(57)【要約】  無細胞ＤＮＡ断片は、多くの場合、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖の一方の末端が他方の鎖の他方の末端を超えて伸びる不揃いな末端を含む。これらの不揃いな末端の長さおよび量は、個体の病態のレベル、生体試料中の臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度、個体の年齢、または癌を呈する組織タイプを決定するために使用することができる。不揃いな末端の長さおよび量は、本明細書に記載の様々な技法を使用して決定することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から得られた生体試料を分析する方法であって、前記生体試料が、複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が、無細胞であり、前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子が、第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり、前記複数の核酸分子のうちの少なくとも一部の前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からの相補的な部分を有さず、前記第２の鎖にハイブリダイズせず、かつ前記第１の鎖の第１の末端にあり、前記方法が、
前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、
前記第２の鎖から突出した前記第１の鎖の長さに比例する、前記第１の鎖および／または前記第２の鎖の特性を測定することと、
前記複数の核酸分子の前記測定された特性を使用して、不揃いな（ｊａｇｇｅｄ）末端値を決定することであって、前記不揃いな末端値が、鎖が前記複数の核酸分子内の別の鎖から突出しているという集合的な尺度を提供する、不揃いな末端値を決定することと、
前記不揃いな末端値を参照値と比較することと、
前記比較に基づいて、前記個体の病態のレベルを決定することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記病態が、疾患、障害、または妊娠を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記病態が、癌、自己免疫疾患、または妊娠関連病態である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の末端が、５’末端である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
核酸分子のサイズを測定することをさらに含み、前記複数の核酸分子が指定された範囲内のサイズを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記指定された範囲が、１４０〜１６０ｂｐである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記複数の核酸分子が、第１の複数の核酸分子であり、
前記指定された範囲が、第１の指定された範囲であり、
前記方法が、
第２の複数の核酸分子のうちの各核酸分子の鎖の前記特性を測定することをさらに含み、前記第２の複数の核酸分子が、第２の指定された範囲を持つサイズを有し、
前記不揃いな末端値を決定することが、前記第１の複数の核酸分子の前記測定された特性と、前記第２の複数の核酸分子の前記測定された特性とを使用して、比を計算することを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記特性が、前記複数の核酸分子のそれぞれの前記第１の鎖および／または第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位におけるメチル化の状態であり、前記不揃いな末端値が、前記第１の鎖および／または第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における前記複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
より高いメチル化レベルが、前記第２の鎖から突出している前記第１の鎖のより長い長さと相関している、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
核酸分子を分析してリードを生成することと、
前記リードを基準ゲノムにアライメントすることと、をさらに含み、
前記複数の核酸分子が、転写開始部位に対してある特定の距離範囲内のリードを有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記測定された特性が、長さである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記参照値が、前記病態を有する対象の１つ以上の参照試料を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記参照値が、前記病態を有さない対象の１つ以上の参照試料を使用して決定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
機械学習モデルを使用して、前記不揃いな末端値の前記参照値との前記比較、および前記個体の前記病態の前記レベルの前記決定を実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
個体から得られた生体試料中の臨床的に関連するＤＮＡの画分を決定する方法であって、前記生体試料が、複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が、無細胞であり、前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子が、第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり、前記複数の核酸分子の少なくとも一部の前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からの相補的な部分を有さず、前記第２の鎖にハイブリダイズせず、かつ前記第１の鎖の第１の末端にあり、前記方法が、
前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、
前記第２の鎖から突出した前記第１の鎖の長さに比例する、前記第１の鎖および／または前記第２の鎖の特性を測定することと、
前記複数の核酸分子の前記測定された特性を使用して、不揃いな末端値を決定することであって、前記不揃いな末端値が、鎖が前記複数の核酸分子内の別の鎖から突出しているという集合的な尺度を提供する、不揃いな末端値を決定することと、
前記不揃いな末端値を参照値と比較することと、
前記比較に基づいて、前記生体試料中の臨床的に関連するＤＮＡの前記画分を決定することと、を含む、方法。
【請求項１６】
前記第１の鎖および／または前記第２の鎖の前記特性を測定する前に、前記複数の核酸分子を、プロトコルによって処理することをさらに含み、
前記参照値が、臨床的に関連するＤＮＡの既知の画分を有する１つ以上の参照対象からの核酸分子を使用して得られ、
前記１つ以上の参照対象からの前記核酸分子が、前記プロトコルによって処理される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記臨床的に関連するＤＮＡが、胎児ＤＮＡ、腫瘍ＤＮＡ、または移植ＤＮＡを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記複数の核酸分子が、特定のサイズ範囲内のサイズを有する、請求項１５に記載の方法。
【請求項１９】
前記参照値が、臨床的に関連するＤＮＡの既知の画分を有し、不揃いな末端値が測定された１つ以上の較正試料から決定される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
前記参照値が、複数の較正試料の較正データポイントに適合される較正曲線から決定され、前記較正データポイントの各々が、前記複数の較正試料のうちの１つの測定された不揃いな末端値および臨床的に関連するＤＮＡの測定された画分を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項２１】
個体から得られた生体試料を使用して、前記個体の年齢を決定する方法であって、前記生体試料が、複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が、無細胞であり、前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子が、第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり、前記複数の核酸分子の少なくとも一部の前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からの相補的な部分を有さず、前記第２の鎖にハイブリダイズせず、かつ前記第１の鎖の第１の末端にあり、前記方法が、
前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、
前記第２の鎖から突出した前記第１の鎖の長さに比例する前記第１の鎖および／または前記第２の鎖の特性を測定することと、
前記複数の核酸分子の前記測定された特性を使用して、不揃いな末端値を決定することであって、前記不揃いな末端値が、鎖が前記複数の核酸分子内の別の鎖から突出しているという集合的な尺度を提供する、不揃いな末端値を決定することと、
前記不揃いな末端値を参照値と比較することと、
前記比較に基づいて、前記個体の前記年齢を決定することと、を含む、方法。
【請求項２２】
前記参照値が、既知の年齢を有する１つ以上の参照対象からの核酸分子を使用して得られる、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記複数の核酸分子が、特定のサイズ範囲内のサイズを有する、請求項２１に記載の方法。
【請求項２４】
前記参照値が、複数の較正試料の較正データポイントに適合される較正曲線から決定され、前記較正データポイントの各々が、測定された不揃いな末端値および前記複数の較正試料のうちの１つが得られた対象の既知の年齢を含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
個体から得られた生体試料を分析することによって組織タイプを分析する方法であって、前記生体試料が、複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が、無細胞であり、前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子が、末端に第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり、前記複数の核酸分子の少なくとも一部の前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からの相補的な部分を有さず、前記第２の鎖にハイブリダイズせず、かつ前記第１の鎖の第１の末端にあり、前記方法が、
前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、
前記第２の鎖から突出した前記第１の鎖の長さに比例する、前記第１の鎖および／または前記第２の鎖の特性を測定することと、
核酸分子を配列決定して１つ以上のリードを生成することと、
前記核酸分子のゲノム位置を決定することと、
第１の組織タイプに関連付けられたオープンクロマチン領域および非オープンクロマチン領域においてゲノム位置を有する核酸分子のセットを特定することと、
前記核酸分子のセットについて、
第１の複数の第１の部分の第１の複数の測定された特性を使用して、パラメータの第１の値を計算することであって、前記第１の複数の第１の部分が、前記第１の組織タイプの前記オープンクロマチン領域に位置する核酸分子からのものである、パラメータの第１の値を計算することと、
第２の複数の第１の部分の第２の複数の測定された特性を使用して、パラメータの第２の値を計算することであって、前記第２の複数の第１の部分が、前記第１の組織タイプの前記非オープンクロマチン領域に位置する核酸分子からのものである、パラメータの第２の値を計算することと、
前記パラメータの前記第１の値と前記パラメータの前記第２の値との間の分離値を計算することと、
前記分離値を参照値と比較することと、
前記分離値と参照値との比較に基づいて、前記第１の組織タイプが癌を呈するかどうかを判定することと、を含む、方法。
【請求項２６】
前記オープンクロマチン領域が、転写開始部位（ＴＳＳ）を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ゲノム位置を決定することが、前記１つ以上のリードを参照配列にアライメントすることを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２８】
前記第１の組織タイプに関連付けられた前記オープンクロマチン領域および非オープンクロマチン領域をデータベースから検索することをさらに含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２９】
前記分離値が、前記第１の値と前記第２の値との比を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項３０】
前記参照値が、前記第１の組織タイプに影響を与える癌を有することが知られている１つ以上の参照対象からの１つ以上の参照試料を使用して決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３１】
前記参照値が、前記第１の組織タイプに影響を与える癌を有さないことが知られている参照対象からの１つ以上の参照試料を使用して決定される、請求項２５に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の組織タイプが、血液、肝臓、肺、腎臓、心臓、または脳である、請求項２５に記載の方法。
【請求項３３】
前記癌が、ＨＣＣである、請求項２５に記載の方法。
【請求項３４】
個体から得られた生体試料を分析する方法であって、前記生体試料が、複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が、無細胞であり、前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子が、末端に第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり、前記複数の核酸分子の少なくとも一部の前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からの相補的な部分を有さず、前記第２の鎖にハイブリダイズせず、かつ前記第１の鎖の第１の末端にあり、前記方法が、
前記生体試料に、第１の化合物のセットを添加することであって、
前記第１の化合物のセットが、異なるヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み、
前記オリゴヌクレオチドのサブセットのうちの各オリゴヌクレオチドが、複数の前記第１の部分のうちの少なくとも１つに相補的なヌクレオチドを含み、
前記第１の化合物のセットのうちの各第１の化合物が、識別子分子を含み、前記識別子分子が、前記第１の化合物の前記オリゴヌクレオチドの長さを示す、第１の化合物のセットを添加することと、
前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、
前記第１の化合物のセットのうちの第１の化合物の前記オリゴヌクレオチドを、前記第１の鎖の前記第１の部分にハイブリダイズさせて、凝集分子の一部であり、前記識別子分子を含む伸長した第２の鎖を形成することと、
前記凝集分子を分析して、前記識別子分子を検出することと、
前記識別子分子に基づいて、前記第１の部分の前記長さを決定することと、を含む、方法。
【請求項３５】
前記オリゴヌクレオチドの前記サブセットのうちの各オリゴヌクレオチドが、Ａｌｕ配列のヌクレオチドを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記伸長した第２の鎖を配列決定して、前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子についての前記識別子分子に対応するリードを生成することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記複数の決定された長さから計算された統計値を使用して、不揃いな末端値を決定することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
個体から得られた生体試料を分析する方法であって、前記生体試料が、複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が、無細胞であり、前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子が、末端に第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり、前記複数の核酸分子の少なくとも一部の前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からの相補的な部分を有さず、前記第２の鎖にハイブリダイズせず、かつ前記第１の鎖の第１の末端にあり、前記方法が、
前記複数の核酸分子の第１および第２の鎖の複数の部位の各々のメチル化状態を測定することであって、前記複数の部位のうちの各部位が、配列決定プロセスのサイクルに対応し、前記複数の部位が、前記第１および第２の鎖の末端をカバーする、メチル化状態を測定することと、
前記複数の部位の各々について、前記部位でのメチル化を示す前記メチル化状態の量に基づいて、メチル化レベルを決定することと、
前記第１および第２の鎖の前記末端に向かう方向において、前記複数の部位の第１の部位における前記メチル化レベルの第１の値への第１の変化を特定することと、
前記配列決定プロセスの前記対応するサイクルに基づいて、前記第１の鎖の前記第１の末端での最も外側のヌクレオチドに対する前記第１の部位の第１の距離を決定することと、
前記メチル化レベルの前記第１の変化の第１の大きさを決定することと、
前記第１の部位の前記第１の距離を使用して、第１の複数の第１の部分の第１の長さを決定することと、
前記メチル化レベルの前記第１の変化の前記第１の大きさを使用して、核酸分子の第１の量を決定することであって、核酸分子の前記第１の量が、前記第１の長さ以下の長さを有する第１の部分を含む、核酸分子の第１の量を決定することと、を含む、方法。
【請求項３９】
前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、
１つ以上のヌクレオチドを含む第１の化合物を前記第１の鎖の前記第１の部分にハイブリダイズすることであって、前記第１の化合物が、前記第２の鎖の第１の末端に結合され、前記第１の化合物を含む第１の末端を有する伸長された第２の鎖を形成し、前記第１の化合物が、前記第２の鎖と接触していない第１の末端を有し、前記１つ以上のヌクレオチドがメチル化されていない、第１の化合物をハイブリダイズすることと、
前記伸長された第２の鎖から前記第１の鎖を分離することと、をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１および第２の鎖の前記末端に向かう方向において、前記複数の部位の第２の部位における前記メチル化レベルの第２の値への第２の変化を特定することであって、
前記第２の部位が、前記第１の鎖の前記第１の末端での前記最も外側のヌクレオチドに対して第２の距離にあり、
前記第２の距離が、前記第１の距離よりも小さく、
前記第２の値が、前記第１の値よりも低い、第２の変化を特定することと、
メチル化レベルの前記第２の変化の第２の大きさを決定することと、
前記第２の部位の前記第２の距離を使用して、第２の複数の第１の部分の第２の長さを決定することと、
前記メチル化レベルの前記第２の変化の前記第２の大きさを使用して、核酸分子の第２の量を決定することであって、
核酸分子の前記第２の量が、前記第２の複数の第１の部分の前記第２の長さ以下の長さを有する第１の部分を含み、および
前記第１の量が、前記第２の長さを超える長さを有する第１の部分を含む、核酸分子の第２の量を決定することと、をさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４１】
前記第１の量および前記第２の量のうちの少なくとも１つを使用して、不揃いな末端値を決定することをさらに含む、請求項３８または４０に記載の方法。
【請求項４２】
個体から得られた生体試料を分析する方法であって、前記生体試料が、二本鎖核酸分子を含み、前記二本鎖核酸分子が、無細胞であり、前記二本鎖核酸分子が、第１の鎖と、第２の鎖と、を有し、前記二本鎖核酸分子が、第１の末端と、前記第１の末端の反対側の第２の末端と、を有し、前記方法が、
既知のパターンを有するオリゴヌクレオチドを使用して前記二本鎖核酸分子を環状化し、それにより環状核酸分子を生成することと、
前記環状核酸分子を切断して一本鎖核酸分子を形成することと、
前記一本鎖核酸分子を分析して、第１のリードおよび第２のリードを生成することであって、
前記一本鎖核酸分子が、
前記第１のリードが対応する前記第１の末端での前記第１の鎖のヌクレオチドの第１のパターンを含む第１のセクションと、
ヌクレオチドの第１の既知のパターンを有する第１のオリゴヌクレオチドと、
前記第２のリードが対応する前記第１の末端での前記第２の鎖のヌクレオチドの第２のパターンを含む第２のセクションと、を含む、第１のリードおよび第２のリードを生成することと、
前記第１のリードおよび前記第２のリードを、参照配列に、または相互にアライメントすることと、
前記第１のリードおよび前記第２のリードの前記アライメントを使用して、前記二本鎖核酸分子が前記第２の鎖にハイブリダイズしていない前記第１の鎖の一部を含むかどうかを決定することと、を含む、方法。
【請求項４３】
前記第２の鎖にハイブリダイズしていない前記第１の鎖の前記一部の前記長さを決定することをさらに含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記複数の決定された長さから計算された統計値を使用して、不揃いな末端値を決定することをさらに含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
前記参照配列が、ヒト基準ゲノムである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４６】
前記第１のオリゴヌクレオチドを、前記第１の末端で前記第１の鎖および前記第２の鎖に結合することと、
第２のオリゴヌクレオチドを、前記第２の端部で前記第１の鎖および前記第２の鎖に結合することであって、前記第２のオリゴヌクレオチドが、ヌクレオチドの第２の既知のパターンを含む、第２のオリゴヌクレオチドを結合することと、をさらに含み、
前記環状核酸分子が、前記第１の鎖、前記第２の鎖、前記第１のオリゴヌクレオチド、および前記第２のオリゴヌクレオチドを含み、
前記一本鎖核酸分子を分析することが、
前記一本鎖核酸分子のランダムタグ付けと、
第３のオリゴヌクレオチドを前記一本鎖核酸分子にアニーリングすることと、
前記一本鎖核酸分子を増幅して配列決定アダプタを付加することと、を含む、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記第１のオリゴヌクレオチドを、前記第１の末端で前記第１の鎖および前記第２の鎖に結合することと、
第２のオリゴヌクレオチドを、前記第２の端部で前記第１の鎖および前記第２の鎖に結合することであって、前記第２のオリゴヌクレオチドが、ヌクレオチドの第２の既知のパターンを含む、第２のオリゴヌクレオチドを結合することと、
前記一本鎖核酸分子を配列決定して、前記第１のリードおよび前記第２のリードを生成することと、をさらに含む、請求項４２〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
個体から得られた生体試料を分析する方法であって、前記生体試料が、二本鎖核酸分子を含み、前記二本鎖核酸分子が、無細胞であり、前記二本鎖核酸分子が、第１の鎖と、第２の鎖と、を有し、前記二本鎖核酸分子が、第１の末端と、前記第１の末端の反対側の第２の末端と、を有し、前記方法が、
既知のパターンを有するオリゴヌクレオチドを使用して前記二本鎖核酸分子を環状化し、それにより環状核酸分子を生成することと、
前記環状鎖核酸分子を分析して、第１のリードおよび第２のリードを生成することであって、
前記環状核酸分子が、
前記第１のリードが対応する前記第１の末端での前記第１の鎖のヌクレオチドの第１のパターンを含む第１のセクションと、
ヌクレオチドの第１の既知のパターンを有する第１のオリゴヌクレオチドと、
前記第２のリードが対応する前記第１の末端での前記第２の鎖のヌクレオチドの第２のパターンを含む第２のセクションと、を含む、第１のリードおよび第２のリードを生成することと、
前記第１のリードおよび前記第２のリードを、参照配列に、または相互にアライメントさせることと、
前記第１のリードおよび前記第２のリードの前記アライメントを使用して、前記二本鎖核酸分子が前記第２の鎖にハイブリダイズしていない前記第１の鎖の一部を含むかどうかを決定することと、を含む、方法。
【請求項４９】
前記第２の鎖にハイブリダイズしていない前記第１の鎖の前記一部の前記長さを決定することをさらに含む、請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記複数の決定された長さから計算された統計値を使用して、不揃いな末端値を決定することをさらに含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記参照配列が、ヒト基準ゲノムである、請求項４８または４９に記載の方法。
【請求項５２】
個体から得られた生体試料を分析する方法であって、前記生体試料が、複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が、無細胞であり、前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子が、第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり、各第１の鎖が、前記第２の鎖にハイブリダイズしていない第１の部分を含み、各第１の部分が、前記第１の鎖の第１の末端にあり、前記方法が、
前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、
１つ以上のヌクレオチド類似体を含む第１の化合物を、前記第１の鎖の前記第１の部分にハイブリダイズすることであって、前記第１の化合物および前記第２の鎖が、伸長した第２の鎖を形成し、前記１つ以上のヌクレオチド類似体が、任意のヌクレオチドにハイブリダイズする、第１の化合物をハイブリダイズすることと、
前記第１の化合物および前記第２の鎖から前記第１の鎖を分離することと、
前記複数の伸長された第２の鎖のうちの各伸長された第２の鎖を配列決定して、前記伸長された第２の鎖上の複数の位置の各々でヌクレオチドシグナルを生成することであって、前記配列決定することが、前記伸長された第２の鎖のクローン増幅を含む、ヌクレオチドシグナルを生成することと、
前記複数の伸長された第２の鎖のうちの各伸長された第２の鎖について、
前記第１の位置から次の位置への最大ヌクレオチドシグナルの強度の変化を検出することによって、前記対応する第２の鎖の末端の第１の位置を特定することであって、前記強度の変化が、閾値を超えている、第２の鎖の末端の第１の位置を特定することと、を含む、方法。
【請求項５３】
前記閾値を超えている前記強度の変化が、前記第１の位置に対してＮ位置で維持するために必要であり、Ｎが、１を超える整数である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
最大ヌクレオチドシグナルの前記強度の変化が、２番目に高いヌクレオチドシグナルに対するものである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
最大ヌクレオチドシグナルの前記強度の変化が、前記第１の位置でのベースコールの品質スコアとして測定される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記配列決定が、
複数の配列決定サイクルを実施することと、
前記複数の配列決定サイクルのうちの各サイクルの後に、複数のヌクレオチドの各々について蛍光強度を決定することと、を含み、前記対応する第２の鎖の前記末端の前記第１の位置を特定することが、
配列決定サイクルの最初の数で、最大蛍光強度が前記閾値を下回る最初の減少を特定することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５７】
前記配列決定が、
複数の配列決定サイクルを実施することと、
前記複数の配列決定サイクルのうちの各サイクルの後に、複数のヌクレオチドの各々について電気強度を決定することと、を含み、前記対応する第２の鎖の前記末端の前記第１の位置を特定することが、
配列決定サイクルの最初の数で、最大電気強度が前記閾値を下回る最初の減少を特定することを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５８】
前記１つ以上のヌクレオチド類似体が、イノシンを含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５９】
前記強度の変化から計算された統計値を使用して、不揃いな末端値を決定することをさらに含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項６０】
個体から得られた生体試料を分析する方法であって、前記生体試料が、複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が、無細胞であり、前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子が、末端に第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり、前記複数の核酸分子の少なくとも一部の前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からの相補的な部分を有さず、前記第２の鎖にハイブリダイズせず、かつ前記第１の鎖の第１の末端にあり、前記方法が、
前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、
１つ以上のヌクレオチドを含む第１の化合物を前記第１の鎖の前記第１の部分にハイブリダイズさせることであって、前記第１の化合物が、前記第２の鎖の第１の末端に結合され、前記第１の化合物を含む第１の末端を有する伸長された第２の鎖を形成し、前記第１の化合物が、前記第２の鎖と接触していない第１の末端を有し、前記１つ以上のヌクレオチドが全てメチル化されているか、または全てメチル化されていないかのいずれかである、第１の化合物をハイブリダイズすることと、
前記伸長された第２の鎖から前記第１の鎖を分離することと、
前記伸長された第２の鎖の１つ以上の第１の部位、前記伸長された第２の鎖の前記第１の末端での前記１つ以上の第１の部位の各々の第１のメチル化状態を決定することと、
前記１つ以上の第１の部位での前記複数の伸長された第２の鎖についての前記第１のメチル化状態を使用して、第１のメチル化レベルを計算することと、
前記第１のメチル化レベルを使用して、不揃いな末端値を計算することであって、前記不揃いな末端値が、前記第２の鎖から突出した前記第１の鎖の平均長さに比例する、不揃いな末端値を計算することと、を含む、方法。
【請求項６１】
前記１つ以上のヌクレオチドが、全てメチル化されており、前記１つ以上のヌクレオチドが、シトシンである、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記１つ以上のヌクレオチドが、アデニン、シトシン、またはチミンに隣接している、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記１つ以上のヌクレオチドが、グアニンに隣接している、請求項６１に記載の方法。
【請求項６４】
前記複数の核酸分子が、あるサイズ範囲内のサイズを有する、請求項６０に記載の方法。
【請求項６５】
前記不揃いな末端値を使用して、臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を推定することをさらに含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記複数の核酸分子が、第１の複数の核酸分子であり、
前記生体試料が、第２の複数の核酸分子を含み、
前記方法が、
前記第２の複数の核酸分子のうちの前記核酸分子のサイズを決定することと、
前記第２の複数の核酸分子をフィルタ処理して、前記サイズ範囲内のサイズを有する核酸分子にして、前記第１の複数の核酸分子を得ることと、を含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
前記伸長された第２の鎖の前記第１の末端が、前記伸長された第２の鎖の３’末端である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６８】
複数の対照核酸分子のうちの各対照核酸分子について、前記複数の対照核酸分子のうちの各対照核酸分子が、末端で第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり、前記複数の対照核酸分子のうちの前記対照核酸分子の前記第１の部分が、前記対照核酸分子の前記第２の鎖からの相補的部分を有さず、前記対照核酸分子の前記第２の鎖にハイブリダイズせず、かつ前記第１の鎖の第１の末端にあり、前記対照核酸分子の前記第１の鎖の前記第１の部分の長さが、既知のものであり、
前記第１の化合物を、前記対照核酸分子の前記第１の部分にハイブリダイズさせることであって、前記第１の化合物が、前記対照核酸分子の前記第２の鎖の第１の末端に結合して、前記第１の化合物を含む第１の末端を有する前記対照核酸分子の伸長された第２の鎖を形成し、前記第１の化合物が、前記対照核酸分子の前記第２の鎖と接触しない第１の末端を有する、第１の化合物をハイブリダイズさせることと、
前記伸長された第２の鎖から前記第１の鎖を分離することと、
前記対照核酸分子の前記伸長された第２の鎖の１つ以上の第１の部位、前記対照核酸分子の前記伸長された第２の鎖の前記第１の末端での前記１つ以上の第１の部位の各々について第３のメチル化状態を決定することと、をさらに含み、
前記第１のメチル化レベルの計算が、前記第３のメチル化状態を使用し、
前記複数の対照核酸分子が、既知の量によって特徴付けられ、
前記方法が、
前記不揃いな末端値を参照値と比較することであって、前記参照値が、前記第１の化合物を前記複数の対照核酸分子にハイブリダイズさせることなく得られる、不揃いな末端値を参照値と比較することと、
前記不揃いな末端値の前記参照値との前記比較を使用して、かつ前記複数の対照核酸分子の前記既知の量を使用して、不揃いな末端の量を計算することと、をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項６９】
前記１つ以上のヌクレオチドが、全てメチル化されておらず、
前記方法が、
前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、
前記伸長された第２の鎖の１つ以上の第２の部位、前記伸長された第２の鎖の前記第２の末端での前記１つ以上の第２の部位の各々についての第２のメチル化状態を決定することと、
前記１つ以上の第２の部位での前記複数の伸長された第２の鎖についての前記第２のメチル化状態を使用して、第２のメチル化レベルを計算することと、
前記第２のメチル化レベルを使用して、前記不揃いな末端値を計算することと、をさらに含む、請求項６０に記載の方法。
【請求項７０】
前記１つ以上の第２の部位が、前記伸長された第２の鎖の前記第２の末端で、前記最も外側の３０の部位を含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記第１のメチル化レベルが、前記第１のメチル化状態の平均値であり、
前記第２のメチル化レベルが、前記第２のメチル化状態の平均値であり、
前記不揃いな末端値を計算することが、前記第１のメチル化レベルと前記第２のメチル化レベルとの間の差を計算し、前記差を前記第１のメチル化レベルで割ることによって行われる、請求項６９に記載の方法。
【請求項７２】
個体から得られた生体試料を分析する方法であって、前記生体試料が、複数の核酸分子を含み、前記複数の核酸分子が、無細胞であり、前記複数の核酸分子のうちの各核酸分子が、末端に第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり、前記複数の核酸分子のうちの第１のサブセットの前記第１の鎖の前記第１の部分が、前記第２の鎖からの相補的な部分を有さず、前記第２の鎖にハイブリダイズせず、かつ前記第１の鎖の第１の末端にあり、前記方法が、
前記複数の核酸分子のうちの前記第１のサブセットの各核酸分子について、
１つ以上のヌクレオチドを含む第１の化合物を前記第１の鎖の前記第１の部分にハイブリダイズさせることであって、前記第１の化合物が、前記第２の鎖の第１の末端に結合され、前記第１の化合物を含む第１の末端を有する伸長された第２の鎖を形成し、前記第１の化合物が、前記第２の鎖と接触していない第１の末端を有し、前記第１の化合物が、メチル化されたシトシンである１つ以上のヌクレオチドを含む、第１の化合物をハイブリダイズさせることと、
メチル化されていないシトシンである前記１つ以上のヌクレオチドをチミンに変換することと、
前記伸長された第２の鎖から前記第１の鎖を分離することと、
第１の位置を決定することであって、前記第１の位置が、前記伸長された第２の鎖の前記第１の末端に最も近い前記第２の鎖にチミンを有する、第１の位置を決定することと、
第２の位置を決定することであって、前記第２の位置が、前記チミンに最も近い前記第１の化合物中にメチル化されたシトシンを有する、第２の位置を決定することと、
前記第１の位置および前記第２の位置から選択された少なくとも１つを使用して、前記伸長された第２の鎖の前記第１の末端からの距離を決定することと、
前記複数の核酸分子のうちの前記第１のサブセットについての前記距離を使用して、不揃いな末端値を計算することと、を含む、方法。
【請求項７３】
前記複数の核酸分子のうちの第２のサブセットの各核酸分子について、前記複数の核酸分子のうちの前記第２のサブセットの各核酸分子の第１の部分が、前記第２の鎖からの相補的な部分を有し、前記第２の鎖にハイブリダイズされており、かつ前記第１の鎖の第１の端部にあり、
前記核酸分子中のメチル化されていないシトシンを、チミンに変換することと、
チミンが、前記第２の鎖の末端にあること、および前記第２の鎖が伸長されていないことを決定することと、
前記核酸分子を、不揃いな末端を有していないものとして特定することと、をさらに含む、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記複数の核酸分子のうちの前記第２のサブセットの各核酸分子について、
前記チミンの前記第２の鎖の前記末端までの距離を決定することをさらに含み、
前記不揃いな末端値を計算することが、前記複数の核酸分子のうちの前記第２のサブセットについての前記距離を使用する、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記生体試料からの核酸分子および既知の量の複数の対照核酸分子を使用して、不揃いな末端値を決定することであって、前記対照核酸分子の各々のオーバーハング長が、既知である、不揃いな末端値を決定することと、
前記不揃いな末端値を参照値と比較することであって、前記参照値が、前記第１の化合物を前記複数の対照核酸分子にハイブリダイズさせることなく得られる、不揃いな末端値を参照値と比較することと、
前記不揃いな末端値の前記参照値との前記比較を使用して、かつ前記複数の対照核酸分子の前記既知の量を使用して、不揃いな末端の量を計算することと、をさらに含む、請求項３４〜６７および６９〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
コンピュータプログラム製品であって、実行時にコンピューティングシステムを制御して、上記方法請求項のいずれか一項に記載の方法を実施する命令を含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項７７】
請求項７６に記載のコンピュータプログラム製品を含む、コンピュータ可読記憶媒体。
【請求項７８】
請求項７６に記載のコンピュータプログラム製品を含む、コンピューティングシステム。
【請求項７９】
プロセッサによって実行されるとき、上記方法請求項のいずれか一項に記載の方法を実装するコンピュータプログラムコードを含む、１つまたは複数のデータパケット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年７月２３日に出願された「ＣＥＬＬ−ＦＲＥＥ  ＤＮＡ  ＤＡＭＡＧＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＡＮＤ  ＩＴＳ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」と題された米国仮出願第６２／７０２，０８０号、および２０１８年１２月２６日に出願された「ＣＥＬＬ−ＦＲＥＥ  ＤＮＡ  ＤＡＭＡＧＥ  ＡＮＡＬＹＳＩＳ  ＡＮＤ  ＩＴＳ  ＣＬＩＮＩＣＡＬ  ＡＰＰＬＩＣＡＴＩＯＮＳ」と題された米国仮出願第６２／７８５，１１８号に対する優先権を主張し、かつこれらのＰＣＴ出願であり、これらの開示が、あらゆる目的のために、その全体が参照により組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
無細胞ＤＮＡは、分子診断およびモニタリングに特に有用であることが証明されている。無細胞ベースの用途としては、非侵襲的出生前検査（Ｃｈｉｕ  ＲＫＷ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２００８；１０５：２０４５８−６３）、癌の検出ならびにモニタリング（Ｃｈａｎ  ＫＣＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０１３；５９：２１１−２４；Ｃｈａｎ  ＫＣＡ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１３；１１０：１８７６−８；Ｊｉａｎｇ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１５；１１２：Ｅ１３１７−２５）、移植モニタリング（Ｚｈｅｎｇ  ＹＷ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０１２；５８：５４９−５８）、および原発組織の追跡（Ｓｕｎ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１５；１１２：Ｅ５５０３−１２；Ｃｈａｎ  ＫＣＡ；Ｓｎｙｄｅｒ  ＭＷ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６；１６４：５７−６８）が挙げられる。これまでに開発された無細胞核酸分析手法としては、一塩基変位（ＳＮＶ）、コピー数異常（ＣＮＡ）、ヒトゲノムの無細胞ＤＮＡ末端位置、またはメチル化マーカーの分析に基づくものが挙げられる。新しい特性を検出するための新しい核酸分析手法を特定し、既存の処方に精度を追加することは有益であると考えられる。
【発明の概要】
【０００３】
二本鎖無細胞ＤＮＡ断片は、互いに正確に相補的ではない２本の鎖を有していることがよくある。一方の鎖が他方の鎖を超えて伸び、オーバーハングが発生する場合がある。これらのオーバーハングは、分析で平滑末端（ｂｌｕｎｔ  ｅｎｄ）を形成するために修復されることが多い。ただし、これらのオーバーハングによって作成された「不揃いな（ｊａｇｇｅｄ）末端」は、生体試料の分析に役立つ場合がある。この文書では、不揃いな末端を分析に使用する方法、および不揃いな末端を測定する方法について説明する。
【０００４】
試料内の不揃いな末端の程度（ギャギド末端の量または長さ）は、個体の病態のレベルを反映している場合がある。例えば、不揃いな末端の程度は、病気、障害、妊娠関連の病態に関連している可能性がある。不揃いな末端は、試料中の臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を決定するために使用することができる。個体の年齢は、不揃いな末端の程度に関連している可能性がある。特定の組織からの不揃いな末端を分析することができ、不揃いな末端の程度が癌のレベルを決定することできる。
【０００５】
不揃いな末端の程度は、様々な方法で測定することができる。例えば、不揃いな末端は、メチル化または非メチル化ヌクレオチドを使用して修復することができ、メチル化のレベルの結果として生じる変化は、不揃いな末端の存在および／または長さを示すことができる。場合によっては、メチル化シトシンを末端修復に使用して、不揃いな末端の正確な長さを測定することができる。別の例として、不揃いな末端の程度は、断片の一部を基準ゲノムもしくは相補鎖にアライメントすることによって、または末端修復によって追加されたヌクレオチドからの他のシグナルを測定することによっても決定することができる。
【０００６】
本発明の実施形態の性質および利点に関するより良好な理解は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照して得ることができる。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】本発明の実施形態による、不揃いな末端値を使用して、生体試料を分析する方法を示す。
【図２】本発明の実施形態による、５’オーバーハングの程度を評価するための一例を示す。
【図３】本発明の実施形態による、ヒト基準ゲノムにマッピングした後のＤＮＡ分子に沿ったメチル化レベルの計算の図解である。
【図４】本発明の実施形態による、個体から得られた生体試料を分析し、メチル化レベルを使用して、不揃いな末端値を計算する方法を示す。
【図５Ａ】は、本発明の実施形態による、超音波処理された肝臓組織ＤＮＡ（Ａ）と妊婦の血漿ＤＮＡ（Ｂ）との間のオーバーハング指数の代表的なプロットを示す。
【図５Ｂ】は、本発明の実施形態による、超音波処理された肝臓組織ＤＮＡ（Ａ）と妊婦の血漿ＤＮＡ（Ｂ）との間のオーバーハング指数の代表的なプロットを示す。
【図６】本発明の実施形態による、超音波処理された組織ＤＮＡと無細胞ＤＮＡ試料との間のオーバーハング指数の差を示す。
【図７Ａ】は、本発明の実施形態による、異なる妊娠三半期（ｔｒｉｍｅｓｔｅｒｓ）にわたる妊婦の血漿中の胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子との間のオーバーハング指数の差を示す。
【図７Ｂ】は、本発明の実施形態による、異なる妊娠三半期（ｔｒｉｍｅｓｔｅｒｓ）にわたる妊婦の血漿中の胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子との間のオーバーハング指数の差を示す。
【図７Ｃ】は、本発明の実施形態による、異なる妊娠三半期（ｔｒｉｍｅｓｔｅｒｓ）にわたる妊婦の血漿中の胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子との間のオーバーハング指数の差を示す。
【図８】本発明の実施形態による、胎児ＤＮＡ分子のオーバーハング指数が胎児ＤＮＡ画分とよく相関していたことを示す。
【図９】本発明の実施形態による、妊婦由来の血漿ＤＮＡ分子の異なるサイズ範囲にわたるオーバーハング指数を示す。
【図１０】本発明の実施形態による、特定のサイズ範囲における母体ならびに胎児ＤＮＡのオーバーハング指数および２つの異なるサイズ範囲間のオーバーハング指数比の一例を示す。
【図１１】本発明の実施形態による、胎児ＤＮＡ画分と相関する全体的なオーバーハング指数比を示す。加えて、血漿ＤＮＡは、超音波処理された組織ＤＮＡと比較して、異なるサイズにわたって明確なオーバーハング指数パターンを呈した（図１２）。
【図１２】本発明の実施形態による、血漿ＤＮＡ分子と超音波処理チタＤＮＡとの間の異なるサイズ範囲にわたるオーバーハング指数の比較を示す。
【図１３】本発明の実施形態による、異なる妊娠三半期にわたる胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡとの間の不揃い指数を示す。
【図１４】本発明の実施形態による、胎児ＤＮＡ画分と不揃いな末端指数比との間の相関関係を示す。
【図１５】本発明の実施形態による、末端修復においてメチル化シトシンを使用するための手法を示す。
【図１６】本発明の実施形態による、不揃いな末端の長さを決定するためのメチル化シトシンの使用を示す。
【図１７】本発明の実施形態による、メチル化シトシンによる末端修復を使用して分析されたＤＮＡ試料の表である。
【図１８】本発明の実施形態による、内部対照としての既知の長さの不揃いな末端を有する２つの合成二本鎖ＤＮＡ断片の使用を示す。
【図１９Ａ】本発明の実施形態による、既知の配列を有する既知の不揃いな末端を有する２つのスパイクイン配列についての配列決定結果を示す。
【図１９Ｂ】本発明の実施形態による、既知の配列を有する既知の不揃いな末端を有する２つのスパイクイン配列についての配列決定結果を示す。
【図２０】本発明の実施形態による、ＣＨまたはＣＧ部位のいずれかを使用する妊婦の血漿ＤＮＡ中のメチル化シトシンの比率の代表的なプロットを示す。
【図２１】本発明の実施形態による、埋め込みメチル化シトシン（ｍＣ）およびメチル化されていないシトシン（Ｃｓ）を使用する手法間の相対的な情報提供力を比較した表である。
【図２２】本発明の実施形態による、「ＣＣタグ」戦略によって推定される不揃いな末端の長さの分布を示す。
【図２３Ａ】本発明の実施形態による、無細胞ＤＮＡ断片の異なるサイズ範囲にわたる不揃いな末端のプロファイルを示す。
【図２３Ｂ】本発明の実施形態による、無細胞ＤＮＡ断片の異なるサイズ範囲にわたる不揃いな末端のプロファイルを示す。
【図２４】本発明の実施形態による、無細胞ＤＮＡ断片の異なるサイズ範囲にわたる不揃いな末端のプロファイルを示す。
【図２５】本発明の実施形態による、異なる妊婦についての配列決定情報および胎児ＤＮＡ画分を含む表を示す。
【図２６】本発明の実施形態による、ＣＨ部位での妊婦の血漿ＤＮＡ中のメチル化シトシンの比率についての１つの試料の代表的なプロットを示す。
【図２７Ａ】本発明の実施形態による、胎児特異的および共有ＤＮＡ分子の異なるサイズ範囲にわたる不揃いな末端のプロファイルを示す。
【図２７Ｂ】本発明の実施形態による、胎児特異的および共有ＤＮＡ分子の異なるサイズ範囲にわたる不揃いな末端のプロファイルを示す。
【図２８Ａ】本発明の実施形態による、胎児特異的および共有ＤＮＡ分子の異なるサイズ範囲にわたる不揃いな末端のプロファイルを示す。
【図２８Ｂ】本発明の実施形態による、胎児特異的および共有ＤＮＡ分子の異なるサイズ範囲にわたる不揃いな末端のプロファイルを示す。
【図２９Ａ】本発明の実施形態による、１４０〜１５０ｂｐ以内の分子の不揃いな末端長分布を示す。
【図２９Ｂ】本発明の実施形態による、１４０〜１５０ｂｐ以内の分子の不揃いな末端長分布を示す。
【図３０Ａ】本発明の実施形態による、１４０ｂｐ、１６６ｂｐ、および２００ｂｐの分子について、不揃いな末端長対胎児ＤＮＡ画分を示す。
【図３０Ｂ】本発明の実施形態による、１４０ｂｐ、１６６ｂｐ、および２００ｂｐの分子について、不揃いな末端長対胎児ＤＮＡ画分を示す。
【図３１】本発明の実施形態による、１４０ｂｐ、１６６ｂｐ、および２００ｂｐの分子について、不揃いな末端長対胎児ＤＮＡ画分を示す。
【図３２】本発明の実施形態による、異なるサイズの不揃いな末端部長を保有する分子のサイズ分布を示す。
【図３３】本発明の実施形態による、ＣＣタグを用いて不揃いな末端値を計算する方法を示す。
【図３４】本発明の実施形態による、ＤＮＡ断片末端ライゲーション媒介血漿ＤＮＡオーバーハングの決定を示す。
【図３５】本発明の実施形態による、ゲノム共通配列の使用によるＤＮＡ断片末端ライゲーション媒介血漿ＤＮＡオーバーハングの測定を示す。
【図３６】本発明の実施形態による、母体血漿ＤＮＡのオーバーハング長の頻度プロファイルを示す。
【図３７】本発明の実施形態による、全ゲノムへのマッピングと、ヒトゲノムにおいて特定された共通配列の周りの隣接配列との間のオーバーハング長頻度の相関関係を示す。
【図３８】本発明の実施形態による、個体から得られた生体試料を分析し、識別子分子を使用して、不揃いな末端の長さを決定する方法を示す。
【図３９】本発明の実施形態による、特定のオーバーハング長の相対的な存在量が、ＢＳ−ｓｅｑの結果から推測することができることを示す。
【図４０】本発明の実施形態による、特定のオーバーハング長の相対的な存在量が、ＢＳ−ｓｅｑの結果から推測することができることを示す。ｘ軸は、調査中のオーバーハング長である。ｙ軸は、２つの隣接するサイクル間の相対的なメチル化の減少である。
【図４１】本発明の実施形態による、ライゲーションベースの手法とＢＳ−ｓｅｑベースの手法との間の比較を示す。
【図４２】本発明の実施形態による、個体から得られた生体試料を分析し、バイサルファイト配列決定を使用して、不揃いな末端の長さおよび量を決定する方法を示す。
【図４３】本発明の実施形態による、設計されたオリゴヌクレオチドとライゲーションすることができる断片についてのサイズの分布を示す。
【図４４】本発明の実施形態による、オーバーハング長と断片サイズとの間の関係を示す。
【図４５】本発明の実施形態による、癌対象と非癌対象との間の血漿ＤＮＡのオーバーハング指数の差を示す。
【図４６】本発明の実施形態による、異なる臨床状態にわたる不揃い指数比を示す。
【図４７】本発明の実施形態による、不揃い指数比および高メチル化についての受信者動作特性（ＲＯＣ）分析を示している。
【図４８】本発明の実施形態による、異なる臨床状態にわたる不揃い指数比を示す。
【図４９】本発明の実施形態による、高メチル化および不揃い指数比を使用した臨床状態の複合分析を示す。
【図５０】本発明の実施形態による、健康で非活動性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）の対象と活動性ＳＬＥの対象との間の血漿ＤＮＡのオーバーハング指数の差を示す。
【図５１】本発明の実施形態による、健康な対照およびＨＣＣ患者についての異なるサイズ範囲にわたるオーバーハング指数を示す。
【図５２Ａ】健康な対照とＨＣＣ患者との間の異なるサイズ範囲にわたるオーバーハング指数についての受信者動作特性（ＲＯＣ）分析の曲線下値を示す。ＡＵＣ：本発明の実施形態による受信者動作特性曲線下の面積である。
【図５２Ｂ】本発明の実施形態による、いかなるサイズ選択もなしに、癌対象と非癌対象との間の血漿ＤＮＡのオーバーハング指数の差を示す。
【図５３】本発明の実施形態による、異なるサイズ範囲にわたる不揃い指数のヒートマップを示す。
【図５４】本発明の実施形態による、健康な対照、非活動性および活動性のＳＬＥ患者について、異なるサイズ範囲にわたるオーバーハング指数を示す。
【図５５】本発明の実施形態による、健康な／非活動性ＳＬＥ対象と活動性ＳＬＥ患者との間の異なるサイズ範囲にわたるオーバーハング指数についての受信者動作特性（ＲＯＣ）分析の曲線下値を示す。ＡＵＣ：受信者動作特性曲線下面積である。
【図５６】本発明の実施形態による、ＨＣＣ患者の術前および術後の血漿ＤＮＡ間のオーバーハング指数のｃｉｒｃｏｓプロットを示す。染色体模式図（プロットの外側）は、時計回りに短腕端部（ｐｔｅｒ）から長腕端部（ｑｔｅｒ）に向けられている。術前の血漿ＤＮＡ（赤い長方形）および術後の血漿ＤＮＡ（青い三角形）のオーバーハング指数の各１Ｍｂビンのオーバーハングが内輪に示された。オーバーハング指数の範囲は０％（最も内側）〜１６％（最も外側）であり、２本の線の間の距離は２％であった。各ドットは１Ｍｂのゲノム領域を表した。
【図５７】ＴＳＳ周辺に偏在するオーバーハング指数を示す。ＴＳＳ：本発明の実施形態による転写開始部位である。
【図５８Ａ】本発明の実施形態による、異なる組織特異的オープンクロマチン領域にわたるオーバーハング指数：健康な対象における異なる組織にわたるオープンクロマチン領域と非オープンクロマチン領域との間のオーバーハング指数を示す。
【図５８Ｂ】本発明の実施形態による、異なる組織特異的オープンクロマチン領域にわたるオーバーハング指数：ＨＣＣの対象における異なる組織にわたるオープンクロマチン領域と非オープンクロマチン領域との間のオーバーハング指数を示す。
【図５８Ｃ】本発明の実施形態による、異なる組織特異的オープンクロマチン領域にわたるオーバーハング指数：対照およびＨＣＣの対象における異なる組織にわたるオープンクロマチン領域と非オープンクロマチン領域との間のオーバーハング指数の差を示す。
【図５８Ｄ】本発明の実施形態による、異なる組織特異的オープンクロマチン領域にわたるオーバーハング指数：異なる組織にわたるオープンクロマチン領域と非オープンクロマチン領域との間のオーバーハング指数の差の統計的有意性（マン・ホイットニー検定）を示す。
【図５９】本発明の実施形態による、生体試料を分析し、不揃いな末端値を使用して、組織タイプが癌を呈するかどうかを判断する方法を示す。
【図６０】本発明の実施形態による、血漿ＤＮＡの環状化による血漿ＤＮＡ粘着末端／オーバーハングの直接評価を示す。
【図６１】本発明の実施形態による、制限酵素を使用した血漿ＤＮＡの環状化により、血漿ＤＮＡの不揃いな末端を直接評価する技法を示す。
【図６２】本発明の実施形態による、ポリメラーゼ結合部位を使用した血漿ＤＮＡの環状化により、血漿ＤＮＡの不揃いな末端を直接評価する技法を示す。
【図６３】本発明の実施形態による、ランダムタグ付け増幅なしに、血漿ＤＮＡの環状化による血漿ＤＮＡ粘着末端／オーバーハングの直接評価を示す。
【図６４】本発明の実施形態による、生体試料を分析し、環状化二本鎖核酸分子を使用して、不揃いな末端が存在するかどうかを判定する方法を示す。
【図６５】本発明の実施形態による、生体試料を分析し、ヌクレオチド類似体を使用して、不揃いな末端が存在するかどうかを判定する方法を示す。
【図６６】本発明の実施形態による、イノシンベースの配列決定を使用して、不揃いな末端を評価することを示す。
【図６７】本発明の実施形態による、二本鎖核酸分子の不揃いな末端を測定するための方法を示す。
【図６８】は、本発明の実施形態による、オーバーハング指数ベースの年齢予測を示す。
【図６９】本発明の実施形態による、測定システムを例示する。
【図７０】本発明の実施形態による、システムおよび方法とともに使用可能な、例示的なコンピュータシステムのブロック図を示す。
【０００８】
用語
「組織」は、機能単位としてともに群化する細胞の群に対応する。２つ以上のタイプの細胞が、単一の組織内に見出され得る。異なるタイプの組織は、異なるタイプの細胞（例えば、肝細胞、肺胞細胞、または血球細胞）からなり得るが、異なる生物（母体対胎児）由来の組織または健常細胞対腫瘍細胞にも対応し得る。「参照組織」は、組織特異的メチル化レベルを決定するために使用される組織に対応する。異なる個体由来の同じ組織タイプの複数の試料を使用して、その組織タイプの組織特異的メチル化レベルを決定することができる。
【０００９】
「生体試料」は、対象（例えば、妊婦、癌に罹患している人、もしくは癌に罹患していると疑われる人、臓器移植レシピエント）、または臓器が関与する疾患過程（例えば、心筋梗塞における心臓、卒中における脳、もしくは貧血における造血系）を有すると疑われる対象から採取され、関心の１つ以上の核酸分子（複数可）を含有する何らかの試料を指す。生体試料は、血液、血漿、血清、尿、膣液、水腫（例えば、精巣の）からの流体、膣洗浄流体、胸水、腹水、脳脊髄液、唾液、汗、涙、痰、気管支肺胞洗浄液、乳首からの排出液、体の異なる部分（例えば、甲状腺、乳腺）からの吸引液などの体液であり得る。便試料もまた、使用することができる。様々な実施形態では、無細胞ＤＮＡのために濃縮された生体試料（例えば、遠心分離プロトコルを介して得られた血漿試料）におけるＤＮＡの大部分は、無細胞であり得、例えば、ＤＮＡの５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超、９５％超、または９９％超は、無細胞であり得る。遠心分離プロトコルは、例えば、３，０００ｇ×１０分で流体部分を得ることと、残留細胞を除去するために３０，０００ｇでさらに１０分間再遠心分離することと、を含み得る。
【００１０】
「配列リード」は、核酸分子の任意の一部または全部から配列決定されるヌクレオチドの鎖を指す。例えば、配列リードは、核酸断片から配列決定された短鎖ヌクレオチド（例えば、約２０〜１５０個）、核酸断片の片端もしくは両端の短鎖ヌクレオチド、または生物学的試料中に存在する核酸断片全体の配列決定であり得る。配列リードは、例えば、配列決定技法を使用するか、もしくはプローブを使用する様々な方法で、例えば、ハイブリダイゼーションアレイもしくは捕捉プローブで、または単一プライマーもしくは等温増幅を使用するポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）もしくは線形増幅などの増幅技法で得られ得る。
【００１１】
「エンディング（ｅｎｄｉｎｇ）位置」または「末端（ｅｎｄ）位置」（または単に「末端（ｅｎｄ）」）は、無細胞ＤＮＡ分子、例えば血漿ＤＮＡ分子の最も外側の塩基、すなわち末端部におけるゲノム座標もしくはゲノム同一性またはヌクレオチド同一性を指すことができる。末端位置は、ＤＮＡ分子のいずれかの端に対応することができる。このように、ＤＮＡ分子の開始と終了に言及する場合、両方がエンディング位置に対応する。実際には、一方の末端位置は、マッシブリーパラレル（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｒａｌｌｅｌ）配列決定もしくは次世代配列決定、単一分子配列決定、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡ配列決定ライブラリー調製プロトコル、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはマイクロアレイなどであるが、これらに限定されない分析方法によって検出または決定される、無細胞ＤＮＡ分子の一方の末端の最も外側の塩基のゲノム座標またはヌクレオチド同一性である。
【００１２】
「較正データポイント」は、「較正値」と、試料または対象の測定された、もしくは既知の特性、例えば、年齢または組織特異的画分（例えば、胎児または腫瘍）を含む。較正値は、特性が既知である較正試料に対して決定された相対的存在量とすることができる。較正データポイントには、較正値（例えば、オーバーハング指数とも呼ばれる不揃いな末端値）と既知の（測定された）特性を含めることができる。較正データポイントは、様々な方法で、例えば、離散ポイントとして、または較正関数（検量線または較正面とも呼ばれる）として定義され得る。較正関数は、較正データポイントの追加の数学的変換から導出することができる。較正関数は、線形または非線形とすることができる。
【００１３】
「部位」（「ゲノム部位」とも呼ばれる）は、単一の塩基位置、または相関する塩基位置の群、例えば、ＣｐＧ部位、または相関する塩基位置のより大きい群であり得る、単一の部位に対応する。「遺伝子座」は、複数の部位を含む領域に対応し得る。遺伝子座は、遺伝子座をその脈絡における部位と等価にするであろうただ１つの部位を含むことができる。
【００１４】
各ゲノム部位（例えば、ＣｐＧ部位）に対する「メチル化指数」または「メチル化状態」は、その部位におけるメチル化を、その部位を覆うリード数の合計にわたって示す、（例えば、配列リードまたはプローブから決定されるような）ＤＮＡ断片の比率を指すことができる。「リード」は、ＤＮＡ断片から得られた情報（例えば、部位のメチル化状態）に対応することができる。リードは、特定のメチル化状態のＤＮＡ断片と優先的にハイブリダイズする試薬（例えば、プライマーまたはプローブ）を使用して、得ることができる。典型的には、このような試薬は、ＤＮＡ分子のメチル化状態、例えば、バイサルファイト変換、またはメチル化感受性制限酵素、またはメチル化結合タンパク質、または抗メチルシトシン抗体、またはメチルシトシンおよびヒドロキシメチルシトシンを認識する一分子配列決定技法に応じて、ＤＮＡ分子を特異的に修飾するか、または特異的に認識するプロセスによる処理後に適用される。
【００１５】
領域の「メチル化密度」は、この領域における部位をカバーするリード数の合計で割ったメチル化を示す、領域内の部位におけるリード数を指し得る。この部位は、具体的な特徴を有し得、例えば、ＣｐＧ部位であり得る。したがって、領域の「ＣｐＧメチル化密度」は、この領域におけるＣｐＧ部位（例えば、特定のＣｐＧ部位、ＣｐＧアイランド内またはそれより大きな領域のＣｐＧ部位）をカバーするリード数の合計で割ったＣｐＧメチル化を示すリード数を指す。例えば、ヒトゲノム中の各１００ｋｂビンのメチル化密度は、１００ｋｂ領域へマップされた配列リードによって覆われた全てのＣｐＧ部位の割合として、ＣｐＧ部位の（メチル化されたシトシンに対応する）バイサルファイト処理後に変換されていないシトシンの総数から判定することができる。この分析はまた、５００ｂｐ、５ｋｂ、１０ｋｂ、５０ｋｂ、もしくは１Ｍｂなどの他のビンサイズに対して実施することができる。領域は、全ゲノム、または染色体、または染色体の一部（例えば、染色体腕）であり得る。ＣｐＧ部位のメチル化指数は、領域がそのＣｐＧ部位のみを含む場合、その領域のメチル化密度と同じである。「メチル化シトシンの比率」は、この領域における解析されたシトシン残基の総数、すなわちＣｐＧの脈絡外のシトシンを含む、メチル化されている（例えば、二亜硫酸塩変換後に覆われていない）ことが示されているシトシン部位「Ｃ」の数を指すことができる。メチル化指数、メチル化密度、およびメチル化シトシンの比率は、「メチル化レベル」の例である。バイサルファイト変換とは別に、当業者に既知の他のプロセスは、これらに限定されないが、メチル化状態に敏感な酵素（例えば、メチル化感受性制限酵素）、メチル化結合タンパク質、メチル化状態に敏感なプラットフォームを使用する単一分子配列決定（例えば、ナノポア配列決定（Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ２０１３；１１０：１８９１０−１８９１５）およびＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ単一分子リアルタイム分析（Ｆｌｕｓｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０１０；７：４６１−４６５）によるもの）を含み、ＤＮＡ分子のメチル化状態を調べるために使用することができる。
【００１６】
「配列決定深度」という用語は、座位が、座位にアライメントされた配列リードによって覆われる回数を指す。座位は、ヌクレオチドの小ささ、または染色体アームの大きさ、またはゲノム全体の大きさであってもよい。配列決定深度は、５０ｘ、１００ｘなどと表され、「ｘ」は、座位が配列リードで覆われる回数を指す。配列決定深度はまた、複数の座位または、ゲノム全体に適用されることができ、その場合、ｘは、座位もしくは１倍体ゲノム、またはゲノム全体がそれぞれ配列決定される平均回数を指す。ウルトラディープ配列決定は、少なくとも１００ｘのシーケンシング深度を指し得る。
【００１７】
「分離値」は、２つの値を包含する差または比、例えば、２つの分数寄与または２つのメチル化レベルに相当する。分離値は、単純な差または比であり得る。例として、ｘ／ｙの直接比はｘ／（ｘ＋ｙ）と同様に分離値である。分離値は、他の因子、例えば、倍数因子を含むことができる。他の例として、値の関数の差または比、例えば、２つの値の自然対数（ｌｎ）の差または比を使用することができる。分離値には、差および比を含むことができる。
【００１８】
本明細書で使用される「分類」という用語は、試料の特定の特性と関係した任意の数（複数可）または他の特徴（複数可）を指す。例えば、「＋」という記号（または「陽性」という語）は、試料が欠失または増幅を有するものとして分類されることを意味し得る。分類は、二項（例えば、陽性または陰性）であるか、またはより多くのレベルの分類（例えば、１〜１０または０〜１のスケール）を有することができる。「カットオフ」および「閾値」という用語は、操作に使用される所定の数を指す。例えば、カットオフサイズは、それを超えると断片が除外されるサイズを指す場合がある。閾値は、特定の分類が要求しているものを上回るまたは下回る値であり得る。これらの用語のいずれも、これらの脈絡のいずれにおいても使用することができる。
【００１９】
ＤＮＡ分子を説明する際の「損傷」という用語は、ＤＮＡニック、二本鎖ＤＮＡに存在する一本鎖、二本鎖ＤＮＡのオーバーハング、酸化グアニンによる酸化的ＤＮＡ修飾、脱塩基部位、チミジン二量体、酸化ピリミジン、ブロックされた３’末端、または不揃いな末端を指し得る。
【００２０】
「不揃いな末端」という用語は、ＤＮＡの粘着末端、ＤＮＡのオーバーハング、または二本鎖ＤＮＡが、ＤＮＡの他の鎖にハイブリダイズしていないＤＮＡの鎖を含む場合を指し得る。「不揃いな末端値」は、不揃いな末端の範囲の尺度である。不揃いな末端値は、二本鎖ＤＮＡの第２の鎖から突出した１本の鎖の平均長に比例し得る。複数のＤＮＡ分子の不揃いな末端値は、ＤＮＡ分子間の平滑末端の考慮を含み得る。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
ここでは、無細胞ＤＮＡ損傷の程度を評価するための新しい手法を発明した。損傷した無細胞ＤＮＡ分子は、限定されないが、鎖内ＤＮＡニック、二本鎖ＤＮＡのオーバーハング、酸化グアニンによる酸化的ＤＮＡ損傷、脱塩基部位、チミジン二量体、酸化ピリミジン、またはブロックされた３’末端などとして現れる可能性がある。担癌マウスの研究で、腫瘍の存在がインビボで慢性炎症反応を誘発し、二本鎖切断（ＤＳＢ）および酸化的に誘発された非ＤＳＢクラスター化ＤＮＡ損傷を含むＤＮＡ損傷の全身レベルの増加につながる可能性があることが報告されている（Ｒｅｄｏｎ  ＣＥ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉｅ  ＵＳＡ．２０１０；１０７：１７９９２−７）。しかしながら、血漿ＤＮＡにおけるＤＮＡ損傷およびその臨床的有用性の評価は、容易に明らかにはわからない。
【００２２】
以前は認識されていなかった無細胞ＤＮＡのＤＮＡ損傷は、多くの臨床応用を有する可能性があると仮定した。第１に、無細胞ＤＮＡ損傷の程度が、新たに収集された試料か、または保管されていた試料であるかどうか、試料が適切に保管および処理されたかどうか、試料が繰り返し凍結融解されたかどうかの、無細胞ＤＮＡ試料の品質を反映し得ることである。第２に、無細胞ＤＮＡ損傷が、炎症（例えば、ある特定の薬物の摂取によって引き起こされる酸化ストレス）、免疫学的発作、および全身性エリテマトーデスなどの自己免疫に関連する病状など、ある特定の病状で増加し得ることである。第３に、無細胞ＤＮＡ損傷の程度が、異なる組織または臓器源に由来する無細胞ＤＮＡ分子間で異なり得ることである。言い換えれば、無細胞ＤＮＡ損傷は、原発組織に関連している可能性があり、腫瘍の発生源の同一性を反映し得ることである。加えて、無細胞ＤＮＡ損傷の程度は、母体血漿中の胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡとの間で異なる可能性があり、循環母体無細胞ＤＮＡと循環胎児無細胞ＤＮＡとの間を区別する手段を提供するか、または循環無細胞胎児ＤＮＡを濃縮もしくは分類する手段を提供する。
【００２３】
無細胞ＤＮＡは、インビボで自然に断片化されることが知られている。したがって、無細胞ＤＮＡ分子は、血漿、血清、尿、唾液、胸膜液、脳脊髄液、腹膜液、滑液などの生体液中に短い断片として存在する。臓器または組織内の病状は、異なる程度もしくは形態の断片化または無細胞ＤＮＡへの損傷をもたらす場合がある。加えて、病状、プロセスまたは状態（例えば、酸化性薬物または化学物質の摂取）は、細胞放出後の生体液内の無細胞ＤＮＡ分子の分子形態にさらなる損傷または変化を引き起こす場合がある。インビトロプロセス（例えば、凍結および解凍の繰り返し、極端な温度への曝露）は、生体液試料または無細胞核酸を含有する検体中の無細胞ＤＮＡ分子にさらなる損傷を引き起こす場合がある。
【００２４】
特定の臓器または組織で細胞死を引き起こす異なる病原性の理由により、無細胞ＤＮＡ分子に存在するＤＮＡ損傷の相対的な表現が変化する可能性がある。例えば、二本鎖ＤＮＡのオーバーハングは、原発組織との関係を有する。したがって、無細胞ＤＮＡ損傷を分析するための本発明の実施形態は、限定されないが、癌検出、臓器損傷、免疫疾患、ならびに非侵襲的出生前検査を実施することなどを検出または監視するための新しい可能性を提供するであろう。追加的に、例えば、不揃いな末端と呼ばれる、ＤＮＡ損傷の測定を実施するための新しい技法が提供される。
【００２５】
Ｉ．無細胞ＤＮＡ分子のオーバーハングの調査
無細胞ＤＮＡ末端は、末端の様式に応じて２つの形態に分類される。無細胞ＤＮＡの１つの形態は、平滑末端を有して血液循環に存在し、他の形態は、粘着末端を保有するであろう。粘着末端は、他の鎖にハイブリダイズしていない少なくとも１つの最も外側のヌクレオチドを有する二本鎖ＤＮＡの末端である。粘着末端は、オーバーハングまたは不揃いな末端とも呼ばれる。任意の特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、不揃いな末端は、無細胞ＤＮＡ断片がどんな状態であるかに関連し得ると考えられている。例えば、ＤＮＡは段階的に断片化する場合があり、不揃いな末端のサイズは、断片化の段階を反映することができる。不揃いな末端の数および／または不揃いな末端のオーバーハングのサイズを使用して、無細胞ＤＮＡを有する生物学的試料を分析し、試料および／または試料が得られた個体に関する情報を提供し得る。
【００２６】
図１は、不揃いな末端値を使用して生体試料を分析する方法１００を示している。生体試料は、個体から得ることができる。生体試料は、無細胞である複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子のうちの各核酸分子は、第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくとも一部の第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖から突出することができ、第２の鎖にハイブリダイズすることができず、かつ第１の鎖の第１の末端にあり得る。第１の末端は、３’末端または５’末端であり得る。
【００２７】
ブロック１０２において、方法１００は、第２の鎖から突出した第１の鎖の長さに比例する、第１の鎖および／または第２の鎖の特性を測定することを含み得る。特性は、複数の核酸のうちの各核酸について測定され得る。特性は、本明細書に記載の任意の技法によって測定され得る。
【００２８】
特性は、複数の核酸分子のそれぞれの第１および／または第２の鎖の末端部分における１つ以上の部位でのメチル化状態であり得る。不揃いな末端値は、第１および／または第２の鎖の末端部分の１つ以上の部位における複数の核酸分子にわたるメチル化レベルを含み得る。
【００２９】
いくつかの実施形態では、方法１００は、核酸分子のサイズを測定することを含み得る。複数の核酸分子は、特定の範囲内のサイズを有し得る。指定された範囲は、１４０〜１６０ｂｐ、生体試料に存在するサイズの全範囲よりも小さい任意の範囲、または本明細書に記載の任意の範囲であり得る。サイズ範囲は、より短い鎖またはより長い鎖のサイズに基づき得る。サイズ範囲は、末端修復後の分子の最も外側のヌクレオチドに基づいてもよい。５’末端が突出している場合、５’から３’までのポリメラーゼを介した伸長が起こり、サイズはより長い鎖になるであろう。３’から５’までの合成機能を持つＤＮＡポリメラーゼなしで、３’末端が突出している場合、３’末端の突出した一本鎖がトリミングされ、サイズがより短い鎖になり得る。
【００３０】
実施形態では、方法１００は、リードを生成するために核酸分子を分析することを含み得る。リードは基準ゲノムにアライメントされ得る。複数の核酸分子は、転写開始部位に対してある特定の距離範囲内で読み取られ得る。
【００３１】
ブロック１０４において、複数の核酸分子の測定された特性を使用して、不揃いな末端値が決定され得る。
【００３２】
第１の複数の核酸分子が指定されたサイズ範囲にある場合、方法は、第２の複数の核酸分子のうちの各核酸分子の特性を測定することを含み得る。第２の複数の核酸分子は、第２の指定されたサイズ範囲を有するサイズを有し得る。不揃いな末端値を決定することは、第１の複数の核酸分子の測定された特性と、第２の複数の核酸分子の測定された特性とを使用して、比を計算することを含み得る。不揃いな末端の値は、本明細書に記載の不揃いな末端比またはオーバーハング指数比を含み得る。
【００３３】
ブロック１０６において、不揃いな末端値は、参照値と比較され得る。参照値または比較は、トレーニングデータセットを用いた機械学習を使用して決定され得る。
【００３４】
比較は、生体試料または個体に関する異なる情報を決定するために使用し得る。実施形態では、比較は、ブロック１０８、１１０、または１１２のうちの少なくとも１つを含み得る。
【００３５】
ブロック１０８において、個体の病態のレベルを、比較に基づいて決定され得る。病態には、疾患、障害、または妊娠を挙げることができる。病態は、癌、自己免疫疾患、妊娠関連病態、または本明細書に記載の任意の病態であり得る。例として、癌には、肝細胞癌（ＨＣＣ）、大腸直腸癌（ＣＲＣ）、白血病、肺癌、または咽頭癌を挙げることができる。自己免疫疾患には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）を挙げることができる。以下の様々なデータは、病態のレベルを決定するための例を提供する。
【００３６】
ブロック１０８が実装されるとき、参照値は、病態を有する対象の１つ以上の参照試料を使用して決定することができる。別の例として、参照値は、病態を有さない対象の１つ以上の参照試料を使用して決定される。参照試料から複数の参照値を決定でき、異なる参照値は、病態の異なるレベルを識別する可能性がある。
【００３７】
いくつかの実施形態では、参照との比較は、例えば、教師あり学習を使用して訓練された機械学習モデルを伴うことができる。不揃いな末端値（およびコピー数、ＤＮＡ断片のサイズ、およびメチル化レベルなどの考えられる他の基準）、およびトレーニング試料を取得したトレーニング対象の既知の病態は、トレーニングデータセットを形成することができる。機械学習モデルのパラメータは、トレーニングセットに基づいて最適化され、病態のレベルを分類する際の最適化された精度を提供することができる。機械学習モデルの例としては、ニューラルネットワーク、決定木、クラスタリング、サポートベクターマシンが挙げられる。
【００３８】
ブロック１１０において、比較に基づいて、生体試料中の臨床的に関連するＤＮＡの画分が決定され得る。臨床的に関連するＤＮＡとしては、胎児ＤＮＡ、腫瘍由来ＤＮＡ、または移植ＤＮＡを挙げることができる。参照値は、臨床的に関連するＤＮＡの既知の画分を有する１つ以上の参照対象からの核酸分子を使用して得ることができる。臨床的に関連するＤＮＡの画分を決定するための方法は、第１の鎖および／または第２の鎖の特性を測定する前に、複数の核酸分子を、プロトコルによって処理することを含み得る。１つ以上の参照対象からの核酸分子は、測定された特性を有する複数の核酸分子と同じプロトコルによって処理され得る。
【００３９】
以下に記載するように、較正データポイントは、例えば、図８、図１１、図１４、図２７Ａ、図３０Ａ、図３０Ｂ、および図３１について説明したように、測定された不揃いな末端値および臨床的に関連するＤＮＡの測定された／既知の画分を含むことができる。このような図は、校正値が新しい試料の画分を決定するための参照値として使用することができる、較正データポイントを示している。別の技法（例えば、組織特異的対立遺伝子を使用）を介して画分が測定される、任意の試料についての測定された不揃いな末端値は、参照値に対応することができる。別の例として、検量線（関数）を較正データポイントに適合させることができ、参照値は検量線上のポイントに対応させることができる。したがって、新しい試料の測定された不揃いな末端値を較正関数に入力することができ、これにより、臨床的に関連するＤＮＡの画分を出力することができる。
【００４０】
例として、臨床的に関連するＤＮＡの画分は、いくつかの方法、例えば、限定されないが、試料中の組織特異的（例えば、胎児、腫瘍、または移植）対立遺伝子の決定、男性の妊娠の染色体Ｙ上の標的の定量化、および組織特異的メチル化マーカーの分析によって決定することができる。この情報を使用して、試験されたＤＮＡ試料（例えば、血漿または血清）中の臨床的に関連するＤＮＡ画分は、検量線、例えば、図８の曲線８０２に基づいて決定することができる。
【００４１】
ブロック１１２において、個体の年齢は、比較に基づいて決定され得る。図６８は、そのような例を示しており、検量線６８０２を使用して、不揃いな末端値を使用して個人の年齢（例えば、遺伝的年齢）を決定することができる。
【００４２】
ブロック１０８、１１０、および１１２に関連する方法は、以下でより詳細に説明される。
【００４３】
ＩＩ．メチル化されていないシトシンで修復した後のメチル化状態を使用した不揃いな末端の測定
従来のライブラリー調製プロトコルでは、通常、二本鎖ＤＮＡ断片の末端修復は、ユニバーサルアダプタを用いてライゲーションする前に実施されるであろう。このような末端修復は、ＤＮＡポリメラーゼを使用して粘着末端を埋め、平滑末端を形成する。このような末端修復は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、およびメチル化されていないシトシン（Ｃ）を使用して実行することができる。したがって、従来のライブラリー調製プロトコルでは、オーバーハング情報を反映して、最終的な配列結果から追跡することはできない。末端修復後に平滑末端を形成するために使用されるセクションで結果として生じるメチル化の欠如は、不揃いな末端を測定するために使用することができる。
【００４４】
Ａ．メチル化レベルおよび不揃いな末端値の決定
この特許出願では、一実施形態は、亜硫酸水素ナトリウムを使用して末端修復されたＤＮＡ分子を処理することを含み、新しく埋め込まれたメチル化されていないＣは、ＰＣＲによってＴとして増幅される変換されたウラシル（Ｕ）であり、分子内に存在する元のメチル化Ｃは、変更されないままである。したがって、配列決定後、亜硫酸水素ナトリウムによって変換された一本鎖ＤＮＡはその相補鎖とペアリングすることができず、この方法で生成されたバイサルファイト配列決定ライブラリーは鎖特異的（すなわち、ワトソン鎖およびクリック鎖）であるため、一本鎖ＤＮＡ分子の３’末端に近い隣接するヌクレオチド（３’末端隣接ヌクレオチド）は、５’末端に近接する隣接ヌクレオチド（５’末端隣接ヌクレオチド）と比較して、末端に近接するギャップにメチル化されていないＣが埋め込まれているため、低いメチル化レベルを生じるであろう。末端に近接する隣接ヌクレオチドは、限定されないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０個の塩基、またはこれらの塩基数のいずれか２つによって定義される任意の範囲のその該末端に対して相対距離を有する、これらのヌクレオチドによって画定されるであろう。ＤＮＡ分子のオーバーハングの程度を計算するための一実施形態は、５’末端隣接ヌクレオチドと３’末端隣接ヌクレオチドとの間のメチル化レベルの差を決定するためのものであり、このような差は、比または減算であり得る。
【００４５】
図２は、無細胞ＤＮＡ分子のオーバーハングの程度（すなわち、オーバーハング指数）をどのように推定できるかを示す一例を例示している。図表２１０、２２０、２３０：塗りつぶされたロリポップ形は、メチル化されたＣｐＧ部位を表し、塗りつぶされていないロリポップ形は、メチル化されていないＣｐＧ部位を表す。図表２２０および２３０：破線は、新しく埋め込まれたヌクレオチドを表す。図表２３０：赤い矢印は、配列決定結果の第１のリード（リード１）であり、シアンの矢印は、第２のリード（リード２）を表す。グラフ２４０：５’から３’までのリード１およびリード２のメチル化レベルのグラフである。式２５０：Ｒ１：リード１のメチル化レベルである。Ｒ２：リード２のメチル化レベルである。
【００４６】
ワトソン鎖およびクリック鎖からの全てのＤＮＡ分子は、ヒト基準ゲノムにマッピングされた後、相対的な位置および方向に従ってそれぞれ積み重ねられた（図３）。積み重ねられた分子は、図３に示されるように、アライメント結果における５’末端に対する相対的な位置に従って全体的なオーバーハング指数を計算するために使用された。
【００４７】
図３は、ヒト基準ゲノムにマッピングした後のＤＮＡ分子に沿ったメチル化レベルの計算の図解である。最も近い末端（すなわち、リード１の場合は５’末端）に対する特定の位置ｉでのメチル化レベルは、ＣおよびＴの総数に対するＣの数の比によって定量化された。第２のリードの３’ギャップは、バイサルファイトシーケンスの結果でＴに変換されることになるメチル化されていないＣで埋められるため、第１のリード（５’末端を有する、すなわち、リード１）は、第２のリード（３’末端を有する、すなわち、リード２）よりも高い平均メチル化レベルを有するであろう。
【００４８】
図４は、個体から得られた生体試料を分析する方法４００を示している。生体試料は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子は、無細胞であり得る。複数の核酸分子のうちの各核酸分子は、第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくとも一部の第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖から突出することができ、第２の鎖にハイブリダイズすることができず、かつ第１の鎖の第１の末端にあり得る。
【００４９】
ブロック４０２において、１つ以上のヌクレオチドを含む第１の化合物は、複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、第１の鎖の第１の部分にハイブリダイズされ得る。第１の化合物は、第２の鎖の第１の末端に結合して、第１の化合物を含む第１の末端を有する伸長された第２の鎖を形成し得る。第１の化合物は、第２の鎖に接触していない第１の末端を含み得る。１つ以上のヌクレオチドは、メチル化されていなくてもよい。他の実装形態では、ある特定のヌクレオチド（例えば、シトシン）は全てメチル化されており、他のヌクレオチドはメチル化されていない。第１の化合物は、一度に１ヌクレオチドずつ第１の部分にハイブリダイズされ得る。
【００５０】
ブロック４０４において、第１の鎖は、複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、伸長された第２の鎖から分離され得る。
【００５１】
ブロック４０６において、伸長された第２の鎖の１つ以上の第１の部位の各々についての第１のメチル化状態は、複数の核酸分子のうちの各核酸分子について決定され得る。１つ以上の第１の部位は、伸長された第２の鎖の第１の末端にあってもよい。
【００５２】
ブロック４０８において、伸長された第２の鎖の１つ以上の第２の部位の各々についての第２のメチル化状態は、任意選択的に、複数の核酸分子のうちの各核酸分子について決定され得る。１つ以上の第２の部位は、伸長された第２の鎖の第２の末端にあってもよい。１つ以上の第２の部位は、伸長された第２の鎖の第２の末端で、最も外側の３０の部位を含み得る。いくつかの例では、第２の部位のメチル化状態を決定する必要がない場合があり、代わりに平均メチル化状態であると想定されてもよい。平均メチル化状態は、ゲノムの特定の領域におけるメチル化されたＣｐＧ部位の既知の頻度から知ることができる。場合によっては、平均メチル化状態は、生体試料が得られたのと同じ個体から、および／または他の個人から採取された参照試料から決定されてもよい。
【００５３】
ブロック４１０において、１つ以上の第１の部位での複数の伸長された第２の鎖についての第１のメチル化状態を使用して、第１のメチル化レベルが計算される。第１のメチル化レベルは、第１のメチル化状態の平均値または中央値であり得る。
【００５４】
ブロック４１２において、第２のメチル化レベルは、任意選択的に、１つ以上の第２の部位における複数の伸長した第２の鎖についての第２のメチル化状態を使用して計算され得る。第２のメチル化レベルは、第２のメチル化状態の平均値または中央値であり得る。いくつかの実施形態では、第２のメチル化レベルは、平均メチル化レベルであると想定され得る。平均メチル化状態は、ゲノムの特定の領域におけるメチル化されたＣｐＧ部位の既知の頻度に基づき得る。場合によっては、平均メチル化レベルは、生体試料が得られたのと同じ個体から、および／または他の個人から採取された参照試料から決定されてもよい。例えば、第２のメチル化レベルは、７０％〜８０％の値であると想定され得る。
【００５５】
ブロック４１４において、第１のメチル化レベルおよび第２のメチル化レベルを使用して、不揃いな末端値が計算され得る。第１のメチル化レベルと第２のメチル化レベルとの間の差は、第２の鎖から突出した第１の鎖の平均長さに比例し得る。不揃いな末端値を計算することは、第１のメチル化レベルと第２のメチル化レベルとの間の差を計算し、この差を第１のメチル化レベルで割ることによって行われ得る（例えば、図３の全オーバーハング指数）。
【００５６】
ブロック４１４で計算された不揃いな末端値は、図１で説明された方法のいずれかで使用することができる。
【００５７】
Ｂ．胎児と母体のＤＮＡにおける不揃いな末端の差
実験は、測定された不揃いな末端の値が、胎児のＤＮＡと母体ＤＮＡとの間で異なることを示している。その結果、不揃いな末端値を使用して、胎児のＤＮＡ画分および妊娠の段階を決定し得る。不揃いな末端値は、メチル化レベルの分析を通して、または本明細書に記載の任意の技法によって決定され得る。加えて、不揃いな末端値を使用して、癌／腫瘍ＤＮＡまたは移植ＤＮＡなどの他の臨床的に関連するＤＮＡの画分を決定し得る。
【００５８】
Ｃ．超音波処理された組織ＤＮＡと無細胞ＤＮＡ断片との間の差次的オーバーハング指数
最初に、マッシブリーペアエンドバイサルファイト配列決定（ｍａｓｓｉｖｅｌｙ  ｐａｉｒ−ｅｎｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（７５ｂｐ×２）を使用して、健康な対象からの８個の超音波処理組織ＤＮＡ試料および４７個の無細胞ＤＮＡ試料を分析した。各試料で１億３２９０万のペアエンドリードの中央値が達成された（範囲：１２０万〜２億６１８０万）。図５Ａおよび図５Ｂにおいて、無細胞ＤＮＡは、より長い３’ギャップを有することが判明し、これは、無細胞ＤＮＡのメチル化レベルの低下が、１２０ｂｐで（３’末端から３０ｂｐ離れて）始まったのに対し、超音波処理されたＤＮＡが、１４５ｂｐで（３’末端からわずか５ｂｐ離れて）開始するメチル化レベルの低下を示したという事実によって示される。
【００５９】
図６は、超音波処理した組織ＤＮＡと無細胞ＤＮＡ試料との間のオーバーハング指数の差の箱ひげ図を示している。無細胞ＤＮＡ試料のオーバーハング指数は、超音波処理されたＤＮＡ試料のオーバーハング指数よりも有意に高く（Ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニー検定）、オーバーハング指数を定量化することにより、新しい方法でＤＮＡが切断される方法を区別できることを示唆している。
【００６０】
Ｄ．胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子との間の異なるオーバーハング指数
胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子との間のオーバーハング指数の差をそれぞれ評価するために、マイクロアレイプラットフォーム（Ｈｕｍａｎ  Ｏｍｎｉ２．５、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、母体のバフィーコートおよび胎児試料のジェノタイピングを行った。妊娠第１（１２〜１４週）、第２（２０〜２３週）、および第３（３８〜４０週）三半期の各々からの１０人の妊婦で末梢血試料を得て、各症例の血漿および母体のバフィーコート試料を採取した。胎児試料は、絨毛生検（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｖｉｌｌｕｓ  ｓａｍｐｌｉｎｇ）、羊水穿刺（ａｍｎｉｏｃｅｎｔｅｓｉｓ）、または胎盤採取によっても得られた。母親がホモ接合であり、胎児がヘテロ接合である場合、１９５，３３１の有益な一塩基多型座（範囲：１４６，４２８〜２０２，８００）の中央値があった。母親がヘテロ接合であり、胎児がホモ接合である場合、１９０，７０６の有益な一塩基多型座（範囲：１５０，１６８〜１９３，４０６）の中央値があった。胎児特異的対立遺伝子を保有する血漿ＤＮＡ分子は、胎児に由来するものとして特定された。母体特異的対立遺伝子を保有する血漿ＤＮＡ分子は、胎児に由来するものとして特定された。これらの試料の中の中央値胎児ＤＮＡ画分は、１７．１％（範囲：７．０％〜４６．８％）であった。マッピングされたペアエンドリードの１億３００万の中央値（範囲：５２００万〜１億８６００万）が、各症例に得られた。ゲノムワイドなＣｐＧの９２％が配列決定された。
【００６１】
ワトソン鎖からの全ての胎児ＤＮＡ分子を積み重ね、図３に示すように全体的なオーバーハング指数を計算するために使用した。リード１およびリード２の相対位置での平均メチル化レベルは、その特定の位置で配列決定されたＣとＴとの総数に対するＣの数の比率によって推定することができる。末端修復はリード２でのみ発生するため、リード１とリード２との間の平均メチル化レベルの差（図３）を使用して、試料の全体的なオーバーハング指数を示すことができる。同様に、ワトソン鎖からの全ての母体ＤＮＡ分子を積み重ね、配列決定サイクルに従って、母体の全体的なオーバーハング指数を計算するために使用した。図７Ａ〜図７Ｃに示すように、胎児ＤＮＡのオーバーハング指数は、妊娠第１三半期（Ｐ値＝０．００５、マン・ホイットニー検定）の対象の妊婦（７Ａ）、妊娠第２三半期（Ｐ値＝０．００５、マン・ホイットニー検定）の対象の妊婦（７Ｂ）、および妊娠第３三半期（Ｐ値＝０．０２、マン・ホイットニー検定）の対象の妊婦（７Ｃ）のそれぞれの血漿中の母体ＤＮＡのオーバーハング指数よりも有意に低い。さらに、胎児ＤＮＡ分子のオーバーハング指数は、胎児ＤＮＡ画分と相関することが見出された（図８、Ｐ値＜０．０００１、ｒ＝０．８６）。このようなデータは、無細胞ＤＮＡ分子のオーバーハングが原発組織の情報を有し得ることを示唆した。
【００６２】
Ｅ．サイズバンドオーバーハング指数分析
さらに、オーバーハング指数と分析されるサイズ範囲との間の関係を調べる。非造血由来のＤＮＡは、血漿中の造血由来のＤＮＡよりも短いことが実証されている（Ｚｈｅｎｇ  ＹＷ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０１２；５８：５４９−５８）。オーバーハング指数と断片サイズとの間の関係を視覚化して調査するために、３０個の妊娠試料から配列決定された全ての断片をプールした。興味深いことに、オーバーハング指数は、分析されている異なるサイズ範囲にわたって不均一に分布しており（図９）、波状の非ランダムパターンを示している。
【００６３】
それぞれ約１００ｂｐ、２４０ｂｐ、４００ｂｐ、および５６０ｂｐに、オーバーハング指数の複数の主要なピークが発生した。図９の２つの隣接する主要なピーク間の距離は約１６０ｂｐであることが見出され、このようなオーバーハング指数がヌクレオソーム構造に関連している可能性があることを示唆している。オーバーハング指数の最大値は、約２３０ｂｐに存在していた。異なるサイズにわたるオーバーハング指数の不均一性は、特定のサイズ範囲が異なる臨床病態の試料間の分離を向上させ得ることも示唆している可能性がある。この目的に光を当てるために、血漿ＤＮＡ分子を、８０〜１００ｂｐ、１００〜１２０ｂｐ、１２０〜１４０ｂｐ、１４０〜１６０ｂｐ、１６０〜１８０ｂｐ、１８０〜２００ｂｐ、２００〜２２０ｂｐ、２２０〜２４０ｂｐ、および２４０〜２６０ｂｐが挙げられるが、これらに限定されない異なるサイズのウィンドウに分割し、異なる対象間のオーバーハング指数を定量化した。図１０は、異なる妊娠三半期からの試料にわたる１４０〜１６０ｂｐの代表的なサイズ範囲のオーバーハング指数を示した。全ての断片に対するサイズ範囲１４０〜１６０ｂｐを有するそれらの分子についてのオーバーハング指数のオーバーハング指数比は、母体ＤＮＡ分子のものよりも胎児ＤＮＡ分子において有意に高いことが判明し、短い胎児ＤＮＡ分子のオーバーハングが、同じ個体内の母体ＤＮＡ分子と比べて、比較的高いオーバーハング存在量を有することを示唆している。
【００６４】
図１１は、母体および胎児のＤＮＡ分子を含む断片の全体的なオーバーハング指数比が、胎児のＤＮＡ画分と相関することを示し（ｒ＝０．５、Ｐ＝０．０２）、サイズ範囲ベースのオーバーハング指数分析が、原発組織を血漿ＤＮＡ分子に情報提供することに使用されること示唆している。
【００６５】
図１２は、血漿ＤＮＡ分子と超音波処理されたＤＮＡとの間の異なるサイズ範囲にわたるオーバーハング指数の比較を示している。
【００６６】
図１３は、異なる妊娠三半期にわたる胎児ＤＮＡと母体ＤＮＡとの間の不揃い指数の追加の結果を示している。穏やかなクリーンアップ条件（ＭｉｎＥｌｕｔｅ  ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ）を使用した実験プロトコルを使用して、妊娠症例を分析した。図１０では、実験プロトコルは、ＧｅｎｅＲｅａｄ  ＤＮＡ  ＦＦＰＥ  Ｋｉｔを使用した。胎児のＤＮＡおよび母体のＤＮＡ分子は、胎児のゲノムと母体のゲノムとの間の遺伝子型の差を利用して特定された。これらの結果により、胎児ＤＮＡの不揃い指数が、母体ＤＮＡの不揃い指数よりも有意に高かったため、胎児ＤＮＡ分子はより多くの不揃いな末端を保有していることが判明した。これらの結果は、胎児ＤＮＡ分子が不揃いな末端を含む可能性が低いことを示した図１０の結果とは異なる。しかしながら、胎児ＤＮＡ分子の１４０〜１６０ｂｐのサイズ範囲についての不揃い指数比は、母体ＤＮＡ分子ものよりも高いことが判明した。不揃い指数比は、別のクリーンアップ条件に基づく、図１０の３列目の結果と一致していた。
【００６７】
不揃いな末端を使用して臨床的に関連するＤＮＡの画分濃度を決定する場合、参照試料と試験する試料との両方に同じ実験プロトコルを使用する必要がある。
【００６８】
図１４は、胎児ＤＮＡ画分と不揃いな末端指数比との間の相関関係を示している（ｒ＝０．５およびｐ値＝０．００４８）。図１４は、図１１と一致する相関関係を示している。
【００６９】
ＩＩＩ．メチル化されたシトシンで修復した後のメチル化状態を使用した不揃いな末端の測定
上述のように、末端修復は、アデニン（Ａ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、および非メチル化シトシン（Ｃ）を使用して実行することができる。しかしながら、末端修復は、メチル化されていないシトシンの代わりにメチル化されたシトシン（ｍＣ）を使用するように変更することができる。末端修復後に平滑末端を形成するために使用されるセクションで結果として生じるメチル化は、不揃いな末端を測定するために使用することができる。加えて、末端修復にメチル化シトシンを使用すると、不揃いな末端の正確な長さを測定したり、または平滑末端を特定したりすることもできる。
【００７０】
Ａ．血漿ＤＮＡ分子の不揃いな末端を調べるための原理
図１５は、ライブラリー調製の末端修復プロセス中に平滑末端を形成するために、ｄＡＴＰ（Ａ）、ｄＧＴＰ（Ｇ）、ｄＴＴＰ（Ｔ）、およびメチル化されていないｄＣＴＰ（Ｃ）の代わりのメチル化ｄＣＴＰ（ｍＣ）を含むリボヌクレオシド三リン酸（ｄＮＴＰ）を使用して、不揃いな末端を埋めるための手法を示している。図１５において、埋め込まれたロリポップ形（例えば、１５０２）は、メチル化されたシトシン（ｍＣ）を表し、埋め込まれていないロリポップ形（例えば、１５０４）は、メチル化されていないシトシン（Ｃ）を表した。図表１５１０において、不揃いな末端を有する二本鎖ＤＮＡ分子が示されている。二本鎖ＤＮＡ分子には、両方の鎖にメチル化されていないシトシンを含む。ＤＮＡ分子は、メチル化され得るＤＮＡ分子内のいくつかのＣｐＧ部位を含み得る。
【００７１】
図表１５２０は、メチル化シトシンによる末端修復後のＤＮＡ分子を示している。破線は新しく埋められたヌクレオチドを表した。新しく埋められたシトシンはメチル化されているが、一方末端修復前のＤＮＡ分子にはメチル化されていないシトシンが含まれている。「クレノウ（Ｋｌｅｎｏｗ）、エキソ−（ｅｘｏ−）」は、ポリメラーゼ断片がポリメラーゼ活性を保持しているが、５’から３’まで、および３’から５’までの両方のエキソヌクレアーゼ活性を欠いていることを意味する。その結果、追加の不揃いな末端はエキソヌクレアーゼによって導入されない。
【００７２】
図表１５３０は、配列決定アダプタ１５０６および１５０８をライゲーションした後の末端修復されたＤＮＡ分子を示している。
【００７３】
図表１５４０は、バイサルファイト処理後のＤＮＡ分子を示している。バイサルファイト処理後、末端修復されたＤＮＡ分子に新たに埋められたメチル化Ｃは変化しないままであったが、分子内に存在する元のメチル化されていないＣはウラシル（Ｕ）に変換され、その後ＰＣＲによってＴとして増幅された。ＤＮＡ分子の３’末端に近い隣接ヌクレオチド（３’末端隣接ヌクレオチド）は、同じ分子の５’末端に近接する隣接ヌクレオチド（５’末端隣接ヌクレオチド）と比較して、３’末端に近接するギャップにｍＣが埋められるため、メチル化レベルの増加を示すであろう。末端修復前のＤＮＡ分子にはメチル化ＣｐＧ部位が含まれている可能性があるため、末端修復で追加されたｍＣ以外の一部のＣは、末端修復後もｍＣとして残り得る。これらのｍＣを説明するために、Ｃの分析はＣＨ（ここでＨは、Ａ、Ｃ、またはＴである）部位に限定され、ＣｐＧ部位は除外され得る。ＣＨ部位はヒトゲノムのジヌクレオチドコンテキストの約１９．２％を占めるため、不揃いな末端を有する分子のかなりの比率を検出することができる。
【００７４】
図表１５５０は、２回のリードにわたるＣＨシトシンのメチル化レベルのグラフを示している。図表１５５０は、グラフ２４０に類似しており、図表１５５０のｘ軸は５’から３’に至ることができる。ＣＨシトシンについてのリード１のメチル化レベルは、０に近い。リード１は、図表１５１０〜１５４０のトップ鎖１５０８の５’末端に対応する。リード２のメチル化レベルは、メチル化レベルが１００に近づくと、３’末端に近づくまで０に近くなる。メチル化レベルの増加は、末端修復で提供されるヌクレオチドのメチル化シトシン（例えば、１５０２）の結果である。
【００７５】
メチル化レベルの増加は、不揃いな末端と相関することができる。不揃いな末端の長さは、メチル化レベルの増加から決定することができる。不揃いな末端の長さはまた、バイサルファイト処理後にチミンおよびメチル化シトシンが現れる場所を分析することによっても決定することができる。
【００７６】
図１６は、末端修復にメチル化シトシンを使用するこの手法により、不揃いな末端の正確な長さを正確に推定できることを示している。ゲノム１６０２は、２つの連続したＣがあることを示している。不揃いな末端を有するＤＮＡ断片は、第１の鎖１６０４と、第２の鎖１６０６と、を有する。ゲノム１６０２は、第２の鎖２０６の配列であり得る。シトシン１６０８は、第１の鎖１６０６の３’末端にあり得る。シトシン１６１０は、末端修復により、第１の鎖１６０６の３’末端に付加され得る。末端修復にメチル化シトシンを使用する場合、このシトシンはメチル化シトシン１６１２である。この構成では、ゲノム内のこの「ＣＣ」タグは、配列決定結果で「ＴＣ」パターンに変換されるであろう。シトシン１６０８に対応するメチル化されていないシトシンは、バイサルファイト処理によりチミン１６１４に変換される。シトシン１６１０に対応するメチル化シトシン１６１２は、メチル化シトシンのままである。この「ＴＣ」パターンを使用することにより、不揃いな末端長を正確に決定することができる。この手法を「ＣＣタグ」戦略と称する。
【００７７】
連続するＣＣを分析して正確な不揃いな末端長を決定し得るが、連続しないＣＣも不揃いな末端長を決定するのに有益であり得る。例えば、ＣＣは、Ｃではないいくつかのヌクレオチドによって分離され得る。一方のＣがＴに変換され、他方がＣのままである場合、不揃いな末端長の範囲を決定することができる。不揃いな末端の最大長はＴの位置から推定でき、不揃いな末端の最小長は３’末端上のＴに最も近いＣの位置によって推定することができる。
【００７８】
Ｂ．既知の不揃いな末端を有するスパイクイン配列
既知の配列を有する既知の不揃いな末端長を有する核酸分子は末端修復で使用して、メチル化シトシンによる末端修復を使用した結果を検証することができる。これらの既知の配列（すなわち、スパイクイン配列）を使用して、不揃いな末端の量（例えば、濃度、モル量）を決定することもできる。
【００７９】
図１７は、メチル化シトシンによる末端修復を使用して分析された１６個の血漿ＤＮＡ試料の表を示している。マッシブリーペアエンドバイサルファイト配列決定（７５ｂｐ×２）を使用して、妊娠第１三半期（１２〜１４週間）、妊娠第２三半期（２０〜２３週間）、および妊娠第３三半期（３８〜４０週間）からの１６個の血漿ＤＮＡ試料を分析した。各試料で２億６９０万のペアエンドリードの中央値が達成された（範囲：１億４８００万〜２億６２４０万）。「試料」とは、試料の特定を指す。「生断片」とは、配列決定された断片の数を指す。「マッピングされた断片」は、マッピングされ得る断片の数を表す。「マッピング率」は、マッピングされた生断片のパーセンテージである。「複製率」は、同一の開始および終了マッピングゲノム座標を有する１つを除く全ての複製断片がフィルタ処理されたプロセスを通して除去されるＤＮＡ断片のパーセンテージである。「在胎月齢（妊娠三半期）」は、試料を採取した女性の妊娠の三半期である。
【００８０】
図１８は、内部対照として既知の長さの不揃いな末端を有する２つの合成二本鎖ＤＮＡ断片１８０２および１８０４の使用を示す。これらの内部対照は、メチル化シトシンの使用が不揃いな末端の分析に有効であることを確認することができる。２つの二本鎖合成ＤＮＡの各々は、Ｐ７（配列決定アダプタ、Ｉｌｌｕｍｉｎａのアニーリング部位）の標的配列（標的配列１８０６および１８０８）、リンカーＤＮＡ（１８１０および１８１２）、不揃いな末端分子タグ（ＪＭＴ）（１８１４および１８１６）からなる。二本鎖ＤＮＡ断片１８０２は、１３−ｎｔプローブ１８１８を含み、二本鎖ＤＮＡ断片１８０４は、２２−ｎｔプローブ１８２０を含む。１３−ｎｔおよび２２−ｎｔの一本鎖断片は、Ａｌｕ１８２２の２４−ｂｐの共通配列のサブ配列である。例として、１３−ｎｔおよび２２−ｎｔの断片１８１８および１８２０が示されている。共通配列の他の長さが、対照として使用されてもよい。ＪＭＴ１８１４および１８１６は、各々６ヌクレオチドの鎖であり、１３−ｎｔの不揃いな末端を有する合成ＤＮＡ対照と２２−ｎｔの不揃いな末端を有する合成ＤＮＡ対照とを差別化することができる。
【００８１】
図１９Ａおよび図１９Ｂは、既知の配列を有する既知の不揃いな末端を備えた２つのスパイクイン配列の配列決定塩基組成を示す。図１８の断片と同様に、合成二本鎖ＤＮＡ断片が使用される。図１９Ａは、２２−ｎｔの既知のスパイクイン配列を使用することを示しており、図１９Ｂは、１３−ｎｔの既知のスパイクイン配列を使用することを示しており、両方の配列は不揃いな末端に相補的であり、メチル化シトシンを有する。ｘ軸のオレンジ色の横棒（１９１０および１９２０）は、スパイクイン配列に不揃いな末端が存在することを示している。濃い青色の横棒１９１２および１９１４は、リンカー１８１０および１８１２と同様のリンカーを表す。これらのリンカーは、メチル化シトシンを有さない。水色の横棒１９１６および１９１８は、配列決定アダプタである。配列決定アダプタもメチル化され得る。緑色、青色、灰色、および赤色で色付けされた縦棒は、それぞれＡ、Ｃ、Ｇ、およびＴの頻度を表している。例えば、縦棒１９３０および１９４０は、Ｔを示す。いくつかの縦棒には複数の色があり、各色はそのその塩基のパーセンテージを表している。
【００８２】
縦棒１９５０および縦棒１９５４は両方とも、スパイクされた不揃いな末端におけるメチル化シトシンに対応する。メチル化シトシンは、縦棒１９５０および縦棒１９５４の両方がＣを示すように、シトシンとして配列決定される。矢印（例えば、１９６０および１９７０）は、不揃いな末端におけるメチル化シトシン（ｍＣ）の埋め込みを表している。縦棒１９５０の上に、Ｔを示す縦棒１９５２がある。縦棒１９５４の上には、Ｔを示す縦棒１９５６がある。Ｔのパーセンテージが低いので、Ｔのこれらの表示は、配列決定エラーの結果である可能性がある。
【００８３】
不揃いな末端（小文字で示されている）内の全てのシトシンは、末端修復工程中にｍＣが組み込まれたため、変化していないことを観察した。対照的に、二本鎖内の非メチル化Ｃ（大文字のリンカー領域に示されている）は、ほぼ全てＴに変換された。これらの結果は、二本鎖ＤＮＡ内のヌクレオチドのバイサルファイト変換の高効率ならびに不揃いな末端へのｍＣの取り込みの成功を示唆している。
【００８４】
不揃いな末端の既知の範囲を有する既知の量の分子を含めることで、試料に元々存在していた他の不揃いな末端種の実際の量を決定することができる。例えば、スパイクイン不揃いな末端を付加した場合と付加しない場合の試料を試験する場合、スパイクされた種についての不揃いな末端主のパーセンテージは、スパイクイン不揃いな末端を付加した試験の方が、付加しない試験よりも高くなるであろう。スパイクイン量とその結果生じるパーセンテージの増加がわかっているため、試料内の他の種の不揃いな末端の量（例えば、濃度、モル量）を決定することができる。
【００８５】
Ｃ．血漿ＤＮＡ不揃いな末端の決定
末端修復にメチル化シトシンを使用した結果のメチル化レベルは、末端修復にメチル化されていないシトシンを使用した結果のメチル化レベルと比較することができる。両方の手法の有効性を比較することができる。
【００８６】
図２０は、末端修復にメチル化シトシンを使用する手法を検証するために、ＣＨおよびＣＧコンテキストでの妊婦の血漿ＤＮＡ中のメチル化シトシンの比率の代表的なプロットを示している。ライブラリーの調製中に、各症例についてメチル化Ｃ（すなわち、ｍＣ）およびメチル化されていないＣ（すなわち、Ｃ）の両方を使用して、各試料（症例Ｍ１２８５５およびＭ１３０１７）の２つのアリコートをそれぞれ末端修復した。ヒトゲノムのＣＨおよびＣＧジヌクレオチドコンテキストの両方でメチル化レベルの比率を分析した。ヒトゲノムのこれらのＣＨ部位、つまりＣｐＧではないジヌクレオチドは、一般に非常に低いメチル化レベル、約０％を示すことが報告されている（Ｈｙｕｎ  Ｓｉｋ  Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ  ８（６）：２−２０）。ｍＣで末端修復された試料の場合、ＣＨのコンテキストでのメチル化シトシンの比率は、ｍＣまたはＣで末端修復されたかどうかに関係なく、全ての試料の分子の５’末端（リード１）で０％に近いことが観察された（グラフ２０１０および２０３０）。
【００８７】
この観察は、無細胞ＤＮＡ分子のこのような５’部分が本質的に二本鎖であり、末端修復の結果としてｄＮＴＰの取り込みがほとんどなかったことを示した。それとは対照的に、メチル化シトシンの比率は、無細胞ＤＮＡ分子のリード２配列の２５ｂｐの位置から３’方向に沿って最大８０％まで急速に増加した。リード２配列は、それらの３’末端に対応する（グラフ２０１０および２０３０）。これらのデータは、末端修復の結果としてｍＣの取り込みが増加したため、無細胞ＤＮＡ分子の３’末端に向かって不揃いな末端が存在することを示した。対照的に、ＣＨ部位のメチル化シトシンの比率は、Ｃで末端修復された試料では０％近くに留まり（グラフ２０１０および２０３０）、これは、末端修復中に新しく組み込まれたメチル化されていないＣが、分子のメチル化レベルを上昇させず、ここでは、ＣＨジヌクレオチド部位でのメチル化のベースラインレベルが約０％であったためである。要約すると、ＣＨジヌクレオチドコンテキストで解釈されるｍＣの取り込みは、メチル化シトシンの増加をもたらし、これによって血漿ＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡに不揃いな末端が存在することを明らかにした。
【００８８】
ＣｐＧジヌクレオチドとも呼ばれるＣＧコンテキストでは、分子の５’末端にメチル化されたＣの比率が高いことが観察し（すなわち、リード１）、これは、ヒトゲノムにおけるＣｐＧ部位のメチル化レベルがほぼ８０％であった以前の研究（Ｈｙｕｎ  Ｓｉｋ  Ｊａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｅ８（６）：２−２０）とほぼ一致していた。メチル化シトシンの比率は、リード２の２５ｂｐの位置から３’方向に沿ってほぼ１００％まで徐々に上昇し、末端修復中に血漿ＤＮＡ不揃いな末端に沿ってｍＣが組み込まれたことを示唆している（グラフＡ５２０およびＡ５４０）。この観察は、末端修復プロセス中に不揃いな末端を埋めるためのｍＣの組み込みに関連しており、末端修復のインビトロプロセスによってＣｐＧでのバックグラウンドメチル化が８０％から１００％に上昇した。加えて、末端修復プロセスにメチル化されていないＣを使用した場合、リード２の対応する位置全体でメチル化シトシンの比率が大幅に減少した（グラフＡ５２０およびＡ５４０）。これらのデータは、一般的に高メチル化されたＣｐＧがインビトロ末端修復プロセス中にメチル化されていないＣに置き換えられるため、不揃いな末端の存在を明らかにした。メチル化シトシンは、不揃いな末端を決定するためにＣＧコンテキストで使用することができるが、バックグラウンドのメチル化レベルが約８０％であるため、このような手法の感度は限定されるであろう。
【００８９】
これらの結果は、メチル化されていないシトシンの代わりにメチル化シトシンで修復する手法により、不揃いな末端を検出できることを明らかにした。ライブラリー調製の末端修復プロセス中にｍＣの埋め込みを利用する手法により、ＣＨのコンテキストで不揃いな末端分析が可能になり、不揃いな末端分析の解像度が大幅に向上する可能性がある。ヒトゲノムにおけるこのようなＣＨ部位は、ＣＧ部位よりもはるかに一般的である（２億７１００万のＣＨ部位対２８００万のＣＧ部位）。
【００９０】
図２１は、埋め込みメチル化シトシン（ｍＣ）とメチル化されていないシトシン（Ｃ）を使用した手法間の相対的な有益性の比較を示している。「不揃いな末端の有益な「Ｃ」の数」は、メチル化シトシンの手法を使用する場合にメチル化されるか、またはメチル化されていないシトシンの手法を使用する場合にメチル化されない不揃いな末端のシトシンの数である。「試料」とは、試料の特定を指す。「末端修復法」とは、末端修復に使用されるシトシンのタイプを指す。「Ｃ」はメチル化されていないシトシンを示し、「ｍＣ」はメチル化シトシンを示す。「有益な「Ｃ」を保有する断片のパーセンテージ」は、末端修復方法に応じて、メチル化されていないＣまたはメチル化Ｃのいずれかを有する試料中のＤＮＡ断片のパーセンテージである。「相対富化倍率（Ｘ）」は、メチル化シトシンの手法でｍＣを保有する断片のパーセンテージの、メチル化されていないシトシンの手法でＣを保有する断片のパーセンテージに対する比である。図２１の表に示されるように、不揃いな末端に関連すると推測されるウルシトシン（すなわち、不揃いな末端の有益な「Ｃ」）を保有する断片のパーセンテージを分析した。メチル化シトシンの埋め込みを使用する方法が、はるかに高い比率の不揃いな末端を保有する断片を検出することができることを観察した。
【００９１】
例えば、分子の不揃いな末端にある少なくとも１つの有益な「Ｃ」を考慮すると、ｍＣを埋め込む方法によって不揃いな末端に関連付けられていると推測できる断片が５８．７３％あり、Ｃを埋め込む方法によって推測されるもの（８．２９％）よりもはるかに高かった。言い換えれば、ｍＣの埋め込みを用いる方法は、メチル化されていないＣの埋め込みを用いる方法よりも７．１倍多くの情報を富化することができる。不揃いな末端にある少なくとも２つの有益な「Ｃ」を考慮すると、ｍＣの埋め込みを用いる方法は、メチル化されていないＣの埋め込みを用いる方法よりも３０倍を超える多くの情報を富化することができる。メチル化されていないＣによる埋め込みは、有益なＣがＣＧ部位に制限されるが、メチル化Ｃによる埋め込みは、より一般的なＣＨ部位に有益なＣを含めることを可能にする。
【００９２】
図２２は、「ＣＣタグ」戦略によって推定された不揃いな末端の長さの分布を示している。「ＣＣタグ」手法は、単一塩基解像度で不揃いな末端を測定する可能性を提供する。この手法を使用すると、図２２は、１〜４ｂｐの長さを有する不揃いな末端が、不揃いな末端のプールの中ではるかに豊富（約２５％）であり、１ｂｐの不揃いな末端が最も頻繁に出現することを明らかにしている。一般に、不揃いな末端が長いほど、血漿ＤＮＡまたは無細胞ＤＮＡで見られる相対頻度は低くなる。「ＣＣタグ」手法を使用すると、平滑末端（すなわち、０ｂｐのサイズを有する不揃いな末端）を有する分子の数を決定することもできた。平滑末端を有する分子の比率は、１２．４％〜１５．５％の範囲であった。
【００９３】
図２３Ａ、図２３Ｂ、および図２４は、無細胞ＤＮＡ断片の異なるサイズ範囲にわたる不揃いな末端のプロファイルを示している。図２３Ａは、図１５の技法のように、ＣＨジヌクレオチドのメチル化レベルを分析する。図２３Ｂおよび図２４は、図１６のＣＣタグ手法を使用する。図２３Ａにおいて、縦軸は、リード２配列中のＣＨジヌセロチド中のメチル化シトシンの比率であり、分子の３’末端近くのメチル化シトシンを反映し、不揃いな末端を示している。リード２のメチル化された「ＣＨ」シトシンレベルが高いほど、ＤＮＡ分子のギザギザの程度が高いことを意味しており、これは、（１）より長い不揃いな末端を有する分子、および／または（２）不揃いな末端を保有する分子の数が多いことに起因し得る。横軸は、平均比率が測定されるＤＮＡ断片のサイズである。したがって、異なる無細胞ＤＮＡサイズにわたって、リード２配列、すなわち不揃いな末端が位置する血漿または無細胞ＤＮＡ分子の３’末端におけるＣＨジヌセロチドの中のメチル化シトシンの比率間の関係を分析した。
【００９４】
図２３Ａは、異なるサイズ範囲にわたるリード２のＣＨ部位でのメチル化レベルの比率を示している。メチル化レベルが高いほど、より多くの不揃いな末端が予想されるであろう。図２３Ａに示されるように、メチル化レベルは、異なるサイズ範囲にわたって不均一に分布し、波状の非ランダムパターンを示した。サイズが１６０ｂｐより小さい場合、メチル化レベルは１０％未満であった。断片サイズが１６０ｂｐを超えると、メチル化レベルは連続的に増加し、２４０ｂｐで約２８％のピーク値に達した。メチル化レベルの増加は、より長い不揃いな末端または不揃いな末端を有するより多くの分子からのより高程度の不揃いな末端を示唆している。メチル化レベルの２つの連続する主要なピーク間の距離は、約１７０ｂｐであることが判明し、これは、ヌクレオソームの位相パターンと非常に一致しており、ヌクレオソーム間の距離を連想させる。これは、不揃いな末端がクロマチン構造によって影響される可能性があることを示唆し得る。クロマチン構造は分解を増加させ、不揃いな末端をもたらし得る。
【００９５】
図２３Ｂは、「ＣＣタグ」手法に基づく異なるサイズ範囲にわたる平均不揃いな末端長を示している。縦軸は、平均不揃いな末端長を示している。横軸は、不揃いな末端長が測定されるＤＮＡ断片のサイズである。図２３Ａでは、ＣＨ部位でのメチル化レベルの比率が、不揃いな末端の長さおよび量のうちの少なくとも１つに起因し得る。対照的に、図２３Ｂでは、不揃いな末端の正確な長さが、ＣＣタグ法を使用して決定される。一般に、図２３Ａのメチル化レベルが高いほど、図２３ＡのＣＣタグ法によって推定される長さは長くなる。
【００９６】
図２４は、「ＣＣタグ」手法に基づく異なるサイズ範囲にわたる中央値不揃いな末端長を示している。平均および中央値の不揃いな末端長は、分子の３’末端に近接するＣＨ部位でのメチル化シトシンの比率と同様のパターンを生じさせた。不揃いな末端の長さの波状のシグナルは、ヌクレオソーム構造を連想させる。したがって、クロマチン構造は不揃いな末端の長さにおいて役割を果たし得る。
【００９７】
Ｄ．胎児ＤＮＡ分子と母体ＤＮＡ分子との間の差次的な不揃いな末端
不揃いな末端が母体血漿中の無細胞母体ＤＮＡ分子と無細胞胎児ＤＮＡ分子との間で異なる特性を有しているかどうか（例えば、不揃いな末端が原発組織の情報提供するよう実現可能であるかどうか）を評価するために、マイクロアレイプラットフォーム（Ｈｕｍａｎ  Ｏｍｎｉ２．５、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して、母体のバフィーコートおよび胎児試料のジェノタイピングを行った。
【００９８】
胎児試料は、どのタイプの組織ＤＮＡ試料が利用可能であるかに応じて、絨毛生検（ｃｈｏｒｉｏｎｉｃ  ｖｉｌｌｕｓ  ｓａｍｐｌｉｎｇ）、羊水穿刺（ａｍｎｉｏｃｅｎｔｅｓｉｓ）、または胎盤採取によっても得られた。母親がホモ接合であり、胎児がヘテロ接合である場合、２０１，３５２の有益な一塩基多型（ＳＮＰ）座（範囲：１７８，６２３〜２０８，５５２）の中央値があった。胎児特異的対立遺伝子を保有する血漿ＤＮＡ分子は、胎児に由来するものとして特定された。
【００９９】
図２５は、異なる妊婦についての配列決定情報および胎児ＤＮＡ画分を含む表を示す。「試料」とは、試料の特定を指す。「胎児ＤＮＡ画分（％）」は、胎児由来の試料中のＤＮＡ断片のパーセンテージである。「有益なＳＮＰの数」は、マイクロアレイベースのＳＮＰジェノタイピングによって決定された、母親がホモ接合であり、胎児がヘテロ接合であるＳＮＰの数である。「共有配列」とは、胎児および妊婦の両方に共通する対立遺伝子を有するＤＮＡ断片の数である。「胎児特異的配列」とは、胎児にのみ存在する対立遺伝子を有するＤＮＡ断片の数である。これらの試料の中の中央値胎児ＤＮＡ画分は、２０．１％（範囲：５．１％〜４１．３％）であった。「在胎月齢（妊娠三半期）」は、試料を採取した女性の妊娠の三半期である。
【０１００】
図２６は、ＣＨ部位での妊婦の血漿ＤＮＡ中のメチル化シトシンの比率についての１つの試料の代表的なプロットを示す。最初に、胎児特異的で共有された対立遺伝子（すなわち、主に母体由来）を保有するこれらの血漿ＤＮＡ断片の中で、リード１およびリード２のＣＨコンテキストでのメチル化シトシンの比率を調べた。胎児特異的断片および共有断片の両方が、分子の３’末端に近接する領域（すなわち、リード２）でメチル化レベルの有意な増加を示した。胎児特異的分子は、共有分子よりもわずかに高いメチル化レベルを示し、不揃いな末端が母体ＤＮＡおよび胎児ＤＮＡ分子の両方に存在することを示唆している。他の試料の結果は、実質的に同様であった。
【０１０１】
図２７Ａ、図２７Ｂ、図２８Ａ、および図２８Ｂは、胎児特異的および共有ＤＮＡ分子の異なるサイズ範囲にわたる不揃いな末端のプロファイルを示している。不揃いな末端と胎児ＤＮＡ画分との間の関係を調査するために、ＣＨ部位でのメチルＣの比率をリード２および胎児ＤＮＡ画分に対して相関させた。リード２に関して、胎児ＤＮＡ画分と、ＣＨ部位でのメチル化Ｃの比率との間に負の関係があることを発見した（図２７Ａ）。これは、胎児ＤＮＡが母体ＤＮＡよりも短い断片を含有し、より短いＤＮＡ分子は一般に、より長いＤＮＡ分子よりも低い程度の不揃いな末端を有するという事実に起因し得る（図２７Ｂ）。言い換えれば、より高い胎児ＤＮＡ画分を有する試料は、不揃いな末端の量および／または長さの減少をもたらす。これは、不揃いな末端が血漿ＤＮＡサイズによって交絡されることを示唆し得る。
【０１０２】
血漿ＤＮＡサイズのこの交絡因子を克服するために、異なるサイズの不揃いな末端を調べた。胎児特異的対立遺伝子を保有する血漿ＤＮＡ分子の場合、共有対立遺伝子を保有する配列のものと比較して、１４０〜２００ｂｐのサイズ範囲でのＣＨコンテキストにおいてメチル化シトシンの比率が高いことが観察された（図２７Ｂ）。より大きな比率のメチル化シトシンは、不揃いな末端がより長く、および／または量がより多いことから、より高い程度の不揃いな末端を示す。また、「ＣＣタグ」手法を使用して、胎児特異的および共有ＤＮＡ分子の正確な不揃いな末端の長さを決定し、胎児特異的分子の平均および中央値不揃いな末端長の両方の値が、１００〜２００ｂｐのサイズ範囲での共有のものよりも大きいことを見出した（図２８Ａおよび図２８Ｂ）。これらの結果は、不揃いな末端長の分布が実際にサイズの影響を受け、胎児特異的断片と共有断片との間の差が、主に１００〜２００ｂｐのサイズ範囲内で生じたことを明らかにした。これらの結果は、不揃いな末端の分析を無細胞ＤＮＡ断片のある特定のサイズ範囲に限定することで、胎児ＤＮＡ画分、腫瘍ＤＮＡ画分、対象の年齢、臓器移植ＤＮＡ画分、または免疫反応のレベルなどの試料についての追加情報を提供することに役立ち得ることを示唆している。
【０１０３】
図２９Ａおよび図２９Ｂは、１４０〜１５０ｂｐ内の分子における不揃いな末端長分布を示している。図２９Ａにおいて、縦軸は、１４０〜１５０ｂｐ内のサイズを有するＤＮＡ断片についての平均不揃いな末端長の平均値であり、横軸は、試料の特定である。図２９Ｂにおいて、縦軸は、１４０〜１５０ｂｐ内のサイズを有するＤＮＡ断片についての中央値不揃いな末端長であり、横軸は、試料の特定である。さらに、１４０〜１５０ｂｐの範囲内の胎児特異的および共有分子の平均不揃いな末端長を調査し、胎児特異的断片が共有された断片（中央値：１０．１６ｂｐ；８．０２〜１４．９１ｂｐ）よりも長い不揃いな末端（中央値：１３．７３ｂｐ；１０．２４〜１９．３８ｂｐ）を含有していたことを見出した（ｐ値：０．００１４、マン・ホイットニーＵ検定）（図２９Ａ）。１４０〜１５０ｂｐに分布する胎児特異的および共有分子の中央値不揃いな末端長は、平均値と同様のパターンを示し（ｐ値＜０．０００１、マン・ホイットニーＵ検定）（図２９Ｂ）。これらの結果は、メチル化されていないシトシンの埋め込みを用いた代替方法を使用した観察と一致し、この方法では、ＣＧコンテキストから推測される共有ＤＮＡ分子の不揃い指数が、胎児固有のＤＮＡ分子の不揃い指数よりもわずかに小さかった。
【０１０４】
図３０Ａ、図３０Ｂ、および図３１は、１４０ｂｐ、１６６ｂｐ、および２００ｂｐの分子についての不揃いな末端長対胎児ＤＮＡ画分を示している。上述したように、不揃いな末端長が異なるサイズによって変化することを考慮して、分子のサイズを１４０ｂｐ、１６６ｂｐ、および１８０ｂｐに固定し、次いで、それらの相対的な不揃いな末端長を評価した。このようなサイズバンド分析は、１４０ｂｐについての妊婦の血漿中の平均不揃いな末端長と胎児ＤＮＡ画分の間の正の相関関係を明らかにした（図３０Ａ）。１６６ｂｐまたは２００ｂｐでの不揃いな末端長は、胎児ＤＮＡ画分と正の相関を示さなかった（図３０Ｂおよび図３１）。まとめると、ここで説明した結果は、１４０ｂｐ〜１５０ｂｐの範囲の分子に由来する不揃いな末端が、胎盤特異的不揃いな末端を保有していた可能性が高いことを示唆し得る。
【０１０５】
図３２は、異なるサイズの不揃いな末端長（平滑、１ｎｔ、２ｎｔ、３ｎｔ、および４ｎｔ）を保有する分子についてのサイズ分布を示している。不揃いな末端長に従って、分子を異なる群に分類した。異なる不揃いな末端長を有する各群について、血漿ＤＮＡ分子の相対的なサイズ分布を実施した。サイズ分布は、平滑末端を有する分子の場合、１５５ｂｐ未満ではるかに鋭い１０ｂｐの周期性を有することを観察した。一方、不揃いな末端の長さが長くなると、相対的な周期性が弱くなることが観察されることを見出し、不揃いな末端は異なるクロマチン構造にしたがって変化することを示唆している。この周期性は、ヌクレオソームの距離に対応し得る。ＤＮＡ分子は、ヌクレオソームに対してある特定の位置で平滑末端を形成する場合があり、それにより、ある特定のサイズのＤＮＡ分子に対してより多くの平滑末端をもたらす。図３２はまた、図２２のデータと一致して、より小さな不揃いな末端がこれらのピークでより一般的であることを示している。
【０１０６】
Ｅ．不揃いな末端を修復するためにメチル化シトシンを使用する例示的方法
不揃いな末端を修復するためにメチル化シトシンを使用して生体試料を分析することは、図４の方法４００と同様であり得る。この生体試料は、図４に記載されている生体試料または本明細書に記載されている任意の生体試料であり得る。生体試料は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子は、無細胞であり得る。複数の核酸分子のうちの各核酸分子は、第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくとも一部の第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖から突出することができ、第２の鎖にハイブリダイズすることができず、かつ第１の鎖の第１の末端にあり得る。
【０１０７】
複数の核酸分子は、あるサイズ範囲でサイズを有し得る。サイズ範囲は、生体試料中の全ての無細胞核酸分子のサイズ範囲よりも小さい場合がある。例として、サイズ範囲は、１００〜２００ｂｐ、１４０〜２００ｂｐ、または１４０〜１５０ｂｐであり得る。生体試料中の第２の複数の核酸分子のサイズが、決定され得る。第２の複数の核酸分子は、生体試料中の全ての無細胞核酸分子を含み得る。サイズは、配列決定し、配列リードを基準ゲノムにアライメントさせることにより決定され得る。第２の複数の核酸分子は、サイズ範囲を有するサイズを有する核酸分子にフィルタ処理され得る。
【０１０８】
ブロック４０２と同様に、１つ以上のヌクレオチドを含む第１の化合物は、複数の核酸分子の各核酸分子の第１の鎖の第１の部分にハイブリダイズされ得る。第１の化合物は、第２の鎖の第１の末端に結合して、第１の化合物を含む第１の末端を有する伸長された第２の鎖を形成し得る。第１の化合物は、第２の鎖に接触していない第１の末端を含み得る。１つ以上のヌクレオチドは、全てメチル化されていても、または全てメチル化されていなくてもよい。
【０１０９】
１つ以上のヌクレオチドは、全てメチル化されてもよい。メチル化ヌクレオチドは、シトシンなどのヌクレオチドの１つのタイプであり得る。第１の化合物は、メチル化ヌクレオチド以外のヌクレオチドを含んでもよい。第１の化合物中のメチル化シトシンは、アデニン、シトシン、またはチミンに隣接し得る。第１の化合物中のメチル化シトシンは、グアニンに隣接していない場合がある。シトシンから別のヌクレオチドへの隣接の方向は、５’から３’への方向であり得る。
【０１１０】
ブロック４０４と同様に、第１の鎖は、複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、伸長された第２の鎖から分離され得る。
【０１１１】
ブロック４０６と同様に、伸長された第２の鎖の１つ以上の第１の部位の各々についての第１のメチル化状態は、複数の核酸分子のうちの各核酸分子について決定され得る。１つ以上の第１の部位は、伸長された第２の鎖の第１の末端にあってもよい。第１の部位は、グアニンに隣接するシトシンを除外し得るか、またはアデニン、シトシン、またはチミンに隣接するシトシンを含み得る。メチル化状態は、アデニン、シトシン、またはチミンに隣接するシトシンのものであり得る。
【０１１２】
ブロック４０８とは異なり、伸長された第２の鎖の第２の末端での１つ以上の第２の部位の各々についての第２のメチル化状態は決定されない場合がある。第２の部位は、グアニンに隣接するシトシンを除外し得るか、またはアデニン、シトシン、またはチミンに隣接するシトシンを含み得る。メチル化状態は、アデニン、シトシン、またはチミンに隣接するシトシンのものであり得るか、またはグアニンに隣接するシトシンのメチル化状態を除外し得る。アデニン、シトシン、またはチミンに隣接するシトシンは、第２の鎖においてメチル化される可能性は低い。その結果、第２のメチル化状態は、１つ以上の第２の部位についてはメチル化されていないと想定され得る。
【０１１３】
ブロック４１０と同様に、１つ以上の第１の部位での複数の伸長された第２の鎖についての第１のメチル化状態を使用して、第１のメチル化レベルが計算される。第１のメチル化レベルは、第１のメチル化状態の平均値、中央値、パーセンタイル、または別の統計値であり得る。
【０１１４】
ブロック４１２とは異なり、第２のメチル化レベルは、１つ以上の第２の部位における複数の伸長した第２の鎖についての第２のメチル化状態を使用しては計算されることはない。アデニン、シトシン、またはチミンに隣接するシトシンはほとんどメチル化されていないため、第２のメチル化レベルはゼロに近く、計算する必要はない。
【０１１５】
ブロック４１４と同様に、第１のメチル化レベルを使用して、不揃いな末端値が計算され得る。不揃いな末端値は、第２の鎖から突出した第１の鎖の平均長に比例し得る。不揃いな末端値を計算することは、第１のメチル化レベルと第２のメチル化レベルとの間の差を計算し、この差を第１のメチル化レベルで割ることによって行われ得る（例えば、図３の全オーバーハング指数）。
【０１１６】
既知の長さの不揃いな末端を有する対照核酸分子（例えば、図１８のスパイクイン配列）を使用して、試料中の不揃いな末端の量を決定し得る。一例として、複数の対照核酸分子を生体試料に添加（スパイクイン）することができ、その結果、それらは、生体試料に由来する核酸分子のハイブリダイズと同時にハイブリダイズする。いくつかの実装形態では、対照核酸分子は、全てメチル化されているかまたは全てメチル化されていないヌクレオチドを有する第１の化合物によってハイブリダイズされ得る。第１のメチル化レベルは、対照核酸分子の修復された不揃いな末端からの部位のメチル化状態を含み得る。不揃いな末端値は、例えば上記のように、１つ以上のメチル化レベルを使用して決定され得る。
【０１１７】
したがって、不揃いな末端値は、修復された対照核酸分子からのメチル化状態または他の技法（例えば、本明細書に記載される）を使用して計算され得る。対照核酸分子で決定されたこの不揃いな末端値は、参照値と比較され得る。参照値は、対照核酸分子をハイブリダイズさせることなく得られてもよい。一例として、参照値は、スパイクイン配列（例えば、図１８からの分子）なしで得られてもよい。
【０１１８】
不揃いな末端を有する核酸の量（例えば、絶対量）は、添加された第２の複数の核酸分子の既知の量と組み合わせて、不揃いな末端値の参照値との比較を使用して、決定することができる。添加された既知の量を使用して、測定された所与の頻度に対して絶対量を較正することができる。したがって、既知量の対照核酸分子が添加されたので、特定の長さでの相対量を絶対量に、例えば、モル質量または体積に変換することができる。
【０１１９】
一例として、参照値は、対照核酸分子なしで決定された不揃いな末端値であり得る。対照核酸分子による不揃いな末端値は、参照値を超えて増加し得る。不揃いな末端値の増加は、対照核酸分子の既知の量に比例し得る。対照核酸分子を用いずに不揃いな末端の量を決定することができ、これには、参照値と不揃いな末端値の増加との比を計算し、既知の量を掛けることを含み得る。同様の方法で、特定の長さのオーバーハングでの量は、特定の長さでの頻度、添加された対照核酸分子の既知の長さでの頻度、および生体試料に添加された既知の量の対照核酸分子に基づいて決定することができる。
【０１２０】
例えば、不揃いな末端値は、対照核酸分子が含まれていない場合の第１の値から、対照核酸分子が含まれている場合の第２の値まで増加し得る。第１の値から第２の値への増加は、対照核酸配列の存在に起因する可能性があり、したがって、増加の大きさは、対照核酸分子の既知の量（例えば、モル濃度）を反映し得る。増加の大きさと既知の量との関係に基づいて、第１の値および／または第２の値の量も決定することができる。この計算された量は、不揃いな末端の総濃度を反映している可能性がある。一例として、１Ｍの対照核酸分子を含むときに不揃いな末端値がｘから１．１ｘに増加する場合、０．１ｘの増加は１Ｍの濃度を反映し得る。対照核酸なしの不揃いな末端の量は、１０Ｍ（ｘ／０．１ｘ×１Ｍ）と計算される。いくつかの実施形態では、関係は線形でなくてもよく、不揃いな末端の量の計算は、非線形回帰または他の統計分析を伴ってもよい。このような非線形性は、不揃いな末端を検出するために使用される方法の動力学によって部分的に支配される可能性がある。例えば、いくつかの方法は、長い不揃いな末端よりも短い不揃いな末端の方が効率的であり得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、特定の長さの不揃いな末端の量も計算することができる。不揃いな末端値は、ある特定の長さについて計算することができ、この値の大きさは、対照核酸分子からの不揃いな末端値の増加および対照核酸分子の既知の量に基づく量に関連付けることができる。対照核酸分子はまた、ある特定の長さの不揃いな末端に限定され得る。例えば、１３−ｎｔの不揃いな末端を有する１Ｍの対照核酸分子は、不揃いな末端の値をｘから１．１ｘまで増加し得る。２０−ｎｔの不揃いな末端についての不揃いな末端値は０．５ｘであり得る。２０−ｎｔの不揃いな末端の濃度は、５Ｍ（０．５ｘ／０．１ｘ×１Ｍ）と計算できる。
【０１２２】
他の実装形態では、不揃いな末端の測定の他の技術を、対照核酸分子と組み合わせて使用することができる。したがって、様々な技法を使用して、生体試料からの核酸分子および複数の対照核酸分子を（例えば、無細胞断片および対照分子が一緒に混合されているように）使用して不揃いな末端値を決定することができ、ここでは対照核酸分子のそれぞれのオーバーハング長さは既知である。次いで、不揃いな末端値は、参照値と比較することができ、参照値は、第１の化合物を複数の対照核酸分子にハイブリダイズさせることなく得られる。また、不揃いな末端の量は、不揃いな末端値の参照値との比較を使用して、かつ第２の複数の核酸分子の既知の量を使用して、計算することができる。
【０１２３】
ブロック４１４で計算された不揃いな末端値は、図１で説明された方法のいずれかで使用することができる。例えば、不揃いな末端値を使用して、生体試料中の胎児ＤＮＡなどの臨床的に関連するＤＮＡの画分を決定することができる。
【０１２４】
Ｆ．例示的ＣＣタグ方法
図３３は、ＣＣタグを用いて不揃いな末端値を計算するための方法３３００を示している。方法３３００は、個体から得られた生体試料を分析することを伴う。生体試料は、複数の核酸分子を含む。核酸分子は、無細胞である。複数の核酸分子のうちの各核酸分子は、末端で第１の部分を有する第１の鎖と、第２の鎖と、を有する二本鎖である。複数の核酸分子のうちの第１のサブセットの第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖からの相補的な部分を有さない。第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖にハイブリダイズせず、かつ第１の鎖の第１の末端にある。
【０１２５】
ブロック３３０２において、第１の化合物は、複数の核酸分子の第１のサブセットのうちの各核酸分子について、第１の鎖の第１の部分にハイブリダイズされる。第１の化合物は、第２の鎖の第１の末端に結合して、第１の化合物を含む第１の末端を有する伸長された第２の鎖を形成し得る。第１の化合物は、第２の鎖に接触していない第１の末端を有し得る。第１の化合物は、メチル化シトシンである１つ以上のヌクレオチドを含み得る。第１のサブセットは、１つの核酸分子または複数の核酸分子を含み得る。
【０１２６】
ブロック３３０４において、メチル化されていないシトシンである１つ以上のヌクレオチドは、第１のサブセットのうちの各核酸分子についてチミンに変換される。
【０１２７】
ブロック３３０６において、第１の鎖は、第１のサブセットのうちの各核酸分子について、伸長された第２の鎖から分離され得る。
【０１２８】
ブロック３３０８において、第１の位置が決定され、第１の位置は、第１のサブセットのうちの各核酸分子の伸長された第２の鎖の第１の末端に最も近い第２の鎖のチミンのものである。
【０１２９】
ブロック３３１０において、第２の位置を決定し、第２の位置が、チミンに最も近い第１の化合物中のメチル化されたシトシンのものである。第２の位置は、第１の位置の３’側にあり得る。メチル化シトシンは、グアニンに隣接していない場合がある。
【０１３０】
ブロック３３１２において、伸長された第２の鎖の第１の末端からの距離は、第１のサブセットのうちの各核酸分子の第１の位置または第２の位置のうちの少なくとも１つを使用して決定され得る。この距離は、不揃いな末端の長さであり得る。図１６で説明したように、ＴＣは不揃いな末端の境界を示し得る。場合によっては、チミンがメチル化されたシトシンに直接隣接していないことがある。このような場合、距離は単一の長さではなく、長さの範囲であり得る。例えば、第１の位置は可能な限り長い不揃いな末端を示し、第２の位置は可能な限り短い不揃いな末端を示し得る。次いで、距離は、最短の長さから最長の長さまでの範囲として表され得る。いくつかの実施形態では、距離は、最短の長さと最長の長さとの平均であり得る。
【０１３１】
ブロック３３１４において、複数の核酸分子のうちの第１のサブセットについての距離を使用して、不揃いな末端値を計算することができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、分析は、複数の核酸分子のうちの第２のサブセットを含み得る。複数の核酸分子のうちの第２のサブセットの各核酸分子の第１の部分は、第２の鎖からの相補的な部分を有し、かつ第２の鎖にハイブリダイズしている。第２のサブセットは、不揃いな末端を有さず、平滑末端のみを有する核酸分子を含み得る。第２のサブセットは、１つの核酸分子または複数の核酸分子を含み得る。
【０１３３】
第２のサブセットの核酸分子中のメチル化されていないシトシンは、チミンに変換され得る。第２のサブセットにおけるメチル化されていないシトシンの変換は、ブロック３３０４における変換と実質的に同時であってもよい。
【０１３４】
チミンは、第２の鎖の末端にあると判定される場合がある。その結果、第２の鎖は伸長されていないと判定され得る。核酸分子は、不揃いな末端を有さないものとして特定され得る。チミンの第２の鎖の末端までの距離が決定され得る。チミンが第２の鎖の末端に位置する場合、この距離はゼロであり得る。不揃いな末端値は、第２のサブセットについての距離を使用して計算することができる。
【０１３５】
ブロック３３１４で計算された不揃いな末端値は、図１で説明された方法のいずれかで使用することができる。例えば、不揃いな末端値を使用して、生体試料中の胎児ＤＮＡなどの臨床的に関連するＤＮＡの画分を決定することができる。
【０１３６】
ＩＶ．血漿ＤＮＡ末端ライゲーションを介したオーバーハングの直接決定
血漿ＤＮＡオーバーハングを評価するための別の実施形態は、一本鎖合成オリゴヌクレオチド（オーバーハングプローブ）を保有する二本鎖配列アダプタを、プローブ配列の組成および長さを血漿ＤＮＡまで遡ることを可能にする配列タグとライゲーションさせることである。このような合成されたオリゴヌクレオチドは、アニーリングされ、設計オリゴヌクレオチドに相補的なオーバーハングを保有する血漿ＤＮＡにライゲーションさせることができる。アダプタの配列タグを配列決定することにより、血漿ＤＮＡオーバーハング配列とそれに対応するサイズを推測することができる。図３４は、ＤＮＡ末端ライゲーションを介したオーバーハングの直接測定の原理を示している。
【０１３７】
ステージ３４０２は、不揃いな末端を有する二本鎖ＤＮＡ分子を示している。不揃いな末端は、Ａｌｕリピートの共通配列で発生する。Ａｌｕリピートの共通配列は、ヒトゲノムに数千のコピーを有している可能性がある。
【０１３８】
ステージ３４０４に示すように、共通配列を合成プローブにハイブリダイズさせることができる（破線の間の赤いバー）。このようなプローブは、リンカー（緑色）、不揃いな末端分子タグ（ＪＭＴ、斜めの縞模様で埋められた長方形）、および配列決定アダプタのプライミング部位（すなわち、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ７）を含むアダプタに連結されている。共通配列の長さは有限であるため、合成されたプローブのタイプを列挙することができる。特定の型の合成プローブは、ユニークなＪＭＴ配列に対応する。プローブのタイプは、共通配列の長さに等しくなる。例えば、共通配列の長さが２４−ｎｔである場合、合成されるプローブのタイプは２４であり、ユニークなＪＭＴ配列の数は２４になる。
【０１３９】
ステージ３４０６において、対応するプローブとの不揃いな末端特異的ライゲーションの後、末端修復およびＡテーリングが実行されることになる。
【０１４０】
続いて、ステージ３４０８において、配列決定アダプタ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ５）が修復された分子にライゲーションされることになる。
【０１４１】
ステージ３４１０において、Ｐ５連結分子は、ＰＣＲ増幅を介してＰ５およびＰ７プライマーによって変性および増幅され、Ｉｌｌｕｍｉｎａプラットフォームでの配列決定に適した分子を生成する。
【０１４２】
ステージ３４１２において、ペアードエンド（ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ）配列決定が実施される。リード２には、目的の不揃いな末端を有する分子にハイブリダイズしている元のプローブを追跡できるＪＭＴ配列が含有されている。リード１は、共通配列とそのフランキング配列を有していることが期待されており、そのゲノム起源を特定することができる。
【０１４３】
このような方法は、ユニークなＪＭＴアダプタにタグ付けされたランダムプローブを合成することにより、任意の血漿ＤＮＡ分子の不揃いな末端を研究するために一般化でき、ゲノム全体の方法で不揃いな末端を検出することの実現を可能にする。
【０１４４】
ライゲーションベースの血漿ＤＮＡオーバーハング評価における一実施形態は、多数のコピーを有するヒトゲノムに存在する共通配列、例えば、Ａｌｕリピートに存在する共通配列を検索することである。有限数のライゲーション体を与えるオリゴヌクレオチドを合成することにより、約５００，０００コピーのヒトゲノムに存在するこのような共通配列で発生する全ての血漿ＤＮＡオーバーハングを決定することができる（図３５）。
【０１４５】
合成されたオリゴヌクレオチドは、ヒトゲノムの５００，０００コピーで発生するこのような共通配列に由来するオーバーハングの全ての組み合わせをカバーする。したがって、この共通領域から生成される血漿ＤＮＡオーバーハングは、限られた数の設計されたオリゴヌクレオチドと特異的にライゲーションされた血漿ＤＮＡ分子を配列決定することによって特定することができる。
【０１４６】
共通配列媒介オーバーハング決定に基づく戦略を使用して、血漿ＤＮＡ分子を、図３５に示すように設計されたオリゴヌクレオチドとライゲーションさせた後、妊婦の１つの血漿ＤＮＡ試料を配列決定した。３−ｎｔ〜２４−ｎｔのオーバーハングをカバーするオリゴヌクレオチドを開始した最初の試験で３２００万ペアの配列決定リードを取得した（すなわち、アダプタの分子タグによって一意にラベル付けされた合計２２個のタイプのオリゴヌクレオチド）。１６３０万（５１％）の第１の末端リード（リード１）がヒトゲノムに一意にマッピングされ、１２１０万（３７％）の第１の末端リードがマッピング可能であったが、複数のゲノム位置にアライメントされた。したがって、合計８８％の配列決定リードを、下流データ分析のためのヒト参照値にアライメントすることができる。次に、マッピング可能なリード１を有する断片の対をなす第２のリード（リード２）においてＯＭＴ配列を特定しようと試みた。有効なＯＭＴ配列を担持するマッピング可能なリード１を有する１２８０万（４５％）の断片あり、ライゲーションプロセスが成功裏に達成されたことを示唆している。症例Ｍ０１６２４のライゲーションされた母体血漿ＤＮＡで特定された各配列決定されたＯＭＴの頻度およびパーセンテージを計算した。図３６は、母体血漿ＤＮＡのオーバーハング長の頻度分布を示した。ほとんどの血漿ＤＮＡ分子（７１％）は、長さが１０ｎｔ（ヌクレオチド）未満のオーバーハングを運んでいるが、１６ｎｔを超える長さのオーバーハングを運んでいる血漿ＤＮＡ分子の小さな集団（９％）がまだある。このような相対的な分布は、ある特定の病態生理学に関連している可能性がある。残りのものは、１０ｎｔ〜１６ｎｔのサイズのものである。ある特定の対照群と比較して、オーバーハング長の頻度の相対的変化は、例えば、炎症、外傷、癌および／または臓器損傷などが挙げられるが、これらに限定されない、患者の病態の情報を与えることができる。
【０１４７】
一方、配列決定リードは、ヒトゲノムから採取された共通配列周辺の配列にマッピングできるため、バイオインフォマティクスデータ分析を高速化することができる。図３７に示すように、２つのアライメント戦略（ゲノム全体へのマッピング対共通配列を担持するＡｌｕ配列）する血漿ＤＮＡオーバーハング長の推測頻度は、非常に一貫していた。インシリコの二次構造予測により、ＯＭＴ配列と８ｎｔのオリゴヌクレオチドとの間に形成された特別な自己アニーリングステムループが見つかったため、８ｎｔのオーバーハングの急激な減少はその合成アダプタの二次構造による可能性がある。このような自己アニーリングの問題は、新しい設計でＯＭＴ配列の配列構成（ｃｏｎｔｅｘｔ）を変更することで解決することができる。加えて、０−ｎｔ、１−ｎｔおよび２−ｎｔのオーバーハングにライゲーションすることを目的としたオリゴヌクレオチドを保有するアダプタも設計可能である。
【０１４８】
図３８は、個体から得られた生体試料を分析する方法３８００を示している。生体試料は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子は、無細胞であり得る。複数の核酸分子のうちの各核酸分子は、第１の部分および第２の鎖を有する第１の鎖を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくとも一部の第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖から突出することができ、第２の鎖にハイブリダイズすることができず、かつ第１の鎖の第１の末端にあり得る。
【０１４９】
ブロック３８０２において、第１の化合物のセットを生体試料に添加することができる。第１の化合物のセットは、異なるヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドを含み得る。オリゴヌクレオチドのサブセットのうちの各オリゴヌクレオチドは、複数の第１の部分のうちの少なくとも１つに相補的であり得るヌクレオチドを含む。サブセットは、全てのオリゴヌクレオチドのセットを含んでもよい。オリゴヌクレオチドは、Ａｌｕ配列のヌクレオチドを含んでもよい。
【０１５０】
第１の化合物のセットのうちの各第１の化合物は、識別子分子を含んでもよい。識別子分子は、第１の化合物のオリゴヌクレオチドの長さを示し得る。識別子分子は、フルオロフォアであり得る。いくつかの実施形態では、識別子分子は、オリゴヌクレオチドの長さに対応するように事前に決定された配列を含んでもよい。
【０１５１】
ブロック３８０４において、第１の化合物のセットのうちの第１の化合物のオリゴヌクレオチドを、第１の鎖の第１の部分にハイブリダイズさせて、凝集分子の一部であり、識別子分子を含む伸長した第２の鎖を形成し得る。ハイブリダイズさせることは、複数の核酸分子のうちの各核酸分子に対して実施され得る。
【０１５２】
ブロック３８０６において、凝集分子は、識別子分子を検出するために分析され得る。凝集分子は、二本鎖分子として分析されてもよく、または一本鎖分子が分析されるように変性されてもよい。分析は、配列決定するか、または蛍光シグナルを検出することによるものであり得る。この方法は、識別子分子に対応するリードを生成するために、伸長された第２の鎖を配列決定することをさらに含んでもよい。分析は、複数の核酸分子のうちの各核酸分子に対して実施され得る。
【０１５３】
ブロック３８０８において、第１の部分の長さは、識別子分子に基づいて決定され得る。決定は、特定の長さを有する特定の識別子分子に連結する基準を参照することを伴い得る。決定は、複数の核酸分子のうちの各核酸分子に対して実施され得る。
【０１５４】
ハイブリダイゼーションベースの方法３８００は、ハイブリダイズするプローブの異なる鎖を合成することにより、５’および／または３’の両方の突出末端（一本鎖部分）へのアクセスを可能にすることができる。しかしながら、ＤＮＡポリメラーゼベースの方法は、伸長の方向性のため、５’突出一本鎖末端にのみ適している可能性がある。
【０１５５】
ブロック３８０８で決定された長さは、図１で説明された方法のいずれかで測定された特性として使用され得る。したがって、不揃いな末端値は、方法３８００を使用して決定することができる。
【０１５６】
方法３８００はまた、セクションＩＩＩ（Ｅ）および図１８で前述したように、不揃いな末端の量を決定するために使用されるスパイクイン配列に適用され得る。既知の不揃いな末端長および既知の配列を有する既知の量の核酸分子を添加することができる。次いで、方法３８００に記載されているように、不揃いな末端の長さを決定することができる。不揃いな末端値が測定されると、生体試料中の不揃いな末端の量を、スパイクイン配列の既知の量を使用して決定することができる。
【０１５７】
Ｖ．マッシブリーパラレルバイサルファイト配列決定（ＭＡＳＳＩＶＥＬＹ  ＰＡＲＡＬＬＥＬ  ＢＩＳＵＬＦＩＴＥ  ＳＥＱＵＥＮＣＩＮＧ）を用いた不揃いな末端分析
別の実施形態では、特定のサイズの相対的なオーバーハングの存在量は、マッシブリーパラレルバイサルファイト配列決定から予測することもできる（図３９）。特定のサイズのオーバーハングの存在量が多いほど、前のサイクルと比較してメチル化レベルの低下が大きくなる。例えば、最後のサイクルと最後から２番目のサイクルとの間のメチル化レベルの差は、１−ｎｔのオーバーハングの相対的な存在量を反映しているであろう。図４０に示すように、主要な血漿ＤＮＡ分子は、１−ｎｔのオーバーハングを担持するであろう。ライゲーションベースの手法およびＢＳ−ｓｅｑベースの手法によって測定されたオーバーハング長の頻度はよく相関している（図４１）。
【０１５８】
図４２は、個体から得られた生体試料を分析する方法４２００を示している。生体試料は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子は、無細胞であり得る。複数の核酸分子のうちの各核酸分子は、第１の部分および第２の鎖を有する第１の鎖を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくとも一部の第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖から突出することができ、第２の鎖にハイブリダイズすることができず、かつ第１の鎖の第１の末端にあり得る。
【０１５９】
ブロック４２０２において、メチル化状態は、複数の核酸分子のうちの第１の鎖および第２の鎖の複数の部位の各々について測定される。複数の部位の各部位は、配列決定プロセスのサイクルに対応し得る。複数の部位は、第１および第２の鎖の末端をカバーし得る。第１および第２の鎖の末端は、第１の鎖の第１の末端を含み得る。いくつかの実施形態では、メチル化状態は、鎖を分離することなく測定され得る。例えば、メチル化状態は、ナノポアを使用して測定されてもよい。他の実施形態では、１つの鎖のみが増幅され、配列決定されてもよい。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、１つ以上のヌクレオチドを含む第１の化合物は、第１の鎖の第１の部分にハイブリダイズすることができる。１つ以上のヌクレオチドは、メチル化されていなくてもよい。第１の化合物は、第２の鎖の第１の末端に結合して、第１の化合物を含む第１の末端を有する伸長された第２の鎖を形成し得る。第１の化合物は、第２の鎖に接触していない第１の末端を有し得る。第１の鎖は、伸長された第２の鎖から分離され得る。メチル化状態は、伸長した第２の鎖の部位を使用して測定され得る。
【０１６１】
ブロック４２０４において、メチル化レベルは、その部位でのメチル化を示すメチル化状態の量に基づいて、複数の部位の各々について決定される。いくつかの実施形態では、部位でのメチル化を示すメチル化状態の量は、その部位でメチル化がないことを示すメチル化状態の量から決定され得る。
【０１６２】
ブロック４２０６において、複数の部位のうちの第１の部位におけるメチル化レベルの第１の値への第１の変化が、第１および第２の鎖の末端に向かう方向で特定される。第１の変化は、メチル化レベルの増加または減少であり得る。
【０１６３】
ブロック４２０８において、配列決定プロセスの対応するサイクルに基づいて、第１の鎖の第１の末端での最も外側のヌクレオチドに対する第１の部位の第１の距離が決定される。
【０１６４】
ブロック４２１０において、メチル化レベルの第１の減少の第１の大きさが決定される。
【０１６５】
ブロック４２１２において、第１の部位の第１の距離を使用して、第１の複数の第１の部分の第１の長さが決定される。
【０１６６】
ブロック４２１４において、メチル化レベルの第１の減少の第１の大きさを使用して、核酸分子の第１の量を決定され、核酸分子の第１の量が、第１の長さ以下の長さを有する第１の部分を含む。
【０１６７】
ブロック４２０６〜４２１４を繰り返すことができる。例えば、方法４２００は、第１および第２の鎖の末端に向かう方向において、複数の部位の第２の部位におけるメチル化レベルの第２の値への第２の変化を特定することができる。第２の変化は、増加または減少の場合があるが、第１の変化と同じタイプの変化である必要がある。第２の部位は、第１の鎖の第１の末端の最も外側のヌクレオチドに対して第２の距離にあり得る。第２の距離は、第１の距離よりも小さい。第２の値は、第１の値よりも低い。メチル化レベルの第２の変化の第２の大きさを決定することができる。第２の部位の第２の距離を使用して、第２の複数の第１の部分の第２の長さを決定することができる。メチル化レベルの第２の変化の第２の大きさを使用して、核酸分子の第２の量を決定され得る。核酸分子の第２の量は、第２の複数の第１の部分の第２の長さ以下の長さを有する第１の部分を含む。第１の量は、第２の長さを超える長さを有する第１の部分を含む。
【０１６８】
この方法で決定された長さおよび／または量は、図１で説明された方法のいずれかで測定された特性として使用され得る。
【０１６９】
ＶＩ．サイズベースのオーバーハング分析
不揃いな末端を有する断片のサイズは、血漿ＤＮＡ末端ライゲーションによる分析後に測定され得る。共通配列に隣接するユニークな部分（通常はリード１に存在する）を保有すると思われる配列決定された断片が、最大２つのミスマッチでヒト基準ゲノムに一意にアライメントされた後、ヒトゲノムにおいて高度に反復性である共通配列を通常担持するリード２はなお、リード１のマッピング情報を利用することによって、リード１の近位の領域に明確に位置することができる。したがって、元の断片サイズは、マッピングされた断片の最も外側のゲノム座標を使用して推測することができる。分析されている断片はまた、サイズプロファイルにおいて、１６６ｂｐの主要なピークおよび約３２０ｂｐの第２のピークを示した（図４３）。
【０１７０】
断片サイズ情報が得られると、血漿ＤＮＡ分子のオーバーハング長と断片サイズとの関係を定量化することができる。一実施形態では、血漿ＤＮＡ分子を異なるサイズ範囲に分割し、例えば、１００ｂｐ、１０１ｂｐ、１０２ｂｐ、１０３ｂｐ、１０４ｂｐ、１０５ｂｐ、１０６ｂｐ、１０７ｂｐ、１０８ｂｐ、１０９ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１３０ｂｐ、１４０ｂｐ、１５０ｂｐ、１６０ｂｐ、１７０ｂｐ、１８０ｂｐ、１９０ｂｐ、２００ｂｐ、３００ｂｐ、４００ｂｐ、５００ｂｐ、６００ｂｐなど、または＜１００ｂｐ、＜１１０ｂｐ、＜１２０ｂｐ、＜１３０ｂｐ、＜１４０ｂｐ、＜１５０ｂｐ、＜１６０ｂｐ、＜１７０ｂｐ、＜１８０ｂｐ、＜１９０ｂｐ、＜２００ｂｐなど、または＞２１０ｂｐ、＞２２０ｂｐ、＞２３０ｂｐ、＞２４０ｂｐ、＞２５０ｂｐ、＞２６０ｂｐ、＞２７０ｂｐ、＞２８０ｂｐ、＞２９０ｂｐ、＞３００ｂｐなど、または任意の組み合わせ間の比率が挙げられるが、これらに限定されない、各サイズ範囲における相対的オーバーハング長（平均または加重平均）を定量化する。相対的なオーバーハング長は、比率、差、または一連の重み係数（例えば、線形変換またはロジット変換）によって調整された線形もしくは非線形の組み合わせによって定量化することができる。図４４では、オーバーハングの長さは、異なる断片サイズにわたって波状の一本鎖であることが示されている。ライゲーションベースの手法から生成された結果では、オーバーハングの最大長は約２００ｂｐに位置した。ＢＳ−ｓｅｑベースの手法から得られた結果でも、同様のパターンを再現することができた（ｒ＝０．７、ｐ＜０．０００１）（図４４）。断片サイズ分析は、不揃いな末端を分析するために、本明細書に記載される他の技法と組み合わせて使用されてもよい。
【０１７１】
本発明の実施形態は、生体試料が得られた患者を治療することを含み得る。治療の例としては、癌、臓器損傷、免疫疾患、新生児合併症、炎症、外傷、または任意の他の病態の治療を提供することが含まれ得る。
【０１７２】
ＶＩＩ．無細胞ＤＮＡ損傷分析およびその臨床応用
図１について説明したように、不揃いな末端値を使用して、病態のレベルを決定することができる。癌および自己免疫疾患の例が提供されている。
【０１７３】
Ａ．癌対象と非癌対象との間のオーバーハング指数
４７人の健康な対象および２８人のＨＣＣの対象において、それぞれ、オーバーハング指数をさらに分析した。マッシブパラレルペアエンドバイサルファイト配列決定（ｍａｓｓｉｖｅ  ｐａｒａｌｌｅｌ  ｐａｉｒｅｄ−ｅｎｄ  ｂｉｓｕｌｆｉｔｅ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）（７５ｂｐ×２）を使用して、これらの試料を１億３２９０万のペアリード（範囲：１２０万〜２億６１８０万）の中央値に対して配列決定した。図４５では、健康な対象と比較して、ＨＣＣの対象では、１２０〜１４０ｂｐのサイズの断片のオーバーハング指数の有意な上昇が観察され（Ｐ値：０．０４８、マン・ホイットニー検定）、オーバーハング指数が、患者が癌を有している可能性がある情報を与えるために使用することができることを示唆している。
【０１７４】
図４６は、異なる臨床状態にわたる不揃い指数比を示している。不揃い指数比は、他の全てのサイズの不揃いな末端値と比較して、１４０〜１６０ｂｐのサイズの不揃いな末端値を使用して決定される。無細胞ＤＮＡの不揃いな末端指数を使用して、癌を検出する際の診断性能を決定するために、マッシブパラレルペアエンドバイサルファイト配列決定技法を使用して、２０人の健康な対照（ＣＴＲ）、１２人の肝硬変の対象（Ｃｉｒｒ）、２２人のＨＢＶキャリア（ＨＢＶ）、２４人の早期ＨＣＣ（ｅＨＣＣ）、１１人の中期ＨＣＣ（ｉＨＣＣ）、および７人の高度進行期ＨＣＣ（ａＨＣＣ）を配列決定した。不揃い指数比に関して０．３８のカットオフを採用した場合、９１％の全体的な特異性および７４％の感度を達成できた。特定の条件については、ＣＴＲ、Ｃｉｒｒ、およびＨＢＶに対してそれぞれ９０％、１００％、および８６％の特異性を、ｅＨＣＣ、ｉＨＣＣ、およびａＨＣＣに対して、それぞれ７５％、５４％、および８５％の感度を、達成することができた。
【０１７５】
図４７は、ＨＣＣについての不揃い指数比の手法、およびＣｐＧ島の高メチル化を使用した場合の受信者動作特性（ＲＯＣ）を示している。不揃い指数比を使用した性能は、ＣｐＧ島の高メチル化を使用した従来の手法よりも優れていることが示され、不揃い指数比は、高メチル化の０．８０と比べて０．８９の曲線下面積（ＡＵＣ）を有した。
【０１７６】
図４８は、異なる臨床状態にわたる不揃い指数比を示している。不揃い指数比は、他の全てのサイズの不揃いな末端値と比較して、１４０〜１６０ｂｐのサイズの不揃いな末端値を使用して決定される。無細胞ＤＮＡの不揃いな末端指数を使用して、癌を検出する際の診断性能を決定するために、マッシブパラレルペアエンドバイサルファイト配列決定技法を使用して、２０人の健康な対照（ＣＴＲ）、２０人の肝硬変の対象（Ｃｉｒｒ）、３４人のＨＢＶキャリア（ＨＢＶ）、および１１人の大腸直腸癌の対象者（ＣＲＣ）を配列決定した。ＣＲＣ患者の不揃い指数比（平均０．４８）は、非癌患者（平均：０．３５）よりも有意に高い（ｐ値＜０．０００１）ことがわかった。
【０１７７】
図４９は、高メチル化および不揃い指数比の両方を使用した複合分析が、臨床状態の分類を改善できることを示している。高メチル化および不揃い指数比を組み合わせて使用することによる相乗効果を調べるために、高メチル化（ｘ軸）と不揃い指数比（ｙ軸）との間の散布図を構築した。高メチル化を判定するために、まず、健康な臓器のリストの中で「安定してメチル化されていない」ことがわかっているゲノム内のＣｐＧ部位を特定した。癌患者のこれらの部位はメチル化される可能性がある。メチル化レベルは、癌の進行（例えば、癌の病期）に依存し得る。健康な臓器の安定してメチル化されていないＣｐＧ部位には、以下の参照組織：ＣＤ４、ＣＤ８、赤芽球、マクロファージ、単球、ナイーブＢ細胞ならびに好中球、ＮＫ細胞、および肝臓が含まれる。これらの参照組織では、メチル化レベルを＜２％（または別のパーセント）にする必要があり得る。ゲノム全体に分布する約１００万のＣｐＧ部位がこれらの基準を満たした。
【０１７８】
試料を分析するとき、無細胞ＤＮＡライブラリーはバイサルファイト変換される。無細胞ＤＮＡ分子の配列が決定され、次いで基準ゲノムにアライメントする。次いで、約１００万のＣｐＧ部位でのメチル化密度を測定した。メチル化密度は、２０１３年３月１５日に出願された米国特許公開第２０１４／００８０７１５Ａ１号に記載されている手法を使用して測定され、その全内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。メチル化密度は、定義されたゲノム領域にアライメントした配列決定された無細胞ＤＮＡ分子上に存在する全てのシトシンのうちのメチル化シトシンのパーセンテージであり得る。図４９では、メチル化密度は、１００万個のＣｐＧ部位の１つの凝集体数として決定されている。非癌血漿試料のメチル化レベルは低いと予想されるであろう。血漿試料中に腫瘍由来の無細胞ＤＮＡが含まれている場合、メチル化レベルは上昇すると予想されるであろう。
【０１７９】
ＨＣＣと非ＨＣＣとの間の最良の分離境界は、破線で示されている。９３％の特異性で９３％の感度が達成され、単一の尺度（高メチル化または不揃い指数比のみ）を使用する場合と比較して、メチル化および不揃いな末端シグナルを同時に使用するＨＣＣ患者の検出がはるかに改善されることを示唆している。組み合わせた分析は、ＨＣＣ以外の他の臨床状態に使用することができる。
【０１８０】
したがって、図４６〜図４８は、病態が癌、例えば、ＨＣＣまたはＣＲＣである場合に、不揃いな末端値を使用して（例えば、図１に記載されるように）病態のレベルを決定するための例示的なデータを示している。
【０１８１】
Ｂ．自己免疫疾患のある患者と自己免疫疾患のない患者との間のオーバーハング指数の差
１４人の健康な対象、２１人の非活動性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）対象、および１９人の活動性ＳＬＥ対象のオーバーハング指数を分析した。マッシブパラレルペアエンドバイサルファイト配列決定を使用して、これらの試料を１億２９５０万のペアリード（範囲：２６４０万〜１億９１４０万）の中央値に対して配列決定した。オーバーハング指数を、前述の方法を使用して、各試料について１２０〜１４０ｂｐのサイズの分子を使用して定量化した。図５０では、健康な対象（Ｐ値＜０．０００１）および非活動性ＳＬＥ対象（Ｐ値＝０．０００６）と比較して、活動性ＳＬＥ対象に見られるオーバーハング指数の有意な上昇が見られ、オーバーハング指数が患者が自己免疫疾患を患っている可能性の情報を与え、治療後のモニタリングに使用される。したがって、図５０は、不揃いな末端値を使用して（例えば、図１に記載されるように）病態のレベルを決定するための例示的なデータを示し、ここで、病態は、自己免疫疾患、具体的にはＳＬＥである。
【０１８２】
Ｃ．オーバーハング指数とサイズ範囲との間の関係
さらに、オーバーハング指数と分析されるサイズ範囲との間の関係を研究する。非造血由来のＤＮＡは、血漿中の造血由来のＤＮＡよりも短いことが実証されている（Ｚｈｅｎｇ  ＹＷ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｌｉｎ  Ｃｈｅｍ．２０１２；５８：５４９−５８）。オーバーハング指数と断片サイズとの間の関係を視覚化して調査するために、健康な対象およびＨＣＣの対象からそれぞれ配列決定された全ての断片をプールして、比較的高い配列決定包括度を得た。興味深いことに、オーバーハング指数は、健康な対象およびＨＣＣの対象の両方で分析されている異なるサイズ範囲に不均一に分布しており（図５１）、波状の非ランダムパターンを示している。それぞれ約８０ｂｐ、２４０ｂｐ、４００ｂｐ、および５６０ｂｐに複数の主要なピークが発生した。図５１の２つの隣接する主要なピーク間の距離は約１６０ｂｐであることが見出され、このようなオーバーハング指数がヌクレオソーム構造に関連している可能性があることを示唆している。オーバーハング指数の最大値は、ＨＣＣおよび対照の両方の対象で２３０ｂｐに存在した。ＨＣＣの対象のオーバーハング指数は一般に、異なるサイズ範囲にわたって健康な対象よりも高く、対照とＨＣＣの対象との間のオーバーハング指数の差は均一ではなく、特定のサイズ範囲がＨＣＣの対象と健康な対象との間の分離を向上させる可能性があることを示唆している。したがって、異なるサイズ範囲が、癌の対象を区別したり、免疫疾患を監視したり、非侵襲的な出生前検査などを行うための異なる識別力を生み出すことができると推論した。この目的のために、血漿ＤＮＡ分子を、６０〜８０ｂｐ、８０〜１００ｂｐ、１００〜１２０ｂｐ、１２０〜１４０ｂｐ、１４０〜１６０ｂｐ、１６０〜１８０ｂｐ、１８０〜２００ｂｐ、２００〜２２０ｂｐ、２２０〜２４０ｂｐ、２４０〜２６０ｂｐ、２６０〜２８０ｂｐ、２８０〜３００ｂｐ、３００〜３２０ｂｐ、３２０〜３４０ｂｐ、３４０〜３６０ｂｐ、３８０〜４００ｂｐ、４２０〜４４０ｂｐ、４４０〜４６０ｂｐ、４８０〜５００ｂｐ、５２０〜５４０ｂｐ、５６０〜５８０ｂｐ、および５８０〜６００ｂｐが挙げられるが、これに限定されない異なるサイズのウィンドウに分割し、異なる対象の間でオーバーハング指数を定量化した。図５２Ａは、健康な対照とＨＣＣ患者との間の異なるサイズ範囲にわたるオーバーハング指数についての受信者動作特性（ＲＯＣ）分析の曲線下面積値を示した。インシリコでサイズを選択しない全ての断片がより少ない識別力を示した一方で、健康な対象と癌の対象との間の最良の識別は、１２０〜１４０ｂｐのサイズ範囲で達成され（図５２Ｂ、ｐ値＝０．２、マン・ホイットニー検定）、サイズ範囲ベースの分析が、オーバーハング指数ベースの癌検出の性能を向上させることを示唆している。
【０１８３】
図５３は、異なる条件の試料の異なるサイズ範囲にわたる不揃い指数のヒートマップを示している。無細胞ＤＮＡ分子は、サイズに関して膨大な多様性を示し、これは、５０ｂｐ〜６００ｂｐの範囲に及ぶ可能性があるが、これらに限定されない。不揃い指数は、同じサイズを有する分子の群で測定することができる。したがって、各血漿ＤＮＡ試料には、６００個の不揃い指数に対応する異なるサイズの６００個の群が含まれることになる。このような６００次元の不揃い指数ベクトルは、階層的クラスタリング、機械学習、深層学習分析に使用することができる。図５３は、６００次元の不揃い指数が、一般にＨＣＣ患者のクラスターを非ＨＣＣ患者のクラスターから区別できることを示し、サイズバンドの高次元の不揃いな末端指数が癌患者を検出するための情報を担持することができることを示唆している。
【０１８４】
また、サイズ範囲ベースの分析を、活動性全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）患者にも適用させた。興味深いことに、非活動性および活動性ＳＬＥ患者では、８０ｂｐ、２４０ｂｐ、４００ｂｐ、および５６０ｂｐで複数の同様のピークが発生し（図５４）、１４０〜１６０ｂｐのサイズ範囲が、活動的ＳＬＥ患者を区別する際に最良の識別力をもたらすことも見出した（図５５）。
【０１８５】
別の実施形態では、異なるサイズ範囲に由来する２つのオーバーハング指数の比を、疾患対象を非疾患対象から区別するために使用する。異なるサイズ範囲にわたるオーバーハング指数のパターンを、機械学習アルゴリズムを通じて疾患を健康な状態から区別する分類器を訓練する機能として使用することができる。
【０１８６】
Ｄ．ＨＣＣ患者の術前の血漿ＤＮＡと術後の血漿ＤＮＡとの間の差次的オーバーハング指数。
また、１２０〜１４０ｂｐのサイズの分子を使用して、１人のＨＣＣ患者の術前および術後の血漿ＤＮＡ試料のオーバーハング分析を実行した。その結果、８．９のその平均値を有する術前血漿ＤＮＡのオーバーハング指数は、ゲノム全体で平均７．４の術後血漿ＤＮＡよりも有意に高いことが判明し（Ｐ値＜０．０００１）（図５６）、血漿ＤＮＡに存在するオーバーハング指数が異なる臨床状態に関連するであろうことを示している。
【０１８７】
Ｅ．関心のあるゲノム領域でのオーバーハング指数は、原発組織の情報を与える
さらに、特定のゲノム領域のセットにおける血漿ＤＮＡのオーバーハング指数が、腫瘍または発生源の同一性を反映し、癌の検出を可能にすることができる血漿ＤＮＡの原発組織の解読を向上させるという仮説を研究する。この目的のために、転写開始部位（ＴＳＳ）、ＤＮＡｓｅ  Ｉ高感受性領域、エンハンサーまたはスーパーエンハンサー領域が挙げられるが、これらに限定されない、異なる組織特異的オープンクロマチン領域にわたるオーバーハング指数の特性を調査する手法を実装した。オーバーハング指数は、ＴＳＳ領域の周囲に不均一に分布していることが判明した。ＴＳＳの近位のオーバーハング指数は、ＴＳＳの遠位のオーバーハング指数よりも比較的低かった（図５７）。ＨＣＣの対象からプールされたデータのオーバーハング指数は、健康な対象からプールされたものよりも少し高く（図５７）、異なるゲノム領域がＨＣＣの対象と健康な対象との間で異なる識別力を与えるであろうことを示唆している。
【０１８８】
また、異なる組織／臓器にわたるオープンクロマチン領域と非クロマチン領域との間のオーバーハング指数を調査した。オープンクロマチン領域は、ＥＮＣＯＤＥプロジェクト（Ｔｈｅ  ＥＮＣＯＤＥ  Ｐｒｏｊｅｃｔ  Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１２；４８９：５７−７４）で注釈が付けられている。一般に、オーバーハング指数は、非オープンクロマチン領域よりもオープンクロマチン領域で高いように見えた（図５８Ａ〜図５８Ｂ）。オープンクロマチン領域と非オープンクロマチン領域との間のオーバーハング指数の最も重要な違いは、血液系統にあった（図５８Ｃ〜図５８Ｄ）。オープンクロマチン領域と非オープンクロマチン領域の間のオーバーハング指数の二次的な重要な違いは、肝臓組織に向けられることであった（図５８Ｃ〜図５８Ｄ）。この結果は、血漿ＤＮＡのオーバーハング指数の分析が癌を伴う組織を明らかにするであろうことを示唆した。
【０１８９】
図５９は、個体から得られた生体試料を分析することによって、組織タイプを分析する方法５９００を示している。生体試料は、複数の核酸分子を含み得る。複数の核酸分子は、無細胞であり得る。複数の核酸分子のうちの各核酸分子は、第１の部分および第２の鎖を有する第１の鎖を有する二本鎖であり得る。複数の核酸分子のうちの少なくとも一部の第１の鎖の第１の部分は、第２の鎖から突出することができ、第２の鎖にハイブリダイズすることができず、かつ第１の鎖の第１の末端にあり得る。
【０１９０】
ブロック５９０２において、第２の鎖から突出した第１の鎖の長さに比例する、第１の鎖および／または第２の鎖の特性を、測定する。特性は、本明細書に記載の任意の技法によって測定することができる。特性は、複数の核酸分子のうちの各核酸分子について測定することができる。
【０１９１】
ブロック５９０４において、複数の核酸分子のうちの各核酸分子を配列決定して、１つ以上のリードを生成する。配列決定は、例えば本明細書に記載されるような様々な方法で実施することができる。例示的な技法は、プローブ、合成による配列決定、ライゲーション、およびナノポアを使用してもよい。
【０１９２】
ブロック５９０６において、複数の核酸分子のうちの各核酸分子のゲノム位置は、例えば、１つ以上のリードを参照配列にアライメントすることによって、または特定のゲノム位置に特異的な提供物を使用することによって決定される。
【０１９３】
ブロック５９０８において、第１の組織タイプに関連付けられたオープンクロマチン領域および非オープンクロマチン領域においてゲノム位置を有する核酸分子のセットが特定される。クロマチン領域は、２０１９年５月３日に出願された米国特許出願第１６／４０２，９１０号に記載されており、その内容は、あらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。例として、組織タイプには、血液、肝臓、肺、腎臓、心臓、または脳が含まれ得る。第１の組織タイプに関連するオープンクロマチン領域および非オープンクロマチン領域は、データベースから検索することができる。
【０１９４】
ブロック５９１０において、核酸分子のセットについて、パラメータの第１の値は、第１の複数の第１の部分の第１の複数の測定された特性を使用して計算される。第１の複数の第１の部分は、第１の組織タイプのオープンクロマチン領域に位置する核酸分子に由来する。測定された特性は、本明細書に記載されている任意の不揃いな末端値であり得る。パラメータは、測定された特性の統計的特性であり得る。例えば、パラメータは、測定された特性の平均値、中央値、最頻値、またはパーセンタイルであってもよい。
【０１９５】
ブロック５９１２において、核酸分子のセットについて、パラメータの第２の値は、第２の複数の第１の部分の第２の複数の測定された特性を使用して計算される。第２の複数の第１の部分は、第１の組織タイプの非オープンクロマチン領域に位置する核酸分子に由来する。
【０１９６】
ブロック５９１４において、パラメータの第１の値とパラメータの第２の値との間の分離値を計算することができる。例として、分離値は、第１の値と第２の値との間の差、または第１の値と第２の値との比を含むか、またはそれらであり得る。様々な比および他の分離値の例は、本明細書、例えば、用語のセクションに提供されている。
【０１９７】
ブロック５９１６において、第１の組織タイプは、分離値を参照値と比較することに基づいて、第１の組織タイプが癌を呈するかどうかを決定することができる。参照値は、ある特定の組織に影響を与える癌を有することが知られている参照対象および／またはある特定の組織タイプに影響を与える癌を有さないことが知られている参照対象からの参照試料を使用して決定することができる。第１の組織タイプは、癌を呈すると決定され得るか、癌を呈さないと決定され得るか、または不確定であり得る。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、決定は、例えば、図１のブロック１０８について説明したように、機械学習モデルを使用して実施することができる。
【０１９９】
ＶＩＩＩ．不揃いな末端を評価するためのＤＮＡ環状化
図６０は、両方の粘着末端に１つの余分な一本鎖分子アダプタを付加することによって、各ＤＮＡ分子のオーバーハングを直接決定するための別の実施形態を示した。その後、亜硫酸水素ナトリウムを使用して、二本鎖ＤＮＡを閉鎖一本鎖末端で処理し、これにより、二本鎖構造を破壊して一本鎖環状ＤＮＡを形成する。このような一本鎖環状ＤＮＡ分子は、ランダムなタグ付けベースの増幅に供されるであろう。増幅産物は超音波処理によって剪断され、短い断片を生成し、その後配列決定されることになる。元のオーバーハング情報は、ヒト基準ゲノムにアライメントさせた後の追加されたアダプタの隣の接合部から推測することができる。
【０２００】
図６０は、血漿ＤＮＡの環状化による血漿ＤＮＡ粘着末端／オーバーハングの直接評価を示す。血漿ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを介して一本鎖ＤＮＡアダプタ（黄色）でライゲーションされるであろう。バイサルファイト処理により、ワトソン（上鎖）およびクリック鎖（下鎖）は相補的ではなくなり、これは、両方の鎖の非ＣｐＧ部位からのほとんど全てのシトシンがウラシルに変換され、環状の一本鎖ＤＮＡ分子が形成されるためである。このような環状化一本鎖ＤＮＡは、３’配列決定アダプタ（例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ７、青色）でタグ付けされたランダムプライマー（例えば、５−ｍｅｒ）を使用して増幅することができ、一本鎖ＤＮＡアダプタ（黄色）を含み得る多数の線状ＤＮＡ分子を生成する。最初にライゲーションされた一本鎖アダプタに隣接するＤＮＡ配列は、不揃いな末端を推測することを可能にするであろう。線状ＤＮＡ分子を配列決定に適したものにするために、５’配列決定アダプタ（赤、例えば、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  Ｐ５、赤色）がアニーリングおよびＰＣＲベースの伸長によって組み込まれるであろう。次に、Ｐ５およびＰ７アダプタでタグ付けされた分子が増幅され、配列決定されることになる。元の一本鎖アダプタ（黄色）に隣接する配列（「ａ」および「ｂ」は赤い矢印で示されている）は、概略図に示されているように「ａ」および「ｂ」配列の相対的な位置を調べることにより、アライメントまたは自己相補性分析によって決定されるであろう。環状分子の「ｃ」および「ｄ」配列は、「ａ」および「ｂ」配列の分析に使用されるのと同様の戦略で分析することができる。
【０２０１】
図６１は、図６０と同様の技法であるが、制限酵素を使用する技法を示している。図６０と同様に、血漿ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを介して一本鎖ＤＮＡアダプタ（黄色）でライゲーションされるであろう。しかしながら、一本鎖ＤＮＡアダプタのうちの１つには、制限酵素切断部位がある。バイサルファイト処理により、ワトソン（上鎖）およびクリック鎖（下鎖）は相補的ではなくなり、これは、両方の鎖の非ＣｐＧ部位からのほとんど全てのシトシンがウラシルに変換され、環状の一本鎖ＤＮＡ分子が形成されるためである。対応する制限酵素は、環状化ＤＮＡ分子を切断して、線状化ＤＮＡ分子を生成するために使用されるであろう。線状化ＤＮＡ分子は、アダプタ（黄色）のユニバーサル配列を介して増幅することができる。増幅されたＤＮＡ分子は、配列決定用の配列決定アダプタとライゲーションすることができる。配列決定リードの「ａ」、「ｂ」、「ｃ」、「ｄ」の部分は、概略図に示されているように相対的な末端位置を比較することによって、不揃いな末端を推測するために使用することができる。この方法は、ＤＮＡ分子の両端の不揃いな末端を決定することを可能にする。
【０２０２】
図６２は、図６０と同様の技法であるが、ポリメラーゼ結合部位を使用する技法を示している。図６０と同様に、血漿ＤＮＡは、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）リガーゼを介して一本鎖ＤＮＡアダプタ（黄色）でライゲーションされるであろう。しかしながら、一本鎖ＤＮＡアダプタのうちの１つには、単一分子ＤＮＡ配列決定（例えば、ＰａｃＢｉｏ  ＳＭＲＴ配列決定）を容易にするＤＮＡポリメラーゼ結合部位がある。したがって、バイサルファイト処理なしの環状化分子は、ＰａｃＢｉｏ  ＳＭＲＴウェルのＤＮＡポリメラーゼに結合し、単一分子配列決定を初期化することができる。環状化分子全体は、「ローリング」によって複数回配列決定される。ローリングを完全に実行するたびに、いわゆるサブリードを生成する。コンセンサス配列は、いくつかのサブリードによって生成される。コンセンサス配列を分析することにより、配列決定エラーを最小限に抑えることができるであろう。「ａｂ」および「ｃｄ」の配列全体を比較することで、単一塩基解像度で不揃いな末端を特定することができる。この方法では、バイサルファイト処理を回避できるため、分析中のＤＮＡ分解を低減させることができる。不揃いな末端の形態は、概略図に示されている形態のうちの１つに存在することができるが、これに限定されない。不揃いな末端を有する分子は、分子の少なくとも一方の末端で平滑ではないことが示されるであろう。このような手法では、単一分子レベルであらゆる形態の不揃いな末端および平滑末端を検出することができる。
【０２０３】
図６３は、オーバーハングを直接評価するが、ランダムなタグ付け工程を抜かす実施形態を示している。ＤＮＡ分子のかなりの部分が亜硫酸水素ナトリウム処理中に断片化され、この断片が、ＤＮＡの直接配列決定を可能にし、亜硫酸水素ナトリウム処理後にオーバーハング情報を検出することができるため、ランダムなタグ付けを回避することができる。
【０２０４】
図６３では、血漿ＤＮＡの不揃いな末端部／オーバーハングが、ランダムなタグ付け増幅なしに、血漿ＤＮＡの環状化によって直接評価される。赤い矢印は、ＤＮＡと余分に挿入されたアダプタとの間の接合部を示しており、これは、赤い矢印で指示された接合部に直接隣接する塩基間の相補性の程度を比較することにより、オーバーハングを推測するために使用されるであろう。接合部を参照すると、オーバーハングについて照合されている左の短い配列の接合部の隣の末端は、「ａ」でラベル付けされ、照合されている右の短い配列の接合部の隣の末端は、「ｂ」でラベル付けされる。「ａ」および「ｂ」でラベル付けされた短い配列をヒト基準ゲノムにアライメントさせた後、最初に「ａ」および「ｂ」でラベル付けされた末端間のゲノム座標のオフセットは、血漿中に存在するオーバーハングを直接反映するであろう。このようなオーバーハング推論は、接合部に直接隣接する左の短い配列および右の短い配列が部分的に相補的である可能性があるため、基準ゲノムにアライメントさせずに行うこともできる。「ａ」末端と「ｂ」末端との間に形成された非相補的な一本鎖は、オーバーハングを示している。
【０２０５】
Ａ．環状核酸分子を切断する例示的な方法
図６４は、個体から得られた生体試料を分析する方法６４００を示している。生体試料は、二本鎖核酸分子を含み得る。二本鎖核酸分子は、無細胞であり得る。二本鎖核酸分子は、第１の鎖と、第２の鎖と、を有する。二本鎖核酸分子は、第１の末端と、第１の末端の反対側の第２の末端と、を有する。
【０２０６】
ブロック６４０２において、二本鎖核酸分子は、既知のパターンを有するオリゴヌクレオチドを使用して環状化される。環状核酸分子が生成される。環状核酸分子は、分子自体が完全な円でなくても、バイサルファイト処理後の図６０または図６１の分子、または図６３のｓｓＤＮＡリガーゼ後の分子を含み得る。
【０２０７】
環状核酸分子は、第１のオリゴヌクレオチドを、第１の末端において、第１の鎖および第２の鎖に結合させることによって形成することができる。第２のオリゴヌクレオチドは、第２の末端において、第１の鎖および第２の鎖に結合させることができる。第２のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの第２の既知のパターンを含み得る。環状核酸分子は、第１の鎖、第２の鎖、第１のオリゴヌクレオチド、および第２のオリゴヌクレオチドを含み得る。
【０２０８】
ブロック６４０４において、環状核酸分子が切断されて一本鎖核酸分子を形成する。
【０２０９】
ブロック６４０６において、一本鎖核酸分子が分析されて、第１のリードおよび第２のリードが生成される。一本鎖核酸分子は、第１のリードが対応する第１の末端に第１の鎖のヌクレオチドのパターンを含む第１のセクションを含むことができる。一本鎖核酸分子はまた、ヌクレオチドの第１の既知のパターンを有する第１のヌクレオチドを含み得る。一本鎖核酸分子は、第２のリードが対応する第１の末端に第２の鎖のヌクレオチドの第２のパターンを含む第２のセクションをさらに含み得る。一本鎖核酸分子を分析すると、第１のオリゴヌクレオチドに対応するリードも生成され得る。リードは、一本鎖核酸分子を配列決定することによって生成することができる。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、一本鎖核酸分子を分析することは、一本鎖核酸分子のランダムなタグ付けを含んでもよい。第３のオリゴヌクレオチドは、一本鎖核酸分子にアニーリングすることができる。第３のオリゴヌクレオチドは、図６０のように、３’末端ブロッキングタグ付けオリゴヌクレオチドであってもよい。一本鎖核酸分子を増幅して配列決定アダプタを付加することができる。
【０２１１】
ブロック６４０８において、第１のリードおよび第２のリードを、参照配列に、または相互にアライメントする。参照配列は、ヒト基準ゲノムであり得る。
【０２１２】
ブロック６４１０において、二本鎖核酸分子が、第２の鎖にハイブリダイズされていない第１の鎖の一部を含むかどうかが、第１のリードおよび第２のリードのアライメントを使用して決定される。
【０２１３】
方法６４００は、第２の鎖にハイブリダイズしていない第１の鎖の一部の長さを決定することをさらに含むことができる。長さを決定するには、アライメントを使用してもよい。長さは、図１で説明された方法のいずれかで測定された特性として使用することができる。
【０２１４】
Ｂ．環状核酸分子を分析する例示的な方法
図６５は、個体から得られた生体試料を分析する方法６５００を示している。生体試料は、二本鎖核酸分子を含むことができる。二本鎖核酸分子は、無細胞であり得る。二本鎖核酸分子は、第１の鎖と、第２の鎖と、を有する。二本鎖核酸分子は、第１の末端と、第１の末端の反対側の第２の末端と、を有する。
【０２１５】
ブロック６５０２において、二本鎖核酸分子は、既知のパターンを有するオリゴヌクレオチドを使用して環状化される。環状核酸分子が生成される。環状核酸分子は、図６２の分子を含むことができる。
【０２１６】
環状核酸分子は、第１のオリゴヌクレオチドを、第１の末端において、第１の鎖および第２の鎖に結合させることによって形成することができる。第２のオリゴヌクレオチドは、第２の末端において、第１の鎖および第２の鎖に結合させることができる。第２のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの第２の既知のパターンを含むことができる。環状核酸分子は、第１の鎖、第２の鎖、第１のオリゴヌクレオチド、および第２のオリゴヌクレオチドを含むことができる。
【０２１７】
ブロック６５０４において、一本鎖核酸分子が分析されて、第１のリードおよび第２のリードが生成される。一本鎖核酸分子は、第１のリードが対応する第１の末端に第１の鎖のヌクレオチドのパターンを含む第１のセクションを含むことができる。一本鎖核酸分子はまた、ヌクレオチドの第１の既知のパターンを有する第１のヌクレオチドを含むことができる。一本鎖核酸分子は、第２のリードが対応する第１の末端に第２の鎖のヌクレオチドの第２のパターンを含む第２のセクションを含むことができる。
【０２１８】
一本鎖核酸分子を分析すると、第１のオリゴヌクレオチドに対応するリードも生成することができる。リードは、環状核酸分子の単一分子配列決定によって生成することができる。図６２およびＰａｃＢｉｏ  ＳＭＲＴウェルに記載されているように、ポリメラーゼは第１のオリゴヌクレオチドに結合することができるか、またポリメラーゼは単一分子配列決定を初期化することができる。方法Ｊ００は、バイサルファイト処理を除外する場合がある。
【０２１９】
ブロック６５０６において、第１のリードおよび第２のリードを、参照配列に、または相互にアライメントさせる。参照配列は、ヒト基準ゲノムであり得る。
【０２２０】
ブロック６５０８において、二本鎖核酸分子が、第２の鎖にハイブリダイズされていない第１の鎖の一部を含むかどうかが、第１のリードおよび第２のリードのアライメントを使用して決定される。
【０２２１】
方法６５００は、第２の鎖にハイブリダイズしていない第１の鎖の一部の長さを決定することをさらに含むことができる。長さを決定するには、アライメントを使用してもよい。長さは、図１で説明された方法のいずれかで測定された特性として使用することができる。
【０２２２】
ＩＸ．無細胞ＤＮＡオーバーハングを評価するためのイノシンベースの配列決定
図６６は、イノシンベースの配列決定を使用して不揃いな末端を評価する方法を示している。従来のｄＮＴＰの代わりに、末端修復時にイノシンを使用することができる。図６６に示されるように、イノシン塩基は、「Ｉ」の伸長によって示される、反対側の鎖に対してくぼみを呈する鎖の３’末端に組み込まれるであろう。
【０２２３】
イノシン（Ｉ）が４つの塩基の各々と塩基対を形成する（ハイブリダイズする）能力があるため、イノシンのみがＤＮＡポリメラーゼと混合される場合、血漿ＤＮＡの不揃いな末端は、末端修復中に一連のイノシンで満たされるであろう。ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡを５’から３’まで合成する。したがって、５’の突出鎖はＤＮＡテンプレートとして機能し、反対側の鎖の３’末端へのイノシンの組み込みを促進する。不揃いな末端を保有するＤＮＡ分子がイノシンで満たされると、５’の突出末端の反対側の鎖でこのような一連のイノシンを検出するための複数の方法がある。（１）このような分子は配列決定アダプタとライゲーションすることができる。アダプタタグ付き分子は、一本鎖ＤＮＡ分子に変性し、アダプタを含有するコンパートメント（すなわち、ウェル、フローセル、液滴）に装填することができる。
【０２２４】
１つのコンパートメントには１つの分子だけを含有する。培地には、そのようなコンパートメントが何百万もある。コンパートメント内の分子は、それぞれ４つのタイプの色素で標識される４つのタイプのヌクレオチド（Ａｓ、Ｃｓ、Ｇｓ、およびＴｓ）と混合されたＤＮＡポリメラーゼによって増幅される。コンパートメント内の非Ｉ塩基（コンセンサス配列）は、元の不揃いな末端に対応するＩ塩基のものよりも、レーザーによって活性化された色素から放出される高純度の光を生成する。蛍光の純度は、最も明るい塩基強度を最も明るい塩基強度と２番目に明るい塩基強度との合計で割ることによって定義することができる。（２）コンパートメント内のクローン増幅分子は、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンスプラットフォームで実行することができる。不揃いな末端に由来する配列決定結果には、コンセンサス配列と比較してはるかに高い配列決定エラーが含まれるため、各分子の不揃いな末端を区別することができる。一方、配列決定品質（ベースクオリティ）は、不揃いな末端の領域で劇的に低下し、これも、不揃いな末端を推測するために使用することができる。
【０２２５】
分子内のイノシンを検出する別の実施形態は、イオン半導体配列決定またはＰａｃＢｉｏ  ＳＭＲＴ配列決定を使用する。イオン半導体配列決定の場合、エマルジョンＰＣＲは、色素標識ヌクレオチドを使用する代わりに、ネイティブなヌクレオチドを使用してコンパートメント（マイクロウェル）で実行することができる。配列決定中に、ヌクレオチド種が一度に１つずつウェルに追加され、標準的な伸長反応が実施される。各塩基の組み込み、単一のプロトン（Ｈ＋）が副産物として生成され、半導体によって電子電圧シグナルに変換される。エマルジョンＰＣＲでのクローン増幅中に特定のタイプのＤＮＡテンプレートの有効濃度が希釈されるという事実のために、主要な電子シグナルは他の領域と比較して不揃いな末端で大幅に減少する。一方、バックグラウンド電子シグナルのベースラインは、コンセンサス領域のベースラインよりも不揃いな末端領域に沿って高くなり、これは、全ての新しいヌクレオチドの追加が可変配列の１つに組み込まれる可能性があるのに対し、４つヌクレオチドが回転するごとにコンセンサス領域中に適切に組み込まれるヌクレオチドのタイプは１つしかないためである。ＰａｃＢｉｏ  ＳＭＲＴ配列決定では、サブリードからコンセンサス配列を構築するときに、不揃いな末端でエラー率が増加すると思われる。他のタイプの配列決定技法もまた、例えば、ライゲーションベースの配列決定に限定されないが、末端修復中に埋め込まれるこのような類似体の検出に有用であり得る。
【０２２６】
図６７は、本発明の実施形態による、二本鎖核酸分子の不揃いな末端を測定するための方法６７００を示している。方法６７００は、本明細書に記載されるように不揃いな末端で実施することができる。
【０２２７】
ブロック６７０２において、複数の核酸分子のうちの各核酸分子について、１つ以上のヌクレオチド類似体を含む第１の化合物が、第１の鎖の第１の部分にハイブリダイズされる。第１の化合物および第２の鎖は、伸長された第２の鎖を形成することができる。１つ以上のヌクレオチド類似体は、任意のヌクレオチドにハイブリダイズすることができる。
【０２２８】
ブロック６７０４において、第１の鎖は、第１の化合物および第２の鎖から分離される。
【０２２９】
ブロック６７０６において、複数の伸長された第２の鎖のうちの各伸長された第２の鎖は、伸長された第２の鎖上の複数の位置の各々でヌクレオチドシグナルを生成するように配列決定される。例として、ヌクレオチドシグナルは、蛍光シグナルまたは電気シグナルであり得る。上記のように、配列決定は、伸長された第２の鎖のクローン増幅を含むことができ、その結果、伸長された第２の鎖の末端で異なる塩基が生じ得る。
【０２３０】
ブロック６７０８において、複数の伸長された第２の鎖のうちの各伸長された第２の鎖について、対応する第２の鎖の末端の第１の位置は、第１の位置から次の位置への最大ヌクレオチドシグナルの強度の変化を検出することによって特定される。上記のように、ヌクレオチド（塩基）の全てが、全て等しい確率（頻度）で類似体にハイブリダイズするため、全てのヌクレオチド（塩基）が同様の強度を持つため、変化はシグナル品質の全体的な低下に関連する可能性がある。
【０２３１】
強度の変化は、閾値を超える可能性がある。閾値を超える強度の変化は、第１の位置に対してＮ個の位置で維持する必要があり、ここで、Ｎは、例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０などの１より大きい整数である。最大ヌクレオチドシグナルの強度の変化は、２番目に高いヌクレオチドシグナルに関連し得る。最大ヌクレオチドシグナルの強度の変化は、第１の位置でのベースコールの品質スコアとして測定することができる。
【０２３２】
Ｘ．老化およびオーバーハング
分子プロファイルから人間の老化を予測する能力は、疾患の治療、予防、老化、薬物反応、ならびに法医学が挙げられるが、これらに限定されない、多くの分野で重要な意味を有している。暦年齢と無細胞分子プロファイルに基づく年齢予測との間の不一致は、疾患と健康状態を示唆し、長寿であるか、または長寿ではないかのバイオマーカーであり得る。図６８は、血漿ＤＮＡオーバーハングプロファイルが老化を予測するために使用され得ることを示している。オーバーハング指数比は、いかなるサイズの選択もない全ての分子のオーバーハング指数に対して１２０〜１４０ｂｐの範囲内の分子のオーバーハング指数によって計算された。
【０２３３】
したがって、いくつかの実施形態では、不揃いな末端値を参照値と比較することができ、その比較に基づいて個体の年齢を決定することができる。例えば、参照値は、較正データポイント６８０４に適合した較正曲線６８０２から、または較正データポイント６８０４のいずれかから決定することができる。したがって、参照値は、較正試料が不揃いな末端値について測定される既知の年齢を有する１つ以上の参照対象からの核酸分子を使用して取得することができる。いくつかの実装形態では、複数の核酸分子は、特定のサイズ範囲内のサイズを有する。
【０２３４】
ＸＩ．例示的なシステム
図６９は、本発明の一実施形態による測定システム６９００を例示する。示されたシステムは、試料ホルダ６９１０内の無細胞ＤＮＡ分子などの試料６９０５を含み、試料６９０５はアッセイ６９０８と接触して物理的特徴６９１５の信号を提供することができる。試料ホルダの例は、アッセイのプローブおよび／もしくはプライマー、または液滴が（アッセイを含む液滴とともに）移動するチューブを含む、フローセルであり得る。試料からの物理的特性６９１５（例えば、蛍光強度、電圧、または電流）は、検出器６９２０によって検出される。検出器６９２０は、データ信号を構成するデータポイントを得るために、間隔（例えば、周期的な間隔）を空けて測定を行うことができる。一実施形態では、アナログ・デジタル変換器は、検出器からのアナログ信号をデジタル形態へと複数回変換する。試料ホルダ６９１０および検出器６９２０は、アッセイデバイス、例えば、本明細書に記載される実施形態に従って配列決定を実施する配列決定デバイスを形成することができる。データ信号６９２５は、検出器６９２０から論理システム６９３０へ送信される。データ信号６９２５は、ローカルメモリ６９３５、外部メモリ６９４０、または記憶デバイス６９４５に保存され得る。
【０２３５】
論理システム６９３０は、コンピュータシステム、ＡＳＩＣ、マイクロプロセッサなどであってもよいか、またはそれらを含んでもよい。それはまた、ディスプレイ（例えば、モニタ、ＬＥＤディスプレイなど）、およびユーザ入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、ボタンなど）を含み得るか、またはそれらに連結され得る。論理システム６９３０および他の構成要素は、スタンドアローンもしくはネットワーク接続されたコンピュータシステムの一部であってもよく、または検出器６９２０および／もしくは試料ホルダ６９１０を含むデバイス（例えば、配列決定デバイス）に直接取り付けられても組み込まれてもよい。論理システム６９３０はまた、プロセッサ６９５０において実行するソフトウェアを含み得る。論理システム６９３０は、本明細書に記載される方法のいずれかを実施するようにシステム６９００を制御するための指示を保存するコンピュータ可読媒体を含み得る。例えば、論理システム６９３０は、配列決定または他の物理的操作が実施されるように、試料ホルダ６９１０を含むシステムにコマンドを提供することができる。そのような物理的操作は、特定の順序で、例えば、試薬が特定の順序で追加および除去されるように、実施することができる。そのような物理的操作は、試料を入手してアッセイを実施するために使用され得るように、例えば、ロボットアームを含む、ロボットシステムによって実施され得る。
【０２３６】
本明細書で言及されるコンピュータシステムのうちのいずれも、任意の好適な数のサブシステムを利用してもよい。このようなサブシステムの例をコンピュータシステム１０の図７０に示す。いくつかの実施形態において、コンピュータシステムは、単一のコンピュータ装置を含み、サブシステムは、コンピュータ装置の構成要素であり得る。他の実施形態において、コンピュータシステムは、各々がサブシステムであり、内部構成要素を備える、複数のコンピュータ装置を含むことができる。コンピュータシステムは、デスクトップコンピュータおよびラップトップコンピュータ、タブレット、携帯電話、ならびに他の携帯デバイスを含み得る。
【０２３７】
図７０に示されるサブシステムは、システムバス７５を介して相互接続される。プリンタ７４、キーボード７８、記憶デバイス（複数可）７９、ディスプレイアダプタ８２へ連結されているモニタ７６（例えば、ＬＥＤなどのディスプレイスクリーン）、および他のものなどの追加のサブシステムが示されている。Ｉ／Ｏコントローラ７１に結合する周辺機器および入力／出力（Ｉ／Ｏ）デバイスは、入力／出力（Ｉ／Ｏ）ポート７７（例えば、ＵＳＢ、ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））などの当技術分野において既知である任意の数の手段によって、コンピュータシステムに接続され得る。例えば、Ｉ／Ｏポート７７または外部インターフェース８１（例えば、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、Ｗｉ−Ｆｉなど）を使用して、Ｉｎｔｅｒｎｅｔなどの広域ネットワーク、マウス入力デバイス、またはスキャナに、コンピュータシステム１０を接続することができる。システムバス７５を介した相互接続は、中央プロセッサ７３が、各サブシステムと通信し、システムメモリ７２または記憶デバイス（複数可）７９（例えば、ハードドライブまたは光ディスクなどの固定ディスク）からの複数の命令の実行、およびサブシステム間の情報交換を制御することを可能にする。システムメモリ７２および／または記憶デバイス（複数可）７９は、コンピュータ可読媒体を具現化してもよい。別のサブシステムは、カメラ、マイクロホン、および加速度計、ならびにこれらに類するものなどのデータ収集デバイス８５である。本明細書に言及されるデータのうちのいずれも、１つの構成要素から別の構成要素に出力されてもよく、ユーザに対して出力されてもよい。
【０２３８】
コンピュータシステムは、例えば、外部インターフェース８１によって、内部インターフェースによって、または１つの構成要素から別の構成要素に接続され得る、もしくは取り外され得る記憶デバイスを介して、ともに接続された、複数の同じ構成要素またはサブシステムを含むことができる。いくつかの実施形態では、コンピュータシステム、サブシステム、または装置は、ネットワーク上で通信することができる。かかる例において、１つのコンピュータをクライアント、別のコンピュータをサーバと見なすことができ、各々が、同じコンピュータシステムの一部であり得る。クライアントおよびサーバは各々、複数のシステム、サブシステム、または構成要素を含むことができる。
【０２３９】
実施形態の態様は、制御ロジックの形態で、ハードウェア回路（例えば、特定用途向け集積回路もしくはフィールドプログラマブルゲートアレイ）を使用して、および／またはモジュール式もしくは集積様態で汎用プログラマブルプロセッサを有するコンピュータソフトウェアを使用して、実装することができる。本明細書で使用される場合、プロセッサは、シングルコアプロセッサ、同じ集積チップ上のマルチコアプロセッサ、または単一の回路基板もしくはネットワーク化された上の複数の処理ユニット、ならびに専用のハードウェアを含むことができる。本開示および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、ハードウェア、およびハードウェアとソフトウェアとの組み合わせを使用して、本発明の実施形態を実装するための他の方法および／または方法を認識および理解するであろう。
【０２４０】
本出願で説明されるソフトウェア構成要素または関数のうちのいずれも、例えば、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ−Ｃ、Ｓｗｉｆｔなどの任意の好適なコンピュータ言語、または、例えば、従来の技術もしくはオブジェクト指向の技術を使用するＰｅｒｌもしくはＰｙｔｈｏｎなどのスクリプト言語を使用する、処理デバイスによって実行されるソフトウェアコードとして実装されてもよい。ソフトウェアコードは、保存および／または伝送のためのコンピュータ可読媒体上に一連の命令またはコマンドとして記憶され得る。好適な非一過性コンピュータ可読媒体は、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、磁気媒体（ハードドライブもしくはフロッピー（登録商標）ディスクなど）、または光学媒体（コンパクトディスク（ＣＤ）もしくはＤＶＤ（デジタル多用途ディスク）など）、またはブルーレイディスク、フラッシュメモリなどを含むことができる。コンピュータ可読媒体は、かかる記憶または送信デバイスの任意の組み合わせであってもよい。
【０２４１】
かかるプログラムはまた、コード化され、インターネットを含む様々なプロトコルに従う有線ネットワーク、光ネットワーク、および／または無線ネットワークを介した送信に適合した搬送波信号を使用して送信されてもよい。したがって、コンピュータ可読媒体は、かかるプログラムでコード化されたデータ信号を使用して作成されてもよい。プログラムコードでコード化されたコンピュータ可読媒体は、互換性のあるデバイスでパッケージ化されていてもよく、または（例えば、インターネットダウンロードを介して）他のデバイスとは別個に提供されてもよい。任意のかかるコンピュータ可読媒体は、単一のコンピュータ製品（例えば、ハードドライブ、ＣＤ、もしくはコンピュータシステム全体）上もしくはその内部に存在してもよく、システムまたはネットワーク内の異なるコンピュータ製品上もしくはその内部に存在してもよい。コンピュータシステムは、モニタ、プリンタ、または本明細書に記載の結果のうちのいずれかをユーザへ提供するための他の好適なディスプレイを含み得る。
【０２４２】
本明細書記載の方法のうちのいずれも、ステップを実施するように構成することができる１つ以上のプロセッサを含むコンピュータシステムを用いて全体的または部分的に実施することができる。したがって、実施形態は、本明細書に説明される方法のうちのいずれかのステップを実施するように構成されたコンピュータシステムを対象とし得、潜在的には異なる構成要素がそれぞれのステップまたはそれぞれのステップのグループを実施する。番号付けされたステップとして提示されるが、本明細書の方法のステップは、同時にもしくは異なる時間に、または異なる順序で実施することができる。追加的に、これらのステップの部分は、他の方法からの他のステップの部分と併用することができる。また、あるステップのすべてまたは部分は、任意選択的であってもよい。追加的に、本方法のうちのいずれかのステップのうちのいずれかを、これらのステップを実施するためのシステムのモジュール、ユニット、回路、または他の手段を用いて実施することができる。
【０２４３】
特定の実施形態の具体的な詳細は、本発明の実施形態の趣旨および範囲から逸脱することなく、任意の好適な様態で組み合わせることができる。しかしながら、本発明の他の実施形態は、各個々の態様、またはこれらの個々の態様の具体的な組み合わせに関する具体的な実施形態を対象とし得る。
【０２４４】
本開示の例示的実施形態の上の説明は、図解および説明目的で提示されている。包括的であること、または本開示を説明された正確な形態に限定することは意図されず、多くの修正および変更が、先の教示に鑑みて可能である。
【０２４５】
「ａ」、「ａｎ」、または「ｔｈｅ」の記述は、それとは反対に具体的に示されない限り、「１つ以上」を意味することが意図される。「または」の使用は、それとは反対に具体的に示されない限り、「を除く、または」ではなく「を含む、または」を意味することが意図される。「第１」のコンポーネントへの言及は、第２のコンポーネントが提供されることを必ずしも必要としない。さらに、「第１」または「第２」のコンポーネントへの言及は、明示的に述べられていない限り、言及されるコンポーネントを特定の場所に限定するものではない。「〜に基づいて」という用語は、「少なくとも一部に基づいて」を意味することを意図している。
【０２４６】
本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、刊行物、および明細書は、すべての目的に対して参照によりそれらの全体が組み込まれる。いかなるものも、先行技術であるとは認められていない。
【図１】
2021531016.tif 000002
【図２】
2021531016.tif 000003
【図３】
2021531016.tif 000004
【図４】
2021531016.tif 000005
【図５Ａ】
2021531016.tif 000006
【図５Ｂ】
2021531016.tif 000007
【図６】
2021531016.tif 000008
【図７Ａ】
2021531016.tif 000009
【図７Ｂ】
2021531016.tif 000010
【図７Ｃ】
2021531016.tif 000011
【図８】
2021531016.tif 000012
【図９】
2021531016.tif 000013
【図１０】
2021531016.tif 000014
【図１１】
2021531016.tif 000015
【図１２】
2021531016.tif 000016
【図１３】
2021531016.tif 000017
【図１４】
2021531016.tif 000018
【図１５】
2021531016.tif 000019
【図１６】
2021531016.tif 000020
【図１７】
2021531016.tif 000021
【図１８】
2021531016.tif 000022
【図１９Ａ】
2021531016.tif 000023
【図１９Ｂ】
2021531016.tif 000024
【図２０】
2021531016.tif 000025
【図２１】
2021531016.tif 000026
【図２２】
2021531016.tif 000027
【図２３Ａ】
2021531016.tif 000028
【図２３Ｂ】
2021531016.tif 000029
【図２４】
2021531016.tif 000030
【図２５】
2021531016.tif 000031
【図２６】
2021531016.tif 000032
【図２７Ａ】
2021531016.tif 000033
【図２７Ｂ】
2021531016.tif 000034
【図２８Ａ】
2021531016.tif 000035
【図２８Ｂ】
2021531016.tif 000036
【図２９Ａ】
2021531016.tif 000037
【図２９Ｂ】
2021531016.tif 000038
【図３０Ａ】
2021531016.tif 000039
【図３０Ｂ】
2021531016.tif 000040
【図３１】
2021531016.tif 000041
【図３２】
2021531016.tif 000042
【図３３】
2021531016.tif 000043
【図３４】
2021531016.tif 000044
【図３５】
2021531016.tif 000045
【図３６】
2021531016.tif 000046
【図３７】
2021531016.tif 000047
【図３８】
2021531016.tif 000048
【図３９】
2021531016.tif 000049
【図４０】
2021531016.tif 000050
【図４１】
2021531016.tif 000051
【図４２】
2021531016.tif 000052
【図４３】
2021531016.tif 000053
【図４４】
2021531016.tif 000054
【図４５】
2021531016.tif 000055
【図４６】
2021531016.tif 000056
【図４７】
2021531016.tif 000057
【図４８】
2021531016.tif 000058
【図４９】
2021531016.tif 000059
【図５０】
2021531016.tif 000060
【図５１】
2021531016.tif 000061
【図５２Ａ】
2021531016.tif 000062
【図５２Ｂ】
2021531016.tif 000063
【図５３】
2021531016.tif 000064
【図５４】
2021531016.tif 000065
【図５５】
2021531016.tif 000066
【図５６】
2021531016.tif 000067
【図５７】
2021531016.tif 000068
【図５８Ａ】
2021531016.tif 000069
【図５８Ｂ】
2021531016.tif 000070
【図５８Ｃ】
2021531016.tif 000071
【図５８Ｄ】
2021531016.tif 000072
【図５９】
2021531016.tif 000073
【図６０】
2021531016.tif 000074
【図６１】
2021531016.tif 000075
【図６２】
2021531016.tif 000076
【図６３】
2021531016.tif 000077
【図６４】
2021531016.tif 000078
【図６５】
2021531016.tif 000079
【図６６】
2021531016.tif 000080
【図６７】
2021531016.tif 000081
【図６８】
2021531016.tif 000082
【図６９】
2021531016.tif 000083
【図７０】
2021531016.tif 000084
【国際調査報告】
2021531016.tif 000085
2021531016.tif 000086
2021531016.tif 000087