(57)【要約】本開示は、癌などの疾患の治療におけるＣＡＲ−Ｔ細胞およびＧＳＫ３β阻害剤を含む組成物および／またはキットの使用を含む、同ＣＡＲ−Ｔ細胞およびＧＳＫ３β阻害剤を含む組成物およびキットに関する。
2021503303.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞の集団のエクスビボ増殖のための方法であって、前記方法は、前記Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることを含む、方法。
【請求項２】
前記Ｔ細胞がＧＳＫ３β阻害剤と接触する前に、同Ｔ細胞は腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質で最初にトランスフェクトされる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記Ｔ細胞が対象から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記方法は、形質導入されたＴ細胞を腫瘍抗原と接触させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤および腫瘍抗原と同時に接触させる、請求項１または請求項２に記載の方法。
【請求項６】
前記Ｔ細胞はインターロイキン１３（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸で形質導入される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記核酸がインターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋまたはそのフラグメントをコードする、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記核酸が、インターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインに結合するドメインを含むインターロイキン１３のフラグメント、またはインターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードする、請求項６記載の方法。
【請求項９】
前記腫瘍抗原がインターロイキン１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）またはそのバリアントを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記腫瘍抗原が、インターロイキン１３受容体のアルファ（α）鎖（ＩＬ１３Ｒα）またはそのバリアントを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
ＧＳＫ３β阻害剤が
（ａ）ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）から選択される化学物質および
（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせから選択される遺伝物質のうちの少なくとも１つである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記Ｔ細胞が、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはγδＴ細胞である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
増殖したＴ細胞は、その後、疾患を治療するために患者に戻すべく投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記疾患が癌である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
癌が固形腫瘍である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記腫瘍が腫瘍抗原を発現する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
Ｔ細胞の集団のエクスビボ増殖のための方法であって、前記方法は：
対象から前記Ｔ細胞を含むサンプルを単離することと；
Ｔ細胞の集団に、腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸を形質導入することと；
形質導入されたＴ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることと、を含む方法。
【請求項１８】
キメラ抗原受容体タンパク質を発現するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）およびＧＳＫ３β阻害剤を含む組成物。
【請求項１９】
キメラ抗原受容体タンパク質が腫瘍抗原に結合する、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２０】
前記Ｔ細胞がインターロイキン１３（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する、請求項１８または請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
前記Ｔ細胞がインターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋを含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が小分子または遺伝物質である、請求項１８に記載の組成物。
【請求項２３】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である小分子；あるいはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）である遺伝物質、である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせ、およびＧＳＫ３のドミナントネガティブ対立遺伝子（ＧＳＫ３ＤＮ）から選択される遺伝物質である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
キメラ抗原受容体タンパク質を発現するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）とＧＳＫ３β阻害剤とを含む別個の投与のための製剤。
【請求項２６】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＳＢ２１６７６３、ＴＷＳ−１１９、１−アザケンパウロンまたは６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である小分子；あるいはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）である遺伝物質、である、請求項２５に記載の製剤。
【請求項２７】
キットであって、１つ以上のパッケージ中に、インターロイキン１３（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードするＣＡＲ核酸構築物；ＧＳＫ３β阻害剤；および前記ＣＡＲ核酸構築物を用いてＴ細胞に形質導入するための任意選択の第１の試薬；Ｔ細胞を活性化するためのさらなる任意選択の第２の試薬、を含む、キット。
【請求項２８】
前記第２の試薬がＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃである、請求項２７に記載のキット。
【請求項２９】
前記核酸構築物がインターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋを含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする、請求項２７または請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である小分子；あるいはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）である遺伝物質、である、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３１】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせ、およびＧＳＫ３ＤＮを含む遺伝物質である請求項２７〜２９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
ネイティブまたは野生型のＴ細胞と比較してＧＳＫβの発現または活性を阻害したＴ細胞。
【請求項３３】
ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはγδＴ細胞である、請求項３２に記載のＴ細胞。
【請求項３４】
Ｔ細胞が、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含む遺伝的阻害剤を含み、前記遺伝的阻害剤は、Ｔ細胞におけるＧＳＫ３βの活性または発現を阻害する、請求項３２に記載のＴ細胞。
【請求項３５】
Ｔ細胞のエクスビボ増殖のための方法であって、前記方法は、Ｔ細胞を含むサンプルを対象から単離することと；前記Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることと；腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸でＴ細胞に形質導入することと；形質導入されたＴ細胞を腫瘍抗原と接触させて形質導入されたＴ細胞を増殖させることと、を含む方法。
【請求項３６】
Ｔ細胞のエクスビボ増殖のための方法であって、前記方法は、Ｔ細胞を含むサンプルを対象から単離することと；前記Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることと、腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸でＴ細胞に形質導入することと；形質導入されたＴ細胞を腫瘍抗原と接触させて形質導入されたＴ細胞を活性化させることおよび増殖させることのうちの少なくとも一方を行うことと、を含む方法。
【請求項３７】
前記Ｔ細胞が、インターロイキン１３（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸で形質導入される、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記核酸がインターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋまたはそのフラグメントをコードする、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記核酸が、インターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインに結合するドメインを含むインターロイキン１３のフラグメント、またはインターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードする、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記腫瘍抗原がインターロイキン１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）またはそのバリアントを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記腫瘍抗原がインターロイキン１３受容体のアルファ（α）鎖（ＩＬ１３Ｒα）またはそのバリアントを含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が
（ａ）ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）から選択される化学物質および
（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせから選択される遺伝物質
のうちの少なくとも１つである、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
【請求項４３】
前記Ｔ細胞がヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはγδＴ細胞である、請求項３５または請求項３６に記載の方法。
【請求項４４】
それを必要とする対象におけるＴ細胞の養子移入により治療可能な疾患を治療する方法であって、前記方法は、前記対象に、複数の活性化および増殖したＴ細胞を含む有効量の組成物を投与することを含み、前記活性化はＣＡＲ−Ｔを抗原と接触させることを含み、前記増殖は、活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることを含む、方法。
【請求項４５】
前記ＧＳＫ３β阻害剤が
（ａ）ＳＢ２１６７６３、ＴＷＳ−１１９、１−アザケンパウロンまたは６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）から選択される化学物質および
（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせから選択される遺伝物質
のうちの少なくとも１つである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記疾患が、腫瘍疾患、細菌性疾患、ウイルス性疾患および原生動物疾患から選択される病原性疾患、または自己免疫疾患である、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
キメラ抗原受容体タンパク質を発現するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）およびＧＳＫ３β阻害剤を含む組成物。
【請求項４８】
それを必要とする対象において腫瘍を治療するための方法であって、前記方法は、腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する複数の活性化および増殖Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を含む有効量の組成物を前記対象に投与することを含み、活性化がＣＡＲ−Ｔを腫瘍抗原と接触させることを含み、増殖が活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることを含み、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞はキメラ抗原受容体タンパク質を発現し、キメラ抗原受容体タンパク質は腫瘍抗原に結合する、方法。
【請求項４９】
前記Ｔ細胞が自家Ｔ細胞である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記腫瘍抗原がインターロイキン１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）またはそのリガンド結合ドメインである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５１】
前記キメラ抗原受容体タンパク質が、Ｉｌ１３またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５２】
前記キメラ抗原受容体タンパク質がＩＬ１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋを含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５３】
ＧＳＫ３β阻害剤が
（ａ）ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）から選択される化学物質および
（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせから選択される遺伝物質
のうちの少なくとも１つである、請求項４８に記載の方法。
【請求項５４】
前記Ｔ細胞が、同時にまたは順次に活性化および増殖される、請求項４８に記載の方法。
【請求項５５】
腫瘍がＩＬ１３Ｒ陽性である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５６】
腫瘍がＩＬ１３Ｒ陽性神経膠腫である、請求項４８に記載の方法。
【請求項５７】
腫瘍特異的メモリーＴ細胞を生成する方法であって、前記方法は、腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ−Ｔ）をコードする核酸を対象の生体サンプルから単離されたＴ細胞に形質導入することと；ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍抗原およびＧＳＫ３β阻害剤と接触させることと；メモリー細胞に特異的な第１のマーカーおよび腫瘍抗原に特異的な第２のマーカーを検出して、それにより腫瘍特異的なメモリーＴ細胞を生成することと、を含む、方法。
【請求項５８】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＩＬ１３またはそのフラグメントまたはそのバリアントをコードする核酸で形質導入される、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＩＬ１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋをコードする核酸で形質導入される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
腫瘍抗原がＩＬ１３受容体またはそのリガンド結合ドメインである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
ＧＳＫ３β阻害剤が
（ａ）ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）から選択される化学物質および
（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはドミナントネガティブＧＳＫ３阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）またはそれらの組み合わせから選択される遺伝物質
のうちの少なくとも１つである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
メモリー細胞に特異的なマーカーは、ＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋から選択され、腫瘍抗原に特異的なマーカーが腫瘍抗原に結合するタンパク質の発現を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ＩＬ１３Ｒ陽性細胞への結合、および場合によりＩＬ１３Ｒ陽性細胞の破壊を含む機能アッセイによって確認されるように、ＩＬ１３Ｒ陽性腫瘍細胞に特異的である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６４】
メモリーＴ細胞がＣＤ８＋Ｔ細胞である、請求項５７に記載の方法。
【請求項６５】
メモリーＣＡＲ−Ｔ細胞ホメオスタシスの第３のマーカーをさらに検出する、請求項５７に記載の方法。
【請求項６６】
前記第３のマーカーが、ＩＬ１３Ｒ発現、Ｔ−ｂｅｔ発現、およびＰＤ−１発現のうちの少なくとも１つである、請求項５７に記載の方法。
【請求項６７】
増加したＴ−ｂｅｔ発現および減弱したＰＤ−１発現の少なくとも１つが、改善されたＣＡＲ−Ｔ細胞ホメオスタシスを示す、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
Ｔ細胞ホメオスタシスが、Ｔ細胞疲弊の減少、持続的なサイトカイン発現、Ｔ細胞クローン性の維持、およびＣＡＲ−Ｔメモリー発達の促進、のうちの少なくとも一つを含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
腫瘍抗原による活性化およびＧＳＫ３β阻害剤の存在下での増殖を介して生成されたＣＡＲ−Ｔ細胞が、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞に対する特異性およびメモリーの増加を示す、請求項５７〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、腫瘍の治療などの様々な治療用途において有用である、受容体タンパク質を発現する、遺伝的に改変された、またはキメラ抗原受容体Ｔ細胞（例えば、ＣＡＲ−Ｔ）の機能を改善するための組成物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍に対する免疫療法戦略としてのキメラ抗原受容体発現人工Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）の使用は、末梢液性腫瘍の治療成功の特徴になっている。しかしながら、固形腫瘍の治療におけるＣＡＲ−Ｔ療法は、種々雑多な反応を示すものであった。養子Ｔ細胞療法の成功は、共刺激シグナルとともに、治療用Ｔ細胞が抗原源にアクセスしやすいかどうかに依存しており、これにより、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞がリンパ節で大量の悪性Ｂ細胞に曝されている血液腫瘍において、またはメラノーマのような免疫原性の高い腫瘍の治療時において、強力な活性化プロファイルと強い細胞毒性効果がもたらされる。対照的に、固形腫瘍のＣＡＲ−Ｔ治療時では、腫瘍抗原への曝露が制限される結果としてＴ細胞の活性化が弱くなり、不安定な免疫応答、貧血性クローン増殖、および未熟なクローン性収縮が起こる。
【０００３】
クローン性収縮およびＴ細胞の弱い活性化のこの問題を克服するための様々な方法が当技術分野で採用されており、中程度の成功を収めている。たとえば、クローン性収縮を克服し、急速な増殖を促進し、かつサイトカイン欠乏を克服するために、ＣＤ２８シグナル伝達分子をＣＡＲ構築物の細胞内部分に追加した、第２世代のＣＡＲ−Ｔ細胞として知られているものが設計されている。時間とともに、この改変は固形腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔの使用に対するすべての障壁を克服しなかったことが観察された。４１ＢＢおよび／またはＯＸ４０のような共刺激分子が追加された「第３世代」のＣＡＲを作成するために、さらなる改変がなされた。さらに、移入されたＴ細胞を生存させ機能させるために、患者はＩＬ２療法で定期的に処置されるが、治療用Ｔ細胞によるサイトカインの制御されない産生を引き起こす結果となっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
これらの方法は固形腫瘍の治療においてＴ細胞の活性化をある程度まで高めることができたが、クローン性の収縮（ｃｌｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）を完全に克服し、Ｔ細胞の急速な増殖と活性化を促進するためのさらなるイノベーションが依然として必要である。そのような方法は本明細書において提供される。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本開示は、ＣＡＲ−Ｔ療法を改善するための組成物および方法に関する。固形腫瘍におけるＣＡＲ−Ｔ細胞免疫療法の成功における主たる障害は、最適なＣＡＲ−Ｔ細胞活性化未満のものをもたらす弱い抗原曝露（ｅｘｐｏｓｕｒｅ）であり、それは付随して弱い抗腫瘍免疫応答をもたらすものであることを認識し、本開示は、ＣＡＲ−Ｔ療法における既存のハードルを克服する組成物および方法を提供する。特に、本明細書に記載される組成物および方法は、補助的なＩＬ２療法に関連する細胞毒性とともに、第２世代ＣＡＲにおけるＣＤ２８および他の共刺激シグナル伝達部分の制限の多くを克服する。
【０００６】
様々な実施形態において、Ｔ細胞の集団をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることを含む、Ｔ細胞の集団のエクスビボ増殖（ｅｘ  ｖｉｖｏ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のための方法が提供される。様々な実施形態において、Ｔ細胞は、最初に、キメラ抗原Ｔ細胞受容体をコードする核酸で形質導入される。様々な実施形態において、Ｔ細胞は哺乳動物に由来する。様々な実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０００７】
様々な実施形態において、方法は、形質導入された細胞を腫瘍抗原と接触させることをさらに含む。
様々な実施形態において、方法は、Ｔ細胞の集団のエクスビボ増殖のために提供され、同方法は：対象からの前記Ｔ細胞を含むサンプルを単離することと；Ｔ細胞の集団に腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸を形質導入することと；形質導入されたＴ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることと、を含む。
【０００８】
様々な実施形態において、方法は、形質導入されたＴ細胞を腫瘍抗原と接触させることをさらに含む。様々な実施形態において、Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤および腫瘍抗原と同時に接触させる。
【０００９】
様々な実施形態において、Ｔ細胞は、インターロイキン１３（ＩＬ１３  ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸で形質導入される。様々な実施形態において、核酸は、インターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋまたはそのフラグメントをコードする。
【００１０】
様々な実施形態において、核酸は、インターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインに結合するドメインを含むインターロイキン１３のフラグメント、またはインターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードする。様々な実施形態において、腫瘍抗原は、インターロイキン１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）またはそのバリアントを含む。
【００１１】
様々な実施形態において、腫瘍抗原は、インターロイキン１３受容体のアルファ（α）鎖（ＩＬ１３Ｒα）またはそのバリアントを含む。
様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、（ａ）ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン（Ａｚａｋｅｎｐａｕｌｌｏｎｅ）、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）から選択される化学物質、および／または（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせから選択される遺伝物質、である。
【００１２】
様々な実施形態において、Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはγδＴ細胞である。
様々な実施形態において、疾患を治療するために、増殖したＴ細胞がその後、患者に戻されるべく投与される。様々な実施形態において、疾患は癌である。様々な実施形態において、癌は固形腫瘍である。様々な実施形態において、腫瘍は腫瘍抗原を発現する。
【００１３】
様々な実施形態において、キメラ抗原受容体タンパク質（ＣＡＲ−Ｔ細胞）およびＧＳＫ３β阻害剤を含む組成物が提供される。様々な実施形態において、キメラ抗原受容体は腫瘍抗原に結合する。
【００１４】
様々な実施形態において、Ｔ細胞は、インターロイキン１３（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体を発現する。様々な実施形態において、Ｔ細胞は、インターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋを含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する。
【００１５】
様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、小分子または遺伝物質である。様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である小分子、或いはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）である遺伝物質である。様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせ、およびＧＳＫ３のドミナントネガティブ対立遺伝子（ｄｏｍｉｎａｎｔ−ｎｅｇａｔｉｖｅ  ａｌｌｅｌｅ）（ＧＳＫ３ＤＮ）から選択される遺伝物質である。
【００１６】
様々な実施形態において、キメラ抗原受容体タンパク質（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を発現するＴ細胞およびＧＳＫ３β阻害剤を含む別個の投与（ｓｅｐａｒａｔｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ）のための製剤が提供される。
【００１７】
様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、ＳＢ２１６７６３、ＴＷＳ−１１９、１−アザケンパウロンまたは６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である小分子、或いはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）である遺伝物質である。
【００１８】
様々な実施形態において、キットが提供され、キットは、１つ以上のパッケージ中に、インターロイキン１３（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードするＣＡＲ核酸構築物；ＧＳＫ３β阻害剤；および前記ＣＡＲ核酸構築物でＴ細胞に形質導入する（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ）ための任意選択の第１の試薬；Ｔ細胞を活性化するためのさらなる任意選択の第２の試薬、を含む。
【００１９】
様々な実施形態において、第２の試薬はＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃである。様々な実施形態において、核酸構築物は、インターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋを含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする。様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である小分子、或いはｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）である遺伝物質である。様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせ、およびＧＳＫ３ＤＮを含む遺伝物質である。
【００２０】
様々な実施形態において、天然または野生型のＴ細胞と比較して、ＧＳＫβの発現または活性を阻害したＴ細胞が提供される。様々な実施形態において、Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはγδＴ細胞である。
【００２１】
様々な実施形態において、Ｔ細胞のエクスビボ増殖のための方法が提供され、同方法は、対象からのＴ細胞を含むサンプルを単離することと；Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることと；腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸を用いてＴ細胞に形質導入することと；形質導入されたＴ細胞を腫瘍抗原と接触させて形質導入されたＴ細胞を増殖させることと、を含む。
【００２２】
様々な実施形態において、方法は、Ｔ細胞のエクスビボ増殖のための方法が提供され、同方法は、対象からのＴ細胞を含むサンプルを単離することと；Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることと；腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸を用いてＴ細胞に形質導入することと；形質導入されたＴ細胞を腫瘍抗原と接触させて形質導入されたＴ細胞を活性化および／または増殖することと、を含む。
【００２３】
様々な実施形態において、Ｔ細胞は、インターロイキン１３（ＩＬ１３  ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸で形質導入される。様々な実施形態において、核酸は、インターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋまたはそのフラグメントをコードする。様々な実施形態において、核酸は、インターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインに結合するドメインを含むインターロイキン１３のフラグメント、またはインターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードする。様々な実施形態において、腫瘍抗原は、インターロイキン１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）またはそのバリアントを含む。様々な実施形態において、腫瘍抗原は、インターロイキン１３受容体のアルファ（α）鎖（ＩＬ１３Ｒα）またはそのバリアントを含む。
【００２４】
様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、（ａ）ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）から選択される化学物質、および／または（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせから選択される遺伝物質、である。
【００２５】
様々な実施形態において、Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはγδＴ細胞である。
様々な実施形態において、それを必要とする対象においてＴ細胞の養子移入により治療可能な疾患を治療するための方法が提供され、同方法は、対象に、複数の活性化および増殖したＴ細胞を含む有効量の組成物を投与することを含み、活性化がＣＡＲ−Ｔを抗原と接触させることを含み、増殖が活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることを含む。
【００２６】
様々な実施形態において、それを必要とする対象においてＴ細胞の養子移入により治療可能な疾患を治療するための方法が提供され、同方法は、対象に、複数の活性化および増殖したＴ細胞を含む有効量の組成物を投与することを含み、活性化がＣＡＲ−Ｔを抗原と接触させることを含み、増殖が活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることを含む。
【００２７】
様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、（ａ）ＳＢ２１６７６３、ＴＷＳ−１１９、１−アザケンパウロンまたは６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）から選択される化学物質、および／または（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせから選択される遺伝物質、である。
【００２８】
様々な実施形態において、疾患は、腫瘍疾患、細菌性疾患、ウイルス性疾患および原生動物疾患から選択される病原性疾患、または自己免疫疾患である。
様々な実施形態において、それを必要とする対象において腫瘍を治療するための方法が提供され、同方法は、腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する複数の活性化および増殖Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を含む有効量の組成物を対象に投与することを含み、活性化がＣＡＲ−Ｔを腫瘍抗原と接触させることを含み、増殖が活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることを含み、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞はキメラ抗原受容体タンパク質を発現し、キメラ抗原受容体タンパク質は腫瘍抗原に結合する。
【００２９】
様々な実施形態において、Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。
様々な実施形態において、Ｔ細胞は、インターロイキン１３（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体を発現する。様々な実施形態において、Ｔ細胞は、インターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋを含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する。
【００３０】
様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、（ａ）ＳＢ２１６７６３、ＴＷＳ−１１９、１−アザケンパウロンまたは６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）から選択される化学物質、および／または（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせから選択される遺伝物質、である。
【００３１】
様々な実施形態において、Ｔ細胞は、同時にまたは順次に、活性化および増殖される。様々な実施形態において、腫瘍はＩＬ１３Ｒ陽性である。様々な実施形態において、腫瘍はＩＬ１３Ｒ陽性神経膠腫である。
【００３２】
様々な実施形態において、腫瘍特異的メモリーＴ細胞を生成する方法が提供され、同方法は、腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体をコードする核酸を対象の生体サンプルから単離されたＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）に形質導入することと；ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍抗原およびＧＳＫ３β阻害剤と接触させることと；メモリー細胞に特異的な第１のマーカーおよび腫瘍抗原に特異的な第２のマーカーを検出して、それにより腫瘍特異的なメモリーＴ細胞を生成することと、を含む。
【００３３】
様々な実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ１３またはそのフラグメントまたはそのバリアントをコードする核酸で形質導入される。様々な実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋをコードする核酸で形質導入される。様々な実施形態において、腫瘍抗原は、ＩＬ１３受容体またはそのリガンド結合ドメインである。
【００３４】
様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、（ａ）ＳＢ２１６７６３、ＴＷＳ−１１９、１−アザケンパウロンまたは６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）から選択される化学物質、および／または（ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそれらの組み合わせから選択される遺伝物質、である。
【００３５】
様々な実施形態において、Ｔ細胞は、同時にまたは順次に、活性化および増殖される。様々な実施形態において、メモリー細胞に特異的なマーカーは、ＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋から選択され、腫瘍抗原に特異的なマーカーは、腫瘍抗原に結合するタンパク質の発現を含む。様々な実施形態において、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ１３Ｒ陽性細胞への結合、および場合によりＩＬ１３Ｒ陽性細胞の破壊を含む機能アッセイによって確認されるように、ＩＬ１３Ｒ陽性腫瘍細胞に特異的である。様々な実施形態において、メモリーＴ細胞はＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【００３６】
様々な実施形態において、方法は、メモリーＣＡＲ−Ｔ細胞ホメオスタシスの第３のマーカーを検出することをさらに含む。様々な実施形態において、第３のマーカーは、発現、Ｔ−ｂｅｔ発現、および／またはＰＤ−１発現である。様々な実施形態において、増加したＴ−ｂｅｔ発現および／または減弱したＰＤ−１発現は、ＣＡＲ−Ｔ細胞ホメオスタシスの改善を示す。様々な実施形態において、Ｔ細胞ホメオスタシスは、Ｔ細胞疲弊の減少、持続的なサイトカイン発現、Ｔ細胞クローン性の維持（ｃｌｏｎａｌ  ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ）、および／またはＣＡＲ−Ｔメモリー発達の促進を含む。様々な実施形態において、腫瘍抗原による活性化およびＧＳＫ３β阻害剤の存在下での増殖を介して生成されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞に対して特異性およびメモリー（ｍｅｍｏｒｙ）の増加を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１−１】図１は、ＧＳＫ３β阻害が、インビトロでＩＬ２補充の非存在下でＡＴＣＤから活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞を保護することを示す。図１Ａは、ＳＢ２１７６３が存在しない場合、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ（白四角、実線；上部パネル；ｐ＝０．２）の生存率は着実に低下するが、それは、ＳＢ２１７６３を伴う（下部パネル；ｐ＜０．０５）ＧＳＫ３β阻害時のＩＬ２補充ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔの生存レベル（黒四角、破線）まで救出される。結果は、サンプルあたり１時点あたり、ｎ＝３ウェルの２つの実験のうちの１つの代表である。エラーバーはＳＤを表す。図１Ｂは、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃのみ（上部パネル）およびＧＳＫ３β阻害での活性化時（下部パネル）にＦａｓＬを発現するＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の頻度（ｆｒｅｑｕｅｎｃｉｅｓ）のフローサイトメトリー表示を示す。結果は、代表的なｎ＝３の独立した実験である。図１Ｃは、ＣＦＳＥ希釈の代表的なＦＡＣＳプロファイルを示し、何も処理しない場合（最上部）、ＳＢ２１６７６３のみで処理した場合（２番目）、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃのみで処理した場合（３番目）、およびＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ＋ＳＢ２１６７６３で活性化した場合（最下部）のＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖を示す。
【図１−２】図１−補足図は、本開示のＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞のＩＬ１３Ｒα２特異性の結果を示す。図１Ａ−補足図は、異なるエフェクターと標的細胞（Ｅ：Ｔ）との比率でＩＬ１３Ｒα２＋Ｕ２５１ＭＧ腫瘍細胞と共培養したとき（左）、１μｇ／ｍｌおよび１０μｇ／ｍｌのＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃでの活性化（中央）、およびＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃでの活性化（右）の、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔエンリッチメント（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）のフローサイトメトリー表示を示す。形質導入されていないＴ細胞は白線（ｏｐｅｎ  ｌｉｎｅｓ）で表され、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔは黒線（ｃｌｏｓｅｄ  ｌｉｎｅｓ）で表されている。図１Ｂ−補足図は、ＣＦＳＥ希釈のフローサイトメトリー表示を示し、Ｕ２５１ＭＧ細胞の存在下でのＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞のＩＬ１３Ｒα２特異的増殖（上部）（Ｅ：Ｔ比が１：０（黒）、１：１（灰色）、並びに１：２（白色））、ＩＬ１３Ｒα２Ｆｃ（中央）およびＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃ（下部）の０（黒色）、１μｇ／ｍｌ（灰色）および１０μｇ／ｍｌ（白色）での活性化、を表している。
【図２−１】図２は、ＧＳＫ３β阻害が、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴ−ｂｅｔの上方制御およびＰＤ−１発現の減少をもたらすことを示す。図２Ａは、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞における核内Ｔ−ｂｅｔ発現（左パネル）、ＳＢ２１６７６３の非存在下または存在下でのＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃによる活性化時のＰＤ−１＋ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の頻度（右パネル）のフローサイトメトリー表示を示す。結果は、代表的なｎ＝３の独立した実験である。図２Ｂは、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴＢＸ２１（Ｔ−ｂｅｔ；左パネル）およびＰＤＣＤ１（ＰＤ−１；右パネル）遺伝子の相対的発現（ｑＰＣＲ）を示す。ＧＡＰＤＨに対して正規化した後、２−ΔΔＣＴ法を使用してデータを分析した。エラーバーは、Ｎ＝３の独立した実験からのＳＥＭを表している。
【図２−２】図２−補足図はＩＬ１３ＣＡＲの形質導入効率を示す。Ｔ細胞は、３人の盲検ドナーから採取したＰＢＭＣからのＯＫＴ−３とＩＬ２で濃縮され（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）、ＩＬ１３ＣＡＲ発現レトロウイルス上清で３回形質導入して、形質導入効率（ＴＥ）を最大化した。最終形質導入から４８時間後、フローサイトメトリーを使用してＣＤ３＋Ｔ細胞上のヒトＩＬ１３の発現を観察することにより、ＴＥを測定した。この研究のすべての実験は、ＩＬ１３ＣＡＲのＴＥに正規化され、ドナー依存性の変動を排除した。
【図３−１】図３は、ＧＳＫ３β阻害が、抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の核におけるβ−カテニンの発現の増加をもたらすことを示す。刺激されていない場合（上部パネル）、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃで活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の場合（中央パネル）、およびＳＢ２１６７６３処理ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃで活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞（下部パネル）の場合の、核β−カテニン発現の代表的なヒストグラムプロファイル。処理または未処理のＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ラット抗ヒトＩＬ１３一次抗体／ＡＰＣ抗ラットＩｇＧ１二次抗体、およびウサギ抗β−カテニンＭＡｂ／ＦＩＴＣ抗ウサギＩｇＧ二次抗体で染色した。特異的抗体対照を使用して、バックグラウンド染色を排除した。結果は代表的なｎ＝２の実験である。
【図３−２】図３−補足図は、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ８エンリッチメントに関する実験結果を示す。図３Ａ−補足図は、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ＋ＳＢ２１６７６３で活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＤ８：ＣＤ４比のフローサイトメトリー表示を示す。各パネルは、３人のドナーそれぞれのＦＡＣＳプロファイルを表す。ゲートはそれぞれの抗体対照に基づいて設定した（ｄｒａｗｎ）。図３Ｂ−補足図は、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＩＦＮＧ（インターフェロン−ガンマ）遺伝子の相対的発現を示す。ＧＡＰＤＨに対して正規化した後、２−ΔΔＣＴ法を使用してデータを分析した。図３Ｃ−補足図は、ＳＢ２１６７６３単独またはＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ活性化と組み合わせて処理されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の培養上清からＥＬＩＳＡにより測定されたインターフェロンガンマレベルを示す。エラーバーは、Ｎ＝３の独立した実験からのＳＥＭを表している。
【図４】図４は、ＧＳＫ３β阻害の際の抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞メモリー表現型を示す。図４Ａは、ＳＢ２１６７６３の存在下（右パネル）または非存在下（左パネル）でＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃを用いて活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の頻度の代表的なＦＡＣＳプロファイルを示す。図４Ｂは、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞メモリー表現型の線グラフ表示（ｌｉｎｅ  ｇｒａｐｈ  ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ）を示す。エラーバーは、Ｎ＝３の独立した実験からのＳＥＭを表している。
【図５】図５は、ＩＬ−１３ＣＡＲ−Ｔで処理された腫瘍担持マウスにおけるＣＡＲ−Ｔのインビボ組織分布およびＴエフェクターメモリー表現型の発現を示す。図５Ａ（左）は、腫瘍担持動物からの、腫瘍−流出（ｔｕｍｏｒ−ｄｒａｉｎｉｎｇ）リンパ節（上）、脾臓（中央）、および腫瘍浸潤リンパ球（下）における組織特異的ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ分布の形態学的表現を示す。図５Ｂ（右）は、腫瘍担持動物からの、腫瘍−流入リンパ節（上）、脾臓（中央）、および腫瘍浸潤リンパ球（下）におけるＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔの分布を示す。非活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理された生存している異種移植動物のすべてで腫瘍が観察され（１００％再発；白丸＊）、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理された生存動物の６７％で腫瘍が検出された（黒丸＊＊）。ＳＢ２１６７６３処理ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理された生存動物では腫瘍は検出されなかった（０％再発；灰色の円）。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本開示の１つまたは複数の実施形態の詳細は、添付の図面／表および以下の説明に記載されている。本開示の他の特徴、目的、および利点は、図面／表および詳細な説明、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【００３９】
本明細書は、本開示の例示的な実施形態および用途を説明する。しかしながら、本開示は、これらの例示的な実施形態および用途、または例示的な実施形態および用途が動作する、または本明細書で説明される方法に限定されるものではない。本教示の他の実施形態、特徴、目的、および利点は、詳細な説明および添付図面から、ならびに特許請求の範囲から明らかになるであろう。さらに、要素のリスト（要素ａ、ｂ、ｃなど）が参照されている場合、そのような参照は、リストされた要素のいずれか１つそれ自体、リストされた要素のすべてより少ない組み合わせ、および／またはリストされているすべての要素の組み合わせ、を含むことを意図している。明細書のセクションの分割は、検討を容易にするためのものであり、説明されている要素の組み合わせを制限するものではない。
【００４０】
本明細書で使用する場合、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｅ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」なる用語およびそれらの変形は、限定を意図するものではなく、包括的または制限のないものであり、追加の、列挙されていない添加物、成分、整数、要素、または方法のステップを除外するものではない。たとえば、特徴のリストを含むプロセス、方法、システム、組成物、キット、または装置は、必ずしもそれらの特徴に限定されるものではなく、明示的にリストされていない、またはそのようなプロセス、方法、システム、組成物、キット、または装置に固有の他の機能を含む場合がある。
【００４１】
他に定義されない限り、本明細書に記載される本教示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
本開示は、ＣＡＲ−Ｔ療法を改善するための組成物および方法に関する。固形腫瘍におけるＣＡＲ−Ｔ細胞免疫療法の成功における主たる障害は、最適なＣＡＲ−Ｔ細胞活性化未満のものをもたらす弱い抗原曝露であり、それは付随して弱い抗腫瘍免疫応答をもたらすものであることを認識し、本開示は、ＣＡＲ−Ｔ療法における既存のハードルを克服する組成物および方法を提供する。特に、本明細書に記載される組成物および方法は、補助的なＩＬ２療法に関連する細胞毒性とともに、第２世代ＣＡＲにおけるＣＤ２８および他の共刺激シグナル伝達部分の制限の多くを克服する。
【００４２】
様々な実施形態において、本開示の組成物および方法は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の生存および／または有効性を改善するためのアジュバントの使用を対象とする。特に、本開示は、ＧＳＫ３β阻害剤を使用して、増殖を増大させ、急速に拡大し（ｅｘｐａｎｄ）、抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の生存を改善することもできることを実証している。本開示の実施例のセクションで詳細に示されているように、ＧＳＫ３βの薬理学的阻害は、これらのＴ細胞の抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞増殖および長期生存を促進した。ＧＳＫ３β阻害は、ＰＤ−１の発現を緩和することにより、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞をＴ細胞疲弊（ｅｘｈａｕｓｔｉｏｎ）から保護し、抗原曝露の変動性で調節できる特定のエフェクターＣＡＲ−Ｔメモリー表現型の発達をさらに促進した。腫瘍担持動物をＧＳＫ３βで処理すると、抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞が阻害され、１００％の腫瘍の除去が得られ、脾臓および流入リンパ節におけるメモリーＣＡＲ−Ｔ細胞の蓄積が増加した。動物モデルでの腫瘍の再チャレンジ実験により、ＧＳＫ３βで阻害された抗原経験のあるＣＡＲ−Ｔ細胞で処理した場合、１００％の腫瘍の除去と無増悪生存率が得られた。合わせると、これらの結果は、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞に対するＧＳＫ３β阻害のこのアジュバントのような効果が、固形腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔ免疫療法を実施するための効果的な方法を提供することを示している。
【００４３】
本開示の実施例におけるデータは、ＧＳＫ３β阻害がＣＡＲ−Ｔ細胞機能の成功した操作において重要な役割を果たすことをさらに実証する。驚くべきことに、活性は抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞または抗原またはリガンドで活性化されたそれらのＣＡＲ−Ｔに限定されていることがわかった。ＧＳＫ３β阻害は、活性化ＣＡＲ−Ｔの増殖において役割を果たすのみならず、ＣＤ８＋ＣＡＲ−Ｔエフェクターメモリー（ＴＥＭ）の生成も促進した。結果は、ＧＳＫ３β阻害が細胞分裂の増加と抗原特異的ＣＡＲ−Ｔの生存率の増加の複合効果を使用したことを示しているが、活性化されなかったＣＡＲ−Ｔ細胞に対してＧＳＫ３β阻害の増殖効果を与えるものでもなく、また、ＧＳＫ３Ｂ阻害剤は、ＩＬ１３ＣＡＲ発現を欠く非形質導入Ｔ細胞にも影響を与えることはなかった。これらの観察は、ＧＳＫ３β阻害の増殖効果が活性化ＣＡＲ−Ｔに特異的であるという事実を確立した。
【００４４】
本発明の様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害は、より長い期間の増大した腫瘍防御をもたらす。本発明の様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害は、免疫メモリーの増加ならびにＣＡＲ−Ｔ細胞の拡大および／または増殖をもたらす。さらに、ＧＳＫ３β阻害抗原特異的ＣＡＲ−Ｔでチャレンジされた実験的異種移植動物を用いた研究は、ＧＳＫ３Ｂ阻害剤で処理したＣＡＲ−Ｔ細胞は、より長い期間腫瘍防御を付与することができ、これは、拡大および／または増殖したＣＡＲ−Ｔ細胞の免疫学的メモリーを示唆するものである。研究は、抗原特異的なＣＡＲ−Ｔ細胞の亜集団を選択的に増殖するこれまで認識されていない方法を指摘している。
【００４５】
したがって、本開示は、以下の非限定的な実施形態に関する。
様々な実施形態において、本開示は、Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることを含む、Ｔ細胞を操作するための方法に関する。いくつかの実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、小分子化学物質、例えば、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）、およびＴＷＳ−１１９である。いくつかの実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、遺伝物質、例えば、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ分子（ｓｉＲＮＡ）、ＤＮＡ指向性ＲＮＡ干渉（ｄｄＲＮＡｉ）オリゴヌクレオチド、またはＧＳＫ３βに特異的なアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用を介したＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、並びにＧＳＫ３βのドミナントネガティブ対立遺伝子（ＧＳＫ３ＤＮ）である。好ましくは、阻害剤は、ヒトＧＳＫ３β、例えば、ヒトＧＳＫ３βバリアント１（ＧＥＮＢＡＮＫのｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００２０９３；タンパク質配列：ＮＰ＿００２０８４）、ヒトＧＳＫ３βバリアント２（ＧＥＮＢＡＮＫのｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１１４６１５６；タンパク質配列：ＮＰ＿００１１３９６２８）またはヒトＧＳＫ３βバリアント３（ＧＥＮＢＡＮＫのｍＲＮＡ配列：ＮＭ＿００１３５４５９６；タンパク質配列：ＮＰ＿００１３４１５２５）を阻害する。さらにいくつかの実施形態において、ＧＳＫ３β阻害は、例えば標的化ノックアウトを介した、ＧＳＫ３βの欠失または破壊を含む。いくつかの実施形態において、操作は、Ｔ細胞の拡大、増殖、生存を増加させ、および／または活性化Ｔ細胞の疲弊を減少させる。
【００４６】
Ｔヘルパー細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または、幹様メモリーＴ細胞）またはエフェクターメモリーＴ細胞（例えば、ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞））、調節性Ｔ細胞（サプレッサーＴ細胞としても知られる）、ナチュラルキラーＴ細胞、粘膜関連インバリアントＴ細胞、γδＴ細胞、腫瘍浸潤性Ｔ細胞（ＴＩＬ）およびＣＡＲ−Ｔ細胞を含むがこれらに限定されない任意のタイプのＴ細胞は、前述の方法によって操作され得る。好ましくは、Ｔ細胞はヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、メモリーＴ細胞、調節性Ｔ細胞、ナチュラルキラーＴ細胞、またはγδＴ細胞である。特に、Ｔ細胞はＣＡＲ−Ｔ細胞である。特に好ましい実施形態において、Ｔ細胞は活性化（ａｃｔｉｖａｔｅｄ）ＣＡＲ−Ｔ細胞である。当技術分野で知られているように、ＣＡＲ−Ｔ細胞は一般に抗原刺激を使用して活性化され、そのようなプロセスから得られるＣＡＲ−Ｔ細胞は抗原特異的、例えば、インターロイキン１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）またはそのバリアントのような腫瘍抗原に特異的である。
【００４７】
様々な実施形態において、Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞（例えば、セントラルメモリーＴ細胞、幹細胞様メモリーＴ細胞（または幹様メモリーＴ細胞）またはエフェクターメモリーＴ細胞（例えば、ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）ではない。
【００４８】
本開示はさらに、前述の方法によって操作されたＴ細胞に関し、ＧＳＫ３βの発現または活性は、例えば、上記に提供されるような化学的または遺伝的阻害剤の使用を介して阻害される。好ましくは、Ｔ細胞は、野生型または正常Ｔ細胞と比較して、ＧＳＫ３βの発現または活性を阻害している。特に好ましくは、Ｔ細胞は、野生型または正常なＴ細胞と比較してＧＳＫ３β活性の低下を示す。特に、Ｔ細胞は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）の使用を介するＲＮＡ干渉に起因して、野生型または通常のＴ細胞と比較してＧＳＫ３β活性の低下を示す。
【００４９】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示の方法に従って操作または改変されたＴ細胞の使用に関する。本明細書において、操作されたＴ細胞は、Ｔ細胞の養子移入が有益であると考えられるあらゆる疾患または疾患の治療に有用であり、当該疾患には、例えば、癌の治療、病原性感染症（例えば、ＨＩＶなどのウイルス性疾患、細菌感染症、原虫感染症）の治療、炎症性疾患（例えば、関節リウマチまたはクローン病）の治療、および免疫系を高めることが含まれる。
【００５０】
様々な実施形態において、本明細書に開示される方法は、癌の治療に使用することができる。「癌」という用語は、本明細書において、黒色腫、肉腫、リンパ腫、脳、乳房、肝臓、胃および結腸癌などの癌腫、および白血病を含むがこれらに限定されない任意の癌を包含するために使用される。様々な実施形態において、本明細書に開示される方法は、腫瘍の治療に使用することができる。様々な実施形態において、腫瘍は固形腫瘍である。様々な実施形態において、固体は神経膠芽腫である。
【００５１】
様々な実施形態において、腫瘍は腫瘍関連抗原を発現する。このような抗原の例には、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）や癌胎児性抗原（ＣＥＡ）などの癌胎児性抗原、ＣＡ−１２５やメソセリンなどの表面糖タンパク質、Ｈｅｒ２などの癌遺伝子、ドパクロムトートメラーゼ（ＤＣＴ）などの黒色腫関連抗原、ＧＰ１００およびＭＡＲＴ１、ＭＡＧＥタンパク質およびＮＹ−ＥＳＯ１のような癌精巣抗原、ＨＨＰＶ  Ｅ６およびＥ７のようなウイルス性腫瘍遺伝子、腫瘍で異所的に発現するタンパク質であって通常はＰＬＡＣ１のような胚組織または胚外組織に限定されるタンパク質、ＧＢＭ腫瘍細胞によって発現されるが、脳および上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）には存在しないＥＣＭタンパク質フィブリン−３が含まれる。当業者が理解するように、１つまたは複数の抗原が特定の癌の治療での使用に特に適している場合があるため、本方法を使用して治療される癌のタイプに基づいて抗原を選択することができる。例えば、黒色腫の治療には、ＤＣＴのような黒色腫関連抗原を使用することができる。
【００５２】
様々な実施形態において、キメラ抗原受容体タンパク質は、インターロイキン１３（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含む。様々な実施形態において、核酸は、インターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋまたはそのフラグメントをコードする。様々な実施形態において、核酸は、インターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインに結合するドメインを含むインターロイキン１３のフラグメント、またはインターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインを含む融合タンパク質をコードする。様々な実施形態において、腫瘍抗原は、インターロイキン１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）またはそのバリアントを含む。様々な実施形態において、腫瘍抗原は、インターロイキン１３受容体のアルファ（α）鎖（ＩＬ１３Ｒα）またはそのバリアントを含む。様々な実施形態において、キメラ抗原受容体タンパク質は、フィブリン３を標的とすることができる細胞外ドメインを含む。
【００５３】
本明細書に開示される様々な実施形態において、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、腫瘍関連抗原を対象とする。様々な実施形態において、ＣＡＲが標的とするように設計されている腫瘍関連抗原は、本明細書に開示される方法によって治療される患者によって発現される腫瘍抗原のタイプに基づいて選択される。
【００５４】
好ましい実施形態において、本開示は、腫瘍により刺激されたＴ細胞（例えば、腫瘍浸潤リンパ球またはＴＩＬ）の操作のための方法および組成物に関し、操作後、腫瘍細胞の殺傷に有利に適用され得る。好ましくは、操作されたＴ細胞は、腫瘍細胞の破壊を促進するために宿主に自己移植される。
【００５５】
特に好ましい実施形態において、本開示は、前述の治療用途の１つまたは複数を実施するのに有用なメモリーＴ細胞を生成するための方法および組成物に関する。
関連する実施形態において、本開示は、Ｔ細胞のエクスビボ増殖のための方法に関し、同方法は、Ｔ細胞を含むサンプルを患者から単離することと；腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸をＴ細胞に形質導入することと；形質導入されたＴ細胞をＧＳＫ３β阻害剤および腫瘍抗原と接触させて形質導入されたＴ細胞を増殖させることと、を含む。好ましくは、Ｔ細胞は、インターロイキン１３（ＩＬ１３  ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードする核酸で形質導入される。特に、核酸は、インターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋまたはそのフラグメントを含むＣＡＲをコードする。
【００５６】
関連する実施形態において、本開示は、Ｔ細胞のエクスビボ増殖のための方法に関し、同方法は、Ｔ細胞を含むサンプルを患者から単離することと；インターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインに結合するドメインまたはインターロイキン１３受容体またはその細胞外ドメインを含む融合タンパク質を含むインターロイキン１３のフラグメントをコードする核酸をＴ細胞に形質導入することと；形質導入されたＴ細胞をＧＳＫ３β阻害剤および腫瘍抗原と接触させて、形質導入されたＴ細胞を増殖させることと、を含む。好ましくは、腫瘍抗原は、インターロイキン１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）またはそのバリアントを含む。特に、腫瘍抗原は、インターロイキン１３受容体のアルファ（α）鎖（ＩＬ１３Ｒα）またはそのバリアントを含む。ＧＳＫ３β阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）を含む、ＧＳＫ３βの小分子阻害剤または遺伝的阻害剤であり得る。好ましくは、ＧＳＫ３β阻害剤は、小分子ＧＳＫ３β阻害剤、例えば、ＳＢ２１６７６３、ＴＷＳ−１１９、１−アザケンパウロンまたは６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である。様々な実施形態において、Ｔ細胞は、例えば、活性化とそれに続く増殖或いは増殖とそれに続く活性化など、同時にまたは順次に、活性化および増殖されてもよい。
【００５７】
様々な実施形態において、本開示は、それを必要とする対象の腫瘍を治療する方法に関し、同方法は、腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する複数の活性化および／または増殖Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を含む有効量の組成物を対象に投与することを含み、活性化がＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍抗原と接触させることを含み、増殖が活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることを含む。例えば、いくつかの実施形態において、活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞は、好ましくはキメラ抗原受容体タンパク質を発現し、キメラ抗原受容体タンパク質は腫瘍抗原に結合する。様々な実施形態において、Ｔ細胞は自家Ｔ細胞である。特に、腫瘍抗原はインターロイキン１３受容体（ＩＬ１３Ｒ）またはそのリガンド結合ドメインであり、キメラ抗原受容体タンパク質は、例えば腫瘍抗原ＩＬ１３Ｒ（α１またはα２）に結合するＩｌ１３またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含む。様々な実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）を含む、ＧＳＫ３βの小分子阻害剤または遺伝的阻害剤であり得る。好ましくは、ＧＳＫ３β阻害剤は、小分子ＧＳＫ３β阻害剤、例えば、ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）またはＴＷＳ−１１９である。様々な実施形態下において、Ｔ細胞は、例えば、活性化とそれに続く増殖或いは増殖とそれに続く活性化など、同時にまたは順次に、活性化および増殖されてもよい。
【００５８】
様々な実施形態において、それを必要とする対象において腫瘍を治療するための方法が提供され、同方法は、ＩＬ１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋを含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する複数の活性化および／または増殖自家Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む有効量の組成物を対象に投与することを含み、活性化がＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍抗原と接触させることを含み、増殖が活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞を小分子ＧＳＫ３β阻害剤（例えば、ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）またはＴＷＳ−１１９）と接触させることを含み、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞はキメラ抗原受容体タンパク質を発現し、キメラ抗原受容体タンパク質は腫瘍抗原に結合する。様々な実施形態下において、Ｔ細胞は、例えば、活性化とそれに続く増殖或いは増殖とそれに続く活性化など、同時にまたは順次に、活性化および増殖されてもよい。
【００５９】
様々な実施形態において、それを必要とする対象の腫瘍を治療する方法が提供され、同方法は、腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する複数の活性化および／または増殖Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）を含む有効量の組成物を対象に投与することを含み、活性化がＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍抗原と接触させることを含み、増殖が活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞をＧＳＫ３β阻害剤と接触させることを含む。この実施形態下において、活性化されたＣＡＲ−Ｔ細胞は好ましくはキメラ抗原受容体タンパク質を発現し、キメラ抗原受容体タンパク質は神経膠腫で発現される腫瘍抗原、例えばＩＬ１３Ｒまたはそのバリアントに結合する。様々な実施形態において、神経膠腫は、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、未分化星状細胞腫または小児神経膠腫である。いくつかの実施形態において、活性化は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を神経膠腫腫瘍抗原と接触させることを含み、増殖は、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞を小分子ＧＳＫ３β阻害剤と接触させることを含み、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞は、神経膠腫腫瘍抗原に結合するキメラ抗原受容体タンパク質を発現する。ＧＳＫ３β阻害剤は、小分子阻害剤または遺伝的阻害剤であり得る。いくつかの実施形態において、ＧＳＫ３β阻害剤は、小分子、例えば、ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９、または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である。代替的にあるいは付随的に、ＧＳＫ３β阻害剤は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）を含む遺伝物質である。
【００６０】
様々な実施形態において、本開示は、腫瘍特異的メモリーＴ細胞を生成する方法に関し、同方法は、腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体をコードする核酸を対象の生体サンプルから単離されたＴ細胞に形質導入すること（ＣＡＲ−Ｔ）と；ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍抗原およびＧＳＫ３β阻害剤と接触させることと；メモリー細胞に特異的な第１のマーカーおよび腫瘍抗原に特異的な第２のマーカーを検出して、それにより腫瘍特異的なメモリーＴ細胞を生成することと、を含む。好ましくは、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ１３またはそのフラグメントまたはそのバリアント、例えばＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋをコードする核酸で形質導入され、ここでＣＡＲタンパク質は、ＩＬ１３受容体またはそのリガンド結合ドメインを含む腫瘍抗原に結合する。様々な実施形態において、活性化は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍抗原と接触させることを含み、増殖は、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞を小分子ＧＳＫ３β阻害剤、例えばＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９、または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）と接触させることを含む。いくつかの実施形態において、メモリー細胞に特異的なマーカーは、ＣＤ４５ＲＯ＋およびＣＤ４５ＲＡ＋から選択され、腫瘍抗原に特異的なマーカーは、腫瘍抗原に結合するタンパク質の発現、例えば、細胞表面発現を含む。様々な実施形態において、腫瘍特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＩＬ１３Ｒ陽性細胞への結合、および場合によりＩＬ１３Ｒ陽性細胞の破壊を含む機能アッセイによって確認されるように、ＩＬ１３Ｒ陽性腫瘍細胞に特異的である。様々な実施形態において、腫瘍特異的メモリー細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原で活性化され、かつＧＳＫ３β阻害剤の存在下で増殖され、かつメモリーＴ細胞のためにさらに選択されるＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞に対する特異性およびメモリーの増加を示す。
【００６１】
様々な実施形態において、腫瘍特異的メモリーＴ細胞を生成する方法が提供され、同方法は、腫瘍抗原に結合する分子を含むキメラ抗原受容体をコードする核酸を対象の生体サンプルから単離されたＴ細胞に形質導入すること（ＣＡＲ−Ｔ）と；ＣＡＲ−Ｔ細胞を腫瘍抗原およびＧＳＫ３β阻害剤と接触させることと；メモリー細胞に特異的な第１のマーカーおよび腫瘍抗原に特異的な第２のマーカー、およびメモリーＣＡＲ−Ｔ細胞ホメオスタシスの第３のマーカーを検出して、それにより腫瘍特異的なメモリーＴ細胞を生成することと、を含む。一実施形態において、第３のマーカーは、ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＩＬ１３Ｒ発現、Ｔ−ｂｅｔ発現、および／またはＰＤ−１発現であり、Ｔ−ｂｅｔ発現の増加および／またはＰＤ−１発現の減少は、ＣＡＲ−Ｔ細胞ホメオスタシスの改善を示す。特に、この方法は、Ｔ細胞疲弊の減少、サイトカイン発現の持続、Ｔ細胞クローン性の維持、および／またはＣＡＲ−Ｔメモリー発達の促進を含む、改善されたＴ細胞ホメオスタシスを提供する。
【００６２】
様々な実施形態において、本開示は、前述の形質導入、活性化、増殖、および任意選択の選択ステップを使用してＴ細胞を操作する方法に関し、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、腫瘍抗原で活性化され、ＧＳＫ３β阻害剤の存在下で増殖され、これらはさらにメモリーＴ細胞に対して選択され、腫瘍抗原を発現する腫瘍細胞に対する特異性の向上とメモリーの改善を示し、ＣＡＲ−Ｔ細胞のホメオスタシス（ｈｏｍｅｏｓｔａｓｈｉｓ）の改善も示す。特に、この方法は、Ｔ細胞疲弊の減少、サイトカイン発現の持続、Ｔ細胞クローン性の維持、および／またはＣＡＲ−Ｔメモリーの発達の促進を含む、改善されたＴ細胞ホメオスタシスを有する活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖した集団を提供する。
【００６３】
様々な実施形態において、キメラ抗原受容体タンパク質を発現するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）およびＧＳＫ３β阻害剤を含む組成物が提供される。好ましくは、Ｔ細胞は、インターロイキン１３（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する。特に、Ｔ細胞は、インターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋを含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する。
【００６４】
様々な実施形態において、キメラ抗原受容体タンパク質を発現するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を含む組成物が提供され、キメラ抗原受容体タンパク質は腫瘍抗原およびＧＳＫ３β阻害剤に結合する。好ましくは、Ｔ細胞は、インターロイキン１３（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）またはそのバリアントまたはそのフラグメントを含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する。特に、Ｔ細胞は、インターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋを含むキメラ抗原受容体タンパク質を発現する。
【００６５】
様々な実施形態において、キメラ抗原受容体タンパク質を発現するＴ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）およびＧＳＫ３β阻害剤を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞および小分子ＧＳＫ３β阻害剤、例えば、ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）を含む。代替的または追加的に、組成物は、ＣＡＲ−Ｔ細胞と、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）を含む遺伝物質と、を含む。
【００６６】
様々な実施形態において、キメラ抗原受容体タンパク質（ＣＡＲ−Ｔ細胞）を発現するＴ細胞およびＧＳＫ３β阻害剤を含む製剤が別個の投与のために提供される。好ましくは、ＧＳＫ３β阻害剤は、小分子ＧＳＫ３β阻害剤、例えば、ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９、または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である。代替的または追加的に、製剤は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）を含む遺伝物質を含む。
【００６７】
様々な実施形態において、本開示はキットに関し、同キットは、１つまたは複数のパッケージにて、インターロイキン１３またはそのバリアントまたはそのフラグメントをコードするキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸構築物（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）；ＧＳＫ３β阻害剤；および前記ＣＡＲ核酸構築物を用いてＴ細胞に形質導入するための任意選択の第１の試薬；およびＴ細胞を活性化するためのさらなる任意選択の第２の試薬、を含む。好ましくは、キットは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸構築物；ＧＳＫ３β阻害剤；前記ＣＡＲ核酸構築物を用いてＴ細胞に形質導入するための第１の試薬；およびＴ細胞を活性化するための第２の試薬、を含む。この実施形態において、第１の試薬はレトロウイルスベクターである。さらにこの実施形態において、第２の試薬はＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃである。特に、キットに含まれる核酸構築物は、インターロイキン１３バリアントＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋを含むキメラ抗原受容体タンパク質をコードし、キットに含まれるＧＳＫ３β阻害剤は、ＳＢ２１６７６３、１−アザケンパウロン、ＴＷＳ−１１９または６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）である。代替的または付随的に、キットは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ｄｄＲＮＡｉ、またはＧＳＫ３のドミナントネガティブ阻害剤（ＧＳＫ３ＤＮ）を含む遺伝子ＧＳＫ３β阻害剤を含む。
【実施例】
【００６８】
本明細書に記載される構造、材料、組成物、および方法は、本開示の代表的な実施例であることが意図され、本開示の範囲は、実施例の範囲によって限定されないことが理解される。当業者は、本開示が開示された構造、材料、組成物および方法の変形例で実施されてもよく、そのような変形例は本開示の範囲内であると見なされることを認識するであろう。
【００６９】
実施例１
ＩＬ１３のＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９ＫへのＣＡＲ−Ｔ改変を選択すると、ＩＬ１３分子のＩＬ１３Ｒα２に対する親和性が増加する
細胞外リガンド結合ドメイン（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）としてのＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋと細胞内ＣＤ２８共刺激ドメイン（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ）からなる第２世代のＣＡＲが、ＩＬ１３Ｒα２発現Ｕ２５１ＭＧヒト神経膠腫細胞株に対する特異的な細胞毒性応答の誘導、および異種移植神経膠腫マウスモデルにおける同所性腫瘍の排除、に成功したことが示されている。さらに、ＩＬ１３ＣＡＲ−ＴのＩＬ１３Ｒα２に対する絶対的特異性は、マイトマイシン−Ｃ（５×１０６細胞／ｍｌあたり５０μｇ／ｍｌ、３７°Ｃで２０分間、Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）の存在下で活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔで処理されたＵ２５１ＭＧ神経膠腫細胞（Ｔ細胞と腫瘍細胞の異なる比率にて）、或いは濃度の増加を伴うＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃキメラ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ社、ミネソタ州ミネアポリス）がＣＡＲエンリッチメントおよびＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔの増殖を示した実験において示された。ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞を、濃度の増加を伴うＩＬ１３Ｒα１−Ｆｃキメラで処理した場合、（精製リガンドが１０μｇ／ｍｌの場合でも）同様の所見は観察されなかった（図１−補足図）。したがって、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔは、この研究に最適なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であった。
【００７０】
ＩＬ１３ＣＡＲレトロウイルスの産生および初代ヒトＴ細胞の改変
ＩＬ１３ＣＡＲを発現するウイルス粒子を含むレトロウイルス上清の調製、および末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離は、以前に説明されているように実施した（Ｂｅａｕｄｏｉｎ他、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ、１４８：２５３−２５９、２００８）。ＰＢＭＣは、ＯＫＴ３（１００ｎｇ／ｍｌ；Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ（登録商標））およびＩＬ２（Ｐｒｏｌｅｕｋｉｎ（登録商標）、３０００ＩＵ／ｍｌ；Ｐｒｏｍｅｔｈｅｕｓ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州サンディエゴ）で４８時間活性化させた。
【００７１】
濃縮された（Ｅｎｒｉｃｈｅｄ）Ｔ細胞は、「スピンフェクション」技術（Ｋｏｎｇ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：５９４９−５９６０、２０１２）を用いてレトロウイルス上清でトランスフェクトされた。トランスフェクトされたＰＢＭＣは、ＩＬ１３ＣＡＲ発現について試験し（図２−補足図）、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）、抗生物質およびＩＬ２を含むＲＰＭＩ−１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、ニューヨーク州グランドアイランド）で培養し、１０〜２０倍の増殖と＞９５％の純粋なＴ細胞が得られた。活性化された非形質導入Ｔ細胞を、すべての実験において対照群として使用した。
【００７２】
ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖中に生成されるＴ細胞の種類を監視する実験は、ＣＤ８エンリッチメントを示している。ＩＬ１３Ｒα２−ＦｃでのＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化およびＧＳＫ３β阻害も、永続的なＣＤ８エンリッチメント表現型を示した。さらに、ＩＦＮＧ遺伝子発現の７．５倍の増加とＧＳＫ３β阻害剤で処理された活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞によるインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）分泌の２倍の増加（図３−補足図）は、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＣＤ８エンリッチメントを確認する。
【００７３】
ドナーの変動を緩和するために、前述の研究の結果はＩＬ１３ＣＡＲの発現に対して制御された。
フローサイトメトリー分析
フローサイトメトリーは、ＬＳＲＩＩ機器（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社、カリフォルニア州サンノゼ）およびＦＡＣＳＤｉｖａ（商標）ソフトウェア（バージョン６．２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を使用して実施した。すべてのフローサイトメトリーデータはＦｌｏｗＪｏ（商標）ソフトウェア（バージョン１０．２、Ｆｌｏｗ  Ｊｏ  ＬＬＣ、オレゴン州アッシュランド）を用いて分析した。
【００７４】
精製されたラット抗ヒトＩＬ１３抗体とアロフィコシアニン（ＡＰＣ）コンジュゲート抗ラット抗体を使用して、ＩＬ１３ＣＡＲ発現を測定した。Ｔ細胞を同定するための特定の実験では、抗ヒトＣＤ３−ＦＩＴＣを使用した。ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＤ４：ＣＤ８分析については、抗ヒトＣＤ４−ＦＩＴＣおよび抗ヒトＣＤ８−ＰＥ．Ｃｙ７をＩＬ１３ＣＡＲ発現が陽性であったＣＡＲ−Ｔ細胞において使用した。活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞上のＦａｓＬ発現およびＰＤ−１発現は、それぞれ抗ヒトＦａｓＬ−ＦＩＴＣ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｈｅｒ社）抗ヒトＰＤ１−ＦＩＴＣで染色することにより測定した。抗ヒトＣＤ１２７−ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ６２Ｌ−ＰＥ、抗ヒトＣＣＲ７−ＦＩＴＣ、抗ヒトＣＤ４５ＲＯ−ＰＥおよび抗ヒトＣＤ４５ＲＡ−ＰＥ．ｙ７は、Ｔ細胞メモリーマーカーのフローサイトメトリー測定に使用した。それぞれのアイソタイプ対照または抗体対照（該当する場合）を使用して、各実験の陽性ゲートを設定した（ｄｒａｗ）。すべての抗体は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社またはｅＢｉｓｏｃｉｅｎｃｅｓ社から入手した。β−カテニン局在の核内染色については、ＦｏｘＰ３染色バッファー（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ−Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、かつ抗ヒトβ−カテニンウサギｍＡｂ（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、マサチューセッツ州ダンバーズ）およびＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）（ＡＦ）４８８または６４７（Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とコンジュゲートした抗ウサギＩｇＧで染色して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の核透過化を行った。ＦｏｘＰ３染色バッファーで核透過処理を行わなかった細胞では、β−カテニンの発現における変化は認められなかった。
【００７５】
カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ；０．５μｇ／ｍｌ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、フローサイトメトリーでＴ細胞の増殖を測定した。
Ｔ細胞生存アッセイ
形質導入されていない細胞またはＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞（１ｘ１０６）は、ＧＳＫ３β阻害剤（ＳＢ２１６７６３、２０μｇ、Ｓｉｇｍａ社、ミズーリ州セントルイス）をともに、或いはＧＳＫ３β阻害剤を含まないで、若しくは培養培地中にＩＬ２を加えて、２４ウェルプレートで特定の濃度のＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃキメラで活性化した。ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞生存アッセイは、上記のように１４日間実施した。ＧＳＫ３β阻害後のＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の長期間の生存は、ライブデッドゲーティング（ｌｉｖｅ−ｄｅａｄ  ｇａｔｉｎｇ）を使用したフローサイトメトリーによって測定した（セングプタ（Ｓｅｎｇｕｐｔａ）他、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２１０：６４７−６５９、２００５）。活性化Ｔ細胞死（ＡＴＣＤ）は、活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞でのＦａｓＬ発現（ＦＩＴＣ；サーモフィッシャー）のフローサイトメトリー測定によって測定した。
【００７６】
定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）
製造業者（Ｑｉａｇｅｎ）のプロトコルに従って、ＲＮｅａｓｙ（登録商標）Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔを使用して、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞から全ＲＮＡを単離した。ｃＤＮＡは、ｉＳｃｒｉｐｔ  ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ、カリフォルニア州カールズバッド）を使用してＲＮＡから調製した。ｑＰＣＲは、ＳｙＢＲ（登録商標）Ｇｒｅｅｎ  ＰＣＲマスターミックス（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、ＩＦＮＧ、ＴＢＸ２１およびＰＤＣＤ１遺伝子をターゲットに実施した。標的遺伝子のＣＴ値はハウスキーピング遺伝子ＧＡＰＤＨのＣＴ値に正規化され、相対的な遺伝子発現はΔΔＣＴ法を使用して計算した。
【００７７】
ＥＬＩＳＡ
ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔから培養上清を採取し、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ±ＳＢ２１６７６３で７２時間活性化し、製造業者のプロトコルに従って、Ｒｅａｄｙ−Ｓｅｔ−Ｇｏ  ＥＬＩＳＡ検出キット（ｅＢｉｏｃｉｅｎｃｅ、米国）を使用したＥＬＩＳＡによってインターフェロン−ガンマ（ＩＦＮγ）レベルを検出した。ＯＤ値は（Ｂｉｏｔｅｋ、ＵＳＡ）を使用して測定した。活性化されていないＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞またはＳＢ２１６７６３のみで処理されたものを実験対照として使用した。ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞によって分泌されたＩＦＮγの濃度は、測定されたＯＤ値を使用して、それぞれの実験設定から作成された標準曲線から外挿した。
【００７８】
Ｉｎ  ｖｉｖｏ免疫再チャレンジ試験
６週齢の雄の無胸腺ヌードマウスをＪＡＸマウス（メイン州バーハーバー）から購入した。すべてのマウスは、ロジャーウィリアムズメディカルセンター（Ｒｏｇｅｒ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ）の特定の無菌施設に収容されており、実験は連邦政府および施設のガイドラインに従って、ロジャーウィリアムズメディカルセンターの施設内動物管理および使用委員会の承認を得て実施した。
【００７９】
４５匹の動物を無作為化し、そのうちの４０匹に腫瘍細胞を移植し、一方、５匹を実験対照として選択した。各マウスの左後肢の上側腹部に、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）２００μｌに懸濁した２×１０６のＩＬ１３Ｒα２発現Ｕ２５１ＭＧヒト神経膠腫細胞を皮下注射した。腫瘍移植の７日後、腫瘍担持マウスを、５０μｌのＰＢＳ中の５×１０６のＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞（４０％の改変；ｎ＝１０）、または、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃキメラで活性化された５×１０６のＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ（ｎ＝１０）、または、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃキメラ＋ＳＢ２１６７６３で活性化された５×１０６のＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ（ｎ＝１０）、または５×１０６の非形質導入Ｔ細胞（ｎ＝５）、またはＰＢＳのみ（ｎ＝５）、で処理するために５つのグループに無作為化した。動物は腫瘍成長、全身毒性および神経学的毒性について観察し、死亡を記録した。
【００８０】
ＣＡＲ−Ｔ処理の６０日後、生存動物に、元の腫瘍移植とは反対側の側腹部に、２００μｌのＰＢＳ中に２×１０６のＵ２５１ＭＧヒト神経膠腫細胞の皮下注射で再チャレンジした。１００日目に実験を終了し、生存している動物を安楽死させた。腫瘍浸潤性ＩＬ１３ＣＡＲ−ＴおよびＴ細胞メモリーマーカーのフローサイトメトリー分析のために、腫瘍組織、流入リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ）（鼠径部）および脾臓を各動物から採取した。
【００８１】
実験の結果は以下の事項を示している。
ＧＳＫ３β阻害は、ＩＬ２の補充が存在しない状態にて活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞を活性化Ｔ細胞死（ＡＴＣＤ）から防御する
ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞（３２％ＣＡＲ＋）は、可溶性ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ（１μｇ／ｍｌ）およびＧＳＫ３β阻害剤（ＳＢ２１６７６３；２０μＭ）の存在下で、１０％ＦＢＳおよび抗生物質を添加したＲＰＭＩ１６４０培地で、ＩＬ２を添加して、或いは添加せずに、１４日間培養した。細胞を１、４、７、１０および１４日目に採取し、ＣＤ３およびＩＬ１３ＣＡＲの発現のために染色し、細胞の生存率をフローサイトメトリーで測定し、前述のように生存率を分析した。ＳＢ２１６７６３が存在しない場合、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ処理は生存率の着実な低下を示し、活性化Ｔ細胞死を示していた（図１Ａ、上部パネル、白四角（ｏｐｅｎ  ｓｑｕａｒｅｓ））。生存率の低下は、培養条件においてＩＬ２の添加（図１Ａ；上部パネル；黒四角（ｃｌｏｓｅ  ｓｑｕａｒｅｓ））またはＩＬ２を添加しない場合のＳＢ２１６７６３を用いたＧＳＫ３βの阻害（図１Ａ；下部パネル；白四角）によって救出された（ｒｅｓｃｕｅｄ）。培養条件においてＳＢ２１６７６３の存在下でＩＬ２を追加しても、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の生存率に相加効果または相乗効果を与えることはなかった（図１Ａ、下部パネル、黒四角）。これは、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＧＳＫ３βの阻害が生存シグナル伝達を促進することを示し、ＧＳＫ３β阻害が活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞をＩＬ２補充の非存在下でＡＴＣＤから保護する可能性があることを示唆していた。この現象を確認するために、１４日目にＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ処理ＣＡＲ−Ｔ細胞中でＦａｓＬ発現を測定した。観察により、ＳＢ２１６７６３処理は、阻害剤で処理されなかったもの（５５％）と比較して、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞（２５．３％）でのＦａｓＬ発現を５５％減少させたと結論付けられ、ＧＳＫ３β阻害が実際にＡＴＣＤから活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞を保護したことを確認した（図１Ｂ）。この研究における他のすべての実験は、培養条件においてＩＬ２を添加せずに行われた。
【００８２】
メカニズムをさらに理解するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞をＣＦＳＥで染色し、無刺激の状態で、或いはＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ±ＳＢ２１６７６３で７２時間処理した状態で、培養した。ＣＦＳＥは蛍光細胞染色色素であり、各細胞分裂後の娘細胞内のＣＦＳＥ蛍光が徐々に半減するため、インビトロおよびインビボのいずれでもリンパ球の増殖を監視するために使用することができる（Ｌｙｏｎｓ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ、１７１：１３１−１３７、１９９４）。ＧＳＫ３β阻害は、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞のみの増殖を引き起こしたが、無刺激のＣＡＲ−Ｔ細胞にはそのようなことはなかった（図１Ｃ）。これらの結果は、ＧＳＫ３β阻害により、ＩＬ１３Ｒα２活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖が増大したことを示すものであるが、これは、増殖の増加と活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞の生存の向上の両方の機能性の結果であった。
【００８３】
Ｔ−ｂｅｔは活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＰＤ−１発現の減少を介在した
ＧＳＫ３阻害は、ＰＤ−１を介したＴ細胞の疲弊を軽減し、これは、Ｔ−ｂｅｔ発現に依存し（Ｔａｙｌｏｒ他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４４：２７４−２８６、２０１６）、そしてＧＳＫ３β経路は活性化Ｔ細胞におけるＴ−ｂｅｔ発現を直接調節する（Ｖｅｒｍａ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９７：１０８−１１８、２０１６）。活性化Ｔ細胞におけるＧＳＫ３β阻害の生存上の有意な利点により、本発明者らはすぐに、ＩＬ１３Ｒα２−活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＴ−ｂｅｔおよびＰＤ−１発現を研究した。活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞のＦＡＣＳ分析は、Ｔ−ｂｅｔ発現の有意なアップレギュレーション（図２Ａ、左パネル）を示した一方で、ＳＢ２１６７３で治療されなかったＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞（４３％；図２Ａ、右パネル）と比較したとき、ＧＳＫ３β阻害時に、ＰＤ−１発現（１７．３％）の６０％の低減であった。ｑＰＣＲ分析は、ＧＳＫ３β阻害時にＴＢＸ２１遺伝子の９０倍の増加（図２Ｂ、左パネル）およびＰＤＣＤ１遺伝子の５倍の減少（図２Ｂ、右パネル）を示し、ＧＳＫ３β阻害が、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞において、Ｔ−ｂｅｔを介したＰＤ−１発現の減少を誘導したことが確認できた。
【００８４】
ＧＳＫ３β阻害は、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞の核におけるβ−カテニンの蓄積を増加させた
実験は、活性化Ｔ細胞増殖に対するＧＳＫ３β阻害の分子メカニズムを理解するために行われた。ＧＳＫ３β阻害は、β−カテニン分解を保護することによりＷｎｔシグナル伝達経路を活性化する（Ｌｙｏｎｓ他、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ、１７１：１３１−１３７、１９９４）。Ｔ細胞生存のマウスモデルでは、ＧＳＫ３β阻害が核β−カテニン発現の増加により活性化Ｔ細胞生存を増加させることが以前に示されている（Ｓｅｎｇｕｐｔａ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１７８：６０８３−６０９１、２００７）。ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞をＳＢ２１６７６３の存在下または非存在下で３６〜４８時間処理し、フローサイトメトリーによりβ−カテニンの核内蓄積を測定した。ＧＳＫ３β阻害により、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞の核におけるβ−カテニン（ＭＦＩ  １６１８）の蓄積がＳＢ２１６７６２で処理されなかったものより６６％増加した。（ＭＦＩ  ９７４；図３）。
【００８５】
ＧＳＫ３β阻害と活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞メモリー生成
最近の研究では、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の発達におけるβ−カテニンの核内蓄積が果たす役割が示唆されている（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ他、Ｎａｔ  Ｍｅｄ、１５：８０８−８１３、２００９；Ｔａｙｌｏｒ他、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４４：２７４−２８６、２０１６；Ｖｅｒｍａ他、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ、１９７：１０８−１１８、２０１６）。ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ集団におけるメモリー生成（ｍｅｍｏｒｙ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ）に対するＳＢ２１６７６３処理の効果を試験するために実験を行った。ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＳＢ２１６７６３の存在下または非存在下で、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃの濃度を増加させながら（０〜１μｇ／ｍｌ）で７日間活性化させた。Ｔ細胞メモリーマーカーの細胞表面発現をフローサイトメトリーで測定した。メモリー生成はＣＤ８＋Ｔ細胞の機能的派生物（ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ）として監視されたため、ＣＤ８＋メモリーＣＡＲ−Ｔ細胞のホメオスタシスのマーカーとしてＩＬ７Ｒ（ＣＤ１２７）発現の細胞内発現をさらに測定する実験を実施した。フローサイトメトリーデータの分析では、ＳＢ２１６７６３処理時に活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞で、ＣＤ１２７が１０倍（図４Ａ、図４Ｂ、上部パネル）、ＣＤ４５ＲＯが４倍（図４Ａ、図４Ｂ、３番目のパネル）の増加を示していた。この観察は、ＧＳＫ３β阻害が核内β−カテニン蓄積を誘導し、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞における抗原特異的ＣＤ８＋エフェクターＴメモリー表現型のホメオスタティックな増殖を促進することを示唆するものであった。しかしながら、ＣＣＲ７（図４Ａ、図４Ｂ、２番目のパネル）とＣＤ４５ＲＡ（図４Ａ、図４Ｂ、４番目のパネル）では差はなく、ＣＤ６２Ｌ発現の完全な阻害（図４Ａ、図４Ｂ、下のパネル）は、ＧＳＫ３βで阻害された抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞における細胞セントラルメモリー表現型の発達を示唆するものであった。
【００８６】
ヒト神経膠腫異種移植腫瘍−再チャレンジ実験およびＳＢ２１６７６３で処理した活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビボメモリー発達
異種移植神経膠腫マウスモデルの活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＧＳＫ３β阻害の免疫再チャレンジ効果を試験するための研究を実施した。実験は材料および方法に記載されているように設定した。ＰＢＳで処理された腫瘍担持動物［生存中央値（ＭＳ）３２日］または形質導入されていないＴ細胞で処理された腫瘍担持動物（ＭＳ４２日）では腫瘍の成長が速く、承認されたＩＡＣＵＣプロトコルに従って動物を安楽死させなければならなかった。ＣＡＲ−Ｔ細胞で処理された動物のグループでは、その活性化状態に関係なく、腫瘍の退縮は急速で、かつ無増悪生存期間は延長された。これは、以前に観察されたものと同様のパターンを反映していた（Ｋｏｎｇ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１８：５９４９−５９６０、２０１２）。移植後６０日を超えて生存した腫瘍担持動物は、元の移植とは反対側腹部にＵ２５１ＭＧ腫瘍細胞を単回注入することで再チャレンジした。腫瘍の成長と動物の生存を監視し、承認されたＩＡＣＵＣプロトコルに従って、移植後１００日目に実験を終了した。各実験群のＭＳおよび全生存率を測定した。実験終了時点において、非活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔで処理された腫瘍担持動物グループは１００％再発したが、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ活性化ＣＡＲ−Ｔで処理されたグループは６７％の再発であった。ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ＋ＳＢ２１６７６３で活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔで処理されたグループの生存動物は全て、腫瘍を有していなかった（０％の再発）。ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ＋ＳＢ２１６７６３を用いてエクスビボで活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔで処理した動物グループでは、ＭＳは７６．５日であった。このグループでは１０匹中４匹が生存しており、生存しているすべての動物には腫瘍がなかった（４匹中０匹）。
【００８７】
実験動物におけるＣＡＲ−Ｔ細胞のメモリー生成
上記から生存している各動物の腫瘍（利用可能な場合）、流入鼠径部リンパ節（ｄｒａｉｎｉｎｇ  ｉｎｇｕｉｎａｌ  ｌｙｍｐｈ  ｎｏｄｅｓ）、および脾臓を採取した。各臓器から調製した単一細胞懸濁液を調製し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の組織分布と免疫メモリーマーカーの発現を試験した。細胞をヒトＣＤ３およびＩＬ１３ＣＡＲ（ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ；図５Ａ）について染色した。フローサイトメトリー分析では、５８％の流入リンパ節の細胞（流入ＬＮ）、６５％の脾臓細胞、４８％の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が、非活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ処理群（白丸）でＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ＋であることが示された。ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃのみでエクスビボで活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔで処理された動物のグループ（黒丸）では、流入ＬＮとＴＩＬの７５％、脾臓細胞の６５％がＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ＋であった。一方、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ＋ＳＢ２１６７６３を用いてエクスビボで活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔで処理された動物（灰色の円）のＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔでは、流入ＬＮの３０％と脾臓細胞の７０％のみが陽性に染色されていた。このグループのすべての動物には腫瘍がないため、ＴＩＬは研究できなかった。ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞上のＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋のフローサイトメトリー分析（図５Ｂ）は、非活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔで処理されたグループおよびＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃのみを用いてエクスビボで活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔで処理されたグループでは、抗原特異的ＣＤ８＋エフェクターＴメモリーの頻度が非常に低い（＜１〜２％）ことを示していた。比較的高い比率の抗原特異的ＣＤ８＋エフェクターＴメモリー発現が、ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ＋ＳＢ２１６７６３を用いてエクスビボで活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔで処理された動物の流入ＬＮ（１０％）および脾臓（１４％）から採取されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞で観察された。ちなみに、末梢リンパ組織でメモリーマーカーの発現がより高い処理群は、実験の終了時に動物が腫瘍を含まなかった処理群でもあった。
【００８８】
他の実施形態：前述の実施例は、前述の実施例で使用されたものを本明細書の他の場所に記載された一般的または具体的に記載された反応物質および／または操作条件に置き換えることにより同様の成功で繰り返すことができる。
【００８９】
例示された実施形態は、ＩＬ１３ＣＡＲ構築物（例えば、ＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）を含むリンパ球、例えば、Ｔ細胞を利用する。構築物をコードする核酸でＴ細胞を形質導入するための方法を含む、そのような構築物の核酸および／またはアミノ酸配列に関する詳細な開示は、Ｓｅｎｇｕｐｔａ他の米国特許第９６５０４２８号明細書および国際出願公開第ＷＯ２０１６／０８９９１６号に提供されており、図面、配列表、および様々な構築物の相対的なマッピングを示す表を含む、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００９０】
例示された実施形態は、Ｔ細胞、特に、キメラ抗原受容体構築物（例えば、ＩＬ１３．Ｅ１３Ｋ．Ｒ１０９Ｋ）を含むＣＡＲ−Ｔ細胞の機能を改善するためにＧＳＫ３β阻害剤を利用する。本開示は、この目的に対して、ＳＢ２１６７６３（３−（２，４−ジクロロフェニル）−４−（１−メチル−１Ｈ−インドール−３イル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国カリフォルニア州サンタクルーズ）の適用に限定されるものではない。他の適切なＧＳＫ−３阻害剤には、限定されるものではないが、リチウム、ＧＦ１０９２０３Ｘ（２−［１−（３−ジメチルアミノプロピル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−３−（１Ｈ−インドール−３−イル）マレイミド）、１−アザケンパウロン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）；６−ブロモインジルビン−３’−オキシム（ＢＩＯ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）；ＲＯ３１８２２０（２−［１−（３−（アミジノチオ）プロピル）−１Ｈ−インドール−３−イル］−３−（１−メチルインドール−３−イル）マレイミドメタンスルホネート）；ＴＷＳ−１１９（（３−［６−（３−アミノフェニル）−７Ｈ−ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン−４−イルオキシ］フェノール；ＣＡＳ＃６０１５１４−１９−６）；（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、アメリカ合衆国ミズーリ州セントルイス）；ＳＢ４１５２８６（３−［（３−クロロ−４−ヒドロキシフェニル）アミノ］−４−（２−ニトロフェニル）−１Ｈ−ピロール−２，５−ジオン）（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、英国ロンドン）；４−ベンジル−２−メチル−１，２，４−チアジアゾリジン−３，５−ジオン（“ＴＤＺＤ−８”）（Ａｘｘｏｒａ、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）；２−チオ（３−ヨードベンジル−５−（１−ピリジル）−［１，３，４］−オキサジアゾール（“ＴＩＢＰＯ”）（Ａｘｘｏｒａ、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）；２，４−ジベンジル−５−オキソチアジアゾリジン−３−チオン（“ＯＴＤＺＴ”）（Ａｘｘｏｒａ、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）；および４−（２−アミノ−４−オキソ−２−イミダゾリン−５−イリデン）−２−ブロモ−４，５，６，７−テトラヒドロピロロ［２，３−ｃ］アゼピン−８−オン（１０Ｚ−ヒメニアルジシン）（Ａｘｘｏｒａ、アメリカ合衆国カリフォルニア州サンディエゴ）、が含まれる。さらに、ＧＳＫ−３βに指向する多くのモノクローナル抗体がＡｘｘｏｒａから市販されている。ＧＳＫ−３βの他の薬理学的阻害剤は、Ｍｅｉｊｅｒ他の「グリコゲン合成酵素キナーゼ３の薬理学的阻害剤」、Ｔｒｅｎｄｓ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｃｉ．、２００４年９月、２５（９）、４７１−８０（ＰＵＢＭＥＤ＃１５５５９２４９）に記載されており、これは参照によりその全体が組み込まれる。また、Ｌｉ他の米国特許出願公開第２００７−０１９６５１４号明細書も参照されたい。
【００９１】
例示された実施形態において、以前の成功した前臨床研究（Ｋｏｎｇ他、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ、１８：５９４９−５９６０、２０１２）のために、ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔが候補ＣＡＲとして使用されてきたが、開示は例示された実施形態に限定されるものではない。開示された方法は、腫瘍抗原へのＣＡＲ−Ｔ細胞のアクセスが制限されることにより免疫反応がより弱い固形腫瘍のＣＡＲ−Ｔ療法に適用できる。そのような腫瘍の代表的な例には、例えば、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）、未分化星状細胞腫および小児神経膠腫が含まれる。
【００９２】
上記で例示した実施形態において、多形神経膠芽腫（ＧＢＭ）のような超可変腫瘍に対するＣＡＲ−Ｔの活性を調査した。ＧＢＭは、固形腫瘍による抗原提示を研究するための優れたモデルである。本開示の実施例のセクションは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の活性化、増殖および成功したメモリー生成を調べる。ＧＢＭのような超可変腫瘍では、抗原プロファイルの予測不能性が、ＣＡＲ−Ｔ療法を含む免疫療法レジメンの成功または失敗に重要な役割を果たし、それは、複数の腫瘍抗原を標的にすることで対処することができる。代替的および／または追加的に、例えば、特定の患者または患者クラスにおける発現レベルに基づいて、個別化療法のために選択される抗原を含む、複数のＧＢＭネオ抗原を使用することができる。
【００９３】
科学文献では一般に、ＧＢＭのような固形腫瘍の抗原に対するＣＡＲ−Ｔ細胞の弱い曝露を指摘しているが、ＧＳＫ３β阻害剤の使用により、強力なＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖がもたらされており、これは、対照と比較して有意であり、腫瘍治療の文脈においても驚くべきことであった。結果は、ＳＢ２１６７６３で処理された活性化ＣＡＲ−Ｔの増殖の増加を示し、それは、ＧＳＫ３β阻害剤の存在下で活性化されなかったものよりも長く生存した。ＩＬ２を培養培地に添加しても、ＧＳＫ３β阻害ＣＡＲ−Ｔ細胞の生存率には影響を与えることはなかった。ＳＢ２１６７６３で処理された活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の生存率の増加は、これらのＴ細胞におけるＦａｓＬの発現低下により影響を受けており、ＧＳＫ３βの阻害が活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞を活性化誘導Ｔ細胞死（ＡＴＣＤ）から保護することを確認した。しかしながら、ＡＴＣＤからの保護は、これらのＴ細胞に対するＧＳＫ３β阻害の唯一の機能的な結果ではなかった。これらの細胞のＣＦＳＥプロファイルで観察されるように、ＳＢ２１６７６３による処理は、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖の増加をもたらした。それでも、Ｔ細胞増殖に対するＧＳＫ３β阻害の同様の効果は非活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞では観察されず、活性化または抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞に対するＧＳＫ３β阻害のアジュバント様効果が示された。
【００９４】
さらに、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞の疲弊に関する研究では、Ｔ−ｂｅｔ遺伝子（ＴＢＸ２１）が９０倍に増加し、ＰＤ−１遺伝子（ＰＤＣＤ１）発現が５倍減少し、活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞のＳＢ２１６７６３処理によるタンパク質発現に対応する変化が見られた。これらの観察は、ＧＢＭのような固形腫瘍に対する免疫療法の設計において強い意義を有するものである。治療用ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む、腫瘍浸潤性Ｔ細胞上のＰＤ−１の高レベルは、増殖、細胞溶解およびサイトカイン産生能力の低下に起因するエフェクター機能の低下を伴う疲弊したＴ細胞のサブセットをマークする。ＰＤ−１経路の遮断により、主にＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１（標的細胞で発現）を標的とするモノクローナル抗体により、これらのＴ細胞が疲弊するのを防ぐ。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ターゲティングならびに他の免疫療法および放射線療法との併用免疫療法がＧＢＭの治療について試験されている複数の臨床試験が進行中である（Ｍａｘｗｅｌｌ他、Ｃｕｒｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  Ｏｎｃｏｌ、１８：５１、２０１７；Ｌｕｋｓｉｋ他、Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、ｄｏｉ：１０．１００７／ｓ１３３１１−０１７−０５１３−３、２０１７年３月３日）。したがって、本開示の実施形態は、例えば、ＧＳＫ３βを阻害することによってＴ細胞におけるＰＤ−１発現を減少させることを含む、ＧＢＭの成功したＣＡＲ−Ｔ細胞免疫療法を提供する。そのような戦略は、Ｔ細胞疲弊、特に活性化および／または増殖したＣＡＲ−Ｔ細胞の疲弊を低減する効果的な方法を提供するかもしれない。
【００９５】
本明細書に記載の実施形態は、ＣＤ４５ＲＯおよびＴ細胞ホメオスタシスのマーカーＩＬ７ＲまたはＣＤ１２７（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＤ１２７＋）の高発現体でもあった非常に明確なＣＤ６２Ｌ陰性ＣＡＲ−Ｔ細胞集団を報告する。活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞でのＧＳＫ３β阻害時のＣＤ４５ＲＡ発現に関して変化は観察されなかったが、これは、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞でのＣＤ４５ＲＡ発現が元の抗原刺激に依存しているという事実と一致した。これらの細胞はＣＣＲ７の発現が低く、明確なＣＤ８＋Ｔエフェクターメモリー（ＴＥＭ）の発生を明確に示すものであった。異種移植動物実験では、Ｕ２５１ＭＧヒト神経膠腫細胞を担持するヌードマウスを、ｉ）インビトロでのＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃで活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｉｉ）インビトロでのＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ＋ＳＢ２１６７６３で活性化されたＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞、ｉｉｉ）非活性化ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞、またはｉｖ）非形質導入Ｔ細胞、で処理した。６０日を超えて生存した動物については腫瘍細胞で再チャレンジした。（インビトロ活性化の有無にかかわらず）ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞を注入した動物は、未処理Ｔ細胞または未形質導入Ｔ細胞のいずれよりも累積的に良好に生存した（生存の中央値４２日対７６．５日）。しかしながら最も重要なことに、ＧＳＫ３βで阻害された活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ＋ＳＢ２１６７６３、インビトロ）で処理された腫瘍担持グループで生存しているすべての動物は、実験の終了時（１００日）に腫瘍がなかった。他の生存グループは、１００％の再発（非活性化ＣＡＲ−Ｔ）または６７％の再発（２／３；インビトロのＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃのみ）であった。インビボでのＣＡＲ−Ｔ細胞メモリー生成の分析は、ＧＳＫ３β阻害剤で処理しなかった非活性化または活性化ＣＡＲ−Ｔ（ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃのみ）を注入した腫瘍担持動物の流入リンパ節および脾臓においてＣＡＲ−Ｔ細胞の蓄積の増加を示した。予想と一致して、これらのＣＡＲ−ＴはＣＤ４５ＲＯ＋ＩＬ７Ｒ＋表現型の低発現因子（ｌｏｗ  ｅｘｐｒｅｓｓｅｒｓ）であった。興味深いことに、腫瘍浸潤ＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞の増加は、非活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞を投与されたグループよりも、活性化ＣＡＲ−Ｔｓ（ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃのみ）で処理されたグループで観察された。これは、活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍除去効率の向上を示唆しており、非活性化ＣＡＲ−Ｔ細胞注入グループの１００％と比較した６７％の再発率にも反映されていた。ただし、ＧＳＫ３β阻害ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＩＬ１３Ｒα２−Ｆｃ＋ＳＢ２１６７６３）で処理された腫瘍担持動物のリンパ節では、低レベルのＩＬ１３ＣＡＲ−Ｔ細胞が観察されたが、脾臓には非常に多く存在していた。これらの動物はすべて腫瘍を含まないため、腫瘍浸潤リンパ球は観察されなかった。これらのＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ４５ＲＯ＋ＩＬ７Ｒ＋表現型のより高い発現因子であり、ＴＥＭ細胞は一般にリンパ節には存在せず、通常は脾臓や他の末梢組織に蓄積するという事実と一致している。これらのインビボの結果は、抗原特異的なＣＡＲ−Ｔ細胞に対するＧＳＫ３β阻害のワクチンのような効果を示唆している。
【００９６】
成功した免疫応答の特徴は、ａ）免疫システムが抗原に対して効果的な応答を開始し、ｂ）将来同じ抗原を認識するためのメモリーを生成する場合である。例示された実施形態は、ＧＳＫ３β阻害が、ＡＴＣＤを軽減し、抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞における増殖を増加させることによって生存の増加を促進し、固形腫瘍に対する免疫応答の成功に必要な「免疫ブースト」を与えることを初めて示すものである。実験動物の腫瘍のその後のクリアランスを含む、抗原特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞におけるＧＳＫ３β阻害時のＰＤ−１発現およびＣＤ８＋ＣＡＲ−ＴＥＭメモリー生成の低下によるＣＡＲ−Ｔ細胞疲弊の減少を示すさらなるデータは、２番目の基準を満たしている。抗原経験のあるＣＡＲ−Ｔ細胞に対するＧＳＫ３β阻害のアジュバントのような効果は、癌（より具体的には、固形腫瘍）の免疫療法のための本開示の組成物および方法（例えば、ＣＡＲ−ＴとともにＧＳＫ３β阻害剤）の使用、そしてまた腫瘍ワクチンの開発を提供する。
【００９７】
さらに、癌ネオ抗原の発見が進むにつれて、本明細書に開示される実施形態は、疾患特異的または患者特異的な様式で個別化され得るＣＡＲ−Ｔ細胞に基づく新しい腫瘍ワクチンの開発のために改変され得る。
【００９８】
前述の説明から、当業者は、方法の本質的な特徴を容易に確認でき、その精神および範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を行って、様々な使用法および条件に適合させることができる。
【００９９】
特に定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の方法および材料を本開示の実施または試験において使用することができるが、適切な方法および材料は、前述の段落で説明されている。さらに、材料、方法および実施例は、単なる例示であり、限定することを意図するものではない。矛盾がある場合、定義を含む本明細書が支配する。
【０１００】
本明細書において引用されているすべての米国特許および公開または未公開の米国特許出願は、参照により組み込まれる。本明細書において引用されたすべての公開された外国特許および特許出願は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において引用されたすべての公開された参考文献、文書、原稿、科学文献は、参照により本明細書に組み込まれる。本明細書において参照される科学的データベース（例えば、ＰＵＢＭＥＤ、ＮＣＢＩ）に関連するすべての識別子およびアクセッション番号は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１０１】
以下の開示は、その全体が参照により組み込まれる。
１．ガーフォール（Ｇａｒｆａｌｌ）他、多発性骨髄腫のＣＤ１９に対するキメラ抗原受容体Ｔ細胞、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７３：１０４０−１０４７、２０１５。
【０１０２】
２．ポーター（Ｐｏｒｔｅｒ）他、慢性リンパ性白血病におけるキメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６５：７２５−７３３、２０１１。
３．ヨン（Ｙｏｎｇ）他、固形腫瘍のＣＡＲ  Ｔ細胞療法、Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ、２０１６年。
【０１０３】
４．ネウィック（Ｎｅｗｉｃｋ）他、固形腫瘍のＣＡＲ  Ｔ細胞療法、Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ、２０１６年。
５．ヨフォン（Ｙｖｏｎ）他、遺伝子操作されたＧＤ２−特異的Ｔ細胞を用いた転移性黒色腫の免疫療法、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １５：５８５２−５８６０、２００９。
【０１０４】
６．エムテージ（Ｅｍｔａｇｅ）他、第２世代の抗癌胎児性抗原デザイナーＴ細胞は、活性化による細胞死に抵抗し、腫瘍との接触で増殖し、サイトカインを分泌し、ｉｎ  ｖｉｖｏで優れた抗腫瘍活性を示す：前臨床評価、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １４：８１１２−８１２２、２００８。
【０１０５】
７．ホンバッハ（Ｈｏｍｂａｃｈ）他、キメラ抗原受容体による共刺激は、ＣＤ２８−ＯＸ４０シグナル伝達の組み合わせによるＴ細胞抗腫瘍応答の利点を再考した、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  １２９：２９３５−２９４４、２０１１。
【０１０６】
８．ブラウン（Ｂｒｏｗｎ）他、キメラ抗原受容体Ｔ細胞療法後の神経膠芽腫の退行、Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７５：２５６１−２５６９、２０１６。
９．フォンデルステーゲン（ｖａｎ  ｄｅｒ  Ｓｔｅｇｅｎ）他、ＥｒｂＢ−最標的化ヒトＴ細胞によって誘発されるサイトカイン放出症候群の前臨床インビボモデリング：治療機会のウィンドウを特定する？、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９１：４５８９−４５９８、２０１３。
【０１０７】
１０．パネリ（Ｐａｎｅｌｌｉ）他、全身性インターロイキン（ＩＬ）−２投与後のサイトカインストームの予測、Ｊ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２：２００４年１７月。
１１．ボニファント（Ｂｏｎｉｆａｎｔ）他、ＣＡＲ  Ｔ細胞療法における毒性と管理、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃｓ  ３：１６０１１、２０１６。
【０１０８】
１２．ガーゲット（Ｇａｒｇｅｔｔ）他、ＧＤ−２特異的ＣＡＲ  Ｔ細胞は、抗原との遭遇に続いて強力な活性化と削除を受けるが、ＰＤ−１遮断により、活性化による細胞死から保護できる、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２４：１１３５−１１４９、２０１６。
【０１０９】
１３．チャーカスキ−（Ｃｈｅｒｋａｓｓｋｙ）他、細胞固有のＰＤ−１チェックポイント遮断を有するヒトＣＡＲ  Ｔ細胞は、腫瘍が媒介する阻害に抵抗する、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １２６：３１３０−３１４４、２０１６。
【０１１０】
１４．パウケン（Ｐａｕｋｅｎ）他、疲弊したＴ細胞のエピジェネティックな安定性は、ＰＤ−１遮断による再活性化の耐久性を制限する、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５４：１１６０−１１６５、２０１６。
【０１１１】
１５．ウェルシュ（Ｗｅｌｓｈ）他、Ｔ細胞の活性化は、翻訳開始因子ｅＩＦ２Ｂの急速な刺激とグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３の不活性化をもたらす、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１１４１０−１１４１３、１９９６。
【０１１２】
１６．オーテキ（Ｏｈｔｅｋｉ）他、セリンスレオニンキナーゼＧＳＫ−３によるＴ細胞増殖とインターロイキン２産生の負の調節、Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９２：９９−１０４、２０００。
【０１１３】
１７．セングプタ（Ｓｅｎｇｕｐｔａ）他、無拘束のグリコーゲンシンターゼキナーゼ−３ベータ活性は活性化Ｔ細胞死を引き起こし、天然のアジュバントによって阻害される、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７８：６０８３−６０９１、２００７。
【０１１４】
１８．ガッティノニ（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ）他、ＷｎｔシグナルはエフェクターＴ細胞の分化を停止させ、ＣＤ８＋メモリー幹細胞を生成する、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １５：８０８−８１３、２００９。
【０１１５】
１９．ゾウ（Ｚｈｏｕ）他、メモリーＣＤ８（＋）Ｔ細胞の分化と持続はＴ細胞因子１に依存する、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ３３：２２９−２４０、２０１０。
２０．チャチ（Ｔｈａｃｉ）他、インターロイキン−１３受容体α２を標的とした膠芽腫療法の意義、Ｎｅｕｒｏ  Ｏｎｃｏｌ  １６：１３０４−１３１２、２０１４。
【０１１６】
２１．コング（Ｋｏｎｇ）他、第２世代ＩＬ１３Ｒ特異的キメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞によるヒト神経膠腫異種移植の抑制、Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １８：５９４９−５９６０、２０１２。
【０１１７】
２２．ビュードイン（Ｂｅａｕｄｏｉｎ）他、高い導入遺伝子発現のためのベクター産生細胞の選別は、レトロウイルス力価を増加させる、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １４８：２５３−２５９、２００８。
【０１１８】
２３．グハ（Ｇｕｈａ）他、フロントラインサイエンス：増加したα５β１インテグリン発現によって救出された機能障害の老人性ＣＡＲ−Ｔ細胞、Ｊ  Ｌｅｕｋｏｃ  Ｂｉｏｌ  １０２：２０１−２０８、２０１７。
【０１１９】
２４．セングプタ（Ｓｅｎｇｕｐｔａ）他、クローン増殖したＴ細胞におけるアジュバント誘発生存シグナル伝達は、ｐＡｋｔレベルの一時的な増加と持続的なグルコースの取り込みに関連する、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、２１０：６４７−６５９、２００５。
【０１２０】
２５．リオンズ（Ｌｙｏｎｓ）他、フローサイトメトリーによるリンパ球分裂の決定、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ、１７１：１３１−１３７、１９９４。
【０１２１】
２６．テイラー（Ｔａｙｌｏｒ）他、グリコーゲンシンターゼキナーゼ３の不活性化は、ＣＤ８（＋）細胞溶解性Ｔ細胞応答を増強するために、共受容体ＰＤ−１のＴ−ｂｅｔを介したダウンレギュレーションを駆動する、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４４：２７４−２８６、２０１６。
【０１２２】
２７．ベルマ（Ｖｅｒｍａ）他、ヒトＴ細胞におけるＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１ライゲーションは、ＧＳＫ３βシグナル伝達依存性ノッチ経路を介してＴｈ１分極を促進する、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９７：１０８−１１８、２０１６。
【０１２３】
２８．イケダ（Ｉｋｅｄａ）他、Ｗｎｔシグナル伝達経路の負の調節因子であるＡｘｉｎは、ＧＳＫ−３βおよびβ−カテニンと複合体を形成し、β−カテニンのＧＳＫ−３β依存性リン酸化を促進する、ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ、１７：１３７１−１３８４、１９９８。
【０１２４】
２９．ジーネット（Ｊｅａｎｎｅｔ）他、機能的ＣＤ８Ｔ細胞メモリーの確立のためのＷｎｔ経路エフェクターＴｃｆ−１の重要な役割、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０７：９７７７−９７８２、２０１０。
【０１２５】
３０．フォーゲット（Ｆｏｒｇｅｔ）他、血液および肺腫瘍からのヒトＣＤ８＋Ｔリンパ球におけるＷｎｔ／ｓｓ−カテニン経路の刺激は、共有される若い／メモリー表現型をもたらす、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７：ｅ４１０７４、２０１２。
【０１２６】
３１．マクスウェル（Ｍａｘｗｅｌｌ）他、神経膠芽腫における免疫チェックポイント遮断を調査する臨床試験、Ｃｕｒｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｏｐｔｉｏｎｓ  Ｏｎｃｏｌ  １８：５１、２０１７。
【０１２７】
３２．ルクシク（Ｌｕｋｓｉｋ）他、脳腫瘍の治療における免疫チェックポイント阻害の役割、Ｎｅｕｒｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ、２０１７。
３３．ガッティノニ（Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ）他、幹細胞のような特性を有するヒトメモリーＴ細胞サブセット、Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １７：１２９０−１２９７、２０１１。
【０１２８】
３４．スタール（Ｓｔａａｌ）他、Ｗｎｔシグナル伝達は胸腺細胞の発生に必要であり、Ｔｃｆ−１を介した転写を活性化する、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３１：２８５−２９３、２００１。
【０１２９】
３５．イオニディス（Ｉｏａｎｎｉｄｉｓ）他、β−カテニン−−ＴＣＦ−１経路は、ＣＤ４（＋）ＣＤ８（＋）胸腺細胞の生存を保証する、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２：６９１−６９７、２００１。
【０１３０】
３６．シ（Ｘｕ）他、β−カテニンの削除はＴ細胞の発達を損う、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：１１７７−１１８２、２００３。
３７．ゾウ（Ｚｈａｏ）、Ｄ．Ｍ．、Ｓ．ユ（Ｙｕ）、Ｘ．ゾウ（Ｚｈｏｕ）、Ｊ．Ｓ．ハリング（Ｈａｒｉｎｇ）、Ｗ．ヘルド（Ｈｅｌｄ）、Ｖ．Ｐ．バドヴィナク（Ｂａｄｏｖｉｎａｃ）、Ｊ．Ｔ．ハーティ（Ｈａｒｔｙ）およびＨ．Ｈ．シュエ（Ｘｕｅ）、２０１０、Ｗｎｔシグナル伝達の構成的活性化はメモリーＣＤ８Ｔ細胞の生成を促進する、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １８４：１１９１−１１９９。
【０１３１】
３８．ハートン（Ｈｕｒｔｏｎ）他、Ｔｅｔｈｅｒｅｄ  ＩＬ−１５は抗腫瘍活性を増強し、腫瘍特異的Ｔ細胞の幹細胞メモリーサブセットを促進する、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １１３：Ｅ７７８８−Ｅ７７９７、２０１６。
【０１３２】
３９．カラスコ（Ｃａｒｒａｓｃｏ）他、ヒトＣＤ８Ｔ細胞のＣＤ４５ＲＡは、最後の抗原刺激からの経過時間に感受性を有する、Ｂｌｏｏｄ、１０８：２８９７−２９０５、２００６。
【０１３３】
４０．ハスター（Ｈｕｓｔｅｒ）他、メモリーＴ細胞上のＩＬ−７受容体の選択的発現は、異なるＣＤ８＋メモリーＴ細胞サブセットの初期のＣＤ４０Ｌ依存性生成を特定する、Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：５６１０−５６１５、２００４。
【０１３４】
４１．ハスター（Ｈｕｓｔｅｒ）他、ＣＤ８＋セントラルメモリーＴ細胞の防御的リステリア特異的エフェクターメモリーＴ細胞への一方向の発達、Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３６：１４５３−１４６４、２００６。
【０１３５】
４２．ケーチ（Ｋａｅｃｈ）他、インターロイキン７受容体の選択的発現は、長命のメモリー細胞を生じさせるエフェクターＣＤ８Ｔ細胞を同定する、Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ４：１１９１−１１９８、２００３。
【０１３６】
４３．ボイマン（Ｂｏｙｍａｎ）他、サイトカインおよびＴ細胞ホメオスタシス、Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９：３２０−３２６、２００７。
４４．セングプタ（Ｓｅｎｇｕｐｔａ）他、米国特許第９６５０４２８号明細書、発明の名称「癌を治療するための方法および組成物」。
【０１３７】
４５．セングプタ（Ｓｅｎｇｕｐｔａ）他、ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０６３２６７の国際公開第ＷＯ２０１６／０８９９１６号、発明の名称「癌を治療するための方法および組成物」。
【図１−１】
2021503303.tif 000003
【図１−２】
2021503303.tif 000004
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
2021503303.tif 000008
【図４】
2021503303.tif 000009
【図５】
2021503303.tif 000010
【国際調査報告】
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