(57)【要約】  本発明は、グリシン−チモシンβ４（Ｇｌｙ−ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、Ｇｌｙ−Ｔβ４）を製造する方法に関し、本発明によれば、ＧＳＴ融合チモシンβ４（ＧＳＴ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、ＧＳＴ−Ｔβ４）を含有する試料をクロマトグラフィー、酵素処理および濾過する段階を通じて大容量の高純度Ｇｌｙ−Ｔβ４を高い生産性で収得することができる優れた効果がある。
2021532811.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
次の段階を含む、グリシン−チモシンβ４（Ｇｌｙ−ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、Ｇｌｙ−Ｔβ４）を製造する方法：
（Ｓ１）試料を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された１次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；
（Ｓ２）溶出物を親和性クロマトグラフィーに適用する段階；
（Ｓ３）溶出物にトロンビン処理して酵素切断する段階；
（Ｓ４）切断物を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された２次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、動的結合能力（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）３ｍｇ／ｍＬ以下で溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；
（Ｓ５）溶出物を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された陽イオン交換クロマトグラフィーに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、動的結合能力（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）３〜８ｍｇ／ｍＬで溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；および
（Ｓ６）溶出物を濾過する段階。
【請求項２】
前記（Ｓ４）段階で切断物をｐＨ８〜９、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）４ｍＳ／ｃｍ以下でカラムに積載することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記（Ｓ４）段階での陰イオン交換クロマトグラフィーでカラムに付着された分画は、１００〜３００ｃｍ／ｈｒの流速で、１０〜３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび３０〜１３０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７〜９の緩衝液で溶出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記（Ｓ５）段階で溶出物をｐＨ４．５±０．１、伝導度（Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２±０．２ｍＳ／ｃｍでカラムに積載することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記（Ｓ５）段階での陽イオン交換クロマトグラフィーで、前記切断物は、ｐＨ４〜７、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）４ｍＳ／ｃｍ以下でカラムに積載することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記（Ｓ５）段階での陽イオン交換クロマトグラフィーでカラムに付着された分画は、１００〜３００ｃｍ／ｈｒの流速で、１０〜３０ｍＭアセテートおよび１５０〜２１０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ４〜５の緩衝液で溶出することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記（Ｓ３）段階でトロンビン対比ＧＳＴ−Ｔβ４は、５〜０．５：１（ｕｎｉｔ：ｍｇ）であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記（Ｓ３）段階での反応温度は、１３〜２７℃であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記方法による最終精製原液の純度が９７％以上であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記（Ｓ１）段階での試料は、次の段階を含んで収得することを特徴とする、請求項１に記載の方法：
目的タンパク質を発現する宿主細胞を培養する段階；
前記宿主細胞を破砕する段階；および
破砕物を洗浄および濾過する段階。
【請求項１１】
前記宿主細胞の本培養は、インダクション（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）開始時にＯＤ６００は、４０〜６５、インダクション（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）温度２５〜３５℃でフェッドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養することを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記方法による細胞生産性は、１８０ｇ  ｐｅｌｌｅｔ／Ｌ以上、目的タンパク質生産性は、５４ｍｇ／ｇ  ｐｅｌｌｅｔ以上であることを特徴とする、請求項１０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）の製造方法に関し、より具体的には、Ｇｌｙ−Ｔβ４の前駆物質であるＧＳＴ  ｆｕｓｉｏｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｈｕｍａｎ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４（以下、「ＧＳＴ−ＴＢ４」という）を発現する発現工程およびＧｌｙ−Ｔβ４の精製工程を含むＧｌｙ−Ｔβ４製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
大量のタンパク質精製は、生物工学産業分野において次第に重要な問題になっている。一般的に、タンパク質は、細胞培養により、目的タンパク質の遺伝子を含む組み換えプラスミドを挿入させて目的タンパク質を生産するように操作された哺乳類またはバクテリア細胞ラインを使用して生産される。使用された細胞ラインが生物体であるから、それらには、一般的に動物血清製剤から供給される糖類、アミノ酸類および成長因子を含有する複合培養培地が供給される。このような細胞に供給された化合物の混合物および細胞自体の副産物から所望のタンパク質を人体治療用に十分な純度で分離することは非常に難しいことである。
【０００３】
しかしながら、薬剤として使用されるタンパク質などの生物医薬品である場合には、産物の収率だけでなく、不純物の除去も非常に重要である。工程依存的不純物と産物依存的不純物との間には差異がありえる。工程依存的不純物は、タンパク質および核酸のような宿主細胞の成分を含有し、細胞培養物（例えば、培地成分）に由来したり、後処理工程（例えは、塩または分離されたクロマトグラフィーリガンド）に由来する。産物依存的不純物は、性質が異なる産物の分子変形体である。その例には、前駆体および加水分解的分解産物のような短縮された形態だけでなく、脱アミン化、不正確なグリコシル化または間違って結合された二硫化ブリッジ等により生産された変形された形態も含まれる。産物依存的変形体は、また、重合体および凝集物も含む。汚染物という用語は、製造工程に直接属しない化学的、生化学的または微生物学的特性のその他すべての物質を示すのに使用される。汚染物の例は、細胞培養物において好ましくなく現れることができるウイルスを含む。
【０００４】
不純物および汚染物は、生物医薬品である場合に安全性問題を引き起こす。これは、生物医薬品である場合に非常にありふれた場合であって、治療用タンパク質が注射または注入により血流に直接投与されると深刻になる。これに伴い、宿主細胞成分は、アレルギー反応または免疫病理学的効果を引き起こすことができる。また、不純物は、投与されたタンパク質の好ましくない免疫原性につながることもでき、すなわち治療剤に対して患者の好ましくない免疫反応を、おそらく致命的なアナフィラキシーショック瞬間まで触発させることができる。したがって、すべての好ましくない物質が無意味な水準まで除去され得る適当な精製方法が要求されている。
【０００５】
一方、生物医薬品である場合には経済的観点を無視することができない。これに伴い、使用された生産および精製方法は、このように生産された生物医薬品の経済的実現可能性を威嚇してはならない。また、新しい精製方法が確立され得る時間の尺度は重要な役割をする。すなわち、費用に及ぼす影響の他にも、工程開発は、薬物の臨床前の開発および臨床開発と調和を生み出さなければならない。これに伴い、例えば一部の臨床前の試みとすべての臨床試みは、十分な純度の生物医薬品が十分な量で利用可能な場合にのみ始めることができる。
【０００６】
細胞破片からタンパク質を精製する方法は、初めにはそのタンパク質の発現部位によって左右される。或るタンパク質は、細胞から周囲増殖培地に直接分泌され得るようにすることができ、或るタンパク質は、細胞内で形成される。後者タンパク質の場合、精製方法の第１段階は、機械的せん断、浸透圧衝撃または酵素処理をはじめとする様々な方法により行われ得る細胞の溶菌段階を含む。このような細胞破裂により、細胞の全体内容物が細胞懸濁液に放出され、また、サイズが小さくて除去しにくい細胞内断片が生成される。この細胞内断片は、一般的に分画遠心分離法または濾過法により除去される。程度は少ないが、このような問題は、細胞の自然死およびタンパク質生産過程中に細胞内宿主細胞タンパク質の放出によって直接分泌されたタンパク質においても同様である。
【０００７】
目的タンパク質を含有する精製された溶液が収得されると、細胞により生産された他のタンパク質から目的タンパク質を分離することは、一般的に他のクロマトグラフィー技術を併用することにより行われる。このようなクロマトグラフィー技術の核心は、タンパク質が長いカラムの下方向に異なる速度で移動して、それらがカラムの下方向に続いて降りて行くに従って次第に大きく物理的に分離されたり、またはタンパク質を分離培地に選別的に付着させた後、他の溶媒により差別的に溶出させることができるということである。場合によって、不純物は、カラムに特異的に付着され、目的タンパク質はカラムに付着されない、すなわち目的タンパク質は、通液（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）中に存在することになる場合に、目的タンパク質が不純物から分離され、または目的タンパク質がカラムに特異的に付着される場合に、付着された目的タンパク質を溶出（ｅｌｕｔｉｏｎ）させて不純物から分離することもできる。この段階に使用され得るカラムクロマトグラフィー方法とクロマトグラフィー物質は、数多くの種類が公知されている。しかしながら、代案的な方法の数が増加するほど、精製効果、収率、生物学的活性、時間、費用等の点から、最適な物質および方法を決定するためには、非常に多い数の予備試みが行われなければならない。
【０００８】
また、精製方法の確立および最適化時には、精製される特定分子（標的分子、標的タンパク質）の生化学的および生物物理学的性質および生物学的出発物質が収得される条件によって非常に個別的に調整されなければならないことを留意すべきである。標的物質が分離されなければならない生物学的出発物質は、一般的に非常に複雑な物質の混合物からなる。標的分子を分離および濃縮するためには、形態、サイズ、溶解性、表面電荷、表面疎水性および結合パートナーに対する生物特異的親和性のような特定性質が用いられる。それぞれ新しい標的分子に対して、たとえ以前の段階のうちの１つ（例えば、発酵培養培地の組成の変化）だけが変化した同じ標的分子に対しても、前記観点から可能な最上の結果が前記新しい条件下でこれ以上達成されないことがあるので、精製工程は新しく調整されなければならない。
【０００９】
これと同時に、理論的に推定できる代替工程の数は、上記で記述した媒介変数の数によって左右される。カラムクロマトグラフィーにおいて例えば全体工程で一連のクロマトグラフィー段階、カラム物質、ｐＨ、塩含量および使用された各種溶出緩衝液の特性、カラムに充填するときのタンパク質濃度およびその他多くの観点は最適化されなければならない。これは、産業的規模で適当な費用と適当な時間範囲内最適なカラムクロマトグラフィー工程を開発することを事実上不可能にする。一方、経済的実現可能性および装置関連制限（例えば、てきるだけ小さい数の緩衝液使用および緩衝液とクロマトグラフィー物質のできるだけ最小量または容積の必要性、てきるだけ小さい容積の産物含有分画維持の必要性、および工程時間と廃水容積の最小化必要性）も、工程の各段階に対して前述した最適化を要求する。
【００１０】
したがって、生体分子のカラムクロマトグラフィー精製方法が、迅速かつ低コストで確立および最適化され得、生体分子の大規模産業的生産および精製条件下で満足できる結果も算出する工程の必要性は依然として切実である。
【００１１】
一方、Ｇｌｙ−Ｔβ４（Ｇｌｙ−チモシンβ４）は、４４個のアミノ酸配列からなるペプチドであって、従前のＴｈｙｍｏｓｉｎ  β４（Ｔβ４）のＮ−末端にＧｌｙ（グリシン）を追加したものである。Ｇｌｙ−Ｔβ４は、すでに公知されたＴβ４の４次構造分析と前記タンパク質Ｎ−末端の遺伝工学的変形を通じて発見されたものであって、本来Ｔβ４とは異なる活性を示す。Ｔβ４は、構造と機能が相対的に定義され、公知された主な胸腺因子のうちの１つである。Ｔβ４は、ウシの乳腺から抽出されたチモシン分画５（ＴＦ５）から初めて分離されたポリペプチドであり、４３個のアミノ酸を有し、二硫化結合とグリコシル化なしに４９６３ＫＤの分子量を有するものと公知されている（Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｖｏｌ  ２５７，Ｎｏ２，ｐｐ１０００−１００６，１９８２，Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  ｂｅｔａ）。
【００１２】
Ｇｌｙ−Ｔβ４は、従来Ｇｌｙ−Ｔβ４が発現されるように操作された菌株で発酵工程を通じてＧｌｙ−Ｔβ４を発現し精製する過程を経てＧｌｙ−Ｔβ４を収得する。しかしながら、精製過程中に流出されるタンパク質の量が相当し、このような工程を通じて収得されるＧｌｙ−Ｔβ４の生産性がきわめて低いという問題点が指摘されてきた。また、従来の中国Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｎｏｒｔｈｌａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社の３０Ｌ培養ｂａｔｃｈ  ｒｅｃｏｒｄ（以下「ＮＲ培養工程」という）によってＧＳＴ−ＴＢ４を発酵させる場合、低い生産性だけでなく、培地沈殿物の形成およびアセテート蓄積等の短所が指摘されてきた。また、Ｎｏｒｔｈｌａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社の精製工程によって精製を進行する場合、低い精製収率によってコストが高いという問題点と最終産物の低い純度に起因して、医薬品に使用されるのに多くの問題点を示した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１３】
本発明が解決しようとする課題は、高純度のＧｌｙ−Ｔβ４を大規模に安定的に収得する方法を提供することである。より具体的に、本発明が解決しようとする課題は、次の段階を含む、グリシン−チモシンβ４（Ｇｌｙ−ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、Ｇｌｙ−Ｔβ４）を製造する方法を提供することである：（Ｓ１）ＧＳＴ融合チモシンβ４（ＧＳＴ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、ＧＳＴ−Ｔβ４）を含有する試料を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された１次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに積載し、溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；（Ｓ２）溶出物を親和性クロマトグラフィーする段階；（Ｓ３）溶出物にトロンビン処理して酵素切断する段階；（Ｓ４）切断物を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された２次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに積載し、動的結合能力（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）１．８ｍｇ／ｍＬ以下で溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；（Ｓ５）溶出物を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された陽イオン交換クロマトグラフィーに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、動的結合能力（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）５ｍｇ／ｍＬ以下で溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；および（Ｓ６）溶出物を濾過する段階。
【００１４】
しかしながら、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者に明確に理解され得る。
【課題を解決するための手段】
【００１５】
上述した課題を解決するために、本発明は、グリシン−チモシンβ４（Ｇｌｙ−ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、Ｇｌｙ−Ｔβ４）を製造する方法を提供する。
【００１６】
より具体的に、本発明によるＧｌｙ−Ｔβ４を製造する方法は、次の段階を含む：
（Ｓ１）試料を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された１次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；
（Ｓ２）溶出物を親和性クロマトグラフィーに適用する段階；
（Ｓ３）溶出物にトロンビン処理して酵素切断する段階；
（Ｓ４）切断物を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された２次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、動的結合能力（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）３ｍｇ／ｍＬ以下で溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；
（Ｓ５）溶出物を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された陽イオン交換クロマトグラフィーに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、動的結合能力（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）３〜８ｍｇ／ｍＬで溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；および
（Ｓ６）溶出物を濾過する段階。
【００１７】
好ましくは、前記（Ｓ４）段階で切断物をｐＨ８〜９、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）４ｍＳ／ｃｍ以下でカラムに積載することを特徴とする。
【００１８】
好ましくは、前記（Ｓ４）段階での陰イオン交換クロマトグラフィーでカラムに付着された分画は、１００〜３００ｃｍ／ｈｒの流速で、１０〜３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび３０〜１３０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７〜９の緩衝液で溶出することを特徴とする。
【００１９】
好ましくは、前記（Ｓ５）段階での陽イオン交換クロマトグラフィーで、前記切断物は、ｐＨ４〜７、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）４ｍＳ／ｃｍ以下でカラムに積載することを特徴とする。
【００２０】
好ましくは、前記（Ｓ５）段階での陽イオン交換クロマトグラフィーでカラムに付着された分画は、１００〜３００ｃｍ／ｈｒの流速で、１０〜３０ｍＭのアセテートおよび１５０〜２１０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ４〜５の緩衝液で溶出することを特徴とする。
【００２１】
好ましくは、前記（Ｓ３）段階でトロンビン対比目的タンパク質は、５〜０．５：１（ｕｎｉｔ：ｍｇ）であることを特徴とする。
【００２２】
好ましくは、前記（Ｓ３）段階での反応温度は、１３〜２７℃であることを特徴とする。
【００２３】
好ましくは、前記方法による最終精製原液の純度が９７％以上であることを特徴とする。
【００２４】
好ましくは、前記（Ｓ１）段階での試料は、次の段階を含んで収得することを特徴とする：
目的タンパク質を発現する宿主細胞を培養する段階；前記宿主細胞を破砕する段階；および破砕物を洗浄および濾過する段階。
【００２５】
好ましくは、前記宿主細胞の本培養は、インダクション（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）開始時にＯＤ６００は、４０〜６５、インダクション（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）温度２５〜３５℃でフェッドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）培養することを特徴とする。
【００２６】
好ましくは、前記方法による細胞生産性は、１８０ｇ  ｐｅｌｌｅｔ／Ｌ以上、目的タンパク質生産性は、５４ｍｇ／ｇ  ｐｅｌｌｅｔ以上であることを特徴とする。
【発明の効果】
【００２７】
本発明によれば、高純度のＧｌｙ−Ｔβ４を大規模に安定的に製造することができるところ、産業的利用価値に優れたＧｌｙ−Ｔβ４を経済的にかつ高効率で収得することができるという長所がある。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】５Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙを示すものである。
【図２】５０Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙを示すものである。
【図３】Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよびｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ濃度（ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ  ５Ｌ培養）を示すものである。
【図４】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（５Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ）結果を示すものである。
【図５】Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよびｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ濃度（ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ  ５０Ｌ培養）を示すものである。
【図６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ  ５０Ｌ培養）結果を示すものである。
【図７】Ｆｌａｓｋ培養ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ（ｆｌａｓｋ  １：ｗ／ＹＥ、ｆｌａｓｋ  ２：ｗ／ｏ  ＹＥ）を示すものである。
【図８】Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよびｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ濃度（５Ｌ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｇｒｏｗｔｈテスト）を示すものである。
【図９ａ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｂ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｃ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｄ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｅ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｆ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｇ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｈ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｉ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｊ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｋ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｌ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図９ｍ】図９ａ〜図９ｍは、ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよび培養液内ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ残存量を示すものである。
【図１０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｒｕｎ情報：ＤｏＥ  １２、７、８、５、１０、２、１３）を示すものである。
【図１１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ（Ｒｕｎ情報：ＤｏＥ  １１、３、９、１、６、４）を示すものである。
【図１２】ＤｏＥ分散分析の適合度結果（残差図）を示すものである。
【図１３】Ｍｉｎｉｔａｂ反応条件最適化を示すものである。
【図１４】反応値（ＧＳＴ−ＴＢ４および細胞生産性）に対する等高線図を示すものである。
【図１５】Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよびｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ濃度（ＤｏＥ最適条件再現性確認）を示すものである。
【図１６】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ分析１（最適条件再現性バッチ）を示すものである。
【図１７】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ分析２（最適条件再現性バッチ）を示すものである。
【図１８】Ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよびｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ濃度（最適条件５０Ｌ規模Ｓｃａｌｅ−ｕｐ）を示すものである。
【図１９】５０Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ  Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｆｌｏｗ  Ｃｈａｒｔを示すものである。
【図２０】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓを示すものである。
【図２１】ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｓｔｕｄｙ  ｉｎ  ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを示すものである。
【図２２】Ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ  ｆｏｒ  ＧＳＴ−Ｔβ４  ｕｓｉｎｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎを示すものである。
【図２３】ＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ６１ｃｍ／ｈｒを示すものである。
【図２４】ＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ２００ｃｍ／ｈｒを示すものである。
【図２５ａ】図２５ａ〜図２５ｂはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ｓｔｕｄｙ（ａ：６１ｃｍ／ｈｒ、ｂ：２００ｃｍ／ｈｒ）を示すものである。
【図２５ｂ】図２５ａ〜図２５ｂはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  Ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ｓｔｕｄｙ（ａ：６１ｃｍ／ｈｒ、ｂ：２００ｃｍ／ｈｒ）を示すものである。
【図２６】ＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ５００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎを示すものである。
【図２７】ＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ２００ｍＭ  ＮａＣｌ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎを示すものである。
【図２８ａ】図２８ａおよび図２８ｂはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｔｕｄｙ（ａ：５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｂ：２００ｍＭ  ＮａＣｌ）を示すものである。
【図２８ｂ】図２８ａおよび図２８ｂはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｔｕｄｙ（ａ：５００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｂ：２００ｍＭ  ＮａＣｌ）を示すものである。
【図２９】ＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を示すものである。
【図３０】ＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（５０ｍＭのＮａＣｌ）を示すものである。
【図３１】ＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ（８０ｍＭのＮａＣｌ）を示すものである。
【図３２ａ】図３２ａおよび図３２ｂはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ＆  ＥＱ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｔｕｄｙ（ａ：８０ｍＭのＮａＣｌ、ｂ：５０ｍＭのＮａＣｌ）を示すものである。
【図３２ｂ】図３２ａおよび図３２ｂはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ＆  ＥＱ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｔｕｄｙ（ａ：８０ｍＭのＮａＣｌ、ｂ：５０ｍＭのＮａＣｌ）を示すものである。
【図３３ａ】図３３ａ、図３３ｂおよび図３３ｃはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＡＥＸ  ＤＢＣ  ｔｅｓｔ（ａ：１０ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｎ、ｂ：８ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｎ、ｃ：７５ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｎ）を示すものである。
【図３３ｂ】図３３ａ、図３３ｂおよび図３３ｃはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＡＥＸ  ＤＢＣ  ｔｅｓｔ（ａ：１０ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｎ、ｂ：８ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｎ、ｃ：７５ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｎ）を示すものである。
【図３３ｃ】図３３ａ、図３３ｂおよび図３３ｃはＳＤＳ−ＰＡＧＥ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＡＥＸ  ＤＢＣ  ｔｅｓｔ（ａ：１０ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｎ、ｂ：８ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｎ、ｃ：７５ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｎ）を示すものである。
【図３４ａ】図３４ａおよび図３４ｂはＨｏｌｄ  ｔｉｍｅ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ＡＥＸＩ  ｅｌｕｔｅｄ  ｐｏｏｌ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（ａ：ｓｔｏｒａｇｅ  ｔｅｍｐ  ２〜８℃、ｂ：ｓｔｏｒａｇｅ  ｔｅｍｐ  １８〜２２℃）を示すものである。
【図３４ｂ】図３４ａおよび図３４ｂはＨｏｌｄ  ｔｉｍｅ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  ＡＥＸＩ  ｅｌｕｔｅｄ  ｐｏｏｌ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（ａ：ｓｔｏｒａｇｅ  ｔｅｍｐ  ２〜８℃、ｂ：ｓｔｏｒａｇｅ  ｔｅｍｐ  １８〜２２℃）を示すものである。
【図３５】Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ９０ｃｍ／ｈｒを示すものである。
【図３６】Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  １８０ｃｍ／ｈｒを示すものである。
【図３７ａ】図３７ａおよび図３７ｂはＡＥＸＩ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｓｃａｌｅ  ｕｐ  ｔｅｓｔ  ｆｒｏｍ  ＸＫ１６（ａ）ｔｏ  ＸＫ５０（ｂ）を示すものである。
【図３７ｂ】図３７ａおよび図３７ｂはＡＥＸＩ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｓｃａｌｅ  ｕｐ  ｔｅｓｔ  ｆｒｏｍ  ＸＫ１６（ａ）ｔｏ  ＸＫ５０（ｂ）を示すものである。
【図３８ａ】図３８ａおよび図３８ｂはＡｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔ  ｉｎ  ＬＲＣ１０  ｓｃａｌｅ（ａ）とＸＫ５０  ｓｃａｌｅ（ｂ）を示すものである。
【図３８ｂ】図３８ａおよび図３８ｂはＡｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔ  ｉｎ  ＬＲＣ１０  ｓｃａｌｅ（ａ）とＸＫ５０  ｓｃａｌｅ（ｂ）を示すものである。
【図３９ａ】図３９ａおよび図３９ｂはＨｏｌｄ  ｔｉｍｅ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｅｌｕｔｅｄ  ｐｏｏｌ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（Ａ：ｓｔｏｒａｇｅ  ｔｅｍｐ  ２〜８℃、Ｂ：ｓｔｏｒａｇｅ  ｔｅｍｐ  １８〜２２℃）を示すものである。
【図３９ｂ】図３９ａおよび図３９ｂはＨｏｌｄ  ｔｉｍｅ  ｓｔｕｄｙ  ｗｉｔｈ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｅｌｕｔｅｄ  ｐｏｏｌ  ｉｎ  ｔｗｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ（Ａ：ｓｔｏｒａｇｅ  ｔｅｍｐ  ２〜８℃、Ｂ：ｓｔｏｒａｇｅ  ｔｅｍｐ  １８〜２２℃）を示すものである。
【図４０】ＳＥＣ−ＨＰＬＣ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｏｆ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ  ａｆｔｅｒ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｒｅｅ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓを示すものである。
【図４１】ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｉｎ  ｐＨ４５  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎを示すものである。
【図４２】ＲＰＣ−ＨＰＬＣ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｉｎ  ｐＨ４５  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎを示すものである。
【図４３ａ】図４３ａおよび図４３ｂはＨＩＣ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｂｕｔｙｌ（ａ）ａｎｄ  Ｐｈｅｎｙｌ（ｂ）を示すものである。
【図４３ｂ】図４３ａおよび図４３ｂはＨＩＣ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  Ｂｕｔｙｌ（ａ）ａｎｄ  Ｐｈｅｎｙｌ（ｂ）を示すものである。
【図４４】ＣａｐｔｏＭＭＣ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍを示すものである。
【図４５】ＲＰ−ＨＰＬＣ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＭＭＣ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｆｒａｃｔｉｏｎを示すものである。
【図４６】ＭＭＣ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｂｙ  ｓｔｅｐ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ａｆｔｅｒ  ｗａｓｈを示すものである。
【図４７】ＭＭＣ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  １００ｍＭ  ＮａＣｌ  Ｗａｓｈｉｎｇ  ｓｔｅｐを示すものである。
【図４８】ＭＭＣ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  １２０ｍＭ  ＮａＣｌ  Ｗａｓｈｉｎｇ  ｓｔｅｐを示すものである。
【図４９】ＭＭＣ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  １４０ｍＭ  ＮａＣｌ  Ｗａｓｈｉｎｇ  ｓｔｅｐを示すものである。
【図５０】ＤＳＰ  ｆｌｏｗ  ｃｈａｒｔを示すものである。
【図５１】ＳＥＣ−ＨＰＬＣ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＡＥＸＩＩ  ＤＢＣ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｓａｍｐｌｅを示すものである。
【図５２】ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｌｏａｄｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ  １ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４  ｐｅｒ  ｒｅｓｉｎ  ｍＬを示すものである。
【図５３】ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｌｏａｄｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ  １５ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４  ｐｅｒ  ｒｅｓｉｎ  ｍＬを示すものである。
【図５４】ＲＰ−ＨＰＬＣ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｓａｍｐｌｅを示すものである。
【図５５】ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅを示すものである。
【図５６】ＲＰ−ＨＰＬＣ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ＡＥＸＩＩ  ｈｏｌｄ  ｔｉｍｅ  ｓｔｕｄｙを示すものである。
【図５７】ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａｔ  Ｈｕｏｎｓ）を示すものである。
【図５８】ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａｔ  ＢＩＮＥＸ）を示すものである。
【図５９】ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｃｋ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｈｅｉｇｈｔ  １０ｃｍ）を示すものである。
【図６０】ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ＸＫ１６  ｃｏｌｕｍｎ（Ｈｅｉｇｈｔ  ２０ｃｍ）を示すものである。
【図６１】ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｗｉｔｈ  ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ  １０ｃｍ  ｃｏｌｕｍｎを示すものである。
【図６２】ＲＰ−ＨＰＬＣ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ｆｏｒ  ＣＥＸ  ｈｏｌｄ  ｔｉｍｅ  ｓｔｕｄｙを示すものである。
【図６３】ＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ａｔ  ５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓを示すものである。
【図６４】Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ａｔ  ５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓを示すものである。
【図６５】ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ａｔ  ５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓを示すものである。
【図６６】ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ  ａｔ  ５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓを示すものである。
【図６７ａ】図６７ａ、図６７ｂおよび図６７ｃはＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａ：Ｃｙｃｌｅ  １、ｂ：Ｃｙｃｌｅ  ２、ｃ：Ｃｙｃｌｅ  ３）を示すものである。
【図６７ｂ】図６７ａ、図６７ｂおよび図６７ｃはＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａ：Ｃｙｃｌｅ  １、ｂ：Ｃｙｃｌｅ  ２、ｃ：Ｃｙｃｌｅ  ３）を示すものである。
【図６７ｃ】図６７ａ、図６７ｂおよび図６７ｃはＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａ：Ｃｙｃｌｅ  １、ｂ：Ｃｙｃｌｅ  ２、ｃ：Ｃｙｃｌｅ  ３）を示すものである。
【図６８ａ】図６８ａ、図６８ｂおよび図６８ｃはＡｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａ：Ｃｙｃｌｅ  １、ｂ：Ｃｙｃｌｅ  ２、ｃ：Ｃｙｃｌｅ  ３）を示すものである。
【図６８ｂ】図６８ａ、図６８ｂおよび図６８ｃはＡｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａ：Ｃｙｃｌｅ  １、ｂ：Ｃｙｃｌｅ  ２、ｃ：Ｃｙｃｌｅ  ３）を示すものである。
【図６８ｃ】図６８ａ、図６８ｂおよび図６８ｃはＡｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａ：Ｃｙｃｌｅ  １、ｂ：Ｃｙｃｌｅ  ２、ｃ：Ｃｙｃｌｅ  ３）を示すものである。
【図６９ａ】図６９ａおよび図６９ｂはＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａ：Ｃｙｃｌｅ  １、ｂ：Ｃｙｃｌｅ  ２）を示すものである。
【図６９ｂ】図６９ａおよび図６９ｂはＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａ：Ｃｙｃｌｅ  １、ｂ：Ｃｙｃｌｅ  ２）を示すものである。
【図７０ａ】図７０ａおよび図７０ｂはＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａ：Ｃｙｃｌｅ  １、ｂ：Ｃｙｃｌｅ  ２）を示すものである。
【図７０ｂ】図７０ａおよび図７０ｂはＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ａ：Ｃｙｃｌｅ  １、ｂ：Ｃｙｃｌｅ  ２）を示すものである。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
以下、本発明を詳細に説明する。
【００３０】
本発明は、次の段階を含む、グリシン−チモシンβ４（Ｇｌｙ−ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、Ｇｌｙ−Ｔβ４）を製造する方法に関する。
（Ｓ１）試料を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された１次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；
（Ｓ２）溶出物を親和性クロマトグラフィーに適用する段階；
（Ｓ３）溶出物にトロンビン処理して酵素切断する段階；
（Ｓ４）切断物を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された２次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、動的結合能力（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）１．８ｍｇ／ｍＬ以下で溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；
（Ｓ５）溶出物を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された陽イオン交換クロマトグラフィーに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、動的結合能力（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）５ｍｇ／ｍＬ以下で溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階；および
（Ｓ６）溶出物を濾過する段階。
【００３１】
本発明において、用語「グリシン−チモシンβ４（Ｇｌｙ−ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、Ｇｌｙ−Ｔβ４）」は、好ましくは哺乳動物、最も好ましくはヒトＧｌｙ−Ｔβ４タンパク質またはそのポリペプチドを意味する。ヒトＧｌｙ−Ｔβ４タンパク質のアミノ酸配列は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ｎｏ．ＮＰ＿０６６９３２．１に記載されており、ヒトＧｌｙ−Ｔβ４タンパク質の遺伝子配列は、ジーンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）ｎｏ．ＮＭ＿０２１１０９に記載されている。
【００３２】
本発明において、用語「試料」は、目的タンパク質と１種以上の汚染物質が混合されたことを意味し、前記「目的タンパク質」は、Ｇｌｙ−Ｔβ４、そのポリペプチドまたはその前駆体を含み、好ましくは前記Ｇｌｙ−Ｔβ４の前駆体は、ＧＳＴ融合チモシンβ４（ＧＳＴ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、ＧＳＴ−Ｔβ４）を意味する。本発明の具体例によれば、試料にはＧＳＴ融合チモシンβ４（ＧＳＴ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、ＧＳＴ−Ｔβ４）を含有する。
【００３３】
本発明では、少なくとも４回以上のクロマトグラフィーを行う。好ましくは、４回のクロマトグラフィーを行う。最も好ましくは、２回の陰イオンクロマトグラフィー、１回の親和性クロマトグラフィー、１回の陽イオンクロマトグラフィーを行う。その他、Ｓ１）段階の前または後、Ｓ２）段階の前または後、Ｓ３）段階の前または後、Ｓ４）段階の前または後、Ｓ５）段階の前または後、またはＳ６）段階の前または後に、親和性クロマトグラフィー（ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、イオン交換クロマトグラフィー（ｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）、疎水性相互作用クロマトグラフィー（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）および混合モードクロマトグラフィー（ｍｉｘｅｄ  ｍｏｄｅ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）よりなる群から選ばれたいずれか１つ以上のクロマトグラフィーに適用する段階をさらに含むことができる。
【００３４】
本発明において、クロマトグラフィーは、全部好ましくは、結合および溶出方式（Ｂ／Ｅ）による。前記用語「結合および溶出方式」は、精製される目的タンパク質を含有する溶液（例えば試料）がクロマトグラフィー物質に適用されて、目的タンパク質がクロマトグラフィー物質に結合するクロマトグラフィー段階の作業方式を意味する。したがって、目的タンパク質は、クロマトグラフィー物質上に維持される反面、目的タンパク質に該当しない物質は、灌流または上澄み液と共に除去される。目的タンパク質は、その次に溶出緩衝液によりクロマトグラフィー物質から回収される。本発明において、結合および溶出方式によることによって、高効率、高純度の目的タンパク質の収得が可能である。
【００３５】
前記用語「適用」は、目的タンパク質を含有する溶液がクロマトグラフィー物質と接触することになる精製方法の部分段階を意味する。これは、（ａ）溶液がクロマトグラフィー物質が含有されたクロマトグラフィー装置に添加されたり、または、（ｂ）クロマトグラフィー物質が溶液に添加されることを意味する。（ａ）の場合、溶液は、装置を通過してクロマトグラフィー物質と溶液に含有された物質間の相互作用を可能にする。例えば、ｐＨ、伝導度、塩濃度、温度および／または流量のような条件によって、溶液の一部物質は、クロマトグラフィー物質に結合され得、他の物質は、クロマトグラフィー物質から回収され得る。溶液に残留したりまたはクロマトグラフィー物質から回収される物質は、灌流（ｆｌｏｗ−ｔｈｒｏｕｇｈ）で探すことができる。前記用語「灌流」は、カラムを洗浄するためにまたはクロマトグラフィー物質に結合された物質の溶出を誘発するために使用される、適用された緩衝液（または溶液）でありうる、装置通過後に収得される溶液を意味する。前記装置は、カラムまたはカセットである。（ｂ）の場合、クロマトグラフィー物質は、例えば、固体であって、例えば、精製される当該物質を含有する溶液に添加されて、クロマトグラフィー物質と溶液中の物質間の相互作用を可能にすることができる。相互作用後に、クロマトグラフィー物質は、例えば、濾過により除去され、クロマトグラフィー物質に結合された物質は、また、それとともに溶液から除去される反面、クロマトグラフィー物質に結合されない物質は溶液中に残留する。
【００３６】
本発明のクロマトグラフィー段階で平衡（または平衡化）、積載、洗浄および溶出工程が含まれ、各工程で緩衝液が使用され得る。
【００３７】
本発明において、用語「緩衝液」は、酸−塩基複合成分の作用によりｐＨの変化に抵抗する溶液である。例えば、緩衝液の所望のｐＨによって使用できる様々な緩衝液が文献［Ｂｕｆｆｅｒｓ．Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｂｕｆｆｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍ，Ｇｕｅｆｆｒｏｙ，Ｄ．，Ｅｄ．Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（１９７５）］に記載されている。一般的に、薬学的に許容される緩衝液を使用する。一態様において、緩衝液は、リン酸および／またはその塩からなるホスフェート緩衝液、または酢酸およびその塩からなるアセテート緩衝液、またはクエン酸および／またはその塩からなるシトラート緩衝液、またはモルホリン緩衝液、または２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液、またはヒスチジン緩衝液、またはグリシン緩衝液、またはトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（トリス）緩衝液から選ばれる。さらに他の態様において、緩衝液は、トリス緩衝液、またはトリス−塩酸緩衝液またはシトラート緩衝液、またはヒスチジン緩衝液から選ばれる。緩衝液は、例えば、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、塩化アンモニウムまたは硫酸アンモニウムのような無機塩を含むことができる。
【００３８】
本発明において、用語「平衡緩衝液」は、試料をカラムに積載するに先立って使用し、前記平衡緩衝液は、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、トリス（Ｔｒｉｓ）、トリス（Ｔｒｉｓ）−塩酸（ＨＣｌ）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）よりなる群から選ばれたいずれか１つでありうるが、これに限定されない。
【００３９】
本発明において、用語「洗浄緩衝液」は、目的タンパク質を溶出するに先立って、イオン交換樹脂を洗浄または再平衡化するのに使用される緩衝液を意味する。イオン交換樹脂を「洗浄」することは、適当な（洗浄）緩衝液がイオン交換樹脂を通過したり通り越すことを意味する。例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、トリス（Ｔｒｉｓ）、トリス（Ｔｒｉｓ）−塩酸（ＨＣｌ）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）よりなる群から選ばれたいずれか１つでありうるが、これに限定されない。
【００４０】
本発明において、用語「溶出」は、イオン交換樹脂（またはカラム）から分子（例えば、目的タンパク質または汚染物質）を溶出させることであり、イオン交換樹脂（またはカラム）を囲む緩衝液のイオン濃度を変化させてイオン交換樹脂の帯電された部位に対して緩衝液が分子と競合することによってイオン交換樹脂（またはカラム）から分子を除去することを意味する。溶出は、目的タンパク質の効率的な溶離を惹起させるのに十分な緩衝液で行って、目的タンパク質含有溶出緩衝液を回収する。前記「効率的な溶離」は、樹脂にローディングされた目的タンパク質含有溶液の７５％以上、８０％以上等、例えば、８５％以上等が樹脂から溶出されることを意味する。本発明において、用語「溶出緩衝液」は、イオン交換樹脂（またはカラム）から目的タンパク質を溶出するのに使用される。前記溶出緩衝液は、例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、トリス（Ｔｒｉｓ）、トリス（Ｔｒｉｓ）−塩酸（ＨＣｌ）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）等よりなる群から選ばれたいずれか１つ以上でありうるが、これに限定されない。溶出緩衝液の伝導度および（または）ｐＨは、目的タンパク質が樹脂（カラム）から溶出される伝導度および（または）ｐＨである。本発明における前記伝導度および（または）ｐＨは、事実上すべての汚染物質および目的タンパク質が樹脂を通じて溶出される程度のものである。
【００４１】
本発明において、用語「伝導度」は、２つの電極間の電流の流れを通すようにする水溶液の能力を意味する。溶液では、イオン運搬により電流が流れる。したがって、水溶液中に存在するイオン量を増加させると、溶液はさらに高い伝導度を有することになる。伝導度の測定単位は、ｍｍｈｏｓ（ｍＳ／ｃｍ）であり、市販の伝導度測定機、例えばオリオン（Ｏｒｉｏｎ）を使用して測定することができる。溶液のイオン濃度を変化させることによって、溶液の伝導度を変化させることができる。例えば、所望の伝導度を得るために溶液中の緩衝物質の濃度および（または）塩（例えば、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、リン酸カリウム、トリス（Ｔｒｉｓ）、ＭＥＳ（２−（Ｎ−ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ）ｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ）−１−ｐｉｐｅｒａｚｉｎｅｅｔｈａｎｅｓｕｌｆｏｎｉｃ  ａｃｉｄ）およびＣＨＡＰＳ（３−［（３−ｃｈｏｌａｍｉｄｏｐｒｏｐｙｌ）−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｏ］−１−ｐｒｏｐａｎｅｓｕｌｆｏｎａｔｅ）等）の濃度を変化させることができる。好ましくは、各種緩衝液の塩濃度を変更して所望の伝導度を得ることができる。
【００４２】
本発明において、用語「動的結合能力（Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）」は、クロマトグラフィーを進行する条件下で一定容量の樹脂にターゲット分子が結合できる能力（Ｑ）を意味する。物質と物質間の結合能力は、温度、ｐＨ、流速等によって平衡および解離定数（Ｋ）の変化をもたらすので、必要な樹脂の容量を計算したり、カラム当たり検体のローディング量を計算するためには、樹脂におけるターゲット分子の結合能力を知っておかなければならない。動的結合能力は、どれだけの物質を分離精製するかを定める参考データとして使用され得る。動的結合能力は、カラムにすべてのターゲット分子が結合された後に溶出し始まる時点を測定し、一般的にローディングされたターゲット分子の１０％の濃度となる時点を基点（ＱＢ、１０％：Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ  ａｔ  １０％  Ｂｒｅａｋｔｈｒｏｕｇｈ  ｐｏｉｎｔ）として取る。ターゲット分子の性質によってＩｄｅｎｔｉｔｙ  ｔｅｓｔおよび測定方法は、例えばＥＬＩＳＡやＳＥＣ、ＵＶ吸光度等の分析法で１０％  ｂｒｅａｋｔｈｏｕｇｈ  ｐｏｉｎｔを取った後、ローディングした瞬間から当該基点までの全体ボリュームを計算してターゲット物質の全体量、ローディング量（Ｌｏｄｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ）（Ｖ１０％＊Ｃ０）を計算した後、樹脂ボリューム（Ｒｅｓｉｎ  ｖｏｌｕｍｅ）（Ｖｃ）で割ってばよい：ＱＢ、１０％＝Ｖ１０％＊Ｃ０／Ｖｃ
【００４３】
本発明の方法によって得られた目的タンパク質試料は、必要に応じて更なる精製段階を経ることができる。
【００４４】
本発明において、用語「精製」は、目的タンパク質および１種以上の汚染物質が混合された試料から１種以上の汚染物質を完全にまたは部分的に除去することによって、目的タンパク質の純度を増加させることを意味する。
【００４５】
本発明の方法によれば、最終精製原液の純度が９７％以上である優れた効果がある。
【００４６】
以下、各段階別に説明する。ただし、各段階で重複する説明は、過度な反復を避けるために最初言及される部分で１回だけを説明し、省略する。
【００４７】
（Ｓ１）ＧＳＴ融合チモシンβ４（ＧＳＴ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、ＧＳＴ−Ｔβ４）を含有する試料を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された１次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階を含む。
【００４８】
本発明において、陰イオン交換クロマトグラフィー段階での陰イオン交換樹脂は、例えば固体相に付着された１種以上の正に帯電されたリガンドであって、例えばジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）または第四級アンモニウム（Ｑｕａｔｅｒｎａｒｙ  ａｍｍｏｎｉｕｍ）基で置換されたものを使用できるが、これに制限されるものではない。好ましくは、強塩基性の第四級アンモニウム基を有するグループや、または弱塩基性のジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）グループを有する陰イオン交換樹脂のうちいずれか１つを選択して使用することができる。例えば、強塩基性の陰イオン交換樹脂としては、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ、Ｑ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｈｉｇｈ  Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ、Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ、Ｓｏｕｒｃｅ  ３０Ｑ、Ｍｏｎｏ  Ｑ、Ｍｉｎｉ  Ｑ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ  ＩｍｐＲｅｓ、Ｑ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ、Ｑ  Ｃｅｒｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｆ、Ｎｕｖｉａ  Ｑ、ＵＮＯｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｑ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ２５  Ｑ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｓ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ  Ｈｉｃａｐ（Ｍ）、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｍ）、Ｅｓｈｍｏｎｏ  Ｑ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＱＡＥ−５５０Ｃ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｃ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｑ−６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  Ｑ−６００Ｃ  ＡＲ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｍ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳｕｐｅｒＱ−６５０Ｓ、ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ（３０）、ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ（２０）、ＴＳＫｇｅｌ  ＳｕｐｅｒＱ−５ＰＷ等を使用することができるが、これに限定されるものではなく、当業界に公知された陰イオン交換樹脂を使用することができる。本発明では、１次陰イオン交換樹脂としてＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｍ）を使用したが、これに制限されない。
【００４９】
陰イオン交換クロマトグラフィーに使用される樹脂の適切な体積は、カラム寸法、すなわちカラムの直径と樹脂の高さにより反映され、例えば、適用される溶液の目的タンパク質溶液量と使用される樹脂の結合性能によって変わる。陰イオン交換クロマトグラフィーを行う前に、陰イオン交換樹脂は、好ましくは、緩衝液で平衡化させて、樹脂がその対イオンと結合することができるようにする。
【００５０】
本発明の具体例によれば、（Ｓ１）段階での陰イオン交換クロマトグラフィーで、試料をｐＨ８〜９、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）４ｍＳ／ｃｍ以下でカラムに積載することができる。より好ましくは、ｐＨ８、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２  ｍＳ／ｃｍ以下でカラムに積載することができる。
【００５１】
本発明において、（Ｓ１）段階の陰イオン交換クロマトグラフィーは、８〜９のｐＨの緩衝液を用いて行われる。
【００５２】
本発明の具体例によれば、本発明の（Ｓ１）段階での陰イオン交換クロマトグラフィーのためのカラムは、１０〜３０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨが７〜９、好ましくｐＨ８になるように平衡化させる。
【００５３】
また、本発明の具体例によれば、本発明の（Ｓ１）段階での陰イオン交換クロマトグラフィーのイオン交換樹脂は、１０〜３０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含むｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ８の緩衝液で洗浄する。
【００５４】
本発明の具体例によれば、本発明の（Ｓ１）段階での陰イオン交換クロマトグラフィーでカラムに付着された分画は、１００〜３００ｃｍ／ｈｒ、好ましくは２００ｃｍ／ｈｒの流速で、１０〜３０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび２００〜４００ｍＭ、好ましくは３００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ８の緩衝液で溶出する。
【００５５】
本発明の具体例によれば、（Ｓ１）段階の陰イオン交換クロマトグラフィーでの動的結合能力は、５〜９、好ましくは７．５ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎである。
【００５６】
（Ｓ２）溶出物を親和性クロマトグラフィーする段階を含む。
【００５７】
本発明において、用語「親和性クロマトグラフィー」は、目的タンパク質が目的タンパク質に特異的なリガンドに特異的に結合されるタンパク質分離技法をいう。前記リガンドは、一般的に生物特異的リガンドと呼ばれるところ、目的タンパク質と特異的相互作用をする（例えば、酵素−基質、酵素−阻害剤、抗原−抗体）。一部の具現例において、生物特異的リガンドは、クロマトグラフィー樹脂に共有結合で付着され、溶液がクロマトグラフィー樹脂に接触することによって、溶液中の目的タンパク質に接近可能である。目的タンパク質は、一般的にクロマトグラフィー段階の間に生物特異的リガンドに対してその特異的な結合親和性を保有していても、混合物中の他の溶質および／またはタンパク質は、明確にまたは特異的にリガンドに結合しない。固定化リガンドに対する目的タンパク質の結合は、汚染タンパク質またはタンパク質不純物がクロマトグラフィー樹脂を通過することを許容する反面、目的タンパク質は、固体相材料上の固定化リガンドに特異的に結合されたまま維持される。特異的に結合された目的タンパク質は、その後に適合した条件（例えば、低いｐＨ、高いｐＨ、高い塩、競争リガンド等）下に固定化リガンドから活性形態で除去され、先立ってカラムを通過するように許容された汚染タンパク質またはタンパク質不純物なしに、溶出緩衝液と共にクロマトグラフィーカラムを通過する。
【００５８】
親和性クロマトグラフィー段階での親和性樹脂は、固体相に付着された１種以上のリガンドであって、例えば、Ｂｌｕｅ  Ｔｒｉｓａｃｒｙｌ  Ｍ、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨｙｐｅｒＤ、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ、Ｌｙｓｉｎｅ  ＨｙｐｅｒＤ、Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨｙｐｅｒＤ  Ｍ、ＨＡ  Ｕｌｔｒｏｇｅｌ、または、Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ等を使用することができるが、これに限定されるものではなく、当業界に公知された親和性樹脂を使用することができる。本発明では、親和性樹脂としてＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗを使用したが、これに制限されない。
【００５９】
本発明の具体例によれば、本発明の（Ｓ２）段階での親和性クロマトグラフィーのためのカラムは、１０〜３０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１００〜２００ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭのＮａＣｌでｐＨが７〜９、好ましくはｐＨ８になるように平衡化させた後、（Ｓ２）段階での親和性クロマトグラフィーの樹脂を２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび１００〜２００ｍＭ、好ましくは１５０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨが７〜９、好ましくはｐＨ８である緩衝液で洗浄し、親和性クロマトグラフィーでカラムに付着された分画は、５３〜７３ｃｍ／ｈｒ、好ましくは６３ｃｍ／ｈｒの流速で、４０〜６０ｍＭ、好ましくは５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび５〜１５ｍＭ、好ましくは１０ｍＭグルタチオン（Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ）を含むｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ８の緩衝液で溶出する。酸緩衝液としては、９０〜１１０ｍＭ、好ましくは１００ｍＭのＳｏｄｉｕｍ  Ａｃｅｔａｔｅ、４００〜６００ｍＭ、好ましくは５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ４〜６、好ましくは４．５を使用し、塩基緩衝液としては、５０〜１５０ｍＭ、好ましくは１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、４００〜６００ｍＭ、好ましくは５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ８を使用することができるが、これに制限されない。
【００６０】
本発明の具体例によれば、（Ｓ２）段階の親和性クロマトグラフィーでのＧＳＴ−Ｔβ４に対するＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗの動的結合能力は、９．３〜９．５ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎである。
【００６１】
（Ｓ３）溶出物にトロンビン処理して酵素切断する段階を含む。
【００６２】
本段階では、前記（Ｓ２）段階の親和性クロマトグラフィーを経て収得した溶出物に酵素（特にトロンビン）を処理する。本段階を通じて、（Ｓ２）段階の親和性クロマトグラフィーを経て収得した溶出物に含まれたＧｌｙ−Ｔβ４の前駆体である、ＧＳＴ融合チモシンβ４（ＧＳＴ  ｆｕｓｉｏｎ  ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４、ＧＳＴ−Ｔβ４）は、酵素切断によりＧｌｙ−Ｔβ４となる。したがって、好ましくは、（Ｓ３）段階前のクロマトグラフィーで精製しようとする目的タンパク質は、ＧＳＴ−Ｔβ４であり、（Ｓ３）段階後のクロマトグラフィーで精製しようとする目的タンパク質は、Ｇｌｙ−Ｔβ４でありうる。
【００６３】
酵素（例えば、トロンビン）対比目的タンパク質（例えば、ＧＳＴ−Ｔβ４）の容量比は、これに制限されないが、好ましくは０．５〜５：１（ｕｎｉｔ：ｍｇ）であり、より好ましくは３〜１：１（ｕｎｉｔ：ｍｇ）、最も好ましくは２：１（ｕｎｉｔ：ｍｇ）である。０．５〜５：１（ｕｎｉｔ：ｍｇ）の範囲内で酵素反応率に特に優れている。酵素（特にトロンビン）処理時間は、これに制限されないが、好ましくは１６〜２０（ｈ）である。酵素（特にトロンビン）処理温度は、これに制限されないが、好ましくは１３〜２７℃、より好ましくは２０〜２４℃である。上述した酵素容量、酵素処理時間および酵素処理温度等は、通常の技術者が条件によって適宜変更することができるが、上述した好ましい範囲で最も優れた効果を発揮する。
【００６４】
（Ｓ４）切断物を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された２次陰イオン交換クロマトグラフィーカラムに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、動的結合能力（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）３ｍｇ／ｍＬ以下で溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階を含む。
【００６５】
本発明の具体例によれば、２次陰イオン交換樹脂としてＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＴＭＡＥ（Ｍ）を使用したが、これに制限されない。
【００６６】
本発明において、（Ｓ４）段階の陰イオン交換クロマトグラフィーは、８〜９のｐＨの緩衝液を用いて行われる。
【００６７】
本発明の具体例によれば、（Ｓ４）段階での陰イオン交換クロマトグラフィーで、前記段階の切断物は、ｐＨ８〜９、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）４ｍＳ／ｃｍ以下でカラムに積載することができる。より好ましくは、ｐＨ８、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２ｍＳ／ｃｍ以下でカラムに積載することができる。
【００６８】
本発明の具体例によれば、本発明の（Ｓ４）段階での陰イオン交換クロマトグラフィーのためのカラムは、１０〜３０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌでｐＨが７〜９、好ましくはｐＨ８になるように平衡緩衝液を用いて平衡化させる。
【００６９】
また、本発明の具体例によれば、本発明の（Ｓ４）段階での陰イオン交換クロマトグラフィーのイオン交換樹脂は、ｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ８の１０〜３０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌを含む緩衝液で洗浄する。
【００７０】
本発明の具体例によれば、本発明の（Ｓ４）段階での陰イオン交換クロマトグラフィーでカラムに付着された分画は、１００〜３００ｃｍ／ｈｒ、好ましくは２００ｃｍ／ｈｒの流速で、１０〜３０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌおよび３０〜１３０ｍＭ、好ましくは８０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ７〜９、好ましくはｐＨ８の溶液で溶出させた。
【００７１】
本発明の具体例によれば、（Ｓ４）段階の陰イオン交換クロマトグラフィーでの動的結合能力は、３ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ以下、好ましくは１．８ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎである。この際、本発明のカラムの量と動的結合能力を乗算すると、最大ロード量を求めることができるところ、例えばカラムの量（樹脂の体積）が２４ｍＬであり、動的結合能力が１．８ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎであるとき、Ｇｌｙ−Ｔβ４の最大ロード量は、４５．２ｍｇである。
【００７２】
（Ｓ５）溶出物を平衡緩衝液（ｅｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）で平衡化された陽イオン交換クロマトグラフィーに積載した後、洗浄緩衝液（Ｗａｓｈ  ｂｕｆｆｅｒ）で前記カラムを洗浄し、動的結合能力（Ｄｙｎａｍｉｃ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ、ＤＢＣ）３〜８ｍｇ／ｍＬで溶出緩衝液（ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ）でカラムに付着された分画を溶出する段階を含む。
【００７３】
本発明において、「陽イオン交換クロマトグラフィー」は、目的タンパク質と樹脂に固定された電荷間の電荷−電荷相互作用に依存する。陽イオン交換クロマトグラフィーで、結合されるべき分子は正電荷に帯電し、固定されたリガンドは負電荷に帯電する。通常的に用いられる陽イオン交換樹脂は、Ｓ−樹脂（スルホネート）、ＳＰ樹脂（スルホプロピル）、ＳＥ樹脂（スルホエチル）、およびＣＭ樹脂（カルボキシメチル）である。しかしながら、一般的に、陽イオン交換クロマトグラフィー段階は、すべての商業的に購入可能な陽イオン交換樹脂により行われ得る。典型的な商業的に購入可能な製品は、例えば、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  Ｈｉｇｈ  Ｓ、Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ  ＣＭ、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓ、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｒａｐｉｄ  Ｓ４０、Ｎｕｖｉａ  Ｓ、およびＮｕｖｉａ  ＨＲ−Ｓ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＣＭ、Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ  ＳＰ、およびＴｏｙｏｐｅａｒｌ  ＧｉｇａＣａｐ  Ｓ（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍｉｌｌｉ気孔ＰｒｏＲｅｓ  Ｓ、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＣＯＯ−、Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ  ＥＭＤ  ＳＯ３−（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｂｉｏｓｅｐｒａ  ＣＭセラミックＨｙｐｅｒＤ、Ｂｉｏｓｅｐｒａ  ＳセラミックＨｙｐｅｒＤ、Ｓ  ＨｙｐｅｒＣｅｌ（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｅｒａｔｉｏｎ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＵＳＡ）、Ｐｏｒｏｓ  ＨＳ、Ｐｏｒｏｓ  ＸＳ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  ３０Ｓ、ＹＭＣ  ＢｉｏＰｒｏ  ７０Ｓ（ＹＭＣ  Ｅｕｒｏｐｅ）ＣＭ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＦＦ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＨＰ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ＸＬ、ＳＰ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  Ｂｉｇ  Ｂｅａｄｓ、ＣＭ−Ｓｅｐｈａｄｅｘ、Ｃａｐｔｏ  Ｓ、Ｃａｐｔｏ  ＳＰ  ＩｍｐＲｅｓ、およびＳｏｕｒｃｅ  Ｓ（全部ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を含むが、これに制限されない。前記「陽イオン交換樹脂」には、イオン交換機能と疎水性相互作用機能の混合方式クロマトグラフィー樹脂（例；Ｃａｐｔｏ  ａｄｈｅｒｅ、ＣａｐｔｏｍＭＣ、ＭＥＰ  ＨｙｐｅｒＣｅｌｌ、Ｅｓｈｍｕｎｏ  ＨＣＸ等）、陰イオン交換機能と陽イオン交換機能の混合方式クロマトグラフィー樹脂（例；ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ、Ｃｅｒａｍｉｃ  ｈｙｄｒｏｘｙａｐａｔｉｔｅ等）等を含む。本発明の好ましい陽イオン交換樹脂は、スルホネートまたはスルホプロピルリガンドを用いる強陽イオン交換基である。最も好ましいものは、高度に架橋結合されたアガロース、例えば、Ｎｕｖｉａ  ＨＲ−Ｓ、またはポリ（スチレンビニルベンゼン）、例えば、Ｐｏｒｏｓ  ５０  ＨＳのように丈夫なマトリックスに結合されたスルホネートまたはスルホプロピルリガンドである。本発明の具体的実施例によれば、陽イオン交換樹脂としてスルホネート基および高度に架橋結合されたアガロースマトリックスに基づく強陽イオン交換基であるＮｕｖｉａ  ＨＲ−Ｓを使用したが、これに制限されない。
【００７４】
本発明において、（Ｓ５）段階の陽イオン交換クロマトグラフィーは、４〜７のｐＨの緩衝液を用いて行われる。
【００７５】
本発明の具体例によれば、（Ｓ５）段階での陽イオン交換クロマトグラフィーで、切断物は、ｐＨ４〜７、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）４ｍＳ／ｃｍ以下でカラムに積載することができる。より好ましくは、ｐＨ４．５、伝導度（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ）２ｍＳ／ｃｍ以下でカラムに積載することができる。
【００７６】
本発明の具体例によれば、本発明の（Ｓ５）段階での陽イオン交換クロマトグラフィーのためのカラムは、１０〜３０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭアセテートでｐＨが４〜５、好ましくは４．５になるように平衡化させる。
【００７７】
また、本発明の具体例によれば、本発明の（Ｓ５）段階での陽イオン交換クロマトグラフィーのイオン交換樹脂は、１０〜３０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭアセテートおよび５０〜１５０ｍＭ、好ましくは１００ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ４〜５、好ましくはｐＨ４．５の緩衝液で洗浄する。
【００７８】
本発明の具体例によれば、本発明の（Ｓ５）段階での陽イオン交換クロマトグラフィーでカラムに付着された分画は、１００〜３００ｃｍ／ｈｒ、好ましくは２００ｃｍ／ｈｒの流速で、１０〜３０ｍＭ、好ましくは２０ｍＭアセテートおよび１５０〜２１０ｍＭ、好ましくは１８０ｍＭのＮａＣｌを含むｐＨ４〜５、好ましくはｐＨ４．５の緩衝液で溶出する。
【００７９】
本発明において、（Ｓ５）段階の陽イオン交換クロマトグラフィーでの動的結合能力は、８ｍｇ以下Ｇｌｙ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ、３〜８ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４  ／  ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ、好ましくは５ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎである。この際、本発明のカラムの量と動的結合能力を乗算すると、最大ロード量を求めることができるところ、カラムの量（樹脂の体積）が１２．６ｍＬであり、動的結合能力が５ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４  ／  ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎであるとき、Ｇｌｙ−Ｔβ４の最大ロード量は、６３ｍｇである。
【００８０】
（Ｓ６）溶出物を濾過する段階を含む。
【００８１】
本発明において、前記（Ｓ６）段階の濾過は、当業界に公知された多様な方法によることができるが、好ましくはナノ濾過（ｎａｎｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）または限外濾過／透析濾過（Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ／Ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ；ＵＦ／ＤＦ）システムを用いることができ、最も好ましくは限外濾過／透析濾過を用いることができる。限外濾過／透析濾過によれば、溶媒と分子サイズが異なる２つ以上の溶質が含有された流体から一部溶質のみを除去する方法であって、高分子物質の精製に効果的であり、一般透析法に比べて時間と費用が節減される長所がある。前記限外濾過／透析濾過は、浸透圧３３０ｍＯｓｍｏｌ／ｋｇ以下で行った後、ｐＨを８に調節することを特徴とする。
【００８２】
本段階によって、溶出物は、透析され、濃縮され得る。
【００８３】
また、本発明において、前記試料は、次の段階を含んで収得することができる：
【００８４】
目的タンパク質を発現する宿主細胞を培養する段階；前記宿主細胞を破砕する段階；および破砕物を洗浄および濾過する段階。
【００８５】
前記目的タンパク質には、Ｇｌｙ−Ｔβ４、そのポリペプチド、その前駆体が含まれ、前記Ｇｌｙ−Ｔβ４の前駆体にＧＳＴ融合チモシンβ４が含まれる。
【００８６】
本発明で使用される宿主細胞は、当業界に公知された多様な種が使用され得、本発明の具体例によれば、Ｅ．ｃｏｌｉを使用することができるが、これに制限されない。
【００８７】
本発明において、用語「培養」には、宿主細胞の生存乃至増殖のための種培養と、宿主細胞で目的タンパク質を発現させるための発酵用本培養が含まれる。
【００８８】
本発明で使用される宿主細胞は、様々な培地で培養することができる。市販の培地、例えばＨａｍ'ｓ  Ｆ１０（シグマ社（Ｓｉｇｍａ））、ＬＢ（Ｌｙｓｏｇｅｎｙ  ｂｒｏｔｈ）培地、最小必須培地（Ｍｉｎｉｍａｌ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）、（シグマ社））、ＲＰＭＩ−１６４０（シグマ社）およびダルベッコ改変イーグル培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ'ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ'ｓ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭ、シグマ社））が宿主細胞の培養に適合する。また、ハム（Ｈａｍ）等の文献［Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚ．５８：４４（１９７９）］、バーンズ（Ｂａｒｎｓ）等の文献［Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１０２：２５５（１９８０）］、米国特許第４，７６７，７０４号、第４，６５７，８６６号、第４，９２７，７６２号、第４，５６０，６５５号または第５，１２２，４６９号、国際特許出願公開第９０／０３４３０号、第８７／００１９５号または米国特許第３０，９８５号に記載された任意培地を宿主細胞のための培養培地として使用することができる。必要に応じて、前記任意培地にホルモンおよび（または）他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウムおよびリン酸塩）、緩衝液（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオチド（例えば、アデノシンおよびチミジン）、抗生剤（例えば、ゲンタマイシン（ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ、登録商標）薬物）、微量元素（一般的に、最終濃度でマイクロモルの範囲で存在する無機化合物と定義される）、およびグルコースまたは等価のエネルギー源を補充することができる。任意の他の必要な補充物を当業者に公知された適合した濃度で含ませることもできる。発現のために選択された宿主細胞に対する培養条件、例えば温度、ｐＨ等は、従前に使用された条件であり、通常の技術者には自明なものである。
【００８９】
本発明の種培養および本培養のための培地は、上述した培地および必要な補充物の中から通常の技術者が適宜選択することができるが、好ましくは、種培養は、ＬＢ培地で３５〜４０℃、好ましく３７℃の温度で３〜４ｈ間培養し、ＯＤ６００が２〜６になると培養終了することができる。また、本培養は、グルコースおよびＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏを補充するＦｅｅｄ  Ａおよびトリップトンおよびイースト抽出物を補充するＦｅｅｄ  Ｂで行われ得る。また、本培養は、３５〜４０℃、好ましくは３７±０．５℃の温度で１７ｈ以下の間にｐＨ７〜８で行うことが好ましい。本培養は、好ましくはＦｅｅｄ  Ａから始まり、ＯＤ６００が４０〜６５、好ましくは４９〜５９でインダクション（Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ）を始めると、ＩＰＴＧ添加および温度変動（２５〜３５℃、好ましくは３０℃）と共にＦｅｅｄ  Ｂを適用し、インダクションが終了すると、Ｆｅｅｄ  Ｂ培地の供給は中断することができる。これにより、細胞成長および目的タンパク質の生産性を最大化することができる。
【００９０】
本発明において、本発明の培養は、好ましくはフェッドバッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）発酵工程によることができる。前記フェッドバッチは、培養の進行と同時に栄養培地を発酵槽に徐々に添加しつつ、培養終了まで発酵槽で培養液を引き抜かない培養方法を意味する。本発明で、フェッドバッチ発酵工程によれば、高い生産性を示し、培地沈殿物およびアセテート形成の短所を解消できるという優れた効果がある。本発明の培養方法によれば、細胞生産性は、１８０ｇ  ｐｅｌｌｅｔ／Ｌ以上、好ましくは１８５ｇ  ｐｅｌｌｅｔ／Ｌ以上てあり、目的タンパク質（ＧＳＴ−Ｔ４）生産性は、５４ｍｇ／ｇ  ｐｅｌｌｅｔ以上、好ましくは５６ｍｇ／ｇ  ｐｅｌｌｅｔ以上の優れた効果がある。
【００９１】
宿主細胞は、目的タンパク質発現のために、好ましくは、組み換え技術を使用する場合、発現またはクローニングベクターで形質転換され、プロモーターを誘導し、形質転換体を選別し、所望の配列をコードする遺伝子を増幅するのに適合するように変形された通常の上述した培地で培養される。
【００９２】
本発明において、宿主細胞で目的タンパク質を発現するために、組み換え技術を使用する場合、目的タンパク質は、細胞内、膜間空間で生成されたりまたは培地内に直接分泌され得る。目的タンパク質が細胞内で生産される場合、宿主細胞を破砕し、破砕物を洗浄および濾過する段階が含まれるところ、第１段階として、宿主細胞または溶菌細胞の破砕微粒子（例えば、均質化して生成される）が例えば遠心分離または限外濾過により除去される。目的タンパク質が培地内に分泌される場合、この発現系の上澄み液は、一般的に市販のタンパク質濃縮フィルター、例えばアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）またはミリポアペリコン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過装置を用いて先に濃縮される。好ましくは、本発明の具体例によれば、前記宿主細胞を破砕する段階および破砕物を洗浄および濾過する段階を含む。
【実施例】
【００９３】
以下、本発明の理解を助けるために好ましい実施例を提示する。しかしながら、下記の実施例は、本発明をさらに容易に理解するために提供されるものに過ぎず、下記実施例により本発明の内容が限定されるものではない。
【００９４】
［１．発酵工程］
実施例（１）菌株情報
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１菌株を用いて、ＧＳＴ−ＴＢ４（ＧＳＴ−ｆｕｓｉｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｔｈｙｍｏｓｉｎ  β４）生産組み換え菌株を製作し、ＲＣＢを製造して、本発明に使用した（表１）。
【００９５】
【表１】
2021532811.tif 000003
【００９６】
実施例（２）中国Ｎｏｒｔｈｌａｎｄ工程再現性確認
（２−１）５Ｌ規模培養
中国Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｎｏｒｔｈｌａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社の３０Ｌ培養ｂａｔｃｈ  ｒｅｃｏｒｄ（以下「ＮＲ工程」という）資料を参考にして５Ｌ規模でｓｃａｌｅ−ｄｏｗｎ培養工程条件を導き出し（表２、３および４）、１〜４次培養を進行した。
【００９７】
【表２】
2021532811.tif 000004
５Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ培養条件
【００９８】
【表３】
2021532811.tif 000005
５Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ培地組成
【００９９】
【表４】
2021532811.tif 000006
Ｍｉｃｒｏｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ組成（ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ）
【０１００】
（２−２）５０Ｌ規模試料生産
５Ｌ規模培養結果および一部条件変更結果に基づいて、試料生産のための５０Ｌ規模のｓｃａｌｅ−ｕｐ条件を導き出した（表５および表６）。また、５０Ｌ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙを確立した後、２バッチの非臨床試料生産のための工程を進行した（図１）。
【０１０１】
【表５】
2021532811.tif 000007
５０Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ培養条件
【０１０２】
【表６】
2021532811.tif 000008
５０Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ培地組成
【０１０３】
実施例（３）ＧＳＴ−ＴＢ４生産性増大のためのｆｅｄ−ｂａｔｃｈ発酵工程開発
上述したＮＲ工程で、低い生産性、培地沈殿物形成、ａｃｅｔａｔｅ蓄積などその他の様々な問題点があることを確認した。したがって、前記問題点を解消できる基本培地組成および工程条件を開発しようとした。
【０１０４】
（３−１）Ｆｌａｓｋ培養（ｂａｔｃｈ−ｃｕｌｔｕｒｅ）
ＢＮＳ−ｐｌａｔｆｏｒｍの培地組成でｙｅａｓｔ  ｅｘｔｒａｃｔ（以下「ＹＥ」という）成分の添加有無を通じてｆｌａｓｋ培養実験（ｆｌａｓｋ  １、２）を進行した（表７、８）。Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ工程開発のための菌株特異的なｇｒｏｗｔｈ  ｐａｒａｍｅｔｅｒを把握し、ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ本培養実行のための種培養条件を確認した。
【０１０５】
【表７】
2021532811.tif 000009
Ｆｌａｓｋ  ｔｅｓｔ培地組成
【０１０６】
【表８】
2021532811.tif 000010
Ｆｌａｓｋ  ｔｅｓｔ培養条件
【０１０７】
（３−２）５Ｌ規模ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養条件
（３−２−１）Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ
Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養ｐａｒａｍｅｔｅｒ（表９）を設定してＦｅｅｄ−Ａ培地の最適ｆｅｅｄｉｎｇ速度を算出した。Ｆｅｅｄ−Ｂは、ＤｏＥ実験条件によってｉｎｄｕｃｔｉｏｎ区間（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ開始〜培養終了）の間にｃｏｎｓｔａｎｔ  ｆｅｅｄｉｎｇ方式で製造量が全部添加され得る速度を計算して適用した（表１０）。
【０１０８】
【表９】
2021532811.tif 000011
Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ
【０１０９】
【表１０】
2021532811.tif 000012
ＤｏＥ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ
【０１１０】
（３−２−２）培地製造および工程条件
ｉｎｉｔｉａｌ  ｍｅｄｉａ  ２．５Ｌから始まって４．２Ｌ（ｆｅｅｄ−Ａ  ０．７Ｌ、ｆｅｅｄ−Ｂ  １．０Ｌ）規模で終了するＤｏＥ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養工程を樹立し（表１１、１２、１３）、ＤｏＥ培養実験に同一に適用した。
【０１１１】
【表１１】
2021532811.tif 000013
ＤｏＥ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養培地組成（ＢＮＳ−Ｐｌａｔｆｏｒｍ）
【０１１２】
【表１２】
2021532811.tif 000014
Ｍｉｃｒｏｅｌｅｍｅｎｔ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ組成（ＢＮＳ−Ｐｌａｔｆｏｒｍ）
【０１１３】
【表１３】
2021532811.tif 000015
ＤｏＥ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養工程条件
【０１１４】
（３−３）最適ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養条件導き出し
Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙを最適化するためにＲｅｓｐｏｎｓｅ  ｓｕｒｆａｃｅ  ｍｅｔｈｏｄ（以下「ＲＳＭ」という）実験を設計した。Ｍｉｎｉｔａｂソフトウェアで２個の因子（ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ開始時点、ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ温度）に対する２水準完全中心合成実験を設計して１３  ｒｕｎｓのｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養実験を進行した（表１４〜１６）。
【０１１５】
【表１４】
2021532811.tif 000016
ＤｏＥ実験因子（ｆａｃｔｏｒ）および条件範囲
【０１１６】
【表１５】
2021532811.tif 000017
ＤｏＥ実験設計条件
【０１１７】
【表１６】
2021532811.tif 000018
２水準完全中心合成要因実験設計
【０１１８】
（３−４）最適培養工程再現性確認
ＲＳＭ  ＤｏＥ培養実験結果を統計的に分析して最適条件および反応値の目標基準を導き出し、最適条件で培養を進行して結果の再現性を確認した（表１７）。
【０１１９】
【表１７】
2021532811.tif 000019
ＤｏＥ最適条件再現性確認
【０１２０】
実施例（４）最適条件５０Ｌ規模Ｓｃａｌｅ−ｕｐ（試料生産）
（４−１）培養工程条件
５Ｌ規模工程開発最適条件をｓｃａｌｅ−ｕｐして、試料生産のための５０Ｌ培養工程を行った（表１８、１９）。
【０１２１】
【表１８】
2021532811.tif 000020
最適条件５０Ｌ規模Ｓｃａｌｅ−ｕｐ培養条件
＊培養温度およびｐＨは、ＢＮＳ−ｐｌａｔｆｏｒｍ条件である
＊＊７５Ｌ装備最大撹拌速度７００ｒｐｍ反映する。
【０１２２】
【表１９】
2021532811.tif 000021
最適条件５０Ｌ規模Ｓｃａｌｅ−ｕｐ培地組成
【０１２３】
（４−２）回収工程条件
（４−２−１）Ｃｅｌｌ  ｓｌｕｒｒｙ回収
（Ａ）培養液回収
−回収時点：培養液冷却（≦１５．０℃）後、ｏｖｅｒｎｉｇｈｔ
−回収体積：４０〜４２Ｌ
（Ｂ）Ｃｅｌｌ  ｓｌｕｒｒｙ回収（連続遠心分離工程）
（１）１次回収
−回収前固形分含量：≧２０％
−Ｂｏｗｌ回転速度：９，５００ｒｐｍ（１１，１１９×ｇ）
−Ｉｎｌｅｔ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１００Ｌ／Ｍ
−Ｏｕｔｌｅｔ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ：１００ｋＰａ
−Ｃｅｌｌ洗浄：３次水４０Ｌ
（２）２次回収
−回収前固形分含量：≧  １０％
−Ｂｏｗｌ回転速度：９，５００ｒｐｍ
−Ｉｎｌｅｔ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１００Ｌ／ｍ
−Ｏｕｔｌｅｔ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ：１００ｋＰａ
−Ｃｅｌｌ洗浄：３次水４０Ｌ
（３）３次回収
−回収前の固形分含量：≧１０％
−Ｂｏｗｌ回転速度：９，５００ｒｐｍ
−Ｉｎｌｅｔ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１００Ｌ／ｍ
−Ｏｕｔｌｅｔ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ：１００ｋＰａ
【０１２４】
（４−２−２）細胞破砕および上澄み液回収
（Ａ）Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ製造（２０Ｘ）
−４００ｍＭのＴｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ８．０±０．２（滴定試薬：ＨＣｌ）、Ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  １７±２ｍＳ／ｃｍ
−４００ｍＭのＴｒｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ組成：Ｔｒｉｓ  ２１．８ｇ／Ｌ、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ３４．７ｇ／Ｌ
（Ｂ）Ｃｅｌｌ  ｓｌｕｒｒｙ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ（１５±１．５％、ｗ／ｗ）
（１）２０Ｘ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒと３次水を添加して固形分１５±１．５％になるように体積を合わせた。
（２）算出公式
＃Ｔｏｔａｌ  ｗｅｉｇｈｔ＝Ｃｅｌｌ  ｃａｋｅ  ｗｅｉｇｈｔ／０．１５
＃２０Ｘ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ  ｗｅｉｇｈｔ＝Ｔｏｔａｌ  ｗｅｉｇｈｔ／２０
＃３次水添加量＝Ｔｏｔａｌ  ｗｅｉｇｈｔ−ｓｌｕｒｒｙ  ｗｅｉｇｈｔ−２０Ｘ  Ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ｗｅｉｇｈｔ
（Ｃ）ＣＩＰ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）
−０．５Ｎ  ＮａＯＨ：１１，０００ｐｓｉ条件、３００ｍＬ  １回、５００ｍＬ  １回
−３次水：１１，０００ｐｓｉ条件、３００ｍＬ  １回、５００ｍＬ  １回
（Ｄ）細胞破砕（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）
（１）ＥＱ：１１，０００ｐｓｉ条件、＊１Ｘ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ３００ｍＬ
（２）細胞破砕：１１，０００ｐｓｉ条件、１５±１．５％  Ｃｅｌｌ  ｓｌｕｒｒｙ破砕２回連続
−細胞破砕基準：破砕前後ＯＤ比率≦３０％
−細胞破砕率計算：（破砕後ＯＤ６００／破砕前ＯＤ６００）×１００
（３）Ｆｌｕｓｈｉｎｇ：１１，０００ｐｓｉ条件、１Ｘ  ｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ５０ｍＬ
（Ｅ）Ｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ上澄み液回収（連続遠心分離）
−Ｂｏｗｌ回転速度：９，５００ｒｐｍ
−Ｉｎｌｅｔ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ：１００Ｌ／Ｍ
−Ｏｕｔｌｅｔ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ：２５０ｋＰａ
【０１２５】
（４−２−３）Ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
（Ａ）Ｆｉｌｔｅｒ情報
（１）Ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ：
−Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＰＯＤ  Ｃ０ＨＣ：０．１１ｍ２×２ｅａ
−Ｍｉｌｌｉｓｔａｋ＋ＰＯＤ  Ｆ０ＨＣ：０．１１ｍ２×２ｅａ
（２）Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆｉｌｔｅｒ
−Ｏｐｔｉｃａｐ  ＸＬ１０（０．４５μｍ）０．６９ｍ２×１ｅａ
（Ｂ）Ｆｉｌｔｅｒ  ｗａｓｈｉｎｇ
−Ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ：３次水１００Ｌ／ｍ２、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ３００  ＬＭＨ（１，１００ｍＬ／ｍｉｎ）
−Ｓｔｅｒｉｌｅ  ｆｉｌｔｅｒ：３次水１０Ｌ／ｍ２、ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  １，０００ｍＬ／ｍｉｎ
（Ｃ）Ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ
2021532811.tif 000022
【０１２６】
実施例（５）培養液分析
（５−１）Ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ測定
培養液の菌体濃度は、６００ｎｍで吸光度（Ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ）を測定した。培養液１ｍＬを取って、ＯＤ６００＝０．２〜０．５となるように蒸留水で希釈した後、吸光度（ＯＤ６００）を測定し、吸光度（ＯＤ６００）値に希釈倍数をかけてｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙを求めた。サンプル希釈は、表２０の方法で標準化して進行した。
【０１２７】
【表２０】
2021532811.tif 000023
ＯＤ  ｖａｌｕｅ測定希釈条件
【０１２８】
（５−２）細胞代謝物測定
培養液のｇｌｕｃｏｓｅおよびａｃｅｔａｔｅ濃度は、培養液１ｍＬを１３，０００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上澄み液をＣｅｄｅｘ  Ｂｉｏ（Ｒｏｃｈｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）装備で測定した（ＳＯＰ  Ｎｏ．ＦＥ０２−９２１）。
【０１２９】
（５−３）細胞生産性測定
（５−３−１）Ｗｅｔ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔ測定（ｇ／Ｌ）
次の方法でＷｅｔ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔを測定した。
（１）５００ｍＬ  ｔｕｂｅ＋ＳＵＰＰＯＲＴ  ＣＵＳＨＩＯＮ重さ測定（２個準備）
（２）培養液５００ｍＬずつ分注（５００ｍＬメスシリンダー使用）
（３）４５００ｒｐｍ、４℃条件で１時間の間遠心分離（ＣＥ−６１４０装備）
（４）上澄み液を捨て、ｐｅｌｌｅｔが含まれた容器（ｔｕｂｅ＋ｃｕｓｈｉｏｎ）重さ測定
（５）Ｗｅｔ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔ重さ計算（ｇ／Ｌ）
Ｗｅｔ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔ＝（Ｐｅｌｌｅｔ包含重さ−容器重さ）ｇ／０．５Ｌ（培養液体積）
（６）細胞生産性は、ｗｅｔ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔ測定値２個の平均で決定した。
【０１３０】
（５−３−２）固形分含量測定（％）
（１）Ｍｉｃｒｏ  ｔｕｂｅ  ２個準備
（２）精密秤でｔｕｂｅ重さそれぞれ測定および記録
（３）培養液１ｍＬ含まれたｔｕｂｅ重さ測定および記録
（４）１３，０００ｒｐｍ、４℃条件で５分遠心分離
（５）上澄み液を捨て、ｐｅｌｌｅｔが含まれたｔｕｂｅ重さ測定
（６）固形分含量（％）計算
2021532811.tif 000024
（７）固形分含量測定値２個の平均値を取る
【０１３１】
（５−４）ＧＳＴ−ＴＢ４生産性測定（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ＆  Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）
（１）ＯＤ６００＝５のｃｅｌｌ  ｐｅｌｌｅｔサンプルにｌｙｓｉｓ  ｂｕｆｆｅｒ（５０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、０．１％  ２ＭＥ、５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．０）１，０００μＬを入れてｖｏｒｔｅｘｉｎｇ実施
（２）Ｓｏｎｉｃａｔｉｏｎ  １０秒実施し、ｉｃｅで１分放置（７回反復）
（３）１０，０００×ｇで２０分遠心分離後、上澄み液１５μＬを取る
（４）ＢＳＡ（ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ  ａｌｂｕｍｉｎ）タンパク質標準時薬を０．５、１、２、４μｇの量がそれぞれ添加されるように合わせて１５μＬの体積で準備
（５）サンプル１５μＬ（遠心分離上澄み液およびＢＳＡ  ｓｔａｎｄａｒｄ）と（４）で準備したｓａｍｐｌｅ  ｂｕｆｆｅｒ  ｍｉｘｔｕｒｅ  ５μＬをそれぞれ混ぜる（総体積２０μＬ）
（６）７０℃、１０分反応
（７）試料全体（２０μＬ）をｇｅｌの各ｗｅｌｌにローディング
（８）２００Ｖ、４００ｍＡ条件で３５分ｒｕｎｎｉｎｇ
（９）Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ  ｂｌｕｅ  ｓｔａｉｎｉｎｇ  ２０分以上実施
（１０）Ｄｅｓｔａｉｎｉｎｇ  ２時間以上実施
（１１）Ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒ装備でｇｅｌ  ｂａｎｄ  ｄｅｎｓｉｔｙのｉｍａｇｅ分析
【０１３２】
実験例（１）中国Ｎｏｒｔｈｌａｎｄ工程再現性確認
（１−１）５Ｌ規模培養
ＮＲ工程をｓｃａｌｅ−ｄｏｗｎして５Ｌ規模ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎを行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を通じてＧＳＴ−ＴＢ４の正常な発現を確認した（図４）。最終ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙがＯＤ６００＝８５、８１、６１、４１、８６であって（表２１）、３次２バッチ（Ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１６０４２８−Ｂ１、Ｂ２）を除いてＮＲ工程と類似したｇｒｏｗｔｈを示した（図３）。しかしながら、全体工程で培養液内ｇｌｕｃｏｓｅが累積されてｆｅｅｄ−Ａ供給中断および再開を通じて制御し、４次まで進行しつつ継続的なＣ−ｓｏｕｒｃｅ（ｆｅｅｄ−Ａ培地）供給改善を試みたが、４次工程を除いてａｃｅｔａｔｅの蓄積が観察された。したがって、ｆｅｅｄ−Ａ培地のさらに精密なｆｅｅｄｉｎｇ速度改善が必要であった。また、培地の調製後、沈殿物が多く形成され、培地組成のｐＨが最適化されていないので、接種前に別途の滴定過程が要求されるなど従前ＮＲ工程の短所が確認された。
【０１３３】
【表２１】
2021532811.tif 000025
５Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ培養結果
【０１３４】
（１−２）５０Ｌ規模培養（試料生産）
ＮＲ工程をｓｃａｌｅ−ｄｏｗｎして行った５Ｌ規模ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ培養結果に基づいて５０Ｌ規模工程条件を導出し（表５〜６、図２）、２バッチの５０Ｌ試料生産工程を行った。ＮＲ工程（３０Ｌ規模培養結果）に比べて培養初期細胞成長のｌａｇ  ｐｈａｓｅが2つのバッチ（１、２次）が全部長かったが、最終ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙは、ＯＤ６００＝８４、９８にそれぞれ到達し、ＮＲ工程と類似していた（図５、表２２）。Ａｃｅｔａｔｅ濃度は、２つのバッチが全部１ｇ／Ｌ以下で培養終了までよく制御されたが、２次バッチ（Ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１６０７２９）の場合、培養後半期（１７ｈ以後）にｇｌｕｃｏｓｅが２ｇ／Ｌまで蓄積された。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を通じてＧＳＴ−ＴＢ４発現を確認し（図６）、培養液の連続遠心分離工程後、最終３．０ｋｇ、３．３ｋｇの菌体を回収した（表２２）。
【０１３５】
【表２２】
2021532811.tif 000026
５０Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ培養結果
【０１３６】
実験例（２）ＧＳＴ−ＴＢ４生産性増大のためのｆｅｄ−ｂａｔｃｈ発酵工程開発
（２−１）Ｆｌａｓｋ培養
ＤｏＥ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養工程のｆｅｅｄｉｎｇ  ｒａｔｅを算出するために必要なｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐａｒａｍｅｔｅｒおよび種培養工程時間を確認するためにｆｌａｓｋ培養実験を行った。Ｆｌａｓｋ  １は、ｆｅｄ−ｂａｔｃｈのｉｎｉｔｉａｌ  ｍｅｄｉａと同じ培地組成であり、ｆｌａｓｋ  ２は、ｉｎｉｔｉａｌ  ｍｅｄｉａからＹＥのみが除外された組成でｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅを進行した。Ｆｌａｓｋ  １（ＹＥを含む）は、ｆｌａｓｋ  ２に比べてｌａｇ  ｐｈａｓｅ区間が短く、最大ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ６００）は、それぞれ８．３（ｆｌａｓｋ  １）、６．９（ｆｌａｓｋ  ２）まで成長した（図７）。Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ区間のＯＤ  ｖａｌｕｅおよびｇｌｕｃｏｓｅ濃度に基づいてｇｌｕｃｏｓｅ基質に対する細胞収率（ＹＸ／Ｓ）と最大非成長速度（μｍ）をそれぞれ算出した（表２３）。Ｆｅｒｍｅｎｔｅｒを用いた５Ｌ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養実験は、ＹＥが添加された培地組成を選択し、したがって、ｆｌａｓｋ  １のｐａｒａｍｅｔｅｒ値を使用してｆｅｅｄｉｎｇ速度を算出した。５Ｌ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ種培養工程は、ＯＤ６００≧２、培養時間は、４ｈ以上に決定した。
【０１３７】
【表２３】
2021532811.tif 000027
ＨＵ０２４  ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ
【０１３８】
（２−２）Ｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙ
（２−２−１）Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ
先立って進行されたｆｌａｓｋ  １の培養テスト結果を参考にしてＣ−ｓｏｕｒｃｅのｆｅｅｄｉｎｇ速度を計算するための各ｐａｒａｍｅｔｅｒを表２４のように設定した。ＹＥが含まれたｉｎｉｔｉａｌ  ｍｅｄｉａ組成のｆｌａｓｋ  ｂａｔｃｈ  ｃｕｌｔｕｒｅで最大比成長速度（μｍ）は、０．４３ｈ−１であったが（表２３）、Ｅ．ｃｏｌｉ培養時に菌体の速い成長は、ｓｏｌｕｂｌｅタンパク質タイプのｐｒｏｄｕｃｔ生産に不利なので、精密なｆｅｅｄｉｎｇ速度制御を通じてｑｕａｓｉ−ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅ状態を誘導して比成長速度を０．３〜０．１４ｈ−１に制御しようとした。
【０１３９】
【表２４】
2021532811.tif 000028
Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ
【０１４０】
（２−２−２）Ｆｅｅｄｉｎｇ速度計算（ｆｅｅｄ−Ａ）
Ｆｅｅｄ−Ａ培地のｆｅｅｄｉｎｇ速度は、下記の式を用いて算出した。各ｐａｒａｍｅｔｅｒ値（表２４）を式（４）に代入して、ｂａｔｃｈ−ｃｕｌｔｕｒｅが終了する時点の最初ｆｅｅｄｉｎｇ速度を算出し、引き続いて、ＶＸ値（式（１））、Ｖ値（式（２））、Ｘ値（式（３））、Ｆ値（式（４））を順に１時間単位（ｄｔ）ごとに計算した。計算されたｆｌｏｗ  ｒａｔｅ（Ｆ）は、Ｌ／ｈ単位であるから、ｍＬ／ｍｉｎ単位に転換後、さらに最終的にポンプ装備の速度単位であるｇ／ｍｉｎ単位に転換した（表２５）。
2021532811.tif 000029
【０１４１】
【表２５】
2021532811.tif 000030
Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｆｅｅｄｉｎｇ速度計算
【０１４２】
（２−３）Ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ工程でのｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ確認
５Ｌ発酵器を用いたｆｅｄ−ｂａｔｃｈ工程で基本的なｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ確認のために、算出されたｆｅｅｄ−Ａ  ｆｅｅｄｉｎｇ速度（表２３）を適用してｆｅｅｄ−Ａのみを供給しつつ、ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養を進行した（図８）。培養終了まで総７８８．８ｍＬのｆｅｅｄ−Ａ培地が供給され、培養器内に流入したｇｌｕｃｏｓｅ総量３９７ｇ（初期ｇｌｕｃｏｓｅを含む）を最終培養体積（３．３Ｌ）に換算して基質収率（ＹＸ／Ｓ）を適用したとき、予測される最大ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙがＯＤ６００＝１３６であるが、これは、実際培養結果の最大ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ（ＯＤ６００＝１４２）とほぼ類似していた。Ａｃｅｔａｔｅ濃度は、培養開始から終了まで１ｇ／Ｌ未満に良好に制御され、培養３ｈを過ぎてｉｎｉｔｉａｌ  ｍｅｄｉａにあった初期ｇｌｕｃｏｓｅが急激に消耗されて、ｇｌｕｃｏｓｅ  ｆｅｅｄｉｎｇを始めた（４ｈ）後にも培養終了まで続いて０ｇ／Ｌに近く良好に制御され、実際ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈも、設定されたμ値に近くｑｕａｓｉ−ｓｔｅａｄｙ  ｓｔａｔｅが良好に誘導されたので、先立って算出されたｆｅｅｄｉｎｇ速度（表２５）は、適切なものと判断された。また、本ｆｅｄｂａｔｃｈ培養実験のｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ結果は、ＤｏＥ培養実験のｉｎｄｕｃｔｉｏｎ時点を予測するための資料にも活用した。
【０１４３】
（２−４）最適培養条件導き出し（ＤｏＥ）
（２−４−１）培養結果
ＤｏＥ  ＲＳＭ設計条件に基づいて１３ｒｕｎｓの培養を進行した。各ＤｏＥ条件のｉｎｄｕｃｔｉｏｎ開始時点にＩＰＴＧ添加および温度ｓｈｉｆｔと同時にｆｅｅｄ−Ｂ培地ｆｅｅｄｉｎｇを始め、高濃度ＹＥで構成されたｆｅｅｄ−Ｂ培地は、ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ区間だけで供給して、ｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈおよびＧＳＴ−ＴＢ４生産性を最大化する戦略で培養を進行した。ＤｏＥ  ５番バッチ（Ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１６１０２７−Ｂ１）を除いて最大ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ＯＤ６００＝１４０〜１９６まで成長し、ｇｌｕｃｏｓｅおよびａｃｅｔａｔｅの過剰蓄積なしに全体的に良好に制御された（図９ａ〜９ｍ）。ＤｏＥ  ５番バッチ（１６１０２７−Ｂ１）は、ＲＳＭ  ＤｏＥ実験設計上、最も速いｉｎｄｕｃｔｉｏｎ開始条件（ＯＤ６００＝１９．６）であって、培養液内ｇｌｕｃｏｓｅおよびａｃｅｔａｔｅが最も多く蓄積されたが、これは、十分なｃｅｌｌ  ｇｒｏｗｔｈ前にｉｎｄｕｃｔｉｏｎと温度ｓｈｉｆｔが行われたためであると判断される。ＤｏＥ  ｒｕｎ全体バッチの細胞生産性の平均は、１８５±３１ｇ／Ｌ（ｗｅｔ  ｃｅｌｌ  ｗｅｉｇｈｔ）であり、ＳＤＳ−ＰＡＧＥとｇｅｌ  ｂａｎｄ  ｉｍａｇｅ分析（図１０、１１）を通じて確認したＧＳＴ−ＴＢ４生産性の全体平均は、５６．４±１０．０ｍｇ／ｇ（ｗｅｔ  ｃｅｌｌ当たり生産性）、１０．４±２．２ｇ／Ｌ（培養体積当たり生産性）であって、５０Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ  ２バッチ（１次、２次）の平均値対比細胞生産性は、約１．５倍、ＧＳＴ−ＴＢ４生産性は、約２．５倍増大した（表２６）。
【０１４４】
【表２６】
2021532811.tif 000031
ＤｏＥ  １３  ｒｕｎｓ培養工程結果要約
【０１４５】
（２−４−２）ＤｏＥ統計分析
（２−４−２−１）分散分析
ＤｏＥ実行バッチ全部（１３  ｒｕｎｓ）の細胞生産性およびＧＳＴ−ＴＢ４生産性の結果値にてＭｉｎｉｔａｂソフトウェアで分散分析を進行した（表２７）。模型説明力を意味するＲ２値がそれぞれ７９．７８％（ＧＳＴ−ＴＢ４生産性）、５８．５７％（細胞生産性）であって、反復がない実験設計（開発期間考慮）と、反応値に対して様々な因子が関与される培養分野特性を考慮するとき、一般的な水準であると判断された。Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ＯＤのｐ−ｖａｌｕｅがそれぞれ０．００２（ＧＳＴ−ＴＢ４生産性）、０．０２９（細胞生産性）であったから、信頼水準０．０５未満で２個の反応値（ＧＳＴ−ＴＢ４および細胞生産性）全部に対して有意な因子と確認され、ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ温度のｐ−ｖａｌｕｅは、それぞれ０．３９９（ＧＳＴ−ＴＢ４生産性）、０．２９９（細胞生産性）であって、ＧＳＴＴＢ４および細胞生産性の結果に対して影響がないものと判断される。「Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ＯＤ＊温度」項のｐ−ｖａｌｕｅがそれぞれ０．３７４、０．４１３であるから、反応値に対して2つの因子の相互条件干渉を意味する「交互作用」効果はないことが確認された。
【０１４６】
【表２７】
2021532811.tif 000032
ＲＳＭ  ＤｏＥ実験回帰係数および分散分析結果
【０１４７】
（２−４−２−２）残差分析（Ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｐｌｏｔ）
行われたＤｏＥ模型結果の残差分析（ｒｅｓｉｄｕａｌ  ｐｌｏｔ）結果、概して特別な傾向性や特異点なしに一定の分散を示した。また、時間および実験順序に対して独立してランダムに実験が進行され、正規分布に従い、適合性欠如が存在しないことを確認した（図１２）。
【０１４８】
（２−４−２−３）最適条件導き出しおよびｄｅｓｉｇｎ  ｓｐａｃｅ設定
ＤｏＥ  ＲＳＭ設計を通した培養実験の分散分析結果に対してＭｉｎｉｔａｂソフトウェアの反応最適化ｔｏｏｌを用いて最適条件を求めた。細胞生産性とＧＳＴ−ＴＢ４生産性に対して合成満足度０．６７を満たす水準で提示された最適条件は、ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ＯＤ６００＝５３．９、ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ温度２８．９℃であり、反応値目標は、それぞれ５８．５ｍｇ／ｇ、１９４ｇ／Ｌと予測された（表２８、図１３）。提示された最適条件は、中央点条件に近かったため、初期ＤｏＥ設計の因子水準（ｌｅｖｅｌ）設定は、適切であったと判断され、最適工程の生産性目標下限範囲を中央点平均の最低点に設定した（表２９）。
【０１４９】
【表２８】
2021532811.tif 000033
Ｍｉｎｉｔａｂ反応条件最適化
【０１５０】
中央点平均最低点（５４．１ｍｇ／ｇ  ＆  １８０ｇ／Ｌ）を下限目標基準とし、上位５個の平均値（６４．１ｍｇ／ｇ  ＆  ２０８ｇ／Ｌ）を上限目標基準とする等高線図を確認した（表２９、図１４）。等高線図の白色下地は、ＧＳＴ−ＴＢ４生産性と細胞生産性目標基準（≧５４．１ｍｇ／ｇ、≧１８０ｇ／Ｌ）を同時に満足させる条件領域（ｄｅｓｉｇｎ  ｓｐａｃｅ）を示すが、この領域の安定した範囲を基準としてさらに導き出された最終的な最適工程条件をｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ＯＤ６００＝５４±５、ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ温度３０±１℃に決定した（表３０）。
【０１５１】
【表２９】
2021532811.tif 000034
ＨＵ０２４培養最適条件工程反応値目標基準
【０１５２】
【表３０】
2021532811.tif 000035
ＨＵ０２４培養最適工程条件
【０１５３】
（２−５）最適培養条件再現性確認
ＤｏＥ  ＲＳＭ培養実験結果の統計分析で導き出された最終最適条件（ＯＤ６００＝５４±５、温度３０±１℃）で反応値再現性確認培養を行った。ＤｏＥ実験に使用したＹＥ製品（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  ０２０２）と同じ製品を使用して１バッチ（Ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１６１１２２−Ｂ１）、ＹＥのメーカーをＢＤ社製品に変更して２バッチ（Ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１６１１１５−Ｂ１、１６１１２２−Ｂ２）、ａｎｔｉｆｏａｍ製品（Ｄｏｗ  ｃｏｒｎｉｎｇ）およびａｅｒａｔｉｏｎ条件（０．５ｖｖｍ）まで変更して１バッチ（１６１１２４−Ｂ１）、総４バッチ培養工程を進行した（表１７）。Ｄｏｗ  ｃｏｒｎｉｎｇ社アンチフォーム使用時には、アンチフォーム使用量が従前アンチフォーム（ｓｉｇｍａ  ２０４）対比１０倍以上増加したが、４バッチが全部類似したｇｒｏｗｔｈを示して、最大ｃｅｌｌ  ｄｅｎｓｉｔｙは、ＯＤ６００＝１６０以上成長し、ｇｌｕｃｏｓｅおよびａｃｅｔａｔｅ濃度も、１ｇ／Ｌ以下に良好に制御された（図１５）。細胞生産性は、それぞれ１８２、２０２、２０８、２０５ｇ／Ｌであり（表３２）、２回反復分析されたＧＳＴ−ＴＢ４生産性平均は、それぞれ６６．５±０．３、５７．５±２．４、６５．１±９．５、６６．６±２．６ｍｇ／ｇであって（表３１、図１６、図１７）、４バッチが全部最適条件反応値目標基準（表２９）以上の結果を達成した。結果的に、本研究で確立された５Ｌ規模最適培養工程条件の再現性が確認され、ＮＲ工程を再現したｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ５０Ｌ培養結果（Ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１６０６２９、１６０７２９）対比細胞生産性は、約１．６倍、ＧＳＴ−ＴＢ４生産性は、約２．８倍増大した（表３２）。
【０１５４】
【表３１】
2021532811.tif 000036
最適条件ＧＳＴ−ＴＢ４生産性分析結果
【０１５５】
【表３２】
2021532811.tif 000037
５Ｌ規模最適培養条件再現性確認結果要約
【０１５６】
実験例（３）最適条件５０Ｌ規模Ｓｃａｌｅ−ｕｐ（試料生産）
５Ｌ規模工程開発最適条件をｓｃａｌｅ−ｕｐして試料生産のための５０Ｌ培養工程を行った。５Ｌ規模のｆｅｅｄｉｎｇ  ｓｔｒａｔｅｇｙと同じパラメーターを適用して５０Ｌ規模のｆｅｄ−ｂａｔｃｈ培養ｆｅｅｄｉｎｇ速度を算出した（表３３）。５０Ｌ規模試料生産培養２バッチ（Ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１７０１０４、１７０１１４）の実行結果、細胞生産性は、それぞれ２０７、２０８ｇ／Ｌであり、ＧＳＴ−ＴＢ４生産性は、それぞれ７６．９、６９．７ｍｇ／ｇ（ｐｅｌｌｅｔ当たり生産性）であって（表３４）、最適条件反応値目標基準（表２９、細胞生産性≧１８０ｇ／Ｌ  ＆  ＧＳＴ−ＴＢ４生産性≧５４．１ｍｇ／ｇ）を満たし、ｇｒｏｗｔｈおよび代謝（ｇｌｕｃｏｓｅ  ＆  ａｃｅｔａｔｅ）ｔｒｅｎｄも、５Ｌ規模の最適条件再現性バッチと同じパターンを示した（図１８）。試料生産工程で進行された（ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１７０１１４）バッチの場合、培養終了後に培養液回収前まで培養器で１０℃まで冷却してｏｖｅｒｎｉｇｈｔ（以下「Ｏ／Ｎ」という）ｈｏｌｄｉｎｇテストを進行したが、Ｏ／Ｎ前後ＯＤ６００値は、１７４．６（前）、１７１．５（後）であり、ｐｅｌｌｅｔ生産性は、２２１ｇ／Ｌ（前）、２０８ｇ／Ｌ（後）で測定された（表３４）。試料生産工程（ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１７０１１４）の実行結果は、表３５に要約した。
【０１５７】
【表３３】
2021532811.tif 000038
５０Ｌ規模Ｓｃａｌｅ−ｕｐ工程Ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｆｅｅｄｉｎｇ速度
【０１５８】
【表３４】
2021532811.tif 000039
最適条件５０Ｌ規模Ｓｃａｌｅ−ｕｐ培養結果要約
【０１５９】
【表３５】
2021532811.tif 000040
５０Ｌ試料生産工程結果要約（ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１７０１１４）
【０１６０】
［２．精製工程］
実施例（１）背景および予備実験
Ｑ  ＦＦ−ＧＳＴ  ＦＦ−ｅｎｚｙｍｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ−ＵＦ／ＤＦ−Ｑ  ＸＬ−Ｓｏｕｒｃｅ  ３０ＲＰＣ−Ｑ  ＨＰ−ＵＦ／ＤＦで進行する中国工程と、Ｑ  ＦＦ−ＧＳＴ  ＦＦ−ｅｎｚｙｍｅ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ−Ｑ  ＦＦ−ＵＦ／ＤＦであるさらに最適化されたヒュオンス工程を比較した。したがって、ヒュオンス工程を基本として純度改善および単位工程最適化、そして高価なＧＳＴ  ＦＦレジン費用最小化を目標とした。
【０１６１】
（１−１）１次カラムレジンスクリーニング
高価なＧＳＴカラムＤＢＣを最大化するために中国工程で１次カラムとして使用したＱ  ＦＦ  ｒｅｓｉｎの代わりに、Ｎｕｖｉａ  Ｑ、Ｆａｃｔｒｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ（Ｍ）を適用して、溶出分画の純度改善によるＧＳＴレジンのＤＢＣ向上効果を確認しようとした。２種類のＲｅｓｉｎを通じて精製されたｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌをＧＳＴカラムに適用したとき、レジンの種類と関係なく４２〜４４ｍｇ／ｍＬ程度のＤＢＣを確認した（表３６、３７）。したがって、比較的ｙｉｅｌｄが高かったＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ（Ｍ）を適用して工程開発に使用することに決定した。
【０１６２】
【表３６】
2021532811.tif 000041
Ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  Ｎｕｖｉａ  Ｑ  ｒｅｓｉｎ  ａｎｄ  ＤＢＣ  ｆｏｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ  ｕｓｉｎｇ  Ｎｕｖｉａ  Ｑ  ｅｌｕｔｅｄ  ｓａｍｐｌｅ
【０１６３】
【表３７】
2021532811.tif 000042
Ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ＴＭＡＥ（Ｍ）ｒｅｓｉｎ  ａｎｄ  ＤＢＣ  ｆｏｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｒｅｓｉｎ  ｕｓｉｎｇ  ＴＭＡＥ（Ｍ）ｅｌｕｔｅｄ  ｓａｍｐｌｅ
【０１６４】
（１−２）５０Ｌ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ  Ｔｅｓｔ
ヒュオンス工程を基準として、ｓｍａｌｌ  ｓｃａｌｅ工程再現性を確認し、５０Ｌ規模培養液で１ｓｔ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎと２ｎｄ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎを２回進行した（図１９、表３８、表３９）。
【０１６５】
【表３８】
2021532811.tif 000043
2021532811.tif 000044
５０Ｌ  １ｓｔ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
【０１６６】
１ｓｔ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎは、Ｓｍａｌｌ  ｓｃａｌｅ工程に基づいて同一に進行され、工程結果は、次のように確認された（表３９、表４０）
【０１６７】
【表３９】
2021532811.tif 000045
Ｓｔｅｐ  Ｙｉｅｌｄ  ｏｆ  ＨＵ０２４  Ｓｍａｌｌ  Ｓｃａｌｅ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ
【０１６８】
【表４０】
2021532811.tif 000046
Ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｏｆ  ＨＵ０２４  １ｓｔ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ
【０１６９】
Ｓｍａｌｌ  ｓｃａｌｅ精製結果と１ｓｔ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ結果、ＡＥＸＩＩ工程（Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ後にＡＥＸ工程）でｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ（Ｆ／Ｔ）分画で多くのｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎが確認された（表４０）。したがって、２ｎｄ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎでは、ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｏｄｅで工程を進行した（表４１）。
【０１７０】
【表４１】
2021532811.tif 000047
2021532811.tif 000048
５０Ｌ  ２ｎｄ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
【０１７１】
【表４２】
2021532811.tif 000049
Ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｏｆ  ＨＵ０２４  ２ｎｄ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ
【０１７２】
１ｓｔ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎでＡＥＸＩＩ工程時にＦ／Ｔ分画の純度は、９９．４％（ＲＰ−ＨＰＬＣ）、９７．９％（ＳＥ−ＨＰＬＣ）と確認され、反面、ｅｌｕｔｉｏｎ分画の純度は、基準不適合と確認された（表４３）。２ｎｄ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎでＡＥＸＩＩ工程をｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｍｏｄｅで進行したとき、１ｓｔ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ時より精製収率は改善されたが（４．３→７．６％）、純度は若干低下した（９７．９→９７．０％）（表４４）。
【０１７３】
【表４３】
2021532811.tif 000050
Ｑｕａｌｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｆｏｒ  １ｓｔ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ
【０１７４】
【表４４】
2021532811.tif 000051
Ｑｕａｌｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｆｏｒ  ２ｎｄ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ
【０１７５】
しかしながら、２回のｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎで最終精製原液のＳＥ−ＨＰＬＣ純度が９８％未満であった。したがって、単位工程最適化以外に９８％以上で純度改善のための工程開発を計画した。
【０１７６】
（１−３）細胞破砕条件最適化
単位工程最適化を目的として、細胞破砕効率を改善することができるかを確認した。
【０１７７】
（１−３−１）破砕緩衝液改善実験
細胞破砕効率改善可能性を確認した。ＥＤＴＡとｄｅｔｅｒｇｅｎｔであるＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を入れたとき、回収されたｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ含量増加が有意でないので（約４〜６％増加）、従前条件を維持することに決定した（図２０、表４５）。
【０１７８】
【表４５】
2021532811.tif 000052
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ＧＳＴ−Ｔβ４  ｂａｎｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ｂｙ  ｃｅｌｌ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
【０１７９】
（１−３−２）不純物除去実験
ＮＲ（中国工程）に基づいてＡｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ添加によるＳａｌｔ−ｏｕｔ現象を用いて不純物除去可能性を確認した。ＮＲ工程では、破砕液１００ｍＬ当たり５．６ｇ（３３％）のＡｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅが添加する工程を適用して、本実験には、Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅを１６．５％、３３％、６６％で処理した破砕液のＧＳＴ−Ｔβ４の量を確認した。Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅの含量が高まるほどＧＳＴ−Ｔβ４含量は、未添加試料対比それぞれ２０％、３７％、４３％減少した（図２１、表４６）。Ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ使用時にＧＳＴ−Ｔβ４含量も減少するので、添加しない条件に決定した。
【０１８０】
【表４６】
2021532811.tif 000053
Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｒｅｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＧＳＴ−Ｔβ４  ａｍｏｕｎｔ  ｂｙ  ａｄｄｉｎｇ  ａｍｍｏｎｉｕｍ  ｓｕｌｆａｔｅ
【０１８１】
（１−３−３）破砕条件変更
細胞破砕機（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ）条件を変更した。Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ  ２回実行時に使用した細胞破砕条件（ｃｅｌｌ  ｓｌｕｒｒｙ  ３０％、１５，０００ｐｓｉ圧力、３回反復破砕）を現在バイネックスＧＭＰ作業場で適用する細胞破砕条件（ｃｅｌｌ  ｓｌｕｒｒｙ  １５％、１１，０００ｐｓｉ圧力、２回反復破砕）に変更した。変更された破砕条件適用時に破砕後の試料の吸光度（ＯＤ６００）減少程度も、従前方法より同等以上であった（表４７）。変更された条件は、５Ｌ規模培養液を使用した精製工程開発から適用された。
【０１８２】
【表４７】
2021532811.tif 000054
Ｃｅｌｌ  ｏｐｔｉｃａｌ  ｄｅｎｓｉｔｙ  ａｃｃｏｒｄｉｎｇ  ｔｏ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎ
【０１８３】
（１−３−４）Ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ  ｓｉｚｉｎｇ  ｔｅｓｔ
メルクミリポアで提供したｆｉｌｔｅｒ  ｔｅｓｔ  １次結果によれば、Ｃ０ＨＣ、Ｆ０Ｈ  Ｃが選定され、ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎに適用した。工程進行中にフィルターの目詰まり現象が発生し、原因の分析は進行されなかった。その後、５Ｌおよび５０Ｌ工程でも同じフィルターを使用したが、目詰まり現象がなかった。したがって、フィルターの種類とは関係なく目詰まり現象が発生したものと判断され、破砕条件変更によって目詰まり現象が解決されたものと予想された。
【０１８４】
破砕条件が変更された後、メルクミリポア側に２次にｆｉｌｔｅｒ  ｔｅｓｔを依頼し、Ｘ０ＨＣを推薦した。ザルトリウス側にｆｉｌｔｅｒ  ｔｅｓｔを依頼して、Ｓａｒｔｏｃｌｅａｒ  ＰＣ２が選定された（表４８）。結論的にメルクミリポアのＤｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒを使用し、５Ｌ  ｐｒｏｃｅｓｓ、５０Ｌ  ３ｒｄ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎには、Ｃ０ＨＣ、Ｆ０ＨＣを用いて進行した（Ｍｅｒｃｋ  ｒｅｐｏｒｔ  Ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ＃２＜２０１６．０６．１７＞、Ｍｅｒｃｋ  ｒｅｐｏｒｔ  ｒｅｖｉｓｉｏｎ  ＃１＜２０１６．１０．２０＞、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ｒｅｐｏｒｔ＜Ｄｏｃ  Ｎｏ．ＳＫＢ２０１６０４＞）。
【０１８５】
【表４８】
2021532811.tif 000055
Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｅｒ  ａｎｄ  ｓｔｅｒｉｌｅ  ｆｉｌｔｅｒ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  ｂｙ  ｅａｃｈ  ｖｅｎｄｅｒｓ
【０１８６】
実施例（２）各工程試料に対する分析条件
（２−１）ＵＶ定量法
タンパク質定量は、下記式（式１）により算出され、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｃｅｓｓに対する工程試料のタンパク質定量に使用された。
【０１８７】
【数１】
2021532811.tif 000056
【０１８８】
（２−２）ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析法
Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ後に工程試料に対して分析を進行し、工程試料に対するＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析法は、ＧＳＴとＧｌｙ−ＴＢ４の分離が可能な条件を用いてＧｌｙ−ＴＢ４の定量測定が可能なＧｌｙ−ＴＢ４工程中に試料のサイズ排除クロマトグラフィー定量試験および純度測定が可能なＧｌｙ−ＴＢ４サイズ排除クロマトグラフィー純度試験（２０１６年１１月１６日付け改正医薬品ＳＯＰ（標準運用手続き）による）に基づいて進行された。その条件は、下記の通りである。
【０１８９】
【表４９】
2021532811.tif 000057
ＳＥＣ−ＨＰＬＣ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
【０１９０】
（２−３）ＲＰ−ＨＰＬＣ分析法
Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ後に工程試料に対して分析を進行し、工程試料に対するＲＰ−ＨＰＬＣ分析法は、Ｇｌｙ−ＴＢ４とＩｍｐｕｒｉｔｙを分離できる条件を用いて定量測定が可能なＧｌｙ−ＴＢ４逆相クロマトグラフィー定量試験および純度測定が可能なＧｌｙ−ＴＢ４逆相クロマトグラフィー純度試験（２０１６年１１月１６日付け改正医薬品ＳＯＰ（標準運用手続き）による）に基づいて分析を進行した。その条件は、下記の通りである。また、ＳＯＰ改正前に進行した１ｓｔ  ＆  ２ｎｄ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ精製原液の純度は信頼できない測定値と見なした。
【０１９１】
【表５０】
2021532811.tif 000058
ＲＰ−ＨＰＬＣ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｍｅｔｈｏｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
【０１９２】
（２−４）Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ分析法
Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ定量は、バイネックスで分析法開発したＧｌｙ−ＴＢ４のＰＴＳを用いたエンドトキシン試験法に基づいて進め、これを通じて工程試料中のＥｎｄｏｔｏｘｉｎを確認した。
【０１９３】
（２−５）Ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ（ＨＣＰ）分析法
ＨＣＰ定量は、バイネックスで分析法を開発したＧｌｙ−ＴＢ４のＨｏｓｔ  Ｃｅｌｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ分析法に基づいて進行し、これを通じて工程試料中のＨＣＰ除去傾向を確認した。
【０１９４】
（２−６）Ｈｏｓｔ  ｃｅｌｌ  ＤＮＡ（ＨＣＤ）分析法
ＨＣＤ定量は、バイネックスで分析法を開発したＧｌｙ−ＴＢ４の残留Ｅ．ｃｏｌｉ  ＨＣＤ分析法に基づいて進行し、これを通じて最終産物のＨＣＤ残留量を確認した。
【０１９５】
（２−７）ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析法
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、Ｇｌｙ−ＴＢ４とＩｍｐｕｒｉｔｙをＳｉｚｅによって分離できる条件を用いてＧｌｙ−ＴＢ４の電気泳動試験法に基づいて進行し、これを通じてＩｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅｓを定性的に確認し、必要に応じてｒｅｆｅｒｅｎｃｅをＢＳＡまたは、ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｏｏｌ試料を通じてＤｅｎｓｉｔｏｍｅｔｅｒを使用して定量的にｃｅｌｌ  ｒｅｃｏｖｅｒｙおよびＡＥＸＩ  ｅｌｕｔｅｄ  ｐｏｏｌを定量的に分析した。
【０１９６】
実施例（３）Ａｎｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＡＥＸＩ）
（３−１）予備実験
溶出緩衝液のＮａＣｌ濃度を最大限低減して純度改善を目的として、予備実験を進行した。
【０１９７】
（３−１−１）Ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ溶出位置確認
ＧＳＴ−Ｔβ４が溶出されるＮａＣｌ濃度をｓｃｒｅｅｎｉｎｇするために精製されたＧＳＴ−Ｔβ４  ２ｍｇ（１６０７０９、１ｓｔ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎで確保された２次カラム溶出分画ＩＰＣ試料）を用いて０−５００ｍＭのＮａＣｌの範囲でｌｉｎｅａｒ  ｇｒａｄｉｅｎｔ条件で進行した。その結果、溶出された主ピーク頂点位置は、伝導度２０ｍＳ／ｃｍで確認され、溶出範囲は、２００〜３００ｍＭのＮａＣｌの範囲であることを確認した。
【０１９８】
（３−１−２）ＧＳＴ−Ｔβ４定量分析法（簡易精製）
ＡＥＸＩ工程の場合、Ｌｏａｄｉｎｇ  ＳａｍｐｌｅおよびＥｌｕｔｉｏｎ試料内Ｉｍｐｕｒｉｔｙが多くて、ＵＶ定量法を通じて段階収率を測定することが不可能であった。Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎを用いて標準物質のｐｅａｋ  Ａｒｅａ定量線を算出し、ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎの量を確認できる分析法を開発しようとした（表５１）。
【０１９９】
【表５１】
2021532811.tif 000059
ＧＳＴ−Ｔβ４  Ｑｕａｎｔｉｔｙ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
【０２００】
標準物質は、１ｓｔ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｏｏｌをＤｉｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８）に緩衝液交換して、ＵＶ定量（吸光係数１．３８５）で０．３、０．６、０．９、１．２ｍｇ／ｍＬ濃度の標準物質を製造し、これを表５１に記述された方法で分析した後、ＡＫＴＡ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ  ｐｒｏｇｒａｍ（Ｕｎｉｃｏｎ  ５．１１）を使用してＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ａｒｅａを算出した。算出された値を用いてＬｉｎｅａｒｉｔｙ曲線を作成し、その結果、Ｌｉｎｅａｒｉｔｙ  ０．９９以上の曲線を算出し、ＡＥＸＩ工程試料（ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ＆  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌ）を分析した。
【０２０１】
（３−２）工程時間短縮のためのＦｌｏｗ  ｒａｔｅ検証試験
（３−２−１）実験目的
工程は、６１ｃｍ／ｈｒ線速度を維持し、単位工程所要時間を短縮するために２００ｃｍ／ｈｒまで線速度を増加させようとした。段階収率および純度が維持されるかを確認した。
【０２０２】
（３−２−２）実験方法
ＡＥＸＩ工程は、下記の表（表５２）のように進行した。Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅは、６１ｃｍ／ｈｒと２００ｃｍ／ｈｒを適用してそれぞれ実験を進行した。工程前後の試料に対して（３−１−２）に明示された方法によって分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じてＩｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅを確認した。
【０２０３】
【表５２】
2021532811.tif 000060
ＡＥＸＩ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
【０２０４】
（３−２−３）実験結果
ＡＥＸＩ工程後、Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅによるＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図２３＆図２４に示された通りであり、赤色の点線円で表示した部分は、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｅａｋに該当する。
【０２０５】
各条件別にＥｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌに対するｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ（表５３）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２５）結果、ＡＥＸＩ工程でのＦｌｏｗ  ｒａｔｅを２００ｃｍ／ｈｒに増加させても、段階収率および純度に影響がないことを確認した。ただし、Ｌｏａｄ  ａｍｏｕｎｔが約５ｍｇ／ｍＬ  ｒｅｓｉｎ条件であるから、Ｌｏａｄ  ａｍｏｕｎｔ増加時に再確認が必要てあった。
【０２０６】
【表５３】
2021532811.tif 000061
Ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ＡＥＸＩ  Ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ｓｔｕｄｙ
【０２０７】
（３−３）純度向上のためのＡＥＸＩ  Ｅｌｕｔｉｏｎ条件試験
（３−３−１）実験目的
高価なａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ（ＧＳＴ  ＦＦ）経済性を考慮して、ＤＢＣを最大化しようとした。このために、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅの純度を最大限高めようとした。したがって、従前条件である５００ｍＭのＮａＣｌ条件から２００ｍＭのＮａＣｌ条件に変更して行った後、段階収率および純度を比較分析した。
【０２０８】
（３−３−２）実験方法
実験方法は、（３−２−２）の表５１を基本として使用し（本実験に使用されたｃｅｌｌ  ｃａｋｅ  ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１６０６０３）、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ＢｕｆｆｅｒのＮａＣｌ濃度を５００ｍＭのＮａＣｌと２００ｍＭのＮａＣｌでそれぞれ適用してテストした。工程前後の試料に対して（２−１−２）に明示された方法によってＨＵ０２４を分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じてＩｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅを確認した。
【０２０９】
（３−３−３）実験結果
ＡＥＸＩ工程後、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ組成によるＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図２６＆図２７に示された通りであり、赤色点線円で表示した部分は、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｅａｋに該当する。
【０２１０】
各条件別にＥｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌに対するｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ（表５４）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図２８）結果、ＡＥＸＩ回収率内では差異がなく、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果、Ｔａｒｇｅｔ  ｂａｎｄの下方にあるＭａｊｏｒ  ｉｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｅａｋが、ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌでなく、ｓｔｒｉｐ  ｐｏｏｌで観察されて、純度改善効果を予想することができた。ただし、低くなったＮａＣｌ濃度によって溶出体積が増加する短所が確認された。また、Ｌｏａｄ  ａｍｏｕｎｔを５ｍｇ／ｍＬ  ｒｅｓｉｎ以上増加させる場合、追加実験が必要になり得た。
【０２１１】
【表５４】
2021532811.tif 000062
Ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ＡＥＸＩ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｓｔｕｄｙ
【０２１２】
（３−４）ＡＥＸＩ  Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ
（３−４−１）実験目的
ＡＥＸＩカラムでＬｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅの伝導度は、カラムにＴａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎが結合できる重要な工程変数と知られている。本実験では、適用可能なＬｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅの伝導度範囲を確認し、変更による不純物含量および段階収率変化を確認しようとした。
【０２１３】
（３−４−２）実験方法
実験方法は、（３−２−２）の表５１を基本として使用し（本実験に使用されたｃｅｌｌ  ｃａｋｅ  ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１６０６０３）、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅの伝導度を１０ｍＳ／ｃｍ（８０ｍＭのＮａＣｌ）、８ｍＳ／ｃｍ（５０ｍＭのＮａＣｌ）、ｃｏｎｔｒｏｌ（≦２．８ｍＳ／ｃｍ）で製造し、平衡緩衝液のＮａＣｌ濃度を８０ｍＭ、５０ｍＭ、０ｍＭの条件で製造して使用した。溶出緩衝液組成は、２００ｍＭのＮａＣｌを使用して工程を進行した。工程前後の試料に対して（２−１−２）に明示された方法によってＨＵ０２４を分析し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じてＩｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅを確認した。
【０２１４】
（３−４−３）実験結果
ＡＥＸＩ工程後、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅとＥｑｕｉｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒのＣｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ変化によるＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図２９〜図３１に示された通りであり、赤色の点線円で表示した部分は、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｅａｋに該当する。
各条件別にＥｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌに対する回収率（表５５）およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析（図３２）結果、Ｃｏｎｔｒｏｌ（０ｍＭのＮａＣｌ）と５０ｍＭのＮａＣｌでは、回収率は、それぞれ８１％、９７％と確認されたが、８０ｍＭのＮａＣｌを適用したときは、回収率は、１９．１％と確認されて、Ｆ／Ｔ分画を分析し、分析結果、Ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎがＦ／Ｔ分画で５７％程度あることを確認した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果、ｃｏｎｔｒｏｌと５０ｍＭ  ＮａＣｌ条件との間に純度差異がないことを確認した。
【０２１５】
【表５５】
2021532811.tif 000063
Ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｗｉｔｈ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ｆｏｒ  ＡＥＸＩ
【０２１６】
Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅと平衡緩衝液伝導度条件の試験結果によって、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅの伝導度は、≦２．８ｍＳ／ｃｍの場合と８．０ｍＳ／ｃｍ（５０ｍＭのＮａＣｌ）の場合において段階収率および純度が同等であることを確認することができた。しかしながら、１０ｍＳ／ｃｍ（８０ｍＭのＮａＣｌ）の条件では、Ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎがＦ／Ｔで流出されるので、適用するには適合しないことを確認し、ＡＥＸＩ工程でＬｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅの伝導度は、最大８．０ｍＳ／ｃｍまではＡＥＸＩ  Ｂｉｎｄｉｎｇには大きな影響を与えないことを確認することができた。ただし、Ｌｏａｄ  ａｍｏｕｎｔが５ｍｇ／ｍＬ  ｒｅｓｉｎ以上増加する場合、追加実験が必要であった。
【０２１７】
（３−５）ＡＥＸＩ  Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｃａｐａｃｉｔｙ（ＤＢＣ）Ｔｅｓｔ
（３−５−１）実験目的
ＧＳＴ−Ｔβ４のＡＥＸＩに対するＤＢＣを確認しようとした。
【０２１８】
（３−５−２）実験方法
実験方法は、（３−２−２）の表５１を基本として使用するものの（本実験に使用されたｃｅｌｌ  ｃａｋｅ  ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１６０６０３）、ＣｏｌｕｍｎをＬＲＣ１０  ｃｏｌｕｍｎにＦｒａｃｔｏｇｅｌ  ＴＭＡＥ（Ｍ）を２ｍＬを充填して使用し、Ｗｏｒｋｉｎｇ  ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅは、１５０ｃｍ／ｈｒ（Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ２  ｍＬ／ｍｉｎ）で進め、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒとＥＱ  ｂｕｆｆｅｒの組成は、工程開発で確立された条件（ＥＱ：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０、Ｅｌｕｔｉｏｎ：２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で進行した。Ｌｏａｄ  ａｍｏｕｎｔをそれぞれ１０ｍｇ、８ｍｇ、７．５ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎとして工程を進行した（従前実験条件は、＜５ｍｇ／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ）。Ｆ／ＴとＥｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析し、Ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎが出る位置を確認した。
【０２１９】
（３−５−３）実験結果
Ｆ／Ｔ  ｐｏｏｌとＥｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌをＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分析した結果は、図３３に示された通りである。７．５ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４を注入した場合には、Ｆ／Ｔ  ｐｏｏｌでＴａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎが確認されず、８．０、１０．０ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４を注入した場合には、Ｌｏａｄ  ａｍｏｕｎｔが多いほどＦ／Ｔ  ｐｏｏｌでＴａｒｇｅｔ  ｂａｎｄが多くなることを確認することができた。これを通じてＡＥＸＩのＤＢＣは、７．５ｍｇ／ｍＬ以下と予想された。
【０２２０】
（３−６）ＡＥＸＩ工程試料に対するＨｏｌｄ  ｔｉｍｅ  Ｓｔｕｄｙ
（３−６−１）実験目的
ＧＭＰ生産時に適用可能な保管条件および期間を確保するために、ＡＥＸＩ工程時に溶出分画試料を冷蔵（２〜８℃）、常温（１８〜２２℃）の条件で７日間保管した後、純度変化を確認した。
【０２２１】
（３−６−２）実験方法
実験方法は、（３−２−２）の表５２を基本として使用し（本実験に使用されたｃｅｌｌ  ｃａｋｅ  ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１６０９０６）、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅの伝導度は、８ｍＳ／ｃｍ（５０ｍＭのＮａＣｌ）とし、溶出条件は、２００ｍＭのＮａＣｌ条件を使用した。Ｅｌｕｔｅｄ  ｐｏｏｌを除菌濾過をして、Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅに５００ｕＬずつ小分して冷蔵と常温条件で７日間保管した。Ｓａｍｐｌｉｎｇされた試料を−７０℃に保管して完全に冷凍させ、保管期間終了後に翌日同時にすべてのＳａｍｐｌｅを解凍してＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分析した。
【０２２２】
（３−６−３）実験結果
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を進行した結果は、図３４に示された通りである。冷蔵保管した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果において大きな差異点が発見されなかった。しかしながら、常温保管を進行した結果、２日目から約５５．４ｋＤａに該当するＢａｎｄが増加し、約４０ｋＤａに該当するＢａｎｄは減少することを確認することができた。したがって、ＡＥＸＩ工程試料は、冷蔵状態（２〜８℃）では７日間安定しているが、常温（１８〜２２℃）条件では不安定であることを確認した。
【０２２３】
（３−７）ＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｕｍｍａｒｙ
【０２２４】
【表５６】
2021532811.tif 000064
Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ＡＥＸＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０２２５】
実施例（４）Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）
（４−１）工程時間短縮のためのＦｌｏｗ  ｒａｔｅ条件試験
（４−１−１）実験目的
従前提供工程は、９０ｃｍ／ｈｒ線速度を維持し、単位工程所要時間を短縮するために１８０ｃｍ／ｈｒまで線速度を増加させようとした。段階収率が維持されるかを確認した。
【０２２６】
（４−１−２）実験方法
Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程は、下記の表（表５７）のように進行した。Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅは、９０ｃｍ／ｈｒと１８０ｃｍ／ｈｒを適用してそれぞれ実験を進行した。工程前後の試料に対して（２−１）に明示された方法によってＨＵ０２４を分析して段階収率を確認した。
【０２２７】
【表５７】
2021532811.tif 000065
Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
【０２２８】
（４−１−３）実験結果
Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程による条件別のＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図３５、３６のように確認された。
【０２２９】
各条件別のＥｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌに対する回収率（表５８）結果、Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程でのＦｌｏｗ  ｒａｔｅを１８０ｃｍ／ｈｒで増加させても段階収率に影響がないことを確認した。ただし、Ｌｏａｄ  ａｍｏｕｎｔが約４．４ｍｇ／ｍＬ  ｒｅｓｉｎ条件であるから、Ｌｏａｄ  ａｍｏｕｎｔ増加時に再確認が必要であった。
【０２３０】
【表５８】
2021532811.tif 000066
Ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ｓｔｕｄｙ
【０２３１】
（４−２）Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＤＢＣ）ｔｅｓｔ
（４−２−１）実験目的
ＧＳＴ−Ｔβ４のＡｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎに対するＤＢＣを確認しようとした。
【０２３２】
（４−２−２）実験方法
Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程は、（４−２）の表５７条件で工程を進め、ＬＲＣ１０  ｃｏｌｕｍｎにＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ  ｒｅｓｉｎを１ｍＬ充填し、Ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ７６．４ｃｍ／ｈｒ（ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  １ｍＬ／ｍｉｎ、ただし、溶出時には、１５０ｃｍ／ｈｒ）で適用して進行した。Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅは、ＡＥＸＩ最適化された工程を通じて出たＡＥＸＩ  Ｅｌｕｔｅｄ  ｐｏｏｌ（ＧＳＴ−Ｔβ４  ４１ｍｇ）を注入してＲｅｓｉｎ  ｍａｎｕａｌにあるＤＢＣ（≒１１ｍｇ  ＧＳＴ−ｔａｇｇｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ／ｍＬ  ｍｅｄｉａ）よりｏｖｅｒｌｏａｄｉｎｇをし、Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程後に工程試料は、２−１項のＵＶ定量法を通じて分析した。
【０２３３】
（４−２−３）実験結果
Ｒｅｓｉｎ  １ｍＬにＯｖｅｒｌｏａｄｉｎｇした後、溶出して確保した溶出分画の含量を測定し（表５９）、ＧＳＴ−Ｔβ４に対するＧｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  ＦｌｏｗのＤＢＣは、９．３ｍｇ／ｍＬと確認された。
【０２３４】
【表５９】
2021532811.tif 000067
ＤＢＣ  ｆｏｒ  Ｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ  ４  Ｆａｓｔ  Ｆｌｏｗ
【０２３５】
（４−３）ＡＥＸＩ工程スケールアップおよびＡｆｆｉｎｉｔｙ工程再現性実験
（４−３−１）実験目的
ＡＥＸＩ工程スケールアップ実験（ＸＫ１６→ＸＫ５０）を行った。
Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程条件（Ｓａｍｐｌｅ  ｌｏａｄｉｎｇ時にｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ８０ｃｍ／ｈｒ、Ｅｌｕｔｉｏｎ時にｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  １５０ｃｍ／ｈｒ、ＬＲＣ１０→ＸＫ５０条件）を所内で行って、再現性およびスケールアップ実験を行った。
【０２３６】
（４−３−２）実験方法
ＡＥＸＩ工程は、（３−７）に明示された条件を同一に適用し、カラムは、それぞれＸＫ１６（ｈ：２０ｃｍ）とＸＫ５０（ｈ：２０ｃｍ）を適用した。Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程は、下記の表（表６０）のように進行し、カラムは、それぞれＬＲＣ１０（ｈ：１５ｃｍ）、ＸＫ５０（ｈ：１５ｃｍ）を適用して進行した。
【０２３７】
【表６０】
2021532811.tif 000068
Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ
【０２３８】
（４−３−３）実験結果
ＡＥＸＩカラムスケールアップ結果、ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図３７のように確認され、段階収率は、表６１のように確認された。
【０２３９】
【表６１】
2021532811.tif 000069
ＡＥＸＩ  ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ｓｃａｌｅ  ｕｐ  ｓｔｕｄｙ  ｆｒｏｍ  ＸＫ１６  ｔｏ  ＸＫ５０
【０２４０】
２種類のカラムで類似した段階収率が測定されてスケールアップされたことを確認した。溶出分画は、その後、Ａｆｆｉｎｉｔｙカラムにそれぞれ適用した（図３８、表６２）。
【０２４１】
【表６２】
2021532811.tif 000070
Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔ  ｉｎ  ＬＲＣ１０  ａｎｄ  ＸＫ５０  ｓｃａｌｅ
【０２４２】
先行実験で決定されたＤＢＣ  ９．３ｍｇ／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎの９０％水準に設定して（８．６ｍｇ／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ）進行、Ｌｏａｄｉｎｇ  ８０ｃｍ／ｈｒ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  １５０ｃｍ／ｈｒ）で行った結果、段階収率は、６０％と７３％であることが確認された。
【０２４３】
（４−４）Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ  ｃｌｅａｎｉｎｇ
（４−４−１）Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ
５０Ｌ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ  １ｓｔバッチで６Ｍ  ＧＨＣｌ処理ＣＩＰ後に測定されたエンドトキシン含量が０．１ＥＵ／ｍＬより高く測定されて、その他ＣＩＰ方法を追加して進行した（表６３）。
【０２４４】
【表６３】
2021532811.tif 000071
Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｒｅｍｏｖａｌ  ｉｎ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｃｏｌｕｍｎ  ｂｙ  ｖａｒｉｏｕｓ  ＣＩＰ  ｍｅｔｈｏｄｓ
【０２４５】
０．１Ｎ  ＮａＯＨとＧＥで推薦したＥｔｈａｎｏｌを適用するＣＩＰ方法（ＣＩＰ  Ｒｕｎ５）に変更して後続工程に適用することとした（表６３）。
【０２４６】
（４−５）Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程試料に対するＨｏｌｄ  Ｔｉｍｅ  Ｓｔｕｄｙ
（４−５−１）実験目的
Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程試料を冷蔵（２〜８℃）、常温（１８〜２２℃）条件で７日間保管後、純度変化を確認して、工程試料保管条件および期間を設定しようとする。
【０２４７】
（４−５−２）実験方法
実験方法は、（４−２）の表５８を基本として使用し、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅは、（３−６）でのＡＥＸＩ  Ｈｏｌｄ  ｔｉｍｅ  Ｓｔｕｄｙ試料を除いた残りの工程試料を使用した。Ｅｌｕｔｅｄ  ｐｏｏｌを除菌濾過をしてＭｉｃｒｏｔｕｂｅに５００ｕＬずつ小分して冷蔵と常温条件で７日間保管した。Ｓａｍｐｌｉｎｇされた試料を−７０度に保管して完全に冷凍させ、保管期間終了後に翌日同時にすべてのＳａｍｐｌｅを解凍してＳＤＳ−ＰＡＧＥを通じて分析した。
【０２４８】
（４−５−３）実験結果
各保管条件（常温、冷蔵）試験後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を進行した結果は、図３９に示された通りである。冷蔵と常温保管した試料のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析結果において大きな差異点が発見されなかった。したがって、Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程試料は、冷蔵状態（２〜８℃）または常温保管（１８〜２２℃）条件で７日間安定していることが確認された。
【０２４９】
（４−６）Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｕｍｍａｒｙ
【０２５０】
【表６４】
2021532811.tif 000072
Ｓｕｍｍｅｒｙ  ｏｆ  ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０２５１】
実施例（５）Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ
（５−１）Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ
中国工程に基づいてＴｈｒｏｍｂｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ条件（２．６ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４）を適用したとき、Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｏｏｌ内のＴａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ濃度が低い場合、Ｅｎｚｙｍｅ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙが低いことを確認した。（Ａｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｏｏｌの濃度０．３ｍｇ／ｍＬでＴｈｒｏｍｂｉｎ  ２ｍｇ／ｕｎｉｔを入れると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上、約５０％のみが反応が進行された）。したがって、本実験では、１ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４／２ｕｎｉｔ  ｏｆ  Ｔｈｒｏｍｂｉｎを適用し、反応時間は、１６時間に固定した後、反応温度範囲設定のために１３〜２７℃の範囲で酵素切断効率が類似しているかを確認しようとした。
【０２５２】
【表６５】
2021532811.tif 000073
Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
【０２５３】
（５−２）Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｓａｍｐｌｅ準備
Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙを進行するためにＡＥＸＩ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程を進行し、工程条件は、工程開発で明示された条件を用いて進行された。工程が完了したＡｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｏｏｌは、４０ｍＬずつＣｏｎｉｃａｌ  ｔｕｂｅに小分した後、冷凍（−２０℃）に保管して、必要に応じて解凍して使用した。
【０２５４】
（５−３）反応温度別にＴｈｒｏｍｂｉｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ  ｓｔｕｄｙ
（５−３−１）実験目的
Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎの反応条件で、追加で温度範囲を設定しようとした。
【０２５５】
（５−３−２）実験方法
（５−２）で製造したＡｆｆｉｎｉｔｙ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌ（２０９．１ｍｇ  ＧＳＴ−Ｔβ４）を使用し、Ｔｈｒｏｍｂｉｎは、反応させるＡｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｏｏｌ体積の１５％（ｖ／ｖ）の２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０に溶解した後、各Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌに処理した。その後、表６５に明示された方法によって反応させ、ただし、反応温度は、それぞれ１５±２℃（ｃｏｌｄ  ｒｏｏｍ）、２０±２℃（ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）、２５±２℃（Ｉｎｃｕｂａｔｏｒ）で同時に反応を進行した。反応が完了した試料は、（２−２）に明示されたＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析を通じてＧｌｙ−Ｔβ４を定量的に確認して収率を確認した（２０１６−０３７、ｐ１３、１８）。
【０２５６】
（５−３−３）実験結果
反応温度別にＴｈｒｏｍｂｉｎ  Ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ完了した試料のＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析結果は、図４０のように確認された。Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍと回収率（表６６）を確認したとき、温度による大きな差異点は確認することができなかった。したがって、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ反応温度条件は、１３〜２７℃で収率と純度に影響がないことが確認された。
【０２５７】
【表６６】
2021532811.tif 000074
Ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ｍｉｘｔｕｒｅｓ
【０２５８】
実施例（６）４次工程Ｓｔｄｕｙ
（６−１）Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ
５０Ｌ  １ｓｔ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ結果によれば、ＡＥＸＩＩ工程でＦ／Ｔ  Ｆｒａｃｔｉｏｎでｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ流出が観察され、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌのＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣの純度がＦ／Ｔ  Ｆｒａｃｔｉｏｎより低いことを確認した。この実験結果を根拠として、２ｎｄ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎ条件をＦ／Ｔ  Ｍｏｄｅに変更し、純度および収率の観点から改善されたが、最終精製原液のＳＥ−ＨＰＬＣ分析時に、純度は９７．０％に追加的な向上が必要てあり、最適化にならないＲＰ−ＨＰＬＣ分析時にも、９８．７％純度と確認され、４次カラム導入を考慮することになった。
【０２５９】
（６−２）４次カラム工程開発のための試料生産
４次カラム工程実験に必要な試料確保のために、２ｎｄ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ条件であるＦ／Ｔ  ｍｏｄｅでＡＥＸ  ＩＩ工程を進行して試料を準備した。試料生産のために５Ｌ  ＤＯＥ  Ｂａｔｃｈ  ２個（Ｂａｔｃｈ  Ｎｏ．１６１０１９−Ｂ１、Ｂ２）をＤｅｐｔｈ  ｓｉｚｉｎｇ  ＴｅｓｔのためにＣｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅを準備した。Ｓｉｚｉｎｇ  ｔｅｓｔ後に、残ったｃｅｌｌ  ｌｙｓａｔｅ（約１２００ｍＬ）を用いてＡＥＸＩ、Ａｆｆｉｎｉｔｙ、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ、ＡＥＸＩＩ工程を進行して７０９９ｍｇのＧｌｙ−Ｔβ４を確保した。ＡＥＸＩとＡｆｆｉｎｉｔｙは、（３−７）と（４−１）によって進行するものの、Ｃｏｌｕｍｎ  ｓｃａｌｅは、ＡＥＸＩ（ＸＫ５０、ｈ：２０ｃｍ）、Ａｆｆｉｎｉｔｙ（ＸＫ５０、ｈ：１５ｃｍ）で適用し、ＡＥＸＩＩ工程は、表６７に明示された方法によって進行した。確保した試料は、Ｍｉｃｒｏｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ（０．２μｍ）した後、１００ｍＬずつ小分して−２０℃に保管し、これを用いて４次カラム工程開発を進行した。
【０２６０】
【表６７】
2021532811.tif 000075
ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
【０２６１】
確保された３次カラム溶出分画の段階収率および純度を分析した（表６８、表６９）。ＳＥ−ＨＰＬＣ純度は、９８．９％まで向上したが、ＲＰ−ＨＰＬＣ純度は９７．６％を示した。しかしながら、最適化されたＲＰ−ＨＰＬＣ分析法で分析時に９２．２％まで純度が低下し、したがって、９９．０％以上純度を改善しようとした。
【０２６２】
【表６８】
2021532811.tif 000076
Ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｏｆ  ＡＥＸ  ＩＩ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｌｏａｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｏｎ  ４ｔｈ  ｃｏｌｕｍｎ
【０２６３】
【表６９】
2021532811.tif 000077
Ｐｕｒｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｆｔｅｒ  ＵＦ／ＤＦ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒｉｎｇ  ｌｏａｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｏｎ  ４ｔｈ  ｃｏｌｕｍｎ
【０２６４】
（６−３）Ｒｅｓｉｎ  ｓｃｏｕｔｉｎｇ
（６−３−１）Ｃａｔｉｏｎ  Ｅｘｃｈａｎｇｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（ＣＥＸ）ｐｒｏｃｅｓｓ
純度向上のために基本的なＣＥＸレジンであるＳＰ  ＦＦを適用してみた（表７０）。
【０２６５】
【表７０】
2021532811.tif 000078
ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ａｓ  ４ｔｈ  ｃｏｌｕｍｎ
【０２６６】
ＣＥＸ工程を進行したＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図４１のように確認された。Ｐｅａｋが２個に分離されて出、各ｐＨ４．５と５．０で進行した工程のＳｔｅｐ  Ｙｉｅｌｄを確認した（表７１）。
【０２６７】
【表７１】
2021532811.tif 000079
Ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｂｙ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｐＨ
【０２６８】
ｐＨ５．０の場合、分離されるＰｅａｋは観察されず、回収率がｐＨ４．５条件より低いことを確認した。これは、Ｆ／Ｔ  ｆｒａｃｔｉｏｎを分析したとき、Ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎが確認されて、これに起因したものと予想してみることができた。したがって、ｐＨ４．５条件のみをＲＰ−ＨＰＬＣ分析し、それに対する結果は、図４２のように確認された。
【０２６９】
Ｍａｉｎ  ｐｅａｋの前方と後方のＩｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｅａｋが多く除去されたことを確認し、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅとＥｌｕｔｉｏｎ  ｓａｍｐｌｅのＲＰ−ＨＰＬＣ  ｐｕｒｉｔｙは、それぞれ９２．２％、９７．６％であることが確認された。しかしながら、Ｍａｉｎ  ｐｅａｋの前方に存在するＩｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｅａｋは除去されず、ＵＦ／ＤＦを進行した結果（表６９）でのＲＰ−ＨＰＬＣ純度（９７．６％）と大きな差異がなかったので、９９％以上純度を確保するためにＣＥＸ形態レジンの代わりに疎水性レジンを確認しようとした。
【０２７０】
（６−３−２）Ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＨＩＣ）ｐｒｏｃｅｓｓ
Ｍａｉｎ  ＩｍｐｕｒｉｔｙとＴａｒｇｅｔ  ｐｅａｋのＲＰ−ＨＰＬＣ分析で分離されるという点を考慮して疎水性カラムを試み、工程条件は、表７２のように進行した。疎水性程度によって２個のレジン（Ｂｕｔｙｌ、ｐｈｅｎｙｌ）を実験し、Ｓａｌｔの条件は、ＮａＣｌとＮａ２ＳＯ４２個を使用した。
【０２７１】
【表７２】
2021532811.tif 000080
ＨＩＣ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ａｓ  ４ｔｈ  ｃｏｌｕｍｎ
【０２７２】
進行された工程Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図４３のように確認された。Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍの前方に高いＰｅａｋが形成され、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｅｐに観察されるＰｅａｋは存在しなかった。
【０２７３】
結果的に、２個のレジンが全部Ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎが結合せず、したがって、追加進行はなかった。
【０２７４】
（６−３−３）Ｍｉｘｅｄ−Ｍｏｄｅ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ（ＭＭＣ）ｐｒｏｃｅｓｓ
ＣＥＸとＨＩＣ  ＲｅｓｉｎのＳｔｕｄｙ結果、ｍａｉｎ  Ｉｍｐｕｒｉｔｙ（ＲＰ−ＨＰＬＣ分析法ｖｅｒ  １．０を適用したときの１７．５ｍｉｎ  ｐｅａｋ）の除去を確認することができなかった。したがって、ＣａｐｔｏｍＭＣを適用してみた。
【０２７５】
（６−３−３−１）実験方法
ＭＭＣ  Ｒｅｓｉｎの場合、Ｂｉｎｄｉｎｇ条件は、ＣＥＸ  Ｍｏｄｅ作動を誘導するために、低いｐＨでＰｒｏｃｅｓｓを進行し、普通は、ｐＨを中性に変えながら、ｐＨとＳａｌｔ  ｇｒａｄｉｅｎｔを与えてＥｌｕｔｉｏｎをする方法を使用する（参考文献６．２）。実験を通じてＥＱ  ｂｕｆｆｅｒのｐＨ４．５〜５．０、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ  ｐＨ４．５〜７．５に変更して進行し、その結果、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐＨが高まるほどＰｅａｋの面積が狭くなって、Ｍａｉｎ  ｉｍｐｕｒｉｔｙとＴａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎの分離能が低下することを確認した。したがって、Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ条件は、低いｐＨで行うことが適切であると判断された。したがって、低いｐＨ（ＥＱ、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒ、ｐＨ４．５）条件で表７３の条件のように進行した。
【０２７６】
【表７３】
2021532811.tif 000081
ＭＭＣ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ａｓ  ４ｔｈ  ｃｏｌｕｍｎ
【０２７７】
Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌをＦｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎしてそれぞれＲＰ−ＨＰＬＣ分析を進行し、純度９８％以上ｐｏｏｌを集めて、純度および収率を確認した。
【０２７８】
（６−３−３−２）実験結果
Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣを進行したＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図３７のように確認された。Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｅｐで単一ｐｅａｋで形成されることが確認され、各ＦｒａｃｔｉｏｎをＲＰ−ＨＰＬＣ（ｖｅｒ  １．０）分析した結果は、図４４に示された通りである。その結果、ｐｅａｋ前方のｆｒａｃｔｉｏｎには、ｍａｉｎ  Ｉｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｅａｋが高く確認されるのに対し、Ｐｅａｋ中間から後方までのＦｒａｃｔｉｏｎには、Ｍａｉｎ  ｉｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｅａｋがほとんど確認されないことを確認することができた。
【０２７９】
溶出分画別にＲＰ−ＨＰＬＣ純度分析結果を見ると、Ｍａｉｎ  ｉｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｅａｋが前方分画に偏重されて存在することを確認することができた。Ｂ８、Ｂ７、Ｂ６分画をｐｏｏｌｉｎｇした場合、７０％段階収率に９９．６％純度を確保することができた（表７４）。
【０２８０】
【表７４】
2021532811.tif 000082
Ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０２８１】
（６−４）４次工程最適化ｓｔｕｄｙ  １
（６−４−１）実験目的
段階収率向上のためのＳｔｅｐ  ｅｌｕｔｉｏｎ条件最適化実験を進行した。
【０２８２】
（６−４−２）実験方法
ＳｔｅｐによるＴａｒｇｅｔ溶出条件を確認し、溶出される条件は、２００ｍＭのＮａＣｌ以上で溶出されることを確認することができた。これを通じてＴａｒｇｅｔが溶出され得るＳａｌｔ濃度より低くＷａｓｈｉｎｇ  ｓｔｅｐ条件を１８５ｍＭのＮａＣｌを適用して確認しようとし、基本的な精製条件は、（６−３−３−１）の表７３によって進行するものの、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｂｕｆｆｅｒのＮａＣｌ濃度を４００ｍＭに変更した。また、確認された条件でＬｏａｄｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔｓを増加させたとき、工程再現性を確認しようとした。
【０２８３】
（６−４−３）実験結果
Ｗａｓｈ  ｓｔｅｐを１８５ｍＭのＮａＣｌ（ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ２０．７〜２１．２ｍＳ／ｃｍ）を適用したＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図４６に示された通りである。０．５ｍｇ／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎでＬｏａｄｉｎｇした後、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｅｐ  ｆｒａｃｔｉｏｎ（Ｃ６〜Ｃ９）をそれぞれ２種類でｐｏｏｌｉｎｇしてＲＰ−ＨＰＬＣを確認し、それぞれ９８．６％（Ｃ６〜Ｃ９  ｐｏｏｌ）、９９．０％（Ｃ７〜Ｃ９  ｐｏｏｌ）であって、９８％以上、Ｙｉｅｌｄでは、Ｃ６〜Ｃ９  Ｆｒａｃｔｉｏｎをｐｏｏｌｉｎｇしたとき、７８．７％を確認することができた（表７５）。
【０２８４】
【表７５】
2021532811.tif 000083
Ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｏｆｍＭＣ  ｓｔｅｐ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏａｄｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔｓ  ０．５ｍｇ／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ）
【０２８５】
【表７６】
2021532811.tif 000084
Ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｏｆｍＭＣ  ｓｔｅｐ  ｅｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏａｄｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔｓ  ４．０ｍｇ／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ
【０２８６】
しかしながら、４７．８ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４をＬｏａｄｉｎｇした場合（４．０ｍｇ／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ）、大部分Ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎがｗａｓｈ段階で流れ出、収率は、３２％であることが確認されて（表７６）、工程適用が不可能であった。
【０２８７】
（６−５）４次工程最適化ｓｔｕｄｙ  ２
（６−５−１）実験目的
Ｌｏａｄｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔｓを従前０．５ｍｇよりは高く、４．０ｍｇよりは低い３ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ条件で、Ｗａｓｈｉｎｇ  ｓｔｅｐのＮａＣｌ濃度条件（１００、１２０、１４０ｍＭ）による純度および段階収率を確認した。
【０２８８】
（６−５−２）実験方法
実験方法は、表７７に示された通りである。工程後の試料は、ＲＰ−ＨＰＬＣ（ｖｅｒ  ２．０）によって分析し、分析結果を通じて工程試料の純度と段階収率を確認した。
【０２８９】
【表７７】
2021532811.tif 000085
ＭＭＣ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｏｆ  ３ｍｇ／ｍＬ  ｒｅｓｉｎ
【０２９０】
（６−５−３）実験結果
各Ｗａｓｈｉｎｇ  ｓｔｅｐのＮａＣｌ濃度によるＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、下記の通りである（図４７、４８、４９）。Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｅｐでＰｅａｋが２個に分かれることを確認することができた。これは、Ｅｌｕｔｉｏｎ  Ｂｕｆｆｅｒ内ｓａｌｔによりｐＨが低下してＥｌｕｔｉｏｎが遅延されるものと推測された。分けられた２個のＥｌｕｔｉｏｎ  ｐｅａｋを分画してそれぞれ分析後にｐｏｏｌｉｎｇ後に再分析した（表７８）。
【０２９１】
【表７８】
2021532811.tif 000086
Ｐｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  Ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｏｆｍＭＣ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ  ＮａＣｌ  ｆｏｒ  ｗａｓｈｉｎｇ
【０２９２】
１００ｍＭのＮａＣｌでＷａｓｈｉｎｇを進行した場合、収率の観点からは、９５％と高いが、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌの平均純度は、９３．７％程度であって、Ｉｍｐｕｒｉｔｙを除去するには不足することが確認された。１４０ｍＭのＮａＣｌでＷａｓｈｉｎｇの場合は、純度の観点からは、９９％以上を満たすが、収率が４７％と非常に低いことを確認した。したがって、純度および収率において最も適合したＷａｓｈｉｎｇ  ｓｔｅｐのＮａＣｌ濃度は、１２０ｍＭと確認され、そのときの収率は、７４％、純度は、９９％以上であることを確認することができた。
【０２９３】
（６−６）４次工程Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＤＢＣ）Ｔｅｓｔ
（６−６−１）実験目的
Ｇｌｙ−Ｔβ４に対するＭＭＣのＤＢＣを確認しようとした。
【０２９４】
（６−６−２）実験方法
実験方法は、表７９のように行い、Ｗａｓｈｉｎｇ  ｓｔｅｐなしにＢｉｎｄｉｎｇしたタンパク質を一度にＥｌｕｔｉｏｎしてＲＰ−ＨＰＬＣを通じて定量を進行した。
【０２９５】
【表７９】
2021532811.tif 000087
Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＤＢＣ  ｔｅｓｔ
【０２９６】
（６−６−３）実験結果
Ｒｅｓｉｎ  １ｍＬにＯｖｅｒｌｏａｄｉｎｇして得られたＭＭＣ工程試料に対するＲＰ−ＨＰＬＣ分析結果は、次の表（表８０）に示された通りであり、Ｇｌｙ−Ｔβ４に対するＣａｐｔｏ  ＭＭＣのＤＢＣは、９．６ｍｇ／ｍＬであることが確認された。この結果は、以前の実験結果と差異を示し、すなわち４．０ｍｇ／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎの条件で大部分タンパク質がＷａｓｈ分画に存在した。したがって、２つの実験間の条件差異（ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ２００  ｖｓ  ７６ｃｍ／ｈｒ）を疑った。
【０２９７】
【表８０】
2021532811.tif 000088
ＤＢＣ  ｆｏｒ  Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０２９８】
（６−７）Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  Ｐｒｏｃｅｓｓ要約
【０２９９】
【表８１】
2021532811.tif 000089
Ｓｕｍｍａｒｙ  ｆｏｒ  Ｃａｐｔｏ  ＭＭＣ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０３００】
実施例（７）提供工程研究
（７−１）Ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ
ＡＥＸＩ工程のｌｏａｄ  ｓａｍｐｌｅ伝導度条件と溶出緩衝液のＮａＣｌ濃度が変更され、ＡＥＸＩＩ工程をｂｉｎｄ−ｅｌｕｔｅ  ｍｏｄｅに変更し、４次カラムとしてＮｕｖｉａ  ＨＲ−Ｓレジンを使用する工程が最終工程に決定された。また、最終精製原液の純度基準は、９７％以上（ｏｎ  ＲＰ−ＨＰＬＣ）と確定された。したがって、工程を小規模実験で再現し、スケールアップする業務を行った。
【０３０１】
【表８２】
2021532811.tif 000090
ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ＤＳＰ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
【０３０２】
（７−２）３次および４次カラム工程研究用試料準備
本実験に使用された試料は、（５−２）に明示されたＡｆｆｉｎｉｔｙ  ｐｏｏｌを使用し（ＧＳＴ−Ｔβ４濃度６．９７ｍｇ／ｍＬ）、３次工程を進行する前日に表６５に明示された方法で進行してＴｈｒｏｍｂｉｎ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎを始めて準備した。
【０３０３】
（７−３）３次カラム工程研究（ＡＥＸＩＩ−Ｂ／Ｅ  ｍｏｄｅ）
（７−３−１）３次カラム工程Ｄｙｎａｍｉｃ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＤＢＣ）確認
（７−３−１−１）実験目的
ＡＥＸＩＩに対するＤＢＣを確認しようとした。ただし、Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅは、従前２００→１５３ｃｍ／ｈｒに変更して進行した。
【０３０４】
（７−３−１−２）実験方法
実験方法は、表８３のように行い、カラムに試料をＯｖｅｒｌｏａｄｉｎｇ（５ｍｇ／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ）した後、溶出分画をＳＥＣ−ＨＰＬＣ方法で定量して溶出されたＧｌｙ−Ｔβ４の量を確認した。
【０３０５】
【表８３】
2021532811.tif 000091
ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＢＣ  ｔｅｓｔ
【０３０６】
（７−３−１−３）実験結果
Ｒｅｓｉｎ  ２ｍＬにＯｖｅｒｌｏａｄｉｎｇして得られたＥｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌに対するＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析結果は、図５１に示された通りである。ＡＥＸＩＩにＯｖｅｒｌｏａｄｉｎｇしたとき、ＧＳＴも一緒に出ることが確認され、ＡＥＸＩＩに次のような条件の場合、ＡＥＸＩＩにつくＧｌｙ−Ｔβ４  ＤＢＣは、１．７ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４／ｍＬであることが確認された（表８４）。ただし、流速が１５３→２００ｃｍ／ｈｒに変更される場合、追加実験が必要であった。
【０３０７】
【表８４】
2021532811.tif 000092
ＤＢＣ  ｆｏｒ  ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０３０８】
（７−３−２）３次カラム工程再現性実験
（７−３−２−１）実験目的
設定されたＤＢＣに約９０％のみを適用し、流速を２００ｃｍ／ｈｒに増加させて、再現性有無（段階収率８０％内外、純度ＲＰ−ＨＰＬＣ  ９０〜９６％水準）を確認しようとした。
【０３０９】
（７−３−２−２）実験方法
３次工程に対する実験方法は、次の表８５のように進行し、工程が完了した実験に対しては、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを通じて定量を確認し、ＲＰ−ＨＰＬＣを通じて純度分析を進行した。
【０３１０】
【表８５】
2021532811.tif 000093
ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
【０３１１】
（７−３−２−３）実験結果
Ｒｅｓｉｎ  ｍＬ当たり１．０ｍｇと１．５ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４をそれぞれＬｏａｄｉｎｇして工程を進行したＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図５２、５３に示された通りである。
【０３１２】
Ｅｌｕｔｉｏｎ前に高いＵＶ  ｐｅａｋが確認され、ｐｅａｋを分析した結果、Ｔａｒｇｅｔ  ｐｒｏｔｅｉｎがないことが確認されて、Ｉｍｐｕｒｉｔｙ（ＧＳＨ）に起因したｐｅａｋであることが確認された。工程に対する回収率および純度は、表８６のように確認された。
【０３１３】
【表８６】
2021532811.tif 000094
Ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｆｏｒ  ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０３１４】
Ｌｏａｄｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔｓに対する回収率および純度において大きな差異点が観察されなかった。したがって、ＡＥＸＩＩのＤＢＣおよび条件に対する再現性を確認することができた。
【０３１５】
（７−３−３）３次工程Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ体積減少実験
（７−３−３−１）実験目的
Ｂ／Ｅ  ｍｏｄｅに変更されるに従って、従前１０倍の希釈倍数を適用するときに増加するＬｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ体積を減らすために、４倍希釈するとき、影響があるかを確認しようとした。
【０３１６】
（７−３−３−２）実験方法
実験方法は、表８５に明示された方法と同一に進行し、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ準備は、ＤＷで４倍希釈して伝導度を２〜３ｍＳ／ｃｍで維持した。工程後に試料に対してＳＥＣ−ＨＰＬＣを通じて定量をし、ＲＰ−ＨＰＬＣを通じて純度を分析した。
【０３１７】
（７−３−３−３）実験結果
Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅの伝導度を変更した後、工程を進行したＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図５５に示された通りである。
【０３１８】
【表８７】
2021532811.tif 000095
Ｐｕｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｙｉｅｌｄ  ｏｆ  ＡＥＸＩＩ  ｗｉｔｈ  ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  ｏｆ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ
【０３１９】
Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ希釈倍数の減少により伝導度が増加（１ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４／ｒｅｓｉｎ  ｍＬ  Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  １．１６→２．７６ｍＳ／ｃｍ、１．５ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４／ｒｅｓｉｎ  ｍＬ  Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ｃｏｎｄｕｃｔｉｖｉｔｙ  １．１３→２．８０ｍＳ／ｃｍ）したが、収率と純度が全部（表８７）大きな差異点を確認することができなかった。
【０３２０】
（７−３−４）３次工程Ｈｏｌｄ  ｔｉｍｅ  ｓｔｕｄｙ
（７−３−４−１）実験目的
ＧＭＰ生産時に適用可能な保管条件および期間を確保するために、ＡＥＸＩＩ工程時に溶出分画試料を冷蔵（２〜８℃）、常温（１８〜２２℃）条件で７日間保管した後、純度変化を確認した。
【０３２１】
（７−３−４−２）実験方法
実験方法は、５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ工程で３次工程Ｅｌｕｔｅｄ  ｐｏｏｌを除菌濾過をして、Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅに３００ｕＬずつ小分して冷蔵と常温条件で７日間保管した。この際、保管期間終了時点に試料を−７０度に保管して完全に冷凍した後、保管期間が全部終了した翌日に同時にすべての試料を解凍した後ねＲＰ−ＨＰＬＣを通じて分析した。
【０３２２】
（７−３−４−３）実験結果
各保管条件（常温、冷蔵）の試験後、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を進行したＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図５６に示された通りであり、ＰｕｒｉｔｙとＭａｉｎ  ｐｅａｋに対するＡｒｅａを示した表は、表８８のように確認された。
【０３２３】
工程試料の安定性判定基準は、（２−３）のＲＰ−ＨＰＬＣ分析法によるシステム適合性基準（％ＣＶ≦２．０％）に基づいて期間が経過することによるＭａｉｎ  ｐｅａｋのＡｒｅａの％ＣＶは、２．０以下と確認されて、変化がないものと判断した。したがって、３次工程試料は、冷蔵状態（２〜８℃）または常温保管条件（１８〜２２℃）で７日間安定したことが確認された。
【０３２４】
【表８８】
2021532811.tif 000096
ＲＰ−ＨＰＬＣ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＡＥＸＩＩ  ｈｏｌｄ  ｔｉｍｅ  ｓｔｕｄｙ
（７−３−５）ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｕｍｍｕｒｙ
【０３２５】
【表８９】
2021532811.tif 000097
Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０３２６】
（７−４）４次カラム工程研究
（７−４−１）組にしても再現性確認実験
４次カラム再現性実験に使用するＬｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅは、ＡＥＸＩＩのＥｌｕｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａを５０Ｌ  ２ｎｄ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎの基準（５０ｍＡＵ〜５０ｍＡＵ）を適用してＢ／Ｅ  ｍｏｄｅで進行して準備し、それ以外にすべての４次カラム条件は、下記表９０に記載されたところによって行った。２回反復実験を行った（図５７、５８）。
【０３２７】
【表９０】
2021532811.tif 000098
ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
【０３２８】
【表９１】
2021532811.tif 000099
Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＣＥＸ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔ
【０３２９】
実験結果、主ピーク溶出位置が従来と若干差異を示した（図５７、５８）。実験条件で差異を考察し、Ｒｅｓｉｎ  ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ差異、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅのタンパク質濃度と体積が異なる点以外に同一であった。従来の場合、ＡＥＸＩＩ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌのＧｌｙ−Ｔβ４の濃度は、１〜１．５ｍｇ／ｍＬであったが、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａを５０ｍＡＵ〜５０ｍＡＵで行った所内実験では、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｐｏｏｌのＧｌｙ−Ｔβ４の濃度が０．４ｍｇ／ｍＬと確認された。したがって、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ体積が増加したが、従来行った条件は、７．５ＣＶ、所内で行った２回実験では、それぞれ１４．５、１７．０ＣＶで行われた。正確な原因把握のために、まず、Ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ差異による影響を確認しようとした。
【０３３０】
（７−４−２）Ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ差異による影響
（７−４−２−１）実験目的
Ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ差異による溶出位置差異有無を確認しようとした。
【０３３１】
（７−４−２−２）Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ準備
従来使用したＬｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅと最大限類似に準備するために、ＡＥＸＩＩ  Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｃｒｉｔｅｒｉａを１００ｍＡＵ〜１７２ｍＡＵに変更して溶出分画を確保した。このように準備された溶出分画の純度および段階収率を確認した（表９２）。しかしながら、タンパク質濃度は、０．９ｍｇ／ｍＬであって、従来の１〜１．５ｍｇ／ｍＬより若干低かった。
【０３３２】
【表９２】
2021532811.tif 000100
Ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｆｏｒ  ＡＥＸＩＩ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０３３３】
（７−４−２−３）実験方法
実験方法は、表９０に明示された方法と同一に進行するものの、Ｍａｎｕａｌ  ｐａｃｋｉｎｇしたＸＫ１６（Ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ  ２０ｃｍ、ＣＶ  ４０ｍＬ）カラムとＰｒｅｐａｃｋ  ｃｏｌｕｍｎ（Ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ  １０ｃｍ、ＣＶ  ５ｍＬ）を使用してそれぞれ独立して実験を進行し、工程にＬｏａｄｉｎｇされる条件は、表９３によって同一に合わせて進行した。
【０３３４】
Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅの体積（５．５  ＣＶ）を２回実験で同一に適用した。しかしながら、以前の実験と比較して約３倍程度減少した体積であった。Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅは、２００ｃｍ／ｈｒで一定に維持したが、Ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ差異により実験間にＲｅｓｉｄｅｎｃｅ  ｔｉｍｅは２倍差異があった。以前に行った実験と比較して、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ伝導度が１．７→２．０ｍＳ／ｃｍに若干増加した。その後、工程が完了した試料に対してＲＰ−ＨＰＬＣを通じて純度を分析した。
【０３３５】
【表９３】
2021532811.tif 000101
Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  ｆｏｒ  ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ  ｓｔｕｄｙ
【０３３６】
（７−４−２−４）実験結果
実験を進行した工程に対するＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図５９、６０に示された通りである。Ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ  １０ｃｍで進行した結果は、Ｗａｓｈ  ｓｔｅｐでｐｅａｋが見られず、Ｅｌｕｔｉｏｎ  ｓｔｅｐで出ることを確認することができた。従来のＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍ（図５６）と類似に確認された。
【０３３７】
Ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔを２０ｃｍで進行した結果は、Ｗａｓｈ  ｓｔｅｐ  ８ＣＶ付近から溶出され始め、Ｅｌｕｔｉｏｎ段階で完全に溶出された。しかしながら、同じＢｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ条件で行った以前の実験結果では、Ｗａｓｈ段階で主ピークが完全に溶出された。このような差異は、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ体積差異（１４．５  ｖｓ  ５．５ＣＶ）と関連性があると推測された。
【０３３８】
【表９４】
2021532811.tif 000102
Ｑｕａｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｑｕａｎｔｉｔｙ  ｐｒｏｆｉｌｅ  ｆｏｒ  ＣＥＸ  ｃｏｌｕｍｎ  ｌｅｎｇｔｈ  ｓｔｕｄｙ
【０３３９】
結果的に、Ｒｅｓｉｄｅｎｃｅ  ｔｉｍｅ差異を誘発するＢｅｄ  ｈｅｉｇｈｔを一定に維持するために１０ｃｍ条件を選定し、Ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ  ２００ｃｍ／ｈｒ、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ体積５．５ＣＶ条件で従来結果と同じ溶出位置が再現されることを確認した。
【０３４０】
（７−５）４次カラム工程再現性実験
（７−５−１）４次カラム工程試料準備
４次カラム工程再現性を確認するためにＡＥＸＩＩ工程を進め、３次カラム工程に対する実験方法は、表９０と同一に進行するものの、３次カラム溶出分画試料の体積を減らすために２００ｍＡＵ〜２００ｍＡＵでＰｏｏｌｉｎｇ  ｃｒｉｔｅｒｉａを変更して進行した。３次工程が完了した試料は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ定量とＲＰ−ＨＰＬＣ純度を分析して以前の結果と差異がないことが確認され、その結果は、表９５に示された通りである。
【０３４１】
【表９５】
2021532811.tif 000103
Ｐｕｒｉｔｙ  ＆  ｓｔｅｐ  ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ＣＥＸ  ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ
【０３４２】
（７−５−２）実験目的
Ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ  １０ｃｍ（ＸＫ１６充填）条件でｐｒｅｐａｃｋｅｄ  ｃｏｌｕｍｎでなく、Ｍａｎｕａｌ  ｐａｃｋｉｎｇ方法で充填されたカラムを使用して実験結果が同一に再現されるかを確認しようとした。
【０３４３】
（７−５−３）実験方法
実験方法は、表９６のように進め、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ体積は、以前の実験結果である５．５ＣＶと類似した７．０ＣＶを適用し、Ｌｏａｄｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔは、以前の実験結果である１．１ｍｇより若干多い１．６５ｍｇ  Ｇｌｙ−Ｔβ４／ｍＬ  ｏｆ  Ｒｅｓｉｎ条件で進行した。工程が完了した試料は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣを通じて定量を進行し、ＲＰ−ＨＰＬＣを通じて純度を確認した。
【０３４４】
【表９６】
2021532811.tif 000104
ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
【０３４５】
（７−５−４）実験結果
工程を進行したＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図６１に示された通りであり、予想とは異なって、溶出緩衝液に変更する前に、洗浄段階の最後の部分から主ピークが溶出され始めた。以前の実験結果と比較して溶出が始まる時点が若干速くなった原因は、Ｌｏａｄｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ増加（１．１→１．７ｍｇ／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ）、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ増加（５．５→７．０  ＣＶ）に由来したものと推測された。
【０３４６】
【表９７】
2021532811.tif 000105
Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ＣＥＸ  ｆｅａｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｔｅｓｔ
【０３４７】
【表９８】
2021532811.tif 000106
Ｐｕｒｉｔｙ  ＆  ｙｉｅｌｄ  ｏｆ  ｐｕｒｉｆｉｅｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｆｏｒ  ＣＥＸ  ｂｅｄ  ｈｅｉｇｈｔ  ｓｔｕｄｙ
【０３４８】
ＣＥＸ工程結果、段階収率は、９１％と確認され、純度は、９８．８％と確認された（表９８）。以前の実験結果（９９．７％）より若干低い純度を示し、段階収率は、以前の結果がなくて、比較することができなかった。
【０３４９】
（７−６）４次カラム工程Ｈｏｌｄ  ｔｉｍｅ  ｓｔｕｄｙ
（７−６−１）実験目的
ＧＭＰ生産時に適用可能な保管条件および期間を確保するために、４次カラム溶出分画試料を冷蔵（２〜８℃）、常温（１８〜２２℃）条件で７日間保管した後、純度変化を確認した。
【０３５０】
（７−６−２）実験方法
実験方法は、５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ工程で４次工程Ｅｌｕｔｅｄ  ｐｏｏｌを除菌濾過をして、Ｍｉｃｒｏｔｕｂｅに３００ｕＬずつ小分して冷蔵と常温条件で７日間保管した。この際、保管期間終了時点に試料を−７０度に保管して完全に冷凍した後、保管期間終了後に翌日に同時にすべての試料を解凍した後、ＲＰ−ＨＰＬＣを通じて分析した。
【０３５１】
（７−６−３）実験結果
各保管条件（常温、冷蔵）試験後、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を進行したＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図６２に示された通りであり、Ｐｕｉｒｔｙとｍａｉｎ  ｐｅａｋに対するＡｒｅａを示した表は、表９９のように確認された。工程試料の安定性判定基準は、（２−３）のＲＰＣ−ＨＰＬＣ分析法（ＨＵ０２４−ＳＯＰ−００４）によるシステム適合性基準（％ＣＶ≦２．０％）を適用し、冷蔵および常温保管条件で期間が経過してもＭａｉｎ  ｐｅａｋのＡｒｅａの％ＣＶは、２．０以下と確認されて、変化がないものと判断された。しかしながら、常温保管した試料では、赤色円で表示された部分（Ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｔｉｍｅ  ２７．４ｍｉｎ）のＩｍｐｕｒｉｔｙ  ｐｅａｋがＤａｙ  ０試料と比較したとき、期間が経過するにつれてＰｅａｋ  ａｒｅａが増加することを確認することができた（表１００）。したがって、４次工程試料は、冷蔵状態（２〜８℃）で７日間安定しており、常温保管は適切でないと判断された。
【０３５２】
【表９９】
2021532811.tif 000107
Ｐｕｒｉｔｙ  ｏｎ  ＲＰ−ＨＰＬＣ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＣＥＸ  ｈｏｌｄ  ｔｉｍｅ  ｓｔｕｄｙ
【０３５３】
【表１００】
2021532811.tif 000108
Ｉｍｐｕｒｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｎ  ＲＰ−ＨＰＬＣ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ＣＥＸ  ｅｌｕｔｅｄ  ｐｏｏｌ  ｈｏｌｄ  ｔｉｍｅ  ｉｎ  ｒｏｏｍ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ（１８〜２２℃）
【０３５４】
（７−７）ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｓｕｍｍａｒｙ
【０３５５】
【表１０１】
2021532811.tif 000109
Ｓｕｍｍａｒｙ  ｏｆ  ＣＥＸ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０３５６】
実施例（８）５Ｌ規模培養液精製
（８−１）実験目的
ＸＫ１６のサイズで行った結果をＢＰＧ１００以上のサイズカラムで再現性を確認しようとした。
【０３５７】
（８−２）実験方法
４次カラム精製は、表１０１に明示された方法に基づいて進行し、残りの工程条件は、表１０２のように進行した。Ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎとＡＥＸＩ工程に対しては、（２−６）に記述された方法でＧＳＴ−Ｔβ４標準物質（５０Ｌ  １ｓｔ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎで製造される）を使用して工程段階収率を計算し、Ｔｈｒｏｍｂｉｎ、ＡＥＸＩＩとＣＥＸ工程に対しては、ＳＥＣ−ＨＰＬＣとＲＰ−ＨＰＬＣを用いて段階収率を算出した。また、各工程試料は、（２−４）、（２−５）に記述された方法によってＥｎｄｏｔｏｘｉｎとＨＣＰを分析した。
【０３５８】
【表１０２】
2021532811.tif 000110
５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｂｕｆｆｅｒ  ａｎｄ  ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ
【０３５９】
【表１０３】
2021532811.tif 000111
５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
【０３６０】
【表１０４】
2021532811.tif 000112
Ｌｏａｄｉｎｇ  Ｓａｍｐｌｅ  ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０３６１】
（８−３）実験結果
各工程に対するＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、次のように算出され、本工程開発と大きな差異点がなく行われたことを確認した（図６３、６４、６５）。しかしながら、ＸＫ１６カラム条件で進行されたＣＥＸ以前の実験では、約９ＣＶ以上Ｗａｓｈ進行されたとき、溶出された主ピークが６ＣＶ進行時点から溶出され始めた（図６６）。すでに言及したように、主ピークが溶出し始まる時点が速くなる原因は、Ｌｏａｄｉｎｇ  ａｍｏｕｎｔ増加（１．７→２．８ｍｇ／ｍＬ  ｏｆ  ｒｅｓｉｎ）、Ｌｏａｄｉｎｇ  ｖｏｌｕｍｅ増加（７．０→８．８ＣＶ）に由来することができることをもう一度確認することができた。したがって、４次カラムＬｏａｄｉｎｇ  ｓａｍｐｌｅ情報は、一定の溶出位置を維持するために、将来ＧＭＰ生産時に必ず考慮すべき事項であると判断された。
【０３６２】
【表１０５】
2021532811.tif 000113
Ｙｉｅｌｄ  ＆  ｐｕｒｉｔｙ  ｉｎ  ５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０３６３】
【表１０６】
2021532811.tif 000114
Ｉｍｐｕｒｉｔｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓ
【０３６４】
５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓを通した最終収率は、７．８％と確認され、３次カラム工程溶出液のＲＰ−ＨＰＬＣ純度は、９６．３％であって、小規模実験結果と同等な水準と確認され、４次カラム工程溶出液のＲＰ−ＨＰＬＣ純度も、９８．０％であって、基準９７％以上を満足させた。しかしながら、以前のＣＥＸ小規模精製結果（９９．６％、９８．８％）と比較して相対的に低い純度（９８．４％）を示したが、段階収率は、９９．４％であって、約８％以上増加してから、４次カラム工程時に以前の実験より速くなった主ピーク溶出時点が影響を与えたものと判断された。段階収率の増加による純度低下と予想された（表１０５）。工程由来不純物（ＨＣＰ、Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ）の除去率は、ＡＥＸＩ工程試料対比Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程でＨＣＰ  ９７．０％、Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ９８．０％が除去された。Ａｆｆｉｎｉｔｙ後にＡＥＸＩＩ工程でＥｎｄｏｔｏｘｉｎは９９．９％以上除去され、Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ除去率は、ＡＥＸＩＩ工程で最も優れていることが確認された。最終精製原液のＥｎｄｏｔｏｘｉｎ（≦０．５ＥＵ／ｍｇ）とＨＣＰ（≦１００ｐｐｍ）結果も、基準に適合した（表１０６）。上記結果を根拠としてＧＭＰ技術移転ｐｒｏｔｏｃｏｌを作成した。
【０３６５】
（９−１）実験目的
５０Ｌ規模培養液精製を通じて、非臨床試験用試料を生産し、標準品１００ｖｉａｌを製造しようとした。
【０３６６】
（９−２）実験方法
５０Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎに対する緩衝液に対する条件は、表１０７に示された通りであり、４次カラム工程の場合、５Ｌ  ｓｃａｌｅ  ｐｒｏｃｅｓｓで進行したＷａｓｈｉｎｇ条件とは異なって、ＮａＣｌ濃度を８０ｍＭから６０ｍＭに変更され、その他の工程は、従前と同一に進行された。そして、１、２、３次カラム工程の場合、従前５０Ｌ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｒｕｎで適用したＦｌｏｗ  ｒａｔｅを同一に適用し、４次カラム工程は、ＢＰＧ２００カラムを使用することになって、ＡＫＴＡ  ｐｉｌｏｔで駆動できる最大流速を適用したが、従前２００ｃｍ／ｈｒ条件を適用することができなかった。したがって、１５０ｃｍ／ｈｒ条件を適用して進行した（製造指示および記録書ｂａｔｃｈ  Ｎｏ  ＨＵ０２４−ＲＤ１６０３）。
【０３６７】
【表１０７】
2021532811.tif 000115
2021532811.tif 000116
５０Ｌ  ３ｒｄ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ  ｐｒｏｃｅｓｓ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ
【０３６８】
（９−３）実験結果
各工程にＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｍは、図６７〜図７０のように確認され、再現性ある結果が導き出されることを確認した。累積精製工程収率は、１２．４％であった（表１０８）。
【０３６９】
【表１０８】
2021532811.tif 000117
Ｐｕｒｉｔｙ  ＆  Ｙｉｅｌｄ  ｆｏｒ  ５０Ｌ  ３ｒｄ  Ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ
【０３７０】
各工程に対する工程由来不純物含量を測定した（表１０９）。
【０３７１】
【表１０９】
2021532811.tif 000118
ＨＣＰ  ＆  ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｆｏｒ  ５０Ｌ  ３ｒｄ  ｖｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｒｕｎ
【０３７２】
最終精製原液約１３ｇを確保し、ＲＰ−ＨＰＬＣ純度は、９８．１％と確認されて、基準（９７％以上）に適合することを確認した（表１０８）。ＨＣＰおよびＥｎｄｏｔｏｘｉｎ含量も、基準に適合した（表１０９）。工程由来不純物の単位工程除去率は、Ａｆｆｉｎｉｔｙ工程でＨＣＰ  ９７．７％、Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ９９．５％と確認された。Ａｆｆｉｎｉｔｙ後にＡＥＸＩＩ工程でＥｎｄｏｔｏｘｉｎ単位工程除去率は、９９．９％と確認された。このような結果は、先行実験である５Ｌ規模培養液精製結果と同等であることが分かった。
【０３７３】
前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解しなければならない。
【産業上の利用可能性】
【０３７４】
本発明によれば、高純度のＧｌｙ−Ｔβ４を大規模に安定的に製造することができるところ、産業的利用価値に優れたＧｌｙ−Ｔβ４を経済的にかつ高効率で収得することができるという点から産業的利用価値が大きいものと思われる。
【図１】
2021532811.tif 000119
【図２】
2021532811.tif 000120
【図３】
2021532811.tif 000121
【図４】
2021532811.tif 000122
【図５】
2021532811.tif 000123
【図６】
2021532811.tif 000124
【図７】
2021532811.tif 000125
【図８】
2021532811.tif 000126
【図９ａ】
2021532811.tif 000127
【図９ｂ】
2021532811.tif 000128
【図９ｃ】
2021532811.tif 000129
【図９ｄ】
2021532811.tif 000130
【図９ｅ】
2021532811.tif 000131
【図９ｆ】
2021532811.tif 000132
【図９ｇ】
2021532811.tif 000133
【図９ｈ】
2021532811.tif 000134
【図９ｉ】
2021532811.tif 000135
【図９ｊ】
2021532811.tif 000136
【図９ｋ】
2021532811.tif 000137
【図９ｌ】
2021532811.tif 000138
【図９ｍ】
2021532811.tif 000139
【図１０】
2021532811.tif 000140
【図１１】
2021532811.tif 000141
【図１２】
2021532811.tif 000142
【図１３】
2021532811.tif 000143
【図１４】
2021532811.tif 000144
【図１５】
2021532811.tif 000145
【図１６】
2021532811.tif 000146
【図１７】
2021532811.tif 000147
【図１８】
2021532811.tif 000148
【図１９】
2021532811.tif 000149
【図２０】
2021532811.tif 000150
【図２１】
2021532811.tif 000151
【図２２】
2021532811.tif 000152
【図２３】
2021532811.tif 000153
【図２４】
2021532811.tif 000154
【図２５ａ】
2021532811.tif 000155
【図２５ｂ】
2021532811.tif 000156
【図２６】
2021532811.tif 000157
【図２７】
2021532811.tif 000158
【図２８ａ】
2021532811.tif 000159
【図２８ｂ】
2021532811.tif 000160
【図２９】
2021532811.tif 000161
【図３０】
2021532811.tif 000162
【図３１】
2021532811.tif 000163
【図３２ａ】
2021532811.tif 000164
【図３２ｂ】
2021532811.tif 000165
【図３３ａ】
2021532811.tif 000166
【図３３ｂ】
2021532811.tif 000167
【図３３ｃ】
2021532811.tif 000168
【図３４ａ】
2021532811.tif 000169
【図３４ｂ】
2021532811.tif 000170
【図３５】
2021532811.tif 000171
【図３６】
2021532811.tif 000172
【図３７ａ】
2021532811.tif 000173
【図３７ｂ】
2021532811.tif 000174
【図３８ａ】
2021532811.tif 000175
【図３８ｂ】
2021532811.tif 000176
【図３９ａ】
2021532811.tif 000177
【図３９ｂ】
2021532811.tif 000178
【図４０】
2021532811.tif 000179
【図４１】
2021532811.tif 000180
【図４２】
2021532811.tif 000181
【図４３ａ】
2021532811.tif 000182
【図４３ｂ】
2021532811.tif 000183
【図４４】
2021532811.tif 000184
【図４５】
2021532811.tif 000185
【図４６】
2021532811.tif 000186
【図４７】
2021532811.tif 000187
【図４８】
2021532811.tif 000188
【図４９】
2021532811.tif 000189
【図５０】
2021532811.tif 000190
【図５１】
2021532811.tif 000191
【図５２】
2021532811.tif 000192
【図５３】
2021532811.tif 000193
【図５４】
2021532811.tif 000194
【図５５】
2021532811.tif 000195
【図５６】
2021532811.tif 000196
【図５７】
2021532811.tif 000197
【図５８】
2021532811.tif 000198
【図５９】
2021532811.tif 000199
【図６０】
2021532811.tif 000200
【図６１】
2021532811.tif 000201
【図６２】
2021532811.tif 000202
【図６３】
2021532811.tif 000203
【図６４】
2021532811.tif 000204
【図６５】
2021532811.tif 000205
【図６６】
2021532811.tif 000206
【図６７ａ】
2021532811.tif 000207
【図６７ｂ】
2021532811.tif 000208
【図６７ｃ】
2021532811.tif 000209
【図６８ａ】
2021532811.tif 000210
【図６８ｂ】
2021532811.tif 000211
【図６８ｃ】
2021532811.tif 000212
【図６９ａ】
2021532811.tif 000213
【図６９ｂ】
2021532811.tif 000214
【図７０ａ】
2021532811.tif 000215
【図７０ｂ】
2021532811.tif 000216
【国際調査報告】
2021532811.tif 000217
2021532811.tif 000218
2021532811.tif 000219
2021532811.tif 000220