(57)【要約】（１）「ＣａｓＺ」タンパク質（ＣａｓＺポリペプチドとも称される）、ＣａｓＺタンパク質をコードする核酸、及び／またはＣａｓＺタンパク質（及び／またはそれをコードする核酸）を含む修飾宿主細胞；（２）ＣａｓＺタンパク質に結合し、ＣａｓＺタンパク質に配列特異性を提供するＣａｓＺガイドＲＮＡ、ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸、及び／またはＣａｓＺガイドＲＮＡ（及び／またはそれをコードする核酸）を含む修飾宿主細胞；ならびに（３）ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）（本明細書では「ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ」と称される）、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸、及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（及び／またはそれをコードする核酸）を含む修飾宿主細胞のうちの１つ以上を含む、組成物及び方法が提供される。【選択図】図２
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣａｓＺポリペプチドを標的核酸の標的配列に誘導する方法であって、
前記標的核酸を、
（ａ）ＣａｓＺポリペプチドと、
（ｂ）前記標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、かつ前記ＣａｓＺポリペプチドに結合する領域を含む、ＣａｓＺガイドＲＮＡと
を含む操作された及び／または非天然型の複合体と接触させること
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記標的核酸の修飾、前記標的核酸からの転写の調節、または標的核酸に関連するポリペプチドの修飾をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的核酸が、切断されることによって修飾される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記ガイド配列、及び前記ＣａｓＺポリペプチドに結合する前記領域が、互いに異種である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記接触が、ゲノム編集をもたらす、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記接触が、細菌細胞の外部、及び古細菌細胞の外部で起きる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記接触が、インビトロにおいて細胞の外部で起きる、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記接触が、標的細胞の内部で起きる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記接触が、
（ａ）前記ＣａｓＺポリペプチド、または前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸、及び
（ｂ）前記ＣａｓＺガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸
のうちの少なくとも１つを前記標的細胞に導入すること
を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする前記核酸が、前記標的細胞における発現のためにコドン最適化された非天然型配列である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記標的細胞が、真核細胞である、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記標的細胞が、インビトロで培養されている、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的細胞が、インビボである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的細胞が、エクスビボである、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記真核細胞が、植物細胞、真菌細胞、単細胞真核生物、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１７】
前記接触が、ＤＮＡドナー鋳型を前記標的細胞に導入することをさらに含む、請求項９〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記標的核酸をＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）と接触させることを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記接触が、ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）及び／または前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸を前記標的細胞に導入することを含む、請求項９〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ｔｒａｎｃＲＮＡが、表２のｔｒａｎｃＲＮＡ配列と７０％以上の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
組成物であって、
（ａ）ＣａｓＺポリペプチド、または前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸と、
（ｂ）標的核酸の標的配列に対して相補的なガイド配列を含みかつ前記ＣａｓＺポリペプチドに結合することができる領域を含む、ＣａｓＺガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸と
を含む、操作された及び／または非天然型の複合体
を含む、前記組成物。
【請求項２２】
ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、請求項２１に記載の組成物。
【請求項２３】
キットであって、
（ａ）ＣａｓＺポリペプチド、または前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸と、
（ｂ）標的核酸の標的配列に対して相補的なガイド配列を含みかつ前記ＣａｓＺポリペプチドに結合することができる領域を含む、ＣａｓＺガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸と
を含む、操作された及び／または非天然型の複合体
を含む、前記キット。
【請求項２４】
ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、請求項２３に記載のキット。
【請求項２５】
遺伝子修飾された真核細胞であって、
（ａ）ＣａｓＺポリペプチド、または前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸、
（ｂ）標的核酸の標的配列に対して相補的なガイド配列を含みかつ前記ＣａｓＺポリペプチドに結合することができる領域を含む、ＣａｓＺガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸、及び
（ｃ）ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸
のうちの少なくとも１つを含む、前記真核細胞。
【請求項２６】
（ａ）前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする前記核酸が、
（ｉ）前記ＣａｓＺポリペプチドをコードしかつ（ｉｉ）異種プロモーターと動作可能に連結しているヌクレオチド配列
を含むこと、
（ｂ）前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする前記核酸が、
（ｉ）前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードしかつ（ｉｉ）異種プロモーターと動作可能に連結しているヌクレオチド配列
を含むこと、及び
（ｃ）前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする前記核酸が、
（ｉ）前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードしかつ（ｉｉ）異種プロモーターと動作可能に連結しているヌクレオチド配列
を含むこと
のうちの少なくとも１つを特徴とする、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物、キット、または真核細胞。
【請求項２７】
患者の治療処置の方法における使用のための、先行する請求項のいずれか一項に記載の組成物、キット、または真核細胞。
【請求項２８】
前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする前記核酸、前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする前記核酸、及び前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする前記核酸のうちの少なくとも１つが、組み換え発現ベクターである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【請求項２９】
前記ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／または前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡが、修飾核酸塩基、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合、修飾糖部分、ロックド核酸、ペプチド核酸、及びデオキシリボヌクレオチドのうちの１つ以上を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【請求項３０】
前記ＣａｓＺポリペプチドが、対応する野生型ＣａｓＺタンパク質と比較して減少したヌクレアーゼ活性を有するバリアントＣａｓＺポリペプチドである、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【請求項３１】
前記ＣａｓＺポリペプチド、前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする前記核酸、前記ＣａｓＺガイドＲＮＡ、前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする前記核酸、前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ、及び前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする前記核酸のうちの少なくとも１つが、異種部分とコンジュゲートする、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【請求項３２】
前記異種部分が、異種ポリペプチドである、請求項３１に記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【請求項３３】
前記ＣａｓＺポリペプチドが、対応する野生型ＣａｓＺタンパク質と比較して減少したヌクレアーゼ活性を有し、異種ポリペプチドと融合する、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【請求項３４】
前記異種ポリペプチドが、（ｉ）ＤＮＡ修飾活性を有し、（ｉｉ）転写を増加もしくは減少させる能力を示し、及び／または（ｉｉｉ）ＤＮＡに関連するポリペプチドを修飾する酵素活性を有する、請求項３３に記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【請求項３５】
前記ＣａｓＺポリペプチドが、図１または図７のＣａｓＺタンパク質と７０％以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【請求項３６】
前記ガイド配列、及び前記ＣａｓＺポリペプチドに結合する前記領域が、互いに異種である、先行する請求項のいずれか一項に記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【請求項３７】
試料中の標的ＤＮＡを検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、
（ｉ）ＣａｓＺポリペプチド、
（ｉｉ）前記ＣａｓＺポリペプチドに結合する領域、及び、前記標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列を含む、ガイドＲＮＡ、ならびに
（ｉｉｉ）一本鎖であり、かつ前記ガイドＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない、検出ＤＮＡ
と接触させることと、
（ｂ）前記ＣａｓＺによる前記一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成された検出可能なシグナルを測定し、それにより、前記標的ＤＮＡを検出することと
を含む、前記方法。
【請求項３８】
前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記標的ＤＮＡが、二本鎖である、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記標的ＤＮＡが、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはパルボウイルスＤＮＡである、請求項３７〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＣａｓＺポリペプチドが、図１及び７のいずれか一方に記載の前記ＣａｓＺアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記ＣａｓＺポリペプチドが、Ｃａｓ１４ａポリペプチドである、請求項３７〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記試料が、細胞溶解物からのＤＮＡ分子を含む、請求項３７〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記試料が、細胞を含む、請求項３７〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記接触が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて細胞の内部で行われる、請求項３７〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が、真核細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記標的ＤＮＡが、１０ａＭ程度の低さの濃度で検出され得る、請求項３７〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記試料中に存在する前記標的ＤＮＡの量を決定することを含む、請求項３７〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記決定が、
前記検出可能なシグナルを測定して試験測定値を生成することと、
参照試料または細胞によって生成される検出可能なシグナルを測定して、参照測定値を生成することと、
前記試験測定値を前記参照測定値と比較して、前記試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することと
を含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
検出可能なシグナルの測定が、金ナノ粒子ベースの検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学検出、及び半導体ベースの感知のうちの１つ以上を含む、請求項３７〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、蛍光発光色素対を含む、請求項３７〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記蛍光発光色素対が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断前に、ある量の検出可能なシグナルを生成し、前記検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に減少する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、切断される前に第１の検出可能なシグナルを生成し、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に第２の検出可能なシグナルを生成する、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、請求項５２〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に増加する、請求項１８に記載の方法。
【請求項５７】
前記蛍光発光色素対が、クエンチャー／蛍光体対である、請求項５２または請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、２つ以上の蛍光発光色素対を含む、請求項５２〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記２つ以上の蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対及びクエンチャー／蛍光体対を含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、修飾核酸塩基、修飾糖部分、及び／または修飾核酸結合を含む、請求項３７〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記試料中の核酸を増幅することを含む、請求項３７〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記増幅が、等温増幅を含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記等温増幅が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記増幅が、ステップ（ａ）の前記接触の前に開始する、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記増幅が、ステップ（ａ）の前記接触と同時に開始する、請求項６１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
試料中の標的ＤＮＡを検出するためのキットであって、
（ａ）ＣａｓＺポリペプチドに結合する領域と標的ＤＮＡに対して相補的なガイド配列とを含む、ガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、及び
（ｂ）一本鎖であり、かつ前記ガイドＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない、標識された検出ＤＮＡ
を含む、前記キット。
【請求項６７】
ＣａｓＺポリペプチドをさらに含む、請求項６６に記載のキット。
【請求項６８】
前記ＣａｓＺポリペプチドが、図１及び７のいずれか一方に記載の前記ＣａｓＺアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項６７に記載のキット。
【請求項６９】
前記ＣａｓＺポリペプチドが、Ｃａｓ１４ａポリペプチドである、請求項６７に記載のキット。
【請求項７０】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、蛍光発光色素対を含む、請求項６６〜６９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７１】
前記蛍光発光色素対が、ＦＲＥＴ対である、請求項７０に記載のキット。
【請求項７２】
前記蛍光発光色素対が、クエンチャー／蛍光体対である、請求項７０に記載のキット。
【請求項７３】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、２つ以上の蛍光発光色素対を含む、請求項７０〜７２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７４】
前記２つ以上の蛍光発光色素対が、第１の検出可能なシグナルを生成する第１の蛍光発光色素対、及び第２の検出可能なシグナルを生成する第２の蛍光発光色素対を含む、請求項７３に記載のキット。
【請求項７５】
核酸増幅成分をさらに含む、請求項６６〜７４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項７６】
前記核酸増幅成分が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）のための成分である、請求項７５に記載のキット。
【請求項７７】
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を切断する方法であって、
標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む、核酸の集団を、
（ｉ）ＣａｓＺポリペプチド、ならびに
（ｉｉ）前記ＣａｓＺポリペプチドに結合する領域、及び前記標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列を含む、ガイドＲＮＡ
と接触させることを含み、
前記ＣａｓＺポリペプチドが、前記複数の非標的ｓｓＤＮＡを切断する、前記方法。
【請求項７８】
前記接触が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて細胞の内部で行われる、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞が、真核細胞である、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記真核細胞が、植物細胞である、請求項７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記非標的ｓｓＤＮＡが、前記細胞にとって異種である、請求項７８〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記非標的ｓｓＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、請求項７７〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記標的ＤＮＡが、二本鎖である、請求項７７〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、請求項７７〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記標的ＤＮＡが、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはパルボウイルスＤＮＡである、請求項７７〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１７年１１月１日に出願された米国仮特許出願第６２／５８０，３９５号の利益を主張するものであり、この出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
テキストファイルとして提供される配列表の参照による組み込み
配列表が、２０１８年１０月３０日に作成され、５３６ＫＢの大きさを有する、テキストファイル「ＢＥＲＫ−３７４ＷＯ＿ＳＥＱ＿ＬＩＳＴＩＮＧ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」として、本明細書とともに提供される。テキストファイルの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
序文
ＤＮＡシーケンシング時代以前には科学に知られていなかった経路の一例であるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、現在、ファージ及びウイルスに対する獲得免疫を細菌及び古細菌に付与することが理解されている。徹底的な研究が、このシステムの生化学を明らかにしている。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、外来ＤＮＡまたはＲＮＡの獲得、標的化、及び切断に関与しているＣａｓタンパク質、ならびにＣａｓタンパク質をそれらの標的に誘導する隣接する短いスペーサー配列の直接反復を含むＣＲＩＳＰＲアレイからなる。クラス２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓは、ＲＮＡに結合された単一のＣａｓタンパク質が、標的化された配列への結合及び標的化された配列の切断を担う、合理化されたバージョンである。これらの最小限のシステムのプログラム可能な性質は、ゲノム操作の分野に変革をもたらす汎用性の高い技術としてのそれらの使用を容易にしている。
【発明の概要】
【０００４】
本開示は、（１）「ＣａｓＺ」タンパク質（ＣａｓＺポリペプチドとも称される）、ＣａｓＺタンパク質をコードする核酸、及び／またはＣａｓＺタンパク質（及び／またはそれをコードする核酸）を含む修飾宿主細胞；（２）ＣａｓＺタンパク質に結合し、ＣａｓＺタンパク質に配列特異性を提供するＣａｓＺガイドＲＮＡ、ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸、及び／またはＣａｓＺガイドＲＮＡ（及び／またはそれをコードする核酸）を含む修飾宿主細胞；ならびに（３）ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）（本明細書では「ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ」と称される）、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸、及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（及び／またはそれをコードする核酸）を含む修飾宿主細胞のうちの１つ以上を含む、組成物及び方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１−１】天然型ＣａｓＺタンパク質配列の例を示す。
【図１−２】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−３】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−４】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−５】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−６】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−７】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−８】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−９】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−１０】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−１１】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−１２】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−１３】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−１４】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−１５】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−１６】図１−１の説明を参照のこと。
【図１−１７】図１−１の説明を参照のこと。
【図２】ＣａｓＺタンパク質に加えてＣａｓ１タンパク質を含む、ＣａｓＺ遺伝子座の概略図を示す。
【図３】ＣａｓＺ配列の系統樹を、他のクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質配列に関連付けて示す。
【図４】ＣａｓＺ遺伝子座からのＣａｓ１配列の系統樹を、他のクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座からのＣａｓ１配列に関連付けて示す。
【図５−１】ＣａｓＺ遺伝子座からのｔｒａｎｃＲＮＡの発現を表すトランスクリプトームのＲＮＡマッピングデータを示す。ｔｒａｎｃＲＮＡはＣａｓＺ反復アレイに隣接しているが、反復配列を含まず、反復配列に対して相補的ではない。以下の遺伝子座、すなわちＣａｓＺａ３、ＣａｓＺｂ４、ＣａｓＺｃ５、ＣａｓＺｄ１、及びＣａｓＺｅ３についてのＲＮＡマッピングデータが示される。小さな反復する整列された矢印は、（ガイドＲＮＡコード配列の存在を示す）ＣＲＩＳＰＲアレイの反復を表す。反復アレイに対して外側及び隣接するピークは、高度に転写されたｔｒａｎｃＲＮＡを表す。図５（続き１）ヌクレオチド配列（上から下に：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３１２〜３３１）。図５（続き３）ヌクレオチド配列（上から下に：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６１〜１７７）。
【図５−２】図５−１の説明を参照のこと。
【図５−３】図５−１の説明を参照のこと。
【図５−４】図５−１の説明を参照のこと。
【図５−５】図５−１の説明を参照のこと。
【図５−６】図５−１の説明を参照のこと。
【図５−７】図５−１の説明を参照のこと。
【図６】ＣａｓＺｃ（上）及びＣａｓＺｂ（下）についてＰＡＭ枯渇アッセイを使用してアッセイした場合のＰＡＭ選好性の結果を示す。
【図７−１】本明細書に記載されるＣａｓ１４タンパク質の配列を示す。
【図７−２】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−３】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−４】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−５】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−６】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−７】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−８】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−９】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−１０】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−１１】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−１２】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−１３】図７−１の説明を参照のこと。
【図７−１４】図７−１の説明を参照のこと。
【図８−１】パネルＡ〜Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ゲノム遺伝子座の構造及び系統発生を示す。
【図８−２】図８−１の説明を参照のこと。
【図９】Ｃａｓ１４オルソログの系統解析を示す。
【図１０】既知のＣＲＩＳＰＲシステムからのＣＡＳ１の最尤樹を示す。
【図１１】パネルＡ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４システムによる新規スペーサーの獲得を示す。
【図１２】パネルＡ〜Ｄは、ｔｒａｃｒＲＮＡを活発に適合してコードする、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ａを示す。
【図１３−１】パネルＡ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４遺伝子座のメタトランスクリプトミクスを示す。
【図１３−２】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−３】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−４】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１３−５】図１３−１の説明を参照のこと。
【図１４】パネルＡ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４によるＲＮＡプロセシング及び異種発現を示す。
【図１５−１】パネルＡ〜Ｄは、Ｃａｓ１４ａ１及びＳｐＣａｓ９によるプラスミドの枯渇を示す。
【図１５−２】図１５−１の説明を参照のこと。
【図１５−３】図１５−１の説明を参照のこと。
【図１５−４】図１５−１の説明を参照のこと。
【図１６−１】パネルＡ〜Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ａが、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼであることを示す。
【図１６−２】図１６−１の説明を参照のこと。
【図１６−３】図１６−１の説明を参照のこと。
【図１７−１】パネルＡ〜Ｅは、Ｃａｓ１４ａ１によるｓｓＤＮＡの分解を示す。
【図１７−２】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１７−３】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１７−４】図１７−１の説明を参照のこと。
【図１８】様々なガイドＲＮＡ成分を有するｓｓＤＮＡのＣａｓ１４ａ１切断の動態を示す。
【図１９−１】パネルＡ〜Ｆは、Ｃａｓ１４ａ１ガイドＲＮＡ成分の最適化を示す。
【図１９−２】図１９−１の説明を参照のこと。
【図１９−３】図１９−１の説明を参照のこと。
【図２０−１】パネルＡ〜Ｅは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ａによる高忠実度のｓｓＤＮＡ  ＤＮＰ検出を示す。パネルＣは、ヌクレオチド配列（上から下に：ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３６７〜３７０）を提供する。
【図２０−２】図２０−１の説明を参照のこと。
【図２０−３】図２０−１の説明を参照のこと。
【図２０−４】図２０−１の説明を参照のこと。
【図２１−１】パネルＡ〜Ｆは、Ｃａｓ１４ａ１切断速度に対する様々なアクチベータの影響を示す。
【図２１−２】図２１−１の説明を参照のこと。
【図２１−３】図２１−１の説明を参照のこと。
【図２２−１】パネルＡ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４システムの多様性を示す。
【図２２−２】図２２−１の説明を参照のこと。
【図２３−１】パネルＡ〜Ｃは、異種宿主におけるＣａｓ１４ａ１媒介干渉の試験を示す。Ｅ．ｃｏｌｉにおける干渉を試験するための、Ｃａｓ１４ａ１及びＬｂＣａｓ１２ａコンストラクトの図である。
【図２３−２】図２３−１の説明を参照のこと。
【図２４−１】本発明において使用されるプラスミドのＣａｓ１４ヌクレオチド配列を示す。
【図２４−２】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−３】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−４】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−５】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−６】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−７】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−８】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−９】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−１０】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−１１】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−１２】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−１３】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−１４】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−１５】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−１６】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２４−１７】図２４−１の説明を参照のこと。
【図２５−１】パネルＡ〜Ｅは、図２４に開示されるプラスミドの各々の配列マップを示す。
【図２５−２】図２５−１の説明を参照のこと。
【図２５−３】図２５−１の説明を参照のこと。
【図２５−４】図２５−１の説明を参照のこと。
【図２５−５】図２５−１の説明を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
定義
本明細書で使用される場合、「異種」とは、それぞれ天然の核酸またはタンパク質中には見られないヌクレオチドまたはポリペプチド配列を意味する。例えば、ＣａｓＺポリペプチドに対して、異種ポリペプチドは、ＣａｓＺポリペプチド以外のタンパク質からのアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、ある種からのＣａｓＺタンパク質の部分が、異なる種からのＣａｓＺタンパク質の部分と融合する。したがって、各種からのＣａｓＺ配列は、互いに対して異種であると見なすことができる。別の例として、ＣａｓＺタンパク質（例えば、ｄＣａｓＺタンパク質）は、非ＣａｓＺタンパク質（例えば、ヒストンデアセチラーゼ）からの活性ドメインと融合することができ、活性ドメインの配列は、異種ポリペプチドである（ＣａｓＺタンパク質に対して異種である）と見なすことができる。
【０００７】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、この用語は、一本鎖、二本鎖、もしくは多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、あるいはプリン塩基及びピリミジン塩基または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを含むが、これらに限定されない。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能である場合、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むことが理解されるべきである。
【０００８】
「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは、遺伝的にコードされた、及び非遺伝的にコードされたアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾された、または誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。この用語は、融合タンパク質を含み、異種アミノ酸配列を有する融合タンパク質、Ｎ末端メチオニン残基を有するかまたは有しない異種及び同種リーダー配列との融合体；免疫学的にタグ付けされたタンパク質等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０００９】
本明細書で使用される場合、「天然型」という用語は、核酸、タンパク質、細胞、または生物に適用される場合、天然に見出される核酸、細胞、タンパク質、または生物を指す。
【００１０】
本明細書で使用される場合、「単離された」という用語は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞が天然に発生する環境とは異なる環境内にあるポリヌクレオチド、ポリペプチド、または細胞を説明することを意味する。単離された遺伝子修飾された宿主細胞は、遺伝子修飾された宿主細胞の混合集団中に存在し得る。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「外因性核酸」という用語は、天然の所与の細菌、生物、もしくは細胞において通常もしくは天然に見出されない、及び／またはそれによって産生されない核酸を指す。本明細書で使用される場合、「内因性核酸」という用語は、天然の所与の細菌、生物、または細胞において通常見出される、及び／またはそれによって産生される核酸を指す。「内因性核酸」はまた、「天然核酸」、または所与の細菌、生物、もしくは細胞に「天然」である核酸とも称される。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「組み換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、自然分類系において見出される内因性核酸から区別可能な構造的コードまたは非コード配列を有するコンストラクトをもたらすクローニング、制限、及び／またはライゲーションステップの様々な組み合わせの産物であることを意味する。一般に、構造的コード配列をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片及び短いオリゴヌクレオチドリンカーから、または一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられて、細胞または無細胞転写及び翻訳系に含有される組み換え転写単位から発現が可能である合成核酸を提供することができる。そのような配列は、典型的に真核生物遺伝子内に存在する、内部非翻訳配列またはイントロンによって中断されない、オープンリーディングフレームの形態で提供され得る。また、関連配列を含むゲノムＤＮＡも、組み換え遺伝子または転写単位の形成において使用することができる。非翻訳ＤＮＡの配列は、そのような配列がコード領域の操作または発現に干渉しない、オープンリーディングフレームから５’または３’に存在してもよく、実際に様々な機序による所望の産生物の産生を調節するように作用してもよい（下記の「ＤＮＡ調節配列」を参照）。
【００１３】
したがって、例えば、「組み換え」ポリヌクレオチドまたは「組み換え」核酸という用語は、天然に発生しない、例えば、ヒト介入を通して、配列の２つの、あるいは分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学的合成手段によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子工学的技法によっての、いずれかで達成されるる。これは通常、コドンを、それをコードする冗長コドンまたは保存アミノ酸と置換するために、典型的には配列認識部位を導入または除去しながら行われる。あるいは、所望の機能の核酸セグメントを一緒に接合して、所望の機能の組み合わせを生成するために実施される。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学的合成手段によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子工学的技法によっての、いずれかで達成される。
【００１４】
同様に、「組み換え」ポリペプチドという用語は、天然に発生しない、例えば、ヒト介入を通して、アミノ配列の２つの、あるいは分離されたセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるポリペプチドを指す。したがって、例えば、異種アミノ酸配列を含むポリペプチドは、組み換えである。
【００１５】
「コンストラクト」または「ベクター」とは、組み換え核酸、一般には、特定のヌクレオチド配列（複数可）の発現及び／もしくは伝播を目的として生成されている、または他の組み換えヌクレオチド配列の構築において使用されるための、組み換えＤＮＡを意味する。
【００１６】
本明細書で互換的に使用される「ＤＮＡ調節配列」「制御要素」、及び「調節要素」という用語は、宿主細胞におけるコード配列の発現及び／またはコードされたポリペプチドの産生を提供及び／または調節する、転写及び翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナル等を指す。
【００１７】
「形質転換」という用語は、本明細書では「遺伝的修飾」と互換的に使用され、細胞中に新たな核酸（例えば、細胞に対して外因性のＤＮＡ）を導入した後に細胞中で誘導される永久的なまたは一過性の遺伝的変化を指す。遺伝的変化（「修飾」）は、宿主細胞のゲノム中への新たな核酸の組み込み、またはエピソーム要素としての新たな核酸の一過性のもしくは安定した維持、のいずれかによって達成することができる。細胞が真核細胞である場合、永久的な遺伝的変化は、一般に細胞のゲノム中への新たなＤＮＡの導入によって達成される。原核細胞では、永久的な変化は、染色体中に、またはプラスミド及び発現ベクターなどの染色体外要素を介して導入され得、これらは組み換え宿主細胞中のそれらの維持を助けるために１つ以上の選択可能なマーカーを含有し得る。遺伝的修飾の好適な方法としては、ウイルス感染、形質移入、コンジュゲート、プロトプラスト融合、電気穿孔、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション等が挙げられる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の種類、及び形質転換が起こる状況（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。これらの方法に関する一般的な考察は、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ，Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９５に見出すことができる。
【００１８】
「動作可能に連結した」は、並立を指し、そのように説明される構成要素は、それらがその意図される様式で機能することを可能する関係にある。例えば、プロモーターは、当該プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列と動作可能に連結している。本明細書で使用される場合、「異種プロモーター」及び「異種制御領域」という用語は、自然では特定の核酸に通常は関連しないプロモーター及び他の制御領域を指す。例えば、「コード領域に対して異種の転写制御領域」は、自然ではそのコード領域に通常は関連しない転写制御領域である。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」は、インビボまたはインビトロの真核細胞、原核細胞、または単細胞実体として培養された多細胞生物からの細胞（例えば、細胞株）を示し、真核または原核細胞は、核酸のレシピエント（例えば、発現ベクター）として使用され得るか、または核酸のレシピエントとして使用されており、核酸によって遺伝子修飾されている元の細胞の子孫を含む。単細胞の子孫は、天然の、不慮の、または意図的な変異に起因して、形態において、またはゲノムもしくは総ＤＮＡ相補体において、元の親と必ずしも完全に同一でない場合があることが理解される。「組み換え宿主細胞」（「遺伝子修飾された宿主細胞」とも称される）は、異種核酸、例えば、発現ベクターが中に導入されている宿主細胞である。例えば、対象の原核宿主細胞は、異種核酸、例えば、その原核宿主細胞に対して外来である（原核宿主細胞中で通常は天然に見出されない）外因性核酸、または原核宿主細胞中で通常は見出されない組み換え核酸の好適な原核宿主細胞への導入によって遺伝子修飾された原核宿主細胞（例えば、細菌）であり、対象の真核宿主細胞は、異種核酸、例えば、その真核宿主細胞に対して外来である外因性核酸、または真核宿主細胞中で通常は見出されない組み換え核酸の好適な真核宿主細胞への導入によって遺伝子修飾された真核宿主細胞である。
【００２０】
「保存アミノ酸置換」という用語は、類似した側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質中の互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンからなる。例示的な保存アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００２１】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定の「配列同一性」のパーセントを有する。これは、整列したときに、そのパーセントの塩基またはアミノ酸が、それら２つの配列を比較したときに同一であり、同じ相対位置にあることを意味する。配列類似性はいくつかの異なる様式で決定することができる。配列同一性を決定するために、ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ／上で利用可能なＢＬＡＳＴを含む方法及びコンピュータプログラムを使用して、配列を整列することができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０を参照されたい。別のアラインメントアルゴリズムは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．の完全所有子会社であるＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）パッケージ（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡ）で入手可能なＦＡＳＴＡである。アラインメントのための他の技法は、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２６６：Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ（１９９６），ｅｄ．Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．（Ｈａｒｃｏｕｒｔ  Ｂｒａｃｅ＆Ｃｏ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，ＵＳＡの一事業部）に記載されている。特に興味深いのは、配列間のギャップを許容するアライメントプログラムである。Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎは、配列アライメントにおけるギャップを許容する一種のアルゴリズムである。Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．７０：１７３−１８７（１９９７）を参照されたい。また、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアライメント法を使用するＧＡＰプログラムを利用して、配列を整列させることもできる。Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）を参照されたい。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「処置」、「処置する」等の用語は、薬理学的及び／または生理学的効果を得ることを指す。その効果は、その疾患もしくは症状を完全にまたは部分的に予防するという観点において予防的であり得、かつ／または疾患及び／もしくはその疾患に起因する副作用の部分的または完全な治癒という観点において治療的であり得る。本明細書で使用される場合、「処置」は、哺乳動物、例えば、ヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（ａ）その疾患にかかりやすいが、まだそれに罹患していると診断されていない対象における発病を予防すること、（ｂ）その疾患を阻害すること、すなわち、その発症を阻止すること、及び（ｃ）その疾患を軽減すること、すなわち、その疾患の退行を引き起こすことを含む。
【００２３】
本明細書で互換的に使用される「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、個々の生物、例えば、マウス、サル、非ヒト霊長類、ヒト、哺乳動物の家畜、哺乳動物の競技用動物、及び哺乳動物の愛玩動物を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。
【００２４】
本発明をさらに記載する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。
【００２５】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、独立して、よりその小さい範囲内に含まれてもよく、また、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本発明に包含される。表示範囲がそれらの限界値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される限界値のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に包含される。
【００２６】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様もしくは同等の任意の方法及び材料を、本発明の実践または試験においても使用することができるが、好ましい方法及び材料がこれから記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、それらの刊行物が引用されるものに関連して方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００２７】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が別途明らかに規定しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「ＣａｓＺポリペプチド（ａ  ＣａｓＺ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、複数のそのようなポリペプチドを含み、「ガイドＲＮＡ（ｔｈｅ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）」への言及は、１つ以上のガイドＲＮＡ及び当業者に既知のそれらの同等物などへの言及を含む。特許請求の範囲があらゆる任意の要素を除外するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関して、「単に」、「のみ」などのような排他的な用語法の使用、または「否定的な」制限の使用に対する先行基準として役立つことが意図される。
【００２８】
明確化のために別個の実施形態の文脈において記載される本発明のある特定の特徴を、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることが理解される。反対に、簡潔化のために単一の実施形態の文脈において記載される本発明の様々な特徴を、別個に、または任意の好適な副組み合わせで提供することもできる。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって特異的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素の全ての副組み合わせもまた、本発明によって特異的に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個々にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
【００２９】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によるそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
【００３０】
詳細な説明
本開示は、（１）「ＣａｓＺ」タンパク質（ＣａｓＺポリペプチドとも称される）、ＣａｓＺタンパク質をコードする核酸、及び／またはＣａｓＺタンパク質（及び／またはそれをコードする核酸）を含む修飾宿主細胞；（２）ＣａｓＺタンパク質に結合し、ＣａｓＺタンパク質に配列特異性を提供するＣａｓＺガイドＲＮＡ、ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸、及び／またはＣａｓＺガイドＲＮＡ（及び／またはそれをコードする核酸）を含む修飾宿主細胞；ならびに（３）ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）（本明細書では「ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ」と称される）、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸、及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（及び／またはそれをコードする核酸）を含む修飾宿主細胞のうちの１つ以上を含む、組成物及び方法を提供する。
【００３１】
組成物
ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＺタンパク質、ガイドＲＮＡ、及びｔｒａｎｃＲＮＡ
クラス２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、単一のマルチドメインタンパク質を含むエフェクターモジュールを特徴とする。ＣａｓＺシステムでは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、ＣａｓＺタンパク質）は、対応するガイドＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ）と相互作用（結合）し、ガイドＲＮＡと標的核酸分子内の標的配列との間の塩基対合を介して標的核酸中の特定の部位に標的化される、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。ガイドＲＮＡは、標的核酸の配列（標的部位）に相補的なヌクレオチド配列（ガイド配列）を含む。したがって、ＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺガイドＲＮＡと複合体を形成し、ガイドＲＮＡは、ガイド配列を介してＲＮＰ複合体に配列特異性を提供する。複合体のＣａｓＺタンパク質は、部位特異的な活性を提供する。換言すれば、ＣａｓＺタンパク質は、ガイドＲＮＡとのその会合により、標的核酸内の標的部位（例えば、標的染色体核酸内の標的ヌクレオチド配列；または、例えば、エピソーム核酸、ミニサークル核酸、ミトコンドリア核酸、緑葉体核酸などの、標的染色体外核酸内の標的ヌクレオチド配列）に誘導される（例えば、標的部位において安定化される）。
【００３２】
本開示は、ＣａｓＺポリペプチド（及び／またはＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸）を含む組成物を提供する（例えば、ＣａｓＺポリペプチドが、天然に存在するＣａｓＺタンパク質、ニッカーゼＣａｓＺタンパク質、ｄＣａｓＺタンパク質、キメラＣａｓＺタンパク質等であり得る）（ＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、ＣａｓＺｉ、ＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｋ、またはＣａｓＺｌタンパク質）。本開示は、ＣａｓＺガイドＲＮＡ（及び／またはＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸）を含む組成物を提供する。例えば、本開示は、（ａ）ＣａｓＺポリペプチド（及び／またはＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸）、ならびに（ｂ）ＣａｓＺガイドＲＮＡ（及び／またはＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸）を含む、組成物を提供する。本開示は、（ａ）ＣａｓＺポリペプチド、及び（ｂ）ＣａｓＺガイドＲＮＡを含む、核酸／タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）を提供する。本開示は、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡを含む組成物を提供する。本開示は、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡと、（ａ）ＣａｓＺタンパク質、及び（ｂ）ＣａｓＺガイドＲＮＡのうちの１つ以上とを含む（例えば、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡとＣａｓＺタンパク質、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡとＣａｓＺガイドＲＮＡ、またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡとＣａｓＺタンパク質及びＣａｓＺガイドＲＮＡを含む）、組成物を提供する。本開示は、（ａ）ＣａｓＺポリペプチド、（ｂ）ＣａｓＺガイドＲＮＡ、及び（ｃ）ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡを含む、核酸／タンパク質複合体（ＲＮＰ複合体）を提供する。本開示は、ＣａｓＺタンパク質と、（ａ）ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ、及び（ｂ）ＣａｓＺガイドＲＮＡのうちの１つ以上とを含む、組成物を提供する。
【００３３】
ＣａｓＺタンパク質
ＣａｓＺポリペプチド（この用語は、「ＣａｓＺタンパク質」、「Ｃａｓ１４」、「Ｃａｓ１４ポリペプチド」、または「Ｃａｓ１４タンパク質」という用語と互換的に使用される）は、標的核酸及び／または標的核酸に関連するポリペプチドと結合及び／またはそれを修飾（例えば、切断、ニック、メチル化、脱メチル化等）することができる（例えば、ヒストン尾部のメチル化またはアセチル化）（例えば、いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質は活性を有する融合パートナーを含み、いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質はヌクレアーゼ活性を提供する）。いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質は、（例えば、原核細胞において天然に発生する）天然型タンパク質である。他の場合では、ＣａｓＺタンパク質は、天然型ポリペプチドではない（例えば、ＣａｓＺタンパク質は、バリアントＣａｓＺタンパク質、キメラタンパク質などである）。ＣａｓＺタンパク質は、３つの部分的なＲｕｖＣドメイン（ＲｕｖＣ−Ｉ、ＲｕｖＣ−ＩＩ、及びＲｕｖＣ−ＩＩＩ、本明細書ではサブドメインとも称される）を含み、これはＣａｓＺタンパク質の一次アミノ酸配列に対して隣接していないが、タンパク質が産生されて折り重なるとＲｕｖＣドメインを形成する。天然型ＣａｓＺタンパク質は、標的化された核酸における特定の配列（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ））での切断に触媒作用を引き起こす、エンドヌクレアーゼとして機能する。配列特異性は、標的ＤＮＡ内の標的配列にハイブリダイズする、付随するガイドＲＮＡによって提供される。天然型ＣａｓＺガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡであり、ｃｒＲＮＡは、（ｉ）標的ＤＮＡ中の標的配列にハイブリダイズするガイド配列、及び（ｉｉ）ＣａｓＺタンパク質に結合するタンパク質結合セグメントを含む。
【００３４】
いくつかの実施形態では、対象の方法及び／または組成物のＣａｓＺタンパク質は、天然型（野生型）のタンパク質である（またはそれに由来する）。天然型ＣａｓＺタンパク質の例（例えば、ＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、ＣａｓＺｉ、ＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｋ、ＣａｓＺｌ）が、図１に示されている。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺａタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｂタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｃタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｄタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｅタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｆタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｇタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｈタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｉタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｊタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｋタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｌタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、またはＣａｓＺｈタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｋ、ＣａｓＺｌタンパク質である。
【００３５】
この新たに発見されたタンパク質（ＣａｓＺ）は、以前特定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓエンドヌクレアーゼと比較して短く、したがって、代替物としてのこのタンパク質の使用は、タンパク質をコードするヌクレオチド配列が比較的短いという利点を提供することに留意することが重要である。これは、例えば、ＣａｓＺタンパク質をコードする核酸が真核細胞（例えば、哺乳動物細胞、ヒト細胞、マウス細胞、インビトロ、エクスビボ、インビボ）などの細胞への送達に望ましい場合において、例えば、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）を用いる状況において、研究及び／または臨床応用に有用である。加えて、ＣａｓＺコードＤＮＡ配列は、それらの自然な文脈では、ＣＡＳ１タンパク質も有する遺伝子座において存在する。
【００３６】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、９００アミノ酸以下（例えば、８５０アミノ酸以下、８００アミノ酸以下、７５０アミノ酸以下、または７００アミノ酸以下）の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、８５０アミノ酸以下（例えば、８５０アミノ酸以下）の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、８００アミノ酸以下（例えば、７５０アミノ酸以下）の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、７００アミノ酸以下の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、６５０アミノ酸以下の長さを有する。
【００３７】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、３５０〜９００アミノ酸（例えば、３５０〜８５０、３５０〜８００、３５０〜７５０、３５０〜７００、４００〜９００、４００〜８５０、４００〜８００、４００〜７５０、または４００〜７００アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００３８】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺａ）は、３５０〜７５０アミノ酸（例えば、３５０〜７００、３５０〜５５０、４５０〜５５０、４５０〜７５０、４５０〜６５０、または４５０〜５５０アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺａ）は、４５０〜７５０アミノ酸（例えば、５００〜７００アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺａ）は、３５０〜７００アミノ酸（例えば、３５０〜６５０、３５０〜６００、または３５０〜５５０アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺａ）は、５００〜７００アミノ酸の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺａ）は、４５０〜５５０アミノ酸の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺａ）は、３５０〜５５０アミノ酸の範囲の長さを有する。
【００３９】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｂ）は、３５０〜７００アミノ酸（例えば、３５０〜６５０、または３５０〜６２０アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｂ）は、４５０〜７００アミノ酸（例えば、４５０〜６５０、５００〜６５０、または５００〜６２０アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｂ）は、５００〜６５０アミノ酸（例えば、５００〜６２０アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｂ）は、５００〜６２０アミノ酸の範囲の長さを有する。
【００４０】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｃ）は、６００〜８００アミノ酸（例えば、６００〜６５０または７００〜８００アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｃ）は、６００〜６５０アミノ酸の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｃ）は、７００〜８００アミノ酸の範囲の長さを有する。
【００４１】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｄ）は、４００〜６５０アミノ酸（例えば、４００〜６００、４００〜５５０、５００〜６５０、５００〜６００、または５００〜５５０アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｄ）は、５００〜６００アミノ酸の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｄ）は、５００〜５５０アミノ酸の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｄ）は、４００〜５５０アミノ酸の範囲の長さを有する。
【００４２】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｅ）は、４５０〜７００アミノ酸（例えば、４５０〜６５０、４５０〜６１５、４７５〜７００、４７５〜６５０、または４７５〜６１５アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｅ）は、４５０〜６７５アミノ酸の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｅ）は、４７５〜６７５アミノ酸の範囲の長さを有する。
【００４３】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｆ）は、４００〜５５０アミノ酸（例えば、４００〜５２０、４００〜５００、４００〜４７５、４１５〜５５０、４１５〜５２０、４１５〜５００、または４１５〜４７５アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｆ）は、４００〜４７５アミノ酸（例えば、４００〜４５０アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００４４】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｇ）は、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０または５００〜７００アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｇ）は、７００〜７５０アミノ酸の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｇ）は、５５０〜６００アミノ酸の範囲の長さを有する。
【００４５】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｈ）は、３８０〜４５０アミノ酸（例えば、３８０〜４２０、４００〜４５０、４００〜４２０アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｈ）は、４００〜４２０アミノ酸の範囲の長さを有する。
【００４６】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｉ）は、７００〜８００アミノ酸（例えば、７００〜７５０、７２０〜８００、または７２０〜７５０アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｉ）は、７２０〜７８０アミノ酸の範囲の長さを有する。
【００４７】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｊ）は、６００〜７５０アミノ酸（例えば、６００〜７００または６５０〜７００アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｊ）は、４００〜４２０アミノ酸の範囲の長さを有する。
【００４８】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｋ）は、４５０〜６００アミノ酸（例えば、４５０〜５８０、４８０〜６００、４８０〜５８０、または５００〜６００アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｋ）は、４８０〜５８０アミノ酸の範囲の長さを有する。
【００４９】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｌ）は、３５０〜５００アミノ酸（例えば、３５０〜４５０、３８０〜４５０、３５０〜４２０、または３８０〜４２０アミノ酸）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（例えば、ＣａｓＺｌ）は、３８０〜４２０アミノ酸の範囲の長さを有する。
【００５０】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）１つ以上のアミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺａアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、３５０〜８００アミノ酸（例えば、３５０〜８００、３５０〜７５０、３５０〜７００、３５０〜５５０、４５０〜５５０、４５０〜７５０、４５０〜６５０、または４５０〜５５０アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００５１】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｂタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｂタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｂタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｂタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｂアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｂアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｂタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、３５０〜７００アミノ酸（例えば、３５０〜６５０、または３５０〜６２０アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００５２】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｃタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｃタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｃタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｃタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｃアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｃアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｃタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、６００〜８００アミノ酸（例えば、６００〜６５０、または７００〜８００アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００５３】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｄタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｄタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｄタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｄタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｄアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｄアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｄタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、４００〜６５０アミノ酸（例えば、４００〜６００、４００〜５５０、５００〜６５０、５００〜６００、または５００〜５５０アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００５４】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｅアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、４５０〜７００アミノ酸（例えば、４５０〜６５０、４５０〜６１５、４７５〜７００、４７５〜６５０、または４７５〜６１５アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００５５】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｆタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｆタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｆタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｆタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｆアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｆアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｆタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、４００〜７５０アミノ酸（例えば、４００〜７００、７００〜６５０、４００〜６２０、４００〜６００、４００〜５５０、４００〜５２０、４００〜５００、４００〜４７５、４１５〜５５０、４１５〜５２０、４１５〜５００、または４１５〜４７５アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００５６】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｇタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｇタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｇタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｇタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｇアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｇアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｇタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５００〜７５０アミノ酸（例えば、５５０〜７５０アミノ酸））の範囲の長さを有する。
【００５７】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｈタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｈタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｈタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｈタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｈアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｈアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｈタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、３８０〜４５０アミノ酸（例えば、３８０〜４２０、４００〜４５０、または４００〜４２０アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００５８】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｉタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｉタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｉタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｉタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｉアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｉアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｉタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、７００〜８００アミノ酸（例えば、７００〜７５０、７２０〜８００、または７２０〜７５０アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００５９】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｊタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｊタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｊタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｊタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｊアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｊアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｊタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、６００〜７５０アミノ酸（例えば、６００〜７００、または６５０〜７００アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００６０】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｋタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｋタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｋタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｋタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｋアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｋアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｋタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、４５０〜６００アミノ酸（例えば、４５０〜５８０、４８０〜６００、４８０〜５８０、または５００〜６００アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００６１】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｌタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｌタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｌタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｌタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｌアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｌアミノ酸配列を含む（例えば、ＣａｓＺタンパク質がｄＣａｓＺであるような場合）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｌタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、４５０〜６００アミノ酸（例えば、４５０〜５８０、４８０〜６００、４８０〜５８０、または５００〜６００アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００６２】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、またはＣａｓＺｈタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、またはＣａｓＺｈタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、またはＣａｓＺｈタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、またはＣａｓＺｈタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、またはＣａｓＺｈタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、またはＣａｓＺｈタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、またはＣａｓＺｈタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、３５０〜９００アミノ酸（例えば、３５０〜８５０、３５０〜８００、４００〜９００、４００〜８５０、または４００〜８００アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００６３】
いくつかの場合には、（対象の組成物及び／または方法の）対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、ＣａｓＺｉ、ＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｋ、またはＣａｓＺｌタンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、ＣａｓＺｉ、ＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｋ、またはＣａｓＺｌタンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、ＣａｓＺｉ、ＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｋ、またはＣａｓＺｌタンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、ＣａｓＺｉ、ＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｋ、またはＣａｓＺｌタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、ＣａｓＺｉ、ＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｋ、またはＣａｓＺｌタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、タンパク質の天然型触媒活性を減少させる、（例えば、１つ以上の触媒アミノ酸位置での）アミノ酸置換（例えば、１つ、２つ、または３つのアミノ酸置換）を含む配列を除いて、図１または図７のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、ＣａｓＺｉ、ＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｋ、またはＣａｓＺｌタンパク質配列を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質は、図１または図７のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、ＣａｓＺｉ、ＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｋ、またはＣａｓＺｌタンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含み、３５０〜９００アミノ酸（例えば、３５０〜８５０、３５０〜８００、４００〜９００、４００〜８５０、または４００〜８００アミノ酸）の範囲の長さを有する。
【００６４】
ＣａｓＺバリアント
バリアントＣａｓＺタンパク質は、対応する野生型ＣａｓＺタンパク質のアミノ酸配列と比較したときに、少なくとも１つのアミノ酸が異なる（例えば、欠失、挿入、置換、融合を有する）アミノ酸配列を有する。二本鎖標的核酸の一方の鎖を切断するが、もう一方は切断しないＣａｓＺタンパク質は、本明細書では「ニッカーゼ」（例えば、「ニッカーゼＣａｓＺ」）と称される。実質的にヌクレアーゼ活性を有しないＣａｓＺタンパク質は、本明細書では死活ＣａｓＺタンパク質（「ｄＣａｓＺ」）と称される（ただし、ヌクレアーゼ活性は、キメラＣａｓＺタンパク質の場合、異種ポリペプチド、すなわち融合パートナーによって提供され得、これは以下でさらに詳細に記載される）。本明細書に記載されるＣａｓＺバリアントタンパク質（例えば、ニッカーゼＣａｓＺ、ｄＣａｓＺ、キメラＣａｓＺ）のうちのいずれについても、ＣａｓＺバリアントは、上記と同じパラメータ（例えば、存在するドメイン、同一性のパーセント、長さ等）を有するＣａｓＺタンパク質配列を含み得る。
【００６５】
バリアント−触媒活性
いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質は、例えば、天然型の触媒的に活性な配列に対して変異されたバリアントＣａｓＺタンパク質であり、対応する天然型の配列と比較したときに、低減された切断活性を呈する（例えば、９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、または３０％以下の切断活性を呈する）。いくつかの場合には、そのようなバリアントＣａｓＺタンパク質は、触媒的に「死活」タンパク質であり（実質的に切断活性を有しない）、「ｄＣａｓＺ」と称され得る。いくつかの場合には、バリアントＣａｓＺタンパク質は、ニッカーゼ（二本鎖標的核酸、例えば、二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖のみ切断する）である。本明細書でより詳細に記載されるように、いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質（いくつかの場合には、野生型切断活性を有するＣａｓＺタンパク質、いくつかの場合には、低減した切断活性を有するバリアントＣａｓＺ、例えば、ｄＣａｓＺまたはニッカーゼＣａｓＺ）は、関心対象の活性（例えば、関心対象の触媒活性）を有する異種ポリペプチドと融合（コンジュゲート）して、融合タンパク質（キメラＣａｓＺタンパク質）を形成する。
【００６６】
ＣａｓＺの触媒残基は、ＣａｓＺｉ．１に従って番号を付けられたとき、Ｄ４０５、Ｅ５８６、及びＤ６８４を含む（例えば、図１参照）。したがって、いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質は、低減された活性を有し、上記のアミノ酸のうちの１つ以上（または任意のＣａｓＺタンパク質の１つ以上の対応するアミノ酸）が変異している（例えば、アラニンで置換される）。いくつかの場合には、バリアントＣａｓＺタンパク質は、触媒的に「死活」タンパク質であり（触媒的に不活性である）、「ｄＣａｓＺ」と称される。ｄＣａｓＺタンパク質は、活性を提供する融合パートナーと融合することができ、いくつかの場合には、ｄＣａｓＺ（例えば、触媒活性を提供する融合パートナーはないが、真核細胞中で発現されるとき、ＮＬＳを有し得るもの）は、標的ＤＮＡに結合することができ、撮像に使用することができ（例えば、タンパク質はタグ付け／標識され得る）、かつ／またはＲＮＡポリメラーゼを標的ＤＮＡから転写するのを遮断することができる。いくつかの場合には、バリアントＣａｓＺタンパク質は、ニッカーゼ（二本鎖標的核酸、例えば、二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖のみ切断する）である。
【００６７】
バリアント−キメラＣａｓＺ（すなわち、融合タンパク質）
上記のように、いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質（いくつかの場合には、野生型切断活性を有するＣａｓＺタンパク質、いくつかの場合には、低減した切断活性を有するバリアントＣａｓＺ、例えば、ｄＣａｓＺまたはニッカーゼＣａｓＺ）は、関心対象の活性（例えば、関心対象の触媒活性）を有する異種ポリペプチドと融合（コンジュゲート）して、融合タンパク質（キメラＣａｓＺタンパク質）を形成する。ＣａｓＺタンパク質が融合され得る異種ポリペプチドは、本明細書では「融合パートナー」と称される。
【００６８】
いくつかの場合には、融合パートナーは、標的ＤＮＡの転写を調節する（例えば、転写を阻害する、転写を増加する）ことができる。例えば、いくつかの場合には、融合パートナーは、転写を阻害するタンパク質（例えば、転写リプレッサー、転写インヒビタータンパク質の動員、メチル化などの標的ＤＮＡの修飾、ＤＮＡ修飾因子の動員、標的ＤＮＡに関連したヒストンの調節、ヒストンのアセチル化及び／またはメチル化を改変するものなどのヒストン修飾因子の動員等を介して機能するタンパク質）（またはタンパク質からのドメイン）である。いくつかの場合には、融合パートナーは、転写を増加させるタンパク質（例えば、転写アクチベータ、転写アクチベータタンパク質の動員、脱メチル化などの標的ＤＮＡの修飾、ＤＮＡ修飾因子の動員、標的ＤＮＡに関連したヒストンの調節、ヒストンのアセチル化及び／またはメチル化を改変するものなどのヒストン修飾因子の動員等を介して機能するタンパク質）（またはタンパク質からのドメイン）である。
【００６９】
いくつかの場合には、キメラＣａｓＺタンパク質は、標的核酸を修飾する酵素活性（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ活性などのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、脱アミノ化活性、ジスムターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、リコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、またはグリコシラーゼ活性）を有する異種ポリペプチドを含む。
【００７０】
いくつかの場合には、キメラＣａｓＺタンパク質は、標的核酸に関連したポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾する酵素活性（例えば、メチルトランスフェラーゼ活性、デメチラーゼ活性、アセチルトランスフェラーゼ活性、デアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、または脱ミリストイル化活性）を有する異種ポリペプチドを含む。
【００７１】
転写の増加に使用され得るタンパク質（またはその断片）の例としては、ＶＰ１６、ＶＰ６４、ＶＰ４８、ＶＰ１６０、ｐ６５サブドメイン（例えば、ＮＦｋＢから）、ならびにＥＤＬＬの活性化ドメイン、及び／またはＴＡＬ活性化ドメイン（例えば、植物における活性のため）などの転写アクチベータ；ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１〜５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３などのヒストンリジンデメチラーゼ；ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ｐ３００、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫなどのヒストンアセチルトランスフェラーゼ；ならびにＴｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１などのＤＮＡデメチラーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【００７２】
転写の減少に使用され得るタンパク質（またはその断片）の例としては、Ｋｒｕｐｐｅｌ関連ボックス（ＫＲＡＢまたはＳＫＤ）などの転写リプレッサー；ＫＯＸ１抑制ドメイン；Ｍａｄ  ｍＳＩＮ３相互作用ドメイン（ＳＩＤ）；ＥＲＦリプレッサードメイン（ＥＲＤ）、ＳＲＤＸ抑制ドメイン（例えば、植物における抑制のため）等；Ｐｒ−ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４−２０Ｈ１、ＲＩＺ１などのヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ；ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ−１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹなどのヒストンリジンデメチラーゼ；ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１などのヒストンリジンデアセチラーゼ；ＨｈａＩ  ＤＮＡ  ｍ５ｃ−メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）などのＤＮＡメチラーゼ；及びＬａｍｉｎ  Ａ、Ｌａｍｉｎ  Ｂなどの末梢動員要素が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７３】
いくつかの場合には、融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）を修飾する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る酵素活性の例としては、制限酵素（例えば、ＦｏｋＩヌクレアーゼ）によって提供されるものなどのヌクレアーゼ活性、メチルトランスフェラーゼ（例えば、ＨｈａＩ  ＤＮＡ  ｍ５ｃ−メチルトランスフェラーゼ（Ｍ．ＨｈａＩ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ１（ＤＮＭＴ１）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ａ（ＤＮＭＴ３ａ）、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ３ｂ（ＤＮＭＴ３ｂ）、ＭＥＴＩ、ＤＲＭ３（植物）、ＺＭＥＴ２、ＣＭＴ１、ＣＭＴ２（植物）等）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性；デメチラーゼ（例えば、Ｔｅｎ−Ｅｌｅｖｅｎ  Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ（ＴＥＴ）ジオキシゲナーゼ１（ＴＥＴ１ＣＤ）、ＴＥＴ１、ＤＭＥ、ＤＭＬ１、ＤＭＬ２、ＲＯＳ１等）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ＤＮＡ修復活性、ＤＮＡ損傷活性、デアミナーゼ（例えば、ラットＡＰＯＢＥＣ１などのシトシンデアミナーゼ酵素）によって提供されるものなどの脱アミン化活性、ジムスターゼ活性、アルキル化活性、脱プリン化活性、酸化活性、ピリミジン二量体形成活性、インテグラーゼ及び／またはレゾルバーゼ（例えば、Ｇｉｎインベルターゼの超活性変異体、ＧｉｎＨ１０６ＹなどのＧｉｎインベルターゼ；ヒト免疫不全ウイルス１型インテグラーゼ（ＩＮ）；Ｔｎ３レゾルバーゼ等）によってもたらされるものなどのインテグラーゼ活性、トランスポザーゼ活性、レコンビナーゼ（例えば、Ｇｉｎレコンビナーゼの触媒ドメイン）によって提供されるものなどのレコンビナーゼ活性、ポリメラーゼ活性、リガーゼ活性、ヘリカーゼ活性、フォトリアーゼ活性、及びグリコシラーゼ活性）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７４】
いくつかの場合には、融合パートナーは、標的核酸（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ）に関連したタンパク質（例えば、ヒストン、ＲＮＡ結合タンパク質、ＤＮＡ結合タンパク質等）を修飾する酵素活性を有する。融合パートナーによって提供され得る（標的核酸に関連したタンパク質を修飾する）酵素活性の例としては、ヒストンメチルトランスフェラーゼ（ＨＭＴ）（例えば、斑入り３〜９ホモログ１のサプレッサー（ＳＵＶ３９Ｈ１、ＫＭＴ１Ａとしても知られる）、真性染色質ヒストンリジンメチルトランスフェラーゼ２（Ｇ９Ａ、ＫＭＴ１Ｃ及びＥＨＭＴ２としても知られる）、ＳＵＶ３９Ｈ２、ＥＳＥＴ／ＳＥＴＤＢ１等、ＳＥＴ１Ａ、ＳＥＴ１Ｂ、ＭＬＬ１〜５、ＡＳＨ１、ＳＹＭＤ２、ＮＳＤ１、ＤＯＴ１Ｌ、Ｐｒ−ＳＥＴ７／８、ＳＵＶ４−２０Ｈ１、ＥＺＨ２、ＲＩＺ１）によって提供されるものなどのメチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデメチラーゼ（例えば、リジンデメチラーゼ１Ａ（ＫＤＭ１Ａ、ＬＳＤ１としても知られる）、ＪＨＤＭ２ａ／ｂ、ＪＭＪＤ２Ａ／ＪＨＤＭ３Ａ、ＪＭＪＤ２Ｂ、ＪＭＪＤ２Ｃ／ＧＡＳＣ１、ＪＭＪＤ２Ｄ、ＪＡＲＩＤ１Ａ／ＲＢＰ２、ＪＡＲＩＤ１Ｂ／ＰＬＵ−１、ＪＡＲＩＤ１Ｃ／ＳＭＣＸ、ＪＡＲＩＤ１Ｄ／ＳＭＣＹ、ＵＴＸ、ＪＭＪＤ３等）によって提供されるものなどのデメチラーゼ活性、ヒストンアセチラーゼトランスフェラーゼ（例えば、ヒトアセチルトランスフェラーゼｐ３００、ＧＣＮ５、ＰＣＡＦ、ＣＢＰ、ＴＡＦ１、ＴＩＰ６０／ＰＬＩＰ、ＭＯＺ／ＭＹＳＴ３、ＭＯＲＦ／ＭＹＳＴ４、ＨＢＯ１／ＭＹＳＴ２、ＨＭＯＦ／ＭＹＳＴ１、ＳＲＣ１、ＡＣＴＲ、Ｐ１６０、ＣＬＯＣＫ等の触媒コア／断片）によって提供されるものなどのアセチルトランスフェラーゼ活性、ヒストンデアセチラーゼ（例えば、ＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、ＨＤＡＣ８、ＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、ＨＤＡＣ９、ＳＩＲＴ１、ＳＩＲＴ２、ＨＤＡＣ１１等によって提供されるものなどのデアセチラーゼ活性、キナーゼ活性、ホスファターゼ活性、ユビキチンリガーゼ活性、脱ユビキチン化活性、アデニル化活性、脱アデニル化活性、ＳＵＭＯ化活性、脱ＳＵＭＯ化活性、リボシル化活性、脱リボシル化活性、ミリストイル化活性、及び脱ミリストイル化活性が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
好適な融合パートナーの追加の例は、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）不安定化ドメイン（例えば、化学的に制御可能なキメラＣａｓＺタンパク質を生成するため）、及び葉緑体移行ペプチドである。好適な葉緑体トランジットペプチドには、
2021503278.tif 000003
が含まれるが、これらに限定されない。
【００７６】
いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチドは、ａ）本開示のＣａｓＺポリペプチド、及びｂ）葉緑体移行ペプチドを含む。したがって、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−ＣａｓＺ複合体は、葉緑体に対して標的化され得る。いくつかの場合には、この標的化は、葉緑体移行ペプチド（ＣＴＰ）またはプラスチド移行ペプチドと呼ばれるＮ末端伸長の存在によって達成され得る。細菌源からの染色体導入遺伝子は、発現されたポリペプチドが、植物プラスチド（例えば、葉緑体）内で区画化される場合、発現されたポリペプチドをコードする配列と融合したＣＴＰ配列をコードする配列を有していなければならない。したがって、葉緑体に対する外因性ポリペプチドの局在は、多くの場合、ＣＴＰ配列をコードするポリヌクレオチド配列を、その外因性ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの５′領域を動作可能に連結することによって達成される。ＣＴＰは、プラスチドへの転位中の処理ステップにおいて除去される。しかしながら、処理効率は、ＣＴＰのアミノ酸配列及びペプチドのＮＨ２末端における付近の配列によって影響され得る。記載されている葉緑体に対して標的化するための他のオプションは、トウモロコシｃａｂ−ｍ７シグナル配列（米国特許第７，０２２，８９６号、ＷＯ９７／４１２２８）、エンドウグルタチオン還元酵素シグナル配列（ＷＯ９７／４１２２８）、及びＵＳ２００９０２９８６１に記載されるＣＴＰである。
【００７７】
いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチドは、ａ）本開示のＣａｓＺポリペプチド、及びｂ）エンドソーム脱出ペプチドを含み得る。いくつかの場合には、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸配列
2021503278.tif 000004
を含み、各Ｘは、独立して、リジン、ヒスチジン、及びアルギニンから選択される。いくつかの場合には、エンドソーム脱出ポリペプチドは、アミノ酸配列
2021503278.tif 000005
を含む。
【００７８】
Ｃａｓ９、亜鉛フィンガー、及び／またはＴＡＬＥタンパク質との融合の文脈において（部位特異的標的核酸修飾、転写の調節、及び／または標的タンパク質修飾、例えば、ヒストン修飾のために）使用される上記の融合パートナー（及びその他）のうちのいくつかの例については、例えば、Ｎｏｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００７  Ｊｕｌ  １８；１２９（２８）：８６７６−７、Ｒｉｖｅｎｂａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１２  Ａｐｒ；７（４）：３５０−６０；Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１６  Ｊｕｌ  ８；４４（１２）：５６１５−２８、Ｇｉｌｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｊｕｌ  １８；１５４（２）：４４２−５１、Ｋｅａｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１５  Ｍａｙ；１２（５）：４０１−３、Ｍｅｎｄｅｎｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｄｅｃ；３１（１２）：１１３３−６、Ｈｉｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｍａｙ；３３（５）：５１０−７、Ｇｏｒｄｌｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００９  Ｍａｒ  ３１；１０６（１３）：５０５３−８、Ａｋｏｐｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ｊｕｌ  ２２；１００（１５）：８６８８−９１、Ｔａｎ  ｅｔ．，ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２００６  Ｆｅｂ；８０（４）：１９３９−４８、Ｔａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ｏｃｔ  １４；１００（２１）：１１９９７−２００２、Ｐａｐｗｏｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００３  Ｆｅｂ  １８；１００（４）：１６２１−６、Ｓａｎｊａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２  Ｊａｎ  ５；７（１）：１７１−９２、Ｂｅｅｒｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９９８  Ｄｅｃ  ８；９５（２５）：１４６２８−３３、Ｓｎｏｗｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｂｉｏｌ．２００２  Ｄｅｃ  ２３；１２（２４）：２１５９−６６、Ｘｕ  ｅｔ．ａｌ．，Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｃｏｖ．２０１６  Ｍａｙ  ３；２：１６００９、Ｋｏｍｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１６  Ａｐｒ  ２０；５３３（７６０３）：４２０−４、Ｃｈａｉｋｉｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１６  Ａｕｇ  １１、Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ  ａｔ．ａｌ．，Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２０１６  Ｊｕｎ  ２３、Ｄｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１６  Ｊａｎ  ４、Ｐｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１６；１３５８：４３−５７、Ｂａｌｂｏａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔｓ．２０１５  Ｓｅｐ  ８；５（３）：４４８−５９、Ｈａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１５  Ｊｕｎ  ９；５：１１２２１、Ｐｉａｔｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｊ．２０１５  Ｍａｙ；１３（４）：５７８−８９、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１４  Ａｐｒ；４��（７）：４３７５−９０、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３−７１、及びＭａｅｄｅｒ  ｅｔ．ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１０（１０）：９７７−９を参照されたい。
【００７９】
追加の好適な異種ポリペプチドとしては、標的核酸の転写及び／または翻訳の増加を直接的及び／または間接的に提供するポリペプチド（例えば、転写アクチベータもしくはその断片、転写アクチベータを動員するタンパク質もしくはその断片、小分子／薬物応答性転写及び／または翻訳調節因子、翻訳調節タンパク質等）が挙げられるが、これらに限定されない。転写の増加または減少を達成する異種ポリペプチドの非限定的な例としては、転写アクチベータ及び転写リプレッサードメインが挙げられる。そのようないくつかの場合には、キメラＣａｓＺポリペプチドは、ガイド核酸（ガイドＲＮＡ）によって標的核酸中の特定の位置（すなわち、配列）に標的化され、プロモーターへのＲＮＡポリメラーゼ結合を遮断する（転写アクチベータの機能を選択的に阻害する）、及び／または局所クロマチン状態を修飾する（例えば、標的核酸を修飾する、もしくは標的核酸に関連したポリペプチドを修飾する融合配列が使用される場合）などの遺伝子座特異的調節をもたらす。いくつかの場合には、変化は、一過性である（例えば、転写抑制または活性化）。いくつかの場合には、変化は、遺伝性である（例えば、標的核酸に対して、または標的核酸に関連したタンパク質、例えば、ヌクレオソームヒストンに対して後成的修飾が行われる場合）。
【００８０】
ｓｓＲＮＡ標的核酸を標的化するときに使用するための異種ポリペプチドの非限定的な例としては、スプライシング因子（例えば、ＲＳドメイン）；タンパク質翻訳成分（例えば、翻訳開始、延長、及び／または放出因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡメチラーゼ；ＲＮＡ編集酵素（例えば、ＡからＩへの、及び／またはＣからＵへの編集酵素を含む、ＲＮＡデアミナーゼ、例えば、ＲＮＡ上で作用するアデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡＲ））；ヘリカーゼ；ＲＮＡ結合タンパク質等が挙げられる（ただし、これらに限定されない）。異種ポリペプチドは、タンパク質全体を含み得るか、またはいくつかの場合には、タンパク質の断片（例えば、機能的ドメイン）を含み得ることが理解される。
【００８１】
対象のキメラＣａｓＺポリペプチドの異種ポリペプチドは、ｓｓＲＮＡと相互作用することができる任意のドメイン（本開示の目的のために、分子内及び／または分子間二次構造、例えば、ヘアピン、ステムループ等の二本鎖ＲＮＡ二重鎖を含む）であり得、一過性または不可逆的、直接的または間接的にかかわらず、エンドヌクレアーゼ（例えば、ＳＭＧ５及びＳＭＧ６などのタンパク質由来のＲＮａｓｅ  ＩＩＩ、ＣＲＲ２２  ＤＹＷドメイン、Ｄｉｃｅｒ、及びＰＩＮ（ＰｉｌＴ  Ｎ末端）ドメイン；ＲＮＡ切断の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＰＳＦ、ＣｓｔＦ、ＣＦＩｍ、及びＣＦＩＩｍ）；エキソヌクレアーゼ（例えば、ＸＲＮ−１またはエキソヌクレアーゼＴ）；デアデニラーゼ（例えば、ＨＮＴ３）；ナンセンス媒介型ＲＮＡ分解に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＵＰＦ１、ＵＰＦ２、ＵＰＦ３、ＵＰＦ３ｂ、ＲＮＰ  Ｓ１、Ｙ１４、ＤＥＫ、ＲＥＦ２、及びＳＲｍ１６０）；ＲＮＡの安定化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＢＰ）；翻訳の抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ａｇｏ２及びＡｇｏ４）；翻訳の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｓｔａｕｆｅｎ）；翻訳の調節に関与する（例えば、調節することができる）タンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、延長因子、放出因子等の翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡのポリアデニル化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＡＰ１、ＧＬＤ−２、及びＳｔａｒ−ＰＡＰ）；ＲＮＡのポリウリジン化に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＩ  Ｄ１及び末端ウリジレートトランスフェラーゼ）；ＲＮＡ局在に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＩＭＰ１、ＺＢＰ１、Ｓｈｅ２ｐ、Ｓｈｅ３ｐ、及びＢｉｃａｕｄａｌ−Ｄ由来）；ＲＮＡの核保持に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、Ｒｒｐ６）；ＲＮＡの核外搬出に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＴＡＰ、ＮＸＦ１、ＴＨＯ、ＴＲＥＸ、ＲＥＦ、及びＡｌｙ）；ＲＮＡスプライシングの抑制に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＰＴＢ、Ｓａｍ６８、及びｈｎＲＮＰ  Ａ１）；ＲＮＡスプライシングの刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）ドメイン）；転写効率の低減に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＦＵＳ（ＴＬＳ））；ならびに転写の刺激に関与するタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、ＣＤＫ７及びＨＩＶ  Ｔａｔ）を含む群から選択されるエフェクタードメインを含むが、これらに限定されない。あるいは、エフェクタードメインは、エンドヌクレアーゼ；ＲＮＡ切断を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；エキソヌクレアーゼ；デアデニラーゼ；ナンセンス媒介型ＲＮＡ分解活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡを安定化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を抑制することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；翻訳を刺激することができるタンパク���及びタンパク質ドメイン；翻訳を調節することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン（例えば、開始因子、延長因子、放出因子等の翻訳因子、例えば、ｅＩＦ４Ｇ）；ＲＮＡをポリアデニル化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡをポリウリジン化することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡ局在活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡの核保持が可能なタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡ核外搬出活性を有するタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを抑制することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ＲＮＡスプライシングを刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；転写効率を低減することができるタンパク質及びタンパク質ドメイン；ならびに転写を刺激することができるタンパク質及びタンパク質ドメインを含む群から選択されてもよい。別の好適な異種ポリペプチドは、ＷＯ２０１２０６８６２７（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されるＰＵＦ  ＲＮＡ結合ドメインである。
【００８２】
キメラＣａｓＺポリペプチドの異種ポリペプチドとして（全体でまたはその断片として）使用され得るいくつかのＲＮＡスプライシング因子は、別個の配列特異的ＲＮＡ結合モジュール及びスプライシングエフェクタードメインを有して、モジュール機構を有する。例えば、セリン／アルギニンリッチ（ＳＲ）タンパク質ファミリーのメンバーは、エクソン封入を促進するｐｒｅ−ｍＲＮＡ及びＣ末端ＲＳドメインにおいてエクソンスプライシングエンハンサー（ＥＳＥ）に結合するＮ末端ＲＮＡ認識モチーフ（ＲＲＭ）を含有する。別の例として、ｈｎＲＮＰタンパク質ｈｎＲＮＰ  Ａｌは、そのＲＲＭドメインを通してエクソンスプライシングサイレンサー（ＥＳＳ）に結合し、Ｃ末端グリシンリッチドメインを通してエクソン封入を阻害する。いくつかのスプライシング因子は、２つの代替部位の間の調節配列に結合することによって、スプライス部位（ｓｓ）の代替使用を調節することができる。例えば、ＡＳＦ／ＳＦ２は、ＥＳＥを認識し、イントロン近位部位の使用を促進することができるが、ｈｎＲＮＰ  Ａｌは、ＥＳＳに結合し、スプライシングをイントロン遠隔部位の使用に変更することができる。そのような因子の１つの用途は、内因性遺伝子、特に疾患関連遺伝子の代替スプライシングを調節するＥＳＦを生成することである。例えば、Ｂｃｌ−ｘ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、２つの代替５′スプライス部位を有する２つのスプライシングアイソフォームを産生して、反対の機能のタンパク質をコードする。長いスプライシングアイソフォームＢｃｌ−ｘＬは、長命の分裂終了細胞中で発現される強力なアポトーシスの阻害因子であり、多くのがん細胞中で上方調節され、アポトーシスシグナルから細胞を保護する。短いアイソフォームＢｃｌ−ｘＳは、アポトーシス促進性アイソフォームであり、高いターンオーバー率で細胞中に高レベルで発現される（例えば、リンパ球を発達させる）。２つのＢｃｌ−ｘスプライシングアイソフォームの比は、コアエクソン領域またはエクソン伸長領域のいずれか（すなわち、２つの代替５′スプライス部位の間）に位置する複数のｃ要素によって調節される。さらなる例については、ＷＯ２０１００７５３０３（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【００８３】
さらに好適な融合パートナーとしては、境界要素（例えば、ＣＴＣＦ）であるタンパク質（またはその断片）、末梢動員を提供するタンパク質及びその断片（例えば、Ｌａｍｉｎ  Ａ、Ｌａｍｉｎ  Ｂ等）、タンパク質ドッキング要素（例えば、ＦＫＢＰ／ＦＲＢ、Ｐｉｌ１／Ａｂｙ１等）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８４】
対象のキメラＣａｓＺポリペプチドに対する様々な追加の好適な異種ポリペプチド（またはその断片）の例としては、以下の出願に記載されるものが挙げられるが、これらに限定されず（それらの公報は、Ｃａｓ９などの他のＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼに関するが、記載される融合パートナーを代わりにＣａｓＺとともに使用することもできる）、ＰＣＴ特許出願：ＷＯ２０１００７５３０３、ＷＯ２０１２０６８６２７、及びＷＯ２０１３１５５５５５、ならびに、例えば、米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４００６８７９７号、第２０１４０１７０７５３号、第２０１４０１７９００６号、第２０１４０１７９７７０号、第２０１４０１８６８４３号、第２０１４０１８６９１９号、第２０１４０１８６９５８号、第２０１４０１８９８９６号、第２０１４０２２７７８７号、第２０１４０２３４９７２号、第２０１４０２４２６６４号、第２０１４０２４２６９９号、第２０１４０２４２７００号、第２０１４０２４２７０２号、第２０１４０２４８７０２号、第２０１４０２５６０４６号、第２０１４０２７３０３７号、第２０１４０２７３２２６号、第２０１４０２７３２３０号、第２０１４０２７３２３１号、第２０１４０２７３２３２号、第２０１４０２７３２３３号、第２０１４０２７３２３４号、第２０１４０２７３２３５号、第２０１４０２８７９３８号、第２０１４０２９５５５６号、第２０１４０２９５５５７号、第２０１４０２９８５４７号、第２０１４０３０４８５３号、第２０１４０３０９４８７号、第２０１４０３１０８２８号、第２０１４０３１０８３０号、第２０１４０３１５９８５号、第２０１４０３３５０６３号、第２０１４０３３５６２０号、第２０１４０３４２４５６号、第２０１４０３４２４５７号、第２０１４０３４２４５８号、第２０１４０３４９４００号、第２０１４０３４９４０５号、第２０１４０３５６８６７号、第２０１４０３５６９５６号、第２０１４０３５６９５８号、第２０１４０３５６９５９号、第２０１４０３５７５２３号、第２０１４０３５７５３０号、第２０１４０３６４３３３号、及び第２０１４０３７７８６８号（全てが参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）において見出すことができる。
【００８５】
いくつかの場合には、異種ポリペプチド（融合パートナー）は、亜細胞性局在を提供する。すなわち、異種ポリペプチドは、亜細胞性局在配列（例えば、核に対して標的化するための核局在シグナル（ＮＬＳ）、融合タンパク質を核外に保持する配列、例えば、核外搬出配列（ＮＥＳ）、融合タンパク質を細胞質中に保持したままにする配列、ミトコンドリアに対して標的化するためのミトコンドリア局在シグナル、葉緑体に対して標的化するための葉緑体局在シグナル、ＥＲ保持シグナル等）を含有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＺ融合ポリペプチドはＮＬＳを含まず、それによりタンパク質は核に対して標的化されない（これは、例えば、標的核酸が、サイトゾル中に存在するＲＮＡである場合に、有利であり得る）。いくつかの実施形態では、異種ポリペプチドは、追跡及び／または精製を容易にするためのタグを提供することができる（すなわち、異種ポリペプチドは、検出可能な標識である）（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ等）。
【００８６】
いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質（例えば、野生型ＣａｓＺタンパク質、バリアントＣａｓＺタンパク質、キメラＣａｓＺタンパク質、ｄＣａｓＺタンパク質、ＣａｓＺ部分が低減したヌクレアーゼ活性を有するキメラＣａｓＺタンパク質、例えば、融合パートナーと融合したｄＣａｓＺタンパク質等）は、核局在シグナル（ＮＬＳ）（例えば、いくつかの場合には、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む（と融合する）。したがって、いくつかの場合には、ＣａｓＺポリペプチドは、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。いくつかの場合には、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端及び／もしくはＣ末端またはそれらの付近（例えば、それらの５０アミノ酸以内）に位置付けられる。いくつかの場合には、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端またはその付近（例えば、その５０アミノ酸以内）に位置付けられる。いくつかの場合には、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｃ末端またはその付近（例えば、その５０アミノ酸以内）に位置付けられる。いくつかの場合には、１つ以上のＮＬＳ（３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端及びＣ末端の両方またはそれらの付近（例えば、それらの５０アミノ酸以内）に位置付けられる。いくつかの場合には、ＮＬＳは、Ｎ末端に位置付けられ、ＮＬＳは、Ｃ末端に位置付けられる。
【００８７】
いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質（例えば、野生型ＣａｓＺタンパク質、バリアントＣａｓＺタンパク質、キメラＣａｓＺタンパク質、ｄＣａｓＺタンパク質、ＣａｓＺ部分が低減したヌクレアーゼ活性を有するキメラＣａｓＺタンパク質、例えば、融合パートナーと融合したｄＣａｓＺタンパク質等）は、１〜１０のＮＬＳ（例えば、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、または２〜５のＮＬＳ）を含む（と融合する）。いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質（例えば、野生型ＣａｓＺタンパク質、バリアントＣａｓＺタンパク質、キメラＣａｓＺタンパク質、ｄＣａｓＺタンパク質、ＣａｓＺ部分が低減したヌクレアーゼ活性を有するキメラＣａｓＺタンパク質、例えば、融合パートナーと融合したｄＣａｓＺタンパク質等）は、２〜５のＮＬＳ（例えば、２〜４または２〜３のＮＬＳ）を含む（と融合する）。
【００８８】
ＮＬＳの非限定な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１１４）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列
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を有するヌクレオプラスミン二連ＮＬＳ）；アミノ酸配列
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を有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ；配列
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を有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ；インポーチン−アルファ由来のＩＢＢドメインの配列
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；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２０）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２１）；ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２２）；マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２３）；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４）及びＰＫＱＫＫＲＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２５）；肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２６）；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２７）；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列
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；ならびにステロイドホルモン受容体（ヒト）糖コルチコイドの配列
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に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、ＮＬＳ（または複数のＮＬＳ）は、真核細胞の核中で検出可能な量のＣａｓＺの蓄積を駆動するのに十分な強度である。核中の蓄積の検出は、任意の好適な技法によって実施され得る。例えば、検出可能なマーカーは、ＣａｓＺタンパク質と融合してもよく、それにより細胞内の位置が可視化され得る。細胞核はまた、細胞から単離されてもよく、次いで、その内容物を、タンパク質を検出するための任意の好適なプロセス、例えば免疫組織化学、ウェスタンブロット、または酵素活性アッセイによって分析することができる。核中の蓄積はまた、間接的に決定されてもよい。
【００８９】
いくつかの場合には、ＣａｓＺ融合ポリペプチドは、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ−細胞透過性ペプチドとしても知られる）を含み、これはポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜の横断を促進する有機もしくは無機化合物を指す。小さな極性分子から大きな高分子の範囲であり得る別の分子及び／またはナノ粒子に付着したＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間に、またはサイトゾルから細胞小器官内に移動する分子の膜横断を促進する。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのアミノ酸末端と共有結合している（例えば、野生型ＣａｓＺと連結して融合タンパク質を生成するか、またはバリアントＣａｓＺタンパク質、例えば、ｄＣａｓＺ、ニッカーゼＣａｓＺ、もしくはキメラＣａｓＺタンパク質と連結して融合タンパク質を生成する）。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、ポリペプチドのカルボキシル末端と共有結合している（例えば、野生型ＣａｓＺと連結して融合タンパク質を生成するか、またはバリアントＣａｓＺタンパク質、例えば、ｄＣａｓＺ、ニッカーゼＣａｓＺ、もしくはキメラＣａｓＺタンパク質と連結して融合タンパク質を生成する）。いくつかの場合には、ＰＴＤは、好適な挿入部位でＣａｓＺ融合ポリペプチドに内的に挿入される（すなわち、ＣａｓＺ融合ポリペプチドのＮ末端またはＣ末端においてではない）。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ融合ポリペプチドは、１つ以上のＰＴＤ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のＰＴＤ）を含む（とコンジュゲートする、と融合する）。いくつかの場合には、ＰＴＤは、核局在シグナル（ＮＬＳ）（例えば、いくつかの場合には、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。したがって、いくつかの場合には、ＣａｓＺ融合ポリペプチドは、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。いくつかの場合には、ＰＴＤは、核酸（例えば、ＣａｓＺガイド核酸、ＣａｓＺガイド核酸をコードするポリヌクレオチド、ＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド等）と共有結合している。ＰＴＤの例としては、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）を含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応する）；細胞中への直接侵入に十分ないくつかのアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０のアルギニン）を含むポリアルギニン配列；ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（７）：１７３２−１７３７）；切断型ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１２４８−１２５６）；ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３０��３−１３００８）；ＲＲＱＲＲＴＳＫＬＭＫＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３１）；トランスポータン
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が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤとしては、
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；３アルギニン残基〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列としては、
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のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ  Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５−６）：３７１−３８１）。ＡＣＰＰは、切断可能なリンカーを介して一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含み、これは正味電荷をほぼ０に低減し、それによって細胞への付着及び取り込みを阻害する。リンカーの切断時に、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその本来の付着性を局所的にアンマスクし、したがってＡＣＰＰを「活性化して」膜を横断するようにする。
【００９０】
リンカー（例えば、融合パートナーのための）
いくつかの事例では、対象のＣａｓＺタンパク質は、リンカーポリペプチド（例えば、１つ以上のリンカーポリペプチド）を介して融合パートナーと融合する。リンカーポリペプチドは、様々なアミノ酸配列のうちのいずれかを有し得る。タンパク質は、一般に可撓性のスペーサーペプチドによって接合され得るが、他の化学結合も除外されない。好適なリンカーとしては、４アミノ酸〜４０アミノ酸長、または４アミノ酸〜２５アミノ酸長のポリペプチドが挙げられる。これらのリンカーは、合成の、リンカーをコードするオリゴヌクレオチドを使用してタンパク質を結合することによって産生され得るか、または融合タンパク質をコードする核酸配列によってコードされ得る。ある程度の可撓性を有するペプチドリンカーを使用することができる。好ましいリンカーが、一般に可撓性のペプチドをもたらす配列を有することを念頭において、連結ペプチドは、事実上任意のアミノ酸配列を有し得る。グリシン及びアラニンなどの小アミノ酸の使用は、可撓性ペプチドを作成する際に有用である。そのような配列の作成は、当業者にとって慣例である。様々な異なるリンカーが商業的に入手可能であり、使用に好適であると考えられる。
【００９１】
リンカーポリペプチドの例としては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ、ＧＳＧＧＳｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４０）、ＧＧＳＧＧＳｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４１）、及びＧＧＧＳｎ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）を含み、ｎは、少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマーが挙げられる。例示的なリンカーは、
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等を含むが、これらに限定されない、アミノ酸配列を含むことができる。当業者であれば、任意の所望の要素とコンジュゲートしたペプチドの設計が、全てまたは部分的に可撓性であるリンカーを含むことができ、それによりリンカーが、可撓性リンカーならびに低可撓性構造を与える１つ以上の部分を含むことができることを認識するであろう。
【００９２】
検出可能な標識
いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺポリペプチドは、検出可能な標識を含む（に結合し得る／と融合し得る）。検出可能なシグナルを提供することができる好適な検出可能な標識及び／または部分としては、酵素、放射性同位体、特異的結合対のメンバー、フルオロフォア、蛍光タンパク質、量子ドット等を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００９３】
好適な蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはそのバリアント、ＧＦＰの青色蛍光バリアント（ＢＦＰ）、ＧＦＰのシアン蛍光バリアント（ＣＦＰ）、ＧＦＰの黄色蛍光バリアント（ＹＦＰ）、強化ＧＦＰ（ＥＧＦＰ）、強化ＣＦＰ（ＥＣＦＰ）、強化ＹＦＰ（ＥＹＦＰ）、ＧＦＰＳ６５Ｔ、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｔｏｐａｚ（ＴＹＦＰ）、Ｖｅｎｕｓ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＧＦＰｕｖ、不安定化ＥＧＦＰ（ｄＥＧＦＰ）、不安定化ＥＣＦＰ（ｄＥＣＦＰ）、不安定化ＥＹＦＰ（ｄＥＹＦＰ）、ｍＣＦＰｍ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、ＣｙＰｅｔ、ＹＰｅｔ、ｍＫＯ、ＨｃＲｅｄ、ｔ−ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−モノマー、Ｊ−Ｒｅｄ、二量体２、ｔ−二量体２（１２）、ｍＲＦＰ１、ｐｏｃｉｌｌｏｐｏｒｉｎ、Ｒｅｎｉｌｌａ  ＧＦＰ、Ｍｏｎｓｔｅｒ  ＧＦＰ、ｐａＧＦＰ、Ｋａｅｄｅタンパク質及びキンドリングタンパク質、フィコビリンタンパク質、ならびにＢ−フィコエリトリン、Ｒ−フィコエリトリン、及びアロフィコシアニンを含むフィコビリンタンパク質コンジュゲートが挙げられるが、これらに限定されない。蛍光タンパク質の他の例としては、ｍＨｏｎｅｙｄｅｗ、ｍＢａｎａｎａ、ｍＯｒａｎｇｅ、ｄＴｏｍａｔｏ、ｔｄＴｏｍａｔｏ、ｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｍＧｒａｐｅ２、ｍＰｌｕｍ（Ｓｈａｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２：９０５−９０９）などが挙げられる。例えば、Ｍａｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１７：９６９−９７３に記載されるような、花虫類種由来の様々な蛍光及び染色タンパク質のうちのいずれかが使用に好適である。
【００９４】
好適な酵素としては、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、ベータ−ガラクトシダーゼ（ＧＡＬ）、グルコース−６−ホスファターゼデヒドロゲナーゼ、ベータ−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、β−グルクロニダーゼ、転化酵素、キサンチンオキシダーゼ、ホタルルシフェラーゼ、グルコースオキシダーゼ（ＧＯ）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
天然のＣａｓＺタンパク質は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の相補性の領域によって定義される標的配列において、標的ＤＮＡに結合する。多くのＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼの場合と同様に、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的結合（及び／または切断）は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ中の短いモチーフ［プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される］の両方によって決定される位置において生じる。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＣａｓＺタンパク質のＰＡＭは、標的ＤＮＡの非相補鎖（非標的鎖とも称される。相補鎖は、ガイドＲＮＡのガイド配列にハイブリダイズし、一方、非相補鎖は、ガイドＲＮＡに直接ハイブリダイズせず、かつ非相補鎖の逆相補体である）の標的配列の５′の直近である。いくつかの場合には（例えば、ＣａｓＺｃの場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＴＴＡ−３’である。いくつかの場合には（例えば、ＣａｓＺｂの場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＴＴＴＮ−３’である。いくつかの場合には（例えば、ＣａｓＺｂの場合）、非相補鎖のＰＡＭ配列は、５’−ＴＴＴＡ−３’である。
【００９７】
いくつかの場合には、異なるＣａｓＺタンパク質（すなわち、様々な種に由来するＣａｓＺタンパク質）は、異なるＣａｓＺタンパク質の様々な酵素的特徴を利用するために（例えば、異なるＰＡＭ配列選好性のため；増加または減少した酵素活性のため；増加または減少したレベルの細胞毒性のため；ＮＨＥＪ、ホモロジー配向型修復、一本鎖切断、二本鎖切断等の間の均衡を変更するため；短い全配列を利用するため等）、様々な提供される方法における使用に有利であり得る。異なる種に由来するＣａｓＺタンパク質は、標的ＤＮＡ中に異なるＰＡＭ配列を必要とし得る。したがって、選択した特定のＣａｓＺタンパク質に対して、ＰＡＭ配列選好性は、上記の配列（複数可）とは異なり得る。適切なＰＡＭ配列の特定のための様々な方法（インシリコ及び／またはウェットラボ法を含む）が当該技術分野において既知かつ慣例であり、任意の簡便な方法を使用することができる。
【００９８】
ＣａｓＺガイドＲＮＡ
ＣａｓＺタンパク質に結合する、リボヌクレオタンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成する、及びその複合体を標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）内の特定の位置に標的化する核酸分子は、本明細書では「ＣａｓＺガイドＲＮＡ」または単に「ガイドＲＮＡ」と称される。いくつかの場合には、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡは、ＣａｓＺガイドＲＮＡがＲＮＡ塩基に加えてＤＮＡ塩基を含むように作製され得るが、「ＣａｓＺガイドＲＮＡ」という用語は、依然として本明細書ではそのような分子を包含するように使用されることを理解されたい。
【００９９】
ＣａｓＺガイドＲＮＡは、標的化セグメント及びタンパク質結合セグメントの２つのセグメントを含むと言うことができる。ＣａｓＺガイドＲＮＡの標的化セグメントは、標的核酸（例えば、標的ｓｓＲＮＡ、標的ｓｓＤＮＡ、二本鎖標的ＤＮＡの相補鎖等）内の特定の配列（標的部位）に相補的な（かつ、したがってそれとハイブリダイズする）ヌクレオチド配列（ガイド配列）を含む。タンパク質結合セグメント（または「タンパク質結合配列」）は、ＣａｓＺポリペプチドと相互作用する（に結合する）。対象のＣａｓＺガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いにハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するヌクレオチドの２つの相補性ストレッチを含む。標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）の部位特異的結合及び／または切断は、ＣａｓＺガイドＲＮＡ（ＣａｓＺガイドＲＮＡのガイド配列）と標的核酸との間の塩基対合相補性によって決定される位置（例えば、標的遺伝子座の標的配列）において生じ得る。
【０１００】
ＣａｓＺガイドＲＮＡ及びＣａｓＺタンパク質、例えば、融合ＣａｓＺポリペプチドは、複合体を形成する（例えば、非共有結合相互作用を介して結合する）。ＣａｓＺガイドＲＮＡは、ガイド配列（標的核酸の配列に対して相補的なヌクレオチド配列）を含む、標的化セグメントを含むことによって、複合体に標的特異性を提供する。複合体のＣａｓＺタンパク質は、部位特異的活性（例えば、ＣａｓＺタンパク質によって提供される切断活性及び／またはキメラＣａｓＺタンパク質の場合には融合パートナーによって提供される活性）を提供する。換言すれば、ＣａｓＺタンパク質は、ＣａｓＺガイドＲＮＡとのその会合によって、標的核酸配列（例えば、標的配列）に誘導される。
【０１０１】
ＣａｓＺガイドＲＮＡの「標的化配列」とも称される「ガイド配列」は、ＣａｓＺガイドＲＮＡがＣａｓＺタンパク質（例えば、天然型ＣａｓＺタンパク質、融合ＣａｓＺポリペプチド（キメラＣａｓＺ）等）を、任意の所望の標的核酸の任意の所望の配列に標的化することができるように修飾され得るが、ただし、（例えば、本明細書に記載されるように）ＰＡＭ配列が考慮され得ることを例外とする。したがって、例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡは、真核細胞中の核酸、例えば、ウイルス核酸、真核細胞核酸（例えば、真核細胞染色体、染色体配列、真核細胞ＲＮＡ等）において、配列に対する相補性を有するガイド配列を有することができる（例えば、ハイブリダイズすることができる）。
【０１０２】
いくつかの場合には、ＣａｓＺガイドＲＮＡは、３０ヌクレオチド（ｎｔ）以上（例えば、３５ｎｔ以上、４０ｎｔ以上、４５ｎｔ以上、５０ｎｔ以上、５５ｎｔ以上、６０ｎｔ以上）の長さを有する。いくつかの実施形態では、ＣａｓＺガイドＲＮＡは、４０ヌクレオチド（ｎｔ）以上（例えば、４５ｎｔ以上、５０ｎｔ以上、５５ｎｔ以上、６０ｎｔ以上）の長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺガイドＲＮＡは、３０ヌクレオチド（ｎｔ）〜１００ｎｔ（例えば、３０〜９０、３０〜８０、３０〜７５、３０〜７０、３０〜６５、４０〜１００、４０〜９０、４０〜８０、４０〜７５、４０〜７０、または４０〜６５ｎｔ）の長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺガイドＲＮＡは、４０ヌクレオチド（ｎｔ）〜１００ｎｔ（例えば、４０〜９０、４０〜８０、４０〜７５、４０〜７０、または４０〜６５ｎｔ）の長さを有する。
【０１０３】
ＣａｓＺガイドＲＮＡのガイド配列
対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、標的核酸中の配列（標的部位）に対して相補的なヌクレオチド配列である、ガイド配列（すなわち、標的化配列）を含む。換言すれば、ＣａｓＺガイドＲＮＡのガイド配列は、ハイブリダイゼーションによる配列特異的な様式（すなわち、塩基対合）で標的核酸（例えば、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、または二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ））と相互作用し得る。ＣａｓＺガイドＲＮＡのガイド配列は、標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡなどの真核細胞標的核酸）内で任意の所望の標的配列にハイブリダイズするように修飾（例えば、遺伝子操作によって）／設計され得る（例えば、ＰＡＭを考慮に入れて、例えば、ｄｓＤＮＡ標的を標的化するとき）。
【０１０４】
いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、６０％以上（例えば、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１００％である。
【０１０５】
いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、標的核酸の標的部位の７つの連続する３′最端ヌクレオチドにわたって１００％である。
【０１０６】
いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
【０１０７】
いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９以上（例えば、２０以上、２１以上、２２以上）の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
【０１０８】
いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７〜２５の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７〜２５の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７〜２５の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１７〜２５の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
【０１０９】
いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９〜２５の連続するヌクレオチドにわたって６０％以上（例えば、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９〜２５の連続するヌクレオチドにわたって８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９〜２５の連続するヌクレオチドにわたって９０％以上（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％）である。いくつかの場合には、ガイド配列と標的核酸の標的部位との間の相補性のパーセントは、１９〜２５の連続するヌクレオチドにわたって１００％である。
【０１１０】
いくつかの場合には、ガイド配列は、１７〜３０ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１７〜２５、１７〜２２、１７〜２０、１９〜３０、１９〜２５、１９〜２２、１９〜２０、２０〜３０、２０〜２５、または２０〜２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、ガイド配列は、１７〜２５ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、１７〜２２、１７〜２０、１９〜２５、１９〜２２、１９〜２０、２０〜２５、または２０〜２２ｎｔ）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、ガイド配列は、１７ｎｔ以上（例えば、１８以上、１９以上、２０以上、２１以上、または２２ｎｔ以上；１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ等）の長さを有する。いくつかの場合には、ガイド配列は、１９ｎｔ以上（例えば、２０以上、２１以上、または２２ｎｔ以上；１９ｎｔ、２０ｎｔ、２１ｎｔ、２２ｎｔ、２３ｎｔ、２４ｎｔ、２５ｎｔ等）の長さを有する。いくつかの場合には、ガイド配列は、１７ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ガイド配列は、１８ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ガイド配列は、１９ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ガイド配列は、２０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ガイド配列は、２１ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ガイド配列は、２２ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ガイド配列は、２３ｎｔの長さを有する。
【０１１１】
ＣａｓＺガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメント
対象のＣａｓＺガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、ＣａｓＺタンパク質と相互作用する。ＣａｓＺガイドＲＮＡは、結合したＣａｓＺタンパク質を、上述のガイド配列を介して標的核酸内の特定のヌクレオチド配列に誘導する。ＣａｓＺガイドＲＮＡのタンパク質結合セグメントは、互いに対して相補的であり、ハイブリダイズして二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を形成するヌクレオチドの２つのストレッチを含む。したがって、タンパク質結合セグメントは、ｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。
【０１１２】
いくつかの場合には、ｄｓＲＮＡ二重鎖領域は、５〜２５塩基対（ｂｐ）（例えば、５〜２２、５〜２０、５〜１８、５〜１５、５〜１２、５〜１０、５〜８、８〜２５、８〜２２、８〜１８、８〜１５、８〜１２、１２〜２５、１２〜２２、１２〜１８、１２〜１５、１３〜２５、１３〜２２、１３〜１８、１３〜１５、１４〜２５、１４〜２２、１４〜１８、１４〜１５、１５〜２５、１５〜２２、１５〜１８、１７〜２５、１７〜２２、または１７〜１８ｂｐ、例えば、５ｂｐ、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ等）の範囲を含む。いくつかの場合には、ｄｓＲＮＡ二重鎖領域は、６〜１５塩基対（ｂｐ）（例えば、６〜１２、６〜１０、または６〜８ｂｐ、例えば、６ｂｐ、７ｂｐ、８ｂｐ、９ｂｐ、１０ｂｐ等）の範囲を含む。いくつかの場合には、二重鎖領域は、５以上のｂｐ（例えば、６以上、７以上、または８以上のｂｐ）を含む。いくつかの場合には、二重鎖領域は、６以上のｂｐ（例えば、７以上、または８以上のｂｐ）を含む。いくつかの場合には、二重鎖領域の全てのヌクレオチドが対合されるわけではなく、したがって、二重鎖形成領域は、バルジを含むことができる。本明細書では、「バルジ」という用語は、二本鎖二重鎖に寄与せず、寄与するヌクレオチドによって５′及び３′を囲まれているヌクレオチド（１つのヌクレオチドであるか、または複数のヌクレオチドであり得る）のストレッチを意味するように使用され、そのようなものとしてバルジは、二重鎖領域の一部と見なされる。いくつかの場合には、ｄｓＲＮＡは、１つ以上のバルジ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のバルジ）を含む。いくつかの場合には、ｄｓＲＮＡ二重鎖は、２つ以上のバルジ（例えば、３つ以上、４つ以上のバルジ）を含む。いくつかの場合には、ｄｓＲＮＡ二重鎖は、１〜５つのバルジ（例えば、１〜４、１〜３、２〜５、２〜４、または２〜３つのバルジ）を含む。
【０１１３】
したがって、いくつかの場合には、互いにハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドのストレッチは、互いに７０％〜１００％の相補性（例えば、７５％〜１００％、８０％〜１０％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有する。いくつかの場合には、互いにハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドのストレッチは、互いに７０％〜１００％の相補性（例えば、７５％〜１００％、８０％〜１０％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有する。いくつかの場合には、互いにハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドのストレッチは、互いに８５％〜１００％の相補性（例えば、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有する。いくつかの場合には、互いにハイブリダイズしてｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドのストレッチは、互いに７０％〜９５％の相補性（例えば、７５％〜９５％、８０％〜９５％、８５％〜９５％、９０％〜９５％の相補性）を有する。
【０１１４】
換言すれば、いくつかの実施形態では、ｄｓＲＮＡ二重鎖は、互いに７０％〜１００％の相補性（例えば、７５％〜１００％、８０％〜１０％、８５％〜１００％、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有するヌクレオチドの２つのストレッチを含む。いくつかの場合には、ｄｓＲＮＡ二重鎖は、互いに８５％〜１００％の相補性（例えば、９０％〜１００％、９５％〜１００％の相補性）を有するヌクレオチドの２つのストレッチを含む。いくつかの場合には、ｄｓＲＮＡ二重鎖は、互いに７０％〜９５％の相補性（例えば、７５％〜９５％、８０％〜９５％、８５％〜９５％、９０％〜９５％の相補性）を有するヌクレオチドの２つのストレッチを含む。
【０１１５】
対象のＣａｓＺガイドＲＮＡの二重鎖領域は、天然型二重鎖領域に対して１つ以上（１、２、３、４、５、など）の変異を含むことができる。例えば、いくつかの場合には、塩基対は維持され得るが、一方、各セグメントからの塩基対に寄与するヌクレオチドは異なり得る。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡの二重鎖領域は、（天然型ＣａｓＺガイドＲＮＡの）天然型二重鎖領域と比較して、より多くの塩基対、より少ない塩基対、より小さなバルジ、より大きなバルジ、より少ないバルジ、より多いバルジ、またはそれらの任意の簡便な組み合わせを含む。
【０１１６】
様々なＣａｓ９ガイドＲＮＡ及びｃｐｆ１ガイドＲＮＡの例は、当該技術分野において見出すことができ、いくつかの場合には、Ｃａｓ９ガイドＲＮＡに導入されたものと同様の変形も、本開示のＣａｓＺガイドＲＮＡに導入され得る（例えば、ｄｓＲＮＡ二重鎖領域に対する変異、別のタンパク質との相互作用を提供するために安定化を追加するための５’または３’末端の伸長等）。例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｍａｙ；１０（５）：７２６−３７、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３  Ｓｅｐ  ２４；１１０（３９）：１５６４４−９、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｓｅｐ；３１（９）：８３９−４３、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｆｅｂ  ２８；１５２（５）：１１７３−８３、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｍａｙ  ９；１５３（４）：９１０−８、Ａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｏｃｔ  ３１、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１９、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３−７１、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１９５（３）：１１７７−８０、ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ａｐｒ；４１（７）：４３３６−４３、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８−３４、Ｅｂｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０、Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ．ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１８７、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ；２３（１１）：１３２２−５、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１８８、Ｌａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  Ｎｏｖ；８（１１）：２１８０−９６、Ｍａｌｉ  ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７−６３、Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３  Ｄｅｃ；５１（１２）：８３５−４３、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｓｅｐ  １２；１５４（６）：１３８０−９、Ｕｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３  Ｄｅｃ  ９；３（１２）：２２３３−８、Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３  Ｓｅｐ  ２４；１１０（３９）：１５５１４−５、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ．２０１３  Ｏｃｔ  ９、Ｙａｎｇ  ｅ���  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｓｅｐ  １２；１５４（６）：１３７０−９、Ｂｒｉｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ２３；５６（２）：３３３−９、ならびに米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５号、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４００６８７９７号、第２０１４０１７０７５３号、第２０１４０１７９００６号、第２０１４０１７９７７０号、第２０１４０１８６８４３号、第２０１４０１８６９１９号、第２０１４０１８６９５８号、第２０１４０１８９８９６号、第２０１４０２２７７８７号、第２０１４０２３４９７２号、第２０１４０２４２６６４号、第２０１４０２４２６９９号、第２０１４０２４２７００号、第２０１４０２４２７０２号、第２０１４０２４８７０２号、第２０１４０２５６０４６号、第２０１４０２７３０３７号、第２０１４０２７３２２６号、第２０１４０２７３２３０号、第２０１４０２７３２３１号、第２０１４０２７３２３２号、第２０１４０２７３２３３号、第２０１４０２７３２３４号、第２０１４０２７３２３５号、第２０１４０２８７９３８号、第２０１４０２９５５５６号、第２０１４０２９５５５７号、第２０１４０２９８５４７号、第２０１４０３０４８５３号、第２０１４０３０９４８７号、第２０１４０３１０８２８号、第２０１４０３１０８３０号、第２０１４０３１５９８５号、第２０１４０３３５０６３号、第２０１４０３３５６２０号、第２０１４０３４２４５６号、第２０１４０３４２４５７号、第２０１４０３４２４５８号、第２０１４０３４９４００号、第２０１４０３４９４０５号、第２０１４０３５６８６７号、第２０１４０３５６９５６号、第２０１４０３５６９５８号、第２０１４０３５６９５９号、第２０１４０３５７５２３号、第２０１４０３５７５３０号、第２０１４０３６４３３３号、及び第２０１４０３７７８６８号（これらの全ては参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０１１７】
ＣａｓＺガイドＲＮＡガイドは、ガイド配列、及びハイブリダイズしてタンパク質結合セグメントのｄｓＲＮＡ二重鎖を形成するヌクレオチドの２つのストレッチ（「二重鎖形成化セグメント」）の両方を含む。所与のＣａｓＺガイドＲＮＡの特定の配列は、ｃｒＲＮＡが見出される種の特徴となり得る。好適なＣａｓＺガイドＲＮＡの例が、本明細書に提供される。
【０１１８】
例示的なガイドＲＮＡ配列
天然に存在するＣａｓＺタンパク質（例えば、図１及び図７を参照）のｃｒＲＮＡｓの反復配列（ＣａｓＺガイドＲＮＡの非ガイド配列部分）を、表１及び表３に示す。
【０１１９】
（表１）ＣａｓＺタンパク質のｃｒＲＮＡ反復配列
2021503278.tif 000016
2021503278.tif 000017
【０１２０】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２１】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、またはＣａｓＺｉ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、またはＣａｓＺｉ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、またはＣａｓＺｉ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、ＣａｓＺｃ、ＣａｓＺｄ、ＣａｓＺｅ、ＣａｓＺｆ、ＣａｓＺｇ、ＣａｓＺｈ、またはＣａｓＺｉ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２２】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺａ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺａ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺａ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺａ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２３】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｂ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｂ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｂ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｂ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２４】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｃ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｃ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｃ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｃ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２５】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｄ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｄ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｄ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｄ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２６】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｅ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｅ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｅ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｅ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２７】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｆ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｆ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｆ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｆ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２８】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｇ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｇ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｇ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｇ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１２９】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｈ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｈ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｈ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｈ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３０】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｉ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｉ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｉ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｉ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３１】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｊ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｊ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｊ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｊ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３２】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｋ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｋ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｋ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｋ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３３】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｌ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｌ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｌ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｌ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３４】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、（例えば、ガイド配列に加えて、例えば、タンパク質結合領域の一部として）表１または表３のＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｌ、またはＣａｓＺｋ  ｃｒＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｌ、またはＣａｓＺｋ  ｃｒＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｌ、またはＣａｓＺｋ  ｃｒＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺガイドＲＮＡは、表１または表３のＣａｓＺｊ、ＣａｓＺｌ、またはＣａｓＺｋ  ｃｒＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。
【０１３５】
ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）
本開示の組成物及び方法は、ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）（「ｔｒａｎｃＲＮＡ」；本明細書では「ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ」とも称される）を含む。いくつかの場合には、ｔｒａｎｃＲＮＡは、本開示のＣａｓＺポリペプチド及びＣａｓＺガイドＲＮＡと複合体を形成する。ｔｒａｎｃＲＮＡは、ＣａｓＺ遺伝子座において存在するヌクレオチド配列によってコードされる高度に転写されたＲＮＡとして特定することができる。ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする配列は、通常、ｃａｓ遺伝子とＣａｓＺ遺伝子座のアレイ（反復）との間に配置される（例えば、反復配列に隣接して配置され得る）。以下の例は、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡの検出を示す。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、ＣａｓＺポリペプチドと免疫共沈降する（複合体を形成する）。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡの存在は、システムの機能のために必要とされる。ｔｒａｎｃＲＮＡに関連するデータ（例えば、それらの発現及び天然型アレイ上のそれらの位置）は、以下の実施例の項に提示される。
【０１３６】
いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、６０ヌクレオチド（ｎｔ）〜２７０ｎｔ（例えば、６０〜２６０、７０〜２７０、７０〜２６０、または７５〜２５５ｎｔ）の長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺａ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、６０〜１５０ｎｔ（例えば、６０〜１４０、６０〜１３０、６５〜１５０、６５〜１４０、６５〜１３０、７０〜１５０、７０〜１４０、または７０〜１３０ｎｔ）の長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺａ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、７０〜１３０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺａ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、約８０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺａ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、約９０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺａ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、約１２０ｎｔの長さを有する。
【０１３７】
いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺｂ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、８５〜２４０ｎｔ（例えば、８５〜２３０、８５〜２２０、８５〜１５０、８５〜１３０、９５〜２４０、９５〜２３０、９５〜２２０、９５〜１５０、または９５〜１３０ｎｔ）の長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺｂ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、９５〜１２０ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺｂ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、約１０５ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺｂ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、約１１５ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺｂ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、約２１５ｎｔの長さを有する。
【０１３８】
いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、８０〜２７５ｎｔ（例えば、８５〜２６０ｎｔ）の長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、８０〜１１０ｎｔ（例えば、８５〜１０５ｎｔ）の長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、２３５〜２７０ｎｔ（例えば、２４０〜２６０ｎｔ）の長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、約９５ｎｔの長さを有する。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（例えば、ＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）は、約２５０ｎｔの長さを有する。
【０１３９】
例示的なｔｒａｎｃＲＮＡ配列
天然に存在するＣａｓＺタンパク質のｔｒａｎｃＲＮＡ配列の例を、表２に示す。
【０１４０】
（表２）ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列
2021503278.tif 000018
【０１４１】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺａ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺａ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺａ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺａ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺａ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含み、６０〜１５０ｎｔ（例えば、６０〜１４０、６０〜１３０、６５〜１５０、６５〜１４０、６５〜１３０、７０〜１５０、７０〜１４０、または７０〜１３０ｎｔ）の長さを有する。
【０１４２】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺｂ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺｂ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺｂ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺｂ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺｂ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含み、８５〜２４０ｎｔ（例えば、８５〜２３０、８５〜２２０、８５〜１５０、８５〜１３０、９５〜２４０、９５〜２３０、９５〜２２０、９５〜１５０、または９５〜１３０ｎｔ）の長さを有する。
【０１４３】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含み、８０〜１１０ｎｔ（例えば、８５〜１０５ｎｔ）または２３５〜２７０ｎｔ（例えば、２４０〜２６０ｎｔ）の長さを有する。
【０１４４】
いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、またはＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、またはＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と７０％以上の同一性（例えば、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、またはＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、またはＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と９０％以上の同一性（例えば、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、上記のＣａｓＺａ、ＣａｓＺｂ、またはＣａｓＺｃ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列と８０％以上の同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９３％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含み、６０ヌクレオチド（ｎｔ）〜２７０ｎｔ（例えば、６０〜２６０、７０〜２７０、７０〜２６０、または７５〜２５５ｎｔ）の長さを有する。
【０１４５】
いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、修飾ヌクレオチド（例えば、メチル化）を含む。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、ｉ）塩基修飾または置換、ｉｉ）骨格修飾、ｉｉｉ）修飾ヌクレオシド間結合、及びｉｖ）修飾糖部分のうちの１つ以上を含む。可能性のある核酸修飾を、以下に記載する。
【０１４６】
ＣａｓＺシステム
本開示は、ＣａｓＺシステムを提供する。本開示のＣａｓＺシステムは、（１）ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）（本明細書では「ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ」と称される）またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸（例えば、発現ベクター）、（２）ＣａｓＺタンパク質（例えば、野生型タンパク質、バリアント、触媒的に損なわれたバリアント、ＣａｓＺ融合タンパク質など）またはＣａｓＺタンパク質をコードする核酸（例えば、ＲＮＡ、発現ベクターなど）、（３）ＣａｓＺガイドＲＮＡ（ＣａｓＺタンパク質に結合して配列特異性を提供する、例えば、真核生物ゲノムの標的配列に結合することができるガイドＲＮＡ）またはＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸（例えば、発現ベクター）のうちの１つ以上を含むことができる。ＣａｓＺシステムは、（１）、（２）、及び（３）のうちの１つ以上を（任意の組み合わせで）含む宿主細胞（例えば、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞）を含むことができ、例えば、いくつかの場合には、宿主細胞は、ｔｒａｎｃＲＮＡ及び／またはｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸を含む。いくつかの場合には、ＣａｓＺシステムは、（例えば、上記に加えて）ドナー鋳型核酸を含む。いくつかの場合には、ＣａｓＺシステムは、１つの以上の核酸（例えば、上記の任意の組み合わせをコードする１つ以上の発現ベクター）のシステムである。
【０１４７】
核酸
本開示は、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＺポリペプチド（例えば、野生型ＣａｓＺタンパク質、ニッカーゼＣａｓＺタンパク質、ｄＣａｓＺタンパク質、キメラＣａｓＺタンパク質／ＣａｓＺ融合タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＺガイドＲＮＡ配列、ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナーポリヌクレオチド（ドナー鋳型、ドナーＤＮＡ）配列のうちの１つ以上を含む、１つ以上の核酸を提供する。いくつかの場合には、対象の核酸（例えば、１つ以上の核酸）は、組み換え発現ベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ミニサークルＤＮＡ等）である。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＺタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び／またはＣａｓＺガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）、例えば、選択した細胞の種類（例えば、原核細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、齧歯類細胞、ヒト細胞など）において動作可能であるものと動作可能に連結する。
【０１４８】
いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化される。この種類の最適化は、同じタンパク質をコードしながら、意図した宿主生物または細胞のコドン選好性を模倣するように、ＣａｓＺコードヌクレオチド配列の変異を伴い得る。したがって、コドンは変更され得るが、コードされたタンパク質は、変更されないままである。例えば、意図した標的細胞がヒト細胞であった場合、ヒトコドン最適化ＣａｓＺコードヌクレオチド配列を使用することができ得る。別の非限定的な例として、意図した宿主細胞がマウス細胞であった場合、次いで、マウスコドン最適化ＣａｓＺコードヌクレオチド配列を生成することができ得る。別の非限定的な例として、意図した宿主細胞が植物細胞であった場合、植物コドン最適化ＣａｓＺコードヌクレオチド配列を生成することができ得る。別の非限定的な例として、意図した宿主細胞が昆虫細胞であった場合、次いで、昆虫コドン最適化ＣａｓＺコードヌクレオチド配列を生成することができ得る。
【０１４９】
本開示は、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ配列、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＺポリペプチド（例えば、野生型ＣａｓＺタンパク質、ニッカーゼＣａｓＺタンパク質、ｄＣａｓＺタンパク質、キメラＣａｓＺタンパク質／ＣａｓＺ融合タンパク質など）をコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＺガイドＲＮＡ配列、ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びドナーポリヌクレオチド（ドナー鋳型、ドナーＤＮＡ）配列を（いくつかの場合には異なる組み換え発現ベクターにおいて、いくつかの場合には同一の組み換え発現ベクターにおいて）含む、１つ以上の組み換え発現ベクターを提供する。いくつかの場合には、対象の核酸（例えば、１つ以上の核酸）は、組み換え発現ベクター（例えば、プラスミド、ウイルスベクター、ミニサークルＤＮＡ等）である。いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、ＣａｓＺタンパク質をコードするヌクレオチド配列、及び／またはＣａｓＺガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター（例えば、誘導性プロモーター）、例えば、選択した細胞の種類（例えば、原核細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、霊長類細胞、齧歯類細胞、ヒト細胞など）において動作可能であるものと動作可能に連結する。
【０１５０】
好適な発現ベクターとしては、ウイルス発現ベクター（例えば、ワクシニアウイルス、ポリオウイルス、アデノウイルス（例えば、Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３５：２５４３  ２５４９，１９９４、Ｂｏｒｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ６：５１５  ５２４，１９９９、Ｌｉ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄｓｏｎ，ＰＮＡＳ  ９２：７７００  ７７０４，１９９５、Ｓａｋａｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ５：１０８８  １０９７，１９９９、ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９、ＷＯ９３／１９１９１、ＷＯ９４／２８９３８、ＷＯ９５／１１９８４、及びＷＯ９５／００６５５を参照）、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）（例えば、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ９：８１  ８６，１９９８、Ｆｌａｎｎｅｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：６９１６  ６９２１，１９９７、Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ３８：２８５７  ２８６３，１９９７、Ｊｏｍａｒｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ４：６８３  ６９０，１９９７、Ｒｏｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １０：６４１  ６４８，１９９９、Ａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ５：５９１  ５９４，１９９６、Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ  ｉｎ  ＷＯ９３／０９２３９、Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒ．（１９８９）６３：３８２２−３８２８、Ｍｅｎｄｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｖｉｒｏｌ．（１９８８）１６６：１５４−１６５、及びＦｌｏｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９３）９０：１０６１３−１０６１７を参照）、ＳＶ４０、ヘルペス単純ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス（例えば、Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ９４：１０３１９  ２３，１９９７、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７３：７８１２  ７８１６，１９９９を参照）、レトロウイルスベクター（例えば、マウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス、及びレトロウイルスに、例えば、ラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、レンチウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルス、及び哺乳動物腫瘍ウイルス由来するベクター）等に基づくウイルスベクターが挙げられる。いくつかの場合には、本開示の組み換え発現ベクターは、組み換えアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである。いくつかの場合には、本開示の組み換え発現ベクターは、組み換えレンチウイルスベクターである。いくつかの場合には、本開示の組み換え発現ベクターは、組み換えレトロウイルスベクターである。
【０１５１】
利用される宿主／ベクター系に応じて、構成的及び誘導性プロモーター、転写エンハンサー要素、転写ターミネーター等を含む、いくつかの好適な転写及び翻訳制御要素のうちのいずれかが、発現ベクター内で使用され得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写制御要素と動作可能に連結している。いくつかの実施形態では、ＣａｓＺタンパク質またはＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、制御要素、例えば、プロモーターなどの転写抑制要素と動作可能に連結している。
【０１５３】
転写制御要素は、プロモーターであり得る。いくつかの場合には、プロモーターは、構成的活性型のプロモーターである。いくつかの場合には、プロモーターは、調節可能なプロモーターである。いくつかの場合には、プロモーターは、誘導性プロモーターである。いくつかの場合には、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。いくつかの場合には、プロモーターは、細胞型特異的プロモーターである。いくつかの場合には、転写制御要素（例えば、プロモーター）は、標的化された細胞の種類または標的化された細胞集団において機能的である。例えば、いくつかの場合には、転写制御要素は、真核細胞、例えば、造血幹細胞（例えば、動員された末梢血（ｍＰＢ）ＣＤ３４（＋）細胞、骨髄（ＢＭ）ＣＤ３４（＋）細胞など）において機能的であり得る。
【０１５４】
真核細胞プロモーター（真核細胞中で機能的なプロモーター）の非限定的な例としては、ＥＦ１α、最初期のサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）由来のもの、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）チミジンキナーゼ、早期及び後期ＳＶ４０、レトロウイルス由来の長い末端反復（ＬＴＲ）、及びマウスメタロチオネイン−Ｉが挙げられる。適切なベクター及びプロモーターの選択は、十分に当業者のレベル内である。発現ベクターはまた、翻訳開始のためのリボソーム結合部位及び転写ターミネーターを含有することができる。発現ベクターはまた、発現を増幅するための適切な配列を含むことができる。発現ベクターはまた、ＣａｓＺタンパク質と融合して、したがってキメラＣａｓＺポリペプチドをもたらすことができる、タンパク質タグ（例えば、６×Ｈｉｓタグ、ヘマグルチニンタグ、蛍光タンパク質等）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【０１５５】
いくつかの場合には、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターと動作可能に連結している。いくつかの場合には、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターと動作可能に連結している。
【０１５６】
プロモーターは、構成的活性型プロモーター（すなわち、構成的に活性／「ＯＮ」状態であるプロモーター）であり得、誘導性プロモーターであってもよく（すなわち、その活性／「ＯＮ」または不活性／「ＯＦＦ」状態が外部刺激、例えば、特定の温度、化合物、またはタンパク質の存在によって制御されるプロモーター）、空間的制約のあるプロモーター（すなわち、転写制御要素、エンハンサー等）（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）であってもよく、時間的制約のあるプロモーターであってもよい（すなわち、プロモーターは、胚発達の特定段階中、または生物学的過程の特定段階、例えば、マウスにおける毛包サイクル中に、「ＯＮ」状態または「ＯＦＦ」状態である）。
【０１５７】
好適なプロモーターは、ウイルスに由来し得、したがってウイルスプロモーターと称され得るか、またはそれらは原核生物もしくは真核生物を含む任意の生物に由来し得る。好適なプロモーターを使用して、任意のＲＮＡポリメラーゼ（例えば、ｐｏｌ  Ｉ、ｐｏｌ  ＩＩ、ｐｏｌ  ＩＩＩ）によって発現を駆動することができる。例示的なプロモーターとしては、ＳＶ４０早期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスの長い末端配列（ＬＴＲ）プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、例えば、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ヒトＵ６小核プロモーター（Ｕ６）（Ｍｉｙａｇｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０，４９７−５００（２００２））、強化Ｕ６プロモーター（例えば、Ｘｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００３  Ｓｅｐ  １；３１（１７））、ヒトＨ１プロモーター（Ｈ１）等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５８】
場合によっては、ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列は、真核細胞中の動作可能なプロモーター（例えば、Ｕ６プロモーター、強化Ｕ６プロモーター、Ｈ１プロモーター等）と動作可能に連結している（その制御下にある）。当業者によって理解されるように、（例えば、真核細胞中で）Ｕ６プロモーター、または別のＰｏｌＩＩＩプロモーターを使用して核酸（例えば、発現ベクター）からＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）を発現するときに、いくつかのＴが一列に並んでいる（ＲＮＡ中のＵをコードする）場合には、ＲＮＡは変異される必要があり得る。これは、ＤＮＡ中の連続したＴ（例えば、５つのＴ）が、ポリメラーゼＩＩＩ（ＰｏｌＩＩＩ）のターミネーターとして作用し得るためである。したがって、真核細胞中でのガイドＲＮＡの転写を確実にするために、時としてガイドＲＮＡをコードする配列を修飾してＴの連続を除去する必要性があり得る。いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質（例えば、野生型ＣａｓＺタンパク質、ニッカーゼＣａｓＺタンパク質、ｄＣａｓＺタンパク質、キメラＣａｓＺタンパク質等）をコードするヌクレオチド配列は、真核細胞中の動作可能なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター、ＥＦ１αプロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーター等）と動作可能に連結している。
【０１５９】
誘導性プロモーターの例としては、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、Ｔ３  ＲＮＡポリメラーゼプロモーター、イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）調節型プロモーター、ラクトース誘導型プロモーター、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、誘導性プロモーターは、ドキシサイクリン、エストロゲン、及び／またはエストロゲン類似体、ＩＰＴＧ等を含むがこれらに限定されない分子によって、調節することができる。
【０１６０】
使用に好適な誘導性プロモーターとしては、本明細書に記載されるか、または当業者に既知である、任意の誘導性プロモーターが挙げられる。誘導性プロモーターの例としては、アルコール調節型プロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、アンヒドロテトラサイクリン（ａＴｃ）応答性プロモーター、ならびにテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ｔｅｔＲ）、テトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）、及びテトラサイクリントランスアクチベータ融合タンパク質（ｔＴＡ）を含む、他のテトラサイクリン応答性プロモーター系）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体、ヒトエストロゲン受容体、ガエクジソン受容体に基づくプロモーター、及びステロイド／レチノイド／甲状腺受容体スーパーファミリー由来のプロモーター）、金属調節型プロモーター（例えば、酵母、マウス、及びヒト由来のメタロチオネイン（金属イオンに結合し、封鎖するタンパク質）に由来するプロモーター）、病因調節型プロモーター（例えば、サリチル酸、エチレン、またはベンゾチアジアゾール（ＢＴＨ）によって誘導される）、温度／熱誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター）、及び光調節型プロモーター（例えば、植物細胞由来の光応答性プロモーター）などの化学的／生化学的調節型及び物理的調節型プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６１】
いくつかの場合には、プロモーターは、空間的制約のあるプロモーター（すなわち、細胞型特異的プロモーター、組織特異的プロモーター等）であり、それにより多細胞生物において、プロモーターは、特定細胞のサブセットにおいて活性（すなわち、「ＯＮ」）である。空間的制約のあるプロモーターはまた、エンハンサー、転写制御要素、制御配列などとも称され得る。任意の簡便な空間的制約のあるプロモーターを、そのプロモーターが標的宿主細胞（例えば、真核細胞、原核細胞）において機能的である限り、使用することができる。
【０１６２】
いくつかの場合には、プロモーターは、可逆的プロモーターである。可逆的誘導性プロモーターを含む好適な可逆的プロモーターは、当該技術分野において既知である。そのような可逆的プロモーターは、多くの生物、例えば、真核生物及び原核生物から単離され得、それに由来し得る。第２の生物において使用するための第１の生物（例えば、第１の生物が原核生物で第２の生物が真核生物、第１の生物が真核生物で第２の生物が原核生物等）に由来する可逆的プロモーターの修飾は、当該技術分野において周知である。そのような可逆的プロモーター、及び、そのような可逆的プロモーターに基づくだけでなく追加の制御タンパク質も含む系としては、アルコール調節型プロモーター（例えば、アルコールデヒドロゲナーゼＩ（ａｌｃＡ）遺伝子プロモーター、アルコールトランスアクチベータタンパク質（ＡｌｃＲ）に応答性のプロモーター等）、テトラサイクリン調節型プロモーター（例えば、ＴｅｔＡｃｔｉｖａｔｏｒ、ＴｅｔＯＮ、ＴｅｔＯＦＦ等を含むプロモーター系）、ステロイド調節型プロモーター（例えば、ラットグルココルチコイド受容体プロモーター系、ヒトエストロゲン受容体プロモーター系、レチノイドプロモーター系、甲状腺プロモーター系、エクジソンプロモーター系、ミフェプリストンプロモーター系等）、金属調節型プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター系等）、病原体関連調節型プロモーター（例えば、サリチル酸調節型プロモーター、エチレン調節型プロモーター、ベンゾチアジアゾール調節型プロモーター等）、温度調節型プロモーター（例えば、ヒートショック誘導性プロモーター（例えば、ＨＳＰ−７０、ＨＳＰ−９０、ダイズヒートショックプロモーター等）、光調節型プロモーター、合成誘導性プロモーター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１６３】
核酸（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）（例えば、ドナーポリヌクレオチド配列を含む核酸、ＣａｓＺタンパク質及び／またはＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする１つ以上の核酸等）を宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の簡便な方法を使用して、核酸（例えば、発現コンストラクト）を細胞に導入することができる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、形質移入、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型形質移入、リポソーム媒介型形質移入、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達等が挙げられる。
【０１６４】
組み換え発現ベクターを細胞に導入することは、任意の培養培地中で、及び細胞の生存を促進する任意の培養条件下で起こり得る。組み換え発現ベクターを標的細胞に導入することは、インビボまたはエクスビボで実行され得る。組み換え発現ベクターを標的細胞に導入することは、インビトロで実行され得る。
【０１６５】
いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質は、ＲＮＡとして提供され得る。ＲＮＡは、直接化学合成によって提供することができるか、または（例えば、ＣａｓＺタンパク質をコードする）ＤＮＡからインビトロで転写され得る。一旦合成されると、ＲＮＡは、核酸を細胞に導入するための周知の技法（例えば、マイクロインジェクション、電気穿孔、形質移入など）のうちのいずれかによって細胞に導入され得る。
【０１６６】
核酸は、十分に開発された形質移入技法（例えば、Ａｎｇｅｌ及びＹａｎｉｋ（２０１０）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ５（７）：ｅ１１７５６を参照）、ならびにＱｉａｇｅｎから市販されているＴｒａｎｓＭｅｓｓｅｎｇｅｒ（登録商標）試薬、ＳｔｅｍｇｅｎｔからのＳｔｅｍｆｅｃｔ（商標）ＲＮＡ形質移入キット、及びＭｉｒｕｓ  Ｂｉｏ  ＬＬＣからのＴｒａｎｓＩＴ（登録商標）−ｍＲＮＡ形質移入キットを使用して、細胞に提供され得る。また、Ｂｅｕｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００８）ＰＮＡＳ  １０５（５０）：１９８２１−１９８２６も参照されたい。
【０１６７】
ベクターは、標的宿主細胞に直接提供され得る。換言すれば、細胞は、対象の核酸を含むベクター（例えば、ドナー鋳型配列を有し、ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする組み換え発現ベクター、ＣａｓＺタンパク質をコードする組み換え発現ベクター等）と接触し、それによってベクターが細胞によって取り込まれる。細胞を、プラスミドである核酸ベクターと接触させるための方法としては、当該技術分野において周知の電気穿孔、塩化カルシウム形質移入、マイクロインジェクション、及びリポフェクションが挙げられる。ウイルスベクター送達の場合、細胞は、対象のウイルス発現ベクターを含むウイルス粒子と接触させることができる。
【０１６８】
レトロウイルス、例えば、レンチウイルスは、本開示の方法における使用に好適である。一般に使用されるレトロウイルスベクターは「欠陥がある」、すなわち、増殖性感染に必要なウイルスタンパク質を産生することができない。むしろ、ベクターの複製は、パッケージング細胞株における増殖を必要とする。関心対象の核酸を含むウイルス粒子を生成するために、その核酸を含むレトロウイルス核酸が、パッケージング細胞株によってウイルスカプシドにパッケージされる。異なるパッケージング細胞株は、カプシドに組み込まれる異なるエンベロープタンパク質（エコトロピック、アンホトロピック、またはゼノトロピック）を提供し、このエンベロープタンパク質は、細胞に対するウイルス粒子の特異性を決定する（マウス及びラットに対してはエコトロピック、ヒト、イヌ、及びマウスを含む大部分の哺乳動物細胞型に対してはアンホトロピック、ならびにマウス細胞を除く大部分の哺乳動物細胞に対してはゼノトロピック）。適切なパッケージング細胞株を使用して、細胞がパッケージされたウイルス粒子によって標的とされることを確実にすることができる。対象のベクター発現ベクターをパッケージング細胞株に導入する方法及びパッケージング株によって生成されるウイルス粒子を採集する方法は、当該技術分野において周知である。核酸はまた、直接マイクロインジェクション（例えば、ＲＮＡのインジェクション）によって導入することもできる。
【０１６９】
ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸を標的宿主細胞に提供するために使用されるベクターは、関心対象の核酸の発現、つまり転写活性化を駆動するための好適なプロモーターを含むことができる。換言すれば、いくつかの場合には、関心対象の核酸は、プロモーターと動作可能に連結する。これは、遍在的に作用するプロモーター、例えば、ＣＭＶ−β−アクチンプロモーター、または誘導性プロモーター、例えば、特定の細胞集団において活性であるか、もしくはテトラサイクリンなどの薬物の存在に応答するプロモーターを含み得る。転写活性化によって、転写が、標的細胞中の基底レベルよりも１０倍、１００倍、より通常は１０００倍増加されることが意図される。加えて、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺタンパク質をコードする核酸を細胞に提供するために使用されるベクターは、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺタンパク質を取り込んだ細胞を特定するように、標的細胞中で選択可能なマーカーをコードする核酸配列を含み得る。
【０１７０】
ＣａｓＺポリペプチド、またはＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸は、いくつかの場合にはＲＮＡである。したがって、ＣａｓＺ融合タンパク質は、ＲＮＡとして細胞に導入することができる。ＲＮＡを細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、直接注入、形質移入、またはＤＮＡの導入のために使用される任意の他の方法を含み得る。ＣａｓＺタンパク質は、代わりにポリペプチドとして細胞に提供されてもよい。そのようなポリペプチドは、任意に、産生物の溶解性を増加させるポリペプチドドメインと融合し得る。このドメインは、定義されたプロテアーゼ切断部位、例えば、ＴＥＶプロテアーゼによって切断される、ＴＥＶ配列を通して、ポリペプチドと連結し得る。リンカーはまた、１つ以上の可撓性配列、例えば、１〜１０個のグリシン残基も含み得る。いくつかの実施形態では、融合タンパク質の切断は、産生物の溶解性を維持する緩衝液中、例えば、０．５〜２Ｍの尿素の存在下、溶解性を増加させるポリペプチド及び／またはポリヌクレオチドの存在下等で行われる。関心対象のドメインには、エンドソーム不安定化ドメイン、例えば、インフルエンザＨＡドメイン、及び産生を助ける他のポリペプチド、例えば、ＩＦ２ドメイン、ＧＳＴドメイン、ＧＲＰＥドメイン等が含まれる。ポリペプチドは、安定性の改善のために配合され得る。例えば、ペプチドは、ＰＥＧ化されてもよく、そこでポリエチレンオキシ基は、血流中の寿命の向上を提供する。
【０１７１】
加えて、または代替的に、本開示のＣａｓＺポリペプチドは、ポリペプチド浸透性ドメインと融合して、細胞による取り込みを促進することができる。いくつかの浸透性ドメインが、当該技術分野において既知であり、ペプチド、ペプチド模倣体、及び非ペプチド担体を含む、本開示の非統合ポリペプチドにおいて使用され得る。例えば、浸透性ペプチドは、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３４）を含む、ペネトラチンと称される、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ転写因子アンテナペディアの第３のアルファらせんに由来し得る。別の例としては、浸透性ペプチドは、ＨＩＶ−１  ｔａｔ塩基性領域アミノ酸配列を含み、これは、例えば、天然型ｔａｔタンパク質のアミノ酸４９〜５７を含み得る。他の浸透性ドメインには、ポリ−アルギニンモチーフ、例えば、ＨＩＶ−１  ｒｅｖタンパク質のアミノ酸３４〜５６の領域、ノナ−アルギニン、オクタ−アルギニン等を含む。（例えば、転位ペプチド及びペプトイドの教示について参照により本明細書に具体的に組み込まれる、Ｆｕｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｐｅｐｔ  Ｓｃｉ．２００３  Ａｐｒ；４（２）：８７−９  ａｎｄ  ４４６、及びＷｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ  ２０００  Ｎｏｖ．２１；９７（２４）：１３００３−８、米国特許出願公開第２００３０２２０３３４号、同第２００３００８３２５６号、同第２００３００３２５９３号、及び同第２００３００２２８３１号を参照されたい）。ノナ−アルギニン（Ｒ９）配列は、特徴付けられているより効率的なＰＴＤのうちの１つである（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００、Ｕｅｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．２００２）。融合が行われる部位は、ポリペプチドの生物活性、分泌、または結合特徴を最適化するために選択され得る。最適な部位は、慣例実験によって決定されるであろう。
【０１７２】
本開示のＣａｓＺポリペプチドは、インビトロで、または真核細胞によって、または原核細胞によって産生することができ、それは、アンフォールディング、例えば、熱変性、ジチオスレイトール還元等によってさらに処理することができ、当該技術分野において既知の方法を使用して、さらにリフォールディングされ得る。
【０１７３】
一次配列を改変しない関心対象の修飾には、ポリペプチドの化学誘導体化、例えば、アシル化、アセチル化、カルボキシル化、アミド化等が含まれる。また、グリコシル化の修飾、例えば、その合成中及び処理中またはさらなる処理ステップ中にポリペプチドのグリコシル化パターンを修飾することによって、例えば、ポリペプチドを、哺乳動物グリコシル化または脱グリコシル化酵素などのグリコシル化に影響を及ぼす酵素に曝露することによって行われるものも含まれる。また、リン酸化アミノ酸残基、例えば、ホスホチロシン、ホスホセリン、またはホスホスレオニンを有する配列も包含される。
【０１７４】
また、核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする、ＣａｓＺ融合タンパク質をコードする等）、ならびにタンパク質分解に対する耐性を改善する、標的配列特異性を変更する、溶解特性を最適化するか、タンパク質活性（例えば、転写調節活性、酵素活性等）を改変する、またはより好適にするように、通常の分子生物学的技法及び合成化学を使用して修飾されているタンパク質（例えば、野生型タンパク質またはバリアントタンパク質に由来するＣａｓＺ融合タンパク質）も、本開示の実施形態に包含するのに好適である。そのようなポリペプチドの類似体としては、天然型Ｌ−アミノ酸以外、例えば、Ｄ−アミノ酸または非天然型合成アミノ酸の残基を含有するものが挙げられる。Ｄ−アミノ酸は、アミノ酸残基の一部または全てについて置換され得る。
【０１７５】
本開示のＣａｓＺポリペプチドは、当該技術分野において既知の簡便な方法を使用して、インビトロ合成によって調製され得る。様々な市販の合成装置、例えば、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｂｅｃｋｍａｎ等による自動合成装置が入手可能である。合成装置を使用することによって、天然型アミノ酸は、非天然のアミノ酸で置換されてもよい。特定の配列及び調製方法は、簡便性、経済性、必要とされる純度などによって決定されるであろう。
【０１７６】
必要に応じて、合成中または発現中に、様々な基をペプチドに導入してもよく、これにより他の分子または表面への連結が可能となる。したがって、システインを使用して、チオエーテル、金属イオン複合体に連結するためのヒスチジン、アミドまたはエステルを形成するためのカルボキシル基、アミドを形成するためのアミノ基等を作製することができる。
【０１７７】
本開示のＣａｓＺポリペプチドはまた、組み換え合成の従来方法に従って単離及び精製されてもよい。発現宿主の溶解物が調製され、溶解物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、排除クロマトグラフィー、ゲル電気穿孔、親和性クロマトグラフィー、または他の精製技法を使用して精製され得る。大抵は、使用される組成物は、産生物の調製及びその精製の方法に関連した汚染物質に対して、２０重量％以上の所望の産生物、より通常は７５重量％以上、好ましくは９５重量％以上、治療目的の場合は通常９９．５重量％を含む。通常、パーセンテージは、総タンパク質に基づく。したがって、いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドは、少なくとも８０％純粋、少なくとも８５％純粋、少なくとも９０％純粋、少なくとも９５％純粋、少なくとも９８％純粋、または少なくとも９９％純粋である（例えば、汚染物質、非ＣａｓＺタンパク質、または他の高分子等を含まない）。
【０１７８】
切断もしくは任意の所望の修飾を標的核酸（例えば、ゲノムＤＮＡ）に誘導するため、または任意の所望の修飾を標的核酸に関連したポリペプチドに誘導するために、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／もしくはＣａｓＺポリペプチド及び／もしくはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ、ならびに／またはドナー鋳型配列は、それらが核酸として導入されるかまたはポリペプチドとして導入されるかにかかわらず、約３０分〜約２４時間、例えば、１時間、１．５時間、２時間、２．５時間、３時間、３．５時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、１２時間、１６時間、１８時間、２０時間、または約３０分〜約２４時間の任意の他の期間にわたって細胞に提供され得、これはほぼ毎日〜約４日毎の頻度、例えば、１．５日毎、２日毎、３日毎、またはほぼ毎日〜約４日毎の任意の他の頻度で繰り返されてもよい。薬剤（複数可）は、対象の細胞に１回以上、例えば、１回、２回、３回、または４回以上提供されてもよく、細胞は、各接触事象に続くいくらかの時間、例えば、１６〜２４時間にわたって、薬剤（複数可）とともにインキュベートされ、この時間の後に培地を新鮮な培地で置き換え、細胞をさらに培養する。
【０１７９】
２つ以上の異なる標的化複合体（例えば、同じまたは異なる標的核酸内の異なる配列に対して相補的である２つの異なるＣａｓＺガイドＲＮＡ）が細胞に提供される場合には、複合体は、同時に提供され得るか（例えば、２つのポリペプチド及び／もしくは核酸として）、または同時に送達され得る。あるいは、それらは順次提供されてもよく、例えば、標的化複合体が最初に提供され、続いて第２の標的化複合体が提供される等、またはその逆も同様である。
【０１８０】
標的細胞へのＤＮＡベクターの送達を改善するために、ＤＮＡは、例えば、リポプレックス及びポリプレックスを使用することによって促進される損傷及びその細胞への侵入から保護され得る。したがって、いくつかの場合には、本開示の核酸（例えば、本開示の組み換え発現ベクター）は、ミセルまたはリポソームのような組織的構造において脂質で被覆され得る。組織的構造がＤＮＡと複合される場合、それはリポプレックスと呼ばれる。アニオン性（負電荷）、中性、またはカチオン性（正電荷）の、３種類の脂質が存在する。カチオン性脂質を用いるリポプレックスは、遺伝子移行に対する有用性が証明されている。カチオン性脂質は、それらの正電荷により、負電荷ＤＮＡと天然に複合する。また、それらの電荷の結果として、それらは細胞膜と相互作用する。次いで、リポプレックスのエンドサイトーシスが起こり、ＤＮＡが細胞質中に放出される。カチオン性脂質はまた、細胞によるＤＮＡの変性に対して保護する。
【０１８１】
ポリマーのＤＮＡとの複合体は、ポリプレックスと呼ばれる。ほとんどのポリプレックスは、カチオン性ポリマーからなり、それらの産生はイオンの相互作用によって調節される。ポリプレックスとリポプレックスの作用方法の１つの大きな差異は、ポリプレックスが、それらのＤＮＡ負荷を細胞質中に放出できないことであり、このため、不活性化アデノウイルスなどのエンドソーム溶解剤との同時形質移入（エンドサイトーシス中に作製されるエンドソームを溶解する）が必ず起こる。しかしながら、これは常にそうであるとは限らず、ポリエチレンイミンなどのポリマーは、それら独自のエンドソーム崩壊方法を有し、キトサン及びトリメチルキトサンも同様である。
【０１８２】
また、球形状を有する高度に分岐した高分子であるデンドリマーを使用して、幹細胞を遺伝子修飾することもできる。デンドリマー粒子の表面を官能化して、その特性を改変してもよい。特に、カチオン性デンドリマー（すなわち、正の表面電荷を有するもの）を構築することが可能である。ＤＮＡプラスミドなどの遺伝子材料の存在下にある場合、電荷相補性は、核酸とカチオン性デンドリマーとの一時的会合をもたらす。送達先に到達したとき、デンドリマー核酸複合体は、エンドサイトーシスによって細胞に取り込まれ得る。
【０１８３】
いくつかの場合には、本開示（例えば、発現ベクター）の核酸は、関心対象のガイド配列のための挿入部位を含む。例えば、核酸は、関心対象のガイド配列に対する挿入部位を含むことができ、挿入部位は、ガイド配列が変化して所望の標的配列にハイブリダイズしても変化しないＣａｓＺガイドＲＮＡの部分をコードするヌクレオチド配列のすぐ隣にある（例えば、ガイドＲＮＡのＣａｓＺ結合態様に寄与する配列、例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡのｄｓＲＮＡ二重鎖（複数可）に寄与する配列であり、ガイドＲＮＡのこの部分はまた、ガイドＲＮＡの「スキャフォールド」または「定常領域」とも称され得る）。したがって、いくつかの場合には、対象の核酸（例えば、発現ベクター）は、ガイドＲＮＡのガイド配列部分をコードする部分が挿入配列（挿入部位）であることを除いて、ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む。挿入部位は、所望の配列の挿入のために使用される任意のヌクレオチド配列である。様々な技法で使用するための「挿入部位」は、当業者に既知であり、任意の簡便な挿入部位を使用することができる。挿入部位は、核酸配列を利用するための任意の方法に対するものであり得る。例えば、いくつかの場合には、挿入部位は、複数クローニング部位（ＭＣＳ）（例えば、１つ以上の制限酵素認識配列を含む部位）、ライゲーション非依存性クローニングのための部位、組み換えに基づくクローニングのための部位（例えば、ａｔｔ部位に基づく組み換え）、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（例えば、Ｃａｓ９）に基づく技術によって認識されるヌクレオチド配列などである。
【０１８４】
挿入部位は、任意の所望の長さであり得、挿入部位の種類に依存し得る（例えば、その部位が１つ以上の制限酵素認識配列を含むかどうか（またその数）、その部位がＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質に対する標的部位を含むかどうか等に依存し得る）。いくつかの場合には、対象の核酸の挿入部位は、３以上のヌクレオチド（ｎｔ）長（例えば、５以上、８以上、１０以上、１５以上、１７以上、１８以上、１９以上、２０以上、もしくは２５以上、または３０以上のｎｔ長）である。いくつかの場合には、対象の核酸の挿入部位の長さは、２〜５０ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、２〜４０ｎｔ、２〜３０ｎｔ、２〜２５ｎｔ、２〜２０ｎｔ、５〜５０ｎｔ、５〜４０ｎｔ、５〜３０ｎｔ、５〜２５ｎｔ、５〜２０ｎｔ、１０〜５０ｎｔ、１０〜４０ｎｔ、１０〜３０ｎｔ、１０〜２５ｎｔ、１０〜２０ｎｔ、１７〜５０ｎｔ、１７〜４０ｎｔ、１７〜３０ｎｔ、１７〜２５ｎｔ）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、対象の核酸の挿入部位の長さは、５〜４０ｎｔの範囲の長さを有する。
【０１８５】
核酸の修飾
いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡまたはｔｒａｎｃＲＮＡ）は、核酸に新たなまたは強化された特徴（例えば、改善された安定性）を提供するために、１つ以上の修飾、例えば、塩基修飾、骨格修飾等を有する。ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結し得る。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、隣接するヌクレオシドと互いに共有結合して、線状ポリマー化合物を形成する。次に、この線状ポリマー化合物のそれぞれの末端は、さらに接合して環状化合物を形成することができるが、線状化合物が好適である。加えて、線状化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有し得、したがって完全にまたは部分的に二本鎖の化合物を産生するような方法で折り畳むことができる。オリゴヌクレオチド内では、リン酸基は一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成していると称される。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の連結または骨格は、３′〜５′ホスホジエステル連結である。
【０１８６】
好適な核酸修飾としては、２′Ｏメチル修飾ヌクレオチド、２′フルオロ修飾ヌクレオチド、ロックド核酸（ＬＮＡ）修飾ヌクレオチド、ペプチド核酸（ＰＮＡ）修飾ヌクレオチド、ホスホロチオエート連結を有するヌクレオチド、及び５′キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる詳細及び追加の修飾が以下に記載される。
【０１８７】
２′−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド（２′−Ｏ−メチルＲＮＡとも称される）は、ｔＲＮＡ及び他の小分子ＲＮＡ中に見出される、転写後修飾として生じる、ＲＮＡの天然型修飾である。２′−Ｏ−メチルＲＮＡを含有するオリゴヌクレオチドは、直接合成することができる。この修飾は、ＲＮＡ：ＲＮＡ二重鎖のＴｍを増加させるが、ＲＮＡ：ＤＮＡ安定性においてはわずかな変化をもたらすにすぎない。これは一本鎖リボヌクレアーゼによる攻撃に対して安定しており、典型的にはＤＮＡよりもＤＮａｓｅの影響を５〜１０倍受けにくい。これは一般に、安定性及び標的メッセージに対する結合親和性を増加させる手段として、アンチセンスオリゴにおいて使用される。
【０１８８】
２′フルオロ修飾ヌクレオチド（例えば、２′フルオロ塩基）は、天然のＲＮＡと比較したときに、結合親和性（Ｔｍ）を増加させ、またいくらかの相対的ヌクレアーゼ耐性を付与する、フルオリン修飾リボースを有する。これらの修飾は、一般に、血清または他の生物流体中の安定性を改善するために、リボザイム及びｓｉＲＮＡにおいて用いられる。
【０１８９】
ＬＮＡ塩基は、ＲＮＡ  Ａ型らせん二重鎖幾何形状を好む、Ｃ３′末端位置にある塩基をロックするリボース骨格に対する修飾を有する。この修飾は、Ｔｍを著しく増加させ、また非常にヌクレアーゼ耐性がある。複数のＬＮＡ挿入を、３′末端を除く任意の位置にあるオリゴに配置することができる。アンチセンスオリゴからＳＮＰ検出、及び対立遺伝子特異的ＰＣＲに対するハイブリダイゼーションプローブに及ぶ用途が記載されている。ＬＮＡによって付与されるＴｍの大幅な増加に起因して、それらはまた、プライマー二量体形成ならびに自己ヘアピン形成の増加も引き起こすことができる。いくつかの場合には、単一のオリゴに組み込まれるＬＮＡの数は、１０塩基以下である。
【０１９０】
ホスホロチオエート（ＰＳ）結合（すなわち、ホスホロチオエート連結）は、核酸（例えば、オリゴ）のリン酸骨格中の非架橋酸素を、硫黄原子で置き換える。この修飾は、ヌクレアーゼ変性に対する耐性をヌクレオチド間連結に付与する。ホスホロチオエート結合は、エキソヌクレアーゼ変性を阻害するために、オリゴの５′または３′末端における最後の３〜５ヌクレオチド間に導入することができる。ホスホロチオエート結合をオリゴ内（例えば、オリゴ全体を通して）に含めることは、エンドヌクレアーゼによる攻撃の低減にも同様に助けとなり得る。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、対象の核酸は、２′−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチドである１つ以上のヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ｔｒａｎｃ  ＲＮＡ等）は、１つ以上の２′フルオロ修飾ヌクレオチドを有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、１つ以上のＬＮＡ塩基を有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、ホスホロチオエート結合によって連結された１つ以上のヌクレオチドを有する（すなわち、対象の核酸は、１つ以上のホスホロチオエート連結を有する）。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ｄｓＲＮＡ、ｓｉＮＡ等）は、５′キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ）を有する。いくつかの実施形態では、対象の核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ｔｒａｎｃ  ＲＮＡ等）は、修飾ヌクレオチドの組み合わせを有する。例えば、対象の核酸（例えば、ガイドＲＮＡ、ｔｒａｎｃ  ＲＮＡ等）は、他の修飾（例えば、２′−Ｏ−メチルヌクレオチド及び／または２′フルオロ修飾ヌクレオチド及び／またはＬＮＡ塩基及び／またはホスホロチオエート連結）を有する１つ以上のヌクレオチドを有することに加えて、５′キャップ（例えば、７−メチルグアニレートキャップ（ｍ７Ｇ））を有することができる。
【０１９２】
修飾骨格及び修飾ヌクレオシド間連結
修飾を含む好適な核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）の例としては、修飾骨格または非天然のヌクレオシド間連結を含む核酸が挙げられる。修飾骨格を有する核酸は、骨格内にリン原子を保持するもの、及び骨格内にリン原子を有しないものを含む。
【０１９３】
リン酸原子を中に含有する好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３′−アルキレンホスホネート、５′−アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミダート（３′−アミノホスホルアミダート及びアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、ホスホロジアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び通常３′−５′連結を有するボラノホスフェート、それらの２′−５′連結類似体、ならびに１つ以上のヌクレオチド間連結が、３′−３′、５′−５′、または２′−２′連結である、反転極性を有するものが挙げられる。反転極性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、３′最端ヌクレオチド間連結において単一の３′−３′連結を含む、すなわち、塩基性であり得る単一の反転ヌクレオシド残基を含む（核酸塩基が欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）。様々な塩（例えば、カリウムまたはナトリウムなど）、混合塩、及び遊離酸形態もまた含まれる。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、対象の核酸は、１つ以上のホスホロチオエート及び／またはヘテロ原子ヌクレオシド間連結、特に−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む（天然のホスホジエステルヌクレオチド間連結は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−として表される）。ＭＭＩ型ヌクレオシド間連結は、上記で参照された米国特許第５，４８９，６７７号において開示されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。好適なアミドヌクレオシド間連結は、米国特許第５，６０２，２４０号において開示されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１９５】
例えば、米国特許第５，０３４，５０６号に記載されるような、モルホリノ骨格構造を有する核酸もまた好適である。例えば、いくつかの実施形態では、対象の核酸は、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含む。これらの実施形態のうちのいくつかでは、ホスホロジアミダートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結に置き換わる。
【０１９６】
リン原子を中に含まない好適な修飾ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ連結（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸塩骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸及びスルホンアミド骨格、アミド骨格を有するもの、ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが含まれる。
【０１９７】
模倣体
対象の核酸は、核酸模倣体であり得る。「模倣体」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドを含むことが意図され、フラノース環のみまたはフラノース環及びヌクレオチド間連結の両方が、非フラノース基で置き換えられ、フラノース環のみの置換はまた、当該技術分野において代理糖であると称される。複素環式塩基部分または修飾された複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているポリヌクレオチド模倣体である、１つのそのような核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡにおいて、ポリヌクレオチドの糖骨格は、アミド骨格を含有する、特にアミノエチルグリシン骨格で置き換えられる。ヌクレオチドは保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接的または間接的に結合する。
【０１９８】
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告されている１つのポリヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物中の骨格は、ＰＮＡにアミド含有骨格を与える２つ以上の連結されたアミノエチルグリシン単位である。複素環式塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を記載する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２号、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号（それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９９】
研究されているポリヌクレオチド模倣体の別のクラスは、モルホリノ環に結合した複素環式塩基を有する連結されたモルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づいている。モルホリノ核酸中のモルホリノモノマー単位を連結する、いくつかの連結基が報告されている。非イオン性オリゴマー化合物を提供するために、連結基の１つのクラスが選択された。非イオン性モルホリノ系オリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を有する可能性がより低い。モルホリノ系ポリヌクレオチドは、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を形成する可能性がより低いオリゴヌクレオチドの非イオン性模倣体である（Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）。モルホリノ系ポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号に開示されており、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。モノマーサブユニットを接合する様々な異なる連結基を有する、モルホリノクラスのポリヌクレオチド内の様々な化合物が調製されている。
【０２００】
ポリヌクレオチド模倣体のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称される。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子中に通常存在するフラノース環が、シクロヘキセニル環で置き換えられる。ＣｅＮＡ  ＤＭＴ保護ホスホルアミダイトモノマーが調製され、古典的ホスホルアミダイト化学に続くオリゴマー化合物合成のために使用されている。完全に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物及びＣｅＮＡで修飾された特定の位置を有するオリゴヌクレオチドが調製され、研究されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２（その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。一般に、ＤＮＡ鎖へのＣｅＮＡモノマーの組み込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのその安定性を増加させる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体に対する同様の安定性を有するＲＮＡ及びＤＮＡ相補体との複合体を形成した。ＣｅＮＡ構造を天然の核酸構造に組み込むことの研究は、ＮＭＲ及び円二色性によって示され、容易な立体構造適応とともに進められた。
【０２０１】
さらなる修飾は、２′−ヒドロキシル基が糖環の４′炭素原子と連結し、それによって２′−Ｃ、４′−Ｃ−オキシメチレン連結を形成し、それによって二環式糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。連結は、２’酸素原子及び４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）基であり得、式中、ｎは、１または２である（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８，４，４５５−４５６、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＬＮＡ及びＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡとの非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、ならびに良好な溶解特性を示す。ＬＮＡを含有する強力かつ非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（例えば、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。
【０２０２】
ＬＮＡモノマーのアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン、及びウラシルの合成及び調製が、オリゴマー化及び核酸認識特性とともに記載されている（例えば、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。ＬＮＡ及びその調製物はまた、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６、ならびに米国出願第２０１２０１６５５１４号、同第２０１００２１６９８３号、同第２００９００４１８０９号、同第２００６０１１７４１０号、同第２００４００１４９５９号、同第２００２００９４５５５号、及び同第２００２００８６９９８号に記載されており、それらの開示は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
修飾糖部分
対象の核酸はまた、１つ以上の置換された糖部分も含むことができる。好適なポリヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される糖置換基を含み、それらのアルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換のＣ１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってもよい。Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２が特に好適であり、ｎ及びｍは、１〜約１０である。他の好適なポリヌクレオチドは、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基から選択される糖置換基を含む。好適な修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２  ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．ＡＣＴＡ，１９９５，７８，４８６−５０４、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらなる好適な修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の下記の実施例において記載される、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野では、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０２０４】
他の好適な糖置換基としては、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−−Ｏ  ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−−Ｏ−−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、及びフルオロ（Ｆ）が挙げられる。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位であってもよい。好適な２′−アラビノ修飾は、２′−Ｆである。同様の修飾が、オリゴマー化合物上の他の位置で、特に３′末端ヌクレオシド上のまたは２′−５′連結オリゴヌクレオチド内の糖の３′位、及び５′末端ヌクレオチドの５′位でなされもよい。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。
【０２０５】
塩基修飾及び置換
対象の核酸はまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換を含み得る。本明細書で使用される場合、「非修飾」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、ピリミジン塩基の５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシンならびに他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが挙げられる。さらなる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３′，２′：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）が挙げられる。
【０２０６】
複素環式塩基部分は、プリンまたはピリミジン塩基が、他の複素環で置換されるもの、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンも含まれ得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられ、それらの開示は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。これらの核酸塩基の一部は、オリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに有用である。これには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリンが含まれ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、例えば、２′−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされたとき、好適な塩基置換である。
【０２０７】
コンジュゲート
対象の核酸の別の可能な修飾は、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、または細胞取り込みを向上させる１つ以上の部分またはコンジュゲートを、ポリヌクレオチドに化学的に連結することを伴う。これらの部分またはコンジュゲートは、１級または２級ヒドロキシル基などの官能基に共有結合したコンジュゲート基を含むことができる。コンジュゲート基としては、インターカレーター、レポーター分子、ポリアミン、ポリアミド、ポリエチレングリコール、ポリエーテル、オリゴマーの薬物力学特性を向上させる基、及びオリゴマーの薬物動態特性を向上させる基が挙げられる。好適なコンジュゲート基としては、コレステロール、脂質、リン脂質、ビオチン、フェナジン、葉酸塩、フェナントリジン、アントラキノン、アクリジン、フルオレセイン、ローダミン、クマリン、及び色素が挙げられる。薬力学的特性を向上させる基としては、取り込みを改善する、分解に対する耐性を向上させる、及び／または標的核酸との配列特異的ハイブリダイゼーションを強化する基が挙げられる。薬物動態特性を向上させる基としては、対象の核酸の取り込み、分布、代謝、または排泄を改善する基が挙げられる。
【０２０８】
コンジュゲート部分としては、コレステロール部分（Ｌｅｔｓｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８９，８６，６５５３−６５５６）、コール酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９４，４，１０５３−１０６０）、チオエーテル、例えば、ヘキシル−Ｓ−トリチルチオール（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９９２，６６０，３０６−３０９、Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔ．，１９９３，３，２７６５−２７７０）、チオコレステロール（Ｏｂｅｒｈａｕｓｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９２，２０，５３３−５３８）、脂肪族鎖、例えば、ドデカンジオールもしくはウンデシル残基（Ｓａｉｓｏｎ−Ｂｅｈｍｏａｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１９９１，１０，１１１１−１１１８、Ｋａｂａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．，１９９０，２５９，３２７−３３０、Ｓｖｉｎａｒｃｈｕｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，１９９３，７５，４９−５４）、リン脂質、例えば、ジ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロールもしくはトリエチルアンモニウム１，２−ジ−Ｏ−ヘキサデシル−ｒａｃ−グリセロ−３−Ｈ−ホスホネート（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４、Ｓｈｅａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１９９０，１８，３７７７−３７８３）、ポリアミンもしくはポリエチレングリコール鎖（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ＆Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，１９９５，１４，９６９−９７３）、またはアダマンタン酢酸（Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  Ｌｅｔｔ．，１９９５，３６，３６５１−３６５４）、パルミチル部分（Ｍｉｓｈｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，１９９５，１２６４，２２９−２３７）、またはオクタデシルアミンもしくはヘキシルアミノ−カルボニル−オキシコレステロール部分（Ｃｒｏｏｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９６，２７７，９２３−９３７）などの脂質部分が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２０９】
コンジュゲートは、「タンパク質形質導入ドメイン」またはＰＴＤ（ＣＰＰ−細胞透過性ペプチドとしても知られる）を含んでよく、これはポリペプチド、ポリヌクレオチド、炭水化物、または脂質二層、ミセル、細胞膜、細胞小器官膜、もしくは小胞膜の横断を促進する有機もしくは無機化合物を指し得る。小さな極性分子から大きな高分子の範囲であり得る別の分子及び／またはナノ粒子に結合したＰＴＤは、例えば、細胞外空間から細胞内空間に、またはサイトゾルから細胞小器官（例えば、核）内に移動する分子の膜横断を促進する。いくつかの場合には、ＰＴＤは、外因性ポリヌクレオチドの３′末端と共有結合する。いくつかの場合には、ＰＴＤは、外因性ポリヌクレオチドの５′末端と共有結合する。例示的なＰＴＤとしては、最小ウンデカペプチドタンパク質形質導入ドメイン（ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３０）を含むＨＩＶ−１  ＴＡＴの残基４７〜５７に対応）、細胞中への直接侵入に十分な複数のアルギニン（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、または１０〜５０アルギニン）を含むポリアルギニン配列、ＶＰ２２ドメイン（Ｚｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．９（６）：４８９−９６）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａタンパク質形質導入ドメイン（Ｎｏｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ５２（７）：１７３２−１７３７）、切断ヒトカルシトニンペプチド（Ｔｒｅｈｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２１：１２４８−１２５６）、ポリリジン（Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９７：１３００３−１３００８）、
2021503278.tif 000019
、トランスポータン
2021503278.tif 000020
、
2021503278.tif 000021
、及び
2021503278.tif 000022
が挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤとしては、
2021503278.tif 000023
、３アルギニン残基〜５０アルギニン残基のアルギニンホモポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。例示的なＰＴＤドメインアミノ酸配列としては、以下：
2021503278.tif 000024
のうちのいずれかが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、ＰＴＤは、活性化可能なＣＰＰ（ＡＣＰＰ）である（Ａｇｕｉｌｅｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｉｎｔｅｇｒ  Ｂｉｏｌ（Ｃａｍｂ）Ｊｕｎｅ；１（５−６）：３７１−３８１）。ＡＣＰＰは、切断可能なリンカーを介して一致するポリアニオン（例えば、Ｇｌｕ９または「Ｅ９」）に接続されたポリカチオン性ＣＰＰ（例えば、Ａｒｇ９または「Ｒ９」）を含み、これは正味電荷をほぼ０に低減し、それによって細胞への付着及び取り込みを阻害する。リンカーの切断時に、ポリアニオンが放出され、ポリアルギニン及びその本来の付着性を局所的にアンマスクし、したがってＡＣＰＰを「活性化して」膜を横断する。
【０２１０】
標的細胞への成分の導入
ＣａｓＺガイドＲＮＡ（もしくはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／またはＣａｓＺポリペプチド（もしくはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（もしくはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／またはドナーポリヌクレオチド（ドナー鋳型）は、様々な周知の方法のうちのいずれかによって宿主細胞に導入され得る。
【０２１１】
任意の様々な化合物及び方法を使用して、本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達することができる。非限定的な例としては、本開示のＣａｓＺシステムは、脂質と組み合わせることができる。別の非限定的な例としては、本開示のＣａｓＺシステムは、粒子と組み合わせることができるか、または粒子に配合することができる。
【０２１２】
核酸を宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の簡便な方法を使用して、対象の核酸（例えば、発現コンストラクト／ベクター）を標的細胞（例えば、原核細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞等）に導入することができる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、形質移入、コンジュゲート、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型形質移入、リポソーム媒介型形質移入、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ  ｅｔ．，ａｌ  Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１２  Ｓｅｐ  １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照）等が挙げられる。
【０２１３】
いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺポリペプチド（例えば、野生型タンパク質、バリアントタンパク質、キメラ／融合タンパク質、ｄＣａｓＺ等）は、ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、発現ベクター、ウイルスベクター等）として提供される。いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺポリペプチドは、タンパク質として（例えば、関連ガイドＲＮＡなしで、または関連ガイドＲＮＡとともに、すなわち、リボ核タンパク質複合体として）直接提供される。本開示のＣａｓＺポリペプチドは、任意の簡便な方法によって細胞に導入する（細胞に提供する）ことができ、そのような方法は、当業者に既知である。例示的な例として、本開示のＣａｓＺポリペプチドは、細胞内に直接注入することができる（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡまたはＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸の有無にかかわらず、及びドナーポリヌクレオチドの有無にかかわらず、及びＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡの有無にかかわらず）。別の例としては、本開示のＣａｓＺポリペプチドとＣａｓＺガイドＲＮＡ（ＲＮＰ）との予め形成された複合体を、細胞（例えば、真核細胞）に導入することができる（例えば、注射を介して、ヌクレオフェクションを介して、１つ以上の成分とコンジュゲートした、例えば、ＣａｓＺタンパク質とコンジュゲートした、ガイドＲＮＡとコンジュゲートした、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡとコンジュゲートした、本開示のＣａｓＺポリペプチド及びガイドＲＮＡとコンジュゲートした、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を介して、など）。
【０２１４】
いくつかの場合には、核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはそれをコードする核酸、ＣａｓＺタンパク質をコードする核酸、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ及び／またはそれをコードする核酸等）及び／またはポリペプチド（例えば、ＣａｓＺポリペプチド、ＣａｓＺ融合ポリペプチド）は、粒子中の細胞（例えば、標的宿主細胞）に送達されるか、または粒子と会合される。いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺシステムは、粒子中の細胞に送達されるか、または粒子と会合される。「粒子」及び「ナノ粒子」という用語は、適切である場合、互換的に使用することができる。例えば、本開示のＣａｓＺポリペプチド及び／またはＣａｓＺガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター、本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ、及びガイドＲＮＡは、粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達され得る。例えば、ＣａｓＺポリペプチド及び／またはＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはｔｒａｎｃＲＮＡは、例えば、複合体（例えば、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体）として、粒子、例えば、脂質またはリピドイド及び親水性ポリマー、例えば、カチオン性脂質及び親水性ポリマーを含む送達粒子を介して送達され得、例えば、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）もしくは１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を含み、及び／または親水性ポリマーは、エチレングリコールもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、及び／または粒子は、コレステロールをさらに含む（例えば、配合物１からの粒子＝ＤＯＴＡＰ  １００、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  ０、コレステロール０；配合物番号２＝ＤＯＴＡＰ  ９０、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  １０、コレステロール０；配合物番号３＝ＤＯＴＡＰ  ９０、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  ５、コレステロール５）。例えば、粒子は、多段階プロセスを使用して形成することができ、ここでＣａｓＺポリペプチド及びＣａｓＺガイドＲＮＡは、例えば、１：１モル比で、例えば、室温で、例えば、３０分間にわたって、例えば、無菌のヌクレアーゼを含まない１倍リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中で一緒に混合され、別個に、配合物に適用できる場合、ＤＯＴＡＰ、ＤＭＰＣ、ＰＥＧ、及びコレステロールを、アルコール、例えば、１００％のエタノールに溶解し、これら２つの溶液を一緒に混合して、複合体を含有する粒子を形成する。
【０２１５】
本開示のＣａｓＺポリペプチド（もしくは本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ、または本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクター）及び／またはＣａｓＺガイドＲＮＡ（もしくはＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現ベクターなどの核酸）は、粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達され得る。例えば、リン脂質二層シェルによって封入されたポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアを有する生分解性コアシェル構造ナノ粒子を使用することができる。いくつかの場合には、自己集合生体付着性ポリマーに基づく粒子／ナノ粒子が使用され、そのような粒子／ナノ粒子は、例えば、脳へのペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達、及びペプチドの経鼻送達に適用され得る。疎水性薬物の経口吸収及び眼内送達などの他の実施形態もまた企図される。保護され、疾患の部位に送達される操作されたポリマーエンベロープを必要とする分子エンベロープ技術を使用することができる。約５ｍｇ／ｋｇの用量が、様々な要因、例えば、標的組織に応じて、単一または複数の用量で使用され得る。
【０２１６】
リピドイド化合物はまた（例えば、米国特許出願第２０１１０２９３７０３号に記載されるように）、ポリヌクレオチドの投与において有用であり、それを使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＺシステムを送達することができる。一態様では、アミノアルコールリピドイド化合物は、細胞または対象に送達される薬剤と組み合わされて、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルを形成する。アミノアルコールリピドイド化合物は、他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成または天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、脂質等と組み合わされて、粒子を形成することができる。次いで、これらの粒子は、任意に、薬学的賦形剤と組み合わされて、医薬組成物を形成することができる。
【０２１７】
ポリ（ベータ−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）を使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達することができる。米国特許公開第２０１３０３０２４０１号は、コンビナトリアル重合を使用して調製されているポリ（ベータ−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）のクラスに関する。
【０２１８】
糖系粒子、例えば、ＧａｌＮＡｃは、ＷＯ２０１４１１８２７２（参照により本明細書に組み込まれる）及びＮａｉｒ，Ｊ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３６（４９），１６９５８−１６９６１）を参照して、記載されるように使用することができ、それを使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達することができる。
【０２１９】
いくつかの場合には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達する。ＲＮＡなどの負電荷ポリマーは、ＬＮＰ中に低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）で負荷され得、イオン化脂質は、正電荷を示す。しかしながら、生理学的ｐＨ値において、ＬＮＰは、より長い循環時間に対応した低表面電荷を呈する。４種のイオン化カチオン脂質、すなわち１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−ケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）に焦点が当てられている。ＬＮＰの調製は、例えば、Ｒｏｓｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９：１２８６−２２００）に記載されている。カチオン性脂質１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイルオキシ３−Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシケト−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−ｏ−［２’'−（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクリノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、及びＲ−３−［（．オメガ．−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリストイルオキシルプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）を使用してもよい。核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ、本開示の核酸等）は、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを（カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧまたはＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧを４０：１０：４０：１０モル比で）含有するＬＮＰにカプセル化され得る。いくつかの場合には、０．２％のＳＰ−ＤｉＯＣ１８が組み込まれる。
【０２２０】
球形核酸（ＳＮＡ（商標））コンストラクト及び他のナノ粒子（特に金ナノ粒子）を使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達することができる。例えば、Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１  １３３：９２５４−９２５７、Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１  ７：３１５８−３１６２、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１１  ５：６９６２−６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１３７６−１３９１、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１２  １２：３８６７−７１、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２  １０９：１１９７５−８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  ７：６３５−６３８、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１６４８８−１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３  ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３  １１０（１９）：７６２５−７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）、及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６−１９２を参照されたい。
【０２２１】
ＲＮＡを有する自己集合ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端に結合したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドでＰＥＧ化されるポリエチレンイミン（ＰＥＩ）で構築され得る。
【０２２２】
一般に、「ナノ粒子」は、１０００ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子を指す。いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに適したナノ粒子は、５００ｎｍ以下、例えば、２５ｎｍ〜３５ｎｍ、３５ｎｍ〜５０ｎｍ、５０ｎｍ〜７５ｎｍ、７５ｎｍ〜１００ｎｍ、１００ｎｍ〜１５０ｎｍ、１５０ｎｍ〜２００ｎｍ、２００ｎｍ〜３００ｎｍ、３００ｎｍ〜４００ｎｍ、または４００ｎｍ〜５００ｎｍの直径を有する。いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに適したナノ粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの直径を有する。いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに適したナノ粒子は、１００ｎｍ以下の直径を有する。いくつかの場合には、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに適したナノ粒子は、３５ｎｍ〜６０ｎｍの直径を有する。
【０２２３】
本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに適したナノ粒子は、異なる形態で、例えば、固体ナノ粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属、非金属、脂質系固体、ポリマー）、ナノ粒子の懸濁液、またはそれらの組み合わせとして提供され得る。金属、絶縁体、及び半導体ナノ粒子、ならびにハイブリッド構造（例えば、コアシェルナノ粒子）が調製され得る。半導体材料で作製されたナノ粒子はまた、それらが電子エネルギーレベルの量子化が起こるのに十分に小さい場合（典型的に、１０ｎｍ以下）、標識化量子ドットと表記され得る。そのようなナノスケール粒子は、生物医学的適用において、薬物担体または造影剤として使用され、本開示において同様の目的で適応され得る。
【０２２４】
半固体かつ軟質のナノ粒子はまた、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達する際に使用するのに好適である。半固体性質のプロトタイプナノ粒子は、リポソームである。
【０２２５】
いくつかの場合には、エキソソームを使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達する。エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送し、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる、内因性ナノベシクル粒子である。
【０２２６】
いくつかの場合には、リポソームを使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達する。リポソームは内部水性区画を取り囲む単層または多層脂質二層、及び比較的不透過性の外側親油性リン脂質二層で構成される球形ベシクル構造である。リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質から作製され得るが、リポソームを生成するために、リン脂質が最も一般に使用される。リポソーム形成は、脂質膜が水溶液と混合されたときに自然に起こるが、それはまた、ホモジナイザー、ソニケーター、または押出装置を使用することによる振盪の形態で力を印加することによって促進することができる。それらの構造及び特性を改変するために、いくつかの他の添加剤がリポソームに添加されてもよい。例えば、リポソーム構造の安定化を助けるため、及びリポソーム内部カーゴの漏出を防止するために、コレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかがリポソーム混合物に添加されてもよい。リポソーム配合物は、主に、天然のリン脂質、ならびに１，２−ジステアロリル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、及びモノシアロガングリオシドなどの脂質で構成され得る。
【０２２７】
安定な核酸−脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）を使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達することができる。ＳＮＡＬＰ配合物は、脂質３−Ｎ−［（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリストイルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ，Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びコレステロールを、２：４０：１０：４８のモル％比で含有し得る。ＳＮＡＬＰリポソームは、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びｓｉＲＮＡと配合することによって、２５：１の脂質／ｓｉＲＮＡ比及び４８／４０／１０／２モル比のコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを使用して調製され得る。結果として得られるＳＮＡＬＰリポソームは、約８０〜１００ｎｍのサイズであり得る。ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ  Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，Ａｌａ．，ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリストイルオキシプロピルアミン、及びカチオン性１，２−ジリノレイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る。ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ、Ａｖａｎｔｉ  Ｐｏｌａｒ  Ｌｉｐｉｄｓ  Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、及び１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る。
【０２２８】
アミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）などの他のカチオン性脂質を使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達することができる。以下の脂質組成物、すなわちアミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び（Ｒ）−２，３−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）をそれぞれ４０／１０／４０／１０モル比、及びおよそ０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ  ｓｉＲＮＡ／総脂質比で有する予め形成されたベシクルが企図され得る。７０〜９０ｎｍの範囲の狭い粒径分布及び０．１１±０．０４（ｎ＝５６）の低い多分散指数を確実にするために、粒子は、ガイドＲＮＡを付加する前に８０ｎｍ膜を通して最大３回押し出され得る。非常に強力なアミノ脂質１６を含有する粒子が使用されてもよく、ここで４つの脂質成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質のモル比（５０／１０／３８．５／１．５）は、さらに最適化されて、インビボ活性を向上させ得る。
【０２２９】
脂質は、本開示のＣａｓＺシステムまたはその成分（複数可）またはそれをコードする核酸と配合され、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成することができる。好適な脂質としては、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００、及び共脂質ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールが挙げられるが、これらに限定されず、ＰＥＧ−ＤＭＧは、自発的なベシクル形成手順を使用して、本開示のＣａｓＺシステムまたはその成分と配合され得る。成分モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡまたはＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であり得る。
【０２３０】
本開示のＣａｓＺシステムまたはその成分は、米国出願公開第２０１３０２５２２８１号及び同第２０１３０２４５１０７号及び同第２０１３０２４４２７９号にさらに記載されるように、ＰＬＧＡ微小球にカプセル化されて送達され得る。
【０２３１】
超電荷タンパク質を使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達することができる。超電荷タンパク質は、異常に高い正または負の正味理論的電荷を有する操作されたまたは天然型タンパク質のクラスである。超負電荷及び超正電荷のタンパク質の両方は、熱的または化学的に誘導される凝集に耐える能力を呈する。超正電荷タンパク質はまた、哺乳動物細胞を透過することができる。カーゴをこれらのタンパク質、例えば、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のタンパク質と会合させることは、インビトロ及びインビボの両方で、哺乳動物細胞へのこれらの高分子の機能的送達を可能にすることができる。
【０２３２】
細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）を使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞に送達することができる。ＣＰＰは、典型的に、リジンもしくはアルギニンなどの高い相対的存在量の正電荷アミノ酸を含有するか、または極性／電荷アミノ酸及び非極性疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有するかのいずれかであるアミノ酸組成物を有する。
【０２３３】
埋め込み型デバイスを使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ、ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸、ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸、ドナー鋳型等）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞（例えば、インビボの標的細胞、ここで、標的細胞は、循環中の標的細胞、組織中の標的細胞、器官内の標的細胞等である）に送達することができる。本開示のＣａｓＺポリペプチド、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチド、本開示のＲＮＰ、本開示の核酸（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または本開示のＣａｓＺシステムを標的細胞（例えば、インビボの標的細胞、ここで、標的細胞は、循環中の標的細胞、組織中の標的細胞、器官内の標的細胞等である）に送達する際に使用するのに好適な埋め込み可能なデバイスとしては、ＣａｓＺポリペプチド、ＣａｓＺ融合ポリペプチド、ＲＮＰ、またはＣａｓＺシステム（もしくはその成分、例えば、本開示の核酸）を含む容器（例えば、貯留器、マトリックス等）を挙げることができる。
【０２３４】
好適な埋め込み可能なデバイスは、例えば、デバイス本体として使用されるマトリックスなどのポリマー基質、及びいくつかの場合には、金属または追加のポリマーなどの追加のスキャフォールド材料、ならびに可視性及び撮像を向上させる材料を含むことができる。埋め込み可能な送達デバイスは、局所的かつ長期間にわたる放出を提供することにおいて有利であり得、送達されるポリペプチド及び／または核酸は、標的部位、例えば、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）、腫瘍を取り囲む血管系、罹患組織等に直接放出される。好適な埋め込み型デバイスとしては、腹腔などの空洞への送達及び／または薬物送達系が係留もしくは付着されていない任意の他の種類の投与における使用に好適なデバイスが挙げられ、生安定性及び／または生分解性及び／または生体吸収性ポリマー基質（例えば、任意にマトリックスであり得る）を含む。いくつかの場合には、好適な埋め込み型薬物送達デバイスは、分解性ポリマーを含み、主な放出機序は、バルク浸食である。いくつかの場合には、好適な埋め込み可能な薬物送達デバイスは、非分解性または分解の遅いポリマーを含み、主な放出機序は、バルク浸食ではなく拡散であり、それにより外側部分は膜として機能し、その内側部分は、薬物貯留器として機能し、これは実際には長期間（例えば、約１週間〜約数ヶ月間）にわたって周囲に影響されない。異なる放出機序を有する異なるポリマーの組み合わせを、任意に使用してもよい。濃度勾配は、総放出期間のかなりの期間中、効果的に一定に維持され得るため、拡散速度は効果的に一定である（「ゼロモード」拡散と称される）。「一定」という用語は、治療効果の低い閾値より上で維持されるが、依然として任意に初期バーストを特徴とし得る、及び／または変動し得る（例えば、ある特定の程度に増加及び減少する）拡散速度を意味する。拡散速度は、長期間にわたってそのように維持することができ、治療有効期間、例えば、有効サイレンシング期間を最適化するために、ある特定のレベルで一定であると見なすことができる。
【０２３５】
いくつかの場合には、埋め込み型送達系は、化学的性質か、または対象の体内の酵素及び他の因子からの攻撃に起因して、ヌクレオチド系治療剤を分解から遮断するように設計される。
【０２３６】
デバイスの埋め込みのための部位、または標的部位を、最大治療効果のために選択することができる。例えば、送達デバイスは、腫瘍環境または腫瘍に関連した血液供給内、またはその近位に埋め込むことができる。標的位置は、例えば、１）基底核、白質、及び灰白質におけるパーキンソン病またはアルツハイマー病のような変性部位での脳、２）筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合のような脊椎、３）子宮頸部、４）活性及び慢性炎症性関節、５）乾癬の場合のような真皮、７）鎮痛効果のための交感及び感覚神経部位、７）骨、８）急性または慢性感染の部位、９）膣内、１０）内耳−聴覚系、内耳の膜迷路、前庭系、１１）気管内、１２）心臓内、環状部、心外膜、１３）尿路または膀胱、１４）胆道系、１５）腎臓、肝臓、脾臓を含むが、これらに限定されない実質組織、１６）リンパ節、１７）唾液腺、１８）歯肉、１９）関節内（関節中）、２０）眼内、２１）脳組織、２２）脳室、２３）腹腔を含む空洞（例えば、限定されないが、卵巣癌の場合）、２４）食道内、２５）直腸内、ならびに２６）血管系中であり得る。
【０２３７】
埋め込みなどの挿入の方法は、任意に、他の種類の組織埋め込みのため、及び／または挿入のため、及び／または組織採取のため、任意に改変なしに、あるいは任意にそのような方法において主要でない改変のみとともに、既に使用されている場合がある。そのような方法としては、任意に、近接照射療法、生検、超音波を伴う及び／または伴わない内視鏡検査、例えば、脳組織への定位放射線法、関節、腹部器官、膀胱壁、及び体腔中への腹腔鏡の埋め込みを含む腹腔鏡検査が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３８】
修飾された宿主細胞
本開示は、本開示のＣａｓＺポリペプチド、及び／または本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、修飾された細胞を提供する。本開示は、本開示のＣａｓＺポリペプチドを含む修飾された細胞を提供し、修飾された細胞は、通常は本開示のＣａｓＺポリペプチドを含まない細胞である。本開示は、本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む、修飾された細胞（例えば、遺伝子修飾された細胞）を提供する。本開示は、本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡで遺伝子修飾された、遺伝子修飾された細胞を提供する。本開示は、本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターで遺伝子修飾された、遺伝子修飾された細胞を提供する。本開示は、ａ）本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、及びｂ）本開示のＣａｓＺガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターで遺伝子修飾された、遺伝子修飾された細胞を提供する。本開示は、ａ）本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ｂ）本開示のＣａｓＺガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列、及びｃ）ドナー鋳型をコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターで遺伝子修飾された、遺伝子修飾された細胞を提供する。
【０２３９】
本開示のＣａｓＺガイドＲＮＡ本開示のＣａｓＺポリペプチド、及び／または本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び／または本開示のＣａｓＺガイドＲＮＡ（またはそれをコードする核酸）、及び／またはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（またはそれをコードする核酸）のレシピエントとして機能する細胞は、例えば、インビトロ細胞、インビボ細胞、エクスビボ細胞、一次細胞、がん細胞、動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞等を含む様々な細胞のうちのいずれかであり得る。本開示のＣａｓＺポリペプチド、及び／または本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、及び／または本開示のＣａｓＺガイドＲＮＡのレシピエントとして機能する細胞は、「宿主細胞」または「標的細胞」と称される。宿主細胞または標的細胞は、本開示のＣａｓＺシステムのレシピエントであり得る。宿主細胞または標的細胞は、本開示のＣａｓＺ  ＲＮＰのレシピエントであり得る。宿主細胞または標的細胞は、本開示のＣａｓＺシステムの単一成分のレシピエントであり得る。
【０２４０】
細胞（標的細胞）の非限定な例としては、原核細胞、真菌細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生生物細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果物、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種、トマト、米、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、カンナビス、タバコ、顕花植物、球果植物、裸子植物、被子植物、シダ類、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類コケ植物、苔類、双子葉植物、単子葉植物等由来の細胞等）、藻類細胞（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．ａｇａｒｄｈ等）、海藻類（例えば、昆布）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、キノコ由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、蠕虫、棘皮動物、線形動物等）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例えば、有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、ネコ科動物（例えば、ネコ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）等）由来の細胞等が挙げられる。いくつかの場合には、細胞は、天然の生物に由来しない細胞である（例えば、細胞は、合成的に作製された細胞であり得、人工細胞とも称される）。
【０２４１】
細胞は、インビトロ細胞（例えば、培養中の細胞、例えば、確立された培養細胞株）であり得る。細胞は、エクスビボ細胞（個体由来の培養細胞）であり得る。細胞は、インビボ細胞（例えば、個体内の細胞）であり得る。細胞は、単離された細胞であり得る。細胞は、生物の内部の細胞であり得る。細胞は、生物であり得る。細胞は、細胞培養内の細胞（例えば、インビトロ細胞培養）であり得る。細胞は、細胞の集団のうちの１つであり得る。細胞は、原核細胞であり得るか、または原核細胞に由来し得る。細胞は、細菌細胞であり得るか、または細菌細胞に由来し得る。細胞は、古細菌細胞であり得るか、または古細菌細胞に由来し得る。細胞は、真核細胞であり得るか、または真核細胞に由来し得る。細胞は、植物細胞であり得るか、または植物細胞に由来し得る。細胞は、動物細胞であり得るか、または動物細胞に由来し得る。細胞は、無脊椎動物細胞であり得るか、または無脊椎動物細胞に由来し得る。細胞は、脊椎動物細胞であり得るか、または脊椎動物に由来し得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得るか、または哺乳動物細胞に由来し得る。細胞は、齧歯類細胞であり得るか、または齧歯類細胞に由来し得る。細胞は、ヒト細胞であり得るか、またはヒト細胞に由来し得る。細胞は、微生物細胞であり得るか、または微生物細胞に由来し得る。細胞は、真菌細胞であり得るか、または真菌細胞に由来し得る。細胞は、昆虫細胞であり得る。細胞は、節足動物細胞であり得る。細胞は、原生動物細胞である得る。細胞は、蠕虫細胞であり得る。
【０２４２】
好適な細胞としては、幹細胞（例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞等）、体細胞、例えば、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞等が挙げられる。
【０２４３】
好適な細胞としては、ヒト胚幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植拡張心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液幹細胞、筋芽細胞、成体肝細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来の前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、及び出生後幹細胞が挙げられる。
【０２４４】
いくつかの場合には、細胞は、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、及び内皮細胞、または幹細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、天然キラー細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。いくつかの場合には、免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
【０２４５】
いくつかの場合には、細胞は、幹細胞である。幹細胞は、成体幹細胞を含む。成体幹細胞はまた、体幹細胞とも称される。
【０２４６】
成体幹細胞は、分化組織中に存在するが、自己更新の特性及び複数の細胞型、通常は幹細胞が見出される組織に典型的な細胞型を生じる能力を保持する。体幹細胞の多くの例が当業者に既知であり、筋幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、哺乳動物幹細胞、腸幹細胞、中胚葉性幹細胞、内皮幹細胞、嗅官幹細胞、神経堤幹細胞等が挙げられる。
【０２４７】
関心対象の幹細胞としては、哺乳動物幹細胞が挙げられ、「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、研究室、競技用、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。いくつかの場合には、幹細胞は、ヒト幹細胞である。いくつかの場合には、幹細胞は、齧歯類（例えば、マウス、ラット）幹細胞である。いくつかの場合には、幹細胞は、非ヒト霊長類幹細胞である。
【０２４８】
幹細胞は、１つ以上の幹細胞マーカー、例えば、ＳＯＸ９、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＬＧＲ５、ＣＡ９、ＦＸＹＤ２、ＣＤＨ６、ＣＬＤＮ１８、ＴＳＰＡＮ８、ＢＰＩＦＢ１、ＯＬＦＭ４、ＣＤＨ１７、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａを発現し得る。
【０２４９】
いくつかの場合には、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、骨髄、血液、臍帯血、胎児肝臓、及び卵黄嚢から単離され得る中胚葉由来の細胞である。ＨＳＣは、ＣＤ３４＋及びＣＤ３−として特徴付けられる。ＨＳＣは、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球、及びリンパ球様造血細胞系統にインビボで再生させることができる。インビトロで、ＨＳＣは、少なくともいくらかの自己更新細胞分裂を受けるように誘導され得、インビボで見られるものと同じ系統に分化するように誘導され得る。したがって、ＨＳＣは、赤血球細胞、巨核球、好中球、マクロファージ、及びリンパ球細胞のうちの１つ以上に分化するように誘導され得る。
【０２５０】
他の場合では、幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。神経幹細胞（ＮＳＣ）は、ニューロン及びグリア（オリゴデンドロサイト及び星状細胞を含む）に分化することができる。神経幹細胞は、多分裂の能力を有する多能性幹細胞であり、特定の条件下で、神経幹細胞である娘細胞、または神経芽細胞もしくは神経膠芽細胞であり得る神経前駆細胞、例えば、それぞれ１種以上のニューロン及びグリア細胞になるように決定された細胞を産生することができる。ＮＳＣを得る方法は、当該技術分野において既知である。
【０２５１】
他の場合では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。本来、胚性中胚葉に由来し、成体骨髄から単離されるＭＳＣは、分化して、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄基質、及び腱を形成することができる。ＭＳＣを単離する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の既知の方法を使用して、ＭＳＣを得ることができる。例えば、ヒトＭＳＣの単離について記載している米国特許第５，７３６，３９６号を参照されたい。
【０２５２】
細胞は、いくつかの場合には、植物細胞である。植物細胞は、単子葉植物の細胞であり得る。細胞は、双子葉植物の細胞であり得る。
【０２５３】
いくつかの場合には、細胞は、植物細胞である。例えば、細胞は、主要な農業植物、例えば、大麦、豆（乾燥食用）、キャノーラ、トウモロコシ、綿（ピマ）、綿（アプランド）、アマニ、乾草（アルファルファ）、乾草（非アルファルファ）、オーツ麦、ピーナッツ、米、モロコシ、大豆、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ（油）、ヒマワリ（非油）、サツマイモ、タバコ（バーレー）、タバコ（黄色種）、トマト、小麦（ダラム）、小麦（春）、小麦（冬）等の細胞であり得る。別の例としては、細胞は、例えば、アルファルファスプラウト、アロエの葉、クズウコン、オモダカ、アーティチョーク、アスパラガス、筍、バナナの花、豆もやし、豆、ビーツの葉茎、ビーツ、ゴーヤ、チンゲンサイ、ブロッコリー、ブロッコリーレイブ（ラピーニ）、芽キャベツ、キャベツ、キャベツスプラウト、カクタスリーフ（ノパル）、カボチャ、カルドン、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハヤトウリ、チョロギ（クローヌ）、ハクサイ、キンサイ、ニラ、サイシン、シュンギク（ｔｕｎｇ  ｈｏ）、カラードグリーン、トウモロコシの茎、スイートコーン、キュウリ、ダイコン、食用タンポポの葉、タロイモ、豆苗（エンドウの葉）、トウキ（冬瓜）、ナス、エンダイブ、キクヂシャ、ゼンマイ、グンバイナズナ、フリゼ、カラシナ（チャイニーズマスタード）、カイラン、ガランガル（サイアム、タイショウガ）、ニンニク、ショウガ、ゴボウ、グリーン、ハノーバーサラダグリーン、ウアウソントレ、エルサレムアーティチョーク、ヒカマ、ケールグリーン、コールラビ、アカザ（クェライト）、レタス（ビッブ）、レタス（ボストン）、レタス（ボストンレッド）、レタス（グリーンリーフ）、レタス（アイスバーグ）、レタス（サニーレタス）、レタス（オークリーフ・グリーン）、レタス（オークリーフ・レッド）、レタス（加工）、レタス（レッドリーフ）、レタス（ロメイン）、レタス（ルビーロメイン）、レタス（ロシアンレッドマスタード）、ｌｉｎｋｏｋ、ロボック、ササゲ、レンコン、マーシュ、マゲイ（アガベ）リーフ、ヤムイモ、メスクランミックス、水菜、ｍｏａｐ（ヘチマ）、ｍｏｏ、モクア（ファジースクオッシュ）、マッシュルーム、マスタード、長芋、オクラ、空芯菜、ネギ、ｏｐｏ（ロングスクオッシュ）、装飾トウモロコシ、装飾ヒョウタン、パセリ、パースニップ、エンドウ、トウガラシ（ベルタイプ）、トウガラシ、カボチャ、ラディッキオ、ラディッシュの芽、ラディッシュ、レイプグリーン、レイプグリーン、ルバーブ、ロメイン（ベビーレッド）、ルタバガ、アッケシソウ（シービーン）、ヘチマ（トカド／トカドヘチマ）、ホウレンソウ、スクオッシュ、ストローベイル、サトウキビ、サツマイモ、スイスチャード、タマリンド、タロ、タロの葉、タロの芽、ターサイ、ｔｅｐｅｇｕａｊｅ（ギンネム）、ティンドラ、トマティーヨ、トマト、トマト（チェリー）、トマト（グレープタイプ）、トマト（プラムタイプ）、ターメリック、カブの葉、カブ、ヒシの実、ｙａｍｐｉ、ヤム（ｎａｍｅｓ）、アブラナ、ユカ（キャッサバ）等を含むが、これらに限定されない野菜作物の細胞である。
【０２５４】
細胞は、いくつかの場合には、節足動物細胞である。例えば、細胞は、例えば、Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ、Ｍｙｒｉａｐｏｄｉａ、Ｈｅｘｉｐｏｄｉａ、Ａｒａｃｈｎｉｄａ、Ｉｎｓｅｃｔａ、Ａｒｃｈａｅｏｇｎａｔｈａ、Ｔｈｙｓａｎｕｒａ、Ｐａｌａｅｏｐｔｅｒａ、Ｅｐｈｅｍｅｒｏｐｔｅｒａ、Ｏｄｏｎａｔａ、Ａｎｉｓｏｐｔｅｒａ、Ｚｙｇｏｐｔｅｒａ、Ｎｅｏｐｔｅｒａ、Ｅｘｏｐｔｅｒｙｇｏｔａ、Ｐｌｅｃｏｐｔｅｒａ、Ｅｍｂｉｏｐｔｅｒａ、Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ、Ｚｏｒａｐｔｅｒａ、Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ、Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ、Ｎｏｔｏｐｔｅｒａ、Ｇｒｙｌｌｏｂｌａｔｔｉｄａｅ、Ｍａｎｔｏｐｈａｓｍａｔｉｄａｅ、Ｐｈａｓｍａｔｏｄｅａ、Ｂｌａｔｔａｒｉａ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ、Ｍａｎｔｏｄｅａ、Ｐａｒａｐｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ、Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａ、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ、Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、ＥｎｄｏｐｔｅｒｙｇｏｔａもしくはＨｏｌｏｍｅｔａｂｏｌａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｓｔｒｅｐｓｉｐｔｅｒａ、Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｔｅｒａ、Ｍｅｇａｌｏｐｔｅｒａ、Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ、Ｍｅｃｏｐｔｅｒａ、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ、またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの亜目、科、亜科、群、下位群、または種の細胞であり得る。
【０２５５】
細胞は、いくつかの場合には、昆虫動物細胞である。例えば、いくつかの場合には、細胞は、蚊、バッタ、半翅類、ハエ、ノミ、ミツバチ、スズメバチ、アリ、シラミ、蛾、またはカブトムシの細胞である。
【０２５６】
キット
本開示は、本開示のＣａｓＺシステム、または本開示のＣａｓＺシステムの成分を含むキットを提供する。
【０２５７】
本開示のキットは、ＣａｓＺシステムについて列挙したように、任意の組み合わせを含むことができる（例えば、上記参照）。本開示のキットは、ａ）本開示のＣａｓＺシステムの上記に記載した成分、または本開示のＣａｓＺシステムを含み得る成分、ならびにｂ）１種以上の追加の試薬、例えば、ｉ）緩衝液、ｉｉ）プロテアーゼインヒビター、ｉｉｉ）ヌクレアーゼインヒビター、ｉｖ）検出可能な標識を現像または可視化するために必要な試薬、ｖ）正及び／または負の対照標的ＤＮＡ、ｖｉ）正及び／または負の対照ＣａｓＺガイドＲＮＡ、ｖｉｉ）ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ等を含むことができる。本開示のキットは、ａ）本開示のＣａｓＺシステムの上記に記載した成分、または本開示のＣａｓＺシステムを含み得る成分、及びｂ）治療剤を含むことができる。
【０２５８】
本開示のキットは、ａ）標的核酸中の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするＣａｓＺガイドＲＮＡの部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を挿入するための挿入部位、及びｂ）ＣａｓＺガイドＲＮＡのＣａｓＺ結合部分をコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを含むことができる。本開示のキットは、ａ）標的核酸中の標的ヌクレオチド配列にハイブリダイズするＣａｓＺガイドＲＮＡの部分をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を挿入するための挿入部位、ｂ）ＣａｓＺガイドＲＮＡのＣａｓＺ結合部分をコードするヌクレオチド配列、及びｃ）本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、組み換え発現ベクターを含むことができる。本開示のキットは、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む組み換え発現ベクターを含むことができる。
【０２５９】
ｓｓＤＮＡの検出
本開示のＣａｓＺ（Ｃａｓ１４）ポリペプチドは、標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）の検出によって活性化されると、非標的化された一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を無差別に切断することができる。ＣａｓＺ（Ｃａｓ１４）は、ガイドＲＮＡによって活性化される（ガイドＲＮＡが標的ＤＮＡの標的配列とハイブリダイズする（すなわち、試料が標的ＤＮＡ、例えば、標的ｓｓＤＮＡを含む）ときに発生する）と、タンパク質は、ｓｓＤＮＡを無差別に切断するヌクレアーゼとなる（すなわち、ヌクレアーゼが非標的ｓｓＤＮＡ（すなわち、ガイドＲＮＡのガイド配列がハイブリダイズしないｓｓＤＮＡ）を切断する）。したがって、標的ＤＮＡが試料中に（例えば、いくつかの場合には、閾値量を超えて）存在するとき、結果は試料中のｓｓＤＮＡの切断であり、これは任意の簡便な方法を使用して（例えば、標識された一本鎖検出ＤＮＡを使用して）検出することができる。いくつかの場合には、ＣａｓＺポリペプチドは、ＣａｓＺガイドＲＮＡに加えて、活性化のためにｔｒａｎｃ  ＲＮＡを必要とする。
【０２６０】
試料中の標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）を検出するための組成物及び方法が提供される。いくつかの場合には、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）であり、ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡが使用される（すなわち、検出ｓｓＤＮＡは、非標的ｓｓＤＮＡである）。そのような方法は、（ａ）試料を、（ｉ）ＣａｓＺポリペプチド、（ｉｉ）ＣａｓＺポリペプチドに結合する領域、及び標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列、を含む、ガイドＲＮＡ、ならびに（ｉｉｉ）一本鎖であり、かつガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡと、接触させることと、（ｂ）ＣａｓＺポリペプチドによる一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することにより、標的ＤＮＡを検出することと、を含むことができる。いくつかの場合には、方法は、（ａ）試料を、（ｉ）ＣａｓＺポリペプチド、（ｉｉ）ＣａｓＺポリペプチドに結合する領域、及び標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列、を含む、ガイドＲＮＡ、（ｉｉｉ）ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃ  ＲＮＡ、ならびに（ｉｖ）一本鎖であり、かつガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡと、接触させることと、（ｂ）ＣａｓＺポリペプチドによる一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することにより、標的ＤＮＡを検出することと、を含むことができる。上述したように、対象のＣａｓＺポリペプチドタンパク質は、試料がガイドＲＮＡによって活性化される（ガイドＲＮＡがハイブリダイズする標的ＤＮＡを含む（すなわち、試料が標的化された標的ＤＮＡを含む）ときに発生する）と、ＣａｓＺポリペプチドが活性化され、試料中に存在するｓｓＤＮＡ（非標的ｓｓＤＮＡを含む）を非特異的に切断するエンドリボヌクレアーゼとして機能する。したがって、標的化された標的ＤＮＡが試料中に（例えば、閾値量を超えて）存在するとき、結果は試料中のｓｓＤＮＡ（非標的ｓｓＤＮＡを含む）の切断であり、これは任意の簡便な方法を使用して（例えば、標識された検出ｓｓＤＮＡを使用して）検出することができる。
【０２６１】
また、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（例えば、非標的ｓｓＤＮＡ）を切断するための組成物及び方法も提供される。そのような方法は、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む、核酸の集団を、（ｉ）ＣａｓＺポリペプチド、ならびに（ｉｉ）ＣａｓＺポリペプチドに結合する領域、及び標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列、を含む、ガイドＲＮＡと、接触させることを含むことができ、ここで、ＣａｓＺポリペプチドは、該複数の非標的ｓｓＤＮＡを切断する。そのような方法は、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む、核酸の集団を、（ｉ）ＣａｓＺポリペプチド、（ｉｉ）ＣａｓＺポリペプチドと結合する領域、及び標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列、を含むガイドＲＮＡ、ならびに（ｉｉｉ）ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃ  ＲＮＡと、接触させることを含むことができ、ここで、ＣａｓＺポリペプチドは、該複数の非標的ｓｓＤＮＡを切断する。そのような方法を使用して、例えば、細胞中の外来ｓｓＤＮＡ（例えば、ウイルスＤＮＡ）を切断することができる。
【０２６２】
対象の方法の接触ステップは、二価金属イオンを含む組成物中で実行することができる。接触ステップは、無細胞環境、例えば、細胞の外部で実行することができる。接触ステップは、細胞の内部で実行することができる。接触ステップは、インビトロ細胞で実行することができる。接触ステップは、エクスビボ細胞で実行することができる。接触ステップは、インビボ細胞で実行することができる。
【０２６３】
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはガイドＲＮＡをコードする核酸として提供され得る（例えば、組み換え発現ベクターなどのＤＮＡ）。ｔｒａｎｃ  ＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはガイドＲＮＡをコードする核酸として提供され得る（例えば、組み換え発現ベクターなどのＤＮＡ）。ＣａｓＺポリペプチドは、タンパク質それ自体として、またはそのタンパク質をコードする核酸として提供され得る（例えば、ｍＲＮＡ、組み換え発現ベクターなどのＤＮＡ）。いくつかの場合には、２個以上の（例えば、３個以上、４個以上、５個以上、または６個以上）のガイドＲＮＡを提供することができる。いくつかの場合には、ｉ）ＣａｓＺガイドＲＮＡ、及びｉｉ）ｔｒａｎｃ  ＲＮＡ、を含む単一分子ＲＮＡ（または単一分子ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）が使用される。
【０２６４】
いくつかの場合には（例えば、試料をガイドＲＮＡ及びＣａｓＺポリペプチドと接触させるとき、または試料をガイドＲＮＡ、ＣａｓＺポリペプチド、及びｔｒａｎｃ  ＲＮＡと接触させるとき）、試料を測定ステップの前に２時間以下（例えば、１．５時間以下、１時間以下、４０分間以下、３０分間以下、２０分間以下、１０分間以下、または５分間以下、または１分間以下）接触させる。例えば、いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に４０分間以下接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に２０分間以下接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に１０分間以下接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に５分間以下接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に１分間以下接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に５０秒〜６０秒間接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に４０秒〜５０秒間接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に３０秒〜４０秒間接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に２０秒〜３０秒間接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に１０秒〜２０秒間接触させる。
【０２６５】
いくつかの場合には、標的ＤＮＡを検出するための本開示の方法は、ａ）試料をガイドＲＮＡ、ＣａｓＺポリペプチド、及び検出ＤＮＡと接触させることであって、試料を、検出ＤＮＡのトランス切断のために提供する条件下で、２時間以下（例えば、１．５時間以下、１時間以下、４０分間以下、３０分間以下、２０分間以下、１０分間以下、または５分間以下、または１分間以下）接触させることと、ｂ）検出ＤＮＡのトランス切断のために提供しない条件下で、一定期間にわたってステップ（ａ）からの試料を維持することと、ｃ）ステップ（ｂ）の期間の後、ＣａｓＺポリペプチドによる一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定し、それによって標的ＤＮＡを検出することと、を含む。検出ＤＮＡのトランス切断のために提供する条件は、１７℃〜約３９℃（例えば、約３７℃）などの温度条件を含む。検出ＤＮＡのトランスの切断のために提供しない条件は、１０℃以下、５℃以下、４℃以下、または０℃の温度を含む。
【０２６６】
いくつかの場合には、標的ＤＮＡを検出するための本開示の方法は、ａ）試料をガイドＲＮＡ、ｔｒａｎｃ  ＲＮＡ、ＣａｓＺポリペプチド、及び検出ＤＮＡと接触させること（または試料をｉ）ガイドＲＮＡ及びｔｒａｎｃ  ＲＮＡを含む単一分子ＲＮＡ、ｉ）ＣａｓＺポリペプチド、及びｉｉｉ）検出ＤＮＡと接触させること）であって、試料を、検出ＤＮＡのトランス切断のために提供する条件下で、２時間以下（例えば、１．５時間以下、１時間以下、４０分間以下、３０分間以下、２０分間以下、１０分間以下、または５分間以下、または１分間以下）接触させることと、ｂ）検出ＤＮＡのトランス切断のために提供しない条件下で、一定期間にわたってステップ（ａ）からの試料を維持することと、ｃ）ステップ（ｂ）の期間の後、ＣａｓＺポリペプチドによる一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定し、それによって標的ＤＮＡを検出することと、を含む。検出ＤＮＡのトランス切断のために提供する条件は、１７℃〜約３９℃（例えば、約３７℃）などの温度条件を含む。検出ＤＮＡのトランスの切断のために提供しない条件は、１０℃以下、５℃以下、４℃以下、または０℃の温度を含む。
【０２６７】
いくつかの場合には、一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルは、６０分間以下生成される。例えば、いくつかの場合には、一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルは、６０分間以下、４５分間以下、３０分間以下、１５分間以下、１０分間以下、または５分間以下生成される。例えば、いくつかの場合には、一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルは、１分〜６０分、例えば、１分〜５分、５分〜１０分、１０分〜１５分、１５分〜３０分、３０分〜４５分、４５分〜６０分の期間にわたって生成される。いくつかの場合には、検出可能なシグナルが生成された（例えば、６０分間以下生成された）後、検出可能なシグナルの生成を、例えば、試料の温度を下げること（例えば、１０℃以下、５℃以下、４℃以下、または０℃以下に温度を下げること）、試料に阻害剤を添加すること、試料を凍結乾燥すること、試料を４０℃超に加熱すること等によって、停止することができる。測定ステップは、検出可能なシグナルの生成が停止した後の任意の時点で行うことができる。例えば、測定ステップは、検出可能なシグナルの生成が停止してから５分〜４８時間後に行うことができる。例えば、測定ステップは、検出可能なシグナルの生成が停止してから５分〜１５分後、１５分〜３０分後、３０分〜６０分後、１時間〜４時間後、４時間〜８時間後、８時間〜１２時間後、１２時間後〜２４時間後、２４時間〜３６時間後、３６時間〜４８時間後に行うことができる。測定ステップは、検出可能なシグナルの生成が停止してから４８時間以上後に行うことができる。
【０２６８】
試料中の標的ＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）を検出するための本開示の方法は、高感度で標的ＤＮＡを検出することができる。いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、複数のＤＮＡ（標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製（例えば、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、または５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製）で存在する。いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、複数のＤＮＡ（標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０１８個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製（例えば、１０１５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０１２個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０９個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、または５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製）で存在する。
【０２６９】
いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製（例えば、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製）で存在する。
【０２７０】
いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０１８個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製（例えば、１０１８個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０１５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０１２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０９個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製）で存在する。
【０２７１】
いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製（例えば、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製）で存在する。
【０２７２】
いくつかの場合には、試料中の標的ＤＮＡを検出するための対象の方法において、検出閾値は１０ｎＭ以下である。したがって、例えば、標的ＤＮＡは、１０ｎＭ以下の濃度で試料中に存在し得る。「検出閾値」という用語は、検出を行うために試料中に存在しなければならない標的ＤＮＡの最小量を説明するために本明細書で使用される。したがって、例示的な例として、検出閾値が１０ｎＭである場合には、標的ＤＮＡが１０ｎＭ以上の濃度で試料中に存在する場合にシグナルを検出することができる。いくつかの場合には、本開示の方法は、５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．０５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．０１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．００５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．００１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．０００５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．０００１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．００００５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．００００１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１０ｐＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１ｐＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５００ｆＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、２５０ｆＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１００ｆＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５０ｆＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５００ａＭ（アトモル）以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、２５０ａＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１００ａＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５０ａＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１０ａＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１ａＭ以下の検出閾値を有する。
【０２７３】
いくつかの場合には、（対象の方法において標的ＤＮＡを検出するための）検出閾値は、５００ｆＭ〜１ｎＭ（例えば、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲である（濃度は、標的ＤＮＡを検出することができる、標的ＤＮＡの閾値濃度を指す）。いくつかの場合には、本開示の方法は、８００ｆＭ〜１００ｐＭの範囲の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１ｐＭ〜１０ｐＭの範囲の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１０ｆＭ〜５００ｆＭ、例えば、１０ｆＭ〜５０ｆＭ、５０ｆＭ〜１００ｆＭ、１００ｆＭ〜２５０ｆＭ、または２５０ｆＭ〜５００ｆＭの範囲の検出閾値を有する。
【０２７４】
いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、５００ｆＭ〜１ｎＭ（例えば、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲である。いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、８００ｆＭ〜１００ｐＭの範囲である。いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１ｐＭ〜１０ｐＭの範囲である。
【０２７５】
いくつかの場合には、（対象の方法において標的ＤＮＡを検出するための）検出閾値は、１ａＭ〜１ｎＭ（例えば、１ａＭ〜５００ｐＭ、１ａＭ〜２００ｐＭ、１ａＭ〜１００ｐＭ、１ａＭ〜１０ｐＭ、１ａＭ〜１ｐＭ、１００ａＭ〜１ｎＭ、１００ａＭ〜５００ｐＭ、１００ａＭ〜２００ｐＭ、１００ａＭ〜１００ｐＭ、１００ａＭ〜１０ｐＭ、１００ａＭ〜１ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｎＭ、２５０ａＭ〜５００ｐＭ、２５０ａＭ〜２００ｐＭ、２５０ａＭ〜１００ｐＭ、２５０ａＭ〜１０ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｐＭ、５００ａＭ〜１ｎＭ、５００ａＭ〜５００ｐＭ、５００ａＭ〜２００ｐＭ、５００ａＭ〜１００ｐＭ、５００ａＭ〜１０ｐＭ、５００ａＭ〜１ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｎＭ、７５０ａＭ〜５００ｐＭ、７５０ａＭ〜２００ｐＭ、７５０ａＭ〜１００ｐＭ、７５０ａＭ〜１０ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｐＭ、１ｆＭ〜１ｎＭ、１ｆＭ〜５００ｐＭ、１ｆＭ〜２００ｐＭ、１ｆＭ〜１００ｐＭ、１ｆＭ〜１０ｐＭ、１ｆＭ〜１ｐＭ、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲である（濃度は、標的ＤＮＡを検出することができる、標的ＤＮＡの閾値濃度を指す）。いくつかの場合には、本開示の方法は、１ａＭ〜８００ａＭの範囲の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５０ａＭ〜１ｐＭの範囲の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５０ａＭ〜５００ｆＭの範囲の検出閾値を有する。
【０２７６】
いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、１ａＭ〜１ｎＭ（例えば、１ａＭ〜５００ｐＭ、１ａＭ〜２００ｐＭ、１ａＭ〜１００ｐＭ、１ａＭ〜１０ｐＭ、１ａＭ〜１ｐＭ、１００ａＭ〜１ｎＭ、１００ａＭ〜５００ｐＭ、１００ａＭ〜２００ｐＭ、１００ａＭ〜１００ｐＭ、１００ａＭ〜１０ｐＭ、１００ａＭ〜１ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｎＭ、２５０ａＭ〜５００ｐＭ、２５０ａＭ〜２００ｐＭ、２５０ａＭ〜１００ｐＭ、２５０ａＭ〜１０ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｐＭ、５００ａＭ〜１ｎＭ、５００ａＭ〜５００ｐＭ、５００ａＭ〜２００ｐＭ、５００ａＭ〜１００ｐＭ、５００ａＭ〜１０ｐＭ、５００ａＭ〜１ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｎＭ、７５０ａＭ〜５００ｐＭ、７５０ａＭ〜２００ｐＭ、７５０ａＭ〜１００ｐＭ、７５０ａＭ〜１０ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｐＭ、１ｆＭ〜１ｎＭ、１ｆＭ〜５００ｐＭ、１ｆＭ〜２００ｐＭ、１ｆＭ〜１００ｐＭ、１ｆＭ〜１０ｐＭ、１ｆＭ〜１ｐＭ、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲で試料中に存在する。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、１ａＭ〜８００ａＭの範囲で試料中に存在する。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、５０ａＭ〜１ｐＭの範囲で試料中に存在する。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、５０ａＭ〜５００ｆＭの範囲で試料中に存在する。
【０２７７】
いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１ａＭ〜１ｎＭ（例えば、１ａＭ〜５００ｐＭ、１ａＭ〜２００ｐＭ、１ａＭ〜１００ｐＭ、１ａＭ〜１０ｐＭ、１ａＭ〜１ｐＭ、１００ａＭ〜１ｎＭ、１００ａＭ〜５００ｐＭ、１００ａＭ〜２００ｐＭ、１００ａＭ〜１００ｐＭ、１００ａＭ〜１０ｐＭ、１００ａＭ〜１ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｎＭ、２５０ａＭ〜５００ｐＭ、２５０ａＭ〜２００ｐＭ、２５０ａＭ〜１００ｐＭ、２５０ａＭ〜１０ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｐＭ、５００ａＭ〜１ｎＭ、５００ａＭ〜５００ｐＭ、５００ａＭ〜２００ｐＭ、５００ａＭ〜１００ｐＭ、５００ａＭ〜１０ｐＭ、５００ａＭ〜１ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｎＭ、７５０ａＭ〜５００ｐＭ、７５０ａＭ〜２００ｐＭ、７５０ａＭ〜１００ｐＭ、７５０ａＭ〜１０ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｐＭ、１ｆＭ〜１ｎＭ、１ｆＭ〜５００ｐＭ、１ｆＭ〜２００ｐＭ、１ｆＭ〜１００ｐＭ、１ｆＭ〜１０ｐＭ、１ｆＭ〜１ｐＭ、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲である。いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１ａＭ〜５００ｐＭの範囲である。いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１００ａＭ〜５００ｐＭの範囲である。
【０２７８】
いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、１ａＭ〜１ｎＭ（例えば、１ａＭ〜５００ｐＭ、１ａＭ〜２００ｐＭ、１ａＭ〜１００ｐＭ、１ａＭ〜１０ｐＭ、１ａＭ〜１ｐＭ、１００ａＭ〜１ｎＭ、１００ａＭ〜５００ｐＭ、１００ａＭ〜２００ｐＭ、１００ａＭ〜１００ｐＭ、１００ａＭ〜１０ｐＭ、１００ａＭ〜１ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｎＭ、２５０ａＭ〜５００ｐＭ、２５０ａＭ〜２００ｐＭ、２５０ａＭ〜１００ｐＭ、２５０ａＭ〜１０ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｐＭ、５００ａＭ〜１ｎＭ、５００ａＭ〜５００ｐＭ、５００ａＭ〜２００ｐＭ、５００ａＭ〜１００ｐＭ、５００ａＭ〜１０ｐＭ、５００ａＭ〜１ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｎＭ、７５０ａＭ〜５００ｐＭ、７５０ａＭ〜２００ｐＭ、７５０ａＭ〜１００ｐＭ、７５０ａＭ〜１０ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｐＭ、１ｆＭ〜１ｎＭ、１ｆＭ〜５００ｐＭ、１ｆＭ〜２００ｐＭ、１ｆＭ〜１００ｐＭ、１ｆＭ〜１０ｐＭ、１ｆＭ〜１ｐＭ、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲で試料中に存在する。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、１ａＭ〜５００ｐＭの範囲で試料中に存在する。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、１００ａＭ〜５００ｐＭの範囲で試料中に存在する。
【０２７９】
いくつかの場合には、対象の組成物または方法は、アトモル（ａＭ）の検出感度を示す。いくつかの場合には、対象の組成物または方法は、フェムトモル（ｆＭ）の検出感度を示す。いくつかの場合には、対象の組成物または方法は、ピコモル（ｐＭ）の検出感度を示す。いくつかの場合には、対象の組成物または方法は、ナノモル（ｎＭ）の検出感度を示す。
【０２８０】
標的ＤＮＡ
標的ＤＮＡは、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖（ｄｓＤＮＡ）であり得る。標的ＤＮＡが一本鎖である場合、標的ＤＮＡにおけるＰＡＭ配列に対する優先傾向または要件は存在しない。しかしながら、標的ＤＮＡがｄｓＤＮＡである場合、ＰＡＭは通常、標的ＤＮＡの標的配列に隣接して存在する（例えば、本明細書の他の箇所のＰＡＭの考察を参照されたい）。標的ＤＮＡの供給源は、例えば、下記に記載するような、試料の供給源と同一であり得る。
【０２８１】
標的ＤＮＡの供給源は、任意の供給源であり得る。場合によっては、標的ＤＮＡは、ウイルスＤＮＡ（例えば、ＤＮＡウイルスのゲノムＤＮＡ）である。したがって、対象の方法は、（例えば、試料中の）核酸の集団の中のウイルスＤＮＡの存在を検出するためのものであり得る。また、対象の方法は、標的ＤＮＡの存在下で非標的ｓｓＤＮＡの切断に使用することもできる。例えば、方法が細胞内で行われる場合、対象の方法は、特定の標的ＤＮＡが細胞内に存在する場合（例えば、細胞がウイルスに感染し、ウイルス標的ＤＮＡが検出される場合）、細胞内の非標的ｓｓＤＮＡ（ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしないｓｓＤＮＡ）を無差別に切断するために使用することができる。
【０２８２】
可能性のある標的ＤＮＡの例としては、例えば、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルスリンパ球、バラ色粃糠疹、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス）、ポックスウイルス（例えば、天然痘、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））、パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４  Ｇ１）、ジェミニウイルス、ナノウイルス、フィコドナウイルスなどのウイルスＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、寄生虫ＤＮＡである。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、細菌ＤＮＡ、例えば、病原性細菌のＤＮＡである。
【０２８３】
試料
対象試料は、核酸（例えば、複数の核酸）を含む。「複数」という用語は、本明細書では、２つ以上を意味するために使用される。したがって、いくつかの場合には、試料は、２個以上（例えば、３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または５，０００個以上）の核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。対象の方法を、試料中の（例えば、ＤＮＡなどの核酸の複合混合物中の）標的ＤＮＡの存在を検出する非常に高感度の方法として使用することができる。いくつかの場合には、試料は、配列が互いに異なる５つ以上のＤＮＡ（例えば、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または５，０００個以上のＤＮＡ）を含む。いくつかの場合には、試料は、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１０３個以上、５×１０３個以上、１０４個以上、５×１０４個以上、１０５個以上、５×１０５個以上、１０６個以上、５×１０６個以上、または１０７個以上のＤＮＡを含む。いくつかの場合には、試料は、１０〜２０個、２０〜５０個、５０〜１００個、１００〜５００個、５００〜１０３個、１０３〜５×１０３個、５×１０３〜１０４個、１０４〜５×１０４個、５×１０４〜１０５個、１０５〜５×１０５個、５×１０５〜１０６個、１０６〜５×１０６個、または５×１０６〜１０７個、または１０７個超のＤＮＡを含む。いくつかの場合には、試料は、（例えば、配列が互いに異なる）５〜１０７個のＤＮＡ（例えば、５〜１０６個、５〜１０５個、５〜５０，０００個、５〜３０，０００個、１０〜１０６個、１０〜１０５個、１０〜５０，０００個、１０〜３０，０００個、２０〜１０６個、２０〜１０５個、２０〜５０，０００個、または２０〜３０，０００個のＤＮＡ）を含む。いくつかの場合には、試料は、配列が互いに異なる２０個以上のＤＮＡを含む。いくつかの場合には、試料は、細胞溶解物（例えば、真核細胞溶解物、哺乳動物細胞溶解物、ヒト細胞溶解物、原核細胞溶解物、植物細胞溶解物など）由来のＤＮＡを含む。例えば、いくつかの場合には、試料は、真核細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞などの細胞由来のＤＮＡを含む。
【０２８４】
「試料」という用語は、本明細書では、ＤＮＡを含むあらゆる試料（例えば、標的ＤＮＡがＤＮＡの集団の中に存在するかどうかを判決定するための）を意味するために使用される。試料は、任意の供給源に由来し得る。例えば、試料は、精製されたＤＮＡの合成的な組み合わせであり得、試料は、細胞溶解物、ＤＮＡ富化細胞溶解物、または細胞溶解物から単離された及び／もしくは精製されたＤＮＡであり得る。試料は、（例えば、診断の目的のために）患者由来であり得る。試料は、透過処理された細胞由来であり得る。試料は、架橋された細胞由来であり得る。試料は、組織切片の形態であり得る。試料は、架橋、続いて脱脂及び調整して、均一な屈折率とする調節によって調製された組織由来であり得る。架橋、続いて脱脂及び均一な屈折率とする調節によって得られた組織調製物の例は、例えば、Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）１４３，２８６２−２８６７  ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１３８５６０に記載されている。
【０２８５】
「試料」は、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含むことができる。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、２５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、または１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つ未満の複製で試料中に存在する。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から２０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から５０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から５００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から５×１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製で試料中に存在する。
【０２８６】
好適な試料としては、唾液、血液、血清、血漿、尿、吸引液、及び生検試料が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、患者に関する「試料」という用語は、生物起源の血液及び他の液体試料、固形組織試料、例えば、生検標本またはそれ由来の組織培養物もしくは細胞、ならびにそれらの子孫を包含する。定義はまた、調達後に任意の方法で、例えば、試薬を用いた処理、洗浄、またはある特定の細胞集団、例えば、がん細胞に対する濃縮などによって操作されている試料も含む。定義はまた、特定の種類の分子、例えば、ＤＮＡに対して濃縮されている試料も含む。「試料」という用語は、例えば、血液、血漿、血清、吸引液、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの臨床試料などの生体試料を包含し、また、外科的切除によって得られた組織、生検によって得られた組織、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織試料、器官、骨髄等も含む。「生体試料」は、それに由来する生物学的流体（例えば、がん細胞、感染細胞、など）、例えば、そのような細胞から得られるＤＮＡを含む試料（例えば、細胞溶解物またはＤＮＡを含む他の細胞抽出物）を含む。
【０２８７】
試料は、任意の種々の細胞、組織、器官、または無細胞流体を含むことができるか、またはそれらから得ることができる。好適な試料の供給源としては、真核細胞、細菌細胞、及び古細菌細胞が挙げられる。好適な試料の供給源としては、単細胞生物及び多細胞生物が挙げられる。好適な試料の供給源としては、単細胞の真核生物；植物または植物細胞；藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．ａｇａｒｄｈ等；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；動物細胞、組織、または器官；無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物、昆虫動物、クモ類など）由来の細胞、組織、または器官；脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、組織、流体、または器官；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、有蹄動物、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等）由来の細胞、組織、流体、または器官などが挙げられる。好適な試料の供給源としては、線形動物、原生動物などが挙げられる。好適な試料の供給源としては、例えば、蠕虫類、マラリア原虫などの寄生虫が挙げられる。
【０２８８】
好適な試料の供給源としては、６界、例えば、細菌（例えば、真正細菌）界、古細菌界、原生生物界、菌界、植物界、及び動物界のうちのいずれかの細胞、組織、または生物が挙げられる。好適な試料の供給源としては、藻類（例えば、緑藻、紅藻、灰色藻、シアノバクテリア）を含むがこれらに限定されない原生生物界の植物様メンバー；原生生物界の菌様メンバー、例えば、粘菌類、水生菌類など；原生生物界の動物様メンバー、例えば、鞭毛虫類（例えば、Ｅｕｇｌｅｎａ）、アメーバ様（例えば、アメーバ）、胞子虫類（例えば、Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ、Ｍｙｘｏｚｏａ、Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ）、及び繊毛虫類（例えば、Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ）が挙げられる。好適な試料の供給源としては、以下の門：Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ（担子菌門、例えば、Ａｇａｒｉｃｕｓ、Ａｍａｎｉｔａ、Ｂｏｌｅｔｕｓ、Ｃａｎｔｈｅｒｅｌｌｕｓなどのメンバー）、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓを含む子嚢菌門）、Ｍｙｃｏｐｈｙｃｏｐｈｙｔａ（地衣類）、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ（抱合菌）、及びＤｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａのうちのいずれかのメンバーを含むが、これらに限定されない、菌界のメンバーが挙げられる。好適な試料の供給源としては、以下の分類：Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ（例えば、蘚類）、Ａｎｔｈｏｃｅｒｏｔｏｐｈｙｔａ（例えば、ツノゴケ類）、Ｈｅｐａｔｉｃｏｐｈｙｔａ（例えば、苔類）、Ｌｙｃｏｐｈｙｔａ（例えば、ヒカゲノカズラ）、Ｓｐｈｅｎｏｐｈｙｔａ（例えば、トクサ）、Ｐｓｉｌｏｐｈｙｔａ（例えば、マツバラン）、Ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓｏｐｈｙｔａ、Ｐｔｅｒｏｐｈｙｔａ（例えば、シダ）、Ｃｙｃａｄｏｐｈｙｔａ、Ｇｉｎｇｋｏｐｈｙｔａ、Ｐｉｎｏｐｈｙｔａ、Ｇｎｅｔｏｐｈｙｔａ、及びＭａｇｎｏｌｉｏｐｈｙｔａ（例えば、顕花植物）のうちのいずれかのメンバーを含むが、これらに限定されない、植物界のメンバーが挙げられる。好適な試料の供給源としては、以下の門：Ｐｏｒｉｆｅｒａ（海綿動物）、Ｐｌａｃｏｚｏａ、Ｏｒｔｈｏｎｅｃｔｉｄａ（海洋無脊椎動物の寄生虫）、Ｒｈｏｍｂｏｚｏａ、Ｃｎｉｄａｒｉａ（サンゴ、イソギンチャク、クラゲ、ウミエラ、ウミシイタケ、キロネックス）、Ｃｔｅｎｏｐｈｏｒａ（有櫛動物）、Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ（扁形動物）、Ｎｅｍｅｒｔｉｎａ（紐形動物）、Ｎｇａｔｈｏｓｔｏｍｕｌｉｄａ（顎口動物）、Ｇａｓｔｒｏｔｒｉｃｈａ、Ｒｏｔｉｆｅｒａ、Ｐｒｉａｐｕｌｉｄａ、Ｋｉｎｏｒｈｙｎｃｈａ、Ｌｏｒｉｃｉｆｅｒａ、Ａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌａ、Ｅｎｔｏｐｒｏｃｔａ、Ｎｅｍｏｔｏｄａ、Ｎｅｍａｔｏｍｏｒｐｈａ、Ｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ、Ｍｏｌｌｕｓｃａ（軟体動物）、Ｓｉｐｕｎｃｕｌａ（星口動物）、Ａｎｎｅｌｉｄａ（条虫）、Ｔａｒｄｉｇｒａｄａ（緩歩動物）、Ｏｎｙｃｈｏｐｈｏｒａ（有爪動物）、Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ（以下の亜門：Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ、Ｍｙｒｉａｐｏｄａ、Ｈｅｘａｐｏｄａ、Ｃｒｕｓｔａｃｅａを含み、Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａは例えばクモ類、Ｍｅｒｏｓｔｏｍａｔａ、及びＰｙｃｎｏｇｏｎｉｄａを含み、Ｍｙｒｉａｐｏｄａは例えばＣｈｉｌｏｐｏｄａ（ムカデ）、Ｄｉｐｌｏｐｏｄａ（ヤスデ）、Ｐａｒｏｐｏｄａ、及びＳｙｍｐｈｙｌａを含み、Ｈｅｘａｐｏｄａは昆虫動物を含み、Ｃｒｕｓｔａｃｅａはエビ、オキアミ、フジツボ等を含む）、Ｐｈｏｒｏｎｉｄａ、Ｅｃｔｏｐｒｏｃｔａ（外肛動物）、Ｂｒａｃｈｉｏｐｏｄａ、Ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍａｔａ（例えば、ヒトデ、ウミシイタケ、ウミユリ、ウニ、ナマコ、クモヒトデ、テヅルモヅル等）、Ｃｈａｅｔｏｇｎａｔｈａ（毛顎動物）、Ｈｅｍｉｃｈｏｒｄａｔａ（半索動物）、ならびにＣｈｏｒｄａｔａのうちのいずれかのメンバーを含むが、これらに限定されない、動物界のメンバーが挙げられる。脊索動物門の好適なメンバーとしては、以下の亜門：Ｕｒｏｃｈｏｒｄａｔａ（Ａｓｃｉｄｉａｃｅａ、Ｔｈａｌｉａｃｅａ、及びＬａｒｖａｃｅａを含むホヤ）；Ｃｅｐｈａｌｏｃｈｏｒｄａｔａ（ナメクジウオ）；Ｍｙｘｉｎｉ（ヌタウナギ）；及び脊椎動物亜門のうちのいずれかのメンバーが挙げられ、脊椎動物亜門のメンバーとしては、例えばＰｅｔｒｏｍｙｚｏｎｔｉｄａ（ヤツメウナギ）、Ｃｈｏｎｄｒｉｃｈｔｈｙｃｅｓ（軟骨魚類）、Ａｃｔｉｎｏｐｔｅｒｙｇｉｉ（硬骨魚類）、Ａｃｔｉｎｉｓｔａ（シーラカンス）、Ｄｉｐｎｏｉ（肺魚類）、Ｒｅｐｔｉｌｉａ（爬虫類、例えば、ヘビ、ワニ、ワニ、トカゲなど）、Ａｖｅｓ（鳥類）、及びＭａｍｍａｌｉａｎ（哺乳動物）のメンバーが挙げられる。好適な植物としては、任意の単子葉植物及び任意の双子葉植物が挙げられる。
【０２８９】
好適な試料の供給源としては、生物から採取した細胞、流体、組織、もしくは器官、または生物から単離された特定の細胞もしくは細胞の集団等が挙げられる。例えば、生物が植物である場合、好適な供給源としては、木部、師部、形成層、葉、根などが挙げられる。生物が動物である場合、好適な供給源としては、特定の組織（例えば、肺、肝臓、心臓、腎臓、脳、脾臓、皮膚、胎児組織など）、または特定の細胞の種類（例えば、ニューロン細胞、上皮細胞、内皮細胞、星状細胞、マクロファージ、グリア細胞、膵島細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球など）が挙げられる。
【０２９０】
いくつかの場合には、試料の供給源は、罹患した（または罹患した疑いがある）細胞、流体、組織、または器官である。いくつかの場合には、試料の供給源は、正常な（罹患していない）細胞、流体、組織、または器官である。いくつかの場合には、試料の供給源は、病原体に感染した（または感染した疑いがある）細胞、組織、または器官である。例えば、試料の供給源は、感染しているか、または感染していない個体であり得、試料は、その個体から採集された任意の生体試料（例えば、血液、唾液、生検、血漿、血清、気管支肺胞洗浄液、痰、糞便試料、脳脊髄液、微細針吸引液、スワブ試料（例えば、頬スワブ、子宮頸部スワブ、鼻腔スワブ）、間質液、滑液、鼻汁、涙液、軟膜、粘膜試料、上皮細胞試料（例えば、上皮細胞擦過物）、など）であり得る。いくつかの場合には、試料は、細胞を含まない液体試料である。いくつかの場合には、試料は、細胞を含み得る液体試料である。病原体としては、ウイルス、真菌類、蠕虫類、原虫動物、マラリア原虫、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ寄生虫、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ寄生虫、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ寄生虫などが挙げられる。「蠕虫類」としては、回虫、犬糸状虫、及び植物食性線虫（Ｎｅｍａｔｏｄａ）、吸虫（Ｔｅｍａｔｏｄａ）、Ａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌａ、及び条虫（Ｃｅｓｔｏｄａ）が挙げられる。原虫感染症としては、Ｇｉａｒｄｉａ菌種、Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ菌種、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ赤痢、バベシア症、バランチジウム赤痢、Ｃｈａｇａ病、コクシジウム症、マラリア、及びトキソプラズマ症由来の感染症が挙げられる。寄生虫性／原生動物性病原体などの病原体の例としては、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、及びＴｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉが挙げられるが、これらに限定されない。真菌性病原体としては、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ、及びＣａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓが挙げられるが、これらに限定されない。病原性ウイルスとしては、例えば、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、デング、西ナイルウイルス、ヘルペスウイルス、黄熱病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パピローマウイルスなどが挙げられる。病原性ウイルスとしては、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルスリンパ球、バラ色粃糠疹、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス）、ポックスウイルス（例えば、天然痘、���クシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））、パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４  Ｇ１）、ジェミニウイルス、ナノウイルス、フィコドナウイルスなどのＤＮＡウイルスなどを挙げることができる。病原体としては、例えば、ＤＮＡウイルス［例えば、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルスリンパ球、バラ色粃糠疹、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス）、ポックスウイルス（例えば、天然痘、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））、パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４  Ｇ１）、ジェミニウイルス、ナノウイルス、フィコドナウイルスなど］、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ、メチシリン耐性のＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ、Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ、ヘモフィルスインフルエンザ菌Ｂ型、Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ、ライム病スピロヘータ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ、狂犬病ウイルス、インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルスＩＩ型、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、いぼウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、サルウイルス４０、マウス乳房腫瘍ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ、Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ、Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ、Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ、Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ、Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ、Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ、Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ、Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ、Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ、Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ、Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ、Ｍ．ｏｒａｌｅ、Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ、Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ、Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ  及びＭ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅを挙げることができる。
【０２９１】
検出可能なシグナルの測定
いくつかの場合には、対象の方法は、測定（例えば、ＣａｓＺ媒介型ｓｓＤＮＡ切断によって生成される検出可能なシグナルの測定）のステップを含む。ＣａｓＺポリペプチドは、活性化されると非標的化ｓｓＤＮＡを切断するため（それはガイドＲＮＡがＣａｓＺポリペプチド（及び、いくつかの場合には、ｔｒａｎｃＲＮＡも含む）の存在下で標的ＤＮＡとハイブリダイズする場合に起こる）、検出可能なシグナルは、ｓｓＤＮＡが切断されるときに生成される任意の信号であり得る。例えば、いくつかの場合には、測定のステップは、金ナノ粒子ベースの検出（例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２００７；４６（１９）：３４６８−７０、及びＸｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  Ｊｕｎ  １５；１０７（２４）：１０８３７−４１を参照）、蛍光偏光、コロイド相転移／分散（例えば、Ｂａｋｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００４  Ｊａｎ  ８；４２７（６９７０）：１３９−４１）、電気化学的検出、半導体ベースの感知（例えば、Ｒｏｔｈｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１  Ｊｕｌ  ２０；４７５（７３５６）：３４８−５２、例えば、２’−３’環状ホスフェートの開口によって、及び溶液中の無機ホスフェートの放出によって、ホスファターゼを使用してｓｓＤＮＡ切断反応後にｐＨ変化を生成することができる）、及び標識された検出ｓｓＤＮＡの検出（詳細は本明細書の他の箇所を参照）のうちの１つ以上を含むことができる。そのような検出方法の読み出しは、任意の簡便な読み出しであり得る。可能性のある読み出しの例としては、検出可能な蛍光シグナルの測定された量、ゲル上のバンド（例えば、未切断基質に対する切断産物を表すバンド）の視覚的分析、色の存在または非存在の視覚的またはセンサーベースの検出（すなわち、色検出法）、及び電気シグナル（もしくはその特定の量）の存在または非存在、が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２９２】
いくつかの場合には、測定は、例えば、検出されるシグナルの量が、試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定するために使用することができるという意味において、定量的であり得る。いくつかの場合には、測定は、例えば、検出可能なシグナルの存在または非存在が、標的ＤＮＡ（例えば、ウイルス、ＳＮＰ等）の存在または非存在を示すことができるという意味において、定性的であり得る。いくつかの場合には、検出可能なシグナルは、標的ＤＮＡ（複数可）（例えば、ウイルス、ＳＮＰ等）が特定の閾値濃度を超えて存在しない限り、（例えば、所定の閾値レベルを超えて）存在しないであろう。いくつかの場合には、検出閾値は、ＣａｓＺポリペプチド、ガイドＲＮＡ、試料の量、及び／または検出ｓｓＤＮＡ（使用される場合）の量を変更することによって滴定することができる。したがって、例えば、当業者によって理解されるように、いくつかの対照を、１つ以上の反応を設定するために必要に応じて使用することができ、それらの各々が、異なる閾値レベルの標的ＤＮＡを検出するために設定され、したがって、そのような一連の反応を使用して試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することができる（例えば、そのような一連の反応を使用して、「少なくともＸの濃度で」試料中に存在する標的ＤＮＡを決定することができる）。本開示の組成物及び組成物の適用／使用の非限定的な例としては、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）の検出、がんのスクリーニング、細菌感染の検出、抗生物質耐性の検出、ウイルス感染の検出などが挙げられる。本開示の組成物及び方法を使用して、任意のＤＮＡ標的を検出することができる。例えば、対象の試料が細胞のゲノムＤＮＡを含み得るため、核酸物質をゲノムに統合するいかなるウイルスも検出することができ、ガイドＲＮＡは統合ヌクレオチド配列を検出するように設計することができる。いくつかの場合には、本開示の方法は、増幅ステップを含まない。いくつかの場合には、本開示の方法は、増幅ステップを含む。
【０２９３】
いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む試料）中の標的ＤＮＡの量を決定することができる。試料中の標的ＤＮＡの量を決定することは、試験試料から生成された検出可能なシグナルの量を、参照試料から生成された検出可能なシグナルの量と比較することを含むことができる。試料中の標的ＤＮＡの量を決定することは、検出可能なシグナルを測定して試験測定値を生成することと、参照試料によって生成される検出可能なシグナルを測定して、参照測定値を生成することと、試験測定値を参照測定値と比較して、試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することと、を含む。
【０２９４】
例えば、いくつかの場合には、試料中の標的ＤＮＡの量を決定するための本開示の方法は、ａ）試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む試料）を、（ｉ）標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイドＲＮＡ、（ｉｉ）試料中に存在するＤＮＡを切断するＣａｓＺポリペプチド、及び（ｉｉｉ）検出ｓｓＤＮＡと接触させることと、ｂ）ＣａｓＺポリペプチド媒介型ｓｓＤＮＡ切断（例えば、検出ｓｓＤＮＡの切断）によって生成される検出可能なシグナルを測定して、試験測定値を生成することと、ｃ）参照試料によって生成される検出可能な信号を測定して、参照測定値を生成することと、ｄ）試験測定値を参照測定値と比較して、試料中の標的ＤＮＡの存在量を判定することとを含む。
【０２９５】
別の例としては、いくつかの場合には、試料中の標的ＤＮＡの量を決定するための本開示の方法は、ａ）試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む試料）を、（ｉ）標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイドＲＮＡ、（ｉｉ）試料中に存在するＤＮＡを切断するＣａｓＺポリペプチド、（ｉｉｉ）ｔｒａｎｃ  ＲＮＡ、及び（ｉｖ）検出ｓｓＤＮＡと接触させることと、ｂ）ＣａｓＺポリペプチド媒介型ｓｓＤＮＡ切断（例えば、検出ｓｓＤＮＡの切断）によって生成される検出可能なシグナルを測定して、試験測定値を生成することと、ｃ）参照試料によって生成される検出可能な信号を測定して、参照測定値を生成することと、ｄ）試験測定値を参照測定値と比較して、試料中の標的ＤＮＡの存在量を判定することとを含む。
【０２９６】
試料中の核酸の増幅
いくつかの実施形態では、対象の組成物及び／または（例えば、細胞のゲノムＤＮＡ中のウイルスＤＮＡまたはＳＮＰなどの標的ＤＮＡの存在を検出するための）方法の感度は、検出を核酸増幅と組み合わせることによって増加させることができる。いくつかの場合には、試料中の核酸は、ｓｓＤＮＡを切断するＣａｓＺポリペプチドと接触する前に増幅される（例えば、試料中の核酸の増幅は、ＣａｓＺポリペプチドとの接触前に開始することができる）。いくつかの場合には、試料中の核酸は、ＣａｓＺポリペプチドとの接触と同時に増幅される。例えば、いくつかの場合には、対象の方法は、（例えば、試料を増幅成分と接触させることによって）試料の核酸を増幅してから、増幅された試料をＣａｓＺポリペプチドと接触させることを含む。いくつかの場合には、対象の方法は、試料をＣａｓＺポリペプチドと接触させるのと一緒に（同時に）試料を増幅成分と接触させることを含む。全ての成分（増幅成分及び検出成分、例えば、ＣａｓＺポリペプチド、ガイドＲＮＡ、及び検出ＤＮＡ）が同時に添加される場合、ＣａｓＺポリペプチドのトランス切断活性は、核酸が増幅を受けるのと同時に試料の核酸を分解し始める可能性がある。しかしながら、このような場合であっても、増幅及び検出を同時に行うことは、増幅せずに方法を実施する場合と比較して、依然として感度を高めることができる。
【０２９７】
いくつかの場合には、特定の配列（例えば、ウイルスの配列、関心対象のＳＮＰを含む配列）は、例えば、プライマーを使用して、試料から増幅される。したがって、ガイドＲＮＡがハイブリダイズするであろう配列は、対象の検出方法の感度を高めるために増幅することができ、これにより、試料中に存在する他の配列と比較して試料中に存在する関心対象の配列の複製の数を増加させるために、所望の配列の偏った増幅を達成することができる。例示的な一例として、所与の試料が特定のウイルス（または特定のＳＮＰ）を含むかどうかを決定するために対象の方法が使用されている場合、ウイルス配列（または非ウイルスゲノム配列）の所望の領域を増幅することができ、増幅された領域は、ウイルス配列（またはＳＮＰ）が実際に試料中に存在する場合、ガイドＲＮＡにハイブリダイズするであろう配列を含む。
【０２９８】
前述のように、いくつかの場合には、核酸は、（例えば、増幅成分と接触させることによって）増幅してから、増幅された核酸をＣａｓＺポリペプチドと接触させる。いくつかの場合には、増幅は、酵素的に活性なＣａｓＺポリペプチドと接触する前に１０秒間以上（例えば、３０秒間以上、４５秒間以上、１分間以上、２分間以上、３分間以上、４分間以上、５分間以上、７．５分間以上、１０分間以上等）発生する。いくつかの場合には、増幅は、活性なＣａｓＺポリペプチドと接触する前に２分間以上（例えば、３分間以上、４分間以上、５分間以上、７．５分間以上、１０分間以上等）発生する。いくつかの場合には、増幅は、１０秒〜６０分（例えば、１０秒〜４０分、１０秒〜３０分、１０秒〜２０分、１０秒〜１５分、１０秒〜１０秒、１０秒〜５分、３０秒〜４０分、３０秒〜３０分、３０秒〜２０分、３０秒〜１５分、３０秒〜１０分、３０秒〜５分、１分〜４０分、１分〜３０分、１分〜２０分、１分〜１５分、１分〜１０分、１分〜５分、２分〜４０分、２分〜３０分、２分〜２０分、２分〜１５分、２分〜１０分、２分〜５分、５分〜４０分、５分〜３０分、５分〜２０分、５分〜１５分、または５分〜１０分）の範囲の期間にわたって発生する。いくつかの場合には、増幅は、５分〜１５分の範囲の期間にわたって発生する。いくつかの場合には、増幅は、７分〜１２分の範囲の期間にわたって発生する。
【０２９９】
いくつかの場合には、試料を、ＣａｓＺポリペプチドと接触させるのと同時に増幅成分と接触させる。いくつかのそのような場合には、ＣａｓＺポリペプチドは、接触時に不活性であり、試料中の核酸が増幅されると活性化される。
【０３００】
様々な増幅方法及び成分が当業者に知られ、任意の簡便な方法を使用することができる（例えば、Ｚａｎｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓｐｏｔｏ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１３  Ｍａｒ；３（１）：１８−４３、Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  Ｇｈａｅｍｉ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２００８，２７：２２４−２４３、Ｃｒａｗ  ａｎｄ  Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎａ，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１２，１２，２４６９−２４８６（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。核酸増幅は、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ｑＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ、多重ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ランダムプライマーＰＣＲ、ヘミネステッドＰＣＲ、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）、コロニーＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、デジタルＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、より低い変性温度での同時増幅ＰＣＲ（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、配列間特異的ＰＣＲ（ＩＳＳ−ＰＣＲ）、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、逆ＰＣＲ、及び熱非対称インターレースＰＣＲ（ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）が挙げられる。
【０３０１】
いくつかの場合には、増幅は等温増幅である。「等温増幅」という用語は、単一温度インキュベーションを使用することによってサーマルサイクラーを不要とすることができる、（例えば、酵素連鎖反応を使用する）核酸（例えば、ＤＮＡ）増幅の方法を示す。等温増幅は、増幅反応中の標的核酸の熱変性に依存せず、したがって、温度の複数の急激な変化を必要としなくてもよい、核酸増幅の一形態である。したがって、等温核酸増幅方法は、実験室環境の内部または外部で行うことができる。逆転写ステップと組み合わせることによって、これらの増幅方法を使用してＲＮＡを等温的に増幅することができる。
【０３０２】
等温増幅方法の例としては、ループ型等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存型増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、分岐（ＲＡＭ）、環状ヘリカーゼ依存型増幅（ＣＨＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅（ＳＭＡＲＴ）自家持続配列複製（３ＳＲ）、ゲノムの指数的増幅反応（ＧＥＡＲ）、及び等温複数置換増幅（ＩＭＤＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０３】
いくつかの場合には、増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）である（例えば、米国特許第８，０３０，０００号、同第８，４２６，１３４号、同第８，９４５，８４５号、同第９，３０９，５０２号、及び同第９，６６３，８２０号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、２つの対向するプライマーを使用し（ＰＣＲに非常に類似）、３つの酵素、すなわちリコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、及び鎖置換ポリメラーゼを用いる。リコンビナーゼはオリゴヌクレオチドプライマーを二本鎖ＤＮＡ中の相同配列とペアリングし、ＳＳＢはＤＮＡの置換された鎖に結合して、プライマーが置換されることを阻止し、鎖置換ポリメラーゼは、プライマーが標的ＤＮＡに結合している場所で、ＤＮＡ合成を開始する。ＲＰＡ反応に逆転写酵素を添加して、ｃＤＮＡを産生するための別個のステップを必要とすることなく、ＲＮＡならびにＤＮＡの検出を容易にすることができる。ＲＰＡ反応のための成分の一例は、以下のとおりである（例えば、米国特許第８，０３０，０００号、同第８，４２６，１３４号、同第８，９４５，８４５号、同第９，３０９，５０２号、同第９，６６３，８２０号参照）：５０ｍＭのトリスｐＨ８．４、８０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、５％のＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）、３ｍＭのＡＴＰ、３０ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μｌのクレアチンキナーゼ、４２０ｎｇ／μｌのｇｐ３２、１４０ｎｇ／μｌのＵｖｓＸ、３５ｎｇ／μｌのＵｖｓＹ、２０００ＭのｄＮＴＰ、３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド、３５ｎｇ／μｌのＢｓｕポリメラーゼ、及び核酸含有試料。
【０３０４】
転写媒介増幅（ＴＭＡ）では、ＲＮＡポリメラーゼは、プライマー領域で操作されたプロモーターからＲＮＡを作製するために使用され、次いで、逆転写酵素は、プライマーからｃＤＮＡを合成する。次いで、第３の酵素、例えば、Ｒｎａｓｅ  Ｈを使用して、熱変性のステップなしにｃＤＮＡからＲＮＡ標的を分解することができる。この増幅技術は、自家持続配列複製（３ＳＲ）及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）と同様であるが、使用される酵素は異なる。別の例としては、ヘリカーゼ依存型増幅（ＨＤＡ）は、ｄｓＤＮＡをほどいて一本鎖を作成するために、熱よりもむしろ熱安定性ヘリカーゼ（Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ）を利用し、一本鎖は次いで、ポリメラーゼによるハイブリダイゼーション及びプライマーの伸長のために利用可能である。さらに別の例としては、ループ型増幅（ＬＡＭＰ）は、鎖置換能力を有する熱安定性ポリメラーゼ、及び４つ以上の特異的に設計されたプライマーのセットを用いる。各プライマーは、置換されるとヘアピンにスナップされるヘアピン端部を有するように設計されており、セルフプライミング及びさらなるポリメラーゼ伸長を容易にする。ＬＡＭＰ反応では、等温条件下で反応が進行するが、最初の熱変性ステップが二本鎖標的のために必要とされる。加えて、増幅は、様々な長さの産生物のラダーパターンを生じる。さらに別の例では、鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、制限エンドヌクレアーゼの、その標的ＤＮＡの非修飾鎖に切れ目を入れる能力と、エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼの、切れ目で３’末端を伸長して下流のＤＮＡ鎖を置換する能力とを組み合わせる。
【０３０５】
検出ＤＮＡ
いくつかの場合には、対象の方法は、試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む試料）を、ｉ）ＣａｓＺポリペプチド、ｉｉ）ガイドＲＮＡ、及びｉｉｉ）一本鎖であり、ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡと接触させることを含む。
【０３０６】
好適な一本鎖検出ＤＮＡは、７ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの長さを有する。例えば、好適な一本鎖検出ＤＮＡは、７ヌクレオチド〜１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド〜１５ヌクレオチド、１５ヌクレオチド〜２０ヌクレオチド、または２０ヌクレオチド〜２５ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの場合には、好適な一本鎖検出ＤＮＡは、１０ヌクレオチド〜１５ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの場合には、好適な一本鎖検出ＤＮＡは、１０ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの場合には、好適な一本鎖検出ＤＮＡは、１１ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの場合には、好適な一本鎖検出ＤＮＡは、１２ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの場合には、好適な一本鎖検出ＤＮＡは、１３ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの場合には、好適な一本鎖検出ＤＮＡは、１４ヌクレオチドの長さを有する。いくつかの場合には、好適な一本鎖検出ＤＮＡは、１５ヌクレオチドの長さを有する。
【０３０７】
いくつかの場合には、対象の方法は、ａ）試料を、蛍光発光色素対を含む標識された一本鎖検出ＤＮＡ（検出ｓｓＤＮＡ）、（標的ＤＮＡにハイブリダイズするガイドＲＮＡの文脈においてガイドＲＮＡに結合することによって）活性化された後に標識された検出ｓｓＤＮＡを切断するＣａｓＺポリペプチドと接触させることと、ｂ）蛍光発光色素対によって生成される検出可能なシグナルを測定することとを含む。例えば、いくつかの場合には、対象の方法は、試料を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対、またはクエンチャー／蛍光体対、またはそれら両方を含む、標識された検出ｓｓＤＮＡと接触させることを含む。いくつかの場合には、対象の方法は、試料を、ＦＲＥＴ対を含む標識された検出ｓｓＤＮＡと接触させることを含む。いくつかの場合には、対象の方法は、試料を、蛍光体／クエンチャー対を含む標識された検出ｓｓＤＮＡと接触させることを含む。
【０３０８】
蛍光発光色素対は、ＦＲＥＴ対またはクエンチャー／蛍光体対を含む。ＦＲＥＴ対及びクエンチャー／蛍光体対の両方の場合において、対の一方の色素の発光スペクトルは、対の他方の色素の吸収スペクトルの領域と重複する。本明細書で使用される場合、「蛍光発光色素対」という用語は、「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対」及び「クエンチャー／蛍光体対」（いずれの用語も以下でより詳細に説明される）の両方を包含するために使用される総称である。「蛍光発光色素対」という用語は、「ＦＲＥＴ対及び／またはクエンチャー／蛍光体対」という表現と互換的に使用される。
【０３０９】
いくつかの場合には（例えば、検出ｓｓＤＮＡが、ＦＲＥＴ対を含む場合）、標識された検出ｓｓＤＮＡは、切断される前に、ある量の検出可能なシグナルを生成し、測定される検出可能なシグナルの量は、標識された検出ｓｓＤＮＡが切断される場合、低減される。いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡは、（例えば、ＦＲＥＴ対から）切断される前に第１の検出可能なシグナルを生成し、標識された検出ｓｓＤＮＡが（例えば、クエンチャー／蛍光体対から）切断される場合、第２の検出可能なシグナルを生成する。したがって、いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡは、ＦＲＥＴ対及びクエンチャー／蛍光体対を含む。
【０３１０】
いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡは、ＦＲＥＴ対を含む。ＦＲＥＴは、それによって励起状態のフルオロフォアから極めて近接した第２の発色団へのエネルギーの無放射移動が起こるプロセスである。エネルギー移動が起こり得る範囲は、約１０ナノメートル（１００オングストローム）に限定され、転写の効率は、フルオロフォア間の分離距離に非常に敏感である。したがって、本明細書で使用される場合、「ＦＲＥＴ」（「蛍光共鳴エネルギー移動」、「Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動」としても知られる）という用語は、ドナーの発光スペクトルがアクセプターの発光スペクトルと重複するように選択され、さらに、ドナー及びアクセプターが互いに極めて近接している（通常１０ｎｍ以下）場合、エネルギーの一部が量子結合効果によりドナーからアクセプターへ通過する際に、ドナーの励起がアクセプターの隆起及びアクセプターからの発光を生じさせるように選択された、ドナーフルオロフォア及び一致するアクセプターフルオロフォアが関与する物理現象を指す。したがって、ＦＲＥＴシグナルは、ドナー及びアクセプターの近接ゲージとして機能し、それらが互いに近接している場合にのみ生成されるシグナルである。ＦＲＥＴドナー部分（例えば、ドナーフルオロフォア）及びＦＲＥＴアクセプター部分（例えば、アクセプターフルオロフォア）は、本明細書では集合的に「ＦＲＥＴ対」と称される。
【０３１１】
ドナーアクセプター対（ＦＲＥＴドナー部分及びＦＲＥＴアクセプター部分）は、本明細書では「ＦＲＥＴ対」または「シグナルＦＲＥＴ対」と称される。したがって、いくつかの場合には、対象の標識された検出ｓｓＤＮＡは、２つのシグナルパートナー（シグナル対）を含み、一方のシグナルパートナーがＦＲＥＴドナー部分である場合、他方のシグナルパートナーはＦＲＥＴアクセプター部分である。したがって、そのようなＦＲＥＴ対（ＦＲＥＴドナー部分及びＦＲＥＴアクセプター部分）を含む、対象の標識された検出ｓｓＤＮＡは、シグナルパートナーが極めて近接している場合（例えば、同じＲＮＡ分子上にある間）は、検出可能なシグナル（ＦＲＥＴシグナル）を示すが、パートナーが（例えば、ＣａｓＺポリペプチドによるＲＮＡ分子の切断後に）分離している場合は、シグナルは減少する（または不在となる）。
【０３１２】
ＦＲＥＴドナー及びアクセプター部分（ＦＲＥＴ対）は当業者に知られ、任意の簡便なＦＲＥＴ対（例えば、任意の簡便なドナー及びアクセプター部分対）を使用することができる。好適なＦＲＥＴ対の例としては、表１に提示されるものが挙げられるが、それらに限定されない。また、Ｂａｊａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１６  Ｓｅｐ  １４；１６（９）、及びＡｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１５  Ａｕｇ  ３；１０（８）：ｅ０１３４４３６も参照されたい。
【０３１３】
（表６）ＦＲＥＴ対（ドナー及びアクセプターＦＲＥＴ部分）の例
2021503278.tif 000025
（１）５−（２−ヨードアセチルアミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸
（２）Ｎ−（４−ジメチルアミノ−３，５−ジニトロフェニル）マレイミド
（３）カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル
（４）４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン
【０３１４】
いくつかの場合には、検出可能なシグナルは、標識された検出ｓｓＤＮＡが切断されたときに生成される（例えば、いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡは、クエンチャー／蛍光体対を含む）。シグナルクエンチング対の一方のシグナルパートナーは、検出可能なシグナルを生成し、他方のシグナルパートナーは、第１のシグナルパートナーの検出可能なシグナルをクエンチするクエンチャー部分である（すなわち、クエンチャー部分は、シグナルパートナーが互いに近接している場合に、例えば、シグナル対のシグナルパートナーが極めて近接している場合に、シグナル部分からのシグナルが低減される（クエンチされる）ように、シグナル部分のシグナルをクエンチする）。
【０３１５】
例えば、いくつかの場合には、検出可能なシグナルの量は、標識された検出ｓｓＤＮＡが切断されたときに増加する。例えば、いくつかの場合には、例えば、ＣａｓＺポリペプチドによる切断の前に両方が同一のｓｓＤＮＡ分子上に存在する場合、一方のシグナルパートナー（シグナル部分）によって示されるシグナルは、他方のシグナルパートナー（クエンチャ−シグナル部分）によってクエンチされる。そのようなシグナル対は、本明細書では「クエンチャー／蛍光体対」、「クエンチング対」、または「シグナルクエンチング対」と称される。例えば、いくつかの場合には、一方のシグナルパートナー（例えば、第１のシグナルパートナー）は、第２のシグナルパートナー（例えば、クエンチャー部分）によってクエンチされる検出可能なシグナルを生成するシグナル部分である。したがって、そのようなクエンチャー／蛍光体対のシグナルパートナーは、パートナーが分離された場合（例えば、ＣａｓＺポリペプチドによる検出ｓｓＤＮＡの切断後に）、検出可能なシグナルを生成するが、パートナーが近接している場合（例えば、ＣａｓＺポリペプチドによる検出ｓｓＤＮＡの切断前に）、シグナルはクエンチされる。
【０３１６】
クエンチャー部分は、（例えば、ＣａｓＺポリペプチドによる検出ｓｓＤＮＡの切断前に）シグナル部分からシグナルを様々な程度にクエンチすることができる。いくつかの場合には、クエンチャー部分は、シグナル部分からシグナルをクエンチし、クエンチャー部分の存在下（シグナルパートナーが互いに近接している場合）で検出されたシグナルは、クエンチャー部分の非存在下（シグナルパートナーが分離されている場合）で検出されたシグナルの９５％以下である。例えば、いくつかの場合には、クエンチャー部分の存在下で検出されるシグナルは、クエンチャー部分の非存在下で検出されるシグナルの９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下である。いくつかの場合には、（例えば、バックグラウンドより高い）シグナルは、クエンチャー部分の存在下では検出されない。
【０３１７】
いくつかの場合には、クエンチャー部分の非存在下で（シグナルパートナーが分離されている場合に）検出されるシグナルは、クエンチャー部分の存在下で（シグナルパートナーが互いに近接している場合に）検出されるシグナルより、少なくとも１．２倍大きい（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍大きい）。
【０３１８】
いくつかの場合には、シグナル部分は、蛍光標識である。いくつかのこのような場合では、クエンチャー部分は、蛍光標識からのシグナル（光シグナル）を（例えば、標識の発光スペクトルのエネルギーを吸収することによって）クエンチする。したがって、クエンチャー部分がシグナル部分に近接していない場合、シグナルはクエンチャー部分によって吸収されないため、蛍光標識からの発光（シグナル）は検出可能である。任意の簡便なドナーアクセプター対（シグナル部分／クエンチャー部分対）を使用することができ、多くの好適な対が当該技術分野で知られている。
【０３１９】
いくつかの場合には、クエンチャー部分は、シグナル部分（本明細書では「検出可能な標識」とも称される）からエネルギーを吸収し、次いでシグナル（例えば、異なる波長の光）を発光する。したがって、いくつかの場合には、クエンチャー部分はそれ自体がシグナル部分であり（例えば、シグナル部分は、６−カルボキシフルオレセインであり得、クエンチャー部分は、６−カルボキシ−テトラメチルローダミンであり得る）、いくつかのそのような場合では、対はまた、ＦＲＥＴ対でもあり得る。いくつかの場合には、クエンチャー部分は、ダーククエンチャーである。ダーククエンチャーは、励起エネルギーを吸収し、エネルギーを別の方法で（例えば、熱として）消散することができる。したがって、ダーククエンチャーは、それ自体は最小の蛍光を有するか、または蛍光を有しない（蛍光を発光しない）。ダーククエンチャーの例は、米国特許第８，８２２，６７３号、及び同第８，５８６，７１８号、米国特許出願公開第２０１４０３７８３３０号、同第２０１４０３４９２９５号、及び同第２０１４０１９４６１１号、ならびに国際特許出願第ＷＯ２００１４２５０５号、及び同第ＷＯ２００１８６００１号（これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に含まれる）にさらに記載される。
【０３２０】
蛍光標識の例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＡＴＴＯ色素（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ  、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ色素、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ色素、Ｓｅｔａ色素、ＩＲＩＳ色素、ＳｅＴａｕ色素、ＳＲｆｌｕｏｒ色素、Ｓｑｕａｒｅ色素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、量子ドット、及びテザー蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２１】
いくつかの場合には、検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＡＴＴＯ色素（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ  、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ色素、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ色素、Ｓｅｔａ色素、ＩＲＩＳ色素、ＳｅＴａｕ色素、ＳＲｆｌｕｏｒ色素、Ｓｑｕａｒｅ色素、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ、及びＰａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅから選択される蛍光標識である。
【０３２２】
いくつかの場合には、検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＡＴＴＯ色素（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ  、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ色素、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ色素、Ｓｅｔａ色素、ＩＲＩＳ色素、ＳｅＴａｕ色素、ＳＲｆｌｕｏｒ色素、Ｓｑｕａｒｅ色素、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、量子ドット、及びテザー蛍光タンパク質から選択される蛍光標識である。
【０３２３】
ＡＴＴＯ色素の例としては、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ  、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、及びＡＴＴＯ  ７４０が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２４】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素の例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７９０などが挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２５】
クエンチャー部分の例としては、ダーククエンチャー、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３）、Ｑｘｌクエンチャー、ＡＴＴＯクエンチャー（例えば、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、ＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１、ＱＳＹ色素（例えば、ＱＳＹ  ７、ＱＳＹ  ９、ＱＳＹ  ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、及び金ナノ粒子などの金属クラスター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２６】
いくつかの場合には、クエンチャー部分は、ダーククエンチャー、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３）、Ｑｘｌクエンチャー、ＡＴＴＯクエンチャー（例えば、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、ＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１、ＱＳＹ色素（例えば、ＱＳＹ  ７、ＱＳＹ  ９、ＱＳＹ  ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、及び金属クラスターから選択される。
【０３２７】
ＡＴＴＯクエンチャーの例としては、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑが挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））の例としては、ＢＨＱ−０（４９３ｎｍ）、ＢＨＱ−１（５３４ｎｍ）、ＢＨＱ−２（５７９ｎｍ）、ＢＨＱ−３（６７２ｎｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３２８】
いくつかの検出可能な標識（例えば、蛍光色素）及び／またはクエンチャー部分の例については、例えば、Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．２００９；１１：２５−４７、ならびに米国特許第８，８２２，６７３号、及び同第８，５８６，７１８号、米国特許出願公開第２０１４０３７８３３０号、同第２０１４０３４９２９５号、同第２０１４０１９４６１１号、同第２０１３０３２３８５１号、同第２０１３０２２４８７１号、同第２０１１０２２３６７７号、同第２０１１０１９０４８６号、同第２０１１０１７２４２０号、同第２００６０１７９５８５号、及び同第２００３０００３４８６号、ならびに国際特許出願第ＷＯ２００１４２５０５号、及び同第ＷＯ２００１８６００１号（これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に含まれる）を参照されたい。
【０３２９】
いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡの切断は、比色分析の読み出しを測定することによって検出することができる。例えば、フルオロフォアの遊離（例えば、ＦＲＥＴ対からの遊離、クエンチャー／蛍光体対からの遊離など）は、検出可能なシグナルの波長シフト（及び、したがって色ずれ）をもたらすことができる。したがって、いくつかの場合には、対象の標識された検出ｓｓＤＮＡの切断は、色ずれによって検出することができる。このようなシフトは、ある色（波長）のシグナルの量の損失、別の色の量の増加、ある色の別の色に対する比率の変化、などのように表すことができる。
【０３３０】
標的ＤＮＡを検出するためのキット
本開示は、例えば、複数のＤＮＡを含む試料中の、標的ＤＮＡを検出するためのキットを提供する。いくつかの場合には、キットは、（ａ）標識された検出ｓｓＤＮＡ（例えば、蛍光発光色素対、例えば、ＦＲＥＴ対及び／またはクエンチャー／蛍光体対を含む標識された検出ｓｓＤＮＡ）と、（ｂ）（ｉ）ガイドＲＮＡ、及び／または該ガイドＲＮＡをコードする核酸、ならびにｉｉ）ＣａｓＺポリペプチド、及び／または該ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸のうちの１つ以上と、を含む。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡをコードする核酸は、ユーザによるガイド配列の挿入のための配列挿入部位を含む。
【０３３１】
いくつかの場合には、キットは、（ａ）標識された検出ｓｓＤＮＡ（例えば、蛍光発光色素対、例えば、ＦＲＥＴ対及び／またはクエンチャー／蛍光体対を含む標識された検出ｓｓＤＮＡ）と、（ｂ）（ｉ）ガイドＲＮＡ、及び／または該ガイドＲＮＡをコードする核酸、ｉｉ）ｔｒａｎｃ  ＲＮＡ及び／または該ガイドＲＮＡをコードする核酸、ならびにｉｉｉ）ＣａｓＺポリペプチド、及び／または該ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸のうちの１つ以上と、を含む。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡをコードする核酸は、ユーザによるガイド配列の挿入のための配列挿入部位を含む。
【０３３２】
いくつかの場合には、キットは、（ａ）標識された検出ｓｓＤＮＡ（例えば、蛍光発光色素対、例えば、ＦＲＥＴ対及び／またはクエンチャー／蛍光体対を含む標識された検出ｓｓＤＮＡ）と、（ｂ）（ｉ）ガイドＲＮＡ及びｔｒａｎｃ  ＲＮＡを含む単一分子ＲＮＡ、及び／または単一分子ＲＮＡをコードする核酸、ならびにｉｉｉ）ＣａｓＺポリペプチド、及び／または該ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸のうちの１つ以上と、を含む。いくつかの場合には、単一分子ＲＮＡをコードする核酸は、ユーザによるガイド配列の挿入のための配列挿入部位を含む。
【０３３３】
いくつかの場合には、対象のキットは、（ａ）蛍光発光色素対、例えば、ＦＲＥＴ対及び／もしくはクエンチャー／蛍光体対を含む標識された検出ｓｓＤＮＡと、（ｂ）（ｉ）ガイドＲＮＡ、及び／もしくは該ガイドＲＮＡをコードする核酸、ならびに／またはｉ）ＣａｓＺポリペプチドのうちの１つ以上と、を含む。
【０３３４】
陽性対照
本開示のキット（例えば、標識された検出ｓｓＤＮＡ及びＣａｓＺポリペプチドを含むもの）はまた、陽性対照標的ＤＮＡも含み得る。いくつかの場合には、キットはまた、対照標的ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、陽性対照ガイドＲＮＡも含む。いくつかの場合には、陽性対照標的ＤＮＡは、様々な量で、別個の容器中に提供される。いくつかの場合には、陽性対照標的ＤＮＡは、様々な既知の濃度で、別個の容器中に、対照非標的ＤＮＡとともに提供される。
【０３３５】
核酸
開示のＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ、ｔｒａｎｃ  ＲＮＡ、ガイドＲＮＡ及びｔｒａｎｃ  ＲＮＡを含む単一分子ＲＮＡ）は、任意の簡便な方法（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用する、インビトロの化学合成）を使用して合成することができるが、そのようなＲＮＡをコードする核酸もまた想定される。さらに、本開示のＣａｓＺポリペプチドは、（例えば、キットの一部として）タンパク質の形態で提供することができるが、ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸（ｍＲＮＡ及び／またはＤＮＡなど）もまた提供することができる。
【０３３６】
いくつかの場合には、本開示のキットは、ｉ）ガイドＲＮＡ、及びｉｉ）ｔｒａｎｃ  ＲＮＡを含む、単一分子ＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸（例えば、ＤＮＡ、例えば、組み換え発現ベクター）を含む。いくつかの場合には、ヌクレオチド配列は、ガイド配列を含まない単一分子ＲＮＡのガイドＲＮＡ部分をコードする。例えば、いくつかの場合には、核酸は、ｉ）ガイドＲＮＡ（ガイド配列を含まないガイドＲＮＡ）の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ガイド配列及びｉｉ）ｔｒａｎｃ  ＲＮＡをコードする核酸の挿入部位を含む。
【０３３７】
例えば、いくつかの場合には、本開示のキットは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸（例えば、ＤＮＡ、例えば、組み換え発現ベクター）を含む。いくつかの場合には、ヌクレオチド配列は、ガイド配列を含まないガイドＲＮＡをコードする。例えば、いくつかの場合には、核酸は、ガイドＲＮＡ（ガイド配列を含まないガイドＲＮＡ）の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ガイド配列をコードする核酸の挿入部位を含む。いくつかの場合には、本開示のキットは、ＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、例えば、組み換え発現ベクター）を含む。
【０３３８】
いくつかの場合には、ガイドＲＮＡコード化ヌクレオチド配列は、プロモーター、例えば、原核細胞で機能するプロモーター、真核細胞で機能するプロモーター、哺乳動物細胞で機能するプロモーター、ヒト細胞で機能するプロモーターなどと動作可能に連結している。いくつかの場合には、ＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、プロモーター、例えば、原核細胞で機能するプロモーター、真核細胞で機能するプロモーター、哺乳動物細胞で機能するプロモーター、ヒト細胞で機能するプロモーター、細胞型特異的プロモーター、調節可能プロモーター、組織特異的プロモーターなどと動作可能に連結している。
【０３３９】
有用性
ＣａｓＺ組成物（例えば、発現ベクター、キット、組成物、核酸、など）は、様々な方法における使用を見出す。例えば、本開示のＣａｓＺ組成物を使用して、（ｉ）標的核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ（一本鎖または二本鎖））を修飾する（例えば、切断、例えば、ニック、メチル化等）、（ｉｉ）標的核酸の転写を調節する、（ｉｉｉ）標的核酸を標識する、（ｉｖ）標的核酸と（例えば、単離、標識化、撮像、追跡等の目的で）結合する、（ｖ）標的核酸と会合したポリペプチド（例えば、ヒストン）を修飾することができる。したがって、本開示は、標的核酸を修飾する方法を提供する。いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸をａ）本開示のＣａｓＺポリペプチド、及びｂ）１つ以上（例えば、２つ）のＣａｓＺガイドＲＮＡと接触させることを含む。いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸をａ）ＣａｓＺポリペプチド、ｂ）１つ以上（例えば、２つ）のＣａｓＺガイドＲＮＡ、及びｃ）ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡと接触させることを含む。いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸をａ）本開示のＣａｓＺポリペプチド、ｂ）ＣａｓＺガイドＲＮＡ、及びｃ）ドナー核酸（例えば、ドナー鋳型）と接触させることを含む。いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸をａ）ＣａｓＺポリペプチド、ｂ）ＣａｓＺガイドＲＮＡ、ｃ）ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ、及びｄ）ドナー核酸（例えば、ドナー鋳型）と接触させることを含む。いくつかの場合には、接触ステップは、インビトロ細胞で実行される。場合によっては、接触ステップは、インビボ細胞で実行される。いくつかの場合には、接触ステップは、エクスビボ細胞で実行される。
【０３４０】
ＣａｓＺポリペプチドを使用する方法は、ＣａｓＺポリペプチドを標的核酸中の特定領域に（会合したＣａｓＺガイドＲＮＡによってそこで標的されることによって）結合することを含むため、これらの方法は、一般に本明細書では、結合方法（例えば、標的核酸の結合方法）として言及される。しかしながら、いくつかの場合には、結合方法は、標的核酸の結合以外は何ももたらさない場合があるが、他の場合では、この方法は、異なる最終結果を有し得る（例えば、この方法は、標的核酸の修飾、例えば、切断／メチル化等；標的核酸からの転写の調節；標的核酸の翻訳の調節；ゲノム編集；標的核酸に会合したタンパク質の調節；標的核酸の単離等をもたらし得る）ことを理解されたい。
【０３４１】
（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９システムを用いて使用される）好適な方法の例としては、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１２  Ａｕｇ  １７；３３７（６０９６）：８１６−２１、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，ＲＮＡ  Ｂｉｏｌ．２０１３  Ｍａｙ；１０（５）：７２６−３７、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｉｎｔ．２０１３；２０１３：２７０８０５、Ｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３  Ｓｅｐ  ２４；１１０（３９）：１５６４４−９、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｌｉｆｅ．２０１３；２：ｅ００４７１、Ｐａｔｔａｎａｙａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｓｅｐ；３１（９）：８３９−４３、Ｑｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｆｅｂ  ２８；１５２（５）：１１７３−８３、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｍａｙ  ９；１５３（４）：９１０−８、Ａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｏｃｔ  ３１、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１９、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｏｃｔ；２３（１０）：１１６３−７１、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１３  Ｎｏｖ；１９５（３）：１１７７−８０、ＤｉＣａｒｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ａｐｒ；４１（７）：４３３６−４３、Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１０（１０）：１０２８−３４、Ｅｂｉｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ  Ｒｅｐ．２０１３；３：２５１０、Ｆｕｊｉｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１８７、Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ；２３（１１）：１３２２−５、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０１３  Ｎｏｖ  １；４１（２０）：ｅ１８８、Ｌａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  Ｎｏｖ；８（１１）：２１８０−９６、Ｍａｌｉ  ｅｔ．ａｔ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１３  Ｏｃｔ；１０（１０）：９５７−６３、Ｎａｋａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓｉｓ．２０１３  Ｄｅｃ；５１（１２）：８３５−４３、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２０１３  Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｓｅｐ  １２；１５４（６）：１３８０−９、Ｕｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇ３（Ｂｅｔｈｅｓｄａ）．２０１３  Ｄｅｃ  ９；３（１２）：２２３３−８、Ｗａｌｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３  Ｓｅｐ  ２４；１１０（３９）：１５５１４−５、Ｘｉｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｐｌａｎｔ．２０１３  Ｏｃｔ  ９、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ．２０１３  Ｓｅｐ  １２；１５４（６）：１３７０−９、ならびに米国特許及び特許出願第８，９０６，６１６号、第８，８９５，３０８号、第８，８８９，４１８号、第８，８８９，３５６号、第８，８７１，４４５号、第８，８６５，４０６号、第８，７９５，９６５��、第８，７７１，９４５号、第８，６９７，３５９号、第２０１４００６８７９７号、第２０１４０１７０７５３号、第２０１４０１７９００６号、第２０１４０１７９７７０号、第２０１４０１８６８４３号、第２０１４０１８６９１９号、第２０１４０１８６９５８号、第２０１４０１８９８９６号、第２０１４０２２７７８７号、第２０１４０２３４９７２号、第２０１４０２４２６６４号、第２０１４０２４２６９９号、第２０１４０２４２７００号、第２０１４０２４２７０２号、第２０１４０２４８７０２号、第２０１４０２５６０４６号、第２０１４０２７３０３７号、第２０１４０２７３２２６号、第２０１４０２７３２３０号、第２０１４０２７３２３１号、第２０１４０２７３２３２号、第２０１４０２７３２３３号、第２０１４０２７３２３４号、第２０１４０２７３２３５号、第２０１４０２８７９３８号、第２０１４０２９５５５６号、第２０１４０２９５５５７号、第２０１４０２９８５４７号、第２０１４０３０４８５３号、第２０１４０３０９４８７号、第２０１４０３１０８２８号、第２０１４０３１０８３０号、第２０１４０３１５９８５号、第２０１４０３３５０６３号、第２０１４０３３５６２０号、第２０１４０３４２４５６号、第２０１４０３４２４５７号、第２０１４０３４２４５８号、第２０１４０３４９４００号、第２０１４０３４９４０５号、第２０１４０３５６８６７号、第２０１４０３５６９５６号、第２０１４０３５６９５８号、第２０１４０３５６９５９号、第２０１４０３５７５２３号、第２０１４０３５７５３０号、第２０１４０３６４３３３号、及び第２０１４０３７７８６８号（これらの各々は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
【０３４２】
例えば、本開示は、標的核酸を切断する方法、標的核酸を編集する方法、標的核酸からの転写を調節する方法、標的核酸を単離する方法、標的核酸と結合する方法、標的核酸を撮像する方法、標的核酸を修飾する方法等を提供する（ただし、これらに限定されない）。
【０３４３】
本明細書で使用される場合、「標的核酸を接触させる」、及び、例えば、ＣａｓＺポリペプチドと、またはＣａｓＺ融合ポリペプチド等と「標的核酸を接触させる」という用語／表現は、標的核酸を接触させるための全ての方法を包含する。例えば、ＣａｓＺポリペプチドは、タンパク質、（ＣａｓＺポリペプチドをコードする）ＲＮＡ、または（ＣａｓＺポリペプチドをコードする）ＤＮＡとして細胞に提供され得るが、ＣａｓＺガイドＲＮＡは、ガイドＲＮＡとして、またはガイドＲＮＡをコードする核酸として提供され得、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡは、ｔｒａｎｃＲＮＡとして、またはｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸として提供され得る。したがって、例えば、細胞中（例えば、インビトロで細胞の内側、インビボで細胞の内側、エクスビボで細胞の内側）で方法を行う場合、標的核酸を接触させることを含む方法は、活性／最終状態にある（例えば、ＣａｓＺポリペプチドのタンパク質（複数可）の形態の、ＣａｓＺ融合ポリペプチドのタンパク質の形態の、いくつかの場合にはガイドＲＮＡのＲＮＡの形態の）任意のまたは全ての成分の、細胞への導入を包含し、また、１つ以上の成分をコードする１つ以上の核酸（例えば、ＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸（複数可）、ガイドＲＮＡ（複数可）をコードするヌクレオチド配列（複数可）を含む核酸（複数可）、ドナー鋳型をコードするヌクレオチド配列を含む核酸等）の、細胞への導入を包含する。これらの方法はまた、細胞の外側で、インビトロで行うこともできるため、標的核酸を接触させることを含む方法は、（別途特定されない限り）インビトロで細胞の外側、インビトロで細胞の内側、インビボで細胞の内側、エクスビボで細胞の内側等で接触させることを包含する。
【０３４４】
いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的細胞にＣａｓＺ遺伝子座、例えば、ＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、ならびにＣａｓＺ遺伝子座を含む細胞からのＣａｓＺコード化ヌクレオチド配列を取り囲む約１キロベース（ｋｂ）〜５ｋｂの長さのヌクレオチド配列を含む核酸を導入することを含み（例えば、いくつかの場合には、その自然状態（それが天然に発生する状態）にある細胞はＣａｓＺ遺伝子座を含む）、標的細胞は、通常（その自然状態で）ＣａｓＺ遺伝子座（例えば、いくつかの場合には、遺伝子座はＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡを含む）を含まない。しかしながら、コードされたｃｒＲＮＡ（複数可）のためのガイド配列をコードする１つ以上のスペーサー配列は、１つの以上の関心対象の標的配列が標的化されるように修飾され得る。したがって、例えば、いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的細胞にＣａｓＺ遺伝子座、例えば、供給源細胞から得られた核酸を導入することを含み（例えば、いくつかの場合には、その自然状態（それが天然に発生する状態）にある細胞はＣａｓＺ遺伝子座を含む）、核酸は、１００ヌクレオチド（ｎｔ）〜５ｋｂの長さ（例えば、１００ｎｔ〜５００ｎｔ、５００ｎｔ〜１ｋｂ、１ｋｂ〜１．５ｋｂ、１．５ｋｂ〜２ｋｂ、２ｋｂ〜２．５ｋｂ、２．５ｋｂ〜３ｋｂ、３ｋｂ〜３．５ｋｂ、３．５ｋｂ〜４ｋｂ、または４ｋｂ〜５ｋｂの長さ）を有し、ＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。上述したように、いくつかのそのような場合には、コードされたｃｒＲＮＡ（複数可）のためのガイド配列をコードする１つ以上のスペーサー配列は、１つの以上の関心対象の標的配列が標的化されるように修飾され得る。いくつかの場合には、方法は、標的細胞にｉ）ＣａｓＺ遺伝子座、及びｉｉ）ドナーＤＮＡ鋳型を導入することを含む。いくつかの場合には、標的核酸は、インビトロで細胞を含まない組成物中である。いくつかの場合には、標的核酸は、標的細胞中に存在する。いくつかの場合には、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、原核細胞である。いくつかの場合には、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、真核細胞である。いくつかの場合には、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの場合には、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、植物細胞である。
【０３４５】
いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸を本開示のＣａｓＺポリペプチドと、または本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチドと接触させることを含む。いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸をＣａｓＺポリペプチド及びＣａｓＺガイドＲＮＡと接触させることを含む。いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸をＣａｓＺポリペプチド、ＣａｓＺガイドＲＮＡ、及びＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡと接触させることを含む。いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸をＣａｓＺポリペプチド、第１のＣａｓＺガイドＲＮＡ、及び第２のＣａｓＺガイドＲＮＡ（ならびにいくつかの場合にはＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ）と接触させることを含む。いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸を本開示のＣａｓＺポリペプチド、ＣａｓＺガイドＲＮＡ、及びドナーＤＮＡ鋳型と接触させることを含む。いくつかの場合には、標的核酸を修飾するための本開示の方法は、標的核酸を本開示のＣａｓＺポリペプチド、ＣａｓＺガイドＲＮＡ、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ、及びドナーＤＮＡ鋳型と接触させることを含む。
【０３４６】
いくつかの場合には、標的核酸は、インビトロで細胞を含まない組成物中である。いくつかの場合には、標的核酸は、標的細胞中に存在する。いくつかの場合には、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、原核細胞である。いくつかの場合には、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、真核細胞である。いくつかの場合には、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、哺乳動物細胞である。いくつかの場合には、標的核酸は、標的細胞中に存在し、標的細胞は、植物細胞である。
【０３４７】
標的核酸及び関心対象の標的細胞
標的核酸は、任意の核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ）であり得、二本鎖または一本鎖であり得、任意の種類の核酸（例えば、染色体（ゲノムＤＮＡ）、染色体由来、染色体ＤＮＡ、プラスミド、ウイルス、細胞外、細胞内、ミトコンドリア、葉緑体、線状、環状等）であり得、任意の生物に由来し得る（例えば、ＣａｓＺガイドＲＮＡが、標的核酸中の標的配列にハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む限り、標的核酸は標的化され得る）。
【０３４８】
標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。標的核酸は、二本鎖（例えば、ｄｓＤＮＡ、ｄｓＲＮＡ）または一本鎖（例えば、ｓｓＲＮＡ、ｓｓＤＮＡ）であり得る。いくつかの場合には、標的核酸は、一本鎖である。いくつかの場合には、標的核酸は、一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）である。いくつかの場合には、標的ｓｓＲＮＡ（例えば、標的細胞ｓｓＲＮＡ、ウイルスｓｓＲＮＡ等）は、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｔＲＮＡ、非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）、長い非コードＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、及びマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）から選択される。いくつかの場合には、標的核酸は、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（例えば、ウイルスＤＮＡ）である。上述したように、いくつかの場合には、標的核酸は、一本鎖である。
【０３４９】
標的核酸は、任意の場所、例えば、インビトロで細胞の外側、インビトロで細胞の内側、インビボで細胞の内側、エクスビボで細胞の内側に位置し得る。好適な標的細胞（ゲノムＤＮＡなどの標的核酸を含み得る）としては、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．ａｇａｒｄｈ等、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞（例えば、ショウジョウバエ、蠕虫、棘皮動物、線形動物等）、昆虫の細胞（例えば、蚊、ミツバチ、農業害虫等）、クモ類動物の細胞（例えば、クモ、ダニ等）、脊椎動物由来の細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）、哺乳動物由来の細胞（例えば、齧歯類由来の細胞、ヒト由来の細胞、非ヒト哺乳動物の細胞、齧歯類の細胞（例えば、マウス、ラット）、ウサギ類の細胞（例えば、ウサギ）、有蹄類の細胞（例えば、ウシ、ウマ、ラクダ、ラマ、ビクーニャ、ヒツジ、ヤギ等）、海洋哺乳動物の細胞（例えば、クジラ、アザラシ、ゾウアザラシ、イルカ、アシカ等）等が挙げられるが、これらに限定されない。任意の種類の細胞が関心対象であり得る（例えば、幹細胞、例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞等）、成体細胞、体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞、任意の段階にある胚のインビトロまたはインビボの胚細胞、例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞等の段階のゼブラフィッシュ胚等）。
【０３５０】
細胞は、確立された細胞株に由来し得るか、またはそれらは一次細胞であってもよく、「一次細胞」、「一次細胞株」、及び「一次培養物」は、本明細書では、対象に由来し、インビトロで培養物の限定数の継代、すなわち分裂にわたって増殖させた細胞及び細胞培養物を指すために互換的に使用される。例えば、一次培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されているが、危機段階を通過するには十分でない場合がある培養物である。典型的には、一次細胞株は、インビトロで１０継代未満にわたって維持される。標的細胞は、単細胞生物であり得、及び／または培養物中で増殖し得る。細胞が一次細胞である場合、それらは任意の簡便な方法によって個体から採取され得る。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離等によって簡便に採取され得る一方、例えば、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃等の組織由来の細胞は、生検によって簡便に採取することができる。
【０３５１】
上記適用のうちのいくつかにおいて、対象の方法を用いて、標的核酸切断、標的核酸修飾を誘導する、及び／または有糸分裂もしくは有糸分裂後の細胞中の標的核酸と（例えば、可視化のために、収集及び／または分析等のために）、インビボで及び／またはエクスビボで及び／またはインビトロで結合する（例えば、標的化ｍＲＮＡによってコードされたタンパク質の産生を妨害する、標的ＤＮＡを切断するかまたは他の方法で修飾する、標的細胞を遺伝子修飾する等）ことができる。ガイドＲＮＡは、標的核酸にハイブリダイズすることによって特異性を提供するため、開示される方法における関心対象の有糸分裂及び／または有糸分裂後の細胞は、任意の生物由来の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．ａｇａｒｄｈ等、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞（例えば、ショウジョウバエ、蠕虫、棘皮動物、線形動物等）、脊椎動物由来の細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）、哺乳動物由来の細胞、齧歯類由来の細胞、ヒト由来の細胞等）を含み得る。いくつかの場合には、対象のＣａｓＺタンパク質（ならびに／またはＤＮＡ及び／もしくはＲＮＡなどのタンパク質をコードする核酸）ならびに／またはＣａｓＺガイドＲＮＡ（及び／またはガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ）、ならびに／またはドナー鋳型、及び／またはＲＮＰは、個体（例えば、哺乳動物、ラット、マウス、ブタ、霊長類、非ヒト霊長類、ヒト等）に導入され得る（すなわち、標的細胞がインビボであり得る）。いくつかの場合には、そのような投与は、例えば、標的化細胞のゲノムを編集することによって、疾患を治療する及び／または予防する目的のためであり得る。
【０３５２】
植物細胞には、単子葉植物の細胞、及び双子葉植物の細胞が含まれる。細胞は、根細胞、葉細胞、木部の細胞、師部の細胞、形成層の細胞、頂端分裂組織細胞、実質細胞、厚角組織細胞、厚壁組織細胞等であり得る。植物細胞としては、農業作物、例えば小麦、トウモロコシ、米、モロコシ、キビ、大豆等の細胞が挙げられる。植物細胞としては、農業果物及びナッツ植物、例えば、アプリコット、オレンジ、レモン、リンゴ、プラム、ナシ、アーモンド等を産生する植物の細胞が挙げられる。
【０３５３】
標的細胞の追加の例は、「修飾細胞」と題された上記の項に列挙される。細胞（標的細胞）の非限定な例としては、原核細胞、真菌細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生生物細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果物、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種、トマト、米、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、カンナビス、タバコ、顕花植物、球果植物、裸子植物、被子植物、シダ類、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類コケ植物、苔類、双子葉植物、単子葉植物等由来の細胞等）、藻類細胞（例えば、Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ、Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ、Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ、Ｃ．ａｇａｒｄｈ等）、海藻類（例えば、昆布）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、マッシュルーム由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、蠕虫、棘皮動物、線形動物等）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例えば、有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、ネコ科動物（例えば、ネコ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）等）由来の細胞等が挙げられる。いくつかの場合には、細胞は、天然の生物に由来しない細胞である（例えば、細胞は、合成的に作製された細胞であり得、人工細胞とも称される）。
【０３５４】
細胞は、インビトロ細胞（例えば、確立された培養細胞株）であり得る。細胞は、エクスビボ細胞（個体由来の培養細胞）であり得る。細胞は、インビボ細胞（例えば、個体内の細胞）であり得る。細胞は、単離された細胞であり得る。細胞は、生物の内部の細胞であり得る。細胞は、生物であり得る。細胞は、細胞培養内の細胞（例えば、インビトロ細胞培養）であり得る。細胞は、細胞の集団のうちの１つであり得る。細胞は、原核細胞であり得るか、または原核細胞に由来し得る。細胞は、細菌細胞であり得るか、または細菌細胞に由来し得る。細胞は、古細菌細胞であり得るか、または古細菌細胞に由来し得る。細胞は、真核細胞であり得るか、または真核細胞に由来し得る。細胞は、植物細胞であり得るか、または植物細胞に由来し得る。細胞は、動物細胞であり得るか、または動物細胞に由来し得る。細胞は、無脊椎動物細胞であり得るか、または無脊椎動物細胞に由来し得る。細胞は、脊椎動物細胞であり得るか、または脊椎動物に由来し得る。細胞は、哺乳動物細胞であり得るか、または哺乳動物細胞に由来し得る。細胞は、齧歯類細胞であり得るか、または齧歯類細胞に由来し得る。細胞は、ヒト細胞であり得るか、またはヒト細胞に由来し得る。細胞は、微生物細胞であり得るか、または微生物細胞に由来し得る。細胞は、真菌細胞であり得るか、または真菌細胞に由来し得る。細胞は、昆虫細胞であり得る。細胞は、節足動物細胞であり得る。細胞は、原生動物細胞である得る。細胞は、蠕虫細胞であり得る。
【０３５５】
好適な細胞としては、幹細胞（例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞等）、体細胞、例えば、線維芽細胞、オリゴデンドロサイト、グリア細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞等が挙げられる。
【０３５６】
好適な細胞としては、ヒト胚幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植拡張心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液肝細胞、筋芽細胞、成体肝細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来の前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、及び出生後幹細胞が挙げられる。
【０３５７】
いくつかの場合には、細胞は、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、及び内皮細胞、または幹細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、天然キラー細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。いくつかの場合には、免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
【０３５８】
いくつかの場合には、細胞は、幹細胞である。幹細胞は、成体幹細胞を含む。成体幹細胞はまた、体幹細胞とも称される。
【０３５９】
成体幹細胞は、分化組織中に存在するが、自己更新の特性及び複数の細胞型、通常は幹細胞が見出される組織に典型的な細胞型を生じる能力を保持する。体幹細胞の多くの例が当業者に既知であり、筋幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、哺乳動物幹細胞、腸幹細胞、中胚葉性幹細胞、内皮幹細胞、嗅覚幹細胞、神経堤幹細胞等が挙げられる。
【０３６０】
関心対象の幹細胞としては、哺乳動物幹細胞が挙げられ、「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、研究室、競技用、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。いくつかの場合には、幹細胞は、ヒト幹細胞である。いくつかの場合には、幹細胞は、齧歯類（例えば、マウス、ラット）幹細胞である。いくつかの場合には、幹細胞は、非ヒト霊長類幹細胞である。
【０３６１】
幹細胞は、１つ以上の幹細胞マーカー、例えば、ＳＯＸ９、ＫＲＴ１９、ＫＲＴ７、ＬＧＲ５、ＣＡ９、ＦＸＹＤ２、ＣＤＨ６、ＣＬＤＮ１８、ＴＳＰＡＮ８、ＢＰＩＦＢ１、ＯＬＦＭ４、ＣＤＨ１７、及びＰＰＡＲＧＣ１Ａを発現し得る。
【０３６２】
いくつかの場合には、幹細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）である。ＨＳＣは、骨髄、血液、臍帯血、胎児肝臓、及び卵黄嚢から単離され得る中胚葉由来の細胞である。ＨＳＣは、ＣＤ３４＋及びＣＤ３−として特徴付けられる。ＨＳＣは、赤血球、好中球−マクロファージ、巨核球、及びリンパ球様造血細胞系統にインビボで再生させることができる。インビトロで、ＨＳＣは、少なくともいくらかの自己更新細胞分裂を受けるように誘導され得、インビボで見られるものと同じ系統に分化するように誘導され得る。したがって、ＨＳＣは、赤血球細胞、巨核球、好中球、マクロファージ、及びリンパ球細胞のうちの１つ以上に分化するように誘導され得る。
【０３６３】
他の場合では、幹細胞は、神経幹細胞（ＮＳＣ）である。神経幹細胞（ＮＳＣ）は、ニューロン及びグリア（オリゴデンドロサイト及び星状細胞を含む）に分化することができる。神経幹細胞は、多分裂の能力を有する多能性幹細胞であり、特定の条件下で、神経幹細胞である娘細胞、または神経芽細胞もしくは神経膠芽細胞であり得る神経前駆細胞、例えば、それぞれ１種以上のニューロン及びグリア細胞になるように決定される細胞を産生することができる。ＮＳＣを得る方法は、当該技術分野において既知である。
【０３６４】
他の場合では、幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）である。本来、胚性中胚葉に由来し、成体骨髄から単離されるＭＳＣは、分化して、筋肉、骨、軟骨、脂肪、骨髄基質、及び腱を形成することができる。ＭＳＣを単離する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の既知の方法を使用して、ＭＳＣを得ることができる。例えば、ヒトＭＳＣの単離について記載している米国特許第５，７３６，３９６号を参照されたい。
【０３６５】
細胞は、いくつかの場合には、植物細胞である。植物細胞は、単子葉植物の細胞であり得る。細胞は、双子葉植物の細胞であり得る。
【０３６６】
いくつかの場合には、細胞は、植物細胞である。例えば、細胞は、主要な農業植物、例えば、大麦、豆（乾燥食用）、キャノーラ、トウモロコシ、綿（ピマ）、綿（アプランド）、アマニ、乾草（アルファルファ）、乾草（非アルファルファ）、オーツ麦、ピーナッツ、米、モロコシ、大豆、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ（油）、ヒマワリ（非油）、サツマイモ、タバコ（バーレー）、タバコ（黄色種）、トマト、小麦（ダラム）、小麦（春）、小麦（冬）等の細胞であり得る。別の例としては、細胞は、例えば、アルファルファスプラウト、アロエの葉、クズウコン、オモダカ、アーティチョーク、アスパラガス、筍、バナナの花、豆もやし、豆、ビーツの葉茎、ビーツ、ゴーヤ、チンゲンサイ、ブロッコリー、ブロッコリーレイブ（ラピーニ）、芽キャベツ、キャベツ、キャベツスプラウト、カクタスリーフ（ノパル）、カボチャ、カルドン、ニンジン、カリフラワー、セロリ、ハヤトウリ、チョロギ（クローヌ）、ハクサイ、キンサイ、ニラ、サイシン、シュンギク（ｔｕｎｇ  ｈｏ）、カラードグリーン、トウモロコシの茎、スイートコーン、キュウリ、ダイコン、食用タンポポの葉、タロイモ、豆苗（エンドウの葉）、トウキ（冬瓜）、ナス、エンダイブ、キクヂシャ、ゼンマイ、グンバイナズナ、フリゼ、カラシナ（チャイニーズマスタード）、カイラン、ガランガル（サイアム、タイショウガ）、ニンニク、ショウガ、ゴボウ、グリーン、ハノーバーサラダグリーン、ウアウソントレ、エルサレムアーティチョーク、ヒカマ、ケールグリーン、コールラビ、アカザ（クェライト）、レタス（ビッブ）、レタス（ボストン）、レタス（ボストンレッド）、レタス（グリーンリーフ）、レタス（アイスバーグ）、レタス（サニーレタス）、レタス（オークリーフ・グリーン）、レタス（オークリーフ・レッド）、レタス（加工）、レタス（レッドリーフ）、レタス（ロメイン）、レタス（ルビーロメイン）、レタス（ロシアンレッドマスタード）、ｌｉｎｋｏｋ、ロボック、ササゲ、レンコン、マーシュ、マゲイ（アガベ）リーフ、ヤムイモ、メスクランミックス、水菜、ｍｏａｐ（ヘチマ）、ｍｏｏ、モクア（ファジースクオッシュ）、マッシュルーム、マスタード、長芋、オクラ、空芯菜、ネギ、ｏｐｏ（ロングスクオッシュ）、装飾トウモロコシ、装飾ヒョウタン、パセリ、パースニップ、エンドウ、トウガラシ（ベルタイプ）、トウガラシ、カボチャ、ラディッキオ、ラディッシュの芽、ラディッシュ、レイプグリーン、レイプグリーン、ルバーブ、ロメイン（ベビーレッド）、ルタバガ、アッケシソウ（シービーン）、ヘチマ（トカド／トカドヘチマ）、ホウレンソウ、スクオッシュ、ストローベイル、サトウキビ、サツマイモ、スイスチャード、タマリンド、タロ、タロの葉、タロの芽、ターサイ、ｔｅｐｅｇｕａｊｅ（ギンネム）、ティンドラ、トマティーヨ、トマト、トマト（チェリー）、トマト（グレープタイプ）、トマト（プラムタイプ）、ターメリック、カブの葉、カブ、ヒシの実、ｙａｍｐｉ、ヤム（ｎａｍｅｓ）、アブラナ、ユカ（キャッサバ）等を含むが、これらに限定されない野菜作物の細胞である。
【０３６７】
細胞は、いくつかの場合には、節足動物細胞である。例えば、細胞は、例えば、Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ、Ｍｙｒｉａｐｏｄｉａ、Ｈｅｘｉｐｏｄｉａ、Ａｒａｃｈｎｉｄａ、Ｉｎｓｅｃｔａ、Ａｒｃｈａｅｏｇｎａｔｈａ、Ｔｈｙｓａｎｕｒａ、Ｐａｌａｅｏｐｔｅｒａ、Ｅｐｈｅｍｅｒｏｐｔｅｒａ、Ｏｄｏｎａｔａ、Ａｎｉｓｏｐｔｅｒａ、Ｚｙｇｏｐｔｅｒａ、Ｎｅｏｐｔｅｒａ、Ｅｘｏｐｔｅｒｙｇｏｔａ、Ｐｌｅｃｏｐｔｅｒａ、Ｅｍｂｉｏｐｔｅｒａ、Ｏｒｔｈｏｐｔｅｒａ、Ｚｏｒａｐｔｅｒａ、Ｄｅｒｍａｐｔｅｒａ、Ｄｉｃｔｙｏｐｔｅｒａ、Ｎｏｔｏｐｔｅｒａ、Ｇｒｙｌｌｏｂｌａｔｔｉｄａｅ、Ｍａｎｔｏｐｈａｓｍａｔｉｄａｅ、Ｐｈａｓｍａｔｏｄｅａ、Ｂｌａｔｔａｒｉａ、Ｉｓｏｐｔｅｒａ、Ｍａｎｔｏｄｅａ、Ｐａｒａｐｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ、Ｐｓｏｃｏｐｔｅｒａ、Ｔｈｙｓａｎｏｐｔｅｒａ、Ｐｈｔｈｉｒａｐｔｅｒａ、Ｈｅｍｉｐｔｅｒａ、ＥｎｄｏｐｔｅｒｙｇｏｔａもしくはＨｏｌｏｍｅｔａｂｏｌａ、Ｈｙｍｅｎｏｐｔｅｒａ、Ｃｏｌｅｏｐｔｅｒａ、Ｓｔｒｅｐｓｉｐｔｅｒａ、Ｒａｐｈｉｄｉｏｐｔｅｒａ、Ｍｅｇａｌｏｐｔｅｒａ、Ｎｅｕｒｏｐｔｅｒａ、Ｍｅｃｏｐｔｅｒａ、Ｓｉｐｈｏｎａｐｔｅｒａ、Ｄｉｐｔｅｒａ、Ｔｒｉｃｈｏｐｔｅｒａ、またはＬｅｐｉｄｏｐｔｅｒａの亜目、科、亜科、群、下位群、または種の細胞であり得る。
【０３６８】
細胞は、いくつかの場合には、昆虫動物細胞である。例えば、いくつかの場合には、細胞は、蚊、バッタ、半翅類、ハエ、ノミ、ミツバチ、スズメバチ、アリ、シラミ、蛾、またはカブトムシの細胞である。
【０３６９】
ドナーポリヌクレオチド（ドナー鋳型）
ＣａｓＺガイドＲＮＡによって誘導されると、いくつかの場合には、ＣａｓＺタンパク質は、（例えば、ＣａｓＺタンパク質がニッカーゼバリアントであるとき）二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）標的核酸内で部位特異的二本鎖破断（ＤＳＢ）または一本鎖破断（ＳＳＢ）を生成し、これらは非相同末端接合（ＮＨＥＪ）または相同性配向型組み換え（ＨＤＲ）のいずれかによって修復される。
【０３７０】
いくつかの場合には、標的ＤＮＡを（ＣａｓＺタンパク質及びＣａｓＺガイドＲＮＡと）接触させることは、非相同性末端接合または相同性配向型修復を許容する条件下で起こる。したがって、いくつかの場合には、対象の方法は、標的ＤＮＡをドナーポリヌクレオチドと（例えば、ドナーポリヌクレオチドを細胞に導入することによって）接触させることを含み、ここでドナーポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチドの部分、ドナーポリヌクレオチドの複製、またはドナーポリヌクレオチドの複製の一部が標的ＤＮＡに統合される。いくつかの場合には、方法は、細胞をドナーポリヌクレオチドと接触させることを含まず、標的ＤＮＡは、標的ＤＮＡ内のヌクレオチドが欠失されるように修飾される。
【０３７１】
いくつかの場合には、ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ（またはそれをコードする核酸）、ＣａｓＺガイドＲＮＡ（またはそれをコードする核酸）、及び／またはＣａｓＺタンパク質（またはそれをコードする核酸、例えば、ＲＮＡまたはＤＮＡ、例えば、１つ以上の発現ベクター）が、少なくとも標的ＤＮＡ配列に対して相同性を有するセグメントを含むドナーポリヌクレオチド配列と同時投与され（例えば、標的核酸と接触される、細胞に投与される等）、対象の方法を使用して、核酸材料を標的ＤＮＡ配列に付加する、すなわち、挿入または置換すること（例えば、核酸、例えば、タンパク質、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等をコードするものに「ノックイン」すること）、タグ（例えば、６ｘＨｉｓ、蛍光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質等）、ヘマグルチニン（ＨＡ）、ＦＬＡＧ等）を付加すること、調節配列を遺伝子に付加すること（例えば、プロモーター、ポリアデニル化シグナル、内部リボソームエントリー配列（ＩＲＥＳ）、２Ａペプチド、開始コドン、停止コドン、スプライスシグナル、局在シグナル等）、核酸配列を修飾すること（例えば、変異を導入する、正しい配列を導入することによって変異を引き起こす疾患を除去する）等ができる。したがって、ＣａｓＺガイドＲＮＡ及びＣａｓＺタンパク質（またはＣａｓＺガイドＲＮＡ及びＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ及びＣａｓＺタンパク質）を含む複合体は、任意のインビトロまたはインビボ用途において有用であり、部位特異的、すなわち「標的化」方法、例えば、遺伝子療法において、例えば疾患を治療するため、または抗ウイルス、抗病原性、または抗がん治療として使用される遺伝子ノックアウト、遺伝子ノックイン、遺伝子編集、遺伝子タグ付け等、農業における遺伝子修飾された生物の産生、治療、診断、または研究を目的とした細胞によるタンパク質の大規模産生、ｉＰＳ細胞の誘導、生物学的研究、欠失または置換のための病原体の遺伝子の標的等でＤＮＡを修飾することが望ましい。
【０３７２】
ポリヌクレオチド配列を、標的配列が切断されるゲノムに挿入することが望ましい用途において、ドナーポリヌクレオチド（ドナー配列を含む核酸）もまた細胞に提供され得る。「ドナー配列」または「ドナーポリヌクレオチド」または「ドナー鋳型」とは、ＣａｓＺタンパク質によって切断された部位において（ｄｓＤＮＡ切断後、標的ＤＮＡをニッキングした後、標的ＤＮＡを二重ニッキングした後等に）挿入される核酸配列を意味する。ドナーポリヌクレオチドは、標的部位におけるゲノム配列に対して十分な相同性、例えば、標的部位に隣接するヌクレオチド配列（例えば、標的部位の約５０以下の塩基内、例えば、約３０塩基内、約１５塩基内、約１０塩基内、約５塩基内、または標的部位にすぐ隣接する）との７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または１００％の相同性を含み、それと相同性を担持するゲノム配列との間の相同性配向型修復を支持することができる。およそ２５、５０、１００、もしくは２００ヌクレオチド、または２００超のヌクレオチドの、ドナーとゲノム配列との間の配列相同性（または１０〜２００ヌクレオチドの任意の整数値、もしくはそれ以上）は、相同性配向型修復を支持することができる。ドナーポリヌクレオチドは、任意の長さ、例えば、１０ヌクレオチド以上、５０ヌクレオチド以上、１００ヌクレオチド以上、２５０ヌクレオチド以上、５００ヌクレオチド以上、１０００ヌクレオチド以上、５０００ヌクレオチド以上等であり得る。
【０３７３】
ドナー配列は、典型的に、それが置換されるゲノム配列と同一ではない。むしろ、ドナー配列は、相同性配向型修復を支持するのに（例えば、遺伝子補正のため、例えば、疾患を引き起こす塩基対を、疾患を引き起こさない塩基対に変換するために）十分な相同性が存在する限り、ゲノム配列に関して少なくとも１つ以上の単一塩基変更、挿入、欠失、反転、または再配置を含み得る。いくつかの実施形態では、ドナー配列は、相同性の２つの領域に隣接した非相同性配列を含み、それにより標的ＤＮＡ領域と２つの隣接する配列との間の相同性配向型修復が、標的領域における非相同性配列の挿入をもたらす。ドナー配列はまた、関心対象のＤＮＡ領域に対して相同性でなく、関心対象のＤＮＡ領域への挿入が意図されないベクター骨格を含有する配列も含み得る。一般に、ドナー配列の相同性領域（複数可）は、組み換えが所望されるゲノム配列に対して少なくとも５０％の配列同一性を有するであろう。ある特定の実施形態では、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、または９９．９％の配列同一性が存在する。ドナーポリヌクレオチドの長さに応じて、１％〜１００％の配列同一性の任意の値が存在し得る。
【０３７４】
ドナー配列は、ゲノム配列と比較して、ある特定の配列の相違、例えば、制限部位、ヌクレオチド多形、選択可能なマーカー（例えば、薬物耐性遺伝子、蛍光タンパク質、酵素等）を含み得、これらを使用して、切断部位におけるドナー配列の良好な挿入について評価することができるか、またはいくつかの場合には、他の目的で使用することができる（例えば、標的化ゲノム遺伝子座における発現を示す）。いくつかの場合には、コード領域に位置する場合、そのようなヌクレオチド配列の相違は、アミノ酸配列を変更しないか、またはサイレントアミノ酸変化（すなわち、タンパク質の構造または機能に影響しない変化）をもたらす。あるいは、これらの配列の相違は、マーカー配列の除去のために後に活性化され得る、隣接する組み換え配列、例えば、ＦＬＰ、ｌｏｘＰ配列等を含み得る。
【０３７５】
いくつかの場合には、ドナー配列は、一本鎖ＤＮＡとして細胞に提供される。いくつかの場合には、ドナー配列は、二本鎖ＤＮＡとして細胞に提供される。これは、線状または環状形態で細胞に導入され得る。線状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、任意の簡便な方法によって（例えば、エキソヌクレアーゼ分解から）保護され得、そのような方法は、当業者に既知である。例えば、１つ以上のジデオキシヌクレオチド残基が、線状分子の３′末端に付加され得、かつ／または自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方の末端もしくは両方の末端にライゲーションされ得る。例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：４９５９−４９６３、Ｎｅｈｌｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：８８６−８８９を参照されたい。外因性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法は、末端アミノ基（複数可）の付加、及び修飾ヌクレオチド間結合、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミド酸、及びＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基の使用を含むが、これらに限定されない。線状ドナー配列の末端を保護することの代替法として、追加の長さの配列が、組み換えに影響を及ぼすことなく分解され得る相同性の領域の外側に含められ得る。ドナー配列は、例えば、複製起点、プロモーター、及び抗生物質耐性をコードする遺伝子などの追加の配列を有するベクター分子の一部として細胞に導入され得る。さらに、ドナー配列は、裸の核酸として、リポソームもしくはポロキサマーなどの薬剤と複合された核酸として導入され得るか、またはＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／またはＣａｓＺ融合ポリペプチド及び／またはドナーポリヌクレオチドをコードする核酸について本明細書の別の場所で記載されるように、ウイルス（例えば、アデノウイルス、ＡＡＶ）によって送達され得る。
【０３７６】
トランスジェニック非ヒト生物
上記のように、いくつかの場合には、本開示の核酸（例えば、組み換え発現ベクター）（例えば、ＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、ＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸等）を導入遺伝子として使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドを産生するトランスジェニック非ヒト生物を生成する。本開示は、本開示のＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック非ヒト生物を提供する。
【０３７７】
トランスジェニック非ヒト動物
本開示は、トランスジェニック非ヒト動物を提供し、この動物は、ＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物のゲノムは、本開示のＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、トランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子修飾のためにホモ接合性である。いくつかの場合には、トランスジェニック非ヒト動物は、遺伝子修飾のためにヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック非ヒト動物は、脊椎動物、例えば、魚類（例えば、サケ、マス、ゼブラフィッシュ、金魚、フグ、洞窟魚等）、両生類（カエル、イモリ、サンショウウオ等）、鳥類（例えば、ニワトリ、七面鳥等）、爬虫類（例えば、ヘビ、トカゲ等）、非ヒト哺乳動物（例えば、有蹄類、例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ等、ウサギ類（例えば、ウサギ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、非ヒト霊長類等）等である。いくつかの場合には、トランスジェニック非ヒト動物は、無脊椎動物である。いくつかの場合には、トランスジェニック非ヒト動物は、昆虫（例えば、蚊、農業害虫等）である。いくつかの場合には、トランスジェニック非ヒト動物は、クモ類である。
【０３７８】
本開示のＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、未知のプロモーターの制御下にあり得るか（すなわち動作可能に連結される）（例えば、核酸が宿主細胞ゲノムにランダムに統合される場合）、または既知のプロモーターの制御下にあり得る（すなわち、動作可能に連結される）。好適な既知のプロモーターは、任意の既知のプロモーターであり、構成的に活性なプロモーター（例えば、ＣＭＶプロモーター）、誘導性プロモーター（例えば、ヒートショックプロモーター、テトラサイクリン調節型プロモーター、ステロイド調節型プロモーター、金属調節型プロモーター、エストロゲン受容体調節型プロモーター等）、空間的制約及び／または時間的制約のあるプロモーター（例えば、組織特異的プロモーター、細胞型特異的プロモーター等）等を含み得る。
【０３７９】
トランスジェニック植物
上記のように、いくつかの場合には、本開示の核酸（例えば、組み換え発現ベクター）（例えば、本開示のＣａｓＺポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸、本開示のＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸等）を導入遺伝子として使用して、本開示のＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドを産生するトランスジェニック植物を生成する。本開示は、本開示のＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドコードするヌクレオチド配列を含むトランスジェニック植物を提供する。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物のゲノムは、対象の核酸を含む。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、遺伝子修飾のためにホモ接合性である。いくつかの実施形態では、トランスジェニック植物は、遺伝子修飾のためにヘテロ接合性である。
【０３８０】
外因性核酸を植物細胞に導入する方法は、当該技術分野において周知である。そのような植物細胞は、上記に定義されるように「形質転換された」と見なされる。好適な方法としては、ウイルス感染（二本鎖ＤＮＡウイルスなど）、形質移入、コンジュゲート、プロトプラスト融合、電気穿孔、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈降、直接マイクロインジェクション、炭化ケイ素ウィスカー技術、アグロバクテリウム媒介型形質転換等が挙げられる。方法の選択は、一般に、形質転換される細胞の種類、及び形質転換が起こる状況（すなわち、インビトロ、エクスビボ、またはインビボ）に依存する。
【０３８１】
土壌細菌のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに基づく形質転換方法は、外因性核酸分子を維管束植物に導入するために特に有用である。野生型形態のＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍは、宿主植物上で増殖する腫瘍原性クラウンゴールの産生を配向するＴｉ（腫瘍誘導）プラスミドを含有する。Ｔｉプラスミドの腫瘍誘導Ｔ−ＤＮＡ領域の、植物ゲノムへの移行は、Ｔｉプラスミドでコードされた病原性遺伝子ならびにＴ−ＤＮＡ境界を必要とし、これらは移行される領域を描写する直接ＤＮＡ反復の組である。Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ系ベクターは、修飾形態のＴｉプラスミドであり、そこでは、腫瘍誘導機能が植物宿主に導入される関心対象の核酸配列によって置換されている。
【０３８２】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ媒介型形質転換は、一般に、融合体ベクターまたはバイナリベクター系を用い、そこでは、Ｔｉプラスミドの成分が、Ｔ−ＤＮＡ配列によって、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ宿主に永久に存在し、病原性遺伝子を担持するヘルパーベクターと、限定された関心対象の遺伝子を含むシャトルベクターとに分けられる。様々なバイナリベクターが、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。例えば、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを、培養された植物細胞または葉組織などの傷ついた組織、根片、胚軸、塊茎の幹片と共培養する方法もまた、当該技術分野において周知である。例えば、Ｇｌｉｃｋ  ａｎｄ  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，（ｅｄｓ．），Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，Ｆｌａ．：ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（１９９３）を参照されたい。
【０３８３】
マイクロプロジェクタイル媒介型形質転換を使用して、対象のトランスジェニック植物を産生することもできる。Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  ３２７：７０−７３（１９８７））によって最初に記載されたこの方法は、塩化カルシウム、スペルミジン、またはポリエチレングリコールでの沈降によって所望の核酸分子でコーティングされた金またはタングステンなどのマイクロプロジェクタイルに依存する。マイクロプロジェクタイル粒子は、ＢＩＯＬＩＳＴＩＣ  ＰＤ−１０００（Ｂｉｏｒａｄ、Ｈｅｒｃｕｌｅｓ  Ｃａｌｉｆ．）などのデバイスを使用して、被子植物組織中に高速で加速される。
【０３８４】
本開示の核酸（例えば、本開示のＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む核酸（例えば、組み換え発現ベクター））は、核酸が、例えば、インビボまたはエクスビボプロトコルを介して植物細胞（複数可）に侵入することができるような方法で植物に導入され得る。「インビボ」とは、核酸が植物の生体に投与されること、例えば、浸潤を意味する。「エクスビボ」とは、細胞または外植片が、植物の外側で改変され、次いでそのような細胞または器官が、植物に再生されることを意味する。植物細胞の安定した形質転換またはトランスジェニック植物の確立に適した複数のベクターが記載されており、Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ  ａｎｄ  Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，（１９８９）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、及びＧｅｌｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｋｌｕｗｅｒ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓに記載されるものが挙げられる。特定の例には、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドに由来するもの、ならびにＨｅｒｒｅｒａ−Ｅｓｔｒｅｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎａｔｕｒｅ  ３０３：２０９、Ｂｅｖａｎ（１９８４）Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１２：８７１１−８７２１、Ｋｌｅｅ（１９８５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ  ３：６３７−６４２によって開示されるものが挙げられる。あるいは、非Ｔｉベクターを使用して、遊離ＤＮＡ送達技法を使用することによって、ＤＮＡを植物及び細胞に移行させることができる。これらの方法を使用することによって、小麦、米（Ｃｈｒｉｓｔｏｕ（１９９１）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：９５７−９及び４４６２）ならびにトウモロコシ（Ｇｏｒｄｏｎ−Ｋａｍｍ（１９９０）Ｐｌａｎｔ  Ｃｅｌｌ  ２：６０３−６１８）などのトランスジェニック植物を産生することができる。未熟な胚もまた、粒子ガンを使用することによる直接ＤＮＡ送達技法のため（Ｗｅｅｋｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０２：１０７７−１０８４；Ｖａｓｉｌ（１９９３）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ  １０：６６７−６７４、Ｗａｎ  ａｎｄ  Ｌｅｍｅａｕｘ（１９９４）Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １０４：３７−４８、及びアグロバクテリウム媒介型ＤＮＡ移行のため（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  １４：７４５−７５０）の単子葉植物の良好な標的組織であり得る。ＤＮＡを葉緑体に導入するための例示的な方法は、微粒子銃ボンバードメント、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、及びマイクロインジェクションである（Ｄａｎｉｅｌｉ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １６：３４５−３４８，１９９８、Ｓｔａｕｂ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １８：３３３−３３８，２０００、Ｏ′Ｎｅｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．３：７２９−７３８，１９９３、Ｋｎｏｂｌａｕｃｈ  ｅｔ  ａｌ  Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １７：９０６−９０９、米国特許第５，４５１，５１３号、同第５，５４５，８１７号、同第５，５４５，８１８号、及び同第５，５７６，１９８号、国際出願第ＷＯ９５／１６７８３号、ならびにＢｏｙｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  ２１７：５１０−５３６（１９９３）、Ｓｖａｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：９１３−９１７（１９９３）、及びＭｃＢｒｉｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９１：７３０１−７３０５（１９９４））。微粒子銃ボンバードメント、プロトプラストのポリエチレングリコール形質転換、及びマイクロインジェクションの方法に適した任意のベクターは、葉緑体形質転換のための標的ベクターとして好適である。任意の二本鎖ＤＮＡベクターは、特に導入の方法がＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍを利用しないときに、形質転換ベクターとして使用され得る。
【０３８５】
遺伝子修飾することができる植物は、穀物、飼料作物、果物、野菜、油料種子作物、ヤシ、森林、及びつる植物が含まれる。修飾され得る植物の特定例としては、以下：トウモロコシ、バナナ、ピーナッツ、エンドウマメ、ヒマワリ、トマト、キャノーラ、タバコ、小麦、バーレー、オーツ麦、ジャガイモ、大豆、綿、カーネーション、ソルガム、ハウチワマメ、及び米が挙げられる。
【０３８６】
本開示は、形質転換された植物細胞、組織、植物、及び形質転換された植物細胞を含有する産生物を提供する。対象の形質転換細胞、及び組織、ならびにそれらを含む産生物の特徴は、ゲノムに統合された対象の核酸の存在、及び植物細胞による本開示のＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドの産生である。本発明の組み換え植物細胞は、組み換え細胞の集合として、または組織、種子、全植物、幹、果実、葉、根、花、幹、塊茎、穀物、動物飼料、植物の分野等において有用である。
【０３８７】
本開示のＣａｓＺポリペプチドまたはＣａｓＺ融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、未知のプロモーターの制御下にあり得るか（すなわち動作可能に連結される）（例えば、核酸が宿主細胞ゲノムにランダムに統合されるとき）、または既知のプロモーターの制御下にあり得る（すなわち、動作可能に連結される）。好適な既知のプロモーターは、任意の既知のプロモーターであり得、構成的に活性なプロモーター、誘導性プロモーター、空間的制約及び／または時間的制約のあるプロモーターなどが挙げられる。
【０３８８】
本開示の非限定的な態様の例
上記に記載される本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様もしくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。上記の記載を制限することなく、１〜３６の番号が付けられた本開示のある特定の非限定的な態様が以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個別に番号が付けられた態様の各々は、先行するまたは後続の個別に番号が付けられた態様のうちのいずれかとともに使用され得るか、または組み合わされ得る。これは、態様の全てのそのような組み合わせに対する支持を提供することが意図され、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに制限されない。
【０３８９】
態様
態様１．ＣａｓＺポリペプチドを標的核酸の標的配列に誘導する方法であって、前記標的核酸を、（ａ）ＣａｓＺポリペプチドと、（ｂ）標的核酸の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、かつ前記ＣａｓＺポリペプチドに結合する領域を含む、ＣａｓＺガイドＲＮＡと、を含む、操作された及び／または非天然型の複合体と接触させることを含む、前記方法。
【０３９０】
態様２．前記標的核酸の修飾、前記標的核酸からの転写の調節、または標的核酸に関連するポリペプチドの修飾をもたらす、態様１に記載の方法。
【０３９１】
態様３．前記標的核酸が、切断されることによって修飾される、態様２に記載の方法。
【０３９２】
態様４．前記標的核酸が、二本鎖ＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、ＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、及び染色体外ＤＮＡから選択される、態様１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【０３９３】
態様５．前記ガイド配列、及び前記ＣａｓＺポリペプチドに結合する前記領域が、互いに異種である、態様１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【０３９４】
態様６．前記接触が、ゲノム編集をもたらす、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３９５】
態様７．前記接触が、細菌細胞の外部、及び古細菌細胞の外部で起きる、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３９６】
態様８．前記接触が、インビトロにおいて細胞の外部で起きる、態様１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０３９７】
態様９．前記接触が、標的細胞の内部で起きる、態様１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０３９８】
態様１０．前記接触が、（ａ）前記ＣａｓＺポリペプチド、または前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸、及び（ｂ）前記ＣａｓＺガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸、のうちの少なくとも１つを前記標的細胞に導入することを含む、態様９に記載の方法。
【０３９９】
態様１１．前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする前記核酸が、前記標的細胞における発現のためにコドン最適化された非天然型配列である、態様１０に記載の方法。
【０４００】
態様１２．前記標的細胞が、真核細胞である、態様９〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【０４０１】
態様１３．前記標的細胞が、インビトロで培養されている、態様９〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０４０２】
態様１４．前記標的細胞が、インビボである、態様９〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０４０３】
態様１５．前記標的細胞が、エクスビボである、態様９〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０４０４】
態様１６．前記真核細胞が、植物細胞、真菌細胞、単細胞真核生物、哺乳動物細胞、爬虫類細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、寄生虫細胞、節足動物細胞、無脊椎動物の細胞、脊椎動物の細胞、齧歯類細胞、マウス細胞、ラット細胞、霊長類細胞、非ヒト霊長類細胞、及びヒト細胞からなる群から選択される、態様１２に記載の方法。
【０４０５】
態様１７．前記接触が、ＤＮＡドナー鋳型を標的細胞に導入することをさらに含む、態様９〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【０４０６】
態様１８．前記標的核酸をＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）と接触させることを含む、態様１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【０４０７】
態様１９．前記接触が、ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）及び／または前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸を前記標的細胞に導入することを含む、態様９〜１７のいずれか１つに記載の方法。
【０４０８】
態様２０．前記ｔｒａｎｃＲＮＡが、表２のｔｒａｎｃＲＮＡ配列と７０％以上（少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のヌクレオチド配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む、態様１８または態様１９に記載の方法。
【０４０９】
態様２１．組成物であって、（ａ）ＣａｓＺポリペプチド、または前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸と、（ｂ）標的核酸の標的配列に対して相補的なガイド配列を含みかつ前記ＣａｓＺポリペプチドに結合することができる領域を含む、ＣａｓＺガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸と、を含む、操作された及び／または非天然型の複合体を含む、組成物。
【０４１０】
態様２２．ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、態様２１に記載の組成物。
【０４１１】
態様２３．キットであって、（ａ）ＣａｓＺポリペプチド、または前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸と、（ｂ）標的核酸の標的配列に対して相補的なガイド配列を含みかつ前記ＣａｓＺポリペプチドに結合することができる領域を含む、ＣａｓＺガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸と、を含む、操作された及び／または非天然型の複合体を含む、前記キット。
【０４１２】
態様２４．ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸をさらに含む、態様２３に記載のキット。
【０４１３】
態様２５．遺伝子修飾された真核細胞であって、（ａ）ＣａｓＺポリペプチド、または前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする核酸、（ｂ）標的核酸の標的配列に対して相補的なガイド配列を含みかつ前記ＣａｓＺポリペプチドに結合することができる領域を含む、ＣａｓＺガイドＲＮＡ、または前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする核酸、及び（ｃ）ＣａｓＺトランス活性化非コードＲＮＡ（ｔｒａｎｃＲＮＡ）、または前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする核酸、のうちの少なくとも１つを含む、前記真核細胞。
【０４１４】
態様２６．（ａ）前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする前記核酸が、（ｉ）前記ＣａｓＺポリペプチドをコードしかつ（ｉｉ）異種プロモーターと動作可能に連結しているヌクレオチド配列を含むこと、（ｂ）前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする前記核酸が、（ｉ）前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードしかつ（ｉｉ）異種プロモーターと動作可能に連結しているヌクレオチド配列を含むこと、及び（ｃ）前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする前記核酸が、（ｉ）前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードしかつ（ｉｉ）異種プロモーターと動作可能に連結しているヌクレオチド配列を含むこと、のうちの少なくとも１つを特徴とする、先行する態様のいずれか１つに記載の組成物、キット、または真核細胞。
【０４１５】
態様２７．患者の治療処置の方法における使用のための、先行する態様のいずれか１つに記載の組成物、キット、または真核細胞。
【０４１６】
態様２８．前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする前記核酸、前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする前記核酸、及び前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする前記核酸のうちの少なくとも１つが、組み換え発現ベクターである、先行する態様のいずれか１つに記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【０４１７】
態様２９．前記ＣａｓＺガイドＲＮＡ及び／または前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡが、修飾核酸塩基、修飾骨格または非天然ヌクレオシド間結合、修飾糖部分、ロックド核酸、ペプチド核酸、及びデオキシリボヌクレオチドのうちの１つ以上を含む、先行する態様のいずれか１つに記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【０４１８】
態様３０．前記ＣａｓＺポリペプチドが、対応する野生型ＣａｓＺタンパク質と比較して減少したヌクレアーゼ活性を有するバリアントＣａｓＺポリペプチドである、先行する態様のいずれか１つに記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【０４１９】
態様３１．前記ＣａｓＺポリペプチド、前記ＣａｓＺポリペプチドをコードする前記核酸、前記ＣａｓＺガイドＲＮＡ、前記ＣａｓＺガイドＲＮＡをコードする前記核酸、前記ＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡ、及びＣａｓＺ  ｔｒａｎｃＲＮＡをコードする前記核酸、のうちの少なくとも１つが、異種部分とコンジュゲートする、先行する態様のいずれか１つに記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【０４２０】
態様３２．前記異種部分が、異種ポリペプチドである、態様３１に記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【０４２１】
態様３３．前記ＣａｓＺポリペプチドが、対応する野生型ＣａｓＺタンパク質と比較して減少したヌクレアーゼ活性を有し、異種ポリペプチドと融合する、先行する態様のいずれか１つに記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【０４２２】
態様３４．前記異種ポリペプチドが、（ｉ）ＤＮＡ修飾活性を有し、（ｉｉ）転写を増加もしくは減少させる能力を示し、及び／または（ｉｉｉ）ＤＮＡに関連するポリペプチドを修飾する酵素活性を有する、態様３３に記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【０４２３】
態様３５．前記ＣａｓＺポリペプチドが、図１または図７のＣａｓＺタンパク質と７０％以上（少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％）のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、先行する態様のいずれか１つに記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【０４２４】
態様３６．前記ガイド配列、及び前記ＣａｓＺポリペプチドに結合する前記領域が、互いに異種である、先行する態様のいずれか１つに記載の方法、組成物、キット、または真核細胞。
【０４２５】
態様３７．試料中の標的ＤＮＡを検出する方法であって、（ａ）試料を、（ｉ）ＣａｓＺポリペプチド、（ｉｉ）前記ＣａｓＺポリペプチドに結合する領域、及び前記標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列、を含む、ガイドＲＮＡ、ならびに（ｉｉｉ）一本鎖であり、かつガイド前記ＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡと、接触させることと、（ｂ）前記ＣａｓＺによる前記一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することにより、前記標的ＤＮＡを検出することと、を含む、方法。
【０４２６】
態様３８．前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、態様３７に記載の方法。
【０４２７】
態様３９．前記標的ＤＮＡが、二本鎖である、態様３７または３８に記載の方法。
【０４２８】
態様４０．前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、態様３７〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【０４２９】
態様４１．前記標的ＤＮＡが、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはパルボウイルスＤＮＡである、態様３７〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【０４３０】
態様４２．前記ＣａｓＺポリペプチドが、図１及び７のいずれか一方に記載のＣａｓＺアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様３７〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【０４３１】
態様４３．前記ＣａｓＺポリペプチドが、Ｃａｓ１４ａポリペプチドである、態様３７〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【０４３２】
態様４４．前記試料が、細胞溶解物からのＤＮＡ分子を含む、態様３７〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０４３３】
態様４５．前記試料が、細胞を含む、態様３７〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【０４３４】
態様４６．前記接触が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて細胞の内部で行われる、態様３７〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０４３５】
態様４７．前記細胞が、真核細胞である、態様４６に記載の方法。
【０４３６】
態様４８．前記標的ＤＮＡが、１０ａＭ程度の低さの濃度で検出され得る、態様３７〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０４３７】
態様４９．前記試料中に存在する前記標的ＤＮＡの量を決定することを含む、態様３７〜４８のいずれか１つに記載の方法。
【０４３８】
態様５０．前記決定が、前記検出可能なシグナルを測定して試験測定値を生成することと、参照試料または細胞によって生成される検出可能なシグナルを測定して、参照測定値を生成することと、前記試験測定値を前記参照測定値と比較して、試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することと、を含む、態様４９に記載の方法。
【０４３９】
態様５１．検出可能なシグナルの測定が、金ナノ粒子ベースの検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学検出、及び半導体ベースの感知のうちの１つ以上を含む、態様３７〜５０のいずれか１つに記載の方法。
【０４４０】
態様５２．前記一本鎖検出ＤＮＡが、蛍光発光色素対を含む、態様３７〜５１のいずれか１つに記載の方法。
【０４４１】
態様５３．前記蛍光発光色素対が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断前に、ある量の検出可能なシグナルを生成し、前記検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に減少する、態様５２に記載の方法。
【０４４２】
態様５４．前記一本鎖検出ＤＮＡが、切断される前に第１の検出可能なシグナルを生成し、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に第２の検出可能なシグナルを産生する、態様５２に記載の方法。
【０４４３】
態様５５．前記蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、態様５２〜５４のいずれか１つに記載の方法。
【０４４４】
態様５６．検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に増加する、態様１８に記載の方法。
【０４４５】
態様５７．前記蛍光発光色素対が、クエンチャー／蛍光体対である、態様５２または態様５６に記載の方法。
【０４４６】
態様５８．前記一本鎖検出ＤＮＡが、２つ以上の蛍光発光色素対を含む、態様５２〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０４４７】
態様５９．前記２つ以上の蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対及びクエンチャー／蛍光体対を含む、態様５８に記載の方法。
【０４４８】
態様６０．前記一本鎖検出ＤＮＡが、修飾核酸塩基、修飾糖部分、及び／または修飾核酸結合を含む、態様３７〜５９のいずれか１つに記載の方法。
【０４４９】
態様６１．前記試料中の核酸を増幅することを含む、態様３７〜６０のいずれか１つに記載の方法。
【０４５０】
態様６２．前記増幅が、等温増幅を含む、態様６１に記載の方法。
【０４５１】
態様６３．前記等温増幅が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を含む、態様６２に記載の方法。
【０４５２】
態様６４．前記増幅が、ステップ（ａ）の前記接触の前に開始する、態様６１〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０４５３】
態様６５．前記増幅が、ステップ（ａ）の前記接触と同時に開始する、態様６１〜６３のいずれか１つに記載の方法。
【０４５４】
態様６６．試料中の標的ＤＮＡを検出するためのキットであって、（ａ）ＣａｓＺポリペプチドに結合する領域と標的ＤＮＡに対して相補的なガイド配列とを含む、ガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、及び（ｂ）一本鎖であり、かつ前記ガイドＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない、標識された検出ＤＮＡを含む、前記キット。
【０４５５】
態様６７．ＣａｓＺポリペプチドをさらに含む、態様６６に記載のキット。
【０４５６】
態様６８．前記ＣａｓＺポリペプチドが、図１及び７のいずれか一方に記載のＣａｓＺアミノ酸配列に対して少なくとも８５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、態様６７に記載のキット。
【０４５７】
態様６９．前記ＣａｓＺポリペプチドが、Ｃａｓ１４ａポリペプチドである、態様６７に記載のキット。
【０４５８】
態様７０．前記一本鎖検出ＤＮＡが、蛍光発光色素対を含む、態様６６〜６９のいずれか１つに記載のキット。
【０４５９】
態様７１．前記蛍光発光色素対が、ＦＲＥＴ対である、態様７０に記載のキット。
【０４６０】
態様７２．前記蛍光発光色素対が、クエンチャー／蛍光体対である、態様７０に記載のキット。
【０４６１】
態様７３．前記一本鎖検出ＤＮＡが、２つ以上の蛍光発光色素対を含む、態様７０〜７２のいずれか１つに記載のキット。
【０４６２】
態様７４．前記２つ以上の蛍光発光色素対が、第１の検出可能なシグナルを生成する第１の蛍光発光色素対、及び第２の検出可能なシグナルを生成する第２の蛍光発光色素対を含む、態様７３に記載のキット。
【０４６３】
態様７５．核酸増幅成分をさらに含む、態様６６〜７４のいずれか１つに記載のキット。
【０４６４】
態様７６．前記核酸増幅成分が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）のための成分である、態様７５に記載のキット。
【０４６５】
態様７７．一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を切断する方法であって、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む、核酸の集団を、（ｉ）ＣａｓＺポリペプチド、ならびに（ｉｉ）前記ＣａｓＺポリペプチドに結合する領域、及び前記標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列、を含む、ガイドＲＮＡと、接触させることを含み、前記ＣａｓＺポリペプチドが、前記複数の非標的ｓｓＤＮＡを切断する、方法。
【０４６６】
態様７８．前記接触が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボにおいて細胞の内部で行われる、態様７７に記載の方法。
【０４６７】
態様７９．前記細胞が、真核細胞である、態様７８に記載の方法。
【０４６８】
態様８０．前記真核細胞が、植物細胞である、態様７９に記載の方法。
【０４６９】
態様８１．前記非標的ｓｓＤＮＡが、前記細胞にとって異種である、態様７８〜８０のいずれか１つに記載の方法。
【０４７０】
態様８２．前記非標的ｓｓＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、態様８１に記載の方法。
【０４７１】
態様８３．前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、態様７７〜８２のいずれか１つに記載の方法。
【０４７２】
態様８４．前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、態様７７〜８２のいずれか１つに記載の方法。
【０４７３】
態様８５．前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、態様７７〜８４のいずれか１つに記載の方法。
【０４７４】
態様８６．前記標的ＤＮＡが、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはパルボウイルスＤＮＡである、態様７７〜８４のいずれか１つに記載の方法。
【実施例】
【０４７５】
以下の実施例は、当業者に本発明の作成方法及び使用方法の完全な開示及び記載を提供するために提示するものであり、本発明者らが考える発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が実施した全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧であるか、またはそれに近い。標準的な略語、例えば、ｂｐは塩基対（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｐｌはピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃは秒（複数可）、ｍｉｎは分（複数可）、ｈまたはｈｒは時間（複数可）、ａａはアミノ酸（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｂｐは塩基対（複数可）、ｎｔはヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍ．は筋肉内の（に）、ｉ．ｐ．は腹腔内の（に）、ｓ．ｃは皮下の（に）等が使用され得る。
【０４７６】
材料及び方法
以下の材料及び方法は、特記する場合を除いて、一般に、本明細書に記載される実施例において提示される結果に適用される。
【０４７７】
メタゲノミクス及びメタトランスクリプトミクス
最初の分析を、２つの場所：Ｃｏｌｏｒａｄｏ州Ｒｉｆｌｅ近郊のＣｏｌｏｒａｄｏ  Ｒｉｖｅｒに隣接するＲｉｆｌｅ  Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  Ｆｉｅｌｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＩＦＲＣ）用地、及びＵｔａｈ州のＣｏｌｏｒａｄｏ  Ｐｌａｔｅａｕにある冷たいＣＯ２間欠泉であるＣｒｙｓｔａｌ  Ｇｅｙｓｅｒからの、以前に組み立てられてビニングされたメタゲノムにおいて実施した。ＩＦＲＣ用地からのメタトランスクリプトームのデータを使用して、天然の非コード要素の転写を検出した。次いで、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４システムのさらなる発掘を、ＩＭＧ／Ｍからの公開メタゲノムにおいて実施した。
【０４７８】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ計算解析
様々な試料からの組み立てられたコンティグを、Ｈｉｄｄｅｎ  Ｍａｒｋｏｖ  Ｍｏｄｅｌ（ＨＭＭ）プロファイルを使用した既知のＣａｓタンパク質のＨＭＭｅｒスイートを用いてスキャンした。追加のＨＭＭを、８００ａａ未満を含有し、獲得ｃａｓ遺伝子及びＣＲＩＳＰＲアレイに隣接した推定上のＶ型エフェクターのＭＡＦＦＴアラインメントに基づいて、Ｃａｓ１４タンパク質のために構築した。これらのＨＭＭを、既存のＣａｓ１４  ＨＭＭモデルを使用して発見された、手作業で選択された新規の推定上のＣａｓ１４配列を用いてそれらを増強することによって反復的に精製した。Ｃａｓ１４反復配列の配列を、表３に提供する。ＣＲＩＳＰＲアレイを、ＣｒｉｓｐｒＦｉｎｄｅｒソフトウェア及びＣＲＩＳＰＲＤｅｔｅｃｔのローカルバージョンを使用して特定した。Ｃａｓ１及びＶ型エフェクタータンパク質の系統樹を、置換モデル及び１００のブートストラップ試料採取としてＰＲＯＴＧＡＭＭＡＬＧを用いるＲＡｘＭＬを使用して構築した。系統樹を、ＦｉｇＴｒｅｅ  １．４．１（ｈｔｔｐ：／／ｔｒｅｅ．ｂｉｏ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｉｇｔｒｅｅ／）を使用して可視化した。メタトランスクリプトームの読み取りを、組み立てられたコンティグにＢｏｗｔｉｅ２を使用してマッピングした。ＲＮａｓｅ存在分析は、ＫＥＧＧデータベースからダウンロードされたＫＥＧＧオーソロガス群（ＫＯ）のアラインメントから構築されたＨＭＭに基づいた。
【０４７９】
（表３）本明細書で使用される全てのＣａｓ１４タンパク質（例えば、図７参照）の反復配列（Ｃａｓ１４ガイドＲＮＡの非ガイド配列部分）を、表３に示す。
2021503278.tif 000026
2021503278.tif 000027
2021503278.tif 000028
【０４８０】
発現プラスミド、ＲＮＡ及びＤＮＡ基質の生成
推定上のシステムのための最小ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を、獲得タンパク質を除去し、単一スペーサーを有する最小アレイを生成することによって設計した。これらの最小遺伝子座を、ｇＢｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）として順序付け、遺伝子座の発現を駆動する、テトラサイクリン誘導性プロモーターを有するプラスミドに組み立てた。プラスミドマップは、Ａｄｄｇｅｎｅにおいて、及び図中で利用可能であった。全てのＲＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼ、及びｄｓＤＮＡ鋳型としてＰＣＲ産生物を使用して、インビトロ転写した。得られたＩＶＴをゲル抽出し、エタノール沈殿した。ＤＮＡ基質はＩＤＴから入手し、それらの配列は表４で入手可能である。放射標識された切断アッセイのために、ＤＮＡオリゴを、放射標識化の前にＰＡＧＥゲルからゲル抽出した。ＤＮＡ基質をさらに精製することなくＦＱアッセイに使用した。
【０４８１】
Ｅ．ｃｏｌｉのＲＮＡ配列
Ｈａｒｒｉｎｇｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）で改変を伴って以前記載されたように、小分子ＲＮＡ配列決定を実行した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＥＢ  Ｓｔａｂｌｅ３を、Ｃａｓ１４ａ１  ＯＲＦの上流でテトラサイクリン誘導性プロモーターを有するＣａｓ１４ａ１システムを発現するプラスミド、またはＣａｓ１４と融合したＮ末端１０倍ヒスチジンタグを有する同一のプラスミドで形質転換した。スターターをＳＯＢ中で一晩増殖させ、２１４ｎＭのアンヒドロテトラサイクリンを含有する、５ｍＬの新たなＳＯＢ中で１：１００に希釈し、２５℃で一晩増殖させた。Ｃａｓ１４ａでプルダウンされたＲＮＡの配列決定のために、Ｃａｓ１４ａ１と融合したＮ末端Ｈｉｓタグを含有するプラスミドを１８℃で増殖させた後、「タンパク質精製」で記載されるように溶解及び精製し、Ｎｉ−ＮＴＡ溶出後に停止した。細胞をペレット化し、ＲＮＡを、以前に記載されたように高温フェノールを使用して抽出した。全核酸を、ＴＵＲＢＯ  ＤＮａｓｅで処理し、フェノール抽出した。得られたＲＮＡを、Ｔ４  ＰＮＫの添加前に熱不活化したｒＳＡＰで処理した。アダプタを、ＮＥＢｎｅｘｔ小分子ＲＮＡキットを使用して小分子ＲＮＡ上にライゲーションし、８％の未変性ＰＡＧＥゲルでゲル抽出した。ＲＮＡを、シングルエンドの３００ｂｐの読み取りを用いてＭｉＳｅｑ上に配列決定した。分析のために、得られた読み取りをＣｕｔａｄａｐｔを使用してトリミングし、８ｎｔ未満の配列を廃棄し、Ｂｏｗｔｉｅ２を使用してプラスミド参照にマッピングした。
【０４８２】
ＰＡＭ枯渇アッセイ
Ｂｕｒｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）で以前記載されたように、ＰＡＭ枯渇アッセイを実行した。ランダム化されたプラスミドライブラリーを、標的配列に隣接するランダム化ＰＡＭ領域を含有するプライマーを使用して生成した。ランダム化されたプライマーを、プライマーの３’末端に相補的なプライマーでハイブリダイズし、二重鎖を、Ｋｌｅｎｏｗ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＮＥＢ）を使用して伸長した。標的を含有するｄｓＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ及びＮｃｏＩで消化し、ｐＵＣ１９骨格にライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＤＨ５αに形質転換し、１０７個を超える細胞を採取した。次に、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＮＥＢｓｔａｂｌｅを、ＣＲＩＳＰＲプラスミドまたは空のベクター対照のいずれかで形質転換し、これらの形質転換されたＥ．ｃｏｌｉを、１０％のグリセロールで繰り返し洗浄することによってエレクトロコンピテントにした。これらのエレクトロコンピテント細胞を、２００ｎｇの標的ライブラリーで形質転換し、標的（カルベニシリン、１００ｍｇｌ−１）及びＣＲＩＳＰＲプラスミド（クロラムフェニコール、３０ｍｇｌ−１）の選択を含有するバイオアッセイ皿上に播種した。細胞を採取し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑ上でのアンプリコン配列決定のために調製した。ＰＡＭ領域を、Ｃｕｔａｄａｐｔを使用して抽出し、枯渇値をＰｙｔｈｏｎで計算した。ＰＡＭを、ＷｅｂＬｏｇｏを使用して可視化した。
【０４８３】
トランスクリプトームのＲＮＡマッピング
ＲＮＡを、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＴＲＩｚｏｌ試薬を使用して０．２ｍｍのフィルターから抽出し、続いて、ゲノムＤＮＡを、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮａｓｅ−Ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  Ｓｅｔキット及びＱｉａｇｅｎ  Ｍｉｎｉ  ＲＮｅａｓｙキットを使用して除去及び洗浄した。Ａｇｉｌｅｎｔ  ２１００  Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、ＲＮＡ試料の整合性を評価した。Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ＳＯＬｉＤ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑキットを使用して、ｃＤＮＡ鋳型ライブラリーを生成した。ＳＯＬｉＤ  ＥＺ  Ｂｅａｄシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して、エマルジョンクローンビーズ増幅を実施し、ＳＯＬｉＤプラットフォーム配列決定のためのビーズ鋳型を生成した。試料を、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙで、５５００ＸＬ  ＳＯＬｉＤ  ｐｌａｔｆｏｒｍ上で配列決定した。５０ｂｐの単一読み取りを、Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）のようにＳｉｃｋｌｅを使用してトリミングした。
【０４８４】
タンパク質の精製
改変を伴って以前記載されたように、Ｃａｓ１４ａ１を精製した。Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）ＲＩＬを、１０倍のＨｉｓ−ＭＢＰ−Ｃａｓ１４ａ１発現プラスミドで形質転換し、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）中でＯＤ６００＝０．５に増殖させて、０．５ｍＭのＩＰＴＧで誘導した。細胞を１８℃で一晩増殖させ、遠心分離によって採集し、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２０ｍＭのイミダゾール、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、５００ｍＭのＮａＣｌ）中に再懸濁して、超音波処理によって破壊した。溶解物を、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂上にバッチ充填し、上記緩衝液で洗浄した後、溶出緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、３００ｍＭのイミダゾール、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、５００ｍＭのＮａＣｌ）で溶出した。ＭＢＰ及びＨｉｓ−ｔａｇを、４℃にてＴＥＶで一晩インキュベーションすることによって除去した。得られたタンパク質を緩衝液Ａ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、１５０ｍＭのＮａＣｌ）に交換し、タンデムＭＢＰ、ヘパリンカラム（ＧＥ、Ｈｉ−Ｔｒａｐ）上に充填し、緩衝液Ａから緩衝液Ｂ（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、０．５ｍＭのＴＣＥＰ、１２５０ｍＭのＮａＣｌ）への直線勾配を用いて溶出した。Ｃａｓ１４ａ１を含有する得られた画分を、Ｓ２００ゲル濾過カラム上に充填し、瞬間冷凍して、使用するまで−８０℃で保存した。
【０４８５】
インビトロ切断アッセイ
放射標識
放射標識された切断アッセイを、１倍の切断緩衝液（２５ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ、５％のグリセロール）中で実行した。１００ｎＭのＣａｓ１４ａ１を、室温で１０分間、１２５ｎＭのｃｒＲＮＡ及び１２５ｎＭのｔｒａｃｒＲＮＡと複合化した。約１ｎＭの放射標識されたＤＮＡまたはＲＮＡ基質を添加し、３７℃で３０分間反応させた。反応を、２倍のクエンチ緩衝液（９０％のホルムアミド、２５ｍＭのＥＤＴＡ、及び微量のブロモフェノールブルー）を添加することによって停止し、９５℃に２分間加熱し、７Ｍの尿素及び０．５倍のＴＢＥを含有する１０％のポリアクリルアミドゲル上で実行した。産生物を、蛍光体撮像によって可視化した。
【０４８６】
Ｍ１３  ＤＮＡ切断
Ｍ１３  ＤＮＡ切断アッセイを、１００ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１ｍＭのＤＴＴ、５％のグリセロール中で実行した。２５０ｎｍのＣａｓ１４ａ１を、２５０ｎＭのｃｒＲＮＡ及び２５０ｎＭのｔｒａｃｒＲＮＡならびに２５０ｎＭのｓｓＤＮＡアクチベータと複合化した。反応を、５ｎＭのＭ１３  ｓｓＤＮＡプラスミドの添加によって開始し、１０ｍＭのＥＤＴＡで補充された充填緩衝液の添加によってクエンチした。産生物を、ＳＹＢＲ  ｇｏｌｄ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）で予め染色された１．５％のアガロースＴＡＥゲルで分離した。
【０４８７】
トランス切断のＦＱ検出
Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）で改変を伴って以前記載されたように、ＦＱ検出を実行した。１００ｎＭのＣａｓ１４ａ１を、１倍の切断緩衝液中の１２５ｎＭのｃｒＲＮＡ、１２５ｎＭのｔｒａｃｒＲＮＡ、５０ｎＭのＦＱプローブ、及び２ｎＭのｓｓＤＮＡアクチベータと、３７℃で１０分間複合化した。次いで、可変ＲＮＡ成分を使用して開始するＲＮＡ最適化実験を除いて、全ての反応について、アクチベータＤＮＡの添加によって反応を開始した。反応を、３７℃で最長１２０分間、蛍光プレートリーダーでモニタリングし、１分毎に蛍光測定した（λｅｘ：４８５ｎｍ、λｅｍ：５３５ｎｍ）。得られたデータを、アクチベータの不在下で得られた読み取り値を使用してバックグラウンドを差し引き、単一の指数関数的減衰曲線を使用して適合した。
【０４８８】
データの可用性
本明細書で使用されるプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅで入手可能である（プラスミド番号１１２５００、１１２５０１、１１２５０２、１１２５０３、１１２５０４、１１２５０５、１１２５０６）。本明細書で使用されるオリゴヌクレオチドを、表４及び表５に提供する。本明細書で使用されるプラスミドを、図２４に提供する。本明細書で使用されるＣａｓ１４タンパク質配列を、図７に提供する。
【０４８９】
（表４）本明細書で使用されるオリゴヌクレオチド及びプラスミド。
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【０４９０】
（表５）ＲＮＡオリゴヌクレオチド。
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【０４９１】
実施例１
図１は、天然型ＣａｓＺタンパク質配列の例を示す。
【０４９２】
図２は、ＣａｓＺタンパク質に加えてＣａｓ１タンパク質を含む、ＣａｓＺ遺伝子座の概略図を示す。
【０４９３】
図３は、ＣａｓＺ配列の系統樹を、他のクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質配列に関連付けて示す。
【０４９４】
図４は、ＣａｓＺ遺伝子座からのＣａｓ１配列の系統樹を、他のクラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ遺伝子座からのＣａｓ１配列に関連付けて示す。
【０４９５】
図５は、ＣａｓＺ遺伝子座からのｔｒａｎｃＲＮＡの発現を表すトランスクリプトームのＲＮＡマッピングデータを示す。ｔｒａｎｃＲＮＡはＣａｓＺ反復アレイに隣接しているが、反復配列を含まず、反復配列に対して相補的ではない。以下の遺伝子座、すなわちＣａｓＺａ３、ＣａｓＺｂ４、ＣａｓＺｃ５、ＣａｓＺｄ１、及びＣａｓＺｅ３についてのＲＮＡマッピングデータが示される。小さな反復する整列された矢印は、（ガイドＲＮＡコード配列の存在をす）ＣＲＩＳＰＲアレイの反復を表す。反復アレイに対して外側及び隣接するピークは、高度に転写されたｔｒａｎｃＲＮＡを表す。
【０４９６】
このメタトランスクリプトームのデータは、１６Ｓを枯渇されておらず、したがってデータの大きな部分が１６Ｓにマッピングされ、例えば、ｍＲＮＡは、これらの読み取りにおいてほとんど全く表されなかった。それにもかかわらず、予測ｔｒａｎｃＲＮＡ領域にマッピングするＲＮＡが観察された。
【０４９７】
実施例２
Ｃａｓ１４を含有する未培養の古細菌由来の一連のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムである、４００〜７００アミノ酸だけの非常にコンパクトなＲＮＡガイドヌクレアーゼのファミリーが本明細書に開示され、これは、ＤＮＡのＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座への統合に関与するＣＡＳ１及びＣＡＳ２タンパク質を含み、ＣＲＩＳＰＲアレイを新たな感染に積極的に適応させる証拠を示した。その小さなサイズにもかかわらず、Ｃａｓ１４タンパク質は制限的な配列要件なしにＲＮＡガイド一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の切断ができた。さらに、Ｃａｓ１４による標的認識は、ｓｓＤＮＡ分子の非特異的切断を引き起こした。メタゲノムのデータは、複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４システムが独立して進化したことを示し、単一エフェクターＣＲＩＳＰＲ系適応免疫の潜在的な進化の起源を示唆した。
【０４９８】
微生物とウイルスとの間の競合は、ＣＲＩＳＰＲ系適応免疫の進化を刺激し、感染病原体に対する保護を提供した。クラス２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムにおいて、多機能ドメインを有する単一の１００〜２００キロダルトン（ｋＤ）のＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質は、ＲＮＡガイド結合及びＤＮＡまたはＲＮＡ基質の切断を行った。より単純な、より小さいＲＮＡガイドタンパク質が天然に発生するかどうかを決定するために、普遍的なＣＲＩＳＰＲインテグラーゼをコードする遺伝子である、ＣＲＩＳＰＲアレイ及びＣＡＳ１の両方に近位の特徴付けられていない遺伝子について、テラベース規模のメタゲノムのデータセットを照会した。この分析は、４０〜７０ｋＤのポリペプチドをコードする、本明細書に記載されるｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃａｓ４、及びｃａｓ１４を含有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムの多様なファミリーを特定した（図８、パネルＡ）。２４の異なるｃａｓ１４遺伝子バリアントは、比較アレイ分析に基づいて３つのサブグループ（Ｃａｓ１４ａ〜ｃ）にクラスター化することが特定された（図８、パネルＡ〜Ｂ、図９、図１０）。Ｃａｓ１４タンパク質は、以前から知られているクラス２のＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡガイド酵素の約半分の大きさである、約４００〜７００アミノ酸（ａａ）であった（図８、パネルＣ〜Ｄ）。特定されたＣａｓ１４タンパク質は、かなりの配列多様性を示したが、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ＤＮＡ標的化酵素に特有の組織を有する予測ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインの存在によって全てが結びついた（図８、パネルＤ）。
【０４９９】
特定されたＣａｓ１４タンパク質は、小さな細胞及びゲノムのサイズを特徴とする共生古細菌の上門であるＤＰＡＮＮにおいてほぼ独占的に発生した。系統学的比較は、Ｃａｓ１４タンパク質が幅広く多様であり、時にＣＲＩＳＰＲアレイ付近に見出されるが、決して他のｃａｓ遺伝子と一緒には見られない、細菌ＲｕｖＣドメイン含有タンパク質のファミリーであるＣ２ｃ１０及びＣ２ｃ９との類似性を有することを示した（図８、パネルＢ及び図９）。この観察ならびに小さなサイズのｃ２ｃ１０及びｃａｓ１４遺伝子は、これらのシステムが独立型のＣＲＩＳＰＲエフェクターとして機能し得ることを不可能にした。
【０５００】
図８、パネルＡ〜Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ゲノム遺伝子座の構造及び系統発生を示す。図８、パネルＡは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲシステムの系統樹を示す。新たに特定された微小ＣＲＩＳＰＲシステムがオレンジ色で強調されている。図８、パネルＢは、Ｃ２ｃ１０及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４システムの代表的な遺伝子座構造を示す。図８、パネルＣは、Ｃａｓ１２ａ〜ｅ及びＣａｓ９と比較したＣａｓ１４ａ〜ｃシステム長さの分布を示す。図８、パネルＤは、Ｃａｓ９及びＣａｓ１２ａと比較したＣａｓ１４ａのドメイン編成を示す。タンパク質の長さは縮尺に合わせて描かれている。
【０５０１】
図９は、既知のＶ型ＣＲＩＳＰＲエフェクター及びＲｕｖＣドメインを含有するクラス２の候補の最尤樹を示す。挿入図は、それぞれ新たに特定されたサブタイプの個々のオルソログを示す図１０は、既知のＣＲＩＳＰＲシステムからのＣＡＳ１の最尤樹を示す。
【０５０２】
実施例３
感染症の遺伝的記憶の作成に関与している保存された遺伝子への近さに基づいて（ｃａｓ１、ｃａｓ２、ｃａｓ４）（図１１、パネルＡ）、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４システムが、積極的にＤＮＡ配列をそれらのＣＲＩＳＰＲアレイに獲得するかどうかを調査した。複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４遺伝子座の組み立てられたメタゲノム隣接ＤＮＡ配列（コンティグ）は、他の点では同一のＣＲＩＳＰＲシステムがそれらのＣＲＩＳＰＲアレイにおける多様性を示したことを明らかにし、新たな感染に対する活性の適応を示唆する（図１１、パネルＢ及び図１２、パネルＡ）。いかなる特定の理論にも束縛されることを意図するものではないが、新しいＤＮＡ配列の積極的な獲得は、これらのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４遺伝子座が、それらの小さなサイズにもかかわらず核酸標的化活性を有する機能的酵素をコードすることを示唆していることが提案される。この可能性を試験するために、ＲＮＡ成分がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４遺伝子座から産生されたかどうかを調査した。環境メタトランスクリプトームの配列決定データを、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ａを含有する天然の古細菌の宿主由来のＲＮＡの存在について分析した（図１２、パネルＢ及び図１３、パネルＡ）。ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に加えて、非常に豊富な非コードＲＮＡを、ｃａｓ１４ａと隣接するＣＲＩＳＰＲアレイとの間に位置する約１３０塩基対の配列にマッピングした。Ｃａｓ９、Ｃａｓ１２ｂ、及びＣａｓ１２ｅ  ＣＲＩＳＰＲシステムに関連して見出されたトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）について観察されたように、この転写産物の３′末端の２０ヌクレオチド（ｎｔ）は、ｃｒＲＮＡの反復セグメントに対してほぼ相補的であった（図１２、パネルＣ及び図１３、パネルＢ）。これらの以前研究されたシステムでは、二本鎖ＲＮＡ切断酵素リボヌクレアーゼＩＩＩ（ＲＮａｓｅ  ＩＩＩ）は成熟ｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡを産生したが、ｃａｓ１４含有再構成ゲノムにおいては、ＲＮａｓｅ  ＩＩＩをコードする遺伝子は存在しなかった（図１４、パネルＡ）。この観察は、ＣＲＩＳＰＲ関連ＲＮＡ処理のための代替機序がこれらの宿主内に存在することを暗示した。
【０５０３】
Ｃａｓ１４ａタンパク質及び関連ＲＮＡ成分が異種生物中で組み立てることができるかどうかを試験するために、プラスミドを、Ｃａｓ１４遺伝子、ＣＲＩＳＰＲアレイ、及び推定ｔｒａｃｒＲＮＡを含有する遺伝子間領域を含む、最小ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ａ遺伝子座を含有するＥ．ｃｏｌｉに導入した。細胞溶解物由来のＣａｓ１４ａタンパク質の親和性精製及び同時精製ＲＮＡの配列決定は、非常に豊富な成熟ｃｒＲＮＡならびに推定ｔｒａｃｒＲＮＡを明らかにし、Ｃａｓ１４がｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの両方に関連付けられていることを示唆した（図１４、パネルＢ）。組み立てられたＣａｓ１４ａタンパク質ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ粒子の計算された質量は、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐＣａｓ９）（図１２、パネルＤ）が１７％だけであり、Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ  Ｃａｓ１２ａ（ＦｎＣａｓ１２ａ）が８％であったのと比較して、４８重量％ＲＮＡであり、Ｃａｓ１４ａ複合体の構造におけるＲＮＡの中心的役割を示唆した。既知のクラス２のＣＲＩＳＰＲシステムは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を標的化するために、プロトスペーサ−隣接モチーフ（ＰＡＭ）と呼ばれる短い配列を必要とする。Ｃａｓ１４ａがＰＡＭを必要とし、ｄｓＤＮＡ干渉を実行することができるかどうかを試験するために、Ｅ．ｃｏｌｉを形質転換し、Ｃａｓ１４アレイ中の標的コード配列（スペーサー）と一致する配列に隣接するランダム化ＰＡＭ領域を含有するｄｓＤＮＡプラスミドを含む最小Ｃａｓ１４ａ遺伝子座を発現した。Ｅ．ｃｏｌｉ形質転換体においては、ＰＡＭ配列の枯渇は検出されず、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ａシステムがｄｓＤＮＡを標的とすることができないか、ＰＡＭを必要とせずにそうすることができるか、またはこの異種宿主において不活性であるか、のいずれかであることを示唆した（図１５、パネルＡ〜Ｄ）。
【０５０４】
図１１、パネルＡ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４システムによる新規スペーサーの獲得を示す。図１１、パネルＡは、Ｃａｓ１４  ＣＡＳ１オルソログのアラインメントを示す。拡大図は、赤色の枠で強調した以前関与した活性部位残基の保存を示す。図１１、パネルＢは、これらのＣＲＩＳＰＲシステムのスペーサーの多様性を明らかにする、様々なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４システムのために組み立てられた複数のＣＲＩＳＰＲアレイを示す。オレンジ色の矢印は、反復配列を示し、一方、様々な色の枠は、独自のスペーサーを示す。
【０５０５】
図１２、パネルＡ〜Ｄは、ｔｒａｃｒＲＮＡを活発に適合してコードする、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ａを示す。図１２、パネルＡは、オレンジ色で示されたＣＲＩＳＰＲ反復、及び異なる色で示された独自のスペーサーで、Ｃａｓ１４ａ及びＣａｓ１４ｂのスペーサーの多様性を示す。図１２、パネルＢは、Ｃａｓ１４ａ１及びＣａｓ１４ａ３にマッピングされたメタトランスクリプトミクスの読み取りを示す。挿入図は、最も豊富な反復及びスペーサー配列の拡大図を示す。図１２、パネルＣは、Ｃａｓ１４ａ１  ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡのインシリコの予測される構造を示す。ＲＮａｓｅ  ＩＩＩのオルソログは、宿主ゲノム（図１４、パネルＡ）において特定されなかった。図１２、パネルＤは、ＲＮＡ及びタンパク質からなる様々なＣＲＩＳＰＲ複合体質量の割合を示す。
【０５０６】
図１３、パネルＡ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４遺伝子座のメタトランスクリプトミクスを示す。図１３、パネルＡは、Ｃａｓ１４ａオルソログの環境ＲＮＡ配列決定読み取りを示す。Ｃａｓ１４及びＣＲＩＳＰＲアレイの位置を下に示す。右側のＲＮＡの構造は、メタトランスクリプトミクスから特定されたｔｒａｃｒＲＮＡのインシリコの予測される構造を示す。図１３、パネルＢは、Ｃａｓ１４ａ１  ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ二重鎖の予測されるハイブリダイゼーションを示す。
【０５０７】
図１４、パネルＡ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４によるＲＮＡプロセシング及び異種発現を示す。図１４、パネルＡは、Ｃａｓ１４含有ゲノムにおける共通ＲＮａｓｅオルソログの存在を示す。薄紫色は、所与のＲＮａｓｅの予想された長さよりも有意に短かったヒットを表す。ＲＮａｓｅ  ＩＩＩは、全ての調査されたゲノムにおいて存在しないことに留意されたい。図１４、パネルＢは、メタトランスクリプトームの読み取り（図１４、パネルＢ、上のグラフ）と比較した、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＣａｓ１４ａ１遺伝子座の異種発現からの小分子ＲＮＡ配列読み取り（図１４、パネルＢ、下の２つのグラフ）を示す。プルダウンは、Ｎｉ−ＮＴＡ親和性精製したＣａｓ１４ａ１とともに同時精製したＲＮＡを指す。
【０５０８】
図１５、パネルＡ〜Ｄは、Ｃａｓ１４ａ１及びＳｐＣａｓ９によるプラスミドの枯渇を示す。図１５、パネルＡは、ＰＡＭ発見実験の概略図を示す。関心対象のＣＲＩＳＰＲシステムを発現するＥ．ｃｏｌｉを、標的に隣接するランダム化ＰＡＭ配列を含有するプラスミドを負荷した。生存する（形質転換された）細胞を採取し、空ベクターを保有する対照とともに配列決定した。次いで、枯渇された配列を配列決定し、ＰＡＭ枯渇値閾値（ＰＤＶＴ）を超えて枯渇されたＰＡＭを使用して、Ｗｅｂｌｏｇｏを生成した。図１５、パネルＢ〜Ｄは、標的のランダム化ＰＡＭ配列５’（図１５、パネルＢ）または３’（図１５、パネルＣ）を含有する標的プラスミドで形質転換された、異種発現されたＣａｓ１４ａ１によって枯渇されたＰＡＭ配列を示す。「配列なし」は、所与のＰＤＶＴで、またはそれを超えて、枯渇された配列が全く見出されなかったことを示した。
【０５０９】
実施例４
精製されたＣａｓ１４ａ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体が、ＲＮＡガイド核酸のインビトロでの切断の能力を有するかどうかを試験した。全ての現在再構成されているＤＮＡ標的化クラス２の干渉複合体は、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡ基質の両方を認識することができた。精製されたＣａｓ１４ａ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡ複合体を、ｃｒＲＮＡガイド配列に相補的な２０ヌクレオチド配列を有する放射標識された標的オリゴヌクレオチド（ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、及びｓｓＲＮＡ）、または非相補的ｓｓＤＮＡとともにインキュベートし、これらの基質を、Ｃａｓ１４ａ媒介切断について分析した。相補的ｓｓＤＮＡ基質の存在下においてのみ、切断産物が検出され（図１６、パネルＡ及び図１７、パネルＡ〜Ｃ）、切断は、単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と組み合わせることもでき得るｔｒａｃｒＲＮＡ及びｃｒＲＮＡの両方の存在に依存した（図１６、パネルＢ及び図１８）。検出可能なｄｓＤＮＡ切断の欠如は、他のいくつかの要因または配列要件が天然宿主におけるｄｓＤＮＡの認識を可能にした可能性はあったが、Ｃａｓ１４ａが選択的にｓｓＤＮＡを標的とすることを示唆した。Ｃａｓ１４ａ  ＲｕｖＣドメイン中の保存された活性部位残基の変異は、切断活性を排除し（図１７、パネルＡ）、ＤＮＡ切断を担うドメインとしてＲｕｖＣを暗示した。さらに、Ｃａｓ１４ａ  ＤＮＡ切断は、天然に産生された配列よりも短い長さへのＲＮＡ成分の切り詰めに感受性であった（図１６、パネルＢ及び図１９、パネルＡ〜Ｄ）。これらの結果は、プログラム可能なＲＮＡガイドＤＮＡ切断を行うことを示す最小のクラス２のＣＲＩＳＰＲエフェクターとしてＣａｓ１４ａを確立した。
【０５１０】
ｓｓＤＮＡ基質全体にＣａｓ１４ａガイドをタイリングすることによって、Ｃａｓ１４ａがインビボでのｓｓＤＮＡ切断のためにＰＡＭを必要とするかどうかを試験した（図１６、パネルＣ）。これらの異なるガイドの標的に隣接する配列の変動にもかかわらず、切断が４つの全ての配列について観察された。切断部位はｓｓＤＮＡのガイド相補的領域を超えて発生し、ガイド結合位置に応答して位置が変化した（図１６、パネルＣ）。これらのデータは、Ｃａｓ１４ａが、活性化のためにＰＡＭを必要としないｓｓＤＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲエンドヌクレアーゼであることを実証した。
【０５１１】
Ｃａｓ１４ａがヘテロ二重鎖を標的化するｃｒＲＮＡ／ＤＮＡの外部で切断したという観察に基づき、Ｃａｓ１４ａが、ＲｕｖＣ含有酵素Ｃａｓ１２ａに類似した標的活性化非特異的ｓｓＤＮＡ切断活性を有し得ることが提案された。この可能性を試験するために、Ｃａｓ１４ａ−ｔｒａｃｒＲＮＡ−ｃｒＲＮＡを、相補的なアクティベーターＤＮＡ、及びＣａｓ１４ａ  ｃｒＲＮＡまたはアクティベーターに配列相補性を有しないＭ１３バクテリオファージｓｓＤＮＡのアリコートとともにインキュベートした（図１６、パネルＤ）。Ｍ１３のｓｓＤＮＡを小さな断片に急速に分解し、保存されたＣａｓ１４ａ  ＲｕｖＣ活性部位の変異によって除去された活性は、Ｃａｓ１４ａの活性化が非特異的ｓｓＤＮＡ分解をもたらしたことを示唆した。
【０５１２】
Ｃａｓ１４ａによる標的依存型非特異的ＤＮＡ切断活性の特異性を調査するために、色素標識されたｓｓＤＮＡの切断が蛍光シグナルを生成する、フルオロフォア−クエンチャー（ＦＱ）アッセイを適合した（図２０、パネルＡ）。Ｃａｓ１４ａを様々なガイドＲＮＡ標的ｓｓＤＮＡ対とともにインキュベートすると、蛍光シグナルは同族標的の存在下でのみ観察され、より長いＦＱ含有基質に対して強い選好性を示した（図１９、パネルＦ及び図２０、パネルＡ）。Ｃａｓ１４ａのミスマッチ許容範囲を、様々なｓｓＤＮＡ基質において標的化された領域全体に２ｎｔのミスマッチをタイリングすることによって試験した。ｓｓＤＮＡ標的の中央付近のミスマッチは、Ｃａｓ１４ａ活性を強力に阻害し、ｄｓＤＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムについて観察されたＰＡＭ近位シード領域とは異なる内部シード配列を明らかにした（図２０、パネルＢ及び図２１、パネルＡ〜Ｄ）。さらに、強固な二次構造を含有するＤＮＡ基質は、Ｃａｓ１４ａの活性化の減少をもたらした（図２１、パネルＥ）。また、ｓｓＤＮＡ基質の切り詰めも、低減したまたは検出不可能なトランス切断をもたらした（図２１、パネルＦ）。これらの結果は、恐らくｃｒＲＮＡの前順序領域を利用してＲＮＡ標的化Ｃａｓ１３ａ酵素に類似した切断活性をゲートする、ｄｓＤＮＡ標的化クラス２のＣＲＩＳＰＲシステムとは異なる忠実度の機序を示唆した。
【０５１３】
メタゲノムデータにおける緻密なＶ型システムのさらなる調査は、Ｃａｓ１４ａ〜ｃのように、獲得関連ｃａｓ遺伝子及びＣＲＩＳＰＲアレイに隣接する短いＲｕｖＣ含有タンパク質をコードする遺伝子を含むシステムの大きな多様性を明らかにした。２０個の追加のそのようなシステムが、５つの主要なファミリー（Ｃａｓ１４ｄ〜ｈ）にクラスター化することを見出した。これらのファミリーは、ＴｎｐＢの独立した適応化事象から進化していると考えられ、トランスポザーゼ関連タンパク質がＶ型ＣＲＩＳＰＲエフェクターの進化上の親として暗示された。ｃａｓ１２ｂに関連していたｃａｓ１４ｇを除いて、ｃａｓ１４様遺伝子はＶ型エフェクター系統に別個のクレードを形成し（図２２、パネルＡ〜Ｂ）、それらのｃａｓ１遺伝子は異なる起源を有した（図１０、パネルＡ）。８つのファミリー（Ｃａｓ１４ａ〜ｈ）に属する全部で３８個のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４システムを特定し、８個の追加のシステムは分析でクラスター化できなかった（Ｃａｓ１４ｕと称される、表３）。
【０５１４】
本明細書に記載されるＣａｓ１４タンパク質の小さなサイズ及びＶ型エフェクタータンパク質に対するそれらの類似性は、ＲＮＡガイドｓｓＤＮＡの切断が祖先のクラス２のＣＲＩＳＰＲシステムとして存在していた可能性を示唆した。このシナリオでは、小さな、適応させられたＴｎｐＢ様ｓｓＤＮＡ干渉複合体は、時と共に追加のドメインを得て、徐々にｄｓＤＮＡ認識及び切断を改善した可能性がある。より小さなＣａｓ９オルソログは、それらのより大きな対応物よりも弱いｄｓＤＮＡ標的化活性を示したが、ｓｓＤＮＡを頑強に切断する能力を保持した。進化の影響は別として、ｓｓＤＮＡを特異的に標的化するＣａｓ１４の能力は、ｓｓＤＮＡ中間体を介して伝播するｓｓＤＮＡウイルスまたは可動遺伝要素（ＭＧＥ）に対する防御における役割を示唆した。いかなる特定の理論に拘束されることも意図しないが、ｓｓＤＮＡ標的化ＣＲＩＳＰＲシステムは、ｓｓＤＮＡウイルスがウイルス存在量の大多数を含むある特定の海洋環境において特に有利であり得る。
【０５１５】
図１６、パネルＡ〜Ｄは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ａが、ＲＮＡガイドＤＮＡエンドヌクレアーゼであることを示す。図１６、パネルＡは、ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｓｓＲＮＡ、及び標的外ｓｓＤＮＡを標的とするＣａｓ１４ａ１の切断動態を示す。図１６、パネルＢは、標的ｓｓＤＮＡに結合したＣａｓ１４ａ  ＲＮＰの図、及び様々なＲＮＡ成分の存在下での放射標識されたｓｓＤＮＡのＣａｓ１４ａ１の切断動態を示す。図１６、パネルＣは、Ｃａｓ１４ａ１ガイド配列によるｓｓＤＮＡ基質のタイリングを示す。図１６、パネルＤは、活性化Ｃａｓ１４ａ１によるｓｓＤＮＡウイルスＭ１３ゲノムの切断を示す。
【０５１６】
図１７、パネルＡ〜Ｅは、Ｃａｓ１４ａ１によるｓｓＤＮＡの分解を示す。図１７、パネルＡは、精製されたＣａｓ１４ａ１及びＣａｓ１４ａ１点変異体のＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。図１７、パネルＢは、ｓｓＤＮＡ標的のＣａｓ１４ａ１切断の塩、カチオン、及び温度の最適化を示す。図１７、パネルＣは、様々な長さのスペーサー配列を有するＣａｓ１４ａ１によるｓｓＤＮＡの放射標識された切断を示す。図１７、パネルＤは、ＲｕｖＣ活性部位残基を特定するために、以前研究されたＣａｓ１２タンパク質とのＣａｓ１４のアラインメントを示し、図１７、パネルＥは、精製されたＣａｓ１４ａ１  ＲｕｖＣ点変異体によるｓｓＤＮＡの切断を示す。
【０５１７】
図１８は、様々なガイドＲＮＡ成分による、ｓｓＤＮＡのＣａｓ１４ａ１切断の動態を示す。
【０５１８】
図１９、パネルＡ〜Ｆは、Ｃａｓ１４ａ１ガイドＲＮＡ成分の最適化を示す。図１９、パネルＡは、ｓｓＤＮＡを標的とするＣａｓ１４ａ１の図を示す。スペーサーの長さ（図１９、パネルＢ）、反復の長さ（図１９、パネルＣ）、ｔｒａｃｒＲＮＡ（図１９、パネルＤ）を変化させることによる、及びｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡとを一緒に融合すること（図１９、パネルＥ）による、ＦＱのｓｓＤＮＡ基質のＣａｓ１４ａ１切断に対する影響である。図１９、パネルＦは、様々なガイド及び標的の組み合わせの存在下でのｓｓＤＮＡ  ＦＱレポーターの切断から生じる、バックグラウンドを差し引いた蛍光を示す、ヒートマップを示す。
【０５１９】
図２０、パネルＡ〜Ｅは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４ａによる高忠実度ｓｓＤＮＡ  ＳＮＰの検出を示す。図２０、パネルＡは、Ｃａｓ１４ａ１によるｓｓＤＮＡの検出に関する蛍光−消光（ＦＱ）アッセイ及び様々な長さのＦＱ基質の切断動態を示す。図２０、パネルＢは、基板を横切ってタイリングされたミスマッチを有するＣａｓ１４ａ１の切断動態を示す（個々の点は、反復測定値を表す）。図２０、パネルＣは、Ｃａｓ１４−ＤＥＴＥＣＴＲ戦略及びＨＥＲＣ２の眼の色のＳＮＰの図を示す。図２０、パネルＤは、Ｔ７エキソヌクレアーゼの滴定及びＣａｓ１４ａ−ＤＥＴＥＣＴＲに対する影響を示す。図２０、パネルＥは、Ｃａｓ１２ａを使用するｓｓＤＮＡ検出と比較した、青い眼及び褐色の眼の唾液試料の、青い眼を標的とするガイドを用いた、Ｃａｓ１４ａ−ＤＥＴＥＣＴＲを使用するＳＮＰ検出を示す。
【０５２０】
図２１、パネルＡ〜Ｆは、Ｃａｓ１４ａ１の切断率に対する様々なアクティベーターの影響を示す。図２１、パネルＡは、パネルＡ〜Ｄにおいて使用されるミスマッチの位置でのｓｓＤＮＡのＣａｓ１４ａ１標的化の図、及び標的１のミスマッチ（ＭＭ）位置の代表的な複製の生率を示す。３つの異なる基質を横切ってタイリングされた変異を有するＣａｓ１４ａ標的化基質の切断率（図２１、パネルＢ〜Ｄ）である。図２１、パネルＥは、二次構造の量の増加を伴う基質のトランス切断率を示す。図２１、パネルＦは、切り詰められた基質でのトランス切断率を示す。点は、個々の測定値を表す。
【０５２１】
図２２、パネルＡ〜Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１４システムの多様性を示す。図２２、パネルＡは、示されたＣａｓ１４システムの代表的な遺伝子座構造を示す。タンパク質の長さが縮尺に合わせて描かれている。図２２、パネルＢは、Ｃａｓ１４の８つの全ての特定されたサブタイプを含むＶ型エフェクターの最尤樹を示す。
【０５２２】
図２３、パネルＡ〜Ｃは、異種宿主におけるＣａｓ１４ａ１媒介干渉の試験を示す。Ｅ．ｃｏｌｉにおける干渉を試験するための、Ｃａｓ１４ａ１及びＬｂＣａｓ１２ａコンストラクトの図である。（Ｂ）Ｅ．ｃｏｌｉにおける点状のΦＸ１７４のプラークは、Ｃａｓ１４ａ１ではなくＣａｓ１２ａに媒介される干渉を明らかにしている。各点は、ΦＸ１７４ストックの１０倍希釈を表す。（Ｃ）ΦＸ１７４で感染されたＣａｓ１４ａ１またはＬｂＣａｓ１２ａを発現しているＥ．ｃｏｌｉの増殖曲線（Ｔ、標的化；ＮＴ、非標的化）である。図１９、パネルＦは、３０分間のインキュベーション後の様々なガイド及び標的の組み合わせの存在下でのｓｓＤＮＡ  ＦＱレポーターの切断から生じるバックグラウンドを差し引いた蛍光を示す、ヒートマップを示す。
【０５２３】
本発明を、その特定の実施形態を参照して記載したが、本発明の真の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされてもよく、同等物に置き換えられてもよいことが、当業者によって理解されるべきである。加えて、特定の状態、材料、組成物、プロセス、プロセスのステップ（複数可）を本発明の目的、主旨、及び範囲に適応させるために、多くの改変がなされてもよい。全てのそのような改変は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であることが意図される。
【０５２４】
参考文献
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【図１−１】
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【図１−２】
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【図１−３】
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【図１−４】
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【図１−５】
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【図１−６】
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【図１−７】
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【図１−８】
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【図１−９】
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【図１−１０】
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【図１−１１】
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【図１−１２】
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【図１−１３】
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【図１−１４】
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【図１−１５】
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【図１−１６】
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【図１−１７】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図５−６】
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【図５−７】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図７−３】
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【図７−４】
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【図７−５】
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【図７−６】
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【図７−７】
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【図７−８】
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【図７−９】
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【図７−１０】
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【図７−１１】
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【図７−１２】
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【図７−１３】
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【図７−１４】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１３−３】
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【図１３−４】
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【図１３−５】
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【図１４】
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【図１５−１】
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【図１５−２】
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【図１５−３】
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【図１５−４】
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【図１６−１】
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【図１６−２】
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【図１６−３】
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【図１７−１】
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【図１７−２】
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【図１７−３】
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【図１７−４】
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【図１８】
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【図１９−１】
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【図１９−２】
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【図１９−３】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２０−３】
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【図２０−４】
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【図２１−１】
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【図２１−２】
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【図２１−３】
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【図２２−１】
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【図２２−２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
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【図２４−５】
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【図２４−６】
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【図２４−７】
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【図２４−８】
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【図２４−９】
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【図２４−１０】
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【図２４−１１】
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【図２４−１２】
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【図２４−１３】
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【図２４−１４】
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【図２４−１５】
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【図２４−１６】
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【図２４−１７】
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【図２５−１】
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【図２５−２】
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【図２５−３】
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【図２５−４】
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【図２５−５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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