(57)【要約】  細胞外小胞が、外因性治療成分を含む。この外因性治療成分は、治療用ポリペプチド、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、治療用核酸、又は治療剤を含み得る。幾つかの態様において、細胞外小胞は、エクソソーム又は精製エクソソーム製品（ＰＥＰ）を含む。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
外因性治療成分を含む細胞外小胞であって、前記外因性治療成分が、以下：
治療用ポリペプチド、
治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、
治療用核酸、又は
治療剤
を含む、細胞外小胞。
【請求項２】
エクソソーム又は精製エクソソーム製品（purified exosome product）（ＰＥＰ）を含む、請求項１に記載の細胞外小胞。
【請求項３】
前記治療用核酸が、ネイティブＲＮＡ、ネイティブＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、修飾プラスミドＤＮＡ、修飾ｍｉＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、阻害性ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、Ｙ  ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ、ａｇｏｍｉＲ、又はａｎｔａｇｏｍｉＲを含む、請求項１又は２に記載の細胞外小胞。
【請求項４】
前記ネイティブＤＮＡ又は前記ネイティブＲＮＡが、治療用ペプチド又は治療用タンパク質をコードする、請求項３に記載の細胞外小胞。
【請求項５】
細胞外小胞を形質転換する方法であって、以下：
細胞外小胞を得ること；
目的の治療剤を提供すること；及び
前記目的の治療剤を前記細胞外小胞の少なくとも一部の中に導入すること、
を含む、方法。
【請求項６】
目的のポリヌクレオチドが、ネイティブＲＮＡ、ネイティブＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、修飾プラスミドＤＮＡ、修飾ｍｉＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、阻害性ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ、短鎖ヘアピンＲＮＡ、ａｇｏｍｉＲ、又はａｎｔａｇｏｍｉＲを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記ネイティブＤＮＡ又は前記ネイティブＲＮＡが、治療用ペプチド又は治療用タンパク質をコードする、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記治療剤が、治療用タンパク質を含む、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記細胞外小胞が、エクソソーム又は精製エクソソーム製品（ＰＥＰ）を含む、請求項５〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
前記目的の治療剤が、電気穿孔により前記細胞外小胞内に導入される、請求項５〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
治療剤を対象の細胞に送達する方法であって、以下：
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞外小胞を含む組成物を提供すること；及び
前記細胞外小胞を前記対象の細胞と接触させること；
前記対象の細胞を前記細胞外小胞に取り込ませて、前記外因性治療成分を前記細胞内に放出させること、
を含む、方法。
【請求項１２】
前記外因性治療成分が、治療用核酸、又は治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み；かつ
前記方法が、前記治療用ポリペプチド又は前記治療用核酸を前記細胞に発現させることをさらに含む、
請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
治療剤を対象の細胞外空間に送達する方法であって、以下：
請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞外小胞を含む組成物を提供すること；及び
前記細胞外小胞を、処置を必要とする前記対象の前記細胞外空間と接触させること；
前記細胞外小胞に、前記処置を必要とする対象の前記細胞外空間を占有させて、前記外因性治療成分を前記細胞外空間内に放出させること、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、全体として参照により本明細書中に取り込まれる、２０１８年７月２４日出願の米国特許仮出願第６２／７０２，８８２号の利益を主張するものである。
【発明の概要】
【０００２】
本開示は、一形態において、外因性治療成分を含む細胞外小胞を記載する。この外因性治療成分は、治療用ポリペプチド、治療用ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、治療用核酸、又は治療剤を含み得る。
【０００３】
幾つかの態様において、細胞外小胞は、エクソソーム又は精製エクソソーム製品（purified exosome product）（ＰＥＰ）を含む。
【０００４】
幾つかの態様において、治療用核酸としては、ネイティブＲＮＡ、ネイティブＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、修飾プラスミドＤＮＡ、修飾ｍｉＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、阻害性ＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、Ｙ  ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ａｇｏｍｉＲ、又はａｎｔａｇｏｍｉＲが挙げられる。
【０００５】
幾つかの態様において、ネイティブＲＮＡは、治療用ペプチド又は治療用タンパク質をコードする。
【０００６】
幾つかの態様において、治療成分としては、ネイティブ又は異種タンパク質を挙げることができる。
【０００７】
別の形態において、本開示は、細胞外小胞を形質転換する方法を記載する。一般にこの方法は、細胞外小胞を得ること、目的の治療剤を提供すること、及び目的の治療剤を細胞外小胞の少なくとも一部の中に導入すること、を含む。
【０００８】
幾つかの態様において、細胞外小胞としては、エクソソーム又は精製エクソソーム製品（ＰＥＰ）が挙げられる。
【０００９】
幾つかの態様において、目的の治療剤は、電気穿孔により細胞外小胞内に導入される。
【００１０】
上記概要は、本発明の各開示された態様又は各々の実行を記載することを意図されていない。以下の記載は、より詳細には例証的態様を例示している。本出願全体の幾つかの箇所において、ガイダンスが、実施例のリストを通して提供され、実施例は、様々な組み合わせで使用され得る。各例において、列挙されたリストは、代表的な群として役立つに過ぎず、排他的リストと解釈されるべきでない。
【００１１】
本特許又は出願のファイルは、カラーで制作された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面を有する本特許又は特許出願公報のコピーは、必要な料金の請求及び支払いの際に特許庁により提供されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】異種材料での形質転換により増強されるエクソソーム／細胞外小胞の合成における例示的工程の概要。
【図２】「ＤＮＡ」の柱は、「伝統的」トランスフェクション試薬と混合された修飾ＤＮＡを注射されたマウス骨格筋の発光を表す（陽性対照、電気穿孔なし）。「ＰＥＰ  ＤＮＡ」の柱は、電気穿孔トランスフェクションを受けた修飾ＤＮＡを注射されたマウス骨格筋の発光を表す。ＲＬＵ＝相対発光量。
【図３】インビトロで細胞膜中に認められ得る非特異的脂質色素（赤色、Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で標識されたＰＥＰ。
【図４】ＰＥＰの溶媒分散及び脂質薄膜調製と、続くＰＢＳでの脂質の水和及びＤＮＡによるＧＦＰコード化。凍結乾燥された脂質薄膜は、一晩再水和され、２９３Ｔ細胞の低血清媒体に添加され、ＧＦＰをコード化したＤＮＡプラスミドの送達を実証した。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
エクソソーム及び他の細胞外小胞は、強力な血管新生及び回復の特性を有する。本開示は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質又は治療剤をこの小胞に添加することによりこれらの小胞がさらに増強され得る方法を記載している。例えばＰＥＰ（精製エクソソーム製品、国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５６２７号；国際公開第２０１９／１１８８１７  Ａ１号パンフレット）又は細胞外小胞は、時にはトランスフェクションと称される工程を利用して、細胞外小胞に抗炎症特性を与えるＲＮＡで、細胞外小胞がさらに増強され得る。
【００１４】
細胞外小胞をトランスフェクトするための例示的工程が、図１に略図で示されている。細胞外小胞は、脂質二重膜が封入する積荷として示されている。図１に例証された通り積荷は、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、公知の薬物、及び／又はタンパク質誘導体を含み得る。
【００１５】
トランスフェクション工程は、目的の核酸、タンパク質、又は薬剤を細胞外小胞内に導入する。目的の核酸は、いずれかの適切なＤＮＡ、ＲＮＡ、又はＤＮＡとＲＮＡとの混合物であってもよい。核酸は、例えば化学療法薬又はタンパク質をコードし得る。或いは細胞外小胞が、精製タンパク質又は他の治療剤（例えば、化学療法剤）を導入することにより形質転換されてもよい。形質転換された細胞外小胞は、治療剤として用いられて、例えば形質転換している核酸を損傷された組織に送達してもよい。
【００１６】
図１に例証された例示的態様において、細胞外小胞は、電気穿孔により核酸でトランスフェクトされて、元の積荷分子とこの核酸又は目的の核酸とを含む増強された細胞外小胞をもたらす。
【００１７】
図１は、より一般的なプラットフォームの一例示的態様を例証したに過ぎない。例えば図１に示された細胞外小胞は、いずれかの適切な細胞外小胞であり得る。特定の態様において、形質転換される細胞外小胞は、エクソソーム、ＰＥＰ（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５６２７号；国際公開第２０１９／１１８８１７  Ａ１号パンフレット）、間葉系幹細胞から単離された細胞外小胞、樹状細胞から単離された細胞外小胞、心筋細胞から単離された細胞外小胞、血管平滑筋からの細胞外小胞、内皮細胞から単離された細胞外小胞、線維芽細胞から単離された細胞外小胞、又は白血球から単離された細胞外小胞であってもよいが、これらに限定されない。
【００１８】
したがって細胞外小胞は、非限定的にエクソソーム又はＰＥＰをはじめとする、いずれかの適切な細胞外小胞であってもよい。例えばＰＥＰは、多くの組織再生特性を有する（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５６２７号；国際公開第２０１９／１１８８１７  Ａ１号パンフレット）。その上、ＰＥＰは、ヌクレオチド及び／又はタンパク質での形質転換をＰＥＰに特に受け易くさせる特有の生物物理学的特性を保有する。それゆえ幾つかの態様において、形質転換されたＰＥＰは、追加の治療特性を送達するように遺伝子操作されていてもよい。
【００１９】
同様に、エクソソームは、薬物送達ビヒクルとして調査されてきた。エクソソームは、核酸でトランスフェクトされてもよく、エクソソームが、細胞に取り込まれた時、その標的細胞を効果的に形質転換して、形質転換されたエクソソームにより細胞に運搬された核酸にコードされた治療用ペプチド、タンパク質、又は核酸を発現する。
【００２０】
例示的核酸としては、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は修飾ＤＮＡ及び／若しくは修飾ｍＲＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。修飾ｍＲＮＡは、国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６３０６０号（国際公開第２０１８／０９８３１２号パンフレット）、及び２０１９年５月２３日に出願された表題「MICROENCAPSULATED MODIFIED POLYNUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS」の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３３７０５号に記載されている。
【００２１】
上記に特筆された通り、核酸としては、非限定的にネイティブＲＮＡ、ネイティブＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、修飾プラスミドＤＮＡ、修飾ｍｉＲＮＡ、修飾ｍＲＮＡ、修飾ＤＮＡ、阻害性ＲＮＡ（例えば、アンチセンスＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、短鎖ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ））、Ｙ  ＲＮＡ、長鎖ノンコーディングＲＮＡ（ｌｎｃＲＮＡ）、ａｇｏｍｉＲ若しくはａｎｔａｇｏｍｉＲ、又はそれらのいずれかの組み合わせをはじめとする、核酸のいずれかの適切な形態を挙げることができる。本明細書で用いられる「ネイティブ」ＲＮＡ又は「ネイティブ」ＤＮＡは、単離されていて修飾のないＲＮＡ又はＤＮＡをいう。対照的に「修飾」核酸は、ＲＮＡ又はＤＮＡにかかわらず、例えば治療用タンパク質（例えば、ＶＥＧＦ）をコードするように、そして／又は半減期若しくは核酸の発現レベルを修飾し得る１つ若しくは複数のエレメントを含有するように修飾されるなど、特定のコード領域を含有するように修飾され得る。
【００２２】
この核酸は、いずれかの適切な治療用ペプチド、タンパク質又はＲＮＡをコードし得る。同様にこのタンパク質又は治療剤は、いずれかの適切な治療用タンパク質又は他の薬剤であり得る。例えば細胞外小胞は、心臓の機能及び／又は組織を再生するのに有用である１種若しくは複数のポリペプチド、−  又はポリペプチドをコードする１種若しくは複数のｍＲＮＡ  −  を含むようにトランスフェクトされ得る。心臓の機能及び／又は組織を再生するのに有用になり得るポリペプチドの例としては、ＴＮＦ−α、ミトコンドリア複合体１、レゾルビン−Ｄ１、ＮＡＰ−２、ＴＧＦ−α、ＥｒＢｂ３、ＶＥＧＦ、ＩＧＦ−１、ＦＧＦ−２、ＰＤＧＦ、ＩＬ−２、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ８０／８６、国際公開第２０１５／０３４８９７号パンフレットに記載されたポリペプチド、又は前述のポリペプチドのいずれかに対する抗体が挙げられるが、これらに限定されない。例えばヒトＮａｐ−２ポリペプチドは、例えば米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）アクセション番号ＮＰ＿００２６９５．１（ＧＩ  Ｎｏ．５４７３）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００２７０４（ＧＩ  Ｎｏ. ５４７３）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＴＧＦ−αポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００３２２７．１（ＧＩ  Ｎｏ．７０３９）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００３２３６（ＧＩ  Ｎｏ．７０３９）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＥｒＢｂ３ポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１００５９１５．１又はＮＰ＿００１９７３．２（ＧＩ  Ｎｏ．２０６５）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１００５９１５．１又はＮＭ＿００１９８２．３（ＧＩ  Ｎｏ．２０６５）に明記された核酸配列によりコードされ得る。例えばヒトＶＥＧＦは、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＡ３５７８９．１（ＧＩ：１８１９７１）、ＣＡＡ４４４４７．１（ＧＩ：３７６５９）、ＡＡＡ３６８０４．１（ＧＩ：３４０２１５）、又はＡＡＫ９５８４７．１（ＧＩ：１５４２２１０９）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＨ００１５５３．１（ＧＩ：３４０２１４）に明記された核酸配列によりコードされ得る。例えばヒトＩＧＦ−１は、ＮＣＢＩアクセション番号ＣＡＡ０１９５４．１（ＧＩ：１２４７５１９）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号Ａ２９１１７．１（ＧＩ：１２４７５１８）に明記された核酸配列によりコードされ得る。例えばヒトＦＧＦ−２は、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１９９７．５（ＧＩ：１５３２８５４６１）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００２００６．４（ＧＩ：１５３２８５４６０）に明記された核酸配列によりコードされ得る。例えばヒトＰＤＧＦは、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＡ６０５５２．１（ＧＩ：３３８２０９）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＨ００２９８６．１（ＧＩ：３３８２０８）に明記された核酸配列によりコードされ得る���例えばヒトＩＬ−２は、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＢ４６８８３．１（ＧＩ：１８３６１１１）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号Ｓ７７８３４．１（ＧＩ：９９９０００）に明記された核酸配列によりコードされ得る。例えばヒトＣＤ１９は、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＡ６９９６６．１（ＧＩ：９０１８２３）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号Ｍ８４３７１．１（ＧＩ：９０１８２２）に明記された核酸配列によりコードされ得る。例えばヒトＣＤ２０は、ＮＣＢＩアクセション番号ＣＢＧ７６６９５．１（ＧＩ：２８５３１０１５７）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＨ００３３５３．１（ＧＩ：１１９９８５７）に明記された核酸配列によりコードされ得る。例えばヒトＣＤ８０は、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００５１８２．１（ＧＩ：４８８５１２３）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００５１９１．３（ＧＩ：１１３７２２１２２）に明記された核酸配列によりコードされ得、そしてヒトＣＤ８６は、ＮＣＢＩアクセション番号ＡＡＢ０３８１４．１（ＧＩ：４３９８３９）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＣＲ５４１８４４．１（ＧＩ：４９４５６６４２）に明記された核酸配列によりコードされ得る。例えば心臓の機能及び／又は組織を再生するのに有用になり得るポリペプチドは、ＴＮＦ−α、ミトコンドリア複合体１、又はレゾルビン−Ｄ１に対する抗体であり得る。
【００２３】
他の適切なタンパク質としては、抗体又はその断片が挙げられる。抗体は、細胞外小胞を形質転換するのに用いられるか、又は細胞外小胞を形質転換するために用いられる核酸によりコードされるかにかかわらず、従来の完全抗体、抗体断片、又は例えばＦａｂ、Ｆ（ａｂ’）2、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ｄｉ−ｓｃＦｖ、ｓｄＡｂ、二機能性抗体（例えば、ＢｉＴＥ又はＢｉＫＥ）、又は三機能性抗体（例えば、ＴｒｉＴＥ又はＴｒｉＫＥ）などのキメラ抗体であってもよい。一例証的態様において、ＰＥＰは、リツキシマブなどの抗体がローディングされていて、併用療法を提供してもよい。
【００２４】
幾つかの例において、細胞外小胞は、重大な有害心臓事象（例えば、急性心筋梗塞）に見舞われた哺乳動物及び／又は重大な有害心臓事象に見舞われるリスクのある哺乳動物（例えば、ＳＴＥＭＩのためにＰＣＩを受けた患者）を処置するのに有用な１種又は複数の阻害性ＲＮＡを含むようにトランスフェクトされ得る。例えば細胞外小胞は、以下のポリペプチドの１つ又は複数の発現を阻害及び／又は低減する１種又は複数の阻害性ＲＮＡを含むようにトランスフェクトされ得る：エオタキシン−３、カテプシン−Ｓ、ＤＫ−１、フォリスタチン、ＳＴ−２、ＧＲＯ−α、ＩＬ−２１、ＮＯＶ、トランスフェリン、ＴＩＭＰ−２、ＴＮＦαＲＩ、ＴＮＦαＲＩＩ、アンギオスタチン、ＣＣＬ２５、ＡＮＧＰＴＬ４、ＭＭＰ−３、及び国際公開第２０１５／０３４８９７号パンフレットに記載されたポリペプチド。例えばヒトエオタキシン−３ポリペプチドは、例えばＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００６０６３．１（ＧＩ  Ｎｏ．１０３４４）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００６０７２（ＧＩ  Ｎｏ．１０３４４）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトカテプシン−Ｓは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００４０７０．３（ＧＩ  Ｎｏ．１５２０）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００４０７９．４（ＧＩ  Ｎｏ．１５２０）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＤＫ−１は、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３６３７４．１（ＧＩ  Ｎｏ．２２９４３）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０１２２４２（ＧＩ  Ｎｏ．２２９４３）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトフォリスタチンはその場合、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０３７５４１．１（ＧＩ  Ｎｏ．１０４６８）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０１３４０９．２（ＧＩ  Ｎｏ．１０４６８）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＳＴ−２は、ＮＣＢＩアクセション番号ＢＡＡ０２２３３（ＧＩ  Ｎｏ．６７６１）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号Ｄ１２７６３．１（ＧＩ  Ｎｏ  ６７６１）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＧＲＯ−αポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１５０２．１（ＧＩ  Ｎｏ．２９１９）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１５１１（ＧＩ  Ｎｏ．  ２９１９）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＩＬ−２1は、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０６８５７５．１（ＧＩ  Ｎｏ．５９０６７）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０２１８０３（ＧＩ  Ｎｏ．５９０６７）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＮＯＶポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００２５０５．１（ＧＩ  Ｎｏ．４８５６）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００２５１４（ＧＩ  Ｎｏ．４８５６）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトトランスフェリンポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１０５４．１（ＧＩ  Ｎｏ．７０１８）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１０６３．３（ＧＩ  Ｎｏ．７０１８）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＴＩＭＰ−２ポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００３２４６．１（ＧＩ  Ｎｏ．７０７７）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００３２５５．４（ＧＩ  Ｎｏ．７０７７）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＴＮＦαＲＩポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１０５６．１（ＧＩ  Ｎｏ．７１３２）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１０６５（ＧＩ  Ｎｏ．７１３２）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＴＮＦαＲＩＩポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１０５７．１（ＧＩ  Ｎｏ．７１３３）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１０６６（ＧＩ  Ｎｏ．７１３３）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトアンギオスタチンポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿０００２９２（ＧＩ  Ｎｏ．５３４０）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿０００３０１（ＧＩ  Ｎｏ．５３４０）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＣＣＬ２５ポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００５６１５．２（ＧＩ  Ｎｏ．６３７０）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００５６２４（ＧＩ  Ｎｏ．６３７０）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＡＮＧＰＴＬ４ポリペプチドは、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＰ＿００１０３４７５６．１又はＮＰ＿６４７４７５．１（ＧＩ  Ｎｏ．５１１２９）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００１０３９６６７．１又はＮＭ＿１３９３１４．１（ＧＩ  Ｎｏ．５１１２９）に明記された核酸配列によりコードされ得る。幾つかの例において、ヒトＭＭＰ−３ポリペプチドは、ＮＰ＿００２４１３．１（ＧＩ  Ｎｏ．４３１４）に明記されたアミノ酸配列を有し得、ＮＣＢＩアクセション番号ＮＭ＿００２４２２（ＧＩ  Ｎｏ．４３１４）に明記された核酸配列によりコードされ得る。
【００２５】
幾つかの例において、細胞外小胞は、心臓再生能に関与するマイクロＲＮＡをモジュレートする（例えば、模倣又は阻害する）１種又は複数のヌクレオチドを含むようにトランスフェクトされ得る。例えば細胞外小胞は、心臓再生能を増大する１種又は複数のｍｉＲＮＡを模倣する１種又は複数のａｇｏｍｉＲを含むようにトランスフェクトされ得る。例えば細胞外小胞は、心臓再生能を増大する１種又は複数のｍｉＲＮＡを阻害する１種又は複数のａｎｔａｇｏｍｉＲを含むようにトランスフェクトされ得る。心臓再生能に関与するｍｉＲＮＡの例としては、miR-127, miR-708, miR-22-3p, miR-411, miR-27a, miR-29a, miR-148a, miR-199a, miR-143, miR-21, miR-23a-5p, miR-23a, miR-146b-5p, miR-146b, miR-146b-3p, miR-2682-3p, miR-2682, miR-4443, miR-4443, miR-4521, miR-4521, miR-2682-5p,miR-2682, miR-137.miR-137, miR-549.miR-549, miR-335-3p, miR-335, miR-181c-5p, miR-181c, miR-224-5p, miR-224, miR-3928, miR-3928, miR-324-5p, miR-324, miR-548h-5p, miR-548h-1, miR-548h-5p, miR-548h-2, miR-548h-5p, miR-548h-3, miR-548h-5p, miR-548h-4, miR-548h-5p, miR-548h-5, miR-4725-3p, miR-4725, miR-92a-3p, miR-92a-1, miR-92a-3p, miR-92a-2, miR-134, miR-134, miR-432-5p, miR-432, miR-651, miR-651, miR-181a-5p, miR-181a-1, miR-181a-5p, miR-181a-2, miR-27a-5p, miR-27a, miR-3940-3p, miR-3940, miR-3129-3p, miR-3129, miR-146b-3p, miR-146b, miR-940, miR-940, miR-484, miR-484, miR-193b-3p, miR-193b, miR-651, miR-651, miR-15b-3p, miR-15b, miR-576-5p, miR-576, miR-377-5p, miR-377, miR-1306-5p, miR-1306, miR-138-5p, miR-138-1, miR-337-5p, miR-337, miR-135b-5p, miR-135b, miR-16-2-3p, miR-16-2, miR-376c.miR-376c, miR-136-5p, miR-136, let-7b-5p, let-7b, miR-377-3p, miR-377, miR-1273g-3p, miR-1273g, miR-34c-3p, miR-34c, miR-485-5p, miR-485, miR-370.miR-370, let-7f-1-3p, let-7f-1, miR-3679-5p, miR-3679, miR-20a-5p, miR-20a, miR-585.miR-585, miR-3934, miR-3934, miR-127-3p, miR-127, miR-424-3p, miR-424, miR-24-2-5p, miR-24-2, miR-130b-5p, miR-130b, miR-138-5p, miR-138-2, miR-769-3p, miR-769, miR-1306-3p, miR-1306, miR-625-3p, miR-625, miR-193a-3p, miR-193a, miR-664-5p, miR-664, miR-5096.miR-5096, let-7a-3p, let-7a-1, let-7a-3p, let-7a-3, miR-15b-5p, miR-15b, miR-18a-5p, miR-18a, let-7e-3p, let-7e, miR-1287.miR-1287, miR-181c-3p, miR-181c, miR-3653, miR-3653, miR-15b-5p, miR-15b, miR-1, miR-1-1, miR-106a-5p, miR-106a, miR-3909.miR-3909, miR-1294.miR-1294, miR-1278, miR-1278, miR-629-3p, miR-629, miR-340-3p, miR-340, miR-200c-3p, miR-200c, miR-22-3p, miR-22, miR-128, miR-128-2, miR-382-5p, miR-382, miR-671-5p, miR-671, miR-27b-5p, miR-27b, miR-335-5p, miR-335, miR-26a-2-3p, miR-26a-2, miR-376b.miR-376b, miR-378a-5p, miR-378a, miR-1255a, miR-1255a, miR-491-5p, miR-491, miR-590-3p, miR-590, miR-32-3p, miR-32, miR-766-3p, miR-766, miR-30c-2-3p, miR-30c-2, miR-128.miR-128-1, miR-365b-5p, miR-365b, miR-132-5p, miR-132, miR-151b.miR-151b, miR-654-5p, miR-654, miR-374b-5p, miR-374b, miR-376a-3p, miR-376a-1, miR-376a-3p, miR-376a-2, miR-149-5p, miR-149, miR-4792.miR-4792, miR-1.miR-1-2, miR-195-3p, miR-195, miR-23b-3p, miR-23b, miR-127-5p, miR-127, miR-574-5p, miR-574, miR-454-3p, miR-454, miR-146a-5p, miR-146a, miR-7-1-3p, miR-7-1, miR-326.miR-326, miR-301a-5p, miR-301a, miR-3173-5p, miR-3173, miR-450a-5p, miR-450a-1, miR-7-5p, miR-7-1, miR-7-5p, miR-7-3, miR-450a-5p, miR-450a-2, miR-1291, miR-1291, miR-7-5p, miR-7-2, and miR-17-5p, or miR-17が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
細胞外小胞をトランスフェクトするために用いられるヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ）は、修飾ヌクレオチドであり得る。幾つかの例において、ヌクレオチドは、上昇された安定性のために修飾され得る。例えば本明細書に記載されたＲＮＡの１つ又は複数のウラシル残基が、修飾ウラシル残基で置き換えられ得る。修飾ウラシル残基の例としては、シュードウリジン（Ψ）、ジヒドロウリジン（Ｄ）、及びジデオキシウラシルが挙げられるが、これらに限定されない。ｍＲＮＡが、国際公開第２０１８／０９８３１２号パンフレットとして公開された、２０１７年１１月２２日出願の表題「PARTICLE-MEDIATED DELIVERY OF BIOLOGICS」の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０６３０６０号の中、そして２０１９年５月２３日出願の表題「MICROENCAPSULATED MODIFIED POLYNUCLEOTIDE COMPOSITIONS AND METHODS」の国際特許出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０３３７０５号の中により詳細に記載された生体機能化されたマイクロカプセル化修飾ｍＲＮＡ（Ｍ3ＲＮＡ）を形成するように修飾されてもよい。
【００２７】
上記に列挙された治療薬は、単に例示である。ｍｉＲＮＡを含む他の治療薬としては、心臓血管系の外部の臓器を標的とする治療剤を挙げることができる。核酸は、いずれかの適切な方法により細胞外小胞内に導入され得る。図１は、核酸が電気穿孔により細胞外小胞内に導入される例示的実施形態を例証している。核酸を細胞外小胞内に導入するための代わりの適切な方法としては、能動的ローディング技術又は受動的ローディング技術が挙げられる。例示的な能動的ローディング技術としては、例えば電気穿孔、化学的勾配と連結されたローディング、浸透圧勾配と連結されたローディング、又はｐＨ依存性ローディングが挙げられる。例示的な受動的ローディング技術としては、機械的分散法（例えば、脂質薄膜水和、マイクロエマルジョン化（ｍｉｃｒｏ  ｅｍｕｌｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、音波処理、フレンチプレスでの細胞処理（Ｆｒｅｎｃｈ  ｐｒｅｓｓｕｒｅ  ｃｅｌｌ）、膜押出し、乾燥して再構成された小胞、凍結解凍されたリポソーム）、溶媒分散法（例えば、マイクロ流体ローディング、エタノール注入、エーテル注入、二重エマルジョン、逆相蒸発、安定した多層小胞（ｐｌｕｒｉ  ｌａｍｅｌｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅｓ））、界面活性剤除去法（例えば、コール酸塩、アルキルグリコシド、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を用いて）、又は混合された小胞からの除去（例えば、透析、カラムクロマトグラフィー、希釈、再構成されたセンダイウイルスエンベロープ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
核酸が、細胞外小胞内に導入された後、形質転換生成物は、将来の使用のために貯蔵されてもよい。例えば、形質転換生成物をフリーズドライ又は凍結乾燥して、形質転換生成物の有効期限を増加させることができる。
【００２９】
形質転換された細胞外小胞は、例えば形質転換する核酸を損傷された組織に送達するために、治療剤として用いられてもよい。例えばＰＥＰは、多くの組織再生特性を有する（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５６２７号；国際公開第２０１９／１１８８１７  Ａ１号パンフレット）。形質転換されたＰＥＰは、追加の治療特性を送達するように遺伝子操作されてもよい。その上、ＰＥＰは、特有の生物物理学的特性を保有し、これによりＰＥＰはヌクレオチド及び／又はタンパク質での形質転換に特に適したものとなる。
【００３０】
先行の記述及び以下の特許請求の範囲において、用語「及び／又は」は、列挙された要素の１つ若しくは全て、又は列挙された要素のいずれか２つ以上の組み合わせを意味し；用語「含む」、「含むこと」及びそれらの変形例は、制限がないものと見なされなければならず、即ち追加の要素又はステップが、任意であり、存在しても、又は存在しなくてもよく；他に明示されなければ、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、「その（ｔｈｅ）」及び「少なくとも１つの」は、互換的に用いられ、１又は１より多くを意味し；エンドポイントによる数字範囲の列挙は、その範囲内に包摂された全ての数字を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．８０、４、５、その他を含む）。
【００３１】
先行の記述において、特有の態様は、明瞭さのために分離して記載される場合がある。特有の態様の特色が、別の態様の特色と不適合であることが他に明確に明示されなければ、特定の態様は、本明細書に記載された適合性のある特色の組み合わせを１つ又は複数の態様に関連して含み得る。
【００３２】
別々のステップを含む本明細書に開示されたいずれかの方法では、それらのステップは、いずれかの実行可能な順序で実施されてもよい。そして適宜、２つ以上のステップのいずれかの組み合わせが、同時に実施されてもよい。
【００３３】
本発明は、以下の実施例により例証される。特有の実施例、材料、量及び手順が、本明細書に明記された発明の適用範囲及び主旨に応じて広義に解釈されなければならないことが、理解されなければならない。
【実施例】
【００３４】
実施例１
精製エクソソーム（ＰＥＰ）は、過去に記載された通り調製された（国際公開第２０１９／１１８８１７  Ａ１号パンフレットとして公開された国際特許出願公開ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６５６２７号）。ＰＥＰは、滅菌水及びヘパリン硫酸塩（１０００単位／ｍＬ（units/mL））を用いて再構成され、その後、０．２μｍフィルターで濾過された。２０μｌの再構成されて濾過されたＰＥＰは、１ｍｍ電気穿孔キュベットに添加された。レポーター遺伝子をコードする１２μｇの修飾ＤＮＡが、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（ニュージャージー州ピスカタウェイ）から得られ、電気穿孔キュベットに添加された。レポーター遺伝子は、酵素基質フリマジン（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）の存在下で光シグナルを発生するナノルシフェラーゼをコードしている。
【００３５】
キュベットが、電気穿孔装置（ＧＥＮＥＰＵＬＳＥＲ  ＸＣＥＬＬ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．、カリフォルニア州ハーキュリーズ）内に配置され、電気穿孔が、以下の設定で実施された：３５０ｖ、１５０μＦ、１パルス。電気穿孔生成物が、キュベットから取り出され、エッペンドルフチューブにピペット注入され、氷上に１０分間配置された。
【００３６】
最終生成物が、マウスの大腿筋に注射された。生成物が注射された４８時間後に、注射部位からの筋肉が回収された。離れた部位からの筋肉が、対照として回収された。注射された筋肉組織及び対照筋肉組織が、その後、ＮＡＮＯ−ＧＬＯルシフェラーゼキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）の中で指導された通り加工され、プレートリーダ（ＦＬＵＯＳＴＡＲ  ＯＭＥＧＡ、ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を介して製造業者の指導に従って、下流のタンパク質量について分析された。
【００３７】
結果が、図２に示されている。
【００３８】
本明細書で引用された全ての特許、特許出願、及び発行物の完全な開示、並びに電子的に入手可能な材料（例として、例えばＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑ内の、ヌクレオチド配列登録、並びに例えばＳｗｉｓｓＰｒｏｔ、ＰＩＲ、ＰＲＦ、ＰＤＢ内の、アミノ酸配列登録、並びにＧｅｎＢａｎｋ及びＲｅｆＳｅｑ内の注釈されたコード領域からの翻訳など）は、全体として参照により取り込まれる。本出願の開示と、参照により本明細書中に取り込まれるいずれかの文書の開示（複数可）の間にいずれかの不一致が存在する場合には、本出願の開示が、支配することになる。前述の詳細な記載及び実施例は、理解の明瞭さのためだけに与えられた。不要な限定がないことが、そこから理解されなければならない。本発明は、図示及び記載された厳密な詳細に限定されず、当業者に明白な変形については、特許請求の範囲により定義された発明に含まれるであろう。
【００３９】
他に示されなければ、本明細書及び特許請求の範囲で用いられた成分、分子量などの量を表す全ての数字は、用語「約」により全ての例で修飾されると理解されなければならない。したがって、他に反することが示されなければ、本明細書及び特許請求の範囲で明記された数字パラメータは、本発明により得られようと努められた所望の特性に応じて変動し得る近似である。最低限でも、そして特許請求の範囲の適用範囲と同等の学説を制限する試みとしてではなく、各数字パラメータは少なくとも、報告された有効数字の数に照らして、そして通常の丸めの技術を適用することにより、解釈されるべきである。
【００４０】
本発明の広い適用範囲を明記する数字範囲及びパラメータは近似であるが、具体的実施例に明記された数値は、可能な限り精密に報告されている。しかし数値は全て、各検査測定で見いだされた標準偏差から必然的に生じた範囲を本質的に含有する。
【００４１】
見出しは全て、読み手の簡便さのためのもので、明示されない限りは見出しに続く本文の意味を限定するために用いられるべきでない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【国際調査報告】
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