(57)【要約】本開示は、コクシエラ・バーネッティイ感染症及びＱ熱に対して免疫化するためのワクチン及びその使用方法に関する。コクシエラ・バーネッティイ感染症に対する防御のための、又はＱ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するためのワクチンであって、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含むワクチンが本明細書において提供される。コクシエラ・バーネッティイ感染症に対する防御のための、又はＱ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するためのコンジュゲートワクチンであって、免疫原性担体に連結した、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含む、コンジュゲートワクチンも提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
コクシエラ・バーネッティイ感染症に対する防御のためのワクチンであって、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含むワクチン。
【請求項２】
Ｃ．バーネッティイ感染症と関連する発熱に対して対象を防御する、請求項１に記載のワクチン。
【請求項３】
Ｑ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するためのワクチンであって、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含むワクチン。
【請求項４】
前記少なくとも１つの症状が発熱である、請求項３に記載のワクチン。
【請求項５】
脱脂多糖が、１相細胞壁リポ多糖のリピドＡ構成成分を除去することによって得られるＯ−特異的多糖である、請求項１〜４のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項６】
前記脱脂多糖が誘導体化されている、請求項１〜５のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項７】
前記脱脂多糖が、免疫原性担体にコンジュゲートしている、請求項１〜６のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項８】
前記担体がタンパク質又はポリペプチドである、請求項７に記載のワクチン。
【請求項９】
前記担体が破傷風トキソイドである、請求項８に記載のワクチン。
【請求項１０】
前記脱脂多糖が、架橋剤を使用して前記担体にコンジュゲートしている、請求項７〜９のいずれか一項に記載のワクチン。
【請求項１１】
コクシエラ・バーネッティイ感染症に対する防御のためのコンジュゲートワクチンであって、免疫原性担体に連結した、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含む、コンジュゲートワクチン。
【請求項１２】
Ｃ．バーネッティイ感染症と関連する発熱に対して対象を防御する、請求項１１に記載のコンジュゲートワクチン。
【請求項１３】
Ｑ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するためのコンジュゲートワクチンであって、免疫原性担体に連結した、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含む、コンジュゲートワクチン。
【請求項１４】
前記少なくとも１つの症状が発熱である、請求項１３に記載のコンジュゲートワクチン。
【請求項１５】
前記脱脂多糖が、架橋剤を使用して前記担体にコンジュゲートしている、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載のコンジュゲートワクチン。
【請求項１６】
前記担体が、タンパク質又はポリペプチドであり、任意選択で破傷風トキソイドである、請求項１１〜１５のいずれか一項に記載のコンジュゲートワクチン。
【請求項１７】
前記脱脂多糖が、１相細胞壁リポ多糖のリピドＡ構成成分を除去することによって得られるＯ−特異的多糖である、請求項１１〜１６のいずれか一項に記載のコンジュゲートワクチン。
【請求項１８】
コクシエラ・バーネッティイ感染症に対する防御のための、及び／又はＱ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するための非毒性ワクチンを調製するための方法であって、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂多糖を免疫原性担体に連結することを含む方法。
【請求項１９】
コクシエラ・バーネッティイ感染症に対して対象を防御するための方法であって、免疫防御量の請求項１〜１７のいずれか一項に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む方法。
【請求項２０】
必要とする対象においてＱ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するための方法であって、免疫防御量の請求項１〜１７のいずれか一項に記載のワクチンを前記対象に投与することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
[0001]本開示は、一般的にはコクシエラ・バーネッティイ（Ｃｏｘｉｅｌｌａ  ｂｕｒｎｅｔｉｉ）感染症及びＱ熱に対して免疫化するためのワクチン及びその使用方法に関する。より詳細には、本開示は、任意選択で免疫原性担体に、典型的にはタンパク質にコンジュゲートしている脱脂Ｃ．バーネッティイ（Ｃ．ｂｕｒｎｅｔｉｉ）多糖を含むワクチンに関する。免疫原性担体タンパク質は、多糖に対するＴ細胞依存性免疫応答を誘発する目的で脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖に共有結合している。
【背景技術】
【０００２】
[0002]Ｑ熱は、偏性細胞内細菌のコクシエラ・バーネッティイによって引き起こされる全身性感染症である。感染症は、家畜及び様々な野生動物を含む動物において一般的なものであるが、動物は典型的には無症状である。しかし、Ｃ．バーネッティイは、多数の経路、主に吸息を介してヒトに容易に伝染する。ヒトでの症状は大きく異なり、その症状としては、肺炎を呈することが最も多い急性熱性疾患、頭痛、大量の発汗及び筋肉痛、心内膜炎又は血管感染症を呈する慢性併発Ｑ熱、並びにＱ熱後疲労があり得る。Ｃ．バーネッティイ感染症に対する個々の応答における変動を考慮すると、診断は困難であることがあり、曝露歴、臨床検査、血清学的及び分子分析（例えばＰＣＲ）の組合せに基づく場合がある。
【０００３】
[0003]急性段階における診断の場合、Ｑ熱は、抗生物質、例えばドキシサイクリンの比較的短いコースで治療することができるが、長期にわたる衰弱及び疲労と関連する慢性Ｑ熱は、治療が非常に困難であり、死亡率が高い。
【０００４】
[0004]Ｑ熱の発症を予防する有効なワクチン、特に最もリスクがある個人及び集団、例えば飼育動物、家畜及び他の畜産動物又は野生動物に日常的に曝露されるものに使用するためのワクチンが当技術分野において明確に必要とされている。
【０００５】
[0005]現在のところ利用可能な唯一のＱ熱のワクチンはＱ−ＶＡＸ（登録商標）である。その有効性にもかかわらず、Ｑ−ＶＡＸ（登録商標）は重大な毒性と関連する。医療専門家にとって使用するには非常に困難なワクチンであり、安全に使用することができる前に、患者がＣ．バーネッティイに曝露したことがあるかを予備試験する必要がある。既に感作したヒトにおいて使用すると、重大な副作用が生じることになる。Ｑ−ＶＡＸ（登録商標）はホルムアルデヒド不活性化全細菌細胞ワクチンであり、もとはイタリアの患者から第二次世界大戦中に単離されたＣ．バーネッティイの「ヘンゼルリング（Ｈｅｎｚｅｒｌｉｎｇ）」菌株から調製されたものである。
【０００６】
[0006]Ｑ−ＶＡＸ（登録商標）の毒性、また対象がワクチンを受けるのに適しているかどうかの決定に極度の慎重さを要することから、その使用が問題になる。Ｑ熱のためのより安全で毒性が少ないワクチンの開発が必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
[0007]本開示の第１の態様によれば、コクシエラ・バーネッティイ感染症に対する防御のためのワクチンであって、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含むワクチンが提供される。
【０００８】
[0008]典型的には、脱脂多糖は、１相細胞壁リポ多糖のリピドＡ構成成分を除去することによって得られるＯ−特異的多糖である。脱脂多糖は、誘導体化されていてもよい。
【０００９】
[0009]特定の実施形態において、脱脂多糖は免疫原性担体にコンジュゲートしている。典型的には、免疫原性担体は、タンパク質又はポリペプチドである。１つの例示的な実施形態において、免疫原性担体タンパク質は破傷風トキソイドである。脱脂多糖は、架橋剤を使用して担体にコンジュゲートしていてもよい。
【００１０】
[0010]特定の実施形態において、ワクチンは、Ｃ．バーネッティイ感染症と関連する発熱に対して対象を防御する。
【００１１】
[0011]本開示の第２の態様によれば、Ｑ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するためのワクチンであって、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含むワクチンが提供される。
【００１２】
[0012]特定の実施形態において、少なくとも１つの症状は発熱である。
【００１３】
[0013]典型的には、脱脂多糖は、１相細胞壁リポ多糖のリピドＡ構成成分を除去することによって得られるＯ−特異的多糖である。脱脂多糖は、誘導体化されていてもよい。
【００１４】
[0014]特定の実施形態において、脱脂多糖は免疫原性担体にコンジュゲートしている。典型的には、免疫原性担体は、タンパク質又はポリペプチドである。１つの例示的な実施形態において、免疫原性担体タンパク質は破傷風トキソイドである。脱脂多糖は、架橋剤を使用して担体にコンジュゲートしていてもよい。
【００１５】
[0015]本開示の第３の態様によれば、コクシエラ・バーネッティイ感染症に対する防御のためのコンジュゲートワクチンであって、ワクチンが、免疫原性担体に連結した、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含む、コンジュゲートワクチンが提供される。
【００１６】
[0016]脱脂多糖は、架橋剤を使用して免疫原性担体にコンジュゲートしていてもよい。例示的な実施形態において、免疫原性担体は、タンパク質、例えば破傷風トキソイドである。
【００１７】
[0017]特定の実施形態において、ワクチンは、Ｃ．バーネッティイ感染症と関連する発熱に対して対象を防御する。
【００１８】
[0018]本開示の第４の態様によれば、Ｑ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するためのコンジュゲートワクチンであって、ワクチンが、免疫原性担体に連結した、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含む、コンジュゲートワクチンが提供される。
【００１９】
[0019]特定の実施形態において、少なくとも１つの症状は発熱である。
【００２０】
[0020]脱脂多糖は、架橋剤を使用して免疫原性担体にコンジュゲートしていてもよい。例示的な実施形態において、免疫原性担体は、タンパク質、例えば破傷風トキソイドである。
【００２１】
[0021]本開示の第５の態様によれば、コクシエラ・バーネッティイ感染症に対する防御のための、及び／又はＱ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するための非毒性ワクチンを調製するための方法であって、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂多糖を免疫原性担体に連結することを含む方法が提供される。
【００２２】
[0022]脱脂多糖は、架橋剤を使用して免疫原性担体にコンジュゲートしていてもよい。例示的な実施形態において、免疫原性担体は、タンパク質、例えば破傷風トキソイドである。
【００２３】
[0023]上記態様の特定の実施形態において、ワクチンは、それが投与される対象における皮膚の有害作用、例えば硬結又は紅斑との関連はない。
【００２４】
[0024]本開示の第６の態様によれば、コクシエラ・バーネッティイ感染症に対して対象を防御するための方法であって、第１の又は第２の態様に記載の免疫防御量のワクチンを対象に投与することを含む方法が提供される。
【００２５】
[0025]本開示の第７の態様によれば、必要とする対象においてＱ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するための方法であって、免疫防御量の第１の又は第２の態様に記載のワクチンを対象に投与することを含む方法が提供される。
【００２６】
[0026]典型的には、対象はヒトである。
【００２７】
本開示の態様及び実施形態は、単に非限定的な例の目的で、以下の図面を参照しながら本明細書において述べる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】１相Ｃ．バーネッティイナインマイル菌株に感染する前及び後のモルモット（ｎ＝８）における体温及び体重変化を示す図である（実施例４に記載の１群）。体温に関しては、グラフの各点は、特定の日における平均体温＋／−１標準偏差を表す。
【図２】Ｃ．バーネッティイに感染していないモルモット（ｎ＝４）における体温及び体重変化を示す図である（実施例４に記載の２群）。体温に関しては、グラフの各点は、特定の日における平均体温＋／−１標準偏差を表す。
【図３】１相Ｃ．バーネッティイナインマイル菌株に感染する前及び後のモルモット（ｎ＝８）における体温及び体重変化を示す図である。動物を、Ｃ．バーネッティイｄＯＳＰ−ＴＴコンジュゲートワクチンで０日目にワクチン接種した（実施例４に記載の３群）。体温に関しては、グラフの各点は、特定の日における平均体温＋／−１標準偏差を表す。
【図４】１相Ｃ．バーネッティイナインマイル菌株に感染する前及び後のモルモット（ｎ＝８）における体温及び体重変化を示す図である。動物を、Ｃ．バーネッティイｄＯＳＰ−ＴＴコンジュゲートワクチンで０日及び２８日目にワクチン接種した（実施例４に記載の４群）。体温に関しては、グラフの各点は、特定の日における平均体温＋／−１標準偏差を表す。
【図５】１相Ｃ．バーネッティイナインマイル菌株に感染する前及び後のモルモット（ｎ＝６）における体温及び体重変化を示す図である。動物を、Ｃ．バーネッティイｄＯＳＰのみのワクチンで０日目にワクチン接種した（実施例４に記載の５群）。体温に関しては、グラフの各点は、特定の日における平均体温＋／−１標準偏差を表す。
【図６】１相Ｃ．バーネッティイナインマイル菌株に感染する前及び後のモルモット（ｎ＝６）における体温及び体重変化を示す図である。動物を、Ｃ．バーネッティイｄＯＳＰのみのワクチンで０日及び２８日目にワクチン接種した（実施例４に記載の６群）。体温に関しては、グラフの各点は、特定の日における平均体温＋／−１標準偏差を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
[0034]別段の定義がない限り、本明細書において使用する全ての技術及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。開示全体にわたって言及する全ての特許、特許出願、公開された出願及び文献、データベース、ウェブサイト、並びに他の公開資料は、特に記載がない限り、その全体が参照により組み込まれるものとする。用語に関して複数の定義が存在する場合には、この項における定義を優先する。ＵＲＬ又は他のそのような識別子若しくはアドレスを参照する場合、そのような識別子は変更されていることがあり、インターネット上の特定の情報は掲載されており、消去される場合があるが、同等の情報をインターネット検索によって見出せることが理解される。識別子に対する言及は、そのような情報の利用度及び一般的な普及度を証明する。
【００３０】
[0035]冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法上の対象物の１つ又は１つ超（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書において使用する。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）又は１つ超の要素（ｅｌｅｍｅｎｔ）を意味する。
【００３１】
[0036]本明細書の文脈において、「約」という用語は、同じ機能又は結果に達する文脈において、当業者であれば列挙される値と同等と考えるであろう様々な数を指すと理解される。
【００３２】
[0037]本明細書全体及びそれに続く特許請求の範囲にわたって、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語、及び変形形態、例えば「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」」又は「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載の整数又はステップ又は整数若しくはステップの群を含むが、その他の整数又はステップ又は整数若しくはステップの群を除外しないことを示唆することは理解されるであろう。
【００３３】
[0038]「任意選択で」という用語は、その後に記載される特徴が存在していてもしていなくてもよいか又はその後に記載される事象又は状況が生じても生じなくてもよいことを意味するために本明細書において使用する。したがって本明細書は、特徴が存在する実施形態及び特徴が存在しない実施形態、並びに事象又は状況が生じる実施形態及び事象又は状況が生じない実施形態を含み、包含することは理解されるであろう。
【００３４】
[0039]本明細書の文脈において、「タンパク質」及び「ポリペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用してもよい。
【００３５】
[0040]本明細書において使用する「治療する」及び「予防する」などの用語は、状態又は症状を治療するか、状態又は疾患の確立を予防するか、そうでなければ状態又は疾患又は１つ若しくは複数のこれらの不所望の症状の進行を何らかの方法で予防するか、妨害するか、遅らせるか、又は逆転させる任意の及び全ての使用を指す。したがって、「治療する」及び「予防する」などの用語は、これらの最も広範な文脈で考慮されるべきである。例えば、治療は、対象が完全に回復するまで治療されることを必ずしも暗示しない。複数の症状を示すか又はそれによって特徴付けられる状態において、治療又は予防は、前記症状の全てを治療するか、予防するか、妨害するか、遅らせるか、又は逆転させることを必ずしも必要としないが、前記症状のうちの１つ若しくは複数を予防するか、妨害するか、遅らせるか、又は逆転させる場合がある。本発明の文脈において、回復させるか、逆転させるか、予防するか、遅らせるか又は関連する場合がある症状としては、これらに限定されないが、発熱がある。
【００３６】
[0041]本明細書において使用する「対象」という用語は、哺乳動物、より詳細には本明細書において開示されるワクチン又は方法から利益を受けることがあるヒトを指す。本明細書において使用する「対象」という用語は、非ヒト霊長目、家畜動物（例えばウシ、乳牛、ウマ、ヒツジ、ブタ）、実験動物（例えばマウス、ウサギ、ラット、モルモット）、コンパニオンアニマル（例えばイヌ、ネコ）、野生動物及び捕獲野生動物も含む。ヒト又は非ヒト哺乳動物にかかわらず、対象は、本明細書において個体、対象、動物、患者、又はレシピエントと称されてもよい。
【００３７】
[0042]本明細書において使用する「免疫防御」という用語は、非毒性であるが、対象において防御免疫応答を誘発するか又は誘導する組成物又はワクチンの十分な量又は用量をその意味の中に含む。必要とされる正確な量又は用量は、因子、例えば治療される種、対象の年齢及び全身状態、投与される特定のワクチン及び投与様式などに応じて対象によって異なることになる。任意の所与の症例に関しては、適切な免疫防御量又は用量は、所定の実験のみを使用して当業者によって判定され得る。
【００３８】
[0043]コクシエラ・バーネッティイは、２つの分子形態で存在することがある。１相は、感染後は毒性があり、防御性であるが、２相は、感染後は無毒性であり、非防御性である。細菌のこれらの２つの形態間の１つの違いは、細菌性細胞壁のリポ多糖（ＬＰＳ）における多糖の長さである。１相では、多糖は長く、特有の単糖類（ビレノース（ｖｉｒｅｎｏｓｅ）など）を含有するが、２相では、多糖は短く、特有の単糖類はなく、「一般的な」糖のみから作製される。１相ＬＰＳは、Ｃ．バーネッティイにおいて重要な免疫原性分子である。
【００３９】
[0044]本発明は、細胞壁ＬＰＳから脂質構成成分を除去（脱脂）した後、その結果ＬＰＳと関連する毒性が除去されており、脱脂多糖を、Ｃ．バーネッティイ感染症及びＱ熱に対する安全で（非毒性の）有効なワクチンのベースとして使用することができ、その免疫原性は、好適な担体タンパク質とコンジュゲートすることによって強化することができるという発明者らの驚くべき実現に基づいている。
【００４０】
[0045]したがって、本開示の１つの態様は、コクシエラ・バーネッティイ感染症に対する防御のためのワクチンであって、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含むワクチンを提供する。
【００４１】
[0046]Ｑ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するためのワクチンであって、Ｃ．バーネッティイの細胞壁リポ多糖由来の脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含むワクチンも本明細書において提供される。
【００４２】
[0047]本明細書において使用する「ワクチン」という用語は広範な用語であり、通常の意味で使用し、限定するものではないが、アジュバント、希釈剤、賦形剤、担体、及び他の薬学的に許容される物質と任意選択で製剤化された、脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖又は免疫原性担体に連結した脱脂Ｃ．バーネッティイ多糖を含むコンジュゲートを含む。「薬学的に許容される」という用語は、生体系、例えば細胞、細胞培養物、組織、又は生物に適合する非毒性材料を指すために使用する。
【００４３】
[0048]特定の実施形態において、本開示は、脱脂多糖が、１相細胞壁リポ多糖のリピドＡ構成成分を除去することによって得られるＯ−特異的多糖である、ワクチンを提供する。
【００４４】
[0049]Ｃ．バーネッティイ細胞壁リポ多糖は、当業者に周知の標準的な技術に従って調製することができる。多糖は、天然に存在する細菌、遺伝子操作された細菌由来であってもよく、又は合成的に製造してもよい。多糖は、典型的には、使用前に１つ又は複数の処理ステップ、例えば、精製、官能基化、弱酸性又は酸化的条件を使用した脱重合、脱アセチル化などが行われる。後処理ステップは、必要に応じて用いてもよい。好適な多糖及びオリゴ糖を合成、調製、及び／又は精製するための当技術分野において既知の任意の好適な方法を用いることもできる。
【００４５】
[0050]本明細書において使用する「脱脂」は、リポ多糖から脂質を完全に又は実質的に除去し、脱脂多糖を生成することを指す。脱脂が実質的であるが完全ではない場合、除去される脂質構成成分の百分率は、例えば、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％超であってもよい。本開示の特定の実施形態において、脱脂は、Ｃ．バーネッティイの１相細胞壁リポ多糖のリピドＡ構成成分が除去されるというようなことである。
【００４６】
[0051]脱脂は、任意の好適な手段によって達成してもよい。例えば、リポ多糖は、酢酸、又はヒドラジン、又はリピドＡからエステル結合脂肪酸を除去することができるその他の薬剤若しくは酵素を用いて処理してもよい。様々な好適な技術が当業者に周知であり、本開示の範囲内である。
【００４７】
[0052]特定の実施形態において、本開示によるワクチンの調製において、脱脂多糖は、免疫原性担体分子に共有結合しているか又は別の方法でコンジュゲートしている。典型的には、免疫原性担体はタンパク質又はポリペプチドである。
【００４８】
[0053]様々な免疫原性担体タンパク質のうちのいずれか１つを用いてもよい。タンパク質の好適なクラスには、病原菌の線毛、外膜タンパク質及び排泄毒素；そのような毒素の非毒性又は「トキソイド」形態、細菌性毒素と抗原性が類似している非毒性タンパク質（すなわち交差反応材料又はＣＲＭ）、及び他のタンパク質が含まれる。免疫原性担体タンパク質としての使用が考慮される細菌性トキソイドの非限定的な例としては、破傷風毒素／トキソイド、ジフテリア毒素／トキソイド、解毒緑膿菌（ｄｅｔｏｘｉｆｉｅｄ  Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）毒素Ａ、コレラ毒素／トキソイド、百日咳毒素／トキソイド及びクロストリジウム・パーフリンゲンス（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ）外毒素／トキソイドがある。他の好適な細菌性タンパク質としては、これらに限定されるものではないが、肺炎球菌表面タンパク質Ａ（ＰｓｐＡ）、肺炎球菌付着タンパク質（ＰｓａＡ）、及び肺炎球菌表面タンパク質ＢＶＨ−３及びＢＶＨ−１１がある。好適なＣＲＭとしては、ＣＲＭ１９７、抗原性が同等のジフテリア毒素及びＣＲＭ３２０１、百日咳毒素の遺伝子操作されたバリアントがある。ウイルス性タンパク質、例えばＢ型肝炎表面／コア抗原；ロタウイルスＶＰ７タンパク質；及び呼吸器合胞体ウイルスＦ及びＧタンパク質の使用と同様に、キーホールリンペットヘモシアニン、カブトガニヘモシアニン及び植物エデスチンを含む非哺乳動物原料からの免疫原性担体タンパク質の使用も検討される。
【００４９】
[0054]例示的な実施形態において、免疫原性担体タンパク質は破傷風トキソイドである。
【００５０】
[0055]脱脂多糖と担体との間のコンジュゲートは、様々な試薬を使用して達成することができる。コンジュゲートは、脱脂多糖と担体タンパク質との間で直接的であっても、例えば還元的アミノ化による直接共有結合であってもよい。或いは、コンジュゲートは架橋薬剤を使用して行ってもよい。
【００５１】
[0056]架橋剤は、二官能性リンカーであってもよい。場合によっては、スペーサー又はリンカーの存在は、コンジュゲートの免疫原性の改善、及び多糖と担体とのより効率的なカップリングを促進することができる。リンカーの長さ及び可撓性は必要に応じて調整することができる。リンカーは、その調整に付随する抗原の並進運動性及び回転運動性特性における増加も可能にし、可溶性抗体に対する結合部位のアクセスも増加させる。本開示に従って用いることができる好適なリンカーとしては、これらに限定されるものではないが、アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）、ε−アミノヘキサン酸、ジアミノヘキサン、ε−アミノ−ｎ−カプロン酸、クロロヘキサノールジメチルアセタール、Ｄ−グルクロノラクトン及びｐ−ニトロフェニルアミンがある。カップリング剤としては、ヒドロキシスクシンイミド及びカルボジイミドがある。当業者に既知の多くの他のリンカー及びカップリング剤も、本開示による使用に好適である。
【００５２】
[0057]コンジュゲートの１つの例示的な方法は、脱脂多糖とアジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ）とを反応させ、多糖を誘導体化し、続いて担体、例えば破傷風トキソイドと１−エチル−３（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）とを反応させ、誘導体化された脱脂多糖に添加することを含む。この方法によって、脱脂多糖−担体コンジュゲートの共有結合凝集体が形成される。
【００５３】
[0058]脱脂多糖に活性化ステップを行ってから、担体とコンジュゲートしてもよい。「活性化」という用語は、多糖を化学的に治療し、担体と反応することができる化学基を提供する（すなわち多糖を官能基化する）ことを指す。Ｃ．バーネッティイ脱脂多糖を活性化するための１つの例示的な試薬は、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ）である。当業者であれば、様々な他の既知の活性化試薬及び手法を用いてもよいことは理解するであろう。
【００５４】
[0059]Ｃ．バーネッティイ感染症に対して対象を防御するため、及びＱ熱の少なくとも１つの症状を治療するか又は予防するための方法であって、本開示のワクチンを対象に投与することを含む方法も本明細書において提供される。
【００５５】
[0060]典型的には、対象はヒトである。特に興味深いものは、Ｃ．バーネッティイ感染症に罹患するリスクが最もある対象、例えば飼育動物、家畜（食肉処理場の労働者を含む）、捕獲野生動物又は野生動物の他の集団と定期的に又は頻繁に接触するものである。
【００５６】
[0061]ワクチンは、任意の好適な経路、例えば、筋肉、皮下、経口又は経鼻腔で投与してもよい。特定の実施形態において、投与は筋肉内又は皮下である。投与されることになる免疫防御量のワクチンは、典型的には、個別に判定し、過度の負担も、更なる発明の必要もなく当業者によって判定され得る。ほんの一例として、対象がヒトである場合、免疫防御量は、約２μｇ〜約２００μｇの間又は約５μｇ〜約５０μｇの間の単独の脱脂多糖を又は脱脂多糖−担体コンジュゲートを含んでいてもよい。例えば、免疫防御量は、約２μｇ、約１０μｇ、約２０μｇ、約３０μｇ、約４０μｇ、約５０μｇ、約６０μｇ、約７０μｇ、約８０μｇ、約９０μｇ、約１００μｇ、約１１０μｇ、約１２０μｇ、約１３０μｇ、約１４０μｇ、約１５０μｇ、約１６０μｇ、約１７０μｇ、約１８０μｇ、約１９０μｇ、又は約２００μｇの単独の脱脂多糖又は脱脂多糖−担体コンジュゲートであってもよい。ワクチンの免疫原性は、ワクチン投与後の対象における抗体の合成を含む、当業者であれば利用可能な様々な技術によって評価し、モニターすることができる。
【００５７】
[0062]免疫防御量のワクチンは、単回用量で又は一連の用量で投与してもよい。１回を超える用量が必要とされる場合、用量は、数日、数週間又は数カ月間隔で、例えば４週間間隔で投与してもよい。したがって、ワクチンは、単回用量又は１回若しくは複数回のブースターを含む一連として投与することができる。ワクチンが本明細書において述べる脱脂多糖−免疫原性担体コンジュゲートを含む実施形態において、典型的には、１回のみ又は２回の用量の免疫防御量のワクチンが、所望の防御性又は治療効果を達成するために必要である。
【００５８】
[0063]対象に投与されることになるワクチンの投薬量及び投与レジメンは、医薬及び獣医学の技術分野の当業者に周知の標準的な技術に従って判定することができ、因子、例えば使用目的、特に抗原、アジュバント（存在する場合）、年齢、性別、体重、種、全身状態、病歴及び／又は治療歴、並びに投与経路を考慮に入れる。予備用量は、動物試験に従って判定することができ、ヒト投与に関する投薬量のスケーリングは、技術的に許容される実践、例えば標準的な投薬トライアルに従って行われる。投薬量は、コンジュゲートの比活性によって決まり、所定の実験によって容易に判定することができる。
【００５９】
[0064]本開示のワクチン組成物は、典型的には滅菌されており、１つ又は複数の薬学的に許容される担体、例えば対象への投与に好適な１つ又は複数の適合する固体若しくは液体フィラー、希釈剤又は封入物質を含有していてもよい。本開示のワクチンの医薬組成物への製剤化は、当技術分野において既知の方法を使用して達成することができる。ワクチン組成物は、１つ又は複数のアジュバントも含有していてもよい。好適なアジュバントとしては、例えば、アルミニウムアジュバント、例えば水酸化アルミニウム又はリン酸アルミニウム、フロイントのアジュバント、ＢＡＹ、ＤＣ−ｃｈｏｌ、ｐｃｐｐ、モノホスホリルリピドＡ、ＣｐＧ、ＱＳ−２１、コレラ毒素及びホルミルメチオニルペプチド（例えば、Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｄｅｓｉｇｎ，ｔｈｅ  Ｓｕｂｕｎｉｔ  ａｎｄ  Ａｄｊｕｖａｎｔ  Ａｐｐｒｏａｃｈ、１９９５年、Ｍ．Ｆ．Ｐｏｗｅｌｌ及びＭ．Ｊ．Ｎｅｗｍａｎ編、Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．を参照のこと）がある。本開示のワクチンは、１つ又は複数のアジュバントを含んでいてもよい。例示的なアジュバントとしては、アルミニウム化合物（ミョウバン）、Ｎ−アセチルムラミル−Ｌ−アラニル−Ｄ−グルタミン、及び当業者に既知の他のアジュバントがある。
【００６０】
[0065]ワクチンは、溶解型又はマイクロ微粒子形態であってもよく、又は、例えば、リポソームとして製剤化されていてもよい。ワクチンが、非経口で、例えば静脈内、皮膚、皮下、又は他の注射によって投与されることになる場合、ワクチンは、典型的には、発熱因子不含の非経口で許容される水性又は油性の溶液又は懸濁剤の形態である。好適なｐＨ、等張性、安定性などを有する非経口で許容される溶液の調製物は、当技術分野の範囲内である。好適な希釈剤としては、例えば、水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び等張塩化ナトリウム溶液がある。更に、滅菌固定油を、溶媒又は懸濁媒体として慣例的に用いてもよい。この目的のために、合成モノ−又はジグリセリドを含む任意の無刺激の固定油を用いてもよい。更に、脂肪酸、例えばオレイン酸を注射可能な調製物の調製に同様に使用してもよい。
【００６１】
[0066]本明細書における任意の先行文献（又はそこからの情報）又は既知の任意の事項に対する言及は、先行文献（若しくはそこからの情報）又は既知の事項が、本明細書が関連する取組みの分野において一般的な知識の一部を形成することを承認する（ａｃｋｎｏｗｌｅｄｇｍｅｎｔ）か又は承認する（ａｄｍｉｓｓｉｏｎ）か又は暗示する任意の形態としては考えないか、又は考えるべきではない。
【００６２】
[0067]本開示は、以下の特定の例を参照しながら記載することになり、本開示の範囲を限定するものと決して解釈するべきではない。
【実施例】
【００６３】
[0068]以下の例は、本開示の例示であり、本明細書全体にわたる説明の開示の一般的な性質を限定するものと決して解釈するべきではない。
【００６４】
実施例１
コクシエラ・バーネッティイ細胞の培養及び精製
[0069]血清学的に相ＩのＣ．バーネッティイ菌株ナインマイル、ＲＳＡ  ４９３（Ｄａｖｉｓ及びＣｏｘ、Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｒｅｐ．５３巻：２２５９−２２７６頁、１９３８年）（本発明者らの実験室において卵黄嚢３継代）を６〜７日齢の発育鶏卵中で増殖させた。接種に関しては、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中のＣ．バーネッティイ感染した卵黄嚢（４０％）の懸濁原液を使用した。接種物は、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｆｏｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｒｉｃｋｅｔｔｓｉａｌ  ａｎｄ  Ｃｈｌａｍｙｄｉａｌ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｓ、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ、Ｓｌｏｖａｋ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｂｒａｔｉｓｌａｖａ、Ｓｌｏｖａｋｉａからのものである。ふ化卵を、感染懸濁原液（各０．２５ｍｌ）で希釈して接種すると、接種してから７〜８日後に胚の死滅が最も多く生じた。接種された卵を、３５．５℃及び５０〜９０％の相対湿度でインキュベートした。３日目から、インキュベートを、ｏｖｏｓｃｏｐｅを用いて１日２回モニターし、顕微鏡下、ヒメネス染色されたスメアによって卵黄嚢を評価した。最初の７２時間以内に死滅した胚を有する卵黄嚢を廃棄した。翌日、死滅した胚を卵黄嚢から分離し、胚を収集し、−２０℃で貯蔵した。残りの胚の４０〜６０％が死滅した日に、培養を終了した。Ｃ．バーネッティイに感染した全ての卵黄嚢から胚を採取し、収集し、−２０℃で貯蔵した。
【００６５】
[0070]解凍後、Ｃ．バーネッティイ感染した卵黄嚢を、０．２％フェノールを含有する１Ｍ  ＮａＣｌ水溶液中、ブレンダーでホモジネートし、２０％懸濁液とし、それを５℃で３日間静置した。次いで、混合物を１４，０００×ｇ、２０℃で４０分間遠心分離した。沈殿物を０．８５％ＮａＣｌ水溶液中に再懸濁し、１０％懸濁液とし、２〜３倍体積のエチルエーテルを添加した。Ｃ．バーネッティイ細胞を含有する水性層が乳白色になり、ヒメネス染色されたスメアから純粋Ｃ．バーネッティイ細胞のみが認められるまで、水相と有機相との間で分配を数回繰り返した。細胞を１０，０００×ｇ、２０℃で３０分間水性相から遠心分離し、０．１％フェノールを含有するＰＢＳ中の２ｍｇ／ｍｌ懸濁液（測光法で４２０ｎｍにおいて調整した）として５℃で貯蔵した。
【００６６】
実施例２
Ｃ．バーネッティイリポ多糖の単離及び解毒
[0071]Ｃ．バーネッティイ細胞（１．５ｇ）を５０ｍＭトリス−ＨＣｌ緩衝液（１５０ｍｌ、ｐＨ７．５）中に懸濁し、両方ともウシ膵臓（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）から得たＲＮＡ分解酵素（ＥＣ３．１．２７．５）及びＤＮａｓｅ（ＥＣ３．１．２７．１）を用いて、３７℃で１６時間、同時に治療した。次いで細胞をトリプシン１：２５０（ＥＣ２３２−６５０−８；Ｓｉｇｍａ）を用いて３７℃で９０分間、続いてＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ（ＥＣ３．４．２１．１４；Ｓｉｇｍａ）から得たプロテイナーゼＫによって、３７℃で１６時間、治療した。酵素治療後、細胞懸濁液を１４，０００×ｇ、１０℃で５０分間遠心分離し、沈殿物をアセトンで洗浄した。細胞をクロロホルム−メタノール（２：１、ｖ／ｖ）を用いて２０℃で３時間抽出し、リン脂質を除去した。抽出を、新鮮な溶媒混合物を用いて２時間繰り返した。細胞懸濁液を３，０００×ｇ、２０℃で２０分間遠心分離し、沈殿物を予熱した蒸留水（１５０ｍｌ、６８℃）中に懸濁し、等体積の９０％フェノール水溶液で前述のように抽出した（Ｗｅｓｔｐｈａｌ  ａｎｄ  Ｊａｎｎ、１９６５年）。リポ多糖（ＬＰＳ）を、大規模の透析（分子量カットオフ３，５００、Ｓｅｒｖａ）後に水性相から得、凍結乾燥した。粗製ＬＰＳの収量は、もとの細胞の重量に対して計算し、１４４ｍｇ（９．６％）であった。ＬＰＳを、ＲＮＡ分解酵素、ＤＮａｓｅ、及びプロテイナーゼＫ（上記を参照のこと）で治療し、透析し、凍結乾燥することによって更に精製した。
【００６７】
[0072]精製したＬＰＳのタンパク質及び核酸含有量は１％未満であった。タンパク質含有量を、Ｈａｒｔｒｅｅ、１９７２年の方法に従って比色分析で推定し、核酸を分光法で判定した。ＬＰＳのホスフェート、３−デオキシ−Ｄ−マンノ−オクタ−２−ウロソン酸（Ｋｄｏ）及びヘキソサミン含有量は、それぞれ１４０．２、９８．６、及び２８８．５ｎｍｏｌ／ｍｇであった。これらをＬｏｗｒｙら、１９５４年（ホスフェート）、Ｂｒａｄｅら、１９８３年（Ｋｄｏ）、並びにＳｗａｎｎ及びＢａｌａｚｓ、１９６６年（ヘキソサミン）の方法に従って比色分析で推定した。対応するアルジトールアセテートとしての構成成分中性糖のガスクロマトグラフィー−質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）による分析によって、ビレノース（６−デオキシ−３−Ｃ−メチル−Ｄ−グロピラノース）、ジヒドロヒドロキシストレプトース［３−Ｃ−（ヒドロキシメチル）−Ｌ−リキソフラノース］（Ｔｏｍａｎら、１９９８年）、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース、及びＤ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースのそれぞれ２４．２、１４．５、３５．２、１．５、及び２４．６（モル％）での存在が明らかになった。
【００６８】
[0073]ＬＰＳ（１２０ｍｇ）を、１％酢酸水溶液（１００ｍｌ）を用い、１００°Ｃで９０分間加水分解し、加水分解物を−２０℃で一晩維持した。融解後、沈殿させたリピドＡを低速遠心分離（９，３００×ｇで１０分間）によって除去した。脱脂多糖（脱脂Ｏ−特異的多糖又はｄＯＳＰ）溶液を中和し、大規模に透析し（分子量カットオフ３，５００、Ｓｅｒｖａ）、凍結乾燥した。ｄＰＳの収量は７８．２ｍｇ（６５．２％）であった。ｄＯＳＰのホスフェート、Ｋｄｏ及びヘキソサミン含有量は、それぞれ７０．３、４５．２、及び３１２．６ｎｍｏｌ／ｍｇであった。ｄＯＳＰのタンパク質及び核酸含有量は１％未満であった。ＧＣ−ＭＳによる中性糖の分析によって、ビレノース、ジヒドロヒドロキシストレプトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−グルコース、及びＤ−グリセロ−Ｄ−マンノ−ヘプトースはそれぞれ２１．１、１１．２、３７．３、３．２、及び２７．２（モル％）であることが明らかになった。
【００６９】
実施例３
脱脂Ｏ−特異的多糖の担体タンパク質へのコンジュゲート
[0074]毒性リピドＡ構成成分を除去することによる、そのリポ多糖（ＬＰＳ）由来の解毒（脱脂）Ｑ熱Ｏ−特異的多糖（ｄＯＳＰ）を、担体タンパク質としての破傷風トキソイドにコンジュゲートした。担体タンパク質の第１の目的は、動物に注射した場合にｄＯＳＰの免疫原性を改善し、Ｔ細胞依存性免疫応答を誘導することである。
【００７０】
[0075]精製したｄＯＳＰ（実施例２）を、１−シアノ−４−ジメチルアミノピリジニウムテトラフルオロボレート（ＣＤＡＰ；Ｓｉｇｍａ）で活性化し、前述の方法の修飾を使用して（Ｋｏｎａｄｕら、１９９６年）アジピン酸ジヒドラジド（ＡＤＨ；Ｓｉｇｍａ）で誘導体化した。簡潔には、方法論は以下のとおりであった。ｄＯＳＰを精製水中で５ｍｇ／ｍＬ（２．０ｍｇ／ｍＬ、ＣＤＡＰ及びＡＤＨの添加後）に希釈し、ｐＨを５．１〜５．５に調整した。ＣＤＡＰ（１００ｍｇ／ｍｌ、アセトニトリル中）を添加し、最終濃度を２．０ｍｇ／ｍＬにし、室温（ＲＴ）で２分間維持した。次いで、ｐＨを、１．０Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）（Ｓｉｇｍａ）を添加することによって約８まで増加させ、次いでＡＤＨ（９０ｍｇ／ｍｌ、０．１Ｍ  ＮａＨＣＯ３（Ｓｉｇｍａ）中）を反応混合物に添加し、最終濃度を９．０ｍｇ／ｍＬにし、１：４．５（ｗ／ｗ）のｄＯＳＰ：ＡＤＨの比率を得た。反応を室温で２時間進行させ、その間は８．０〜８．５の間のｐＨを維持した。次いで反応混合物を、８０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（Ｓｉｇｍａ）に対してｐＨ５．６、４℃で一晩透析した（ＭＷＣＯ６〜８ｋＤ、Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）。
【００７１】
[0076]破傷風トキソイド（ＴＴ）を以下のとおりに誘導体化ｄＯＳＰにコンジュゲートした。１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）（８０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ）（Ｓｉｇｍａ）ｐＨ５．６中に２０ｍｇ／ｍｌ）を８０ｍＭ  ＭＥＳ中のＴＴに添加し、次いで混合物を誘導体化ｄＯＳＰに添加し、ｄＯＳＰＡＨ：ＴＴ：ＥＤＣの最終濃度がそれぞれ０．５：０．２５：２．０ｍｇ／ｍｌになるようにした。反応を室温で３時間進行させ、ｐＨを５．５〜５．８の間で維持した。反応の最後に、残渣ＥＤＣを、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に対して１４回交換して透析することによって除去した（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ−Ｓｔｅｄｉｍ  ３００ｋＤ  Ｖｉｖａｓｐｉｎを使用して）。
【００７２】
実施例４
Ｃ．バーネッティイワクチンのモルモットへの投与
[0077]モルモットに、多糖−担体タンパク質（ｄＯＳＰ−ＴＴ）コンジュゲートワクチン又は多糖（ｄＯＳＰ）単独ワクチンのいずれかを１相Ｃ．バーネッティイナインマイル菌株に感染させる前にワクチン接種した。Ｃ．バーネッティイに感染したモルモットは急性ヒト感染症を最も詳細に模倣するので、モルモットはＱ熱研究のために選択される実験用小動物である。感染後、モルモットは数日間発熱し、次いで自然回復し、大部分のヒト感染症の進行を反映する。対照的に、実験室マウスの大部分の系統は、Ｃ．バーネッティイに感染した場合、感染症のいずれの症状も示さない。更に、いくつかのモルモットは、症状が消失するにもかかわらず感染症は完全に治癒せず、免疫抑制された場合、後日再発性感染症が再発する場合がある。これは、ヒトにおける慢性Ｑ熱に類似しており、ヒトの場合、急性Ｑ熱から明らかに回復した後に再発し、慢性Ｑ熱を発症する。
【００７３】
[0078]４０匹の成体モルモットを以下のとおり６つの実験群に分けた。
１群  陽性対照；ワクチンなし；Ｃ．バーネッティイ感染；ｎ＝８
２群  陰性対照；ワクチンなし；未感染；ｎ＝４
３群  Ｃ．バーネッティイに感染する前にｄＯＳＰ−ＴＴコンジュゲートワクチン（単回用量）をワクチン接種した；ｎ＝８
４群  Ｃ．バーネッティイに感染する前にｄＯＳＰ−ＴＴコンジュゲートワクチン（×２用量）をワクチン接種した；ｎ＝８
５群  Ｃ．バーネッティイに感染する前にｄＯＳＰ単独ワクチン（単回用量）をワクチン接種した；ｎ＝６
６群  Ｃ．バーネッティイに感染する前にｄＯＳＰ単独ワクチン（×２用量）をワクチン接種した；ｎ＝６
【００７４】
[0079]ワクチンの第１の用量（３、４、５及び６群）を０日目に筋肉内注射によって投与した。４及び６群では第２の用量を２８日目に筋肉内注射によって投与した。両用量は３０μｇのワクチンを含んでいた。Ｃ．バーネッティイのチャレンジ感染（１及び３〜６群）を５７日目に投与し、これはマウス脾臓で増殖した５×１０５細胞の生存可能な１相Ｃ．バーネッティイ、ナインマイル菌株からなり、モルモットを麻酔しながら液滴として経鼻腔で接種した。
【００７５】
[0080]各モルモットを−７日目から０日目まで（動物をそのケージに馴化させる１週間）及び０日目から７５日目まで毎日検討した。各モルモットの体温は、埋め込み式体温トランスポンダー（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ  ｔｒａｎｓｐｏｎｄｅｒ）を用いて毎日測定した。モルモットの体重を１週間に２回測定した。一般的な健康状態を連続的にモニターした。ワクチン注射後のＣ．バーネッティイに対する抗体の発生、並びに局所性（皮膚）及び全身性有害事象も評価した。
【００７６】
[0081]研究の間の各群におけるモルモットの体温変化を図１〜６に示す。「発熱」の定義は４０℃以上の体温であった。感染後の発熱は、１群（陽性対照、ワクチンなし）及び５群（ワクチン接種×１、ｄＯＳＰ単独ワクチン）のみにおいて検出された。陰性対照の２群を含む全ての他のモルモット群は熱がなかった。全ての群において発熱した日数を表１に要約する。
【００７７】
【表１】
2021502957.tif 000002
【００７８】
[0082]モルモットがワクチン接種されていないが、感染した１群では、モルモットは平均で３．９日発熱した。３群及び６群は、発熱した日数が有意に減少したことを（ｐ＜０．００７）示した。これらの結果より、ｄＯＳＰ−ＴＴコンジュゲートワクチンとｄＯＳＰ単独ワクチンの両方が、毒性があるＣ．バーネッティイに曝露されたモルモットにおける発熱の予防に効果的であったが、ｄＯＳＰ−ＴＴコンジュゲートワクチンのみが単回用量のワクチン後に効果を達成したことが実証された。１回用量のｄＯＳＰ単独ワクチンのみが投与された５群では、発熱からの防御は認められなかった（ｐ＜０．３）。これは、多糖の免疫原性が低いという既知の観点から予想された。
【００７９】
[0083]各群における研究中のモルモットの体重変化を図１〜６に示す。陰性対照群（２群）では、動物は、３０日まで一定の体重の増加、３０〜５５日に体重の上昇、次いで研究終了まで一定の体重を示した（図２）。それぞれワクチン群（３〜６群）では、動物は同様の体重曲線を有し、ワクチン接種及びその後の感染は体重損失につながらないことが実証された。しかし、陽性対照群（１群）では、動物にＣ．バーネッティイを感染させた５７日目から体重に顕著な減少があった。したがって、Ｃ．バーネッティイ感染症は、モルモットに体重の低下及び状態をもたらしたが、事前にワクチン接種していた場合はそうではなかった。感染したモルモットにおける臨床的悪化は、ｄＯＳＰ−ＴＴコンジュゲートワクチンとｄＯＳＰ単独ワクチンの両方によって予防された。
【００８０】
[0084]１０匹のモルモット（３〜６群から選択される）を、免疫蛍光法によって、ワクチン接種してから５６日後の１：２５の出発血清希釈における、Ｃ．バーネッティイに対する２相及び１相抗体の発生に関して検討した。１相と２相の両方のＣ．バーネッティイ細胞をガラススライドのウェル上に固定した。これらの細胞を、モルモット血清中の抗体と反応させた。血清の出発希釈は１：２５であり、そのような反応性が血清から消失するまでより高希釈（すなわち１：５０、１：１００等）を使用した。最後の陽性の希釈をそのモルモット血清に関する抗体力価と称した。陽性反応を、Ｃ．バーネッティイ細胞に付着したモルモット抗体と反応させる、フルオロセイン標識化抗モルモットＩｇＧ血清を使用した蛍光顕微鏡法によって検出した。結果を表２に示す。
【００８１】
【表２】
2021502957.tif 000003
【００８２】
[0085]１匹の動物（４群における＃１２）のみに抗体が発生した。体液性（抗体）免疫応答の非存在下にもかかわらず、ワクチン接種したモルモットはＣ．バーネッティイ感染から保護され、この感染症において細胞介在性免疫の重要性が高い可能性が指摘された。これは宿主動物及びヒトにおける細菌の既知の細胞内位置（ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａr  ｌｏｃａｔｉｏｎ）と一致する。全てのモルモットを、研究の最後の安楽死の直前に血液を抜き取り、そのうち３０匹のモルモットを試験すると、全てがＣ．バーネッティイに感染しているにもかかわらず、３匹のみが抗体を産生していなかった（表３）。
【００８３】
【表３−１】
2021502957.tif 000004
【表３−２】
2021502957.tif 000005
【００８４】
[0086]ワクチン接種を介してＣ．バーネッティイに既に曝露されている及び／又はＣ．バーネッティイ感染している８匹のモルモット（１、３、５及び６群からそれぞれ２匹の動物）に、その後ｄＯＳＰ−ＴＴコンジュゲートワクチン（１５μｇ）０．１ｍｌを皮下注射した。研究は、Ｃ．バーネッティイに曝露されたことがない２匹の非免疫モルモット（２群）も含んでいた。各動物を、ワクチンを注射してから７日間、毎日挙動の変化に関して検討し、任意の硬結又は紅斑が皮膚に発生したかどうかを評価した。結果を表４に示す。有害反応は全ての動物で認められず、ｄＯＳＰ−ＴＴコンジュゲートワクチンは、モルモットにおいてアレルゲン性ではなく、Ｃ．バーネッティイに既に曝露されているモルモットにおいて有害反応は一切なかったことを示した。
【００８５】
【表４】
2021502957.tif 000006
【００８６】
参考文献
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Hartree, Anal Biochem, 48:422-427, 1972
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Toman et al., Carbohyd Res, 306:291-296,1998
Westphal and Jann, Meth Carbohydr Chem,5:83-91, 1965
【図１】
2021502957.tif 000007
【図２】
2021502957.tif 000008
【図３】
2021502957.tif 000009
【図４】
2021502957.tif 000010
【図５】
2021502957.tif 000011
【図６】
2021502957.tif 000012
【国際調査報告】
2021502957.tif 000013
2021502957.tif 000014
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