形態では、同一性は、少なくとも約２５個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長または５０〜１００個のアミノ酸もしくはヌクレオチド長を有する領域にわたって存在する。
【００２９】
本明細書において、用語「免疫学的に交差反応性」とは、異なる抗原を使用して生じた抗体と反応する抗原を意味する。
本明細書において、用語「無傷の抗体」とは、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖ポリペプチドおよび２つの軽（Ｌ）鎖ポリペプチドを有する抗体を意味する。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＨＣＶＲまたはＶHと略される）および重鎖定常領域から構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ1、ＣＨ2およびＣＨ3から構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＬＣＶＲまたはＶLと略される）および軽鎖定常領域から構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣLから構成される。ＶHおよびＶL領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれ、より保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が散剤する超可変性の領域にさらに細分できる。各ＶHおよびＶLは、以下の順序：ＦＲ1、ＣＤＲ1、ＦＲ2、ＣＤＲ2、ＦＲ3、ＣＤＲ3、ＦＲ4でアミノ末端からカルボキシル末端に配列された３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重鎖および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的な相補系の第１の構成成分（Ｃｌｑ）を含む、免疫グロブリンの宿主組織または因子との結合を媒介し得る。
【００３０】
抗原性ペプチドに関して、用語「模倣物」とは、抗原性ペプチドＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳ（配列番号５６）の実質的に同一の構造的および／または機能的特徴を有する合成化学化合物を指す。模倣物は、完全にアミノ酸の合成非天然類似体から構成され得るか、または天然アミノ酸およびアミノ酸の非天然類似体のキメラ分子であり得る。模倣物はまた、任意の量の保存的置換を、このような置換が、模倣物の構造または活性を実質的にしない限り組み込んでもよい。
本明細書において用語「モノクローナル抗体」とは、実質的に均一な抗体の集団から得られた抗体を指し、すなわち、集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得るあり得る天然に存在する突然変異を除いて同一である。例えば、モノクローナル抗体は、任意の真核細胞の、原核生物の、またはファージクローンを含む単一クローンに由来する抗体であり得るのであって、それが製造される方法に由来しない。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一結合特異性および親和性を示す。モノクローナル抗体は、高度に特異的であり、単一の抗原性部位に対するものである。さらに、通常、種々の決定基（エピトープ）に対する種々の抗体を含む従来の（ポリクローナル）抗体調製物とは対照的に、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。修飾語句「モノクローナル」は、実質的に均一な集団から得られているような抗体の特徴を示し、任意の特定の方法に織る抗体の製造を必要とすると解釈されてはならない。モノクローナル抗体は、例えば、それだけには限らないが、ハイブリドーマ、組換えおよびファージディスプレイ技術を含む当技術分野で公知のさまざまな技術を使用して調製され得る。例えば、本方法に従って使用されるべきモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)によって最初に記載されたハイブリドーマ方法によって作製され得る、または組換えＤＮＡ方法によって作製され得る（例えば、米国特許第４，８１６，５６７号）を参照のこと。「モノクローナル抗体」はまた、例えば、Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)およびMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載された技術を使用して、ファージ抗体ライブラリーから単離されてもよい。
【００３１】
本明細書において、「神経疾患」とは、軽度認知障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病（ＰＤ）、外傷性脳損傷、進行性核上性麻痺、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、前頭側頭型認知症、前頭側頭葉変性症、リティコ−ボディグ病、タングル優位型認知症、髄膜血管腫症、亜急性硬化性全脳炎、ピック病、大脳皮質基底核変性症およびアルツハイマー病などの、発達異常、障害、傷害または毒物に起因する神経系の構造または機能の撹乱を指す。
本明細書において、用語「医薬上許容される担体」は、医薬的投与と適合する、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング、抗菌薬および抗真菌薬化合物、等張性および吸収遅延化合物などを含むように意図される。医薬上許容される担体およびその製剤化は、当業者に公知であり、例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences (20th edition, ed. A. Gennaro, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, Pa.)に記載されている。
【００３２】
本明細書において、用語「ポリクローナル抗体」は、少なくとも２種（２）の異なる抗体産生細胞株に由来する抗体の調製物を意味する。この用語の使用は、抗原の異なるエピトープまたは領域と特異的に結合する抗体を含有する少なくとも２種（２）の抗体の調製物を含む。
本明細書において、用語「ポリヌクレオチド」または「核酸」とは、任意のＲＮＡまたはＤＮＡを意味し、非修飾または修飾ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。ポリヌクレオチドとして、制限するものではないが、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡ、一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡならびに一本鎖またはより通常は、二本鎖または一本鎖および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子が挙げられる。さらに、ポリヌクレオチドとは、ＲＮＡもしくはＤＮＡまたはＲＮＡおよびＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。用語ポリヌクレオチドはまた、１つ以上の修飾された塩基を含有するＤＮＡまたはＲＮＡおよび安定性のためにまたはその他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡも含む。
【００３３】
本明細書において、用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において同義的に使用されて、ペプチド結合または修飾されたペプチド結合、すなわち、ペプチドアイソスターによって互いにつながれた２個以上のアミノ酸を含むポリマーを意味する。ポリペプチドとは、一般に、ペプチド、グリコペプチドまたはオリゴマーと呼ばれる短い鎖および一般に、タンパク質と呼ばれる長い鎖の両方を指す。ポリペプチドは、２０種の遺伝子によってコードされるアミノ酸以外のアミノ酸を含有し得る。ポリペプチドは、翻訳後プロセシングなどの天然プロセスによって、または当技術分野で周知である化学的修飾技術によって修飾されたアミノ酸配列を含む。このような修飾は、基本的な教本におよびより詳細な研究所に、ならびに多量の研究文献に十分に記載されている。
【００３４】
ポリペプチドまたはペプチドは、細胞性構成成分からポリペプチドを除去するために物理的、機械的または化学的方法が使用されている場合には、「単離された」または「実質的に純粋」であるといわれることがある。「単離されたポリペプチド」（例えば、単離された抗体）、「実質的に純粋なポリペプチド」または「実質的に純粋な、単離されたポリペプチド」は、通常、天然においてそれが付随するタンパク質および天然に存在する有機分子を少なくとも６０質量％含まない場合に細胞性構成成分から取り出され、実質的に純粋である。ポリペプチドは、少なくとも７５質量％、８０質量％、８５質量％、９０質量％、９５質量％または９９質量％純粋であり得る。実質的に純粋なポリペプチド（例えば、実質的に純粋な抗体またはその断片）は、標準技術によって、例えば、ポリペプチドをコードする組換え核酸の発現によって、またはポリペプチドを化学的に合成することによって得ることができる。純度は、任意の適当な方法によって、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ解析によって測定できる。
【００３５】
本明細書において、用語「組換え体」は、例えば、細胞または核酸、タンパク質またはベクターに関連して使用される場合、細胞、核酸、タンパク質またはベクターが、異種核酸もしくはタンパク質の導入または天然核酸もしくはタンパク質の変更によって修飾されていること、または材料がそのように修飾された細胞に由来することを示す。したがって、例えば、組換え細胞は、細胞の天然（非組換え）形態内で見られない遺伝子を発現する、またはそうでなければ異常に発現される、発現不足である、または全く発現されない天然遺伝子を発現する。
本明細書において、治療的使用を用語「分離する」とは、異なる経路による同時のまたは実質的に同時の少なくとも２種の有効成分の投与を指す。
本明細書において、用語「逐次」治療的使用とは、異なる時間での少なくとも２種の有効成分の投与を指し、投与経路は、同一であるか、または異なっている。より詳しくは、逐次使用とは、有効成分のうち１種の、別のもの（単数または複数）の投与開始の前の全投与を指す。したがって、有効成分のうち１種を数分、数時間または数日かけて投与し、その後、その他の有効成分（単数または複数）を投与することが可能である。この場合には、同時処置はない。
本明細書において、用語「同時の」治療的使用とは、同時のまたは実質的に同時の同一経路による少なくとも２種の有効成分の投与を指す。
【００３６】
本明細書において、用語「対象」、「個体」および「患者」は、同義的に使用され、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、飼育動物（例えば、イヌ、ネコなど）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマなど）、野生動物（コウモリ、アライグマ、キツネ、スカンク、リス、シマリス、マウス、ウサギなど）および実験動物（サル、ラット、マウスなど）ウサギ、モルモットなど）を指す。
本明細書において、用語「治療薬」は、有効量で存在する場合に、それを必要とする対象に所望の治療効果をもたらす化合物を意味するように意図される。
本明細書において記載される抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体のアミノ酸配列修飾が考慮される。例えば、抗体の結合親和性および／またはその他の生物学的特性を改善することが、望ましい場合がある。抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体のアミノ酸配列バリアントは、抗体核酸中に適当なヌクレオチド変化を導入することによって、またはペプチド合成によって調製される。このような修飾として、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失および／またはそれへの挿入および／またはその置換が挙げられる。得られた抗体が所望の特性を有する限り、対象の抗体を得るために欠失、挿入および置換の任意の組合せが行われる。修飾はまた、タンパク質のグリコシル化のパターンの変化も含む。置換的突然変異誘発のための最大の対象の部位として、超可変領域が挙げられるが、ＦＲ変更も考慮される。「保存的置換」は以下の表に示される。
【００３７】
【表１】
2021502125.tif 000003
【００３８】
置換的バリアントのうち１種類は、親抗体の１つ以上の超可変領域残基を置換することを含む。このような置換的バリアントを作製するための好都合な方法は、ファージディスプレイを使用する親和性成熟を含む。具体的には、各部位ですべての可能性あるアミノ酸置換を作製するためにいくつかの超可変領域部位（例えば、６〜７部位）が突然変異される。このように作製された抗体バリアントは、各粒子内でパッケージングされたＭ１３の遺伝子ＩＩＩ産物への融合物として繊維状ファージ粒子から一価様式で提示される。ファージに提示されたバリアントは、次いで、本明細書において開示されるようなその生物活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングされる。修飾のための候補超可変領域部位を同定するために、アラニンスキャニング突然変異誘発を実施して抗原結合に大きく寄与する超可変領域残基を同定してもよい。ひとたびこのようなバリアントを作製すれば、バリアントのパネルを本明細書において記載されるようなスクリーニングに付し、さらなる開発のために、１つ以上の関連アッセイにおいて同様のまたは優れた特性を有する抗体を選択してもよい。
【００３９】
本明細書において、「参照サンプル」とは、比較目的で使用される任意のサンプルを指す。「正常な参照サンプル」は、障害（例えば、タウオパチー、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）または卒中）の発症の前に同一対象から採取された事前サンプル、障害について成功裏に処置されている障害を有さない対象から得たサンプルまたは既知正常濃度の精製参照ポリペプチドのサンプルであり得る。用語「参照標準」または「参照レベル」とは、参照サンプルに由来する１つ以上の遺伝子またはタンパク質の値、数また発現パターンを指す。正常参照標準またはレベルは、以下の判定基準：年齢、体重、疾患ステージおよび全体的な健康のうち少なくとも１つによって対象のサンプルに対応されている正常対象に由来する値、数または発現パターンである場合もある。一例では、例えば、障害を示すポリペプチドまたは障害を示すポリペプチドのコンホメーションの正常参照レベルは、血清サンプルにおいて５ｎｇ／ｍｌ未満、血清サンプルにおいて４ｎｇ／ｍｌ未満、３ｎｇ／ｍｌ未満、２ｎｇ／ｍｌ未満または１ｎｇ／ｍｌ未満である。「陽性参照」サンプル、標準または値は、以下の判定基準：年齢、体重、疾患ステージおよび全体的な健康のうち少なくとも１つによって対象のサンプルに対応されている、障害（例えば、タウオパチー、ＴＢＩまたは卒中）を有するとわかっている対象に由来するサンプル、標準、値または数である。例えば、障害を示すポリペプチドの例えば、陽性参照値は、５ｎｇ／ｍｌ血清より大きい、１０ｎｇ／ｍｌ血清より大きい、２０ｎｇ／ｍｌより大きい、３０ｎｇ／ｍｌより大きい、４０ｎｇ／ｍｌより大きいまたは５０ｎｇ／ｍｌ血清より大きい。
【００４０】
本明細書において、「特異的に結合する」とは、別の分子（例えば、抗原）を認識し、結合するが、その他の分子を実質的に認識しない、結合しない分子（例えば、抗体）を指す。一例では、ｐＴ２３１−タウのシスコンホメーションと特異的に結合する抗体は、ｐＴ２３１−タウのトランスコンホメーションと特異的に結合しない。特定の分子（例えば、ポリペプチド、ポリペプチド上のエピトープまたはポリペプチドのコンホメーション）に、用語「特異的に結合する」、「と特異的に結合する」または「にとって特異的である」は、本明細書において、例えば、少なくとも約１０-4Ｍ、１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍ、１０-12Ｍまたはそれより大きいものという、結合する分子のＫdを有する分子によって示すことができる。用語「特異的に結合する」はまた、分子（例えば、抗体）が、特定のポリペプチド（例えば、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフ（ここで、Ｘａａは、セリンまたはトレオニンである）を含有するポリペプチド）、特定のポリペプチド上のエピトープまたは特定のポリペプチドのコンホメーション（例えば、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのシスコンホメーション、例えば、シスｐＴ２３１−タウ）と結合し、任意のその他のポリペプチド、ポリペプチドエピトープまたはポリペプチドコンホメーション（例えば、Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフのトランスコンホメーション、例えば、トランスｐＴ２３１−タウ）と実質的に結合しない結合を指す場合もある。例えば、コンホメーション特異的抗体は、例えば、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフの１種のコンホメーション（例えば、シスコンホメーション）に対して、別のコンホメーション（例えば、トランスコンホメーション）に対してよりも、例えば、少なくとも１０〜１００倍より大きい親和性（例えば、１０1−、１０2−、１０3−、１０4−、１０5−、１０6−、１０7−、１０8−、１０9−または  １０10−倍大きい親和性）を有し得る。
【００４１】
本明細書において、「試験サンプル」とは、対象の対象から得られた生物学的サンプルを意味する。例えば、試験サンプルは、生物学的流体（例えば、血清）、細胞または組織サンプル、培養物または成長培地から得られたサンプルまたはそれらに由来する単離された核酸もしくはポリペプチドであり得る。
「処置すること」または「処置」は、本明細書において、ヒトなどの対象における本明細書において記載される疾患または障害の処置を対象とし、（ｉ）疾患もしくは障害を阻害すること、すなわち、その発生を停止すること、（ｉｉ）疾患もしくは障害を軽減すること、すなわち、障害の退縮を引き起こすこと、（ｉｉｉ）障害の進行を減速することおよび／または（ｉｖ）疾患もしくは障害の１つ以上の症状の進行を阻害、軽減もしくは減速することを含む。「タウオパチー、ＴＢＩまたは卒中を処置すること」とは、タウオパチー、ＴＢＩまたは卒中と関連する症状が、例えば、緩和される、低減される、治癒されるまたは緩解の状態に置かれることを意味する。
本明細書において記載されるような神経疾患の処置の種々の様式は、完全な処置だけでなく、完全未満の処置も含み、いくつかの生物学的にまたは医学的に関連する結果が達成される「実質的」なものを意味するものとすることも理解されたい。処置は、慢性疾患のための連続する長期の処置または急性状態の処置のための単回のもしくは２、３回の投与であり得る。
【００４２】
Ｉ．本技術の組成物
本技術は、コンホメーション特異的抗体またはその断片の作製および使用のための方法および組成物を説明する。コンホメーション特異的抗体は、例えば、特定のポリペプチドのシス−またはトランス−コンホメーションと特異的に結合し得る。いくつかの実施形態では、本技術のコンホメーション特異的抗体は、ポリペプチドのリン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフのシス−コンホメーション（例えば、シスｐＴ２３１−タウ）と結合する。コンホメーション特異的抗体のその抗原（例えば、ｐＴ２３１−タウ）との結合は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の進行の処置、診断またはモニタリングにおいて有用であり得る。
【００４３】
本技術のコンホメーション特異的抗体は、例えば、特定のコンホメーション（例えば、シス−またはトランス−コンホメーション）において、または混合シス−およびトランス−コンホメーションにおいて、固定されたリン酸化Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフ（ここで、Ｘａａは、セリンまたはトレオニンである）を含有する免疫原性抗原を使用して作製できる。
例えば、リン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏを含有する本技術の抗原性ペプチドのシスまたはトランス含量は、Ｓｔｉｌｌ−ＷｉｔｔｉｇおよびＩｒｅｌａｎｄ−Ｃｌａｉｓｅｎ再編成（参照により本明細書に組み込まれる、J. Org. Chem. 68: 2343-2349 (2003)）による、（Ｚ）−および（Ｅ）−アルケン模倣物の立体選択的合成によって固定され得る。あるいは、本技術のリン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏ含有抗原性ペプチドのシスまたはトランス含量は、プロリンアミノ酸残基を、プロリン類似体と置換することによって増大または固定され得る。プロリン類似体として、制限するものではないが、ホモプロリン、ピペコリン酸（Ｐｉｐ）、ジメチルプロリン（Ｄｍｐ）、アゼチジン−２−カルボン酸（Ａｚｅ）、ｔ−ブチル−Ｌ−プロリン（ＴＢＰ）、トランス−４−フルオロ−Ｌ−プロリン（ｔ−４Ｆ−Ｐｒｏ）およびシス−４−フルオロ−Ｌ−プロリン（ｃ−４Ｆ−Ｐｒｏ）が挙げられる。所与の抗原のシスまたはトランス含量は、例えば、核磁気共鳴（ＮＭＲ）解析によって解析され得る。
【００４４】
本技術の抗原性ペプチドは、シス／トランス異性化可能である、リン酸化または非リン酸化Ｘａａ−Ｐｒｏモチーフ（式中、Ｘａａは、セリンまたはトレオニンである）を含有し得る。いくつかの実施形態では、抗原性ペプチドは、プロリン残基がプロリン類似体に置換された、タウタンパク質のＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフのアミノ酸残基を含有し得る。抗原性ペプチドはまた、全長タウポリペプチドのＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフのアミノ酸残基を含有し得る。抗原性ペプチドは、全長タウポリペプチドのＳｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｒｏモチーフを囲むさらなる残基をさらに含み得る。例えば、抗原性ペプチドは、全長タウポリペプチドのＳｅｒ／Ｔｈｒ残基のＮ末端に３〜１０個のアミノ酸残基および全長タウポリペプチドのプロリンのＣ末端に３〜１０個のアミノ酸残基を含み得る。本技術の抗原性ペプチドは、例えば、少なくとも４、５、６、７または８個のアミノ酸残基の長さであり得る。抗原性ペプチドは、８から２０個のアミノ酸残基の長さ（例えば、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０個のアミノ酸残基の長さ）であり得るが、２０個を超えるアミノ酸残基の長さである場合もある。
【００４５】
このような抗原は、当業者に公知の種々の方法にいずれによっても製造および精製され得る。抗原性ペプチドは、例えば、固相化学合成、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳によって、または組換え技術によって製造および精製され得る。抗原性ペプチドは、担体タンパク質に化学的にカップリングされてもよく、またはペプチドは、抗原性を増大するために融合タンパク質として作製されてもよい。抗原性ペプチドは、コンホメーション特異的抗体の産生を誘導するその能力に基づいてスクリーニングされ得る。この点において、このようなスクリーニング技術は、それだけには限らないが、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫沈降またはその他のイムノアッセイを含む。
コンホメーション特異的抗体の産生において有用な例示的抗原として、リン酸化または非リン酸化Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ホモプロリン、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｐｉｐ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ｄｍｐ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−Ａｚｅ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ＴＢＰ、Ｓｅｒ／Ｔｈｒ−ｔ−４Ｆ−ＰｒｏまたはＳｅｒ／Ｔｈｒ−ｃ−４Ｆ−Ｐｒｏモチーフを含有する抗原が挙げられる。このような抗原の具体例として、例えば、ｐＴ２３１−ＰｉｐタウペプチドおよびｐＴ２３１−Ｄｍｐタウペプチド（ＫＶＡＶＶＲ−ｐＴ２３１−Ｐｒｏ−ＰＫＳＰＳ）が挙げられる。このようなペプチドは、例えば、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体（例えば、ウサギまたはマウスモノクローナル抗体）を作製するための抗原として使用され得る。
【００４６】
一態様では、本開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む単離された抗体を提供し、重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、以下のアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２）
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号３）；
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号４）；
または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
【００４７】
別の態様では、本開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む単離された抗体を提供し、重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、本明細書において記載されるシグナル配列および重鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列を含む。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、シグナル配列は、ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳ（配列番号５）またはＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳ（配列番号６）である。
【００４８】
例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、単離された抗体は、シグナル配列（下線が引かれた）を含み、以下から選択されるアミノ酸配列：
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号７）；
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号８）；
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号９）；
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１０）；
【００４９】
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１１）；
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１２）；
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１３）；
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号１４）；
または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する重鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む。
【００５０】
別の態様では、本開示は、本明細書において記載される重鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列および重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む単離された抗体を提供する。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、重鎖免疫グロブリン定常ドメインは、以下からなる群から選択されるアミノ酸配列：
ＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１５）；および
ＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１６）
を有する。
【００５１】
例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、単重鎖免疫グロブリン可変ドメインおよび重鎖免疫グロブリン定常ドメイン（太字フォント）を含む離された抗体は、以下から選択されるアミノ酸配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１７）；
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号１８）；
【００５２】
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号１９）；
【００５３】
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号２０）；
【００５４】
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２１）；
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号２２）；
【００５５】
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２３）；
【００５６】
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号２４）；
または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
【００５７】
別の態様では、本開示は、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む単離された抗体を提供し、重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、シグナル配列および重鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列および重鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、単離された抗体は、重鎖免疫グロブリン可変ドメインを含み、重鎖免疫グロブリン可変ドメインは、シグナル配列および重鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列を含み、重鎖免疫グロブリン定常ドメインは、以下から選択されるアミノ酸配列（シグナル配列は下線が引かれ、重鎖免疫グロブリン定常ドメインは太字である）：
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２５）；
【００５８】
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号２６）；
【００５９】
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２７）；
【００６０】
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号２８）；
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号２９）；
【００６１】
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号３０）；
【００６２】
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３１）；
【００６３】
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号３２）；
【００６４】
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３３）；
【００６５】
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号３４）；
【００６６】
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３５）；
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＬＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号３６）；
【００６７】
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３７）；
【００６８】
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＡＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号３８）；
【００６９】
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＡＡＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ（配列番号３９）；
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧ（配列番号４０）；
【００７０】
ＭＲＷＳＣＩＩＬＦＬＶＡＴＡＴＧＶＮＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１３２）
【００７１】
ＭＥＷＳＷＶＦＬＦＦＬＳＶＴＴＧＶＨＳＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＡＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＳＹＷＩＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＩＧＶＩＤＰＳＤＳＹＴＲＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＭＴＶＤＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＲＳＬＲＳＤＤＴＡＶＹＹＣＴＴＷＥＶＤＹＷＧＱＧＴＴＶＴＶＳＳＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧ（配列番号１３３）
または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
【００７２】
さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、本技術の単離された抗体は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含み、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、以下のアミノ酸配列：
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＬＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号４１）、
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴ（配列番号４２）、
または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
さらにまたはあるいは、別の態様では、本開示は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む単離された抗体を提供し、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、シグナル配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列を含む。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、シグナル配列は、ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＮＳ（配列番号４３）またはＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣ（配列番号４４）である。
【００７３】
例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、単離された抗体は、シグナル配列を含み、以下から選択されるアミノ酸配列（シグナル配列は下線が引かれている）：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＮＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＬＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号４５）；
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＬＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ（配列番号４６）；
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＮＳＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴ（配列番号４７）；
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴ（配列番号４８）；
または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む。
【００７４】
さらにまたはあるいは、別の態様では、本開示は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインおよび軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む単離された抗体を提供する。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、軽鎖免疫グロブリン定常ドメインは、
ＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号４９）
のアミノ酸配列を有する。
【００７５】
例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインおよび軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む単離された抗体は、以下から選択されるアミノ酸配列（軽鎖免疫グロブリン定常ドメインは太字である）：
ＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＬＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号５０）
ＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号５１）；
または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
【００７６】
さらにまたはあるいは、別の態様では、本開示は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含む単離された抗体を提供し、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、シグナル配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列および軽鎖免疫グロブリン定常ドメインを含む。例として、制限するものではないが、いくつかの実施形態では、単離された抗体は、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインを含み、軽鎖免疫グロブリン可変ドメインは、シグナル配列および軽鎖免疫グロブリン可変ドメインアミノ酸配列を含み、軽鎖免疫グロブリン定常ドメインは、以下から選択されるアミノ酸配列（シグナル配列は下線が引かれており、軽鎖免疫グロブリン定常ドメインは太字である）：
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＮＳＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＬＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号５２）；
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣＤＶＶＭＴＱＴＰＬＳＬＰＶＳＬＧＤＱＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＫＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＬＥＡＥＤＬＧＶＹＦＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号５３）；
【００７７】
ＭＫＬＰＶＲＬＬＶＬＭＦＷＩＰＡＳＮＳＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号５４）；
ＭＳＶＰＴＱＶＬＧＬＬＬＬＷＬＴＤＡＲＣＤＩＶＭＴＱＳＰＬＳＬＰＶＴＰＧＥＰＡＳＩＳＣＲＳＳＱＳＬＶＨＳＤＧＮＴＹＬＨＷＹＬＱＫＰＧＱＳＰＱＬＬＩＹＫＶＳＮＲＦＳＧＶＰＤＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＫＩＳＲＶＥＡＥＤＶＧＶＹＹＣＳＱＳＴＨＶＰＷＴＦＧＧＧＴＫＶＥＩＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ（配列番号５５）；
または１つ以上の保存的アミノ酸置換を有するそのバリアントを有する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、本技術の単離された抗体は、配列番号１−４、７〜１４、１７〜４０および１３２〜１３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの重鎖を含む。いくつかの実施形態では、本技術の単離された抗体は、配列番号４１〜４２、４５〜４８、５０〜５４および５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、本技術の単離された抗体は、配列番号１−４、７〜１４、１７〜４０および１３２〜１３３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの重鎖ならびに配列番号４１〜４２、４５〜４８、５０〜５４および５５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む少なくとも１つの軽鎖を含む。
いくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、アミノ酸配列ＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳ（配列番号５６）またはその模倣物を含むヒトシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質のエピトープと結合する抗原結合部位を形成する。
【００７９】
抗体のいくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、同一ポリペプチド鎖の構成成分である。抗体のいくつかの実施形態では、重鎖および軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、異なるポリペプチド鎖の構成成分である。特定の実施形態では、抗体は、全長抗体である。
別の態様では、本開示は、本明細書において開示される抗体の抗原結合断片を提供し、抗原結合断片は、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ）’２、Ｆａｂ’、ｓｃＦvおよびＦvからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と特異的に結合する。いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と１０-4Ｍ、１０-5Ｍ、１０-6Ｍ、１０-7Ｍ、１０-8Ｍ、１０-9Ｍ、１０-10Ｍ、１０-11Ｍまたは１０-12Ｍ未満の解離定数（ＫD）で結合する。特定の実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体、キメラ抗体またはヒト化抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト抗体フレームワーク領域を含む。
【００８０】
本技術の範囲内の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体として、例えば、それだけには限らないが、標的ポリペプチド、その相同体、誘導体または断片と特異的に結合するモノクローナル、キメラ、ヒト化およびダイアボディーが挙げられる。本明細書において開示される方法にとって有用な抗体は、任意のアイソタイプのＦｃドメイン、例えば、それだけには限らないが、ＩｇＧ（ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3およびＩｇＧ4を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡ1およびＩｇＡ2を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥまたはＩｇＭおよびＩｇＹを含み得る。定常領域配列の限定されない例として、以下が挙げられる：
【００８１】
ヒトＩｇＤ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８８０配列番号１３４
ＡＰＴＫＡＰＤＶＦＰＩＩＳＧＣＲＨＰＫＤＮＳＰＶＶＬＡＣＬＩＴＧＹＨＰＴＳＶＴＶＴＷＹＭＧＴＱＳＱＰＱＲＴＦＰＥＩＱＲＲＤＳＹＹＭＴＳＳＱＬＳＴＰＬＱＱＷＲＱＧＥＹＫＣＶＶＱＨＴＡＳＫＳＫＫＥＩＦＲＷＰＥＳＰＫＡＱＡＳＳＶＰＴＡＱＰＱＡＥＧＳＬＡＫＡＴＴＡＰＡＴＴＲＮＴＧＲＧＧＥＥＫＫＫＥＫＥＫＥＥＱＥＥＲＥＴＫＴＰＥＣＰＳＨＴＱＰＬＧＶＹＬＬＴＰＡＶＱＤＬＷＬＲＤＫＡＴＦＴＣＦＶＶＧＳＤＬＫＤＡＨＬＴＷＥＶＡＧＫＶＰＴＧＧＶＥＥＧＬＬＥＲＨＳＮＧＳＱＳＱＨＳＲＬＴＬＰＲＳＬＷＮＡＧＴＳＶＴＣＴＬＮＨＰＳＬＰＰＱＲＬＭＡＬＲＥＰＡＡＱＡＰＶＫＬＳＬＮＬＬＡＳＳＤＰＰＥＡＡＳＷＬＬＣＥＶＳＧＦＳＰＰＮＩＬＬＭＷＬＥＤＱＲＥＶＮＴＳＧＦＡＰＡＲＰＰＰＱＰＧＳＴＴＦＷＡＷＳＶＬＲＶＰＡＰＰＳＰＱＰＡＴＹＴＣＶＶＳＨＥＤＳＲＴＬＬＮＡＳＲＳＬＥＶＳＹＶＴＤＨＧＰＭＫ
ヒトＩｇＧ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５７配列番号１３５
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
ヒトＩｇＧ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８５９配列番号１３６
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＮＦＧＴＱＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＴＶＥＲＫＣＣＶＥＣＰＰＣＰＡＰＰＶＡＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＶＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００８２】
ヒトＩｇＧ３定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６０配列番号１３７
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＴＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＬＫＴＰＬＧＤＴＴＨＴＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＥＰＫＳＣＤＴＰＰＰＣＰＲＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＱＦＫＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＦＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＴＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＳＧＱＰＥＮＮＹＮＴＴＰＰＭＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＩＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＲＦＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００８３】
ヒトＩｇＭ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７１配列番号１３８
ＧＳＡＳＡＰＴＬＦＰＬＶＳＣＥＮＳＰＳＤＴＳＳＶＡＶＧＣＬＡＱＤＦＬＰＤＳＩＴＬＳＷＫＹＫＮＮＳＤＩＳＳＴＲＧＦＰＳＶＬＲＧＧＫＹＡＡＴＳＱＶＬＬＰＳＫＤＶＭＱＧＴＤＥＨＶＶＣＫＶＱＨＰＮＧＮＫＥＫＮＶＰＬＰＶＩＡＥＬＰＰＫＶＳＶＦＶＰＰＲＤＧＦＦＧＮＰＲＫＳＫＬＩＣＱＡＴＧＦＳＰＲＱＩＱＶＳＷＬＲＥＧＫＱＶＧＳＧＶＴＴＤＱＶＱＡＥＡＫＥＳＧＰＴＴＹＫＶＴＳＴＬＴＩＫＥＳＤＷＬＧＱＳＭＦＴＣＲＶＤＨＲＧＬＴＦＱＱＮＡＳＳＭＣＶＰＤＱＤＴＡＩＲＶＦＡＩＰＰＳＦＡＳＩＦＬＴＫＳＴＫＬＴＣＬＶＴＤＬＴＴＹＤＳＶＴＩＳＷＴＲＱＮＧＥＡＶＫＴＨＴＮＩＳＥＳＨＰＮＡＴＦＳＡＶＧＥＡＳＩＣＥＤＤＷＮＳＧＥＲＦＴＣＴＶＴＨＴＤＬＰＳＰＬＫＱＴＩＳＲＰＫＧＶＡＬＨＲＰＤＶＹＬＬＰＰＡＲＥＱＬＮＬＲＥＳＡＴＩＴＣＬＶＴＧＦＳＰＡＤＶＦＶＱＷＭＱＲＧＱＰＬＳＰＥＫＹＶＴＳＡＰＭＰＥＰＱＡＰＧＲＹＦＡＨＳＩＬＴＶＳＥＥＥＷＮＴＧＥＴＹＴＣＶＡＨＥＡＬＰＮＲＶＴＥＲＴＶＤＫＳＴＧＫＰＴＬＹＮＶＳＬＶＭＳＤＴＡＧＴＣＹ
【００８４】
ヒトＩｇＧ４定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８６１配列番号１３９
ＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＣＳＲＳＴＳＥＳＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＫＴＹＴＣＮＶＤＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＲＶＥＳＫＹＧＰＰＣＰＳＣＰＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
ヒトＩｇＡ１定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７６配列番号１４０
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＣＳＴＱＰＤＧＮＶＶＩＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＧＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＬＡＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＴＰＰＴＰＳＰＳＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＶＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＥＰＷＮＨＧＫＴＦＴＣＴＡＡＹＰＥＳＫＴＰＬＴＡＴＬＳＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＬＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ
【００８５】
ヒトＩｇＡ２定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８７７配列番号１４１
ＡＳＰＴＳＰＫＶＦＰＬＳＬＤＳＴＰＱＤＧＮＶＶＶＡＣＬＶＱＧＦＦＰＱＥＰＬＳＶＴＷＳＥＳＧＱＮＶＴＡＲＮＦＰＰＳＱＤＡＳＧＤＬＹＴＴＳＳＱＬＴＬＰＡＴＱＣＰＤＧＫＳＶＴＣＨＶＫＨＹＴＮＰＳＱＤＶＴＶＰＣＰＶＰＰＰＰＰＣＣＨＰＲＬＳＬＨＲＰＡＬＥＤＬＬＬＧＳＥＡＮＬＴＣＴＬＴＧＬＲＤＡＳＧＡＴＦＴＷＴＰＳＳＧＫＳＡＶＱＧＰＰＥＲＤＬＣＧＣＹＳＶＳＳＶＬＰＧＣＡＱＰＷＮＨＧＥＴＦＴＣＴＡＡＨＰＥＬＫＴＰＬＴＡＮＩＴＫＳＧＮＴＦＲＰＥＶＨＬＬＰＰＰＳＥＥＬＡＬＮＥＬＶＴＬＴＣＬＡＲＧＦＳＰＫＤＶＬＶＲＷＬＱＧＳＱＥＬＰＲＥＫＹＬＴＷＡＳＲＱＥＰＳＱＧＴＴＴＦＡＶＴＳＩＬＲＶＡＡＥＤＷＫＫＧＤＴＦＳＣＭＶＧＨＥＡＬＰＬＡＦＴＱＫＴＩＤＲＭＡＧＫＰＴＨＶＮＶＳＶＶＭＡＥＶＤＧＴＣＹ
ヒトＩｇカッパ定常領域、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０１８３４配列番号１４２
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、配列番号１３４〜１４０または１４１に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一である重鎖定常領域を含む。さらにまたはあるいは、いくつかの実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、配列番号１４２に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％または１００％同一である軽鎖定常領域を含む。
【００８６】
ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３ＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（リーダー配列を含む）の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン可変ドメイン配列が以下に提供される：
【表２】
2021502125.tif 000004
【００８７】
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）抗体の重鎖（ＨＣ）および軽鎖（ＬＣ）免疫グロブリン配列が以下に提供されている。
【表３】
2021502125.tif 000005
【００８８】
抗体のいくつかの実施形態では、ＨＣ可変ドメイン配列は、ＨｕＰＴ−１１３Ａの可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、ＨｕＰＴ−１１３Ａの可変ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群から選択されるＨＣ定常領域をさらに含む。特定の実施形態では、抗体は、位置２３４および２３５でＬｅｕからＡｌａへのアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常領域を含有する。
抗体のいくつかの実施形態では、ＨＣ可変ドメイン配列は、ＨｕＰＴ−１１３Ｂの可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、ＨｕＰＴ−１１３Ｂの可変ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群から選択されるＨＣ定常領域をさらに含む。特定の実施形態では、抗体は、位置２３４および２３５でＬｅｕからＡｌａへのアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常領域を含有する。
【００８９】
抗体のいくつかの実施形態では、ＨＣ可変ドメイン配列は、ＨｕＰＴ−１１３Ｃの可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、ＨｕＰＴ−１１３Ｃの可変ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群から選択されるＨＣ定常領域をさらに含む。特定の実施形態では、抗体は、位置２３４および２３５でＬｅｕからＡｌａへのアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常領域を含有する。
抗体のいくつかの実施形態では、ＨＣ可変ドメイン配列は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄの可変ドメイン配列を含み、ＬＣ可変ドメイン配列は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄの可変ドメイン配列を含む。特定の実施形態では、抗体は、ＩｇＧ1、ＩｇＧ2、ＩｇＧ3、ＩｇＧ4、ＩｇＡ1、ＩｇＡ2、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭからなる群から選択されるＨＣ定常領域をさらに含む。特定の実施形態では、抗体は、位置２３４および２３５でＬｅｕからＡｌａへのアミノ酸置換を含むＩｇＧ１定常領域を含有する。
【００９０】
特定の実施形態では、単離された抗体は、以下の特徴のうち１つ以上を含む：（ａ）軽鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号４５に対して少なくとも８５％同一であるおよび／または（ｂ）重鎖免疫グロブリン可変ドメイン配列は、配列番号７〜１０のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一である。別の態様では、本明細書において提供される抗体中の１つ以上のアミノ酸残基は、別のアミノ酸で置換されている。置換は、本明細書において定義されるような「保存的置換」であり得る。
本明細書において提供される抗体のいくつかの態様では、抗体は、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または持続放出を促進するための構造的修飾を含有する。いくつかの態様では、シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または持続放出を促進するために、抗体のＣＨ２定常抗体重鎖領域中に欠失を含有する。いくつかの態様では、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または持続放出を促進するために、Ｆａｂ断片が使用される。いくつかの態様では、迅速な結合および細胞取り込みおよび／または持続放出を促進するために、Ｆ（ａｂ）’2断片が使用される。
いくつかの実施形態では、本技術は、本技術のシス−ｐＴ２３１−タウ中和抗体をコードする核酸配列またはその断片を提供する。いくつかの実施形態では、本技術は、本技術のシス−ｐＴ２３１−タウ中和抗体をコードする核酸配列を発現する宿主細胞を提供する。
【００９１】
本技術の抗体は、単一特異性、二重特異性、三重特異性またはそれより多い多重特異性であり得る。多重特異性抗体は、本技術のシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の異なるエピトープに特異的であり得る、またはシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質ならびに異種組成物、例えば、異種ポリペプチドまたは固相支持体材料の両方に特異的であり得る。例えば、ＷＯ９３／１７７１５、ＷＯ９２／０８８０２、ＷＯ９１／００３６０、ＷＯ９２／０５７９３、Tutt et al., J. Immunol. 147: 60-69 (1991)、米国特許第５，５７３，９２０号、同４，４７４，８９３号、同５，６０１，８１９号、同４，７１４，６８１号、同４，９２５，６４８号、同６，１０６，８３５号、Kostelny et al., J. Immunol. 148: 1547-1553 (1992)を参照のこと。いくつかの実施形態では、抗体は、キメラである。特定の実施形態では、抗体は、ヒト化である。
本技術の抗体は、さらに、Ｎ末端またはＣ末端で異種ポリペプチドに組換えによって融合されてもよく、またはポリペプチドもしくはその他の組成物に化学的にコンジュゲートされてもよい（共有結合によるおよび非共有結合によるコンジュゲーションを含む）。例えば、本技術の抗体は、検出アッセイにおいて標識として有用である分子およびエフェクター分子、例えば、異種ポリペプチド、薬物または毒素に組換えによって融合されても、コンジュゲートされてもよい。例えば、ＷＯ９２／０８４９５、ＷＯ９１／１４４３８、ＷＯ８９／１２６２４、米国特許第５，３１４，９９５号およびＥＰ０３９６３８７を参照のこと。
【００９２】
Ａ．本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を調製する方法
一般的な概要。最初に、本技術の抗体が作製され得る標的ポリペプチドが選択される。例えば、抗体は、全長タウタンパク質に対して、または位置２３１のリン酸化トレオニン（ｐＴ２３１）を含有するタウタンパク質の一部に対して作製され得る。このような標的ポリペプチドに対する抗体を作製するための技術は、当業者に周知である。このような技術の例として、例えば、それだけには限らないが、ディスプレイライブラリー、異種またはヒトマウス、ハイブリドーマなどを含むものが挙げられる。本技術の範囲内の標的ポリペプチドは、ｐＴ２３１を含有するタウタンパク質に由来する任意のポリペプチドを含み、免疫応答を誘発可能である。シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質に特異的な抗体の調製は、実施例２〜８に例示されている。
シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質およびその断片に向けられた、組換えによって遺伝子操作された抗体および抗体断片、例えば、抗体関連ポリペプチドは、本開示に従って使用するのに適しているということは理解されなくてはならない。
【００９３】
本明細書において示される技術に付され得る抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体として、モノクローナルおよびポリクローナル抗体および抗体断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆｄ、ｓｃＦｖ、ダイアボディー、抗体軽鎖、抗体重鎖および／または抗体断片が挙げられる。抗体Ｆｖ含有ポリペプチド、例えば、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）2抗体断片の高収率製造にとって有用な方法は、記載されている。米国特許第５，６４８，２３７を参照のこと。
一般に、抗体は、元来の種から得られる。より詳しくは、標的ポリペプチド抗原に対して特異性を有する元来の種の抗体の軽鎖、重鎖または両方の可変部分の核酸またはアミノ酸配列が得られる。元来の種は、本技術の抗体または抗体のライブラリーを作製するのに有用であった任意の種、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ニワトリ、サル、ヒトなどである。
ファージまたはファージミドディスプレイ技術は、本技術の抗体を導くための有用な技術である。モノクローナル抗体を作製し、クローニングするための技術は、当業者に周知である。本技術の抗体をコードする配列の発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で実施され得る。
【００９４】
配列をコードする核酸の縮重のために、本技術の実施において、天然に存在するタンパク質のものと実質的に同一のアミノ酸配列をコードするその他の配列が使用されてもよい。これらとして、それだけには限らないが、配列内で機能的に同等のアミノ酸残基をコードする異なるコドンの置換によって変更され、したがって、サイレント変化をもたらす、上記のポリペプチドをコードする核酸配列のすべてまたは一部を含む核酸配列が挙げられる。本技術の免疫グロブリンのヌクレオチド配列は、このようなバリアントがシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質を認識する作動抗体を形成する限り、標準方法（“Current Methods in Sequence Comparison and Analysis,” Macromolecule Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pp. 127-149, 1998, Alan R. Liss, Inc.）によって算出されるような最大２５％の配列相同性変動を許容することは理解される。例えば、ポリペプチド配列内の１つ以上のアミノ酸残基が、機能的等価物として働く同様の極性の別のアミノ酸によって置換されてもよく、その結果、サイレント変化が得られる。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属するクラスのその他のメンバーから選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸として、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファンおよびメチオニンが挙げられる。極性天然アミノ酸として、グリシン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギンおよびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸として、アルギニン、リシンおよびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。例えば、グリコシル化、タンパク質分解による切断、抗体分子またはその他の細胞性リガンドとの連結などによって、翻訳の間または翻訳後に異なって修飾されるタンパク質またはその断片または誘導体も本技術の範囲内に含まれる。さらに、免疫グロブリンをコードする核酸配列は、翻訳、開始および／または終止配列を作出および／または破壊して、コーディング領域の変動を作出する、および／または新規制限エンドヌクレアーゼ部位を形成する、または既存のものを破壊するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ修飾をさらに促進するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで突然変異され得る。それだけには限らないが、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ部位特異的突然変異誘発、J. Biol. Chem. 253:6551、use of Tab linkers (Pharmacia)などを含む、当技術分野で公知の突然変異誘発のための任意の技術が使用されてもよい。
【００９５】
ポリクローナル抗血清および免疫原の調製。本技術の抗体または抗体断片を作製する方法は、対象（全般的に、マウスまたはウサギなどの非ヒト対象）を、精製シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質もしくはその断片を用いて、またはシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質もしくはその断片を発現する細胞を用いて免疫処置することを含む。適当な免疫原性調製物は、組換え発現されたシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質または化学合成されたシス−ｐＴ２３１−タウペプチドを含有し得る。ｐＴ２３１−タウタンパク質のシス−コンホメーションまたはその一部または断片は、ポリクローナルおよびモノクローナル抗体調製のための標準技術を使用してシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質またはその一部または断片と結合する抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を作製するための免疫原として使用され得る。
【００９６】
全長ｐＴ２３１−タウタンパク質またはその断片は、免疫原としての断片として有用である。いくつかの実施形態では、ｐＴ２３１−タウ断片は、アミノ酸配列ＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳ（配列番号５６）またはその模倣物の少なくとも８個のアミノ酸残基を含み、ｐＴ２３１−タウタンパク質のエピトープを包含し、その結果、ペプチドに対して作製された抗体は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と特異的免疫複合体を形成する。
いくつかの実施形態では、ｐＴ２３１を含有する抗原性タウペプチドは、少なくとも５、８、１０、１５、２０または３０個のアミノ酸残基を含む。より長い抗原性ペプチドは、使用に応じて、当業者に周知の方法に従って、時には、より短い抗原性ペプチドを上回って望ましいものである。所与のエピトープの多量体は、時には、モノマーよりも有効である。
【００９７】
必要に応じて、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質（またはその断片）の免疫原性は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはオボアルブミン  （ＯＶＡ）などのハプテンとの融合またはコンジュゲーションによって増大され得る。多数のこのようなハプテンは、当技術分野で公知である。ポリペプチドに対する対象の免疫反応を増大するために、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質を、従来のアジュバント、例えば、フロイントの完全または不完全アジュバントと組み合わせてもよい。免疫学的反応を増大するために使用される種々のアジュバントとして、それだけには限らないが、フロイントのもの（完全および不完全）、無機ゲル（例えば、水酸化アルミニウム）、表面活性物質（例えば、リゾレシチン、プルロニックポリオール、ポリアニオン、ペプチドまたはオイルエマルジョン、ジニトロフェノールなど）、ヒトアジュバント、例えば、カルメット・ゲラン桿菌およびコリネバクテリウム・パルバム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍ）または同様の免疫賦活性化合物が挙げられる。これらの技術は、当技術分野で標準である。
【００９８】
本技術の説明において、免疫応答は、「一次」または「二次」免疫応答として記載され得る。一次免疫応答は、「防御的」免疫応答とも記載され、特定の抗原、例えば、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質に対するいくつかの最初の曝露（例えば、最初の「免疫処置」）の結果として個体において生じた免疫応答を指す。いくつかの実施形態では、免疫処置は、抗原を含有するワクチンを用いる個体のワクチン接種の結果として生じ得る。例えば、ワクチンは、１つ以上のシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質由来抗原を含むシス−ｐＴ２３１−タウ  ワクチンであり得る。一次免疫応答は、継時的に減弱または弱毒化になり得る、さらに消失し得る、または少なくとも検出され得ないように弱毒化になり得る。したがって、本技術はまた、本明細書において「記憶免疫応答」とも記載される「二次」免疫応答に関する。用語二次免疫応答は、一次免疫応答がすでに生成された後に個体において誘発される免疫応答を指す。
したがって、減弱または弱毒化になった既存の免疫応答を増強するために、または消失してしまった、またはもはや検出され得ないこれまでの免疫応答を再構築するために、二次免疫応答が誘発され得る。二次または記憶免疫応答は、体液性（抗体）応答または細胞性応答のいずれかであり得る。二次または記憶体液性応答は、抗原の最初の提示で生じた記憶Ｂ細胞の刺激の際に生じる。遅延型過敏症（ＤＴＨ）応答は、ＣＤ４+Ｔ細胞によって媒介される細胞性二次または記憶免疫応答の種類である。抗原に対する最初の曝露は、免疫系を抗原刺激し、さらなる曝露は、ＤＴＨをもたらす。
【００９９】
適当な免疫処置後、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、対象の血清から調製され得る。必要に応じて、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質に向けられた抗体分子は、ＩｇＧ画分を得るために周知の技術、例えば、ポリペプチドＡクロマトグラフィーによって、哺乳動物から（例えば、血液から）単離され、さらに精製され得る。
モノクローナル抗体。本技術の一実施形態では、抗体は、抗シス−ｐＴ２３１−タウモノクローナル抗体である。例えば、いくつかの実施形態では、抗シス−ｐＴ２３１−タウモノクローナル抗体は、ヒトまたはマウス抗シス−ｐＴ２３１−タウモノクローナル抗体であり得る。ｐＴ２３１−タウタンパク質のシス−コンホメーションまたはその誘導体、断片、類似体または相同体に対するモノクローナル抗体の調製のために、連続細胞株培養による抗体分子の製造を提供する任意の技術が利用され得る。このような技術として、それだけには限らないが、ハイブリドーマ技術（例えば、Kohler & Milstein, 1975.  Nature 256: 495-497を参照のこと）、トリオーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（例えば、Kozbor, et al., 1983. Immunol. Today 4: 72を参照のこと）およびヒトモノクローナル抗体を作製するためのＥＢＶハイブリドーマ技術（例えば、Cole, et al., 1985.  In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96）が挙げられる。本技術の実施では、ヒトモノクローナル抗体が利用されてもよく、ヒトハイブリドーマを使用することによって（例えば、Cote, et al., 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 2026-2030を参照のこと）またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでＥｐｓｔｅｉｎ  Ｂａｒｒウイルスを用いてヒトＢ細胞を形質転換することによって（例えば、Cole, et al., 1985.  In: MONOCLONAL ANTIBODIES AND CANCER THERAPY, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96を参照のこと）製造されてもよい。例えば、抗体の領域をコードする核酸の集団が単離され得る。集団に由来する抗体の一部をコードする配列を増幅するために、抗体の保存された領域をコードする配列に由来するプライマーを利用するＰＣＲが使用され、次いで、抗体またはその断片、例えば、可変ドメインをコードするＤＮＡが、増幅された配列から再構築される。このような増幅された配列はまた、ファージまたは細菌での融合ポリペプチドの発現およびディスプレイのために、その他のタンパク質、例えば、バクテリオファージコートまたは細菌細胞表面タンパク質をコードするＤＮＡと融合され得る。次いで、増幅された配列は発現され、例えば、ｐＴ２３１−タウタンパク質のシス−コンホメーション上に存在する抗原またはエピトープに対する発現された抗体またはその断片の親和性に基づいて、さらに選択され得るまたは単離され得る。あるいは、抗シス−ｐＴ２３１−タウモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマは、対象を免疫処置し、次いで、日常的な方法を使用して対象の脾臓からハイブリドーマを単離することによって調製され得る。例えば、Milstein et al., (Galfre and Milstein, Methods Enzymol (1981) 73: 3-46)を参照のこと。標準方法を使用してハイブリドーマをスクリーニングすることは、変動する特異性（すなわち、種々のエピトープに対する）および親和性のモノクローナル抗体をもたらす。所望の特性、例えば、シス−ｐＴ２３１−タウ結合を有する選択されたモノクローナル抗体は、ハイブリドーマによって発現されたように使用されてもよく、その特性を変更するためにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの分子に結合されてもよく、またはそれをコードするｃＤＮＡは、種々の方法で単離されてもよく、シーケンシングされてもよく、操作されてもよい。シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の免疫原性特性を増強するために、合成デンドロマーツリーが反応性アミノ酸側鎖、例えば、リシンに付加されてもよい。また、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の免疫原性特性を増強するために、ＣＰＧ−ジヌクレオチド技術が使用され得る。その他の操作として、貯蔵の際または対象への投与後の抗体の不安定性に寄与する特定のアミノアシル残基を置換または欠失することおよびシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の抗体の親和性を改善するための親和性成熟技術が挙げられる。
【０１００】
ハイブリドーマ技術。いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、不死化細胞に融合された、ヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えば、トランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって生成される抗シス−ｐＴ２３１−タウモノクローナル抗体である。ハイブリドーマ技術は、当技術分野で公知の、Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, 349 (1988); Hammerling et al., Monoclonal Antibodies And T-Cell Hybridomas, 563-681 (1981)において教示されたものを含む。ハイブリドーマおよびモノクローナル抗体を製造するためのその他の方法は、当業者には周知である。
【０１０１】
ファージディスプレイ技術。上記で記載したように、本技術の抗体は、組換えＤＮＡおよびファージディスプレイ技術の適用によって製造され得る。例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、当技術分野で公知の種々のファージディスプレイ方法を使用して調製され得る。ファージディスプレイ方法では、機能的抗体ドメインは、それらをコードするポリヌクレオチド配列を保持するファージ粒子の表面にディスプレイされる。所望の結合特性を有するファージは、抗原、通常、固体表面またはビーズに結合または捕捉された抗原を用いて直接的に選択することによって、レパートリーまたはコンビナトリアル抗体ライブラリー（例えば、ヒトまたはマウス）から選択される。これらの方法において使用されるファージは、通常、ファージ遺伝子ＩＩＩまたは遺伝子ＶＩＩＩタンパク質のいずれかに組換えによって融合されたＦａｂ、Ｆｖまたはジスルフィド安定化Ｆｖ抗体ドメインを有するｆｄおよびＭ１３を含む繊維状ファージである。さらに、シス−ｐＴ２３１−タウポリペプチド、例えば、ポリペプチドまたはその誘導体、断片、類似体または相同体に対して所望の特異性を有するモノクローナルＦａｂ断片の迅速な有効な同定を可能にするために、方法が、Ｆａｂ発現ライブラリーの構築のために適用され得る（例えば、Huse, et al., Science 246: 1275-1281, 1989を参照のこと）。本技術の抗体を作製するために使用され得るファージディスプレイ方法のその他の例として、Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 85: 5879-5883, 1988; Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A., 87: 1066-1070, 1990; Brinkman et al., J. Immunol. Methods 182: 41-50, 1995; Ames et al., J. Immunol. Methods 184: 177-186, 1995; Kettleborough et al., Eur. J. Immunol. 24: 952-958, 1994; Persic et al., Gene 187: 9-18, 1997; Burton et al., Advances in Immunology 57: 191-280, 1994、ＰＣＴ／ＧＢ９１／０１１３４、ＷＯ９０／０２８０９、ＷＯ９１／１０７３７、ＷＯ９２／０１０４７、ＷＯ９２／１８６１９、ＷＯ９３／１１２３６、ＷＯ９５／１５９８２、ＷＯ９５／２０４０１、ＷＯ９６／０６２１３、ＷＯ９２／０１０４７（Medical Research Council et al.）、ＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ）、ＷＯ９２／０１０４７（ＣＡＴ／ＭＲＣ）、ＷＯ９１／１７２７１（Ａｆｆｙｍａｘ）および米国特許第５，６９８，４２６号、同５，２２３，４０９号、同５，４０３，４８４号、同５，５８０，７１７号、同５，４２７，９０８号、同５，７５０，７５３号、同５，８２１，０４７号、同５，５７１，６９８号、同５，４２７，９０８号、同５，５１６，６３７号、同５，７８０，２２５号、同５，６５８，７２７号および同５，７３３，７４３号に開示されるものが挙げられる。ジスルフィド結合によってポリペプチドを引きつけることによるバクテリオファージ粒子の表面上にポリペプチドをディスプレイするのに有用な方法は、Lohning、米国特許第６，７５３，１３６号によって記載されている。上記の参考文献に記載されるように、ファージ選択後、ファージから得た抗体コーディング領域は、単離され、ヒト抗体を含む全抗体または任意のその他の所望の抗原結合断片を作製するために使用され、任意の哺乳動物細胞、昆虫細胞、植物細胞、酵母および細菌を含む所望の宿主において発現され得る。例えば、Ｆａｂ、Ｆａ���’およびＦ（ａｂ’）2断片を組換え製造するための技術もまた、ＷＯ９２／２２３２４； Mullinax et al., BioTechniques 12: 864-869, 1992;およびSawai et al., AJRI 34: 26-34, 1995; およびBetter et al., Science 240: 1041-1043, 1988に開示されるものなどの当技術分野で公知の方法を使用して使用され得る。
【０１０２】
一般に、ディスプレイベクター中にクローニングされたハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片は、抗体または抗体断片は、ファージまたはファージミド粒子の表面に存在するからであるので、良好な結合活性を維持するバリアントを同定するために適当な抗原に対して選択され得る。例えば、Barbas III et al., Phage Display, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 2001)を参照のこと。しかし、選択および／またはスクリーニングのために、抗体断片ライブラリーの溶解性ファージベクターへのクローニングなどのその他のベクターフォーマットが、このプロセスに使用され得る（修飾されたＴ７またはラムダＺａｐ系）。
【０１０３】
組換え抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の発現。上記で記載されたように、本技術の抗体は、組換えＤＮＡ技術の適用によって製造され得る。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードする組換えポリヌクレオチド構築物は、通常、天然において付随するまたは異種のプロモーター領域を含む、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体鎖のコード配列に作動可能に連結された発現制御配列を含む。そのようなものとして、本技術の別の態様は、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードする１つ以上の核酸配列を含有するベクターを含む。本技術の１つ以上のポリペプチドの組換え発現のために、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードするヌクレオチド配列のすべてまたは一部を含有する核酸は、当技術分野で周知の、以下に詳述されるような組換えＤＮＡ技術によって、適当なクローニングベクターまたは発現ベクター（すなわち、挿入されたポリペプチドコード配列の転写および翻訳のために必要なエレメントを含有するベクター）に挿入される。ベクターの多様な集団を製造する方法は、Lerner et al.,米国特許第６，２９１，１６０号および同６，６８０，１９２号によって記載されている。
【０１０４】
一般に、組換えＤＮＡ技術において有用な発現ベクターがプラスミドの形態であることが多い。本開示では、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドがベクターの最も一般的な形態であるので同義的に使用され得る。しかし、本技術は、同等の機能を果たす技術的にプラスミドではない発現ベクターのこのようなその他の形態、例えば、ウイルスベクター（例えば、複製欠損のレトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）を含むように意図される。このようなウイルスベクターは、対象の感染およびその対象における構築物の発現を可能にする。いくつかの実施形態では、発現制御配列は、真核細胞の宿主細胞を形質転換またはトランスフェクト可能なベクターにおける真核細胞プロモーター系である。ベクターが適当な宿主に組み込まれると、宿主は、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードするヌクレオチド配列の高レベル発現ならびに抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体、例えば、交差反応性抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の収集および精製に適した条件下で維持される。全般的に、米国特許出願公開第２００２／０１９９２１３号を参照のこと。これらの発現ベクターは、通常、エピソームとして、または宿主染色体ＤＮＡの不可欠な部分としてのいずれかで宿主生物において複製可能である。一般に、発現ベクターは、所望のＤＮＡ配列を用いて形質転換された細胞の検出を可能にするために、選択マーカー、例えば、アンピシリン耐性またはハイグロマイシン耐性を含有する。ベクターはまた、細胞外抗体断片の分泌に向けるのに有用なシグナルペプチド、例えば、ペクチン酸リアーゼをコードしてもよい。米国特許第５，５７６，１９５号を参照のこと。
【０１０５】
本技術の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態で、シス−ｐＴ２３１−タウ結合特性を有するタンパク質をコードする核酸を含み、これは、組換え発現ベクターが、発現されるべき核酸配列に作動可能に連結されている発現に使用されるべき宿主細胞に基づいて選択された１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内に、「作動可能に連結された」とは、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系における、またはベクターが宿主細胞に導入される場合宿主細胞において）、対象のヌクレオチド配列が、調節配列に連結されていることを意味することを意図される。用語「調節配列」とは、プロモーター、エンハンサーおよびその他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むように意図される。このような調節配列は、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に記載されている。調節配列は、多くの種類の宿主細胞においてヌクレオチド配列の構成的発現を指示するものおよび特定の宿主細胞のみにおいてヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）を含む。発現ベクターの設計は、形質転換されるべき宿主細胞の選択、所望のポリペプチドの発現のレベルなどのような因子に応じて変わり得るということは当業者によって理解されよう。組換えポリペプチド発現（例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体）のプロモーターとして有用である通常の調節配列として、例えば、それだけには限らないが、３−ホスホグリセリン酸キナーゼおよびその他の解糖酵素のプロモーターが挙げられる。誘導性酵母プロモーターとして、中でも、アルコールデヒドロゲナーゼ、イソチトクロームＣならびにマルトースおよびガラクトース利用に関与する酵素に由来するプロモーターが挙げられる。一実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードするポリヌクレオチドは、ａｒａ  Ｂプロモーターに作動可能に連結され、宿主細胞において発現可能である。米国特許第５，０２８，５３０号を参照のこと。本技術の発現ベクターは、宿主細胞に導入され、それによって、本明細書において記載されるような核酸によってコードされる融合ポリペプチドを含むポリペプチドまたはペプチド（例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体など）を産生できる。
【０１０６】
本技術の別の態様は、１つ以上の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードする核酸を含有する、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を発現する宿主細胞に関する。本技術の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞における抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の発現のために設計され得る。例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、大腸菌、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）、真菌細胞、例えば、酵母、酵母細胞または哺乳動物細胞などの細菌細胞において発現され得る。適した宿主細胞は、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)においてさらに論じられる。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して転写され、翻訳され得る。確率論的に作製されるポリヌクレオチド配列の発現による、所定の特性を有するポリペプチド、例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の調製およびスクリーニングにとって有用な方法は、これまでに記載されている。米国特許第５，７６３，１９２号、同５，７２３，３２３号、同５，８１４，４７６号、同５，８１７，４８３号、同５，８２４，５１４号、同５，９７６，８６２号、同６，４９２，１０７号、同６，５６９，６４１号を参照のこと。
【０１０７】
原核生物におけるポリペプチドの発現は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で融合または非融合ポリペプチドいずれかの発現を指示する構成的または誘導プロモーターを含有するベクターを用いて実施されることが最も多い。融合ベクターは、いくつかのアミノ酸を、本明細書においてコードされるポリペプチドに普通、組換えポリペプチドのアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、通常、３つの目的：（ｉ）組換えポリペプチドの発現を増大するため、（ｉｉ）組換えポリペプチドの溶解度を増大するため、および（ｉｉｉ）アフィニティー精製においてリガンドとして作用することによって組換えポリペプチドの精製を補助するためを果たす。融合発現ベクターでは、融合ポリペプチドの精製後に融合部分からの組換えポリペプチドの分離を可能にするために、融合部分と組換えポリペプチドの接合部にタンパク質分解による切断部位が導入されることが多い。このような酵素およびその同族認識配列として、第Ｘ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが挙げられる。通常の融合発現ベクターとして、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合ポリペプチドまたはポリペプチドＡをそれぞれ標的組換えポリペプチドに融合する、ｐＧＥＸ（Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州、ビバリー）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）が挙げられる。
【０１０８】
適した誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ（Amrann et al., (1988) Gene 69: 301-315）およびｐＥＴ  １１ｄ（Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego、Calif. (1990) 60-89）が挙げられる。ポリペプチド融合によって多機能ポリペプチドを得るための、別個の活性ペプチドまたはタンパク質ドメインの標的化されたアセンブリーの方法は、Pack et al.,米国特許第６，２９４，３５３号、同６，６９２，９３５号によって記載されている。大腸菌における組換えポリペプチド発現、例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を最大化するための１つの戦略は、組換えポリペプチドをタンパク質分解性に切断する能力が損なわれた宿主細菌においてポリペプチドを発現することである。例えば、Gottesman, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 119-128を参照のこと。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが、発現宿主、例えば、大腸菌において優先的に利用されるものであるように、発現ベクター中に挿入されるべき核酸の核酸配列を変更することである（例えば、Wada, et al., 1992. Nucl. Acids Res. 20: 2111-2118を参照のこと）。本技術の核酸配列のこのような変更は、標準ＤＮＡ合成技術によって実施され得る。
【０１０９】
別の実施形態では、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体発現ベクターは、酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における発現のためのベクターの例として、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234）、ｐＭＦａ（Kurjan and Herskowitz、Cell 30: 933-943, 1982）、ｐＪＲＹ８８（Schultz et al., Gene 54: 113-123, 1987）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、カリフォルニア州、サンディエゴ）およびｐｉｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ、カリフォルニア州、サンディエゴ）が挙げられる。あるいは、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、バキュロウイルス発現ベクターを使用して昆虫細胞において発現されてもよい。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）における、ポリペプチド、例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の発現のために利用可能なバキュロウイルスベクターとして、ｐＡｃシリーズ（Smith, et al., Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165, 1983）およびｐＶＬシリーズ（Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39）が挙げられる。
【０１１０】
さらに別の実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードする核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞において発現される。哺乳動物発現ベクターの例として、例えば、それだけには限らないが、ｐＣＤＭ８（Seed, Nature 329: 840, 1987）およびｐＭＴ２ＰＣ（Kaufman, et al., EMBO J. 6: 187-195, 1987）が挙げられる。哺乳動物細胞において使用される場合には、発現ベクターの制御機能は、ウイルス調節エレメントによって提供されることが多い。例えば、よく使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０に由来する。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の発現に適している原核細胞および真核細胞両方のためのその他の適した発現系については、例えば、Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989のChapter 16および17を参照のこと。
【０１１１】
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞種において核酸の発現を指示可能である（例えば、組織特異的調節エレメント）。組織特異的調節エレメントは、当技術分野で公知である。適した組織特異的プロモーターの限定されない例として、アルブミンプロモーター（肝臓特異的; Pinkert, et al., Genes Dev. 1: 268-277, 1987）、リンパ球特異的プロモーター（Calame and Eaton, Adv. Immunol. 43: 235-275, 1988）、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Winoto and Baltimore, EMBO J. 8: 729-733, 1989）および免疫グロブリン（Banerji, et al., 1983. Cell 33: 729-740;Queen and Baltimore, Cell 33: 741-748, 1983.）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、神経フィラメントプロモーター； Byrne and Ruddle, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477, 1989）、膵臓特異的プロモーター（Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916）および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号および欧州特許出願公開第２６４，１６６号）が挙げられる。発達によって調節されるプロモーターも包含される、例えば、マウスｈｏｘプロモーター（Kessel and Gruss, Science 249: 374-379, 1990）およびα−胎児タンパク質プロモーター（Campes and Tilghman, Genes Dev. 3: 537-546, 1989)。
本方法の別の態様は、本技術の組換え発現ベクターが導入されている宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書において同義的に使用される。このような用語は、特定の対象細胞だけでなく、このような細胞の後代または潜在的な後代も指すことは理解される。特定の修飾は突然変異または環境影響いずれかのために続く世代において生じ得るので、このような後代は、親細胞と実際同一ではない場合もあるが、本明細書における用語の範囲内に依然として含まれる。
【０１１２】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、大腸菌、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞などの細菌細胞において発現され得る。哺乳動物細胞は、免疫グロブリンまたはその断片をコードするヌクレオチドセグメントを発現するための適した宿主である。Winnacker, From Genes To Clones(VCH Publishers, NY, 1987)を参照のこと。無傷の異種タンパク質を分泌可能ないくつかの適した宿主細胞株が当技術分野で開発されており、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、種々のＣＯＳ細胞株、ＨｅＬａ細胞、Ｌ細胞および骨髄腫細胞株が挙げられる。いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒトである。これらの細胞の発現ベクターは、発現制御配列、例えば、複製起点、プロモーター、エンハンサーおよび必要なプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライシング部位、ポリアデニル化部位および転写ターミネーター配列を含み得る。Queen et al., Immunol. Rev. 89: 49, 1986。例示的発現制御配列は、内因性遺伝子、サイトメガロウイルス、ＳＶ４０、アデノウイルス、ウシパピローマウイルスなどに由来するプロモーターである。Co et al., J Immunol. 148: 1149, 1992。その他の適した宿主細胞は、当業者に公知である。
【０１１３】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術によって原核細胞または真核細胞中に導入され得る。本明細書において、用語「形質転換」および「トランスフェクション」は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性トランスフェクション、リポフェクション、エレクトロポレーション、微粒子銃またはウイルスベーストランスフェクションを含む、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞中に導入するための種々の技術分野で認識された技術を指すように意図される。哺乳動物細胞を形質転換するために使用されるその他の方法として、ポリブレンの使用、プロトプラスト融合、リポソーム、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションが挙げられる（全般的には、Sambrook et al.，Molecular Cloningを参照のこと）。宿主細胞に形質導入するまたはトランスフェクトするための適した方法は、Sambrook, et al. (MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989)およびその他の実験室マニュアルに見出すことができる。対象のＤＮＡセグメントを含有するベクターは、細胞宿主の種類に応じて周知の方法によって宿主細胞中に移行され得る。
【０１１４】
哺乳動物細胞の安定なトランスフェクションのために、使用される発現ベクターおよびトランスフェクション技術に応じて、細胞の小画分のみが外来ＤＮＡをそのゲノム中に組み込み得るということがわかっている。これらの組み込み体を同定および選択するために、一般に、選択マーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子が、対象の遺伝子とともに宿主細胞中に導入される。種々の選択マーカーとして、Ｇ４１８、ハイグロマイシンおよびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するものが挙げられる。選択マーカーをコードする核酸は、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードするものと同一ベクターで宿主細胞中に導入され得る、または別個のベクターで導入され得る。導入される核酸を用いて安定にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって同定され得る（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生存し、その他の細胞は死滅する）。
培養中の原核細胞または真核細胞の宿主細胞などの本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を含む宿主細胞は、組換え抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を製造（すなわち、発現）するために使用され得る。一実施形態では、方法は、宿主細胞（シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードする組換え発現ベクターが導入されている）を、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体が産生されるような適した培地中で培養することを含む。別の実施形態では、方法は、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を、培地または宿主細胞から単離するステップをさらに含む。ひとたび発現されると、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体、例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体または抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体関連ポリペプチドの収集物は、培養培地および宿主細胞から精製される。抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、ＨＰＬＣ精製、カラムクロマトグラフィー、ゲル電気泳動などを含む当技術分野の標準手順に従って精製され得る。一実施形態では、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、Boss et al.米国特許第４，８１６，３９７号の方法によって宿主生物において産生される。普通、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体鎖は、シグナル配列とともに発現され、したがって、培養培地中に放出される。しかし、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体鎖が、宿主細胞によって自然に分泌されない場合には、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体鎖は、穏やかな洗浄剤を用いる処置によって放出され得る。組換えポリペプチドの精製は、当技術分野で周知であり、硫酸アンモニウム沈殿、アフィニティークロマトグラフィー精製技術、カラムクロマトグラフィー、イオン交換精製技術、ゲル電気泳動などが挙げられる（全般的には、Scopes, Protein Purification (Springer-Verlag、N.Y.、1982)を参照のこと。
【０１１５】
抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体をコードするポリヌクレオチド、例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体コード配列は、トランスジェニック動物のゲノムへの導入およびトランスジェニック動物の乳におけるその後の発現のために導入遺伝子に組み込まれ得る。例えば、米国特許第５，７４１，９５７号、同５，３０４，４８９号および同５，８４９，９９２号を参照のこと。適した導入遺伝子は、乳腺特異的遺伝子、例えば、カゼインまたはβ−ラクトグロブリン由来のプロモーターおよびエンハンサーと作動可能な連結にある軽鎖および／または重鎖のコード配列を含む。トランスジェニック動物の製造のためには、導入遺伝子は、受精した卵母細胞中にマイクロインジェクションされてもよい、または胚幹細胞のゲノム中に組み込まれてもよく、このような細胞の核は、除核された卵母細胞に移される。
【０１１６】
一本鎖抗体。一実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、一本鎖抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体である。本技術によれば、技術は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質に特異的な一本鎖抗体の製造のために採用され得る（例えば、米国特許第４，９４６，７７８号を参照のこと）。一本鎖Ｆｖおよび本技術の抗体を製造するために使用され得る技術の例として、米国特許第４，９４６，７７８号および同５，２５８，４９８号； Huston et al., Methods in Enzymology, 203: 46-88, 1991; Shu, L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 7995-7999, 1993;およびSkerra et al., Science 240: 1038-1040, 1988に記載されるものが挙げられる。
【０１１７】
キメラおよびヒト化抗体。一実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、キメラ抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体である。一実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、ヒト化抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体である。本技術の一実施形態では、ドナーおよびアクセプター抗体は、異なる種に由来するモノクローナル抗体である。例えば、アクセプター抗体は、ヒト抗体であり（ヒトにおけるその抗原性を最小化するために）、その場合には、得られたＣＤＲ移植抗体は、「ヒト化」抗体と呼ばれる。
組換え抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体、例えば、ヒトおよび非ヒト部分両方を含む、キメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、標準組換えＤＮＡ技術を使用して作製され得、本技術の範囲内である。ヒトにおける本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ使用ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏ検出アッセイにおけるこれらの物質の使用を含むいくつかの使用のために、キメラまたはヒト化抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を使用することがあり得る。このようなキメラおよびヒト化モノクローナル抗体は、当技術分野で公知の組換えＤＮＡ技術によって製造され得る。このような有用な方法として、例えば、それだけには限らないが、国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９、米国特許第５，２２５，５３９号、欧州特許第１８４１８７号、欧州特許第１７１４９６号、欧州特許第１７３４９４号、ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ８６／０１５３３、米国特許第４，８１６，５６７号、同５，２２５，５３９号、欧州特許第１２５０２３号、Better, et al., 1988. Science 240: 1041-1043; Liu, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu, et al., 1987. J. Immunol. 139: 3521-3526; Sun, et al., 1987. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura, et al., 1987. Cancer Res. 47: 999-1005; Wood, et al., 1985. Nature 314: 446-449; Shaw, et al., 1988. J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559; Morrison (1985) Science 229: 1202-1207; Oi, et al. (1986) BioTechniques 4: 214; Jones, et al., 1986. Nature 321: 552-525; Verhoeyan, et al., 1988に記載される方法が挙げられる。例えば、抗体は、ＣＤＲ移植（ＥＰ０２３９４００、ＷＯ９１／０９９６７、米国特許第５，５３０，１０１号、同５，５８５，０８９号、同５，８５９，２０５号、同６，２４８，５１６号、ＥＰ４６０１６７）、ベニアリング（ｖｅｎｅｅｒｉｎｇ）またはリサーフェシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（ＥＰ０５９２１０６、ＥＰ０５１９５９６、Padlan E. A., Molecular Immunology、28: 489-498, 1991; Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805-814, 1994; Roguska et al., PNAS 91: 969-973, 1994）およびチェーンシャッフリング（ｃｈａｉｎ  ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）（米国特許第５，５６５，３３２号）を含む種々の技術を使用してヒト化され得る。一実施形態では、マウス抗シス−ｐＴ２３１−タウモノクローナル抗体をコードするｃＤＮＡは、Ｆｃ定常領域をコードする配列を除去するように特別に選択された制限酵素を用いて消化され、ヒトＦｃ定常領域をコードするｃＤＮＡの同等部分が置換される(Robinson et al.、ＰＣＴ／ＵＳ８６／０２２６９；Akira et al.、欧州特許出願第１８４，１８７号； Taniguchi、欧州特許出願第１７１，４９６号； Morrison et al.、欧州特許出願第１７３，４９４号； Neuberger et al.、ＷＯ８６／０１５３３； Cabilly et al.、米国特許第４，８１６，５６７号； Cabilly et al.、欧州特許出願第１２５，０２３号； Better et al. (1988) Science 240: 1041-1043; Liu et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 3439-3443; Liu et al. (1987) J Immunol 139: 3521-3526; Sun et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214-218; Nishimura et al. (1987) Cancer Res 47: 999-1005; Wood et al. (1985) Nature 314: 446-449;およびShaw et al. (1988) J. Natl. Cancer Inst. 80: 1553-1559;米国特許第６，１８０，３７０号；米国特許第６，３００，０６４号；同６，６９６，２４８号；同６，７０６，４８４号；同６，８２８，４２２号。
【０１１８】
一実施形態では、本技術は、ヒト抗マウス抗体（本明細書において以下、「ＨＡＭＡ」と呼ばれる）応答を誘導する可能性が低く、一方で、有効な抗体エフェクター機能は依然として有するヒト化抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の構築を提供する。本明細書において、抗体に関連して、用語「ヒト」および「ヒト化」は、ヒト対象において治療上許容される弱い免疫原性応答を誘発するように予測される任意の抗体に関する。一実施形態では、本技術は、ヒト化抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体、重鎖および軽鎖免疫グロブリンを提供する。
【０１１９】
ＣＤＲ抗体。いくつかの実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、抗シス−ｐＴ２３１−タウＣＤＲ抗体である。全般的に、抗シス−ｐＴ２３１−タウＣＤＲ抗体を作製するために使用されるドナーおよびアクセプター抗体は、異なる種に由来するモノクローナル抗体であり、通常、アクセプター抗体は、ヒト抗体であり（ヒトにおける抗原性を最小化するために）、その場合には、得られたＣＤＲ移植抗体は、「ヒト化」抗体と呼ばれる。移植は、アクセプター抗体の単一ＶHまたはＶL内の単一ＣＤＲ（またはさらに単一ＣＤＲの一部）のものであり得る、またはＶHおよびＶLの一方または両方内の複数のＣＤＲ（またはその一部）のものであり得る。得られたＣＤＲ移植抗体のシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質との適切な結合を可能にするのに必要な数だけを置き換えることを必要とするが、アクセプター抗体のすべての可変ドメインの３つのＣＤＲすべてが置き換えられることが多い。ＣＤＲ移植およびヒト化抗体を作製する方法は、Queen et al.米国特許第５，５８５，０８９号；米国特許第５，６９３，７６１号；米国特許第５，６９３，７６２号；およびWinter 米国特許第５，２２５，５３９号；およびＥＰ０６８２０４０によって教示される。ＶHおよびＶLポリペプチドを調製するのに有用な方法は、Winter et al.米国特許第４，８１６，３９７号；同６，２９１，１５８号；同６，２９１，１５９号；同６，２９１，１６１号；同６，５４５，１４２号；ＥＰ０３６８６８４；ＥＰ０４５１２１６；およびＥＰ０１２０６９４によって教示される。
【０１２０】
同一ファミリーおよび／または同一ファミリーメンバーから適したフレームワーク領域候補を選択した後、元の種からハイブリッドフレームワーク領域中にＣＤＲを移植することによって、重鎖および軽鎖可変領域のいずれかまたは両方が製造される。上記の態様のいずれかに関して、当業者に公知の従来の方法を使用して、ハイブリッド可変鎖領域を有するハイブリッド抗体またはハイブリッド抗体断片のアセンブリーが達成され得る。例えば、本明細書において記載されるハイブリッド可変ドメイン（すなわち、標的種および元の種に由来するＣＤＲをベースとするフレームワーク）をコードするＤＮＡ配列は、オリゴヌクレオチド合成および／またはＰＣＲによって製造され得る。ＣＤＲ領域をコードする核酸はまた、適した制限酵素を使用して元の種の抗体から単離され、適したライゲーション酵素を用いてライゲーションすることによって標的種フレームワーク中にライゲーションされ得る。あるいは、元の種の抗体の可変鎖のフレームワーク領域は、部位特異的突然変異誘発によって変更され得る。
【０１２１】
各フレームワーク領域に対応する複数の候補の中から選択してハイブリッドが構築されるので、本明細書において記載される原理に従う構築を受け入れる配列の多数の組合せが存在する。したがって、個々のフレームワーク領域の異なる組合せを有するメンバーを有するハイブリッドのライブラリーがアセンブルされ得る。このようなライブラリーは、ハイブリッドの、配列の電子データベース収集物または物理的収集物であり得る。
このプロセスは、通常、移植ＣＤＲをフランキングするアクセプター抗体のＦＲを変更しない。しかし、当業者ならば、時には、ドナー抗体の対応するＦＲにより同様のＦＲを作製するために、所与のＦＲの特定の残基を置き換えることによって、得られた抗シス−ｐＴ２３１−タウＣＤＲ移植抗体の抗原結合親和性を改善できる。置換の適した位置は、ＣＤＲに隣接する、またはＣＤＲと相互作用可能なアミノ酸残基を含む（例えば、ＵＳ５，５８５，０８９、特に列１２〜１６を参照のこと）。または当業者ならば、ドナーＦＲを用いて開始し、アクセプターＦＲまたはヒトコンセンサスＦＲとより同様であるように修飾できる。これらの修飾を行う技術は、当技術分野で公知である。特に、得られたＦＲが、その位置のヒトコンセンサスＦＲと適合する、またはこのようなコンセンサスＦＲに対して少なくとも９０％またはそれ以上同一である場合には、そのようにすることは、得られた修飾された抗シス−ｐＴ２３１−タウＣＤＲ移植抗体の抗原性を、完全ヒトＦＲを有する同一抗体と比較して有意に増大しない可能性がある。
【０１２２】
融合タンパク質。一実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、融合タンパク質である。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、第２のタンパク質に融合された場合、抗原性タグとして使用され得る。ポリペプチドに融合され得るドメインの例として、異種シグナル配列だけでなく、その他の異種機能性領域も挙げられる。融合は必ずしも直接である必要はなく、リンカー配列を介して起こる場合もある。さらに、本技術の融合タンパク質はまた、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の特徴を改善するように遺伝子操作され得る。例えば、さらなるアミノ酸、特に、荷電アミノ酸の領域は、宿主細胞からの精製またはその後の取り扱いおよび貯蔵の間の安定性および持続性を改善するために、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体のＮ末端に付加され得る。また、ペプチド部分が、精製を促進するために抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体に付加され得る。このような領域は、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の最終調製に先立って除去され得る。ポリペプチドの取り扱いを促進するためのペプチド部分の付加は、当技術分野ではよく知られており、日常的な技術である。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、ペプチドなどのマーカー配列に融合されてもよく、これは、融合されたポリペプチドの精製を促進する。選択実施形態では、マーカーアミノ酸配列は、ヘキサヒスチジンペプチド、例えば、中でも、その多くが市販されているｐＱＥベクター（ＱＩＡＧＥＮ、Ｉｎｃ．、カリフォルニア州、チャッツワース）において提供されるタグである。Gentz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 821-824, 1989に記載されるように、例えば、ヘキサヒスチジンは、融合タンパク質の好都合な精製を提供する。精製に有用な別のペプチドタグ、「ＨＡ」タグは、インフルエンザ血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する。Wilson et al., Cell 37: 767, 1984。
【０１２３】
したがって、これらの上記の融合タンパク質のいずれも、本技術のポリヌクレオチドまたはポリペプチドを使用して遺伝子操作され得る。また、いくつかの実施形態では、本明細書において記載される融合タンパク質は、ｉｎ  ｖｉｖｏで半減期の増大を示す。
ジスルフィド結合された二量体構造（ＩｇＧによる）を有する融合タンパク質は、単量体で分泌されるタンパク質またはタンパク質断片単独と比較して、その他の分子に結合および中和することにおいてより有効であり得る。Fountoulakis et al., J. Biochem. 270: 3958-3964, 1995。
【０１２４】
同様に、ＥＰ−Ａ−Ｏ  ４６４５３３（カナダ対応物２０４５８６９）には、免疫グロブリン分子の定常領域の種々の部分を含む融合タンパク質が、別のヒトタンパク質またはその断片と一緒に開示されている。多くの場合、融合タンパク質中のＦｃ部分は、療法および診断において有益であり、したがって、例えば、薬物動態特性の改善をもたらし得る。ＥＰ−Ａ０２３２２６２を参照のこと。あるいは、融合タンパク質が発現され、検出され、精製された後にＦｃ部分を欠失することが望まれることもある。例えば、融合タンパク質が免疫処置の抗原として使用される場合には、Ｆｃ部分が、療法および診断を妨げることもある。創薬では、例えば、ｈＩＬ−５などのヒトタンパク質が、ｈＩＬ−５のアンタゴニストを同定するためのハイスループットスクリーニングアッセイを目的としてＦｃ部分と融合されている。Bennett et al., J. Molecular Recognition 8: 52-58, 1995; Johanson et al., J. Biol. Chem., 270: 9459-9471, 1995。
【０１２５】
標識された抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体。一実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、標識部分、すなわち、検出可能な基とカップリングされている。抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体にコンジュゲートされた特定の標識または検出可能な基は、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体のシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質との特異的結合を大幅に干渉しない限り、技術の重大な態様ではない。検出可能な基は、検出可能な物理的または化学的特性を有する任意の材料であり得る。このような検出可能な標識は、イムノアッセイおよびイメージングの分野では十分に開発されている。一般に、このような方法において有用なほとんどあらゆる標識が、本技術に適用され得る。したがって、標識は、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、電気的、光学的または化学的手段によって検出可能な任意の組成物である。本技術の実施において有用な標識として、磁性ビーズ（例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標））、蛍光色素（例えば、フルオレセインイソチオシアネート、テキサスレッド、ローダミンなど）、放射標識（例えば、3Ｈ、14Ｃ、35Ｓ、125Ｉ、121Ｉ、131Ｉ、112Ｉｎ、99ｍＴｃ）、マイクロバブルなどのその他の造影剤（超音波イメージングのための）、18Ｆ、11Ｃ、15Ｏ（陽電子放射型断層撮影のための）、99mＴＣ、111Ｉｎ（単一光子放出型コンピュータ断層撮影のための）、酵素（例えば、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼおよびＥＬＩＳＡにおいて一般に使用されるその他のもの）およびコロイド金などの熱量測定標識または着色ガラスまたはプラスチック（例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど）ビーズが挙げられる。このような標識の使用を記載する特許として、米国特許第３，８１７，８３７号、同３，８５０，７５２号、同３，９３９，３５０号、同３，９９６，３４５号、同４，２７７，４３７号、同４，２７５，１４９号および同４，３６６，２４１号が挙げられ、各々、すべての目的でその全文が参照により本明細書に組み込まれる。またHandbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (6th Ed., Molecular Probes, Inc., Eugene OR.)も参照のこと。
【０１２６】
標識は、当技術分野で周知の方法に従って、アッセイの所望の成分に直接的にまたは間接的にカップリングされている。上記で示されたように、広範な標識が使用されてもよく、標識の選択は、必要な感受性、化合物とのコンジュゲーションの容易さ、安定性必要条件、入手可能な計測手段および廃棄規定などの因子に応じて変わる。
非放射性標識は、間接的な手段によって付着されることが多い。一般に、リガンド分子（例えば、ビオチン）は、分子に共有結合によって結合される。次いで、リガンドは、本質的に検出可能であるか、または検出可能な酵素、蛍光化合物もしくは化学発光化合物などのシグナル系に共有結合によって結合された抗リガンド（例えば、ストレプトアビジン）分子と結合する。いくつかのリガンドおよび抗リガンドが使用され得る。リガンドが、中性抗リガンド、例えば、ビオチン、チロキシンおよびコルチゾールを有する場合には、標識された天然に存在する抗リガンドとともに使用され得る。あるいは、任意のハプテン性または抗原性化合物が、抗体、例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体と組み合わせて使用され得る。
【０１２７】
分子はまた、シグナル生成化合物に直接的に、例えば、酵素またはフルオロフォアとのコンジュゲーションによってコンジュゲートされ得る。標識として対象の酵素は、主に、ヒドロラーゼ、特に、ホスファターゼ、エステラーゼおよびグリコシダーゼまたは酸化還元酵素、特に、ペルオキシダーゼとなる。標識部分として有用である蛍光化合物として、それだけには限らないが、例えば、フルオレセインおよびその誘導体、ローダミンおよびその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどが挙げられる。標識部分として有用である化学発光化合物として、それだけには限らないが、例えば、ルシフェリンおよび２，３−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールが挙げられる。使用され得る、種々の標識またはシグナル生成系の概要については、米国特許第４，３９１，９０４を参照のこと。
【０１２８】
標識を検出する手段は、当業者に周知である。したがって、例えば、標識が放射性標識である場合には、検出のための手段として、シンチレーションカウンターまたはオートラジオグラフィーにおけるような写真フィルムが挙げられる。標識が蛍光標識である場合には、光の適当な波長を用いて蛍光色素を励起することおよび得られた蛍光を検出することによって検出され得る。蛍光は、写真フィルムによって、電荷結合素子（ＣＣＤ）または光電子増倍管などのような電子検出器を使用することによって視覚的に検出され得る。同様に、酵素的標識は、酵素に適当な物質を提供することおよび得られた反応生成物を検出することによって検出され得る。最後に、簡単な比色標識は、標識と関連する色を観察することによって簡単に検出され得る。したがって、種々の尿試験紙アッセイにおいて、コンジュゲートされた金はピンク色に見え、一方で、種々のコンジュゲートされたビーズは、ビーズの色に見える。
いくつかのアッセイ形式は、標識された構成成分の使用を必要としない。例えば、凝集アッセイは、標識抗体、例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の存在を検出するために使用され得る。この場合には、抗原によってコーティングされた粒子が、標的抗体を含むサンプルによって凝集される。この形式では、標識されることを必要とする構成成分はなく、標識抗体の存在は、簡単な目視検査によって検出される。
【０１２９】
Ｂ．本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の同定および特性決定
本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を同定および／またはスクリーニングする方法。シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質に対して所望の特異性を有するものについて、シス−ｐＴ２３１−タウポリペプチドに対する抗体を同定およびスクリーニングするために有用な方法は、当技術分野で公知の任意の免疫学的に媒介される技術を含む。免疫応答の構成成分は、当業者に周知である種々の方法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで検出され得る。例えば、（１）細胞傷害性Ｔリンパ球は、放射活性標識された標的細胞とともにインキュベートされ、これらの標的細胞の溶解は、放射活性の放出によって検出され得る、（２）ヘルパーＴリンパ球は、抗原および抗原提示細胞とともにインキュベートされ、サイトカインの合成および分泌は、標準方法によって測定され得る（Windhagen A et al., Immunity, 2: 373-80, 1995）、（３）抗原提示細胞は、全タンパク質抗原とともにインキュベートされ、ＭＨＣ上のその抗原の提示は、Ｔリンパ球活性化アッセイまたは生物物理学的方法のいずれかによって検出され得る（Harding et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 86: 4230-4, 1989）、（４）肥満細胞は、そのＦｃ−イプシロン受容体と架橋結合する試薬とともにインキュベートされ、ヒスタミン放出は、酵素イムノアッセイによって測定され得る（Siraganian et al., TIPS, 4: 432-437, 1983）および（５）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）。
【０１３０】
同様に、モデル生物（例えば、マウス）またはヒト対象いずれかにおける免疫応答の生成物はまた、当業者に周知である種々の方法によって検出され得る。例えば、（１）ワクチン接種に応じた抗体の製造は、臨床検査室において現在使用される標準方法、例えば、ＥＬＩＳＡによって容易に検出され得る、（２）免疫細胞の炎症の部位への遊走は、皮膚の表面を引っ掻くことおよび引っ掻き部位にわたって遊走細胞を捕捉するために滅菌容器を置くことによって検出され得る（Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988）、（３）マイトジェンまたは混合リンパ球反応物に応じた末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の増殖は、3Ｈ−チミジンを使用して測定され得る、（４）ＰＢＭＣ中の顆粒球、マクロファージおよびその他の貪食細胞の食作用は、ＰＢＭＣを標識された粒子と一緒にウェル中に入れることによって測定され得る（Peters et al., Blood, 72: 1310-5, 1988）および（５）免疫系細胞の分化は、ＰＢＭＣをＣＤ４およびＣＤ８などのＣＤ分子に対する抗体を用いて標識することおよびこれらのマーカーを発現するＰＢＭＣの画分を測定することによって測定され得る。
【０１３１】
一実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、複製可能な遺伝子パッケージの表面でのシス−ｐＴ２３１−タウペプチドのディスプレイを使用して選択される。例えば、米国特許第５，５１４，５４８号、同５，８３７，５００号、同５，８７１，９０７号、同５，８８５，７９３号、同５，９６９，１０８号、同６，２２５，４４７号、同６，２９１，６５０号、同６，４９２，１６０号、ＥＰ５８５２８７、ＥＰ６０５５２２、ＥＰ６１６６４０、ＥＰ１０２４１９１、ＥＰ５８９８７７、ＥＰ７７４５１１、ＥＰ８４４３０６を参照のこと。所望の特異性を有する結合分子をコードするファージミドゲノムを含有する繊維状バクテリオファージ粒子を製造／選択するのに有用な方法は、記載されている。例えば、ＥＰ７７４５１１、ＵＳ５８７１９０７、ＵＳ５９６９１０８、ＵＳ６２２５４４７、ＵＳ６２９１６５０、ＵＳ６４９２１６０を参照のこと。
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、酵母宿主細胞の表面上のシス−ｐＴ２３１−タウペプチドのディスプレイを使用して選択される。酵母表面ディスプレイによるＦｖポリペプチドの単離に有用な方法は、Kieke et al., Protein Eng. 1997 Nov; 10(11): 1303-10によって記載されている。
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、リボソームディスプレイを使用して選択される。リボソームディスプレイを使用してペプチドライブラリー中でリガンドを同定するのに有用な方法は、Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 9022-26, 1994およびHanes et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 4937-42, 1997によって記載されている。
【０１３２】
特定の実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、シス−ｐＴ２３１−タウペプチドのｔＲＮＡディスプレイを使用して選択される。ｔＲＮＡディスプレイを使用するリガンドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ選択に有用な方法は、Merryman et al., Chem. Biol., 9: 741-46, 2002によって記載されている。
一実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、ＲＮＡディスプレイを使用して選択される。ＲＮＡディスプレイライブラリーを使用してペプチドおよびタンパク質を選択するために有用な方法は、Roberts et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA、94: 12297-302, 1997およびNemoto et al., FEBS Lett., 414: 405-8, 1997によって記載されている。非天然ＲＮＡディスプレイライブラリーを使用してペプチドおよびタンパク質を選択するのに有用な方法は、Frankel et al., Curr. Opin. Struct. Biol., 13: 506-12, 2003に記載されている。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、グラム陰性菌の周辺質において発現され、標識されたシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と混合される。ＷＯ０２／３４８８６を参照のこと。Harvey et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 22: 9193-98 2004および米国特許公開第２００４／００５８４０３号に記載されるように、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質に対して親和性を有する組換えポリペプチドを発現するクローンでは、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体に結合された標識されたシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の濃度が増大され、細胞が、ライブラリーの残部から単離されることを可能にする。
所望の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の選択後、当業者に公知の任意の技術、例えば、原核細胞または真核細胞発現などによって前記抗体が大容量で製造され得ることが考慮される。例えば、それだけには限らないが、抗シス−ｐＴ２３１−タウハイブリッド抗体または断片である抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、抗体重鎖をコードする発現ベクターを構築するための従来技術を使用して製造されてもよく、ＣＤＲおよび必要に応じて、元の種の抗体結合特異性を保持するために必要である可変領域フレームワークの最小部分（本明細書において記載される技術に従って遺伝子操作されるので）が、元の種の抗体に由来し、抗体の残部が、本明細書において記載されるように操作される標的種免疫グロブリンに由来し、それによって、ハイブリッド抗体重鎖の発現のためのベクターが生成する。
【０１３４】
シス−ｐＴ２３１−タウ結合の測定。いくつかの実施形態では、シス−ｐＴ２３１−タウ結合アッセイとは、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質および抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体が、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体間の結合に適した条件下で混合され、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体間の結合の量を評価するアッセイ形式を指す。結合の量は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の非存在下での結合の量、非特異的免疫グロブリン組成物の存在下での結合の量または両方であり得る適した対照と比較される。結合の量は、任意の適した方法によって評価され得る。結合アッセイ法として、例えば、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイ、シンチレーション近接アッセイ、蛍光エネルギー移動アッセイ、液体クロマトグラフィー、膜濾過アッセイなどが挙げられる。抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体とのシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質結合の直接測定のための生物物理学的アッセイとして、例えば、核磁気共鳴、蛍光、蛍光偏光、表面プラズモン共鳴（ＢＩＡＣＯＲＥチップ）などがある。特異的結合は、当技術分野で公知の標準アッセイ、例えば、放射性リガンド結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＦＲＥＴ、免疫沈降、ＳＰＲ、ＮＭＲ（２Ｄ−ＮＭＲ）、質量分析などによって決定される。候補抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の特異的結合が、候補抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の非存在下で観察される結合よりも少なくとも１パーセント多い場合には、候補抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体として有用である。
シス−ｐＴ２３１−タウ中和の測定。本明細書において使用されるように、「シス−ｐＴ２３１−タウ中和」とは、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の結合によるシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の活性および／または発現の低減を指す。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の、シス−ｐＴ２３１−タウ活性／発現を中和する能力は、当技術分野で公知の方法を使用してｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで評価され得る。例えば、ＷＯ２０１４１５２１５７； Yanamandra et al., Ann Clin Transl Neurol. 2(3): 278-288 (2015)を参照のこと。
【０１３５】
ＩＩ．本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の使用
全般。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の局在性および／または定量化に関する当技術分野で公知の方法において有用である（例えば、適当なものなどの範囲内のシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質のレベルの測定において使用するための）。本技術の抗体は、アフィニティークロマトグラフィーまたは免疫沈降などの標準技術によってシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質を単離するために有用である。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、生物学的サンプル、例えば、哺乳動物血清または細胞からの天然免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の精製、ならびに宿主系において発現された組換えによって製造された免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の精製を促進し得る。さらに、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質（例えば、血漿、細胞溶解物または細胞上清において）を検出して、免疫反応性ポリペプチドの発現の量およびパターンを評価するために使用され得る。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、臨床試験手順の一部として組織における免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質レベルをモニタリングするために、例えば、所与の治療計画の有効性を調べるために診断的に使用され得る。上記で記載されるように、検出は、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を、検出可能な物質にカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）によって促進され得る。
【０１３６】
シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の検出。生物学的サンプル中の免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の有無を検出するための例示的方法は、試験対象から生物学的サンプルを得ることおよび生物学的サンプルを、免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質を検出可能な本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体と接触させ、その結果、生物学的サンプルにおいて免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の存在が検出されることを含む。検出は、抗体に付着された検出可能な標識によって達成され得る。
用語「標識された」は、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体に関して、検出可能な物質を、抗体にカップリングすること（すなわち、物理的に連結すること）による抗体の直接標識ならびに二次抗体などの直接標識される別の化合物との反応性による抗体の間接標識を包含するように意図される。間接標識の例として、蛍光標識二次抗体を使用する一次抗体の検出および蛍光標識ストレプトアビジンを用いて検出され得るようなビオチンを用いるＤＮＡプローブの末端標識が挙げられる。
【０１３７】
本技術の検出方法は、生物学的サンプルにおいてｉｎ  ｖｉｔｒｏならびにｉｎ  ｖｉｖｏで免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質を検出するために使用され得る。免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質を検出するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ技術として、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）、ウエスタンブロット、免疫沈降、ラジオイムノアッセイおよび免疫蛍光が挙げられる。さらに、免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の検出のためのｉｎ  ｖｉｖｏ技術は、標識された抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を対象へ導入することを含む。例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、標準イメージング技術によって対象におけるその存在および位置が検出され得る放射活性マーカーを用いて標識されてもよい。一実施形態では、生物学的サンプルは、試験対象から得たシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質分子を含有する。
【０１３８】
イムノアッセイおよびイメージング。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、抗体ベース技術を使用して生物学的サンプル（例えば、ヒト血漿）において免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質レベルをアッセイするために使用され得る。例えば、組織におけるタンパク質発現が、古典的免疫組織学的方法を用いて研究され得る。Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 101: 976-985, 1985; Jalkanen, M. et al., J. Cell. Biol. 105: 3087-3096, 1987。タンパク質遺伝子発現を検出するのに有用なその他の抗体ベース方法として、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）およびラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）などのイムノアッセイが挙げられる。適した抗体アッセイ標識は、当技術分野で公知であり、グルコースオキシダーゼなどの酵素標識および放射性同位元素またはその他の放射活性物質、例えば、ヨウ素（125Ｉ、121Ｉ、131Ｉ）、炭素（14Ｃ）、硫黄（35Ｓ）、トリチウム（3Ｈ）、インジウム（112Ｉｎ）およびテクネチウム（99ｍＴｃ）ならびに蛍光標識、例えば、フルオレセイン、ローダミンおよび緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ならびにビオチンが挙げられる。
【０１３９】
生物学的サンプルにおいて免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質レベルをアッセイすることに加えて、本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、シス−ｐＴ２３１−タウのｉｎ  ｖｉｖｏイメージングに使用され得る。この方法にとって有用な抗体として、Ｘ−Ｘ線撮影、ＮＭＲまたはＥＳＲによって検出可能なものが挙げられる。Ｘ−Ｘ線撮影のために、適した標識として、検出可能な放射線を発するが、対象にとって明白に有害ではないバリウムまたはセシウムなどの放射性同位元素が挙げられる。ＮＭＲおよびＥＳＲにとって適したマーカーとして、重水素などの検出可能な特徴的なスピンを有するものが挙げられ、これは、関連ｓｃＦｖ  クローンの栄養分を標識することによって、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体中に組み込まれ得る。
適当な検出可能なイメージング部分、例えば、放射性同位元素（例えば、131Ｉ、112Ｉｎ、99ｍＴｃ）、放射性不透過性物質または核磁気共鳴によって検出可能な材料を用いて標識されている抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体が、対象中に導入される（例えば、非経口的に、皮下にまたは腹膜内に）。対象の大きさおよび使用されるイメージングシステムが、診断画像を作成するのに必要なイメージング部分の量を左右するということは、当技術分野では理解されよう。放射性同位元素部分の場合には、ヒト対象のためには、注入される放射能の量は、普通、約５〜２０ミリキュリーの99ｍＴｃの範囲となる。標識された抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は次いで、特異的標的ポリペプチドを含有する細胞の位置に蓄積する。例えば、標識された本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質が局在した細胞および組織において対象内に蓄積する。
【０１４０】
したがって、本技術は、医学的状態の診断方法であって、（ａ）個体の細胞または体液において本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の結合を測定することによって、免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の発現をアッセイすることと、（ｂ）サンプル中に存在する免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の量を、標準参照と比較することとを含み、標準と比較した免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質レベルの増大または減少が、医学的状態を示す方法を提供する。
アフィニティー精製。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質をサンプルから精製するために使用され得る。いくつかの実施形態では、抗体は、固相支持体上に固定化されている。このような固相支持体の例として、ポリカーボネートなどのプラスチック、アガロースおよびセファロースなどの複合糖質、ポリアクリルアミドおよびラテックスビーズなどのアクリル樹脂が挙げられる。抗体をこのような固相支持体にカップリングする技術は、当技術分野で周知である（Weir et al., “Handbook of Experimental Immunology” 4th Ed., Blackwell Scientific Publications, Oxford, England, Chapter 10 (1986); Jacoby et al., Meth. Enzym. 34 Academic Press, N.Y. (1974)）。
抗原を抗体−支持体マトリックスに結合させる最も簡単な方法は、カラム中にビーズを集め、抗原溶液をカラムに流すことである。この方法の効率は、固定化抗体と抗原の間の接触時間に応じて変わり、これは低流速を使用することによって延長され得る。固定化抗体は、抗原を、それが流れ過ぎるときに捕捉する。あるいは、抗原は、抗原溶液を支持体（例えば、ビーズ）と混合することおよびスラリーを回転または振盪することによって抗体−支持体マトリックスと接触されてもよく、これによって、抗原と固定化抗体の間の最大接触が可能となる。結合反応が完了した後、ビーズの回収のために、スラリーはカラムに通される。適した洗浄バッファーを使用してビーズが洗浄され、次いで。純粋なまたは実質的に純粋な抗原が溶出される。
【０１４１】
対象の抗体またはポリペプチドは、ビーズなどの固相支持体にコンジュゲートされ得る。さらに、第１のビーズなどの固相支持体はまた、必要に応じて、ポリペプチドの支持体とのコンジュゲーションのための本明細書において開示されるものを含む任意の適した手段によって、第２のビーズまたは支持体であり得る第２の固相支持体にコンジュゲートされてもよい。したがって、ポリペプチドの固相支持体とのコンジュゲーションに関して本明細書において開示されるコンジュゲーション方法および手段のいずれも、第１の支持体の第２の支持体とのコンジュゲーションに適用されてもよく、第１および第２の固相支持体は、同一である場合も異なっている場合もある。
【０１４２】
ポリペプチドを固相支持体とコンジュゲートさせるために使用するための架橋結合剤であり得る適当なリンカーとして、支持体の表面上に存在する官能基と、またはポリペプチドとまたは両方と反応し得る種々の物質が挙げられる。架橋結合物質として有用である試薬として、ホモ二機能性、特に、ヘテロ二機能性試薬が挙げられる。有用な二機能性架橋結合物質として、それだけには限らないが、Ｎ−ＳＩＡＢ、ジマレイミド、ＤＴＮＢ、Ｎ−ＳＡＴＡ、Ｎ−ＳＰＤＰ、ＳＭＣＣおよび６−ＨＹＮＩＣが挙げられる。架橋結合物質は、ポリペプチドと固相支持体の間の選択的に切断可能な結合を提供するように選択され得る。例えば、感光性架橋剤、例えば、３−アミノ−（２−ニトロフェニル）プロピオン酸が、固相支持体からポリペプチドを切断するための手段として使用され得る（Brown et al., Mol. Divers, pp, 4-12 (1995); Rothschild et al., Nucl. Acids Res., 24:351-66 (1996)および米国特許第５，６４３，７２２号）。その他の架橋結合試薬は当技術分野で周知である（例えば、Wong (1991)、前掲;およびHermanson (1996)、前掲を参照のこと）。
【０１４３】
抗体またはポリペプチドは、ビーズなどの固相支持体上に、カルボキシル基官能基付与されたビーズと、ポリペプチドのアミノ末端の間で形成された共有結合アミド結合によって、または逆に、アミノ基官能基付与されたビーズと、ポリペプチドのカルボキシル末端の間で形成された共有結合アミド結合によって固定化され得る。さらに、二機能性トリチルリンカーは、支持体、例えば、Ｗａｎｇ樹脂などの樹脂上の４−ニトロフェニル活性エステルに、アミノ樹脂による樹脂上のアミノ基またはカルボキシル基によって付着され得る。二機能性トリチルアプローチを使用すると、固相支持体は、ポリペプチドが切断され、除去され得ることを確実にするために、ギ酸またはトリフルオロ酢酸などの揮発性酸を用いる処置を必要とし得る。このような場合には、ポリペプチドは、固相支持体のウェルの底に、または固相支持体の平坦な表面上にビーズのないパッチとして堆積されてもよい。マトリックス溶液を加えた後、ポリペプチドはＭＳ中に放出され得る。
ポリペプチドからアミノ連結されたトリチル基を切断するために、揮発性酸または適当なマトリックス溶液、例えば、３−ＨＰＡを含有するマトリックス溶液を使用することによって、酸不安定性リンカーとして疎水性トリチルリンカーも利用され得る。酸不安定性はまた、変更され得る。例えば、トリチル、モノメトキシトリチル、ジメトキシトリチルまたはトリメトキシトリチルは、ポリペプチドの適当なｐ−置換された、またはより酸不安定性のトリチルアミン誘導体に変更されてもよい、すなわち、トリチルエーテルおよびトリチルアミン結合がポリペプチドに行われる。したがって、ポリペプチドは、例えば、疎水性引力を破壊することによって、または必要に応じて、３−ＨＰＡなどのマトリックスが酸として作用する通常のＭＳ条件下を含む酸性条件下でトリチルエーテルもしくはトリチルアミン結合を切断することによって、疎水性リンカーから除去され得る。
【０１４４】
直交性に切断可能なリンカーもまた、第１の固相支持体、例えば、ビーズの第２の固相支持体への結合にとって、または対象のポリペプチドの固相支持体への結合にとって有用であり得る。このようなリンカーを使用すると、第１の固相支持体、例えば、ビーズが第２の固相支持体から、ポリペプチドを支持体から切断することなく選択的に切断され得、次いで、後の時間にポリペプチドがビーズから切断され得る。例えば、ＤＴＴなどの還元剤を使用して切断され得るジスルフィドリンカーが、ビーズを第２の固相支持体に結合するために使用されてもよく、ポリペプチドを支持体に固定化するために酸切断可能な二機能性トリチル基が使用されてもよい。必要に応じて、例えば、第１および第２の支持体間の連結は無傷なままで、ポリペプチドの固相支持体との連結が、最初に切断され得る。トリチルリンカーは、共有結合または疎水性コンジュゲーションを提供し得るが、コンジュゲーションの性質に関わらず、トリチル基は、酸性条件において容易に切断される。
【０１４５】
例えば、ビーズは、ビーズの固相支持体との高密度結合、またはポリペプチドのビーズとの高密度結合が促進されるような、長さおよび科学的性質を有するように選択され得る連結基によって第２の支持体に結合され得る。このような連結基は、例えば、「ツリー状」構造を有し、それによって、固相支持体上の付着部位あたりに多様な官能基を提供し得る。このような連結基の例として、ポリリジン、ポリグルタミン酸、ペンタエリスロールおよびトリス−ヒドロキシ−アミノメタンが挙げられる。
非共有結合関連。非共有結合相互作用によって、抗体またはポリペプチドは、固相支持体にコンジュゲートされ得る、または第１の固相支持体はまた、第２の固相支持体にコンジュゲートされ得る。例えば、磁化されることが可能である強磁性材料で作製された磁性ビーズは、磁性固相支持体に引き寄せられ得る、また磁場の除去によって支持体から放出され得る。あるいは、固相支持体は、イオン性または疎水性部分を提供されてもよく、これは、それぞれ、イオン性または疎水性部分の、ポリペプチド、例えば、付着されたトリチル基を含有するポリペプチドとの、または疎水性を有する第２の固相支持体との相互作用を可能にし得る。
【０１４６】
固相支持体はまた、特異的結合対のメンバーを提供されてもよく、したがって、相補性結合部分を含有するポリペプチドまたは第２の固相支持体にコンジュゲートされ得る。例えば、アビジンでまたはストレプトアビジンでコーティングされたビーズは、ビオチン部分が組み込まれたポリペプチドに、またはビオチンもしくはビオチンの誘導体、例えば、イミノビオチンでコーティングされた第２の固相支持体に結合され得る。
本明細書において開示される、そうでなければ当技術分野で公知の結合メンバーのいずれも逆転されてもよいということは理解されなくてはならない。したがって、ビオチンは、例えば、ポリペプチドまたは固相支持体のいずれかに組み込まれてもよく、逆に、アビジンまたはその他のビオチン結合部分がそれぞれ支持体またはポリペプチドに組み込まれる。本明細書において使用するために考慮されるその他の特異的結合対として、それだけには限らないが、ホルモンおよびその受容体、酵素およびその基質、ヌクレオチド配列およびその相補性配列、抗体および特異的に相互作用する抗原および当業者に公知のその他のこのような対が挙げられる。
Ａ．本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の診断的使用
全般。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、診断方法において有用である。そのようなものとして、本技術は、対象におけるシス−ｐＴ２３１−タウ活性の診断において抗体を使用する方法を提供する。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、任意のレベルのエピトープ結合特異性およびシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質に対する極めて高い結合親和性を有するように選択され得る。一般に、イムノアッセイでは標的ポリペプチドを除去することなく非特異的に結合した材料を除去するために、抗体の結合親和性が高いほど、よりストリンジェントな洗浄条件が実施され得る。したがって、診断アッセイにおいて有用な本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、普通、少なくとも１０8、１０9、１０10、１０11または１０12Ｍ-1の結合親和性を有する。さらに、診断試薬として使用される抗シス−ｐＴ２３１−タウは、少なくとも１２時間、少なくとも５（５）時間または少なくとも１（１）時間で標準条件下で平衡に達するための十分な動力学的結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）を有することが望ましい。
【０１４７】
抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、種々の標準アッセイ形式で免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質を検出するために使用され得る。このような形式として、免疫沈降、ウエスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、ラジオイムノアッセイおよび免疫測定アッセイが挙げられる。Harlow & Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Publications, New York, 1988)、米国特許第３，７９１，９３２号、同３，８３９，１５３号、同３，８５０，７５２号、同３，８７９，２６２号、同４，０３４，０７４号、同３，７９１，９３２号、同３，８１７，８３７号、同３，８３９，１５３号、同３，８５０，７５２号、同３，８５０，５７８号、同３，８５３，９８７号、同３，８６７，５１７号、同３，８７９，２６２号、同３，９０１，６５４号、同３，９３５，０７４号、同３，９８４，５３３号、同３，９９６，３４５号、同４，０３４，０７４号および同４，０９８，８７６号を参照のこと。生物学的サンプルは、対象の任意の組織または体液から得ることができる。特定の実施形態では、対象は、前記タウオパチーの初期段階である。一実施形態では、前記タウオパチーの初期段階は、対象から得られたサンプルにおけるシスｐＴ２３１−タウのレベルの上昇またはシス：トランスｐＴ２３１−タウ比の増大によって決定される。いくつかの実施形態では、方法は、対象から得られたサンプルにおけるＣＳＦ  ｔ−タウのレベル、ｐＴ１８１−タウ、Αβ４２またはＡｐｏＥ４レベルを決定することをさらに含む。特定の実施形態では、サンプルは、尿、血液、血清、血漿、唾液、羊水および脳脊髄液（ＣＳＦ）からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、対象は、脳外傷の反復の病歴を有する。
【０１４８】
免疫測定またはサンドイッチアッセイは、本技術の診断方法のための１つの形式である。米国特許第４，３７６，１１０号、同４，４８６，５３０号、同５，９１４，２４１号および同５，９６５，３７５号を参照のこと。このようなアッセイは、１種の抗体、例えば、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体または固相に固定化された抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の集団および別の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体または溶液中の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の集団を使用する。通常、溶液抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体または抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の集団は標識される。抗体集団が使用される場合には、集団は、標的ポリペプチド内の異なるエピトープ特異性と結合する抗体を含有し得る。したがって、固相および溶液抗体の両方に同一集団が使用され得る。抗シス−ｐＴ２３１−タウモノクローナル抗体が使用される場合には、固体および溶液相に対して、異なる結合特異性を有する第１および第２のシス−ｐＴ２３１−タウモノクローナル抗体が使用される。固相（「捕捉」とも呼ばれる）および溶液（「検出」とも呼ばれる）抗体は標的抗原と、いずれかの順序でまたは同時に接触され得る。固相抗体が第１に接触される場合には、アッセイは、フォワードアッセイであると呼ばれる。逆に、溶液抗体が第１に接触される場合には、アッセイは、リバースアッセイであると呼ばれる。標的が両抗体に同時に接触される場合には、アッセイは、同時アッセイと呼ばれる。シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質を、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体と接触させた後、サンプルは、普通、約１０分〜約２４時間で変わる期間、普通、約１時間である期間の間インキュベートされる。次いで、洗浄ステップが実施されて、診断試薬として使用されている抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体に特異的に結合していないサンプルの構成成分が除去される。固相および溶液抗体が別個のステップで結合される場合には、洗浄は、いずれかまたは両方の結合ステップの後に実施されてもよい。洗浄後、結合は、通常、標識された溶液抗体の結合によって固相に連結された標識を検出することによって定量化される。普通、抗体または抗体の集団の所与の対および所与の反応条件について、既知濃度の標的抗原を含有するサンプルから較正曲線が準備される。試験されているサンプル中の免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の濃度が次いで、較正曲線（すなわち、標準曲線）からの補間から読み取られる。解析物は、平衡で結合した標識された溶液抗体の量から、または平衡が到達される前の一連の時点での結合した標識された溶液抗体の動力学的測定によって測定され得る。このような曲線の傾斜は、サンプル中のシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の濃度の尺度である。
【０１４９】
上記の方法において使用するための適した支持体として、例えば、ニトロセルロースメンブレン、ナイロンメンブレンおよび誘導体化ナイロンメンブレンならびにまたアガロースなどの粒子、デキストランベースゲル、尿試験紙、微粒子、ミクロスフェア、磁性粒子、試験管、マイクロタイターウェル、ＳＥＰＨＡＤＥＸ（商標）（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、ニュージャージー州、ピスカタウェイ）などが挙げられる。固定化は、吸収によってでも、共有結合的付着によってでもよい。抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体が、アビジンなどの表面に結合されたリンカーへの付着のためにビオチンなどのリンカー分子につながれてもよい。
【０１５０】
Ｂ．本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の治療的使用
本技術の抗体は、病的に高レベルのリン酸化タウタンパク質のシス−コンホメーションを特徴とする神経疾患の処置にとって有用である。このような処置は、病的に高レベルのリン酸化タウのシス−コンホメーションを有すると同定された患者（例えば、本明細書において記載される方法によって診断されたもの）において、またはこのような病的レベルと関連するとわかっている疾患を有すると診断された患者において使用され得る。本技術の抗体によって処置され得る神経疾患の例として、アルツハイマー病（ＡＤ）、軽度認知障害（ＭＣＩ）、パーキンソン病（ＰＤ）、大脳皮質基底核変性症、ピック病、卒中、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、進行性核上性麻痺、前頭側頭葉変性症、リティコ−ボディグ病、タングル優位型認知症、髄膜血管腫症および亜急性硬化性全脳炎が挙げられる。
【０１５１】
本技術の組成物は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇と関連している神経疾患の処置において有用なその他の治療薬とともに使用され得る。例えば、本技術の抗体は、ドネペジル、リバスチグミン、ガランタミン、メマンチンおよび塩化リチウムからなる群から選択される少なくとも１種のさらなる治療薬とともに別個に、逐次または同時に投与され得る。
本技術の組成物は、単回ボーラスとしてそれを必要とする対象に投与されてもよい。あるいは、投薬計画は、タウＮＦＴの出現後種々の時間で実施される複数回投与を含んでもよい。
投与は、経口で、鼻腔内に、非経口的に（静脈内に、筋肉内に、腹膜内にまたは皮下に）、直腸性に、頭蓋内に、くも膜下腔内に、または局所的にを含む任意の適した経路で実施され得る。投与は、自己投与および別のものによる投与を含む。記載されるような医学的状態の処置の種々の様式は、完全な処置だけでなく、完全未満の処置も含み、いくつかの生物学的にまたは医学的に関連する結果が達成される「実質的」なものを意味するものとすることも理解されたい。
いくつかの実施形態では、本技術の抗体は、１回または複数回用量でそれを必要とする対象に投与され得る医薬製剤を含む。投与計画は、所望の応答（例えば、治療的応答）を提供するように調整され得る。
【０１５２】
通常、治療効果を達成するのに十分な本技術の抗体組成物の有効量は、約０．０００００１ｍｇ／体重１キログラム／日〜約１０，０００ｍｇ／体重１キログラム／日の範囲である。通常、投与量範囲は、約０．０００１ｍｇ／体重１キログラム／日〜約１００ｍｇ／体重１キログラム／日である。抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の投与については、投与量は、対象の体重の約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より普通は、０．０１〜５ｍｇ／ｋｇ毎週、２週毎または３週毎の範囲である。例えば、投与量は、１ｍｇ／体重１ｋｇまたは１０ｍｇ／体重１ｋｇ毎週、２週毎もしくは３週毎または１〜１０ｍｇ／ｋｇ毎週、２週毎もしくは３週毎の範囲内であり得る。一実施形態では、抗体の単回投与量は、０．１〜１０，０００マイクログラム／体重１ｋｇの範囲である。一実施形態では、担体中の抗体濃度は、送達されるミリリットルあたり０．２〜２０００マイクログラムの範囲である。例示的処置投与計画は、２週に１回または１カ月に１回または３〜６カ月毎に１回の投与を伴う。抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、複数回投与され得る。単回投与量の間の間隔は、毎時、毎日、毎週、毎月または毎年であり得る。間隔は、対象における抗体の血液レベルを測定することによって示されるので、不定期である場合もある。いくつかの方法では、投与量は、約７５μｇ／ｍＬ〜約１２５μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬ〜約１５０μｇ／ｍＬ、約１２５μｇ／ｍＬ〜約１７５μｇ／ｍＬまたは約１５０μｇ／ｍＬ〜約２００μｇ／ｍＬの対象における血清抗体濃度を達成するように調整される。あるいは、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、徐放製剤として投与されることがあり、この場合には、あまり頻繁ではない投与が必要とされる。投与量および頻度は、対象における抗体の半減期に応じて変わる。投与の投与量および頻度は、処置が予防的であるか治療的であるかに応じて変わる。予防的適用では、比較的低い投与量が、比較的頻繁ではない間隔で長期間にわたって投与される。治療的適用では、疾患の進行が低減もしくは終結されるまで、または対象が、疾患の症状の部分的もしくは完全寛解を示すまで、比較的短い間隔での比較的高い投与量が時には必要とされる。その後、患者は、予防的投与計画を投与され得る。
【０１５３】
毒性。最適には、本明細書において記載される抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の有効量（例えば、用量）は、対象に実質的な毒性を引き起こすことなく治療的利益を提供する。本明細書において記載される抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の毒性は、細胞培養または実験動物における標準製薬手順によって、例えば、ＬＤ50（集団の５０％に対する致死用量）またはＬＤ100（集団の１００％に対する致死用量）を決定することによって決定され得る。毒性および治療効果の間の用量比が治療係数である。これらの細胞培養アッセイおよび動物研究から得られたデータが、ヒトにおいて使用するための毒性ではない投与量範囲の策定において使用され得る。本明細書において記載される抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の投与量は、毒性がほとんどまたは全くない有効用量を含む循環濃度の範囲内にある。投与量は、使用される投与形および利用される投与経路に従ってこの範囲内で変わり得る。正確な処方、投与経路、および投与量は、対象の状態を鑑みて個々の医師によって選択され得る。例えば、Fingl et al., In: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1 (1975)を参照のこと。
【０１５４】
医薬組成物の製剤化。本技術の方法に従って、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、投与に適した医薬組成物に組み込まれ得る。医薬組成物は、一般に、組換えまたは実質的に精製された天然抗体および医薬上許容される担体を、対象への投与に適した形態で含む。医薬上許容される担体は、投与される個々の組成物の一部において、ならびに組成物を投与するために使用される個々の方法によって決定される。したがって、抗体組成物を投与するための医薬組成物のさまざまな適した製剤化がある（例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, PA 18th ed., 1990を参照のこと）。医薬組成物は、一般に、無菌で、実質的に等張性として、米国食品医薬品局のすべての適正製造基準（ＧＭＰ）規制に完全準拠して製剤化される。
【０１５５】
用語「医薬上許容される」、「生理学的に許容される」およびそれらの文法的変形は、それらが、組成物、担体、希釈剤および試薬を指す場合、同義的に使用され、材料が組成物の投与を妨げる程度に、望ましくない生理学的効果をもたらすことなく、対象に投与可能であることを表す。例えば、「医薬上許容される賦形剤」とは、一般に、安全な、非毒性の、望ましい医薬組成物の調製において有用である賦形剤を意味し、獣医学的使用に、ならびにヒト医薬的使用に許容される賦形剤を含む。このような賦形剤は、固体、液体、半固体、またはエアゾール組成物の場合には気体であり得る。「医薬上許容される塩およびエステル」とは、医薬上許容される、所望の薬理学的特性を有する塩およびエステルを意味する。このような塩として、組成物中に存在する酸性プロトンが、無機または有機塩基と反応可能である場合に形成され得る塩が挙げられる。適した無機塩として、アルカリ金属、例えば、ナトリウムおよびカリウム、マグネシウム、カルシウムおよびアルミニウムと形成されたものが挙げられる。適した有機塩として、アミン塩基、例えば、エタノールアミン、ジエタノールアミン、トリエタノールアミン、トロメタミン、Ｎ−メチルグルカミンなどといった有機塩基と形成されたものが挙げられる。このような塩としてまた、無機酸（例えば、塩酸および臭化水素酸）および有機酸（例えば、酢酸、クエン酸、マレイン酸およびアルカン−およびアレン−スルホン酸、例えば、メタンスルホン酸およびベンゼンスルホン酸）と形成された酸付加塩が挙げられる。医薬上許容されるエステルとして、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体中に存在するカルボキシ、スルホニルオキシおよびホスホンオキシ基から形成されたエステル、例えば、Ｃ1-6  アルキルエステルが挙げられる。２つの酸性基が存在する場合には、医薬上許容される塩またはエステルは、モノ−酸−モノ−塩またはエステルまたはジ−塩またはエステルである場合があり、同様に、２つ以上の酸性基が存在する場合には、このような基のうちいくつかまたはすべてが塩化またはエステル化され得る。この技術において名付けられた抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、非塩化もしくは非エステル化形態で、または塩化および／もしくはエステル化形態で存在する可能性があり、このような抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の命名は、元の（非塩化および非エステル化）化合物およびその医薬上許容される塩およびエステルの両方を含むように意図される。また、本技術の特定の実施形態は、２つ以上の立体異性形で存在する可能性があり、このような抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の命名は、このような立体異性体のすべての単一立体異性体およびすべての混合物（ラセミか否かに関わらず）を含むように意図される。当業者ならば、特定の薬物および本技術の組成物の投与の適当なタイミング、順序および投与量を決定するのに困難はないであろう。
【０１５６】
このような担体または希釈剤の例として、それだけには限らないが、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液および５％ヒト血清アルブミンが挙げられる。リポソームおよび硬化油などの非水性ビヒクルも使用され得る。医薬上活性な物質のためのこのような媒体および化合物の使用は、当技術分野で周知である。任意の従来媒体または化合物が、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体不適合である場合を除いて、組成物におけるその使用が考慮される。補足的活性化合物も組成物中に組み込まれる。
【０１５７】
本技術の医薬組成物は、その意図される投与経路と適合するように製剤化される。本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体組成物は、非経口、局所、静脈内、経口、皮下、動脈内、皮内、経皮、直腸、頭蓋内、くも膜下腔内、腹腔内、鼻腔内または筋肉内経路によって、または吸入剤として投与され得る。抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、種々のアクチン−または微小繊維−関連疾患を含む種々の疾患の処置において少なくとも部分的に有効であるその他の物質と組み合わせて投与されてもよい。
非経口、皮内または皮下適用のために使用される溶液または懸濁液として、以下の構成成分を挙げることができる：注射水、生理食塩水溶液、硬化油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコールまたはその他の合成溶媒などの滅菌希釈剤、ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌化合物、アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化物質、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）などのキレート化化合物、酢酸、クエン酸またはリン酸などのバッファーおよび塩化ナトリウムまたはデキストロースなおの張力の調整のための化合物。ｐＨは、塩酸または水酸化ナトリウムなどの酸または塩基を用いて調整され得る。非経口調製物は、ガラスまたはプラスチック製のアンプル、ディスポーザブルシリンジまたは複数可用量バイアルに封入され得る。
【０１５８】
注射用使用に適した医薬組成物として、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散物および滅菌注射用溶液または分散物の即時調製のための滅菌散剤が挙げられる。静脈内投与のために、適した担体として、生理食塩水、静菌性水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ  ＥＬ（商標）（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州、パーシッパニー）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は、無菌でなくてはならず、容易な注射性（ｓｙｒｉｎｇｅａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなくてはならない。製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されなくてはならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの適した混合物を含有する溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散物の場合には必要な粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、種々の抗菌薬および抗真菌薬化合物、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって達成され得る。多くの場合、組成物中に等張性化合物、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどの多価アルコール、塩化ナトリウムを含むことが望ましい。注射用組成物の吸収延長は、組成物中に吸収を遅延する化合物、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを含めることによってもたらされ得る。
【０１５９】
滅菌注射用溶液は、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を、必要に応じて、上記で列挙された成分のうち１種または組合せとともに、適当な溶媒中に必要な量で組み込むことと、それに続く、濾過滅菌によって調製され得る。一般に、分散物は、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を、基本分散媒および上記で列挙されたものから必要なその他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に組み込むことによって調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌散剤の場合には、調製する方法は、事前に滅菌濾過されたその溶液から、有効成分および任意のさらなる所望の成分の散剤が得られる真空乾燥および凍結乾燥である。本技術の抗体は、有効成分の持続性または拍動性放出を可能にするような方法で製剤化され得る、デポー注射液または留置調製物の形態で投与され得る。
【０１６０】
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または食用担体を含む。それらは、ゼラチンカプセル中に封入されてもよく、錠剤に打錠されてもよい。経口治療的投与目的で、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、賦形剤とともに組み込まれ、錠剤、トローチ剤またはカプセル剤の形態で使用されてもよい。経口組成物はまた、マウスウォッシュとして使用するために流体担体を使用して調製されてもよく、流体担体中の化合物は経口的に適用され、素早く動かされ（ｓｗｉｓｈ）、吐出されるか飲み込まれる。医薬上適合する結合化合物および／またはアジュバント材料は、組成物の一部として含まれ得る。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、以下の成分または同様の性質の化合物のうちいずれも含有し得る：微晶質セルロース、トラガカントゴムまたはゼラチンなどの結合剤、デンプンまたはラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌまたはコーンスターチなどの崩壊化合物、ステアリン酸マグネシウムまたはＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースまたはサッカリンなどの甘味化合物またはペパーミント、サリチル酸メチルまたはオレンジフレーバーなどの矯味化合物。
吸入による投与のために、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、適した噴射剤、例えば、二酸化炭素などのガスを含有する加圧容器もしくはディスペンサーまたは噴霧器からエアゾールスプレーの形態で送達される。
【０１６１】
全身投与は、経粘膜または経皮手段によるものであり得る。経粘膜または経皮投与のために、製剤中で浸透されるべき障壁に適当な浸透剤が使用される。このような浸透剤は、一般に、当技術分野で公知であり、例えば、経粘膜投与のための、洗浄剤、胆汁酸塩およびフシジン酸誘導体が挙げられる。経粘膜投与は、鼻腔スプレーまたは坐剤の使用によって達成され得る。経皮投与のためには、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、当技術分野で一般に知られるような、軟膏（ｏｉｎｔｍｅｎｔ）、軟膏（ｓａｌｖｅ）、ゲルまたはクリーム中に製剤化される。
抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体はまた、坐剤（例えば、ココアバターおよびその他のグリセリドなどの従来の坐剤基剤を用いて）または直腸送達のための保留浣腸の形態で医薬組成物として調製され得る。
【０１６２】
一実施形態では、抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体は、インプラントおよびマイクロカプセル化送達系を含む放出制御製剤などの抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体を身体からの迅速な排出から保護する担体を用いて調製される。エチレン酢酸ビニル、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステルおよびポリ乳酸などの生分解性、生体適合性ポリマーが使用され得る。このような製剤の調製方法は、当業者には明らかとなろう。材料はまた、Ａｌｚａ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎおよびＮｏｖａ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、Ｉｎｃから商業的に得ることができる。リポソーム懸濁液（ウイルス抗原に対するモノクローナル抗体を有する感染細胞を標的とするリポソームを含む）も、医薬上許容される担体として使用され得る。これらは、当業者に公知の、例えば、米国特許第４，５２２，８１１号に記載されるような方法に従って調製され得る。
【０１６３】
１．Ｃ．キット
本技術は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の診断および／または処置のためのキットであって、本技術の少なくとも１種の抗体またはその機能的バリアント（例えば、置換バリアント）を含むキットを提供する。本技術のキットの上記の構成成分は、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の診断および／または処置のために、適した容器に詰められ、ラベルが付けられてもよい。上記の構成成分は、水性の、任意に無菌の溶液として、または復元のための凍結乾燥された、任意に無菌の製剤として、単位または複数回用量容器、例えば、密閉されたアンプル、バイアル、ボトル、シリンジおよび試験管中で貯蔵され得る。キットは、医薬組成物をより大きな容量にするために希釈するのに適した希釈剤を保持する第２の容器をさらに含み得る。適した希釈剤として、それだけには限らないが、医薬組成物の医薬上許容される賦形剤および生理食塩水溶液が挙げられる。さらに、キットは、医薬組成物を希釈するための説明書および／または希釈されるか否かに関わらず、医薬組成物を投与するための説明書を含み得る。容器は、ガラスまたはプラスチックなどの種々の材料から形成されてもよく、無菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、皮下注射針によって穿刺され得るストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルであり得る）。キットは、リン酸緩衝生理食塩水、リンガー溶液およびデキストロース溶液などの医薬上許容されるバッファーを含むより多くの容器をさらに含み得る。その他のバッファー、希釈剤、フィルター、ニードル、シリンジ、適した宿主のうち１種以上のための培養培地を含む、商業的およびユーザー観点から望ましいその他の材料をさらに含み得る。キットは、治療薬または診断薬の市販のパッケージ中に習慣的に含まれる説明書を含んでもよく、これは、このような治療薬または診断薬の、例えば、適応症、用法、投与量、製造、投与、禁忌症に関する情報および／または使用に関わる警告を含有する。
キットは、生物学的サンプル、例えば、それだけには限らないが、例えば、血清、血漿、リンパ、嚢胞液、尿、便、脳脊髄液、腹水または血液を含む、および身体組織の生検サンプルを含む任意の体液における免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の存在を検出するのに有用である。例えば、キットは、生物学的サンプル中のシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と結合可能な１種以上の本技術の抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体（またはその抗原結合断片）、サンプル中のシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の量を決定する手段およびサンプル中の免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の量を標準と比較する手段を含み得る。抗シス−ｐＴ２３１−タウ抗体の１種以上は標識され得る。キット構成成分（例えば、試薬）は、適した容器中に詰められ得る。キットは、免疫反応性シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質を検出するためのキットを使用するための説明書をさらに含み得る。
【０１６４】
抗体ベースのキットについては、キットは、例えば、１）第１の抗体、例えば、シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質と結合する、固相支持体に付着された本技術のシス−ｐＴ２３１−タウ抗体と、任意に、２）シス−ｐＴ２３１−タウタンパク質または第１の抗体のいずれかと結合する、検出可能な標識にコンジュゲートされる第２の異なる抗体とを含み得る。
キットはまた、例えば、緩衝剤、防腐剤またはタンパク質安定化剤を含み得る。キットは、検出可能な標識を検出するのに必要な構成成分、例えば、酵素または基質をさらに含み得る。キットはまた、アッセイされ、試験サンプルと比較され得る、対照サンプルまたは一連の対照サンプルを含有し得る。キットの各成分は、個々の容器内に封入されてもよく、種々の容器のすべては、キットを使用して実施されるアッセイの結果を解釈するための説明書とともに単一パッケージ内にあり得る。本技術のキットは、キット容器上または中に書面の製品を含有し得る。書面の製品には、それを必要とする対象におけるシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の処置のための、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質の検出のための、キット中に含有される試薬の使用方法が記載されている。特定の実施形態では、試薬の使用は、本技術の方法に従い得る。
【実施例】
【０１６５】
本技術は、以下の実施例によってさらに例示されるが、これは決して制限と解釈されてはならない。以下の実施例は、本技術の例示的コンホメーション特異的リン酸化タウ（ｐＴ２３１−タウ）抗体の調製、特性決定および使用を実証する。実施例１〜１２は、本技術のキメラおよびヒト化抗体の製造およびその結合特異性の特性決定を実証する。
【０１６６】
（実施例１）
マウスＰＴ−１１３モノクローナル抗体の可変領域の配列
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッド）を供給業者のプロトコールに従って使用して、およそ１０6個のマウスＰＴ−１１３ハイブリドーマ細胞（ＷＯ２０１４１５２１５７を参照のこと）から全ＲＮＡを抽出した。５’−ＲＡＣＥのためのオリゴｄＴプライミングｃＤＮＡを、ＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カリフォルニア州、マウンテンビュー）を供給業者のプロトコールに従って使用して合成した。重鎖および軽鎖の可変ドメインｃＤＮＡを、マウス重鎖および軽鎖定常領域と特異的にアニーリングする３’プライマーおよびＳＭＡＲＴｅｒ  ＲＡＣＥ  ｃＤＮＡ増幅キットにおいて提供された５’−ＲＡＣＥプライマーを使用して、Ｐｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、ウォルサム）を用いてポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅した。ＶＨの増幅のための遺伝子特異的３’プライマーとしてＭＣＧ２ｂ（５’−ＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧ−３’）を使用した。ＶＬ増幅のためには、ＭＣＫ（５’−ＧＡＴＧＧＡＴＡＣＡＧＴＴＧＧＴＧＣＡＧＣ−３’）を使用した。
増幅されたＶＨおよびＶＬ  ｃＤＮＡを、配列決定のために  ｐＪｅｔ１．２ベクター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にサブクローニングした。ＤＮＡシーケンシングを、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  （ケンタッキー州、ルイビル）でプライマーとしてＪｅｔＲｅｖ（５’−ＡＡＧＡＡＣＡＴＣＧＡＴＴＴＴＣＣＡＴＧＧＣＡＧ−３’）を用いて実施した。いくつかの重鎖および軽鎖クローンをシーケンシングし、通常のマウス重鎖および軽鎖可変領域に対して相同なユニーク配列を同定した。それぞれ、図１および２に、マウスＰＴ−１１３  ＩｇＧ２ｂ／カッパモノクローナル抗体の重鎖および軽鎖可変領域（ＶＨおよびＶＬ、それぞれ）のヌクレオチド配列が、その推定されるアミノ酸配列と並んで示されている。
【０１６７】
図３は、Ｋａｂａｔ定義に基づく、マウスＰＴ−１１３  ＶＨドメインの各アミノ酸残基の位置および相補性決定領域（ＣＤＲ）の配置を示す。図３はまた、ＰＴ−１１３  ＶＨドメインとその予測されるマウス親の生殖系列ＶセグメントＩＧＨＶ１Ｓ１２７＊０１およびそのＪＨ２セグメントの間のアミノ酸配列のアラインメントを示す。アスタリスクは、ＰＴ−１１３ＶＨとＩＧＨＶ１Ｓ１２７＊０１アミノ酸配列の間の相違を示し、これは、体細胞高頻度変異による可能性が最も高い。
図４は、Ｋａｂａｔ定義に基づく、マウスＰＴ−１１３  ＶＬドメインの各アミノ酸残基の位置およびＣＤＲの配置を示す。図４はまた、ＰＴ−１１３  ＶＬドメインとその予測されるマウス親の生殖系列ＶセグメントＩＧＫＶ１−１１０＊０２（２）およびそのＪκ１セグメントの間のアミノ酸配列のアラインメントを示す。アスタリスクは、ＰＴ−１１３  ＶＬとＩＧＫＶ１−１１０＊０２アミノ酸配列の間の相違を示し、これは、体細胞高頻度変異による可能性が最も高い。
【０１６８】
（実施例２）
キメラＰＴ−１１３  ＩｇＧ１抗体の構築
マウスＰＴ−１１３抗体のＶＨドメインをコードする遺伝子を、コーディング領域の後ろにスプライスドナーシグナル、５’末端のＳｐｅＩ部位および３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むエキソンとして設計した（図５）。同様に、マウスＰＴ−１１３抗体のＶＬドメインをコードする遺伝子を、コーディング領域の後ろにスプライスドナーシグナル、５’末端のＮｈｅＩ部位および３’末端のＥｃｏＲＩ部位を含むエキソンとして設計した（図６）。ＰＴ−１１３ＶＨおよびＶＬエキソンにおいて、哺乳動物において稀に使用されるコドンを、頻繁に使用される対応するコドンによって置き換えた。
ＰＴ−１１３  ＶＨおよびＶＬ遺伝子をＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎ（アラバマ州、ハンツビル）によって合成した。ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＶＨ遺伝子のために）またはＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ（ＶＬ遺伝子のために）を用いる消化後、得られたＰＴ−１１３  ＶＨおよびＶＬ断片を、キメラＰＴ−１１３（ＣｈＰＴ−１１３）ＩｇＧ１／カッパ抗体の製造のためにヒトガンマ−１およびカッパ定常領域を保持する哺乳動物発現ベクターにクローニングした。得られた発現ベクター、ｐＣｈＰＴ−１１３の模式的構造が図７に示されている。
【０１６９】
（実施例３）
ヒト化ＰＴ−１１３  ＶＨおよびＶＬ遺伝子の設計
ヒト化ＰＴ−１１３  ＶＨおよびＶＬアミノ酸配列の設計を、以下に記載されるように実施した。
マウスＰＴ−１１３  ＶＨフレームワークに相同なヒトＶＨ配列をＧｅｎＢａｎｋデータベース内で照会し、ヒトＡＦ１７４０９２  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：ＡＦ１７４０９２、Wang & Stollar, Clin. Immunol. 93:132-142 (1999)において記載される）によってコードされるＶＨ配列をヒト化のためのアクセプターとして選択した。ＰＴ−１１３  ＶＨのＣＤＲ配列をまずＡＦ１７４０９２  ＶＨの対応する位置に移した。次いで、ＰＴ−１１３可変ドメインの三次元モデルが、ＣＤＲと大幅な接触を示したフレームワーク位置４８、６７、６９、７１、９３および９４で、ＡＦ１７４０９２  ＶＨのアミノ酸残基を、マウスＰＴ−１１３  ＶＨの対応する残基によって置き換えた。得られたヒト化ＶＨドメインのアミノ酸配列、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１が、マウスＰＴ−１１３およびヒトＡＦ１７４０９２  ＶＨ配列とともに図８に示されている。
【０１７０】
マウスＰＴ−１１３  ＶＨにおける位置６７のＡｌａおよび位置６９のＬｅｕは、ＣＤＲに近接して配置され、ＣＤＲ構造の形成にとって重要であると予測される一方で、ＰＴ−１１３  ＣＤＲの構造の詳細解析は、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１中の位置６７および６９の２個のアミノ酸残基のいずれか一方またはおそらくは両方が、ヒトアクセプターＡＦ１７４０９２  ＶＨ配列の対応する残基によって置き換えられ得る可能性を示唆した。免疫原性の可能性をさらに低減するために、３つのさらなるヒト化ＶＨドメイン（ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ２、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ３およびＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ４）を設計した。ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ２では、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１中の位置６７のＡｌａが、Ｖａｌに変更された。ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ３では、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１中の位置６９のＬｅｕが、Ｍｅｔに変更された。ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ４では、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１中の位置６７のＡｌａおよび位置６９のＬｅｕが、それぞれＶａｌおよびＭｅｔに変更された。ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ４のアミノ酸配列は、図８に示されている。
マウスＰＴ−１１３  ＶＬフレームワーク配列を用いる相同性検索に基づいて、Ｍ９９６０８  ｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｍ９９６０８、Weng et al. J. Immuno. 149:2518-2529 (1992)に記載される）によってコードされるヒトＶκ領域を、ヒト化のためのアクセプターとして選択した。ＰＴ−１１３  ＶＬのＣＤＲ配列をまずＭ９９６０８  ＶＬの対応する位置に移した。フレームワーク領域において、マウス残基とのアミノ酸置換は必要ではなかった。得られたヒト化ＶＬ、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＬ１のアミノ酸配列は、マウスＰＴ−１１３およびヒトＭ９９６０８  ＶＬ配列とともに図９に示されている。
【０１７１】
（実施例４）
ヒト化ＰＴ−１１３  ＶＨおよびＶＬ遺伝子の構築
ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１をコードする遺伝子を、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、５’末端のＳｐｅＩ部位および３’末端のＨｉｎｄＩＩＩ部位を含むエキソンとして設計した（図１０）。マウスＰＴ−１１３  ＶＨエキソン（図５）中のシグナルペプチド配列およびスプライスドナーシグナルは、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１のために使用した。
ＨｕＰＴ−１１３  ＶＬ１をコードする遺伝子を同様に、シグナルペプチド、スプライスドナーシグナル、５’末端のＮｈｅＩ部位および３’末端のＥｃｏＲＩ部位を含むエキソンとして設計した（図１４）。マウスＰＴ−１１３  ＶＬエキソン（図６）中のシグナルペプチド配列およびスプライスドナーシグナルは、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＬ１のために使用した。
【０１７２】
ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１およびＶＬ１遺伝子を、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ  Ｏｐｅｒｏｎによって合成した。ＳｐｅＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ（ＶＨのために）またはＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ（ＶＬのために）を用いる消化後、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１およびＨｕＰＴ−１１３  ＶＬ１遺伝子を、ヒトＩｇＧ１／カッパ形態での製造のために哺乳動物発現ベクター中の対応する部位にサブクローニングした。得られた発現ベクターｐＨｕＰＴ−１１３Ａは、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１およびＶＬ１（ＨｕＰＴ−１１３Ａ）を含有するヒト化ＰＴ−１１３  ＩｇＧ１／カッパ抗体を発現する。
ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ４エキソンをコードする遺伝子（図８）を、Higuchi, R., Using PCR to Engineer DNA. In PCR Technology: Principles and Applications for DNA Amplification. 61-67 (H. A. Erlich, ed., New York, NY (1989))に記載される重複伸長ＰＣＲ法を使用して、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１遺伝子の部位特異的突然変異誘発によって作製した。ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ４のヌクレオチド配列は、その推定されるアミノ酸配列とともに、それぞれ、図１１、１２および１３に示されている。ｐＨｕＰＴ−１１３Ａ発現ベクター中のＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ１遺伝子を、ＨｕＰＴ−１１３  ＶＨ２、ＶＨ３およびＶＨ４によって置き換えて、それぞれｐＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ｐＨｕＰＴ−１１３ＣおよびｐＨｕＰＴ−１１３Ｄを作製した。ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３ＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）抗体は、それぞれｐＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ｐＨｕＰＴ−１１３ＣおよびｐＨｕＰＴ−１１３Ｄベクターから発現される。
【０１７３】
（実施例５）
抗原結合についてのＣｈＰＴ−１１３、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３ＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）抗体の特性決定
ＣｈＰＴ−１１３、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３ＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）抗体の、ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチド（Ｈ−ＫＶＡＶＶＲＴ（ＰＯ3Ｈ2）ＸＰＫＳＰＳ−ＯＨ、Ｘ＝５，５−ジメチル−Ｌ−プロリン）との結合を、ＥＬＩＳＡによって特性決定した。これら５種の抗体の製造のために、ｐＣｈＰＴ−１１３、ｐＨｕＰＴ−１１３Ａ、ｐＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ｐＨｕＰＴ−１１３ＣおよびｐＨｕＰＴ−１１３Ｄベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カリフォルニア州、カールスバッド）を供給業者のプロトコールに従って使用して、ヒト胚性腎臓細胞株、ＨＥＫ２９３に個別にトランスフェクトした。ＨＥＫ２９３細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＨｙＣｌｏｎｅ、ユタ州、ローガン）を含有するＤＭＥ培地において、７．５％  ＣＯ2インキュベーター中、３７℃で増殖させた。
【０１７４】
一過性にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞の培養上清における抗体発現を、ＥＬＩＳＡによって解析した。ＥＬＩＳＡプレートを、ＰＢＳ中、１００μｌ／ウェルの１／２，０００希釈したヤギ抗ヒトＩｇＧ、Ｆｃγ特異的ポリクローナル抗体（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、ミズーリ州、セントルイス）とともに４℃で一晩コーティングし、洗浄バッファー（０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）を用いて洗浄し、３００μｌ／ウェルのブロッキングバッファー（２％スキムミルクおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）を用いてブロッキングした。洗浄バッファーを用いる洗浄後、結合バッファー（１％スキムミルクおよび０．０２５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有するＰＢＳ）で適宜希釈された１００μｌ／ウェルの試験サンプルを、ＥＬＩＳＡプレートに適用した。適当なヒト化ＩｇＧ１／カッパ抗体を、標準として使用した。ＥＬＩＳＡプレートを１時間室温でインキュベートし、洗浄バッファーを用いて洗浄した後、結合した抗体を１００μｌ／ウェルの１／２，０００希釈されたＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトカッパ鎖ポリクローナル抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州、バーミンガム）を使用して検出した。０．５時間室温でインキュベートし、洗浄バッファーを用いて洗浄した後、１００μｌ／ウェルのＡＢＴＳ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することによって発色を開始し、１００μｌ／ウェルの２％シュウ酸を用いて停止した。吸光度は、４０５ｎｍで読み取った。
【０１７５】
ＣｈＰＴ−１１３、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３ＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）抗体の、ｐＴｈｒ−Ｄｍｐとの結合を、ＥＬＩＳＡによって試験した。ＭａｘｉＳｏｒｐ  ＥＬＩＳＡプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州、ウォルサム）のコーティングのために、２，２，２−トリフルオロエタノール中、５０μｌの１μｇ／ｍｌのｐＴｈｒ−Ｄｍｐ（ロット番号１５５６８８０、ＡｎａＳｐｅｃ、Ｆｒｅｍｏｎｔ、ＣＡ）を、各ウェルに適用した。３７℃で一晩ペプチド溶液を乾燥させた後、ＥＬＩＳＡバッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５％スキムミルク、０．４％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ  ７．６））を用いてウェルをブロッキングした。ＥＬＩＳＡバッファー中、種々の濃度の試験抗体（５０μｌ／ウェル）をロードし、室温で２時間インキュベートした。洗浄バッファー（１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、０．４％ウシ血清アルブミンおよび０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０を含有する１０ｍＭ  ＴｒｉｓＨＣｌ（ｐＨ  ７．６））を用いてウェルを洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗ヒトカッパ鎖抗体（ＥＬＩＳＡバッファーで  １／２，０００希釈された）を各ウェルに適用した。室温で１時間インキュベートした後、洗浄バッファーを用いてウェルを洗浄した。５０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、カタログ番号３４０２８、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いて発色を開始し、５０μｌ／ウェルの２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を用いて停止した。吸光度は、４５０ｎｍで測定した。
【０１７６】
ＣｈＰＴ−１１３、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３ＣおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）抗体の、ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドとの結合パターンが、図１５に示されている。これら５種の抗体の間でｐＴｈｒ−Ｄｍｐ結合パターンに有意な相違は観察されなかった。さらなる解析のために、４種のヒト化ＰＴ−１１３抗体の中でも最小数のマウスフレームワーク残基を保持するＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）を選択した。
【０１７７】
（実施例６）
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体の構築
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）抗体の潜在的な細胞破壊的活性を排除するために、ＩｇＧ抗体のエフェクター機能を排除するとわかっている（Xu et al., Cell Immunol. 200:16-26 (2000); Hezareh et al.,J. Virol. 75:12161-12168 (2001)）位置２３４および２３５での（ＫａｂａｔのＥｕ番号付け）ＬｅｕからＡｌａへのアミノ酸置換を、重複伸長ＰＣＲ法（Ｈｉｇｕｃｈｉ，Ｒ（１９８９）、前掲を参照のこと）を使用して部位特異的突然変異誘発によってｐＨｕＰＴ−１１３Ｄ中のＣＨ２定常領域に導入した。得られたプラスミドｐＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡは、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体を発現する。
【０１７８】
（実施例７）
ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体をもたらすＣＨＯ−Ｋ１安定なトランスフェクションの作製
ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ  （Ｉ）抗体を安定に産生する細胞株を得るために、発現ベクターｐＣｈＰＴ−１１３、ｐＨｕＰＴ−１１３ＤおよびｐＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡを、チャイニーズハムスター卵巣細胞株ＣＨＯ−Ｋ１（ＡＴＣＣ、バージニア州、マナサス）の染色体中にそれぞれ導入した。ＣＨＯ−Ｋ１細胞をＳＦＭ４ＣＨＯ培地（ＨｙＣｌｏｎｅ、ユタ州、ローガン）において、７．５％  ＣＯ2インキュベーター中３７℃で増殖させた。ＣＨＯ−Ｋ１への安定なトランスフェクションは、エレクトロポレーションによって実施した。トランスフェクションの前に、各発現ベクターをＦｓｐＩを使用して直線化した。およそ２．５×１０6個の細胞を、２０μｇの直線化されたプラスミドを用いてトランスフェクトし、ＳＦＭ４ＣＨＯ培地に懸濁し、細胞の適当な希釈後、いくつかの９６ウェルプレートにプレーティングした。４８時間後、安定な形質導入体の単離のために１０μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加した。選択の開始のおよそ１０日後、上記のようにサンドイッチＥＬＩＳＡによって、形質導入体の培養上清を抗体産生についてアッセイした。
高レベルのＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡ（Ｉ）抗体を産生するＣＨＯ−Ｋ１安定形質導入体（それぞれ、ＣＨＯ−Ｋ１−ＣｈＰＴ−１１３  １Ｄ１１、ＣＨＯ−Ｋ１−ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  １Ｄ６およびＣＨＯ−Ｋ１−ＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡ  １Ｄ２）を、ＰＣＲマイコプラズマ検出セット（Ｔａｋａｒａ  Ｂｉｏ  ＵＳＡ、ウィスコンシン州、マディソン）を用いて試験し、マイコプラズマの存在について陰性とわかった。
【０１７９】
（実施例８）
ＣｈＰＴ−１１３およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１／カッパ（Ｉ）抗体の精製
ＣＨＯ−Ｋ１−ＣｈＰＴ−１１３  １Ｄ１１、ＣＨＯ−Ｋ１−ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  １Ｄ６およびＣＨＯ−Ｋ１−ＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡ  １Ｄ２細胞の各々を、ローラーボトル中でＳＦＭ４ＣＨＯ中で約１０6個／ｍｌの密度まで増殖させ、１／１０容量の３５ｍｇ／ｍｌのＣｅｌｌ  Ｂｏｏｓｔ  ４（ＨｙＣｌｏｎｅ、ユタ州、ローガン）を与え、細胞生存力が５０％未満になるまでさらに増殖させた。遠心分離および濾過後、培養上清をプロテインＡセファロースカラム（ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ，ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、ピスカタウェイ、ＮＪ）上にロードした。カラムをＰＢＳを用いて洗浄し、その後、０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ（ｐＨ３．０）を用いて抗体を溶出した。１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８）を用いる中和後、溶出された抗体のバッファーを透析によってＰＢＳに変更した。抗体濃度を、２８０ｎｍでの吸光度（１．４ＯＤ＝１ｍｇ／ｍｌ）を測定することによって決定した。５００ｍｌの培養上清からの収量は、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１について２０ｍｇ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）について３８ｍｇおよびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）について１６ｍｇであった。
【０１８０】
精製されたＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体を、標準手順に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥによって特性決定した。還元条件下での解析は、これらの抗体の各々は、およそ５０ｋＤａの分子量を有する重鎖およびおよそ２５ｋＤａの分子量を有する軽鎖からなることを示した（図１６）。各抗体の純度は、９５％より高いと思われた。
【０１８１】
（実施例９）
ＣＨＯ−Ｋ１−ＣｈＰＴ−１１３  １Ｄ１１、ＣＨＯ−Ｋ１−ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  １Ｄ６およびＣＨＯ−Ｋ１−ＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡ  １Ｄ２細胞から単離された重鎖および軽鎖ｍＲＮＡ配列のｃＤＮＡ解析
ＣＨＯ−Ｋ１−ＣｈＰＴ−１１３  １Ｄ１１、ＣＨＯ−Ｋ１−ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  １Ｄ６およびＣＨＯ−Ｋ１−ＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡ  １Ｄ２細胞によって産生された重鎖および軽鎖が正しいものであることを、ｃＤＮＡシーケンシングによって確認した。これらの細胞から、ＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して全ＲＮＡを抽出し、オリゴｄＴプライミングｃＤＮＡは、ＰｒｏｔｏＳｃｒｉｐｔ  Ｍ−ＭｕＬＶ  Ｆｉｒｓｔ  Ｓｔｒａｎｄ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、マサチューセッツ州、イプスウィッチ）を供給業者のプロトコールに従って使用して合成した。ガンマ重鎖のコーディング領域を、プライマーとしてＣＭＶ２およびＪＮＴ０９８ならびにＰｈｕｓｉｏｎ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ断片をゲル精製し、プライマーとしてＣＭＶ２およびＪＮＴ０９８を用いるシーケンシングに付した。同様に、カッパ軽鎖のコーディング領域を、ＣＭＶ２およびＪＮＴ０２６を使用して増幅した（図１７）。ゲル精製ＤＮＡ断片は、プライマーとしてＣＭＶ２およびＪＮＴ０２６を用いるシーケンシングに付した。
ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１重鎖、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１軽鎖、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）重鎖、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）軽鎖、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）重鎖およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）軽鎖のコーディング領域の得られたヌクレオチド配列は、ｐＣｈＰＴ−１１３、ｐＨｕＰＴ−１１３ＤおよびｐＨｕＰＴ−１１３Ｄ−ＡＡベクター中の対応する配列とすべて完全に対応していた（図１８〜２２）。
【０１８２】
（実施例１０）
マウスＰＴ−１１３  ＩｇＧ２ｂおよびＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１抗体の抗原結合
精製されたマウスＰＴ−１１３  ＩｇＧ２ｂおよびＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１抗体の、以下の４種のＴｈｒ２３１−タウペプチド（ＡｎａＳｐｅｃ（カリフォルニア州、フリーモント）によって合成された）との結合を、ＥＬＩＳＡによって解析した：
ｐＴｈｒ−Ｄｍｐ（Ｈ−ＫＶＡＶＶＲＴ（ＰＯ3Ｈ2）ＸＰＫＳＰＳ−ＯＨ、Ｘ＝５，５−ジメチル−Ｌ−プロリン）（ロット番号１５５６８８０）
ｐＴｈｒ−Ｐｒｏ（Ｈ−ＫＶＡＶＶＲＴ（ＰＯ3Ｈ2）ＰＰＫＳＰＳ−ＯＨ）（ロット番号１５５６８７８）
ｐＴｈｒ−Ａｌａ（Ｈ−ＫＶＡＶＶＲＴ（ＰＯ3Ｈ2）ＡＰＫＳＰＳ−ＯＨ）（ロット番号１５５６８８１）
ｎｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ（Ｈ−ＫＶＡＶＶＲＴＰＰＫＳＰＳ−ＯＨ）（ロット番号１５５６８７９）
【０１８３】
ＭａｘｉＳｏｒｐプレートのウェルを、５０μｌ／ウェルの、１μｇ／ｍｌで２，２，２−トリフルオロエタノールに溶解された各ペプチドを用いてコーティングした。ＥＬＩＳＡのその後の手順は、マウスＰＴ−１１３  ＩｇＧ２ｂの検出を、ＨＲＰがコンジュゲートされたヤギ抗マウスカッパ鎖抗体（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州、バーミンガム）を用いて実施した点を除いて実施例５に記載されている。
マウスＰＴ−１１３  ＩｇＧ２ｂおよびＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１の、４種のペプチドとの結合パターンは、それぞれ図２３および２４に示されている。４種の試験されたＴ２３１−タウペプチドとの結合の全体的な傾向は、これら２種の抗体の間で同様であった。特に、マウスＰＴ−１１３  ＩｇＧ２ｂおよびＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１は両方とも、ｐＴｈｒ−Ｄｍｐ−タウペプチド（シス−コンホメーションでロックされた）と強力に結合し、ｐＴｈｒ−Ａｌａ−タウペプチド（トランス−コンホメーションでロックされた）とは不十分に結合した。さらに、図２３および２４は、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１のｎｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−タウペプチド（すなわち、非リン酸化Ｔ２３１−タウペプチド）との結合は、マウスＰＴ−１１３のものよりも弱かったことを示す。この結果は、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１抗体が、マウスＰＴ−１１３抗体を用いた場合に観察されるものと比較して、非リン酸化Ｔ２３１−タウペプチドと免疫学的交差反応性をあまり示さないことを実証する。
【０１８４】
（実施例１１）
マウスＰＴ−１１３  ＩｇＧ２ｂおよびＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１抗体を用いる競合結合アッセイ
マウスおよびキメラＰＴ−１１３抗体の親和性を、競合結合アッセイによって評価した。ＭａｘｉＳｏｒｐプレートのウェルを、ｐＴｈｒ−Ｄｍｐ−タウペプチドを用いてコーティングし、実施例５に記載されるようなＥＬＩＳＡバッファーを用いてブロッキングした。ウェルを洗浄した後、ＥＬＩＳＡバッファー中の、２μｇ／ｍｌのビオチン化マウスＰＴ−１１３  ＩｇＧ２ｂ抗体と種々の濃度の競合抗体（１０μｇ／ｍｌおよび段階３倍希釈）の混合物の５０μｌを各ウェルに適用した。室温で２時間インキュベートし、洗浄バッファーを用いて洗浄した後、室温で１時間のインキュベーションのために、各ウェルに５０μｌのＨＲＰがコンジュゲートされたストレプトアビジン（ＥＬＩＳＡバッファーで  １／２，０００希釈された；ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈ、アラバマ州、バーミンガム）を適用した。洗浄バッファーを用いて洗浄した後、５０μｌ／ウェルのＴＭＢ基質を用いて発色を開始し、５０μｌ／ウェルの２Ｎ  Ｈ2ＳＯ4を用いて停止した。吸光度は、４５０ｎｍで読み取った。
競合結合ＥＬＩＳＡの結果が、図２５に示されている。マウスＰＴ−１１３  ＩｇＧ２ｂを用いた場合の競合パターンは、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１を用いた場合と同様であり、これは、ｐＴｈｒ−Ｄｍｐ−タウペプチド（シス−コンホメーションでロックされた）との結合の親和性が、これら２種の抗体間で極めて同様であることを示す。しかし、ビオチン化ＰＴ−１１３の結合の完全なブロッキングは、使用された最高濃度（１０μｇ／ｍｌ）でさえ観察されなかった。
【０１８５】
（実施例１２）
抗原結合についてのＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体の解析
実施例５および１０に記載される手順に従ってＥＬＩＳＡによって、精製ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体の、４種のＴ２３１−タウペプチド、ｐＴｈｒ−Ｄｍｐ、ｐＴｈｒ−Ｐｒｏ、ｐＴｈｒ−Ａｌａおよびｎｐ−Ｔｈｒ−Ｐｒｏの各々との抗原結合を、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１のものと比較した。図２６に示されるように、これら３種の抗体は、４種のＴ２３１−タウペプチドの各々を用いた場合に同様の結合パターンを示した。特に、ｐＴｈｒ−Ｄｍｐ−タウペプチド（シス−コンホメーションでロックされた）との結合は、ＣｈＰＴ−１１３  ＩｇＧ１、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（Ｉ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（Ｉ）抗体の間でほとんど区別できなかった。
これらの結果は、本技術の抗体は、リン酸化トレオニン２３１−タウタンパク質（シス−ｐＴ２３１−タウ）のシス−コンホメーションに特異的に結合し、したがって、それを必要とする対象におけるシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置する方法において有用であることを示す。
【０１８６】
（実施例１３）
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ（ＩＩ）抗体
一過性トランスフェクション。１２ｍｇの精製二重遺伝子ベクターを使用して、２×１０9個のＧＳ−ＫＯ  ＣＨＯ細胞をトランスフェクトした。トランスフェクトされた細胞を、（ＩＩ）の独自のフィードおよび１ｍＭグルタミンを補給した培地中、３×１０6個細胞／ｍｌで播種し、５Ｌ（Ｇｅｎｅｒｏｎ、９３１１１６）振盪フラスコ中、３１℃、５％  ＣＯ2、８５％湿度および１４０ｒｐｍで培養した。
一次回収。２Ｌ培養物を８０００ｒｐｍでの遠心分離によって回収し、０．２２μｍ濾過によって濾過滅菌し、その後プロテインＡ精製した。
Ｏｃｔｅｔ  ＱＫｅによるプロテインＡアッセイ。清澄化した細胞培養上清のサンプルをプロテインＡ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、１８−５０１０）を使用してＯｃｔｅｔ  ＱＫｅで解析した。０．２２μｍフィルターを用いて濾過された上清サンプルの２００μＬのアリコートを、９６ウェルプレート中にロードし、８点標準曲線に対して定量化した。標準曲線の範囲の外側の濃度を有するサンプルを、希釈後に再解析した。
【０１８７】
プロテインＡアフィニティークロマトグラフィー。一過性の培養のために、ＡＫＴ  Ａ精製装置（１０ｍＬ／分で実行）上の４つの５ｍＬ  ＨｉＴｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲＥカラムのうち１つを使用して清澄化された上清を精製した。すべての場合において、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１２５ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．０を用いてカラムを平衡化し、５０ｍＭリン酸ナトリウムおよび１Ｍ塩化ナトリウムｐＨ７．０を用いて洗浄し、続いて、平衡を再導入し、その後、溶出した。分子は、１０ｍＭギ酸ナトリウム、ｐＨ３．５を用いて溶出した。溶出され画分を、２×ＰＢＳバッファー、ｐＨ７．４を用いて中和することによって直ちにｐＨ調整し、希水酸化ナトリウム溶液の添加によっておよそｐＨ７．２まで滴定した。
ＳＥ−ＨＰＬＣ。Ｚｏｒｂａｘ  ＧＦ−２５０  ９．４ｍｍ  ＩＤ×２５ｃｍカラム（Ａｇｉｌｅｎｔ）を使用しＡｇｉｌｅｎｔ  １２００シリーズＨＰＬＣシステムでＳＥ−ＨＰＬＣによって２連サンプルを解析した。１ｍｇ／ｍｌサンプル（またはサンプルが＜１ｍｇ／ｍＬである場合にはストック濃度）の８０μｌのアリコートを、注入し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、５００ｍＭアルギニン、ｐＨ６．０中、１ｍＬ／分で１５分間で実行した。Ｃｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェアを使用して可溶性凝集体レベルを解析した。バッファー成分から生じるシグナルを、ブランクバッファー注入によって解析し、別に示されない限り、データ解析において省いた。
【０１８８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析。ＮｕＰａｇｅ  ４ｘ  ＬＯＳサンプルバッファー（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＰ０００７）およびＮｕＰａｇｅ  Ｉ  Ｏｘサンプル還元剤（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＰ０００９）と混合することによって、解析のために還元サンプルを調製し、７０℃で１０分間インキュベートした。非還元サンプルのためには、還元剤および加熱インキュベーションは省いた。サンプルを、ＮｕＰａｇｅ  ＭＥＳ  ＳＯＳランニングバッファーを用いて変性条件下で１．５ｍｍ  ＮｕＰａｇｅ４〜１２％  Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  Ｎｏｖｅｘプレキャストゲル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＮＰ０３１５／６）で電気泳動した。ＳｅｅＢｌｕｅ  Ｐｌｕｓ  ２事前染色分子量標準（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＬＣ５９２５）の１０μｌのアリコートおよび１ｍｇ／ｍｌの対照抗体をゲルに含めた。各サンプルの１μｇをゲルにロードした。電気泳動すると、ＩｎｓｔａｎｔＢｌｕｅ（ＴｒｉｐｌｅＲｅｄ、ＩＳＢＯ  １Ｌ）を用いて室温で３０分間ゲルを染色した。染色されたゲルのイメージを、ＢｉｏＳｐｅｃｔｒｕｍ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＵＶＰ）で解析した。
プロテインＡ精製結果。単一の５ｍＬカラムを使用して最初の精製を実施した。これは、Ｏｃｔｅｔ測定に従っておよそ２５％に相当する６０．８ｍｇの材料の回収および樹脂１グラムあたりおよそ１２ｍｇの抗体の結合能をもたらした。
【０１８９】
４つのタンデム５ｍＬ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳＵＲＥカラムを使用してその後の精製を実施し、３種の抗体すべて（すなわち、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ））の製品力価を超える結合能をもたらす。３種の抗体製品すべての精製は、単一の明確に定義されたピークの溶出をもたらした。結合していない画分のＯｃｔｅｔ解析は、すべての製品が回収されたことを示した。
図４７によって、良好なレベルの純度を有する抗体製品の存在が確認される。抗体製品は、対照ｌｇＧ１抗体（レーン１０および１１）と十分に比較される。すべての製品について、還元条件下で重鎖（＞４９ｋＤａ）および軽鎖（＜２８ｋＤａ）の大きさと一致する２つのバンドが観察され（レーン５、７および９）、対照抗体（レーン１１）について見られたバンドと匹敵する。アッセイ間対照ｌｇＧ１抗体（レーン１０および１１）の結果は、予測された通りであった。非還元条件下では、すべての製品（レーン２、４、６および８）について、同一条件下で実行された対照ＩｇＧ１抗体（レーン１０）と匹敵する９８ｋＤａおよび１９８ｋＤａの間のタンパク質種バンドが見られ、全長抗体の予測分子量と一致する。ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）のバッチ４５５−０３０４１７−０１については、非還元サンプルにおいておよそ１９８ｋＤａのバンドが見られ、これは、凝集体の存在を示し、ＳＥ−ＨＰＬＣの結果と一致する。
【０１９０】
（実施例１４）
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体によるＦｃＲ活性化
この研究は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）は、ＦｃＲを活性化しない（すなわち、本技術の抗体は、異なるＦｃ受容体を発現する免疫細胞の活性化を誘導しない）ことを示す。
方法および材料
オボアルブミンは、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、使用まで＋２〜８℃で貯蔵した。抗オボアルブミン（ウサギポリクローナル）は、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入し、使用まで−２０℃で貯蔵した。抗オボアルブミン（マウスモノクローナルＩｇＧ２ａ）は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄから購入し、使用まで＋２〜８℃で貯蔵した。
以下のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体：ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）を使用した。
【０１９１】
ヒトタウタンパク質に由来する以下のペプチドを使用した：
１）ＷＴ−ｐＴｈｒ−Ｐｒｏ  （ＫＶＡＶＶＲｐＴＰＰＫＳＰＳ）、ヒトタウ由来の１０アミノ酸配列。
２）ｐＴｈｒ−Ｄｍｐ（ＫＶＡＶＶＲｐＴ（５，５−ジメチル−Ｌ−プロリン）ＰＫＳＰＳ）、ＷＴペプチドに類似した１０アミノ酸「シスロックされた」配列。
両ペプチド（ペプチドあたり≧１０ｍｇ）を凍結乾燥し、復元まで−８０℃で貯蔵した。ペプチドは、２，２，２−トリフルオロエタノール（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中、１ｍｇ／ｍＬの濃度で復元し、複数アリコート中、−８０℃で貯蔵し、凍結−解凍サイクル数を最小化した。ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドはまた、Ｌｉｇｈｔｅｎｉｎｇ−Ｌｉｎｋ（登録商標）Ｒａｐｉｄビオチンキット（Ｉｎｎｏｖａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してビオチン化し、使用まで−２０℃で貯蔵した。
【０１９２】
細胞株。ＴＨＰ−１細胞（ＤＳＭＺ）は、ＴＨＰ−１培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０（（ＩＩ））＋１０％熱不活性化（ｈｉ）ＦＢＳ（（ＩＩ）））中で培養し、週に３回継代した。ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８バリアントおよびルシフェラーゼ遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）をＪｕｒｋａｔ培養培地（ＲＰＭＩ１６４０（（ＩＩ））、１０％  ｈｉＦＢＳ（（ＩＩ））、１００μｇ／ｍＬハイグロマイシン（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、２５０μｇ／ｍＬ  Ｇ−４１８スルフェート溶液（Ｐｒｏｍｅｇａ）、１ｍＭピルビン酸ナトリウム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、０．１ｍＭ  ＭＥＭ非必須アミノ酸（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ））中で培養し、週に３回継代した。
細胞株ＦｃＲ発現。ＴＨＰ−１またはＪｕｒｋａｔ細胞を回収し、冷ＣｅｌｌＷＡＳＨ溶液（ＢＤ）で洗浄し、ＣＤ１６（ＦｃγＲＩＩＩ）、ＣＤ３２（ＦｃγＲＩＩ）およびＣＤ６４（ＦｃγＲ１）の細胞表面発現について染色した。非特異的結合を最小化するために染色抗体の添加の前にＦｃＲブロッキングステップ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）も含めた。ＦｃＲ発現は、抗ＣＤ１６  Ａ６４７、抗ＣＤ３２  ＰＥおよび抗ＣＤ６４  Ａ４８８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を使用するフローサイトメトリーによって調べ、Ｇｕａｖａ（登録商標）ｅａｓｙＣｙｔｅ  ８ＨＴシステム（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で解析した。
【０１９３】
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ酵素結合免疫吸着測定法。ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェルを、２，２，２−トリフルオロエタノールまたはＤＰＢＳ（（ＩＩ））に溶解した１、１０または１００μＬ／ウェルのｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドとともに＋４℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルを、洗浄バッファー（ＤＰＢＳ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ））を用いて洗浄し、ＤＰＢＳ＋１％  ＢＳＡ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて室温で６０分間ブロッキングした。ウェルを洗浄バッファーを用いて洗浄し、１００μｌ／ウェルの、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ））のうち１種を２連で室温で６０分間添加した。ウェルを洗浄バッファーを用いて洗浄した後、結合した抗体をビオチン化抗ヒトＦｃ抗体およびストレプトアビジン−ＨＲＰを用いて検出し、シグナルを１００μＬのＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて検出した。５０μＬのＴＭＢ停止溶液（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を添加することによって反応を停止し、吸光度を４５０ｎｍで測定した。
【０１９４】
ＴＨＰ−１サイトカインアッセイ。アッセイプレート（Ｌｕｍｉｔｒａｃ  ６００、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）を、ＤＰＢＳ中、１００μＬ／ウェルのオボアルブミンまたは２，２，２−トリフルオロエタノールもしくはＤＰＢＳに溶解されたｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドとともに＋４℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルをＤＰＢＳを用いて洗浄し、２００μＬのブロッキング培地（ＲＰＭＩ＋５％超低ＩｇＧ血清（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて室温で６０分間ブロッキングした。ブロッキング後、ウェルあたり１００μｌの抗体（抗オボアルブミンまたはＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）））を室温で６０分間添加した。いくつかのアッセイでは、結合していない抗体を、洗浄バッファーで洗浄することによって除去し、ＴＨＰ−１細胞をウェルあたり１００μｌアッセイ培地（ＲＰＭＩ＋０．５％超低ＩｇＧ血清）で添加し、３７℃、５％  ＣＯ2、加湿雰囲気中で２４時間インキュベートした。上清サンプルを回収し、３００ｘ  Ｇで１０分間遠心分離して、任意の細胞を回収し、その後、サイトカイン解析のために−８０℃で貯蔵した。上清中のサイトカインレベル（ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６）を、ＭＡＧＰＩＸ（登録商標）マルチプレキシングプラットフォーム（Ｌｕｍｉｎｅｘ）で．Ｍｉｌｌｉｐｌｅｘ（登録商標）アッセイ（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）によってアッセイした。
【０１９５】
Ｊｕｒｋａｔ  ＦｃＲＩＩＩａ活性化アッセイ。アッセイプレートを、ＤＰＢＳ中、１００μＬ／ウェルのオボアルブミンまたは２，２，２−トリフルオロエタノールもしくはＤＰＢＳに溶解されたｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドとともに＋４℃で一晩コーティングした。次いで、ウェルをＤＰＢＳを用いて洗浄し、２００μＬのブロッキング培地（ＲＰＭＩ＋５％超低ＩｇＧ血清（ＧＥ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ））を用いて室温で６０分間ブロッキングした。ブロッキング後、ウェルあたり１００μＬの抗体（抗オボアルブミンまたはＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）））を室温で６０分間添加した。いくつかのアッセイでは、結合していない抗体を、洗浄バッファーで洗浄することによって除去し、Ｊｕｒｋａｔ細胞をウェルあたり１００μＬアッセイ培地（ＲＰＭＩ＋０．５％超低ＩｇＧ血清）で添加し、３７℃、５％  ＣＯ2、加湿雰囲気中で２４時間インキュベートした。ＦｃγＲＩＩＩａ活性化は、ＢｉｏＧｌｏ（商標）試薬を１０分間添加することによって評価し、ＲＬＵは、ＧｌｏＭａｘ（登録商標）ルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定した。
【０１９６】
結果
ＴＨＰ−１細胞Ｆｃ受容体発現。ＴＨＰ−１細胞を３種の主要なＦｃ受容体（ＣＤ１６、ＣＤ３２およびＣＤ６４）に対する抗体を用いて染色して、細胞表面発現を評価した。図３０Ａ〜Ｃは、各ＦｃＲのヒストグラムプロットを示し、非染色細胞は赤色で、抗ＦｃＲ抗体で染色された細胞は青色である。ＴＨＰ−１細胞は、高レベルのＣＤ３２（ＦＣγＲＩＩ）およびＣＤ６４（ＦＣγＲＩ）を発現するが、ＣＤ１６（ＦＣγＲＩＩＩ）はほとんどまたは全く発現しないと思われる。これは、ＴＨＰ−１アッセイが、主にＣＤ３２およびＣＤ６４のＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）結合および活性化を評価し、Ｊｕｒｋａｔアッセイが、ＣＤ１６のみによってＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）結合および活性化を評価したことを示す。
Ｊｕｒｋａｔ  ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６）Ｖ１５８細胞をまた、フローサイトメトリーによって評価したが、ＦｃＲ発現は検出されなかった（示されないデータ）。これは、ＪｕｒｋａｔではＣＤ１６レベルが極めて低く、シグナル伝達は、ルシフェラーゼリポーター遺伝子アッセイによって通常検出されるので、予測されることであった。製造業者は、抗ＣＤ１６阻止抗体が添加される場合にシグナル伝達の阻害を示すデータを提供し、これは、ルシフェラーゼシグナルが、ＣＤ１６依存性であることを示す。
免疫複合体（ＩＣ）によるＴＨＰ−１細胞の、陽性対照によって誘導された活性化。ＩＣを固定化して（プレートを抗原を用いてコーティングすることによって）、架橋結合およびＦｃＲのその後の活性化を増大した。ＩＣは、オボアルブミンタンパク質および抗オボアルブミン抗体を含有する。２種の異なる抗オボアルブミン抗体を別個に使用して、ＩＣ；１つのマウスモノクローナル抗体および１つのウサギポリクローナル抗体を作製した。ウサギポリクローナルは、免疫細胞を刺激すると知られているが、マウスモノクローナルは、これらのアッセイでは試験されなかった。マウスモノクローナル抗体を、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体のモノクローナル性を模倣するために含めた。
【０１９７】
図３１Ａ〜Ｄは、ＴＨＰ−１細胞の活性化に対するオボアルブミンＩＣコーティング密度および細胞数の影響を示す。オボアルブミンＩＣを、オボアルブミンコーティングされたウェルおよびウサギポリクローナル抗オボアルブミン抗体を用いて作製した（オボアルブミンを用いてコーティングされたウェルへの抗体の添加後、ウェルを洗浄しなかったので、いくつかの条件では、幾分かの遊離抗体が存在する可能性がある）。上の２つのプロットは、漸増量のＩＣ（０．１、１および１０μｇ／ｍＬのオボアルブミンコーティングおよび５０μｇ／ｍＬの固定量のウサギ抗体）およびＴＨＰ−１細胞（５，０００および５０，０００個細胞／ウェル）に応じた、ＴＮＦα分泌を示し、下の２つのプロットは、ＩＬ−６分泌を示す。オボアルブミンＩＣの量およびＴＨＰ−１細胞数を増大することは、アッセイの間に分泌されたＴＮＦαおよびＩＬ−６のレベルの増大につながった。
【０１９８】
図３２Ａ〜Ｄ（ＴＮＦα放出）および図３３Ａ〜Ｄ（ＩＬ−６放出）は、オボアルブミンＩＣを作製するためにマウスモノクローナル抗体を使用する、ＩＣ濃度およびＴＨＰ−１細胞数のさらなる最適化を示す。図３２Ａ〜Ｂおよび３３Ａ〜Ｂは、５０，０００個ＴＨＰ−１細胞／ウェルを使用し、図３２Ｃ〜Ｄおよび３３Ｃ〜Ｄは、１５０，０００個ＴＨＰ−１細胞／ウェルを使用した。図３２ＡおよびＣならびに３３ＡおよびＣは、ウェルをコーティングするために０．１μｇ／ｍＬのオボアルブミンが使用された場合のデータを示す。図３２ＢおよびＤならびに３３ＢおよびＤは、ウェルをコーティングするために１０μｇ／ｍＬのオボアルブミンが使用された場合のデータを示す。図３２Ａ〜Ｄおよび３３Ａ〜Ｄは、１５０，０００個ＴＨＰ−１細胞／ウェルおよび１０μｇ／ｍＬでコーティングされるオボアルブミンを使用することが最高レベルのサイトカイン放出をもたらし、ＴＨＰ−１細胞活性化は、抗体用量依存性であったことを示す。
データは、ＴＨＰ−１サイトカインアッセイを使用して、抗体の、固定化されたタンパク質抗原との結合後に細胞と結合し、続いて活性化する能力を評価できることを示す。
【０１９９】
Ｊｕｒｋａｔ細胞の、陽性対照によって誘導された活性化。この研究は、十分に特性決定された免疫複合体（ＩＣ）によるＪｕｒｋａｔ細胞におけるＦｃＲ活性化を示した。ＩＣを固定化して（プレートを抗原を用いてコーティングすることによって）架橋結合およびＦｃＲのその後の活性化を増大した。ＩＣは、オボアルブミンタンパク質および抗オボアルブミン抗体を含有する。２種の異なる抗オボアルブミン抗体を別個に使用して、ＩＣ；１つのマウスモノクローナル抗体および１つのウサギポリクローナル抗体を作製した。これまでこれらのアッセイでは、抗体は試験されなかった。マウスモノクローナル抗体を、この研究において使用されるＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ））のモノクローナル性を模倣するために含めた。
図３４Ａ〜Ｂは、ＦｃＲの活性化に対するオボアルブミンＩＣ濃度およびＪｕｒｋａｔ細胞数の影響を示す。オボアルブミンＩＣを、オボアルブミンコーティングされたウェル（１０μｇ／ｍＬ）およびウサギポリクローナルおよびマウスモノクローナル抗オボアルブミン抗体の両方の濃度の範囲を用いて作製した（オボアルブミンを用いてコーティングされたウェルへの抗体の添加後、ウェルを洗浄しなかったので、いくつかの条件では、幾分かの遊離抗体が存在する可能性がある）。図３４Ａは、５０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞／ウェルを使用したＦｃＲ活性化を示し、図３４Ｂは、１００，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞／ウェルを使用した活性化を示す。両プロットは、ウサギポリクローナル抗体によるＦｃＲ活性化を示すが、マウスモノクローナル抗体を用いた場合は示さず、１００，０００個のＪｕｒｋａｔは、５０，０００個のＪｕｒｋａｔ細胞／ウェルよりも強い応答を生成した。
【０２００】
データは、Ｊｕｒｋａｔ  ＦｃＲ活性化アッセイを使用して、抗体の、固定化されたタンパク質抗原との結合後にＦｃγＲＩＩＩａと結合し、続いて活性化する能力を評価できることを示す。データはまた、マウス抗体は、ＦｃγＲＩＩＩａの活性化ではウサギ抗体ほど強力ではないことを示唆する。
ＨｕＰＴ−１１３Ｄペプチド結合ＥＬＩＳＡ。３種のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体すべて（ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ））が、ＩＣを成功裏に形成でき、結合ＥＬＩＳＡを使用して、ｐＴｈｒ−ＤｍｐペプチドとのＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体結合を評価した。２，２，２−トリフルオロエタノール中、１、１０および１００μｇ／ｍＬのｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドを用いてコーティングされたＥＬＩＳＡプレートを用いて各ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体の用量応答を作製した。
【０２０１】
図３５は、各ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドコーティング濃度での各抗体の結合曲線を示す。３種のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体すべてが、極めて同様の結合曲線をもたらし、ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドコーティング濃度の増大の影響はなく、これは、１μｇ／ｍＬの濃度がすでにウェルを飽和していることを示唆した。すべての条件のＥＣ５０値は、およそ２１ｎｇ／ｍＬ（１４０ｐＭ）であった。
ＴＨＰ−１サイトカインアッセイにおけるＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドコーティング最適化。この研究は、ＴＨＰ−１細胞に対して２，２，２−トリフルオロエタノールの何らかの影響があるか否かを調べるために実施した。ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドを、２，２，２−トリフルオロエタノールまたはＤＰＢＳのいずれかで１μｇ／ｍＬに希釈し、アッセイプレートのウェルをコーティングするために使用した。コーティング後、ＤＰＢＳを用いてウェルを洗浄し、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）の濃度の範囲を添加し、ＩＣを形成させ、その後、ＴＨＰ−１細胞を添加した（１５０，１０００個細胞／ウェル）。２４時間後、ＴＮＦαおよびＩＬ−６のレベルを評価した。
図３６Ａは、ＴＮＦα分泌のレベルを示し、図３６Ｂは、ＩＬ−６分泌のレベルを示す。データは、両サイトカインの分泌が用量依存性に増大され、２，２，２−トリフルオロエタノールとＤＰＢＳペプチドコーティング条件の間に有意差はなかったことを示す。
【０２０２】
Ｊｕｒｋａｔ  ＦｃＲ活性化アッセイにおけるＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドコーティング最適化。この研究は、Ｊｕｒｋａｔ細胞に対して２，２，２−トリフルオロエタノールの何らかの影響があるか否かを調べるために実施した。ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドを、２，２，２−トリフルオロエタノールまたはＤＰＢＳのいずれかで１μｇ／ｍＬに希釈し、アッセイプレートのウェルをコーティングするために使用した。コーティング後、ＤＰＢＳを用いてウェルを洗浄し、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）の濃度の範囲を添加し、ＩＣを形成させ、その後、Ｊｕｒｋａｔ細胞を添加した（１００，０００個細胞／ウェル）。２４時間後、ＦｃγＲＩＩＩａの活性化をＢｉｏＧｌｏ（登録商標）試薬を用いて評価した。
図３７は、ＦｃγＲＩＩＩａ活性化のレベルおよび各ペプチドコーティング条件を示す。２，２，２−トリフルオロエタノールとＤＰＢＳペプチドコーティング条件の間に有意差はなく、どちらもＦｃγＲＩＩＩａを活性化できないと思われた。
【０２０３】
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＴＨＰ−１サイトカインアッセイ１。各ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ））の、ＴＨＰ−１細胞アッセイにおいてサイトカイン分泌を誘導する能力を比較するために、天然およびビオチン化ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドの両方を使用して、ＩＣを作製した。天然ペプチド（ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチド）を使用して、１μｇ／ｍＬでアッセイプレートのウェルをコーティングし、ビオチン化ペプチドを使用して、ストレプトアビジンプレコーティングプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）のウェルをコーティングした。ペプチドを用いて一晩コーティングした後、両プレートを洗浄し、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）の段階希釈を３連でプレートに添加した。ＴＨＰ−１細胞が添加される時にＩＣのみが存在することを確実にするためにＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体が添加された後にさらなる洗浄ステップを含めた。このさらなる洗浄ステップによって、阻止抗体として働き、ＦｃＲを架橋結合するプレート上に固定化されたＩＣを妨げ得る遊離ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体はすべて除去された。
【０２０４】
図３８Ａ〜Ｃは、各ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ））および天然ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドによるサイトカイン放出（ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６）の誘導を示す。図３８Ｄ〜Ｆは、各ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体およびビオチン化ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドによるサイトカイン放出（ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６）の誘導を示す。ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）は、青色で示され、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）は赤色で示され、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）は、緑色で示される。３種のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体すべてが、サイトカイン放出を用量依存性に誘導したが、各抗体は、場合に異なる曲線を生成する傾向があり、ＩｇＧ１抗体は特に、より低い最大レベルのサイトカイン放出をもたらした。
しかし、ＩＣを作製するために天然ペプチドが使用された場合には、３種のサイトカインのすべてにおいて同様のパターンが見られ、ＩｇＧ１抗体は最大を示し、ＩｇＧ１−ＡＡは、サイトカイン誘導のための最低の効力を示した。ビオチン化ペプチドプロットは、同様のパターンを示し、ＩｇＧ１−ＡＡは、サイトカイン放出の最少の効力刺激装置であった。
【０２０５】
天然およびビオチン化ペプチドの結果を直接比較すると、ビオチン化ペプチドがサイトカイン放出のバックグラウンドレベルを増大することが示された。これは、ビオチン化ペプチド自体ではなくプレートをコーティングするために使用されるストレプトアビジンによる可能性が高い。ＴＨＰ−１細胞活性化のバックグラウンドレベルをできる限り低く維持するために、その後のアッセイは、天然ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドを使用してプレートをコーティングし、ＩＣを作製した。
図３９は、３種のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（天然ペプチド）について算出されたＥＣ５０値を示す。ＩｇＧ１抗体は、３種のサイトカインすべてについて最低のＥＣ５０値を有しており、ＩｇＧ１−ＡＡは最大であり、これは、ＩｇＧ１−ＡＡ抗体が、ＴＨＰ−１細胞からのサイトカインの放出を誘導する最低の能力を有することを示唆した。
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  Ｊｕｒｋａｔ  ＦｃＲ活性化アッセイ１。各ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ））の、Ｊｕｒｋａｔ細胞アッセイにおいてＦｃγＲＩＩＩａを活性化する能力を比較するために、天然ｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドを使用して、ＩＣを作製した（１、１０または１００μｇ／ｍＬで天然ペプチドを使用してアッセイプレートのウェルをコーティングした）。次いで、プレートを洗浄し、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）の段階希釈をプレートに３連で添加した。Ｊｕｒｋａｔ細胞が添加される時にＩＣのみが存在することを確実にするためにＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体が添加された後にさらなる洗浄ステップを含めた。このさらなる洗浄ステップによって、阻止抗体として働き、ＦｃγＲＩＩＩａを架橋結合するプレート上に固定化されたＩＣを妨げ得る遊離ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体はすべて除去された。
図３９は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体の各々によるＦｃγＲＩＩＩａの活性化を示す。ＩｇＧ１抗体は、用量依存性にＪｕｒｋａｔ細胞を活性化でき、ペプチドコーティング濃度の各々について同様の曲線が生成された。ＩｇＧ１−ＡＡおよびＩｇＧ４抗体は、Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化を全く示さなかった。
【０２０６】
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＴＨＰ−１サイトカインアッセイ２。ＴＨＰ−１サイトカインアッセイを反復して、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）抗体が、実際、サイトカイン放出のあまり強力ではないインデューサーであることを確認した。プレートを１μｇ／ｍＬの天然ペプチドを用いてコーティングし、各抗体のより大きな用量範囲を含めた。ＴＨＰ−１細胞の添加の前に任意の結合していない抗体を洗浄除去して、ＩＣのみが存在することを確実にした。
図４１Ａ〜Ｃは、３種のサイトカインの各々についての各ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体のプロットを示す。プロットは、図３８Ａ〜Ｆにおいて上記で見られたものと同様であり、ＩｇＧ１は、ＴＨＰ−１細胞におけるサイトカイン放出の最も強力な、ＩｇＧ１−ＡＡは最も強力でないインデューサーである。
【０２０７】
図４２は、３種のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体について算出されたＥＣ５０値を示す。ＩｇＧ１抗体は、３種のサイトカインすべてについてＩｇＧ１−ＡＡおよびＩｇＧ４抗体よりも低いＥＣ５０値を有しており、これは、ＩｇＧ１−ＡＡおよびＩｇＧ４抗体が、ＴＨＰ−１細胞からサイトカインの放出を誘導するより低い能力を有することを示唆した。
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  Ｊｕｒｋａｔ  ＦｃＲ活性化アッセイ。Ｊｕｒｋａｔ  ＦｃＲ活性化アッセイを反復して、ＩｇＧ１−ＡＡおよびＩｇＧ４抗体が、実際、ＦｃＲ活性化のあまり強力ではないインデューサーであることを確認した。プレートを１μｇ／ｍＬの天然ペプチドを用いてコーティングし、各抗体のより大きな用量範囲を含めた。Ｊｕｒｋａｔ細胞の添加の前に任意の結合していない抗体を洗浄除去して、ＩＣのみが存在することを確実にした。
図４３は、各ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体のプロットを示す。プロットは、図４０において上記で見られたものと同様であり、ＩｇＧ１抗体のみが、ＦｃγＲＩＩＩａを活性化できる。
【０２０８】
結果はまた、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）が、ＴＨＰ−１サイトカインアッセイにおいて３種のサイトカインすべて（ＴＮＦα、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６）において用量依存応答を誘導したことを示す。
結果はまた、ＩｇＧ１−ＡＡおよびＩｇＧ４版が、サイトカインのあまり強力ではないインデューサーであり、ＩｇＧ１のものよりも最大３０倍高いＥＣ５０値を有することを示す。
結果は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）が、Ｊｕｒｋａｔ  ＦｃγＲＩＩＩａ活性化アッセイにおいて用量依存応答を誘導したことを示す。ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）抗体について活性化は見られなかった。
結果は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）は、そのＦｃＲによって免疫細胞と結合し、活性化するより低い能力を示し、対象において不要な免疫応答を誘導するより低いリスクと考えられなければならないことを示す。
これらの結果は、本技術のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））は、ＦｃγＲＩＩＩａを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体が対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
【０２０９】
（実施例１５）
Ｊｕｒｋａｔ  ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８活性化アッセイ−解凍および使用キット対増殖細胞株
この研究は、本技術の抗体の、ＦｃＲＩＩＩａ  Ｖ１５８細胞を活性化する能力を評価した。
方法。ウェルを、ＴＦＥ中、１μｇ／ｍｌのｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドを用いてコーティングした。ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）を６０分間添加した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を２４時間添加した。２４時間後ＢｉｏＧｌｏ（登録商標）試薬を添加し、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）で読み取った。
結果。ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）抗体のみが、細胞を活性化できた。図４４Ａ〜Ｂを参照のこと。結果は、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）抗体による活性化がなかったことを示す。図４４Ａ〜Ｂを参照のこと。増殖および解凍および使用細胞は同様の結果を有していた。
これらの結果は、本技術のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））は、ＦｃγＲＩＩＩａを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体は、対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
【０２１０】
（実施例１６）
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体を使用するＪｕｒｋａｔ  ＦｃγＲＩＩＩａおよびＦｃγＲＩＩａ活性化
この研究は本技術の抗体の、ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８、ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｆ１５８およびＦｃγＲＩＩａ  Ｈ１３１を活性化する能力を評価した。
方法
ウェルを、ＴＦＥ中、１μｇ／ｍｌのｐＴｈｒ−Ｄｍｐペプチドを用いてコーティングした。ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）を６０分間添加した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を２４時間添加した。２４時間後ＢｉｏＧｌｏ（登録商標）試薬を添加し、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）で読み取った。
【０２１１】
結果
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）は、ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８およびＦｃγＲＩＩａ  Ｈ１３１細胞を活性化した。図４５ＡおよびＣを参照のこと。ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）は、ＦｃγＲＩＩａ  Ｈ１３１細胞において低レベルの活性化を示し、ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８では全く活性化しなかった。図４５ＡおよびＣを参照のこと。ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）は、ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８細胞およびＦｃγＲＩＩａ  Ｈ１３１細胞を活性化しなかった。図４５ＡおよびＣを参照のこと。ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｆ１５８を活性化した抗体はなかった。図４５Ｂを参照のこと。
これらの結果は、本技術のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））は、ＦｃγＲＩＩＩａを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体は、対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
【０２１２】
（実施例１７）
Ｊｕｒｋａｔ  ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８活性化アッセイ−増殖細胞
この研究は、ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８細胞のＨｕＰＴ−１１３Ｄ活性化を評価した。
方法
ウェルを、ＤＰＢＳ中、１０μｇ／ｍｌのｐＴａｕを用いてコーティングした。ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ）またはＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１（ＩＩ）を６０分間添加した。Ｊｕｒｋａｔ細胞を２４時間添加した。２４時間後ＢｉｏＧｌｏ（登録商標）試薬を添加し、発光をＧｌｏＭａｘ（登録商標）で読み取った。
結果
ＦｃγＲＩＩＩａ  Ｖ１５８細胞の活性化を誘導した抗体はなかった。図４６を参照のこと。
これらの結果は、本技術のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））は、ＦｃγＲＩＩＩａを活性化しないことを示し、これは、本技術の抗体が、対象において細胞傷害性応答を誘導しないことを示す。
【０２１３】
（実施例１８）
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体を使用する外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の防止
この研究は、ＴＢＩを防ぐために本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））が有用であることを示す。
方法
ｗｔＣ５７／Ｂｌ６マウスを、ＴＢＩの３日前に、単回用量のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体または対照抗体（２００μｇ  ｉｐ＝約８ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置した。ＴＢＩモデルは、以下から選択される：単回重度ＴＢＩ（爆風；ｓｓＴＢＩ）、反復性軽度ＴＢＩ（衝撃；ｒｍＴＢＩ）または単回軽度ＴＢＩ（衝撃；ｓｍＴＢＩ）。外傷の１５分前に、すべてのマウスを脳室内投薬によって単回用量のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体または対照抗体（２０μｇ／５μｌ）を用いて処置する。いくつかの実施形態では、マウスを、３つの用量レベル、例えば、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇで処置する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、偽群のマウス（すなわち、ＴＢＩなし）を対照に使う。
第１のコホート（８ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ  ４日毎を用いて１２日間前処置されたマウス（合計３用量））を、ＥＬＩＳＡ／ウエスタンブロット解析（例えば、脳およびＣＳＦにおいてシスタウおよび総（中間ドメイン）タウを評価するため）およびｆＥＰＳＰのために外傷の１４日後に屠殺する。
第２のコホート（上記のように処置されたが処置が継続されているマウス、８ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ毎週、さらに６週間）を、外傷の２カ月後に屠殺する。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する（例えば、ＥＰＭ、ＭＷＭおよび自発運動試験（ロータロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ））。
第３のコホート（外傷後６カ月まで８ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ毎週を受け続けたマウス）を屠殺し、タウ凝集（例えば、シスタウおよび総タウ）およびニューロン萎縮を評価する。その他のエンドポイントとして、ＩＨＣについてアッセイすることならびにＡＬＺ５０、ＭＣ１および／またはＡＴ８を使用するアッセイが挙げられる。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、未処置対照マウスと比較した、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち１つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））が、ＴＢＩなどのシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の予防において有用であることを示す。
【０２１５】
（実施例１９）
アルツハイマー病のＴＭＨＴマウスモデルにおけるＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体を使用する神経変性状態の予防
この研究は、本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））が、アルツハイマー病などの神経変性状態の予防において有用であることを示す。
方法
ＴＭＨＴ（Ｔｈｙ−１突然変異ヒトタウ）トランスジェニックマウス（Flunkert et al., 2013）を、１カ月齢で始めて、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体または対照抗体（１〜１００ｍｇ／ｋｇの間）を用いて処置する。マウスを、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体または対照抗体を用いて、腹腔内（ＩＰ）注射、皮下（ＳＣ）注射または静脈内（ＩＶ）投与によって毎週処置する。代替アッセイでは、異なる用量頻度は、それだけには限らないが、毎日、２日毎、３日毎、４日毎、隔週、３週毎および毎月を含み得る。ＷＴマウスを対照として使用する。
【０２１６】
第１のコホート（１〜１００ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ毎週を用いて２カ月間処置されたマウス）を、ＥＬＩＳＡ／ウエスタンブロット解析（例えば、脳およびＣＳＦにおいてシスタウおよび総（中間ドメイン）タウを評価するため）のために３カ月齢で屠殺する。
第２のコホート（１〜１００ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ毎週を用いて４カ月間処置されたマウス）を５カ月齢で屠殺する。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する（例えば、ＭＷＭ、高架式十字迷路、新規物体認識、回転運動能力、嗅覚を含む自発運動量の一般的指標）。
第３のコホート（１〜１００ｍｇ／ｋｇ  ＩＰ毎週を用いて８カ月間、９カ月齢まで処置されたマウス）を屠殺し、タウ凝集（例えば、シスタウおよび総タウ）およびニューロン萎縮を評価する。その他のエンドポイントとして、ＩＨＣについてアッセイすることならびにＡＬＺ５０、ＭＣ１および／またはＡＴ８を使用するアッセイが挙げられる。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、未処置対照マウスまたはシスタウを認識しない対照抗体を用いて処置されたマウスと比較して、シスタウオシスの低減、全体的なタウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち１つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））が、アルツハイマー病などのシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患の予防において有用であることを示す。
【０２１７】
（実施例２０）
アルツハイマー病のＴＨＭＴマウスモデルにおけるＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体を使用する神経変性状態の処置
この研究は、本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４  （ＩＩ））が、アルツハイマー病などの神経変性状態を処置するのに有用であることを示す。
方法
ＴＭＨＴ（Ｔｈｙ−１突然変異ヒトタウ）トランスジェニックマウス（Flunkert et al., 2013）を、５カ月齢で始めて、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体または対照抗体（２００μｇ  ｉｐ＝約８ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置する。ＷＴマウスを対照として使用する。
【０２１８】
マウスを、８ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ４日毎を用いて１２日間処置する（合計３回の処置）。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する（例えば、ＭＷＭ、嗅覚）。次いで、マウスをＥＬＩＳＡ／ウエスタンブロット解析（例えば、脳およびＣＳＦにおいてシスタウおよび総（中間ドメイン）タウを評価するため）のために屠殺する。代替アッセイでは、マウスを、各処置について３つの異なる漸増用量レベル、例えば、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇを用いて処置する。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、対照抗体処置マウスおよび未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち１つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））が、アルツハイマー病などのシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するために有用であることを示す。
【０２１９】
（実施例２１）
アルツハイマー病のｈＴａｕマウスモデルにおけるＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体を使用する神経変性状態の予防
この研究は、本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４  （ＩＩ））が、アルツハイマー病などの神経変性状態を予防するのに有用であることを示す。
方法
ｈＴａｕトランスジェニックマウス（Andorfer et al., 2003）を、１カ月齢で始めて、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体または対照抗体（２００μｇ  ｉｐ＝約８ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置する。ＷＴマウスを対照として使用する。
【０２２０】
第１のコホート（８ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ４日毎を用いて５カ月間処置されたマウス）を、ＥＬＩＳＡ／ウエスタンブロット解析（例えば、脳およびＣＳＦにおいてシスタウおよび総（中間ドメイン）タウを評価するため）のために６カ月齢で屠殺する。
第２のコホート（８ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ毎週を用いて１１カ月間、１２カ月齢まで受け続けたマウス）。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する（例えば、ＭＷＭ、新規物体認識）。タウ凝集（例えば、シスタウおよび総タウ）およびニューロン萎縮を評価する。その他のエンドポイントとして、ＩＨＣについてアッセイすることならびにＡＬＺ５０、ＭＣ１および／またはＡＴ８を使用するアッセイが挙げられる。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、対照抗体処置マウスおよび未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち１つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））が、アルツハイマー病などのシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を予防するために有用であることを示す。
【０２２１】
（実施例２２）
アルツハイマー病のｈＴａｕマウスモデルにおけるＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体を使用する神経変性状態の処置
この研究は、本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））が、アルツハイマー病などの神経変性状態を処置するのに有用であることを示す。
方法
ｈＴａｕトランスジェニックマウス（Andorfer et al., 2003）を、１２カ月齢で始めて、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体または対照抗体（２００μｇ  ｉｐ＝約８ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置する。ＷＴマウスを対照として使用する。
マウスを、８ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ４日毎を用いて１２日間処置する（合計３用量）。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する（例えば、ＭＷＭ、新規物体認識）。マウスをＥＬＩＳＡ／ウエスタンブロット解析（例えば、脳およびＣＳＦにおいてシスタウおよび総（中間ドメイン）タウを評価するため）のために３カ月齢で屠殺する。代替アッセイでは、マウスを、各処置について３つの異なる漸増用量レベル、例えば、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇを用いて処置する。
【０２２２】
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、対照抗体処置マウスおよび未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち１つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））が、アルツハイマー病などのシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するために有用であることを示す。
【０２２３】
（実施例２３）
ＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体を使用する外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の処置
この研究は、本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））が、ＴＢＩを処置するのに有用であることを示す。
方法
ｗｔＣ５７／Ｂｌ６マウスを、ＴＢＩの直後に、単回用量のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体または対照抗体（２００μｇ  ｉｐ＝約８ｍｇ／ｋｇ）を用いて処置する。ＴＢＩモデルは、以下から選択される：単回重度ＴＢＩ（爆風；ｓｓＴＢＩ）、反復性軽度ＴＢＩ（衝撃；ｒｍＴＢＩ）または単回軽度ＴＢＩ（衝撃；ｓｍＴＢＩ）。外傷の１５分後に、すべてのマウスを脳室内投薬によって単回用量のＨｕＰＴ−１１３Ｄ抗体または対照抗体（２０μｇ／５μｌ）を用いて処置する。いくつかの実施形態では、マウスを、３つの用量レベル、例えば、３、１０および３０ｍｇ／ｋｇで処置する。
いくつかの実施形態では、偽群のマウス（すなわち、ＴＢＩなし）を対照に使う。
第１のコホート（８ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ  ４日毎を用いて１２日間処置されたマウス（合計３用量））を、ＥＬＩＳＡ／ウエスタンブロット解析（例えば、脳およびＣＳＦにおいてシスタウおよび総（中間ドメイン）タウを評価するため）およびｆＥＰＳＰのために外傷の１４日後に屠殺する。
第２のコホート（上記のように処置されたが処置が継続されているマウス、８ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ毎週、さらに６週間）を、外傷の２カ月後に屠殺する。屠殺の前に、行動エンドポイントを評価する（例えば、ＥＰＭ、ＭＷＭおよび自発運動試験（ロータロッド（ｒｏｔｏｒｏｄ））
【０２２４】
第３のコホート（外傷後６カ月まで８ｍｇ／ｋｇ  ｉｐ毎週を受け続けたマウス）を屠殺し、タウ凝集（例えば、シスタウおよび総タウ）およびニューロン萎縮を評価する。その他のエンドポイントとして、ＩＨＣについてアッセイすることならびにＡＬＺ５０、ＭＣ１および／またはＡＴ８を使用するアッセイが挙げられる。
結果
本技術の抗体を用いて処置されたマウスは、未処置対照マウスと比較して、シスタウオシスの低減、タウオパチー発生および広がりの低減、神経変性の低減および病理組織学的および機能的転帰の改善のうち１つ以上を示すと予測される。
これらの結果は、本技術の抗体（例えば、ＨｕＰＴ−１１３Ａ、ＨｕＰＴ−１１３Ｂ、ＨｕＰＴ−１１３Ｃ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ、ＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ１−ＡＡ（ＩＩ）およびＨｕＰＴ−１１３Ｄ  ＩｇＧ４（ＩＩ））が、ＴＢＩなどのシス−ｐＴ２３１−タウタンパク質発現の上昇を伴う神経疾患を処置するのに有用であることを示す。
【０２２５】
均等物
本技術は、本出願に記載される特定の実施形態に関して限定されるべきではなく、本技術の個々の態様の単一の例示として意図される。当業者には明らかなように、この技術の多くの改変および変法は、その趣旨および範囲から逸脱することなく行うことができる。本明細書に列挙されたものに加えて、本技術の範囲内の機能的に同等の方法および装置は、前述の説明から当業者には明らかであろう。そのような改変および変法は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。本技術は、添付の特許請求の範囲の用語、およびそのような特許請求の範囲が与えられる均等物の全範囲によってのみ制限されるべきである。この技術は、特定の方法、試薬、化合物組成または生物学的システムに限定されず、これらはもちろん変わり得ることは理解されなければならない。また、本明細書で使用される用語は、単に特定の実施形態を説明することを目的としており、限定されることを意図するものではないことも理解されるべきである。
【０２２６】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループの観点から説明される場合、当業者は、開示がまた、マーカッシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点から説明されることを認識するであろう。
当業者によって理解されるように、特に書面による説明を提供するという観点から、ありとあらゆる目的のために、本明細書に開示されるすべての範囲は、ありとあらゆるあり得る部分範囲およびその部分範囲の組合せも包含する。列挙された範囲は、同じ範囲を少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分解して十分に説明し、有効にするものとして簡単に認識できる。限定されない例として、本明細書で論じられる各範囲は、下位３分の１、中３分の１、および上位３分の１などに容易に分解できる。また、当業者によって理解されるように、「まで」、「少なくとも」、「より大きい」、「未満」などのすべての言語は、列挙された数を含み、上記で論じたような部分範囲にその後分解され得る範囲を指す。最後に、当業者によって理解されるように、範囲は各個々のメンバーを含む。したがって、例えば、１〜３個のセルを有するグループは、１個、２個、または３個のセルを持つグループを指す。同様に、１〜５個のセルを有するグループは、１、２、３、４、または５個のセルを有するグループなどを指します。
【０２２７】
本明細書で参照されるまたは引用されるすべての特許、特許出願、仮出願、および刊行物は、本明細書の明示的な教示と矛盾しない範囲で、すべての図および表を含む、全文が参照により組み込まれる。
その他の実施形態は以下の特許請求の範囲内に示される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２６Ｃ】
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【図２６Ｄ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２７Ｃ】
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【図２７Ｄ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２８Ｄ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３２Ｃ】
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【図３２Ｄ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３３Ｃ】
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【図３３Ｄ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３８Ｆ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４５Ｃ】
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【図４６】
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【図４７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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