(57)【要約】【課題】ヒト脂肪細胞への治療薬の標的化送達の提供。【解決手段】熱産生制御の調節に関する組成物及び方法が開示される。上記組成物及び方法は、肥満症や、２型糖尿病、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨ等の心血管代謝障害等の疾患又は異常を治療するために用いることができる。組成物としては、熱産生制御を調節することができる治療薬と、標的化された脂肪細胞への上記治療薬の細胞取込及び送達を促進する標的化要素と、スフィンゴミエリン、ＤＭＰＣ及びコレステロールを含むリポソーム粒子であって、上記治療薬の細胞内浸透を高め、かつ上記治療薬の分解を防ぐリポソーム粒子とを含む脂肪細胞標的化組成物が挙げられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）脂質酸化及び／又は熱産生制御を調節することができる治療薬と、
（ｂ）標的化された脂肪細胞への上記治療薬の細胞取込及び送達を促進する標的化要素と、
（ｃ）スフィンゴミエリン、ＤＭＰＣ及びコレステロールを含むリポソーム粒子であって、上記治療薬の細胞内浸透を高め、かつ上記治療薬の分解を防ぐリポソーム粒子と
を含む脂肪細胞標的化組成物。
【請求項２】
スフィンゴミエリンは上記リポソーム粒子の３０〜５０重量％を構成し、ＤＭＰＣは上記リポソーム粒子の３０〜５０重量％を構成し、コレステロールは上記リポソーム粒子の１０〜３０重量％を構成する、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
スフィンゴミエリンは上記リポソーム粒子の４０重量％を構成し、ＤＭＰＣは上記リポソーム粒子の４０重量％を構成し、コレステロールは上記リポソーム粒子の２０重量％を構成する、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
上記リポソームは、ピーク平均径が約１３５〜１５０ｎｍであるか、又は多分散指数が約０．０３５未満である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
上記治療薬は、７〜１４ヌクレオチド長のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
上記治療薬は、ｍｉＲ−２２アンタゴミール、ｍｉＲ−５１５アゴミール、ジニトロフェノール、ニクロサミド、β３アドレナリン受容体アゴニスト、甲状腺ホルモン模倣薬、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト、レチノイン酸、ヘキサレリン、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、プロヒビチン（ＰＨＢ）、ポリフェノール、レスベラトロール、クルクミン、カプシシノイド、イソフラボン、又は遺伝子編集システムの成分を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
上記標的化要素は、上記治療薬に結合している脂質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
上記脂質は、デカン酸、ドデカン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、オレオイルグリシン、ドコサン酸、ヘキサデカン酸、ドトリアコンタヘキサエン酸、ドコサヘキサエン酸又はコレステロールを含む、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
上記脂質は、脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６／ＳＣＡＲＢ３）によって自然輸送される脂肪酸である、請求項７又は８に記載の組成物。
【請求項１０】
上記治療薬は、上記リポソームの内部中に封入されている、請求項５〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
上記治療薬は、上記リポソームの表面に結合している、請求項５〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
上記治療薬は、共有結合、ジスルフィド結合、ジエステル結合、ペプチド結合、イオン結合及びビオチン−ストレプトアビジン結合からなる群から選択されるリンカーによって上記脂質に結合している、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
上記標的化要素は、脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６／ＳＣＡＲＢ３）、アクアポリン７（ＡＱＰ７）、ペリリピン１（ＰＬＩＮ１）又はペリリピン２（ＰＬＩＮ２）に特異的に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
上記標的化要素は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体を含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
上記標的化要素は、ヘキサレリン、トロンボスポンジン−１、又はアミノ酸配列ＧＶＩＴＲＩＲを有するトロンボスポンジン−１ペプチドを含む、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
上記治療薬は、共有結合、ジスルフィド結合、ジエステル結合、ペプチド結合、イオン結合及びビオチン−ストレプトアビジン結合からなる群から選択されるリンカーによって上記標的化要素に結合している、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
上記治療薬は、脂質酸化及び／又は呼吸鎖脱共役を調節する、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１８】
上記治療薬は、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２又はＵＣＰ３の活性を調節する、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ジスルフィド結合を介してヘキサレリンに結合した一本鎖オリゴヌクレオチドを含む脂肪細胞標的化治療薬。
【請求項２０】
上記一本鎖オリゴヌクレオチドは７〜１４ヌクレオチド長である、請求項１９に記載の治療薬。
【請求項２１】
上記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２２アンタゴミール又はｍｉＲ−５１５アゴミールである、請求項１９又は２０に記載の治療薬。
【請求項２２】
対象において熱産生制御を調節をする方法であって、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物を上記対象に供給することを含む方法。
【請求項２３】
上記組成物又は治療薬の供給は、上記組成物又は治療薬を皮下投与、経皮投与又は静脈内投与することを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
上記患者は、肥満症又は関連する２型糖尿病、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨ等の心血管代謝障害を有する、請求項２２又は２３に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本出願は、２０１８年７月２日に出願された米国仮特許出願第６２／６９３，０２５号及び２０１９年２月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／８１０，１４１号の優先権の利益を主張し、それらはいずれも全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
＜技術分野＞
本発明は、概して、治療薬（マイクロＲＮＡ類似体、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、栄養補助食品又は遺伝子編集システム等のオリゴヌクレオチド治療薬）を含む組成物、並びにヒト肥満症及び関連する２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝疾患（ＮＡＦＬＤ）及び非アルコール性脂肪性肝炎（ＮＡＳＨ）等の心血管代謝障害の治療のためにこのような治療薬を脂肪細胞に送達する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
肥満症及び過体重は、世界的に増えつつある健康問題である。肥満症は、エネルギーの摂取と消費との慢性的な不均衡の結果である。これにより、過剰なエネルギーがトリグリセリドとして脂肪細胞に貯蔵され、脂肪細胞は典型的には肥大化（細胞サイズの増大）と過形成（細胞数又は脂肪生成の増加）とを示す。肥満症の近年の悪化は、飽和脂肪及び糖を多く含む高エネルギー食品の過剰摂取と身体活動の減少とが組み合わさったことによるものである。
【０００４】
肥満症に対する現在の対症療法は、主に限られた薬効と患者の生活様式の変更及び治療に対する順守度の低さとに起因して、長期治療目標を達成することができていない。肥満治療薬の中には、安全上の理由で市場から排除されたものもあり、現在開発中の小分子は、短期有効性が中程度であって、安全性プロファイルが未知であるため、規制当局の承認を得るのに難航している。現在のところ、制限的及び吸収抑制的な肥満外科手術のみが、いくつかの好ましい心血管ベネフィットとともに、過剰体重の著しい長期減少を達成できる。しかし、肥満外科手術は慢性的な消化吸収不良状態を生じさせる。したがって、当該技術分野において肥満症の新規治療法が求められている。
【０００５】
ＮＡＦＬＤは増えつつある世界的流行病であり、肥満症及び２型糖尿病の有病率の増加に関連して、世界の成人人口の最大３１％にまで影響を及ぼしている［非特許文献１］。１億人のアメリカ人が脂肪肝を有しており、ほとんどの人がそれに気づいていない。彼らの多くがＮＡＦＬＤ、ＮＡＳＨ、肝線維症、場合によっては末期の肝不全及び癌を発症する［非特許文献２］。現在承認されている治療法がないため、ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨには安全で有効な治療法が必要である。ＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨは慢性肝疾患の主な原因であり、先進国では相当な罹患率及び死亡率を伴う［非特許文献３］。ＮＡＦＬＤはかなり複雑な疾患であり、現在、以下のようにＮＡＦＬＤの発症を説明する「マルチヒット」仮説が提案されている［非特許文献４］。
・ファーストヒット：脂質蓄積（脂肪症）
・セカンドヒット：炎症、ミトコンドリア機能障害及び酸化ストレス（脂肪性肝炎）
・サードヒット：肝細胞再生の欠陥（線維症）
【０００６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、単一のｍｉＲＮＡによって多くの標的遺伝子を同時に調節することで、肥満症、２型糖尿病及びＮＡＦＬＤ／ＮＡＳＨのような多因子性疾患の有効な治療法を提供できることから、細胞運命決定を制御し、複雑な疾患を改善するための魅力的な薬剤候補である。実際、ｍｉＲＮＡは脂肪細胞の分化、発達及び機能に対する広範囲の制御因子であり、肥満症の実行可能な治療薬である。現在、心血管代謝障害を含む様々なヒト疾患を治療するためにいくつかのｍｉＲＮＡアゴニスト（アゴミール）及びアンタゴニスト（アンタゴミール）が開発中である。このような薬剤は、例えば特許文献１（Ｔｈｉｂｏｎｎｉｅｒ）に開示されている。近年、オリゴヌクレオチドを薬剤に変換するための技術プラットフォームが成熟しており、いくつかの薬剤が現在臨床開発中である［非特許文献５、６］。しかし、肝臓以外の組織／臓器への標的化送達はほとんど試験されておらず、革新的アプローチから利益が得られる可能性がある［非特許文献７、８］。
【０００７】
脂肪細胞へのマイクロＲＮＡ調節因子及び他の治療薬（小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、栄養補助食品及び遺伝子編集システム等）の標的化送達を達成することによって、長期有効性／安全性プロファイルを最適化し、商品原価を削減し、オフターゲット効果を最小限に抑えることが求められている［非特許文献９］。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】米国特許第９，０３４，８３９号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Ｙｏｕｎｏｓｓｉ，Ｚ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｏｂａｌ  ｂｕｒｄｅｎ  ｏｆ  ＮＡＦＬＤ  ａｎｄ  ＮＡＳＨ：ｔｒｅｎｄｓ，ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ，ｒｉｓｋ  ｆａｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ  Ｈｅｐａｔｏｌ，２０１８．１５（１）：ｐ．１１−２０
【非特許文献２】Ｈａｎｓｏｎ，Ａ．，Ｄ．Ｗｉｌｈｅｌｍｓｅｎ，ａｎｄ  Ｊ．Ｋ．ＤｉＳｔｅｆａｎｏ，Ｔｈｅ  Ｒｏｌｅ  ｏｆ  Ｌｏｎｇ  Ｎｏｎ−Ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ（ｌｎｃＲＮＡｓ）ｉｎ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ａｎｄ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  Ｆａｔｔｙ  Ｌｉｖｅｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ（ＮＡＦＬＤ）．Ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ，２０１８．４（３）
【非特許文献３】Ｓａｒｗａｒ，Ｒ．，Ｎ．Ｐｉｅｒｃｅ，ａｎｄ  Ｓ．Ｋｏｐｐｅ，Ｏｂｅｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ．Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｍｅｔａｂ  Ｓｙｎｄｒ  Ｏｂｅｓ，２０１８．１１：ｐ．５３３−５４２
【非特許文献４】Ｂｕｚｚｅｔｔｉ，Ｅ．，Ｍ．Ｐｉｎｚａｎｉ，ａｎｄ  Ｅ．Ａ．Ｔｓｏｃｈａｔｚｉｓ，Ｔｈｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｈｉｔ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ  ｆａｔｔｙ  ｌｉｖｅｒ  ｄｉｓｅａｓｅ（ＮＡＦＬＤ）．Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，２０１６．６５（８）：ｐ．１０３８−４８
【非特許文献５】Ｌｉ，Ｚ．ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．Ｒａｎａ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，２０１４．１３（８）：ｐ．６２２−３８
【非特許文献６】ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓ．Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｓ  ｃｏｍｉｎｇ  ｏｆ  ａｇｅ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２０１４．６（７）：ｐ．８５１−６４
【非特許文献７】Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｚ．Ｗａｎｇ，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｇｅｍｅｉｎｈａｒｔ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１３．１７２（３）：ｐ．９６２−７４
【非特許文献８】Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ａ．ａｎｄ  Ｊ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｋｎｏｃｋｉｎｇ  ｄｏｗｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｓｉＲＮＡ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ，２０１５．１６（９）：ｐ．５４３−５２
【非特許文献９】Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｒ．，Ｈ．Ｌｏｄｉｓｈ，ａｎｄ  Ｌ．Ｓｕｎ，ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ，２０１１．１５：ｐ．６２３−３６
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
この目標を達成するために、本発明者らは、（ａ）ｍｉＲＮＡ薬剤組成物（例えば、ｍｉＲＮＡアゴミール及びアンタゴミール）、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、栄養補助食品及び遺伝子編集システム等、脂質酸化及び／又は熱産生制御を調節することができる治療薬と、（ｂ）脂肪細胞に特異的な細胞表面マーカー、受容体又は輸送体に結合し、標的化された脂肪細胞への熱産生治療薬の細胞取込及び送達を促進する標的化要素（例えば、脂肪酸輸送体によって輸送される分子、又は脂肪酸輸送体を認識する抗体）と、（ｃ）標的化された脂肪細胞へ治療薬を送達し、治療薬の分解を防ぎつつその細胞内浸透を高めることができる担体若しくは送達ナノ粒子との様々な新規の組み合わせを開発した。このような治療薬、標的化要素及び担体若しくは送達ナノ粒子を採用する組成物は、治療薬をヒト脂肪組織へ局所皮下投与（注射、パッチ又はマイクロニードル）する方法で用いることができ、その結果、全身曝露及び「オフターゲット効果」が最小限に抑えられ、治療指数が更に改善し、商品原価が削減され、患者の利便性及び治療への順守が改善する。
【００１１】
幾つかの実施形態では、本明細書には、（ａ）脂質酸化及び／又は熱産生制御を調節することができる治療薬と、（ｂ）標的化された脂肪細胞への上記治療薬の細胞取込及び送達を促進する標的化要素と、（ｃ）スフィンゴミエリン、ＤＭＰＣ及びコレステロールを含むリポソーム粒子であって、上記治療薬の細胞内浸透を高め、かつ上記治療薬の分解を防ぐリポソーム粒子とを含む脂肪細胞標的化組成物が開示されている。上記リポソーム粒子は、様々な処方を有する。幾つかの実施形態では、上記リポソーム粒子中の上記コレステロールは上記リポソーム粒子の３０〜５０重量％を構成し、上記ＤＭＰＣは上記リポソーム粒子の３０〜５０重量％を構成し、上記コレステロールは上記リポソーム粒子の１０〜３０重量％を構成する。幾つかの実施形態では、上記コレステロールは上記リポソーム粒子の４０重量％を構成し、上記ＤＭＰＣは上記リポソーム粒子の４０重量％を構成し、上記コレステロールは上記リポソーム粒子の２０重量％を構成する。幾つかの実施形態では、上記リポソームは、ピーク平均径が約１３５〜１５０ｎｍであるか、又は多分散指数が約０．０３５未満である。
【００１２】
上記組成物中の上記治療薬は、例えば、ｍｉＲＮＡアゴミール及びアンタゴミール、小分子、ペプチド、ペプチド模倣薬、栄養補助食品、遺伝子編集システム、又は脂質酸化及び／又は熱産生を調節することができる他の薬剤を含む様々な脂質酸化及び／又は熱産生調節因子のうちの１つ又はそれらの組み合わせであってよい。幾つかの実施形態では、上記治療薬は、７〜１４ヌクレオチド長のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む。幾つかの実施形態では、上記治療薬は、ｍｉＲ−２２アンタゴミール、ｍｉＲ−５１５アゴミール、ジニトロフェノール、ニクロサミド、β３アドレナリン受容体アゴニスト、甲状腺ホルモン模倣薬、ＰＰＡＲαアゴニスト、ＰＰＡＲγアゴニスト、レチノイン酸、ヘキサレリン、トロンボスポンジン−１（ＴＳＰ−１）、プロヒビチン（ＰＨＢ）、ポリフェノール、レスベラトロール、クルクミン、カプシシノイド、イソフラボン、又は遺伝子編集システムの成分を含む。
【００１３】
幾つかの実施形態では、上記標的化要素は脂質である。幾つかの実施形態では、上記脂質は上記治療薬に結合している。幾つかの実施形態では、上記脂質は、デカン酸、ドデカン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、オレオイルグリシン、ドコサン酸、ヘキサデカン酸、ドトリアコンタヘキサエン酸、ドコサヘキサエン酸又はコレステロールを含む。幾つかの実施形態では、上記脂質は、脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６／ＳＣＡＲＢ３）によって自然輸送される脂肪酸である。幾つかの実施形態では、上記治療薬は、共有結合、ジスルフィド結合、ジエステル結合、ペプチド結合、イオン結合及びビオチン−ストレプトアビジン結合からなる群から選択されるリンカーによって上記脂質に結合している。
【００１４】
幾つかの実施形態では、上記標的化要素は、脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６／ＳＣＡＲＢ３）、アクアポリン７（ＡＱＰ７）、ペリリピン１（ＰＬＩＮ１）又はペリリピン２（ＰＬＩＮ２）に特異的に結合する。幾つかの実施形態では、上記標的化要素は、抗体、抗体断片、ｓｃＦｖ又は単一ドメイン抗体を含む。幾つかの実施形態では、上記標的化要素は、ヘキサレリン（Ｈｉｓ−Ｄ−２−Ｍｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２）、ＴＳＰ−１、アミノ酸配列ＧＶＩＴＲＩＲ若しくはＶＴＣＧＶＩＴＲＩＲを有するＴＳＰ−１ペプチド、又はアミノ酸配列ＣＫＧＧＲＡＫＤＣを有するＰＨＢペプチドを含む。幾つかの実施形態では、上記治療薬は、共有結合、ジスルフィド結合、ジエステル結合、ペプチド結合、イオン結合及びビオチン−ストレプトアビジン結合からなる群から選択されるリンカーによって上記標的化要素に結合している。
【００１５】
幾つかの実施形態では、上記治療薬は、上記リポソームの内部中に封入されている。幾つかの実施形態では、上記治療薬は、上記リポソームの表面に結合している。幾つかの実施形態では、上記治療薬は上記リポソームの外面に結合しており、上記リポソームの内部には含まれない。
【００１６】
幾つかの実施形態では、上記治療薬は、呼吸鎖脱共役を調節する。幾つかの実施形態では、上記治療薬は、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２又はＵＣＰ３の活性を調節する。
【００１７】
更に本明細書には、ジスルフィド結合を介してヘキサレリンに結合した一本鎖オリゴヌクレオチドを含む脂肪細胞標的化治療薬が開示されている。幾つかの実施形態では、上記一本鎖オリゴヌクレオチドは、７〜１４ヌクレオチド長である。幾つかの実施形態では、上記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ｍｉＲ−２２アンタゴミール又はｍｉＲ−５１５アゴミールである。
【００１８】
更に本明細書には、対象において脂質酸化及び／又は熱産生制御を調節をする方法であって、上記組成物のいずれかを上記対象に供給することを含む方法が開示されている。幾つかの実施形態では、上記組成物又は治療薬の供給は、上記組成物又は治療薬を皮下注射、経皮注射又は静脈内注射することを含む。上記脂質酸化及び／又は熱産生制御を調節する方法は、疾患又は異常を治療するための方針の一部であってよい。幾つかの実施形態では、上記疾患又は異常は、肥満症、又は２型糖尿病、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨ等の心血管代謝障害である。
【００１９】
幾つかの実施形態では、上記組成物を投与される患者は、肥満症、又は関連する２型糖尿病、ＮＡＦＬＤ及びＮＡＳＨ等の心血管代謝障害を有するか又はそれと診断されている。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ＡＴＰを産生するミトコンドリア呼吸鎖複合体（上段パネル）、並びに熱産生／エネルギー消耗をもたらす脂肪組織でのＵＣＰ１による複合体ＩＶ及びＶの脱共役（下段パネル）の概略図を示す。
【図２】化学修飾されたｓｓ−ｍｉＲＮＡの作用のメカニズムを示す［１０］。
【図３】ＲＮＡ系治療薬をヒト脂肪細胞培養物で試験するための実験計画を示す。
【図４】分子動力学シミュレーションプログラムを用いてヒトｍｉＲ−２２−３ｐ標的のシード領域と相互作用する８量体ｍｉＲ−２２−３ｐアンタゴミールの３Ｄモデルを示す。
【図５】ＰｙＭＯＬプログラムを用いて生成した各指示ＡｄｉｐｏｍｉＲの３Ｄモデルを示す。
【図６】分子動力学シミュレーションプログラムを用いて生成した、ヒトｍｉＲ−２２−３ｐのシード領域を標的とし、かつジスルフィド結合を介してヘキサレリンに結合しているペプチド核酸骨格を有する１２量体ｍｉＲ−２２−３ｐアンタゴミールの３Ｄモデルを示す。
【図７】緑色蛍光ヘキサレリンがヒト脂肪細胞の細胞質中へ効率的に輸送されることを示す。
【図８Ａ】指示した脂質ナノ粒子ＬＮＰ１、ＬＮＰ２、ＬＮＰ３又はＬＮＰ４とともに製剤化した各指示量の二本鎖ｍｉＲ−１２４とともにインキュベートした脂肪細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲで測定した各指示ＲＮＡの相対存在量を示すグラフである。図８ＡはｍｉＲ−１２４の相対存在量を示す。
【図８Ｂ】指示した脂質ナノ粒子ＬＮＰ１、ＬＮＰ２、ＬＮＰ３又はＬＮＰ４とともに製剤化した各指示量の二本鎖ｍｉＲ−１２４とともにインキュベートした脂肪細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲで測定した各指示ＲＮＡの相対存在量を示すグラフである。図８Ｂはｌｅｔ−７ｍＲＮＡの相対存在量を示す。
【図８Ｃ】指示した脂質ナノ粒子ＬＮＰ１、ＬＮＰ２、ＬＮＰ３又はＬＮＰ４とともに製剤化した各指示量の二本鎖ｍｉＲ−１２４とともにインキュベートした脂肪細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲで測定した各指示ＲＮＡの相対存在量を示すグラフである。図８ＣはＩＱＧＡＰ１ｍＲＮＡの相対存在量を示す。
【図８Ｄ】指示した脂質ナノ粒子ＬＮＰ１、ＬＮＰ２、ＬＮＰ３又はＬＮＰ４とともに製剤化した各指示量の二本鎖ｍｉＲ−１２４とともにインキュベートした脂肪細胞においてｑＲＴ−ＰＣＲで測定した各指示ＲＮＡの相対存在量を示すグラフである。図８ＤはレプチンｍＲＮＡの相対存在量を示す。
【図９】マウスに皮下注射を行った後のマウス組織の１細胞あたりのｍｉＲ−５１５コピー数と相関するＵＣＰ１ｍＲＮＡの相対的発現量を示すグラフである。
【図１０】脂肪酸輸送体（ＦＡＴ／ＣＤ３６／ＳＣＡＲＢ３）の構造を示す［１１］。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
Ｉ．定義
別段の規定がない限り、本明細書で用いられる技術用語及び科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。矛盾する場合には、定義を含めて本出願が優先する。
【００２２】
本明細書中、「ｍｉＲＮＡ類似体」とは、直接的又は間接的に間葉系幹細胞（ＡＴＭＳＣ）又は白色脂肪細胞（ＷＡＴ）を褐色脂肪細胞（ＢＡＴ）へと再プログラムするオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド模倣物を言う。ｍｉＲＮＡ類似体は、標的遺伝子又は標的遺伝子の活性化因子若しくは抑制因子、あるいは熱産生制御因子（例えば、ミトコンドリア脱共役剤又はその活性化因子若しくは抑制因子）の活性を直接的又は間接的に調節する標的ｍｉＲＮＡに作用し得る。
【００２３】
本明細書中、「ｍｉＲＮＡ」とは、標的遺伝子（ｍＲＮＡ又はＤＮＡのいずれか）に結合し、その遺伝子の発現を制御することができる一本鎖ＲＮＡ分子（又はその合成誘導体）を言う。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡは生物において天然に発現する。
【００２４】
本明細書中、「シード配列」とは、標的特異性の重要な決定基であるｍｉＲＮＡの５’末端の最初の８ヌクレオチド（ｎｔ）（すなわち、シード配列）内の６〜８ヌクレオチド長部分列を言う。
【００２５】
本明細書中、「アゴミール（ａｇｏｍｉｒ）」とは、ｍｉＲＮＡを機能的に模倣する合成オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド模倣物を言う。アゴミールは、ｍｉＲＮＡ又はｍｉＲＮＡの一部と同じ又は類似の核酸配列を有するオリゴヌクレオチドであってよい。特定の実施形態では、アゴミールは、模倣するｍｉＲＮＡとの差が１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチドである。更に、アゴミールは、模倣するｍｉＲＮＡと同じ長さ、それよりも長い又は短い長さを有していてもよい。特定の実施形態では、アゴミールは、模倣するｍｉＲＮＡの５’末端の６〜８ヌクレオチドと同じ配列を有する。他の実施形態では、アゴミールは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチド長であってもよい。特定の実施形態では、アゴミールは、ｍｉＲＢａｓｅに示された配列のいずれかを含む。これらの化学修飾された合成ＲＮＡ二重鎖は、目的のｍｉＲＮＡと同一であるか又は実質的に同一であるガイド鎖を含むことで、ＲＩＳＣ複合体への効率的なロードが可能になる一方、パッセンジャー鎖が化学修飾されることで、ＲＩＳＣ複合体中のアルゴノートタンパク質へのロードが防止される（Ｔｈｏｒｓｅｎ  ＳＢ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．，１８（３）：２７５−２８４（２０１２）；Ｂｒｏｄｅｒｉｃｋ  ＪＡ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．，１８（１２）：１１０４−１１１０（２０１１））。
【００２６】
本明細書中、「アンタゴミール（ａｎｔａｇｏｍｉｒ）」とは、特定のマイクロＲＮＡに対して相補性を有し、そのｍｉＲＮＡの活性を阻害する合成オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド模倣物を言う。「アンチミール（ａｎｔｉｍｉｒ）」は、「アンタゴミール」と同義である。特定の実施形態では、アンタゴミールは、阻害するｍｉＲＮＡとの差が１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０ヌクレオチドである。更に、アンタゴミールは、阻害するｍｉＲＮＡと同じ長さ、それよりも長い又は短い長さを有していてもよい。特定の実施形態では、アンタゴミールは、阻害するｍｉＲＮＡの５’末端の６〜８ヌクレオチドとハイブリダイズする。他の実施形態では、アンタゴミールは、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１又は２２ヌクレオチド長であってもよい。特定の実施形態では、アンタゴミールは、ｍｉＲＢａｓｅに示される配列のいずれかに相補的なヌクレオチドを含む。アンタゴミールは、特定のｍｉＲＮＡに強く結合し、不活性化させる合成逆相補体である。ヌクレアーゼ耐性及び結合親和性を改善するために様々な化学修飾が用いられている。効力を高めるために最も一般的に用いられる修飾としては、２’−Ｏ−メチル（２’−Ｏ−Ｍｅ）、２’−Ｏ−メトキシエチル（２’−ＭＯＥ）、又は２’−フルオロ（２’−Ｆ）等の様々な２’糖修飾が挙げられる。また、ｍｉＲＮＡの核酸構造は、２’位酸素と４’位炭素とのメチレン架橋によってロック核酸（ＬＮＡ）へと修飾することで、核酸のＡ型コンホメーションにおける３’−エンド（ノース型）コンホメーションにリボースをロックすることもできる（Ｌｅｎｎｏｘ  ＫＡ  ｅｔ  ａｌ．．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｄｅｃ  ２０１１；１８（１２）：１１１１−１１２０；Ｂａｄｅｒ  ＡＧ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．Ｄｅｃ  ２０１１；１８（１２）：１１２１−１１２６）。この修飾によって、分子の標的特異性とハイブリダイゼーション特性とが顕著に高まる。他の修飾としては、５’−（Ｅ）−ビニルホスホネート保護（５’−ＶＰ）、骨格修飾（ホスホロチオエート（ＰＳ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴヌクレオチド（ＰＭＯ）、エチレン架橋核酸（ＥＮＡ）、５−メチルシトシン修飾、「ピリミジンカセット」の導入及び／又は「ＤＮＡギャップ」の導入が挙げられる。
【００２７】
本明細書中、「干渉ＲＮＡ」とは、ＲＮＡ干渉を媒介することで遺伝子発現を阻害又は下方制御することができる任意の二本鎖又は一本鎖ＲＮＡ配列を言う。干渉ＲＮＡとしては、特に限定されないが、小分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）及び小分子ヘアピン型ＲＮＡ（「ｓｈＲＮＡ」）が挙げられる。「ＲＮＡ干渉」とは、配列適合性のあるメッセンジャーＲＮＡ転写物の選択的分解を言う。
【００２８】
本明細書中、「小分子干渉ＲＮＡ」又は「ｓｉＲＮＡ」とは、配列特異的にＲＮＡ干渉を媒介することで遺伝子発現を阻害又は下方制御することができる任意の小分子ＲＮＡを言う。小分子ＲＮＡは、例えば約１６〜２１ヌクレオチド長であってよい。
【００２９】
本明細書中、「ｓｈＲＮＡ」（小分子ヘアピン型ＲＮＡ）とは、アンチセンス領域、ループ部分及びセンス領域を含むＲＮＡ分子を言い、上記センス領域は、上記アンチセンス領域と塩基対合して二重鎖ステムを形成する相補的ヌクレオチドを有する。転写後プロセシングの後、小分子ヘアピン型ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩファミリーの一員である酵素ダイサーに媒介される切断イベントによって小分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）へと変換される。
【００３０】
本明細書中、「アンチセンスオリゴヌクレオチド」とは、ＤＮＡ又はｍＲＮＡ配列（例えば、ｍｉＲＮＡ）に相補的な合成オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド模倣物を言う。
【００３１】
本明細書中、「ｍｉＲ−マスク」とは、標的ｍＲＮＡのｍｉＲＮＡ結合部位と相補的であり、ｍｉＲＮＡのｍＲＮＡ結合部位への結合を阻害するよう機能する一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドを言う。例えば、Ｘｉａｏ，ｅｔ  ａｌ．“Ｎｏｖｅｌ  ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ  ｖｉａ  ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ａｃｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｅｘａｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐａｃｅｍａｋｅｒ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｇｅｎｅｓ  ＨＣＮ２  ａｎｄ  ＨＣＮ４，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２１２，ｎｏ．２，ｐｐ．２８５−２９２，２００７を参照されたい。この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００３２】
本明細書中、「ｍｉＲＮＡスポンジ」とは、目的のｍｉＲＮＡに対する複数のタンデム結合部位を含み、目的の内因性ｍｉＲＮＡをタイトレーションアウトすることで、目的のｍｉＲＮＡのその内因性標的への結合を阻害するよう機能する合成核酸（例えば、ｍＲＮＡ転写物）を言う。例えば、Ｅｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，“ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｓｐｏｎｇｅｓ：ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，ｖｏｌ．４，ｎｏ．９，ｐｐ．７２１−７２６，２００７を参照されたい。この文献は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【００３３】
本明細書中、「呼吸鎖脱共役」とは、ミトコンドリア内膜のプロトン勾配の消失を言い、それによって酸化的リン酸化によるミトコンドリアでのＡＴＰの合成が妨げられる。
【００３４】
本明細書中、「ミトコンドリア脱共役剤」とは、ミトコンドリア内膜のプロトン勾配を消失させることができるタンパク質（又はコード核酸）を言い、それによって酸化的リン酸化によるミトコンドリアでのＡＴＰの合成が妨げられる。ミトコンドリア脱共役剤としては、例えばＵＣＰ１、ＵＣＰ２及びＵＣＰ３が挙げられる。
【００３５】
本明細書中、ミトコンドリア脱共役剤の「活性化因子」又は「抑制因子」とは、ミトコンドリア脱共役剤の活性をそれぞれ上方制御又は下方制御するよう機能するタンパク質を言う。
【００３６】
本明細書中、「熱産生制御因子」とは、熱産生を直接的又は間接的に制御する治療薬（オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド、ペプチド模倣物又は遺伝子編集システム）を言う。本用語は、ミトコンドリア脱共役剤に加え、ミトコンドリア脱共役剤の活性化因子及び抑制因子も包含する。
【００３７】
本明細書中、「調節する」とは、パラメーターを増加又は減少させることを言う。例えば、あるタンパク質の活性を調節するには、そのタンパク質の活性を増加又は減少させる。
【００３８】
本明細書中、ミトコンドリア脱共役剤又は熱産生制御因子の「活性」とは、ｍＲＮＡ発現、タンパク質発現又は呼吸鎖脱共役を含む測定可能な生物学的活性を言うが、これらに限定されない。
【００３９】
組成物又は治療薬の「有効量」は、障害の治療若しくは予防に効果的であるために又はヒトにおいて生理的状態を制御するために十分な量を言う。
【００４０】
本明細書中、「心血管代謝障害」としては、心血管疾患、脳卒中、糖尿病、脂質異常症、メタボリックシンドローム及び脂肪肝が挙げられる。
【００４１】
「対象」は、ヒト、飼育動物及び家畜、動物園の動物、スポーツ動物又は愛玩動物、例えば、マウス、ウサギ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウシ及び高等霊長類等を含む哺乳綱の任意の構成員を含む脊椎動物を言う。
【００４２】
「哺乳動物」とは、齧歯類、霊長類、イヌ、ネコ、ラクダ類及び有蹄動物を含む哺乳綱の構成員である任意の種を言う。「齧歯類」とは、マウス、ラット、ハムスター、スナネズミ及びウサギを含む齧歯目の構成員である任意の種を言う。「霊長類」とは、サル、類人猿及びヒトを含む霊長目の構成員である任意の種を言う。「ラクダ類」とは、ラクダ及びラマを含むラクダ科の構成員である任意の種を言う。「有蹄動物」とは、ウシ、ウマ及びラクダ類を含む有蹄上目の構成員である任意の種を言う。いくつかの実施形態によれば、哺乳動物はヒトである。
【００４３】
本明細書中、「治療」又は「治療する」とは、疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状、又は疾患若しくは障害に対する素因を治癒させる、治す、軽減する、緩和する、変化させる、改善する、回復させる、向上させる、又はそれらに作用することを目的として、その疾患若しくは障害、疾患若しくは障害の症状、又は疾患若しくは障害に対する素因を有する患者への治療薬（例えば、オリゴヌクレオチド、小分子、ペプチド、ペプチド模倣物、栄養補助食品又は遺伝子編集システム）の適用又は投与、あるいはそのような患者由来の単離組織若しくは細胞株への治療薬の適用又は投与と定義される。
【００４４】
本明細書中、「薬理ゲノミクス」とは、臨床開発中及び市販の薬剤に対する遺伝子配列決定、統計遺伝学及び遺伝子発現解析等のゲノミクス技術の適用を言う。より具体的には、本用語は、患者の遺伝子が薬剤に対するその患者の反応をどのように決定するかについての研究を言う（例えば、患者の「薬剤反応表現型」又は「薬剤反応遺伝子型」）。
【００４５】
ＩＩ．ＲＮＡ薬剤による遺伝子発現の制御
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）は、相補的なメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に結合した後、タンパク質発現を制御する非コード小分子ＲＮＡである［１２］。各ｍｉＲＮＡは、遺伝子経路の発現を調節するように進化的に選択される。ｍｉＲＮＡは、折りたたまれてヘアピンループ構造（プレｍｉＲＮＡ）となる長い一本鎖ＲＮＡ（プリｍｉＲＮＡ）として合成される。これらのヘアピン構造は、酵素であるドローシャ及びダイサーによってプロセシングされて成熟二本鎖ｍｉＲＮＡとなる。標的ｍＲＮＡ転写物に相補的なガイド鎖はアルゴノート（ＡＧＯ）タンパク質へロードされ、一方でパッセンジャー鎖は除去される［１３］。次に、ガイド鎖／ＡＧＯ複合体は、典型的にはｍＲＮＡの３’−非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）内に位置する標的に配列相補性によって結合する。
【００４６】
ｍｉＲＮＡ阻害剤（アンタゴミール）は、ワトソン−クリックの塩基対形成を介して相補的ｍｉＲＮＡに結合して、その標的ｍＲＮＡとの相互作用をブロックする改変された一本鎖オリゴヌクレオチドである。ｍｉＲＮＡ阻害剤の構造活性相関を改善するために、以下の化学修飾を行ってもよい。骨格中のホスフェートをホスホロチオエートに置き換えることで、ヌクレアーゼ分解が阻害され、血漿タンパク質結合が促進されるため、循環時間及び組織分布が拡張される。また、糖基の２’位炭素の修飾（２’−フルオロ、２’−Ｏ−メチル、２’−メトキシエチル）及びロック核酸（ＬＮＡ）コンフォメーションによって、ヌクレアーゼ分解が阻害され、標的ＲＮＡへの親和性が高まり、外来ＤＮＡ及びＲＮＡに対する免疫反応が鈍る［５］。ホスホロチオエート骨格修飾オリゴヌクレオチドは、生理食塩水を用い、更に製剤化せずに（いわゆる「ネイキッドｍｉＲＮＡ阻害剤」）皮下投与することができ、通常、同様な予測可能な薬物動態を有する。初期分布は速く、循環ｔ１／２は数時間であり、生物学的利用能は９０％を超える。肝臓、腎臓、脂肪組織、脾臓及び骨髄への送達はロバストで、心臓及び筋肉に見られる量ははるかに少ない。これらの化合物は血液脳関門を通過しない。
【００４７】
ｍｉＲＮＡ模倣物（アゴミール）は、ネイティブｍｉＲＮＡの化学修飾バージョンであり、ＲＩＳＣ複合体へロードすることで、「ガイド」鎖を介して標的ｍＲＮＡを結合及び制御することができ、その際、相補的な「パッセンジャー」鎖は分解される。化学修飾によって、ｍｉＲＮＡ模倣物のヌクレアーゼ分解が防止され、効力が向上するが、最適な化学修飾のパターンは、ｓｉＲＮＡや一本鎖ｍｉＲＮＡ阻害剤と異なっていてもよい。合成化学修飾一本鎖ｍｉＲＮＡ（ｓｓ−ｍｉＲＮＡ）は、図２に示すように、二本鎖ｍｉＲＮＡの機能を模倣することで標的遺伝子の発現を停止させることができる［１４、１５］。このような作用には、標的転写物へのアルゴノート２（ＡＧＯ２）タンパク質の動員が必要である。修飾ｓｓ−ｍｉＲＮＡ模倣物は、ＲＮＡｉ経路を介した機能力を一本鎖オリゴヌクレオチドのより好ましい薬理学的特性と組み合わせることができる。動物におけるｓｓ−ｍｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏ効果は、全身投与又は局所投与することで達成された［１４、１６、１７］。本発明者らは、一本鎖及び二本鎖ｍｉＲＮＡを脂肪細胞へ効果的に送達する標的化戦略を開発した。
【００４８】
ＩＩＩ．熱産生調節因子要素
特定の態様において、本明細書に開示の組成物は、熱産生を調節するための治療薬を含む。熱産生制御因子の例を本明細書の表１に示す。
【００４９】
【表１】
2021531252.tif 000002
【００５０】
実施形態の一例では、ｍｉＲＮＡ類似体等の熱産生調節因子は、少なくとも１つのミトコンドリア脱共役剤（例えば、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２及び／又はＵＣＰ３）の活性を調節する。このような方法及び組成物は肥満症の治療に特に有用である。米国特許第９，０３４，８３９号、及び２０１３年４月２２日に出願された国際出願シリアル番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０３７５７９を参照されたい。これらの文献はそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる。ミトコンドリア呼吸鎖複合体、並びにＵＣＰ１による複合体ＩＶ及びＶの脱共役の概略図については図１を参照されたい。
【００５１】
ミトコンドリア脱共役タンパク質（ＵＣＰ）は、ミトコンドリア陰イオン担体タンパク質（ＭＡＣＰ）ファミリーの構成員である。ＵＣＰは、ＡＴＰ合成から酸化的リン酸化を分離し、エネルギーを熱として消散させる（「ミトコンドリアプロトン漏出」とも言う）。ＵＣＰは、ミトコンドリア内膜から外膜への陰イオンの移動及びミトコンドリア外膜から内膜へのプロトンの戻り移動を促進し、その過程で熱が生じる。ＵＣＰは、熱産生及び熱消散に関与する主要なタンパク質である。脱共役タンパク質１（ＵＣＰ１）はサーモゲニンとも称され、熱産生及び熱消散に関与するＢＡＴ特異的タンパク質である。ＵＣＰ２は、脂肪細胞でも発現される別の脱共役タンパク質である。ＵＣＰ３は、主に骨格筋で発現する。ＵＣＰは、熱産生制御因子タンパク質のネットワークの一部である。
【００５２】
熱産生制御因子を調節してＢＡＴの分化及び／又はミトコンドリア脱共役を誘導することによって、対象において熱産生を誘導する方法、したがって肥満症を治療する方法が得られる。しかしながら、化学薬理学的アプローチはこれらの分子を標的化することができない。これらは、伝統的な創薬の「ドラッガブル空間」を支配する古典的な「標的クラス」（キナーゼ、イオンチャネル、Ｇタンパク質共役受容体等）に属さないからである。したがって、本明細書に開示される組成物及び方法は、ｍｉＲＮＡ薬剤を用いてこれらの熱産生制御因子を調節する。
【００５３】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ調節因子又は他の治療薬を採用して、ミトコンドリア脱共役剤の活性（例えば、ｍＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現レベル又はミトコンドリア脱共役活性）を上方制御する。ミトコンドリア脱共役剤の上方制御はいくつかの方法で達成することができる。１つの実施形態において、ｍｉＲＮＡ類似体は、ミトコンドリア脱共役剤の活性（例えば、ｍＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現レベル）の下方制御に関与する天然に存在するｍｉＲＮＡの活性を直接阻害する。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ薬剤は、ミトコンドリア脱共役剤のｍＲＮＡ又はプロモーター領域に直接結合する。例えば、ｍｉＲＮＡ薬剤は、少なくとも１つのミトコンドリア脱共役剤のｍＲＮＡの５’ＵＴＲ又はコード配列に直接結合できる。
【００５４】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ薬剤又は他の治療薬は、ミトコンドリア脱共役タンパク質の活性化因子又は抑制因子の活性を調節する。別の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体は、ミトコンドリア脱共役剤の活性化因子の活性（例えば、ｍＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現レベル）を上方制御する。この上方制御は、例えば、活性化因子の発現の下方制御に関与する天然に存在するｍｉＲＮＡの活性を直接阻害することによって達成することができる。他の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体は、ミトコンドリア脱共役剤の抑制因子の活性（例えば、ｍＲＮＡ発現レベル、タンパク質発現レベル）を下方制御する。この下方制御は、例えば、ｍｉＲＮＡ類似体を用いてミトコンドリア脱共役剤の抑制因子の発現を直接阻害することによって達成することができる。
【００５５】
特定の実施形態では、本明細書に開示される組成物及び方法は、熱産生制御因子（例えば、ＵＣＰ１等のミトコンドリア脱共役剤）を調節するためにｍｉＲＮＡ類似体又は他の治療薬を採用する。本明細書に開示される方法で使用するのに適したｍｉＲＮＡ類似体としては、特に限定されないが、ｍｉＲＮＡ、アゴミール、アンタゴミール、ｍｉＲ−マスク、ｍｉＲＮＡ−スポンジ、ｓｉＲＮＡ（一本鎖又は二本鎖）、ｓｈＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、又は標的核酸の少なくとも一部とハイブリダイズしてその機能を調節する他のオリゴヌクレオチド模倣物が挙げられる。
【００５６】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体は、ｍｉＲＮＡ分子又はその合成誘導体（例えば、アゴミール）である。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体はｍｉＲＮＡである。ｍｉＲＮＡは、哺乳動物を含む様々な生物に存在する小分子（例えば、１８〜２４ヌクレオチド）非コードＲＮＡ群であり、進化の過程で保存されている。ｍｉＲＮＡは、ＲＮＡｓｅ  ＩＩＩ酵素であるドローシャ及びダイサーによる連続的切断によって一次転写物に由来する約７０ヌクレオチドのヘアピン型前駆体からプロセシングされる。多くのｍｉＲＮＡは、遺伝子間領域にコードされ、プレｍＲＮＡのイントロン内又はｎｃＲＮＡ遺伝子内に含まれる。多くのｍｉＲＮＡはまた、ポリシストロンとしてクラスター化及び転写される傾向があり、多くの場合、類似した時空間的発現パターンを有する。一般的に、ｍｉＲＮＡは、標的遺伝子（ｍＲＮＡ又はＤＮＡ）の相補的配列に結合する転写後制御因子であり、その結果、翻訳抑制又は標的分解等によって遺伝子サイレンシングが起こる。１つのｍｉＲＮＡが多くの異なる遺伝子を同時に標的化できる。
【００５７】
本開示方法で用いられるｍｉＲＮＡ分子の例としては、特に限定されないが、ｈｓａ−ｍｉＲ−１−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１−２、ｍｉＲ−１９ａ−ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−１０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−１２８３、ｈｓａ−ｍｉｒ−１２９、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１３３ａ−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−１４３、ｈｓａ−ｍｉｒ−１４３−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１４７、ｈｓａ−ｍｉｒ−１４９、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９９ａ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２００ｃ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２０４、ｈｓａ−ｍｉｒ−２０５、ｈｓａ−ｍｉＲ−２０６、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１８−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１９−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１９−２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２４−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ａ−ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３１７７−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３２５、ｈｓａ−ｍｉｒ−３３１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３３１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６１３−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６２、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６２−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３６５８、ｈｓａ−ｍｉｒ−３６７、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７１、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７７、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７８、ｈｓａ−ｍｉｒ−３７８ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３８２、ｈｓａ−ｍｉｒ−３８３、ｈｓａ−ｍｉｒ−４２２ａ、ｈｓａ−ｍｉｒ−４２５、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４５５−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−４９１、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０８、ｈｓａ−ｍｉｒ−５０８−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５１２−１、ｈｓａ−ｍｉｒ−５１２−２、ｈｓａ−ｍｉＲ−５１５−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５１９ｅ、ｈｓａ−ｍｉＲ−５２０ａ、ｈｓａ−ｍｉｒ−５４３、ｈｓａ−ｍｉｒ−５４５、ｈｓａ−ｍｉｒ−５４９、ｈｓａ−ｍｉｒ−５５６、ｈｓａ−ｍｉＲ−５６８、ｈｓａ−ｍｉｒ−６２０、ｈｓａ−ｍｉｒ−６４３、ｈｓａ−ｍｉｒ−６５４−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉＲ−７ａ−ｇ、ｈｓａ−ｍｉｒ−７６５、ｈｓａ−ｍｉｒ−８７１、ｈｓａ−ｍｉｒ−８８８、ｈｓａ−ｍｉｒ−８８８−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９２ｂ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９３、ｈｓａ−ｍｉｒ−９６及びｈｓａ−ｍｉｒ−９９ａからなる群から選択されるものが挙げられる。
【００５８】
制御因子分子を調節する他のｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ標的を予測する公のインターネットツールを用いて同定できる。単一ｍｉＲＮＡを調節することによって、脂肪生成前駆細胞からの脂肪細胞の形成を促進できる。多くのシグナル伝達経路、機能又は過程に関与するユニバーサルなｍｉＲＮＡよりもむしろ、１つの分離したシグナル伝達経路内の複数の遺伝子を標的化する経路特異的ｍｉＲＮＡが好ましい。
【００５９】
別の特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体はアゴミールである。特定のｍｉＲＮＡのアゴミールは、本明細書に開示されているスクリーニング方法を用いて同定できる。ある特定の実施形態では、アゴミールは、ヒトｍｉＲ−２２の機能的模倣物である（Ｄａｖｉｄｓｏｎ  ＢＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．，１２（５）：３２９−３４０（２０１１））。
【００６０】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体は、１つ以上のｍｉＲＮＡの活性を阻害するオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド模倣物である。このような分子としては、特に限定されないが、例えば、アンタゴミール、干渉ＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム、ｍｉＲＮＡスポンジ及びｍｉＲ−マスクが挙げられる。ある特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体はアンタゴミールである。一般的に、アンタゴミールは、標的ｍｉＲＮＡに結合し、ｍｉＲＮＡのその同族遺伝子標的への結合を妨げることでｍｉＲＮＡ機能を阻害する化学修飾されたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンタゴミールは、当該技術分野で公知の任意の塩基修飾を含んでいてもよい。ある特定の実施形態では、アンタゴミールはヒトｍｉＲ−２２の活性を阻害する（ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ  Ｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．，１１０（３）：４９６−５０７（２０１２）；Ｓｎｅａｄ  ＮＭ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ．，２２（３）：１３９−１４６（２０１２）；Ｃｚｅｃｈ  ＭＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ．，７（８）：４７３−４８４（２０１１））。
【００６１】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体は８〜５０ヌクレオチド長である。当業者であれば、これを具体化すると、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９若しくは５０ヌクレオチド長の、又はそれらのうちの任意の範囲のアンチセンス部分を有するオリゴヌクレオチドとなることを理解するであろう。
【００６２】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体は、それぞれが少なくとも１つのヌクレオチドで構成されている２つ以上の化学的に別個の領域を含むキメラオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には、１つ以上の有益な特性（例えば、ヌクレアーゼ耐性の増加、細胞内取込の増加、標的への結合親和性の増加等）を付与する修飾ヌクレオチドの少なくとも１つの領域と、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッド又はＲＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを切断できる酵素の基質である領域とを含む。キメラ阻害性核酸は、上述したオリゴヌクレオチド、修飾オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオシド及び／又はオリゴヌクレオチド模倣物の２つ以上からなる複合構造として形成できる。このような化合物は、当該技術分野においてハイブリッド又はギャップマーとも呼ばれている。このようなハイブリッド構造の調製を教示する代表的な米国特許としては、特に限定されないが、米国特許第５，０１３，８３０号、第５，１４９，７９７号、第５，２２０，００７号、第５，２５６，７７５号、第５，３６６，８７８号、第５，４０３，７１１号、第５，４９１，１３３号、第５，５６５，３５０号、第５，６２３，０６５号、第５，６５２，３５５号、第５，６５２，３５６号及び第５，７００，９２２号が挙げられる。これらの文献は、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６３】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体は、糖の２’位で修飾された少なくとも１つのヌクレオチド、最も好ましくは２’−Ｏ−アルキル、２’−Ｏ−アルキル−Ｏ−アルキル又は２’−フルオロ修飾ヌクレオチドを含む。他の好ましい実施形態において、ＲＮＡ修飾としては、ピリミジンのリボース、塩基性残基又はＲＮＡの３’末端の逆位塩基への２’−フルオロ、２’−アミノ及び２’−Ｏ−メチル修飾が挙げられる。このような修飾は、通常通りにオリゴヌクレオチドに組み込まれ、これらオリゴヌクレオチドは、所与の標的に対して２’−デオキシオリゴヌクレオチドよりも高いＴｍ（すなわち、より高い標的結合親和性）を有することが示されている。
【００６４】
幾つかのヌクレオチド及びヌクレオシド修飾によって、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ消化に対する耐性が高くなり、それによりｉｎ  ｖｉｖｏ半減期が延びることが示されている。修飾オリゴヌクレオチドの具体例としては、例えば、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖アルキル若しくはシクロアルキル糖間結合又は短鎖ヘテロ原子若しくは複素環糖間結合を含む骨格を有するものが挙げられる。最も好ましいのは、ホスホロチオエート骨格を有するオリゴヌクレオチド、及びヘテロ原子骨格を有するオリゴヌクレオチドであり、特に、ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２、ＣＨ、〜Ｎ（ＣＨ３）〜Ｏ〜ＣＨ２（メチレン（メチルイミノ）又はＭＭＩ骨格として知られる）、ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２、ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２及びＯ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２骨格（天然のホスホジエステル骨格はＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨで表される）、アミド骨格（Ｄｅ  Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ａｃｅ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．１９９５，２８：３６６−３７４を参照されたい）、モルホリノ骨格構造（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｅｒの米国特許第５，０３４，５０６号を参照されたい）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）骨格（オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格がポリアミド骨格で置換され、ヌクレオチドがポリアミド骨格のアザ窒素原子に直接的又は間接的に結合している。Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１，２５４，１４９７を参照されたい）を有するものである。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。リン含有結合としては、特に限定されないが、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートを含むメチルホスホネート及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホラミデート及びアミノアルキルホスホラミデートを含むホスホラミデート、チオノホスホラミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、通常の３’−５’結合を有するボラノホスフェート、これらの２’−５’結合類似体、並びに逆の極性を有するもの（ヌクレオシド単位の隣接対が３’−５’から５’−３’に又は２’−５’から５’−２’に結合している）が挙げられ、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，４６９，８６３号、第４，４７６，３０１号、第５，０２３，２４３号、第５，１７７，１９６号、第５，１８８，８９７号、第５，２６４，４２３号、第５，２７６，０１９号、第５，２７８，３０２号、第５，２８６，７１７号、第５，３２１，１３１号、第５，３９９，６７６号、第５，４０５，９３９号、第５，４５３，４９６号、第５，４５５，２３３号、第５，４６６，６７７号、第５，４７６，９２５号、第５，５１９，１２６号、第５，５３６，８２１号、第５，５４１，３０６号、第５，５５０，１１１号、第５，５６３，２５３号、第５，５７１，７９９号、第５，５８７，３６１号及び第５，６２５，０５０号を参照されたい。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。モルホリノ系オリゴマー化合物は、Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０；Ｇｅｎｅｓｉｓ，ｖｏｌｕｍｅ  ３０，ｉｓｓｕｅ  ３，２００１；Ｈｅａｓｍａｎ，Ｊ．，Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．，２００２，２４３，２０９−２１４；Ｎａｓｅｖｉｃｉｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０００，２６，２１６−２２０；Ｌａｃｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０００，９７，９５９１−９５９６；及び１９９１年７月２３日に発行された米国特許第５，０３４，５０６号に記載されるように当該技術分野で公知である。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。シクロヘキセニル核酸オリゴヌクレオチド模倣物は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２に記載されており、その内容はその全体が本明細書に組み込まれる。
【００６５】
リン原子を含まない修飾オリゴヌクレオチド骨格は、短鎖アルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキル若しくはシクロアルキルヌクレオシド間結合、又は１つ以上の短鎖ヘテロ原子若しくは複素環ヌクレオシド間結合によって形成された骨格を有する。これらには、モルホリノ結合を有するもの（一部がヌクレオシドの糖部分から形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファメート骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホネート及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、並びに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２成分部分を有する他のものが含まれる。米国特許第５，０３４，５０６号、第５，１６６，３１５号、第５，１８５，４４４号、第５，２１４，１３４号、第５，２１６，１４１号、第５，２３５，０３３号、第５，２６４，５６２号、第５，２６４，５６４号、第５，４０５，９３８号、第５，４３４，２５７号、第５，４６６，６７７号、第５，４７０，９６７号、第５，４８９，６７７号、第５，５４１，３０７号、第５，５６１，２２５号、第５，５９６，０８６号、第５，６０２，２４０号、第５，６１０，２８９号、第５，６０２，２４０号、第５，６０８，０４６号、第５，６１０，２８９号、第５，６１８，７０４号、第５，６２３，０７０号、第５，６６３，３１２号、第５，６３３，３６０号、第５，６７７，４３７号及び第５，６７７，４３９号を参照されたい。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６６】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体は、１つ以上の置換された糖部分、例えば、２’位にＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ３、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ３、ＯＣＨ３、ＯＣＨ３Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２又はＯ（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ｎは１から約１０である）、Ｃｉ〜ＣＩＯの低級アルキル、アルコキシアルコキシ、置換低級アルキル、アルカリル又はアラルキル、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルキル、Ｏ−、Ｓ−又はＮ−アルケニル、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、又はオリゴヌクレオチドの薬物動態／薬力学特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基のうちの１つを含む。好ましい修飾としては、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）としても知られる）が挙げられる。他の好ましい修飾としては、２’−メトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ３）、２’−プロポキシ（２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３）及び２’−フルオロ（２’−Ｆ）が挙げられる。同様の修飾は、オリゴヌクレオチドの他の位置、特に３’末端ヌクレオチドの糖の３’位及び５’末端ヌクレオチドの５’位で行ってもよい。オリゴヌクレオチドはまた、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチル等の糖模倣物を有していてもよい。
【００６７】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ類似体は、１つ以上の塩基修飾及び／又は置換を含む。本明細書中、「未修飾」又は「天然」塩基としては、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾塩基としては、特に限定されないが、天然核酸にはまれに又は一時的にしか見られない塩基、例えば、ヒポキサンチン、６−メチルアデニン、５−Ｍｅピリミジン、特に５−メチルシトシン（５−メチル−２’−デオキシシトシンとも呼ばれ、当該技術分野ではしばしば５−Ｍｅ−Ｃと呼ばれる）、５−ヒドロキシメチルシトシン（ＨＭＣ）、グリコシルＨＭＣ及びジェントビオシルＨＭＣの他、合成塩基、例えば、２−アミノアデニン、２−（メチルアミノ）アデニン、２−（イミダゾリルアルキル）アデニン、２−（アミノアルキルアミノ）アデニン又は他のヘテロ置換アルキルアデニン、２−チオウラシル、２−チオチミン、５−ブロモウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、８−アザグアニン、７−デアザグアニン、Ｎ６（６−アミノヘキシル）アデニン及び２，６−ジアミノプリン（Ｋｏｒｎｂｅｒｇ，Ａ．，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９８０，ｐｐ７５−７７；Ｇｅｂｅｙｅｈｕ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９８７，１５：４５１３）が挙げられる。当該技術分野で公知の「ユニバーサル」塩基（例えばイノシン）も挙げられる。５−Ｍｅ−Ｃ置換も挙げられる。これらは、核酸二重鎖の安定性を０．６〜１．２ＯＣ増加させることが示されている（Ｓａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，ｉｎ  Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）。更に好適な修飾塩基は、米国特許第３，６８７，８０８号、第４，８４５，２０５号、第５，１３０，３０２号、第５，１３４，０６６号、第５，１７５，２７３号、第５，３６７，０６６号、第５，４３２，２７２号、第５，４５７，１８７号、第５，４５９，２５５号、第５，４８４，９０８号、第５，５０２，１７７号、第５，５２５，７１１号、第５，５５２，５４０号、第５，５８７，４６９号、第５，５９６，０９１号、第５，６１４，６１７号、第５，７５０，６９２号及び第５，６８１，９４１号に記載されており、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
【００６８】
所定のオリゴヌクレオチド中のすべての位置が一様に修飾される必要はなく、実際、前述の修飾のうちの２つ以上が単一のオリゴヌクレオチドに又はオリゴヌクレオチド内の単一のヌクレオシド中に組み込まれていてもよい。
【００６９】
特定の実施形態では、ヌクレオチド単位の糖及びヌクレオシド間結合の両方、すなわち骨格が新たな基で置換される。塩基単位は、適当な核酸標的化合物とハイブリダイゼーションを行えるように維持される。このようなオリゴマー化合物の１つ、すなわち、優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているオリゴヌクレオチド模倣物は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡ化合物において、オリゴヌクレオチドの糖骨格は、アミド含有骨格、例えばアミノエチルグリシン骨格で置換される。核酸塩基は保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接的又は間接的に結合している。ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、特に限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号及び第５，７１９，２６２号が挙げられ、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。更に、ＰＮＡ化合物の教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００で確認できる。
【００７０】
ＰＮＡ化合物の調製を教示する代表的な米国特許としては、特に限定されないが、米国特許第５，５３９，０８２号、第５，７１４，３３１号及び第５，７１９，２６２号が挙げられ、それぞれ参照により本明細書に組み込まれる。更に、ＰＮＡ化合物の教示は、Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７−１５００で確認できる。
【００７１】
特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ薬剤又は他の治療薬は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布又は細胞取込を高める１つ以上の部分又は複合物に結合（共有結合又は非共有結合）している。このような部分としては、特に限定されないが、脂質部分、例えば、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール等のチオエーテル（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９；Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、ドデカンジオール又はウンデシル残基等の脂肪族鎖（Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０；Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、ジヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロール又はトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート等のリン脂質（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４；Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミン又はポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｃｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、アダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、あるいはオクタデシルアミン又はヘキシルアミノ−カルボニル−ｔ−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）が挙げられ、それぞれの文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。更に、米国特許第４，８２８，９７９号、第４，９４８，８８２号、第５，２１８，１０５号、第５，５２５，４６５号、第５，５４１，３１３号、第５，５４５，７３０号、第５，５５２，５３８号、第５，５７８，７１７号、第５，５８０，７３１号、第５，５８０，７３１号、第５，５９１，５８４号、第５，１０９，１２４号、第５，１１８，８０２号、第５，１３８，０４５号、第５，４１４，０７７号、第５，４８６，６０３号、第５，５１２，４３９号、第５，５７８，７１８号、第５，６０８，０４６号、第４，５８７，０４４号、第４，６０５，７３５号、第４，６６７，０２５号、第４，７６２，７７９号、第４，７８９，７３７号、第４，８２４，９４１号、第４，８３５，２６３���、第４，８７６，３３５号、第４，９０４，５８２号、第４，９５８，０１３号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，０８２，８３０号、第５，１１２，９６３号、第５，２１４，１３６号、第５，２４５，０２２号、第５，２５４，４６９号、第５，２５８，５０６号、第５，２６２，５３６号、第５，２７２，２５０号、第５，２９２，８７３号、第５，３１７，０９８号、第５，３７１，２４１号、第５，３９１，７２３号、第５，４１６，２０３号、第５，４５１，４６３号、第５，５１０，４７５号、第５，５１２，６６７号、第５，５１４，７８５号、第５，５６５，５５２号、第５，５６７，８１０号、第５，５７４，１４２号、第５，５８５，４８１号、第５，５８７，３７１号、第５，５９５，７２６号、第５，５９７，６９６号、第５，５９９，９２３号、第５，５９９，９２８号及び第５，６８８，９４１号も参照されたい。これらの文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７２】
ｍｉＲＮＡ類似体は、所望の効果が得られるように、標的ｍＲＮＡと十分に相補的でなければならない、すなわち十分に良好にかつ十分な特異性でハイブリダイズしなければならない。「相補的」とは、天然又は非天然の塩基又はその類似体を含む２つの配列間で水素結合を介して対形成する能力を言う。例えば、ｍｉＲＮＡ類似体のある位置の塩基が、標的核酸配列の対応する位置の塩基と水素結合することができるならば、それらの塩基はその位置で互いに相補的であると見なされる。特定の実施形態では、１００％の相補性は必要ない。他の実施形態では、１００％の相補性が必要である。
【００７３】
本明細書に開示の方法において使用されるｍｉＲＮＡ類似体は、通常の方法を用いて設計することができる。他の標的セグメントは、当業者であれば本開示を考慮して容易に同定可能である。シード配列内にあるか又はそれに直接隣接する少なくとも５個の連続したヌクレオチドのひと続きを含む５、６、７、８、９、１０又はそれ以上のヌクレオチド長の標的セグメントが、遺伝子を標的化するのに適していると考えられる。幾つかの実施形態では、標的セグメントは、シード配列の１つの５’末端から少なくとも５個の連続したヌクレオチドを含む配列を有していてもよい（残りのヌクレオチドは、シード配列の５’末端のすぐ上流から始まり、ｍｉＲＮＡ薬剤が約５〜約３０ヌクレオチドを含むまで続く同ＲＮＡの連続したひと続きである）。幾つかの実施形態では、標的セグメントは、シード配列の１つの３’末端から少なくとも５個の連続したヌクレオチドを含むＲＮＡ配列で表される（残りのヌクレオチドは、標的セグメントの３’末端のすぐ下流から始まり、ｍｉＲＮＡ薬剤が約５〜約３０ヌクレオチドを含むまで続く同ｍｉＲＮＡの連続したひと続きである）。米国特許第９，０３４，８３９号に示されている配列を得た当業者は、過度の実験を行うことなく、ｍｉＲＮＡ類似体を用いた標的化にとって更に好ましい領域を同定することができるであろう。１つ以上の標的領域、セグメント又は部位が同定されれば、所望の効果が得られるように、標的と十分に相補的である、すなわち十分に良好にかつ十分な特異性でハイブリダイズする（すなわち、他の非標的核酸配列に実質的に結合しない）阻害核酸化合物が選択される。
【００７４】
特定の実施形態では、本明細書に開示の組成物及び方法で用いられるｍｉＲＮＡ薬剤は、組換えベクターから発現される。好適な組換えベクターとしては、特に限定されないが、ＤＮＡプラスミド、ウイルスベクター又はＤＮＡミニサークルが挙げられる。ベクター構築物の生成は、当該技術分野で周知の任意の好適な遺伝子工学技術を用いて達成することができる。特定の実施形態では、ｍｉＲＮＡ薬剤は化学合成技術を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏで合成される。
【００７５】
特定の実施形態では、熱産生調節因子要素は、経口投与によって脂肪細胞の熱産生及び褐変を増加させることが実証されている小分子の治療クラスに属する。これらとしては、ジニトロフェノール、β３アドレナリン受容体アゴニスト、甲状腺ホルモン模倣薬、ＰＰＡＲαアゴニスト及びＰＰＡＲγアゴニストが挙げられる。残念ながら、これらの全身投与によって、これらの治療用途での規制当局の承認を妨げる副作用が引き起こされる。これらの小分子の量をはるかに減らして脂肪組織へ標的化送達することによって、オフターゲット及び毒性効果を回避しつつ、所望の熱産生効果が得られることが理論づけられている。
【００７６】
特定の実施形態では、熱産生調節因子要素は、経口投与によって脂肪細胞の熱産生及び褐変を増加させることが実証されている栄養補助食品の治療クラスに属する。これらとしては、ポリフェノール（例えば、レスベラトロール）、クルクミン、カプシシノイド、ケルセチン、イソフラボン（例えば、ゲニステイン）及び緑茶抽出物（例えば、エピガロカテキンガレート又はＥＧＣＧ）が挙げられる。
【００７７】
本明細書に開示される組成物及び方法に従ってこれらの栄養補助食品の量をはるかに減らして脂肪組織へ標的化送達することによって、オフターゲット及び毒性効果を回避しつつ、所望の熱産生効果が得られることが期待される。
【００７８】
特定の実施形態では、熱産生調節因子要素は、脂肪細胞の熱産生及び褐変を増加させる可能性がある遺伝子編集システムの治療クラスに属する。これらとしては、ＵＣＰ１遺伝子のプロモーター領域に位置し、肥満症及び糖尿病のリスクに関連する一塩基多型（ＳＮＰ）の遺伝子編集、ＵＣＰ１遺伝子発現を調節する転写因子の遺伝子編集抑制又は活性化、及びＵＣＰ１遺伝子メチル化のエピジェネティック抑制が挙げられる。明らかな安全上の理由から、これらの遺伝子編集システムは、その効果を限定すべき脂肪細胞組織へ特異的に送達される必要がある。
【００７９】
ＩＶ．脂肪細胞に特異的な標的化
前述のように、本開示は、脂肪組織（例えば、白色脂肪組織（ＷＡＴ））への熱産生調節因子の標的化送達のための組成物及び方法を提供する。具体的には、本明細書に開示の組成物及び薬剤は、熱産生調節因子を脂肪組織へ選択的に送達する。ヒト皮下脂肪組織は、いくつかの細胞型を含み、それらのいずれもが本明細書に開示される組成物を用いて選択的に標的化できる。例えば、特定の実施形態では、標的細胞は脂肪細胞である。他の実施形態では、標的細胞は、前脂肪細胞又は脂肪組織間葉系幹細胞（ＡＴＭＳＣ）等の脂肪細胞前駆体であってよい。ＡＴＭＳＣは、脂肪細胞、骨細胞及び軟骨細胞等の複数の系統に分化する能力を有しており、かなりの量でヒト皮下脂肪組織に存在する。ヒトＡＴＭＳＣは、規定された一連の転写因子の調節を介して褐色脂肪細胞（ＢＡＴ）になるように再プログラムすることができる。
【００８０】
いくつかの実施形態では、組成物は、１つ以上のＡＴＭＳＣ陽性表面マーカーを含む脂肪標的細胞に結合する。ＡＴＭＳＣ陽性表面マーカーとしては、例えば、アクアポリン７（ＡＱＰ７）、ＣＤ９（テトラスパン）、ＣＤ１０（ＭＭＥ）、ＣＤ１３（ＡＮＰＥＰ）、ＣＤ２９（β−１インテグリン）、ＣＤ３６（ＦＡＴ／ＳＣＡＲＢ３）、ＣＤ４４（ヒアルロン酸塩）、ＣＤ４９ｄ（α−４インテグリン）、ＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）、ＣＤ５５（ＤＡＦ）、ＣＤ５９、ＣＤ７３（ＳＨ３）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ１）、ＣＤ９１（ＬＰＲ１）、ＣＤ１０５（ＳＨ２、エンドグリン）、ＣＤ１３７、ＣＤ１４６（Ｍｕｃ１８）、ＣＤ１６６（ＡＬＣＡＭ）及びＨＬＡ−ＡＢＣが挙げられる。
【００８１】
幾つかの実施形態では、組成物は、皮下又は白色脂肪組織（ＷＡＴ）に選択的に結合する。ＷＡＴに選択的に結合することで、組成物は、白色脂肪細胞の熱産生ブライト、褐色又はベージュ脂肪細胞（ＢＡＴ）への変換を促進する熱産生ｍｉＲＮＡ調節因子の標的化送達を促進することができる。ＷＡＴ陽性マーカーとしては、例えば、アディポネクチン、アクアポリン７（ＡＱＰ７）、カベオリン−１、カベオリン−２、ＣＤ３６（ＦＡＴ／ＳＣＡＲＢ３）、ＣＬＨ−２２（クラスリン重鎖ｃｈｒ．２２）、ＦＡＢＰ４（脂肪細胞タンパク質２、ａｐ２）、ＳＬＣ２７Ａ１（ＦＡＴＰ１）、ＳＬＣ２７Ａ２（ＦＡＴＰ２）、ＧＬＵＴ４（グルコーストランスポーター４）、ペリリピン１、ペリリピン２及びレジスチンが挙げられる。
【００８２】
幾つかの実施形態では、組成物は、脂肪細胞の表面で優先的に発現される細胞マーカー（いくつかの脂質輸送体を含む）を含む脂肪標的細胞に結合する。脂肪細胞マーカーとしては、例えば、アクアポリン７（ＡＱＰ７）、カベオリン−１（ＣＡＶ１）、カベオリン−２（ＣＡＶ２）、ＣＤ１０（ＭＭＥ）、ＣＤ３６（ＦＡＴ／ＳＣＡＲＢ３）、ＣＤ９０（Ｔｈｙ−１）、ＣＤ９１（低密度リポタンパク質受容体関連タンパク質１、ＬＲＰ１）、ＣＤ１４６（細胞表面糖タンパク質ＭＵＣ１８、ＭＣＡＭ）、ＣＤ１６６（活性化白血球細胞接着分子、ＡＬＣＡＭ）、ＣＬＨ−２２（クラスリン重鎖染色体２２）、ＤＰＴ（デルマトポンチン）、ＦＡＢＰ４（脂肪酸結合タンパク質４）、ＧＬＵＴ４（グルコーストランスポーター４、ＳＬＣ２Ａ４）、ＮＰＲ１（ナトリウム利尿ペプチド受容体Ａ）、ＳＬＣ２７Ａ１（ＦＡＴＰ１）及びＳＬＣ２７Ａ２（ＦＡＴＰ２）が挙げられる。脂肪組織の他の特定の（陽性）マーカーとしては、アディポネクチン、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ｂ、ＣＩＤＥＣ、ＦＧＦ１７、ＦＧＦ１９、レプチン、ＬＰＬ、ＭｅｔＡＰ２、ＮＲ１Ｈ３（ＬＸＲＡ）、ペリリピン１、ペリリピン２、ペリリピン３、ＰＰＡＲＧ、ＲＢＰ４及びレジスチンが挙げられる。
【００８３】
細胞表面タンパク質はある程度細胞内で循環し、多くの表面受容体及び輸送体が、リガンド結合に応答して活発に取り込まれる。例えば、脂肪酸輸送体（ＦＡＴ、別名ＣＤ３６又はＳＣＡＲＢ３）は、２つの膜貫通領域を有するヘアピン膜トポロジーを有する４７２個のアミノ酸（５３ｋＤａ）の単鎖からなる膜内在性糖タンパク質であり、ＮＨ２及びＣＯＯＨ末端は共に細胞質中に短いセグメントとして存在する［１８−２０］（図１０）［２０］。
【００８４】
ＦＡＴは、脂肪細胞膜と細胞内区画（エンドソーム）との間を循環する。したがって、脂肪細胞表面受容体／輸送体に結合する分子は、様々な熱産生調節因子を細胞に送達するのに利用できる。
【００８５】
幾つかの実施形態では、組成物は、上記特定したマーカーの１つ以上を選択的に結合する標的化要素を含んでもよく、それにより脂肪細胞への熱産生調節因子の選択的送達が向上して熱産生が高まる。細胞表面マーカーを知ることで、該マーカーをフローサイトメトリーセルソーティング（ＦＡＣＳ）で単離することができ、その後、標的化薬剤のスクリーニング及び選択を行うことができる。
【００８６】
熱産生調節因子はまた、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）製剤として送達することもできる。幾つかの実施形態では、オリゴヌクレオチドのＬＮＰ送達では、以下の３つの成分：脂質二重層を形成してその剛性を維持する構造脂質、負に帯電したオリゴヌクレオチドの粒子への取込を促進し、細胞内移行後のエンドソーム経路からの脱出を促進するカチオン性脂質、及び循環時間を増加させ、血漿タンパク質結合を最小限に抑える「シールド」（多くの場合、ポリエチレングリコール）からなるナノ粒子中へのオリゴヌクレオチドの封入が行われる［２１］。ＬＮＰ製剤化オリゴヌクレオチドは静脈内投与することができ、その場合、ほとんどの薬剤が肝臓に行き着く。その結果、この技術は主に生命を脅かす肝疾患（癌や肝炎）に適用されている。しかしながら、本発明者らは、ＬＮＰは、脂肪組織に直接注射することで熱産生制御因子を脂肪細胞に送達するのに用いることができることを発見した。
【実施例】
【００８７】
Ｖ．実施例
Ａ．実施例１：構造及び長さを改変した一本鎖ｍｉＲＮＡ（ｓｓ−ｍｉＲＮＡ）類似体
シード領域（２〜８塩基）の重要な役割と、ｓｓ−ｍｉＲＮＡが機能するために必要なＡｇｏ２タンパク質との相互作用とを考慮して、５’−（Ｅ）−ビニルホスホネート保護（５’−ＶＰ）、ホスホロチオエート（ＰＳ）骨格、２’Ｆ、２’−Ｏ−Ｍｅ及び２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾、５−メチルシトシン修飾、「ピリミジンカセット」の導入、並びに「ギャップマー」を作製するための「ＤＮＡギャップ」の導入という化学修飾を含む様々な長さのｓｓ−ｍｉＲＮＡ類似体を作製する。図４〜６に示すように、これらの分子を、単独で（「ネイキッド」）、又は脂質タグ（例えば、長さを増加させたコレステロール若しくは脂肪酸）若しくは短いペプチドタグ（例えば、ヘキサレリン）と組み合わせて、抗肥満薬の最終標的であるヒト皮下脂肪細胞の初代培養モデルで試験する。
【００８８】
Ｂ．実施例２：脂肪酸／ｍｉＲＮＡ複合体
成熟ヒト皮下脂肪細胞及びそのエクソソームについて広範な「オミック」プロファイリングを行った。本発明者らは、脂肪酸の脂肪細胞への取込に関与する内在性細胞膜輸送体である脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ、別名：スカベンジャー受容体Ｂ３又はＣＤ３６）の高レベルの発現を観察した［１９、２２〜２５］。ｓｓ−ｍｉＲＮＡ類似体をＦＡＴによって自然輸送される脂肪酸と組み合わせることで、このようなｓｓ−ｍｉＲＮＡ類似体の成熟脂肪細胞への標的化送達が促進されると予想される。このことは、脂肪酸に共有結合して脂肪細胞ＦＡＴの優先的な標的化及び脂肪細胞ＦＡＴによる輸送を促進する一連のｍｉＲＮＡ類似体を合成及び検証することによって示されるであろう。本明細書において、これらｍｉＲＮＡ類似体はＡｄｉｐｏｍｉＲ（Ａｄｉｐｏｃｙｔｅ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｍｉＲＮＡ（脂肪細胞標的化マイクロＲＮＡ））と称される。
【００８９】
ＡｄｉｐｏｍｉＲの合成
脂肪酸は、オリゴヌクレオチドを含む様々な薬剤の化学的浸透促進剤（ＣＰＥ）として使用されている［２６］［２７］。脂肪酸に結合した一本鎖ｍｉＲＮＡ類似体（ＡｄｉｐｏｍｉＲ）からなる複合体を合成する。様々な長さの脂肪酸をｍｉＲＮＡ類似体の３’位に結合させる。蛍光標識スクランブルｍｉＲＮＡ  ＡｄｉｐｏｍｉＲも合成する。以下の表２では、長さによって脂肪酸を分類する。
【００９０】
【表２】
2021531252.tif 000003
【００９１】
ＡｄｉｐｏｍｉＲのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリング
オープンソースモデル視覚化ＰｙＭＯＬプログラムを用いて、脂肪酸に結合した一本鎖ｍｉＲＮＡ類似体の３Ｄ画像を生成した。図５に、４種類のＡｄｉｐｏｍｉＲの３Ｄモデルを示す。
【００９２】
機能性ｍｉＲＮＡのＡｄｉｐｏｍｉＲ標的化送達のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検証
ＡｄｉｐｏｍｉＲがｓｓ−ｍｉＲＮＡ類似体を脂肪細胞へ標的化及び送達する能力を、ヒト皮下脂肪細胞の初代培養モデルで評価した。実験の最初の工程は、初代培養ヒト皮下脂肪細胞に発明者のｉｎ  ｖｉｔｒｏプロトコルを行って、脂肪酸がヒト成熟脂肪細胞へ効率的に輸送されることを確認することである。これを試験するために、パルミチン酸やヘキサデカン酸等の脂肪酸を緑色蛍光プローブで標識し、培養脂肪細胞とともにインキュベートした。蛍光顕微鏡による脂肪細胞の試験から、標識脂肪酸は初代培養ヒト脂肪細胞によって非常に効率的に輸送されたことが分かった。
【００９３】
次の工程でＡｄｉｐｏｍｉＲの脂肪細胞送達を確認するために、ヒト脂肪細胞を様々な濃度（２５〜１００ｎＭ）のＡｄｉｐｏｍｉＲでインキュベートする。１〜４８時間のいくつかの時点で、細胞を採取してｍｉＲＮＡ類似体及び標的遺伝子の共焦点顕微鏡観察、ハイコンテントイメージング及びｑＲＴ−ＰＣＲを行うことで、機能性熱産生ｍｉＲＮＡ類似体の脂肪細胞取込を検証する。ＡｄｉｐｏｍｉＲの結合及び細胞内移行がＦＡＴ依存性であることを検証するために、細胞をオレイン酸スルホ−Ｎ−スクシンイミジル（ＳＳＯ、公知のＦＡＴ阻害剤）で前処理する。これらのＡｄｉｐｏｍｉＲをヒト前脂肪細胞、マクロファージ及び肝細胞でも試験して、細胞取込の選択性を評価する。
【００９４】
ｉｎ  ｖｉｖｏでのＡｄｉｐｏｍｉＲの体内分布及び有効性
ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて機能性熱産生ｍｉＲＮＡ類似体の成熟ヒト脂肪細胞への輸送が高まったことが示されたＡｄｉｐｏｍｉＲを、更にｉｎ  ｖｉｖｏで試験する。ＩＡＣＵＣ承認の体内分布及び有効性プロトコルに基づき、ＵＴオースティン動物資源センター（ＵＴ  Ａｕｓｔｉｎ  Ａｎｉｍａｌ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ  Ｃｅｎｔｅｒ）で実施される研究において、食事性肥満（ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｅ：ＤＩＯ）Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊマウスを用いて、選択されたＡｄｉｐｏｍｉＲの組織内分布及び治療有効性を試験する。動物を１日２回モニターすることで毒性をモニターする。主要組織及び臓器へのＡｄｉｐｏｍｉＲの体内分布は、０日目、２日目及び４日目に鼠径部脂肪パッドにＡｄｉｐｏｍｉＲを皮下注射した後、７日目に回収してｍｉＲＮＡ類似体及び標的遺伝子の組織学的染色及びｑＲＴ−ＰＣＲを行うことによって評価する。「ネイキッド」ｍｉＲＮＡ類似体（１５ｍｇ／ｋｇ）をコントロールとして使用する。
【００９５】
ＷＡＴからＢＡＴへの熱産生褐変を誘導するＡｄｉｐｏｍｉＲの能力をＤＩＯマウスで測定する。８週間の研究の開始時において、ＤＩＯマウスは通常の固形飼料又は６０％の高脂肪食で飼育し、第１週目の０日目、２日目及び４日目に鼠径部脂肪パッドへＡｄｉｐｏｍｉＲを皮下注射して処理し、その後、残りの研究期間中は週に１回注射する。処理１週目及び８週目に、マウスをＮＭＲによる体組成分析にかける。脂質パラメーター及びインスリン感受性を評価する。処理後、動物は屠殺し、血液を採取して分析にかけ、主要組織及び臓器には組織学的及び遺伝子発現分析を行う。ＡｄｉｐｏｍｉＲを投与されているマウスは、体脂肪が減少し、インスリン感受性が低下し、脂質パラメーターが好ましいことが予想される。この活性を有することが予想されるＡｄｉｐｏｍｉＲとしては、例えば、中鎖脂肪酸、長鎖脂肪酸又は超長鎖脂肪酸に結合した一本鎖ｍｉＲ−２２アンタゴミール及びｍｉＲ−５１５アゴミールが挙げられる。
【００９６】
Ｃ．実施例３：ヘキサレリン／ｍｉＲＮＡ複合体
近年、化学的に安定で強力な成長ホルモン分泌促進物質であるヘキサレリン（Ｈｉｓ−Ｄ−２−Ｍｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２、分子式：Ｃ４７Ｈ５８Ｎ１２Ｏ６、分子量：８８７）が、ＦＡＴ／ＣＤ３６輸送体を介した脂肪代謝に対して有益な効果を示し［２８、２９］、それによって脂肪酸動員が起こり、ミトコンドリアの酸化的リン酸化及び熱産生が活性化することが示されている。ヘキサレリン処理によって、ＭＫＲインスリン抵抗性マウスにおいてグルコース及びインスリン不耐性が顕著に改善され、血漿及び肝臓トリグリセリドが減少した。更に、ヘキサレリンの心臓保護効果が十分に立証されている［３０］。
【００９７】
ｓｓ−ｍｉＲＮＡ類似体をＦＡＴによって自然輸送されるヘキサレリンと組み合わせることで、このようなｓｓ−ｍｉＲＮＡ類似体の成熟脂肪細胞への標的化送達が促進されると予想される。従って、ヘキサレリンに共有結合して脂肪細胞ＦＡＴの優先的な標的化を促進する一連のｍｉＲＮＡ類似体を合成し、評価する。本明細書において、これらのヘキサレリン結合ｍｉＲＮＡは、ＨｅｘａｍｉＲ（Ｈｅｘａｒｅｌｉｎ−ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ  ｍｉＲＮＡ）と称される。
【００９８】
ＨｅｘａｍｉＲのｉｎ  ｓｉｌｉｃｏモデリング
上記のように、オープンソース分子動力学シミュレーションプログラムを用いて、図６に示すようにヘキサレリンに結合した一本鎖ｍｉＲＮＡ類似体の３Ｄ画像を生成した。
【００９９】
機能性ｍｉＲＮＡのＨｅｘａｍｉＲ標的化送達のｉｎ  ｖｉｔｒｏ検証
ＨｅｘａｍｉＲがｓｓ−ｍｉＲＮＡ類似体を脂肪細胞へ標的化及び送達する能力を、ヒト皮下脂肪細胞の初代培養モデルで評価する。実験の最初の工程は、初代培養ヒト皮下脂肪細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏプロトコルを行って、ヘキサレリンがヒト成熟脂肪細胞へ効率的に輸送されることを確認することである。これを試験するために、緑色蛍光プローブで標識したヘキサレリンを培養脂肪細胞とともにインキュベートした。蛍光顕微鏡による培養脂肪細胞の試験から、ヘキサレリンは、図７に示すようにヒト脂肪細胞の細胞質へ非常に効率的に輸送されたことが分かった。
【０１００】
その後のＨｅｘａｍｉＲのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ検証工程は、上述したＡｄｉｐｏｍｉＲについての実験に従う。ＨｅｘａｍｉＲを投与されているマウスは、体脂肪が減少し、インスリン感受性が低下し、脂質パラメーターが好ましいことが予想される。この活性を有することが予想されるＨｅｘａｍｉＲとしては、例えば、Ｈｉｓ−Ｄ−２−Ｍｅ−Ｔｒｐ−Ａｌａ−Ｔｒｐ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ２に結合した一本鎖ｍｉＲ−２２アンタゴミール及びｍｉＲ−５１５アゴミールが挙げられる。
【０１０１】
Ｄ．実施例４：脂質ナノ粒子／ｍｉＲＮＡ複合体
脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）は、全身投与した場合にはｓｉＲＮＡの細胞取込及び効率的なエンドソーム脱出のために最適化されているが［３１〜３３］、脂肪組織への局所送達後の広範な評価が行われていない。
【０１０２】
ヒト脂肪細胞へのコントロールｍｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＬＮＰ送達
構造脂質、カチオン性脂質及びＰＥＧからなるＬＮＰを用いて実験を行った。ＬＮＰ１、ＬＮＰ２、ＬＮＰ３及びＬＮＰ４という４つの異なるＬＮＰ製剤を用いた。初代培養成熟ヒト脂肪細胞にネガティブコントロール（空のＬＮＰ）又は様々な量（５〜２５０ｎＭ）の二本鎖ｍｉＲ−１２４（脂肪細胞で発現しないｍｉＲＮＡ）をロードしたＬＮＰをトランスフェクトした。２日後、脂肪細胞へ導入されたｍｉＲ−１２４量及び標的ｍＲＮＡの下方制御をｑＲＴ−ＰＣＲで測定した。図８Ａに示すように、ｍｉＲ−１２４は、用量依存的に脂肪細胞で検出されたが（最大１２１倍のＲＱ）、２種類のコントロールｍｉＲＮＡ（ｌｅｔ−７（図８Ｂ）及びｍｉＲ−１４３（図示せず））の発現は変化しなかった。図８Ａはまた、ＬＮＰ１及びＬＮＰ２ではｍｉＲＮＡの最も効率的な送達が得られ、ＬＮＰ３では中程度の効率が得られ、ＬＮＰ４は比較的非効率的であったことを示す。ｍｉＲ−１２４の３種類の標的遺伝子（ＣＤ１６４（図示せず）、ＩＱＧＡＰ１（図８Ｃ）、ＶＡＭＰ３）の発現は用量依存的にノックダウンされたが、２種類のコントロール遺伝子（ＦＡＢＰ４（図示せず）及びレプチン（図８Ｄ））の発現は変化しなかった。
【０１０３】
マウス脂肪細胞への熱産生ｍｉＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏでのＬＮＰ送達
コントロールの二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物（ｍｉＲ−１２４）を培養ヒト脂肪細胞へ最も効率的に送達した２種類のＬＮＰ（ＬＮＰ１及びＬＮＰ２）をマウスで試験した。コントロールｍｉＲ−１２４又は熱産生二本鎖ヒトｍｉＲ−５１５−３ｐ模倣物（Ｄｈａｒｍａｃｏｎ）のいずれかを担持するこれら２種類のＬＮＰを皮下（ＳＣ）又は静脈内（ＩＶ）投与し、これらのＬＮＰの様々な臓器及び組織への体内分布を、高脂肪食で飼育した肥満Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雄性マウスで試験した。２日目の１回の皮下注射の後、又は０日目、１日目及び２日目の３回の静脈内注射の後、４日目に臓器及び組織を採取した。予想通り、ＬＮＰを静脈内注射した場合、ｍｉＲ−５１５模倣物が主に肝臓及び腎臓へ蓄積し、各種脂肪組織には全く又はほとんど取り込まれなかった。しかし、皮下注射を１回行った場合、ＬＮＰによって熱産生ｍｉＲＮＡ模倣物は左鼠径部脂肪パッド（皮下注射部位）へ送達された。十分なコピー数のｍｉＲ−５１５模倣物が鼠径部脂肪パッドへ送達された場合（１細胞あたりのｍｉＲＮＡのコピー数が１００以上）、ＵＣＰ１ｍＲＮＡ発現の顕著な用量依存的増加が観察された（図９：ＬＮＰ１を示し、フォーム２はＬＮＰ２を示す）。驚くことに、皮下注射を１回行った後、ナノ粒子のうちの１つ（ＬＮＰ２）はｍｉＲ−５１５模倣物を肺、腎臓及び四頭筋にも送達した。要約すると、この研究から、ＬＮＰに担持された二本鎖ｍｉＲＮＡ模倣物をマウス皮下脂肪組織へ細胞内送達することによって、このようなｍｉＲＮＡが組織内に少量存在すれば、ＵＣＰ１遺伝子発現が上方制御されるという概念が立証された。しかし、ペグ化されたＬＮＰは、その体内分布特性が理由となって、ヒトでのｍｉＲＮＡの送達に適さない場合がある。更に、カチオン性脂質は細胞膜に損傷をもたらす可能性がある。したがって、さらなるＬＮＰが開発された。
【０１０４】
ＳＤＣリポソーム製剤
スフィンゴミエリンは、ヒト脂肪細胞膜に最も多く存在するリン脂質（４０％）である。スフィンゴミエリンがコレステロールと結合すると、膜選別及び輸送、シグナル伝達並びに細胞極性化等の多くの細胞プロセスに関与する脂質ラフトが形成される［３４、３５］。スフィンゴミエリン／コレステロールリポソームは、ＤＳＰＣ／コレステロールリポソームよりも安定性が高く、より効率的に捕捉された薬剤を送達することができる［３６］。組成が異なる様々なリポソームが特徴づけられた。最高の性能を発揮するリポソーム候補は、スフィンゴミエリン（ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）及びコレステロール（ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ）を４０：４０：２０（重量％／重量％）の比率で含んでいた。これらの「ＳＤＣ」リポソームは十分に特徴づけられており、ピーク平均直径が１４０ｎｍ、多分散指数（ＰＤＩ）が＜０．０１、ゼータ電位が＋２．３２ｍＶであり、４℃で３か月間以上保存しても大きく変化しない。
【０１０５】
ＳＤＣリポソームと熱産生ｍｉＲＮＡとの複合体形成（ＬｉｐｏｍｉＲ）
精製ＳＤＣリポソームにｍｉＲ−５１５アゴミールを添加すると、そのサイズが約１４７ｎｍまでわずかに増加し、ＰＤＩが＜０．０３２となり、ゼータ電位が＋２．３２ｍＶから−５５．７ｍＶまで減少したことから、ｍｉＲＮＡ表面結合が示された。ハイコンテント蛍光イメージングによって、これらのＳＤＣリポソームｍｉＲＮＡ複合体（ＬｉｐｏｍｉＲ）は脂肪細胞への蛍光及び機能性ｍｉＲＮＡの効率的な送達を示した。
【０１０６】
ｍｉＲＮＡの取込が顕微鏡によって視覚的に確認されるとともに、ＵＣＰ１の用量依存的誘導がｑＲＴ−ＰＣＲ分析によって示された。ＵＣＰ１の上方制御は、ＤｈａｒｍａＦｅｃｔトランスフェクション試薬によって送達された遊離ｍｉＲＮＡのポジティブコントロールに類似していた。
【０１０７】
Ｅ．実施例５：ＳＤＣリポソームに固定された脂肪酸結合ｍｉＲＮＡ（ＡｄｉｐｏＬｉｐｏｍｉＲ）
脂肪酸結合ｍｉＲＮＡ（ＡｄｉｐｏｍｉＲ）によって、熱産生ｍｉＲＮＡ類似体をＳＤＣリポソーム膜に固定しやすくできる可能性がある。２つのアプローチを採用することができる。第一に、脂質膜の調製／水和中にＡｄｉｐｏｍｉＲを導入することができ、その結果、ＳＤＣリポソームへの内部及び外部固定が改善される。第二に、ＳＤＣリポソームをあらかじめ調製してから、脂肪酸結合ｍｉＲＮＡとともにインキュベートして親油性相互作用を介して表面膜に固定することができる。第一のアプローチでは、リポソームサイジング押出プロセス中に結合ｍｉＲＮＡを大幅に失うという問題があるが、ｍｉＲＮＡがリポソーム内腔内に高度に内部封入されるという利点があり、それによって全身輸送中の更なる保護及び送達能力が得られる。補完的なアプローチとして、コスト及び複雑さの削減手段として、脂質水和中に膜に固定させるために脂肪酸に結合したｍｉＲＮＡを最小限に改変して封入することを試みる。遊離又は脂肪酸結合ｍｉＲＮＡ類似体を、ＳＤＣリポソームの形成中又は形成後に加えてロード効率を比較する。ＬｉｐｏｍｉＲのサイズ及び電荷によってｍｉＲＮＡの外部ロード量を評価する一方、総ｍｉＲＮＡ保持レベルは、ＵＶ−ｖｉｓ分光法及びＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いたｍｉＲＮＡ抽出後のＲｉｂｏＧｒｅｅｎ蛍光定量によってアッセイできる。硫酸デキストランを用いたイオン競合によって、リポソーム表面へのｍｉＲＮＡの脂肪酸固定を評価する。ｍｉＲＮＡの安定性を評価するために、ｍｉＲＮＡをロードしたＳＤＣリポソームをヒト血清の存在下でインキュベートする。様々な時点で、ｍｉＲＮＡの分解をＨＰＬＣで評価する。ｍｉＲＮＡは、弱カチオン性ＤＭＰＣが存在するため、ＳＤＣリポソームと複合体を形成するが、脂肪酸の結合は、構築されたＬｉｐｏｍｉＲ内の長期安定性を改善する上で重要な要素となり得る。更に、ＤＭＰＣを完全に除去できる場合もあるため、それによってスケールアップ製造可能性及び安全性が更に簡素化される。加えて、調製中にこれらリポソーム内に可溶性蛍光マーカーを内部パッケージすることで、周縁対内腔染色パターンを有するツートーン蛍光ナノ粒子を示すことができる。
【０１０８】
Ｆ．実施例６：他の標的化製剤
脂肪酸を用いて成熟ヒト脂肪細胞へのｍｉＲＮＡ類似体の標的化送達を促進することに加えて、このようなｍｉＲＮＡは、受容体及び輸送体等の脂肪細胞膜タンパク質を標的化することによって脂肪細胞へ送達することもできる。本発明者らは、「オミクス」プロファイリングを通して、脂肪酸トランスロカーゼ（ＦＡＴ／ＣＤ３６／ＳＣＡＲＢ３、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：９４８）、アクアポリン７（ＡＱＰ７、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：３６４）、ペリリピン１（ＰＬＩＮ１、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５３４６）及びペリリピン２（ＰＬＩＮ２、ＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：１２３）というタンパク質が特異的に成熟脂肪細胞で大量に発現することを発見した。ＦＡＴは、例えば、ＶＨＨ単一ドメイン抗体（１５ｋＤａ）［３７］又は他の特異的抗体、トロンボスポンジン−１ペプチド（ＧＶＩＴＲＩＲ）［３８］又はヘキサレリンペプチド［２９］で標的化することができる。本発明者らが行った実験によって、抗ＦＡＴ抗体による脂肪細胞膜の抗体染色を示し、脂肪細胞膜レベルでの高密度のＦＡＴ発現を確認することに成功した。ＡＱＰ７、ＰＬＩＮ１及びＰＬＩＮ２は、特異的抗体で標的化することもできる。
【０１０９】
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５．Ｌｉ，Ｚ．ａｎｄ  Ｔ．Ｍ．Ｒａｎａ，Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡｓ：ｃｕｒｒｅｎｔ  ｓｔａｔｕｓ  ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ，２０１４．１３（８）：ｐ．６２２−３８
６．ｖａｎ  Ｒｏｏｉｊ，Ｅ．ａｎｄ  Ｓ．Ｋａｕｐｐｉｎｅｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ｉｓ  ｃｏｍｉｎｇ  ｏｆ  ａｇｅ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ，２０１４．６（７）：ｐ．８５１−６４
７．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，Ｚ．Ｗａｎｇ，ａｎｄ  Ｒ．Ａ．Ｇｅｍｅｉｎｈａｒｔ，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｉｎ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ，２０１３．１７２（３）：ｐ．９６２−７４
８．Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ａ．ａｎｄ  Ｊ．Ｌｉｅｂｅｒｍａｎ，Ｋｎｏｃｋｉｎｇ  ｄｏｗｎ  ｄｉｓｅａｓｅ：ａ  ｐｒｏｇｒｅｓｓ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｎ  ｓｉＲＮＡ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｇｅｎｅｔ，２０１５．１６（９）：ｐ．５４３−５２
９．Ａｌｅｘａｎｄｅｒ，Ｒ．，Ｈ．Ｌｏｄｉｓｈ，ａｎｄ  Ｌ．Ｓｕｎ，ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｆｏｒ  ｏｂｅｓｉｔｙ．Ｅｘｐｅｒｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｔａｒｇｅｔｓ，２０１１．１５：ｐ．６２３−３６
１０．Ｙｕ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡｓ  ｕｓｅ  ＲＮＡｉ  ｔｏ  ｐｏｔｅｎｔｌｙ  ａｎｄ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ  ｉｎｈｉｂｉｔ  ｍｕｔａｎｔ  ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ，２０１２．１５０（５）：ｐ．８９５−９０８
１１．Ｇｌａｔｚ，Ｊ．Ｆ．，Ｊ．Ｊ．Ｌｕｉｋｅｎ，ａｎｄ  Ａ．Ｂｏｎｅｎ，Ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ａｓ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｒｅｖ，２０１０．９０（１）：ｐ．３６７−４１７
１２．Ｉｎｕｉ，Ｍ．，Ｇ．Ｍａｒｔｅｌｌｏ，ａｎｄ  Ｓ．Ｐｉｃｃｏｌｏ，ＭｉｃｒｏＲＮＡ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２０１０．１１：ｐ．２５２−６３
１３．Ｈａ，Ｍ．ａｎｄ  Ｖ．Ｎ．Ｋｉｍ，Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２０１４．１５（８）：ｐ．５０９−２４
１４．Ｍａｔｓｕｉ，Ｍ．，Ｔ．Ｐ．Ｐｒａｋａｓｈ，ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ａｒｇｏｎａｕｔｅ  ２−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍｉＲＮＡ  Ｍｉｍｉｃｓ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ，２０１６．２４（５）：ｐ．９４６−５５
１５．Ｃｈｏｒｎ，Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ  ｍｉｍｉｃｓ．ＲＮＡ，２０１２．１８（１０）：ｐ．１７９６−８０４
１６．Ｌｉｍａ，Ｗ．Ｆ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｉＲＮＡｓ  ａｃｔｉｖａｔｅ  ＲＮＡｉ  ｉｎ  ａｎｉｍａｌｓ．Ｃｅｌｌ，２０１２．１５０（５）：ｐ．８８３−９４
１７．Ｈｕ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｌｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌｅｎｇｔｈ  ａｎｄ  ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ  ｏｎ  ａｌｌｅｌｅ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ＲＮＡｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｔｈｅｒ，２０１４．２４（３）：ｐ．１９９−２０９
１８．Ｇｌａｔｚ，Ｊ．Ｆ．ａｎｄ  Ｊ．Ｊ．Ｌｕｉｋｅｎ，Ｆｒｏｍ  ｆａｔ  ｔｏ  ＦＡＴ（ＣＤ３６／ＳＣＡＲＢ３）：Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｕｐｔａｋｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，２０１７．１３６：ｐ．２１−２６
１９．Ｚｈｏｕ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，ＣＤ３６  ｌｅｖｅｌ  ａｎｄ  ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ  ａｒｅ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  ｌｉｐｏｌｙｓｉｓ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．ＦＡＳＥＢ  Ｊ，２０１２．２６（１１）：ｐ．４７３３−４２
２０．Ｌｕｉｋｅｎ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ＣＤ３６（ＳＣＡＲＢ３）：Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｙｏｃｅｌｌｕｌａｒ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｕｐｔａｋｅ．Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ，２０１６．１８６２（１２）：ｐ．２２５３−２２５８
２１．Ｚａｔｓｅｐｉｎ，Ｔ．Ｓ．，Ｙ．Ｖ．Ｋｏｔｅｌｅｖｔｓｅｖ，ａｎｄ  Ｖ．Ｋｏｔｅｌｉａｎｓｋｙ，Ｌｉｐｉｄ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ−ｇｏｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ｂｅｎｃｈ  ｔｏ  ｂｅｄｓｉｄｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１６．１１：ｐ．３０７７−８６
２２．Ｆｅｂｂｒａｉｏ，Ｍ．，Ｄ．Ｐ．Ｈａｊｊａｒ，ａｎｄ  Ｒ．Ｌ．Ｓｉｌｖｅｒｓｔｅｉｎ，ＣＤ３６：ａ  ｃｌａｓｓ  Ｂ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ，ａｔｈｅｒｏｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ，２００１．１０８（６）：ｐ．７８５−９１
２３．Ｐｏｈｌ，Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，ＦＡＴ／ＣＤ３６−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｌｏｎｇ−ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｕｐｔａｋｅ  ｉｎ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒａｆｔｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ，２００５．１６（１）：ｐ．２４−３１
２４．Ｎｉｃｋｅｒｓｏｎ，Ｊ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｇｒｅａｔｅｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｉｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ  ＦＡＴ／ＣＤ３６  ａｎｄ  ＦＡＴＰ４  ｃｏｍｐａｒｅｄ  ｗｉｔｈ  ＦＡＢＰｐｍ  ａｎｄ  ＦＡＴＰ１  ａｎｄ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｅｓｔｅｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｏｘｉｄａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｒａｔ  ｓｋｅｌｅｔａｌ  ｍｕｓｃｌｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２００９．２８４（２４）：ｐ．１６５２２−３０
２５．Ｃｏｂｕｒｎ，Ｃ．Ｔ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ  ｕｐｔａｋｅ  ａｎｄ  ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｏｎｇ  ｃｈａｉｎ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｎｄ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅｓ  ｏｆ  ＣＤ３６  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｉｃｅ．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ，２０００．２７５（４２）：ｐ．３２５２３−９
２６．Ｈａｒｄｅｅ，Ｇ．Ｅ．，Ｏｒａｌ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ−ｂａｓｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ．Ｔｈｅｒ  Ｄｅｌｉｖ，２０１２．３（２）：ｐ．１４３−５
２７．Ｍａｈｅｒ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓａｆｅｔｙ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃａｐｒａｔｅ  ｉｎ  ｐｒｏｍｏｔｉｎｇ  ｏｒａｌ  ｄｒｕｇ  ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ：ｆｒｏｍ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｃｌｉｎｉｃ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ，２００９．６１（１５）：ｐ．１４２７−４９
２８．Ｍｏｓａ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｘａｒｅｌｉｎ，ａ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ  Ｓｅｃｒｅｔａｇｏｇｕｅ，Ｉｍｐｒｏｖｅｓ  Ｌｉｐｉｄ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ａｂｅｒｒａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  Ｎｏｎｏｂｅｓｅ  Ｉｎｓｕｌｉｎ−Ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  Ｍａｌｅ  ＭＫＲ  Ｍｉｃｅ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２０１７．１５８（１０）：ｐ．３１７４−３１８７
２９．Ｒｏｄｒｉｇｕｅ−Ｗａｙ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｈｏｒｍｏｎｅ−ｒｅｌｅａｓｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｓ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｂｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ａ  ｆａｔ  ｂｕｒｎｉｎｇ−ｌｉｋｅ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｓｃａｖｅｎｇｅｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＣＤ３６  ｉｎ  ｗｈｉｔｅ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅｓ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ，２００７．１４８（３）：ｐ．１００９−１８
３０．Ｍａｏ，Ｙ．，Ｔ．Ｔｏｋｕｄｏｍｅ，ａｎｄ  Ｉ．Ｋｉｓｈｉｍｏｔｏ，Ｔｈｅ  ｃａｒｄｉｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｅｘａｒｅｌｉｎ．Ｊ  Ｇｅｒｉａｔｒ  Ｃａｒｄｉｏｌ，２０１４．１１（３）：ｐ．２５３−８
３１．Ｙｕ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｓｉｇｈｔ  ｉｎｔｏ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｕｐｔａｋｅ  ｏｆ  Ｌｉｐｉｄ  Ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ａｎｄ  Ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡｓ．Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ，２０１４
３２．Ｄｏｎｇ，Ｙ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌｉｐｏｐｅｐｔｉｄｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｐｏｔｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎ  ｒｏｄｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｎｏｎｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，２０１４．１１１（１１）：ｐ．３９５５−６０
３３．Ｄａｈｌｍａｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｓｉＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｗｉｔｈ  ｌｏｗ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｗｅｉｇｈｔ．Ｎａｔ  Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１４
３４．Ｍｉｌｈａｓ，Ｄ．，Ｃ．Ｊ．Ｃｌａｒｋｅ，ａｎｄ  Ｙ．Ａ．Ｈａｎｎｕｎ，Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ：ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏａｃｔｉｖｅ  ｓｐｈｉｎｇｏｌｉｐｉｄｓ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ，２０１０．５８４（９）：ｐ．１８８７−９４
３５．Ｌａｊｏｉｅ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｔｔｉｃｅｓ，ｒａｆｔｓ，ａｎｄ  ｓｃａｆｆｏｌｄｓ：ｄｏｍａｉｎ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｔ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２００９．１８５（３）：ｐ．３８１−５
３６．Ｗｅｂｂ，Ｍ．Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｈｉｎｇｏｍｙｅｌｉｎ−ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ  ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｔｈｅ  ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ  ｏｆ  ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ  ｉｎ  ｍｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  ｈｕｍａｎ  ｔｕｍｏｕｒ  ｍｏｄｅｌｓ．Ｂｒ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ，１９９５．７２（４）：ｐ．８９６−９０４
３７．Ｂｅｒｒｅ，Ｓ．，ｅｔ  ａｌ．，ＣＤ３６−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｂｌｏｃｋ  ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｆｒｏｍ  ｉｎｆｅｃｔｅｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｍａｃｒｏｐｈａｇｅｓ  ａｎｄ  ｉｔｓ  ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｔｏ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ，２０１３．２１０（１２）：ｐ．２５２３−３８
３８．Ｋｏｎｇ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｎｄｉｎ−１  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ａｄｉｐｏｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｉｅｔ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｏｂｅｓｉｔｙ  ｅｎｈａｎｃｉｎｇ  ａｄｉｐｏｓｅ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｎｇ  ａｄｉｐｏｃｙｔｅ  ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ．Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ  Ｍｅｔａｂ，２０１３．３０５（３）：ｐ．Ｅ４３９−５０
【図１】
2021531252.tif 000004
【図２】
2021531252.tif 000005
【図３】
2021531252.tif 000006
【図４】
2021531252.tif 000007
【図５】
2021531252.tif 000008
【図６】
2021531252.tif 000009
【図７】
2021531252.tif 000010
【図８Ａ】
2021531252.tif 000011
【図８Ｂ】
2021531252.tif 000012
【図８Ｃ】
2021531252.tif 000013
【図８Ｄ】
2021531252.tif 000014
【図９】
2021531252.tif 000015
【図１０】
2021531252.tif 000016
【国際調査報告】
2021531252.tif 000017
2021531252.tif 000018