(57)【要約】【課題】TNF以外の機序により引き起こされる疾患を患う患者に対する新規の治療戦略が必要とされている。【解決手段】本発明は、複数の細胞死受容体誘発系を標的とする少なくとも3種の薬剤の組み合わせを対象に投与することに基づく、炎症性疾患を処置するための新規の処置(方法、使用、及び組成物)であって、この組み合わせは、(1)受容体TNFR1又はそのリガンドを中和する第1の薬剤と、(2)下記:(2a)TRAIL-R若しくはそのリガンド、又は(2b)CD95若しくはそのリガンドのいずれかを中和する第2の薬剤と、(3)下記:(3a)TLR3若しくはTLR4、又はいずれかのリガンド、又は(3b)表1に示すTNF受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、(3c)カスパーゼ、(3d)RIPK1の内のいずれかを中和する第3の薬剤を含む、新規の処置を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の炎症性疾患を処置する方法であって、前記方法は、少なくとも３種の薬剤の組み合わせ処置を前記対象に施すことを含み、前記組み合わせは、
（１）受容体ＴＮＦＲ１又はそのリガンドを中和する第１の薬剤と、
（２）下記：
（２ａ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ若しくはそのリガンド、
又は
（２ｂ）ＣＤ９５若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第２の薬剤と、
（３）下記：
（３ａ）ＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４、又はいずれかのリガンド、
又は
（３ｂ）表１に示すＴＮＦ受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
（３ｃ）カスパーゼ、
（３ｄ）ＲＩＰＫ１
のいずれかを中和する第３の薬剤と
を含む、方法。
【請求項２】
対象の炎症性疾患を処置するために、
（１）受容体ＴＮＦＲ１又はそのリガンドを中和する第１の薬剤
の治療有効性を増強する方法であって、この方法は、前記対象に、
（２）下記：
（２ａ）ＴＲＡＩＬ  Ｒ若しくはそのリガンド、
又は
（２ｂ）ＣＤ９５若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第２の薬剤と、
（３）下記：
（３ａ）ＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４、又はいずれかのリガンド、
又は
（３ｂ）表１に示すＴＮＦ受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
（３ｃ）カスパーゼ、
（３ｄ）ＲＩＰＫ１
のいずれかを中和する第３の薬剤と
を投与することを含む方法。
【請求項３】
前記受容体又はそのリガンドを中和する薬剤が、
（ｉ）前記リガンドが前記受容体に結合することを防止するか、若しくは阻害するか、
（ｉｉ）そのような結合から生じる受容体／リガンド複合体を破壊する、
請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の薬剤が、ＴＮＦ及び／又はＬＴ−αを中和する、請求項１から３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第２の薬剤が、ＴＲＡＩＬ−Ｒを中和するか、又はＴＲＡＩＬを中和する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記第２の薬剤が、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ  Ｒ２を中和する、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記第３の薬剤が、ＣＤ９５を中和するか、又はＣＤ９５Ｌを中和する、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
（１）前記第１の薬剤が、ＴＮＦ及び／又はＬＴ−αを中和し、
（２ａ）前記第２の薬剤が、ＴＲＡＩＬ−Ｒ又はＴＲＡＩＬを中和し、
（３ａ）前記第３の薬剤が、ＣＤ９５Ｌを中和する、
請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
前記第３の薬剤が、ＴＬＲ３を中和するか、又はＴＬＲ３のリガンド、又はＴＬＲ４若しくはいずれかのリガンドを中和する、請求項１から５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
（１）前記第１の薬剤が、ＴＮＦ及び／又はＬＴ−αを中和し、
（２）前記第２の薬剤が、ＴＲＡＩＬ−Ｒ又はＴＲＡＩＬを中和し、
（３ａ）前記第３の薬剤が、ＴＬＲ３を中和する、
請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第２の薬剤が、ＣＤ９５を中和するか、又はＣＤ９５Ｌを中和する、請求項１から４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
前記第３の薬剤が、ＴＬＲ３を中和するか、又はＴＬＲ３のリガンドを中和する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
（１）前記第１の薬剤が、ＴＮＦ及び／又はＬＴ−αを中和し、
（２ａ）前記第２の薬剤が、ＣＤ９５又はＣＤ９５Ｌを中和し、
（３ａ）前記第３の薬剤が、ＴＬＲ３を中和する、
請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第３の薬剤が、カスパーゼを中和し、ＲＩＰＫ３及び／又はＭＬＫＬを中和する第４の薬剤を使用する、請求項１から５のいずれか１項又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記カスパーゼが、カスパーゼ８である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記第３の薬剤が、ＬＴ−βを中和する、請求項１から５のいずれか１項又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記第３の薬剤が、ＲＩＰＫ１を中和する、請求項１から５のいずれか１項又は請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記薬剤が、前記受容体若しくはリガンドの発現を妨げる一本鎖ヌクレオチド若しくは二本鎖ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、ＰＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子）であるか、又は前記受容体若しくはリガンドに結合して中和する抗体若しくはその断片である、請求項１から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
表２に示す阻害剤の内の１つ又は複数を利用する請求項１から１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
（ａ）前記受容体の発現を減少させることにより、
（ｂ）受容体脱感作若しくは受容体破壊を増加させることにより、
（ｃ）ＴＲＡＩＬと、内在性受容体である前記受容体との間の相互作用を減少させることにより、
（ｄ）受容体により媒介される細胞内シグナル伝達を減少させることにより、
（ｅ）ＴＲＡＩＬの結合に関して内在性受容体と競合することにより、
（ｆ）前記受容体に結合してＴＲＡＩＬの結合をブロックすることにより、
又は
（ｇ）ＴＲＡＩＬに結合して前記受容体との相互作用を防止することにより、
ＴＲＡＩＬ−Ｒ又はＴＲＡＩＬの生物活性を低下させる第２の薬剤を利用する請求項５から１０又は１４から１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＴＲＡＩＬに結合して中和する第２の薬剤を利用する請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記薬剤が、ＴＲＡＩＬに結合して中和する抗体又はその断片である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いて、又は抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いることなく、ヒト抗体Ｆｃドメイン又はその一部に融合している、ＴＲＡＩＬ−Ｒ（好ましくはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）の細胞外ドメイン又はその一部を含む融合タンパク質である薬剤を利用する、請求項２０又は２１に記載の方法。
【請求項２４】
２種以上のＴＲＡＩＬ−Ｒに結合する第２の薬剤を利用するか、又は第２の薬剤及び１種若しくは複数種のさらなる薬剤を利用し、これらのそれぞれは１種若しくは複数種のＴＲＡＩＬ−Ｒに結合する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記第２の薬剤が、
（１）ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２の両方に結合してこれらの活性を中和する抗体若しくはその断片であるか、
又は
（２）前記第２の薬剤は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１に結合してその活性を中和する抗体若しくはその断片であり、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合してその活性を中和するさらなる抗体若しくはその断片と共に使用される、
請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記対象に、１種若しくは複数種の薬剤、又は外因性のアポトーシス及び／又はネクロトーシスのメディエータを中和する１種若しくは複数種のさらなる薬剤を投与することをさらに含み、前記メディエータは、カスパーゼ、ＲＩＰＫ３、及びＭＬＫＬの内の１つ又は複数から任意選択的に選択される、請求項１から２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記対象に、さらなる抗炎症性生物学的薬剤又は抗炎症性化学薬剤を投与することをさらに含む請求項１から２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記さらなる抗炎症性生物学的薬剤又は抗炎症性化学薬剤が、経口副腎皮質ステロイド又は局所副腎皮質ステロイドである、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記炎症性疾患が、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）から任意選択的に選択される自己免疫疾患；任意選択的に筋ジストロフィーである神経炎症性疾患；パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病から任意選択的に選択される神経変性疾患；心臓、腎臓、又は脳の虚血性疾患から任意選択的に選択される虚血性疾患；敗血症；ＨＯＩＬ−１、ＨＯＩＰ、又はＯＴＵＬＩＮの欠損症の内のいずれかにより引き起こされる炎症性疾患からなるリストから選択される、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記炎症性疾患が表３から選択される、請求項１から２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記炎症性疾患が、関節リウマチ（ＲＡ）；乾癬；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）からなるリストから選択される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記炎症性疾患が癌であり、前記方法が、前記癌を処置するための１種若しくは複数種の追加の薬剤を前記対象に投与すること、又は前記対象に放射線療法を実施することをさらに含む、請求項１から２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌を処置するための１種又は複数種の追加の薬剤が、化学療法剤；抗ＰＤ−１／Ｌ１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体から任意選択的に選択される免疫チェックポイント阻害剤；例えばトランスジェニックキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ））発現Ｔ細胞から任意選択的に選択される細胞ベースの治療薬からなるリストから選択される、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象が、炎症性疾患を有するものとして選択され、前記患者から採取された生体サンプル中における細胞死の証拠に関してスクリーニングすることによりさらに選択される、請求項１から３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記対象が、炎症性疾患を有するものとして選択され、前記疾患は、ＴＮＦ阻害剤による処置に対して難治性であることが証明されている、請求項１から３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
（ｉ）対象における前記疾患がＴＮＦ阻害剤による処置に対して難治性であることが証明されている対象を選択する工程と、
（ｉｉ）前記少なくとも３種の薬剤の組み合わせ処置を前記対象に投与する工程と
を含む請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
請求項１から３６のいずれか１項に記載の組み合わせ方法での使用のための、前記受容体ＴＮＦＲ１を中和するか又はＴＮＦＲ１のリガンドを中和する第１の薬剤。
【請求項３８】
請求項１から３６のいずれか１項に記載の組み合わせ方法での使用のための、
下記：
（２ａ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ若しくはそのリガンド、
又は
（２ｂ）ＣＤ９５若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第２の薬剤。
【請求項３９】
請求項１から３６のいずれか１項に記載の組み合わせ方法での使用のための、
下記：
（３ａ）ＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４、又はいずれかのリガンド、
又は
（３ｂ）表１に示すＴＮＦ受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
（３ｃ）カスパーゼ、
（３ｄ）ＲＩＰＫ１
の内のいずれかを中和する第３の薬剤。
【請求項４０】
少なくとも３種の薬剤の組み合わせ処置であって、前記組み合わせは、
（１）受容体ＴＮＦＲ１又はそのリガンドを中和する第１の薬剤と、
（２）下記：
（２ａ）ＴＲＡＩＬ  Ｒ若しくはそのリガンド、
又は
（２ｂ）ＣＤ９５若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第２の薬剤と、
（３）下記：
（３ａ）ＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４、又はいずれかのリガンド、
又は
（３ｂ）表１に示すＴＮＦ受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
（３ｃ）カスパーゼ、
（３ｄ）ＲＩＰＫ１
の内のいずれかを中和する第３の薬剤と
を含み、
組み合わせ処置は、対象の炎症性疾患を処置する方法での使用のためであり、
前記方法は、前記少なくとも３種の薬剤の組み合わせ処置を前記対象に施すことを含む、
少なくとも３種の薬剤の組み合わせ処置。
【請求項４１】
対象の炎症性疾患の処置のための薬物の製造における、
（１）受容体ＴＮＦＲ１又はそのリガンドを中和する第１の薬剤と、
（２）下記：
（２ａ）ＴＲＡＩＬ  Ｒ若しくはそのリガンド、
又は
（２ｂ）ＣＤ９５若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第２の薬剤と、
（３）下記：
（３ａ）ＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４、又はいずれかのリガンド、
又は
（３ｂ）表１に示すＴＮＦ受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
（３ｃ）カスパーゼ、
（３ｄ）ＲＩＰＫ１
の内のいずれかを中和する第３の薬剤と
の使用。
【請求項４２】
対象の炎症性疾患の処置のための薬物の製造における、
下記：
（２ａ）ＴＲＡＩＬ  Ｒ若しくはそのリガンド、
又は
（２ｂ）ＣＤ９５若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第２の薬剤の使用であって、
処置は、
（１）受容体ＴＮＦＲ１又はそのリガンドを中和する第１の薬剤と、
（３）下記：
（３ａ）ＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４、又はいずれかのリガンド、
又は
（３ｂ）表１に示すＴＮＦ受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
（３ｃ）カスパーゼ、
（３ｄ）ＲＩＰＫ１
の内のいずれかを中和する第３の薬剤と
の使用をさらに含む、
第２の薬剤の使用。
【請求項４３】
請求項１から３６のいずれか１項に記載の方法での使用のための請求項３９から４２のいずれか１項に記載の組み合わせ処置又は使用であって、前記各薬剤は、これらの請求項の内のいずれかで定義されている薬剤である、組み合わせ処置又は使用。
【請求項４４】
前記第１の薬剤、前記第２の薬剤、及び前記第３の薬剤を、互いに１２時間以内に順次投与する、請求項１から４３のいずれか１項に記載の方法、処置、又は使用。
【請求項４５】
前記第１の薬剤、前記第２の薬剤、及び前記第３の薬剤を、任意選択的に単一投与単位内で、同時に投与する、請求項１から４３のいずれか１項に記載の方法、処置、又は使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
技術分野
本発明は概して、ＴＮＦ阻害剤又は関連する薬剤による疾患の処置での使用のための、改善された方法及び材料に関する。
【背景技術】
【０００２】
背景技術
腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）は炎症の主要な誘導因子であり1、様々な自己免疫疾患を患っている患者は、単独での又は他の薬物との組み合わせでのＴＮＦ阻害剤により、成功裏に処置され得る2。
【０００３】
しかしながら、ＴＮＦ阻害剤による治療は必ずしも有効とは限らず、例えば、関節リウマチ（ＲＡ）を患っている患者の約５０％、乾癬の患者の約６５％、及び炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の患者の約６０〜８０％が、ＴＮＦ阻害剤による処置に反応するだけである3,4。
【０００４】
さらに、ＴＮＦ阻害剤による処置の恩恵を患者が受けない多くの他の疾患も存在する5。
【０００５】
Croft及びSiegel（Nature Reviews Rheumatology 13.4 (2017): 217-233）は、リウマチ性疾患の将来の治療の標的としてのＴＮＦスーパーファミリ（ＴＮＦＳＦ）のある特定のメンバーの可能性を論じている。彼らは、ＴＮＦＳＦメンバーが、免疫活性化、組織炎症反応、及び細胞死又は細胞抑制等のいくつかのプロセスを開始することに言及している。組織炎症のブロッキングに関して、例えば、ＴＮＦブロッカーに反応しなかったＲＡ患者では、ＴＮＦに加えて、ＴＮＦＳＦのＴＷＥＡＫメンバー及びＬＩＧＨＴメンバーの中和に特に重点が置かれている（第２２９頁）。
【０００６】
特開２００２−１１４８００号は、受容体配列をベースとし且つＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、及びＦａｓＬに対する阻害活性を有することが報告されているペプチドに関する。このペプチドは、リガンドにより引き起こされるアポトーシス及び炎症の阻害に有用であると言われている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
それにもかかわらず、ＴＮＦ以外の機序により引き起こされる疾患（例えば、限定されないが、（自己）炎症性疾患、自己免疫疾患、及び他の疾患、例えば、上記で列挙されたもの）を患う患者に対する新規の治療戦略が必要とされている。そのような新規の処置の提供は、当該技術分野への貢献となるだろう。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の開示
本発明は、炎症性疾患の新規のモデルを使用して、任意選択的に外因性のアポトーシス及びネクロトーシスのメディエータの遮断（又は他の方法による阻害）と共に、リガンド又はその受容体を遮断する（か又は他の方法で阻害する）薬剤の組み合わせにより媒介される細胞死の阻害をベースとする、そのような疾患の新規の併用療法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
図面
【図１】ケラチノサイトにおけるＨＯＩＰの欠失により、ＴＮＦＲ１依存性の出生後致死、及びより高い年齢でのＴＮＦＲ１非依存性の致死的皮膚炎が引き起こされることを示す。ａ，ｄ，ｇ，示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝１０のマウス）（ａ，ｇ）。動物を、合計４回の用量で１日おきにビヒクル又は４−ＯＨＴで処置した（１つの遺伝子型当たりｎ＝３）（ｄ）。ｂ，ｅ，ｈ，示した遺伝子型を有するマウスからの、Ｈ＆Ｅ又は示した抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。矢印（Arrows）：濃縮核、星：免疫細胞浸潤、矢印（arrowhead）：錯角化、及び黒色の線：角質増殖。核をDAPIで染色した（青色）。白色の破線は、表皮（上）と真皮（下）とを分ける。スケールバー、５０μｍ。ｃ，ｆ，ｉ，示した遺伝子型（上部のパネル）を有するマウスにおける、ＴＵＮＥＬ（赤色）及びＣＣ３抗体（緑色）で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した（青色）。白色の破線は、表皮（上）と真皮（下）とを分ける。スケールバー、５０μｍ。示した遺伝子型（下部のパネル）を有するマウスからの皮膚切片中におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞及びＣＣ３陽性細胞の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。エラーバーは、平均値±平均の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ）を表す。*Ｐ≦０．０５、***Ｐ≦０．００１。ＣＣ３：切断されたカスパーゼ−３。コントロールマウスは、Ｈｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＨｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋（ａ〜ｃ）、又はＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウス（ｇ〜ｉ）のプールを表す。
【図１−１】「拡張データ図１」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
【図２】ＨＯＩＬ−１の欠失により、ＴＮＦＲ１依存性の致死的皮膚炎及びＴＮＦＲ１非依存性の致死的皮膚炎が引き起こされることを示す。ａ，ｄ，示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝１０のマウス）。ｂ，ｅ，示した遺伝子型を有するマウスからの、Ｈ＆Ｅ又は示した抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。矢印（Arrows）：濃縮核、星：免疫浸潤、矢印（arrowhead）：錯角化、及び黒色の線：角質増殖。核をDAPIで染色した（青色）。白色の破線は、表皮（上）と真皮（下）とを分ける。スケールバー、５０μｍ。ｃ，ｆ，示した遺伝子型（上部のパネル）を有するマウスにおける、ＴＵＮＥＬ（赤色）及びＣＣ３抗体（緑色）で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した（青色）。白色の破線は、表皮（上）と真皮（下）とを分ける。スケールバー、５０μｍ。示した遺伝子型（下部のパネル）を有するマウスからの皮膚切片中におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞及びＣＣ３陽性細胞の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。**Ｐ≦０．０１、***Ｐ≦０．００１。ＣＣ３：切断されたカスパーゼ−３。コントロールマウスは、Ｈｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＨｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋（ａ〜ｃ）又はＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウス（ｄ〜ｆ）のプールを表す。
【図２−１】「拡張データ図２」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
【図３】ＨｏｉｐE-KOマウス及びＨｏｉｌ−１E-KOマウスでは、異常なアポトーシスにより致死的皮膚炎が引き起こされることを示す。ａ，示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片中におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞及びＣＣ３陽性細胞の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。*Ｐ≦０．０５、**Ｐ≦０．０１、***Ｐ≦０．００１。ｂ，Ｐ０でＣＤ４５に対する抗体で染色した（赤色）、示した遺伝子型を有するマウス（ｎ＝４）からの皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した（青色）。白色の破線は、表皮（上）と真皮（下）とを分ける。スケールバー、５０μｍ。ｃ，示した出生後日数での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、Forward and Side scatterプロファイルに対するＣＤ４５陽性細胞の割合を表す（１つの遺伝子型当たりｎ＝５のマウス）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。**Ｐ≦０．０１、***Ｐ≦０．００１、ＮＳ＝有意ではない。ｄ，ZVAD-fmkの存在下で培養した、コントロール（＋）マウス又はＨｏｉｐE-KO（−）マウスに由来するＰＭＫ中で、ＦＡＤＤ  ＩＰを実施した（ｎ＝２の独立した実験の代表的なブロット）。溶解物及びＩＰを、示したタンパク質に関するウエスタンブロッティングにより分析した。ｅ，ＨｏｉｐE-KOマウス及びコントロールマウスに由来するＰＭＫを、阻害剤Necrostatin-1s(N)、ZVAD-fmk(Z)、又はRIPK3iの非存在下で（ＮＴ：処置なし）又は存在下で、４日にわたり培養した。４日目に、CellTiter-Gloアッセイにより細胞生存率（％）を測定した。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す（ｎ＝５）。***Ｐ≦０．００１、ＮＳ＝有意ではない。ＣＣ３：切断されたカスパーゼ−３。ｆ，示した遺伝子型を有する成体マウスに由来するＰＭＫのCellTiter-Gloアッセイにより、細胞生存率（％）を測定した。結果を、平均値±ＳＥＭ（１つの遺伝子型当たりｎ＝８のマウス）で表す。ＮＳ＝有意ではない。ｇ，示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝１５のマウス）。ｈ，示した遺伝子型を有するマウスにおける、Ｈ＆Ｅ又は示した抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。矢印：濃縮核。核をDAPIで染色した（青色）。スケールバー、５０μｍ。ＣＣ３：切断されたカスパーゼ−３。ｉ，示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片中におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞及びＣＣ３陽性細胞の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。*Ｐ≦０．０５、***Ｐ≦０．００１、ＮＳ＝有意ではない。ｊ，Ｄ７０でＣＤ４５に対する抗体で染色した（赤色）、示した遺伝子型を有するマウス（ｎ＝４）からの皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した（青色）。白色の破線は、表皮（上）と真皮（下）とを分ける。スケールバー、５０μｍ。ｋ，示した遺伝子型を有するマウスのKaplan Meier生存曲線。ＨｏｉｐE-KOマウス（ｎ＝１０）と、ＭｌｋｌKO；ＨｏｉｐE-KOマウス（ｎ＝９）又はＭｌｋｌKO；カスパーゼ−８KO；ＨｏｉｐE-KOマウス（ｎ＝４）との比較、及びＨｏｉｌ−１E-KOマウス（ｎ＝１３）と、Ｒｉｐｋ３KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウス（ｎ＝８）又は��スパーゼ−８KO/WT；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウス（ｎ＝４）又はＲｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO/WT；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウス（ｎ＝１１）又はＲｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウス（ｎ＝１５）との比較を、統計解析のために提示した。**Ｐ≦０．０１、***Ｐ≦０．００１、ＮＳ＝有意ではない。Ｒｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｌ−１fl/wtＫ１４ｃｒｅ＋マウス（ｎ＝１３）、及びＭｌｋｌKO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｐfl/wtＫ１４ｃｒｅ＋マウス（ｎ＝４）を、コントロールとして使用した。カスパーゼ−８とＭＬＫＬ又はＲＩＰＫ３とが複合的に欠損している全てのマウスを、重度のリンパ節腫脹及び脾腫大を発症した場合に、動物福祉に関するＵＫ内務省の規則に従って選別淘汰した。コントロールマウスは、Ｈｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＨｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋又はＨｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＨｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋（ａ〜ｅ）、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウス（ｆ）、Ｒｉｐｋ３KO；Ｈｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＲｉｐｋ３KO；Ｈｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋又はＲｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＲｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウス（ｇ〜ｉ）のプールを表す。
【図３−１】「拡張データ図３」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
【図４】ＣＤ９５Ｌにより誘発される細胞死及びＴＲＡＩＬにより誘発される細胞死によりＴＮＦＲ１非依存性皮膚炎が引き起こされることを示す。ａ，示した遺伝子型を有する成体マウスに由来するＰＭＫを、ＴＲＡＩＬ［５０ｎｇ／ｍｌ］、ＣＤ９５Ｌ［５０ｎｇ／ｍｌ］、及びポリ（Ｉ：Ｃ）［１００μｇ／ｍｌ］で２４時間にわたり処置したか、又は処置しなかった。CellTiter-Gloアッセイにより細胞生存率（％）を測定した。結果を、平均値±ＳＥＭで表す（１つの遺伝子型当たりｎ＝７のマウス）。**ｐ≦０．０１、***ｐ≦０．００１、ＮＳ＝有意ではない。コントロールマウスは、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウスのプールを表す。ｂ，示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像。ｃ，示した遺伝子型を有するマウスにおける皮膚炎の重症度スコアを、Ｐ７０で評価した。病変の影響を受けた身体の領域（黒色）と病変の特徴（白色）とを評価することにより、総合スコアを決定した。Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝６）、Ｔｒａｉｌ−ｒKO；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝４）、Ｔｌｒ３KO；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝４）、Ｃｄ９５E-DD；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝１２）、Ｔｒａｉｌ−ｒKO；Ｔｌｒ３KO；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝２０）及びＣｄ９５E-DD；Ｔｒａｉｌ−ｒKO；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝１９）、ＭｌｋｌKO；Ｔｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KO（ｎ＝１３）。ｄ，示した遺伝子型を有するマウスのKaplan-Meier生存曲線。Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO又はＴｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KOマウスと、示した遺伝子型を有するマウスとの比較を、統計解析のために提示した。*Ｐ≦０．０５、***Ｐ≦０．００１；ＮＳ＝有意ではない。Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝２１）、Ｔｒａｉｌ−ｒKO；Ｔｌｒ３KO；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝１９）及びＣｄ９５E-DD；Ｔｒａｉｌ−ｒKO；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝３２）、ＭｌｋｌKO；Ｔｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KO（ｎ＝１７）。
【図４−１】「拡張データ図４」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
【図５−１】「拡張データ図５」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
【図６−１】「拡張データ図６」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
【図７−１】「拡張データ図７」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
【図８−１】「拡張データ図８」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
【図９−１】「拡張データ図９」として「拡張データ図の凡例」にて説明。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
そのようなリガンドの例として、ＴＮＦスーパーファミリのメンバーが挙げられる。
【００１１】
ＴＮＦ自体に加えて、他のＴＮＦスーパーファミリのメンバー（例えば、限定されないが、リンホトキシン（ＬＴ）−α、ＬＴ−β、ＣＤ９５リガンド（ＣＤ９５Ｌ；ＦａｓＬ又はＡＰＯ−１Ｌとしても既知である）、ＴＲＡＩＬ（Ａｐｏ２Ｌとしても既知である）、ＴＷＥＡＫ、及びＴＬ１Ａ）、並びにパターン認識受容体（ＰＰＲ）のリガンド（例えば、限定されないが、ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）３としても既知であるＰＲＲ）も、細胞死を誘発し得る10,11。
【００１２】
具体的には、本発明者らは、そのような標的に関する組み合わせ介入が相乗効果をもたらし得ることを示している。
【００１３】
非限定的な例として、マウス炎症モデルにおけるＴＮＦスーパーファミリ受容体（ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、及びＣＤ９５）の複合的な除去又は機能障害により、炎症が完全に予防されたが、これらの受容体の個々のターゲティングは、この効果を有しなかった。
【００１４】
非限定的なさらなる例として、マウス炎症モデルにおいて、ＴＮＦスーパーファミリ受容体ＴＮＦＲ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒの除去と、ＴＬＲ３（ｔｏｌｌ様受容体）の除去とを組み合わせることにより、これらの受容体の内の２つのみ（ＴＮＦＲ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ、又はＴＮＦＲ１及びＴＬＲ３）の個々のターゲティングと比較して、炎症の寛解が改善された。
【００１５】
本発明を支持する本発明者らの他の発見を下記で説明する。
【００１６】
【表１】
2021511289.tif 000002
【００１７】
本発明者らのこれらの発見は、複数の細胞死受容体誘導系（ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、及び／又はさらに第３の標的）が組み合わさって作用して炎症関連疾患の一因となり得ること、これらの細胞死受容体誘導系は互いに実際に補い得ること、そのため、そのような系を組み合わせてブロックすることにより、これらの疾患の処置が改善され得ることを実証する。
【００１８】
下記で説明するように、これらの受容体により媒介される細胞死の阻害を、カスパーゼの活性の阻害と有利に組み合わせ得、好ましくは、受容体共役タンパク質キナーゼ３（ＲＩＰＫ３）及び／又はＭＬＫＬの阻害と有利に組み合わせ得る。
【００１９】
これらの併用療法を下記でより詳細に説明する。
【００２０】
これは、例えばＴＮＦ（又は、ＬＴ−β等の他のＴＮＦスーパーファミリリガンド）の阻害剤が単剤では働かない疾患に特に意味を持つ。疾患の例として、炎症及び炎症関連疾患（例えば、限定されないが、自己免疫疾患、神経炎症性疾患、神経変性疾患、虚血性疾患、敗血症、及び癌）が挙げられる。
【００２１】
本発明の態様は、本明細書で説明されている疾患の処置のための方法又は薬物の製造において、細胞死を誘発し得る他の受容体又はリガンド（例えば、ＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４及びそのリガンド）及び／又は外因性のアポトーシス及びネクロトーシスのメディエータと共にＴＮＦ受容体スーパーファミリのメンバー又はそれぞれのリガンドの生物活性を中和するか又は低下させる薬剤の組み合わせを提供する。そのような薬剤は、（例えば）ＴＮＦ／ＬＴ−α、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、又はＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＣＤ９５、ＲＩＰＫ１、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、カスパーゼ−８、ＲＩＰＫ３、及びＭＬＫＬの生物活性を低下させ得る。
【００２２】
本発明の方法は、細胞死受容体又は細胞死リガンドを中和して細胞死を阻害し得るか又は細胞死の阻害をもたらし得、炎症の疾患において治療上有用である。このことは、ＴＮＦ／ＬＴ−α、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳ、及び／又はＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＣＤ９５、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４による細胞死の阻害若しくはこの細胞死の活性化の防止により達成されるか、又はＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬ、若しくはカスパーゼ−８による細胞死の阻害若しくはこの細胞死の活性化の防止により達成される。
【００２３】
ＴＮＦは、異常な細胞死の誘発により炎症を引き起こす可能性があることが既に分かっている6,7。これより以前は、ＴＮＦは、異常に高いレベルの遺伝子活性化を誘発することにより炎症及び自己免疫を引き起こすというのが定説であった。この発見に基づいて、疾患の病因がＴＮＦにより誘発される細胞死である患者では、ＴＮＦにより誘発される遺伝子活性化を阻害するのではなくＴＮＦにより誘発される異常な細胞死を阻害することによりＴＮＦ阻害が働く可能性があることが提案されている8。
【００２４】
さらに、カスパーゼ−８及びＲＩＰＫ３／ＭＬＫＬの欠失により、ある特定の炎症モデルにおいて皮膚炎が予防されることが既に分かっている。さらに、炎症のマウスモデルにおける致死性皮膚炎は、ＴＮＦＲ１により媒介されるがＴＮＦＲ１にとは無関係でもある過剰なカスパーゼ−８により引き起こされるアポトーシスにより誘発されたことが既に示唆されており、このことは、ＴＮＦＲ１非依存性アポトーシスに起因する病理を示唆するだけでなく、ＲＩＰＫ１キナーゼ依存性アポトーシス及びカスパーゼ−８依存性アポトーシスに起因する病理も示唆する（例えば、Abstract presented at 15th TNF international conference, May 20-23, 2015, Ghent, Belgiumを参照されたい）。
【００２５】
しかしながら、これらの先行開示は、本開示の併用療法を教示も示唆もしていなかった。
【００２６】
そのため、本発明の一態様によれば、対象の炎症性疾患を処置する方法であって、この方法は、少なくとも３種の薬剤の組み合わせ処置を個体に施すことを含み、この組み合わせは、
（１）受容体ＴＮＦＲ１又はそのリガンドを中和する第１の薬剤と、
（２）下記：
（２ａ）ＴＲＡＩＬ−Ｒ若しくはそのリガンド、
又は
（２ｂ）ＣＤ９５若しくはそのリガンド
のいずれかを中和する第２の薬剤と、
（３）下記：
（３ａ）ＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４、又はいずれかのリガンド、
又は
（３ｂ）表１に示すＴＮＦ受容体スーパーファミリのメンバーであるさらなる別の受容体、若しくはそのリガンド、
（３ｃ）カスパーゼ、
又は
（３ｄ）ＲＩＰＫ１
のいずれかを中和する第３の薬剤と
を含む、方法が提供される。
【００２７】
この文脈における「中和する」は、直接的に（例えば、関連標的への結合により）又は間接的に生物活性を調節することを意味すると理解されるだろう。本明細書で使用される場合、用語「生物活性」は、タンパク質／受容体（結合パートナー）間の相互作用に起因するあらゆる観察可能な効果を意味する。本発明に関連する生物活性の非限定的な例として、本明細書で考察されている遺伝子（例えば、細胞のアポトーシス又はネクロトーシスに関与するもの）のシグナル伝達及び調節が挙げられる。
【００２８】
「中和する」は、完全な不活性化を意味しない。調節とは一般に、阻害のことであり、即ち、薬剤の非存在下で見られる活性と比較した、関連する生物活性の低下又は減少のことである。
【００２９】
中和は概して、（ｉ）リガンドが受容体に結合することを防止するか、若しくは阻害し、（ｉｉ）そのような結合から生じる受容体／リガンド複合体を破壊することにより達成される。
【００３０】
本発明は、対象の炎症性疾患を処置するために薬剤の内のいずれか（例えば第１の薬剤）の治療有効性を増強する方法であって、他の２種の薬剤を個体に投与することを含む方法をさらに提供する。
【００３１】
一実施形態では、第１の薬剤は、ＴＮＦ及び／又はＬＴ−αを中和する。一実施形態では、第１の薬剤はＴＮＦを中和する。
【００３２】
一実施形態では、第２の薬剤は、ＴＲＡＩＬ−Ｒの内のいずれか又は組み合わせを中和するか、又はＴＲＡＩＬを中和する。一実施形態では、第２の薬剤はＴＲＡＩＬ−Ｒ２を中和する。
【００３３】
一実施形態では、第３の薬剤は、ＣＤ９５を中和するか、又はＣＤ９５Ｌを中和する。そのため、本発明は、
（１）ＴＮＦ及び／又はＬＴ−αを中和する薬剤、
（２）ＴＲＡＩＬ−Ｒ又はＴＲＡＩＬを中和する薬剤、
（３）ＣＤ９５Ｌを中和する薬剤
の使用を包含する。
【００３４】
別の実施形態では、第３の薬剤は、ＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４を中和するか、又はＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４のリガンドを中和する。
【００３５】
一実施形態では、第２の薬剤は、ＣＤ９５を中和するか、又はＣＤ９５Ｌを中和する。
【００３６】
一実施形態では、第３の薬剤は、ＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４を中和するか、又はＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４のリガンドを中和する。
【００３７】
そのため、本発明は、
（１）ＴＮＦ及び／又はＬＴ−αを中和する薬剤、
（２）ＣＤ９５又はＣＤ９５Ｌを中和する薬剤、
（３）ＴＬＲ３を中和する薬剤
の使用を包含する。
【００３８】
別の実施形態では、第３の薬剤は、１種又は複数種のカスパーゼ（例えば、カスパーゼ８及び／又はカスパーゼ１０）を中和し、ＲＩＰＫ３及び／又はＭＬＫＬを中和する第４の薬剤が使用される。
【００３９】
別の実施形態では、第３の薬剤は、ＬＴ−βを中和する。
【００４０】
別の実施形態では、第３の薬剤は、ＲＩＰＫ１を中和する。
【００４１】
下記で説明するように、第４の薬剤及び他の追加の薬剤も使用し得る。
【００４２】
例えば、併用療法にまだ含まれていない場合には、第４の薬剤は、１種又は複数種のカスパーゼ（例えばカスパーゼ８）を中和し得、任意選択の第５の薬剤は、ＲＩＰＫ３及び／又はＭＬＫＬを中和し得る。
【００４３】
他の追加の薬剤として、当該技術分野で既知のさらなる抗炎症性生物学的薬剤又は抗炎症性化学薬剤が挙げられる。一実施形態では、このさらなる抗炎症性生物学的薬剤又は抗炎症性化学薬剤は、経口副腎皮質ステロイド又は局所副腎皮質ステロイドである。
【００４４】
本発明の特定の例示的な実施形態として、下記が挙げられる。
【００４５】
ＴＮＦ／ＬＴ−α、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、ｄｓＲＮＡ（ＴＬＲ３に結合する）、ＬＰＳ（ＴＬＲ４に結合する）の内の１つ若しくは複数を中和し、及び／又はＴＮＦＲ１／ＴＲＡＩＬ−Ｒ／ＣＤ９５／ＴＬＲ３の内の１つ若しくは複数を中和し、及び／又は下記の１つ若しくは複数の相互作用：ＴＮＦ／ＬＴ−α／ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＣＤ９５Ｌ／ＣＤ９５、ｄｓＲＮＡ／ＴＬＲ３、ＬＰＳ／ＴＬＲ４を減少させる薬剤の組み合わせの使用。
【００４６】
上記の組み合わせと組み合わせた、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬ、又はカスパーゼ−８の活性を低下させる薬剤の使用。
【００４７】
リガンドＴＮＦ／ＬＴ−α、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳが受容体ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＣＤ９５、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４それぞれに結合することを防止するか若しくは阻害するか、又はそのような結合から生じるＴＮＦ／ＬＴ−α／ＴＮＦＲ１複合体、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ複合体、ＣＤ９５Ｌ／ＣＤ９５複合体、ｄｓＲＮＡ／ＴＬＲ３複合体、ＬＰＳ／ＴＬＲ４複合体を破壊する薬剤の組み合わせの使用。
【００４８】
上記で説明したリガンド−受容体結合に起因するＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬ、又はカスパーゼ−８の活性を防止するか若しくは阻害する薬剤の使用。
【００４９】
薬剤の例
本発明での使用に適した中和剤の例を、下記でより詳細に説明する。この中和剤の例として、小分子、受容体又はリガンドに結合して中和する抗体又はその断片、受容体又はリガンドの発現を妨げる一本鎖ヌクレオチド又は二本鎖ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、ＰＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子）が挙げられる。
【００５０】
そのため、非限定的な例として、本発明は、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ（好ましくは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＣＤ９５、ＴＬＲ３、又はＴＬＲ４に結合して、その活性を中和する薬剤（例えば、受容体により媒介される細胞内シグナル伝達をブロックする）（例えば、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ（好ましくは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＣＤ９５、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４に特異的に結合する抗体若しくはその断片、又はＴＬＲ３若しくはＴＬＲ４に特異的に結合する小分子若しくはその断片）の組み合わせを使用し得る。
【００５１】
本発明は、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬ、又はカスパーゼ−８に結合する薬剤を使用し得る。例えば、ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬ、又はカスパーゼ−８に特異的に結合してその活性を中和する小分子又はその断片（例えば、キナーゼ活性又はプロテアーゼ活性をブロックする）。
【００５２】
この例は、抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いて、又は抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いることなく、ヒト抗体の一部（好ましくはＦｃドメイン）に融合している、ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ（好ましくは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２若しくはＴＲＡＩＬ−Ｒ１）、ＣＤ９５、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４の細胞外ドメイン若しくは他のドメイン又はその一部を含む融合タンパク質である薬剤を使用し得る。
【００５３】
本発明は、例えば発現を減少させるようにＲＮＡ転写産物に結合することにより、ＴＮＦ／ＬＴ−α、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、及び／又はＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒの内のいずれか（好ましくは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＣＤ９５、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、及び／又はＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬ若しくはカスパーゼ−８の発現を妨げる一本鎖ヌクレオチド又は二本鎖ヌクレオチド（ＤＮＡ、ＲＮＡ（ｓＩＲＮＡ、ｒｈｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ）、ＰＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド分子）である薬剤を使用し得る。
【００５４】
（ａ）受容体の発現を減少させることにより、
（ｂ）受容体の脱感作、又は受容体の破壊を増加させることにより、
（ｃ）ＴＮＦ／ＬＴ−α、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳと、それぞれの内在性受容体との間の相互作用を減少させることにより、
（ｄ）受容体により媒介される細胞内シグナル伝達を減少させることにより、
（ｅ）ＴＮＦ／ＬＴ−α、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳの結合に関して内在性受容体と競合することにより、
（ｆ）受容体に結合して、ＴＮＦ／ＬＴ−α、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳの結合をブロックすることにより、
又は
（ｇ）ＴＮＦ／ＬＴ−α、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、ｄｓＲＮＡ、ＬＰＳに結合して受容体との相互作用を防止することにより。
（ｈ）ＲＩＰＫ１及びＲＩＰＫ３のキナーゼ活性を低下させることにより、
（ｉ）カスパーゼ−８のプロテアーゼ活性を低下させることにより、
（ｊ）ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬ、及び／又はカスパーゼ−８の発現を減少させることにより、
（ｋ）ＲＩＰＫ１と、ＲＩＰＫ３及び／又はカスパーゼ−８との相互作用を減少させることにより、
（ｌ）ＲＩＰＫ３とＭＬＫＬとの相互作用を減少させることにより、
（ｍ）ＲＩＰＫ１、ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬ、及び／又はカスパーゼ−８の細胞内シグナル伝達を減少させることにより、
ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒの内のいずれか（好ましくは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、ＣＤ９５、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４の生物活性を低下させる薬剤の使用。
【００５５】
特許請求の範囲で列挙されているリガンドに作用する阻害剤は、市販されているか、又は本明細書で説明されている。
【００５６】
好ましい阻害剤を表２に示す。
【００５７】
【表２−１】
2021511289.tif 000003
【００５８】
【表２−２】
2021511289.tif 000004
【００５９】
これらの内のいくつかを、これからより詳細に説明する。
【００６０】
ＴＮＦの遮断は診療所で広く使用されており、ＴＮＦ（シグナル伝達）のいくつかの阻害剤が利用可能である2。市販のモノクローナルＴＮＦ中和抗体又は組換えタンパク質は、例えば下記である：ＴＮＦ及びＬＴ−αを中和するＴＮＦＲ２−免疫グロブリン融合タンパク質であるエタネルセプト／Enbrel（Amgen,Pfizer）；（Johnson & Johnson）のインフリキシマブ／Remicade；（AbbVie Inc.）のアダリムマブ／Humira；ゴリムマブ／Simponi（Janssen Biotech）；セルトリズマブ／Cimzia（UCB）。
【００６１】
ＬＴ−βの阻害のために、ＬＴ−β受容体−免疫グロブリン融合タンパク質であるバミネルセプトが利用可能である。
【００６２】
本発明は、
（ａ）受容体の発現を減少させることにより、
（ｂ）受容体脱感作若しくは受容体破壊を増加させることにより、
（ｃ）ＴＲＡＩＬと、内在性受容体である受容体との間の相互作用を減少させることにより、
（ｄ）受容体により媒介される細胞内シグナル伝達を減少させることにより、
（ｅ）ＴＲＡＩＬの結合に関して内在性受容体と競合することにより、
（ｆ）受容体に結合してＴＲＡＩＬの結合をブロックすることにより、
又は
（ｇ）ＴＲＡＩＬに結合して受容体との相互作用を防止することにより、
ＴＲＡＩＬ−Ｒの内のいずれか若しくは組み合わせ（好ましくは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及び／又はＴＲＡＩＬ−Ｒ２）、又はＴＲＡＩＬの生物活性を低下させる薬剤を利用し得る。
【００６３】
ＴＲＡＩＬに結合して中和する薬剤に関して、ＴＲＡＩＬに結合して中和する抗体又はその断片。
【００６４】
市販のモノクローナルＴＲＡＩＬ中和抗体は、例えば下記である：Enzo(http://www.enzolifesciences.com/ALX-804-296/trail-human-mab-2e5/)の抗ヒトＴＲＡＩＬクローン2E5、及びAbcam(http://www.abcam.com/TRAIL-antibody-75411-11-ab10516.html)の抗ＴＲＡＩＬ抗体[75411.11] (ab10516)。
【００６５】
上記で説明したように、本発明での使用に適したＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ融合タンパク質は、国際公開第２０１５００１３４５号で説明されている。そのため、本発明は、抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いて、又は抗体ヒンジ領域若しくはその一部を用いることなく、ヒト抗体の一部（好ましくはＦｃドメイン）に融合している、ＴＲＡＩＬ−Ｒ（好ましくはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）の細胞外ドメイン又はその一部を含む融合タンパク質である薬剤を使用し得る。
【００６６】
本発明は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合してその活性を中和する薬剤（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２に特異的に結合する抗体又はその断片）を利用し得る。
【００６７】
本発明は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１に結合してその活性を中和する薬剤（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１に特異的に結合する抗体又はその断片）を利用し得る。
【００６８】
本発明は、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２に結合してその活性を中和する薬剤（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１及びＴＲＡＩＬ−Ｒ２に特異的に結合する抗体又はその断片）を利用し得る。
【００６９】
ヒトＩｇＧ１のＦｃ領域に融合しているヒトＣＤ９５の細胞外ドメインからなるＣＤ９５Ｌ−結合タンパク質は、ＣＤ９５シグナル伝達をブロックするために使用されている12,13。ＣＤ９５Ｌ阻害剤として、Apogenix's APG101 (Asunercept)が挙げられる。
【００７０】
エムリカサンは、カスパーゼに対する使用に適した経口活性パン−カスパーゼプロテアーゼ阻害剤である。
【００７１】
ＴＬＲ３シグナル伝達の阻害は、ＴＬＲ３に結合するｄｓＲＮＡの直接阻害剤、競合阻害剤、及び高親和性阻害剤として作用する小分子により達成され得る14。
【００７２】
ＴＬＲ３と同様に、ＴＬＲ４が細胞死を誘発し得ることが知られている。ＴＬＲ４のリガンドはＬＰＳ（リポ多糖）である。Ｇａｏ他（２０１７）は、（特に）炎症性障害を処置するためにＴＬＲシグナルを標的とする様々なＴＬＲ阻害剤／アンタゴニストの使用を論じている。
【００７３】
ポナチニブ及びパゾパニブは、ＭＬＫＬ阻害剤として知られている。コンゲンシンＡ及びセラストロールは、ＲＩＰＫ３阻害剤として知られている。
【００７４】
本発明の一実施形態では、本薬剤は、下記の３種の薬剤の組み合わせを含む：
・ＴＮＦ阻害剤（例えば、Enbrel、Humira、又はRemicade）、
・ＣＤ９５Ｌの阻害剤（例えばAsunercept）、
及び
・ＴＲＡＩＬの阻害剤（例えばＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ）。
【００７５】
さらなる実施形態では、上述した組み合わせは、ＲＩＰＫ１のキナーゼ活性の阻害剤と組み合わされる。
【００７６】
コンパニオン診断
本発明は患者選択を提供し、例えば、疾患を患っている個体は、ＴＮＦ阻害剤による処置に対して難治性であることが証明されている。
【００７７】
本発明は、受容体、リガンド、又は標的の組み合わせの内の１つ、複数、又は全ての過剰発現に関して患者をスクリーニングすることを含み得、本治療方法は、この組み合わされた中和に基づく。例えば、ＴＮＦ、ＬＴ−α、ＴＲＡＩＬ、及びＣＤ９５Ｌ等。
【００７８】
このことは、本明細書で説明されている薬剤による処置のために患者を選択するか又は拒否するために行なわれ得る（「コンパニオン診断」）。例えば、この方法は、標的がある特定の閾値を超えて発現されているかどうかを評価すること、及び閾値を超えている場合には、本明細書で説明されている組み合わせ処置により患者を処置することを含み得る。
【００７９】
コンパニオン診断のために、核酸又はタンパク質を含む代表的なサンプルを使用し、このサンプルは、組織、生検プローブ、細胞溶解物、細胞培養物、細胞系統、臓器、オルガネラ、体液、血液サンプル、尿サンプル、皮膚サンプル、及び同類ものからなる群から選択され得る。
【００８０】
例えば、炎症性疾患又は炎症関連疾患の診断時に患者から血液又は生検を採取し、関連する標的に関してスクリーニングする可能性がある。
【００８１】
ＲＮＡレベル又はタンパク質レベルにより遺伝子発現を評価する方法は、当該技術分野で既知である。当業者に既知のあらゆる方法（例えば、ディファレンシャルスクリーニング、サブトラクティブハイブリダイゼーション、ディファレンシャルディスプレイ、及びマイクロアレイ）により、ＲＮＡレベルを測定し得る。タンパク質に特異的なポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを使用してタンパク質の発現を検出して測定するための様々なプロトコルが、当該技術分野で既知である。例として、ウエスタンブロッティング、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、及び蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）が挙げられる。
【００８２】
好ましい例として、病理組織学的分析、免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、インサイチュハイブリダイゼーション、ＲＮＡスコープ、又はフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）が挙げられる。遺伝子発現を定量するために、長年にわたりリアルタイム定量ＰＣＲが使用されている（例えば、Giulietti, Annapaula, et al. Methods 25.4 (2001): 386-401を参照されたい）。
【００８３】
多くの標的用のさらなるアッセイが、例えば、Abcam（Human FAS Ligand ELISA Kit；Human TRAIL ELISA Kit等）、R&D Systems（Human TNF-alpha Quantikine ELISA Kit）等から市販されている。
【００８４】
本発明は、代わりに、又は加えて、細胞死マーカーに関して患者をスクリーニングすることを含み得る。
【００８５】
例えば、炎症性疾患又は炎症関連疾患の診断時に患者から血液又は生検を採取し、細胞死マーカー（例えば、切断されたカスパーゼ−３又はＴＵＮＥＬ陽性）に関してスクリーニングする可能性がある。或いは、例えば抗炎症剤又は抗ＴＮＦで処置されていて、且つそのような処置に対して抵抗性である患者も、このスクリーニングにかける可能性がある。患者が細胞死マーカーに関して陽性であることが判明した場合には、この患者を、本発明に従う処置のために選択し得る。
【００８６】
細胞死を検出するための市販の診断キットは、例えば、細胞死のマーカーとしてのＤＮＡ鎖切断の検出用の、Merck MilliporeのApopTag Red In Situ Apoptosis Detectionキットである。このキットは、ホルマリン固定組織で特に有効である。
【００８７】
細胞死の検出のための別の市販の診断技術は、切断された（即ち、活性化された）カスパーゼ−３（細胞シグナル伝達、９６６４）のインサイチュ検出である11。或いは、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assayキット（Promega）により、又はＤＮＡ挿入剤又は抗体を使用するＦＡＣＳ分析により、細胞死を検出し得る9。
【００８８】
本発明は、本発明のコンパニオン診断としての、そのような細胞死検出ツールの使用をさらに提供する。
【００８９】
本発明は、対象における、本明細書で説明されている薬剤の組み合わせによる処置の有効性の可能性を決定するための、そのようなキットの使用をさらに含む。
【００９０】
炎症性疾患
「炎症性疾患」には、炎症、並びに自己免疫及び癌等の炎症関連疾患が含まれる。例として、いくつかの炎症性疾患及び自己免疫疾患が挙げられ、例えば下記が挙げられる：炎症性腸疾患（例えば、クローン病及び潰瘍性大腸炎）、乾癬、網膜剥離（及び網膜変性）、網膜色素変性症、黄斑変性症、膵炎、アトピー性皮膚炎、関節炎（例えば、関節リウマチ、脊椎関節炎、痛風、全身型若年性特発性関節炎（ＳｏＪＩＡ）、乾癬性関節炎）、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、シェーグレン症候群、全身性強皮症、抗リン脂質抗体症候群（ＡＰＳ）、血管炎、変形性関節症、肝損傷／疾患（非アルコール性脂肪性肝炎、アルコール性脂肪性肝炎、自己免疫性肝炎、自己免疫性肝胆道疾患、原発性硬化性胆管炎（ＰＳＣ）、アセトアミノフェン毒性、肝毒性）、腎損傷／傷害（腎炎、腎移植、手術、腎毒性薬物（例えばシスプラチン）の投与、急性腎障害（ＡＫＩ））、セリアック病、自己免疫特発性血小板減少性紫斑病（自己免疫ＩＴＰ）、移植片拒絶、実質臓器の虚血再灌流障害、敗血症、全身性炎症反応症候群（ＳＩＲＳ）、脳血管発作（ＣＶＡ、脳卒中）、心筋梗塞（ＭＩ）、粥状動脈硬化、ハンチントン病、アルツハイマー病、パーキンソン病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、新生児低酸素性脳傷害、アレルギー性疾患（例えば、喘息及びアトピー性皮膚炎）、火傷（熱傷、火傷ショック）、多発性硬化症、Ｉ型糖尿病、ウェゲナー肉芽腫症、肺サルコイドーシス、ベーチェット病、インターロイキン−１変換酵素（ＩＣＥ、カスパーゼ−１としても既知である）と関連する発熱症候群、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、タバコの煙により誘発される損傷、嚢胞性線維症、腫瘍壊死因子受容体関連周期性症候群（ＴＲＡＰＳ）、新生物腫瘍、歯周炎、ＮＥＭＯ変異（ＮＦ−κＢ必須修飾因子遺伝子（ＩＫＫ−ガンマ又はＩＫＫＧとしても既知である）、特に、ＮＥＭＯ欠損症候群、ＨＯＩＬ−１変異（（ＲＢＣＫ１としても既知である）ｈｅｍｅ酸化ＩＲＰ２ユビキチンリガーゼ−１欠損症）、ＨＯＩＰ変異（（ＲＮＦ３１としても既知である）ＨＯＩＬ−１相互作用タンパク質）、ＸＩＡＰ変異（（ＢＩＲＣ４としても既知である）アポトーシスのＸ結合阻害剤）、ＯＴＵＬＩＮ変異（（ＦＡＭ１０５Ｂとしても既知である）直鎖結合特異性を有するＯＴＵデユビキチナーゼ）、ＣＹＬＤ変異（円柱腫症）、ＳＰＡＴＡ２変異（精子形成関連２）、Ａ２０変異（ＴＮＦＡＩＰ３としても既知である）、ＦＡＤＤ変異（Ｆａｓ関連デスドメイン）、カスパーゼ−８変異、又は血液悪性腫瘍及び実質臓器悪性腫瘍、細菌感染及びウイルス感染（例えば、インフルエンザ、スタフィロコッカス（staphylococcus）、及びマイコバクテリウム（mycobacterium）（結核））、並びにリソソーム蓄積症（特に、ゴーシェ病、及び例えば、ＧＭ２ガングリオシドーシス、α−マンノシドーシス、アスパルチルグルコサミン尿症、コレステロールエステル蓄積症、慢性ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、シスチン症、ダノン病、ファブリ病、ファーバー病、フコシドーシス、ガラクトシアリドーシス、ＧＭ１ガングリオシドーシス、ムコリピドーシス、小児型遊離シアル酸蓄積症、若年型ヘキソサミニダーゼＡ欠損症、クラッベ病、リゾリーマル酸リ��ーゼ欠損症、異染性白質ジストロフィー、ムコ多糖症障害、多重スルファターゼ欠損症、ニーマン・ピック病、神経セロイドリポフスチン症、ポンペ病、濃化異骨症、サンドホフ病、シンドラー病、シアル酸蓄積症、テイ・サックス病、及びウォルマン病）、スティーブンス・ジョンソン症候群、中毒性表皮壊死症、並びに移植臓器、組織、及び細胞の拒絶、並びにあらゆるタイプの炎症関連癌。
【００９１】
一実施形態では、ＨＯＩＬ−１、ＨＯＩＰ、又はＯＴＵＬＩＮの欠損症（例えば変異）の内のいずれかにより引き起こされる炎症性疾患（例えば、Krenn, Martin, et al. “Mutations outside the N-terminal part of RBCK1 may cause polyglucosan body myopathy with immunological dysfunction: expanding the genotype-phenotype spectrum.” Journal of neurology (2017): 1-8；Boisson, Bertrand, et al. “Human HOIP and LUBAC deficiency underlies autoinflammation, immunodeficiency, amylopectinosis, and lymphangiectasia.” Journal of Experimental Medicine 212.6 (2015): 939-951を参照されたい）。
【００９２】
一実施形態では、炎症性疾患は、多発性硬化症（ＭＳ）、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）から任意選択的に選択される自己免疫疾患；任意選択的に筋ジストロフィーである神経炎症性疾患；パーキンソン病、アルツハイマー病、及びハンチントン病から任意選択的に選択される神経変性疾患；心臓、腎臓、又は脳の虚血性疾患から任意選択的に選択される虚血性疾患；敗血症からなるリストから選択される。
【００９３】
好ましい標的疾患は、ＴＮＦ阻害が有益であると考えられる疾患を列挙する表３に示すものであり、ある特定の患者（例えば、最初の処置に反応しないか又は経時的に反応を失う患者）が成功裏に反応していないものが挙げられる。
【００９４】
【表３】
2021511289.tif 000005
【００９５】
最も好ましい一実施形態では、炎症性疾患は、関節リウマチ（ＲＡ）；乾癬；炎症性腸疾患（ＩＢＤ）からなるリストから選択される。
【００９６】
別の実施形態では、炎症性疾患は癌であり、本方法は、前記癌を処置するための１種若しくは複数種の追加の薬剤を個体に投与すること、又は前記個体に放射線療法を実施することをさらに含む。任意選択的に、前記癌を処置するための１種又は複数種の追加の薬剤は、化学療法剤；抗ＰＤ−１／Ｌ１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体から任意選択的に選択される免疫チェックポイント阻害剤；例えばトランスジェニックキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（又はＴ細胞受容体（ＴＣＲ））発現Ｔ細胞から任意選択的に選択される細胞ベースの治療薬
からなるリストから選択される。
【００９７】
併用療法
本発明の方法又は処置は、少なくとも３種の薬剤を利用する併用療法である。
【００９８】
これらの薬剤を、同時に投与してもよいし、順次投与してもよく、且つ個々に異なる用量スケジュールで及び異なる経路で投与してもよい。例えば、順次投与する場合には、これらの薬剤を、密な間隔で（例えば、５〜１０分の期間にわたり）投与し得るか、又はより長い間隔で（例えば、１、２、３、４、若しくはより長い時間離れて、又は必要な場合にはさらに長い期間離れて）投与し得、正確な投与レジメンは、治療薬の特性に見合ったものである。
【００９９】
薬剤（即ち、本明細書で説明されている化合物、さらに１種又は複数種の他の薬剤）を、単一剤形で一緒に製剤化してもよいし、或いは、個々の薬剤を別々に製剤化して、任意選択でこれらの使用説明書と共に、キットの形態で一緒に提示してもよい。
【０１００】
別の実施形態では、本発明の併用療法を、少なくとも１種の他の治療的に活性な薬剤と組み合わせて施し得、この他の治療的に活性な薬剤は、下記から選択される：血栓溶解剤、組織プラスミノーゲン活性化因子、抗凝固薬、血小板凝集抑制剤、抗菌剤（抗生物質、広域抗生物質、β−ラクタム、抗マイコバクテリア剤、殺菌性抗生物質、抗ＭＲＳＡ治療薬）、長期間作用性ベータアゴニスト、吸入ステロイド剤及び長期間作用性ベータアゴニストの組み合わせ、短期間作用性ベータアゴニスト、ロイコトリエン修飾薬（leukotriene modifier）、抗ＩｇＥ、メチルキサンチン気管支拡張剤、肥満細胞阻害剤、タンパク質チロシンキナーゼ阻害剤、ＣＲＴＨ２／Ｄプロスタノイド受容体アンタゴニスト、エピネフリン吸入エアロゾル、ホスホジエステラーゼ阻害剤、ホスホジエステラーゼ−３阻害剤及びホスホジエステラーゼ−４阻害剤の組み合わせ、長期間作用性吸入抗コリン作用薬、ムスカリン性アンタゴニスト、長期間作用性ムスカリン性アンタゴニスト、低用量ステロイド、吸入副腎皮質ステロイド、経口副腎皮質ステロイド、局所副腎皮質ステロイド、抗胸腺細胞グロブリン、サリドマイド、クロラムブシル、カルシウムチャネル遮断薬、局所皮膚軟化薬、ＡＣＥ阻害剤、セロトニン再取り込み阻害剤、エンドセリン−１受容体阻害剤、抗線維化剤、タンパク質ポンプ阻害剤、嚢胞性線維症膜貫通透過性制御因子増強剤（cystic fibrosis transmembrane conductance regulator potentiator）、粘液溶解薬、膵酵素、気管支拡張剤、眼硝子体内注射（opthalmic intravitreal injection）、抗血管内皮増殖因子阻害剤、繊毛様神経栄養成長因子剤、３価（ＩＩＶ３）不活性化インフルエンザワクチン、４価（ＩＩＶ４）不活性化インフルエンザワクチン、３価組換えインフルエンザワクチン、４価弱毒化生インフルエンザワクチン、抗ウイルス剤、不活性化インフルエンザワクチン、繊毛様神経栄養成長因子、遺伝子導入剤、局所免疫調節剤、カルシニューリン阻害剤、インターフェロンガンマ、抗ヒスタミン剤、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗Ｔ細胞抗体、抗胸腺細胞ガンマグロブリン−ウマ抗体、抗胸腺細胞グロブリン−ウサギ抗体、抗ＣＤ４０アンタゴニスト、ＪＡＫ阻害剤、及び抗ＴＣＲマウスｍＡｂ。
【０１０１】
例示的な他の治療的に活性な薬剤として、下記が挙げられる：ヘパリン、クマジン、クロピドグレル（clopidrogel）、ジピリダモール、チクロピジンＨＣ？、エプチフィバチド、アスピリン、バンコマイシン（vacomycin）、セフェピライム（cefeprime）、ピペラシリン及びタゾバクタムの組み合わせ、イミペネム、メロペネム、ドリペネム、シプロフロキサシン、レボフロキサシン、オフロキサシン、モキシフロキサシン、ヒドロコルチゾン、ベドリズマブ、アリカホルセン、レメステメセル−Ｌ（remestemcel-L）、イキセキズマブ、ティルドラキズマブ、セクキヌマブ、クロルヘキシジン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、フルチカゾン（フルチカゾンプロピオン酸エステル、フルチカゾンフロ酸エステル）、ベクロメタゾンプロピオン酸エステル、ブデソニド、トリアムシノロンアセトニド（trimcinolone acetonide）、フルニソリド、モメタゾンフランカルボン酸エステル、シクレソニド、アルフォルモテロール酒石酸塩、ホルモテロールフマル酸塩、サルメテロールキシナホ酸塩、アルブテロール（アルブテロール硫酸塩）、レバルブテロール酒石酸塩、臭化イプラトロピウム、モンテルカストナトリウム、ザフィルルカスト、ジロートン、オマリズマブ、テオフィリン、クロモリンナトリウム、ネドクロミルナトリウム、マシチニブ、AMG 853、インダカテロール、E004、レスリズマブ、サルブタモール、臭化チオトロピウム、VR506、レブリキズマブ、RPL554、アフリベルセプト（afibercept）、ウメクリジニウム、インダカテロールマレイン酸塩、アクリジニウム臭化物、ロフルミラスト、SCH527123、臭化グリコピロニウム、オロダテロール、フルチカゾンフロ酸エステル及びビランテロールビランテロールの組み合わせ、フルチカゾンプロピオン酸エステル及びサルメテロールの組み合わせ、フルチカゾンフロ酸エステル及びフルチカゾンプロピオン酸エステルの組み合わせ、フルチカゾンプロピオン酸エステル及びホルモテロールフマル酸塩二水和物（eformoterol fumarate dihydrate）の組み合わせ、ホルモテロール及びブデソニドの組み合わせ、ベクロメタゾンプロピオン酸エステル及びホルモテロールの組み合わせ、フランカルボン酸モメタゾン及びホルモテロールフマル酸塩二水和物の組み合わせ、ウメクリジニウム及びビランテロールの組み合わせ、臭化イプラトロピウム及びアルブテロール硫酸塩の組み合わせ、臭化グリコピロニウム及びインダカテロールマレイン酸塩の組み合わせ、グリコピロレート及びフマル酸ホルモテロールの組み合わせ、アクリジニウム及びホルモテロールの組み合わせ、イソニアジド、エタンブトール、リファンピン、ピラジナミド、リファブチン、リファペンチン、カプレオマイシン、レボフロキサシン、モキシフロキサシン、オフロキサシン、エチオナミド、サイクロセリン、カナマイシン、ストレプトマイシン、バイオマイシン、ベダキリンフマル酸塩、PNU-100480、デラマニド、イマチニブ、ARG201、トシリズマブ、ムロモナブ−ＣＤ３、バシリキシマブ、ダクリズマブ、リツキシマブ、プレドニゾロン、抗胸腺細胞グロブリン、FK506（タクロリムス）、メトトレキサート、シクロスポリン、シロリムス、エベロリムス、ミコフェノール酸ナトリウム、ミコフェノール酸モフェチル、シクロホスファミド、アザチオプリン、サリドマイド、クロラムブシル、ニフェジピン、ニカルジピン、ニトログリセリン、リシノプリル、ジルチアゼム、フルオキセチン、ボセンタン、エポプロステノール、コルヒチン、パラ−アミノ安息香酸、ジメチルスルホキシド、Ｄ−ペニシラミン、インターフェロンアルファ、インターフェロンガンマ（ＩＮＦ−ｇ）、オメプラゾール、メトクロプラミド、ランソプラゾール、エソメプラゾール、パントプラゾール、ラベプラゾール、イマチニブ、ベリムマブ、ARG201、トシリズマブ、イバクフトール（ivacftor）、ドルナーゼアルファ、パンクレリパーゼ、トブラマイシン、アズトレオナム、コリスチンメタナトリウム、セファドロキシル一水和物、セファゾリン、セファレキシン、セファゾリン、モキシフロキサシン、レボフロキサシン、ゲミフロキサシン、アジスロマイシン、ゲンタマイシン、セフタジジム、トリメトプリム及びスルファメトキサゾールの組み合わせ、クロラムフェニコール、イバクフトール及びルマカフトールの組み合わせ、アタルレン、NT-501-CNTF、ミオシンＶＩＩＡをコードする遺伝子導入剤（MY07A）、ラニビズマブ、ペガプタニブナトリウム、NT501、ヒト化スフィンゴマブ（humanized sphingomab）、ベバシズマブ、オセルタミビル、ザナミビル、リマンタジン、アマンタジン、ナフシリン、スルファメトキサゾレム（sulfamethoxazolem）、トリメトプリム、スルファサラジン、アセチルスルフィソキサゾール、バンコマイシン、ムロモナブ−ＣＤ３、ASKP-1240、ASP015K、TOL101、ピメクロリムス、ヒドロコルチゾン、ベタメタゾン、フルランドレノロン、トリアムシノロン、フルオシノニド、クロベタゾール、ヒドロコルチゾン、メチルプレドニゾロン、プレドニゾロン、組換え合成Ｉ型インターフェロン、インターフェロンアルファ−２ａ、インターフェロンアルファ−２ｂ、ヒドロキシジン、ジフェンヒドラミン、フルクロキサシリン、ジクロキサシリン、並びにエリスロマイシン。
【０１０２】
別の実施形態では、本発明の併用療法を、少なくとも１種の他の治療的に活性な薬剤と組み合わせて施し得、例えば、上記適応症の内のいずれかの他の抗炎症剤、例えば、経口副腎皮質ステロイド又は局所副腎皮質ステロイド、５−アミノサルチル酸及びメサラミン調製物、ヒドロキシクロロキン（hydroxyeloroquine）、チオプリン、メトトレキサート、シクロホスファミド、シクロスポリン、カルシニューリン阻害剤、ミコフェノール酸、ｍＴＯＲ阻害剤、ＪＡＫ阻害剤、Ｓｙｋ阻害剤、抗炎症性生物学的薬剤、例えば、抗ＩＬ−６生物製剤、抗ＩＬ−１剤（例えば、抗ＩＬ１β及び抗ＩＬ−１α生物製剤）、抗Ｉ−１７生物製剤、抗ＣＤ２２、抗インテグリン剤、抗ＩＦＮα、抗ＣＤ２０又はＣＤ４生物製剤、並びにＴ細胞受容体又はＢ細胞受容体又はインターロイキンに対する他のサイトカイン阻害剤又は生物製剤）と組み合わせて施し得る。
【０１０３】
本明細書で説明されている方法は、リガンド又は受容体の生物活性を低下させる薬剤の「治療上有効な」量を、そのような処置を必要とする対象に投与することを含み得る。生物活性を低下させ得る薬剤は、多くの手段によりその効果を達成し得る。例えば、そのような薬剤は、（非限定的な例として）受容体の発現を減少させるもの；受容体脱感作又は受容体破壊を増加させるもの；リガンドとその内在性受容体との間の相互作用を減少させるもの；受容体により媒介される細胞内シグナル伝達を減少させるもの；リガンドの結合に関して内在性受容体を競合するもの；受容体に結合してリガンドの結合をブロックするもの；又はリガンドに結合してその受容体との相互作用を防止するものであり得る。
【０１０４】
この薬剤が受容体又はリガンドと直接相互作用することが好ましい。
【０１０５】
好ましい一実施形態では、この薬剤は、受容体又はリガンドに結合してその活性をブロックし、又は結合して内在性リガンド／受容体複合体が適切に形成されることをブロックし、その結果、この複合体は細胞内シグナル伝達にもはや関与し得ない。
【０１０６】
そのような標的と相互作用し得る生物学的薬物の一例は抗体であり、例えばヒト抗体又はヒト化抗体である。本発明における抗体は、モノクローナル抗体であってもよいし、ポリクローナル抗体であってもよいし、キメラ抗体であってもよいし、一本鎖抗体であってもよいし、機能性抗体断片であってもよい。
【０１０７】
生物学的薬物の別の例は可溶性受容体タンパク質であり、例えば、受容体の細胞外タンパク質を含む可溶性受容体−Ｆｃ融合タンパク質、又はその、問題となっているそれぞれのリガンド（の受容体刺激活性）が阻害される方法でリガンドに結合し得る少なくとも一部である。
【０１０８】
簡潔さのために、下記の実施形態を、ＴＲＡＩＬ又はＴＲＡＩＬ−Ｒ（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１若しくはＴＲＡＩＬ−Ｒ２）に関する非限定的な例により説明し得る。それにもかかわらず、そのような考察の全ては、あらゆる他のＴＲＡＩＬ−Ｒ（例えば、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、又はＴＲＡＩＬ−Ｒ４）に準用されることが認識されるだろう。そのような考察の全ては、本明細書で説明されている他のリガンド及びそのそれぞれの受容体に準用されることも認識されるだろう。
【０１０９】
抗体
本発明に係る抗体の製造のために、様々な宿主種を、標的とする上述のタンパク質又は免疫原性である２種のタンパク質の任意の断片の注射により免疫化し得る。
【０１１０】
例えば、ＴＲＡＩＬ活性を中和するための抗体は、完全長ヒトＴＲＡＩＬ配列に対して産生され得る。
【０１１１】
免疫応答を高めるために、宿主種に応じて適切なアジュバントを選択する。好ましくは、このアジュバントに対する抗体応答を誘発するために使用されるペプチド、断片、又はオリゴペプチドは、少なくとも５個のアミノ酸を含むが、好ましくは１０個のアミノ酸を含む。培養中に連続細胞系統により抗体分子又はこの抗体の組換え機能性断片及び非組み換え機能性断片を産生する任意の技術を使用して、２種のタンパク質に対するモノクローナル抗体を製造し得る。この技術として、ハイブリドーマ技術、及びヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術が上げられるが、これらに限定されない。加えて、キメラ抗体（例えば組換え抗体）の製造のために開発され技術を使用し得る。得られた抗体を、改変（例えば、ラベリング、抗体ストレッチ（antibody stretch）の組換え結合）と共に、若しくはこの改変なしに、又はレポーターとして機能する分子と共に、使用し得る。改変は、共有結合的であり得、及び／又は非共有結合的であり得る。
【０１１２】
所望の特異性を有する抗体を同定するためのスクリーニングに、多くの様々な免疫アッセイ及び非免疫アッセイを使用し得る。既に確立されている特異性を有するポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体のいずれかを使用する競合的結合アッセイ及び免疫放射アッセイのための様々なプロトコルが、当該技術分野で公知である。これら免疫アッセイは概して、受容体又はリガンドとそれらの特異的抗体との間の複合体形成を測定することを含む。２種の非干渉性タンパク質エピトープに対するモノクローナル抗体を含む「サンドイッチ」（即ち両側性の）モノクローナルベースの免疫アッセイが好ましいが、競合的結合アッセイも使用し得る。
【０１１３】
より具体的には、この抗体はγ−免疫グロブリン（ＩｇＧ）であることが好ましい。抗体の可変領域はこの抗体の特異性を定義すること、及びこの領域それ自体が、本発明に係る抗体の機能性誘導体で保存されるべきであることが認識されるだろう。この可変ドメインを超える領域（Ｃ−ドメイン）は、配列が比較的不変である。本発明に係る抗体の特徴的な性質はＶHドメイン及びＶLドメインであることが認識されるだろう。ＣHドメイン及びＣLドメインの正確な性質は概して本発明にとって不可欠ではないことがさらに認識されるだろう。実際に、本発明に係る好ましい抗体は、非常に異なるＣHドメイン及びＣLドメインを有し得る。さらに好ましい抗体機能性誘導体は、可変ドメインを含み得るがＣドメインを含まない（例えば、ｓｃＦＶ抗体）。
【０１１４】
抗体誘導体は、ポリクローナルミックス中のモノクローナル抗体又は特異的抗体に対して７５％の配列同一性を有し得、より好ましくは９０％の配列同一性を有し得、最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。ほとんどの配列変化はフレームワーク領域（ＦＲ）で起こり得、抗体のＣＤＲ及びその機能性誘導体の配列はほとんど保存されていることが認識されるだろう。
【０１１５】
本発明の多くの好ましい実施形態は、可変ドメイン及び定常ドメインの両方を有する分子に関する。しかしながら、抗体の可変領域を本質的に含むがいかなる定常領域も含まない抗体断片（例えばｓｃＦＶ抗体）もまた、本発明に包含されることが認識されるだろう。
【０１１６】
ある種で生成された抗体は、異なる種を処置するために使用される場合には、いくつかの重大な欠点を有することが知られている。例えば、マウス抗体をヒトで使用する場合には、このマウス抗体は、血清中での循環半減期が短い傾向があり、且つ処置されている患者に外来タンパク質と認識される。このことにより、望ましくないヒト抗マウス（又はラット）抗体応答が発生する。このことは、抗体を頻繁に投与することが必要である場合には特に厄介であり、なぜならば、抗体のクリアランスが増強され、この抗体の治療効果がブロックされ、且つ過敏性応答が誘発される可能性があるからである。従って、ヒトの治療での使用に好ましい抗体（非ヒト由来の場合）は、ヒト化されている。
【０１１７】
モノクローナル抗体は、非ヒトｍＡｂの生成を通常は含むハイブリドーマ技術により生成される。この技術により、ほとんどの特異性を有する齧歯類モノクローナル抗体の作製が可能になる。従って、本発明の好ましい実施形態は、そのような技術を使用して、ＴＲＡＩＬ受容体に対するモノクローナル抗体を開発し得る。そのような抗体は治療的に有用であるが、（上記で示唆したように）そのような抗体はヒトでの理想的な治療薬ではないことが認識されるだろう。理想的には、ヒトモノクローナル抗体が、治療への応用のための好ましい選択であるだろう。しかしながら、従来の細胞融合技術を使用するヒトｍＡｂの生成は、これまであまり成功していない。このヒト化の問題は、非ヒト（例えば齧歯類）ｍＡｂ由来のＶ領域配列と、ヒト抗体由来のＣ領域（及び理想的にはＶ領域由来のＦＲ）配列とを使用する抗体を操作することにより、少なくとも部分的に対処され得る。得られた「操作された」ｍＡｂは、これが由来する齧歯類ｍＡｂと比べてヒトでの免疫原性が低く、そのため臨床での使用により適している。
【０１１８】
ヒト化抗体は、組換えＤＮＡ技術を使用して齧歯類免疫グロブリンの定常領域がヒト抗体の定常領域に置き換えられているキメラモノクローナル抗体であってもよい。次いで、キメラＨ鎖遺伝子及びキメラＬ鎖遺伝子を、適切な調節エレメントを含む発現ベクターにクローニングし、哺乳類動物細胞に誘導して完全グリコシル化抗体を作製し得る。このプロセスのために適切なヒトＨ鎖Ｃ領域遺伝子を選択することにより、この抗体の生物活性を予め決定し得る。そのようなキメラ抗体は、エフェクター機能を活性化する能力を特定の治療用途に合せて調整し得るという点で、及びこのキメラ抗体が誘発する抗グロブリン応答が減少するという点で、非ヒトモノクローナル抗体よりも優れている。
【０１１９】
そのようなキメラ分子は、本発明に係る疾患の処置に好ましい薬剤である。ＲＴ−ＰＣＲを使用して、好ましいｍＡｂからＶH遺伝子及びＶL遺伝子を単離し、クローニングし、使用して、ヒトドメインを有するｍＡｂのキメラバージョンを構築し得る。
【０１２０】
抗体のさらなるヒト化は、抗体のＣＤＲグラフト化又は再形成を含んでもよい。そのような抗体を、（この抗体の抗原結合部位を形成する）齧歯類ｍＡｂの重鎖ＣＤＲ及び軽鎖ＣＤＲを、ヒト抗体の対応するフレームワーク領域に移植することにより作製する。
【０１２１】
断片又は融合タンパク質
本明細書で説明されている薬剤は、受容体の一部（例えば可溶性断片）をベースとし得、任意選択的に、異種タンパク質ドメインに融合しているか又は非タンパク質部分と結合している。
【０１２２】
非限定的な例として、ＴＲＡＩＬ阻害剤は、ヒンジ領域若しくはその一部を用いて、又はヒンジ領域若しくはその一部を用いることなく、例えばヒトＩｇＧ分子（好ましくは、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はヒトＩｇＧ４のＦｃ領域）由来の（ヒンジ領域又はその一部を含むか又は含まない）異種ポリペプチドドメイン（特に、免疫グロブリン分子のＦｃ部分）に融合され得る、ＴＲＡＩＬ−Ｒ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、若しくはＯＰＧの細胞外ドメイン（優先的には、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２のもの）又はそのリガンド結合部分、又は参照により本明細書に具体的に組み込まれるWalczak他(Walczak, H., Degli-Esposti, M.A., Johnson, R.S., Smolak, P.J., Waugh, J.Y., Boiani, N., Timour, M.S., Gerhart, M.J., Schooley, K.A., Smith, C.A., et al. (1997). TRAIL-R2: a novel apoptosis-mediating receptor for TRAIL. The EMBO journal 16, 5386-5397)並びにC.T. Rauch及び H. Walczakの特許（米国特許第６５６９６４２Ｂ１号）に従う成熟ＴＲＡＩＬ−Ｒ２配列の細胞外ドメインを含む。
【０１２３】
２種の完全ヒトタンパク質部分を融合させる方法を、Walczak（国際公開第２００４／０８５４７８号；ＰＣＴ／ＥＰ２００４／００３２３９：「改善されたＦｃ融合タンパク質」）で説明されているように、得られた融合タンパク質の免疫原性の可能性を低下させる方法で行ない得る。
【０１２４】
発現したＴＲＡＩＬ−Ｒ２には２種のスプライシング型が存在し、且つこのスプライシングはＴＲＡＩＬ−Ｒ２の細胞外ドメインに影響を及ぼすことから（Screaton, G.R., Mongkolsapaya, J., Xu, X.N., Cowper, A.E., McMichael, A.J., and Bell, J.I. (1997). TRICK2, a new alternatively spliced receptor that transduces the cytotoxic signal from TRAIL. Current biology: CB 7, 693-696.）、アミノ酸配列が異なるＴＲＡＩＬ−Ｒ２の少なくとも２種の細胞外ドメインが知られている。一実施形態では、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２の細胞外ドメインのＴＲＡＩＬ結合部分は、ＴＲＡＩＬ阻害性ＴＲＡＩＬ−Ｒ２融合タンパク質を構築する際に、これらの２種の内のいずれか一方に由来し得る。
【０１２５】
本発明での使用に適したＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ融合は、国際公開第２０１５００１３４５号で説明されており、この内容は、特にＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃ融合に関して、相互参照により本明細書で明示的に組み込まれる。国際公開第２０１５００１３４５号由来のＴＲＡＩＬ−Ｒ２−Ｆｃポリペプチドを下記に示す。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２部分に下線を引いている。Ｆｃ部分を太字で示す。ＴＲＡＩＬ−Ｒ２部分とヒトＩｇＧ１  ＦＣ部分との間に１個のアミノ酸重複が存在することに留意されたい。リーダーペプチドをイタリックで示す。成熟タンパク質は配列ＩＴＱＱＤＬＡで始まる。組換えにより製造された場合には、Ｎ末端の正確な位置は数個のアミノ酸だけ異なり得、このことは、成熟タンパク質が例えば１〜５個のアミン酸だけ短い又は長い可能性があることを意味する。
【０１２６】
【化１】
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【０１２７】
ＴＲＡＩＬに結合してその活性を中和するＴＲＡＩＬ−Ｒ融合タンパク質を、培養中に連続細胞系統によりこのタンパク質の組換え及び非組み換えの完全長又は機能性断片が産生される任意の技術を使用して製造し得る。
【０１２８】
下記で説明するように、得られたタンパク質を、改変（例えば、ラベリング、抗体ストレッチの組換え結合）と共に、若しくはこの改変なしに、又はレポーターとして機能する分子と共に、使用し得る。改変は、共有結合的であり得、及び／又は非共有結合的であり得る。
【０１２９】
ペプチド剤
本発明に従って使用されるか又は提供されるペプチド剤又はタンパク質剤は、天然の又はオリジナルの配列の派生であり得、そのため、インビボでのこの薬剤の有効性又は半減期を増加させる誘導体を含むことが認識されるだろう。本発明に係るポリペプチドの半減期を増加させ得る誘導体の例として、ペプトイド誘導体、Ｄアミノ酸誘導体、及びペプチド−ペプトイドハイブリッドが挙げられる。
【０１３０】
本発明に係るタンパク質剤及びペプチド剤は、多くの手段（例えば、標的部位でのプロテアーゼ活性）による分解を受け得る。そのような分解は、これらのバイオアベイラビリティを制限し、従って治療上の有用性を制限する場合がある。生物学的分文脈で安定性が増強されているペプチド誘導体を設計して製造し得る、多くの十分に確立された技術が存在する。そのようなペプチド誘導体は、プロテアーゼにより媒介される分解に対する抵抗性の増加の結果としてバイオアベイラビリティが改善され得る。好ましくは、本発明に従う使用に適した誘導体は、この誘導体が由来するタンパク質又はペプチドと比べてプロテアーゼ耐性が高い。ペプチド誘導体及びこのペプチド誘導体が由来するタンパク質又はペプチドのプロテアーゼ耐性を、公知のタンパク質分解アッセイにより評価し得る。次いで、ペプチド誘導体及びペプチドに関するプロテアーゼ耐性の相対値を比較し得る。
【０１３１】
本発明に係るタンパク質及びペプチドのペプトイド誘導体は、本発明の第１の態様に係る受容体の知識から、又は本発明の第４、第５、若しくは第６の態様に係る薬剤の知識から、容易に設計され得る。市販のソフトウェアを使用して、十分に確立されたプロトコルに従ってペプトイド誘導体を開発し得る。
【０１３２】
レトロペプトイド（retropeptoid）（全てのアミノ酸が逆の順序でレペプトイド残基に置き換えられている）もまた、本発明に係るタンパク質又はペプチドを模倣し得る。レトロペプトイドは、１個のペプトイド残基を含むペプチド又はペプトイド−ペプチドハイブリッドと比較して、リガンド結合溝中で逆方向に結合することが予想される。その結果、このペプトイド残基の側鎖は、オリジナルのペプチドにおける側鎖と同じ方向を示し得る。
【０１３３】
本発明に係るペプチド又はタンパク質の改変形態のさらなる実施形態は、Ｄ−アミノ酸形態を含む。この場合には、アミノ酸残基の順序が逆になる。Ｌ−アミノ酸よりもむしろＤ−アミノ酸を使用するペプチドの調製により、通常の代謝プロセスによるそのような誘導体のあらゆる不要な分解が大幅に減少し、投与する必要がある誘導体の量が、この誘導体の投与頻度と共に減少する。
【０１３４】
核酸
本発明のさらなる実施形態では、本薬剤又は本阻害剤は、核酸エフェクター分子である。
【０１３５】
この核酸エフェクター分子は、ＤＮＡ、ＲＮＡ（例えば、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びｓｈＲＮＡ）、ＰＮＡ、又はＤＮＡ−ＲＮＡ−ハイブリッド分子であり得る。これらは、具体的には、ＴＲＡＩＬ配列又はＴＲＡＩＬ−Ｒ配列の下方制御に向けられ得る（例えば実施例５を参照されたい）。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）として既知である遺伝子サイレンシング機序の一部を形成し、これにより、ｍＲＮＡが配列特異的に破壊され、遺伝子発現の標的化ノックアウトが可能になる。遺伝子サイレンシングで使用されるｓｉＲＮＡは、典型的には各３'末端で２個のヌクレオチドオーバーハングを有する、２１個のヌクレオチドの長さの二本鎖ＲＮＡを含み得る。或いは、ヘアピンループにより接続されているセンス配列及びアンチセンス配列を使用する短いヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）を使用してもよい。ｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡは両方とも、化学的に合成されて、一過性ＲＮＡｉのために細胞に導入され得るか、又は遺伝子発現の長期にわたる阻害のためにプロモーターから内因的に発現され得る。本発明に係る薬剤としての使用のためのｓｉＲＮＡ分子は、１０〜５０個のヌクレオチドのいずれかの二本鎖ＲＮＡを含んでもよい。好ましくは、本発明の係る薬剤としての使用のためのｓｉＲＮＡは、１８〜３０個のヌクレオチドを含む。より好ましくは、本発明に係る薬剤としての使用のためのｓｉＲＮＡは、２１〜２５個のヌクレオチドを含む。最も好ましくは、本発明に係る薬剤としての使用のためのｓｉＲＮＡは、２１個のヌクレオチドを含む。ｓｉＲＮＡは、本発明の第２の態様に係る配列をベースとする必要があることが認識されるだろう。好ましい二本鎖ｓｉＲＮＡ分子は、相補的なアンチセンス鎖に結合しているＴＲＡＩＬ又はその受容体の配列由来の２１〜２５個の連続ヌクレオチドのセンス鎖を含む。或いは、センス配列及びアンチセンス配列を使用するｓｈＲＮＡが、本発明に係る薬剤として使用され得る。好ましくは、本発明に係る薬剤として用いられ得るセンス配列及びアンチセンス配列を使用するｓｈＲＮＡは、２０〜１００個のヌクレオチドを含む。
【０１３６】
他の実施形態では、核酸は本発明の他の薬剤をコードし得、例えば、説明されている融合タンパク質をコードし得る。
【０１３７】
核酸は、一本鎖であってもよいし二本鎖であってもよい。この核酸エフェクター分子は、薬物として直接送達されてもよく（これは、「裸」にされるか又は例えばリポソーム中の可能性がある）、標的とする臓器、組織、又は細胞集団へのヌクレオチド配列の送達のために、レトロウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス若しくはワクシニアウイルス、又は細菌プラスミドから発現されてもよい。
【０１３８】
この構築物を使用して、翻訳不能なセンス配列又はアンチセンス配列を細胞に導入し得る。
【０１３９】
ＤＮＡへの組込みなしに、これらのベクターは、細胞ヌクレアーゼによる分解までＲＮＡ分子を産生し続け得る。ベクター系は、非複製ベクターを用いて１ヶ月以上にわたり、適切な複製エレメントがこのベクター系の一部である場合にはより長くにわたり、一時的に発現し得る。
【０１４０】
そのため、当該技術分野で公知であるように、組換えベクターは、他の機能性エレメントを含んでもよい。例えば、組換えベクターは、このベクターが細胞内で自律的に複製するように設計され得る。この場合には、この組換えベクターには、ＤＮＡ複製を誘発するエレメントが必要とされ得る。或いは、この組換えベクターは、このベクター及び核酸分子が細胞のゲノムに統合するように設計されてもよい。この場合には、（例えば相同組換えによる）標的統合を好むＤＮＡ配列が望ましい。組換えベクターはまた、クローニングプロセスにおいて選択可能マーカーとして使用され得る遺伝子をコードするＤＮＡを有してもよい。この組換えベクターはまた、必要に応じて、核酸の発現を制御するためのプロモーター又はレギュレーターをさらに含んでもよい。
【０１４１】
バリアント
アミノ酸配列及び核酸配列が、（例えば、融合タンパク質又は他の薬剤のコーディングに関して）本明細書で論じられている場合は常に、本明細書で開示されているアミノ酸配列及び核酸配列の機能性誘導体も想定されていることが当業者に認識され、そのような誘導体は、本明細書で言及されている配列の内のいずれかのアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列と少なくとも３０％、好ましくは４０％、より好ましくは５０％、さらにより好ましくは６０％の配列同一性を有する配列を有し得る。言及されている配列の内のいずれかに対して好ましくは６５％、より好ましくは７５％、さらにより好ましくは８５％、さらにより好ましくは９０％を超える同一性を有するアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列も想定される。好ましくは、アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列は、言及されている配列の内のいずれかと９２％の同一性、さらにより好ましくは９５％の同一性、さらにより好ましくは９７％の同一性、さらにより好ましくは９８％の同一性、最も好ましくは９９％の同一性を有する。
【０１４２】
異なるアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列の間の同一性百分率の算出を、下記のように実行し得る。多重アラインメントを、ClustalXプログラム（ペアワイズパラメータ：ギャップオープニング１０．０、ギャップ伸長０．１、タンパク質マトリックスＧｏｎｎｅｔ  ２５０、ＤＮＡマトリックスＩＵＢ；多重パラメータ：ギャップオープニング１０．０、ギャップ伸長０．２、遅延発散配列（delay divergent sequence）３０％、ＤＮＡ遷移重量（DNA transition weight）０．５、負のマトリックスオフ、タンパク質マトリックスｇｏｎｎｅｔシリーズ、ＤＮＡ重量ＩＵＢ；タンパク質ギャップパラメータ、残基特異的ペナルティオン、親水性ペナルティオン、親水性残基ＧＰＳＮＤＱＥＲＫ、ギャップ分離距離４、エンドギャップ分離オフ）により最初に作成する。次いで、同一性百分率を、（Ｎ／Ｔ）*１００（Ｎは、２種の配列が同一残基を共有する位置の数であり、Ｔは、比較する位置の総数である）として、この多重アラインメントから算出する。或いは、同一性百分率を、（Ｎ／Ｓ）*１００（Ｓは、比較するより短い配列の長さである）として算出し得る。アミノ酸／ポリペプチド／核酸配列をデノボで合成してもよいし、天然のアミノ酸／ポリペプチド／核酸配列又はこれらの誘導体であってもよい。
【０１４３】
或いは、実質的に類似するヌクレオチド配列は、ストリンジェントな条件下で、本明細書で言及されている核酸配列の内のいずれか又はその相補体にハイブリダイズする配列によりコードされる。ストリンジェントな条件とは、ヌクレオチドが、約４５℃で、６×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中において、フィルタに結合したＤＮＡ又はＲＮＡにハイブリダイズし、続いて約５〜６５℃で、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで少なくとも１回洗浄することを意味する。或いは、実質的に類似するポリペプチドは、本発明に係るペプチド配列と少なくとも１個ではあるが５個、１０個、２０個、５０個、又は１００個未満のアミノ酸が異なり得る。
【０１４４】
遺伝子コードの縮重に起因して、コードされる受容体タンパク質の配列に実質的に影響を及ぼすことなく、任意の核酸配列を変更するか又は変化させて、この受容体タンパク質の機能性バリアントを得ることができることは明白である。適切なヌクレオチドバリアントは、配列内の同一のアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により変更され、そのためサイレント変化を生じる配列を有するものである。他の適切なバリアントは、相同ヌクレオチド配列を有するが、保存的変化を生じるように、置換されるアミノ酸に対して生物物理学的特徴が類似する側鎖を有するアミノ酸をコードする異なるコドンの置換により変更されている配列の全て又は一部を含むものである。例えば、小さい非極性の疎水性アミノ酸として、グリシン、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、及びメチオニンが挙げられる。大きい非極性の疎水性アミノ酸として、フェニルアライン、トリプトファン、及びチロシンが挙げられる。極性中性のアミノ酸として、セリン、トレオニン、システイン、アスパラギン、及びグルタミンが挙げられる。正に帯電した（塩基性）アミノ酸として、リシン、アルギニン、及びヒスチジンが挙げられる。負に帯電した（酸性）アミノ酸として、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。
【０１４５】
タンパク質又はＤＮＡの正確なアラインメントは、多くの研究者により詳細に調べられている。特に重要なのは、配列の最適なマッチングと、そのようなマッチを得るためのギャップの導入との間のトレードオフである。タンパク質の場合には、マッチをスコア化する手段も重要である。ＰＡＭマトリックス（例えば、Dayhoff, M. et al., 1978, Atlas of protein sequence and structure, Natl. Biomed. Res. Found.）及びＢＬＯＳＵＭマトリックスのファミリは、保存的置換の性質及び可能性を定量し、多重アラインメントアルゴリズムで使用されるが、他の同等に適用可能なマトリックスが当業者に既知であるだろう。一般的な多重アラインメントプログラムClustalW及びそのウィンドウズバージョンClustalX（Thompson et al., 1994, Nucleic Acids Research, 22, 4673-4680; Thompson et al., 1997, Nucleic Acids Research, 24, 4876-4882）は、タンパク質及びＤＮＡの多重アラインメントを作成するのに効果的な方法である。
【０１４６】
高頻度で、自動的に作成されるアラインメントは、研究されているタンパク質ファミリに関する熟練したユーザーの知識（例えば、重要な保存部位の生物学的知識）を利用する手動のアラインメントを必要とする。そのようなアラインメントエディタプログラムの１つは、Align（http://www.gwdg.de/~dhepper/download/; Hepperle, D., 2001: Multicolor Sequence Alignment Editor. Institute of Freshwater Ecology and Inland Fisheries, 16775 Stechlin, Germany）であるが、他のもの（例えばJalView又はCinema）も適している。
【０１４７】
タンパク質間の同一性百分率の算出は、Clustalによる多重アラインメントの作成の最中に行なわれる。しかしながら、この値は、このアラインメントが手動により改善されている場合には、又は２種の配列を意図的に比較するために、再算出される必要がある。アラインメント内のタンパク質配列のペアに関するこの値を算出するプログラムとして、アミノ酸置換（Ｐ）のモデルとして「Similarity Table」オプションを使用するPHYLIP系統パッケージ（Felsenstein; http://evolution.gs.washington.edu/ phylip.html）内のPROTDISTが挙げられる。ＤＮＡ／ＲＮＡの場合には、同一のオプションがPHYLIPのDNADISTプログラム内に存在する。
【０１４８】
タンパク質配列における他の改変（即ち、例えば、アセチル化、アミド化、カルボキル化、リン酸化、タンパク質分解切断、又はリガンドへの連結により、翻訳の最中又は後に生じるもの）も想定され、且つ特許請求されている本発明の範囲内である。
【０１４９】
組成物、投与量、及びレジメン
本発明で利用される薬剤（例えば、ＴＮＦ／ＬＴ−α／ＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ／ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＣＤ９５Ｌ／ＣＤ９５、ｄｓＲＮＡ／ＴＬＲ３、ＬＰＳ／ＴＬＲ４、ＲＩＰＫ１、カスパーゼ−８、ＲＩＰＫ３、及びＭＬＫＬにより引き起こされる細胞死及び炎症を中和する、ＴＮＦ／ＬＴ−α、ＴＲＡＩＬ、ＣＤ９５Ｌ、又はＴＮＦＲ１、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＣＤ９５、ＴＬＲ３、ＴＬＲ４、カスパーゼ−８、ＲＩＰＫ３、ＭＬＫＬ、又はＲＩＰＫ１に結合する薬剤）を、「医薬組成物」として提供してもよい。
【０１５０】
医薬組成物を、単独で投与してもよいし、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、ブドウ糖、及び水が挙げられるがこれらに限定されない任意の滅菌された生体適合性のある医薬担体溶液中で投与され得る少なくとも１種の他の薬剤（例えば安定化化合物）と組み合わせて投与してもよい。この組成物を、単独で患者に投与してもよいし、他の薬剤、薬物、又はホルモンと組み合わせて患者に投与してもよい。本発明で詳述されている医薬組成物を、あらゆる経路（例えば、限定されないが、経口、静脈内、筋肉内、動脈内、髄内、髄腔内、心室内（intraventricular）、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸内、局所、舌下、又は直腸の手段）により投与し得る。
【０１５１】
医薬組成物は一般に、意図された目的を達成するのに有効な量で薬剤を含む。
【０１５２】
有効用量の決定は、十分に熟練者の能力内である。任意の化合物に関して、治療上有効な用量を、例えば細胞系統の細胞培養アッセイ、又は通常はマウスであるがそれに限定されない動物モデルのいずれかにおいて、最初に推定し得る。同様に、動物モデルを使用して、適切な濃度範囲及び投与経路を決定し得る。そのようなパイロット実験に基づいて、ヒトでの投与に有用な用量及び経路を決定し得る。治療上有効な用量は、特定の状態を処置するのに十分な有効成分（例えば、本発明の核酸若しくはタンパク質、又は抗体）の量を指す。治療上での有効性及び毒性を、細胞培養又は実験動物における標準的な薬学的手順により決定し得、例えば、ＥＤ５０（集団の５０％において治療上有効な用量）及びＬＤ５０（集団の５０％に致死的な用量）により決定し得る。治療効果と毒性効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０で表され得る。大きな治療指数を示す医薬組成物が好ましい。投与量は、好ましくは、毒性がほぼないＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内である。投与量は、用いられる投与量、患者の感受性、及び投与経路に依存して、この範囲内で変動する。正確な投与量は、処置を必要とする対象に関連する因子を考慮して、専門家により決定される。投与量及び投与を、十分なレベルの活性部位を提供するために、又は所望の効果を維持するために、調整する。考慮され得る因子として、病状の重症度の、対象の全身の健康状態、対象の年齢、体重、及び性別、食事、投与の時間及び頻度、薬物の組み合わせ、反応感度、並びに治療に対する耐性／応答が挙げられる。長時間作用する医薬組成物を、特定の製剤の半減期及びクリアランス率に応じて、３〜４日に１回、１週間に１回、又は２週間に１回投与し得る。通常の投与量は、投与経路に応じて、０．１〜１００，０００マイクログラムで変動し得、最大で約１ｇの総用量であり得る。特定の投与量及び送達方法に関するガイダンスは文献に記載されており、当業者は一般に入手可能である。当業者は、ヌクレオチドに関して、タンパク質又はその阻害剤の場合とは異なる製剤を用いる。同様に、ポリヌクレオチド又はポリペプチドの送達は、上記で詳述したように特定の細胞又は状態に特異的である。
【０１５３】
概説
用語「処置」は、本明細書においてある状態を処置する文脈で使用される場合、一般に、ヒトか（例えば獣医学的用途での）動物かに関わりなく、いくつかの所望の治療効果（例えば、この状態の進行の阻害）が達成される処置及び治療に関し、進行速度の低下（生存期間の延長）、進行速度の停止、この状態の後退、この状態の寛解、及びこの状態の治癒を含む。
【０１５４】
用語「治療上有効な量」は、本明細書で使用される場合、所望の処置レジメンに従って投与された場合に、合理的な利益／リスク比に見合って、いくつかの所望の治療効果をもたらすのに有効な本発明の化合物、又は前記化合物を含む材料、組成物、若しくは剤形（dosage from）の量に関する。本発明者らは、本発明の疾患に関するＭＴ化合物の治療上有効な量が、これまで当該技術分野で理解されていたのと比べてはるかに低い量であり得ることを実証している。
【０１５５】
本発明はまた、予防手段としての処置も含まれることを包含し、「処置する」は、それに応じて理解されるだろう。予防的処置は、「予防上有効な量」を利用し得、この量は、本明細書で使用される場合、所望の処置レジメンに従って投与された場合に、合理的な利益／リスク比に見合って、いくつかの所望の予防効果をもたらすのに有効な薬剤の量に関する。
【０１５６】
本明細書の文脈における「予防」は、完全な成功（即ち、完全な保護又は完全な予防）を制限するように理解されるべきではない。むしろ、本文脈における予防は、ある症候性の状態を遅延させるか、緩和するか、又は回避することを助けることにより健康を維持することを目的として、この特定の状態の検出に先だって施される措置を指す。
【０１５７】
薬剤を利用する処置方法が本明細書で説明されている場合は常に、この方法での使用のための薬剤（第１、第２、第３の薬剤の内のいずれか１つ）も説明されており、関連する炎症性疾患を処置するための薬物の製造での使用のための薬剤（第１、第２、第３の薬剤の内のいずれか１つ）も説明されていることが認識されるだろう。同様に説明されているのは、他の２種の薬剤の活性を増強する方法での使用のための第１、第２、第３の薬剤の内のいずれか１つである。
【０１５８】
組成物が本明細書で説明されている場合は常に、本明細書で説明されている治療方法（予防方法を含む）での使用のための同一の組成物も想定され、関連する炎症性疾患を処置するための薬物の製造における使用のための組成物も想定されることが認識されるだろう。
【０１５９】
本明細書では、本発明及び本発明が関連する技術水準をより完全に説明し且つ開示するために、多くの特許及び刊行物が引用されている。これらの参考文献のそれぞれは、本明細書では、各個々の参考文献が、参照により組み込まれることが具体的に且つ個別に示されていた場合と同程度まで、その全体が本開示に参照により組み込まれる。
【０１６０】
別途文脈が求めない限り、本明細書（後続する特許請求の範囲を含む）全体を通して、単語「含む（comprise）」、並びに「含む（comprises）」及び「含む（comprising）」等の変化形は、述べられている整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の包含を意味するが、いかなる他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群の排除も意味しないことが理解されるだろう。
【０１６１】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、別途文脈が明確に示さない限り、単数形「a」、「an」、及び「the」は複数の参照対象を含むことに留意しなければならない。そのため、例えば、「医薬担体（a pharmaceutical carrier）」への言及は、２種以上のそのような担体の混合物及び同類のものを含む。
【０１６２】
範囲は、本明細書では、「約」ある特定の値から及び／又は「約」別の特定の値までとして表現されることが多い。そのような範囲が表現されている場合には、別の実施形態は、ある特定の値から及び／又は他の特定の値までを含む。同様に、値が、先行詞「約」の使用により近似値として表現されている場合には、この特定の値が別の実施形態を形成することが理解されるだろう。
【０１６３】
本明細書におけるあらゆるサブタイトルは、便宜のみのために含まれており、決して本開示を限定すると解釈してはならない。
【０１６４】
これより、下記の非限定的な図及び実施例を参照して本発明をさらに説明する。これらを考慮して、当業者は、本発明の他の実施形態に気付くだろう。
【０１６５】
拡張データ図の凡例
拡張データ図１：ケラチノサイトにおけるＨＯＩＰの欠損の生成及びキャラクタリゼーションを示す。ａ，示した遺伝子型を有するマウスの耳パンチから単離されたＤＮＡのＰＣＲ遺伝子型判定。ｂ，示した遺伝子型を有するマウスに由来するＰＭＫにおけるＬＵＢＡＣ成分のウエスタンブロット分析。ｃ，Ｐ４でＨＯＩＰに対する抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像。スケールバー、５０μｍ。ｄ，ZVAD-fmkの存在下で培養してＦＬＡＧ−ＴＮＦで刺激した、コントロール（＋）マウス又はＨｏｉｐE-KO（−）マウスに由来するＰＭＫ中におけるＦＬＡＧ  ＩＰにより、内在性ＴＮＦＲ１複合体Ｉのプルダウンを実施した。溶解物及びＩＰを、示したタンパク質に関するウエスタンブロッティングにより分析した。ｅ，様々な時点（分）での、Ｈｉｓタグ付きＴＮＦ［１００ｎｇ／ｍｌ］刺激後のコントロール（＋）マウス及びＨｏｉｐE-KO（−）マウスに由来するＰＭＫからの全細胞溶解物中における、示したタンパク質のウエスタンブロット分析。ｆ，Ｐ４での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝４のマウス）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。***Ｐ≦０．００１。ｇ，Ｐ４での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、live and Side Scatterプロファイルに対するＣＤ４５+、ＣＤ１１ｂ+ＧＲ−１+、ＣＤ１１ｂ+Ｆ４／８０+及びＣＤ１９+、ＣＤ３+細胞の割合を示す（１つの遺伝子型当たりｎ＝５のマウス）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。**Ｐ≦０．０１、***Ｐ≦０．００１。ＮＳ＝有意ではない。ｈ，合計４回の用量で１日おきにビヒクル又は４−ＯＨＴで処置し、Ｈ＆Ｅ又は示した抗体で染色したＨｏｉｐfl/wtＫ１４ＣｒｅＥＲtamマウスの皮膚切片の代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。核をDAPIで染色した（青色）。白色の破線は、表皮（上）と真皮（下）とを分ける。スケールバー、５０μｍ。ｉ，示した遺伝子型を有し且つ（ｈ）と同様に処置されたマウスの表皮厚の定量（１つの表現型当たりｎ＝３）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。*Ｐ≦０．０５、ＮＳ＝有意ではない。ｊ，ImageJを使用して全体の蛍光強度を測定することにより、ｈと同様に処置した、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片におけるＣＤ４５染色の定量を実施した。ａｕ＝任意の単位。ｋ，示した遺伝子型（上部のパネル）を有するマウスにおける、ＴＵＮＥＬ（赤色）及びＣＣ３抗体（緑色）で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した（青色）。白色の破線は、表皮（上）と真皮（下）とを分ける。スケールバー、５０μｍ。示されている（下部のパネル）ように処置したＨｏｉｐfl/wtＫ１４ＣｒｅＥＲtamマウスからの皮膚切片中におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞及びＣＣ３陽性細胞の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。ＣＣ３を検出しなかった（ｎｄ）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。ＮＳ＝有意ではない。ＣＣ３：切断されたカスパーゼ−３。コントロールマウスは、Ｔｎｆｒ１KOＨｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＴｎｆｒ１KOＨｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウス（ｂ）、又はＨｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃ��ｅ−及びＨｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウス（ｃ，ｆ，ｇ）のプールを表す。
拡張データ図２：ＨｏｉｐE-KOマウスにおけるＴＮＦＲ１欠損により、成体期に皮膚炎症が引き起こされることを示す。ａ，示した遺伝子型を有するマウスのKaplan-Meier生存曲線。ＨｏｉｐE-KOマウス（ｎ＝１０）とＴｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KOマウス（ｎ＝２７）との比較を、統計解析のために提示した。***Ｐ≦０．００１。Ｔｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KOマウスを、動物福祉に関するＵＫ内務省の規則に従って、重度の皮膚疾患に起因して選別淘汰した。ｂ，Ｄ７０での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝４）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。***Ｐ≦０．００１。ｃ，Ｄ７０での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、ライブ及びSide Scatterプロファイルに対する、示した免疫細胞亜集団の割合を示す（１つの遺伝子型当たりｎ＝５）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。*Ｐ≦０．０５、**Ｐ≦０．０１、***Ｐ≦０．００１。コントロールマウスは、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウス（ｂ，ｃ）のプールを表す。
拡張データ図３：ＲＩＰＫ１のキナーゼ活性の遺伝的阻害により、ＨｏｉｐE-KOマウスの致死が４日遅れることを示す。ａ，示した出生後日数でのマウスの代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝８のマウス）。矢印は、Ｐ８でのＲＩＰＫ１D138N；ＨｏｉｐE-KOマウスを示す（右側のパネル）。ＲＩＰＫ１D138N；ＨｏｉｐE-KOマウスは、Ｐ４ではコントロール同腹子と識別不能であった（左側のパネル）。ｂ，示した遺伝子型を有するマウスからの、Ｈ＆Ｅで染色した皮膚切片の代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。矢印（Arrows）：濃縮核、星：免疫細胞浸潤、矢印（arrowhead）：錯角化、及び黒色の線：角質増殖。スケールバー、５０μｍ。コントロールマウスは、ＲＩＰＫ１D138N；Ｈｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＲＩＰＫ１D138N；Ｈｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウスのプールを表す。
拡張データ図４：Ｈｏｉｌ−１E-KOマウス及びＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスの作成及びキャラクタリゼーションを示す。ａ，Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスを作成するために従うノックアウト戦略の略図。ｂ，示した遺伝子型を有するマウスの耳パンチから単離されたＤＮＡのＰＣＲ遺伝子型判定。ｃ，示した遺伝子型を有するマウスに由来するＰＭＫにおけるＬＵＢＡＣ成分のウエスタンブロット分析。ｄ，Ｐ４でＨＯＩＬ−１に対する抗体で染色した皮膚切片の代表的な画像。スケールバー、５０μｍ。ｅ，ｈ，Ｐ４（ｅ）及びＤ７０（ｈ）での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝４）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。**Ｐ≦０．０１、***Ｐ≦０．００１。ｆ，ｉ，Ｐ４（ｆ）及びＤ７０（ｉ）での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、Forward and Side scatterプロファイルに対するＣＤ４５陽性細胞の割合を表す（１つの遺伝子型当たりｎ＝５）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。*Ｐ≦０．０５、**Ｐ≦０．０１。ｇ，示した遺伝子型を有するマウスのKaplan-Meier生存曲線。Ｈｏｉｌ−１E-KOマウス（ｎ＝１２）マウスと、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウス（ｎ＝２０）との比較を、統計解析のために提示した。Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスを、動物福祉に関するＵＫ内務省の規則に従って選別淘汰した。***Ｐ≦０．００１。コントロールマウスは、Ｈｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＨｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋（ｄ〜ｆ）又はＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウス（ｃ，ｇ〜ｉ）のプールを表す。
拡張データ図５：様々な日でのＨｏｉｐE-KOマウス及びＨｏｉｌ−１E-KOマウスの分析を示す。ａ，ｂ，示した時間で示した染色及び対応する定量（ＴＵＮＥＬ（赤色）及びＣＣ３抗体（緑色））を行なった、ＨｏｉｐE-KOマウスからの皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した（青色）。白色の破線は、表皮（上）と真皮（下）とを分ける。矢印は濃縮核を示す。スケールバー、５０μｍ。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。*Ｐ≦０．０５、**Ｐ≦０．０１（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。ｃ，Ｐ２での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚サンプル中における免疫細胞のフローサイトメトリー分析。棒グラフは、Forward and Side scatterプロファイルに対する示した免疫細胞亜集団の割合を表す（１つの遺伝子型当たりｎ＝５）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。*Ｐ≦０．０５、***Ｐ≦０．００１。ｄ，ｅ，Ｐ０（ｄ）及びＰ２（ｆ）で示したように染色した、示した遺伝子型を有するマウスの皮膚切片の代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。矢印は濃縮核を示す。核をDAPIで染色した（青色）。スケールバー、５０μｍ。ｆ，ｇ，Ｐ０（ｆ）及びＰ２（ｇ）での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝３）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。*Ｐ≦０．０５、**Ｐ≦０．０１、ＮＳ＝有意ではない。ＣＣ３＝切断されたカスパーゼ−３。コントロールマウスは、Ｈｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＨｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋又はＨｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＨｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋（ａ〜ｇ）のプールを表す。
拡張データ図６：成体マウスのケラチノサイトにおいてＨＯＩＰが欠失した場合には、細胞死が炎症に先行することを示す。ａ，ビヒクル又は４−ＯＨＴによる１回、２回、又は３回の処置の後に分析し、示したように染色した、Ｈｏｉｐfl/flＫ１４ＣｒｅＥＲtamマウスの代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝３）。矢印：濃縮核、星：免疫浸潤。核をDAPIで染色した（青色）。スケールバー、５０μｍ。ｂ，（ａ）と同様に処置したＨｏｉｐfl/flＫ１４ＣｒｅＥＲtamマウスの皮膚切片におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝３）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。***Ｐ≦０．００１、ＮＳ＝有意ではない。ｃ，ImageJを使用して全体の蛍光強度を測定することにより、ａと同様に処置したＨｏｉｐfl/flＫ１４ＣｒｅＥＲtamマウスからの皮膚切片におけるＣＤ４５染色の定量を実施した。ＮＳ＝有意ではない（１つの遺伝子型当たりｎ＝３のマウス）。ａｕ＝任意の単位。ｄ，ＨｏｉｐE-KOマウス及びコントロールマウスに由来するＰＭＫを、エタネルセプト（Enbrel（登録商標））［５０μｇ／ｍｌ］と共に又はなし（ＮＴ）で培養した。CellTiter-Gloアッセイにより細胞生存率（％）を測定した。結果を、平均値±ｓ．ｅ．ｍで表す（１つの遺伝子型当たりｎ＝７のマウス）。*Ｐ≦０．０５、**Ｐ≦０．０１、***Ｐ≦０．００１。コントロールマウスは、Ｈｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＨｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋のプールを表す。
拡張データ図７：ＲＩＰＫ３／ＭＬＫＬにより媒介されるネクロトーシスの欠失は、ＬＵＢＡＣ特異的ケラチノサイト欠損マウスの表現型には影響を及ぼさないことを示す。ａ，ｇ，示した遺伝子型を有するマウスの交配の後に得られた動物の遺伝子型統計を示す表。Mendelian度数（Mendelian frequency）に従って、得られた（離乳した）動物の数と、予想される動物の数とを報告する。ｂ，ｈ，Ｐ５での、示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像。ｃ，ｉ，Ｐ０（ｃ）及びＰ４（ｉ）で示したように染色した、示した遺伝子型を有するマウスの皮膚切片の代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝４）。矢印は濃縮核を示す。核をDAPIで染色した（青色）。スケールバー、５０μｍ。ｄ，ｊ，Ｐ０（ｄ）及びＰ４（ｊ）での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝４）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍ．表す。*Ｐ≦０．０５、ＮＳ＝有意ではない。ｅ，ｋ，示した遺伝子型（上部のパネル）を有するマウスにおける、ＴＵＮＥＬ（赤色）及びＣＣ３抗体（緑色）で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した（青色）。白色の破線は、表皮（上）と真皮（下）とを分ける。スケールバー、５０μｍ。示した遺伝子型（下部のパネル）を有するマウスからの皮膚切片中におけるＴＵＮＥＬ陽性細胞及びＣＣ３陽性細胞の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝３）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。*Ｐ≦０．０５、**Ｐ≦０．０１。ＣＣ３：切断されたカスパーゼ−３。ｆ，示した遺伝子型を有するマウスに由来する示した臓器におけるＭＬＫＬ発現のウエスタンブロット分析。コントロールマウスは、Ｒｉｐｋ３KO；Ｈｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＲｉｐｋ３KO；Ｈｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウス（ｂ〜ｅ）、並びにＭｌｋｌKO；Ｈｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＭｌｋｌKO；Ｈｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウス（ｈ〜ｋ）のプールを表す。
拡張データ図８：ＲＩＰＫ３及びカスパーゼ−８の複合的な欠失により、Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスの致死的炎症表現型が完全の防止されることを示す。ａ，示した遺伝子型を有するマウスの交配の後に得られた動物の遺伝子型統計を示す表。Mendelian度数に従って、得られた（離乳した）動物の数と、予想される動物の数とを報告する。ｂ，ｇ，示した表現型を有するマウスの代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝４（ｂ）及び１１（ｇ））。ｃ，生後から指定した日数での、示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片の表皮厚の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝３）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。*Ｐ≦０．０５、ＮＳ＝有意ではない。ｄ，示した遺伝子型を有するマウスにおける、ＴＵＮＥＬ（赤色）及びＣＣ３抗体（緑色）で二重に染色した皮膚切片の代表的な画像。核をDAPIで染色した（青色）。白色の破線は、表皮（上）と真皮（下）とを分ける。スケールバー、５０μｍ。ｅ，約７ヶ月での、示した遺伝子型を有するマウスからの軸リンパ節及び脾臓の代表的な画像。ｆ，Ｄ２０で示したように染色した、示した遺伝子型を有するマウスの皮膚切片の代表的な画像（１つの遺伝子型当たりｎ＝３）。矢印は濃縮核を示す。核をDAPIで染色した（青色）。スケールバー、５０μｍ。ｈ，示した遺伝子型を有するマウスからの皮膚切片における、ＴＵＮＥＬ陽性細胞及びＣＣ３陽性細胞の定量（１つの遺伝子型当たりｎ＝３）。エラーバーは、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。*Ｐ≦０．０５。ＣＣ３：切断されたカスパーゼ−３。コントロールマウスは、ＭｌｋｌKO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｐfl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＭｌｋｌKO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｐfl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋（ｂ）又はＲｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−、Ｒｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋又はＲｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO/WT；Ｈｏｉｌ−１fl/fl；Ｋ１４−Ｃｒｅ−及びＲｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO/WT；Ｈｏｉｌ−１fl/wt；Ｋ１４−Ｃｒｅ＋マウス（ｃ、ｄ、ｆ〜ｈ）のプールを表す。
拡張データ図９：ＴＬＲ３、ＣＤ９５のＤＤ、又はＴＲＡＩＬ−Ｒの欠失のみでは、ＴＮＦＲ１非依存性の皮膚炎を予防するには不十分であることを示す。ａ，示した遺伝子型を有するマウスの代表的な画像。ｂ，Kaplan-Meier生存曲線、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスと、示した遺伝子型を有するマウスとの比較を、統計解析のために提示した。Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝２１）、Ｔｒａｉｌ−ｒKO；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝１１）、Ｔｌｒ３KOＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝６）、及びＣｄ９５E-DD；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO（ｎ＝１５）。ｃ，示した遺伝子型を有するマウスの寿命。
【実施例】
【０１６６】
実施例１−概要
本発明者らは現在、マウスにおける疾患モデルを開発しており、この疾患モデルでは、動物は、２０１１年及び２０１３年での本発明者らの研究6,7で本発明者らが利用したモデルと比べて重症の炎症性皮膚疾患を発症する。
【０１６７】
具体的には、直鎖状ユビキチン鎖集合複合体（linear ubiquitin chain assembly complex）（ＬＵＢＡＣ）6〜9の構成成分であるＳＨＡＲＰＩＮは、TNFにより誘発されるRIPK1キナーゼ活性依存性細胞死を阻害することにより、炎症を予防する7,8,10。
【０１６８】
本モデルでは、本発明者らは、他の２種のＬＵＢＡＣ構成成分ＨＯＩＰ又はＨＯＩＬ−１11〜13のいずれかでのケラチノサイト特異的欠失（ＨｏｉｐE-KOマウス及びＨｏｉｌ−１E-KOマウス）により出生後の致死性皮膚炎症が引き起こされることを示す。
【０１６９】
ＳＨＡＲＰＩＮ変異動物とは対照的に、ＨｏｉｐE-KOマウス及びＨｏｉｌ−１E-KOマウスでは、ＴＮＦＲ１の欠失は致死性皮膚炎を抑止せず、遅延させるだけであった。ＴＮＦＲ１の遺伝的アブレーションにより、この受容体を介した細胞死誘発が完全に不活性化され、遺伝子活性化も完全に不活性化される。このことは、これらの新規モデルでは、ＴＮＦＲ１により媒介されるシグナル伝達が炎症の一因となるが、炎症の唯一の原因ではないことを意味する。
【０１７０】
本発明者らは、ＴＲＡＩＬ−Ｒ、ＴＬＲ３の構成的欠失、又はケラチノサイトにおけるＣＤ９５のデスドメイン（ＤＤ）の特異的欠失のいずれかとの、ＴＮＦＲ１の複合的な構成的欠失は、ＴＮＦＲ１を構成的に欠失させた場合と比較して炎症の発症をそれ以上遅延させないことを発見した。
【０１７１】
しかしながら、際立ったことに、ＴＮＦＲ１の構成的欠失は、ＴＲＡＩＬ−Ｒの構成的欠失及びケラチノサイトにおけるＣＤ９５のＤＤの特異的欠失と組み合わせた場合には、得られたマウスにおける任意の炎症性症候群の発症を予想外にも予防した。
【０１７２】
そのため、ＴＮＦＲ１の非存在下では、ＣＤ９５Ｌ及びＴＲＡＩＬは一緒に、細胞死を誘発することにより致死性皮膚炎を引き起こす原因となる。
【０１７３】
さらに、本発明者らはまた、ＴＮＦＲ１の欠失と、ＴＲＡＩＬ−Ｒ及びＴＬＲ３の欠失とを組み合わせることにより、皮膚炎症は完全には予防されないが、重度の皮膚炎症疾患が有意に寛解されることも発見した。
【０１７４】
まとめると、この研究は、皮膚炎の病因として、細胞死受容体により媒介される異常な細胞死を明らかにし、ＴＮＦＲ１の非存在下で起こるか又はＴＮＦがブロックされた場合に起こる自己炎症及び自己免疫の機序に新たな光を当てる。
【０１７５】
本発明者らの結果は、細胞死病因を有するがＴＮＦ阻害に対して抵抗性である（と現在は考えられる）自己免疫疾患の患者が、ＴＮＦ阻害と、ＴＲＡＩＬ及びＣＤ９５Ｌか又は本明細書で説明されているような他の標的の阻害との組み合わせから利益を得る可能性があることをさらに示唆する。重要なことに、この新規の処置パラダイムは、現在ＴＮＦ阻害が成功裏に使用されている自己免疫疾患を超えて広がる可能性がある。
【０１７６】
説明及び実施例１の参考文献
1  Kalliolias, G. D. & Ivashkiv, L. B. TNF biology, pathogenic mechanisms and em      erging therapeutic strategies. Nature reviews. Rheumatology 12, 49-62, doi      :10.1038/nrrheum.2015.169 (2016).
2  Monaco, C., Nanchahal, J., Taylor, P. & Feldmann, M. Anti-TNF therapy: past,       present and future. International immunology 27, 55-62, doi:10.1093/intimm      /dxu102 (2015).
3  Lopetuso, L. R. et al. Can We Predict the Efficacy of Anti-TNF-alpha Agents?       Int J Mol Sci 18, doi:10.3390/ijms18091973 (2017).
4  Cho, J. H. & Feldman, M. Heterogeneity of autoimmune diseases: pathophysiolog      ic insights from genetics and implications for new therapies. Nature medic      ine 21, 730-738, doi:10.1038/nm.3897 (2015).
5  Roda, G., Jharap, B., Neeraj, N. & Colombel, J. F. Loss of Response to Anti-T      NFs: Definition, Epidemiology, and Management. Clin Transl Gastroenterol 7      , e135, doi:10.1038/ctg.2015.63 (2016).
6  Gerlach, B. et al. Linear ubiquitination prevents inflammation and regulates       immune signalling. Nature 471, 591-596, doi:10.1038/nature09816 (2011).
7  Rickard, J. A. et al. TNFR1-dependent cell death drives inflammation in Sharp      in-deficient mice. eLife 3, doi:10.7554/eLife.03464 (2014).
8  Walczak, H. TNF and ubiquitin at the crossroads of gene activation, cell deat      h, inflammation, and cancer. Immunological reviews 244, 9-28, doi:10.1111/      j.1600-065X.2011.01066.x (2011).
9  Peltzer, N., Darding, M. & Walczak, H. Holding RIPK1 on the Ubiquitin Leash i      n TNFR1 Signaling. Trends in cell biology, doi:10.1016/j.tcb.2016.01.006 (      2016).
10  Ward-Kavanagh, L. K., Lin, W. W., Sedy, J. R. & Ware, C. F. The TNF Receptor       Superfamily in Co-stimulating and Co-inhibitory Responses. Immunity 44, 1      005-1019, doi:10.1016/j.immuni.2016.04.019 (2016).
11  Zinngrebe, J. & Walczak, H. TLRs Go Linear - On the Ubiquitin Edge. Trends i      n molecular medicine 23, 296-309, doi:10.1016/j.molmed.2017.02.003 (2017).      
12  Vanden Berghe, T., Linkermann, A., Jouan-Lanhouet, S., Walczak, H. & Vandena      beele, P. Regulated necrosis: the expanding network of non-apoptotic cell       death pathways. Nature reviews. Molecular cell biology 15, 135-147, doi:10      .1038/nrm3737 (2014).
13  von Karstedt, S., Montinaro, A. & Walczak, H. Exploring the TRAILs less trav      elled: TRAIL in cancer biology and therapy. Nature reviews. Cancer 17, 352      -366, doi:10.1038/nrc.2017.28 (2017).
14  Wick, W. et al. A phase II, randomized, study of weekly APG101+reirradiation       versus reirradiation in progressive glioblastoma. Clinical cancer researc      h : an official journal of the American Association for Cancer Research 20      , 6304-6313, doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-0951-T (2014).
15  Tuettenberg, J. et al. Pharmacokinetics, pharmacodynamics, safety and tolera      bility of APG101, a CD95-Fc fusion protein, in healthy volunteers and two       glioma patients. Int Immunopharmacol 13, 93-100, doi:10.1016/j.intimp.2012      .03.004 (2012).
17  Cheng, K., Wang, X. & Yin, H. Small-molecule inhibitors of the TLR3/dsRNA co      mplex. J Am Chem Soc 133, 3764-3767, doi:10.1021/ja111312h (2011).
【０１７７】
実施例２−炎症の哺乳類モデル
ＬＵＢＡＣは、ＴＮＦＲ１等のいくつかの先天性免疫応答及び適応免疫応答により引き起こされる遺伝子活性化及び細胞死経路の主要な調節因子である19〜21。ＳＨＡＲＰＩＮ欠損マウス（慢性増殖性皮膚炎マウス（ｃｐｄｍ）とも称される）は、ＴＮＦ／ＴＮＦＲ１により誘発されるＲＩＰＫ１キナーゼ活性依存性の異常な細胞死7,8,10,25により引き起こされる重度の皮膚炎症に罹患する22〜24。
【０１７８】
ＨＯＩＰは、中心的な且つ触媒的に活性なＬＵＢＡＣ構成成分であり11,13、ＨＯＩＰの欠損は胚性致死をもたらす26。皮膚恒常性におけるＨＯＩＰの役割を理解するために、本発明者らは、表皮ケラチノサイトにおいて選択的にＨＯＩＰを欠くマウス（ＨｏｉｐE-KOマウス）を作成した（拡張データ図１ａ〜ｃ）。ＨＯＩＰ欠損は、ＴＮＦＲ１シグナル伝達複合体（ＴＮＦＲ１−ＳＣ）での直鎖状ユビキチン化を抑止し（拡張データ図１ｄ）、ＨｏｉｐE-KOマウスからの初代マウスケラチノサイト（ＰＭＫ）におけるＴＮＦＲ１により媒介されるＮＦ−κＢ活性化を減少させた（拡張データ図１ｅ）。これらのマウスは、重度の損傷を受けた鱗状の皮膚を迅速に発症し、その結果、Ｐ４〜Ｐ６で常に死亡した（図１ａ）。Ｐ４でのＨｏｉｐE-KOマウスの組織学的分析により、表皮厚の増加、錯角化、角質増殖、及びケラチノサイト分化障害が明らかになった（図１ｂ、及び拡張データ図１ｆ）。これらの特徴は、切断されたカスパーゼ−３及びＴＵＮＥＬ染色の増加により実証されるように、骨髄細胞浸潤及び高レベルの細胞死を伴っていた（図１ｂ、ｃ、及び拡張データ図１ｇ）。まとめると、これらの観察から、ＨｏｉｐE-KOマウスが、炎症及び異常なケラチノサイト死を特徴とする致死性皮膚炎を発症していることが明らかになる。
【０１７９】
ケラチノサイトにおけるＨＯＩＰの急性欠失の影響を評価するために、本発明者らは、皮膚の局所領域において、４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）で成体Ｈｏｉｐfl/flＫ１４ＣｒｅＥＲTam成体マウスを処置した。この皮膚領域は、表皮肥厚、過形成、角質増殖及び錯角化、並びにケラチノサイト分化障害を示しており（図１ｄ、ｅ、及び拡張データ図１ｈ、ｉ）、免疫細胞浸潤及び細胞死の増加を伴っていた（図１ｅ、ｆ、及び拡張データズ１ｈ、ｊ、ｋ）。このことはＨｏｉｐE-KOマウスの皮膚表現型を連想させ、成体マウスにおいて皮膚恒常性を維持するためにはＨＯＩＰも必要であることが実証される。
【０１８０】
実施例３−炎症の哺乳類モデルにおけるＴＮＦＲ１及びＲＩＰＫ１
ｃｐｄｍマウスで観察した炎症性表現型は、ＴＮＦ、ＴＮＦＲ１の非存在によるか又はＲＩＰＫ１のキナーゼ死バージョンにより完全に救出されることから7,8,10、本発明者らは、次に、ＴＮＦＲ１の遺伝的アブレーション又はＲＩＰＫ１のキナーゼ活性の遺伝的アブレーションによっても、ＨｏｉｐE-KOマウスにおける病的状態及び死亡が予防され得るかどうかを試験した。
【０１８１】
しかしながら、予想外にも、重度の皮膚病変が連続的に発症され、その結果、生存期間の中央値が７０日であったことから、Ｔｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KOマウスでは、炎症は遅延されるだけであった（図１ｇ、及び拡張データ図２ａ）。病的なＴｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KOマウスは、表皮の破壊、肥厚、錯角化、及び角質増殖を呈した（図１ｈ、及び拡張データズ２ｂ）。重要なことに、コントロール動物と比較して、成体Ｔｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KOマウスの表皮では、骨髄細胞及びリンパ球細胞の浸潤と細胞死とが有意に増加していた（図１ｈ、ｉ、及び拡張データ図２ｃ）。
【０１８２】
驚くべきことに、ＲＩＰＫ１のキナーゼ活性の遺伝的アブレーションは、致死性皮膚炎の予防においてＴＮＦＲ１アブレーションと比べてはさらに低い効率であり、なぜならば、ＲＩＰＫ１D138N；ＨｏｉｐE-KOマウスは、重度の皮膚疾患の徴候を示す約Ｐ８で死亡したからである（拡張データ図３）。そのため、ケラチノサイトにおけるＨＯＩＰ欠損により引き起こされる致死性皮膚炎は、ＲＩＰＫ１のキナーゼ活性により部分的にのみ媒介され、且つＴＮＦＲ１の非存在下であっても発生する。
【０１８３】
実施例４−炎症のさらなる哺乳類モデル
本発明者らは、次に、皮膚恒常性における、第３のＬＵＢＡＣ構成成分であるＨＯＩＬ−１の役割を調べた。他で作成されたＨＯＩＬ−１欠損マウスは健康であることが報告されていたが27、本発明者らは、ケラチノサイトにおけるＨＯＩＬ−１の欠如（Ｈｏｉｌ−１E-KOマウス）（拡張データ図４ａ〜ｄ）により、上皮細胞死が増加している重度の皮膚炎により引き起こされる出生後致死がもたらされることを発見した（図２ａ〜ｃ、及び拡張データ図４ｅ、ｆ）。これはＨｏｉｐE-KOマウスの表現型を再現しており、これにより、ＨＯＩＬ−１は、表皮細胞死及び致死性皮膚炎症の予防においてＨＯＩＰと同様に重要であることが実証される。この発見は、ＨＯＩＰの構成的欠失と同様に26、ＨＯＩＬ−１の構成的欠失によっても胚性致死が引き起こされるという本発明者らの最近の観察と一致している（Peltzer他、原稿修正中）。
【０１８４】
実施例３の発見と同様に、成体Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスは、Ｔｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KOマウスの表現型に類似する免疫細胞浸潤及び表細胞死の増加を特徴とする皮膚炎の発症後７０日の生存期間の中央値を示した（図２ｄ〜ｆ、及び拡張データ図４ｇ〜ｉ）。このことは、ＨＯＩＰ又はＨＯＩＬ−１のいずれかのケラチノサイト特異的欠失の場合には、皮膚炎症への影響が、ＴＮＦＲ１シグナル伝達の調節を超えて広がることを実証する。
【０１８５】
本発明者らは、次に、ＨｏｉｐE-KOマウス及びＨｏｉｌ−１E-KOマウスにおける異常細胞死と炎症との間の時間的関係を調べた。ＨｏｉｐE-KOマウス及びＨｏｉｌ−１E-KOマウスの表皮における細胞死の増加は、Ｅ１８．５で子宮内内において及び出生時（Ｐ０）で既に明らかであった（図３ａ、及び拡張データ図５ａ、ｂ）。このことは、ケラチノサイトにおける直鎖状ユビキチン化の欠如により滅菌条件下で異常な細胞死がもたらされることを暗示する。ＨｏｉｐE-KOマウス及びＨｏｉｌ−１E-KOマウスは、Ｐ２及びＰ４でのみ免疫細胞浸潤の異常な増加を示し、出生時には示さなかった（図１、２、３ｂ、ｃ及び拡張データ図１ｇ、４ｆ、５ｃ）。従って、ケラチノサイト分化及び表皮厚は、Ｐ２及びＰ４で異常であるように見えたが、Ｅ１８．５又はＰ０ではそうは見えなかった（図１、２、及び拡張データ図５ａ、ｄ〜ｇ）。
【０１８６】
さらに、４−ＯＨＴ処置したＨｏｉｐfl/flＫ１４ＣｒｅＥＲTamマウスは、免疫細胞浸潤が明らかになる前に細胞死の増加を一貫して示した（拡張データ図６ａ〜ｃ）。そのため、過剰な細胞死は炎症反応に先行しており、ケラチノサイトにおけるＨＯＩＰ又はＨＯＩＬ−１の欠失時に細胞死が致死性皮膚炎を引き起こすことが示唆される。
【０１８７】
実施例５−炎症の哺乳類モデルにおける細胞死誘発の機序
ＨｏｉｐE-KOマウス及びＨｏｉｌ−１E-KOマウスの皮膚における細胞死誘発の機序を理解するために、本発明者らは、最初に、これらの動物に由来するＰＭＫにおけるアダプタータンパク質ＦＡＤＤを免疫沈降させることにより、細胞死受容体の下流で細胞死を引き起こすことが知られているシグナル伝達プラットフォームの形成28を分析した。これにより、たとえ外因性刺激がなくても、ＨＯＩＰ欠損ではＦＡＤＤ／カスパーゼ−８／ＲＩＰＫ１含有複合体が容易に検出可能であるが、コントロールＰＭＫではそうではないことが明らかになった（図３ｄ）。そのような複合体によるアポトーシスシグナル伝達と一致して、ＨＯＩＰ欠損細胞はまた、外因性刺激の非存在下であっても生存能力が低かった（図３ｅ）。
【０１８８】
この生存率の低下は、ZVAD又はnecrostatin-1sそれぞれとのインキュベーションによるカスパーゼ又はＲＩＰＫ１の活性の阻害により防止されたが、ＲＩＰＫ３活性の阻害では防止されなかった（図３ｅ）。
【０１８９】
ＴＮＦＲ１の遺伝的アブレーション又はＴＮＦの阻害もまた、生存率を回復した（図３ｆ、及び拡張データ図６ｄ）。これらの結果は、ＰＭＫにおいて、ＨＯＩＰは、自己分泌ＴＮＦにより引き起こされた異常なＲＩＰＫ１キナーゼ依存性アポトーシスを防止することを示す。さらに、インビボでのアポトーシスの調節はより複雑であると思われ、なぜならば、ＲＩＰＫ１キナーゼ活性又はＴＮＦＲ１の遺伝的アブレーションはＨｏｉｐE-KOマウスの皮膚炎を予防しなかったからである。
【０１９０】
実施例６−炎症の哺乳類モデルにける細胞死誘発でのアポトーシス及びネクロトーシスの役割
過剰な細胞死が、ＨｏｉｐE-KOマウス及びＨｏｉｌ−１E-KOマウスにおける致死性皮膚炎の原因であり得るかどうかを評価するために、本発明者らは、最初に、ネクロトーシスの役割を調べた。
【０１９１】
インビボで観察したアポトーシス細胞死と一致して、Ｈｏｉｌ−１E-KOにおけるＲｉｐｋ３の遺伝的アブレーション及びＨｏｉｐE-KOマウスにおけるＭｌｋｌの遺伝的アブレーションは、出生後致死をもたらす細胞死及び皮膚炎症を予防し得なかった（図３ｈ、ｉ、及び拡張データ図７）。
【０１９２】
従って、本発明者らは、次に、ＭｌｋｌKO；ＨｏｉｐE-KOマウス及びＲｉｐｋ３KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスにおいてカスパーゼ−８を欠失させることにより、アポトーシスの役割を調べた。意外なことに、ＭｌｋｌKO；カスパーゼ−８KO；ＨｏｉｐE-KOマウス及びＲｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスの両方が、皮膚疾患のいかなる徴候も示すことなく成体期に達した（図３ｇ、及び拡張データ８ａ〜ｂ）。一貫して、Ｒｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスでは表皮構造及びケラチノサイト分化は完全に正常であり、この動物は、その皮膚において細胞死や免疫細胞浸潤の増加を示さなかった（図３ｈ〜ｊ、及び拡張データ図８ｃ、ｄ）。Ｒｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスは、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスが重度の皮膚炎で死亡した７０日を超えて良好に生存したが（図３ｋ、及び拡張データ図４ｇ）、ＲＩＰＫ３及びカスパーゼ−８が欠損したマウスに関して既に報告されているように29,30、リンパ節腫脹及び脾腫大のために屠殺しなければならなかった（拡張データ図８ｅ）。
【０１９３】
注目すべきことに、カスパーゼ−８の異型接合性は、Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスの生存期間をＰ７〜Ｐ９まで延長し得（図３ｋ）、Ｒｉｐｋ３KO；カスパーゼ−８KO/WT；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスは、約２０日で致死性皮膚炎を発症した（図３ｋ、及び拡張データ図８ｆ〜ｈ）。まとめると、これらの結果から、ケラチノサイトにおいてＨＯＩＰ又はＨＯＩＬ−１を欠くマウスでは、カスパーゼ８により媒介されるアポトーシスが致死性皮膚炎の原因であることが実証される。対照的に、カスパーゼ−８KO/WT；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスでは、ネクロトーシスは皮膚炎症にのみ寄与するが、実施的なアポトーシス成分が残っていることから唯一の原因ではない。
【０１９４】
実施例７−炎症の哺乳類モデルにおけるＴＮＦＲ１非依存性細胞死
次いで、本発明者らは、ＬＵＢＡＣ−ケラチノサイト特異的欠損マウスにおいて、致死性炎症の原因となるＴＮＦＲ１非依存性細胞死を研究した。
【０１９５】
本発明者らは、最初に、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスにおける細胞死のメディエータを同定することを目指した。
【０１９６】
Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスに由来するＰＭＫは、ＴＮＦ関連アポトーシス誘発リガンド（ＴＲＡＩＬ）、ＣＤ９５（Ｆａｓ／ＡＰＯ−１）リガンド（ＣＤ９５Ｌ）、又はポリイノシン酸：ポリシチジル酸（Ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ））による刺激時に、他の細胞型での本発明者らの以前の発見と一致して21,32、コントロールと比較して細胞生存率の低下を示した（図４ａ）。従って、本発明者らは、次に、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスにおいて、全身的にＴＲＡＩＬ−Ｒ又はＴＬＲ３を遺伝的アブレートしたか、又はケラチノサイトにおいて特異的にＣＤ９５のデスドメイン（ＤＤ）を遺伝的アブレートした。しかしながら、残念なことながら、得られたＴｒａｉｌ−ｒKO；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウス、Ｔｌｒ３KO；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウス、及びＣｄ９５E-DD；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスは全て、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスのものとは強度が識別不能な皮膚病変に罹患した（図４ｃ、及び拡張データ図９ａ、ｂ）。
【０１９７】
この残念な結果にもかかわらず、本発明者らは、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスにおいてＴＲＡＩＬ−Ｒ及びＴＬＲ３を共欠失させ、Ｄ７０での、得られたＴｒａｉｌ−ｒKO；Ｔｌｒ３KO；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスにおいて、一時的ではあるが有意な皮膚炎症の寛解を観察した（図４ｂ、ｃ）。しかしながら、このマウスは、約Ｄ８０にて炎症性皮膚疾患で死亡した（図４ｄ）。
【０１９８】
本発明者らは、次に、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスにおいて、ＴＲＡＩＬ−Ｒの欠失と、ＣＤ９５のＤＤのケラチノサイト特異的欠失とを組み合わせた。際立ったことに、このことにより、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスと比較して、得られたＣｄ９５E-DD；Ｔｒａｉｌ−ｒKO；Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスにおいて、Ｄ７０での皮膚炎の完全な予防と、生存期間の有意な延長とがもたらされた（図４ｂ〜ｄ）。
【０１９９】
従って、本発明者らは、ＣＤ９５に誘発される細胞死及びＴＲＡＩＬ−Ｒにより誘発される細胞死は、Ｔｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KOマウスにおいて互いに補償して炎症を引き起こし得ると、並びに両方の系が同時に不活性化された場合にのみＴＮＦＲ１非依存性疾患が予防され得ると結論付ける。
【０２００】
本発明者らは、次に、Ｔｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KOマウスの病理におけるネクロトーシスの役割を研究した。Ｔｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KOマウスでのＭＬＫＬの欠失は皮膚炎の進行を有意に遅延させており、なぜならば、ＭｌｋｌKO；Ｔｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KOマウスは、Ｔｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KOマウスと比較した場合にＤ７０で軽度の病変を有したからである（図４ｂ、ｃ）。しかしながら、このマウスは、重度の皮膚炎に起因して約Ｄ９０で死亡した（図４ｄ）。従って、ネクロトーシスはＴＮＦＲ１非依存性疾患の一因となっているが唯一の原因ではなく、なぜならば、持続的なアポトーシスは、この疾患を引き起こすには十分であるからである。
【０２０１】
実施例８−実施例２〜７からの結論
まとめると、本発明者らの研究は、致死性皮膚炎の予防におけるＨＯＩＰ及びＨＯＩＬ−１の重要な且つこれまで未知の生理的役割を明らかにする。この皮膚炎症は、ケラチノサイトのＴＮＦＲ１依存性死により引き起こされるが、重要なことに、ケラチノサイトのＴＮＦＲ１非依存性死によっても引き起こされる（拡張データ図９ｃ）。
【０２０２】
さらに、本発明者らは、このＴＮＦＲ１非依存性細胞死は、ＴＲＡＩＬシグナル伝達系及びＣＤ９５Ｌシグナル伝達系の統合された作用により引き起こされることを認めた。
【０２０３】
この発見は、ＴＮＦの阻害という現在の処置パラダイムに勝る、自己炎症及び自己免疫の処置に対するいくつかの意味を持つ。
【０２０４】
第一に、本発明者らは、細胞死の予防は、トリガーに関係なく、自己免疫の処置におそらく有効な戦略と認める。
【０２０５】
第二に、本発明者らの研究は、ＴＮＦ、ＴＲＡＩＬ、及びＣＤ９５Ｌのブロッカーを含む組み合わせ処置が、ＴＮＦ阻害単独の恩恵を受けず且つ疾患がＴＮＦ阻害に対して難治性と現在分類されている自己免患者に対して有益であり得る証拠を提供する。任意選択的に、本明細書で説明されているＲＩＰＫ１キナーゼ阻害又は他の阻害剤と併せて、本発明の方法は、ＴＮＦ阻害剤による処置に現在適している自己免疫を超える疾患にまで及ぶと予想され得る。
【０２０６】
実施例２〜８の方法
マウス。Ｈｏｉｐfl/flマウスは既に説明されている26。ターゲティングカセットが、Ｆｒｔ部位で挟まれたハイグロマイシン耐性カセットと、ｌｏｘＰ部位で挟まされたＨｏｉｌ−１遺伝子のエクソン１及び２とで構成されている遺伝子ターゲティング戦略により、Ｈｏｉｌ−１fl/fマウスを作成した。このマウスと、ＦｌｐＥリコンビナーゼを発現するマウスとを交配させることにより、このハイグロマイシンカセットを除去した34。ＨｏｉｐE-KOマウス及びＨｏｉｌ−１E-KOマウスを作成するために、ヒトケラチン１４プロモーター（Geert van Looから得た）12、株ＡＺＯ−Ｎｎ４Ｃｒｅ（Ｋ１４）の制御下で、Ｈｏｉｐfl/flマウス及びＨｏｉｌ−１fl/flマウスと、ＣｒｅＥリコンビナーゼを発現するマウスとを交配させた。ＭｌｋｌKOマウスを、ＴＡＬＥＮ技術を使用して作成した。簡潔に説明すると、Ｍｌｋｌ遺伝子のエクソン１を標的とするＴＡＬＥＮを、ゴールデンゲートアセンブリによりクローニングした。ＴＡＣＣＧＴＴＴＣＡＧＡＴＧＴＣＡに対するＴＡＬ１のＲＶＤ配列は、ＮＩ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＮ  ＮＧ  ＮＧ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩ  ＮＮ  ＮＩ  ＮＧ  ＮＮ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＩであり、ＴＣＧＡＴＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＣＣに対するＴＡＬ２は、ＨＤ  ＮＮ  ＮＩ  ＮＧ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＧ  ＨＤ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮ  ＨＤ  ＮＧ  ＮＮ  ＨＤ  ＨＤであった。キャップされたＲＮＡを、mMESSAGE mMACHINE（登録商標）T7 Transcription Kit(Ambion)を使用してインビトロで作製し、ポリＡテールを、Poly(A) Tailing Kit (Ambion)を使用して付加した。精製した転写産物を、混合して２５ｎｇ／μＬに調整した。受精卵を、細胞質及び前核の両方に注射した。胚を偽妊娠雌に移植した。耳パンチから得たゲノムＤＮＡを使用する配列決定により、仔の遺伝子型を決定した。早期停止コドンを生じる１９ｂｐのホモ接合欠失を持つ１匹の雌を、さらなる繁殖のために選択した。Ｋ１４ＣｒｅＥＲTamマウスは既に説明されている35。Ｔｎｆｒ１KOマウス、Ｔｌｒ３KOマウス、及びＣｄ９５−ＤＤflマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｆａｓｔｍ１Ｃｇｎ／Ｊ）を、Jackson Laboratoriesから購入した。Ｒｉｐｋ３KO 36、カスパーゼ−８KO 37、Ｔｒａｉｌ−ｒKO（Grosse-Wilde, A., Voloshanenko, O., Bailey, S.L., Longton, G.M., Schaefer, U., Csernok, A.I., Schutz, G., Greiner, E.F., Kemp, C.J., and Walczak, H. (2008). TRAIL-R deficiency in mice enhances lymph node metastasis without affecting primary tumor development. The Journal of clinical investigation 118, 100-110）。及びRipk1D138Nマウスは、既に説明されている38。成体マウスの皮膚においてＨＯＩＰの欠失を誘発するために、Ｈｏｉｐfl/flＫ１４ＣｒｅＥＲTamマウスを、既に説明されているように処置した39。簡潔に説明すると、背頸部の小さい剃毛領域を、示したように、合計１回、２回、３回、又は４回の処置で１日おきに、エタノールに溶解させた４−ヒドロキシタモキシフェン（４−ＯＨＴ）２０ｍｇ／ｍＬ  ５０μＬで処置した。ビヒクル処置として、尾部付近の小さい背領域を剃毛し、エタノールで処置した。Ｈｏｉｐfl/wtＫ１４ＣｒｅＥＲTamマウスを、タモキシフェンコントロールとして使用した。マウスを、最後の処置から２日後に又は図の凡例で示すように分析した。時限交配（timed mating）を、既に説明されているように実施した26。全てのマウスをＰＣＲ分析により分類した。コロニーに自由に給餌���た。全ての動物実験を、ＡＳＰＡ（animal (scientific procedure) Act 1986）に従って、動物福祉に関するＵＫ内務省の規則に従い、適切なＵＫプロジェクトライセンスの下で実行した。
【０２０７】
免疫染色及び定量。４μｍ厚のホルマリン固定パラフィン包埋皮膚切片を、標準的なプロトコルに従って染色した。簡潔に説明すると、切片を、マイクロ波中において１０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．０）中で沸騰させた。スライドを、Ｔｗｅｅｎ  ２０  ０．５％及びＢＳＡ  ０．２％を含む緩衝液中でブロックした。ＣＤ４５染色のために、スライドをRetrievagen A(BD)中で沸騰させ、Ｔｗｅｅｎを含まない緩衝液でブロックした。次に、スライドを、４℃で一晩、一次抗体と共にインキュベートした。下記の抗体を使用した：抗Ｋ１４、抗Ｋ１０、抗ロリクリン、及び抗Ｋ６（Covance）、抗Ｋｉ−６７（Abcam）、抗ＣＤ４５（BDbiosciences）、抗切断カスパーゼ−３（Cell Signaling）、抗ＨＯＩＰ（特注、Thermo Fisher Scientific）、抗ＨＯＩＬ−１11。スライドを、１時間にわたり室温（ＲＴ）で、下記の二次抗体と共にインキュベートした：Alexa Fluor 488 Goat anti-Rabbit IgG、594 Goat anti-Rabbit IgG（Invitrogen）、又はgoat anti-rat HRP（Cambridge bioscience）。ＨＲＰコンジュゲート抗体を使用した場合には、製造業者の指示に従って、TSA（商標）Plus Cyanine 3 System（Perkin Elmer）を適用した。切片をDAPI（Roche）で対染色した。或いは、既に説明されているプロトコル40に従って、BOND-III（Leica Microsystems）及びBenchMark Ultra（Ventana-Roche Medical System）に対して従来の免疫組織化学を実施した。切断されたカスパーゼ−３染色と組み合わせて実施するＴＵＮＥＬ染色のために、製造業者の指示に従って、ApopTag Red In Situ Apoptosis Detectionキット（Merck Millipore）を使用した。切片を蛍光顕微鏡で分析した。１枚のスライド当たり少なくとも１０枚の異なる画像（４０×）を取得した。表皮内の細胞の総数（DAPI陽性）に対する特異的染色に関する陽性の細胞の割合として、モノクロ画像に対してImageJ Softwareを使用することにより、サンプルの遺伝子型に対して盲検化された実験者により定量を実施した。
【０２０８】
表皮厚の定量。表皮厚を、１匹のマウス当たり少なくとも１０箇所の異なる領域にわたり１つの顕微鏡視野当たり５箇所の異なる位置で測定した。ImageJ Softwareを使用することにより、サンプルの遺伝子型に対して盲検化された実験者により定量を実施した。
【０２０９】
スコアリングシステム。マウスを、２種の主要な臨床基準に基づいて巨視的に評価した。病変の影響を受けた身体の各領域（頭部、頸部、背部、側腹部を含む）に１のスコアを付与し、これらの合計は、この病原がどのようにして拡大したかの情報を提供した。他の基準は、病変の下記の特徴：断続的な小さい外皮、癒合した外皮、及び潰瘍化（それぞれ１〜３のスコア）であった。両方の基準の合計は、病変の総重症度スコアを表した。スコアリングを、２名の独立した研究者により実施した。
【０２１０】
原発性マウスケラチノサイトの単離、培養、及び生存率。確立されたプロトコル41に従って、ＨｏｉｐE-KO新生仔、Ｔｎｆｒ１KO；ＨｏｉｐE-KO及びＴｎｆｒ１KO；Ｈｏｉｌ−１E-KO成体の尾部からＰＭＫを得た。簡潔に説明すると、皮膚を、４℃で一晩、カルシウム及びマグネシウムを含まないHBSS中の０．２５％ Trypsin（Stratech Scientific Ltd）と共にインキュベートした。翌日、真皮及び表皮を分離した。細胞懸濁液を、８％のキレートＦＣＳ及びペニシリン−ストレプトマイシン（Sigma）と共に、カルシウムを含まないEMEM（Lonza）中で培養した。ＰＭＫを、その後の実験のために、コラーゲンＩ（Life technologies）でプレーコートしたプレート中に播種した。ＰＭＫを、４日にわたり、２０μＭのZ-VAD-fmk（Abcam）、１０μＭのNecrostatin-1s（Cambridge Bioscience）、１μＭのＲＩＰＫ３阻害剤（GSK2399872B）、又は５０μｇ／ｍＬのエタネルセプト（Enbrel（登録商標））（Pfizer and Pentaglobin from Biotest）が補充された培地中で培養し、補充された培地を毎日交換した。最終日に、製造業者の指示に従って、CellTiter-Glo Luminescent Cell Viability Assay キット（Promega）を使用して、細胞生存率を測定した。或いは、ＰＭＫを、下記に示すリガンドで２４時間にわたり処理した：５０ｎｇ／ｍｌのマウスｉｚ−ＴＲＡＩＬ、５０ｎｇ／ｍｌのＣＤ９５Ｌ−Ｆｃ、又は１００μｇ／ｍｌのポリ（Ｉ：Ｃ）（Invitrogen）。
【０２１１】
ウエスタンブロッティング及び免疫沈降。ウエスタンブロッティングを、既に説明されているように実施した11。簡潔に説明すると、ＰＭＫを、２０分にわたり４℃で、ＩＰ−溶解緩衝液（３０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ［ｐＨ７．４］、１２０ｍＭのＮａＣｌ、２ｍＭのＥＤＴＡ、２ｍＭのＫＣｌ、１％  Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ＥＤＴＡ−フリープロテイナーゼ阻害剤カクテル（Roche）、及び１ｘホスファターゼ阻害剤カクテル２（Sigma）に溶解させた。溶解物を、１０分にわたり９５℃にて、還元性サンプル緩衝液及びＤＴＴで変性させた。タンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（NuPAGE）で分離し、ＨＯＩＰ（特注、Thermo Fisher Scientific)、ＨＯＩＬ−１11、Ｓｈａｒｐｉｎ（ProteinTech）、アクチン（Sigma）、チューブリン（Sigma）、ＦＡＤＤ（Santa Cruz）、ＲＩＰＫ１（BD）、切断されたカスパーゼ−８（Cell signalling）、ＭＬＫＬ（Millipore）、ＴＮＦＲ１（Abcam）、リン酸化ＩκＢα（Cell Signaling）、ＩκＢα（Cell Signaling）、及び直鎖状ユビキチン（Millipore）に対する抗体によるウエスタンブロッティングにより分析した。未変性ＴＮＦＲ１−ＳＣの単離及びＦＡＤＤ免疫沈降（ＩＰ）を、既に説明されているように実施した26。簡潔に説明すると、ＰＭＫを、２０μＭのZ-VAD-fmk（Abcam）の存在下で培養し、ＴＮＦＲ１−ＳＣの分析の場合には、示した時間にわたり０．５μｇ／ｍＬ  ３ｘＦｌａｇ−２ｘＳｔｒｅｐ−ＴＮＦで刺激したか、又は未処理のままであった。細胞溶解物を、１６時間にわたり、４２ビーズ（SIGMA; Schnelldorf, Germany）を使用して、抗Ｆｌａｇ  ＩＰにかけた。ＦＡＤＤ  ＩＰの場合には、溶解物を、４時間にわたり４℃にて、抗ＦＡＤＤ抗体（Santa Cruz）及びプロテインG Sepharose Beads（GE healthcare）と共にインキュベートした。
【０２１２】
フローサイトメトリー。皮膚サンプルから得た細胞懸濁液を、Fixable Viability Dye eFluor（登録商標）780（eBioscience）で蛍光標識した。次いで、サンプルを、下記の細胞表面マーカーに対する抗体で染色した：ＣＤ４５−ＡＰＣ、ＣＤ４５−ＡＦ７００、ＣＤ３−ＰｅｒＣＰ／Ｃｙ５．５、ＣＤ４−ＦＩＴＣ、ＣＤ８−ＰＥ／Ｃｙ７、ＧＲ１−ＦＩＴＣ、ＧＲ１−ＰＥ／Ｃｙ７、Ｆ４／８０−ＰＥ、Ｆ４／８０−ＢＶ７８６、ＣＤ１１ｂ−Ｐｅｒｃｐ／Ｃｙ５．５（Biolegend）、ＣＤ１９−ＢＶ６５０、及びＣＤ１９−ＰＥ  （Invitrogen）。サンプルをLSRFORTESSA X-20（BD）又はAccuri（BD）により取得し、FlowJoソフトウェアを使用して、その後のデータ解析を行なった。
【０２１３】
統計。データを、GraphPad Prism 6ソフトウェア（GraphPad Software）又はMicrosoft Excelで解析した。グラフに示したデータは、図の凡例に示すように、平均値±ｓ．ｅ．ｍを表す。予備的データセットを使用して、十分な検出力に必要な群サイズを決定した。統計解析を、対応のない両側スチューデントのｔ検定により実施した。生存曲線における統計的有意性を、対数順位検定を使用して決定した。＞０．０５のＰ値は有意でない（ＮＳ）と見なし、Ｐ≦０．０５を１個のアスタリスク（*）で示し、Ｐ≦０．０１（**）及びＰ≦０．００１（***）。全ての場合において、示されたＫＯマウスと、それぞれの同腹子コントロールとの間で比較を行なった。
【０２１４】
実施例２〜８の参考文献
7  Gerlach, B. et al. Linear ubiquitination prevents inflammation and regulates       immune signalling. Nature 471, 591-596, doi:10.1038/nature09816 (2011).
8  Rickard, J. A. et al. TNFR1-dependent cell death drives inflammation in Sharp      in-deficient mice. eLife 3, doi:10.7554/eLife.03464 (2014).
10  Kumari, S. et al. Sharpin prevents skin inflammation by inhibiting TNFR1-ind      uced keratinocyte apoptosis. eLife 3, doi:10.7554/eLife.03422 (2014).
11  Haas, T. L. et al. Recruitment of the linear ubiquitin chain assembly comple      x stabilizes the TNF-R1 signaling complex and is required for TNF-mediated       gene induction. Molecular cell 36, 831-844, doi:10.1016/j.molcel.2009.10.      013 (2009).
13  Tokunaga, F. et al. Involvement of linear polyubiquitylation of NEMO in NF-k      appaB activation. Nat Cell Biol, doi:10.1038/ncb1821 (2009).
19  Tokunaga, F. Linear ubiquitination-mediated NF-kappaB regulation and its rel      ated disorders. Journal of biochemistry 154, 313-323, doi:10.1093/jb/mvt07      9 (2013).
20  Shimizu, Y., Taraborrelli, L. & Walczak, H. Linear ubiquitination in immunit      y. Immunological reviews 266, 190-207, doi:10.1111/imr.12309 (2015).
21  Zinngrebe, J. et al. --LUBAC deficiency perturbs TLR3 signaling to cause imm      unodeficiency and autoinflammation. The Journal of experimental medicine,       doi:10.1084/jem.20160041 (2016).
22  HogenEsch, H. et al. A spontaneous mutation characterized by chronic prolife      rative dermatitis in C57BL mice. The American journal of pathology 143, 97      2-982 (1993).
23  HogenEsch, H., Janke, S., Boggess, D. & Sundberg, J. P. Absence of Peyer’s       patches and abnormal lymphoid architecture in chronic proliferative dermat      itis (cpdm/cpdm) mice. J Immunol 162, 3890-3896 (1999).
24  Seymour, R. E. et al. Spontaneous mutations in the mouse Sharpin gene result       in multiorgan inflammation, immune system dysregulation and dermatitis. G      enes Immun 8, 416-421, doi:6364403 [pii]10.1038/sj.gene.6364403 (2007).
25  Berger, S. B. et al. Cutting Edge: RIP1 kinase activity is dispensable for n      ormal development but is a key regulator of inflammation in SHARPIN-defici      ent mice. J Immunol 192, 5476-5480, doi:10.4049/jimmunol.1400499 (2014).
26  Peltzer, N. et al. HOIP deficiency causes embryonic lethality by aberrant TN      FR1-mediated endothelial cell death. Cell Rep 9, 153-165, doi:10.1016/j.ce      lrep.2014.08.066 (2014).
27  Tokunaga, F. et al. Involvement of linear polyubiquitylation of NEMO in NF-k      appaB activation. Nature cell biology 11, 123-132, doi:10.1038/ncb1821 (20      09).
28  Peltzer, N., Darding, M. & Walczak, H. Holding RIPK1 on the Ubiquitin Leash       in TNFR1 Signaling. Trends in cell biology, doi:10.1016/j.tcb.2016.01.006       (2016).
29  Kaiser, W. J. et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-defi      cient mice. Nature 471, 368-372, doi:10.1038/nature09857 (2011).
30  Oberst, A. et al. Catalytic activity of the caspase-8-FLIP(L) complex inhibi      ts RIPK3-dependent necrosis. Nature 471, 363-367, doi:10.1038/nature09852       (2011).
32  Lafont, E. et al. The linear ubiquitin chain assembly complex regulates TRAI      L-induced gene activation and cell death. The EMBO journal, doi:10.15252/e      mbj.201695699 (2017).
34  Rodriguez, C. I. et al. High-efficiency deleter mice show that FLPe is an al      ternative to Cre-loxP. Nature genetics 25, 139-140, doi:10.1038/75973 (200      0).
35  Vasioukhin, V., Degenstein, L., Wise, B. & Fuchs, E. The magical touch: geno      me targeting in epidermal stem cells induced by tamoxifen application to m      ouse skin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United S      tates of America 96, 8551-8556 (1999).
36  Newton, K., Sun, X. & Dixit, V. M. Kinase RIP3 is dispensable for normal NF-      kappa Bs, signaling by the B-cell and T-cell receptors, tumor necrosis fac      tor receptor 1, and Toll-like receptors 2 and 4. Molecular and cellular bi      ology 24, 1464-1469 (2004).
37  Salmena, L. et al. Essential role for caspase 8 in T-cell homeostasis and T-      cell-mediated immunity. Genes & development 17, 883-895, doi:10.1101/gad.1      063703 (2003).
38  Polykratis, A. et al. Cutting edge: RIPK1 Kinase inactive mice are viable an      d protected from TNF-induced necroptosis in vivo. J Immunol 193, 1539-1543      , doi:10.4049/jimmunol.1400590 (2014).
39  Weinlich, R. et al. Protective Roles for Caspase-8 and cFLIP in Adult Homeos      tasis. Cell reports, doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.celrep.2013.08.045 (2      013).
40  Marafioti, T. et al. Novel markers of normal and neoplastic human plasmacyto      id dendritic cells. Blood 111, 3778-3792, doi:10.1182/blood-2007-10-117531       (2008).
41  Lichti, U., Anders, J. & Yuspa, S. H. Isolation and short-term culture of pr      imary keratinocytes, hair follicle populations and dermal cells from newbo      rn mice and keratinocytes from adult mice for in vitro analysis and for gr      afting to immunodeficient mice. Nat Protoc 3, 799-810, doi:10.1038/nprot.2      008.50 (2008).
【０２１５】
表２及び３の参考文献
Arnason (1999). TNF neutralization in MS: results of a randomized, placebo-controlled multicenter study. The Lenercept Multiple Sclerosis Study Group and The University of British Columbia MS/MRI Analysis Group. Neurology 53, 457-465.
Cessak, G., Kuzawinska, O., Burda, A., Lis, K., Wojnar, M., Mirowska-Guzel, D., and Balkowiec-Iskra, E. (2014). TNF inhibitors - Mechanisms of action, approved and off-label indications. Pharmacol Rep 66, 836-844.
Boisson, B., Laplantine, E., Prando, C., Giliani, S., Israelsson, E., Xu, Z., Abhyankar, A., Israel, L., Trevejo-Nunez, G., Bogunovic, D., et al. (2012). Immunodeficiency, autoinflammation and amylopectinosis in humans with inherited HOIL-1 and LUBAC deficiency. Nat Immunol 13, 1178-1186.
Chaudhari, U., Romano, P., Mulcahy, L.D., Dooley, L.T., Baker, D.G., and Gottlieb, A.B. (2001). Efficacy and safety of infliximab monotherapy for plaque-type psoriasis: a randomised trial. Lancet 357, 1842-1847.
Cheng, K., Wang, X., and Yin, H. (2011). Small-molecule inhibitors of the TLR3/dsRNA complex. J Am Chem Soc 133, 3764-3767.
Cho, J.H., and Feldman, M. (2015). Heterogeneity of autoimmune diseases: pathophysiologic insights from genetics and implications for new therapies. Nature medicine 21, 730-738.
Croft, M., and Siegel, R.M. (2017). Beyond TNF: TNF superfamily cytokines as targets for the treatment of rheumatic diseases. Nature reviews. Rheumatology 13, 217-233.
Damgaard, R.B., Walker, J.A., Marco-Casanova, P., Morgan, N.V., Titheradge, H.L., Elliott, P.R., McHale, D., Maher, E.R., McKenzie, A.N.J., and Komander, D. (2016). The Deubiquitinase OTULIN Is an Essential Negative Regulator of Inflammation and Autoimmunity. Cell 166, 1215-1230 e1220.
Fausel, R., and Afzali, A. (2015). Biologics in the management of ulcerative colitis - comparative safety and efficacy of TNF-alpha antagonists. Ther Clin Risk Manag 11, 63-73.
Fauster, A., Rebsamen, M., Huber, K.V., Bigenzahn, J.W., Stukalov, A., Lardeau, C.H., Scorzoni, S., Bruckner, M., Gridling, M., Parapatics, K., et al. (2015). A cellular screen identifies ponatinib and pazopanib as inhibitors of necroptosis. Cell death & disease 6, e1767.
Fernandez-Nebro, A., Olive, A., Castro, M.C., Varela, A.H., Riera, E., Irigoyen, M.V., Garcia de Yebenes, M.J., and Garcia-Vicuna, R. (2010). Long-term TNF-alpha blockade in patients with amyloid A amyloidosis complicating rheumatic diseases. Am J Med 123, 454-461.
Gao W, Xiong Y, Li Q and Yang H (2017) Inhibition of Toll-Like Receptor Signaling as a Promising Therapy for Inflammatory Diseases: A Journey from Molecular to Nano Therapeutics. Front. Physiol. 8:508. doi: 10.3389/fphys.2017.00508
Hanauer, S.B., Feagan, B.G., Lichtenstein, G.R., Mayer, L.F., Schreiber, S., Colombel, J.F., Rachmilewitz, D., Wolf, D.C., Olson, A., Bao, W., et al. (2002). Maintenance infliximab for Crohn’s disease: the ACCENT I randomised trial. Lancet 359, 1541-1549.
Harris, P.A., Berger, S.B., Jeong, J.U., Nagilla, R., Bandyopadhyay, D., Campobasso, N., Capriotti, C.A., Cox, J.A., Dare, L., Dong, X., et al. (2017). Discovery of a First-in-Class Receptor Interacting Protein 1 (RIP1) Kinase Specific Clinical Candidate (GSK2982772) for the Treatment of Inflammatory Diseases. J Med Chem 60, 1247-1261.
Hoglen, N.C., Chen, L.S., Fisher, C.D., Hirakawa, B.P., Groessl, T., and Contreras, P.C. (2004). Characterization of IDN-6556 (3-[2-(2-tert-butyl-phenylaminooxalyl)-amino]-propionylamino]-4-oxo-5-(2,3,5,6-te trafluoro-phenoxy)-pentanoic acid): a liver-targeted caspase inhibitor. J Pharmacol Exp Ther 309, 634-640.
Jia, Z., Xu, C., Shen, J., Xia, T., Yang, J., and He, Y. (2015). The natural compound celastrol inhibits necroptosis and alleviates ulcerative colitis in mice. Int Immunopharmacol 29, 552-559.
Kearsley-Fleet, L., McErlane, F., Foster, H.E., Lunt, M., Watson, K.D., Symmons, D.P., and Hyrich, K.L. (2016). Effectiveness and safety of TNF inhibitors in adults with juvenile idiopathic arthritis. RMD Open 2, e000273.
Lee, R.A., and Eisen, D.B. (2015). Treatment of hidradenitis suppurativa with biologic medications. J Am Acad Dermatol 73, S82-88.
Li, D., Li, C., Li, L., Chen, S., Wang, L., Li, Q., Wang, X., Lei, X., and Shen, Z. (2016). Natural Product Kongensin A is a Non-Canonical HSP90 Inhibitor that Blocks RIP3-dependent Necroptosis. Cell Chem Biol 23, 257-266.
Liu, W., Wu, Y.H., Zhang, L., Liu, X.Y., Bin, X., Bin, L., Wang, Y., and Ji, Y. (2016). Efficacy and safety of TNF-alpha inhibitors for active ankylosing spondylitis patients: Multiple treatment comparisons in a network meta-analysis. Scientific reports 6, 32768.
Manns, M., Bichler, Z., Leske, O., and Heumann, R. (2010). Neuronal Ras activation inhibits adult hippocampal progenitor cell division and impairs spatial short-term memory. Genes Brain Behav 9, 525-536.
Mease, P.J. (2002). Tumour necrosis factor (TNF) in psoriatic arthritis: pathophysiology and treatment with TNF inhibitors. Ann Rheum Dis 61, 298-304.
Meijer, J.M., Pijpe, J., Bootsma, H., Vissink, A., and Kallenberg, C.G. (2007). The future of biologic agents in the treatment of Sjogren’s syndrome. Clin Rev Allergy Immunol 32, 292-297.
Ratziu, V., Sheikh, M.Y., Sanyal, A.J., Lim, J.K., Conjeevaram, H., Chalasani, N., Abdelmalek, M., Bakken, A., Renou, C., Palmer, M., et al. (2012). A phase 2, randomized, double-blind, placebo-controlled study of GS-9450 in subjects with nonalcoholic steatohepatitis. Hepatology 55, 419-428.
Roda, G., Jharap, B., Neeraj, N., and Colombel, J.F. (2016). Loss of Response to Anti-TNFs: Definition, Epidemiology, and Management. Clin Transl Gastroenterol 7, e135.
St Clair, E.W., Baer, A.N., Noaiseh, G., Parke, A., Coca, A., Utset, T., Genovese, M.C., Wallace, D.J., McNamara, J., Boyle, K., et al. (2015). The Clinical Efficacy and Safety of Baminercept, a Lymphotoxin-Beta Receptor Fusion Protein, in Primary Sjogren’s Syndrome: Results from a Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Phase II Trial. Arthritis & Rheumatology 67.
Stohl, W. (2013). Future prospects in biologic therapy for systemic lupus erythematosus. Nature reviews. Rheumatology 9, 705-720.
Tweedie, D., Sambamurti, K., and Greig, N.H. (2007). TNF-alpha inhibition as a treatment strategy for neurodegenerative disorders: new drug candidates and targets. Curr Alzheimer Res 4, 378-385.
Wick, W., Fricke, H., Junge, K., Kobyakov, G., Martens, T., Heese, O., Wiestler, B., Schliesser, M.G., von Deimling, A., Pichler, J., et al. (2014). A phase II, randomized, study of weekly APG101+reirradiation versus reirradiation in progressive glioblastoma. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research 20, 6304-6313.
Yang, H., Kozicky, L., Saferali, A., Fung, S.Y., Afacan, N., Cai, B., Falsafi, R., Gill, E., Liu, M., Kollmann, T.R., et al. (2016). Endosomal pH modulation by peptide-gold nanoparticle hybrids enables potent anti-inflammatory activity in phagocytic immune cells. Biomaterials 111, 90-102.
【０２１６】
特許参考文献
米国特許出願公開第５９１９４５２Ａ号
欧州特許第０９１４１５７Ｂ１号
国際公開第２０１３０８７９１２Ａ１号
国際公開第２００７０２２８１３Ａ２号
欧州特許出願公開第１４４７０９３Ａ１号
国際公開第２００４０７１５２８Ａ１号
欧州特許出願公開第１０２０５２１Ａ１号
国際公開第２０１０００６７７２Ａ３号
国際公開第２０１５００１３４５号
米国特許第８１５３５８３Ｂ２号
【図１−１】
2021511289.tif 000007
【図１−２】
2021511289.tif 000008
【図２−１】
2021511289.tif 000009
【図２−２】
2021511289.tif 000010
【図３−１】
2021511289.tif 000011
【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図Ｅ１−１】
2021511289.tif 000015
【図Ｅ１−２】
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【図Ｅ２】
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【図Ｅ３】
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【図Ｅ４−１】
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【図Ｅ４−２】
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【図Ｅ５−１】
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【図Ｅ５−２】
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【図Ｅ６】
2021511289.tif 000023
【図Ｅ７−１】
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【図Ｅ７−２】
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【図Ｅ８−１】
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【図Ｅ８−２】
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【図Ｅ９−１】
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【図Ｅ９−２】
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【配列表】
2021511289000001.app
【国際調査報告】
2021511289.tif 000030
2021511289.tif 000031
2021511289.tif 000032