(57)【要約】  本発明は、ＰＲＡＫの薬物標的としての、腫瘍細胞の転移を抑制または予防する薬物のスクリーニングにおける使用を提供する。本発明は、ＰＲＡＫを腫瘍細胞の転移の標的とする発見に基づき、さらに腫瘍細胞の転移を抑制または予防できる薬物を提供し、前記薬物の活性成分は、ＰＲＡＫの発現レベルを低下させ、またはＰＲＡＫの生物活性を阻害することができ、細胞の遊走、ＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及び／またはＥＭＴにかかわる分子の発現及び／または機能を制御することにより、腫瘍細胞の転移に対する抑制または予防を達成する。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＲＡＫの薬物標的としての、腫瘍細胞の転移を抑制または予防する薬物のスクリーニングにおける使用。
【請求項２】
ＰＲＡＫの阻害剤の、腫瘍細胞の転移を抑制または予防する薬物の製造における使用。
【請求項３】
前記阻害剤が、ＰＲＡＫの発現レベルを低下させ、またはＰＲＡＫの生物活性を阻害することにより、細胞の遊走、ＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及び／またはＥＭＴにかかわる分子の発現及び／または機能を制御し、腫瘍細胞の転移の抑制または予防を実現することを特徴とする請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記阻害剤が、ＰＲＡＫの発現レベルを低下させ、またはＰＲＡＫの生物活性を阻害することにより、ｍＴＯＲ及びその基質の発現を制御し、さらにＨＩＦ１αタンパクの発現を制御することを特徴とする請求項３に記載の使用。
【請求項５】
活性成分が、ＰＲＡＫの発現レベルを低下させ、またはＰＲＡＫの生物活性を阻害できることを特徴とする腫瘍細胞の転移を抑制または予防する薬物。
【請求項６】
前記薬物が、化学薬品、生物高分子、ポリペプチド、一本鎖抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ゲノム編集システムであってもよいことを特徴とする請求項５に記載の薬物。
【請求項７】
前記薬物が、[１，２，４]トリアゾロ[１，５−ａ]ピラジン化合物またはその医薬として許容し得る塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、及びその立体異性体、同位体変異体と互変異性体を含むことを特徴とする請求項６に記載の薬物。
【請求項８】
前記薬物が、イミダゾ[１，２−ａ]ピラジン化合物またはその医薬として許容し得る塩、溶媒和物もしくはプロドラッグ、及びその立体異性体、同位体変異体と互変異性体を含むことを特徴とする請求項６に記載の薬物。
【請求項９】
活性成分が、ＰＲＡＫの発現レベルを低下させ、またはＰＲＡＫの生物活性を阻害できることを特徴とする、ＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及び／またはＥＭＴにかかわる分子の発現及び／または機能を制御する薬物。
【請求項１０】
活性成分が、ＰＲＡＫの発現レベルを低下させ、またはＰＲＡＫの生物活性を阻害できることを特徴とする、ｍＴＯＲの活性を制御する薬物。
【発明の詳細な説明】
【相互参照】
【０００１】
本願は、２０１８年３月２７日に出願された、特許名称が「腫瘍転移の薬物治療における標的、及びその使用」である中国特許出願第２０１８１０２５９３６９．２号に基づく優先権を主張し、引用によりその全開示内容を本明細書に援用する。
【技術分野】
【０００２】
本願は、バイオテクノロジー及び医薬分野に関し、具体的には、ＰＲＡＫの薬物標的としての、腫瘍細胞の転移を抑制または予防する薬物のスクリーニングにおける使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
悪性腫瘍は転移しやすく、その形態として、（１）隣接する部位に直接広がっていくもの、（２）原発がんの細胞がリンパの流れに乗って、各リンパ節、及び肺、肝臓、骨、脳などの遠隔部位に転移し、二次性腫瘍を形成するリンパ行性転移、（３）癌細胞が血管に入り込み、血管内で、または血液の流れに乗って、肺、肝臓、骨、脳などの遠隔部位に転移し、二次性腫瘍を形成する血行性転移、（４）癌細胞が脱落した後、別の部位に移植され、例えば内臓の癌が腹膜または胸膜に播種される播種性転移がある。悪性腫瘍の転移は、疾患の転帰に大きな影響を及ぼす。
【０００４】
癌患者の死亡の９０％は転移に起因すると推定されている。したがって、人々は、腫瘍細胞の転移をいかに抑制／予防することに取り組んでいる。
【０００５】
Ｐ３８−調節／活性化プロテインキナーゼ（ｐ３８−ｒｅｇｕｌａｔｅｄ／ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）（ＰＲＡＫ、ＭＫ５とも呼ばれる。）は、マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（ＭＡＰＫ）のファミリーメンバーの一つである。Ｐ３８ＭＡＰＫの下流基質であるＰＲＡＫ自身も１種のキナーゼであり、例えば、ＨＳＰ２７、ＥＲＫ３／４、１４−３−３ε、ｐ５３、ＦＯＸＯ３、Ｒｈｅｂなどの複数種の基質のリン酸化を触媒することができ、細胞ストレス、代謝、運動、成長、老化などの生命過程の制御に関与する。例えば、エネルギーが尽きてしまった場合などでは、ｐ３８が活性化され、次にＰＲＡＫが活性化され、後者がＲｈｅｂのリン酸化を触媒し、ｍＴＯＲＣ１の活性が阻害され、このようにして細胞の代謝が制御される。その腫瘍の形成における役割について、従来の研究により、ＰＲＡＫが細胞の老化を促進することにより腫瘍の発生を阻害する一方で、血管新生を誘導することで一定の規模に形成した腫瘍の進行を加速させてしまうことが明らかとなっている。しかしながら、その腫瘍の転移における役割は、未だに不明である。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、従来技術に存在する課題を解決するために、腫瘍転移の薬物治療における標的及びその使用を提供することを目的とする。
【０００７】
上記の目的を達成するための本発明の技術形態は、下記の通りである。
【０００８】
まず、本発明は、ＰＲＡＫの薬物標的としての、腫瘍細胞の転移を抑制または予防する薬物のスクリーニングにおける使用を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、ＰＲＡＫの阻害剤の、腫瘍細胞の転移を抑制または予防する薬物の製造における使用を提供する。
【００１０】
前記阻害剤は、ＰＲＡＫの発現レベルを低下させ、またはＰＲＡＫの生物活性を阻害する。ここで、前記阻害剤は、ＰＲＡＫの発現レベルを特異的または非特異的に低下させるか、あるいはＰＲＡＫの生物活性を不活性化させる阻害剤を含むが、これらに限定されない。即ち、ＰＲＡＫの発現を低下させ、またはＰＲＡＫの生物活性を低下させることにより、腫瘍細胞の転移を抑制または予防することができる薬物であれば、いずれも本発明の保護範囲に属する。
【００１１】
選択的に、前記阻害剤は、化学薬品、生物高分子、ポリペプチド、一本鎖抗体、アンチセンスオリゴヌクレオチド、低分子ヘアピン型ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、ゲノム編集システムから選ばれるものであってもよい。
【００１２】
そのうち、前記化学薬品は、ＰＲＡＫの発現レベルを低下させ、またはＰＲＡＫの生物活性を阻害することができる化合物、もしくはその薬学的に許容される塩を含む。
【００１３】
本発明は、研究過程において、先行技術から、変性疾患及び炎症性疾患の治療に有用な[１，２，４]トリアゾロ[１，５−ａ]ピラジン化合物またはその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ、およびその立体異性体、同位体変異体と互変異性体（公開番号ＣＮ１０１４５４３２６Аの特許出願に記載されている。）と、変性疾患及び炎症性疾患の治療に有用なイミダゾ[１，２−ａ]ピラジン化合物またはその医薬として許容し得る塩、溶媒和物、もしくはプロドラッグ、およびその立体異性体、同位体変異体と互変異性体（公開番号ＣＮ１０２０３６９９７Аの特許出願に記載されている。）が、ＰＲＡＫの阻害剤として、ＰＲＡＫの生物活性を阻害し、腫瘍細胞の遊走能を低下させ、ＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及びＥＭＴにかかわる分子の発現及び／または機能を制御することにより、腫瘍細胞の転移に対する抑制または予防を達成できることを発見した。即ち、本発明は、腫瘍細胞の転移の抑制または予防に使用する当該化合物及びその薬用組成物の新たな用途を提供する。
【００１４】
さらに、本発明は、大量の客観的試験によってそのメカニズムを検討し、前記阻害剤がＰＲＡＫの生物活性を阻害し、腫瘍細胞の遊走能を低下させ、ＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及び／またはＥＭＴにかかわる分子の発現及び／または機能を制御することにより、腫瘍細胞の転移に対する抑制または予防を達成することを発見した。
【００１５】
さらに、前記阻害剤は、ＰＲＡＫの生物活性を阻害し、ｍＴＯＲのタンパク質の翻訳を促進する能力を制御することにより、ＨＩＦ１αタンパクの発現を低下させる。
【００１６】
ＰＲＡＫは複数種の腫瘍細胞において発現し、そして、ＨＩＦ１αタンパクは腫瘍転移のマスターレギュレーターであるため、本発明の前記腫瘍細胞は、黒色腫細胞、乳がん細胞などを含むが、これらに限定されない。本発明の具体的な実施形態に記載の例示的な説明に基づき、当業者は、通常知識から、前記腫瘍が脳腫瘍、肺がん、膀胱がん、胃がん、卵巣がん、腹膜がん、膵臓がん、頭頸部がん、子宮頸がん、子宮内膜がん、大腸癌、肝臓がん、腎がん、食道がん、胆嚢がん、非ホジキンリンパ腫、前立腺がん、甲状腺がん、女性生殖管がん、リンパ腫、骨がん、皮膚がん、結腸がん、精巣がんなどをも含むと推測できる。
【００１７】
このため、本発明は、上記の研究結果に基づき、活性成分がＰＲＡＫの生物活性を阻害できる、腫瘍細胞の転移を抑制または予防できる薬物を提供する。
【００１８】
さらに、上記のメカニズムに基づき、本発明は、腫瘍細胞の遊走能を低下させ、ＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及び／またはＥＭＴにかかわる分子の発現及び／または機能を制御する薬物、及びｍＴＯＲの活性を制御する薬物を提供し、前記薬物の活性成分はＰＲＡＫの生物活性を阻害できる。
【００１９】
特筆すべき点として、本発明は、研究によって、ＰＲＡＫの生物活性と「ｍＴＯＲの活性」との関係、及びＰＲＡＫの生物活性と「ＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及び／またはＥＭＴにかかわる分子の発現及び／または機能」との関係を発見した。このため、ＰＲＡＫを標的とする阻害剤でｍＴＯＲの活性、またはＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及び／またはＥＭＴにかかわる分子の発現及び／または機能を制御することにより達成される派生の使用も、本発明の保護範囲に属する。
【００２０】
本発明で採用される実験手段は、（１）低分子化合物阻害剤、（２）具体的に、ＰＲＡＫ遺伝子ノックアウトマウス（ＰＲＡＫノックアウト）、Ｃａｓ９でＰＲＡＫをノックアウトした（ＰＲＡＫノックアウト）Ｂ１６（マウス黒色腫）細胞株、ｓｈＲＮＡを用いてトランスフェクションを行いＰＲＡＫをノックダウンしたＡ３７５（ヒト黒色腫）／ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳がん細胞株）細胞株を含む、遺伝子レベルでの介入である。
【００２１】
ＰＲＡＫ阻害剤、ＰＲＡＫノックダウンマウス及び各種のノックアウト／ノックダウンの細胞株を作製した後、それらで黒色腫と乳がん細胞株のインビトロ機能、腫瘍担持マウス及び自然発症乳がんマウスへの介入を行い、得られた実験効果は下記の通りであった。
【００２２】
（１）インビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）実験
Ｂ１６（マウス黒色腫）、Ａ３７５（ヒト黒色腫）及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ヒト乳がん細胞株）のトランズウェル（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ）インサート実験の結果及びスクラッチアッセイの結果により、ＰＲＡＫ分子の欠落または発現レベルが、腫瘍細胞の体外での遊走能を大幅に低下させるが、腫瘍細胞の増殖（ＭＴＳ試験）及びアポトーシス（ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−７−ＡＡＤ複合染色）に影響を及ぼさないことが証明された。
【００２３】
（２）インビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）実験
Ａ）Ｂ１６皮下注射モデル（ｓ．ｃ．）の結果は、ＰＲＡＫノックアウト／ノックダウンまたは阻害剤の使用が、インサイチュにある腫瘍細胞の成長に影響を及ぼさず、その腫瘍の成長曲線及び最終的な腫瘍の大きさ／重量が、野生型群または阻害剤非使用群と明らかな差がないことを示した。
【００２４】
Ｂ）Ｂ１６尾静脈内注射モデル（ｉ．ｖ．）の結果は、ＰＲＡＫノックアウト／ノックダウンまたは阻害剤の使用が、当該モデルの肺への転移率を大幅に低減させるが、用量依存性を有すること、かつ、当該介入が腫瘍細胞転移の初期段階でより重要な意味を持っており、腫瘍細胞注入後の最初の５日間にＰＲＡＫ阻害剤を使用すれば、腫瘍細胞の遠隔転移に対する抑制を達成でき、その効果も全過程において阻害剤を注入する場合の効果とほとんど同一であること、この至適投与時期(ｔｉｍｅ  ｗｉｎｄｏｗ)を過ぎてしまうと、阻害剤を使用しても、ほとんど効果がないこと、および、Ａ３７５ヒト黒色腫にｓｈＰＲＡＫ及びＰＲＡＫ阻害剤を使用すると、類似な効果があることを示した。
【００２５】
Ｃ）ＭＤＡ−ＭＢ−２３１生体イメージングモデル：生体蛍光検出方法を採用してＢ１６尾静脈内注射モデルと類似する結果を得た。即ち、ｓｈＰＲＡＫ／ＰＲＡＫ阻害剤の使用は、腫瘍細胞の肺への定着を強力に阻害し、１４日／２１日（マウスを獲得して犠牲死させる最終の時間）のモニター結果はいずれも阻害剤群の肺の蛍光強度が阻害剤非使用群より遥かに低いことを示した。
【００２６】
Ｄ）ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスの自然発症乳がんモデル：ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ自然発症乳がんマウス（ほぼ１００％発症し、発症時間が８〜１２週間であり、市販により入手でき、例えばＴｈｅ  Ｊａｃｋｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入できる。）とＰＲＡＫノックアウトマウスを交配させて、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴのバックグラウンドでの野生型及びＰＲＡＫノックアウトマウスを得た。その結果によれば、ＰＲＡＫノックアウトを使用すると、ＰｙＭＴマウスの自然肺転移率を大幅に低減させることができ、ＰＲＡＫノックアウトＰｙＭＴマウスにおいて、肺に転移巣が発見されたのは１匹（１／１９）だけであった。これで分かるように、ＰＲＡＫノックアウトは、腫瘍細胞の転移抑制率を顕著に向上させることができる。そして、このマウスのインサイチュにある腫瘍細胞の生物学的特性（インサイチュにある腫瘍細胞を直接粉砕・消化した後、試験を行う）は、インビトロ実験の結果に近かった。即ち、ＰＲＡＫの欠落は、ただその遠隔転移に影響を及ぼし、その増殖及びアポトーシスに影響を及ぼすことはなかった。ＰＲＡＫ阻害剤を使用する場合も、類似な転移阻害効果があった。
【００２７】
（３）ＰＲＡＫが腫瘍の転移を制御する潜在的メカニズム：
Ａ）ＲＮＡ−ｓｅｑのビッグデータ分析によると、ＰＲＡＫの発現は、酸素不足及びレドックス関連経路と密接に関連する。
【００２８】
Ｂ）ＰＲＡＫは、ＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及びＥＭＴにかかわる分子の発現及び機能を制御できる。
【００２９】
Ｃ）ＰＲＡＫは、ｍＴＯＲの活性を制御することによりＨＩＦ１αタンパク質の合成を制御できる。
【００３０】
（４）ＰＲＡＫの発現と肺腺がん／扁平上皮がんの転移との相関について、腫瘍が転移した患者と腫瘍が転移していない患者とのインサイチュにある腫瘍の標本を比較したところ、腫瘍が転移した患者は、より高いレベルでＰＲＡＫ（ｐ<０．００５）を発現し、かつ、ＰＲＡＫの発現はＭＭＰ２と正の相関がある（ｒ(Ｓｐｅａｒｍａｎ)＝０．５０５０２３８(ｐ＝３.６５１ｅ−０５)）。
【００３１】
（５）ＰＲＡＫのＲＮＡレベル及び肺がん患者の生存率に対するビッグデータスクリーニングによると、ＰＲＡＫの発現の高低は患者の生存率と明らかな負の相関がある。
【００３２】
当分野の常識に合致することに基づき、上記の各好ましい条件を互いに組み合わせて、具体的な実施形態を得てもよい。
【００３３】
本発明の有益な効果は下記の通りである：
本発明は、腫瘍細胞の転移を効果的に抑制できる標的ＰＲＡＫを提供し、そのメカニズムを検討した。その結果、ＰＲＡＫの酵素活性を低下させ、またはＰＲＡＫの発現レベルを低下させることにより、腫瘍細胞の遊走能を低下させることができ、そしてｍＴＯＲの活性、ＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及び／またはＥＭＴにかかわる分子の発現及び／または機能を制御することにより、腫瘍細胞の転移に対する抑制または予防を達成できることを見出した。
【００３４】
一方、本発明は、実験及び研究によって、既存の腫瘍の化学療法薬と異なるＰＲＡＫ阻害剤の特性を検証した。通常、化学療法薬は、腫瘍細胞の成長と生存に影響を与えることにより、抗腫瘍効果を発揮するため、正常組織に対する毒性と薬剤耐性は基本的に避けられないものであった。しかしながら、ＰＲＡＫノックアウト／ノックダウンまたは阻害剤の使用は、インサイチュにある腫瘍細胞の成長と生存に影響を及ぼさず、転移ステップのみに作用し、遠隔転移の発生を防止する。当該介入は、腫瘍細胞転移の初期段階でより重要な意味を持っており、腫瘍細胞静脈注入後の最初の５日間にＰＲＡＫ阻害剤を使用すれば、腫瘍細胞の遠隔転移に対する抑制作用を達成でき、かつ腫瘍細胞の肺への定着を強力に阻害することができる。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
【図１】ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤のＢ１６−Ｆ１０の増殖に対する影響を示す。
【図２】ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤のＢ１６−Ｆ１０のアポトーシスに対する影響を示す。
【図３】ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤のＢ１６−Ｆ１０の遊走に対する影響を示す。
【図４】ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤のＢ１６−Ｆ１０の浸潤に対する影響を示す。
【図５】ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤のインサイチュにあるＢ１６−Ｆ１０腫瘍の成長に対する影響を示す。
【図６】ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤のＢ１６−Ｆ１０の肺への定着能に対する影響を示す。
【図７】異なる時点での３つの異なるＰＲＡＫ阻害剤のＢ１６−Ｆ１０腫瘍細胞の遠隔転移に対する影響を示す。
【図８】ＰＲＡＫノックダウン及びＰＲＡＫ阻害剤のＡ３７５の浸潤能に対する影響を示す。
【図９】ＰＲＡＫノックダウン及びＰＲＡＫ阻害剤のＡ３７５の肺への定着能に対する影響を示す。
【図１０】ＰＲＡＫノックダウン及びＰＲＡＫ阻害剤のＭＤＡ−ＭＢ−２３１の浸潤能に対する影響を示す。
【図１１】ＰＲＡＫノックダウン及びＰＲＡＫ阻害剤のＭＤＡ−ＭＢ−２３１の肺への定着能に対する影響を示す。
【図１２】ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤のＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスの自然発症乳腺腫瘍の発生に対する影響を示す。
【図１３】ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤のＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスの自然発症乳腺腫瘍の肺転移に対する影響を示す。
【図１４】ＰＲＡＫノックアウトのＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスの腫瘍細胞の体外増殖に対する影響を示す。
【図１５】ＰＲＡＫノックアウトのＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスの腫瘍細胞の体外アポトーシスに対する影響を示す。
【図１６】野生型とＰＲＡＫノックアウトのＢ１６−Ｆ１０細胞のＲＮＡ  ｓｅｑ結果が示差的に発現される遺伝子の分布を示す。
【図１７】野生型とＰＲＡＫノックアウトのＢ１６−Ｆ１０細胞の発現変動遺伝子のＧＯ経路エンリッチメントを示す。
【図１８】ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤がＢ１６−Ｆ１０細胞株のＨＩＦ１α及びＭＭＰ２のタンパク質の発現レベルを顕著に低下させることを示す。
【図１９】ＰＲＡＫノックアウトのＢ１６−Ｆ１０細胞株におけるＥＭＴ関連分子の発現に対する影響を示す。
【図２０】ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤に誘導されたｍＴＯＲ経路の関連分子のリン酸化レベルの変化を示す。
【図２１】遠隔転移のない肺がん患者と遠隔転移のある肺がん患者の腫瘍サンプルのＰＲＡＫ  ｍＲＮＡレベルの検出を示す。
【図２２】肺がん患者の腫瘍サンプルのＰＲＡＫ及びＭＭＰ２  ｍＲＮＡの発現レベルの相関分析を示す。
【図２３】ＧＥＰＩＡデータベースにおけるＰＲＡＫを高発現または低発現する肺がん患者の生存期間に対する分析を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３６】
以下、実施例を組み合わせて、本発明の好ましい実施形態を詳しく説明する。以下の実施例が、説明のために例示されたものであり、本発明の範囲を限定するためのものではないことを理解できるはずである。当業者は、本発明の趣旨および技術的思想から逸脱しない範囲で本発明に対して各種の修正および置き換えを行うことができる。
【００３７】
特に説明のない限り、下記の実施例に使用される実験方法は、いずれも一般的な方法である。
【００３８】
特に説明のない限り、下記の実施例に使用される材料、試薬等は、いずれも商業経路から入手できるものである。
【００３９】
本発明の下記の実施例に使用されるＰＲＡＫ阻害剤は、下記の化合物から選ばれるものである：
【００４０】
【表１】
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【００４１】
実施例１
本実施例は、マウス黒色腫を例として、ＰＲＡＫのＢ１６−Ｆ１０の体外増殖、体外生存、浸潤能、インサイチュにある腫瘍の成長及び初期の肺への定着に対する影響を説明するためのものである。
【００４２】
一、実験方法
１、体外増殖及び生存に対する影響
実験ステップ：
ＭＴＳ：同じ数量のＰＲＡＫ  ＷＴ及びＫＯ細胞を９６ウェルプレートに蒔き、付着後、異なる時点でＣｅｌｌ  Ｔｉｔｅｒ  ９６  Ａｑｕｅｏｕｓ細胞増殖検出液を加え、３７℃で１〜４時間インキュベートした後、４９０ｎｍの吸光度値を測定し、細胞増殖曲線を作成した。
【００４３】
ＡｎｎｅｘｉｎＶ／７−ＡＡＤ染色：細胞を２４ウェルプレートに蒔き、付着後、ＰＲＡＫ阻害剤０．１μＭ、１μＭを加えて処理し、２４ｈ後細胞を回収して、ＡｎｎｅｘｉｎＶ／７−ＡＡＤで染色し、フローサイトメトリーによって細胞のアポトーシスを分析した。
【００４４】
２、遊走及び浸潤能に対する影響
実験ステップ：
スクラッチアッセイ：同じ数のＰＲＡＫ  ＷＴ及びＫＯ細胞を１２ウェルプレートに蒔き、付着後、ピペットチップでウェルプレートの中心にひっかき傷をつけ、０．１％ＦＢＳ培地に変更して培養し、２４ｈ後、創傷癒合の様子を比較した。同様に、異なる濃度のＰＲＡＫ阻害剤の創傷癒合に対する影響を比較することもできる。
【００４５】
浸潤アッセイ：Ｍａｔｒｉｇｅｌ（マトリゲル）でコーティングされたトランズウェルインサートを、予め３７℃で再水和し、２ｈ後、０．５〜２×１０５の細胞を無血清培地で再懸濁させてインサートに置き、ウェルに１０％ＦＢＳ培地を加え、１２〜２０時間後、インサートを取り出して液体を吸い切り、予め予冷されたメタノールに投入し、４℃で１５ｍiｎ固定した。メタノールを吸い切り、綿棒でメンブレンの表面を拭き、遮光下でインサートをクリスタルバイオレットで２０ｍiｎ染色した。ＰＢＳで３回洗い、毎回５ｍiｎとした。メンブレンの表面を拭き、封止し、顕微鏡で計数した。
【００４６】
３、インサイチュにある腫瘍の成長に対する影響
実験ステップ：６−８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウス（市販により入手でき、例えばＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入できる。）を選択して実験を行い、対数増殖期にあるＢ１６−Ｆ１０細胞を消化し、ＰＢＳで２回洗い、計数した後、ＰＢＳで再懸濁することによって細胞の懸濁液の濃度を１．５×１０６／ｍｌに調整した。腫瘍細胞を、細胞懸濁液２００μＬ／匹で、マウスの側肋骨部に皮下接種し、前記細胞懸濁液２００μＬは３×１０５個の細胞を含有する。薬物投与群では、ＰＲＡＫ阻害剤を２ｍｇ／ｋｇ／ｄで腹腔内注射した。
【００４７】
２日ごとにノギスで腫瘍の長径（Ｌ）と短径（Ｓ）を測定し、式Ｌ×Ｓ×Ｓ×０．５で腫瘍の大きさを算出し、腫瘍成長曲線を作成した。
【００４８】
４、初期の肺への定着に対する影響
実験ステップ：６−８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスを選択して実験を行い、対数増殖期にあるＢ１６−Ｆ１０細胞を消化し、ＰＢＳで２回洗い、計数した後、ＰＢＳで再懸濁することによって細胞の懸濁液の濃度を５×１０５／ｍｌに調整した。腫瘍細胞を尾静脈内注射でマウスに注入し、１匹あたりに、細胞懸濁液２００μＬ、細胞５×１０５個を注入した。１５日後、マウスを殺し、肺を摘出して、肺表面の腫瘍・結節の数を計数した。薬物投与群を、０−４日間投与または５−１５日間投与に分け、投与方法はＰＲＡＫ阻害剤を２ｍｇ／ｋｇ／ｄで腹腔内注射するにした。
【００４９】
二、試験結果
１、図１に示すように、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤はＢ１６−Ｆ１０の増殖に明らかな影響を及ぼさなかった。
【００５０】
２、図２に示すように、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤はＢ１６−Ｆ１０のアポトーシスに明らかな影響を及ぼした。
【００５１】
３、図３に示すように、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤はＢ１６−Ｆ１０の遊走能を明らかに阻害した。
【００５２】
４、図４に示すように、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤はＢ１６−Ｆ１０の浸潤能を明らかに阻害した。
【００５３】
５、図５に示すように、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤は皮下接種されたインサイチュにあるＢ１６−Ｆ１０腫瘍の成長に明らかな影響を及ぼさばかった。
【００５４】
６、図６に示すように、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤は静脈内注射されたＢ１６−Ｆ１０細胞の肺への定着能を明らかに阻害した。
【００５５】
７、図７に示すように、細胞の静脈内注射後の０−４日目にＰＲＡＫ阻害剤を使用すると、Ｂ１６−Ｆ１０腫瘍細胞の遠隔転移を顕著に抑制できた。５−１５日目にＰＲＡＫ阻害剤を使用すると、明らかな阻害効果はなかった。それだけでなく、当該実験結果によって、三種類の異なるＰＲＡＫ阻害剤が、いずれも類似する阻害効果を持つことが表れている。
【００５６】
上記により、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤が、Ｂ１６−Ｆ１０の増殖及びインサイチュにあるＢ１６−Ｆ１０の成長に対して明らかな影響を及ぼさないものの、Ｂ１６−Ｆ１０の浸潤能及び肺への定着能を顕著的に阻害できることを説明できる。
【００５７】
実施例２
本実施例は、ヒト黒色腫を例として、ＰＲＡＫのＡ３７５の浸潤能及び肺への定着能に対する影響を説明するためのものである。
【００５８】
一、実験方法
Ｂ１６−Ｆ１０をＡ３７５に置き換え、ＰＲＡＫノックダウンにｓｈＲＮＡトランスフェクションを使用し、体内接種を受けるレシピエントマウスをＳｃｉｄ−Ｂｅｉｇｅとした（市販により入手でき、例えばＣｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒから購入できる。）こと以外は、実施例１と同様にした。
【００５９】
二、実験結果
１、図８に示すように、ＰＲＡＫノックダウン及びＰＲＡＫ阻害剤はＡ３７５の浸潤能を明らかに阻害した。
【００６０】
２、図９に示すように、ＰＲＡＫノックダウン及びＰＲＡＫ阻害剤はＡ３７５の肺への定着能を明らかに阻害した。
【００６１】
上記により、ＰＲＡＫノックダウン及びＰＲＡＫ阻害剤がＡ３７５の浸潤能及び肺への定着能を顕著に阻害できることを説明できる。
【００６２】
実施例３
本実施例は、ヒト乳がん細胞株を例として、ＰＲＡＫのＭＤＡ−ＭＢ−２３１の浸潤能及び肺への定着能に対する影響を説明するためのものである。
【００６３】
一、実験方法
実験ステップ：６−８週齢のＳＣＩＤ  Ｂｅｉｇｅ雌マウスを選択して実験を行い、対数増殖期にある野生型またはＰＲＡＫ  ｓｈＲＮＡでトランスフェクションされたＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞を消化し、ＰＢＳで２回洗い、計数した後、ＰＢＳで再懸濁することによって細胞の懸濁液の濃度を２．５×１０６／ｍｌに調整した。腫瘍細胞を尾静脈内注射でマウスに注入し、１匹あたりに、細胞懸濁液２００μＬ、細胞５×１０５個を注入した。ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ小動物生体イメージングシステムでマウスの肺腫瘍細胞の成長をモニターし、２１日後、マウスを殺し、肺を摘出して、肺表面の腫瘍・結節の数を計数した。薬物投与群では、最初の５日間にＰＲＡＫ阻害剤を２ｍｇ／ｋｇ／ｄで腹腔内注射した。
【００６４】
二、試験結果
１、図１０に示すように、ＰＲＡＫノックダウン及びＰＲＡＫ阻害剤は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の浸潤能を明らかに阻害した。
【００６５】
２、図１１に示すように、ＰＲＡＫノックダウン及びＰＲＡＫ阻害剤は、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の肺への定着能を明らかに阻害した。
【００６６】
上記により、ＰＲＡＫノックダウン及びＰＲＡＫ阻害剤が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１の浸潤能及び肺への定着能を顕著に阻害できることを説明できる。
【００６７】
実施例４
本実施例は、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ自然発症乳がんマウスを例として、ＰＲＡＫの自然発症乳がんの肺転移に対する影響を説明するためのものである。
【００６８】
一、実験方法
１、マウスの原発性乳腺腫瘍の発生及び成長に対する影響
ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスとＰＲＡＫマウスを交配させることにより、ＭＭＴＶ−ＰＲＡＫ  ＷＴ及びＭＭＴＶ−ＰＲＡＫノックダウンマウスを獲得し、８−１０週目から乳腺部位における腫瘍の発生を観察した。別の群であるＭＭＴＶ−ＰＲＡＫ  ＷＴマウスに対しては、ＰＲＡＫ阻害剤（１ｍｇ／ｋｇ）を１２週目から１日おきに投与した。１５週目に、マウスを殺し、乳腺における腫瘍・結節の数を計数して重量を測定するとともに、肺の腫瘍・結節の数を計数した。
【００６９】
２、マウスの原発腫瘍の体外増殖及びアポトーシスに対する影響
実験ステップ：マウスの乳腺のインサイチュにある腫瘍を摘出し、細切にして、ＤＮＡ酵素およびコラゲナーゼで消化し、密度勾配遠心法によって腫瘍細胞を分離して、ＭＴＳ分析及びＡｎｎｅｘｉｎＶ／７−ＡＡＤ染色を行った。
【００７０】
二、実験結果
１、図１２に示すように、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤は、自然発症乳腺腫瘍の発生率及び成長に明らかな影響を及ぼさなった。
【００７１】
２、図１３に示すように、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤は、マウスの自然発症乳腺腫瘍の肺転移を明らかに抑制した。
【００７２】
３、図１４に示すように、ＰＲＡＫノックアウトは、マウスの自然発症乳腺腫瘍から分離された腫瘍細胞の体外での増殖能に対して明らかな影響を及ぼさなかった。
【００７３】
４、図１５に示すように、ＰＲＡＫノックアウトは、マウスの自然発症乳腺腫瘍から分離された腫瘍細胞の体外のアポトーシスに対して明らかな影響を及ぼさなかった。
【００７４】
実施例５
本実施例は、ＰＲＡＫノックアウトのＢ１６−Ｆ１０細胞株のトランスクリプトームに対する影響を説明するためのものである。
【００７５】
一、実験方法
１、ＰＲＡＫ  ＷＴ及びＰＲＡＫノックアウトのＢ１６−Ｆ１０細胞のＲＮＡをそれぞれ抽出し、ＲＮＡ  ｓｅｑを行い、得られた発現変動遺伝子をＧＯ経路エンリッチメントによって解析した。
【００７６】
二、実験結果
１、図１６に示すように、野生型と比べ、ＰＲＡＫノックアウト後の発現変動遺伝子は、大部分の発現がダウンレギュレートされ、ほんの一部の発現がアップレギュレートされた。
【００７７】
２、図１７に示すように、ＰＲＡＫ  ＷＴ及びＰＲＡＫノックアウトの発現変動遺伝子の機能エンリッチメントによって、ＰＲＡＫノックアウト後にダウンレギュレートされた遺伝子の多くが低酸素反応に関連することが示された。
【００７８】
実施例６
本実施例は、ＰＲＡＫのＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及び／またはＥＭＴにかかわる分子の発現及び機能に対する影響を説明するためのものである。
【００７９】
一、実験方法
Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法で、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤で処理された各分子のタンパク質レベルの変化を測定した。
【００８０】
二、実験結果
１、図１８に示すように、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤は、Ｂ１６−Ｆ１０細胞株のＨＩＦ１α及びＭＭＰ２の発現レベルを顕著的に低下させることができた。
【００８１】
２、図１９に示すように、ＰＲＡＫノックアウトは、Ｂ１６−Ｆ１０細胞株のＮ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現を顕著に低下させるとともに、Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎの発現を促進させた。
【００８２】
実施例７
本実施例は、ＰＲＡＫのｍＴＯＲ関連分子の発現に対する影響を説明するためのものである。
【００８３】
一、実験方法
Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法で、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤で処理された各分子のタンパク質のリン酸化レベルの変化を測定した。
【００８４】
二、実験結果
図２０に示すように、ＰＲＡＫノックアウト及びＰＲＡＫ阻害剤で処理された後、ｍＴＯＲ経路の関連分子のリン酸化レベルはダウンレギュレートされた。
【００８５】
実施例８
本実施例は、ＰＲＡＫと肺がん患者の腫瘍の転移能との相関を説明するためのものである。
【００８６】
一、実験方法
１、肺腺がんや肺扁平上皮がんの患者の腫瘍標本を収集し、ＰＲＡＫの発現に対してｍＲＮＡレベルを測定し、術後フォローアップに基づき、遠隔転移のない群（Ｎ）と遠隔転移のある群（Ｔ）に分け、その結果に対して統計分析を実行した。
【００８７】
２、上記の患者のサンプルのＰＲＡＫ及びＭＭＰ２に対して、ｍＲＮＡレベルの測定を行い、その結果に対して相関分析を行った。
【００８８】
３、ＧＥＰＩＡウェブサイトデータベースを利用し、ＰＲＡＫの発現レベルの肺がん患者の生存期間に対する影響を分析した。
【００８９】
二、実験結果
１、図２１に示すように、遠隔転移のない患者と比べ、遠隔転移のある患者の腫瘍サンプルにおけるＰＲＡＫ発現は比較的に高い。
【００９０】
２、図２２に示すように、腫瘍患者サンプルにおけるＰＲＡＫの発現レベルとＭＭＰ２の発現レベルは、正の相関がある。
【００９１】
３、図２３に示すように、肺がん患者の生存期間はＰＲＡＫ遺伝子と顕著に関連しており、ＰＲＡＫ発現の高い患者は、ＰＲＡＫ発現の低い患者よりもその生存期間が短い。
【００９２】
纏めて説明すると、実施例２−９はいずれもＰＲＡＫ阻害剤−２３をＰＲＡＫ阻害剤として採用し、実験を行った後、ＰＲＡＫ阻害剤−２２、ＰＲＡＫ阻害剤−２９に置き換えて同じ実験を繰り返しており、実験によって、三種類の阻害剤の機能が同じである（いずれも同じ阻害効果を達成できる）ことが実証された。
【００９３】
また、上記では、一般的な説明や具体的な実施例により本発明を詳しく述べたが、本発明に基づき、それらを修正または改善できることは、当業者にとって自明である。このため、本発明の趣旨から逸脱しない範囲で行われたこれらの修正及び改善は、本発明の保護しようとする範囲に属する。
【産業上の利用可能性】
【００９４】
本発明では、ＰＲＡＫの薬物標的としての、腫瘍細胞の転移を抑制または予防する薬物のスクリーニングにおける使用が開示されている。本発明は、ＰＲＡＫを腫瘍細胞の転移の標的とする発見に基づき、さらに腫瘍細胞の転移を抑制または予防できる薬物を提供し、前記薬物の活性成分は、ＰＲＡＫの発現レベルを低下させ、またはＰＲＡＫの生物活性を阻害することができ、細胞の遊走、ＨＩＦ１α、ＭＭＰ２及び／またはＥＭＴにかかわる分子の発現及び／または機能を制御することにより、腫瘍細胞の転移に対する抑制または予防を達成し、良好な経済的価値と使用の見通しを持つ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【国際調査報告】
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