(57)【要約】  本発明は、組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む細菌株であって、（ｉｉ）野生型ｌｐｐ遺伝子によってコードされるリポタンパク質Ｌｐｐと比較して、最大で１０個のアミノ酸の相違を示す変異したリポタンパク質（Ｌｐｐ（Ｎ））をコードする以下のＤＮＡ配列（ｌｐｐ（Ｎ））及び（ｉｉｉ）野生型ｌｐｐ遺伝子によってコードされるリポタンパク質（Ｌｐｐ）と比較して、最大で１０個のアミノ酸の相違を示す変異したリポタンパク質（Ｌｐｐ（Ｃ））をコードするさらなるＤＮＡ配列（ｌｐｐ（Ｃ））に結合した（ｉ）ペリプラズムにタンパク質の移動を媒介するＮ末端シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片からなるオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする、細菌株に関する。本発明はさらに、本発明による細菌株を使用する組換えタンパク質の発酵生産のための方法に関する。このようにして、先行技術と比較して、培地中の組換えタンパク質の量を増加させることが可能である。
2021531784.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む細菌株であって、以下からなるオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする細菌株。
ｉ  以下のｉｉ及びｉｉｉに連結している、ペリプラズムへのタンパク質の移動を媒介するＮ末端シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片、
ｉｉ  野生型ｌｐｐ遺伝子によってコードされるリポタンパク質Ｌｐｐと比較して、最大で１０個のアミノ酸の相違を有するリポタンパク質（Ｌｐｐ（Ｎ））をコードするｉに続くＤＮＡ配列（ｌｐｐ（Ｎ））、及び
ｉｉｉ  野生型ｌｐｐ遺伝子によってコードされるリポタンパク質（Ｌｐｐ）と比較して、最大で１０個のアミノ酸の相違を有するリポタンパク質（Ｌｐｐ（Ｃ））をコードするさらなるＤＮＡ配列（ｌｐｐ（Ｃ））。
【請求項２】
前記細菌株が、大腸菌種の菌株であることを特徴とする、請求項１に記載の細菌株。
【請求項３】
プロセシングされた野生型Ｌｐｐタンパク質と比較して少なくとも８０％の同一性を有するタンパク質をコードするさらなる遺伝子を含まないことを特徴とする、請求項１又は２に記載の細菌株。
【請求項４】
Ｌｐｐ（Ｎ）及びＬｐｐ（Ｃ）が、１個から複数のアミノ酸からなるリンカーにより連結されていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項以上に記載の細菌株。
【請求項５】
ｌｐｐ（Ｎ）及びｌｐｐ（Ｃ）によってコードされるアミノ酸配列が、
Ｌｐｐ（Ｎ）において野生型Ｌｐｐタンパク質に存在するＣ末端アミノ酸リジンが存在しないか、又は
Ｌｐｐ（Ｃ）において野生型Ｌｐｐタンパク質に存在するＮ末端アミノ酸システインが存在しない
点で、野生型Ｌｐｐタンパク質のアミノ酸配列と異なることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか一項に記載の細菌株。
【請求項６】
ｌｐｐ（Ｎ）又はｌｐｐ（Ｃ）によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも１つにおいて、アミノ酸位置７７のアルギニンの代わりに存在するものが、タンパク質を構成する他の任意のアミノ酸であることを特徴とする（アミノ酸の番号付け及び配列は、プロセシングを受けていない野生型Ｌｐｐタンパク質に基づく）、請求項１〜５のいずれか一項以上に記載の細菌株。
【請求項７】
ｌｐｐ（Ｎ）又はｌｐｐ（Ｃ）によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも１つについて７７位におけるタンパク質を構成するアミノ酸が、システインであることを特徴とする、請求項６に記載の細菌株。
【請求項８】
Ｎ末端シグナルペプチドが、野生型Ｌｐｐタンパク質のシグナルペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一項以上に記載の細菌株。
【請求項９】
Ｎ末端シグナルペプチドが、アミノ酸位置１４において、グリシンの代わりに、タンパク質を構成する他の任意のアミノ酸を含み、他の全てのアミノ酸位置において野生型Ｌｐｐタンパク質のシグナルペプチドと同一であることを特徴とする（アミノ酸の番号付け及び配列は、野生型Ｌｐｐタンパク質のシグナルペプチドに基づく）、請求項８に記載の細菌株。
【請求項１０】
Ｎ−末端シグナルペプチドの位置１４におけるタンパク質を構成するアミノ酸が、アスパラギン酸であることを特徴とする、請求項９に記載の細菌株。
【請求項１１】
リンカー配列を形成するアミノ酸が、グリシン、セリン及びアラニンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項以上に記載の細菌株。
【請求項１２】
２ｘＬｐｐタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、野生型Ｌｐｐタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの代わりに、染色体に位置することを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一項以上に記載の細菌株。
【請求項１３】
組換えタンパク質が、異種タンパク質であることを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一項以上に記載の細菌株。
【請求項１４】
請求項１〜１３のいずれか一項以上に記載の細菌株を発酵培地で培養し、発酵後、細胞から前記発酵培地を除去し、前記発酵培地からタンパク質を単離することを特徴とする、組換えタンパク質の発酵産生方法。
【請求項１５】
組換えタンパク質が、発酵培地の除去後に発酵培地から精製されることを特徴とする、請求項１４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規な細菌ｌｐｐ突然変異体及び組換えタンパク質の分泌産生のための発酵法におけるその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、組換えタンパク質医薬品（医薬品タンパク質／生物製剤）の市場が堅調に成長している。特に重要なタンパク質医薬品は、真核生物のタンパク質、特に哺乳類のタンパク質及びヒトのタンパク質である。重要な医薬品タンパク質（医薬活性タンパク質）の例は、サイトカイン、成長因子、タンパク質キナーゼ、タンパク質及びペプチドホルモン、並びに抗体及び抗体断片である。医薬品タンパク質の製造コストは依然として非常に高いので、より効率的で、したがって、より費用効果の高い方法及びその生産のためのシステムの研究が進行中である。
【０００３】
一般に、組換えタンパク質は、哺乳類の細胞培養又は微生物系のいずれかで産生される。哺乳類の細胞培養と比較して、微生物系は、組換えタンパク質をより短時間かつ低コストで産生することが可能であるという利点を有する。したがって、細菌は特に組換えタンパク質の産生に適している。遺伝学及び生理学が広く研究されているため、世代時間が短く、取り扱いも簡単であることから、グラム陰性腸内細菌エスケリキア・コリ（大腸菌）は現在、組換えタンパク質の産生に最もよく使われている生物である。複雑な細胞破壊及び潜在的に不採算なタンパク質のリフォールディング過程の手間を省くので、特に魅力的なのは、標的タンパク質が細菌細胞によって正しい折りたたみの中で直接発酵培地に放出される産生方法である。細胞外産生のさらなる利点は、標的タンパク質の蓄積がペリプラズムの空間又は細胞質の空間に限定されないので、培地への標的タンパク質の放出がしばしば生成物の収率を増加させることができることである。
【０００４】
標的タンパク質の細胞外産生に適しているのは、例えば、大腸菌のいわゆる「リーキー（ｌｅａｋｙ）」株であり、この株は、細胞エンベロープの特定の構造要素の欠失又は変化ゆえに、ペリプラズム中に位置するタンパク質を、増加した程度で培地中に放出する。このような「リーキー」株は、特に、Ｂｒａｕｎのリポタンパク質（ｌｐｐ）における特定の突然変異体の場合のように、外膜におけるリポタンパク質の割合を変化させた可能性がある（Ｉｎｏｕｙｅら、１９７７、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２、３０８〜３１３頁、Ｓｕｚｕｋｉ  １９７８、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６７、１〜９頁、Ｇｉａｍら  １９８４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４１、３３１〜３７９頁）。
【０００５】
異種タンパク質の工業規模の産生方法が開示されており、この方法では、大腸菌の異なるｌｐｐ突然変異体を用いて、発酵培地への標的タンパク質の放出が達成される（ＵＳ２００８／０２５４５１１Ａ１号、ＵＳ５，２２３，４８２Ａ号）。
【０００６】
しかし、細胞溶解の傾向が高いため、「リーキー」株は、いくつかの異種標的タンパク質の産生において、例えば、培地への増加した量のＣａ及びＭｇイオンの添加のような、細胞を安定化するための特定の手段にもかかわらず、リーキー株は相対的に早期かつ大幅に溶解するという欠点を有しており（ＵＳ２００８／０２５４５１１Ａ１号参照）、その結果は第一に、タンパク質産生相が短縮され、このためより長い産生相の場合よりも製品収率が低いことである。第二に、細胞溶解により培地の粘度が上昇し、これは特に細胞溶解時に放出されるＤＮＡに起因する。その結果、その後の標的タンパク質の精製及び回収がより困難になり、ひいては不必要に高い方法コストにつながる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００７】
【特許文献１】米国特許出願公開第２００８／０２５４５１１号明細書
【特許文献２】米国特許第５，２２３，４８２Ａ号明細書
【非特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｉｎｏｕｙｅら、１９７７、Ｊ．Ｂａｃｔ．１３２、３０８〜３１３頁
【非特許文献２】Ｓｕｚｕｋｉ  １９７８、Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ．１６７、１〜９頁
【非特許文献３】Ｇｉａｍら  １９８４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４１、３３１〜３７９頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
本発明の目的は、組換え標的タンパク質を産生するための発酵方法において使用するための突然変異細菌株を提供することであり、ここで、培養中に標的タンパク質の主たる部分が発酵培地に分泌され、培養培地中に存在する標的タンパク質の量は、先行技術で開示されている細菌株の場合よりも多い。すなわち、標的タンパク質は、増加した収率で培養培地中に存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目的は、組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む細菌株であって、以下のｉからなるオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする細菌株によって達成される。
ｉ  以下のｉｉ及びｉｉｉに連結している、ペリプラズムへのタンパク質の移動を媒介するＮ末端シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片
ｉｉ  野生型ｌｐｐ遺伝子によってコードされるリポタンパク質Ｌｐｐと比較して、最大で１０個のアミノ酸の相違を有するリポタンパク質（Ｌｐｐ（Ｎ））をコードするｉに続くＤＮＡ配列（ｌｐｐ（Ｎ））及び
ｉｉｉ  野生型ｌｐｐ遺伝子によってコードされるリポタンパク質（Ｌｐｐ）と比較して、最大で１０個のアミノ酸の相違を有するリポタンパク質（Ｌｐｐ（Ｃ））をコードするさらなるＤＮＡ配列（ｌｐｐ（Ｃ））
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１Ａ】実施例で使用されたプロセシングを受けていないＬｐｐ融合タンパク質（Ａ、２ｘＬｐｐ）の模式図を示す。
【図１Ｂ】実施例で使用されたプロセシングを受けていないＬｐｐ野生型タンパク質（Ｂ、Ｌｐｐ、配列番号２で明記されている配列）の模式図を示す。
【図１Ｃ】実施例で使用されたプロセシングを受けていないＬｐｐ融合タンパク質（Ｃ、２ｘＬｐｐΔ、配列番号３で明記されている配列）の模式図を示す。
【図２】発現プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
細菌株は、好ましくは、グラム陰性細菌、特に好ましくは腸内細菌科の細菌株、特に好ましくは大腸菌種の株であることを特徴とする。
【００１３】
オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンと終止コドンの間にあり、タンパク質のアミノ酸配列をコードするＤＮＡ又はＲＮＡのその領域を指す。ＯＲＦはコード領域ともよばれる。
【００１４】
ＯＲＦは非コード領域に囲まれている。したがって、遺伝子とは、生物学的に活性なＲＮＡを作るための全ての基本情報を含むＤＮＡ断片を指す。このように遺伝子は、それから転写によって一本鎖ＲＮＡの複製が作られるＤＮＡ断片だけでなく、この複製方法の調節に関与する追加のＤＮＡ断片も含んでいる。遺伝子は少なくとも１つのＯＲＦを含んでいるので、遺伝子はまた少なくとも１つのタンパク質をコードしている。
【００１５】
ＯＲＦでは、ＤＮＡの塩基トリプレットが、いずれの場合も特定のアミノ酸又は終止シグナルをコードしている。タンパク質の形成のための構成単位としてコードされるアミノ酸は、タンパク質を構成するアミノ酸とも呼ばれる。
【００１６】
本発明の文脈において単数形で使用される「一つの／その組換えタンパク質」という用語はまた、複数の異なる組換えタンパク質を意味することができる。好ましくは、１〜３種類の異なる組換えタンパク質、特に好ましくは１種類の組換えタンパク質又は２種類の異なる組換えタンパク質が関与する。組換えタンパク質は標的タンパク質とも呼ばれる。
【００１７】
ＥｃｏＧｅｎｅ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎ  Ｎｏ．  ＥＧ１０５４４に掲載された大腸菌のｌｐｐ野生型遺伝子のＤＮＡ配列（配列番号１）は、７８個のアミノ酸（配列番号２）からなるプロセシングを受けていないＬｐｐタンパク質（Ｌｐｐプレタンパク質）をコードする。ここで、最初の６０個のヌクレオチドが、タンパク質のペリプラズムへの分泌を制御し、移動（プロセシング）後に切断されるシグナルペプチドをコードする。プロセシングされたＬｐｐ野生型タンパク質のＮ末端及びＣ末端にそれぞれ位置するのは、システイン残基（Ｃｙｓ）及びリジン残基（Ｌｙｓ）（図１Ｂ参照）であり、これらは、Ｌｐｐタンパク質の完全な機能、すなわち、ペプチドグリカン層（細菌細胞壁とも呼ばれる）への外膜の連結を保証するために、細胞によって翻訳後修飾される（Ｇｉａｍら  １９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９、５６０１〜５６０５頁）。Ｌｐｐ、Ｌｐｐタンパク質、野生型Ｌｐｐタンパク質及びＬｐｐ野生型タンパク質という用語は、本発明において同義的に使用され、技術文献においてはリポタンパク質、ムレインリポタンパク質又はＢｒａｕｎのリポタンパク質とも呼ばれる。タンパク質Ｌｐｐは遺伝子ｌｐｐ（ｌｐｐ遺伝子、野生型ｌｐｐ遺伝子、ｌｐｐ野生型遺伝子）によってコードされる。
【００１８】
本発明による細菌株は、Ｎ末端シグナルペプチド、ｌｐｐ（Ｎ）及びｌｐｐ（Ｃ）をコードするＤＮＡ断片からなるＯＲＦを含む。前記ＯＲＦによってコードされるタンパク質は、Ｌｐｐ融合タンパク質である。本発明の文脈において、Ｌｐｐ融合タンパク質は、２つのＬｐｐタンパク質（以下、Ｌｐｐ部分と呼ばれる。各部分は、場合によっては突然変異したＬｐｐ野生型タンパク質に相当する）から構成され、プロセシングを受けていない形態ではシグナルペプチド（ＳＰ）を担う融合タンパク質を意味すると理解される。図１Ａは、プロセシングを受けていない形態のこのような融合タンパク質を模式的に表す。この場合、融合タンパク質のプロセシングを受けていない形態のシグナルペプチドと結合しているＮ末端部分（Ｌｐｐ（Ｎ））は、Ｃ末端部分（Ｌｐｐ（Ｃ））と連結している。Ｌｐｐ（Ｎ）及びＬｐｐ（Ｃ）は、直接または１個から複数個のアミノ酸からなるアミノ酸リンカー配列（Ｌ）により連結することができる。
【００１９】
融合タンパク質の２つのＬｐｐ部分のそれぞれのアミノ酸配列は、いずれの場合も、プロセシングされたＬｐｐ野生型配列に相当することもあれば、プロセシングされたＬｐｐ野生型配列と比較して、アミノ酸配列に１０個までの突然変異を含むこともあり、２つのＬｐｐ部分の突然変異が同一である必要はない。本発明では、Ｌｐｐ融合タンパク質は２ｘＬｐｐタンパク質とも呼ばれ、２ｘｌｐｐ遺伝子によってコードされる。
【００２０】
Ｌｐｐ融合タンパク質のアミノ酸配列に存在する可能性のある突然変異には、置換（アミノ酸の交換）、欠失（アミノ酸の欠失）及び挿入（付加アミノ酸の挿入）がある。
【００２１】
本発明による菌株において、Ｌｐｐ融合タンパク質をコードする２ｘｌｐｐ遺伝子は、染色体上又はプラスミド上のいずれかに存在する。好ましくは、Ｌｐｐ融合タンパク質をコードする遺伝子は染色体上に位置する。
【００２２】
好ましくは、細菌株は、プロセシングされた野生型Ｌｐｐタンパク質と比較して少なくとも８０％の同一性を有するタンパク質をコードするさらなる遺伝子を含まないことを特徴とする。プロセシングされた野生型Ｌｐｐタンパク質の配列は、配列番号２においてアミノ酸２１からアミノ酸７８までに規定されている。
【００２３】
特に好ましくは、本発明による細菌株は野生型ｌｐｐ遺伝子を含まない。このように、Ｌｐｐ融合タンパク質が、前記株で起こる唯一のＬｐｐ型である細菌株が好ましい。この実施形態では、細菌株はＬｐｐ野生型タンパク質を形成せず、Ｌｐｐ融合タンパク質とは別に、アミノ酸交換によるＬｐｐ野生型タンパク質に由来するＬｐｐバリアントを形成しない。
【００２４】
好ましくは、Ｌｐｐ（Ｎ）及びＬｐｐ（Ｃ）は、１乃至複数のアミノ酸、特に好ましくは１〜２０個、特に好ましくは１〜１０個のアミノ酸からなるリンカーにより連結される。リンカー配列のために原則的に可能なものは、任意の所望の順序の２０個のタンパク質を構成するアミノ酸全てである。リンカー配列が構成される好ましいアミノ酸は、グリシン、セリン及びアラニンである。特に好ましい実施形態では、リンカー配列は３つのグリシン残基からなる。
【００２５】
細菌株は、ｌｐｐ（Ｎ）及びｌｐｐ（Ｃ）によってコードされるアミノ酸配列が、
ｉ）  Ｌｐｐ（Ｎ）  野生型Ｌｐｐタンパク質に存在するＣ末端アミノ酸リジンが突然変異するか、
ｉｉ）  Ｌｐｐ（Ｃ）  野生型Ｌｐｐタンパク質に存在するＮ末端アミノ酸システインが突然変異する
という点で、野生型Ｌｐｐタンパク質のアミノ酸配列と異なることを特徴とすることが好ましい。
【００２６】
特に好ましい実施形態では、Ｌｐｐ野生型タンパク質とは対照的に、Ｌｐｐ（Ｎ）の場合にはＣ末端リジン残基の、及びＬｐｐ（Ｃ）の場合にはＮ末端システイン残基の突然変異が存在する。特に好ましくは、前記残基が欠失する（図１Ｃ参照）。この突然変異は、前記アミノ酸残基で通常起こる翻訳後修飾を防止することを意図している。
【００２７】
配列番号３（図１Ｃに模式的に表される）は、シグナルペプチド（アミノ酸１〜２０）、Ｌｐｐ（Ｎ）ΔＬｙｓ７８（アミノ酸２１〜７７）及びＬｐｐ（Ｃ）ΔＣｙｓ２１（アミノ酸８１〜１３７）を含み、Ｌｐｐ（Ｎ）ΔＬｙｓ７８及びＬｐｐ（Ｃ）ΔＣｙｓ２１は、Ｃ末端リジン残基の欠失によってのみ、及びＮ末端システイン残基の欠失によってのみ、それぞれＬｐｐ野生型配列と異なり、３つのグリシン残基からなるリンカー配列により互いに連結されている、依然としてプロセシングを受けていないＬｐｐ融合タンパク質の特に好ましい配列の例を規定する。本発明の文脈において、前記タンパク質は、２ｘＬｐｐΔと命名される。２ｘＬｐｐΔタンパク質は、配列番号１６に規定されているＤＮＡ断片によってコードされる。前記ＤＮＡ断片を２ｘｌｐｐΔと命名する。
【００２８】
好ましくは、細菌株は、ｌｐｐ（Ｎ）又はｌｐｐ（Ｃ）によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも１つにおいて、アミノ酸位置７７のアルギニンの代わりに存在するものが、任意の他のタンパク質を構成するアミノ酸（プロセシングを受けていない野生型Ｌｐｐタンパク質に基づくアミノ酸の番号付け及び配列）であることを特徴とする。特に好ましくは、２つのＬｐｐ部分の少なくとも１つについて７７位におけるアルギニン残基の、システイン残基との交換（Ｒ７７Ｃ交換）である。
【００２９】
大腸菌由来のリポタンパク質の全てのシグナルペプチドは、Ｌｐｐ融合タンパク質のペリプラズムへの移動のシグナルペプチドとして原則的に可能である。例は、リポタンパク質Ｌｐｐ、Ｐａｌ、ＮｌｐＩ、ＮｌｐＢ及びＯｓｍＢのシグナルペプチドである（Ｈａｙａｓｈｉ及びＷｕ  １９９０、Ｊ．Ｂｉｏｅｎｅｒｇ．Ｂｉｏｍｅｍｂｒ．２２、４５１〜４７１頁）。本発明の文脈において、シグナルペプチドは、それぞれの野生型配列、又は１つ以上の突然変異によって野生型配列から誘導される配列を含むことができる。Ｌｐｐ融合タンパク質のシグナルペプチドは、好ましくは、野生型Ｌｐｐタンパク質のシグナルペプチドの配列を含み、野生型Ｌｐｐタンパク質のシグナルペプチドと比較して、アミノ酸配列の相違が最大で８箇所に存在する。
【００３０】
好ましくは、細菌株は、Ｎ末端シグナルペプチドが野生型Ｌｐｐタンパク質のシグナルペプチドに対して少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列であることを特徴とする。特に好ましくは、Ｌｐｐ融合タンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列は、野生型Ｌｐｐタンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列と同一であり、特に好ましくは、ヌクレオチド配列も同一である。野生型Ｌｐｐタンパク質のシグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号２において配列番号１から２０まで、ヌクレオチド配列は配列番号１においてヌクレオチド１から６０までに規定されている。
【００３１】
好ましくは、細菌株は、Ｎ末端シグナルペプチドが、アミノ酸位置１４において、グリシンの代わりにいくつかの他のタンパク質を構成するアミノ酸を含み、他の全てのアミノ酸位置において野生型Ｌｐｐタンパク質のシグナルペプチドと同一であることを特徴とする。
【００３２】
特に好ましくは、細菌株は、Ｎ末端シグナルペプチドの１４位のタンパク質を構成するアミノ酸がアスパラギン酸であることを特徴とする。この場合、グリシン残基の代わりに１４位にアスパラギン酸残基が存在し（Ｇ１４Ｄ交換）、他の全てのアミノ酸位置は野生型Ｌｐｐタンパク質のシグナルペプチドと同一である。
【００３３】
２ｘｌｐｐ遺伝子の発現は、大腸菌で機能しているどのプロモーターによっても制御できる。この場合、ほとんどの増殖条件下で構成的に活性なプロモーター（例えば、σ７０依存性プロモーター）、例えば、遺伝子ｇａｐＡ、ｒｐｉＡ、ｍｐｐＡ、ｌｐｐ、ｃａｔＢ、ｔｕｆＢ及びｐｒｏＣのプロモーター、並びに、例えば、ｔｅｔＡプロモーター、ｌａｃプロモーター、ｔａｃプロモーター及びｔｒｐプロモーターのような規制的に活性なオペレーター領域を持たない天然又は人工のプロモーターが好ましい。プロモーターは、天然配列を含むか、又は塩基交換によりその強度に関して調節され得る。
【００３４】
好ましい実施形態において、細菌株は、２ｘＬｐｐタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、野生型Ｌｐｐタンパク質をコードするオープンリーディングフレームの代わりに染色体に位置することを特徴とする。染色体ｌｐｐ野生型ＯＲＦをＬｐｐ融合タンパク質のＯＲＦに置換したこれらの株では、Ｌｐｐ融合タンパク質の発現は天然ｌｐｐプロモーターの制御下にある。これは、２ｘｌｐｐ遺伝子が野生型Ｌｐｐタンパク質の発現にも関与するプロモーターの制御下にあることを意味する。
【００３５】
本発明によるＬｐｐ融合タンパク質の遺伝子を生成する方法は、当業者に知られている。
【００３６】
このような遺伝子は、一般に最初にｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成され、次に細胞に導入される。例えば、Ｌｐｐ融合タンパク質の遺伝子は、融合タンパク質の２つのＬｐｐ部分の１つを各々コードする２つのＤＮＡ分子をスプライシングすることにより、「オーバーラップ伸長」ＰＣＲ法を用いて産生することができ（Ｈｏｒｔｏｎら  ２０１３、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５４、１２９〜１３３頁）、最初にｌｐｐ野生型遺伝子のＤＮＡが鋳型として機能する。あるいは、２ｘｌｐｐ遺伝子は遺伝子合成によっても完全に生成される。
【００３７】
Ｌｐｐ融合タンパク質の遺伝子をプラスミドによって細胞内で発現させる場合には、まずその遺伝子をプラスミド内にクローニングしなければならない。この目的に適しているのは、選択された菌株の中を伝播可能な全ての既知のプラスミドであり、例えば、ｐＪＦ１１８ＥＨ、ｐＫ２２３−３、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＳＫ−ＩＢＡｐ３又はｐＥＴのような既知の発現ベクターの派生物である。２ｘｌｐｐ遺伝子のプラスミドへの一体化及びプラスミドの細菌細胞への形質転換のための方法は、当業者に知られている。
【００３８】
あるいは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成された２ｘｌｐｐ遺伝子はまた、種々の標準的方法によって宿主細胞の染色体に一体化させることができる。この一体化は天然のｌｐｐ遺伝子座（その結果、もともとそこに位置していたｌｐｐ野生型遺伝子が２ｘｌｐｐ遺伝子と置換される）、あるいは染色体の別の部位のどちらでも起こり得る。
【００３９】
染色体への一体化は、例えば、相同的組換えのメカニズムを介して、Ｌｉｎｋら（１９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９、６２２８〜６２３７頁）に記載されている方法によって達成することができる。この目的のためには、まずＬｐｐ融合タンパク質をコードする遺伝子をプラスミドｐＫＯ３にクローニングしなければならず、次いで該プラスミドは細胞に導入される。次に、これらの形質転換細胞を用いて行われるのは、Ｌｐｐ融合タンパク質をコードする遺伝子を染色体に一体化するＬｉｎｋらに記載された手順である。
【００４０】
あるいは、２ｘｌｐｐ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、Ｓｕｎら（２００８、Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．７４、４２４１〜４２４５頁）によって記載された方法に従って細胞に直接形質転換し、所望の部位で染色体に一体化することもできる。これには、対抗選択の原理を利用することが含まれる。まず、２ｘｌｐｐ遺伝子が細胞の染色体に一体化されるべき所望の遺伝子座に導入されるものは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードするネコ遺伝子及びレバンスクラーゼをコードする枯草菌のｓａｃＢ遺伝子を含む発現カセットである。前記カセットの一体化は、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法によって可能であり（２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．９７、６６４０〜６６４５頁）、クロラムフェニコール耐性に対する選択によって正しい要素を同定することが可能である。このような細胞はクロラムフェニコールに耐性であり、ｓａｃＢ遺伝子の発現により、ショ糖に感受性がある。その後、これらの細胞を直鎖ＤＮＡ断片で形質転換し、そこでのＤＮＡ断片の部位特異的一体化を保証するために、当該断片は２ｘｌｐｐ遺伝子を含み、当該断片の側面は所望の遺伝子座に相同のＤＮＡ配列を含む。２ｘｌｐｐ遺伝子によるｃａｔ−ｓａｃＢカセットの交換が行われた細胞は、ショ糖の存在下で増殖能が回復するために同定することができる。２ｘｌｐｐ遺伝子の染色体への正確な一体化の最終的な検証は、一体化部位に特異的なオリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲ及びその後のＰＣＲ産物の配列決定によって達成することができる。
【００４１】
好ましくは、組換えタンパク質は異種タンパク質である。本発明の文脈において、異種タンパク質は、細菌株のプロテオーム、すなわちタンパク質の天然セット全体に属さないタンパク質を意味すると理解される。
【００４２】
好ましくは、異種タンパク質は真核生物タンパク質であり、特に好ましくは、１つ以上のジスルフィド結合を含むか、又はその機能的形態で、二量体又は多量体として存在するタンパク質、すなわち、タンパク質が四次構造を有し、複数の同一（相同）又は非同一（異種）サブユニットから構成されるタンパク質である。
【００４３】
最も重要な異種タンパク質クラスには、抗体及びその断片、サイトカイン、成長因子、タンパク質キナーゼ、タンパク質ホルモン、リポカリン、アンチカリン、酵素、結合タンパク質及び分子足場及びそれに由来するタンパク質、並びに薬理学的に有効なペプチドが含まれる。前記タンパク質クラスの例は、とりわけ、重鎖抗体及びその断片（例えば、ナノボディ）、一本鎖抗体、インターフェロン、インターロイキン、インターロイキン受容体、インターロイキン受容体アンタゴニスト、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、白血病阻害剤、幹細胞成長因子、腫瘍壊死因子、成長ホルモン、インスリン様成長因子、線維芽細胞成長因子、血小板由来成長因子、形質転換成長因子、肝細胞成長因子、骨形態形成因子、神経成長因子、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、グリア細胞株由来神経栄養因子、血管新生阻害剤、組織プラスミノーゲン活性化因子、血液凝固因子、トリプシン阻害剤、エラスターゼ阻害剤、補体成分、低酸素症誘導ストレスタンパク質、プロト発ガン性製品、転写因子、ウイルス構成タンパク質、プロインスリン、副甲状腺ホルモン、プロウロキナーゼ、エリスロポエチン、トロンボポエチン、ニューロトロフィン、タンパク質Ｃ、グルコセレブロシダーゼ、スーパーオキシドジスムターゼ、レニン、リゾチーム、Ｐ４５０、プロキモシン、リポコルチン、レプチン（ｒｅｐｔｉｎ）、血清アルブミン、ストレプトキナーゼ、テネクテプラーゼ、ＣＮＴＦ及びシクロデキストリン糖転移酵素である。
【００４４】
分子足場に由来するタンパク質の例は、とりわけ、エビボディ（ｅｖｉｂｏｄｙ）（ＣＴＬＡ−４に由来する）、アフィボディ（Ｓ．ａｕｒｅｕｓのＡタンパク質のもの）、アビマー（ヒトＡドメインファミリーのもの）、トランスボディ（トランスフェリンのもの）、ＤＡＲＰｉｎ（アンキリン反復タンパク質のもの）、アドネクチン（フィブロネクチンＩＩＩのもの）、ペプチドアプタマー（チオレドキシンのもの）、ミクロボディ（微小タンパク質のもの）、アフィリン（ユビキチンのもの）、α−クリスタリン、カリブドトキシン、テトラネクチン、ＲＡＳ結合タンパク質ＡＦ−６のＰＤＺドメイン、タンパク質阻害剤のクニッツ型ドメインである。
【００４５】
複数のタンパク質サブユニットからなるタンパク質の特に好ましいクラスは、抗体である。したがって、特に好ましくは、細菌株は、異種タンパク質が抗体又は抗体の断片であることを特徴とする。抗体は、研究、診断において及び治療薬として広く使用されており、そのため、工業規模で特に効率的かつ可能な生産方法が必要とされている。
【００４６】
機能性Ｆａｂ抗体断片及び完全長抗体もまた、本発明による方法によって細胞外で産生することができる。この関連において、好ましい完全長抗体は、ＩｇＧクラス及びＩｇＭクラスの抗体、特にＩｇＧクラスの抗体である。
【００４７】
機能性Ｆａｂ抗体断片を産生する場合、細胞は、ドメインＶＬ及びＣＬを含む軽鎖（ＬＣ）及びドメインＶＨ及びＣＨ１を含む重鎖（ＨＣ）の対応する断片を同時に合成し、ペリプラズムに分泌し、最後に発酵培地に分泌しなければならない。その後、細胞質の外側で２本の鎖が集合して機能性Ｆａｂ断片が形成される。
【００４８】
組換え標的タンパク質が細胞質からペリプラズムに分泌されるためには、フレームで作られるタンパク質のＯＲＦの５’末端とタンパク質排出のためのシグナル配列の３’末端を結合する必要がある。この目的に適しているのは、原則として、ＳｅｃやＴＡＴ装置を用いて移動を可能にする全てのシグナル配列である。様々なシグナル配列が先行技術に記載されており、例えば、以下の遺伝子のシグナル配列、すなわち、ｐｈｏＡ、ｏｍｐＡ、ｐｅｌＢ、ｏｍｐＦ、ｏｍｐＴ、ｌａｍＢ、ｍａｌＥ、ブドウ球菌タンパク質Ａ、ＳｔＩＩ及びその他が記載されている（Ｃｈｏｉ及びＬｅｅ、Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．６４（２００４）、６２５−６３５）。
【００４９】
細胞質からペリプラズムへの組換え標的タンパク質の分泌に関して本発明によれば好ましいのは、大腸菌のｐｈｏＡ遺伝子又はｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列、又はクレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）M５ａ１由来のシクロデキストリン糖転移酵素（ＣＧＴａｓｅ）のシグナル配列、又はＵＳ２００８／０７６１５７Ａ１号に開示されているこのシグナル配列に由来する配列である。特に好ましいのは、ＥＰ０４４８０９３号に開示されており、配列番号４を用いて本発明に規定されているクレブシエラ・ニューモニエM５ａ１由来のＣＧＴａｓｅのシグナル配列、及び該シグナル配列に由来する配列番号５を有する配列であり、これはＵＳ２００８／０７６１５７Ａ１号にも開示されている。
【００５０】
シグナル配列と組換え標的タンパク質のＯＲＦとから構成されるインフレーム融合を含むＤＮＡ分子は、当業者に既知の方法によって製造される。例えば、標的タンパク質の遺伝子は、まずオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲ法によって増幅され、次に、シグナルペプチドの配列を含み、かつインフレーム融合、すなわち、標的タンパク質のシグナル配列及び遺伝子を含む連続的な読み枠が形成されるように標的タンパク質の遺伝子と類似して生成されたＤＮＡ分子に、通常の分子生物学的技術を用いて結合され得る。あるいは、遺伝子合成によって、上記の２つの機能セグメントを含むＤＮＡ分子全体を作製することも可能である。このシグナル配列−組換え遺伝子融合は、次いで、ベクター、例えばプラスミドに導入され、その後、ベクターは形質転換によって宿主細胞に導入されるか、又は既知の方法によって宿主細胞の染色体に直接一体化されるかのいずれかであり得る。好ましくは、シグナル配列−組換え遺伝子融合体をプラスミドに導入し、宿主細胞を該プラスミドで形質転換する。
【００５１】
複数の異なるサブユニットからなる組換え標的タンパク質を細胞質からペリプラズムに分泌するためには、産生される全てのサブユニットの遺伝子（標的遺伝子）をそれぞれ機能的にタンパク質排出のためのシグナル配列に結合する必要がある。この関係で、種々サブユニットの遺伝子を同じあるいは異なるシグナル配列に結合することができる。異なるシグナル配列への結合が好ましく、１つのサブユニットを大腸菌のｐｈｏＡ遺伝子又はｏｍｐＡ遺伝子のシグナル配列へ結合する、及び配列番号４を有するクレブシエラ・ニューモニエM５ａ１由来のＣＧＴａｓｅに対するシグナル配列又はそれに由来する配列、例えば配列番号５などの配列へさらなるサブユニットを結合することが特に好ましい。
【００５２】
個々のサブユニットのシグナル配列−標的遺伝子融合体は、次いで、ベクター、例えばプラスミドに導入され得るか、又は既知の方法によって宿主細胞の染色体に直接一体化され得る。この関連において、個々のサブユニットのシグナル配列−標的遺伝子融合体は、互いに適合性がある別々のプラスミド上でクローン化され得るか、又はそれらは一つのプラスミド上でクローン化され得る。この関連において、遺伝子融合体は、一つのオペロンに組み合わされることもあれば、それぞれ別々のシストロンに発現することもある。ここでは、１つのオペロンにおける組合せが好ましい。２つの遺伝子構成体は、宿主細胞の染色体に等しく一体化され、１つのオペロンに組み合わされるか、あるいはそれぞれ別々のシストロンに組み合わされることができる。ここでは、同様に１つのオペロンにおける組合せが好ましい。
【００５３】
好ましくは、シグナル配列及び分泌されるべき組換えタンパク質をコードするＯＲＦからなるＤＮＡ発現構成体（シグナル配列−標的遺伝子融合体）は、選択された細菌株（プロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位、ターミネーター）において機能的な発現シグナルを備える。
【００５４】
組換え標的タンパク質をコードする遺伝子のプロモーターとして適切なものは、当業者に既知の全てのプロモーターであり、例としては、第一に、ｌａｃ、ｔａｃ、ｔｒｃ、ラムダＰＬ、ａｒａ又はｔｅｔプロモーター、又はそれらに由来する配列などの誘導性プロモーターである。第２に、例えばｇａｐＡプロモーターなどの構成的プロモーターの使用によって永久的な発現を達成することも可能である。しかし、通常は産生されるべき組換えタンパク質の遺伝子に結合されたプロモーターを用いることも可能である。
【００５５】
当業者に知られた方法（例えば、形質転換）を用いて、この発現構成体（プロモーター−シグナル配列−組換えタンパク質をコードする配列）を次に、Ｌｐｐ融合タンパク質を形成する細胞に導入する。組換えタンパクの産生のための発現構成体は、例えば、ベクター、例えば、プラスミド、例えば、ｐＪＦ１１８ＥＨ、ｐＫＫ２２３−３、ｐＵＣ１８、ｐＢＲ３２２、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＡＳＫ−ＩＢＡ３又はｐＥＴのような既知の発現ベクターの派生物上に導入される。プラスミドの選択マーカーとして適切なのは、例えば、アンピシリン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、カナマイシン又は他の抗生物質に対する耐性をコードする遺伝子である。
【００５６】
したがって本発明によれば、選択された細菌株において活性なシグナルペプチドをコードするシグナル配列に機能的に結合された組換えタンパク質をコードするＯＲＦが、選択された細菌株、好ましくはプロモーター、転写開始部位、翻訳開始部位、リボソーム結合部位及びターミネーターにおいて機能的である発現シグナルを備える細菌株を用いることが好ましい。
【００５７】
本発明はさらに、本発明に係る細菌株を発酵培地で培養し、発酵後に細胞から発酵培地を除去し、発酵培地からタンパク質を単離する、組換えタンパク質の発酵産生方法を提供する。
【００５８】
Ｌｐｐ融合タンパク質の遺伝子を発現し、かつ、シグナル配列と分泌されるタンパク質をコードする組換え遺伝子とからなるＤＮＡ発現構成体を含み、機能的発現シグナルに結合された細胞の培養（発酵）は、当業者に既知の通例の発酵方法によりバイオリアクター（発酵装置）内で達成される。
【００５９】
発酵は、通常のバイオリアクター、例えば撹拌槽、気泡カラム発酵装置又はエアリフト発酵装置で行うことが好ましい。撹拌槽発酵装置が特に好ましい。
【００６０】
発酵は、タンパク質産生株の細胞を１６〜１５０時間にわたって液体培地で培養し、例えば栄養供給、酸素分圧、ｐＨ及び培養物の温度のような様々なパラメータの継続的なモニタリング及び正確な制御を行うことを含む。培養期間は、好ましくは２４〜７２時間である。
【００６１】
培地（発酵培地）として選ばれそうなものは、原則として、微生物の培養のために当業者に知られている全ての通常の培地である。
【００６２】
これに関連して、細菌細胞を培養するための媒体として、例えば、ペプトン、トリプトン、酵母エキス、糖蜜又はトウモロコシ浸出液のような特定の割合の複合成分が添加された複合媒体又は最小塩媒体を使用することが可能である。医薬品タンパク質の産生に好まれるものは、化学的に規定された塩培地、すなわち、完全培地とは対照的に、正確に規定された基質組成を有する培地である。
【００６３】
好ましくは、大腸菌細胞などの細菌細胞を培養するための適切な最小塩培地の例は、特に、Ｍ９最小培地、修飾最小培地又はＲｉｅｓｅｎｂｅｒｇ無機培地（Ｋａｎｇｗａら、２０１５、ＡＭＢ  Ｅｘｐｒ  ５、７０頁）であり、ＵＳ２００８／０２５４５１１Ａ１号に記載されている培地ＦＭ４でもある。
【００６４】
本発明による方法では、Ｌｐｐ融合タンパク質の遺伝子、及びシグナルペプチドをコードするシグナル配列にフレーム単位で連結された組換えタンパク質をコードする遺伝子を発現する細菌株が、Ｌｐｐ野生型タンパク質を含む菌株に関連して比較的短い発酵時間で増殖して、比較的高い細胞密度を形成し、同時に、組換えタンパク質を塩培地中に分泌する。
【００６５】
発酵に使用される一次炭素源は、原則として、細胞によって利用可能な全ての糖、糖アルコール又は有機酸又はその塩であり得る。これとの関連で、グルコース、ラクトース又はグリセロールを使用することが好ましい。グルコース及びラクトースが特に好ましい。また、複数の異なる炭素源を組み合わせて供給することも可能である。さらに、発酵開始時には最初に炭素源を発酵培地中に満杯に充填することができ、あるいは開始時には炭素源を何も、あるいはその一部だけを最初に充填し、発酵の過程で炭素源を供給する。この関係で特に好ましいのは、炭素源の一部を最初に充填し、一部を供給する１つの実施形態である。特に好ましくは、炭素源は最初１０〜３０ｇ／ｌの濃度で充填し、濃度が５ｇ／ｌ未満に低下したときに供給を開始し、その濃度が５ｇ／ｌ未満に保たれるように設定される。
【００６６】
培養中の酸素分圧（ｐＯ２）は、１０〜７０％の間の飽和度が望ましい。２０〜６０％の間のｐＯ２が好ましく、ｐＯ２が２０〜４０％の間の飽和度であることが特に好ましい。
【００６７】
培養のｐＨはｐＨ６〜ｐＨ８の間が望ましい。好ましくは、ｐＨが６．５〜７．５の間に設定され、特に好ましくは、培養のｐＨが６．８〜７．２の間に保持される。
【００６８】
培養の温度は１５〜４５℃の間が好ましい。２０〜４０℃の間の温度範囲が好ましく、２５〜３５℃の間の温度範囲が特に好ましく、３０℃が非常に特に好ましい。
【００６９】
好ましくは、本方法は、組換えタンパク質が、発酵培地の除去後に発酵培地から精製されることを特徴とする。粗生成物からの分泌されたタンパク質の精製は、先行技術において知られているように、当業者に既知の慣用の精製方法によって行うことができる。慣例的には、細胞は、第一段階において、遠心分離又は濾過のような分離方法によって、分泌された標的タンパク質から除去される。次いで、標的タンパク質を、例えば、限外濾過により濃縮することができ、次いで、標準的な方法、例えば、沈殿、クロマトグラフィー又は限外濾過によりさらに精製する。タンパク質の既に正しく折りたたまれた本来の立体配座構造を利用するアフィニティークロマトグラフィーなどの方法が特に好ましい。
【００７０】
２ｘｌｐｐ遺伝子及び組換え標的タンパク質を発現する細菌株の特別な利点は、培地中に存在する標的タンパク質の量が、先行技術で開示された細菌株の場合よりも多いことである。
【００７１】
実施例３（表１参照）は、このことの明確な証拠を提供する。２ｘｐｐｌΔ（ＪＥ５５１２  ２ｘｐｐｌΔ／ｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４）を発現する菌株を用いた場合、培養上清において測定した抗ＣＤ１５４−Ｆａｂ力価は、絶対的に（すなわち、同じ体積に正規化されて）、既知のｌｐｐ３突然変異体（ＪＥ５５１２  ｌｐｐ３／ｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４）を用いた場合のほぼ２倍の高さであり、野生型菌株ＪＥ５５１２／ｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４について決定した値の数倍であった。
【００７２】
実施例４（表２）でも、２ｘｌｐｐｌΔを発現する菌株（ＪＥ５５１２  ２ｘｌｐｐΔ／ｐＣＧＴ）を用いた場合には、培養上清の中で最高のＣＧＴａｓｅが絶対的に測定されていたことが確認される。
【００７３】
収率の増加は、培地中に放出される組換えタンパク質の収率が、組換えタンパク質の遺伝子を含む野生型細菌株及び／又は組換えタンパク質の遺伝子を含み、細菌細胞エンベロープの不安定化のためのタンパク質をさらに発現する野生型細菌株を用いて、現行の技術水準に従って製造することができる培地中の組換えタンパク質の収率の少なくとも１．１倍、好ましくは少なくとも１．５倍、特に好ましくは少なくとも１．８倍であることを意味すると理解される。
【００７４】
２ｘｌｐｐ遺伝子及び組換え標的タンパク質を発現する細菌株のさらなる利点は、標的タンパク質の主要部分が培養中に発酵培地中に分泌されることである。
【００７５】
実施例３（表１参照）はこのことの明確な証拠を再度提供する。２ｘｌｐｐΔを発現する細菌株（ＪＥ５５１２  ２ｘｌｐｐΔ／ｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４）を用いた場合には、培養上清中で抗ＣＤ１５４  Ｆａｂ力価のほぼ６０％が測定されたが、既知のｌｐｐ３突然変異体（ＪＥ５５１２  ｌｐｐ３／ｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４）を用いた場合には、わずか５０％未満であり、野生型株ＪＥ５５１２／ｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４の場合には、わずか７％未満であった。
【００７６】
同様に実施例４では、２ｘｌｐｐΔを発現する細菌株（ＪＥ５５１２  ２ｘｌｐｐΔ／ｐＣＧＴ）を用いた場合には、培養上清中の組換え標的タンパク質（ＣＧＴａｓｅ）のほぼ６０％を測定することができた。
【００７７】
組換え標的タンパク質の主要部分の培地中への分泌は、標的タンパク質の産生量に基づいて、好ましくは５０重量％超、特に好ましくは５５重量％超が培地中に存在することを意味すると理解される。
【００７８】
「リーキー」細菌株の使用とは対照的に、本発明による細菌株は、安定した方法で培養可能である、すなわち、無傷細胞数の尺度である培地の光学濃度が、後の培養段階でもわずかに減少するだけであるという利点を有する。その結果、「リーキー」細菌株と比較して、タンパク質産生期が延長され、生成物収率が増加し、細胞溶解時に放出されるＤＮＡによる培地の粘度上昇がない。最後に言及することは、その後の標的タンパク質の精製及び回収を単純化し、これがひいては方法のコストにプラスの影響を及ぼす。
【００７９】
図１は、プロセシングを受けていないＬｐｐ融合タンパク質（Ａ、２ｘＬｐｐ）を、実施例で使用されたプロセシングを受けていないＬｐｐ野生型タンパク質（Ｂ、Ｌｐｐ、配列番号２で規定された配列）及びプロセシングを受けていないＬｐｐ融合タンパク質（Ｃ、２ｘＬｐｐΔ、配列番号３で規定された配列）と比較した模式図を示す。
【００８０】
図１で用いられている略語は、次の意味を持つ。
ＳＰ、シグナルペプチド
Ｃｙｓ、アミノ酸システイン
Ｌｙｓ、アミノ酸リジン
Ｇｌｙ、アミノ酸グリシン
Ｌ、０〜２０個のアミノ酸からなる存在する可能性があるリンカー配列
Ｌｐｐ、Ｌｐｐ野生型タンパク質のアミノ酸配列
Ｌｐｐ（Ｎ）、Ｌｐｐ野生型配列に基づいて、最大で１０個のアミノ酸位置に突然変異がある、Ｌｐｐのアミノ酸配列のＮ末端に位置する複製
Ｌｐｐ（Ｃ）、Ｌｐｐ野生型配列に基づいて、最大で１０個のアミノ酸位置に突然変異がある、Ｌｐｐのアミノ酸配列のＣ末端に位置する複製
Ｌｐｐ（Ｎ）ΔＬｙｓ７８、Ｌｐｐ野生型配列に基づいて７８位のアミノ酸リジンを欠く、Ｌｐｐのアミノ酸配列のＮ末端に位置する複製
Ｌｐｐ（Ｃ）ΔＣｙｓ２１、Ｌｐｐ野生型配列に基づいて２１位のアミノ酸システインを欠く、Ｌｐｐのアミノ酸配列のＣ末端に位置する複製
−、破線はアミノ酸の欠失を表す
【００８１】
図２は、発現プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４の模式図である。
【００８２】
図２で用いられている略語は次の意味を持つ。
ｔａｃ  ｐ／ｏ：ｔａｃプロモーター／オペレーター
ＥｃｏＲＩ：制限酵素ＥｃｏＲＩの切断部位
ｃｇｔ−ＳＰ：ＣＧＴａｓｅのシグナルペプチド
ＨＣ：Ｆａｂ断片ＣＤ１５４の重鎖のＯＲＦ
ｐｈｏＡ−ＳＰ：ｐｈｏＡシグナルペプチド
ＬＣ：Ｆａｂ断片ＣＤ１５４の軽鎖のＯＲＦ
Ｈｉｓ−Ｔａｇ：Ｆａｂ断片の軽鎖のＣ末端のＨｉｓタグ
ｒｒｎＢ：ターミネーター
ｂｌａ：β−ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリン耐性）
ＣｏｌＥ１：ＣｏｌＥ１複製起点
ＴｃＲ：テトラサイクリン耐性遺伝子
ｌａｃＩｑ：ｔａｃプロモーターのリプレッサー
【実施例】
【００８３】
以下の実施例は、本発明を制限することなく、本発明をさらに明らかにするのに役立つ。
【００８４】
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子合成、ＤＮＡの単離及び精製、制限酵素、Ｋｌｅｎｏｗ断片及びリガーゼによるＤＮＡの修飾、形質転換、Ｐ１形質導入など、用いられた全ての分子生物学及び微生物学的方法を、文献に記載されているか、又はそれぞれの製造業者によって推奨されている、当業者に知られている方法で実施した。使用したオリゴヌクレオチドはＭｅｔａｂｉｏｎ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＧ（プラネッグ／ドイツ）から購入した。
【００８５】
［実施例１：Ｌｐｐ融合タンパク質（２ｘＬｐｐΔタンパク質）を形成する大腸菌ＪＥ５５１２菌株（２ｘｌｐｐΔ突然変異体）の作製］
【００８６】
＜１．大腸菌株ＪＥ５５１２  ｌｐｐ：：ｃａｔ−ｓａｃＢ  ｐＫＤ４６の作製＞
Ｌｐｐ融合タンパク質を形成する菌株の生成に用いられた出発菌株は、大腸菌ｌｐｐ野生型株ＪＥ５５１２（ＨｆｒＣ  ｍａｎ  ｐｐｓ）であった（Ｈｉｒｏｔａら  １９７７、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７４、１４１７〜１４２０頁、国立遺伝学研究所微生物遺伝学研究所、ＮＢＲＰ大腸菌、４１１−８５４０日本静岡県三島市谷田１１１１から入手した菌株）。
【００８７】
この菌株では、染色体野生型ｌｐｐ遺伝子のコード領域（配列番号１のヌクレオチド１−２３７）を、最初に、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．P６２５７７）の遺伝子だけでなく、枯草菌由来のレバンスクラーゼの遺伝子（ｓａｃＢ；ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｎｏ．Ｐ０５６５５）を含む発現カセットで置き換えた。この目的のために、ＰＣＲによって前記ｃａｔ−ｓａｃＢカセットの増幅のための鋳型として使用されたものは、制限酵素ＳｍａＩ及びＢｓｔ１１０７Ｉで切断し、４７２９塩基対の断片をサイズにおいて再連結することによって、ネコ遺伝子とｓａｃＢ遺伝子との間の領域の大部分が除去されたプラスミドｐＫＯ３の派生物であった（Ｌｉｎｋら  １９９７、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１７９、６２２８〜６２３７頁、ｐＫＯ３の配列については、ｈｔｔｐ：／／ａｒｅｐ．ｍｅｄ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｌａｂｇｃ／ｐＫＯ３ｖ．ｈｔｍｌ）を参照）。得られたプラスミドをｐＫＯ３−Ｄｅｌｔａ−Ｍ１３と命名した。ｐＫＯ３−Ｄｅｌｔａ−Ｍ１３を鋳型として、オリゴヌクレオチドｌｐｐ−ｃａｔ−ｓａｃ−ｆｗ（配列番号６）及びｌｐｐ−ｃａｔ−ｓａｃ−ｒｅｖ（配列番号７）を用いて、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを増幅するＰＣＲを実施した。この場合、ｌｐｐ−ｃａｔ−ｓａｃ−ｆｗの最初の６０個のヌクレオチドは、５’側にあるｌｐｐのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の配列と相同であり、ｌｐｐ−ｃａｔ−ｓａｃ−ｒｅｖの最初の６０個のヌクレオチドは、３’側にあるｌｐｐ  ＯＲＦの配列と相同である。その結果は、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを含む直鎖状ＤＮＡ断片であった。
【００８８】
ＪＥ５５１２株をプラスミドｐＫＤ４６（Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ  ＣＧＳＣ＃：７７３９）で形質転換し、これによりＪＥ５５１２  ｐＫＤ４６株が得られた。Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒ（２０００、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７、６６４０〜６６４５頁）からの情報に従って作製されたＪＥ５５１２  ｐＫＤ４６株のコンピテント細胞を、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを含む直鎖状ＤＮＡ断片で形質転換した。野生型ｌｐｐ  ＯＲＦの位置におけるＪＥ５５１２の染色体へのｃａｔ−ｓａｃＢカセットの一体化のための選択を、２０ｍｇ／ｌのクロラムフェニコールを含むＬＢ寒天プレート上で実施した。この方法で得られたのは、野生型ｌｐｐ  ＯＲＦがｃａｔ−ｓａｃＢカセットで完全に置換された細胞（ＪＥ５５１２  ｌｐｐ：：ｃａｔ−ｓａｃＢ  ｐＫＤ４６）であった。クロラムフェニコール耐性細胞のオリゴヌクレオチドｐｙｋＦ（配列番号８）及びｙｎｈＧ２（配列番号９）及び染色体ＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより染色体の正しい位置に一体化されていることを確認した。ＪＥ５５１２  ｌｐｐ：：ｃａｔ−ｓａｃＢ  ｐＫＤ４６株の細胞は、次にクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼをコードする遺伝子ｃａｔ及びｌｐｐ野生型遺伝子の代わりにレバンスクラーゼをコードする遺伝子ｓａｃＢを発現する。
【００８９】
＜２．２ｘＬｐｐΔタンパク質をコードするＤＮＡ断片の作製＞
２ｘＬｐｐΔタンパク質をコードするＤＮＡ断片を、「オーバーラップ伸長」ＰＣＲの方法により作製した（Ｈｏｒｔｏｎら  ２０１３、ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ５４、１２９−３３）。この目的のために、ＪＥ５５１２の染色体ＤＮＡを最初に鋳型とした。これは野生型ｌｐｐ遺伝子を含む。
【００９０】
特にｌｐｐ（Ｎ）ΔＬｙｓ７８を含むＤＮＡ断片を作製するために、オリゴヌクレオチドｌｐｐ−Ａｌｌｅｌ−ｆｗ（配列番号１０）及びｌｐｐ−２ｘ−ｒｅｖ２（配列番号１１）を用いてＰＣＲを行った（ＰＣＲ１）。ＰＣＲ１の産物を鋳型として、オリゴヌクレオチドｌｐｐ−Ａｌｌｅｌ−ｆｗ（配列番号１０）及びｌｐｐ−２ｘ−ｒｅｖ３（配列番号１２）を用いて２回目のＰＣＲを実施した（ＰＣＲ２）結果、ＰＣＲ１の産物は３’側に４１個の塩基対により伸長した。
【００９１】
特にｌｐｐ（Ｃ）ΔＣｙｓ２１を含むＤＮＡ断片を生成するために、ＪＥ５５１２の染色体ＤＮＡを鋳型として、オリゴヌクレオチドｌｐｐ−２ｘ−ｆｗ２(配列番号１３）及びｌｐｐ−Ａｌｌｅｌ−ｒｅｖ（配列番号１４）を用いてＰＣＲを行った（ＰＣＲ３）。ＰＣＲ３の産物を鋳型として、オリゴヌクレオチドｌｐｐ−２ｘ−ｆｗ３（配列番号１５）及びｌｐｐ−Ａｌｌｅｌ−ｒｅｖ（配列番号１４）を用いてさらにＰＣＲを実施した（ＰＣＲ４）結果、ＰＣＲ３の産物は５’側に５７個の塩基対で伸長した。
【００９２】
ＰＣＲ２及びＰＣＲ４の産物を鋳型として、最後に行ったのは、オリゴヌクレオチドｌｐｐ−Ａｌｌｅｌ−ｆｗ（配列番号１０）及びｌｐｐ−Ａｌｌｅｌ−ｒｅｖ（配列番号１４）をプライマーとした５回目のＰＣＲであった。それによって生成された長さ１００５個の塩基対のＤＮＡ断片は、特に、この実施例では、７８位のリジン残基のコドンを欠くＬｐｐ野生型タンパク質のコード配列（ｌｐｐ（Ｎ）ΔＬｙｓ７８と命名）を含むＤＮＡ断片、３つの連続するグリシンコドンからなるリンカー配列（Ｌ）、及びこの実施例では、２１位のシステイン残基のコドンを欠くＬｐｐ野生型タンパク質のコード配列（ｌｐｐ（Ｃ）ΔＣｙｓ２１と命名）、さらにｌｐｐ遺伝子座の５’及び３’領域のそれぞれ約３００個の塩基対（配列番号１６、２ｘｌｐｐΔ）を含む末端ＤＮＡ断片に連結されたＯＲＦ中のｌｐｐ遺伝子のシグナル配列（ＳＰ）を含んでいた。前記ＤＮＡ断片によって形成される２ｘＬｐｐΔタンパク質は、図１Ｃに概略的に表される。
【００９３】
＜３．大腸菌株ＪＥ５５１２  ２ｘｌｐΔの作製＞
次の段階では、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットを２ｘｌｐｐΔで置き換えた。この目的のために、Ｄａｔｓｅｎｋｏ及びＷａｎｎｅｒの方法（上記参照）により、ＰＣＲ５からの産物をＪＥ５５１２  ｌｐｐ：：ｃａｔ−ｓａｃＢ  ｐＫＤ４６株のコンピテント細胞に形質転換した。野生型ｌｐｐ遺伝子の元の位置でのＪＥ５５１２  ｌｐｐ：：ｃａｔ−ｓａｃＢ  ｐＫＤ４６の染色体への２ｘｌｐｐΔの一体化のための選択を、７％のショ糖を含むＬＢ寒天プレート上で行った。ｓａｃＢの発現のない細胞のみがショ糖含有培地上で増殖できるので、ｃａｔ−ｓａｃＢカセットが２ｘｌｐｐΔ（ＪＥ５５１２  ２ｘｌｐｐΔ）に置き換えられた細胞を選択することができた。オリゴヌクレオチドｐｙｋＦ（配列番号８）及びｙｎｈＧ２（配列番号９）及びショ糖耐性細胞の染色体ＤＮＡを鋳型として用いるＰＣＲにより、染色体の正しい位置に一体化が行われていることを確認した。一体化された２ｘｌｐｐΔの配列は、ＰＣＲ産物の配列決定によって確認した。その結果得られた株をＪＥ５５１２  ２ｘｌｐΔと命名した。
【００９４】
［実施例２：ｌｐｐ３対立遺伝子を含む大腸菌ＪＥ５５１２株（ｌｐｐ３突然変異体）の作製］
【００９５】
比較目的のために、染色体ｌｐｐ野生型遺伝子の代わりに既知のｌｐｐ３対立遺伝子を含むｌｐｐ突然変異体を、大腸菌株ＪＥ５５１２から開始して作製した（Ｇｉａｍら、１９８４、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４１、３３１〜３７９頁）。ｌｐｐ３対立遺伝子は、Ｌｐｐタンパク質の１４位でグリシンからアスパラギン酸へのアミノ酸交換を導き、ペリプラズムタンパク質に対して細胞の特定の「リーキーさ」をもたらす突然変異によって区別される（ＵＳ２００８／０２５４５１１Ａ１号参照）。
【００９６】
ＰＣＲを、オリゴヌクレオチドｌｐｐ−Ａｌｌｅｌ−ｆｗ（配列番号１０）及びｌｐｐ−Ａｌｌｅｌ−ｒｅｖ（配列番号１４）を用いて、ｌｐｐ３突然変異体大腸菌「Ｗ３１１０  ｌｐｐ３」（ＵＳ２００８／０２５４５１１Ａ１号、実施例３参照）の染色体ＤＮＡ上で実施した。ｌｐｐ３対立遺伝子を含むＰＣＲ産物を、実施例１に記載されているように、２ｘｌｐｐΔと類似して、ＪＥ５５１２  ｌｐｐ：：ｃａｔ−ｓａｃＢ  ｐＫＤ４６株の染色体に一体化した。ＰＣＲ産物の染色体への正確な一体化は、上記のようにＰＣＲ及び配列決定により確認した。得られた株をＪＥ５５１２  ｌｐｐ３と命名した。
【００９７】
［実施例３：３ｌスケールでの２ｘｌｐｐΔ突然変異体を用いたＦａｂ抗体断片の発酵産生］
【００９８】
＜１．プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４の作製＞
本実施例は、ヒト化モノクローナル抗ＣＤ１５４抗体５ｃ８のＦａｂ断片の作製を記述し、その配列は、野生型ｌｐｐ株及びｌｐｐ３突然変異体と比較して、大腸菌ＪＥ５５１２  ２ｘｌｐｐΔ株を用いて、Ｋａｒｐｕｓａｓら（２００１、Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ９、３２１〜３２９頁）に公表されている。ＵＳ２００８／０２５４５１１Ａ１号に記載されているプラスミドｐＪＦ１１８ｕｔを、抗ＣＤ１５４  Ｆａｂ断片の遺伝子のクローニング及び発現のための出発ベクターとして使用した。ｐＪＦ１１８ｕｔを、Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ  ａｎｄ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ＧｍｂＨ（ブラウンシュヴァイク）のＤＳＭＺ−ドイツコレクションに番号ＤＳＭ  １８５９６で寄託する。いずれの場合もシグナル配列を含む、Ｆａｂ断片の重鎖（ＶＨ−ＣＨ１ドメイン）及び軽鎖（ＶＬ−ＣＬドメイン）についての２つの読み枠を、前記プラスミド中にクローン化した。このために、以下の手順を実施した。すなわち、配列番号１７のＤＮＡ断片を遺伝子合成（Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ）により作製した。それは、
ｉ  配列番号５に由来するシグナル配列及び
ｉｉ  Ｆａｂ断片の重鎖の読み枠
からなる遺伝子融合、及び
ｉ  大腸菌のｐｈｏＡシグナル配列及び
ｉｉ  Ｆａｂ断片の軽鎖の読み枠及び
ｉｉｉ  軽鎖のＣ末端の４つのアミノ酸からなるリンカー及び
ｉｖ  リンカーのＣ末端のヘキサヒスチジンタグ
からなる遺伝子融合を含んでいた。
【００９９】
このＤＮＡ断片を制限酵素ＥｃｏＲＩとＰｄｍＩを用いて切断し、ＥｃｏＲＩ及びＳｍａＩを用いて切断された発現ベクターｐＪＦ１１８ｕｔを用いて結合した。抗ＣＤ１５４  Ｆａｂ断片の重鎖及び軽鎖の遺伝子の表現がｔａｃプロモーターの制御下にある、結果として得られたプラスミドをｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４と命名した。図２は、プラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４のプラスミドマップを示す。
【０１００】
＜２．抗ＣＤ１５４  Ｆａｂ抗体断片の作成＞
発酵装置スケールでの抗ＣＤ１５４  Ｆａｂ抗体断片の作製のために、ＪＥ５５１２、ＪＥ５５１２  ｌｐｐ３及びＪＥ５５１２  ２ｘｌｐｐΔ株を、ＣａＣｌ２法によりプラスミドｐＪＦ１１８ｕｔ−ＣＤ１５４で形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、テトラサイクリン（２０ｍｇ／ｌ）を用いて行った。
【０１０１】
産生は３ｌの撹拌槽発酵装置で行った。１５ｇ／ｌのグルコースを含み、複合成分（１．５ｇ／ｌのＨｙ−Ｅｘｐｒｅｓｓ  ＩＩ（Ｋｅｒｒｙ）；１．０ｇ／ｌのＡｍｉｓｏｙ（Ｋｅｒｒｙ）；０．５ｇ／ｌのＨｙ−Ｙｅｓｔ（Ｋｅｒｒｙ））で強化した大腸菌の培養に通例の無機塩培地１．２ｌを、約６時間振盪フラスコにおいて複合培地（３０ｇ／ｌのフィトンペプトン（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、５ｇ／ｌの酵母エキス（Ｏｘｏｉｄ）、５ｇ／ｌのＮａＣｌ）中で３０℃で培養した予備培地と共にＯＤ６００＝０．０１に接種した。接種は発酵の０時点又は発酵の開始を表す。発酵中、３０℃の温度を設定し、ＮＨ４ＯＨ又はＨ３ＰＯ４で計量することによりｐＨを７．０の値に一定に保った。開始時、培養物を４００ｒｐｍで撹拌し、滅菌フィルターにより滅菌した圧縮空気２ｖｍでスパージした。酸素プローブは、接種前にこれらの開始条件で飽和度１００％に較正させた。発酵中のＯ２飽和度の目標値を３０％に設定した。Ｏ２飽和度が目標値を下回ったならば、Ｏ２飽和度を目標値に回復させるために調節カスケードを開始した。これとの関連で、ガス供給をまず連続的に最大５ｖｍまで増加させ、次いで撹拌速度を連続的に最大１５００ｒｐｍまで増加させた。培養開始１０時間後にグルコースの供給を開始した。計画した誘導の約０．５〜１時間前に、温度を３０℃から２７℃に下げた。発現の誘導は、約２１〜２３時間の培養期間後にイソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を０．１ｍＭまで添加することによって達成した。
【０１０２】
６４時間の培養期間の後、試料を収集し、遠心分離によって細胞を培地から除去し、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイ（下記参照）を用いて、培養上清中のＦａｂ断片の含有量を決定した。全培養ブロス中の標的タンパク質の量、すなわち細胞内外に存在するＦａｂ断片の合計を確認するために、均質化した培養ブロス中のＦａｂ含有量を決定した。この目的のために、１５０μｌの培養ブロスを８５０μｌの１００ｍＭのＴｒｉｓ／Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．４）と混合し、ＦａｓｔＰｒｅｐホモジナイザー（ＦａｓｔＰｒｅｐ−２４（商標）５Ｇ、ＭＰ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌｓ社）を用いて細胞を破壊した。遠心分離により細胞残屑を除去した後、サンドイッチＥＬＩＳＡアッセイで透明な上清を用いた。
【０１０３】
抗ＣＤ１５４  Ｆａｂ断片を、当業者に知られたサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイにより定量化した。これは、固定化抗Ｆｄ重鎖抗体（Ｔｈｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｓｉｔｅ、製品番号：ＰＣ０７５）をキャッチャー、ペルオキシダーゼ結合ヤギ抗ヒトκ軽鎖抗体（Ｓｉｇｍａ、製品番号：Ａ７１６４）を検出抗体として用いることを含んでいた。ペルオキシダーゼによる発色基質Ｄａｋｏ  ＴＭＢ＋（Ｄａｋｏ、製品番号：Ｓ１５９９）の変換とそれに伴う４５０ｎｍでの吸収変化により定量化を行った。ＥＬＩＳＡは、Ｆａｂ断片「Ｈｕｍａｎ  Ｆａｂ／Ｋａｐｐａ」（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、製品番号：Ｐ８０−１１５）を用いて較正した。
【０１０４】
表１は、培養上清及び培養物全体における抗ＣＤ１５４抗体断片の収率を列挙したものである。
【０１０５】
【表１】
2021531784.tif 000003
【０１０６】
［実施例４：３ｌスケールでの２ｘｌｐｐΔ変異体を用いたシクロデキストリン糖転移酵素の発酵産生］
【０１０７】
３ｌスケールでのシクロデキストリン糖転移酵素（ＣＧＴａｓｅ）の産生のために、ＪＥ５５１２、ＪＥ５５１２  ｌｐｐ３及びＪＥ５５１２  ２ｘｌｐｐΔ株をＣａＣｌ２法によりプラスミドｐＣＧＴで形質転換した。プラスミド含有細胞の選択は、テトラサイクリン（２０ｍｇ／ｌ）を用いて行った。
【０１０８】
ＣＧＴａｓｅの過剰発現のためのプラスミドｐＣＧＴの産生は、ＵＳ２００８／０２５４５１１Ａ１号の実施例４に記載されており、プラスミドマップは、ＵＳ２００８／０２５４５１１Ａ１号の図４に規定されている。本質的に、プラスミドは、テトラサイクリンに対する耐性のための遺伝子だけでなく、特に、天然のＣＧＴａｓｅシグナル配列を含むクレブシエラ・ニューモニエM５ａ１由来のＣＧＴａｓｅの構造遺伝子も含む。ＣＧＴａｓｅをコードする遺伝子の発現は、ｔａｃプロモーターの制御下にある。
【０１０９】
ＪＥ５５１２／ｐＣＧＴ、ＪＥ５５１２  ｌｐｐ３／ｐＣＧＴ及びＪＥ５５１２  ２ｘｌｐｐΔ／ｐＣＧＴ株を用いてＣＧＴａｓｅの発酵産生のための培養を実施例３に記載されているように実施した。
【０１１０】
６４時間の発酵期間の後、試料を収集し、培養上清及び均質化し、清澄化した培養ブロス（実施例３参照）中のＣＧＴａｓｅ含有量を、次いで、ＣＧＴａｓｅ活性アッセイによってデンプンから酵素を用いて産生されたシクロデキストリン（ＣＤ）の量に基づいて決定した。
【０１１１】
ＣＧＴａｓｅ活性アッセイ
アッセイ緩衝液：５ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ緩衝液、５ｍＭのＣａＣｌ２×２Ｈ２Ｏ、ｐＨ６．５
基質液：アッセイ緩衝液中の１０％デンプン溶液（Ｍｅｒｃｋ  Ｎｏ．１．０１２５２）、ｐＨ６．５
アッセイミックス：基質溶液０．２ｍｌ＋適切に希釈したＣＧＴａｓｅ試料（培養上清又は均質化し清澄化した培養ブロス）０．２ｍｌ
反応温度：４０℃
【０１１２】
酵素アッセイ
＊  基質溶液及びＣＧＴａｓｅ含有試料の事前調整（４０℃で約５分）
＊  基質溶液とＣＧＴａｓｅ含有試料を速やかに混合（渦巻きミキサー）してアッセイミックスを調製し、必要ならばアッセイ緩衝液で試料を希釈し、その後のＨＰＬＣ分析で０．９〜１．５ｇ／ｌ  ＣＤの値を決定する
＊  ４０℃で３分間インキュベート
＊  メタノール０．６ｍｌ添加、迅速混合（渦巻きミキサー）による酵素反応停止
＊  氷上でのミックスの冷却（約５分）
＊  遠心分離（５分、１２０００ｒｐｍ）し、透明な上清をピペットオフ（ｐｉｐｅｔｔｅ  ｏｆｆ）する
＊  ＨＰＬＣによるＣＤ産生量の分析：Ｎｕｃｌｅｏｄｕｒ  １００−３  ＮＨ２−ＲＰカラム（１５０ｍｍ×４．６ｍｍ、Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）及び移動相として水中の６４％アセトニトリル（ｖ／ｖ）を用いるＡｇｉｌｅｎｔ  ＨＰ  １１００  ＨＰＬＣシステムで、流速２．１ｍｌ／分で分析を行った。検出はＲＩ検出器（１２６０  Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  ＲＩ、Ａｇｉｌｅｎｔ）を用いて行い、ピーク面積及びα−ＣＤ標準物質（Ｃａｖａｍａｘ  Ｗ６−８  Ｐｈａｒｍａ、Ｗａｃｋｅｒ）に基づいて定量を行った。
【０１１３】
酵素活性の計算：Ａ＝Ｇ＊Ｖ１＊Ｖ２／（ｔ＊ＭＧ）  ［Ｕ／ｍｌ］
Ａ＝活性、
Ｇ＝ＣＤ含有量（ｍｇ／ｌ）
Ｖ１＝アッセイミックスにおける希釈係数
Ｖ２＝アッセイに用いる前のＣＧＴ含有試料の希釈係数、希釈していない場合はＶ２＝１
ｔ＝分で表される反応時間
ＭＧ＝ｇ／ｍｏｌで表される分子量（ＭＧＣＤ＝９７３ｇ／ｍｏｌ）
１単位（Ｕ）は１μｍｏｌ／ｌ製品（ＣＤ）／分に相当する。
【０１１４】
表２は、それぞれ達成されたＣＧＴａｓｅ収量を示す。
【０１１５】
【表２】
2021531784.tif 000004
【０１１６】
総タンパク質との比較では、ＪＥ５５１２  ２ｘｌｐｐΔ／ｐＣＧＴにより培地中に放出されたＣＧＴａｓｅの割合は、抗ＣＤ１５４  Ｆａｂと同様に、約５８％であった。
【０１１７】
実施例３及び４は、それぞれ種々の大腸菌株を用いた医学的に重要なＦａｂ抗体断片及び工業用酵素の発酵産生を説明している。いずれの場合においても、本発明による２ｘｌｐｐΔ突然変異体は、培地中に放出される標的タンパク質の量に関して、ｌｐｐ野生型株及び「リーキー表現型」を有するｌｐｐ３突然変異体と比較して優位性を示す。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年4月8日(2019.4.8)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
組換えタンパク質をコードする少なくとも１つの遺伝子を含む大腸菌株の細菌株であって、以下からなるオープンリーディングフレームを含むことを特徴とする細菌株。
ｉ  以下のｉｉ及びｉｉｉに連結している、ペリプラズムへのタンパク質の移動を媒介するＮ末端シグナルペプチドをコードするＤＮＡ断片、ここで、Ｎ末端シグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸１〜２０と比較して、少なくとも８０％の同一性を有するアミノ酸配列である、又は、大腸菌のリポタンパク質Ｐａｌ、ＮｌｐＩ、ＮｌｐＢ若しくはＯｓｍＢのシグナルペプチドである、
ｉｉ  配列番号２のアミノ酸２１〜７８と比較して、最大で１０個のアミノ酸の相違を有するリポタンパク質（Ｌｐｐ（Ｎ））をコードするｉに続くＤＮＡ配列（ｌｐｐ（Ｎ））、及び
ｉｉｉ  配列番号２のアミノ酸２１〜７８と比較して、最大で１０個のアミノ酸の相違を有するリポタンパク質（Ｌｐｐ（Ｃ））をコードするさらなるＤＮＡ配列（ｌｐｐ（Ｃ））。
【請求項２】
配列番号２のアミノ酸２１〜７８と比較して少なくとも８０％の同一性を有するタンパク質をコードするさらなる遺伝子を含まないことを特徴とする、請求項１に記載の細菌株。
【請求項３】
Ｌｐｐ（Ｎ）及びＬｐｐ（Ｃ）が、１個から複数のアミノ酸からなるリンカーにより連結されていることを特徴とする、請求項１又は２のいずれか、又は請求項１及び２に記載の細菌株。
【請求項４】
ｌｐｐ（Ｎ）及びｌｐｐ（Ｃ）によってコードされるアミノ酸配列が、
Ｌｐｐ（Ｎ）において配列番号２のアミノ酸２１〜７８に存在するＣ末端アミノ酸リジンが存在しないか、又は
Ｌｐｐ（Ｃ）において配列番号２のアミノ酸２１〜７８に存在するＮ末端アミノ酸システインが存在しない
点で、配列番号２のアミノ酸２１〜７８と異なることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一項以上に記載の細菌株。
【請求項５】
ｌｐｐ（Ｎ）又はｌｐｐ（Ｃ）によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも１つにおいて、アミノ酸位置７７のアルギニンの代わりに存在するものが、タンパク質を構成する他の任意のアミノ酸であることを特徴とする（アミノ酸の番号付け及び配列は、プロセシングを受けていない配列番号２に基づく）、請求項１〜４のいずれか一項以上に記載の細菌株。
【請求項６】
ｌｐｐ（Ｎ）又はｌｐｐ（Ｃ）によってコードされるアミノ酸配列の少なくとも１つについて７７位におけるタンパク質を構成するアミノ酸が、システインであることを特徴とする、請求項５に記載の細菌株。
【請求項７】
Ｎ末端シグナルペプチドが、アミノ酸位置１４において、グリシンの代わりに、タンパク質を構成する他の任意のアミノ酸を含み、他の全てのアミノ酸位置において野生型Ｌｐｐタンパク質のシグナルペプチドと同一であることを特徴とする（アミノ酸の番号付け及び配列は、配列番号２のアミノ酸１〜２０に基づく）、請求項６に記載の細菌株。
【請求項８】
Ｎ−末端シグナルペプチドの位置１４におけるタンパク質を構成するアミノ酸が、アスパラギン酸であることを特徴とする、請求項７に記載の細菌株。
【請求項９】
リンカー配列を形成するアミノ酸が、グリシン、セリン及びアラニンからなる群から選択されることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一項以上に記載の細菌株。
【請求項１０】
２ｘＬｐｐタンパク質をコードするオープンリーディングフレームが、配列番号１の代わりに、染色体に位置することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項以上に記載の細菌株。
【請求項１１】
組換えタンパク質が、異種タンパク質であることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一項以上に記載の細菌株。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項以上に記載の細菌株を発酵培地で培養し、発酵後、細胞から前記発酵培地を除去し、前記発酵培地からタンパク質を単離することを特徴とする、組換えタンパク質の発酵産生方法。
【請求項１３】
組換えタンパク質が、発酵培地の除去後に発酵培地から精製されることを特徴とする、請求項１２に記載の方法。
【国際調査報告】
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