(57)【要約】  本発明は、発酵ブロスからＬ−フコースを単離するための効率的な手法に関する。発酵ブロスに含まれるＬ−フコースは、微生物発酵（細菌または酵母）により生成される。本発明の方法は、発酵ブロスからバイオマスを除去する工程と、得られる溶液をカチオン交換処理およびアニオン交換処理の少なくとも１つに供する工程と、イオン交換処理後に塩を除去する工程とを含む。方法は、粉末形態、顆粒化形態およびＬ−フコース結晶の形態のＬ−フコースを提供し得る。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
発酵ブロスからＬ−フコースを精製するための方法であって、
Ｌ−フコースを含む発酵ブロスからバイオマスを除去する工程であり、清澄化溶液が提供される工程と、
カチオン性イオン交換処理、および
アニオン性イオン交換処理
に清澄化溶液を供することによって、精製溶液を提供する工程と、
電気透析および／またはナノ濾過によって精製溶液から塩を除去する工程と
を含む方法。
【請求項２】
Ｌ−フコースがカチオン性イオン交換材料を通過し、通過液中に存在する条件下でカチオン性イオン交換処理が行われ、Ｌ−フコースがアニオン交換材料を通過し、通過液中に存在する条件下でアニオン性イオン交換処理が行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
バイオマスが、
ｉ）遠心分離および／もしくは濾過によって発酵ブロスから除去され、濾過は、好ましくは、精密濾過、限外濾過、クロスフロー濾過、透析濾過およびそれらの組合せからなる群から選択される；ならびに／または
ｉｉ）Ｌ−フコースを生成する細胞、好ましくは細菌細胞、より好ましくは組換え細菌細胞、最も好ましくは組換え大腸菌細胞、組換えバチルス属細胞および／もしくは組換えコリネバクテリウム属細胞、特に組換え枯草菌および／もしくは組換えバチルス・メガテリウムを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
カチオン性イオン交換処理において強カチオン性イオン交換体が使用される、および／またはアニオン性イオン交換処理において強アニオン交換体が使用される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
カチオン性イオン交換処理が、不特定のカチオンを除去してそれらを特定のカチオンで置き換えるために、好ましくはそれらを特定のカチオンＨ＋またはＮａ＋で置き換えるために行われ、不特定のカチオンがＨ＋で置き換えられる場合、通過液のｐＨは、好ましくは、さらなる処理工程を行う前に６〜８のｐＨに、最も好ましくはＮａＯＨを通過液に添加することによって、調整される、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
アニオン交換工程が、不特定のアニオンを除去してそれらを特定のアニオンで、好ましくは特定のアニオンＣｌ−またはＯＨ−で置き換えるために行われ、不特定のアニオンがＣｌ−で置き換えられる場合、通過液のｐＨは、好ましくは、さらなる処理工程を行う前に６〜８のｐＨに、最も好ましくはＮａＯＨを通過液に添加することによって、調整される、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
Ｌ−フコースがアニオン交換材料およびカチオン交換材料を通過する条件が、清澄化溶液のｐＨおよび／または塩濃度を調整することによって、好ましくは清澄化溶液のｐＨを６〜８の範囲内のｐＨに調整することによって確立される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
カチオン性イオン交換処理およびアニオン性イオン交換処理後、精製溶液が、Ｌ−フコース、色彩付与物質および塩を含み、塩は、好ましくはＮａＣｌである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
アニオン性イオン交換処理において、塩化物形態のアニオン交換材料が使用され、および／またはカチオン性イオン交換処理において、水素形態のカチオン性イオン交換材料が使用される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
清澄化溶液が、まずカチオン性イオン交換処理に供され、その後アニオン性イオン交換処理に供される、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
精製溶液が、好ましくはナノ濾過および／または逆浸透によって、より好ましくはナノ濾過によって濃縮され、最も好ましくは、１００〜２００ｋＤａの範囲内の分子量カットオフを有するナノ濾過膜が使用される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
清澄化溶液および／または精製溶液が、
ｉ）１００ｇ／Ｌ以上、好ましくは２００ｇ／Ｌ以上、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以上のＬ−フコース濃度まで濃縮される；および／または
ｉｉ）８０℃未満、好ましくは５０℃未満、より好ましくは４℃〜４５℃、より好ましくは１０℃〜４０℃、より一層好ましくは１５℃〜３０℃、最も好ましくは１５℃〜２０℃の温度でのナノ濾過によって濃縮される；および／または
ｉｉｉ）２０℃〜５０℃、より好ましくは３０℃〜４５℃、最も好ましくは３５℃〜４５℃の温度での逆浸透によって濃縮される；および／または
ｉｖ）５バール超５０バール未満の間の圧力、好ましくは１０バール超４０バール未満の間の圧力、より好ましくは１５バール超３０バール未満の間の圧力でのナノ濾過によって濃縮される；および／または
ｖ）５バール超１００バール未満の間の圧力、好ましくは１０バール超８０バール未満の間の圧力、より好ましくは１５バール超７０バール未満の間の圧力での逆浸透によって濃縮される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
電気透析が、中性条件下での電気透析または酸性条件下での電気透析である、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
精製溶液から塩を除去した後に、
ｉ）精製溶液中の塩の量が、１０％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは５％（ｗ／ｗ）未満、より好ましくは１％（ｗ／ｗ）以下、より一層好ましくは０．５％（ｗ／ｗ）以下、最も好ましくは０．４％（ｗ／ｗ）以下、特に０．２％（ｗ／ｗ）以下である；および／または
ｉｉ）導電率が、０．２ｍＳ／ｃｍ２〜１０．０ｍＳ／ｃｍ２の間、好ましくは０．４ｍＳ／ｃｍ２〜５．０ｍＳ／ｃｍ２の間、より好ましくは０．５ｍＳ／ｃｍ２〜１．０ｍＳ／ｃｍ２の間である、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
清澄化溶液および／または精製溶液が、好ましくは活性チャコールでの処理ならびに／または直列に結合されたカチオン性イオン交換体およびアニオン性イオン交換体での処理による、変色の工程に供され、前記除去が、任意選択で、
ｉ）清澄化溶液の透析濾過および／もしくは濃縮の工程の前もしくは後に行われる；ならびに／または
ｉｉ）清澄化溶液の電気透析および／もしくは透析濾過の工程の前もしくは後に行われる、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
精製溶液が、
ｉ）顆粒化；
ｉｉ）噴霧乾燥；
ｉｉｉ）ローラー乾燥；または
ｉｖ）凍結乾燥
に供される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
精製溶液が、任意選択でブタノールを精製溶液に添加することによってまたはいかなる有機溶媒も精製溶液に添加せずに、結晶化に供される、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
１．少なくとも９５．００ｗｔ．％のＬ−フコース；
２．最大１．００ｗｔ．％の有機溶媒；および
３．最大１．００ｗｔ．％の塩
を含む組成物。
【請求項１９】
ａ）９５．５０〜１００ｗｔ．％のＬ−フコース、好ましくは９８．００〜１００．００ｗｔ．％のＬ−フコース、より好ましくは９８．５０〜１００．００ｗｔ．％のＬ−フコース、任意選択で９８．７０〜９９．９０ｗｔ．％のＬ−フコース；および／または
ｂ）０．００〜１．００ｗｔ．％の有機溶媒、好ましくは０．００〜０．５０ｗｔ．％の有機溶媒、より好ましくは０．００〜０．４０ｗｔ．％の有機溶媒、任意選択で０．１０〜０．２００ｗｔ．％の有機溶媒；および／または
ｃ）０．００〜１．００ｗｔ．％の塩、好ましくは０．００〜０．５０ｗｔ．％の塩、より好ましくは０．００〜０．４０ｗｔ．％の塩、任意選択で０．１０〜０．２０ｗｔ．％の塩
を含む、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
Ｌ−フコースが、非晶質形態または結晶形態で、好ましくは顆粒形態または結晶形態で存在する、請求項１８または１９に記載の組成物。
【請求項２１】
Ｌ−フコース、ならびにガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、イヌリン、ラクツロース、イソマルトース、マルトデキストリン、ラクトースおよびヒトミルクオリゴ糖から選択される少なくとも１種の他の炭水化物を含む食品組成物、好ましくは乳児用食品フォーミュラ、幼児用食品フォーミュラまたは医療用栄養製品。
【請求項２２】
２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトースおよびシアリル化ラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよびラクト−Ｎ−テトラオース誘導体からなる群から選択される少なくとも１種のヒトミルクオリゴ糖を含む、請求項２１に記載の食品組成物。
【請求項２３】
ｉ）液体食品組成物であり、１ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌの濃度、より好ましくは５ｍｇ／ｌ〜１．５ｇ／ｌの濃度、より一層好ましくは２０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌの濃度、最も好ましくは５０ｍｇ／ｌ〜０．７ｇ／ｌの濃度のＬ−フコースを含む；または
ｉｉ）固体食品組成物であり、５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｇ／ｋｇの濃度、より好ましくは２５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇの濃度、より一層好ましくは１００ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇの濃度、最も好ましくは３７５ｍｇ／ｋｇ〜５．２５ｇ／ｋｇの濃度のＬ−フコースを含む、請求項２１または２２に記載の食品組成物。
【請求項２４】
ｉ）少なくとも１種の中性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオースおよびラクト−Ｎ−ネオテトラオースからなる群から選択される少なくとも１種の中性ヒトミルクオリゴ糖、最も好ましくは前記中性ヒトミルクオリゴ糖の全て；ならびに
ｉｉ）少なくとも１種の酸性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースからなる群から選択される少なくとも１種の酸性ヒトミルクオリゴ糖、最も好ましくは前記酸性ヒトミルクオリゴ糖の全て；ならびに
ｉｉｉ）シアル酸、好ましくはＮ−アセチルノイラミン酸を含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項２５】
ラクトース、乳清タンパク質、ビオチン、無脂肪乳、植物油、脱脂粉乳、モルティエラ・アルピン（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ）の油、魚油、炭酸カルシウム、塩化カリウム、ビタミンＣ、塩化ナトリウム、ビタミンＥ、酢酸鉄、硫酸亜鉛、ナイアシン、カルシウム−Ｄ−パントテネート、硫酸銅、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ６、硫酸マグネシウム、ヨウ化カリウム、葉酸、ビタミンＫ、亜セレン酸ナトリウムおよびビタミンＤからなる群から選択される少なくとも１種の物質、任意選択で全ての物質を含む、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項２６】
タンパク質源、ビタミン、油、ミネラル、酵素、さらなる炭水化物およびプロバイオティクス株からなる群から選択される少なくとも１種の物質を含む、請求項２１〜２５のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項２７】
医療用食品組成物、健康補助食品、小袋製品、液体の即時使用可能な乳児用栄養製品、液体の即時使用可能な幼児用栄養製品、顆粒化製品、噴霧乾燥乳児用フォーミュラ製品、およびそれらの組合せからなる群から選択される組成物である、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の食品組成物。
【請求項２８】
１ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌの濃度のＬ−フコース、シアル酸ならびに
ｉ）２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオースおよびラクト−Ｎ−ネオテトラオースからなる群から選択される少なくとも１種の中性ヒトミルクオリゴ糖；ならびに／または
ｉｉ）３’−シアリラクトースまたは６’−シアリルラクトースからなる群から選択される少なくとも１種の酸性ヒトミルクオリゴ糖
を含む、液体の即時使用可能な乳児または幼児用栄養製品。
【請求項２９】
５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｇ／ｋｇの濃度のＬ−フコース、シアル酸ならびに
ｉ）２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオースおよびラクト−Ｎ−ネオテトラオースからなる群から選択される少なくとも１種の中性ヒトミルクオリゴ糖；ならびに／または
ｉｉ）３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースからなる群から選択される少なくとも１種の酸性ヒトミルクオリゴ糖
を含む、噴霧乾燥乳児用フォーミュラ製品。
【請求項３０】
Ｌ−フコース、ならびに２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオースおよびラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩからなる群から選択される少なくとも１種の中性ＨＭＯを含む健康補助食品。
【請求項３１】
Ｌ−フコース、ならびにタンパク質源、ビタミン、油、ミネラル、酵素、さらなる炭水化物およびプロバイオティクス株からなる群から選択される少なくとも１種の物質を含む、好ましくは噴霧乾燥、顆粒化または液体製品の形態の、プレミックスであって、好ましくは、
ｉ）タンパク質源は、乳清、トウモロコシ大豆ブレンド、タンパク質加水分解物およびそれらの組合せからなる群から選択される；ならびに／または
ｉｉ）ビタミンは、ビタミンＡ、チアミン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、フォレートおよびそれらの組合せからなる群から選択される；ならびに／または
ｉｉｉ）油は、パーム油、ＤＨＡ、アラキドン酸およびそれらの組合せからなる群から選択される；ならびに／または
ｉｖ）ミネラルは、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、酸化亜鉛およびそれらの組合せからなる群から選択される；ならびに／または
ｖ）酵素は、アミラーゼ、アミログルコシダーゼおよびそれらの組合せからなる群から選択される；ならびに／または
ｖｉ）炭水化物は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、イヌリン（ＦＯＳ）、ラクトース、イソマルトース、シアル酸およびそれらの組合せからなる群から選択される；ならびに／または
ｖｉｉ）プロバイオティクス株は、（カプセル化）ラクトバチルス、ビフィドバクテリア、バチルス、酵母およびそれらの組合せからなる群から選択される、プレミックス。
【請求項３２】
請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物を含み、任意選択で、Ｌ−フコースとは異なる少なくとも１種の糖および／または少なくとも１種のプロバイオティクス細菌株を含み、少なくとも１種の糖は、好ましくは、ラクトース、ラクツロース、イヌリンおよびスクロースからなる群から選択される少なくとも１種の糖である、好ましくはウイルス感染、細菌感染、記憶障害および腸内毒素症の少なくとも１つの予防または処置における使用のための、医薬組成物。
【請求項３３】
食品組成物および／または医薬組成物の製造における、請求項１８〜２０のいずれか１項に記載の組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、発酵ブロスからＬ−フコースを単離するための効率的な手法に関する。発酵ブロスに含まれるＬ−フコースは、微生物発酵（細菌または酵母）により生成される。本発明の方法は、発酵ブロスからバイオマスを除去する工程と、得られる溶液をカチオン交換処理およびアニオン交換処理の少なくとも１つに供する工程と、イオン交換処理後に塩を除去する工程とを含む。方法は、粉末形態、顆粒化形態およびＬ−フコース結晶の形態のＬ−フコースを提供し得る。
【背景技術】
【０００２】
炭水化物は、エネルギー貯蔵、構造的機能、シグナル伝達、情報記憶等において重要な役割を担うことによって、あらゆる種類の生物で役割を果たす。この目的のために、いくつかのメジャーな単糖、例えばグルコース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、マンノース、Ｎ−アセチル−マンノサミン、フルクトース、フコース、リボース、Ｌ−フコース、キシロース等、およびより特殊な用途のためのいくつかのマイナーな糖、例えばＤ−アロースが、天然に合成される。
【０００３】
Ｌ−フコース（６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース）は、いわゆる希少単糖の１つである。これは、多くの天然生成物においてＤ−およびＬ−形態：Ｌ−フコース（イソデュライト（ｉｓｏｄｕｌｉｔｅ）とも呼ばれる）およびＤ−フコース（ＣＡＳ  ３６１５−３７−０）の両方で見られる。Ｌ−型は、天然において最も一般的である。Ｌ−フコースは、研究開発における使用のための基本分子であり、グリカン構造の特徴的構成要素である。フコシル化物質の分野における科学的調査では、なかでも、それらが胚発生において極めて重要であり、生物の免疫応答に関与することが示されている。
【０００４】
Ｌ−フコースならびにフコシル化オリゴ糖および多糖は、栄養学および生物医学用途への高い可能性を有することから、化学、食品、化粧品および製薬産業において極めて注目されている（Ｈａｕｂｅｒら、２００８年、Ｉｎｔ．Ｊ．  Ｍｅｄ．  Ｓｃｉ．５：３７１〜３７６．；Ｉｓｎａｒｄら、２００５年、Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｉｃｓ  ２１９：３２４〜３３３；Ｒｏｂｅｒｔら、２００４年、Ｂｉｏｍｅｄ．Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒ．５８：１２３〜１２８；Ｗｉｌｄら、２００２年、Ｃｅｌｌｓ  Ｔｉｓｓｕｅｓ  Ｏｒｇａｎｓ  １７２：１６１〜１７３；Ａｄａｍら、１９９７年、Ａｍ．Ｊ．  Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃａｒｅ  Ｍｅｄ．１５５：２１０２〜２１０４）。さらに、フコシル化誘導体は、その抗アレルギーおよび乳化特性が知られている。また、食物により供給されるＬ−フコースは、哺乳動物に存在するＬ−フコースサルベージ経路を介してフコシル化グリカンの合成に使用され得ることも知られている。このように、Ｌ−フコースは、脳および免疫系の発達に重要である。重要性はまた、フコース代謝の遺伝性障害である白血球接着不全ＩＩ症候群によっても明らかである。
【０００５】
哺乳動物細胞では、Ｌ−フコースはフコシル化グリカン、例えばＡＢＯ血液型抗原およびヒトミルクオリゴ糖に存在する。Ｌ−フコースおよびフコシル化オリゴ糖またはタンパク質はまた、化学、製薬および栄養補給食品産業において極めて注目されている。
【０００６】
Ｌ−フコースはまた、なかでも、ヒト母乳中に約（０．５ｇ／ｌ）の濃度で見られる。ヒト母乳は、健康な子供の発育において重要な役割が与えられている。その中に存在する物質、特にオリゴ糖（ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ））は、母乳の主要な固形成分の１つであり、還元末端にラクトース単位を有し、分岐状している、またはＮ−アセチルラクトサミンに連鎖しているコア構造を有する。構造の変動性は、末端位置におけるフコシル修飾により拡張される。健康および発育上の利益の点で、ＨＭＯの生物学的機能は数多くの研究の対象となっているが、十分な量の化合物の技術的精製が必要である。先行技術では、天然源からの直接抽出により、または単糖の化学修飾によりＬ−フコースを提供することが知られている（ＰＴ  Ｖａｎｈｏｏｒｅｎら、１９９９年、Ｊ．Ｃｈｅｍ．，Ｔｅｃｈｎｏｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、７４、４７９）。
【０００７】
いくつかの単糖は、天然から大量に、妥当なコストで得ることができるが（例えばグルコース、Ｎ−アセチルグルコサミンおよびフルクトース）、ほとんどの単糖は比較的希少であり、例えばＬ−フコース（６−デオキシ−Ｌ−ガラクトース）のように天然では少量でしか見出すことができない。
【０００８】
単糖の商業生産では、ほとんど天然から得られたオリゴ糖のみが源として使用される。これらのオリゴ糖は酸加水分解され、放出された単糖から個々の糖が精製される。単糖の高い化学的類似性により（ほとんどの場合、個々のヒドロキシル基の配向によってのみ互いから区別される）、純粋な形態の個々の単糖の分離はいくぶん骨の折れる作業であり、費用を要する。
【０００９】
Ｌ−フコースの天然源は、海藻（フコイダン、硫酸化フコースポリマー）、ジャガイモ、大豆等の植物からの多糖である。植物では、フコースは、典型的には、多糖鎖の末端または多糖鎖内にＬ−フコピラノシル単位を有する多糖に関連している。Ｌ−フコースの別の重要な発生源は、細菌、真菌および微細藻類の細胞外多糖類である。
【００１０】
Ｌ−フコースは、様々な抽出方法によって藻類または細菌源等の天然源から得ることができる。Ｌ−フコースの回収に使用されるこれらの天然源の希少材料は、典型的には多成分混合物である。Ｌ−フコースは現在、これらの複合的なオリゴ糖の加水分解により得られる。十分な純度のＬ−フコースの分離を達成するのは困難であり、先端技術における問題である。
【００１１】
複合的な加水分解物からの個々の単糖の精製には、多くの場合、有害化学物質を使用する必要がある。例えば、ＵＳ３，２４０，７７６は、酢酸鉛および過剰量の有機溶媒を使用してＬ−フコースが単離される、Ｌ−フコースの抽出方法を開示している。
【００１２】
したがって、オリゴ糖の複合的な加水分解物からの個々の単糖の単離は困難であり（放出された個々の単糖の高い化学的類似性に起因する）、また環境に有害である（炭酸鉛等の毒性化学物質の過剰な使用に起因する）。また、ある特定の糖に富むオリゴ糖の利用可能性は、天然では幾分制限され得、また季節の変化により極めて変動性となり得る。Ｌ−フコースは主に、ヒバマタ科およびコンブ科を含む全ての一般的なワカメ中に存在するフカン一硫酸塩である多糖フコイダンから得られる（Ｂｌａｃｋ，Ｗ．Ａ．Ｐ  （１９５４）：Ｔｈｅ  ｓｅａｓｏｎａｌ  ｖａｒｉａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｏｍｂｉｎｅｄ  Ｌ−ｆｕｃｏｓｅ  ｃｏｎｔｅｎｔ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｏｍｍｏｎ  ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｌａｍｉｎａｒｉａｃｅａｅ  ａｎｄ  Ｆｕｃａｃｅａｅ．Ｊ．Ｓｃｉ．Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．５、４４５〜４４８）。
【００１３】
今日では、Ｌ−フコースは主に、世界中に見られるが大西洋の欧州沿岸で大量に見られるヒバマタ科に属するワカメの採集により大量に得られる。海岸からのワカメの大量採取は、環境上の懸念をもたらし、環境保護法により制限されている。Ｌ−フコースおよびＬ−フコース含有物質は、進行中の研究の対象である。
【００１４】
例えば、ＪＰ２０００３５１７９０は、フコイダンを抽出するための、ならびに抽出されたフコイダンからフコース含有オリゴ糖を獲得および分離するための方法を開示している。
【００１５】
ＷＯ２０１２／０３４９９６Ａ１は、天然のＬ−フコース含有細菌性多糖の加水分解によってＬ−フコースを得ることができることを示している。この文献は、腸内細菌科に属する株を開示しており、この株は、Ｌ−フコースを含む細胞外多糖を生成することができる。Ｌ−フコースの生成のために、その株により生成された多糖が回収され、例えば硫酸またはトリフルオロ酢酸での処理による加水分解に供される。
【００１６】
多糖またはオリゴ糖加水分解物からのＬ−フコースの抽出の他に、Ｌ−フコースの合成的生成のための異なる方法が開発されている。この生成プロセスは、Ｌ−アラビノース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ラムノース、Ｄ−マンノースおよびＤ−グルコース等の他の単糖から出発する。希少な単糖であるＬ−ラムノースから出発する最も効率的な合成経路により、Ｌ−フコースの効率的合成を達成することができた（Ｄｅｆａｙｅら、１９８４年、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ．Ｒｅｓ．１２６、１６５〜１６９）。一般に、これらの化学合成の収率は多くの場合幾分低く、いくつかの化学工程が関与する。いくつかの合成工程が関与することの他に、Ｌ−フコースの化学合成には広範な保護基化学を使用する必要がある。一般に、単糖の大量化学合成は、天然から収集された多糖からのＬ−フコースの抽出と比較して、経済的に実行可能であることは証明されていない。
【００１７】
Ｌ−フコースの回収には、典型的には、付随する糖または糖関連化合物の性質に依存して、例えばアニオンまたはカチオン交換樹脂によるクロマトグラフィー、透析、分別結晶化等の高度の分離技術が必要であった（ＷＯ２００５／０４０４３０Ａ１）。
【００１８】
ＪＰ６３０２７４９６は、ナガマツモ科またはモズク科に属する藻類からのＬ−フコースの直接抽出を記載している。藻類は、水中に分散され、濃硫酸で処理された。得られた加水分解藻類溶液は冷却され、不溶性物質は濾過により除去された。濾液のｐＨは５に調整され、濾液はチャコールで処理され、濾過された。Ｌ−フコース以外の糖を消化および除去するために、酵母が濾液に添加された。混合物は、チャコールで処理され、濾過された。濾液は、脱イオン化のためにカチオンおよびアニオン交換樹脂で処理され、濃縮された。濃縮された糖溶液は、エタノールと混合され、結晶化された。このようにして、９８．７％の純度のＬ−フコースが得られた。
【００１９】
ある刊行物は、テンサイパルプのエタノール不溶性残渣からのペクチンの単離を記載している（Ｒｏｍｂｏｕｔｓら、１９８６年、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、１５４：１７７〜１８７）。単離されたペクチンは、ＤＥＡＥ−セルロースでのクロマトグラフィーにより、またはＣｕＳＯ４での沈殿により精製された。ペクチンは、比較的高い含量の中性糖を有していた。各ペクチン中の主要な中性糖は、アラビノースおよびガラクトースであったが；存在する他の糖は、ラムノース、Ｌ−フコース、キシロース、マンノースおよびグルコースであった。Ｌ−フコースは、糖／ペクチン混合物から分離されなかった。
【００２０】
したがって、現在、純粋な形態のいかなる単糖の調製も、混合物中の他の単糖からの目的とする単糖の分離に著しい労力を必要とし、多くの場合大量の有機溶媒および他の有害化学物質が関与する。その結果、例えばＬ−フコース等の目的とする単一の単糖のみの蓄積が、多大な助けとなる。しかしながら、ほとんどの微生物は、それらが利用可能な単糖の種類に制限がある。さらに、微生物は、炭素源として同時にいくつかの単糖が利用可能である場合、ある特定の単糖に対する強い優先性を示すことが多い。
【００２１】
Ｌ−フコースの生成のための別の可能な手法は、化学合成である。Ｄ−ガラクトースのＣ−６炭素の脱酸素は、Ｄ−フコースをもたらす。しかしながら、Ｌ−ガラクトースは大量に利用可能ではないため、この方法はＬ−フコースの合成に実用的ではない。Ｌ−フコースは、Ｌ−アラビノースから、数多くの中間体が関与する複雑な反応シーケンスを介して得ることができる。Ｄ−グルコースにおけるＣ−５での立体配置の反転およびＣ−６の脱酸素は、複数工程手順でＬ−フコースを提供する。
【００２２】
Ｌ−フコースはまた、化学合成により、Ｌ−アラビノース（Ｔａｎｉｍｕｒａ、１９６１年、Ｃｈｅｍ．  Ａｂｓｔｒ．５５：１２３０６）、Ｄ−グルコース（Ｃｈｉｂａ，Ｔ．＆Ｔｅｊｉｍａ、１９７９年、Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．２７：２８３８〜２８４０）、メチル−Ｌ−ラムノース（Ｄｅｆａｙｅ，Ｊ．ら、１９８４年、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．１２６：１６５〜１６９）、Ｄ−マンノース（Ｇｅｓｓｏｎ，Ｊ−Ｐら、１９９２年、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．３３：３６３７〜３６４０）およびＤ−ガラクトース（Ｄｅｊｔｅｒ−Ｊｕｓｚｙｎｓｋｉ，Ｍ＆Ｆｌｏｗｅｒｓ，Ｈ−Ｍ．、１９７３年、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｒｅｓ．２８：１４４〜１４６）から得ることができる。複数酵素系を使用したフクロース−６−ホスフェートからのＬ−フコースおよびその類似体の酵素合成が行われている（ＷＯ９７／１５６８３Ａ１を参照されたい）。
【００２３】
Ｄ−マンノースから出発すると、Ｌ−フコースの生成にはＣ−１での立体選択的鎖伸長および末端グリコール部分の開裂が必要である。６−デオキシヘキソースとしてのＬ−ラムノースは、Ｌ−フコースを生成するためにＯＨ−反転、すなわちＣ−２およびＣ−４での反転を必要とする。Ｄ−ガラクトースは、反転を行う必要がなく、Ｃ−１ホルミル基の還元およびＣ−６一級ヒドロキシルからホルミルへの酸化がＬ−フコースをもたらすため、Ｌ−フコースの生成のための最も好適な出発材料であると思われている。上述のプロセスの共通の特徴は、プロセスの立体配置反転、脱酸素、ならびに還元および／または酸化工程を受けないヒドロキシル基の不可避の一時的保護である。しばしば選択的技術を必要とする数多くの保護／脱保護工程が、これらの方法を非効果的にしている。さらに、いくつかの場合において、副生成物から中間体を単離するために骨の折れるクロマトグラフィー分離が必要である。
【００２４】
ＷＯ２０１４／０６７６９６Ａ１は、一緒に作用して遊離形態のＬ−フコースを合成するグリコシルトランスフェラーゼおよびグリコシダーゼを有する組換え微生物を使用することによりＬ−フコースを生成するための方法を初めて記載している。この方法は、２種類の酵素および受容体分子を必要とする。グリコシルトランスフェラーゼは、ＧＤＰ−Ｌ−フコースから受容体、例えばラクツロースへのフコースの移動を触媒して、フコシルラクツロースを合成する。フコシル化受容体（例えばフコシルラクツロース）は、次いでグリコシダーゼにより受容体分子およびＬ−フコースに加水分解される。次いで受容体は、使用されたフコシルトランスフェラーゼにより再びフコシル化に利用可能となる。次いでＬ−フコースは、培地への輸送によって細胞から解放され、上清から回収され得る。この手段により、ＧＤＰ−フコース経路のフィードバック阻害を容易に克服することができ、微生物発酵によって有意な（数ｇ／ｌ）量の遊離Ｌ−フコースを得ることができる。
【００２５】
Ｌ−フコース自体およびフコシル化基質は、化学および製薬産業において重要な出発材料であるだけでなく、化粧品および栄養補給食品の製造において有用である。したがって、工業規模でのＬ−フコースの生成のための革新的な生成プロセスが常に必要とされている。
【００２６】
Ｌ−フコースを回収するためのバイオテクノロジー的な方法が提案されている。例えば、ＷＯ２０１２／０３４９９６Ａ１は、Ｌ−フコースの発酵生成のための腸内細菌科の単離微生物を使用したＬ−フコースの生成方法を教示している。しかしながら、Ｌ−フコースは時間を要する発酵の後にのみ非精製混合物として得られるため、Ｌ−フコースを得るために複雑なさらなる精製ステップが必要である。
【００２７】
ＵＳ８，６４２，２９７Ｂ２は、組換えセロリマンニトール−１−デヒドロゲナーゼを使用したＬ−フコースの生成を意図した一般的な発酵方法を前提としている。しかしながら、この目的において具体的な実施形態も実施例も開示されていない。さらに、反応に使用され得る代替の酵素は開示されていない。
【００２８】
ＷＯ２００５／０８７９４１Ａ１は、Ｌ−フコースの生成のための組み合わされた発酵酵素方法を開示している。この場合、まず、アセトバクテリウムのデヒドロゲナーゼを使用してＬ−フシトールからＬ−フクロースが生成される。次いでこれは、さらなる工程においてＬ−フコースに合成されなければならない。
【００２９】
別の方法として、アニオン交換クロマトグラフィーによるオリゴ糖の複雑な混合物の分離が説明されている（Ｄｅｒｅｖｉｔｓｋａｙａら、１９７５年、Ｄｏｋｌ．  Ａｋａｄ．Ｎａｕｋ．ＳＳＳＲ、２２３：１１３７〜１１３９）。この開示によれば、２−アミノ−２−デオキシグルシトール、グルコサミン、ガラクトースおよびＬ−フコースが、アニオン交換クロマトグラフィーによって０．２Ｍホウ酸塩で緩衝されたオリゴ糖混合物から成功裏に分離された。
【００３０】
ＪＰ  Ｈ１１−０３５５９１は、オキナワモズクから調製されたフコイダンまたはフコイダンを含有する抽出物からＬ−フコースを生成するための方法を開示している。この方法は、例えば、水および／または酸による処理、中和、透析および電気透析処理、ならびに溶離剤としてアルカリを使用したイオン交換処理を含む複数工程の方法である。Ｌ−フコースは、最終的にアルコールから結晶化される。
【００３１】
酵素および微生物合成もまた、Ｌ−フコースの生成に使用されている。Ｌ−フコースは、Ｌ−フクロース−１−ホスフェートアルドラーゼにより触媒され、続いて酸ホスファターゼおよびＬ−フコースイソメラーゼと反応する、ジヒドロキシアセトンホスフェート（ＤＨＡＰ）およびＤＬ−ラクトアルデヒドからの酵素合成により生成される。Ｌ−フコース生成物は、任意選択でシリカゲルによる分離と組み合わされたＤｏｗｅｘ（登録商標）５０Ｗ−Ｘ８（Ｂａ２＋形態）クロマトグラフィーにより単離された（Ｗｏｎｇら、１９９５年；Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．、６０：７３６０〜７３６３）。
【００３２】
ＥＰ０１０２５３５Ａ２は、１０％超のフコースおよび／またはラムノースを含む細胞外多糖を生成するアルカリゲネス属、クレブシエラ属、シュードモナス属またはエンテロバクター属を使用した発酵によって、フコースおよびラムノースから選択されるデオキシ糖を生成するための方法を開示している。フコースおよび／またはラムノースは、クロマトグラフィー、イオン交換もしくは吸着（例えばゼオライトとの）によって、またはさらなる発酵処理によって、発酵生成物の加水分解物から回収され得る。
【００３３】
同様に、腸内細菌科からの細菌株が、好気性発酵条件下で、Ｌ−フコース含有多糖を生成し得ることが判明しており、そこからフコースが酸性加水分解および多くの精製工程によって分離および単離されている（ＷＯ２０１２／０３４９９６Ａ１）。
【００３４】
しかしながら、例えば形質転換された大腸菌での発酵による、より低コストのフコシル化ラクトース生成手法が探求されている（Ｄｒｏｕｉｌｌａｒｄら、２００６年、Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ，Ｉｎｔ．Ｅｄ．４５、１７７８；ＷＯ２０１０／０７０１０４Ａ１；ＷＯ２０１０／１４２３０５Ａ１；ＷＯ２０１２／０９７９５０Ａ１、ＷＯ２０１２／１１２７７７Ａ２；Ｂａｕｍｇａｒｔｎｅｒら、２０１３年、Ｍｉｃｒｏｂ．Ｃｅｉｌ  Ｆａｃｔ．１２：４０）。
【００３５】
ＷＯ２０１５／０３２４１２Ａ１は、ラクトースの存在下で単一フコシルトランスフェラーゼをコードする組換え遺伝子を有する遺伝子修飾細胞を培養することにより、２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）およびジフコシルラクトース（ＤＦＬ）の混合物を高収率で作製する方法を開示している。２’−ＦＬおよびＤＦＬの得られる混合物は、酸により開始される、またはフコシダーゼにより媒介される加水分解に供され、Ｌ−フコースを高収率で生成し得る。
【００３６】
ＷＯ２０１６／１５０６２９Ａ１は、原材料としてＬ−フシトールを使用することによるＬ−フコースの生体触媒および／または発酵生成の方法を示している。１工程反応でＬ−フシトールをＬ−フコースに変換するために、生体触媒工程において単離後に、または生成する細胞内にｉｎ  ｖｉｖｏで直接、ガラクトースオキシダーゼが使用される。
【００３７】
ＷＯ２０１６／１２０４４８Ａ１は、Ｌ−フコースの発酵生成のための方法を記載している。微生物発酵プロセスを使用して遊離形態の単糖、例えばＬ−フコースを生成するための方法が開示されている。使用された微生物は、細胞内で生成されたヌクレオチド活性化糖に対してヒドロラーゼ活性を示し、非修飾遊離形態の単糖を放出する。遊離形態のＬ−フコースは、培養上清に運ばれる。
【００３８】
精製Ｌ−フコースを提供するための現行の試みは、小規模の実証にのみ関連しているが、今日まで、発酵ブロスからの食品グレード純度および食品グレード品質の大量精製プロセスは利用可能ではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００３９】
本発明の目的は、高純度のＬ−フコースの大量（工業規模）精製のための方法を提供することであった。具体的には、方法は、食品グレード品質でｋｇ規模からトン規模のＬ−フコースを提供するのに好適であるべきであり、連続的な様式で実行されるのに好適であるべきである。
【課題を解決するための手段】
【００４０】
この目的は、請求項１に記載の方法、請求項１８に記載の組成物、請求項２１に記載の食品組成物、請求項２８に記載の液体の即時使用可能な乳児または幼児用栄養製品、請求項２９に記載の噴霧乾燥乳児用フォーミュラ製品、請求項３０に記載の健康補助食品、請求項３１に記載のプレミックス、および請求項３３に記載の組成物の使用によって解決される。従属請求項は、有利な実施形態を例示している。
【００４１】
本発明によれば、発酵ブロスからＬ−フコースを精製するための方法が提供される。この方法は、
Ｌ−フコースを含む発酵ブロスからバイオマスを除去する工程であり、清澄化溶液が提供される工程と、
カチオン性イオン交換材料によるカチオン性イオン交換処理であり、Ｌ−フコースがカチオン性イオン交換材料を通過し、通過液中に存在する条件下で行われる、カチオン性イオン交換処理；および
アニオン性イオン交換材料によるアニオン性イオン交換処理であり、Ｌ−フコースがアニオン性イオン交換材料を通過し、通過液中に存在する条件下で行われる、アニオン性イオン交換処理
に清澄化溶液を供することによって、精製溶液を提供する工程と；
電気透析および／またはナノ濾過によって精製溶液から塩を除去する工程と
を含む。
【００４２】
本発明の方法は、高純度（食品グレード品質）および大量（１回の実行当たりｋｇからトンの範囲の工業規模）の目的とするＬ−フコースを提供するのに好適である。さらに、本発明の方法は、極めて迅速および安価に行うことができる。したがって、これは非常に経済的に実行され得る。さらに、方法は、バッチ式または連続式で行うことができる。後者は、回数当たりに得ることができる収率をさらに改善する。方法の最後には、Ｌ−フコースの純度は、８０％超、好ましくは９０％超、より好ましくは９５％超、最も好ましくは少なくとも９８％となり得る。
【００４３】
Ｌ−フコースの精製のための提示された方法はまた、Ｌ−フコースの生成に使用される組換え微生物発酵株由来の組換えＤＮＡおよび組換えタンパク質を、Ｌ−フコースの調合物が含まないという点で有利である。
【００４４】
本発明の方法は、発酵ブロスからの特定のＬ−フコースの精製のために考案されたものであるが、前記方法はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの酵素反応、いわゆるｉｎ  ｖｉｔｒｏ生体触媒反応により、または透過処理された全細胞生体触媒アプローチを使用することにより生成されたＬ−フコースの精製にも使用され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生体触媒反応の反応混合物からのＬ−フコースの精製は、反応混合物からのバイオマスの除去を必要としないことが理解される。したがって、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ生体触媒反応の反応混合物は、清澄化プロセスストリームに対応する。
【発明を実施するための形態】
【００４５】
定義
本発明によれば、「純度」という用語は、化学的純度を指し、Ｌ−フコース等の物質が異物で希釈されていない、または異物と混合されていない程度を指定するものである。したがって、化学的純度は、単一物質と副生成物／不純物との間の関係の指標である。化学的純度は、パーセンテージ（％）として表現され、以下の式を用いて計算される。
【００４６】
【数１】
2021503898.tif 000003
【００４７】
Ｌ−フコースを含む組成物において、Ｌ−フコースの純度は、当業者に公知の任意の好適な方法によって、例えばＨＰＬＣを使用することによって決定され得る。適切な検出器は、電気化学的検出器、屈折率（ＲＩ）検出器、質量分析計（ＭＳ）、ダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）およびＮＭＲ検出器からなる群から選択される検出器であってもよい。例えば、ＨＰＬＣにおいて、同じクロマトグラムにおけるＬ−フコースおよびＬ−フコースとは異なる化合物の量の両方を表すピーク下面積の合計に対するＬ−フコースの量を表すピーク下面積の比。しかしながら、これは、選ばれたＨＰＬＣ法によってすべての不純物が分析され得ることを暗に意味する。さもなければ、質量収支アプローチ、すなわち目的とする生成物（例えばＬ−フコース）の絶対的定量が必要である。このアプローチでは、純度の定量のために参照物質として純粋な物質が使用され、そして純度は生成物（目的とする生成物および全不純物）から得られた乾燥物量に対して鑑定される。前記質量収支アプローチはまた、本発明による純度を決定するために使用され得る。
【００４８】
本発明によれば、「培養ブロス」は、精製されるＬ−フコースを含有する発酵後の任意の液体を指す。「培養ブロス」、「発酵ブロス」および「培養培地」という用語は、本明細書において同義語として使用される。培養ブロスは、精製されるＬ−フコースだけでなく、バイオマス（例えば生体細胞および細胞残屑）、培地成分、塩、ならびに他の酸および有色化合物等の夾雑物を含む。培養ブロス中のＬ−フコースの純度は、８０％未満であってもよい。培養ブロス中に含まれる生体細胞は、Ｌ−フコースを細胞内で生成し、生成したＬ−フコースを液体培養培地中に排出する生体細胞である。生体細胞は、遺伝子修飾生体細胞、例えば遺伝子修飾大腸菌細胞を含んでもよく、またはそれからなってもよい。遺伝子修飾は、特にその生体細胞の増殖期の間にＬ−フコースを生成するための修飾を含んでもよく、またはそれからなってもよい。
【００４９】
「バイオマス」という用語は、本明細書において使用される場合、発酵工程の最後に発酵ブロス中に存在する生体細胞全体を指す。バイオマスは、Ｌ−フコースを生成した微生物の細胞、発酵工程中にＬ−フコースを生成する能力を失っていてもよい微生物の子孫細胞、および発酵工程の最後に発酵ブロス中に意図せずに存在する任意の他の細胞を含む。したがって、清澄化発酵ブロス、すなわちプロセスストリームが実質的に細胞を含まないように、発酵工程の最後に発酵ブロス中に存在する本質的にすべての生体細胞が、発酵ブロスから分離される。
【００５０】
「プロセスストリーム」という用語は、精製されるＬ−フコースを含む任意の溶液を指す。
「通過液」という用語は、イオン交換材料（すなわちカチオンおよび／またはアニオン交換材料）を通過した直後の、Ｌ−フコースを含む溶液を指し、すなわち、固相イオン交換材料に接触した後の、Ｌ−フコースを含む移動相である。換言すれば、通過液中に存在するＬ−フコースは、固定相に吸着されない、または固定相により吸収されいない。
【００５１】
本発明によれば、弱カチオン性イオン交換材料と強カチオン性イオン交換材料との間の違いは、前者のイオン交換に好適な化学基はｐＫａが少なくとも１（例えばカルボキシレート基のｐＫａのように、ｐＫａが２〜５）であり、一方で後者はｐＫａが１未満（例えばスルホン酸基のｐＫａのように、ｐＫａが−４〜０）であるという点である。
【００５２】
清澄化溶液の生成
バイオマスは、好ましくは、Ｌ−フコースを生成する生体細胞、好ましくはＬ−フコースを生成する細菌細胞、より好ましくはＬ−フコースを生成する組換え細菌細胞、最も好ましくはＬ−フコースを生成する組換え大腸菌細胞、組換えバチルス属細胞および／または組換えコリネバクテリウム属細胞、特に組換え枯草菌および／または組換えバチルス・メガテリウムを含む。
【００５３】
バイオマスは、遠心分離および／もしくは濾過によって発酵ブロスから除去され得、濾過は、好ましくは、精密濾過、限外濾過、クロスフロー濾過、透析濾過およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００５４】
培養ブロスからバイオマスを除去するための好適な遠心分離法では、バイオマスはペレットとして得られ、上清は、さらなる処理に供される清澄化プロセスストリームとして得られる。培養ブロスからバイオマスを除去するための好適な濾過法では、濾液が清澄化プロセスストリームとなる。バイオマスを除去するための好ましい濾過法は、精密濾過および／または限外濾過である。限外濾過では、精密濾過の場合よりもさらに小さい粒子が除去され得る。任意選択で、限外濾過は、クロスフロー限外濾過である。
【００５５】
精密濾過は、粒子を含有する流体が媒体に通される物理的分離プロセスであり、前記媒体は、粒子を保持するための入り組んだ（ｔｏｒｔｕｒｏｕｓ）チャネルを含有する多孔質物質（深層濾過）、および／または特定の細孔サイズより小さい粒子／分子を通過させる、前記細孔サイズを有する膜（膜濾過もしくはデッドエンド濾過）を含む。「精密濾過」という用語は、本明細書において使用される場合、生体細胞（および細胞残屑）が発酵ブロスから除去されて（清澄化）プロセスストリームから離れる物理的分離プロセスを指す。
【００５６】
限外濾過は、デッドエンド精密濾過と根本的には異ならない膜濾過の形態である。限外濾過では、圧力および濃度勾配により生成された力が、粒子および巨大可溶性分子を含む液体を半透膜に通し、粒子および巨大可溶性分子をいわゆる保持物中に保持させることによりそのような粒子および巨大可溶性分子の除去をもたらし、一方、水および低分子量溶質、例えばＬ−フコース等は、膜を通過して透過液（濾液）中に入る。限外濾過用の膜は、膜を通過して透過液中に入ることができる可溶性分子の最大分子量を表すその分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）により定義される。ＭＷＣＯより大きい任意の粒子および分子は、膜を通過することができず、保持物中に残留する。限外濾過は、液体の流れが膜表面と平行であるクロスフローモードで、または液体の流れが膜表面に垂直であるデッドエンドモードで適用されてもよい。
【００５７】
発酵ブロスからバイオマスを除去するための精密濾過および／または限外濾過用の非限定的な例および好適なフィルタは、コンパクトな設計およびより良好な性能を提供するためにらせん状に巻回されたポリエーテルスルホン膜を備えるモジュールであり、限外濾過用途のために０．０５μｍの公称細孔サイズを有するＳＰＩＲＡ−ＣＥＬ（登録商標）ＤＳ  ＭＰ００５  ４３３３を含む。精密濾過によりバイオマスを除去するための好適な膜は、少なくとも０．２μｍの細孔サイズを有し得る。あるいは、バイオマスの除去は、バイオマスおよびより大きなタンパク質等の追加的な細胞残屑を除去するために１００〜１０００ＫＤａの間、好ましくは１５０ｋＤａ〜５００ｋＤａの間のＭＷＣＯを有する膜を用いた精密濾過により行われてもよい。例えば、１５０，０００ダルトン（１５０ｋＤａ）のＭＷＣＯを有するポリエーテルスルホン膜（５ｍ２）を使用した中空繊維限外濾過モジュールであるＦＳ１０−ＦＣ  ＦＵＳ１５８２（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ  ＧｍｂＨ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ＤＥ）を代替として使用することができる。
【００５８】
追加的および／または代替的実施形態において、より小さい粒子および巨大可溶性分子は、クロスフロー限外濾過によって清澄化プロセスストリームから除去される。ここで、清澄化プロセスストリームは、１０ｋＤａのＭＷＣＯを有するフィルタ、例えば、１０，０００ダルトン（１０ｋＤａ）のＭＷＣＯを有するポリエーテルスルホン膜を使用したらせん状巻回限外濾過モジュール（５．７ｍ２）であるＳｐｉｒａ−Ｃｅｌ（登録商標）ＤＳＵＰ０１０（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ  ＧｍｂＨ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ＤＥ）を使用した限外濾過工程に供されてもよい。
【００５９】
要約すると、発酵ブロスからバイオマスを除去するための以下の可能性が、本発明において採用され得る。
１）遠心分離による採取。不溶性部分が、１工程で培養ブロスから除去される。利点：不溶性部分の迅速な除去；
２）精密濾過による採取。ある特定のサイズを超える不溶性部分および巨大分子が、１工程で培養ブロスから除去される。精密濾過では、らせん状巻回膜または中空繊維クロスフローフィルタが使用され得る。５００ｋＤａ以上の範囲内、より好ましくは１５０ＫＤａ以上の範囲内の分子量カットオフを有する精密濾過膜が使用され得る。利点：ある特定のサイズを超える不溶性部分および巨大分子の迅速な除去；
３）限外濾過による採取。ある特定のサイズを超える不溶性部分、巨大分子および小分子が、１工程で培養ブロスから除去される。限外濾過では、らせん状巻回膜または中空繊維クロスフローフィルタが使用され得る。１００ｋＤａ以下の範囲内、より好ましくは１０ＫＤａ以下の範囲内の分子量カットオフを有する限外濾過膜が使用され得る。利点：ある特定のサイズを超える不溶性部分、巨大分子および小分子の迅速な除去；
４）精密濾過と組み合わせた遠心分離による採取：ある特定のサイズを超える不溶性部分および巨大分子が、２工程で培養ブロスから除去される。精密濾過では、らせん状巻回膜または中空繊維クロスフローフィルタが使用され得る。５００ｋＤａ以上の範囲内、より好ましくは１５０ＫＤａ以上の範囲内の分子量カットオフを有する精密濾過膜が使用され得る。利点：精密濾過に使用される膜またはフィルタを詰まらせることのない、ある特定のサイズを超える不溶性部分および巨大分子の迅速な除去；
５）限外濾過と組み合わせた遠心分離による採取：ある特定のサイズを超える不溶性部分、巨大分子および小分子が、２工程で培養ブロスから除去される。限外濾過では、らせん状巻回膜または中空繊維クロスフローフィルタが使用され得る。１００ｋＤａ以下の範囲内、より好ましくは１０ＫＤａ以下の範囲内の分子量カットオフを有する限外濾過膜が使用され得る。利点：限外濾過に使用される膜またはフィルタを詰まらせることのない、ある特定のサイズを超える不溶性部分、巨大分子および小分子の迅速な除去；
６）限外濾過工程と組み合わせた精密濾過による採取：ある特定のサイズを超える不溶性部分、巨大分子および小分子が、２工程で培養ブロスから除去される。精密濾過および／または限外濾過では、らせん状巻回膜または中空繊維クロスフローフィルタが使用され得る。５００ｋＤａ以上の範囲内、より好ましくは１５０ＫＤａ以上の範囲内の分子量カットオフを有する精密濾過膜が使用され得る。１００ｋＤａ以下の範囲内、より好ましくは１０ＫＤａ以下の範囲内の分子量カットオフを有する限外濾過膜が使用され得る。利点：限外濾過に使用される膜またはフィルタを詰まらせるリスクが少ない、ある特定のサイズを超える不溶性部分、巨大分子および小分子の最も迅速な除去。
【００６０】
Ｌ−フコースを含む清澄化プロセスストリームは通常、（これらに限定されないが）一価イオン、二価イオン、アミノ酸、ポリペプチド、タンパク質、有機酸、核酸、単糖および／またはオリゴ糖を含む、実質的な量の望ましくない不純物を含有し得る。
【００６１】
好ましくは本発明の方法には存在しない工程
本発明の方法は、１つまたは複数のクロマトグラフィー分離工程を含んでもよい。しかしながら、好ましい実施形態において、方法は、クロマトグラフィー分離を必要としない、またはそれを含まない（例えばクロマトグラフィー分画を必要としない）ことを特徴とし得る。クロマトグラフィー分離を行わないことの利点は、溶出溶液を調製し、それを使用して固相からＬ−フコースを溶出し、溶出物の分画物をプールするための時間および経費が省かれることから、この方法がより迅速に、およびより安価に実行され得ることである。
【００６２】
さらに、本発明の方法は、メタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、２−ブタノンおよび／または酢酸エチルの使用を含まず、任意選択で有機溶媒の使用を必要としないことを特徴とし得る。有機溶媒を使用しないことの利点は、最終生成物である最終的なＬ−フコースまたはＬ−フコースを含む組成物が、メタノール、エタノール、ｎ−プロパノール、イソプロパノール、２−ブタノンおよび／または酢酸エチルを含まず、任意選択でいかなる有機溶媒も含まないことが確実となり得ることである。さらに、プロセスはより安価となり、環境に優しくなり、また作業者にとってより安全となる。
【００６３】
さらに、本発明の方法は、有機溶媒を含む溶液で固定相からＬ−フコースを溶出する工程を含まないことを特徴とし得る。利点は、精製Ｌ−フコースがいかなる有機溶媒も含まないことを維持し得ることである。さらに、プロセスはより安価となり、環境に優しくなり、また作業者にとってより安全となる。
【００６４】
さらに、本発明の方法は、重金属の使用を必要としないことを特徴とし得る。利点は、精製Ｌ−フコースが重金属を含まないことが確実となり得ることである。
本発明の方法は、プロセスストリームを、好ましくは４５℃超の温度に加熱する１つまたは複数の工程を含んでもよい。しかしながら、好ましい実施形態において、本発明の方法は、発酵ブロス、清澄化溶液および／または精製溶液を４５℃超の温度に加熱する工程を含まない。利点は、そのような熱処理工程を採用する先行技術の方法と比較して、各溶液を加熱するためのエネルギーが削減され、それによって方法がより経済的で、かつより環境に優しくなることである。
【００６５】
カチオン性イオン交換処理
不純物のなかでも、カチオンは、本発明の方法のカチオン性イオン交換処理工程によって、すなわち少なくとも１回のカチオン交換処理を清澄化プロセスストリームに適用することによって、清澄化プロセスストリームから除去され得る。具体的には、カチオンは、清澄化プロセスストリームがカチオン性イオン交換処理工程に適用される前にカチオン交換体（固定相）の材料に結合している他のカチオンに、交換される。重要なことに、カチオン性イオン交換処理が、清澄化プロセスストリームからアンモニアおよび汚染タンパク質の一部を除去することが判明した。
【００６６】
カチオン性イオン交換処理工程では、正電荷を有する材料が樹脂に結合するため、それらは、細胞を含まない培養ブロスから除去され得る。Ｌ−フコースの水溶液は、正電荷を有する材料をカチオン交換材料に吸着させる一方でＬ−フコースを通過させる任意の好適な様式で接触する。カチオン交換樹脂と接触した後に得られる液体は、水、所定のカチオン（この工程の前にカチオン性イオン交換材料に固定されていたカチオン）、アニオン、着色物質およびＬ−フコースを含む。
【００６７】
カチオン交換処理は、弱カチオン性イオン交換材料または強カチオン性イオン交換材料を用いて行うことができ、好ましくは強カチオン性イオン交換材料を用いて行われる。
本発明の方法のカチオン性イオン交換処理では、強カチオン性イオン交換体が使用され得る。正電荷を有する化合物を除去するのに好適なカチオン交換樹脂は、強酸性カチオン交換樹脂、例えば、固体骨格（例えばポリスチレン骨格）に結合したカルボキシレート基（弱カチオン交換体）またはスルホン酸基（強カチオン交換体）を含む樹脂である。好適な樹脂は、（これらに限定されないが）Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ２５６８（Ｈ＋）（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）５０ＷＸ２（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ＤＥ）；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ−１１６（オルガノ株式会社）およびＤｉａｉｏｎ（商標）ＳＫ−１０２（三菱ケミカル株式会社）を含む。
【００６８】
カチオン性イオン交換処理工程は、培養培地からのバイオマスの除去後の第１の工程、すなわち清澄化培養培地が供される第１の工程であってもよい。
不特定のカチオンは、好ましくは、特定のカチオンＨ＋またはＮａ＋により置き換えられる。不特定のカチオンがＨ＋により置き換えられる場合、通過液のｐＨは、好ましくは、さらなる処理工程（例えばアニオン性イオン交換処理）を行う前に６〜８のｐＨに、最も好ましくは通過液にＮａＯＨを添加することにより調整される。
【００６９】
好ましい実施形態において、清澄化プロセスストリームがカチオン交換体に適用される前に、カチオン性イオン交換材料はＨ＋形態で存在する、すなわちカチオン性イオン交換材料のイオン交換リガンドがプロトン化されている。これによって、カチオン交換の間に、清澄化プロセスストリーム中のカチオンがＨ＋により置き換えられる。したがって、前記の工程後の溶液（通過液）のｐＨは、前記の工程前の溶液のｐＨよりも酸性である。好ましくは、その後の精製工程の前に、通過液のｐＨは中性またはほぼ中性のｐＨ値（例えばｐＨ６．５以上ｐＨ７．５以下）まで上昇する。ｐＨの上昇は、プロセスストリームにＮａＯＨを添加することにより達成され得る。
【００７０】
カチオン性イオン交換体は、対イオンとして任意のアルカリ金属（Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋）、アルカリ土類金属（例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋）、アンモニウムイオンまたは炭酸イオンと共に使用され得る。好ましくは、ナトリウム（Ｎａ＋）がカチオン性イオン交換体の対イオンである。より好ましくは、水素（Ｈ＋）が対イオンである。対イオンとしての水素の利点は、カチオン性イオン交換材料と接触した際にプロセスストリーム中にプロトン化形態のアニオンが生成され、これらのプロトン化アニオンが通過液中に、すなわちカチオン性イオン交換材料を通過した溶液中に見られることである。その後、プロトン化形態の前述のアニオンは、塩基（例えばＮａＯＨ）を生成物ストリームに添加し、これがプロトン化形態の前述のアニオンを特定の塩形態（例えばナトリウム塩形態）に変換することによって中和され得る。ナトリウム塩形態のアニオンを得ることは、ナトリウムイオンが比較的小さいカチオンであり、より大きいカチオンよりもナノ濾過および／または電気透析によって容易に除去され得るため有益である。
【００７１】
好ましくは、カチオン交換処理工程は、アニオン交換処理工程の前に行われる。しかしながら、原則的に、カチオン性イオン交換処理はまたアニオン交換処理工程後に行うことができる。
【００７２】
カチオン交換樹脂の粒子サイズは、好ましくは、０．１〜１ｍｍの間の範囲内である。この粒子サイズ範囲は、使用された細胞を含まない培養ブロスが効率的に流動する一方で、それでも電荷を有する材料がカチオン交換樹脂により効果的に除去されることを可能にする。イオンの効率的な交換が生じ得ることを確実にするために、流速は、好ましくは床容積の０．５倍超２．５倍未満の間、より好ましくは１．０倍超２．０倍未満の間となるべきである。イオン交換処理は、従来の様式で、例えばバッチ式または連続式で、好ましくは連続式で行うことができる。
【００７３】
Ｌ−フコースがカチオン交換材料を通過する条件は、清澄化溶液のｐＨおよび／または塩濃度を調整することによって、好ましくは清澄化溶液のｐＨを６〜８の範囲内のｐＨに調整すること、および／または必要に応じて塩濃度を調整することによって確立され得る。
【００７４】
カチオン性イオン交換処理およびアニオン性イオン交換処理後、精製溶液は、Ｌ−フコース、色彩付与物質および塩を含んでもよく、塩は、好ましくはＮａＣｌである。本発明の好ましい実施形態によれば、アニオン性イオン交換処理において、塩化物形態のアニオン交換材料が使用される。
【００７５】
本発明のさらなる好ましい実施形態によれば、カチオン性イオン交換処理において、水素形態のカチオン性イオン交換材料が使用される。水素形態（Ｈ＋対イオン）のカチオン交換体の使用は、任意の他の形態（Ｈ＋以外の対イオン）のカチオン交換材料と比較して、塩および汚染タンパク質のはるかにより良好な結合が得られるため有益であることが発見された。水素形態の使用によって、通過液がカチオン性イオン交換処理に適用された溶液よりも酸性のｐＨを有するようになる。しかしながら、前記ｐＨは、塩基、好ましくはＮａＯＨの添加によって容易に中性ｐＨまで、好ましくは６〜８の範囲内のｐＨまで上昇する。ＮａＯＨによる中和は、導入されるナトリウムイオンが比較的小さく、ナノ濾過および／または電気透析によって容易に除去され得るため有益である。
【００７６】
カチオン交換樹脂の粒子サイズは、使用された細胞を含まない培養ブロスが効率的に流動する一方で、それでも電荷を有する材料がカチオン性イオン交換樹脂により効果的に除去されることを可能にするように選択されるべきである。イオンの効率的な交換が生じ得ることを確実にするために、流速は、好ましくは床容積の０．２倍超２．０倍未満、より好ましくは０．５倍超１．５倍未満となるべきである。イオン交換処理は、従来の様式で、例えばバッチ式または連続式で、好ましくは連続式で行うことができる。
【００７７】
清澄化溶液は、まずカチオン性イオン交換処理に供され、その後アニオン性イオン交換処理に供されてもよい。このプロセスの順番は、カチオン性イオン交換材料が汚染タンパク質の強い結合を得るためにＨ＋形態となり得、塩基（例えばＮａＯＨ）での中和後に、アニオン性イオン交換材料にプロセスストリーム中の所定の塩形態のアニオン（例えばＮａ＋形態のアニオン）を含む溶液が流され得るという利点を有する。
【００７８】
アニオン性イオン交換処理
好ましくは、アニオン交換処理工程は、カチオン交換処理工程の後に行われる。しかしながら、原則的に、アニオン交換処理工程は、カチオン交換処理工程の前に、すなわちプロセスストリームがカチオン性イオン交換体で処理された後に行うことができる。
【００７９】
アニオン交換工程は、不特定のアニオンを除去し、それらを特定のアニオン、好ましくは特定のアニオンＣｌ−またはＯＨ−により置き換えるために行われる。不特定のアニオンがＣｌ−により置き換えられる場合、通過液のｐＨは、好ましくは、さらなる処理工程（例えば電気透析により精製溶液から塩を除去する工程）を行う前に６〜８のｐＨに、最も好ましくは通過液にＮａＯＨを添加することにより調整される。
【００８０】
アニオンは、本発明の方法のアニオン性イオン交換処理工程によって、すなわち少なくとも１回のアニオン性イオン交換処理を清澄化プロセスストリームに適用することによって、清澄化プロセスストリームから除去され得る。アニオン性イオン交換処理工程は、培養培地からのバイオマスの除去後の第１の工程、すなわち清澄化培養培地が供される第１の工程であってもよい。好ましくは、アニオン性イオン交換処理は、カチオン性イオン交換処理工程の後の工程で行われる。
【００８１】
負電荷を有する材料は、アニオン性イオン交換樹脂に結合するため、プロセスストリームから除去され得る。Ｌ−フコースを含む水溶液は、負電荷を有する材料をアニオン交換材料に吸着させる一方でＬ−フコースを通過させる、任意の好適な様式で接触する。アニオン交換樹脂と接触した後に得られる液体は、水、所定のカチオン、所定のアニオン、着色物質およびＬ−フコースを含む。アニオン性イオン交換工程の条件は、Ｌ−フコースがアニオン交換材料に結合しない、すなわち材料と接触した後に通過液中に存在するような条件である。
【００８２】
アニオン性イオン交換処理の開始時に、生成物ストリームのｐＨは好ましくはｐＨ６〜８（最も好ましくはｐＨ７）に調整される。通過液（アニオン交換材料を通過した生成物ストリーム）は、より低いｐＨ、例えば４．５〜６の範囲内のｐＨを有し得る。このｐＨでは、通過液中のアニオンは、プロトン化形態で存在し得る。通過液のｐＨは、塩基、例えばＮａＯＨを添加することにより上昇され得る。
【００８３】
アニオン交換の間、清澄化プロセスストリーム中のアニオンは、Ｃｌ−により置き換えられ得る。したがって、プロセスストリームのｐＨは若干より酸性となる。好ましくは、ｐＨは、その後の精製工程の前に、好ましくはプロセスストリームの中性またはほぼ中性のｐＨ値（ｐＨ６．５以上ｐＨ７．５以下）を達成するように増加される。より好ましくは、プロセスストリームのｐＨの増加は、プロセスストリームにＮａＯＨを添加することにより達成される。
【００８４】
アニオン交換体は、弱アニオン性イオン交換体または強アニオン性イオン交換体、好ましくは強アニオン性イオン交換体であってもよい。
好適な強塩基性アニオン交換樹脂は、固体骨格（例えばポリスチレン骨格）に結合したトリメチルアンモニウム基またはヒドロキシエチル基を含む樹脂である。好適な樹脂は、（これらに限定されないが）Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ６３６８Ａ、Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ４２６８、Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ５５２８、Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ６３６８Ａ（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＡＧ  １ｘ２、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）１ｘ８、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ＣＧＡ１００ｘ４（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  ＧｍｂＨ、ラーティンゲン、ＤＥ）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＦＰＡ５１（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＭＩ、ＵＳＡ）を含む。好ましくは、アニオン交換樹脂は、塩化物形態で存在する。好適な弱アニオン交換樹脂は、固体骨格（例えばポリスチレン骨格）に結合したアミノ酸を含む樹脂である。
【００８５】
アニオン性イオン交換体は、対イオンとして任意の塩基、例えばＨＣＯ３−、Ｉ−、Ｂｒ−、ＮＯ３−等と共に使用され得る。好ましくは、対イオンは、水酸化物イオン（ＯＨ−）である。より好ましくは、対イオンは、塩化物イオン（Ｃｌ−）である。対イオンとして塩化物イオンを使用する利点は、Ｃｌ−アニオンが、発酵ブロス中に元々存在する多くの他のアニオンより小さいことである。これによって、電気透析および／またはナノ濾過（例えば透析濾過）により塩化物アニオンがプロセスストリームからより容易に除去され得る。対イオンとしてＯＨ−アニオンを使用する利点は、アニオン性イオン交換処理後の工程においてｐＨがＨＣｌで中和される場合、他のアニオンより容易に除去され得る小さい塩化物アニオンがプロセスストリームに導入されることである。
【００８６】
アニオン交換樹脂の粒子サイズは、使用されたプロセスストリームが効率的に流動する一方で、それでも電荷を有する材料がアニオン交換樹脂により効果的に除去されることを可能にするために、好ましくは０．１〜１ｍｍの間である。イオンの効率的な交換が生じ得ることを確実にするために、流速は、好ましくは床容積の０．５倍超２．５倍未満、より好ましくは１．０倍超２．０倍未満となるべきである。イオン交換処理は、従来の様式で、例えばバッチ式または連続式で、好ましくは連続式で行うことができる。
【００８７】
Ｌ−フコースがアニオン交換材料を通過する条件は、清澄化溶液のｐＨおよび／または塩濃度を調整することによって、好ましくは清澄化溶液のｐＨを６〜８の範囲内のｐＨに調整することによって、および／または必要に応じて塩濃度を調整することによって確立され得る。例えば、ＮａＯＨの添加によりｐＨ６〜８に調整された、対イオンとしてＨ＋を用いたカチオン性イオン交換処理の通過液に由来するＬ−フコースを含む溶液がアニオン性イオン交換処理に供される場合、通過液の塩濃度は、アニオン性イオン交換樹脂へのＬ−フコースの結合を回避するのに十分高いことが観察された。しかしながら、前述の条件下では、アニオン交換樹脂に汚染物（例えばある特定のタンパク質、ＤＮＡおよびＲＮＡ分子（特に組換えＤＮＡおよびＲＮＡ分子）ならびに有色物質）がまだ結合することが観察された。
【００８８】
好ましい実施形態において、精製プロセスは、水素（Ｈ＋）形態のカチオン交換樹脂および塩化物（Ｃｌ−）形態のアニオン交換樹脂による処理を含む。カチオン交換樹脂は、好ましくは、強カチオン交換体である。アニオン交換体は、弱または強アニオン交換体であってもよく、好ましくは強アニオン交換体である。さらに、アニオン交換材料はまた、吸収体材料であってもよい。カチオン性イオン交換樹脂およびアニオン性イオン交換樹脂の両方による処理は、生成物ストリームからの全ての不特定のイオンの除去を可能にする。したがって、不特定のイオンは、特定のアニオン、好ましくはナトリウムカチオン（例えば、対イオンとしてＨ＋を有するカチオン性イオン交換材料との接触後のＮａＯＨによる生成物ストリームの中和により導入される）および塩化物アニオンにより置き換えられ得る。ナトリウムカチオンおよび塩化物アニオンは、共に比較的小さいイオンであり、より大きいイオンよりも迅速および経済的に電気透析および／またはナノ濾過（透析濾過）によって除去され得る。
【００８９】
精製溶液の濃縮
好ましい実施形態において、Ｌ−フコースを含むイオン交換処理後の溶液（通過液）は、好ましくはナノ濾過、逆浸透および／または真空蒸発（例えば流下膜式蒸発器、回転蒸発器もしくはプレート蒸発器の使用による）によって濃縮される。逆浸透および／またはナノ濾過が好ましい方法である（例えば、２０Å以上のサイズ排除限界を有するナノ濾過膜によるナノ濾過）。ナノ濾過および／または逆浸透が特に好ましい。逆浸透に勝るナノ濾過の利点は、ナノ濾過がより迅速な濃縮を達成し、また塩イオンの部分的除去を達成することである。真空蒸発に勝るナノ濾過および／または逆浸透の利点は、Ｌ−フコースとのカラメル化反応が生じないこと、すなわち濃縮中に有色カラメル体（ｃａｒａｍｅｌ  ｂｏｄｉｅｓ）が生成されないことである。
【００９０】
精製溶液は、最も好ましくはナノ濾過により濃縮され、最も好ましくは、１００〜２００ｋＤａの範囲内の分子量カットオフを有するナノ濾過膜が使用される。この分子量カットオフの利点は、Ｌ−フコースが阻止される一方で塩イオンが膜を通過し得る、すなわち濃縮の他に脱塩が実現されることである。
【００９１】
溶液の濃縮の前に、溶液中のＬ−フコースは、２０％（ｗ／ｗ）以下、１０％（ｗ／ｗ）以下または５％（ｗ／ｗ）以下の濃度を有し得る。
プロセス中、清澄化溶液および／または精製溶液は、１００ｇ／Ｌ以上、好ましくは２００ｇ／Ｌ以上、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以上のＬ−フコース濃度まで濃縮され得る。
【００９２】
さらに、清澄化溶液および／または精製溶液は、８０℃未満、好ましくは５０℃未満、より好ましくは４℃〜４５℃、より好ましくは１０℃〜４０℃、より一層好ましくは１５℃〜３０℃、最も好ましくは１５℃〜２０℃の温度でのナノ濾過によって濃縮され得る。
【００９３】
さらに、清澄化溶液および／または精製溶液は、２０℃〜５０℃、より好ましくは３０℃〜４５℃、最も好ましくは３５℃〜４５℃の温度での逆浸透によって濃縮され得る。
さらに、清澄化溶液および／または精製溶液は、ナノ濾過により、５バール超５０バール未満の間の圧力、好ましくは１０バール超４０バール未満の間の圧力、より好ましくは１５バール超３０バール未満の間の圧力で濃縮され得る。
【００９４】
さらに、清澄化溶液および／または精製溶液は、逆浸透により、５バール超１００バール未満の間の圧力、好ましくは１０バール超８０バール未満の間の圧力、より好ましくは１５バール超７０バール未満の間の圧力で濃縮され得る。
【００９５】
逆浸透は、溶液（プロセスストリーム）から０．１ｎｍ超の粒子を除去する膜濾過法である。プロセスストリームから水のみが除去され、一方で、イオン、糖等の全ての他の分子は保持物中に濃縮される。逆浸透を使用することによって、Ｌ−フコースの濃度の上昇のみが達成され得るが、その脱塩は達成されない。
【００９６】
追加的および／または代替的実施形態において、濃縮工程は、以下のパラメータの少なくとも１つ、任意選択で以下のパラメータの全てを含む。
ｉ）濃縮は、１００ｇ／Ｌ以上、好ましくは２００ｇ／Ｌ以上、より好ましくは３００ｇ／Ｌ以上のＬ−フコース濃度まで行われる；
ｉｉ）濃縮がナノ濾過により行われる場合、濃縮は、８０℃未満、好ましくは５０℃以下、より好ましくは４℃〜４５℃、最も好ましくは４℃〜４０℃の温度で行われる；
ｉｉｉ）濃縮が逆浸透および／または真空蒸発により行われる場合、濃縮は、５０℃未満、好ましくは２０℃〜４５℃、最も好ましくは３０℃〜４５℃、より好ましくは３５℃〜４５℃の温度で行われる；ならびに
ｉｖ）濃縮は、５バール超５０バール未満の間の圧力、好ましくは１０バール超４０バール未満の間の圧力、より好ましくは１５バール超３０バール未満の間の圧力で行われる。
【００９７】
本発明の好ましい実施形態において、Ｌ−フコースを含む溶液は、電気透析工程前に、真空蒸発（例えば流下膜式蒸発器もしくはプレート蒸発器の使用による）、逆浸透またはナノ濾過（例えば２０Å以上のサイズ排除限界を有するナノ濾過膜によるナノ濾過）を使用して、好ましくはナノ濾過または逆浸透を使用して、より好ましくはナノ濾過を使用して濃縮される。
【００９８】
本発明のさらなる好ましい実施形態において、Ｌ−フコースを含む溶液は、電気透析工程後に、真空蒸発（例えば流下膜式蒸発器もしくはプレート蒸発器の使用による）、逆浸透またはナノ濾過（例えば２０Å以上のサイズ排除限界を有するナノ濾過膜によるナノ濾過）を使用して、好ましくはナノ濾過または逆浸透を使用して、より好ましくはナノ濾過を使用して濃縮される。
【００９９】
好ましくは、Ｌ−フコースを含む溶液は、固体形態（例えば結晶化形態または顆粒化形態）のＬ−フコースの単離が行われる前に濃縮される。
塩の除去
Ｌ−フコースを精製するための方法は、塩が溶液から除去される、好ましくは清澄化溶液および／または精製溶液から除去される工程を含む。塩の除去は、脱塩される溶液をナノ濾過および／または電気透析に供することにより達成され得る。
【０１００】
ナノ濾過は、膜がナノメートルサイズの細孔を含む膜濾過法である。ナノ濾過膜は、１〜１０ナノメートルの範囲の細孔サイズを有する。ナノ濾過膜の細孔サイズは、精密濾過の細孔サイズより小さく、さらには限外濾過膜の細孔サイズより小さいが、実際には逆浸透に使用される膜の細孔サイズより大きい。ナノ濾過における使用のための膜は、主に薄いポリマーフィルムから形成される。一般的に使用される材料は、ポリエチレンテレフタレートまたはアルミニウム等の金属を含む。細孔密度は、１ｃｍ２当たり１〜１０６個の細孔の範囲であってもよい。ナノ濾過は、Ｌ−フコースを精製するための方法において、溶液中、例えば清澄化溶液および／または精製溶液中のＬ−フコースの濃度を増加させるために使用される。さらに、溶液（プロセスストリーム）の脱塩が生じる。
【０１０１】
ナノ濾過に好適な膜は、１５０〜３００Ｄａの範囲内のサイズ排除を提供するポリアミドまたはポリピペラジンの薄いフィルム複合膜、例えばＤｏｗ  Ｆｉｌｍｔｅｃ（商標）ＮＦ２７０（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、ＵＳＡ）を含む。そのような膜は、高フラックスを可能にする。特に、１００〜３００ＫＤａの間の分子カットオフを有するナノ濾過膜は、プロセスストリーム中のＬ−フコースの濃度を上昇させるのに有益である。この分子カットオフを有する膜は、膜を通したＬ−フコースの通過を防止し、それらはまた、イオン交換材料での処理後のプロセスストリーム中に存在する塩（例えば塩化ナトリウム）が膜を通過し、Ｌ−フコースから分離されるため、脱塩を実現するという利点を有する。ナノ濾過のための好適な膜の追加の例は、Ｔｒｉｓｅｐ（登録商標）４０４０−ＸＮ４５−ＴＳＦ（Ｍｉｃｒｏｄｙｎ−Ｎａｄｉｒ  ＧｍｂＨ、Ｗｉｅｓｂａｄｅｎ、ＤＥ）、ＧＥ４０４０Ｆ３０およびＧＨ４０４０Ｆ５０（ＧＥ  Ｗａｔｅｒ  ＆  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ラーティンゲン、ＤＥ）を含む。
【０１０２】
ナノ濾過は、Ｌ−フコースを含む溶液の電気透析処理の前に、実質的な量の夾雑物（例えば塩イオン）を効率的に除去することが判明した。ナノ濾過はまた、（例えば限外濾過工程による）発酵ブロスからのバイオマスの除去後の清澄化発酵ブロスから低分子量夾雑物を除去するのに効率的であることが判明した。低分子量成分の除去は、イオン交換処理前にＬ−フコースを含む溶液を濃縮および脱ミネラル化するのに有益である。Ｌ−フコースの濃度を上昇させるためのナノ濾過の使用は、より低いエネルギーおよび処理コストをもたらし、また低減された熱曝露に起因して製品のよりよい品質をもたらす。
【０１０３】
電気透析は、透析および電気分解を組み合わせたものであり、半透膜を通したその選択的エレクトロマイグレーションに基づく溶液中のイオンの分離および濃縮に使用され得る。工業的電気透析の応用は１９６０年代初頭に遡り、この方法は乳児用フォーミュラに含めるための乳清の脱ミネラル化に使用された。電気透析のさらなる応用は、ワイン、ブドウマスト、リンゴジュースおよびオレンジジュース等の飲料のｐＨの調整を含む。
【０１０４】
今日では、飲料水の製造のための汽水の脱塩および乳児用食品製造のための乳清の脱ミネラル化が、電気透析の最も普及した用途である。電気透析の基本原理は、直流発電機に接続された、イオン伝導のために電解質に浸漬された電極の対を備える電解槽からなる。直流発電機の陽極に接続された電極はアノードであり、陰極に接続された電極はカソードである。次いで電解液は電流の流れを担うが、これは、それぞれアノードおよびカソードに向かう陰イオンおよび陽イオンの移動から生じる。電気透析に使用される膜は、本質的に、負電荷基または正電荷基を有する多孔質イオン交換樹脂のシートであり、したがってそれぞれカチオン膜またはアニオン膜と説明される。イオン交換膜は、通常、ジビニルベンゼンで架橋された好適な官能基（例えば、カチオン膜の場合はスルホン酸基、またはアニオン膜の場合は四級アンモニウム基）を保持するポリスチレンマトリックスからなる。
【０１０５】
電解質は、例えば、塩化ナトリウム、酢酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウムおよび／またはスルファミン酸を含む水溶液であってもよい。電解質はカソードおよびアノードを包囲し、槽内の電流の流れを可能にするように機能する。次いで、イオンが枯渇しているストリームが、イオンが高濃度化されているストリームから十分に分離される（２つの溶液はまた、希釈物（イオンが枯渇している）および濃縮物（イオンが高濃度化されている）と呼ばれる）ように、アニオン膜およびカチオン膜が２つの電極ブロック間のフィルタプレスのように平行となる手法で電気透析積層体が組み立てられる。
【０１０６】
電気透析プロセスの中心は膜積層体であり、これは、２つの電極間に設置されるスペーサーで隔てられたいくつかのアニオン交換膜およびカチオン交換膜からなる。直流電流を印加することにより、アニオンおよびカチオンは膜を介して電極に移動し、（脱塩された）希釈物ストリームおよび濃縮物ストリームを生成する。
【０１０７】
電気透析における使用のためのイオン交換膜の細孔サイズは、希釈物ストリームと濃縮物ストリームとの間の高い濃度差により生じる、希釈物ストリームから濃縮物ストリームへの生成物の拡散を防止するのに十分小さい。バイオマスからの分離、ならびに／またはカチオンおよび／もしくはアニオンの交換後、タンパク質、および特に組換えＤＮＡ分子（断片から全ゲノムまでのサイズ範囲）は、目的とする生成物から定量的に除去されなければならない。
【０１０８】
電気透析は、水溶液からイオンを除去するために使用され、一方で、Ｌ−フコースはプロセスストリーム中に残留する。電気透析の重要な利点は、Ｌ−フコースを含む溶液から組換えＤＮＡ分子が完全に除去され得ることである。さらに、プロセスストリーム中の塩の量が、電気透析により大幅に低減され得ることが見いだされた。実際に、生成物ストリームから塩化ナトリウムが完全に除去され得ることが発見された。これは、塩化ナトリウム等の塩を含まないＬ−フコースが提供され得るという利点を有し、これによって塩（例えば塩化ナトリウム）の存在が最終生成物、例えば乳児用食品において有し得るいかなる悪影響も防止される。
【０１０９】
塩の除去（例えば電気透析による）は、０．２〜１０．０ｍＳ／ｃｍ２、好ましくは０．４〜５．０ｍＳ／ｃｍ２、より好ましくは０．５〜１．０ｍＳ／ｃｍ２の間の安定な導電率（ｍＳ／ｃｍ２）が達成されるまで行うことができる。さらに、電気透析は、１０．０ｇ／ｌ未満、好ましくは５．０ｇ／ｌ未満、より好ましくは１．０ｇ／ｌ未満、より一層好ましくは０．５ｇ／ｌ以下、最も好ましくは０．４ｇ／ｌ以下、特に０．２ｇ／ｌ以下の塩の量（ｇ／ｌ）が達成されるまで行うことができる。
【０１１０】
電気透析は、中性条件下または酸性条件下で行うことができる。２つの異なる型の間の違いは、プロセスストリーム中に存在するアニオンの形態にある。
電気透析の間中性条件である場合、電気透析を開始する前に、プロセスストリームのｐＨは、５．０〜９．０、好ましくは６．０〜８．０、より好ましくは６．５〜７．５のｐＨに達するまで、酸、好ましくは塩酸（ＨＣｌ）で、または塩基、好ましくは水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）で調整され得る。
【０１１１】
電気透析の間酸性条件である場合、電気透析を開始する前に、プロセスストリームは、１．０〜３．０、好ましくは１．５〜２．５、より好ましくは１．８〜２．２のｐＨに達するまで、酸、好ましくは塩酸（ＨＣｌ）で酸性化される。電気透析は、好ましくは、安定な導電率（ｍＳ／ｃｍ２）およびｐＨが達成されるまで行われる。
【０１１２】
電気透析は、１．０〜１０．０ｍＳ／ｃｍ２、好ましくは１．５〜１０．０ｍＳ／ｃｍ２、より好ましくは２．０〜８．０ｍＳ／ｃｍ２の間の安定な導電率（ｍＳ／ｃｍ２）が達成されるまで行うことができる。電気透析の間、ｐＨは、塩基、好ましくは水酸化ナトリウムで制御および調整されなければならない。中性条件下で、電気透析は、バイポーラ膜を使用して行うことができる。この場合、Ｌ−フコースは別個の電気透析濃縮回路で濃縮され得る。したがって、Ｌ−フコースは電気透析の間高濃度化され得る。
【０１１３】
プロセスにおいて、精製溶液から塩を除去した後、
ｉ）精製溶液中の塩の量は、１０％（ｗ／ｗ）未満、好ましくは５％（ｗ／ｗ）未満、より好ましくは１％（ｗ／ｗ）未満、より一層好ましくは０．５％（ｗ／ｗ）以下、最も好ましくは０．４％（ｗ／ｗ）以下、特に０．２％（ｗ／ｗ）以下となり得る；および／または
ｉｉ）導電率は、０．２〜１０．０ｍＳ／ｃｍ２の間、好ましくは０．４〜５．０ｍＳ／ｃｍ２の間、より好ましくは０．５〜１．０ｍＳ／ｃｍ２の間となり得る。
【０１１４】
清澄化および／または精製溶液の変色
清澄化溶液および／または精製溶液は、好ましくは活性チャコールでの処理、ならびに／または直列に結合されたカチオン性イオン交換体およびアニオン性イオン交換体での処理による変色の工程に供されてもよい。
【０１１５】
変色工程は、
ｉ）清澄化溶液の透析濾過および／もしくは濃縮の工程の前もしくは後；ならびに／または
ｉｉ）清澄化溶液の電気透析および／もしくは透析濾過の工程の前もしくは後に行われてもよい。
【０１１６】
好ましくは、変色工程は、特にその工程がカチオン性イオン交換体およびアニオン性イオン交換体（直列に結合されている）による処理によって行われる場合、電気透析工程の後に行われる。利点は、カチオン性イオン交換体およびアニオン性イオン交換体に、非常に低濃度の塩を含むプロセスストリームが流され得、これによって、電荷を有する多くの汚染物（例えば、電荷を有するペプチドおよび／またはＤＮＡ分子）がイオン交換材料に結合する一方で、Ｌ−フコースは非結合状態を維持し、通過液中に位置することである。したがって、有色物質および電荷を有する非有色物質に関して、Ｌ−フコースの純度はこの工程により大幅に改善され得る。任意選択で、前記工程は、ナノ濾過工程の後および／または電気透析工程の前に行われる。
【０１１７】
カチオン性イオン交換体およびアニオン性イオン交換体（直列に結合されている）での処理と比較した、活性チャコールでの処理による色彩付与物質の除去の利点は、電荷を有する色彩付与物質および電荷を有さない（中性の）色彩付与物質の両方が除去され得、また電荷を有さない（中性の）炭水化物（例えばオリゴ糖、単糖）が除去され得ることである。
【０１１８】
活性チャコールとも呼ばれる活性炭は、吸着に利用可能な表面積を増加させる微小な低容積細孔を有するように加工された炭素の形態である。典型的には、わずか１グラムの活性炭は、その高度のミクロ多孔性に起因して、ガス吸着により決定される３０００ｍ２を超える表面積を有する。
【０１１９】
単糖またはオリゴ糖等の炭水化物物質は、水溶液からチャコール粒子の表面に結合する傾向を有する。オリゴ糖の活性チャコールとの相互作用は、単糖の相互作用よりはるかに強力である。この挙動はその構造によりもたらされ、これによって、Ｌ−フコースは、汚染オリゴ糖より、弱く結合する、すなわちより少量が活性チャコールに結合する。オリゴ糖以外に、有色材料が活性チャコールに吸着する。塩等の他の水溶性材料は、より弱く結合し、チャコールを水で洗浄することにより（インキュベーション後）Ｌ−フコースと共に活性チャコールから溶出される。水での溶出後、吸着したオリゴ糖および有色物質は依然として活性チャコールに結合したままである。したがって、活性チャコールでの処理工程により、汚染オリゴ糖および有色夾雑物の除去が可能である。要するに、活性チャコール工程は、着色剤、他の不純物を除去し、塩等の水溶性夾雑物の量を低減する。
【０１２０】
色彩付与化合物、オリゴ糖または夾雑物の除去に好適な活性チャコールは、（これらに限定されないが）顆粒化活性チャコール、例えばＮｏｒｉｔ（登録商標）ＧＡＣ８３０ＥＮ（Ｃａｒｂｏｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）およびＥｐｉｂｏｎ（登録商標）Ｙ１２×４０  ｓｐｅｚｉａｌ（Ｄｏｎａｕｃａｒｂｏｎ）、または粉末化活性チャコール、例えばＮｏｒｉｔ（登録商標）ＤＸ１、Ｎｏｒｉｔ（登録商標）ＳＡ２（Ｃａｒｂｏｔ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｏｎ）およびＣａｒｂｏｐａｌ（登録商標）ＭＢ４（Ｄｏｎａｕｃａｒｂｏｎ）である。
【０１２１】
カチオン性イオン交換体およびアニオン性イオン交換体（直列に結合されている）での処理による色彩付与物質の除去は、活性チャコールでの処理と比較して、色彩付与物質が溶液から除去され得るだけでなく、溶液中の不特定の塩イオンが特定の塩イオン、例えばＮａ＋およびＣｌ−に交換され得、また電荷を有するペプチドが除去され得るという利点を有する。このイオン交換の利点は、脱塩プロセスがより効率的となり得ることである（Ｎａ＋およびＣｌ−は、他の可能なイオンと比較して小さいイオンであり、したがって脱塩処理工程によってより容易に除去され得る）。さらなる利点は、Ｌ−フコースの結晶化に対するある不特定の塩の悪影響が回避され得ることである。
【０１２２】
イオン交換処理は、電荷を有する材料および色彩付与物質が各イオン交換材料に吸着し、一方Ｌ−フコースは各イオン交換材料を通過する、すなわち通過液中に位置するように行われる。得られる液体（通過液）は、水、少量の所定のイオン、低減された量の色彩付与物質およびＬ−フコースを含む。
【０１２３】
カチオン交換体は、弱カチオン性イオン交換体または強カチオン性イオン交換体であってもよく、好ましくは強カチオン性イオン交換体である。
好適なカチオン交換樹脂は、（これらに限定されないが）Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ２５６８（Ｈ＋）（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）５０ＷＸ２（Ｍｅｒｃｋ  ＫＧａＡ、ダルムシュタット、ＤＥ）；Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＩＲ−１１６（オルガノ株式会社）およびＤｉａｉｏｎ（商標）ＳＫ−１０２（三菱ケミカル株式会社）等の強酸性カチオン交換樹脂である。
【０１２４】
カチオン性イオン交換体は、対イオンとして任意のアルカリ金属（Ｌｉ＋、Ｎａ＋、Ｋ＋）、アルカリ土類金属（例えばＣａ２＋、Ｍｇ２＋）、アンモニウムイオンまたは炭酸イオンと共に使用され得る。好ましくは、ナトリウムイオン（Ｎａ＋）が対イオンである。
【０１２５】
アニオン交換体は、弱アニオン交換体または強アニオン交換体であってもよく、好ましくは強アニオン性イオン交換体である。
好適なアニオン交換樹脂は、（これらに限定されないが）Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ６３６８Ａ、Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ４２６８、Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ５５２８、Ｌｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ６３６８Ａ（Ｌａｎｘｅｓｓ  ＡＧ、ケルン、ＤＥ）、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＡＧ  １ｘ２、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）１ｘ８、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）Ｃｈｒｏｍａｌｉｔｅ  ＣＧＡ１００ｘ４（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ  ＧｍｂＨ、ラーティンゲン、ＤＥ）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＦＰＡ５１（Ｄｏｗ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＭＩ、ＵＳＡ）等の強塩基性（Ｉ型）アニオン交換樹脂である。好ましくは、アニオン交換樹脂は、塩化物形態で存在する。
【０１２６】
アニオン性イオン交換体は、対イオンとして任意の塩基と、例えばＨＣＯ−３、Ｉ−、Ｂｒ−、ＮＯ−３等と共に使用され得る。好ましくは、水酸化物イオン（ＯＨ−）が対イオンとして使用される。より好ましくは、塩化物イオン（Ｃｌ−）が対イオンとして使用される。
【０１２７】
カチオン性イオン交換体とアニオン性イオン交換体が直列に結合した場合、アニオン性イオン交換体は、カチオン性イオン交換体の上流側または下流側に位置し得る。好ましくは、アニオン性イオン交換体は、それと直列に結合されたカチオン性イオン交換体の下流側に位置する。したがって、上記の直列構造を通過する溶液は、まずカチオン性イオン交換体を通過し、次いでアニオン性イオン交換体を通過する。
【０１２８】
カチオン性イオン交換体および／またはアニオン性イオン交換体を通過したプロセスストリーム（すなわち対応する通過液）のｐＨは、好ましくは２．０超１０．０未満、より好ましくは３．０超９．０、最も好ましくは４．０超８．０未満である。
【０１２９】
イオン交換樹脂の粒子サイズは、プロセスストリームが効率的に流動する一方で、それでも電荷を有する材料および色彩付与物質がイオン交換樹脂により効果的に除去されることを可能にするように選択されるべきである。イオンの効率的な交換が生じ得ることを確実にするために、流速は、好ましくは床容積の０．２倍超２．０倍未満の間、より好ましくは床容積の０．５倍超１．５倍未満の間、最も好ましくは床容積の０．７５倍超１．２倍未満となるべきである。イオン交換処理は、従来の様式で、例えばバッチ式または連続式で、好ましくは連続式で行うことができる。
【０１３０】
しかしながら、エンドトキシンを含まない株（例えばバチルス株および／または遺伝子操作されたエンドトキシンを含まない株）が使用される場合、エンドトキシンを除去する工程は必要でなくなり得る。
【０１３１】
エンドトキシンの無菌濾過および／または除去
本発明の好ましい実施形態において、精製溶液は、好ましくは１０ｋＤａ以下のフィルタモジュールを通した精製溶液の濾過により、無菌濾過されおよび／またはエンドトキシン除去に供される。一例として、Ｌ−フコースを含有する精製溶液は、３ｋＤａフィルタを通した、または６ｋＤａフィルタを通した精製溶液の濾過により、無菌濾過されおよび／またはエンドトキシン除去工程に供される。エンドトキシンの除去は、Ｌ−フコースが人による消費に意図される場合に必要である。
【０１３２】
Ｌ−フコースの顆粒化形態の提供
顆粒化（例えば噴霧乾燥）生成物のインスタント特性を改善するために、食品粉末凝集が一般的に使用される。このプロセスは、流動性および／または視覚的外観を改善するために生成物粒子を大きくすることが望ましい場合に使用される。
【０１３３】
一般に、顆粒または凝集体の主な特性、例えばサイズ、多孔性、可溶性、湿潤性、形状および／または密度等は、凝集（顆粒化）プロセスの種類、および凝集の間の動作条件に依存する。流動床凝集は、取り扱いおよび包装のための高い多孔性および良好な機械的抵抗性を有する凝集体を生成するのに好適なプロセスの１つである。
【０１３４】
流動床凝集の動作原理は、高温気流による粒子の流動化、および液体結合剤噴霧化による表面粒子の湿潤からなる。流動床上での湿潤粒子間の衝突は、液体架橋および粒子合体を形成する。これらの粒子を乾燥させると、架橋は固化し、凝集体の一体化をもたらす。
【０１３５】
本発明によれば、精製溶液は顆粒化され得る、特に５〜５０％（ｗ／ｗ）、好ましくは１０〜４０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは１５〜３５％（ｗ／ｗ）のＬ−フコース濃度で顆粒化され得る。
【０１３６】
入口温度は、５０℃〜１２０℃、好ましくは６５℃〜１１０℃、より好ましくは８０〜１００℃の範囲内であってもよい。
出口温度（生成物温度）は、３０℃〜８０℃、好ましくは３５〜７５℃、より好ましくは４０〜７５℃の範囲内であってもよい。
【０１３７】
得られる顆粒は、好ましくは材料重量の０．１〜５％の間、より好ましくは材料重量の０．５％〜２．５％の間、最も好ましくは材料重量の０．７％〜１．５％の間の乾燥減量を有するべきである。
【０１３８】
好ましい実施形態において、顆粒化Ｌ−フコースは、好ましくは、１５０μｍ〜１４００μｍの間の粒子サイズを有する材料を少なくとも５０％（ｗ／ｗ）、より好ましくは、１５０μｍ〜１４００μｍの間の粒子サイズを有する材料を少なくとも６０％（ｗ／ｗ）超、最も好ましくは１５０〜１４００μｍの間の粒子サイズを有する材料を７０％（ｗ／ｗ）超有する。
【０１３９】
粒子サイズは、異なる細孔サイズを有する篩で材料を篩い分けすることにより決定され得る。例えば、１５０μｍ〜１４００μｍの間の粒子サイズを有する材料としてＬ−フコースを得るためには、１４００μｍのメッシュ開口直径を有する篩、および１５０μｍのメッシュ開口直径を有する篩を続けて使用して（いずれの順番でもよい）、目的とする粒子サイズを有する材料を選択することができる。
【０１４０】
Ｌ−フコースのロール乾燥形態の提供
Ｌ−フコースは、ローラー乾燥形態で提供されてもよい。これに関して、精製溶液は、ローラー乾燥されてもよい、すなわちローラー乾燥手順に供されてもよい。
【０１４１】
Ｌ−フコースの結晶化形態の提供
Ｌ−フコースは、結晶化形態で提供されてもよい。水溶液からＬ−フコースを結晶化するための方法が、本明細書において説明される。
【０１４２】
Ｌ−フコースは、酵素または発酵（培養）ブロスを使用した生体触媒アプローチから選択的に結晶化され得ることが発見されている。
好ましい実施形態において、結晶化に使用されるＬ−フコースの水溶液は、５０％（ｗ／ｗ）超、好ましくは６０％（ｗ／ｗ）超、好ましくは７０％（ｗ／ｗ）超、特に８０％（ｗ／ｗ）超の炭水化物含量を有する。
【０１４３】
あるいは、結晶化に使用される水溶液中のＬ−フコース濃度は、６５０〜９５０ｇ／ｌ、好ましくは８００〜８８０ｇ／ｌである。
上記濃度範囲および比率は、好ましくは、前に説明した方法を使用することにより培養ブロスから例えば細胞、色彩付与物質、塩および／または電荷を有する分子を除去した後に、培養ブロスからの水性プロセスストリームを濃縮することによって、従来の様式で達成され得る。
【０１４４】
Ｌ−フコース含有溶液の濃縮は、ナノ濾過および／または真空蒸発（例えば回転蒸発器またはプレート蒸発器の使用による）、好ましくは真空蒸発と組み合わせたナノ濾過により、水を除去することによって達成され得る。
【０１４５】
結晶化を開始するために、２０℃〜５０℃の間、好ましくは２５℃の温度の前述の濃縮Ｌ−フコース溶液にシード結晶が添加され得る。
濃縮溶液中、Ｌ−フコースは、好ましくは、特に７５％（ｗ／ｗ）超の炭水化物濃度を有する。
【０１４６】
Ｌ−フコースを含む溶液は、真空下、好ましくは２００ミリバール未満の圧力、より好ましくは１００ミリバールｒ未満の圧力、特に５０ミリバール未満の圧力でインキュベートされ得る。
【０１４７】
さらに、Ｌ−フコースを含む溶液は、１５℃〜６０℃の間、好ましくは２０℃〜４５℃の間、より好ましくは２５℃〜４０℃の間、特に３０℃〜３５℃の間の温度でインキュベートされ得る。
【０１４８】
さらに、Ｌ−フコースを含む溶液は、炭水化物濃度が８５％超、好ましくは９０％超となるまで、または粘凋性結晶化パルプ（ｖｉｓｃｏｕｓ  ｃｒｙｓｔａｌｌｉｚａｔｉｏｎ  ｐｕｌｐ）が生成するまでインキュベートされ得る。
【０１４９】
Ｌ−フコースを含む溶液（結晶化混合物）は、次いで好適な結晶化槽内に設置され、室温（２５℃）で１２〜９６時間、固体結晶化塊が形成されるまでインキュベートされ得る。
【０１５０】
結晶化塊は機械的に破砕され得、有機溶媒、例えばメタノール、アセトン、イソプロパノールおよび／またはエタノール、好ましくはエタノールが、結晶溶液に添加され得る。Ｌ−フコース結晶を溶解するために、１ｋｇの結晶化材料が、０．５〜３ｌのエタノール、好ましくは０．７〜２．０ｌのエタノール、より好ましくは１．０〜１．５ｌのエタノールと混合される。
【０１５１】
Ｌ−フコース結晶は、（真空ありもしくはなしでの）濾過により、または遠心分離により液相から除去され得る。残りの母液を除去するために、結晶は、有機溶媒、例えばメタノール、アセトン、イソプロパノールおよび／またはエタノール、好ましくはエタノールで洗浄される。残りの母液を除去するために、１ｋｇの結晶化Ｌ−フコースが、０．５〜３ｌ、好ましくは０．７〜２．０ｌ、より好ましくは１．０〜１．５ｌのエタノールで好ましくは洗浄される。
【０１５２】
得られた結晶は、４〜４８時間、好ましくは８〜３６時間、より好ましくは１２〜２４時間、または重量の変化が観察され得なくなるまで乾燥され得る。乾燥温度は、１０℃〜８０℃の間、好ましくは２０℃〜７０℃の間、より好ましくは３０℃〜６０℃の間、特に４０℃〜５０℃の間となるように選択される。
【０１５３】
水溶液からのＬ−フコースの結晶化に関して、有機溶媒を使用して水溶液からＬ−フコースを結晶化するための第２の代替の方法が、本明細書において説明される。
好ましい実施形態において、結晶化に使用されるＬ−フコースの水溶液は、４０％（ｗ／ｗ）超、好ましくは５０％（ｗ／ｗ）超、好ましくは６０％（ｗ／ｗ）超、特に７０％（ｗ／ｗ）超の炭水化物含量を有する。
【０１５４】
あるいは、結晶化に使用される水溶液中のＬ−フコース濃度は、６５０〜８５０ｇ／ｌ、好ましくは７００〜７８０ｇ／ｌであってもよい。
上記濃度範囲および比率は、好ましくは、前に説明した方法を使用することにより培養ブロスから例えば細胞、色彩付与物質、塩および／または電荷を有する分子を除去した後に、培養ブロスからの水性プロセスストリームを濃縮することによって、従来の様式で達成され得る。
【０１５５】
Ｌ−フコース含有溶液の濃縮は、ナノ濾過および／または真空蒸発（例えば回転蒸発器またはプレート蒸発器の使用による）により、水を除去することによって達成され得る。好ましくは、ナノ濾過は、真空蒸発と組み合わせて使用される。
【０１５６】
Ｌ−フコースを含む溶液の濃縮後、溶液は、特に７０％（ｗ／ｗ）超のＬ−フコース炭水化物濃度を有する。結晶化アプローチから残りの水を除去するために、０．５倍体積のブタノールが溶液に添加され得る。次いで、結晶化アプローチは、真空下、真空蒸留により等量の添加液体が除去されるまでインキュベートされ得る。
【０１５７】
結晶化を開始するために、前述の濃縮Ｌ−フコース溶液にシード結晶が添加され得るが、この溶液は、好ましくは、２０℃〜５０℃の間、好ましくは２５℃の温度である。
結晶化は、好ましくは、２００ミリバール未満、より好ましくは１００ミリバール未満、特に５０ミリバール未満の圧力で行われてもよい。
【０１５８】
さらに、結晶化は、１５℃〜６０℃の間、好ましくは２０℃〜４５℃の間、より好ましくは２５℃〜４０℃の間、特に３０℃〜３５℃の間の結晶化溶液の温度で行われてもよい。
【０１５９】
さらに、結晶化溶液は、炭水化物濃度が８５％超、好ましくは９０％超となるまで、または粘凋性結晶化パルプが発生するまでインキュベートされ得る。
結晶化混合物は、次いで好適な結晶化槽内に設置され、室温（２５℃）で１２〜９６時間、固体結晶化塊が形成されるまでインキュベートされ得る。
【０１６０】
結晶化塊は機械的に破砕され得、有機溶媒、例えばメタノール、アセトン、イソプロパノールおよび／またはエタノール、好ましくはエタノールが、結晶化塊に添加され得る。Ｌ−フコース結晶を溶解するために、１ｋｇの結晶化材料が、０．５〜３ｌのエタノール、好ましくは０．７〜２．０ｌのエタノール、より好ましくは１．０〜１．５ｌのエタノールと好ましくは混合される。
【０１６１】
Ｌ−フコース結晶は、真空ありもしくはなしでの濾過、または遠心分離により液相から除去され得る。残りの母液を除去するために、結晶は、有機溶媒、例えばメタノール、アセトン、イソプロパノールおよび／またはエタノール、好ましくはエタノールで洗浄され得る。残りの母液を除去するために、１ｋｇの結晶化Ｌ−フコースが、０．５〜３ｌ、好ましくは０．７〜２．０ｌ、より好ましくは１．０〜１．５ｌのエタノールで好ましくは洗浄される。
【０１６２】
得られた結晶は、４〜４８時間、好ましくは８〜３６時間、より好ましくは１２〜２４時間、または重量の変化が観察され得なくなるまで乾燥され得る。乾燥温度は、１０℃〜８０℃の間、好ましくは２０℃〜７０℃の間、より好ましくは３０℃〜６０℃の間、特に４０℃〜５０℃の間で選択され得る。
【０１６３】
Ｌ−フコースの凍結乾燥形態の提供
Ｌ−フコースを含む精製溶液はまた、凍結乾燥されてもよい。この凍結乾燥において、Ｌ−フコースを含む精製溶液は凍結され、次いで、凍結した水が固相から気相に直接昇華するように減圧される。この方法は通常、吸湿性のＬ−フコース粉末を生成する。
【０１６４】
本発明により提供される組成物および製品
本発明によれば、
ａ）少なくとも９５ｗｔ．％のＬ−フコース；
ｂ）最大１ｗｔ．％の有機溶媒；および
ｃ）最大１ｗｔ．％の塩
を含む組成物が提供される。
【０１６５】
好ましい実施形態において、組成物は、
ａ）９５．５０〜１００．００ｗｔ．％のＬ−フコース、好ましくは９８．００〜１００．００ｗｔ．％のＬ−フコース、より好ましくは９８．５０〜１００．００ｗｔ．％のＬ−フコース、任意選択で９８．７０〜９９．９０ｗｔ．％のＬ−フコース；および／または
ｂ）０．００〜１．００ｗｔ．％の有機溶媒、好ましくは０．００〜０．５０ｗｔ．％の有機溶媒、より好ましくは０．００〜０．４０ｗｔ．％の有機溶媒、任意選択で０．１０〜０．２０ｗｔ．％の有機溶媒；および／または
ｃ）０．００〜１．００ｗｔ．％の塩、好ましくは０．００〜０．５０ｗｔ．％の塩、より好ましくは０．００〜０．４０ｗｔ．％の塩、任意選択で０．１０〜０．２０ｗｔ．％の塩を含む。
【０１６６】
好ましくは、組成物は、
ａ）０．００〜０．５０ｗｔ％のタンパク質、より好ましくは０．００〜０．４０ｗｔ％のタンパク質、任意選択で０．１０〜０．２０ｗｔ％のタンパク質；および／または
ｂ）０．００〜０．５０ｗｔ％のＤＮＡ、より好ましくは０．００〜０．４０ｗｔ％のＤＮＡ、任意選択で０．１０〜０．２０ｗｔ％のＤＮＡ
（のみ）を含む。
【０１６７】
組成物は、Ｌ−フコースが、非晶質形態または結晶形態で、好ましくは顆粒形態または結晶形態で存在することを特徴とし得る。結晶形態は、好ましくは二水和物結晶形態である。
【０１６８】
ヒトミルクは、乳児の最善の栄養源である。ヒトミルクは、遊離Ｌ−フコースを含む。フコースは、ヒトにより吸収され、ＧＤＰ−フコースへのフコースサルベージ経路により活性化され得ることが知られている。次いで、ＧＤＰ−フコースは、免疫認識および脳の発達等の細胞間伝達（ｃｏｍｍｉｎａｔｉｏｎ）プロセスにおいて重要なフコシル化グリカンの合成に使用される。
【０１６９】
食品組成物、好ましくは乳児用食品フォーミュラ、幼児用食品フォーミュラまたは医療用栄養製品が提供され、食品組成物は、Ｌ−フコース、およびプロバイオティクス炭水化物（例えばガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、イヌリン、マルトデキストリン、イソマルトース、ラクツロース等）または別の単糖（例えばＮ−アセチル−ノイラミン酸等のシアル酸）を含む。
【０１７０】
食品組成物、好ましくは乳児用食品フォーミュラ、幼児用食品フォーミュラまたは医療用栄養製品は、Ｌ−フコースおよび少なくとも１種のヒトミルクオリゴ糖を含んでもよい。
【０１７１】
食品組成物は、２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−フココペンタオース（ｆｕｃｏｃｏｐｅｎｔａｏｓｅ）Ｉ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩＩＩ、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＶ、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−ネオテトラオース、３’−シアリルラクトース、６’−シアリルラクトースおよびシアリル化ラクト−Ｎ−ネオテトラオースおよびラクト−Ｎ−テトラオース誘導体からなる群から選択される少なくとも１種の糖を含んでもよい。
【０１７２】
食品組成物は、
ｉ）液体食品組成物であってもよく、１ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌの濃度、より好ましくは５ｍｇ／ｌ〜１．５ｇ／ｌの濃度、より一層好ましくは２０ｍｇ／ｌ〜１ｇ／ｌの濃度、最も好ましくは５０ｍｇ／ｌ〜０．７ｇ／ｌの濃度のＬ−フコースを含む；または
ｉｉ）固体食品組成物であってもよく、５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｇ／ｋｇの濃度、より好ましくは２５ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇの濃度、より一層好ましくは１００ｍｇ／ｋｇ〜１０ｇ／ｋｇの濃度、最も好ましくは３７５ｍｇ／ｋｇ〜５．２５ｇ／ｋｇの濃度のＬ−フコースを含む。
【０１７３】
食品組成物は、Ｌ−フコース（上記参照）と同じ濃度（範囲）のシアル酸（例えばＮ−アセチルノイラミン酸）を含んでもよい。
食品組成物は、
ｉ）少なくとも１種の中性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオースおよびラクト−Ｎ−ネオテトラオースからなる群から選択される少なくとも１種の中性ヒトミルクオリゴ糖、最も好ましくはその中性ヒトミルクオリゴ糖の全て；ならびに
ｉｉ）少なくとも１種の酸性ヒトミルクオリゴ糖、好ましくは３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースからなる群から選択される少なくとも１種の酸性ヒトミルクオリゴ糖、最も好ましくはその酸性ヒトミルクオリゴ糖の全て；ならびに
ｉｉｉ）シアル酸（例えばＮ−アセチルノイラミン酸）
を含んでもよい。
【０１７４】
組成物は、さらに、ラクトース、乳清タンパク質、ビオチン、無脂肪乳、植物油、脱脂粉乳、モルティエラ・アルピン（Ｍｏｒｔｉｅｒｅｌｌａ  ａｌｐｉｎｅ）の油、魚油、炭酸カルシウム、塩化カリウム、ビタミンＣ、塩化ナトリウム、ビタミンＥ、酢酸鉄、硫酸亜鉛、ナイアシン、カルシウム−Ｄ−パントテネート、硫酸銅、ビタミンＡ、ビタミンＢ１、ビタミンＢ６、硫酸マグネシウム、ヨウ化カリウム、葉酸、ビタミンＫ、亜セレン酸ナトリウムおよびビタミンＤからなる群から選択される少なくとも１種の物質、任意選択で全ての物質を含んでもよい。
【０１７５】
食品組成物は、タンパク質源、ビタミン、油、ミネラル、酵素、さらなる炭水化物およびプロバイオティクス株からなる群から選択される少なくとも１種の物質を含んでもよい。
【０１７６】
食品組成物は、医療用食品組成物、健康補助食品、小袋製品、液体の即時使用可能な乳児用栄養製品、液体の即時使用可能な幼児用栄養製品、顆粒化製品、噴霧乾燥乳児用フォーミュラ製品、およびそれらの組合せからなる群から選択される組成物であってもよい。
【０１７７】
さらに、１ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌの濃度のＬ−フコース、シアル酸（例えばＮ−アセチルノイラミン酸）（好ましくは１ｍｇ／ｌ〜２ｇ／ｌの濃度）、ならびに
ｉ）２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオースおよびラクト−Ｎ−ネオテトラオースからなる群から選択される少なくとも１種の中性ヒトミルクオリゴ糖；ならびに／または
ｉｉ）３’−シアリラクトース（ｓｉａｌｙｌａｃｔｏｓｅ）または６’−シアリルラクトースからなる群から選択される少なくとも１種の酸性ヒトミルクオリゴ糖
を含む、液体の即時使用可能な乳児または幼児用栄養製品が提供される。
【０１７８】
本発明はまた、５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｇ／ｋｇの濃度のＬ−フコース、シアル酸（例えばＮ−アセチルノイラミン酸）（好ましくは５ｍｇ／ｋｇ〜１５ｇ／ｋｇの濃度）、ならびに
ｉ）２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−テトラオースおよびラクト−Ｎ−ネオテトラオースからなる群から選択される少なくとも１種の中性ヒトミルクオリゴ糖；ならびに／または
ｉｉ）３’−シアリルラクトースおよび６’−シアリルラクトースからなる群から選択される少なくとも１種の酸性ヒトミルクオリゴ糖
を含む、噴霧乾燥乳児用フォーミュラ製品を提供する。
【０１７９】
さらに、Ｌ−フコース、ならびに２’−フコシルラクトース、３−フコシルラクトース、ジフコシルラクトース、ラクト−Ｎ−トリオースＩＩ、ラクト−Ｎ−テトラオースおよびラクト−Ｎ−ネオテトラオース、ラクト−Ｎ−フコペンタオースＩからなる群から選択される少なくとも１種の中性ＨＭＯを含む健康補助食品が提供される。
【０１８０】
本発明によれば、Ｌ−フコース、ならびにタンパク質源、ビタミン、油、ミネラル、酵素、さらなる炭水化物（例えばプレミックス中にすでに存在するＬ−フコースとは異なる炭水化物）およびプロバイオティクス株からなる群から選択される少なくとも１種の物質を含む、食品用のプレミックス（例えば乳児または幼児用食品フォーミュラ用のプレミックス）が提供される。より好ましくは、プレミックスは、これらの物質の全てを含む。
【０１８１】
タンパク質源は、乳清、トウモロコシ大豆ブレンド（ＣＳＢ）、タンパク質加水分解物およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。
ビタミンは、ビタミンＡ、チアミン、リボフラビン、ビタミンＢ１２、フォレートおよびそれらの組合せからなる群から選択され得る。
【０１８２】
油は、パーム油、ＤＨＡ、アラキドン酸およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。
ミネラルは、塩化カリウム、ヨウ化カリウム、酸化亜鉛およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。
【０１８３】
酵素は、アミラーゼ、アミログルコシダーゼ（ａｍｙｌｏｇｌｃｏｓｉｄａｓｅ）およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。
炭水化物は、ヒトミルクオリゴ糖（ＨＭＯ）、ガラクトオリゴ糖（ＧＯＳ）、イヌリン、フラクトオリゴ糖（ＦＯＳ）、ラクトース、イソマルトース、シアル酸およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。
【０１８４】
プロバイオティクス株は、ラクトバチルス、ビフィドバクテリア、バチルス、酵母およびそれらの組合せからなる群から選択され得る。
プレミックスは、粉末乾燥、顆粒化または液体（シロップ）製品の形態であってもよい。
【０１８５】
本発明によれば、医薬組成物、好ましくはウイルス感染、細菌感染（改善された免疫機能）、記憶障害、脳の発達および腸内毒素症の少なくとも１つの予防または処置における使用のための医薬組成物が提供される。医薬組成物は、本発明による組成物を含み、任意選択で、Ｌ−フコースとは異なる少なくとも１種の糖および／または少なくとも１種のプロバイオティクス細菌株を含み、少なくとも１種の糖は、好ましくは、ラクトース、ラクツロース、イヌリンおよびスクロースからなる群から選択される少なくとも１種の糖である。
【０１８６】
本発明による全ての組成物（例えば食品組成物、液体の即時使用可能な乳児または幼児用栄養製品、噴霧乾燥乳児用フォーミュラ製品、健康補助食品およびプレミックス）は、以下の特徴の少なくとも１つを特徴とし得る。
【０１８７】
組成物は、好ましくはラクトースを含む。
固体組成物の場合、ラクトースの濃度は、５０〜８００ｇ／ｋｇ、好ましくは１００〜７５０ｇ／ｋｇ、より好ましくは２００〜７００ｇ／ｋｇ、より一層好ましくは３００〜６５０ｇ／ｋｇ、最も好ましくは４００〜６００、特に４４０〜５６０ｇ／ｋｇであってもよい。
【０１８８】
液体組成物の場合、ラクトースの濃度は、１０〜９５ｇ／Ｌ、好ましくは２０〜９０ｇ／Ｌ、より好ましくは３０〜８５ｇ／Ｌ、より一層好ましくは４０〜８０ｇ／Ｌ、最も好ましくは５０〜７５ｇ／Ｌ、特に６０〜７４ｇ／Ｌであってもよい。
【０１８９】
組成物中にラクトースを有することは、その組成物を食品として消費する人の健康への好ましい効果に関連することが見出された。この効果は、ラクトースと本発明の組成物中に存在する他の成分（例えばフコース、シアル酸、中性ＨＭＯおよび酸性ＨＭＯ）との組合せ効果に起因する。ラクトースは、他の成分と共に、病原性細菌から体を保護し、組成物を消費する人の胃腸管内での炎症反応を調整するように連携して作用すると推測される。
【０１９０】
組成物は、好ましくは、最大量のＨＭＯ（酸性および中性ＨＭＯ）を含む。
固体組成物の場合、ＨＭＯの最大濃度は、２０〜７０ｇ／ｋｇ、好ましくは２５〜６５ｇ／ｋｇ、より好ましくは３０〜６０ｇ／ｋｇ、より一層好ましくは３５〜５５ｇ／ｋｇ、最も好ましくは４０〜５０、特に４２．２〜４８．１ｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。
【０１９１】
液体組成物の場合、ＨＭＯの最大濃度は、２．０〜９．０ｇ／Ｌ、好ましくは３．０〜８．０ｇ／Ｌ、より好ましくは４．０〜７．０ｇ／Ｌ、より一層好ましくは４．５〜６．５ｇ／Ｌ、最も好ましくは５．０〜７．０ｇ／Ｌ、特に５．７〜６．５ｇ／Ｌであってもよい。
【０１９２】
組成物は、好ましくは、ある特定の濃度のＨＭＯを含む。
固体組成物の場合、２’−ＦＬの濃度は、５〜４０ｇ／ｋｇ、好ましくは１０〜３５ｇ／ｋｇ、より好ましくは１２．５〜３０ｇ／ｋｇ、最も好ましくは１５〜２５ｇ／ｋｇ、特に１８．５〜２２．２ｇ／ｋｇであってもよい。
【０１９３】
液体組成物の場合、２’−ＦＬの濃度は、０．５〜５．５ｇ／Ｌ、好ましくは１．０〜４．５ｇ／Ｌ、より好ましくは１．５〜４．０ｇ／Ｌ、最も好ましくは２．０〜３．５ｇ／Ｌ、特に２．５〜３．０ｇ／Ｌであってもよい。
【０１９４】
固体組成物の場合、３’−ＦＬの濃度は、３．５〜７．５ｇ／ｋｇ、好ましくは４．０〜７．０ｇ／ｋｇ、より好ましくは４．５〜６．５ｇ／ｋｇ、最も好ましくは５．０〜６．０ｇ／ｋｇ、特に５．５〜５．９ｇ／ｋｇであってもよい。
【０１９５】
液体組成物の場合、３’−ＦＬの濃度は、５００〜１０００ｍｇ／Ｌ、好ましくは６００〜９５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは６５０〜９００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは７００〜８５０ｍｇ／Ｌ、特に７５０〜８００ｍｇ／Ｌであってもよい。
【０１９６】
固体組成物の場合、ＬＮＴの濃度は、７〜１５ｇ／ｋｇ、好ましくは８〜１４ｇ／ｋｇ、より好ましくは９〜１３ｇ／ｋｇ、最も好ましくは１０〜１２ｇ／ｋｇ、特に１１．１ｇ／ｋｇであってもよい。
【０１９７】
液体組成物の場合、ＬＮＴの濃度は、０．２〜３．５ｇ／Ｌ、好ましくは０．４〜３．０ｇ／Ｌ、より好ましくは０．８〜２．５ｇ／Ｌ、最も好ましくは１．０〜２．０ｇ／Ｌ、特に１．５ｇ／Ｌであってもよい。
【０１９８】
固体組成物の場合、３’−ＳＬの濃度は、０．４〜３．５ｇ／ｋｇ、好ましくは０．８〜３．０ｇ／ｋｇ、より好ましくは１．０〜２．５ｇ／ｋｇ、最も好ましくは１．４〜２．０ｇ／ｋｇ、特に１．４８〜１．７ｇ／ｋｇであってもよい。
【０１９９】
液体組成物の場合、３’−ＳＬの濃度は、５０〜４００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１００〜３５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは１５０〜３００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは１８０〜２５０ｍｇ／Ｌ、特に２００〜２３０ｍｇ／Ｌであってもよい。
【０２００】
固体組成物の場合、６’−ＳＬの濃度は、０．５〜３．５ｇ／ｋｇ、好ましくは１．０〜３．０ｇ／ｋｇ、より好ましくは１．５〜２．５ｇ／ｋｇ、最も好ましくは２．０〜２．３ｇ／ｋｇ、特に２．０７〜２．２２ｇ／ｋｇであってもよい。
【０２０１】
液体組成物の場合、６’−ＳＬの濃度は、１００〜５００ｍｇ／Ｌ、好ましくは１５０〜４５０ｍｇ／Ｌ、より好ましくは２００〜４００ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは２５０〜３５０ｍｇ／Ｌ、特に２８０〜３００ｍｇ／Ｌであってもよい。
【０２０２】
固体組成物の場合、ＬＮｎＴの濃度は、０．２〜３．５ｇ／ｋｇ、好ましくは０．４〜１．８ｇ／ｋｇ、より好ましくは０．８〜１．４ｇ／ｋｇ、最も好ましくは１．０〜１．２ｇ／ｋｇ、特に１．１１ｇ／ｋｇであってもよい。
【０２０３】
液体組成物の場合、ＬＮｎＴの濃度は、１０〜３５０ｍｇ／Ｌ、好ましくは２０〜３００ｍｇ／Ｌ、より好ましくは５０〜２５０ｍｇ／Ｌ、最も好ましくは１００〜２００ｍｇ／Ｌ、特に１５０ｍｇ／Ｌであってもよい。
【０２０４】
固体組成物の場合、ＬＮＦＰ−Ｉの濃度は、１．０〜１０．０ｇ／ｋｇ、好ましくは３．０〜９．０ｇ／ｋｇ、より好ましくは６．０〜８．０ｇ／ｋｇ、最も好ましくは７．０〜７．５ｇ／ｋｇ、特に７．４ｇ／ｋｇであってもよい。
【０２０５】
液体組成物の場合、ＬＮＦＰ−Ｉの濃度は、０．１〜２．０ｇ／Ｌ、好ましくは０．３〜１．５ｇ／Ｌ、より好ましくは０．６〜１．２ｇ／Ｌ、最も好ましくは０．８〜１．１ｇ／Ｌ、特に１．０ｇ／Ｌであってもよい。
【０２０６】
組成物がプレミックスの場合、上述の濃度は、少なくとも２倍、好ましくは少なくとも４倍、より好ましくは少なくとも８倍、より一層好ましくは少なくとも１６倍、最も好ましくは少なくとも２０倍、特に少なくとも２２倍高くてもよい。
【０２０７】
例示的食品組成物
本発明の方法は、特に乳児および幼児用栄養製品に含めるのに有用な、食品または食事用途での使用を可能にするのに十分な純度の目的とするＬ−フコースを提供する。得られるＬ−フコースは、それを乳児用ベースフォーミュラの成分と混合することにより、乳児用フォーミュラの調製に使用され得る。乳児用フォーミュラは、粉末フォーミュラまたは即時使用可能な液体乳児用フォーミュラであってもよい。
【０２０８】
ベースフォーミュラは、以下の成分の少なくとも１つ、任意選択で全てを有し得る。
【表Ａ】
2021503898.tif 000004
【０２０９】
本発明の組成物の使用
食品組成物および／または医薬組成物の製造における本発明の組成物の使用が提案される。
【０２１０】
以下の図面および実施例を参照しながら、本発明による主題をより詳細に説明するが、その主題を本明細書に示す特定の態様に限定することは望まない。
【図面の簡単な説明】
【０２１１】
【図１】図１は、Ｌ−フコースを精製するための本発明の方法の例を示す。発酵後、発酵ブロスは遠心分離および／または濾過により清澄化される。清澄化発酵ブロスは、電荷を有する汚染物の除去および不特定イオンの特定イオンへの交換のために、イオン交換処理に供される。次いで、イオン交換処理の通過液は、透析濾過および／または濃縮に供される。この工程後、Ｌ−フコースを含む溶液は、電気透析および／または透析濾過に供される。次いで、Ｌ−フコースを含む溶液は、電荷を有する有色物質およびペプチドの除去のためにさらなるイオン交換処理に供される。その後、Ｌ−フコースを含む溶液は、活性チャコール処理に供される。次いで、溶液は、Ｌ−フコースの結晶化に供されるか、またはさらなる電気透析および／もしくは透析濾過工程とその後の顆粒化および／もしくは噴霧乾燥に供される。
【図２】図２は、Ｌ−フコースを精製するための本発明の第２の方法の例を示す。発酵後、発酵ブロスは遠心分離および／または濾過により清澄化される。清澄化発酵ブロスは、電荷を有する汚染物の除去および不特定イオンの特定イオンへの交換のために、イオン交換処理に供される。次いで、イオン交換処理の通過液は、透析濾過および／または濃縮に供される。この工程後、Ｌ−フコースを含む溶液は、電気透析および／または透析濾過に供される。次いで、Ｌ−フコースを含む溶液は、活性チャコール処理に供される。その後、Ｌ−フコースを含む溶液は、電荷を有する有色物質およびペプチドの除去のためにさらなるイオン交換処理に供される。次いで、溶液は、Ｌ−フコースの結晶化に供されるか、またはさらなる電気透析および／もしくは透析濾過工程とその後の顆粒化および／もしくは噴霧乾燥に供される。
【図３】図３は、Ｌ−フコースを精製するための本発明の第３の方法の例を示す。発酵後、発酵ブロスは遠心分離および／または濾過により清澄化される。清澄化発酵ブロスは、透析濾過および／または濃縮に供される。次いで、溶液は、電荷を有する汚染物の除去および不特定イオンの特定イオンへの交換のために、イオン交換処理に供される。この工程後、Ｌ−フコースを含む溶液は、電気透析および／または透析濾過に供される。次いで、Ｌ−フコースを含む溶液は、活性チャコール処理に供される。その後、Ｌ−フコースを含む溶液は、電荷を有する有色物質およびペプチドの除去のためにさらなるイオン交換処理に供される。次いで、溶液は、Ｌ−フコースの結晶化に供されるか、またはさらなる電気透析および／もしくは透析濾過工程とその後の顆粒化および／もしくは噴霧乾燥に供される。
【図４】図４は、Ｌ−フコースを精製するための本発明の第４の方法の例を示す。発酵後、発酵ブロスは遠心分離および／または濾過により清澄化される。清澄化発酵ブロスは、透析濾過および／または濃縮に供される。次いで、溶液は、活性チャコール処理に供される。この工程後、Ｌ−フコースを含む溶液は、電荷を有する汚染物の除去および不特定イオンの特定イオンへの交換のために、イオン交換処理に供される。その後、Ｌ−フコースを含む溶液は、電気透析および／または透析濾過に供される。その後、溶液は、電荷を有する有色物質およびペプチドの除去のためにさらなるイオン交換処理に供される。次いで、溶液は、Ｌ−フコースの結晶化に供されるか、またはさらなる電気透析および／もしくは透析濾過工程とその後の顆粒化および／もしくは噴霧乾燥に供される。
【図５】図５は、水溶液からの結晶化により形成されたＬ−フコースの結晶の顕微鏡写真を示す。Ｌ−フコースは、５０μｍ〜１５０μｍの長さを有する針状結晶を形成することが観察され得る。
【図６】図６は、水溶液から結晶化されたＬ−フコースに対して記録されたＨＰＬＣダイアグラムを示す。結晶化したＬ−フコースの純度は、９９．８％として検出される。含水率は０．１％（ｗ／ｗ）である。
【図７】図７は、水溶液から顆粒化されたＬ−フコースに対して記録されたＨＰＬＣダイアグラムを示す。顆粒化したＬ−フコースの純度は、９７．８％として検出される。含水率は１．７％（ｗ／ｗ）である。
【実施例】
【０２１２】
実施例１
細菌発酵からのＬ−フコースの精製
細菌発酵によりＬ−フコースを生成し、濾過により採取した。得られた透明な、粒子を含まないＬ−フコース溶液（３４ｇ／ｌ）を、強カチオン性イオン交換体（プロトン形態のＬｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ２５６８、Ｌａｎｘｅｓｓ）で処理した。水酸化ナトリウムでの中和後、溶液をさらに強アニオン性イオン交換体（塩化物形態のＬｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ６３６８Ａ）で処理した。
【０２１３】
イオン交換処理後のＬ−フコースの濃縮のために、溶液をさらに逆浸透工程によって処理した。Ｅｍｒｉｃｈ  ＥＭＲＯ１．８逆浸透システム（Ｅｍｒｉｃｈ  Ｅｄｅｌｓｔａｈｌｂａｕ）は、Ｔｒｉｓｅｐ（登録商標）ＴＳ８０（８０−４０−ＴＳ８０−ＴＳＡ）ナノ濾過モジュールを備えていた。入口圧力を２５バールに設定し、Ｌ−フコース濃度が１００ｇ／ｌに達するまで溶液を濃縮した。あるいは、Ｌ−フコース溶液はまた、真空蒸発により濃縮されてもよいが、それでも濾過技術は濃縮中のメイラード反応の発生を低減する。
【０２１４】
イオン交換工程からの塩化ナトリウムおよび他のイオンの除去のために、ＰＣＣｅｌｌ  ＥＤ  １０００Ａ膜積層体を備えるＰＣＣｅｌｌ  Ｐ１５電気透析システム（ＰＣｅｌｌ、ドイツ、ホイスヴァイラー）を使用して溶液を電気透析した。その積層体はサイズ排除限界６０Ｄａをもつ下記の膜から構成されていた：カチオン交換膜ＣＥＭ：ＰＣ  ＳＫ、およびアニオン交換膜ＣＥＭ：ＰｃＡｃｉｄ６０。出発溶液の導電率は１５〜２５ｍＳ／ｃｍ２の間であったが、導電率が１．５〜２ｍＳ／ｃｍ２となるまで溶液を電気透析した。
【０２１５】
電気透析後、溶液を再び強カチオン性イオン交換体（ナトリウム形態のＬｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ２５６８、Ｌａｎｘｅｓｓ）および強アニオン性イオン交換体（塩化物形態のＬｅｗａｔｉｔ（登録商標）Ｓ６３６８Ａ）で処理し、有色物質および残留し得る不特定イオン（例えばペプチド等）を除去した。
【０２１６】
有色物質のより厳密な除去のために、Ｌ−フコース含有溶液をさらに活性炭粉末で処理した。溶液を撹拌下でＮｏｒｉｔ  ＤＸ１活性チャコールと共に２時間インキュベートした。インキュベーション後、活性炭を濾過により除去した。
【０２１７】
活性炭処理後、ＣＳＭ  ＲＥ８０４０ＢＥ逆浸透モジュールを備えるＥｍｒｉｃｈ  ＥＭＲＯ１．８逆浸透システム（Ｅｍｒｉｃｈ  Ｅｄｅｌｓｔａｈｌｂａｕ）を使用して、逆浸透濾過によりＬ−フコース含有溶液を濃縮した。濾過システムの流速が５０リットル／時未満に低下するまで溶液を濃縮した。濃縮後の乾燥物量は、３０〜３５％（ｗ／ｗ）の間であった。
【０２１８】
あるいは、Ｌ−フコースはまた、真空蒸発により濃縮されてもよい。この技術は、より高濃度（５０〜６０％（ｗ／ｗ））のＬ−フコースをもたらす。真空蒸発による濃縮の欠点は、Ｌ−フコースが部分的にカラメル化を生じることであり、これは溶液が明確な褐色に変化することにより明らかである。つまり、生成物品質、生成物純度および生成物収率は、この濃縮法によって低減される。
【０２１９】
実施例２
有機溶媒の使用によるＬ−フコースの結晶化
Ｌ−フコースの結晶化のために、１５リットルの３２％（ｗ／ｗ）溶液を、Ｈｅｉ−ＶＡＰ工業用蒸発器（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ、シュヴァーバッハ、ドイツ）を使用した真空蒸発により乾燥物量８０〜８５％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで濃縮し、Ｌ−フコースの結晶化のための母液を得た。
【０２２０】
結晶化工程を開始するために、母液にシード結晶を播種した。さらに２．５リットル（ブタノール対フコースの比１：２）のｎ−ブタノールを添加し、溶液が結晶で飽和するまで溶液を真空下で濃縮した。
【０２２１】
結晶化塊をピストンから取り出し、固体結晶化塊が得られるまで少なくとも２４時間インキュベートした。
固体結晶をエタノールと１対１（１ｋｇの結晶化塊に対して１リットルエタノール）の比で混合した。結晶から母液およびエタノールを除去するために、溶液を遠心分離した。
【０２２２】
結晶を再びエタノール（５ｋｇのＬ−フコース結晶に対して２．５リットル）で洗浄し、再び遠心分離した。固体Ｌ−フコース結晶を遠心分離物から取り出し、エタノールが残留しなくなるまで４０℃で乾燥させた。Ｌ−フコースを０．２ｍｍ径の篩にかけた。
【０２２３】
最終的に、５ｋｇのＬ−フコース結晶化アプローチから３．３ｋｇのＬ−フコースが得られた（収率：６６％）。
実施例３
水溶液からのＬ−フコースの結晶化
水溶液からのＬ−フコースの結晶化のために、１５リットルの３２％（ｗ／ｗ）溶液を、Ｈｅｉ−ＶＡＰ工業用蒸発器（Ｈｅｉｄｏｌｐｈ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  ＧｍｂＨ、シュヴァーバッハ、ドイツ）を使用した真空蒸発により乾燥物量８０％〜８５％（ｗ／ｗ）の最終濃度まで濃縮した。
【０２２４】
結晶化工程を開始するために、母液にシード結晶を播種した。溶液を、透明結晶の形成が観察されるまで真空下で濃縮した。
結晶化塊をピストンから取り出し、固体結晶化塊が得られるまで少なくとも７２時間インキュベートした。固体結晶をエタノールと１対１（１ｋｇの結晶化塊に対して１リットルエタノール）の比で混合した。
【０２２５】
結晶から母液およびエタノールを除去するために、溶液を遠心分離した。結晶をエタノール（５ｋｇのＬ−フコース結晶に対して２．５リットル）で洗浄し、再び遠心分離した。固体Ｌ−フコース結晶を遠心分離物から取り出し、エタノールが残留しなくなるまで４０℃で乾燥させた。Ｌ−フコースを０．２ｍｍ径の篩にかけた。
【０２２６】
最終的に、５ｋｇのＬ−フコース結晶化アプローチから３．０ｋｇのＬ−フコースが得られた（収率：６０％）。
実施例４
顆粒化によるＬ−フコースの単離
Ｌ−フコースの顆粒化のために、Ｇｌａｔｔ（Ｇｌａｔｔ  ＧｍｂＨ、ドイツ）からの流動床システムを使用した。Ｌ−フコースの結晶化アプローチから、４０％（ｗ／ｗ）のＬ−フコース溶液が提供され、流動床システムにおける顆粒化に使用された。
【０２２７】
流動床システムは、合計５００ｇの固体Ｌ−フコースを備え、システムは、供給溶液を添加することにより開始された。システムは、４５℃〜５０℃の間の生成物温度により安定化された。３００ｇのＬ−フコース後、第１の凝集体が形成された。１０００ｇの４０％（ｗ／ｗ）Ｌ−フコース溶液（４００ｇのＬ−フコース）後、システムを停止し、分析した。
【０２２８】
顆粒化および８０％の回収率の後、５７０ｇ／ｌのかさ密度および０．９％の乾燥減量で７２０ｇのＬ−フコースを回収することができた。顆粒化したＬ−フコースのサイズを、篩い分けにより分析した。この試験は、材料の７０％が１５０μｍ〜１４００μｍの間のサイズを有することを示している。
【０２２９】
実施例５
Ｌ−フコースの例示的精製における純度
培養ブロスからのＬ−フコースの例示的精製における純度を、表１に示す。
【０２３０】
【表１】
2021503898.tif 000005
【０２３１】
実施例６
代表的な乳児用フォーミュラ製品の組成物
以下では、代表的な乳児用フォーミュラ製品の組成物が示される（以下の表２を参照されたい）。
【０２３２】
組成物は、豊富な中性ＨＭＯである２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）および任意選択でラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）およびラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ−Ｉ）、酸性ＨＭＯ（６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）および３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ））、ならびにシアル酸であるＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）と組み合わせたＬ−フコースを含む。
【０２３３】
１種または複数種のプロバイオティクス株が製品中に存在してもよい。各成分の最終濃度は、９０ｍｌの水中の１３．５ｇの粉末の調製に基づいている。
【０２３４】
【表２−１】
2021503898.tif 000006
【０２３５】
【表２−２】
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【０２３６】
実施例７
ヒトミルクオリゴ糖、単糖Ｌ−フコースおよび単糖Ｎ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）を含む乳児用フォーミュラ製品用の代表的プレミックスの組成物
以下では、乳児用フォーミュラ製品用の代表的プレミックスの組成物が示される（以下の表３を参照されたい）。
【０２３７】
組成物は、豊富な中性ＨＭＯである２’−フコシルラクトース（２’−ＦＬ）、３−フコシルラクトース（３−ＦＬ）、ラクト−Ｎ−テトラオース（ＬＮＴ）および任意選択でラクト−Ｎ−ネオテトラオース（ＬＮｎＴ）およびラクト−Ｎ−フコペンタオースＩ（ＬＮＦＰ−Ｉ）、ならびに酸性ＨＭＯ（例えば６’−シアリルラクトース（６’−ＳＬ）、３’−シアリルラクトース（３’−ＳＬ）およびシアリル化ＬＮＴ誘導体）、ならびにシアル酸であるＮ−アセチルノイラミン酸（Ｎｅｕ５Ａｃ）と組み合わせた単糖Ｌ−フコースを含む。
【０２３８】
プレミックスは、乳清、ラクトース、脂質（飽和および不飽和脂肪酸）ならびにミネラル等の乳児用食品フォーミュラを再構成するために必要な他の栄養製品に前記プレミックスを添加することにより、乳児用フォーミュラに再構成するために使用され得る。表３に示されるプレミックスは、１ｋｇの最終的な乳児用フォーミュラ製品に使用されることが意図される。
【０２３９】
【表３】
2021503898.tif 000008
【図１】
2021503898.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
2021503898.tif 000013
【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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