(57)【要約】  本発明は、概して、環状ポリリボヌクレオチドの医薬組成物及び調製並びにその使用に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の発現配列のローリングサークル型翻訳の方法であって、ローリングサークル型翻訳を介して、環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発現する工程を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記１つ以上の発現配列、前記発現配列の少なくとも１つの３’末端におけるスタガー要素を含み、且つ終止要素を欠いている、方法。
【請求項２】
前記スタガー要素は、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記ローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記１つ以上の発現配列を発現する工程は、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記ローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の別個のポリペプチドを生成し、前記別個のポリペプチドのそれぞれは、単一の発現配列から生成される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記発現配列の少なくとも１つは、分泌タンパク質をコードする、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記環状ポリリボヌクレオチドは、
（ａ）エンクリプトゲン；
（ｂ）調節要素；
（ｃ）複製要素；及び
（ｄ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記環状ポリリボヌクレオチドは、
（ｉ）線状同等物より高い翻訳効率；
（ｉｉ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
（ｉｉｉ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
（ｉｖ）線状同等物より増加した半減期；及び
（ｖ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記１つ以上の発現配列を発現する前記工程は、線状同等物より少なくとも５倍多い発現産物を生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記１つ以上の発現配列を発現する前記工程は、前記環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞内で前記１つ以上の発現配列を発現することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記環状ポリリボヌクレオチドは、細胞分裂中に持続する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記環状ポリリボヌクレオチドの量の少なくとも約６０％は、前記細胞内で少なくとも約７日間にわたって持続する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
（ａ）後の時点での前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現は、前の時点と等しいか又はそれより多いか；又は
（ｂ）少なくとも約７日間の期間にわたる前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現は、４０％だけ低下しないか；又は
（ｃ）前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現は、少なくとも約７日間にわたって４０％を超えて変化しないレベルに維持される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記１つ以上の発現配列を発現する前記工程は、哺乳動物対象において前記発現配列を発現することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記終止要素は、終止コドンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記環状ポリリボヌクレオチドの自己複製を媒介するように構成される複製ドメインをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物であって、
（ａ）１つ以上の発現配列と、前記１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端におけるスタガー要素とを含む環状ポリリボヌクレオチドであって、ローリングサークル型翻訳の能力があり、且つ終止要素を欠いている、環状ポリリボヌクレオチドと；
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤と
を含む医薬組成物。
【請求項１９】
１つ以上の発現配列と、前記１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端におけるスタガー要素とを含む環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞であって、前記環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力があり、且つ終止要素を欠いている、細胞。
【請求項２０】
対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
前記１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを前記対象の細胞に投与する工程と；
前記細胞内の前記環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される、方法。
【請求項２１】
対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
前記１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを前記対象の細胞に投与する工程と；
前記細胞内の前記環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４又は１６日間の期間にわたる前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現が約４０％を超えて低下しないように構成される、方法。
【請求項２２】
対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
前記１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを前記対象の細胞に投与する工程と；
前記細胞内の前記環状ポリリボヌクレオチドから前記１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記細胞内における前記１つ以上の発現配列の発現が、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４又は１６日間にわたって約４０％を超えて変化しないレベルに維持されるように構成される、方法。
【請求項２３】
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；
ｆ）疑似二本鎖二次構造；及び
ｇ）発現配列
から選択される少なくとも１つの構造要素と、
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性と
を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物。
【請求項２４】
薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、前記環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある、医薬組成物。
【請求項２５】
薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含み、且つローリングサークル型翻訳の能力がある環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、前記環状ポリリボヌクレオチドは、前記環状ポリリボヌクレオチドの前記ローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、前記別個のポリペプチドのそれぞれは、前記１つ以上の発現配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される、医薬組成物。
【請求項２６】
薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列及び前記１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端におけるスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、前記スタガー要素は、前記環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１８又は２３〜２６のいずれか一項に記載の組成物を製造する方法であって、請求項１８又は２３〜２６のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチド及び請求項１８又は２３〜２６のいずれか一項に記載の薬学的に許容される担体又は賦形剤を組み合わせる工程を含む方法。
【請求項２８】
治療の方法であって、請求項１８又は２３〜２６のいずれか一項に記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【請求項２９】
タンパク質発現のための方法であって、請求項１８又は２３〜２６のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳する工程を含む方法。
【請求項３０】
前記環状ポリリボヌクレオチドの前記少なくとも領域の前記翻訳は、インビトロで行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記環状ポリリボヌクレオチドの前記少なくとも領域の前記翻訳は、インビボで行われる、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１８又は２３〜２６のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド。
【請求項３３】
請求項１８又は２３〜２６のいずれか一項に記載の環状ポリリボヌクレオチドを製造する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
[0001]  本出願は、２０１７年１２月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５９９，５４７号明細書及び２０１８年５月２５日に出願された米国仮特許出願第６２／６７６，６８８号明細書の利益を主張するものであり、これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
[0002]  特定の環状ポリリボヌクレオチドは、健常人の組織及び細胞を含むヒト組織及び細胞中に遍在的に存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
[0003]  一態様において、本発明は、ａ）エンクリプトゲン（encryptogen）；ｂ）スタガー要素（stagger element）；ｃ）調節要素；ｄ）複製要素；ｆ）疑似二本鎖二次構造；及びｇ）発現配列から選択される少なくとも１つの構造要素と；ａ）線状同等物より高い翻訳効率；ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；ｄ）線状同等物より増加した半減期；及びｅ）細胞分裂中の持続性から選択される少なくとも１つの機能特性とを含む環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物を含む。
【０００４】
[0004]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能を有する。このような一実施形態において、疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントと共に少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む。別のこのような実施形態において、疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び第２の配列を含む。
【０００５】
[0005]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エンクリプトゲンを含む。ある実施形態において、エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチド、例えばプソイドウリジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む。ある実施形態において、エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えばリボヌクレオチド結合タンパク質を含む。ある実施形態において、エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免疫タンパク質結合部位を含む。
【０００６】
[0006]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドを含む。
[0007]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ−２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、ＩＦＮ−βの少なくとも１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価される際、エンクリプトゲンを欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する。
【０００７】
[0008]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボスイッチをさらに含む。
[0009]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む。
【０００８】
[0010]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳開始配列、例えばＧＵＧ、ＣＵＧ開始コドン、例えばストレス条件下での発現を含む。
[0011]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。このような一実施形態において、発現配列は、ペプチド又はポリヌクレオチドをコードする。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、同じであるか又は異なる複数の発現配列を含む。
【０００９】
[0012]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素、例えば２Ａを含む。
[0013]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノンコーディングＲＮＡを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、発現配列の発現を変化させる調節要素を含む。
【００１０】
[0014]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基〜約２０ｋｂの範囲のサイズを有する。
[0015]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリヌクレオチドの環状化によって合成される。
【００１１】
[0016]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に抵抗性である。
[0017]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ａ）５’−ＵＴＲ；ｂ）３’−ＵＴＲ；ｃ）ポリ−Ａ配列；ｄ）５’−キャップ；ｅ）終止要素；ｆ）内部リボソーム進入部位；ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性、及びｈ）キャップ結合タンパク質への結合の少なくとも１つを欠いている。
【００１２】
[0018]  一態様において、本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物を製造する方法を含む。
[0019]  一態様において、本発明は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある、医薬組成物を含む。
【００１３】
[0020]  ある実施形態において、１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチド中のスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられ、１つ以上の発現配列のローリングサークル型翻訳は、少なくとも２つのポリペプチド分子を生成し、例えば、スタガー要素は、伸長ポリペプチドがリボソームから落下するようにリボソームを停滞又は停止させる。ある実施形態において、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。例えば、スタガー要素は、２つ以上の発現配列の２回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止することができ、例えば、スタガー要素は、リボソームを停止させ、且つ／又は伸長ポリペプチドが環状ポリリボヌクレオチドの周りを１周した後にリボソームから落下することを可能にする。
【００１４】
[0021]  ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。
[0022]  ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む。
【００１５】
[0023]  一態様において、本発明は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含み、且つローリングサークル型翻訳の能力がある環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、別個のポリペプチドのそれぞれは、１つ以上の発現配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される、医薬組成物を含む。
【００１６】
[0024]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される。
【００１７】
[0025]  ある実施形態において、インビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む。
[0026]  ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの下流又は３’末端側にあり、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される。
【００１８】
[00207]  一態様において、本発明は、薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列及び１つ以上の発現配列の少なくとも１つの下流又は３’末端側にあるスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物を提供する。ある実施形態において、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される。
【００１９】
[0028]  ある実施形態において、スタガー要素は、２Ａ配列及び２Ａ様配列からなる群から選択されるペプチド配列をコードする。
[0029]  ある実施形態において、スタガー要素は、ＧＰであるＣ末端配列を有する配列をコードする。
【００２０】
[0030]  ある実施形態において、スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ  Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。
【００２１】
[0031]  ある実施形態において、スタガー要素は、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳＥＦＮＰＧＰの少なくとも１つをコードする。
【００２２】
[0032]  ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列のそれぞれの下流又は３’末端側にある。
[0033]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の下流（５’末端側）にあり、スタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び後続の発現配列の連続した翻訳を可能にする。ある実施形態において、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列に続く発現配列の翻訳開始配列から上流（５’末端側）の距離を有する環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列の終止要素を含み、この距離は、第１の発現配列及びその後続の発現配列の連続した翻訳を可能にする。
【００２３】
[0034]  ある実施形態において、第１のスタガー要素は、連続して翻訳された環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあり、対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されていない対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２のスタガー要素を含み、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２のスタガー要素は、第２の翻訳開始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中の第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍大きい距離にある。ある実施形態において、スタガー要素は、連続して翻訳された環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にある第１の終止要素を含み、対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されていない対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列から上流にある第２の終止要素を含むスタガー要素を含み、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の終止要素は、第２の翻訳開始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の終止要素と第１の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍大きい距離にある。
【００２４】
[0035]  ある実施形態において、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える。ある実施形態において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超えて大きい。
【００２５】
[0036]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含む。
[0037]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍高い翻訳効率を有する。
【００２６】
[0038]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５倍高い翻訳効率を有する。
[0039]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。
【００２７】
[0040]  ある実施形態において、１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む。
[0041]  ある実施形態において、１つ以上の発現配列は、ペプチドをコードする。
[0042]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノンコーディングＲＮＡを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、発現配列の発現を変化させる調節要素を含む。
【００２８】
[0043]  一態様において、本発明は、本明細書において提供される医薬組成物のいずれかの環状ポリリボヌクレオチドを提供する。
[0044]  一態様において、本発明は、本明細書において提供される医薬組成物を製造する方法であって、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチド及び本明細書に記載される薬学的に許容される担体又は賦形剤を組み合わせることを含む方法を含む。
【００２９】
[0045]  一態様において、本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物を投与する方法を含む。
[0046]  一態様において、本発明は、タンパク質発現のための方法であって、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳することを含む方法を含む。
【００３０】
[0047]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビトロで行われる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビボで行われる。
【００３１】
[0048]  一態様において、本発明は、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、例えばＤＮＡベクターを含む。
[0049]  一態様において、本発明は、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドを製造する方法を含む。
【００３２】
[0050]  ある実施形態において、本方法は、線状ポリリボヌクレオチドのスプリントライゲーション媒介性環状化を含む。
[0051]  ある実施形態において、環状化、例えばスプリントライゲーション媒介性環状化は、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４４％、少なくとも４６％、少なくとも４８％又は少なくとも５０％の効率を有する。ある実施形態において、スプリントライゲーション媒介性環状化は、約４０％〜約５０％又は５０％超の効率を有する。
定義
[0052]  本発明は、特定の実施形態に関して及び特定の図を参照して説明されるが、本発明は、それらに限定されず、特許請求の範囲のみによって限定される。これ以降に記載される用語は、一般に、特に示されない限り、それらの一般的な意味で理解されるべきである。
【００３３】
[0053]  「によって得ることができる」、「によって生成可能である」などの用語は、請求項又は実施形態が化合物、組成物、生成物など自体を指す、すなわち、化合物、組成物、生成物などが、化合物、組成物、生成物などの製造について記載される方法によって得ることができるか又は生成可能であるが、化合物、組成物、生成物などが、記載される方法以外の方法によっても得られるか又は生成され得ることを示すのに使用される。「によって得られる」、「によって生成される」などの用語は、化合物、組成物、生成物が、記載される特定の方法によって得られるか又は生成されることを示す。「によって得ることができる」、「によって生成可能である」などの用語は、「によって得ることができる」、「によって生成可能である」などの好ましい実施形態として、「によって得られる」、「によって生成される」などの用語も開示することが理解されるべきである。
【００３４】
[0054]  「処置、調節などのための化合物、組成物、生成物など」という表現は、処置、調節などの示される目的に好適な化合物、組成物、生成物など自体を指すことが理解されるべきである。「処置、調節などのための化合物、組成物、生成物など」という表現は、好ましい実施形態として、このような化合物、組成物、生成物などが処置、調節などに使用するためのものであることをさらに開示する。
【００３５】
[0055]  「に使用するための化合物、組成物、生成物など」又は「のための薬剤、医薬組成物、獣医用組成物、診断用組成物などの製造における化合物、組成物、生成物などの使用」という表現は、このような化合物、組成物、生成物などが、ヒト又は動物の身体において実施され得る治療方法に使用されるものであることを示す。それらは、処置などの方法に関する実施形態及び請求項の均等な開示であると考えられる。実施形態又は請求項が、このように、「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物を処置するのに使用するための化合物」を指す場合、これは、「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物を処置するための薬剤の製造における化合物の使用」又は「疾患に罹患している疑いのあるヒト又は動物に化合物を投与することによる処置の方法」の開示であるとも考えられる。「処置、調節などのための化合物、組成物、生成物など」という表現は、処置、調節などの示される目的に好適な化合物、組成物、生成物など自体を指すことが理解されるべきである。
【００３６】
[0056]  「医薬組成物」という用語は、医薬組成物内に含まれる環状ポリリボヌクレオチドが治療によるヒト又は動物の身体の処置のために使用され得ることも開示することが意図される。したがって、それは、「治療に使用するための環状ポリリボヌクレオチド」と同等であることが意図される。
【００３７】
[0057]  本明細書に記載される、環状ポリリボヌクレオチド、このような環状ポリリボヌクレオチドを含む組成物、このような環状ポリリボヌクレオチドを使用する方法などは、異なる要素、例えば複製要素、発現配列、スタガー要素及びエンクリプトゲン（例えば、実施例１を参照されたい）又は例えば発現配列、スタガー要素及び調節要素（例えば、実施例３０及び３８を参照されたい）を含む環状ポリリボヌクレオチドエフェクターが、異なる技術効果（例えば、実施例１及び３８における線状同等物より増加した翻訳効率並びに実施例３８における線状同等物より増加した半減期）を達成するのにどのように使用され得るかを示す実施例に部分的に基づいている。これ以降の説明が、実施例において考えられる特定の発見及び組合せの様々な変形を想定していることは、特にこれらの実施例に基づいている。
【００３８】
[0058]  本明細書において使用される際、「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃＲＮＡ）」、又は「環状ポリリボヌクレオチド」、又は「環状ＲＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＲＮＡ）」という用語は、同義的に使用され、共有結合又は非共有結合を介して環状構造を形成するポリリボヌクレオチドを指し得る。
【００３９】
[0059]  本明細書において使用される際、「エンクリプトゲン」という用語は、免疫細胞による検出を低下させ、避け、且つ／若しくは回避し、及び／又は環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答の誘導を低下させるのに役立つ環状ポリリボヌクレオチドの核酸配列又は構造を指し得る。
【００４０】
[0060]  本明細書において使用される際、「発現配列」という用語は、産物、例えばペプチド若しくはポリペプチド又は調節核酸をコードする核酸配列を指し得る。ペプチド又はポリペプチドをコードする例示的な発現配列は、複数のヌクレオチド三つ組を含むことができ、これらは、それぞれアミノ酸をコードすることができ、「コドン」と呼ばれる。
【００４１】
[0061]  本明細書において使用される際、「免疫タンパク質結合部位」という用語は、免疫タンパク質に結合するヌクレオチド配列を指し得る。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、外因性であるものとして環状ポリリボヌクレオチドをマスクするのに役立ち、例えば、免疫タンパク質結合部位は、環状ポリリボヌクレオチドが免疫タンパク質によって認識及び結合されることを防ぐタンパク質（例えば、競合阻害剤）によって結合され得、それにより環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を低下させるか又は回避する。本明細書において使用される際、「免疫タンパク質」という用語は、例えば、免疫原、例えば環状ポリリボヌクレオチドなどに対する免疫応答に関連する任意のタンパク質又はペプチドを指し得る。免疫タンパク質の非限定的な例としては、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、抗体（免疫グロブリン）、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質、補体タンパク質及びＲＮＡ結合タンパク質が挙げられる。
【００４２】
[0062]  本明細書において使用される際、「修飾リボヌクレオチド」という用語は、糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合に対する少なくとも１つの修飾を有するヌクレオチドを指し得る。
【００４３】
[0063]  本明細書において使用される際、「疑似らせん構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造を指し得、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部がらせん構造に折り畳まれる。
【００４４】
[0064]  本明細書において使用される際、「疑似二本鎖二次構造」という語句は、環状ポリリボヌクレオチドの高次構造を指し得、ここで、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも一部が内部二本鎖を形成する。
【００４５】
[0065]  本明細書において使用される際、「調節要素」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する核酸配列などの部分を指し得る。
[0066]  本明細書において使用される際、「反復ヌクレオチド配列」という用語は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡのストレッチ内又はゲノム全体にわたる反復核酸配列を指し得る。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＴＧ（ＵＧ）配列を含む。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリー中の反復される配列を含む。
【００４６】
[0067]  本明細書において使用される際、「複製要素」という用語は、複製に有用であるか、又は環状ポリリボヌクレオチドの転写を開始させる配列及び／又はモチーフを指し得る。
【００４７】
[0068]  本明細書において使用される際、「スタガー要素」という用語は、翻訳中のリボソームの休止を誘導するヌクレオチド配列などの部分を指し得る。ある実施形態において、スタガー要素は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列−Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ  Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）である。ある実施形態において、スタガー要素は、グリセロール、非核酸連結部分、化学修飾、修飾核酸又はそれらの任意の組合せなどの化学部分を含み得る。
【００４８】
[0069]  本明細書において使用される際、「実質的に抵抗性」という用語は、対照と比較して少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の抵抗性を有するものを指し得る。
【００４９】
[0070]  本明細書において使用される際、「化学量論的翻訳」という用語は、環状ポリリボヌクレオチドから翻訳された発現産物の実質的に同等の生成を指し得る。例えば、２つの発現配列を有する環状ポリリボヌクレオチドでは、環状ポリリボヌクレオチドの化学量論的翻訳は、２つの発現配列の発現産物が実質的に等しい量を有し得ること、例えば２つの発現配列間の量の差（例えば、モルの差）が約０又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％若しくは２０％未満であり得ることを意味し得る。
【００５０】
[0071]  本明細書において使用される際、「翻訳開始配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を開始させる核酸配列を指し得る。
[0072]  本明細書において使用される際、「終止要素」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を停止させる核酸配列などの部分を指し得る。
【００５１】
[0073]  本明細書において使用される際、「翻訳効率」という用語は、リボヌクレオチド転写産物からのタンパク質又はペプチド産生の速度又は量を指し得る。ある実施形態において、翻訳効率は、例えば、所与の翻訳系、例えばウサギ網状赤血球溶解物のようなインビトロ翻訳系において又は真核細胞若しくは原核細胞のようなインビボ翻訳系において、例えば所与の期間で、タンパク質又はペプチドをコードする所与の量の１転写産物当たりで生成されるタンパク質又はペプチドの量として表され得る。
【００５２】
[0074]  本明細書において使用される際、「環状化効率」という用語は、得られる環状ポリリボヌクレオチドの、その出発材料と比べた測定値を指し得る。
[0075]  本明細書において使用される際、「免疫原性」という用語は、物質に対する免疫応答を誘導する可能性を指し得る。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が誘導され得る。「非免疫原性」という用語は、物質に対する検出可能な閾値を超える免疫応答の欠如又は非存在を指し得る。ある実施形態において、生物又はある種の免疫細胞の免疫系が非免疫原性物質に曝されたとき、免疫応答が検出されない。ある実施形態において、本明細書において提供される非免疫原性環状ポリリボヌクレオチドは、免疫原性アッセイによって測定される際に所定の閾値を超える免疫応答を誘導しない。例えば、免疫原性アッセイを用いて、環状ポリリボヌクレオチド又は炎症マーカーに対して誘起される抗体を測定する際、本明細書において提供される非免疫原性ポリリボヌクレオチドは、所定の閾値より低いレベルで抗体又はマーカーの産生をもたらし得る。所定の閾値は、例えば、対照参照によって誘起される抗体又はマーカーのレベルの１．５倍、２倍、３倍、４倍又は５倍以下であり得る。
【００５３】
参照による援用
[0076]  本明細書に記載される全ての刊行物、特許及び特許出願は、それぞれの個々の刊行物、特許又は特許出願が具体的に及び個別に参照により援用されていることが示されているのと同程度に、参照により本明細書に援用される。
【００５４】
[0077]  本発明の実施形態の以下の詳細な説明は、添付の図面と共に読んだときによりよく理解されるであろう。本発明を例示する目的のために、本明細書で例示される実施形態が図面に示される。しかしながら、本発明は、図面に示される実施形態の正確な構成及び手段に限定されないことが理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】[0078]  図１は、様々な例示的な環状化方法を示す。
【図２】[0079]  図２は、開始コドン、ＧＦＰをコードするＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）、スタガー要素（２Ａ）、エンクリプトゲン及びＩＲＥＳ（内部リボソーム進入部位）を含有する環状ＲＮＡの例示的なインビトロ生成プロセスの概略図を示す。
【図３】[0080]  図３は、環状ＲＮＡの例示的なインビボ生成プロセスの概略図を示す。
【図４】[0081]  図４は、開始コドン、ＧＦＰをコードするＯＲＦ、スタガー要素（２Ａ）及びエンクリプトゲンを含む例示的な環状ＲＮＡの設計を示す。
【図５】[0082]  図５Ａ及び５Ｂは、２つの異なる環状ＲＮＡのインビボ化学量論的タンパク質発現を示す概略図である。
【図６】[0083]  図６は、イントロンを有し、ＧＦＰを発現する対照環状ＲＮＡの概略図を示す。
【図７】[0084]  図７は、リボスイッチに対するリガンドの存在下又は非存在下における環状ＲＮＡからのＧＦＰの発現を調節する合成リボスイッチ（赤色）を有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。
【図８】[0085]  図８は、例示的な環状ＲＮＡからのマウスモデルにおけるインビボタンパク質発現を示す概略図である。
【図９】[0086]  図９は、マウスモデルにおける例示的な環状ＲＮＡのインビボ生体内分布を示す概略図である。
【図１０】[0087]  図１０は、エンクリプトゲン（イントロン）を有する例示的な環状ＲＮＡからのマウスモデルにおけるインビボタンパク質発現を示す概略図である。
【図１１】[0088]  図１１は、その構造情報についてドットブロット分析にかけられ得る、１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。
【図１２】[0089]  図１２は、その構造情報についてＳＨＡＰＥ分析にかけられ得る、疑似らせん構造（ＨＤＶｍｉｎ）を有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。
【図１３】[0090]  図１３は、ＨＤＡｇ結合活性を示す、機能的疑似らせん構造（ＨＤＶｍｉｎ）を有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。
【図１４】[0091]  図１４は、例示的な自己複製可能な環状ＲＮＡの転写、自己切断及びライゲーションを示す概略図である。
【図１５】[0092]  図１５は、インビボで発現され、向上したインビボ安定性を有する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。
【図１６】[0093]  図１６は、有糸分裂中に保存され、娘細胞内で持続する例示的な環状ＲＮＡの概略図を示す。示されるＢｒｄＵパルスは、分割した細胞を標識するのに使用される。
【図１７】[0094]  図１７は、様々な例示的な環状ＲＮＡのインビトロ生成を示す変性ＰＡＧＥゲル画像である。
【図１８】[0095]  図１８は、様々な例示的な環状ＲＮＡの環状化効率をまとめたグラフである。
【図１９】[0096]  図１９は、その線状同等物と比較して、例示的な環状ＲＮＡの低下した分解感受性を示す変性ＰＡＧＥゲル画像である。
【図２０】[0097]  図２０は、例示的な精製プロセス後の例示的な環状ＲＮＡを示す変性ＰＡＧＥゲル画像である。
【図２１】[0098]  図２１は、ＩＲＥＳ、キャップ、５’及び３’ＵＴＲを欠いた例示的な環状ＲＮＡによるＦｌａｇタンパク質（約１５ｋＤａ）の発現を示すウエスタンブロット画像である。
【図２２】[0099]  図２２は、例示的な環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を示すウエスタンブロット画像である。
【図２３】[0100]  図２３は、例示的なスタガー要素を用いた又は用いない様々な例示的な環状ＲＮＡからの別個のタンパク質又は連続した長鎖ペプチドの生成を示すウエスタンブロット画像を示す。
【図２４】[0101]  図２４Ａは、例示的なスタガー要素又は終止要素（終止コドン）を用いた様々な例示的な環状ＲＮＡ間のタンパク質発現の比較を示すウエスタンブロット画像である。[0102]  図２４Ｂは、２つの例示的な環状ＲＮＡから翻訳されたタンパク質産物のウエスタンブロット分析からのシグナル強度をまとめたグラフである。
【図２５】[0103]  図２５は、ビヒクル対照ＲＮＡと比較した、例示的な環状ＲＮＡ及びその線状同等物の翻訳産物のルシフェラーゼ活性をまとめたグラフである。
【図２６】[0104]  図２６は、例示的な環状ＲＮＡの半減期を試験する時間経過実験における異なる収集時点におけるＲＮＡ量をまとめたグラフである。
【図２７】[0105]  図２７Ａは、線状及び環状ＲＮＡの両方を捕捉したプライマーを用いた細胞への送達の２４時間後の線状及び環状ＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示すグラフである。[0106]  図２７Ｂは、環状ＲＮＡに対して特異的なプライマーを用いた線状及び環状ＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示すグラフである。
【図２８】[0107]  図２８は、ＥＧＦタンパク質及びβ−チューブリンローディングコントロールについて調べられた環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡからの細胞溶解物のブロットを示す画像である。
【図２９】[0108]  図２９は、環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲ分析を示すグラフである。
【図３０】[0109]  図３０は、ローリングサークル型翻訳によって環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図３１】[0110]  図３１は、環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図３２】[0111]  図３２は、ローリングサークル型翻訳によって線状ＲＮＡ又は環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図３３】[0112]  図３３は、ＩＲＥＳ翻訳開始によって環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図３４】[0113]  図３４は、ＩＲＥＳ開始及びローリングサークル型翻訳によって環状ＲＮＡから発現されたタンパク質のルシフェラーゼ活性を示すグラフである。
【図３５】[0114]  図３５は、環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡからの発現産物のタンパク質ブロットを示す画像である。
【図３６】[0115]  図３６は、環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡからの発現産物のタンパク質ブロットを示す画像である。
【図３７】[0116]  図３７は、例示的な環状ＲＮＡの疑似二本鎖構造を有する予測構造を示す。
【図３８】[0117]  図３８は、例示的な環状ＲＮＡの疑似らせん構造を有する予測構造を示す。
【図３９】[0118]  図３９は、例示的な環状ＲＮＡの反復配列と連結された疑似らせん構造を有する予測構造を示す。
【図４０】[0119]  図４０は、例示的な環状ＲＮＡのＲＮＡｓｅ  Ｈによる分解が、コンカテマーＲＮＡではなく環状ＲＮＡと一致する核酸分解産物を生成したという実験データを示す。
【図４１】[0120]  図４１は、様々なＲＮＡ長さの形成のために生成された様々な長さのＤＮＡの電気泳動画像を示す。
【図４２】[0121]  図４２は、様々な長さの環状結合に対するＲＮＡｓｅ  Ｒ処理及びｑＰＣＲ分析を用いてＲＮＡの環状化を確認した実験データを示す。
【図４３】[0122]  図４３は、ｍｉＲＮＡ結合部位を有する例示的な環状ＲＮＡの生成を示す。
【図４４】[0123]  図４４は、自己スプライシングによる例示的な環状ＲＮＡの生成を示す。
【図４５】[0124]  図４５は、タンパク質結合部位を有する例示的な環状ＲＮＡの生成を示す。
【図４６】[0125]  図４６は、線状対照と比較して、分割細胞内の環状ＲＮＡのより高い安定性を示す実験データを示す。
【図４７】[0126]  図４７は、複数の発現配列を有する例示的な環状ＲＮＡからのタンパク質発現及び複数の発現配列を有する例示的な環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を示す実験データを示す。
【図４８】[0127]  図４８は、線状対照と比較して、例示的な環状ＲＮＡのトランスフェクトされた細胞に対する減少した毒性を示す実験データを示す。
【図４９】[0128]  図４９は、例示的な環状ＲＮＡがストレス条件下で線状ＲＮＡと比較してより高いレベルで翻訳されたことを示す。
【図５０】[0129]  図５０は、リボスイッチを有する環状ＲＮＡの生成を示す。
【図５１Ａ】[0130]  図５１Ａは、修飾環状ＲＮＡが細胞内で翻訳されたことを示す。
【図５１Ｂ】図５１Ｂは、修飾環状ＲＮＡが細胞内で翻訳されたことを示す。
【図５１Ｃ】図５１Ｃは、修飾環状ＲＮＡが細胞内で翻訳されたことを示す。
【図５２Ａ】[0131]  図５２Ａは、修飾環状ＲＮＡが、トランスフェクトされた細胞内のＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ−β発現によって評価した際、細胞に対する非修飾環状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有することを示す。
【図５２Ｂ】図５２Ｂは、修飾環状ＲＮＡが、トランスフェクトされた細胞内のＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ−β発現によって評価した際、細胞に対する非修飾環状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有することを示す。
【図５２Ｃ】図５２Ｃは、修飾環状ＲＮＡが、トランスフェクトされた細胞内のＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ−β発現によって評価した際、細胞に対する非修飾環状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有することを示す。
【図５３】[0132]  図５３は、マウスへの注入後、環状ＲＮＡが、注入の３、４及び７日後の時点でマウスの肝臓における線状ＲＮＡより高いレベルで検出されたことを示す。
【図５４Ａ】[0133]  図５４Ａは、マウスへのガウシアルシフェラーゼを発現する環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡの注入後、ガウシアルシフェラーゼ活性が環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血漿中において検出された一方、その活性が修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中において検出されたことを示す。
【図５４Ｂ】図５４Ｂは、マウスへのガウシアルシフェラーゼを発現する環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡの注入後、ガウシアルシフェラーゼ活性が環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血漿中において検出された一方、その活性が修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中において検出されたことを示す。
【図５５】[0134]  図５５は、ＲＮＡの注入後、線状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡがＲＮＡの投与の１６日後の時点で肝臓及び脾臓中で検出されたことを示す。
【図５６】[0135]  図５６は、ＲＮＡの注入後、環状ＲＮＡではなく線状ＲＮＡが、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ−５、ＩＦＮ−Ｂ及びＯＡＳによって評価した際、免疫原性を示したことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５６】
[0136]  本発明は、概して、環状ポリリボヌクレオチド医薬組成物及び調製並びにその使用に関する。
【００５７】
環状ポリリボヌクレオチド
[0137]  ある態様において、本明細書に記載される本発明は、組成物並びに環状ポリリボヌクレオチドの使用及び作製方法並びに環状ポリリボヌクレオチドの送達を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物、例えばヒトにおいて非免疫原性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えばペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞又はそれらの任意の組合せにおいて複製することが可能であるか又は複製する。ある実施形態において、本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む細胞を含み、ここで、細胞は、水産養殖動物（魚、カニ、エビ、カキなど）に由来する細胞、哺乳動物細胞、例えばペット若しくは動物園の動物（ネコ、イヌ、トカゲ、鳥類、ライオン、トラ及びクマなど）に由来する細胞、家畜若しくは使役動物（ウマ、ウシ、ブタ、ニワトリなど）に由来する細胞、ヒト細胞、培養細胞、初代細胞若しくは細胞株、幹細胞、前駆細胞、分化した細胞、生殖細胞、癌細胞（例えば、腫瘍形成性、転移性）、非腫瘍形成性細胞（正常細胞）、胎児細胞、胚細胞、成体細胞、有糸分裂細胞、非有糸分裂細胞又はそれらの任意の組合せである。ある実施形態において、細胞は、環状ポリリボヌクレオチドを含むように改変される。
【００５８】
[0138]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、配列又は発現産物を含む。
[0139]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも、線状同等物、例えば線状発現配列又は線状環状ポリリボヌクレオチドのものの半減期を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより増加した半減期を有する。ある実施形態において、半減期は、約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％又はそれを超えて増加される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間〜約３０日間又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたって細胞内で半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分間以下〜約７日間又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下又はそれらの間の任意の時間にわたって細胞内で半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞が分割している間、細胞内で半減期又は持続性を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分割後の細胞内で半減期又は持続性を有する。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０分間超〜約３０日間又は少なくとも約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたり、分割している細胞内で半減期又は持続性を有する。
【００５９】
[0140]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞機能、例えば一時的に又は長期間調節する。特定の実施形態において、少なくとも約１時間〜約３０日間又は少なくとも約２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたって持続する、調節などの細胞機能は、安定して変化される。特定の実施形態において、例えば約３０分間以下〜約７日間又は約１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２４時間、３６時間、４８時間、６０時間、７２時間、４日間、５日間、６日間、７日間以下又はそれらの間の任意の時間にわたって持続する、調節などの細胞機能は、一時的に変化される。
【００６０】
[0141]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソームのための結合部位に対応するのに十分なサイズのものであり得る。当業者は、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズが、環状ポリリボヌクレオチドを生成し、且つ／又は環状ポリリボヌクレオチドを使用する技術的制約の範囲内である程度の大きさであり得ることを理解することができる。理論によって制約されるものではないが、ＲＮＡの複数のセグメントが、ＤＮＡ並びにＲＮＡの「列」を生成するようにアニールされたそれらの５’及び３’遊離末端（それらは、最終的に、１つの５’遊離末端及び１つの３’遊離末端のみが残るときに環状化され得る）から生成され得ることが可能である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの最大サイズは、ＲＮＡをパッケージングと、標的に送達する能力によって制限され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのサイズは、有用なポリペプチドをコードするのに十分な長さであり、したがって少なくとも２０，０００ヌクレオチド、少なくとも１５，０００ヌクレオチド、少なくとも１０，０００ヌクレオチド、少なくとも７，５００ヌクレオチド又は少なくとも５，０００ヌクレオチド、少なくとも４，０００ヌクレオチド、少なくとも３，０００ヌクレオチド、少なくとも２，０００ヌクレオチド、少なくとも１，０００ヌクレオチド、少なくとも５００ヌクレオチド、少なくとも４００ヌクレオチド、少なくとも３００ヌクレオチド、少なくとも２００ヌクレオチド、少なくとも１００ヌクレオチドの長さが有用であり得る。
【００６１】
[0142]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の要素を含む。ある実施形態において、要素は、スペーサー配列又はリンカーによって互いに隔てられ得る。ある実施形態において、要素は、１リボヌクレオチド、２ヌクレオチド、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約３０ヌクレオチド、約４０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約６０ヌクレオチド、約８０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチド、約１５０ヌクレオチド、約２００ヌクレオチド、約２５０ヌクレオチド、約３００ヌクレオチド、約４００ヌクレオチド、約５００ヌクレオチド、約６００ヌクレオチド、約７００ヌクレオチド、約８００ヌクレオチド、約９００ヌクレオチド、約１０００ヌクレオチド、最大で約１ｋｂ、少なくとも約１０００ヌクレオチド、それらの間のヌクレオチドの任意の量だけ互いに隔てられ得る。ある実施形態において、１つ以上の要素は、例えば、スペーサー要素を欠いて、互いに連続している。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の要素は、立体配座柔軟性がある。ある実施形態において、立体配座柔軟性は、配列が二次構造を実質的に含まないことによる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載される１つ以上の所望の機能又は特性に対応する、例えばリボソームのための結合部位、例えば翻訳、例えばローリングサークル型翻訳に対応する二次又は三次構造を含む。
【００６２】
[0143]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、特定の配列特性を含む。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、特定のヌクレオチド組成物を含み得る。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のプリンリッチ領域（アデニン又はグアノシン）を含み得る。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のプリンリッチ領域（アデニン又はグアノシン）を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＡＵリッチ領域又は要素（ＡＲＥ）を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のアデニンリッチ領域を含み得る。
【００６３】
[0144]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の反復要素を含み得る。
[0145]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む。
【００６４】
[0146]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、インビボで対象の細胞内における持続的発現のために構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される。このような実施形態において、１つ以上の発現配列の発現は、比較的安定したレベルに維持され得るか、又は時間と共に増加し得る。発現配列の発現は、長期間にわたって比較的に安定的であり得る。例えば、ある場合において、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日又はそれを超える期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現は、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％減少しない。ある場合において、細胞内における１つ以上の発現配列の発現は、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日又はそれを超えて、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２５％、２０％、１５％、１０％又は５％を超えて変化しないレベルに維持される。
【００６５】
発現配列
ペプチド又はポリペプチド
[0147]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ペプチド又はポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む。このようなペプチドとしては、限定はされないが、低分子ペプチド、ペプチド模倣物（例えば、ペプトイド）、アミノ酸及びアミノ酸類似体が挙げられる。ペプチドは、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。このようなペプチドは、１モル当たり約５，０００ｇ未満の分子量、１モル当たり約２，０００ｇ未満の分子量、１モル当たり約１，０００ｇ未満の分子量、１モル当たり約５００ｇ未満の分子量並びにこのような化合物の塩、エステル及び他の薬学的に許容される形態を有し得る。このようなペプチドとしては、限定はされないが、神経伝達物質、ホルモン、薬剤、毒素、ウイルス若しくは微生物粒子、合成分子及びそれらのアゴニスト又はアンタゴニストが挙げられる。
【００６６】
[0148]  ポリペプチドは、直鎖状又は分枝鎖状であり得る。ポリペプチドは、約５〜約４０，０００アミノ酸、約１５〜約３５，０００アミノ酸、約２０〜約３０，０００アミノ酸、約２５〜約２５，０００アミノ酸、約５０〜約２０，０００アミノ酸、約１００〜約１５，０００アミノ酸、約２００〜約１０，０００アミノ酸、約５００〜約５，０００アミノ酸、約１，０００〜約２，５００アミノ酸又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。ある実施形態において、ポリペプチドは、約４０，０００未満のアミノ酸、約３５，０００未満のアミノ酸、約３０，０００未満のアミノ酸、約２５，０００未満のアミノ酸、約２０，０００未満のアミノ酸、約１５，０００未満のアミノ酸、約１０，０００未満のアミノ酸、約９，０００未満のアミノ酸、約８，０００未満のアミノ酸、約７，０００未満のアミノ酸、約６，０００未満のアミノ酸、約５，０００未満のアミノ酸、約４，０００未満のアミノ酸、約３，０００未満のアミノ酸、約２，５００未満のアミノ酸、約２，０００未満のアミノ酸、約１，５００未満のアミノ酸、約１，０００未満のアミノ酸、約９００未満のアミノ酸、約８００未満のアミノ酸、約７００未満のアミノ酸、約６００未満のアミノ酸、約５００未満のアミノ酸、約４００未満のアミノ酸、約３００未満のアミノ酸又はそれを下回る長さを有し、有用であり得る。
【００６７】
[0149]  ペプチド又はポリペプチドのいくつかの例としては、限定はされないが、蛍光タグ又はマーカー、抗原、ペプチド治療薬、天然生物活性ペプチドに由来する合成若しくはアナログペプチド、アゴニスト若しくはアンタゴニストペプチド、抗菌ペプチド、孔形成ペプチド、二環式ペプチド、標的化若しくは細胞毒性ペプチド、分解若しくは自壊性ペプチド及び複数の分解若しくは自壊性ペプチドが挙げられる。本明細書に記載される本発明において有用なペプチドとしては、抗原結合ペプチド、例えば抗原結合抗体又は抗体様フラグメント、例えば一本鎖抗体、ナノボディも挙げられる（例えば、Ｓｔｅｅｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１６．Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ  ａｓ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ｂｉｇ  ｏｐｐｏｒｔｕｎｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｓｍａｌｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ：２１（７）：１０７６−１１３を参照されたい）。このような抗原結合ペプチドは、細胞質抗原、核抗原、小器官内抗原に結合し得る。
【００６８】
[0150]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ発現配列を含み、これらは、それぞれポリペプチドをコードし得る。ポリペプチドは、かなりの量で生成され得る。したがって、ポリペプチドは、生成され得る任意のタンパク質分子であり得る。ポリペプチドは、細胞から分泌されるか、又は細胞の細胞質、核若しくは膜区画に限局され得るポリペプチドであり得る。いくつかのポリペプチドとしては、限定はされないが、ウイルスエンベロープタンパク質の少なくとも一部、代謝調節酵素（例えば、脂質又はステロイド産生を調節する）、抗原、トレラゲン、サイトカイン、毒素、非存在が疾患に関連する酵素、及び切断されるまで動物内（例えば、動物の腸内）で活性でないポリペプチド、及びホルモンが挙げられる。
【００６９】
[0151]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えば治療用タンパク質をコードする発現配列を含む。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る治療用タンパク質は、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性又は輸送活性を有する。治療用タンパク質のいくつかの例としては、限定はされないが、酵素補充タンパク質、補充用のタンパク質、タンパク質ワクチン接種、抗原（例えば腫瘍抗原、ウイルス、細菌）、ホルモン、サイトカイン、抗体、免疫療法（例えば、癌）、リプログラミング／分化転換因子、転写因子、キメラ抗原受容体、トランスポザーゼ又はヌクレアーゼ、免疫エフェクター（例えば、免疫応答／シグナルに対する感受性に影響を与える）、調節された死エフェクタータンパク質（例えば、アポトーシス又は壊死の誘導因子）、腫瘍の非溶解性阻害剤（例えば、癌タンパク質の阻害剤）、エピジェネティック修飾剤、エピジェネティック酵素、転写因子、ＤＮＡ又はタンパク質修飾酵素、ＤＮＡ挿入剤、排出ポンプ阻害剤、核内受容体活性化剤若しくは阻害剤、プロテアソーム阻害剤、酵素用の競合阻害剤、タンパク質合成エフェクター若しくは阻害剤、ヌクレアーゼ、タンパク質フラグメント若しくはドメイン、リガンド若しくは受容体及びＣＲＩＳＰＲシステム若しくはその構成要素が挙げられる。
【００７０】
[0152]  ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、ヒトタンパク質、例えば受容体結合タンパク質、ホルモン、成長因子、成長因子受容体モジュレータ及び再生タンパク質（例えば、増殖及び分化に関与しているタンパク質、例えば創傷治癒のための治療用タンパク質）が挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、ＥＧＦ（上皮成長因子）が挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、酵素、例えばオキシドレダクターゼ酵素、代謝酵素、ミトコンドリア酵素、オキシゲナーゼ、デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ非依存性酵素及びデサチュラーゼが挙げられる。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、細胞内タンパク質又は細胞質タンパク質が挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）ルシフェラーゼ（ｎＬｕｃ）を発現する。ある実施形態において、本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、分泌タンパク質、例えば分泌酵素が挙げられる。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、血液中で治療効果のある短い半減期を有し得る分泌タンパク質を発現するか、又は細胞内局在化シグナルを有するタンパク質若しくは分泌シグナルペプチドを有するタンパク質であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガウシアルシフェラーゼ（ｇＬｕｃ）を発現する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、非ヒトタンパク質、例えば蛍光タンパク質、エネルギー移動受容体又はＦｌａｇ、Ｍｙｃ若しくはＨｉｓのようなタンパク質タグを発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドから発現され得る例示的なタンパク質としては、ＧＦＰが挙げられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タグ化タンパク質、例えばタンパク質タグを含有する融合タンパク質又は改変タンパク質、例えばキチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｆｃタグ、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、ＡｖｉＴａｇ（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）、カルモジュリン−タグ（ＫＲＲＷＫＫＮＦＩＡＶＳＡＡＮＲＦＫＫＩＳＳＳＧＡＬ）；ポリグルタメートタグ（ＥＥＥＥＥＥ）；Ｅ−タグ（ＧＡＰＶＰＹＰＤＰＬＥＰＲ）；ＦＬＡＧ−タグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）、ＨＡ−タグ（ＹＰＹＤＶＰＤＹＡ）；Ｈｉｓ−タグ（ＨＨＨＨＨＨ）；Ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）；ＮＥ−タグ（ＴＫＥＮＰＲＳＮＱＥＥＳＹＤＤＮＥＳ）；Ｓ−タグ（ＫＥＴＡＡＡＫＦＥＲＱＨＭＤＳ）；ＳＢＰ−タグ（ＭＤＥＫＴＴＧＷＲＧＧＨＶＶＥＧＬＡＧＥＬＥＱＬＲＡＲＬＥＨＨＰＱＧＱＲＥＰ）；Ｓｏｆｔａｇ  １（ＳＬＡＥＬＬＮＡＧＬＧＧＳ）；Ｓｏｆｔａｇ  ３（ＴＱＤＰＳＲＶＧ）；Ｓｐｏｔ−タグ（ＰＤＲＶＲＡＶＳＨＷＳＳ）；Ｓｔｒｅｐ−タグ（Ｓｔｒｅｐ−タグＩＩ：ＷＳＨＰＱＦＥＫ）；ＴＣタグ（ＣＣＰＧＣＣ）；Ｔｙタグ（ＥＶＨＴＮＱＤＰＬＤ）；Ｖ５タグ（ＧＫＰＩＰＮＰＬＬＧＬＤＳＴ）；ＶＳＶ−タグ（ＹＴＤＩＥＭＮＲＬＧＫ）；又はＸｐｒｅｓｓタグ（ＤＬＹＤＤＤＤＫ）を発現する。
【００７１】
[0153]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体、例えば抗体フラグメント又はその部分を発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドによって発現される抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭなどの任意のアイソタイプのものであり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の一部、例えば軽鎖、重鎖、Ｆｃフラグメント、ＣＤＲ（相補性決定領域）、Ｆｖフラグメント又はＦａｂフラグメント、そのさらなる部分を発現する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の１つ以上の部分を発現する。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含むことができ、これらは、それぞれ抗体の一部を発現し、これらの集合が抗体を構成し得る。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドは、抗体の重鎖をコードする１つの発現配列及び抗体の軽鎖をコードする別の発現配列を含む。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチドが細胞内又は無細胞環境で発現される場合、軽鎖及び重鎖は、適切な修飾、折り畳み又は機能的抗体を形成する他の翻訳後修飾に供され得る。
【００７２】
調節要素
[0154]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節要素、例えば環状ポリリボヌクレオチド内の発現配列の発現を調節する配列を含む。
【００７３】
[0155]  調節要素は、発現産物をコードする発現配列に隣接して位置する配列を含み得る。調節要素は、隣接する配列に動作可能に連結され得る。調節要素は、調節要素が存在しない場合に発現される産物の量と比較して、発現される産物の量を増加させ得る。さらに、１つの調節要素が、並んで結合された複数の発現配列について発現される産物の量を増加させ得る。したがって、１つの調節要素が１つ以上の発現配列の発現を促進することができる。複数の調節要素が当業者に周知である。
【００７４】
[0156]  本明細書において提供される調節要素は、選択的翻訳配列を含み得る。本明細書において使用される際、「選択的翻訳配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド、例えば特定のリボスイッチアプタザイム中の発現配列の翻訳を選択的に開始させるか又は活性化する核酸配列を指し得る。調節要素は、選択的分解配列も含み得る。本明細書において使用される際、「選択的分解配列」という用語は、環状ポリリボヌクレオチド又は環状ポリリボヌクレオチドの発現産物の分解を開始させる核酸配列を指し得る。例示的な選択的分解配列は、リボスイッチアプタザイム及びｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。
【００７５】
[0157]  ある実施形態において、調節要素は、翻訳モジュレータである。翻訳モジュレータは、環状ポリリボヌクレオチド中の発現配列の翻訳を調節し得る。翻訳モジュレータは、翻訳エンハンサー又はサプレッサーであり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳モジュレータを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接する翻訳モジュレータを含む。ある実施形態において、翻訳モジュレータは、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物、例えばペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。
【００７６】
[0158]  ある実施形態において、翻訳開始配列は、調節要素として機能し得る。ある実施形態において、翻訳開始配列は、ＡＵＧコドンを含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、ＡＵＧ、ＣＵＧ、ＧＵＧ、ＵＵＧ、ＡＣＧ、ＡＵＣ、ＡＵＵ、ＡＡＧ、ＡＵＡ又はＡＧＧなどの任意の真核生物開始コドンを含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、コザック配列を含む。ある実施形態において、翻訳は、選択的条件、例えばストレス誘発性条件下で別の翻訳開始配列、例えばＡＵＧコドン以外の翻訳開始配列から開始する。非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧなどの別の翻訳開始配列から開始する。別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチド翻訳は、別の翻訳開始配列、ＣＴＧ／ＣＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチド翻訳は、別の翻訳開始配列、ＧＴＧ／ＧＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドは、反復ＲＮＡ、例えばＣＧＧ、ＧＧＧＧＣＣ、ＣＡＧ、ＣＴＧの短いストレッチを含む別の翻訳開始配列などのリピート関連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列から翻訳を開始し得る。
【００７７】
[0159]  限定はされないが、開始コドン又は別の開始コドンなど、翻訳を開始させるコドンに隣接するヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率、長さ及び／又は構造に影響を与えることが知られている。（例えば、内容全体が参照により本明細書に援用されるＭａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照されたい）。翻訳を開始するコドンに隣接するヌクレオチドのいずれかをマスクすることを用いて、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳開始の位置、翻訳効率、長さ及び／又は構造を変化させ得る。
【００７８】
[0160]  一実施形態において、マスキング剤は、マスクされた開始コドン又は別の開始コドンにおける翻訳開始の可能性を低下させるために、コドンをマスクするか又は隠すために、開始コドン又は別の開始コドンの近くで使用され得る。マスキング剤の非限定的な例としては、アンチセンスロックト核酸（ＬＮＡ）オリゴヌクレオチド及びエクソン接合部複合体（ＥＪＣ）が挙げられる。（例えば、内容全体が参照により本明細書に援用されるＭａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ｄｅｓｃｒｉｂｉｎｇ  ｍａｓｋｉｎｇ  ａｇｅｎｔｓ  ＬＮＡ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  ＥＪＣｓ（ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１）を参照されたい）。別の実施形態において、マスキング剤は、翻訳が別の開始コドンから開始する可能性を増加させるために、環状ポリリボヌクレオチドの開始コドンをマスクするために使用され得る。
【００７９】
[0161]  ある実施形態において、翻訳は、限定はされないが、ＧＲＳＦ−１の存在下におけるウイルス誘発性選択などの選択的条件下で開始され、環状ポリリボヌクレオチドは、ＧＲＳＦ−１結合部位を含み、例えばｈｔｔｐ：／／ｊｖｉ．ａｓｍ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／７６／２０／１０４１７．ｆｕｌｌを参照されたい。
【００８０】
翻訳開始配列
[0162]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリペプチドをコードし、翻訳開始配列、例えば開始コドンを含み得る。ある実施形態において、翻訳開始配列は、コザック又はシャイン・ダルガノ配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する翻訳開始配列、例えばコザック配列を含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、非コード開始コドンである。ある実施形態において、翻訳開始配列、例えばコザック配列は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物の分離をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つの翻訳開始配列を含む。ある実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドに立体配座柔軟性を与える。ある実施形態において、翻訳開始配列は、環状ポリリボヌクレオチドの実質的に一本鎖領域内にある。
【００８１】
[0163]  環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２５、少なくとも３０、少なくとも３５、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０又は６０超の開始コドンなどの２つ以上の開始コドンを含み得る。翻訳は、第１の開始コドン上で開始し得るか、又は第１の開始コドンの下流で開始し得る。
【００８２】
[0164]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、第１の開始コドンでないコドン、例えばＡＵＧから開始し得る。環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、限定はされないが、ＡＣＧ、ＡＧＧ、ＡＡＧ、ＣＴＧ／ＣＵＧ、ＧＴＧ／ＧＵＧ、ＡＴＡ／ＡＵＡ、ＡＴＴ／ＡＵＵ、ＴＴＧ／ＵＵＧなどの別の翻訳開始配列から開始し得る（それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用されるＴｏｕｒｉｏｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ  ９５（２００３）１６９−１７８及びＭａｔｓｕｄａ  ａｎｄ  Ｍａｕｒｏ  ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，２０１０  ５：１１を参照されたい）。ある実施形態において、翻訳は、選択的条件、例えばストレス誘発性条件下で別の翻訳開始配列から開始する。非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳は、ＡＣＧなどの別の翻訳開始配列から開始し得る。別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチド翻訳は、別の翻訳開始配列、ＣＴＧ／ＣＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチド翻訳は、別の翻訳開始配列、ＧＴＧ／ＧＵＧから開始し得る。さらに別の非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドは、反復ＲＮＡ、例えばＣＧＧ、ＧＧＧＧＣＣ、ＣＡＧ、ＣＴＧの短いストレッチを含む別の翻訳開始配列などのリピート関連非ＡＵＧ（ＲＡＮ）配列から翻訳を開始し得る。
【００８３】
[0165]  ある実施形態において、翻訳は、Ｒｏｃａｇｌａｔｅｓによる真核生物開始因子４Ａ（ｅＩＦ４Ａ）処理によって開始される（翻訳は、４３Ｓスキャニングをブロックすることによって抑制されて、ＲｏｃＡ−ｅＩＦ４Ａ標的配列を有する転写産物からの早期の上流の翻訳開始及び減少したタンパク質発現につながり、例えばｗｗｗ．ｎａｔｕｒｅ．ｃｏｍ／ａｒｔｉｃｌｅｓ／ｎａｔｕｒｅ１７９７８を参照されたい）。
【００８４】
ＩＲＥＳ
[0166]  ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）要素を含む。環状ポリリボヌクレオチド中に含むのに好適なＩＲＥＳ要素は、真核生物リボソームにかみ合うことが可能なＲＮＡ配列を含む。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、少なくとも約５ｎｔ、少なくとも約８ｎｔ、少なくとも約９ｎｔ、少なくとも約１０ｎｔ、少なくとも約１５ｎｔ、少なくとも約２０ｎｔ、少なくとも約２５ｎｔ、少なくとも約３０ｎｔ、少なくとも約４０ｎｔ、少なくとも約５０ｎｔ、少なくとも約１００ｎｔ、少なくとも約２００ｎｔ、少なくとも約２５０ｎｔ、少なくとも約３５０ｎｔ又は少なくとも約５００ｎｔである。一実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、限定はされないが、ウイルス、哺乳動物及びショウジョウバエ（Drosophila）を含む生物のＤＮＡに由来する。このようなウイルスＤＮＡは、限定はされないが、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）ｃＤＮＡ及びポリオウイルスｃＤＮＡと共にピコルナウイルス相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に由来し得る。一実施形態において、ＩＲＥＳ要素が由来するショウジョウバエ（Drosophila）ＤＮＡとしては、限定はされないが、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）に由来するアンテナペディア遺伝子が挙げられる。
【００８５】
[0167]  ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、ウイルスに少なくとも部分的に由来し、例えば、それは、ＡＢＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＡＥＶ、ＡＬＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＢＱＣＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＢＶＤＶ１＿１−３８５、ＢＶＤＶ１＿２９−３９１、ＣｒＰＶ＿５ＮＣＲ、ＣｒＰＶ＿ＩＧＲ、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｃｐ、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｍｐ７５、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｍｐ２２８、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｃｐ、ｃｒＴＭＶ＿ＩＲＥＳｃｐ、ＣＳＦＶ、ＣＶＢ３、ＤＣＶ＿ＩＧＲ、ＥＭＣＶ−Ｒ、ＥｏＰＶ＿５ＮＴＲ、ＥＲＡＶ＿２４５−９６１、ＥＲＢＶ＿１６２−９２０、ＥＶ７１＿１−７４８、ＦｅＬＶ−Ｎｏｔｃｈ２、ＦＭＤＶ＿ｔｙｐｅ＿Ｃ、ＧＢＶ−Ａ、ＧＢＶ−Ｂ、ＧＢＶ−Ｃ、ｇｙｐｓｙ＿ｅｎｖ、ｇｙｐｓｙＤ５、ｇｙｐｓｙＤ２、ＨＡＶ＿ＨＭ１７５、ＨＣＶ＿ｔｙｐｅ＿１ａ、ＨｉＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＨＩＶ−１、ＨｏＣＶ１＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＨＲＶ−２、ＩＡＰＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ｉｄｅｆｉｘ、ＫＢＶ＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＬＩＮＥ−１＿ＯＲＦ１＿−１０１＿ｔｏ＿−１、ＬＩＮＥ−１＿ＯＲＦ１＿−３０２＿ｔｏ＿−２０２、ＬＩＮＥ−１＿ＯＲＦ２＿−１３８＿ｔｏ＿−８６、ＬＩＮＥ−１＿ＯＲＦ１＿−４４＿ｔｏ＿−１、ＰＳＩＶ＿ＩＧＲ、ＰＶ＿ｔｙｐｅ１＿Ｍａｈｏｎｅｙ、ＰＶ＿ｔｙｐｅ３＿Ｌｅｏｎ、ＲＥＶ−Ａ、ＲｈＰＶ＿５ＮＣＲ、ＲｈＰＶ＿ＩＧＲ、ＳＩＮＶ１＿ＩＧＲｐｒｅｄ、ＳＶ４０＿６６１−８３０、ＴＭＥＶ、ＴＭＶ＿ＵＩ＿ＩＲＥＳｍｐ２２８、ＴＲＶ＿５ＮＴＲ、ＴｒＶ＿ＩＧＲ又はＴＳＶ＿ＩＧＲなどのウイルスＩＲＥＳ要素に由来し得る。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、ＡＭＬ１／ＲＵＮＸ１、Ａｎｔｐ−Ｄ、Ａｎｔｐ−ＤＥ、Ａｎｔｐ−ＣＤＥ、Ａｐａｆ−１、Ａｐａｆ−１、ＡＱＰ４、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ１、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ２、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ３、ＡＴ１Ｒ＿ｖａｒ４、ＢＡＧ１＿ｐ３６ｄｅｌｔａ２３６ｎｔ、ＢＡＧ１＿ｐ３６、ＢＣＬ２、ＢｉＰ＿−２２２＿−３、ｃ−ＩＡＰ１＿２８５−１３９９、ｃ−ＩＡＰ１＿１３１３−１４６２、ｃ−ｊｕｎ、ｃ−ｍｙｃ、Ｃａｔ−１＿２２４、ＣＣＮＤ１、ＤＡＰ５、ｅＩＦ４Ｇ、ｅＩＦ４ＧＩ−ｅｘｔ、ｅＩＦ４ＧＩＩ、ｅＩＦ４ＧＩＩ−ｌｏｎｇ、ＥＬＧ１、ＥＬＨ、ＦＧＦ１Ａ、ＦＭＲ１、Ｇｔｘ−１３３−１４１、Ｇｔｘ−１−１６６、Ｇｔｘ−１−１２０、Ｇｔｘ−１−１９６、ｈａｉｒｌｅｓｓ、ＨＡＰ４、ＨＩＦ１ａ、ｈＳＮＭ１、Ｈｓｐ１０１、ｈｓｐ７０、ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、ＩＧＦ２＿ｌｅａｄｅｒ２、Ｋｖ１．４＿１．２、Ｌ−ｍｙｃ、ＬａｍＢ１＿−３３５＿−１、ＬＥＦ１、ＭＮＴ＿７５−２６７、ＭＮＴ＿３６−１６０、ＭＴＧ８ａ、ＭＹＢ、ＭＹＴ２＿９９７−１１５２、ｎ−ＭＹＣ、ＮＤＳＴ１、ＮＤＳＴ２、ＮＤＳＴ３、ＮＤＳＴ４Ｌ、ＮＤＳＴ４Ｓ、ＮＲＦ＿−６５３＿−１７、ＮｔＨＳＦ１、ＯＤＣ１、ｐ２７ｋｉｐ１、ｐ５３＿１２８−２６９、ＰＤＧＦ２／ｃ−ｓｉｓ、Ｐｉｍ−１、ＰＩＴＳＬＲＥ＿ｐ５８、Ｒｂｍ３、ｒｅａｐｅｒ、Ｓｃａｍｐｅｒ、ＴＦＩＩＤ、ＴＩＦ４６３１、Ｕｂｘ＿１−９６６、Ｕｂｘ＿３７３−９６１、ＵＮＲ、Ｕｒｅ２、ＵｔｒＡ、ＶＥＧＦ−Ａ＿−１３３＿−１、ＸＩＡＰ＿５−���６４、ＸＩＡＰ＿３０５−４６６又はＹＡＰ１などの細胞ＩＲＥＳに少なくとも部分的に由来する。ある実施形態において、ＩＲＥＳ要素は、合成ＩＲＥＳ、例えば（ＧＡＡＡ）１６、（ＰＰＴ１９）４、ＫＭＩ１、ＫＭＩ１、ＫＭＩ２、ＫＭＩ２、ＫＭＩＸ、Ｘ１又はＸ２を含む。
【００８６】
[0168]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５つ又はそれを超える）の発現配列に隣接する少なくとも１つのＩＲＥＳを含む。ある実施形態において、ＩＲＥＳは、少なくとも１つ（例えば、２、３、４、５つ又はそれを超える）の発現配列の両側に隣接する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、得られるペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす１つ以上のＩＲＥＳ配列を含む。
【００８７】
終止要素
[0169]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、各発現配列は、終止要素を有していても又は有していなくてもよい。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、発現配列は、環状ポリリボヌクレオチドが連続して翻訳されるように終止要素を欠いている。終止要素の排除は、リボソームの停滞又は落下がないために、発現産物、例えばペプチド又はポリペプチドのローリングサークル型翻訳又は連続した発現をもたらし得る。このような実施形態において、ローリングサークル型翻訳は、各発現配列を介して連続した発現産物を発現する。ある他の実施形態において、発現配列の終止要素は、スタガー要素の一部であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の発現配列は、終止要素を含む。しかしながら、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列のローリングサークル型翻訳又は発現が行われる。このような場合、リボソームが終止要素、例えば終止コドンに遭遇し、翻訳を終止するとき、発現産物は、リボソームから落下し得る。ある実施形態において、翻訳は、リボソーム、例えばリボソームの少なくとも１つのサブユニットが環状ポリリボヌクレオチドと接触状態を保ちながら終止される。
【００８８】
[0170]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列の末端に終止要素を含む。ある実施形態において、１つ以上の発現配列は、連続して２つ以上の終止要素を含む。このような実施形態において、翻訳が終止され、ローリングサークル型翻訳が終止される。ある実施形態において、リボソームは、環状ポリリボヌクレオチドと完全に離脱する。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の（例えば、第２、第３、第４、第５などの）発現配列の生成は、リボソームが翻訳の開始前に環状ポリリボヌクレオチドと再度かみ合うことを必要とし得る。一般に、終止要素は、翻訳の終止を示すインフレームヌクレオチド三つ組、例えばＵＡＡ、ＵＧＡ、ＵＡＧを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド中の１つ以上の終止要素は、限定はされないが、翻訳を終止し得るオフフレーム又は−１及び＋１シフトされたリーディングフレーム（例えば、隠れた停止）などのフレームシフト終止要素である。フレームシフト終止要素は、発現配列の第２及び第３のリーディングフレームに現れるヌクレオチド三つ組、ＴＡＡ、ＴＡＧ及びＴＧＡを含む。フレームシフト終止要素は、細胞に有害であることが多い、ｍＲＮＡの読み違いを防ぐ際に重要であり得る。
【００８９】
スタガー要素
[0171]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現配列に隣接する少なくとも１つのスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態において、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、発現産物、例えばペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の一部である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の発現配列を含み、１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられる。ある実施形態において、スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む。
【００９０】
[0172]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含む。ローリングサークル型翻訳を維持しながら、連続した発現産物、例えばペプチド又はポリペプチドの生成を避けるために、スタガー要素は、翻訳中のリボソームの休止を誘導するために含まれ得る。ある実施形態において、スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にある。スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成され得る。スタガー要素としては、限定はされないが、２Ａ様又はＣＨＹＳＥＬ（シス作用性ヒドロラーゼ要素）配列が挙げられる。ある実施形態において、スタガー要素は、Ｘ１Ｘ２Ｘ３ＥＸ５ＮＰＧＰ（ここで、Ｘ１は、存在しないか、又はＧ若しくはＨであり、Ｘ２は、存在しないか、又はＤ若しくはＧであり、Ｘ３は、Ｄ、又はＶ、又はＩ、又はＳ、又はＭであり、Ｘ５は、任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする。ある実施形態において、この配列は、強いαらせん傾向を有するアミノ酸の非保存配列、続いてコンセンサス配列−Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧ  Ｐ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）を含む。スタガー要素のいくつかの非限定的な例としては、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳＥＦＮＰＧＰが挙げられる。
【００９１】
[0173]  ある実施形態において、本明細書に記載されるスタガー要素は、本明細書に記載されるコンセンサス配列のＧとＰとの間などで発現産物を切断する。１つの非限定的な例として、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物を切断するために少なくとも１つのスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの発現配列に隣接するスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列の後にスタガー要素を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含み、スタガー要素は、各発現配列の１つの側又は両側に存在して、各発現配列からの個々のペプチド及び又はポリペプチドの翻訳をもたらす。
【００９２】
[0174]  ある実施形態において、スタガー要素は、翻訳中にリボソームの休止を誘導する１つ以上の修飾ヌクレオチド又は非天然ヌクレオチドを含む。非天然ヌクレオチドは、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、モルホリノ及びロックト核酸（ＬＮＡ）並びにグリコール核酸（ＧＮＡ）及びトレオース核酸（ＴＮＡ）を含み得る。これらなどの例は、分子の骨格に対する変化により、天然ＤＮＡ又はＲＮＡと区別される。例示的な修飾は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、連結するホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の修飾及び翻訳中にリボソームの休止を誘導し得るそれらの任意の組合せを含み得る。本明細書において提供される例示的な修飾のいくつかが本明細書の他の箇所に記載される。
【００９３】
[0175]  ある実施形態において、スタガー要素は、他の形態で環状ポリリボヌクレオチド中に存在する。例えば、ある例示的な環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の終止要素及び第１の発現配列に続く発現の第１の翻訳開始配列から終止要素を隔てるヌクレオチドスペーサー配列を含む。いくつかの例において、第１の発現配列の第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にある。ある場合において、第１の発現配列及び第１の発現配列に続く発現配列は、環状ポリリボヌクレオチド中の２つの別個の発現配列である。第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及びその後続の発現配列の連続した翻訳を可能にし得る。ある実施形態において、第１のスタガー要素は、終止要素を含み、第１の発現配列の発現産物をその後続の発現配列の発現産物から隔て、それにより別個の発現産物を形成する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中の後続の配列の第１の翻訳開始配列の上流の第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳される一方、第２の発現配列に続く発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２の発現配列のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されない。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中に１つのみの発現配列があり、第１の発現配列及びその後続の発現配列は、同じ発現配列である。ある例示的な環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の終止要素及び終止要素を下流の翻訳開始配列から隔てるヌクレオチドスペーサー配列を含む。あるこのような例において、第１のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にある。ある場合において、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び任意の後続の発現配列の連続した翻訳を可能にする。ある実施形態において、第１のスタガー要素は、第１の発現配列のある回の発現産物を第１の発現配列の次回の発現産物から隔て、それにより別個の発現産物を形成する。ある場合において、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列の第１の翻訳開始配列の上流の第１のスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳される一方、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されない。ある場合において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始配列との間の距離は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より、対応する環状ポリリボヌクレオチド中で少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は１０倍大きい。ある場合において、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ���１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える。ある実施形態において、第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、第１のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超えて大きい。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つ以上の発現配列を含む。
【００９４】
調節核酸
[0176]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸をコードし、例えば内在性遺伝子及び／又は外来性遺伝子の発現を調節する１つ以上の発現配列を含む。ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの発現配列は、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ、Ｙ  ＲＮＡ及びｈｎＲＮＡなど、ノンコーディングＲＮＡのような調節核酸に対してアンチセンスである配列を含み得る。
【００９５】
[0177]  一実施形態において、調節核酸は、宿主遺伝子を標的にする。調節核酸としては、限定はされないが、内在性遺伝子（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、ＲＮＡ、ＤＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｇＲＮＡ）にハイブリダイズする核酸、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡなどの外来性核酸にハイブリダイズする核酸、ＲＮＡにハイブリダイズする核酸、遺伝子転写を妨げる核酸、ＲＮＡ翻訳を妨げる核酸、分解を標的化することなどによってＲＮＡを安定させるか又はＲＮＡを不安定化する核酸及びＤＮＡ又はＲＮＡ結合因子を調節する核酸が挙げられる。一実施形態において、配列は、ｍｉＲＮＡである。ある実施形態において、調節核酸は、宿主遺伝子のセンス鎖を標的にする。ある実施形態において、調節核酸は、宿主遺伝子のアンチセンス鎖を標的にする。
【００９６】
[0178]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）などの調節核酸を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ガイドＲＮＡを含むか、又はガイドＲＮＡをコードする。ｇＲＮＡ短鎖合成ＲＮＡは、不完全なエフェクター部分に結合するのに必要な「足場」配列及びゲノム標的のためのユーザー定義の約２０ヌクレオチド標的化配列から構成される。実際に、ガイドＲＮＡ配列は、一般に、１７〜２４ヌクレオチド（例えば、１９、２０又は２１ヌクレオチド）の長さを有し、標的化核酸配列に対して相補的であるように設計される。カスタムｇＲＮＡジェネレータ及びアルゴリズムは、有効なガイドＲＮＡの設計に使用するために市販されている。遺伝子編集は、天然ｃｒＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体を模倣し、ｔｒａｃｒＲＮＡ（ヌクレアーゼに結合するため）及び少なくとも１つのｃｒＲＮＡ（編集のために標的化される配列にヌクレアーゼをガイドするため）の両方を含有する改変された（合成）単一ＲＮＡ分子であるキメラ「シングルガイドＲＮＡ」（「ｓｇＲＮＡ」）を用いても行われた。化学修飾されたｓｇＲＮＡは、ゲノム編集に有効であることも実証され、例えばＨｅｎｄｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，９８５−９９１を参照されたい。
【００９７】
[0179]  ｇＲＮＡは、特定のＤＮＡ配列（例えば、遺伝子のプロモータ、エンハンサー、サイレンサー若しくはリプレッサーに隣接するか又はそれらの中にある配列）を認識し得る。
【００９８】
[0180]  一実施形態において、ｇＲＮＡは、遺伝子編集のためのＣＲＩＳＰＲシステムの一部として使用される。遺伝子編集のために、環状ポリリボヌクレオチドは、所望の標的ＤＮＡ配列に対応する１つ又は複数のガイドＲＮＡ配列を含むように設計され得、例えばＣｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉｅｎｃｅ，３３９：８１９−８２３；Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，８：２２８１−２３０８を参照されたい。ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６又は１７ヌクレオチドが、ＤＮＡ切断が起こるためにＣａｓ９によって必要とされ；Ｃｐｆ１について、ｇＲＮＡ配列の少なくとも約１６ヌクレオチドが、検出可能なＤＮＡ切断を達成するために必要とされる。
【００９９】
[0181]  特定の調節核酸がＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）の生物学的プロセスを介して遺伝子発現を阻害することができる。ＲＮＡｉ分子は、典型的に、１５〜５０塩基対（約１８〜２５塩基対など）を含有し、細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列と同一の（相補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有するＲＮＡ又はＲＮＡ様構造を含む。ＲＮＡｉ分子としては、限定はされないが、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、メロ二本鎖（meroduplex）及びダイサー基質（dicer substrate）が挙げられる（米国特許第８，０８４，５９９号明細書、同第８，３４９，８０９号明細書及び同第８，５１３，２０７号明細書）。
【０１００】
[0182]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、典型的に、約５〜５００塩基対（特定のＲＮＡ構造に応じて、例えばｍｉＲＮＡ５〜３０ｂｐ、ｌｎｃＲＮＡ２００〜５００ｂｐ）のＲＮＡ又はＲＮＡ様構造であり、細胞内で発現される標的遺伝子中のコード配列と同一の（相補的な）又はほぼ同一の（実質的に相補的な）核酸塩基配列を有し得る調節核酸を含む。
【０１０１】
[0183]  長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）は、１００ヌクレオチドより長い非タンパク質コード転写産物として定義される。このいくらか任意的な制限は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）及び他の短鎖ＲＮＡなどの小分子調節ＲＮＡとｌｎｃＲＮＡを区別する。一般に、大部分（約７８％）のｌｎｃＲＮＡは、組織特異的であると特徴付けられる。近傍のタンパク質コード遺伝子（哺乳動物ゲノム中の全ｌｎｃＲＮＡの約２０％というかなりの割合を占める）と反対方向に転写される分岐ｌｎｃＲＮＡが近傍の遺伝子の転写を場合により調節し得る。一実施形態では、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮＡのセンス鎖を含む。一実施形態では、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、ｌｎｃＲＮＡのアンチセンス鎖を含む。
【０１０２】
[0184]  環状ポリリボヌクレオチドは、内在性遺伝子又は遺伝子産物（例えば、ｍＲＮＡ）の全て又はフラグメントに対して実質的に相補的な又は完全に相補的な調節核酸をコードし得る。調節核酸は、イントロンとエクソンとの間、エクソン間又はエクソンに隣接する境界にある配列を補完して、転写のためのｍＲＮＡへの、特定の遺伝子の新たに生成された核ＲＮＡ転写産物の成熟を防止し得る。特定の遺伝子に対して相補的な調節核酸は、その遺伝子のためのｍＲＮＡとハイブリダイズし、その翻訳を防止し得る。アンチセンス調節核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はそれらの誘導体若しくはハイブリッドであり得る。ある実施形態において、調節核酸は、内在性遺伝子又は外来性遺伝子の発現の調節に関与するタンパク質に結合し得るタンパク質−結合部位を含む。
【０１０３】
[0185]  環状ポリリボヌクレオチドの長さは、約５〜３０ヌクレオチド、約１０〜３０ヌクレオチド又は約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０又はそれを超えるヌクレオチドである、対象とする転写産物にハイブリダイズする調節核酸をコードし得る。標的化転写産物に対する調節核酸の同一性の程度は、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％であるべきである。
【０１０４】
[0186]  環状ポリリボヌクレオチドは、標的遺伝子の約５〜約２５の連続ヌクレオチドと同一のマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）分子をコードし得る。ある実施形態において、ｍｉＲＮＡ配列は、ｍＲＮＡを標的にし、ジヌクレオチドＡＡで開始し、約３０〜７０％（約３０〜６０％、約４０〜６０％又は約４５％〜５５％）のＧＣ−含量を含み、例えば標準的なＢＬＡＳＴ検索によって決定した際、それが導入されるべきである哺乳動物のゲノム中の標的以外の任意のヌクレオチド配列との高いパーセンテージの同一性を有さない。
【０１０５】
[0187]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、例えば２、３、４、５、６つ又はそれを超えるものを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、このヌクレオチド配列のいずれか１つ又は標的配列に対して相補的な配列との少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のヌクレオチド配列同一性を有するｍｉＲＮＡをコードする配列を含む。
【０１０６】
[0188]  ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは、内在性マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）遺伝子のプロセシング経路中の中間体に類似している（Ｂａｒｔｅｌ，Ｃｅｌｌ  １１６：２８１−２９７，２００４）。ある実施形態において、ｓｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡとして機能することができ、逆も同様である（Ｚｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ９：１３２７−１３３３，２００２；Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １７：４３８−４４２，２００３）。ｓｉＲＮＡのようなマイクロＲＮＡは、ＲＩＳＣを用いて、標的遺伝子を下方制御するが、ｓｉＲＮＡと異なり、ほとんどの動物ｍｉＲＮＡは、ｍＲＮＡを切断しない。代わりに、ｍｉＲＮＡは、翻訳抑制又はポリＡ除去及びｍＲＮＡ分解によってタンパク質出力を減少させる（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０３：４０３４−４０３９，２００６）。公知のｍｉＲＮＡ結合部位は、ｍＲＮＡ  ３’ＵＴＲ内にあり；ｍｉＲＮＡは、ｍｉＲＮＡの５’末端からのヌクレオチド２〜８に対してほぼ完全な相補性を有する部位を標的にするようである（Ｒａｊｅｗｓｋｙ，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ  ３８  Ｓｕｐｐｌ：Ｓ８−１３，２００６；Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３３：７６９−７７３，２００５）。この領域は、シード領域として知られている。ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡは、置き換え可能であるため、外因性ｓｉＲＮＡは、ｓｉＲＮＡとのシード相補性を有するｍＲＮＡを下方制御する（Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ３：１９９−２０４，２００６．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｉｔｅｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ３’  ＵＴＲ  ｇｉｖｅ  ｓｔｒｏｎｇｅｒ  ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ（Ｄｏｅｎｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １７：４３８−４４２，２００３）。
【０１０７】
[0189]  公知のｍｉＲＮＡ配列の一覧は、中でも特に、Ｗｅｌｌｃｏｍｅ  Ｔｒｕｓｔ  Ｓａｎｇｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ、Ｐｅｎｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ、Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｓｌｏａｎ  Ｋｅｔｔｅｒｉｎｇ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｎｔｅｒ及びＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙなどの調査機関によって維持されているデータベースにおいて見られる。公知の有効なｓｉＲＮＡ配列及び同種結合部位は、関連文献でも十分に表されている。ＲＮＡｉ分子は、当該技術分野において公知の技術によって容易に設計及び生成される。さらに、有効及び特定の配列モチーフを発見する機会を増加させるコンピューターによる手段がある（Ｌａｇａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．，２０１５，１２６９：３９３−４１２）。
【０１０８】
[0190]  環状ポリリボヌクレオチドは、遺伝子によってコードされるＲＮＡの発現を調節し得る。複数の遺伝子が、互いにある程度の配列相同性を共有し得るため、ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、十分な配列相同性を有する遺伝子のクラスを標的にするように設計され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、異なる遺伝子標的間で共有されるか又は特定の遺伝子標的に固有の配列に対する相補性を有する配列を含有し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、いくつかの遺伝子間で相同性を有するＲＮＡ配列の保存領域を標的にし、それにより遺伝子ファミリー（例えば、異なる遺伝子アイソフォーム、スプライス変異、突然変異遺伝子など）におけるいくつかの遺伝子を標的にするように設計され得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、単一の遺伝子の特定のＲＮＡ配列に固有の配列を標的にするように設計され得る。
【０１０９】
[0191]  ある実施形態において、発現配列は、５０００ｂｐ未満（例えば、約５０００ｂｐ、４０００ｂｐ、３０００ｂｐ、２０００ｂｐ、１０００ｂｐ、９００ｂｐ、８００ｂｐ、７００ｂｐ、６００ｂｐ、５００ｂｐ、４００ｂｐ、３００ｂｐ、２００ｂｐ、１００ｂｐ、５０ｂｐ、４０ｂｐ、３０ｂｐ、２０ｂｐ、１０ｂｐ未満又はそれを下回る）の長さを有する。ある実施形態において、発現配列は、独立して又はそれに加えて、１０ｂｐ超（例えば、少なくとも約１０ｂｐ、２０ｂｐ、３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐ、７００ｂｐ、８００ｂｐ、９００ｂｐ、１０００ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、３．８ｋｂ、３．９ｋｂ、４ｋｂ、４．１ｋｂ、４．２ｋｂ、４．３ｋｂ、４．４ｋｂ、４．５ｋｂ、４．６ｋｂ、４．７ｋｂ、４．８ｋｂ、４．９ｋｂ、５ｋｂ又はそれを超える）の長さを有する。
【０１１０】
[0192]  ある実施形態において、発現配列は、本明細書に記載される特徴の１つ以上、例えば１つ以上のペプチド又はタンパク質をコードする配列、１つ以上の調節要素、１つ以上の調節核酸、例えば１つ以上のノンコーディングＲＮＡ、他の発現配列及びそれらの任意の組合せを含む。
【０１１１】
翻訳効率
[0193]  ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの翻訳効率は、参照、例えば線状同等物、線状発現配列又は線状環状ポリリボヌクレオチドより高い。ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、参照の翻訳効率より少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％、１２５％、１５０％、１７５％、２００％、２５０％、３００％、３５０％、４００％、４５０％、５００％、６００％、７０％、８００％、９００％、１０００％、２０００％、５０００％、１００００％、１０００００％又はそれを超えて高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより１０％高い翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物のものより３００％高い翻訳効率を有する。
【０１１２】
[0194]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、化学量論比の発現産物を生成する。ローリングサークル型翻訳は、実質的に同等の比率で発現産物を連続して生成する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、発現産物が実質的に同等の比率で生成されるような化学量論的翻訳効率を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複数の発現産物、例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２又はそれを超える発現配列からの産物の化学量論的翻訳効率を有する。
【０１１３】
ローリングサークル型翻訳
[0195]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも１回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある。ある実施形態において、ローリングサークル型翻訳中、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳が開始されたら、環状ポリリボヌクレオチドに結合されたリボソームは、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも１１回、少なくとも１２回、少なくとも１３回、少なくとも１４回、少なくとも１５回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１５０回、少なくとも２００回、少なくとも２５０回、少なくとも５００回、少なくとも１０００回、少なくとも１５００回、少なくとも２０００回、少なくとも５０００回、少なくとも１００００回、少なくとも１０５回又は少なくとも１０６回の翻訳を完了する前に環状ポリリボヌクレオチドから離脱しない。
【０１１４】
[0196]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの２回以上の翻訳から翻訳されたポリペプチド産物（「連続した」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素を含み、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳は、環状ポリリボヌクレオチドの１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成されるポリペプチド産物（「別個の」発現産物）の生成をもたらす。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成される。ある実施形態において、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率がインビトロ翻訳系において試験される。ある実施形態において、量比率の試験に使用されるインビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む。ある実施形態において、量比率は、真核細胞若しくは原核細胞、培養細胞又は生物内の細胞などのインビボ翻訳系において試験される。
【０１１５】
非翻訳領域
[0197]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。遺伝子を含むゲノム領域のＵＴＲは、転写され得るが、翻訳されていない。ある実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の翻訳開始配列の上流に含まれ得る。ある実施形態において、ＵＴＲは、本明細書に記載される発現配列の下流に含まれ得る。ある場合において、第１の発現配列のための１つのＵＴＲは、第２の発現配列のための別のＵＴＲと同じであるか又はそれと連続しているか又はそれと重複している。ある実施形態において、イントロンは、ヒトイントロンである。ある実施形態において、イントロンは、完全長ヒトイントロン、例えばＺＫＳＣＡＮ１である。
【０１１６】
[0198]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、中に埋め込まれたアデノシン及びウリジンの１つ以上のストレッチを有するＵＴＲを含む。これらのＡＵリッチシグネチャーは、発現産物のターンオーバ速度を上昇させ得る。
【０１１７】
[0199]  ＵＴＲ  ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の導入、除去又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得る。特定の環状ポリリボヌクレオチドを改変するとき、ＡＲＥの１つ以上のコピーが環状ポリリボヌクレオチドに導入され得、ＡＲＥのコピーが発現産物の翻訳及び／又は生成を調節し得る。同様に、ＡＲＥは、環状ポリリボヌクレオチド中で同定され、除去又は改変されて細胞内安定性を調節し、したがって得られるタンパク質翻訳及び生成に影響を与え得る。
【０１１８】
[0200]  任意の遺伝子からの任意のＵＴＲは、環状ポリリボヌクレオチドのそれぞれの隣接領域に組み込まれ得ることが理解されるべきである。非限定的な例として、組み込まれ得るＵＴＲ又はそのフラグメントは、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される米国仮特許出願第６１／７７５，５０９号明細書及び米国仮特許出願第６１／８２９，３７２号明細書又は国際特許出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１４／０２１５２２号明細書に列挙されるＵＴＲである。さらに、任意の公知の遺伝子の複数の野生型ＵＴＲが用いられ得る。野生型遺伝子の変異型でない人工ＵＴＲを提供することも本発明の範囲内である。これらのＵＴＲ又はその部分は、それらを選択した転写産物と同じ配向で配置され得るか、又は配向若しくは位置が改変され得る。したがって、５’又は３’ＵＴＲは、反転され、短縮され、伸長され、１つ以上の他の５’ＵＴＲ又は３’ＵＴＲと共にキメラにされ得る。本明細書において使用される際、「改変」という用語は、それがＵＴＲ配列に関する際、ＵＴＲが参照配列に対して何らかの方法で変化されたことを意味する。例えば、３’又は５’ＵＴＲは、上に教示されるように配向若しくは位置の変化によって野生型若しくは天然ＵＴＲに対して改変され得るか、又はさらなるヌクレオチドの包含、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換又は転位によって改変され得る。「改変」ＵＴＲ（３’又は５’のいずれにかかわらず）を生成するこれらの変化のいずれも変異型ＵＴＲを含む。
【０１１９】
[0201]  一実施形態において、５’又は３’ＵＴＲなどの二重、三重又は四重ＵＴＲが使用され得る。本明細書において使用される際、「二重」ＵＴＲは、同じＵＴＲの２つのコピーが連続して又は実質的に連続してコードされるものである。例えば、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１００１２９８７７号明細書に記載されるように、二重β−グロビン３’ＵＴＲが使用され得る。
【０１２０】
ポリＡ配列
[0202]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ−Ａ配列を含み得る。ある実施形態において、ポリ−Ａ配列の長さは、１０ヌクレオチド長を超える。一実施形態において、ポリ−Ａ配列は、１５ヌクレオチド長を超える（例えば、少なくとも約１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１２０、１４０、１６０、１８０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，１００、１，２００、１，３００、１，４００、１，５００、１，６００、１，７００、１，８００、１，９００、２，０００、２，５００及び３，０００ヌクレオチド又はこれらを超える）。ある実施形態において、ポリ−Ａ配列は、約１０〜約３，０００ヌクレオチド（例えば、３０〜５０、３０〜１００、３０〜２５０、３０〜５００、３０〜７５０、３０〜１，０００、３０〜１，５００、３０〜２，０００、３０〜２，５００、５０〜１００、５０〜２５０、５０〜５００、５０〜７５０、５０〜１，０００、５０〜１，５００、５０〜２，０００、５０〜２，５００、５０〜３，０００、１００〜５００、１００〜７５０、１００〜１，０００、１００〜１，５００、１００〜２，０００、１００〜２，５００、１００〜３，０００、５００〜７５０、５００〜１，０００、５００〜１，５００、５００〜２，０００、５００〜２，５００、５００〜３，０００、１，０００〜１，５００、１，０００〜２，０００、１，０００〜２，５００、１，０００〜３，０００、１，５００〜２，０００、１，５００〜２，５００、１，５００〜３，０００、２，０００〜３，０００、２，０００〜２，５００及び２，５００〜３，０００）である。
【０１２１】
[0203]  一実施形態において、ポリ−Ａ配列は、全環状ポリリボヌクレオチドの長さに対して設計される。この設計は、コード領域の長さ、特定の特徴若しくは領域の長さ（第１若しくは隣接領域など）に基づくか、又は環状ポリリボヌクレオチドから発現される最終産物に基づき得る。これに関して、ポリ−Ａ配列は、環状ポリリボヌクレオチド又はその特徴より１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０又は１００％大きい長さであり得る。ポリ−Ａ配列は、それが属する環状ポリリボヌクレオチドの一部としても設計され得る。これに関して、ポリ−Ａ配列は、構築物の全長又は構築物の全長マイナスポリ−Ａ配列の１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０若しくは９０％又はそれを超え得る。さらに、ポリ−Ａ結合タンパク質のための環状ポリリボヌクレオチドの改変された結合部位及び共役は、発現を促進し得る。
【０１２２】
[0204]  一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡ−Ｇカルテットを含むように設計される。Ｇ−カルテットは、ＤＮＡ及びＲＮＡの両方におけるＧリッチ配列によって形成され得る４つのグアニンヌクレオチドの環状水素結合アレイである。一実施形態において、Ｇ−カルテットは、ポリ−Ａ配列の末端に組み込まれる。得られる環状ポリリボヌクレオチド構築物は、安定性、タンパク質産生及び／又は様々な時点における半減期を含む他のパラメータについてアッセイされる。ある実施形態において、ポリＡ−Ｇカルテットは、１２０ヌクレオチド単独のポリ−Ａ配列を用いて見られるものの少なくとも７５％に相当するタンパク質産生をもたらす。
【０１２３】
[0205]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリＡを含むか、ポリＡを欠いているか、又は環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の特性を調節するための修飾ポリＡを有する。ある実施形態において、ポリＡを欠いた又は修飾ポリＡを有する環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の機能特性、例えば免疫原性、半減期、発現効率などを改善する。
【０１２４】
ＲＮＡ結合
[0206]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のＲＮＡ結合部位を含む。マイクロＲＮＡ（又はｍｉＲＮＡ）は、核酸分子の３’ＵＴＲに結合し、核酸分子安定性を低下させるか又は翻訳を阻害することによって遺伝子発現を下方制御する短鎖ノンコーディングＲＮＡである。環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的配列、マイクロＲＮＡ配列又はマイクロＲＮＡシードを含み得る。このような配列は、内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２００５／０２６１２１８号明細書及び米国特許出願公開第２００５／００５９００５号明細書において教示されるものなど、任意の公知のマイクロＲＮＡに対応し得る。
【０１２５】
[0207]  マイクロＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟マイクロＲＮＡの２〜８位の領域中の配列を含み、この配列は、ｍｉＲＮＡ標的配列に対する完全なワトソン・クリック相補性を有する。マイクロＲＮＡシードは、成熟マイクロＲＮＡの２〜８又は２〜７位を含み得る。ある実施形態において、マイクロＲＮＡシードは、７個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜８）を含み得、ここで、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。ある実施形態において、マイクロＲＮＡシードは、６個のヌクレオチド（例えば、成熟マイクロＲＮＡのヌクレオチド２〜７）を含み得、対応するｍｉＲＮＡ標的におけるシード相補的部位は、マイクロＲＮＡ１位と反対のアデニン（Ａ）に隣接する。例えば、それぞれ全体が参照により本明細書に援用されるＧｒｉｍｓｏｎ  Ａ，Ｆａｒｈ  Ｋ，Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ＷＫ，Ｇａｒｒｅｔｔ−Ｅｎｇｅｌｅ  Ｐ，Ｌｉｍ  ＬＰ，Ｂａｒｒｅｌ  ＤＰ；Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ．２００７  Ｊｕｌ  ６；２７（１）：９１−１０５を参照されたい。
【０１２６】
[0208]  マイクロＲＮＡシードの塩基は、標的配列と実質的に相補性である。マイクロＲＮＡ標的配列を環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、該当するマイクロＲＮＡが利用可能であることを条件として、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって検出され得、調節された分解又は調節された翻訳を有し得る。このプロセスは、環状ポリリボヌクレオチド送達時のオフターゲット効果の危険を低下させる。マイクロＲＮＡ、マイクロＲＮＡ標的領域並びにそれらの発現パターン及び生物学における役割の特定が報告されている（それぞれ全体が参照により本明細書に援用されるＢｏｎａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｄｒｕｇ  Ｔａｒｇｅｔｓ  ２０１０  １１：９４３−９４９；Ａｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６；Ｃｏｎｔｒｅｒａｓ  ａｎｄ  Ｒａｏ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ２０１２  ２６：４０４−４１３（２０１１  Ｄｅｃ  ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｌｅｕ．２０１１．３５６）；Ｂａｒｒｅｌ  Ｃｅｌｌ  ２００９  １３６：２１５−２３３；Ｌａｎｄｇｒａｆ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｅｌｌ，２００７  １２９：１４０１−１４１４）。
【０１２７】
[0209]  逆に、マイクロＲＮＡ結合部位は、特定の組織におけるタンパク質発現を調節するために、環状ポリリボヌクレオチドから出るように操作され得る（すなわち環状ポリリボヌクレオチドから除去され得る）。複数の組織における発現の調節は、１つ若しくはいくつかのマイクロＲＮＡ結合部位の導入又は除去を通して行われ得る。
【０１２８】
[0210]  マイクロＲＮＡがｍＲＮＡを調節し、それによってタンパク質発現を調節することが知られている組織の例としては、限定はされないが、肝臓（ｍｉＲ−１２２）、筋肉（ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−２０６、ｍｉＲ−２０８）、内皮細胞（ｍｉＲ−１７−９２、ｍｉＲ−１２６）、骨髄細胞（ｍｉＲ−１４２−３ｐ、ｍｉＲ−１４２−５ｐ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−２１、ｍｉＲ−２２３、ｍｉＲ−２４、ｍｉＲ−２７）、脂肪組織（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−３０ｃ）、心臓（ｍｉＲ−ｌｄ、ｍｉＲ−１４９）、腎臓（ｍｉＲ−１９２、ｍｉＲ−１９４、ｍｉＲ−２０４）及び肺上皮細胞（ｌｅｔ−７、ｍｉＲ−１３３、ｍｉＲ−１２６）が挙げられる。マイクロＲＮＡは、血管新生（ｍｉＲ−１３２）などの複雑な生物学的プロセスも調節し得る（全体が参照により本明細書に援用されるＡｎａｎｄ  ａｎｄ  Ｃｈｅｒｅｓｈ  Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｈｅｍａｔｏｌ  ２０１１  １８：１７１−１７６）。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドにおいて、このようなプロセスに関与するマイクロＲＮＡの結合部位は、生物学的に関連する細胞型に対して又は関連する生物学的プロセスに関連して、環状ポリリボヌクレオチドからの発現を調整するために除去又は導入され得る。マイクロＲＮＡ、ｍｉＲ配列及びｍｉＲ結合部位の一覧は、２０１３年１月１７日に出願された米国仮特許出願第６１／７５３，６６１号明細書の表９、２０１３年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６１／７５４，１５９明細書の表９及び２０１３年１月３１日に出願された米国仮特許出願第６１／７５８，９２１明細書の表７に列挙されており、これらは、それぞれ全体が参照により本明細書に援用される。ある実施形態において、マイクロＲＮＡ結合部位は、例えば、ｍｉＲ−７を含む。
【０１２９】
[0211]  本明細書に開示される環状ポリリボヌクレオチドは、ｍｉＲＢａｓｅ、ｄｅｅｐＢａｓｅ、ｍｉＲＢａｓｅ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ．ｏｒｇ、ｍｉＲＧｅｎ  ２．０；ｍｉＲＮＡＭａｐ、ＰＭＲＤ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ又はＶＩＲｍｉＲＮＡなどのｍｉＲＮＡデータベースに開示されているもののいずれかなどの任意のｍｉＲＮＡにハイブリダイズするｍｉＲＮＡ結合部位を含み得る。ある場合において、ｍｉＲＮＡ結合部位は、その標的遺伝子が、ＳｔａｒＢａｓｅ、ＳｔａｒＳｃａｎ、Ｃｕｐｉｄ、ＴａｒｇｅｔＳｃａｎ、ＴａｒＢａｓｅ、Ｄｉａｎａ−ｍｉｃｒｏＴ、ｍｉＲｅｃｏｒｄｓ、ＰｉｃＴａｒ、ＰＩＴＡ、ＲｅｐＴａｒｍ  ＲＮＡ２２、ｍｉＲＴａｒＢａｓｅ、ｍｉＲｗａｌｋ又はＭＢＳＴＡＲなどのマイクロＲＮＡ標的遺伝子データベースに開示されているｍｉＲＮＡに対して相補的な任意の部位であり得る。
【０１３０】
[0212]  様々な細胞型のマイクロＲＮＡの発現パターンの理解により、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、特定の細胞型で又は特定の生物学的条件下のみでのより標的化された発現のために操作され得る。組織特異的マイクロＲＮＡ結合部位の導入により、環状ポリリボヌクレオチドは、組織において又は生物学的条件に関連して最適なタンパク質発現のために設計され得る。組織又は疾患特異的遺伝子発現を駆動するためのマイクロＲＮＡの使用の例が列挙されている（全体が参照により本明細書に援用されるＧｅｔｎｅｒ  ａｎｄ  Ｎａｌｄｉｎｉ，Ｔｉｓｓｕｅ  Ａｎｔｉｇｅｎｓ．２０１２，８０：３９３−４０３）。
【０１３１】
[0213]  さらに、マイクロＲＮＡシード部位は、環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれて、生物学的改善をもたらす、特定の細胞における発現を調節することができる。この例は、ｍｉＲ−１４２部位への組み込みである。本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドへのｍｉＲ−１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節し得るだけではく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を低下させるか又はなくすことができる。
【０１３２】
[0214]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の大きい遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）結合部位を含む。大きい遺伝子間ノンコーディングＲＮＡ（ｌｉｎｃＲＮＡ）は、長鎖ノンコーディングＲＮＡの大部分を構成する。ＬｉｎｃＲＮＡは、非コード転写産物であり、ある実施形態において、約２００ヌクレオチドを超える長さである。ある実施形態において、それらは、タンパク質コード遺伝子と類似のエクソン−イントロン−エクソン構造を有するが、オープンリーディングフレームを包含せず、タンパク質をコードしない。８，０００超のｌｉｎｃＲＮＡが最近記載されており、ヒトにおける非コードトランスクリプトームに由来するＲＮＡの最大のサブクラスであると考えられている。何千ものｌｉｎｃＲＮＡが知られており、いくつかが多様な細胞過程の主な調節因子であるようである。個々のｌｉｎｃＲＮＡの機能を決定することは、依然として課題である。ｌｉｎｃＲＮＡ発現は、コード遺伝子と比較して著しく組織特異的であり、それらは、隣接するタンパク質コード遺伝子の対のものと同程度にではあるが、典型的にそれらの隣接する遺伝子と共発現される。
【０１３３】
[0215]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＦＩＲＲＥ、ＬＩＮＣ００９６９、ＰＶＴ１、ＬＩＮＣ０１６０８、ＪＰＸ、ＬＩＮＣ０１５７２、ＬＩＮＣ００３５５、Ｃ１ｏｒｆ１３２、Ｃ３ｏｒｆ３５、ＲＰ１１−７３４、ＬＩＮＣ０１６０８、ＣＣ−４９９Ｂ１５．５、ＣＡＳＣ１５、ＬＩＮＣ００９３７、ＲＰ１１−１９１などの１つ以上のｌｉｎｃＲＮＡ又は公知のｌｎｃＲＮＡデータベースからのものなどの他のｌｉｎｃＲＮＡ若しくはｌｎｃＲＮＡを含む。
【０１３４】
タンパク質結合
[0216]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質、例えばリボソームが、ＲＮＡ配列における内部部位に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位、例えばリボソーム結合部位を環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系の構成要素から環状ポリリボヌクレオチドをマスクすることにより、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解又は調節された翻訳を有し得る。
【０１３５】
[0217]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ（細胞傷害性Ｔリンパ球）応答を回避するために少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性であるものとしてマスクするのに役立つヌクレオチド配列である。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性又は外来性であるものとして隠すのに役立つヌクレオチド配列である。
【０１３６】
[0218]  線状ＲＮＡへのリボソームのかみ合いの従来の機構は、ＲＮＡのキャップされた５’末端に結合するリボソームを含む。５’末端から、リボソームが開始コドンに移動すると直ちに第１のペプチド結合が形成される。本発明によれば、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳の内部の開始（すなわちキャップ非依存的）は、遊離末端又はキャップされた末端を必要としない。むしろ、リボソームは、非キャップ内部部位に結合し、それにより、リボソームは、開始コドンにおけるポリペプチド伸長を開始する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、リボソーム結合部位、例えば開始コドンを含む１つ以上のＲＮＡ配列を含む。
【０１３７】
[0219]  天然５’ＵＴＲは、翻訳開始のために役割を果たす特徴を有する。それらは、リボソームが多くの遺伝子の翻訳を開始させるプロセスに関与することが一般的に知られているコザック配列のようなシグネチャーを有する。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、ここで、Ｒは、開始コドン（ＡＵＧ）の３塩基上流のプリン（アデニン又はグアニン）であり、その後、別の「Ｇ」が続く。５’ＵＴＲは、伸長因子結合に関与する二次構造にも関与することが知られている。
【０１３８】
[0220]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、タンパク質に結合するタンパク質結合配列をコードする。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、環状ポリリボヌクレオチドを標的にするか又はそれを特定の標的に限局する。ある実施形態において、タンパク質結合配列は、タンパク質のアルギニンリッチ領域に特異的に結合する。
【０１３９】
[0221]  ある実施形態において、タンパク質結合部位としては、限定はされないが、ＡＣＩＮ１、ＡＧＯ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｆ、ＡＰＯＢＥＣ３Ｇ、ＡＴＸＮ２、ＡＵＨ、ＢＣＣＩＰ、ＣＡＰＲＩＮ１、ＣＥＬＦ２、ＣＰＳＦ１、ＣＰＳＦ２、ＣＰＳＦ６、ＣＰＳＦ７、ＣＳＴＦ２、ＣＳＴＦ２Ｔ、ＣＴＣＦ、ＤＤＸ２１、ＤＤＸ３、ＤＤＸ３Ｘ、ＤＤＸ４２、ＤＧＣＲ８、ＥＩＦ３Ａ、ＥＩＦ４Ａ３、ＥＩＦ４Ｇ２、ＥＬＡＶＬ１、ＥＬＡＶＬ３、ＦＡＭ１２０Ａ、ＦＢＬ、ＦＩＰ１Ｌ１、ＦＫＢＰ４、ＦＭＲ１、ＦＵＳ、ＦＸＲ１、ＦＸＲ２、ＧＮＬ３、ＧＴＦ２Ｆ１、ＨＮＲＮＰＡ１、ＨＮＲＮＰＡ２Ｂ１、ＨＮＲＮＰＣ、ＨＮＲＮＰＫ、ＨＮＲＮＰＬ、ＨＮＲＮＰＭ、ＨＮＲＮＰＵ、ＨＮＲＮＰＵＬ１、ＩＧＦ２ＢＰ１、ＩＧＦ２ＢＰ２、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＩＬＦ３、ＫＨＤＲＢＳ１、ＬＡＲＰ７、ＬＩＮ２８Ａ、ＬＩＮ２８Ｂ、ｍ６Ａ、ＭＢＮＬ２、ＭＥＴＴＬ３、ＭＯＶ１０、ＭＳＩ１、ＭＳＩ２、ＮＯＮＯ、ＮＯＮＯ−、ＮＯＰ５８、ＮＰＭ１、ＮＵＤＴ２１、ＰＣＢＰ２、ＰＯＬＲ２Ａ、ＰＲＰＦ８、ＰＴＢＰ１、ＲＢＦＯＸ２、ＲＢＭ１０、ＲＢＭ２２、ＲＢＭ２７、ＲＢＭ４７、ＲＮＰＳ１、ＳＡＦＢ２、ＳＢＤＳ、ＳＦ３Ａ３、ＳＦ３Ｂ４、ＳＩＲＴ７、ＳＬＢＰ、ＳＬＴＭ、ＳＭＮＤＣ１、ＳＮＤ１、ＳＲＲＭ４、ＳＲＳＦ１、ＳＲＳＦ３、ＳＲＳＦ７、ＳＲＳＦ９、ＴＡＦ１５、ＴＡＲＤＢＰ、ＴＩＡ１、ＴＮＲＣ６Ａ、ＴＯＰ３Ｂ、ＴＲＡ２Ａ、ＴＲＡ２Ｂ、Ｕ２ＡＦ１、Ｕ２ＡＦ２、ＵＮＫ、ＵＰＦ１、ＷＤＲ３３、ＸＲＮ２、ＹＢＸ１、ＹＴＨＤＣ１、ＹＴＨＤＦ１、ＹＴＨＤＦ２、ＹＷＨＡＧ、ＺＣ３Ｈ７Ｂ、ＰＤＫ１、ＡＫＴ１及びＲＮＡに結合する任意の他のタンパク質などのタンパク質への結合部位が挙げられる。
【０１４０】
エンクリプトゲン
[0222]  本明細書に記載される際、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答を低下させるか、避けるか又は回避するためにエンクリプトゲンを含む。一態様において、細胞に送達されると、参照化合物、例えば記載される環状ポリリボヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いた環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主からの低下された免疫応答をもたらす環状ポリリボヌクレオチドが本明細書において提供される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性を有する。
【０１４１】
[0223]  ある実施形態において、エンクリプトゲンは、安定性を向上させる。核酸分子及び翻訳の安定性に関してＵＴＲが果たす調節的役割についての証拠が増加している。ＵＴＲの調節的特徴は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性を向上させるために、エンクリプトゲンに含まれ得る。
【０１４２】
[0224]  ある実施形態において、５’又は３’ＵＴＲは、環状ポリリボヌクレオチド中のエンクリプトゲンを構成し得る。例えば、ＵＴＲ  ＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の除去又は修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得る。
【０１４３】
[0225]  ある実施形態において、発現配列、例えば翻訳可能領域におけるＡＵリッチ要素（ＡＲＥ）の修飾又は除去は、環状ポリリボヌクレオチドの安定性又は免疫原性を調節するのに有用であり得る。
【０１４４】
[0226]  ある実施形態において、エンクリプトゲンは、ｍｉＲＮＡ結合部位又は任意の他のノンコーディングＲＮＡへの結合部位を含む。例えば、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドへのｍｉＲ−１４２部位の組み込みは、造血細胞における発現を調節するだけではなく、環状ポリリボヌクレオチドにおいてコードされるタンパク質に対する免疫応答を低下させるか又はなくすことができる。
【０１４５】
[0227]  ある実施形態において、エンクリプトゲンは、タンパク質、例えば免疫タンパク質がＲＮＡ配列に結合することを可能にする１つ以上のタンパク質結合部位を含む。タンパク質結合部位を、環状ポリリボヌクレオチド中に操作することにより、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主の免疫系の構成要素から環状ポリリボヌクレオチドをマスクすることにより、宿主の免疫系を回避するか若しくは宿主の免疫系によって減少された検出を有し得、調節された分解又は調節された翻訳を有し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために少なくとも１つの免疫タンパク質結合部位を含む。ある実施形態において、免疫タンパク質結合部位は、免疫タンパク質に結合し、環状ポリリボヌクレオチドを外因性であるものとしてマスクするのに役立つヌクレオチド配列である。
【０１４６】
[0228]  ある実施形態において、エンクリプトゲンは、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含む。例示的な修飾は、糖、核酸塩基、ヌクレオシド間結合に対する（例えば、結合ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の修飾及び環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫応答を防ぐか又は低下させ得るそれらの任意の組合せを含み得る。本明細書において提供される例示的な修飾のいくつかが以下に詳細に説明される。
【０１４７】
[0229]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば修飾を欠いた環状ポリリボヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主からの免疫応答を低下させるために、本明細書の他の箇所に記載される１つ以上の修飾を含む。特に、１つ以上のイノシンの追加は、ウイルスに対して内在性であるものとしてＲＮＡを区別することが示されている。例えば、全体が参照により援用されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ＡＤＡＲ１  ｍａｒｋｓ  ｄｓＲＮＡ  ａｓ  “ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５，１２８３−１２８４を参照されたい。
【０１４８】
[0230]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ｓｈＲＮＡのための１つ以上の発現配列又はｓｉＲＮＡにプロセシングされ得るＲＮＡ配列を含み、ｓｈＲＮＡ又はｓｉＲＮＡは、ＲＩＧ−１を標的にし、ＲＩＧ−１の発現を低下させる。ＲＩＧ−１は、外来性環状ＲＮＡを感知することができ、外来性環状ＲＮＡの分解をもたらす。したがって、ＲＩＧ−１標的化ｓｈＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は任意の他の調節核酸のための配列を有する環状ポリヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドに対する免疫、例えば宿主細胞免疫を低下させ得る。
【０１４９】
[0231]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞の自然免疫応答を低下させるか、避けるか又は回避する際に環状ポリリボヌクレオチドを補助する配列、要素又は構造を欠いている。あるこのような実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ配列、５’末端、３’末端、リン酸基、ヒドロキシル基又はそれらの任意の組合せを欠き得る。
【０１５０】
リボスイッチ
[0232]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のリボスイッチを含む。
【０１５１】
[0233]  リボスイッチは、典型的に、小さい標的分子に直接結合することができる環状ポリリボヌクレオチドの一部であると考えられ、その標的の結合がＲＮＡ翻訳、発現産物安定性及び活性に影響を与える（Ｔｕｃｋｅｒ  Ｂ  Ｊ，Ｂｒｅａｋｅｒ  Ｒ  Ｒ（２００５），Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｌ  １５（３）：３４２−８）。したがって、リボスイッチを含む環状ポリリボヌクレオチドは、その標的分子の存在又は非存在に応じて、自らの活性を調節するのに直接関与する。ある実施形態において、リボスイッチは、別個の分子に対するアプタマーのような親和性の領域を有する。したがって、本発明のより広い文脈において、非コード核酸内に含まれる任意のアプタマーは、かさ容積からの分子の隔離のために使用され得る。「（リボ）スイッチ」活性による事象の下流での報告が特に有利であり得る。
【０１５２】
[0234]  ある実施形態において、リボスイッチは、限定はされないが、転写終結、翻訳開始の阻害、ｍＲＮＡ自己切断及び真核生物におけるスプライシング経路の変更を含む遺伝子発現に影響を与え得る。リボスイッチは、トリガー分子の結合又は除去によって遺伝子発現を制御するように機能し得る。したがって、リボスイッチを含む環状ポリリボヌクレオチドを、リボスイッチを活性化、不活性化又はブロックする条件に供して、発現を変化させる。発現は、例えば、ＲＮＡに結合するリボソームの転写の終止又はブロックの結果として変化され得る。トリガー分子又はその類似体の結合は、リボスイッチの性質に応じて、ＲＮＡ分子の発現を低下させるか若しくは防ぐか、又はＲＮＡ分子の発現を促進するか若しくは増加させ得る。リボスイッチのいくつかの例が本明細書に記載される。
【０１５３】
[0235]  ある実施形態において、リボスイッチは、コバラミンリボスイッチ（Ｂ１２要素とも呼ばれる）であり、これは、アデノシルコバラミン（ビタミンＢ１２の補酵素形態）に結合して、コバラミン及び同様の代謝産物の生合成及び輸送を調節する。
【０１５４】
[0236]  ある実施形態において、リボスイッチは、環状ジ−ＧＭＰリボスイッチであり、これは、環状ジ−ＧＭＰに結合して様々な遺伝子を調節する。２つの非構造的に関連する種類が存在する  −  環状ジ−ＧＭＰ−ｌ及び環状ジ−ＧＭＰ−ｌｌ。
【０１５５】
[0237]  ある実施形態において、リボスイッチは、ＦＭＮリボスイッチ（ＲＦＮ要素とも呼ばれる）であり、これは、フラビンモノヌクレオチド（ＦＭＮ）に結合して、リボフラビン生合成及び輸送を調節する。
【０１５６】
[0238]  ある実施形態において、リボスイッチは、ｇｌｍＳリボスイッチであり、これは、十分な濃度のグルコサミン−６−リン酸があるときにそれ自体で切断する。
[0239]  ある実施形態において、リボスイッチは、グルタミンリボスイッチであり、これは、グルタミンに結合して、グルタミン及び窒素代謝に関与する遺伝子を調節する。それらは、不明な機能の短鎖ペプチドにも結合する。このようなリボスイッチは、構造的に関連する２つの種類に分類される：ｇｌｎＡ  ＲＮＡ、モチーフ及び下流−ペプチドモチーフ。
【０１５７】
[0240]  ある実施形態において、リボスイッチは、グリシンリボスイッチであり、これは、グリシンに結合してグリシン代謝遺伝子を調節する。それは、同じｍＲＮＡ中に２つの隣接するアプタマードメインを含み、協同的結合を示す公知の天然ＲＮＡのみである。
【０１５８】
[0241]  ある実施形態において、リボスイッチは、リジンリボスイッチ（Ｌ−ボックスとも呼ばれる）であり、これは、リジンに結合して、リジン生合成、異化及び輸送を調節する。
【０１５９】
[0242]  ある実施形態において、リボスイッチは、ＰｒｅＱ１リボスイッチであり、これは、ｐｒｅ−クエオシンに結合して、クエオシンのこの前駆体の合成又は輸送に関与する遺伝子を調節する。２つの全く異なる種類のＰｒｅＧＩリボスイッチが公知である：ＰｒｅＱ１−ｌリボスイッチ及びＰｒｅＱ１−ｌｌリボスイッチ。ＰｒｅＱ１−ｌリボスイッチの結合ドメインは、天然のリボスイッチの中でも非常に小さい。ストレプトコッカス属（Streptococcus）及びラクトコッカス属（Lactococcus）の特定の種のみに見られるＰｒｅＧＩ−ＩＩリボスイッチは、完全に異なる構造を有し、より大きい。
【０１６０】
[0243]  ある実施形態において、リボスイッチは、プリンリボスイッチであり、これは、プリンに結合して、プリン代謝及び輸送を調節する。異なる形態のプリンリボスイッチがグアニン（Ｇ−ボックスとして元々知られている形態）又はアデニンに結合する。グアニン又はアデニンのいずれかに対する特異性は、Ｙ７４位におけるリボスイッチ中の単一のピリミジンによるワトソン・クリック相互作用に完全に依存する。グアニンリボスイッチにおいて、この残基は、シトシン（すなわちＣ７４）であり、アデニン残基において、それは、常にウラシル（すなわちＵ７４）である。同種のタイプのプリンリボスイッチがデオキシグアノシンに結合するが、単一のヌクレオチド突然変異より有意な差を有する。
【０１６１】
[0244]  ある実施形態において、リボスイッチは、ＳＡＨリボスイッチであり、これは、Ｓ−アデノシルホモシステインに結合して、Ｓ−アデノシルメチオニンがメチル化反応に使用されるときに生成されるこの代謝産物の再利用に関与する遺伝子を調節する。
【０１６２】
[0245]  ある実施形態において、リボスイッチは、ＳＡＭリボスイッチであり、これは、Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）に結合して、メチオニン及びＳＡＭ生合成及び輸送を調節する。３つの異なるＳＡＭリボスイッチが公知である：ＳＡＭ−Ｉ（元々Ｓ−ボックスと呼ばれる）、ＳＡＭ−ＩＩ及びＳＭＫボックスリボスイッチ。ＳＡＭ−Ｉは、細菌中に広く存在するが、ＳＡＭ−ＩＩは、α−、β−及び少しのγ−プロテオバクテリアのみに見られる。ＳＭＫボックスリボスイッチは、ラクトバチルス目（Lactobacillales）のみに見られる。これらの３つの種のリボスイッチは、配列又は構造に関して明らかな類似点を有さない。第４の種、ＳＡＭ−ＩＶは、ＳＡＭ−Ｉのものと類似のリガンド結合コアを有するようであるが、異なる足場にある。
【０１６３】
[0246]  ある実施形態において、リボスイッチは、ＳＡＭ−ＳＡＨリボスイッチであり、これは、同様の親和性でＳＡＭ及びＳＡＨの両方に結合する。それらは、メチオニンアデノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を調節する位置において常に見られるため、ＳＡＭへのそれらの結合のみが生理学的に関連することが提示された。
【０１６４】
[0247]  ある実施形態において、リボスイッチは、テトラヒドロ葉酸リボスイッチであり、これは、テトラヒドロ葉酸に結合して、合成及び輸送遺伝子を調節する。
[0248]  ある実施形態において、リボスイッチは、テオフィリン結合リボスイッチ又はチミンピロリン酸結合リボスイッチである。
【０１６５】
[0249]  ある実施形態において、リボスイッチは、Ｔ．テングコンジェンシス（T. tengcongensis）ｇｌｍＳ触媒リボスイッチであり、これは、グルコサミン−６リン酸（Ｋｌｅｉｎ  ａｎｄ  Ｆｅｒｒｅ−Ｄ’Ａｍａｒｅ  ２００６）を感知する。
【０１６６】
[0250]  ある実施形態において、リボスイッチは、ＴＰＰリボスイッチ（ＴＨＩ−ボックスとも呼ばれる）であり、これは、チアミンピロリン酸（ＴＰＰ）に結合して、チアミン生合成及び輸送並びに同様の代謝産物の輸送を調節する。それは、これまで真核生物のみに見られるリボスイッチである。
【０１６７】
[0251]  ある実施形態において、リボスイッチは、Ｍｏｃｏリボスイッチであり、これは、モリブデン補因子に結合して、この補酵素並びにそれ又はその誘導体を補因子として使用する酵素の生合成及び輸送に関与する遺伝子を調節する。
【０１６８】
[0252]  ある実施形態において、リボスイッチは、ビブリオ・バルニフィカス（Vibrio vulnificus）のアデニンデアミナーゼコード遺伝子の５’ＵＴＲに見られるアデニン感知ａｄｄ−Ａリボスイッチである。
【０１６９】
アプタザイム
[0253]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムを含む。アプタザイムは、アプタマー領域がアロステリック制御要素として使用され、触媒ＲＮＡ（後述される「リボザイム」）の領域に結合される条件的発現のためのスイッチである。ある実施形態において、アプタザイムは、細胞型特異的翻訳において活性である。ある実施形態において、アプタザイムは、細胞状態特異的翻訳、例えばウイルス感染細胞で又はウイルス核酸若しくはウイルスタンパク質の存在下で活性である。
【０１７０】
[0254]  リボザイム（ＲＮＡ酵素又は触媒ＲＮＡとも呼ばれるリボ核酸酵素に由来する）は、化学反応を触媒するＲＮＡ分子である。多くの天然リボザイムは、それら自体のホスホジエステル結合の１つの加水分解又は他のＲＮＡにおける結合の加水分解のいずれかを触媒するが、それらは、リボソームのアミノトランスフェラーゼ活性を触媒することも分かっている。より最近では、触媒ＲＮＡがインビトロ方法によって「発生」され得ることが示されている［１．Ａｇｒｅｓｔｉ  Ｊ  Ｊ，Ｋｅｌｌｙ  Ｂ  Ｔ，Ｊａｓｃｈｋｅ  Ａ，Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  Ａ  Ｄ：Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ  ｔｈａｔ  ｃａｔａｌｙｓｅ  ｍｕｌｔｉｐｌｅ−ｔｕｒｎｏｖｅｒ  Ｄｉｅｌｓ−Ａｌｄｅｒ  ｃｙｃｌｏａｄｄｉｔｉｏｎｓ  ｂｙ  ｕｓｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｏｍｐａｒｔｍｅｎｔａｌｉｚａｔｉｏｎ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００５，１０２：１６１７０−１６１７５；２．Ｓｏｏｔｅｒ  Ｌ  Ｊ，Ｒｉｅｄｅｌ  Ｔ，Ｄａｖｉｄｓｏｎ  Ｅ  Ａ，Ｌｅｖｙ  Ｍ，Ｃｏｘ  Ｊ  Ｃ，Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ  Ａ  Ｄ：Ｔｏｗａｒｄ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｅｎｚｙｍｅ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ．Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００１，３８２（９）：１３２７−１３３４］。Ｗｉｎｋｌｅｒらは、上述されるリボスイッチ活性と同様に、リボザイム及びそれらの反応生成物が遺伝子発現を調節し得ることを示した［Ｗｉｎｋｌｅｒ  Ｗ  Ｃ，Ｎａｈｖｉ  Ａ，Ｒｏｔｈ  Ａ，Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｊ  Ａ，Ｂｒｅａｋｅｒ  Ｒ  Ｒ：Ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｒｉｂｏｚｙｍｅ．Ｎａｔｕｒｅ  ２００４，４２８：２８１−２８６］。本発明に関して、リボザイムが、かさ容積からの分子の化学変換のために細胞内の多くのコピーに存在するように、触媒ＲＮＡ又はリボザイムをより大きいノンコーディングＲＮＡ内に配置することが特に有利であり得る。さらに、同じノンコーディングＲＮＡ中のアプタマー及びリボザイムの両方をコードすることが特に有利であり得る。
【０１７１】
[0255]  リボザイムのいくつかの非限定的な例としては、ハンマーヘッド型リボザイム、ＶＬリボザイム、リードザイム、ヘアピン型リボザイムが挙げられる。
[0256]  ある実施形態において、アプタザイムは、ＲＮＡ配列を切断することができ、結合リガンド／モジュレータの結果として調節され得るリボザイムである。リボザイムは、自己切断リボザイムでもあり得る。したがって、それらは、リボザイム及びアプタマーの特性を兼ね備えている。アプタザイムは、トランスにおけるそれらの活性の可能性のために従来のアプタマーを上回る利点を提供し、それらが発現を不活性化するように触媒的に作用すること及びその不活性化は、それら自体の切断又は異種転写産物のために不可逆的である。
【０１７２】
[0257]  ある実施形態において、アプタザイムは、環状ポリリボヌクレオチドの非翻訳領域に含まれ、リガンド／モジュレータの非存在下で不活性であり、導入遺伝子の発現を可能にする。発現は、リガンドの添加によって停止され得る（又は下方制御され得る）。特定のモジュレータの存在に応答して下方制御されるアプタザイムは、モジュレータに応答した遺伝子発現の上方制御が望ましい制御系において使用され得ることが留意されるべきである。
【０１７３】
[0258]  アプタザイムは、環状ポリリボヌクレオチド発現の自動調節のためのシステムの開発も可能にし得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドのタンパク質産物は、特定の小分子の合成における律速酵素であり、その分子の存在下で増加した触媒活性を有するように選択されるアプタザイムを含むように修飾され得、それにより、その合成のための自己調節フィードバックループを提供する。代わりに、アプタザイム活性は、環状ポリリボヌクレオチドからのタンパク質産物又は任意の他の細胞高分子の蓄積に対して感受性であるように選択され得る。
【０１７４】
[0259]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、アプタマー配列を含み得る。いくつかの非限定的な例としては、ＲＮＡアプタマー結合リゾチーム、高い特異性及び親和性でトロンビンに結合する２’フルオロピリミジンヌクレオチドを含むＲＮＡアプタマーであるＴｏｇｇｌｅ−２５ｔ、ヒト免疫不全ウイルストランス作用性応答要素（ＨＩＶ  ＴＡＲ）に結合するＲＮＡＴａｔ、ＲＮＡアプタマー結合ｈｅｍｉｎ、ＲＮＡアプタマー結合インターフェロンγ、ＲＮＡアプタマー結合血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）、ＲＮＡアプタマー結合前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、ＲＮＡアプタマー結合ドーパミン及びＲＮＡアプタマー結合非古典的癌遺伝子、熱ショック因子１（ＨＳＦ１）が挙げられる。
【０１７５】
環状化
[0260]  一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、環状化又はコンカテマー化され得る。ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、製剤化及び／又は送達前にインビトロで環状化され得る。ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で環状化され得る。
【０１７６】
細胞外環状化
[0261]  ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、化学的方法を用いて環状化又はコンカテマー化されて、環状ポリリボヌクレオチドを形成する。ある化学的方法において、核酸（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）の５’末端及び３’末端は、互いに近づけると、分子の５’末端と３’末端との間で新たな共有結合を形成し得る化学的に反応性の基を含む。５’末端は、ＮＨＳエステル反応性基を含有し得、３’末端は、３’−アミノ末端ヌクレオチドを含有し得、有機溶媒中において、線状ＲＮＡ分子の３’末端における３’−アミノ末端ヌクレオチドが、５’−ＮＨＳ−エステル部分上で求核攻撃を起こして、新たな５’−／３’−アミド結合を形成するようになっている。
【０１７７】
[0262]  一実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼを用いて、５’−リン酸化核酸分子（例えば、線状環状ポリリボヌクレオチド）を核酸（例えば、線状核酸）の３’−ヒドロキシル基に酵素的に連結して、新たなホスホロジエステル結合を形成し得る。例の反応において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、製造業者のプロトコルに従って１〜１０単位のＴ４  ＲＮＡリガーゼと共に１時間にわたって３７℃でインキュベートされる（ニュー・イングランド・バイオラボ、マサチューセッツ州イプスウィッチ）。ライゲーション反応は、酵素的ライゲーション反応を補助するために並んだ５’−及び３’−領域の両方と塩基対合することが可能な線状核酸の存在下で起こり得る。一実施形態において、ライゲーションは、スプリントライゲーションである。例えば、ＳｐｌｉｎｔＲ（登録商標）リガーゼのようなスプリントリガーゼがスプリントライゲーションに使用され得る。スプリントライゲーションでは、一本鎖ＲＮＡのような一本鎖ポリヌクレオチド（スプリント）は、２つの末端が一本鎖スプリントとのハブリダイゼーション時に並置され得るように線状ポリリボヌクレオチドの両方の末端とハイブリダイズするように設計され得る。したがって、スプリントリガーゼは、線状ポリリボヌクレオチドの並置される２つの末端のライゲーションを触媒して、環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。
【０１７８】
[0263]  一実施形態において、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリヌクレオチドの合成に使用され得る。非限定的な例として、リガーゼは、ｃｉｒｃリガーゼ又は環状リガーゼである。
【０１７９】
[0264]  一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端又は３’末端のいずれかは、インビトロ転写中、得られる線状環状ポリリボヌクレオチドが、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端を線状環状ポリリボヌクレオチドの３’末端にライゲートすることが可能な活性リボザイム配列を含むように、リガーゼリボザイム配列をコードし得る。リガーゼリボザイムは、グループＩイントロン、デルタ肝炎ウイルス、ヘアピン型リボザイムに由来し得るか、又はＳＥＬＥＸ（指数関数的濃縮によるリガンドの体系的な進化）によって選択され得る。リボザイムリガーゼ反応は、０〜３７℃の温度で１〜２４時間行われ得る。
【０１８０】
[0265]  一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの非核酸部分を用いることによって環状化又はコンカテマー化され得る。一態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化するために、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端の近傍及び／又は３’末端の近傍の領域又は特徴と反応し得る。別の態様において、少なくとも１つの非核酸部分は、線状環状ポリリボヌクレオチド５’末端及び／又は３’末端に位置するか又は連結されるか又はその近傍にあり得る。考えられる非核酸部分は、同種又は異種であり得る。非限定的な例として、非核酸部分は、疎水性結合、イオン結合、生分解性結合及び／又は切断可能な結合などの結合であり得る。別の非限定的な例として、非核酸部分は、ライゲーション部分である。さらに別の非限定的な例として、非核酸部分は、本明細書に記載されるアプタマー又は非核酸リンカーなどのオリゴヌクレオチド又はペプチド部分であり得る。
【０１８１】
[0266]  一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、線状環状ポリリボヌクレオチド５’及び３’末端における、その近傍における若しくはそのような５’及び３’末端に連結された、原子間、分子表面間の吸引力を引き起こす非核酸部分により、環状化又はコンカテマー化され得る。非限定的な例として、１つ以上の線状環状ポリリボヌクレオチドは、分子間力又は分子内力によって環状化又はコンカテマー化され得る。分子間力の非限定的な例としては、双極子−双極子力、双極子−誘起双極子力、誘起双極子−誘起双極子力、ファン・デル・ワールス力及びロンドン分散力が挙げられる。分子内力の非限定的な例としては、共有結合、金属結合、イオン結合、共鳴結合、アグノスティック結合（agnostic bond）、双極子結合、共役、超共役及び反結合が挙げられる。
【０１８２】
[0267]  一実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、５’末端の近傍及び３’末端の近傍にリボザイムＲＮＡ配列を含み得る。リボザイムＲＮＡ配列は、配列がリボザイムの残りの部分に曝されるとき、ペプチドに共有結合し得る。一態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡ配列に共有結合されたペプチドは、互いに結合して、線状環状ポリリボヌクレオチドを環状化又はコンカテマー化させ得る。別の態様において、５’末端及び３’末端の近傍でリボザイムＲＮＡに共有結合されたペプチドは、限定はされないが、タンパク質ライゲーションなどの当該技術分野において公知の様々な方法を用いたライゲーションに線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡを供した後、それらを環状化又はコンカテマー化させ得る。本発明の線状一次構築物若しくは線状ＲＮＡに使用するためのリボザイムの非限定的な例又はペプチドを組み込み且つ／又は共有結合するための方法の非限定的な一覧が米国特許出願公開第２００３００８２７６８号明細書に記載されており、その内容全体が参照により本明細書に援用される。
【０１８３】
[0268]  ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、５’トリホスフェートをＲＮＡ  ５’ピロホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）又はＡＴＰジホスホヒドロラーゼ（アピラーゼ）と接触させることによって５’モノホスフェートに転化される核酸の５’トリホスフェートを含み得る。代わりに、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’トリホスフェートを５’モノホスフェートに転化することは、（ａ）線状環状ポリリボヌクレオチドの５’ヌクレオチドをホスファターゼ（例えば、アンタークティック（Ａｎｔａｒｃｔｉｃ）ホスファターゼ、エビ由来アルカリホスファターゼ又は仔牛小腸由来ホスファターゼ）と接触させて、３つ全てのホスフェートを除去する工程；及び（ｂ）工程（ａ）後の５’ヌクレオチドを、１つのホスフェートを追加するキナーゼ（例えば、ポリヌクレオチドキナーゼ）と接触させる工程を含む２工程反応によって行われ得る。
【０１８４】
[0269]  ある実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％又は１００％である。ある実施形態において、本明細書において提供される環状化方法の環状化効率は、少なくとも約４０％である。
【０１８５】
スプライシング要素
[0270]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスプライシング要素を含む。本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドにおいて、スプライシング要素は、環状ポリリボヌクレオチドのスプライシングを媒介し得る完全なスプライシング要素であり得る。代わりに、スプライシング要素は、完了したスプライシング事象からの残留スプライシング要素でもあり得る。例えば、ある場合において、線状ポリリボヌクレオチドのスプライシング要素は、線状ポリリボヌクレオチドの環状化をもたらすスプライシング事象を媒介することができ、それにより、得られる環状ポリリボヌクレオチドは、このようなスプライシングを介した環状化事象からの残留スプライシング要素を含む。ある場合において、残留スプライシング要素は、スプライシングを媒介することができない。他の場合、残留スプライシング要素は、特定の状況下でスプライシングを依然として媒介することができる。ある実施形態において、スプライシング要素は、少なくとも１つの発現配列に隣接する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、各発現配列に隣接するスプライシング要素を含む。ある実施形態において、スプライシング要素は、各発現配列の１つの側又は両側にあり、発現産物、例えばペプチド及び又はポリペプチドの分離をもたらす。
【０１８６】
[0271]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複製されると、スプライスされた末端が互いに結合される内部のスプライシング要素を含む。いくつかの例は、スプライス部位配列及びＡｌｕＳｑ２、ＡｌｕＪｒ及びＡｌｕＳｚなどの短い逆方向反復（３０〜４０ｎｔ）、隣接するイントロン中の逆方向配列、隣接するイントロン中のＡｌｕ要素並びに隣接するエクソンを有するバックスプライス部位の２００ｂｐ前にある（上流にある）又は後ろにある（下流にある）配列など、バックスプライス事象の近位にある（ｓｕｐｔａｂｌｅ４富化モチーフ）シス−配列要素に見られるモチーフを有する小型のイントロン（＜１００ｎｔ）を含み得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部のスプライシング要素として本明細書の他の箇所に記載される少なくとも１つの反復ヌクレオチド配列を含む。このような実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、イントロンのＡｌｕファミリーからの反復配列を含み得る。ある実施形態において、スプライシングに関連するリボソーム結合タンパク質は、環状ポリリボヌクレオチド生合成を調節し得る（例えば、Ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ及びＱｕａｋｉｎｇ（ＱＫＩ）スプライシング因子）。
【０１８７】
[0272]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの頭尾接合部（head-to-tail junction）に隣接する標準スプライス部位を含み得る。
【０１８８】
[0273]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの３−ヌクレオチドバルジによって隣接される４−塩基対ステムを含むバルジ−ヘリックス−バルジモチーフを含み得る。切断がバルジ領域において起こり、末端５’−ヒドロキシル基及び２’，３’−環状ホスフェートを有する特徴的なフラグメントを生成する。環状化は、３’，５’−ホスホジエステル架橋を形成する同じ分子の２’，３’−環状ホスフェートへの５’−ＯＨ基の求核攻撃によって進行する。
【０１８９】
[0274]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＨＰＲ要素を有する多量体反復ＲＮＡ配列を含み得る。ＨＰＲは、２’，３’−環状ホスフェート及び５’−ＯＨ末端を含む。ＨＰＲ要素は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’末端及び３’末端を自己プロセシングし、それによって末端を互いにライゲートする。
【０１９０】
[0275]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲーションを媒介する配列を含み得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲートするために、ＨＤＶ配列（例えば、ＨＤＶ複製ドメイン保存配列、
GGCUCAUCUCGACAAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCAAGUUCGAGCAUGAGCC  又は
GGCUAGAGGCGGCAGUCCUCAGUACUCUUACUCUUUUCUGUAAAGAGGAGACUGCUGGACUCGCCGCCCGAGCC）を含み得る。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己ライゲートするために、ループＥ配列（例えば、ＰＳＴＶｄ中に）を含み得る。別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己環状化イントロン、例えば５’及び３’スプライス接合部又はグループＩ、グループＩＩ若しくはグループＩＩＩイントロンなどの自己環状化触媒イントロンを含み得る。グループＩイントロン自己スプライシング配列の非限定的な例は、Ｔ４バクテリオファージ遺伝子ｔｄに由来する自己スプライシング置換イントロン−エクソン配列及びテトラヒメナ属（Tetrahymena）の介在配列（ＩＶＳ）ｒＲＮＡを含み得る。
【０１９１】
他の環状化方法
[0276]  ある実施形態において、線状環状ポリリボヌクレオチドは、個々のイントロン内に又は隣接するイントロンにわたって反復又は非反復核酸配列を含む相補的配列を含み得る。反復核酸配列は、環状ポリリボヌクレオチドのセグメント内に存在する配列である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、反復核酸配列を含む。ある実施形態において、反復ヌクレオチド配列は、ポリＣＡ又はポリＵＧ配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの別のセグメント中の相補的な反復核酸配列にハイブリダイズする少なくとも１つの反復核酸配列を含み、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、２つの別個の環状ポリリボヌクレオチドからの反復核酸配列及び相補的な反復核酸配列がハイブリダイズして、単一の環状化ポリリボヌクレオチドを生成し、ハイブリダイズされたセグメントが内部二本鎖を形成する。ある実施形態において、相補的配列は、線状環状ポリリボヌクレオチドの５’及び３’末端において見られる。ある実施形態において、相補的配列は、約３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを含む。
【０１９２】
[0277]  ある実施形態において、環状化の化学的方法が、環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。このような方法としては、限定はされないが、クリック化学（例えば、アルキン及びアジドに基づく方法又はクリック可能な塩基）、オレフィンメタセシス、ホスホロアミデートライゲーション、ヘミアミナール−イミン架橋、塩基修飾及びそれらの任意の組合せが挙げられる。
【０１９３】
[0278]  ある実施形態において、環状化の酵素的方法は、環状ポリリボヌクレオチドを生成するのに使用され得る。ある実施形態において、ライゲーション酵素、例えばＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼは、環状ポリリボヌクレアーゼ若しくは相補体の鋳型、環状ポリリボヌクレアーゼの相補鎖又は環状ポリリボヌクレアーゼを生成するのに使用され得る。
【０１９４】
[0279]  環状ポリリボヌクレオチドの環状化は、当該技術分野において公知の方法、例えばＮｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ，２０１５，４３（４）：２４５４−２４６５からのＰｅｔｋｏｖｉｃ及びＭｕｌｌｅｒによる“ＲＮＡ  ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ”及びＲＮＡ  Ｂｉｏｌ，２０１７，１４（８）：１０１８−１０２７からのＭｕｌｌｅｒ及びＡｐｐｅｌによる“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｃｉｒｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＲＮＡ”に記載されているものによって行われ得る。
【０１９５】
複製要素
[0280]  環状ポリリボヌクレオチドは、複製に有用な配列及び／又はモチーフをコードし得る。環状ポリリボヌクレオチドの複製は、相補体環状ポリリボヌクレオチドを生成することによって行われ得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、転写を開始させるためのモチーフを含み、ここで、転写は、環状ポリリボヌクレオチドによってコードされる内在性細胞機構（ＤＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼ）又はＲＮＡ依存的ＲＮＡポリメラーゼのいずれかによって駆動される。ローリングサークル型転写事象の産物は、単位長において相補的又は伝播される環状ポリリボヌクレオチドのいずれかを生成するためにリボザイムによって切断され得る。リボザイムは、環状ポリリボヌクレオチド、その相補体又はトランスにおけるＲＮＡ配列によってコードされ得る。ある実施形態において、コードされたリボザイムは、環状ＲＮＡ伝播を制御するためにリボザイムの活性を調節する（阻害又は促進する）配列又はモチーフを含み得る。ある実施形態において、単位長配列は、細胞内ＲＮＡリガーゼによって環状形態にライゲートされ得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己増幅に役立つ複製要素を含む。このような複製要素の例としては、限定はされないが、本明細書の他の箇所に記載されるＨＤＶ複製ドメイン、ジャガイモやせいもウイロイド（Ｐｏｔａｔｏ  Ｓｐｉｎｄｌｅ  Ｔｕｂｅｒ  Ｖｉｒｏｉｄ）のＲＮＡプロモータ（例えば、Ｋｏｌｏｎｋｏ  ２００５  Ｖｉｒｏｌｏｇｙを参照されたい）並びにアンチゲノム 5’-CGGGUCGGCAUGGCAUCUCCACCUCCUCGCGGUCCGACCUGGGCAUCCGAAGGAGGACGCACGUCCACUCGGAUGGCUAAGGGAGAGCCA-3’  若しくはゲノム 5’-UGGCCGGCAUGGUCCCAGCCUCCUCGCUGGCGCCGGCUGGGCAACAUUCCGAGGGGACCGUCCCCUCGGUAAUGGCGAAUGGGACCCA-3’
などの複製コンピテント環状ＲＮＡセンス及び／又はアンチセンスリボザイムが挙げられる。
【０１９６】
[0281]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、複製を促進することが本明細書に記載される少なくとも１つのスタガー要素を含む。環状ポリリボヌクレオチド内のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドから複製された長い転写産物を、特定の長さに切断することができ、これが後に環状化されて、環状ポリリボヌクレオチドに対する相補体を形成する。
【０１９７】
[0282]  別の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドから複製された長い転写産物を特定の長さに切断するために、少なくとも１つのリボザイム配列を含み、ここで、別のコードされたリボザイムがリボザイム配列において転写産物を切断する。環状化は、環状ポリリボヌクレオチドに対する相補体を形成する。
【０１９８】
[0283]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、エキソヌクレアーゼによる分解に対して実質的に抵抗性である。
[0284]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜７５％、７５％〜８０％、８０％〜８５％、８５％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％又はそれらの間の任意のパーセンテージの速度において細胞内で複製する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製され、娘細胞に送られる。ある実施形態において、細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態において、減数分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態において、有糸分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。
【０１９９】
[0285]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主細胞内で複製する。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞内で複製することが可能である。
【０２００】
[0286]  実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主細胞内で複製するが、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の染色体により、宿主のゲノムに組み込まれない。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の染色体により、ごくわずかな組み換え頻度を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、宿主の染色体により、例えば約１．０ｃＭ／Ｍｂ、０．９ｃＭ／Ｍｂ、０．８ｃＭ／Ｍｂ、０．７ｃＭ／Ｍｂ、０．６ｃＭ／Ｍｂ、０．５ｃＭ／Ｍｂ、０．４ｃＭ／Ｍｂ、０．３ｃＭ／Ｍｂ、０．２ｃＭ／Ｍｂ、０．１ｃＭ／Ｍｂ未満又はそれを下回る組み換え頻度を有する。
【０２０１】
他の配列
[0287]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、別の核酸配列をさらに含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は人工核酸を含む他の配列を含み得る。他の配列としては、限定はされないが、ｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ｒＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｇＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ又は他のＲＮＡｉ分子をコードするゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ又は配列が挙げられる。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドと同じ遺伝子発現産物の異なる遺伝子座を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。一実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドと異なる遺伝子発現産物を標的にするためにｓｉＲＮＡを含む。
【０２０２】
[0288]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’−ＵＴＲを欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’−ＵＴＲを欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ−Ａ配列を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解感受性を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドが分解感受性を欠いていることは、環状ポリリボヌクレオチドがエキソヌクレアーゼによって分解されないか、又はエキソヌクレアーゼの非存在下と同等又は同様の限られた程度にエキソヌクレアーゼの存在下でのみ分解されることを意味し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼによる分解を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、エキソヌクレアーゼに曝されたときに減少した分解を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップ結合タンパク質への結合を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’キャップを欠いている。
【０２０３】
[0289]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’−ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、３’−ＵＴＲを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、ポリ−Ａ配列を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、終止要素を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、キャップを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、５’−ＵＴＲ、３’−ＵＴＲ及びＩＲＥＳを欠いており、その１つ以上の発現配列からタンパク質を発現する能力がある。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、以下の配列の１つ以上を含む：１つ以上のｍｉＲＮＡをコードする配列、１つ以上の複製タンパク質をコードする配列、外来性遺伝子をコードする配列、治療薬をコードする配列、調節要素（例えば、翻訳モジュレータ、例えば翻訳エンハンサー又はサプレッサー）、翻訳開始配列、内在性遺伝子（ｓｉＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡｓ、ｓｈＲＮＡ）を標的にする１つ以上の調節核酸及び治療用ｍＲＮＡ又はタンパク質をコードする配列。
【０２０４】
[0290]  他の配列は、約２〜約１００００ｎｔ、約２〜約５０００ｎｔ、約１０〜約１００ｎｔ、約５０〜約１５０ｎｔ、約１００〜約２００ｎｔ、約１５０〜約２５０ｎｔ、約２００〜約３００ｎｔ、約２５０〜約３５０ｎｔ、約３００〜約５００ｎｔ、約１０〜約１０００ｎｔ、約５０〜約１０００ｎｔ、約１００〜約１０００ｎｔ、約１０００〜約２０００ｎｔ、約２０００〜約３０００ｎｔ、約３０００〜約４０００ｎｔ、約４０００〜約５０００ｎｔ又はそれらの間の任意の範囲の長さを有し得る。
【０２０５】
[0291]  その環状化の結果として、環状ポリリボヌクレオチドは、それを線状ＲＮＡと区別するいくつかの特徴を含み得る。例えば、環状ポリリボヌクレオチドは、線状ＲＮＡと比較して、エキソヌクレアーゼによる分解に対する感受性がより低い。したがって、環状ポリリボヌクレオチドは、特に、エキソヌクレアーゼの存在下でインキュベートされるとき、線状ＲＮＡより安定している。線状ＲＮＡと比較した環状ポリリボヌクレオチドの増加した安定性により、環状ポリリボヌクレオチドが、ポリペプチドを生成する細胞形質転換試薬としてより有用になり、線状ＲＮＡより容易に及びより長く貯蔵可能になる。エキソヌクレアーゼで処理された環状ポリリボヌクレオチドの安定性は、ＲＮＡ分解が起こったかどうかを決定する、当該技術分野において標準的な方法を用いて（例えば、ゲル電気泳動によって）試験され得る。
【０２０６】
[0292]  さらに、線状ＲＮＡと異なり、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドが仔牛小腸由来ホスファターゼなどのホスファターゼと共にインキュベートされるとき、脱リン酸化に対する感受性がより低い。
【０２０７】
ヌクレオチドスペーサー配列
[0293]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、スペーサー配列を含む。
【０２０８】
[0294]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスペーサー配列を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７つ又はそれを超えるスペーサー配列を含む。
【０２０９】
[0295]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、約０．０５：１、約０．０６：１、約０．０７：１，約０．０８：１、約０．０９：１、約０．１：１、約０．１２：１、約０．１２５：１、約０．１５：１、約０．１７５：１、約０．２：１、約０．２２５：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．３５：１、約０．４：１、約０．４５：１、約０．５：１、約０．５５：１、約０．６：１、約０．６５：１、約０．７：１、約０．７５：１、約０．８：１、約０．８５：１、約０．９：１、約０．９５：１、約０．９８：１、約１：１、約１．０２：１、約１．０５：１、約１．１：１、約１．１５：１、約１．２：１、約１．２５：１、約１．３：１、約１．３５：１、約１．４：１、約１．４５：１、約１．５：１、約１．５５：１、約１．６：１、約１．６５：１、約１．７：１、約１．７５：１、約１．８：１、約１．８５：１、約１．９：１、約１．９５：１、約１．９７５：１、約１．９８：１又は約２：１の、環状ポリリボヌクレオチド、例えば発現配列のスペーサー配列対非スペーサー配列の比率を含む。
【０２１０】
[0296]  ある実施形態において、スペーサー配列は、約０．５：１、約０．０６：１、約０．０７：１，約０．０８：１、約０．０９：１、約０．１：１、約０．１２：１、約０．１２５：１、約０．１５：１、約０．１７５：１、約０．２：１、約０．２２５：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．３５：１、約０．４：１、約０．４５：１、約０．５：１、約０．５５：１、約０．６：１、約０．６５：１、約０．７：１、約０．７５：１、約０．８：１、約０．８５：１、約０．９：１、約０．９５：１、約０．９８：１、約１：１、約１．０２：１、約１．０５：１、約１．１：１、約１．１５：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約１．９５：１、約１．９７５：１、約１．９８：１、約２．１：１、約２．２：１、約２．３：１、約２．４：１、約２．５：１、約２．６：１、約２．７：１、約２．８：１、約２．９：１、約３：１、約３．１：１、約３．２：１、約３．３：１、約３．４：１、約３．５：１、約３．６：１、約３．７：１、約３．８：１、約３．８５：１，約３．９：１、約３．９５：１、約３．９８：１又は約４：１の、環状ポリリボヌクレオチドの下流（例えば、スペーサー配列３’末端側）の非スペーサー要素に対するスペーサー配列の比率を含む。ある実施形態において、スペーサー配列は、約０．５：１、約０．０６：１、約０．０７：１，約０．０８：１、約０．０９：１、約０．１：１、約０．１２：１、約０．１２５：１、約０．１５：１、約０．１７５：１、約０．２：１、約０．２２５：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．３５：１、約０．４：１、約０．４５：１、約０．５：１、約０．５５：１、約０．６：１、約０．６５：１、約０．７：１、約０．７５：１、約０．８：１、約０．８５：１、約０．９：１、約０．９５：１、約０．９８：１、約１：１、約１．０２：１、約１．０５：１、約１．１：１、約１．１５：１、約１．２：１、約１．３：１、約１．４：１、約１．５：１、約１．６：１、約１．７：１、約１．８：１、約１．９：１、約１．９５：１、約１．９７５：１、約１．９８：１、約２．１：１、約２．２：１、約２．３：１、約２．４：１、約２．５：１、約２．６：１、約２．７：１、約２．８：１、約２．９：１、約３：１、約３．１：１、約３．２：１、約３．３：１、約３．４：１、約３．５：１、約３．６：１、約３．７：１、約３．８：１、約３．８５：１，約３．９：１、約３．９５：１、約３．９８：１又は約４：１の、環状ポリリボヌクレオチドの上流（例えば、スペーサー配列の５’末端側）の非スペーサー要素に対するスペーサー配列の比率を含む。
【０２１１】
[0297]  ある実施形態において、スペーサー配列は、少なくとも３リボヌクレオチド、少なくとも４リボヌクレオチド、少なくとも５リボヌクレオチド、少なくとも約８リボヌクレオチド、少なくとも約１０リボヌクレオチド、少なくとも約１２リボヌクレオチド、少なくとも約１５リボヌクレオチド、少なくとも約２０リボヌクレオチド、少なくとも約２５リボヌクレオチド、少なくとも約３０リボヌクレオチド、少なくとも約４０リボヌクレオチド、少なくとも約５０リボヌクレオチド、少なくとも約６０リボヌクレオチド、少なくとも約７０リボヌクレオチド、少なくとも約８０リボヌクレオチド、少なくとも約９０リボヌクレオチド、少なくとも約１００リボヌクレオチド、少なくとも約１２０リボヌクレオチド、少なくとも約１５０リボヌクレオチド、少なくとも約２００リボヌクレオチド、少なくとも約２５０リボヌクレオチド、少なくとも約３００リボヌクレオチド、少なくとも約４００リボヌクレオチド、少なくとも約５００リボヌクレオチド、少なくとも約６００リボヌクレオチド、少なくとも約７００リボヌクレオチド、少なくとも約８００リボヌクレオチド、少なくとも約９００リボヌクレオチド又は少なくとも約１００リボヌクレオチドの配列を含む。
【０２１２】
[0298]  ある実施形態において、スペーサー配列は、スペーサーの完全長にわたり又はスペーサーの連続した核酸残基の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％若しくは９９％にわたり、例えば６５％、６０％、５５％、５０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３９％、３８％、３７％、３６％、３５％、３４％、３３％、３２％、３１％、３０％、２９％、２８％、２７％、２６％、２５％、２４％、２３％、２２％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％若しくは１％未満の低いＧＣ含量を有する核酸配列又は分子であり得る。ある実施形態において、スペーサー配列は、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２０％又はそれらの間の任意のパーセンテージのアデニンリボヌクレオチドを含み得る。ある実施形態において、スペーサー配列は、連続して少なくとも５個以上のアデニンリボヌクレオチドを含む。ある実施形態において、スペーサー配列は、連続して少なくとも６個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも７個のアデニンリボヌクレオチド、少なくとも８個のリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１２個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１５個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約２０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約２５個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約３０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約４０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約６０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約７０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約８０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約９０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約９５個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約１５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約２００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約２５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約３００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約３５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約４００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約４５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約５００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約５５０個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約６００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約７００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約８００個のアデニンリボヌクレオチド、連続して少なくとも約９００個のアデニンリボヌクレオチド又は連続して少なくとも約１０００個のアデニンリボヌクレオチ���を含む。
【０２１３】
[0299]  ある実施形態において、スペーサー配列は、１つ以上の要素間に位置する。ある実施形態において、スペーサー配列は、要素間の立体配座柔軟性を提供する。ある実施形態において、立体配座柔軟性は、スペーサー配列が二次構造を実質的に含まないことによる。ある実施形態において、スペーサー配列は、４０ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満、−３９、−３８、−３７、−３６、−３５、−３４、−３３、−３２、−３１、−３０、−２９、−２８、−２７、−２６、−２５、−２４、−２３、−２２、−２０、−１９、−１８、−１７、−１６、−１５、−１４、−１３、−１２、−１１、−１０、−９、−８、−７、−６、−５、−４、−３、−２又は−１ｋｃａｌ／ｍｏｌ未満など、二次構造を実質的に含まない。スペーサーは、ＤＮＡ又はＲＮＡなどの核酸を含み得る。
【０２１４】
[0300]  ある実施形態において、スペーサー配列は、ＲＮＡ配列及び好ましくは分泌シグナルペプチドを含むタンパク質又はペプチド配列をコードし得る。
[0301]  ある実施形態において、スペーサー配列は、非コード性であり得る。スペーサーが非コード配列である場合、翻訳開始配列は、隣接する配列のコード配列において提供され得る。ある実施形態において、コード配列の第１の核酸残基は、ＡＵＧなどの翻訳開始配列のＡ残基であり得ることが想定される。スペーサーがＲＮＡ又はタンパク質又はペプチド配列をコードする場合、翻訳開始配列は、スペーサー配列において提供され得る。
【０２１５】
[0302]  ある実施形態において、スペーサーは、本明細書に記載される別の配列に動作可能に連結される。
【０２１６】
非核酸リンカー
[0303]  本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、非核酸リンカーも含み得る。ある実施形態において、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、本明細書に記載される配列又は要素の１つ以上の間に非核酸リンカーを有する。一実施形態において、本明細書に記載される１つ以上の配列又は要素は、リンカーを用いて連結される。非核酸リンカーは、化学結合、例えば１つ以上の共有結合又は非共有結合であり得る。ある実施形態において、非核酸リンカーは、ペプチド又はタンパク質リンカーである。このようなリンカーは、２〜３０アミノ酸又はそれを超えるものであり得る。リンカーは、本明細書に記載される可撓性、剛性又は切断可能なリンカーを含む。
【０２１７】
[0304]  最も一般的に使用される可撓性リンカーは、主に、Ｇｌｙ及びＳｅｒ残基（「ＧＳ」リンカー）のストレッチからなる配列を有する。可撓性リンカーは、ある程度の移動又は相互作用を必要とするドメインを結合するのに有用であり得、小さい非極性（例えば、Ｇｌｙ）又は極性（例えば、Ｓｅｒ又はＴｈｒ）アミノ酸を含み得る。Ｓｅｒ又はＴｈｒの組み込みは、水分子により水素結合を形成することによって水溶液中のリンカーの安定性も維持し、したがってリンカーとタンパク質部分との間の好ましくない相互作用を減少させ得る。
【０２１８】
[0305]  剛性リンカーは、ドメイン間の一定の距離を保持し、それらの独立した機能を維持するのに有用である。剛性リンカーは、ドメインの空間的隔離が、融合中の１つ以上の構成要素の安定性又は生物活性を保つのに重要である場合にも有用であり得る。剛性リンカーは、αヘリックス構造又はＰｒｏリッチ配列、（ＸＰ）ｎを有し得、ここで、Ｘは、任意のアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ｌｙｓ又はＧｌｕを示す。
【０２１９】
[0306]  切断可能なリンカーは、インビボで遊離機能的ドメインを解放し得る。ある実施形態において、リンカーは、還元試薬又はプロテアーゼの存在下などの特定の条件下で切断され得る。インビボで切断可能なリンカーは、ジスルフィド結合の可逆性を用い得る。一例としては、２つのＣｙｓ残基間のトロンビン感受性配列（例えば、ＰＲＳ）を含む。ＣＰＲＳＣのインビトロトロンビン処理は、トロンビン感受性配列の切断をもたらす一方、可逆的なジスルフィド結合は無傷のままである。このようなリンカーが公知であり、例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１３．Ｆｕｓｉｏｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｌｉｎｋｅｒ：Ｐｒｏｐｅｒｔｙ，Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｙ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７−１３６９に記載されている。融合中のリンカーのインビボ切断は、特定の細胞又は組織内で病的状態（例えば、癌又は炎症）においてインビボで発現されるか、又は特定の細胞内区画内で制限されるプロテアーゼによっても行われ得る。多くのプロテアーゼの特異性は、制限された区画におけるリンカーのよりゆっくりとした切断を提供する。
【０２２０】
[0307]  連結分子の例としては、疎水性リンカー、例えば負の電荷を帯びたスルホネート基；脂質、例えばポリ（−ＣＨ２−）炭化水素鎖、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基、その不飽和形態、その水酸化形態、そのアミド化若しくは他の形のＮ含有形態、非炭素リンカー；炭水化物リンカー；ホスホジエステルリンカー又は２つ以上のポリペプチドを共有結合することが可能な他の分子が挙げられる。例えば、ポリペプチドの疎水性領域若しくはポリペプチドの疎水性伸長を介して、ポリペプチドが連結された疎水性脂質小球、例えばロイシン、イソロイシン、バリン又はさらにおそらくアラニン、フェニルアラニン或いはチロシン、メチオニン、グリシン又は他の疎水性残基に富んだ一連の残基などの非共有結合リンカーも含まれる。ポリペプチドの正の電荷を帯びた部分が別のポリペプチド又は核酸の負電荷に連結されるように、ポリペプチドは、電荷に基づいた化学を用いて連結され得る。
【０２２１】
安定性／半減期
[0308]  ある実施形態において、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドは、対照、例えば同じヌクレオチド配列を有するが、環状されていない線状ポリリボヌクレオチド（線状同等物）より増加した半減期を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に抵抗性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、自己分解に対して抵抗性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、酵素切断部位、例えばダイサー切断部位を欠いている。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、対照、例えば線状同等物より、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約２００％、少なくとも約３００％、少なくとも約４００％、少なくとも約５００％、少なくとも約６００％、少なくとも約７００％、少なくとも約８００％、少なくとも約９００％、少なくとも約１０００％又は少なくとも約１００００％長い半減期を有する。
【０２２２】
[0309]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞分裂中に細胞内で持続する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、有糸分裂後に娘細胞内で持続する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内で複製され、娘細胞に送られる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドの自己複製を媒介する複製要素を含む。ある実施形態において、複製要素は、環状ポリリボヌクレオチドに対して相補的な線状ポリリボヌクレオチド（線状相補性）への環状ポリリボヌクレオチドの転写を媒介する。ある実施形態において、線状相補性ポリリボヌクレオチドは、相補的な環状ポリリボヌクレオチドに細胞内においてインビボで環状化され得る。ある実施形態において、相補的ポリリボヌクレオチドは、出発環状ポリリボヌクレオチドと同じ又は類似したヌクレオチド配列を有する別の環状ポリリボヌクレオチドにさらに自己複製し得る。１つの例示的な自己複製要素としては、ＨＤＶ複製ドメインが挙げられる（Ｂｅｅｈａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ，Ｖｉｒｏｌ，２０１４，４５０−４５１：１６５−１７３によって記載されるように）。ある実施形態において、細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で少なくとも１つの環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態において、減数分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。ある実施形態において、有糸分裂を行っている細胞は、少なくとも２５％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％又は９９％の効率で環状ポリリボヌクレオチドを娘細胞に送る。
【０２２３】
修飾
[0310]  環状ポリリボヌクレオチドは、参照配列に対して１つ以上の置換、挿入及び／又は付加、欠失及び共有結合修飾を含み得、特に親ポリリボヌクレオチドが本発明の範囲内に含まれる。
【０２２４】
[0311]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の転写後修飾（例えば、キャッピング、切断、ポリアデニル化、スプライシング、ポリ−Ａ配列、メチル化、アシル化、リン酸化、リジン及びアルギニン残基のメチル化、アセチル化並びにチオール基及びチロシン残基のニトロシル化など）を含む。１つ以上の転写後修飾は、ＲＮＡにおいて同定された１００を超える様々なヌクレオシド修飾のいずれかなどの任意の転写後修飾であり得る（Ｒｏｚｅｎｓｋｉ，Ｊ，Ｃｒａｉｎ，Ｐ，ａｎｄ  ＭｃＣｌｏｓｋｅｙ，Ｊ．（１９９９）．Ｔｈｅ  ＲＮＡ  Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ：１９９９  ｕｐｄａｔｅ．Ｎｕｃｌ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２７：１９６−１９７）。ある実施形態において、第１の単離核酸は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）を含む。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、ピリジン−４−オンリボヌクレオシド、５−アザ−ウリジン、２−チオ−５−アザ−ウリジン、２−チオウリジン、４−チオ−プソイドウリジン、２−チオ−プソイドウリジン、５−ヒドロキシウリジン、３−メチルウリジン、５−カルボキシメチル−ウリジン、１−カルボキシメチル−プソイドウリジン、５−プロピニル−ウリジン、１−プロピニル−プソイドウリジン、５−タウリノメチルウリジン、１−タウリノメチル−プソイドウリジン、５−タウリノメチル−２−チオ−ウリジン、１−タウリノメチル−４−チオ−ウリジン、５−メチル−ウリジン、１−メチル−プソイドウリジン、４−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−プソイドウリジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、２−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドウリジン、ジヒドロウリジン、ジヒドロシュードウリジン、２−チオ−ジヒドロウリジン、２−チオ−ジヒドロシュードウリジン、２−メトキシウリジン、２−メトキシ−４−チオ−ウリジン、４−メトキシ−プソイドウリジン及び４−メトキシ−２−チオ−プソイドウリジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、５−アザ−シチジン、プソイドシチジン、３−メチル−シチジン、Ｎ４−アセチルシチジン、５−ホルミルシチジン、Ｎ４−メチルシチジン、５−ヒドロキシメチルシチジン、１−メチル−プソイドシチジン、ピロロ−シチジン、ピロロ−プソイドシチジン、２−チオ−シチジン、２−チオ−５−メチル−シチジン、４−チオ−プソイドシチジン、４−チオ−１−メチル−プソイドシチジン、４−チオ−１−メチル−１−デアザ−プソイドシチジン、１−メチル−１−デアザ−プソイドシチジン、ゼブラリン、５−アザ−ゼブラリン、５−メチル−ゼブラリン、５−アザ−２−チオ−ゼブラリン、２−チオ−ゼブラリン、２−メトキシ−シチジン、２−メトキシ−５−メチル−シチジン、４−メトキシ−プソイドシチジン及び４−メトキシ−１−メチル−プソイドシチジンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、２−アミノプリン、２、６−ジアミノプリン、７−デアザ−アデニン、７−デアザ−８−アザ−アデニン、７−デアザ−２−アミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２−アミノプリン、７−デアザ−２，６−ジアミノプリン、７−デアザ−８−アザ−２，６−ジアミノプリン、１−メチルアデノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−（シス−ヒドロキシイソペンテニル）アデノシン、Ｎ６−グリシニルカルバモイル（glycinylcarbamoyl）アデノシン、Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、２−メチルチオ−Ｎ６−トレオニルカルバモイルアデノシン、Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデノシン、７−メチルアデニン、２−メチルチオ−アデニン及び２−メトキシ−アデニンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。ある実施形態において、ｍＲＮＡは、イノシン、１−メチル−イノシン、ワイオシン、ワイブトシン、７−デアザ−グアノシン、７−デアザ−８−アザ−グアノシン、６−チオ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−グアノシン、６−チオ−７−デアザ−８−アザ−グアノシン、７−メチル−グアノシン、６−チオ−７−メチル−グアノシン、７−メチルイノシン、６−メトキシ−グアノシン、１−メチルグアノシン、Ｎ２−メチルグアノシン、Ｎ２，Ｎ２−ジメチルグアノシン、８−オキソ−グアノシン、７−メチル−８−オキソ−グアノシン、１−メチル−６−チオ−グアノシン、Ｎ２−メチル−６−チオ−グアノシン及びＮ２，Ｎ２−ジメチル−６−チオ−グアノシンからなる群から選択される少なくとも１つのヌクレオシドを含む。
【０２２５】
[0312]  環状ポリリボヌクレオチドは、糖、核酸塩基又はヌクレオシド間結合などに対する（例えば、連結ホスフェート／ホスホジエステル結合／ホスホジエステル骨格に対する）任意の有用な修飾を含み得る。ピリミジン核酸塩基の１つ以上の原子は、任意選択的に置換されるアミノ、任意選択的に置換されるチオール、任意選択的に置換されるアルキル（例えば、メチル若しくはエチル）又はハロ（例えば、クロロ若しくはフルオロ）で置き換えられ得るか又は置換され得る。特定の実施形態において、修飾（例えば、１つ以上の修飾）は、糖及びヌクレオシド間結合のそれぞれに存在する。修飾は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、ロックト核酸（ＬＮＡ）又はそのハイブリッド）へのリボ核酸（ＲＮＡ）の修飾であり得る。さらなる修飾が本明細書に記載される。
【０２２６】
[0313]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳効率を高めるために、少なくとも１つのＮ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾を含む。ある実施形態において、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）修飾は、環状ポリリボヌクレオチドの免疫原性を低下させ得る。
【０２２７】
[0314]  ある実施形態において、修飾は、化学修飾又は細胞誘導性修飾を含み得る。例えば、細胞内ＲＮＡ修飾のいくつかの非限定的な例は、Ｎａｔ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，２０１７，１８：２０２−２１０からの“ＲＮＡ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ  ａｎｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ｃｏｏｐｅｒａｔｅ  ｔｏ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ−ｐｒｏｔｅｉｎ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ”においてＬｅｗｉｓ及びＰａｎによって記載されている。
【０２２８】
[0315]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドのリボヌクレオチドに対する化学修飾は、免疫回避を促進し得る。環状ポリリボヌクレオチドは、参照により本明細書に援用される“Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ”，Ｂｅａｕｃａｇｅ，Ｓ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．（Ｅｄｓ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ，ＵＳＡに記載されているものなど、当該技術分野において十分に確立された方法によって合成及び／又は修飾され得る。修飾としては、例えば、末端修飾、例えば５’末端修飾（リン酸化（一−、二−及び三−リン酸化）、共役、反転結合など）、３’末端修飾（共役、ＤＮＡヌクレオチド、反転結合など）、塩基修飾（例えば、安定化塩基、不安定化塩基又は広いレパートリーのパートナーと塩基対合する塩基による置換）、塩基の除去（脱塩基ヌクレオチド）又は共役塩基が挙げられる。修飾リボヌクレオチド塩基は、５−メチルシチジン及びプソイドウリジンも含み得る。ある実施形態において、塩基修飾は、環状ポリリボヌクレオチドのいくつかの機能的効果を挙げると、発現、免疫応答、安定性、細胞内局在化を調節し得る。ある実施形態において、修飾としては、双直交（bi-orthogonal）ヌクレオチド、例えば非天然塩基が挙げられる。例えば、参照により本明細書に援用されるＫｉｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ，Ｃｈｅｍ  Ｃｏｍｍｕｎ（Ｃａｍｂ），２０１７，５３：１２３０９，ＤＯＩ：１０．１０３９／ｃ７ｃｃ０６６６１ａを参照されたい。
【０２２９】
[0316]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上のリボヌクレオチドの糖修飾（例えば、２’位若しくは４’位における）又は糖の置換には、骨格修飾だけでなく、ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含み得る。環状ポリリボヌクレオチドの具体例としては、限定はされないが、ホスホジエステル結合の修飾又は置換を含む、ヌクレオシド間修飾などの修飾骨格又は非天然ヌクレオシド間結合を含む環状ポリリボヌクレオチドが挙げられる。修飾骨格を有する環状ポリリボヌクレオチドとしては、中でも特に、骨格中にリン原子を有さないものが挙げられる。本出願の趣旨では、且つ当該技術分野において時々参照されるように、それらのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有さない修飾ＲＮＡもオリゴヌクレオシドであると考えられ得る。特定の実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、そのヌクレオシド間骨格中にリン原子を有するリボヌクレオチドを含む。
【０２３０】
[0317]  修飾環状ポリリボヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、３’−アルキレンホスホネート及びキラルホスホネートなどのメチル及び他のアルキルホスホネート、ホスフィネート、３’−アミノホスホロアミデート及びアミノアルキルホスホロアミデートなどのホスホロアミデート、チオノホスホロアミデート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル及びこれらの通常の３’−５’結合、２’−５’連結類似体を有するボラノホスフェート及び逆極性を有するものが挙げられ、ここで、ヌクレオシド単位の隣接する対が連結される（３’−５’を５’−３’に又は２’−５’を５’−２’に）。様々な塩、混合塩及び遊離酸形態も含まれる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、負の電荷又は正の電荷を帯び得る。
【０２３１】
[0318]  環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれ得る修飾ヌクレオチドは、ヌクレオシド間結合（例えば、ホスフェート骨格）上で修飾され得る。本明細書において、ポリヌクレオチド骨格に関して、「ホスフェート」及び「ホスホジエステル」という語句は、同義的に使用される。骨格リン酸基は、酸素原子の１つ以上を様々な置換基で置換することによって修飾され得る。さらに、修飾ヌクレオシド及びヌクレオチドは、本明細書に記載される別のヌクレオシド間結合による非修飾ホスフェート部分の大規模な置換を含み得る。修飾リン酸基の例としては、限定はされないが、ホスホロチオエート、ホスホロセレネート、ボラノホスフェート、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、ホスホロジアミデート、アルキル又はアリールホスホネート及びホスホトリエステルが挙げられる。ホスホロジチオエートは、両方の非連結酸素が硫黄で置換されている。ホスフェートリンカーは、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）及び炭素（架橋メチレン−ホスホネート）による連結酸素の置換によっても修飾され得る。
【０２３２】
[0319]  非天然ホスホロチオエート骨格結合によってＲＮＡ及びＤＮＡポリマーに安定性を与えるためにａ−チオ置換ホスフェート部分が提供される。ホスホロチオエートＤＮＡ及びＲＮＡは、増加したヌクレアーゼ耐性、したがって細胞環境内でのより長い半減期を有する。環状ポリリボヌクレオチドに連結されたホスホロチオエートは、細胞の自然免疫分子のより弱い結合／活性化によって自然免疫応答を低減すると予測される。
【０２３３】
[0320]  特定の実施形態において、修飾ヌクレオシドとしては、α−チオ−ヌクレオシド（例えば、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−アデノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−シチジン（α−チオ−シチジン）、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−グアノシン、５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−ウリジン又は５’−Ｏ−（１−チオホスフェート）−プソイドウリジン）が挙げられる。
【０２３４】
[0321]  リン原子を含有しないヌクレオシド間結合を含む、本発明に従って用いられ得る他のヌクレオシド間結合が本明細書に記載される。
[0322]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上の細胞毒性ヌクレオシドを含み得る。例えば、細胞毒性ヌクレオシドは、二機能性修飾などの環状ポリリボヌクレオチドに組み込まれ得る。細胞毒性ヌクレオシドとしては、限定はされないが、アデノシンアラビノシド、５−アザシチジン、４’−チオ−アラシチジン、シクロペンテニルシトシン、クラドリビン、クロファラビン、シタラビン、シトシンアラビノシド、１−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）−シトシン、デシタビン、５−フルオロウラシル、フルダラビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、テガフール及びウラシルの組合せ、テガフール（（ＲＳ）−５−フルオロ−１−（テトラヒドロフラン−２−イル）ピリミジン−２，４（１Ｈ，３Ｈ）−ジオン）、トロキサシタビン、テザシタビン、２’−デオキシ−２’−メチリデンシチジン（ＤＭＤＣ）及び６−メルカプトプリンが挙げられる。さらなる例としては、フルダラビンホスフェート、Ｎ４−ベヘノイル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４−オクタデシル−１−β−Ｄ−アラビノフラノシルシトシン、Ｎ４−パルミトイル−１−（２−Ｃ−シアノ−２−デオキシ−β−Ｄ−アラビノ−ペントフラノシル）シトシン及びＰ−４０５５（シタラビン５’−エライジン酸エステル）が挙げられる。
【０２３５】
[0323]  環状ポリリボヌクレオチドは、分子の全長に沿って均一に修飾されても又はされなくてもよい。例えば、ヌクレオチドの１つ以上若しくは全てのタイプ（例えば、天然ヌクレオチド、プリン又はピリミジン又はＡ、Ｇ、Ｕ、Ｃ、Ｉ、ｐＵのいずれか１つ以上若しくは全て）は、環状ポリリボヌクレオチドにおいて又はその所与の所定の配列領域において均一に修飾されても又はされなくてもよい。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、プソイドウリジンを含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、イノシンを含み、これは、免疫系が、ウイルスＲＮＡに対して内在性であるものとして環状ポリリボヌクレオチドを特徴付けることを促進し得る。イノシンの組み込みは、向上したＲＮＡ安定性／減少した分解も媒介し得る。例えば、全体が参照により援用されるＹｕ，Ｚ．ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＲＮＡ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｂｙ  ＡＤＡＲ１  ｍａｒｋｓ  ｄｓＲＮＡ  ａｓ“ｓｅｌｆ”．Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ．２５，１２８３−１２８４を参照されたい。
【０２３６】
[0324]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチド（又はその所与の配列）中の全てのヌクレオチドが修飾される。ある実施形態において、修飾としては、発現を増大し得るｍ６Ａ；免疫応答を弱め得るイノシン；ＲＮＡ安定性又は翻訳の読み過ごしを増大し得るプソイドウリジン（スタガー要素）、安定性を増大し得るｍ５Ｃ；及び細胞内転座（例えば、核局在化）を促進する２，２，７−トリメチルグアノシンが挙げられる。
【０２３７】
[0325]  様々な糖修飾、ヌクレオチド修飾及び／又はヌクレオシド間結合（例えば、骨格構造）が環状ポリリボヌクレオチド中の様々な位置に存在し得る。当業者は、環状ポリリボヌクレオチドの機能が実質的に低下されないように、ヌクレオチド類似体又は他の修飾が環状ポリリボヌクレオチドの任意の位置に位置し得ることを理解するであろう。修飾は、非コード領域の修飾でもあり得る。環状ポリリボヌクレオチドは、約１％〜約１００％の修飾ヌクレオチド（全ヌクレオチド含量に対して又はヌクレオチドの１つ以上のタイプ、すなわちＡ、Ｇ、Ｕ若しくはＣのいずれか１つ以上に対して）又はその間の任意のパーセンテージ（例えば、１％〜２０％＞、１％〜２５％、１％〜５０％、１％〜６０％、１％〜７０％、１％〜８０％、１％〜９０％、１％〜９５％、１０％〜２０％、１０％〜２５％、１０％〜５０％、１０％〜６０％、１０％〜７０％、１０％〜８０％、１０％〜９０％、１０％〜９５％、１０％〜１００％、２０％〜２５％、２０％〜５０％、２０％〜６０％、２０％〜７０％、２０％〜８０％、２０％〜９０％、２０％〜９５％、２０％〜１００％、５０％〜６０％、５０％〜７０％、５０％〜８０％、５０％〜９０％、５０％〜９５％、５０％〜１００％、７０％〜８０％、７０％〜９０％、７０％〜９５％、７０％〜１００％、８０％〜９０％、８０％〜９５％、８０％〜１００％、９０％〜９５％、９０％〜１００％及び９５％〜１００％）を含み得る。
【０２３８】
構造
[0326]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、高次構造、例えば二次又は三次構造を含む。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの相補的セグメントが二本鎖セグメントに折り畳まれ、対間、例えばＡ−Ｕ及びＣ−Ｇの水素結合で結合される。ある実施形態において、末端ループに連結された二本鎖セグメントを有する、ステムとしても知られているらせんが分子内に形成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。ある実施形態において、疑似二本鎖二次構造を有するセグメントは、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超える対合ヌクレオチドを有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似二本鎖二次構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、セグメントは、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドによって隔てられる。
【０２３９】
[0327]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、実質的に一本鎖対二本鎖領域を含む。ある実施形態において、一本対二本鎖の比率は、環状ポリリボヌクレオチドの機能性に影響を与え得る。
【０２４０】
[0328]  ある実施形態では、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列である。ある実施形態において、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、タンパク質−又はＲＮＡ−結合部位を含み得る。ある実施形態において、実質的に一本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、増大した相互作用を可能にするために立体配座柔軟性であり得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、結合するか又はタンパク質若しくは核酸結合を増加させるために、このような二次構造を含むように意図的に操作される。
【０２４１】
[0329]  ある実施形態では、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列である。ある実施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチドの１つ以上の配列は、立体配座認識部位、例えばリボスイッチ又はアプタザイムを含み得る。ある実施形態において、実質的に二本鎖である環状ポリリボヌクレオチド配列は、立体配座的に固定され得る。あるこのような場合において、立体配座的に固定された配列は、環状ポリリボヌクレオチドを、タンパク質又は核酸の結合から立体的に遮蔽し得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの配列は、タンパク質又は核酸結合を回避又は低減するために、このような二次構造を含むように意図的に操作される。
【０２４２】
[0330]  １６の可能な塩基対合があるが、これらの６つ（ＡＵ、ＧＵ、ＧＣ、ＵＡ、ＵＧ、ＣＧ）が実際の塩基対を形成し得る。残りは、ミスマッチと呼ばれ、らせん中に非常に低い頻度で存在する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの構造は、その機能に対する影響及び致命的な結果なしに容易に破壊することができず、それにより二次構造を維持する選択を与える。ある実施形態において、ステム（すなわちそれらのヌクレオチド配列）の一次構造は、らせん領域を依然として維持しながら、依然として変化し得る。塩基の性質は、より高次の構造に伴い、置換は、それらが二次構造を保つ限り可能である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する少なくとも１つのセグメントを有する。ある実施形態において、疑似らせん構造を有するセグメントは、少なくとも３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドを有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、疑似らせん構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、セグメントは、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００又はそれを超えるヌクレオチドによって隔てられる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｕリッチ又はＡリッチ配列又はそれらの組合せの少なくとも１つを含む。ある実施形態において、Ｕリッチ及び／又はＡリッチ配列は、三重疑似らせん構造を生成し得るように配置される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、二重疑似らせん構造を有する１つ以上のセグメント（例えば、２、３、４、５、６つ又はそれを超える）を有する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列の少なくとも１つを含む。ある実施形態において、Ｃリッチ及び／又はＧリッチ配列は、三重疑似らせん構造を生成し得るように配置される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、安定化を促進する分子内三重疑似らせん構造を有する。
【０２４３】
[0331]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、２つの疑似らせん構造（例えば、ホスホジエステル結合によって隔てられる）を有し、それらの末端塩基対がスタックし、疑似らせん構造が同一直線上になり、「同軸上にスタックされた」部分構造をもたらすようになっている。
【０２４４】
[0332]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、１つ以上のモチーフ、例えばシュードノット、グアニン四重鎖、らせん及び同軸的スタッキングを有する三次構造を含む。
【０２４５】
[0333]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの結合部位、例えば少なくとも１つのタンパク質結合部位、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｌｎｃＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｔＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｒＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｐｉＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎｏＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｎＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｅｘＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｓｃａＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのＹ  ＲＮＡ結合部位、少なくとも１つのｈｎＲＮＡ結合部位及び／又は少なくとも１つのｔＲＮＡモチーフを有する。
【０２４６】
送達
[0334]  本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドは、送達担体と共に医薬組成物にも含まれ得る。
【０２４７】
[0335]  本明細書に記載される医薬組成物は、例えば、医薬担体及び／又はポリマー担体、例えばリポソームなどの担体を含む製剤であり得、それを必要とする対象（例えば、ヒト又は非ヒト農用動物又は家畜、例えばウシ、イヌ、ネコ、ウマ、家禽）に公知の方法によって送達され得る。このような方法としては、限定はされないが、トランスフェクション（例えば、脂質媒介性、カチオン性ポリマー、リン酸カルシウム、デンドリマー）；エレクトロポレーション又は膜破壊の他の方法（例えば、ヌクレオフェクション）、ウイルス送達（例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、ＡＡＶ）、微量注入、微粒子銃（「遺伝子銃」）、フゲン（fugene）、直接音波負荷、細胞スクイージング、光学的トランスフェクション、プロトプラスト融合、インペールフェクション、マグネトフェクション、エクソソーム媒介性移動、脂質ナノ粒子媒介性移動及びそれらの任意の組合せが挙げられる。送達の方法は、例えば、Ｇｏｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｎｄ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  ｆｏｒ  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊｕｌｙ  ２０１５、２６（７）：４４３−４５１．ｄｏｉ：１０．１０８９／ｈｕｍ．２０１５．０７４；及びＺｕｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｃａｔｉｏｎｉｃ  ｌｉｐｉｄ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｅｎａｂｌｅｓ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４  Ｏｃｔ  ３０；３３（１）：７３−８０にも記載されている。
【０２４８】
[0336]  本発明は、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを含む宿主又は宿主細胞にさらに関する。ある実施形態において、宿主又は宿主細胞は、植物、昆虫、細菌、真菌、脊椎動物、哺乳動物（例えば、ヒト）又は他の生物若しくは細胞である。
【０２４９】
[0337]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、宿主において非免疫原性である。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、参照化合物、例えば記載される環状ポリリボヌクレオチド又はエンクリプトゲンを欠いた環状ポリリボヌクレオチドに対応する線状ポリヌクレオチドによって引き起こされる応答と比較して、宿主の免疫系による応答が減少されるか、又は宿主の免疫系による応答を生成することができない。いくつかの免疫応答としては、限定はされないが、液性免疫応答（例えば、抗原特異的抗体の産生）及び細胞媒介性免疫応答（例えば、リンパ球増殖）が挙げられる。
【０２５０】
[0338]  ある実施形態において、宿主又は宿主細胞が環状ポリリボヌクレオチドと接触される（例えば、それに送達又は投与される）。ある実施形態において、宿主は、ヒトなどの哺乳動物である。宿主中の環状ポリリボヌクレオチド、発現産物又はその両方の量は、投与後の任意の時点で測定され得る。特定の実施形態において、培養物中の宿主成長の時間経過が決定される。成長が環状ポリリボヌクレオチドの存在下で増加又は減少される場合、環状ポリリボヌクレオチド若しくは発現産物又はその両方は、宿主の成長を増加又は減少させるのに有効であると特定される。
【０２５１】
生成の方法
[0339]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、非天然であり、組み換え技術（以下に詳細に記載される方法、例えばＤＮＡプラスミドを用いてインビトロで得られる）又は化学合成を用いて生成され得るデオキシリボ核酸配列を含む。
【０２５２】
[0340]  ＲＮＡ環を生成するのに使用されるＤＮＡ分子が、天然の元の核酸配列のＤＮＡ配列、その修飾形態又は自然界で通常見られない合成ポリペプチド（例えば、キメラ分子又は融合タンパク質）をコードするＤＮＡ配列を含む得ることは、本発明の範囲内である。ＤＮＡ及びＲＮＡ分子は、限定はされないが、部位特異的突然変異誘発、突然変異を誘発するための核酸分子の化学的処理、核酸フラグメントの制限酵素切断、核酸フラグメントのライゲーション、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅及び／又は核酸配列の選択された領域の突然変異誘発、オリゴヌクレオチド混合物の合成及び核酸分子の混合物を「構築する」ための混合物群のライゲーション並びにそれらの組合せなど、古典的な突然変異誘発技術及び組み換え技術を含む様々な技術を用いて修飾され得る。
【０２５３】
[0341]  環状ポリリボヌクレオチドは、限定はされないが、化学合成及び酵素的合成を含む任意の利用可能な技術に従って調製され得る。ある実施形態において、線状一次構築物又は線状ｍＲＮＡは、環状化又はコンカテマー化されて、本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを生成し得る。環状化又はコンカテマー化の機構は、限定はされないが、化学的、酵素的、スプリントライゲーション）又はリボザイム触媒方法などの方法によって行われ得る。新たに形成される５’−／３’−結合は、分子内結合又は分子間結合であり得る。
【０２５４】
[0342]  本明細書に記載される環状ポリリボヌクレオチドを作製する方法は、例えば、Ｋｈｕｄｙａｋｏｖ＆Ｆｉｅｌｄｓ，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  ＤＮＡ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ（２００２）；Ｚｈａｏ，Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，（Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（２０１３）；及びＥｇｌｉ＆Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，（Ｆｉｒｓｔ  Ｅｄｉｔｉｏｎ），Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ（２０１２）に記載されている。
【０２５５】
[0343]  環状ポリリボヌクレオチドを合成する様々な方法は、当該技術分野でも記載されている（例えば、それぞれの内容全体が参照により本明細書に援用される米国特許第６２１０９３１号明細書、米国特許第５７７３２４４号明細書、米国特許第５７６６９０３号明細書、米国特許第５７１２１２８号明細書、米国特許第５４２６１８０号明細書、米国特許出願公開第２０１００１３７４０７号明細書、国際公開第１９９２００１８１３号パンフレット及び国際公開第２０１００８４３７１号パンフレットを参照されたい）。
【０２５６】
[0344]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、生成不純物、例えば遊離リボ核酸、線状又はニックＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質などを除去するために、生成後にクリーンアップされ得る。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、当該技術分野において一般的に使用される任意の公知の方法によって精製され得る。非限定的な精製方法の例としては、カラムクロマトグラフィー、ゲル排除、サイズ排除などが挙げられる。
【０２５７】
医薬組成物
[0345]  本発明は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた組成物を含む。医薬組成物１つ以上のさらなる活性物質、例えば治療的及び／又は予防的に活性な物質を任意選択的に含み得る。本発明の医薬組成物は、滅菌されており且つ／又はパイロジェンフリーであり得る。医薬品の製剤化及び／又は製造における概論は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ  ２１ｓｔ  ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５（参照により本明細書に援用される）に見られる。
【０２５８】
[0346]  本明細書において提供される医薬組成物の説明は、主に、ヒトへの投与に好適な医薬組成物に関するが、このような組成物は、一般に、任意の他の動物、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳動物への投与に好適であることが当業者によって理解されるであろう。組成物を様々な動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の変更は、十分に理解されており、通常の技能を有する獣医薬理学者は、あったとしても通常の実験のみでこのような変更を設計及び／又は行うことができる。医薬組成物の投与が想定される対象としては、限定はされないが、ヒト及び／又は他の霊長類；家禽、ニワトリ、カモ、ガチョウ及び／又はシチメンチョウなどの商業的に関連する鳥類を含むウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス及び／又はラット；及び／又は鳥類などの商業的に関連する哺乳動物を含む哺乳動物が挙げられる。
【０２５９】
[0347]  本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知であるか又は今後開発される任意の方法によって調製され得る。一般に、このような調製方法は、有効成分を賦形剤及び／又は１つ以上の他の補助成分と組み合わせて、次に必要に応じて及び／又は望ましい場合、生成物を分割、成形及び／又は包装する工程を含む。
【０２６０】
発現の方法
[0348]  本発明は、タンパク質発現のための方法であって、本明細書において提供される環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳することを含む方法を含む。
【０２６１】
[0349]  ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、ポリペプチドへの、環状ポリリボヌクレオチドの全長の少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％の翻訳を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、少なくとも５アミノ酸、少なくとも１０アミノ酸、少なくとも１５アミノ酸、少なくとも２０アミノ酸、少なくとも５０アミノ酸、少なくとも１００アミノ酸、少なくとも１５０アミノ酸、少なくとも２００アミノ酸、少なくとも２５０アミノ酸、少なくとも３００アミノ酸、少なくとも４００アミノ酸、少なくとも５００アミノ酸、少なくとも６００アミノ酸、少なくとも７００アミノ酸、少なくとも８００アミノ酸、少なくとも９００アミノ酸又は少なくとも１０００アミノ酸のポリペプチドへの、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、約５アミノ酸、約１０アミノ酸、約１５アミノ酸、約２０アミノ酸、約５０アミノ酸、約１００アミノ酸、約１５０アミノ酸、約２００アミノ酸、約２５０アミノ酸、約３００アミノ酸、約４００アミノ酸、約５００アミノ酸、約６００アミノ酸、約７００アミノ酸、約８００アミノ酸、約９００アミノ酸又は約１０００アミノ酸のポリペプチドへの、環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。ある実施形態において、本方法は、本明細書において提供される連続したポリペプチド、本明細書において提供される別個のポリペプチド又はその両方への環状ポリリボヌクレオチドの翻訳を含む。
【０２６２】
[0350]  ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、ウサギ網状赤血球溶解物など、インビトロで行われる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、例えば、真核細胞のトランスフェクション又は細菌などの原核細胞の形質転換後、インビボで行われる。
【０２６３】
[0351]  ある態様において、本開示は、対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程とを含む方法を提供する。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日間又はそれを超える期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現が約４０％を超えて低下しないように構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内における１つ以上の発現配列の発現が、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２３日間又はそれを超えて、約４０％を超えて変化しないレベルに維持されるように構成される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの投与は、本明細書に記載される任意の送達方法を用いて行われる。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドは、静脈注射によって対象に投与される。ある実施形態において、環状ポリリボヌクレオチドの投与としては、限定はされないが、出産前投与、新生児期投与、出生後投与、経口、注入によるもの（例えば、静脈内、動脈内、腹腔内、皮内、皮下及び筋肉内）、眼内投与及び鼻腔内投与によるものが挙げられる。
【０２６４】
[0352]  ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、翻訳産物の修飾、折り畳み又は他の翻訳後修飾を含む。ある実施形態において、タンパク質発現のための方法は、例えば、細胞機構を介したインビボでの翻訳後修飾を含む。
【０２６５】
[0353]  本明細書に引用される全ての参考文献及び刊行物は、参照により本明細書に援用される。
[0354]  上述される実施形態は、上記の機能特性を得るために組み合わされ得る。これは、得られる例示的な組合せ及び機能特性を記載する以下の実施例によっても示される。表１は、上述される様々な要素がどのように組み合わされ得るか、及び観察される機能特性を示す例示的な概要を示す。
【０２６６】
【表１−１】
2021508490.tif 000003
【０２６７】
【表１−２】
2021508490.tif 000004
【実施例】
【０２６８】
[0355]  以下の実施例は、本発明のある実施形態をさらに例示するために提供されるが、本発明の範囲を限定することを意図されておらず；それらの例示的な性質により、当業者に公知の他の手順、方法又は技術が代わりに使用され得ることが理解されるであろう。
【０２６９】
実施例１：インビトロ環状ＲＮＡ生成
[0356]  この実施例は、環状ＲＮＡのインビトロ生成を実証する。
【０２７０】
[0357]  図２に示されるように、環状ＲＮＡは、開始コドン（配列番号１）、ＯＲＦ（配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＩＲＥＳ（配列番号５）を用いて設計される。環状化は、ローリングサークル型翻訳、別個のＯＲＦ発現及び制御されたタンパク質化学量論のための交互のスタガー要素を有する複数のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、ＲＮＡ免疫原性を弱めるか又は軽減するためのエンクリプトゲン及びポリ−Ａ配列なしでリボソーム進入のためのＲＮＡを標的にする任意選択のＩＲＥＳを可能にする。
【０２７１】
[0358]  この実施例において、環状ＲＮＡは、以下のように生成される。非修飾線状ＲＮＡは、５’−及び３’−ＺＫＳＣＡＮ１イントロン及び２Ａ配列に連結されたＧＦＰをコードするＯＲＦを有するＤＮＡセグメントから、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いてインビトロ転写によって合成される。転写されたＲＮＡがＲＮＡ精製システム（キアゲン）を用いて精製され、製造業者の説明に従ってアルカリホスファターゼ（サーモフィッシャーサイエンティフィック、ＥＦ０６５２）で処理され、ＲＮＡ精製システムを用いて再度精製される。
【０２７２】
[0359]  スプリントライゲーション環状ＲＮＡは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏ，Ｉｎｃ．、Ｍ０２０２Ｍ）を用いて転写された線状ＲＮＡ及びＤＮＡスプリントの処理によって生成され、環状ＲＮＡは、ＲＮａｓｅ  Ｒ処理による富化後、単離される。ＲＮＡ品質がアガロースゲル又は自動化電気泳動（Ａｇｉｌｅｎｔ）によって評価される。
【０２７３】
実施例２：インビボ環状ＲＮＡ生成、細胞培養
[0360]  この実施例は、環状ＲＮＡのインビボ生成を実証する。
【０２７４】
[0361]  ＧＦＰ（配列番号２）が発現ベクター、例えばｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ａｄｄｇｅｎｅ）（配列番号６）にクローニングされる。図３に示されるように、このベクターは、細胞内での環状ＲＮＡ生成を誘発するように突然変異誘発される（配列番号６及びＫｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５によって記載される）。
【０２７５】
[0362]  ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン−ストレプトマイシン及び１０％のウシ胎仔血清が補充された、高グルコース（ライフテクノロジーズ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において、３７℃及び５％のＣＯ２で成長させる。１μｇの上記の発現プラスミドを、脂質トランスフェクション試薬（ライフテクノロジーズ）を用いてトランスフェクトし、トランスフェクト細胞からの全ＲＮＡを、トランスフェクションの１時間〜２０日後、製造業者の説明に従ってフェノール系ＲＮＡ単離試薬（ライフテクノロジーズ）を用いて単離する。
【０２７６】
[0363]  ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡレベルを測定するために、ランダムヘキサマーを用いたｑＰＣＲ逆転写が行われる。要するに、ＲＴ−ｑＰＣＲのために、同じ供給源からのＨｅｌａ細胞の全ＲＮＡ及びＲＮａｓｅ  Ｒ−消化ＲＮＡがＲＴ−ＰＣＲのための鋳型として使用される。ＧＦＰ  ｍＲＮＡ及び環状ＧＦＰ  ＲＮＡのｃＤＮＡを調製するために、逆転写反応は、製造業者の説明に従って逆転写酵素（Ｓｕｐｅｒ−Ｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ：ＲＮａｓｅ  Ｈ；インビトロジェン）及びランダムヘキサマーを用いて行われる。増幅されたＰＣＲ産物が６％のＰＡＧＥを用いて分析され、臭化エチジウム染色によって視覚化される。富化因子を推定するために、ＰＣＲ産物がデンシトメトリー（ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｙｎａｍｉｃｓ）によって定量化され、全ＲＮＡサンプルの濃度がＵＶ吸光度によって測定される。
【０２７７】
[0364]  さらなるＲＮＡ測定がノーザンブロット分析を用いて行われる。簡潔には、全細胞抽出物を、フェノール系試薬（ＴＲＩｚｏｌ）を用いて得るか、又は核及び細胞質タンパク質抽出物を市販のキット（ＣｅｌＬｙｔｉｃ  ＮｕＣＬＥＡＲ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、シグマ）を用いて細胞の分画によって得る。ＲＮＡポリメラーゼＩＩ転写を阻害するために、細胞を３７℃で０〜６時間にわたってフラボピリドール（１ｍＭの最終濃度；シグマ）で処理する。ＲＮａｓｅ  Ｒ処理のために、１０ｍｇの全ＲＮＡを３７℃で１時間にわたって２０ＵのＲＮａｓｅ  Ｒ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ）で処理する。
【０２７８】
[0365]  オリゴヌクレオチドプローブを用いたノーザンブロットが以下のように行われる。オリゴヌクレオチドプローブ、ＰＣＲプライマーが標準的なプライマー設計ツールを用いて設計される。Ｔ７プロモータ配列がリバースプライマーに加えられて、インビトロ転写反応におけるアンチセンスプローブが得られる。インビトロ転写は、製造業者の説明に従ってＤＩＧ−ＲＮＡ標識用ミックスを用いて、Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて行われる。ＤＮＡ鋳型がＤＮＡ  Ｉ消化によって除去され、ＲＮＡプローブがフェノールクロロホルム抽出及びその後の沈殿によって精製される。プローブは、５０ｎｇ／ｍｌで使用される。全ＲＮＡ（２μｇ〜１０μｇ）を、グリオキサールローディングダイ（アンビオン）を用いて変性させ、ＭＯＰＳ緩衝液中１．２％のアガロースゲル上で分解させる。ゲルを２０分間にわたって１×ＴＢＥに浸漬させ、セミドライブロッティングシステム（バイオラッド）を用いて１時間（１５Ｖ）にわたってＨｙｂｏｎｄ−Ｎ＋膜（ＧＥヘルスケア）に移す。膜を乾燥させ、１２０，０００μＪ／ｃｍ２で１回、（２６５ｎｍで）ＵＶ架橋させる。プレハイブリダイゼーションを１時間にわたって６８℃で行い、ＤＩＧで標識したインビトロで転写されたＲＮＡプローブを一晩ハイブリダイズする。膜を３０分間にわたって６８℃において２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで３回洗浄した後、６８℃において０．２×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳで３０分間３回洗浄する。免疫検出は、アルカリホスファターゼ抗体と直接共役された抗ＤＩＧを用いて行われる。免疫活性ビースは、化学発光アルカリホスファターゼ基質（ＣＤＰ  ｓｔａｒ試薬）並びに画像検出及び定量化システムＬＡＳ−４０００検出システム）を用いて視覚化される。
【０２７９】
実施例３：環状ＲＮＡの調製及びインビトロ翻訳
[0366]  この実施例は、環状ＲＮＡからの遺伝子産物の遺伝子発現及び検出を実証する。
【０２８０】
[0367]  この実施例において、環状ＲＮＡは、開始コドン（配列番号１）、ＧＦＰ  ＯＲＦ（配列番号２）、スタガー要素（配列番号３）、ヒト由来エンクリプトゲン（配列番号４）を用いて、且つＩＲＥＳ（配列番号５）を用いて若しくは用いずに設計される（図４を参照されたい）。この実施例において、環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
【０２８１】
[0368]  環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ、米国ウイスコンシン州フィッツバーグ）中で５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭのメチオニン及びロイシン、２０μＭのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（東洋紡、大阪）を含む。アリコートを混合物から取り、１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（アトー、東京）上で分離させる。上清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％のＳＤＳ、３０％のグリセロール、５％の２−メルカプトエタノール、０．０１％のブロモフェノールブルー）に７０℃で１５分間溶解させる。ヘモグロビンタンパク質がこのプロセス中に除去される一方、ヘモグロビン以外のタンパク質が濃縮される。
【０２８２】
[0369]  ５分間にわたる１，４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販の標準（バイオラッド）がサイズマーカーとして使用される。セミドライ方法を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア）に電気泳動転写された後、ブロットが化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いて視覚化される。
【０２８３】
[0370]  ＧＦＰタンパク質が細胞溶解物中で視覚化され、ローリングサークル型翻訳の結果として、線状ＲＮＡより環状ＲＮＡ中で多い量で検出されることが予測される。
【０２８４】
実施例４：環状ＲＮＡからの化学量論的タンパク質発現
[0371]  この実施例は、タンパク質を化学量論的に発現する環状ＲＮＡの能力を実証する。
【０２８５】
[0372]  この実施例において、１つの環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）及びＲＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号８）を、ＧＦＰ及びＲＦＰ  ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図５を参照されたい）。別の環状ＲＮＡが同様に設計されるが、隣接する２Ａ配列の代わりに、それは、ＧＦＰ及びＲＦＰ  ＯＲＦ間に終止及び開始コドンを有する。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
【０２８６】
[0373]  環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ、米国ウイスコンシン州フィッツバーグ）中で５時間又は一晩インキュベートする。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、１０μＭのメチオニン及びロイシン、２０μＭのメチオニン及びロイシン以外のアミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（東洋紡、大阪）を含む。アリコートを混合物から取り、１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）ゲル（アトー、東京）上で分離させる。上清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液（０．１２５Ｍのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％のＳＤＳ、３０％のグリセロール、５％の２−メルカプトエタノール、０．０１％のブロモフェノールブルー）に７０℃で１５分間溶解させる。ヘモグロビンタンパク質がこのプロセス中に除去される一方、ヘモグロビン以外のタンパク質が濃縮される。
【０２８７】
[0374]  ５分間にわたる１，４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析する。市販の標準（バイオラッド）がサイズマーカーとして使用される。セミドライ方法を用いてポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）膜（ミリポア）に電気泳動転写された後、ブロットが化学発光キット（Ｒｏｃｋｌａｎｄ）を用いて視覚化される。
【０２８８】
[0375]  ＧＦＰ及びＲＦＰ  ＯＲＦが終止及び開始コドンによって隔てられていない環状ＲＮＡは、いずれのタンパク質も等量で有する一方、ＯＲＦ間に開始及び終止コドンを含む環状ＲＮＡで処理された細胞は、いずれのタンパク質も異なる量で有することが予測される。
【０２８９】
実施例５：細胞培養物における非免疫原性
[0376]  この実施例は、細胞感染後の環状ＲＮＡの免疫原性のインビボ評価を実証する。
【０２９０】
[0377]  この実施例において、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン、例えばＺＫＳＣＡＮ１イントロン及びＧＦＰ  ＯＲＦを含むように設計される。さらに、対照環状ＲＮＡは、イントロンを含むか又は含まずに、ＧＦＰ  ＯＲＦを含むように設計される（図６を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。ＨｅＬａ細胞が５００ｎｇの環状ＲＮＡでトランスフェクトされる。
【０２９１】
[0378]  環状ＲＮＡのトランスフェクションは、以下の条件を含む：（１）細胞培養培地中の裸の環状ＲＮＡ（Ｌｉｎｇｏｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００４）；（２）エレクトロポレーション（Ｍｕｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５）；（３）カチオン性脂質（ＳＮＡＬＰ、Ｖａｘｆｅｃｔｉｎ）（Ｃｈｅｓｎｏｙ  ａｎｄ  Ｈｕａｎｇ，２０００）；（３）カチオン性ポリマー（ＰＥＩ、ポリブレン、ＤＥＡＥ−デキストラン）（Ｔｕｒｂｏｆｅｃｔ）；（４）ウイルス様粒子（ＨＰＶからのＬ１、ポリオーマウイルスからのＶＰ１）（Ｔｏｎｇｅｓ  ｅｔ  ａｌ  ２００６）；（５）エクソソーム（ＳＢＩからのＥｘｏ−Ｆｅｃｔ）；（６）ナノ構造リン酸カルシウム（ナノＣａＰ）（Ｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００６）；（６）ペプチド形質導入ドメイン（ＴＡＴ、ポリＲ、ＳＰ、ｐＶＥＣ、ＳｙｎＢ１など）（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）；（７）小胞（ＶＳＶ−Ｇ、ＴＡＭＥＬ）（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ  ２０１７）；（８）細胞スクイージング；（ＳＱＺ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）（９）ナノ粒子（Ｎｅｕｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ  ２０１６）；及び／又は（１０）マグネトフェクション（Ｍａｉｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）。トランスフェクション方法が細胞培養培地（ＤＭＥＭ  １０％のＦＢＳ）中で行われ、細胞が、その後、２４〜４８時間にわたって培養される。
【０２９２】
[0379]  トランスフェクションの２〜４８時間後、培地が除去され、示されるＲＮＡ及びトランスフェクトされたＲＮＡの相対的発現がｑＲＴ−ＰＣＲによって測定される。
[0380]  ｑＲＴ−ＰＣＲ分析の場合、全ＲＮＡは、製造業者の説明に従ってフェノール系ＲＮＡ単離溶液（ＴＲＩｚｏｌ）及びＲＮＡ（キアゲン）を用いて、細胞から単離される。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＰＣＲマスターミックス（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）及びＰＣＲサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０）を用いて３連で行われる。ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ及びＰＫＲなどの周知の自然免疫調節因子のｍＲＮＡレベルが定量化され、アクチン、ＧＡＰＤＨ又はＨＰＲＴ値に対して正規化される。環状ＲＮＡトランスフェクションについての示されるＲＮＡ遺伝子の相対的発現は、トランスフェクトされたＲＮＡのレベルによって正規化され、エンクリプトゲンを含有しない環状ＲＮＡトランスフェクションによる細胞の発現レベルと比較される。
【０２９３】
[0381]  ｑＲＴ−ＰＣＲ分析に加えて、実施例４に上述されるように、ウエスタンブロット分析及び免疫組織化学を用いて、ＧＦＰ発現効率を評価する。
[0382]  エンクリプトゲンを含有するＧＦＰ陽性細胞は、弱められた免疫原性応答を示すことが予測される。
【０２９４】
[0383]  さらに、（１）初代マウス樹枝状細胞；（２）ＴＬＲ−７、８又は９を安定的に発現するヒト胚腎臓２９３細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）；（３）単球由来樹枝状細胞（ＡｌｌＣｅｌｌｓ）、又は（４）Ｒａｗ  ２６４．７細胞は、上述されるようにＧＦＰをコードする環状ＲＮＡを生成するＺＫＳＣＡＮ１又はｔｄイントロンを含むＤＮＡプラスミドでトランスフェクトされる。トランスフェクションの６〜４８時間後、細胞培養物上清が収集され、サイトカイン発現がＥＬＩＳＡを用いて測定される。細胞培養物上清が収集されるとき、細胞がノーザンブロット、遺伝子発現アレイ及びＦＡＣＳ分析のために収集される。
【０２９５】
[0384]  ＥＬＩＳＡの場合、インターフェロン−β（ＩＦＮ−β）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）、ＩＬ−１２（ＢＤバイオサイエンス）、ＩＦＮ−α、ＴＮＦ−α及びＩＬ−８（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）のためのＥＬＩＳＡキットが使用される。ＥＬＩＳＡが製造業者の推奨に従って行われる。環状ＲＮＡトランスフェクト細胞についての示されるサイトカインの発現が対照ＲＮＡトランスフェクト細胞のレベルと比較される。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して低下されたサイトカイン発現を有することが予測される。
【０２９６】
[0385]  ノーザンブロット分析の場合。サンプルを処理し、上述されるように分析する。プローブは、プラスミドから得られ、ヒトＩＦＮ−α  １３、ＩＦＮ−β（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＮＦ−α又はＧＡＰＤＨ（ＡＴＣＣ）のコード領域に特異的である。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して低下されたサイトカイン発現を有することが予測される。
【０２９７】
[0386]  遺伝子発現アレイの場合、ＲＮＡがフェノール系溶液（ＴＲＩｚｏｌ）及び／又はＲＮＡ単離キット（ＲＮｅａｓｙ、キアゲン）を用いて単離される。ＲＮＡを増幅し、分析する（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＢｅａｄＳｔａｔｉｏｎ  ５００ＧＸ中のＩｌｌｕｍｉｎａヒトＨＴ１２ｖ４チップ）。モック対照処理細胞におけるレベルが増加倍数の計算のためのベースラインとして使用される。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して低下されたサイトカイン発現を有することが予測される。
【０２９８】
[0387]  ＦＡＣＳ分析の場合、細胞をＣＤ８３（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０又はＣＤ８６に対する直接共役抗体で染色し、フローサイトメーターにおいて分析する。エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、対照トランスフェクト細胞と比較して、これらのマーカーの低下された発現を示すことが予測される。
【０２９９】
実施例６：選択的発現のためのリボスイッチ
[0388]  この実施例は、インビボの環状ＲＮＡからのタンパク質発現を制御する能力を実証する。
【０３００】
[0389]  この実施例では、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）、ＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）の発現を調節する合成リボスイッチ（配列番号９）を、ＧＦＰ  ＯＲＦに隣接するスタガー要素（２Ａ配列）（配列番号３）と共に含むように設計される（図７を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
【０３０１】
[0390]  テオフィリンは、リボスイッチの活性化を誘導して、遺伝子発現のオフスイッチをもたらす（Ａｕｓｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１０によって記載されるように）。リボスイッチは、環状ＲＮＡからのＧＦＰ発現を制御することが予測される。テオフィリンの存在下でＧＦＰ発現が観察されることは予測されなかった。
【０３０２】
[0391]  ＨｅＬａ細胞を、テオフィリン依存性合成リボスイッチ（配列番号９）の制御下でＧＦＰをコードする５００ｎｇの記載される環状ＲＮＡでトランスフェクトして、選択的発現を評価する。トランスフェクション方法は、実施例５に記載されるとおりである。
【０３０３】
[0392]  ３７℃及び５％のＣＯ２で２４時間の培養後、細胞を、１ｎＭ〜３ｍＭの範囲の濃度のテオフィリンを用いて及び用いずに処理する。２４時間の連続した培養後、細胞を室温で１５分間にわたって４％のパラホルムアルデヒド中で固定し、ブロックし、０．２％の洗浄剤を含むＰＢＳ中の１０％のＦＢＳを用いて４５分間にわたって透過処理する。次に、サンプルを、ＧＦＰに対する一次抗体（インビトロジェン）及び１０％のＦＢＳ及び０．１％の洗浄剤を含むＰＢＳ中のＡｌｅｘａ  ４８８及びＤＡＰＩ（インビトロジェン）と共役された二次抗体と共に室温で２時間又は４℃で一晩インキュベートする。次に、細胞をＰＢＳで洗浄し、その後、蛍光顕微鏡を用いてＧＦＰ発現について分析する。
【０３０４】
実施例７：インビボ発現
[0393]  この実施例は、インビボの環状ＲＮＡからタンパク質を発現する能力を実証する。
【０３０５】
[0394]  この実施例では、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）又はＲＦＰ（配列番号８）又はルシフェラーゼ（配列番号１０）を、ＧＦＰ、ＲＦＰ又はルシフェラーゼＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図８を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
【０３０６】
[0395]  ６〜８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスに、３００ｍｇ／ｋｇ（６ｍｇ）の環状ＲＮＡ（５０μＬ容量）を、本明細書に記載されるＧＦＰ、ＲＦＰ若しくはルシフェラーゼＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に皮内（ＩＤ）、筋肉内（ＩＭ）、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）又は静脈内（ＩＶ）投与によって投与する。動物に単回投与又は３回の注入（１日目、３日目、５日目）を与える。
【０３０７】
[0396]  血液、心臓、肺、脾臓、腎臓、肝臓及び皮膚注入部位を非投与対照マウスから、且つ投与の２、４、８、２４、４８、７２、９６、１２０、１６８及び２６４時間後の時点（ｎ＝４匹のマウス／時点）で採取する。血液サンプルを試験の終了時に頸静脈穿刺から採取する。
【０３０８】
[0397]  血清及び組織の両方についての環状ＲＮＡ定量化が分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）（Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の定量化を用いて行われる。公知の量のＲＮＡ（非処理の組織サンプルに加えられる）の各プレートに関する標準曲線は、処理された組織中のＲＮＡを定量化するために使用される。ピコグラム（ｐｇ）単位で計算される量は、プレートに適用される溶解物中の計量された組織の量に対して正規化される。タンパク質発現（ＲＦＰ又はＧＦＰ）は、前の実施例に記載されるように、各組織におけるＦＡＣＳ又はウエスタンブロットによって評価される。
【０３０９】
[0398]  ルシフェラーゼ環状ＲＮＡを投与されたマウスの別の群に３ｍｇのルシフェリンを投与の６、２４、４８、７２及び９６時間後の時点で注入し、動物をインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、パーキンエルマー）においてイメージングする。投与の６時間後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域リンパ節、肝臓及び脾臓をエクスビボでイメージングする。
【０３１０】
[0399]  マウスは、処理された組織においてＧＦＰ、ＲＦＰ又はルシフェラーゼを発現することが予測される。
【０３１１】
実施例８：インビボ生体内分布
[0400]  この実施例は、インビボの環状ＲＮＡの生体内分布を制御及び測定する能力を実証する。
【０３１２】
[0401]  この実施例において、マウスを、実施例９に記載されるように、ルシフェラーゼをコードする環状ＲＮＡで処理する。要するに、環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びルシフェラーゼをコードするＯＲＦ（配列番号１０）を、ルシフェラーゼＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図９を参照されたい）。環状ＲＮＡは、実施例１及び２に記載されるように、インビトロで又は細胞内で生成される。
【０３１３】
[0402]  マウスにルシフェラーゼ環状ＲＮＡを投与し、投与の６、２４、４８、７２及び９６時間後の時点で３ｍｇのルシフェリンを注入し、動物をインビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、パーキンエルマー）においてイメージングする。投与の６時間後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域リンパ節、肝臓及び脾臓をエクスビボでイメージングする。
【０３１４】
[0403]  血清及び組織の両方についての環状ＲＮＡ定量化が分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）（Ｐａｎｏｍｉｃｓ／Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）の定量化を用いて行われる。公知の量のＲＮＡ（非処理の組織サンプルに加えられる）の各プレートに関する標準曲線は、処理された組織中のＲＮＡを定量化するために使用される。ピコグラム（ｐｇ）単位で計算される量は、プレートに適用される溶解物中の計量された組織の量に対して正規化される。
【０３１５】
[0404]  ６〜８週齢の雄ＢＡＬＢ／ｃマウスの別の群に筋肉内（ＩＭ）又は皮内（ＩＤ）投与によって４つの用量レベル：１０、２、０．４及び０．０８ｍｇでルシフェラーゼ環状ＲＮＡを投与する（１群当たりｎ＝６）。投与の６、２４、４８、７２及び９６時間後の時点で動物に３ｍｇのルシフェリンを注入し、インビボイメージングシステム（ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ、パーキンエルマー）においてイメージングする。投与の６時間後の時点で３匹の動物を殺処分し、解剖し、筋肉、皮膚、流入領域リンパ節、肝臓及び脾臓をエクスビボでイメージングする。また、マウスからの組織を、実施例９に記載されるように、ルシフェラーゼ発現について評価し、この発現の組織分布を分析する。
【０３１６】
[0405]  マウスは、処理された組織においてルシフェラーゼの発現を示すことが予測される。
【０３１７】
実施例９：インビボでの非免疫原性
[0406]  この実施例は、細胞感染後の環状ＲＮＡの免疫原性のインビボ評価を実証する。
【０３１８】
[0407]  この実施例は、エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡの投与後の免疫応答の定量化及び比較を記載している（図１０を参照されたい）。一実施形態において、エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡのいずれも、対照と比較して、環状ＲＮＡの１回以上の投与後、免疫原性応答を低下させる（例えば、対照ＲＮＡの投与と比較して低下させる）。
【０３１９】
[0408]  環状ＲＮＡについての免疫原性の指標は、血清中のサイトカインレベルである。
[0409]  この実施例において、サイトカイン血清濃度が環状ＲＮＡの１回以上の投与後に調べられる。前の実施例のいずれか１つからの環状ＲＮＡが皮内（ＩＤ）、筋肉内（ＩＭ）、経口（ＰＯ）、腹腔内（ＩＰ）又は静脈内（ＩＶ）を介して６〜８週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスに投与される。血清が異なるコホートから抜き取られる：エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡ及びエンクリプトゲンを有さない環状ＲＮＡの注射を全身及び／又は局所的に注入されたマウス。
【０３２０】
[0410]  採取された血清サンプルをＰＢＳ中で１〜１０倍に希釈し、酵素結合免疫吸着法（ＰＢＬ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｌａｂｓ、ニュージャージー州ピスカタウェイ）及びＴＮＦ−α（Ｒ＆Ｄ、ミネソタ州ミネアポリス）により、マウスＩＦＮ−αについて分析する。
【０３２１】
[0411]  血清中のサイトカインレベルに加えて、炎症マーカーの発現は、免疫原性の別の指標である。この実施例において、ビヒクル（環状ＲＮＡなし）、線状ＲＮＡ又は環状ＲＮＡで処理されたマウスからの脾臓組織を投与の１、４及び２４時間後に採取する。サンプルを、以下の技術、ｑＲＴ−ＰＣＲ分析、ノーザンブロット又はＦＡＣＳ分析を用いて分析する。
【０３２２】
[0412]  ｑＲＴ−ＰＣＲ分析の場合、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＴＮＦ−α及びＰＫＲについてのｍＲＮＡレベルを上述されるように定量化する。
[0413]  ノーザンブロット分析の場合。サンプルを処理し、上述されるようにＩＦＮ−α  １３、ＩＦＮ−β（Ｏｐｅｎ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ＴＮＦ−α又はＧＡＰＤＨ（ＡＴＣＣ）について分析する。
【０３２３】
[0414]  ＦＡＣＳ分析の場合、細胞をＣＤ８３に対する直接共役抗体（Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ  Ｉｎｃ）、ＨＬＡ−ＤＲ、ＣＤ８０又はＣＤ８６で染色し、フローサイトメーターにおいて分析する。
【０３２４】
[0415]  一実施形態において、エンクリプトゲンを有する環状ＲＮＡは、対照ＲＮＡと比較して、１回又は複数回の投与後、サイトカインレベルを低下させるであろう（ＥＬＩＳＡ、ノーザンブロット、ＦＡＣＳ及び／又はｑＲＴ−ＰＣＲによって測定される際）。
【０３２５】
実施例１０：環状ＲＮＡは、少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む
[0416]  この実施例は、環状ＲＮＡが少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含むことを実証する。
【０３２６】
[0417]  この実施例において、環状ＲＮＡは、上述される方法の１つにより、ＧＦＰ  ＯＲＦ及びＩＲＥＳを含むように合成される（図１１を参照されたい）。Ｊ２及びＫ１モノクローナル抗体によるドットブロットアッセイを用いて、少なくとも４０ｂｐの長さの二本鎖ＲＮＡ構造を測定する。環状ＲＮＡ（２００ｎｇ）をナイロン膜（スーパーチャージ（super charged）Ｎｙｔｒａｎ）上にブロッティングし、乾燥させ、ＴＢＳ−Ｔ緩衝液（５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、０．０５％のＴｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７．４）中５％の脱脂粉乳でブロックし、６０分間にわたってｄｓＲＮＡ特異的ｍＡｂ  Ｊ２又はＫ１（Ｅｎｇｌｉｓｈ＆Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｏｎｓｕｌｔｉｎｇ）と共にインキュベートする。膜をＴＢＳ−Ｔで６回洗浄し、次にＨＲＰ共役ロバ抗マウスＩｇ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）で処理し、次に６回洗浄し、ドットを、増強化学発光ウエスタンブロット検出試薬（アマシャム）を用いて視覚化する。
【０３２７】
[0418]  環状ＲＮＡは、内部の疑似二本鎖ＲＮＡセグメントを生成することが予測される。
【０３２８】
[0419]  実施例１１：環状ＲＮＡは、疑似二本鎖構造を含む
[0420]  この実施例は、環状ＲＮＡが疑似二本鎖構造を含むことを実証する。
【０３２９】
[0421]  この実施例において、環状ＲＮＡは、ＨＤＶｍｉｎの発現の追加を伴って及び伴わずに、上述される方法の１つによって合成される（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４）。このＲＮＡ配列は、疑似らせん構造を形成し（図１２を参照されたい）、陽性対照として使用される（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４によって示されるように）。
【０３３０】
[0422]  環状ＲＮＡ構造が機能的疑似二本鎖構造を含むかどうかを試験するために、本発明者らは、プライマー伸長（ＳＨＡＰＥ）によって分析される選択的２’ＯＨアシル化を用いて二次構造を決定する。ＳＨＡＰＥは、単一ヌクレオチド分解におけるＲＮＡの局所的骨格柔軟性を評価する。ＳＨＡＰＥ求電子剤に対する塩基位置の反応性は、二次構造に関連している：塩基対合された位置は、反応性が弱く、非対合位置は、より反応性が高い。
【０３３１】
[0423]  ＳＨＡＰＥが環状ＲＮＡ、ＨＤＶｍｉｎ及び線状ＲＮＡにおいて行われる。ＳＨＡＰＥは、それぞれＷｉｌｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ  ２００６及びＧｒｉｆｆｉｎ  ２０１４  ｅｔ  ａｌによって本質的に報告されるＮ−メチルイサト酸無水物（ＮＭＩＡ）又はシアン化ベンゾイル（ＢｚＣＮ）を用いて行われる。ＢｚＣＮを用いたＳＨＡＰＥについて簡潔に述べると、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中の１μｌの８００ｍＭのＢｚＣＮを、１６０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０、１Ｕ／ｌのＲＮＡｓｅ阻害剤（例えば、ＳｕｐｅｒａｓｅＩｎ  ＲＮａｓｅ阻害剤）中の３〜６ｐｍｏｌのＲＮＡを含有する２０μｌの反応混合物に加え、３７℃で１分間インキュベートする。対照反応混合物は、ＢｚＣＮなしで１μｌのＤＭＳＯを含む。ＢｚＣＮとのインキュベーション後、ＲＮＡをフェノールクロロホルムで抽出し、製造業者によって指示されるように精製し（例えば、ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ＆Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ−５キットを用いて）、６μｌの１０ｍＭのトリス、ｐＨ８．０中で再懸濁させる。一染料系を用いて、ＢｚＣＮ付加物を検出する。ＲＮＡを、６−カルボキシフルオレセイン（６−ＦＡＭ）で標識されたプライマーでアニールする。プライマー伸長は、インキュベーション条件に対する以下の変更を伴い、製造業者の推奨に従って逆転写酵素（ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ、インビトロジェン）を用いて行われる：４２℃で５分、５５℃で３０分、６５℃で２５分及び７５℃で１５分。２つのシーケンシングラダーは、プライマー伸長反応において０．５ｍＭのｄｄＡＴＰ又は０．５ｍＭのｄｄＣＴＰのいずれかを用いて生成される。プライマー伸長産物をエタノールで沈殿させ、洗浄して、過剰な塩を除去し、市販のサイズ標準（例えば、Ｌｉｚサイズ標準Ｇｅｎｅｗｉｚ  Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｅｒｖｉｃｅ）と共にキャピラリー電気泳動によって分解する。
【０３３２】
[0424]  そのままの電気泳動図を、一次フラグメント分析ツール（例えば、ＰｅａｋＳｃａｎｎｅｒ、アプライドバイオシステムズ）を用いて分析する。次に、電気泳動図の各位置におけるピークを積分する。分析される各ＲＮＡについて、各プライマー伸長反応のためのバックグラウンドが、ＢｚＣＮで処理されないＲＮＡにおいて行われる陰性対照反応のバックグラウンドに対して正規化されるように、ローディングエラー（loading error）を補正するためのｙ軸スケーリングが行われる。シグナル減衰補正が各反応についてデータに適用される。ピークは、２つのシーケンシング反応から生成されるラダーに整列される。各位置において、陰性対照のピーク面積が、ＢｚＣＮ処理されたサンプルにおけるピーク面積から差し引かれ；次に、これらの値が、差し引かれたピーク面積を、差し引かれたピーク面積の上位２％〜１０％の平均で除算することにより、正規化ＳＨＡＰＥ反応性に換算される。
【０３３３】
[0425]  ＳＨＡＰＥ分析に加えて、本発明者らは、ＮＭＲ（Ｍａｒｃｈａｎｋａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１５）；ヒドロキシル基プロービング（Ｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２）；又はＤＭＳ及びＣＭＴＣ及びケトキサールの組合せ（Ｔｉｊｅｒｉｎａ  ｅｔ  ａｌ  ２００７及びＺｉｅｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２００１）を行う。
【０３３４】
[0426]  環状ＲＮＡは、疑似二本鎖構造を有することが予測される。
【０３３５】
実施例１２：環状ＲＮＡは、機能的疑似らせん構造を含む
[0427]  この実施例は、環状ＲＮＡが機能的疑似らせん構造を含むことを実証する。
【０３３６】
[0428]  この実施例において、環状ＲＮＡは、３９５Ｌの発現の追加を伴い、上述される方法の１つによって合成される（Ｄｅｆｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ  ２００９）。このＲＮＡ配列は、疑似らせん構造（上に示されるように、ＲＮＡ二次構造折り畳みアルゴリズムｍｆｏｌｄ及びＤｅｆｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ  ２００９によって）、図１３。この構造は、Ｄ型肝炎抗原（ＨＤＡｇ）との複合体形成に必須である。
【０３３７】
[0429]  したがって、環状ＲＮＡ構造が機能的疑似構造を含むかどうかを試験するために、本発明者らは、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、ＨＤＡｇ−１６０又はＨＤＡｇ−１９５と共にインキュベートし、ＥＭＳＡアッセイを用いて結合を分析する。結合反応を、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、２５ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＮａＣｌ、０．１ｇ／ｌのウシ血清アルブミン（ニュー・イングランド・バイオラボ）、５％のグリセロール、０．５ｍＭのＤＴＴ、０．２Ｕ／ｌのＲＮａｓｅ阻害剤（アプライドバイオシステムズ）及び１ｍＭのフッ化フェニルメチルスルホニル溶液を含む２５μｌ中で行う。環状ＲＮＡを０〜１１０ｎＭの範囲の濃度のＨＤＡｇタンパク質（Ｄｅｆｅｎｂａｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ  ２００９によって記載されるように得られた）と共にインキュベートする。反応混合物を氷上で集めて、３７℃で１時間インキュベートし、２．５時間にわたって２４０Ｖで０．５トリス−ボレート−ＥＤＴＡ中において６％の天然ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させる。遊離及び結合ＲＮＡのレベルを、核酸染色（例えば、ゲルレッド（gelred））を用いて決定する。結合は、バックグラウンドを差し引いた全レーンの強度に対する非結合ＲＮＡの強度として計算される。
【０３３８】
[0430]  環状ＲＮＡは、機能的疑似らせん構造を有することが予測される。
【０３３９】
実施例１３：自己転写／複製
[0431]  この実施例において、環状ＲＮＡは、ＨＤＶ複製ドメインの発現の追加（Ｂｅｅｈａｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４によって記載されるように）、アンチゲノム複製コンピテントリボザイム及び核局在化シグナルを伴い、上述される方法の１つによって合成される。これらのＲＮＡ配列は、環状ＲＮＡが核に位置することを可能にし、ここで、宿主ＲＮＡポリメラーゼがＲＮＡに結合し、ＲＮＡを転写する。次に、このＲＮＡは、リボザイムを用いて自己切断される。次に、ＲＮＡは、ライゲートされ、再度自己複製される（図１４を参照されたい）。
【０３４０】
[0432]  環状ＲＮＡ（１〜５μｇ）は、上述される技術を用いてＨｅＬａ細胞中にトランスフェクトされる。ＨｅＬａ細胞を、ペニシリン−ストレプトマイシン及び１０％のウシ胎仔血清が補充された、高グルコース（ライフテクノロジーズ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中において３７℃及び５％のＣＯ２で成長させる。トランスフェクション後、ＨｅＬａ細胞をさらに４〜７２時間培養し、次にトランスフェクトされた細胞からの全ＲＮＡをトランスフェクションの１時間〜２０日後、製造業者の説明に従ってフェノール系ＲＮＡ単離試薬（ライフテクノロジーズ）を用いて単離し、ＨＤＶドメインをコードする環状ＲＮＡの総量を決定し、本明細書に記載されるようにｑＰＣＲを用いて、対照環状ＲＮＡと比較する。
【０３４１】
実施例１４：環状ＲＮＡ安定性／半減期
[0433]  この実施例において、環状ＲＮＡは、上述される方法の１つによって合成される。環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）を、ＧＦＰ  ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図１５を参照されたい）。
【０３４２】
[0434]  ヒト線維芽細胞（例えば、ＩＭＲ−９０）を、組織培養物で処理されたプレート上で５％のＣＯ２下、３７℃において、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；インビトロジェン）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；インビトロジェン）中でコンフルエンスになるまで成長させる。線維芽細胞がコンフルエンスに達したとき、それらは、接触阻止により分裂を停止する（Ｌｅｏｎｔｉｅｖａ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４）。脂質トランスフェクション試薬（２μＬ；インビトロジェン）を、１２ウェル組織培養物で処理されたプレートの１つのウェル中において、１μｇの環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡ（上述される）及び１４５μＬの血清低減培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ溶液）の混合物に加える。１５分間にわたる室温でのインキュベーション後、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で懸濁された約１×１０５個の細胞を環状ＲＮＡ溶液（上述される）に加える。
【０３４３】
[0435]  細胞を培養し、次に環状ＲＮＡトランスフェクションの１、２、３、４、５、１０、２０及び３０日後の時点で収集する。細胞をｑ−ｒｔ−ＰＣＲのために及び別のサブセットをＦＡＣＳ分析のために単離する。ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡレベルを測定するために、実施例２に記載されるように、ランダムヘキサマーを用いたｑＰＣＲ逆転写が行われる。細胞を、本明細書に記載されるようにＧＦＰ抗体を用いて、ＦＡＣＳを用いて分析する。
【０３４４】
[0436]  環状ＲＮＡは、少なくとも数日間にわたって細胞内で持続し、それらは、ＧＦＰタンパク質の機能的発現を保持することが予測される。
【０３４５】
実施例１５：娘細胞における環状ＲＮＡ保存
[0437]  この実施例において、環状ＲＮＡは、上述される方法の１つによって合成される。環状ＲＮＡは、エンクリプトゲン（配列番号４）及びＧＦＰをコードするＯＲＦ（配列番号２）を、ＧＦＰ  ＯＲＦに隣接するスタガー要素（配列番号３）と共に含むように設計される（図１６を参照されたい）。
【０３４６】
[0438]  ヒト線維芽細胞（例えば、ＩＭＲ−９０）を、組織培養物で処理されたプレート上で５％のＣＯ２下、３７℃において、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ；インビトロジェン）が補充されたダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；インビトロジェン）中で成長させる。細胞を、指数増殖を維持するために定期的に継代する。脂質トランスフェクション試薬（２μＬ；インビトロジェン）を、１２ウェル組織培養物で処理されたプレートの１つのウェル中において、１μｇの環状ＲＮＡ又は線状ＲＮＡ（上述される）及び１４５μＬの血清低減培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ  Ｉ溶液）の混合物に加える。１５分間にわたる室温でのインキュベーション後、１０％のＦＢＳを含むＤＭＥＭ中で懸濁された１×１０５個のＨｅＬａ細胞を環状ＲＮＡ溶液（上述される）に加える。３７℃及び５％のＣＯ２で２４時間にわたるインキュベーション後、細胞は、ＢｒｄＵ（例えば、シグマ−アルドリッヒ）を用いてパルスをかけられる。ＢｒｄＵ、標識期間がそれらの特定の集団の倍加時間に従って各細胞型について最適化され、例えば、ＩＭＲ−９０ヒト線維芽細胞は、２７時間の倍加時間を有し、Ｅｌａｂｄ  ｅｔ  ａｌ  ２０１３によって記載されるように、８〜９時間にわたってパルスをかけられる。
【０３４７】
[0439]  細胞をＢｒｄＵパルスの１、２、３、４、５及び１０日後の時点で収集する。細胞のサブセットをｑ−ｒｔ−ＰＣＲのために単離し、別のサブセットをＦＡＣＳ分析のために単離する。ＧＦＰ環状ＲＮＡ及びｍＲＮＡレベルを測定するために、実施例２に記載されるように、ランダムヘキサマーを用いたｑＰＣＲ逆転写が行われる。細胞を、本明細書に記載されるようにＢｒｄＵ及びＧＦＰ抗体を用いて、ＦＡＣＳを用いて分析する。
【０３４８】
[0440]  環状ＲＮＡは、娘細胞内で持続し、娘細胞は、ＧＦＰタンパク質を発現することが予測される。
【０３４９】
実施例１６：環状ＲＮＡ環状化
[0441]  この実施例は、スプリントライゲーションを用いた環状ＲＮＡのインビトロ生成を実証する。
【０３５０】
[0442]  非天然環状ＲＮＡは、１つ以上の望ましい特性を含むように操作され得、組み換えＤＮＡ技術を用いて生成され得る。以下の実施例に示されるように、スプリントライゲーションが線状ＲＮＡを環状化した。
【０３５１】
[0443]  環状ＲＮＡ１を、終止コドン（２６４ｎｔ）なしで三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。それは、翻訳開始のために開始コドンにおいてコザック配列（配列番号１１）を有する。環状ＲＮＡ２は、それが終止要素（三重終止コドン）（２７３ｎｔ、配列番号１２）を有することを除いて、環状ＲＮＡ１と同一の配列を有する。環状ＲＮＡ３を、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ）なしで、スタガー要素（２Ａ配列、配列番号１３）によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。環状ＲＮＡ４は、それが終止要素（三重終止コドン）（３３９ｎｔ）を有することを除いて、環状ＲＮＡ３と同一の配列を有する。
【０３５２】
[0444]  この実施例において、環状ＲＮＡを以下のように生成した。インビトロ転写のためのＤＮＡ鋳型を、Ｔ７プロモータを有するフォワードプライマー及び２−Ｏ−メチル化ヌクレオチドをリバースプライマーと共に有する対応する配列（ＩＤＴ）を有するｇＢｌｏｃｋｓ遺伝子フラグメントから増幅した。増幅されたＤＮＡ鋳型を、ＤＮＡゲル精製キット（キアゲン）を用いてゲル精製した。２５０〜５００ｎｇの精製されたＤＮＡ鋳型をインビトロ転写に供した。線状、５’−一リン酸化インビトロ転写産物を７．５ｍＭのＧＭＰ、１．５ｍＭのＧＴＰ、７．５ｍＭのＵＴＰ、７．５ｍＭのＣＴＰ及び７．５ｍＭのＡＴＰの存在下において、対応する配列を有する各ＤＮＡ鋳型からＴ７  ＲＮＡポリメラーゼを用いて生成した。約４０μｇの線状ＲＮＡを各反応において生成した。インキュベーション後、各反応をＤＮａｓｅで処理して、ＤＮＡ鋳型を除去した。インビトロ転写ＲＮＡを２．５Ｍの酢酸アンモニウムの存在下においてエタノールで沈殿させて、取り込まれないモノマーを除去した。
【０３５３】
[0445]  転写された線状ＲＮＡを、鋳型としての２０ｎｔのスプリントＤＮＡオリゴマー（配列番号１４）上でＴ４  ＲＮＡリガーゼ２を用いて環状化した。スプリントＤＮＡを、線状ＲＮＡの１０ｎｔの各５’又は３’末端をアニールするように設計した。スプリントＤＮＡ（３μＭ）でアニールした後、１μＭの線状ＲＮＡを３７℃又は４時間で０．５Ｕ／μｌのＴ４  ＲＮＡリガーゼ２と共にインキュベートした。Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ２を含まない混合物を陰性対照として使用した。
【０３５４】
[0446]  線状ＲＮＡの環状化を６％の変性ＰＡＧＥにおいてＲＮＡを分離することによって監視した。よりゆっくりと移動するＲＮＡバンドは、それらの環状構造のため、変性ポリアクリルアミドゲルにおける線状ＲＮＡより環状ＲＮＡと一致する。図１７から分かるように、ＲＮＡ混合物へのリガーゼの追加（＋レーン）は、リガーゼを欠いた混合物（−レーン）中に存在する線状ＲＮＡバンドを超えるようである新たなバンドを生成した。よりゆっくりと移動するバンドは、全てのＲＮＡ混合物において見られ、これは、陰性対照と比較して、複数の構築物で行われる成功したスプリントライゲーション（例えば、環状化）を示す。
【０３５５】
実施例１７：ＲＮＡ環状化効率
[0447]  この実施例は、ＲＮＡスプリントライゲーションの環状化効率を実証する。
【０３５６】
[0448]  １つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡがスプリント媒介性環状化を用いて生成され得る。以下の実施例に示されるように、スプリントライゲーションは、対照より高い効率で線状ＲＮＡを環状化した。
【０３５７】
[0449]  実施例１に記載される環状ＲＮＡ１、環状ＲＮＡ２、環状ＲＮＡ３及び環状ＲＮＡ４をここでも使用した。環状ＲＮＡ５を、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計した。環状ＲＮＡ６は、ナノルシフェラーゼ配列（７６２ｎｔ、配列番号１８）の末端において、ＥＧＦ及びナノルシフェラーゼ遺伝子及び終止要素（三重終止コドン）間に終止要素（三重終止コドン）を含んでいたことを除いて、環状ＲＮＡ５と同一の配列を有する。
【０３５８】
[0450]  この実施例において、ＲＮＡの環状化効率を測定するために、６つの異なるサイズの線状ＲＮＡ（２６４ｎｔ、２７３ｎｔ、３３０ｎｔ、３３９ｎｔ、８７３ｎｔ及び７６２ｎｔ）を生成し、実施例１に記載されるように環状化した。環状ＲＮＡを６％の変性ＰＡＧＥによって分解し、線状又は環状ＲＮＡについてのゲルにおける対応するＲＮＡバンドを精製のために切除した。切除されたＲＮＡゲルバンドを破砕し、ＲＮＡを、８００μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールで沈殿させた。
【０３５９】
[0451]  環状化効率を以下のように計算した。溶離された環状ＲＮＡの量を、溶離された全ＲＮＡの量（環状＋線状ＲＮＡ）で除算し、結果を図１８中のグラフとして示した。
[0452]  Ｔ４  ＲＮＡｓｅリガーゼ２を用いた線状ＲＮＡのライゲーションは、対照より高い効率速度で環状ＲＮＡを生成した。傾向データは、より多い構築物がより高い速度で環状化されたことを示した。
【０３６０】
実施例１８：分解感受性を欠いた環状ＲＮＡ
[0453]  この実施例は、線状ＲＮＡと比較した、ＲＮＡｓｅ  Ｒによる分解に対する環状ＲＮＡの感受性を実証する。
【０３６１】
[0454]  環状ＲＮＡは、５’及び３’末端の欠如のために、線状ＲＮＡよりエキソヌクレアーゼ分解に対して抵抗性である。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より分解に対する感受性が低い。
【０３６２】
[0455]  環状ＲＮＡ５を生成し、本明細書に記載されるアッセイに使用するために実施例２に記載されるように環状化した。
[0456]  環状ＲＮＡ５の環状化を試験するために、２０ｎｇ／μｌの線状又は環状ＲＮＡ５を３０分間にわたって３７℃において、２Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ  Ｒ、線状ＲＮＡを消化するが、ラリアット又は環状ＲＮＡ構造を消化しない３’−５’エキソリボヌクレアーゼと共にインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。
【０３６３】
[0457  エキソヌクレアーゼを欠いたレーンに存在する線状ＲＮＡバンドは、環状ＲＮＡ５レーンに存在せず（図１９を参照されたい）、これは、環状ＲＮＡ５が、線状ＲＮＡ対照と比較して、エキソヌクレアーゼ処理に対するより高い抵抗性を示したことを示す。
【０３６４】
実施例１９：環状ＲＮＡの単離及び精製
[0458]  この実施例は、環状ＲＮＡ精製を実証する。
【０３６５】
[0459]  特定の実施形態において、前の実施例に記載される環状ＲＮＡが単離され、コードされるタンパク質産物の発現前に精製され得る。この実施例は、ＵＲＥＡゲル分離を用いた単離を記載している。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡを単離し、精製した。
【０３６６】
[0460]  実施例２に記載される環状ＲＮＡ１、環状ＲＮＡ２、環状ＲＮＡ３、環状ＲＮＡ４、環状ＲＮＡ５及び環状ＲＮＡ６を本明細書に記載されるように単離した。
[0461]  この実施例において、線状及び環状ＲＮＡを記載されるように生成した。環状ＲＮＡを精製するために、ライゲーション混合物を６％の変性ＰＡＧＥにおいて分解し、環状ＲＮＡのそれぞれに対応するＲＮＡバンドを切除した。切除されたＲＮＡゲルフラグメントを破砕し、ＲＮＡを８００μｌの３００ｍＭのＮａＣｌで一晩溶離させた。ゲル破片を遠心分離フィルタによって除去し、ＲＮＡを０．３Ｍの酢酸ナトリウムの存在下においてエタノールで沈殿させた。溶離された環状ＲＮＡを６％の変性ＰＡＧＥによって分析した（図２０を参照されたい）。
【０３６７】
[0462]  単一のバンドを、可変サイズを有する環状ＲＮＡについてＰＡＧＥによって視覚化した。
【０３６８】
実施例２０：タンパク質発現の検出
[0463]  この実施例は、環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
【０３６９】
[0464]  タンパク質発現は、ｍＲＮＡから特定のタンパク質を生成するプロセスである。このプロセスは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）へのＤＮＡの転写、続いてポリペプチド鎖へのｍＲＮＡの翻訳を含み、このポリペプチド鎖が最終的に機能的タンパク質に折り畳まれ、特定の細胞内又は細胞外の位置に標的化され得る。
【０３７０】
[0465]  以下の実施例に示されるように、タンパク質を環状ＲＮＡ配列からインビトロで発現させた。
[0466]  環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
【０３７１】
[0467]  線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含有していた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０３７２】
[0468]  ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０３７３】
[0469]  蛍光が検出され、発現産物が存在することが示された。したがって、環状ＲＮＡがタンパク質の発現を駆動することが示された。
【０３７４】
実施例２１：ＩＲＥＳ非依存的発現
[0470]  この実施例は、環状ＲＮＡがＩＲＥＳの非存在下で発現を駆動することを実証する。
【０３７５】
[0471]  ＩＲＥＳ又は内部リボソーム進入部位は、キャップ非依存的に翻訳開始を可能にするＲＮＡ要素である。環状ＲＮＡがＩＲＥＳの非存在下でＦｌａｇタンパク質の発現を駆動することが示された。
【０３７６】
[0472]  環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
[0473]  線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０３７７】
[0474]  ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０３７８】
[0475]  発現産物は、ＩＲＥＳの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
【０３７９】
実施例２２：キャップ非依存的発現
[0476]  この実施例は、環状ＲＮＡがキャップの非存在下で発現を駆動できることを実証する。
【０３８０】
[0477]  キャップは、ｍＲＮＡの５’末端において特異的に改変されたヌクレオチドである。５’キャップは、線状ｍＲＮＡの安定性並びに翻訳開始のために有用である。環状ＲＮＡは、キャップの非存在下で産物の発現を駆動した。
【０３８１】
[0478]  環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
[0479]  線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを１５分間にわたって７０℃で３０μｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させた。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０３８２】
[0480]  ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０３８３】
[0481]  発現産物は、キャップの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
【０３８４】
実施例２３：５’−ＵＴＲなしでの発現
[0482]  この実施例は、５’非翻訳領域を欠いた環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
【０３８５】
[0483]  ５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）は、ＲＮＡ転写産物の下流のタンパク質翻訳を促進する開始コドンの直接上流にある領域である。
[0484]  以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ配列中の５’−非翻訳領域は、インビトロタンパク質発現に必要でなかった。
【０３８６】
[0485]  環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
【０３８７】
[0486]  線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０３８８】
[0487]  ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０３８９】
[0488]  発現産物は、５’ＵＴＲの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
【０３９０】
実施例２４：３’−ＵＴＲなしでの発現
[0489]  この実施例は、３’−ＵＴＲを欠いた環状ＲＮＡからのインビトロタンパク質発現を実証する。
【０３９１】
[0490]  ３’非翻訳領域（３’−ＵＴＲ）は、翻訳終止コドンの直接下流にある領域であり、遺伝子発現に転写後に影響を与え得る調節領域を含む。３’−非翻訳領域は、ｍＲＮＡの局在化、安定性、輸送及び翻訳効率に影響を与えることにより、遺伝子発現において役割も果たし得る。さらに、３’−ＵＴＲの構造特性及び別のポリアデニル化のその使用が遺伝子発現において役割を果たし得る。
【０３９２】
[0491]  以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ配列中の３’−ＵＴＲは、インビトロタンパク質発現に必要でなかった。
[0492]  環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
【０３９３】
[0493]  線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０３９４】
[0494]  ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２１を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０３９５】
[0495]  発現産物は、３’ＵＴＲの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
【０３９６】
実施例２５：終止コドンを用いない発現
[0496]  この実施例は、終止コドンを欠いた環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳後のポリペプチド産物の生成を実証する。
【０３９７】
[0497]  タンパク質は、アミノ酸の固有の配列から構成されるポリペプチドに基づいている。各アミノ酸は、コドンと呼ばれるヌクレオチド三つ組によってｍＲＮＡ中でコードされる。タンパク質翻訳中、ｍＲＮＡ中の各コドンは、成長しているポリペプチド鎖中のアミノ酸の付加に対応する。終止要素又は終止コドンは、結合解放因子によってこのプロセスの終了を示し、それによりリボソームサブユニットを分離させて、アミノ酸鎖を解放する。
【０３９８】
[0498]  以下の実施例に示されるように、終止コドンを欠いた環状ＲＮＡは、ローリングサークル型翻訳により、反復したポリペプチド配列から構成される大きいポリペプチド産物を生成した。
【０３９９】
[0499]  環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（２６４ｎｔ、配列番号２０）なしで、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計し、翻訳開始に有利に作用するように開始コドンにおいてコザック配列を含んでいた。
【０４００】
[0500]  線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０４０１】
[0501]  ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２２を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０４０２】
[0502]  発現産物は、終止コドンの非存在下でも環状ＲＮＡ反応混合物中で検出された。
【０４０３】
実施例２６：終止要素（終止コドン）を用いない別個のタンパク質の発現
[0503]  この実施例は、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡから翻訳された別個のタンパク質産物の生成を実証する。
【０４０４】
[0504]  ２Ａペプチドなどのスタガー要素は、約２０ａａの短いアミノ酸配列を含み得、これは、単一のｍＲＮＡからの等モルレベルの複数の遺伝子の生成を可能にする。スタガー要素は、リボソームに、２Ａ要素のＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップさせて、２Ａ配列の末端と下流の次のペプチドとの間の分離をもたらすことによって機能し得る。分離は、Ｃ末端上に見られるグリシン及びプロリン残基間で起こり、上流のシストロンは、末端に加えられたいくつかのさらなる残基を有する一方、下流のシストロンは、プロリンから開始する。
【０４０５】
[0505]  以下の実施例に示されるように、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡは、大きいポリペプチドポリマーを生成し（図２３の左側のパネル：スタガーなし−環状ＲＮＡレーン）、コード領域の３’末端における２Ａ配列の包含は、同等の線状ＲＮＡ構築物によって生成されるものと同等のサイズで別個のタンパク質の生成をもたらした（図２３の右側のパネル：スタガー−環状ＲＮＡレーン）。
【０４０６】
[0506]  環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（２６４ｎｔ、配列番号２０）なり及びスタガー要素なしで、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。第２の環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
【０４０７】
[0507]  線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭのアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含んでいた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０４０８】
[0508]  ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２３を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０４０９】
[0509]  別個の発現産物が検出され、これは、スタガー要素を含む環状ＲＮＡが終止要素（終止コドン）の非存在下でも個々のタンパク質の発現を駆動したことを示す。
【０４１０】
実施例２７：ローリングサークル型翻訳
[0510]  この実施例は、スタガー要素を用いた、環状ＲＮＡからのタンパク質の増加したインビトロ生合成を実証する。
【０４１１】
[0511]  非天然環状ＲＮＡを、スタガー要素を欠いた環状ＲＮＡを用いたタンパク質発現と比較するために、スタガー要素を含むように操作した。以下の実施例に示されるように、スタガー要素は、このような配列を欠いた以外は同一の環状ＲＮＡと比較して、タンパク質を過剰発現した。
【０４１２】
[0512]  環状ＲＮＡを、終止要素（例えば、並んだ３つの終止コドン）（２７３ｎｔ、配列番号２１）を用いて、三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。第２の環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）（３３０ｎｔ、配列番号１９）なしで、２Ａ配列によって隣接される三重ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦをコードするように設計した。
【０４１３】
[0513]  線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤及び１μｇの線状又は環状ＲＮＡを含有していた。インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを３０ｌの２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０４１４】
[0514]  ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し（図２４を参照されたい）、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０４１５】
[0515]  別個の発現産物が検出され、これは、スタガー要素を含む環状ＲＮＡが終止要素（終止コドン）の非存在下でも個々のタンパク質の発現を駆動したことを示す。
【０４１６】
実施例２８：インビトロでの生物活性タンパク質の発現
[0516]  この実施例は、環状ＲＮＡからの生物活性タンパク質のインビトロ生合成を実証する。
【０４１７】
[0517]  非天然環状ＲＮＡを、生物活性治療用タンパク質を発現するように操作した。以下の実施例に示されるように、生物活性タンパク質が網状赤血球溶解物中で環状ＲＮＡから発現された。
【０４１８】
[0518]  環状ＲＮＡを、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計した。
【０４１９】
[0519]  線状又は環状ＲＮＡを２５μｌの体積中において、３０℃で、ウサギ網状赤血球溶解物中で５時間にわたってインキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭアミノ酸、０．８Ｕ／μｌのＲＮａｓｅ阻害剤を含有していた。翻訳混合物中のルシフェラーゼ活性を、製造業者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて監視した。
【０４２０】
[0520]  図２５に示されるように、対照ビヒクルＲＮＡよりはるかに高い蛍光が環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡの両方で検出され、これは、発現産物が存在していたことを示す。したがって、環状ＲＮＡが生物活性タンパク質を発現することが示された。
【０４２１】
実施例２９：線状ＲＮＡ同等物より長い半減期を有する環状ＲＮＡ
[0521]  この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡと比較して延長された半減期を有するように操作されることを実証する。
【０４２２】
[0522]  治療用タンパク質をコードする環状ＲＮＡは、例えば、線状ＲＮＡと比較して、延長された生物学的半減期に起因する、より高いレベルのコードされたタンパク質を生成する能力をレシピエント細胞に与えた。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、網状赤血球溶解物中でその線状ＲＮＡ同等物より長い半減期を有していた。
【０４２３】
[0523]  環状ＲＮＡを、２Ａ配列によって隣接されるＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ、続いてＦＬＡＧタグ化ナノルシフェラーゼ（８７３ｎｔ、配列番号１７）をコードするように設計した。
【０４２４】
[0524]  この実施例において、時間経過実験がＲＮＡ安定性を監視するために行われた。１００ｎｇの線状又は環状ＲＮＡをウサギ網状赤血球溶解物と共にインキュベートし、サンプルを１時間、５時間、１８時間及び３０時間の時点で収集した。全ＲＮＡを、フェノール系試薬（インビトロジェン）を用いて溶解物から単離し、ｃＤＮＡを逆転写によって生成した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲ反応ミックス（バイオラッド）を用いて行った。
【０４２５】
[0525]  図２６に示されるように、より高い濃度の環状ＲＮＡが線状ＲＮＡより後の時点で検出された。したがって、環状ＲＮＡは、より安定しているか、又はその線状同等物と比較して増加した半減期を有していた。
【０４２６】
実施例３０：環状ＲＮＡは、細胞内における線状ＲＮＡより長い半減期を実証した
[0526]  この実施例は、環状ＲＮＡが細胞内に送達され、線状ＲＮＡと比較して細胞内での増加した半減期を有することを実証する。
【０４２７】
[0527]  非天然環状ＲＮＡを、生物活性治療用タンパク質を発現するように操作した。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較してより高いレベルで存在し、これは、環状ＲＮＡのより長い半減期を実証している。
【０４２８】
[0528]  この実施例において、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、コザック、２Ａによって隣接されるＥＧＦ、終止又は非終止配列（配列番号１１、１９、２０、２１）をコードするように設計した。細胞中のＲＮＡの半減期を監視するために、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（インビトロジェン）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（バイオラッド）を用いて行った。プライマー配列は、以下のとおりであった：線状又は環状ＲＮＡについてのプライマー、Ｆ：ＡＣＧＡＣＧＧＴＧＴＧＴＧＣＡＴＧＴＡＴ、Ｒ：ＴＴＣＣＣＡＣＣＡＣＴＴＣＡＧＧＴＣＴＣ；環状ＲＮＡについてのプライマー、Ｆ：ＴＡＣＧＣＣＴＧＣＡＡＣＴＧＴＧＴＴＧＴ、Ｒ：ＴＣＧＡＴＧＡＴＣＴＴＧＴＣＧＴＣＧＴＣ。
【０４２９】
[0529]  環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。２４時間後、保持された環状及び線状ＲＮＡを、ｑＰＣＲを用いて測定した。図２７Ａ及びＢに示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して細胞内におけるより長い半減期を有することが示された。
【０４３０】
実施例３１：合成環状ＲＮＡを細胞内で翻訳し、合成環状ＲＮＡをローリングサークル型翻訳によって翻訳した
[0530]  この実施例は、細胞内での合成環状ＲＮＡの翻訳を実証する。
【０４３１】
[0531]  以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、終止要素（配列番号１１）なしで、コザック、３ｘＦＬＡＧ−ＥＧＦ配列をコードするように設計した。環状ＲＮＡがポリマーＥＧＦに翻訳された一方、線状ＲＮＡが翻訳されず、これは、細胞が合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を行ったことを実証している。
【０４３２】
[0532]  この実施例において、細胞内での線状又は環状ＲＮＡの翻訳効率を監視するために、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を各ウェルに加えることにより、細胞を収集した。次に、１０μｇの細胞溶解物タンパク質を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。ドライ転写方法を用いて、ニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ローディングコントロールとして、抗βチューブリン抗体を使用した。ブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化した。ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０４３３】
[0533]  環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。しかしながら、図２８は、トランスフェクションの２４時間後、ＥＧＦタンパク質が環状ＲＮＡトランスフェクト細胞中で検出された一方、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞中で検出されなかったことを示す。したがって、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、ローリングサークル型翻訳によって細胞内で翻訳された。
【０４３４】
実施例３２：合成環状ＲＮＡは、細胞内における低下した免疫原性遺伝子発現を実証した
[0534]  この実施例は、環状ＲＮＡが線状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有するように操作されることを実証する。
【０４３５】
[0535]  治療用タンパク質をコードした環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、レシピエント細胞内での免疫原性関連遺伝子（ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＡ及びＩＦＮ−β）の低下した誘導を示した。ＲＩＧ−Ｉは、短い５’トリホスフェート非キャップ二本鎖又は一本鎖ＲＮＡを認識し得る一方、ＭＤＡ５は、より長いｄｓＲＮＡを認識し得る。ＲＩＧ−Ｉ及びＭＤＡ５の両方は、ＭＡＶＳを活性化し、抗ウイルス応答を引き起こすことに関与し得る。ＰＫＲは、ｄｓＲＮＡによって活性化され、ＩＦＮ−βなどのインターフェロンによって誘導され得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、ｑ−ＰＣＲによるＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ−βの発現によって評価した際、類似した線状ＲＮＡより、２９３Ｔ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有することが示された。
【０４３６】
[0536]  環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを、（１）コザック、終止要素（配列番号１１）を有さない３ｘ  ＦＬＡＧ−ＥＧＦ配列；（２）コザック、終止要素（終止コドン）（配列番号２１）によって隣接された３ｘ  ＦＬＡＧ−ＥＧＦ；（３）コザック、２Ａ配列（配列番号１９）によって隣接された３ｘ  ＦＬＡＧ−ＥＧＦ；又は（４）コザック、２Ａ配列によって隣接された３ｘ  ＦＬＡＧ−ＥＧＦ配列、続いて終止要素（終止コドン）（配列番号２０）のいずれかをコードするように設計した。
【０４３７】
[0537]  この実施例において、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養することにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視した。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（インビトロジェン）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（バイオラッド）を用いて行った。
【０４３８】
[0538]  使用されるプライマー配列：ＧＡＰＤＨについてのプライマー、Ｆ：ＡＧＧＧＣＴＧＣＴＴＴＴＡＡＣＴＣＴＧＧＴ、Ｒ：ＣＣＣＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＧＧＡＧＧＧＡ；ＲＩＧ−Ｉ、Ｆ：ＴＧＴＧＧＧＣＡＡＴＧＴＣＡＴＣＡＡＡＡ、Ｒ：ＧＡＡＧＣＡＣＴＴＧＣＴＡＣＣＴＣＴＴＧＣ；ＭＤＡ５、Ｆ：ＧＧＣＡＣＣＡＴＧＧＧＡＡＧＴＧＡＴＴ、Ｒ：ＡＴＴＴＧＧＴＡＡＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＧ；ＰＫＲ、Ｆ：ＴＣＧＣＴＧＧＴＡＴＣＡＣＴＣＧＴＣＴＧ、Ｒ：ＧＡＴＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＣＣＡＧＡＧ；ＩＦＮ−β、Ｆ：ＣＴＣＴＣＣＴＧＴＴＧＴＧＣＴＴＣＴＣＣ、Ｒ：ＧＴＣＡＡＡＧＴＴＣＡＴＣＣＴＧＴＣＣＴＴＧ。
【０４３９】
[0539]  図２９に示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ−βの減少を示した。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、環状ＲＮＡトランスフェクト細胞内で減少された。
【０４４０】
実施例３３：細胞内におけるローリングサークル型翻訳による合成環状ＲＮＡからの増加した発現
[0540]  この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳からの増加した発現を実証する。
【０４４１】
[0541]  環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）なしで、ナノルシフェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照遺伝子と共にＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；ｎＬＵＣ  ｓｔｏｐ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣスタガー（配列番号２４）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列及びスタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３０に示されるように、両方の環状ＲＮＡは、機能的ルシフェラーゼ活性を有する翻訳産物を生成した。
【０４４２】
[0542]  この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
【０４４３】
[0543]  図３０に示されるように、両方の環状ＲＮＡが細胞内でタンパク質を発現した。しかしながら、スタガー要素、例えば２Ａ配列を含み、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡは、終止要素（終止コドン）を有する環状ＲＮＡより、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
【０４４４】
実施例３４：細胞内で翻訳される合成環状ＲＮＡ
[0544]  この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡ翻訳を実証する。さらに、この実施例は、環状ＲＮＡがその線状同等物より多くの発現産物を生成したことを示す。
【０４４５】
[0545]  環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。細胞を、陰性対照としてＥＧＦをコードする環状ＲＮＡ（配列番号２２）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ配列、スタガー配列（２Ａ配列）；線状又は環状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドンでトランスフェクトした。図３１に示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でナノルシフェラーゼにおいて翻訳された。
【０４４６】
[0546]  線状又は環状ＲＮＡ翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
【０４４７】
[0547]  図３１に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較して、より高いレベルのルシフェラーゼ活性又は生成された増加したタンパク質を有していた。
【０４４８】
実施例３５：合成環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳が細胞内で機能的タンパク質産物を生成した
[0548]  この実施例は、終止要素（終止コドン）を欠いた、例えば細胞内において、終止要素（終止コドン）を欠き、スタガー要素を有する、合成環状ＲＮＡからの機能的タンパク質産物のローリングサークル型翻訳を実証する。さらに、この実施例は、スタガー要素を有する環状ＲＮＡがその線状同等物より多い機能的タンパク質産物を発現したことを示す。
【０４４９】
[0549]  環状ＲＮＡは、その線状同等物と同様に、２９３Ｔ細胞中で問題なくトランスフェクトされた。細胞を環状ＲＮＡ  ＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；線状及び環状ｎＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３２に示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でナノルシフェラーゼ中において翻訳された。
【０４５０】
[0550]  線状又は環状ＲＮＡ翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの線状又は環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
【０４５１】
[0551]  図３２に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、終止要素（終止コドン）を有さない環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
【０４５２】
実施例３６：合成環状ＲＮＡが細胞内におけるＩＲＥＳ開始によって翻訳される
[0552]  この実施例は、細胞内におけるＩＲＥＳによる合成環状ＲＮＡ翻訳開始を実証する。
【０４５３】
[0553]  環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照遺伝子と共にコザック配列又はＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）、ｎＬＵＣコザック（配列番号２５）：コザック配列、１ｘ  ＦＬＡＧタグ化ＥＧＦ配列、スタガー配列（Ｔ２Ａ配列）、１ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ、スタガー配列（Ｐ２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣ  ＩＲＥＳ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドンでトランスフェクトした。図３３に示されるように、ＩＲＥＳを有する環状ＲＮＡは、コザック配列を有する環状ＲＮＡと比較して、より高いタンパク質レベルに対応する、より高いレベルのルシフェラーゼ活性を示した。
【０４５４】
[0554]  この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
【０４５５】
[0555]  図３３に示されるように、環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳによりタンパク質発現を開始させ、コザックを有する環状ＲＮＡがタンパク質発現を開始させるより、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を生成した。
【０４５６】
実施例３７：細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳
[0556]  この実施例は、ＩＲＥＳによりタンパク質産生を開始させる細胞内における合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳によるより多いタンパク質産生を実証する。
【０４５７】
[0557]  環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）を用いるか又は用いずに、ナノルシフェラーゼ遺伝子又はＥＧＦ陰性対照と共にコザック配列又はＩＲＥＳを含むように設計した。細胞をＥＧＦ陰性対照（配列番号２２）；ｎＬＵＣ  ＩＲＥＳ  ｓｔｏｐ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列、スタガー配列（２Ａ配列）及び終止コドン；又はｎＬＵＣ  ＩＲＥＳスタガー（配列番号２４）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー配列（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬＵＣ配列及びスタガー配列（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３４に示されるように、両方の環状ＲＮＡが発現産物を生成し、ローリングサークル型翻訳を実証し、ＩＲＥＳを有し終止要素を有さない（例えば、コザック配列を有さない）環状ＲＮＡは、ＩＲＥＳを有さず終止要素を有する（例えば、コザック配列を有する）環状ＲＮＡより、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより高いレベルのタンパク質産物を開始及び生成し、これは、ローリングサークル型翻訳を実証している。
【０４５８】
[0558]  この実施例において、環状ＲＮＡの翻訳を細胞内で監視した。具体的には、０．１×１０６個の細胞を１２ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。１日後、３００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。溶解物中のナノルシフェラーゼ活性を、その製造業者のプロトコル（プロメガ）に従ってルシフェラーゼアッセイシステムを用いて測定した。
【０４５９】
[0559]  図３４に示されるように、環状ＲＮＡを、両方の環状ＲＮＡから与えられるローリングサークル型方法により、細胞内でタンパク質に翻訳した。しかしながら、終止要素（終止コドン）を欠いた環状ＲＮＡである。しかしながら、環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳は、ＩＲＥＳでより多いタンパク質産生を開始させ、終止要素コザック翻訳開始を有する環状ＲＮＡと比較して、機能的ルシフェラーゼ活性を有するより多くのタンパク質産物を生成した。
【０４６０】
実施例３８：環状ＲＮＡから発現される増加したタンパク質
[0560]  この実施例は、細胞内における合成環状ＲＮＡ翻訳を実証する。さらに、この実施例は、環状ＲＮＡが、その線状同等物より、適切な分子量のより多い発現産物を生成したことを示す。
【０４６１】
[0561]  線状及び環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）と共にナノルシフェラーゼ遺伝子を含むように設計した。細胞を、ビヒクル：トランスフェクション試薬のみ；線状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）；又は環状ｎＬＵＣ（配列番号２３）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列、スタガー要素（２Ａ配列）及び終止要素（終止コドン）でトランスフェクトした。図３５に示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、適切な分子量を有する、より多いレベルのタンパク質を生成した。
【０４６２】
[0562]  ２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０４６３】
[0563]  ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０４６４】
[0564]  図３５に示されるように、環状ＲＮＡは、細胞内でタンパク質に翻訳された。特に、環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物と比較して、適切な分子量を有するより高いレベルのタンパク質を生成した。
【０４６５】
実施例３９：合成環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳が細胞内で別個のタンパク質産物を生成した
[0565]  この実施例は、別個のタンパク質産物が、終止要素（終止コドン）を欠いた、例えば細胞内において、終止要素（終止コドン）の代わりにスタガー要素を有する合成環状ＲＮＡからのローリングサークル型翻訳によって翻訳されたことを実証する。さらに、この実施例は、スタガー要素を有する環状ＲＮＡが、その線状同等物より、適切な分子量を有するより多いタンパク質産物を発現したことを示す。
【０４６６】
[0566]  環状ＲＮＡを、終止要素（終止コドン）の代わりに、スタガー要素と共にナノルシフェラーゼ遺伝子を含むように設計した。細胞をビヒクル：トランスフェクション試薬のみ；線状ｎＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列及びスタガー要素（２Ａ配列）；又は環状ｎＬＵＣ（配列番号２４）：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、スタガー要素（２Ａ配列）、３ｘ  ＦＬＡＧタグ化ｎＬｕｃ配列及びスタガー要素（２Ａ配列）でトランスフェクトした。図３６に示されるように、環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して、適切な分子量を有するより高いレベルのタンパク質を生成した。
【０４６７】
[0567]  ２４時間後、１００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を加えることにより、細胞を収集した。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０４６８】
[0568]  ドライ転写方法を用いてニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ブロットを、ＥＣＬキットを用いて視覚化し、ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０４６９】
[0569]  図３６に示されるように、環状ＲＮＡ翻訳産物が細胞内で検出された。特に、終止要素（終止コドン）を有さない環状ＲＮＡは、その線状ＲＮＡ同等物より、適切な分子量を有するより高いレベルの別個のタンパク質産物を生成した。
【０４７０】
実施例４０：疑似二本鎖、らせん構造を有する環状ＲＮＡの調製
[0570]  この実施例は、環状ＲＮＡが疑似二本鎖及びらせん構造の両方を有していたことを実証する。
【０４７１】
[0571]  非天然環状ＲＮＡを、疑似二本鎖、らせん構造を採用するように操作した。同様の構造は、固有に長い生体内半減期を有する天然環状ＲＮＡの縮合に関与することが示された（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．２０１４  Ｊｕｌ；８８（１３）：７４０２−１１．ｄｏｉ：１０．１１２８／ＪＶＩ．００４４３−１４，Ｇｕｅｄｊ  ｅｔ  ａｌ，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ．２０１４  Ｄｅｃ；６０（６）：１９０２−１０．ｄｏｉ：１０．１００２／ｈｅｐ．２７３５７）。
【０４７２】
[0572]  この実施例において、環状ＲＮＡを、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、ＯＲＦとしての３ＸＦＬＡＧでタグ化されたＮｌｕｃ及びスタガー配列（ＥＭＣＶ  ２Ａ  ３ＸＦＬＡＧ  Ｎｌｕｃ  ２Ａ  ｎｏ  ｓｔｏｐ）をコードするように設計した、ＲＮＡ二次構造を評価するために、熱力学的ＲＮＡ構造予測ツール（ＲＮＡｆｏｌｄ）を使用した（Ｖｉｅｎｎａ  ＲＮＡ）。さらに、ＲＮＡ三次構造を、ＲＮＡモデリングアルゴリズムを用いて分析した。
【０４７３】
[0573]  図３７及び３８に示されるように、環状ＲＮＡは、疑似二本鎖、らせん構造を採用したようにモデル化される。
【０４７４】
実施例４１：反復配列と連結された疑似らせん構造を有する環状ＲＮＡの調製
[0574]  この実施例は、環状ＲＮＡが、反復配列と連結された疑似らせん構造を有するように設計され得ることを実証する。
【０４７５】
[0575]  非天然環状ＲＮＡを、反復配列と連結された疑似らせん構造を採用するように操作した。同様の構造は、固有に長い生体内半減期を有する天然環状ＲＮＡの縮合に関与することが示された（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４、Ｇｕｅｄｊ  ｅｔ  ａｌ  ２０１４）。
【０４７６】
[0576]  この実施例において、環状ＲＮＡを、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、Ｎｌｕｃ及び反復配列（配列番号２６）を含むスペーサーをコードするように設計した。ＲＮＡ三次構造を評価するためにＲＮＡモデリングアルゴリズムを使用した。
【０４７７】
[0577]  図３９に示されるように、環状ＲＮＡは、疑似らせん構造を採用したようにモデル化される。
【０４７８】
実施例４２：環状化ＲＮＡは、環状であり、コンカテマーでない
[0578]  この実施例は、ＲＮＡｓｅ  Ｈによる環状ＲＮＡ分解が、環状ＲＮＡと一致し、コンカテマーＲＮＡと一致しない核酸分解産物を生成したことを実証する。
【０４７９】
[0579]  ＲＮＡは、リガーゼと共にインキュベートされる場合、反応しないか又は分子内若しくは分子間結合を形成することができないかのいずれかであり、これは、それぞれ環状（遊離末端がない）又はコンカテマーＲＮＡを生成する。相補的ＤＮＡプライマー及びＲＮＡｓｅ  Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を認識する非特異的エンドヌクレアーゼによる各タイプのＲＮＡの処理は、出発ＲＮＡ材料に応じて、特定のサイズの固有の数の分解産物を生成することが予測される。
【０４８０】
[0580]  以下の実施例に示されるように、ライゲートされたＲＮＡは、ＲＮＡｓｅ  Ｈ分解によって生成されるＲＮＡの数及びサイズに基づいて環状であり、コンカテマーでないことが示された。
【０４８１】
[0581]  ＥＭＣＶ  Ｔ２Ａ  ３ＸＦＬＡＧ−Ｎｌｕｃ  Ｐ２Ａを含有する環状ＲＮＡ及び線状ＲＮＡを生成した。
[0582]  ＲＮＡ（１２９９ｎｔ）の環状化状態を試験するために、０．０５ｐｍｏｌｅ／μｌの線状又は環状ＲＮＡを２０分間にわたって３７℃において、１０３７−１０４６ｎｔのＲＮＡ（ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ、配列番号５５）に対して、０．２５Ｕ／μｌのＲＮＡｓｅ  Ｈ、ＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を消化するエンドリボヌクレアーゼ及び０．３ｐｍｏｌｅ／μｌのオリゴマーと共にインキュベートした。インキュベーション後、反応混合物を６％の変性ＰＡＧＥによって分析した。
【０４８２】
[0583]  上述される使用される線状ＲＮＡについて、ＤＮＡプライマーの結合及びＲＮＡｓｅ  Ｈによるその後の切断後、２つの切断産物が１０４１ｎｔ及び２５８ｎｔで得られることが予測される。コンカテマーが２５８、１０４１及び１２９９ｎｔの３つの切断産物を生成することが予測される。環状が単一の１２９９ｎｔ切断産物を生成することが予測される。
【０４８３】
[0584]  ＲＮＡｓｅエンドヌクレアーゼと共にインキュベートされた線状ＲＮＡレーン中のバンドの数は、予測されるように１０４１ｎｔ及び２５８ｎｔの２つのバンドを生成した一方、１２９９ｎｔの単一のバンドは、環状ＲＮＡレーンにおいて生成され（図４０を参照されたい）、これは、環状ＲＮＡが実際に環状であり、コンカテマーでなかったことを示す。
【０４８４】
実施例４３：大きい環状ＲＮＡの調製
[0585]  この実施例は、約２０塩基〜約６．２Ｋｂの範囲の環状ポリリボヌクレオチドの生成を実証する。
【０４８５】
[0586]  １つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡは、所望の機能に応じたサイズの範囲で生成された。以下の実施例に示されるように、最大で６２００ｎｔの線状ＲＮＡが環状化された。
【０４８６】
[0587]  プラスミドｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴ（６．２ｋｂ）をここで使用した。プライマーを、規則的な間隔でｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴにアニールして、５００ｎｔ、１０００ｎｔ、２０００ｎｔ、４０００ｎｔ、５０００ｎｔ及び６２００ｎｔに対応するＤＮＡオリゴヌクレオチドを生成するように設計した。示されるＤＮＡオリゴヌクレオチドのインビトロ転写を行って、対応するサイズの線状ＲＮＡを生成した。環状ＲＮＡを、スプリントＤＮＡを用いて、これらのＲＮＡオリゴヌクレオチドから生成した。
【０４８７】
[0588]  ＲＮＡの環状化効率を測定するために、６つの異なるサイズの線状ＲＮＡ（５００ｎｔ、１０００ｎｔ、２０００ｎｔ、４０００ｎｔ、５０００ｎｔ及び６２００ｎｔ）を生成した。それらを、ＤＮＡスプリント及びＴ４  ＤＮＡリガーゼ２を用いて環状化した。対照として、１つの反応をＴ４  ＲＮＡリガーゼなしで行った。環状化サンプルの半分をＲＮＡｓｅ  Ｒで処理して、線状ＲＮＡを除去した。
【０４８８】
[0589]  環状化効率を監視するために、各サンプルを、ｑＰＣＲを用いて分析した。図４１に示されるように、環状ＲＮＡを異なる長さの様々なＤＮＡから生成した。図４２に示されるように、ＲＮＡの環状化を、環状接合部に対して、ＲＮＡｓｅ  Ｒ処理及びｑＰＣＲ分析を用いて確認した。この実施例は、様々な長さの環状ＲＮＡ生成を実証する。
【０４８９】
実施例４４：タンパク質結合部位を用いて操作される環状ＲＮＡ
[0590]  この実施例は、タンパク質結合部位を有する環状ＲＮＡの生成を実証する。
【０４９０】
[0591]  この実施例において、１つの環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３  ＩＲＥＳ（配列番号５６）及びガウシアルシフェラーゼ（Ｇｌｕｃ）をコードするＯＲＦ（配列番号５７）、続いて少なくとも１つのタンパク質結合部位を含むように設計される。特定の例では、シンドビスウイルス３’ＵＴＲからのＨｕＲ結合配列（配列番号５２）を用いて、環状ＲＮＡ免疫原性に対するタンパク質結合の影響を試験する。ＨｕＲ結合配列は、２つの要素、ＵＲＥ（Ｕリッチ要素；配列番号５０）及びＣＳＥ（保存配列要素；配列番号５１）を含む。ＨｕＲ結合配列を有さない又はＵＲＥを有する環状ＲＮＡが対照として使用される。アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン及びエクソン配列の一部をＣＶＢ３  ＩＲＥＳ（配列番号５６）の前に配置する。環状ＲＮＡは、記載されるようにインビトロで生成される。図４５に示されるように、環状ＲＮＡは、ＨｕＲ結合部位を含有するように生成された。
【０４９１】
[0592]  環状ＲＮＡ免疫原性に対するＲＮＡ結合タンパク質の影響を監視するために、細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養する。１日後、５００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中にトランスフェクトする。翻訳効率／ＲＮＡ安定性／免疫原性を毎日最大で７２時間監視する。Ｇｌｕｃ活性を監視するために培地を収集する。ＲＮＡレベルを測定するための細胞溶解物を、リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ（インビトロジェン）によって相対的遺伝子発現の測定を可能にするキットを用いて調製する。
【０４９２】
[0593]  製造業者の説明（ピアース）に従ってガウシアルシフェラーゼフラッシュアッセイキットを用いて、Ｇｌｕｃ活性を測定することにより、翻訳効率を監視する。
[0594]  ｑＲＴ−ＰＣＲ分析のために、ｃＤＮＡは、製造業者の説明（インビトロジェン）に従って細胞溶解物調製キットを用いて生成される。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、ＰＣＲマスターミックス（Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  ＩＩ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ）及びＰＣＲサイクラー（ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０）を用いて３連で行われる。環状ＲＮＡ安定性をＮｌｕｃに対するプライマーによって測定する。ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ及びＰＫＲなどの周知の自然免疫調節因子のｍＲＮＡレベルを定量化し、アクチン値に対して正規化する。
【０４９３】
実施例４５：調節核酸部位を有する環状ＲＮＡの調製
[0595]  この実施例は、調節ＲＮＡ結合部位を有する環状ＲＮＡのインビトロ生成を実証する。
【０４９４】
[0596]  異なる細胞型は、特定のＲＮＡ配列を標的にする独自の核酸調節機構を有する。環状ＲＮＡ中のこれらの特定の配列をコードすることは、異なる細胞型における独自の特性を与え得る。以下の実施例に示されるように、環状ＲＮＡは、マイクロＲＮＡ結合部位をコードするように操作された。
【０４９５】
[0597]  この実施例において、環状ＲＮＡは、ＷＴ  ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳをコードする配列、ｍｉｒ６９２マイクロＲＮＡ結合部位（ＧＡＧＧＵＧＣＵＣＡＡＡＧＡＧＡＵ）及びＩＲＥＳ−ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
【０４９６】
[0598]  環状ＲＮＡをインビトロで生成した。転写を駆動するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ５’−ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＧＧＣＴＡＴＴＣＣＣＡＡＴＡＧＣＣＧＴＴ）及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素−ＰＡＧＥで精製し（図４３）、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮａｓｅフリー水中で再懸濁させた。
【０４９７】
[0599]  図４３に示されるように、環状ＲＮＡを、ｍｉＲＮＡ結合部位を用いて生成した。
【０４９８】
実施例４６：環状ＲＮＡの自己スプライシング
[0600]  この実施例は、自己スプライシングによって環状ＲＮＡを生成する能力を実証する。
【０４９９】
[0601]  この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３  ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ−ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
【０５００】
[0602]  環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。インビトロ転写反応は、１μｇの鋳型ＤＮＡ  Ｔ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータ、１０×Ｔ７反応緩衝液、７．５ｍＭのＡＴＰ、７．５ｍＭのＣＴＰ、７．５ｍＭのＧＴＰ、７．５ｍＭのＵＴＰ、１０ｍＭのＤＴＴ、４０ＵのＲＮａｓｅ阻害剤及びＴ７酵素を含んでいた。転写を３７℃で４時間行った。転写されたＲＮＡは、３７℃で１５分間１ＵのＤＮａｓｅ  Ｉで処理されたＤＮａｓｅであった。自己スプライシングによる環状化に有利に作用するように、さらなるＧＴＰを２ｍＭの最終濃度に加え、５５℃で１５分間インキュベートした。次に、ＲＮＡをカラム精製し、ＵＲＥＡ−ＰＡＧＥによって視覚化した。
【０５０１】
[0603]  図４４は、自己スプライシングによって生成された環状ＲＮＡを示す。
【０５０２】
実施例４７：エンクリプトゲンを含むスプライシング要素を有する環状ＲＮＡ
[0604]  この実施例は、環状ＲＮＡが、低下した免疫原性を有するように操作されることを実証する。
【０５０３】
[0605]  この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３  ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ−ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでおり、これらの２つのスペーサー要素は、アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン及びエクソン配列（配列番号５９）の一部であるスプライシング要素を含む。
【０５０４】
[0606]  環状ＲＮＡは、インビトロで生成される。
[0607]  この実施例において、細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養することにより、自然免疫応答遺伝子のレベルを細胞内で監視する。１日後、１μｇの線状又は環状ＲＮＡは、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中にトランスフェクトされる。トランスフェクションの２４時間後、全ＲＮＡは、フェノール系抽出試薬（インビトロジェン）を用いて細胞から単離される。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成する。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析は、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（バイオラッド）を用いて行われる。
【０５０５】
[0608]  スプライシング要素を含む環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲレベルは、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ−βの減少を示すことが予測される。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、線状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、環状ＲＮＡトランスフェクト細胞内で減少されることが予測される。
【０５０６】
実施例４８：細胞分裂中の環状ＲＮＡの持続性
[0609]  この実施例は、細胞分裂中の環状ポリリボヌクレオチドの持続性を実証する。１つ以上の望ましい特性を含むように操作された非天然環状ＲＮＡは、分解されずに細胞分裂を通して細胞内で持続し得る。以下の実施例に示されるように、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）を発現する環状ＲＮＡをＨｅＬａ細胞内で７２時間にわたって監視した。
【０５０７】
[0610]  この実施例において、１３０７ｎｔの環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３  ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ−ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
【０５０８】
[0611]  細胞分裂にわたる環状ＲＮＡの持続性をＨｅＬａ細胞内で監視した。９６ウェルプレート中の５０００個の細胞／ウェルは、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた懸濁液であった。Ｂｒｉｇｈｔ細胞イメージングをＡｖｏｓ  ｉｍａｇｅｒ（サーモフィッシャー）において行い、細胞計数を、０時間、２４時間、４８時間、７２時間及び９６時間の時点で発光細胞生存アッセイ（プロメガ）を用いて行った。ガウシアルシフェラーゼ酵素活性をタンパク質発現の指標として毎日監視し、ｇＬｕｃ発現を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（サーモサイエンティフィック  ピアース）を用いて、２４時間ごとにウェルから除去された上清中で毎日監視した。５０μｌの１Ｘ  Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（プロメガ）において混合した直後に読み取った。
【０５０９】
[0612]  環状ＲＮＡからのタンパク質の発現は、分裂細胞内で線状ＲＮＡより高いレベルで検出された（図４６）。環状ＲＮＡを有する細胞は、測定される全ての時点において、線状ＲＮＡと比較してより高い細胞分裂速度を有していた。この実施例は、その線状ＲＮＡ同等物より、細胞分裂中の環状ＲＮＡの増加した検出を実証する。
【０５１０】
実施例４９：ローリングサークル型翻訳は、複数の発現配列を生成した
[0613]  この実施例は、単一の構築物から複数のタンパク質を発現する環状ＲＮＡの能力を実証する。さらに、この実施例は、複数のＯＲＦをコードする環状ＲＮＡのローリングサークル型翻訳を実証する。この実施例は、単一の構築物からの２つのタンパク質の発現をさらに実証する。
【０５１１】
[0614]  １つの環状ＲＮＡ（ｍｔＥＭＣＶ  Ｔ２Ａ  ３ＸＦＬＡＧ−ＧＦＰ  Ｆ２Ａ  ３ＸＦＬＡＧ−Ｎｌｕｃ  Ｐ２Ａ  ＩＳスペーサー）を、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ（配列番号５８）及び３ＸＦＬＡＧタグを有するＧＦＰをコードするＯＲＦ及び３ＸＦＬＡＧタグを有するナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦを含むようにローリングサークル型翻訳のために設計した。スタガー要素（２Ａ）は、ＧＦＰ及びＮｌｕｃ  ＯＲＦに隣接していた。別の環状ＲＮＡを同様に設計したが、Ｎｌｕｃ  ＯＲＦとスペーサーとの間に三重終止コドンを含んでいた。アナベナ属（Ａｎａｂａｅｎａ）自己触媒イントロン及びエクソン配列の一部がＥＭＣＶ  ＩＲＥＳの前に含まれていた。環状ＲＮＡを記載されるようにインビトロで生成した。
【０５１２】
[0615]  環状ＲＮＡからのタンパク質の発現をインビトロ又は細胞内で監視した。インビトロ分析の場合、環状ＲＮＡを３０℃においてウサギ網状赤血球溶解物（プロメガ，Ｆｉｔｃｈｂｕｒｇ，ＷＩ，ＵＳＡ）中で３時間インキュベートした。反応混合物の最終組成物は、７０％のウサギ網状赤血球溶解物、２０μＭの完全アミノ酸及び０．８Ｕ／μＬのＲＮａｓｅ阻害剤（東洋紡、大阪）を含んでいた。
【０５１３】
[0616]  インキュベーション後、ヘモグロビンタンパク質を、酢酸（０．３２μｌ）及び水（３００μｌ）を反応混合物（１６μｌ）に加え、１５℃で１０分間にわたって２０，８１７×ｇで遠心分離することによって除去した。上清を除去し、ペレットを２×ＳＤＳサンプル緩衝液に溶解させ、１５分間にわたって７０℃でインキュベートした。５分間にわたる１４００×ｇでの遠心分離後、上清を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０５１４】
[0617]  細胞内での分析のため、細胞内での環状ＲＮＡの翻訳効率を監視するために細胞を１２ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。１日後、５００ｎｇの環状ＲＮＡを、脂質ベースのトランスフェクション試薬（インビトロジェン）を用いて各ウェル中でトランスフェクトした。トランスフェクションの４８時間後、２００μｌのＲＩＰＡ緩衝液を各ウェルに加えることにより、細胞を収集した。次に、１０μｇの細胞溶解物タンパク質を１０〜２０％の勾配のポリアクリルアミド／ＳＤＳゲル上で分析した。
【０５１５】
[0618]  ドライ転写方法を用いて、網状赤血球溶解物及び細胞からのサンプルをニトロセルロース膜に電気泳動転写した後、ブロットを抗ＦＬＡＧ抗体及び抗マウスＩｇＧペルオキシダーゼと共にインキュベートした。ローディングコントロールとして、抗βチューブリン抗体を使用した。ブロットを、増強化学発光（ＥＣＬ）キットを用いて視覚化した。ウエスタンブロットバンド強度をＩｍａｇｅＪによって測定した。
【０５１６】
[0619]  図４７に示されるように、ＧＦＰ及びｎＬｕｃをコードする環状ＲＮＡは、２つのタンパク質産物を生成した。三重終止を有さない環状ＲＮＡからの翻訳は、三重終止コドンを有する環状ＲＮＡより多い両方のタンパク質産物を生成した。最後に、三重終止を有する及び有さない両方の環状ＲＮＡは、それぞれ１／３．２４及び１／３．３７の比率でタンパク質を発現した。
【０５１７】
実施例５０：環状ＲＮＡは、線状ＲＮＡと比較して低下した毒性を示す
[0620]  この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡより毒性が低いことを実証する。
【０５１８】
[0621]  この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、３ＸＦＬＡＧタグを有し、且つスタガー要素（２Ａ）及び終止要素（終止コドン）によって両側が隣接されたＮａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦを含む。環状ＲＮＡをインビトロで生成し、本明細書に記載されるように精製した。この実施例に使用される線状ＲＮＡは、グロビンＵＴＲを有するｎＬｕｃをコードするキャップ修飾ポリＡテイルＲＮＡ又はキャップ非修飾ポリＡテイルＲＮＡであった。
【０５１９】
[0622]  細胞内のＲＮＡの毒性を監視するために、ＢＪヒト線維芽細胞を９６ウェルプレートの各ウェル上で平板培養した。５０ｎｇの環状又はキャップ修飾ポリＡテイル線状ＲＮＡのいずれかを、製造業者の推奨に従って脂質ベースのトランスフェクション試薬（サーモフィッシャー）を用いて、０、４８及び７２時間後にトランスフェクトした。Ｂｒｉｇｈｔ細胞イメージングを９６時間の時点でＡｖｏｓ  ｉｍａｇｅｒ（サーモフィッシャー）において行った。１条件当たりの全細胞を、ＩｍａｇｅＪを用いて分析した。
【０５２０】
[0623]  図４８に示されるように、環状ＲＮＡのトランスフェクションは、線状ＲＮＡと比較して、低下した毒性を実証した。
【０５２１】
実施例５１：ストレス条件下での発現
[0624]  この実施例は、環状ＲＮＡが、線状ＲＮＡより、ストレス条件下でより良好に発現されたことを実証する。
【０５２２】
[0625]  この実施例では、環状ＲＮＡは、ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ、３ＸＦＬＡＧタグを有し、且つスタガー要素によって隣接されたＮａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦを含む。環状ＲＮＡをインビトロで生成し、記載されるように精製した。この実施例に使用される線状ＲＮＡは、グロビンＵＴＲを有するｎＬｕｃをコードするキャップポリＡテイルＲＮＡであった。
【０５２３】
[0626]  細胞からのガウシアルシフェラーゼの発現を監視するために、ＢＪヒト線維芽細胞を９６ウェルプレートの各ウェル中で平板培養した。５０ｎｇの環状又はキャップ−ポリＡテイル線状ＲＮＡのいずれかを、製造業者の推奨に従って脂質ベースのトランスフェクション試薬を用いて、０、４８及び７２時間後にトランスフェクトした。ガウシアルシフェラーゼ酵素活性をタンパク質発現の指標として毎日監視し、ｇＬｕｃ発現を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（サーモサイエンティフィック  ピアース）を用いて、２４時間ごとにウェルから除去された上清中で毎日監視した。５０μｌの１Ｘ  Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（プロメガ）において混合した直後に読み取った。
【０５２４】
[0627]  図４９に示されるように、環状ＲＮＡは、ストレス条件下において、線状ＲＮＡと比較してより高いレベルで翻訳された。
【０５２５】
実施例５２：選択的発現のためのリボスイッチ
[0628]  この実施例は、環状ＲＮＡからのタンパク質発現を制御する能力を実証する。
【０５２６】
[0629]  この実施例では、環状ＲＮＡを、ＮａｎｏＬｕｃをコードするＯＲＦの発現を調節する合成リボスイッチ（配列番号６０）を含むように設計した（図５０を参照されたい）。環状ＲＮＡをインビトロで生成した。転写を駆動するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータに加えて、上に列挙される全てのモチーフを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ  ５’−ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＣＣＧＴＴＧＴＧＧＴＣＴＣＣＣＡＧＡＴＡＡＡＣＡＧＴＡＴＴＴＴＧＴＣＣ）及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素−ＰＡＧＥで精製した（図５０）。
【０５２７】
[0630]  テオフィリン又はテトラサイクリンは、その特定のリボスイッチの活性化を誘導して、遺伝子発現のオフスイッチをもたらす（Ａｕｓｌａｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．２０１０  Ｍａｙ；６（５）：８０７−１４及びＯｇａｗａ  ｅｔ  ａｌ，ＲＮＡ．２０１１  Ｍａｒ；１７（３）：４７８−８８．ｄｏｉ：１０．１２６１／ｒｎａ．２４３３１１１．Ｅｐｕｂ  ２０１１  Ｊａｎ  １１によって記載されるように）。リボスイッチは、環状ＲＮＡからのＧＦＰ又はＮＬｕｃ発現を制御することが予測される。したがって、ＧＦＰ又はＮＬｕｃ発現は、テオフィリン又はテトラサイクリンの追加後に予測されない。
【０５２８】
[0631]  リボスイッチの効率が無細胞翻訳系及びＨｅＬａ細胞内で試験される。無細胞翻訳は、製造業者の推奨に従って無細胞翻訳キット（プロメガ、Ｌ４１４０）を使用し、ＮＬｕｃ  ＯＲＦについて発光測定装置（プロメガ）及びＧＦＰ  ＯＲＦについて細胞イメージングマルチモードリーダー（ＢｉｏＴｅｋ）を用いて発光を測定することによって行われる。
【０５２９】
[0632]  細胞アッセイのために、ＨｅＬａ細胞／ウェルは、テオフィリン又はテトラサイクリン依存的合成リボスイッチ（ｔｈｅｏＮ５についての第１のＰＣＲフォワードプライマー：ATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGG；ｔｈｅｏＮ５についての第２のＰＣＲフォワードプライマー：GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAG；ｔｃ−Ｎ５についての第１のＰＣＲフォワードプライマー：ACATACCAGATTTCGATCTGGAGAGGTGAAGAATACGACCACCTAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATC；ｔｃ−Ｎ５についての第２のＰＣＲフォワードプライマー：GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTAAAACATACCAGATTTCGATC）のいずれかの制御下において、１ｎＭの、ＧＦＰ又はＮＬｕｃをコードする記載される環状ＲＮＡでトランスフェクトされて、選択的発現を評価する。脂質ベースのトランスフェクション試薬が製造業者の推奨に従って使用される。
【０５３０】
[0633]  ３７℃及び５％のＣＯ２で２４時間の培養後、細胞は、１ｎＭ〜３ｍＭの範囲の濃度を有する、環状ＲＮＡ内でコードされるリボスイッチに応じて、テオフィリン又はテトラサイクリンを用いて及び用いずに処理される。２４時間の連続した培養後、蛍光又は発光が評価される。ＧＦＰについて、生細胞は、５％のＦＢＳ及びペニシリン／ストレプトマイシン及び核の染色を含む蛍光ニュートラルＤＭＥＭ培地中でイメージングされる。ＮＬｕｃについて、発光は、発光測定装置（プロメガ）を用いて、製造業者の説明に従ってルシフェラーゼシステムを用いて評価される。
【０５３１】
ＮＬｕｃ（青色：チャバネアオカメムシ（Plautia stali）腸管ウイルスＩＲＥＳ、オレンジ色：ＮＬｕｃ  ＯＲＦ）についてのＤＮＡ鋳型
GACACGCGGCCTTCCAAGCAGTTAGGGAAACCGACTTCTTTGAAGAAGAAAGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGGTTAAATTTCGAGGTTAAAAATAGTTTTAATATTGCTATAGTCTTAGAGGTCTTGTATATTTATACTTACCACACAAGATGGACCGGAGCAGCCCTCCAATATCTAGTGTACCCTCGTGCTCGCTCAAACATTAAGTGGTGTTGTGCGAAAAGAATCTCACTTCAAGAAAAAGAAACTAGTATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTAACTCGAGCTCGGTACCTGTCCGCGGTCGCGACGTACGCGGGCGGCCGCCATAAATTGGATCCATATATAGGGCCCGGGTTATAATTACCTCAGGTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAATTTACGGCTAGCGCCGGATGCGACGCCGGTCGCGTCTTATCCGGCCTTCCTATATCAGGCGGTGTTTAAGACGCCGCCGCTTCGCCCAAATCCTTATGCCGGTTCGACGACTGGACAAAATACTGTTTATCT
ｅＧＦＰ（青色：チャバネアオカメムシ（Plautia stali）腸管ウイルスＩＲＥＳ、オレンジ色：ｅＧＦＰ  ＯＲＦ）についてのＤＮＡ鋳型
GACACGCGGCCTTCCAAGCAGTTAGGGAAACCGACTTCTTTGAAGAAGAAAGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGGTTAAATTTCGAGGTTAAAAATAGTTTTAATATTGCTATAGTCTTAGAGGTCTTGTATATTTATACTTACCACACAAGATGGACCGGAGCAGCCCTCCAATATCTAGTGTACCCTCGTGCTCGCTCAAACATTAAGTGGTGTTGTGCGAAAAGAATCTCACTTCAAGAAAAAGAAACTAGTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAACTCGAGCTCGGTACCTGTCCGCGGTCGCGACGTACGCGGGCGGCCGCCATAAATTGGATCCATATATAGGGCCCGGGTTATAATTACCTCAGGTCGACGTCCCATGGTTTTGTATAGAATTTACGGCTAGCGCCGGATGCGACGCCGGTCGCGTCTTATCCGGCCTTCCTATATCAGGCGGTGTTTAAGACGCCGCCGCTTCGCCCAAATCCTTATGCCGGTTCGACGACTGGACAAAATACTGTTTATCT
プライマー配列
２（下線：Ｔ７プロモータ）についてのフォワードプライマー：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTGACTATGTGATC
ｔｈｅｏＮ５（オレンジ色：アプタマー；赤色：ａＩＲＥＳ；紫色：ａａＩＲＥＳ）についての第１のＰＣＲにおけるフォワードプライマー：
ATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGG
ＴｈｅｏＮ５  第２のＰＣＲ：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAG
ｔｃ−Ｎ５についての第１のＰＣＲにおけるフォワードプライマー：
ACATACCAGATTTCGATCTGGAGAGGTGAAGAATACGACCACCTAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATC
ｔｃ−Ｎ５についての第２のＰＣＲにおけるフォワードプライマー：
GAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCACAACGGTTTCCCTCCTCTAAAACATACCAGATTTCGATC
全てのＰＣＲにおけるリバースプライマー：
AGATAAACAGTATTTTGTCCAGTCGTCGAAC
接合部：
GGACAAAATACTGTTTATCTGGGAGACCACAACGG
スプリント：
5’-CCG TTG TGG TCT CCC AGA TAA ACA GTA TTT TGT CC -3’
【０５３２】
実施例５３：修飾ヌクレオチドを有する環状ＲＮＡが生成され、翻訳され、環状ＲＮＡの免疫原性を低下させた
[0634]  この実施例は、タンパク質産物を生成した修飾環状ポリリボヌクレオチドの生成を実証する。さらに、この実施例は、ヌクレオチド修飾を有するように操作された環状ＲＮＡが線状ＲＮＡと比較して低下した免疫原性を有していたことを実証する。
【０５３３】
[0635]  １つ以上の望ましい特性を含み、且つ修飾ヌクレオチドの完全又は部分的な組み込みを有するように操作された非天然環状ＲＮＡを生成した。以下の実施例に示されるように、完全長修飾線状ＲＮＡ又は修飾及び非修飾線状ＲＮＡのハイブリッドを環状化し、ｎＬｕｃの発現を評価した。さらに、修飾環状ＲＮＡは、非修飾環状ＲＮＡと比較して、ＢＪ細胞内における免疫関連遺伝子の低下した活性化を有することが示された（ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ−β発現のｑ−ＰＣＲ）。
【０５３４】
[0636]  ＷＴ  ＥＭＣＶ  Ｎｌｕｃ  ｓｔｏｐスペーサーを有する環状ＲＮＡを生成した。完全な修飾置換のために、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンのそれぞれの代わりに加えた。ハイブリッド構築物について、ＷＴ  ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳをｎＬｕｃ  ＯＲＦとは別々に合成した。ＷＴ  ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを、修飾又は非修飾ヌクレオチドのいずれかを用いて合成した。対照的に、ｎＬｕｃ  ＯＲＦ配列を、インビトロ転写反応中、標準的な非修飾ヌクレオチド、ウリジン及びシトシン又はアデノシンのそれぞれの代わりに、修飾ヌクレオチド、プソイドウリジン及びメチルシトシン又はｍ６Ａを用いて合成した。修飾又は非修飾ＩＲＥＳ及び修飾ＯＲＦの合成後、これらの２つのオリゴヌクレオチドを、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼを用いて一緒にライゲートした。図５１Ａに示されるように、修飾環状ＲＮＡを生成した。
【０５３５】
[0637]  完全修飾又はハイブリッド修飾構築物からのｎＬｕｃの発現効率を測定するために、０．１ｐｍｏｌの線状及び環状ＲＮＡを６時間にわたってＢＪ線維芽細胞中にトランスフェクトした。ｎＬｕｃ発現をトランスフェクションの６時間、２４時間、４８時間及び７２時間後の時点で測定した。
【０５３６】
[0638]  自然免疫応答遺伝子のレベルを、フェノール系抽出試薬（インビトロジェン）を用いて、細胞から単離された全ＲＮＡから細胞中で監視した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（バイオラッド）を用いて行った。
【０５３７】
[0639]  図５１Ｂ及び５１Ｃに示されるように、修飾環状ＲＮＡが翻訳された。図５２Ａ〜Ｃに示されるように、環状ＲＮＡでトランスフェクトされたＢＪ細胞からの免疫関連遺伝子のｑＲＴ−ＰＣＲレベルは、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、ＭＤＡ５、ＯＡＳ及びＩＦＮ−β発現の低下を示した。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、非修飾環状ＲＮＡトランスフェクト細胞と比較して、修飾環状ＲＮＡでトランスフェクトされた細胞内で減少された。
【０５３８】
実施例５４：環状ＲＮＡがインビボで投与され、より長い半減期／増加した安定性を示した
[0640]  この実施例は、環状ＲＮＡを送達する能力及びインビボの線状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡの増加した安定性を実証する。
【０５３９】
[0641]  この実施例では、環状ＲＮＡを、ナノルシフェラーゼ（Ｎｌｕｃ）をコードするＯＲＦ及びスタガー配列（ＥＭＣＶ  ２Ａ  ３ＸＦＬＡＧ  Ｎｌｕｃ  ２Ａ  ｎｏ  ｓｔｏｐ及びＥＭＣＶ  ２Ａ  ３ＸＦＬＡＧ  Ｎｌｕｃ  ２Ａ  ｓｔｏｐ）と共にＥＭＣＶ  ＩＲＥＳを含むように設計した。環状ＲＮＡをインビトロで生成した。
【０５４０】
[0642]  Ｂａｌｂ／ｃマウスに環状ＲＮＡをＮｌｕｃ  ＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に静脈内（ＩＶ）尾静脈投与によって注入した。動物に、製造業者の説明に従い、脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された単回用量の５μｇのＲＮＡを投与した。
【０５４１】
[0643]  マウスを殺処分し、肝臓を投与の３、４及び７日後の時点で採取した（ｎ＝２匹のマウス／時点）。肝臓を採取し、ＲＮＡ安定化試薬（インビトロジェン）中で貯蔵した。組織を、マイクロチューブホモジナイザ（フィッシャーサイエンティフィック）を用いてＲＩＰＡ緩衝液中で均質化し、ＲＮＡを、ｃＤＮＡ合成のためにフェノール系ＲＮＡ抽出試薬を用いて抽出した。ｑＰＣＲを用いて、肝臓中の線状及び環状ＲＮＡの両方の存在を測定した。
【０５４２】
[0644]  組織におけるＲＮＡ検出をｑＰＣＲによって行った。線状及び環状ＲＮＡを検出するために、Ｎｌｕｃ  ＯＲＦを増幅するプライマーを使用した。（Ｆ：ＡＧＡＴＴＴＣＧＴＴＧＧＧＧＡＣＴＧＧＣ、Ｒ：ＣＡＣＣＧＣＴＣＡＧＧＡＣＡＡＴＣＣＴＴ）。環状ＲＮＡのみを検出するために、５’−３’接合物を増幅するプライマーは、線状ＲＮＡ構築物ではなく環状ＲＮＡ構築物の検出を可能にした（Ｆ：ＣＴＧＧＡＧＡＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＡＣ、Ｒ：ＣＣＡＡＡＡＧＡＣＧＧＣＡＡＴＡＴＧＧＴ）。
【０５４３】
[0645]  環状ＲＮＡは、注入の３、４−及び７日後の時点でマウスの肝臓中において線状ＲＮＡより高いレベルで検出された（図５３）。したがって、環状ＲＮＡが投与され、投与後少なくとも７日間においてインビボで検出可能であった。
【０５４４】
実施例５５：環状ＲＮＡのインビボ発現、半減期及び非免疫原性
[0646]  この実施例は、インビボで環状ＲＮＡから発現を駆動する能力を実証する。それは、線状ＲＮＡと比較して、環状ＲＮＡの増加した半減期を実証する。最後に、それは、環状ＲＮＡがインビボで非免疫原性であるように操作されたことを実証する。
【０５４５】
[0647]  この実施例では、環状ＲＮＡは、ＣＶＢ３  ＩＲＥＳ、ガウシアルシフェラーゼ（ＧＬｕｃ）をコードするＯＲＦ及びＩＲＥＳ−ＯＲＦに隣接する２つのスペーサー要素を含んでいた。
【０５４６】
[0648]  環状ＲＮＡをインビトロで生成した。上に列挙される全てのモチーフ並びに転写を駆動するＴ７  ＲＮＡポリメラーゼプロモータを含むＤＮＡ鋳型から非修飾線状ＲＮＡをインビトロで転写した。転写されたＲＮＡを、ＲＮＡクリーンアップキット（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｔ２０５０）を用いて精製し、製造業者の説明に従ってＲＮＡ５’−ホスホヒドロラーゼ（ＲｐｐＨ）（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０３５６）で処理し、ＲＮＡ精製カラムを用いて再度精製した。ＲｐｐＨで処理されたＲＮＡを、スプリントＤＮＡ（ＧＴＣＡＡＣＧＧＡＴＴＴＴＣＣＣＡＡＧＴＣＣＧＴＡＧＣＧＴＣＴＣ）及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ２（ニュー・イングランド・バイオラボ、Ｍ０２３９）を用いて環状化した。環状ＲＮＡを尿素−ＰＡＧＥで精製し、緩衝液（０．５Ｍの酢酸ナトリウム、０．１％のＳＤＳ、１ｍＭのＥＤＴＡ）で溶離させ、エタノールで沈殿させ、ＲＮａｓｅフリー水中で再懸濁させた。
【０５４７】
[0649]  マウスに、ガウシアルシフェラーゼＯＲＦ又は対照としての線状ＲＮＡと共に２．５μｇの環状ＲＮＡの単回の尾静脈注入投与を与え、これらの両方は、担体として脂質ベースのトランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ）中で製剤化された。
【０５４８】
[0650]  投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血液サンプル（５０μｌ）を各マウスの尾静脈からＥＤＴＡチューブ中に採取した。血漿を４℃において１３００ｇで２５分間にわたって遠心分離によって単離し、ガウシアルシフェラーゼ、分泌酵素の活性を、ガウシアルシフェラーゼ活性アッセイ（サーモサイエンティフィック  ピアース）を用いて試験した。５０μｌの１Ｘ  Ｇｌｕｃ基質を５μｌの血漿に加えて、Ｇｌｕｃルシフェラーゼ活性アッセイを行った。プレートを、発光測定装置（プロメガ）において混合した直後に読み取った。
【０５４９】
[0651]  ガウシアルシフェラーゼ活性は、環状ＲＮＡの投与の１、２、７、１１、１６及び２３日後の時点で血漿中において検出された（図５４Ａ〜Ｂ）。
[0652]  対照的に、ガウシアルシフェラーゼ活性は、修飾線状ＲＮＡの投与の１及び２日後の時点でのみ血漿中で検出された。線状ＲＮＡ由来タンパク質からの酵素活性は、６日又はそれを超える時点でバックグラウンドレベルを超えて検出されなかった（図５４Ａ〜Ｂ）。
【０５５０】
[0653]  １６日目に肝臓を３匹の動物から切除し、全ＲＮＡを、フェノール系抽出試薬（インビトロジェン）を用いて細胞から単離した。全ＲＮＡ（５００ｎｇ）を逆転写に供して、ｃＤＮＡを生成した。ｑＲＴ−ＰＣＲ分析を、色素ベースの定量的ＰＣＲミックス（バイオラッド）を用いて行った。
【０５５１】
[0654]  図５５に示されるように、線状ＲＮＡではなく環状ＲＮＡのｑＲＴ−ＰＣＲレベルは、１６日目に肝臓及び脾臓の両方において検出された。図５６に示されるように、線状ＲＮＡでトランスフェクトされた肝臓からの免疫関連遺伝子は、ＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＩＦＮ−Ｂ及びＯＡＳの増加した発現を示した一方、環状ＲＮＡでトランスフェクトされた肝臓は、１６日目に、担体でトランスフェクトされた動物と比較して、これらのマーカーＲＩＧ−Ｉ、ＭＤＡ５、ＰＫＲ及びＩＦＮ−βの増加した発現を示さなかった。したがって、レシピエント細胞内における免疫原性関連遺伝子の誘導は、トランスフェクトされた肝臓からの環状ＲＮＡ中に存在しなかった。
【０５５２】
[0655]  この実施例は、環状ＲＮＡが注入の複数日数後に血漿中のタンパク質活性のレベルを有して、長期間にわたってインビボでタンパク質を発現したことを実証する。マウス血漿中のガウシアルシフェラーゼの半減期が約２０分間である場合（Ｔａｎｎｏｕｓ，Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．，２００９，４（４）：５８２−５９１を参照されたい）、同様の活性レベルは、環状ＲＮＡからの連続した発現を示す。さらに、環状ＲＮＡは、免疫関連遺伝子を誘導せずに、その修飾線状ＲＮＡ同等物より長い発現プロファイルを示した。
【０５５３】
配列表
配列番号１（開始コドン）
ＡＵＧ
配列番号２（ＧＦＰ）
ＥＧＦＰ：
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag
配列番号３（スタガー要素）
Ｐ２Ａ：gctactaacttcagcctgctgaagcaggctggcgacgtggaggagaaccctggacct
Ｔ２Ａ：gagggcaggggaagtctactaacatgcggggacgtggaggaaaatcccggccca
Ｅ２Ａ：cagtgtactaattatgctctcttgaaattggctggagatgttgagagcaacccaggtccc
その他：Ｆ２Ａ、ＢｍＣＰＶ２Ａ、ＢｍＩＦＶ２Ａ
配列番号４  ＺＫＳＣＡＮイントロン
GTAAAAAGAGGTGAAACCTATTATGTGTGAGCAGGGCACAGACGTTGAAACTGGAGCCAGGAGAAGTATTGGCAGGCTTTAGGTTATTAGGTGGTTACTCTGTCTTAAAAATGTTCTGGCTTTCTTCCTGCATCCACTGGCATACTCATGGTCTGTTTTTAAATATTTTAATTCCCATTTACAAAGTGATTTACCCACAAGCCCAACCTGTCTGTCTTCAG
又は
GTAAGAAGCAAGGTTTCATTTAGGGGAAGGGAAATGATTCAGGACGAGAGTCTTTGTGCTGCTGAGTGCCTGTGATGAAGAAGCATGTTAGTcctgggcaacgtagcgagaccccatctctacaaaaaatagaaaaattagccaggtatagtggcgcacacctgtgattccagctacgcaggaggctgaggtgggaggattgcttgagcccaggaggttgaggctgcagtgagctgtaatcatgccactactccaacctgggcaacacagcaaggaccctgtctcaaaaGCTACTTACAGAAAAGAATTAggctcggcacggtagctcacacctgtaatcccagcactttgggaggctgaggcgggcagatcacttgaggtcaggagtttgagaccagcctggccaacatggtgaaaccttgtctctactaaaaatatgaaaattagccaggcatggtggcacattcctgtaatcccagctactcgggaggctgaggcaggagaatcacttgaacccaggaggtggaggttgcagtaagccgagatcgtaccactgtgctctagccttggtgacagagcgagactgtcttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaagaattaattaaaaatttaaaaaaaaatgaaaaaaaGCTGCATGCTTGTTTTTTGTTTTTAGTTATTCTACATTGTTGTCATTATTACCAAATATTGGGGAAAATACAACTTACAGACCAATCTCAGGAGTTAAATGTTACTACGAAGGCAAATGAACTATGCGTAATGAACCTGGTAGGCATTA
配列番号５（ＩＲＥＳ）
ＩＲＥＳ（ＥＭＣＶ）：
Acgttactggccgaagccgcttggaataaggccggtgtgcgtttgtctatatgttattttccaccatattgccgtcttttggcaatgtgagggcccggaaacctggccctgtcttcttgacgagcattcctaggggtctttcccctctcgccaaaggaatgcaaggtctgttgaatgtcgtgaaggaagcagttcctctggaagcttcttgaagacaaacaacgtctgtagcgaccctttgcaggcagcggaaccccccacctggcgacaggtgcctctgcggccaaaagccacgtgtataagatacacctgcaaaggcggcacaaccccagtgccacgttgtgagttggatagttgtggaaagagtcaaatggctctcctcaagcgtattcaacaaggggctgaaggatgcccagaaggtaccccattgtatgggatctgatctggggcctcggtgcacatgctttacatgtgtttagtcgaggttaaaaaacgtctaggccccccgaaccacggggacgtggttttcctttgaaaaacacgatgataata
配列番号６（ａｄｄｇｅｎｅ  ｐ３．１ラッカーゼ）
ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ラッカーゼ２  ＭＣＳエクソンベクター配列  ６９２６ｂｐ
GACGGATCGGGAGATCTCCCGATCCCCTATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATCTGCTCCCTGCTTGTGTGTTGGAGGTCGCTGAGTAGTGCGCGAGCAAAATTTAAGCTACAACAAGGCAAGGCTTGACCGACAATTGCATGAAGAATCTGCTTAGGGTTAGGCGTTTTGCGCTGCTTCGCGATGTACGGGCCAGATATACGCGTTGACATTGATTATTGACTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAAATGGCCCGCCTGGCTGACCGCCCAACGACCCCCGCCCATTGACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCAATGGGTGGAGTATTTACGGTAAACTGCCCACTTGGCAGTACATCAAGTGTATCATATGCCAAGTACGCCCCCTATTGACGTCAATGACGGTAAATGGCCCGCCTGGCATTATGCCCAGTACATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACATCTACGTATTAGTCATCGCTATTACCATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATGGGCGTGGATAGCGGTTTGACTCACGGGGATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATGGGAGTTTGTTTTGGCACCAAAATCAACGGGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTAGGCGTGTACGGTGGGAGGTCTATATAAGCAGAGCTCTCTGGCTAACTAGAGAACCCACTGCTTACTGGCTTATCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGCTAGCGTTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCACTAGTCCAGTGTGGTGGAATTCCATTGAGAAATGACTGAGTTCCGGTGCTCTCAAGTCATTGATCTTTGTCGACTTTTATTTGGTCTCTGTAATAACGACTTCAAAAACATTAAATTCTGTTGCGAAGCCAGTAAGCTACAAAAAGAAAaaacaagagagaatgctatagtcgtatagtatagtttcccgactatctgatacccattacttatctagggggaatgcgaacccaaaattttatcagttttctcggatatcgatagatattggggaataaatttaaataaataaattttgggcgggtttagggcgtggcaaaaagttttttggcaaatcgctagaaatttacaagacttataaaattatgaaaaaatacaacaaaattttaaacacgtgggcgtgacagttttggGcggttttagggcgttagagtaggcgaggacagggttacatcgactaggctttgatcctgatcaagaatatatatactttataccgcttccttctacatgttacctatttttcaacgaatctagtatacctttttactgtacgatttatgggtataaTAATAAGCTAAATCGAGACTAAGttttattgttatatatattttttttattttatGCAGAAATTAATTAAACCGGTCCTGCAGGTGATCAGGCGCGCCGGTTACCGGCCGGCCCCGCGGAGCGTAAGTATTCAAAATTCCAAAATTTTTTACTAGAAATATTCGATTTTTTAATAGGCAGTTTCTATACTATTGTATACTATTGtagattcgttgaaaagtatgtaacaggaagaataaagcatttccgaccatgtaaagtatatatattcttaataaggatcaatagccgagtcgatctcgccatgtccgtctgtcttattGttttattaccgccgagacatcaggaactataaaagctagaaggatgagttttagcatacagattctagagacaaggacgcagagcaagtttgttgatccatgctgccacgctttaactttctcaaattgcccaaaactgccatgcccacatttttgaactattttcgaaattttttcataattgtattactcgtgtaaatttccatcaatttgccaaaaaactttttgtcacgcgttaacgccctaaagccgccaatttggtcacgcccacactattgaGcaattatcaaattttttctcattttattccccaatatctatcgatatccccgattatgaaattattaaatttcgcgttcgcattcacactagctgagtaacgagtatctgatagttggggaaatcgactTATTTTTTATATACAATGAAAATGAATTTAATCATATGAATATCGATTATAGCTTTTTATTTAATATGAATATTTATTTGGGCTTAAGGTGTAACCTcctcgacataagactcacatggcgcaggcacattgaagacaaaaatactcaTTGTCGGGTCTCGCACCCTCCAGCAGCACCTAAAATTATGTCTTCAATTATTGCCAACATTGGAGACACAATTAGTCTGTGGCACCTCAGGCGGCCGCTCGAGTCTAGAGGGCCCGTTTAAACCCGCTGATCAGCCTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAGCCATCTGTTGTTTGCCCCTCCCCCGTGCCTTCCTTGACCCTGGAAGGTGCCACTCCCACTGTCCTTTCCTAATAAAATGAGGAAATTGCATCGCATTGTCTGAGTAGGTGTCATTCTATTCTGGGGGGTGGGGTGGGGCAGGACAGCAAGGGGGAGGATTGGGAAGACAATAGCAGGCATGCTGGGGATGCGGTGGGCTCTATGGCTTCTGAGGCGGAAAGAACCAGCTGGGGCTCTAGGGGGTATCCCCACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTAATTCTGTGGAATGTGTGTCAGTTAGGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCAGGTGTGGAAAGTCCCCAGGCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCTGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTCCCGGGAGCTTGTATATCCATTTTCGGATCTGATCAAGAGACAGGATGAGGATCGTTTCGCATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAGGTTCTCCGGCCGCTTGGGTGGAGAGGCTATTCGGCTATGACTGGGCACAACAGACAATCGGCTGCTCTGATGCCGCCGTGTTCCGGCTGTCAGCGCAGGGGCGCCCGGTTCTTTTTGTCAAGACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGGACGAGGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGCCACGACGGGCGTTCCTTGCGCAGCTGTGCTCGACGTTGTCACTGAAGCGGGAAGGGACTGGCTGCTATTGGGCGAAGTGCCGGGGCAGGATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCGAGAAAGTATCCATCATGGCTGATGCAATGCGGCGGCTGCATACGCTTGATCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGCGAAACATCGCATCGAGCGAGCACGTACTCGGATGGAAGCCGGTCTTGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTCGCGCCAGCCGAACTGTTCGCCAGGCTCAAGGCGCGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATGGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGCCGGCTGGGTGTGGCGGACCGCTATCAGGACATAGCGTTGGCTACCCGTGATATTGCTGAAGAGCTTGGCGGCGAATGGGCTGACCGCTTCCTCGTGCTTTACGGTATCGCCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTATCGCCTTCTTGACGAGTTCTTCTGAGCGGGACTCTGGGGTTCGAAATGACCGACCAAGCGACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGAAAGGTTGGGCTTCGGAATCGTTTTCCGGGACGCCGGCTGGATGATCCTCCAGCGCGGGGATCTCATGCTGGAGTTCTTCGCCCACCCCAACTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTATCATGTCTGTATACCGTCGACCTCTAGCTAGAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTC
配列番号８（ＲＦＰ）
ｍＣｈｅｒｒｙ：
atggtgagcaagggcgaggaggataacatggccatcatcaaggagttcatgcgcttcaaggtgcacatggagggctccgtgaacggccacgagttcgagatcgagggcgagggcgagggccgcccctacgagggcacccagaccgccaagctgaaggtgaccaagggtggccccctgcccttcgcctgggacatcctgtcccctcagttcatgtacggctccaaggcctacgtgaagcaccccgccgacatccccgactacttgaagctgtccttccccgagggcttcaagtgggagcgcgtgatgaacttcgaggacggcggcgtggtgaccgtgacccaggactcctccctgcaggacggcgagttcatctacaaggtgaagctgcgcggcaccaacttcccctccgacggccccgtaatgcagaagaagaccatgggctgggaggcctcctccgagcggatgtaccccgaggacggcgccctgaagggcgagatcaagcagaggctgaagctgaaggacggcggccactacgacgctgaggtcaagaccacctacaaggccaagaagcccgtgcagctgcccggcgcctacaacgtcaacatcaagttggacatcacctcccacaacgaggactacaccatcgtggaacagtacgaacgcgccgagggccgccactccaccggcggcatggacgagctgtacaag
配列番号９（リボスイッチ）
アプタザイム（テオフィリン依存性、Ａｕｓｌａｎｄｅｒ  ２０１０  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓを参照されたい）：
cugagaugcagguacauccagcugaugagucccaaauaggacgaaagccauaccagccgaaaggcccuuggcaggguuccuggauuccacugcuauccac
配列番号１０（ルシフェラーゼ）
ｎＬｕｃ：
ATGGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTAA
配列番号１１
コザック３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCCT
５〜１３：コザック配列
１４〜２６２：３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ
配列番号１２
コザック３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAACT
５〜１３：コザック配列
１４〜２６２：３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ
２６３〜２７１：三重終止コドン
配列番号１３
コザック３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  Ｐ２Ａ  ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
５〜１３：コザック配列
１４〜２６２：３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ
２６３〜３２８：Ｐ２Ａ
配列番号１４
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）についてのスプリント
GGTGGCTCCCAGGCGCAGTT
配列番号１５
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）についてのスプリント
GGTGGCTCCCAGTTACTATC
配列番号１６
構築物コザック３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  Ｐ２Ａ  ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）についてのスプリント
GGTGGCTCCCAGAGGTCCAG
配列番号１７
コザック１ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  Ｔ２Ａ  １ＸＦＬＡＧ−Ｎｌｕｃ  Ｐ２Ａ  ｎｏｓｔｏｐ（８７３ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
５〜１３：コザック配列
１４〜２０２：１ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ
２０３〜２６５：Ｔ２Ａ
２６６〜８０５：１ＸＦＬＡＧ−Ｎｌｕｃ
８０６〜８７１：Ｐ２Ａ
配列番号１８
コザック１ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  ｓｔｏｐ  １ＸＦＬＡＧ−Ｎｌｕｃ  ｓｔｏｐ（７６２ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGTGATAGTAACT
５〜１３：コザック配列
１４〜２０２：１ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ
２０３〜２１１：三重終止コドン
２１２〜７５１：１ＸＦＬＡＧ−Ｎｌｕｃ
７５２〜７６０：三重終止コドン
配列番号１９
コザック３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  Ｐ２Ａ  ｎｏｓｔｏｐ（３３０ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
５〜１３：コザック配列
１４〜２６２：３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ
２６３〜３２８：Ｐ２Ａ
配列番号２０
コザック３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  ｎｏｓｔｏｐ（２６４ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCCT
５〜１３：コザック配列
１４〜２６２：３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ
配列番号２１
コザック３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  ｓｔｏｐ（２７３ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCTGATAGTAACT
５〜１３：コザック配列
１４〜２６２：３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ
２６３〜２７１：三重終止コドン
配列番号２２
ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ  Ｔ２Ａ  ３ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  Ｐ２Ａ  ｎｏｓｔｏｐ（９５４ｂｐ）
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
５〜５７４：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ
５７５〜６３７：Ｔ２Ａ
６３８〜８８６：３ＸＦＡＬＧ−ＥＧＦ
８８７〜９５２：Ｐ２Ａ
配列番号２３
ＥＭＣＶ  Ｔ２Ａ  ３ＸＦＬＡＧ  Ｎｌｕｃ  Ｐ２Ａ  ｓｔｏｐ（１３１４ｎｔ）
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTGATAGTAACT
５〜５７４：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ
５７５〜６３７：Ｔ２Ａ
６３８〜１２３７：３ＸＦＬＡＧ  Ｎｌｕｃ
１２３８〜１３０３：Ｐ２Ａ
１３０４〜１３１２：三重終止コドン
配列番号２４
ＥＭＣＶ  Ｔ２Ａ  ３ＸＦＬＡＧ  Ｎｌｕｃ  Ｐ２Ａ  ｎｏｓｔｏｐ（１３０５ｎｔ）
GGGACCTAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTCT
５〜５７４：ＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ
５７５〜６３７：Ｔ２Ａ
６３８〜１２３７：３ＸＦＬＡＧ  Ｎｌｕｃ
１２３８〜１３０３：Ｐ２Ａ
配列番号２５
コザック１ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ  Ｔ２Ａ  １ＸＦＬＡＧ−ＮＬｕｃ  Ｐ２Ａ  ｓｔｏｐ（８８２ｂｐ）
GGGAGCCACCATGGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCAATAGTGACTCTGAGTGTCCCCTGTCCCACGACGGGTACTGCCTCCACGACGGTGTGTGCATGTATATTGAAGCATTGGACAAGTACGCCTGCAACTGTGTTGTTGGCTACATCGGGGAGCGCTGTCAGTACCGAGACCTGAAGTGGTGGGAACTGCGCGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTATAAGGACGACGACGACAAAATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTGATAGTAACT
５〜１３：コザック配列
１４〜２０２：１ＸＦＬＡＧ−ＥＧＦ
２６６〜８０５：１ＸＦＬＡＧ−ＮＬｕｃ
８０６〜８７１：Ｐ２Ａ
８７２〜８８０：三重終止コドン
配列番号２６
例示的な反復スペーサー配列
AAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATTATGCGTTACCGGCGAGACGCTACGGACTTGGGAAAATCCGTTGACCTTAAACGGTCGTGTGGGTTCAAGTCCCTCCACCCCCACGCCGGAAACGCAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACA
配列番号２７
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるフォワードプライマー
CGCGGATCCTAATACGACTCACTATAGGGAGACCCAAGCTGGC
配列番号２８
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから０．５ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACATCGTCGTGGTATTCACTCCAGAGCGATG
配列番号２９
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから１ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACACGGGGGAGGGGCAAACAACAGATGG
配列番号３０
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから２ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACGCTTTTTGCAAAAGCCTAGGCCTCCAAAAAAGCC
配列番号３１
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから４ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGC
配列番号３２
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから５ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGAC
配列番号３３
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから６．２ｋｂ鋳型を増幅するために実施例４３に使用されるリバースプライマー
AATAGCCGTTTTGTTTTTTGGATTACCAGTGTGCCATAGTGCAGGATCACATTTCGATAAGCCAGTAAGCAGTGGGTTCTCTAG
配列番号３４
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから線状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるフォワードｑＰＣＲプライマー
ATTCTTGCCCGCCTGATGAA
配列番号３５
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから線状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるリバースｑＰＣＲプライマー
TTGCTCATGGAAAACGGTGT
配列番号３６
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから環状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるフォワードｑＰＣＲプライマー
TGATCCTGCACTATGGCACA
配列番号３７
ｐＣＤＮＡ３．１／ＣＡＴから環状転写産物を検出するために実施例４３に使用されるリバースｑＰＣＲプライマー
CTGGACTAGTGGATCCGAGC
配列番号３８
ＡＣＴＩＮを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
GACGAGGCCCAGAGCAAGAGAGG
配列番号３９
ＡＣＴＩＮを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GGTGTTGAAGGTCTCAAACATG
配列番号４０
ＲＩＧ−Ｉを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
TGTGGGCAATGTCATCAAAA
配列番号４２
ＲＩＧ−Ｉを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GAAGCACTTGCTACCTCTTGC
配列番号４２
ＭＤＡ５を検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
GGCACCATGGGAAGTGATT
配列番号４３
ＭＤＡ５を検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
ATTTGGTAAGGCCTGAGCTG
配列番号４４
ＰＫＲを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
TCGCTGGTATCACTCGTCTG
配列番号４５
ＰＫＲを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GATTCTGAAGACCGCCAGAG
配列番号４６
ＩＦＮ−βを検出するために実施例４４に使用されるフォワードプライマー配列
CTCTCCTGTTGTGCTTCTCC
配列番号４７
ＩＦＮ−βを検出するために実施例４４に使用されるリバースプライマー配列
GTCAAAGTTCATCCTGTCCTTG
配列番号４８
ＥＭＣＶ  Ｔ２Ａ  ３ＸＦＬＡＧ−ＧＦＰ  Ｆ２Ａ  ３ＸＦＡＬＧ−Ｎｌｕｃ  Ｐ２Ａ  ＩＳ
GGGAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGTAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
配列番号４９
ＥＭＣＶ  Ｔ２Ａ  ３ＸＦＬＡＧ−ＧＦＰ  Ｆ２Ａ  ３ＸＦＡＬＧ−Ｎｌｕｃ  Ｐ２Ａ  ＩＳ
GGGAATAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTGTAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATGGGCTCCGGCGAGGGCAGGGGAAGTCTTCTAACATGCGGGGACGTGGAGGAAAATCCCGGCCCAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGGGAAGCGGAGTGAAACAGACTTTGAATTTTGACCTTCTCAAGTTGGCGGGAGACGTGGAGTCCAACCCTGGACCTTGATAGTAAGACTACAAGGACGACGACGACAAGATCATCGACTATAAAGACGACGACGATAAAGGTGGCGACTATAAGGACGACGACGACAAAGCCATTATCATCGTCTTCACACTCGAAGATTTCGTTGGGGACTGGCGACAGACAGCCGGCTACAACCTGGACCAAGTCCTTGAACAGGGAGGTGTGTCCAGTTTGTTTCAGAATCTCGGGGTGTCCGTAACTCCGATCCAAAGGATTGTCCTGAGCGGTGAAAATGGGCTGAAGATCGACATCCATGTCATCATCCCGTATGAAGGTCTGAGCGGCGACCAAATGGGCCAGATCGAAAAAATTTTTAAGGTGGTGTACCCTGTGGATGATCATCACTTTAAGGTGATCCTGCACTATGGCACACTGGTAATCGACGGGGTTACGCCGAACATGATCGACTATTTCGGACGGCCGTATGAAGGCATCGCCGTGTTCGACGGCAAAAAGATCACTGTAACAGGGACCCTGTGGAACGGCAACAAAATTATCGACGAGCGCCTGATCAACCCCGACGGCTCCCTGCTGTTCCGAGTAACCATCAACGGAGTGACCGGCTGGCGGCTGTGCGAACGCATTCTGGCGGGAAGCGGAGCTACTAACTTCAGCCTGCTGAAGCAGGCTGGAGACGTGGAGGAGAACCCTGGACCTTAAAAAAAACAAAAAACAAAACGGCTATT
配列番号５０
ＵＲＥ
UCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUU
配列番号５１
ＣＳＥ
AUUUUGUUUUUAACAUUUC
配列番号５２
ＵＲＥ／ＣＳＥ
UCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUC
配列番号５３
ＣＶＢ３−ＧＬｕｃ−ＳＴＯＰ−ＵＲＥ
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAUUAAAACAGCCUGUGGGUUGAUCCCACCCACAGGCCCAUUGGGCGCUAGCACUCUGGUAUCACGGUACCUUUGUGCGCCUGUUUUAUACCCCCUCCCCCAACUGUAACUUAGAAGUAACACACACCGAUCAACAGUCAGCGUGGCACACCAGCCACGUUUUGAUCAAGCACUUCUGUUACCCCGGACUGAGUAUCAAUAGACUGCUCACGCGGUUGAAGGAGAAAGCGUUCGUUAUCCGGCCAACUACUUCGAAAAACCUAGUAACACCGUGGAAGUUGCAGAGUGUUUCGCUCAGCACUACCCCAGUGUAGAUCAGGUCGAUGAGUCACCGCAUUCCCCACGGGCGACCGUGGCGGUGGCUGCGUUGGCGGCCUGCCCAUGGGGAAACCCAUGGGACGCUCUAAUACAGACAUGGUGCGAAGAGUCUAUUGAGCUAGUUGGUAGUCCUCCGGCCCCUGAAUGCGGCUAAUCCUAACUGCGGAGCACACACCCUCAAGCCAGAGGGCAGUGUGUCGUAACGGGCAACUCUGCAGCGGAACCGACUACUUUGGGUGUCCGUGUUUCAUUUUAUUCCUAUACUGGCUGCUUAUGGUGACAAUUGAGAGAUCGUUACCAUAUAGCUAUUGGAUUGGCCAUCCGGUGACUAAUAGAGCUAUUAUAUAUCCCUUUGUUGGGUUUAUACCACUUAGCUUGAAAGAGGUUAAAACAUUACAAUUCAUUGUUAAGUUGAAUACAGCAAAAUGGGAGUCAAAGUUCUGUUUGCCCUGAUCUGCAUCGCUGUGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACUUCAACAUCGUGGCCGUGGCCAGCAACUUCGCGACCACGGAUCUCGAUGCUGACCGCGGGAAGUUGCCCGGCAAGAAGCUGCCGCUGGAGGUGCUCAAAGAGAUGGAAGCCAAUGCCCGGAAAGCUGGCUGCACCAGGGGCUGUCUGAUCUGCCUGUCCCACAUCAAGUGCACGCCCAAGAUGAAGAAGUUCAUCCCAGGACGCUGCCACACCUACGAAGGCGACAAAGAGUCCGCACAGGGCGGCAUAGGCGAGGCGAUCGUCGACAUUCCUGAGAUUCCUGGGUUCAAGGACUUGGAGCCCAUGGAGCAGUUCAUCGCACAGGUCGAUCUGUGUGUGGACUGCACAACUGGCUGCCUCAAAGGGCUUGCCAACGUGCAGUGUUCUGACCUGCUCAAGAAGUGGCUGCCGCAACGCUGUGCGACCUUUGCCAGCAAGAUCCAGGGCCAGGUGGACAAGAUCAAGGGGGCCGGUGGUGACUAAUCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUCAAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGCGUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
配列番号５４
ＣＶＢ３−ＧＬｕｃ−ＳＴＯＰ−ＵＲＥ／ＣＳＥ
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACAUUAAAACAGCCUGUGGGUUGAUCCCACCCACAGGCCCAUUGGGCGCUAGCACUCUGGUAUCACGGUACCUUUGUGCGCCUGUUUUAUACCCCCUCCCCCAACUGUAACUUAGAAGUAACACACACCGAUCAACAGUCAGCGUGGCACACCAGCCACGUUUUGAUCAAGCACUUCUGUUACCCCGGACUGAGUAUCAAUAGACUGCUCACGCGGUUGAAGGAGAAAGCGUUCGUUAUCCGGCCAACUACUUCGAAAAACCUAGUAACACCGUGGAAGUUGCAGAGUGUUUCGCUCAGCACUACCCCAGUGUAGAUCAGGUCGAUGAGUCACCGCAUUCCCCACGGGCGACCGUGGCGGUGGCUGCGUUGGCGGCCUGCCCAUGGGGAAACCCAUGGGACGCUCUAAUACAGACAUGGUGCGAAGAGUCUAUUGAGCUAGUUGGUAGUCCUCCGGCCCCUGAAUGCGGCUAAUCCUAACUGCGGAGCACACACCCUCAAGCCAGAGGGCAGUGUGUCGUAACGGGCAACUCUGCAGCGGAACCGACUACUUUGGGUGUCCGUGUUUCAUUUUAUUCCUAUACUGGCUGCUUAUGGUGACAAUUGAGAGAUCGUUACCAUAUAGCUAUUGGAUUGGCCAUCCGGUGACUAAUAGAGCUAUUAUAUAUCCCUUUGUUGGGUUUAUACCACUUAGCUUGAAAGAGGUUAAAACAUUACAAUUCAUUGUUAAGUUGAAUACAGCAAAAUGGGAGUCAAAGUUCUGUUUGCCCUGAUCUGCAUCGCUGUGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACUUCAACAUCGUGGCCGUGGCCAGCAACUUCGCGACCACGGAUCUCGAUGCUGACCGCGGGAAGUUGCCCGGCAAGAAGCUGCCGCUGGAGGUGCUCAAAGAGAUGGAAGCCAAUGCCCGGAAAGCUGGCUGCACCAGGGGCUGUCUGAUCUGCCUGUCCCACAUCAAGUGCACGCCCAAGAUGAAGAAGUUCAUCCCAGGACGCUGCCACACCUACGAAGGCGACAAAGAGUCCGCACAGGGCGGCAUAGGCGAGGCGAUCGUCGACAUUCCUGAGAUUCCUGGGUUCAAGGACUUGGAGCCCAUGGAGCAGUUCAUCGCACAGGUCGAUCUGUGUGUGGACUGCACAACUGGCUGCCUCAAAGGGCUUGCCAACGUGCAGUGUUCUGACCUGCUCAAGAAGUGGCUGCCGCAACGCUGUGCGACCUUUGCCAGCAAGAUCCAGGGCCAGGUGGACAAGAUCAAGGGGGCCGGUGGUGACUAAUCAUAAUCAAUUUAUUAUUUUCUUUUAUUUUAUUCACAUAAUUUUGUUUUUAUUUUGUUUUUAACAUUUCAAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGCGUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
配列番号５５
実施例４２に使用される相補的プライマー
CACCGCTCAGGACAATCCTT
配列番号５６
ＣＶＢ３  ＩＲＥＳ
TTAAAACAGCCTGTGGGTTGATCCCACCCACAGGCCCATTGGGCGCTAGCACTCTGGTATCACGGTACCTTTGTGCGCCTGTTTTATACCCCCTCCCCCAACTGTAACTTAGAAGTAACACACACCGATCAACAGTCAGCGTGGCACACCAGCCACGTTTTGATCAAGCACTTCTGTTACCCCGGACTGAGTATCAATAGACTGCTCACGCGGTTGAAGGAGAAAGCGTTCGTTATCCGGCCAACTACTTCGAAAAACCTAGTAACACCGTGGAAGTTGCAGAGTGTTTCGCTCAGCACTACCCCAGTGTAGATCAGGTCGATGAGTCACCGCATTCCCCACGGGCGACCGTGGCGGTGGCTGCGTTGGCGGCCTGCCCATGGGGAAACCCATGGGACGCTCTAATACAGACATGGTGCGAAGAGTCTATTGAGCTAGTTGGTAGTCCTCCGGCCCCTGAATGCGGCTAATCCTAACTGCGGAGCACACACCCTCAAGCCAGAGGGCAGTGTGTCGTAACGGGCAACTCTGCAGCGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGTGTTTCATTTTATTCCTATACTGGCTGCTTATGGTGACAATTGAGAGATCGTTACCATATAGCTATTGGATTGGCCATCCGGTGACTAATAGAGCTATTATATATCCCTTTGTTGGGTTTATACCACTTAGCTTGAAAGAGGTTAAAACATTACAATTCATTGTTAAGTTGAATACAGCAAA
配列番号５７
Ｇｌｕｃ
ATGGGAGTCAAAGTTCTGTTTGCCCTGATCTGCATCGCTGTGGCCGAGGCCAAGCCCACCGAGAACAACGAAGACTTCAACATCGTGGCCGTGGCCAGCAACTTCGCGACCACGGATCTCGATGCTGACCGCGGGAAGTTGCCCGGCAAGAAGCTGCCGCTGGAGGTGCTCAAAGAGATGGAAGCCAATGCCCGGAAAGCTGGCTGCACCAGGGGCTGTCTGATCTGCCTGTCCCACATCAAGTGCACGCCCAAGATGAAGAAGTTCATCCCAGGACGCTGCCACACCTACGAAGGCGACAAAGAGTCCGCACAGGGCGGCATAGGCGAGGCGATCGTCGACATTCCTGAGATTCCTGGGTTCAAGGACTTGGAGCCCATGGAGCAGTTCATCGCACAGGTCGATCTGTGTGTGGACTGCACAACTGGCTGCCTCAAAGGGCTTGCCAACGTGCAGTGTTCTGACCTGCTCAAGAAGTGGCTGCCGCAACGCTGTGCGACCTTTGCCAGCAAGATCCAGGGCCAGGTGGACAAGATCAAGGGGGCCGGTGGTGACTAA
配列番号５８
終止突然変異を有するＥＭＣＶ  ＩＲＥＳ
ACGTTACTGGCCGAAGCCGCTTGGAACAAGGCCGGTGTGCGTTTGTCTATATGTTATTTTCCACCATATTGCCGTCTTTTGGCAATGTGAGGGCCCGGAAACCTGGCCCTGTCTTCTTGACGAGCATTCCTAGGGGTCTTTCCCCTCTCGCCAAAGGAATGCAAGGTCTGTTGAATGTCGTGAAGGAAGCAGTTCCTCTGGAAGCTTCTTCAAGACAAACAACGTCTGTAGCGACCCTTTGCAGGCAGCGGAACCCCCCACCTGGCGACAGGTGCCTCTGCGGCCAAAAGCCACGTGTATACGATACACCTGCAAAGGCGGCACAACCCCAGTGCCACGTTGTGAGTTGGATAGTTGTGGAAAGAGTCAAATGGCTCTCCTCAAGCGTATTCAACAAGGGGCTGAAGGATGCCCAGAAGGTACCCCATTGTATGGGATCTGATCTGGGGCCTCGGTGCACATGCTTTACATGTGTTCAGTCGAGGTTAAAAAACGTCCAGGCCCCCCGAACCACGGGGACGTGGTTTTCCTTTGAAAAACACGATGATAATATGGCCACAACCATG
配列番号５９
スペーサー１
AAAAUCCGUUGACCUUAAACGGUCGUGUGGGUUCAAGUCCCUCCACCCCCACGCCGGAAACGCAAUAGCCGAAAAACAAAAAACAAAAAAAACAAAAAAAAAACCAAAAAAACAAAACACA
スペーサー２
AAAAAACAAAAAACAAAACGGCUAUUAUGCGUUACCGGCGAGACGCUACGGACUU
配列番号６０
ATACCAGCCGAAAGGCCCTTGGCAGAGAGGTCTGAAAAGACCTCTGCTGACTATGTGATCTTATTAAAATTAGGTTAAATTTCGAGGTTAAAAATAGTTTTAATATTGCTATAGTCTTAGAGGTCTTGTATATTTATACTTACCACACAAGATGGACCGGAGCAGCCCTCCAATATCTAGTGTACCCTCGTGCTCGCTCAAACATTAAGTGGTGTTGTGCGAAAAGAATCTCACTTCAAGAAAAAGAAACTAGT
【０５５４】
実施形態の段落
[1]対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；
細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、環状ポリリボヌクレオチドは、後の時点での細胞内における１つ以上の発現配列の発現が前の時点と等しいか又はそれより多いように構成される、方法。
【０５５５】
[2]対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；
細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４又は１６日間の期間にわたる細胞内における１つ以上の発現配列の発現が約４０％を超えて低下しないように構成される、方法。
【０５５６】
[3]対象における１つ以上の発現配列のインビボ発現の方法であって、
１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドを対象の細胞に投与する工程と；
細胞内の環状ポリリボヌクレオチドから１つ以上の発現配列を発現する工程と
を含み、環状ポリリボヌクレオチドは、細胞内における１つ以上の発現配列の発現が、少なくとも７、８、９、１０、１２、１４又は１６日間にわたって約４０％を超えて変化しないレベルに維持されるように構成される、方法。
【０５５７】
[4]１つ以上の発現配列の発現産物は、治療用タンパク質を含む、段落[1]〜[3]のいずれか１つに記載の方法。
[5]治療用タンパク質は、酸化防止活性、結合、積み荷受容体活性、触媒活性、分子担体活性、分子機能調節剤、分子トランスデューサ活性、栄養貯留活性、タンパク質タグ、構造分子活性、毒素活性、転写調節活性、翻訳調節活性又は輸送活性を有する、段落[4]に記載の方法。
【０５５８】
[6]１つ以上の発現配列の発現産物は、分泌タンパク質を含む、段落[1]〜[5]のいずれか１つに記載の方法。
[7]分泌タンパク質は、分泌酵素を含む、段落[6]に記載の方法。
【０５５９】
[8]分泌タンパク質は、分泌抗体を含む、段落[6]に記載の方法。
[9]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約２０ヌクレオチド、少なくとも約３０ヌクレオチド、少なくとも約４０ヌクレオチド、少なくとも約５０ヌクレオチド、少なくとも約７５ヌクレオチド、少なくとも約１００ヌクレオチド、少なくとも約２００ヌクレオチド、少なくとも約３００ヌクレオチド、少なくとも約４００ヌクレオチド、少なくとも約５００ヌクレオチド、少なくとも約１，０００ヌクレオチド、少なくとも約２，０００ヌクレオチド、少なくとも約５，０００ヌクレオチド、少なくとも約６，０００ヌクレオチド、少なくとも約７，０００ヌクレオチド、少なくとも約８，０００ヌクレオチド、少なくとも約９，０００ヌクレオチド、少なくとも約１０，０００ヌクレオチド、少なくとも約１２，０００ヌクレオチド、少なくとも約１４，０００ヌクレオチド、少なくとも約１５，０００ヌクレオチド、少なくとも約１６，０００ヌクレオチド、少なくとも約１７，０００ヌクレオチド、少なくとも約１８，０００ヌクレオチド、少なくとも約１９，０００ヌクレオチド又は少なくとも約２０，０００ヌクレオチドである、段落[1]〜[8]のいずれか１つに記載の方法。
【０５６０】
[10]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間、２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたって細胞内で持続性を有する、段落[1]〜[9]のいずれか１つに記載の方法。
【０５６１】
[11]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間、２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたり、細胞が分裂しているときに細胞内で持続性を有する、段落[1]〜[10]のいずれか１つに記載の方法。
【０５６２】
[12]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも約１時間、２時間、６時間、１２時間、１８時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、１４日間、１５日間、１６日間、１７日間、１８日間、１９日間、２０日間、２１日間、２２日間、２３日間、２４日間、２５日間、２６日間、２７日間、２８日間、２９日間、３０日間、６０日間若しくはそれを超える時間又はそれらの間の任意の時間にわたって分割後の細胞内で持続性を有する、段落[1]〜[11]のいずれか１つに記載の方法。
【０５６３】
[13]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つのスペーサー配列を含む、段落[1]〜[12]のいずれか１つに記載の方法。
[14]スペーサー配列は、スペーサー配列の両側の環状ポリリボヌクレオチドの要素間の立体配座柔軟性を与えるように構成される、段落[13]に記載の方法。
【０５６４】
[15]環状ポリリボヌクレオチド、例えば発現配列のスペーサー配列対非スペーサー配列の比率は、約０．０５：１、約０．０６：１、約０．０７：１、約０．０８：１、約０．０９：１、約０．１：１、約０．１２：１、約０．１２５：１、約０．１５：１、約０．１７５：１、約０．２：１、約０．２２５：１、約０．２５：１、約０．３：１、約０．３５：１、約０．４：１、約０．４５：１、約０．５：１、約０．５５：１、約０．６：１、約０．６５：１、約０．７：１、約０．７５：１、約０．８：１、約０．８５：１、約０．９：１、約０．９５：１、約０．９８：１、約１：１、約１．０２：１、約１．０５：１、約１．１：１、約１．１５：１、約１．２：１、約１．２５：１、約１．３：１、約１．３５：１、約１．４：１、約１．４５：１、約１．５：１、約１．５５：１、約１．６：１、約１．６５：１、約１．７：１、約１．７５：１、約１．８：１、約１．８５：１、約１．９：１、約１．９５：１、約１．９７５：１、約１．９８：１又は約２：１である、段落[13]又は[14]に記載の方法。
【０５６５】
[16]スペーサー配列は、少なくとも３リボヌクレオチド、少なくとも４リボヌクレオチド、少なくとも５リボヌクレオチド、少なくとも約８リボヌクレオチド、少なくとも約１０リボヌクレオチド、少なくとも約１２リボヌクレオチド、少なくとも約１５リボヌクレオチド、少なくとも約２０リボヌクレオチド、少なくとも約２５リボヌクレオチド、少なくとも約３０リボヌクレオチド、少なくとも約４０リボヌクレオチド、少なくとも約５０リボヌクレオチド、少なくとも約６０リボヌクレオチド、少なくとも約７０リボヌクレオチド、少なくとも約８０リボヌクレオチド、少なくとも約９０リボヌクレオチド、少なくとも約１００リボヌクレオチド、少なくとも約１２０リボヌクレオチド、少なくとも約１５０リボヌクレオチド、少なくとも約２００リボヌクレオチド、少なくとも約２５０リボヌクレオチド、少なくとも約３００リボヌクレオチド、少なくとも約４００リボヌクレオチド、少なくとも約５００リボヌクレオチド、少なくとも約６００リボヌクレオチド、少なくとも約７００リボヌクレオチド、少なくとも約８００リボヌクレオチド、少なくとも約９００リボヌクレオチド又は少なくとも約１００リボヌクレオチドを含む、段落[13]〜[15]のいずれか１つに記載の方法。
【０５６６】
[17]スペーサー配列は、少なくとも９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％、５５％、５０％、５５％、５０％、４５％、４０％、３５％、３０％、２０％又はそれらの間の任意のパーセンテージのアデニンリボヌクレオチドを含む、段落[13]〜[16]のいずれか１つに記載の方法。
【０５６７】
[18]環状ポリリボヌクレオチドは、ローリング翻訳の能力がある、段落[1]〜[17]のいずれか１つに記載の方法。
[19]１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられ、１つ以上の発現配列のローリングサークル型翻訳は、少なくとも２つのポリペプチド分子を生成する、段落[18]に記載の方法。
【０５６８】
[20]スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する、段落[19]に記載の方法。
【０５６９】
[21]スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である、段落[19]又は[20]に記載の方法。
[22]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む、段落[19]又は[20]に記載の方法。
【０５７０】
[23]環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、別個のポリペプチドのそれぞれは、１つ以上の発現配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される、段落[18]〜[22]のいずれか１つに記載の方法。
【０５７１】
[24]環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率は、インビトロ翻訳系において試験される、段落[23]に記載の方法。
【０５７２】
[25]インビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む、段落[24]に記載の方法。
[26]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にあり、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、段落[19]〜[25]のいずれか１つに記載の方法。
【０５７３】
[27]スタガー要素は、２Ａ配列及び２Ａ様配列からなる群から選択されるペプチド配列をコードする、段落[19]〜[26]のいずれか１つに記載の方法。
[28]スタガー要素は、ＧＰであるＣ末端配列を有する配列をコードする、段落[19]〜[27]のいずれか１つに記載の方法。
【０５７４】
[29]スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、段落[19]〜[28]のいずれか１つに記載の方法。
【０５７５】
[30]スタガー要素は、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳＥＦＮＰＧＰからなる群から選択される配列をコードする、段落[19]〜[29]のいずれか１つに記載の方法。
【０５７６】
[31]スタガー要素は、１つ以上の発現配列のそれぞれの３’末端にある、段落[19]〜[30]のいずれか１つに記載の方法。
[32]環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあり、スタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び後続の発現配列の連続した翻訳を可能にする、段落[19]〜[31]のいずれか１つに記載の方法。
【０５７７】
[33]環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、連続して翻訳された環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあり、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されておらず、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２のスタガー要素は、第２の翻訳開始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍大きい距離にある、段落[19]〜[32]のいずれか１つに記載の方法。
【０５７８】
[34]スタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える、段落[19]〜[33]のいずれか１つに記載の方法。
【０５７９】
[35]第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、スタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超えて大きい、段落[19]〜[34]のいずれか１つに記載の方法。
【０５８０】
[36]環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列に続く発現配列は、第１の発現配列以外の発現配列である、段落[19]〜[35]のいずれか１つに記載の方法。
[37]環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列の後続の発現配列は、第１の発現配列である、段落[19]〜[35]のいずれか１つに記載の方法。
【０５８１】
[38]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；及び
ｆ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素を含む、段落[1]〜[37]のいずれか１つに記載の方法。
【０５８２】
[39]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、段落[1]〜[38]のいずれか１つに記載の方法。
【０５８３】
[40]環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍高い翻訳効率を有する、段落[1]〜[39]のいずれか１つに記載の方法。
【０５８４】
[41]環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５倍高い翻訳効率を有する、段落[1]〜[40]のいずれか１つに記載の方法。
[42]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’−ＵＴＲ；
ｂ）３’−ＵＴＲ；
ｃ）ポリ−Ａ配列；
ｄ）５’−キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[1]〜[41]のいずれか１つに記載の方法。
【０５８５】
[43]環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を含む、[1]〜[42]のいずれか１つに記載の方法。
[44]環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている、[1]〜[42]のいずれか１つに記載の方法。
【０５８６】
[45]１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む、[1]〜[43]のいずれか１つに記載の方法。
[46]疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントと共に少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む、[38]〜[45]のいずれか１つに記載の方法。
【０５８７】
[47]疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び第２の配列を含む、段落[38]又は[46]に記載の方法。
[48]エンクリプトゲンは、スプライシング要素を含む、段落[38]〜[47]のいずれか１つに記載の方法。
【０５８８】
[49]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドを含む、段落[38]〜[48]のいずれか１つに記載の方法。
[50]環状ポリリボヌクレオチドは、その全長の一部に修飾リボヌクレオチドを含む、段落[38]〜[49]のいずれか１つに記載の方法。
【０５８９】
[51]エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチド、例えばプソイドウリジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む、段落[38]〜[50]のいずれか１つに記載の方法。
【０５９０】
[52]エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えばリボヌクレオチド結合タンパク質を含む、段落[38]〜[51]のいずれか１つに記載の方法。
[53]エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免疫タンパク質結合部位を含む、段落[38]〜[52]のいずれか１つに記載の方法。
【０５９１】
[54]環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ−２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、ＩＦＮ−βの少なくとも１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価される際、エンクリプトゲンを欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する、段落[38]〜[53]のいずれか１つに記載の方法。
【０５９２】
[55]環状ポリリボヌクレオチドは、リボスイッチをさらに含む、段落[38]〜[54]のいずれか１つに記載の方法。
[56]環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む、段落[38]〜[55]のいずれか１つに記載の方法。
【０５９３】
[57]環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳開始配列、例えばＧＵＧ、ＣＵＧ開始コドン、例えばストレス条件下での発現を含む、段落[38]〜[56]のいずれか１つに記載の方法。
[58]環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素、例えば２Ａを含む、段落[38]〜[57]のいずれか１つに記載の方法。
【０５９４】
[59]環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノンコーディングＲＮＡを含む、段落[38]〜[58]のいずれか１つに記載の方法。
[60]環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基〜約２０ｋｂの範囲のサイズを有する、段落[38]〜[59]のいずれか１つに記載の方法。
【０５９５】
[61]環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリヌクレオチドの環状化によって合成される、段落[38]〜[60]のいずれか１つに記載の方法。
[62]環状ポリリボヌクレオチドは、同じであるか又は異なる複数の発現配列を含む、段落[38]〜[61]のいずれか１つに記載の方法。
【０５９６】
[63]環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に抵抗性である、段落[38]〜[62]のいずれか１つに記載の方法。
[64]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’−ＵＴＲ；
ｂ）３’−ＵＴＲ；
ｃ）ポリ−Ａ配列；
ｄ）５’−キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[38]〜[63]のいずれか１つに記載の方法。
【０５９７】
[65]
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；
ｆ）疑似二本鎖二次構造；及び
ｇ）発現配列；
から選択される少なくとも１つの構造要素と、
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性と
を含む環状ポリリボヌクレオチドを含む医薬組成物。
【０５９８】
[66]環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳能を有する、段落[65]に記載の組成物。
[67]疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントと共に少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む、段落[65]又は[66]に記載の組成物。
【０５９９】
[68]疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び第２の配列を含む、段落[65]〜[67]のいずれか１つに記載の組成物。
[69]エンクリプトゲンは、スプライシング要素を含む、段落[65]〜[68]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６００】
[70]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドを含む、段落[65]〜[69]のいずれか１つに記載の組成物。
[71]エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチド、例えばプソイドウリジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む、段落[65]〜[70]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６０１】
[72]エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えばリボヌクレオチド結合タンパク質を含む、段落[65]〜[71]のいずれか１つに記載の組成物。
[73]エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免疫タンパク質結合部位を含む、段落[65]〜[72]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６０２】
[74]環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ−２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、ＩＦＮ−βの少なくとも１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価される際、エンクリプトゲンを欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する、段落[65]〜[73]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６０３】
[75]環状ポリリボヌクレオチドは、リボスイッチをさらに含む、段落[65]〜[74]のいずれか１つに記載の組成物。
[76]環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む、段落[65]〜[75]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６０４】
[77]環状ポリリボヌクレオチドは、翻訳開始配列、例えばＧＵＧ、ＣＵＧ開始コドン、例えばストレス条件下での発現を含む、段落[65]〜[76]のいずれか１つに記載の組成物。
[78]環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ポリペプチドをコードする少なくとも１つの発現配列を含む、段落[65]〜[77]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６０５】
[79]発現配列は、ペプチド又はポリヌクレオチドをコードする、段落[78]に記載の組成物。
[80]環状ポリリボヌクレオチドは、スタガー要素、例えば２Ａを含む、段落[65]〜[79]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６０６】
[81]環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノンコーディングＲＮＡを含む、段落[65]〜[80]のいずれか１つに記載の組成物。
[82]環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基〜約２０ｋｂの範囲のサイズを有する、段落[65]〜[81]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６０７】
[83]環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリヌクレオチドの環状化によって合成される、段落[65]〜[82]のいずれか１つに記載の組成物。
[84]環状ポリリボヌクレオチドは、同じであるか又は異なる複数の発現配列を含む、段落[65]〜[83]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６０８】
[85]環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に抵抗性である、段落[65]〜[84]のいずれか１つに記載の組成物。
[86]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’−ＵＴＲ；
ｂ）３’−ＵＴＲ；
ｃ）ポリ−Ａ配列；
ｄ）５’−キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[65]〜[85]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６０９】
[87]段落[65]〜[86]のいずれか１つに記載の組成物を製造する方法であって、環状ポリリボヌクレオチドを薬学的に許容される担体又は賦形剤と組み合わせる工程を含む方法。
[88]治療の方法であって、段落[65]〜[86]のいずれか１つに記載の組成物を投与する工程を含む方法。
【０６１０】
[89]タンパク質発現の方法であって、段落[65]〜[86]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳する工程を含む方法。
[90]環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビトロで行われる、段落[89]に記載の方法。
【０６１１】
[91]環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビボで行われる、段落[89]に記載の方法。
[92]段落[65]〜[86]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド。
【０６１２】
[93]薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、環状ポリリボヌクレオチドは、ローリングサークル型翻訳の能力がある、医薬組成物。
【０６１３】
[94]１つ以上の発現配列のそれぞれは、環状ポリリボヌクレオチドにおけるスタガー要素によって後続の発現配列から隔てられ、１つ以上の発現配列のローリングサークル型翻訳は、少なくとも２つのポリペプチド分子を生成する、段落[93]に記載の組成物。
【０６１４】
[95]スタガー要素は、（ａ）単一の発現配列の２回の翻訳から、又は（ｂ）２つ以上の発現配列の１回以上の翻訳からの単一のポリペプチドの生成を防止する、段落[94]に記載の組成物。
【０６１５】
[96]スタガー要素は、１つ以上の発現配列から切り離された配列である、段落[94]又は[95]に記載の組成物。
[97]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の発現配列の一部を含む、段落[94]又は[95]に記載の組成物。
【０６１６】
[98]薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列を含み、且つローリングサークル型翻訳の能力がある環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、別個のポリペプチドのそれぞれは、１つ以上の発現配列の１回の翻訳又は１回未満の翻訳から生成される、医薬組成物。
【０６１７】
[99]環状ポリリボヌクレオチドは、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中に生成される全ポリペプチド（モル／モル）の少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は１００％が別個のポリペプチドであるように構成され、全ポリペプチドにわたる別個の産物の量比率は、インビトロ翻訳系において試験される、段落[98]に記載の組成物。
【０６１８】
[100]インビトロ翻訳系は、ウサギ網状赤血球溶解物を含む、段落[99]に記載の組成物。
[101]スタガー要素は、１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端にあり、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、段落[93]〜[100]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６１９】
[102]薬学的に許容される担体又は賦形剤と、１つ以上の発現配列及び１つ以上の発現配列の少なくとも１つの３’末端におけるスタガー要素を含む環状ポリリボヌクレオチドとを含む医薬組成物であって、スタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチドのローリングサークル型翻訳中にリボソームを停滞させるように構成される、医薬組成物。
【０６２０】
[103]スタガー要素は、２Ａ配列及び２Ａ様配列からなる群から選択されるペプチド配列をコードする、段落[101]又は[102]に記載の組成物。
[104]スタガー要素は、ＧＰであるＣ末端配列を有する配列をコードする、段落[101]〜[103]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６２１】
[105]スタガー要素は、Ｄ（Ｖ／Ｉ）ＥｘＮＰＧＰ（ここで、ｘ＝任意のアミノ酸である）であるＣ末端コンセンサス配列を有する配列をコードする、段落[101]〜[104]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６２２】
[106]スタガー要素は、ＧＤＶＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＥＮＰＧＰ、ＶＥＰＮＰＧＰ、ＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＬＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＥＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＱＮＰＧＰ、ＩＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＬＮＰＧＰ、ＨＤＩＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＨＤＶＥＭＮＰＧＰ、ＧＤＭＥＳＮＰＧＰ、ＧＤＶＥＴＮＰＧＰ、ＧＤＩＥＱＮＰＧＰ及びＤＳＥＦＮＰＧＰからなる群から選択される配列をコードする、段落[101]〜[105]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６２３】
[107]スタガー要素は、１つ以上の発現配列のそれぞれの３’末端にある、段落[101]〜[106]のいずれか１つに記載の組成物。
[108]環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあり、スタガー要素と第１の翻訳開始配列との間の距離は、第１の発現配列及び後続の発現配列の連続した翻訳を可能にする、段落[93]〜[107]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６２４】
[109]環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現配列のスタガー要素は、連続して翻訳された環状ポリリボヌクレオチド中の第１の発現に続く発現配列の第１の翻訳開始配列の上流（５’末端側）にあり、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２の発現配列の第２の翻訳開始配列の上流にある第２のスタガー要素を含む対応する環状ポリリボヌクレオチドは、連続して翻訳されておらず、対応する環状ポリリボヌクレオチド中の第２のスタガー要素は、第２の翻訳開始配列から、環状ポリリボヌクレオチド中のスタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より例えば少なくとも２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍大きい距離にある、段落[93]〜[107]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６２５】
[110]スタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離は、少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超える、段落[108]又は[109]に記載の組成物。
【０６２６】
[111]第２のスタガー要素と第２の翻訳開始との間の距離は、スタガー要素と第１の翻訳開始との間の距離より少なくとも２ｎｔ、３ｎｔ、４ｎｔ、５ｎｔ、６ｎｔ、７ｎｔ、８ｎｔ、９ｎｔ、１０ｎｔ、１１ｎｔ、１２ｎｔ、１３ｎｔ、１４ｎｔ、１５ｎｔ、１６ｎｔ、１７ｎｔ、１８ｎｔ、１９ｎｔ、２０ｎｔ、２５ｎｔ、３０ｎｔ、３５ｎｔ、４０ｎｔ、４５ｎｔ、５０ｎｔ、５５ｎｔ、６０ｎｔ、６５ｎｔ、７０ｎｔ、７５ｎｔ又はそれを超えて大きい、段落[108]又は[109]に記載の組成物。
【０６２７】
[112]環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列に続く発現配列は、第１の発現配列以外の発現配列である、段落[108]〜[110]のいずれか１つに記載の組成物。
[113]環状ポリリボヌクレオチドにおける第１の発現配列の後続の発現配列は、第１の発現配列である、段落[108]〜[110]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６２８】
[114]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）エンクリプトゲン；
ｂ）スタガー要素；
ｃ）調節要素；
ｄ）複製要素；及び
ｆ）疑似二本鎖二次構造
から選択される少なくとも１つの構造要素を含む、段落[93]〜[113]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６２９】
[115]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）線状同等物より高い翻訳効率；
ｂ）複数の翻訳産物の化学量論的翻訳効率；
ｃ）エンクリプトゲンを欠いた同等物より低い免疫原性；
ｄ）線状同等物より増加した半減期；及び
ｅ）細胞分裂中の持続性
から選択される少なくとも１つの機能特性を含む、段落[93]〜[114]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６３０】
[116]環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも１００％、少なくとも１５０％、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも５０倍又は少なくとも１００倍高い翻訳効率を有する、段落[93]〜[115]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６３１】
[117]環状ポリリボヌクレオチドは、線状同等物より少なくとも５倍高い翻訳効率を有する、段落[93]〜[115]のいずれか１つに記載の組成物。
[118]環状ポリリボヌクレオチドは、
ａ）５’−ＵＴＲ；
ｂ）３’−ＵＴＲ；
ｃ）ポリ−Ａ配列；
ｄ）５’−キャップ；
ｅ）終止要素；
ｆ）内部リボソーム進入部位；
ｇ）エキソヌクレアーゼによる分解感受性；及び
ｈ）キャップ結合タンパク質への結合
の少なくとも１つを欠いている、段落[93]〜[117]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６３２】
[119]環状ポリリボヌクレオチドは、内部リボソーム進入部位を欠いている、段落[93]〜[118]のいずれか１つに記載の組成物。
[120]１つ以上の発現配列は、コザック開始配列を含む、段落[93]〜[119]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６３３】
[121]疑似らせん構造は、少なくとも１つの非二本鎖セグメントと共に少なくとも１つの二本鎖ＲＮＡセグメントを含む、段落[114]〜[120]のいずれか１つに記載の組成物。
[122]疑似らせん構造は、反復配列、例えばＡリッチ配列で連結される第１の配列及び第２の配列を含む、段落[121]に記載の組成物。
【０６３４】
[123]エンクリプトゲンは、スプライシング要素を含む、段落[114]〜[122]のいずれか１つに記載の組成物。
[124]環状ポリリボヌクレオチドは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチドを含む、段落[93]〜[123]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６３５】
[125]エンクリプトゲンは、少なくとも１つの修飾リボヌクレオチド、例えばプソイドウリジン、Ｎ（６）メチルアデノシン（ｍ６Ａ）を含む、段落[93]〜[124]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６３６】
[126]エンクリプトゲンは、タンパク質結合部位、例えばリボヌクレオチド結合タンパク質を含む、段落[93]〜[125]のいずれか１つに記載の組成物。
[127]エンクリプトゲンは、例えば、免疫応答、例えばＣＴＬ応答を回避するために免疫タンパク質結合部位を含む、段落[93]〜[126]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６３７】
[128]環状ポリリボヌクレオチドは、例えば、ＲＩＧ−Ｉ、ＴＬＲ−３、ＴＬＲ−７、ＴＬＲ−８、ＭＤＡ−５、ＬＧＰ−２、ＯＡＳ、ＯＡＳＬ、ＰＫＲ、ＩＦＮ−βの少なくとも１つの発現、又はシグナル伝達、又は活性化によって評価される際、エンクリプトゲンを欠いた同等物より少なくとも２倍低い免疫原性を有する、段落[93]〜[127]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６３８】
[129]環状ポリリボヌクレオチドは、リボスイッチをさらに含む、段落[93]〜[128]のいずれか１つに記載の組成物。
[130]環状ポリリボヌクレオチドは、アプタザイムをさらに含む、段落[93]〜[129]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６３９】
[131]環状ポリリボヌクレオチドは、非標準的翻訳開始配列、例えばＧＵＧ、ＣＵＧ開始コドン、例えばストレス条件下での発現を開始させる翻訳開始配列を含む、段落[93]〜[130]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６４０】
[132]１つ以上の発現配列は、ペプチドをコードする、段落[93]〜[131]のいずれか１つに記載の組成物。
[133]環状ポリリボヌクレオチドは、調節核酸、例えばノンコーディングＲＮＡを含む、段落[93]〜[132]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６４１】
[134]環状ポリリボヌクレオチドは、約２０塩基〜約２０ｋｂの範囲のサイズを有する、段落[93]〜[133]のいずれか１つに記載の組成物。
[135]環状ポリリボヌクレオチドは、線状ポリリボヌクレオチドの環状化によって合成される、段落[93]〜[134]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６４２】
[136]環状ポリリボヌクレオチドは、同じヌクレオチド配列又は異なるヌクレオチド配列のいずれかを有する複数の発現配列を含む、段落[93]〜[135]のいずれか１つに記載の組成物。
【０６４３】
[137]環状ポリリボヌクレオチドは、分解、例えばエキソヌクレアーゼに対して実質的に抵抗性である、段落[93]〜[136]のいずれか１つに記載の組成物。
[138]段落[94]〜[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチド。
【０６４４】
[139]段落[93]〜[137]のいずれか１つに記載の組成物を製造する方法であって、段落[93]〜[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチド及び段落[93]〜[137]のいずれか１つに記載の薬学的に許容される担体又は賦形剤を組み合わせる工程を含む方法。
【０６４５】
[140]治療の方法であって、段落[93]〜[137]のいずれか１つに記載の組成物を投与する工程を含む方法。
[141]タンパク質発現のための方法であって、段落[93]〜[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域を翻訳する工程を含む方法。
【０６４６】
[142]環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビトロで行われる、段落[141]に記載の方法。
[143]環状ポリリボヌクレオチドの少なくとも領域の翻訳は、インビボで行われる、段落[141]に記載の方法。
【０６４７】
[144]段落[65]〜[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド。
[145]段落[65]〜[137]のいずれか１つに記載の環状ポリリボヌクレオチドを製造する方法。
【０６４８】
[146]線状ポリリボヌクレオチドのスプリントライゲーション媒介性環状化を含む、段落[145]に記載の方法。
[147]スプリントライゲーション媒介性環状化は、少なくとも２％、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３２％、少なくとも３４％、少なくとも３６％、少なくとも３８％、少なくとも４０％、少なくとも４２％、少なくとも４４％、少なくとも４６％、少なくとも４８％又は少なくとも５０％の効率を有する、段落[146]に記載の方法。
【０６４９】
[148]スプリントライゲーション媒介性環状化は、約４０％〜約５０％又は５０％超の効率を有する、段落[146]に記載の方法。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１Ａ】
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【図５１Ｂ】
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【図５１Ｃ】
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【図５２Ａ】
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【図５２Ｂ】
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【図５２Ｃ】
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【図５３】
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【図５４Ａ】
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【図５４Ｂ】
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【図５５】
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【図５６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021508490.tif 000067
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