(57)【要約】  本開示は、ＣＤ１３７結合性物質、ならびに疾患の処置、予防および検出における該結合性物質の使用に関する。
2021502104.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトＣＤ１３７に結合するが、単一特異性エンティティとしてＣＤ１３７に結合した場合、ＣＤ１３７シグナル伝達を誘発しない、単離されたシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項２】
前記シングル可変重鎖ドメイン抗体が、ＣＤ１３７に対するＣＤ１３７Ｌの結合を阻害する、請求項１に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項３】
表１から選択される配列番号を含んでなるＣＤＲ１、表１から選択される配列番号を含んでなるＣＤＲ２および表１から選択される配列番号を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる、請求項１または２に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項４】
ヒトフレームワーク領域を含んでなる、請求項３に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項５】
配列番号４またはそれと少なくとも７０％、８０％もしくは９０％の相同性を有する配列を含んでなる、請求項１〜４のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項６】
表２から選択される配列番号を含んでなるＣＤＲ１、表２から選択される配列番号を含んでなるＣＤＲ２および表２から選択される配列番号を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる、請求項１または２に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項７】
ヒトフレームワーク領域を含んでなる、請求項６に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項８】
配列番号４２８、８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２、８７６もしくは８８０またはそれと少なくとも７０％の相同性を有する配列を含んでなる、請求項５または６に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項９】
約０．４ｎＭまたは約３ｎＭのＫＤの親和性でＣＤ１３７に結合することができる、請求項１〜８のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項１０】
ヒトＶ、ＤおよびＪ領域を含んでなるトランスジーンを発現するトランスジェニック齧歯類から得られたまたは得ることができる、請求項１〜９のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項１１】
前記齧歯類が、機能的な内因性の軽鎖および重鎖を産生しない、請求項１０に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体。
【請求項１２】
ａ）請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および
ｂ）腫瘍特異抗原に結合する部分
を含んでなる、結合性分子。
【請求項１３】
腫瘍特異抗原に結合する部分が、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、重鎖、軽鎖、シングル可変ドメイン抗体またはシングル可変重鎖ドメイン抗体から選択される、請求項１２に記載の結合性分子。
【請求項１４】
ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体が、ペプチドリンカーにより、腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体と連結されている、請求項１２または１３に記載の結合性分子。
【請求項１５】
前記リンカーが（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー（式中、ｎは１〜１０である）から選択される、請求項１４に記載の結合性分子。
【請求項１６】
腫瘍特異抗原が、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ７４、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＲＦ、ＣＥＣＡＭ６、ＣＡＸＩＩ、ＣＤ２４、ＣＥＡ、メソセリン、ｃＭｅｔ、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＥｐｈｖＩＩＩ、ＦＡＰ、ＧＤ２、ＩＬ−１３Ｒａ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＧＰＣ３、Ｈｅｒ３、ｇｐＡ３３、５Ｔ４およびＲＯＲ１から選択される、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の結合性分子。
【請求項１７】
前記可変重鎖シングルドメイン抗体または結合性分子が、毒素、酵素、放射性同位体、半減期延長部分、標識、治療分子または他の化学部分から選択される１つまたは複数の部分とコンジュゲートされている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離されたシングル可変重鎖ドメイン抗体または請求項１２〜１６のいずれか一項に記載の結合性分子。
【請求項１８】
前記半減期延長部分が、アルブミン結合性部分、トランスフェリン結合性部分、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの断片、および、アルブミン結合性ペプチドまたはヒト血清アルブミンに結合するシングルドメイン抗体からなる群から選択される、請求項１７に記載の単離されたシングル可変重鎖ドメイン抗体または結合性分子。
【請求項１９】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の結合性分子と、薬学的担体とを含んでなる、医薬組成物。
【請求項２０】
疾患の処置に使用するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体、または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の結合性分子、または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記疾患が、がん、免疫障害、神経疾患、炎症障害、アレルギー、移植拒絶反応、ウイルス感染症、免疫不全または他の免疫系関連障害から選択される、請求項２０に記載の使用のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体、または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の結合性分子、または請求項１９に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
がん、免疫障害、神経疾患、炎症障害、アレルギー、移植拒絶反応、ウイルス感染症、免疫不全または他の免疫系関連障害を処置する方法であって、
治療有効量の、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体、または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の結合性分子、または請求項１９に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項２３】
前記がんが、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、乳がん、脳がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、腎臓がん、軟部組織肉腫、尿道がん、膀胱がん、腎臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、胸腺腫、尿路上皮癌、白血病、前立腺がん、中皮腫、副腎皮質癌、リンパ腫、例えばホジキン病、非ホジキンリンパ腫、胃がん、および多発性骨髄腫から選択される、請求項２０もしくは２１に記載の使用のための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体、または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の結合性分子、または請求項１９に記載の医薬組成物、または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
任意選択で試薬および／または使用説明書とともに、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体、または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の結合性分子、または請求項１９に記載の医薬組成物を含んでなる、キット。
【請求項２５】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体をコードする核酸配列を含んでなる、核酸分子。
【請求項２６】
配列番号６２９もしくは７３５またはそれと７０％の相同性を有する核酸分子を含んでなる、請求項２５に記載の核酸分子。
【請求項２７】
請求項２５または２６のいずれか一項に記載の核酸分子を含んでなる、ベクター。
【請求項２８】
請求項２５もしくは２６のいずれか一項に記載の核酸分子または請求項２７に記載のベクターを含んでなる、宿主細胞。
【請求項２９】
前記宿主細胞が、細菌、酵母、ウイルスまたは哺乳動物細胞である、請求項２８に記載の宿主細胞。
【請求項３０】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングルドメイン抗体を産生する方法であって、
宿主細胞において前記結合性分子をコードする核酸を発現させる工程、および
宿主細胞から結合性分子を単離する工程を含んでなる、方法。
【請求項３１】
ヒトＣＤ１３７に結合するシングルＶＨドメイン抗体を産生する方法であって、
ヒト重鎖Ｖ遺伝子を含んでなる核酸構築物を発現し、機能的な内因性の軽鎖または重鎖を作製することができないトランスジェニック動物を、ＣＤ１３７抗原によって免疫する工程、
前記動物からライブラリを生成する工程、
前記ライブラリからシングルＶＨドメイン抗体を単離する工程、
ヒトＣＤ１３７に結合するシングルＶＨドメイン抗体を同定する工程、および
前記抗体を単離する工程を含んでなる、方法。
【請求項３２】
請求項３１に記載の方法により得られたまたは得ることができる、シングルＶＨドメイン。
【請求項３３】
請求項３２に記載のＶＨドメインを含んでなる重鎖のみの抗体を産生する、トランスジェニック齧歯類。
【請求項３４】
ＣＤ１３７による免疫の後にトランスジェニックマウスから得られたまたは得ることができるヒトＣＤ１３７に結合する、ＶＨドメイン、例えば請求項１〜１１のいずれか一項に記載のＶＨドメインを含んでなる重鎖のみの抗体であって、前記マウスは、ヒトＶ、ＤおよびＪ座を発現するが、機能的な内因性のラムダおよびカッパ軽鎖ならびに重鎖を産生しない、抗体。
【請求項３５】
ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化および／またはサイトカイン放出を誘導する方法であって、対象に、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体、または請求項１２〜１８のいずれか一項に記載の結合性分子、または請求項１９に記載の医薬組成物を投与する工程を含んでなる、方法。
【請求項３６】
腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子における、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のシングル可変重鎖ドメイン抗体の使用。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
がんは、依然として世界において主な死因の１つである。最近の試験では、世界中で推定１２７０万のがん症例が示されている。この数字は、２０３０年までに２１００万に増加すると予想されている（Vinay and Kwon 2014）。
【０００２】
ＣＤ１３７（４−１ＢＢ、ＴＮＦＲＳ９）は、ＴＮＦ受容体スーパーファミリーに属する１型膜貫通糖タンパク質である。これは、活性化されたマウスＴ細胞のｃＤＮＡから最初にクローン化された。これは、その後、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫおよびＮＫ  Ｔ細胞、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、好中球ならびに好酸球上で認められる広範な免疫細胞発現パターンを有することが示されている。発現は、非造血細胞、例えば、上皮、内皮および平滑筋細胞上、ならびに腫瘍細胞株上でも報告されている。ＣＤ１３７発現は、主に活性化誘導性であるが、低レベルの構成的発現が、ＴｒｅｇおよびＤＣを含む一部の細胞型で示されている。
【０００３】
２５５アミノ酸ヒトＣＤ１３７タンパク質（Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿００１５５２）は、１７アミノ酸シグナルペプチド配列、４つのシステインリッチドメインを含有する細胞外領域、２７アミノ酸膜貫通領域および短い４２アミノ酸細胞内ドメインからなる。これは、細胞表面上で単量体および二量体の両方として存在する。ＣＤ１３７に対する主なリガンドは、ＣＤ１３７リガンド（ＣＤ１３７Ｌ、４−１ＢＢ−Ｌ、ＴＮＦＳ９）であるが、受容体凝集を促進するガレクチン−９（Madireddi et al 2014）およびフィブロネクチンなどのマトリックスタンパク質（Chalupny et al, 1992）との相互作用も報告されている。ＣＤ１３７リガンドは、樹状細胞、Ｂ細胞およびマクロファージなどの活性化された抗原提示細胞上で主に発現される。
【０００４】
三量体ＣＤ１３７リガンドとＣＤ１３７との相互作用は、受容体の多量体化、ならびにキナーゼ調節およびＮｆ−ＫＢ経路の活性化をもたらすタンパク質のＴＲＡＦファミリーなどのシグナル伝達分子の動員をもたらす。このように、ＣＤ１３７の多量体化は、下流シグナル伝達の開始および調節のために非常に重要である。
【０００５】
アゴニスト抗ＣＤ１３７モノクローナル抗体をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏで用いた試験では、活性化時、ＣＤ１３７は、「シグナロソーム」と呼ばれるエンドソーム区画に迅速に内部移行され、そこからシグナル伝達を維持することが示されている（Sanchez-Paulete et al 2016における論評）。
【０００６】
ＣＤ１３７、ＣＤ２７、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＨＶＥＭ、ＣＤ３０、およびＧＩＴＲなどの同時刺激ＴＮＦＲファミリーメンバーは、最初のＴ細胞活性化後のＴ細胞応答の維持に関与する。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞において、ＣＤ１３７は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介シグナル伝達を調節する同時刺激受容体として作用する。ＴＣＲ活性化とともにＣＤ１３７のライゲーションは、増殖、サイトカイン産生を促進し、抗アポトーシスＢ細胞リンパ腫−特大（Ｂｃｌ−ｘｌ）およびＢ細胞リンパ腫２（Ｂｃｌ−２）経路の誘導を通じてアポトーシスを阻害する。ＮＫ細胞上でのＣＤ１３７の架橋は、ＩＦＮ−γの分泌および増殖を刺激することが示されている。ＣＤ１３７刺激に対する樹状細胞応答には、増強された成熟および抗原提示、ならびにサイトカインＩＬ−６、ＩＬ１２-およびＩＬ−２７ならびにＴ細胞機能を調節できるインドールアミン−２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）などの酵素の分泌が含まれる。ＣＤ１３７は、腫瘍血管内皮上で細胞間接着分子１（ＩＣＡＭ１）および血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ１）をアップレギュレートすることもでき、それにより、エフェクター細胞の遊走および腫瘍微小環境における活性化Ｔ細胞の保持が誘導される。
【０００７】
抗ＣＤ１３７抗体によるＣＤ１３７の架橋は、肉腫、肥満細胞腫、神経膠腫、リンパ腫、骨髄腫、および肝細胞癌を含む多数のモデルにおいて、ｉｎ  ｖｉｖｏでの強力な抗腫瘍効果を有することが示されている。ＣＤ８＋細胞枯渇試験では、この効果は、主に細胞溶解性Ｔ細胞の増殖および浸潤に関与し、腫瘍細胞の溶解をもたらすことが実証されている。しかしながら、ＤＣ、ＮＫ細胞またはＣＤ４＋Ｔ細胞などの他の種類の細胞の寄与が、一部の腫瘍モデルにおいて報告されている。さらに、抗ＣＤ１３７療法は、免疫記憶応答を誘発し、自己免疫反応を阻害することが示されている（Vinay et al 2012における論評）。
【０００８】
既存のアゴニスト療法は、全身性のＣＤ１３７作用をもたらし、望まれない副作用に至ることが示されている。ＣＤ１３７シグナル伝達の活性化は、マウスモデルにおける重度の毒性と関連している。完全ヒトＩｇＧ４抗ＣＤ１３７アゴニスト抗体（Ｕｒｅｌｕｍａｂ（登録商標）、ＢＭＳ−６６３５１３）の臨床試験では、好中球減少症、肝酵素の上昇および高用量での重度の肝毒性が報告され、試験中止に至った。この重度の毒性は、これも単剤療法および併用療法のアプローチの両方として臨床試験中である完全ヒトＩｇＧ２（ＰＦ−０５０８２５６６）では認められなかった。同時刺激ＴＮＦＲを標的とするアゴニスト抗体は、ＦｃγＲの関与（engagement）を必要とすることが示されている（Bulliard et al, 2014）。このように、ＦｃγＲを介した非標的クラスタ形成は、それによりアゴニスト抗体がこれらの標的に作用する機序に影響を及ぼし得る。
【０００９】
既存の療法で認められた毒性プロファイルを考慮すると、毒性を低減させた代替のＣＤ１３７結合性分子の使用に基づいた、代替のがん療法の必要性が存在する。特に、細胞の表面でＣＤ１３７と効果的に関与し（engage）、肝毒性を含む毒性を低減させた標的ＣＤ１３７アゴニストの臨床的必要性が存在する。
【００１０】
従って、最小限のアゴニスト活性および内部移行活性を有するＣＤ１３７結合性分子を開発すれば、ＣＤ１３７および他の分子、例えば、腫瘍微小環境内で発現した腫瘍関連抗原を同時標的とする二特異性分子を生成するためのビルディングブロックが提供されるであろう。そのような分子において、両標的の二重関与（dual engagement）、例えば同時関与（simultaneous engagement）は、ＣＤ１３７活性化をもたらし得、それにより、腫瘍微小環境に対する作用部位を制限し、ＣＤ１３７療法の望ましくない効果を最小限にできる可能性がある。
【発明の概要】
【００１１】
本発明は、ＣＤ１３７に対する特異性を有する新規な結合性分子（binding molecule）に関する。本発明者らは、ＣＤ１３７に結合するが、単一特異性フォーマット（monospecific format）で、すなわち、第２の標的に結合する別の部分と連結されることなく、ＣＤ１３７に結合した場合、ＣＤ１３７シグナル伝達を生じないシングル可変重鎖ドメイン抗体を同定した。しかしながら、腫瘍特異抗原に結合する部分に連結された場合、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、アゴニスト応答を誘発する。このように、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、第２の抗原を標的とする結合パートナーなしに、ＣＤ１３７と結合した場合、受容体のクラスタ形成を誘導せず、アゴニスト活性を示さない一方で、二特異性分子におけるＣＤ１３７および腫瘍特異抗原の二重関与（dual engagement）は、ＣＤ１３７アゴニズムをもたらす。
【００１２】
一つの態様において、ヒトＣＤ１３７に結合するが、単一特異性エンティティ（monospecific entity）としてＣＤ１３７に結合した場合、ＣＤ１３７シグナル伝達を誘発しない、単離されたシングル可変重鎖ドメイン抗体が提供される。一つの実施形態において、前記シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＣＤ１３７に対するＣＤ１３７Ｌの結合を阻害する。
【００１３】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表１から選択される配列番号を含んでなるＣＤＲ１、表１から選択される配列番号を含んでなるＣＤＲ２および表１から選択される配列番号を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。好ましくは、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ命名法を用いて定義される。
【００１４】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号１またはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号２またはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号３またはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。好ましくは、ＣＤＲは、Ｋａｂａｔ命名法を用いて定義される。
【００１５】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号４２５またはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号４２６またはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号４２７またはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。
【００１６】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ヒトフレームワーク領域を含んでなる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号４もしくは４２８またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列を含んでなる。
【００１７】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号４、３１２、８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２、８７６もしくは８８０またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列から選択される。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、約０．４ｎＭまたは約３ｎＭのＫＤの親和性でＣＤ１３７に結合することができる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ヒトＶ、ＤおよびＪ領域を含んでなるトランスジーンを発現するトランスジェニック齧歯類、例えばマウスから得られたまたは得ることができる。
【００１８】
一つの実施形態において、前記齧歯類は、機能的な内因性の軽鎖および重鎖を産生しない。
【００１９】
別の態様において、
ａ）本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および
ｂ）腫瘍特異抗原に結合する部分
を含んでなる結合性分子も提供される。
【００２０】
一つの実施形態において、腫瘍特異抗原に結合する部分は、シングル可変重鎖ドメイン抗体である。結合性分子の一つの実施形態において、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、ペプチドリンカーにより、腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体と連結されている。一つの実施形態において、前記リンカーは（Ｇ４Ｓ）ｎリンカーから選択され、式中、ｎは１〜１０である。一つの実施形態において、腫瘍特異抗原は、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ７４、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＲＦ、ＣＥＣＡＭ６、ＣＡＸＩＩ、ＣＤ２４、ＣＥＡ、メソセリン、ｃＭｅｔ、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＥｐｈｖＩＩＩ、ＦＡＰ、ＧＤ２、ＩＬ−１３Ｒａ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＧＰＣ３、Ｈｅｒ３、ｇｐＡ３３、５Ｔ４およびＲＯＲ１から選択される。一つの実施形態において、単離されたシングル可変重鎖ドメイン抗体または結合性分子は、毒素、酵素、放射性同位体、半減期延長部分（half-life extending moiety）、標識、治療分子または他の化学部分とコンジュゲートされている。一つの実施形態において、前記半減期延長部分は、アルブミン結合性部分、トランスフェリン結合性部分、ポリエチレングリコール分子、組換えポリエチレングリコール分子、ヒト血清アルブミン、ヒト血清アルブミンの断片、または、アルブミン結合性ペプチドもしくはヒト血清アルブミンに結合するシングルドメイン抗体から選択される。
【００２１】
本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体または結合性分子、および薬学的担体を含んでなる医薬組成物も提供される。
【００２２】
別の態様において、本発明者らは、疾患の処置に使用するための、上記のシングル可変重鎖ドメイン抗体、結合性分子、医薬組成物を提供し、例えば、前記疾患は、がん、免疫障害、神経疾患、炎症障害、アレルギー、移植拒絶反応、ウイルス感染症、免疫不全または他の免疫系関連障害から選択される。
【００２３】
がん、免疫障害、神経疾患、炎症障害、アレルギー、移植拒絶反応、ウイルス感染症、免疫不全または他の免疫系関連障害を処置する方法であって、治療有効量の、上記のシングル可変重鎖ドメイン抗体、結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法も提供される。
【００２４】
別の態様において、本発明者らは、本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体、結合性分子または医薬組成物を含んでなるキットを提供する。
【００２５】
別の態様において、本発明者らは、本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体をコードする核酸配列を含んでなる核酸分子、例えば、配列番号６２９もしくは７３５を含んでなる核酸分子またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する核酸分子を提供する。別の態様において、本発明者らは、上記の核酸分子を含んでなるベクターまたは宿主細胞を提供する。
【００２６】
別の態様において、本発明者らは、ヒトＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を産生する方法を提供する。本発明者らはまた、前記方法により得られたまたは得ることができる、シングルＶＨドメイン抗体も提供する。別の態様において、本発明者らは、ＣＤ１３７抗原による免疫時に産生されたＣＤ１３７に結合する重鎖のみの抗体（heavy chain only antibody）を産生する、トランスジェニック齧歯類、例えばマウスを提供する。本発明者らはまた、トランスジェニック齧歯類から得られたまたは得ることができるヒトＣＤ１３７に結合するＶＨドメインを含んでなる重鎖のみの抗体（heavy chain only antibody）も提供する。
【００２７】
別の態様において、本発明者らは、ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進し、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化および／またはサイトカイン放出を誘導する方法であって、対象に、本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体、結合性分子または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法を提供する。
【００２８】
別の態様において、本発明者らは、腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体をさらに含んでなる結合性分子における、本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体の使用を提供する。
【００２９】
本発明を、以下の非制限的な図面においてさらに説明する。図面に使用されるシングルドメイン抗体は、表２および３に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】一価、二価および三価Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨの結合速度論。（Ａ）一価、（Ｂ）二価および（Ｃ）三価バージョンのＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ１．１（配列番号４）ならびに（Ｄ）一価、（Ｅ）二価および（Ｆ）三価のＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ２．１（配列番号４２８）の結合および解離速度論を、バイオレイヤー干渉法を用いてプロテインＧセンサー上に捕捉されたヒトＣＤ１３７ｈｕＦｃタグ付きタンパク質に対する結合に関して測定した。多価フォーマットは、一価のＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨと比較して、増強した結合を示す。
【図２】二重結合細胞に基づくＥＬＩＳＡ。ＣＨＯヒトＰＳＭＡ発現細胞をプレートに播種し、一価ＶＨまたは二特異性分子を添加した。引き続きＣＤ１３７ｈｕＦｃを添加し、抗ヒトＦｃ−ＨＲＰを用いて結合を検出した。二特異性分子のみが結合シグナルの増加を示し、二重標的結合が確認された。
【図３】Ｊｕｒｋａｔ  ＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポーターアッセイにおけるＣＤ１３７シグナル伝達の活性化。ＰＳＭＡ発現細胞（ＡおよびＢ）または非発現親細胞（ＣおよびＤ）を、ＪｕｒｋａｔヒトＣＤ１３７ＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポーター細胞と共培養した。（Ｅ）ＣＨＯ  ＰＳＭＡ細胞、（Ｆ）ＤＵ１４５  ＰＳＭＡ細胞または（Ｇ）ＤＵ１４５親細胞（二特異性試験）／培地のみ（抗体試験）を、ＪｕｒｋａｔヒトＣＤ１３７ＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポーター細胞とともに培養した。相対発光シグナル（ＲＬＵ）を、ＮＦ−ｋＢシグナル伝達経路のＣＤ１３７媒介活性化から生じたルシフェラーゼレポーター遺伝子活性の読み取り値として測定した。一価、二価、三価および二特異性バージョンのＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ１．１（配列番号４）ならびに一価、二価、三価および二特異性バージョンのＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ２．１（配列番号４２８）を、ＣＤ１３７を刺激してＮＦ−ｋＢを介したシグナル伝達をもたらす可能性に関して試験した。一価ＰＳＭＡ  Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨｓを、対照として含めた。一価、二価および三価分子は、アッセイにおいてアゴニストとして作用しなかった。ＰＳＭＡ発現細胞の存在下での二特異性分子は、ＣＤ１３７シグナル伝達を効果的に刺激することができた。
【図４】Ｔ細胞におけるＩＬ−２産生の増強。ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を、プレートに結合した抗ＣＤ３抗体の存在下で、ＰＳＭＡ発現細胞または非発現親細胞と共培養した。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ１．１（配列番号４）一価および二特異性分子、Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ２．１（配列番号４２８）一価および二特異性分子、抗ＣＤ１３７ベンチマーク抗体ならびに抗ＰＳＭＡ抗体を、１０ｎＭの濃度で添加した。上清を４８時間後に回収し、ＩＬ−２のレベルを決定した。（Ａ）ＰＳＭＡ発現細胞の存在下での３匹の異なるＴ細胞ドナーに関するＩＬ−２応答の増強。（Ｂ）親細胞の存在下でのＩＬ−２レベルの測定に関する代表的なデータ。一価Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨは、アッセイにおいてＩＬ２産生を刺激しなかった。（Ｃ）ＰＳＭＡ発現細胞の存在下での二特異性分子は、ＩＬ−２産生を効果的に増強することができた。抗ＣＤ１３７抗体（可溶性、非架橋）は、ＰＳＭＡ非依存的応答においてＩＬ−２産生を増強した。（ＤおよびＥ）ＩＬ−２応答の濃度依存性。（Ｆ）二特異性分子は、インターフェロンγを誘導する。
【図５】ＣＤ１３７媒介内部移行。（Ａ）ＶＨ１．１（配列番号４）、（Ｂ）三価ＶＨおよび（Ｃ）抗ＣＤ１３７抗体を、４℃でＣＨＯ  ＣＤ１３７細胞とともにインキュベートし、内部移行のために３７℃でそれらを結合させた。細胞を、リソソームの検出のために、抗ヒトＩｇ  ＡＦ４８８抗体または抗Ｈｉｓ／抗マウスＩｇ  ＡＦ４８８抗体に次いで、抗ＬＡＭＰ１／抗ウサギＩｇ  ＡＦ４８８で共染色した。一価ＶＨは、リソソームに対する共局在なしに、結合した細胞表面に主に残存する最小限の内部移行を示した。多価単一特異性ＶＨは、細胞の内部であるが、リソソームに対して共局在しなかったクラスタの存在により示されるように、内部移行の増大を示した。リソソーム染色により共局在したＣＤ１３７抗体は、この分子が内部移行されることを示している。
【図６】二特異性分子の作用機序。この図面は、ＣＤ１３７および腫瘍特異抗原、例えばＰＳＭＡに同時に結合し、腫瘍選択的Ｔ細胞アゴニズムをもたらす結合性分子の作用機序を例示したものである。
【図７】ｉｎ  ｖｉｖｏ実験。ＤＵ１４５  ＰＳＭＡ／ｈｕ  ＰＢＭＣ移植ＮＣＧマウスにおけるＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）の効果。ＤＵ１４５  ＰＳＭＡ前立腺細胞株を移植したＨｕＰＢＭＣ移植ＮＣＧマウスからのプール腫瘍容積データ。第４〜６群（３匹のｈｕＰＢＭＣドナー、ドナーあたりｎ＝５のマウス）を３３〜４５日目に処置し、第４〜６群（３匹のｈｕＰＢＭＣドナー、各群ドナーあたりｎ＝５のマウス）を、９〜３２日目にＰＢＳ（隔週）で、３３〜４５日目に４．１−６ＧＳ−１．１−ＶＨ（ＭＳＡ）（３ｍｇ／ｋｇ、毎日）で処置した。第７〜９群（３匹のｈｕＰＢＭＣドナー、ドナーあたりｎ＝５のマウス）を、９〜３２日目に対照抗ＣＤ１３７抗体（３ｍｇ／ｋｇ、隔週）で処置した。第３群（非ｈＰＢＭＣ移植群、ｎ＝５のマウス）は、無処置とした。腫瘍移植後４６日目に、腫瘍容積を測定した。統計的有意性（マン・ホイットニーのＵ検定）：＊＊＝Ｐ＜０．０１、第３群との比較。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
本発明の実施形態を以下にさらに詳しく説明する。以下の節では、様々な実施形態を説明する。明らかに反対であることを示していない限り、そのように定義された各々の態様を、他の任意の態様または複数の態様と組み合わせてもよい。
【００３２】
Ｔ細胞同時刺激受容体ＣＤ１３７は、免疫応答の重要な制御因子であり、従って、がん療法における重要な標的である。ＣＤ１３７は、活性化Ｔ細胞上で誘導され、活性化誘導細胞死（ＡＩＣＤ）の防止、細胞周期進行の促進、細胞傷害性ならびにＩＬ−２、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αなどの１型サイトカインの産生の増強、ならびに記憶ＣＤ８＋Ｔ細胞の増加といった、多様な非常に重要な役割を果たす。アゴニスト抗体によるｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＤ１３７誘発は、腫瘍に対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答を増強する。ＣＤ１３７媒介抗がん効果は、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、およびとりわけ、高量のＩＦＮ−γの活性化を誘導するその能力に基づく。ＣＤ１３７／ＣＤ１３７Ｌ相互作用は、インフルエンザウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）、および単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）などのウイルスに対するＣＤ８＋Ｔ細胞応答の正の制御因子としても考えられている。ＣＤ１３７は、最初のＴ細胞活性化後のＴ細胞応答の持続に関与する。
【００３３】
重要なことに、ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＣＤ１３７受容体のクラスタ形成を必要とする。そのような多量体化は、三量体ＣＤ１３７リガンドとＣＤ１３７受容体との相互作用により媒介され、タンパク質のＴＲＡＦファミリーなどのシグナル伝達分子の動員をもたらす。これは次に、キナーゼ調節およびＮｆ−ＫＢシグナル伝達経路の活性化をもたらす。転写因子のＮＦ−κＢファミリーは、炎症および自然免疫において重要な役割を有する。さらに、ＮＦ−κＢは、がんの発生および進行の多くの段階における重要なプレーヤーとしてますます認識されている。
【００３４】
本発明者らは、意外にも、単一特異性フォーマットで、すなわち、第２の抗原に特異的な別の部分と連結されることなく、ＣＤ１３７を標的とした場合、ＣＤ１３７に特異的に結合するが、ＣＤ１３７受容体の多量体化を誘導しないシングル可変重鎖ドメイン抗体を同定した。従って、一価または単一特異性フォーマットでの本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体の結合は、ＣＤ１３７シグナル伝達を活性化せず、ＣＤ１３７シグナル伝達をもたらさない。例えば、多特異性、例えば二特異性融合タンパク質としての、第２の抗原に特異的な別の部分とともにシングル可変重鎖ドメイン抗体が提供される場合にのみ、ＣＤ１３７シグナル伝達は活性化され、ここで、本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体は、腫瘍特異抗原に結合する部分、例えば、腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体と連結されている。
【００３５】
一価分子は、１つの抗原結合部位を有し、単一の標的に結合する。二価分子は、２つの抗原結合部位を有し、単一の標的に結合する。二特異性分子は、２つの異なる標的（抗原）に結合する。三特異性分子は、３つの標的（抗原）などに結合する。
【００３６】
本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体が、第２の部分、例えば、腫瘍特異抗原に特異的に結合する分子とともに、融合タンパク質の一部として提供される場合、第２の標的部分およびＣＤ１３７の両方に対する二重結合は、ＣＤ１３７受容体の多量体化およびＣＤ１３７シグナル伝達をもたらす。このように、ＣＤ１３７シグナル伝達の誘導は、両標的、すなわちＣＤ１３７および腫瘍特異抗原の二重関与を必要とする。これは、腫瘍微小環境における局在したＣＤ１３７シグナル伝達をもたらす。多特異性分子による両標的の二重関与、例えば同時関与のみが、ＣＤ１３７活性化をもたらす。腫瘍の近傍における標的特異的活性化は、制御できない副作用に至る全身性のＣＤ１３７作用を回避する。結合性分子は、Ｆｃ受容体に対する結合以外の機序を介して、細胞の表面でＣＤ１３７と効果的に関与し、ひいては、望まれない肝毒性を回避する可能性もある。
【００３７】
一般的に、本明細書に記載される細胞および組織培養、病理学、腫瘍学、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質化学および核酸化学およびハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法、ならびにそれらの技術は、当技術分野で周知であり、当技術分野で一般的に使用される。本開示の方法および技術は、それ以外であることを示していない限り、当技術分野で周知の、ならびに本明細書を通して引用および考察される様々な一般的なおよびより特定の参考文献に記載される通常の方法に従って実施される。例えば、Green and Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第4版, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (2012); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic, Zhiqiang An (編), Wiley, (2009);およびAntibody Engineering, 第2版, 1および2巻, Ontermann and Dubel編, Springer-Verlag, Heidelberg (2010)を参照されたい。
【００３８】
酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般的に実施されているように、または本明細書に記載されているように製造元の説明書に従って実施される。本明細書に記載される分析化学、合成有機化学、ならびに医薬品化学および薬化学に関連して使用される命名法、ならびにその実験手順および技術は、当技術分野で周知であり、一般的に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬学的調製、製剤、および送達、ならびに患者の処置に関しては、標準的な技術を使用する。上記の特性を測定するための好適なアッセイも、実施例において説明する。
【００３９】
特に、以下に説明するように、本明細書に記載されるシングルドメイン抗体は、多価フォーマットまたは多特異的フォーマットで使用することができる。このように、本明細書に記載されるシングルドメイン抗体は、多特異性分子のためのビルディングブロックとして使用することができ、本発明はまた、本明細書に記載されるシングルドメイン抗体を含んでなる多機能性の結合性物質（multifunctional binding agent）にも関する。
【００４０】
上記の本発明のシングルドメイン抗体の特性は、治療方法および使用ならびに本明細書に記載される医薬製剤（pharmaceutical formulation）に利用することができる。
【００４１】
本明細書に記載されるシングルドメイン抗体は、野生型ヒトＣＤ１３７（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０７０１１、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＮＭ＿００１５６１）に特異的に結合する。野生型ヒトＣＤ１３７に関するアミノ酸配列（配列番号７８６）およびヌクレオチド配列を以下に示す（配列番号７８７）。
【００４２】
MGNSCYNIVATLLLVLNFERTRSLQDPCSNCPAGTFCDNNRNQICSPCPPNSFSSAGGQRTCDICRQCKGVFRTRKECSSTSNAECDCTPGFHCLGAGCSMCEQDCKQGQELTKKGCKDCCFGTFNDQKRGICRPWTNCSLDGKSVLVNGTKERDVVCGPSPADLSPGASSVTPPAPAREPGHSPQIISFFLALTSTALLFLLFFLTLRFSVVKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL（配列番号７８６）
【００４３】
ATGGGAAACAGCTGTTACAACATAGTAGCCACTCTGTTGCTGGTCCTCAACTTTGAGAGGACAAGATCATTGCAGGATCCTTGTAGTAACTGCCCAGCTGGTACATTCTGTGATAATAACAGGAATCAGATTTGCAGTCCCTGTCCTCCAAATAGTTTCTCCAGCGCAGGTGGACAAAGGACCTGTGACATATGCAGGCAGTGTAAAGGTGTTTTCAGGACCAGGAAGGAGTGTTCCTCCACCAGCAATGCAGAGTGTGACTGCACTCCAGGGTTTCACTGCCTGGGGGCAGGATGCAGCATGTGTGAACAGGATTGTAAACAAGGTCAAGAACTGACAAAAAAAGGTTGTAAAGACTGTTGCTTTGGGACATTTAACGATCAGAAACGTGGCATCTGTCGACCCTGGACAAACTGTTCTTTGGATGGAAAGTCTGTGCTTGTGAATGGGACGAAGGAGAGGGACGTGGTCTGTGGACCATCTCCAGCCGACCTCTCTCCGGGAGCATCCTCTGTGACCCCGCCTGCCCCTGCGAGAGAGCCAGGACACTCTCCGCAGATCATCTCCTTCTTTCTTGCGCTGACGTCGACTGCGTTGCTCTTCCTGCTGTTCTTCCTCACGCTCCGTTTCTCTGTTGTTAAACGGGGCAGAAAGAAACTCCTGTATATATTCAAACAACCATTTATGAGACCAGTACAAACTACTCAAGAGGAAGATGGCTGTAGCTGCCGATTTCCAGAAGAAGAAGAAGGAGGATGTGAACTGTGA（配列番号７８７）
【００４４】
それ以外であることを明記していない限り、本明細書において使用される用語ＣＤ１３７は、ヒトＣＤ１３７を指す。ＣＤ１３７は、「４−１ＢＢ」、「ＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー９」、「ＴＮＦＲＳ９」、「リンパ球活性化により誘導された」および「ＩＬＡ」としても知られ、これらの用語は、互換的に使用され、ヒトＣＤ１３７の変異体、アイソフォームを含む。
【００４５】
用語「ＣＤ１３７結合性分子／タンパク質／ポリペプチド／物質（agent）／部分（moiety）」、「ＣＤ１３７抗原結合性分子／タンパク質／ポリペプチド／物質（agent）／部分（moiety）」、「抗ＣＤ１３７シングルドメイン抗体」、「抗ＣＤ１３７シングル免疫グロブリン可変ドメイン」、「抗ＣＤ１３７重鎖のみの抗体（anti-CD137 heavy chain only antibody）」または「抗ＣＤ１３７抗体」は総て、ヒトＣＤ１３７抗原に特異的に結合することができる分子を指す。結合反応は、例えば無関係な特異性の抗体を使用する陰性対照試験を基準とする標準的な方法によって示され得る。
【００４６】
目的の抗原、例えばヒトＣＤ１３７に「結合する」または「結合することができる」、本明細書に記載される多特異性、例えば二特異性または三特異性の結合性物質を含む本発明のシングルドメイン抗体または結合性分子は、シングルドメイン抗体が、本明細書に記載される抗原ＣＤ１３７を発現する細胞または組織の標的化において治療剤として有用であるように十分な親和性で抗原に結合する抗体または結合性分子である。結合は、ＣＤ１３７の細胞外ドメインに対するものである。
【００４７】
本明細書に記載されるシングルドメイン抗体および多特異性の結合性物質を含む本発明の結合性分子は、ヒトＣＤ１３７に特異的に結合する。言い換えれば、ＣＤ１３７抗原に対する結合は、非特異的相互作用とは測定可能に異なる。実施例に証明されているように、本発明のシングルドメイン抗体は、マウスＣＤ１３７と交叉反応しない。好ましくは、本発明のシングルドメイン抗体は、ヒトＣＤ１３７に結合し、同様にサル（例えば、カニクイザル）ＣＤ１３７にも結合する。
【００４８】
本明細書に使用される特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド標的上のエピトープに「特異的結合」または「特異的に結合する」、または「特異的である」という用語は、例えば、標的に対するＫＤが少なくとも約１０−６Ｍ、あるいは少なくとも約１０−７Ｍ、あるいは少なくとも約１０−８Ｍ、あるいは少なくとも約１０−９Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１０Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１１Ｍ、あるいは少なくとも約１０−１２Ｍ、またはそれより低い分子によって示され得る。一つの実施形態において、用語「特異的結合」は、分子が、他の任意のポリペプチドまたはポリペプチドエピトープに実質的に結合することなく、特定のポリペプチドまたは特定のポリペプチド上のエピトープに結合する場合の結合を指す。
【００４９】
本明細書に使用される用語「抗体」は、４つのポリペプチド鎖、すなわち２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖で構成される任意の免疫グロブリン（Ｉｇ）分子もしくはその抗原結合部分、またはＩｇ分子の本質的なエピトープ結合特徴を保持するその任意の機能的断片、変異体（mutant）、変異体（variant）、もしくは誘導体を広範に指す。
【００５０】
完全長の抗体では、各々の重鎖は、重鎖可変領域またはドメイン（本明細書においてＨＣＶＲと省略される）および重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、すなわちＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３で構成される。各々の軽鎖は、軽鎖可変領域またはドメイン（本明細書においてＬＣＶＲと省略される）および軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬで構成される。
【００５１】
重鎖および軽鎖可変領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域にさらに細分することができ、それらの領域の間にはより保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる領域が介在する。各々の重鎖および軽鎖可変領域は、３つのＣＤＲと４つのＦＲで構成され、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で整列する。
【００５２】
免疫グロブリン分子は、任意のタイプ（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、およびＩｇＹ）、クラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２）またはサブクラスの分子であり得る。
【００５３】
用語「ＣＤＲ」は、抗体可変配列内の相補性決定領域を指す。重鎖および軽鎖の可変領域の各々には、可変領域の各々に関してＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３と呼ばれる３つのＣＤＲが存在する。用語「ＣＤＲの組」は、抗原に結合することができる単一の可変領域に存在する３つのＣＤＲの群を指す。これらのＣＤＲの正確な境界は、当技術分野で公知の異なるシステムに従って異なるように定義することができる。
【００５４】
Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列多様性に基づいており、最も一般的に使用される（Kabat et al., (1971) Ann. NY Acad. Sci. 190:382-391およびKabat, et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 第５版, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242）。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに構造ループの位置を指している（Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）。Ｋａｂａｔの付番システムは、可変ドメインにおける残基（軽鎖のおよそ１〜１０７位の残基および重鎖の１〜１１３位の残基）を指す場合に一般的に使用される。別のシステムは、ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓ（ＩＭＧＴ）付番スキームである。ＩＭＧＴ付番スキームは、Lefranc et al., Dev. Comp. Immunol., 29, 185-203 (2005) に記載されている。
【００５５】
本明細書において、Ｋａｂａｔによって記載されるシステムを使用する。用語「Ｋａｂａｔ付番」、「Ｋａｂａｔ定義」および「Ｋａｂａｔ表記」は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語は、当技術分野で認識されるように、抗体の重鎖および軽鎖可変領域または抗原結合部分における他のアミノ酸残基より可変(すなわち、超可変)であるアミノ酸残基の付番システムを指す。
【００５６】
キメラ抗体は、１つの種に由来する抗体、好ましくは齧歯類抗体の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む可変ドメインを含み、抗体分子の定常ドメインがヒト抗体の定常ドメインに由来する組換えタンパク質である。
【００５７】
ヒト化抗体は、１つの種の抗体、例えば齧歯類抗体のＣＤＲが、齧歯類抗体の重鎖および軽鎖可変鎖からヒト重鎖および軽鎖可変ドメイン（例えば、フレームワーク領域配列）に移植されている組換えタンパク質である。抗体分子の定常ドメインは、ヒト抗体のそれに由来する。特定の複数の実施形態において、親（齧歯類）抗体からの限定数のフレームワーク領域アミノ酸残基を、ヒト抗体フレームワーク領域配列に置換してもよい。
【００５８】
用語「抗原結合部位」は、抗原に特異的に結合する領域を含んでなる抗体の一部または抗体断片を指す。抗原結合部位は、１つまたは複数の抗体可変ドメインによって提供され得る。抗原結合部位は、一般的に、抗体または抗体断片における会合したＶＨおよびＶＬ内に含まれる。
【００５９】
抗体断片は、抗体の一部、例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、重鎖、軽鎖、可変重（ＶＨ）鎖ドメイン、可変軽（ＶＬ）鎖ドメイン、およびその他である。完全長の抗体の機能的断片は、完全長の抗体の標的特異性を保持する。従って、組換えの機能的抗体断片、例えばＦａｂ（断片、抗体）、ｓｃＦｖ（一本鎖可変鎖断片）、およびシングルドメイン抗体（ｄＡｂ）は、ｍＡｂに基づく治療薬の代替として治療薬を開発するために使用されている。
【００６０】
ｓｃＦｖ断片（約２５ｋＤａ）は、２つの可変ドメイン、ＶＨおよびＶＬからなる。天然において、ＶＨおよびＶＬドメインは、疎水性相互作用を介して非共有結合により会合し、解離する傾向がある。しかしながら、ドメインを親水性のフレキシブルリンカーに連結して一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を作製することによって、安定な断片を工学操作することができる。
【００６１】
最小の抗原結合性断片は、単一の可変断片、すなわち可変重（ＶＨ）鎖ドメインまたは可変軽（ＶＬ）鎖ドメインである。ＶＨおよびＶＬドメインはそれぞれ、抗原に結合することができる。軽鎖／重鎖パートナーに対する結合はそれぞれ、または実際には完全長の抗体の他の部分の存在は、標的結合にとって必要ではない。サイズが１つのシングルドメイン（ＶＨまたはＶＬドメインに対応）に縮小した、抗体の抗原結合性エンティティ（antigen-binding entity）は、一般的に、「シングルドメイン抗体」または「免疫グロブリンシングル可変ドメイン」と呼ぶ。このように、シングルドメイン抗体（約１２〜１５ｋＤａ）は、ＶＨまたはＶＬドメインのいずれかを有する。軽鎖を天然的に欠如するラクダ化重鎖のみの抗体に由来するシングルドメイン抗体、ならびにヒト重鎖ドメインを有するシングルドメイン抗体が記載されている（Muyldermans 2001, Holliger 2005）。抗原結合性シングルＶＨドメインも、例えば、免疫マウスの脾臓由来のゲノムＤＮＡから増幅され、大腸菌において発現したマウスＶＨ遺伝子のライブラリから同定されている（Ward et al., 1989, Nature 341: 544-546）。Ｗａｒｄらは、単離されたシングルＶＨドメインを「ｄＡｂ」、すなわち「ドメイン抗体」と命名した。用語「ｄＡｂ」または「ｓｄＡｂ」（すなわち、シングルドメイン抗体）は、一般的に、抗原に特異的に結合するシングル免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＨ、ＶＨＨまたはＶＬ）ポリペプチドを指す。療法に使用するためには、ヒトシングルドメイン抗体がラクダ由来ＶＨＨより好ましく、その主な理由は、ヒトシングルドメイン抗体は、患者に投与した場合、免疫応答を引き起こす可能性が低いからである。
【００６２】
用語「シングルドメイン抗体」、「シングル可変ドメイン抗体」、「シングル可変重鎖ドメイン抗体」、「シングルＶＨドメイン抗体」、「免疫グロブリンシングル可変ドメイン（ＩＳＶ）」または「免疫グロブリンシングル可変ドメイン抗体」は、総て当技術分野で周知であり、標的抗原に結合する抗体の単一の可変断片を記載する。これらの用語は、本明細書において互換的に使用される。これらの用語、例えば、「シングル重鎖ドメイン抗体」、「シングル可変重鎖ドメイン抗体」、「免疫グロブリンシングル重鎖可変ドメイン」、「単一のＶＨシングルドメイン抗体」、「ＶＨシングルドメイン抗体」、「シングル重鎖ドメイン」、「シングル可変重鎖ドメイン」、「単一のＶＨシングルドメイン」、「ＶＨシングルドメイン」は、軽鎖または他の抗体断片の非存在下で抗原に対する結合特異性を保持する抗体の単一の重鎖可変断片を記載する。従って、本明細書に使用されるシングル可変「重鎖ドメイン抗体、シングル可変重鎖ドメイン、免疫グロブリンシングル重鎖可変ドメイン（ＩＳＶ）、ヒトＶＨシングルドメイン」などは、完全長の抗体の他の任意の部分を含まないが、抗原結合性ＶＨドメインのみを含んでなり、例えば、それは、ＶＨドメインのみを含み、定常重鎖ドメインを含まず、軽鎖を含まない。シングル可変重鎖ドメイン抗体は、軽鎖の非存在下で抗原に結合することができる。
【００６３】
一つの態様において、本発明は、ヒトＣＤ１３７に結合する単離されたシングル可変重鎖ドメイン抗体に関する。
【００６４】
以下に説明するように、複数の実施形態は、ＣＤ１３７抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体／免疫グロブリンシングル可変重鎖ドメインに関する。このように、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、軽鎖の非存在下でＣＤ１３７に結合することができる。ヒトシングル可変重鎖ドメイン抗体（「ＶＨドメイン抗体」）が、特に好ましい。そのような結合性分子はまた、本明細書においてＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）と呼ばれる。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）は、Ｃｒｅｓｃｅｎｄｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ  Ｌｔｄの登録商標である。
【００６５】
このように、いくつかの実施形態において、単離された結合性物質／分子は、前記ドメインがヒト重鎖可変ドメインである少なくとも１つのシングルドメイン抗体を含んでなるか、またはそれからなり、単離された結合性物質／分子は、ＶＬドメインおよびＶＨ定常ドメインを欠如し、標的抗原に結合する。他の複数の実施形態において、単離された結合性物質／分子は、２つ以上のシングルドメイン抗体を含んでなるか、またはそれらからなる。
【００６６】
用語「単離された」は、その自然環境から単離された部分を指す。例えば、用語「単離された」は、他のシングルドメイン抗体、抗体または抗体断片を実質的に含まないシングルドメイン抗体を指す。その上、単離されたシングルドメイン抗体は、他の細胞材料および／または化学物質を実質的に含まなくてもよい。
【００６７】
各々のＶＨドメイン抗体は、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含んでなり、これらはアミノ末端からカルボキシ末端へと以下の順序：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４で整列した。このように、本発明の一つの実施形態において、ドメインは、以下の式：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有するヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメインである。
【００６８】
本発明のシングルドメイン抗体に対して、その特性を改善するためにＣ末端またはＮ末端ＶＨフレームワーク配列に対する修飾を行ってもよい。例えば、ＶＨドメインは、Ｃ末端またはＮ末端の伸長を含んでなり得る。Ｃ末端伸長は、残基ＶＴＶＳＳ（配列番号７８８）で終止するＶＨドメインのＣ末端に付加することができる。例えば、Ｃ末端伸長は、中性非極性アミノ酸、例えばＡ、Ｌ、Ｖ、Ｐ、Ｍ、Ｇ、Ｉ、ＦもしくはＷまたは中性極性アミノ酸、例えばＳもしくはＴを含んでなってもよい。Ｃ末端伸長はまた、ペプチドリンカーまたはタグ、例えば、式中、ｎ＝１〜１５である（Ｇ４Ｓ）ｎリンカー、例えば、配列番号７９０〜７９７の１つから選択され得る。
【００６９】
一つの実施形態において、本発明のシングルドメイン抗体は、１〜５０の残基、例えば１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０、１〜２０、１〜３０または１〜４０個の追加のアミノ酸のＣ末端伸長を含んでなる。一つの実施形態において、本発明のシングルドメイン抗体は、ヒトＣＨ１ドメインの追加のアミノ酸を含んでなり、このためＣ末端はＣＨ１ドメイン内に、例えば１〜５個のアミノ酸分伸長する。
【００７０】
さらなるＣ末端またはＮ末端残基は、例えば、本発明のシングルドメイン抗体を、分子の検出を助ける別の部分またはタグにコンジュゲートするために使用されるペプチドリンカーであり得る。そのようなタグは当技術分野で周知であり、例えばリンカーＨｉｓタグ、例えばヘキサＨｉｓ（ＨＨＨＨＨＨ、配列番号７８９）またはｍｙｃタグを含む。
【００７１】
本明細書に使用される場合、用語「相同性」または「同一性」は一般的に、配列を整列させた後に、およびいくつかの実施形態においては最大のパーセント相同性を達成するために必要に応じてギャップを導入した後に、いかなる保存的置換も配列同一性の一部として考慮することなく比較される参照ポリペプチドの残基と同一である配列におけるアミノ酸残基の百分率を指す。このように、２つのアミノ酸配列間のパーセント相同性は、２つの配列間のパーセント同一性と同等である。Ｎ末端もしくはＣ末端の伸長、タグ、または挿入はいずれも、同一性または相同性を低減させると解釈すべきではない。アライメントのための方法およびコンピュータープログラムは周知である。２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、周知の数学的アルゴリズムを使用して決定することができる。
【００７２】
本発明の様々な態様のいくつかの実施形態によれば、本明細書に記載されるシングルドメイン抗体の可変ドメインは、ＶＨドメイン、ＶＨＨドメイン、ヒト化ＶＨＨドメイン、ラクダ化ＶＨドメインまたは配列改変ＶＨもしくはＶＨＨドメインである。一つの実施形態において、本明細書に記載されるシングルドメイン抗体の可変ドメインは、ヒト可変ドメイン（ＶＨ）である。本明細書に使用される場合、用語シングルＶＨドメイン抗体は、シングルヒト可変重鎖ドメイン抗体をいう。
【００７３】
本明細書に使用される場合、ヒトＶＨドメインは、完全にヒトのまたは実質的に完全にヒトのＶＨドメインを含む。本明細書に使用される場合、用語ヒトＶＨドメインはまた、例えば、ＷＯ２０１６／０６２９９０および以下の実施例に記載されるように、特に目的の抗原による免疫に応答して完全にヒトの免疫グロブリン重鎖座を発現するトランスジェニックマウスによって作製される重鎖のみの抗体から単離されるＶＨドメインも含む。一つの実施形態において、ヒトＶＨドメインはまた、ヒトＶＨドメインアミノ酸に由来するもしくは基づく、またはヒトＶＨ生殖系列核酸配列から産生されるＶＨドメインも含み得る。このため、用語ヒトＶＨドメインは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に由来するまたはそれによってコードされる、例えば、完全ヒトＶＨ遺伝子を発現するトランスジェニックマウスにおいて産生される重鎖のみの抗体から得られる可変重鎖領域を含む。いくつかの実施形態において、実質的にヒトのＶＨドメイン、またはヒトＶＨドメインに由来するもしくは基づくＶＨドメインは、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えばランダムもしくは部位特異的変異誘発によって導入された変異、またはｉｎ  ｖｉｖｏで体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。従って、用語「ヒトＶＨドメイン」は、例えば、配列ライアビリティ(liabilities)を除去するために１つまたは複数のアミノ酸残基が改変されている実質的にヒトのＶＨドメイン、すなわちＶＨドメインも含む。例えば、実質的にヒトのＶＨドメイン、ＶＨドメインは、生殖系列ヒト配列と比較して最大１０個、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９もしくは１０または最大２０個のアミノ酸改変を含み得る。
【００７４】
しかしながら、本明細書に使用される場合の用語「ヒトＶＨドメイン」または「実質的にヒトのＶＨドメイン」は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含まないと意図される。一つの実施形態において、本明細書に使用される場合の用語「ヒトＶＨドメイン」は、１つまたは複数の既定の残基をラクダ化ＶＨＨドメインにおいて見出され得る特定の残基へと変化させるために、ＶＨドメイン配列における既定の位置を選択して既定の位置で１つまたは複数の点突然変異を導入するように、例えば通常の変異誘発法によってｉｎ  ｖｉｔｒｏで特に改変されているヒトＶＨドメインであるラクダ化ＶＨドメインを含まないと意図される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、シングルドメイン抗体は、ドメインがヒト可変重鎖（ＶＨ）ドメインであるシングルドメイン抗体である。このように、好ましい複数の実施形態において、本発明は、ヒトＣＤ１３７に結合する単離されたシングルドメイン抗体であって、ドメインが可変重鎖ドメイン、好ましくはＶＨドメインであり、前記シングルドメイン抗体がヒトＣＤ１３７に結合する、単離されたシングルドメイン抗体を提供する。
【００７６】
一つの態様において、本発明は、シングル可変重鎖ドメイン抗体（すなわち、１つの結合性エンティティ（binding entity）のみを有する分子である一価の結合性分子）に関し、シングルドメイン抗体は、以下の特性のうち１つまたは複数を示す：
（ａ）実施例において測定されるＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する；
（ｂ）ＣＤ１３７を発現する細胞に結合するが、ＣＤ１３７を発現しない細胞には結合しない。これは、実施例６に示されるように測定することができる；
（ｃ）最小限の細胞内部移行を示す。これは、実施例に示されるように測定することができる；
（ｄ）ＣＤ１３７リガンドと細胞の表面に発現したＣＤ１３７との間の相互作用を阻害する。これは、実施例６に示されるように測定することができる；
（ｅ）Ｔ細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達を活性化しない。これは、実施例に示されるように測定することができる；
（ｆ）ＣＤ８＋細胞からのＩＬ−２産生を刺激しない。これは、実施例９に示されるように測定することができる；
（ｇ）マウスＣＤ１３７に結合しない；
（ｈ）実施例に示される良好な安定性を提供する；
（ｉ）レポーター遺伝子活性を増加させず、このため、アゴニストＣＤ１３７活性を有さない。これは、実施例９に示されるように測定することができる；
（ｊ）カニクイザルＣＤ１３７に結合する、かつ／または
（ｋ）ＰＳＭＡに結合するＶＨと連結された場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍成長を阻害する。これは、例えば、実施例、例えば実施例１０のように測定することができる。
【００７７】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ａ）〜ｊｋから選択される２つ以上の特徴、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個の特徴の組合せを有する。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＣＤ１３７リガンドと細胞の表面に発現したＣＤ１３７との間の相互作用を阻害する。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＣＤ１３７リガンドと細胞の表面に発現したＣＤ１３７との間の相互作用を阻害し、また、ａ、ｂ、ｃ、ｅ〜ｋに記載の特徴のうち１つまたは複数を示す。
【００７８】
例示的な配列の特徴
一つの態様において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表１に示されるシングルドメイン抗体のうちの１つに関して示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含んでなる。一つの態様において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表１に示されるシングルドメイン抗体のうちの１つに関して示されるＣＤＲの組から選択される一組のＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含んでなる。一つの実施形態において、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３は、表１におけるＣＤＲのうちの１つと少なくとも４０％、少なくとも７５％または少なくとも８０％の相同性を有する。一つの態様において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号１もしくはそれと少なくとも４０％、少なくとも７５％もしくは少なくとも８０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号２もしくはそれと少なくとも４０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号３もしくは少なくとも４０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３、または配列番号５もしくはそれと少なくとも４０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号６もしくはそれと少なくとも４０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号７などを含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号３０９、３１０および３１１またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含んでなる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号８７３、８７４および８７５またはそれと少なくとも４０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％または少なくとも９０％の相同性を有する配列に示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２またはＣＤＲ３を含んでなる。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って定義される。
【００７９】
上記で定義されるおよび一般的に本明細書に定義される配列相同性は、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性であり得る。
【００８０】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ヒトフレームワーク領域を含んでなる。
【００８１】
一つの態様において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表１に示される完全長の配列またはそれと少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％の相同性を有する配列を含んでなるか、またはそれからなる。例えば、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表１に記載の配列から選択される配列、すなわち配列番号４、８、１２、１６、２０など、またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列を含んでなるか、またはそれからなる完全長の配列を含んでなる。配列相同性は、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性であり得る。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＶＨシングルドメイン抗体１．１．〜１．８９もしくは１．９０〜１．１０６に関して示されるＣＤＲ１、２、および３を含んでなる、または、ＶＨシングルドメイン抗体１．９０〜１．１０６（すなわち、配列番号３６４、３６８、３７２、３７６、３８０、３８４、３８８、３９２、３９６、４００、４０４、４０８、４１２、４１６、４２０もしくは４２４）に関して示される完全長の配列を含んでなるか、もしくはそれからなる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＶＨ１．７８またはその変異体から選択される。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＶＨ１．１０７〜１．１１４またはそれと少なくとも７５％の相同性（例えば、９０％もしくは９５％）を有する配列から選択されるＶＨシングルドメイン抗体に関して示されるＣＤＲ１、２、および３を含んでなる。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表１に示されるＶＨ１．１０７〜１．１１４、すなわち、配列番号８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２、８７６もしくは８８０またはそれと少なくとも７５％の相同性（例えば、９０％もしくは９５％）を有する配列から選択される。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表１に示されるＶＨ１．１１３またはそれと少なくとも７５％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列相同性を有する配列から選択される。
【００８２】
【表１】
2021502104.tif 000003
2021502104.tif 000004
2021502104.tif 000005
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【００８３】
一つの態様において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表２に示されるシングルドメイン抗体のうちの１つに関して示されるＣＤＲ１、ＣＤＲ２もしくはＣＤＲ３を含んでなり、または、それと少なくとも４０％もしくは７５％の相同性を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を含んでなる。例えば、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、配列番号４２５もしくはそれと少なくとも８０％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号４２６もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号４２７もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ３、または配列番号４２９もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ１、配列番号４３０もしくはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列を含んでなるＣＤＲ２、および配列番号４３１などを含んでなるＣＤＲ３を含んでなる。ＣＤＲは、Ｋａｂａｔに従って定義される。一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＶＨシングルドメイン抗体２．４１〜２．５１に関して示されるＣＤＲ１、２、および３を含んでなる、または、ＶＨシングルドメイン抗体２．４１〜２．５１（すなわち、配列番号５８８、５９２、５９６、６００、６０４、６０８、６１２、６１６、もしくは６２０）に関して示される完全長の配列を含んでなるか、もしくはそれからなる。
【００８４】
配列相同性は、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性であり得る。
【００８５】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、ヒトフレームワーク領域を含んでなる。
【００８６】
一つの実施形態において、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表２に示される完全長の配列またはそれと少なくとも７０％の相同性を有する配列を含んでなるか、またはそれからなる。例えば、シングル可変重鎖ドメイン抗体は、表２に示される配列から選択される配列、例えば配列番号４２８、４３２、４３６、４４０など、またはそれと少なくとも５０％の相同性を有する配列を含んでなるか、またはそれからなる完全長の配列を含んでなる。上記の配列相同性は、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％、例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性であり得る。
【００８７】
【表２】
2021502104.tif 000015
2021502104.tif 000016
2021502104.tif 000017
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2021502104.tif 000020
【００８８】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数のアミノ酸置換、欠失、挿入、または他の改変を有する表１または表２に示される上記のシングルＶＨドメイン抗体のいずれかの変異体であり、シングルドメイン抗体の生物機能、すなわち、ＣＤ１３７に対する結合、例えば、ＣＤ１３７に対するＣＤ１３７Ｌの結合の遮断を保持しているＶＨシングルドメイン抗体が提供される。このように、変異体ＶＨシングルドメイン抗体の配列を、操作することができる。改変は、ネイティブ配列のシングルＶＨドメイン抗体またはポリペプチドと比較してアミノ酸配列に変化が起こるシングルドメイン抗体またはポリペプチドをコードする１つまたは複数のコドンの１つまたは複数の置換、欠失、または挿入を含み得る。アミノ酸置換は、１つのアミノ酸の、類似の構造および／または化学特性を有する別のアミノ酸への交換、例えばロイシンのセリンへの交換、すなわち保存的アミノ酸交換の結果であり得る。挿入または欠失は、任意選択で約１〜２５、例えば、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０アミノ酸、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０アミノ酸の範囲であり得る。配列においてアミノ酸の挿入、欠失、または置換を系統的に作製すること、および得られた変異体を、完全長または成熟ネイティブ配列によって示される活性に関して試験することによって、許容される多様性を決定してもよい。本明細書に記載されるＶＨシングルドメイン抗体の変異体は、非変異体分子と少なくとも７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列相同性を有し、例えば少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％、または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列相同性を有する。一つの実施形態において、配列番号４、３１２、４２８、６２４、８５２、８５６、８６０、８６４、８６８、８７２、８７６または８８０から選択される変異体が提供され、前記変異体は、これらの配列のうちの１つと比較して、１〜２０、例えば１〜１０個のアミノ酸置換を有する。
【００８９】
一つの実施形態において、改変は、保存的配列改変である。本明細書において使用される場合、用語「保存的配列改変」は、アミノ酸配列を含む抗体の結合特徴に有意に影響を及ぼさないまたは変化させないアミノ酸改変を指すと意図される。そのような保存的改変は、アミノ酸置換、付加、および欠失を含む。改変は、当技術分野で公知の標準的な技術、例えば部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発によって本発明のｓｄＡｂに導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基を、類似の側鎖を有するアミノ酸残基と交換する置換である。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーが当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、ベータ分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）、および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が挙げられる。このように、本発明のシングルドメイン抗体のＣＤＲ領域内の１つまたは複数のアミノ酸残基を、同じ側鎖ファミリーからの他のアミノ酸残基と交換することができ、変化した抗体を、本明細書に記載される機能的アッセイを使用して機能（すなわち、ＣＤ１３７結合）の保持に関して試験することができる。
【００９０】
このように、これらのアミノ酸変化は、典型的に、ポリペプチドの生物活性、機能、または他の所望の特性、例えば抗原に対するその親和性またはその特異性を変化させることなく作製することができる。一般的に、ポリペプチドの非必須領域における一アミノ酸置換は、生物活性を実質的に変化させない。さらに、構造または機能が類似であるアミノ酸の置換は、ポリペプチドの生物活性を破壊する可能性がより低い。本明細書に記載されるポリペプチドおよびペプチドを構成するアミノ酸残基の略語、およびこれらのアミノ酸残基の保存的置換を、以下の表３に示す。
【００９１】
【表３】
2021502104.tif 000021
【００９２】
いくつかの実施形態において、本発明は、非改変のシングルドメイン抗体と比較して、１つまたは複数の配列改変を含んでなり、結合親和性、特異性、熱安定性、発現レベル、エフェクター機能、グリコシル化、低減された免疫原性、または溶解性などの特性の１つまたは複数が改善されている、表１または表２に示される抗体から選択されるシングルドメイン抗体の変異体であるＶＨシングルドメイン抗体を提供する。
【００９３】
当業者は、本明細書に記載される抗原結合性分子を同定する、得る、および最適化するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ発現ライブラリを含む異なる方法が存在することを承知しているであろう。これを実施例においてさらに説明する。ディスプレイ（例えば、リボソームおよび／またはファージディスプレイ）および／または変異誘発（例えば、誤りがちな変異誘発）などの、当技術分野で公知の最適化技術を使用することができる。従って、本発明はまた、本明細書に記載のシングルドメイン抗体の配列最適化変異体も含んでなる。
【００９４】
一つの実施形態において、シングルドメイン抗体の免疫原性を減少させる改変を行うことができる。例えば、１つのアプローチは、１つまたは複数のフレームワーク残基を、対応するヒト生殖系列配列に復帰させることである。より具体的には、体細胞変異を受けたシングルドメイン抗体は、シングルドメイン抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含んでもよい。そのような残基は、シングルドメイン抗体フレームワーク配列を、シングルドメイン抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定することができる。一つの実施形態において、総てのフレームワーク配列は生殖系列配列である。
【００９５】
フレームワーク領域配列におけるアミノ酸残基の１つまたは複数を、その生殖系列構成に戻すために、例えば部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発によって、体細胞変異を生殖系列配列に「逆変異」させることができる。
【００９６】
別のタイプのフレームワーク改変は、Ｔ細胞エピトープを除去するために、フレームワーク領域内の、またはさらに１つもしくは複数のＣＤＲ領域内の１つまたは複数の残基を変異させ、それによって抗体の潜在的免疫原性を低減させることを伴う。
【００９７】
さらに別の実施形態において、グリコシル化を改変する。例えば、無グリコシル化抗体（すなわち、抗体はグリコシル化を欠如する）を作製することができる。グリコシル化を、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化させることができる。そのような炭水化物改変は、例えば抗体配列内のグリコシル化の１つまたは複数の部位を変化させることによって行うことができる。例えば、それによって１つまたは複数の可変領域フレームワークグリコシル化部位が除去され、それによってその部位でのグリコシル化が除去される１つまたは複数のアミノ酸置換を行うことができる。そのような無グリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。
【００９８】
一つの実施形態において、１つまたは複数の置換は、ＣＤＲ１、２または３領域に存在する。例えば、ＣＤＲ１、２または３における１、２、３、４、５個以上のアミノ酸置換が存在し得る。別の例において、１または２個のアミノ酸欠失が存在する。一つの実施形態において、１つまたは複数の置換は、フレームワーク領域に存在する。例えば、ＣＤＲ１、２または３における１〜１０個以上のアミノ酸置換が存在し得る。別の例において、１〜１０個以上のアミノ酸欠失が存在し得る。
【００９９】
置換の例
一つの実施形態において、変異体は、配列番号４（ＶＨ１．１）に関する１つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ：
・Ｆ３７Ｖ、
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ
・Ｅ６５Ｋ
・Ｖ７０Ｉ
・Ｖ７９Ｌ
・Ｆ３７Ｖ  ＋  Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ
・Ｆ３７Ｖ  ＋  Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０１Ｖ  ＋  Ｄ１０５Ｉ
・Ｆ３７Ｖ  ＋  Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９ＬＦＧＬ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０１Ｅ  ＋  Ｄ１０５Ｉ
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０５Ｉ
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｄ５４Ｇ、Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｄ５４Ｅ、
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｄ１０１Ｅ
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｄ１０１Ｖまたは
・Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０１Ｖ  ＋  Ｄ１０５Ｉ、Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０１Ｅ  ＋  Ｄ１０５Ｉ
を含んでなる。
【０１００】
一つの実施形態において、変異体は、配列番号４（ＶＨ１．１）に関する１つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ：
ａ）Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０１→以下のＦ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｗ、Ｒ、Ｇから選択される任意のアミノ酸；
ｂ）Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｄ１０５→以下のＦ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｗ、Ｒ、Ｇから選択される任意のアミノ酸、または
ｃ）Ｅ６１Ｖ  ＋  Ｅ６５Ｋ  ＋  Ｖ７０Ｉ  ＋  Ｖ７９Ｌ  ＋  Ｇ５５Ｅ、Ｄ１０１→以下のＦ、Ｌ、Ｉ、Ｍ、Ｖ、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｋ、Ｄ、Ｗ、Ｒ、Ｇから選択される任意のアミノ酸  ＋  Ｄ１０５→以下のＦ、Ｌ、Ｍ、Ｓ、Ｐ、Ｔ、Ａ、Ｙ、Ｈ、Ｑ、Ｎ、Ｋ、Ｄ、Ｅ、Ｗ、Ｒ、Ｇから選択される任意のアミノ酸
を含んでなる。
【０１０１】
一つの実施形態において、変異体は、配列番号３１２（ＶＨ１．７８）に関する１つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ：
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｔ２５Ｓ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｓ８４Ｎ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｆ９５Ｙ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｔ２５Ｓ  ＋  Ｓ８４Ｎ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｔ２５Ｓ  ＋  Ｆ９５Ｙ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｓ８４Ｎ  ＋  Ｆ９５Ｙ
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｔ２５Ｓ  ＋  Ｓ８４Ｎ  ＋  Ｆ９５Ｙまたは
・Ｑ１Ｅ  ＋  Ｔ２５Ｓ  ＋  Ｇ５５Ｅ  ＋  Ｓ８４Ｎ  ＋  Ｆ９５Ｙ
を含んでなる。
【０１０２】
一つの実施形態において、変異体は、配列番号４２８（ＶＨ２．１）に関する１つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ：
・Ｖ２０Ｌ、
・Ｆ３７Ｉ、
・Ｎ８５Ｓ、
・Ｎ９５Ｙ、
・Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｈ９５Ｙ
・Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｆ３７Ｉ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ、Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ、
・Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｆ３７Ｉ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ  ＋  Ｓ１０１Ａ、
・Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｆ３７Ｉ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ  ＋  Ｓ１０１Ｐまたは
・Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ  ＋  Ｓ１０１Ａ、Ｖ２０Ｌ  ＋  Ｎ８５Ｓ  ＋  Ｈ９５Ｙ  ＋Ｓ１０１Ａ
配列番号６２４（ＶＨ２．５０）に関する１つもしくは複数の以下の置換またはその組合せ：
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｉ５７Ｔ  ＋  Ｌ１０３Ｍ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｉ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ａ１０１Ｔ  ＋  Ｌ１０３Ｖ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｖ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｉ５７Ｔ  ＋  Ａ１０１Ｅ  ＋  Ｌ１０３Ｌ  ＋  Ｔ１０４Ｗ  ＋  Ｔ１０７Ｖ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｌ１０３Ｔ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｖ
・Ｙ３２Ｈ  ＋  Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｓ５２Ｇ  ＋  Ｓ５４Ｄ  ＋  Ｄ５６Ａ  ＋  Ｉ５８Ｌ  ＋  Ａ１０１Ｌ  ＋  Ｔ１０４Ｐ  ＋  Ｔ１０７Ｉ  ＋  Ｎ１１１Ｈ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ａ１０１Ｔ  ＋  Ｌ１０３Ｖ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｖ  ＋  Ｎ１１１Ｓ
・Ａ２８Ｔ  ＋  Ｓ３０Ｔ  ＋  Ｙ３３Ｗ  ＋  Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｇ５３Ｓ  ＋  Ｓ５４Ｄ  ＋  Ｄ５６Ｋ  ＋  Ｉ５７Ｔ  ＋  Ｌ１０３Ｍ  ＋  Ｔ１０４Ｐ  ＋  Ｔ１０７Ｉ  ＋  Ｎ１１１Ｙ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｌ１０３Ｔ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｖ  ＋  Ｎ１１１Ｓ
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｉ５７Ｔ  ＋  Ｓ１０１Ｅ  ＋  Ｔ１０４Ｗ  ＋  Ｔ１０７Ｖ  ＋  Ｎ１１１Ｓまたは
・Ｓ３５Ｔ  ＋  Ｖ４８Ｉ  ＋  Ｉ５７Ｔ  ＋  Ｌ１０３Ｍ  ＋  Ｔ１０４Ｒ  ＋  Ｔ１０７Ｉ  ＋  Ｎ１１１Ｓ
を含んでなる。
【０１０３】
例示的な特徴
本明細書に記載されるシングルＶＨドメイン抗体は、優れた安定性を示す。さらに、本明細書に記載されるＶＨシングルドメイン抗体は、ヒトＣＤ１３７に対して特異性を示す。本明細書に記載されるＶＨシングルドメイン抗体はまた、ＣＤ１３７に対するＣＤ１３７Ｌの結合も阻害する。
【０１０４】
本発明のシングルＶＨドメイン抗体は、好ましくは本明細書において詳しく説明し、実施例で示されるＫＤ、ＩＣ５０および／またはＥＣ５０値を有する。例えば、ＫＤは、少なくとも約０．４ｎＭまたは約３ｎＭであり得る。ＩＣ５０および／またはＥＣ５０値は、実施例で示される通りであり得る。
【０１０５】
用語「ＫＤ」は、「平衡解離定数」を指し、平衡時の滴定測定で得た値、または解離速度定数（Ｋｏｆｆ）を結合速度定数（Ｋｏｎ）で除算することによって得た値を指す。「ＫＡ」は、親和性定数を指す。結合速度定数、解離速度定数、および平衡解離定数は、抗原に対する抗体の結合親和性を表すために使用される。結合および解離速度定数を決定する方法は、当技術分野で周知である。蛍光ベースの技術を使用することにより、高い感度が得られ、平衡時に生理的緩衝液中で試料を調べることができる。他の実験アプローチおよび機器、例えばＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）アッセイを使用することができる。
【０１０６】
一つの実施形態において、本明細書に記載される一価シングルＶＨドメイン抗体は、内部移行されないまたは実質的に内部移行されない。内部移行は、実施例のように測定することができる。
【０１０７】
例示的な核酸
本発明はさらに、本発明のシングルドメイン抗体をコードする単離された核酸を提供する。核酸は、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡを含み得る。一つの態様において、本発明は、ＣＤＲ、例えばＣＤＲ３、２つもしくは３つのＣＤＲの組、または上記に示される本発明の完全長シングルＶＨドメイン抗体をコードする核酸を提供する。
【０１０８】
一つの態様において、本発明はこのように、表４または表５に示される配列から選択される配列を含んでなるか、またはそれからなる核酸配列にも関する。
【０１０９】
【表４】
2021502104.tif 000022
2021502104.tif 000023
2021502104.tif 000024
2021502104.tif 000025
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【０１１０】
【表５】
2021502104.tif 000039
2021502104.tif 000040
2021502104.tif 000041
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2021502104.tif 000046
【０１１１】
一つの実施形態において、核酸配列は、上記で選択される配列のうちの１つと少なくとも５０％の配列相同性を有する。一つの実施形態において、前記配列相同性は、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％である。一つの実施形態において、核酸は、配列番号６２９、７０６、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、９９６、８８７もしくは７３５のうちの１つまたはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列から選択される。
【０１１２】
本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含んでなってもよく、完全または部分的に合成または組換えによって産生されてもよい。本明細書に記載されるヌクレオチド配列という言及は、明記された配列を有するＤＮＡ分子を包含し、本文がそれ以外であることを必要としていない限り、ＵがＴの代わりに置換されている明記された配列を有するＲＮＡ分子を包含する。
【０１１３】
さらに、本発明は、上記で定義される少なくとも１つの核酸を含んでなる核酸構築物に関する。構築物は、プラスミド、ベクター、転写または発現カセットの形態であり得る。
【０１１４】
本発明はまた、上記の１つまたは複数の核酸構築物を含んでなる単離された組換え宿主細胞にも関する。宿主細胞は、細菌、ウイルス、植物、哺乳動物または他の適した宿主細胞であり得る。一つの実施形態において、細胞は、大腸菌細胞である。別の実施形態において、細胞は酵母細胞である。別の実施形態において、細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【０１１５】
一つの実施形態において、本明細書に記載される抗ＣＤ１３７シングルドメイン抗体を作製する方法が提供され、方法は、シングルドメイン抗体をコードするポリヌクレオチドの発現にとって適した条件で宿主細胞を培養する工程、およびシングルドメイン抗体を単離する工程を含んでなる。
【０１１６】
別の態様において、本発明のＣＤ１３７シングルドメイン抗体のいずれかと、ヒトＣＤ１３７上の同じエピトープまたは重複するエピトープにまたはその近くに結合する結合性分子、例えば、抗体、抗体断片または抗体模倣物が提供される（すなわち、ＣＤ１３７に対する結合に関して本発明のシングルドメイン抗体のいずれかと交叉競合する能力を有する抗体。このように、本発明のシングルドメイン抗体は、参照抗体として使用することができる）。いくつかの実施形態において、交叉競合試験のための参照抗体は、シングルドメイン抗体１．１（配列番号４）である。そのような交叉競合抗体は、標準的なＣＤ１３７結合アッセイにおいて本明細書に記載されるシングルドメイン抗体と交叉競合するその能力に基づいて同定することができる。例えば、ＢＩＡｃｏｒｅ（登録商標）分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーを使用して、シングルドメイン抗体との交叉競合を証明してもよい。
【０１１７】
一つの実施形態において、ヒトＣＤ１３７に結合することができる結合性物質であって、上記のシングルドメイン抗体のいずれか１つが、競合アッセイにおいて、結合性物質と置換する結合性物質が提供される。一つの実施形態において、前記シングルドメイン抗体は、ＶＨ１．１（配列番号４）、ＶＨＶＨ１．７８（配列番号３１２）、ＶＨ１．１１３（配列番号８７６）もしくはＶＨ２．１（配列番号４２８）またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列である。いくつかの実施形態において、結合性物質は、抗体、その機能的断片、例えばシングルドメイン抗体、抗体模倣タンパク質またはＣＤ１３７の天然リガンドを模倣するタンパク質である。別の態様において、ヒトＣＤ１３７に結合することができる結合性物質であって、結合性物質が、競合アッセイにおいて、上記のシングルドメイン抗体のいずれか１つと置換する結合性物質が提供される。一つの実施形態において、前記シングルドメイン抗体は、ＶＨ１．１（配列番号４）、ＶＨ１．７８（配列番号３１２）、ＶＨ１．１１３（配列番号８７６）もしくはＶＨ２．１（配列番号４２８）またはそれと少なくとも７５％の相同性を有する配列である。別の態様において、本発明は、ヒトＣＤ１３７に結合することができる結合性物質であって、結合性物質が、本発明のシングルドメイン抗体と本質的に同じエピトープに結合する結合性物質を提供する。
【０１１８】
別の態様において、本発明者らは、本明細書に記載されるＶＨドメインを含んでなる、またはそれと少なくとも７０％、８０％または９０％の相同性を有する単離された重鎖のみの抗体を提供する。重鎖のみの抗体は、本明細書に記載されるヒトＶ、ＤおよびＪ領域を発現するトランスジェニック哺乳動物から単離され得る。
【０１１９】
本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体は、ＣＤ１３７発現細胞および例えば、腫瘍特異抗原を発現する細胞の二重標的を提供する多特異性、例えば二特異性の結合性物質におけるビルディングブロックとして使用することができる。従って、本発明者らは、ＣＤ１３７および第２の抗原、例えば腫瘍特異抗原の二重関与、例えば同時関与のための結合性分子における本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体の使用を提供する。そのような結合性分子は、少なくとも２つの異なる標的に同時に結合する。以下に記載するように、いくつかの実施形態において、ＣＤ１３７発現細胞および例えば、腫瘍特異抗原を発現する細胞の二重標的を提供する結合性物質を作製する方法が提供される。本明細書に記載される、例えば上記のシングル可変重鎖ドメイン抗体をコードする核酸は、リンカーペプチドをコードする核酸に連結され、リンカーペプチドは次に、例えば、腫瘍特異抗原をコードするシングル可変重鎖ドメイン抗体をコードする核酸に連結される。核酸構築物は、宿主細胞、例えば、細菌、哺乳動物または酵母細胞において発現させることができる。
【０１２０】
例示的な多特異性の結合性分子
一つの態様において、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および第２の抗原、例えば腫瘍特異抗原に結合する少なくとも第２の部分を含んでなる結合性分子が提供される。用語  結合性物質および結合性分子は、本明細書において互換的に使用される。結合性分子は、融合タンパク質であってもよい。
【０１２１】
一つの実施形態において、少なくとも第２の部分は、例えば抗体、または抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはシングルドメイン抗体、例えばＶＨもしくはＶＨＨドメイン）、または抗体模倣タンパク質から選択される結合性分子である。一つの実施形態において、本発明のシングルドメイン抗体は、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインの１つまたは両方、および任意選択でヒンジ領域を含んでなる、抗体Ｆｃ領域またはその断片に連結させることができる。一つの実施形態において、少なくとも第２の部分は、ＶＨドメインである。
【０１２２】
結合性物質は、多特異性、例えば二特異性であり得る。一つの実施形態において、結合性分子は、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合する第１のＶＨシングルドメイン抗体（ＶＨ（Ａ））、および別の抗原に結合する第２のＶＨシングルドメイン抗体（ＶＨ（Ｂ））を含んでなり、例えば、以下の式：ＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ｂ）を有する。ＶＨ（Ａ）は、例えばペプチドリンカーにより、ＶＨ（Ｂ）とコンジュゲートされている、すなわちＶＨ（Ｂ）と連結されている。Ｌは、リンカーを表す。
【０１２３】
各々のＶＨは、ＣＤＲおよびＦＲ領域を含んでなる。このように、結合性分子は、以下の式：ＦＲ１（Ａ）−ＣＤＲ１（Ａ）−ＦＲ２（Ａ）−ＣＤＲ２（Ａ）−ＦＲ３（Ａ）−ＣＤＲ３（Ａ）−ＦＲ４（Ａ）−Ｌ−ＦＲ１（Ｂ）−ＣＤＲ１（Ｂ）−ＦＲ２（Ｂ）−ＣＤＲ２（ＢＡ）−ＦＲ３（Ｂ）−ＣＤＲ３（Ｂ）−ＦＲ４（Ｂ）を有し得る。シングルＶＨドメインＡおよびＢの順序は特に限定されず、そのため、本発明のポリペプチドにおいて、シングル可変ドメインＡはＮ末端に位置してもよく、シングル可変ドメインＢはＣ末端に位置してもよく、またはその逆であってもよい。
【０１２４】
一つの実施形態において、結合性分子は、二特異性である。このように一つの態様において、本発明は、前記シングルドメイン抗体とは異なる結合特異性を有する第２の機能的部分に連結された本明細書に記載されるシングルドメイン抗体を含んでなる二特異性分子に関する。
【０１２５】
用語「ペプチドリンカー」は、１つまたは複数のアミノ酸を含んでなるペプチドを指す。ペプチドリンカーは、１〜４４個のアミノ酸、より詳しくは、２〜２０個のアミノ酸を含んでなる。ペプチドリンカーは、当技術分野で公知であるか、または本明細書に記載される。好適な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、Ｇおよび／またはＳ残基を含むリンカー、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎまたはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、式中、「ｎ」は、一般的に、１〜１０の間の数字、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。一つの実施形態において、ペプチドは、例えば、ＧＧＧＧＳ（配列番号７９０）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号７９１）、ＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７９２）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧ（配列番号７９３）、ＧＳＧＳＧＳＧＳ（配列番号７９４）、ＧＧＳＧＳＧＳＧ（配列番号７９５）、ＧＧＳＧＳＧ（配列番号７９６）およびＧＧＳＧ（配列番号７９７）からなる群から選択される。
【０１２６】
一つの実施形態において、第２の部分は、腫瘍特異抗原に結合する。一つの実施形態において、
ａ）本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、および
ｂ）腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体
を含んでなる結合性分子が提供される。
【０１２７】
本明細書に使用される腫瘍特異抗原は、限定されるものではないが、ＰＳＭＡ、Ｈｅｒ２、ＣＤ１２３、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ２３、ＣＤ７４、ＢＣＭＡ、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、ＥＧＲＦ、ＣＥＣＡＭ６、ＣＡＸＩＩ、ＣＤ２４、ＣＥＡ、メソセリン、ｃＭｅｔ、ＴＡＧ７２、ＭＵＣ１、ＭＵＣ１６、ＳＴＥＡＰ、ＥｐｈｖＩＩＩ、ＦＡＰ、ＧＤ２、ＩＬ−１３Ｒａ２、Ｌ１−ＣＡＭ、ＰＳＣＡ、ＧＰＣ３、Ｈｅｒ３、ｇｐＡ３３、５Ｔ４およびＲＯＲ１を含む一覧から選択され得る。ＣＤ１３７およびＰＳＭＡに結合する例示的な結合性分子を、実施例に示す。
【０１２８】
一つの態様において、本発明は、腫瘍特異抗原に結合する別の部分と連結された本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、例えば、腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子に関し、結合性分子は、以下の特性のうち１つまたは複数を示す：
（ａ）実施例において測定されるＫＤでヒトＣＤ１３７に結合する；
（ｂ）ヒトＣＤ１３７リガンドと細胞ＣＤ１３７リガンドの表面に発現したヒトＣＤ１３７との間の相互作用を阻害する。これは、実施例６に示されるように測定することができる。
（ｃ）マウスＣＤ１３７に結合しない；
（ｄ）ＣＤ１３７を発現する細胞に結合するが、ＣＤ１３７を発現しない細胞には結合しない。これは、実施例６に示されるように測定することができる；
（ｅ）レポーター遺伝子活性を増加させる。これは、実施例９に示されるように測定することができる。
（ｆ）実施例１０に示されるように、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍細胞成長を阻害する；
（ｇ）ＣＤ８＋Ｔ細胞増殖を促進する；
（ｈ）細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の活性化を誘導する；
（ｉ）ＣＤ８＋細胞からのＩＬ−２産生を刺激する。これは、実施例９に示されるように測定することができる；
（ｊ）腫瘍特異的Ｔ細胞活性化を誘導する；
（ｋ）実施例において測定されるように、Ｔ細胞におけるＣＤ１３７シグナル伝達を活性化する；
（ｌ）活性化誘導細胞死を阻害する；
（ｍ）Ｔ細胞生存を増強する；
（ｎ）全身性のＴ細胞活性化を制限する；
（ｏ）Ｔ細胞の細胞傷害性エフェクター機能を増強する；
（ｐ）腫瘍抗原陽性腫瘍における抗腫瘍細胞の局所活性化を促進する；
（ｑ）ＣＤ１３７陽性ＮＫ細胞活性化を介した抗体依存性細胞傷害性を増強する；
（ｒ）腫瘍特異抗原に結合する部分に連結された場合、ＣＤ１３７および腫瘍特異抗原、例えばＰＳＭＡに同時に結合する；
（ｓ）カニクイザルＣＤ１３７に結合する；
（ｔ）Ｔ−ｒｅｇ細胞の制御因子機能を逆転させる；
（ｕ）ＮＫ細胞を活性化する；
（ｖ）Ｔ細胞を腫瘍細胞に動員する。
【０１２９】
一つの実施形態において、結合性分子は、上記の特性のうち２つ以上、例えば、特性の任意の組合せを含む、上記の一覧から選択される２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０もしくは２１個の特性または総ての特性の組合せを示す。
【０１３０】
一つの実施形態において、結合性分子は、腫瘍特異抗原に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体と連結されたＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる融合タンパク質である。リンカーは、例えばＧＳ残基を有するペプチドリンカー、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、式中、ｎ＝１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。そのようなリンカーの例は、上記の通りである。ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、そのＮまたはＣ末端を介して他のポリペプチドに連結させることができる。
【０１３１】
上記の融合タンパク質は、エフェクター細胞の表面上のＣＤ１３７および腫瘍細胞の細胞表面に提示された腫瘍特異抗原に同時結合することができる。
【０１３２】
二重結合、例えば同時結合は、ＣＤ１３７受容体の多量体化をもたらし、それにより、ＣＤ１３７シグナル伝達が生じる。これは、Ｔ細胞活性化をもたらす。いくつかの実施形態において、２つの標的の同時関与、すなわち、それらの標的に対する同時結合は、腫瘍抗原特異的エフェクター細胞活性化をもたらし、腫瘍細胞死滅をもたらす。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、一価シングル重鎖ドメイン抗体がＣＤ１３７に結合するＥＣ５０値と少なくとも類似する、匹敵するまたは同等のＥＣ５０値で、ＣＤ１３７に結合することができる。いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、実施例に示されるＥＣ５０値でＣＤ１３７に結合する。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、本質的に実施例に記載の通りに、機能的Ｔ細胞活性化におけるＴ細胞応答を同時刺激することができ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される融合タンパク質は、機能的Ｔ細胞活性化におけるＩＬ−２および／またはＩＦＮγの分泌ならびにＴ細胞増殖を誘導することができ得る。いくつかの実施形態において、本明細書に記載される融合ポリペプチドもまた、標的腫瘍、すなわち、融合タンパク質が結合する腫瘍抗原に対して陽性である細胞の近傍でＩＬ−２および／またはＩＦＮγの分泌を局所誘導することができる。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、融合タンパク質は、ＣＤ１３７発現細胞および腫瘍抗原発現細胞の二重標的を介した相乗作用をもたらすことができ得る。
【０１３６】
別の態様において、本明細書に記載される融合タンパク質をコードする核酸が提供される。そのような核酸を含んでなるベクターおよびそのようなベクターを発現する宿主細胞も提供される。
【０１３７】
一つの実施形態において、本明細書に記載される結合性分子は、実施例に示される方法に従って測定された約０．４ｎＭまたは約３ｎＭのＫＤでＣＤ１３７に結合する。結合は、実施例のように測定することができる。
【０１３８】
腫瘍の微小環境におけるＣＤ１３７および腫瘍関連抗原の同時標的は、抗腫瘍活性を増強し、腫瘍成長を低減し得る。さらに、ＣＤ１３７シグナル伝達を局所で誘発することにより、副作用が低減され得る。
【０１３９】
ＣＤ１３７シグナル伝達は、ＴＲＡＦファミリーメンバーの動員およびキナーゼの活性化をもたらす。Ｔ細胞媒介シグナル伝達は、ＣＤ８＋細胞を活性化誘導死から保護する。
【０１４０】
Ｔ細胞を同時刺激するための本明細書に記載される融合タンパク質の使用も提供される。
【０１４１】
例示的な改変
一つの実施形態において、上記のシングルドメイン抗体または結合性物質は、さらなる結合性分子を含んでなる。このように、結合性物質は、例えば、三特異性または四特異性であり得る。さらなる特異性も同様に想像される。上記の分子の任意の組合せを、多特異性の結合性物質、例えば本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングルドメイン抗体ならびに第２および第３の結合特異性を含む三特異性の結合性物質において作製することができる。
【０１４２】
一つの実施形態において、結合性分子は、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合する第１のＶＨシングルドメイン抗体（ＶＨ（Ａ））、および各々が別の抗原に結合する第２、第３、第４、第５などの部分を含んでなる。この部分は、別の抗原に結合するＶＨシングルドメイン抗体（ＶＨ（Ｂ）、ＶＨ（Ｃ）、ＶＨ（Ｄ）、ＶＨ（Ｅ））であり得、例えば、結合性物質は、以下の式：ＶＨ（Ａ）−Ｌ−ＶＨ（Ｂ）−Ｌ−ＶＨ（Ｘ）ｎを有し、式中、Ｘは、標的ＶＨ（Ａ）およびＶＨ（Ｂ）が結合する以外の標的に結合するＶＨを表し、式中、ｎは、１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。Ｌは、リンカー、例えばペプチドリンカーを表す。リンカーは、上記のように、ＧＳ残基を有するペプチドリンカー、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり得る。一つの実施形態において、ＶＨドメインの順序は逆にされる。言い換えれば、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、そのＣまたはＮ末端を介して別のエンティティ（entity）と連結されている。
【０１４３】
別の実施形態において、さらなる部分は、結合性分子の半減期を延長させるように作用し得る。さらなる部分は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に結合するタンパク質、例えば抗体またはその一部を含んでなり得る。さらなる部分は、例えば配列番号９０１に示される、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはマウス血清アルブミン（ＭＳＡ）に結合するＶＨドメインを含んでなり得る。
【０１４４】
さらなる部分は、血清アルブミン、例えばヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはその変異体、例えばＨＳＡ  Ｃ３４Ｓを含んでなり得る。さらに、例えばＶＨドメインがＦｃドメインに融合されている、本明細書に記載されるＶＨドメインおよびＦｃドメインを含んでなる本明細書に記載される結合性分子も提供される。さらに、第２の抗原に特異的に結合する第２の可変ドメインを含んでなる結合性分子も提供され、第２の抗原はヒトＣＤ１３７以外の抗原である。第２の抗原は、白血球分化抗原（ＣＤ）分子または主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子であり得る。
【０１４５】
一つの実施形態において、抗ＣＤ１３７シングルドメイン抗体または多価の結合性物質は、検出可能な標識または機能的標識によって標識される。標識は、フルオロフォア、蛍光剤、放射標識、酵素、化学発光剤、核磁気共鳴活性標識、または光感作剤を含むがこれらに限定されない、シグナルを産生するまたは産生するように誘導することができる任意の分子であり得る。このように、結合は、蛍光もしくは発光、放射活性、酵素活性、または吸光を検出することによって検出および／または測定してもよい。
【０１４６】
さらに他の複数の実施形態において、抗ＣＤ１３７シングルドメイン抗体または多価の結合性物質は、少なくとも１つの治療部分（therapeutic moiety）、例えば薬物、酵素、または毒素にカップリングされる。一つの実施形態において、治療部分は、毒素、例えば細胞傷害性放射性核種、化学毒素、またはタンパク質毒素である。
【０１４７】
別の態様において、本発明の抗ＣＤ１３７シングルドメイン抗体または多価の結合性物質は、例えば化学改変、特にＰＥＧ化によって、またはリポソームへの取り込みによって、または血清アルブミンタンパク質を使用することによって、半減期を増加させるように改変される。半減期の増加は、分子を抗体断片、例えば半減期を増加させるＶＨドメインとコンジュゲートすることによって、与えることもできる。
【０１４８】
本明細書に使用される場合の用語「半減期」は、例えば、配列もしくは化合物の分解、および／または天然の機序による配列もしくは化合物の排除または隔離のために、アミノ酸配列、化合物またはポリペプチドの血清中濃度がｉｎ  ｖｉｖｏで５０％減少するのに要する時間を指す。半減期は、本発明の対応するＶＨシングルドメイン抗体の半減期より少なくとも１．５倍、好ましくは少なくとも２倍、例えば少なくとも５倍、例えば少なくとも１０倍、または２０倍超増加させてもよい。例えば、半減期の増加は、本発明の対応するＶＨシングルドメイン抗体または融合タンパク質と比較して１時間超、好ましくは２時間超、より好ましくは６時間超、例えば１２時間超、またはさらに２４、４８、または７２時間超であり得る。本発明のアミノ酸配列、化合物またはポリペプチドのｉｎ  ｖｉｖｏ半減期は、それ自体公知の任意の様式で、例えば薬物動態解析によって決定することができる。適した技術は、当業者に明らかであろう。半減期は、例えば、パラメーター、例えばｔ１／２アルファ、ｔ１／２ベータ、および曲線下面積（ＡＵＣ）を使用して表すことができる。
【０１４９】
上記の多価の結合性物質および融合タンパク質を生成するために、２つ以上のポリペプチドをリンカー、例えばポリペプチドリンカーによって接続することができる。適したリンカーには、例えばＧＳ残基を有するリンカー、例えば（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎが挙げられ、式中、ｎ＝１〜１０、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０である。
【０１５０】
シングルドメイン抗体を作製する例示的な方法
本明細書に記載されるシングルドメイン抗体は、ＣＤ１３７抗原による刺激時に重鎖のみの抗体を発現するトランスジェニック哺乳動物、例えば齧歯類から得ることができる。トランスジェニック齧歯類、例えばマウスは、好ましくは内因性の抗体遺伝子を発現する許容量が低減されている。このように、一つの実施形態において、齧歯類は、内因性の軽鎖および／または重鎖抗体遺伝子を発現する許容量が低減されている。従って、齧歯類、例えばマウスは、例えば以下に詳しく説明するように、機能的な軽鎖および／または重鎖が産生されないように、内因性のカッパおよびラムダ軽鎖ならびに／または重鎖抗体遺伝子の発現を妨害する改変を含んでなり得る。
【０１５１】
一つの態様はまた、ヒトＣＤ１３７に結合することができるヒト重鎖のみの抗体を産生する方法であって、
ａ）トランスジェニック齧歯類、例えばマウスをＣＤ１３７抗原によって免疫する工程であって、前記齧歯類が、再構成されていないヒト重鎖Ｖ遺伝子を含んでなる核酸構築物を発現し、機能的な内因性の軽鎖または重鎖を作製することができない工程、
ｂ）ヒト重鎖のみの抗体を単離する工程
を含んでなる方法にも関する。
【０１５２】
さらなる工程は、例えば、前記齧歯類、例えばマウスからＶＨドメイン配列を含んでなる配列のライブラリを生成する工程によって、および前記ライブラリからＶＨドメイン配列を含んでなる配列を単離する工程によって、前記重鎖のみの抗体からＶＨドメインを単離する工程を含み得る。
【０１５３】
別の態様はまた、ヒトＣＤ１３７に結合することができるシングルＶＨドメイン抗体を産生する方法であって、
ａ）トランスジェニック齧歯類をＣＤ１３７抗原によって免疫する工程であって、前記齧歯類、例えばマウスが、再構成されていないヒト重鎖Ｖ遺伝子を含んでなる核酸構築物を発現し、機能的な内因性の軽鎖または重鎖を作製することができない工程、
ｂ）前記齧歯類、例えばマウスからＶＨドメイン配列を含んでなる配列のライブラリを生成する工程、および
ｃ）前記ライブラリからＶＨドメイン配列を含んでなる配列を単離する工程
を含んでなる方法にも関する。
【０１５４】
さらなる工程は、例えば実施例に示される機能的アッセイを使用することによって、ヒトＣＤ１３７に結合するシングルＶＨドメイン抗体または重鎖のみの抗体を同定する工程を含み得る。
【０１５５】
本明細書に記載されるポリペプチド、核酸、宿主細胞、産物、および組成物を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現ライブラリを使用して調製または生成する方法は、以下の工程：
ａ）アミノ酸配列をコードする核酸配列の組、コレクション、またはライブラリを提供する工程；および
ｂ）ＣＤ１３７に結合することができる／ＣＤ１３７に対して親和性を有するアミノ酸配列に関して、前記組、コレクション、またはライブラリをスクリーニングする工程；および
ｃ）ＣＤ１３７に結合することができる／ＣＤ１３７に対して親和性を有するアミノ酸配列（複数）を単離する工程
を含んでなり得る。
【０１５６】
上記の方法において、アミノ酸配列の組、コレクション、またはライブラリは、例えばスクリーニングを容易にするために、ファージ、ファージミド、リボソーム、または適した微生物（例えば、酵母）上に提示され得る。アミノ酸配列（の組、コレクション、またはライブラリ）を提示およびスクリーニングするための適した方法、技術、および宿主生物は、当業者に明らかである（例えば、Phage Display of Peptides and Proteins: A Laboratory Manual, Academic Press;第1版(10月28日, 1996年) Brian K. Kay, Jill Winter, John McCaffertyを参照されたい）。
【０１５７】
ライブラリ、例えばファージライブラリは、抗原特異的な重鎖のみの抗体を発現する細胞または組織を単離する工程、単離された細胞または組織に由来するｍＲＮＡからＶＨドメイン（複数）をコードする配列をクローニングする工程、およびライブラリを使用してコードされるタンパク質を提示する工程によって生成される。ＶＨドメイン（複数）は、細菌、酵母、または他の発現系において発現させることができる。
【０１５８】
別の態様はまた、単離されたＶＨシングルドメイン抗体、またはヒトＶＨ生殖系列配列のアミノ酸産物を含んでなる、もしくはヒトＶＨ生殖系列配列に由来する、ＣＤ１３７に結合するＶＨドメインを含んでなる単離された重鎖のみの抗体にも関する。重鎖のみの抗体は、完全なヒト配列であってもよく、またはマウス配列を含んでなってもよい。
【０１５９】
本明細書に記載の様々な態様および実施形態において、齧歯類という用語は、マウスまたはラットに関連し得る。一つの実施形態において、齧歯類はマウスである。マウスは、非機能的な内因性のラムダ軽鎖座を含み得る。このように、マウスは、機能的な内因性のラムダ軽鎖を作製しない。一つの実施形態において、ラムダ軽鎖座を、部分的もしくは完全に欠失させるか、または挿入、逆位、組換え事象（recombination event）、遺伝子編集、もしくは遺伝子サイレンシングを通して非機能的にする。例えば、少なくとも定常領域遺伝子Ｃ１、Ｃ２、およびＣ３を欠失させてもよく、または上記の挿入もしくは他の改変を通して非機能的にしてもよい。一つの実施形態において、マウスが機能的なラムダ軽鎖を作製しないように、座を機能的に沈黙化させる。
【０１６０】
さらに、マウスは、非機能的な内因性のカッパ軽鎖座を含んでなり得る。このように、マウスは、機能的な内因性のカッパ軽鎖を作製しない。一つの実施形態において、カッパ軽鎖座を、部分的もしくは完全に欠失させるか、または挿入、逆位、組換え事象、遺伝子編集、もしくは遺伝子サイレンシングを通して非機能的にする。一つの実施形態において、マウスが機能的なカッパ軽鎖を作製しないように、座を機能的に沈黙化させる。
【０１６１】
機能的に沈黙化した内因性のラムダおよびカッパＬ鎖座を有するマウスは、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれているＷＯ２００３／０００７３７に開示されるように作製してもよい。
【０１６２】
さらに、マウスは、非機能的な内因性の重鎖座を含んでなり得る。このように、マウスは、機能的な内因性の重鎖を作製しない。一つの実施形態において、重鎖座を、部分的もしくは完全に欠失させるか、または挿入、逆位、組換え事象、遺伝子編集、もしくは遺伝子サイレンシングを通して非機能的にする。一つの実施形態において、マウスが機能的な重鎖を作製しないように、座を機能的に沈黙化させる。
【０１６３】
例えば、ＷＯ２００４／０７６６１８（その全体が参照により本明細書に組み込まれている）に記載されているように、８個総ての内因性の重鎖定常領域免疫グロブリン遺伝子（μ、δ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂ、ε、およびα）がマウスにおいて存在しないか、もしくはそれらが非機能的となる程度に部分的に存在せず、または遺伝子δ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂおよびεは存在しないが、隣接する遺伝子μおよびαは、それらが非機能的となる程度に部分的に存在せず、または遺伝子μ、δ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂ、およびεは存在しないが、αはそれが非機能的となる程度に部分的に存在せず、またはδ、γ３、γ１、γ２ａ、γ２ｂ、ε、およびαは存在しないが、μはそれが非機能的となる程度に部分的に存在しない。部分的に欠失させるとは、内因性の座の遺伝子配列が、機能的な内因性の遺伝子産物が座によってコードされない程度に、すなわち機能的産物が座から発現されないように、欠失しているかまたは例えば挿入によって破壊されていることを意味する。別の実施形態において、座は機能的に沈黙化している。
【０１６４】
一つの実施形態において、マウスは、非機能的な内因性の重鎖座、非機能的な内因性のラムダ軽鎖座、および非機能的な内因性のカッパ軽鎖座を含んでなる。従って、マウスは、いかなる機能的な内因性の軽鎖または重鎖も産生しない。このように、マウスはトリプルノックアウト（ＴＫＯ）マウスである。
【０１６５】
トランスジェニックマウスは、異種の、好ましくはヒトの重鎖座を発現させるためのベクター、例えば酵母人工染色体（ＹＡＣ）を含んでなり得る。ＹＡＣは、酵母において非常に大きいＤＮＡインサートをクローニングするために使用することができるベクターである。天然の酵母染色体のような挙動を示すために必須の３つ総てのシス作用型構造エレメント（自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア（ＣＥＮ）、および２つのテロメア（ＴＥＬ））を含んでなることに加えて、大きいＤＮＡインサートを許容できることにより、それらは、染色体様の安定性にとって、および酵母細胞における伝播の正確性にとって必要な最小サイズ（１５０ｋｂ）に到達することができる。ＹＡＣの構築および使用は、当技術分野で周知である（例えば、Bruschi, C.V. and Gjuracic, K. Yeast Artificial Chromosomes, Encyclopedia of Life Sciences, 2002 Macmillan Publishers Ltd, Nature Publishing Group）。
【０１６６】
例えば、ＹＡＣは、ＣＨ１ドメイン、マウスエンハンサー、および調節領域を欠如するマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせて、再構成されていない過剰なヒトＶＨ、Ｄ、およびＪ遺伝子を含んでなり得る。ヒトＶＨ、Ｄ、およびＪ遺伝子は、ヒトＶＨ、Ｄ、およびＪ座であり、それらは完全にヒトである再構成されていない遺伝子である。
【０１６７】
当技術分野で公知の代替方法を、内因性のマウスまたはラット免疫グロブリン遺伝子の欠失または不活化のために、およびＣＨ１ドメイン、マウスエンハンサー、および調節領域を欠如するマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせて、ヒトＶＨ、Ｄ、およびＪ遺伝子の導入のために使用してもよい。
【０１６８】
トランスジェニックマウスは、実施例に例証するように標準的な技術に従って作製することができる。トランスジェニックマウスを作製するための２つの最も特徴付けられた経路は、新鮮な受精卵母細胞の前核への遺伝子材料のマイクロインジェクションを介して、または安定にトランスフェクトした胚性幹細胞を桑実胚もしくは胚盤胞期の胚に導入することを介して行われる。遺伝子材料を導入する方法にかかわらず、操作された胚は、偽妊娠雌性レシピエントに移入され、そこで妊娠を継続させて、候補となるトランスジェニック子孫を産まれさせる。
【０１６９】
これらの広範な方法の間の主な差は、ＥＳクローンを、使用前に広範にスクリーニングして、トランスジェニック動物を作製することができる点である。これに対し、前核マイクロインジェクションは、その導入後の宿主ゲノムに遺伝子材料が組み込まれることに依存しており、一般的に、トランスジーンの取り込みの成功は、子孫が産まれるまで確認することができない。
【０１７０】
トランスジーンの取り込みの成功が起こるか否かを補助および決定するために当技術分野で公知の多くの方法が存在する。トランスジェニック動物は、ゲノムへの構築物のランダムな組み込み、部位特異的組み込み、または相同組換えを含む複数の手段によって作製することができる。薬物抵抗性マーカー（ポジティブ選択）、リコンビナーゼ、組換え媒介カセット交換、ネガティブ選択技術、および組換え効率を改善するためのヌクレアーゼの使用を含む、トランスジーンの組み込みおよびその後の改変を促進および選択するために使用することができる様々なツールおよび技術が存在する。これらの方法のほとんどがＥＳ細胞の改変において一般的に使用されている。しかしながら、技術の一部は、前核注射を介して媒介される遺伝子導入を増強するために有用性を有し得る。
【０１７１】
さらなる精密化を使用して、所望のバックグラウンド内でトランスジェニック系統をより効率的に生成することができる。上記のように、好ましい複数の実施形態において、内因性のマウス免疫グロブリン発現を沈黙化させて、薬物探索のために利用することができる重鎖のみのレパートリーを発現させるために、導入されたトランスジーンのみを使用することができるようにする。遺伝子操作されたマウス、例えば総ての内因性の免疫グロブリン座（マウス重鎖、マウスカッパ鎖、およびマウスラムダ鎖）を沈黙化させたＴＫＯマウスを、上記のように使用することができる。導入された任意のトランスジーンのこのＴＫＯバックグラウンドへの移入は、通常の交配、またはプロセスを効率的に拡大させるためにＩＶＦ工程を含めることによる交配のいずれかによって行うことができる。しかしながら、同様に、遺伝子導入手順の際にＴＫＯバックグラウンドを含めることも可能である。例えば、マイクロインジェクションの場合、卵母細胞はＴＫＯドナーに由来してもよい。同様に、ＴＫＯ胚からのＥＳ細胞を、遺伝子導入において使用するために誘導することができる。
【０１７２】
免疫グロブリン座を発現するようにトランスジーンが導入されているトリプルノックアウトマウスを、本明細書においてＴＫＯ／Ｔｇと呼ぶ。
【０１７３】
一つの実施形態において、マウスはＷＯ２０１６／０６２９９０に記載されている通りである。
【０１７４】
本発明はまた、齧歯類、好ましくはヒト重鎖座を発現し、ＣＤ１３７抗原によって免疫されているマウスにも関する。本発明はまた、上記の齧歯類、好ましくはヒトＣＤ１３７に結合するヒトＶＨドメインを含んでなる重鎖のみの抗体を発現するマウスにも関する。好ましくは、前記齧歯類は、機能的な内因性のカッパおよびラムダ軽鎖ならびに／または重鎖を作製することができない。ヒト重鎖座は、上記の通りであり得るトランスジーン上に位置する。
【０１７５】
本発明はまた、ヒトＶＨドメインを含んでなる、またはヒトＣＤ１３７抗原によって免疫し、ヒト重鎖座を発現する齧歯類、好ましくはマウスから得られるもしくは得ることができる抗ヒトＣＤ１３７シングルＶＨドメイン抗体または抗ヒトＣＤ１３７重鎖のみの抗体にも関する。好ましくは、前記齧歯類は、機能的な内因性のカッパおよびラムダ軽鎖ならびに／または重鎖を作製することができない。ヒト重鎖座は、上記の通りであり得るトランスジーン上に位置する。
【０１７６】
例示的な治療応用
一つの態様において、本発明者らは、抗がん剤または免疫調節剤として使用するための、本明細書に記載されるシングル可変重鎖ドメイン抗体および本明細書に記載される結合性物質を提供する。
【０１７７】
別の態様において、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる、または本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、および任意選択で薬学的に許容される担体を含んでなる医薬組成物が提供される。本発明のシングルドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子もしくは組成物、または医薬組成物は、経口、局所表面、非経口、舌下、直腸、膣、眼、鼻腔内、肺、皮内、硝子体内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、脳内、経皮、経粘膜、吸入、または特に耳、鼻、眼、もしくは皮膚への局所表面、または吸入を含むがこれらに限定されない任意の通常の経路によって投与することができる。
【０１７８】
非経口投与には、例えば、静脈内、筋肉内、動脈内、腹腔内、鼻腔内、直腸内、膀胱内、皮内、局所表面、または皮下投与が挙げられる。好ましくは、組成物は非経口投与される。
【０１７９】
薬学的に許容される担体または媒体は、微粒子であり得て、そのため、組成物は例えば錠剤または散剤形態である。用語「担体」は、それとともに本発明の薬物抗体コンジュゲートが投与される希釈剤、アジュバント、または賦形剤を指す。そのような薬学的担体は、液体、例えば水、ならびに石油、動物、植物、もしくは合成起源の油を含む油、例えば、落花生油、ダイズ油、鉱油、ゴマ油、およびその他であり得る。担体は、食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンペースト、タルク、ケラチン、コロイド状シリカ、尿素、およびその他であり得る。加えて、補助剤、安定剤、濃化剤、潤滑剤、および着色剤を使用することができる。一つの実施形態において、動物に投与する場合、本発明のシングルドメイン抗体または組成物および薬学的に許容される担体は無菌的である。水は、本発明の薬物抗体コンジュゲートを静脈内投与する場合の好ましい担体である。食塩水溶液およびデキストロース水溶液およびグリセロール水溶液もまた、液体担体として、特に注射可能溶液として使用することができる。適した薬学的担体はまた、賦形剤、例えばデンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノール、およびその他を含む。本発明の組成物は、望ましければ、微量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含み得る。
【０１８０】
本発明の医薬組成物は、液体、例えば溶液、乳剤、または懸濁剤の形態であり得る。液体は、注射、輸注（例えば、ＩＶ輸注）、または皮下による送達にとって有用であり得る。
【０１８１】
経口投与のために意図される場合、組成物は好ましくは固体または液体形態であり、半固体、半液体、懸濁剤、およびゲル形態は、本明細書において固体または液体のいずれかであると考えられる形態に含まれる。
【０１８２】
経口投与のための固体組成物として、組成物を、散剤、顆粒剤、圧縮錠、丸剤、カプセル剤、チューインガム、カシェ剤、または類似の形態に製剤化することができる。そのような固体組成物は典型的に、１つまたは複数の不活性な希釈剤を含む。加えて、以下のうちの１つまたは複数が存在し得る：結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、結晶セルロース、またはゼラチン；賦形剤、例えばデンプン、ラクトース、またはデキストリン；崩壊剤、例えばアルギン酸、アルギン酸ナトリウム、コーンスターチ、およびその他；潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウム；滑剤、例えばコロイド状二酸化ケイ素；甘味剤、例えばスクロースまたはサッカリン；香味剤、例えばペパーミント、サリチル酸メチル、またはオレンジ香料；ならびに着色剤。組成物がカプセル剤（例えば、ゼラチンカプセル）の形態である場合、これは、上記のタイプの材料に加えて、液体担体、例えばポリエチレングリコール、シクロデキストリン、または脂肪油を含み得る。
【０１８３】
組成物は、液体、例えばエリキシル剤、シロップ剤、液剤、乳剤、または懸濁剤の形態であり得る。液体は、経口投与または注射による送達にとって有用であり得る。経口投与が意図される場合、組成物は、甘味剤、保存剤、色素／着色剤、および香味増強剤のうちの１つまたは複数を含んでなり得る。注射による投与のための組成物では、界面活性剤、保存剤、湿潤剤、分散剤、懸濁剤、緩衝剤、安定剤、および等張剤のうちの１つまたは複数も同様に含めることができる。
【０１８４】
組成物は、１つまたは複数の投与単位の形態をとり得る。
【０１８５】
特定の複数の実施形態において、処置を必要とする領域に組成物を局所投与するか、または注射、静脈内注射もしくは輸注によって組成物を投与することが望ましい場合がある。一つの実施形態において、組成物は、注射ペンを含むデバイスの一部である。組成物は、プレフィルドシリンジまたは他の自己投与デバイスとして提供されてもよい。
【０１８６】
特定の障害または状態の処置において有効／活性である療法の量は、障害または状態の性質に依存し、標準的な臨床技術によって決定することができる。加えて、最適な投与量範囲を同定するために役立つように、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを任意選択で使用することができる。組成物に使用される正確な用量もまた、投与経路および疾患または障害の重篤度に依存し、医師の判断および各々の患者の状況に従って決定すべきである。年齢、体重、性別、食事、投与時間、排泄速度、宿主の状態、薬物の組合せ、反応感度、および疾患の重症度のような要因を考慮に入れるべきである。
【０１８７】
典型的に、量は、組成物の少なくとも約０．０１重量％の本発明のシングルドメイン抗体である。経口投与が意図される場合、この量は、組成物の約０．１重量％〜約８０重量％の範囲に変化し得る。好ましい経口組成物は、組成物の約４重量％〜約５０重量％の本発明のシングルドメイン抗体を含んでなり得る。
【０１８８】
本発明の好ましい組成物は、非経口用量単位が本発明のシングルドメイン抗体の約０．０１重量％〜約２重量％を含むように調製される。
【０１８９】
注射による投与に関して、組成物は、典型的に対象の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２５０ｍｇ／ｋｇ、好ましくは動物の体重の約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２０ｍｇ／ｋｇの間、およびより好ましくは動物の体重の約１ｍｇ／ｋｇ〜約１０ｍｇ／ｋｇを含んでなり得る。一つの実施形態において、組成物は、約１〜３０ｍｇ／ｋｇ、例えば約５〜２５ｍｇ／ｋｇ、約１０〜２０ｍｇ／ｋｇ、約１〜５ｍｇ／ｋｇ、または約３ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与スケジュールは、例えば１週間に１回から２、３、または４週間に１回まで異なり得る。
【０１９０】
本発明は、哺乳動物、例えばヒト患者におけるＣＤ１３７媒介疾患または障害を処置する方法であって、それを必要とする哺乳動物に、有効量の本発明の抗体を投与する工程を含んでなる方法を提供する。特に、本発明はさらに、がん、免疫障害、神経疾患、炎症障害、アレルギー、移植拒絶反応、ウイルス感染症、免疫不全、および他の免疫系関連障害から選択される障害の予防および／または処置のための方法であって、それを必要とする対象に、薬学的有効量（pharmaceutically active amount）の、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体もしくは本発明の医薬組成物を含んでなる結合性分子組成物、または本発明の医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法に関する。
【０１９１】
本明細書において使用される場合、「処置する」、「処置している」、または「処置」は、疾患または障害を阻害または軽減することを意味する。例えば、処置は、疾患または障害に関連する症状の発生の延期、および／または前記疾患とともに発生するまたは発生すると予想されるそのような症状の重症度の低減を含み得る。用語は、既存の症状を改善する、さらなる症状を予防する、およびそのような症状の基礎となる原因を改善または予防することを含む。このように、用語は、処置される哺乳動物、例えばヒト患者の少なくとも一部に有益な結果が付与されることを表す。多くの医学的処置は、処置を受ける患者の総てではないが一部にとって有効である。
【０１９２】
用語「対象」または「患者」は、処置、観察、または実験の対象である動物を指す。単なる例に過ぎないが、対象は、ヒトまたは非ヒト哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、またはネコを含むがこれらに限定されない。
【０１９３】
本明細書に使用される場合、用語「有効量」は、細胞、組織、または対象に単独で投与される場合、または追加の治療剤と組み合わせて投与される場合に、投与の条件下で所望の治療効果または予防効果を達成するために有効である抗ＣＤ１３７抗体の量を意味する。
【０１９４】
本発明はまた、疾患の処置または予防に使用するための本発明のＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物にも関する。
【０１９５】
別の態様において、本発明は、がん、免疫障害、神経疾患、炎症障害、アレルギー、移植拒絶反応、ウイルス感染症、免疫不全、および他の免疫系関連障害の処置または予防に使用するための本発明のＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物に関する。
【０１９６】
別の態様において、本発明は、疾患の処置または予防における本発明のＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物の使用に関する。
【０１９７】
別の態様において、本発明は、がん、免疫障害、神経疾患、炎症障害、アレルギー、移植拒絶反応、ウイルス感染症、免疫不全、および他の免疫系関連障害の処置または予防のための医薬の製造における本発明のＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物の使用に関する。
【０１９８】
がんは、固形腫瘍または非固形腫瘍から選択され得る。例えば、がんは、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚または眼内悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、乳がん、脳がん、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、外陰癌、食道がん、小腸がん、内分泌系のがん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、腎臓がん、軟部組織肉腫、尿道がん、膀胱がん、腎臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、胸腺腫、尿路上皮癌、白血病、前立腺がん、中皮腫、副腎皮質癌、リンパ腫、例えばホジキン病、非ホジキンリンパ腫、胃がん、および多発性骨髄腫から選択され得る。
【０１９９】
一つの実施形態において、腫瘍は固形腫瘍である。従って処置され得る固形腫瘍の例には、乳癌、肺癌、結腸直腸癌、膵臓癌、神経膠腫およびリンパ腫が挙げられる。そのような腫瘍の一部の例には、類上皮腫瘍、扁平上皮腫瘍、例えば頭頸部腫瘍、結腸直腸腫瘍、前立腺腫瘍、乳房腫瘍、小細胞および非小細胞肺腫瘍を含む肺腫瘍、膵腫瘍、甲状腺腫瘍、卵巣腫瘍、および肝腫瘍が挙げられる。他の例には、カポジ肉腫、ＣＮＳ新生物、神経芽腫、毛細管性血管芽腫、髄膜腫および脳転移、黒色腫、消化管および腎臓癌および肉腫、横紋筋肉腫、神経膠芽腫、好ましくは多型神経膠芽腫、および平滑筋肉腫が挙げられる。本発明のアンタゴニストが有効である血管形成皮膚がんの例には、扁平上皮癌、基底細胞癌、および悪性のケラチノサイト、例えばヒト悪性ケラチノサイトの成長を抑制することによって処置することができる皮膚がんが挙げられる。
【０２００】
一つの実施形態において、腫瘍は非固形腫瘍である。非固形腫瘍の例には、白血病、多発性骨髄腫、およびリンパ腫が挙げられる。
【０２０１】
一つの態様において、がんは、局所進行切除不能、転移性、または再発性がんである。
【０２０２】
その成長が本発明の抗体を使用して阻害され得る、好ましいがんには、典型的に免疫療法に応答するがんが挙げられる。処置するために好ましいがんの非制限的な例には、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞癌）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、乳がん、結腸がん、および肺がん（例えば、非小細胞肺がん）が挙げられる。
【０２０３】
一つの実施形態において、がんは、別の処置、例えば化学療法後に進行している。
【０２０４】
本明細書に記載される競合ＣＤ１３７結合性物質は、ＣＤ１３７に結合するＣＤ１３７リガンドを阻害する。これにより、ＣＤ１３７受容体が受け取るシグナルが抑制される。このことは、炎症疾患および自己免疫疾患の処置にとって有利であり得、従って、本明細書に記載される一価の結合性分子は、そのような疾患の処置に応用される。
【０２０５】
免疫障害は、移植片対宿主病、関節炎、円形脱毛症、強直性脊椎炎、抗リン脂質症候群、自己免疫性アジソン病、副腎の自己免疫疾患、自己免疫性溶血性貧血、自己免疫性肝炎、自己免疫性卵巣炎および睾丸炎、自己免疫性血小板減少症、ベーチェット病、水疱性類天疱瘡、心筋症、セリアックスプルー皮膚炎、慢性疲労性免疫機能障害症候群（ＣＦＩＤＳ）、慢性炎症性脱髄性多発神経障害、チャーグストラウス症候群、瘢痕性類天疱瘡、ＣＲＥＳＴ症候群、寒冷凝集素症、クローン病、円板状エリテマトーデス、本態性混合型クリオグロブリン血症、線維筋痛症線維筋炎、糸球体腎炎、グレーヴス病、ギランバレー、橋本甲状腺炎、特発性肺線維症、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、ＩｇＡ腎症、若年性関節炎、扁平苔癬、エリテマトーデス、メニエール病、混合結合組織病、多発性硬化症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、１型または免疫媒介性糖尿病、重症筋無力症、尋常性天疱瘡、悪性貧血、結節性多発動脈炎、多発性軟骨炎、多腺性症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発筋炎および皮膚筋炎、原発性無ガンマグロブリン血症、原発性胆汁性肝硬変、乾癬、乾癬性関節炎、レイノー現象、ライター症候群、リウマチ性関節炎、サルコイドーシス、強皮症、シェーグレン症候群、スティフマン症候群、全身性エリテマトーデス、エリテマトーデス、高安動脈炎、側頭動脈炎／巨細胞動脈炎、横断性脊髄炎、潰瘍性大腸炎、ぶどう膜炎、血管炎、例えば疱疹状皮膚炎性血管炎、白斑、ならびにウェゲナー肉芽腫症から選択され得る。神経疾患は、アルツハイマー病、てんかん、パーキンソン病、認知症、多発性硬化症、末梢神経障害、または帯状疱疹後神経痛から選択され得る。
【０２０６】
他の剤との例示的な組合せ
本発明の分子または医薬組成物は、唯一の活性成分として、または１つもしくは複数の他の治療剤と組み合わせて投与してもよい。治療剤は、疾患の処置において有用である化合物または分子である。治療剤の例には、抗体、抗体断片、薬物、毒素、ヌクレアーゼ、ホルモン、免疫調節剤、アポトーシス促進剤、抗血管新生剤、ホウ素化合物、光活性剤または色素、および放射性同位体が挙げられる。抗体分子には、完全な抗体またはその断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、またはシングルドメイン抗体、例えばＶＨドメイン、または抗体模倣タンパク質が挙げられる。
【０２０７】
一つの実施形態において、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物は、既存の治療または治療剤、例えば抗がん治療と組み合わせて使用される。このように、別の態様において、本発明はまた、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物、および抗がん治療の投与を含んでなる組合せ治療にも関する。
【０２０８】
抗がん治療は、治療剤または放射線治療を含んでもよく、これには、遺伝子治療、ウイルス治療、ＲＮＡ治療、骨髄移植、ナノ治療、標的化抗がん治療、または腫瘍溶解薬が挙げられる。他の治療剤の例には、他のチェックポイント阻害剤、抗新生物剤、免疫原性剤、減弱化がん様細胞、腫瘍抗原、抗原提示細胞、例えば腫瘍由来抗原もしくは核酸をパルスした樹状細胞、免疫刺激サイトカイン（例えば、ＩＬ−２、ＩＦＮａ２、ＧＭ−ＣＳＦ）、標的化低分子および生物学的分子（例えば、シグナル伝達経路の構成要素、例えばチロシンキナーゼの調節剤、および受容体チロシンキナーゼの阻害剤、およびＥＧＦＲアンタゴニストを含む腫瘍特異的抗原に結合する薬剤）、抗炎症剤、細胞傷害剤、放射性毒素剤、または免疫抑制剤および免疫刺激サイトカイン（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞、化学療法が挙げられる。一つの実施形態において、シングルドメイン抗体は手術と組み合わせて使用される。
【０２０９】
本発明の特定の実施形態において、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物は、化学療法剤または放射線療法と同時に投与される。別の特定の実施形態において、化学療法剤または放射線療法は、本発明の組成物の投与の、好ましくは少なくとも１時間、５時間、１２時間、１日、１週間、１カ月前または後に、より好ましくは本発明の組成物の投与の数カ月（例えば、最大３カ月）前または後に投与される。
【０２１０】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物は、２つまたはそれより多くの治療剤とともに投与され得る。いくつかの実施形態において、本発明の結合性物質は、２つまたはそれより多くの治療剤とともに投与され得る。
【０２１１】
本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物は、他の治療または治療化合物または治療と同時または異なる時期に、例えば、同時、個別に、または連続的に投与され得る。
【０２１２】
免疫応答を調節する例示的な方法、腫瘍成長を阻害する例示的な方法など
さらに別の態様において、対象における免疫応答を調節する方法であって、対象における免疫応答が調節されるように、対象に、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法が提供される。好ましくは、結合性分子は、対象における免疫応答を増強する、刺激する、または増加させる。
【０２１３】
さらなる態様において、対象における腫瘍細胞の成長を阻害する方法であって、対象に、治療有効量の、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法が提供される。
【０２１４】
さらなる態様において、ＣＤ１３７の下流シグナル伝達経路を活性化する方法であって、対象に、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法が提供される。
【０２１５】
さらなる態様において、Ｔリンパ球の活性化および／または増殖を誘導する方法であって、対象に、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法が提供される。
【０２１６】
さらなる態様において、ＣＤ１３７発現細胞および腫瘍抗原発現細胞を二重標的とする方法であって、対象に、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物を投与する工程を含んでなる方法が提供される。
【０２１７】
さらなる態様において、ＣＤ１３７発現細胞および腫瘍抗原発現細胞の二重標的のための、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物が提供される。
【０２１８】
免疫コンジュゲートおよび他の剤
別の態様において、少なくとも１つの治療剤および／または診断剤にコンジュゲートされた本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体またはＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子を含んでなる免疫コンジュゲートが提供される。
【０２１９】
本発明はまた、診断剤を使用するための本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体またはＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子の使用にも関する。本発明はまた、標識にコンジュゲートされた本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体またはＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子の使用にも関する。
【０２２０】
例示的なキット
別の態様において、本発明は、例えば本明細書に記載される疾患もしくは免疫応答を処置もしくは予防するため、および／または本発明のシングルドメイン抗体を含んでなる疾患を診断する、予後を判定する、もしくはモニターするためにＰＤ−１を検出するためのキットを提供する。そのようなキットは、ＣＤ１３７タンパク質の検出を補助する他の構成要素、包装、説明書、または材料を含み得る。キットは、標識されたＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体またはＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、および標識を検出するための１つまたは複数の化合物を含み得る。
【０２２１】
別の態様において、本発明は、凍結乾燥型で包装された、または水性媒体中で包装された本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物を提供する。
【０２２２】
例示的な非治療応用
別の態様において、本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体は、診断試験およびアッセイなどの非治療目的のために使用される。試験試料中のヒトＣＤ１３７の存在を検出する方法は、前記試料を、本明細書に記載されるシングルドメイン抗体、および少なくとも１つの検出可能な標識と接触させる工程、ならびにヒトＣＤ１３７に対する前記シングルドメイン抗体の結合を検出する工程を含んでなる。
【０２２３】
診断目的のための抗体の改変は当技術分野で周知である。例えば、抗体を、ビオチンなどのリガンド基、または蛍光基、放射性同位体、もしくは酵素などの検出可能なマーカー基によって改変してもよい。本発明の化合物は、診断目的のために使用することができ、例えば、通常の技術を使用して標識することができる。適した検出可能な標識には、フルオロフォア、クロモフォア、放射活性原子、電子密度の高い試薬、酵素、および特異的結合パートナーを有するリガンドが挙げられるがこれらに限定されない。
【０２２４】
図面および実施例を参照して本明細書に記載されるＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体、ＣＤ１３７に結合するシングル可変重鎖ドメイン抗体を含んでなる結合性分子、または医薬組成物も提供される。
【０２２５】
本明細書において特に定義していない限り、本開示に関連して使用した科学技術用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有する。前述の開示は、本開示を作製および使用するための方法、ならびにその最善の様式を含む本発明の範囲に包含される主題の一般的説明を提供するが、当業者が本開示を実践することができるように、以下の実施例を提供する。しかしながら、当業者は、これらの実施例の細部が本発明を制限すると解釈すべきではなく、その範囲は、本開示に添付される特許請求の範囲およびその同等物から理解されるべきであることを認識するであろう。本開示の様々なさらなる態様および実施形態は、本開示を考慮すれば当業者に明らかであろう。
【０２２６】
本明細書において言及した総ての文書は、遺伝子受託番号の参照、科学刊行物および特許刊行物の参照を含む、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０２２７】
本明細書において使用される場合の「および／または」は、他方の存在下または非存在下での２つの明記された特色または構成要素の各々の具体的開示であると解釈すべきである。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、各々が本明細書において個々に記載されているかのように、（ｉ）Ａ、（ｉｉ）Ｂ、ならびに（ｉｉｉ）ＡおよびＢの各々の具体的開示であると解釈すべきである。本文がそれ以外であることを指示していない限り、上記の特色の説明および定義は、本発明の任意の特定の態様または実施形態に限定されず、記載の総ての態様および実施形態に等しく適用される。
【０２２８】
本発明を、ここで非制限的な実施例においてさらに説明する。
【実施例】
【０２２９】
実施例１．Ｔｇ／ＴＫＯマウスの構築
内因性の重鎖および軽鎖抗体発現に関して沈黙化されているバックグラウンド内の生殖系列構成にヒト重鎖抗体トランスジェニック座を有するマウス（トリプルノックアウト、またはＴＫＯ）を、既に記述されている通りに作製した（WO2004/076618, WO2003/000737, Ren et  al., Genomics, 84, 686, 2004; Zou et al., J. Immunol., 170, 1354, 2003およびWO2016/062990）。要約すると、トランスジェニックマウスを、ＣＨ１ドメイン、マウスエンハンサー、および調節領域を欠如するマウス免疫グロブリン定常領域遺伝子と組み合わせて過剰なヒトＶＨ、Ｄ、およびＪ遺伝子を含んでなる酵母人工染色体（ＹＡＣ）を、新鮮な受精卵母細胞の前核へのマイクロインジェクション後に誘導した。使用したＹＡＣは、複数のヒト重鎖Ｖ遺伝子、複数のヒト重鎖ＤおよびＪ遺伝子、マウスＣＨ１遺伝子、およびマウス３’エンハンサー遺伝子を含んだ。これはＣＨ１エクソンを欠如する。
【０２３０】
トランスジェニック創始マウスを、内因性の免疫グロブリン発現を欠如する動物と戻し交配して、下記の免疫試験に使用するＴｇ／ＴＫＯ系統を作製した。
【０２３１】
実施例２．免疫プロトコール
８〜１２週齢のＴｇ／ＴＫＯマウスを、ヒトＣＤ１３７−ヒトＦｃキメラタンパク質（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４１Ｂ−Ｈ５２５８）、ヒトＣＤ１３７−Ｈｉｓタグタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カスタム製品）、ヒトＣＤ１３７を過剰発現するＣＨＯ細胞（標準的な方法を使用して施設内で生成された細胞株）、または組換えタンパク質およびＣＨＯヒトＣＤ１３７発現細胞の組合せによって免疫した。
【０２３２】
実施例３．血清のＥＬＩＳＡ
血清を免疫の前後にマウスから回収し、ＣＤ１３７抗原による免疫に応答した血清中ヒトＣＤ１３７反応性重鎖抗体の存在に関してＥＬＩＳＡによってチェックした。
【０２３３】
全血試料を１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離して、血液から血清を分離した。血清の連続希釈液をポリプロピレンチューブまたはプレートにおいて３％Ｍａｒｖｅｌ（登録商標）／ＰＢＳ中で調製し、室温で少なくとも１時間プレインキュベートした後、ブロックしたＥＬＩＳＡプレートに移し、少なくとも１時間インキュベートした。非結合タンパク質を、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）−２０の後にＰＢＳによる繰り返し洗浄によって除去した。ＰＢＳ／３％Ｍａｒｖｅｌ（登録商標）中で調製したビオチンコンジュゲートヤギ抗マウスＩｇＧ、Ｆｃガンマサブクラス１特異的抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−０６５−２０５）の１：１０，０００の溶液を各ウェルに添加して、室温で少なくとも１時間インキュベートした。非結合検出抗体を、ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０およびＰＢＳによる繰り返し洗浄によって除去した。ニュートラアビジン−ＨＲＰ溶液（Ｐｉｅｒｃｅ、カタログ番号３１０３０）の３％Ｍａｒｖｅｌ（登録商標）／ＰＢＳ中の溶液をＥＬＩＳＡプレートに添加し、３０分間結合させた後、上記のように洗浄した。ＴＭＢ基質（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ｔ０４４０）を使用してＥＬＩＳＡを展開し、５０ｕｌ  ０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号３２０５０１）を添加することによって反応を停止させた。ＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒを使用して、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０２３４】
実施例４．免疫したマウスからのライブラリの生成
上記の免疫したマウスからのライブラリの生成は、以下に概要するライブラリ生成の標準プロトコールに従った。
【０２３５】
脾臓全体、鼠径部および上腕リンパ節を含む組織を、数匹の免疫したマウスからＲＮＡｌａｔｅｒ（登録商標）に回収した。全ＲＮＡを上清から抽出した。ＶＨ配列を、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ＲＴ−ＰＣＲ高正確性キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号１２５７４−０３５）を使用して、製造元のプロトコールに従ってＲＮＡ試料から得た。ＶＨ／ファージミドＰＣＲ産物を、動物起源毎またはＶＨ生殖系列ファミリー毎にプールし、Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  ＰＣＲ精製キット（カタログ番号Ｋ０７０２）を使用して製造元の説明書に従って精製した。溶出したＤＮＡを、ＴＧ１大腸菌（Ｌｕｃｉｇｅｎ、カタログ番号６０５０２−２）に、２５００Ｖ、２５ｕＦ、２００ＷでパルスしたＢｉｏ−Ｒａｄ  ＧｅｎｅＰｕｌｓｅｒ  Ｘｃｅｌｌを使用する電気穿孔によって形質転換した。電気穿孔した細胞をプールした。ライブラリを回収した。
【０２３６】
実施例５．ＣＤ１３７結合ＶＨの単離および最適化のための選択戦略
ライブラリファージストックの調製およびファージディスプレイ選択は、公表された方法（Antibody Engineering, Benny Lo編, 8章, 161〜176頁, 2004）に従って実施した。ほとんどの場合、パニングアプローチと組み合わせたファージディスプレイを使用して、結合ＶＨドメインを単離した。しかしながら、可溶性タンパク質選択、細胞に基づく選択、およびストレス（例えば、熱）下で実施する選択を含む、多様な異なる選択方法が当技術分野において十分に記載されている。
【０２３７】
実施例６：ＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞に対する結合およびヒトＣＤ１３７に結合するヒトＣＤ１３７リガンドの阻害に関するペリプラズム抽出物のスクリーニング
ライブラリの選択後、ヒトＣＤ１３７を発現するＣＨＯ細胞に結合し、ＣＨＯ親細胞に結合せず、ＣＨＯ細胞の表面に発現したヒトＣＤ１３７と組換えヒトＣＤ１３７リガンドタンパク質との間の相互作用を阻害する特定のＶＨを、細菌ペリプラズム抽出物のシングルポイントスクリーニングによって同定した。小規模細菌ペリプラズム抽出物を、標準的な技術に従って深型ウェルプレートにおいて成長させた１ｍｌ培養物から調製した。上清中のＨｉｓタグＶＨのＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞および非ＣＤ１３７特異的結合の決定のためのＣＨＯ親細胞に対する結合を、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ）を使用して評価した。ＴＴＰ  Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌプレートリーダーにおいて、４８８ｎｍおよび６４０ｎｍで励起後、ＦＬ２（５０２ｎｍ〜５３７ｎｍ）およびＦＬ５（６７７〜８００ｎｍ）チャネルにおいて蛍光発光を測定した。データを、ＦＬ５の境界およびピーク強度でゲートを設定し、ゲート設定したデータのＦＬ２平均蛍光強度の中央値を、ＶＨ結合の決定のために使用した。
【０２３８】
結合アッセイと並行して、ペリプラズム抽出物を、ＦＭＡＴフォーマットにおけるヒトＣＤ１３７リガンドタンパク質とＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞との相互作用を阻害する能力に関して試験した。希釈ペリプラズム抽出物試料緩衝液を含む総結合対照および過剰量の非Ｆｃタグ付き競合物質を含む非特異的結合対照を、データ正規化のために各々のプレートに設定した。ＴＴＰ  Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌ、およびデータ正規化に使用したゲート設定したＦＬ２平均蛍光強度の中央値を使用して、蛍光シグナルを測定した。データを、非特異的結合対照ウェルから決定したバックグラウンドシグナルを差し引いた後の総結合対照の％（％対照）として表記した。ＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞に結合し、ＣＨＯ親細胞に結合せず、ＣＤ１３７リガンドに結合するＣＤ１３７を阻害するＶＨのファミリーを同定した。
【０２３９】
実施例７．シークエンシング
表１に、ファミリー１のＶＨの配列を示し、表２に、ファミリー２のＶＨの配列を示す。上記のように同定した各々の個々のＶＨクローンをファージミドからシークエンシングし、ＶＨ生殖系列およびＣＤＲ３アミノ酸類似性に基づいて群分けした。代表的なクローンをさらに特徴付けした。さらなるクローンを、それぞれクローンＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ１．１およびＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ２．１の配列最適化によって生成し、結合活性を改善し、生殖系列に配列を復帰させ、または生物物理学的配列ライアビリティ(liabilities)、例えば異性化または脱アミド部位を除去した。
【０２４０】
実施例８．精製ＶＨの調製
ａ）精製ＶＨの調製
精製ＶＨを、標準的な手順に従って、ペリプラズム抽出物のニッケル−アガロースアフィニティクロマトグラフィー精製のために、ＶＨ  Ｃ末端６ｘＨＩＳタグを使用することによって得た。精製ＶＨの収率を、分光光度法によって推定し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを使用して純度を評価した。あるいは、ＶＨを、標準的な手順に従って、ｐＪＥｘｐｒｅｓｓベクターを有するＷ３１１０大腸菌の上清から精製した。精製ＶＨの収率を、分光光度法によって推定し、ＳＤＳ  ＰＡＧＥを使用して純度を評価した。必要に応じて、Ｖｉｖａｓｐｉｎ  ２０、３ｋＤａ  ＭＷＣＯ  ＰＥＳ、濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、＃  ＶＳ２０９２）を使用して試料を濃縮し、Ｅｔｏｘｉｃｌｅａｒ樹脂（Ｐｒｏｍｅｔｉｃ、＃  ３２５０−０００１０）を使用してエンドトキシンを枯渇させた。
【０２４１】
ｂ）多価構築物の生成
ＣＤ１３７に対して特異的であるＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨおよびＰＳＭＡに対して特異的であるＶＨをコードするＤＮＡ配列を、ＰＣＲにより増幅した。それらを、ＶＨ配列がグリシン／セリンリッチ配列をコードするリンカーと隣接するより大きな断片に構築し、制限酵素に基づく方法によって発現ベクターにライゲートした。プラスミドを、標準的な技術に従って微生物発現系に形質転換した。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ配列の存在を、標準的なコロニーＰＣＲ法によって確認した。次に、ベクター特異的および内部プライマーを使用して、Ｓａｎｇｅｒシークエンシングによってインサート配列を確認し、完全な配列包括度を確実なものとした。例示的な構築物に関する配列を以下に示す。
【０２４２】
【表６】
2021502104.tif 000047
【０２４３】
【表７】
2021502104.tif 000048
【０２４４】
【表８】
2021502104.tif 000049
【０２４５】
【表９】
2021502104.tif 000050
2021502104.tif 000051
【０２４６】
ＰＳＭＡ結合性分子は、野生型ヒトＰＳＭＡに結合する（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ０４６０９）。単量体に関する配列を以下に示す（配列番号８４２）。
1 MWNLLHETDS AVATARRPRW LCAGALVLAG GFFLLGFLFG WFIKSSNEAT NITPKHNMKA
61 FLDELKAENI KKFLYNFTQI PHLAGTEQNF QLAKQIQSQW KEFGLDSVEL AHYDVLLSYP
121 NKTHPNYISI INEDGNEIFN TSLFEPPPPG YENVSDIVPP FSAFSPQGMP EGDLVYVNYA
181 RTEDFFKLER DMKINCSGKI VIARYGKVFR GNKVKNAQLA GAKGVILYSD PADYFAPGVK
241 SYPDGWNLPG GGVQRGNILN LNGAGDPLTP GYPANEYAYR RGIAEAVGLP SIPVHPIGY
301 DAQKLLEKMG GSAPPDSSWR GSLKVPYNVG PGFTGNFSTQ KVKMHIHSTN EVTRIYNVIG
361 TLRGAVEPDR YVILGGHRDS WVFGGIDPQS GAAVVHEIVR SFGTLKKEGW RPRRTILFAS
421 WDAEEFGLLG STEWAEENSR LLQERGVAYI NADSSIEGNY TLRVDCTPLM YSLVHNLTKE
481 LKSPDEGFEG KSLYESWTKK SPSPEFSGMP RISKLGSGND FEVFFQRLGI ASGRARYTKN
541 WETNKFSGYP LYHSVYETYE LVEKFYDPMF KYHLTVAQVR GGMVFELANS IVLPFDCRDY
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661 LRMMNDQLMF LERAFIDPLG LPDRPFYRHV IYAPSSHNKY AGESFPGIYD ALFDIESKVD
721 PSKAWGEVKR QIYVAAFTVQ AAAETLSEVA
【０２４７】
【表１０】
2021502104.tif 000052
2021502104.tif 000053
2021502104.tif 000054
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2021502104.tif 000060
2021502104.tif 000061
【０２４８】
実施例９．精製ＶＨの試験
ｂ）結合アッセイ
精製Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨを、ヒトＣＤ１３７タンパク質、アカゲザルＣＤ１３７Ｆｃ組換えタンパク質、マウスＣＤ１３７タンパク質、腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーＯＸ４０およびＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連）、ＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞、ＣＨＯ親細胞ならびにヒトＴ細胞に対する結合に関して試験した。
【０２４９】
ヒトＣＤ１３７Ｆｃ組換えタンパク質（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４１Ｂ−Ｈ５２５８）、アカゲザルＣＤ１３７Ｆｃ組換えタンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ、カタログ番号９０８４７−Ｋ０２Ｈ）およびマウスＣＤ１３７Ｆｃタンパク質（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４１Ｂ−Ｍ５２５８）に対する結合を、ＨＴＲＦ結合アッセイフォーマットを使用して測定した。総ての試薬および連続希釈したＶＨを、ＰＢＳ、０．１％ＢＳＡ、および０．４Ｍフッ化カリウムを含むアッセイ緩衝液中で調製した。試料またはアッセイ緩衝液（非特異的結合）を、黒色３８４ウェル浅型アッセイプレートにおいて、０．５ｎＭヒト、アカゲザルまたはマウスＣＤ１３７、１ｎＭ抗ヒト−ＦｃクリプテートＰＡｂ（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６１ＨＦＣＫＬＢ）、および２０ｎＭ抗Ｈｉｓ−Ｄ２（ＣｉｓＢｉｏ、カタログ番号６１ＨＩＳＤＬＡ）とともに室温で少なくとも３時間インキュベートした。６２０ｎｍおよび６６５ｎｍでの時間分解蛍光発光をＢＭＧ  ＰＨＥＲＡｓｔａｒプレートリーダーにおいて３３７ｎｍで励起後に測定した。ＨＴＲＦ比（（６６５ｎｍ発光／６２０ｎｍ発光）×１００００）を計算し、データを（非特異的結合）に関して補正し、特異的結合シグナルを生じた。ヒトＣＤ１３７、アカゲザルＣＤ１３７およびマウスＣＤ１３７タンパク質に対する結合に関するモルＥＣ５０値を表８に示す。ＶＨは、ヒトおよびアカゲザルＣＤ１３７に結合したが、マウスＣＤ１３７タンパク質には結合しなかった。
【０２５０】
【表１１】
2021502104.tif 000062
【０２５１】
【表１２】
2021502104.tif 000063
【０２５２】
腫瘍壊死因子受容体ファミリーメンバーＯＸ４０およびＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導性ＴＮＦＲ関連）上でのＣＤ１３７に関する結合の特異性を、ＥＬＩＳＡアッセイを使用して決定した。Ｎｕｎｃ  Ｍａｘｉｓｏｒｐプレートを、炭酸ナトリウム緩衝液中の１ｕｇ／ｍｌヒトＣＤ１３７−Ｆｃ組換えタンパク質（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４１Ｂ−Ｈ５２５８）、ヒトＧＩＴＲ−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号６８９−ＧＲ）ヒトＯＸ４０−Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号３３８８−ＯＸ）によって４℃で一晩コーティングした後、ＰＢＳで２回洗浄した。非特異的タンパク質相互作用を、ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中１％（ｗ／ｖ）スキムミルク粉末（Ｍａｒｖｅｌ（登録商標））によって室温で１時間インキュベーションすることにより、遮断した。プレートをＰＢＳで２回洗浄した後、ＶＨまたは抗体対照（１ｕｇ／ｍｌ）を室温で１時間添加した。ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回洗浄した後、抗Ｈｉｓ−ＨＲＰ（ＶＨの検出）または抗マウス−ＨＲＰ（陽性対照マウスモノクローナル抗体の検出）の１：１０００希釈液を、１％Ｍａｒｖｅｌ／ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０に添加した。検出抗体を室温で１時間結合させた後、プレートをＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０中で２回、ＰＢＳ中で１回洗浄した。ＴＭＢ基質を使用してＥＬＩＳＡを展開し、５０ｕｌ  ０．５Ｍ  Ｈ２ＳＯ４溶液を添加することによって反応を停止させた。ＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒを使用して、４５０ｎｍにおける吸光度を測定した。試験した総てのＶＨは、ＣＤ１３７に結合したが、ＧＩＴＲまたはＯＸ４０には結合しなかった（表８）。
【０２５３】
ＣＨＯヒトＣＤ１３７、ＣＨＯ親、ＣＨＯヒトＰＳＭＡ、ＤＵ１４５  ＰＳＭＡおよびＤＵ１４５親細胞に対するＨｉｓタグ分子の結合を、蛍光マイクロボリュームアッセイ技術（ＦＭＡＴ）を使用して評価した。試薬は総て、ＰＢＳ、０．１％ウシ血清アルブミン、０．０５％アジ化ナトリウムを含むＦＭＡＴアッセイ緩衝液（ｐＨ７．４）中で調製した。連続希釈した試料を、３８４ウェル黒色透明ボトムアッセイプレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号３６５５）に移し、１．５ｎＭ抗Ｈｉｓ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号０５−９４９）、３ｎＭヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌａｂｓ、カタログ番号１１５−５４５−０７１）およびＤＲＡＱ５（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号６２２５１）によって予め染色した２０００個／ウェルとともに室温で少なくとも２時間インキュベートした。次に、ＴＴＰ  Ｍｉｒｒｏｒｂａｌｌプレートリーダーにおいて、４８８ｎｍおよび６４０ｎｍで励起後、ＦＬ２（５０２ｎｍ〜５３７ｎｍ）およびＦＬ５（６７７〜８００ｎｍ）チャネルにおいて蛍光発光を測定した。データを、ＦＬ５の境界およびピーク強度でゲートを設定し、ゲート設定したデータのＦＬ２平均蛍光強度の中央値を、ＶＨ結合の決定のために使用した。結合に関する例示的なＥＣ５０値を表９に示す。一価ＣＤ１３７特異的Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ、ＣＤ１３７結合アームを有する二特異性および三特異性分子は、ＣＨＯ  ＣＤ１３７発現細胞に結合した。一価ＰＳＭＡ特異的Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ、ＰＳＭＡ結合アームを有する二特異性および三特異性分子は、ＰＳＭＡ発現細胞に結合した。
【０２５４】
初代Ｔ細胞に対する結合を、フローサイトメトリーを使用して測定した。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によりヒト血液から単離した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造元のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）に従ってネガティブ選択単離キットを使用して精製した。Ｔ細胞を、１０％ＦＢＳ、２ｍＭグルタミン、１倍Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ培地において、ＰＭＡ／イオノマイシンで４８〜７２時間刺激した。細胞を９６ウェルプレートに移し、染色緩衝液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．０５％アジ化ナトリウム）で１０分間ブロックした後、染色緩衝液（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ）中の連続希釈したＶＨで、４℃にて３０分〜１時間インキュベートした。細胞を遠心分離により洗浄した後、ＶＨ結合を、抗Ｈｉｓ抗体（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、０５−９４９）およびヤギ抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１１５−５４５−０７１）を使用して検出した。生細胞の識別に、Ｌｉｖｅ  Ｄｅａｄ  ｎｅａｒ  ＩＲ染色（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓ、カタログ番号Ｌ１０１１９）を使用した。さらに洗浄した後、細胞を固定し、蛍光をフローサイトメトリーにより測定した。
【０２５５】
結合（２〜３匹のドナー）に関する平均モルＥＣ５０値を表９に示す。一価ＣＤ１３７特異的Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨおよびＣＤ１３７結合アームを有する二特異性分子は、予備刺激したＣＤ８＋細胞に結合した。
【０２５６】
精製ＶＨ、二価ＶＨおよび三価ＶＨ分子の結合速度論を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ３８４機器で測定した。ＣＤ１３７−Ｆｃタグ付きタンパク質を、速度論緩衝液（０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ、１倍ＰＢＳ）中で３μｇ／ｍｌに希釈し、Ｆｃタグを介してプロテインＧバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８−５０８２）にカップリングさせた。ＶＨを連続希釈し（一般的に、最高濃度のＶＨである５０ｎＭで開始する１：２希釈シリーズ）、ＣＤ１３７−ＦｃカップリングしたプロテインＧバイオセンサーに対する結合を測定した。１：１結合モデルおよびＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ９．０ソフトウェアを使用して、（ブランクを差し引いた）センサーグラムトレースから結合速度論を決定した。得られた例示的な速度論および結合親和性のデータを、表１０（一価ＶＨ）および図１（二価および三価分子）に示す。このアッセイフォーマットにおいて、単量体ＶＨは、９１ｐＭ〜５．３ｎＭの間の親和性でＣＤ１３７−Ｆｃに結合した。二価および三価フォーマットは、一価ＶＨと比較して増強した結合を示した。
【０２５７】
【表１３】
2021502104.tif 000064
【０２５８】
一価および二特異性Ｈｕｍａｂｏｄｙ  ＶＨの速度論を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ  ３８４機器で決定した。抗原との相互作用を調べるために、ＣＤ１３７−Ｆｃタグタンパク質（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４１Ｂ−Ｈ５２５８）またはＰＳＭＡ−ｈｉｓ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４２３４−ＺＮ）を、アミンカップリングによってＡＲ２Ｇバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ、カタログ番号１８−５０８２）上に固定した。一価ＶＨおよび二特異性分子を、速度論緩衝液（０．１％ＢＳＡ、０．０２％Ｔｗｅｅｎ、１倍ＰＢＳ）中で連続希釈し（一般的に、最高濃度である１２〜２５ｎＭの間で開始する１：２希釈シリーズ）、固定したタンパク質に対する結合を、結合相および解離相中に調べた。１８０秒の結合相および６００秒の解離相を使用して、ＰＳＭＡ結合を測定した。１８０秒の結合相および６００秒の解離相を使用して、ＣＤ１３７結合を測定した。リファレンスを差し引いたデータを、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェアを使用して１：１結合モデルにフィットさせた。得られた例示的な速度論および結合親和性データを表１１に示す。
【０２５９】
【表１４】
2021502104.tif 000065
【０２６０】
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を使用して、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によるＶＨとヒトおよびアカゲザルＣＤ１３７−ヒトＩｇＧ１Ｆｃタグ付きタンパク質との間の相互作用を調べた。単一サイクル速度論アッセイを使用して、相互作用の速度論および親和性を評価した。実験は、流速３０μｌ／分でＨＢＳ−ＥＰ＋アッセイ緩衝液において２５℃で実施した。プロテインＧチップを使用して、２μｇ／ｍｌまで希釈されたＦｃタグ付き組換えＣＤ１３７を７秒にわたりフローセルの１つに捕捉した。いずれの捕捉されたＣＤ１３７も有さない第２のフローセルを、参照細胞として使用した。ＶＨの３倍希釈シリーズを、６０ｎＭの最高濃度から５点濃度で作製した。結合速度論は、これらをチップ表面に流すことによって追跡した。結合工程の各々の接触時間は１８０秒間であり、解離工程は、アカゲザルおよびヒトＣＤ１３７でそれぞれ１８００および３６００秒であった。各ランの後、センサーをグリシンｐＨ１．５で再生し、捕捉されたＣＤ１３７を除去した。データを、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００評価ソフトウェアを使用してダブルリファレンスを差し引いた後に、１：１結合モデルにフィットさせた。表２におけるｓｄＡｂ１．１１３に関する平均速度論定数（±標準偏差）は、ヒトＣＤ１３７Ｆｃに対する結合に関しては、ｋａ  ３．６Ｅ＋０６  ±  １．６Ｅ＋０６（１／Ｍｓ）、Ｋｄｉｓ  ３．０Ｅ−０４  ±  １．１Ｅ−０４（１／ｓ）およびＫＤ  ８．５Ｅ−１１  ±  ７．８Ｅ−１２（Ｍ）であり、アカゲザルＣＤ１３７Ｆｃに対する結合に関しては、ｋａ  １．１Ｅ＋０６  ±  ２．２Ｅ＋０５（１／Ｍｓ）、Ｋｄｉｓ  ２．８Ｅ−０４  ±  ６．８Ｅ−０６（１／ｓ）およびＫＤ  ２．７Ｅ−１０  ±  ５．２Ｅ−１１であった。
【０２６１】
ｓｄＡｂ１．１１３は、試験した他の分子と比較して優れたカニクイザル結合を示した。ｓｄＡｂ１．１１３はまた、良好な全体的な開発可能性の特徴（安定性および／または発現）も示した。
【０２６２】
二特異性分子によるＣＤ１３７およびＰＳＭＡの二重標的関与を、ＥＬＩＳＡフォーマットを使用して評価した。ＣＨＯ−ＰＳＭＡ細胞（２００００個／ウェル）を、Ｌ−グルタミン＋ブラストサイジン＋テトラサイクリンを補充したＨａｍｓ  Ｆ１２において９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ、カタログ番号３５３８７２）に播種し、３７℃にて５％ＣＯ２で一晩インキュベートした。その後の総ての工程は、室温で実施し、各工程間にＰＢＳによる洗浄を含めた。プレートをＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで１時間ブロックした後、連続希釈したＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨを添加し、１時間結合させた。非結合ＶＨを除去した後、１ｎＭ  ＣＤ１３７ｈｕＦｃ（Ａｃｒｏ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号４１Ｂ−Ｈ５２５８）をウェルに添加し、１時間インキュベートした。その後、抗ｈｕＦｃ−ＨＲＰ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、カタログ番号１０９−０３５−０９８）の１：３０００希釈液を１時間添加し、ＴＭＢを添加することによってプレートを展開した。０．５Ｍ硫酸を添加することによって反応を停止させ、プレートを吸光度４５０ｎｍでのＢＭＧ  ＰｈｅｒａＳｔａｒで読み取った。図２に、二特異性分子はヒトＣＤ１３７およびヒトＰＳＭＡの両方に同時に結合できることを実証した代表的なデータを示す。
【０２６３】
ａ）ＣＤ１３７に結合するＣＤ１３７リガンドの阻害
精製Ｈｕｍａｂｏｄｙ  ＶＨが、ＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞に対するＣＤ１３７リガンドの結合を阻害する能力を、本質的に実施例６に記載の通りに、ＦＭＡＴリガンド阻害アッセイにおいて測定した。連続希釈したＶＨから決定したＩＣ５０値を表１２に示す。ＶＨは、ヒトＣＤ１３７に対するヒトＣＤ１３７リガンドの結合を阻害した。
【０２６４】
【表１５】
2021502104.tif 000066
【０２６５】
ｂ）安定性
精製Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨをサイズ排除クロマトグラフィーに供した。簡単に説明すると、精製ＶＨを、ＰＢＳ緩衝液中の８．９８〜９．２６ｍｇ／ｍｌの間で、４℃または４０℃のいずれかで０〜１４日間保存した後、Ｗａｔｅｒｓ  ＡＣＱＵＩＴＹ  ＢＥＨ  １２５Å  ＳＥＣカラム上での分離のために、ＰＤＡ検出器（２８０ｎｍでの検出）を含むＷａｔｅｒｓ  Ｈ−Ｃｌａｓｓ  Ｂｉｏ  ＵＰＬＣを使用して様々な時点で分析した。試料を、１０μｌ体積で注入し、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、１００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４＋５％プロパン−１−オールを含む移動相によって流速０．４ｍｌ／分で実行した。データを６分間収集し、貯蔵後の単量体を含んでなる試料の百分率を計算した（代表的なデータについては表１３）。これらのデータは非最適化緩衝液条件下で収集されたことに留意するべきである。
【０２６６】
【表１６】
2021502104.tif 000067
【０２６７】
ｃ）血清中安定性
Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨの血清中安定性を、マウス血清（Ｓｉｇｍａ、Ｍ５９０５）またはヒト血清（Ｓｉｇｍａ、Ｈ４５２２）において０、１、３／４、または７日間インキュベーション後のそれらの活性の測定によって評価した。プレインキュベートした試料を、連続希釈し、実施例６において既に記載されているＦＭＡＴ  ＣＨＯ  ＣＤ１３７リガンド阻害およびＣＨＯ  ＣＤ１３７結合アッセイにおいて試験した。血清によるインキュベーションの後、活性の最小限の損失が認められた（代表的なデータについては表１４）。
【０２６８】
【表１７】
2021502104.tif 000068
【０２６９】
ｄ）機能活性
一価ＶＨがＣＤ１３７アゴニストとして作用する能力を、ＣＤ１３７およびＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポーター遺伝子を発現するＪｕｒｋａｔ細胞を使用してレポーター遺伝子アッセイにおいて評価した。それらの活性を、相互作用を回避する可能性が増加している二価および三価分子、ならびに腫瘍抗原ＰＳＭＡに結合したＶＨと連結したＣＤ１３７  ＶＨからなる二特異性分子と比較した。二特異性分子において、ＣＤ１３７アゴニズムは、ＣＤ１３７およびＰＳＭＡを発現した細胞の両方の同時関与から生じた。
【０２７０】
ＰＳＭＡ発現細胞または親（非ＰＳＭＡ）発現細胞（５０００個／ウェル）を、３８４ウェル白色平底組織培養処理プレート内に、培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１倍Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ  １６４０）に一晩播種した。連続希釈した一価ＶＨ、多価ＶＨおよびＰＳＭＡ／ＣＤ１３７標的二特異性分子を、培地において調製し、ウェルに添加した後、ＪｕｒｋａｔヒトＣＤ１３７  ＮＦ−ｋＢルシフェラーゼレポーター遺伝子細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。ＣＯ２インキュベータ中で３７℃にて５〜６時間インキュベートした後、ＢｉｏＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｇ７９４０）を添加し、ＢＭＧ  Ｐｈｅｒａｓｔａｒで発光シグナルを測定することによって、ルシフェラーゼレポーター発現のレベルを決定した。図３は、一価ＶＨ、および例示された多価ＣＤ１３７結合性分子は、レポーター遺伝子活性を増加させず、このため、このアッセイにおいてアゴニストＣＤ１３７活性を有さないことを示す。二特異性分子は、ＰＳＭＡ発現細胞の存在下でＪｕｒｋａｔレポーター細胞を活性化したが（図３Ａおよび３ＢＣ）、親非ＰＳＭＡ発現細胞と共培養された場合は、活性化しなかった（図３Ａ、３Ｂ、３Ｅおよび３Ｆ）。このことは、一価ＣＤ１３７結合アームによるＰＳＭＡおよびＣＤ１３７の二重標的関与は、アゴニストＣＤ１３７活性をもたらすことを示している。
【０２７１】
Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨを、ＰＳＭＡ発現細胞または親細胞およびヒトＣＤ８＋Ｔ細胞を使用した共培養アッセイにおいてＩＬ−２放出を誘導するそれらの能力に関してさらに試験した。ＰＳＭＡまたは親細胞を、培地（１０％ＦＢＳ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１倍Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐを補充したＲＰＭＩ１６４０）に再懸濁し、５ｕｇ／ｍｌ抗ＣＤ３抗体（ｅ−Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、カタログ番号１４−００３７−８２）でプレコーティングしておいた９６ウェル平底プレートに２００００個／ウェルの密度で播種した。細胞を、３７℃、５％ＣＯ２で一晩接着させた。末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、密度勾配遠心分離によりヒト血液から単離した後、ＣＤ８＋Ｔ細胞を、製造元のプロトコール（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号１３０−０４２−４０１）に従ってネガティブ選択単離キットを使用して精製した。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨ、二特異性およびベンチマーク抗体を、培地において調製し、Ｔ細胞（１０００００個／ウェル）とともにアッセイプレートに添加した。３７℃、５％ＣＯ２での４８時間のインキュベーション後に上清を回収し、ＩＬ２レベルを、製造元の説明書（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６４ＩＬ２ＰＥＢ）に従ってヒトＩＬ−２アッセイキットを使用して定量した。ＩＦＮγレベルを、製造元の説明書（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６２ＨＩＦＮＧＰＥＨ）に従ってヒトＩＦＮγアッセイキットを使用して定量した。
【０２７２】
図４Ａは、一価ＣＤ１３７標的ＶＨは、ＣＤ８＋Ｔ細胞からのＩＬ−２産生を刺激しないことを示す。一価ＣＤ１３７およびＰＳＭＡ結合アームを有する二特異性分子は、ＰＳＭＡ発現細胞の存在下でＴ細胞からのＩＬ−２産生を増加させる。ＣＤ８＋Ｔ細胞を使用した共培養アッセイに親細胞を使用する場合は、この刺激は認められず、このことは、二特異性分子によるＣＤ１３７およびＰＳＭＡの二重標的関与の必要性を確認するものである（代表的なデータを図４Ｂに示す）。ベンチマーク抗ＣＤ１３７抗体は、ＰＳＭＡ細胞株非依存的な応答でＩＬ−２産生を刺激した（図４Ｂおよび４Ｃ）。ＣＤ８＋Ｔ細胞によるＩＬ−２産生の刺激は、濃度依存的であった（図４Ｄ）。最大応答レベルは、抗体および二特異性分子の両方に対してＴ細胞ドナー依存的であった（図４Ｅ）。インターフェロンγも、二特異性分子に応答して産生された（図４Ｆ）。
【０２７３】
ｅ）内部移行
ＣＨＯヒトＣＤ１３７細胞を、ポリ−Ｌ−リシンをコーティングしたカバーガラスに播種し、一晩接着させた。一価ＶＨ（５００ｎＭ）、三価ＶＨ（５００ｎＭ）および抗ＣＤ１３７ベンチマーク抗体（１００ｎＭ）を、１０％ＦＢＳ／０．５％脂肪酸不含ＢＳＡを補充したＲＰＭＩにおいて調製し、細胞で４℃にて３０分間インキュベートした。次に、試料を、３７℃で２時間インキュベートした後、室温にて１０分間４％ＰＦＡで固定し、ＰＢＳで３回洗浄したか、または４℃でのインキュベーションの直後に固定した（対照試料）。洗浄工程の後、試料を室温にてＰＢＳ中０．５％サポニンで１０分間透過処理し、ＰＢＳで３回洗浄し、１％ＢＳＡ／１０％ＦＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで４５分間ブロックした。ＰＢＳ／０．５％ＢＳＡ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含む染色緩衝液中の抗ヒトＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８抗体（１：２０００希釈）で１時間染色することによって、抗体を検出した。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）ＶＨは、抗Ｈｉｓ抗体（１：５００希釈）に次いで、抗マウスＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−４８８二次抗体（１：２０００希釈）で染色することによって、検出した。試料をＰＢＳ／０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０（ＰＢＳ−Ｔ）で洗浄した後、ＬＡＭＰ−１に対する一次抗体（染色緩衝液中１：２００希釈）を使用して、リソソームを１時間染色した。ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、試料を抗ウサギＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ−６４７（染色緩衝液中１：５００希釈）で染色し、次いで再度洗浄した。カバーガラスをスライドに載せ、Ａｐｏ  ６０ｘ  Ｏｉｌ  λＳ  ＤＩＣ  Ｎ２対物レンズを備えたＮＩＬＯＮ  Ａ１Ｒ共焦点システム（レーザー線４８８ｎｍおよび６４０ｎｍ）を使用して画像化した。
【０２７４】
図５は、多価ＶＨ分子または抗ＣＤ１３７抗体と比較して、単量体ＶＨが内部移行する可能性が低減したことを例示したものである。一価ＶＨは、リソソームとの共局在を示さず、結合した細胞表面に主に残存した。多価ＶＨは、リソソーム染色により認められたクラスタ形成および共局在した抗体によって示されるように、内部移行の増加を示した。
【０２７５】
実施例１０．ＤＵ１４５  ＰＳＭＡ／ｈｕ  ＰＢＭＣ移植ＮＣＧマウスにおけるＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）の効果
雄ＮＣＧマウス（ＮＯＤ−Ｐｒｋｄｃｅｍ２６Ｃｄ５２Ｉｌ２ｒｇｅｍ２６Ｃｄ２２／ＮｊｕＣｒｌ、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）に対し、５０％マトリゲル中１×１０７個のＤＵ１４５  ＰＳＭＡ細胞を右側腹部に皮下注射した。８日目に、ｈＰＢＭＣ（ＨｅｍａＣａｒｅ  ＢｉｏＲｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）を、尾静脈を介して移植した。非移植マウスを対照群として使用した。次に、マウスを、腹膜内投与したＨｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）または対照ＣＤ１３７アゴニスト抗体で処置し、体重、臨床観察、および腫瘍容積を記録した。拘束、飼育、外科手技、食餌および液体の調節、ならびに獣医学的ケアに関してＧｕｉｄｅ  ｆｏｒ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓの推奨に特別に従い、ＡＡＡＬＡＣによって公認されているＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ（ＣＲ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）において試験を実施した。半減期延長二特異性Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）処置群は、対照群と比較して減少した腫瘍容積を示した（図７）。
【０２７６】
実施例１１：スーパー抗原活性化細胞の刺激
健常ドナーからのＰＢＭＣを、処置前に１６時間、１０ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢ（ブドウ球菌エンテロトキシンＢ）で刺激した。ＣＨＯ細胞またはＰＳＭＡを発現するＣＨＯ細胞を、１０，０００個／ウェルで９６ウェルプレートに播種した。Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）構築物を添加し、終濃度５０ｎＭおよび４倍希釈シリーズとした。ＳＥＢ刺激ＰＢＭＣを、１ｎｇ／ｍｌ  ＳＥＢを含む培地に７５，０００個／ウェルで添加した。プレートを３７℃、５％ＣＯ２で３日間インキュベートした。サイトカイン測定のために上清を回収した。ＴＮＦ−αを、製造元の説明書に従ってＣｉｓｂｉｏ  ＨＴＲＦキット（６２ＨＴＮＦＡＰＥＧ）を使用して測定した。ＴＮＦ−αは、ＰＳＭＡを発現する細胞の存在下で、二特異性Ｈｕｍａｂｏｄｙ（登録商標）依存的な用量反応様式で増加した。ＰＳＭＡの非存在下では誘導はみられなかった。
【０２７７】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３Ａ−Ｅ】
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【図３Ｆ−Ｇ】
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【図４Ａ−Ｃ】
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【図４Ｄ−Ｆ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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