(57)【要約】  本発明は、配列番号２の配列および１つまたは複数の突然変異を含む、３−フィターゼ（配列番号１）に基づいて少なくとも９５％の配列同一性を有する生物学的に有効なフィターゼ突然変異体である、最適化３−フィターゼに関する。本発明はさらに、食品または飼料製品の製造におけるこのような最適化３−フィターゼの使用に向けられる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に基づいて少なくとも９６．２５％の配列同一性を有する生物学的に有効なフィターゼ突然変異体であって、配列番号２の配列、ならびにＤ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｒ２１０Ｑ、Ｌ２１１Ｅ、Ｌ２１１Ｍ、Ｋ２５Ｅ、Ｋ２５Ａ、Ｇ２６Ｎ、Ｇ２６Ｓ、Ｎ１９３Ｈ、Ｎ１９３Ｋ、Ｎ１９３Ｓ、Ｎ１９３Ｒ、Ｄ１Ｅ、Ｐ３Ｔ、Ｇ２６Ｋ、Ｋ２９Ａ、Ｔ３０Ｓ、Ｔ３０Ａ、Ｔ３０Ｋ、Ｄ３６Ｎ、Ｑ４５Ｎ、Ｑ４５Ｒ、Ｖ５８Ｅ、Ｓ７５Ｃ、Ｑ７６Ｒ、Ｐ１０７Ｓ、Ａ１１２Ｇ、Ｄ１２０Ｋ、Ｔ１２９Ｋ、Ｑ１３６Ｒ、Ｑ１４４Ｌ、Ｄ１４９Ｎ、Ｋ１８７Ｅ、Ｄ１８９Ｎ、Ｇ１９２Ｒ、Ｓ１９５Ｒ、Ｓ１９５Ｙ、Ｓ１９５Ｔ、Ｓ１９５Ｎ、Ｎ２０４Ｉ、Ｎ２０４Ｔ、Ｎ２０４Ｓ、Ｓ２１４Ａ、Ｎ２１６Ｄ、Ａ２３０Ｔ、Ｍ２３７Ｌ、Ｎ２４３Ｋ、Ｎ２４８Ｋ、Ｒ２５５Ｈ、Ｇ２５７Ｓ、Ｆ２６４Ｙ、Ａ２７５Ｐ、Ｄ２７６Ｇ、Ｋ２９５Ｙ、Ｋ２９５Ｍ、Ｑ３３２Ｄ、Ａ３５２Ｓ、Ｖ３８３Ｍ、Ｒ３９３Ｈ、Ａ３９５Ｔおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される突然変異を含む、上記の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体。
【請求項２】
突然変異Ｄ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０ＮおよびＫ１９１Ｎを含む、請求項１に記載の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体。
【請求項３】
突然変異Ｒ２１０ＱおよびＬ２１１Ｍを含む、請求項１または２に記載の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体。
【請求項４】
突然変異Ｋ２５ＥまたはＫ２５Ａ、およびＧ２６ＮまたはＧ２６Ｓ、およびＮ１９３ＳまたはＮ１９３Ｒを含む、請求項１〜３のいずれか１つに記載の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体。
【請求項５】
２５、２６、１９３、２１０および／または２１１位に突然変異を含む、請求項１〜４のいずれか１つに記載の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体。
【請求項６】
Ｄ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ２５ＥもしくはＫ２５Ａ、Ｇ２６ＳもしくはＧ２６Ｎ、Ｎ１９３Ｓ、Ｎ１９３ＲもしくはＮ１９３Ｋ、Ｒ２１０ＱおよびＬ２１１Ｍ位に突然変異を含む、請求項１〜５のいずれか１つに記載の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体。
【請求項７】
９０℃まで活性である、請求項１〜６のいずれか１つに記載の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体。
【請求項８】
３〜５．５のｐＨで活性である、請求項１〜７のいずれか１つに記載の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体。
【請求項９】
食品または飼料製品の製造のための、請求項１〜８のいずれか１つに記載の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、配列番号２の配列および１つまたは複数の突然変異を含む、３−フィターゼ（配列番号１）に基づいて少なくとも９５％の配列同一性を有する生物学的に有効なフィターゼ突然変異体である、最適化３−フィターゼに関する。本発明はさらに、食品または飼料製品の製造におけるこのような最適化３−フィターゼの使用に向けられる。
【背景技術】
【０００２】
フィターゼは、有機ホスフェート化合物、例えばフィテートおよびフィチン酸から、それぞれホスフェートを切り離す酵素である。多くのタイプのフィターゼが本技術分野において知られており、それらの一部は既に、代謝、ならびに動物飼料製品材料、例えばトウモロコシ、コムギおよびダイズ内に天然に存在するフィテートの利用を改善するために動物飼料製品への添加剤として使用されている。フィターゼの分類は、最初の段階におけるフィテート分子からのホスフェートの開裂の開始位置に依存する。３−フィターゼ（Ｅ．Ｃ．  ３．１．３．８。１−フィターゼ；ｍｙｏ−イノシトール−ヘキサキスホスフェート３−ホスホヒドロラーゼ；フィターゼ１−ホスファターゼまたはフィテート３−ホスファターゼとも呼ばれる）は、フィテート分子の３位におけるホスフェート開裂で開始する。６−フィターゼは、６位におけるホスフェート開裂で開始する。フィターゼのタイプに応じて、他の位置のさらなるホスフェート開裂が生じる。例えば、３−フィターゼは、フィテートから全てのホスフェート基を開裂することができる。
【０００３】
ホスフェートはヒトのもしくは動物の食餌の重要な要素であるため、フィターゼを食物もしくは飼料に添加することにより、食物もしくは飼料の天然のフィテート部分のより良好な代謝が可能となるが、排出物における残留リンの減少ももたらされる。排出物における高リン含有量は通常、肥料としてのその使用の厳格な制限をもたらし、なぜならば多くの国々が厳しい制限を課しているためである。
【０００４】
不十分な天然フィテート代謝および、特に肥料中における残留リン含有量を増加させることも知られている食物もしくは飼料の費用のかかる人工的なリン富化のこれらの欠点を克服するために、フィターゼは既に、胃および消化管におけるフィテート代謝を増加させるために食品もしくは飼料製品に導入されてきた。
【０００５】
現在市販されているそのようなフィターゼの例は、エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、シトロバクター・ブラアキイ（Ｃｉｔｒｏｂａｃｔｅｒ  ｂｒａａｋｉｉ）、ブティアウクセラ（Ｂｕｔｔｉａｕｘｅｌｌａ）種およびアスペルギニス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）に由来する。
【０００６】
こららのフィターゼ製品の各々は、少なくとも比活性、用量要件、反応時間および阻害中間体化合物の蓄積において制限を有する。その種で最初の製品は、所望の効果を達成するためには高い酵素用量を必要とする真菌性の３−フィターゼを含んでいた。現在入手可能な市販の飼料製品は、細菌起源の６−フィターゼを使用することによりこの影響の克服を試みている。しかしながら、これらの６−フィターゼの重大な欠点は、中間体化合物であるイノシトール−テトラホスフェートの蓄積であり、これは効率的なフィテート代謝を大きく限定する。さらに、フィテートおよびその中間体、特にイノシトール−テトラホスフェートは、二価イオン、例えばＣａ２＋、Ｚｎ２＋およびＭｇ２＋と錯体を形成する。さらに、本技術分野内において公知のフィターゼ製品の多くは、最大１．５時間というヒトまたは動物の胃における食物または飼料の現実の臨界的な保持時間に関して十分なホスフェートの放出を保障するためには、高量のフィターゼの使用を必要とする。
【０００７】
いくつかの因子が、フィターゼの機能性、ならびにヒトまたは動物の消化管におけるそれらのｉｎ  ｖｉｖｏフィターゼ酵素活性に影響を及ぼす。例えばブタでは、飼料フィターゼは主に、胃および小腸の上部において活性であり、そして添加されたフィターゼ活性は、回腸において回復されない。例えば、家禽において、飼料フィターゼ活性は主に、そ嚢、前胃および砂嚢を含む消化管の上部において見出される。例えば、胃を有する魚の場合、フィターゼ活性は主に胃における。多くの因子が胃腸管における食物または飼料フィターゼの効率に影響を及ぼし得、それらは３つの主要な群に分けることができる：（ｉ）フィターゼに関連；（ｉｉ）食餌に関連、および（ｉｉｉ）対象に関連。フィターゼに関連する因子には、フィターゼの種類（例えば、３−または６−フィターゼ；細菌または真菌フィターゼ起源）、ｐＨ最適条件および内因性プロテアーゼに対するフィターゼの耐性が含まれる。食餌に関連する因子は主に、食餌のフィテート含有量、食物もしくは飼料成分組成、および食物もしくは飼料加工、ならびに全Ｐ、ＣａおよびＮａ含有量に関連する。対象に関連する因子には、対象の種、性および年齢が含まれる（Ｙｕｅｍｉｎｇ  Ｄｅｒｓｊａｎｔ−Ｌｉｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｓｃｉ．  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．２０１５  Ｍａｒ  ３０；  ９５（５）：  ８７８-８９６（非特許文献１））。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【非特許文献１】Ｙｕｅｍｉｎｇ  Ｄｅｒｓｊａｎｔ−Ｌｉｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｓｃｉ．  Ｆｏｏｄ  Ａｇｒｉｃ．２０１５  Ｍａｒ  ３０；  ９５（５）：  ８７８-８９６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
食物および飼料はそれぞれ、一般に、例えば汚染を低減するために、高温で製造され、その結果、食物および／または飼料製造に使用されるフィターゼは熱安定性でなければならない。
【００１０】
よって、広範囲のｐＨ値にわたって作用し、従って胃ならびに腸上部において活性であり、そして同時に高温で安定であるフィターゼが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、このギャップを満たすものであり、予期せぬ驚くべき温度およびｐＨ安定性をもたらす突然変異を含む３−フィターゼ突然変異体、例えば細菌性３−フィターゼ突然変異体を提供し、ここで前記３−フィターゼは活性であり、ホスフェート開裂において高度に効率的である。
【００１２】
概要
本発明は、生物学的に有効なフィターゼ突然変異体、例えば、配列番号１に基づいて少なくとも９６．２５％の配列同一性を有する３−フィターゼ突然変異体に言及し、該突然変異体は、配列番号２の配列、ならびにＤ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｒ２１０Ｑ、Ｌ２１１Ｅ、Ｌ２１１Ｍ、Ｋ２５Ｅ、Ｋ２５Ａ、Ｇ２６Ｎ、Ｇ２６Ｓ、Ｎ１９３Ｈ、Ｎ１９３Ｋ、Ｎ１９３Ｓ、Ｎ１９３Ｒ、Ｄ１Ｅ、Ｐ３Ｔ、Ｇ２６Ｋ、Ｋ２９Ａ、Ｔ３０Ｓ、Ｔ３０Ａ、Ｔ３０Ｋ、Ｄ３６Ｎ、Ｑ４５Ｎ、Ｑ４５Ｒ、Ｖ５８Ｅ、Ｓ７５Ｃ、Ｑ７６Ｒ、Ｐ１０７Ｓ、Ａ１１２Ｇ、Ｄ１２０Ｋ、Ｔ１２９Ｋ、Ｑ１３６Ｒ、Ｑ１４４Ｌ、Ｄ１４９Ｎ、Ｋ１８７Ｅ、Ｄ１８９Ｎ、Ｇ１９２Ｒ、Ｓ１９５Ｒ、Ｓ１９５Ｙ、Ｓ１９５Ｔ、Ｓ１９５Ｎ、Ｎ２０４Ｉ、Ｎ２０４Ｔ、Ｎ２０４Ｓ、Ｓ２１４Ａ、Ｎ２１６Ｄ、Ａ２３０Ｔ、Ｍ２３７Ｌ、Ｎ２４３Ｋ、Ｎ２４８Ｋ、Ｒ２５５Ｈ、Ｇ２５７Ｓ、Ｆ２６４Ｙ、Ａ２７５Ｐ、Ｄ２７６Ｇ、Ｋ２９５Ｙ、Ｋ２９５Ｍ、Ｑ３３２Ｄ、Ａ３５２Ｓ、Ｖ３８３Ｍ、Ｒ３９３Ｈ、Ａ３９５Ｔおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される突然変異を含む。
【００１３】
本発明の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体は、例えば、突然変異Ｄ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０ＮおよびＫ１９１Ｎ、またはＲ２１０ＱおよびＬ２１１Ｍ、またはＫ２５ＥもしくはＫ２５Ａ、およびＧ２６ＮもしくはＧ２６Ｓ、およびＮ１９３ＳもしくはＮ１９３Ｒ；あるいはＤ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｒ２１０Ｑ、Ｌ２１１Ｍ、Ｋ２５ＥもしくはＫ２５Ａ、およびＧ２６ＮもしくはＧ２６Ｓ、およびＮ１９３ＳもしくはＮ１９３Ｒを含む。
【００１４】
本発明の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体は、例えば、２５、２６、１９３、２１０および／または２１１位に突然変異を含む。
【００１５】
有利な熱安定性を示す本発明のさらなる有利なフィターゼ突然変異体は、突然変異Ｄ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０ＮおよびＫ１９１Ｎを含み、特に有利なフィターゼ突然変異体は、突然変異Ｋ２５ＥまたはＫ２５Ａ；Ｎ１９３Ｈ、Ｎ１９３Ｓ、Ｎ１９３ＲもしくはＮ１９３ＫおよびＬ２１１ＭもしくはＬ２１１Ｅをさらに含む。有利な熱安定性を示す他の有利なフィターゼ突然変異体は、突然変異Ｄ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ２５ＥもしくはＫ２５Ａ、Ｇ２６ＳもしくはＧ２６Ｎ、Ｎ１９３Ｈ、Ｎ１９３Ｓ、Ｎ１９３ＲもしくはＮ１９３Ｋ、Ｒ２１０ＱおよびＬ２１１Ｍを含む。有利な熱安定性および特に良好なホスフェート放出を示す本発明による特に好適なフィターゼ突然変異体は、突然変異Ｄ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｋ２５Ｅ、Ｇ２６ＳもしくはＧ２６Ｎ、Ｎ１９３Ｓ、Ｎ１９３ＲもしくはＮ１９３Ｋ、Ｒ２１０ＱおよびＬ２１１Ｍを含む。
【００１６】
本発明の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体は、例えば９０℃まで活性であり、そして例えば３〜５．５のｐＨで活性である。
【００１７】
本発明の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体は、例えば、例えばヒトおよび／または動物のための、食品または飼料製品の製造のために使用される。
【００１８】
本明細書において引用または参照される全ての文献（「本明細書において引用される文献」）、および本明細書において引用または参照される文献において引用または参照される全ての文献は、本明細書において言及されるかまたは本明細書において参照により組み込まれるいずれかの文献におけるいずれかのものに関するいずれかの製造業者の指示書、説明書、製品仕様書および製品シートとともに、これにより参照によって本明細書に組み込まれ、本発明の実施において使用され得る。より具体的には、全ての参照された文献は、あたかも各個々の文献が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されたのと同じ程度まで参照により組み込まれる。
【００１９】
図面の説明
以下の図は本発明をより詳細に示すが、本発明はこれらの図に限定されるものではない。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１：配列番号２の３−フィターゼ突然変異体の、用途設定におけるそれらの触媒性能、および熱安定性に関する尺度としてのそれらのＩＣ５０値に関する改善；○（灰色）野生型  配列番号２、●配列番号４７、配列番号４、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号１０、配列番号１４、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２６、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３４、配列番号１、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４５および配列番号４６の３−フィターゼ突然変異体。
【図２】図２：ｐＨ２〜５．５における、野生型配列番号２、および配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３４、配列番号１の３−フィターゼ突然変異体のｐＨプロファイル。
【図３】図３：配列番号２と比較した、３−フィターゼ突然変異体  配列番号１、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７、配列番号１８、配列番号１９、配列番号２０、配列番号２１、配列番号２２、配列番号２３、配列番号２４、配列番号２５、配列番号２６、配列番号２７、配列番号２８、配列番号２９、配列番号３０、配列番号３１、配列番号３２、配列番号３３、配列番号３４、配列番号３５、配列番号３６、配列番号３７、配列番号３８、配列番号３９、配列番号４０、配列番号４１、配列番号４２、配列番号４３、配列番号４４、配列番号４５、配列番号４６、配列番号４７の生物学的有効性指数
【００２１】
詳細な説明
本発明は、フィターゼ突然変異体、例えば、配列番号１に対して９０％〜９７％、９１％〜９６％、９２％〜９５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６．２５％または少なくとも９７％の配列同一性を有し、配列番号２の配列ならびに１つまたは複数の、例えば少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つまたは少なくとも１０個の突然変異を含むかまたはそれらからなる、３−フィターゼ突然変異体に向けられている。
【００２２】
本発明内において、「フィターゼ突然変異体」という用語は、それ自体天然には存在しないが、天然に存在するフィターゼ酵素配列と比較して少なくとも１つのアミノ酸の遺伝的改変の結果である任意の配列を表すものと理解されるべきである。
【００２３】
本発明のフィターゼ、例えば３−フィターゼの突然変異は、Ｄ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｒ２１０Ｑ、Ｌ２１１Ｅ、Ｌ２１１Ｍ、Ｋ２５Ｅ、Ｋ２５Ａ、Ｇ２６Ｎ、Ｇ２６Ｓ、Ｎ１９３Ｈ、Ｎ１９３Ｋ、Ｎ１９３Ｓ、Ｎ１９３Ｒ、ＤＩＥ、Ｐ３Ｔ、Ｇ２６Ｋ、Ｋ２９Ａ、Ｔ３０Ｓ、Ｔ３０Ａ、Ｔ３０Ｋ、Ｄ３６Ｎ、Ｑ４５Ｎ、Ｑ４５Ｒ、Ｖ５８Ｅ、Ｓ７５Ｃ、Ｑ７６Ｒ、Ｐ１０７Ｓ、Ａ１１２Ｇ、Ｄ１２０Ｋ、Ｔ１２９Ｋ、Ｑ１３６Ｒ、Ｑ１４４Ｌ、Ｄ１４９Ｎ、Ｋ１８７Ｅ、Ｄ１８９Ｎ、Ｇ１９２Ｒ、Ｓ１９５Ｒ、Ｓ１９５Ｙ、Ｓ１９５Ｔ、Ｓ１９５Ｎ、Ｎ２０４Ｉ、Ｎ２０４Ｔ、Ｎ２０４Ｓ、Ｓ２１４Ａ、Ｎ２１６Ｄ、Ａ２３０Ｔ、Ｍ２３７Ｌ、Ｎ２４３Ｋ、Ｎ２４８Ｋ、Ｒ２５５Ｈ、Ｇ２５７Ｓ、Ｆ２６４Ｙ、Ａ２７５Ｐ、Ｄ２７６Ｇ、Ｋ２９５Ｙ、Ｋ２９５Ｍ、Ｑ３３２Ｄ、Ａ３５２Ｓ、Ｖ３８３Ｍ、Ｒ３９３Ｈ、Ａ３９５Ｔおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される。前記の組み合わせは、１つまたは複数の突然変異を含む。
【００２４】
得られるフィターゼ突然変異体は生物学的に有効であり、すなわち、該フィターゼ突然変異体は、様々な条件（本発明では、高温、例えば９０℃まで、および酸性〜塩基性ｐＨ、例えばｐＨ２．５〜５．５の範囲）下で一貫して活性である。
【００２５】
以下、本発明の構成要素についてより詳細に説明する。これらの要素は特定の実施態様と共に列挙されているが、追加的な実施態様を作成するために、任意の方法および任意の数で組み合わせることができることが理解されるべきである。様々に記載された例および実施態様は、明示的に記載された実施態様のみに本発明を限定するように解釈されるべきではない。この記載は、明示的に説明された実施態様を任意の数の開示された構成要素と組み合わせる実施態様を支持し、包含するものと理解されるべきである。さらに、本出願において説明されるすべての構成要素の任意の置換および組み合わせは、文脈が別段の指示をしない限り、本出願の記載によって開示されたとみなされるべきである。
【００２６】
本明細書および特許請求の範囲を通して、文脈が別段の要求をしない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、言及された数、整数またはステップ、または数、整数またはステップの群を含むことを意味し、他の数、整数またはステップ、または数、整数またはステップの群を排除しないことを意味すると理解される。本発明を説明する文脈において（特に特許請求の範囲の文脈において）使用される「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」という用語ならびに類似の指示対象は、本明細書において別段の示唆がない限り、または文脈によって明らかに否定されていない限り、単数形と複数形との両方をカバーするものと解釈すべきである。本明細書における値の範囲の記述は、単に、当該範囲内のそれぞれの別個の値を個々に参照する簡略な方法として機能することを意図するものである。本明細書において別段の示唆がない限り、それぞれの個々の値は、それが本明細書に個々に列挙されているかのように本明細書中に組み込まれる。本明細書に記載される全ての方法は、本明細書において別段の示唆がない限り、または明確に文脈に相反しない限り、任意の適切な順番で行うことができる。本明細書において供される、いずれかのおよび全ての例、または例示的な語句（例えば、「などの」、「例えば」）の使用は、単に本発明をよりよく理解させることを意図するものであり、別段特許請求される発明の範囲を限定するものではない。本明細書におけるいずれの文言も、本発明の実施に必須な特許請求されていない要素を示していると解釈すべきではない。
【００２７】
例えば、食品または飼料製品の、および従って、例えば食品または飼料製品に含まれるフィターゼ突然変異体の温度は、例えば、−１８℃、４℃または室温という貯蔵温度、対象、例えばヒトまたは動物における温度（これは例えば３７℃である）、および、例えば除染プロセス（例えば９０℃までの温度での）における食品または飼料製品の製造のための温度によって大きく変化する。本発明の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体は、４℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、２８℃、３０℃、３５℃、３７℃、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃または７５℃〜９０℃で安定かつ活性であり、または、４０℃、４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃、７０℃、７５℃、８０℃、８５℃または９０℃までで安定かつ活性である。
【００２８】
さらに、ヒトまたは動物の腸管を通過するフィターゼは、異なるｐＨ範囲に曝露され、例えばヒトにおいて、唾液は約６．５〜７．５のｐＨを有し、上部胃は約４．０〜６．５のｐＨを有し、下部胃は約１．５〜４．０のｐＨを有し、十二指腸は約７．０〜８．５のｐＨを有し、小腸および大腸は約４．０〜７．０のｐＨを有する。フィテートからのホスフェートの高い開裂率をもたらす高効率フィターゼ突然変異体、例えば３−フィターゼ突然変異体は、広いｐＨ範囲で活性でなければならない。本発明の生物学的に有効なフィターゼ突然変異体は、ｐＨ２．５〜５．５、ｐＨ３．０〜５．０、ｐＨ３．５〜４．５、３．０〜５．５またはｐＨ５．０〜５．５の範囲で、そして例えば、上記で開示された温度および温度範囲のいずれかで、それぞれ安定かつ活性である。
【００２９】
本発明のフィターゼおよびフィターゼ突然変異体の活性は、特定のｐＨでのホスフェート放出（ｍｍｏｌ／Ｌフィテートで示される）を測定することによって決定される。配列番号２などの参照と比較した、異なるｐＨにおけるフィターゼ突然変異体の活性についての情報を提供する性能指数を、［（ｐＨ  Ｘで放出されたホスフェート［ｍＭ］）突然変異体／ｐＨ  Ｘで放出されたホスフェート［ｍＭ］）参照］ｘ［（ｐＨ  Ｙで放出されたホスフェート［ｍＭ］）突然変異体／（ｐＨ  Ｙで放出されたホスフェート［ｍＭ］）参照］（式中、ＸおよびＹは、異なるｐＨ値である）、すなわち、例えば［（ｐＨ３で放出されたホスフェート［ｍＭ］）突然変異体／ｐＨ３で放出されたホスフェート［ｍＭ］）配列番号２］ｘ［（ｐＨ５で放出されたホスフェート［ｍＭ］）突然変異体／（ｐＨ５で放出されたホスフェート［ｍＭ］）配列番号２］と定義する。
【００３０】
生物学的有効性指数は、フィターゼ突然変異体の性能および安定性の相関を、参照、例えば配列番号２と比較して決定し、ＩＣ５０（バリアント）／ＩＣ５０（参照）ｘ［（ｐＨ  Ｘで放出されたホスフェート［ｍＭ］）突然変異体／ｐＨ  Ｘで放出されたホスフェート［ｍＭ］）参照］ｘ［（ｐＨ  Ｙで放出されたホスフェート［ｍＭ］）突然変異体／（ｐＨ  Ｙで放出されたホスフェート［ｍＭ］）参照］（式中、ＸおよびＹは異なるｐＨ値である）、すなわち、例えばＩＣ５０（バリアント）／ＩＣ５０（配列番号２）ｘ［（ｐＨ３で放出されたホスフェート［ｍＭ］）突然変異体／ｐＨ３で放出されたホスフェート［ｍＭ］）配列番号２］ｘ［（ｐＨ５で放出されたホスフェート［ｍＭ］）突然変異体／（ｐＨ５で放出されたホスフェート［ｍＭ］）配列番号２］として定義される。
【００３１】
本発明において使用される場合に語句「飼料」または「飼料製品」は、任意の種類の動物、例えば哺乳動物および鳥類、例えばこれらに限定はされないが反芻動物、ブタ、シカ、家禽（しかし一般に魚介類と呼ばれる魚または他の水性家畜もまた含む）に給餌するために適切なものとして当業者に公知の任意の製品に関する。反芻しない動物、例えば家禽（ｐｏｕｌｔｒｙ）、ブロイラー、鳥類、鶏、七面鳥、鴨、ガチョウおよび大型の鳥（ｆｏｗｌ）；反芻動物、例えば雌牛、牛、馬および羊；豚（ｐｉｇｓ）、豚（ｓｗｉｎｅ）、子豚、育成豚および雌豚；猫、犬、げっ歯類およびウサギを含むがこれらに限定されないコンパニオンアニマル；サケ、マス、ティラピア、ナマズおよびコイを含むがこれらに限定されない魚類；シュリンプおよびエビを含むがこれらに限定されない甲殻類のための飼料製品が含まれる。
【００３２】
本発明に従って使用される場合に、語句「食物」または「食品」は、ヒトの飲食に適するものとして当業者に公知の任意の製品に関する。
【００３３】
本発明の飼料製品または食品は例えばデンプンを含む。デンプン含有飼料成分には、典型的には、植物性材料、例えば穀物（穀物類）、例えば一種以上のトウモロコシ（ｃｏｒｎ／ｍａｉｚｅ）、小麦、大麦、ライムギ、米、モロコシおよびキビ、および／または塊茎、例えばジャガイモ、キャッサバおよびサツマイモが含まれる。前記植物性材料は、粉砕されてもよく、例えば湿式もしくは乾式粉砕粒、または穀類蒸留粕（ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  ｄｒｙ  ｇｒａｉｎ  ｓｏｌｉｄｓ）であってもよい。
【００３４】
本発明の飼料製品または食品は、例えば、タンパク質に富む飼料成分、例えばダイズ（好ましくはダイズミール）、ナタネ、パーム核、綿実およびヒマワリを含む。
【００３５】
さらに、前記飼料製品または食品は、例えば、ビタミン類、鉱物類、有機酸、プロバイオティック成分、油類、脂肪類、顔料、増殖因子および抗菌剤からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を含む。
【００３６】
任意選択的に、前記飼料製品または食品は、前記の３−フィターゼ突然変異体に加えて、少なくとも１種以上の酵素、例えば飼料の消化率を改善し、および／または３−フィターゼ突然変異体によって産生される中間体生成物、例えばイノシトール−テトラホスフェートを分解する食物または飼料酵素、例えば別のフィターゼ、例えば６−フィターゼ、アミラーゼまたはプロテアーゼ、アミノペプチダーゼ、カルボヒドラーゼ、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、クチナーゼ、シクロデキストリングリコシルトランスフェラーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エステラーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、アルファ−グルコシダーゼ、ベータ−グルコシダーゼ、ハロペルオキシダーゼ、インベルターゼ、ラッカーゼ、リパーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、ペクチン分解酵素、ペプチドグルタミナーゼ、ペルオキシダーゼ、ポリフェノールオキシダーゼ、タンパク質分解酵素、リボヌクレアーゼ、トランスグルタミナーゼまたはキシラナーゼを含む。食物もしくは飼料酵素（複数可）は、例えば、微生物、例えば細菌または真菌に由来するか、または植物または動物に由来する。
【００３７】
前記飼料製品または食品は、例えば、粒状物、圧密物（ｃｏｍｐａｃｔａｔｅ）、押出物または液体形態の形態である。
【００３８】
本発明のフィターゼ突然変異体は、対象に、例えば食品または飼料製品中で、あるいは食品または飼料製品なしで直接、例えば錠剤、粉末、液体、押出物または粒状物、例えばコーティングされた粒状物（例えば、塩、例えば少なくとも６０ｗ／ｗ％の例えばＮａＣＩ、ＫＣＩ、Ｎａ２Ｓ０４、Ｋ２Ｓ０４およびＭｇＳ０４からなる群から選択される塩、を含むコーティングを有する）の形態で、投与される。
【００３９】
本発明のフィターゼ突然変異体は、例えば、食品または飼料製品、例えば乾燥もしくは液体形態の穀物、トウモロコシ、干し草、糖蜜および藁のペレット化または押出混合物の製造のために使用される。
【００４０】
本明細書において使用される場合、「液体形態」は、例えば、バッファー、安定剤および抗菌剤、および任意選択的に少なくとも１種のさらに別の酵素を含む組成物に関し、ここで、前記酵素は、アミラーゼ、セルラーゼ、ラクターゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、カタラーゼ、キシラナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、マンナナーゼ、アミラーゼ、アミダーゼ、エポキシドヒドロラーゼ、エステラーゼ、ホスホリパーゼ、トランスアミナーゼ、アミンオキシダーゼ、セロビオヒドロラーゼ、アンモニアリアーゼまたはそれらの任意の組み合わせである。
【００４１】
本明細書で使用される場合に、「乾燥形態」は、例えば１種以上の以下の成分を含む、組成物に関する：担体、バッファー、安定剤、結合剤、可塑剤、抗菌剤。食品または飼料製品の乾燥形態は、例えば、スクロース、塩化ナトリウム、ソルビトール、クエン酸ナトリウム、ソルビン酸カリウム、安息香酸ナトリウム、プロピオン酸ナトリウム、グアーガムおよび／または小麦粉を含む。
【００４２】
本発明のフィターゼ突然変異体の配列は例えば以下の通りであり、これらは例で部分的に試験された：
【００４３】
配列番号１
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＮＮＶＫＴＩＱＥＧＴＮＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＳＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＫＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＲＩＹＬＨＧＰＥＶＬＡＮＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＫＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＹＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００４４】
配列番号２
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＫＧＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＳＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＤＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＳＫＫＧＮＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＮＩＡＥＴＩＲＬＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００４５】
配列番号３
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＮＮＶＫＴＩＱＥＧＴＮＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＭＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００４６】
配列番号４
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＮＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００４７】
配列番号５
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＮＮＶＫＴＩＱＥＧＴＮＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＳＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００４８】
配列番号６
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＲＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００４９】
配列番号７
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＬＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００５０】
配列番号８
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＮＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＨＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００５１】
配列番号９
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＳＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＫＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００５２】
配列番号１０
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＲＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＲＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＴＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＹＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００５３】
配列番号１１
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＲＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００５４】
配列番号１２
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＲＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＨＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００５５】
配列番号１３
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＲＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００５６】
配列番号１４
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＴＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＫＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＴＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００５７】
配列番号１５
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＲＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＳＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＧＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００５８】
配列番号１６
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＨＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００５９】
配列番号１７
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【００６０】
配列番号１８
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【００６１】
配列番号１９
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配列番号２６
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配列番号２８
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【００７６】
配列番号３４
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【００７７】
配列番号３５
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【００７８】
配列番号３６
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【００７９】
配列番号３７
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【００８０】
配列番号３８
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＥＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＧＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＲＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００８１】
配列番号３９
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＡＳＮＶＡＫＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＴＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＫＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＭＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＲＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００８２】
配列番号４０
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＡＳＮＶＡＫＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＥＥＤＮＮＧＳＩＳＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＫＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＭＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００８３】
配列番号４１
ＥＴＴＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＡＳＮＶＡＫＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＶＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＴＬＨＧＰＥＶＬＡＮＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＤＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＫＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＭＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＲＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００８４】
配列番号４２
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＥＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＲＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＡＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００８５】
配列番号４３
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＧＮＶＫＡＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＥＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＲＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＫＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＤＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００８６】
配列番号４４
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＥＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＲＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＲＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００８７】
配列番号４５
ＤＴＰＳＡＡＡＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＥＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＲＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００８８】
配列番号４６
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＥＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＲＬＨＧＰＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＡＡＡＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００８９】
配列番号４７
ＤＴＰＳＳＧＷＴＬＥＫＶＶＥＶＳＲＨＧＶＲＰＰＴＥＳＮＶＫＴＩＱＥＧＴＤＲＱＷＰＴＷＬＴＱＹＧＥＬＴＧＨＧＹＡＡＡＥＬＫＧＨＹＥＧＱＹＬＲＱＨＧＬＬＣＱＡＣＰＡＰＧＤＶＦＶＷＡＳＰＬＱＲＴＲＥＴＡＭＡＬＭＤＧＶＦＰＧＣＧＶＡＩＱＧＰＥＤＥＤＮＤＰＬＦＨＡＥＴＡＧＶＴＬＤＱＱＱＶＫＡＤＬＱＮＡＭＱＮＫＳＡＡＱＩＱＡＱＷＱＰＡＩＤＲＬＫＱＡＶＣＬＰＤＫＰＣＰＡＦＳＴＰＷＥＶＫＥＤＮＮＧＳＩＲＬＨＧＰＥＶＡＡＡＥＶＬＡＩＩＡＥＴＩＱＭＳＹＳＮＮＮＰＬＳＥＶＡＦＧＨＡＫＴＡＡＥＶＡＡＬＭＰＬＬＴＡＮＹＤＦＴＮＤＬＰＹＶＡＲＲＧＡＳＶＬＭＮＱＩＡＬＡＬＮＴＥＨＱＡＤＡＰＰＤＡＫＷＬＬＹＶＡＨＤＴＮＩＡＫＬＲＴＭＬＧＦＴＷＱＭＧＤＹＰＲＧＮＩＰＰＡＧＳＬＩＦＥＲＷＲＮＱＱＳＧＱＲＶＶＲＩＹＦＱＡＱＳＬＤＱＩＲＧＬＡＡＬＤＤＳＨＰＰＬＲＳＥＦＳＭＰＤＣＱＫＴＤＩＧＴＬＣＰＹＤＡＶＭＫＲＬＮＤＡＶＤＲＴＡＬＬＰＶＨＹＴＰＨＨＨＨＨＨ
【００９０】
例
以下、例により本発明を説明する。これらの例は、例示の目的だけのために考慮されるものであり、いかなる点においても本発明および特許請求の範囲の範囲を限定するものではない。
【００９１】
例１：３−フィターゼ突然変異体の熱安定性
熱安定性に関する３−フィターゼ突然変異体の特性分析を、熱処理前後にアセテートバッファーにおいてｐＨ５．５で体積活性を測定することによって行った。熱処理を異なる温度（５８〜８５℃）で１５分間行い、酵素活性を、例４による光度アッセイを用いて異なる時点でのホスフェート放出を測定することによって決定した。熱処理前後の活性を用いて、ＩＣ５０値を決定した。ここで、ＩＣ５０は、酵素が２５分のインキュベーション後に５０％の残留活性を示す温度として定義される。配列番号２の全ての３−フィターゼ突然変異体が、以下に示すように野生型配列番号２よりも著しく高い熱安定性を示す：
【００９２】
【表１】
2021532804.tif 000002
【００９３】
例２：突然変異Ｄ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｒ２１０ＱおよびＬ２１１Ｍを含む熱安定性３−フィターゼ突然変異体の適用性試験におけるホスフェート放出
突然変異Ｄ１４９Ｎ、Ｓ１８９Ｄ、Ｋ１９０Ｎ、Ｋ１９１Ｎ、Ｒ２１０ＱおよびＬ２１１Ｍを含む配列番号２の各３−フィターゼ突然変異体のホスフェート放出を、ｃｌｏｓｅ−ｔｏ−ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ試験において決定し、野生型配列番号２と比較した。従って、３−フィターゼ突然変異体をピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）で発現させ、細かい変更を施した（５倍スケールダウンした構成）ＤＩＮ  ＥＮ  ＩＳＯ  ３００２４：２００９（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｉｓｏ．ｏｒｇ／ｓｔａｎｄａｒｄ／４５７８７．ｈｔｍｌ）に従って体積活性を決定した。酵素を、５００ユニット／ｋｇ飼料で適用性試験において施与した。ここで、トウモロコシとダイズの７０／３０混合物１５ｇを、２５％乾燥物質を用いて４１℃で６０分間、ｐＨ３および５でインキュベートした。その後、放出されたホスフェートを、例４によるモリブデン酸アンモニウムアッセイを用いて測定した。性能指数を、以下のように計算した：［（ｐＨ３で放出されたホスフェート［ｍＭ］）バリアント／ｐＨ３で放出されたホスフェート［ｍＭ］）配列番号２］ｘ［（ｐＨ５で放出されたホスフェート［ｍＭ］）バリアント／（ｐＨ５で放出されたホスフェート［ｍＭ］）配列番号２］。全ての３−フィターゼ突然変異体が、以下の表に示すように、野生型配列番号２と比較して改善された性能指数を示す：
【００９４】
【表２】
2021532804.tif 000003
【００９５】
例３：配列番号２の熱安定性３−フィターゼ突然変異体のｐＨプロファイルの決定
３−フィターゼ突然変異体の改善された性能は主に、より低いｐＨに向かってシフトしたｐＨプロファイルによって見出される。従って、配列番号２の選択された３−フィターゼ突然変異体のｐＨプロファイルは、例４に従う光度アッセイを用いて異なるｐＨでの活性を測定することによって決定した。図は、野生型配列番号２と比較した、全てのバリアントに関してのｐＨ最適条件のシフトを示す。
【００９６】
例４：３−フィターゼ突然変異体の酵素活性の決定
５ｐＬ酵素溶液（１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ５．５、０．０５％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００における）を、９５ｐＬ  ２．８８ｍｍｏｌ／Ｌフィチン酸ナトリウム（Ｓｉｇｍａ  ６８３８８、ｌｏｔ  ＢＣＢＭ４００６Ｖ）と、１００ｍｍｏｌ／Ｌ酢酸ナトリウムバッファー、ｐＨ ５．５において２５分間インキュベートした。１００ｐＬの１０％（ｗ／ｖ）トリクロロ酢酸を添加することにより反応を停止した。引き続き、１００ｐＬの停止させた酵素反応を、１００ｐＬのモリブデート試薬（１．２％（ｗ／ｖ）モリブデン酸アンモニウム；４．４％（ｖ／ｖ）硫酸および２７ｍｇ／ｍＬ（ｗ／ｖ）硫酸鉄の水溶液）と混合し、当該溶液を室温で１５分間インキュベートした。７００ｎｍでの吸光度を測定し、放出された無機ホスフェートの量を、無機ホスフェート標準溶液（０〜１．５ｍｍｏｌ／Ｌ）を用いて計算した。１ユニットのフィターゼ活性を、３７℃で１分あたり１μｍｏｌのホスフェートを放出する酵素量として定義した。
【図１】
2021532804.tif 000004
【図２】
2021532804.tif 000005
【図３】
2021532804.tif 000006
【配列表】
2021532804000001.app
【国際調査報告】
2021532804.tif 000007
2021532804.tif 000008
2021532804.tif 000009