(57)【要約】  生菌製品としてのラクトバチルス・サリバリウス株、及び中耳炎と上気道感染症の予防及び/または治療におけるその使用。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ラクトバチルス・サリバリウス PS7株または該株と少なくとも95％の同一性を有する株、もしくはそれらの変異株であって、ここで、該変異株が、寄託株を原料として用いて得られ、また、中耳炎及び上気道感染症の治療または予防において該ラクトバチルス・サリバリウスPS7株の活性を保持し、またはさらに改良する、ラクトバチルス・サリバリウス PS7株または該株と少なくとも95％の同一性を有する株、もしくはそれらの変異株。
【請求項２】
ラクトバチルス・サリバリウスPS7株と少なくとも97％の同一性を有する、請求項1に記載の株。
【請求項３】
前記株がラクトバチルス・サリバリウスPS7である、請求項２に記載の株。
【請求項４】
請求項１〜３のいずれかに記載の株を含む組成物。
【請求項５】
生菌として使用するための、請求項４に記載の組成物。
【請求項６】
治療剤及び／または予防剤として使用するための、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
中耳炎または上気道感染症（URI）の治療及び／または予防に使用するための、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
中耳炎の治療及び／または予防に使用するための、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
急性中耳炎（AOM）の治療及び／または予防に使用するための、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
中耳炎を起こし易い子供における中耳炎または上気道感染症の治療及び／または予防に使用するための、請求項７、８または９に記載の組成物。
【請求項１１】
上気道感染症の治療及び／または予防に使用するための、請求項７に記載の組成物。
【請求項１２】
有効量の請求項１〜３のいずれかに記載の株を、薬剤的に許容される賦形剤と共に含む医薬品。
【請求項１３】
有効量の請求項１〜３のいずれかに記載の株を、他の食用成分含と共に含む食品。
【請求項１４】
栄養補助食品、栄養補助製品または乳製品から選択される、請求項１３に記載の食品。
【発明の詳細な説明】
【本発明の分野】
【０００１】
本発明は、生菌株の分野、特に、新規生菌株ラクトバチルス・サリバリウス、それを含む組成物、その取得方法、及び疾患、特に中耳炎と上気道感染症の予防及び治療のためのその使用に関する。
【本発明の背景】
【０００２】
急性中耳炎（AOM）は、最も一般的な細菌による感染症の1つであり、小児期における抗生物質を用いる治療の主な理由である（Hendley、2002年）。耳管は成人よりも子供の方が短いため、細菌やウイルスが中耳に侵入しやすく、急性中耳炎を引き起こす。肺炎球菌（strep）やヘモフィルスインフルエンザ（H. flu）等の細菌は急性中耳炎症例の約85%を占め、ウイルスは残りの15%を占める。2歳までの子どもの約70%が中耳炎を少なくとも1回経験し、またその20〜30%が再発性AOMに罹患している（Pichichero、2000年）。再発性AOM（rAOM）は、子供とその家族に不快感を与え、社会に経済的負担をもたらす（Klein、2001年）。
【０００３】
風邪とも知られる上気道感染症（URI）は、最も一般的な病気の1つであり、毎年それによる医療機関への受診、学校や仕事の欠席が他の病気によるものより多い。2歳未満のほとんどの子供は、1歳までにURIを数回経験し、先進国では、その4分の1が再発または長期感染に苦しんでいる。鼻や喉の粘膜に炎症を起こすウイルスによる風邪は200種以上の異なるウイルスが原因で発生することがある。しかし、全ての風邪ウイルスの中で大部分の風邪を引き起こすのはライノウイルスである。他種のウイルスとしては、コロナウイルス、パラインフルエンザ、アデノウイルス、エンテロウイルス、及び呼吸器合胞体ウイルスがある。これらのウイルスは免疫反応を引き起こし、結果的に粘液産生の増加、鼻粘膜の腫れ、呼吸困難、増加した粘液が喉から垂れ下がることによる鬱血、くしゃみ、及び咳を引き起こす。上気道感染症も急性中耳炎の主要な危険因子である。
【０００４】
抗生物質はウイルスに対して有効ではないため、URIは小児診療において抗生物質の不適切な処方につながる。抗生物質の不適切な広範囲の使用は、細菌耐性の発生につながり、ヒトの微生物叢の正常なバランスを乱すことがある。これは、病原体コロニーを促進し、ウイルスに対するワクチンの利用可能性を低下させる。
【０００５】
同様に、抗生物質を用いた再発AOMの治療及び予防は、必然的に抗生物質耐性微生物の発生と正常な上気道微生物叢のバランスの乱れにつながり、これは、病原体のコロニー形成をさらに促進する(BrookとGober、2000年)。
【０００６】
世界保健機関による定義では、生菌は、適切な量で投与されると、宿主に健康上の利益を与える生きた微生物とされている。最も一般的に用いられる生菌として、乳酸菌種及びビフィズス菌種があるが、他には連鎖球菌、腸球菌、プロピオン酸菌、桿菌、及び大腸菌がある。また、いくつかの酵母種は生菌として用いられる。例えば、サッカロマイセス・ブラウディや出芽酵母は、胃腸障害の治療に頻繁に用いられる。生菌製品は、カプセル、錠剤、粉末（栄養補助食品として規制されている）として製剤化され、また食品成分（ヨーグルト、ケフィア等）や薬物とされてもよい。生菌は、宿主の腸内細菌叢のバランスをとり、自然免疫及び適応免疫系と相互作用する等幅広い有益な効果を発揮し、病原体に対する耐性を促進することがある。
【０００７】
過去数年間、生菌が呼吸器や胃腸の状態、泌尿生殖器の感染症、アレルギー、早産児の壊死性腸炎、乳児疝痛、自己免疫疾患、過敏性腸症候群（IBS）に広く使用されてきた。生菌療法は、微生物バランスの再確立、中耳炎を含む感染症の予防に魅力的な選択肢を提供する（Niittynenら、2012年）。微生物による病原体への干渉に寄与する生菌のメカニズムとしては、必須栄養素と上皮表面上接着部位の競合、バクテリオシンと他の阻害物質の産生、及び粘膜免疫と全身免疫の強化が含まれる（Popovaら、2012年）。
【０００８】
WO2006/007526には、、乳児における呼吸器感染症と急性中耳炎の治療法または予防法が記載されている。それには、ビフィズス菌株を投与することや乳酸菌種等の生菌を促進することが含まれる。
【０００９】
WO2016/0077190には、呼吸器ウイルス感染の病原性炎症の後遺症を予防するための吸引投与用の組成物における乳酸菌種の使用が記載されている。
【００１０】
WO2015/093937には、ラクトバチルス・サリバリウス株は乳房炎の治療に使用することが記載されている。
【００１１】
中耳炎、特に急性中耳炎（AOM）と上部呼吸器感染症（URI）は、幼児の間で広まっている健康問題であり、その予防法と治療法が緊急に必要とされている。以前の研究は、生菌が健康な子供たちにおけるURIとAOMの発生を減らすことを示したが、該株が、そのような状態を防止し、中耳炎を非常に起こし易い子供たちの原因となる病原体の鼻咽頭への移行を減らすことができなかった。そのため、特に中耳炎を起こし易い子供において、中耳炎及び上気道感染症の新規治療法が必要である。
【本発明の概要】
【００１２】
我々は、ラクトバチルス・サリバリウスの生菌株を健康な女性の膣の拭き取り検体から単離し、特徴付けした。これは、中耳炎及び上気道感染症等他の上気道症状の予防や治療に有用である。実施例に示されるように、本発明のラクトバチルス・サリバリウスPS7株は、再発性AOMに苦しむ子供（中耳炎にかかりやすい子供）における急性中耳炎（AOM）関連の発症、及び/または中耳炎病原体の外耳道内への移行を減少させることができ、そのような非常にかかりやすい集団での予防に高い可能性を示している。該ラクトバチルス・サリバリウス株PS7は寄託されており、受入番号CECT9422が付与されている。
【００１３】
一態様では、本発明は、ラクトバチルス・サリバリウスPS7株、または該株と少なくとも95%の同一性を有する株、またはそれらの変異株に関し、ここで、該変異株が、前記寄託株を原料として用いることで得られ、また、該変異株が、中耳炎及び上気道感染症の予防または治療における該ラクトバチルス・サリバリウスPS7株の活性を保持し、またはさらに改良する。好ましくは、該株は、ラクトバチルス・サリバリウスPS7株と少なくとも97%の同一性を有する。
【００１４】
別の態様では、該株は、ラクトバチルス・サリバリウスPS7である。
【００１５】
本発明は、また上記で定義した株を含む組成物、及びその生菌としての使用に関する。
【００１６】
別の態様では、本発明は、中耳炎または上気道感染症（URI）の予防及び／または治療、好ましくは、急性中耳炎（AOM）の治療及び／または予防のための上記で定義された株または組成物に関する。
【００１７】
本発明の株及び組成物は、中耳炎にかかりやすい子供における中耳炎または上気道感染症の治療及び／または予防に特に有用である。
【００１８】
別の態様では、本発明は、先に定義された有効量の該株及び薬剤的に許容される賦形剤を含む医薬品に関する。
【００１９】
別の態様では、本発明は、上記で定義された有効量の該株及び他の食用成分を含む食品に関する。好ましくは、該食品は、栄養補助食品、栄養補助製品または乳製品から選択される。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】バクテリオシンAbp118の構造遺伝子を検出するためのPCRアッセイ。レーン1：マーカー（HyperladderTM 100bp、BIOLINE）；レーン2：陽性対照；レーン3：陰性対照；レーン4、5及び6：L.サリバリウス PS7。
【図２】室温保存における凍結乾燥したL.サリバリウス PS7培養物（赤い線）の安定性。
【図３】4℃保存における凍結乾燥したL.サリバリウス PS7培養物の安定性。
【本発明の詳細な説明】
【００２１】
定義
本明細書において、
「生菌」という用語は、宿主の健康に有益な効果を与える微生物を意味する。これは、微生物のバランスを改善することにより宿主に有益な効果を与える、生きている微生物が供給されたサプリメントまたは医薬品、生きている細菌または死んだ細菌を含む微生物の調製物、またはその両方の組み合わせであってもよい。
【００２２】
「株」という用語は当分野で周知であり、微生物の遺伝的変異体またはサブタイプを意味する。「突然変異株」は、突然変異による1つ以上の（新しい）特性が野生型とは異なるものである。
【００２３】
「中耳炎」という用語は、耳における炎症を意味する。中耳炎の場合には、中耳に炎症があり、中耳に感染した液体がたまる、鼓膜が膨らむ、耳が痛む、鼓膜に穴があいた場合には化膿物質（膿）が外耳道に排出される特徴がある。
【００２４】
「上部気道感染症」という用語は、肺の上にある呼吸器系の上部における感染症を意味する。上気道感染症は、任意の数のウイルス性または細菌性の感染によるものがある。これらの感染症は、喉（咽頭炎）、鼻咽頭（鼻咽頭炎）、副鼻腔（副鼻腔炎）、喉頭（喉頭炎）、気管（気管炎）または気管支（気管支炎）に影響を及ぼすことがある。
【００２５】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、所望の有益性をもたらすのに十分に高いが、深刻な副作用を回避するのに十分に低い活性剤の量を意味する。
【００２６】
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【００２７】
本発明はまた、実施例に記載されるL.サリバリウス PS7株の16S rRNA配列と少なくとも95%の同一性を有するL.サリバリウスの株に関する（参照：StackebrandtとGoebel、1994年、「分類学ノート：細菌学における現在の種の定義に関する、DNA-DNA再会合と16s rRNA配列分析のための場所」、Int. J. Syst. Bacteriol. 44:846-849）。
【００２８】
好ましい実施形態では、本発明による株は、L.サリバリウスPS7株の16S rRNA配列と少なくとも97%の同一性を有し、より好ましくは少なくとも98%の同一性を有し、より好ましくは少なくとも99%の同一性を有する。別の好ましい実施形態では、本発明による株は、L.サリバリウスPS7の16S rRNA配列と100%の同一性を有する。即ち、本発明による株は、ラクトバチルス・サリバリウス株PS7である。
【００２９】
寄託されたラクトバチルス・サリバリウス PS7株から、当業者は、通常の変異誘発または再単離技術により、本明細書に記載のPS7株の関連特徴及び利点を保持するさらなる変異体またはその誘導体を日常的に得ることができる。したがって、ラクトバチルス・サリバリウス PS7の変異株も本発明の一部である。本発明の文脈において、「その変異体」という用語は、該寄託株を原料として用いて得られる変異株に関する。該変異株は、親株の治療特性を保持し、または増強する。当業者は、特に本願の実施例に記載されているような中耳炎及び上気道感染症の治療及び／または予防における該株の治療活性を決めるため、採用する適切な方法を決める。
【００３０】
本発明の株は、実施例で示されるように、哺乳動物の胃腸環境の条件（酸性環境、高いリゾチーム、胆汁酸塩及び過酸化酸素の濃度）に対して非常に耐性があり、したがって、GITの通過を生き残ることができる。該株は腸上皮への接着性も良好である。これにより該株は腸管内に留まり、生菌の効果を発揮できる。
【００３１】
本発明では、上記で定義された生きた微生物が好ましい。その理由として、これらは、完全な一連の抗原を産生し、腸内環境または他の身体組織内において再生し、そのような生物の数を増やし、粘膜の相互作用を促進し、また、腸や他の体組織に付着し、粘膜の免疫反応をよりよく刺激することがある。
【００３２】
組成物
好ましくは、本発明のL.サリバリウス PS7株、またはその変異株は、栄養組成物、栄養補助品、医薬組成物または栄養組成物等の組成物に含まれ、好ましくは、栄養組成物または栄養補助品、または医薬品に含まれる。好ましくは、本発明の組成物は、本発明のL.サリバリウス PS7株またはその変異株、ならびに生理学的に許容される担体または賦形剤及び/または下記のさらなる成分を含む。好ましくは、本発明によるL.サリバリウス株は、凍結乾燥の状態で存在する。
【００３３】
当技術分野で知られている任意の生理学的に許容される賦形剤または担体を使用することができる。適切な賦形剤または担体には、水、グルコース、ラクトース、スクロース、マンニトール、マルトデキストリン、（耐性）デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、例えば メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石、炭酸マグネシウム等が含まれるが、これらに限定されない。
【００３４】
本発明による組成物は、上記のようなL.サリバリウスPS7株またはその変異株とは別に、さらなる生菌を含んでもよい。生菌には免疫系に有益な効果があるため、生菌との組み合わせは免疫系に優れた効果がある。好ましくは、さらなる生菌は、乳酸桿菌及びビフィズス菌からなる群から選択される。
【００３５】
本発明の組成物は、プレバイオティクスをさらに含んでもよい。プレバイオティクスは、複製されない状態になる前のプロバイオティクスの成長をサポートすることがある。「プレバイオティクス」とは、腸内の健康に役立つ微生物やプロバイオティクスの成長を促進する非消化性の食品物質を意味する。それらは胃及び/または上部の腸で分解されず、それらを摂取した人の消化管で吸収されないが、胃腸内微生物叢及び/またはプロバイオティクスによって発酵される。好ましくは、それらは、オリゴ糖、任意でフルクトース、ガラクトース、マンノースを含む；食物繊維、特に可溶性繊維、大豆繊維;イヌリン;またはそれらの混合物からなる群から選択されてもよい。好ましいプレバイオティクスは、フラクトオリゴ糖、ガラクトオリゴ糖、イソマルトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、アラビノキシロオリゴ糖、マンナンオリゴ糖、大豆オリゴ糖、グリコシルスクロース、ラクトスクロース、ラクツロース、パラチノースオリゴ糖、マルトオリゴ糖、ガム糖またはオリゴ糖ペクチン及び/またはその加水分解物である。
【００３６】
当業者は、最終剤形に応じて本発明の組成物中の各株のコロニー形成単位（cfu）の有効量を決める。例えば、食品において、本発明の株は、約105 cfu/g〜約1012 cfu/gの量で、好ましくは約107 cfu/g〜約1012 cfu/gの量で、より好ましくは約109 cfu/g〜約1012 cfu/gの量で存在する。これらの量は全て乾燥重量のグラム数として表される。
【００３７】
CFUという用語は、「コロニー形成単位」を指す。通常、元の試料を連続に希釈して、寒天プレート上で成長したコロニー形成単位（CFU）の総数を計数して、試料中の細菌を定量する。これは試料のグラムまたはmLあたりのCFUとして表される。このように、プレート上のコロニーの数を熟練に解釈し、存在する細胞の推定数を得る。
【００３８】
好ましい実施形態では、本発明による組成物は、栄養組成物または栄養補助品である。本発明による補助品は、粉末、錠剤（チュアブル錠を含む）またはカプセルの形態であってもよい。本発明による栄養組成物は、任意の食品または飲料であってもよい。好ましくは、本発明による組成物、特に栄養補助品は、生理学的に許容される賦形剤または担体をさらに含む。好ましい実施形態では、該組成物または補助品は、1〜10 g、より好ましくは1.5〜7 g、最も好ましくは2〜5 gの量を含む容器（好ましくは小袋）に詰められた粉末である。好ましくは、各容器は１回の用量を含む。
【００３９】
本発明による組成物が栄養補助食品として用いられる場合、水、ヨーグルト、ミルクまたはフルーツジュース等の適切な飲料と混合し、あるいは固体または液体の食品と混合して投与することができる。これに関連し、該栄養補助食品は、通常は単位用量の形態にある錠剤、丸薬、カプセル、顆粒、粉末、懸濁液、サシェ、トローチ、スイーツ、バー、シロップ及び相当する投与形態であってもよい。
【００４０】
投与方法
本法で用いられる組成物は、好ましくは経腸投与され、より好ましくは経口投与される。本発明による組成物は、1日1回の単回投与または1日数回の反復投与、例えば1日少なくとも2回、少なくとも3回、または少なくとも4回で投与することができる。好ましくは、本発明による組成物は、1日2回以上投与される。特に好ましい実施形態では、本発明による組成物は、1日2用量または3用量で投与され、最も好ましくは1日3用量で投与される。好ましくは、本発明の株またはその変異体は、用量あたり105cfu〜用量あたり約1012cfuで、好ましくは、用量あたり約107cfu〜用量あたり約1012cfu、より好ましくは用量あたり約109cfu〜用量あたり約1012cfuで投与される。「用量あたり」という用語は、この量の微生物が、1日あたりまたは1回の摂取あたり、好ましくは1日あたりのいずれかで被験者に提供されることを意味する。当業者は、治療的有効量及び／または予防的有効量を適切に調整できるであろう。
【００４１】
予防的用途では、本発明による組成物は、障害にかかりやすいか、そうでなければ障害のリスクがある人に、その障害を発症するリスクを少なくとも部分的に低減するのに十分な量で投与される。そのような量は「予防的有効量」であると定義される。繰り返しになるが、正確な量は、子供の健康状態や体重等の多くの要因、及び食品マトリックスの影響に依存する。
【００４２】
本発明の一実施形態では、本発明の株または組成物は子供に投与される。好ましい実施形態では、それが就学前の子供である。いくつかの好ましい実施形態では、それが約3歳〜約5歳の間の子供である。
【００４３】
一実施形態では、それが中耳炎を起こし易い子供である。好ましくは、それが中耳炎及び／または上気道感染症に罹患しているか、または罹患し易い子供である。
【００４４】
有益な効果
以下の実施例によって証明されたように、本発明の株及び組成物は安全であり、重要な有益な効果を有する。臨床試験において、本発明の株は、介入前の6ヶ月間と比べて、中耳炎の子供たちの6ヶ月間の介入でAOMの発症数を86％減少した。また、AOMが発生した際、AOMの平均発症期間も短縮された。最後に、本発明の株は、該生菌を投与された子供における上気道感染症の発症数を減らした。
【実施例】
【００４５】
実施例１：PS7株の同定と特徴付け
1.1. 膣の拭き取り検体からの単離と同定（種と株）
健康な女性の母乳と膣中の乳酸菌グループの細菌多様性を評価し、それらの腸からの潜在的な転位を調べるための研究の枠組みの中でラクトバチルス・サリバリウス PS7を単離した。女性を以下の基準で本研究に登録した：（a）現在または過去に基礎疾患（乳房炎を含む）のない健康な女性;（b）通常の満期妊娠;及び（c）乳児及び/または周産期の問題（乳房炎を含む）がないこと。出産後7日目に母乳試料、膣拭き取り検体、及び直腸拭き取り検体を滅菌チューブ及びスワブの中に無菌的に採取し、採取後最初の3時間以内に実験室へ搬入するまで4℃で保管した。該株が単離された本研究は、Clinico病院（マドリード）の臨床研究に関する倫理委員会の承認を得た。
【００４６】
膣及び直腸の拭き取り検体に含まれる生体物質を1 mlのペプトン水に再懸濁した。該試料のペプトン水希釈液を、L-システイン(0.5 g/L）を添加したde Man、Rogosa and Sharpe(MRS, Oxoid, Basingstoke, 英国)の寒天プレート（MRS-Cys）にn＝3でプレーティングし、嫌気性ワークステーション(MINI-MACS, DW Scientific社, Shipley, 英国)を用い、37℃で嫌気的に（85％窒素、10％水素、5％二酸化炭素）48時間インキュベートした。
【００４７】
位相差顕微鏡で分離株を検査し、細胞形態とグラム染色反応を判定し、オキシダーゼとカタラーゼの活性、及び37℃で最大24時間インキュベートしたMRSブロスの良好な増殖（>108 CFU/ml）について試験した。
【００４８】
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【００４９】
Probisearchの施設（Tres Cantos、スペイン）において、Vitek-MS（登録商標）機器（BioMerieux社、Marcy l'Etoile、フランス）を用いたMatrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight（MALDI-TOF）質量分析により、該同定結果を確認した。簡単に言えば、細菌コロニーの一部（約1 μl）をMALDI試料プレートに直接スポットした。次に、これに1 μlのα-シアノ-4-ヒドロキシケイ皮酸のアセトニトリル飽和溶液（28％）を重層し、室温で乾燥させた。少なくとも50 m/zのスペクトルプロファイルで平均スペクトルを作成し、Mylaデータベース（Biomerieux社）に含まれるスペクトルとの比較による同定に用いた。同定は、該データベース内の種固有のm/z値に99〜100%一致するものとして定義された。
【００５０】
ランダムに増幅された多型DNA（RAPD）とパルスフィールドゲル電気泳動（PFGE）分析による遺伝子型解析により、該株は我々が収集した他のL.サリバリウス株と区別できた。
【００５１】
1.2. in vitro消化管モデル通過後の生存
Marteauら（1997年）が記載したものに基づいたヒトの胃及び小腸のin vitroモデルを用いて該株の生存について試験した。試験した株を約109 CFU/ml含み、UHTで処理した母乳（25 ml）を、5 mlの滅菌電解質溶液（6.2 g/lのNaCl、2.2 g/lのKCl、0.22 g/lのCaCl2及び1.2 g/lのNaHCO3を含む）の中に希釈し、唾液によるin vivo希釈をシミュレートした。次に、5 mlのブタ胃液を加え、混合物を37℃で攪拌しながらインキュベートした。胃に似た区画のpH曲線は、ヨーグルト摂取後の単胃で見られる値を再現するように制御した（Conwayら、1987年）：開始時pH 5.0、20分にpH 4.1、40分にpH 3.0、及び60分にpH 2.1。通常の胃排出をシミュレートする方法（Marteauら、1997年）で、20、40、60、及び80分に該区画から分画を連続的に採取した。1 M NaHCO3でそれらのpHを6.5±0.2に調整した後、それらを10 mlの滅菌電解質溶液（5 g/lのNaCl、0.6 g/lのKCl、0.3 g/lのCaCl2、4％のブタ胆汁、及び7％のパンクレアチン（Sigma社）を含む）と混合した（これは、十二指腸液の内容物をシミュレートする。）。これらの条件に120分間連続に暴露した後、試料をMRS寒天プレートにプレーティングし、37℃で48時間嫌気的にインキュベートし、細菌の生存率を測定した。これらの測定は全てn = 4で行い、値は平均値±SDとして表した。
【００５２】
結果：該株は消化管で見られた状態をシミュレートした状態へ暴露され後に、その生存率は高かった(51.53%; 表１)。
（表１）
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【００５３】
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【００５４】
本研究に用いられた全ての指標微生物に対し、L.サリバリウス PS7は明確な阻害的な抗菌活性（条斑周囲2 mm以上の阻害ゾーン）を示した。
【００５５】
抗菌活性の原因となる化合物を解明するために、バクテリオシン、過酸化水素、乳酸塩、及び/または酢酸塩の産生について該株をスクリーニングした。
【００５６】
1.4. バクテリオシンの産生
L.サリバリウス PS7株を37℃でMRSブロスの中に初期固定相（A620約1.0）まで増殖させた。該培養物を12,000 g及び4℃で10分間遠心分離し、上清を1 M NaOHでpH6.2に中和し、5分間煮沸し、孔径0.22 μｍのフィルター（Millipore、Bedford、米国）で濾過滅菌した。寒天ウェル拡散アッセイで細胞フリーの上清中のバクテリオシン産生活性を測定した。冷却BHI寒天プレートの中でカットされ、あらかじめ該指標株を播種（105 cfu/ml）したウェル（直径7 mm）に100 μl分量の該上清を入れた。該プレートを4℃で2時間保持した後、指標の増殖に最適な条件下でインキュベートした。バクテリオシノゲン活性の指標として用いられた微生物は、以下の種の異なる菌株であった：インフルエンザ菌、肺炎球菌、化膿性連鎖球菌、モラクセラカタラリス、アロイオコッカス耳炎、アクチノミセスエウロペウス、フェカリス菌、黄色ブドウ球菌、表皮ブドウ球菌、大腸菌及び緑膿菌。
【００５７】
L.サリバリウス PS7は、本研究で試験したいくつかの指標株に対してバクテリオシン産生活性を示したため、サリバリシンの生合成に関連する構造遺伝子を検出するためのPCR分析を行った。簡単に言えば、1つのコロニーを50 μlの滅菌水に再懸濁した。次に、50 μlのクロロホルムを該懸濁液に加えた。4℃で該混合物を13,000×gで10分間遠心分離した。その後、次の開始剤カップルを用いたPCRアッセイにその水相5 μlをDNAテンプレートとして使用した:(i)サリバリシン Bには、SalB-for (5' TGATAAGAAAGAATTGGCACATATAATTG 3',配列番号:3)及びSalB-rev (5' TCTGTTTAACTACAAATATTTTGATTTGAATG-3',配列番号:4) (Cataloluk, 2001年); (ii)バクテリオシン Abp-118には、Abp118A-for (5'-AAACGTGGTCCTAACTGTGTAGG-3',配列番号:5)及びAbp118B-rev (5' AACGGCAACTTGTAAAACCACCAG 3',配列番号:6) (Flynn ら、2002年)。各PCR反応（20 μl）には、5 μlの緩衝混合物（5x MyTaq Red）、0.5 μlの各プライマー、0.15 μlの酵素MyTaq Red DNAポリメラーゼ（BIOLINE）及び13.85 μlの脱イオン水が含まれた。PCRプログラムは次のとおりである。最初の変性ステップ（95℃で2分間）、続いて95℃で30秒間、58℃で30秒間、そして72℃で30秒間のサイクルを30回繰り返し、最後に72℃で5分間延長した。マーカーとして100-1,013 bpラダー（Hyperladder（登録商標） 100 bp、BIOLINE）；染色剤としてゲルレッド核酸染色剤（Biotium）を用いたアガロース（2％）ゲル電気泳動（90 Vで1時間）により、ゲルイメージングシステム（Gel Doc 2000年、Bio-Rad）の中で増幅産物を可視化した。
【００５８】
該株は、本研究で用いられた指標生物として含まれたグラム陽性菌株に対して顕著なバクテリオシン活性を示した。図１に示されるように、既知のサリバリシンの構造遺伝子に関するPCR分析から、該株はバクテリオシンAbp-118を産生できることが明らかになった。
【００５９】
1.5. 過酸化水素の産生
Songらが記載した方法（1999年）に従って乳酸菌株による過酸化水素の産生について最初に試験した。0.25 mg/mlのテトラメチルベンジジン（TMB; Sigma社, St. Louis, 米国）と0.01 mg/mlのホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP、Sigma社）を補充したMRS寒天プレートに該株を接種し、37℃で2日間嫌気的にインキュベートした。HRPは過酸化水素の存在下でTMBを酸化し、H2O2生成コロニーの中で青い色素を形成することが知られている。並行して、YapとGilliland（2000年）の定量法を改変した方法でも過酸化水素を測定した。37℃でMRSブロス10 ml中で該株を嫌気的に24時間増殖させた。4℃及び12000×gで10分間の遠心分離により細胞を収集し、リン酸カリウム緩衝液（50 mM、pH 6）で2回洗浄し、5 mMグルコースを補充した同じ緩衝液9 mlに再懸濁した。9 mlのグルコース含有緩衝液が入ったチューブに該細胞懸濁液（0.5 ml）を接種した。37℃で24時間好気的に培養した後、4℃及び12000×gで10分間の遠心分離により細胞を除去し、上清中の過酸化水素を測定した。簡潔にいえば、5 mlの上清を100 μLの1％水性o-ジアニシジン（Sigma社）及び1 mlの0.001％水性HRPと混合した。該チューブを37℃で10分間インキュベートし、0.2 mlの4 N HClを加え、反応を停止させた。吸光度の読み取り値（A400 nm）を測定し、得られた値をH2O2標準曲線の値と比較することにより、過酸化物の含有量を定量した。全てのH2O2測定における陽性対照としてL.johnsonii La1を使用した。
【００６０】
過酸化水素生成に関する定性的スクリーニングにおいて、L.サリバリウス PS7は陽性であった。その後、定量測定で示されたように、該株が産生したH2O2の量は0.729 μg/ml±0.240であったが、一方、対照株(L. johnsonii La1）の産生量はもっと高かった(7.63 μg/mL±0.407）。
【００６１】
1.6. 乳酸と酢酸の産生
MRSブロス（pH 6.2）の中でL.サリバリウス株による乳酸の産生について測定した。MRSの終夜培養液からの1%接種菌液を用い、MACS-MG-1000-嫌気性ワークステーション（DW Scientific社、Shipley、英国）の中で、37℃で24時間嫌気的に（窒素85％、水素10％、二酸化炭素5％）インキュベーションを行った。12000×gで5分間の遠心分離により細胞を除去し、酵素キット（Roche Diagnostics社、Mannheim,ドイツ）を用いてメーカーの取扱説明書に従って上清中のL-及びD-乳酸の濃度を定量した。上清のpH値も測定した。同様に、別の酵素キット（Roche Diagnostics社）を用いてメーカーの取扱説明書に従って培養上清中の酢酸の濃度を定量した。この場合、MRSは酢酸ナトリウムを除く異なる成分から構成された。これらの測定はn = 3で行い、値は平均値±SDとして表した。
【００６２】
結果：L.サリバリウス PS7は高濃度のL-乳酸を産生したが、一方、D-乳酸異性体を産生しなかった（表２）。該株の培養上清に酢酸も有意な濃度で検出された(0.68 mg/mL±0.17）。
（表２）
2021511822.tif 000007
Nd,検出されず
【００６３】
全体的に、これらの結果で示されたように、L.サリバリウス PS7は、少なくとも4種の抗菌化合物（バクテリオシン、過酸化水素、L-乳酸塩及び酢酸塩）を同時に産生できるため、病原菌を阻害する可能性が非常に高く、非常に特異な株である。
【００６４】
1.7. 共凝集アッセイ
Younesらにより適応された（2012年）Reidらの方法（1990年）に従って、該株の上記中耳炎に関連する株の細胞との凝集力を調べた。該アッセイは、ブロス培地における共培養と光学顕微鏡の技術に基づいている。
【００６５】
L.サリバリウス PS7は、中耳炎に関連する細菌株、特に連鎖球菌属、アロイオコッカス属、腸球菌属、ブドウ球菌属に属するもの、と共凝集する大きな可能性を示した。該メカニズムでは、そのようなパトゲンとそれらのヒト標的細胞との相互作用を防ぐことがある。
【００６６】
1.8. Caco-2/HT-29細胞への付着
該株のHT-29及びCaco-2細胞への付着について、基本的にCoconnierらが記載した方法（1992年）に従って調べた。通常、細胞は、25 mMグルコース及び1 mMピルビン酸ナトリウムを含み、10％熱不活化（30分、56℃）ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、1％非必須アミノ酸製剤、100 U/mLペニシリン及び100 mg/mLストレプトマイシンを補充したDMEM培地（PAA、Linz、オーストリア）の中で増殖させた。付着試験は、HT-29とCaco-2を、抗生物質を含まない2 mLの培地の中で集密になるまで培養した。集密後約10日で、1 mLの培地を1 mLの乳酸桿菌懸濁液（DMEM中108 cfu/mL）に交換した。接種した培養物を、37℃、5％CO2で1時間インキュベートした。次に、単層を滅菌PBSで5回洗浄し、メタノールで固定し、グラム染色剤で染色し、顕微鏡で調べた。各試験では、20のランダムな顕微鏡視野における付着乳酸菌を計数した。
【００６７】
該株は、Caco-2細胞及びHT-29細胞に高い付着力を示し、20のランダムな顕微鏡視野における付着乳酸菌数の平均値±SDとして表す場合、それぞれ697.1±297.6及び251.7±82.3であった。
【００６８】
1.9. リボフラビン/葉酸/シアノコバラミンの産生
MRSで終夜培養したL.サリバリウス PS7の細菌細胞を生理食塩水で3回洗浄し、元の培養液量で該溶液に再懸濁し、それを用いてリボフラビン、葉酸、またはビタミンB12フリーの培地（Difco、米国）のいずれかに接種（4％; v/v）した。次に、接種した培地を37℃で18時間攪拌せずにインキュベートした。インキュベーションの後、この洗浄-再懸濁手順を繰り返し、得られた細胞溶液を用いて、それぞれの新鮮なビタミンフリーの培地に接種した（2％; v/v）。この最後のステップを7回繰り返し、最終インキュベーションの後に試料を採取し、細胞外及び細胞内のビタミン濃度を測定した。葉酸濃度を測定するために、細菌が生育したビタミンフリーの培地の試料（500 μl）を等量の保護緩衝液（0.1 Mリン酸塩緩衝液、pH 6.8、アスコルビン酸[1.5％; w/v]を含む）と混合し、ビタミンの酸化と分解を防ぐ。一方、リボフラビンの場合、酢酸（1％; v/v）を加えた。保護緩衝液または酢酸のいずれかを加えた直後に、混合物を5,000×gで5分間遠心分離した。次に、上清（細胞外試料）を収集し、5分間煮沸した。一方、ペレットを500 μlの保護緩衝液に再懸濁し、5分間煮沸し、10,000×gで6分間遠心分離し、対応する上清（細胞内試料）も収集した。ビタミンの定量に使用するまでに全ての上清を-70℃で保存した。
【００６９】
2021511822.tif 000008
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【００７０】
参照法として、Lactobacillus delbrueckii B12アッセイ（Horwitz、2000年）を用い、細胞抽出物を調製し、コバラミンの生成を分析した。
【００７１】
PS7株は非存在下で増殖し、ビタミンB2を生成することができた。細胞内及び細胞外のリボフラビンの濃度(平均値±SD）は、それぞれ165.00±0.52 ng/ml及び34.74±3.06 ng/mlであった（合計濃度：約200 ng/ml）。該株は、ビタミンB6とシアノコバラミンをいずれも生成しなかった。
【００７２】
1.10. ブタムチンへの付着
若干修正されたCohenとLaux（1995年）が記載した方法に従って、該株のムチンへの付着を測定した。簡単に言えば、100 μlのブタムチン（Sigma社）溶液（1 mg/ml）(HEPES緩衝されたHanks緩衝塩溶液, HH）を4℃で終夜インキュベートした後、ポリスチレンマイクロタイタープレート（Maxisorp; Nunc、Roskilde、デンマーク）に固定した。ウェルを250 μlのHHで2回洗浄した。並行して、細菌をMRSブロスの中、37℃で終夜増殖させ、遠心分離により1 mlの画分から細菌ペレットを得て、HHで洗浄した。次に、10 μlの10 mMカルボキシフルオレセイン（Sigma社）をペレットに加え、細菌の懸濁液を37℃で20分間インキュベートした。続いて、細菌細胞をHHで3回洗浄し、最後に1 mlのHHに再懸濁した。次に、50 μlの蛍光標識細菌（約5×107CFU）の懸濁液を各ウェルに加えた。37℃で1時間インキュベートした後、プレートを250 μlのHHで2回洗浄し、付着していない細胞を除去し、50 μlの1％ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）-0.1 M NaOHの存在下及び60℃で1時間インキュベートし、結合した微生物を放出して溶解した。蛍光マイクロプレートリーダー（Tecan Austria GMBH社、Salzburg、オーストリア）で蛍光を測定した。付着は、ウェルに最初に添加され、標識された細菌の分量に存在するものと比較した場合に、洗浄操作の後にウェルに保持された蛍光の百分率として評価した。該アッセイはn = 2で行った。
PS7株はムチンに高い付着力を示した。
【００７３】
1.11. ムチンの分解
Ruseler-van Embedenらが開発し（1995年）、そしてZhouらによって改変された（2001年）方法に従って、該株がin vitroで胃ムチン（HGM; Sigma社）を分解する可能性についてn = 2で評価した。
PS7株は、in vitroで胃ムチンを分解することができなかった。
【００７４】
1.12. 抗生物質
乳酸菌感受性試験培地（LSM）（Klareら、2005年）で終夜増殖されたL.サリバリウス PS7培地の中で本研究に含まれる16種の抗生物質のMICを測定し、希釈し、Mcfarland標準1に相当する密度（分光光度法での同等値：約3×108 CFU/ml）を得た。該懸濁液をさらにLSMで3×105 CFU/mlに調整し、その100 μlを乳酸菌用のマイクロタイターVetMICプレート（スウェーデン国立獣医研究所、Uppsala、スウェーデン）のウェルに接種した。該プレートを37℃で48時間インキュベートし、そのMICは増殖が観察されなかった最低濃度として定義した。
【００７５】
並行して、最小発育阻害濃度（MIC）は、Eテスト（AB BIODISK社、Solna、スウェーデン）を用いてもメーカーの取扱説明書に従って測定した。簡単に言えば、終夜インキュベーションの後、寒天培地の純度を確認した。接種物調製のため、0.5のMcfarland（McF）標準に相当する密度が得られるまで、5 mlの無菌生理食塩水（0.85％NaCl溶液）を含有する無菌ガラス培養管に個々のコロニーを懸濁した。無菌綿棒を標準化された接種材料に浸し、寒天プレートに接種するために用いた。接種したプレートを約15分間乾燥させ後、事前に作成した抗菌勾配を有するEテストストリップを貼り付けた。24時間インキュベーションの後、阻害楕円に沿って増殖が起こらなかったEテストストリップの最初のポイントに対応する値はそのMICと定義した。静菌剤（例えば、テトラサイクリン、エリスロマイシン、クリンダマイシン）の場合、そのMICは成長が80％阻害された時点で読み取った（即ち、肉眼で判断される有意な阻害の最初のポイント）。
【００７６】
欧州食品安全機関（EFSA、2012年）が提案したカットオフレベルに従って、様々な抗生物質感受性試験の結果を解釈した。これらの値によると、乳酸菌は、カナマイシンとバンコマイシンを除いて、本研究で調べた全ての抗生物質に感受性を有した（L.サリバリウス種の全ての株がこれら2種の抗生物質に本質的に耐性をもつため、それは予想された事実である。）（表３）。
（表３）
2021511822.tif 000010
【００７７】
1.13. 生体アミンの形成
デカルボキシラーゼブロス、Bover-CidとHolzapfelが記載した方法（1999年）、及びガスクロマトグラフィー質量分析を用いて、生体アミン（チラミン、ヒスタミン、プトレシン、及びカダベリン）の形成力を評価した。前駆体アミノ酸（それぞれ、チロシン、ヒスチジン、オルニチン、及びリジン）はSigma社から購入した。
PS7株は生体アミンを生成することができなかった。
【００７８】
1.14. 未成熟樹状細胞の刺激
メスのC57BL/6マウス（6〜10週齢）の脾臓からマウスの未成熟樹状細胞（DC）を単離し、前記（Luら、1995年）のように特徴付けした。単離されたDCを増殖するため、それらは10％熱不活性化FBS、2 mM L-グルタミン、100 IU/mlペニシリンG、100 μg/mlストレプトマイシン、及び20 pMβ-メルカプトエタノールを含有し、0.4 ng/mlのマウスrGM-CSF（R＆D Systems）が補充されたIMDM培地（完全なIMDM、全ての成分はSigma社より入手）の中に、加湿された5％CO2雰囲気中、37℃で日常的に培養した。4日ごとに該培地を交換し、穏やかに洗浄し、顆粒球及び成熟DCを除去した後、新鮮なrGM-CSF（Luら、1995年）を含有する新しい培地を培養物に補充した。
【００７９】
マウスMHC II及びB7.2をそれぞれ特異的に認識するモノクローナル抗マウス抗体IA/Ed（2G9）及びCD86/B7.2（GL1）は、PharMingen社（San Diego、米国）から購入した。フィコエリトリン及びストレプトアビジンはSigma社から入手した。
【００８０】
L.サリバリウス PS7のMRS-Cys終夜培養物を6,000×gで5分間遠心分離により回収し、PBSで2回洗浄した。次に、それを、100 μl分量の抗生物質を含まないIsocoveの改変Dulbecco培地（IMDM）に分配し（2×107 cfu）、10 mlの2×106細胞を含有する新鮮なDC培養液に加えた。該共培養物を37℃で90分間インキュベートし、接種していないDC培養物を陰性対照として含めた。インキュベーション期間の後、細胞をPBSと2 mM EDTAで洗浄し、ゲンタマイシン（250 μg/ml）とテトラサイクリン（10 μg/ml）を補充した完全なIMDM及び37℃で18時間維持し、残りの細菌を殺した。次に、細胞をPBSで2回洗浄し、DC及び表面マーカーの潜在的な活性化の両方を検出するために、抗MHCクラスII及び抗B7.2抗体で染色した。染色は標準的な免疫蛍光技術により行った。一方、フィコエリトリンによる抗体の標識はメーカー（Sigma社）の取扱説明書に従って行った。最後に、フローサイトメトリー分析をFACSスキャン（Becton Dickinson, San Jose, CA）で行い、得られたデータをWinMDI 2.8ソフトウェアで分析した。細胞内粒子を除外するために、前方光及び直角光散乱パラメーターで測定された生存細胞ゲートを介して、合計10,000個の細胞を分析した（Langaら、2013年）。
【００８１】
L.サリバリウス CECT 5713の潜在的な刺激作用に関連するDC表現型の変化を評価した。
細菌DC共培養物（比率10：1）を90分間インキュベートした後、DC細胞の形態は劇的に変化した。それらは、活性化DCの主な特徴である可視的な伸びまたは樹状突起をもち、より不規則になった。これらの形態上の変化は、細菌細胞への暴露後に少なくとも24時間観察された。さらに、該乳酸菌は、DCの表面に共刺激分子B7.2（CD86）とMHCクラスIIの存在を強く増加させた。これらのマーカーは、共培養されたDCのそれぞれ66.2％及び68.9％で検出された。対照的に、該細菌株に暴露されなかったDCの当該値は有意に低かった（それぞれ10.7％及び8.8％）。
【００８２】
1.15. 凍結乾燥後の安定性
MRSブロスの中37℃でL.サリバリウス PS7を好気的に培養した。静止相の培養物から、10,000×g及び4℃における10分間の遠心分離により細胞を収集した。細菌ペレットを、再構成したスキムミルク（10％p/v）に再懸濁し、最終濃度を109〜1010 CFU/mlの範囲とした。該細菌懸濁液を-80℃で凍結し、続いて次の条件下で凍結乾燥した：-20℃で2時間、-15℃で20時間、最後に15℃で24時間。該凍結乾燥した培養物を室温（約25℃）及び4℃で保存し、その生存率を毎月１回、8か月間に亘って確認した。
【００８３】
生菌数に関して、最初の新鮮な培養物（9.3〜8.8 log10 cfu/g）と凍結乾燥操作の直後における凍結乾燥された培養物（9.3〜8.7 log10 cfu/g）との間に相違はなかった。次に、室温または4℃での保管中の凍結乾燥されたL.サリバリウス PS7培養物の安定性を、8か月間に亘って毎月１回確認した（それぞれ図２及び図３を参照、赤い点/線）。室温で3〜4か月後にL.サリバリウス PS7の生存細胞数は、約8.0〜8.6 log10 cfu/gであった。該条件で5か月後の生存率は激減した。対照的に、4℃で8か月後の生存率はまだ約6.8 log10 cfu/gであった。
【００８４】
実施例２：動物における毒性試験
2.1. 急性及び反復投与（4週間）による経口毒性試験 
試験開始前に、オスとメスのWistarラット（Charles River Inc.社、Marget, Kent, 英国）について、健康状態の評価を伴う7日間の順応を行った。該ラットをおがくずの寝具が付いたポリカーボネートケージの中に個別に収容し、環境が制御された空間（22±2℃、50％±10％の相対湿度）で12時間の明暗サイクル（8時〜20時は照明）を維持した。餌（A03げっ歯類の餌、Scientific Animal Food and Engineering社、Villemoisson-sur-Orge、フランス）と水の摂取は自由にできた。該ラットは、処置開始時に56日齢であった。欧州連合のガイドライン（EC理事会規則No.440、2008a、b）に従って急性（限界試験）及び反復投与（4週間）の試験を実施した。両研究とも倫理要件に従って行われ、Complutence大学の公式倫理委員会から承認を得た。
【００８５】
急性研究（限界試験）では、24匹のラット（オス12匹、メス12匹）を２群に分け、各群はそれぞれオス6匹とメス6匹であった。一晩絶食させた後、各ラットにスキムミルク（500 μl）を経口で与え（対照群または第1群）、または500 μlのスキムミルクに溶解した1×1010コロニー形成単位（cfu）のL.サリバリウス PS7を単回経口投与した（治療群または第2群）。被験物及び対照品は胃管から投与した。動物の臨床状態と死亡率を1日2回（午前と午後）確認した。14日間の観察期間が終了した時点に、該ラットの体重を測り、CO2吸入により安楽死させ、放血し、剖検した。
【００８６】
反復投与（4週間）（制限試験）の研究は、それぞれオス6匹とメス6匹の4つの群に分けられた48匹のラット（オス24匹、メス24匹）で行った（対照群または第3群、処置群または第4群、サテライト対照群または第5群、及びサテライト処置群または第6群）。該ラットに、スキムミルク（第3群及び第5群）または500 μlのスキムミルク（第4群及び第6群）に溶かした1×109 cfuのL.サリバリウス PS7を1日1回、4週間かけて経口で与えた。被験物及び対照品は胃管から投与した。該動物には毎日ほぼ同じ時間に投与した（照明周期は約4〜6時間）。対照品と被験物投与の4時間前から2時間後まで、水ではなく餌を差し控えた。該動物の臨床状態と死亡率を1日2回（午前と午後）確認した。29日目に第3群と第4群の全てのラットには、18時間餌を与えず、体重を測り、CO2吸入により安楽死させ、放血し、剖検した。サテライト群（第5群及び第6群）の全ての動物については、毒性作用の遅延発生、持続、または回復を調べるために処置せず、さらに14日間飼育した。42日目に第5群及び第6群の全てのラットに18時間餌を与えず、体重を測り、CO2吸入により安楽死させ、放血し、剖検した。
【００８７】
2.2. 観察
全ての動物を一般的な外観、行動、罹患率及び死亡率の兆候について毎日2回観察した（処置前に1回、その後は1日1回）。ラットの全身、皮膚と毛皮、目、鼻、口腔、腹部、及び外性器の状態を観察し、呼吸数を評価し、腫瘤を触診した。確認した行動パラメーターは、異常な動き（振戦、けいれん、筋肉の収縮）、オープンフィールドにおける取り扱いへの反応と行動（興奮性、タッチや鋭い騒音への反応）、通常行動の変化（グルーミング、頭の振り、回転運動の変化）、異常行動（自食、後方運動）及び攻撃性である。体重、体重増加、摂餌量及び飲水量を毎日に測定し、観察期間の最後にラットを剖検により検査し、臓器の重量を記録した。
【００８８】
2.3. 臨床試験パラメーター
血液学的及び臨床生化学的な評価をするために血液試料を採取した。採取は、CO2吸入により誘発された軽麻酔下で動物の眼窩後叢から行った。急性経口試験の場合、14日間の観察期間の後に；4週間反復投与よる安全性試験の場合、4週間の処置と14日間回復の後に行った。血液学的な評価に用いる試料には抗凝固剤としてEDTAを用い；臨床生化学的な評価に用いる試料には抗凝固剤としてクエン酸ナトリウムを用いた。採血の前に約18時間餌を差し控え、生物学的変動を減らすため、就業日の早い時点に試料を採取した。水は自由に与えた。
【００８９】
臨床病理学パラメーター（血液学及び臨床生化学）を評価した（表４）。ほとんどの血液学的変数は、Coulter/CELL-DYN 3500全血自動分析装置（Abbott、Chicago、IL）で測定した。Olympus顕微鏡BX41（Olympus社、東京、日本）で血球塗抹を観察した。臨床生化学的パラメーター（表１）は、分光光度計Konelab PRIME 30（Thermofisher Scientific Inc. Waltham社、MA、米国）を用い、特別な生化学的パラメーターは、臨床化学分析装置AU640（Olympus社、東京、日本）を用いて評価した。凝固に関するパラメーターは、凝固分析装置Coatron M1(Teco Medical Instruments社、GMBH、Neufahrn、ドイツ)を用いて分析した。
【００９０】
2.4. 解剖病理学
全てのラットをCO2吸入により安楽死させ、剖検した。剖検には、体の外面、全ての開口部、頭蓋腔、脳と脊髄、鼻腔と副鼻腔、胸腔、腹部、骨盤腔、及び内臓の肉眼的検査が含まれた。全ての肉眼的異常を記録した。剖検時に全ての動物から以下の組織及び臓器の試料を採取し、中性のリン酸塩緩衝4％ホルムアルデヒド溶液で固定した：副腎、脳、心臓、回腸、空腸、盲腸、結腸、十二指腸、直腸、胃、食道、気管、腎臓、肝臓、肺、膵臓、脾臓、皮膚、睾丸、精巣上体、輸卵管を含む卵巣、骨髄、胸腺、 甲状腺及び副甲状腺、精嚢、膀胱及び子宮。臓器/体重比を算出した。組織病理学的検査のため全ての臓器及び組織試料を処理し、パラフィンに包埋し、約2〜4 μmの厚さに切り、ヘマトキシリンとエオシンで染色した。対照群と処置群の全ての動物から上記全ての臓器と組織のスライドを収集した。
（表４）
2021511822.tif 000011
【００９１】
2.5. 細菌の移行
血液、肝臓、及び脾臓における細菌の移行について分析した。血液（50 μl）をde Man、Rogosa、Sharpe（MRS）寒天培地で培養し、37℃で48時間嫌気的にインキュベートした。組織試料を緩衝ペプトン水（1 g/ml）でホモジナイズし、得られたホモジネート（100 μl）を前述のようにMRS寒天上で培養した。48時間後、乳酸菌の存在についてプレートを確認した。MRS寒天プレート上に１つのコロニーさえ存在すれば、陽性の増殖とした。
【００９２】
2.6. 総肝臓グルタチオン（GSH）濃度
各マウスから100 mgの肝臓の一部を7.5％トリクロロ酢酸溶液の中でホモジナイズし、ホモジネートを3,000×g及び4℃で10分間遠心分離した。上清中の総グルタチオン濃度は、比色分析用市販キット(OxisResearch、Portland、OR)を用いて測定した。簡潔にいえば、マイクロタイタープレートの各ウェルに40 μlのホモジネートまたは標準を、40 mlの還元剤（トリス（2-カルボキシエチル）ホスフィンのHCl溶液）、40 mlの色素原（1-メチル-3-クロロ-7-トリフルオロメチルキノリニウムメチルサルフェートのHCl溶液）及び40 mlの発色剤（NaOH）と共に加えた。室温及び暗所で30分間インキュベートした後、マイクロプレート分光光度計(Bio-Rad Laboratories社、Hercules CA)を用いて415 nmにおける光学密度を測定した。
【００９３】
2.7. 統計分析（毒性試験）
全てのデータは、6回測定した平均値±標準誤差（SEM）として表される（即ち、オス6匹とメス6匹）。対照群と処置群の相違は、一元配置分散分析（ANOVA）とその後のDunnett検定（1995年）で評価した。P<0.05の場合に有意差があると見なした。
【００９４】
結果
ラットにおける経口投与による急性毒性
異常な臨床徴候、行動の変化、体重の変化、肉眼的所見、または臓器重量の変化は観察されなかった。全ての動物は2週間の観察期間を生き延びた。群間で体重の統計的な差はなかった。同様に、体重増加、餌と水の消費量に統計的に有意差は認められなかった。したがって、体重、毎日の体重増加、餌と水の消費量は、処置によって影響を受けなかった（1ｘ1010cfu のL.サリバリウス PS7の単回経口投与）。
【００９５】
投与量1ｘ1010 cfuでの該株の単回投与から2週間後に評価した血液学と臨床化学的パラメーターは、対照群と比べて有意差はなかった。処置に関連した変化は認められなかった。
【００９６】
試験株に関連した臓器または組織の重量/体重の比には、統計的な差はなかった（データは示せず）。L.サリバリウス PS7の調製物は、肉眼的及び顕微鏡的変化の発生との関連性がなかった。1ｘ1010 cfuの単回経口投与株を投与した2週間後、処置に関連した組織病理学的変化は観察されなかった。したがって、L.サリバリウス PS7は急性毒性が低く、オスとメスのラットでの経口致死量（LD50）は1ｘ1010 cfu以上である。
【００９７】
ラットにおける反復経口投与(4週間)による毒性
死亡は観察されなかった。投与量1ｘ109 cfu/dayのL.サリバリウス PS7で処置されたオスとメスのラットでは、一般状態と外観には処置に関連した変化は観察されなかった。実験期間中における動物の発達は、その種と年齢に対応していた。L.サリバリウス PS7で処置した群の間では、実験期間のどの時点でも、対照群と比べて、体重または体重増加に有意差はなかった。L.サリバリウス PS7処置群は全て、対応する対照群と同じ量の餌と水を消費した（データは示せず）。
【００９８】
全ての血液学データは正常範囲内であり、群間の差は観察されなかった。臨床生化学的データでは、4週間の処置期間が終了した時点に処置に関連した変化が示されなかった。個々の値と群における平均値は生理学的範囲内であった。潜在的な毒性作用の遅延した発生を検出するための無処置の14日間後に、血液学的及び臨床試験のパラメーターにおいて処置に関連した変化はなかった。
【００９９】
L.サリバリウス PS7の最終投与後の29日目（第4群）、及び14日間無処置の42日目（第6群）に行った剖検は、対応する対照群と比べて、肉眼で観察された病理学的な変化、または臓器重量に明らかな有意差はなかった。4週間の処置後、オスとメスのラットで検査した臓器に処置に関連したと考えられた組織病理学的所見はなかった。サテライト処置群（第6群）では、処置に関連した組織病理学的所見もなかった。
【０１００】
該反復投与（4週間）試験における副作用が観察されないレベルは、試験された投与量、即ちL.サリバリウス PS7の1×109 cfuであった。
【０１０１】
総肝臓グルタチオン（GSH）の濃度
該生菌処置による抗酸化防御の変化を調べるために、肝臓中GSHの濃度を測定した。対照群と処置群の間で肝臓中GSHの濃度に有意差は観察されなかった（9.67±1.42 mmol/g対9.71±1.56 mmol/g、P>0.1）。これに示されたように、L.サリバリウス PS7による処置がラットに酸化ストレスを引き起こさなかった。また、ラットの血液、肝臓、または脾臓から乳酸桿菌を単離できなかったため、菌血症がないことと一致している。それは、試験した株がラットにおいて局所感染または全身感染のいずれも引き起こさないことを示唆している。
【０１０２】
実施例３：子供における中耳炎の治療と予防
3.1. 被験者
10か月から6歳までの中耳炎になりやすい子供たち（n = 64）を採用した（かれらの両親たちは主に大学教授、CSIC科学者、または健康関連の専門家であった）。選択基準は、過去12か月間に少なくとも4回のAOM発症歴、または過去6か月間に少なくとも3回の発症歴があったことであった（del Castilloら、2012年）。慢性疾患、ダウン症候群、唇または口蓋裂を伴う定期的に投薬されていた子供、または本研究中にすでに鼓室吻合術またはアデノイド切除術が予定されていた子供を除外した。該手術以降少なくとも3回のAOM発症に罹患していない限り、過去6か月間に鼓室吻合術またはアデノイド切除術を受けた患者も除外した。該両親たちは、本研究に関する説明を受けた後、インフォームドコンセントに署名した。
【０１０３】
3.2. L.サリバリウス PS7の介入
2012年9月から2015年4月までの間に本研究を実施した。6か月間の介入の間、該子供たちは毎日約1×109 cfuのプロバイオティクス細菌L.サリバリウス PS7を消費した。該両親たちは、好ましくは小袋を開け、粉末を空にし、牛乳または乳製品に入れるように指導された。該両親たちは、子供が毎日の投与を受けたかどうかを研究日記に毎日記録した。順守率（％）は、子供が実際に受けた投与の回数を追跡日数で割ったものとして算出した。本研究では、抗生物質（AOM発症の治療を除く）またはプロバイオティクス細菌を含むその他の製品の使用は除外基準であった。
【０１０４】
主な結果変数は、AOMの発症と期間であった。二次的な評価項目は、外耳道における病原体保有の頻度であった。
【０１０５】
3.3. 臨床検査
開始前では、両親が記入したアンケートに基づき、子供の健康、栄養、生活環境、及び中耳炎/呼吸器疾患の病歴に関する背景情報を収集した。該子供たちは、本研究の開始時、中間時点（3か月）及び終了時（6か月）に上級医師による検査を受けた。該子供たちにおいてAOMの症状が出ないときに予定されていた該「健康訪問」の間に一般的な身体検査と空気圧耳鏡検査を実施し、また、細菌分析のため外耳道から試料を採取した。
【０１０６】
AOMの疑いがあるたびに子供をその医師に連れて行くように両親たちを指導した。AOMの診断は定義された臨床基準に従った。即ち、中耳滲出の証拠、炎症を示す鼓膜の異常、及び急性感染症の少なくとも1つの症状（発熱、耳痛、耳漏等）が同時に認められた場合にはAOMと診断する。中耳滲出液の存在は、空気圧耳鏡検査で検出した。AOM発症の期間は、その診断後の既存症状の期間と定義した。アモキシシリンはAOM治療の第一選択抗生物質であった。
【０１０７】
3.4. 微生物学的方法
外耳道の試料中の細菌叢を定量的（密度）かつ定性的に評価した。培地を含まない綿棒で耳道から試料を採取した。次に、1 mlのペプトン水を加え、ボルテックスした。再懸濁したものを異なる寒天培地（Colimbia CNA及びチョコレート寒天プレートを含む）に接種した。該プレートを37℃で、好気的または5％CO2のいずれかで48時間までインキュベートした。その細菌コロニーの数と形態を記録し、Probisearchの施設(Tres Cantos、スペイン)において、Vitek-MS（登録商標）機器（BioMerieux社、Marcy l'Etoile、フランス）を用いたMALDI-TOF分析により各コロニー形態の少なくとも1つの代表を同定した。同定は、該データベース中の種固有m/z値と99〜100％一致することとして定義された。
【結果】
【０１０８】
選択基準を満たした合計64人の子供たちが登録され、プロバイオティクスの治療を受けた。3人の子供たち（約4.6％）が脱落した（1人は抗生物質の摂取によるもの、1人は鼓膜瘻によるもの、1人は牛の乳タンパク質に対するアレルギーによるものである）。したがって、62人の子供たちが本研究を完了した。子供たちが摂取した投与量の割合は>96％であったため、本研究では優れた順守率を得た。
【０１０９】
36％の子供たちは少なくとも1回のAOM発症と診断された。興味深いことに、そのような割合が、同じ期間において同じ医師に受診し、プロバイオティック株を受けなかった中耳炎の子供たちの間で報告された65〜72％より著しく低い。該割合は、L. rhamnosus GG等の他のプロバイオティクス株を用いた以前の研究（Hatakkaら、2007年; Tapiovaaraら、2014年）で観察された割合よりもはるかに低い。介入前の6か月の期間と比べて、6か月の介入中のAOM発症数は86％減少した。
【０１１０】
AOMが発症したとき、発症の平均期間は3.2日であった。これは、未治療の子供たち（6.0日）または以前のプロバイオティクス試験（5.6日）で得られた結果と比べてもはるかに短いものである。抗菌薬治療の数は、同じ医師に受診している他の中耳炎になりやすい子供たちと比べて、プロバイオティクスを受けている子供たちでは60％以上減少した。他の上気道感染症の発症数は、プロバイオティクスを投与された子供たちの場合では<2.0％であった（残りの子供たちの場合での>4.6％と比較）。
【０１１１】
全体的に、外耳道における微生物の密度は、介入期間を通して、イニシャル時（全ての培養物は採取時点で陽性であった）の>3 log10 cfuから介入の終了時点（該培養物の29％が陰性）の<2 log10 cfuに減少した。より具体的には、参加した子供たちではインフルエンザ菌、肺炎球菌、化膿性連鎖球菌、モラクセラカタラーリス、アロイオコッカス中耳炎、アクチノミセスエウロペウス、黄色ブドウ球菌及び/または緑膿菌の有病率は大幅に減少（または消失）した。
【参考文献】
【０１１２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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