(57)【要約】  本開示は、変化した総アルカロイドレベルおよびニコチンレベルならびに商業的に許容される葉の等級を有するタバコ植物、その育種またはトランスジェニックアプローチを介した開発、ならびにそのタバコ植物からのタバコ製品の製造に関する、組成物および方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも１種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含むタバコ植物またはその一部であって、前記タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、前記１つ以上の変異体対立遺伝子を有しない対照タバコ植物からの葉のニコチンレベルより低いニコチンレベルを含む葉を産生することができる、前記タバコ植物またはその一部。
【請求項２】
前記タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも２種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む、請求項１に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項３】
前記タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも３種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む、請求項１に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項４】
前記タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも４種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む、請求項１に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項５】
前記タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される５種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む、請求項１に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項６】
前記タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、前記１つ以上の変異体対立遺伝子を有しない対照タバコ植物からの葉のニコチンレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．２５％より低いニコチンレベルを含む葉を産生することができる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項７】
前記タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、前記対照タバコ植物からの葉の総アルカロイドレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．２５％より低い総アルカロイドレベルを含む葉を産生することができる、請求項１〜６のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項８】
前記タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、前記対照タバコ植物からの葉の総アルカロイドレベルの４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％より低い総アルカロイドレベルを含む葉を産生することができる、請求項７に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項９】
前記１つ以上の変異体対立遺伝子が、プロモーター、５’ＵＴＲ、第１のエキソン、第１のイントロン、第２のエキソン、第２のイントロン、第３のエキソン、３’ＵＴＲ、ターミネーター、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される配列領域における変異を含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項１０】
前記１つ以上の変異体対立遺伝子が、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、スプライス部位変異、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の変異タイプを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項１１】
前記１つ以上の変異体対立遺伝子が、以下：
ＰＭＴタンパク質切断、非翻訳性ＰＭＴ遺伝子転写物、非機能性ＰＭＴタンパク質、ＰＭＴ遺伝子における未成熟終止コドン、およびこれらの任意の組み合わせ
のうちの１つ以上をもたらす、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項１２】
前記１つ以上の変異体対立遺伝子が、野生型ＰＭＴ遺伝子に対して、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群から選択される変異を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項１３】
前記１つ以上の変異体対立遺伝子が、ホモ接合性、ヘテロ接合性、およびヘテロ対立遺伝子性からなる群から選択される接合状態を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項１４】
前記１つ以上の変異体対立遺伝子が、少なくとも１〜５種のＰＭＴ遺伝子において、ホモ接合性またはヘテロ対立遺伝子性である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項１５】
前記１つ以上の変異体対立遺伝子が、少なくとも４種のＰＭＴ遺伝子において、ホモ接合性またはヘテロ対立遺伝子性である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項１６】
前記１つ以上の変異体対立遺伝子が、５種全てのＰＭＴ遺伝子において、ホモ接合性またはヘテロ対立遺伝子性である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項１７】
前記少なくとも２種のＰＭＴ遺伝子が、ＰＭＴ１ａおよびＰＭＴ３である、請求項１〜１６のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項１８】
前記タバコ植物は、乾燥重量で、０．１５％未満、０．１２５％未満、０．１％未満、０．０８％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、および０．０１％未満からなる群から選択されるニコチンレベルを含む葉を産生することができる、前記請求項のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項１９】
前記タバコ植物は、乾燥重量で、１％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、および０．２％未満からなる群から選択される総アルカロイドレベルを含む葉を産生することができる、前記請求項のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項２０】
前記タバコ植物は、２〜０．０５、１．９〜０．０５、１．８〜０．０５、１．７〜０．０５、１．６〜０．０５、１．５〜０．０５、１．４〜０．０５、１．３〜０．０５、１．２〜０．０５、１．１〜０．０５、１．０〜０．０５、０．９〜０．０５、０．８〜０．０５、０．７〜０．０５、０．６〜０．０５、０．５〜０．０５、０．４〜０．０５、０．３〜０．０５、０．２〜０．０５、０．１５〜０．０５、または０．１〜０．０５ｐｐｍの総ＴＳＮＡレベルを含む乾燥葉を産生することができる、前記請求項のいずれか一項に記載のタバコ植物またはその一部。
【請求項２１】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のタバコ植物の、集団。
【請求項２２】
請求項１〜２０のいずれか一項に記載のタバコ植物に由来する、乾燥タバコ材料。
【請求項２３】
熱風乾燥、空気乾燥、直火乾燥、および日干乾燥からなる群から選択される乾燥プロセスによって作製される、請求項２２に記載の乾燥タバコ材料。
【請求項２４】
タバコ葉を含み、
前記タバコ葉が、品種ＬＡバーレー２１由来の対照乾燥タバコ材料と比較して低減されたカビ感染を示す、
請求項２２に記載の乾燥タバコ材料。
【請求項２５】
請求項２２に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコブレンド。
【請求項２６】
前記乾燥タバコ材料が、前記タバコブレンド中、乾燥タバコの少なくとも約１０重量％、少なくとも１５重量％、少なくとも２０重量％、少なくとも２５重量％、少なくとも３０重量％、少なくとも３５重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも４５重量％、少なくとも５０重量％、少なくとも５５重量％、少なくとも６０重量％、少なくとも６５重量％、少なくとも７０重量％、少なくとも７５重量％、少なくとも８０重量％、少なくとも８５重量％、少なくとも９０重量％、または少なくとも９５重量％を構成する、請求項２５に記載のタバコブレンド。
【請求項２７】
前記乾燥タバコ材料が、前記タバコブレンド中、乾燥タバコの少なくとも約１０体積％、少なくとも１５体積％、少なくとも２０体積％、少なくとも２５体積％、少なくとも３０体積％、少なくとも３５体積％、少なくとも４０体積％、少なくとも４５体積％、少なくとも５０体積％、少なくとも５５体積％、少なくとも６０体積％、少なくとも６５体積％、少なくとも７０体積％、少なくとも７５体積％、少なくとも８０体積％、少なくとも８５体積％、少なくとも９０体積％、または少なくとも９５体積％を構成する、請求項２５に記載のタバコブレンド。
【請求項２８】
請求項２２に記載の乾燥タバコ材料を含む、タバコ製品。
【請求項２９】
シガレット、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット（ｎｏｎ−ｖｅｎｔｉｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ  ｃｉｇａｒｅｔｔｅ）、通気式リセスフィルターシガレット（ｖｅｎｔｅｄ  ｒｅｃｅｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ  ｃｉｇａｒｅｔｔｅ）、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ（ｐｉｐｅ  ｔｏｂａｃｃｏ）、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ（ｌｅａｆ  ｔｏｂａｃｃｏ）、細断タバコ（ｓｈｒｅｄｄｅｄ  ｔｏｂａｃｃｏ）、および刻みタバコ（ｃｕｔ  ｔｏｂａｃｃｏ）からなる群から選択される、請求項２８に記載のタバコ製品。
【請求項３０】
無煙タバコ製品である、請求項２８に記載のタバコ製品。
【請求項３１】
前記無煙タバコ製品は、ルーズリーフ噛みタバコ（ｌｏｏｓｅ  ｌｅａｆ  ｃｈｅｗｉｎｇ  ｔｏｂａｃｃｏ）、プラグ噛みタバコ（ｐｌｕｇ  ｃｈｅｗｉｎｇ  ｔｏｂａｃｃｏ）、湿性嗅ぎタバコ（ｍｏｉｓｔ  ｓｎｕｆｆ）、および鼻嗅ぎタバコ（ｎａｓａｌ  ｓｎｕｆｆ）からなる群から選択される、請求項３０に記載のタバコ製品。
【請求項３２】
請求項２２に記載の乾燥タバコ材料を含む、再構成タバコ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表の組み込み
本出願は、２０１８年７月２６日に出願された米国仮出願第６２／７０３，７７５号、および２０１９年５月１５日に出願された米国仮出願第６２／８４８，１５９号の利益を主張するものであり、これらの両方は、参照によりそれらの全体が本明細書に援用される。「Ｐ３４６２０ＷＯ００＿ＳＬ．ｔｘｔ」という名称のファイルに含まれる配列表は、２００，３３８バイトであり（ＭＳ−Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で測定）、２０１９年７月２５日に作成され、本明細書に添えて電子的に提出されるものであり、参照によりその全体が援用される。
【０００２】
分野
本開示は、アルカロイドレベルおよびニコチンレベルを調節するためのタバコの遺伝子操作を提供する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ニコチンは、主なアルカロイドであり、通常、市販のタバコ栽培品種において総アルカロイドの９０〜９５％超を占める。残りのアルカロイド画分は、主に、ノルニコチン、アナバシン、およびアナタビンの３つの追加のアルカロイドからなる。異なるニコチン生合成遺伝子および転写調節因子を調節することによって、ニコチンレベルが低減したタバコ植物が得られているが、結果は様々で一貫性がない。タバコの葉のニコチンレベルを低減するための新しい技術が必要である。
【発明の概要】
【０００４】
概要
本開示は、変化した総アルカロイドレベルおよびニコチンレベルならびに商業的に許容される葉の等級を有するタバコ植物、その育種またはトランスジェニックアプローチを介した開発、ならびにそのタバコ植物からのタバコ製品の製造を提供する。
【０００５】
一態様では、本開示は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも１種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む、タバコ植物またはその一部を提供し、タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、１つ以上の変異体対立遺伝子を有しない対照タバコ植物からの葉のニコチンレベルより低いニコチンレベルを含む葉を産生することができる。
【０００６】
別の態様では、タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも２種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む。
【０００７】
さらなる態様では、タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも３種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む。
【０００８】
別の態様では、タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも４種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む。
【０００９】
さらなる態様では、タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される５種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む。
【００１０】
一態様では、本開示は、表８Ａ〜表８Ｅに列挙されるように、単一ｐｍｔ変異体、二重ｐｍｔ変異体、三重変異体、四重変異体、および五重変異体からなる群から選択されるタバコ植物を提供する。
【００１１】
一態様では、本開示は、表４Ａ〜表４Ｅまたは表１０に列挙されるタバコ植物を提供する。別の態様では、本開示は、表４Ａ〜表４Ｅまたは表１０における自家受粉または別の植物との交雑のいずれかに由来する表４Ａ〜表４Ｅまたは表１０のタバコ植物の子孫植物を提供する。
【００１２】
別の態様では、本開示は、単一ｐｍｔ変異体、二重ｐｍｔ変異体、三重変異体、四重変異体、または五重変異体をもたらす、表５Ａ〜表５Ｅまたは表１２Ａ〜表１２Ｅに列挙されるｐｍｔ変異体対立遺伝子の様々な組み合わせを含むタバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、配列番号２１〜２００、４１０〜４４１、４７４〜５０５、５３８〜５６９、６０２〜６３３、および６６６〜６９７からなる群から選択されるｐｍｔ変異体対立遺伝子の配列を含むタバコ植物を提供する。
【００１３】
本開示はさらに、乾燥タバコ（ｃｕｒｅｄ  ｔｏｂａｃｃｏ）、タバコブレンド（ｔｏｂａｃｃｏ  ｂｌｅｎｄ）、開示されるタバコ植物、株、品種、またはハイブリッド由来の植物材料を含むタバコ製品を提供する。
【００１４】
配列の簡単な説明
配列番号１〜５は、ＴＮ９０参照ゲノムからのＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４の例示的なゲノム配列をそれぞれ記載する。
【００１５】
配列番号６〜１０は、ＴＮ９０からのＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４の例示的なｃＤＮＡ配列をそれぞれ記載する。
【００１６】
配列番号１１〜１５は、ＴＮ９０からのＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４の例示的なポリペプチド配列をそれぞれ記載する。
【００１７】
配列番号１６〜２２は、例示的なガイドＲＮＡ配列を示す。
【００１８】
配列番号２３〜２００、４１０〜４４１、４７４〜５０５、５３８〜５６９、６０２〜６３３、および６６６〜６９７は、例示的な編集されたｐｍｔ変異体配列を記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
【図１】ＴＮ９０根における５種のＰＭＴ遺伝子のＲＮＡ発現。
【図２】様々な低アルカロイド株：ＣＳ１５（ＮＬＭ（Ｐｈ  Ｐｈ）背景における五重ｐｍｔノックアウト変異株ＣＳ１５）、ＶＡ３５９背景におけるＰＭＴ  ＲＮＡｉトランスジェニック株）および低ニコチンＫＹ１７１（「ＬＮ  ＫＹ１７１」）品種（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２二重変異を有するＫＹ１７１背景）におけるニコチンレベル。それらのそれぞれの正常アルカロイド対照株：ＮＬＭ（Ｐｈ  Ｐｈ）、ＶＡ３５９、およびＫＹ１７１背景と比較したもの。
【図３】様々な低アルカロイド株：ＣＳ１５、ＰＭＴ  ＲＮＡｉ、およびＬＮ  ＫＹ１７１における総アルカロイドレベル。それらのそれぞれの正常アルカロイド対照株：ＮＬＭ（Ｐｈ  Ｐｈ）、ＶＡ３５９、およびＫＹ１７１背景と比較したもの。
【図４】様々な低アルカロイド株：ＣＳ１５、ＰＭＴ  ＲＮＡｉ、およびＬＮ  ＫＹ１７１における葉収量。それらのそれぞれの正常アルカロイド対照株：ＮＬＭ（Ｐｈ  Ｐｈ）、ＶＡ３５９、およびＫＹ１７１背景と比較したもの。
【図５】様々な低アルカロイド株：ＣＳ１５、ＰＭＴ  ＲＮＡｉ、およびＬＮ  ＫＹ１７１における葉の品質。それらのそれぞれの正常アルカロイド対照株：ＮＬＭ（Ｐｈ  Ｐｈ）、ＶＡ３５９、およびＫＹ１７１背景と比較したもの。
【図６Ａ】ＴＮ９０ＬＣ（図６Ａ）、ＬＡ  ＢＵ２１（図６Ｂ）、ＰＲ５０を下方制御するＲＮＡｉ構築物を含むＴＮ９０（図６Ｃ）、ＰＭＴ遺伝子を下方制御するＲＮＡｉ構築物を含むＴＮ９０（図６Ｄ）、および５種全てのＰＭＴ遺伝子への編集を含むＴＮ９０（図６Ｅ）を含む、乾燥タバコ上のカビ増殖を示す写真。
【図６Ｂ】図６Ａの説明を参照のこと。
【図６Ｃ】図６Ａの説明を参照のこと。
【図６Ｄ】図６Ａの説明を参照のこと。
【図６Ｅ】図６Ａの説明を参照のこと。
【図７】図６Ａ〜図６Ｅで調査された株において観察されたカビ感染の描写。
【発明を実施するための形態】
【００２０】
詳細な説明
特に定義しない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、当業者に一般的に理解される意味と同じ意味を有する。当業者は、本開示の実施に使用され得る多くの方法を認識するであろう。実際、本開示は、記載された方法および材料に決して限定されない。本開示の目的のために、次の用語を以下に定義する。
【００２１】
例えば、全ての特許および刊行物を含む、本明細書に引用される任意の参照文献は、それらの全体が参照により援用される。
【００２２】
本明細書で使用される場合、単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈から明らかでない限り、複数の参照を含む。例えば、「化合物」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、それらの混合物を含む複数の化合物を含み得る。
【００２３】
「約」という用語が数値範囲と併用される場合、それは、１０％で示される数値の上下の境界を延長することによってその範囲を修正する。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「未満」、「より多い」、「少なくとも」、「せいぜい」、「約（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」、「下回る」、「上回る」、および「約（ａｂｏｕｔ）」などの語句は、一連の数値と併用される場合、一連の中の各値を修正する。例えば、「１％、２％、または３％未満」の表現は、「１％未満、２％未満、または３％未満」に等しい。
【００２５】
本明細書で使用される場合、タバコ植物は、ニコチアナ・タバカム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ）種由来の植物を指す。
【００２６】
タバコにおけるニコチン生合成は、Ｓ−アデノシル−メチオニンを補因子として使用して、酵素プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）によって、ポリアミンであるプトレシンを、Ｎ−メチルプトレシンへとメチル化することで始まる。これは、前駆体代謝産物が、ニコチン生合成に関与するステップである。ＰＭＴ酵素は、酵素分類システムの下でＥＣ２．１．１．５３として分類される。ニコチアナ・タバカムでは、５種の遺伝子がプトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼをコードし、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４と称される。表１Ａに、ＴＮ９０植物におけるこれらの５種のＰＭＴ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、およびタンパク質配列を列挙する。本開示は、ＰＭＴ遺伝子を編集して、葉の品質を維持しながら、低減したニコチンレベルを有するｐｍｔ変異体植物を産生するために使用される組成物および方法を記載する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「ＰＭＴ１ｂ」または「ＰＭＴ１ｂ遺伝子」は、配列番号１１に記載されるＴＮ９０の例示的なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするタバコの遺伝子座を指す。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「ＰＭＴ１ａ」または「ＰＭＴ１ａ遺伝子」は、配列番号１２に記載されるＴＮ９０の例示的なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするタバコの遺伝子座を指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「ＰＭＴ２」または「ＰＭＴ２遺伝子」は、配列番号１３に記載されるＴＮ９０の例示的なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするタバコの遺伝子座を指す。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ＰＭＴ３」または「ＰＭＴ３遺伝子」は、配列番号１４に記載されるＴＮ９０の例示的なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするタバコの遺伝子座を指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「ＰＭＴ４」または「ＰＭＴ４遺伝子」は、配列番号１５に記載されるＴＮ９０の例示的なアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードするタバコの遺伝子座を指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合、変異は、遺伝子によってコードされる産物の発現または活性を低減、阻害、または排除するために遺伝子に導入される遺伝子改変を指す。かかる改変は、遺伝子の任意の配列領域、例えば、プロモーター、５’ＵＴＲ、エキソン、イントロン、３’ＵＴＲ、またはターミネーター領域にあり得る。一態様では、変異は、特定のタバコ品種または栽培品種に存在する自然多型ではない。本明細書で使用される場合、「変異体対立遺伝子」は、その対立遺伝子座が変異を含む遺伝子座由来の対立遺伝子を指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「ｐｍｔ変異体」は、１種以上のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異を含むタバコ植物を指す。ｐｍｔ変異体は、単一変異体、二重変異体、三重変異体、四重変異体、または五重変異体であり得る。本明細書で使用される場合、単一、二重、三重、四重、または五重ｐｍｔ変異体は、それぞれ１種、２種、３種、４種、または５種のＰＭＴ遺伝子に改変を有する変異体を指す。ｐｍｔ変異体はまた、１種以上のＰＭＴ遺伝子におけるホモ接合変異体、ヘテロ接合変異体、またはヘテロ対立遺伝子変異体の組み合わせであり得る。
【００３４】
本明細書で使用される場合、遺伝子名または遺伝子座名は、大文字で表記され、斜体で、例えば、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４で示される。タンパク質またはポリペプチド名は、斜体にせずに、大文字で、例えば、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４で表記される。変異体名（遺伝子もしくは遺伝子群における一般的な変異を参照するため、または特定の変異体対立遺伝子を参照するため）は、小文字および斜体で、例えば、ｐｍｔ、ｐｍｔ１ａ、ｐｍｔ１ｂ、ｐｍｔ２、ｐｍｔ３、およびｐｍｔ４で示される。
【００３５】
一態様では、本開示は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも１種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む、タバコ植物またはその一部を提供し、タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、１つ以上の変異体対立遺伝子を有しない対照タバコ植物からの葉のニコチンレベルより低いニコチンレベルを含む葉を産生することができる。一態様では、単一ｐｍｔ変異体タバコ植物が提供される。別の態様では、単一ｐｍｔ変異体タバコ植物は、類似の成長条件下で成長したときに、単一ｐｍｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または９５％未満のレベルでニコチンを含む。さらなる態様では、単一ｐｍｔ変異体タバコ植物は、類似の成長条件下で成長したときに、単一ｐｍｔ変異体を有しない対照植物のニコチンレベルの１％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜９５％のレベルでニコチンを含む。
【００３６】
別の態様では、タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも２種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む。一態様では、二重ｐｍｔ変異体タバコ植物が提供される。別の態様では、二重ｐｍｔ変異体タバコ植物は、類似の成長条件下で成長したときに、二重ｐｍｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または９５％未満のレベルでニコチンを含む。さらなる態様では、二重ｐｍｔ変異体タバコ植物は、類似の成長条件下で成長したときに、二重ｐｍｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜９５％のレベルでニコチンを含む。
【００３７】
さらなる態様では、タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも３種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む。一態様では、三重ｐｍｔ変異体タバコ植物が提供される。別の態様では、三重ｐｍｔ変異体タバコ植物は、類似の成長条件下で成長したときに、三重ｐｍｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または９５％未満のレベルでニコチンを含む。さらなる態様では、三重ｐｍｔ変異体タバコ植物は、類似の成長条件下で成長したときに、三重ｐｍｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜９５％のレベルでニコチンを含む。
【００３８】
別の態様では、タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される少なくとも４種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む。一態様では、四重ｐｍｔ変異体タバコ植物が提供される。別の態様では、四重ｐｍｔ変異体タバコ植物は、類似の成長条件下で成長したときに、四重ｐｍｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または９５％未満のレベルでニコチンを含む。さらなる態様では、四重ｐｍｔ変異体タバコ植物は、類似の成長条件下で成長したときに、四重ｐｍｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜９５％のレベルでニコチンを含む。
【００３９】
さらなる態様では、タバコ植物は、ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４からなる群から選択される５種のＰＭＴ遺伝子に１つ以上の変異体対立遺伝子を含む。一態様では、五重ｐｍｔ変異体タバコ植物が提供される。別の態様では、五重ｐｍｔ変異体タバコ植物は、類似の成長条件下で成長したときに、五重ｐｍｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、８０％未満、９０％未満、または９５％未満のレベルでニコチンを含む。さらなる態様では、五重ｐｍｔ変異体タバコ植物は、類似の成長条件下で成長したときに、五重ｐｍｔ変異を有しない対照植物のニコチンレベルの１％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜９５％のレベルでニコチンを含む。
【００４０】
一態様では、タバコ植物は、表８Ａ〜表８Ｅに列挙される単一ｐｍｔ変異体、二重ｐｍｔ変異体、三重変異体、四重変異体、または五重変異体である。別の態様では、タバコ植物は、表５Ａ〜表５Ｅおよび表１２Ａ〜表１２Ｅに列挙される１つ以上のｐｍｔ変異体対立遺伝子を含む。表５Ａ〜表５Ｅおよび表１２Ａ〜表１２Ｅに列挙されるｐｍｔ変異体対立遺伝子の各々および全ての組み合わせもまた、単一ｐｍｔ変異体、二重ｐｍｔ変異体、三重変異体、四重変異体、または五重変異体をもたらすように提供される。変異遺伝子座の各々は、ホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかであり得るか、またはヘテロ対立遺伝子性の組み合わせを含み得る。別の態様では、タバコ植物は、表４Ａ〜表４Ｅおよび表１０に列挙される各々の別個の株について示されるように、ｐｍｔ変異体遺伝子型の組み合わせを含む。一態様では、タバコ植物は、配列番号２１〜２００、４１０〜４４１、４７４〜５０５、５３８〜５６９、６０２〜６３３、および６６６〜６９７からなる群から選択されるｐｍｔ変異体対立遺伝子の配列を含む。別の態様では、本開示は、配列番号２１〜２００、４１０〜４４１、４７４〜５０５、５３８〜５６９、６０２〜６３３、および６６６〜６９７からなる群から選択されるｐｍｔ変異体対立遺伝子の配列を含む、二重ｐｍｔ変異体、三重変異体、四重変異体、または五重変異体を提供する。
【００４１】
一態様では、タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、対照タバコ植物からの葉のニコチンレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．２５％より低いニコチンレベルを含む葉を産生することができる。別の態様では、タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、対照タバコ植物のニコチンレベルの１％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜９５％のニコチンレベルを含む葉を産生することができる。
【００４２】
別の態様では、タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、対照タバコ植物からの葉の総アルカロイドレベルの９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、または０．２５％より低い総アルカロイドレベルを含む葉を産生することができる。別の態様では、タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、対照タバコ植物の総アルカロイドレベルの１％〜５％、５％〜１０％、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜９５％の総アルカロイドレベルを含む葉を産生することができる。
【００４３】
さらなる態様では、タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、対照タバコ植物からの葉の総アルカロイドレベルの４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％、または５％より低い総アルカロイドレベルを含む葉を産生することができる。
【００４４】
一態様では、変異体ｐｍｔ対立遺伝子は、プロモーター、５’ＵＴＲ、第１のエキソン、第１のイントロン、第２のエキソン、第２のイントロン、第３のエキソン、第３のイントロン、第４のエキソン、第４のイントロン、第５のエキソン、第５のイントロン、第６のエキソン、第６のイントロン、第７のエキソン、第７のイントロン、第８のエキソン、３’ＵＴＲ、ターミネーター、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるＰＭＴ配列領域に変異を含む。別の態様では、変異体ｐｍｔ対立遺伝子は、表１Ｄ〜表１Ｈに列挙されるＰＭＴゲノム配列領域に変異を含む。
【００４５】
別の態様では、変異体ｐｍｔ対立遺伝子は、ナンセンス変異、ミスセンス変異、フレームシフト変異、スプライス部位変異、およびこれらの任意の組み合わせからなる群から選択される１つ以上の変異タイプを含む。一態様では、変異体ｐｍｔ対立遺伝子は、ヌル対立遺伝子またはノックアウト対立遺伝子である。
【００４６】
一態様では、変異体ｐｍｔ対立遺伝子は、ＰＭＴタンパク質切断、翻訳不可能なＰＭＴ遺伝子転写物、非機能性ＰＭＴタンパク質、ＰＭＴ遺伝子における未成熟終止コドン、およびこれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上をもたらす。
【００４７】
別の態様では、変異体ｐｍｔ対立遺伝子は、野生型ＰＭＴ遺伝子に対して１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、挿入、重複、および逆位からなる群から選択される変異を含む。
【００４８】
一態様では、ｐｍｔ変異体は、ホモ接合性、ヘテロ接合性、およびヘテロ対立遺伝子性からなる群から選択される接合状態を含む。別の態様では、ｐｍｔ変異体は、少なくとも１、２、３、４、または５種のＰＭＴ遺伝子において、ホモ接合性またはヘテロ対立遺伝子性である。一態様では、ｐｍｔ変異体は、少なくとも４種のＰＭＴ遺伝子において、ホモ接合性またはヘテロ対立遺伝子性である。別の態様では、ｐｍｔ変異体は、５種全てのＰＭＴ遺伝子において、ホモ接合性またはヘテロ対立遺伝子性である。別の態様では、ｐｍｔ変異体は、ＰＭＴ１ａおよびＰＭＴ３に変異を含む。
【００４９】
一態様では、タバコ植物は、乾燥重量で、０．１５％未満、０．１２５％未満、０．１％未満、０．０８％未満、０．０６％未満、０．０５％未満、０．０４％未満、０．０３％未満、０．０２％未満、および０．０１％未満からなる群から選択されるニコチンレベルを含む葉を産生することができる。
【００５０】
別の態様では、タバコ植物は、乾燥重量で、１％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、および０．２％未満からなる群から選択される総アルカロイドレベルを含む葉を産生することができる。
【００５１】
さらなる態様では、タバコ植物は、２〜０．０５、１．９〜０．０５、１．８〜０．０５、１．７〜０．０５、１．６〜０．０５、１．５〜０．０５、１．４〜０．０５、１．３〜０．０５、１．２〜０．０５、１．１〜０．０５、１．０〜０．０５、０．９〜０．０５、０．８〜０．０５、０．７〜０．０５、０．６〜０．０５、０．５〜０．０５、０．４〜０．０５、０．３〜０．０５、０．２〜０．０５、０．１５〜０．０５、または０．１〜０．０５ｐｐｍの総ＴＳＮＡレベルを含む乾燥葉を産生することができる。
【００５２】
一態様では、タバコ植物は、乾燥すると、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、８０以上、８５以上、９０以上、および９５以上からなる群から選択されるＵＳＤＡ等級指標値を有する葉を産生することができる。別の態様では、タバコ植物は、乾燥すると、類似の条件下で成長および乾燥させたときに、対照植物のものと同等のＵＳＤＡ等級指標値を有する葉を産生することができ、対照植物は、改変を除いて、タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる態様では、タバコ植物は、乾燥すると、類似の条件下で成長させたときに、対照植物のＵＳＤＡ等級指標値の少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９８％のＵＳＤＡ等級指標値を有する葉を産生することができ、対照植物は、改変を除いてタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。さらなる態様では、タバコ植物は、乾燥すると、対照植物のＵＳＤＡ等級指標値の６５％〜１３０％、７０％〜１３０％、７５％〜１３０％、８０％〜１３０％、８５％〜１３０％、９０％〜１３０％、９５％〜１３０％、１００％〜１３０％、１０５％〜１３０％、１１０％〜１３０％、１１５％〜１３０％、または１２０％〜１３０％のＵＳＤＡ等級指標値を有する葉を産生することができる。さらなる態様では、タバコ植物は、乾燥すると、対照植物のＵＳＤＡ等級指標値の７０％〜１２５％、７５％〜１２０％、８０％〜１１５％、８５％〜１１０％、または９０％〜１００％のＵＳＤＡ等級指標値を有する葉を産生することができる。
【００５３】
一態様では、タバコ植物は、類似の成長条件で成長させたときに、対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満のレベルでニコチンを含み、対照植物は、改変を除き、タバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。
【００５４】
さらなる態様では、タバコ植物は、１つ以上のｐｍｔ変異体対立遺伝子を含み、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＢＢＬ、Ａ６２２、アスパラギン酸オキシダーゼ、アグマチンデイミナーゼ（ＡＩＣ）、アルギナーゼ、ジアミンオキシダーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ、アルギニンデカルボキシラーゼ、ニコチン取り込みパーミアーゼ（ＮＵＰ）、およびＭＡＴＥ輸送体からなる群から選択される産物をコードする１つ以上の遺伝子の発現または活性を直接抑制する導入遺伝子または変異をさらに含む。
【００５５】
一態様では、タバコ植物は、１つ以上のｐｍｔ変異体対立遺伝子を含み、Ｎｉｃ２遺伝子座のＥＲＦ遺伝子における変異をさらに含む。一態様では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、ＥＲＦ２２１、ＥＲＦ１０４、ＥＲＦ１７９、ＥＲＦ１７、およびＥＲＦ１６８からなる群から選択される２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ全ての遺伝子における１つ以上の変異をさらに含む。Ｓｈｏｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ，（１０）：３３９０−４０９（２０１０）；およびＫａｊｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，，Ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９−１０１１を参照されたい。一態様では、タバコ植物は、ＥＲＦ１８９、ＥＲＦ１１５、またはその両方において１つ以上の変異をさらに含む。
【００５６】
一態様では、タバコ植物は、１つ以上のｑｐｔ変異体対立遺伝子を含み、さらに、Ｎｉｃ１遺伝子座（またはＮｉｃ１ｂ遺伝子座、ＷＯ／２０１９／１４０２９７として公開されている、２０１９年１月１１日に出願されたＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０１３３４５にみられる）のＥＲＦ遺伝子における変異を含む。ＷＯ／２０１８／２３７１０７も参照されたい。一態様では、タバコ植物は、ＥＲＦ１０１、ＥＲＦ１１０、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ１３０、ＥＲＦ１６、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２からなる群から選択される２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上の遺伝子における１つ以上の変異をさらに含む。Ｋａｊｉｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，，Ｐｌａｎｔ  ｐｈｙｓｉｏｌ．２０１７，１７４：９９９−１０１１を参照されたい。一態様では、タバコ植物は、ＥＲＦｎｅｗ、ＥＲＦ１９９、ＥＲＦ１９、ＥＲＦ２９、ＥＲＦ２１０、およびＥＲＦ９１Ｌ２からなる群から選択される１つ以上、２つ以上、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ全ての遺伝子における１つ以上の変異をさらに含む。
【００５７】
一態様では、本開示は、３％未満、２．７５％未満、２．５％未満、２．２５％未満、２．０％未満、１．７５％未満、１．５％未満、１．２５％未満、１％未満、０．９％未満、０．８％未満、０．７％未満、０．６％未満、０．５％未満、０．４％未満、０．３％未満、０．２％未満、０．１％未満、０．０５％未満、０．０２５％未満、０．０１％未満、および０．００５％未満からなる群から選択されるニコチンレベルまたは総アルカロイドレベルを含むｐｍｔ変異体タバコ植物またはその一部をさらに提供し、タバコ植物は、乾燥すると、５０以上、５５以上、６０以上、６５以上、７０以上、７５以上、８０以上、８５以上、９０以上、および９５以上のＵＳＤＡ等級指標値を有する葉を産生することができる。別の態様では、かかるｐｍｔ変異体タバコ植物は、０．０２％未満のニコチンレベルを含み、乾燥すると、ＵＳＤＡ等級指標値が７０以上である葉を産生することができる。さらなる態様では、かかるタバコ植物は、０．０１％未満のニコチンレベルを含み、乾燥すると、ＵＳＤＡ等級指標値が７０以上の葉を産生することができる。
【００５８】
一態様では、本開示はまた、非トランスジェニック変異を含むタバコ植物またはその一部を提供し、非トランスジェニック変異は、タバコ植物のニコチンレベルまたは総アルカロイドレベルを、類似の成長条件下で成長させたときに、対照植物のニコチンレベルの１％未満、２％未満、５％未満、８％未満、１０％未満、１２％未満、１５％未満、２０％未満、２５％未満、３０％未満、４０％未満、５０％未満、６０％未満、７０％未満、または８０％未満に低減させ、タバコ植物は、乾燥すると、対照植物のＵＳＤＡ等級指標値と同等なＵＳＤＡ等級指標値を有する葉を産生することができ、対照植物は、非トランスジェニック変異を除くタバコ植物と本質的に同一の遺伝的背景を共有する。
【００５９】
一態様では、タバコ植物は、ランダム変異誘発および標的変異誘発からなる群から選択されるアプローチによって導入されるｐｍｔ変異を含む。別の態様では、ｐｍｔ変異は、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ、およびＣＲＩＳＰＲからなる群から選択される標的変異誘発アプローチによって導入される。
【００６０】
特に明記しない限り、タバコ植物、品種、栽培品種、または株について、本明細書で言及されるアルカロイドまたはニコチンレベル（または別の葉の化学的性質もしくは特性評価）または葉等級指標値の測定値は、例えば、単一の植物の複数の葉の平均、または単一の品種、栽培品種、もしくは株由来のタバコ植物の集団からの平均測定値を含む平均測定値を指す。
【００６１】
特に明記しない限り、タバコ植物のニコチンまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学的性質または特性評価）は、摘花（ｔｏｐｐｉｎｇ）後の葉数３、４、および５から収集されたプールされた葉試料において、摘花後に測定される。本明細書で使用される場合、２つの植物（例えば、変異体植物と対照植物）からの葉間の比較が言及されるときはいつも、同じまたは同等の着葉位置（複数可）および発生段階（複数可）からの葉が意図され、その比較から、他の因子からではなく、遺伝子型の違いによる効果を実証することができる。例示として、野生型対照植物の葉３は、ｐｍｔ変異体植物の葉３と比較するための参照点として意図される。一態様では、少なくとも１つのｐｍｔ変異を含むタバコ植物を、同じタバコ品種の対照タバコ植物と比較する。
【００６２】
タバコ植物のニコチンレベルまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学的性質または特性評価）も、代替的な方法で測定することができる。一態様では、タバコ植物のニコチンレベルまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学的性質または特性評価）は、最高レベルのニコチンまたはアルカロイド（または別の葉の化学的性質または特性評価）を有する葉で、摘花後に測定される。一態様では、タバコ植物のニコチンレベルまたはアルカロイドレベルは、葉数１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０で、摘花後に測定される。別の態様では、タバコ植物のニコチンレベルまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学的性質または特性評価）は、葉数１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、および３０からなる群から選択される連続した葉数の２つ以上のプールで、摘花後に測定される。別の態様では、タバコ植物のニコチンレベルまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学的性質または特性評価）は、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、および２６〜３０からなる群から選択される葉数の葉において、摘花後に測定される。別の態様では、タバコ植物のニコチンレベルまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学的性質または特性評価）は、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、および２６〜３０からなる群から選択される葉数の２つ以上の葉のプールにおいて、摘花後に測定される。別の態様では、タバコ植物のニコチンレベルまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学的性質または特性評価）は、１〜５、６〜１０、１１〜１５、１６〜２０、２１〜２５、および２６〜３０からなる群から選択される葉数を３つ以上の葉のプールにおいて、摘花後に測定される。
【００６３】
本明細書で使用される場合、葉の番号付けは、タバコの茎上の葉の位置に基づき、摘花後の葉数１が最も若い葉（上部）であり、最高の葉数が最も古い葉（下部）に割り振られる。
【００６４】
平均測定値（例えば、アルカロイドレベルもしくはニコチンレベルまたは葉の等級付け）を決定するためのタバコ植物の集団またはタバコの葉の収集物は、任意のサイズ、例えば、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、または５０であり得る。平均測定値または等級指標値を決定するために、業界で認められている標準プロトコルに従う。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「摘花」は、タバコ植物が植物の成熟に近く、生殖成長の開始頃に、茎頂分裂組織（ＳＡＭ）を含む茎頂、花、および最大でいくつかの隣接する葉を含む茎頂を除去することを指す。典型的には、タバコ植物はボタンステージ（ｂｕｔｔｏｎ  ｓｔａｇｅ）で摘花される（花が現れ始めた直後）。例えば、温室または畑で栽培されたタバコ植物は、植物の５０％が少なくとも１つの開花を有するときに摘花することができる。タバコ植物を摘花すると、頂芽優勢が失われ、増加したアルカロイド産生が誘導される。
【００６６】
別段の指示がない限り、タバコ植物のニコチンレベルまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学的性質または特性評価）は、摘花の２週間後に測定される。あるいは、他の時点を使用することができる。一態様では、タバコ植物のニコチンレベルまたはアルカロイドレベル（または別の葉の化学的性質または特性評価）は、摘花の約１、２、３、４、または５週間後に測定される。別の態様では、タバコ植物のニコチンレベル、アルカロイドレベル、またはポリアミンレベル（または別の葉の化学的性質もしくは特性評価）は、摘花の約３、５、７、１０、１２、１４、１７、１９、または２１日後に測定される。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「類似の成長条件」または「同等の成長条件」は、２つ以上の植物遺伝子型間で成長させ、有意義な比較を行うための類似の環境条件および／または農学的慣行を指し、その結果、環境条件も農学的慣行も、２つ以上の植物遺伝子型間で観察されたいかなる違いにも寄与しないか、またはそれを説明しない。環境条件としては、例えば、光、温度、水（湿度）、および栄養素（例えば、窒素およびリン）が挙げられる。農学的慣行としては、例えば、播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）、摘み取り（ｃｌｉｐｐｉｎｇ）、根切り（ｕｎｄｅｒｃｕｔｔｉｎｇ）、移植（ｔｒａｎｓｐｌａｎｔｉｎｇ）、摘花（ｔｏｐｐｉｎｇ）、および脇芽取り（ｓｕｃｋｅｒｉｎｇ）が挙げられる。Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ（１９９９），ｐｐ  ７０−１０３の４Ｂ章および４Ｃ章を参照されたい。
【００６８】
「アルカロイド」は、植物において天然に存在し、ヒトおよび動物において薬理学的効果を有する、複雑な窒素含有化合物である。「ニコチン」は、商品化されているシガレットタバコ中の主要な天然アルカロイドであり、ニコチアナ・タバカム中のアルカロイド含有量の約９０％を占める。タバコ中の他の主要なアルカロイドとしては、コチニン、ノルニコチン、ミオスミン、ニコチリン、アナバシン、およびアナタビンが挙げられる。微量のタバコアルカロイドとしては、ニコチン−ｎ−オキシド、Ｎ−メチルアナタビン、Ｎ−メチルアナバシン、シュードオキシニコチン、２，３ジピリジル、および他のものが挙げられる。
【００６９】
アルカロイドレベルは、例えば、ガス−液体クロマトグラフィー、高性能液体クロマトグラフィー、放射免疫アッセイ、および酵素結合免疫吸着アッセイに基づく定量によって、当該技術分野で既知の方法によってアッセイすることができる。例えば、ニコチン性アルカロイドレベルは、ＣＯＲＥＳＴＡ  Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄｅｄ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｎｏ．７，１９８７およびＩＳＯ規格（ＩＳＯ  ＴＣ  １２６Ｎ  ３９４  Ｅ．に基づいたＧＣ−ＦＩＤによって測定することができる。キャピラリーカラムおよびＦＩＤ検出器を装備したガス−液体クロマトグラフィーを使用する方法については、Ｈｉｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １００：８２６−３５（１９９２）を参照されたい。
【００７０】
特に断りのない限り、アルカロイドレベルおよびニコチンレベルは、ＣＯＲＥＳＴＡ法第６２号、ガスクロマトグラフィー分析によるタバコおよびタバコ製品中のニコチンの決定、２００５年２月、ならびに連邦登録第６４巻、第５５号、１９９９年３月２３日に公表された（および第７４巻、第４号、２００９年１月７日に修正された）、無煙タバコ製品中のニコチン、総水分およびｐＨの分析のための疾病管理予防センターのプロトコルに定義されているものに従う方法を使用して測定される。あるいは、タバコの総アルカロイドは、Ｓｋａｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）によって適応され、Ｃｏｌｌｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １３：７９−８１（１９６９）に記載されているタバコ試料の分析のために開発されたセグメントフロー比色法を使用して測定することができる。要するに、タバコの試料は、総アルカロイドおよび還元糖の分析の前に、乾燥させ、粉砕し、抽出することができる。次いで、本方法は、脱色のために酢酸／メタノール／水抽出および木炭を使用する。総アルカロイドの決定は、芳香族アミンの存在下での塩化シアンとニコチンアルカロイドとの反応に基づいて、４６０ｎｍで測定される呈色した複合体を形成する。特に明記しない限り、本明細書に示される総アルカロイドレベルまたはニコチンレベルは、乾燥重量基準である（例えば、総アルカロイドの割合またはニコチンの割合）。
【００７１】
一態様では、タバコ植物は、乾燥重量基準で、約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．７５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、５％、６％、７％、８％、および９％からなる群から選択される平均ニコチンレベルまたは総アルカロイドレベルを含む。別の態様では、タバコ植物は、乾燥重量基準で、約０．０１％〜０．０２％、０．０２％〜０．０５％、０．０５％〜０．７５％、０．７５％〜０．１％、０．１％〜０．１５％、０．１５％〜０．２％、０．２％〜０．３％、０．３％〜０．３５％、０．３５％〜０．４％、０．４％〜０．５％、０．５％〜０．６％、０．６％〜０．７％、０．７％〜０．８％、０．８％〜０．９％、０．９％〜１％、１％〜１．１％、１．１％〜１．２％、１．２％〜１．３％、１．３％〜１．４％、１．４％〜１．５％、１．５％〜１．６％、１．６％〜１．７％、１．７％〜１．８％、１．８％〜１．９％、１．９％〜２％、２％〜２．１％、２．１％〜２．２％、２．２％〜２．３％、２．３％〜２．４％、２．４％〜２．５％、２．５％〜２．６％、２．６％〜２．７％、２．７％〜２．８％、２．８％〜２．９％、２．９％〜３％、３％〜３．１％、３．１％〜３．２％、３．２％〜３．３％、３．３％〜３．４％、３．４％〜３．５％、および３．５％〜３．６％からなる群から選択される平均ニコチンレベルまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる態様では、タバコ植物は、乾燥重量基準で、約０．０１％〜０．１％、０．０２％〜０．２％、０．０３％〜０．３％、０．０４％〜０．４％、０．０５％〜０．５％、０．７５％〜１％、０．１％〜１．５％、０．１５％〜２％、０．２％〜３％、および０．３％〜３．５％からなる群から選択される平均ニコチンレベルまたは総アルカロイドレベルを含む。
【００７２】
本開示はまた、他のタバコの形質、例えば、葉の等級指標値に対して悪影響を及ぼさない変化したニコチンレベルを有するタバコ植物を提供する。一態様では、低ニコチンまたはニコチンフリーのタバコ品種は、商業的に許容される等級の乾燥タバコを提供する。タバコの等級は、葉の着葉位置、葉のサイズ、葉の色、葉の均一性および完全性、成熟度、質感、弾力性、光沢（葉の強度および着色深度ならびに輝きに関連）、吸湿性（タバコの葉が周囲の湿気を吸収および保持する能力）、ならびに緑色の色合いまたは色被りを含むがこれらに限定されない要因に基づいて評価される。葉の等級は、例えば、米国農務省の農業マーケティングサービスによって公表された公式標準等級を使用して決定することができる（７Ｕ．Ｓ．Ｃ．§５１１）。例えば、１９９０年１１月５日発効のバーレータバコ（Ｂｕｒｌｅｙ  Ｔｏｂａｃｃｏ）の公式標準等級（米国タイプ３１および外国タイプ９３）（５５Ｆ．Ｒ．４０６４５）、１９８９年３月２７日発効の熱風乾燥タバコ（Ｆｌｕｅ−Ｃｕｒｅｄ  Ｔｏｂａｃｃｏ）の公式標準等級（米国タイプ１１、１２、１３、１４および外国タイプ９２）（５４Ｆ．Ｒ．７９２５）、１９６５年１月８日発効のペンシルバニア州シードリーフタバコ（Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  Ｓｅｅｄｌｅａｆ  Ｔｏｂａｃｃｏ）の公式標準等級（米国タイプ４１）（２９Ｆ．Ｒ．１６８５４）、１９６３年１２月８日発効のオハイオ州シガーリーフタバコ（Ｏｈｉｏ  Ｃｉｇａｒ−Ｌｅａｆ  Ｔｏｂａｃｃｏ）の公式標準等級（米国タイプ４２、４３、および４４）（２８Ｆ．Ｒ．１１７１９および２８Ｆ．Ｒ．１１９２６）、１９６９年１１月２０日発効のウィスコンシン州シガーバインダータバコ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｃｉｇａｒ−Ｂｉｎｄｅｒ  Ｔｏｂａｃｃｏ）の公式標準等級（米国タイプ５４および５５）（３４Ｆ．Ｒ．１７０６１）、１９６９年１１月２０日発効のウィスコンシン州シガーバインダータバコ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｃｉｇａｒ−Ｂｉｎｄｅｒ  Ｔｏｂａｃｃｏ）の公式標準等級（米国タイプ５４および５５）（３４Ｆ．Ｒ．１７０６１）、１９７１年４月発効のジョージア州・フロリダ州日陰栽培シガーラッパータバコ（Ｇｅｏｒｇｉａ  ａｎｄ  Ｆｌｏｒｉｄａ  Ｓｈａｄｅ−Ｇｒｏｗｎ  Ｃｉｇａｒ−Ｗｒａｐｐｅｒ  Ｔｏｂａｃｃｏ）の公式標準等級（米国タイプ６２）を参照されたい。ＵＳＤＡ等級指標値は、業界で認められている等級指標に従って決定することができる。例えば、Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２：３９−４０（１９８８）、Ｌｅｇａｃｙ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  Ｌｉｂｒａｒｙ（Ｂａｔｅｓ  Ｄｏｃｕｍｅｎｔ  ＃５２３２６７８２６−５２３２６７８３３，Ｊｕｌｙ  １，１９８８，Ｍｅｍｏｒａｎｄｕｍ  ｏｎ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｐｏｓｅｄ  Ｂｕｒｌｅｙ  Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｇｒａｄｅ  Ｉｎｄｅｘ）、およびＭｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｉｎｔｅｒｎ．，１９２：５５−５７を参照されたい（前述の参照文献は全て、それらの全体が推論により援用される）。一態様では、ＵＳＤＡ等級指標は、連邦等級を受けた０〜１００の数値表現であり、全ての着葉位置の加重平均である。��級指標が高いほど、品質がより高い。あるいは、葉の等級は、ハイパースペクトルイメージングを介して決定することができる。例えば、ＷＯ２０１１／０２７３１５（２０１１年３月１０日に公開され、その全体が推論によって組み込まれる）を参照されたい。
【００７３】
一態様では、本明細書に提供されるタバコ植物は、類似の成長条件下で成長させたとき、対照タバコ植物と比較して、同様のレベルの１つ以上のタバコ芳香化合物を含む。別の態様では、本明細書に提供されるタバコ植物は、類似の成長条件下で成長させとき、対照タバコ植物と比較して、３−メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、ラブデノイド、センブレノイド、糖エステル、および還元糖からなる群から選択される、同様のレベルの１つ以上のタバコ芳香化合物を含む。
【００７４】
本明細書で使用される場合、タバコ芳香化合物は、タバコの煙の風味（ｆｌａｖｏｒ）および芳香に関連する化合物である。これらの化合物には、３−メチル吉草酸、吉草酸、イソ吉草酸、センブレノイドおよびラブデノイド、ジテルペン、ならびに糖エステルが含まれるが、これらに限定されない。タバコ芳香化合物の濃度は、限定されないが、ガスクロマトグラフィー質量分析法（ＧＣ−ＭＳ）、核磁気共鳴分光法、液体クロマトグラフィー−質量分析法を含む当技術分野における任意の既知の代謝物プロファイリング法によって測定することができる。Ｔｈｅ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｅｔａｂｏｌｏｍｉｃｓ，ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｗｅｃｋｗｅｒｔｈ  ａｎｄ  Ｋａｈｌ，（Ｗｉｌｅｙ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ）（Ｍａｙ  ２８，２０１３）を参照されたい。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「還元糖（複数可）」は、遊離または潜在的に遊離したアルデヒド基またはケトン基を有する任意の糖（単糖または多糖）である。グルコースおよびフルクトースは、煙のｐＨを低減し、「遊離」の非プロトン化ニコチンの量を効果的に低減することによって、シガレットの煙中のニコチン緩衝剤として作用する。糖を還元することは、例えば、ニコチンおよび他のタバコアルカロイドの感覚的影響を改変することによって、煙の風味をバランスよくする。糖含有量とアルカロイド含有量との間の逆の関係は、タバコ品種間、同じ品種内、および栽培条件に起因する同じ植物株内で報告されている。糖レベルの低減は、Ｓｋａｌａｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ  Ｃｏ（Ｗｅｓｔ  Ｃｈｅｓｔｅｒ，ＰＡ）によって適応され、Ｄａｖｉｓ，Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２０：１３９−１４４（１９７６）に記載されているタバコ試料の分析のために開発されたセグメントフロー比色法を使用して測定することができる。例えば、試料は、炭酸ナトリウム溶液に対して透析される。ネオクプロイン銅を試料に添加し、溶液を加熱する。ネオクプロイン銅キレートは、糖の存在下で還元され、４６０ｎｍで測定される呈色した複合体をもたらす。
【００７６】
一態様では、タバコ植物は、１つ以上のＰＭＴ遺伝子座に１つ以上の天然に存在しない変異体対立遺伝子を含み、１つ以上のＰＭＴ遺伝子座由来のＰＭＴ酵素活性を低減または排除する。一態様では、これらの変異体対立遺伝子は、より低いニコチンレベルをもたらす。変異体ｐｍｔ対立遺伝子は、ランダム変異誘発または標的変異誘発アプローチを含む当該技術分野で既知の任意の方法によって導入され得る。
【００７７】
かかる変異誘発法としては、限定されないが、メチル硫酸エチル（ｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆａｔｅ）（ＥＭＳ）（Ｈｉｌｄｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｖｅｒｋｅｒｋ，Ｉｎ，Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｍｕｔａｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ．Ｐｅｒｇａｍｏｎ  ｐｒｅｓｓ，ｐｐ  ３１７−３２０，１９６５）、またはＵＶ照射、Ｘ線、および高速中性子照射（例えば、Ｖｅｒｋｅｒｋ，Ｎｅｔｈ．Ｊ．Ａｇｒｉｃ．Ｓｃｉ．１９：１９７−２０３，１９７１、およびＰｏｅｈｌｍａｎ，Ｂｒｅｅｄｉｎｇ  Ｆｉｅｌｄ  Ｃｒｏｐｓ，Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  Ｒｅｉｎｈｏｌｄ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（３．ｓｕｐ．ｒｄ  ｅｄ），１９８７を参照されたい）、トランスポゾンタグ化（Ｆｅｄｏｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４、米国特許第４，７３２，８５６号および同第５，０１３，６５８号）、ならびにＴ−ＤＮＡ挿入法（Ｈｏｅｋｅｍａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３；Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｎｏ．５，１４９，６４５）による種子の処理が挙げられる。ＥＭＳ誘発変異誘発は、ゲノムの鎖長にわたって化学的に誘導されるランダムな点変異からなる。高速中性子変異誘発は、種子を中性子照射に曝露することからなり、二本鎖ＤＮＡ破壊を通して大きな欠失を引き起こす。トランスポゾンタグ化は、内因性遺伝子内にトランスポゾンを挿入して、遺伝子の発現を低減または排除することを含む。タバコ遺伝子に存在し得る変異の種類として、例えば、点変異、欠失、挿入、重複、および逆位が挙げられる。望ましくは、かかる変異は、タバコ遺伝子のコード領域に存在するが、プロモーター領域、およびイントロン、またはタバコ遺伝子の非翻訳領域における変異も望ましい場合がある。
【００７８】
加えて、変性ＨＰＬＣまたは選択されたＰＣＲ産物の選択的エンドヌクレアーゼ消化を使用した、化学的に誘発された変異、ＴＩＬＬＩＮＧ（ゲノムの標的誘導局所破壊）についてスクリーニングするための迅速かつ自動化可能な方法も、本開示に適用される。ＭｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：４５５−４５７を参照されたい。遺伝子発現に影響を及ぼす、または遺伝子の機能を妨げる変異は、当該技術分野で周知の方法を使用して決定することができる。遺伝子エキソンにおける挿入変異は、通常、ヌル変異体をもたらす。保存された残基中の変異は、タンパク質の機能を阻害する際に特に効果的であり得る。一態様では、タバコ植物は、本明細書に記載の１種以上のＰＭＴ遺伝子にナンセンス（例えば、終止コドン）変異を含む。
【００７９】
変異を同定するとき、内因性参照ＤＮＡ配列は、同じ品種のタバコ由来であるべきであることを理解されたい。例えば、変異を含む改変タバコ植物が品種ＴＮ９０由来である場合、内因性参照配列は、異なるタバコ品種（例えば、Ｋ３２６）由来の相同配列ではなく、内因性ＴＮ９０配列でなければならない。同様に、変異を含む改変タバコ細胞がＴＮ９０細胞である場合、内因性参照配列は、異なるタバコ品種（例えば、Ｋ３２６）由来のタバコ細胞からの相同配列ではなく、内因性ＴＮ９０配列でなければならない。
【００８０】
一態様では、本開示はまた、商業的に許容される葉の品質を維持しながら、変化したニコチンレベルを有するタバコ株を提供する。この株は、正確なゲノム操作技術、例えば、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ、およびクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１システム、およびこれらの組み合わせを介して１種以上のＰＭＴ遺伝子に変異を導入することによって産生され得る（例えば、米国特許出願公開第２０１７／０２３３７５６号を参照されたい）。例えば、Ｇａｊ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，３１（７）：３９７−４０５（２０１３）を参照されたい。
【００８１】
変異誘発タバコ植物のスクリーニングおよび選択は、当業者に既知の任意の方法を通して行うことができる。スクリーニングおよび選択方法の例としては、限定されないが、サザン分析、ポリヌクレオチドの検出のためのＰＣＲ増幅、ノーザンブロット、ＲＮａｓｅプロテクション、プライマー伸長、ＲＮＡ転写物を検出するためのＲＴ−ＰＣＲ増幅、サンガー配列決定、次世代配列決定技術（例えばＩｌｌｕｍｉｎａ、ＰａｃＢｉｏ、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ、４５４）、ポリペプチドおよびポリヌクレオチドの酵素活性またはリボザイム活性を検出するための酵素アッセイ、ならびにタンパク質ゲル電気泳動、ウェスタンブロット、免疫沈降、ならびにポリペプチドを検出するための酵素結合免疫アッセイが挙げられる。また、インサイチュハイブリダイゼーション、酵素染色、および免疫染色などの他の技術を使用して、ポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドの存在または発現を検出することもできる。引用された技術を行うための方法は、全て既知である。
【００８２】
一態様では、本明細書に提供されるタバコ植物または植物ゲノムは、メガヌクレアーゼ、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１ヌクレアーゼ、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１ヌクレアーゼからなる群から選択されるヌクレアーゼによって変異または編集される。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「編集」または「ゲノム編集」は、内因性植物ゲノム核酸配列の少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、もしくは少なくとも１０のヌクレオチドの標的変異誘発、または内因性植物ゲノム核酸配列の除去もしくは置換を指す。一態様では、提供される編集された核酸配列は、内因性核酸配列と、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。一態様では、提供される編集された核酸配列は、配列番号１〜１０、およびその断片からなる群から選択されるポリヌクレオチドと、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。別の態様では、提供される編集された核酸配列は、配列番号１１〜１５からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、少なくとも９９．９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９％、少なくとも９８％、少なくとも９７％、少なくとも９６％、少なくとも９５％、少なくとも９４％、少なくとも９３％、少なくとも９２％、少なくとも９１％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、または少なくとも７５％の配列同一性を有する。
【００８４】
メガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１は、ゲノム配列の標的部位で二本鎖ＤＮＡ切断を誘導し、次いで、それは相同組換え（ＨＲ）または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）の自然プロセスによって修復される。次いで、配列改変は切断部位で生じ、ＮＨＥＪの場合は遺伝子破壊をもたらす欠失もしくは挿入、またはＨＲによるドナー核酸配列の組み込みを含み得る。一態様では、提供される方法は、提供されるヌクレアーゼを用いて植物ゲノムを編集することを含み、ドナーポリヌクレオチドとのＨＲを介して、植物ゲノムで、少なくとも１個、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、少なくとも１０個、または１０個超のヌクレオチドを変異させる。一態様では、提供される変異は、ヌクレアーゼを使用したゲノム編集によって引き起こされる。別の態様では、提供される変異は、非相同末端結合または相同組換えによって引き起こされる。
【００８５】
微生物において一般的に同定されるメガヌクレアーゼは、標的ＤＮＡの部位特異的消化をもたらす高活性および長い認識配列（＞１４ｂｐ）を有する固有の酵素である。天然に存在するメガヌクレアーゼの操作バージョンは、典型的には、延長したＤＮＡ認識配列（例えば、１４〜４０ｂｐ）を有する。メガヌクレアーゼの操作は、メガヌクレアーゼのＤＮＡ認識および切断機能が単一ドメイン内で絡み合うため、ＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの操作よりも困難であり得る。特有の配列を認識し、改善されたヌクレアーゼ活性を有する新規のメガヌクレアーゼバリアントを作成するために、変異誘発およびハイスループットスクリーニングの特殊な方法が使用されている。
【００８６】
ＺＦＮは、ＦｏｋＩ制限エンドヌクレアーゼの切断ドメインに融合した操作された亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインからなる合成タンパク質である。ＺＦＮは、亜鉛フィンガーＤＮＡ結合ドメインの改変のために、ほぼあらゆる長さの二本鎖ＤＮＡを切断するように設計され得る。ＺＦＮは、標的ＤＮＡ配列に結合するように操作された亜鉛フィンガーアレイに融合されたＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの非特異的ＤＮＡ切断ドメインからなる単量体から、二量体を形成する。
【００８７】
ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には、３〜４つの亜鉛フィンガーアレイからなる。標的ＤＮＡへの部位特異的結合に寄与する亜鉛フィンガー∞−ヘリックスの開始部に対して−１、＋２、＋３、および＋６位のアミノ酸は、特異的な標的配列に適合するように変更およびカスタマイズすることができる。他のアミノ酸は、異なる配列特異性を有するＺＦＮを生成するためにコンセンサス骨格を形成する。ＺＦＮの標的配列を選択するための規則は、当該技術分野で既知である。
【００８８】
ＦｏｋＩヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡを切断するために二量体化を必要とし、したがって、切断部位の反対側のＤＮＡ鎖（５〜７ｂｐで分離）に結合するために、それらのＣ末端領域を有する２つのＺＦＮが必要である。ＺＦＮ単量体は、２つのＺＦ結合部位が回文構造である場合、標的部位を切断することができる。本明細書で使用される場合、ＺＦＮという用語は、広義であり、別のＺＦＮの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体ＺＦＮを含む。ＺＦＮという用語はまた、同じ部位でＤＮＡを切断するように共に機能するように操作された一対のＺＦＮの１つまたは両方のメンバーを指すように使用される。
【００８９】
いかなる科学理論にも制限されることなく、亜鉛フィンガードメインのＤＮＡ結合特異性は、原則として様々な方法のうちの１つを使用して再操作され得るため、カスタマイズされたＺＦＮは、理論的に、ほぼ任意の遺伝子配列を標的とするように構築され得る。亜鉛フィンガードメインを操作するための一般に利用可能な方法としては、文脈依存性アセンブリ（Ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ、ＣｏＤＡ）、オリゴマー化プールエンジニアリング（Ｏｌｉｇｏｍｅｒｉｚｅｄ  Ｐｏｏｌ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ、ＯＰＥＮ）、およびモジュラーアセンブリ（Ｍｏｄｕｌａｒ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ）が挙げられる。
【００９０】
ＴＡＬＥＮは、転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ結合ドメインをＦｏｋＩヌクレアーゼドメインに融合することによって生成される人工制限酵素である。ＴＡＬＥＮ対の各メンバーが標的部位に隣接するＤＮＡ部位に結合すると、ＦｏｋＩ単量体は、二量体化し、標的部位で二本鎖ＤＮＡ切断を引き起こす。本明細書で使用される場合、ＴＡＬＥＮという用語は、広義であり、別のＴＡＬＥＮの補助なしで二本鎖ＤＮＡを切断することができる単量体ＴＡＬＥＮを含む。ＴＡＬＥＮという用語はまた、同じ部位でＤＮＡを切断するために共に機能する一対のＴＡＬＥＮのうちの１つまたは両方のメンバーを指すために使用される。
【００９１】
転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）は、実質的に任意のＤＮＡ配列に結合するように操作することができる。ＴＡＬＥタンパク質は、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の様々な植物細菌病原体に由来するＤＮＡ結合ドメインである。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ病原体は、感染中に宿主植物細胞にＴＡＬＥを分泌する。ＴＡＬＥは、核に移動し、宿主ゲノムの特定の遺伝子のプロモーター領域における特定のＤＮＡ配列のプロモーター領域における特定のＤＮＡ配列を認識し、それに結合する。ＴＡＬＥは、３３〜３４アミノ酸の単量体の１３〜２８反復からなる中央ＤＮＡ結合ドメインを有する。各単量体のアミノ酸は、１２位および１３位の超可変アミノ酸残基を除いて、高度に保存されている。２つの可変アミノ酸は、反復可変二残基（ＲＶＤ）と呼ばれる。ＲＶＤのアミノ酸対であるＮＩ、ＮＧ、ＨＤ、およびＮＮは、それぞれ優先的に、アデニン、チミン、シトシン、およびグアニン／アデニンを認識し、ＲＶＤの調節は連続したＤＮＡ塩基を認識することができる。アミノ酸配列とＤＮＡ認識との間のこの単純な関係は、適切なＲＶＤを含有する反復セグメントの組み合わせを選択することによって、特定のＤＮＡ結合ドメインの操作を可能にした。
【００９２】
野生型ＦｏｋＩ切断ドメインに加えて、変異を有するＦｏｋＩ切断ドメインのバリアントは、切断特異性および切断活性を改善するように設計されている。ＦｏｋＩドメインは二量体として機能し、適切な配向および間隔を有する標的ゲノムの部位に対して特有のＤＮＡ結合ドメインを有する２つの構築物を必要とする。ＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインとＦｏｋＩ切断ドメインとの間のアミノ酸残基の数、および２つの個々のＴＡＬＥＮ結合部位間の塩基の数の両方は、高レベルの活性を達成するためのパラメータである。
【００９３】
ＴＡＬＥ結合ドメインのアミノ酸配列とＤＮＡ認識との関係は、設計可能なタンパク質を可能にする。ＤＮＡ  Ｗｏｒｋｓなどのソフトウェアプログラムを使用して、ＴＡＬＥ構築物を設計することができる。ＴＡＬＥ構築物を設計する他の方法は、当業者に既知である。Ｄｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ，．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１２）４０：Ｗ１１７−１２２、Ｃｅｒｍａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（２０１１）．３９：ｅ８２およびｔａｌｅ−ｎｔ．ｃａｃ．ｃｏｒｎｅｌｌ．ｅｄｕ／ａｂｏｕｔを参照されたい。
【００９４】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、ＦｏｋＩに基づく方法であるＺＦＮおよびＴＡＬＥＮの代替物である。ＣＲＩＳＰＲシステムは、標的部位におけるＤＮＡ配列を認識するための相補的な塩基対形成を使用したＲＮＡ誘導性の操作されたヌクレアーゼに基づく。
【００９５】
ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｓｍ１、およびＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムは、細菌および古細菌の適応免疫系の一部であり、配列依存的な様式で外来ＤＮＡを切断することによって、ウイルスなどの侵入核酸からそれらを保護する。免疫は、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の近位末端の２つの隣接する反復間のスペーサーとして知られる侵入ＤＮＡの短い断片の組み込みによって獲得される。スペーサーを含むＣＲＩＳＰＲアレイは、侵入ＤＮＡとのその後の遭遇中に転写され、約４０ｎｔ長の小さな干渉ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に処理され、これはトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と組み合わせてＣａｓ９ヌクレアーゼを活性化および誘導する。これは、侵入ＤＮＡ中のプロトスペーサーとして知られる相同二本鎖ＤＮＡ配列を切断する。切断の前提条件は、標的ＤＮＡの下流の保存されたプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在であり、これは通常、配列５−ＮＧＧ−３を有し、低い頻度でＮＡＧを有する。特異性は、ＰＡＭの約１２塩基上流の、いわゆる「シード配列」によって提供され、ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間で一致しなければならない。Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１は、Ｃａｓ９と同様な様式で作用するが、Ｃｐｆ１およびＣｓｍ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを必要としない。
【００９６】
さらに別の態様では、本明細書で提供されるタバコ植物は、１つ以上のｐｍｔ変異を含み、ニコチンデメチラーゼをコードする１つ以上の遺伝子座において１つ以上の変異を欠く対照植物と比較して、ニコチンデメチラーゼをコードする１つ以上の遺伝子座（例えば、ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５、ＣＹＰ８２Ｅ１０）において、ノルニコチンの低減した量を付与する１つ以上の変異をさらに含む（米国特許第８，３１９，０１１号、同第８，１２４，８５１号、同第９，１８７，７５９号、同第９，２２８，１９４号、同第９，２２８，１９５号、同第９，２４７，７０６号を参照されたい）。一態様では、記載されるタバコ植物は、同等の条件下で成長および乾燥させたときに、対照植物と比較して、低減したニコチンデメチラーゼ活性をさらに含む。
【００９７】
一態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、野生型対照タバコ植物からの葉のアナバシンレベル未満のアナバシンレベルを含む葉を産生することができる変異をさらに含む。別の態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、野生型対照タバコ植物からの葉のアナバシンレベルの５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、または８０％より低いアナバシンレベルを含む葉を産生することができる変異をさらに含む。
【００９８】
一態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、対照タバコ植物からの葉と比較して、２倍以上低減されたアナタビンレベルを含む葉を産生することができるさらなる変異を含む。別の態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、野生型対照タバコ植物からの葉と比較して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、または１３倍超低減されたアナタビンレベルを含む葉を産生することができるさらなる変異を含む。一態様では、より低いレベルのアナタビンを提供する変異は、米国出願公開第２０１４／０２８３１６５号および同第２０１６／００１０１０３号に記載される変異である。別の態様では、ｐｍｔ変異体は、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）またはキノリネートシンターゼ（ＱＳ）遺伝子に変異をさらに含む。さらなる態様では、ｐｍｔ変異体植物は、ＱＰＴまたはＱＳ遺伝子の発現または活性を抑制する導入遺伝子または変異をさらに含む。
【００９９】
一態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、同等の条件下で成長させ、かつ加工したときに、野生型対照タバコ植物からの葉のノルニコチンレベルの８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、４５％、４０％、または３５％より低いノルニコチンレベルを提供することができる変異をさらに含む。
【０１００】
一態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、２未満、１．９未満、１．８未満、１．７未満、１．６未満、１．５未満、１．４未満、１．３未満、１．２未満、１．１未満、１．０未満、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１５未満、０．１未満、または０．０５ｐｐｍ未満の総Ｎ−ニトロソノルニコチン（ＮＮＮ）レベルを含む乾燥葉を産生することができる。
【０１０１】
別の態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、２〜０．０５、１．９〜０．０５、１．８〜０．０５、１．７〜０．０５、１．６〜０．０５、１．５〜０．０５、１．４〜０．０５、１．３〜０．０５、１．２〜０．０５、１．１〜０．０５、１．０〜０．０５、０．９〜０．０５、０．８〜０．０５、０．７〜０．０５、０．６〜０．０５、０．５〜０．０５、０．４〜０．０５、０．３〜０．０５、０．２〜０．０５、０．１５〜０．０５、または０．１〜０．０５百万分率（ｐｐｍ）の総ＮＮＮレベルを含む乾燥葉を産生することができる。
【０１０２】
一態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、２未満、１．９未満、１．８未満、１．７未満、１．６未満、１．５未満、１．４未満、１．３未満、１．２未満、１．１未満、１．０未満、０．９未満、０．８未満、０．７未満、０．６未満、０．５未満、０．４未満、０．３未満、０．２未満、０．１５未満、０．１未満、または０．０５ｐｐｍ未満の総ニコチン由来ニトロソアミンケトン（ＮＮＫ）レベルを含む乾燥葉を産生することができる。
【０１０３】
別の態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、２〜０．０５、１．９〜０．０５、１．８〜０．０５、１．７〜０．０５、１．６〜０．０５、１．５〜０．０５、１．４〜０．０５、１．３〜０．０５、１．２〜０．０５、１．１〜０．０５、１．０〜０．０５、０．９〜０．０５、０．８〜０．０５、０．７〜０．０５、０．６〜０．０５、０．５〜０．０５、０．４〜０．０５、０．３〜０．０５、０．２〜０．０５、０．１５〜０．０５、または０．１〜０．０５ｐｐｍの総ＮＮＫレベルを含む乾燥葉を産生することができる。
【０１０４】
一態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、１つ以上の増加したレベルの抗酸化物質を提供する変異または導入遺伝子をさらに含む。別の態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、内因性遺伝子における遺伝子改変をさらに含み、遺伝子改変を欠く対照乾燥タバコ葉と比較して、乾燥葉中の１つ以上の増加したレベルの抗酸化物質をさらに含み、内因性遺伝子は、抗酸化物質の生合成酵素、抗酸化物質の調節転写因子、抗酸化物質の輸送体、抗酸化物質の代謝酵素、またはこれらの組み合わせをコードする。さらなる一態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、導入遺伝子をさらに含み、導入遺伝子を欠く対照乾燥タバコ葉と比較して、乾燥葉中の１つ以上の増加したレベルの抗酸化物質をさらに含み、導入遺伝子は、抗酸化物質の生合成酵素、抗酸化物質の調節転写因子、抗酸化物質の輸送体、抗酸化物質の代謝酵素、またはこれらの組み合わせをコードまたは直接調節する。一態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、ＡｔＰＡＰ１、ＮｔＡＮ２、ＮｔＡＮ１、ＮｔＪＡＦ１３、ＮｔＭｙｂ３、コリスミ酸ムターゼ、およびアロゲン酸デヒドロターゼ（ＡＤＴ）からなる群から選択される１つ以上の遺伝子を発現する導入遺伝子またはシスジェニック構築物をさらに含む。別の態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、ＷＩＰＯ公開第２０１８／０６７９８５号または米国公開第２０１８／０１１９１６３号に記載されるように、抗酸化物質を増加させる、または１つ以上のＴＳＮＡを減少させるための１つ以上の導入遺伝子または遺伝子改変をさらに含む。
【０１０５】
一態様では、記載されるタバコ植物は、改変タバコ植物である。本明細書で使用される場合、植物の文脈で改変された」とは、ある特定の目的のために、および自然多型を超えて導入された遺伝子変異（ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｌｔｅｒａｔｉｏｎ）を含む植物を指す。
【０１０６】
一態様では、記載されるタバコ植物は、シスジェニック植物である。本明細書で使用される場合、「シスジェネシス」または「シスジェニック」は、全ての成分（例えば、プロモーター、ドナー核酸、選択遺伝子）が植物起源のみを有する（すなわち、非植物起源成分は使用されない）植物、植物細胞、または植物ゲノムの遺伝子改変を指す。一態様では、提供される植物、植物細胞、または植物ゲノムは、シスジェニックである。提供されるシスジェニック植物、植物細胞、および植物ゲノムは、すぐに使用できるタバコ株につながり得る。別の態様では、提供されるタバコ植物は、非タバコ遺伝物質または配列を含まない。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「遺伝子発現」または遺伝子の発現は、遺伝子産物の転写および／または翻訳を含む、遺伝子産物の生合成または産生を指す。
【０１０８】
一態様では、提供されるタバコ植物は、１つ以上のｐｍｔ変異を含み、ニコチン生合成またはニコチン輸送に関与する１つ以上の遺伝子の低減された発現または活性をさらに含む。ニコチン生合成に関与する遺伝子としては、アルギニンデカルボキシラーゼ（ＡＤＣ）、メチルプトレシンオキシダーゼ（ＭＰＯ）、ＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ（ＯＤＣ）、ホスホリボシルアントラニル酸イソメラーゼ（ＰＲＡＩ）、キノリン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）、およびＳ−アデノシルメチオニンシンターゼ（ＳＡＭＳ）が含まれるが、これらに限定されない。ニコチン酸誘導体とメチルピロリニウムカチオンとの間の縮合ステップを触媒するニコチンシンターゼは、２つの候補遺伝子（Ａ６２２およびＮＢＢ１）が提案されているが、解明されていない。ＵＳ２００７／０２４０７２８Ａ１およびＵＳ２００８／０１２０７３７Ａ１を参照されたい。Ａ６２２は、イソフラボンレダクターゼ様タンパク質をコードする。加えて、いくつかの輸送体は、ニコチンの透過に関与し得る。ＭＡＴＥという名前の輸送体遺伝子がクローニングされ、特徴付けられている（Ｍｏｒｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １０６：２４４７−５２（２００９））。
【０１０９】
一態様では、提供されるタバコ植物は、１つ以上のｐｍｔ変異を含み、対照タバコ植物と比較して、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つ以上の遺伝子の低減したレベルのｍＲＮＡ、タンパク質、またはそれらの両方をさらに含む。別の態様では、提供されるタバコ植物は、１つ以上のｐｍｔ変異を含み、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つ以上の遺伝子の発現を直接抑制する導入遺伝子をさらに含む。別の態様では、提供されるタバコ植物は、１つ以上のｐｍｔ変異を含み、ＭＰＯ、ＱＰＴ、ＡＤＣ、ＯＤＣ、ＰＲＡＩ、ＳＡＭＳ、ＢＢＬ、ＭＡＴＥ、Ａ６２２、およびＮＢＢ１からなる群から選択される産物をコードする１つ以上の遺伝子の発現または活性を抑制する導入遺伝子または変異をさらに含む。
【０１１０】
一態様では、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコ、空気乾燥タバコ、暗色空気乾燥タバコ、暗色直火乾燥タバコ、ガルパオタバコ、およびオリエンタルタバコからなる群から選択されるタバコの種類に由来する。別の態様では、提供されるタバコ植物は、バーレータバコ、メリーランドタバコ、および暗色タバコからなる群から選択されるタバコの種類に由来する。
【０１１１】
一態様では、提供されるタバコ植物は、熱風乾燥タバコの背景にあるか、または本明細書に記載の１つ以上の熱風乾燥タバコの特徴を示す。熱風乾燥タバコ（バージニアタバコまたは明色タバコとも呼ばれる）は、世界のタバコ生産量の約４０％に相当する。熱風乾燥タバコは、乾燥中に黄金色から深いオレンジ色になるため、しばしば「明色タバコ」と称されることもある。熱風乾燥タバコは、軽くて際立つ芳香および風味（ｔａｓｔｅ）がある。熱風乾燥タバコは、一般的に糖分が多く、油分が少ない。熱風乾燥タバコの主要な栽培国は、アルゼンチン、ブラジル、中国、インド、タンザニア、および米国である。一態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンタバコ植物または種子は、ＣＣ１３、ＣＣ２７、ＣＣ３３、ＣＣ３７、ＣＣ６５、ＣＣ６７、ＣＣ７００、ＧＦ３１８、ＧＬ３３８、ＧＬ３６８、ＧＬ９３９、Ｋ３４６、Ｋ３９９、Ｋ３２６、ＮＣ１０２、ＮＣ１９６、ＮＣ２９１、ＮＣ２９７、ＮＣ２９９、ＮＣ４７１、ＮＣ５５、ＮＣ６０６、ＮＣ７１、ＮＣ７２、ＮＣ９２、ＰＶＨ１１１８、ＰＶＨ１４５２、ＰＶＨ２１１０、ＳＰＥＩＧＨＴ１６８、ＳＰＥＩＧＨＴ２２０、ＳＰＥＩＧＨＴ２２５、ＳＰＥＩＧＨＴ２２７、ＳＰＥＩＧＨＴ２３６、ならびに前述の品種のうちのいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される熱風乾燥タバコの背景にある。別の態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンタバコ植物または種子は、コーカー（Ｃｏｋｅｒ）４８、コーカー１７６、コーカー３７１−ゴールド、コーカー３１９、コーカー３４７、ＧＬ９３９、Ｋ１４９、Ｋ３２６、Ｋ３４０、Ｋ３４６、Ｋ３５８、Ｋ３９４、Ｋ３９９、Ｋ７３０、ＮＣ２７ＮＦ、ＮＣ３７ＮＦ、ＮＣ５５、ＮＣ６０、ＮＣ７１、ＮＣ７２、ＮＣ８２、ＮＣ９５、ＮＣ２９７、ＮＣ６０６、ＮＣ７２９、ＮＣ２３２６、ＭｃＮａｉｒ３７３、ＭｃＮａｉｒ９４４、Ｏｘ２０７、Ｏｘ４１４ＮＦ、リームス（Ｒｅａｍｓ）１２６、リームス７１３、リームス７４４、ＲＧ８、ＲＧ１１、ＲＧ１３、ＲＧ１７、ＲＧ２２、ＲＧ８１、ＲＧＨ４、ＲＧＨ５１、ＳｐｅｉｇｈｔＨ−２０、ＳｐｅｉｇｈｔＧ−２８、ＳｐｅｉｇｈｔＧ−５８、ＳｐｅｉｇｈｔＧ−７０、ＳｐｅｉｇｈｔＧ−１０８、ＳｐｅｉｇｈｔＧ−１１１、ＳｐｅｉｇｈｔＧ−１１７、Ｓｐｅｉｇｈｔ１６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ１７９、ＳｐｅｉｇｈｔＮＦ−３、Ｖａ１１６、Ｖａ１８２、および前述の品種のうちのいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択される熱風乾燥タバコの背景にある。ＷＯ２００４／０４１００６Ａ１を参照されたい。さらなる態様では、低アルカロイドまたは低ニコチンタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、Ｋ３２６、Ｋ３４６、およびＮＣ１９６からなる群から選択される任意の熱風乾燥の背景にある。
【０１１２】
一態様では、提供されるタバコ植物は、空気乾燥タバコの背景にあるか、または本明細書に記載の１つ以上の空気乾燥タバコの特徴を示す。空気乾燥タバコには、バーレー、メリーランド、および暗色タバコが含まれる。一般的な要因は、乾燥に、人工的な熱源および湿度源を主として用いないことである。バーレータバコは、薄色から濃い茶色で、油分が多く、糖分が少ない。バーレータバコは、小屋で空気乾燥される。バーレーの主要な栽培国はアルゼンチン、ブラジル、イタリア、マラウイ、および米国である。メリーランドタバコは、非常にふわふわとして、良い燃焼特性を有し、ニコチンが少なく、自然な芳香がする。メリーランドの主要な栽培国としては、米国およびイタリアが含まれる。一態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、クレー（Ｃｌａｙ）４０２、クレー４０３、クレー５０２、Ｋｙ１４、Ｋｙ９０７、Ｋｙ９１０、Ｋｙ８９５９、ＮＣ２、ＮＣ３、ＮＣ４、ＮＣ５、ＮＣ２０００、ＴＮ８６、ＴＮ９０、ＴＮ９７、Ｒ６１０、Ｒ６３０、Ｒ７１１、Ｒ７１２、ＮＣＢＨ１２９、Ｂｕ２１×Ｋｙ１０、ＨＢ０４Ｐ、Ｋｙ１４×Ｌ８、Ｋｔ２００、ニュートン（Ｎｅｗｔｏｎ）９８、ペディーゴ（Ｐｅｄｉｇｏ）５６１、Ｐｆ５６１、およびＶａ５０９からなる群から選択されるバーレータバコの背景にある。さらなる態様では、低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、ＴＮ９０、ＫＴ２０９、ＫＴ２０６、ＫＴ２１２、およびＨＢ４４８８からなる群から選択される任意のバーレー背景にある。別の態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、Ｍｄ１０、Ｍｄ４０、Ｍｄ２０１、Ｍｄ６０９、Ｍｄ８７２、およびＭｄ３４１からなる群から選択されるメリーランドタバコの背景にある。
【０１１３】
一態様では、提供されるタバコ植物は、暗色空気乾燥タバコの背景にあるか、または本明細書に記載される１つ以上の暗色空気乾燥タバコの特徴を示す。暗色空気乾燥タバコは、主にその乾燥プロセスによって他の種類と区別され、暗色空気乾燥タバコに中〜濃い褐色および独特の芳香を与える。暗色空気乾燥タバコは、主に噛みタバコおよび嗅ぎタバコに使用される。一態様では、低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、スマトラ（Ｓｕｍａｔｒａ）、ジャティム（Ｊａｔｉｍ）、ドミニカンクバノ（Ｄｏｍｉｎｉｃａｎ  Ｃｕｂａｎｏ）、ベスキ（Ｂｅｓｕｋｉ）、ワンサッカー（Ｏｎｅ  ｓｕｃｋｅｒ）、グリーンリバー（Ｇｒｅｅｎ  Ｒｉｖｅｒ）、バージニアサンキュアード（Ｖｉｒｇｉｎｉａ  ｓｕｎ−ｃｕｒｅｄ）、およびパラグアンパサド（Ｐａｒａｇｕａｎ  Ｐａｓｓａｄｏ）からなる群から選択される暗色空気乾燥タバコの背景で提供される。
【０１１４】
一態様では、提供されるタバコ植物は、暗色直火乾燥タバコの背景にあるか、または本明細書に記載の１つ以上の暗色直火乾燥タバコの特徴を示す。暗色直火乾燥タバコは、一般に、閉鎖乾燥小屋の床で低燃焼の焚火で乾燥する。それらの葉は、糖含有量は低いが、ニコチン含有量は高い。暗色直火乾燥タバコは、パイプブレンド、シガレット、噛みタバコ、嗅ぎタバコ、および強い風味のシガーを作製するために使用される。暗色直火乾燥タバコの主な栽培地域は、米国のテネシー州、ケンタッキー州、およびバージニア州である。一態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物または種子は、ナローリーフマドール（Ｎａｒｒｏｗ  Ｌｅａｆ  Ｍａｄｏｌｅ）、改良マドール（Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｍａｄｏｌｅ）、トムロッソンマドール（Ｔｏｍ  Ｒｏｓｓｏｎ  Ｍａｄｏｌｅ）、ニュートンズＶＨマドール（Ｎｅｗｔｏｎ’ｓ  ＶＨ  Ｍａｄｏｌｅ）、リトルクリッテンデン（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｃｒｉｔｔｅｎｄｅｎ）、グリーンウッド（Ｇｒｅｅｎ  Ｗｏｏｄ）、リトルウッド（Ｌｉｔｔｌｅ  Ｗｏｏｄ）、スモールストークブラックマンモス（Ｓｍａｌｌ  Ｓｔａｌｋ  Ｂｌａｃｋ  Ｍａｍｍｏｔｈ）、ＤＴ５０８、ＤＴ５１８、ＤＴ５９２、ＫＹ１７１、ＤＦ９１１、ＤＦ４８５、ＴＮＤ９４、ＴＮＤ９５０、ＶＡ３０９、およびＶＡ３５９からなる群から選択される暗色直火乾燥タバコの背景にある。
【０１１５】
一態様では、提供されるタバコ植物は、オリエンタルタバコの背景にあるか、または本明細書に記載の１つ以上のオリエンタルタバコの特徴を示す。オリエンタルタバコは、典型的には、トルコ、ギリシャ、ブルガリア、マケドニア、シリア、レバノン、イタリア、ルーマニアなどの東地中海地域で栽培されるという事実から、ギリシャタバコ、アロマタバコ、およびトルコタバコとも称される。今日のオリエンタル品種の特徴である小さな植物および葉のサイズ、ならびにその特有の芳香特性は、過去数世紀にわたって培われた、この植物の土壌の悪さおよびストレスの多い気候条件に対する適応の結果である。一態様では、提供される低アルカロイドまたは低ニコチンタバコ植物または種子は、イズミル（Ｉｚｍｉｒ）、カテリニ（Ｋａｔｅｒｉｎｉ）、サムスン（Ｓａｍｓｕｎ）、バスマ（Ｂａｓｍａ）およびクルモヴグラト（Ｋｒｕｍｏｖｇｒａｄ）、トラブゾン（Ｔｒａｂｚｏｎ）、テサリアン（Ｔｈｅｓａｌｉａｎ）、タショヴァ（Ｔａｓｏｖａ）、シノプ（Ｓｉｎｏｐ）、イズミト（Ｉｚｍｉｔ）、ヘンデック（Ｈｅｎｄｅｋ）、エディルネ（Ｅｄｉｒｎｅ）、シェムディンリ（Ｓｅｍｄｉｎｌｉ）、アドゥヤマン（Ａｄｉｙａｎｍａｎ）、ヤイラダウ（Ｙａｙｌａｄａｇ）、イスケンデルン（Ｉｓｋｅｎｄｅｒｕｎ）、デュズジェ（Ｄｕｚｃｅ）、マケドニアン（Ｍａｃｅｄｏｎｉａｎ）、マヴラ（Ｍａｖｒａ）、プリレプ（Ｐｒｉｌｅｐ）、バフラ（Ｂａｆｒａ）、ブルサ（Ｂｕｒｓａ）、ブチャク（Ｂｕｃａｋ）、ビトリス（Ｂｉｔｌｉｓ）、バルケシル（Ｂａｌｉｋｅｓｉｒ）および前述の品種のうちのいずれか１つに本質的に由来する任意の品種からなる群から選択されるオリエンタルタバコの背景にある。
【０１１６】
一態様では、低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物、種子、ハイブリッド、品種、または株は、ＢＵ６４、ＣＣ１０１、ＣＣ２００、ＣＣ２７、ＣＣ３０１、ＣＣ４００、ＣＣ５００、ＣＣ６００、ＣＣ７００、ＣＣ８００、ＣＣ９００、コーカー１７６、コーカー３１９、コーカー３７１ゴールド、コーカー４８、ＣＵ２６３、ＤＦ９１１、ガルパオタバコ、ＧＬ２６Ｈ、ＧＬ３５０、ＧＬ６００、ＧＬ７３７、ＧＬ９３９、ＧＬ９７３、ＨＢ０４Ｐ、Ｋ１４９、Ｋ３２６、Ｋ３４６、Ｋ３５８、Ｋ３９４、Ｋ３９９、Ｋ７３０、ＫＤＨ９５９、ＫＴ２００、ＫＴ２０４ＬＣ、ＫＹ１０、ＫＹ１４、ＫＹ１６０、ＫＹ１７、ＫＹ１７１、ＫＹ９０７、ＫＹ９０７ＬＣ、ＫＴＹ１４ｘＬ８ＬＣ、リトルクリッテンデン、ＭｃＮａｉｒ３７３、ＭｃＮａｉｒ９４４、ｍｓＫＹ１４ｘＬ８、ナローリーフマドール、ＮＣ１００、ＮＣ１０２、ＮＣ２０００、ＮＣ２９１、ＮＣ２９７、ＮＣ２９９、ＮＣ３、ＮＣ４、ＮＣ５、ＮＣ６、ＮＣ７、ＮＣ６０６、ＮＣ７１、ＮＣ７２、ＮＣ８１０、ＮＣＢＨ１２９、ＮＣ２００２、ニールスミスマドール（Ｎｅａｌ  Ｓｍｉｔｈ  Ｍａｄｏｌｅ）、ＯＸＦＯＲＤ２０７、「ペリック（Ｐｅｒｉｑｕｅ）」タバコ、ＰＶＨ０３、ＰＶＨ０９、ＰＶＨ１９、ＰＶＨ５０、ＰＶＨ５１、Ｒ６１０、Ｒ６３０、Ｒ７−１１、Ｒ７−１２、ＲＧ１７、ＲＧ８１、ＲＧＨ５１、ＲＧＨ４、ＲＧＨ５１、ＲＳ１４１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ１６８、Ｓｐｅｉｇｈｔ１７２、Ｓｐｅｉｇｈｔ１７９、Ｓｐｅｉｇｈｔ２１０、Ｓｐｅｉｇｈｔ２２０、Ｓｐｅｉｇｈｔ２２５、Ｓｐｅｉｇｈｔ２２７、Ｓｐｅｉｇｈｔ２３４、ＳｐｅｉｇｈｔＧ−２８、ＳｐｅｉｇｈｔＧ−７０、ＳｐｅｉｇｈｔＨ−６、ＳｐｅｉｇｈｔＨ２０、ＳｐｅｉｇｈｔＮＦ３、ＴＩ１４０６、ＴＩ１２６９、ＴＮ８６、ＴＮ８６ＬＣ、ＴＮ９０、ＴＮ９７、ＴＮ９７ＬＣ、ＴＮＤ９４、ＴＮＤ９５０、ＴＲ（トムロッソン）マドール、ＶＡ３０９、もしくはＶＡ３５９、Ｍａｒｙｌａｎｄ６０９、ＨＢ３３０７ＰＬＣ、ＨＢ４４８８ＰＬＣ、ＫＴ２０６ＬＣ、ＫＴ２０９ＬＣ、ＫＴ２１０ＬＣ、ＫＴ２１２ＬＣ、Ｒ６１０ＬＣ、ＰＶＨ２３１０、ＮＣ１９６、ＫＴＤ１４ＬＣ、ＫＴＤ６ＬＣ、ＫＴＤ８ＬＣ、ＰＤ７３０２ＬＣ、ＰＤ７３０５ＬＣ、ＰＤ７３０９ＬＣ、ＰＤ７３１８ＬＣ、ＰＤ７３１９ＬＣ、ＰＤ７３１２ＬＣ、シャーレイ（Ｓｈｉｒｅｙ）ＬＣまたは当該技術分野で既知の標準的なタバコ育種技術による任意の市販タバコ品種に、本質的に由来するか、またはその遺伝的背景にある。
【０１１７】
前述の暗色空気乾燥、バーレー、メリーランド、暗色直火乾燥、またはオリエンタル種類の全ての特定の品種を、例示の目的としてのみ列挙している。本出願では、任意の追加の暗色空気乾燥、バーレー、メリーランド、暗色直火乾燥、オリエンタル品種も企図される。
【０１１８】
また、記載されるタバコ植物の集団も提供される。一態様では、タバコ植物の集団は、１エーカー当たり約５，０００〜約８０００、約５，０００〜約７，６００、約５，０００〜約７，２００、約５，０００〜約６，８００、約５，０００〜約６，４００、約５，０００〜約６，０００、約５，０００〜約５，６００、約５，０００〜約５，２００、約５，２００〜約８，０００、約５，６００〜約８，０００、約６，０００〜約８，０００、約６，４００〜約８，０００、約６，８００〜約８，０００、約７，２００〜約８，０００、または約７，６００〜約８，０００の植物の栽植密度を有する。別の態様では、タバコ植物の集団は、低〜中程度の肥沃度を有する土壌型である。
【０１１９】
また、記載されるタバコ植物由来の種子の容器も提供される。本開示のタバコ種子の容器は、任意の数、重量、または体積の種子を含有し得る。例えば、容器は、約１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００以上の種子を含有することができる。あるいは、容器は、約１オンス、５オンス、１０オンス、１ポンド、２ポンド、３ポンド、４ポンド、５ポンド、またはそれ以上の種子を含有することができる。タバコ種子の容器は、当該技術分野で入手可能な任意の容器であってもよい。非限定的な例として、容器は、箱、バッグ、パケット、ポーチ、テープロール、チューブ、またはボトルであり得る。
【０１２０】
記載される低アルカロイドまたは低ニコチンのタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料も提供される。さらに、より高いレベルの総アルカロイドまたはニコチンで記載されるタバコ植物から作製された乾燥タバコ材料が提供される。
【０１２１】
「乾燥」は、老化プロセスであり、水分を低減させ、葉緑素の破壊をもたらして、タバコの葉を黄金色にし、デンプンを糖に変換する。したがって、乾燥タバコは、収穫された緑色の葉と比較して、より高い還元糖含有量およびより低いデンプン含有量を有する。一態様では、提供される緑葉タバコは、従来の手段、例えば、熱風乾燥、納屋乾燥、直火乾燥、空気乾燥、または日干乾燥を使用して乾燥され得る。異なる種類の乾燥方法の説明は、例えば、Ｔｓｏ（１９９９，Ｃｈａｐｔｅｒ  １  ｉｎ  Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ）を参照されたい。乾燥タバコは、通常、木製ドラム（例えば、ホグスヘッド）または段ボール箱内で、数年間（例えば、２〜５年）圧縮条件で熟成され、水分量が１０％〜約２５％の範囲である。米国特許第４，５１６，５９０号および同第５，３７２，１４９号を参照されたい。次いで、乾燥させ、熟成させたタバコをさらに加工することができる。さらなる処理は、様々な温度の蒸気の導入、低温殺菌、および発酵の有無にかかわらず、真空下でタバコを調節することを含む。発酵は、典型的には、最初に含水率が高く、発熱し、乾燥重量が１０〜２０％減少することを特徴とする。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、同第４，８４８，３７３号、同第５，３７２，１４９号、米国公開第２００５／０１７８３９８号、およびＴｓｏ（１９９９，Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの第１章、Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ）を参照されたい。乾燥、熟成、および発酵させたタバコを、さらに加工することができる（例えば、裁断、寸断、膨張、またはブレンドする）。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、および同第４，９８７，９０７号を参照されたい。一態様では、本開示の乾燥タバコ材料は、日干乾燥される。別の態様では、本開示の乾燥タバコ材料は、熱風乾燥、空気乾燥、または直火乾燥される。
【０１２２】
乾燥タバコ上のカビの存在は、乾燥葉の品質および市場性（例えば、葉の等級）を著しく低減させ得る。カビの増殖は、約１０℃（５０°Ｆ）〜３２．２℃（９０°Ｆ）の温度で高い湿度（例えば、７０％を超える相対湿度）が長期間続くと発生し得る一般的な問題である。カビは、より高い温度でより一般的である傾向がある。
【０１２３】
１種以上のＰＭＴ遺伝子、２種以上のＰＭＴ遺伝子、３種以上のＰＭＴ遺伝子、４種以上のＰＭＴ遺伝子、または５種のＰＭＴ遺伝子における変異体対立遺伝子を含む、本明細書に提供されるタバコ植物、品種、および株は、低アルカロイドのタバコ品種ＬＡバーレー２１（ＬＡ  ＢＵ２１）と比較して、低減されたカビ感染を示す。同様に、１種以上のＰＭＴ遺伝子、２種以上のＰＭＴ遺伝子、３種以上のＰＭＴ遺伝子、４種以上のＰＭＴ遺伝子、または５種のＰＭＴ遺伝子の発現または翻訳を下方制御するＲＮＡｉ構築物を含む、本明細書に提供されるタバコ植物、品種、および株は、低アルカロイドのタバコ品種ＬＡバーレー２１（ＬＡ  ＢＵ２１）と比較して、低減されたカビ感染を示す。
【０１２４】
ＬＡ  ＢＵ２１は、幾数回の戻し交配を通して、キューバシガー品種由来の低アルカロイド遺伝子（複数可）をバーレー２１に組み込むことによって産生される総アルカロイドが低いタバコ株である（Ｌｅｇｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｒｏｐ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１０：２１２（１９７０））。それは、その親であるＢａｒｌｅｙ２１の約３．５％（乾燥重量）と比較して、総アルカロイド（乾燥重量）を約０．２％有する。ＬＡ  ＢＵ２１は、葉等級が商業的に許容される基準をはるかに下回る。
【０１２５】
一態様では、ｐｍｔ１ａの変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、観察可能なカビ感染を含まない。別の態様では、ｐｍｔ１ｂの変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、観察可能なカビ感染を含まない。別の態様では、ｐｍｔ２の変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、観察可能なカビ感染を含まない。別の態様では、ｐｍｔ３の変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、観察可能なカビ感染を含まない。別の態様では、ｐｍｔ４の変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、観察可能なカビ感染を含まない。別の態様では、ｐｍｔ１ａの変異体対立遺伝子、ｐｍｔ１ｂの変異体対立遺伝子、ｐｍｔ２の変異体対立遺伝子、ｐｍｔ３の変異体対立遺伝子、およびｐｍｔ４の変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、観察可能なカビ感染を含まない。
【０１２６】
一態様では、ｐｍｔ１ａの変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、様々なＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥タバコ葉と比較して、低減されたカビ感染を含む。別の態様では、ｐｍｔ１ｂの変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、様々なＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥タバコ葉と比較して低減されたカビ感染を含む。別の態様では、ｐｍｔ２の変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、様々なＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥タバコ葉と比較して低減されたカビ感染を含む。別の態様では、ｐｍｔ３の変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、様々なＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥タバコ葉と比較して低減されたカビ感染を含む。別の態様では、ｐｍｔ４の変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、様々なＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥タバコ葉と比較して低減されたカビ感染を含む。別の態様では、ｐｍｔ１ａの変異体対立遺伝子、ｐｍｔ１ｂの変異体対立遺伝子、ｐｍｔ２の変異体対立遺伝子、ｐｍｔ３の変異体対立遺伝子、およびｐｍｔ４の変異体対立遺伝子を含む乾燥タバコ葉は、品種ＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥タバコ葉と比較して、低減されたカビ感染を含む。
【０１２７】
一態様では、表４Ａ〜表４Ｅ、表１０、または表１４のうちのいずれか１つに提供されるタバコ植物、品種、または株由来の乾燥葉は、観察可能なカビ感染を含まない。別の態様では、表４Ａ〜表４Ｅ、表１０、または表１４のうちのいずれか１つに提供されるタバコ植物、品種、または株由来の乾燥葉は、品種ＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥タバコ葉と比較して低減されたカビ感染を含む。
【０１２８】
一態様では、表５Ａ〜表５Ｅおよび表１２Ａ〜表１２Ｅのうちのいずれか１つに提供される１つ以上のｐｍｔ変異を含むタバコ植物、品種、または株由来の乾燥葉は、観察可能なカビ感染を含まない。別の態様では、表５Ａ〜表５Ｅおよび表１２Ａ〜表１２Ｅのうちのいずれか１つに提供される１つ以上のｐｍｔ変異を含むタバコ植物、品種、または株由来の乾燥葉は、品種ＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥葉と比較して低減されたカビ感染を含む。
【０１２９】
一態様では、ｐｍｔ１ａの変異体対立遺伝子を含むタバコ植物、品種、または株由来の乾燥葉は、品種ＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥葉よりも高い葉等級を含む。一態様では、ｐｍｔ１ｂの変異体対立遺伝子を含むタバコ植物、品種、または株由来の乾燥葉は、品種ＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥葉よりも高い葉等級を含む。一態様では、ｐｍｔ２の変異体対立遺伝子を含むタバコ植物、品種、または株由来の乾燥葉は、品種ＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥葉よりも高い葉等級を含む。一態様では、ｐｍｔ３の変異体対立遺伝子を含むタバコ植物、品種、または株由来の乾燥葉は、品種ＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥葉よりも高い葉等級を含む。一態様では、ｐｍｔ４の変異体対立遺伝子を含むタバコ植物、品種、または株由来の乾燥葉は、品種ＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥葉よりも高い葉等級を含む。別の態様では、ｐｍｔ１ａの変異体対立遺伝子、ｐｍｔ１ｂの変異体対立遺伝子、ｐｍｔ２の変異体対立遺伝子、ｐｍｔ３の変異体対立遺伝子、およびｐｍｔ４の変異体対立遺伝子を含む植物、品種、または株由来の乾燥タバコ葉は、ＬＡ  ＢＵ２１の対照乾燥葉よりも高い葉等級を含む。
【０１３０】
一態様では、表４Ａ〜表４Ｅ、表１０、または表１４のうちのいずれか１つに提供されるタバコ植物、品種、または株由来の乾燥葉は、品種ＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥葉よりも高い葉等級を含む。
【０１３１】
一態様では、表５Ａ〜表５Ｅおよび表１２Ａ〜表１２Ｅのうちのいずれか１つに提供される１つ以上のｐｍｔ変異を含むタバコ植物、品種、または株由来の乾燥葉は、品種ＬＡ  ＢＵ２１由来の対照乾燥葉よりも高い葉の等級を含む。
【０１３２】
一態様では、「低減されたカビ感染」は、低減された感染葉の面積を指す。別の態様では、「低減されたカビ感染」は、感染葉に生存する低減されたカビ胞子の数を指す。生存胞子の検出および計数の標準的な方法は、当該技術分野で既知であり、かつ利用可能である。
【０１３３】
一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも１％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも２％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも３％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも４％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも５％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも１０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも１５％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも２０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも２５％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも３０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも３５％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも４０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも５０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも６０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも７０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも７５％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも８０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも９０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して少なくとも９５％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１００％の感染葉面積の低減を含む。
【０１３４】
一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１％〜１００％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１％〜９０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１％〜８０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１％〜７０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１％〜６０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１％〜５０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１％〜４０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１％〜３０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１％〜２０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１％〜１０％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１０％〜１００％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して２０％〜１００％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して３０％〜１００％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して４０％〜１００％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して５０％〜１００％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して６０％〜１００％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して７０％〜１００％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して８０％〜１００％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して９０％〜１００％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して１０％〜７５％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して２５％〜７５％の感染葉面積の低減を含む。一態様では、低減されたカビ感染は、対照葉と比較して２５％〜５０％の感染葉面積の低減を含む。
【０１３５】
一態様では、乾燥タバコに感染するカビは、クラドスポリウム属（Ｃｌａｄｏｓｐｏｒｉｕｍ）、アオカビ属（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、アルテルナリア属（Ａｌｔｅｒｎａｒｉａ）、コウジカビ属（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）、およびケカビ属（Ｍｕｃｏｒ）からなる群から選択される属のカビである。
【０１３６】
本開示のタバコ株、品種、またはハイブリッドから得られたタバコ材料を使用して、タバコ製品を作製することができる。本明細書で使用される場合、「タバコ製品」は、ヒトによる使用または消費を意図したタバコから作製された、または由来する任意の製品として定義される。
【０１３７】
提供されるタバコ製品には、シガレット製品（例えば、シガレットおよびビディシガレット）、シガー製品（例えば、葉巻タバコおよびシガリロ）、パイプタバコ製品、タバコ由来製品、タバコ由来ニコチン製品、無煙タバコ製品（例えば、湿性嗅ぎタバコ（ｍｏｉｓｔ  ｓｎｕｆｆ）、乾燥嗅ぎタバコ（ｄｒｙ  ｓｎｕｆｆ）、および噛みタバコ）、フィルム、チュアブル、タブ、成型部分、ゲル、消耗品ユニット、不溶性マトリックス、中空形状、再構成タバコ、膨張タバコなどが含まれるが、これらに限定されない。例えば、米国特許公開第ＵＳ２００６／０１９１５４８号を参照されたい。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「シガレット」は、「ロッド（ｒｏｄ）」および「フィラー（ｆｉｌｌｅｒ）」を有するタバコ製品を指す。シガレットの「ロッド」には、シガレット紙、フィルター、プラグラップ（濾過材料を含むために使用）、シガレット紙（フィラーを含む）をフィルターに保持するチップペーパー、およびこれらの構成要素を一緒に保持する全ての接着剤が含まれる。「フィラー」は、（１）再構成タバコおよび膨張タバコを含むがこれらに限定されない全てのタバコ、（２）非タバコ置換物（ハーブ、非タバコ植物材料、ならびにシガレット紙内で巻かれたタバコに付随し得る他のスパイスを含むがこれらに限定されない）、（３）ケーシング、（４）調味料、ならびに（５）全ての他の添加物（タバコおよび置換物に混合され、シガレット内に巻かれる）を含む。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「再構成タバコ」は、タバコダストおよび他のタバコスクラップ材料から作製され、シート形態に加工され、タバコに類似するようにストリップに切断されたタバコフィラーの一部を指す。コスト削減に加えて、再構成タバコは、アンモニアと糖との間の反応を使用した風味発生の加工によりシガレットの味に貢献するため、非常に重要である。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「膨張タバコ」は、タバコフィラーの一部を指し、タバコが「充填される」ように好適なガスの膨張を通して処理され、密度が低減し、充填容量が増加する。それによって、シガレットに使用されるタバコの重量が低減する。
【０１４１】
また、本開示の植物由来のタバコ製品は、シガレットおよび他の喫煙物、特に、フィルター要素を含む喫煙物を含み、喫煙可能な材料のロッドは、タバコブレンド内の乾燥タバコを含む。一態様では、本開示のタバコ製品は、シガリロ、非通気式リセスフィルターシガレット（ｎｏｎ−ｖｅｎｔｉｌａｔｅｄ  ｒｅｃｅｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ  ｃｉｇａｒｅｔｔｅ）、通気式リセスフィルターシガレット（ｖｅｎｔｅｄ  ｒｅｃｅｓｓ  ｆｉｌｔｅｒ  ｃｉｇａｒｅｔｔｅ）、シガー、嗅ぎタバコ、パイプタバコ（ｐｉｐｅ  ｔｏｂａｃｃｏ）、シガータバコ、シガレットタバコ、噛みタバコ、葉タバコ（ｌｅａｆ  ｔｏｂａｃｃｏ）、水タバコ（ｈｏｏｋａｈ  ｔｏｂａｃｃｏ）、細断タバコ（ｓｈｒｅｄｄｅｄ  ｔｏｂａｃｃｏ）、および刻みタバコ（ｃｕｔ  ｔｏｂａｃｃｏ）からなる群から選択される。別の態様では、本開示のタバコ製品は、無煙タバコ製品である。無煙タバコ製品は、燃焼せず、限定されないが、噛みタバコ、湿性無煙タバコ（ｍｏｉｓｔ  ｓｍｏｋｅｌｅｓｓ  ｔｏｂａｃｃｏ）、嗅ぎタバコ、乾燥嗅ぎタバコが含まれる。噛みタバコは粗分割されたタバコの葉で、典型的には、大きなポーチのようなパッケージに包装され、プラグやツイストに使用される。湿性無煙タバコは、しっとりして、細かく分割されたタバコであり、ばらの形態またはポーチの形態で提供され、典型的には、丸い缶に包装され、ピンチとしてまたはポーチとして、成人タバコ消費者が頬と歯茎の間に入れて使用する。嗅ぎタバコは熱処理された無煙タバコである。乾燥嗅ぎタバコは、口に入れるか、鼻に使用する、細かく粉砕されたタバコである。さらなる態様では、本開示のタバコ製品は、ルーズリーフ噛みタバコ（ｌｏｏｓｅ  ｌｅａｆ  ｃｈｅｗｉｎｇ  ｔｏｂａｃｃｏ）、プラグ噛みタバコ（ｐｌｕｇ  ｃｈｅｗｉｎｇ  ｔｏｂａｃｃｏ）、湿性嗅ぎタバコ、および鼻嗅ぎタバコ（ｎａｓａｌ  ｓｎｕｆｆ）からなる群から選択される。さらに別の態様では、本開示のタバコ製品は、電子加熱シガレット、電子シガレット、電子蒸発装置からなる群から選択される。
【０１４２】
一態様では、本開示のタバコ製品は、ブレンドタバコ製品であり得る。別の態様では、本開示のタバコ製品は、低ニコチンタバコ製品であり得る。さらなる態様では、本開示のタバコ製品は、約３ｍｇ／ｇ未満のレベルでノルニコチンを含み得る。例えば、かかる製品中のノルニコチン含有量は、３．０ｍｇ／ｇ、２．５ｍｇ／ｇ、２．０ｍｇ／ｇ、１．５ｍｇ／ｇ、１．０ｍｇ／ｇ、７５０μｇ／ｇ、５００ｐｇ／ｇ、２５０ｐｇ／ｇ、１００ｐｇ／ｇ、７５ｐｇ／ｇ、５０ｐｇ／ｇ、２５ｐｇ／ｇ、１０ｐｇ／ｇ、７．０ｐｇ／ｇ、５．０ｐｇ／ｇ、４．０ｐｇ／ｇ、２．０ｐｇ／ｇ、１．０ｐｇ／ｇ、０．５ｐｇ／ｇ、０．４ｐｇ／ｇ、０．２ｐｇ／ｇ、０．１ｐｇ／ｇ、０．０５ｐｇ／ｇ、０．０１ｐｇ／ｇ、または検出不能であり得る。
【０１４３】
一態様では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量基準で、約０．０１％、０．０２％、０．０５％、０．７５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．３％、０．３５％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．１％、１．２％、１．３％、１．４％、１．５％、１．６％、１．７％、１．８％、１．９％、２％、２．１％、２．２％、２．３％、２．４％、２．５％、２．６％、２．７％、２．８％、２．９％、３％、３．１％、３．２％、３．３％、３．４％、３．５％、３．６％、３．７％、３．８％、３．９％、４％、５％、６％、７％、８％、および９％からなる群から選択される平均ニコチンレベルまたは総アルカロイドレベルを含む。別の態様では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量基準で、約０．０１％〜０．０２％、０．０２％〜０．０５％、０．０５％〜０．７５％、０．７５％〜０．１％、０．１％〜０．１５％、０．１５％〜０．２％、０．２％〜０．３％、０．３％〜０．３５％、０．３５％〜０．４％、０．４％〜０．５％、０．５％〜０．６％、０．６％〜０．７％、０．７％〜０．８％、０．８％〜０．９％、０．９％〜１％、１％〜１．１％、１．１％〜１．２％、１．２％〜１．３％、１．３％〜１．４％、１．４％〜１．５％、１．５％〜１．６％、１．６％〜１．７％、１．７％〜１．８％、１．８％〜１．９％、１．９％〜２％、２％〜２．１％、２．１％〜２．２％、２．２％〜２．３％、２．３％〜２．４％、２．４％〜２．５％、２．５％〜２．６％、２．６％〜２．７％、２．７％〜２．８％、２．８％〜２．９％、２．９％〜３％、３％〜３．１％、３．１％〜３．２％、３．２％〜３．３％、３．３％〜３．４％、３．４％〜３．５％、および３．５％〜３．６％からなる群から選択される平均ニコチンレベルまたは総アルカロイドレベルを含む。さらなる態様では、提供される乾燥タバコ材料またはタバコ製品は、乾燥重量基準で約０．０１％〜０．１％、０．０２％〜０．２％、０．０３％〜０．３％、０．０４％〜０．４％、０．０５％〜０．５％、０．７５％〜１％、０．１％〜１．５％、０．１５％〜２％、０．２％〜３％、および０．３％〜３．５％からなる群から選択される平均ニコチンレベルまたは総アルカロイドレベルを含む。
【０１４４】
本開示はまた、タバコ株、栽培品種、または所望のレベルの総アルカロイドまたはニコチン、例えば、低ニコチンまたはニコチンフリーを含む品種を育種するための方法も提供する。育種は、任意の既知の手順を介して実行することができる。望ましい形質または対立遺伝子を、タバコ植物に移入または育種するために、ＤＮＡフィンガープリンティング、ＳＮＰマッピング、ハプロタイプマッピング、または同様の技術を、マーカー支援選択（ＭＡＳ）育種プログラムに使用してもよい。例えば、ブリーダーは、Ｆ１ハイブリッド植物を使用してＦ２または戻し交配世代で分離集団を作成するか、または農学的に望ましい遺伝子型を有する他のドナー植物とＦ１ハイブリッド植物をさらに交配することができる。Ｆ２または戻し交配世代における植物は、当該技術分野で既知の技術、または本明細書に列挙された技術のうちの１つを使用して、望ましい農学的形質または望ましい化学的特性についてスクリーニングすることができる。予想される遺伝パターンまたは使用されるＭＡＳ技術に応じて、望ましい個々の植物の同定を支援するために、戻し交配の各サイクルの前に選択された植物の自家受粉を行うことができる。反復親（ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｐａｒｅｎｔ）の所望の表現型を回復するまで、戻し交配または他の育種手順を繰り返すことができる。本開示における反復親は、熱風乾燥品種、バーレー品種、暗色空気乾燥品種、暗色直火乾燥品種、またはオリエンタル品種であり得る。他の育種技術は、例えば、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ  Ｒｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７Ｃｈａｐｔｅｒ  Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ  ６６９−６９８    Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（ｅｄ．），ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．に見出すことができる（それらの全体が参照により本明細書に援用される）。
【０１４５】
記載されるタバコ植物を使用した植物育種プログラムの結果としては、有用な株、栽培品種、品種、子孫、近交系、および本開示のハイブリッドが挙げられる。本明細書で使用される場合、「品種」という用語は、それらを同じ種の他の植物から分離する一定の特徴を共有する植物の集団を指す。品種は、いつもではないが、しばしば商業的に販売されている。品種は、１つ以上の特徴的な形質を有する一方で、その品種内の個体間の非常に小さな全体的なバリエーションによってさらに特徴付けられる。「純系（ｐｕｒｅ  ｌｉｎｅ）」品種は、数世代の自家受粉および選択、または組織もしくは細胞培養技術を使用した単一の親からの栄養繁殖によって作成され得る。品種は、本質的に別の株または品種に由来し得る。植物の新品種の保護に関する国際条約（１９６１年１２月２日、１９７２年１１月１０日、１９７８年１０月２３日、および１９９１年３月１９日にジュネーブで改訂）によって定義されるように、品種は、ａ）原品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせから生じる本質的特徴の発現を保持しながら、主に原品種に由来するか、または主に原品種に由来する品種に由来し、ｂ）原品種と明確に区別可能であり、ｃ）派生行為に起因する差異を除き、原品種の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせから生じる本質的特徴の発現において原品種に適合する場合、原品種に「本質的に由来する」。本質的に由来する品種は、例えば、天然もしくは誘導変異体、ソマクローナルバリアント、原品種の植物由来のバリアント個体、戻し交配、または形質転換の選択によって得ることができる。第１のタバコ品種および第１の品種が本質的に由来する第２のタバコ品種は、本質的に同一の遺伝的背景を有するとみなされる。品種と区別される「株」は、最も多くの場合、例えば植物研究で非商業的に使用される植物の群を指す。株は、典型的には、１つ以上の目的の形質に関して個体間で全体的な変動はほとんど示さないが、他の形質に関して個体間でいくらかの変動があり得る。
【０１４６】
一態様では、本開示は、表５Ａ〜表５Ｅおよび表１２Ａ〜表１２Ｅのうちのいずれか１つに提供される１つ以上のｐｍｔ変異を含むタバコ植物、品種、株、または細胞を提供する。
【０１４７】
別の態様では、本開示は、表４Ａ〜表４Ｅ、表１０、または表１４のうちのいずれか１つに提供される任意のタバコ植物、品種、または株に由来するタバコ植物、品種、株、または細胞を提供する。
【０１４８】
一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２０３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ３４１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１６７８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１６８０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８０４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８９８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２０７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ３４２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ３４３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ３４８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ３４９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ３５５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ３５９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ６４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ６８２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ６９２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ６９７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ９２２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ９５７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８０８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８１０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８８６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８８８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８８９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８９３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９０１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９０２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１２５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２０８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４０３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４１４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４３４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４３６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４３７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４４９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７０６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７０９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７１０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７１６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７２９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７３１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７５２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７５６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７６８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７７１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７７６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ８００、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ８１８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１００４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１０３３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１３２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１３４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２１７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４５６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４５７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４６０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４６５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ８３０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ８３１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ８３６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ８４１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ９７４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ９８１、およびＦ
１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ９９４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９０５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１２８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１３０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１３１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１３３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１３６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２１６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２２７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ６５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ６６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ６９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１６９６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７１７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７１９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７２９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７３６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７３７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７３９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７４０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８３５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８４８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８４９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９１２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９３７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９４０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９４３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９４４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１０５１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ３４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４７３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ５０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ８４８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ８５０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ８５１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１６９９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７０８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７２２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７２４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７２５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８４５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８４６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８４７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９１１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９１２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９１５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９１８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９２８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９３２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９３３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１９３６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ３１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由
来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ５１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ５２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１０７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１０６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１１５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８０９−１３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１１１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１１２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１６７８−６０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１３１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７０９−０１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ７０９−０８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４１４−１１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４１４−１９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４３７−０４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４３７−０８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４３７−３２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４３７−３９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４４９−２６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ４４９−３３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１２５−４８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１０２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１０３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７１９−３０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７４０−３６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１６９８−２２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７００−１３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７０２−１７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８４９−０１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１８４９−４８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１７ＧＨ１７３７−２４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１１８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１３３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１２０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ１１０８−０７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２１６２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１６４、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１６３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１４６、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１４７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１５０、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１５１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１４８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１４９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１５２、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１５３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１４３、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２１６９、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２１７１、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１６５、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株ＣＳ１１８、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。一態様では、本開示は、タバコ株１８ＧＨ２２５４−７、およびＦ１もしくはＦ２タバコ植物、またはそれらに由来する雄性不稔タバコ植物を提供する。
【０１４９】
一態様では、本開示は、低ニコチン形質をタバコ品種に遺伝子導入する（ｉｎｔｒｏｇｒｅｓｓ）方法であって、（ａ）低ニコチン形質を含む第１のタバコ品種を、低ニコチン形質を有しない第２のタバコ品種と交配させ、１つ以上の子孫タバコ植物を産生することと、（ｂ）表４Ａ〜表４Ｅ、表５Ａ〜表５Ｅ、表１０、および表１２Ａ〜表１２Ｅに列挙されるものから選択されるｐｍｔ変異体対立遺伝子について、１つ以上の子孫タバコ植物を遺伝子型決定することと、（ｃ）ｐｍｔ変異体対立遺伝子を含む子孫タバコ植物を選択することと、を含む、方法を提供する。別の態様では、これらの方法は、選択された子孫タバコ植物を第２のタバコ品種と戻し交配することをさらに含む。さらなる態様では、これらの方法は、（ｄ）選択された子孫植物を、それ自体または第２のタバコ品種と交配させて、１つ以上のさらなる子孫タバコ植物を産生することと、（ｅ）低ニコチン形質を含むさらなる子孫タバコ植物を選択することと、をさらに含む。一態様では、ステップ（ｅ）の選択することは、マーカー支援選択を含む。一態様では、これらの方法は、低ニコチン形質を含む単一遺伝子転換を生成する。一態様では、これらの方法は、ｐｍｔ変異体対立遺伝子を含む単一遺伝子転換を生成する。一態様では、第２のタバコ品種は、優良品種である。別の態様では、これらの方法の遺伝子型決定ステップは、１つ以上の分子マーカーアッセイを伴う。別の態様では、遺伝子型決定は、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列における挿入または欠失（インデル）、ＤＮＡ配列の単純配列反復（ＳＳＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰからなる群から選択される多型を含む多型マーカーを含み得る。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「遺伝子座」は、多型の核酸、形質決定基、遺伝子、またはマーカーが位置する染色体の遺伝子座または領域である。「遺伝子座」は、２つの相同染色体によって共有されて、それらの対応する遺伝子座または領域を指し得る。本明細書で使用される場合、「対立遺伝子」は、遺伝子または特定の遺伝子座における代替的な核酸配列を指す（例えば、他の対立遺伝子とは異なり、同じ遺伝子または同じ遺伝子座についての遺伝子または遺伝子座の核酸配列）。かかる対立遺伝子は、（ｉ）野生型、または（ｉｉ）野生型対立遺伝子と比較して１つ以上の変異または編集が変異体対立遺伝子の核酸配列に存在する場合、変異体とみなすことができる。遺伝子の変異体対立遺伝子は、野生型対立遺伝子と比較して、遺伝子の活性または発現レベルが低減または排除され得る。タバコなどの二倍体生物について、第１の対立遺伝子は、１つの染色体上で生じ得、第２の対立遺伝子は、第２の相同染色体上の同じ遺伝子座で生じ得る。植物の１つの染色体上の遺伝子座における１つの対立遺伝子が変異体対立遺伝子であり、かつ植物の相同染色体上の他の対応する対立遺伝子が野生型である場合、その植物は、変異体対立遺伝子についてヘテロ接合性であると記載される。しかしながら、遺伝子座における両方の対立遺伝子が変異体対立遺伝子である場合、その植物は、変異体対立遺伝子についてホモ接合性であると記載される。遺伝子座における変異体対立遺伝子についてホモ接合性の植物は、ヘテロ対立遺伝子性または両対立遺伝子性の場合、同じ変異体対立遺伝子または異なる変異体対立遺伝子を含み得る。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「遺伝子導入」または「遺伝子導入する」は、ある遺伝子座の所望の対立遺伝子を、ある遺伝的背景由来の別の遺伝子座に伝達することを指す。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「交配された」または「交配」は、受精（例えば、細胞、種子または植物）を介して子孫を産生することを意味し、植物間の交配（有性）および自家受精（自家受粉）を含む。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「戻し交配（ｂａｃｋｃｒｏｓｓ）」および「戻し交配すること（ｂａｃｋｃｒｏｓｓｉｎｇ）」は、子孫植物がその親のうちの１つと繰り返し交配し直すプロセスを指す。戻し交配スキームでは、「ドナー」親は、遺伝子導入される所望の遺伝子または遺伝子座を有する親植物を指す。「レシピエント」親（１回以上使用）または「反復」親（２回以上使用）は、遺伝子または遺伝子座が遺伝子導入される親植物を指す。初期交配は、Ｆ１世代を生み出す。「ＢＣ１」という用語は、反復親の第２の使用を指し、「ＢＣ２」は、反復親の第３の使用などを指す。一態様では、戻し交配は、各逐次戻し交配世代の子孫個体を用いて、それ自体が同じ親の遺伝子型へと戻し交配されように、繰り返し行われる。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「単一遺伝子転換された」または「単一遺伝子転換」は、戻し交配として知られる植物育種技術を使用して、または遺伝子操作を介して開発され、戻し交配技術を介して、または遺伝子操作を介して、単一遺伝子を品種に移入すること加えて、本質的に品種の所望の形態学的特徴および生理学的特徴の全てが回復される植物を指す。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「優良品種」は、優れた農学的性能のための育種および選択から生じた任意の品種を意味する。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、マーカー支援選択または育種の文脈における「選択すること」または「選択」は、特定の所定の基準に基づいて、通常、集団から、所望の個体を選び取る（ｐｉｃｋ）または選び出す（ｃｈｏｏｓｅ）行為を指す。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、「形質（ｔｒａｉｔ）」という用語は、遺伝子型に影響を受け得る細胞または生物の１つ以上の検出可能な特徴を指す。表現型は、肉眼で、または当該技術分野で既知の任意の他の評価の手段、例えば、顕微鏡検査、生化学分析、ゲノム分析、特定の耐病性のアッセイなどによって観察可能であり得る。場合によっては、表現型は、単一の遺伝子または遺伝子座、例えば、「単一遺伝子形質」によって直接制御される。他の場合、表現型はいくつかの遺伝子に起因する。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「マーカーアッセイ」とは、特定の方法、例えば、少なくとも１つの表現型（種子の色、花の色、または他の視覚的に検出可能な形質など）の測定、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、単一塩基伸長、電気泳動、配列整列、対立遺伝子特異的オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーション（ＡＳＯ）、ランダム増幅多型ＤＮＡ（ＲＡＰＤ）、マイクロアレイベースの技術、および核酸配列決定技術などを使用して、特定の遺伝子座で多型を検出する方法を意味する。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「マーカー支援選択」（ＭＡＳ）は、マーカー遺伝子型に基づいて表現型が選択されるプロセスである。「マーカー支援選択育種」は、植物から１つ以上の核酸を検出することによって、植物（複数可）の所望の形質（複数可）を選択するプロセスを指し、それらの核酸を所望の形質と関連付けて、次いでそれらの１つ以上の核酸を有する植物または生殖質を選択する。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、「多型（ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」は、集団における１つ以上のバリエーションの存在を意味する。多型は、核酸のヌクレオチド配列におけるバリエーションとして、またはタンパク質のアミノ酸配列におけるバリエーションとして現れ得る。多型には、１つ以上の個体の集団における１つ以上の遺伝子座の核酸配列または核酸特徴のうちの１つ以上のバリエーションの存在が含まれる。バリエーションは、１つ以上のヌクレオチドの塩基変化、１つ以上のヌクレオチドの挿入、または１つ以上のヌクレオチドの欠失を含み得るが、これらに限定されない。多型は、核酸複製におけるランダムなプロセスから、変異誘発を通して、可動ゲノム要素の結果として、コピー数多型から、ならびに減数分裂のプロセス中に（例えば、不等交差、ゲノム重複、ならびに染色体切断および染色体融合）生じ得る。バリエーションは、一般的に発見され得るか、または集団内で低頻度で存在し得るが、前者は、一般的な植物育種においてより大きな有用性を有し、後者は、稀であるが重要な表現型バリエーションと関連し得る。有用な多型としては、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、ＤＮＡ配列内の挿入または欠失（Ｉｎｄｅｌｓ）、ＤＮＡ配列の単純配列反復（ＳＳＲ）、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、およびタグＳＮＰが挙げることができる。また、遺伝子マーカー、遺伝子、ＤＮＡ由来配列、ＲＮＡ由来配列、プロモーター、遺伝子の５’非翻訳領域、遺伝子の３’非翻訳領域、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、耐性遺伝子座、サテライトマーカー、導入遺伝子、ｍＲＮＡ、ｄｓｍＲＮＡ、転写プロファイル、およびメチル化パターンは、多型を含み得る。加えて、前述のコピー数の存在、不在、またはバリエーションも、多型を含み得る。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「ＳＮＰ」または「単一ヌクレオチド多型（ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）」は、ゲノム配列中の単一ヌクレオチド（Ａ、Ｔ、Ｃ、またはＧ）が変化または可変である場合に生じる配列のバリエーションを意味する。「ＳＮＰマーカー」は、ＳＮＰがゲノム上の部位にマッピングされるときに存在する。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「マーカー」または「分子マーカー」または「マーカー遺伝子座」という用語は、ゲノム上の特定の遺伝子座を特徴付けるのに十分に固有な核酸またはアミノ酸配列を示すために使用される。任意の検出可能な多型形質は、それが差異的に遺伝し、目的の表現型形質と連鎖不均衡を示す限り、マーカーとして使用することができる。したがって、各マーカーは、特有のヌクレオチド配列を有するＤＮＡの特定のセグメントの指標である。マップ位置は、互いに対する特定のマーカーの相対位置の尺度を提供する。形質が所与のマーカーに関連付けられると記載されている場合、その配列が形質に影響を与える実際のＤＮＡセグメントは、概して、マーカーと共分離することが理解されるであろう。形質のより正確かつ確実な局在化は、マーカーが形質の両方の側で同定される場合に得ることができる。形質自体の外観を実際に評価することなく（形質の実際の評価は、形質が発現され得る段階で、および／または形質が発現され得る環境条件下で、植物を成長させる必要があるため、困難かつ時間がかかり得る）、交配の子孫におけるマーカー（複数可）の外観を測定することによって、比較的単純な分子試験で形質の存在を検出することができる。
【０１６３】
本開示の任意のタバコ植物は、例えば、当該技術分野で既知の技術を使用して、遺伝子構築物または導入遺伝子で形質転換することによって、追加の農学的に望ましい形質をさらに含み得ることが理解される。望ましい形質の例としては、限定されないが、除草剤耐性、害虫耐性、耐病性、高収量、高等級指標値、乾燥性、乾燥品質、機械収穫性、保持能、葉の品質、高さ、植物の成熟（例えば、早期成熟、早期から中期の成熟、中期成熟、中基から晩期成熟、もしくは晩期成熟）、茎の大きさ（例えば、小さい、中程度、もしくは大きい茎）、または植物当たりの葉数（例えば、少ない（例えば、５〜１０葉）、中程度（例えば、１１〜１５葉）、もしくは多い（１６〜２１葉））、または任意の組み合わせである。一態様では、開示される低ニコチンまたはニコチンフリーのタバコ植物または種子は、１つ以上の殺虫性タンパク質、例えば、バチルス・スリンギエンシス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）の結晶タンパク質、またはＶＩＰ３などのバチルス・セレウス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｅｒｅｕｓ）由来の植物性殺虫性タンパク質を発現する１つ以上の導入遺伝子を含む（例えば、Ｅｓｔｒｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：１３７を参照されたい）。別の態様では、タバコ植物は、落葉病（ｂｒｏｗｎ  ｓｔｅｍ  ｒｏｔ）に対する耐性（米国特許第５，６８９，０３５号）またはシスト線虫（ｃｙｓｔ  ｎｅｍａｔｏｄｅ）に対する耐性（米国特許第５，４９１，０８１号）を付与する遺伝子導入形質をさらに含む。
【０１６４】
本開示はまた、変化したニコチンレベルまたは総アルカロイドレベルを含むが、そのようなニコチンレベルの変化を伴わない対応する最初のタバコ植物の収量と同等な収量を有する、ｐｍｔ変異体タバコ植物を提供する。一態様では、ｐｍｔ変異体は、約１２００〜３５００、１３００〜３４００、１４００〜３３００、１５００〜３２００、１６００〜３１００、１７００〜３０００、１８００〜２９００、１９００〜２８００、２０００〜２７００、２１００〜２６００、２２００〜２５００、および２３００〜２４００ポンド／エーカーからなる群から選択される収量を提供する。別の態様では、ｐｍｔ変異体タバコ品種は、約１２００〜３５００、１３００〜３５００、１４００〜３５００、１５００〜３５００、１６００〜３５００、１７００〜３５００、１８００〜３５００、１９００〜３５００、２０００〜３５００、２１００〜３５００、２２００〜３５００、２３００〜３５００、２４００〜３５００、２５００〜３５００、２６００〜３５００、２７００〜３５００、２８００〜３５００、２９００〜３５００、３０００〜３５００、および３１００〜３５００ポンド／エーカーからなる群から選択される収量を提供する。さらなる態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、ｐｍｔ変異（複数可）を除いて、本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収量の６５％〜１３０％、７０％〜１３０％、７５％〜１３０％、８０％〜１３０％、８５％〜１３０％、９０％〜１３０％、９５％〜１３０％、１００％〜１３０％、１０５％〜１３０％、１１０％〜１３０％、１１５％〜１３０％、または１２０％〜１３０％の収量を提供する。さらなる態様では、ｐｍｔ変異体タバコ植物は、ｐｍｔ変異を除いて、本質的に同一の遺伝的背景を有する対照植物の収量の７０％〜１２５％、７５％〜１２０％、８０％〜１１５％、８５％〜１１０％、または９０％〜１００％の収量を提供する。
【０１６５】
一態様では、開示されるタバコ植物（例えば、低ニコチン、ニコチンフリー、または低アルカロイドタバコ品種）は、収量、成熟および老化、昆虫食害に対する感受性、摘花後のポリアミン含有量、葉緑素レベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、および乾燥後の最終産物の品質からなる群から選択される形質に実質的に影響を与えることなく、望ましい形質（例えば、低ニコチン、ニコチンフリー、または低アルカロイド）を付与する改変を含む。
【０１６６】
一態様では、開示されるタバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチンフリー、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、非改変対照植物と実質的に同等の形質をさらに含み、その形質は、収量、成熟および老化、昆虫食害に対する感受性、摘花後のポリアミン含有量、葉緑素レベル、単位葉面積当たりの葉肉細胞数、および乾燥後の最終産物の品質からなる群から選択される。
【０１６７】
一態様では、開示されるタバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチンフリー、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、非改変対照植物の収量に対して８０％超、８５％超、９０％超、９５％超、１００％超、１０５％超、１１０％超、１１５％超、１２０％超、１２５％超、１３０％超、１３５％超、または１４０％超である収量をさらに含む。一態様では、開示されるタバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチンフリー、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、非改変対照植物の収量に対して７０％〜１４０％、７５％〜１３５％、８０％〜１３０％、８５％〜１２５％、９０％〜１２０％、９５％〜１１５％、または１００％〜１１０％の収量をさらに含む。一態様では、開示されるタバコ植物は、所望の形質（例えば、低ニコチン、ニコチンフリー、または低アルカロイド）を付与する改変を含み、非改変対照植物の収量に対して７０％〜８０％、７５％〜８５％、８０％〜９０％、８５％〜９５％、９０％〜１００％、９５％〜１０５％、１０５％〜１１５％、１１０％〜１２０％、１１５％〜１２５％、１２０％〜１３０％、１２５〜１３５％、または１３０％〜１４０％である収量をさらに含む。
【０１６８】
一態様では、開示される低ニコチンまたはニコチンフリーのタバコ品種は、機械収穫のために適合される。別の態様では、開示される低ニコチンまたはニコチンフリーのタバコ品種は、機械的に収穫される。
【０１６９】
一態様では、提供されるタバコ植物は、ハイブリッド植物である。ハイブリッドは、第１の品種の雌性親植物（例えば、種子親）の自家受粉を防止し、第２の品種の雄性親植物からの花粉を雌性親植物に受精させ、雌性植物でＦ１ハイブリッド種子を形成することによって産生することができる。雌性植物の自家受粉は、花の発達の初期段階で花を除雄することによって防止することができる。あるいは、雄性不稔の形態を使用して、雌性親植物で花粉形成を防止することができる。例えば、雄性不稔は、雄性不稔（ＭＳ）またはトランスジェニック雄性不稔によって産生することができ、導入遺伝子が、小胞子形成および／もしくは花粉形成、または自己不和合性を阻害する。ＭＳを含有する雌性親植物は、特に有用である。雌性親植物がＭＳである一態様では、雄性の稔性植物から花粉を採取し、ＭＳ雌性親植物の柱頭に手動で適用し、得られるＦ１種子を採取する。
【０１７０】
植物を使用して、単交配タバコＦ１ハイブリッドを形成することができる。雄性親植物由来の花粉を、除雄された雌性親植物または雄性不稔の雌性親植物に手動で移して、Ｆ１種子を形成する。あるいは、単交配Ｆ１ハイブリッドを雌親として使用し、異なる雄親と交配する、三元交配を実行することができる。別の代替として、２つの異なる単交配のＦ１子孫自体を交配する、二重交配ハイブリッドを作成することができる。二重交配ハイブリッドを形成する場合、自家不和合性を使用すると特に有利であり、雌親の自家受粉を防止することができる。
【０１７１】
一態様では、低ニコチンまたはニコチンフリーのタバコ品種は、雄性不稔である。別の態様では、低ニコチンまたはニコチンフリーのタバコ品種は、細胞質雄性不稔である。雄性不稔タバコ植物は、当該技術分野で既知の任意の方法によって産生され得る。雄性不稔タバコの産生方法は、Ｗｅｒｎｓｍａｎ，Ｅ．Ａ．，ａｎｄ  Ｒｕｆｔｙ，Ｒ．Ｃ．１９８７Ｃｈａｐｔｅｒ  Ｓｅｖｅｎｔｅｅｎ．Ｔｏｂａｃｃｏ．Ｐａｇｅｓ  ６６９−６９８    Ｃｕｌｔｉｖａｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ．Ｃｒｏｐ  Ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｅｈｒ（ｅｄ．），ＭａｃＭｉｌｌａｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｇｏ．，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．７６１  ｐｐ．に記載されている。
【０１７２】
一態様では、本開示は、表５Ａ〜表５Ｅおよび表１２Ａ〜表１２Ｅのうちのいずれか１つに提供される１つ以上のｐｍｔ変異を含む雄性不稔タバコ植物、品種、または株を提供する。
【０１７３】
別の態様では、本開示は、表４Ａ〜表４Ｅ、表１０、または表１４のうちのいずれか１つに提供される任意のタバコ植物、品種、または株に由来する雄性不稔タバコ植物、品種、または株を提供する。
【０１７４】
一態様では、本開示は、雄性不稔株ｄＣＳ１１を提供する。別の態様では、本開示は、雄性不稔株ｄＣＳ１２を提供する。別の態様では、本開示は、雄性不稔株ｄＣＳ１３を提供する。別の態様では、本開示は、雄性不稔株ｄＣＳ１４を提供する。別の態様では、本開示は、雄性不稔株ｄＣＳ１５を提供する。別の態様では、本開示は、雄性不稔株ｄＣＳ１６を提供する。別の態様では、本開示は、雄性不稔株ｄＣＳ１７を提供する。別の態様では、本開示は、雄性不稔株ｄＣＳ１８を提供する。別の態様では、本開示は、雄性不稔株ｄＳ６９７を提供する。
【０１７５】
さらなる態様では、提供されるタバコ部分としては、限定されないが、葉、茎、根、種子、花、花粉、葯、胚珠、小花柄、果実、成長点、子葉、胚軸、鞘、胚、胚乳、外植片、カルス、組織培養物、苗条、細胞、およびプロトプラストが挙げられる。一態様では、提供されるタバコ部分は、種子を含まない。一態様では、本開示は、タバコ植物の細胞、組織、および生殖物質ではなく、植物の自然生殖を媒介しない器官を提供する。別の態様では、本開示はまた、タバコ植物の細胞、組織、および生殖物質であり、植物の自然生殖を媒介する器官も提供する。別の態様では、本開示は、光合成を介して自身を維持することができないタバコ植物の細胞、組織、および器官を提供する。別の態様では、本開示は、体細胞性のタバコ植物細胞を提供する。体細胞は、生殖系列細胞とは反対に、植物生殖を媒介しない。
【０１７６】
細胞、組織、および器官は、種子、果実、葉、子葉、胚軸、成長点、胚、胚乳、根、苗条、茎、鞘、花、花序、柄、小花柄、花柱、花床、花弁、萼片、花粉、葯、花糸、子房、胚珠、果皮、篩部、維管束組織に由来し得る。別の態様では、本開示は、タバコ植物の葉緑体を提供する。さらなる態様では、本開示は、表皮細胞、気孔細胞、葉または根毛、貯蔵根、または塊茎を提供する。別の態様では、本開示は、タバコのプロトプラストを提供する。
【０１７７】
当業者は、タバコ植物が無性生殖や栄養繁殖を介してではなく、種子を介して自然生殖することを理解している。一態様では、本開示は、タバコの胚乳を提供する。別の態様では、本開示は、タバコの胚乳細胞を提供する。さらなる態様では、本開示は、ヒトの介入なしで生殖することができない雄性または雌性不稔タバコ植物を提供する。
【０１７８】
一態様では、本開示は、配列番号１〜１０からなる群から選択される配列およびその断片と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含む核酸分子を提供する。一態様では、本開示は、配列番号１１〜１５からなる群から選択されるアミノ酸配列と、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を含むポリペプチドまたはタンパク質を提供する。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、２つのポリヌクレオチド配列またはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」という用語は、指定された比較ウィンドウにわたって最大の対応関係について整列させたときに、２つの配列内の同じ残基を指す。タンパク質に関して配列同一性のパーセンテージが使用される場合、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によってしばしば異なり、アミノ酸残基は、類似の化学特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基に置換され、したがって、分子の機能特性を変化させないことが認識される。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性のパーセントは、置換の保存的性質を補正するために上向きに調整され得る。
【０１８０】
本開示は、開示されるタバコ植物からタバコ材料を含むタバコ製品を製造する方法をさらに提供する。一態様では、方法は、タバコ植物から作製された熟成タバコ材料を調節して、その水分含有量を約１２．５％〜約１３．５％から約２１％まで増加させることと、調節されたタバコ材料をブレンドして、所望のブレンドを生成することと、を含む。一態様では、タバコ製品の製造方法は、ブレンドをケーシングすることまたは風味付けすることをさらに含む。一般に、ケーシングプロセスの間、ケーシングまたはソース材料をブレンドに添加して、化学組成のバランスを取ることによって、それらの品質を強化し、特定の所望の風味特徴を開発する。ケーシングプロセスのさらなる詳細は、Ｔｏｂａｃｃｏ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｅｄｉｔｅｄ  ｂｙ  Ｌ．Ｄａｖｉｓ  ａｎｄ  Ｍ．Ｎｉｅｌｓｅｎ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９９に見出すことができる。
【０１８１】
また、提供されるタバコ材料は、限定されないが、熱処理（例えば、調理、トースト）、風味付け、酵素処理、膨張、および／または乾燥を含む方法を使用して処理することができる。発酵タバコおよび非発酵タバコの両方は、これらの技法を使用して処理することができる。好適な加工タバコの例としては、暗色空気乾燥、暗色直火乾燥、バーレー、熱風乾燥、および葉巻芯葉（ｆｉｌｌｅｒ）または巻き葉（ｗｒａｐｐｅｒ）、ならびに全葉の茎除去作業（ｗｈｏｌｅ  ｌｅａｆ  ｓｔｅｍｍｉｎｇ  ｏｐｅｒａｔｉｏｎ）による製品が挙げられる。一態様では、タバコ繊維は、生重量基準で、最大７０％の暗色タバコを含む。例えば、タバコは、米国公開第２００４／０１１８４２２号または同第２００５／０１７８３９８号に記載されるように、加熱ステップ、脱水（ｓｗｅａｔｉｎｇ）ステップ、および／または低温殺菌ステップによって調節され得る。
【０１８２】
提供されるタバコ材料を、発酵させることができる。発酵は、典型的には、最初に含水率が高く、発熱し、乾燥重量が１０〜２０％減少することを特徴とする。例えば、米国特許第４，５２８，９９３号、同第４，６６０，５７７号、同第４，８４８，３７３号、および同第５，３７２，１４９号を参照されたい。発酵は、葉の芳香を改変するうえ、葉の色および質感のいずれかまたは両方を変化させることができる。また、発酵プロセス中に、放出ガスを生成することができ、酸素を取り込むことができ、ｐＨを変化させることができ、保持される水分の量を変化させることができる。例えば、米国公開第２００５／０１７８３９８号およびＴｓｏ（１９９９，Ｔｏｂａｃｃｏ，Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙの第１章、Ｄａｖｉｓ  ＆  Ｎｉｅｌｓｅｎ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｏｘｆｏｒｄ）を参照されたい。乾燥した、または乾燥かつ発酵させたタバコは、経口製品に組み込まれる前に、さらに加工することができる（例えば、切断、膨張、ブレンド、製粉、または粉砕する）。タバコは、場合によっては、コポリマー、および任意選択的に風味剤および他の添加剤と混合する前に、４８〜５０重量％のオーブン揮発物含有量を有する長刻みの発酵乾燥湿性タバコである。
【０１８３】
一態様では、提供されるタバコ材料は、所望のサイズに加工され得る。一態様では、タバコ繊維を処理して、２００マイクロメートル未満の平均繊維サイズを有するようにすることができる。一態様では、タバコ繊維は、７５〜１２５マイクロメートルである。別の態様では、タバコ繊維は、７５マイクロメートル以下のサイズを有するように加工される。一態様では、タバコ繊維には、幅が、約１０カット／インチ〜約１１０カット／インチ、および長さが、約０．１インチ〜約１インチに、切断または細断され得る長刻み（ｌｏｎｇ  ｃｕｔ）タバコが含まれる。二重カットされたタバコ繊維は、約７０％の二重カットされたタバコ繊維が−２０メッシュ〜８０メッシュのメッシュサイズになるように、様々な粒径を有することができる。
【０１８４】
提供されるタバコ材料は、約１０重量％以上、約２０重量％以上、約４０重量％以上、約１５重量％〜約２５重量％、約２０重量％〜約３０重量％、約３０重量％〜約５０重量％、約４５重量％〜約６５重量％、または約５０重量％〜約６０重量％の総オーブン揮発物含有量を有するように処理することができる。当業者は、「湿性（ｍｏｉｓｔ）」タバコは、典型的には、約４０重量％〜約６０重量％（例えば、約４５重量％〜約５５重量％、または約５０重量％）のオーブン揮発物含有量を有するタバコを指すことを理解するであろう。本明細書で使用される場合、「オーブン揮発物」は、試料を、事前に温められた強制ドラフトオーブン中、１１０℃で３．２５時間乾燥させた後、試料の減量のパーセンテージを計算することによって決定される。経口製品は、経口製品を作製するために使用されるタバコ繊維のオーブン揮発物含有量とは異なる総オーブン揮発物含有量を有することができる。記載される処理ステップは、オーブン揮発物含有量を低減または増加させることができる。
【０１８５】
これまで本開示を一般的に説明してきたが、特に指定しない限り、例示として提供され、かつ本開示の限定を意図しない以下の実施例を参照することによって、同様のことがより容易に理解されるであろう。
【実施例】
【０１８６】
実施例１：５種のＰＭＴ遺伝子の発現プロファイリング
ニコチン生合成は、酵素プトレシンＮ−メチルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）により、ポリアミンであるプトレシンをＮ−メチルプトレシンに変換することで開始される。これは、前駆体代謝産物が、ニコチン生合成に関与するステップである。ＰＭＴ（ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４）をコードする遺伝子は、タバコ（ニコチアナ・タバカム）ゲノムに存在する。表１Ａは、５種のＰＭＴ遺伝子のゲノムＤＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列、およびタンパク質配列を列挙する。表１Ｂおよび表１Ｃは、５種のＰＭＴ遺伝子間の配列同一性を提供する。摘花前から収穫までのプールされた発現レベルは、いずれの特定の理論にも制限されることなく、ＰＭＴ１ａおよびＰＭＴ３が２種の主要なＰＭＴ遺伝子を表すことへの支持を提供する（図１）。
【０１８７】
（表１Ａ）５種のタバコＰＭＴ遺伝子の配列
2021531021.tif 000003
【０１８８】
（表１Ｂ）Ｃｌｕｓｔａｌ２．１によって決定された５種のタバコＰＭＴ遺伝子間のｃＤＮＡ配列同一性
2021531021.tif 000004
【０１８９】
（表１Ｃ）Ｃｌｕｓｔａｌ２．１によって決定された５種のタバコＰＭＴ遺伝子間のタンパク質配列同一性
2021531021.tif 000005
【０１９０】
（表１Ｄ）ＰＭＴ１ｂゲノム配列（配列番号１）注釈付け
2021531021.tif 000006
【０１９１】
（表１Ｅ）ＰＭＴ１ｂゲノム配列（配列番号２）注釈付け
2021531021.tif 000007
【０１９２】
（表１Ｆ）ＰＭＴ２ゲノム配列（配列番号３）注釈付け
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【０１９３】
（表１Ｇ）ＰＭＴ３ゲノム配列（配列番号４）注釈付け
2021531021.tif 000009
【０１９４】
（表１Ｈ）ＰＭＴ４ゲノム配列（配列番号５）注釈付け
2021531021.tif 000010
【０１９５】
実施例２：ＰＭＴゲノム編集とタバコ株の開発
ＰＭＴノックアウト変異体は、様々なＰＭＴ遺伝子を編集することによって生成される。タバコのプロトプラストは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して、ゲノム編集技術１（ＧＥＴ１）タンパク質またはゲノム編集技術（ＧＥＴ）２タンパク質をコードするプラスミド、および所望の位置でＰＭＴ遺伝子を標的とする特定のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いてトランスフェクトされる。表２は、ＰＭＴ編集に使用されるｇＲＮＡ配列を列挙する。いくつかのｇＲＮＡ（例えば、番号６および７）は、単一のトランスフェクションで複数種のＰＭＴ遺伝子を標的とするために、一緒にプールされる。
【０１９６】
次いで、トランスフェクトされたプロトプラストを、１％アガロースビーズに固定し、組織培養に供する。カルスが直径約１ｍｍまで成長したら、ＴＯＭ２プレート上に撒く。カルスを、断片分析を使用して、標的位置での挿入または欠失（インデル）についてスクリーニングする。野生型対照と比較したサイズシフトを示す候補をさらなる培養のために選択し、結果としての苗条を、再び断片分析によって試験して、インデルの存在を確認する。根付いた苗条を鉢植えし、標的位置について配列決定して、正確な欠失した配列を決定する。各植物からの若葉を採取し、ｐｈｉｒｅｋｉｔを使用してＰＭＴ断片についてＰＣＲ増幅する。各株についてＰＭＴライブラリをインデックス化し、３８４株をプールし、Ｍｉｓｅｑを使用して配列決定する。
【０１９７】
ＳＮＰ分析を実行して、正確な編集ｐｍｔ変異体対立遺伝子の配列と、各ＰＭＴ遺伝子座における接合状態の両方を決定する。表３は、代表的な編集植物の接合性の情報を提供する。表４Ａ〜表４Ｅは、様々なタバコ品種（例えば、Ｋ３２６、ＴＮ９０、ＮＬＭ、オリエンタル）の各編集株におけるインデルの配列情報を提供する。表５Ａ〜表５Ｅは、ゲノム配列の中央に編集部位を有する各ｐｍｔ変異体対立遺伝子由来の約４０のヌクレオチドのゲノム配列を提供する（例えば、欠失または挿入の配列部位の各側の２０のヌクレオチド）。
【０１９８】
（表２）２つのゲノム編集技術で使用されたｇＲＮＡ配列およびそれらの標的遺伝子。「Ｙ」は、ｇＲＮＡがそのＰＭＴ遺伝子を標的とすることを表し、一方、「−」は、ｇＲＮＡがそのＰＭＴ遺伝子を標的としないことを表す。
2021531021.tif 000011
【０１９９】
（表３）ＧＥＴ２を使用したゲノム編集によって生成された様々な背景での選択されたｐｍｔ変異体における個々のＰＭＴ遺伝子座の接合性。番号１は、単一変異体対立遺伝子についてホモ接合性であることを表す。数字２〜５は、２〜５個のインデルを有するヘテロ対立遺伝子の組み合わせを表す。ハイフンは、データがないことを示す。詳細な遺伝子型情報を、表４Ａ〜表４Ｄに示す。
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【０２００】
（表４Ａ）ＧＥＴ２を使用したゲノム編集によって生成されたＫ３２６における変異体ｐｍｔ対立遺伝子。各編集部位（例えば、インデル）の位置は、各ＰＭＴ遺伝子の対応するｃＤＮＡ配列上のヌクレオチド番号に対してである。例えば、株１７ＧＨ１６７８は、ＰＭＴ１ｂの両対立遺伝子変異を有する。２つの対立遺伝子のうちの一方は、ＰＭＴ１ｂ  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド４１６〜４１９に対応する４つのヌクレオチドの欠失を有する。他方の対立遺伝子は、ＰＭＴ１ｂ  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチド４１８〜４１９に対応する２つのヌクレオチドの欠失を有する。１０のヌクレオチドを超える配列について、配列番号が割り当てられ、示されている。
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【０２０１】
（表４Ｂ）ＧＥＴ２を使用したゲノム編集によって生成されたＴＮ９０の変異体ｐｍｔ対立遺伝子
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【０２０２】
（表４Ｃ）ＧＥＴ２を使用したゲノム編集によって生成されたＮＬＭｚの変異体ｐｍｔ対立遺伝子。ＮＬＭｚは、３種のニコチンデメチラーゼ遺伝子（ＣＹＰ８２Ｅ４、ＣＹＰ８２Ｅ５ｖ２、およびＣＹＰ８２Ｅ１０）における３つの機能喪失変異を含有するナローリーフマドール品種を指す。
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【０２０３】
（表４Ｄ）ＧＥＴ２を使用したゲノム編集によって生成されたオリエンタルタバコの変異体ｐｍｔ対立遺伝子
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【０２０４】
（表４Ｅ）ＧＥＴ１を使用したゲノム編集によって生成されたＮＬＭ（Ｐｈ  Ｐｈ）タバコの変異体ｐｍｔ対立遺伝子
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【０２０５】
（表５Ａ）ＰＭＴ１ｂ遺伝子で得られた例示的な変異体対立遺伝子のリスト。本明細書および表５Ｂ〜表５Ｅに列挙される変異体対立遺伝子の配列は、ゲノム配列の中央に編集部位を有する各編集ＰＭＴ遺伝子由来の約４０のヌクレオチド長のゲノム配列を表す（例えば、欠失または挿入の配列部位の各側の２０のヌクレオチド）。これらの変異体対立遺伝子は、表４Ａ〜表４Ｅに列挙されるものに対応する。
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【０２０６】
（表５Ｂ）ＰＭＴ１ａ遺伝子で得られた例示的な変異体対立遺伝子のリスト
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【０２０７】
（表５Ｃ）ＰＭＴ２遺伝子で得られた例示的な変異体対立遺伝子のリスト
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【０２０８】
（表５Ｄ）ＰＭＴ３遺伝子で得られた例示的な変異体対立遺伝子のリスト
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【０２０９】
（表５Ｅ）ＰＭＴ４遺伝子で得られた例示的な変異体対立遺伝子のリスト
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【０２１０】
実施例３：ＰＭＴ編集株のアルカロイド分析
対照とともにゲノム編集されたタバコ植物を、７５ＰＰＭ肥料を用いて、温室で、１０インチポットで成長させる。開花段階では、植物を摘花し、摘花２週間後、上部から３番目、４番目、および５番目の葉からの葉身試料を収集し、アルカロイドレベルを測定する（表６Ａ〜表６Ｃを参照されたい）。この測定は、ＣＯＲＥＳＴＡ法第６２号、ガスクロマトグラフィー分析によるタバコおよびタバコ製品中のニコチンの決定（２００５年２月）に従う方法、ならびに連邦登録第６４巻、第５５号、１９９９年３月２３日（第７４巻、第４号、２００９年１月７日修正）に公開された、疾病管理予防センターの無煙タバコ製品中のニコチン、総水分およびｐＨの分析のためのプロトコルに定義されている方法を使用する。
【０２１１】
簡潔には、内部標準物を含有する有機溶媒中への液体／液体抽出を使用して、約０．５ｇのタバコを抽出し、炎イオン化検出（ＦＩＤ）を伴うガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析する。結果は、そのまま、または乾燥重量基準のいずれかで、重量パーセント（重量％）として報告することができる。乾燥重量基準でデータを報告するには、オーブン揮発物（ＯＶ）決定が必要である。特に明記しない限り、本明細書に示される総アルカロイドレベルもしくは個々のアルカロイドレベルまたはニコチンレベルは、乾燥重量基準である（例えば、総アルカロイドのパーセントまたはニコチンのパーセント）。
【０２１２】
植物はまた、畑に植えられ、収穫され、乾燥タバコ中のアルカロイドおよびＴＳＮＡレベルについて試験される。葉の収量と葉の等級の両方も、ＰＭＴ編集植物について評価する。さらに、個々のＰＭＴ遺伝子の異なる変異体の組み合わせが生成され、試験される（例えば、単一変異体、二重変異体、三重変異体、または四重変異体）。
【０２１３】
実施例４：五重ｐｍｔノックアウト変異体を他の低アルカロイドタバコ植物と比較すること
五重ｐｍｔノックアウト変異株ＣＳ１５（ＮＬＭ（Ｐｈ  Ｐｈ）背景、遺伝子型については、表４Ｅを参照）を、ＰＭＴ  ＲＮＡｉ導入遺伝子株（ＶＡ３５９背景、米国特許第２０１５／０３２２４５１号に記載）、および低ニコチンＫＹ１７１（「ＬＮ  ＫＹ１７１」）品種（ｎｉｃ１およびｎｉｃ２の二重変異を有するＫＹ１７１背景）と並べて成長させる。葉を採取し、暗色直火乾燥法を介して乾燥させる。各株を、ニコチンレベルおよび総アルカロイドレベル、葉の収量、ならびに葉の品質について分析する（図２〜図５）。データは、５種全てのＰＭＴ遺伝子を編集することによって、ＰＭＴ遺伝子の活性を抑制すると、葉の収量または葉の品質を含むことなくニコチンレベルを低減することを示す。
【０２１４】
実施例５：１種以上のＰＭＴ遺伝子において、編集された変異体対立遺伝子を有するタバコ株を得ること
個々のＰＭＴ遺伝子またはＰＭＴ遺伝子の選択された組み合わせに変異を有するタバコ株は、表３に列挙されるタバコ株から得られる。五重、四重、三重、または二重変異体（それぞれ５種、４種、３種、または２種のＰＭＴ遺伝子に変異を有する）を、非変異対照株と交配し、特定のＰＭＴ変異の組み合わせについて分離子孫植物を選択すること。表７Ａ〜表７Ｅは、得られる可能性のある変異体の組み合わせを表す。各変異遺伝子は、変異に対してホモ接合性またはヘテロ接合性のいずれかであり得る。表４Ａ〜表４Ｅおよび表１０に列挙される変異体対立遺伝子の各々を使用して、単一、二重、三重、五重、または四重変異体を生成することができる。例示的な個々のｐｍｔ変異体対立遺伝子を、表９Ａ〜表９Ｅに列挙する。
【０２１５】
実施例６：ｐｍｔ変異を他の遺伝子の変異と組み合わせることによる、総アルカロイドのさらなる低減
総アルカロイドおよび／または選択された個々のアルカロイドをさらに低減するために、ｐｍｔ変異体を、タバコのアルカロイド生合成に関連する追加の遺伝子、例えば、キノレートホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＱＰＴ）またはキノリネートシンターゼ（ＱＳ）の変異と組み合わせる。簡潔には、遺伝子編集を使用して、所望のｐｍｔ変異体背景（例えば、四重または五重ｐｍｔ変異体）において選択されたＱＰＴおよび／またはＱＳ遺伝子を変異させる。得られた組み合わせのｑｐｔ／ｐｍｔまたはｑｓ／ｐｍｔ変異体では、アルカロイドレベルおよびＴＳＮＡレベルを乾燥タバコで試験する。葉の収量と葉の等級の両方も評価する。
【０２１６】
（表６Ａ）Ｋ３２６のＰＭＴ編集株におけるアルカロイドレベル（１グラムの葉の葉身当たりの重量パーセンテージ（乾燥重量）として、ここと表６Ｂ、表６Ｃ、および表７に示す）
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【０２１７】
（表６Ｂ）ＴＮ９０のＰＭＴ編集株におけるアルカロイドレベル
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【０２１８】
（表６Ｃ）ナローリーフマドール（ＮＬＭ）のＰＭＴ編集株におけるアルカロイドレベル
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【０２１９】
（表７）様々な品種における五重ｐｍｔノックアウト変異体におけるニコチンレベルおよび総アルカロイドレベルの相対変化。ニコチンおよび総アルカロイドの平均パーセントレベルは、表６Ａ〜表６Ｃに示すように、個々の株からのパーセントレベルのデータに基づいて計算される。相対変化は、五重ｐｍｔ変異体における、その対照と比べたニコチンレベルまたは総アルカロイドレベルを反映する。
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【０２２０】
（表８Ａ）５種のＰＭＴ遺伝子の様々な遺伝子型の組み合わせで得られた変異体のリスト：単一遺伝子変異
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【０２２１】
（表８Ｂ）５種のＰＭＴ遺伝子の様々な遺伝子型の組み合わせで得られた変異体のリスト：二重遺伝子変異
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【０２２２】
（表８Ｃ）５種のＰＭＴ遺伝子の様々な遺伝子型の組み合わせで得られた変異体のリスト：三重遺伝子の組み合わせ
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【０２２３】
（表８Ｄ）５種のＰＭＴ遺伝子の様々な遺伝子型の組み合わせで得られた変異体のリスト：四重遺伝子の組み合わせ
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【０２２４】
（表８Ｅ）５種のＰＭＴ遺伝子の様々な遺伝子型の組み合わせで得られた変異体のリスト：五重遺伝子の組み合わせ
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【０２２５】
実施例７：ＰＭＴゲノム編集とタバコ株の開発
さらなるＰＭＴノックアウト変異体は、異なるタバコ株において５種全てのＰＭＴ遺伝子（ＰＭＴ１ａ、ＰＭＴ１ｂ、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３、およびＰＭＴ４）を編集することによって生成される。タバコのプロトプラストは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を使用して、ゲノム編集技術（ＧＥＴ２）タンパク質をコードするプラスミドと、所望の位置でＰＭＴ遺伝子を標的とする特異的ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）とを用いてトランスフェクトされる。表９は、ＰＭＴ編集に使用されるｇＲＮＡ配列を列挙する。いくつかのｇＲＮＡ（例えば、番号６および７）は、単一のトランスフェクションで複数種のＰＭＴ遺伝子を標的とするために、一緒にプールされる。
【０２２６】
（表９）実施例７で使用したＧＥＴ２のためのガイドＲＮＡ。「Ｙ」は、ｇＲＮＡがそのＰＭＴ遺伝子を標的とすることができることを示し、一方、「−」は、ｇＲＮＡがそのＰＭＴ遺伝子を標的としないことを示す。
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【０２２７】
次いで、トランスフェクトされたプロトプラストを、１％アガロースビーズに固定し、組織培養に供する。カルスが直径約１ｍｍまで成長したら、ＴＯＭ２プレート上に撒く。カルスを、断片分析を使用して、標的位置での挿入または欠失（インデル）についてスクリーニングする。野生型対照と比較したサイズシフトを示す候補をさらなる培養のために選択し、結果としての苗条を、再び断片分析によって試験して、インデルの存在を確認する。根付いた苗条を鉢植えし、標的位置について配列決定して、正確な欠失した配列を決定する。各植物からの若葉を採取し、ｐｈｉｒｅｋｉｔを使用してＰＭＴ断片についてＰＣＲ増幅する。各株についてＰＭＴライブラリをインデックス化し、３８４株をプールし、Ｍｉｓｅｑを使用して配列決定する。
【０２２８】
ＳＮＰ分析を実行して、正確な編集ｐｍｔ変異体対立遺伝子の配列と、各ＰＭＴ遺伝子座における接合状態の両方を決定する。表１０は、様々なタバコ品種（例えば、バスマ、Ｋ３２６、カテリニ、ＴＮ９０、イズミル）の各編集された株におけるインデルの配列情報を提供する。
【０２２９】
（表１０）ＧＥＴ２を使用したゲノム編集によって生成された様々な株の変異体ｐｍｔ対立遺伝子。各編集部位（例えば、インデル）の位置は、各ＰＭＴ遺伝子の対応するｃＤＮＡ配列（例えば、ＰＭＴ１ａについて配列番号６、ＰＭＴ１ｂについて配列番号７、ＰＭＴ２について配列番号８、ＰＭＴ３について配列番号９、ＰＭＴ４について配列番号１０）上のヌクレオチド番号に対するものである。１０のヌクレオチドを超える配列について、配列番号が割り当てられ、示されている。
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【０２３０】
表１１は、表１０に提供されるように、各株内の各遺伝子の各ＰＭＴインデルの鎖長（ヌクレオチド単位）を提供する。
【０２３１】
（表１１）表１０に提供される選択された株の各インデルの鎖長（ヌクレオチド単位）
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【０２３２】
表１２Ａ〜表１２Ｅは、ゲノム配列の中央に編集部位を有する各ｐｍｔ変異体対立遺伝子由来の約９０のヌクレオチドのゲノム配列を提供する（例えば、欠失または挿入の配列部位の各側の４５のヌクレオチド）。
【０２３３】
（表１２Ａ）ＰＭＴ１ａ遺伝子で得られた例示的な変異体対立遺伝子のリスト。本明細書に列挙される変異体対立遺伝子の配列は、ゲノム配列の中央に編集部位を有する各編集ＰＭＴ１ａ遺伝子由来の約９０のヌクレオチド長のゲノム配列を表す（例えば、欠失した配列部位の各側の４５のヌクレオチド）。変異体対立遺伝子は、表１０の各株について提供されたインデルに対応する。参照対立遺伝子の配列（配列番号６）の小文字は、変異体対立遺伝子で欠失したヌクレオチドを示す。
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【０２３４】
（表１２Ｂ）ＰＭＴ１ｂ遺伝子で得られた例示的な変異体対立遺伝子のリスト。本明細書に列挙される変異体対立遺伝子の配列は、ゲノム配列の中央に編集部位を有する各編集ＰＭＴ１ｂ遺伝子由来の約９０のヌクレオチド長のゲノム配列を表す（例えば、欠失した配列部位の各側の４５のヌクレオチド）。変異体対立遺伝子は、表１０の各株について提供されたインデルに対応する。参照対立遺伝子の配列（配列番号７）の小文字は、変異体対立遺伝子で欠失したヌクレオチドを示す。
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【０２３５】
（表１２Ｃ）ＰＭＴ２遺伝子で得られた例示的な変異体対立遺伝子のリスト。本明細書に列挙される変異体対立遺伝子の配列は、ゲノム配列の中央に編集部位を有する各編集ＰＭＴ２遺伝子由来の約９０のヌクレオチド長のゲノム配列を表す（例えば、欠失した配列部位の各側の４５のヌクレオチド）。変異体対立遺伝子は、表１０の各株について提供されたインデルに対応する。参照対立遺伝子の配列（配列番号８）の小文字は、変異体対立遺伝子で欠失したヌクレオチドを示す。
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【０２３６】
（表１２Ｄ）ＰＭＴ３遺伝子で得られた例示的な変異体対立遺伝子のリスト。本明細書に列挙される変異体対立遺伝子の配列は、ゲノム配列の中央に編集部位を有する各編集ＰＭＴ３遺伝子由来の約９０のヌクレオチド長のゲノム配列を表す（例えば、欠失した配列部位の各側の４５のヌクレオチド）。変異体対立遺伝子は、表１０の各株について提供されたインデルに対応する。参照対立遺伝子の配列（配列番号９）の小文字は、変異体対立遺伝子で欠失したヌクレオチドを示す。
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【０２３７】
（表１２Ｅ）ＰＭＴ４遺伝子で得られた例示的な変異体対立遺伝子のリスト。本明細書に列挙される変異体対立遺伝子の配列は、ゲノム配列の中央に編集部位を有する各編集ＰＭＴ４遺伝子由来の約９０のヌクレオチド長のゲノム配列を表す（例えば、欠失した配列部位の各側の４５のヌクレオチド）。変異体対立遺伝子は、表１０の各株について提供されたインデルに対応する。参照対立遺伝子の配列（配列番号１０）の小文字は、変異体対立遺伝子で欠失したヌクレオチドを示す。
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【０２３８】
実施例８．ＰＭＴ編集株のアルカロイド分析
実施例７からのホモ接合ゲノム編集タバコ株、ならびに対照株を、畑で成長させる。開花段階では、植物を摘花し、摘花２週間後、植物の上部から３番目、４番目、および５番目の葉からの葉身試料を収集し、アルカロイドレベルを測定する（表１３Ａ〜表１３Ｃを参照されたい）。この測定は、ＣＯＲＥＳＴＡ法第６２号、ガスクロマトグラフィー分析によるタバコおよびタバコ製品中のニコチンの決定（２００５年２月）に従う方法、ならびに連邦登録第６４巻、第５５号、１９９９年３月２３日（第７４巻、第４号、２００９年１月７日修正）に公開された、疾病管理予防センターの無煙タバコ製品中のニコチン、総水分およびｐＨの分析のためのプロトコルに定義されている方法を使用する。
【０２３９】
内部標準を含有する有機溶媒中への液体／液体抽出を使用して、約０．５ｇのタバコを抽出し、炎イオン化検出（ＦＩＤ）を用いたガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によって分析する。結果は、そのまま、または乾燥重量基準のいずれかで、重量パーセント（重量％）として報告することができる。乾燥重量基準でデータを報告するには、オーブン揮発物（ＯＶ）決定が必要である。特に明記しない限り、本明細書に示される総アルカロイドレベルもしくは個々のアルカロイドレベルまたはニコチンレベルは、乾燥重量基準である（例えば、総アルカロイドのパーセントまたはニコチンのパーセント）。
【０２４０】
植物はまた、畑に植えられ、収穫され、乾燥タバコ中のアルカロイドおよびＴＳＮＡレベルについて試験される。葉の収量および葉の等級の両方も、ＰＭＴ編集植物について評価する。
【０２４１】
（表１３Ａ）開花２週間後のＫ３２６およびＴＮ９０  ＰＭＴ編集株のニコチン分析
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【０２４２】
（表１３Ｂ）摘花２週間後のＫ３２６およびＴＮ９０  ＰＭＴ編集株のニコチン分析
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【０２４３】
（表１３Ｃ）開花２週間後のカテリニおよびバスマＰＭＴ編集株のニコチン分析
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【０２４４】
実施例９．雄性不稔ＰＭＴ編集株の開発
ＰＭＴ編集ハイブリッド株は、実施例７由来の株を使用して開発される。ハイブリッド株は、畑で成長し、雄性不稔株の前駆体として使用される。表１４を参照。
【０２４５】
（表１４）ＰＭＴ編集極低ニコチン雄性不稔株
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【０２４６】
実施例１０．ＰＭＴ編集株は、乾燥中、カビに耐性である
いくつかの低アルカロイドタバコ株から採取されたタバコの葉を、標準的な空気乾燥法に供する。タバコの葉は、乾燥の完了後、カビについて検査される。
【０２４７】
ＬＡ  ＢＵ２１由来のタバコは、ＴＮ９０  ＬＣ、５種全てのＰＭＴ遺伝子を下方制御するＲＮＡｉ構築物を含むＴＮ９０品種、アルカロイド生合成遺伝子ＰＲ５０を下方制御するＲＮＡｉ構築物を含むＴＮ９０品種、およびＴＮ９０遺伝的背景内の４つのＰＭＴ編集株（ＣＳ４７、ＣＳ５９、ＣＳ６３、およびＣＳ６４）よりも多いカビ感染を示す。表１５ならびに図６Ａ〜図６Ｅおよび図７を参照されたい。
【０２４８】
（表１５）タバコ株ごとのカビ損傷。「Ｇ」は、カビほとんどなし／なしを指し、「Ｓ」は、若干のカビを指し、「Ｂ」は、顕著なカビを指す。カビのパーセンテージは、カビ損傷の各カテゴリーで示されるタバコの空気乾燥スティックの割合を指す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図６Ｄ】
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【図６Ｅ】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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