(57)【要約】本発明は、神経変性疾患の自己免疫構成要素を抑制し、それによって、このような疾患に罹患している患者に治療効果を提供するための組成物および方法を提供する。組成物および方法は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）および１種またはこれより多くのグリア細胞マーカーに特異的に結合するキメラ抗原レセプターまたはタンパク質に連結されたＴｒｅｇによって発現されるタンパク質のような免疫抑制部分を含む。進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、およびプリオン病を含む神経変性疾患を処置するための治療上有効な用量の上記化合物が、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
被験体において神経変性疾患を処置するための方法であって、前記方法は、前記被験体に、神経組織を保護しかつ前記神経組織における炎症を低減するために治療上有効な量の、グリア細胞マーカーに特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を各々発現する制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を投与し、それによって、前記神経変性疾患を処置する工程を包含し、ただし前記神経変性疾患は多発性硬化症ではない、方法。
【請求項２】
前記被験体はヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記グリア細胞マーカーは、希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞マーカー０１（ＯＭ１）、希突起膠細胞マーカー０４（ＯＭ４）、神経／グリアマーカー２（ＮＧ２）、Ａ２Ｂ５、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、およびミエリン希突起膠細胞特異的タンパク質（ＭＯＳＰ）からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記グリア細胞マーカーは、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記神経変性疾患は、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、およびプリオン病からなる群より選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記神経変性疾患は、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記神経変性疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）である、請求項５に記載の方法。
【請求項９】
多発性硬化症ではない神経変性疾患を処置するために治療上有効な量において複数の操作された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含む組成物であって、前記複数の操作されたＴｒｅｇの各々は、グリア細胞マーカーに特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する、組成物。
【請求項１０】
前記グリア細胞マーカーは、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞マーカー０１（ＯＭ１）、希突起膠細胞マーカー０４（ＯＭ４）、神経／グリアマーカー２（ＮＧ２）、Ａ２Ｂ５、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、およびミエリン希突起膠細胞特異的タンパク質（ＭＯＳＰ）からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１１】
前記グリア細胞マーカーは、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）である、請求項９に記載の組成物。
【請求項１２】
前記神経変性疾患は、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、およびプリオン病からなる群より選択される、請求項９に記載の組成物。
【請求項１３】
前記神経変性疾患は、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１４】
前記神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１５】
前記神経変性疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）である、請求項１２に記載の組成物。
【請求項１６】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって発現される分子に連結されたグリア細胞特異的結合タンパク質を含む、操作されたタンパク質。
【請求項１７】
Ｔｒｅｇによって発現される前記分子は、細胞外免疫抑制酵素である、請求項１６に記載の操作されたタンパク質。
【請求項１８】
Ｔｒｅｇによって発現される前記分子は、ＣＤ７３、ＣＤ３９、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、およびグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）からなる群より選択される、請求項１７に記載の操作されたタンパク質。
【請求項１９】
前記グリア細胞特異的結合タンパク質は、抗体分子のテトラマー単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項１６に記載の操作されたタンパク質。
【請求項２０】
前記グリア細胞特異的結合タンパク質は、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞マーカー０１（ＯＭ１）、希突起膠細胞マーカー０４（ＯＭ４）、神経／グリアマーカー２（ＮＧ２）、Ａ２Ｂ５、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、およびミエリン希突起膠細胞特異的タンパク質（ＭＯＳＰ）からなる群より選択されるマーカーに結合する、請求項１６に記載の操作されたタンパク質。
【請求項２１】
前記グリア細胞特異的結合タンパク質は、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）に結合する、請求項２０に記載の操作されたタンパク質。
【請求項２２】
前記グリア細胞特異的結合タンパク質は、配列番号４、６、および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む抗体分子の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項２１に記載の操作されたタンパク質。
【請求項２３】
制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって発現される分子の活性を模倣する分子に連結されたグリア細胞特異的結合タンパク質を含む、操作されたタンパク質。
【請求項２４】
Ｔｒｅｇによって発現される前記分子は、細胞外免疫抑制酵素である、請求項２３に記載の操作されたタンパク質。
【請求項２５】
Ｔｒｅｇによって発現される前記分子は、ＣＤ７３、ＣＤ３９、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、およびグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）からなる群より選択される、請求項２４に記載の操作されたタンパク質。
【請求項２６】
前記グリア細胞特異的結合タンパク質は、抗体分子のテトラマー単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項２３に記載の操作されたタンパク質。
【請求項２７】
前記グリア細胞特異的結合タンパク質は、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞マーカー０１（ＯＭ１）、希突起膠細胞マーカー０４（ＯＭ４）、神経／グリアマーカー２（ＮＧ２）、Ａ２Ｂ５、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、およびミエリン希突起膠細胞特異的タンパク質（ＭＯＳＰ）からなる群より選択されるマーカーに結合する、請求項２３に記載の操作されたタンパク質。
【請求項２８】
前記グリア細胞特異的結合タンパク質は、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）に結合する、請求項２７に記載の操作されたタンパク質。
【請求項２９】
前記グリア細胞特異的結合タンパク質は、配列番号４、６、および１２からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む抗体分子の単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である、請求項２８に記載の操作されたタンパク質。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年３月２７日出願の米国仮出願第６２／６４８，６８４号（その内容は、その全体において参考として援用される）の優先権および利益を主張する。
【０００２】
発明の分野
本発明は、種々の神経変性疾患（例えば、進行性核上性麻痺およびパーキンソン病）に関する免疫応答および炎症を特異的に調節するＣＡＲ−Ｔｒｅｇ組成物およびその使用方法を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）のような神経変性疾患は、かなりの数の人々に影響を及ぼしており、しばしば、急激な物理的および／または精神的悪化ならびに死亡を生じる。それらの疾患の治癒、ならびに症状の管理および悪化を遅らせることに焦点を当てる処置は、既知でない。
【０００４】
１つのこのような疾患であるＰＳＰは、パーキンソン病（ＰＤ）を模倣し、高齢者において希ではない特発性の変性疾患である。その臨床像は、核上性注視麻痺、体幹硬直（ａｘｉａｌ  ｒｉｇｉｄｉｔｙ）、認知症、および仮性球麻痺の四徴を含む。それは、動作緩徐、重篤な姿勢障害および頻繁な転倒と関連する。病状は、主に脳幹、淡蒼球、視床下核、および歯状核において、細胞喪失およびＴａｕ神経原線維変化と関連する。ＰＳＰは、１００，０００人あたり５〜６人の有病率を有し、米国で１年に５０００〜２５０００人の患者が発生する。上記疾患の平均発病年齢は、６３歳であり、通常の予後は、診断から死亡まで５〜１０年の範囲に及ぶ。利用可能な疾患修飾処置は存在しない。
【０００５】
パーキンソン病は、既知の治癒法のないもう１つの神経変性疾患である。パーキンソン病は、１，０００人あたり約１〜２人の有病率を有する。パーキンソン病は、黒質における星状細胞死およびその領域でのドパミン欠乏を生じるミクログリアの増大とともに、大脳基底核における細胞死によって特徴づけられる。レビー小体といわれる封入体は、細胞死の前に損傷した細胞において発生する。根底にある機構に関してパーキンソン病における脳の細胞死を駆動することが推測されるが、それらは、理解が不十分なままであり、現在、処置は疾患症状を管理することに焦点をあてている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
本発明の組成物および方法は、制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）またはＴｒｅｇ細胞によって発現される免疫抑制タンパク質を使用して、中枢神経系（ＣＮＳ）におけるグリア細胞を標的とする神経変性性免疫応答を調節する。Ｔｒｅｇまたは免疫抑制タンパク質を、グリア細胞マーカーを特異的に認識しかつ結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）のいずれかに連結することによって、上記免疫抑制性Ｔｒｅｇまたはタンパク質は、炎症を低減し、ＣＮＳを自己免疫による攻撃から防御するように、ＣＮＳのグリア細胞を誘導する。
【０００７】
本発明は、大部分の神経変性疾患に対する有効な処置選択肢の欠如、ならびにいくつかのこのような疾患に対する自己免疫および／または炎症構成要素の存在を認識し、それらの疾患構成要素を特異的に抑制するように組成物を設計する。本発明の化合物および方法は、グリア細胞が、１型ヘルパー細胞（Ｔｈ1）、Ｔヘルパー１７細胞（Ｔｈ１７）、細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）、Ｍ１マクロファージ、および多形核好中球（ＰＭＮ）のような損傷を与える免疫細胞を調節することを可能にする。
【０００８】
本発明は、免疫抑制分子（Ｔｒｅｇまたは免疫抑制タンパク質）を希突起膠細胞（ＯＤＣ）グリア細胞へと導く。得られる化合物およびその使用法は、身体自体の免疫系を動員して、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、および進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）のような神経変性疾患の影響に対抗する。本発明は、いくつかの神経変性疾患が神経機能を破壊するがその根底にある疾患のいかなる特定の生化学的原因にも依存していない機構（すなわち、中枢神経系の自己免疫による攻撃）に対処する。よって、本発明の化合物および方法は、いくつもの神経変性疾患におよぶ治療効果を提供し得る。
【０００９】
本発明の局面は、被験体において神経変性疾患を処置するための方法であって、前記方法は、上記被験体に、グリア細胞マーカーに特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する治療上有効な量の制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を投与する工程であって、ここで上記神経変性疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）ではない工程を包含する方法を包含する。次いで、上記ＣＡＲ−Ｔｒｅｇは、神経組織を保護し、神経組織における炎症を低減し、それによって、上記神経変性疾患を処置する。種々の実施形態において、上記被験体は、ヒトであり得る。
【００１０】
グリア細胞マーカーは、希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞マーカー０１（ＯＭ１）、希突起膠細胞マーカー０４（ＯＭ４）、神経／グリアマーカー２（ＮＧ２）、Ａ２Ｂ５、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、またはミエリン希突起膠細胞特異的タンパク質（ＭＯＳＰ）であり得る。いくつかの実施形態において、上記グリア細胞マーカーは、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）であり得る。
【００１１】
処置され得る神経変性疾患は、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはプリオン病であり得る。いくつかの実施形態において、上記神経変性疾患は、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）である。他の実施形態において、上記神経変性疾患は、アルツハイマー病（ＡＤ）である。さらに他の実施形態において、上記神経変性疾患は、パーキンソン病（ＰＤ）である。
【００１２】
ある種の局面において、本発明は、多発性硬化症ではない神経変性疾患を処置するために治療上有効な量において操作された制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）を含む組成物を提供し、上記操作されたＴｒｅｇは、グリア細胞マーカーに特異的に結合するキメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）を発現する。上記組成物におけるグリア細胞マーカーは、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞マーカー０１（ＯＭ１）、希突起膠細胞マーカー０４（ＯＭ４）、神経／グリアマーカー２（ＮＧ２）、Ａ２Ｂ５、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、またはミエリン希突起膠細胞特異的タンパク質（ＭＯＳＰ）であり得る。
【００１３】
上記組成物は、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、パーキンソン病（ＰＤ）、アルツハイマー病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはプリオン病を処置するために治療上有効であり得る。
【００１４】
本発明の種々の局面は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって発現される分子に連結されたグリア細胞特異的結合タンパク質を含む操作されたタンパク質を包含する。Ｔｒｅｇによって発現される上記分子は、細胞外免疫抑制酵素であり得る。ある種の実施形態において、Ｔｒｅｇによって発現される上記分子は、ＣＤ７３、ＣＤ３９、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、またはグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）であり得る。上記グリア細胞特異的結合タンパク質は、抗体分子のテトラマー単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る。
【００１５】
ある種の実施形態において、上記Ｔｒｅｇが発現する分子に結合したグリア細胞特異的結合タンパク質は、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞マーカー０１（ＯＭ１）、希突起膠細胞マーカー０４（ＯＭ４）、神経／グリアマーカー２（ＮＧ２）、Ａ２Ｂ５、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、またはミエリン希突起膠細胞特異的タンパク質（ＭＯＳＰ）に結合し得る。
【００１６】
いくつかの局面において、本発明は、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）によって発現される分子の活性を模倣する分子に連結されたグリア細胞特異的結合タンパク質を含む操作されたタンパク質を提供する。Ｔｒｅｇによって発現される上記模倣された分子は、ＣＤ７３、ＣＤ３９、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、またはグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）のような細胞外免疫抑制酵素であり得る。上記模倣された分子に結合したグリア細胞特異的結合タンパク質は、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞マーカー０１（ＯＭ１）、希突起膠細胞マーカー０４（ＯＭ４）、神経／グリアマーカー２（ＮＧ２）、Ａ２Ｂ５、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、またはミエリン希突起膠細胞特異的タンパク質（ＭＯＳＰ）に結合し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】図１は、グリア細胞特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇおよびその免疫抑制機能を図示する。
【図２】図２は、グリア細胞標的化免疫抑制タンパク質およびその免疫抑制機能を図示する。
【図３】図３は、細胞傷害性Ｔ細胞へのｐＭＨＣ−テトラマーの結合および標的ＭＯＧタンパク質への本発明のＧＩＴＰの結合を図示する。
【図４】図４は、ＣＴＬおよびｐＭＨＣのものと比較して、標識ＧＩＴＰタンパク質でのＭＯＧ標的細胞の最大染色を図示する。
【図５】図５は、ＣＴＬおよびｐＭＨＣのものと比較して、標識ＧＩＴＰタンパク質でのＭＯＧ標的細胞の染色の半減期を図示する。
【図６】図６は、陰性コントロールおよび陽性コントロールと比較して、Ｔエフェクター細胞増殖を抑制するＧＴＩＰ結合したＭＯＧ標的細胞の比較を図示する。
【図７】図７は、ＭＯＧ−標的細胞のＭＯＧに特異的なｓｃＦｖを発現するＣＡＲ分子の相対的結合力と比較して、相当する細胞傷害性Ｔ細胞クローンのｐＭＨＣの相対的結合力を図示する。
【図８】図８は、ヒトＭＯＧ−１に対する７種の異なるｓｃＦｖタンパク質に関する相対的免疫反応性を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
本発明は、種々の神経変性疾患の自己免疫構成要素を調節するための組成物に関する。本明細書で提供される組成物および方法は、グリア細胞特異的マーカーを標的として、免疫抑制分子（例えば、ＴｒｅｇまたはＴｒｅｇによって発現される免疫抑制タンパク質）をＣＮＳに誘導し、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、またはプリオン病のような疾患の神経変性性効果に寄与する自己免疫による攻撃を妨害する。
【００１９】
血液脳関門は、脳またはＣＮＳの障害の処置に対して障害物として働き得る。なぜならこの関門は、治療用化合物が、罹患した細胞にアクセスすることを遮断し得るからである。重要なことには、Ｔｒｅｇは、血液脳関門を越えることができ、Ｔｒｅｇが結合したグリア細胞によってＣＮＳのニューロンに局在化されることができ、それによって、本発明の化合物がＣＮＳの神経変性障害を効果的に処置することを可能にし得る。
【００２０】
本発明の化合物および方法は、いかなる疾患特異的な生化学的機構にも依拠せず、代わりに、多くの神経変性疾患が精神的および物理的悪化に影響を与える免疫応答を避ける。よって、同化合物および方法は、多くの神経変性疾患に対して治療効果を提供し得る。
【００２１】
例えば、ＰＳＰは、ｔａｕタンパク質蓄積および神経原線維変化を伴い、身体的および精神的悪化と関連する、ニューロンおよびグリア細胞の損傷および喪失、ならびに最終的には死亡を生じる。パーキンソン病は、黒質における星状細胞死およびミクログリアの増大とともに、大脳基底核におけるニューロン喪失を伴う。レビー小体といわれる封入体は、細胞死の前に損傷した細胞において発生する。ＡＬＳは、運動ニューロンの細胞体および軸索においてタンパク質が豊富な封入体を発生させた後の、運動野における運動ニューロンの死を特徴とする。
【００２２】
本発明は、根底にある原因および疾患機構が異なっているにも拘わらず、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、およびプリオン病を含む神経変性疾患とともに、ＰＳＰ、パーキンソン病、およびＡＬＳはおそらく、炎症およびＣＮＳ劣化に寄与する免疫構成要素を含むことを認識する。Ｍａｌａｓｐｉｎａ，  ｅｔ  ａｌ，  ２０１５，  Ｄｉｓｅａｓｅ  ｏｒｉｇｉｎ  ａｎｄ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ：  ａｎ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２７（３）：  １１７−１２９；  Ｍｏｓｌｅｙ  Ｒ，  Ｇｅｎｄｅｌｍａｎ  Ｈ，  ２０１７，  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｐｅｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  ｄｉｓｅａｓｅ，  Ｌａｎｃｅｔ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ，  １６（１０）：７６９−７１を参照（これらの各々の内容は、本明細書に参考として援用される）。よって、ＣＮＳにおける免疫応答の抑制および多くの神経変性疾患を引き起こす慢性炎症の対処に焦点を当てた本発明の化合物および方法は、多くのそれら疾患を処置するにあたって治療上有効であり得る。
【００２３】
本発明の化合物および方法は、グリア細胞マーカーに特異的に結合する、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）、抗体、または単鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を使用する。上記グリア細胞結合分子は、Ｔｒｅｇ、Ｔｒｅｇによって発現される免疫抑制タンパク質、またはＴｒｅｇによって発現される免疫抑制タンパク質を模倣するように構成された分子に連結される。グリア細胞は、種々の動物（ヒトを含む）の中枢神経系および末梢神経系においてニューロンを支持することにおいて多くの機能を果たす非ニューロン細胞である。グリア細胞は、希突起膠細胞。星状細胞、上衣細胞、およびミクログリアを含む。ＣＮＳのニューロンを維持することにおけるそれらの機能の結果として、グリア細胞は、ＣＮＳのニューロンへと移動するので、治療用化合物をそこに局在化させるために使用され得る。例えば、希突起膠細胞（ＯＤＣ）グリア細胞は、ＣＮＳへと行って（ｔｒａｆｆｉｃ）、ミエリン鞘を作ることによって、軸索の絶縁を維持する。本発明の化合物および方法は、免疫抑制分子を、ＯＤＣのようなグリア細胞へと連結し、その結果、グリア細胞が、それらの機能を発揮するにつれて、免疫抑制分子が、図１および２に示されるように、ＣＮＳのニューロンの直ぐ近くにもたらされることを包含する。上記免疫抑制分子が存在することによって、ＣＮＳに存在し得、ＰＤ、ＰＳＰなどにおける神経変性疾患症状に寄与する任意の進行中の免疫応答および慢性炎症が調節される。
【００２４】
グリア細胞特異的標的としては、種々のグリア細胞によって発現されるタンパク質および他のマーカー、例えば、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、希突起膠細胞マーカー０１（ＯＭ１）、希突起膠細胞マーカー０４（ＯＭ４）、神経／グリアマーカー２（ＮＧ２）、Ａ２Ｂ５、ガラクトシルセラミダーゼ（ＧＡＬＣ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）、またはミエリン希突起膠細胞特異的タンパク質（ＭＯＳＰ）が挙げられる。
【００２５】
種々の実施形態において、ＣＡＲ、ｓｃＦｖ、または抗体は、免疫抑制分子に結合され得、グリア細胞を標的化するために使用され得る。ＣＡＲは、免疫エフェクター細胞（Ｔ細胞）に特異性を提供し得る操作されたレセプターである。ＣＡＲは、がん免疫療法における使用のために細胞傷害性Ｔリンパ球に、腫瘍細胞特異性を付与するために使用されてきた。Ｃｏｕｚｉｎ−Ｆｒａｎｋｅｌ，  ２０１３，  Ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ３４２（６１６５）：  １４３２−３３；  Ｓｍｉｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１６，  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  （ＣＡＲ）  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｍａｌｉｇｎａｎｔ  ｃａｎｃｅｒｓ：  Ｓｕｍｍａｒｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ，  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  ２（２）：５９−６８（それらの各々の内容は、本明細書に参考として援用される）を参照のこと。類似の原理を使用して、本発明の化合物および方法は、ＯＤＣのようなグリア細胞上で見出されるマーカーに特異的なＣＡＲを操作する工程を包含するが、細胞傷害性Ｔ細胞にグリア細胞特異的ＣＡＲをグラフト化する代わりに、それらは、操作された免疫抑制Ｔｒｅｇ上にグラフト化される。
【００２６】
本発明のＣＡＲ−Ｔｒｅｇは、同じかまたは２種もしくはこれより多くの異なるグリア細胞マーカーを標的とする多数のキメラ抗原レセプターを発現し得る。
【００２７】
ｓｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖の可変領域（ＶＨ）および軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む融合タンパク質である。ｓｃＦｖは、所望の標的分子（例えば、ＭＯＧ）で免疫したマウスまたは他の動物のＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子をクローニングすることによって作製され得る。次いで、上記ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子は、所望の安定性、発現レベル、およびグリア細胞またはその特異的マーカーに対する結合親和性を提供することが実験的に検証され得る種々のｓｃＦｖを形成するために、多数の配向において、および種々のリンカーとともに発現され得る。上記で考察されるグリア細胞マーカーに対して特異的なｓｃＦｖまたは抗体は、図２に示されかつ以下で考察されるＣＮＳ局在化免疫抑制療法を提供し得る融合タンパク質を形成するために、以下で考察される免疫抑制タンパク質に連結され得る。
【００２８】
グリア細胞マーカーを標的とする抗体は、例えば、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  ＣＡ）またはＡＢｃｌｏｎａｌ  （Ｗｏｂｕｒｎ，  ＭＡ）の特注の抗体を生成するための生姜用的に利用可能なサービスを含めた、当該分野で公知の方法によって生成され得る。
【００２９】
ＣＡＲ−Ｔｒｅｇは、ＣＡＲ−Ｔ細胞を調製するための公知の方法によって操作され得る。Ｔｒｅｇ細胞は、被験体から単離され得、好ましくは、処置される患者に由来する自家Ｔｒｅｇ細胞であり得る。次いで、上記Ｔｒｅｇ細胞の遺伝子は、エレクトロポレーション、ウイルスベクター、または選り抜きの操作されたキメラ抗原レセプターをコードする核酸でのトランスフェクションの他の形態のような公知の技術を通じて、改変され得る。次いで、ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞は、処置のために上記患者の系へと導入される前に、実験的に検証され得る。
【００３０】
制御性Ｔ細胞またはＴｒｅｇは、免疫系を調節し、概して、エフェクターＴ細胞の誘導および増殖をダウンレギュレートする。Ｔｒｅｇは、自己免疫応答を防止し、免疫系による自己と非自己との識別を助ける。制御性Ｔ細胞は、トランスフォーミング増殖因子β、インターロイキン３５、およびインターロイキン１０を含む阻害性サイトカインを生成し、インターロイキン−１０を発現するように他の細胞タイプを誘導し得る。Ｔｒｅｇはまた、グランザイムＢを生成し得、それは、続いて、エフェクター細胞のアポトーシスを誘導し得る。Ｔｒｅｇはまた、樹状細胞との直接的な相互作用および免疫抑制性のインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼの誘導を経る逆シグナル伝達を通じて機能する。Ｔｒｅｇはまた、免疫抑制性アデノシンの生成とともに、エクトザイムＣＤ３９およびＣＤ７３を通じて、免疫応答をダウンレギュレートし得る。Ｔｒｅｇはまた、ＬＡＧ３によって、およびＴＩＧＩＴによって、樹状細胞との直接的な相互作用を通じて免疫応答を抑制する。別のコントロール機構は、ＩＬ−２フィードバックループを介する。Ｔｒｅｇによる免疫抑制の別の機構は、ＣＴＬＡ−４分子の作用によって、エフェクターＴ細胞上のＣＤ２８を通じて、共刺激の防止を経るものである。
【００３１】
図１は、グリア細胞を標的とするＣＡＲ−Ｔｒｅｇおよびその治療機構を図示する。上記ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞は、グリア細胞上のマーカーに特異的に結合するＣＡＲを発現する。それによって、上記ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞はグリア細胞に結合され、血液脳関門を越えて運ばれ、天然のグリア細胞機能を通じてＣＮＳのニューロンへと局在化される。上記結合したＴｒｅｇ細胞は、次いで、局部の、ニューロンの免疫による攻撃を抑制することによって、その天然の調節機能を果たす。
【００３２】
図２は、ニューロンの免疫による攻撃を抑制する、本発明のグリア細胞標的化免疫抑制タンパク質（ＧＴＩＰ）を示す。ＧＴＩＰは、Ｔｒｅｇ細胞に存在する免疫抑制タンパク質または免疫活性化代謝産物（例えば、ＡＴＰ、ＡＭＰ、トリプトファン、およびグルタミン酸）をスカベンジする細胞外酵素のような酵素を含み得る。このような細胞外酵素としては、ＣＤ７３、ＣＤ３９、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）、およびグルタミン酸オキサロ酢酸トランスアミナーゼ１（ＧＯＴ１）が挙げられ得る。図２において、ＭＯＧを発現するグリア細胞は、免疫抑制酵素（ＩＥ）に連結された抗ＭＯＧ  ｓｃＦＶからなるＧＴＩＰによって結合される。上記グリア細胞は、そのニューロン関連機能を果たすにあたって、上記結合したＩＥを、種々の免疫細胞（Ｔｈ１７細胞、Ｔｈ１細胞、ＣＴＬ細胞、Ｍ１細胞、およびＰＭＮ細胞）による免疫攻撃を受けているニューロンに局在化させ、上記免疫応答を調節するかもしくは停止させ、それによって、ニューロンを維持し、根底にある神経変性疾患の症状を低減させる。ＧＴＩＰは、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、アルツハイマー病（ＡＤ）、ハンチントン病、パーキンソン病（ＰＤ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）、多発性硬化症（ＭＳ）、およびプリオン病のような神経変性疾患を処置するにあたって有用であり得る。
【００３３】
本発明のＧＴＩＰは、同じかまたは２種もしくはこれより多くの異なるグリア細胞マーカーを標的とする、１種またはこれより多くのｓｃＦＶまたは抗体に連結された１種またはこれより多くの免疫抑制タンパク質（２種またはこれより多くの異なるタンパク質を含む）を含み得る。タンパク質は、本発明のＧＴＩＰを形成するために任意の公知の手段によって結合され得る（例えば、融合タンパク質またはビオチン−ストレプトアビジン連結を含む）。
【００３４】
細胞傷害性Ｔリンパ球が関わるものを含む、がん免疫療法技術において使用されるとおりの養子細胞移入技術は、本発明の化合物および方法における使用のための自家ＣＡＲ−Ｔｒｅｇを調製するために使用され得る。Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８，  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ：  ａ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐａｔｈ  ｔｏ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ，  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ，  ８（４）：２９９−３０８を参照のこと（その内容は、本明細書に参考として援用される）。
【００３５】
本発明のＣＡＲ−Ｔｒｅｇまたはグリア細胞標的化免疫抑制タンパク質は、本明細書で記載される治療用化合物のうちの１種またはこれより多くを含むキャリアシステムに組み込まれ得る。ある種の実施形態において、上記キャリアシステムは、ジスルフィド架橋したポリエチレンイミン（ＣＬＰＥＩ）および脂質を含むナノ粒子であり得る。上記脂質は、胆汁酸（例えば、コール酸、デオキシコール酸、およびリトコール酸）であり得る。このようなキャリアシステムは、以下の実施例においてさらに記載される。他の例示的キャリアシステムは、例えば、Ｗｉｔｔｒｕｐ  ｅｔ  ａｌ．  （Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ／Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，  １６：５４３−５５２，  ２０１５）に記載される（その内容は、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される。
【００３６】
語句「非経口投与（ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」および「非経口投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｐａｒｅｎｔｅｒａｌｌｙ）」とは、本明細書で使用される場合、経腸投与および局所（ｔｏｐｉｃａｌ）投与以外の投与様式（通常は、注射による）を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射および注入が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３７】
語句「全身投与（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」、「全身投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃａｌｌｙ）」、「末梢投与（ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）」および「末梢投与される（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌｌｙ）」とは、本明細書で使用される場合、患者の系に入り、従って、代謝および他の類似プロセスに供されるように、中枢神経系に直接以外の、化合物、薬物または他の物質の投与（例えば、皮下投与）を意味する。
【００３８】
本発明の化合物が医薬として、ヒトおよび動物に投与される場合、それらは、それ自体が与えられ得るか、または薬学的に受容可能なキャリアとの組み合わせにおいて、例えば、０．１〜９９．５％（より好ましくは、０．５〜９０％）の活性成分、すなわち、本発明の少なくとも１種の治療用化合物および／もしくはその誘導体を含む薬学的組成物として、与えられ得る。
【００３９】
各薬剤の有効投与量は、各々、患者の年齢、体重、性別および臨床歴のような代表的な因子を鑑みて、当業者によって容易に決定され得る。一般に、本発明の化合物の適切な１日用量は、治療効果を生じるために有効な最低用量である化合物の量である。このような有効用量は、一般に、上記で記載される要因に依存する。
【００４０】
望ましい場合、上記活性化合物の有効１日用量は、一日を通して適切な間隔をあけて別々に投与される２、３、４、５、６またはこれより多くの部分用量として、必要に応じて単位投与形態において、投与され得る。
【００４１】
本発明の薬学的組成物は、本発明の化合物のうちの１種またはこれより多く、またはその機能的誘導体の「治療上有効な量（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」または「予防上有効な量（ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃａｌｌｙ  ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」を含む。「有効量（ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ａｍｏｕｎｔ）」とは、本明細書中、定義の節において定義されるとおりの量であり、所望の治療結果、例えば、神経障害性および／または炎症性の疼痛と関連する影響の減少または防止を達成するために必要な投与量においておよび期間にわたって有効な量を指す。本発明の化合物またはその機能的誘導体の治療上有効な量は、被験体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに上記治療用化合物が上記被験体において所望の応答を誘発する能力のような要因に従って変動し得る。治療上有効な量はまた、上記治療剤の任意の毒性または有害な効果を治療上有益な効果が上回る量である。
【００４２】
「予防上有効な量」は、所望の予防結果を達成するために必要な投与量においておよび期間にわたって有効な量を指す。代表的には、予防的用量は、疾患の前に、または疾患のより早期のステージで被験体に使用されることから、上記予防上有効な量は、治療上有効な量より少なくてもよい。予防上または治療上有効な量はまた、上記化合物の任意の毒性または有害な効果を有益な効果が上回る量である。
【００４３】
投与レジメンは、最適な所望の応答（例えば、治療的または予防的な応答）を提供するために調節され得る。例えば、単一のボーラスが投与されてもよいし、いくつかの分割用量が経時的に投与されてもよいし、上記用量は、比例して低減されても、その治療の状況の逼迫によって示される場合に増大されてもよい。非経口用組成物を、投与の容易さおよび投与量の均一性のために投与単位形態で製剤化することは、特に有利である。本発明の薬学的組成物における活性成分の実際の投与量レベルは、上記患者に毒性であることなく、特定の被験体の所望の治療応答、組成物、および投与様式を達成するために有効な活性成分の量を得るために、変動され得る。
【００４４】
用語「投与単位（ｄｏｓａｇｅ  ｕｎｉｔ）」とは、本明細書で使用される場合、処置される哺乳動物被験体のための単位投与量として適した物理的に不連続の単位を指し；各単位は、必要とされる薬学的キャリアを伴って、所望の治療効果を生じるように計算された活性化合物の所定の量を含む。本発明の投与単位形態の仕様は、（ａ）上記化合物の特有の特性、および（ｂ）個体における感受性の処置のためにこのような活性化合物を調合する分野において固有の制限、によって要求されるかまたはこれらに直接依存する。
【００４５】
いくつかの実施形態において、治療上有効な量は、細胞培養アッセイ、または動物モデル、通常は、マウス、ウサギ、イヌ、もしくはブタのいずれかにおいて、最初に予測され得る。上記動物モデルはまた、望ましい濃度範囲および投与経路を達成するために使用される。このような情報は、次いで、他の被験体における有用な用量および投与経路を決定するために使用され得る。一般に、上記治療上有効な量は、被験体において神経障害性および／または炎症性の疼痛を低減または阻害するために十分である。いくつかの実施形態において、上記治療上有効な量は、被験体において神経障害性および／または炎症性の疼痛を排除するために十分である。特定の患者のための投与量は、従来の考慮事項を使用して（例えば、適切な従来の薬理学的プロトコールによって）、当業者によって決定され得る。医師は、例えば、最初に比較的低用量で、その後、適切な応答が得られるまで、上記用量を増大させて、処方し得る。患者に投与される用量は、患者において有益な治療応答を経時的にもたらす、または例えば、適用に応じて、症状、もしくは他の適切な活性を低減するために十分である。上記用量は、特定の製剤の有効性、および本発明の化合物またはその機能的誘導体の活性、安定性または血清半減期、ならびに患者の状態、ならびに処置される患者の体重もしくは体表面積によって決定される。上記用量のサイズはまた、特定の被験体における特定のベクター、製剤などの投与に付随する任意の有害な副作用の存在、性質および程度によって決定される。１種またはこれより多くの本発明の化合物またはその機能的誘導体を含む治療用組成物は、必要に応じて、当該分野で周知の方法に従って、有効性、組織代謝を確認し、投与量を見積もるために、１またはこれより多くの適切な、インビトロモデルおよび／またはインビボでの疾患動物モデル（例えば、神経障害性および／または炎症性の疼痛のモデル）において試験される。特に、投与量は、関連アッセイにおいて、活性、安定性または非処置に対する他の適切な処置の尺度（例えば、処置した細胞または動物モデル  対  処置していない細胞または動物モデルの比較）によって最初に決定され得る。製剤は、例えば、患者の重さおよび全体的な健康状態に適用される場合、関連製剤のＬＤ５０および／または本発明の化合物もしくはその機能的誘導体の、種々の濃度での任意の副作用の観察によって決定された速度で投与される。投与は、単一用量または分割用量を介して達成され得る。
【００４６】
投与は、代表的には、薬学的に受容可能な投与形態を投与することを含み、上記投与形態は、本明細書で記載される化合物の投与形態を意味し、例えば、錠剤、糖衣錠、散剤、エリキシル剤、シロップ剤、液体調製物（懸濁物を含む）、スプレー、吸入用錠剤（ｉｎｈａｌａｎｔｓ  ｔａｂｌｅｔ）、ロゼンジ、エマルジョン、液剤、顆粒剤、カプセル剤、および坐剤、ならびに注射用の液体調製物（リポソーム調製物を含む）が挙げられる。技術および製剤化は、一般に、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，  Ｅａｓｔｏｎ，  Ｐａ．，  最新版（これは、その全体において参考として援用される）に見出され得る。投与は、経口的に、皮内に、筋肉内に、腹腔内に、静脈内に、皮下に、または鼻内に行われ得る。化合物は、単独で、または適切な薬学的キャリアとともに投与されてもよく、固体または液体の形態（例えば、錠剤、カプセル剤、散剤、液剤、懸濁物、またはエマルジョン）にあり得る。
【００４７】
活性成分を含む薬学的組成物は、経口用途に適した形態、例えば、錠剤、トローチ、ロゼンジ、水性もしくは油性の懸濁物、分散性の散剤もしくは顆粒剤、エマルジョン、硬質もしくは軟質のカプセル剤、またはシロップ剤もしくはエリキシル剤であり得る。経口用途が意図される組成物は、薬学的組成物の製造について当該分野で公知の任意の方法に従って調製され得、このような組成物は、薬学的に的を射たかつ口当たりの良い調製物を提供するために、甘味剤、矯味矯臭剤、着色剤および保存剤から選択される、１種またはこれより多くの薬剤を含み得る。錠剤は、錠剤の製造において適切な、非毒性の薬学的に受容可能な賦形剤と混合して、活性成分を含む。これらの賦形剤は、例えば、不活性希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはリン酸ナトリウム）、造粒剤および崩壊剤、例えば、コーンスターチ、またはアルギン酸；結合剤（例えば、デンプン、ゼラチンまたはアカシアガム）、ならびに滑沢剤（例えば、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸またはタルク）であり得る。上記錠剤はコーティングされていなくてもよいし、消化管での崩壊および吸収を遅らせ、それによって、より長期間にわたって持続した作用を提供するための公知の技術によってコーティングされてもよい。例えば、グリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートのような時間遅延物質（ｔｉｍｅ  ｄｅｌａｙ  ｍａｔｅｒｉａｌ）が使用されてもよい。それらは、制御放出のために治療用浸透圧錠剤を形成するために、米国特許第４，２５６，１０８号、同第４，１６６，４５２号および同第４，２６５，８７４号（これらの各々の内容は、その全体において本明細書に参考として援用される）に記載される技術によってコーティングされ得る。
【００４８】
経口用途のための製剤はまた、活性成分が不活性固体希釈剤（例えば、炭酸カルシウム、リン酸カルシウムまたはカオリン）と混合される硬質ゼラチンカプセル剤、または活性成分が水または油媒体（例えば、ラッカセイ油、流動パラフィンまたはオリーブ油）と混合される軟質ゼラチンカプセル剤として提示され得る。
【００４９】
製剤はまた、親（非イオン化）化合物とβ−シクロデキストリンの誘導体、特に、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンとの複合体を含み得る。
【００５０】
代替の経口製剤は、上記化合物が腸溶性コーティングの中に被包される放出制御製剤を使用して達成され得る。
【００５１】
水性懸濁物は、水性懸濁物の製造に適した賦形剤と混合した状態にある活性物質を含む。このような賦形剤は、懸濁化剤（例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニル−ピロリドン、トラガカントガムおよびアカシアガム）；分散剤または湿潤剤（例えば、天然に存在するホスファチド、例えば、レシチン）またはアルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、またはエチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールとの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、またはエチレンオキシドと脂肪酸およびヘキシトールに由来する部分エステル（例えば、ポリオキシエチレンと脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来する部分エステル）との縮合生成物、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエートである。上記水性懸濁物はまた、１種またはこれより多くの保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、またはｐ−ヒドロキシ安息香酸ｎ−プロピル）、１種またはこれより多くの着色剤、１種またはこれより多くの矯味矯臭剤、および１種またはこれより多くの甘味剤（例えば、スクロースまたはサッカリン）を含み得る。
【００５２】
油性懸濁物は、活性成分を、植物性油（例えば、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油またはココナッツ油）中、またはミネラルオイル（例えば、流動パラフィン）中に懸濁することによって製剤化され得る。上記油性懸濁物は、濃化剤（例えば、蜜蝋、固形パラフィンまたはセチルアルコール）を含み得る。甘味剤（例えば、上記のもの）および矯味矯臭剤は、口に合う経口調製物を提供するために添加され得る。これらの組成物は、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）の添加によって保存され得る。
【００５３】
水の添加による水性懸濁物の調製に適した分散性の散剤および顆粒剤は、活性成分を、分散剤または湿潤剤、懸濁化剤および１種またはこれより多くの保存剤と混合した状態で提供する。適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤が例示され、例えば、甘味剤、矯味矯臭剤および着色剤もまた存在し得る。
【００５４】
本発明の薬学的組成物はまた、水中油型エマルジョンの形態にあり得る。その油相は、植物性油（例えば、オリーブ油またはラッカセイ油）、またはミネラルオイル（例えば、流動性パラフィン）またはこれらの混合物であり得る。適切な乳化剤は、天然に存在するガム（例えば、アカシアガムまたはトラガカントガム）、天然に存在するホスファチド（例えば、大豆レシチン）、ならびに脂肪酸およびヘキシトール無水物に由来するエステルもしくは部分エステル（例えば、ソルビタンモノオレエート）、ならびに上記部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）であり得る。上記エマルジョンはまた、甘味剤および矯味矯臭剤を含み得る。
【００５５】
シロップ剤およびエリキシル剤は、甘味剤（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、ソルビトールまたはスクロース）を用いて製剤化され得る。このような製剤はまた、粘滑剤（ｄｅｍｕｌｃｅｎｔ）、保存剤、ならびに矯味矯臭剤および着色剤を含み得る。上記薬学的組成物は、無菌で注射用の水性または油性の懸濁物の形態にあり得る。この懸濁物は、上記で言及されているそれら適切な分散剤または湿潤剤および懸濁化剤を使用して、公知の技術に従って製剤化され得る。上記無菌で注射用の調製物はまた、非毒性の非経口的に受容可能な希釈剤または溶媒中の無菌で注射用の液剤または懸濁物にあり得、例えば１，３−ブタンジオール中の液剤として存在し得る。使用され得る上記受容可能なビヒクルおよび溶媒の中には、水、リンゲル液および等張性塩化ナトリウム溶液がある。さらに、無菌の不揮発性油は、溶媒または懸濁媒体として従来どおり使用される。この目的のために、任意の刺激のない不揮発性油が使用され得る（合成モノグリセリドまたはジグリセリドが挙げられる）。さらに、オレイン酸のような脂肪酸は、注射物の調製における使用が見出される。
【００５６】
各活性薬剤はまた、薬物の直腸投与のための坐剤の形態で投与され得る。これらの組成物は、上記薬物と適切な非刺激性賦形剤とを混合することによって調製され得る。この非刺激性賦形剤は、通常の温度では固体であるが、直腸温では液体であり、従って、直腸では融解して、上記薬物を放出する。このような物質は、カカオ脂およびポリエチレングリコールである。
【００５７】
局所的使用のために、クリーム剤、軟膏、ゼリー、液剤または懸濁物が適切である。局所適用は、マウスウォッシュおよび含嗽剤の使用を含む。
【００５８】
用語「薬学的組成物（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ）」は、投与様式および投与形態の性質に依存して、本明細書で記載されるとおりの化合物、ならびに薬学的に受容可能なキャリア、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクル（例えば、保存剤、充填剤、崩壊剤、湿潤剤、乳化剤、懸濁化剤、甘味剤、矯味矯臭剤、香料（ｐｅｒｆｕｍｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、抗細菌剤、抗真菌剤、滑沢剤および分散剤を含む少なくとも１種の成分を含む組成物を意味する。用語「薬学的に受容可能なキャリア（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ  ｃａｒｒｉｅｒ）」とは、本明細書で記載されるように、任意のキャリア、希釈剤、アジュバント、賦形剤、またはビヒクルを意味するために使用される。懸濁化剤の例としては、エトキシル化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、アルミニウムメタヒドロキシド、ベントナイト、寒天およびトラガカントガム、またはこれらの物質の混合物が挙げられる。微生物活動の防止は、種々の抗細菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって保証され得る。等張化剤（ｉｓｏｔｏｎｉｃ  ａｇｅｎｔ）、例えば、糖、塩化ナトリウムなどを含むこともまた、望ましいことであり得る。上記注射用の薬学的形態の長期の吸収は、吸収を遅延させる薬剤（例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチン）を使用することによってもたらされ得る。適切なキャリア、希釈剤、溶媒、またはビヒクルの例としては、水、エタノール、ポリオール、これらの適切な混合物、植物性油（例えば、オリーブ油）、および注射用有機エステル（例えば、オレイン酸エチル）が挙げられる。賦形剤の例としては、ラクトース、乳糖（ｍｉｌｋ  ｓｕｇａｒ）、クエン酸ナトリウム、炭酸カルシウム、およびリン酸二カルシウムが挙げられる。崩壊剤の例としては、デンプン、アルギン酸、およびある種の複合シリケートが挙げられる。滑沢剤の例としては、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、タルク、および高分子量ポリエチレングリコールが挙げられる。
【００５９】
用語「薬学的に受容可能な（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｌｙ  ａｃｃｅｐｔａｂｌｅ）」とは、それが過度の毒性、刺激、アレルギー応答などがなく、妥当な医学的判断の範囲内でヒトおよび下等動物の細胞と接触した状態における使用に適切であり、妥当な利益／リスク比と釣り合っていることを意味する。
【００６０】
参照による援用
特許、特許出願、特許公報、学術雑誌、書籍、論文、ウェブコンテンツのような他の文書への言及および引用は、本開示全体を通じて行われている。全てのこのような文書は、全ての目的のためにそれらの全体において本明細書に参考として援用される。
【００６１】
均等物
本発明の種々の改変およびその多くのさらなる実施形態は、本明細書で示されかつ記載されるものに加えて、本明細書で引用される科学文献および特許文献への言及を含め、本文書の全内容から当業者に明らかになる。本明細書における主題は、本発明の実施に適合され得る重要な情報、例示およびガイダンスを、その種々の実施形態およびその均等物において含む。
【実施例】
【００６２】
実施例１
試験デザイン
進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）を有する参加者は、エキソビボで拡大増殖された自家ＣＤ４＋ＣＤｌ２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋  ＣＡＲ−制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の１回の注入を受ける。ＣＡＲ−Ｔｒｅｇを、中枢神経系（ＣＮＳ）において特異的に発現される糖タンパク質であるミエリン−希突起膠細胞タンパク質（ＭＯＧ）を特異的に認識し、脳における免疫寛容および抗炎症効果を誘導するようにデザインする。
【００６３】
主な目的は、ＰＳＰを有する少なくとも５名の患者において、エキソビボで選択され、拡大増殖されかつ形質導入される自家ＣＮＳ特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの静脈内注入の安全性および実現性を評価することである。
【００６４】
一時的な転帰尺度は、以下である：
１．有害事象
２．検査の異常
３．注入反応
４．感染に関連する合併症
５．ＰＳＰの経過に対する潜在的な負の影響
【００６５】
二次的な目的は、ＰＳＰに対するＣＮＳ特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの効果を評価することおよび他の神経変性疾患における潜在的適用に関する兆候を得ることである。
【００６６】
エンドポイントは、以下である：
１．ＰＳＰ患者における臨床パラメーター、神経心理学的パラメーター、放射線医学的パラメーターおよび生化学的パラメーターに対するＣＮＳ特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの効果を評価する
２．アルツハイマー病（ＡＤ）を含む他の神経変性疾患におけるＣＮＳ特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの潜在的な治療上の使用法に関する兆候を得る
３．神経変性障害に関するＣＡＲ−Ｔｒｅｇの潜在的有効性への価値ある洞察を提供し得るプラシーボを対照とした潜在的なフェーズＩＩ無作為化二重盲検において兆候を得る。
【００６７】
患者評価
臨床評価および神経心理学的評価：  包含基準および排除基準の詳細な説明、ならびに臨床評価（運動および神経心理学的）および神経画像診断評価を、以前（Ｇｉｏｒｄａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ２０１４；  Ｃａｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ２０１６（本明細書に参考として援用される））に報告されたように行う。患者は、神経学的検査を受けて、以下のスケールを使用して運動機能が評価される：統一パーキンソン病評価スケール（ＵＰＤＲＳ  パートＩＩＩ、運動スコア）、ホーエン・ヤール重症度分類（Ｈｏｅｈｎ  ａｎｄ  Ｙａｈｒ  ｓｔａｇｉｎｇ）（Ｈ＆Ｙ）、ＰＳＰ評価スケール（ＰＳＰ−ＲＳ）（Ｇｏｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｏｖ．  Ｄｉｓｏｒｄ．  ２００４；  Ｇｏｌｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｒａｉｎ  ２００７（これらの各々の内容は、本明細書に参考として援用される）。ミニメンタルステート評価（ＭＭＳＥ）をまた、以前（Ｆｏｌｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｊ．  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒ．  Ｒｅｓ．  １９７５（本明細書に参考として援用される））に記載されたように行う。全てのこれらの検査を、ベースライン時および各追跡点（細胞投与の１ヶ月後、３ヶ月後、６ヶ月後、および１２ヶ月後）において評価する。ＵＰＤＲＳおよびＰＳＰ−ＲＳスコアが、ベースラインと比較して３０％より大きく減少しなかった場合、およびＨ＆Ｙ重症度分類が規定された時点で変化しなかった場合、「安定」として臨床状態を分類する（Ｃａｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ２０１６（本明細書に参考として援用される））。
【００６８】
神経画像診断：  全ての患者は、脳の核磁気共鳴画像化法（ＭＲＩ）を使用して、長軸方向の神経画像診断評価（ベースライン時、細胞投与の２４時間後、および１年後）、線条体ドパミントランスポーター単一光子放射型コンピューター断層撮影法（ＳＰＥＣＴ）および陽電子放出断層撮影法（ＰＥＴ）（ともに、ベースライン時および１２ヶ月後）を受ける。ヨウ素−１２３（ＦＰ−ＣＩＴ）および１８Ｆ−フルオロ−２−デオキシグルコース（Ｂｅｔａ−ＣＩＴ）で標識したトロパントレーサー（ｔｒｏｐａｎｉｃ  ｔｒａｃｅｒ）をそれぞれ、ＳＰＥＣＴ画像化およびＰＥＴ／ＴＣ画像化のために使用する。
【００６９】
ＳＰＥＣＴに関しては、１１０〜１４０ＭＢｑの［１２３Ｉ］ＦＰ−ＣＩＴ（Ｄａｔｓｃａｎ，  ＧＥ−Ｈｅａｌｔｈ，  Ａｍｅｒｓｈａｍ，  ＵＫ）の静脈内投与を、全ての患者において、甲状腺ブロックの３０〜４０分後に行う（１０〜１５ｍｇのルゴール溶液経口）。分析を以前（Ｉｓａｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．，  ＮｅｕｒｏＲｅｐｏｒｔ  ２００７（本明細書に参考として援用される））に記載されたように行う。灰白質解剖学的分布の容積測定テンプレートを、巨視的な解剖法（自動化解剖学的ラベリング）を適用することによって、Ｍｏｎｔｒｅａｌ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ＭＲＩ単一参加者脳アトラスから生成し、２．６４ｃｍ厚の参照断面を得るために、再配向および再フォーマットする。８つの不規則な目的の領域（ＲＯＩ）のテンプレートを、この断面上に手で線を引いて、それぞれ、［１２３Ｉ］ＦＰ−ＣＩＴの特異的取り込みおよび非特異的取り込みを有する線条体および後頭葉構造の解剖学的な程度を評価する。上記ＲＯＩテンプレートをまた、参照ＳＰＥＣＴ断面上に配置し、線条体および後頭皮質の両方に対して調節する。線条体ＲＯＩをまた、それらの前方（尾状核）部分および後方（被殻）部分へと分割する。
【００７０】
［１２３Ｉ］ＦＰ−ＣＩＴの特異的線条体ドパミン取り込みトランスポーター（ＤＡＴ）結合を、式：［（特定のＲＯＩにおける平均数）−（後頭ＲＯＩにおける平均数）］／（後頭ＲＯＩにおける平均数）を使用して、線条体全体、被殻および尾状核において計算する。各被験体の被殻／尾状核比も計算する。
【００７１】
全ての患者はまた、１７０ＭＢｑの静脈注射後、安静時にＦ−フルオロ−２−デオキシグルコース陽電子放出断層撮影スキャニング（ＦＤＧＰＥＴ）を受ける。各獲得は、頭部のコンピューター断層撮影法（ＣＴ）トランスミッションスキャン（１６秒持続して５０ｍＡ）、続いて、Ｂｉｏｇｒａｐｈ  Ｔｒｕｅｐｏｉｎｔ  ６４  ＰＥＴ／ＣＴスキャナー（Ｓｉｅｍｅｎｓ）を使用する１５分間の三次元（３Ｄ）静的放出を含む。ＰＥＴ断面を、反復アルゴリズム（ＯＳ−ＥＭ）を使用して再構築し、同じスキャナーで得られた頭部の低線量ＣＴスキャンから得られる密度係数を使用して、散乱および減衰に関して補正する。画像を、反復アルゴリズム順序化サブセット期待値最大化法（ＯＳＥＭ）を使用して、１２８Å−２ｍｍの１２８ピクセルの長軸横断画像の形態において再構築する。ＰＥＴシステムの解像度は、４〜５ｍｍ  ＦＷＨＭである。
【００７２】
生体力学的評価：  生体力学的評価を、ベースライン時、ならびにＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞投与の６ヶ月後および１２ヶ月後に評価する。パラメーターの２つの特定のセット（一方は、立位のもの、および一方は歩行開始のもの）を、アドホックアルゴリズム（Ｃａｒｐｉｎｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ，  ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓ  Ｎｅｕｒａｌ  Ｓｙｓｔ  Ｒｅｈａｂｉｌ  Ｅｎｇ．  ２００７（本明細書に参考として援用される））によって自動的に抽出する。立位に関しては、圧力中心（ＣｏＰ）平均速度および空間変位を測定する（Ｃａｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ２０１６（本明細書に参考として援用される））。歩行開始を検査するために、予想姿勢調節を分析し（Ｃａｎｅｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．  ２０１６（本明細書に参考として援用される））（すなわち、不安定および非荷重相）、以下のパラメーターを測定する：（１）両方の相の継続時間、（２）ＣｏＰの前後（ＡＰ）および内外（ＭＬ）のシフトおよび速度、（３）ＣｏＰ平均長および速度、（４）第１歩の長さおよび（５）速度もまた、測定する。空間パラメーターを、身長（ｂｏｄｙ  ｈｅｉｇｈｔ）（％ＢＨ）に基づいて正規化する。
【００７３】
ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞の調製および投与
Ｔｒｅｇ単離および拡大増殖（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）：  ポリＴｒｅｇを選択し、３種の細胞表面マーカー（ＣＤ４、ＣＤ２５、およびＣＤ１２７）に基づいて、ＰＳＰを有する５名の個体から拡大増殖して、以前（Ｐｕｔｎａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ２００９；  Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  ２０１５（本明細書に参考として援用される））に記載されたように末梢血に存在するＦＯＸＰ３＋  Ｔｒｅｇを精製する。
【００７４】
４００ｍｌの新鮮な末梢血を、クエン酸リン酸デキストロースを含む血液パックユニットに集め、Ｆｉｃｏｌｌ密度勾配を介してＰＢＭＣの単離のために、２４時間以内に処理する。Ｔｒｅｇを、以下のＧＭＰグレード凍結乾燥抗体を用いて高速セルソーターで単離する：ＣＤ４−ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルタンパク質）（Ｌ２００クローン）、ＣＤ１２７−ＰＥ（フィコエリトリン）（４０１３１クローン）、およびＣＤ２５−ＡＰＣ（アロフィコシアニン）（２Ａ３クローン）。ソートしたＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋細胞を、１０％  ヒト熱非働化プールＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を含む３ｍｌのＸ−ＶＩＶＯ  １５培地（Ｌｏｎｚａ，  カタログ番号０４−４１８Ｑ）中に集める。Ｔｒｅｇを、ソート後に純度に関して分析する。ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋細胞の予測される純度は、９６％より多い（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  ２０１５（本明細書に参考として援用される））。
【００７５】
精製Ｔｒｅｇを、以前（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  ２０１５（本明細書に参考として援用される））に記載されたように、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８＋組換えＩＬ−２でコーティングした臨床グレードのＤｙｎａｂｅａｄｓとともに培養する。血液ユニットは、４．２×１０６〜１１．８×１０６  精製ＣＤ４＋ＣＤ１２７ｌｏ／−ＣＤ２５＋  Ｔｒｅｇの間を得ると予測される（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  ２０１５（本明細書に参考として援用される））。拡大増殖したＴｒｅｇ調製物は、およそ９０％  ＦＯＸＰ３＋であると予測される。Ｔｒｅｇ調製物を、生存率、ＣＤ４＋パーセンテージ、およびＣＤ８＋細胞混入に関してチェックする（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  ２０１５（本明細書に参考として援用される））。
【００７６】
拡大増殖したポリＴｒｅｇｓの表現型およびＴＣＲ分析：  Ｔｒｅｇを単離するために使用される重要な細胞表面マーカーであるＣＤ４およびＣＤ１２７を、拡大増殖後にチェックする。
【００７７】
以前のデータは、天然のＣＤ４５ＲＡ＋  Ｔｒｅｇがこれらの培養物中で優先的に拡大増殖し、ＣＤ４５ＲＡ＋ＲＯ−細胞が、拡大増殖期を通じてＣＤ４５ＲＡをダウンレギュレートし、ＣＤ４５ＲＯをアップレギュレートすることを示した（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  ２０１５（本明細書に参考として援用される））。ＣＣＲ７（Ｔｒｅｇトラフィッキングレセプター）、ＣＤ３８（増強されたＴｒｅｇ機能と関連する多機能性細胞外酵素）およびＣＤ４５  ＲＯを、拡大増殖の前および後に決定する。拡大増殖したＴｒｅｇのＴＣＲβレパートリーも分析し、新鮮に単離された集団と比較して、拡大増殖したＴｒｅｇのポリクローン性を決定する。拡大増殖した細胞は、拡大増殖前培養物とは識別不可能なポリクローン性を示すこと、およびＴｒｅｇが、拡大増殖後に非常に多様な集団のままであることが予測される（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  ２０１５（本明細書に参考として援用される））。
【００７８】
拡大増殖したポリＴｒｅｇの機能分析：  Ｔｒｅｇ拡大増殖後に以下のアッセイ（Ｂｌｕｅｓｔｏｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉ．  Ｔｒａｎｓｌ．  Ｍｅｄ．，  ２０１５（本明細書に参考として援用される））を行う：
−  拡大増殖したＴｒｅｇの全体の純度および安定性を評価するためのＦＯＸＰ３座のエンハンサー領域のＤＮＡメチル化状態。
−  リンパ球表現型を評価するためのサイトカイン生成（ＩＦＮγ、ＩＬ−４、ＩＬ−５およびＩＬ−１７）。
−  拡大増殖した細胞の機能的潜在能力を決定するためのインビトロ抑制活性。
【００７９】
ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞の生成および機能分析：  ＣＡＲ  ＲＮＡを、ヒトＴｒｅｇのエレクトロポレーション後のＴｒｅｇ上の、および公開されたプロトコール（Ｚｈａｏ，  Ｙ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ａｎｄ  Ｂｅａｔｔｙ，  ＧＬ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ；  Ｓｉｎｇｈ，  Ｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１４  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌ（これらの各々の内容は、本明細書に参考として援用される）に従ったＰＳＰマウスモデルへの養子移入後のマウスＴｒｅｇ上での抗ＭＯＧ  ＣＡＲ発現に関して最適化する。第二世代レンチウイルスベクターおよび標準的プロトコール（Ｌｅｖｉｎｅ，  Ｂ．Ｌ．  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ＆  Ｃｌｉｎ  Ｄｅｖ（本明細書に参考として援用される））を使用する抗ＭＯＧ  ＣＡＲの送達もまた、最適化する。ヒトＴｒｅｇを、ＲＮＡのエレクトロポレーションを使用するＧＭＰ条件（約１ｍｇ／３×１０６  Ｔｒｅｇ）下で、またはレンチウイルス形質導入（１×１０６  ｐｆｕ／３×１０６  Ｔｒｅｇ）のいずれかで形質導入する。抗ＭＯＧ  ＣＡＲの臨床グレードのＲＮＡを生成する。２．６×１０９  Ｔｒｅｇ細胞に対して約０．９ｍｇ  ＲＮＡ／患者；５名の患者につき４．５ｍｇが、必要とされる。臨床グレードのレンチウイルスを生成する。２．６×１０９  Ｔｒｅｇ細胞に対して約８．７×１０９  ｐｆｕ／患者；５名の患者につき４．３×１０１０  ｐｆｕが、必要とされる。ＭＯＧ特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの機能分析を、３．３において上記で記載されるように行う。
【００８０】
細胞投与
ＭＯＧ特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの１回の投与を、各患者に対して行う（２．６×１０９  ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ／患者）。細胞を、少なくとも５名のＰＳＰ患者に投与する。患者は、アセトアミノフェンおよびジフェンヒドラミンでの前投薬を受ける。ＣＡＲ−Ｔｒｅｇを、末梢静脈ラインを介して１０〜３０分かけて注入する。注入の前および後に、次いで、少なくとも１時間にわたって１５分ごとに、次いで、最初の４時間について１時間ごとに、および２０時間について４時間ごとに、バイタルサインを測定する。種々の血球数を伴う化学的性質および全血球カウントを、臨床研究ユニットから退院する前に翌日に反復する。患者を、注入後４日目に、次いで、４週間にわたって１週間に１回、次いで、１年間にわたって１３週間ごとに１回、および２年間にわたって２６週間ごとに１回、追跡評価のために診察する。有害事象に関する電話モニタリングを、５年間にわたって６ヶ月毎に継続し、その後、最後のクリニック訪問を行う。
【００８１】
ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞注入後の患者評価
ＰＳＰ患者における臨床パラメーター、神経心理学的パラメーター、放射線医学的パラメーターおよび生化学的パラメーターに対するＣＮＳ特異的ＣＡＲ−Ｔｒｅｇの効果を、上記のように評価する。試験は全て、各追跡点で行う：細胞投与後１ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、および１２ヶ月。
【００８２】
実施例２
疾患を引き起こす、損傷を与える免疫応答を止める免疫抑制制御性Ｔリンパ球（Ｔｒｅｇ）の構成要素を利用する多発性硬化症（ＭＳ）の薬物を、開発および試験する。全世界のＭＳ市場は、約２１５億ドルであるが、ＭＳの最も一般的な形態に関して承認された薬物は、顕著な副作用を伴うが若干の疾患修飾を与えるに過ぎない。ＭＳのより重篤な形態に関しては、処置選択肢は、わずか１種の最近承認された薬物に限られている。
【００８３】
ＭＳの再発寛解型（ＲＲＭＳ−診断されるＭＳのうちの８５％）については、１１種のＦＤＡ承認薬が存在する。現在承認されているかまたはＲＲＭＳに関して臨床評価中の、いくつかの経口利用可能なおよび抗体ベースの薬物が存在する。２０１７年３月に、ＦＤＡは、一次進行型ＭＳ（ＰＰＭＳ−診断されるＭＳのうちの約１０％）については、オクレリズマブ（抗ＣＤ２０抗体，  Ｒｏｃｈｅ）の使用を承認した。オクレリズマブは、症状の２５％  低減をもたらし、現在、ＵＳＡではＰＰＭＳの唯一の免疫調節剤である。二次進行型ＭＳ（ＳＰＭＳ）は、ＲＲＭＳを有する患者において常に発症し、それに関しても、制限された疾患修飾選択肢が存在する。
【００８４】
生物製剤の生成
抗ＭＯＧハイブリドーマを、ＣＲＯを通じて、組換えヒトＭＯＧでマウスを免疫することによって生成する。ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子をクローニングし、抗ｓｃＦｖ分子。ＶＨおよびＶＬの配向、ならびにリンカー（ｓｃＦｖ間のまたは各ｓｃＦｖ内部の）は、ＧＴＩＰの安定性、発現レベルおよび結合能力に大きく影響を及ぼし得る。場合によっては、これらの形態のうちの１つのみが、機能的分子を生成する。従って、ＶＨ−ＶＬのいくつかの配向を、小規模に発現させ、スケールアップ生成の前に試験する。接続するリンカー、中心リンカー、次いで、Ｔｒｅｇ関連酵素または模倣物へと接続するとともに４種の抗ＭＯＧ  ｓｃＦｖをコードする発現構築物を、生成する。
【００８５】
マウスＭＳモデルにおけるＧＴＩＰタンパク質生成物の検証
ＧＴＩＰを、マウスのＭＳの急性および慢性のＥＡＥモデルにおいて試験する。ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、骨髄炎症性細胞（マクロファージおよび好中球）および抗ＭＢＰ抗体に対して特異的なＴｈ１、Ｔｈ１７、ＣＴＬ（血液およびＣＮＳ）のレベルを測定する。免疫学的応答は、疾患進行と相関する。投与を、後期ステージＭＳにおける潜在的用途への洞察を得るために変化させる。生成物を通常のマウスにおいて投与して、任意の潜在的オフターゲット効果への洞察を得る。
【００８６】
臨床評価
臨床試験を行って、ＭＳにおける疾患修飾薬剤としてのＧＴＩＰの有効性を試験する。その生成物を、第１使用薬（ｆｉｒｓｔ  ｕｓｅ  ｄｒｕｇ）に応答しないＲＲＭＳ患者において最初に試験する。安全性および耐容性を、抗体治療に関するものに類似の投与レジメンを使用して測定する（例えば、最初に２週間ごとに３回のｉ．ｖ．用量、次いで、２０週間にわたって４週間ごと）。フェーズ２試験において、一次尺度は、減少した疾患再発頻度および脳病変である。二次尺度は、血中において減少した炎症性サイトカイン、Ｔｈ１／Ｔｈ１７細胞および他の白血球レベルである。副作用は、感染しやすさの増大を含み得る。これらの試験は、再発頻度において４９％までの低減を示す他の第２使用薬に対して、上記化合物の有効性を本発明者らが基準にする（ｂｅｎｃｈｍａｒｋ）ことを可能にする。上記生成物が受容可能な有効性レベルを示す場合、それらは、ＰＰＭＳ患者におけるより長期間のフェーズ２臨床試験に入る。一次尺度は、運動機能の低下の遅延および低減した脳病変であり、二次尺度は、血中において減少した炎症性サイトカイン、Ｔｈ１／Ｔｈ１７細胞および他の白血球のレベルである。
【００８７】
実施例３
テトラマー結合アッセイを使用して、図３に示されるように、標的細胞へのＧＩＴＰ結合の結合力を、Ｔ細胞に対する既知のテトラマー（Ｏｂｅｒ，  Ｂ  ｅｔ  ａｌ，  ２０００  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ（本明細書に参考として援用される））のものと、比較する。Ｂ６．２．１６  ＣＴＬ上のＴＣＲに対するＨ−Ｙペプチド／ＭＨＣ  Ｈ−２Ｄｂ（ｐＭＨＣ）テトラマーの相対的結合力を、細胞染色およびフローサイトメトリー（ＦＣＭ）を使用する２つのパラメーターを決定することによって測定する。これらは、テトラマー染色（細胞洗浄後）の最大染色を与えるために必要とされる濃度および半減期（ｔ１／２）である。ＭＯＧ標的細胞を、非接着性標的細胞（例えば、ＲＭＡまたはＪｕｒｋａｔ細胞）の遺伝子トランスフェクションによって生成する。抗体染色およびフローサイトメトリー（ＦＣＭ）は、ＭＯＧの表面発現を確認する。抗体染色およびＦＣＭは、ＣＴＬ上にＢ６．２．１６  ＴＣＲと同じＭＯＧレベルを有するトランスフェクト体を同定する。標識ＧＩＴＰタンパク質でのＭＯＧ標的細胞の染色の最大染色および半減期を測定し、図４および５に示されるように、ＣＴＬおよびｐＭＨＣテトラマーのものと比較する。その目的は、ＣＴＬおよびｐＭＨＣテトラマーのものに匹敵するかまたはこれより良好な細胞相互作用の結合力を有するＧＩＴＰを生成することである。ＧＩＴＰ分子におけるテトラマー抗ＭＯＧ  ｓｃＦｖが、このバーを下回る場合、ｓｃＦｖのバランス（ｖａｌａｎｃｅ）結合価は増大され得る。さらにより高い結合価が必要とされる場合、ナノ粒子足場が、標的細胞結合のための必要な結合力を達成するために使用され得る。
【００８８】
実施例４
ＭＯＧ標的細胞に結合したＧＴＩＰがＴエフェクター（Ｔｅｆｆ）細胞の増殖を抑制する能力を試験する。所定のスカベンジャーＩＥ（以下の表１を参照のこと）のテトラマーから構成されるＧＴＩＰは、ＭＯＧ標的細胞に結合され、洗浄され、次いで、増殖しつつあるヒトＴｅｆｆ（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８およびＩＬ−２刺激の３日後に標準的手順を使用して生成される）とともにインキュベートされる（図６の中央の列）。
【表１】
2021531280.tif 000002
【００８９】
細胞を、ＧＴＩＰにおけるＩＥの基質である関連する有糸分裂促進性代謝産物（Ｍ）（上記の表を参照のこと）を添加した培地中で培養する。経時的に、Ｍの濃度およびＴｅｆｆの数を、図６に示されるように測定する。ＧＴＩＰ修飾されたＭＯＧ−標的細胞の数は、抑制活性の指数を与えるために、一定の時間後にＴｅｆｆの数に対して量が決定される（ｔｉｔｒａｔｅ）。陰性コントロール実験（図６の左列）では、ＭＯＧ−標的細胞に結合したテトラマーｓｃＦｖは、より長いＭ半減期、一定時間後のより多量のＴｅｆｆおよびＴｅｆｆ細胞蓄積に対する抑制活性なしを生じる。陽性コントロール（図６の右列）として、ヒトＴｒｅｇ（標準条件下で、例えば、ＣＤ３／ＣＤ２８およびＴＧＦ−β刺激の９日後に、生成される）を、Ｔｅｆｆ細胞と共存培養し、抑制活性を、ＧＴＩＰ修飾されたＭＯＧ標的細胞のものと比較する。ヒトＴｒｅｇ細胞のものと匹敵する、ＧＴＩＰ修飾したＭＯＧ標的細胞の細胞間ベースでの有効性は、特定のＩＥでのＧＴＩＰ分子の陽性検証として働く。上記アッセイは、最も有効なＩＥ分子から構成されるＧＴＩＰを同定する。有効性は、ＧＴＩＰ分子におけるＩＥ分子の１より多くのタイプを添加すること、および／またはＩＥ分子の結合価を増大させることによって、増大され得る。
【００９０】
実施例５
ＭＯＧに特異的なｓｃＦｖを発現するＣＡＲ分子が、Ｔｒｅｇ細胞をＭＯＧ発現標的細胞に、生理学的に意味のあるＴ細胞：標的細胞相互作用に近い相対的結合力で結合させる能力を測定するために、アッセイが使用される。比較のために使用される生理学的に意味のあるＴ細胞：標的細胞相互作用は、ＣＴＬ：ペプチド／ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）／標的細胞相互作用である。これは、細胞−細胞結合体のためのフローサイトメトリー（ＦＣＭ）ベースのアッセイ（Ｏｐｆｅｒｍａｎ，  ＪＴ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００１  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．（本明細書に参考として援用される））を使用して行われる。
【００９１】
関連するＣＴＬクローン（Ｂ６．２．１６）に対するｐＭＨＣ標的の相対的結合力を決定する（図７の左列）。標的を、生体染色色素（ｖｉｔａｌ  ｄｙｅ）ＰＫＨ２６（赤色）で標識し、ＣＴＬをＣＦＳＥ（緑色）で標識し、４時間にわたって共インキュベートし、次いで、標準的剪断力に供して、ＦＣＭによって検査する。結合体は、二重染色ダブレットとして検出され、Ｈ−Ｙペプチド抗原の存在に依存する。ｐＭＨＣ標的：Ｂ６．２．１６  ＣＴＬ相互作用の相対的結合力は、２つのパラメーター（結合体形成の最大レベル（全投入細胞のうちの約８０％）および結合体の解離の半減期）によって測定される。ＭＯＧ標的細胞を、標準的条件（例えば、抗ＣＤ３／ＣＤ２８  ＩＬ−２刺激Ｔ細胞のレンチウイルス形質導入）下で生成したＣＡＲ−抗ＭＯＧ  ｓｃＦｖ発現ヒトＴ細胞とともにインキュベートする。標識した細胞間の結合体の半減期を、ＦＣＭによって測定する（図７の右列）。ＣＴＬ：ｐＭＨＣ／標的細胞のものと匹敵する結合体半減期は、ＭＯＧ陽性標的細胞に関するＴ細胞に対する抗ＭＯＧ  ｓｃＦｖ／ＣＡＲの生理学的結合力を示す。  
【００９２】
実施例６
ヒトファージディスプレイｓｃＦｖライブラリーの親和性パニングによって、ヒトＭＯＧに対して特異的なｓｃＦｖ抗体を生成した。ＱＣ  ＳＤＳ−ＰＡＧＥを、ライブラリースクリーニングの前に行って、標的の純度を評価した。非特異的結合因子を低減するために、プレカウンター選択（ｐｒｅ−ｃｏｕｎｔｅｒ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ）を、ポリスチレン平底プレートおよびブロッキング緩衝液を使用して、先ず標的化スクリーニングの前に上記ファージライブラリーに対して行った。
【００９３】
３回のバイオパニングの後に、陽性富化を観察した。２０個のクローンを、３回目から無作為に拾い上げ、ＱＣモノクローナルファージＥＬＩＳＡを行った。１８個のクローンは、コントロールと比較して、標的に結合することが見出された。１８個全ての陽性クローンを配列決定した。
【００９４】
別の２０のクローンを、３回目から拾い上げ、ＱＣモノクローナルファージＥＬＩＳＡに供した。第２のクローンセットの２０個の全てが、コントロールと比較して、標的に結合することが見出された。それらの全てを配列決定した。
【００９５】
３８の陽性クローンの分析後に、特有の配列を有する７個の陽性クローン（クローン１、３、６、１０、１３、１７、２１）が同定された。７種のｓｃＦｖタンパク質の配列およびこれらをコードするＤＮＡ配列を、以下に列挙する：
【００９６】
【化１】
2021531280.tif 000003
【化２】
2021531280.tif 000004
【化３】
2021531280.tif 000005
【化４】
2021531280.tif 000006
【化５】
2021531280.tif 000007
【００９７】
発現ベクターを、上記７種のｓｃＦｖタンパク質の各々に関して構築した。その後、上記細胞溶解物を、ＥＬＩＳＡのためにコーティングした。次いで、可溶性ＥＬＩＳＡを、３０℃および３７℃の両方からの細胞溶解物を使用して行った。コントロールと比較したところ、全７個のクローンにおいて差異が容易に観察された。上記７個の陽性クローンの中で、クローン１、６および１３は、他のものより遙かに強かった。
【００９８】
量の決定を伴うＥＬＩＳＡを、上記７個の陽性クローンから生成した可溶性ｓｃＦｖに対して行って、それらがＭＯＧに結合する能力をランク付けした。上記７種のｓｃＦｖをｐＥＴ−２６ｂにサブクローニングして、ｓｃＦｖ−ｍｙｃ−６×Ｈｉｓフォーマットとして構築した。１６℃において誘導した上記７種のｓｃＦｖの純度は、＞８５％であったのに対して、３７℃で誘導した場合の純度は、より低かった。よって、１６℃を、生成のためのより適切な条件であると決定した。ＱＣ  ＥＬＩＳＡを行って、上記７種のｓｃＦｖの各々に関して標的ＭＯＧへの結合能力を分析した。コントロールと比較したところ、上記７個の陽性クローン（クローン１、３、６、１０、１３、１７、２１）の各々において差異が容易に見出された。上記７個の陽性クローンの中で、３個のクローン（クローン３、６および１７）は、標的に対してより強い結合能力を示した。
【００９９】
１６℃で誘導した上記７個のクローンの各々に関するＱＣ  ＥＬＩＳＡによる量の決定を、行った。上記７個のクローンの７種の異なる濃度を、ＥＬＩＳＡによる量の決定のために使用した。結果は、７個全てのクローンが、標的ＭＯＧに特異的に結合し得ることを示した。上記７個のクローンの中で、クローン３、６および１７は、上記標的に対してより強い結合親和性をなお示した。結果を、図８に示す。図８は、クローン１７の抗ｈＭＯＧ１  ｓｃＦｖが最強の結合を示し、続いて、クローン６の結合、次いで、クローン３の結合であったことを図示する。その残りの４個のクローンは、クローン１７、６および３のものより有意に弱い結合を示した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年5月13日(2021.5.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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2021531280.tif 000017
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