(57)【要約】呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を不活化し、ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質を安定化する方法、及びそれによって得られる不活化ＲＳＶウイルスが提供される。不活化ＲＳＶウイルスを含むワクチン、及びＲＳＶ感染症又はそれに関連する疾患の予防又は治療における上記ワクチンの使用も提供される。
2021531820.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
単離された呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を不活化し、前記ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質を安定化する方法であって、以下の工程：
（１）単離された生ＲＳＶを提供する工程と；
（２）約０．０１５重量％〜約０．２７重量％（Ｗ／Ｗ、以下同様）のホルムアルデヒド濃度を有するホルムアルデヒド溶液及び約０．０２重量％〜約０．３重量％（Ｗ／Ｗ、以下同様）のパラホルムアルデヒド濃度を有するパラホルムアルデヒド溶液からなる群から選択される固定剤を使用することによって、前記生ＲＳＶを固定及び不活化する工程と；
（３）工程（２）の産物から前記固定剤を除去することによって、不活化ＲＳＶを得る工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
工程（２）において、前記固定剤は、ホルムアルデヒド溶液であり、約０．０１５％〜約０．２７％、例えば、約０．０１５６％〜約０．２６６７％；例えば、約０．０１５６％〜約０．０２３４％、約０．０２３４％〜約０．０２４４％、約０．０２４４％〜約０．０３５１％、約０．０３５１％〜約０．０５２７％、約０．０５２７％〜約０．０７９％、約０．０７９％〜約０．０９７７％、約０．０９７７％〜約０．１１８５％、又は約０．１１８５％〜約０．１７７８％、又は約０．１７７８％〜約０．２６６７％のホルムアルデヒド濃度を有し；
好ましくは、前記生ＲＳＶは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約０℃〜約４０℃（例えば、約０℃〜約４℃、約４℃〜約１０℃、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約３７℃、又は約３７℃〜約４０℃；例えば、約４℃、約２５℃、又は約３７℃）の温度で固定及び不活化され；
好ましくは、前記生ＲＳＶは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、又は約３６時間）の期間にわたり固定及び不活化され；好ましくは、前記生ＲＳＶは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約１２時間の期間にわたり固定及び不活化される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（２）において、前記固定剤は、パラホルムアルデヒド溶液であり、約０．０２％〜約０．３％、例えば、約０．０２６％〜約０．２９６３％；例えば、約０．０２６％〜約０．０３９％、約０．０３９％〜約０．０５８５％、約０．０５８５％〜約０．０６２５％、約０．０６２５％〜約０．０８７８％、約０．０８７８％〜約０．１３１７％、約０．１３１７％〜約０．１９７５％、約０．１９７５％〜約０．２５％、又は約０．２５％〜約０．２９６３％のパラホルムアルデヒド濃度を有し；
好ましくは、前記生ＲＳＶは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約１０℃〜約４０℃（例えば、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約３７℃、又は約３７℃〜約４０℃、例えば、約１０℃、約２５℃、約３７℃、又は約４０℃）の温度で固定及び不活化され；
好ましくは、前記生ＲＳＶは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、又は約３６時間）の期間にわたり固定及び不活化され；好ましくは、前記生ＲＳＶは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約１２時間の期間にわたり固定及び不活化され；
好ましくは、前記生ＲＳＶは、約０．０１５％〜約０．２５％（例えば、約０．０１５６％〜約０．２５％；例えば、約０．０１５６％〜約０．０６２５％、又は約０．０６２５％〜約０．２５％）の濃度を有するパラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約２０℃〜約３０℃（例えば、約２０℃、約２５℃、又は約３０℃）の温度で約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約１２時間）の期間にわたり固定及び不活化される；又は前記生ＲＳＶは、約０．０１５６％〜約０．０６２５％の濃度を有するパラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約３５℃〜約４０℃（例えば、約３５℃、約３７℃、又は約４０℃）の温度で約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約１２時間）の期間にわたり固定及び不活化される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
工程（１）において、前記単離された生ＲＳＶは、以下の工程：（１ａ）宿主細胞にＲＳＶを感染させる工程；（１ｂ）工程（１ａ）で得られた感染した宿主細胞を前記ＲＳＶの増殖を可能にする条件下で培養する工程；及び（１ｃ）工程（１ｂ）で得られた培養された宿主細胞を収集して溶解させ、その溶解物から前記ＲＳＶを回収する工程によって提供され；
好ましくは、工程（１ｃ）の産物は、前記宿主細胞を含まない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程（３）において、前記固定剤を、透析、濾過、又は遠心分離によって除去し；
好ましくは、工程（３）において、工程（２）の産物を塩溶液に対して透析して、前記固定剤を除去し；
好ましくは、前記塩溶液は、約１００ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ、約９００ｍＭ〜約９５０ｍＭ、又は約９５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有し；
好ましくは、前記塩溶液は、約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約３００ｍＭ〜約９００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、又は約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ；例えば、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＲＳＶを保存し、前記ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質を安定化する方法であって、前記ＲＳＶを貯蔵溶液中に入れる工程を含み、ここで、前記貯蔵溶液は、約１５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約２００ｍＭ〜約１０００ｍＭ、又は約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ；例えば、約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ、約９００ｍＭ〜約９５０ｍＭ、又は約９５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する塩溶液であり；
好ましくは、前記貯蔵溶液は、約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約３００ｍＭ〜約９００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、又は約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ；例えば、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する塩溶液であり；
好ましくは、前記不活化ＲＳＶを、透析、濾過、又は遠心分離によって前記貯蔵溶液中に入れる、方法。
【請求項７】
前記ＲＳＶを塩溶液に対して透析することによって、前記ＲＳＶを貯蔵溶液中に入れ；ここで、前記塩溶液は、約１５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約２００ｍＭ〜約１０００ｍＭ、又は約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ；例えば、約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ、約９００ｍＭ〜約９５０ｍＭ、又は約９５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有し；
好ましくは、前記塩溶液は、約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約３００ｍＭ〜約９００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、又は約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ；例えば、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有し；
好ましくは、前記ＲＳＶを、約６時間〜約２４時間（例えば、約１２時間〜約２４時間、約１２時間〜約２０時間、又は約１６時間〜約２０時間；例えば、約１８時間）の期間にわたり塩溶液に対して透析する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＲＳＶは、不活化ウイルスであり；
好ましくは、前記方法を使用して、不活化ＲＳＶが保存され、前記不活化ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質が安定化され；
好ましくは、前記不活化ＲＳＶは、以下の工程：
（ｉ）単離された生ＲＳＶを提供する工程と；
（ｉｉ）固定剤を使用することによって前記生ＲＳＶを固定及び不活化する工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の産物から前記固定剤を除去することによって、不活化ＲＳＶを得る工程と；
によって提供され、
好ましくは、工程（ｉｉ）において、前記固定剤は、ホルムアルデヒド溶液、パラホルムアルデヒド溶液、グルタルアルデヒド溶液、及びβ−プロピオラクトン溶液からなる群から選択され、好ましくは、前記固定剤は、ホルムアルデヒド溶液又はパラホルムアルデヒド溶液であり；
好ましくは、前記不活化ＲＳＶは、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によって提供される、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
以下の工程：
（１）単離された生ＲＳＶを提供する工程と；
（２）固定剤を使用することによって前記生ＲＳＶを固定及び不活化する工程と；
（３）塩溶液を使用することによって工程（２）の産物を透析して、前記不活化ＲＳＶを含む貯蔵溶液を得る工程と；
を含み、ここで、工程（３）において、前記塩溶液は、約１５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約２００ｍＭ〜約１０００ｍＭ、又は約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ；例えば、約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ、約９００ｍＭ〜約９５０ｍＭ、又は約９５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有し；
好ましくは、前記塩溶液は、約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約３００ｍＭ〜約９００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、又は約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ；例えば、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
工程（２）において、前記固定剤は、ホルムアルデヒド溶液であり；
好ましくは、ホルムアルデヒドの濃度は、約０．２７重量％以下、例えば、約０．２６６７％以下であり；
好ましくは、前記生ＲＳＶは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約０℃〜約４０℃（例えば、約０℃〜約４℃、約４℃〜約１０℃、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約３７℃、又は約３７℃〜約４０℃、例えば、約４℃、約２５℃、又は約３７℃）の温度で固定及び不活化され；
好ましくは、前記生ＲＳＶは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、又は約３６時間）の期間にわたり固定及び不活化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
工程（２）において、前記固定剤は、パラホルムアルデヒド溶液であり；
好ましくは、パラホルムアルデヒドの濃度は、約０．３重量％以下、例えば、約０．２９６３％以下であり；
好ましくは、前記生ＲＳＶは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約１０℃〜約４０℃（例えば、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約３７℃、又は約３７℃〜約４０℃；例えば、約１０℃、約２５℃、約３７℃、又は約４０℃）の温度で固定及び不活化され；
好ましくは、前記生ＲＳＶは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、又は約３６時間）の期間にわたり固定及び不活化される、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
ＲＳＶを含む前記貯蔵溶液を、約０℃〜約４０℃（例えば、約０℃〜約４℃、約４℃〜約１０℃、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約３７℃、又は約３７℃〜約４０℃；例えば、約４℃、約２５℃、又は約３７℃）の温度で保存する工程を更に含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法によって作製された及び／又は請求項６〜１２のいずれか一項に記載の方法によって保存された、不活化ＲＳＶ。
【請求項１４】
請求項１３に記載の不活化ＲＳＶと、任意に、薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤（例えば、アジュバント）とを含むワクチン。
【請求項１５】
ワクチンを作製する方法であって、請求項１３に記載の不活化ＲＳＶと、薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤（例えば、アジュバント）とを混合することを含む、方法。
【請求項１６】
被験体におけるＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患（例えば、小児肺炎等の肺炎）を予防、治療、又は抑止するワクチンの製造における、請求項１３に記載の不活化ＲＳＶの使用であって、
好ましくは、前記被験体は、ヒト等の哺乳動物である、使用。
【請求項１７】
被験体におけるＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患（例えば、小児肺炎等の肺炎）を予防、治療、又は抑止する方法であって、それを必要とする被験体に請求項１３に記載の不活化ＲＳＶ又は請求項１４に記載のワクチンを有効量、投与することを含む、方法。
【請求項１８】
被験体におけるＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患（例えば、小児肺炎等の肺炎）を予防、治療、又は抑止するのに使用される、請求項１３に記載の不活化ＲＳＶ又は請求項１４に記載のワクチン。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ウイルス学及び免疫学の分野に関する。特に、本出願は、単離された呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を不活化し、ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質を安定化する方法に関する。さらに、本出願はまた、ＲＳＶを保存し、ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質を安定化する方法に関する。本出願はまた、本発明の方法によって作製及び／又は保存された不活化ＲＳＶを含むワクチン、並びにＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患の予防又は治療のための上記ワクチンの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ヒト呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）は、１９５０年代に発見されて以来、乳幼児における下気道感染症の最も主要な病原体である。米国では、ＲＳＶは１歳未満の乳児における主な入院の原因であり（非特許文献１）、５歳未満の小児における外来予約の主な理由の１つである（非特許文献２）。世界的に、ＲＳＶによって引き起こされる下気道感染症の症例は毎年３０００万件超に上り、３００万人超が入院を必要とする。ＲＳＶは、５歳未満の小児における最も一般的な入院の原因である（非特許文献３）。気管支及び肺異形成症、先天性心疾患、並びに免疫不全を伴う未熟児及び乳幼児におけるＲＳＶ感染率は、５０％〜７０％ほどの高さである（非特許文献４）。ＲＳＶに関連して毎年１６００００件〜６０００００件の小児死亡がある（非特許文献５、非特許文献６）。ＲＳＶに感染した乳幼児の場合の入院期間は最長２．５ヶ月となる場合があり、それに起因する関連医療費は、米国では年間３億６０００万米ドル〜５億７０００万米ドルほどの高さになり得る（非特許文献７）。高齢者もＲＳＶに罹りやすい。ＲＳＶ感染症を原因とする毎年の高齢者の死亡数は１２０００件を上回り、これは同じ人口におけるインフルエンザ死亡率の約３分の１である（非特許文献８、非特許文献９）。中国では、国内で開発されたＲＳＶ診断試薬が不足しているため、高いコストのためにＲＳＶ検査を推進することができない。これは中国におけるＲＳＶの蔓延につながり、その有害性はまだ完全に理解されていない。しかしながら、中国の幾つかの地域での研究から、ＲＳＶ感染症も中国の小児における下気道感染症の有力な原因であることが分かった（非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２）。
【０００３】
１８６０年代に、ＦＩ−ＲＳＶ（ホルマリン不活化全ウイルスワクチン、筋肉内注射、アジュバントとしてアルミニウムを使用）の防御効率が乳幼児において評価された。しかしながら、これらの結果から、上記ワクチンが後の自然ＲＳＶ感染症に対する防御を欠いており、疾患の重症度の増加すら引き起こすことが分かった。ワクチンが疾患の重症度の増加を引き起こしたという事実は、ＲＳＶワクチンの開発を著しく妨げた。これまでのところ、効果的な防御をもたらし得る抗ＲＳＶワクチンは存在しない。現在、ＲＳＶ融合タンパク質を認識する中和抗体（パリビズマブ、商品名：シナジス）だけが唯一、新生児における受動免疫を引き起こし、新生児における発生率を低下させることができる。シナジスの適用は、臨床的防御のためにＲＳＶ−Ｆタンパク質に結合する中和モノクローナル抗体を使用することができ、Ｆタンパク質上に効果的な中和活性部位が存在することを示している。Ｆタンパク質はウイルスの表面上にあり、ウイルスの侵入及び合胞体形成に必要である。したがって、Ｆタンパク質は、抗ＲＳＶワクチンを開発し、予防抗体及び防御抗体をスクリーニングするのに重要な標的タンパク質である。
【０００４】
ＲＳＶは、パラミクソウイルス科のニューモウイルス属に属する一本鎖非分節マイナス鎖ＲＮＡウイルスである。そのゲノムは１５２２２ヌクレオチドを有し、１０個の主要なタンパク質をコードしており、中でも、Ｆタンパク質（融合タンパク質）は５７４アミノ酸の全長を有するＮ−グリコシル化Ｉ型膜貫通型糖タンパク質であり、主要な膜貫通型タンパク質として、Ｆタンパク質はＲＳＶ感染過程における重要な表面分子である。Ｆタンパク質によって惹起される膜融合の機序及び過程はまだ明らかになっていない。McLellanらは、哺乳動物発現系を使用することにより、安定したｐｏｓｔ−Ｆタンパク質構造物を取得した（非特許文献１３）。ｐｒｅ−Ｆタンパク質については、その構造が不安定であり、多くの中間体が存在するため、その結晶を作製することによってｐｒｅ−Ｆタンパク質の構造を研究することは非常に困難である。McLellanら（同書）は、既知の構造を有するＨＰＩＶ３のｐｒｅ−Ｆタンパク質を使用して、ＲＳＶのｐｒｅ−Ｆタンパク質の構造をシミュレートして予測し、ＲＳＶのＦタンパク質がｐｒｅ−Ｆコンフォメーションを有し得ることを提唱した。さらに、McLellanら（同書）はまた、Ｆタンパク質が標的細胞に結合した後に、そのコンフォメーションがプレフュージョンＦタンパク質（プレフュージョンＦ、ｐｒｅ−Ｆ）の高エネルギー準安定状態のコンフォメーションからポストフュージョンＦタンパク質（ポストフュージョンＦ、ｐｏｓｔ−Ｆ）の高度に安定したコンフォメーションに変化し、それによりウイルス膜と細胞膜との融合が引き起こされることを提唱した。準安定のｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び安定したｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションの自由エネルギーは大きく異なることから、膜融合の過程は不可逆的となる。
【０００５】
さらに、ｐｒｅ−Ｆタンパク質及びｐｏｓｔ−Ｆタンパク質のコンフォメーションにおける中和エピトープも特定されている。これらの結果から、ｐｒｅ−Ｆタンパク質及びｐｏｓｔ−Ｆタンパク質はタンパク質表面の約５０％を共有し、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションでは、主にサイトφ等の高い中和活性を有するエピトープ（強い中和エピトープ）が分布しているのに対して、ｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションは、主にサイトＩＩ及びサイトＩＶ等のより弱い中和活性を有するエピトープ（中和力の弱いエピトープ）を含むことが分かる（図１を参照）。
【０００６】
これらの研究結果から、ｐｒｅ−Ｆタンパク質は、ｐｏｓｔ−Ｆタンパク質と比較してより一層強力な中和エピトープを有するため、ワクチンとして使用するのにより高い可能性を有することが分かる。しかしながら、ｐｒｅ−Ｆタンパク質は準安定状態にあり、安定したｐｏｓｔ−Ｆタンパク質へと容易に変換されるため、ｐｒｅ−Ｆタンパク質から効果的なワクチンを開発するに当たって依然として大きな困難及び課題がある。不活化ＲＳＶのワクチンとしての有効性を改善するために、単離された不活化ＲＳＶにおいてｐｒｅ−Ｆタンパク質を発生させ、安定化し、そして維持する方法が当該技術分野で必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】D.K. Shay, R.C. Holman. et al., JAMA, 282 (1999) 1440-1446
【非特許文献２】C.B. Hall, G.A. Weinberg, et al., N Engl J Med, 360 (2009) 588-598
【非特許文献３】H. Nair, W.A. Brooks, et al., Lancet, 378 (2011) 1917-1930
【非特許文献４】A.C. Cooper, N.C. Banasiak, P.J. Allen, Pediatr Nurs, 29 (2003) 452-456
【非特許文献５】T.S. Howard, L.H. Hoffman, et al. J Pediatr, 137 (2000) 227-232
【非特許文献６】S. Leader, K. Kohlhase. J Pediatr, 143 (2003) S127-132
【非特許文献７】E.A. Simoes. Lancet, 354 (1999) 847-852
【非特許文献８】A.R. Falsey, P.A. Hennessey, et al. N Engl J Med, 352 (2005) 1749-1759
【非特許文献９】W.W. Thompson, D.K. Shay, E. Weintraub, et al. JAMA, 289 (2003) 179-186
【非特許文献１０】Xu Guanren, Sun Songwen, Xu Xuqing, et al. Journal of Disease Control, 4 (2000) 37-39
【非特許文献１１】Xie Jianping, Xie Jianping, He Cuijuan, et al. Chinese Journal of Pediatrics, 35 (1997) 402-403
【非特許文献１２】Zhu Runan, Deng Jie, Wang Fang, et al. 21 (2003) 25-28
【非特許文献１３】J.S. McLellan, M. Chen, J.S. Chang, et al. J Virol, 84 (2010) 12236-12244
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明においては、特段の指定がない限り、本明細書で使用される科学用語及び技術用語は、当業者により一般的に理解される意味を有する。さらに、本明細書で使用される細胞培養、分子遺伝学、核酸化学、及び免疫学の実験室手順は全て、対応する分野で広く使用されている常用の手順である。一方で、本発明をより良く理解するために、関連する用語の定義及び説明を以下に示す。
【０００９】
本明細書で使用される場合に、「ＲＳＶ融合タンパク質」又は「Ｆタンパク質」という用語は、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）の融合タンパク質（Ｆタンパク質）を指し、これは当業者に十分に知られており、その例示的なアミノ酸配列は、例えば、ＮＣＢＩ  ＧＥＮＢＡＮＫデータベースのアクセッション番号：Ｐ０３４２０を参照することができる。文脈において、「ＲＳＶ融合タンパク質」、「融合タンパク質」、及び「Ｆタンパク質」は、区別なく使用される。
【００１０】
本明細書で使用される場合に、Ｆタンパク質のアミノ酸配列について言及するとき、そのアミノ酸配列は、配列番号１に示される配列を使用することによって記載される。例えば、「Ｆタンパク質のアミノ酸残基１９６〜２０９」という表現は、配列番号１に示されるポリペプチドのアミノ酸残基１９６〜２０９を指す。しかしながら、当業者は、Ｆタンパク質のアミノ酸配列において、突然変異又は変異（限定されるものではないが、種々の遺伝子型又はサブタイプのＦタンパク質等の置換、欠失、及び／又は付加を含む）が、その生物学的機能に影響を与えることなく自然発生し得る又は人工的に導入され得ることを理解している。したがって、本発明において、「Ｆタンパク質」という用語は、例えば、配列番号１に示される配列及びその天然変異体又は人工変異体を含む、全てのそのような配列を含むものとする。さらに、Ｆタンパク質の配列断片を記載する場合に、その配列断片には、配列番号１の配列断片だけでなく、その天然変異体又は人工変異体における対応する配列断片も含まれる。例えば、「Ｆタンパク質のアミノ酸残基１９６〜２０９」という表現には、配列番号１のアミノ酸残基１９６〜２０９及びその（天然又は人工）変異体における対応する断片が含まれる。本発明によれば、「対応する配列断片」又は「対応する断片」という表現は、配列が最適にアラインメントされた場合、すなわち、最高の同一性のパーセンテージが得られるように配列がアラインメントされた場合と比較して同等の配列の位置に位置する断片を指す。
【００１１】
以前の研究により、Ｆタンパク質は、少なくとも１つの一定のコンフォメーション、ｐｏｓｔ−Ｆを有することが示された。パラインフルエンザウイルス（ＰＩＶ）のＦタンパク質の研究結果と併せて、McLellanらは、ＲＳＶのＦタンパク質がｐｒｅ−Ｆコンフォメーションを有する可能性があると推測した（McLellan et al. (2010), J Vriol, 84: 12236-12244）。通常の状況では、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションは不安定であり、安定したｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションへと自発的に変形することとなる。したがって、細胞から発現されて精製されたＦタンパク質は、主としてｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションで存在し、不活化ＲＳＶでも、Ｆタンパク質は、主としてｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションで存在する。
【００１２】
本明細書で使用される場合に、「ｐｒｅ−Ｆタンパク質」という用語は、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションで存在するＦタンパク質を指す。本明細書で使用される場合に、「ｐｏｓｔ−Ｆタンパク質」という用語は、ｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションで存在するＦタンパク質を指す。ｐｒｅ−Ｆタンパク質、ｐｏｓｔ−Ｆタンパク質、及びそれらのコンフォメーションのより詳細な説明については、McLellan et al. (2010), J Vriol, 84: 12236-12244、McLellan et al. (2013), Science, 340: 1113-1117、McLellan et al. (2015), Curr Opin Virol, 11: 70-75、中国特許出願公開第２０１４８００１３９２７．７号、及び国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０７３５０５号（これらの全文は、あらゆる目的のために引用することにより本明細書の一部をなす）を参照されたい。文脈において、「ｐｒｅ−Ｆ」と「プレフュージョン」とは区別なく使用され、「ｐｏｓｔ−Ｆ」と「ポストフュージョン」とは区別なく使用される。
【００１３】
本明細書で使用される場合に、「ｐｒｅ−Ｆタンパク質を安定化する」という表現は、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のｐｏｓｔ−Ｆタンパク質への変換を少なくとも部分的に阻止、低減、又は遅延させることを指す。さらに、この表現はまた、Ｆタンパク質のｐｒｅ−Ｆコンフォメーションを可能な限り大部分維持して、そのｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションへの変換を回避することを指す。
【００１４】
ウイルスの最も重要な表面構造タンパク質の１つとして、Ｆタンパク質は、その表面上に多数の中和抗体認識エピトープを有している。ＲＳＶのＦタンパク質の現在知られている中和抗体は、主として以下のエピトープを標的とする（J.S. McLellan, Y. Yang, et al. J Virol, 85 (2011) 7788-7796、及びM. Magro, D. Andreu, et al. al. J Virol, 84 (2010) 7970-7982）。
【００１５】
サイトＩＩエピトープ：サイトＩＩエピトープに対する抗体には、市販の予防的モノクローナル抗体のシナジス、並びにその同等の誘導体であるモタビズマブ及び４７Ｆが含まれる。これらは、主としてＦタンパク質のアミノ酸２５５〜２７５を認識する。McLellanら（非特許文献１３）は、モノクローナル抗体モタビズマブとＦタンパク質ペプチドのアミノ酸２５４〜２７７との複合体の結晶構造を分析することにより、この領域が「ヘリックスターンヘリックス」二次構造を形成することを確認した。その結晶構造から、モノクローナル抗体モタビズマブが「ヘリックスターンヘリックス」構造物の一方の端部に結合し、２６８位のＡｓｎ及び２７２位のＬｙｓに水素結合及びイオン結合を作用させることが分かった。更なる研究では、これらの２つの位置での突然変異が抗体逃避を引き起こし得ることが示された。モタビズマブによって結合されるサイトＩＩエピトープの構造は、ｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションでは十分にインタクトであり、抗体結合部位は完全に露出していた。モタビズマブ及びｐｏｓｔ−Ｆタンパク質の構造から、モノクローナル抗体のシナジス及びモタビズマブが中和活性を有する機構が明らかとなった。ＲＳＶのｐｒｅ−Ｆタンパク質の構造のシミュレーションにより、エピトープはｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションの内側にあり、ｐｒｅ−Ｆタンパク質の表面に露出し得ないことが分かった。Grahamらにより、モノクローナル抗体のシナジス及びモタビズマブはＲＳＶと細胞との融合のみを阻害することができるにすぎず、ＲＳＶの吸着を阻害することはできないことが確認された（J.S. McLellan, Y. Yang, et al. J Virol, 85 (2011) 7788-7796、J.S. McLellan, M. Chen, A. Kim, et al. Nat Struct Mol Biol, 17 (2010) 248-250）。
【００１６】
サイトＩエピトープ：サイトＩエピトープを認識する抗体には、Ｆタンパク質のシステインリッチ領域を認識する１３１−２ａが含まれる。そのような抗体はＲＳＶ感染の５０％までを妨げることから、該エピトープが翻訳後の不均一性を有すること又はこれらの抗体が間接的な作用（例えば、ウイルスの凝集）による中和作用を有することが示される。さらに、これらの抗体は、標的細胞へのウイルスの吸着を部分的に遮断する。サイトＩエピトープは、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションではウイルスの細胞膜近くにあるが、ｐｏｓｔ−Ｆタンパク質のコンフォメーションでは頂点に位置している。
【００１７】
サイトＩＶエピトープ：サイトＩＶエピトープは、主としてＦタンパク質のアミノ酸４２２〜４３８に関与している１９及び１０１Ｆ等のモノクローナル抗体の標的である。このエピトープは、Ｆタンパク質中の比較的保存された領域内に位置している。McLellanら（J.S. McLellan, Y. Yang, et al. J Virol, 85 (2011) 7788-7796）は、１０１Ｆタンパク質ペプチド及びＦタンパク質ペプチド（アミノ酸４２２〜４３８）の複合体の結晶構造を特定した。これらの結果から、サイトＩＶエピトープのコア領域はアミノ酸４２７〜４３７であることが分かった。
【００１８】
サイトφエピトープ：サイトφエピトープは、ｐｒｅ−Ｆ特異抗体Ｄ２５、ＡＭ２２、及び５Ｃ４の標的である。McLellanら（McLellan J.S., Chen M, et al. Science 2013, 340:1113-1117）は、ｐｒｅ−Ｆ特異抗体とｐｒｅ−Ｆとの複合体の構造を分析し、このエピトープがＦタンパク質の緩い領域（アミノ酸６２〜６９）及びＦタンパク質のα４ヘリックス（アミノ酸１９６〜２０９）に含まれることを見出した。さらに、これらの研究結果から、Ｆタンパク質がｐｒｅ−Ｆコンフォメーションからｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションに変形するときに、エピトープは少なくとも５Åシフトし、α４ヘリックスは１８０゜変換されることも分かった。したがって、このエピトープを認識した抗体は、ｐｒｅ−Ｆ特異抗体であり、ｐｏｓｔ−Ｆタンパク質を認識することはできなかった。
【００１９】
以前の研究結果（McLellan J.S., Chen M, et al. Science 2013, 340: 1113-1117）から、サイトφエピトープは高い中和活性を有し、主としてｐｒｅ−Ｆコンフォメーションに分布しており、サイトＩＩエピトープ及びサイトＩＶエピトープは比較的弱い中和活性を有し、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションとｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションとの両方に分布していることが分かった（図１）。
【００２０】
本明細書で使用される場合に、「エピトープ」という用語は、免疫グロブリン又は抗体によって特異的に結合される抗原上の部位を指す。「エピトープ」は、当該技術分野では「抗原決定基」とも呼ばれる。エピトープ又は抗原決定基は、通常、アミノ酸又は炭水化物又は糖側鎖等の分子の化学的に活性な表面基からなり、通常、特定の３次元構造的特徴及び特定の電荷特徴を有する。例えば、エピトープは、通常、「線状」又は「立体構造」であり得る固有の空間的コンフォメーションで、少なくとも３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、又は１５個の連続的アミノ酸又は不連続的アミノ酸を含む。例えば、Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66, G. E. Morris, Ed. (1996)を参照のこと。線状エピトープでは、タンパク質と該タンパク質と相互作用する分子（例えば、抗体）との間の全ての相互作用点が、タンパク質の一次アミノ酸配列に沿って線状に存在する。立体構造エピトープでは、相互作用点が、互いに分離されたタンパク質アミノ酸残基にわたって存在する。
【００２１】
本明細書で使用される場合に、「特異的結合」という用語は、抗体と該抗体が向けられる抗原との間の反応等の２つの分子間の非無作為な結合反応を指す。幾つかの実施の形態では、或る特定の抗原に特異的に結合する抗体（すなわち、抗体は或る特定の抗原に対して特異性を有する）は、抗体が約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍ未満の親和性（ＫＤ）で抗原に結合することを指す。
【００２２】
本明細書で使用される場合に、「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の解離平衡定数を指し、これを使用して、抗体と抗原との間の結合親和性が説明される。解離平衡定数が小さいほど、抗体−抗原結合は強くなり、抗体と抗原との間の親和性は高くなる。一般に、抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）を使用してＢＩＡＣＯＲＥ機器で測定される、約１０−５Ｍ未満、例えば、約１０−６Ｍ、１０−７Ｍ、１０−８Ｍ、１０−９Ｍ、又は１０−１０Ｍ未満、又はそれ以下の解離平衡定数（ＫＤ）で抗原に結合する。
【００２３】
本明細書で使用される場合に、「中和エピトープ」という用語は、体内のウイルスに対する中和活性を誘導することができるエピトープを指す。そのようなエピトープは、免疫系（例えば、抗体）によるウイルスタンパク質の認識に関与するだけでなく、通常、身体の免疫系を誘導して、中和活性を有する抗体（すなわち、中和抗体）を産生する。本明細書で使用される場合に、「中和抗体」は、標的ウイルスの毒性（例えば、細胞に感染する能力）を大幅に低減又は完全に阻止することができる抗体を指す。一般的に言えば、中和抗体は、標的ウイルス上の中和エピトープを認識して結合し、標的ウイルスが被験体の細胞に侵入／感染するのを防ぐことができる。本明細書で使用される場合に、エピトープの中和活性は、ウイルスに対する中和活性を生ずるようにエピトープが身体を誘導する能力を指す。エピトープの中和活性が高いほど、ウイルスに対する中和活性を生ずるようにエピトープが身体を誘導する能力は強くなる。
【００２４】
本明細書で使用される場合に、「宿主細胞」という用語は、ＲＳＶが感染して内部でＲＳＶの増殖を可能にすることができる細胞を指す。そのような宿主細胞は、接着細胞又は浮遊細胞であり得て、初代細胞及び樹立細胞系統を含む。そのような宿主細胞の例には、限定されるものではないが、哺乳動物（例えば、齧歯類及び霊長類、例えば、マウス、サル、及びヒト）の呼吸器上皮細胞、肝臓細胞、肺細胞、腎臓細胞、頸部細胞、卵巣細胞、骨細胞、乳腺細胞、横紋筋細胞、胃上皮細胞、皮膚表皮細胞、線維芽細胞、及び前立腺細胞、例えば、Ｈｅｐ−２細胞、ＣＮＥ１細胞、ＣＮＥ２細胞、ＢＥＬ−７４０４細胞、ＢＥＬ−７４０２細胞、ＱＳＧ−７７０１細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、Ｈｕｈ７細胞、Ｈｕｈ７．５．１細胞、ＳＳＭＣ−７７２１細胞、ＢＮＬ−ＨＣＣ細胞、Ｈｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−７３９細胞、ＴＩＢ７５細胞、Ａ５４９細胞、Ｈ４８０細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４４１細胞、Ｈ３６８細胞、Ｈ１３３５細胞、Ｈ２３細胞、Ｌ９２９細胞、２９３ＦＴ細胞、２９３Ｔ細胞、２９３β５細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ−ＭＫＬ細胞、ＲＫ−１３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＺＭ−ｂｌ細胞、ＳＫ−ＯＶ−３細胞、Ｕ２−ＯＳ細胞、１４３Ｂ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｔ−４７Ｄ細胞、ＲＤ細胞、ＢＧＣ−８２３細胞、ＡＧＳ細胞、Ａ４３１ＮＳ細胞、ＭｅＷｏ細胞、ＬＮＣａｐ細胞、ＲＭ１細胞、及びＰＣ−３細胞が含まれる。
【００２５】
本明細書で使用される場合に、「同一性」という用語は、２つのポリペプチド間又は２つの核酸間の一致度を指す。比較される２つの配列が或る特定の部位に同じ単量体サブユニットの塩基又はアミノ酸を有する（例えば、２つのＤＮＡ分子の各々が或る特定の部位にアデニンを有する又は２つのポリペプチドの各々が或る特定の部位にリジンを有する）場合に、２つの分子はその部位で同一である。２つの配列間の同一性のパーセントは、比較される部位の総数に対する、２つの配列が共有する同一の部位の数に１００を掛けた関数である。例えば、２つの配列の１０個の部位の６個が一致している場合に、これらの２つの配列は６０％の同一性を有する。例えば、ＤＮＡ配列：ＣＴＧＡＣＴとＣＡＧＧＴＴとは、５０％の同一性を共有する（６個の部位の３個が一致している）。一般的に、２つの配列の比較は、最大の同一性が得られるように行われる。そのようなアラインメントは、例えばNeedlemanらの方法（J. Mol. Biol. 48:443-453, 1970）に基づくＡｌｉｇｎプログラム（DNAstar, Inc.社）等のコンピュータープログラムを使用することにより実施することができる。２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントはまた、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているE. Meyers及びW. Millerのアルゴリズム（Comput. Appl. Biosci., 4:11-17 (1988)）を使用して、ＰＡＭ１２０残基重み付け表を使用して、１２のギャップ長ペナルティー及び４のギャップペナルティーで決定することもできる。さらに、２つのアミノ酸配列間の同一性のパーセントは、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（http://www.gcg.comで入手可能）内のＧＡＰプログラムに組み込まれているNeedleman及びWunschのアルゴリズム（J. Mol. Biol. 48:444-453 (1970)）によって、Ｂｌｏｓｓｕｍ  ６２行列又はＰＡＭ２５０行列のいずれかを使用して、１６、１４、１２、１０、８、６又は４のギャップ重み付け及び１、２、３、４、５、又は６の長さ重み付けで決定することができる。
【００２６】
本明細書で使用される場合に、「保存的置換」という用語は、アミノ酸配列を含むタンパク質／ポリペプチドの本質的な特性に不利な影響又は変化を及ぼさないアミノ酸置換を指す。例えば、保存的置換は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介型突然変異誘発等の当該技術分野で知られている標準的な技術によって導入され得る。保存的アミノ酸置換には、アミノ酸残基が、類似の側鎖を有する別のアミノ酸残基、例えば、対応するアミノ酸残基に物理的又は機能的に類似した（例えば、類似のサイズ、形状、電荷、共有結合又は水素結合を形成する能力を含む化学的特性等を有する）残基で置換される置換が含まれる。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当該技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖を有するアミノ酸（例えば、リジン、アルギニン及びヒスチジン）、酸性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アスパラギン酸及びグルタミン酸）、非荷電極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖を有するアミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖を有するアミノ酸（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖を有するアミノ酸（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）が含まれる。したがって、一般に、保存的置換とは、対応するアミノ酸残基を同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換することを指す。アミノ酸の保存的置換を特定する方法は、当該技術分野で十分に知られている（例えば、Brummell et al., Biochem. 32: 1180-1187 (1993)、Kobayashi et al., Protein Eng. 12(10): 879-884 (1999)、及びBurks et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 412-417 (1997)が参照され、これらは、引用することにより本明細書の一部をなす）。
【００２７】
本明細書で使用される場合に、「モノクローナル抗体」及び「ｍＡｂ」という用語は同じ意味を有し、区別なく使用され得る。「ポリクローナル抗体」及び「ｐＡｂ」という用語は同じ意味を有し、区別なく使用され得る。「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は同じ意味を有し、区別なく使用され得る。さらに、本発明では、アミノ酸は、通常、当該技術分野で十分に知られる１文字及び３文字の略語によって表される。例えば、アラニンは、Ａ又はＡｌａによって表され得る。
【００２８】
本明細書で使用される場合に、「薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤」という用語は、被験体及び有効成分と薬理学的及び／又は生理学的に適合可能な担体及び／又は添加剤を指し、その担体及び／又は添加剤は、当該技術分野において十分に知られており（例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences. Edited by Gennaro AR, 19th ed. Pennsylvania: Mack Publishing Company, 1995を参照）、限定されるものではないが、ｐＨ調整剤、界面活性剤、アジュバント、イオン強度増強剤が含まれる。例えば、ｐＨ調整剤には、限定されるものではないが、リン酸緩衝液が含まれ、界面活性剤には、限定されるものではないが、陽イオン界面活性剤、陰イオン界面活性剤、又は非イオン界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０が含まれ、イオン強度増強剤には、限定されるものではないが、塩化ナトリウムが含まれる。
【００２９】
本明細書で使用される場合に、「アジュバント」という用語は、事前に又は抗原と一緒に体内に送達されると、抗原に対する身体の免疫応答を増強することができる又は免疫応答の種類を変えることができる非特異的免疫増強剤を指す。限定されるものではないが、アルミニウムアジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）、フロイントアジュバント（例えば、完全フロイントアジュバント及び不完全フロイントアジュバント）、コリネバクテリウム・パルバム（corynebacterium parvum）、リポ多糖、サイトカイン等を含む多くのアジュバントが存在する。フロイントアジュバントは、現在動物実験において最も一般的に使用されるアジュバントである。臨床試験では、水酸化アルミニウムアジュバントがより使用されている。
【００３０】
本明細書で使用される場合に、「有効量」という用語は、所望の効果を得る又は少なくとも部分的に得るのに十分な量を指す。例えば、疾患（例えば、ＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患）を予防する有効量は、疾患（例えば、ＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患）の発生を予防、停止又は遅延させるのに十分な量を指し、疾患を治療する有効量は、既に疾患に罹患している患者における疾患及びその合併症を治癒する又は少なくとも部分的に防ぐのに十分な量を指す。そのような有効量を決定することは、完全に当業者の能力の範囲内である。例えば、治療的使用の有効量は、治療される疾患の重症度、患者自身の免疫系の全体的な状態、患者の一般的な状態、例えば、年齢、体重及び性別、薬物の投与様式、並びに同時に投与される他の治療薬等に依存する。
【００３１】
本明細書で使用される場合に、「被験体」という用語は、哺乳動物、例えば霊長類、例えばヒトを指す。
【００３２】
本明細書で使用される場合に、「約」という用語は、測定可能な値（例えば、物質の濃度、時間、温度等）を指すときに、与えられた値の±１０％、±５％、又は±１％の範囲を包含することを意味する。或る特定の例示的な実施の形態では、「約」という用語は、与えられた値の±１０％の間の範囲を指し、例えば、約０．０１５％は、０．０１３５％〜０．０１６５％の範囲を指す。
【００３３】
多数の実験的研究の後に、本発明者らは、予想外にも、特定の固定剤（例えば、ホルムアルデヒド又はパラホルムアルデヒド）を使用し、特定の固定／不活化条件（例えば、固定剤の特定の濃度）を使用することによってＲＳＶを固定／不活化すると、従来の方法によって得られた不活化ウイルスと比較してより高い含有量のｐｒｅ−Ｆタンパク質を含んだ、特に有利な不活化ＲＳＶを得ることができる（すなわち、本発明で得られた不活化ＲＳＶにおいて、より多くのＦタンパク質がｐｒｅ−Ｆコンフォメーションで存在した）ことを見出した。一方で、特定の貯蔵条件（例えば、特定の貯蔵溶液のイオン濃度）を使用することによってＲＳＶを保存した場合に、ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質を維持及び安定化することができ、ｐｒｅ−Ｆタンパク質の含有量を新鮮な生ウイルスのレベルに近いレベルに維持することさえもできた。これは特に有利である。それというのも、このような不活化ＲＳＶは、ｐｒｅ−Ｆタンパク質中にのみ存在してｐｏｓｔ−Ｆタンパク質中には存在しないより強力な中和エピトープを提示し、それによりＲＳＶに対してより強力な中和活性を生ずるように身体が誘導されるため、ＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患（例えば、小児肺炎等の肺炎）を予防又は治療するＲＳＶに対するワクチンの開発に特に適しているからである。
【００３４】
したがって、第１の態様において、本発明は、単離された呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）を不活化し、ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質を安定化する方法であって、以下の工程：
（１）単離された生ＲＳＶを提供する工程と；
（２）約０．０１５重量％〜約０．２７重量％（Ｗ／Ｗ、以下同様）のホルムアルデヒド濃度を有するホルムアルデヒド溶液及び約０．０２重量％〜約０．３重量％（Ｗ／Ｗ、以下同様）のパラホルムアルデヒド濃度を有するパラホルムアルデヒド溶液からなる群から選択される固定剤を使用することによって、生ＲＳＶを固定及び不活化する工程と；
（３）工程（２）の産物から固定剤を除去することによって、不活化ＲＳＶを得る工程と、
を含む、方法を提供する。
【００３５】
本発明において、「単離された」という表現は、ＲＳＶが細胞（例えば、宿主細胞）中に含まれていない又は任意の他の方法で細胞（例えば、宿主細胞）中に提供されていないことを指す。
【００３６】
或る特定の好ましい実施の形態では、工程（２）において、固定剤は、ホルムアルデヒド溶液であり、約０．０１５％〜約０．２７％；例えば、約０．０１５６％〜約０．２６６７％、例えば、約０．０１５６％〜約０．０２３４％、約０．０２３４％〜約０．０２４４％、約０．０２４４％〜約０．０３５１％、約０．０３５１％〜約０．０５２７％、約０．０５２７％〜約０．０７９％、約０．０７９％〜約０．０９７７％、約０．０９７７％〜約０．１１８５％、又は約０．１１８５％〜約０．１７７８％、又は約０．１７７８％〜約０．２６６７％のホルムアルデヒド濃度を有する。幾つかの好ましい実施の形態では、ホルムアルデヒド溶液は、無機溶剤中に溶解されたホルムアルデヒドの溶液である。好ましくは、無機溶剤は、水、培地、及び緩衝液からなる群から選択される。或る特定の例示的な実施の形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００３７】
或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約０℃〜約４０℃（例えば、約０℃〜約４℃、約４℃〜約１０℃、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約３７℃、又は約３７℃〜約４０℃；例えば、約４℃、約２５℃、又は約３７℃）の温度で固定及び不活化される。
【００３８】
或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、又は約３６時間）の期間にわたり固定及び不活化される。或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約１２時間の期間にわたり固定及び不活化される。
【００３９】
或る特定の好ましい実施の形態では、工程（２）において、固定剤は、パラホルムアルデヒド溶液であり、約０．０２％〜約０．３％、例えば、約０．０２６％〜約０．２９６３％；例えば、約０．０２６％〜約０．０３９％、約０．０３９％〜約０．０５８５％、約０．０５８５％〜約０．０６２５％、約０．０６２５％〜約０．０８７８％、約０．０８７８％〜約０．１３１７％、約０．１３１７％〜約０．１９７５％、約０．１９７５％〜約０．２５％、又は約０．２５％〜約０．２９６３％のパラホルムアルデヒド濃度を有する。幾つかの好ましい実施の形態では、パラホルムアルデヒド溶液は、無機溶剤中に溶解されたパラホルムアルデヒドの溶液である。好ましくは、無機溶剤は、水、培地、及び緩衝液からなる群から選択される。或る特定の例示的な実施の形態では、緩衝液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。
【００４０】
或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約１０℃〜約４０℃（例えば、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約３７℃、又は約３７℃〜約４０℃；例えば、約１０℃、約２５℃、約３７℃、又は約４０℃）の温度で固定及び不活化される。
【００４１】
或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、又は約３６時間）の期間にわたり固定及び不活化される。或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約１２時間の期間にわたり固定及び不活化される。
【００４２】
或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、約０．０１５％〜約０．２５％（例えば、約０．０１５６％〜約０．２５％；例えば、約０．０１５６％〜約０．０６２５％、又は約０．０６２５％〜約０．２５％）の濃度を有するパラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約２０℃〜約３０℃（例えば、約２０℃、約２５℃、又は約３０℃）の温度で約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約１２時間）の期間にわたり固定及び不活化される。
【００４３】
或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、約０．０１５６％〜約０．０６２５％の濃度を有するパラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約３５℃〜約４０℃（例えば、約３５℃、約３７℃、又は約４０℃）の温度で約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約１２時間）の期間にわたり固定及び不活化される。
【００４４】
幾つかの好ましい実施の形態では、工程（１）において、単離された生ＲＳＶは、以下の工程：（１ａ）宿主細胞にＲＳＶを感染させる工程；（１ｂ）工程（１ａ）で得られた感染した宿主細胞をＲＳＶの増殖を可能にする条件下で培養する工程；及び（１ｃ）工程（１ｂ）で得られた培養された宿主細胞を収集して溶解させ、その溶解物からＲＳＶを回収する工程によって提供される。本発明において、工程（１ｃ）の産物は、宿主細胞を含まない。
【００４５】
或る特定の好ましい実施の形態では、工程（１ｃ）において、ＲＳＶを、遠心分離又は濾過によって回収し、宿主細胞を除去する。
【００４６】
或る特定の好ましい実施の形態では、宿主細胞は接着細胞である。或る特定の好ましい実施の形態では、宿主細胞は浮遊細胞である。或る特定の好ましい実施の形態では、宿主細胞は初代細胞である。或る特定の好ましい実施の形態では、宿主細胞は樹立細胞系統である。或る特定の好ましい実施の形態では、宿主細胞は、哺乳動物（例えば、齧歯類及び霊長類、例えば、マウス、サル、及びヒト）の呼吸器上皮細胞、肝臓細胞、肺細胞、腎臓細胞、頸部細胞、卵巣細胞、骨細胞、乳腺細胞、横紋筋細胞、胃上皮細胞、皮膚表皮細胞、線維芽細胞、及び前立腺細胞、例えば、Ｈｅｐ−２細胞、ＣＮＥ１細胞、ＣＮＥ２細胞、ＢＥＬ−７４０４細胞、ＢＥＬ−７４０２細胞、ＱＳＧ−７７０１細胞、ＰＬＣ／ＰＲＦ／５細胞、Ｈｕｈ７細胞、Ｈｕｈ７．５．１細胞、ＳＳＭＣ−７７２１細胞、ＢＮＬ−ＨＣＣ細胞、Ｈｅｐ３Ｂ、ＳＮＵ−７３９細胞、ＴＩＢ７５細胞、Ａ５４９細胞、Ｈ４８０細胞、Ｈ１２９９細胞、Ｈ４４１細胞、Ｈ３６８細胞、Ｈ１３３５細胞、Ｈ２３細胞、Ｌ９２９細胞、２９３ＦＴ細胞、２９３Ｔ細胞、２９３β５細胞、Ｖｅｒｏ細胞、ＢＨＫ−ＭＫＬ細胞、ＲＫ−１３細胞、ＨｅＬａ細胞、ＴＺＭ−ｂｌ細胞、ＳＫ−ＯＶ−３細胞、Ｕ２−ＯＳ細胞、１４３Ｂ細胞、ＭＣＦ−７細胞、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞、Ｔ−４７Ｄ細胞、ＲＤ細胞、ＢＧＣ−８２３細胞、ＡＧＳ細胞、Ａ４３１ＮＳ細胞、ＭｅＷｏ細胞、ＬＮＣａｐ細胞、ＲＭ１細胞、及びＰＣ−３細胞からなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、工程（１ｃ）において、培養された宿主細胞を、スパチュラで掻き取ることによって又はトリプシンでの消化によって又は濾過若しくは遠心分離によって収集する。或る特定の好ましい実施の形態では、工程（１ｃ）において、培養された宿主細胞を超音波法によって溶解する。
【００４７】
幾つかの好ましい実施の形態では、工程（３）において、固定剤を透析、濾過、又は遠心分離によって除去する。幾つかの好ましい実施の形態では、工程（３）において、固定剤を含まない溶液に対して工程（２）の産物を透析して、固定剤を除去する。
【００４８】
幾つかの好ましい実施の形態では、工程（３）において、工程（２）の産物を塩溶液に対して透析して、固定剤を除去する。或る特定の好ましい実施の形態では、塩溶液は、約１００ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約１５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭ、約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ、約９００ｍＭ〜約９５０ｍＭ、約９５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する。
【００４９】
幾つかの好ましい実施の形態では、工程（３）において、工程（２）の産物を約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約３００ｍＭ〜約９００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、又は約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ、例えば、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する塩溶液に対して透析する。
【００５０】
或る特定の例示的な実施の形態では、塩溶液は、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム又はそれらの組み合わせ）及び／又はカリウム塩（例えば、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム又はそれらの組み合わせ）を含む。或る特定の例示的な実施の形態では、塩溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である。或る特定の例示的な実施の形態では、塩溶液は、ナトリウム塩溶液（例えば、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム又はそれらの組み合わせ）である。
【００５１】
或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の方法によって得られる不活化ＲＳＶ中の保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質は、採取されたばかりの生ウイルス中のｐｒｅ−Ｆタンパク質と比較して、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％であり得る。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の方法によって得られる不活化ＲＳＶ中の保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質は、採取されたばかりの生ウイルスにおけるｐｒｅ−Ｆタンパク質と比較して、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％であり得て、上記割合は、少なくとも２４時間、例えば、少なくとも４８時間又は少なくとも７２時間にわたり維持され得る。
【００５２】
或る特定の好ましい実施の形態では、不活化ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質は、そのコンフォメーションを少なくとも２４時間、例えば、少なくとも４８時間又は少なくとも７２時間にわたり維持することができる。
【００５３】
第２の態様において、本発明は、ＲＳＶを保存し、ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質を安定化する方法であって、ＲＳＶを貯蔵溶液中に入れる工程を含み、ここで、貯蔵溶液は、約１５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約２００ｍＭ〜約１０００ｍＭ、又は約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ、約９００ｍＭ〜約９５０ｍＭ、約９５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する塩溶液である。
【００５４】
幾つかの好ましい実施の形態では、貯蔵溶液は、約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約３００ｍＭ〜約９００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、又は約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ、例えば、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する塩溶液である。
【００５５】
幾つかの好ましい実施の形態では、貯蔵溶液は、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム又はそれらの組み合わせ）及び／又はカリウム塩（例えば、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム又はそれらの組み合わせ）を含む。或る特定の例示的な実施の形態では、貯蔵溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、又は貯蔵溶液は、ナトリウム塩溶液（例えば、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム又はそれらの組み合わせ）である。
【００５６】
或る特定の好ましい実施の形態では、不活化ＲＳＶを、透析、濾過、又は遠心分離によって貯蔵溶液中に入れる。
【００５７】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＲＳＶを塩溶液に対して透析することによって、ＲＳＶを貯蔵溶液中に入れ、ここで、塩溶液は、約１５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約２００ｍＭ〜約１０００ｍＭ、又は約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ；例えば、約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ、約９００ｍＭ〜約９５０ｍＭ、約９５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する。
【００５８】
或る特定の好ましい実施の形態では、塩溶液は、約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約３００ｍＭ〜約９００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、又は約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ、例えば、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する。
【００５９】
或る特定の好ましい実施の形態では、塩溶液は、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム又はそれらの組み合わせ）及び／又はカリウム塩（例えば、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム又はそれらの組み合わせ）を含み、例えば、塩溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、又は塩溶液は、ナトリウム塩溶液（例えば、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム又はそれらの組み合わせ）である。
【００６０】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＲＳＶを、約６時間〜約２４時間（例えば、約１２時間〜約２４時間、約１２時間〜約２０時間、又は約１６時間〜約２０時間；例えば、約１８時間）の期間にわたり塩溶液に対して透析する。
【００６１】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＲＳＶは生ウイルスである。そのような実施の形態では、上記方法を使用して、生ＲＳＶが保存され、生ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質が安定化される。或る特定の好ましい実施の形態では、ＲＳＶは、宿主細胞から採取されたばかりの生ウイルスである。
【００６２】
或る特定の好ましい実施の形態では、ＲＳＶは不活化ウイルスである。そのような実施の形態では、上記方法を使用して、不活化ＲＳＶが保存され、不活化ＲＳＶ中のｐｒｅ−Ｆタンパク質が安定化される。本発明においては、ウイルスを不活化して、被験体（例えば、ヒト等の哺乳動物）の細胞に感染するその能力を消失させる方法は、化学的方法及び物理的方法を含めて当業者に十分に知られている。ウイルスを不活化するのに適切な方法には、限定されるものではないが、固定剤（例えば、アルコール（例えば、メタノール）、アルデヒド（例えば、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド）、β−プロピオラクトン、フェノール等）、熱、放射線（例えば、電磁線、Ｘ線、γ線、紫外線等）、ソラレン、メチレンブルー、オゾン等からなる群から選択される有効量の１つ以上の事項による処理が含まれる。
【００６３】
或る特定の好ましい実施の形態では、不活化ＲＳＶは、以下の工程：
（ｉ）単離された生ＲＳＶを提供する工程と；
（ｉｉ）固定剤を使用することによって生ＲＳＶを固定及び不活化する工程と；
（ｉｉｉ）工程（ｉｉ）の産物から固定剤を除去することによって、不活化ＲＳＶを得る工程と、
によって提供される。
【００６４】
幾つかの好ましい実施の形態では、工程（ｉｉ）において、固定剤は、ホルムアルデヒド溶液、パラホルムアルデヒド溶液、グルタルアルデヒド溶液、及びβ−プロピオラクトン溶液からなる群から選択される。或る特定の好ましい実施の形態では、固定剤は、ホルムアルデヒド溶液又はパラホルムアルデヒド溶液である。
【００６５】
或る特定の好ましい実施の形態では、不活化ＲＳＶは、第１の態様に記載されるＲＳＶを不活化する方法によって提供される。
【００６６】
幾つかの好ましい実施の形態では、上記方法は、以下の工程：
（１）単離された生ＲＳＶを提供する工程と；
（２）固定剤を使用することによって生ＲＳＶを固定及び不活化する工程と；
（３）工程（２）の産物を塩溶液に対して透析して、不活化ＲＳＶを含む貯蔵溶液を得る工程と、
を含み、ここで、工程（３）において、塩溶液は、約１５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約２００ｍＭ〜約１０００ｍＭ、又は約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ；例えば、約１５０ｍＭ〜約２００ｍＭ、約２００ｍＭ〜約２５０ｍＭ、約２５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ、約９００ｍＭ〜約９５０ｍＭ、約９５０ｍＭ〜約１０００ｍＭ、例えば、約１５０ｍＭ、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する。
【００６７】
或る特定の好ましい実施の形態では、塩溶液は、約３００ｍＭ〜約１０００ｍＭ（例えば、約３００ｍＭ〜約９００ｍＭ、約３００ｍＭ〜約３５０ｍＭ、約３５０ｍＭ〜約４００ｍＭ、約４００ｍＭ〜約４５０ｍＭ、約４５０ｍＭ〜約５００ｍＭ、約５００ｍＭ〜約５５０ｍＭ、約５５０ｍＭ〜約６００ｍＭ、約６００ｍＭ〜約６５０ｍＭ、約６５０ｍＭ〜約７００ｍＭ、約７００ｍＭ〜約７５０ｍＭ、約７５０ｍＭ〜約８００ｍＭ、約８００ｍＭ〜約８５０ｍＭ、又は約８５０ｍＭ〜約９００ｍＭ；例えば、約３３０ｍＭ、約５５０ｍＭ、又は約８８０ｍＭ）のイオン濃度を有する。
【００６８】
幾つかの好ましい実施の形態では、貯蔵溶液は、ナトリウム塩（例えば、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム又はそれらの組み合わせ）及び／又はカリウム塩（例えば、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム又はそれらの組み合わせ）を含み、例えば、貯蔵溶液は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）である、又は貯蔵溶液は、ナトリウム塩溶液（例えば、塩化ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム又はそれらの組み合わせ）である。
【００６９】
幾つかの好ましい実施の形態では、工程（２）において、固定剤は、ホルムアルデヒド溶液である。
【００７０】
或る特定の好ましい実施の形態では、ホルムアルデヒドの濃度は、約０．２７重量％以下、例えば、約０．２６６７％以下である。或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約０℃〜約４０℃（例えば、約０℃〜約４℃、約４℃〜約１０℃、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約３７℃、又は約３７℃〜約４０℃；例えば、約４℃、約２５℃、又は約３７℃）の温度で固定及び不活化される。或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、又は約３６時間）の期間にわたり固定及び不活化される。
【００７１】
幾つかの好ましい実施の形態では、工程（２）において、固定剤は、パラホルムアルデヒド溶液である。
【００７２】
或る特定の好ましい実施の形態では、パラホルムアルデヒドの濃度は、約０．３重量％以下、例えば、約０．２９６３％以下である。或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、パラホルムアルデヒド溶液を使用することによって約１０℃〜約４０℃（例えば、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約３７℃、又は約３７℃〜約４０℃；例えば、約１０℃、約２５℃、約３７℃、又は約４０℃）の温度で固定及び不活化される。或る特定の好ましい実施の形態では、生ＲＳＶは、ホルムアルデヒド溶液を使用することによって約６時間〜約３６時間（例えば、約６時間〜約１２時間、約１２時間〜約２４時間、又は約２４時間〜約３６時間；例えば、約６時間、約１２時間、約２４時間、又は約３６時間）の期間にわたり固定及び不活化される。
【００７３】
或る特定の好ましい実施の形態では、上記方法は、ＲＳＶを含む貯蔵溶液を約０℃〜約４０℃（例えば、約０℃〜約４℃、約４℃〜約１０℃、約１０℃〜約１５℃、約１５℃〜約２０℃、約２０℃〜約２５℃、約２５℃〜約３０℃、約３０℃〜約３５℃、約３５℃〜約３７℃、又は約３７℃〜約４０℃、例えば、約４℃、約２５℃、又は約３７℃）の温度で保存する工程を更に含む。
【００７４】
或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の方法によって保存された不活化ＲＳＶ中の保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質は、採取されたばかりの生ウイルスにおけるｐｒｅ−Ｆタンパク質と比較して、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）であり得る。或る特定の好ましい実施の形態では、本発明の方法によって保存された不活化ＲＳＶ中の保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質は、採取されたばかりの生ウイルスにおけるｐｒｅ−Ｆタンパク質と比較して、少なくとも６０％（例えば、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は１００％）であり得て、上記割合は、少なくとも２４時間、例えば、少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間にわたり維持され得る。
【００７５】
別の態様では、本発明は、第１の態様に記載される方法によって作製された及び／又は第２の態様に記載される方法によって保存された、不活化ＲＳＶを提供する。
【００７６】
別の態様では、本発明は、本発明による不活化ＲＳＶと、任意に、薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤（例えば、アジュバント）とを含むワクチンを提供する。
【００７７】
或る特定の好ましい実施の形態では、不活化ＲＳＶは、第１の態様に記載される方法によって作製される、又は不活化ＲＳＶは、第２の態様に記載される方法によって保存される、又は不活化ＲＳＶは、第１の態様に記載される方法によって作製され、第２の態様に記載される方法によって保存される。
【００７８】
本発明のワクチンを使用して、被験体におけるＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患（例えば、小児肺炎等の肺炎）を予防、治療、又は抑制することができる。
【００７９】
本発明のワクチンは、単独で又は別の薬学的活性剤（例えば、インターフェロン又はペグインターフェロン等のインターフェロン薬）と組み合わせて使用することができる。
【００８０】
別の態様では、本発明は、ワクチンを作製する方法であって、本発明による不活化ＲＳＶと、薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤（例えば、アジュバント）とを混合することを含む、方法を提供する。
【００８１】
或る特定の好ましい実施の形態では、不活化ＲＳＶは、第１の態様に記載される方法によって作製される、又は不活化ＲＳＶは、第２の態様に記載される方法によって保存される、又は不活化ＲＳＶは、第１の態様に記載される方法によって作製され、第２の態様に記載される方法によって保存される。
【００８２】
別の態様では、本発明は、被験体におけるＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患（例えば、小児肺炎等の肺炎）を予防、治療、又は抑止する方法であって、上記被験体に本発明による不活化ＲＳＶ又は本発明によるワクチンを有効量、投与することを含む、方法を提供する。
【００８３】
或る特定の好ましい実施の形態では、不活化ＲＳＶは、第１の態様に記載される方法によって作製される、又は不活化ＲＳＶは、第２の態様に記載される方法によって保存される、又は不活化ＲＳＶは、第１の態様に記載される方法によって作製され、第２の態様に記載される方法によって保存される。
【００８４】
別の態様では、被験体におけるＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患（例えば、小児肺炎等の肺炎）を予防、治療、又は抑止するワクチンの製造における、本発明の不活化ＲＳＶの使用が提供される。
【００８５】
或る特定の好ましい実施の形態では、不活化ＲＳＶは、第１の態様に記載される方法によって作製される、又は不活化ＲＳＶは、第２の態様に記載される方法によって保存される、又は不活化ＲＳＶは、第１の態様に記載される方法によって作製され、第２の態様に記載される方法によって保存される。
【００８６】
別の態様では、被験体におけるＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患（例えば、小児肺炎等の肺炎）の予防、治療、又は抑止において使用される、本発明の不活化ＲＳＶ又はワクチンが提供される。
【発明の効果】
【００８７】
従来技術と比較して、本発明の技術的解決策は、以下の有益な効果を有する：
（１）本発明によるＲＳＶを不活化する方法を使用して、ｐｒｅ−Ｆタンパク質を含む不活化ＲＳＶを作製し、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションを維持及び安定化することができる。
（２）本発明によるＲＳＶを保存する方法は、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションを維持及び安定化することができ、ｐｒｅ−Ｆタンパク質の含有量を新鮮な生ウイルスのレベルに近いレベルで維持することさえもでき、また該方法を使用して、ｐｒｅ−Ｆタンパク質を含む不活化ＲＳＶを作製することもできる。
（３）従来の不活化法又は保存法によって得られる不活化ウイルスと比較して、本発明による不活化ＲＳＶは、より高い含有量のｐｒｅ−Ｆタンパク質を含み、体内でより有効な免疫応答を誘導することができるため、ＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患（例えば、小児肺炎等の肺炎）を予防又は治療するＲＳＶに対するワクチンの開発に特に適している。
【００８８】
本発明の実施形態を添付の図面及び以下の実施例と併せて詳細に説明するが、当業者であれば、添付の図面及び以下の実施例は本発明の範囲を限定するのではなく、本発明を例示するためにのみ使用されることを理解するであろう。本発明の様々な対象及び有利な態様は、当業者には添付の図面及び以下の好ましい実施形態の詳細な説明から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８９】
【図１】ｐｒｅ−Ｆタンパク質及びｐｏｓｔ−Ｆタンパク質における中和エピトープの分布を示す図である。これらの結果から、ｐｒｅ−Ｆタンパク質及びｐｏｓｔ−Ｆタンパク質がタンパク質表面の約５０％を共有し、ｐｒｅ−Ｆコンフォメーションでは、主にサイトφ等の高い中和活性を有するエピトープ（強い中和エピトープ）が分布しているのに対して、ｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーションは、主にサイトＩＩ及びサイトＩＶ等のより弱い中和活性を有するエピトープ（弱い中和エピトープ）を含むことが分かる。
【図２】９Ｆ７抗体、５Ｃ４抗体、又は８Ｃ２抗体とインキュベートされた試料のゲルイメージング画像を示す図である。ここで、試料は左から右に、固定剤として６．２５％、１．５６２５％、０．３９０６％、０．０９７７％、０．０２４４％、０．００６１％の濃度を有するホルムアルデヒド溶液を使用することによって得られた不活化ウイルス、及び固定剤で固定／不活化されていないウイルスである。
【図３】指定された濃度のβ−プロピオラクトンで指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図３Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図３Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示す図である。
【図４】指定された濃度のグルタルアルデヒドで指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図４Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図４Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示す図である。
【図５】指定された濃度のホルムアルデヒドで指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図５Ａ、図５Ｃ、図５Ｅ、図５Ｇ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図５Ｂ、図５Ｄ、図５Ｆ、図５Ｈ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示す図である。
【図６】指定された濃度のホルムアルデヒドで１２時間にわたり処理されて、指定された期間にわたり貯蔵された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図６Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図６Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示す図である。
【図７】指定された濃度のパラホルムアルデヒドで１２時間にわたり処理されて、指定された期間にわたり貯蔵された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図７Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図７Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示す図である。
【図８】指定された濃度のホルムアルデヒドで１２時間にわたり処理されて、指定された期間にわたり貯蔵された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図８Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図８Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示す図である。
【図９】指定された濃度のパラホルムアルデヒドで１２時間にわたり処理されて、指定された期間にわたり貯蔵された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図９Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図９Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示す図である。
【図１０】指定された濃度のパラホルムアルデヒドで４℃、２５℃、又は３７℃にて１２時間にわたり処理されて、指定された期間にわたり貯蔵された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図１０Ａ〜図１０Ｃ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図１０Ｄ〜図１０Ｆ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示す図である。
【図１１】ホルムアルデヒドで処理されて、ＰＢＳ溶液中で保存された試料と、固定剤で処理されていない試料とにおける、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合の経時変化を示す図である。
【図１２】不活化／固定されたウイルスを１５０ｍＭ、３３０ｍＭ、５５０ｍＭ、８８０ｍＭの塩溶液中で透析した後に貯蔵時間を延長した、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図１２Ａ〜図１２Ｄ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図１２Ｅ〜図１２Ｈ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示す図である。
【図１３】免疫原として、好ましい濃度のホルムアルデヒド溶液及び好ましくない濃度のホルムアルデヒド溶液を使用することによって不活化されたウイルスで免疫化した後のマウスにおけるＲＳＶ特異的中和抗体レベルの検出結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００９０】
配列の説明
本出願に含まれる配列の情報は以下の通りである：
配列番号１（Ｆタンパク質のアミノ酸配列）
MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGYLSALRTGWYTSVITIELSNIKENKCNGTDAKVKLIKQELDKYKNAVTELQLLMQSTPPTNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGVGSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLDLKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTPVSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVLAYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNAGSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEINLCNVDIFNPKYDCKIMTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNKGMDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQVNEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAGKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCKARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN
【実施例】
【００９１】
ここで、以下の実施例を参照して本発明を説明するが、これらの実施例は、本発明を限定することを意図するものではなく、本発明を例示することを意図するものである。
【００９２】
特段の指定がない限り、本発明で使用される分子生物学実験法及びイムノアッセイ法は、基本的にJ. Sambrook et al., Molecular Cloning: Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989、及びFM Ausubel et al., Short Molecular Biology Experiment Guide, 3rd Edition, John Wiley & Sons, Inc., 1995よって記載される方法を参照し、制限酵素は、製品の製造業者により推奨される条件に従って使用した。当業者は、実施例が本発明を例として説明し、本発明によって保護されることが求められる保護範囲を限定することを意図しないことを理解している。
【００９３】
実施例１．ＲＳＶの不活化
１．材料及び機器：
Ｈｅｐ−２細胞（ＡＴＣＣ（商標）ＣＣＬ−２３（商標））、Ｖｅｒｏ細胞（ＡＴＣＣ）：ＡＴＣＣから入手
ｈＲＳＶ（ｐＳｙｎｋＲＳＶ  Ａ２  Ｄ４６Ｆ）：米国国立衛生研究所のＮＩＨから入手したヒト呼吸器合胞体ウイルスの標準株
５Ｃ４抗体：インハウスで作製。５Ｃ４抗体は、ｐｒｅ−Ｆタンパク質を特異的に認識して結合するが、ｐｏｓｔ−Ｆタンパク質を認識又は結合しない。５Ｃ４抗体はｐｒｅ−Ｆタンパク質上のサイトφエピトープを認識し、パリビズマブよりも大幅に高い中和活性を有する強力な中和抗体である。５Ｃ４抗体に関する詳細な情報については、中国特許出願公開第２０１４８００１３９２７．７号、及び国際出願ＰＣＴ／ＣＮ２０１４／０７３５０５号を参照されたい。
８Ｃ２抗体：インハウスで作製。８Ｃ２抗体は、ｐｒｅ−Ｆタンパク質とｐｏｓｔ−Ｆタンパク質との両方に特異的に結合することができる。８Ｃ２抗体は、ｐｒｅ−Ｆタンパク質及びｐｏｓｔ−Ｆタンパク質上のサイトＩＩエピトープを認識し、パリビズマブと基本的に同等の中和活性を有する中和抗体である。
９Ｆ７抗体：インハウスで作製。９Ｆ７抗体は、Ｅ型肝炎ウイルスを特異的に認識する抗体であり、ｐｒｅ−Ｆタンパク質又はｐｏｓｔ−Ｆタンパク質のいずれとも特異的に反応することができない。９Ｆ７抗体に関する詳細な情報については、例えば、Min Zhao et al. J Biol Chem, 2015, 290: 19910-19922を参照のこと。
ＧａＭ−ＦＩＴＣ：Sigma社から入手したＦＩＴＣ標識ヤギ抗マウス抗体
Bio-Rad Company社から入手したＢｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦブロッティングデバイス
Bio-Rad社から入手したＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ全波長ゲルイメージングシステム
Thermo Company社から入手した大型の卓上高速冷却遠心分離機（モデル：Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ１６Ｒ）。
【００９４】
２．ウイルスの作製
Ｈｅｐ−２細胞（ＡＴＣＣ（商標）ＣＣＬ−２３（商標））又はＶｅｒｏ細胞を細胞培養プレートに接種し、１０％ＦＢＳ（Gibco社、カタログ番号：１００９９１４１）及び１００Ｕ／ｍｌのペニシリン−ストレプトマイシン（Gibco社、カタログ番号：１５１４０１２２）を含むＭＥＭ培地（Gibco社、商品番号：１１０９５０７２）を使用することによって培養した。細胞密度が８０％〜９０％のコンフルエンスに達したら、細胞にｈＲＳＶ（ｐＳｙｎｋＲＳＶ  Ａ２  Ｄ４６Ｆ）をＭＯＩ＝０．３で感染させた。感染後に、細胞を７２時間培養した。
【００９５】
培養後に、細胞をセルスクレーパーで収集し、氷上で冷却した後に、超音波細胞破砕装置で破砕／溶解してウイルスを放出させた。細胞溶解物を遠心分離し、上清を収集した後に、ウイルスを含む上清をクライオジェニックバイアル中にサブパッケージし、−８０℃の冷蔵庫において急速冷凍し、後で使用するために保存した。
【００９６】
３．ウイルスの固定及び不活化
各ＥＰチューブ中で、１×ＰＢＳを使用することによって指定された種類及び濃度（２×）の固定溶液を作製した。ウイルスを３７℃で解凍し、ウイルス溶液を各固定溶液と１：１の容量比で混合し、指定された温度で指定された時間にわたり不活化／固定を行った。使用された固定剤は、以下のとおりである：
ホルムアルデヒド（ＣＨ２Ｏ、ＣＰ、Xilong Chemical社、商品番号：５０−００−０）、
パラホルムアルデヒド（ＨＯ（ＣＨ２Ｏ）ｎＨ、ｎ＝１０〜１００、SIGMA-ALDRICH社、商品番号：１６００５）、
メタノール（ＣＨ３ＯＨ、メタノール、AR Xilong Chemical社、カタログ番号：１０３０００３ＡＲ５００）、
グルタルアルデヒド（グルタルアルデヒド溶液、Fluka社、カタログ番号：４９６２９）、
β−プロピオラクトン（プロピオラクトン、研究グレード、SERVA社、カタログ番号：５７−５７−８）。
【００９７】
固定後に、１５０ｍＭ以上（例えば、３３０ｍＭ、５５０ｍＭ、８８０ｍＭ）の塩溶液中で４℃又は２５℃又は３７℃で１８時間にわたり透析を行い、残留固定剤を除去した。透析後に、試料を取り出し、１．５ｍｌ容のＥＰチューブに入れて、２５℃で２４時間又は４８時間又は７２時間置いた。
【００９８】
４．不活化ウイルスの表面上でのｐｒｅ−Ｆタンパク質及びｐｏｓｔ−Ｆタンパク質の検出
上記ＥＰチューブから１００μｌの不活化ウイルス溶液を採取し、Ｂｉｏ−Ｄｏｔ  ＳＦブロッティングデバイスを使用することによってニトロセルロースメンブレンにロードした。室温で、５％のスキムミルクを使用することによって１時間ブロッキングを行った。
【００９９】
室温で、ニトロセルロースメンブレンを一次抗体（１×ＰＢＳ中で希釈）と、メンブレン当たり２０ｍｌで１時間インキュベートした。一次抗体は、ｐｒｅ−Ｆタンパク質に特異的に結合する５Ｃ４抗体（２ｎｇ／μｌ）、ｐｒｅ−Ｆタンパク質及びｐｏｓｔ−Ｆタンパク質に結合する８Ｃ２抗体（０．３ｎｇ／μｌ）、並びにｐｒｅ−Ｆタンパク質及びｐｏｓｔ−Ｆタンパク質に結合しない９Ｆ７抗体（０．３ｎｇ／μｌ）を含んでいた。インキュベートした後に、２５℃にて１×ＰＢＳを用いて１回当たり１０分間で３回洗浄を行った。引き続き、ニトロセルロースメンブレンを二次抗体ＧａＭ−ＦＩＴＣ（Sigma社、商品番号：Ｆ５３８７−２ｍＬ；１×ＰＢＳ中で１：３０００希釈した）と室温で暗所にて１時間インキュベートした。インキュベートした後に、２５℃にて１×ＰＢＳを用いて１回当たり１０分間で３回洗浄を行った。引き続き、Bio-Rad社のＣｈｅｍｉＤｏｃ  ＭＰ全波長ゲルイメージングシステムを使用して検出及び写真撮影を行い、実験データを記録した。
【０１００】
５．データ処理
ニトロセルロースメンブレンの上述の検出データ及び写真撮影データを、Ｉｍａｇｅ  Ｌａｂソフトウェアによって分析した。具体的な操作は以下の通りである：固定溶液で処理された各試料について、３つの一次検出抗体（それぞれ５Ｃ４、８Ｃ２、９Ｆ７）と別々にインキュベートした後に、３つの異なるバンドが生成され、その際、３つの異なるＦＩＴＣシグナル強度値が生成され、これらをＩ−５Ｃ４、Ｉ−８Ｃ２、Ｉ−９Ｆ７として記録した。ここで、Ｉ−９Ｆ７をネガティブコントロール群として使用した。ここで、Ｉ−５Ｃ４からＩ−９Ｆ７を差し引くことにより得られた差の値は、この固定条件下でのウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆの相対量を表しており、Ｉ−８Ｃ２からＩ−９Ｆ７を差し引くことにより得られた差の値は、この固定条件下でのウイルス表面上の総Ｆタンパク質の相対量を表していた。
【０１０１】
各実験群において、未処理の新鮮なウイルス試料のチューブをコントロール群として使用し、これをニトロセルロースメンブレンに直接ロードし、引き続き、工程４に示されるような固定試料と同じ検出を行った。各実験群試料におけるｐｒｅ−Ｆの定量的相対量をコントロール群におけるｐｒｅ−Ｆの相対量で割った割合を、固定されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合として使用した。各実験群試料における総Ｆタンパク質の定量的相対量をコントロール群における総Ｆタンパク質の相対量で割った割合を、固定された総Ｆタンパク質の相対割合として使用した。
【０１０２】
図２は、９Ｆ７抗体、５Ｃ４抗体、又は８Ｃ２抗体とインキュベートされた試料のゲルイメージング画像を示している。ここで、試料は左から右に、固定剤として６．２５％、１．５６２５％、０．３９０６％、０．０９７７％、０．０２４４％、０．００６１％の濃度を有するホルムアルデヒド溶液を使用することによって得られた不活化ウイルス、及び固定剤を添加せずに固定／不活化されたウイルスである。
【０１０３】
６．実験結果
６．１  固定剤及びその濃度の選択
最初に、この分野で一般的に使用される固定剤がＲＳＶのウイルス表面ｐｒｅ−Ｆに対して及ぼす安定化効果を評価した。これらの固定剤については、薬局方又は参考文献で推奨されている固定条件（すなわち、温度）を使用した。
【０１０４】
手短に言えば、β−プロピオラクトンを１×ＰＢＳと配合して、指定された濃度（１．６％、０．４％、０．０２５％、０．００６２５％、０．００１５６３％、又は０．０００３９１％）の２倍の濃度を得て、２５℃で３０分間静置した。引き続き、２５℃で、配合されたβ−プロピオラクトン溶液とＲＳＶとを１：１の容量比で指定された時間（１時間、５時間、１２時間、又は２４時間）にわたり均一に混合した。０％の濃度（すなわち、非固定群）は、ＲＳＶ試料とＰＢＳとを１：１の容量比で均一に混合し、指定された時間（以下と同じ）にわたりインキュベートしたことを表した。引き続き、上記のように、固定剤を１×ＰＢＳに対する透析によって除去し、固定された試料をドットブロット検出に使用した。図３は、指定された濃度のβ−プロピオラクトンで指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図３Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図３Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示している。これらの結果から、試料を指定された濃度のβ−プロピオラクトンで１時間、５時間、１２時間、又は２４時間にわたり処理した後に、非固定群（０％）と比較して、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質が安定的に維持されないことが分かった。この結果は、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションを安定化又は維持する明らかな好ましいβ−プロピオラクトン濃度が存在しないため、β−プロピオラクトンがＲＳＶの不活化には適していないことを示している。
【０１０５】
グルタルアルデヒドを１×ＰＢＳと配合して、指定された濃度（０．１５６２５％、０．０３９０６３％、０．００９７６６％、０．００２４４１％、０．０００６１％、０．０００１５３％、０．００００３８％、又は０．００００１％）の２倍の濃度を得て、２５℃で３０分間静置した。引き続き、２５℃で、配合されたグルタルアルデヒド溶液とＲＳＶとを１：１の容量比で指定された時間（０．２５時間、０．５時間、１時間、５時間、又は１２時間）にわたり均一に混合した。引き続き、上記のように、固定剤を１×ＰＢＳに対する透析によって除去し、固定された試料をドットブロット検出に使用した。図４は、指定された濃度のグルタルアルデヒドで指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図４Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図４Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示している。これらの結果から、試料を指定された濃度のグルタルアルデヒドで０．２５時間、０．５時間、１時間、５時間、又は１２時間にわたり処理した後に、非固定群（０％）と比較して、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質が安定的に維持されないことが分かった。この結果は、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションを安定化又は維持する好ましいグルタルアルデヒド濃度が存在しないため、グルタルアルデヒドがＲＳＶの不活化には適していないことを示している。
【０１０６】
ホルムアルデヒドを１×ＰＢＳと配合して、指定された濃度（６．２５％、１．５６２５％、０．３９０６％、０．０９７７％、０．０２４４％、０．００６１％、０％）の２倍の濃度を得て、２５℃で３０分間静置した。引き続き、２５℃で、配合されたホルムアルデヒド溶液とＲＳＶとを１：１の容量比で均一に混合し、これを、それぞれ６時間（図５Ａ及び図５Ｂ）、１２時間（図５Ｃ及び図５Ｄ）、２４時間（図５Ｅ及び図５Ｆ）、３６時間（図５Ｇ及び図５Ｈ）にわたり実施した。引き続き、上記のように、固定剤を１×ＰＢＳに対する透析によって除去し、最後に不活化ウイルスを２５℃で指定された時間（０時間、２４時間、４８時間、７２時間）にわたり静置し、試料を各時点でドットブロット検出のために採取した。図５は、指定された濃度のホルムアルデヒドで指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図５Ａ、図５Ｃ、図５Ｅ、図５Ｇ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図５Ｂ、図５Ｄ、図５Ｆ、図５Ｈ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示している。これらの結果から、試料を指定された濃度のホルムアルデヒドで６時間（図５Ａ及び図５Ｂ）、１２時間（図５Ｃ及び図５Ｄ）、２４時間（図５Ｅ及び図５Ｆ）、３６時間（図５Ｇ及び図５Ｈ）にわたり処理したら、同じホルムアルデヒド濃度範囲（例えば、６．２５％〜１．５６２５％、１．５６２５％〜０．３９０６％、０．３９０６％〜０．０９７７％、０．０９７７％〜０．０２４４％、０．０２４４％〜０．００６１％）内で、１２時間にわたり処理した場合のｐｒｅ−Ｆの陽性値は相対的により大きく、時間を延長させても、１２時間にわたり処理した試料はその値を依然として或る特定のレベルで維持し得ることが分かった。
【０１０７】
さらに、固定に対するホルムアルデヒドの濃度の影響を予備的に調査した。ホルムアルデヒドを１×ＰＢＳと配合して、指定された濃度（６．２５％、１．５６２５％、０．３９０６％、０．０９７７％、０．０２４４％、０．００６１％、０．００１５％、又は０．０００４％）の２倍の濃度を得て、２５℃で３０分間静置した。引き続き、配合されたホルムアルデヒド溶液とＲＳＶとを１：１の容量比で２５℃にて均一に混合し、２５℃で１２時間にわたり不活化した。次いで、上記のように、固定剤を１×ＰＢＳに対する透析によって除去した。最後に不活化ウイルスを２５℃で指定された時間（０時間、２４時間、４８時間、７２時間）にわたり静置し、試料を各時点でドットブロット検出のために採取した。図６は、指定された濃度のホルムアルデヒドで指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図６Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図６Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示している。これらの結果から、試料を０．０２４４％〜０．０９７７％の濃度のホルムアルデヒドで１２時間にわたり処理した後に、時間を延長（０時間、２４時間、４８時間、７２時間）させても、ウイルス表面上にかなりの量のｐｒｅ−Ｆが依然として安定的に保持され得る（すなわち、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションは安定化及び維持される）ことが分かった。この結果は、１２時間の固定及び不活化の条件下で、０．０２４４％〜０．０９７７％の範囲の濃度を有するホルムアルデヒドが、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションを安定化及び維持し得るため、ＲＳＶの不活化に特に適していることを示している。
【０１０８】
パラホルムアルデヒドを１×ＰＢＳと配合して、指定された濃度（４％、１％、０．２５％、０．０６２５％、０．０１５６％、０．００３９％、又は０．００１％）の２倍の濃度を得て、２５℃で３０分間静置した。引き続き、配合されたパラホルムアルデヒド溶液とＲＳＶとを１：１の容量比で２５℃にて均一に混合した後に、２５℃で１２時間にわたり不活化した。次いで、上記のように、固定剤を１×ＰＢＳに対する透析によって除去し、最後に不活化ウイルスを２５℃で指定された時間（０時間、２４時間、４８時間、７２時間）にわたり静置し、試料を各時点でドットブロット検出のために採取した。図７は、指定された濃度のパラホルムアルデヒドで指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図７Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図７Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示している。これらの結果から、０．０１５６％〜０．２５％の濃度のパラホルムアルデヒドで１２時間にわたり処理した後に、時間を延長（０時間、２４時間、４８時間、７２時間）しても、ウイルス表面上にかなりの量のｐｒｅ−Ｆタンパク質が依然として安定的に保持され得る（すなわち、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションは安定化及び維持される）ことが分かる。この結果は、１２時間の固定及び不活化の場合に、０．０１５６％〜０．２５％の範囲の濃度を有するパラホルムアルデヒドが、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションを安定化及び維持し得るため、ＲＳＶの不活化に特に適していることを示している。
【０１０９】
さらに、図３〜図７の結果はまた、固定剤が異なるとｐｒｅ−Ｆタンパク質に対する効果が異なることも示している。特に、図３及び図４の結果から、低濃度のβ−プロピオラクトン又はグルタルアルデヒドによる処理と比較して、高濃度のβ−プロピオラクトン又はグルタルアルデヒドによる処理が、試料の５Ｃ４抗体に対する反応性においてより迅速な低下をもたらした（すなわち、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションはより迅速に変化した）ことが分かる。これらの結果は、β−プロピオラクトン及びグルタルアルデヒドがｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーション変化を促進することを示している。したがって、β−プロピオラクトン及びグルタルアルデヒドは、ＲＳＶのＦタンパク質のプレフュージョンコンフォメーションの維持及び安定化に寄与しない。
【０１１０】
それに対して、図６及び図７の実験結果からは、Ｆタンパク質のｐｒｅ−Ｆコンフォメーションに対するホルムアルデヒド及びパラホルムアルデヒドの影響がそれらの濃度に関連しており、ホルムアルデヒド及びパラホルムアルデヒドのそれぞれが、ｐｒｅ−Ｆタンパク質を安定化するのに適した濃度範囲を有したことが分かる。特に、０．０２４４％〜０．０９７７％の濃度を有するホルムアルデヒドを固定のために使用した場合に、固定時間は１２時間もの長さとなり得て、固定された試料においてかなりの量のｐｒｅ−Ｆタンパク質が依然として保持された。０．０１５６％〜０．２５％の濃度を有するパラホルムアルデヒドを固定のために使用した場合に、固定時間は１２時間もの長さとなり得て、固定された試料においてかなりの量のｐｒｅ−Ｆタンパク質が依然として保持された。
【０１１１】
さらに、図６及び図７の実験結果からは、ホルムアルデヒド又はパラホルムアルデヒドを上述の濃度範囲よりも低い濃度で使用した場合に、５Ｃ４抗体（ｐｒｅ−Ｆタンパク質）に対する試料の反応性が非固定群と比較して有意差を示さなかった、すなわち、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質が安定的に維持されなかったことも分かる。ホルムアルデヒド濃度が０．３９０６％以上に達した場合又はパラホルムアルデヒド濃度が１％以上に達した場合に、５Ｃ４抗体及び８Ｃ２抗体（ｐｒｅ−Ｆタンパク質及びｐｏｓｔ−Ｆタンパク質）に対する試料の反応性が有意に低下したことから、Ｆタンパク質（Ｐｒｅ−Ｆ及びｐｏｓｔ−Ｆ）のエピトープが、高濃度の固定剤によって容易に破壊されることを示している。
【０１１２】
Ｆタンパク質のｐｒｅ−Ｆコンフォメーションは、ＲＳＶに対する防御抗体応答を誘導し得る好ましいコンフォメーションであることが確認されている。さらに、以前の研究では、ｐｒｅ−Ｆタンパク質によって誘導された中和抗体価がｐｏｓｔ−Ｆタンパク質よりも１ＬＯＧ〜２ＬＯＧ高いことが示されている。上記分析のように、本発明の方法によって得られた不活化ＲＳＶは、かなりの量のｐｒｅ−Ｆタンパク質を保持したので、これはＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患を予防又は治療する抗ウイルスワクチンとして使用するのに特に適している。
【０１１３】
６．２  ホルムアルデヒド及びパラホルムアルデヒドの濃度の選択
ホルムアルデヒド及びパラホルムアルデヒドの至適濃度範囲を更に研究した。手短に言えば、ホルムアルデヒドを１×ＰＢＳと配合して、指定された濃度（２．０１５％、１．３５％、０．９％、０．６％、０．４％、０．２６６７％、０．１７７８％、０．１１８５％、０．０７９％、０．０５２７％、０．０３５１％、０．０２３４％、０．０１５６％、０．０１０４％、０．００６９％、０．００４６％、又は０．００３１％）の２倍の濃度を得て、２５℃で３０分間静置した。引き続き、２５℃で、配合されたホルムアルデヒド溶液とＲＳＶとを１：１の容量比で指定された時間（１２時間）にわたり均一に混合した。引き続き、上記のように、固定剤を１×ＰＢＳに対する透析によって除去し、不活化ウイルスを２５℃で指定された時間（０時間、２４時間、４８時間、７２時間）にわたり静置した後に、試料をドットブロット検出のために採取した。図８は、指定された濃度のホルムアルデヒドで指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図８Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図８Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示している。
【０１１４】
これらの結果から、試料を０．０１５６％〜０．２６６７％の濃度のホルムアルデヒドで処理した後に、ウイルス表面上にかなりの量のｐｒｅ−Ｆタンパク質が依然として安定的に保持され得る（すなわち、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションは安定化及び維持される）ことが分かった。この結果は、１２時間の固定及び不活化の場合に、０．０１５６％〜０．２６６７％の範囲の濃度を有するホルムアルデヒドが、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションを安定化及び維持し得るため、ＲＳＶの不活化に特に適していることを示している。
【０１１５】
さらに、パラホルムアルデヒドを１×ＰＢＳと配合して、指定された濃度（１％、０．６６６７％、０．４４４４％、０．２９６３％、０．１９７５％、０．１３１７％、０．０８７８％、０．０５８５％、０．０３９％、０．０２６％、０．０１７３％、０．０１１６％、又は０％）の２倍の濃度を得て、２５℃で３０分間静置した。引き続き、２５℃で、配合されたパラホルムアルデヒド溶液とＲＳＶとを１：１の容量比で指定された時間（１２時間）にわたり均一に混合した。引き続き、上記のように、固定剤を１×ＰＢＳに対する透析によって除去し、不活化ウイルスを２５℃で指定された時間（０時間、２４時間、４８時間、７２時間）にわたり静置した後に、試料をドットブロット検出のために採取した。図９は、指定された濃度のパラホルムアルデヒドで指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図９Ａ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図９Ｂ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示している。
【０１１６】
これらの結果から、試料を０．０２６０％〜０．２９６３％の濃度のパラホルムアルデヒドで処理した後に、ウイルス表面上にかなりの量のｐｒｅ−Ｆタンパク質が依然として安定的に保持され得る（すなわち、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションは安定化及び維持される）ことが分かった。この結果は、１２時間の固定及び不活化の場合に、０．０２６０％〜０．２９６３％の範囲の濃度を有するパラホルムアルデヒドが、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションを安定化及び維持し得るため、ＲＳＶの不活化に特に適していることを示している。
【０１１７】
６．３  温度の選択
固定剤の固定に対する温度の効果を更に研究した。一般的に言えば、ホルムアルデヒド溶液は比較的安定した固定剤であり、その固定効果は基本的に温度変化による影響を受けない。本発明者らの実験結果から、好ましい濃度範囲のホルムアルデヒド溶液を使用することで、ＲＳＶを固定及び不活化し、不活化ウイルス中のｐｒｅ−Ｆタンパク質を０℃〜４０℃の温度で安定化及び維持することができることも分かった。
【０１１８】
パラホルムアルデヒドは低温（０℃〜１０℃）では比較的安定しているが、より高い温度では分解してホルムアルデヒドを形成し得る。したがって、パラホルムアルデヒドは通常、低温条件下（例えば、４℃）で使用される。しかしながら、ＲＳＶは温度に非常に敏感であるため、その表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質は、低温条件下でｐｏｓｔ−Ｆタンパク質へと容易に変換され得る。したがって、種々の温度でのＲＳＶの不活化に対するパラホルムアルデヒドの効果を研究するために、更に以下の実験を進めた。
【０１１９】
手短に言えば、パラホルムアルデヒドを１×ＰＢＳと配合して、指定された濃度（４％、１％、０．２５％、０．０６２５％、０．０１５６％、０．００３９％、又は０．００１％）の２倍の濃度を得て、指定された温度（４℃、２５℃、又は３７℃）で３０分間静置した。引き続き、指定された温度で、配合されたパラホルムアルデヒド溶液とＲＳＶとを１：１の容量比で指定された時間（例えば、１２時間）にわたり均一に混合した。引き続き、上記のように、固定剤を１×ＰＢＳに対する透析によって除去し、不活化ウイルスを２５℃で指定された時間（０時間、２４時間、４８時間、７２時間）にわたり静置した後に、試料をドットブロット検出のために採取した。
【０１２０】
実験結果は図１０に示されている。図１０は、指定された濃度のパラホルムアルデヒドで４℃（Ａ、Ｄ）、２５℃（Ｂ、Ｅ）、又は３７℃（Ｃ、Ｆ）にて指定された期間にわたり処理された試料における、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図１０Ａ〜図１０Ｃ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図１０Ｄ〜図１０Ｆ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示している。
【０１２１】
これらの結果から、試料を０．００１％〜４％の濃度のパラホルムアルデヒドで４℃にて処理した後に、試料中のウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質がほぼ完全に検出されなかった（すなわち、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションを安定化及び維持することができなかったどころか、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーション変化を加速又は促進させた）ことが分かった。試料を０．０１５６％〜０．２５％の濃度のパラホルムアルデヒドで２５℃にて処理した後に、ウイルス表面上にかなりの量のｐｒｅ−Ｆタンパク質が安定的に保持され得た（すなわち、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションは安定化及び維持された）。試料を０．０１５６％〜０．０６２５％の濃度のパラホルムアルデヒドで３７℃にて処理した後に、試料は依然としてかなりの量のｐｒｅ−Ｆタンパク質陽性細胞を含んでいた（すなわち、試料中のｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションは安定化及び維持された）。
【０１２２】
これらの結果は、パラホルムアルデヒドが種々の温度でその役割（すなわち、ＲＳＶの不活化、並びにウイルス中のｐｒｅ−Ｆタンパク質の安定化及び維持）を果たし得るが、実際に使用される温度に応じて、その好ましい濃度範囲が適宜調整されるべきであることを示している。しかしながら、最も好ましくは、ＲＳＶを固定及び不活化し、ｐｒｅ−Ｆタンパク質を安定化及び維持するために、パラホルムアルデヒドは常温条件下（１０℃〜３７℃）で使用される。
【０１２３】
６．４  固定された試料のウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質の安定性の検出
固定された試料におけるウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質の安定性を更に研究した。手短に言えば、ホルムアルデヒドを１×ＰＢＳと配合して、指定された濃度（例えば、２５％、６．２５％、１．５６２５％、０．３９０６％、０．０９７７％、０．０２４４％、０．００６１％、０．００１５％、又は０．０００４％）の２倍の濃度を得て、２５℃で３０分間静置した。引き続き、２５℃で、配合されたホルムアルデヒド溶液とＲＳＶとを１：１の容量比で１２時間にわたり均一に混合した。引き続き、ＰＢＳ塩溶液に対する透析を行うことで、固定剤を除去し、固定された試料をＰＢＳ塩溶液中で保存した。さらに、固定剤で処理されていない試料を、生理食塩緩衝液中で保存し、コントロールとして使用した。次いで、室温で指定された時間（０時間、２４時間、４８時間、又は７２時間）にわたり静置した後に、固定された試料をドットブロット検出に使用した。
【０１２４】
実験結果は図１１に示されている。図１１は、ホルムアルデヒドで処理されて、ＰＢＳ溶液中で保存された試料と、固定剤で処理されていない試料とにおける、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（５Ｃ４抗体とインキュベート）の経時変化を示している。
【０１２５】
これらの結果から、７２時間まで保存した後に、かなりの量のｐｒｅ−Ｆタンパク質がホルムアルデヒド処理された試料中のウイルス表面上で保持された（すなわち、試料中のウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質が安定したままであり、コンフォメーション変化を受けなかった）ことが分かった。それに対して、２４時間保存した後に、固定剤で処理していない試料中のウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の量は、静置時間の延長とともに減少した。これらの結果は、本発明のＲＳＶを固定及び不活化する方法が、ＲＳＶの表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質を効果的に安定化し、ｐｒｅ−Ｆタンパク質がｐｏｓｔ−Ｆタンパク質に変形するのを防ぐことができることを示している。
【０１２６】
実施例２．ＲＳＶの保存
この実施例では、固定後のウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質に対する透析塩溶液（すなわち、貯蔵溶液）の効果を更に研究した。一般的に言えば、透析、濾過、又は遠心分離を使用して、固定された試料（すなわち、不活化ウイルス及び固定剤を含む溶液）中の固定剤を除去した。実施例１では、固定された試料を種々の濃度の透析塩溶液中に入れて固定剤を交換する方法を使用して、不活化ウイルスを対応する貯蔵溶液中で保存した。この実施例では、固定された試料を種々の塩溶液に対して更に透析して、種々の塩溶液中での不活化／固定されたウイルスタンパク質の安定性を経時的に監視し、それによって、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質をより安定にするより適切な貯蔵塩溶液の環境を選択した。
【０１２７】
塩化ナトリウム（ＮａＣｌ、塩化ナトリウム）、（ＡＲ）（Xilong Chemical Industry社、１００１１０１２ＡＲ）及びリン酸水素二ナトリウム十二水和物（Sinopharm Group社、３２５）を１０：１のモル濃度比で使用して、種々の濃度（３３０ｍＭ、５５０ｍＭ、８８０ｍＭ）の塩溶液を作製した。ＰＢＳ溶液も１種類の溶液として使用し、そのモル濃度は約１５０ｍＭと計算された。
【０１２８】
得られた不活化／固定された試料を透析バッグに入れた後に、透析用の種々の塩溶液中に入れ、透析条件は２５℃、３００ｒｐｍであり、試料対透析液の容量比は１：５００であり、透析時間は１８時間であり、液体をそれぞれ３時間、６時間、及び１２時間で交換した。
【０１２９】
透析された試料を採取し、適切な容量のＥＰチューブに入れた。２５℃で或る特定の期間（例えば、０時間、２４時間、４８時間、７２時間）にわたり静置した後に、ウイルス表面のＦタンパク質を検出し、種々の塩溶液中でのウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質及び総Ｆタンパク質の経時変化を監視した。
【０１３０】
実験結果は図１２に示されている。図１２は、不活化／固定されたウイルスを１５０ｍＭ（Ａ、Ｂ）、３３０ｍＭ（Ｃ、Ｄ）、５５０ｍＭ（Ｅ、Ｆ）、８８０ｍＭ（Ｇ、Ｈ）の塩溶液中で透析した後に静置時間を延長した、ウイルス表面上での保持されたｐｒｅ−Ｆタンパク質の相対割合（図１２Ａ、図１２Ｃ、図１２Ｅ、図１２Ｇ、５Ｃ４抗体とインキュベート）及び保持された総Ｆタンパク質の相対割合（ｐｒｅ−Ｆコンフォメーション及び／又はｐｏｓｔ−Ｆコンフォメーション）（図１２Ｂ、図１２Ｄ、図１２Ｆ、図１２Ｈ、８Ｃ２抗体とインキュベート）を示している。
【０１３１】
これらの結果から、１５０ｍＭの塩溶液中で透析した後に、好ましい固定剤濃度で固定されたウイルスは、その表面上により多くのｐｒｅ−Ｆタンパク質を保持し、静置時間を延長しても、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質は高いレベルで保たれ、７２時間より長く維持され得ることが分かった。しかしながら、好ましい固定溶液の濃度範囲よりも低い又は高い濃度の条件下で固定されたウイルスについては、その表面上で大量のｐｒｅ−Ｆタンパク質が失われ、塩溶液中で静置時間を延長すると、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質がより多く失われた。３３０ｍＭ、５５０ｍＭ、８８０ｍＭの塩溶液中で透析した後に、好ましい固定溶液濃度と等しい又はそれより高い又は低い濃度の条件下で固定されたウイルスについては、その表面上に大量のｐｒｅ−Ｆタンパク質が保持され、これは塩溶液濃度の増加とともに増加し、徐々に９０％〜１００％に近づき、この高レベルのタンパク質を７２時間より長く安定的に維持することができた。
【０１３２】
上記結果は、透析によって固定／不活化されたウイルスから固定剤を除去する過程において、透析液（すなわち、固定／不活化されたウイルスの貯蔵溶液）の塩イオン濃度が、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションを安定化又は維持するのに重要であることを示している。より低いイオン濃度（例えば、１５０ｍＭ未満の塩イオン濃度）を有する塩溶液を透析又は貯蔵の間に貯蔵溶液として使用する場合に、透析時間又は貯蔵時間を延長すると、ウイルス表面上のｐｒｅ−Ｆタンパク質は急速にｐｏｓｔ−Ｆタンパク質に変換される。より高いイオン濃度（例えば、１５０ｍＭ以上の塩イオン濃度）を有する塩溶液を貯蔵溶液として使用する場合に、透析時間又は静置時間を延長しても、好ましい固定／不活化条件（例えば、実施例１に記載される好ましい濃度のホルムアルデヒド又はパラホルムアルデヒド）下で不活化されたウイルスを塩溶液中で保存することで、固定されたｐｒｅ−Ｆタンパク質を十分に維持することができ、好ましくない固定条件／不活化条件（例えば、実施例１に記載される好ましい濃度よりも低い、及び／又は好ましくない固定剤）下で不活化されたウイルス及びそれどころか固定されていないウイルスについては、固定されていないｐｒｅ−Ｆタンパク質は、高い塩濃度溶液中での透析又は貯蔵の間にｐｒｅ−Ｆコンフォメーションで保たれ得ることから、コンフォメーション変化を受けにくくなる。したがって、より高いイオン濃度（例えば、１５０ｍＭ以上）を有する溶液は、ｐｒｅ−Ｆタンパク質のコンフォメーションを十分に安定化することができるため、ＲＳＶの保存に特に適している。
【０１３３】
実施例３．免疫防御の検出
この実施例では、ホルムアルデヒド固定剤で処理されたＲＳＶの免疫防御を調査した。手短に言えば、ホルムアルデヒドを２×ＰＢＳと配合して、０．０１％又は０．０５２７％の濃度を得て、２５℃で３０分間静置した。引き続き、２５℃で、配合されたホルムアルデヒド溶液とウイルスとを１：１の容量比で均質になるまでゆっくりと１２時間にわたり混合した。引き続き、上記のように、固定剤を透析（２５℃で１８時間）によって除去し、透析液は５５０ｍＭの塩溶液であった。次いで、透析された試料を遠心分離して可溶性混入物の一部を除去し、沈殿物を再懸濁し、或る特定の容量の無血清培地と混合し、１：１の容量比でＡＬアジュバントとよく混ぜて、これを使用してＳＰＦのＢａｌｂ／Ｃマウス（ｎ＝６〜１０）において筋肉内注射によって免疫化した。０．０５２７％のホルムアルデヒドによる不活化の群は、マウス当たり２．５２×１０５個（Ｌ）、２×１０７個（Ｍ）及び１×１０８個（Ｈ）のウイルス粒子である３つの免疫化用量を有し、０．０１％のホルムアルデヒドによる不活化の群は、マウス当たり２．５２×１０５個のウイルス粒子の免疫化用量を有し、免疫化サイクルは１５日ごとに１回で、合計２回であった。各注射の終了から１５日後に、眼球採血法によってマウスから血液試料を収集し、それを使用して、血清中の中和抗体のレベルを検出した。
【０１３４】
血清中の中和抗体のレベルを、以下のプロトコルによって検出した。マウス血清を９６ウェルプレート（SIGMA-ALDRICH社）において培養培地で希釈し、合計９つの希釈勾配について、各血清の最初のウェルを１０倍に希釈し（９０μｌの培地＋１０μｌの血清）、残りのウェルを４倍に希釈した（７５μｌの培地＋２５μｌの希釈血清）。７５μｌの希釈された血清及び７５μＬの２×１０６ＰＦＵの力価を有するＲＳＶ−Ａ  ｍｋａｔｅウイルス（このウイルスは感染した細胞で蛍光タンパク質ｍｋａｔｅを発現することができ、感染強度を最終的にｍｋａｔｅの蛍光強度によって判断することができる）。希釈された血清とウイルスとを混合し、３７℃で１時間インキュベートした。１時間後に、血清とウイルスとの混合溶液を１００μｌ採取し、Ｈｅｐ−２細胞（ＡＴＣＣ）（１ウェルあたり５×１０４細胞）が予め播種された９６ウェル細胞プレート中に加えた。細胞プレートを３７℃で２４時間インキュベートした後に、ＰＡＲＡＤＩＧＭ多機能プレートリーダー（BECKMAN COULTER社）で蛍光値を読み取った。各血清について、細胞に種々の希釈濃度でウイルスを感染させた後に、一連の蛍光読み取り値を得た。蛍光読み取り値及び血清希釈度をＧｒａｐｈ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアに入力し、各血清の中和ＩＣ５０をカーブフィッティングによって計算した。この実験では、コントロールとして中和検出に８Ｃ２モノクローナル抗体も使用した。最後に、ＩＣ５０データに基づいて、８Ｃ２に対するＩＣ５０力価を各血清につき変換し、１ｍｇ／ｍＬの８Ｃ２抗体を１中和単位と解釈することによって、各血清につき８Ｃ２に対する中和単位を出力した。
【０１３５】
実験結果は図１３に示されている。図１３は、免疫原として、好ましい濃度（すなわち、０．０５２７％）のホルムアルデヒド溶液及び好ましくない濃度（すなわち、０．０１％）のホルムアルデヒド溶液を使用することによって不活化されたウイルスで免疫化した後のマウスにおけるＲＳＶ特異的中和抗体レベルの検出結果を示している。
【０１３６】
図１３での縦座標は、２回目の免疫化注射後のマウス血清中和抗体のＩＣ５０値を表している。これらの結果から、種々の濃度のホルムアルデヒド溶液によって不活化されたウイルスは、同じ免疫化用量で種々のレベルのＲＳＶ中和抗体を刺激し得ることが分かる。０．０１％及び０．０５２７％の濃度で不活化されたウイルス間の比較では、免疫原としての好ましい条件（０．０５２７％のホルムアルデヒド）下で不活化されたウイルスは、より高いレベルの中和抗体を誘導することができ、統計的差異があった。さらに、免疫化用量が増加するにつれ、誘導された中和抗体のレベルも増加した。これらの結果は、本発明の方法によって得られた不活化ＲＳＶがかなりの量のｐｒｅ−Ｆタンパク質を保持し、それによって高力価の中和抗体が誘導されることを示している。したがって、この不活化ＲＳＶは、ＲＳＶ感染症又はＲＳＶ感染症に関連する疾患の予防又は治療のための抗ウイルスワクチンとしての使用に特に適している。
【０１３７】
本発明の具体的な実施形態を詳細に説明したが、当業者は、開示されているあらゆる教示に従って、その詳細に対して様々な修正及び変更を加えることができ、これらの変更の全てが本発明の保護範囲内であることを理解するであろう。本発明の範囲全体は、添付の特許請求の範囲及びそれらのあらゆる等価物によって与えられる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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