(57)【要約】本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、およびこのような方法によって生成される分化細胞を提供する。本開示の主題は、成長ホルモン欠損症を処置するためのこのような細胞の使用も提供する。本開示は、下垂体前駆体の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。例えば、本開示は、下垂体前駆体の、分化細胞の細胞集団への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、分化細胞の少なくとも約５０％が、成長ホルモンを産生することが可能である成長ホルモン産生細胞（「ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞」と称される）である、方法を提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
下垂体前駆体の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、１つまたは複数の背方化剤および１つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップと；前記細胞を、Ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（Ｗｎｔ活性化剤）および成長ホルモンの発現を誘導することが可能である１つまたは複数の分子（ＧＨ誘導剤）と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞のうちの少なくとも約５０％が、成長ホルモンを産生することが可能である成長ホルモン産生細胞（ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞）であるステップとを含む、方法。
【請求項２】
前記ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞が、低レベルのＧＨＲＨＲ免疫反応性を発現する細胞（ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞）、高レベルのＧＨＲＨＲ免疫反応性を発現する細胞（ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞）、およびその組合せを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約１０日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約２週間または３週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項５】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約１５日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項２または３に記載の方法。
【請求項６】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約１０日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項２に記載の方法。
【請求項７】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約３週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項２から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約２５日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約３５日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む請求項２から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞を、１つまたは複数のＢＭＰ分子およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップと；前記細胞を、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、Ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（Ｗｎｔ活性化剤）および１つまたは複数の成長ホルモン（ＧＨ）誘導剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約５０％が、成長ホルモンを産生することが可能である成長ホルモン産生細胞（ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞）であるステップとを含む、方法。
【請求項１１】
前記ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞が、低レベルのＧＨＲＨＲ免疫反応性を発現する細胞（ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞）、高レベルのＧＨＲＨＲ免疫反応性を発現する細胞（ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞）、およびその組合せを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約３週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約２４日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約４週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項１１または１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約４週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項１１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約６週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約３０日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から３３日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
下垂体前駆体の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、１つまたは複数の背方化剤および１つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップと；前記細胞を、Ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約５０％が、Ｐｉｔ１を発現するステップとを含む、方法。
【請求項２０】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約５日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約７日または約１１日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、幹細胞を、１つまたは複数のＢＭＰ分子およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップと；前記細胞を、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、およびＷｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（Ｗｎｔ活性化剤）と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約５０％が、Ｐｉｔ１を発現するステップとを含む、方法。
【請求項２３】
前記幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１５日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項２２または２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約１５日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約２０日で、前記細胞集団を得るステップを含む、請求項２２から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記細胞の、前記１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤との最初の接触が、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から５日以内である、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞の、前記１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤との最初の接触が、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触と同じ日に起こる、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞の、前記１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤との最初の接触が、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約４日である、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞を、少なくとも約５日間および／または最長約１５日間、前記１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させるステップを含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記細胞を、少なくとも約７日間、前記１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させるステップを含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記細胞を、少なくとも約３日間および／または最長約１０日間、前記１つまたは複数の背方化剤と接触させるステップを含む、請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記細胞を、約４日間または約７日間、前記１つまたは複数の背方化剤と接触させるステップを含む、請求項１から３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記細胞を、少なくとも約５日間および／または最長約１５日間、前記１つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップを含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記細胞を、少なくとも約７日間または約１１日間、前記１つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップを含む、請求項１から３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞を、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１から３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記細胞を、少なくとも約３日間および／または最長約１０日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップを含む、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記細胞を、約４日間または約７日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップを含む、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記細胞を、前記１つまたは複数の背方化剤およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤と、同時に接触させるステップを含む、請求項３６から３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記細胞を、１つまたは複数のエストロゲン受容体（ＥＲ）アゴニストと接触させるステップをさらに含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記細胞を、１つまたは複数のＥＲアゴニストおよび前記１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と、同時に接触させるステップを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記細胞の、前記１つまたは複数のＥＲアゴニストとの最初の接触が、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から１０日以内である、請求項４０または４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記細胞の、前記１つまたは複数のＥＲアゴニストとの最初の接触が、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触と同じ日に起こる、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記細胞の、前記１つまたは複数のＥＲアゴニストとの最初の接触が、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞の、前記１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約４日である、請求項４０から４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記細胞を、少なくとも約５日間および／または最長約１５日間、前記１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させるステップを含む、請求項４０から４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記細胞を、少なくとも約７日間または約８日間、前記１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させるステップを含む、請求項４０から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞が、幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化によって得られる、請求項１から９、１９から２１、および２７から４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
幹細胞の前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化が、幹細胞を、１つまたは複数のＢＭＰ分子およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップ、前記細胞を、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の１つ、２つ、またはそれより多い活性化剤と接触させるステップを含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記幹細胞を、少なくとも約２日間および／または約４日以内、前記１つまたは複数のＢＭＰ分子と接触させる、請求項１０から１８、２２から２６、４７、および４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記幹細胞を、少なくとも約５日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項１０から１８、２２から２６、および４７から４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記幹細胞を、約８日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項１０から１８、２２から２６、および４７から５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記幹細胞を、少なくとも約２日間、ＳＨＨシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤、およびＦＧＦシグナル伝達の１つ、２つ、またはそれより多い活性化剤と接触させる、請求項１０から１８、２２から２６、および４７から５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記幹細胞を、約５日間、ＳＨＨシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤、およびＦＧＦシグナル伝達の１つ、２つ、またはそれより多い活性化剤と接触させる、請求項１０から１８、２２から２６、および４７から５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
幹細胞の前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化が、前記細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１０から１８、２２から２６、および４７から５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記幹細胞を、少なくとも約２日間、ＳＭＡＤシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記幹細胞を、約５日間、ＳＭＡＤシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項５４または５５に記載の方法。
【請求項５７】
１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞を、Ｐｉｔ１を発現する細胞へと分化させるステップと、Ｐｉｔ１を発現する前記細胞を、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞へと分化させるステップと、前記ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を、ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞へと分化させるステップとを含む、請求項１から９および２７から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記幹細胞を、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞へと分化させるステップと、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞を、Ｐｉｔ１を発現する細胞へと分化させるステップと、Ｐｉｔ１を発現する前記細胞を、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞へと分化させるステップと、前記ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を、ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞へと分化させるステップとを含む、請求項１０から１８および２７から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記幹細胞を、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞へと分化させるステップと、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する前記細胞を、Ｐｉｔ１を発現する細胞へと分化させるステップとを含む、請求項２２から５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
Ｐｉｔ１を発現する前記細胞の、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞への分化が、Ｐｉｔ１を発現する細胞を、ＧＨ誘導剤の第１の組合せと接触させることを含む、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項６１】
ＧＨ誘導剤の前記第１の組合せが、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、ＥＲアゴニスト、およびＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストからなる群から選択される、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
ＧＨ誘導剤の前記第１の組合せが、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、およびＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニストを含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６３】
ＧＨ誘導剤の前記第１の組合せが、ＲＡ、デキサメタゾン、Ｔ３、およびＧＨＲＨを含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
ＧＨ誘導剤の前記第１の組合せが、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、２種のＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、およびＥＲアゴニストを含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６５】
ＧＨ誘導剤の前記第１の組合せが、ＲＡ、デキサメタゾン、Ｔ３、ＧＨＲＨ、ｃＡＭＰ、およびＤＰＮを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
ＧＨ誘導剤の前記第１の組合せが、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、ＥＲアゴニスト、およびＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストを含む、請求項６０または６１に記載の方法。
【請求項６７】
ＧＨ誘導剤の前記第１の組合せが、ＲＡ、デキサメタゾン、Ｔ３、ＧＨＲＨ、ＤＰＮ、およびＧｈｒｅｌｉｎを含む、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
Ｐｉｔ１を発現する前記細胞を、少なくとも約３日間、ＧＨ誘導剤の前記第１の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項６０から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
Ｐｉｔ１を発現する前記細胞を、約５日間、ＧＨ誘導剤の前記第１の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項６０から６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
Ｐｉｔ１を発現する前記細胞を、約２週間、ＧＨ誘導剤の前記第１の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項６０から６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞への分化が、前記ＧＨＲＨｌｏｗ細胞を、ＧＨ誘導剤の第２の組合せと接触させることを含む、請求項５７または５８に記載の方法。
【請求項７２】
ＧＨ誘導剤の前記第２の組合せが、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、ＥＲアゴニスト、インターロイキン、およびＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストからなる群から選択される、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
ＧＨ誘導剤の前記第２の組合せが、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、およびＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニストを含む、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７４】
ＧＨ誘導剤の前記第２の組合せが、ＲＡ、デキサメタゾン、Ｔ３、およびＧＨＲＨを含む、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
ＧＨ誘導剤の前記第２の組合せが、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、２種のＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、およびＥＲアゴニストを含む、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７６】
ＧＨ誘導剤の前記第２の組合せが、ＲＡ、デキサメタゾン、Ｔ３、ＧＨＲＨ、ｃＡＭＰ、およびＤＰＮを含む、請求項７５に記載の方法。
【請求項７７】
ＧＨ誘導剤の前記第２の組合せが、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、ＥＲアゴニスト、インターロイキン、およびＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストを含む、請求項７１または７２に記載の方法。
【請求項７８】
ＧＨ誘導剤の前記第２の組合せが、デキサメタゾン、Ｔ３、ＧＨＲＨ、ＩＬ−６、Ｇｈｒｅｌｉｎ、およびＤＰＮを含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を、少なくとも約５日間、ＧＨ誘導剤の前記第２の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項７１から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を、約１０日間、ＧＨ誘導剤の前記第２の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項７１から７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を、約４週間、ＧＨ誘導剤の前記第２の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む、請求項７１から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーが、ＳＩＸ１、ＬＨＸ３、ＬＨＸ４、ＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＨＥＳＸ１、ＰＲＯＰ１、ＳＩＸ６、ＴＢＸ１９、ＰＡＸ６、ＧＡＴＡ２、ＳＦ１、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から９、１９から２１、および２７から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記１つまたは複数の背方化剤が、ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤を含み、請求項１から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
ＦＧＦシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤が、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０から１８および２２から８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
ＦＧＦシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤が、ＦＧＦ８を含む、請求項１０から１８および２２から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
ＦＧＦシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤が、ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０を含む、請求項１０から１８、２２から８２、８４、および８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
ＦＧＦシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤が、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ１８を含む、請求項１０から１８、２２から８２、８４から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記１つまたは複数の腹方化剤が、１つまたは複数のＢＭＰ分子を含む、請求項１から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記１つまたは複数のＢＭＰ分子が、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０から１８および２２から８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記１つまたは複数のＢＭＰ分子が、ＢＭＰ２を含む、請求項１０から１８および２２から８９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
前記１つまたは複数のＢＭＰ分子が、ＢＭ４を含む、請求項１０から１８、２２から８７、８９、および９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ−１、ＷＮＴ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、ＷＡＹ−３１６６０６、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＳＢ−２１６７６３、ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、ＬＹ２０９０３１４、ＤＣＡ、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、（ヘテロ）アリールピリミジン、その誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤が、ＣＨＩＲ９９０２１である、請求項１から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
前記１つまたは複数のＧＨ誘導剤が、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＥＲアゴニスト、ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト、Ｇｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニスト、インターロイキン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１から１８および６０から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記コルチコステロイドが、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６１から９４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
前記コルチコステロイドが、デキサメタゾンである、請求項６１から９５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
前記甲状腺ホルモンが、Ｔ３、Ｔ４、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６１から９６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
前記甲状腺ホルモンが、Ｔ３である、請求項６１から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストが、ＧＨＲＨ、ｃ−ＡＭＰ（例えば、ジブチリル−ｃＡＭＰ）、ＰＫＡ、ＣＲＥＢ、ＭＡＰＫ活性化剤、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６１から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストが、ＧＨＲＨ、ｃ−ＡＭＰ、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６１から９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記Ｇｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストが、Ｇｈｒｅｌｉｎ、ＧＨＳＲアゴニスト、その誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項６１から１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記インターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６１から１０１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０３】
前記インターロイキンが、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項６１から１０２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０４】
前記インターロイキンが、ＩＬ−６である、請求項６１から１０３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
前記１つまたは複数のＥＲアゴニストが、ジアリールプロピオニトリル（ＤＰＮ）、エストラジオール（Ｅ２）、プロピルピラゾール−トリオール（ＰＰＴ）、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項４０から１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記１つまたは複数のＥＲアゴニストが、ＤＰＮを含む、請求項４０から１０５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤が、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０から１８および２２から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
ＳＨＨシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤が、ＳＨＨ、Ｃ２５ＩＩおよびパルモルファミンなどのスムーズンド（ＳＭＯ）受容体小分子アゴニスト、ＳＡＧ（例えば、Ｓｔａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．  ２０１０  Ｊａｎ；６（１）：４４−５４に開示されているような）、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１０から１８および２２から１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
ＳＨＨシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤が、ＳＨＨを含む、請求項１０から１８および２２から１０８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
ＳＨＨシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤が、ＳＡＧを含む、請求項１０から１８および２２から１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
ＳＭＡＤシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｋ０２２８８、ＤＭＨ１、ＭＬ３４７、ＬＤＮ２１２８５４、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項５４から１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
ＳＭＡＤシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤が、ＬＤＮ１９３１８９を含む、請求項５４から１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記細胞を、約１０ｎｇ／ｍＬから２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度の前記１つまたは複数の背方化剤と接触させる、請求項１から１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記細胞を、約１ｎｇ／ｍＬから３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の前記１つまたは複数の腹方化剤と接触させる、請求項１から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記細胞を、約１０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度のＦＧＦシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤と接触させる、請求項１０から１８および２２から１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記細胞を、約０．１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの間の濃度のＢＭＰ分子の前記１つまたは複数の活性化剤と接触させる、請求項１０から１８および２２から１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記細胞を、約１μＭから２０μＭの間の濃度のＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項１から１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの間、または約５０ｎＭから２００ｎＭの間の濃度のＳＨＨシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤と接触させる、請求項１０から１８および２２から１１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記細胞を、約１μＭから１０μＭの濃度の前記１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる、請求項１から１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記細胞を、約０．１ｎＭから２０ｎＭの間の濃度の前記１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させる、請求項４０から１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記細胞を、約０．１μＭから１μＭの濃度のＲＡと接触させる、請求項６１から１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記細胞を、約１ｎＭから２０ｎＭの間の濃度の１つまたは複数の甲状腺ホルモンと接触させる、請求項６１から１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記細胞を、約０．１μＭから１０μＭの濃度の１つまたは複数のコルチコステロイドと接触させる、請求項６１から１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記細胞を、約０．１μＭから１０μＭまたは約０．１μＭ未満、または１０ｎＭの濃度の１つまたは複数のＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる、請求項６１から１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記細胞を、約１ｎＭから５０ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる、請求項６１から１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記細胞を、約１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度の１つまたは複数のインターロイキンと接触させる、請求項６１から１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記細胞を、約１００ｎＭから３００ｎＭの間の濃度のＳＭＡＤシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤と接触させる、請求項６１から１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
成長ホルモンを産生することが可能であるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞（ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞）の細胞集団であって、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞が、請求項１０から１８および２２から１２７のいずれか一項に記載の方法に従って、幹細胞から生じる、細胞集団。
【請求項１２９】
成長ホルモンを産生することが可能であるｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞（ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞）の細胞集団であって、前記ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞が、請求項１から９、１９から２１、および２７から１２８のいずれか一項に記載の方法に従って、下垂体前駆体から生じる、細胞集団。
【請求項１３０】
請求項１２８または１２９に記載の細胞集団を含む組成物。
【請求項１３１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞の集団を含む組成物であって、前記分化細胞の少なくとも約５０％が、成長ホルモンを産生することが可能（ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞）であり、前記分化細胞の約２５％未満が、プロラクチン産生細胞マーカー、甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカー、下垂体前駆体マーカー、Ｐｉｔ１、幹細胞マーカー、ＮＮＥマーカー、神経堤（ＮＣ）系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカーからなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する、組成物。
【請求項１３２】
前記非下垂体プラコードマーカーが、頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーからなる群から選択される、請求項１３１に記載の組成物。
【請求項１３３】
（ａ）１つまたは複数の背方化剤；
（ｂ）１つまたは複数の腹方化剤；
（ｃ）Ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（Ｗｎｔ活性化剤）；および
（ｄ）１つまたは複数の成長ホルモン（ＧＨ）誘導剤
を含む、下垂体前駆体のＧＨ産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのキット。
【請求項１３４】
（ａ）１つまたは複数のＢＭＰ分子；
（ｂ）ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤；
（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤；
（ｄ）ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤
（ｅ）１つまたは複数の背方化剤；
（ｆ）１つまたは複数の腹方化剤；
（ｇ）Ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（Ｗｎｔ活性化剤）；および
（ｈ）１つまたは複数の成長ホルモン（ＧＨ）誘導剤
を含む、幹細胞のＧＨ産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのキット。
【請求項１３５】
１つまたは複数のＥＲアゴニストをさらに含む、請求項１３３または１３４に記載のキット。
【請求項１３６】
対象におけるＧＨの発現および／もしくは分泌を増加させる、ＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに／またはＧＨ欠損症を処置する方法であって、前記対象に、以下の：
（ａ）請求項１２８または１２９に記載の細胞集団；および
（ｂ）請求項１３０から１３２のいずれか一項に記載の組成物
のうちの１つを投与するステップを含む方法。
【請求項１３７】
対象におけるＧＨの発現および／もしくは分泌を増加させる、ＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに／またはＧＨ欠損症を処置するための医薬の製造における、請求項１２８または１２９に記載の細胞集団の使用。
【請求項１３８】
対象におけるＧＨの発現および／もしくは分泌を増加させる、ＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに／またはＧＨ欠損症を処置するための医薬の製造における、請求項１３０から１３２のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１３９】
療法における使用のための、請求項１２８または１２９に記載の細胞集団。
【請求項１４０】
療法における使用のための、請求項１３０から１３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４１】
対象におけるＧＨの発現および／もしくは分泌を増加させる、ＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに／またはＧＨ欠損症を処置することにおける使用のための、請求項１２８または１２９に記載の細胞集団。
【請求項１４２】
対象におけるＧＨの発現および／もしくは分泌を増加させる、ＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに／またはＧＨ欠損症を処置することにおける使用のための、請求項１３０から１３２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４３】
ＧＨ欠損症に関連する１つまたは複数の細胞表現型を克服することが可能である治療用化合物をスクリーニングするための方法であって、
（ａ）請求項１２８または１２９に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したＧＨ産生成長ホルモン産生細胞の細胞集団を、試験化合物と接触させるステップと；（ｂ）前記ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞の機能的活性および／または遺伝子発現を測定するステップであって、前記ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞が、ＧＨ欠損症を有する対象の幹細胞またはＧＨ欠損症を有する対象の１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞から得られるステップとを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その内容がその全体として参照により組み込まれ、それに対して優先権が主張される、２０１７年１１月１０日に出願された米国仮出願第６２／５８４，２９９号の優先権を主張する。
特許付与情報
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）からの助成金番号ＮＣＩ−１−Ｒ２１−ＣＡ１７６７００のもとで政府の支援によってなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
１．導入
【０００３】
本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）から生じる成長ホルモン産生細胞、ならびに成長ホルモン（ＧＨ）欠損症における細胞ベースの処置および創薬のためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
２．発明の背景
成長ホルモン（ＧＨ）は、脳下垂体前葉において産生され、特に、小児において重大な作用を有する。成長および代謝に対するＧＨの作用は、直接的なＧＨ作用とインスリン様成長因子１および２（ＩＧＦ−１およびＩＧＦ−２）産生の刺激を介する間接的な作用とによって媒介される。主な標的組織は、骨、脂肪および筋肉である。ＧＨレベルが低いと、骨塩密度、筋肉強度の低下、およびコレステロールの増加がもたらされる。小児では、小人症をもたらす。
【０００５】
成長ホルモン欠損症として、先天性成長ホルモン欠損症および後天性成長ホルモン欠損症が挙げられる。先天性成長ホルモン欠損症は、成長ホルモンの発達に関与する遺伝子の変異に起因する。後天性成長ホルモン欠損症は、視床下部−下垂体領域における腫瘍、外科手術、傷害などによって誘導され得る。先天性成長ホルモン欠損症は、２つのカテゴリーに分けることができる：複合下垂体ホルモン欠損症（ＣＰＨＤ）型と成長ホルモン単独欠損症（ＩＧＨＤ）型。ＣＰＨＤを引き起こし得る遺伝子変異として、ＰＯＵ１Ｆ１変異（ＣＰＨＤ１）、ＰＲＯＰ−１変異（ＣＰＨＤ２；最も一般的、１２〜５５％）、ＬＨＸ３変異（ＣＰＨＤ３）、およびＬＨＸ４変異（ＣＰＨＤ４）が挙げられる。ＩＧＨＤ型を引き起こし得る遺伝子変異として、ＧＨ１変異（ＩＡおよびＩＩ型）、ＧＨ１または成長ホルモン放出ホルモン受容体（ＧＨＲＨＲ）変異（ＩＢ型）、およびブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）変異（ＩＩＩ型）が挙げられる。成長障害について多くの単一遺伝子の原因が同定されているが、ＩＧＨＤ／ＣＰＨＤを有する患者のほとんどは、比較的低い変異検出率によって示されるように、病因不明のままである。さらに、成長ホルモンおよび他の下垂体ホルモンの後天性病因は複数であり、多数の患者に影響を及ぼす。
【０００６】
成長ホルモン欠損症に対する再生手法の役割は、状態の蔓延（１００，０００人当たり４５．５人）および多数の患者が下垂体ホルモンの補充を必要とするにもかかわらず、ほとんど注目されてこなかった。成長ホルモン欠損症に関する現在の処置方法として、一生続くホルモン補充療法が挙げられ、これは最適以下の解決策であり、その理由は、これらの分子の静的送達が、概日パターン、フィードバック機構またはストレスの多い状況に応答するホルモンの動的分泌などの正常な下垂体の特徴に対する代わりにほとんどならないためである。処置は、成長ホルモンの補充のみのコストが１年当たり５０，０００ドルを超え、法外に高価であり得る。よって、成長ホルモン欠損症に対する新たな療法に対する必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
３．発明の概要
本開示の主題は、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化によって、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）から生じる成長ホルモン産生細胞（例えば、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞）に関する。
【０００８】
ある特定の実施形態では、幹細胞の、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞への分化は、３つの段階：（ａ）幹細胞の、下垂体前駆細胞（「下垂体前駆体」とも称される）へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化、（ｂ）下垂体前駆細胞の、Ｐｉｔ１を発現する細胞（Ｐｉｔ１＋細胞）へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化；および（ｃ）Ｐｉｔ１＋細胞の、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化を含む。
【０００９】
本開示は、下垂体前駆体の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。例えば、本開示は、下垂体前駆体の、分化細胞の細胞集団への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、分化細胞の少なくとも約５０％が、成長ホルモンを産生することが可能である成長ホルモン産生細胞（「ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞」と称される）である、方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、１つまたは複数の背方化剤（ｄｏｒｓａｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）および１つまたは複数の腹方化剤（ｖｅｎｔｒａｌｉｚｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）と接触させるステップと；細胞を、Ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（「Ｗｎｔ活性化剤」と称される）および成長ホルモン（ＧＨ）の発現を誘導することが可能である１つまたは複数の分子（「ＧＨ誘導剤」と称される）と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞のうちの少なくとも約５０％は、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞であるステップとを含む。
【００１０】
ある特定の実施形態では、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞は、低レベルのＧＨＲＨＲ免疫反応性を発現する細胞（ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞）、高レベルのＧＨＲＨＲ免疫反応性を発現する細胞（ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞）、およびその組合せを含む。
【００１１】
ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約１０日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約２週間または３週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約１５日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
【００１２】
ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約１０日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約３週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約２５日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約３５日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
【００１３】
さらに、本開示は、下垂体前駆体の、分化細胞の細胞集団への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、分化細胞の少なくとも約５０％が、Ｐｉｔ１を発現する、方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、１つまたは複数の背方化剤および１つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップと；細胞をＷｎｔシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約５０％は、Ｐｉｔ１を発現するステップとを含む。ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約５日で、細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約７日または約１１日で、細胞集団を得るステップを含む。
【００１４】
さらに、本開示は、幹細胞の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。例えば、本開示は、幹細胞の、分化細胞の細胞集団への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、分化細胞の少なくとも約５０％が、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞である、方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞を、１つまたは複数のＢＭＰ分子およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップ；細胞を、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（「ＳＨＨ活性化剤」と称される）、ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（「ＦＧＦ活性化剤」と称される）、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤および１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約５０％は、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞であるステップを含む。
【００１５】
ある特定の実施形態では、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞は、低レベルのＧＨＲＨＲ免疫反応性を発現する細胞（ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞）、高レベルのＧＨＲＨＲ免疫反応性を発現する細胞（ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞）、およびその組合せを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約３週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約２４日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約４週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
【００１６】
ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約４週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約６週間で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約３０日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から３３日で、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
【００１７】
さらに、本開示は、幹細胞の、分化細胞の細胞集団への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法であって、分化細胞の少なくとも約５０％が、Ｐｉｔ１を発現する、方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞を、１つまたは複数のＢＭＰ分子およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップ；細胞を、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤、１つまたは複数のＦＧＦ活性化剤、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させて、分化細胞の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約５０％は、Ｐｉｔ１を発現するステップを含む。
【００１８】
ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日で、細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１５日で、細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約１５日で、細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約２０日で、細胞集団を得るステップを含む。
【００１９】
本明細書に開示される様々な方法について、ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤との最初の接触は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約２日および／または約５日以内である。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤との最初の接触は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触と同じ日に起こる。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤との最初の接触は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約４日である。
【００２０】
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約５日間および／または最長約１５日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約７日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させるステップを含む。
【００２１】
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約３日間および／または最長約１０日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、約４日間または約７日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約５日間および／または最長約１５日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約７日間または約１１日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップを含む。
【００２２】
ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約３日間および／または最長約１０日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、約４日間または約７日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、１つまたは複数の背方化剤およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と、同時に接触させるステップを含む。
【００２３】
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、１つまたは複数のエストロゲン受容体（ＥＲ）アゴニストと接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、１つまたは複数のＥＲアゴニストおよび１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と、同時に接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＥＲアゴニスト（ｔｈｅ  ｏｎｅ  ｏｒ  ＥＲ  ａｇｏｎｉｓｔ）との最初の接触は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約２日および／または約５日以内である。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＥＲアゴニストとの最初の接触は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触と同じ日に起こる。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＥＲアゴニストとの最初の接触は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約４日である。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約５日間および／または最長約１５日間、１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、少なくとも約７日間、１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させるステップを含む。
【００２４】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞は、幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化によって得られる。ある特定の実施形態では、幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化は、幹細胞を、１つまたは複数のＢＭＰ分子およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させること、細胞を、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤および１つ、２つ、またはそれより多いＦＧＦ活性化剤と接触させることを含む。
【００２５】
ある特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約２日間および／または約４日以内、１つまたは複数のＢＭＰ分子と接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約５日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞を、約８日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。
【００２６】
ある特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約２日間、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤および１つ、２つ、またはそれより多いＦＧＦ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞を、約５日間、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤および１つ、２つ、またはそれより多いＦＧＦ活性化剤と接触させる。
【００２７】
ある特定の実施形態では、幹細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化は、細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤（「ＳＭＡＤ阻害剤」と称される）と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約２日間、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞を、約５日間、ＳＭＡＤシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。
【００２８】
ある特定の実施形態では、様々な方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、Ｐｉｔ１を発現する細胞へと分化させるステップと、Ｐｉｔ１を発現する細胞を、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞へと分化させるステップと、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を、ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞へと分化させるステップとを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞を、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞へと分化させるステップと、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、Ｐｉｔ１を発現する細胞へと分化させるステップと、Ｐｉｔ１を発現する細胞を、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞へと分化させるステップと、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を、ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞へと分化させるステップとを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞を、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞へと分化させるステップと、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞を、Ｐｉｔ１を発現する細胞へと分化させるステップとを含む。
【００２９】
ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１を発現する細胞の、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞への分化は、Ｐｉｔ１を発現する細胞を、ＧＨ誘導剤の第１の組合せと接触させることを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第１の組合せは、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、ＥＲアゴニスト、およびＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第１の組合せは、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、およびＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第１の組合せは、ＲＡ、デキサメタゾン、Ｔ３、およびＧＨＲＨを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第１の組合せは、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、２種のＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、およびＥＲアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第１の組合せは、ＲＡ、デキサメタゾン、Ｔ３、ＧＨＲＨ、ｃＡＭＰ、およびＤＰＮを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第１の組合せは、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、ＥＲアゴニスト、およびＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第１の組合せは、ＲＡ、デキサメタゾン、Ｔ３、ＧＨＲＨ、ＤＰＮ、およびＧｈｒｅｌｉｎを含む。
【００３０】
ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１を発現する細胞を、少なくとも約３日間、ＧＨ誘導剤の第１の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１を発現する細胞を、約５日間、ＧＨ誘導剤の第１の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１を発現する細胞を、約２週間、ＧＨ誘導剤の第１の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
【００３１】
ある特定の実施形態では、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞への分化は、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を、ＧＨ誘導剤の第２の組合せと接触させることを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第２の組合せは、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、ＥＲアゴニスト、インターロイキン、およびＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第２の組合せは、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、およびＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第２の組合せは、ＲＡ、デキサメタゾン、Ｔ３、およびＧＨＲＨを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第２の組合せは、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、２種のＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、およびＥＲアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第２の組合せは、ＲＡ、デキサメタゾン、Ｔ３、ＧＨＲＨ、ｃＡＭＰ、およびＤＰＮを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第２の組合せは、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＧＨＲＨシグナル伝達のアゴニスト、ＥＲアゴニスト、インターロイキン、およびＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤の第２の組合せは、デキサメタゾン、Ｔ３、ＧＨＲＨ、ＩＬ−６、Ｇｈｒｅｌｉｎ、およびＤＰＮを含む。
【００３２】
ある特定の実施形態では、方法は、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を、少なくとも約５日間、ＧＨ誘導剤の第２の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を、約１０日間、ＧＨ誘導剤の第２の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を、約４週間、ＧＨ誘導剤の第２の組合せと接触させて、少なくとも約５０％のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む細胞集団を得るステップを含む。
【００３３】
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、本開示の主題は、幹細胞の、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカー（下垂体前駆体）を発現する細胞への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の集団を、有効量の、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤、有効量の、ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、有効量の、Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、および有効量の、ＦＧＦシグナル伝達の１つ、２つまたはそれより多い活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、ＳＭＡＤシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤は、少なくともＦＧＦ８およびＦＧＦ１０シグナル伝達を活性化する。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤は、少なくともＦＧＦ８、ＦＧＦ１０およびＦＧＦ１８シグナル伝達を活性化する。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約２日間、または少なくとも約３日間ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長３日間、最長４日間、または最長５日間ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約３日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約３日または約４日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間かつ最長約１０日間、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤および２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約９日間、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤および２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約８日間、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤および２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。
【００３４】
下垂体前駆体は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、Ｐｉｔ１を発現する細胞へと分化され得る。ある特定の実施形態では、下垂体前駆体を、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約７０％または約８０％）のＰｉｔ１を発現する細胞を含む細胞集団へと分化させるための方法は、下垂体前駆体の集団を、有効量の、１つまたは複数の背方化剤、有効量の、１つまたは複数の腹方化剤、および有効量の、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、下垂体前駆体を、有効量の、エストロゲン受容体（ＥＲ）の１つまたは複数のアゴニスト（ＥＲアゴニスト）と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間および最長約１０日間、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤、ならびに必要に応じてＥＲアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約７日間、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤、ならびに必要に応じてＥＲアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約８日間、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤、ならびに必要に応じてＥＲアゴニストと接触させる。
【００３５】
Ｐｉｔ１を発現する細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、成長ホルモン産生細胞へとさらに分化され得る。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１を発現する細胞を、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約７０％または約８０％）の１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団へと分化させるための方法は、Ｐｉｔ１を発現する細胞を、成長ホルモン（ＧＨ）の発現を誘導することが可能である１つまたは複数の分子（ＧＨ誘導剤）と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、１、２、３、４、５、または６種のＧＨ誘導剤と接触させる。
【００３６】
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の、１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカー（成長ホルモン産生細胞）を発現する細胞への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞の、１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法は、幹細胞の集団を、（ａ）有効量の、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤、（ｂ）有効量の、ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｃ）有効量の、Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｄ）有効量の、ＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤、（ｅ）有効量の１つまたは複数の背方化剤、（ｆ）有効量の１つまたは複数の腹方化剤、および（ｇ）有効量の１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させるステップを含む。
【００３７】
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約２日間、または少なくとも約３日間ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長３日間、最長４日間、または最長５日間ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤と、幹細胞のＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約３日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤と、幹細胞のＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約３日または約４日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間および最長約１０日間、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤、および２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約９日間、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤、および２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤を、細胞と、同時に接触させる。
【００３８】
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間および最長約１０日間、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約７日間、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約８日間、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約５日および最長約１５日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約８日で、接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約９日で接触させる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤を、細胞と同時に接触させる。
【００３９】
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、（ｈ）有効量の１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤は、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤と同時に、細胞と接触させる。
【００４０】
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、（ｉ）有効量の１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＥＲアゴニストを、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と同時に、細胞と接触させる。
【００４１】
ある特定の実施形態では、細胞を、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日および最長約２５日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約１５日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約１６日で接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約１０日間および最長約１０週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約２週間、少なくとも約４週間、または少なくとも約６週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約２週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約４週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約６週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。
【００４２】
ある特定の実施形態では、細胞集団は、少なくとも約５０％（例えば、約７０％または約８０％）の１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約３０日で含む。
【００４３】
ある特定の実施形態では、細胞を、有効量の前述の作用物質（ａｇｅｎｔ）と、少なくとも５０％（例えば、約７０％または約８０％）の細胞が検出可能なレベルの１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現するように、一定期間接触させる。
【００４４】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の背方化剤は、ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤を含む。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤は、ＦＧＦ８を含む。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤は、ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０を含む。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤は、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ１８を含む。
【００４５】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の腹方化剤は、１つまたは複数のＢＭＰ分子を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＢＭＰ分子は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＢＭＰ分子は、ＢＭＰ２を含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＢＭＰ分子は、ＢＭ４を含む。
【００４６】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ−１、ＷＮＴ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、ＷＡＹ−３１６６０６、ＩＱ１、ＱＳ１１、ＳＢ−２１６７６３、ＢＩＯ（６−ブロモインジルビン−３’−オキシム）、ＬＹ２０９０３１４、ＤＣＡ、２−アミノ−４−［３，４−（メチレンジオキシ）ベンジル−アミノ］−６−（３−メトキシフェニル）ピリミジン、（ヘテロ）アリールピリミジン、その誘導体、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。
【００４７】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＧＨ誘導剤は、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＥＲアゴニスト、ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト、Ｇｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニスト、インターロイキン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００４８】
ある特定の実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾンを含む。
【００４９】
ある特定の実施形態では、甲状腺ホルモンは、Ｔ３、Ｔ４、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、甲状腺ホルモンは、Ｔ３を含む。
【００５０】
ある特定の実施形態では、ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストは、ＧＨＲＨ、ｃ−ＡＭＰ（例えば、ジブチリル−ｃＡＭＰ）、ＰＫＡ、ＣＲＥＢ、ＭＡＰＫ活性化剤、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストは、ＧＨＲＨ、ｃ−ＡＭＰ、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
【００５１】
ある特定の実施形態では、Ｇｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストは、Ｇｈｒｅｌｉｎ、ＧＨＳＲアゴニスト、その誘導体およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００５２】
ある特定の実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、およびそれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、インターロイキンは、ＩＬ−６である。
【００５３】
ある特定の実施形態では、ＥＲアゴニストは、ジアリールプロピオニトリル（ＤＰＮ）、エストラジオール（Ｅ２）、プロピルピラゾール−トリオール（ＰＰＴ）、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＥＲアゴニストは、ＤＰＮを含む。
【００５４】
ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２を含む。
【００５５】
ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤は、ＳＨＨ、Ｃ２５ＩＩおよびパルモルファミンなどのスムーズンド（ＳＭＯ）受容体小分子アゴニスト、ＳＡＧ（例えば、Ｓｔａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．  ２０１０  Ｊａｎ；６（１）：４４−５４に開示されているような）、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤は、ＳＨＨを含む。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤は、ＳＡＧを含む。
【００５６】
ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｋ０２２８８、ＤＭＨ１、ＭＬ３４７、ＬＤＮ  ２１２８５４、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９を含む。
【００５７】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎｇ／ｍＬから２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度の１つまたは複数の背方化剤と接触させる。
【００５８】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１ｎｇ／ｍＬから３０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。
【００５９】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度のＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。
【００６０】
ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの間の濃度のＢＭＰ分子の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。
【００６１】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１μＭから２０μＭの間の濃度のＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。
【００６２】
ある特定の実施形態では、細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍｌの間または約５０ｎＭから２００ｎＭの間の濃度のＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。
【００６３】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１μＭから１０μＭの濃度の１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。
【００６４】
ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１ｎＭから２０ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させる。
【００６５】
ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１μＭから１μＭの濃度のＲＡと接触させる。
【００６６】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１ｎＭから２０ｎＭの間の濃度の１つまたは複数の甲状腺ホルモンと接触させる。
【００６７】
ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１μＭから１０μＭの濃度の１つまたは複数のコルチコステロイドと接触させる。
【００６８】
ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１μＭから１０μＭ、約０．１μＭ未満、または約１０ｎＭの濃度の１つまたは複数のＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。
【００６９】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１ｎＭから５０ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。
【００７０】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間の濃度の１つまたは複数のインターロイキンと接触させる。
【００７１】
ある特定の実施形態では、細胞を、約５０ｎＭから２００ｎＭの間の濃度のＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。
【００７２】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１００ｎＭから５００ｎＭの間の濃度のＳＭＡＤシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。
【００７３】
さらに、本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。
【００７４】
ある特定の実施形態では、幹細胞の、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するためのキットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、および（ｄ）ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤を含む。ある特定の実施形態では、キットは、（ｅ）幹細胞の、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示をさらに含む。ある特定の実施形態では、キットは、（ｆ）１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤をさらに含む。
【００７５】
ある特定の実施形態では、幹細胞の、Ｐｉｔ１を発現する分化細胞の集団への分化を誘導するためのキットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｄ）ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｅ）１つまたは複数の背方化剤、（ｆ）１つまたは複数の腹方化剤、および（ｇ）１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤を含む。ある特定の実施形態では、キットは、（ｈ）幹細胞の、Ｐｉｔ１を発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示をさらに含む。ある特定の実施形態では、キットは、（ｉ）１つまたは複数のＥＲアゴニストをさらに含む。
【００７６】
ある特定の実施形態では、幹細胞の、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのキットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｄ）ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｅ）１つまたは複数の背方化剤、（ｆ）１つまたは複数の腹方化剤、（ｇ）１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤、および（ｈ）１つまたは複数のＧＨ誘導剤を含む。ある特定の実施形態では、キットは、（ｉ）幹細胞の、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞の集団への分化を誘導するための指示をさらに含む。
【００７７】
本開示は、下垂体前駆体の、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのキットをさらに提供する。ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）１つまたは複数の背方化剤；（ｂ）１つまたは複数の腹方化剤；（ｃ）Ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（Ｗｎｔ活性化剤）；および（ｄ）１つまたは複数の成長ホルモン（ＧＨ）誘導剤を含む。
【００７８】
さらに、本開示は、幹細胞の、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）１つまたは複数のＢＭＰ分子；（ｂ）ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤；（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤；（ｄ）ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤；（ｅ）１つまたは複数の背方化剤；（ｆ）１つまたは複数の腹方化剤；（ｇ）Ｗｉｎｇｌｅｓｓ（Ｗｎｔ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（Ｗｎｔ活性化剤）；および（ｈ）１つまたは複数の成長ホルモン（ＧＨ）誘導剤を含む。ある特定の実施形態では、キットは、１つまたは複数のＥＲアゴニストをさらに含む。
【００７９】
ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２を含む。
【００８０】
ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達の前記１つまたは複数の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｋ０２２８８、ＤＭＨ１、ＭＬ３４７、ＬＤＮ２１２８５４、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９を含む。
【００８１】
ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためのグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の前記１つまたは複数の活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、Ｗｎｔ−１、ＷＮＴ３Ａ、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。
【００８２】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の前記活性化剤は、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、および／またはＦＧＦ１８を含む。
【００８３】
ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝の前記活性化剤は、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００８４】
ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の活性化剤は、Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、Ｃ２５ＩＩおよびパルモルファミンなどのスムーズンド（ＳＭＯ）受容体小分子アゴニスト、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００８５】
ある特定の実施形態では、ＥＲアゴニストは、ジアリールプロピオニトリル（ＤＰＮ）、エストラジオール（Ｅ２）、プロピルピラゾール−トリオール（ＰＰＴ）、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＥＲアゴニストは、ＤＰＮを含む。
【００８６】
ある特定の実施形態では、ＧＨ誘導剤は、酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＥＲアゴニスト、およびＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、コルチコステロイドは、デキサメタゾン、コルチゾン、およびヒドロコルチゾン、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、甲状腺ホルモンは、Ｔ３、Ｔ４、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストは、ＧＨＲＨ、ジブチリル−ｃＡＭＰ、ＰＫＡ，ＣＲＥＢ、ＭＡＰＫ活性化剤、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。
【００８７】
加えて、本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したＧＨ産生成長ホルモン産生細胞の細胞集団、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したＰｉｔ１＋細胞の細胞集団を含む、本明細書に開示される方法によって得られる分化細胞の様々な細胞集団を提供する。
【００８８】
本開示は、本明細書に開示される細胞集団を含む組成物をさらに提供する。
【００８９】
本開示は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を含む組成物であって、分化細胞の少なくとも約５０％が、成長ホルモンを産生することが可能であり（ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞（ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈ））、分化細胞の約２５％未満が、プロラクチン産生細胞（ｌａｃｔｒｏｔｒｏｐｈ）マーカー、甲状腺刺激ホルモン産生細胞（ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｈ）マーカー、下垂体前駆体マーカー、Ｐｉｔ１、幹細胞マーカー、ＮＮＥマーカー、神経堤（ＮＣ）系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカーからなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する、組成物をさらに提供する。
【００９０】
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団であって、前記分化細胞集団が、幹細胞の集団を、有効量の（ａ）有効量の、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤、（ｂ）有効量の、ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｃ）有効量の、Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｄ）有効量の、ＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤、（ｅ）有効量の１つまたは複数の背方化剤、（ｆ）有効量の１つまたは複数の腹方化剤、および（ｇ）有効量の１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤に曝露するステップを含む方法に従って、幹細胞の集団から生じ、
【００９１】
分化細胞の集団の２５％未満が、プロラクチン産生細胞マーカー、甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカー、下垂体前駆体マーカー、Ｐｉｔ１、幹細胞マーカー、ＮＮＥマーカー、神経堤（ＮＣ）系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカー（頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーを含むがこれらに限定されない）からなる群から選択される、検出可能なレベルの１つまたは複数のマーカーを発現する、集団を提供する。
【００９２】
本開示の主題は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化した細胞の集団を含む組成物であって、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）の細胞の集団が、１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現し、約２５％未満（例えば、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）の細胞の集団が、プロラクチン産生細胞マーカー、甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカー、下垂体前駆体マーカー、Ｐｉｔ１、幹細胞マーカー、ＮＮＥマーカー、神経堤（ＮＣ）系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカー（頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーを含むがこれらに限定されない）からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する、組成物も提供する。
【００９３】
ある特定の実施形態では、下垂体前駆細胞マーカーは、ＳＩＸ１、ＬＨＸ３、ＬＨＸ４、ＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＨＥＳＸ１、ＰＲＯＰ１、ＳＩＸ６、ＴＢＸ１９、およびＰＡＸ６、ＧＡＴＡ２、およびＳＦ１からなる群から選択される。
【００９４】
ある特定の実施形態では、成長ホルモン産生細胞マーカーは、ＧＨ１、ＧＨＲＨ受容体（ＧＨＲＨＲ）、ＰＯＵ１Ｆ１、ＮｅｕｒｏＤ４、およびＧＨＳＲからなる群から選択される。
【００９５】
ある特定の実施形態では、ＮＣ系統マーカーは、ＳＯＸ１０、ＦｏｘＤ３、ＡＳＣＬ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ、およびＳｎａｉｌからなる群から選択される。
【００９６】
ある特定の実施形態では、ＮＮＥマーカーは、ＴＦＡＰ２Ａ、ＥＹＡ１、ＤＬＸ３、およびＤＬＸ５からなる群から選択される。
【００９７】
ある特定の実施形態では、非下垂体プラコードマーカーは、頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーからなる群から選択される。
【００９８】
ある特定の実施形態では、頭蓋プラコードマーカーは、ＳＩＸ１、ＰＡＸ６、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、およびクリスタリンアルファＢからなる群から選択される。
【００９９】
ある特定の実施形態では、三叉神経プラコードマーカーは、ＰＡＸ３である。
【０１００】
ある特定の実施形態では、上鰓プラコードマーカーは、ＰＡＸ２である。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、耳プラコードマーカーは、ＰＡＸ８である。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、プロラクチン産生細胞マーカーは、ＰＲＬ、ＰＩＴ１、およびＤ２Ｒからなる群から選択される。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカーは、ＴＳＨ、ＴＨＲＨ、およびＰＩＴ１からなる群から選択される。
【０１０４】
ある特定の非限定の実施形態では、組成物は、前記１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する約１×１０４から約１×１０１０個の細胞の集団を含む。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト多能性幹細胞は、ヒト胚性幹細胞、およびヒト人工多能性幹細胞からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、幹細胞は、非ヒト幹細胞、例えば、これらに限定されないが、哺乳動物幹細胞、霊長類幹細胞、またはげっ歯類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジなど由来の幹細胞である。
【０１０６】
本開示の主題は、対象における成長ホルモンの発現および／または分泌を増加させる方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に、有効量の本明細書に記載の分化細胞集団（例えば、少なくとも約５０％（例えば、約７０％、または約８０％）の１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団）またはそれを含む組成物を投与するステップを含む。
【０１０７】
本開示の主題は、対象における成長ホルモンの発現および／または分泌を増加させるための、本明細書に記載の分化細胞集団（例えば、少なくとも約５０％（例えば、約７０％、または約８０％）の１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団）、それを含む組成物をさらに提供する。
【０１０８】
本開示の主題は、対象におけるＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つまたは複数の動的放出を回復させる方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に、有効量の本明細書に記載の分化細胞集団（例えば、少なくとも約５０％（例えば、約７０％または約８０％）の１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団）またはそれを含む組成物を投与するステップを含む。
【０１０９】
本開示の主題は、対象におけるＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つまたは複数の動的放出を回復させるための、本明細書に記載の分化細胞集団（例えば、少なくとも約５０％（例えば、約７０％または約８０％）の１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団）、それを含む組成物をさらに提供する。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、対象は、成長ホルモン欠損症を患っている。
【０１１１】
本開示の主題は、対象における成長ホルモン欠損症を処置する方法をさらに提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に、有効量の本明細書に記載の分化細胞集団（例えば、少なくとも約５０％（例えば、約７０％または約８０％）の１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団）またはそれを含む組成物を投与するステップを含む。
【０１１２】
本開示は、対象におけるＧＨの発現および／もしくは分泌を増加させる、ＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに／またはＧＨ欠損症を処置する方法も提供する。ある特定の実施形態では、方法は、対象に、以下の：（ａ）本明細書に開示される分化細胞の細胞集団（例えば、本明細書に開示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したＧＨ産生成長ホルモン産生細胞の細胞集団）；および（ｂ）本明細書に開示される組成物のうちの１つを投与するステップを含む。
【０１１３】
本開示の主題は、対象における成長ホルモン欠損症を処置するための、本明細書に記載の分化細胞集団（例えば、少なくとも約５０％（例えば、約７０％または約８０％）の１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団）、それを含む組成物をさらに提供する。
【０１１４】
本開示の主題は、成長ホルモンの発現および／もしくは分泌を増加させる、ＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに／または成長ホルモン欠損症を処置するための医薬の製造における、本明細書に記載の分化細胞集団（例えば、少なくとも約５０％（例えば、約７０％または約８０％）の１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む細胞集団）、それを含む組成物の使用をさらに提供する。
【０１１５】
さらに、本開示は、ＧＨ欠損症に関連する１つまたは複数の細胞表現型を克服することが可能である治療用化合物をスクリーニングする方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）本明細書に開示されるｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化したＧＨ産生成長ホルモン産生細胞の細胞集団を、試験化合物と接触させるステップと；（ｂ）ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞の機能的活性および／または遺伝子発現を測定するステップであって、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞が、ＧＨ欠損症を有する対象の幹細胞またはＧＨ欠損症を有する対象の１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞から得られるステップとを含む。
４．図面の簡単な説明
【図面の簡単な説明】
【０１１６】
【図１】図１は、本開示の主題のある特定の実施形態に従った、幹細胞の、成長ホルモン産生細胞への分化のための方法を示す。
【０１１７】
【図２】図２は、ｈＰＳＣから生じる前プラコード外胚葉（ｐｒｅ−ｐｌａｃｏｄａｌ  ｅｃｔｏｄｅｒｍ）および下垂体前葉前駆細胞の遺伝子発現を示す。シングルセルＲＮＡ−ｓｅｑ分析により、７０％の細胞がＰＩＴＸ１およびＬＨＸ３などの下垂体転写物を共発現することが示された。４つの細胞（分析した全細胞の５％）のみが、Ｔ（中胚葉）、ＳＯＸ１７、またはＭＹＯＤを発現し、夾雑細胞の割合が低いことを示唆する。他のプラコードの運命は、ＰＡＸ２（上鰓）、ＰＡＸ３（三叉神経）、またはＰＡＸ８（耳）を含み、これらは、ＳＩＸ１＋集団の約２０％において一緒に検出された。
【０１１８】
【図３】図３は、低用量および高用量のＮｏｔｃｈシグナル伝達誘導剤（例えば、ＦＧＦ８／１０）で処置した多能性幹細胞の遺伝子発現を示す。ＰＲＯＰ１発現は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達誘導剤によって有意に上方調節された。
【０１１９】
【図４】図４は、ＣＨＩＲ９９０２１によってさらに処置された細胞におけるＰｉｔ１遺伝子発現を示す。ほとんどのＰｉｔ１を発現する細胞は、Ｋｉ６７標識によって示されるように増殖していなかった。
【０１２０】
【図５】図５は、ＰＲＯＰ１、ＰＩＴ１およびＰＯＭＣ発現に対するＦＧＦ８の作用を示す。ＦＧＦ８処置は、ＰＲＯＰ１を維持し、ＰＩＴ１を下方調節し、ＰＯＭＣを上方調節した。ＢＭＰ２処置は、このような作用を中和した。
【０１２１】
【図６】図６は、ＧＨ１、ＰＲＬおよびＴＳＨ−β発現に対するＢＭＰ２とＣＨＩＲの組合せの作用を示す。ＢＭＰ２とＣＨＩＲの組合せは、ＧＨ１の発現を有意に促進した。＊＊：対照群と比較して、ｐ値＜０．０１。
【０１２２】
【図７】図７Ａ〜７Ｄは、成長ホルモン産生細胞の選択的誘導に対するＲＡ、ＧＨＲＨ、Ｔ３、およびコルチコステロンの作用を示す。図６Ａは、ＲＡによる処置によってＧＨ１の発現が有意に増加したことを示す。図６Ｂは、ＧＨＲＨによる処置によってＧＨ１の発現が有意に増加したことを示す。図６Ｃは、Ｔ３による処置によってＴＳＨ−βの発現が有意に低下したことを示す。図６Ｄは、コルチコステロンによる処置によってＰＲＬの発現が有意に低下したことを示す。＊＊：対照群と比較して、ｐ値＜０．０１。
【０１２３】
【図８】図８は、成長ホルモン誘導後の細胞表現型を示す。細胞集団は、多量のＧＨおよびＧＨＲＨＲ、および少量のＴＳＨ、ＰＲＬおよびＬＨを発現した。右下のパネルは、ＧＨＲＨ刺激によりＧＨ発現が増加したことを示す。
【０１２４】
【図９】図９は、ＧＨＲＨＲ陽性細胞集団におけるＫｉ６７およびＧＨＲＨＲの発現を示す。ＧＨＲＨＲ陽性細胞では、ほとんどの細胞が低レベルのＧＨＲＨＲを発現し、細胞の一部だけが高レベルのＧＨＲＨＲを発現した。高レベルのＧＨＲＨＲを発現する細胞は、低い増殖速度を有する多角形形態を示し、これらがより成熟したＧＨ細胞であることが示された。
【０１２５】
【図１０】図１０は、成長ホルモンの分泌とＧＨＲＨＲ発現の間の相関を示す。左側のパネルは、高レベルのＧＨＲＨＲを発現する細胞が、Ｋｉ６７の低発現によって反映される低い増殖速度を有していたことを示す。真ん中のパネルは、細胞がＧＨＲＨＲの発現に基づいてスクリーニングされ、ここで、高レベルのＧＨＲＨＲを発現する細胞が集団の１５％を占めたことを示す。右側のパネルは、高レベルのＧＨＲＨＲを発現する細胞が、低レベルのＧＨＲＨＲを発現する細胞と比較して、有意に多い量の成長ホルモンを発現したことを示す。＊＊＊：対照群と比較して、ｐ値＜０．００１。
【０１２６】
【図１１】図１１は、それによって別個の細胞集団を分析することができる、ステージ特異的レポーター系を生成するための例示的なレポーター構築物を示す。
【０１２７】
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｆは、Ａｍｅｓ小人症マウスコロニーの特徴付けを示す。Ａ）１１週齢のＡｍｅｓ小人症マウスとヘテロ接合同腹子の比較。Ａｍｅｓ小人症マウスは、サイズおよび体重において小型であった。Ｂ）ＥＬＩＳＡによって検出された循環血漿中ＧＨレベル。Ｃ）腓腹筋におけるＩＧＦ−１（クラスＩＩ）遺伝子発現のＲＴ−ｑＰＣＲ分析。Ｄ）Ａｍｅｓマウスと正常な対照から得られた大腿骨は、長さに有意な差を示した。Ｅ）大腿骨の皮質骨密度および厚みのＭｉｃｒｏＣＴ分析。Ｆ）骨梁骨塩密度（ＴＭＤ）のＭｉｃｒｏＣＴ分析。ＴＭＤは、２つのマウスの間で類似していたが、Ａｍｅｓマウスは、非常により薄い骨梁骨（より多くの分離とより多数の骨梁を示す）を示した。データは、２から４つの別々の試料の平均±ＳＥＭとしてプロットした。野生型群と比較して、＊ｐ＜０．０５、＊＊：ｐ値＜０．０１、＊＊＊：ｐ値＜０．００１。
【０１２８】
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｆは、ＲＡＧ１−／−／Ｐｒｏｐ１ｄｆ／ｄｆマウスに対するＧＨ細胞の作用を示す。Ａ）左の２匹のマウスはＲＡＧ１−／−／Ｐｒｏｐ１ｄｆ／ｄｆであった。右のマウスはＲＡＧ１−／−／Ｐｒｏｐ１ｗｔ／ｄｆであった。マウスは６カ月齢であった。Ｂ）ＩＨＣは、移植後移植６週以内にヒト核（ｈＮＡ）で標識したヒト細胞におけるＧＨ細胞の存在を示す。Ｃ）ＥＬＩＳＡによって検出された基底のおよびＧＨＲＨで刺激されたｈＧＨの血漿中レベル。Ｄ）ＩＧＦ−１クラスＩＩ（ＩＧＦ−１の循環形態）のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｅ）肝臓におけるＩＧＦＢＰ３  ｍＲＮＡ発現のｑＲＴ−ＰＣＲ分析。Ｆ）ＥＬＩＳＡによって検出された基底の血漿中ＩＧＦ−１レベルのｑＲＴ−ＰＣＲ分析。ｎ＝２〜３。データは、平均±ＳＥＭとしてプロットされた。スケールバー＝５０μｍ。偽群と比較して、＊：ｐ値＜０．０５；＊＊：ｐ値＜０．０１。
【０１２９】
【図１４】図１４は、本開示の主題のある特定の実施形態に従った、幹細胞の、成長ホルモン産生細胞への分化のための方法を示す。
【０１３０】
【図１５】図１５は、本開示の主題のある特定の実施形態に従った、幹細胞の、成長ホルモン産生細胞への分化のための方法を示す。
【０１３１】
【図１６】図１６は、インターロイキン（「ＩＬ」）がＧＨ１の遺伝子発現を促進することを示す。ＩＬ６およびＩＬ１０は、対照群と比較して、ＰＩＴ１およびＧＨ１の遺伝子発現を増加させた。対照群と比較して、＊＊：ｐ値＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
５．発明の詳細な説明
本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の、１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞へのまたはＧＨ産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、および下垂体前駆細胞（または下垂体前駆体）の、１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞へのまたはＧＨ産生成長ホルモン産生細胞への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法、およびこのような方法によって生成される細胞、ならびにこのような細胞を含む組成物に関する。成長ホルモンの発現および／分泌を増加させる、成長ホルモンの動的放出を回復させる、ならびに／または成長ホルモン欠損症を処置するためのこのような細胞の使用も提供される。
【０１３３】
本開示の明確化のためであって限定としてではなく、詳細な説明は以下の下位項目に分割される。
５．１．定義；
５．２．幹細胞を分化させる方法；
５．３．分化細胞集団を含む組成物；
５．４．成長ホルモンを増加させる方法；
５．５．キット；
５．６．治療用化合物をスクリーニングする方法
５．１  定義
【０１３４】
本明細書において使用される用語は、一般的に、本発明の文脈内で、かつ各用語が使用される特定の文脈において、当技術分野における通常の意味を有する。特定の用語について以下に、または本明細書中の他所において議論し、従事者に本発明の組成物および方法を説明する際の追加のガイダンスならびにそれらを作製および使用する方法を提供する。
【０１３５】
「約」または「およそ」という用語は、当業者によって決定された特定の値に関する許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値が測定または決定される方法に部分的に依存する（すなわち、測定系の限界）。例えば、「約」は、当技術分野における実践で、３以内または３を超える標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、例えば、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の一桁以内、例えば、５倍以内、または２倍以内を意味し得る。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「シグナル伝達タンパク質」に関する「シグナル伝達」という用語は、膜受容体タンパク質へのリガンド結合またはいくつかの他の刺激によって活性化されるかまたはそうでなければ影響を受けるタンパク質を指す。シグナル伝達タンパク質の例として、これらに限定されないが、ＳＭＡＤ、ベータ−カテニンを含むウイングレス（Ｗｎｔ）複合体タンパク質、ＮＯＴＣＨ、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、Ａｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）タンパク質、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、ＧＨＲＨ、およびＧｈｒｅｌｉｎが挙げられる。多くの細胞表面受容体または細胞内受容体タンパク質では、リガンド−受容体相互作用は、細胞の応答と直接結びついていない。リガンド活性化受容体は、細胞の挙動に対するリガンドの最終的な生理的作用が生じる前に、細胞の内部で他のタンパク質と最初に相互作用し得る。一連のいくつかの相互作用する細胞タンパク質の挙動は、受容体の活性化または阻害後に変化することが多い。受容体の活性化によって誘導される細胞変化の全体のセットは、シグナル伝達機構またはシグナル伝達経路と呼ばれる。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「シグナル」という用語は、細胞の構造および機能の変化を制御する内部および外部の因子を指す。これらは、本質的に化学的または物理的であり得る。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「リガンド」という用語は、受容体に結合する分子およびタンパク質、例えば、形質転換成長因子ベータ（ＴＦＧβ）、Ａｃｔｉｖｉｎ、Ｎｏｄａｌ、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）などを指す。
【０１３９】
「阻害剤」は、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能を妨げる（例えば、低減するか、低下させるか、抑制するか、排除するか、またはブロックする）ことが可能である化合物または分子（例えば、小分子、ペプチド、ペプチド模倣体、天然化合物、ｓｉＲＮＡ、アンチセンス核酸、アプタマー、または抗体）を指す。阻害剤は、指定されるタンパク質（シグナル伝達分子、指定されるシグナル伝達分子に関与する任意の分子、指定される関連分子）の任意の活性を変化させる任意の化合物または分子であり得る。阻害剤は、指定されるシグナル伝達分子から上流の分子に結合して影響を及ぼすこと（次に指定される分子の阻害を引き起こす）によって誘導される阻害に加えて、競合的阻害（別の公知の結合化合物の結合を排除または低減するように活性部位に結合する）およびアロステリック阻害（化合物がそのタンパク質の活性部位に結合するのを妨げるようにタンパク質のコンフォメーションを変化させるようにタンパク質に結合する）の観点から説明される。阻害剤は、実際にシグナル伝達標的と接触することによってシグナル伝達標的またはシグナル伝達標的経路を阻害する「直接的阻害剤」であり得る。
【０１４０】
「活性化剤」は、本明細書で使用される場合、分子または経路のシグナル伝達機能、例えば、Ｗｎｔシグナル伝達、ＢＭＰシグナル伝達、ＳＨＨシグナル伝達、ＦＧＦシグナル伝達、ＧＨＲＨシグナル伝達、Ｇｈｒｅｌｉｎシグナル伝達などの活性化を増加させる、誘導する、刺激する、活性化する、促進する、および／または増強することが可能である化合物を指す。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「誘導体」という用語は、類似するコア構造を有する化学的化合物を指す。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「細胞の集団」または「細胞集団」という用語は、少なくとも２つの細胞の群を指す。非限定的な例では、細胞集団は、少なくとも約１０個、少なくとも約１００個、少なくとも約２００個、少なくとも約３００個、少なくとも約４００個、少なくとも約５００個、少なくとも約６００個、少なくとも約７００個、少なくとも約８００個、少なくとも約９００個、少なくとも約１０００個の細胞、少なくとも約５，０００個の細胞または少なくとも約１０，０００個の細胞または少なくとも約１００，０００個の細胞または少なくとも約１，０００，０００個の細胞を含み得る。集団は、１つの細胞型を含む純粋集団、例えば、下垂体前駆細胞または下垂体前駆体の集団、Ｐｉｔ１を発現する細胞、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞（ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞、ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞）、または未分化幹細胞の集団であってもよい。あるいは、集団は、１種より多い細胞型、例えば、混合細胞集団を含んでもよい。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、培養下で無期限に分裂し、特殊化した細胞を生じさせる能力を有する細胞を指す。ヒト幹細胞は、ヒトに由来する幹細胞を指す。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞」および「ＥＳＣ」という用語は、培養下で長期間分化せずに分裂することが可能である、着床前段階の胚から生じ、３つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知である、原始（未分化）細胞を指す。ヒト胚性幹細胞は、ヒトに由来する胚性幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ヒト胚性幹細胞」または「ｈＥＳＣ」という用語は、培養下で長期間分化せずに分裂することが可能であり、３つの一次胚葉の細胞および組織へと発生することが公知である、初期ヒト胚（胚盤胞段階まで、および胚盤胞段階を含む）から生じる多能性幹細胞の一種を指す。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞系」という用語は、数日間、数カ月間から数年間まで分化せずに増殖することが可能である、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ条件下で培養された胚性幹細胞の集団を指す。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「全能性」という用語は、身体のすべての細胞型および胎盤などの胚体外組織を構成するすべての細胞型を生じさせる能力を指す。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｔ）」という用語は、身体の１つより多くの細胞型へと発生する能力を指す。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「多能性」という用語は、内胚葉、中胚葉、および外胚葉を含む生物の３つの発生胚葉へと発生する能力を指す。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」という用語は、特定の胚性遺伝子（例えば、ＯＣＴ４、ＳＯＸ２、およびＫＬＦ４導入遺伝子）（例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Ｔａｋａｈａｓｈｉ  ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ  Ｃｅｌｌ  １２６，  ６６３−６７６  （２００６）を参照されたい）が体細胞、例えば、Ｃ１４、Ｃ７２などに導入されることによって形成される、胚性幹細胞に類似する、多能性幹細胞の一種を指す。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、配偶子（卵子または精子）以外の身体中の任意の細胞を指し、「成体」細胞と称される場合もある。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「体性（成体）幹細胞」という用語は、自己再生（実験室における）および分化の両方について限られた能力を有する、多くの器官および分化組織において見られる比較的稀な未分化細胞を指す。このような細胞の分化能力は様々であるが、通常は起源の器官における細胞型に限定される。
【０１５２】
本明細書で使用される場合、「ニューロン」という用語は、神経系の主要な機能的単位である神経細胞を指す。ニューロンは、細胞体とその突起−軸索および１つまたは複数の樹状突起からなる。ニューロンは、シナプスにおいて神経伝達物質を放出することによって他のニューロンまたは細胞に情報を伝達する。
【０１５３】
本明細書で使用される場合、「増殖」という用語は、細胞数の増加を指す。
【０１５４】
本明細書で使用される場合、「未分化」という用語は、まだ特殊化した細胞型へと発生していない細胞を指す。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「分化」という用語は、特殊化していない胚細胞が、心臓、肝臓、または筋細胞などの特殊化した細胞の特徴を獲得するプロセスを指す。分化は、通常は、細胞表面に埋め込まれたタンパク質を含むシグナル伝達経路を介して、細胞の遺伝子の、細胞の外側の物理的および化学的条件との相互作用によって制御される。
【０１５６】
本明細書で使用される場合、「定方向性分化」という用語は、神経、神経堤、頭蓋プラコード、および非神経外胚葉前駆体などの、特定の（例えば、所望する）細胞型への分化を誘導する幹細胞培養条件の操作を指す。
【０１５７】
本明細書で使用される場合、幹細胞に関する「定方向性分化」という用語は、幹細胞の、多能性状態からより成熟したまたは特殊化した細胞運命への移行を促進するための小分子、成長因子タンパク質、および他の成長条件の使用を指す。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「下垂体前駆細胞」および「下垂体前駆体」という用語は互換的に使用され、１つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカーを発現する細胞を指す。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「成長ホルモン産生細胞」という用語は、１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を指す。ある特定の実施形態では、成長ホルモン産生細胞は、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞またはＧＨ分泌成長ホルモン産生細胞である。
【０１６０】
本明細書で使用される場合、細胞に関する「分化を誘導する」という用語は、デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）を非デフォルト細胞型（遺伝子型および／または表現型）に変化させることを指す。よって、「細胞（例えば、幹細胞）において分化を誘導する」とは、細胞（例えば、幹細胞）を、遺伝子型（例えば、マイクロアレイなどの遺伝子分析によって決定される遺伝子発現の変化）および／または表現型（例えば、下垂体前駆細胞マーカー、ＰＩＴ１、および成長ホルモン産生細胞マーカーなどのタンパク質の発現の変化）などの、その細胞とは異なる特徴を有する子孫細胞へと分裂するように誘導することを指す。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「細胞培養」という用語は、研究または医学的処置のための人工培地におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の成長を指す。
【０１６２】
本明細書で使用される場合、「培養培地」という用語は、例えば、ペトリ皿、マルチウェルプレートなどの培養容器中で細胞を覆う液体を指し、細胞に栄養を与え、支持する栄養分を含有する。培養培地はまた、細胞に所望の変化を生じさせるために添加される成長因子も含み得る。
【０１６３】
本明細書で使用される場合、細胞を化合物（例えば、１つまたは複数の阻害剤、活性化剤、および／または誘導剤）と「接触させる」という用語は、細胞を化合物に曝露させること、例えば、化合物を細胞と触れることを可能にする位置に置くことを指す。接触させることは、任意の適切な方法を使用して達成され得る。例えば、接触させることは、化合物を細胞のチューブに添加することによって達成され得る。接触させることはまた、化合物を細胞を含む培養培地に添加することによって達成され得る。化合物（例えば、本明細書に開示される阻害剤および活性化剤）のそれぞれは、溶液（例えば、濃縮溶液）として、細胞を含む培養培地に添加することができる。あるいはまたはさらに、化合物（例えば、本明細書に開示される阻害剤および活性化剤）および細胞は、製剤化された細胞培養培地中に存在し得る。
【０１６４】
本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｔｒｏ」という用語は、人工環境および人工環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ環境は、試験管および細胞培養物に例示されるが、これらに限定されない。
【０１６５】
本明細書で使用される場合、「ｉｎ  ｖｉｖｏ」という用語は、自然環境（例えば、動物または細胞）および、例えば、胚発生、細胞分化、神経管形成などの自然環境内で起こるプロセスまたは反応を指す。
【０１６６】
本明細書で使用される場合、遺伝子またはタンパク質に関連する「発現する」という用語は、例えば、マイクロアレイアッセイ、抗体染色アッセイなどのアッセイを使用して観察することができるｍＲＮＡまたはタンパク質が生じることを指す。
【０１６７】
本明細書で使用される場合、「マーカー」または「細胞マーカー」という用語は、特定の細胞または細胞型を同定する遺伝子またはタンパク質を指す。細胞に関するマーカーは、１つのマーカーに限定されなくてもよく、マーカーは、指定される群のマーカーが細胞または細胞型を別の細胞または細胞型から識別し得るように、マーカーの「パターン」を指し得る。
【０１６８】
本明細書で使用される場合、「から生じた」または「から確立された」または「から分化した」という用語は、本明細書に開示される任意の細胞に関連して述べられる場合、細胞系、組織中の親細胞（例えば、任意の操作、例えば、限定されないが、単一細胞単離、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでの培養、例えば、タンパク質、化学物質、放射線、ウイルスによる感染を使用する処置および／または変異誘発、例えば、モルフォゲンなどのＤＮＡ配列でのトランスフェクション、培養親細胞中に含有される任意の細胞の選択（連続培養によるなどの）を使用して分離された胚、または流体）から得られた（例えば、単離された、精製されたなど）細胞を指す。生じた細胞は、成長因子、サイトカイン、サイトカイン処置の選択進行、接着性、接着性の欠如、選別手順などに対する応答によって混合集団から選択することができる。
【０１６９】
本明細書における「個体」または「対象」は、脊椎動物、例えば、ヒトまたは非ヒト動物、例えば、哺乳動物である。哺乳動物として、これらに限定されないが、ヒト、霊長類、家畜動物、競技用動物、げっ歯類およびペットが挙げられる。非ヒト動物対象の非限定例として、げっ歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット；ウサギ；イヌ；ネコ；ヒツジ；ブタ；ヤギ；ウシ；ウマ；ならびに非ヒト霊長類、例えば、類人猿およびサルが挙げられる。
【０１７０】
本明細書で使用される場合、「疾患」という用語は、細胞、組織、または器官の正常な機能に損傷を与えるかまたはそれを妨げる任意の状態または障害を指す。
【０１７１】
本明細書で使用される場合、「処置すること」または「処置」という用語は、処置されている個体または細胞の疾患の経過を変更することを試みる臨床的介入を指し、予防のためにまたは臨床病理の経過の間のいずれかに実施され得る。処置の治療的効果として、限定されないが、疾患の発症または再発を防止すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病理学的転帰の消失、転移を防止すること、疾患の進行速度を低下させること、疾患状態の軽快または緩和、および寛解または予後改善が挙げられる。疾患または障害の進行を防止することによって、処置は、罹患したもしくは診断された対象または障害を有することが疑われる対象において障害による悪化を防止することができるが、処置は、障害のリスクを有する対象または障害を有することが疑われる対象において障害または障害の症状の発症を防止することもできる。
５．２  幹細胞を分化させる方法
【０１７２】
本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト幹細胞である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、ヒト多能性幹細胞である。ヒト幹細胞の非限定的な例として、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）、ヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）、ヒト単為生殖幹細胞、始原生殖細胞様多能性幹細胞、胚盤葉上層幹細胞、Ｆクラス多能性幹細胞、体性幹細胞、がん幹細胞、または系統特異的分化が可能な任意の他の細胞が挙げられる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ヒト人工多能性幹細胞（ｈｉＰＳＣ）である。ある特定の実施形態では、幹細胞は、これらに限定されないが、哺乳動物幹細胞、霊長類幹細胞、またはげっ歯類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、ブタ、ウシ、ヒツジなどに由来する幹細胞を含む非ヒト幹細胞である。
【０１７３】
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ幹細胞由来成長ホルモン産生細胞（例えば、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞）を作製する方法に関する。ある特定の実施形態では、幹細胞の、成長ホルモン産生細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化は、３つのフェーズ：（ａ）幹細胞の、下垂体前駆細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化、（ｂ）下垂体前駆細胞の、Ｐｉｔ１を発現する細胞（Ｐｉｔ１＋細胞）へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化；および（ｃ）Ｐｉｔ１＋細胞の、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化を含む。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、下垂体前駆細胞の、成長ホルモン産生細胞（例えば、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞）への分化を誘導する方法に関する。ある特定の実施形態では、方法は、下垂体前駆細胞の、Ｐｉｔ１を発現する細胞（Ｐｉｔ１＋細胞）へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化；およびＰｉｔ１＋細胞の、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化を含む。
【０１７５】
これらに限定されないが、Ｚｉｍｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐｏｒｔ  （２０１６）；６：８５８−８７２、および２０１７年９月７日に出願された米国特許仮出願第６２／５５５，６２９号に開示されたものを含む、幹細胞の、下垂体前駆細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの分化のための任意の好適な方法を、本開示の方法の第１のフェーズで使用することができる。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、幹細胞の集団は、下垂体前駆細胞の集団へとｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化され、これは、Ｐｉｔ１＋細胞の集団へとｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化され、これは、成長ホルモン産生細胞の集団へとさらにｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化される。
【０１７７】
本開示の方法は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化剤（「Ｗｎｔ活性化剤」と称される；例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）によって、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を上方調節することによりＰｉｔ１誘導が増強され得る；ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤（「ＦＧＦ活性化剤」と称される、例えば、ＦＧＦ８）によって、Ｐｒｏｐ１が維持され、Ｐｉｔ１が下方調節される一方でＰＯＭＣが上方調節され得、この作用が骨形成タンパク質（ＢＭＰ）分子（例えば、ＢＭＰ２）によってアンタゴナイズされ得る；ならびにＦＧＦ活性化剤、ＢＭＰ分子およびＷｎｔ活性化剤の組合せ（例えば、ＦＧＦ８、ＢＭＰ２およびＣＨＩＲの組合せ）によってＧＨ１の発現が促進され得るという本発明者らの発見に少なくとも基づく。図４〜６を参照されたい。さらに、Ｐｉｔ１＋細胞によって、成長ホルモン産生細胞、プロラクチン産生細胞および甲状腺刺激ホルモン産生細胞がもたらされ得る（Ｔａｂａｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ．  （２０１１  Ｄｅｃ  ２）；９（６）：４９０−１）。本発明者らは、Ｐｉｔ１＋細胞の、成長ホルモン産生細胞への選択的分化を誘導することが可能である以下の分子を発見した：レチノイン酸（副腎皮質刺激ホルモン産生細胞（ｃｏｒｔｉｃｏｔｒｏｐｈ）によって発現されたＰＯＭＣを抑制し、ＧＨ１の発現を促進する）、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）および甲状腺ホルモン（例えば、Ｔ３）（ＰＲＬ（プロラクチン産生細胞（ｌａｃｔｏｔｒｏｐｈ）によって発現される）およびＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン産生細胞（ｔｈｙｒｏｔｒｏｐｈ）によって発現される）を阻害する一方で、ＧＨ１の発現を促進する）、ＥＲアゴニスト（例えば、ＤＰＮ）（ＧＨ１の発現を促進する）、ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、ＧＨＲＨ、ｃ−ＡＭＰ）（ＧＨ１の発現を促進する）、Ｇｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、Ｇｈｒｅｌｉｎ）（ＧＨ１の発現を促進する）およびインターロイキン（例えば、ＩＬ−６）（ＧＨ１の発現を促進する）。
５．２．１．幹細胞を下垂体前駆体へと分化させる方法
【０１７８】
ある特定の実施形態では、幹細胞を、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体または下垂体細胞へと分化させる。ある特定の実施形態では、下垂体前駆体は、下垂体前葉前駆体である。ある特定の実施形態では、幹細胞を、下垂体前駆体、下垂体細胞、または下垂体プラコード前駆体へと分化させ、幹細胞を、有効量の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤および有効量の、ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（ＢＭＰ活性化剤、例えば、ＢＭＰ分子）と接触させ、細胞を、有効量の、Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（ＳＨＨ活性化剤）および有効量の、ＦＧＦシグナル伝達の１つ、２つまたはそれより多い活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、有効量の、Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｔｈｅｒｓ  Ａｇａｉｎｓｔ  Ｄｅｃａｐｅｎｔａｐｌｅｇｉｃ（ＳＭＡＤ）シグナル伝達を阻害することが可能である１つまたは複数の阻害剤（「ＳＭＡＤ阻害剤」）とさらに接触させる。
【０１７９】
ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤は、ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０シグナル伝達を活性化する。ある特定の実施形態では、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤は、ＦＧＦ１８シグナル伝達をさらに活性化する。ＦＧＦ活性化剤の非限定的な例として、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、分化方法は、細胞を、２種のＦＧＦ活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、２種のＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ８およびＦＧＦ１０である。ある特定の実施形態では、分化方法は、細胞を、３種のＦＧＦ活性化剤と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、３種のＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ１８である。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤は、ＴＧＦβ、ＢＭＰ、Ｎｏｄａｌ、およびアクチビンを含むリガンドを中和するか、または受容体および下流のエフェクターをブロックすることによりそれらのシグナル経路をブロックする。ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤の非限定的な例は、参照によりその全体が組み込まれる、ＷＯ２０１１／１４９７６２、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  （２００９）、およびＣｈａｍｂｅｒｓ  （２０１２）に開示されている。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤は、ＳＢ４３１５４２である。
【０１８１】
「ＳＢ４３１５４２」は、ＣＡＳ番号  ３０１８３６−４１−９、分子式Ｃ２２Ｈ１８Ｎ４Ｏ３、および４−［４−（１，３−ベンゾジオキソール−５−イル）−５−（２−ピリジニル）−１Ｈ−イミダゾール−２−イル］−ベンズアミドという名称を有する分子を指し、例えば、以下の構造：
【０１８２】
【化１】
2021502091.tif 000003
を参照されたい。
【０１８３】
ＳＭＡＤ阻害剤の非限定的な例は、参照によりその全体が組み込まれている、ＷＯ２０１１／１４９７６２、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  （２００９）、およびＣｈａｍｂｅｒｓ  （２０１２）に開示されている。ＳＭＡＤ阻害剤の非限定的な例として、ＬＤＮ１９３１８９、Ｎｏｇｇｉｎ、Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ、Ｋ０２２８８、ＤＭＨ１、ＭＬ３４７、ＬＤＮ２１２８５４、その誘導体、およびそれらの混合物、ならびに他のＢＭＰ阻害剤が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＳＭＡＤシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９である。
【０１８４】
「ＬＤＮ１９３１８９」は、以下の式を有する化学式Ｃ２５Ｈ２２Ｎ６を有する、ＩＵＰＡＣ名４−（６−（４−（ピペラジン−１−イル）フェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル）キノリンの、小分子ＤＭ−３１８９を指す。
【化２】
2021502091.tif 000004
【０１８５】
ＬＤＮ１９３１８９は、ＳＭＡＤシグナル伝達阻害剤として機能することが可能である。ＬＤＮ１９３１８９はまた、ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６、プロテインチロシンキナーゼ（ＰＴＫ）の極めて強力な小分子阻害剤であり、Ｉ型ＴＧＦβ受容体のＡＬＫ１およびＡＬＫ３ファミリーのメンバーのシグナル伝達を阻害し、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）ＢＭＰ２、ＢＭＰ４、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、およびアクチビンサイトカインシグナルを含む多数の生物学的シグナルの伝達ならびにその後のＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ８のＳＭＡＤリン酸化の阻害を生じさせる（参照により本明細書に組み込まれる、Ｙｕ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １４：１３６３−１３６９；Ｃｕｎｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｂｉｏｏｒｇ．  Ｍｅｄ．  Ｃｈｅｍ．  Ｌｅｔｔ．  １８：  ４３８８−４３９２）。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、ＢＭＰ活性化剤は、ＢＭＰ分子である。ＢＭＰ活性化剤の非限定的な例として、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＢＭＰ活性化剤は、ＢＭＰ４を含む。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の活性化剤は、Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）、Ｃ２５ＩＩおよびスムーズンド（ＳＭＯ）受容体小分子アゴニスト、例えば、パルモルファミン、スムーズンドアゴニスト（ＳＡＧ）（例えば、Ｓｔａｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ，  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔ．  ２０１０  Ｊａｎ；６（１）：４４−５４に開示されているような）、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤は、ＳＨＨを含む。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤は、ＳＡＧを含む。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤を、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、または少なくとも約２０日間、幹細胞と接触させて（またはそれに曝露させて）、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤を、最長約３日、最長約４日、最長約５日、最長約６日、最長約７日、最長約８日、最長約９日、最長約１０日、最長約１１日、最長約１２日、最長約１３日、最長約１４日、最長約１５日、最長約１６日、最長約１７日、最長約１８日、最長約１９日、または最長約２０日間、幹細胞と接触させて（またはそれに曝露させて）、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約３日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約４日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約８日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、９日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＢＭＰ活性化剤を、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、もしくは少なくとも約５日間、および／または最長約３日、最長約４日、最長約５日間幹細胞と接触させて（またはそれに曝露させて）、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＢＭＰ活性化剤を、少なくとも約２日間および／または最長約４日間幹細胞と接触させて（またはそれに曝露させて）、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＢＭＰ活性化剤を、約３日間幹細胞と接触させて（またはそれに曝露させて）、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＢＭＰ活性化剤を、４日間幹細胞と接触させて（またはそれに曝露させて）、下垂体前駆細胞を得る。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の１つ、２つ、またはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤を、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、または少なくとも約１０日間、細胞と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約４日、最長約５日、最長約６日、最長約７日、最長約８日、最長約９日、最長約１０日、最長約１１日、最長約１２日、最長約１３日、最長約１４日、最長約１５日、最長約１６日、最長約１７日、最長約１８日、最長約１９日、または最長約２０日間、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の１つ、２つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の１つ、２つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤を、少なくとも約２日間、細胞に接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の１つ、２つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤を、少なくとも約５日間、細胞と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の１つ、２つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤を、６日間、細胞と接触させて、下垂体前駆細胞を得る。
【０１９１】
ある特定の実施形態では、ＳＨＨの１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦの１つ、２つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤を、少なくとも約２日、約３日、約４日、約５日、もしくは約６日間、および／または幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約数日以内に、約４日以内に、約５日以内に、約６日以内に、約７日以内に、約８日以内に、約９日以内に、もしくは約１０日以内に細胞と最初に接触させて（それに曝露させて）、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、ＳＨＨの１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦの１つ、２つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤を、少なくとも約２日間および／または幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約５日以内に細胞と最初に接触させて（それに曝露させて）、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、ＳＨＨの１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦの１つ、２つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約３日間、細胞と最初に接触させて、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、ＳＨＨの１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦの１つ、２つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から４日間、細胞と最初に接触させて（それに曝露させて）、下垂体前駆細胞を得る。ある特定の実施形態では、ＳＨＨの１つまたは複数の活性化剤および１つ、２つまたはそれより多い（例えば、３つの）ＦＧＦ活性化剤、ならびに１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約３日間、細胞と最初に接触させて、下垂体前駆細胞を得る。
【０１９２】
ある特定の実施形態では、細胞を、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤および１つまたは複数のＢＭＰ活性化剤と同時に接触させる（それに曝露させる）。ある特定の実施形態では、細胞を、ＳＨＨの１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦの１つ、２つまたはそれより多い活性化剤、ならびに必要に応じて１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と同時に接触させる（それに曝露させる）。
【０１９３】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１μＭから２０μＭの間、約２μＭから１８μＭの間、約４から１６μＭの間、約６μＭから１４μＭの間、または約８μＭから１２μＭの間の濃度のＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる（それに曝露させる）。ある特定の実施形態では、細胞を、約１０μＭの濃度のＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１０μＭの濃度のＳＢ４３１５２に接触させる。
【０１９４】
ある特定の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達の活性化剤またはＢＭＰ分子を、約０．０１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍｌの間、約０．１ｎｇ／ｍｌから８ｎｇ／ｍＬの間、約１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍＬの間、約１ｎｇ／ｍｌから６ｎｇ／ｍＬの間、約１ｎｇ／ｍｌから５ｎｇ／ｍＬの間、または約２ｎｇ／ｍｌから５ｎｇ／ｍＬの間の濃度の細胞と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１ｎｇ／ｍｌから１０ｎｇ／ｍＬの間の濃度のＢＭＰシグナル伝達の活性化剤またはＢＭＰ分子と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰシグナル伝達の活性化剤またはＢＭＰ分子と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ４に接触させる。
【０１９５】
ある特定の実施形態では、細胞を、それぞれ約１０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍＬの間、約２０ｎｇ／ｍｌから１５０ｎｇ／ｍＬの間、約３０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍＬの間、または約４０ｎｇ／ｍｌから７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度のＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦ８と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦ１０と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦ１８と接触させる。
【０１９６】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎｇ／ｍｌから４００ｎｇ／ｍＬの間、約５０ｎｇ／ｍｌから３５０ｎｇ／ｍＬの間、約５０ｎｇ／ｍｌから２５０ｎｇ／ｍＬの間、約１００ｎｇ／ｍｌから３００ｎｇ／ｍＬの間、約１５０ｎｇ／ｍｌから２５０ｎｇ／ｍＬの間、または約５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度のＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約５０ｎｇ／ｍｌから２００ｎｇ／ｍＬの間の濃度のＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約２００ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＳＨＨと接触させる。
【０１９７】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎＭから４００ｎＭの間、約５０ｎＭから３５０ｎＭの間、約５０ｎＭから２５０ｎＭの間、約１００ｎＭから３００ｎＭの間、約５０ｎＭから２００ｎＭの間、または約１５０ｎＭから２５０ｎＭの間の濃度のＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約５０ｎＭから２００ｎＭの間の濃度のＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約２００ｎＭの濃度のＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１００ｎＭの濃度のＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１００ｎＭの濃度のＳＡＧと接触させる。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎＭから３００ｎＭの間、約１０ｎＭから１００ｎＭの間、約１０ｎＭから５０ｎＭの間、約２０ｎＭから５０ｎＭの間、約２０ｎＭから４０ｎＭの間、約１０ｎＭから３０ｎＭの間、約３０ｎＭから５０ｎＭの間、約５０ｎＭから１００ｎＭの間、約５０ｎＭから６０ｎＭの間、約５０ｎＭから８０ｎＭの間、約６０ｎＭから８０ｎＭの間、約１００ｎＭから２００ｎＭの間、約１００ｎＭから１５０ｎＭの間、約１５０ｎＭから２００ｎＭの間、約２００ｎＭから３００ｎＭの間、約２００ｎＭから２５０ｎＭの間、または約２５０ｎＭから３００ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎＭから３０ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約２５ｎＭの濃度の１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約２５ｎＭの濃度のＬＤＮ１９３１８９と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約２００ｎＭから２５０ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約２５０ｎＭの濃度の１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約２５０ｎＭの濃度のＬＤＮ１９３１８９と接触させる。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、細胞を、毎日、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤、１つまたは複数のＢＭＰ活性化剤、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤、２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤、および１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤のそれぞれと接触させる（またはそれに曝露させる）。ある特定の実施形態では、細胞を、１日おきに、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤、１つまたは複数のＢＭＰ活性化剤、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤、２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤、および１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤のそれぞれと接触させる（またはそれに曝露させる）。ある特定の実施形態では、細胞を、毎日、１つまたは複数のＢＭＰ活性化剤と接触させる（またはそれに曝露させる）。ある特定の実施形態では、細胞を、０日目から２日目まで毎日、かつ３日目以降は１日おきに、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる（またはそれに曝露させる）。ある特定の実施形態では、細胞を、１日おきに、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤、２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤、および１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させる（またはそれに曝露させる）。
【０２００】
ある特定の実施形態では、分化細胞は、検出可能なレベルの１つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカーを発現する。下垂体前駆細胞マーカーの非限定的な例として、ＳＩＸ１、ＬＨＸ３、ＬＨＸ４、ＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＨＥＳＸ１、ＰＲＯＰ１、ＳＩＸ６、ＴＢＸ１９、およびＰＡＸ６、ＧＡＴＡ２、およびＳＦ１が挙げられる。ある特定の実施形態では、分化細胞は、細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、約９日、約１０日、約１５日、または約３０日後に、検出可能なレベルの１つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカー（例えば、下垂体前葉前駆細胞マーカー）を発現する。ある特定の実施形態では、分化細胞は、細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約５日で、検出可能なレベルの１つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカー（例えば、下垂体前葉前駆細胞マーカー）を発現する。ある特定の実施形態では、分化細胞は、細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約８日で、検出可能なレベルの１つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカー（例えば、下垂体前葉前駆細胞マーカー）を発現する。ある特定の実施形態では、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％を超える細胞の集団（例えば、細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約８日、約９日、約１０日、約１５日、または約３０日の）が、検出可能なレベルの、１つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカー（例えば、下垂体前葉前駆細胞マーカー）を発現する。ある特定の実施形態では、約７０％を超える分化細胞が、検出可能なレベルの１つまたは複数の下垂体前駆細胞マーカー（例えば、下垂体前葉前駆細胞マーカー）を発現する。
【０２０１】
ある特定の実施形態では、幹細胞の、下垂体細胞、下垂体前駆体または下垂体プラコード前駆体への分化を誘導する方法は、幹細胞を、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤（例えば、１０μＭのＳＢ４３１５４２）およびＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（例えば、５ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４）と接触させるステップ（例えば、約３日間（例えば、３または４日間））と、細胞を、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（例えば、１００ｎｇ／ｍＬのＳＨＨまたは１００ｎＭのＳＡＧ）、ＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い（例えば、３つの）活性化剤（例えば、１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ８、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１０、および５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ１８）、ならびに１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤（例えば、２５０ｎＭのＬＤＮ１９３１８９）と接触させるステップ（例えば、約５日間（例えば、５または６日間））とを含む。ある特定の実施形態では、ＳＨＨ活性化剤（複数可）、ＦＧＦ活性化剤（複数可）およびＳＭＡＤ阻害剤（複数可）の細胞との最初の接触は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約３日（例えば、３または４日）であり、細胞を、約５日間（例えば、５または６日間）、ＳＨＨ活性化剤（複数可）、ＦＧＦ活性化剤（複数可）およびＳＭＡＤ阻害剤（複数可）と接触させる（それに曝露させる）。
５．２．２．下垂体前駆体をＰｉｔ１＋細胞へと分化させる方法
【０２０２】
ある特定の実施形態では、下垂体前駆体（例えば、項目５．２．１に記載の方法から得られた分化細胞）を、Ｐｉｔ１（「ＰＯＵドメイン、クラス１、転写因子１（「Ｐｏｕｌｆ１」）としても公知）を発現する細胞、すなわち、「Ｐｉｔ１＋細胞」へと分化させる。Ｐｉｔ１は、哺乳動物における下垂体の発生とホルモンの発現を担う下垂体特異的転写因子であり、哺乳動物の発生を調節する転写因子のＰＯＵファミリーのメンバーである。マウスの下垂体発生中、Ｐｉｔ１は、Ｐｒｏｐ１の発現が低下した後に出現することが分かっており、Ｐｒｏｐ１のＰｉｔ１への遷移は、標的因子Ａｘｉｎ２によって示されるＦＧＦ８およびＢＭＰ２およびＷｎｔ／β−カテニングシグナル伝達の存在に付随して起こることが分かっている（Ｄａｓｅｎ  ＪＳ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  （２００１）；２４：３２７−５５；Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ．  （２００６  Ｍａｙ  ５）；１２５（３）：５９３−６０５）。Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達は、Ｐｉｔ１系統の決定に必要とされ、Ｗｎｔ／β−カテニン／Ｐｒｏｐ１複合体は、ＨＥＳＸ１を抑制し、Ｐｉｔ１を活性化するのに必要とされる（Ｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００６）。
【０２０３】
ある特定の実施形態では、本開示の主題は、下垂体前駆体の、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、および最大約１００％のＰｉｔ１＋細胞を含む第１の細胞集団への分化を誘導する方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、下垂体前駆体を、有効量の１つまたは複数の背方化剤および有効量の１つまたは複数の腹方化剤と接触させるステップと；細胞を、有効量の、Ｗｎｔシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤（「Ｗｎｔ活性化剤」と称される）と接触させるステップとを含む。ある特定の実施形態では、方法は、下垂体前駆体を、有効量の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、有効量の、エストロゲン受容体（ＥＲ）の１つまたは複数のアゴニスト（「ＥＲアゴニスト」と称される）と接触させるステップをさらに含む。
【０２０４】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の背方化剤は、ＦＧＦシグナル伝達の活性化剤（「ＦＧＦ活性化剤」と称される）を含む。ＦＧＦ活性化剤の非限定的な例として、ＦＧＦ１、ＦＧＦ２、ＦＧＦ３、ＦＧＦ４、ＦＧＦ７、ＦＧＦ８、ＦＧＦ１０、ＦＧＦ１８、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＦＧＦ活性化剤は、ＦＧＦ８を含む。
【０２０５】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数の腹方化剤は、ＢＭＰの活性化剤（「ＢＭＰ活性化剤」と称される）またはＢＭＰ分子、例えば、ＢＭＰ２を含む。ＢＭＰ活性化剤の非限定的な例として、ＢＭＰ１、ＢＭＰ２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ５、ＢＭＰ６、ＢＭＰ７、ＢＭＰ８ａ、ＢＭＰ８ｂ、ＢＭＰ１０、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１５、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＢＭＰ活性化剤は、ＢＭＰ２を含む。
【０２０６】
本明細書で使用される場合、リガンドに関連する「ＷＮＴ」または「ウイングレス」という用語は、ＷＮＴ受容体、例えば、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体ファミリーにおける受容体と相互作用することが可能である分泌タンパク質の群（すなわち、ヒトにおけるＩｎｔ１（ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ１））を指す。本明細書で使用される場合、シグナル伝達経路に関する「ＷＮＴ」または「ウイングレス」という用語は、β−カテニンで媒介されるかまたはβ−カテニンを含まない、ＷｎｔファミリーリガンドおよびＷｎｔファミリー受容体、例えば、ＦｒｉｚｚｌｅｄおよびＬＲＰＤｅｒａｉｌｅｄ／ＲＹＫ受容体からなるシグナル経路を指す。ある特定の実施形態では、ＷＮＴシグナル伝達経路は、β−カテニンによる媒介、例えば、ＷＮＴ／−カテニンを含む。
【０２０７】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤は、Ｗｎｔシグナル伝達の活性化のためにグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ３β）を低下させる。よって、Ｗｎｔ活性化剤は、ＧＳＫ３β阻害剤であり得る。ＧＳＫ３Ｐ阻害剤は、ＷＮＴシグナル伝達経路を活性化することが可能である。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｃａｄｉｇａｎ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  ２００６；１１９：３９５−４０２；Ｋｉｋｕｃｈｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．  ２００７；１９：６５９−６７１を参照されたい。本明細書で使用される場合、「グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β阻害剤」という用語は、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３β酵素を阻害する化合物を指す。例えば、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、Ｄｏｂｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  ２００３；１１６：１１７５−１１８６を参照されたい。
【０２０８】
Ｗｎｔ活性化剤またはＧＳＫ３β阻害剤の非限定的な例は、参照によりその全体が組み込まれる、ＷＯ２０１１／１４９７６２、Ｃｈａｍｂｅｒｓ  （２０１２）、およびＣａｌｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．  ２０１５  Ａｕｇ  １９；３５（３３）：１１４６２−８１に開示されている。Ｗｎｔ活性化剤の非限定的な例として、ＣＨＩＲ９９０２１、ＷＮＴ３Ａ、Ｗｎｔ−１、Ｗｎｔ４、Ｗｎｔ５ａ、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１、その誘導体、およびそれらの混合物からなる群から選択される小分子である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。
【０２０９】
「ＣＨＩＲ９９０２１」（「アミノピリミジン」または「３−［３−（２−カルボキシエチル）−４−メチルピロール−２−メチリデニル］−２−インドリノン」としても公知）は、以下の式を有する、ＩＵＰＡＣ名６−（２−（４−（２，４−ジクロロフェニル）−５−（４−メチル−１Ｈ−イミダゾール−２−イル）ピリミジン−２−イルアミノ）エチルアミノ）ニコチノニトリルを指す。
【化３】
2021502091.tif 000005
【０２１０】
ＣＨＩＲ９９０２１は、非常に選択的であり、関連するおよび関連しないキナーゼの集団に対してほぼ１０００倍の選択性を示し、ヒトＧＳＫ３βに対してＩＣ５０＝６．７ｎＭおよびげっ歯類ＧＳＫ３βホモログに対してナノモル濃度のＩＣ５０値を有する。
【０２１１】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＥＲアゴニストは、ＥＲβのアゴニストを含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＥＲアゴニストは、ＥＲαのアゴニストを含む。ＥＲβアゴニストの非限定的な例として、ジアリールプロピオニトリル（ＤＰＮ）、エストラジオール（Ｅ２）、プロピルピラゾール−トリオール（ＰＰＴ）、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＥＲアゴニストは、ＤＰＮを含む。
【０２１２】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、または少なくとも約２０日で、１つまたは複数の背方化剤および１つまたは複数の腹方化剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約５日で、１つまたは複数の背方化剤および１つまたは複数の腹方化剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約８日で、１つまたは複数の背方化剤および１つまたは複数の腹方化剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約８日で、１つまたは複数の背方化剤および１つまたは複数の腹方化剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から９日で、１つまたは複数の背方化剤および１つまたは複数の腹方化剤と最初に接触させる。
【０２１３】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、または少なくとも約２０日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、最長約４日間、最長約５日間、最長約６日間、最長約７日間、最長約８日間、最長約９日間、または最長約１０日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、最長約４日間または最長約５日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、最長約１０日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、少なくとも約３日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、少なくとも約３日間および／または最長約１０日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約４日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、５日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、少なくとも約５日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約７日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、８日間、１つまたは複数の背方化剤と接触させる。
【０２１４】
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、または少なくとも約２０日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約７日間、最長約８日間、最長約９日間、最長約１０日間、最長約１１日間、最長約１２日間、最長約１３日間、最長約１４日間、最長約１５日間、最長約１６日間、最長約１７日間、最長約１８日間、最長約１９日間、または最長約２０日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約８日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約１５日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約１２日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約７日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、８日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約１０日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１１日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、１２日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。
【０２１５】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤とさらに接触させるかまたはそれに曝露させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、１つまたは複数の背方化剤およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と同時に接触させるかまたはそれに曝露させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、または少なくとも約２０日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、最長約４日間、最長約５日間、最長約６日間、最長約７日間、最長約８日間、最長約９日間、または最長約１０日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、最長約４日間または最長約５日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、最長約１０日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、少なくとも約３日間および／または最長約１０日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約４日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、少なくとも約５日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約７日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、８日間、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。
【０２１６】
ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）との最初の接触は、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触と同じ日に起こる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約１日、少なくとも約２日、少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、もしくは少なくとも約１０日で、および／または約３日以内、約４日以内、約５日以内、約６日以内、約７日以内、約８日以内、約９日以内、もしくは約１０日以内に、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約２日で、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）の１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約５日以内に、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約２日でおよび約５日以内に、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約４日で、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から５日で、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と最初に接触させる。
【０２１７】
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１５日間、または少なくとも約２０日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約７日間、最長約８日間、最長約９日間、最長約１０日間、最長約１１日間、最長約１２日間、最長約１３日間、最長約１４日間、最長約１５日間、最長約１６日間、最長約１７日間、最長約１８日間、最長約１９日間、または最長約２０日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約１０日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、最長約８日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間および最長約１０日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約７日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約７日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、８日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（および必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニスト）と接触させる。
【０２１８】
ある特定の実施形態では、細胞を、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤、ならびに必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニストと同時に接触させる。
【０２１９】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約１０ｎｇ／ｍＬから２００ｎｇ／ｍＬの間、約２０ｎｇ／ｍＬから１５０ｎｇ／ｍＬの間、約５０ｎｇ／ｍＬから１５０ｎｇ／ｍＬの間、約１５０ｎｇ／ｍＬから２００ｎｇ／ｍＬの間、約３０ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬの間、約５０ｎｇ／ｍＬから１００ｎｇ／ｍＬの間、約４０ｎｇ／ｍＬから７５ｎｇ／ｍＬの間または約５０ｎｇ／ｍＬから７５ｎｇ／ｍＬの間の濃度の１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約５０ｎｇ／ｍＬまたは約１００ｎｇ／ｍＬの濃度の１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約５０ｎｇ／ｍＬの濃度の１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦ８と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約１００ｎｇ／ｍＬの濃度の１つまたは複数の背方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦ８と接触させる。
【０２２０】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約１ｎｇ／ｍＬから３０ｎｇ／ｍＬの間、約５ｎｇ／ｍＬから２５ｎｇ／ｍＬの間、または約１０ｎｇ／ｍＬから２０ｎｇ／ｍＬの間の濃度の１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約１０ｎｇ／ｍＬ、または約２０ｎｇ／ｍＬの濃度の１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度の１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約２０ｎｇ／ｍＬの濃度のＢＭＰ２と接触させる。
【０２２１】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約１μＭから２０μＭの間、約２μＭから１８μＭの間、約４μＭから１６μＭの間、約６μＭから１４μＭの間、または約８μＭから１２μＭの間の濃度のＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）を、約１０μＭの濃度のＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１０μＭの濃度のＳＢ４３１５２と接触させる。
【０２２２】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１μＭから１００μＭの、約１μＭから２０μＭの、約１μＭから１５μＭの、約１μＭから１０μＭの、約１μＭから５μＭの、約５μＭから１０μＭの、約５μＭから１５μＭの、約１５μＭから２０μＭの、約２０μＭから３０μＭの、約３０μＭから４０μＭの、約４０μＭから５０μＭの、約５０μＭから６０μＭの、約６０μＭから７０μＭの、約７０μＭから８０μＭの、約８０μＭから９０μＭの、または約９０μＭから１００μＭの濃度の１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（Ｗｎｔ  ａｃｔｉｖａｔｏｒ  ａｇｅｎｔ）と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１μＭから１０μＭの濃度の１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１μＭから５μＭの濃度の１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約３μＭの濃度の１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約３μＭの濃度のＣＨＩＲ９９０２１と接触させる。
【０２２３】
ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１ｎＭから２０ｎＭの間、約０．１ｎＭから１０ｎＭの間、約０．１ｎＭから１ｎＭの間、または約０．１ｎＭから０．５ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１ｎＭから０．５ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１ｎＭの濃度の１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１ｎＭの濃度のＤＰＮと接触させる。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、細胞を、毎日、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤、１つまたは複数のＥＲアゴニスト、およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤のそれぞれと接触させる（またはそれに曝露させる）。ある特定の実施形態では、細胞を、１日おきに、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤、１つまたは複数のＥＲアゴニスト、およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤のそれぞれと接触させる（またはそれに曝露させる）。ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤、ならびに必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニストおよびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させて、分化細胞の第１の細胞集団を得るステップであって、約５０％を超える、約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、または約９０％を超える分化細胞が、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、または約１５日で、検出可能なレベルのＰｉｔ１を発現する、ステップを含む。ある特定の実施形態では、約７０％を超える分化細胞は、検出可能なレベルのＰｉｔ１を発現する。ある特定の実施形態では、方法は、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約５日で、第１の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から約７日（例えば、７日または８日）、約１０日（例えば、１１日または１２日）で、第１の細胞集団を得るステップを含む。
【０２２５】
ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、または少なくとも約２０日で、第１の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日で、第１の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日または約２０日で、第１の細胞集団を得るステップを含む。
【０２２６】
ある特定の実施形態では、方法は、細胞（例えば、本明細書に開示される１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞）を、１つまたは複数の背方化剤および１つまたは複数の腹方化剤、ならびに必要に応じて、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させて、分化細胞の第２の細胞集団を得るステップであって、約５０％を超える、約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、または約９０％を超える分化細胞が、細胞の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約２日、約３日、約４日、または約５日で、検出可能なレベルのＰｒｏｐ１を発現する、ステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、細胞（例えば、下垂体前駆体、下垂体プラコード前駆体）の、１つまたは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約２日（例えば、約４日または約５日）で、第２の細胞集団を得るステップを含む。
【０２２７】
ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、または少なくとも約１５日で、第２の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約８日で、第２の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約１２日で、第２の細胞集団を得るステップを含む。
【０２２８】
ある特定の実施形態では、方法は、第２の細胞集団を、１つまたは複数の腹方化剤および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤、ならびに必要に応じて、１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させて、第１の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、第１の細胞集団は、第２の細胞集団の存在から少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、または少なくとも約１５日で得られる。ある特定の実施形態では、第１の細胞集団は、第２の細胞集団の存在から少なくとも約５日で得られる。ある特定の実施形態では、第１の細胞集団は、第２の細胞集団の存在から約７日で得られる。ある特定の実施形態では、第１の細胞集団は、第２の細胞集団の存在から約８日で得られる。ある特定の実施形態では、方法は、細胞（例えば、本明細書に開示される１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞）を、例えば、細胞（例えば、本明細書に開示される１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞）の、１つもしくは複数の背方化剤との最初の接触から約７日もしくは約８日で、および／または幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つもしくは複数の阻害剤との最初の接触から約１５日もしくは約１６日で、１つまたは複数の背方化剤（例えば、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ８）、１つまたは複数の腹方化剤（例えば、２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２）、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（例えば、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１）、および１つまたは複数のＥＲアゴニスト（例えば、０．１ｎＭのＤＰＮ）と接触させて、第１の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、本明細書に開示される１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞）の、背方化剤（複数可）、腹方化剤（複数可）、Ｗｎｔ活性化剤（複数可）およびＥＲアゴニスト（複数可）との最初の接触は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約８日または約９日である。
【０２２９】
ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞（例えば、本明細書に開示されるもの）を、１つまたは複数の背方化剤（例えば、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ８または１００ｎｇ／ｍＬ）、１つまたは複数の腹方化剤（例えば、２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２）、およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）阻害剤（例えば、１０μＭのＳＢ４３１５２）と接触させるステップと；細胞を、例えば、１つもしくは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つもしくは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約１０日（例えば、約１０日、約１１日、または約１２日）で、および／または幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つもしくは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１５日（例えば、約１９日または約２０日）で、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（例えば、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１）および１つまたは複数のＥＲアゴニスト（例えば、０．１ｎＭのＤＰＮ）と接触させて、第１の細胞集団を得るステップとを含む。
【０２３０】
ある特定の実施形態では、方法は、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞（例えば、本明細書に開示されるもの）を、例えば、１つもしくは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する細胞の、１つもしくは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約４日（例えば、約４日または約５日）で、および／または幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つもしくは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日（例えば、約１０日、約１１日、または約１２日）で、１つまたは複数の背方化剤（例えば、５０ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ８または１００ｎｇ／ｍＬのＦＧＦ８）、１つまたは複数の腹方化剤（例えば、２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２）、およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の（ｏｎｅ  ｏｆ  ｍｏｒｅ）阻害剤（例えば、１０μＭのＳＢ４３１５２）と接触させて、第２の細胞集団を得るステップを含む。
【０２３１】
ある特定の実施形態では、方法は、第２の細胞集団を、例えば、第２の細胞集団の存在から少なくとも約７日（例えば、約７日または約８日）で、１つまたは複数の腹方化剤（例えば、２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ２）、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤（例えば、３μＭのＣＨＩＲ９９０２１）、および１つまたは複数のＥＲアゴニスト（例えば、０．１ｎＭのＤＰＮ）と接触させて、第１の細胞集団を得るステップを含む。
５．２．３．Ｐｉｔ１＋細胞をＧＨ産生成長ホルモン産生細胞へと分化させる方法
【０２３２】
ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞（例えば、項目５．２．２に記載の方法から得られる分化細胞）または項目５．２．２に開示されている第１の細胞集団を、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞へと分化させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、または少なくとも約９０％、および最大約１００％のＧＨ産生成長ホルモン産生細胞を含む細胞集団へと分化させ、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、有効量の、成長ホルモン（ＧＨ）の発現を誘導することが可能である１つまたは複数の分子（ＧＨ誘導剤）と接触させる（またはそれに曝露させる）。ＧＨ誘導剤は、非ＧＨ系統細胞、例えば、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、およびプロラクチン産生細胞を抑制し得る。
【０２３３】
ＧＨ誘導剤の非限定的な例として、レチノイン酸（ＲＡ）、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＥＲアゴニスト、ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト、Ｇｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニスト、およびインターロイキン、ならびにその誘導体、ならびにそれらの混合物が挙げられる。
【０２３４】
コルチコステロイドの非限定的な例として、デキサメタゾン、コルチゾン、ヒドロコルチゾン、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のコルチコステロイドは、デキサメタゾンを含む。
【０２３５】
甲状腺ホルモンの非限定的な例として、Ｔ３、Ｔ４、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の甲状腺ホルモンは、Ｔ３を含む。
【０２３６】
ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストの非限定的な例として、ＧＨＲＨ、ｃ−ＡＭＰ（例えば、ジブチリル−ｃＡＭＰ）、ＰＫＡ、ＣＲＥＢ、ＭＡＰＫ活性化剤、その誘導体、およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストは、ＧＨＲＨ、ｃ−ＡＭＰ、またはそれらの組合せを含む。
【０２３７】
Ｇｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストの非限定的な例として、Ｇｈｒｅｌｉｎ、ＧＨＳＲアゴニスト、その誘導体およびそれらの混合物が挙げられる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストは、Ｇｈｒｅｌｉｎを含む。
【０２３８】
インターロイキンの非限定的な例として、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、およびこれらの組合せが挙げられる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のインターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ６、ＩＬ−１０、およびこれらの組合せからなる群から選択される。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のインターロイキンは、ＩＬ−６を含む。
【０２３９】
ＲＡは、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞によって発現されるＰＯＭＣを抑制し、成長ホルモン産生細胞によって発現されるＧＨ１の発現を促進し得る。コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）および甲状腺ホルモン（例えば、Ｔ３）は、ＧＨ１の発現を促進する一方で、ＰＲＬ（プロラクチン産生細胞によって発現される）および／またはＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン産生細胞によって発現される）を阻害し得る。
【０２４０】
ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、１、２、３、４、５、６、または７つのＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、４つのＧＨ誘導剤、例えば、ＲＡ、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、および１つのＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、ＧＨＲＨ）と接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、５つのＧＨ誘導剤、例えば、ＲＡ、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、および２つのＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、ＧＨＲＨおよびｃＡＭＰ）と接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、５つのＧＨ誘導剤、例えば、ＲＡ、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、１つのＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、ＧＨＲＨ）、および１つのＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、Ｇｈｒｅｌｉｎ）と接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、６つのＧＨ誘導剤、例えば、ＲＡ、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、および２つのＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、ＧＨＲＨおよびｃＡＭＰ）、および１つのＥＲアゴニスト（例えば、ＤＰＮ）と接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、６つのＧＨ誘導剤、例えば、ＲＡ、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、１つのＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、ＧＨＲＨ）、１つのＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、Ｇｈｒｅｌｉｎ）、および１つのＥＲアゴニスト（例えば、ＤＰＮ）と接触させる。
【０２４１】
ある特定の実施形態では、細胞を、約０．０５μＭから１０μＭの、約０．０５μＭから０．１μＭの、約０．１μＭから１０μＭの、約０．１μＭから５μＭの、約０．１μＭから３μＭの、約０．１μＭから２μＭの、約０．１μＭから１μＭの、または約５μＭから１０μＭの濃度のＲＡと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１μＭから１μＭの濃度のＲＡと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．０５μＭから０．１μＭの濃度のＲＡと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１μＭの濃度のＲＡと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１μＭの濃度のＲＡと接触させる。
【０２４２】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１ｎＭから２０ｎＭの間、約２ｎＭから１８ｎＭの間、約４ｎＭから１６ｎＭの間、約６ｎＭから１４ｎＭの間、または約８ｎＭから１２ｎＭの間の濃度の１つまたは複数の甲状腺ホルモンと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎＭの濃度の１つまたは複数の甲状腺ホルモンと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎＭの濃度のＴ３と接触させる。
【０２４３】
ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１μＭから１０μＭの、約０．１μＭから５μＭの、約０．１μＭから３μＭの、約０．１μＭから２μＭの、約０．１μＭから１μＭの、または約５μＭから１０μＭの濃度の１つまたは複数のコルチコステロイドと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１μＭから１０μＭの濃度の１つまたは複数のコルチコステロイドと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１μＭから１μＭの濃度の１つまたは複数のコルチコステロイドと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１μＭの濃度のコルチコステロイドと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１μＭの濃度のデキサメタゾンと接触させる。
【０２４４】
ある特定の実施形態では、細胞を、約０．０１μＭから１０μＭの、約０．０１μＭから０．０５μＭの、約０．０１μＭから０．１μＭの、約０．１μＭから１０μＭの、約０．１μＭから５μＭの、約０．１μＭから３μＭの、約０．１μＭから２μＭの、約０．１μＭから１μＭの、約５μＭから１０μＭの、約１０μｇ／ｍＬから２００μｇ／ｍＬの間、約２０μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬの間、約５０μｇ／ｍＬから１５０μｇ／ｍＬの間、約５０μｇ／ｍＬから１００μｇ／ｍＬの間、または約１００μｇ／ｍＬから２００μｇ／ｍＬの間の濃度の１つまたは複数のＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１μＭの濃度の１つまたは複数のＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１μＭの濃度のＧＨＲＨと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．０１μＭの濃度の１つまたは複数のＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．０１μＭの濃度のＧＨＲＨと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１００μｇ／ｍＬの濃度の１つまたは複数のＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１００μｇ／ｍＬの濃度のｃＡＭＰと接触させる。
【０２４５】
ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１ｎＭから２０ｎＭの間、約０．１ｎＭから１０ｎＭの間、約０．１ｎＭから１ｎＭの間、または約０．１ｎＭから０．５ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１ｎＭから約０．５ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１ｎＭの濃度の１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約０．１ｎＭの濃度のＤＰＮと接触させる。
【０２４６】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１ｎＭから１００ｎＭの間、約１ｎＭから５０ｎＭの間、約１ｎＭから３０ｎＭの間、約１ｎＭから２０ｎＭの間、約１ｎＭから１５ｎＭの間、約５ｎＭから２０ｎＭの間、約５ｎＭから１５ｎＭの間、約２０ｎＭから３０ｎＭの間、約３０ｎＭから４０ｎＭの間、約４０ｎＭから５０ｎＭの間、または約５０ｎＭから１００ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約５ｎＭから１５ｎＭの間の濃度の１つまたは複数のＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎＭの濃度の１つまたは複数のＧｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎＭの濃度のＧｈｒｅｌｉｎと接触させる。
【０２４７】
ある特定の実施形態では、細胞を、約１ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間、約１ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間、約１ｎｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌの間、約１ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌの間、約５ｎｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌの間、約１０ｎｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌの間、約１０ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌの間、約２０ｎｇ／ｍｌから２５ｎｇ／ｍｌの間、約３０ｎｇ／ｍｌから４０ｎｇ／ｍｌの間、約４０ｎｇ／ｍｌから５０ｎｇ／ｍｌの間、または約５０ｎｇ／ｍｌから１００ｎｇ／ｍｌの間の濃度の１つまたは複数のインターロイキンと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約１０ｎｇ／ｍｌから３０ｎｇ／ｍｌの間の濃度の１つまたは複数のインターロイキンと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約２５ｎｇ／ｍｌの濃度の１つまたは複数のインターロイキンと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約２５ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−６と接触させる。
【０２４８】
ある特定の実施形態では、細胞を、毎日、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる（またはそれに曝露させる）。ある特定の実施形態では、細胞を、１日おきに、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる（またはそれに曝露させる）。
【０２４９】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約４週間、少なくとも約５週間、少なくとも約６週間、または少なくとも約７週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、少なくとも約５日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、少なくとも約６日間、ＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、少なくとも約１４日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、少なくとも約１５日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、少なくとも約１９日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、少なくとも約２０日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、少なくとも約２週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、少なくとも約４週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、少なくとも約６週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、最長約５日間、最長約６日間、最長約７日間、最長約８日間、最長約９日間、最長約１０日間、最長約１１日間、最長約１２日間、最長約１３日間、最長約１４日間、最長約１５日間、最長約１６日間、最長約１７日間、最長約１８日間、最長約１９日間、最長約２０日間、最長約１週間、最長約２週間、最長約３週間、最長約４週間、最長約５週間、最長約６週間、最長約７週間、最長約８週間、最長約９週間、または最長約１０週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、最長約５日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、最長約６日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、最長約１４日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、最長約１５日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、最長約１９日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、最長約２０日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、最長約４週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、最長約６週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、約５日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、約６日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、約１４日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、約１５日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、約１９日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、約２０日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、約２週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、約４週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、約６週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。
【０２５０】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）を、または第１の細胞集団を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約２週間、もしくは少なくとも約３週間、および／または最長約１５日、最長約１６日、最長約１７日、最長約１８日、最長約１９日、最長約２０日、最長約２１日、最長約２２日、最長約２３日、最長約２４日、または最長約２５日で、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日で、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１５日で、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から２５日以内で、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から２０日以内で、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１５日（例えば、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、または約２０日）で、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と最初に接触させる。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞を、または第１の細胞集団を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約２週間（例えば、約２週間、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、または約２０日）で、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と最初に接触させる。
【０２５１】
ある特定の実施形態では、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞は、検出可能なレベルの１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。成長ホルモン産生細胞マーカーの非限定的な例として、ＧＨ１、ＧＨＲＨ受容体（ＧＨＲＨＲ）、ＰＯＵ１Ｆ１、ＮｅｕｒｏＤ４、およびＧＨＳＲが挙げられる。１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞は、ＧＨを分泌し得る。
【０２５２】
ある特定の実施形態では、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞は、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）または第１の細胞集団の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触から少なくとも約３日、少なくとも約４日、少なくとも約５日、少なくとも約６日、少なくとも約７日、少なくとも約８日、少なくとも約９日、少なくとも約１０日、少なくとも約１０日、少なくとも約１１日、少なくとも約１２日、少なくとも約１３日、少なくとも約１４日、少なくとも約１５日、少なくとも約１６日、少なくとも約１７日、少なくとも約１８日、少なくとも約１９日、少なくとも約２０日、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、または少なくとも約４週間で、検出可能なレベルの１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞は、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）または第１の細胞集団の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触から少なくとも約５日（例えば、約５日または６日）で、検出可能なレベルの１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞は、細胞または第１の細胞集団の１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触から少なくとも約１５日（例えば、約１４日または１５日）で、検出可能なレベルの１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞は、細胞（例えば、Ｐｉｔ１＋細胞）または第１の細胞集団の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触から少なくとも約２週間で、検出可能なレベルの１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。
【０２５３】
ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団を、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、分化細胞の第３の細胞集団を得るステップであって、分化細胞の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）は、低レベルのＧＨＲＨＲ免疫反応性を発現する（「ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞」と称される）ステップを含む。ある特定の実施形態では、第３の細胞集団の細胞の約１５％未満（例えば、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約３％未満、約２％未満、例えば、約１％）は、高レベルのＧＨＲＨＲ免疫反応性を発現する（「ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞」と称される）。
【０２５４】
ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞をまたは第１の細胞集団を、少なくとも約５日間（例えば、約５日または約６日間）、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第３の細胞集団を得る。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞をまたは第１の細胞集団を、少なくとも約１５日間（例えば、約１４日または約１５日間）、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第３の細胞集団を得る。
【０２５５】
ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団を、少なくとも約１５日間（例えば、約１４日または約１５日間）、ＲＡ、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、ＧＨＲＨ）と接触させて、第３の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団を、少なくとも約１５日間（例えば、約１４日または約１５日間）、ＲＡ、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、２つのＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、ＧＨＲＨおよびｃＡＭＰ）、およびＥＲアゴニスト（例えば、ＤＰＮ）と接触させて、第３の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団を、少なくとも約５日間（例えば、約５日または約６日間）、ＲＡ、コルチコステロイド、甲状腺ホルモン、ＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、ＧＨＲＨ）、Ｇｈｒｅｌｉｎシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、Ｇｈｒｅｌｉｎ）、およびＥＲアゴニスト（例えば、ＤＰＮ）と接触させて、第３の細胞集団を得るステップを含む。
【０２５６】
細胞の１つまたは複数のＧＨ誘導剤への拡張された曝露／接触により、ＧＨ増殖および／またはＧＨ成熟が促進され得る。ある特定の実施形態では、方法は、第３の細胞集団を、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて／それに曝露させて、少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または少なくとも約９９％）のＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む第４の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、第４の細胞集団は、約１５％未満（例えば、約１０％未満、約９％未満、約８％未満、約７％未満、約６％未満、約５％未満、約３％未満、約２％未満、例えば、約１％）のＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞を含む。
【０２５７】
ある特定の実施形態では、第４の細胞集団は、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触から少なくとも約１４日（例えば、約１４日または１５日）で得られる。ある特定の実施形態では、第４の細胞集団は、第３の細胞集団の最初の存在から少なくとも約９日（例えば、約９日または１０日）で得られる。ある特定の実施形態では、第４の細胞集団は、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触から少なくとも約４週間（例えば、約４週間、約５週間、または約６週間）で得られる。ある特定の実施形態では、第４の細胞集団は、第３の細胞集団の最初の存在から少なくとも約２週間（例えば、約２週間、約３週間または約４週間）で得られる。
【０２５８】
ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞は、より低い増殖速度とともに多角形形態を示し、これは、これらがより成熟したＧＨ細胞（成長ホルモン産生細胞）であることを示す。さらに、ＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞は、より多量のＧＨ（例えば、ＧＨ１）を分泌する。
【０２５９】
ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触から（例えば、約５日、約６日、約１５日、約２週間、約１９日、約２０日、約４週間、または約６週間で）、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、または約９０％を超える細胞の集団は、検出可能なレベルの１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、約７０％を超える細胞の集団は、検出可能なレベルの１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する。ある特定の実施形態では、細胞集団は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約３０日で、少なくとも約５０％（例えば、約７０％または８０％）の、１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む。ある特定の実施形態では、細胞集団は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約２５日で、少なくとも約５０％（例えば、約７０％または８０％）の、１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞を含む。
【０２６０】
ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団を、約１４日間（例えば、約１４または１５日間）、１つまたは複数のＧＨ誘導剤（例えば、１μＭのＲＡ、１０ｎＭのＴ３、１μＭのデキサメタゾン、１μＭのＧＨＲＨ、ならびに必要に応じて、１００μＭのｃ−ＡＭＰ、および０．１ｎＭのＤＰＮ）と接触させて、第３の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団を、約２週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤（例えば、１μＭのＲＡ、１０ｎＭのＴ３、１μＭのデキサメタゾン、１μＭのＧＨＲＨ、ならびに必要に応じて、１００μＭのｃ−ＡＭＰ、および０．１ｎＭのＤＰＮ）と接触させて、第３の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団を、約４週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤（例えば、１μＭのＲＡ、１０ｎＭのＴ３、１μＭのデキサメタゾン、１μＭのＧＨＲＨ、ならびに必要に応じて、１００μＭのｃ−ＡＭＰ、および０．１ｎＭのＤＰＮ）と接触させて、第４の細胞集団を得るステップを含む。ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団を、約６週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤（例えば、１μＭのＲＡ、１０ｎＭのＴ３、１μＭのデキサメタゾン、１μＭのＧＨＲＨ、ならびに必要に応じて、１００μＭのｃ−ＡＭＰ、および０．１ｎＭのＤＰＮ）と接触させて、第４の細胞集団を得るステップを含む。
【０２６１】
ある特定の実施形態では、方法は、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団を、約５日間（例えば、約５または６日間）、１つまたは複数のＧＨ誘導剤（例えば、１μＭのＲＡ、１０ｎＭのＴ３、１μＭのデキサメタゾン、１μＭのＧＨＲＨ、１０ｎＭのＧｈｒｅｌｉｎ、および０．１ｎＭのＤＰＮ）と接触させるステップを含む。ある特定の実施形態では、細胞（Ｐｉｔ１＋細胞）を、約５日または約６日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤（例えば、１μＭのＲＡ、１０ｎＭのＴ３、１μＭのデキサメタゾン、１μＭのＧＨＲＨ、１０ｎＭのＧｈｒｅｌｉｎ、および０．１ｎＭのＤＰＮ）と接触させて、第３の細胞集団を得る。
【０２６２】
ある特定の実施形態では、方法は、第３の細胞集団を、約９日間または約１０日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤（１０ｎＭのＴ３、１μＭのデキサメタゾン、１μＭのＧＨＲＨ、１０ｎＭのＧｈｒｅｌｉｎ、０．１ｎＭのＤＰＮ、および２５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−６）と接触させて、第４の細胞集団を得るステップを含む。
【０２６３】
ある特定の実施形態では、方法は、第４の細胞集団を、ＧＨ細胞成熟のための条件に供するステップを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ細胞成熟のための条件は、第４の細胞集団を、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、または少なくとも約５日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤（１０ｎＭのＴ３、１μＭのデキサメタゾン、および０．１ｎＭのＤＰＮ）に曝露させることを含む。ある特定の実施形態では、ＧＨ細胞成熟のための条件は、第４の細胞集団を、約５または６日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤（１０ｎＭのＴ３、１μＭのデキサメタゾン、および０．１ｎＭのＤＰＮ）に曝露させることを含む。
【０２６４】
ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＧＨ誘導剤の、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団との最初の接触は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１５日および／または約２５日以内（例えば、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日または約２０日）である。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞または第１の細胞集団を、少なくとも約１４日間または少なくとも約２週間（例えば、約１４または１５日間）、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第３の細胞集団を得、少なくとも約４週間または少なくとも約６週間（例えば、約４週間または約６週間）、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第４の細胞集団を得る。ある特定の実施形態では、Ｐｉｔ１＋細胞をまたは第１の細胞集団を、少なくとも約５日間（例えば、約５日間または６日間）、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第３の細胞集団を得、少なくとも約１４日間または少なくとも約２週間（例えば、約１４または１５日間）、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第４の細胞集団を得る。
【０２６５】
本開示の主題は、幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）の、１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する細胞（成長ホルモン産生細胞）への分化を誘導するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法を提供する。ある特定の実施形態では、方法は、幹細胞の集団を、（ａ）有効量の、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤および（ｂ）有効量の、ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させるステップと；細胞を、（ｃ）有効量の、Ｓｏｎｉｃ  Ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）シグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｄ）有効量の、ＦＧＦシグナル伝達の１つ、２つまたはそれより多い活性化剤、（ｅ）有効量の１つまたは複数の背方化剤、（ｆ）有効量の１つまたは複数の腹方化剤、および（ｇ）有効量の１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させるステップとを含む。
【０２６６】
ある特定の実施形態では、幹細胞を、少なくとも約２日間、または少なくとも約３日間、ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、幹細胞を、最長約３日間、最長約４日間、または最長約５日間、ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤と接触させる。
【０２６７】
ある特定の実施形態では、細胞を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約３日で、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約３日または約４日で、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間および最長約１０日間、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤および２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤、および２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約５日間または約６日間、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤および２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約９日間、１つまたは複数のＳＨＨ活性化剤および２つまたはそれより多いＦＧＦ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤を、細胞と同時に接触させる。
【０２６８】
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間および最長約１０日間、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約７日間、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約８日間、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約５日および最長約１５日で、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約８日で、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約９日で、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤を、細胞と同時に接触させる。
【０２６９】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）を、少なくとも約２日間および最長約１０日間、１つまたは複数の背方化剤およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）を、約４日間、１つまたは複数の背方化剤およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）を、約５日間、１つまたは複数の背方化剤およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）を、少なくとも２日間および最長１５日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）を、少なくとも約１０日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）を、約１１日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）を、約１２日間、１つまたは複数の腹方化剤と接触させる。
【０２７０】
ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）の、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約５日および約１５日以内である。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）の、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約８日である。ある特定の実施形態では、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）の、１つまたは複数の背方化剤、１つまたは複数の腹方化剤、およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約９日である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数の背方化剤およびＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤を、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）と同時に接触させる。
【０２７１】
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間および最長約１０日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤および１つまたは複数のＥＲアゴニストとさらに接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約７日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤および１つまたは複数のＥＲアゴニストとさらに接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、約８日間、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤および１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させる。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤および１つまたは複数のＥＲアゴニストとの最初の接触は、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）の、１つもしくは複数の背方化剤との最初の接触から少なくとも約２日および１０日以内ならびに／または幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つもしくは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約５日および２５日以内である。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤および１つまたは複数のＥＲアゴニストとの最初の接触は、細胞（例えば、下垂体前駆細胞）の、１つもしくは複数の背方化剤との最初の接触から約４日もしくは５日、および／または幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つもしくは複数の阻害剤との最初の接触から約１２日もしくは１３日である。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤および１つまたは複数のＥＲアゴニストを、細胞と同時に接触させる。
【０２７２】
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、（ｈ）有効量の１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤と接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤を、ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤およびＦＧＦシグナル伝達の２つまたはそれより多い活性化剤と同時に、細胞と接触させる。
【０２７３】
ある特定の実施形態では、方法は、細胞を、（ｉ）有効量の１つまたは複数のＥＲアゴニストと接触させるステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、１つまたは複数のＥＲアゴニストを、１つまたは複数の背方化剤および１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤と同時に、細胞と接触させる。
【０２７４】
ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１０日および約２５日以内である。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触は、幹細胞のＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から少なくとも約１５日である。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約１５日である。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約１６日である。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約１９日である。ある特定の実施形態では、細胞の、１つまたは複数のＧＨ誘導剤との最初の接触は、幹細胞の、ＴＧＦβ／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤との最初の接触から約２０日である。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約１０日間および最長約１０週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約２週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第３の細胞集団を得、少なくとも約４週間または少なくとも約６週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第４の細胞集団を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約２週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第３の細胞集団を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約４週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第４の細胞集団を得る。ある特定の実施形態では、細胞を、約６週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第４の細胞集団を得る。
【０２７５】
ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約３日間および最長約１０週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させる。ある特定の実施形態では、細胞を、少なくとも約５日間または６日間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第３の細胞集団を得、少なくとも約２週間、１つまたは複数のＧＨ誘導剤と接触させて、第４の細胞集団を得る。
【０２７６】
本開示の主題のある特定の実施形態に従って、幹細胞を、成長ホルモン産生細胞へと分化させるための方法は、図１に示される。本開示の主題のある特定の実施形態に従って、幹細胞を、成長ホルモン産生細胞へと分化させるための方法は、図１４に示される。本開示の主題のある特定の実施形態に従って、幹細胞を、成長ホルモン産生細胞へと分化させるための方法は、図１５に示される。
【０２７７】
ある特定の実施形態では、上述の阻害剤、活性化剤および誘導剤は、分化されている細胞を含む細胞培養培地に添加される。好適な細胞培養培地として、これらに限定されないが、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ８（登録商標）／Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ６（登録商標）（「Ｅ８／Ｅ６」）培地が挙げられる。Ｅ８／Ｅ６培地は市販されている。
【０２７８】
Ｅ８／Ｅ６培地は、ヒト多能性幹細胞の成長および拡大を支持するフィーダーフリーおよびゼノフリー（ｘｅｎｏ  ｆｒｅｅ）培地である。Ｅ８／Ｅ６培地は、体細胞再プログラミングを支持することが判明した。さらに、Ｅ８／Ｅ６培地は、ＰＳＣの培養に対するカスタム培地の配合物のベースとして使用することができる。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、参照によりその全体が組み込まれる、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．  ２０１１  Ｍａｙ；８（５）：４２４−９に記載されている。Ｅ８／Ｅ６培地の一例は、参照によりその全体が組み込まれる、ＷＯ１５／０７７６４８に開示されている。ある特定の実施形態では、Ｅ８／Ｅ６細胞培養培地は、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、アスコルビン酸、セレン、インスリン、ＮａＨＣＯ３、トランスフェリン、ＦＧＦ２およびＴＧＦβを含む。ある特定の実施形態では、Ｅ６培地は、ＦＧＦ２およびＴＧＦβを含まない。Ｅ８／Ｅ６培地は、Ｅ８／Ｅ６培地が、活性ＢＭＰまたはＷｎｔ成分を含まないという点でＫＳＲ培地と異なる。
【０２７９】
分化細胞は、１つまたは複数のレポーターをさらに発現し得る。レポーターの非限定的な例として、蛍光タンパク質（緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ａｚｕｒｉｔｅ、ｍＫａｌａｍａｌ）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ２）、および黄色蛍光タンパク質誘導体（ＹＦＰ、Ｃｉｔｒｉｎｅ、Ｖｅｎｕｓ、ＹＰｅｔ、ＥＹＦＰ）など）、β−ガラクトシダーゼ（ＬａｃＺ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ｃａｔ）、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）、酵素（オキシダーゼおよびペルオキシダーゼなど）、および抗原分子が挙げられる。本明細書で使用される場合、「レポーター遺伝子」または「レポーター構築物」という用語は、発色タンパク質、ＧＦＰなどの蛍光タンパク質またはベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ遺伝子）などの酵素のような、容易に検出可能または容易にアッセイ可能であるタンパク質をコードする核酸を含む遺伝的構築物を指す。ある特定の実施形態では、レポーターは、ＮＥ系統マーカー遺伝子の組み換えプロモーター、ＮＣ系統マーカー遺伝子の組み換えプロモーター、ＣＰ系統マーカー遺伝子の組み換えプロモーター、またはＮＮＥ系統マーカー遺伝子の組み換えプロモーターによって駆動され得る。
【０２８０】
分化細胞は、例えば、細胞培養培地中で、分化後に精製され得る。本明細書で使用される場合、「精製された」、「精製する」、「精製」、「単離された」、「単離する」、および「単離」という用語は、試料由来の少なくとも１種の夾雑物の量の低減を指す。例えば、所望の細胞型は、望ましくない細胞型の量の対応する低減によって、少なくとも約１０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９０％精製される。「精製する」という用語は、試料からある特定の細胞（例えば、望ましくない細胞）を除去することを指し得る。
【０２８１】
本開示の主題は、本明細書に記載の方法によって生成される、１つまたは複数の下垂体前駆体／前駆細胞マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞、Ｐｉｔ１を発現する分化細胞、および／または１つもしくは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現する分化細胞（ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞およびＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む）の集団、ならびにこのようなｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞を含む組成物も提供する。
５．３  分化細胞集団を含む組成物
【０２８２】
本開示の主題は、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化方法によって生成される１つまたは複数の下垂体前駆体／前駆細胞マーカーを発現する細胞の集団を含む組成物を提供する。さらに、本開示の主題は、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化方法によって生成されるＰｉｔ１を発現する細胞の集団を含む組成物を提供する。さらに、本開示の主題は、本明細書に記載のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化方法によって生成されるＧＨ産生成長ホルモン産生細胞（ＧＨＲＨＲｌｏｗ細胞およびＧＨＲＨＲｈｉｇｈ細胞を含む）の集団を含む組成物を提供する。
【０２８３】
さらに、本開示の主題は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞の集団を含む組成物であって、分化細胞の集団の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）が、１つまたは複数の下垂体前駆体／前駆細胞マーカーを発現し、分化細胞の集団の約２５％未満（例えば、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）が、幹細胞マーカー、非神経外胚葉（ＮＮＣ）マーカー、神経堤（ＮＣ）系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカー（頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーを含むがこれらに限定されない）からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する、組成物を提供する。
【０２８４】
さらに、本開示の主題は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞の集団を含む組成物であって、分化細胞の集団の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）が、Ｐｉｔ１を発現し、分化細胞の集団の約２５％未満（例えば、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）が、下垂体前駆体マーカー、幹細胞マーカー、ＮＮＥマーカー、神経堤（ＮＣ）系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカー（頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーを含むがこれらに限定されない）からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する、組成物を提供する。ある特定の実施形態では、このような細胞集団は、項目５．２．２に開示された第１の細胞集団である。
【０２８５】
さらに、本開示の主題は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞の集団を含む組成物であって、分化細胞の集団の少なくとも約５０％（例えば、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％、または少なくとも約９９．５％）が、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞であり、分化細胞の集団の約２５％未満（例えば、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、約１％未満、約０．５％未満、または約０．１％未満）が、プロラクチン産生細胞マーカー、甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカー、Ｐｉｔ１、下垂体前駆体マーカー、幹細胞マーカー、ＮＮＥマーカー、神経堤（ＮＣ）系統マーカー、および非下垂体プラコードマーカー（頭蓋プラコードマーカー、上鰓プラコードマーカー、三叉神経プラコードマーカー、および耳プラコードマーカーを含むがこれらに限定されない）からなる群から選択される１つまたは複数のマーカーを発現する、組成物を提供する。ある特定の実施形態では、このような細胞集団は、項目５．２．２で開示された第３の細胞集団、項目５．２．２で開示された第４の細胞集団、およびこれらの組合せを含む。
【０２８６】
幹細胞マーカーの非限定的な例として、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＳＯＸ２、ＬＩＮ２８、ＳＳＥＡ４、およびＳＳＥＡ３が挙げられる。
【０２８７】
ＮＣ系統マーカーの非限定的な例として、ＳＯＸ１０、ＦｏｘＤ３、ＡＳＣＬ１、Ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ、およびＳｎａｉｌが挙げられる。
【０２８８】
非下垂体プラコードマーカーの非限定的な例として、頭蓋プラコードマーカー（ＳＩＸ１、ＰＡＸ６、ＰＩＴＸ３、クリスタリンアルファＡ、およびクリスタリンアルファＢを含むがこれらに限定されない）、上鰓プラコードマーカー（ＰＡＸ２を含むがこれに限定されない）、三叉神経プラコードマーカー（ＰＡＸ３を含むがこれに限定されない）、耳プラコードマーカー（ＰＡＸ８を含むがこれに限定されない）が挙げられる。
【０２８９】
ＮＮＥマーカーの非限定的な例として、ＴＦＡＰ２Ａ、ＥＹＡ１、ＤＬＸ３、およびＤＬＸ５が挙げられる。
【０２９０】
下垂体前駆細胞マーカーの非限定的な例として、ＳＩＸ１、ＬＨＸ３、ＬＨＸ４、ＰＩＴＸ１、ＰＩＴＸ２、ＨＥＳＸ１、ＰＲＯＰ１、ＳＩＸ６、ＴＢＸ１９、ＰＡＸ６、ＧＡＴＡ２、およびＳＦ１が挙げられる。
【０２９１】
成長ホルモン産生細胞マーカーの非限定的な例として、ＧＨ、ＧＨＲＨＲ、ＰＯＵ１Ｆ１、ＮｅｕｒｏＤ４、およびＧＨＳＲが挙げられる。
【０２９２】
プロラクチン産生細胞マーカーの非限定的な例として、ＰＲＬ、ＰＩＴ１、およびＤ２Ｒが挙げられる。
【０２９３】
甲状腺刺激ホルモン産生細胞マーカーの非限定的な例として、ＴＳＨ、ＴＨＲＨ、およびＰＩＴ１が挙げられる。
【０２９４】
ある特定の実施形態では、組成物は、約１×１０４から約１×１０１０、約１×１０４から約１×１０５、約１×１０５から約１×１０９、約１×１０５から約１×１０６、約１×１０５から約１×１０７、約１×１０６から約１×１０７、約１×１０６から約１×１０８、約１×１０７から約１×１０８、約１×１０８から約１×１０９、約１×１０８から約１×１０１０、または約１×１０９から約１×１０１０個の、本開示の幹細胞由来細胞の集団を含む。
【０２９５】
ある特定の実施形態では、組成物は、約１×１０４から約１×１０１０、約１×１０４から約１×１０５、約１×１０５から約１×１０９、約１×１０５から約１×１０６、約１×１０５から約１×１０７、約１×１０６から約１×１０７、約１×１０６から約１×１０８、約１×１０７から約１×１０８、約１×１０８から約１×１０９、約１×１０８から約１×１０１０、または約１×１０９から約１×１０１０個の、本開示のｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化成長ホルモン産生細胞の集団を含む。
【０２９６】
ある特定の実施形態では、前記組成物は凍結される。ある特定の実施形態では、前記組成物は、１つまたは複数の凍結保護物質、例えば、これらに限定されないが、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、スクロース、トレハロース、デキストロース、またはこれらの組合せをさらに含んでもよい。
【０２９７】
ある特定の非限定的な実施形態では、組成物は、生物適合性足場またはマトリックス、例えば、細胞が、対象に対して埋め込まれるまたは移植される場合に、組織の再生を促進する生物適合性三次元足場をさらに含む。ある特定の非限定的な実施形態では、生体適合性足場は、細胞外マトリックス材料、合成ポリマー、サイトカイン、コラーゲン、ポリペプチドもしくはタンパク質、フィブロネクチン、ラミニン、ケラチン、フィブリン、フィブリノゲン、ヒアルロン酸、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、アガロースもしくはゼラチンを含む多糖類、および／またはヒドロゲルを含む。（例えば、それぞれの内容が参照によりその全体が組み込まれる、米国公開第２０１５／０１５９１３５号、同第２０１１／０２９６５４２号、同第２００９／０１２３４３３号、および同第２００８／０２６８０１９号を参照されたい）。
【０２９８】
ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される担体、賦形剤、希釈剤またはそれらの組合せを含む医薬組成物である。組成物は、本明細書に記載されているように、ＧＨ欠損症を予防および／または処置するために使用することができる。
【０２９９】
本開示の主題は、本明細書に開示されているように、分化細胞またはそれを含む組成物を含むデバイスも提供する。デバイスの非限定的な例として、シリンジ、微小ガラス管、定位針およびカニューレが挙げられる。
５．４  成長ホルモンを増加させる方法
【０３００】
１つまたは複数の成長ホルモン産生細胞マーカーを発現するｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化細胞（「幹細胞由来成長ホルモン産生細胞」とも称され、例えば、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞）は、ＧＨの発現および／もしくは分泌を増加させる、ならびに／またはＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出を回復させる（例えば、生理学的手法で）ために使用することができる。よって、幹細胞由来成長ホルモン産生細胞は、ＧＨ欠損症を処置するために使用することができる。
【０３０１】
ホルモン欠損症は、現在、処置可能な状態であるが、ＧＨの補充は、若い患者には非常にコストが高く困難であり、彼らは、保険適用が十分でなく、年間５０，０００ドルを超えることも多い、非常に高価な、毎日の（時には１日に２回の）、週に６〜７回の注射を必要とする。よって、代謝の回復および骨量の維持には、青年期にＧＨに対する継続的な需要を支持するデータが存在するが、処置は、思春期に中断されることが多い。組換え産物としてＧＨが製造されて以来、この分野においていかなる刷新も存在していない。
【０３０２】
本開示の主題は、対象におけるＧＨの発現および／もしくは分泌を増加させる、ＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出を回復させる、ならびに／またはＧＨ欠損症を処置する方法であって、対象に、有効量の以下の：
（ａ）本明細書に記載の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞の集団；
（ｂ）このような幹細胞由来成長ホルモン産生細胞を含む組成物；および
（ｃ）このような組成物を含むデバイス
のうちの１つまたは複数を投与するステップを含む方法を提供する。
【０３０３】
さらに、本開示の主題は、ＧＨの発現および／もしくは分泌を増加させる、ならびに／またはＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数を回復させる、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞またはそれを含む組成物またはそれを含むデバイスの使用を提供する。
【０３０４】
成長ホルモン欠損症として、先天性成長ホルモン欠損症および後天性成長ホルモン欠損症が挙げられる。先天性成長ホルモン欠損症は、成長ホルモンの発達に関与する遺伝子の変異に起因する。後天性成長ホルモン欠損症は、視床下部−下垂体領域における腫瘍、外科手術、傷害などによって誘導され得る。先天性成長ホルモン欠損症は、２つのカテゴリーに分けることができる：複合下垂体ホルモン欠損症（ＣＰＨＤ）型と成長ホルモン単独欠損症（ＩＧＨＤ）型。ＣＰＨＤを引き起こし得る遺伝子変異として、ＰＯＵ１Ｆ１変異（ＣＰＨＤ１）、ＰＲＯＰ−１変異（ＣＰＨＤ２；最も一般的、１２〜５５％）、ＬＨＸ３変異（ＣＰＨＤ３）、およびＬＨＸ４変異（ＣＰＨＤ４）が挙げられる。ＩＧＨＤ型を引き起こし得る遺伝子変異として、ＧＨ１変異（ＩＡおよびＩＩ型）、ＧＨ１または成長ホルモン放出ホルモン受容体（ＧＨＲＨＲ）変異（ＩＢ型）、およびブルトンチロシンキナーゼ（ＢＴＫ）変異（ＩＩＩ型）が挙げられる。
【０３０５】
ある特定の実施形態では、対象は、ＧＨ欠損症を患っている。ＧＨ欠損症は、遺伝的（例えば、小人症）であり、外傷、腫瘍、外科手術、および放射線に関連し、例えば、医学的処置によって引き起こされる下垂体病変および／または下垂体抑制に関連し得る。ある特定の実施形態では、対象は、小人症を患っている。ＧＨ欠損症の非限定的な例として、小人症、骨粗鬆症、筋肉量の低下、骨量の低下、鬱もしくは不安症などの精神障害、免疫系の弱化または代謝の変更が挙げられる。ある特定の実施形態では、ＧＨ欠損症は、小人症である。
【０３０６】
ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞は、目的の器官（例えば、ＧＨ欠損症によって影響を受けた器官、例えば、脳下垂体（例えば、脳下垂体前葉、視床下部または正中隆起、皮下組織））中に直接的に注射される。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞、それを含む組成物またはデバイスは、例えば、経鼻的および／または経蝶形骨的（ｔｒａｎｓｐｈｅｎｏｉｄａｌ）手法によって、対象の脳下垂体（例えば、脳下垂体前葉、視床下部または正中隆起、皮下組織）に直接的に投与（注射）される。ある特定の実施形態では、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞は、ポリマー内にカプセル化され、皮下注射され得る。
【０３０７】
本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞は、任意の生理学的に許容されるビヒクル中で投与され得る。本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞および薬学的に許容される担体を含む医薬組成物も提供される。本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞およびそれを含む医薬組成物は、局所注射、同所（ｏｒｔｈｏｔｒｏｐｉｃ）（ＯＴ）注射、全身注射、静脈内投与、皮下投与、または非経口投与によって投与され得る。
【０３０８】
本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞またはそれを含む組成物は、滅菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルション、分散液、または粘性組成物として提供するのが好都合であり得、選択されたｐＨに緩衝されてもよい。液体調製物は、通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも調製し易い。加えて、液体組成物は、特に注射によって投与するのに幾分より好都合である。一方、粘性組成物は、適当な粘度範囲内に製剤化され、特定の組織とのより長い接触期間をもたらし得る。液体または粘性組成物は、担体を含むことができ、担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）およびそれらの好適な混合物を含有する溶媒または分散媒であってもよい。滅菌注射用液剤は、本開示の主題の組成物、例えば、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞を含む組成物を、所望であれば様々な量の他の成分とともに、必要量の適当な溶媒中に加えることによって調製することができる。このような組成物は、例えば、滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどの好適な担体、希釈剤、または賦形剤と混合してもよい。組成物はまた、凍結乾燥され得る。組成物は、所望の投与経路および調製物に応じて、例えば、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、ｐＨ緩衝剤、ゲル化または増粘添加剤、保存剤、着香剤、色素などの補助剤を含有することができる。参照により本明細書に組み込まれる、”ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥ”，  １７ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８５などの標準テキストは、過度な実験をせずに好適な調製物を調製するために参照され得る。
【０３０９】
抗微生物保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性および滅菌性を増強する様々な添加剤を添加することができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸などによって保証され得る。注射用医薬品形態の長期の吸収は、吸収遅延剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム（ａｌｕｍ  ｉｎｕｒｎ  ｍｏｎｏｓｔｅａｒａｔｅ）およびゼラチンの使用によってもたらされ得る。しかしながら、本開示の主題によれば、使用される任意のビヒクル、希釈剤、または添加剤は、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞と適合性でなければならない。
【０３１０】
所望の場合、組成物の粘度は、薬学的に許容される増粘剤を使用して、選択されるレベルで維持され得る。メチルセルロースは、容易にかつ経済的に入手可能であり、扱い易いことから、使用されてもよい。他の好適な増粘剤として、例えば、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボマーなどが挙げられる。増粘剤の濃度は、選択される剤（ａｇｅｎｔ）に応じて変わる。重要な点は、選択される粘度を達成する量を使用することである。明らかに、好適な担体および他の添加剤の選択は、正確な投与経路および特定の剤形、例えば、液体剤形（例えば、組成物が、液剤、懸濁剤、ゲル剤または別の液体形態、例えば、徐放形態または液体充填形態中に製剤化されるべきかどうか）の性質に応じて変わる。
【０３１１】
当業者は、組成物の構成成分が化学的に不活性であるように、かつ本開示の幹細胞由来腸溶ＮＣ前駆体の生存性または有効性に影響を与えないように選択されるべきであることを認識する。これは、化学および薬学の原理に精通した当業者にとって何ら問題を生じさせず、または問題は、本開示および本明細書で引用される文書からの、標準テキストを参照することによってもしくは単純な実験（過度な実験を要しない）によって、容易に回避され得る。
【０３１２】
本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞の治療用途に関する１つの懸念は、最適な効果を達成するために必要な細胞の量である。最適な効果として、これらに限定されないが、ＧＨの発現の増加、ＧＨの分泌の増加、ＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出の回復、ならびに／または成長の回復および代謝の正常化が挙げられる。
【０３１３】
「有効量」（または「治療有効量」）は、処置の際に有益なまたは所望の臨床的結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、１または複数の用量で対象に投与され得る。処置に関して、有効量は、ＧＨの発現および／もしくは分泌を増加させる；ＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出を回復させる、成長の回復および代謝の正常化、ならびに／またはＧＨ欠損症（例えば、小人症）の進行を和らげるか、軽快するか、安定化するか、逆転するかもしくは遅らせるか、またはそうでなければＧＨ欠損症（例えば、小人症）の病理学的転帰を低減するのに十分な量である。有効量は、一般的には、ケースバイケースで医師によって決定され、当業者の技術の範囲内である。典型的には、有効量を達成するために適当な投薬量を決定する場合に、いくつかの要因が考慮される。これらの要因として、対象の年齢、性別および体重、処置されている状態、状態の重症度ならびに投与される細胞の形態および有効濃度が挙げられる。
【０３１４】
ある特定の実施形態では、有効量は、最適な効果（これらに限定されないが、ＧＨの発現の増加、ＧＨの分泌の増加、ＧＨ、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ−１）、およびＩＧＦ−２のうちの１つもしくは複数の動的放出の回復、ならびに／または成長の回復および代謝の正常化を含む）を達成するのに十分な量である。ある特定の実施形態では、有効量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約１００％、対象（例えば、ＧＨ欠損症を患っているもの）におけるＧＨの発現を増加させるのに十分な量である。ある特定の実施形態では、有効量は、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約１００％、対象（例えば、ＧＨ欠損症を患っているもの）におけるＧＨの分泌を増加させるのに十分な量である。ある特定の実施形態では、有効量は、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約１００％、対象（例えば、ＧＨ欠損症を患っているもの）の体のサイズを増加させるのに十分な量である。ある特定の実施形態では、有効量は、約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９８％、約９９％または約１００％、対象（例えば、ＧＨ欠損症を患っているもの）の体重を増加させるのに十分な量である。
【０３１５】
投与される細胞の量は、処置されている対象に対して変わる。ある特定の実施形態では、約１×１０４から約１×１０１０、約１×１０４から約１×１０５、約１×１０５から約１×１０９、約１×１０５から約１×１０６、約１×１０５から約１×１０７、約１×１０６から約１×１０７、約１×１０６から約１×１０８、約１×１０７から約１×１０８、約１×１０８から約１×１０９、約１×１０８から約１×１０１０の、または約１×１０９から約１×１０１０個の本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞が、対象に投与される。ある特定の実施形態では、約１×１０５から約１×１０７個の本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞が、ＧＨ欠損症を患っている対象に投与される。
５．５  キット
【０３１６】
本開示の主題は、幹細胞の分化を誘導するためのキットを提供する。ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｄ）ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、および（ｅ）幹細胞の、１つまたは複数の下垂体前駆体マーカーを発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示を含む。ある特定の実施形態では、キットは、（ｆ）１つまたは複数のＳＭＡＤ阻害剤をさらに含む。
【０３１７】
ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｄ）ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｅ）１つまたは複数の背方化剤、（ｆ）１つまたは複数の腹方化剤、（ｇ）１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤、および（ｈ）幹細胞の、Ｐｉｔ１を発現する分化細胞の集団への分化を誘導するための指示を含む。ある特定の実施形態では、キットは、（ｉ）１つまたは複数のＥＲアゴニストをさらに含む。
【０３１８】
ある特定の実施形態では、キットは、（ａ）形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）／Ａｃｔｉｖｉｎ−Ｎｏｄａｌシグナル伝達の１つまたは複数の阻害剤、（ｂ）ＢＭＰシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｃ）ＦＧＦシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｄ）ＳＨＨシグナル伝達の１つまたは複数の活性化剤、（ｅ）１つまたは複数の背方化剤、（ｆ）１つまたは複数の腹方化剤、（ｇ）１つまたは複数のＷｎｔ活性化剤、（ｈ）１つまたは複数のＧＨ誘導剤、および（ｉ）幹細胞の、ＧＨ産生成長ホルモン産生細胞の集団への分化を誘導するための指示を含む。
【０３１９】
ある特定の実施形態では、指示は、幹細胞を、阻害剤（複数可）、活性化剤（複数可）、作用物質（複数可）、および誘導剤（複数可）と、特定の順序で接触させることを含む。阻害剤（複数可）、作用物質（複数可）、および誘導剤（複数可）を接触させる順序は、幹細胞を培養するために使用される細胞培養培地によって決定され得る。
【０３２０】
ある特定の実施形態では、指示は、本開示の方法によって記載されているように、幹細胞を、阻害剤（複数可）、活性化剤（複数可）、作用物質（複数可）、および誘導剤（複数可）と接触させることを含む（上掲、項目５．２を参照されたい）。
【０３２１】
ある特定の実施形態では、本開示は、単位剤形中に、有効量の、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞の集団または前記成長ホルモン産生細胞を含む組成物を含むキットを提供する。ある特定の実施形態では、幹細胞由来細胞は、成熟した分化細胞である。ある特定の実施形態では、キットは、治療用組成物を含有する滅菌容器を含み；このような容器は、ボックス、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、バッグ、パウチ、ブリスターパック、または当該分野で公知の他の好適な容器形態であり得る。このような容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属ホイル、または医薬を保持するのに好適な他の材料から作製され得る。
【０３２２】
ある特定の実施形態では、キットは、本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞の集団またはそれを含む組成物を、対象（例えば、ＧＨ欠損症を患っている対象）に投与するための指示を含む。指示は、ＧＨ欠損症を処置するための細胞または組成物の使用についての情報を含み得る。ある特定の実施形態では、指示は、以下の：治療剤の説明；神経変性障害またはその症状の処置もしくは予防のための投与スケジュールおよび投与；予防措置；警告；適応症；禁忌；過剰投与情報；有害反応；動物薬理学；臨床研究；および／または参考文献のうちの少なくとも１つを含む。指示は、容器（存在する場合）に直接印刷されてもよく、または容器に貼付されるラベルとして、または別個のシート、パンフレット、カード、もしくは容器の中にもしくは容器と一緒に供給されるホルダーとして印刷されてもよい。
５．６  治療用化合物をスクリーニングする方法
【０３２３】
本開示の幹細胞由来成長ホルモン産生細胞を使用してＧＨ欠損症をモデリングすることができ、ＧＨ欠損症に関連する細胞の表現型を克服することができる候補化合物をスクリーニングするためのプラットフォームとして機能することもできる。ＧＨ欠損症を軽減する候補化合物の能力は、ＧＨ欠損症を引き起こす生理学的または細胞の欠点を救済する候補化合物の能力をアッセイすることによって決定することができる。
【０３２４】
ある特定の実施形態では、方法は、（ａ）（ｉ）幹細胞（例えば、ヒト幹細胞）から生じる本開示の成長ホルモン産生細胞の集団であって、成長ホルモン産生細胞が、ＧＨ欠損症を有する対象由来のヒト幹細胞（例えば、ヒト多能性幹細胞、例えば、ｈＥＳＣ、またはｈｉＰＳＣ）から調製されるか、または成長ホルモン産生細胞が、ＧＨ欠損症の細胞および／もしくは代謝特性を発現する、集団、および（ｉｉ）試験化合物を用意するステップと；（ｂ）成長ホルモン産生細胞を、試験化合物と接触させるステップと、（ｃ）成長ホルモン産生細胞の機能的活性、または遺伝子発現を測定するステップとを含む。ある特定の実施形態では、成長ホルモン産生細胞を、少なくとも約２４時間（１日）、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約７日間、約８日間、約９日間、または約１０日間、試験化合物と接触させる。
【実施例】
【０３２５】
６．実施例
本開示の主題は、本開示の主題の例示として提供され、限定のために提供されるのではない、以下の実施例および付属書類を参照してよりよく理解されよう。
（実施例１）
幹細胞からのヒト成長ホルモン産生細胞の選択的誘導
概要
【０３２６】
単層培養によってヒト多能性幹細胞からの成長ホルモン産生細胞の誘導方法（ｍｅｔｈｏｄ  ｏｆ  ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ）が提供される。この方法により、成長ホルモンを放出することができる成長ホルモン産生細胞がもたらされた。手順は、ステップワイズ分化プロセスであり、これは、異なるタイミングで様々な分子に曝露させ、成長ホルモン産生細胞を生じさせる、前駆細胞／前駆体のいくつかの発生段階を誘導する（ｉｎｄｕｃｅ）ことを含んだ。細胞の、ＧＨ欠損マウスに関する前臨床モデルへの移植により、血漿中のＧＨおよびＩＧＦ−１レベルが有意に増加した。
方法および材料
【０３２７】
ヒトＥＳまたはｉＰＳ細胞を、マトリゲル上のＥ８培地中で拡大させた。
【０３２８】
０日目に、細胞を、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍｌ）およびＳＢ４３１５２（１０μＭ）が添加されたＥ６培地に取り替え、毎日培地と因子を取り替えた。
【０３２９】
３日目に、ＢＭＰ４を除去し、以下の因子を添加した：ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ）；ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）；ＦＧＦ１８（５０ｎｇ／ｍｌ）；Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＳＡＧ（スムーズンドアゴニスト）（１００ｎＭ）；ＬＤＮ１９３１８９（２５０ｎＭ）。培地および因子を１日おきに取り替えた。
【０３３０】
８日目に、以下の因子を使用した：ＦＧＦ８（５０ｎｇ／ｍｌ）；ＢＭＰ２（２０ｎｇ／ｍｌ）；ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）；ＤＰＮ  ２，３−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロピオニトリル（０．１ｎＭ）。培地および因子を１日おきに取り替えた。
【０３３１】
１５日目に、以下の因子を使用した：レチノイン酸（１μＭ）；甲状腺ホルモンＴ３（１０ｎＭ）；デキサメタゾン（１μＭ）；サイクリックＡＭＰ（１００μｇ／ｍｌ）；ＤＰＮ（０．１ｎＭ）；成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）（１μＭ）。培地および因子を１日おきに取り替えた。
【０３３２】
２９日目に、細胞は成熟期に入り、１〜４週間の範囲のさまざまな期間中同じ因子中に維持することができた。この段階の細胞は、ＧＨＲＨ受容体（ＧＨＲＨＲ）を発現した。これらを、ＧＨＲＨに関するＦＡＣＳ選別に供し、成長ホルモン産生細胞の純粋な細胞集団を得ることができた。プロトコールの持続期間中、細胞はマトリゲル上に存在したままであった。
【０３３３】
例えば、図１および１４に示されているプロトコールを参照されたい。
【０３３４】
このプロトコールはＧＭＰ適合性であった。これらの条件は、他の下垂体細胞系統、例えば、ＡＣＴＨを分泌する副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、プロラクチンを分泌する細胞、ＦＳＨ／ＬＨおよびＴＳＨを分泌する細胞などを有効に抑制した。
結果
【０３３５】
ＧＨ細胞を得るために、戦略は、最初に、ヒト多能性幹細胞を、前プラコード外胚葉および下垂体前葉前駆細胞に分化させることであった。細胞を、ＰＲＯＰ１系統へと、次いで、ＰＩＴ１系統へとさらに分化させた。次いで、細胞を、最終的に、ＧＨ細胞へと分化させた。多能性幹細胞を、成長ホルモンを分泌する細胞へと分化させるためのステップワイズプロトコールは、下垂体前葉前駆細胞においてＰｒｏｐ１の発現を促進すること、ＰＯＵ１Ｆ１（ＰＩＴ１）を活性化すること、細胞分化を成長ホルモンを発現する細胞へと方向付けることを含んだ。成長ホルモンを発現する細胞をまた、インキュベーションを延長することによってさらに成熟させた。分化のプロセスをモニターするための重要なマーカーは、Ｐｒｏｐ１、ＰＯＵ１Ｆ１（ＰＩＴ１）、ＧＨおよびＧＨＲＨＲを含んだ。
【０３３６】
例えば、第１のステップは、ＢＭＰ４およびＴＧＦ−β／Ａｃｔｉｖｉｎ／ＮＯＤＡＬ経路の阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）によって、非神経外胚葉を誘導することであった。次いで、細胞を、ＴＧＦ−β／Ａｃｔｉｖｉｎ／ＮＯＤＡＬ経路の阻害剤（例えば、ＳＢ４３１５４２）、ＦＧＦ８／１０／１８、ＳＨＨアゴニスト（例えば、ＳＨＨ）、およびＳＭＡＤ阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９）に供し、下垂体前葉前駆細胞を誘導し、これを、ＰＩＴＸ１／２、ＬＨＸ３／４およびＰＲＯＰ１の発現によって特徴付けた。得られた前プラコード外胚葉および下垂体前葉前駆細胞の遺伝子発現を、単一細胞ＲＮＡ−ｓｅｑによって分析し、結果を図２に示す。細胞の７０％が、ＰＩＴＸ１およびＬＨＸ３などの下垂体転写物を共発現した。４つの細胞（分析した全細胞の５％）のみが、Ｔ（中胚葉）、ＳＯＸ１７、またはＭＹＯＤを発現し、これは、夾雑細胞の割合が低いことを示唆した。他のプラコードの運命は、ＰＡＸ２（上鰓）、ＰＡＸ３（三叉神経）、またはＰＡＸ８（耳）を含み、これらは一緒に、ＳＩＸ１＋集団の約２０％において検出された。
【０３３７】
加えて、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達誘導剤（例えば、ＢＭＰ４、ＳＢ４３１５４２、ＦＧＦ８／１０およびＳＨＨ）は、ＰＲＯＰ１の発現を増加させることができた。図３は、Ｎｏｔｃｈシグナル伝達誘導剤で処置した細胞が、ＰＲＯＰ１の発現の増加を示したことを示す。
【０３３８】
次いで、細胞を、ＴＧＦ−β／Ａｃｔｉｖｉｎ／ＮＯＤＡＬ経路（例えば、ＳＢ４３１５４２）、ＷＮＴ経路の活性化剤（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）、ＦＧＦ８、ＢＭＰ２およびエストロゲンＥＲβ受容体選択的アゴニスト（例えば、ＤＰＮ）で処置し、ＰＩＴ１（ＰＯＵ１Ｆ１）を発現する細胞を誘導し、これは、成長ホルモン産生細胞、プロラクチン産生細胞および甲状腺刺激ホルモン産生細胞を生じさせることができた。ＣＨＩＲ９９０２１は、Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達を上方調節するためのＧＳＫ−β阻害剤であり、Ｐｉｔ１の発現を誘導することができた。図４は、ＣＨＩＲ９９０２１によって処置した細胞におけるＰＩＴ１遺伝子発現を示す。ほとんどのＰＩＴ１細胞は増殖しておらず、Ｋｉ６７発現の欠如によって示された。図５は、ＦＧＦ８による処置は、ＰＲＯＰ１の発現を維持することができたが、しかしながら、ＦＧＦ８による処置のみではＰＩＴ１が下方調節され、ＰＯＭＣが上方調節されたことを示す。ＢＭＰ２の添加は、ＦＧＦ８の作用を相殺することができた。ＦＧＦ８、ＢＭＰ２およびＣＨＩＲの組合せの効果は、図６に示されている。この組合せは、ＧＨ１の発現を有意に促進した。
【０３３９】
成長ホルモン産生細胞への選択的分化のために、レチノイン酸を使用して、甲状腺刺激ホルモン産生細胞によって発現されたＰＯＭＣを抑制し、成長ホルモン産生細胞によって発現されるＧＨ１の発現を促進した。さらに、コルチコステロイド（例えば、デキサメタゾン）および甲状腺ホルモン（例えば、Ｔ３）を培地に添加し、ＰＲＬ（プロラクチン産生細胞によって発現された）およびＴＳＨ（甲状腺刺激ホルモン産生細胞によって発現された）を阻害し、一方、ＧＨ１の発現を促進させた。ＧＨ１の発現は、エストロゲンＥＲβ受容体選択的アゴニスト（ＤＰＮ）およびＧＨＲＨシグナル伝達経路のアゴニスト（例えば、ＧＨＲＨおよびデブチル−ｃＡＭＰ）によってさらに促進された。成長ホルモンを分泌する細胞の選択的誘導に対する、ＲＡ、ＧＨＲＨ、Ｔ３、およびコルチコステロンの作用は、図６に示されている。図６Ａは、ＲＡによる処置によって、ＧＨ１の発現が有意に増加したことを示す。図６Ｂは、ＧＨＲＨによる処置によって、ＧＨ１の発現が有意に増加したことを示す。図６Ｃは、Ｔ３による処置によって、ＴＳＨ−βの発現が有意に減少したことを示す。図６Ｄは、コルチコステロンによる処置によって、ＰＲＬの発現が有意に減少したことを示す。
【０３４０】
このステップの後、培養における大部分の集団が成長ホルモン産生細胞であり、これは、上清中で、成長ホルモン産生細胞マーカーであるＧＨ１を発現し、成長ホルモンを分泌した。この集団の表現型が図８に示されている。細胞集団は、多量のＧＨおよびＧＨＲＨＲ、ならびに少量のＴＳＨ、ＰＲＬおよびＬＨを発現した。ＧＨの発現は、ＧＨＲＨ刺激に際してさらに増加した（図８、右下のパネル）。
【０３４１】
この方法の最終ステップは、成長ホルモン産生細胞の成熟をさらに可能にし、数週間にわたって、ＧＨＲＨの発現を増加させることであった。成長ホルモン産生細胞を、抗ＧＨＲＨＲによる細胞選別（例えば、ＦＡＣＳ）によって富化した。図９は、ＧＨＲＨＲ陽性細胞において、ほとんどの細胞が、低レベルのＧＨＲＨＲを発現し、一部の細胞だけが、高レベルのＧＨＲＨＲを発現したことを示す。高レベルのＧＨＲＨＲを発現する細胞は、より低い増殖速度とともに多角形形態を示し、これらがより成熟したＧＨ細胞であることを示した。図１０は、高レベルのＧＨＲＨＲを発現する細胞が、低いＫｉ６７の発現によって反映される低い増殖速度を有し、低レベルを発現する細胞と比較して有意に多量の成長ホルモンを発現したことを示す。これらの細胞は、抗ＧＨＲＨＲによる細胞選別（例えば、ＦＡＣＳ）によってさらに富化することができた。
【０３４２】
分化の進行をより密接にモニタリングするために、遺伝子編集によって挿入された内因性レポーターを含むことができる。段階特異的レポーター系を生成するための例示的なレポーター構築物を図１１に示す。
（実施例２）
ＧＨ欠損症を処置するための分化細胞の使用
【０３４３】
ＧＨ欠損マウス株に関する前臨床モデルとして、ヒトにおける最も一般的なＣＰＨＤを表すＰＲＯＰ１変異を有するため、Ａｍｅｓ小人症マウスを選択した。Ａｍｅｓ小人症マウスは、正常なマウスの半分のサイズを示し、ＧＨおよびＩＧＦ−１のレベルは検出不能であった（図１２Ａ〜１２Ｃ）。Ｍｉｃｒｏ−ＣＴ分析を大腿骨に関して実施し、結果を図１２Ｄ〜１２Ｆに示す。主な差は、皮質骨におけるものであった。Ａｍｅｓ小人症マウスの骨塩密度と平均皮質厚は、正常なマウスより有意に低かった。加えて、Ａｍｅｓマウスは、より多くの分離とより多数の骨梁とともに、非常に薄い骨梁骨を示した。
【０３４４】
Ｒａｇ１−／−およびＡｍｅｓ小人症マウスを異種交配して、ヒト細胞を受容する免疫欠損Ａｍｅｓ小人症マウスを得た。異種交配Ａｍｅｓ小人症マウスは、依然として、Ａｍｅｓ小人症マウスと同様のサイズを示し、正常なマウスの約半分のサイズであった（図１３Ａ）。実施例１に記載された方法に従って得たＧＨＲＨＲ陽性細胞を、免疫欠損Ａｍｅｓ小人症マウスに皮下注射した。細胞は移植後６週間生存し、ＧＨを発現する（図１３Ｂを参照されたい）。移植片はＧＨＲＨ注射によって刺激され、ヒトＧＨの血漿中レベルを上昇させた（図１３Ｃを参照されたい）。循環形態のＩＧＦ−１とＩＧＦＢＰ３発現は、肝臓において４８％と７５％に回復した（図１３Ｄおよび１３Ｃを参照されたい）。血漿中ＩＧＦ−１レベルは、正常レベルの約３１％であった（図１３Ｆを参照されたい）。この実験のために、１５０，０００個の細胞だけを注射した。最適な結果は、移植細胞数を増加させることによって達成することができる。
【０３４５】
よって、これらの結果は、ホルモン産生細胞を視床下部−下垂体の境界面に移植することができ、ホルモン産生細胞が内分泌系を機能させ、統合することができ、動的放出およびフィードバック応答性を含む生理学的に適当な機能、ならびに欠損の救済をもたらすという多くの必要とされる前臨床の概念実証を提供し得る。ここで示される結果は、ａ）概念実証としてのＧＨ欠損症に関する細胞移植の実行可能性、ｂ）移植細胞の視床下部−下垂体軸への統合と生理学的様式でのＧＨの動的放出の回復、およびｃ）潜在的な臨床適用に向けた研究を加速させるｃＧＭＰを遵守した条件下での貴重な前臨床データの開発への重要な洞察をもたらすことができる。さらに、ｃＧＭＰ条件に十分に適合性のある化合物および方法を優先することによって、細胞分化プロトコールを作成することができる。
（実施例３）
幹細胞からのヒト成長ホルモン産生細胞の選択的誘導
概要
【０３４６】
単層培養によるヒト多能性幹細胞からの成長ホルモン産生細胞の誘導方法が提供される。この方法により、成長ホルモンを放出することができる成長ホルモン産生細胞がもたらされた。手順は、ステップワイズ分化プロセスであり、これは、異なるタイミングで様々な分子に曝露させ、成長ホルモン産生細胞を生じさせる、前駆細胞／前駆体のいくつかの発生段階を誘導することを含んだ。細胞の、ＧＨ欠損マウスに関する前臨床モデルへの移植により、血漿中のＧＨおよびＩＧＦ−１レベルの有意な増加がもたらされた。
方法および材料
【０３４７】
ヒトＥＳまたはｉＰＳ細胞を、マトリゲル上のＥ８培地中で拡大させた。
【０３４８】
０日目に、細胞を、ＢＭＰ４（５ｎｇ／ｍｌ）およびＳＢ４３１５２（１０μＭ）が添加されたＥ６培地に取り替え、毎日培地と因子を取り替えた。
【０３４９】
３日目に、ＢＭＰ４を除去し、以下の因子を添加した：ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ）；ＦＧＦ１０（５０ｎｇ／ｍｌ）；ＦＧＦ１８（５０ｎｇ／ｍｌ）；Ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ（ＳＨＨ）（１００ｎｇ／ｍｌ）またはＳＡＧ（スムーズンドアゴニスト）（１００ｎＭ）；ＬＤＮ１９３１８９（２５０ｎＭ）。培地および因子を１日おきに取り替えた。
【０３５０】
８日目に、以下の因子を使用した：ＦＧＦ８（１００ｎｇ／ｍｌ）；ＢＭＰ２（２０ｎｇ／ｍｌ）；ＳＢ４３１５２（１０μＭ）。培地および因子を１日おきに取り替える。
【０３５１】
１２日目に、以下の因子を使用した：ＢＭＰ２（２０ｎｇ／ｍｌ）；ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）；ＤＰＮ  ２，３−ビス（４−ヒドロキシフェニル）プロピオニトリル（０．１ｎＭ）。培地および因子を１日おきに取り替える。
【０３５２】
１９日目に、以下の因子を使用した：レチノイン酸（０．１μＭ）；甲状腺ホルモンＴ３（１０ｎＭ）；デキサメタゾン（１μＭ）；ＤＰＮ（０．１ｎＭ）；成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）（１０ｎＭ）、Ｇｈｒｅｌｉｎ（１０ｎＭ）。培地および因子を１日おきに取り替えた。
【０３５３】
２４日目に、以下の因子を使用した：甲状腺ホルモンＴ３（１０ｎＭ）；デキサメタゾン（１μＭ）；ＤＰＮ（０．１ｎＭ）；成長ホルモン放出ホルモン（ＧＨＲＨ）（１０ｎＭ）；Ｇｈｒｅｌｉｎ（１０ｎＭ）；ＩＬ−６（２５ｎｇ／ｍｌ）。培地および因子を１日おきに取り替えた。
【０３５４】
３３日目に、以下の因子を使用した：甲状腺ホルモンＴ３（１０ｎＭ）；デキサメタゾン（１μＭ）；ＤＰＮ（０．１ｎＭ）。培地および因子を１日おきに取り替えた。
【０３５５】
３３日目に、細胞は成熟期に入った。この段階の細胞は、ＧＨＲＨ受容体（ＧＨＲＨＲ）を発現した。
【０３５６】
例えば、図１５に示されているプロトコールを参照されたい。
【０３５７】
これらを、ＧＨＲＨに関するＦＡＣＳ選別に供し、成長ホルモン産生細胞の純粋な細胞集団を得ることができた。プロトコールの持続期間中、細胞はマトリゲル上に存在したままであった。このプロトコールはＧＭＰ適合性であった。これらの条件は、ＡＣＴＨを分泌する副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、プロラクチンを分泌する細胞、ＦＳＨ／ＬＨおよびＴＳＨを分泌する細胞などの他の下垂体細胞系統を有効に抑制した。
【０３５８】
本開示の主題およびその利点が詳細に記載されてきたが、様々な変更、置換および改変が、添付の特許請求の範囲によって定義されているように、本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく本明細書においてなされ得ることが理解されるべきである。さらに、本出願の範囲は、本明細書に記載されているプロセス、機械、製造、および組成物、手段、方法およびステップの特定の実施形態に限定されることを意図されていない。当業者が、本開示の主題の開示から容易に理解するように、既存のまたは後に開発される、本明細書に記載の対応する実施形態と実質的に同じ機能を行うかまたは実質的に同じ結果を達成する、プロセス、機械、製造、組成物、手段、方法またはステップを、本開示の主題に従って利用することができる。したがって、添付の特許請求の範囲は、その範囲内に、このようなプロセス、機械、製造、組成物、手段、方法、またはステップを含むことを意図する。
【０３５９】
特許、特許出願、刊行物、製品説明およびプロトコールが本出願全体を通して引用されており、その開示は、すべての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021502091.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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