(57)【要約】ヒトＣＴＬＡ４に結合する交差反応性抗体（またはその抗原結合断片）、ヒトＣＴＬＡ４に結合する活性化可能抗体、それをコードする核酸分子、その医薬組成物、及びそれらの（例えば、がんの治療のための）治療的使用方法が本明細書に提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗ＣＴＬＡ４抗体であって、ヒトＣＴＬＡ４に結合し、カニクイザル、マウス、ラット、及びイヌＣＴＬＡ４と交差反応性である、前記抗体。
【請求項２】
前記抗体が、ヒトＣＴＬＡ４、カニクイザルＣＴＬＡ４、マウスＣＴＬＡ４、ラットＣＴＬＡ４、及びイヌＣＴＬＡ４に、約３５０ｎＭ以下の解離定数（ＫＤ）で結合する、請求項１に記載の抗体。
【請求項３】
前記ＫＤが、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
前記抗ＣＴＬＡ４抗体の結合が、ＣＴＬＡ４発現ヒト細胞またはヒトＴｒｅｇ細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し、前記抗ＣＴＬ４抗体のＡＤＣＣ活性がイピリムマブのＡＤＣＣ活性よりも高い、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項５】
（ａ）前記抗体が、ヒトＣＴＬＡ４のアミノ酸残基Ｙ１０５及びＬ１０６を含むが残基Ｉ１０８を含まないエピトープに特異的に結合し、前記アミノ酸残基の番号付けが配列番号２０７に従っており、及び／または（ｂ）前記抗ＣＴＬＡ４抗体が、ＣＤ８０及び／またはＣＤ８６がプレート結合されている場合、またはヒトＣＴＬＡ４が細胞表面上に存在する場合のいずれかのアッセイにおいて、ヒトＣＴＬＡ４へのＣＤ８０及び／またはＣＤ８６の結合を遮断するために、イピリムマブのＩＣ５０よりも高いＩＣ５０を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項６】
前記抗体が、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、
ａ）前記重鎖可変領域が、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、
前記ＨＶＲ−Ｈ１は、
式（Ｉ）：Ｘ１ＴＦＳＸ２ＹＸ３ＩＨＷＶ（配列番号１）（式中、Ｘ１はＦまたはＹであり、Ｘ２はＤまたはＧであり、Ｘ３はＡ、Ｇ、またはＷである）、
式（ＩＩ）：ＹＳＩＸ１ＳＧＸ２Ｘ３ＷＸ４ＷＩ（配列番号２）（式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＨまたはＹであり、Ｘ３はＨまたはＹであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、またはＳである）、及び
式（ＩＩＩ）：ＦＳＬＳＴＧＧＶＡＶＸ１ＷＩ（配列番号３）（式中、Ｘ１はＧまたはＳである）からなる群から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、
前記ＨＶＲ−Ｈ２は、
式（ＩＶ）：ＩＧＸ１ＩＸ２ＨＳＧＳＴＹＹＳＸ３ＳＬＫＳＲＶ（配列番号４）（式中、Ｘ１はＤまたはＥであり、Ｘ２はＳまたはＹであり、Ｘ３はＰまたはＱである）、
式（Ｖ）：ＩＧＸ１ＩＳＰＳＸ２ＧＸ３ＴＸ４ＹＡＱＫＦＱＧＲＶ（配列番号５）（式中、Ｘ１はＩまたはＷであり、Ｘ２はＧまたはＳであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＫまたはＮである）、及び
式（ＶＩ）：ＶＳＸ１ＩＳＧＸ２ＧＸ３Ｘ４ＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦ（配列番号６）（式中、Ｘ１はＡ、Ｇ、またはＳであり、Ｘ２はＳまたはＹであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＳまたはＴである）からなる群から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、
前記ＨＶＲ−Ｈ３は、
式（ＶＩＩ）：ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＦＤＸ５（配列番号７）（式中、Ｘ１はＧ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ２はＡ、Ｉ、またはＹであり、Ｘ３はＤ、Ｖ、またはＹであり、Ｘ４はＡ、Ｅ、またはＹであり、Ｘ５はＩまたはＹである）、
式（ＶＩＩＩ）：ＡＲＸ１ＧＸ２ＧＹＦＤＸ３（配列番号８）（式中、Ｘ１はＤまたはＬであり、Ｘ２はＦまたはＹであり、Ｘ３はＶまたはＹである）、
式（ＩＸ）：ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ５Ｘ６ＦＤＹ（配列番号９）（式中、Ｘ１はＬまたはＲであり、Ｘ２はＩまたはＰであり、Ｘ３はＡまたはＹであり、Ｘ４はＳまたはＴであり、Ｘ５はＴまたはＹであり、Ｘ６はＡまたはＹである）、
式（Ｘ）：ＡＲＤＸ１Ｘ２Ｘ３ＧＳＳＧＹＹＸ４ＧＦＤＸ５（配列番号１０）（式中、Ｘ１はＩまたはＶであり、Ｘ２はＡまたはＨであり、Ｘ３はＰまたはＳであり、Ｘ４はＤまたはＹであり、Ｘ５はＦまたはＶである）からなる群から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、
ｂ）前記軽鎖可変領域が、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、
前記ＨＶＲ−Ｌ１は、
式（ＸＩ）：ＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３ＳＸ４ＬＸ５（配列番号１１）（式中、Ｘ１はＧまたはＳであり、Ｘ２はＩまたはＶであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＳまたはＹであり、Ｘ５はＡまたはＮである）、
式（ＸＩＩ）：ＲＡＳＱＸ１ＶＸ２Ｘ３ＲＸ４ＬＡ（配列番号１２）（式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＦ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＦまたはＹである）、及び
式（ＸＩＩＩ）：ＲＡＳＸ１ＳＶＤＦＸ２ＧＸ３ＳＦＬＸ４（配列番号１３）（式中、Ｘ１はＥまたはＱであり、Ｘ２はＤ、Ｆ、Ｈ、またはＹであり、Ｘ３はＦ、Ｉ、またはＫであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、またはＨである）からなる群から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、
前記ＨＶＲ−Ｌ２は、式（ＸＩＶ）：Ｘ１ＡＳＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＧＸ６（配列番号１４）（式中、Ｘ１はＡまたはＤであり、Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＴであり、Ｘ３はＬまたはＲであり、Ｘ４はＡ、Ｅ、またはＱであり、Ｘ５はＳまたはＴであり、Ｘ６はＩまたはＶである）に従うアミノ酸配列を含み、
前記ＨＶＲ−Ｌ３は、
式（ＸＶ）：ＹＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＰＸ７Ｔ（配列番号１５）（式中、Ｘ１はＥ、Ｑ、またはＶであり、Ｘ２はＨまたはＱであり、Ｘ３はＡ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ４はＤ、Ｌ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ５はＥ、Ｇ、Ｐ、Ｑ、またはＳであり、Ｘ６はＬ、Ｔ、Ｖ、またはＷであり、Ｘ７はＦ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、またはＹである）、
式（ＸＶＩ）：ＹＣＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３ＷＰＰＷＴ（配列番号１６）（式中、Ｘ１はＳまたはＹであり、Ｘ２はＤまたはＹであり、Ｘ３はＱまたはＹである）、及び
式（ＸＶＩＩ）：ＹＣＱＸ１ＹＸ２ＳＳＰＰＸ３ＹＴ（配列番号１７）（式中、Ｘ１はＨまたはＱであり、Ｘ２はＴまたはＶであり、Ｘ３はＥまたはＶである）からなる群から選択される式に従うアミノ酸配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項７】
前記ＨＶＲ−Ｈ１が、配列番号１８〜２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲ−Ｈ２が、配列番号３０〜３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲ−Ｈ３が、配列番号４０〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲ−Ｌ１が、配列番号５３〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲ−Ｌ２が、配列番号６６〜６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、前記ＨＶＲ−Ｌ３が、配列番号７０〜８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項８】
前記抗体が、
ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｇ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｈ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｊ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｋ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、
ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、または
ｍ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項９】
前記重鎖可変領域が、配列番号８２〜９４からなる群から選択されるアミノ酸配列、または前記配列番号８２〜９４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、及び／または前記軽鎖可変領域が、配列番号９５〜１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列、または前記配列番号９５〜１０７からなる群から選択される配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項７または請求項８に記載の抗体。
【請求項１０】
前記抗体が、
ａ）配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｂ）配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｃ）配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｄ）配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｅ）配列番号８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｆ）配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｇ）配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｈ）配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｊ）配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｋ）配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、
ｌ）配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域、または
ｍ）配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項７〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
前記抗体が、（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域、あるいは（ｂ）配列番号８７のアミノ酸配列、または配列番号８７のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号１００のアミノ酸配列、または配列番号１００のアミノ酸配列と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
前記抗体が、ヒト抗体である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１３】
前記抗体が、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、及びｓｃＦｖ断片からなる群から選択される抗体断片である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
前記抗体が、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒトＣＴＬＡ４への結合に関して、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の抗体と交差競合する、抗体。
【請求項１６】
活性化可能抗体であって、
Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）、及び標的結合部分（ＴＢＭ）を含むポリペプチドを含み、
前記ＭＭが、式（ＸＶＩＩＩ）：ＸｍＣＸｎＣＺｏ（配列番号１３４）に従うアミノ酸配列を含み、式中、ｍは２〜１０であり、ｎは３〜１０であり、ｏは１〜１０であり、各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、前記ＭＭは、前記ＣＭが切断されていない場合、前記活性化可能抗体のヒトＣＴＬＡ４への結合を阻害し、
前記ＣＭが、少なくとも第１の切断部位を含み、
ａ）前記ＴＢＭが、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記活性化可能抗体が、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第２のポリペプチドをさらに含むか、
ｂ）前記ＴＢＭが、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、前記活性化可能抗体が、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第２のポリペプチドをさらに含むか、
ｃ）前記ＴＢＭが、Ｎ末端からＣ末端にかけて、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含むか、または
ｄ）前記ＴＢＭが、Ｎ末端からＣ末端にかけて、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、
前記活性化可能抗体が、前記ＣＭが切断されている場合、ＶＨ及びＶＬを介してヒトＣＴＬＡ４に結合する、前記活性化可能抗体。
【請求項１７】
前記ＴＢＭが、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、前記活性化可能抗体が、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第２のポリペプチドをさらに含む、請求項１６に記載の活性化可能抗体。
【請求項１８】
ｍが２または３〜１０である、請求項１６または１７に記載の活性化可能抗体。
【請求項１９】
ｎが６〜８である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項２０】
ｎが６である、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項２１】
ｏが１〜２である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項２２】
ｏが２である、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項２３】
各ＸがＭ、Ｗ、またはＣではない、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項２４】
式（ＸＶＩＩＩ）のＸｍにおける各Ｘが、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項２５】
式（ＸＶＩＩＩ）のＸｎにおける各Ｘが、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項２６】
前記ＭＭが、ＸｍＣＰＤＨＰＹＰＣＸＸ（配列番号１８１）、ＸｍＣＤＡＦＹＰＹＣＸＸ（配列番号１８２）、ＸｍＣＤＳＨＹＰＹＣＸＸ（配列番号１８３）、及びＸｍＣＶＰＹＹＹＡＣＸＸ（配列番号１８４）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、式中、ｍが２〜１０であり、各Ｘが独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸である、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項２７】
前記ＭＭが、そのＮ末端に追加のアミノ酸配列をさらに含む、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項２８】
前記追加のアミノ酸配列が、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の活性化可能抗体。
【請求項２９】
前記第１の切断部位が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、プラスミン、トロンビン、第Ｘ因子、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、カテプシンＤ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、カスパーゼ−１４、及びＴＡＣＥからなる群から選択されるプロテアーゼのプロテアーゼ切断部位である、請求項１６〜２８のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項３０】
前記ＣＭが、前記第１の切断部位のＣ末端に第１のリンカー（Ｌ１）をさらに含む、請求項１６〜２９のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項３１】
前記Ｌ１が、配列番号１５６〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３０に記載の活性化可能抗体。
【請求項３２】
前記ＣＭが、第２の切断部位をさらに含む、請求項１６〜３１のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項３３】
前記第２の切断部位が、前記Ｌ１のＣ末端にある、請求項３２に記載の活性化可能抗体。
【請求項３４】
前記第２の切断部位が、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、プラスミン、トロンビン、第Ｘ因子、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、カテプシンＤ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、カスパーゼ−１４、及びＴＡＣＥからなる群から選択されるプロテアーゼのプロテアーゼ切断部位である、請求項３２または３３に記載の活性化可能抗体。
【請求項３５】
前記第１及び第２の切断部位が異なる、請求項３２〜３４のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項３６】
前記ＣＭが、前記第２の切断部位のＣ末端に第２のリンカー（Ｌ２）をさらに含む、請求項３２〜３５のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項３７】
前記Ｌ２が、配列番号１５６〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項３６に記載の活性化可能抗体。
【請求項３８】
前記ＣＭが、前記第１の切断部位のＮ末端に第３のリンカー（Ｌ３）をさらに含む、請求項１６〜３７のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項３９】
前記ＣＭが、少なくとも第１のプロテアーゼ切断部位を含み、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、プラスミン、トロンビン、第Ｘ因子、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、カテプシンＤ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、カスパーゼ−１４、及びＴＡＣＥからなる群から選択される１つ以上のプロテアーゼで切断される、請求項１６〜３８のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項４０】
前記活性化可能抗体が、式（ＸＸＩＸ）に従うアミノ酸配列：ＥＶＧＳＹＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＣＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＣＸ１３Ｘ１４ＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳ（配列番号１６４）を含み、式中、Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ２はＡ、Ｆ、Ｎ、Ｓ、またはＶであり、Ｘ３はＡ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、またはＹであり、Ｘ４はＡ、Ｈ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、またはＹであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｌ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ７はＤ、Ｐ、またはＶであり、Ｘ８はＡ、Ｄ、Ｈ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり、Ｘ９はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ１０はＬ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ１１はＦ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ１２はＡ、Ｐ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ１３はＡ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、Ｘ１４はＡ、Ｓ、またはＹである、請求項１６〜３９のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項４１】
前記活性化可能抗体が、配列番号１６５〜１７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１６〜４０のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項４２】
前記ＶＬが、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、請求項１６〜４１のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項４３】
前記ＶＬが、配列番号１００のアミノ酸配列、または前記配列番号１００のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６〜４２のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項４４】
前記ＶＨが、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、請求項１６〜４３のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項４５】
前記ＶＨが、配列番号８７のアミノ酸配列、または前記配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１６〜４４のいずれか一項に記載の活性化可能抗体。
【請求項４６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体または請求項１６〜４５のいずれか一項に記載の活性化可能抗体をコードする、ポリヌクレオチド。
【請求項４７】
配列番号１０８〜１３３からなる群から選択される配列を含む、ポリヌクレオチド。
【請求項４８】
請求項４６または請求項４７に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター。
【請求項４９】
前記ベクターが発現ベクター及び／または提示ベクターである、請求項４８に記載のベクター。
【請求項５０】
請求項４６〜４９のいずれか一項に記載のポリヌクレオチドまたはベクターを含む、宿主細胞。
【請求項５１】
前記宿主細胞が、真核細胞である、請求項５０に記載の宿主細胞。
【請求項５２】
前記宿主細胞が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項５０または請求項５１に記載の宿主細胞。
【請求項５３】
抗体または活性化可能抗体の作製方法であって、請求項５０〜５２のいずれか一項に記載の宿主細胞を前記抗体または活性化可能抗体の産生に好適な条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項５４】
前記細胞によって産生された前記抗体または活性化可能抗体を回収することをさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体または請求項１６〜４５のいずれか一項に記載の活性化可能抗体と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
【請求項５６】
がんの治療または進行の遅延を必要とする対象においてそれを行う方法であって、前記対象に有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体、請求項１６〜４５のいずれか一項に記載の活性化可能抗体、または請求項５５に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５７】
固形腫瘍のサイズの縮小を必要とする対象においてそれを縮小する方法であって、前記固形腫瘍が約４００〜１０００ｍｍ３のサイズを有し、前記対象に有効量の請求項１〜１５のいずれか一項に記載の抗体、請求項１６〜４５のいずれか一項に記載の活性化可能抗体、または請求項５５に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５８】
前記対象に有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、ウイルス遺伝子治療、免疫チェックポイント阻害剤、標的療法、放射線療法、ワクチン療法、及び化学療法からなる群から選択される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記少なくとも１つの追加の治療剤が、ポマリスト、レブラミド、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ＤＮＡアルキル化白金含有誘導体、シスプラチン、５−フルオロウラシル、シクロホスファミド、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＤＲ５抗体、抗ＣＤ１ｄ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＳＬＡＭＦ７抗体、抗ＫＩＲ受容体抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥｒｂＢ−２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、セツキシマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ペムブロリズマブ、放射線療法、単回放射線、分割放射線、焦点放射線、全臓器放射線、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＧＭ−ＣＳＦ、キメラ抗原受容体、養子移入Ｔ細胞、抗がんワクチン、及び腫瘍溶解性ウイルスからなる群から選択される、請求項５８または請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記方法が、前記対象に有効量の前記抗体、前記活性化可能抗体、または前記医薬組成物を手術前または手術後に投与して、前記対象における固形腫瘍を除去することを含む、請求項５６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、２０１８年２月２日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０７５０６４号の優先権の利益を主張するものである。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる：コンピュータ可読形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：６９５４０２０００５４１ＳＥＱＬＩＳＴ．ＴＸＴ、記録日：２０１９年２月１日、サイズ：１０２ＫＢ）。
【０００３】
本開示は、ヒト細胞傷害性Ｔリンパ球タンパク質４（ＣＴＬＡ４）に結合する交差反応性抗体、ヒトＣＴＬＡ４に結合する精度／状況依存性活性化可能抗体、それをコードする核酸、その医薬組成物、及びそれらの治療的使用に関する。
【背景技術】
【０００４】
ＣＴＬＡ４は、Ｔ細胞の活性化をダウンレギュレートし、免疫原性の恒常性を維持するように作用するタンパク質の免疫グロブリン（Ｉｇ）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＴＬＡ４のインビボ抗体媒介型遮断は、同系マウスの前立腺癌モデルにおいて抗がん免疫応答を増強することが示されている（Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ，９４（１５）：８０９９−１０３）。さらに、ＣＴＬＡ４機能の遮断は、腫瘍担持マウスにおける腫瘍増殖の様々な段階で抗腫瘍Ｔ細胞応答を増強することが示された（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ５７（１８）：４０３６−４１、Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９５（１７）：１００６７−７）。しかしながら、前臨床動物モデルからヒトの安全性への変換はしばしば不十分であるため、ヒトの使用に好適な抗体ベースの治療剤の開発は依然として困難である。したがって、動物モデル研究を可能にすると同時に好適なヒト治療候補を提供するために、ヒト及び実験動物（例えば、マウス、サル、ラットなど）のような異種間で交差反応性である抗ＣＴＬＡ４抗体に対する必要性が存在する。さらに、プロテアーゼに富む腫瘍微小環境などの特定の状況でのみ活性である、より安全な抗ＣＴＬＡ４抗体の開発に対する必要性が存在する。
【０００５】
特許出願、特許公報、非特許文献、及びＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＧｅｎＢａｎｋ受託番号を含む、本明細書に引用される全ての参考文献は、各個々の参考文献が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されているかのように、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００６】
上記及び他の必要性を満たすために、ヒトＣＴＬＡ４に結合する抗体（例えば、交差反応性抗体）、及びその抗原結合断片が本明細書に開示される。本開示の抗ＣＴＬＡ４抗体、またはその抗原結合断片は、以下の機能的特性：（ａ）ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４に５００ｎＭ以下のＫＤで結合する、（ｂ）ヒトＣＴＬＡ４に対してアンタゴニスト活性を有する、（ｃ）１００ｎＭまでの濃度でヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ９５、ＣＤ１２０ａ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、及び／またはＢ７−Ｈ４に結合しない、（ｄ）サル、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４と交差反応性である、（ｅ）（例えば、Ｔｒｅｇに対する）ＡＤＣＣ効果を誘導する、（ｆ）ヒトＰＢＭＣを活性化する（例えば、ＩＬ−２及び／またはＩＦＮγの分泌を刺激する）、（ｇ）腫瘍細胞の増殖を阻害し、腫瘍細胞に対する免疫記憶を確立することができる、（ｈ）がんに対する治療効果を有する、ならびに（ｉ）ヒトＣＴＬＡ４のヒトＣＤ８０及び／またヒトＣＤ８６への結合を遮断する、のうちの少なくとも１つ（例えば、１つ、いくつか、または全て）を保有した（以下の実施例１〜５を参照）。
【０００７】
活性型ではあるが不活性型ではない場合にヒトＣＴＬＡ４に結合する精度／状況依存性活性化可能抗体、すなわち、切断可能部分（ＣＭ）の切断後にのみＣＴＬＡ４に結合して（活性であり）マスキング部分（ＭＭ）を除去する活性化可能抗体が本明細書に開示される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の発見されたマスキング部分（ＭＭ）は、抗体活性を効率的にマスキングする、及び／または抗原結合を減少または完全に阻害することができる一方、いくつかの実施形態では、化学的に不安定な残基であるメチオニン及び／またはトリプトファンを欠いている。さらに、本明細書で特定及び説明されている活性化可能抗体は、それらの親抗体と同様に複数のがんの種類を治療するのに効率的であり、感受性動物（ＮＯＤマウス）における細胞傷害を有意に低減する。
【０００８】
したがって、一態様では、ヒトＣＴＬＡ４に結合し、カニクイザル、マウス、ラット、及びイヌからなる群から選択される少なくとも１種の非ヒト動物由来のＣＴＬＡ４ポリペプチドと交差反応性である、抗ＣＴＬＡ４抗体（例えば、ヒト抗体）が本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、抗体は、カニクイザルＣＴＬＡ４及びマウスＣＴＬＡ４に結合する。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４、カニクイザルＣＴＬＡ４、マウスＣＴＬＡ４、ラットＣＴＬＡ４、及び／またはイヌＣＴＬＡ４に、約３５０ｎＭ以下（例えば、約３００ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、または約１０ｎＭ以下）の解離定数（ＫＤ）で結合する。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定される。いくつかの実施形態では、抗体のＣＴＬＡ４への結合は、ＣＴＬＡ４発現細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導する。いくつかの実施形態では、抗体のＣＴＬＡ４への結合は、Ｔｒｅｇ細胞に対するＡＤＣＣを誘導する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体の結合は、ＣＴＬＡ４発現ヒト細胞またはヒトＴｒｅｇ細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し、抗ＣＴＬ４抗体のＡＤＣＣ活性はインビトロでのイピリムマブのＡＤＣＣ活性よりも高く、両方の抗体は野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体の結合は、ＣＴＬＡ４発現ヒト細胞またはヒトＴｒｅｇ細胞に対する抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を誘導し、抗ＣＴＬＡ４抗体のＡＤＣＣ活性はインビトロでのイピリムマブのＡＤＣＣ活性よりも２倍以上高く、両方の抗体は野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬ４抗体ＡＤＣＣ活性のＥＣ５０は、インビトロでのイピリムマブＡＤＣＣ活性のＥＣ５０の５０％以下である。ＡＤＣＣ活性を測定するためのアッセイは、実施例３及び１５に記載されている。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、マウスがんモデルにおけるＰＢＭＣまたは脾臓と比較して、腫瘍微小環境においてＴｒｅｇ細胞を選択的に枯渇させる（例えば、腫瘍浸潤リンパ球におけるＴｒｅｇ細胞の割合を減少させる）。例えば、実施例１８を参照されたい。
【０００９】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４のＣＤ８０及び／またはＣＤ８６結合部位などのヒトＣＴＬＡ４のリガンド結合部位でアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４のＣＤ８０及び／またはＣＤ８６結合部位などのヒトＣＴＬＡ４のリガンド結合部位に類似するエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４のアミノ酸残基Ｙ１０５及びＬ１０６を含むエピトープに特異的に結合し、アミノ酸残基の番号付けは配列番号２０７に従う。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４の残基Ｉ１０８に結合せず、アミノ酸残基の番号付けは、配列番号２０７に従う。いくつかの実施形態では、前記抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＣＤ８０及び／またはＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ４への結合を遮断する。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＣＤ８０及び／またはＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ４への結合を遮断するために、イピリムマブのＩＣ５０よりも高いＩＣ５０を有する。いくつかの実施形態では、ＣＤ８６またはＣＤ８０がプレート結合され、ＣＴＬＡ４が溶液中にあるか、またはＣＴＬＡ４が細胞表面上に提示されているアッセイにおいて、抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＣＤ８０及び／またはＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ４への結合を遮断するために、イピリムマブのＩＣ５０よりも３．５倍以上高い（３．９倍以上高い、を含む）ＩＣ５０を有する。実施例１３、表２３、図５７Ａ〜５７Ｄ及び図５８を参照されたい。抗体の遮断活性（リガンド競合）及びＩＣ５０を試験するためのアッセイは、実施例３及び１３に記載されている。
【００１０】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、抗体は重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、ａ）重鎖可変領域はＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＨＶＲ−Ｈ１は、式（Ｉ）：Ｘ１ＴＦＳＸ２ＹＸ３ＩＨＷＶ（配列番号１）（式中、Ｘ１はＦまたはＹであり、Ｘ２はＤまたはＧであり、Ｘ３はＡ、Ｇ、またはＷである）、式（ＩＩ）：ＹＳＩＸ１ＳＧＸ２Ｘ３ＷＸ４ＷＩ（配列番号２）（式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＨまたはＹであり、Ｘ３はＨまたはＹであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、またはＳである）、及び式（ＩＩＩ）：ＦＳＬＳＴＧＧＶＡＶＸ１ＷＩ（配列番号３）（式中、Ｘ１はＧまたはＳである）からなる群から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２が、式（ＩＶ）：ＩＧＸ１ＩＸ２ＨＳＧＳＴＹＹＳＸ３ＳＬＫＳＲＶ（配列番号４）（式中、Ｘ１はＤまたはＥであり、Ｘ２はＳまたはＹであり、Ｘ３はＰまたはＱである）、式（Ｖ）：ＩＧＸ１ＩＳＰＳＸ２ＧＸ３ＴＸ４ＹＡＱＫＦＱＧＲＶ（配列番号５）（式中、Ｘ１はＩまたはＷであり、Ｘ２はＧまたはＳであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＫまたはＮである）、及び式（ＶＩ）：ＶＳＸ１ＩＳＧＸ２ＧＸ３Ｘ４ＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦ（配列番号６）（式中、Ｘ１はＡ、Ｇ、またはＳであり、Ｘ２はＳまたはＹであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＳまたはＴである）からなる群から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ３が、式（ＶＩＩ）：ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＦＤＸ５（配列番号７）（式中、Ｘ１はＧ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ２はＡ、Ｉ、またはＹであり、Ｘ３はＤ、Ｖ、またはＹであり、Ｘ４はＡ、Ｅ、またはＹであり、Ｘ５はＩまたはＹである）、式（ＶＩＩＩ）：ＡＲＸ１ＧＸ２ＧＹＦＤＸ３（配列番号８）（式中、Ｘ１はＤまたはＬであり、Ｘ２はＦまたはＹであり、Ｘ３はＶまたはＹである）、式（ＩＸ）：ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ５Ｘ６ＦＤＹ（配列番号９）（式中、Ｘ１はＬまたはＲであり、Ｘ２はＩまたはＰであり、Ｘ３はＡまたはＹであり、Ｘ４はＳまたはＴであり、Ｘ５はＴまたはＹであり、Ｘ６はＡまたはＹである）、式（Ｘ）：ＡＲＤＸ１Ｘ２Ｘ３ＧＳＳＧＹＹＸ４ＧＦＤＸ５（配列番号１０）（式中、Ｘ１はＩまたはＶであり、Ｘ２はＡまたはＨであり、Ｘ３はＰまたはＳであり、Ｘ４はＤまたはＹであり、Ｘ５はＦまたはＶである）からなる群から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、ならびにｂ）軽鎖可変領域はＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、ＨＶＲ−Ｌ１が、式（ＸＩ）：ＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３ＳＸ４ＬＸ５（配列番号１１）（式中、Ｘ１はＧまたはＳであり、Ｘ２はＩまたはＶであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＳまたはＹであり、Ｘ５はＡまたはＮである）、式（ＸＩＩ）：ＲＡＳＱＸ１ＶＸ２Ｘ３ＲＸ４ＬＡ（配列番号１２）（式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＦ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＦまたはＹである）、及び式（ＸＩＩＩ）：ＲＡＳＸ１ＳＶＤＦＸ２ＧＸ３ＳＦＬＸ４（配列番号１３）（式中、Ｘ１はＥまたはＱであり、Ｘ２はＤ、Ｆ、Ｈ、またはＹであり、Ｘ３はＦ、Ｉ、またはＫであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、またはＨである）からなる群から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ２が、式（ＸＩＶ）：Ｘ１ＡＳＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＧＸ６（配列番号１４）（式中、Ｘ１はＡまたはＤであり、Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＴであり、Ｘ３はＬまたはＲであり、Ｘ４はＡ、Ｅ、またはＱであり、Ｘ５はＳまたはＴであり、Ｘ６はＩまたはＶである）に従うアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３が、式（ＸＶ）：ＹＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＰＸ７Ｔ（配列番号１５）（式中、Ｘ１はＥ、Ｑ、またはＶであり、Ｘ２はＨまたはＱであり、Ｘ３はＡ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ４はＤ、Ｌ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ５はＥ、Ｇ、Ｐ、Ｑ、またはＳであり、Ｘ６はＬ、Ｔ、Ｖ、またはＷであり、Ｘ７はＦ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、またはＹである）、式（ＸＶＩ）：ＹＣＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３ＷＰＰＷＴ（配列番号１６）（式中、Ｘ１はＳまたはＹであり、Ｘ２はＤまたはＹであり、Ｘ３はＱまたはＹである）、及び式（ＸＶＩＩ）：ＹＣＱＸ１ＹＸ２ＳＳＰＰＸ３ＹＴ（配列番号１７）（式中、Ｘ１はＨまたはＱであり、Ｘ２はＴまたはＶであり、Ｘ３はＥまたはＶである）からなる群から選択される式に従うアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＨＶＲ−Ｈ１は配列番号１８〜２９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２は配列番号３０〜３９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ３は配列番号４０〜５２からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ１は配列番号５３〜６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ２は配列番号６６〜６９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３は配列番号７０〜８１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ａ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｂ）配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｃ）配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｄ）配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｅ）配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｆ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｇ）配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｈ）配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｉ）配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｊ）配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｋ）配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、ｌ）配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３、またはｍ）配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、
配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、重鎖可変領域は配列番号８２〜９４からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み、及び／または軽鎖可変領域は配列番号９５〜１０７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、抗体は、ａ）配列番号８２のアミノ酸配列または配列番号８２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号９５のアミノ酸配列または配列番号９５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、ｂ）配列番号８３のアミノ酸配列または配列番号８３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号９６のアミノ酸配列または配列番号９６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、ｃ）配列番号８４のアミノ酸配列または配列番号８４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号９７のアミノ酸配列または配列番号９７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、ｄ）配列番号８５のアミノ酸配列または配列番号８５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号９８のアミノ酸配列または配列番号９８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、ｅ）配列番号８６のアミノ酸配列または配列番号８６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号９９のアミノ酸配列または配列番号９９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、ｆ）配列番号８７のアミノ酸配列または配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号１００のアミノ酸配列または配列番号１００のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、ｇ）配列番号８８のアミノ酸配列または配列番号８８のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号１０１のアミノ酸配列または配列番号１０１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、ｈ）配列番号８９のアミノ酸配列または配列番号８９のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号１０２のアミノ酸配列または配列番号１０２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、ｉ）配列番号９０のアミノ酸配列または配列番号９０のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号１０３のアミノ酸配列または配列番号１０３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、ｊ）配列番号９１のアミノ酸配列または配列番号９１のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号１０４のアミノ酸配列または配列番号１０４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、ｋ）配列番号９２のアミノ酸配列または配列番号９２のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号１０５のアミノ酸配列または配列番号１０５のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、ｌ）配列番号９３のアミノ酸配列または配列番号９３のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号１０６のアミノ酸配列または配列番号１０６のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域、またはｍ）配列番号９４のアミノ酸配列または配列番号９４のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む重鎖可変領域、及び配列番号１０７のアミノ酸配列または配列番号１０７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも約９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む軽鎖可変領域を含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、抗体の１、２、３、４、５、または６つのＨＶＲは、表Ａに示されるＨＶＲ配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域を含み、ＨＶＲ−Ｈ１が配列番号２３のアミノ酸配列を含むか、ＨＶＲ−Ｈ２が配列番号３５のアミノ酸配列を含むか、またはＨＶＲ−Ｈ３が配列番号４５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含み、ＨＶＲ−Ｌ１が配列番号５８のアミノ酸配列を含むか、ＨＶＲ−Ｌ２が配列番号６６のアミノ酸配列を含む抗体を含むか、またはＨＶＲ−Ｌ３が配列番号７５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗体のＨＶＲ−Ｈ２は、配列番号３５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、（ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体の１、２、３、４、５、または６つのＨＶＲは、ＨＶＲ中に１、２、または３つの保存的アミノ酸置換を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＣＴＬＡ４抗体は、（ｂ）配列番号８７のアミノ酸配列または配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号１００のアミノ酸配列または配列番号１００のアミノ酸配列対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００１２】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、抗体は抗体断片である。いくつかの実施形態では、断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、またはｓｃＦｖ断片である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＩｇＧ１またはＡＤＣＣ活性が強化されたバリアントを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、フコシル化が低減された（または非フコシル化）ヒトＩｇＧ１を含む。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。
【００１３】
本開示の他の態様は、ヒトＣＴＬＡ４への結合に関して、本明細書に記載される抗体のいずれかと競合または交差競合する抗体に関する。本明細書に記載される抗体のいずれかと同じエピトープ及び／または本質的に同じエピトープに結合する抗体もまた本明細書に提供される。
【００１４】
本開示の他の態様は、ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）、及び標的結合部分（ＴＢＭ）を含む第１のポリペプチド（ＭＭは、式（ＸＶＩＩＩ）：ＸｍＣＸｎＣＺｏ（配列番号１３４）に従うアミノ酸配列を含み、式中、ｍは２〜１０であり、ｎは３〜１０であり、ｏは１〜１０であり、各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、ＭＭは、ＣＭが切断されていない場合、活性化可能抗体のヒトＣＴＬＡ４への結合を阻害し、ＣＭは、少なくとも第１の切断部位を含み、ＴＢＭは、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む）、ならびにｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む第２のポリペプチド（活性化可能抗体は、ＣＭが切断されている場合、ＶＨ及びＶＬを介してヒトＣＴＬＡ４に結合する）を含む活性化可能抗体に関する。いくつかの実施形態では、ｍは３〜１０である。
【００１５】
本開示の他の態様は、ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）、及び標的結合部分（ＴＢＭ）を含むポリペプチド（ＭＭは、式（ＸＶＩＩＩ）：ＸｍＣＸｎＣＺｏ（配列番号１３４）に従うアミノ酸配列を含み、式中、ｍは２〜１０であり、ｎは３〜１０であり、ｏは１〜１０であり、各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、ＭＭは、ＣＭが切断されていない場合、活性化可能抗体のヒトＣＴＬＡ４への結合を阻害し、ＣＭは、少なくとも第１の切断部位を含み、ＴＢＭは、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む）、ならびにｂ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む第２のポリペプチド（活性化可能抗体は、ＣＭが切断されている場合、ＶＨ及びＶＬを介してヒトＣＴＬＡ４に結合する）を含む活性化可能抗体に関する。いくつかの実施形態では、ｍは３〜１０である。
【００１６】
本開示の他の態様は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）、及び標的結合部分（ＴＢＭ）を含むポリペプチドを含む活性化可能抗体に関し、ＭＭは、式（ＸＶＩＩＩ）：ＸｍＣＸｎＣＺｏ（配列番号１３４）に従うアミノ酸配列を含み、式中、ｍは２〜１０であり、ｎは３〜１０であり、ｏは１〜１０であり、各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、ＭＭは、ＣＭが切断されていない場合、活性化可能抗体のヒトＣＴＬＡ４への結合を阻害し、ＣＭは、少なくとも第１の切断部位を含み、ＴＢＭは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、活性化可能抗体は、ＣＭが切断されている場合、ＶＨ及びＶＬを介してヒトＣＴＬＡ４に結合する。いくつかの実施形態では、ｍは３〜１０である。
【００１７】
本開示の他の態様は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）、及び標的結合部分（ＴＢＭ）を含むポリペプチドを含む活性化可能抗体に関し、ＭＭは、式（ＸＶＩＩＩ）：ＸｍＣＸｎＣＺｏ（配列番号１３４）に従うアミノ酸配列を含み、式中、ｍは２〜１０であり、ｎは３〜１０であり、ｏは１〜１０であり、各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、ＭＭは、ＣＭが切断されていない場合、活性化可能抗体のヒトＣＴＬＡ４への結合を阻害し、ＣＭは、少なくとも第１の切断部位を含み、ＴＢＭは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、活性化可能抗体は、ＣＭが切断されている場合、ＶＨ及びＶＬを介してヒトＣＴＬＡ４に結合する。
【００１８】
上記の活性化可能抗体のいずれか１つに従ういくつかの実施形態では、ｍは２、３、４、５、または６である。いくつかの実施形態では、ｍは６である。いくつかの実施形態では、ｎは６〜８である。いくつかの実施形態では、ｎは６である。いくつかの実施形態では、ｏは１〜２である。いくつかの実施形態では、ｏは２である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、各Ｘは、Ｍ、Ｗ、またはＣではない。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、式（ＸＶＩＩＩ）のＸｍの各Ｘは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、式（ＸＶＩＩＩ）のＸｎの各Ｘは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＸｍＣＰＤＨＰＹＰＣＸＸ（配列番号１８１）、ＸｍＣＤＡＦＹＰＹＣＸＸ（配列番号１８２）、ＸｍＣＤＳＨＹＰＹＣＸＸ（配列番号１８３）、及びＸｍＣＶＰＹＹＹＡＣＸＸ（配列番号１８４）からなる群から選択されるアミノ酸を含み、ｍは２〜１０であり、各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、各Ｘは、Ｍ、Ｗ、またはＣではない。いくつかの実施形態では、各Ｘは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、配列番号１４１〜１４７から選択されるアミノ酸配列を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ＭＭは、そのＮ末端に、追加のアミノ酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、配列番号１４８のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、第１の切断部位は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、プラスミン、トロンビン、第Ｘ因子、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、カテプシンＤ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、カスパーゼ−１４、及びＴＡＣＥからなる群から選択されるプロテアーゼのプロテアーゼ切断部位である。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ＣＭは、第１の切断部位のＣ末端に第１のリンカー（Ｌ１）をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｌ１は、配列番号１５６〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ＣＭは、第２の切断部位をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の切断部位は、Ｌ１のＣ末端にある。いくつかの実施形態では、第２の切断部位は、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、プラスミン、トロンビン、第Ｘ因子、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、カテプシンＤ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、カスパーゼ−１４、及びＴＡＣＥからなる群から選択されるプロテアーゼのプロテアーゼ切断部位である。いくつかの実施形態では、第１及び第２の切断部位は異なる。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ＣＭは、第２の切断部位のＣ末端に第２のリンカー（Ｌ２）をさらに含む。いくつかの実施形態では、Ｌ２は、配列番号１５６〜１６３からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ＣＭは、第１の切断部位のＮ末端に第３のリンカー（Ｌ３）をさらに含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ＣＭは少なくとも第１のプロテアーゼ切断部位を含み、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１（ＭＭＰ−１）、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１４、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、プラスミン、トロンビン、第Ｘ因子、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、カテプシンＤ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、カスパーゼ−１４、及びＴＡＣＥからなる群から選択される１つ以上のプロテアーゼで切断される。
【００２０】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、式（ＸＸＩＸ）：ＥＶＧＳＹＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＣＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＣＸ１３Ｘ１４ＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳ（配列番号１６４）に従うアミノ酸配列を含むマスキング部分（ＭＭ）及び切断可能部分（ＣＭ）を含み、式中、Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ２はＡ、Ｆ、Ｎ、Ｓ、またはＶであり、Ｘ３はＡ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、またはＹであり、Ｘ４はＡ、Ｈ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、またはＹであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｌ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ７はＤ、Ｐ、またはＶであり、Ｘ８はＡ、Ｄ、Ｈ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり、Ｘ９はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ１０はＬ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ１１はＦ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ１２はＡ、Ｐ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ１３はＡ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、Ｘ１４はＡ、Ｓ、またはＹである。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、活性化可能抗体は配列番号１６５〜１７９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００２１】
先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ＶＬは配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ＶＬは、配列番号１００のアミノ酸配列、または配列番号１００のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ＶＨは配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む。先行する実施形態のいずれかと組み合わせることができるいくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号８７のアミノ酸配列、または配列番号８７のアミノ酸配列に対して少なくとも約９０％（例えば、少なくとも９２％、９５％、９８％、９９％以上）の配列同一性を有するそのバリアントを含む。
【００２２】
本開示の他の態様は、抗体のいずれかを含む医薬組成物、及び／または本明細書に記載される活性化可能抗体及び薬学的に許容される担体に関する。
【００２３】
本開示の他の態様は、本明細書に記載の任意の抗体及び／または活性化可能抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１０８〜１３３から選択される配列を含む。
【００２４】
本開示の他の態様は、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチドを含むベクターに関する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクター及び／または提示ベクターである。
【００２５】
本開示の他の態様は、本明細書に記載の任意のポリヌクレオチド及び／またはベクターを含む宿主細胞に関する。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、真核生物である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。
【００２６】
本開示の他の態様は、本明細書に記載の宿主細胞のいずれかを、抗体または活性化可能抗体の産生に好適な条件下で培養することを含む、抗体または活性化可能抗体の作製方法に関する。いくつかの実施形態では、方法は、細胞によって産生された抗体または活性化可能抗体を回収することをさらに含む。
【００２７】
本開示の他の態様は、がんの治療または進行の遅延を必要とする対象においてそれを行う方法に関し、方法は対象に有効量の本明細書に記載の抗体、活性化可能抗体、及び／または医薬組成物のいずれかを投与することを含む。いくつかの実施形態では、がんは、肝臓癌、消化器系のがん（例えば、結腸癌、結腸直腸癌）、肺癌、骨癌、心臓癌、脳癌、腎臓癌、膀胱癌、血液癌（例えば、白血病）、皮膚癌、乳癌、甲状腺癌、膵臓癌、頭頸部癌、眼に関連するがん、男性生殖器系のがん（例えば、前立腺癌、精巣癌）、または女性生殖器系のがん（例えば、子宮癌、子宮頸癌）である。本開示の他の態様は、固形腫瘍のサイズの縮小を必要とする対象においてそれを縮小する方法に関し、固形腫瘍は約４００〜１０００ｍｍ３のサイズを有し、方法は対象に有効量の本明細書に記載の抗体、活性化可能抗体、及び／または医薬組成物のいずれかを投与することを含む。いくつかの実施形態では、固形腫瘍は、約４００〜８００ｍｍ３のサイズを有する。いくつかの実施形態では、方法は、対象に有効量の少なくとも１つの追加の治療剤を投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、ウイルス遺伝子治療、免疫チェックポイント阻害剤、標的療法、放射線療法、ワクチン療法、及び化学療法からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの追加の治療剤は、ポマリスト、レブラミド、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ＤＮＡアルキル化白金含有誘導体、シスプラチン、５−フルオロウラシル、シクロホスファミド、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＤＲ５抗体、抗ＣＤ１ｄ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、ＳＬＡＭＦ７抗体、抗ＫＩＲ受容体抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥｒｂＢ−２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、セツキシマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ペムブロリズマブ、放射線療法、単回放射線、分割放射線、焦点放射線、全臓器放射線、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＧＭ−ＣＳＦ、キメラ抗原受容体、養子移入Ｔ細胞、抗がんワクチン、及び腫瘍溶解性ウイルスからなる群から選択される。いくつかの実施形態では、方法は、対象に有効量の本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体、活性化可能抗体、または医薬組成物を手術前または手術後に投与して、対象における腫瘍を除去することを含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１３７抗体は、アミノ酸配列ＦＳＬＳＴＧＧＶＧＶＧＷＩ（配列番号２２３）を含むＨＶＲ−Ｈ１、アミノ酸配列ＬＡＬＩＤＷＡＤＤＫＹＹＳＰＳＬＫＳＲＬ（配列番号２２４）を含むＨＶＲ−Ｈ２、及びアミノ酸配列ＡＲＧＧＳＤＴＶＩＧＤＷＦＡＹ（配列番号２２５）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体重鎖可変領域、ならびにアミノ酸配列ＲＡＳＱＳＩＧＳＹＬＡ（配列番号２２６）を含むＨＶＲ−Ｌ１、アミノ酸配列ＤＡＳＮＬＥＴＧＶ（配列番号２２７）を含むＨＶＲ−Ｌ２、及びアミノ酸配列ＹＣＱＱＧＹＹＬＷＴ（配列番号２２８）を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＣＤ１３７抗体は、配列番号２２９のアミノ酸配列もしくは配列番号２２９の配列に対して少なくとも９０％（例えば、９１���、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）を有する配列を含む抗体重鎖可変領域、及び／または配列番号２３０のアミノ酸配列もしくは配列番号２３０の配列対して少なくとも９０％（例えば、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）を有する配列を含む抗体軽鎖可変領域を含む。
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【００２８】
上記及び本明細書において説明される様々な実施形態の特性のうちの１つ、いくつか、または全ては、組み合わされて本開示の他の実施形態を形成し得ることが理解されるべきである。本開示のこれらの及び他の態様は、当業者に明らかになるであろう。本開示のこれらの及び他の実施形態は、後続の発明を実施するための形態によってさらに説明される。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】ＥＬＩＳＡによって決定された、ＣＴＬＡ４への抗体結合を示す。Ａは、示された抗体のヒトＣＴＬＡ４への結合を示す。Ｂは、示された抗体のイヌＣＴＬＡ４への結合を示す。
【図２】フローサイトメトリーによって決定された、空のベクター（ｐＩＲＥＳ）、またはマウスもしくはヒトＣＴＬＡ４を一時的に過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対する、示された抗体、アイソタイプ対照、またはビヒクル（ＰＢＳＡ）の種交差反応性を示す。
【図３】フローサイトメトリーによって決定された、活性化されたヒト、サル、及びマウスＴ細胞への抗体ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照の結合を示す。
【図４Ａ】フローサイトメトリーによって決定された、ＣＴＬＡ４に対する抗体特異性を示す。示された抗体またはアイソタイプ対照の、ヒトＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ３、または空のベクター（２９３Ｆ）を一時的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞への結合を示す。
【図４Ｂ】フローサイトメトリーによって決定された、ＣＴＬＡ４に対する抗体特異性を示す。示された抗体、アイソタイプ対照、またはビヒクル（ＰＢＳＡ）の、ヒトＣＤ９５、ＣＤ１２０ａ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＣＴＬＡ４、または空のベクター（ｐＩＲＥＳ）を一時的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞への結合を示す。
【図４Ｃ】フローサイトメトリーによって決定された、ＣＴＬＡ４に対する抗体特異性を示す。示された抗体、アイソタイプ対照、またはビヒクル（ＰＢＳＡ）の、ヒトＴＩＭ３、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−Ｌ１、ＬＡＧ３、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＰＤ−Ｌ２、ＩＣＯＳ、Ｂ７−Ｈ４、ＰＤ−１、Ｂ７−Ｈ３、または空のベクター（ｐＩＲＥＳ）を一時的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞への結合を示す。
【図５Ａ】ＥＬＩＳＡによって決定された、抗体の遮断能力を示す。抗体ＴＹ２１６８７、ＴＹ２１６８９、ＴＹ２１６８０、及びＴＹ２１６９１の、ヒトＣＴＬＡ４へのヒトＣＤ８０の結合を遮断する能力を示す。
【図５Ｂ】ＥＬＩＳＡによって決定された、抗体の遮断能力を示す。抗体ＴＡＣ２１１４、ＴＹ２１５８５、ＴＹ２１５８７、ＴＹ２１５８８、ＴＹ２１５８９、ＴＹ２１５８０、及びＴＹ２１５９１の、ヒトＣＴＬＡ４へのヒトＣＤ８０の結合を遮断する能力を示す。
【図５Ｃ】ＥＬＩＳＡによって決定された、抗体の遮断能力を示す。抗体ＴＹ２１６８７、ＴＹ２１６８９、ＴＹ２１６８０、及びＴＹ２１６９１の、ヒトＣＴＬＡ４へのヒトＣＤ８６の結合を遮断する能力を示す。
【図５Ｄ】ＥＬＩＳＡによって決定された、抗体の遮断能力を示す。抗体ＴＡＣ２１１４、ＴＹ２１５８５、ＴＹ２１５８７、ＴＹ２１５８８、ＴＹ２１５８９、ＴＹ２１５８０、及びＴＹ２１５９１の、ヒトＣＴＬＡ４へのヒトＣＤ８６の結合を遮断する能力を示す。
【図６】ＦＡＣＳによって決定された、抗体の遮断能力を示す。Ａは、示された抗体、アイソタイプ対照、またはビヒクル（ＰＢＳＡ）の、ヒトＣＴＬＡ４を一時的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞へのヒトＣＤ８０の結合を遮断する能力を示す。Ｂは、示された抗体、アイソタイプ対照、またはビヒクル（ＰＢＳＡ）の、ヒトＣＴＬＡ４を一時的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞へのヒトＣＤ８６の結合を遮断する能力を示す。
【図７】表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって決定された、示された抗体のＦｃＲｎに結合する能力を示す。
【図８】ＥＬＩＳＡによって測定された、抗体ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照によるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の活性化を示す。Ａは、抗体ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照で処理されたＣＤ３刺激ヒトＰＢＭＣからのＩＬ−２分泌に対する効果を示す。Ｂは、抗体ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照で処理されたＣＤ３刺激ヒトＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌に対する効果を示す。
【図９】ＥＬＩＳＡによって測定された、抗ＣＤ３抗体の存在下または非存在下における抗体ＴＹ２１５８０で処理されたヒトＰＢＭＣからのＩＬ−２分泌に対する効果を示す。
【図１０】ＥＬＩＳＡによって測定された、抗体ＴＹ２１５８０、アイソタイプ対照、または抗ＰＤ−１抗体で処理された同種異系ＣＤ４＋Ｔ細胞と共培養されたヒト樹状細胞（ＤＣ）からのＩＦＮγ分泌に対する効果を示す。
【図１１】乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）放出アッセイによって決定された、ヒトＣＴＬＡ４を一次的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対する例示的な抗体の抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す。Ａは、ヒトＣＴＬＡ４を一時的に過剰発現し、ヒトナチュラルキラー（ＮＫ）細胞とインキュベートしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対する抗体ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照のＡＤＣＣ活性を示す。Ｂは、ヒトＣＴＬＡ４を一次的に過剰発現し、ヒトＮＫ細胞とインキュベートしたＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対する抗体ＴＹ２１５８０、ＴＡＣ２１１４、またはアイソタイプ対照のＡＤＣＣ活性を示す。
【図１２】カルセインＡＭ放出アッセイによって決定された、２人のドナーから単離されたヒトＴｒｅｇに対する例示的な抗体のＡＤＣＣ活性を示す。Ａは、ヒトＮＫ細胞でインキュベートされたヒトＴｒｅｇ細胞（ドナー＃９６由来）に対する抗体ＴＹ２１５８０、ＴＡＣ２１１４、またはアイソタイプ対照のＡＤＣＣ活性を示す。Ｂは、ヒトＮＫ細胞でインキュベートされたヒトＴｒｅｇ細胞（ドナー＃１２由来）に対する抗体ＴＹ２１５８０、ＴＡＣ２１１４、またはアイソタイプ対照のＡＤＣＣ活性を示す。
【図１３】カルセインＡＭ放出アッセイによって決定された、ヒトＣＴＬＡ４を一時的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対する抗体ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照の補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）活性を示す。
【図１４】カルセインＡＭ放出アッセイによって決定された、活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞に対する抗体ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照のＣＤＣ活性を示す。
【図１５】ＭＣ３８同系マウス結腸直腸腫瘍モデルにおける抗体ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照のインビボ抗腫瘍効果を示す。Ａは、異なる治療群の雌のＭＣ３８型腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。データポイントは群平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。Ｂは、試験された各群の個々の腫瘍増殖曲線を示す。Ｃは、ＭＣ３８腫瘍細胞に対する長期持続性の免疫記憶を示す再投与試験の研究を示す。
【図１６】ＣＴ２６同系マウス結腸直腸腫瘍モデルにおける抗体ＴＹ２１５８０、またはアイソタイプ対照のインビボ抗腫瘍効果を示す。異なる治療群の雌のＣＴ２６型腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。データポイントは群平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図１７】Ｈ２２同系マウス肝臓腫瘍モデルにおける抗体ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１５８０、またはアイソタイプ対照のインビボ抗腫瘍効果を示す。異なる治療群の雌のＨ２２型腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。データポイントは群平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図１８】Ｌｅｗｉｓ同系マウス肺腫瘍モデルにおける抗体ＴＹ２１５８０、ＴＹ２１６８７、ＴＹ２１６８７、ＴＹ２１６９１及びＴＹ２１５８０、またはアイソタイプ対照のインビボ抗腫瘍効果を示す。異なる治療群の雌のＬｅｗｉｓ型腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。データポイントは群平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図１９】ＰＡＮ０２同系マウス膵臓腫瘍モデルにおける抗体ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照のインビボ抗腫瘍効果を示す。異なる治療群の雌のＰＡＮ０２型腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。データポイントは群平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図２０】３ＬＬ同系マウス肺腫瘍モデルにおける抗体ＴＹ２１５８０、抗ＣＤ１３７抗体、またはアイソタイプ対照の単剤療法、ならびにＴＹ２１５８０＋抗ＣＤ１３７併用療法のインビボ抗腫瘍効果を示す。Ａは、異なる治療群の雌の３ＬＬ型腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。データポイントは群平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。Ｂは、試験された各群の個々の腫瘍増殖曲線を示す。
【図２１】Ｈ２２マウス肝臓腫瘍細胞に対する長期持続性の免疫記憶を示す再投与試験の研究を示す。ＴＹ２１５８０治療群で完全応答が見られたマウスを、５９日目に反対側の脇腹でＨ２２腫瘍細胞を皮下再投与試験した。未処置のマウスにもＨ２２腫瘍細胞を同時に接種した。
【図２２】ＥＬＩＳＡによって決定された、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに１０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈内投与された示された抗体の血中濃度のタイムコースを示す。
【図２３】ＥＬＩＳＡによって決定された、カニクイザルに１０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈内投与された示された抗体の血中濃度のタイムコースを示す。
【図２４】ＥＬＩＳＡによって決定された、カニクイザルに１０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈内投与された示された抗体の、これらのサルにおける抗薬物抗体（ＡＤＡ）の出現と比較した血中濃度のタイムコースを示す。
【図２５】抗体ＴＹ２１５８０またはビヒクル対照のいずれかを反復腹腔内投与した後の雄及び雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの平均脾臓重量を示す。Ａは、１、４、７、及び１１日目に抗体ＴＹ２１５８０またはビヒクル対照のいずれかを反復腹腔内投与した後の、雄のＢＡＬＢ／ｃマウスの平均脾臓重量を示す。Ｂは、１、４、７、及び１１日目に抗体ＴＹ２１５８０またはビヒクル対照のいずれかを反復腹腔内投与した後の、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスの平均脾臓重量を示す。
【図２６】１、４、７、及び１１日目に抗体ＴＹ２１５８０またはビヒクル対照のいずれかを反復腹腔内投与した後の、ＢＡＬＢ／ｃマウスの病理組織学を示す。
【図２７】高濃度で保存した後の例示的な抗体の安定性を示す。Ａは、１００ｍｇ／ｍＬ超で保存した後の抗体ＴＹ２１５８６のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。Ｂは、１００ｍｇ／ｍＬ超で保存した後の抗体ＴＹ２１５８０のＳＥＣプロファイルを示す。
【図２８】加速ストレス条件下での例示的な抗体のＳＥＣプロファイルを示す。
【図２９】酵母表面上に提示された抗ＣＴＬＡ４抗体のＦａｂ断片を使用する自己遮断ペプチドの選択プロセスの概略図を示す。
【図３０】酵母表面上に提示された抗ＣＴＬＡ４抗体のｓｃＦｖ断片を使用する自己遮断ペプチドの選択プロセスの概略図を示す。
【図３１】フローサイトメトリーによって決定された、酵母上のＣＴＬＡ４を標的化するＦａｂ及びｓｃＦｖの機能的提示を示す。Ａは、酵母の表面上のＣＴＬＡ４を標的化するＦａｂの機能的提示を示す。Ｂは、酵母の表面上のＣＴＬＡ４を標的化するｓｃＦｖの機能的提示を示す。
【図３２】ヒトＣＴＬＡ４を標的化する活性化可能抗体の例示的な選択プロセスを示す。融合タンパク質を提示する酵母ライブラリーを、数ラウンドのＦＡＣＳベースのスクリーニングに供した。
【図３３】フローサイトメトリーによって決定された、例示的なＣＴＬＡ４活性化可能抗体クローンのＣＴＬＡ４結合親和性を示す。Ａは、マスキングペプチドを有さない標的抗体のｓｃＦｖ断片と比較した、無傷のマスキングペプチドを有するか、またはＴＥＶプロテアーゼによって切断されたマスキングペプチドを有するＣＴＬＡ４活性化可能抗体クローンＢ１３２８７を含むｓｃＦｖフォーマットにおける、ＣＴＬＡ４活性化可能抗体クローンの結合親和性を示す。Ｂは、マスキングペプチドを有さない標的抗体のＦａｂ断片と比較した、無傷のマスキングペプチドを有するか、またはＴＥＶプロテアーゼによって切断されたマスキングペプチドを有するＣＴＬＡ４活性化可能抗体クローンＢ１３１８９を含むＦａｂフォーマットにおける、ＣＴＬＡ４活性化可能抗体クローンのＣＴＬＡ４結合親和性を示す。
【図３４】親抗体ＴＹ２１５８０と比較した、例示的なＣＴＬＡ４活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０３、ＴＹ２２４０２、及びＴＹ２２４０４のマスキング効率を示す。Ａは、ＦｏｒｔｅＢｉｏシステムによって決定された、親抗体ＴＹ２１５８０と比較した、示された活性化可能抗体の会合及び解離曲線を示す。Ｂは、親抗体ＴＹ２１５８０と比較した、結合された活性化可能抗体の相対比のグラフを示す。
【図３５】ＥＬＩＳＡによって決定された、組換えヒトＣＴＬＡ４−Ｆｃに対する例示的なＣＴＬＡ４活性化可能抗体のマスキング効率を示す。Ａは、親抗体ＴＹ２１５８０と比較した、ＣＴＬＡ４活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、ＴＹ２２４０３、ＴＹ２２４０４の組換えヒトＣＴＬＡ４−Ｆｃへの結合を示すＥＬＩＳＡデータの第１のバッチを示す。Ｂは、親抗体ＴＹ２１５８０と比較した、ＣＴＬＡ４活性化可能抗体ＴＹ２２５６３、ＴＹ２２５６４、ＴＹ２２５６５、ＴＹ２２５６６の組換えヒトＣＴＬＡ４−Ｆｃへの結合を示す。
【図３６】マスキングペプチドを除去した際のＣＴＬＡ４活性化可能抗体ＴＹ２２４０４の活性を示す。Ａは、無処理、プロテアーゼｕＰＡで処理された、または５もしくは１０ユニットのプロテアーゼＭＭＰ−９で処理された活性化可能抗体ＴＹ２２４０４のＳＤＳ−ＰＡＧＥ結果を示す。Ｂは、ＥＬＩＳＡによって決定された、親抗体ＴＹ２１５８０と比較した、無処理、プロテアーゼｕＰＡで処理された、またはプロテアーゼＭＭＰ−９で処理された活性化可能抗体ＴＹ２２４０４の結合を示す。
【図３７】加速ストレス条件下での例示的な活性化可能抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。Ａは、対照条件と比較した、６サイクルの凍結融解後の活性化可能抗体ＴＹ２２４０２のＳＥＣプロファイルを示す。Ｂは、対照条件と比較した、５０℃で７日後の活性化可能抗体ＴＹ２２４０２のＳＥＣプロファイルを示す。Ｃは、対照条件と比較した、５０℃で７日後、４０℃で最長２８日間の保存後、または６サイクルの凍結融解後の例示的な活性化可能抗体のＳＥＣメインピーク面積のパーセンテージを示す。
【図３８】約８ｍｇ／ｍＬまたは１５０ｍｇ／ｍＬ超で保存した後の活性化可能抗体ＴＹ２２４０１及びＴＹ２２４０２のＳＥＣメインピーク面積のパーセンテージを示す。
【図３９】ＦｏｒｔｅＢｉｏシステムによって決定された、ｐＨ３．７で３０分間インキュベートされた、またはｐＨ３．７で１時間インキュベートされた、未処理の活性化可能抗体ＴＹ２１５８０、ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、及びＴＹ２２５６６のマスキング効率を示す。
【図４０】ＥＬＩＳＡによって測定された、アイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、または例示的なＣＴＬＡ４活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、もしくはＴＹ２２４０４によるヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）活性化を示す。Ａは、アイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、及び例示的なＣＴＬＡ４活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、またはＴＹ２２４０４で刺激された、ＣＤ３で初回刺激を受けたヒトＰＢＭＣからのＩＬ−２分泌に対する効果を示す。Ｂは、アイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、及び例示的なＣＴＬＡ４活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、またはＴＹ２２４０４で刺激された、ＣＤ３で初回刺激を受けたヒトＰＢＭＣからのＩＦＮγ分泌に対する効果を示す。
【図４１】ＡＤＣＣレポーター遺伝子アッセイによって決定された、アイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、または例示的な活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２１５８０、もしくはＴＹ２２４０４の、ヒトＣＴＬＡ４を一時的に過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞に対する抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を示す。
【図４２】ＭＣ３８同系マウス結腸直腸腫瘍モデルにおける親抗体ＴＹ２１５８０、アイソタイプ対照抗体、または例示的なＣＴＬＡ４活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、もしくはＴＹ２２５６６のインビボ抗腫瘍効果を示す。Ａは、異なる治療群の雌のＭＣ３８型腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。データポイントは群平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。Ｂは、ＴＹ２１５８０、ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、及びＴＹ２２５６６で治療された群の個々の腫瘍増殖曲線を示す。
【図４３】ＣＴ２６同系マウス結腸直腸腫瘍モデルにおけるアイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、または３つの活性化可能抗体のうちの１つのインビボ抗腫瘍効果を示す。異なる治療群の雌のＣＴ２６型腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。データポイントは群平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図４４】Ｈ２２同系マウス肝臓腫瘍モデルにおけるアイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、または３つの活性化可能抗体のうちの１つのインビボ抗腫瘍効果を示す。異なる治療群の雌のＨ２２型腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。データポイントは群平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。
【図４５】３ＬＬ同系マウス肺腫瘍モデルにおける親抗体ＴＹ２１５８０、アイソタイプ対照抗体、及び例示的な活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、またはＴＹ２２５６６のインビボ抗腫瘍効果を示す。Ａは、異なる治療群の雌の３ＬＬ型腫瘍担持Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腫瘍増殖曲線を示す。データポイントは群平均値を表し、エラーバーはＳＥＭを表す。Ｂは、ＴＹ２１５８０、ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、及びＴＹ２２５６６で治療された群の個々の腫瘍増殖曲線を示す。
【図４６】雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに１０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈内投与された試験品（ＴＡ）の、ＥＬＩＳＡによって決定された血中濃度のタイムコースを示す。Ａは、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに１０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈内投与された活性化可能抗体ＴＹ２２４０１の、親抗体ＴＹ２１５８０と比較した血中濃度のタイムコースを示す。Ｂは、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに１０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈内投与された活性化可能抗体ＴＹ２２４０２の、親抗体ＴＹ２１５８０と比較した血中濃度のタイムコースを示す。Ｃは、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスに１０ｍｇ／ｋｇの濃度で静脈内投与された活性化可能抗体ＴＹ２２４０４の、親抗体ＴＹ２１５８０と比較した血中濃度のタイムコースを示す。
【図４７】ＮＯＤマウスモデルを使用した、アイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、ならびに例示的な活性化可能抗体ＴＹ２２５６６、ＴＹ２２４０１、及びＴＹ２２４０２の反復投与毒性を示す。２０日間の生存率のパーセントを、各治療群について示した。
【図４８Ａ】示された活性化可能抗体を反復腹腔内投与した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの平均脾臓重量を示す。１、４、７、及び１１日目に、活性化可能抗体ＴＹ２２４０２、親抗体ＴＹ２１５８０、またはアイソタイプ対照を反復腹腔内投与した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの平均脾臓重量を示す。
【図４８Ｂ】示された活性化可能抗体を反復腹腔内投与した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの平均脾臓重量を示す。１、４、７、及び１１日目に、活性化可能抗体ＴＹ２２５６６、親抗体ＴＹ２１５８０、またはアイソタイプ対照を反復腹腔内投与した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの平均脾臓重量を示す。
【図４８Ｃ】示された活性化可能抗体を反復腹腔内投与した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの平均脾臓重量を示す。１、４、７、及び１１日目に、活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、親抗体ＴＹ２１５８０、またはアイソタイプ対照を反復腹腔内投与した後のＢＡＬＢ／ｃマウスの平均脾臓重量を示す。
【図４９】対照条件と比較した、５０℃で７日後の示された活性化可能抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。
【図５０】対照条件と比較した、４０℃で７、１４、２１、または２８日間保存した後の示された活性化可能抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。
【図５１】対照条件と比較した、６サイクルの凍結融解後の示された活性化可能抗体のサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）プロファイルを示す。
【図５２】１１５ｍｇ／ｍＬ超で保存した後の示された活性化可能抗体のＳＥＣメインピーク比のパーセンテージを示す。
【図５３】安定性データの概要を示す。
【図５４】ヒトＣＴＬＡ４と、ＣＤ８０、ＣＤ８６、またはイピリムマブのうちの１つ（２つの結晶構造に基づく）との間に接触残基がマッピングされた、ヒトＣＴＬＡ４及びマウスＣＴＬＡ４の一部分の複数配列アライメントを示す。接触アミノ酸を灰色で網掛けし、主要な接触アミノ酸を太枠で示し、二量体界面アミノ酸を点で示し、マウスＣＴＬＡ４とヒトＣＴＬＡ４との間で異なるアミノ酸を下線及び太字で示す。示された配列は、上から下に、配列番号２０３〜２０８によって表される。
【図５５】Ａは、ヒトＣＴＬＡ４とそのリガンドＣＤ８０との間の相互作用を示す。Ｂは、ヒトＣＴＬＡ４とそのリガンドＣＤ８６との間の相互作用を示す。Ｃは、ヒトＣＴＬＡ４とマウスＣＴＬＡ４との間の構造アラインメントを示す。ヒトＣＴＬＡ４を黒、マウスＣＴＬＡ４を白に着色した。
【図５６Ａ】フローサイトメトリーによる、ＴＹ２１５８０（Ａ）、イピリムマブ（Ｂ）、ヒトＣＤ８０（Ｃ）、ヒトＣＤ８６（Ｄ）、及びマウスＣＤ８６（Ｅ）の、ヒトＣＴＬＡ４、マウスＣＴＬＡ４、及びＣＴＬＡ４変異体への結合能力を示す、エピトープマッピング実験からの結果を示す。
【図５６Ｂ】フローサイトメトリーによる、ＴＹ２１５８０（Ａ）、イピリムマブ（Ｂ）、ヒトＣＤ８０（Ｃ）、ヒトＣＤ８６（Ｄ）、及びマウスＣＤ８６（Ｅ）の、ヒトＣＴＬＡ４、マウスＣＴＬＡ４、及びＣＴＬＡ４変異体への結合能力を示す、エピトープマッピング実験からの結果を示す。
【図５６Ｃ】フローサイトメトリーによる、ＴＹ２１５８０（Ａ）、イピリムマブ（Ｂ）、ヒトＣＤ８０（Ｃ）、ヒトＣＤ８６（Ｄ）、及びマウスＣＤ８６（Ｅ）の、ヒトＣＴＬＡ４、マウスＣＴＬＡ４、及びＣＴＬＡ４変異体への結合能力を示す、エピトープマッピング実験からの結果を示す。
【図５６Ｄ】フローサイトメトリーによる、ＴＹ２１５８０（Ａ）、イピリムマブ（Ｂ）、ヒトＣＤ８０（Ｃ）、ヒトＣＤ８６（Ｄ）、及びマウスＣＤ８６（Ｅ）の、ヒトＣＴＬＡ４、マウスＣＴＬＡ４、及びＣＴＬＡ４変異体への結合能力を示す、エピトープマッピング実験からの結果を示す。
【図５６Ｅ】フローサイトメトリーによる、ＴＹ２１５８０（Ａ）、イピリムマブ（Ｂ）、ヒトＣＤ８０（Ｃ）、ヒトＣＤ８６（Ｄ）、及びマウスＣＤ８６（Ｅ）の、ヒトＣＴＬＡ４、マウスＣＴＬＡ４、及びＣＴＬＡ４変異体への結合能力を示す、エピトープマッピング実験からの結果を示す。
【図５７】ヒトＣＴＬＡ４とＣＤ８０またはＣＤ８６との間の受容体−リガンド結合遮断に対するＴＹ２１５８０及びイピリムマブの効果を示す。Ａ及びＢは、ＥＬＩＳＡによって測定された、ＴＹ２１５８０、イピリムマブ、またはアイソタイプ対照抗体の段階希釈の存在下におけるヒトＣＤ８０（Ａ）またはＣＤ８６（Ｂ）のプレート結合ヒト組換えＣＴＬＡ４タンパク質への結合曲線を示す。Ｃ〜Ｄは、ＥＬＩＳＡによって測定された、ＴＹ２１５８０、イピリムマブ、またはアイソタイプ対照抗体の段階希釈の存在下におけるヒト組換えＣＴＬＡ４タンパク質のプレート結合ヒトＣＤ８０（Ｃ）またはＣＤ８６（Ｄ）の結合曲線を示す。
【図５８】抗ＣＴＬＡ４抗体によるＣＤ２８経路のＣＴＬＡ４遮断媒介型レポーターのシグナル伝達活性化を示す。Ｊｕｒｋａｔ／ＣＴＬＡ４及びａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞を、段階希釈した抗ＣＴＬＡ４抗体の存在下で共培養し、アイソタイプ対照としてヒトＩｇＧ１抗ＨＥＬ抗体を用いた。一晩インキュベートした後、発光シグナルをＢｉｏ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質で測定し、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）をブランク対照に対して正規化した。結果を平均ＲＬＵ倍±ＳＥＭで表す。実験を３通り実施した。注釈：ＴＹ２１５８０の最高濃度（５００μｇ／ｍＬ）のデータポイントは、この時点で明らかなフック効果が観察されたため、曲線をフィッティングしている間、分析から除外した。
【図５９】抗ＣＴＬＡ４抗体によるＡＤＣＣレポーターのシグナル伝達活性化を示す。Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−Ｌｕｃ／ＣＤ１６細胞及びＨＥＫ２９３Ｆ／ｈＣＴＬＡ４細胞を、段階希釈した抗ＣＴＬＡ４抗体の存在下で共培養し、アイソタイプ対照としてヒトＩｇＧ１抗ＨＥＬ抗体を用いた。６時間インキュベートした後、発光シグナルをＯＮＥ−Ｇｌｏルシフェラーゼ基質で測定した。相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）をブランク対照に対して正規化し、結果を平均ＲＬＵ±ＳＥＭで表した。実験を３通り実施した。
【図６０Ａ】抗ＣＴＬＡ４抗体で治療されたＭＣ３８腫瘍担持マウスの腫瘍増殖曲線を示す。アイソタイプ対照抗体（１ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＷ）、ＴＹ２１５８０（１ｍｇ／ｋｇもしくは０．２ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＷ）、またはイピリムマブ（１ｍｇ／ｋｇもしくは０．２ｍｇ／ｋｇ  ＢＩＷ）で治療されたＭＣ３８腫瘍担持マウスにおける経時的な群平均腫瘍増殖を示す。データポイントは平均値を表し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。
【図６０Ｂ】抗ＣＴＬＡ４抗体で治療されたＭＣ３８腫瘍担持マウスの腫瘍増殖曲線を示す。アイソタイプ対照抗体（群１）、ＴＹ２１５８０（群２及び群３）、またはイピリムマブ（群４及び群５）で治療された個々のＭＣ３８腫瘍担持マウスにおける経時的な腫瘍増殖を示す。
【図６１】ＴＹ２１５８０またはイピリムマブで治療されたマウスからの皮下ＭＣ３８腫瘍における腫瘍内制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞レベルに対するＴＹ２１５８０及びイピリムマブの効果を示す。Ａは、腫瘍から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）のパーセンテージを示す。Ｂは、腫瘍から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団における細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋Ｔ細胞）のＴｒｅｇ細胞に対する比（すなわち、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比）を示す。各データポイントは、１匹のマウスからのデータを表す。Ｐｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて統計分析を行った。Ｐ値を多重Ｔ検定を使用して計算した。ｎｓ：Ｐ＞０．０５、＊＊：０．００１＜Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図６２】ＴＹ２１５８０またはイピリムマブで治療されたマウスからの皮下ＣＴ２６腫瘍における腫瘍内制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞レベルに対するＴＹ２１５８０及びイピリムマブの効果を示す。Ａは、腫瘍から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞におけるＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）のパーセンテージを示す。Ｂは、腫瘍から単離されたＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団における細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋Ｔ細胞）のＴｒｅｇ細胞に対する比（すなわち、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比）を示す。各データポイントは、１匹のマウスからのデータを表す。Ｐｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて統計分析を行った。Ｐ値を多重Ｔ検定を使用して計算した。ｎｓ：Ｐ＞０．０５、＊＊：０．００１＜Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図６３】アイソタイプ対照抗体またはＴＹ２１５８０で治療されたＣＴ２６腫瘍担持マウスのＦＯＸＰ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞における平均蛍光強度（ＭＦＩ）によって測定されたＣＴＬＡ４発現レベルを示す。各データポイントは、１匹のマウスからのデータを表す。Ｐｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて統計分析を行った。Ｐ値を多重Ｔ検定を使用して計算した。ｎｓ：Ｐ＞０．０５、＊＊：０．００１＜Ｐ＜０．０１、＊＊＊：Ｐ＜０．００１。
【図６４Ａ】ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照抗体で治療されたマウスＨ２２肝臓癌担持マウスの腫瘍増殖曲線を示す。Ａは、腫瘍が５００ｍｍ３もしくは８００ｍｍ３に達したときにＴＹ２１５８０治療を開始した場合の、または腫瘍が５００ｍｍ３に達したときにアイソタイプ対照抗体治療を開始した場合の、群平均の腫瘍増殖を示す。データポイントは８匹のマウス／群の腫瘍の平均値を表し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。Ｂ〜Ｄは、各マウスにおける個々の腫瘍増殖を示す。Ｂは、腫瘍が５００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、アイソタイプ対照抗体で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。Ｃは、腫瘍が５００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、ＴＹ２１５８０で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。Ｄは、腫瘍が８００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、ＴＹ２１５８０で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。
【図６４Ｂ】ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照抗体で治療されたマウスＨ２２肝臓癌担持マウスの腫瘍増殖曲線を示す。Ａは、腫瘍が５００ｍｍ３もしくは８００ｍｍ３に達したときにＴＹ２１５８０治療を開始した場合の、または腫瘍が５００ｍｍ３に達したときにアイソタイプ対照抗体治療を開始した場合の、群平均の腫瘍増殖を示す。データポイントは８匹のマウス／群の腫瘍の平均値を表し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。Ｂ〜Ｄは、各マウスにおける個々の腫瘍増殖を示す。Ｂは、腫瘍が５００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、アイソタイプ対照抗体で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。Ｃは、腫瘍が５００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、ＴＹ２１５８０で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。Ｄは、腫瘍が８００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、ＴＹ２１５８０で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。
【図６４Ｃ】ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照抗体で治療されたマウスＨ２２肝臓癌担持マウスの腫瘍増殖曲線を示す。Ａは、腫瘍が５００ｍｍ３もしくは８００ｍｍ３に達したときにＴＹ２１５８０治療を開始した場合の、または腫瘍が５００ｍｍ３に達したときにアイソタイプ対照抗体治療を開始した場合の、群平均の腫瘍増殖を示す。データポイントは８匹のマウス／群の腫瘍の平均値を表し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。Ｂ〜Ｄは、各マウスにおける個々の腫瘍増殖を示す。Ｂは、腫瘍が５００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、アイソタイプ対照抗体で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。Ｃは、腫瘍が５００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、ＴＹ２１５８０で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。Ｄは、腫瘍が８００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、ＴＹ２１５８０で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。
【図６４Ｄ】ＴＹ２１５８０またはアイソタイプ対照抗体で治療されたマウスＨ２２肝臓癌担持マウスの腫瘍増殖曲線を示す。Ａは、腫瘍が５００ｍｍ３もしくは８００ｍｍ３に達したときにＴＹ２１５８０治療を開始した場合の、または腫瘍が５００ｍｍ３に達したときにアイソタイプ対照抗体治療を開始した場合の、群平均の腫瘍増殖を示す。データポイントは８匹のマウス／群の腫瘍の平均値を表し、エラーバーは平均値の標準誤差（ＳＥＭ）を表す。Ｂ〜Ｄは、各マウスにおける個々の腫瘍増殖を示す。Ｂは、腫瘍が５００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、アイソタイプ対照抗体で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。Ｃは、腫瘍が５００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、ＴＹ２１５８０で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。Ｄは、腫瘍が８００ｍｍ３に達したときに治療を開始した、ＴＹ２１５８０で治療されたマウスにおける腫瘍増殖を示す。
【図６５】親抗体ＴＹ２１５８０と比較した場合の、可変長のマスキングペプチドを含有する例示的な活性化可能抗体のマスキング効率を示す。マスキング効率は、ＥＬＩＳＡベースの方法を使用して決定した。Ａ及びＢは、様々な活性化可能抗ＣＴＬＡ４抗体を試験するために同じ実験方法を使用して設定された２つの実験を表す。
【図６６】親抗体ＴＹ２１５８０と比較した場合の、異なる長さの切断ペプチドを含有する例示的な活性化可能抗体のマスキング効率を示す。マスキング効率は、ＥＬＩＳＡベースの方法を使用して決定した。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
Ｉ．一般的技法
本明細書に記載または参照される技法及び手順は、一般的に、当業者によってよく理解され、従来の方法論、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））、ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ、Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）、Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）、Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ��Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）、Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）、Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）、及びＣａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（Ｖ．Ｔ．ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）に記載されている広く利用されている方法論などを使用して一般的に援用されている。
【００３１】
ＩＩ．定義
本開示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物または生体系に限定されず、言うまでもなく多様であり得ることを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としており、限定するようには意図されていないことも理解されたい。
【００３２】
本明細書で使用される場合、文脈上明らかに示されない限り、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という単数形は、複数の言及物を含む。したがって、例えば、「分子」への言及は、２つ以上のそのような分子の組み合わせを任意に含むといった具合である。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、当業者であれば容易に理解するそれぞれの値の通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする実施形態を含む（かつ説明する）。
【００３４】
本明細書に記載される本開示の態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む」、「からなる」、及び「から本質的になる」を含むことを理解されたい。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「及び／または」という用語は、「Ａ及び／またはＢ」などの語句がＡ及びＢの両方、ＡまたはＢ、Ａ（単独）、及びＢ（単独）を含むことを意図している。同様に、本明細書で使用される場合、「及び／または」という用語は、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などの語句が以下の実施形態：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；及びＣ（単独）の各々を包含することを意図している。
【００３６】
「アミノ酸」という用語は、天然アミノ酸及び合成アミノ酸、ならびに天然アミノ酸と同様に機能するアミノ酸類似体及びアミノ酸模倣体を指す。天然アミノ酸は、遺伝暗号によってコードされるもの、ならびにそれらのアミノ酸が後で修飾されたもの、例えば、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート、及びＯ−ホスホセリンである。「アミノ酸類似体」という用語は、天然アミノ酸と同じ基本的な化学構造を有する化合物を指すが、Ｃ末端のカルボキシ基、Ｎ末端のアミノ基、または側鎖の官能基は、別の官能基に化学的に修飾されている。「アミノ酸模倣体」という用語は、アミノ酸の一般的な化学構造とは異なる構造を有するが、天然アミノ酸と同様に機能する化学化合物を指す。本明細書で使用される場合、２０個の従来のアミノ酸及びそれらの略称は、従来の使用法に従う。例えば、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｓ．Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｄ．Ｒ．Ｇｒｅｎ，Ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．（１９９１））を参照されたい。
【００３７】
「ポリペプチド」、「タンパク質」、及び「ペプチド」という用語は、本明細書において互換的に使用され、２つ以上のアミノ酸のポリマーを指し得る。
【００３８】
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」または「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいはＤＮＡもしくＲＮＡポリメラーゼにより、または合成反応によりポリマーに組み込むことができる任意の基質であり得る。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含み得る。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの組み立て前または組み立て後に付与され得る。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド成分によって中断され得る。ポリヌクレオチドは、標識へのコンジュゲートなどの、合成後になされる修飾（複数可）を含み得る。他のタイプの修飾としては、例えば、天然に存在するヌクレオチドのうちの１つ以上を類似体と置換する「キャップ」、ヌクレオチド間修飾、例えば、非電荷性結合（例えば、メチルホスホン酸塩、ホスホトリエステル、ホスホアミデート、カルバメート等）によるもの、及び電荷性結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート等）によるもの、例えば、タンパク質（例えば、ヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ポリ−Ｌ−リジン等）の懸垂部分を含むもの、挿入剤（例えば、アクリジン、ソラーレン等）によるもの、キレート剤（例えば、金属、放射活性金属、ホウ素、酸化金属等）を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾結合（例えば、アルファアノマー核酸等）によるもの、ならびにポリヌクレオチド（複数可）の未修飾形態が挙げられる。さらに、糖内に通常存在するヒドロキシル基のうちのいずれかは、例えば、ホスホン酸基、リン酸基によって置換されるか、標準保護基によって保護されるか、もしくは活性化されて追加のヌクレオチドへの追加の結合を調製してもよく、または固体もしくは半固体支持体にコンジュゲートされてもよい。５’及び３’末端ＯＨをリン酸化するか、またはアミンもしくは１〜２０個の炭素原子の有機キャッピング基部分で置換することができる。他のヒドロキシルは、標準保護基に誘導体化され得る。ポリヌクレオチドは、例えば、２’−Ｏ−メチル−、２’−Ｏ−アリル、２’−フルオロ−、または２’−アジド−リボース、炭素環糖類似体、α−アノマー糖、アラビノース、キシロースまたはリキソースなどのエピマー糖、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、アクリル酸類似体、及びメチルリボシドなどの塩基性ヌクレオシド類似体を含む、当該技術分野において一般的に既知であるリボース糖またはデオキシリボース糖の類似形態も含有することができる。１つ以上のホスホジエステル結合は、代替連結基に置き換えられ得る。これらの代替連結基としては、限定されないが、リン酸塩がＰ（Ｏ）Ｓ（「チオエート」）、Ｐ（Ｓ）Ｓ（「ジチオエート」）、（Ｏ）ＮＲ２（「アミデート」）、Ｐ（Ｏ）Ｒ、Ｐ（Ｏ）ＯＲ’、ＣＯ、またはＣＨ２（「ホルムアセタール」）に置き換えられる実施形態を含み、式中、各ＲまたはＲ’は、独立して、Ｈであるか、または置換もしくは非置換アルキル（１〜２０Ｃ）（任意にエーテル（−Ｏ−）結合を含���）、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、またはアラルジルである。ポリヌクレオチドにおける全ての結合が同一である必要はない。先行する説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、本明細書において言及される全てのポリヌクレオチドに適用する。
【００３９】
「単離された核酸」という用語は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離された、ゲノム、ｃＤＮＡ、もしくは合成起源の核酸分子、またはそれらの組み合わせを指す。例えば、ゲノムＤＮＡに関して、「単離された」という用語は、ゲノムＤＮＡが天然に結合している染色体から分離されている核酸分子を含む。好ましくは、「単離された」核酸は、天然に核酸に隣接する配列（すなわち、目的の核酸の５’及び３’末端に位置する配列）を含まない。
【００４０】
「抗体」という用語は、本明細書において最も広義に使用され、具体的には、それらが所望の生物学的活性を示す限り、モノクローナル抗体（完全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体、三重特異的抗体）、及び抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ及び／または一本鎖可変断片またはｓｃＦｖ）を網羅する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、「抗体」という用語は、２つの同一の重（Ｈ）鎖及び２つの同一の軽（Ｌ）鎖からなる基本的な４ポリペプチド鎖構造を有する抗原結合タンパク質（すなわち、免疫グロブリン）を指す。各Ｌ鎖は、１つのジスルフィド共有結合によってＨ鎖に連結されているが、一方で２本のＨ鎖は、Ｈ鎖アイソタイプに応じて１つ以上のジスルフィド結合によって互いに連結されている。各重鎖は、Ｎ末端に可変領域（本明細書ではＶＨと略される）、続いて定常領域を有する。重鎖定常領域は、３つのドメインＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３からなる。各軽鎖は、Ｎ末端に可変領域（本明細書ではＶＩと略される）、続いてその反対側の端部に定常領域を有する。軽鎖定常領域は、１つのドメインＣＬからなる。ＶＬはＶＨと整列し、ＣＬは重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）と整列する。ＶＨ及びＶＬの対合は、一緒になって単一抗原結合部位を形成する。ＩｇＭ抗体は、５つの基本的なヘテロ四量体ユニットならびにＪ鎖と呼ばれる追加のポリペプチドからなり、ひいては１０個の抗原結合部位を含有しているが、分泌されたＩｇＡ抗体は重合して、２〜５つの基本的な４鎖ユニットならびにＪ鎖を含む多価集合体を形成することができる。
【００４２】
ＶＨ及びＶＬ領域は、構造及び配列分析に基づいて、超可変領域（ＨＶＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化できる。ＨＶＲには、フレームワーク領域（ＦＷ）と呼ばれる、より保存された領域が散在している（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９９）２９３，８６５−８８１を参照）。各ＶＨ及びＶＬは、３つのＨＶＲ及び４つのＦＷから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端にかけて、以下の順序：ＦＷ−１＿ＨＶＲ−１＿ＦＷ−２＿ＨＶＲ−２＿ＦＷ−３＿ＨＶＲ−３＿ＦＷ４で配列される。本開示全体を通して、重鎖の３つのＨＶＲは、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３と呼ばれる。同様に、軽鎖の３つのＨＶＲは、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３と呼ばれる。
【００４３】
重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。軽鎖及び重鎖の中で、可変領域及び定常領域は約１２個以上のアミノ酸の「Ｊ」領域によって結合され、重鎖は約１０個以上のアミノ酸の「Ｄ」領域も含む（例えば、Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｃｈ．７（Ｐａｕｌ，Ｗ．，ｅｄ．，２ｎｄ  ｅｄ．Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ）（１９８９）を参照）。
【００４４】
任意の脊椎動物種に由来するＬ鎖は、それらの定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ及びラムダと呼ばれる２つの明確に異なる種類のうちの１つに割り当てることができる。抗体は、それらの重鎖（ＣＨ）の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、異なるクラスまたはアイソタイプに割り当てることができる。５つのクラスの抗体：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭがあり、それぞれ、α（アルファ）、δ（デルタ）、ε（エプシロン）、γ（ガンマ）、及びμ（ミュー）と命名された重鎖を有する。抗体のＩｇＧクラスは、ガンマ重鎖Ｙ１〜Ｙ４によって、それぞれ４つのサブクラス、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４にさらに分類することができる。
【００４５】
抗体の「抗体誘導体」または「誘導体」という用語は、抗体が結合する同じ抗原（例えば、ＣＴＬＡ４）に結合することができ、追加の分子実体に連結された抗体のアミノ酸配列を含む分子を指す。抗体誘導体に含有される抗体のアミノ酸配列は、抗体、抗体の任意の他の断片（複数可）、または完全抗体の、完全長重鎖、完全長軽鎖、完全長重鎖の任意の部分（複数可）、完全長軽鎖の任意の部分（複数可）であり得る。追加の分子実体は、化学的または生物学的分子であり得る。追加の分子実体の例としては、化学基、アミノ酸、ペプチド、タンパク質（酵素、抗体など）、及び化学化合物が挙げられる。追加の分子実体は、検出剤、標識、マーカー、医薬品または治療剤としての使用などに任意の有用性を有し得る。抗体のアミノ酸配列は、化学的カップリング、遺伝的融合、非共有結合などによって、追加の分子実体に付着または連結され得る。「抗体誘導体」という用語はまた、キメラ抗体、ヒト化抗体、ならびに保存アミノ酸の置換、付加、及び挿入などのＣＴＬＡ４抗体のアミノ酸配列の改変に由来する分子を包含する。
【００４６】
抗体の「抗原結合断片」または「抗原結合部分」という用語は、抗体が結合する抗原（例えば、ＣＴＬＡ４）に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の部分を指す。抗体の「抗原結合断片」の例としては、（ｉ）ＶＬ，、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６（１９８９））、ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。
【００４７】
「結合分子」という用語は、（１）抗体、（２）抗体の抗原結合断片、及び（３）抗体の誘導体を包含し、それぞれ本明細書で定義されている。
【００４８】
「ＣＴＬＡ４」という用語は、本出願で使用され、ヒトＣＴＬＡ４（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１６４１０）、ならびにそのバリアント、アイソフォーム、及び種相同体（例えば、マウスＣＴＬＡ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ０９７９３）、ラットＣＴＬＡ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９Ｚ１Ａ７）、イヌＣＴＬＡ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｑ９ＸＳＩ１）、カニクイザルＣＴＬＡ４（ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｇ７ＰＬ８８）など）を含む。したがって、本明細書で定義及び開示される場合、結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）はまた、ヒト以外の種からのＣＴＬＡ４にも結合し得る。他の場合では、結合分子はヒトＣＴＬＡ４に対して完全に特異的であり得、種または他の種類の交差反応性を示さない場合がある。
【００４９】
本明細書で定義される場合、「ＣＴＬＡ４抗体」という用語は、ヒトＣＴＬＡ４に結合することができる抗体を指す。
【００５０】
「キメラ抗体」という用語は、ヒト抗体に由来する可変領域及びマウス免疫グロブリン定常領域を有するものなど、異なる動物種に由来するアミノ酸配列を含む抗体を指す。
【００５１】
「結合に関して競合する」という用語は、結合標的への結合における２つの抗体の相互作用を指す。第２の抗体の非存在下での第１の抗体の結合と比較して、第２の抗体の存在下で第１の抗体のその同族エピトープとの結合が検出可能に減少する場合、第１の抗体は結合に関して第２の抗体と競合する。第２の抗体のそのエピトープへの結合も第１の抗体の存在下で検出可能に減少する代替案は、事実であり得るが、そうである必要はない。すなわち、第１の抗体は、第２の抗体が第１の抗体のそのそれぞれのエピトープへの結合を阻害することなく、第２の抗体のそのエピトープへの結合を阻害することができる。しかしながら、各抗体が他の抗体のその同族エピトープとの結合を検出可能に阻害する場合、それが同じ程度か、多いか少ないかにかかわらず、抗体はそれらのそれぞれのエピトープ（複数可）の結合に関して互いに「交差競合する」と言われる。
【００５２】
「エピトープ」という用語は、抗体（またはその抗原結合断片）が結合する抗原の一部を指す。エピトープは、隣接アミノ酸、またはタンパク質の三次折りたたみによって並列した非隣接アミノ酸の両方から形成することができる。隣接アミノ酸から形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒への曝露の際に保持されるが、三次折りたたみによって形成されたエピトープは、典型的には、変性溶媒での治療の際に失われる。エピトープは、ユニークな空間的立体配座において様々な数のアミノ酸を含むことができる。エピトープの空間的立体配座を決定する方法としては、例えば、Ｘ線結晶学、２次元核磁気共鳴、質量分析法と組み合わせた重水素及び水素交換、または部位特異的変異誘発、または抗原ならびにその結合抗体及びそのバリアントとのその複合体構造の計算論的モデルと組み合わせて使用される全ての方法が挙げられる（例えば、Ｅｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇ．Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照）。抗原の所望のエピトープが決定されると、例えば、本明細書に記載される技術を使用して、そのエピトープに対する抗体を生成することができる。また、抗体の生成及び特性評価は、望ましいエピトープについての情報を解明し得る。この情報から、同じエピトープへの結合について抗体を競合的にスクリーニングすることが可能である。これを達成するためのアプローチは、交差競合研究を実施して、互いに競合的に結合する抗体を発見することであり、すなわち、抗体は抗原への結合に関して競合する。それらの交差競合に基づいて抗体を「ビニングする」ためのハイスループットプロセスは、ＰＣＴ公開第ＷＯ０３／４８７３１号に記載されている。
【００５３】
用語「生殖系列」は、生殖細胞を介して親から子孫に受け継がれるような抗体遺伝子及び遺伝子セグメントのヌクレオチド配列を指す。生殖系列配列は、Ｂ細胞の成熟過程中に組換え及び高頻度変異事象によって変化された成熟Ｂ細胞の抗体をコードするヌクレオチド配列とは区別される。
【００５４】
用語「グリコシル化部位」は、糖残基の付着のための位置として真核細胞によって認識されるアミノ酸残基を指す。オリゴ糖などの炭水化物が付着するアミノ酸は、典型的には、アスパラギン（Ｎ結合）、セリン（Ｏ結合）、及びスレオニン（Ｏ結合）残基である。特定の付着部位は、典型的には、本明細書で「グリコシル化部位配列」と呼ばれるアミノ酸の配列によってシグナル伝達される。Ｎ結合型グリコシル化のグリコシル化部位配列は、−Ａｓｎ−Ｘ−Ｓｅｒ−または−Ａｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒ−であり、Ｘはプロリン以外の従来のアミノ酸のいずれかであり得る。「Ｎ結合型」及び「Ｏ結合型」という用語は、糖分子とアミノ酸残基との間の付着部位として機能する化学基を指す。Ｎ結合型糖はアミノ基を介して付着される。Ｏ結合型糖はヒドロキシル基を介して付着される。「グリカン占有率」という用語は、グリコシル化部位に連結された（すなわち、グリカン部位が占有されている）炭水化物部分の存在を指す。ポリペプチド上に少なくとも２つの潜在的なグリコシル化部位が存在する場合、ゼロ（０−グリカン部位の占有）、１つ（１−グリカン部位の占有）、または両方（２−グリカン部位の占有）の部位のいずれかが炭水化物部分によって占有され得る。
【００５５】
「宿主細胞」という用語は、目的のタンパク質、タンパク質断片、またはペプチドを生成するように操作することができる細胞系を指す。宿主細胞としては、培養細胞、例えば、ＣＨＯ、ＢＨＫ、ＮＳＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０などのげっ歯類（ラット、マウス、モルモット、またはハムスター）に由来する哺乳動物培養細胞；ヒト細胞（例えば、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞；またはヒト組織もしくはハイブリドーマ細胞、酵母細胞、昆虫細胞（例えば、Ｓ２細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞）、ならびにトランスジェニック動物または培養組織内に含まれる細胞が挙げられるが、これらに限定されない。この用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫も包含する。ある特定の修飾は、変異または環境的影響のいずれかに起因して後続の世代において起こり得るため、そのような子孫は親細胞と同一でない場合があるが、「宿主細胞」という用語の範囲内に依然として含まれる。
【００５６】
「ヒト抗体」は、ヒトもしくはヒト細胞によって産生されたか、またはヒト抗体レパートリーを利用する非ヒト源に由来する抗体のアミノ酸配列、あるいは他のヒト抗体コード配列に対応するアミノ酸配列を保有するものである。ヒト抗体のこの定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特異的に除外する。
【００５７】
「ヒト化抗体」という用語は、ヒト抗体配列に由来するアミノ酸残基を含有するキメラ抗体を指す。ヒト化抗体は、非ヒト動物または合成抗体からのＣＤＲまたはＨＶＲのいくつかまたは全てを含有し得るが、抗体のフレームワーク及び定常領域は、ヒト抗体配列に由来するアミノ酸残基を含有する。
【００５８】
「例示的な抗体」という用語は、本開示に記載され、表Ａ及びＢに列挙したように命名された抗体、ならびに表Ａ及びＢに列挙した抗体の６つのＨＶＲ及び／またはＶＨ及びＶＬを含む任意の抗体のうちのいずれか１つを指す。これらの抗体は、任意のクラス（例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）であり得る。したがって、上記で特定された各抗体は、ＶＬ及びＶＨ領域について同じアミノ酸配列を有する５つのクラス全ての抗体を包含する。さらに、ＩｇＧクラスの抗体は、任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４）であり得る。したがって、ＩｇＧサブクラスの上記で特定された各抗体は、ＶＬ及びＶＨ領域について同じアミノ酸配列を有する４つのサブクラス全ての抗体を包含する。５つのクラスならびに４つのＩｇＧサブクラスにおけるヒト抗体の重鎖定常領域のアミノ酸配列が当該技術分野で知られている。
【００５９】
「単離された」抗体または結合分子（例えば、活性化可能抗体）は、その天然環境の構成成分から単離されているものである。いくつかの実施形態では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動法（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動法）、またはクロマトグラフィー（例えば、イオン交換または逆相ＨＰＬＣ）によって決定される、９５％または９９％を超える純度に精製される。抗体の純度を評価するための方法の概説については、例えば、Ｆｌａｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．Ｂ  ８４８：７９−８７（２００７）を参照されたい。
【００６０】
用語「Ｋａ」は、特定の結合分子−抗原相互作用の会合速度定数を指し、用語「ｋｄ」は、特定の結合分子−抗原相互作用の解離速度定数を指す。
【００６１】
「ＫＤ」という用語は、特定の抗体−抗原相互作用の平衡解離定数を指す。これは、ｋｄ対ｋａの比（すなわち、ｋｄ／ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。ＫＤは、抗体の結合パートナーへの結合の親和性の尺度として使用される。ＫＤが小さいほど、抗体はより強く結合するか、または抗体と抗原との間の親和性がより高くなる。例えば、ナノモル（ｎＭ）の解離定数を有する抗体は、マイクロモル（μＭ）の解離定数を有する抗体よりも強く特定の抗原に結合する。抗体のＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立されている方法を使用して決定することができる。抗体のＫＤを決定するための１つの方法は、表面プラズモン共鳴を使用することによるものであり、典型的にはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを使用することによる。例えば、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）システムを使用するアッセイ手順（ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ）は、本開示の少なくとも実施例３に記載されている。
【００６２】
「哺乳動物」という用語は、哺乳類クラスのあらゆる動物種を指す。哺乳動物の例としては、ヒト；ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、非ヒト霊長類、及びモルモットなどの実験動物；ネコ、イヌ、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、及びブタなどの家畜；ならびにライオン、トラ、ゾウなどの捕獲された野生動物等が挙げられる。
【００６３】
哺乳動物における特定の疾患状態に関する「予防する」または「予防」という用語は、疾患の発症を防止もしくは遅延させること、またはその臨床的もしくは無症候性症状の発現を防止することを指す。
【００６４】
本明細書で使用される場合、２つのポリペプチド配列間の「配列同一性」は、配列間で同一であるアミノ酸のパーセンテージを示す。ポリペプチドのアミノ酸配列同一性は、Ｂｅｓｔｆｉｔ、ＦＡＳＴＡ、またはＢＬＡＳＴなどの既知のコンピュータプログラムを使用して慣習的に決定することができる（例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）、Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１３２：１８５−２１９（２０００）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｅｌｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）を参照されたい）。Ｂｅｓｔｆｉｔまたは任意の他の配列アラインメントプログラムを使用して、特定の配列が、例えば、参照アミノ酸配列と９５％同一であるかどうかを決定する場合、パラメータは、同一性の割合が参照アミノ酸配列の全長にわたって計算され、参照配列内のアミノ酸残基の総数の最大５％の相同性における差が許容されるように設定される。ポリペプチド間の同一性の割合の決定におけるこの前述の方法は、本明細書に開示される全てのタンパク質、断片、またはそれらのバリアントに適用可能である。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「結合する」、「に結合する」、「特異的に結合する」、「に特異的に結合する」または「に特異的な」という用語は、生物学的分子を含む異種分子集団の存在下で標的の存在を決定する標的と抗体との間の結合などの測定可能かつ再現可能な相互作用を指す。例えば、標的（エピトープであり得る）に結合するか、またはそれに特異的に結合する抗体は、この標的に、他の標的に結合するよりも高い親和性、結合力で、より容易に、及び／またはより長期間結合する抗体である。一実施形態では、無関係の標的への抗体の結合の程度は、例えば、放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定された、標的への抗体の結合の約１０％未満である。ある特定の実施形態では、標的に特異的に結合する抗体は、１μＭ以下、１００ｎＭ以下、１０ｎＭ以下、１ｎＭ以下、または０．１ｎＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。ある特定の実施形態では、抗体は、異なる種由来のタンパク質間で保存されるタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。別の実施形態では、特異的結合は、排他的結合を含み得るが、それを必要としない。
【００６６】
「治療する」、「治療すること」、または「治療」という用語は、哺乳動物における特定の疾患状態に関して、疾患状態を有する哺乳動物において望ましいまたは有益な効果を引き起こすことを指す。望ましいまたは有益な効果には、疾患の１つ以上の症状（すなわち、腫瘍増殖及び／または転移、あるいは免疫細胞の数及び／または活性によって媒介される他の効果など）の頻度または重篤度の低下、あるいは疾患、状態、または障害のさらなる進行の阻止または阻害を含み得る。哺乳動物においてがんを治療する文脈において、望ましいまたは有益な効果には、がん細胞のさらなる増殖もしくは転移の阻害、がん細胞の死滅、がんの再発の阻害、がんに関連する疼痛の低減、または哺乳動物の生存能の改善が含まれ得る。効果は主観的または客観的のいずれかであり得る。例えば、哺乳動物がヒトである場合、ヒトは、改善または治療応答の自覚症状として、活力もしくは生存能の向上、または疼痛の低減を認め得る。あるいは、臨床医は、理学的検査、臨床検査値、腫瘍マーカー、またはＸ線所見に基づく、腫瘍サイズまたは負荷の減少を認め得る。治療応答に関して臨床医が観察し得るいくつかの臨床徴候には、白血球数、赤血球数、血小板数、赤血球沈降速度、及び種々の酵素レベル等の検査値の正常化が含まれる。さらに、臨床医は、検出可能な腫瘍マーカーの減少を観察し得る。あるいは、他の検査、例えば、超音波画像法、核磁気共鳴検査、及び陽電子放出検査を使用して客観的改善を評価することができる。
【００６７】
「ベクター」という用語は、外来核酸分子を輸送することができる核酸分子を指す。外来核酸分子は、ライゲーションまたは組換えなどの組換え技術によってベクター核酸分子に連結される。これにより、外来核酸分子を増殖させ、選択し、さらに操作するか、または宿主細胞もしくは生物中で発現させることができる。ベクターは、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、染色体、ウイルス、またはビリオンであり得る。ある種類のベクターは、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ得、それにより、宿主ゲノムとともに複製される（例えば、非エピソーム性哺乳動物ベクター）。別の種類のベクターは、それらが導入される宿主細胞において自律増殖が可能である（例えば、細菌起源の複製を有する細菌ベクター及びエピソーム性哺乳動物ベクター）。それらが作動可能に連結されている発現可能な外来核酸の発現を指示することができる別の特定の種類のベクターは、通常「発現ベクター」と称される。発現ベクターは、一般的に、発現可能な外来核酸の発現を駆動する制御配列を有する。「転写ベクター」として既知のより単純なベクターは、転写のみ可能であるが翻訳は不可能であり、これらは、標的細胞内で複製できるが発現はできない。用語「ベクター」は、全ての種類のベクターをそれらの機能に関係なく包含する。それらが動作可能に連結されている発現可能な核酸の発現を指示することができるベクターは、通常「発現可能ベクター」と称される。「ベクター」の他の例は、提示ベクター（例えば、ウイルスまたは細胞（細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、及び／または哺乳動物細胞など）の表面上でコードされたポリペプチドの発現及び提示を指示するベクター）を含み得る。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「対象」、「患者」、または「個体」は、ヒトまたは非ヒト動物を指し得る。「非ヒト動物」は、ヒトとして分類されないあらゆる動物、例えば、飼育動物、家畜、または動物園の動物、競技用動物、ペットの動物（例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシなど）、ならびに研究において使用される動物を指し得る。研究動物とは、線虫、節足動物、脊椎動物、哺乳動物、カエル、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、魚類（例えば、ゼブラフィッシュまたはフグ）、鳥類（例えば、ニワトリ）、イヌ、ネコ、及び非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル、カニクイザル、チンパンジーなど）を指し得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、対象、患者、または個体は、ヒトである。
【００６９】
「有効量」とは、治療結果または予防結果を含む、１つ以上の所望のまたは示された効果を達成するために必要な投薬量及び期間で少なくとも有効な量を指す。有効量は、１回以上の投与で提供され得る。本開示の目的のための、抗体、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、予防的または治療的治療を直接的または間接的に達成するのに十分な量である。臨床的状況において理解されるように、薬物、化合物、または医薬組成物の有効量は、別の薬物、化合物、または医薬組成物と併せて達成されても、されなくてもよい（例えば、単剤療法または併用療法として投与される場合の有効量）。したがって、「有効量」は、１つ以上の治療剤の投与の状況において考慮され得、単一の薬剤は、１つ以上の他の薬剤と併せると望ましい結果が達成され得るか、または達成される場合、有効量で与えられると見なされ得る。
【００７０】
ＩＩＩ．ヒトＣＴＬＡ４に結合する結合分子
本開示は、ＣＴＬＡ４抗体、ＣＴＬＡ４抗体の抗原結合断片、及びＣＴＬＡ４抗体の誘導体を含む、ヒトＣＴＬＡ４に結合する単離された結合分子に部分的に関する。いくつかの実施形態では、結合分子は、ＨＶＲ、可変領域（ＶＬ、ＶＨ）、ならびに軽鎖及び重鎖（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４）の特定のアミノ酸配列に関して記載される抗体を含む、本明細書に記載される抗体のいずれかである。いくつかの実施形態では、抗体はヒト抗体である。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、及び／またはキメラ抗体である。いくつかの実施形態では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ４に結合し、以下の機能的特性：（ａ）ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４に５００ｎＭ以下のＫＤで結合する、（ｂ）ヒトＣＴＬＡ４に対してアンタゴニスト活性を有する、（ｃ）１００ｎＭまでの濃度でヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ９５、ＣＤ１２０ａ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、及び／またはＢ７−Ｈ４に結合しない、（ｄ）サル、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４と交差反応性である、（ｅ）（例えば、Ｔｒｅｇに対する）ＡＤＣＣ効果を誘導する、（ｆ）ヒトＰＢＭＣを活性化する（例えば、ＩＬ−２及び／またはＩＦＮγの分泌を刺激する）、（ｇ）腫瘍細胞の増殖を阻害することができる、（ｈ）がんに対する治療効果を有する、ならびに（ｉ）ヒトＣＴＬＡ４のヒトＣＤ８０及び／またヒトＣＤ８６への結合を遮断する、のうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または９つ全て）を有する結合分子に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体は、ヒトＣＤ８０及び／またはＣＤ８６が固定化（もしくはプレート結合）されている場合、またはヒトＣＴＬＡ４タンパク質が細胞表面上に存在している場合のいずれかのアッセイにおけるイピリムマブと比較して、ＣＤ８０及び／またはＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ４への結合の遮断において、より低い活性を有する。図５７Ｃ及び５７Ｄならびに図５８を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体は、ＰＢＭＣまたは脾臓におけるＴｒｅｇ枯渇と比較して、腫瘍微小環境においてＴｒｅｇ細胞を選択的に枯渇させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブと比較して、腫瘍微小環境において、より高いＴｒｅｇ枯渇活性を有する。図６１Ａ〜Ｂ、図６２Ａ〜Ｂ、及び図６３を参照されたい。また、ヒトＣＴＬＡ４への結合に関して、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片の１つ以上と交差競合する１つ以上の抗ＣＴＬＡ４抗体または抗原結合断片も本明細書に提供される。
【００７１】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４に約５００ｎＭ以下（例えば、約５００ｎＭ以下、約４５０ｎＭ以下、約４００ｎＭ以下、約３５０ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約２５０ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約１５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約９０ｎＭ以下、約８０ｎＭ以下、約７０ｎＭ以下、約６０ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下など）のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４に約３５０ｎＭ以下のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約１００ｎＭ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ４に結合する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約５０ｎＭ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ４に結合する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約１０ｎＭ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ４に結合する。抗体または抗原結合断片のＫＤを測定する方法は、例えば、表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定、フィルター結合アッセイ、ＥＭＳＡなどによるものを含む、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴またはＥＬＩＳＡによって測定される（例えば、以下の実施例３を参照）。
【００７２】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体または抗原結合断片は、ヒトＣＴＬＡ４に対してアンタゴニスト活性を有する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ヒトＣＴＬＡ４を発現する細胞（例えば、ヒト細胞）が抗体または抗原結合断片によって接触されると、ヒトＣＴＬＡ４の１つ以上の活性を抑制する（例えば、ＣＬＡ４遮断レポーター遺伝子アッセイを使用したレポーター遺伝子シグナルの増加によって測定されたＣＴＬＡ４遮断）。
【００７３】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、サル（例えば、カニクイザル）、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、サルＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、マウスＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ラットＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、イヌＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、サル及びマウスＣＴＬＡ４；サル及びラットＣＴＬＡ４；サル及びイヌＣＴＬＡ４；マウス及びラットＣＴＬＡ４；マウス及びイヌＣＴＬＡ４；ラット及びイヌＣＴＬＡ４；サル、マウス、及びラットＣＴＬＡ４；サル、マウス、及びイヌＣＴＬＡ４；サル、ラット、及びイヌＣＴＬＡ４；マウス、ラット、及びイヌＣＴＬＡ４；またはサル、マウス、ラット、及びイヌＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、抗体または抗原結合断片が非ヒトＣＴＬＡ４分子に約５００ｎＭ未満（例えば、約１ｎＭ未満、約１０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約７５ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約１５０ｎＭ未満、約２００ｎＭ未満、約２５０ｎＭ未満、約３００ｎＭ未満、約３５０ｎＭ未満など）のＫＤで結合する場合、交差反応性である。抗体交差反応性を測定する方法は当該技術分野で既知であり、表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定、フィルター結合アッセイ、ＥＭＳＡなどを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、交差反応性は、ＥＬＩＳＡによって測定される（例えば、以下の実施例３を参照）。
【００７４】
いくつかの実施形態では、抗体は、抗体が細胞発現ＣＴＬＡ４に結合した後、ＣＴＬＡ４発現細胞に対して（例えば、ＴｒｅｇなどのＣＴＬＡ４発現ヒト細胞に対して）ＡＤＣＣ効果を誘導する。ＡＤＣＣ効果を測定する方法（例えば、インビトロ法）は当該技術分野で既知であり、以下の実施例３に記載される方法によるものを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗体は、対照（例えば、アイソタイプ対照またはイピリムマブ）と比較して約１０％超でＡＤＣＣ効果を誘導する（例えば、約１０％超、約１５％超、約２０％超、約２５％超、約３０％超、約３５％超、約４０％超などでＡＤＣＣを誘導する）。
【００７５】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、腫瘍細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）は、抗体または抗原結合断片と接触していない対応する腫瘍細胞と比較して（あるいはアイソタイプ対照抗体と接触している対応する腫瘍細胞と比較して）、抗体または抗原結合断片と接触している場合、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９９％）で阻害される。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、対象に抗体または抗原結合断片が投与されるとき、対象における腫瘍体積を減少させることができる。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、対象における初期腫瘍体積と比較して（例えば、抗体または抗原結合断片の投与前に、アイソタイプ対照抗体を投与された対象における対応する腫瘍と比較して）、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９９％）で対象における腫瘍体積を減少させることができる。腫瘍細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）／増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、腫瘍体積、及び／または腫瘍阻害をモニターする方法は当該技術分野で既知であり、例えば、以下の実施例４に記載される方法によるものを含む。
【００７６】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、がんに対して治療効果を有する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、がんの１つ以上の徴候または症状を軽減する。いくつかの実施形態では、がんに罹患している対象は、抗体または抗原結合断片を投与されると、部分寛解または完全寛解する。
【００７７】
別の態様では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ４への結合に関して、本開示の例示的な抗体、例えば、ＴＹ２１５８５、ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１５８７、ＴＹ２１５８８、ＴＹ２１５８９、ＴＹ２１５８０、ＴＹ２１５９１、ＴＹ２１６８６、ＴＹ２１６８７、ＴＹ２１６８９、ＴＹ２１６８０、ＴＹ２１６９１、及び／またはＴＹ２１６９２のいずれかと競合または交差競合する、単離された抗体を提供する。特定の実施形態では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ４上の同じエピトープへの結合に関して、本開示の例示的な抗体のいずれかと競合または交差競合する、単離された抗体を提供する。別の抗体との結合に関して競合または交差競合する抗体の能力は、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーなどの当該技術分野で既知の標準的な結合アッセイを使用して決定することができる。例えば、本開示の例示的な抗体が飽和条件下でヒトＣＴＬＡ４に結合することを可能にし、次いで、試験抗体のＣＴＬＡ４に結合する能力を測定することができる。試験抗体が例示的抗体と同時にＣＴＬＡ４に結合することができる場合、試験抗体は例示的抗体とは異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験抗体が同時にＣＴＬＡ４に結合することができない場合、試験抗体は、同じエピトープ、重複するエピトープ、または例示的な抗体によって結合されたエピトープに非常に近接するエピトープに結合する。この実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、または表面プラズモン共鳴などの様々な方法を使用して実施することができる。
【００７８】
いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＣＴＬＡ４と１つ以上のその結合パートナー（例えば、ヒトＣＴＬＡ４及びヒトＣＤ８０、ヒトＣＴＬＡ４及びヒトＣＤ８６）との間の結合を遮断する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＣＴＬＡ４とそのリガンドとの間の結合をインビトロで遮断する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０及び／またはＣＤ８６への結合を遮断するための、約５００ｎＭ以下（例えば、約５００ｎＭ以下、約４００ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下など）の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０及び／またはＣＤ８６への結合を遮断するための、約１００ｎＭ以下の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いくつかの実施形態では、抗体または抗原結合断片は、約１００ｎＭ以上（例えば、約１００ｎＭ以上、約５００ｎＭ以上、約１μＭ以上、約１０μＭ以上など）の濃度で提供された場合、ヒトＣＴＬＡ４のＣＤ８０及び／またはＣＤ８６への結合を完全に遮断する。本明細書で使用される場合、「完全な遮断」または「完全に遮断する」という用語は、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の結合を少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％など）低減する抗体または抗原結合断片の能力を指す。第１のタンパク質（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）及び第２のタンパク質（例えば、ヒトＣＤ８０またはヒトＣＤ８６）の結合を遮断する抗体または抗原結合断片の能力を測定する方法は、当該技術分野で既知であり、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、及びフローサイトメトリーによるもの（例えば、以下の実施例３を参照）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体は、イピリムマブよりもリガンド結合の遮断においてより低い活性を有する。
【００７９】
ＣＴＬＡ４抗体
いくつかの態様では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ４に結合する単離された抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、表面プラズモン共鳴によって測定される場合、１０００ｎＭ以下（例えば、５０ｎＭ以下、１０ｎＭ以下）のＫＤでヒトＣＴＬＡ４と結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、カニクイザル、マウス、ラット、及びイヌから選択される少なくとも１つの非ヒト種と交差反応性である。
【００８０】
いくつかの態様では、本開示は、ヒトＣＴＬＡ４のリガンド結合部位に類似したエピトープに特異的に結合する単離された抗体を提供する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４のＣＤ８０結合部位に類似したエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４のＣＤ８６結合部位に類似したエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４のリガンド結合部位（例えば、ＣＤ８０及び／またはＣＤ８６結合部位）に１つ以上のアミノ酸残基を含むエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、抗体は、イピリムマブのエピトープとは異なるヒトＣＴＬＡ４上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、エピトープは、ヒトＣＴＬＡ４のＣＣ’ループモチーフ中にアミノ酸残基を含まない。いくつかの実施形態では、エピトープは、ヒトＣＴＬＡ４のアミノ酸残基Ｌ１０６またはＩ１０８を含まない。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒトＣＴＬＡ４のアミノ酸残基Ｙ１０５及びＬ１０６を含むがＩ１０８は含まないエピトープに特異的に結合し、アミノ酸残基の番号付けは配列番号２０７に従う。
ＫＡＭＨＶＡＱＰＡＶＶＬＡＳＳＲＧＩＡＳＦＶＣＥＹＡＳＰＧＫＡＴＥＶＲＶＴＶＬＲＱＡＤＳＱＶＴＥＶＣＡＡＴＹＭＭＧＮＥＬＴＦＬＤＤＳＩＣＴＧＴＳＳＧＮＱＶＮＬＴＩＱＧＬＲＡＭＤＴＧＬＹＩＣＫＶＥＬＭＹＰＰＰＹＹＬＧＩＧＮＧＴＱＩＹＶＩＤＰＥ（配列番号２０７）
【００８１】
一態様では、本開示は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む単離された抗体を提供し、ａ）重鎖可変領域が、ＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３を含み、ＨＶＲ−Ｈ１が、式（Ｉ）：Ｘ１ＴＦＳＸ２ＹＸ３ＩＨＷＶ（配列番号１）（式中、Ｘ１はＦまたはＹであり、Ｘ２はＤまたはＧであり、Ｘ３はＡ、Ｇ、またはＷである）、式（ＩＩ）：ＹＳＩＸ１ＳＧＸ２Ｘ３ＷＸ４ＷＩ（配列番号２）（式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＨまたはＹであり、Ｘ３はＨまたはＹであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、またはＳである）、及び式（ＩＩＩ）：ＦＳＬＳＴＧＧＶＡＶＸ１ＷＩ（配列番号３）（式中、Ｘ１はＧまたはＳである）から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ２が、式（ＩＶ）：ＩＧＸ１ＩＸ２ＨＳＧＳＴＹＹＳＸ３ＳＬＫＳＲＶ（配列番号４）（式中、Ｘ１はＤまたはＥであり、Ｘ２はＳまたはＹであり、Ｘ３はＰまたはＱである）、式（Ｖ）：ＩＧＸ１ＩＳＰＳＸ２ＧＸ３ＴＸ４ＹＡＱＫＦＱＧＲＶ（配列番号５）（式中、Ｘ１はＩまたはＷであり、Ｘ２はＧまたはＳであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＫまたはＮである）、及び式（ＶＩ）：ＶＳＸ１ＩＳＧＸ２ＧＸ３Ｘ４ＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦ（配列番号６）（式中、Ｘ１はＡ、Ｇ、またはＳであり、Ｘ２はＳまたはＹであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＳまたはＴである）から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｈ３が、式（ＶＩＩ）：ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＦＤＸ５（配列番号７）（式中、Ｘ１はＧ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ２はＡ、Ｉ、またはＹであり、Ｘ３はＤ、Ｖ、またはＹであり、Ｘ４はＡ、Ｅ、またはＹであり、Ｘ５はＩまたはＹである）、式（ＶＩＩＩ）：ＡＲＸ１ＧＸ２ＧＹＦＤＸ３（配列番号８）（式中、Ｘ１はＤまたはＬであり、Ｘ２はＦまたはＹであり、Ｘ３はＶまたはＹである）、式（ＩＸ）：ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＡＸ５Ｘ６ＦＤＹ（配列番号９）（式中、Ｘ１はＬまたはＲであり、Ｘ２はＩまたはＰであり、Ｘ３はＡまたはＹであり、Ｘ４はＳまたはＴであり、Ｘ５はＴまたはＹであり、Ｘ６はＡまたはＹである）、及び式（Ｘ）：ＡＲＤＸ１Ｘ２Ｘ３ＧＳＳＧＹＹＸ４ＧＦＤＸ５（配列番号１０）（式中、Ｘ１はＩまたはＶであり、Ｘ２はＡまたはＨであり、Ｘ３はＰまたはＳであり、Ｘ４はＤまたはＹであり、Ｘ５はＦまたはＶである）から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、及び／またはｂ）軽鎖可変領域が、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３を含み、ＨＶＲ−Ｌ１が、式（ＸＩ）：ＲＡＳＱＸ１Ｘ２Ｘ３ＳＸ４ＬＸ５（配列番号１１）（式中、Ｘ１はＧまたはＳであり、Ｘ２はＩまたはＶであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＳまたはＹであり、Ｘ５はＡまたはＮである）、式（ＸＩＩ）：ＲＡＳＱＸ１ＶＸ２Ｘ３ＲＸ４ＬＡ（配列番号１２）（式中、Ｘ１はＳまたはＴであり、Ｘ２はＦ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ３はＧまたはＳであり、Ｘ４はＦまたはＹである）、及び式（ＸＩＩＩ）：ＲＡＳＸ１ＳＶＤＦＸ２ＧＸ３ＳＦＬＸ４（配列番号１３）（式中、Ｘ１はＥまたはＱであり、Ｘ２はＤ、Ｆ、Ｈ、またはＹであり、Ｘ３はＦ、Ｉ、またはＫであり、Ｘ４はＡ、Ｄ、またはＨである）から選択される式に従うアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ２が、式（ＸＩＶ）：Ｘ１ＡＳＸ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５ＧＸ６（配列番号１４）（式中、Ｘ１はＡまたはＤであり、Ｘ２はＮ、Ｓ、またはＴであり、Ｘ３はＬまたはＲであり、Ｘ４はＡ、Ｅ、またはＱであり、Ｘ５はＳまたはＴであり、Ｘ６はＩまたはＶである）に従うアミノ酸配列を含み、ＨＶＲ−Ｌ３が、式（ＸＶ）：ＹＣＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＰＸ７Ｔ（配列番号１５）（式中、Ｘ１はＥ、Ｑ、またはＶであり、Ｘ２はＨまたはＱであり、Ｘ３はＡ、Ｇ、Ｈ、Ｒ、またはＳであり、Ｘ４はＤ、Ｌ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ５はＥ、Ｇ、Ｐ、Ｑ、またはＳであり、Ｘ６はＬ、Ｔ、Ｖ、またはＷであり、Ｘ７はＦ、Ｌ、Ｐ、Ｗ、またはＹである）、式（ＸＶＩ）：ＹＣＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３ＷＰＰＷＴ（配列番号１６）（式中、Ｘ１はＳまたはＹであり、Ｘ２はＤまたはＹであり、Ｘ３はＱまたはＹである）、及び式（ＸＶＩＩ）：ＹＣＱＸ１ＹＸ２ＳＳＰＰＸ３ＹＴ（配列番号１７）（式中、Ｘ１はＨまたはＱであり、Ｘ２はＴまたはＶであり、Ｘ３はＥまたはＶである）から選択される式に従うアミノ酸配列を含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、抗体は、（ａ）配列番号１８〜２９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３０〜３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号４０〜５２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び／または（ｂ）配列番号５３〜６５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６〜６９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７０〜８１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、以下の表Ａに記載される例示的な抗体のいずれかについて示されるＨＶＲのうちの１、２、３、４、５、または６つ全てを含む。
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【００８３】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号５０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号８０のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号１８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号５１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６４のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号８１のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号２９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号５２のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７７のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。
【００８４】
いくつかの実施形態では、抗体は、ａ）配列番号８２〜９４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／またはｂ）配列番号９５〜１０７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８２〜９４から選択される配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／または配列番号９５〜１０７から選択される配列に対して少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、以下の表Ｂに記載される例示的な抗体のいずれかの重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、以下の表Ｂに記載される例示的な抗体のいずれかについて示される重鎖可変領域の１、２、もしくは３つ全てのＨＶＲ、及び／または軽鎖可変領域の１、２、もしくは３つ全てのＨＶＲを含む。
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【００８５】
いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８６のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号９９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１００のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８８のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０１のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号８９のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０４のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９３のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、配列番号９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び配列番号１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＣＴＬＡ４への結合に関して、（ａ）配列番号１８〜２９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３０〜３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号４０〜５２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び／または（ｂ）配列番号５３〜６５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６〜６９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７０〜８１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体と交差競合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＣＴＬＡ４への結合に関して、表Ａに記載される例示的な抗体のいずれかについて示されるＨＶＲのうちの１、２、３、４、５、または６つ全てを含む抗体と交差競合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＣＴＬＡ４への結合に関して、ａ）配列番号８２〜９４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／またはｂ）配列番号９５〜１０７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と交差競合する。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ヒトＣＴＬＡ４への結合に関して、表Ｂに記載される例示的な抗体のいずれかについて示されるＶＨ及び／またはＶＬを含む抗体と交差競合する。
【００８７】
本明細書に記載されるＣＴＬＡ４抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤなどの任意のクラスであり得る。いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスなどのＩｇＧクラスである。ＣＴＬＡ４抗体は、当該技術分野で既知の方法を使用して、あるクラスまたはサブクラスから別のクラスまたはサブクラスに変換することができる。所望のクラスまたはサブクラスの抗体を産生するための例示的な方法は、ＣＴＬＡ４抗体の重鎖をコードする核酸及びＣＴＬＡ４抗体の軽鎖をコードする核酸を単離し、ＶＨ領域をコードする配列を単離し、ＶＨ配列を所望のクラスまたはサブクラスの重鎖定常領域をコードする配列に連結し、細胞内で軽鎖遺伝子及び重鎖構築物を発現させ、ＣＴＬＡ４抗体を収集するステップを含む。本開示の抗体は、モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体であり得る。本開示の抗体は、単一特異性抗体または多重特異性（例えば、二重特異性、三重特異性など）抗体であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＬＡ４抗体は、１つ以上のＦｃ変異（例えば、ＡＤＣＣまたはＣＤＣ活性を調節（増加または減少）する）を含み得る。当該技術分野で既知の任意の好適なＦｃ変異は、本開示のＣＴＬＡ４抗体において使用され得る。
【００８８】
いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、第１及び第２の標的に結合する二重特異性抗体であり、第１の標的はヒトＣＴＬＡ４である。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は第１及び第２の標的に結合し、第１の標的はヒトＣＴＬＡ４であり、二重特異性抗体は、（ａ）配列番号１８〜２９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３０〜３９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び配列番号４０〜５２から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び／または（ｂ）配列番号５３〜６５から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６〜６９から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７０〜８１から選択されるアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は第１及び第２の標的に結合し、第１の標的はヒトＣＴＬＡ４であり、二重特異性抗体は、表Ａに記載される例示的な抗体のいずれかについて示されるＨＶＲのうちの１、２、３、４、５、または６つ全てを含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は第１及び第２の標的に結合し、第１の標的はヒトＣＴＬＡ４であり、二重特異性抗体は、ａ）配列番号８２〜９４から選択されるアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／またはｂ）配列番号９５〜１０７から選択されるアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、二重特異性抗体は第１及び第２の標的に結合し、第１の標的はヒトＣＴＬＡ４であり、二重特異性抗体は、表Ｂに記載される例示的な抗体のいずれかについて示されるＶＨ及び／またはＶＬを含む。いくつかの実施形態では、第２の標的は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ９５、ＣＤ１２０ａ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、Ｈｅｒ１、Ｈｅｒ２、Ｈｅｒ３、またはＢ７−Ｈ４である。
【００８９】
本開示の抗体は、従来のモノクローナル抗体方法論、例えば、標準的な体細胞ハイブリダイゼーション技術（例えば、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５（１９７５）を参照）、Ｂリンパ球のウイルス性または発がん性形質転換、または本明細書に詳細に記載されている組換え抗体技術（例えば、実施例１及び２を参照）を含む、当該分野で既知の任意の技術によって産生され得る。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９８３３３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）及び／またはＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９８２９９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されているライブラリー及び／または方法のいずれかを使用して産生される。
【００９０】
ハイブリドーマの産生は非常によく確立された手順である。ハイブリドーマを調製するための一般的な動物系は、マウス系である。融合のために免疫された脾細胞を単離するための免疫プロトコル及び技術は、当該技術分野で既知である。融合パートナー（例えば、マウス骨髄腫細胞）及び融合手順も既知である。本開示によって提供されるヒトＣＴＬＡ４抗体を作製するために使用され得る１つの周知の方法としては、ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）動物系の使用が含まれる。ＸｅｎｏＭｏｕｓｅ（商標）マウスは、ヒト免疫グロブリン重鎖及び軽鎖遺伝子座の大型断片を含む操作されたマウス系統であり、マウス抗体産生が欠乏している（例えば、Ｇｒｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ７：１３−２１、ＷＯ２００３／０４０１７０を参照）。動物はＣＴＬＡ４抗原で免疫化される。ＣＴＬＡ４抗原は単離された及び／または精製されたＣＴＬＡ４である。これは、ＣＴＬＡ４の断片、例えばＣＴＬＡ４の細胞外ドメインであり得る。動物の免疫化は、当該技術分野で既知の任意の方法によって行うことができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，１９９０を参照）。マウス、ラット、ヒツジ、ヤギ、ブタ、ウシ及びウマなどの非ヒト動物を免疫化する方法は、当該技術分野で周知である（例えば、上記のＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ、及び米国特許第５，９９４，６１９号を参照）。ＣＴＬＡ４抗原をアジュバントとともに投与して、免疫反応を刺激することができる。例示的なアジュバントには、完全または不完全フロイントアジュバント、ＲＩＢＩ（ムラミルジペプチド）、またはＩＳＣＯＭ（免疫刺激複合体）が含まれる。動物をＣＴＬＡ４抗原で免疫化した後、抗体を産生する不死化細胞株を、免疫化された動物から単離された細胞から調製する。免疫化後、動物を犠牲にし、リンパ節及び／または脾臓のＢ細胞を不死化する。細胞を不死化する方法には、細胞に発がん遺伝子を導入すること、細胞を発がんウイルスで屈曲すること、不死化細胞を選択する条件下で細胞を培養すること、細胞を発がん性または変異化合物に供すること、細胞を不死化細胞、例えば、骨髄腫細胞と融合させること、及び腫瘍抑制遺伝子を不活性化することが含まれるが、これらに限定されない（例えば、上記のＨａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅを参照）。骨髄腫細胞との融合が使用される場合、骨髄腫細胞は、好ましくは免疫グロブリンポリペプチドを分泌しない（非分泌細胞株）。不死化細胞は、ＣＴＬＡ４、その一部、またはＣＴＬＡ４を発現する細胞を使用してスクリーニングされる。以下でさらに考察するように、ＣＴＬＡ４抗体産生細胞、例えば、ハイブリドーマを選択し、クローニングして、強力な増殖、高い抗体産生、及び望ましい抗体特性を含む望ましい特性についてさらにスクリーニングする。ハイブリドーマは、同系の動物、免疫系が欠如している動物、例えば、ヌードマウスにおいてインビボで、または細胞培養においてインビトロで増殖することができる。ハイブリドーマを選択、クローニング、及び増殖する方法は、当業���に周知である。
【００９１】
本開示の抗体はまた、ファージ提示法または酵母提示法を使用して調製され得る。ヒト抗体を単離するためのそのような提示方法は、当該技術分野で確立されている（例えば、Ｋｎａｐｐｉｋ，ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６，５７−８６、Ｆｅｌｄｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２１：１６３−１７０を参照、また、下記の実施例１及び２の方法も参照されたい）。
【００９２】
抗原結合断片
いくつかの他の態様では、本開示は、本明細書に記載のＣＴＬＡ４抗体のいずれかの抗原結合断片を提供する。
【００９３】
抗原結合断片は、本明細書に記載される抗体のいずれかの任意の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、抗原結合断片は、（１）ＣＴＬＡ４抗体の軽鎖、（２）ＣＴＬＡ４抗体の重鎖、（３）ＣＴＬＡ４抗体の軽鎖からの可変領域、（４）ＣＴＬＡ４抗体の重鎖からの可変領域、（５）ＣＴＬＡ４抗体の１つ以上のＨＶＲ（例えば、１、２、３、４、５、もしくは６つのＨＶＲ）、または（６）ＣＴＬＡ４抗体の軽鎖からの３つのＨＶＲ及び重鎖からの３つのＨＶＲのアミノ酸配列を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、本開示は、表Ａ及びＢに列挙されたものから選択される抗体の抗原結合断片を提供する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＣＴＬＡ４抗体の抗原結合断片は、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ、及びＣＨ１ドメインからなる一価の断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、（ｖｉ）単離されたＣＤＲ、ならびに（ｖｉｉ）抗体のＶＨ領域と連結した抗体のＶＬ領域を含むポリペプチドである一本鎖抗体（ｓｃＦｖ）（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）を含む。
【００９６】
抗体誘導体
いくつかのさらなる態様では、本開示は、本明細書に記載のＣＴＬＡ４抗体のいずれかの誘導体を提供する。
【００９７】
いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、本開示の例示的な抗体（例えば、「親抗体」）のアミノ酸配列の修飾に由来し、親抗体のアミノ酸配列の全体的な分子構造を保存する。親抗体鎖の任意の領域、例えばフレームワーク領域、ＨＶＲ領域、または定常領域のアミノ酸配列を修飾することができる。修飾の種類には、親抗体の１つ以上のアミノ酸の置換、挿入、欠失、またはそれらの組み合わせが含まれる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、配列番号８２〜１０７のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＶＬまたはＶＨ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、配列番号１８〜２９のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＨＶＲ−Ｈ１アミノ酸配列領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、配列番号３０〜３９のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＨＶＲ−Ｈ２アミノ酸配列領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、配列番号４０〜５２のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＨＶＲ−Ｈ３アミノ酸配列領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、配列番号５３〜６５のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＨＶＲ−Ｌ１アミノ酸配列領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、配列番号６６〜６９のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＨＶＲ−Ｌ２アミノ酸配列領域を含む。いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、配列番号７０〜８１のいずれかに記載のアミノ酸配列と少なくとも６５％、少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるＨＶＲ−Ｌ３アミノ酸配列領域を含む。
【００９９】
いくつかの特定の実施形態では、誘導体は、配列番号１８〜１０７のいずれかに記載のアミノ酸配列に対する１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の保存的または非保存的置換、及び／または１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５個の付加及び／または欠失を含む。
【０１００】
アミノ酸置換は、保存的置換及び非保存的置換の両方を包含する。「保存的アミノ酸置換」という用語は、２つのアミノ酸が極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／または関連する残基の両親媒性などの特定の物理化学的特性において類似性を有する場合に、１つのアミノ酸を別のアミノ酸で置き換えることを意味する。例えば、典型的には、以下の群：（ａ）アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、及びメチオニンなどの非極性（疎水性）アミノ酸、（ｂ）グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、及びグルタミンなどの極性中性アミノ酸、（ｃ）アルギニン、リジン、ヒスチジンなどの正に帯電した（塩基性）アミノ酸、及び（ｄ）アスパラギン酸及びグルタミン酸などの負に帯電した（酸性）アミノ酸のそれぞれの中で置換を行うことができる。
【０１０１】
修飾は、ＨＶＲ、フレームワーク領域、または定常領域を含む、抗体のアミノ酸配列の任意の位置でなされ得る。一実施形態では、本開示は、本開示の例示的な抗体のＶＨ及びＶＬのＨＶＲ配列を含有するが、例示的な抗体のものとは異なるフレームワーク配列を含有する抗体誘導体を提供する。このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公開ＤＮＡデータベースまたは公開された参考文献から取得することができる。例えば、ヒト重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースまたは「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベース（Ｋａｂａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２（１９９１）、Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８（１９９２）、及びＣｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６（１９９４））に見られる。抗体誘導体の構築において使用され得るフレームワーク配列には、本開示の例示的な抗体によって使用されるフレームワーク配列と構造的に類似しているものが含まれる。例えば、例示的な抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、及びＨＶＲ−Ｈ３配列、ならびにＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２、及びＨＶＲ−Ｌ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖細胞系免疫グロブリン遺伝子において見出されるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植することができるか、あるいはＨＶＲ配列は、生殖系列配列と比較して１つ以上の変異を含有するフレームワーク領域に移植することができる。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、本開示の例示的な抗体のアミノ酸配列を含むキメラ抗体である。一例では、１つ以上の例示的な抗体からの１つ以上のＨＶＲを、マウスまたはラットなどの非ヒト動物からの抗体からのＨＶＲと組み合わせる。別の例では、キメラ抗体の全てのＨＶＲは、１つ以上の例示的な抗体に由来する。いくつかの特定の実施形態では、キメラ抗体は、例示的な抗体の重鎖可変領域からの１、２、もしくは３つのＨＶＲ、及び／または軽鎖可変領域からの１、２、もしくは３つのＨＶＲを含む。キメラ抗体は、当該技術分野で既知の従来的な方法を使用して生成することができる。
【０１０３】
別の種類の修飾は、ＶＨ及び／またはＶＬ鎖のＨＶＲ領域内のアミノ酸残基を変異させることである。部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発を行って変異（複数可）を導入することができ、抗体結合または他の目的の機能的特性に対する効果を、当該技術分野で既知のインビトロまたはインビボアッセイで評価することができる。典型的には、保存的置換が導入される。変異は、アミノ酸付加及び／または欠失であり得る。さらに、典型的には、ＨＶＲ領域内の１、２、３、４、または５つ以下の残基が変更される。いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、重鎖ＨＶＲ及び／または軽鎖ＨＶＲにおいて１、２、３、または４つのアミノ酸置換を含む。別の実施形態では、アミノ酸置換は、抗体中の１つ以上のシステインを別の残基、例えば、これらに限定されないが、アラニンまたはセリンに変更することである。システインは、標準または非標準のシステインであり得る。一実施形態では、抗体誘導体は、例示的な抗体のアミノ酸配列と比較して、重鎖ＨＶＲ領域に１、２、３、または４つの保存的アミノ酸置換を有する。
【０１０４】
また、ＶＨ及び／またはＶＬ領域内のフレームワーク残基に修飾を加えることもできる。典型的には、そのようなフレームワークバリアントは、抗体の免疫原性を低下させるために作製されている。１つのアプローチは、１つ以上のフレームワーク残基を、対応する生殖系列配列に「復帰変異」させることである。体細胞変異を受けた抗体は、抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含有し得る。そのような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって特定することができる。フレームワーク領域配列をそれらの生殖系列構成に戻すために、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲ媒介変異誘発によって、体細胞変異を生殖系列配列に「復帰変異」させることができる。
【０１０５】
さらに、修飾はまた、例示的な抗体のＦｃ領域内でもなされ、典型的には、抗体の１つ以上の機能的特性、例えば、血清半減期、補体結合、Ｆｃ受容体結合、及び／または抗原依存性細胞傷害を変更し得る。一例では、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域内のシステイン残基の数が変化するように、例えば、増加または減少するように改変される。このアプローチについては、米国特許第５，６７７，４２５号にさらに記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域のシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖の構築を容易にするため、または抗体の安定性を増加もしくは低下させるために変更される。別の場合では、抗体のＦｃヒンジ領域が変異して、抗体の生物学的半減期が減少する。
【０１０６】
さらに、本開示の抗体は、当該技術分野で既知の日常的な実験に従って、その潜在的なグリコシル化部位またはパターンを変更するために改変され得る。別の態様では、本開示は、可変領域におけるグリコシル化のパターンを変化させる、軽鎖または重鎖の可変領域における少なくとも１つの変異を含有するＣＴＬＡ４抗体の誘導体を提供する。このような抗体誘導体は、抗原の結合に関して増加した親和性及び／改変された特異性を有し得る。変異は、Ｖ領域に新規のグリコシル化部位を追加するか、１つ以上のＶ領域グリコシル化部位（複数可）の位置を変更するか、または既存のＶ領域グリコシル化部位を除去し得る。一実施形態では、本開示は、重鎖可変領域のアスパラギンに潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を有するＣＴＬＡ４抗体の誘導体を提供し、１つの重鎖可変領域の潜在的なＮ結合型グリコシル化部位が除去される。別の実施形態では、本開示は、重鎖可変領域のアスパラギンに潜在的なＮ結合型グリコシル化部位を有するＣＴＬＡ４抗体の誘導体を提供し、両方の重鎖可変領域の潜在的なＮ結合型グリコシル化部位が除去される。抗体のグリコシル化パターンを変更する方法は、当該技術分野で既知であり、その開示が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，９３３，３６８号に記載されているものなどがある。
【０１０７】
別の態様では、本開示は、追加の分子実体に連結された、本明細書に記載されているＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片を含む抗体誘導体を提供する。追加の分子実体の例には、医薬品、ペプチドまたはタンパク質、検出剤または標識、及び抗体が含まれる。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、医薬品に連結された本開示の抗体を含む。医薬品の例には、細胞傷害剤または他のがん治療剤、及び放射性同位元素が含まれる。細胞傷害剤の具体例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭素エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピュロマイシン、及びそれらの類似体または相同体が挙げられる。また、治療剤としては、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラシクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も挙げられる。診断的または治療的に使用するために抗体にコンジュゲートすることができる放射性同位元素の例としては、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、及びルテチウム１７７が挙げられるが、これらに限定されない。抗体を医薬品に連結する方法は、様々なリンカー技術を使用する等の方法が当該技術分野で知られている。リンカーの種類の例としては、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、及びペプチド含有リンカーが挙げられる。治療剤を抗体に連結するためのリンカー及び方法のさらなる考察については、例えば、Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５（２００３）、Ｔｒａｉｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７（２００３）、Ｐａｙｎｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２（２００３）、Ａｌｌｅｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０−７６３（２００２）、Ｐａｓｔａｎ  ａｎｄ  Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９−１０９１（２００２）、Ｓｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４を参照されたい。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、抗体誘導体は、抗体二量体、三量体、または単量体抗体の高次オリゴマーなどのＣＴＬＡ４抗体の多量体型である、ＣＴＬＡ４抗体多量体である。抗体多量体内の個々の単量体は、同一であっても異なっていてもよい。さらに、多量体内の個々の抗体は、同じまたは異なる結合特異性を有し得る。抗体の多量体化は、抗体の自然な凝集によって達成され得る。例えば、精製された抗体調製物（例えば、精製されたＩｇＧ４分子）の一部の割合は、抗体ホモ二量体及び他のより高次の抗体多量体を含有するタンパク質凝集体を自発的に形成する。あるいは、抗体ホモ二量体は、架橋剤を使用することによって等、当該技術分野で既知の化学結合技術によって形成し得る。好適な架橋剤には、適切なスペーサーによって単離された２つの明確な反応基を有するヘテロ二官能性であるもの（例えば、ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル、スクシンイミジル４−（マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート、及びＮ−スクシンイミジルＳ−アセチルチオ−アセテート）、またはホモ二官能性であるもの（例えば、ジスクシンイミジルスベレート）が含まれる。そのようなリンカーは、例えば、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬから市販されている。抗体はまた、当該技術分野で既知の組換えＤＮＡ技術を介して多量体化するように作製され得る。
【０１１０】
本開示によって提供される他の抗体誘導体の例には、単鎖抗体、ダイアボディ、ドメイン抗体、ナノボディ、及びユニボディが含まれる。「単鎖抗体」（ｓｃＦｖ）は、ＶＨドメインに連結されたＶＬドメインを含む単一のポリペプチド鎖からなり、ＶＬドメイン及びＶＨドメインは対合して一価分子を形成する。一本鎖抗体は、当該技術分野で既知の方法に従って調製することができる（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照）。「ダイアボディ」は２つの鎖からなり、各鎖は、短いペプチドリンカーによって接続された同じポリペプチド鎖上の軽鎖可変領域に接続された重鎖可変領域を含み、同じ鎖上の２つの領域は互いに対合しないが、他方の鎖上に相補的ドメインを有し、二重特異性分子を形成する。ダイアボディを調製する方法は当該技術分野で既知である（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  Ｐ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８、及びＰｏｌｊａｋ  Ｒ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照）。ドメイン抗体（ｄＡｂ）は抗体の小さな機能的結合単位であり、抗体の重鎖または軽鎖のいずれかの可変領域に対応している。ドメイン抗体は、細菌、酵母、及び哺乳動物細胞系においてよく発現する。ドメイン抗体及びその産生方法のさらなる詳細は、当該技術分野で既知である（例えば、米国特許第６，２９１，１５８号、同第６，５８２，９１５号、同第６，５９３，０８１号、同第６，１７２，１９７号、同第６，６９６，２４５号、欧州特許第０３６８６８４号及び同第０６１６６４０号、ＷＯ０５／０３５５７２、ＷＯ０４／１０１７９０、ＷＯ０４／０８１０２６、ＷＯ０４／０５８８２１、ＷＯ０４／００３０１９、及びＷＯ０３／００２６０９を参照）。ナノボディは、抗体の重鎖に由来する。ナノボディは、典型的には、単一の可変ドメイン及び２つの定常ドメイン（ＣＨ２及びＣＨ３）を含み、元の抗体の抗原結合能力を保持する。ナノボディは、当該技術分野で既知の方法によって調製することができる（例えば、米国特許第６，７６５，０８７号、米国特許第６，８３８，２５４号、ＷＯ０６／０７９３７２を参照）。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体の１つの軽鎖及び１つの重鎖からなる。ユニボディは、ＩｇＧ４抗体のヒンジ領域の除去により作製され得る。ユニボディ及びそれらを調製する方法のさらなる詳細は、ＷＯ２００７／０５９７８２に見出すことができる。
【０１１１】
ＩＶ．ＣＴＬＡ４を標的化する活性化可能な結合ポリペプチド
本開示はまた、部分的に、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体のいずれかを含む活性化可能抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体結合断片、及び／または抗ＣＴＬＡ４抗体誘導体）、活性化可能抗ＣＴＬＡ４抗体の抗原結合断片、及び／または活性化可能抗ＣＴＬＡ４抗体の誘導体を含む、ヒトＣＴＬＡ４に結合する精度／状況依存性活性化可能結合ポリペプチド（すなわち、活性化可能抗体）に関する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の活性化可能抗ＣＴＬＡ４抗体は、改善された安全性プロファイルを有し得る。例えば、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体は、脾臓重量変化によって評価された、より良好な安全域を有し得る。投与される薬物用量の増加に伴う脾臓サイズの変化をベンチマークとして使用して、候補者が使用した薬物の安全域を評価する。図４８Ａ〜Ｂに示すように、本明細書に記載の活性化可能抗ＣＴＬＡ４抗体は、親抗体（マスキング部分を有さない抗体）と比較して、より良好な安全域を有する。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、（ａ）マスキング部分（ＭＭ）、（ｂ）切断可能部分（ＣＭ）、及び（ｃ）標的結合部分（ＴＢＭ）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭは、本明細書に記載のマスキング部分のいずれかである。いくつかの実施形態では、ＣＭは、本明細書に記載の切断可能部分のいずれかである。いくつかの実施形態では、ＴＢＭは、本明細書に記載の標的結合部分（例えば、抗体軽鎖可変領域及び／または抗体重鎖可変領域、例えば、本明細書に記載の抗ＣＴＬＡ４抗体のいずれかのＶＨ及び／またはＶＬを含む、標的結合部分（ＴＢＭ））のいずれかである。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＣＭが切断されていない場合、活性化可能抗体のその標的（例えば、ヒトＣＴＬＡ４またはヒトＣＤ１３７）への結合を妨害及び／または阻害する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＭが切断されている場合、その標的（例えば、ヒトＣＴＬＡ４またはヒトＣＤ１３７）に結合することができる。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）、及び標的結合部分（ＴＢＭ）を含むポリペプチドであって、ＭＭが本明細書に記載のマスキング部分のいずれかであり、ＣＭが本明細書に記載の切断可能部分のいずれかであり、ＴＢＭが抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、ポリペプチド、ならびに（ｂ）抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、（ａ）Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）、及び標的結合部分（ＴＢＭ）を含むポリペプチドであって、ＭＭが本明細書に記載のマスキング部分のいずれかであり、ＣＭが本明細書に記載の切断可能部分のいずれかであり、ＴＢＭが抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、ポリペプチド、ならびに（ｂ）抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１１５】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）、切断可能部分（ＣＭ）、及び標的結合部分（ＴＢＭ）を含むポリペプチドを含み、ＭＭは本明細書に記載のマスキング部分のいずれかであり、ＣＭは本明細書に記載の切断可能部分のいずれかであり、ＴＢＭは抗体重鎖可変領域（ＶＨ）及び抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１１６】
「活性化可能結合ポリペプチド」、「ＡＢＰ」、または「活性化可能抗体」という用語は、標的結合部分（ＴＢＭ）、切断可能部分（ＣＭ）、及びマスキング部分（ＭＭ）を含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、ＴＢＭは、標的に結合するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＢＭは、抗体またはその抗体断片の抗原結合ドメイン（ＡＢＤ）（例えば、本明細書中に記載される抗体または抗原結合断片のいずれか）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の重鎖可変領域ＨＶＲの１、２、または３つを含む重鎖可変領域、及び本明細書に記載の軽鎖可変領域ＨＶＲの１、２、または３つを含む軽鎖可変領域（例えば、表Ａに示されるような例示的な抗体のいずれかの６つ全てのＨＶＲを含む、表Ａに示されるような重鎖可変領域ＨＶＲ配列の１、２、もしくは３つ、及び／または軽鎖可変領域ＨＶＲ配列の１、２、もしくは３つ）を含む。いくつかの実施形態では、抗原結合ドメインは、本明細書に記載の重鎖可変領域配列のいずれかを含む重鎖可変領域、及び本明細書に記載の軽鎖可変領域配列のいずれかを含む軽鎖可変領域（例えば、表Ｂに示されるような重鎖可変領域配列及び／または軽鎖可変領域配列）を含む。いくつかの実施形態では、ＴＢＭ（例えば、ＡＢＤを含む）は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）及び抗体重鎖可変領域（ＶＨ）を含み、ＶＨ及びＶＬは、ＭＭの非存在下で標的に結合する結合ドメインを形成する。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、例えば、ｓｃＦｖにおいて共有結合される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、共有結合されない。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬは、Ｆａｂ断片を形成する。いくつかの実施形態では、ＶＨは抗体重鎖定常領域に連結され、ＶＬは抗体軽鎖定常領域に連結される。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）−切断可能部分（ＣＭ）−ＶＬの構造を含むポリペプチドを含み、活性化可能抗体は、ＶＨを含む第２のポリペプチドをさらに含む（例えば、Ｆａｂ断片）。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）−切断可能部分（ＣＭ）−ＶＬ−ＶＨの構造を含むポリペプチドを含む（例えば、ｓｃＦｖ）。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）−切断可能部分（ＣＭ）−ＶＨの構造を含むポリペプチドを含み、活性化可能抗体は、ＶＬを含む第２のポリペプチドをさらに含む（例えば、Ｆａｂ断片）。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、マスキング部分（ＭＭ）−切断可能部分（ＣＭ）−ＶＨ−ＶＬの構造を含むポリペプチドを含む（例えば、ｓｃＦｖ）。
【０１１８】
ＣＭは、一般的に、切断可能な、例えば、酵素の基質として機能するアミノ酸配列、及び／または還元可能なジスルフィド結合を形成することができるシステイン−システイン対を含む。したがって、「切断」、「切断可能」、「切断された」などの用語がＣＭに関連して使用される場合、この用語は、例えば、プロテアーゼによる酵素的切断、ならびに還元剤への曝露から生じる得るジスルフィド結合の還元によるシステイン−システイン対間のジスルフィド結合の破壊を包含する。
【０１１９】
ＭＭは、活性化可能抗体のＣＭが無傷である（例えば、対応する酵素によって切断されない、及び／または未還元システイン−システインジスルフィド結合を含有する）場合、アミノ酸配列を指し、ＭＭは、ＴＢＭのその標的への結合を妨害または阻害する。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＴＢＭのその標的への結合を非常に効率的に妨害または阻害するので、ＴＢＭのその標的への結合は極めて低い、及び／または検出限界より低い（例えば、結合は、ＥＬＩＳＡまたはフローサイトメトリーアッセイでは検出することができない）。ＣＭのアミノ酸配列は、ＭＭと重複してもよいし、ＭＭ内に含まれてもよい。便宜上、「ＡＢＰ」または「活性化可能抗体」は、それらの非切断（または「天然」）状態、ならびにそれらの切断状態の両方におけるＡＢＰまたは活性化可能抗体を指すために本明細書で使用されることが留意されるべきである。いくつかの実施形態では、切断されたＡＢＰは、（例えば、ＭＭが共有結合（例えば、システイン残基間のジスルフィド結合）によってＡＢＰに結合されていない場合、）例えば、プロテアーゼによるＣＭの切断に起因してＭＭを欠き、少なくともＭＭの放出をもたらす可能性があることが当業者には明らかであろう。例示的なＡＢＰは、以下にさらに詳細に記載される。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、その標的（例えば、不活性な活性化可能抗体）への結合に関して、標的結合部分を妨害、閉塞、その能力を低下、防止、阻害、または競合する。いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、ポリペプチドが活性化（例えば、ｐＨの変化（上昇または低下）によって活性化、温度変化（上昇または低下）によって活性化、第２の分子（小分子またはタンパク質リガンドなど）と接触した後に活性化など）されていない場合にのみ、その標的への結合に関して、標的結合部分を妨害、閉塞、低下、防止、阻害、または競合する。いくつかの実施形態では、活性化は、切断部分内のポリペプチドの切断を誘導する。いくつかの実施形態では、活性化がポリペプチドの立体配座変化（例えば、マスキング部分（ＭＭ）の転置）を誘導することにより、マスキング部分が活性化可能抗体のその標的への結合をそれ以上妨げないようにする。いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、切断可能部分（ＣＭ）内で切断する１つ以上のプロテアーゼによって切断可能部分（ＣＭ）が切断されていない場合にのみ、その標的への結合に関して、標的結合部分を妨害、閉塞、その能力を低下、防止、阻害、または競合する。いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、活性化前に少なくとも約２．０（例えば、少なくとも約２．０、少なくとも約３．０、少なくとも約４．０、少なくとも約５．０、少なくとも約６．０、少なくとも約７．０、少なくとも約８．０、少なくとも約９．０、少なくとも約１０、少なくとも約２５、少なくとも約５０、少なくとも約７５、少なくとも約１００、少なくとも約１５０、少なくとも約２００、少なくとも約３００、少なくとも約４００、少なくとも約５００など）のマスキング効率を有する。いくつかの実施形態では、マスキング効率は、マスキング部分（ＭＭ）を欠くポリペプチドのその標的への結合に対する親和性と比較した、（活性化前の）マスキング部分を含む活性化可能抗体のその標的への結合に対する親和性における差異（例えば、マスキング部分（ＭＭ）を欠く親抗体と比較した、（活性化前の）マスキング部分（ＭＭ）を含む活性化可能抗体の標的抗原（ＣＴＬＡ４など）に対する親和性における差異、または活性化後の活性化可能抗体の標的抗原に対する親和性と比較した、（活性化前の）マスキング部分（ＭＭ）を含む活性化可能抗体の標的抗原（ＣＴＬＡ４など）に対する親和性における差異）によって測定される。いくつかの実施形態では、マスキング効率は、（活性化前の）マスキング部分（ＭＭ）を含む活性化可能抗体の結合のＥＣ５０を、親抗体のＥＣ５０で除算することによって測定される（例えば、ＥＬＩＳＡによってＥＣ５０を測定することによって、例えば、実施例８の方法を参照）。いくつかの実施形態では、マスキング効率は、活性化後のマスキング部分（ＭＭ）を含む活性化可能抗体のその標的への結合に対する親和性と比較した、活性化前のマスキング部分（ＭＭ）を含む活性化可能抗体のその標的への結合に対する親和性における差異（例えば、活性化後の活性化可能抗体と比較した、活性化前の活性化可能抗体の標的抗原（ＣＴＬＡ４など）に対する親和性における差異）によって測定される。いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は標的結合部分（ＴＢＭ）に結合し、活性化可能抗体がその標的（例えば、「不活性な」活性化可能抗体）に結合するのを防ぐ。いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、その標的に対する標的結合部分（ＴＢＭ）の解離定数よりも大きい、標的結合部分（ＴＢＭ）への結合についての解離定数を有する。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、活性化可能抗体が活性化（例えば、切断可能部分（ＣＭ）内を切断する１つ以上のプロテアーゼでの処理によって活性化、ｐＨの変化（上昇または低下）によって活性化、温度変化（上昇または低下）によって活性化、第２の分子（酵素またはタンパク質リガンドなど）と接触した後に活性化など）された後、その標的への結合に関して、標的結合部分（ＴＢＭ）を妨害、閉塞、その能力を低下、防止、阻害、または競合しない。いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、切断可能部分（ＣＭ）が、切断可能部分（ＣＭ）内を切断する１つ以上のプロテアーゼによって切断された後、その標的への結合に関して、標的結合部分（ＴＢＭ）を妨害、閉塞、その能力を低下、防止、阻害、または競合しない。いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、活性化後、最大で約１．７５（例えば、最大で約１．７５、最大で約１．５、最大で約１．４、最大で約１．３、最大で約１．２、最大で約１．１、最大で約１．０、最大で約０．９、最大で約０．８、最大で約０．７、最大で約０．６、または最大で約０．５など）のマスキング効率を有する（例えば、親抗体の親和性と比較した、活性化後の活性化可能抗体の相対親和性）。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、固定位置に一対のシステイン残基を含み、活性化可能抗体が制約された立体配座を有することを確実にし、及び／または化学的に不安定な残基（メチオニンまたはトリプトファンなど）をほとんどもしくは全く保有しないマスキング部分（ＭＭ）を含む。有利なことに、固定位置に一対のシステイン残基を含めることは、活性化可能抗体が制約された立体配座を有することを確実にし、結合親和性及び／または特異性の増加を示す傾向がある。さらに、本開示の活性化可能抗体は、メチオニンまたはトリプトファンなどの製造プロセスにとって好ましくない残基をほとんどまたは全く含まないマスキング部分を含んでいた。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、状況依存性である（例えば、特定の状況（プロテアーゼに富む腫瘍微小環境など）において活性化される（それらの標的にのみ結合することができる））。いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、より伝統的な非活性化可能抗体よりも改善された安全性を提供する（例えば、毒性の低下を示し、多くの臓器の重量に有意な変化を誘導せず、肝臓病理組織学、血液学、及び／または血液生化学を変化させないなど）。いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、より伝統的な非活性化可能抗体と比較して、改善された薬物動態特性（例えば、より長いインビボ半減期）を有する。
【０１２４】
抗ＣＴＬＡ４活性化可能抗体活性
いくつかの実施形態では、本開示は、活性型である場合にヒトＣＴＬＡ４に結合する活性化可能抗体に関する（例えば、活性化可能抗体は、（例えば、１つ以上のプロテアーゼを用いた）切断可能部分での切断後に活性であるが、（例えば、１つ以上のプロテアーゼを用いた）切断可能部分での切断前は不活性である）。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、以下の機能的特性：（ａ）ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４に５００ｎＭ以下、例えば、約１０ｎＭ以下のＫＤで結合する、（ｂ）ヒトＣＴＬＡ４に対してアンタゴニスト活性を有する、（ｃ）１００ｎＭまでの濃度でヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ９５、ＣＤ１２０ａ、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＢＴＬＡ、ＶＩＳＴＡ、ＩＣＯＳ、及び／またはＢ７−Ｈ４に結合しない、（ｄ）サル、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４と交差反応性である、（ｅ）（例えば、Ｔｒｅｇに対する）ＡＤＣＣ効果を誘導する、（ｆ）ヒトＰＢＭＣを活性化する（例えば、ＩＬ−２及び／またはＩＦＮγの分泌を刺激する）、（ｇ）腫瘍細胞の増殖を阻害することができる、（ｈ）がんに対する治療効果を有する、ならびに（ｉ）ヒトＣＴＬＡ４のヒトＣＤ８０及び／またヒトＣＤ８６への結合を阻害する、のうちの少なくとも１つ（例えば、少なくとも１つ、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、または９つ全て）を有する。また、ヒトＣＴＬＡ４への結合に関して、本明細書に記載のＣＴＬＡ４標的活性化可能抗体及び／または抗ＣＴＬＡ４抗体のうちの１つ以上と競合または交差競合する１つ以上の活性化可能抗体も本明細書に提供される。
【０１２５】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、不活性型である場合、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４に約５００ｎＭ以上のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４に約５００ｎＭ以下（例えば、約５００ｎＭ以下、約４５０ｎＭ以下、約４００ｎＭ以下、約３５０ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約２５０ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約１５０ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約９０ｎＭ以下、約８０ｎＭ以下、約７０ｎＭ以下、約６０ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約４０ｎＭ以下、約３０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約２０ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下、約０．１ｎＭ以下など）のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、ヒト、カニクイザル、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４に約３５０ｎＭ以下のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、ヒトＣＴＬＡ４に約１００ｎＭ以下のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、ヒトＣＴＬＡ４に約５０ｎＭ以下のＫＤで結合する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、ヒトＣＴＬＡ４に約１０ｎＭ以下のＫＤで結合する。活性化可能抗体のＫＤを測定する方法は、例えば、表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定、フィルター結合アッセイ、ＥＭＳＡなどによるものを含む、当該技術分野で既知の任意の方法を使用して実施することができる。いくつかの実施形態では、ＫＤは、ＥＬＩＳＡによって測定される（例えば、以下の実施例を参照）。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、不活性型である場合、ヒトＣＴＬＡ４に対してアンタゴニスト活性を有さない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、ヒトＣＴＬＡ４に対してアンタゴニスト活性を有する（例えば、ＡＤＣＣ効果を（例えば、Ｔｒｅｇに対して）誘導し、ＰＢＭＣを（例えば、ＩＬ−２及び／またはＩＦＮγ分泌を活性化、誘導、及び／または刺激することによって）活性化し、ヒトＣＴＬＡ４のヒトＣＤ８０及び／またはヒトＣＤ８６への結合を遮断する等）。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、ヒトＣＴＬＡ４の１つ以上の活性を抑制する（例えば、ヒトＣＴＬＡ４を発現する細胞（例えば、ヒト細胞）が活性化可能抗体によって接触されると、ヒトＣＴＬＡ４の１つ以上の活性を抑制する）。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、不活性型である場合、サル（例えば、カニクイザル）、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４と交差反応性ではない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、サル（例えば、カニクイザル）、マウス、ラット、及び／またはイヌＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、サルＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、マウスＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、ラットＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、イヌＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、サル及びマウスＣＴＬＡ４；サル及びラットＣＴＬＡ４；サル及びイヌＣＴＬＡ４；マウス及びラットＣＴＬＡ４；マウス及びイヌＣＴＬＡ４；ラット及びイヌＣＴＬＡ４；サル、マウス、及びラットＣＴＬＡ４；サル、マウス、及びイヌＣＴＬＡ４；サル、ラット、及びイヌＣＴＬＡ４；マウス、ラット、及びイヌＣＴＬＡ４；またはサル、マウス、ラット、及びイヌＣＴＬＡ４と交差反応性である。いくつかの実施形態では、活性化可能な結合ポリペプチドは、活性型である場合、約３５０ｎＭ（例えば、約１ｎＭ、約１０ｎＭ、約２５ｎＭ、約５０ｎＭ、約７５ｎＭ、約１００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２５０ｎＭ、約３００ｎＭ、約３５０ｎＭ）で交差反応性である。交差反応性を測定する方法は当該技術分野で既知であり、表面プラズモン共鳴、ＥＬＩＳＡ、等温滴定熱量測定、フィルター結合アッセイ、ＥＭＳＡなどを含むが、これらに限定されない。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、不活性型である場合、（例えば、ＴｒｅｇなどのＣＴＬＡ４発現ヒト細胞に対して）ＡＤＣＣ効果を誘導しない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、不活性型である場合、対照結合ポリペプチド（例えば、親抗体）と比較して（例えば、ＴｒｅｇなどのＣＴＬＡ４発現ヒト細胞に対して）ＡＤＣＣ効果を減少させる。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、（例えば、ＴｒｅｇなどのＣＴＬＡ４発現に対して）ＡＤＣＣ効果を誘導する。ＡＤＣＣ効果を測定する方法（例えば、インビトロ法）は当該技術分野で既知であり、以下の実施例に記載される方法によるものを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、不活性型である場合、対照（例えば、親抗体）と比較して約１０％未満でＡＤＣＣ効果を誘導する（例えば、約１０％未満、約５％未満、約１％未満などでＡＤＣＣ効果を誘導する）。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、活性型である場合、対照（例えば、アイソタイプ対照）と比較して約１０％超でＡＤＣＣ効果を誘導する（例えば、約１０％超、約１５％超、約２０％超、約２５％超、約３０％超、約３５％超、約４０％超などでＡＤＣＣ効果を誘導する）。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、腫瘍細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）及び／または増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）は、活性化可能抗体と接触していない対応する腫瘍細胞と比較して（あるいはアイソタイプ対照抗体と接触している対応する腫瘍細胞と比較して）、活性化可能抗体と接触している場合、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９９％）で阻害される。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、対象に活性化可能抗体が投与されると、対象の腫瘍体積を減少させることができる。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、対象における初期腫瘍体積と比較して（例えば、活性化可能抗体の投与前に、アイソタイプ対照抗体を投与された対象における対応する腫瘍と比較して）、少なくとも約５％（例えば、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９９％）で対象における腫瘍体積を減少させることができる。腫瘍細胞増殖（ｇｒｏｗｔｈ）／増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、腫瘍体積、及び／または腫瘍阻害をモニターする方法は当該技術分野で既知であり、例えば、以下の実施例に記載される方法によるものを含む。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、がんに対して治療効果を有する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、がんの１つ以上の徴候または症状を軽減する。いくつかの実施形態では、がんに罹患している対象は、活性化可能抗体を投与されると、部分寛解または完全寛解する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、本開示は、活性型である場合、ヒトＣＴＬＡ４への結合に関して、ａ）配列番号２３のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ１、配列番号３５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ２、配列番号４５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｈ３、及び／またはｂ）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ１、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び配列番号７５のアミノ酸配列を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む抗体と競合または交差競合する、単離された活性化可能抗体を提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、活性型である場合、ヒトＣＴＬＡ４への結合に関して、ａ）配列番号８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域、及び／またはｂ）配列番号１００のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域を含む抗体と競合または交差競合する、単離された活性化可能抗体を提供する。抗体との結合に関して競合または交差競合する活性化可能抗体の能力は、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、またはフローサイトメトリーなどの当該技術分野で既知の標準的な結合アッセイを使用して決定することができる。例えば、（例えば、上記の）抗体が飽和条件下でヒトＣＴＬＡ４に結合することを可能にし、次いで、（活性型である場合の）試験活性化可能抗体のＣＴＬＡ４に結合する能力を測定することができる。試験活性化可能抗体が抗体と同時にＣＴＬＡ４に結合することができる場合、試験活性化可能抗体は抗体とは異なるエピトープに結合する。しかしながら、試験活性化可能抗体が同時にＣＴＬＡ４に結合することができない場合、試験活性化可能抗体は、同じエピトープ、重複するエピトープ、または抗体によって結合されたエピトープに非常に近接するエピトープに結合する。この実験は、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＦＡＣＳ、または表面プラズモン共鳴などの様々な方法を使用して実施することができる。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、（不活性型である場合、）ＣＴＬＡ４と１つ以上のその結合パートナー（例えば、ヒトＣＴＬＡ４及びヒトＣＤ８０、ヒトＣＴＬＡ４及びヒトＣＤ８６）との間の結合を阻害しない。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、（活性型である場合、）ＣＴＬＡ４と１つ以上のその結合パートナー（例えば、ヒトＣＴＬＡ４及びヒトＣＤ８０、ヒトＣＴＬＡ４及びヒトＣＤ８６）との間の結合を阻害する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＴＬＡ４とそのリガンドとの間の結合をインビトロで阻害する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０及び／またはＣＤ８６への結合を阻害するための、約５００ｎＭ以下（例えば、約５００ｎＭ以下、約４００ｎＭ以下、約３００ｎＭ以下、約２００ｎＭ以下、約１００ｎＭ以下、約５０ｎＭ以下、約２５ｎＭ以下、約１０ｎＭ以下、約１ｎＭ以下など）の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＣＴＬＡ４のＣＤ８０及び／またはＣＤ８６への結合を阻害するための、約１００ｎＭ以下の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を有する。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、約１００ｎＭ以上（例えば、約１００ｎＭ以上、約５００ｎＭ以上、約１μＭ以上、約１０μＭ以上など）の濃度で提供された場合、ヒトＣＴＬＡ４のＣＤ８０及び／またはＣＤ８６への結合を完全に阻害する。本明細書で使用される場合、「完全な阻害」または「完全に阻害する」という用語は、第１のタンパク質と第２のタンパク質との間の結合を少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％など）低減する活性化可能抗体の能力を指す。第１のタンパク質（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）及び第２のタンパク質（例えば、ヒトＣＤ８０またはヒトＣＤ８６）の結合を阻害するポリペプチドの能力を測定する方法は、当該技術分野で既知であり、ＢＩＡｃｏｒｅ分析、ＥＬＩＳＡアッセイ、及びフローサイトメトリーによるものが含まれるが、これらに限定されない。
【０１３３】
マスキング部分（ＭＭ）
いくつかの実施形態では、本開示は、マスキング部分（ＭＭ）を含む活性化可能抗体に関する。いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、式（ＸＶＩＩＩ）：ＸｍＣＸｎＣＺｏ（配列番号１３４）に従うアミノ酸配列を含み、式中、ｍは２〜１０であり、ｎは３〜１０であり、ｏは１〜１０であり、各Ｘは独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、各Ｚは独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＸはＷ、Ｍ、及び／またはＣではない。いくつかの実施形態では、式（ＸＶＩＩＩ）のＸｍにおける各Ｘは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸であり、及び／または式（ＸＶＩＩＩ）のＸｎにおける各Ｘは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、ＭＭは、式（ＸＸ）：（ＮＮＫ）ｍＴＧＹ（ＮＮＫ）ｎＴＧＹ（ＮＨＣ）ｏ（配列番号１３６）に従うポリヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドを含み、式中、各Ｎは独立して、Ａ、Ｇ、Ｔ、またはＣであり、各Ｋは独立して、ＴまたはＧであり、各Ｙは独立して、ＴまたはＣであり、各Ｈは独立して、Ａ、Ｔ、またはＣである。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、式（ＸＩＸ）：ＺｍＣＺｎＣＺｏ（配列番号１３５）に従うアミノ酸配列を含み、式中、ｍは２〜１０であり、ｎは３〜１０であり、ｏは１〜１０であり、各Ｚは独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１３５】
いくつかの実施形態では、ｍは、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１０、８〜９、または９〜１０である。いくつかの実施形態では、ｍは６〜８である。いくつかの実施形態では、ｍは３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、ｍは６である。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、ｎは、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１０、８〜９、または９〜１０である。いくつかの実施形態では、ｎは６〜８である。いくつかの実施形態では、ｎは３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、ｎは６である。いくつかの実施形態では、ｎは８である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、ｏは、１〜１０、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、１〜４、１〜３、１〜２、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、２〜５、２〜４、２〜３、３〜１０、３〜９、３〜８、３〜７、３〜６、３〜５、３〜４、４〜１０、４〜９、４〜８、４〜７、４〜６、４〜５、５〜１０、５〜９、５〜８、５〜７、５〜６、６〜１０、６〜９、６〜８、６〜７、７〜１０、７〜９、７〜８、８〜１０、８〜９、または９〜１０である。いくつかの実施形態では、ｏは１〜２である。いくつかの実施形態では、ｏは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。いくつかの実施形態では、ｏは２である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、式（ＸＸＩ）：Ｚ６ＣＸ６ＣＺ２（配列番号１３７）に従うアミノ酸配列を含み、式中、各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、式（ＸＸＩＩ）：Ｚ６ＣＸ８ＣＺ２（配列番号１３８）に従うアミノ酸配列を含み、式中、各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、第１のペプチド（ＦＰ）は、式（ＸＸＩＩＩ）：（Ｚ６）Ｃ（Ｚ６）Ｃ（Ｚ２）（配列番号１３９）に従うアミノ酸配列を含み、式中、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、式（ＸＸＩＶ）：（Ｚ６）Ｃ（Ｚ８）Ｃ（Ｚ２）（配列番号１４０）に従うアミノ酸配列を含み、式中、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＸｍＣＰＤＨＰＹＰＣＸＸ（配列番号１８１）、ＸｍＣＤＡＦＹＰＹＣＸＸ（配列番号１８２）、ＸｍＣＤＳＨＹＰＹＣＸＸ（配列番号１８３）、及びＸｍＣＶＰＹＹＹＡＣＸＸ（配列番号１８４）からなる群から選択される配列を含むマスキング部分（ＭＭ）を含み、式中、ｍは２〜１０であり、各Ｘは独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸である。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、配列ＥＶＧＳＹＮＦＶＡＤＳＣＰＤＨＰＹＰＣＳＡ（配列番号１８９）、ＥＶＧＳＹＩＶＨＨＳＤＣＤＡＦＹＰＹＣＤＳ（配列番号１９０）、ＥＶＧＳＹＹＳＡＹＰＡＣＤＳＨＹＰＹＣＮＳ（配列番号１９１）、ＥＶＧＳＹＰＮＰＳＳＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹ（配列番号１９２）、ＥＶＧＳＹＹＳＡＹＰＡＣＤＳＨＹＰＹＣＱＳ（配列番号１９３）、ＥＶＧＳＹＰＱＰＳＳＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹ（配列番号１９５）、またはＥＶＧＳＹＰＮＰＡＳＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹ（配列番号１９６）を含むマスキング部分（ＭＭ）を含む。いくつかの実施形態では、ＭＭは、ＥＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹ（配列番号２１３）、ＥＶＧＳＳＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹ（配列番号２１４）、ＥＤＣＤＡＦＹＰＹＣＤＳ（配列番号２１５）、またはＥＶＧＨＳＤＣＤＡＦＹＰＹＣＤＳ（配列番号２１６）の配列を含む。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、ＮＦＶＡＤＳＣＰＤＨＰＹＰＣＳＡ（配列番号１４１）、ＩＶＨＨＳＤＣＤＡＦＹＰＹＣＤＳ（配列番号１４２）、ＹＳＡＹＰＡＣＤＳＨＹＰＹＣＮＳ（配列番号１４３）、ＰＮＰＳＳＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹ（配列番号１４４）、ＹＳＡＹＰＡＣＤＳＨＹＰＹＣＱＳ（配列番号１４５）、ＰＱＰＳＳＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹ（配列番号１４６）、及びＰＮＰＡＳＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹ（配列番号１４７）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマスキング部分（ＭＭ）のいずれかは、１つ以上の追加のアミノ酸配列（例えば、１つ以上のポリペプチドタグ）をさらに含み得る。好適な追加のアミノ酸配列の例としては、精製タグ（例えば、ｈｉｓタグ、ｆｌａｇタグ、マルトース結合タンパク質、及びグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼタグ）、検出タグ（例えば、測光的に検出され得るタグ（例えば、赤色または緑色蛍光タンパク質など））、検出可能な酵素活性を有するタグ（例えば、アルカリホスファターゼなど）、分泌配列、リーダー配列、及び／また安定化配列を含有するタグ、プロテアーゼ切断部位（例えば、フリン切断部位、ＴＥＶ切断部位、トロンビン切断部位）などが含まれ得るが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のアミノ酸配列は、マスキング部分（ＭＭ）のＮ末端にある。いくつかの実施形態では、追加のアミノ酸配列は、配列ＥＶＧＳＹ（配列番号１４８）を含むかまたはそれからなる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、活性化前に（例えば、切断可能部分（ＣＭ）内で切断する１つ以上のプロテアーゼで処理する前に、ｐＨの（局所的な）変化（上昇または低下）を受ける前に、温度変化（上昇または低下）の前に、第２の分子（小分子またはタンパク質リガンドなど）と接触する前に、など）標的結合部分（ＴＢＭ）に結合し、活性化可能抗体がその標的に結合するのを阻害するが、活性化後に（例えば、切断可能部分（ＣＭ）内で切断する１つ以上のプロテアーゼで処理した後に、ｐＨの（局所的な）変化（上昇または低下）を受けた後に、温度変化（上昇または低下）の後に、第２の分子（小分子またはタンパク質リガンドなど）と接触した後に、など）ＴＢＭに結合しない、及び／または活性化可能抗体がその標的に結合するのを阻害しない。いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、ＣＭが切断されていない場合、活性化可能抗体のその標的への結合を阻害するが、ＣＭが切断されている場合、活性化可能抗体のその標的への結合を阻害しない。いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は、活性化可能抗体（活性型である場合）のその標的に対する解離定数より大きい（例えば、少なくとも約１．５倍大きい、少なくとも約２倍大きい、少なくとも約２．５倍大きい、少なくとも約３倍大きい、少なくとも約３．５倍大きい、少なくとも約４倍大きい、少なくとも約４．５倍大きい、少なくとも約５倍大きい、少なくとも約１０倍大きい、少なくとも約１００倍大きい、少なくとも約５００倍大きい、など）ＴＢＭへの結合に対する解離定数を有する。
【０１４５】
切断可能部分（ＣＭ）
いくつかの実施形態では、本開示は、切断可能部分（ＣＭ）を含む活性化可能抗体に関する。いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）は、切断可能部分（ＣＭ）内で切断する１つ以上のプロテアーゼでの処理によって、ｐＨの変化（上昇または低下）によって、温度変化（上昇または低下）によって、及び／または第２の分子（小分子またはタンパク質リガンドなど）との接触などによって、切断及び／または破壊される。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）は、少なくとも第１の切断部位（ＣＳ１）（例えば、第１のプロテアーゼ切断部位）を含む。いくつかの実施形態では、第１の切断部位は、第１のプロテアーゼ切断部位である。当該技術分野で既知の任意のプロテアーゼ（例えば、ＣＭを含む活性化可能抗体の標的と共存していることが知られているプロテアーゼ）によって認識及び／または切断される任意の好適なプロテアーゼ切断部位が使用され得、それには、例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）、マトリックスメタロプロテイナーゼ（例えば、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−７、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、ＭＭＰ−１０、ＭＭＰ−１１、ＭＭＰ−１２、ＭＭＰ−１３、ＭＭＰ−１４、ＭＭＰ−１５、ＭＭＰ−１６、ＭＭＰ−１７、ＭＭＰ−１９、ＭＭＰ−２０、ＭＭＰ−２３、ＭＭＰ−２４、ＭＭＰ−２６、及び／またはＭＭＰ−２７）、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ、プラスミン、トロンビン、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、ＡＤＡＭＳ／ＡＤＡＭＴＳ（例えば、ＡＤＡＭ  ８、ＡＤＡＭ  ９、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭ１５、ＡＤＡＭ１７／ＴＡＣＥ、ＡＤＡＭＤＥＣ１、ＡＤＡＭＴＳ１、ＡＤＡＭＴＳ４、及び／またはＡＤＡＭＴＳ５）、カスパーゼ（例えば、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、及び／またはカスパーゼ−１４）、アスパラギン酸プロテアーゼ（例えば、ＲＡＣＥ及び／またはレニン）、アスパラギン酸カテプシン（例えば、カテプシンＤ及び／またはカテプシンＥ）、システインカテプシン（例えば、カテプシンＢ、カテプシンＣ、カテプシンＫ、カテプシンＬ、カテプシンＳ、カテプシンＶ／Ｌ２、及び／またはカテプシンＸ／Ｚ／Ｐ）、システインプロテイナーゼ（例えば、クルジパイン、レグマイン、及び／またはＯｔｕｂａｉｎ−２）、ＫＬＫ（例えば、ＫＬＫ４、ＫＬＫ５、ＫＬＫ６、ＫＬＫ７、ＫＬＫ８、ＫＬＫ１０、ＫＬＫ１１、ＫＬＫ１３、及び／またはＫＬＫ１４）、メタロプロテイナーゼ（例えば、メプリン、ネプリライシン、ＰＳＭＡ、及び／またはＢＭＰ−１）、セリンプロテアーゼ（例えば、活性化されたタンパク質Ｃ、カテプシンＡ、カテプシンＧ、キマーゼ、及び／または凝固因子プロテアーゼ（例えば、ＦＶＩＩａ、ＦＩＸａ、ＦＸａ、ＦＸＩａ、ＦＸＩＩａ））、エラスターゼ、グランザイムＢ、グアニジノベンゾアターゼ、ＨｔｒＡ１、ヒト好中球エラスターゼ、ラクトフェリン、マラプシン、ＮＳ３／４Ａ、ＰＡＣＥ４、ｔＰＡ、トリプターゼ、ＩＩ型膜貫通型セリンプロテアーゼ（ＴＴＳＰ）（例えば、ＤＥＳＣ１、ＤＰＰ−４、ＦＡＰ、ヘプシン、マトリプターゼ−２、ＭＴ−ＳＰ１／マトリプターゼ、ＴＭＰＲＳＳ２、ＴＭＰＲＳＳ３、及び／またはＴＭＰＲＳＳ４）などによって認識及び／または切断されたプロテアーゼ切断部位が含まれる。いくつかの実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位は、ｕＰＡ、ＭＭＰ−１、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＭＭＰ−８、ＭＭＰ−９、��ＭＰ−１４、ＴＥＶプロテアーゼ、プラスミン、トロンビン、第Ｘ因子、ＰＳＡ、ＰＳＭＡ、カテプシンＤ、カテプシンＫ、カテプシンＳ、ＡＤＡＭ１０、ＡＤＡＭ１２、ＡＤＡＭＴＳ、カスパーゼ−１、カスパーゼ−２、カスパーゼ−３、カスパーゼ−４、カスパーゼ−５、カスパーゼ−６、カスパーゼ−７、カスパーゼ−８、カスパーゼ−９、カスパーゼ−１０、カスパーゼ−１１、カスパーゼ−１２、カスパーゼ−１３、カスパーゼ−１４、及びＴＡＣＥから選択されるプロテアーゼの切断部位である。いくつかの実施形態では、第１のプロテアーゼ切断部位は、ｕＰＡ、ＭＭＰ−２、ＭＭＰ−９、及び／またはＴＥＶプロテアーゼから選択されるプロテアーゼの切断部位である。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ切断は、ＳＧＲＳＡ（配列番号１４９）、ＰＬＧＬＡＧ（配列番号１５０）、及びＥＮＬＹＦＱＧ（配列番号１５１）から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、式（ＸＸＶ）：ＥＶＧＳＹ（Ｚ６）Ｃ（Ｚ６）Ｃ（Ｚ２）ＳＧＲＳＡ（配列番号１５２）に従うアミノ酸配列を含むマスキング部分（ＭＭ）及び切断可能部分（ＣＭ）を含み、式中、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰから選択されるアミノ酸である。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、式（ＸＸＶＩ）：ＥＶＧＳＹ（Ｚ６）Ｃ（Ｘ６）Ｃ（Ｚ２）ＳＧＲＳＡ（配列番号１５３）に従うアミノ酸配列を含むマスキング部分（ＭＭ）及び切断可能部分（ＣＭ）を含み、式中、各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹから選択されるアミノ酸であり、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、式（ＸＸＶＩＩ）：ＥＶＧＳＹ（Ｚ６）Ｃ（Ｚ８）Ｃ（Ｚ２）ＳＧＲＳＡ（配列番号１５４）に従うアミノ酸配列を含むマスキング部分（ＭＭ）及び切断可能部分（ＣＭ）を含み、式中、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰから選択されるアミノ酸である。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、式（ＸＸＶＩＩＩ）：ＥＶＧＳＹ（Ｚ６）Ｃ（Ｘ８）Ｃ（Ｚ２）ＳＧＲＳＡ（配列番号１５５）に従うアミノ酸配列を含むマスキング部分（ＭＭ）及び切断可能部分（ＣＭ）を含み、式中、各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）は、第１のリンカー（Ｌ１）をさらに含む。いくつかの実施形態では、第１のリンカー（Ｌ１）は、第１の切断部位（ＣＳ１）（例えば、第１のプロテアーゼ切断部位）のＣ末端にある。いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ＣＳ１）−Ｌ１の構造を含む。
【０１５２】
例えば、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ（式中、ｎは少なくとも１（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０など）の整数である）；ＧＧＧＧＳ（配列番号１５６）、ＳＧＧＳ（配列番号１５７）、ＧＧＳＧ（配列番号１５８）、ＧＧＳＧＧ（配列番号１５９）、ＧＳＧＳＧ（配列番号１６０）、ＧＳＧＧＧ（配列番号１６１）、ＧＧＧＳＧ（配列番号１６２）、及び／またはＧＳＳＳＧ（配列番号１６３）などのグリシン−セリンポリマー（ＧＳ）ｎ（式中、ｎは少なくとも１（例えば、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０など）の整数である）；グリシンアラニンポリマー；アラニン−セリンポリマーなどを含む、当該技術分野で既知の任意の好適なリンカー（例えば、可撓性リンカー）を使用し得る。リンカー配列は、例えば、約１アミノ酸（例えば、グリシンまたはセリン）〜約２０アミノ酸（例えば、２０アミノ酸のグリシンポリマーまたはグリシン−セリンポリマー）、約１アミノ酸〜約１５アミノ酸、約３アミノ酸〜約１２アミノ酸、約４アミノ酸〜約１０アミノ酸、約５アミノ酸〜約９アミノ酸、約６アミノ酸〜約８アミノ酸などの任意の長さであり得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０アミノ酸長のうちのいずれかである。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１５９〜１６３から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、配列番号１５６または１５７のアミノ酸配列を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）は、少なくとも第２の切断部位（例えば、少なくとも第２、少なくとも第３、少なくとも第４、少なくとも第５など）をさらに含む。いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）は、第２の切断部位（ＣＳ２）をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の切断部位は、第２のプロテアーゼ切断部位である。第２のプロテアーゼ切断部位は、上記のプロテアーゼのいずれかによって認識及び／または切断される任意の好適なプロテアーゼ切断部位であり得る。いくつかの実施形態では、第１（ＣＳ１）及び第２（ＣＳ２）の切断部位は、同じプロテアーゼによって認識及び／または切断されるプロテアーゼ切断部位である。いくつかの実施形態では、第１（ＣＳ１）及び第２（ＣＳ２）の切断部位は、異なるプロテアーゼによって認識及び／または切断されるプロテアーゼ切断部位である（例えば、第１のプロテアーゼ切断部位はｕＰＡによって認識及び／または切断され、第２のプロテアーゼ切断部位はＭＭＰ−２によって認識及び／または切断される；第１のプロテアーゼ切断部位はｕＰＡによって認識及び／または切断され、第２のプロテアーゼ切断部位はＭＭＰ−９によって認識及び／または切断される；第１のプロテアーゼ切断部位はｕＰＡによって認識及び／または切断され、第２のプロテアーゼ切断部位はＴＥＶプロテアーゼによって認識及び／または切断される、など）。いくつかの実施形態では、少なくとも第２の切断部位（ＣＳ２）は、第１のリンカー（Ｌ１）のＣ末端にある。いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ＣＳ１）−Ｌ１−（ＣＳ２）の構造を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）は、少なくとも第２のリンカー（例えば、少なくとも第２、少なくとも第３、少なくとも第４、少なくとも第５など）をさらに含む。いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）は、第２のリンカー（Ｌ２）をさらに含む。第２のリンカー（Ｌ２）は、上記の任意の好適なリンカーであり得る。いくつかの実施形態では、第２のリンカーは、配列番号１５６〜１６３から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１（Ｌ１）及び第２（Ｌ２）のリンカーは同じである（例えば、両方のリンカーが配列番号１５６または１５７の配列を含む）。いくつかの実施形態では、第１（Ｌ１）及び第２（Ｌ２）のリンカーは異なる（例えば、第１のリンカー（Ｌ１）は配列番号１５６のアミノ酸配列を含み、第２のリンカー（Ｌ２）は配列番号１５７のアミノ酸配列を含む、など）。いくつかの実施形態では、少なくとも第２のリンカー（Ｌ２）は、第２の切断部位（ＣＳ２）のＣ末端にある。いくつかの実施形態では、切断可能部分（ＣＭ）は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ＣＳ１）−Ｌ１−（ＣＳ２）−Ｌ２の構造を含む。
【０１５５】
例示的なＭＭ−ＣＭ配列
いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ＦＰ）−（ＰＣＳ１）−Ｌ１−（ＰＣＳ２）−Ｌ２の構造を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、式（ＸＸＩＸ）に従うアミノ酸配列、ＥＶＧＳＹＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６ＣＸ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０Ｘ１１Ｘ１２ＣＸ１３Ｘ１４ＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳ（配列番号１６４）を含み、式中、Ｘ１はＡ、Ｄ、Ｉ、Ｎ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ２はＡ、Ｆ、Ｎ、Ｓ、またはＶであり、Ｘ３はＡ、Ｈ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、またはＹであり、Ｘ４はＡ、Ｈ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ５はＡ、Ｄ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、またはＹであり、Ｘ６はＡ、Ｄ、Ｌ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ７はＤ、Ｐ、またはＶであり、Ｘ８はＡ、Ｄ、Ｈ、Ｐ、Ｓ、またはＴであり、Ｘ９はＡ、Ｄ、Ｆ、Ｈ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ１０はＬ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ１１はＦ、Ｐ、またはＹであり、Ｘ１２はＡ、Ｐ、Ｓ、またはＹであり、Ｘ１３はＡ、Ｄ、Ｎ、Ｓ、Ｔ、またはＹであり、Ｘ１４はＡ、Ｓ、またはＹである。いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、ＥＶＧＳＹＤＡＬＨＹＡＣＰＰＤＹＹＡＣＹＹＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳ（配列番号１６５）、ＥＶＧＳＹＮＳＹＨＡＹＣＰＨＰＬＹＰＣＴＡＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳ（配列番号１６６）、ＥＶＧＳＹＡＳＳＡＶＬＣＶＴＡＹＦＳＣＮＳＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳ（配列番号１６７）、ＥＶＧＳＹＮＦＶＡＤＳＣＰＤＨＰＹＰＣＳＡＳＧＲＳＡＧＧＧＧＳＰＬＧＬＡＧＳＧＧＳ（配列番号１６８）、ＥＶＧＳＹＮＦＶＡＤＳＣＰＤＨＰＹＰＣＳＡＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳ（配列番号１６９）、ＥＶＧＳＹＩＶＨＨＳＤＣＤＡＦＹＰＹＣＤＳＳＧＲＳＡＧＧＧＧＳＰＬＧＬＡＧＳＧＧＳ（配列番号１７０）、ＥＶＧＳＹＩＶＨＨＳＤＣＤＡＦＹＰＹＣＤＳＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳ（配列番号１７１）、ＥＶＧＳＹＹＳＡＹＰＡＣＤＳＨＹＰＹＣＮＳＳＧＲＳＡＧＧＧＧＳＰＬＧＬＡＧＳＧＧＳ（配列番号１７２）、ＥＶＧＳＹＹＳＡＹＰＡＣＤＳＨＹＰＹＣＮＳＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳ（配列番号１７３）、ＥＶＧＳＹＰＮＰＳＳＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹＳＧＲＳＡＧＧＧＧＳＰＬＧＬＡＧＳＧＧＳ（配列番号１７４）、ＥＶＧＳＹＰＮＰＳＳＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳ（配列番号１７５）、ＥＶＧＳＹＹＳＡＹＰＡＣＤＳＨＹＰＹＣＱＳＳＧＲＳＡＧＧＧＧＳＰＬＧＬＡＧＳＧＧＳ（配列番号１７６）、ＥＶＧＳＹＹＳＡＹＰＡＣＤＳＨＹＰＹＣＮＳＡＧＲＳＡＧＧＧＧＳＰＬＧＬＡＧＳＧＧＳ（配列番号１７７）、ＥＶＧＳＹＰＱＰＳＳＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹＳＧＲＳＡＧＧＧＧＳＰＬＧＬＡＧＳＧＧＳ（配列番号１７８）、及び／またはＥＶＧＳＹＰＮＰＡＳＤＣＶＰＹＹＹＡＣＡＹＳＧＲＳＡＧＧＧＧＳＰＬＧＬＡＧＳＧＧＳ（配列番号１７９）のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、（ＦＰ）−（ＰＣＳ１）−Ｌ１−（ＰＣＳ２）−Ｌ２−（ＴＢＭ）の構造を含む。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、アミノ酸配列ＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＥＮＬＹＦＱＧＳＧＧＳ（配列番号２２０）、ＳＧＲＳＡＧＧＧＧＴＰＬＧＬＡＧＳＧＧＳ（配列番号２２１）、またはＳＧＲＳＡＰＬＧＬＡ（配列番号２２２）を含む。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、ＥＶ（Ｚｎ）Ｃ（Ｘ８）Ｃ（Ｚ２）ＳＧＲＳＡ（配列番号２１７）、ＥＤＣ（Ｚ６）Ｃ（Ｚ２）ＳＧＲＳＡ（配列番号２１８）、またはＥＤＣ（Ｚ６）Ｃ（Ｚ２）ＰＬＧＬＡ（配列番号２１９）の配列を含み、式中、各Ｘは独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、ｎは１〜１１であり、各Ｚは独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０１５７】
標的結合部分（ＴＢＭ）
いくつかの実施形態では、本開示は、標的結合部分（ＴＢＭ）を含む活性化可能抗体に関する。いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、抗体軽鎖可変領域及び／または抗体重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、抗体軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、抗体重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、抗体軽鎖可変領域及び抗体重鎖可変領域を含む。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、完全長抗体軽鎖及び／または完全長抗体重鎖を含む。抗体軽鎖は、カッパまたはラムダ軽鎖であり得る。抗体重鎖は、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ、またはＩｇＤなどの任意のクラスであり得る。いくつかの実施形態では、抗体重鎖は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスなどのＩｇＧクラスである。本明細書に記載の抗体重鎖は、当該技術分野で既知の方法を使用して、あるクラスまたはサブクラスから別のクラスまたはサブクラスに変換し得る。
【０１５９】
本明細書に記載の標的結合部分（ＴＢＭ）のいずれか１つ以上は、本明細書に記載されるＨＶＲ配列（例えば、上記の表Ａに示されるような重鎖可変領域ＨＶＲ配列の１、２、もしくは３つ、及び／または軽鎖可変領域ＨＶＲ配列の１、２、もしくは３つ）のいずれか、本明細書に記載される重鎖可変領域配列及び／または軽鎖可変領域配列（例えば、上記の表Ｂに示されるような重鎖可変領域配列及び／または軽鎖可変領域配列）のいずれか、及び／または本明細書に記載される抗体のいずれかを組み入れ得る。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、ＨＶＲ、可変領域（ＶＬ、ＶＨ）、及び／または軽鎖及び重鎖（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４）の特定のアミノ酸配列に関して記載される抗体を含む、本明細書に記載される抗ＣＴＬＡ４抗体のうちの１つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＲＧＲＦＬＡ（配列番号５８）を含むＨＶＲ−Ｌ１、アミノ酸配列ＤＡＳＮＲＡＴＧＩ（配列番号６６）を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び／またはアミノ酸配列ＹＣＱＱＳＳＳＷＰＰＴ（配列番号７５）を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、配列番号１００のアミノ酸配列、または配列番号１００の配列に対して少なくとも９０％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する配列を含む、抗体軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、アミノ酸配列ＹＳＩＳＳＧＹＨＷＳＷＩ（配列番号２３）を含むＨＶＲ−Ｈ１、アミノ酸配列ＬＡＲＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＴＳＬＫＳＲＬ（配列番号３５）を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び／またはアミノ酸配列ＡＲＳＹＶＹＦＤＹ（配列番号４５）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、配列番号８７のアミノ酸配列、または配列番号８７の配列に対して少なくとも９０％（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する配列を含む、抗体重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、ａ）アミノ酸配列ＲＡＳＱＳＶＲＧＲＦＬＡ（配列番号５８）を含むＨＶＲ−Ｌ１、アミノ酸配列ＤＡＳＮＲＡＴＧＩ（配列番号６６）を含むＨＶＲ−Ｌ２、及び／またはアミノ酸配列ＹＣＱＱＳＳＳＷＰＰＴ（配列番号７５）を含むＨＶＲ−Ｌ３を含む、抗体軽鎖可変領域、ならびにｂ）アミノ酸配列ＹＳＩＳＳＧＹＨＷＳＷＩ（配列番号２３）を含むＨＶＲ−Ｈ１、アミノ酸配列ＬＡＲＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＴＳＬＫＳＲＬ（配列番号３５）を含むＨＶＲ−Ｈ２、及び／またはアミノ酸配列ＡＲＳＹＶＹＦＤＹ（配列番号４５）を含むＨＶＲ−Ｈ３を含む、抗体重鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、標的結合部分（ＴＢＭ）は、配列番号１００のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変領域、及び配列番号８７のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変領域を含む。
【０１６１】
活性化可能な結合ポリペプチドの特性
いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能な結合ポリペプチド（すなわち、活性化可能抗体）は、（ａ）マスキング部分（ＭＭ）、（ｂ）切断可能部分、及び（ｃ）標的結合部分を含む。いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）は活性化可能抗体の標的結合部分（ＴＢＭ）に結合し、マスキング部分を欠く対応する結合ポリペプチドのＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）への結合と比較して、及び／または親抗体のＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）への結合と比較して、活性化可能結合部分のＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）への結合を低減または阻害する。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、「活性化可能な」結合ポリペプチドは、阻害され、マスキングされ、及び／または切断されていない状態である場合、ＣＴＬＡ４への第１のレベルの結合を示し、阻害されていない、マスキングされていない、及び／または切断されている状態である場合、ＣＴＬＡ４への第２のレベルの結合を示す、結合ポリペプチドを指し、第２のレベルのＣＴＬＡ４結合は、第１のレベルのＣＴＬＡ４結合より大きい。いくつかの実施形態では、活性化可能な結合ポリペプチドによるＣＴＬＡ４へのアクセスは、（例えば、１つ以上のプロテアーゼによる）切断可能部分内での切断後により増大する。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、一般的に、活性化可能抗体の活性化前と比較して、活性化可能抗体の活性化後（例えば、切断可能部分（ＣＭ）内を切断する１つ以上のプロテアーゼでの処理による活性化後、ｐＨの変化（上昇または低下）による活性化後、温度変化（上昇または低下）による活性化後、第２の分子（小分子など）との接触による活性化後など）に、ポリペプチドのＣＴＬＡ４（例えば、ヒトＣＴＬＡ４）への結合親和性が少なくとも約２倍（例えば、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１０００倍以上）増加する場合、「活性化可能な」結合ポリペプチドであると見なされる。いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、一般的に、活性化可能抗体のＥＣ５０が、「活性化」後に少なくとも約２倍（例えば、少なくとも約２倍、少なくとも約２．５倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．５倍、少なくとも約４倍、少なくとも約４．５倍、少なくとも約５倍、少なくとも約５．５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約６．５倍、少なくとも約７倍、少なくとも約７．５倍、少なくとも約８倍、少なくとも約８．５倍、少なくとも約９倍、少なくとも約９．５倍、少なくとも約１０倍、少なくとも約２５倍、少なくとも約５０倍、少なくとも約７５倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約２５０倍、少なくとも約５００倍、少なくとも約７５０倍、または少なくとも約１０００倍以上）減少する場合（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳアッセイによって測定される場合；以下の実施例を参照）、「活性化可能」であると見なされる。いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、一般的に、ポリペプチドのＥＣ５０が、切断可能部分（ＣＭ）内で切断するプロテアーゼでの処理後に少なくとも約２倍減少した場合（例えば、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳアッセイによって測定される場合；以下の実施例を参照）、「活性化可能」と見なされる。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、マスキング部分（ＭＭ）が活性化可能抗体の標的結合部分（ＴＢＭ）に結合している場合、活性化可能抗体のＣＴＬＡ４に対するＫＤは、（例えば、活性化可能抗体の「活性化」後（例えば、切断可能部分（ＣＭ）内で切断するプロテアーゼ処理後）に）マスキング部分（ＭＭ）が標的結合部分（ＴＢＭ）に結合されていない場合よりも、及び／または親抗体のＣＴＬＡ４に対するＫＤよりも、約２倍以上（例えば、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約２５０、約５００、約７５０、または約１０００以上）大きい。親和性を測定する方法は当該技術分野で既知であり、例えば、以下の実施例に記載される方法を含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、マスキング部分が活性化可能抗体の標的結合部分に結合している場合、活性化可能抗体のＣＴＬＡ４に対するＫＤは、（例えば、活性化可能抗体の「活性化」後（例えば、切断可能部分（ＣＭ）内で切断するプロテアーゼ処理後）に）マスキング部分が標的結合部分に結合していない場合と比較して、及び／または親抗体のＣＴＬＡ４に対するＫＤと比較して、少なくとも約２５％（例えば、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９９％）減少する。親和性を測定する方法は当該技術分野で既知であり、例えば、以下の実施例に記載される方法を含む。
【０１６６】
いくつかの実施形態では、マスキング部分は、活性化可能抗体のＣＴＬＡ４への結合を立体的に遮蔽する、及び／または活性化可能な抗体のＣＴＬＡ４への結合をアロステリックに遮蔽する。いくつかの実施形態では、マスキング部分は、活性化可能抗体及び／または親抗体の天然結合パートナーのアミノ酸配列を含まない。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、マスキング部分の標的結合部分に対する解離定数は、（活性化された場合）活性化可能抗体のＣＴＬＡ４に対する解離定数よりも大きい。いくつかの実施形態では、マスキング部分の標的結合部分に対する解離定数は、（活性化された場合）活性化可能抗体のＣＴＬＡ４に対する解離定数よりも約２倍以上（例えば、約２、約２．５、約３、約３．５、約４、約４．５、約５、約５．５、約６、約６．５、約７、約７．５、約８、約８．５、約９、約９．５、約１０、約２５、約５０、約７５、約１００、約２５０、約５００、約７５０、または約１０００倍以上）大きい。いくつかの実施形態では、マスキング部分の標的結合部分に対する解離定数は、（活性化された場合）活性化可能抗体のＣＴＬＡ４に対する解離定数にほぼ等しい。
【０１６８】
本明細書に記載される活性化可能抗体は、さらに修飾されてもよい。いくつかの実施形態では、活性化可能抗体は、追加の分子実体に連結される。追加の分子実体の例には、医薬品、ペプチドまたはタンパク質、検出剤または標識、及び抗体が含まれる。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、本開示の活性化可能抗体は、医薬品に連結される。医薬品の例には、細胞傷害剤または他のがん治療剤、及び放射性同位元素が含まれる。細胞傷害剤の具体例としては、タキソール、サイトカラシンＢ、グラミシジンＤ、臭素エチジウム、エメチン、マイトマイシン、エトポシド、テノポシド、ビンクリスチン、ビンブラスチン、コルチシン、ドキソルビシン、ダウノルビシン、ジヒドロキシアントラシンジオン、ミトキサントロン、ミトラマイシン、アクチノマイシンＤ、１−デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、プロカイン、テトラカイン、リドカイン、プロプラノロール、ピュロマイシン、及びそれらの類似体または相同体が挙げられる。また、治療剤としては、例えば、代謝拮抗物質（例えば、メトトレキサート、６−メルカプトプリン、６−チオグアニン、シタラビン、５−フルオロウラシルデカルバジン）、アルキル化剤（例えば、メクロレタミン、チオテパクロラムブシル、メルファラン、カルムスチン（ＢＳＮＵ）及びロムスチン（ＣＣＮＵ）、シクロトスファミド、ブスルファン、ジブロモマンニトール、ストレプトゾトシン、マイトマイシンＣ、及びシス−ジクロロジアミンプラチナ（ＩＩ）（ＤＤＰ）シスプラチン）、アントラシクリン（例えば、ダウノルビシン（以前のダウノマイシン）及びドキソルビシン）、抗生物質（例えば、ダクチノマイシン（以前のアクチノマイシン）、ブレオマイシン、ミトラマイシン、及びアントラマイシン（ＡＭＣ））、ならびに抗有糸分裂剤（例えば、ビンクリスチン及びビンブラスチン）も挙げられる。診断的または治療的に使用するために抗体にコンジュゲートすることができる放射性同位元素の例としては、ヨウ素１３１、インジウム１１１、イットリウム９０、及びルテチウム１７７が挙げられるが、これらに限定されない。ポリペプチドを医薬品に連結する方法は、様々なリンカー技術を使用する等の方法が当該技術分野で知られている。リンカーの種類の例としては、ヒドラゾン、チオエーテル、エステル、ジスルフィド、及びペプチド含有リンカーが挙げられる。治療剤を抗体に連結するためのリンカー及び方法のさらなる考察については、例えば、Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５５：１９９−２１５（２００３）、Ｔｒａｉｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５２：３２８−３３７（２００３）、Ｐａｙｎｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３：２０７−２１２（２００３）、Ａｌｌｅｎ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ  ２：７５０−７６３（２００２）、Ｐａｓｔａｎ  ａｎｄ  Ｋｒｅｉｔｍａｎ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔｉｇ．Ｄｒｕｇｓ  ３：１０８９−１０９１（２００２）、Ｓｅｎｔｅｒ  ａｎｄ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（２００１）Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ．Ｒｅｖ．５３：２４７−２６４を参照されたい。
【０１７０】
Ｖ．核酸、ベクター、宿主細胞、ならびにＣＴＬＡ４抗体及び／または精度／状況依存性活性化可能抗体を産生する組換え法
本開示の別の態様は、本明細書で提供される結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列は、ＨＶＲ、１、２、もしくは３つのＨＶＲを含む配列、重鎖の可変領域、軽鎖の可変領域などの抗体の任意の部分であり得るか、または完全長重鎖もしくは完全長軽鎖であり得る。本開示の核酸は、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得、イントロン配列を含有しても含有しなくてもよい。典型的には、核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、本開示は、（１）本明細書に記載される例示的な抗体のＨＶＲ−Ｈ１、ＨＶＲ−Ｈ２、ＨＶＲ−Ｈ３、ＨＶＲ−Ｌ１、ＨＶＲ−Ｌ２及び／またはＨＶＲ−Ｌ３のアミノ酸配列、（２）本明細書に記載される例示的な抗体の重鎖の可変領域及び／または軽鎖の可変領域、または（３）例示的な抗体の完全長重鎖または完全長軽鎖からなる群から選択されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる単離された核酸分子を提供する。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、配列番号１８〜１０７のいずれか１つに記載のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、核酸分子は、以下の表Ｃに記載のヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。
2021511808.tif 000008
2021511808.tif 000009
2021511808.tif 000010
2021511808.tif 000011
2021511808.tif 000012
2021511808.tif 000013
2021511808.tif 000014
2021511808.tif 000015
【０１７４】
本開示の核酸は、任意の好適な分子生物学技術を使用して得ることができる。ハイブリドーマによって発現される抗体の場合、ハイブリドーマによって作製される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、ＰＣＲ増幅またはｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリーから（例えば、ファージ提示技術を使用して）得られた抗体の場合、抗体をコードする核酸はライブラリーから回収することができる。
【０１７５】
ＶＨ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを、重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に連結することによって、完全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で既知であり（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭまたはＩｇＤ定常領域であり得る。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子の場合、ＶＨをコードするＤＮＡは、重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に連結することができる。
【０１７６】
ＶＬ領域をコードする単離されたＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを、軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に動作可能に連結することによって、完全長軽鎖遺伝子（ならびにＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は、当該技術分野で既知であり（例えば、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１−３２４２を参照）、これらの領域を包含するＤＮＡ断片は、標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。軽鎖定常領域は、カッパまたはラムダ定常領域であり得る。
【０１７７】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片は、ＶＨ及びＶＬ配列が、可撓性リンカーによって結合されたＶＬ及びＶＨ領域を有する連続した一本鎖タンパク質として発現され得るように、可撓性リンカーをコードする、例えば、アミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする別の断片と動作可能に連結される（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６（１９８８）、Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３（１９８８）、及びＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４（１９９０）を参照）。
【０１７８】
本開示は、本明細書に記載される核酸分子を含むベクターをさらに提供する。いくつかの実施形態では、ベクターは、発現ベクターまたは提示ベクター（例えば、ウイルス提示ベクター、細菌提示ベクター、酵母提示ベクター、昆虫提示ベクター、哺乳動物提示ベクターなど）である。核酸分子は、軽鎖もしくは重鎖（例えば、ＣＤＲもしくはＨＶＲ、軽鎖もしくは重鎖可変領域）の一部、完全長軽鎖もしくは重鎖、重鎖もしくは軽鎖の一部もしくは完全長を含むポリペプチド、または抗体誘導体もしくは抗原結合断片のアミノ酸配列をコードし得る。いくつかの実施形態では、ベクターは、抗体またはその抗原結合断片などの結合分子の発現に有用な発現ベクターである。いくつかの実施形態では、第１のベクターが本明細書に記載の重鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含み、第２のベクターが本明細書に記載の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチド配列を含むベクターが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、単一ベクターは、本明細書に記載の重鎖可変領域及び本明細書に記載の軽鎖可変領域をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０１７９】
本開示の結合分子を発現させるために、部分長または完全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、ＤＮＡ分子が転写及び翻訳制御配列に動作可能に連結されるように発現ベクターに挿入される。この文脈では、「動作可能に連結される」という用語は、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が、ＤＮＡ分子の転写及び翻訳を調節する意図された機能を果たすように、抗体遺伝子がベクターにライゲーションされることを意味する。発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択される。抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、別個のベクターに挿入することができるか、または両方の遺伝子を同じ発現ベクターに挿入することができる。抗体遺伝子は、任意の好適な方法（例えば、抗体遺伝子断片及びベクター上の相補的制限部位のライゲーション、または相同組換えベースのＤＮＡライゲーション）によって発現ベクターに挿入される。本明細書に記載の抗体の軽鎖及び重鎖可変領域を使用して、所望のアイソタイプ及びサブクラスの重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をすでにコードしている発現ベクターに、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメント（複数可）に動作可能に連結され、ＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに動作可能に連結されるようにそれらを挿入することによって、任意の抗体アイソタイプ及びサブクラスの完全長抗体遺伝子を作成することができる。さらにまたはあるいは、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードすることができる。抗体鎖遺伝子は、シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように、ベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチドまたは異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質由来のシグナルペプチド）であり得る。
【０１８０】
抗体配列に加えて、本開示の発現ベクターは、典型的には、宿主細胞における抗体配列の発現を制御する調節配列を有する。「調節配列」という用語は、抗体鎖遺伝子の転写または翻訳を制御する、プロモーター、エンハンサー、及び他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むように意図されている。このような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に説明されている。調節配列の選択を含む発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどといった因子に依存し得ることは、当業者により理解されるであろう。哺乳動物宿主細胞発現のための調節配列の例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、及びポリオーマに由来するプロモーター及び／またはエンハンサーなどの哺乳動物細胞における高レベルのタンパク質発現を指示するウイルス要素が挙げられる。あるいは、ユビキチンプロモーターまたはβ−グロビンプロモーターなどの非ウイルス性調節配列が使用され得る。またさらに、調節要素は、ＳＶ４０初期プロモーターからの配列及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端反復配列を含有するＳＲプロモーターシステムなどの様々な源からの配列で構成されている（Ｔａｋｅｂｅ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）。
【０１８１】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、発現ベクターは追加の配列、例えば、宿主細胞内でベクターの複製を調節する配列（例えば、複製起点）及び選択可能マーカー遺伝子を有し得る。選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞の選択を促進する（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号、同第４，６３４，６６５号、及び同第５，１７９，０１７号（全てＡｘｅｌ  ｅｔ  ａｌ．による）を参照）。例えば、典型的には、選択可能マーカー遺伝子は、ベクターが導入されている宿主細胞に対して、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、またはメトトレキサートなどの薬剤に対する耐性を付与する。選択可能マーカー遺伝子としては、（メトトレキサート選択／増幅を伴うｄｈｆｒ宿主細胞における使用のための）ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子、及び（Ｇ４１８選択のための）ｎｅｏ遺伝子が挙げられる。
【０１８２】
軽鎖及び重鎖の発現のために、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクター（複数可）は、任意の好適な技術によって宿主細胞にトランスフェクトされる。用語「トランスフェクション」の様々な形態は、外因性ＤＮＡを原核生物または真核生物宿主細胞に導入するために一般的に使用される多種多様な技術、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクションなどを包含することが意図される。本開示の抗体を原核生物または真核生物宿主細胞のいずれかにおいて発現させることが可能であるが、真核生物細胞、及び典型的には哺乳動物宿主細胞における抗体の発現が最も典型的である。
【０１８３】
本開示は、本開示によって提供される核酸分子を含有する宿主細胞をさらに提供する。宿主細胞は、発現ベクターが利用可能である実質的にあらゆる細胞であり得る。これは、例えば、哺乳動物細胞などの高等真核生物宿主細胞、酵母細胞などの低等真核生物宿主細胞であり得、細菌細胞などの原核生物細胞であり得る。組換え核酸を宿主細胞に導入する方法は当該技術分野で既知であり、例えば、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ、デキストラン媒介トランスフェクション、電気穿孔、またはファージ感染によるものが挙げられる。
【０１８４】
形質転換に好適な原核生物宿主としては、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、ならびにＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ属内の様々な種が挙げられる。
【０１８５】
形質転換に好適な真核生物宿主としては、酵母、昆虫（例えば、Ｓ２細胞）、及び哺乳動物細胞が挙げられる。本開示の結合分子を発現するための哺乳動物宿主細胞としては、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０（１９８０）、Ｓｈａｒｐ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１（１９８２）に記載されているｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞を含む）、ＮＳ０骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞、及びＳｐ２細胞が挙げられる。特に、ＮＳ０骨髄腫またはＣＨＯ細胞で使用するための別の発現系は、ＷＯ８７／０４４６２、ＷＯ８９／０１０３６、及びＥＰ３３８，８４１に開示されているＧＳ（グルタミンシンセターゼ）遺伝子発現系である。いくつかの実施形態では、本開示の抗体はＣＨＯ細胞において産生される。いくつかの実施形態では、本開示の抗体は修飾され、かつＣ末端リジン残基を含まない（例えば、本明細書に記載の抗体重鎖のＣ末端リジン残基は、（例えば、抗体産生前または産生中に）除去される）。抗体遺伝子をコードする発現ベクターが哺乳動物宿主細胞に導入される場合、抗体は、宿主細胞における抗体の発現、または宿主細胞が増殖している培養培地への抗体の分泌を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって産生される。抗体は、当該技術分野で既知の任意の好適なタンパク質精製法（例えば、タンパク質Ａクロマトグラフィー及び／またはイオン交換クロマトグラフィー）を使用して培養培地から回収することができる。
【０１８６】
ＶＩ．組成物
他の態様では、本開示は、本開示によって提供される結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）を含有する組成物を提供する。一態様では、組成物は、結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物である。組成物は、当該技術分野で既知の従来的な方法によって調製することができる。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、本開示は、本開示によって提供される結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）及び薬学的に許容される担体を含む組成物を提供し、該結合分子は、本明細書に開示されるＨＶＲアミノ酸配列を含む可変ドメインを含み、該組成物は、該組成物中に存在する結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）の総量と比較して、該アミノ酸配列のアスパラギンでグリコシル化された約１１％、１０％、８％、５％、３％、または２％未満の該結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）を含む。別の実施形態では、組成物は、該組成物中に存在する結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）の総量と比較して、該アミノ酸配列のアスパラギンでグリコシル化された少なくとも約２％の該結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）を含む。
【０１８８】
「薬学的に許容される担体」という用語は、結合分子の送達のための製剤における使用に好適な任意の不活性物質を指す。担体は、付着防止剤、結合剤、コーティング、崩壊剤、充填剤または希釈剤、保存剤（抗酸化剤、抗菌剤、または抗真菌剤など）、甘味料、吸収遅延剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝剤などであり得る。好適な薬学的に許容される担体の例としては、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、ブドウ糖、植物油（オリーブオイルなど）、生理食塩水、緩衝液、緩衝生理食塩水、ならびに糖類、多価アルコール、ソルビトール、及び塩化ナトリウムなどの等張剤が挙げられる。
【０１８９】
組成物は、液体、半固体、及び固体剤形などの任意の好適な形態であり得る。液体剤形の例としては、溶液（例えば、注射及び注入可能な溶液）、マイクロエマルジョン、リポソーム、分散液、または懸濁液が挙げられる。固体剤形の例としては、錠剤、丸剤、カプセル、マイクロカプセル、及び散剤が挙げられる。結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）を送達するのに好適な組成物の特定の形態は、注射もしくは注入のための溶液、懸濁液、または分散液などの滅菌液体である。滅菌溶液は、適切な担体中に必要量の抗体を組み込み、続いて滅菌精密濾過することによって調製することができる。一般的に、分散液は、結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）を、基本的な分散媒及び他の担体を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌液体の調製のための滅菌散剤の場合、調製方法は、活性成分に、その事前に滅菌濾過された溶液からの任意の追加の所望の成分を添加した散剤を得るための、真空乾燥及びフリーズドライ（凍結乾燥）を含む。組成物の様々な剤形は、当該技術分野で既知の従来的な技法によって調製することができる。
【０１９０】
組成物中に含まれる結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）の相対量は、使用される特定の結合分子及び担体、剤形、ならびに所望の放出及び薬力学的特性などの多くの要因に応じて異なるであろう。単一剤形中の結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）の量は、一般的に治療効果をもたらす量であるが、より少ない量であってもよい。一般的に、この量は、剤形の総重量に対して、約０．０１パーセント〜約９９パーセント、約０．１パーセント〜約７０パーセント、または約１パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
【０１９１】
結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）に加えて、１つ以上の追加の治療剤を組成物に含めることができる。追加の治療剤の例は、本明細書において以下に記載される。組成物中に含まれるべき追加の治療剤の好適な量は、当業者によって容易に選択することができ、使用される特定の薬剤及び担体、剤形、ならびに所望の放出及び薬力学的特性などの多くの要因に応じて異なるであろう。単一剤形に含まれる追加の治療剤の量は、一般的に治療効果をもたらす薬剤の量であるが、より少ない量であってもよい。
【０１９２】
本明細書に記載の結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）及び／または組成物（例えば、医薬組成物）のいずれかを、医薬品（例えば、がんの治療または進行の遅延を必要とする対象においてそれを行う際に使用するための医薬品）の調製において使用することができる。
【０１９３】
ＶＩＩ．結合分子及び医薬組成物の使用
本開示により提供される結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）及び医薬組成物は、治療、診断、または他の目的、例えば、免疫応答の調節、がんの治療、他のがん療法の効果の増強、ワクチン効果の増強、または自己免疫疾患の治療に有用である。したがって、他の態様では、本開示は、結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）または医薬組成物を使用する方法を提供する。一態様では、本開示は、哺乳動物における障害を治療する方法を提供し、治療を必要とする哺乳動物に有効量の本開示により提供される結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）または組成物を投与することを含む。結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）は、ＣＴＬＡ４抗体（例えば、ヒト抗ヒトＣＴＬＡ４抗体）またはＣＴＬＡ４活性化可能抗体であり得る。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、障害はがんである。本開示により提供される方法、使用、組成物、または医薬品を用いて、様々ながんを治療または予防することができる。そのようながんの例としては、気管支原性癌（例えば、扁平上皮癌、小細胞癌、大細胞癌、及び腺癌）、肺胞上皮癌、気管支腺腫、軟骨性過誤腫（非がん性）、及び肉腫（がん性）などの肺癌；粘液腫、線維腫、及び横紋筋腫などの心臓癌；骨軟骨腫、コンドロマ、軟骨芽細胞腫、軟骨粘液性線維腫、類骨骨腫、巨細胞腫瘍、軟骨肉腫、多発性骨髄腫、骨肉腫、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、ユーイング腫瘍（ユーイング肉腫）、及び細網細胞肉腫などの骨癌；神経膠腫（例えば、多形神経膠芽腫）、退形成性星細胞腫、星状細胞腫、乏突起神経膠腫、髄芽腫、脊索腫、神経鞘腫、上衣腫、髄膜腫、下垂体腺腫、松果体腫、骨腫、血管芽腫、頭蓋咽頭腫、脊索腫、胚細胞腫、奇形腫、類皮嚢胞、及び血管腫などの脳癌；平滑筋腫、類表皮癌、腺癌、平滑筋肉腫、胃腺癌、腸脂肪腫、腸神経線維腫、腸線維腫、大腸ポリープ、及び結腸直腸癌などの消化器系におけるがん；肝細胞腺腫、血管腫、肝細胞癌、線維層板型癌、胆管癌、肝芽腫、及び血管肉腫などの肝臓癌；腎腺癌、腎細胞癌、腎機能亢進症、及び腎盂移行細胞癌などの腎臓癌；膀胱癌；急性リンパ性（リンパ芽球性）白血病、急性骨髄性（骨髄球性、骨髄性、骨髄芽球性、骨髄単球性）白血病、慢性リンパ性白血病（例えば、セザリー症候群及び有毛細胞白血病）、慢性骨髄性（骨髄様、骨髄性、顆粒球性）白血病、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞リンパ腫、菌状息肉腫、及び骨髄増殖性疾患（真性多血症、骨髄線維症、血小板血症、及び慢性骨髄性白血病などの骨髄増殖性疾患を含む）などの血液癌；基底細胞癌、扁平上皮癌、黒色腫、カポジ肉腫、及びパジェット病などの皮膚癌；頭頸部癌；網膜芽細胞腫及び眼球内黒色腫などの眼に関連するがん；良性前立腺肥大、前立腺癌、及び精巣癌（例えば、精上皮腫、奇形腫、胚性癌腫、及び絨毛癌）などの男性生殖器系癌；乳癌；子宮癌（子宮内膜癌）、子宮頸癌（子宮頸癌腫）、卵巣癌（卵巣癌腫）、外陰癌、膣癌、卵管癌、及び胞状奇胎などの女性生殖器系癌；甲状腺癌（乳頭癌、濾胞癌、未分化癌、または髄様癌を含む）；褐色細胞腫（副腎）；副甲状腺の非がん性増殖；膵臓癌；ならびに白血病、骨髄腫、非ホジキンリンパ腫、及びホジキンリンパ腫などの血液癌が挙げられる。
【０１９５】
別の態様では、本開示は、哺乳動物における免疫応答を強化する方法を提供し、哺乳動物に有効量の本開示により提供される結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）または組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、結合分子はＣＴＬＡ４抗体またはその抗原結合断片であり、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、結合分子はＣＴＬＡ４活性化可能抗体であり、哺乳動物はヒトである。用語「免疫応答の強化」またはその文法的バリエーションは、哺乳動物の免疫系の任意の応答を刺激、誘発、増加、改善、または増強することを意味する。免疫応答は、細胞応答（すなわち、細胞傷害性Ｔリンパ球媒介型などの細胞媒介型）、または体液性応答（すなわち、抗体媒介型）であり得、一次または二次免疫応答であり得る。免疫応答の強化の例としては、ＰＢＭＣ及び／またはＴ細胞の活性化（ＩＬ−２及び／またはＩＦＮγなどの１つ以上のサイトカインの分泌の増加を含む）が挙げられる。免疫応答の強化は、細胞傷害性Ｔリンパ球アッセイ、サイトカインの放出、腫瘍の退縮、腫瘍担持動物の生存、抗体産生、免疫細胞増殖、細胞表面マーカーの発現、及び細胞傷害活性を含むが、これらに限定されない、当業者に既知の多くのインビトロまたはインビボ測定を使用して評価することができる。典型的には、本開示の方法は、未治療の哺乳動物、または引用される方法を使用して治療されていない哺乳動物による免疫応答と比較した場合の、哺乳動物による免疫応答を強化する。
【０１９６】
治療法の実施において、結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）は、単独療法として単独で投与されてもよく、または１つ以上の追加の治療剤もしくは療法と組み合わせて投与されてもよい。したがって、別の態様では、本開示は、別個の、連続した、または同時投与のための１つ以上の追加の療法または治療剤と組み合わせた結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）を含む併用療法を提供する。「追加の治療剤」という用語は、本開示によって提供される結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）以外の任意の治療剤を指し得る。ある特定の態様では、本開示は、哺乳動物におけるがんを治療するための併用療法を提供し、哺乳動物に有効量の本明細書に提供される結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）を１つ以上の追加の治療剤と組み合わせて投与することを含む。さらなる実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【０１９７】
多種多様ながん治療剤は、本開示によって提供される結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）と組み合わせて使用し得る。当業者は、本開示の方法及び結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）と組み合わせて使用することができる他のがん療法の存在及び開発を認識し、本明細書に記載されている療法の形態に制限されないであろう。がんを治療するための併用療法において使用され得る追加の治療剤のカテゴリーの例には、（１）化学療法剤、（２）免疫療法剤、及び（３）ホルモン治療剤が含まれる。いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ウイルス遺伝子治療、免疫チェックポイント阻害剤、標的療法、放射線療法、ワクチン療法、及び／または化学療法である。
【０１９８】
「化学療法剤」という用語は、がん細胞の死滅を引き起こす、またはがん細胞の増殖、分裂、修復、及び／または機能を妨害することができる化学的または生物学的物質を指す。化学療法剤の例としては、ＷＯ２００６／１２９１６３、及びＵＳ２００６０１５３８０８に開示されているものが挙げられ、これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。特定の化学療法剤の例としては、（１）クロラムブシル（ＬＥＵＫＥＲＡＮ）、シクロホスファミド（ＣＹＴＯＸＡＮ）、イホスファミド（ＩＦＥＸ）、塩酸メクロレタミン（ＭＵＳＴＡＲＧＥＮ）、チオテパ（ＴＨＩＯＰＬＥＸ）、ストレプトゾトシン（ＺＡＮＯＳＡＲ）、カルムスチン（ＢＩＣＮＵ、ＧＬＩＡＤＥＬ  ＷＡＦＥＲ）、ロムスチン（ＣＥＥＮＵ）、及びダカルバジン（ＤＴＩＣ−ＤＯＭＥ）などのアルキル化剤、（２）ドキソルビシン（ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮ）、エピルビシン（ＥＬＬＥＮＣＥ、ＰＨＡＲＭＯＲＵＢＩＣＩＮ）、ダウノルビシン（ＣＥＲＵＢＩＤＩＮＥ、ＤＡＵＮＯＸＯＭＥ）、ネモルビシン、イダルビシン（ＩＤＡＭＹＣＩＮ  ＰＦＳ、ＺＡＶＥＤＯＳ）、ミトキサントロン（ＤＨＡＤ、ＮＯＶＡＮＴＲＯＮＥ）、ダクチノマイシン（アクチノマイシンＤ、ＣＯＳＭＥＧＥＮ）、プリカマイシン（ＭＩＴＨＲＡＣＩＮ）、マイトマイシン（ＭＵＴＡＭＹＣＩＮ）、及びブレオマイシン（ＢＬＥＮＯＸＡＮＥ）、酒石酸ビノレルビン（ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ）、ビンブラスチン（ＶＥＬＢＡＮ）、ビンクリスチン（ＯＮＣＯＶＩＮ）、及びビンデシン（ＥＬＤＩＳＩＮＥ）などの細胞毒性抗生物質を含む、アルカロイドまたは植物ビンカアルカロイド、（３）カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）、シタラビン（ＣＹＴＯＳＡＲ−Ｕ）、フルダラビン（ＦＬＵＤＡＲＡ）、ゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ）、ヒドロキシウレア（ＨＹＤＲＡ）、メトトレキサート（ＦＯＬＥＸ、ＭＥＸＡＴＥ、ＴＲＥＸＡＬＬ）、ネララビン（ＡＲＲＡＮＯＮ）、トリメトレキサート（ＮＥＵＴＲＥＸＩＮ）、及びペメトレキセド（ＡＬＩＭＴＡ）などの代謝拮抗物質、（４）５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、カペシタビン（ＸＥＬＯＤＡ）、ラルチトレキセド（ＴＯＭＵＤＥＸ）、テガフール・ウラシル（ＵＦＴＯＲＡＬ）、及びゲムシタビン（ＧＥＭＺＡＲ）などのピリミジンアンタゴニスト、（５）ドセタキセル（ＴＡＸＯＴＥＲＥ）、パクリタキセル（ＴＡＸＯＬ）などのタキサン、（６）シスプラチン（ＰＬＡＴＩＮＯＬ）及びカルボプラチン（ＰＡＲＡＰＬＡＴＩＮ）、及びオキサリプラチン（ＥＬＯＸＡＴＩＮ）などのプラチナ剤、（７）イリノテカン（ＣＡＭＰＴＯＳＡＲ）、トポテカン（ＨＹＣＡＭＴＩＮ）、エトポシド（ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ、ＶＥＰＥＳＳＩＤ、ＴＯＰＯＳＡＲ）、及びテニポシド（ＶＵＭＯＮ）などのトポイソメラーゼ阻害剤、（８）エトポシド（ＥＴＯＰＯＰＨＯＳ、ＶＥＰＥＳＳＩＤ、ＴＯＰＯＳＡＲ）などのエピポドフィロトキシン（ポドフィロトキシン誘導体）、（９）ロイコボリン（ＷＥＬＬＣＯＶＯＲＩＮ）などの葉酸誘導体、（１０）カルムスチン（ＢｉＣＮＵ）、ロムスチン（ＣｅｅＮＵ）などのニトロソウレア、（１１）ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ）、ボルテゾミ��（ＶＥＬＣＡＤＥ）、メシル酸イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ）、ゲネフィチニブ、ラパチニブ、ソラフェニブ、サリドマイド、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、アキシチニブ、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ、ＭＡＢＴＨＥＲＡ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、及びラニビズマブ（ＬＵＣＥＮＴＩＳ）、ｌｙｍ−１（ＯＮＣＯＬＹＭ）、ＷＯ２００２／０５３５９６に記載のインスリン様増殖因子−１受容体（ＩＧＦ−１Ｒ）に対する抗体などの上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）、インスリン受容体、インスリン様増殖因子受容体（ＩＧＦＲ）、肝細胞増殖因子受容体（ＨＧＦＲ）、及び血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）を含む、受容体型チロシンキナーゼの阻害剤、（１２）ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、スラミン（ＧＥＲＭＡＮＩＮ）、アンジオスタチン、ＳＵ５４１６、サリドマイドなどの血管新生阻害剤、及びマトリックスメタロプロテアーゼ阻害剤（バチマスタット及びマリマスタットなど）、及びＷＯ２００２０５５１０６に記載されているもの、ならびに（１３）ボルテゾミブ（ＶＥＬＣＡＤＥ）などのプロテアソーム阻害剤が挙げられる。
【０１９９】
「免疫治療剤」という用語は、哺乳動物の免疫応答を強化することができる化学的または生物学的物質を指す。免疫療法剤の例としては、カルメット−ゲラン桿菌（ＢＣＧ）；インターフェロンなどのサイトカイン；ＭｙＶａｘ個別化免疫療法、Ｏｎｙｖａｘ−Ｐ、Ｏｎｃｏｐｈａｇｅ、ＧＲＮＶＡＣ１、Ｆａｖｌｄ、Ｐｒｏｖｅｎｇｅ、ＧＶＡＸ、Ｌｏｖａｘｉｎ  Ｃ、ＢｉｏｖａｘＩＤ、ＧＭＸＸ、及びＮｅｕＶａｘなどのワクチン；ならびにアレムツズマブ（ＣＡＭＰＡＴＨ）、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、セツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）、ゲムツズナブオゾガミシン（ＭＹＬＯＴＡＲＧ）、イブリツモマブチウクセタン（ＺＥＶＡＬＩＮ）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）、リツキシマブ（ＲＩＴＵＸＡＮ、ＭＡＢＴＨＥＲＡ）、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、トシツモマブ（ＢＥＸＸＡＲ）、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）、トレメリムマブ、ＣＡＴ−３８８８、ＯＸ４０受容体に対するアゴニスト抗体（例えば、ＷＯ２００９／０７９３３５に開示されているもの）、ＣＤ４０受容体に対するアゴニスト抗体（例えば、ＷＯ２００３／０４０１７０に開示されているもの）、及びＴＬＲ−９アゴニスト（例えば、ＷＯ２００３／０１５７１１、ＷＯ２００４／０１６８０５、及びＷＯ２００９／０２２２１５に開示されているもの）などの抗体が挙げられる。
【０２００】
「ホルモン治療剤」という用語は、ホルモンの産生を阻害もしくは排除するか、またはがん性細胞の増殖及び／または生存に対するホルモンの効果を阻害または妨害する、化学的または生物学的物質を指す。本明細書の方法に好適なそのような薬剤の例には、ＵＳ２００７０１１７８０９に開示されているものが含まれる。特定のホルモン治療剤の例としては、タモキシフェン（ＮＯＬＶＡＤＥＸ）、トレミフェン（Ｆａｒｅｓｔｏｎ）、フルベストラント（ＦＡＳＬＯＤＥＸ）、アナストロゾール（ＡＲＩＭＩＤＥＸ）、エキセメスタン（ＡＲＯＭＡＳＩＮ）、レトロゾール（ＦＥＭＡＲＡ）、酢酸メゲストロール（ＭＥＧＡＣＥ）、ゴセレリン（ＺＯＬＡＤＥＸ）、及びリュープロイド（ＬＵＰＲＯＮ）が挙げられる。本開示の結合分子はまた、（１）卵巣、睾丸、副腎、及び下垂体などのホルモンの産生に関与する臓器または腺の全てまたは一部を除去する外科的方法、ならびに（２）標的化されたホルモンの産生を阻害または排除するのに十分な量で患者の臓器または腺に放射線を照射する放射線治療などの非薬物ホルモン療法と組み合わせて使用され得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、追加の治療剤は、ポマリスト、レブラミド、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ＤＮＡアルキル化白金含有誘導体、シスプラチン、５−フルオロウラシル、シクロホスファミド、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＰＤ−１抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＤ２０抗体、抗ＣＤ４０抗体、抗ＤＲ５抗体、抗ＣＤ１ｄ抗体、抗ＴＩＭ３抗体、ＳＬＡＭＦ７抗体、抗ＫＩＲ受容体抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＨＥＲ２抗体、抗ＥｒｂＢ−２抗体、抗ＥＧＦＲ抗体、セツキシマブ、リツキシマブ、トラスツズマブ、ペムブロリズマブ、放射線療法、単回放射線、分割放射線、焦点放射線、全臓器放射線、ＩＬ−１２、ＩＦＮα、ＧＭ−ＣＳＦ、キメラ抗原受容体、養子移入Ｔ細胞、抗がんワクチン、及び腫瘍溶解性ウイルスのうちの１つ以上である。
【０２０２】
また、がんを治療するための併用療法は、結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）と、腫瘍を除去するための手術との併用も包含する。結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）は、手術前、手術中、または手術後に哺乳動物に投与され得る。
【０２０３】
また、がんを治療するための併用療法は、結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）と、電離（電磁）放射線療法（例えば、Ｘ線またはガンマ線）及び粒子線放射線療法（例えば、高線形エネルギー放射線）などの放射線療法との併用も包含する。放射線源は、哺乳動物に対して外部でも内部でもあり得る。結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）は、放射線療法前、放射線療法中、または放射線療法後に哺乳動物に投与され得る。
【０２０４】
本開示によって提供される結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）及び組成物は、任意の好適な投与の経腸経路または非経口経路を介して投与することができる。投与の「経腸経路」という用語は、胃腸管の任意の部分を介した投与を指す。経腸経路の例としては、経口、粘膜、頬側、及び直腸経路、または胃内経路が挙げられる。投与の「非経口経路」とは、経腸経路以外の投与経路を指す。投与の非経口経路の例としては、静脈内、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、膀胱内、動脈内、髄腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、気管内、関節内、嚢下、くも膜下、脊髄内、硬膜外、及び胸骨内、皮下、または局所投与が挙げられる。本開示の結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）及び組成物は、経口摂取、経鼻胃管、胃瘻チューブ、注射、注入、埋め込み型注入ポンプ、及び浸透圧ポンプなどの任意の好適な方法を使用して投与することができる。好適な投与経路及び投与方法は、使用される特定の結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）、所望の吸収速度、使用される特定の製剤または剤形、治療される障害の種類または重篤度、特定の作用部位、及び患者の状態などの多数の要因に応じて異なり得、当業者によって容易に選択することができる。
【０２０５】
結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）の「有効量」という用語は、意図された治療目的に有効な量を指し得る。例えば、免疫応答を強化する文脈において、「有効量」は、哺乳動物の免疫系の任意の応答を刺激、誘発、増加、改善、または増強するのに有効である任意の量であり得る。疾患の治療の文脈において、「有効量」は、治療される哺乳動物において任意の望ましいまたは有益な効果を引き起こすのに十分な任意の量であり得る。具体的には、がんの治療において、望ましいまたは有益な効果の例としては、がん細胞のさらなる増殖もしくは転移の阻害、がん細胞の死滅、がんの再発の阻害、がんに関連する疼痛の低減、または哺乳動物の生存能の改善が挙げられる。結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）の治療有効量は、通常、哺乳動物の体重の約０．００１〜約５００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には約０．０１〜約１００ｍｇ／ｋｇの範囲である。例えば、量は、哺乳動物の体重の約０．３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、５０ｍｇ／ｋｇ、または１００ｍｇ／ｋｇであり得る。いくつかの実施形態では、結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）の治療有効量は、哺乳動物の体重の約０．０１〜３０ｍｇ／ｋｇの範囲である。いくつかの他の実施形態では、結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）の治療有効量は、哺乳動物の体重の約０．０５〜１５ｍｇ／ｋｇの範囲である。投与される正確な投与量レベルは、当業者によって容易に決定することができ、例えば、治療される障害の種類及び重篤度、援用される特定の結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）、投与経路、投与時間、治療期間、援用される特定の追加療法、治療される患者の年齢、性別、体重、状態、一般的な健康状態及び以前の病歴、ならびに医療分野でよく知られている要因などの多数の要因に依存する。
【０２０６】
結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）または組成物は、通常、複数回投与される。単回の投薬の合間の間隔は、例えば、毎日、毎週、毎月、３か月毎、または毎年であり得る。例示的な治療レジメンは、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１か月に１回、３か月に１回、または３〜６か月に１回の投与を伴う。結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）のための典型的な投与量レジメンは、体重１ｋｇあたり１ｍｇまたは体重１ｋｇあたり３ｍｇを静脈内投与によって、以下の投薬スケジュール：（ｉ）６投与量を４週間毎、次いで３か月毎、（ｉｉ）３週間毎、（ｉｉｉ）体重１ｋｇあたり３ｍｇを１回、続いて体重１ｋｇあたり１ｍｇを３週間毎、のうちの１つを使用することを含む。
【０２０７】
ＶＩＩＩ．キット
他の態様では、本開示に記載の結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）及び／または組成物を含むキットが本明細書に提供される。いくつかの実施形態では、キットは、結合分子（例えば、抗体または活性化可能抗体）及び／または組成物の使用説明書を含む添付文書をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、例えば、結合分子（例えば、抗体または活性化抗体）及び／または組成物を保存、移行、投与、またはそうでなければ使用するための１つ以上の緩衝液をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、結合分子（例えば、抗体または活性化抗体）及び／または組成物を保存するための１つ以上の容器をさらに含む。
【０２０８】
前述の記述は、当業者が本開示を実践することを可能にするのに十分であると見なされる。以下の実施例は例証目的でのみ提示され、決して本開示の範囲を限定することを意図していない。実際、本明細書に示され、説明される改変に加えて、本開示の様々な改変が前述の説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内に入るであろう。
【実施例】
【０２０９】
実施例１：ヒトＣＴＬＡ４に特異的に結合する一次Ｆａｂの生成
独自のファージミドライブラリー（ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９８３３３号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）を参照、また、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９８２９９号（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）も参照）を用いて、ヒトＣＴＬＡ４抗原に対してパニングした。合計３〜５ラウンドのパニングを実行した。最終ラウンドのパニング後、単一コロニー上清ＥＬＩＳＡを実施して、ヒトＣＴＬＡ４（例えば、ＵｎｉＰｒｏｔ受託番号Ｐ１６４１０を参照）を特異的に認識した一次ヒットを特定した。一次ヒットを、ＥＬＩＳＡシグナルがバックグラウンドの少なくとも２倍のヒットとして定義した。次いで、ヒットを配列決定し、ユニークなクローンをＥ．ｃｏｌｉ中に発現させて、精製した。ヒトＣＴＬＡ４に対する親和性を、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システムによって測定した。簡潔に言えば、ＡＨＣセンサー（Ａｎｔｉ−Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ  Ｆｃ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｄｉｐ及びＲｅａｄ  Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ）を使用して、組換えヒトＣＴＬＡ４−Ｆｃ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、１１１５９−Ｈ０３Ｈ）を捕捉し、動態緩衝液（ＰＢＳ緩衝液中０．０２％のＴｗｅｅｎ２０、０．１％のＢＳＡ）中で１０μｇ／ｍＬに希釈した精製Ｆａｂを含有するウェルに浸漬した。取得したＦｏｒｔｅＢｉｏデータをＤａｔａ  Ａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎソフトウェア７．１で処理し、動態データを１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングした。候補者リストを、ＥＬＩＳＡ陽性ヒット及びユニーク配列の両方で２３４のＦａｂヒットに絞り込んだ。ＫＤ応答シグナルの基準Ｒ＞０．１、Ｒ２＞０．９に従い、リストを目的の４３のヒットにさらに絞り込んだ。これらのヒットの親和性及び動態パラメータ（バックグラウンドを差し引いたもの）を、以下の表１に示す。
2021511808.tif 000016
2021511808.tif 000017
【０２１０】
次に、様々なＦａｂヒットの種交差反応性をＥＬＩＳＡによって決定した。簡潔に言えば、１００μＬの１．２５μｇ／ｍＬの抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ、Ｉ５２６０）を、Ｍａｘｉｓｏｒｐマイクロプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ４４６４６９）上に４℃で一晩塗布した。遮断後、１００μＬのＦａｂヒット（２μｇ／ｍＬ）を添加し、１時間インキュベートした。ウェルを３〜４回洗浄した後、ヒトＦＣ断片と融合したヒト、カニクイザル、またはマウスＣＴＬＡ４抗原の段階希釈を加え、１時間インキュベートした。洗浄後、ＨＲＰ標識ヤギ抗ヒトＦＣをＰＢＳで１：２０００に希釈し、１時間のインキュベーションのために各ウェルに添加した。プレートを３回洗浄し、ＴＭＢ基質と室温で３〜５分間インキュベートした。反応停止後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。試験した各Ｆａｂの種交差反応性を、以下の表２に概説する。興味深いことに、この分析は異なる交差反応性を有するＦａｂを特定し、結果は、ヒットＢ１３８７３、Ｂ１５７００、Ｂ１５７０４、Ｂ１５７０６、Ｂ１５７０９、Ｂ１５７１１、Ｂ１５７１２、Ｂ１５７１５、Ｂ１５７２０、Ｂ１５７２５、Ｂ１５７２３、Ｂ１５７３１、Ｂ１５７３２、Ｂ１５７３５、Ｂ１５７３６、Ｂ１５７４４、Ｂ１５７６０、Ｂ１６０８３、及びＢ１５１８８が、ヒト、サル、及びマウスＣＴＬＡ４に結合し、ヒットＢ１５１８８、Ｂ１５１９０、Ｂ１５７０１、Ｂ１５７２９、Ｂ１５７３３、Ｂ１５７４２、Ｂ１５７４７、Ｂ１５７４３、Ｂ１５７５１、Ｂ１５７５２、Ｂ１５７５３、及びＢ１８１５７が、ヒト及びサルＣＴＬＡ４に結合し、かつマウスＣＴＬＡ４に弱く結合し、ヒットＢ１３８７８、Ｂ１４２４２、Ｂ１５１８９、Ｂ１５４９１、Ｂ１５６７３、Ｂ１５６９４、Ｂ１５６９６、Ｂ１５６９９、Ｂ１５７０２、Ｂ１５７０５、Ｂ１５７１０、Ｂ１５７１６、Ｂ１５７１７、Ｂ１５７１９、Ｂ１５７２１、Ｂ１５７２２、Ｂ１５７２４、Ｂ１５７２８、Ｂ１５７３４、Ｂ１５７３７、Ｂ１５７３８、Ｂ１５７３９、Ｂ１５７４０、Ｂ１５７４５、Ｂ１５７４６、Ｂ１５７４９、Ｂ１５７５０、Ｂ１５７５４、Ｂ１５７５６、Ｂ１５７５７、Ｂ１５７５９、及びＢ１５７６２が、ヒトＣＴＬＡ４に結合したが、マウスＣＴＬＡ４には結合せず、ヒットＢ１５６８８は、ヒト及びマウスＣＴＬＡ４結合したが、サルＣＴＬＡ４には結合せず、ヒットＢ１３８７４、Ｂ１３８８０、Ｂ１３８９８、Ｂ１５１８７、Ｂ１５４８９、Ｂ１５６７２、Ｂ１５６９５、Ｂ１５７３０、Ｂ１５７４１、Ｂ１８１５３、及びＢ１８１７４は、ヒトＣＴＬＡ４に結合したが、サルまたはマウスＣＴＬＡ４には結合しなかったことを示した。
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【０２１１】
実施例２：ＩｇＧ変換及び発現
上記の実施例１からの１３個の精製されたヒットを、次いで、詳細な生物物理学的及び機能的特性評価のためにヒトＩｇＧ１抗体に変換した（表３）。ＦａｂヒットＢ１５７０９、Ｂ１５７１６、Ｂ１５７２２、Ｂ１５７３２、Ｂ１５７４０、Ｂ１５７４４、Ｂ１５７５６、Ｂ１５７００、Ｂ１５７１１、Ｂ１５７１７、Ｂ１５７３５、Ｂ１５７３６、及びＢ１６０８３の重鎖及び軽鎖を、哺乳動物発現ベクターｐＴＴ５−ＳＰＢに別個にクローニングした。参照抗体の重鎖及び軽鎖もｐＴＴ５−ＳＰＢにクローニングした。
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【０２１２】
抗体の重鎖及び軽鎖をコードするプラスミドの対を、製造業者のプロトコルに従って２９３Ｆ細胞に一時的にトランスフェクトした。抗体ＴＹ２１５８５、ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１５８７、ＴＹ２１５８８、ＴＹ２１５８９、ＴＹ２１５８０、またはＴＹ２１５９１をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞の上清を採取し、遠心分離及び濾過によって清澄化して、得られたＩｇＧを標準のタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。タンパク質を溶出及び中和し、緩衝液を２０ｍＭのＰＢ緩衝液（２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に交換した。タンパク質濃度をＵＶ分光光度法によって決定し、ＩｇＧ純度を変性、還元、及び非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０２１３】
抗体ＴＹ２１６８７、ＴＹ２１６８９、ＴＹ２１６８０、ＴＹ２１６９１、またはＴＹ２１６９２をコードするプラスミドでトランスフェクトされた細胞の上清を採取し、遠心分離及び濾過によって清澄化して、得られたＩｇＧを標準のタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。タンパク質を溶出及び中和し、緩衝液を２０ｍＭのヒスチジン緩衝液（２０ｍＭのヒスチジン、３．５ｍＬの６ＭのＨＣｌ、ｐＨ５．５）に交換した。タンパク質濃度をＵＶ分光光度法によって決定し、ＩｇＧ純度を変性、還元、及び非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。
【０２１４】
実施例３：ＩｇＧ変換抗体のインビトロ機能的特性評価
製造業者のガイドラインに従って、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって、ヒト、サル、及びマウスＣＴＬＡ４に対する抗体の結合親和性及び動態を調査した（表４）。ヒト抗体捕捉キット（ＧＥ  ＢＲ−１００８−３９）からの抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｂｉａｃｏｒｅ＃ＢＲ−１０００−５０）の説明書に従って、そのアミン群をセンサーチップのカルボキシル化表面にカップリングすることによって、ＣＭ５チップに固定化した。固定化抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を使用して、抗体ＴＹ２１５８５、ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１５８０、ＴＹ２１５９１、ＴＹ２１６８７、ＴＹ２１６８９、ＴＹ２１６８０、ＴＹ２１６９１、ＴＹ２１６９２、及びＴＡＣ２１１４を捕捉した。ＴＡＣ２１１４は、市販の抗体イピリムマブと同じアミノ酸配列を有する。結合を、６つの異なる濃度（泳動用緩衝液中で希釈した３．１３、６．２５、１２．５、２５、５０、及び１００ｎＭ）で測定し、３０μＩ／分の流速を使用した。使用した泳動用緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．６）であった。製造業者のガイドラインに従って、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ）を使用して、会合及び解離曲線を１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングした。以下の表４に示すように、全ての試験された抗体がヒト及びサルＣＴＬＡ４に結合することができ、ＴＹ２１５９１、ＴＹ２１６８９、及びＴＡＣ２１１４を除く全ての抗体はマウスＣＴＬＡ４にも結合することができた。
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【０２１５】
次に、特定のＩｇＧ抗体の可溶性ヒト（図１Ａ、表５Ａ）またはイヌ（図１Ｂ、表５Ｂ）ＣＴＬＡ４に結合する能力を試験した。１μｇ／ｍＬの、ヒトＦＣ断片と融合したヒトＣＴＬＡ４、またはＨｉｓタグと融合したイヌＣＴＬＡ４を調製して、ＥＬＩＳＡプレートを２〜８℃で一晩塗布するために使用した。遮断後、１００μＬの段階希釈されたＩｇＧ抗体を添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、次いで、ＨＲＰ抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（１：６０００希釈）と３７℃で１時間インキュベートした。再度、プレートを４回洗浄し、ＴＭＢ基質と室温で１５分間インキュベートした。反応停止後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。データを、非線形フィッティングを備えたＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６によって分析した。図１Ａ〜Ｂ及び表５Ａ〜Ｂに示すように、全ての試験された抗体がヒトＣＴＬＡ４に結合し、また、抗体ＴＹ２１５８６及びＴＡＣ２１１４を除いて、イヌＣＴＬＡ４にも結合した。興味深いことに、ＴＹ２１５８０はヒト及びイヌＣＴＬＡ４の両方に最高親和性で結合し、ＫＤはそれぞれ、０．２７及び０．４９であった。
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【０２１６】
抗体の親和性はまた、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の表面上に一時的に発現されたヒト及びマウスＣＴＬＡ４に対して評価された（図２）。簡潔に言えば、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、ＥＧＦＰもコードするバイシストロニックＩＲＥＳベクターからの完全長ヒト、サル、またはマウスＣＴＬＡ４を発現するプラスミドをトランスフェクトし、ＥＧＦＰ発現を使用してトランスフェクトされた細胞を特定した。４８時間後、哺乳動物細胞の懸濁液（２×１０５／ウェル）をエッペンドルフチューブに移し、遠心分離して、上清を廃棄し、細胞を１ｍＬのＰＢＳＡで（密度が４×１０６細胞／ｍＬになるまで）再懸濁して、９６ウェルプレートに添加した。試験抗体の３倍段階希釈（１５μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、１．６７μｇ／ｍＬ、０．５５μｇ／ｍＬ、０．１８５μｇ／ｍＬ、０．０６２μｇ／ｍＬ、及び０．０３０９μｇ／ｍＬ、ならびに０μｇ／ｍＬブランク対照）をピペットで９６ウェルプレートに移し、氷上で１時間（光から保護して）インキュベートして、細胞を事前に冷却した１倍のＰＢＳＡ緩衝液で洗浄し、続いてＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートマウス抗ヒトＦＣ抗体と氷上で３０分間インキュベートした。次いで、フローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ（登録商標）ＣｙｔｏＦｌｅｘ）による分析の前に、細胞を１回洗浄した。図２に示すように、全ての試験抗体はＨＥＫ２９３Ｆ細胞の表面に発現したヒトＣＴＬＡ４に結合することができ、ＴＹ２１５８９を除く全ての抗体は、マウス細胞表面に露出したマウスＣＴＬＡ４に結合した。ＴＹ２１５８０は、細胞表面に発現したヒト及びマウスＣＴＬＡ４に低ｎＭ親和性で結合したが、抗体ＴＹ２１５８５及びＴＹ２１５８６は、細胞表面に発現したヒトＣＴＬＡ４に高ｎＭ親和性で結合した。
【０２１７】
ラットＣＴＬＡ４タンパク質に対する抗体ＴＹ２１５８０、ＴＹ２１６８７、ＴＹ２１６８０、及びＴＹ２１６９１の結合親和性及び動態も、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  ｒｅｄ  ９６機器（Ｐａｌｌ、ＵＳＡ）を使用して試験した。ＳＡセンサー（Ｐａｌｌ、１８５０１９）を使用して、ヒトＦＣと融合したビオチン化ラットＣＴＬＡ４タンパク質を固定化し、次いで、センサーをＩｇＧ変換ヒットと１５μｇ／ｍＬの濃度（０．０２％のＴｗｅｅｎ  ２０及び０．１％のＢＳＡで補充したＰＢＳ緩衝液であるＫＢ緩衝液で希釈した）で３００秒間接触させ、次いで、ＫＢ緩衝液中で３００秒間解離した。製造業者のガイドラインに従って、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ７．１（Ｐａｌｌ、ＵＳＡ）を使用して、会合及び解離曲線を１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングした。以下の表６に示すように、全ての試験された抗体がラットＣＴＬＡ４に結合することができた。
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【０２１８】
活性化されたＴ細胞へのＩｇＧの結合
次に、活性化されたヒト、サル、及びマウスのＴ細胞に結合するＩｇＧの能力を試験した。ヒトＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ）を使用した密度勾配遠心分離によって、健康なドナー（＃１０６）の血液から新たに単離した。ヒトＴ細胞を、ヒトＴ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＰＢＭＣから単離し、続いて、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体で刺激した。簡潔に言えば、抗ＣＤ３抗体（クローン：ＯＫＴ３、ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬ中０．２μｇで、４℃で一晩塗布した。洗浄後、Ｔ細胞を１０％のＦＢＳ及び１％のＰｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で懸濁し、プレートに添加した。２００μＬ中５×１０Ｅ５のＴ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。次いで、１μＬの抗ヒトＣＤ２８抗体（クローン：２８．２、ＢＤ）を、最終濃度５μｇ／ｍＬになるまで添加した。Ｔ細胞を９６時間インキュベートし、次いで、ＴＹ２１５８０のＴ細胞への結合をフローサイトメトリー分析によって決定した（図３）。Ｔ細胞を、ＡＰＣ標識ＴＹ２１５８０またはヒトＩｇＧ１（アイソタイプ対象）を用いて３７℃で２時間染色した。洗浄後、細胞をＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で分析し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。図３に示すように、ＴＹ２１５８０は活性化されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋ヒトＴ細胞に結合したが、対照ＩｇＧは結合を示さなかった。さらに、ＡＰＣ−ＴＹ２１５８０は、休止Ｔ細胞への結合を示さなかった（データ未掲載）。
【０２１９】
サルＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ）を使用した密度勾配遠心分離によって、未処置のカニクイザルの血液から新たに単離した。サルＴ細胞を、パンＴ細胞単離キット非ヒト霊長類（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用してＰＢＭＣから単離し、続いて、抗ＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体で刺激した。簡潔に言えば、抗ＣＤ３抗体（クローン：ＳＰ３４、ＢＤ）を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬ中０．２μｇで、４℃で一晩塗布した。洗浄後、Ｔ細胞を１０％のＦＢＳ及び１％のＰｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で懸濁し、プレートに添加した。２００μＬ中２×１０Ｅ５のＴ細胞を、９６ウェルプレートの各ウェルに添加した。次いで、１μＬの抗ヒトＣＤ２８抗体（クローン：２８．２、ＢＤ）を、最終濃度５μｇ／ｍＬになるまで添加した。Ｔ細胞を７２時間インキュベートし、ＴＹ２１５８０のＴ細胞への結合をフローサイトメトリー分析によって決定した（図３）。Ｔ細胞を、ＡＰＣ標識ＴＹ２１５８０またはヒトＩｇＧ１（アイソタイプ対象）を用いて３７℃で２時間染色した。洗浄後、細胞をＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で分析し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。図３に示すように、ＴＹ２１５８０は活性化されたＣＤ４＋及びＣＤ８＋サルＴ細胞に結合したが、対照ＩｇＧは結合を示さなかった。さらに、ＡＰＣ−ＴＹ２１５８０は、休止Ｔ細胞への結合を示さなかった（データ未掲載）。
【０２２０】
成体のＢＡＬＢ／ｃマウスの脾臓から単離されたマウスＴ細胞を使用して、ＣＴＬＡ−４発現を誘導した。新たなマウスの脾臓からの脾細胞を使用して、ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウスＴ細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いてＴ細胞を単離し、続いて抗マウスＣＤ３及び抗ＣＤ２８抗体で刺激した。簡潔に言えば、抗マウスＣＤ３ε抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）を、９６ウェルプレートに１ウェルあたり２００μＬ中０．２μｇで、４℃で一晩塗布した。洗浄後、マウスＴ細胞を１０％のＦＢＳ及び１％のＰｅｎｎ／Ｓｔｒｅｐを含有するＲＰＭＩ−１６４０中で懸濁し、プレートの各ウェルに２００μＬ中５×１０Ｅ５のＴ細胞で添加した。次いで、１μＬの抗マウスＣＤ２８抗体（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を５μｇ／ｍＬの最終濃度まで添加した。マウスＴ細胞を７２時間インキュベートし、次いで、ＴＹ２１５８０のＴ細胞への結合をフローサイトメトリー分析によって決定した（図３）。Ｔ細胞を、ＡＰＣ標識ＴＹ２１５８０またはヒトＩｇＧ１（アイソタイプ対象）を用いて３７℃で２時間染色した。洗浄後、細胞をＣｙｔｏＦＬＥＸフローサイトメーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ）上で分析し、データをＦｌｏｗＪｏソフトウェアで分析した。図３に示すように、ＴＹ２１５８０は活性化されたマウスＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞に結合したが、対照ＩｇＧは結合を示さなかった。
【０２２１】
ヒトＣＴＬＡ４に対する抗体の結合選択性
次に、抗体選択性を調査した。ヒトＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、Ｂ７Ｈ３、ＣＤ９５、ＴＮＦＲ１、ＯＸ４０、ＣＤ４０、ＰＤ−Ｌ１、ＢＬＴＡ、ＶＩＳＴＡ、ＰＤＬ２、ＩＣＯＳ、及びＢ７Ｈ４は、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞の表面上に一時的に過剰発現した。トランスフェクトした細胞を、事前に冷却した１倍のＰＢＳＡ緩衝液（１．７６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０．１４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、１３６．８９ｍＭのＮａＣｌ、及び１％のＢＳＡ）中で洗浄し、次いで、１００ｎＭの試験抗体と氷上で１時間インキュベートした。細胞を染色緩衝液で１回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７コンジュゲートマウス抗ヒトＦＣ抗体を添加して、光から保護して氷上で３０分間インキュベートした。フローサイトメトリーによる分析の前に、試料を染色緩衝液で１回洗浄した。ＴＹ２１５８５  ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１５８０、ＴＹ２１６８７、ＴＹ２１６８９、ＴＹ２１６８０、及びＴＹ２１６９１を、ヒトＣＴＬＡ４、ＰＤ１、ＬＡＧ３、Ｔｉｍ３、及びＢ７−Ｈ３で試験し（図４Ａ）、ＴＹ２１５８５  ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１５８０を、ヒトＣＤ９５、ＴＮＦＲ１、ＯＸ４０、及びＣＤ４０でさらに試験し（図４Ｂ）、さらに、ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１５８０を、ヒトＰＤ−Ｌ１、ＢＬＴＡ、ＶＩＳＴＡ、ＰＤＬ２、ＩＣＯＳ、及びＢ７−Ｈ４で試験した（図４Ｃ）。図４Ａ〜Ｃに示すように、全ての試験された抗体がヒトＣＴＬＡ４に特別に結合し、他の試験された抗原（または空のベクターでトランスフェクトされた親細胞）のいずれにも結合しなかった。
【０２２２】
ＥＬＩＳＡによるリガンド競合結合
次いで、抗体を、ＣＴＬＡ４のその同族リガンドＣＤ８０及びＣＤ８６への結合を遮断するそれらの能力について、ＥＬＩＳＡによって試験した。組換えヒトＣＴＬＡ４（ヒトＦｃ及びＨｉｓタグと融合）を、ｐＨ９．４の炭酸緩衝液中で１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に４℃で一晩塗布した。プレートを、２％（ｗ／ｖ）の脱脂乳で補充されたＰＢＳを用いて、３７℃で１時間遮断した。洗浄後、５０ｕＬのビオチン化ＣＤ８０（４μｇ／ｍＬ）及び５０ｕＬの様々な濃度の試験抗体（２００μｇ／ｍＬ〜１．５６μｇ／ｍＬの範囲の２倍段階希釈）を各ウェルに連続して添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、１００μＬのＨＲＰ−ニュートラアビジン（１：１０００）を各ウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを前述のように洗浄し、５０μＬのＴＭＢ基質溶液を添加して、室温で５分間インキュベートした後、反応を５０μＬの硫酸（２Ｍ）によって停止した。図５Ａ〜Ｂに示すように、ＴＹ２１５８９を除く全ての試験された抗体がＣＴＬＡ４のＣＤ８０への結合を遮断した。
【０２２３】
ヒトＦｃと融合した組換えヒトＣＤ８６を、ｐＨ９．４の炭酸緩衝液中で１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に４℃で一晩塗布した。プレートを、２％（ｗ／ｖ）の脱脂乳で補充されたＰＢＳを用いて、３７℃で１時間遮断した。洗浄後、ヒトＦＣ及びＨｉｓタグと融合した５０ｕＬのビオチン化ヒトＣＴＬＡ４（２．８μｇ／ｍＬ）及び５０ｕＬの様々な濃度の試験抗体（１００μｇ／ｍＬ〜０．７８μｇ／ｍＬの範囲の２倍段階希釈）を各ウェルに連続して添加し、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを４回洗浄し、１００μＬのＨＲＰ−ニュートラアビジン（１：１０００）を各ウェルに添加して、３７℃で１時間インキュベートした。プレートを前述のように洗浄し、５０μＬのＴＭＢ基質溶液を添加して、室温で５分間インキュベートした後、反応を５０μＬの硫酸（２Ｍ）によって停止した。図５Ｃ〜Ｄに示すように、全ての試験された抗体がＣＴＬＡ４のＣＤ８６への結合を遮断した。
【０２２４】
フローサイトメトリーによるリガンド競合結合
また、抗体を、ＣＴＬＡ４のその同族リガンドＣＤ８０及びＣＤ８６への結合を遮断するそれらの能力について、フローサイトメトリーによって試験した。完全長ヒトＣＴＬＡ４をコードするプラスミドは、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞において一時的に発現した。細胞を染色緩衝液（１．７６ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、１０．１４ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４・１２Ｈ２Ｏ、２．６８ｍＭのＫＣｌ、１３６．８９ｍＭのＮａＣｌ、及び１％のＢＳＡを含むＰＢＳＡ緩衝液）で洗浄し、１００ｎＭの試験抗体を含有する染色緩衝液中に再懸濁した。氷上で６０分間インキュベートした後、１００ｎＭのビオチン化ヒトＣＤ８０−Ｆｃ−ＢｉｏまたはＣＤ８６−Ｆｃ−Ｂｉｏを各ウェルに添加し、氷上でさらに１時間インキュベートした。細胞を染色緩衝液で１回洗浄し、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６３３コンジュゲートストレプトアビジンを含有する１００μＬの染色緩衝液を添加して、光から保護して氷上で３０分間インキュベートした。細胞を１回洗浄し、ＣｙｔｏＦｌｅｘフローサイトメトリーによって分析した。図６Ａに示すように、全ての試験された抗体が濃度依存性の様式でＣＴＬＡ４のＣＤ８０への結合を遮断した。ＴＹ２１５８８が最も強力な遮断機能を示し、続いてＴＹ２１５８０及びＴＡＣ２１１４が有意な遮断を示し、ＴＹ２１５８５、ＴＹ２１５８７、ＴＹ２１５８９、ＴＹ２１５９１がより低い遮断効果を示した。ＴＹ２１５８９は、ほとんどまたは全く遮断を示さなかった。図６Ｂに示すように、全ての試験された抗体が濃度依存性の様式でＣＴＬＡ４のＣＤ８６への結合を遮断した。ＴＹ２１５８８、ＴＹ２１５８９、ＴＹ２１５８０、ＴＹ２１５９１、及びＴＡＣ２１１４が最も強力な遮断機能を示し、ＴＹ２１５８５及びＴＹ２１５８７がより低い遮断効果を示した。
【０２２５】
ＦｃγＲへの結合
次に、ＣＤ１６ａ（１７６Ｐｈｅ）（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ、１０３８９−Ｈ０８Ｈ）、ＣＤ１６ａ（１７６Ｖａｌ、１０３８９−Ｈ０８Ｈ１）、ＣＤ３２ａ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ、１０３７４−Ｈ０８Ｈ）、ＣＤ３２ｂ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ、１０２５９−Ｈ０８Ｈ）、及びＣＤ６４（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ、１０２５６−Ｈ０８Ｈ）に対するＴＹ２１５８６、ＴＹ２１５８０、及びＴＡＣ２１１４の結合親和性を試験した。製造業者のガイドラインに従って、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析によって、タンパク質結合を調査した。タンパク質Ｌ（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．１１０４４−Ｈ０７Ｅ）を、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｂｉａｃｏｒｅ＃ＢＲ−１０００−５０）の説明書に従って、そのアミン群をセンサーチップのカルボキシル化表面にカップリングすることによって、ＣＭ５チップに固定化した。固定化抗ヒトＩｇＧ（Ｆｃ）抗体を使用して、ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１５８０、及びＴＡＣ２１１４を捕捉した。ＦｃγＲタンパク質の泳動用緩衝液中で希釈した段階濃度（１２．５、２５、５０、２５、１００、及び２００ｎＭ）を、３０μＩ／分の流速で注入した。使用した泳動用緩衝液は、ＨＢＳ−ＥＰ（１００ｍＭのＨＥＰＥＳ、１．５Ｍの塩化ナトリウム、０．０５％の界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．６）であった。製造業者のガイドラインに従って、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して、会合及び解離曲線を１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングした。以下の表７に示すように、ＴＹ２１５８６及びＴＹ２１５８０は、参照抗体（ＴＡＣ２１１４）と比較して、ＦｃγＲへの結合に対して同様の親和性を示した。
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【０２２６】
ＦｃＲｎへの結合
製造業者のガイドラインに従って、Ｂｉａｃｏｒｅ（商標）Ｔ２００機器（Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用した表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）分析により、組換えヒトＦｃＲｎに対する試験抗体の結合親和性を調査した。ヒトＦｃＲｎタンパク質（Ｓｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｃ．１１０４４−Ｈ０７Ｅ）を、アミンカップリングキット（ＧＥ  Ｂｉａｃｏｒｅ＃ＢＲ−１０００−５０）の説明書に従って、そのアミン群をセンサーチップのカルボキシル化表面にカップリングすることによって、ＣＭ５チップに固定化した。１００ｎＭの各抗体を泳動用緩衝液（５０ｍＭのＮａＰＯ４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０５％（ｖ／ｖ）の界面活性剤２０、ｐＨ６．０）中で希釈し、試料を３０μＩ／分の流速で１２０秒間注入した。図７に示すように、抗体ＴＹ２１５８５、ＴＹ２１５８０、ＴＹ２１５９１、ＴＹ２１６８７、及びＴＹ２１６９１は、ＴＡＣ２１１４よりも高いＦｃＲｎへの結合％を示し、これは、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上のＩｇＧ−ＦｃＲｎ複合体が、参照抗体（ＴＡＣ２１１４）と比較して、複合体を安定させる立体配座変化を受け得ることを示した。抗体ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１５８７、ＴＹ２１５８９、ＴＹ２１６８９、及びＴＹ２１６８０は、低い結合％を示した。
【０２２７】
ヒトＰＢＭＣ活性化
予備研究は、ＴＹ２１５８０がヒトＴ細胞の活性化または増殖を刺激しなかったことを示した。Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ４活性は、第１のシグナル（ＴＣＲ／ＣＤ３）及びＢ７−ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４に関与する第２のシグナルに関連しているため、ヒトＰＢＭＣを選択し、低濃度の抗ＣＤ３の存在下でのＴＹ２１５８０の活性を決定した。抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３）を９６ウェルプレート上に４℃で一晩に塗布した。洗浄後、１×１０５の新たに単離したヒトＰＢＭＣを各ウェルに添加し、続いて、異なる濃度で試験品を添加した。ＩＬ−２の誘導を、ヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを使用して刺激から４８時間後に測定した。上清中のＩＦＮγを、ヒトＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを使用して測定した。図８Ａ及び図９に示すように、抗体ＴＹ２１５８０は、抗ＣＤ３の存在下でヒトＰＢＭＣ活性化を有意に増加させたが、ＴＹ２１５８０単独では活性を有しなかった。
【０２２８】
樹状細胞ＭＬＲアッセイ
ＤＣ−ＭＬＲアッセイを、３つのドナー対：Ｄ４２／Ｄ１０９、Ｄ３２／Ｄ１０４、及びＤ１０４／Ｄ４２において、単球由来のＤＣ及びＣＤ４＋Ｔリンパ球を使用して実行した（図１０）。ＤＣ細胞を得るために、ＰＢＭＣを健康なドナーから密度勾配遠心分離によって単離し、ＣＤ１４＋単球を陽性選択市販キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用してＰＢＭＣから精製した。ＣＤ１４＋単球を、１０％の熱不活化ＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、２０ｎｇ／ｍＬのｒｈＧＭ−ＣＳＦ、及び２０ｎｇ／ｍＬのｒｈＩＬ−４で補充されたＲＰＭＩ−１６４０中で６日間インビトロ培養することによって、ＤＣに歪めた。培養培地を３日目に新鮮な培地と交換した。ＤＣ成熟を、１０％の熱不活化ＦＢＳ、１％のペニシリン／ストレプトマイシン、及び５０ｎｇ／ｍＬのｒｈＴＮＦ−αで補充されたＲＰＭＩ−１６４０培地中で、６日目に２４時間誘導した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を、別の健康なドナーから陰性単離することによって精製した。（図１０に示すように、）試験品を対応する濃度に滴定した。採取したＤＣ（１×１０４）を、滴定した試験品の有無にかかわらず、同種異形ＣＤ４＋Ｔ細胞（１×１０５）と共培養した。抗ＰＤ１抗体をＤＣ−ＭＬＲアッセイの陽性対照として使用した。共培養後５日目に、ＩＦＮγを、ヒトＩＦＮγ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ  ＥＬＩＳＡキットを使用してＥＬＩＳＡによって上清中で測定した。図１０に示すように、抗体ＴＹ２１５８０は、ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＣを使用するＤＣ−ＭＬＲアッセイにおいて弱い活性を示した。
【０２２９】
抗体ＴＹ２１５８０のＡＤＣＣ活性
ヒトＣＴＬＡ−４を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞を標的細胞として使用して、ＴＹ２１５８０媒介型ＡＤＣＣ活性を評価した。ヒトＮＫ細胞を、ヒトＮＫ単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して、ヒトＰＢＭＣから新たに単離した。１×１０５個のＮＫ細胞及び１×１０４個のＨＥＫ２９３Ｆ／ｈＣＴＬＡ−４細胞（Ｅ：Ｔ比１０：１）を、異なる濃度の抗体と混合した。４時間インキュベートした後、ＬＤＨを測定してＡＤＣＣ活性を決定した。次いで、％溶解を、以下の式：％溶解＝［（実験的放出）−平均値（標的＋ＮＫ）］／［平均値（標的最大）−平均値（標的単独）］×１００％を使用して計算した。図１１Ａ〜Ｂに示すように、ＴＹ２１５８０は、参照抗体（ＴＡＣ２１１４）よりも強いＡＤＣＣ活性を示した。アイソタイプ対照はＡＤＣＣ活性を全く示さなかった。
【０２３０】
また、ＡＤＣＣ活性を、ヒトＴｒｅｇ細胞（Ａ、ドナー＃９６；Ｂ、ドナー＃１２）及びＮＫ細胞（Ａ、ドナー＃９９；Ｂ、ドナー＃０５）を使用して評価した。ヒトＴｒｅｇ細胞を得るために、ヒトＰＢＭＣを健康なドナーから新たに単離し、ＥＡＳＹＳＥＰ（商標）ヒト制御性Ｔ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用してＴｒｅｇ細胞を陰性選択した。濃縮されたヒトＴｒｅｇ細胞は、ＩＬ−２の存在下でのＣＤ３／ＣＤ２８刺激によってさらに増殖し、ＣＤ２５及びＦＯＸＰ３染色ならびにＦＡＣＳ分析によって確認された。ヒトＮＫ細胞を得るために、ヒトＰＢＭＣを別の健康なドナーから新たに単離し、ＮＫ細胞をヒトＮＫ単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して単離した。ヒトＴｒｅｇ細胞を、１０μＭのカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃で３０分間標識した。３回洗浄した後、標識されたＴｒｅｇ細胞を異なる濃度の試験品と混合し、続いてＮＫ細胞を添加した。１×１０５個のＮＫ細胞及び１×１０４個の標識されたヒトＴｒｅｇ細胞を９６ウェルプレートのウェルに添加し、混合してＥ：Ｔ比を１０：１にした。４時間インキュベートした後、上清中のカルセインＡＭ濃度を測定し、以下の式：％溶解＝［（実験的放出）−平均値（標的＋ＮＫ）］／［平均値（標的最大）−平均値（標的単独）］×１００％を使用してＡＤＣＣ活性を決定した。図１２Ａ〜Ｂに示すように、抗体ＴＹ２１５８０は、参照抗体（ＴＡＣ２１１４）よりも強いＡＤＣＣ活性を示した。アイソタイプ対照はＡＤＣＣ活性を示さなかった。
【０２３１】
ＴＹ２１５８０のＣＤＣ活性
ヒトＣＴＬＡ−４を過剰発現しているＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、１０μＭのカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃で３０分間標識した。９６ウェルプレートのウェルに、異なる濃度の抗体を１×１０４個の標識された細胞及び５％の正常ヒト血清補体（ＮＨＳＣ、Ｑｕｉｄｅｌ）と混合した。５時間インキュベートした後、上清中のカルセインＡＭを測定して、ＣＤＣ活性を決定した（図１３）。
【０２３２】
ヒトＰＢＭＣを、健康なドナー（ドナー＃５７）から新たに単離した。ＣＤ４＋Ｔ細胞をＥａｓｙＳｅｐヒトＣＤ４＋Ｔ細胞濃縮キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ）を使用して単離し、ＰＭＡ（５０ｎｇ／ｍＬ）＋イオンマイシン（１μＭ）で２０時間刺激して、細胞表面上にＣＴＬＡ−４発現を誘導した。次いで、活性化されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞を、１０μＭのカルセインＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で３７℃で３０分間標識した。９６ウェルプレートのウェルに、異なる濃度の抗体を１×１０４個の標識されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞及び５％の正常ヒト血清補体（ＮＨＳＣ、Ｑｕｉｄｅｌ）と混合した。５時間インキュベートした後、上清中のカルセインＡＭを測定して、ＣＤＣ活性を決定した（図１４）。ＴＹ２１５８０はＨＥＫ２９３Ｆ／ｈＣＴＬＡ−４細胞または活性化されたヒトＴ細胞に対してＣＤＣ活性を示さなかった。
【０２３３】
まとめると、これらの結果は、本明細書に記載の抗体が高い親和性及び特異性でヒトＣＴＬＡ４に結合することができ、そのような抗体がＣＴＬＡ４のその同族リガンドＣＤ８６及びＣＤ８０との相互作用を効率的に遮断したことを示している。抗体はまた、複数の種からのＣＴＬＡ４と交差反応性であることも示された。さらに、ＣＴＬＡ４への結合は、Ｔ細胞の活性化を調節し、ＴｒｅｇなどのＣＴＬＡ４発現細胞に対するＡＤＣＣ活性を誘導し得る。
【０２３４】
実施例４：ＩｇＧ変換抗体のインビボ特性評価
上記の実施例に記載したように、抗体の種交差反応性（ヒト及びマウス）は、ＭＣ３８及びＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデル、Ｈ２２肝臓腫瘍モデル、ＰＡＮ０２膵臓腫瘍モデル、及び３ＬＬ肺腫瘍モデルを含む複数の同系腫瘍モデルにおいて抗体の抗腫瘍効力の決定を可能にした。
【０２３５】
ＭＣ３８結腸直腸腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝８、雌、６〜８週齢）に、ＭＣ３８（ＮＴＣＣ−ＭＣ３８）マウス結腸癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（８０ｍｍ３）、治療を、週に２回、３週間の腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体及び３つの異なる投与量の抗体ＴＹ２１５８０を用いて開始した。腫瘍増殖を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として報告した（図１５Ａ〜Ｃ）。図１５Ａに示すように、アイソタイプ対照抗体と比較して、ＴＹ２１５８０は強力なインビボ抗腫瘍活性を示し、腫瘍は３つ全ての投与量で完全に退縮した。図１５Ｂに示すように、治療後６０日まで、１０ｍｇ／ｋｇのＴＹ２１５８０群における８匹中８匹のマウス、２．５ｍｇ／ｋｇのＴＹ２１５８０群における７／８、０．５ｍｇ／ｋｇのＴＹ２１５８０群における６／８は、腫瘍がないままであった。図１５Ｃに示すように、ＭＣ３８腫瘍細胞に対する長期持続性の免疫記憶は、１０ｍｇ／ｋｇのＴＹ２１５８０群のマウスを再投与試験した場合に示された。
【０２３６】
ＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝８、雌、７〜８週齢）に、ＣＴ２６（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）マウス結腸癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（７０ｍｍ３）、治療を、週に２回、腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体及び２つの異なる投与量の抗体ＴＹ２１５８０を用いて開始した。腫瘍増殖を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として報告した。図１６に示すように、アイソタイプ対照抗体と比較して、ＴＹ２１５８０は、０．１〜１ｍｇ／ｋｇ程度の低い投与量でほぼ１００％の阻害を伴う、強力なインビボ抗腫瘍活性を示した。
【０２３７】
Ｈ２２肝臓腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝５、雌、７〜８週齢）に、Ｈ２２（Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）マウス肝臓癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（６０ｍｍ３）、治療を、週に２回、腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体、３つの異なる投与量（０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ）の抗体ＴＹ２１５８６、及び２つの異なる投与量（０．１ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ）の抗体ＴＹ２１５８０を用いて開始した。腫瘍増殖を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として報告した。図１７に示すように、アイソタイプ対照抗体と比較して、ＴＹ２１５８０及びＴＹ２１５８６の両方は、用量依存性の様式で強力なインビボ抗腫瘍活性を示した。同じ投与量で比較した場合、ＴＹ２１５８０はこの腫瘍モデルにおいてＴＹ２１５８６よりも強力であった。さらに、１ｍｇ／ｋｇでのＴＹ２１５８０の投与は、腫瘍退縮をもたらした。
【０２３８】
Ｌｅｗｉｓ肺腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝６、雌、８週齢）に、Ｌｅｗｉｓ（ＪｅｎＮｉｏ  Ｂｉｏ、Ｇｕａｎｄｏｎｇ，Ｃｈｉｎａ）マウス肺癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（７０ｍｍ３）、治療を、週に２回、腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体、または抗体ＴＹ２１５８０、ＴＹ２１６８７、ＴＹ２１６８０、もしくはＴＹ２１６９１を全て５ｍｇ／ｋｇの投与量で用いて開始した。腫瘍増殖を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として報告した。図１８に示すように、アイソタイプ対照抗体と比較して、抗体ＴＹ２１５８０、ＴＹ２１６８７、及びＴＹ２１６８０は腫瘍増殖の有意な阻害を示したが、抗体ＴＹ２１６９１は強力な抗腫瘍活性を示さなかった。
【０２３９】
ＰＡＮ０２膵臓腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝８、雌、６週齢）に、ＰＡＮ−０２（ＣＡＭＳ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ）マウス膵臓癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（８５ｍｍ３）、治療を、週に２回、腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体、または３つの異なる投与量（０．５ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ）の抗体ＴＹ２１５８０を用いて開始した。腫瘍増殖を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として報告した。図１９に示すように、アイソタイプ対照抗体と比較して、ＴＹ２１５８０は、用量依存性の様式で強力な抗腫瘍活性を示した。
【０２４０】
３ＬＬ肺腫瘍モデルにおける抗体ＴＹ２１５８０単剤療法、または抗ＣＤ１３７抗体との併用療法の抗腫瘍効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝１０、雌、６〜８週齢）に、３ＬＬ（ＪＣＲＢ）マウス肺癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（７５ｍｍ３）、治療を、週に２回、腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体、ＴＹ２１５８０（１０ｍｇ／ｋｇ）、抗ＣＤ１３７（１０ｍｇ／ｋｇ）、またはＴＹ２１５８０及び抗ＣＤ１３７の組み合わせを用いて開始した。抗ＣＤ１３７は、ヒト及びマウスＣＤ１３７の両方に結合する能力を保有する、開発された独自のモノクローナル抗体である（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９８３３２号を参照）。腫瘍増殖を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として報告した。図２０Ａ〜Ｂに示すように、アイソタイプ対照抗体と比較して、ＴＹ２１５８０及び抗ＣＤ１３７の両方が強力な抗腫瘍活性を示し、その組み合わせは、いずれかの単独療法よりも腫瘍増殖を阻害した。
【０２４１】
ＴＹ２１５８０への完全応答を有するマウスの再投与試験
ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝８、雌、７〜８週齢）に、Ｈ２２（Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）マウス肝臓癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（６０ｍｍ３）、治療を、週に２回、３週間の腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体、または２つの異なる投与量（１ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ）の抗体ＴＹ２１５８０を用いて開始した。腫瘍増殖を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として報告した。アイソタイプ対照抗体と比較して、両方の投与量でのＴＹ２１５８０は、最後の投薬の数日後に完全な腫瘍退縮をもたらし、マウスは治療後６０日間、腫瘍がないままであった。次いで、１０ｍｇ／ｋｇのＴＹ２１５８０治療群のマウスを、６０日目に反対側の脇腹でＨ２２腫瘍細胞を皮下再投与試験し、腫瘍増殖をモニターした。図２１に示すように、これらのマウスは、同じ腫瘍細胞で再投与試験した後も腫瘍がないままであり、特定の抗腫瘍記憶がこれらのマウスにおいて発達したことを示唆した。同数のＨ２２腫瘍細胞を接種された未処置のマウスを用いて、再投与試験対照群を同時に設定したところ、それらの腫瘍は急速に増殖した。
【０２４２】
抗体の薬物動態
抗体ＴＹ２１５８５、ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１５８０及びＴＹ２１５９１の薬物動態研究を、雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（生後約８週間）において実行した。１群あたり３匹のマウスに、試験抗体を１０ｍｇ／ｋｇで尾静脈注射によって静脈内注射した。血液試料（試料あたり約２０μＬ）を、投薬から１時間、８時間、４８時間、１６８時間、３３６時間、５００時間後に採取した。ブランク対照血液を、抗体を投与されていない３匹の未処置の雌のマウスから採取した。各試験抗体の血清濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、ＣＴＬＡ４−Ｈｉｓ−Ｆｃを捕捉に使用し、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ）を検出に使用した。図２２に示すように、ＴＹ２１５８６は、マウスにおいてＴＡＣ２１１４に匹敵する薬物動態を示したが、ＴＹ２１５８５、ＴＹ２１５８０、及びＴＹ２１５９１ははるかに速くクリアされた。
【０２４３】
ＴＹ２１５８６及びＴＹ２１５８０の薬物動態研究も、未処置のカニクイザルにおいて行った。各抗体を、１匹の雌及び１匹の雄のサルに１０ｍｇ／ｋｇで静脈内ボーラス注射によって投与した。血清試料を、投与前（０時間）、ならびに投薬から０．２５時間、１時間、８時間、２４時間、７２時間、１２０時間、１６８時間、２４０時間、３３６時間、５０４時間、及び６７２時間後に採取した。ＴＹ２１５８６及びＴＹ２１５８０の血清濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、ＣＴＬＡ４−Ｈｉｓ−Ｆｃを捕捉に使用し、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ）を検出に使用した。図２３及び図２４に示すように、ＴＹ２１５８６と比較して、ＴＹ２１５８０はサルにおいてはるかに迅速にクリアされ、これは、これらの動物で観察された抗薬物抗体における急激な増加に潜在的に起因する。
【０２４４】
反復投与毒性試験
ＴＹ２１５８０の反復投与毒性を、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスで実行した。ビヒクル対照または抗体ＴＹ２１５８０を（２５ｍｇ／ｋｇまたは５０ｍｇ／ｋｇで）、１日目、４日目、７日目、及び１１日目に腹腔内投与（１０ｍＬ／ｋｇ）した。５匹の雌のマウス及び５匹の雄のマウス（５週齢）を各群に含んだ。マウスを異常な行動及び症状について毎日モニターし、食物摂取量及び体重を毎日測定した。１４日目に、死後検査及びその他の分析のために動物を安楽死させた。血液を各動物から採取し、１群あたり最高６匹（雄３匹、雌３匹）の血液試料を採取して、血液学（ＲＢＣ、血小板、ＷＢＣ、ＷＢＣ鑑別）及び／または血液生化学（ＡＬＴ、ＡＳＴ、ＧＬＢ、ＡＬＰ、及びＬＤＨなど）分析に使用した。各マウスから以下の臓器：心臓、肺、胸腺、肝臓、脾臓、腎臓、精巣、及び卵巣を採取して重量を測定した。１群あたり６匹の動物（雄３匹、雌３匹）からの肝臓試料を、ＦＦＰＥで固定した。肝臓組織用のＦＦＰＥブロックを調製し、切片化して、病理組織学分析のためにＨ＆Ｅ染色した。
【０２４５】
研究全体の生存期間中、異常な行動は観察されず、予定外の動物の死亡もなかった。ビヒクル処理と比較して、ＴＹ２１５８０は動物の食物摂取量及び体重に影響を及ぼさなかった。死後検査でも、ＴＹ２１５８０治療群において脾臓重量が増加したことを除いて、両方の投与量レベルで治療群のマウスにおけるいかなる明らかな病変も見られなかった（図２５Ａ〜Ｂ）。血液分析では、ＴＹ２１５８０で治療されたマウスにおいて試験された血液生化学パラメータによって示されるように、いかなる有意な変化も示さなかった。マウスからの肝臓の病理組織学切片において、明らかな異常は見つからなかった（図２６）。全体として、ＴＹ２１５８０はこの試験において良好な耐性を示し、マウスにおいて有意な毒性は観察されなかった。
【０２４６】
まとめると、これらの結果は、本明細書に記載のＣＴＬＡ４抗体が、マウスに対して非常に安全であり、強力な抗腫瘍活性を有し、腫瘍細胞に対する長期持続性の免疫記憶を誘導し得ることを示している。
【０２４７】
実施例５：抗体の開発可能性プロファイル
開発可能性評価のために、精製されたＴＹ２１５８６及びＴＹ２１５８０を保存緩衝液（２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．５）に交換した。溶解度、加速ストレス条件下での安定性、及び示差走査蛍光（ＤＳＦ）試験を含む全ての実験を、保存緩衝液中で実施した。全てのＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析には、ＴＳＫｇｅｌカラム（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｇ３０００ＳＷｘｌ）を使用した。
【０２４８】
抗体溶解度
抗体ＴＹ２１５８６またはＴＹ２１５８０を含有する試料を、保存緩衝液中で１００ｍｇ／ｍＬ超の濃度で配合し、高分子量（ＨＭＷ）タンパク質凝集体の量を試験した（表８）。次いで、抗体を保存緩衝液中で約１２ｍｇ／ｍＬに調整した。次いで、試料（各１２μｇ）を、高分子量タンパク質凝集体の検出についてＳＥＣ−ＨＰＬＣでアッセイした。図２７に示すように、ＨＭＷ凝集体の有意な増加は、高濃度（１００ｍｇ／ｍＬ超）で３０分間配合された抗体では観察されなかった。
2021511808.tif 000026
【０２４９】
加速ストレス条件下での抗体安定性
加速ストレス条件下での抗体安定性も調査した。これらの実験の結果を表９及び図２８に要約する。ＴＹ２１５８６及びＴＹ２１５８０は、６サイクルの凍結（−８０℃）及び解凍（室温）後も安定したままであった。５０℃で７日後、ＨＭＷ凝集体または低分子量（ＬＭＷ）断片の変化はほとんどなかった。長期のタイムコース実験（４０℃で最大２８日間）では、ＴＹ２１５８６及びＴＹ２１５８０は安定したままであり、ＨＭＷ凝集体またはＬＭＷ断片の有意な増加はなかった。
2021511808.tif 000027
【０２５０】
さらに、熱安定性（示差走査蛍光（ＤＳＦ）によって測定）は、ＴＹ２１５８６及びＴＹ２１５８０の両方が少なくとも約５５℃まで安定していたことを示した。ほとんど全てのタンパク質ドメインでアンフォールディング転移が生じる特徴的な温度である転移中点（Ｔｍ）を、以下の表１０に示す。
2021511808.tif 000028
【０２５１】
最後に、抗体ＴＹ２１５８６及びＴＹ２１５８０の最も高い達成可能濃度は、遠心分離後、それぞれ１９７．８ｍｇ／ｍＬ及び１２６．０ｍｇ／ｍＬ超であることを見出した。
【０２５２】
まとめると、これらの結果は、処方最適化を伴わないとしても、ＣＴＬＡ４抗体ＴＹ２１５８６及びＴＹ２１５８０が優れた開発可能性プロファイルを有したことを示す。
【０２５３】
実施例６：ＴＹ２１５８０由来のＣＴＬＡ４活性化可能抗体の自己遮断ペプチドを特定する方法
良好な開発可能性を有するマスキング部分を効率的に発見するために設計及び実行されている新しいシステムが本明細書に記載される。このシステムでは、標的抗体断片Ｆａｂ（図２９）またはｓｃＦｖ（図３０）のいずれかが最初に酵母表面上に提示され、その抗原への結合において機能的であることが確認された。次いで、改良されたペプチドライブラリーをＣＴＬＡ４抗体（ＴＹ２１５８０）の軽鎖のＮ末端に直接融合し、酵母表面上に融合タンパク質を提示した酵母ライブラリーを構築した。次いで、酵母ライブラリーは数ラウンドのＦＡＣＳベースのスクリーニングを受けた。最初に、抗原への低結合を有した酵母クローンを濃縮し、次いで濃縮酵母クローンをプロテアーゼで処理してＮ末端ペプチドを除去し、抗原への高結合を有するクローンを選択した（図２９及び３０）。４〜５ラウンドの選別後、プラスミドをこれらのクローンから抽出し、マスキングペプチド配列をＤＮＡ配列決定により確認した。
【０２５４】
実施例７：ＣＴＬＡ４活性化可能抗体のための制約付きペプチドライブラリー（ＣＰＬ）の設計
４つの例示的な制約付きペプチドライブラリー（ＣＰＬ）を設計した（表１１）。
2021511808.tif 000029
各Ｘは、独立して、Ａ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｋ、Ｌ、Ｍ、Ｎ、Ｐ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、Ｔ、Ｖ、Ｗ、及びＹからなる群から選択されるアミノ酸であり、各Ｚは、独立して、Ｄ、Ａ、Ｙ、Ｓ、Ｔ、Ｎ、Ｉ、Ｌ、Ｆ、Ｖ、Ｈ、及びＰからなる群から選択されるアミノ酸である。
【０２５５】
それらのコアには、配列Ｚ６ＣＸ６ＣＺ２（配列番号１３７）またはＺ６ＣＸ８ＣＺ２（配列番号１３８）があり、２つの固定システイン残基がジスルフィド結合を形成して、ペプチドの立体配座を制約した。合成されたオリゴヌクレオチドでは、ループの内側を除く全ての場所において縮退コドンＮＨＣが適用され、ＮＮＫコドンもまたＣＰＬ０１１及びＣＰＬ０１３において援用された。ＮＮＫまたはＮＮＳコドンとは対照的に、ＮＨＣコドンは１２の残基（表１２）をコードし、有意な多様性を包含するが、化学的に不安定な残基であるメチオニン、トリプトファン、及びシステインを欠く。さらに、ＮＮＫまたはＮＮＳコドンと比較して減少した理論上の多様性は、より広い網羅範囲を有するライブラリーの構築を可能にした。
2021511808.tif 000030
【０２５６】
これらのマスキングペプチド配列に続くのは、２つのプロテアーゼ認識部位：プロテアーゼウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子（ｕＰＡ）のＳＧＲＳＡ（配列番号１４９）、ならびにプロテアーゼマトリックスメタロプロテイナーゼ−２（ＭＭＰ−２）及びマトリックスメタロプロテイナーゼ−９（ＭＭＰ−９）のＰＬＧＬＡＧ（配列番号１５０）を含有する、インバリアント切断ペプチド配列（ＳＧＲＳＡＧＧＧＧＳＰＬＧＬＡＧＳＧＧＳ、配列番号１８０）であった。これらの認識部位は、標的化剤のインビボ腫瘍細胞特異的活性化において、多くの群によって使用されている（例えば、Ｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２（３３）：２０４５６−６２、Ｇｅｒｓｐａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５５（１２）：１５９０−６００、及びＪｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１（５１）：１７８６７−７２を参照）。酵母ベースのスクリーニング中に、ＴＥＶプロテアーゼの可用性及び特異性により、ＭＭＰ−９認識配列をタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ認識配列（ＥＮＬＹＦＱＧ、配列番号１５１）に置換した。
【０２５７】
ＣＰＬ及びインバリアント切断ペプチドを、酵母表面に提示されたＡｇａ２タンパク質に接続しているｓｃＦｖまたはＦａｂのいずれかの形式で、標的抗体（ＴＹ２１５８０）の軽鎖のＮ末端に融合した。代理ＴＥＶプロテアーゼ認識部位の包含は、正しい種類のマスキングペプチド配列を特定する上で重要であった。すなわち、抗原結合はプロテアーゼ切断前に遮断され、抗原結合はプロテアーゼ切断後に可能となる。以下に説明する例は、酵母において最初に示された活性化可能抗体の切断活性化メカニズムが、哺乳動物細胞中で発現された完全なＩｇＧ分子において複製されることを示した。
【０２５８】
実施例８：ＣＴＬＡ４を標的化するＴＹ２１５８０由来の活性化可能抗体の構築及び検証
酵母表面の機能的標的抗体の提示
低コピー数のＣＥＮ／ＡＲＳベースのベクターを使用して、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に、誘導性ＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下で標的抗体（ヒトＣＴＬＡ４を標的化する抗体ＴＹ２１５８０）を発現させた。ｓｃＦｖの表面提示を、以前に公開された配置（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５（６）：５５３−７）と同様に、ＧＡＬ１プロモーターの制御下でそのＣ末端に融合したＡｇａ２タンパク質を介して達成した。Ｆａｂについては、それらの表面提示を、ＧＡＬ１プロモーターの制御下で重鎖（ＶＨとＣＨ１の融合）のＮ末端に融合したＡｇａ２タンパク質によって達成したが、軽鎖（ＶＬとＣＬの融合）はＧＡＬ１０プロモーターの制御下であった。Ｆａｂを、膜に固定された重鎖との結合によって酵母表面上に提示した。
【０２５９】
ＦａｂまたはｓｃＦｖの表面提示を、融合親和性タグを認識する抗体で染色することによって検証し、酵母上に提示されたＦａｂまたはｓｃＦｖの機能を、ビオチン化ヒトＣＴＬＡ４を使用して調査した。簡潔に言えば、ガラクトース培地での誘導から４８時間後、酵母細胞（１×１０＾６）を採取し、ＰＢＳＡ緩衝液で１回洗浄し、次いで、１０ｎＭのビオチン化抗原と室温で１時間インキュベートした。次いで、酵母細胞をＰＢＳＡ緩衝液で２回洗浄し、ＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（１：５００希釈）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃２−４３１７−８７）と４℃で３０分間インキュベートした。次いで、酵母細胞をフローサイトメトリーによって分析した。図３１Ａ〜Ｂに示すように、ＣＴＬＡ４を標的化するＦａｂ（図３１Ａ）及びｓｃＦｖ（図３１Ｂ）の両方が酵母表面上に正常に提示され、それらの両方がそれらの抗原に強力に会合することが可能であった。
【０２６０】
ＣＰＬを含有する酵母ライブラリーの構築
ＣＰＬをコードする合成されたオリゴヌクレオチドを、５サイクルのＰＣＲによって切断ペプチドをコードするオリゴヌクレオチドと融合した。ＰＣＲ反応の組成は、１×ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ緩衝液、２．５ｍＭのｄＮＴＰ、各１００μＭのＦプライマー及びＲプライマー、ならびに各１００μＭのテンプレート１（ＣＰＬオリゴヌクレオチド）及びテンプレート２（切断ペプチドをコードするオリゴヌクレオチド）、及び２．５ＵのＰｒｉｍｅＳＴＡＲ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼであった。使用したＰＣＲプログラムは、ａ）９６℃で５分間の１サイクル、２）９６℃（１５秒）、６０℃（１５秒）、７２℃（６秒）の５サイクル、３）７２℃で３分間の１サイクルであった。エキソヌクレアーゼＩを使用して、ゲル電気泳動によるＰＣＲ産物の精製前に、一本鎖ＤＮＡを分解した。次いで、精製したＰＣＲ産物をＢａｍＨＩ及びＫｐｎＩで分解し、同じ２つの制限酵素で分解した細菌フィルターベクターにクローニングした。フィルターベクターでは、ＣＰＬ及び切断ペプチドを、細菌分泌シグナルペプチドの下流、及びシグナル配列を欠くベータラクタマーゼの上流に配置した。アンピシリンプレート上で選択された機能的なベータラクタマーゼは、ＣＰＬと切断ペプチドのインフレーム融合を示し、それによって、合成された縮退オリゴヌクレオチドに導入されたあらゆるフレーム外エラー（Ｎ−１またはＮ−２）を排除した。さらに、いくつかの不完全に折りたたまれた配列もプールから削減した。ライゲーション産物をエレクトロコンピテント細菌細胞に形質転換し、ＣＰＬライブラリーの多様性は一般的に５×１０＾９〜１×１０＾１０であった。個々のクローンの配列決定は、非常に高いインフレーム比（多くの場合、ほぼ１００％）がこのアプローチによって達成されたことを示した。
【０２６１】
ＣＰＬを含有する酵母ライブラリーを作製するために、プラスミドを細菌ライブラリーから抽出し、ＣＰＬ及び切断ペプチドをコードするＤＮＡ断片のＰＣＲ増幅のテンプレートとして使用した。増幅されたＰＣＲ断片をゲル電気泳動によって精製し、Ａｇａ２に融合された標的抗体を発現した線形化されたプラスミドと一緒に、エレクトロコンピテント酵母細胞に形質転換した。ＰＣＲ断片及びプラスミドの両端の相同配列は、酵母細胞内での効率的な相同組換えを確実にした。構築された酵母ライブラリーの多様性は一般的に１×１０＾９〜２×１０＾９であった。
【０２６２】
ＣＴＬＡ４抗体に対するマスキングペプチドのＦＡＣＳベースのスクリーニング
ＣＰＬ酵母ライブラリーからの合計１×１０＾８の酵母細胞を使用して、標的抗体に対するマスキングペプチドをスクリーニングした。ＭｏＦｌｏ  ＸＤＰによる各選別ラウンドについて、ガラクトース培地中で誘導された酵母細胞を採取し、ＰＢＳＡ緩衝液で１回洗浄し、次いで、１０ｎＭ（後のラウンドで１ｎＭに低下）のビオチン化抗原と室温で１時間インキュベートした。次いで、酵母細胞をＰＢＳＡ緩衝液で２回洗浄し、ＰＥコンジュゲートストレプトアビジン（１：５００希釈）（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ＃２−４３１７−８７）と４℃で３０分間インキュベートした。ＰＢＳＡ緩衝液でさらに２回洗浄した後、酵母細胞を２〜３ＯＤ／ｍＬに調整し、選別に供した。図３２に示すように、ラウンド１では、１０ｎＭのビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃを使用して、弱い結合剤を濃縮した。ラウンド１からの酵母細胞を、グルコース培地中で増殖後、ガラクトース培地中で誘導し、ＡｃＴＥＶプロテアーゼ（６Ｕ／ＯＤ細胞）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ＃１２５７５０１５）を用いて３０℃で２時間処理して、強力な結合剤を精製した。第３の選別ラウンドから開始して、ビオチン化ＣＴＬＡ４−Ｆｃの濃度を１ｎＭに低減し、弱い結合剤を収集した。第４のラウンドでは、酵母細胞の画分も並行してＡｃＴＥＶで処理し、標的抗体のプロテアーゼ切断媒介型活性化を検証した。図３２に示すように、ＡｃＴＥＶ切断が、抗原に強力に結合する細胞集団の劇的な増加をもたらしたことは明らかであり、スクリーニング戦略が有効であったことを示唆した。第５の選別ラウンドからの単一クローンを選択培地に播種し、切断媒介型活性化抗原結合のさらなる確認のために個々に増殖させた。
【０２６３】
図３３Ａ〜Ｂに示すように、選択されたＣＴＬＡ４活性化可能抗体クローンは、ｓｃＦｖ（図３３Ａ）またはＦａｂ（図３３Ｂ）形式のいずれかで、マスキングペプチドの存在下では抗原への結合をほとんど示さなかった。しかしながら、酵母細胞をＴＥＶプロテアーゼで処理してマスキングペプチドを除去すると、抗原への結合が劇的に増加した。選択されたクローンを検証するためのＴＥＶプロテアーゼの適用と合わせて、ＴＥＶ認識部位を切断ペプチドに組み込むことにより、マスキングペプチド選択の成功率が有意に上昇した。
【０２６４】
マスキングペプチド配列を特定するために、選択された酵母クローン（Ｇｅｎｅｒａｙ  ＃ＧＫ２００２−２００）からシャトルプラスミドを抽出し、コンピテントなＥ．ｃｏｌｉ細胞に形質転換した。プラスミドを調製し、マスキングペプチドをコードする領域を配列決定して整列した。予想されたように、これらの配列はいくつかの群に分けることができ、選別ラウンドによって明確な濃縮を示した。マスキングペプチド配列の４つの群を、インバリアント切断ペプチド配列と一緒に表１３に列挙する。
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【０２６５】
ＩｇＧ変換及び発現
潜在的なグリコシル化部位を排除するための表１３に列挙されるマスキングペプチドの４つの群、ならびにそれらの２つ（Ｂ１３１９２及びＢ１３１９７）から派生した追加の４つのマスキングペプチド配列（表１４）は、ＩｇＧ１に変換された。
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【０２６６】
重鎖及び軽鎖を哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮＡ３．３（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、カタログ番号Ｋ８３０００１）に別個にクローニングし、マスキングペプチド及びインバリアント切断ペプチドを、酵母表面に提示されたのと同じ様式で軽鎖のＮ末端に融合した。親ＣＴＬＡ４抗体（ＴＹ２１５８０）のＶＨ及びＶＬ配列を以下に示す。
抗ＣＴＬＡ４重鎖可変領域（配列番号８７）：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＹＳＩＳＳＧＹＨＷＳＷＩＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＬＡＲＩＤＷＤＤＤＫＹＹＳＴＳＬＫＳＲＬＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＬＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＳＹＶＹＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
抗ＣＴＬＡ４軽鎖可変領域（配列番号１００）：
ＤＩＱＬＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＶＲＧＲＦＬＡＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＤＡＳＮＲＡＴＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＳＳＷＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ．
【０２６７】
プラスミドの対をＨＥＫ２９３Ｆ細胞に一時的にトランスフェクトした。６日後、上清を採取し、遠心分離及び濾過によって清澄化して、ＩｇＧを標準のタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィー（ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて精製した。ＩｇＧを溶出及び中和し、緩衝液をＰＢ緩衝液（２０ｍＭのリン酸ナトリウム、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．０）に交換した。タンパク質濃度をＵＶ分光光度法によって決定し、ＩｇＧ純度を変性、還元、及び非還元条件下で、ＳＤＳ−ＰＡＧＥまたはＳＥＣ−ＨＰＬＣによって分析した。重要なことに、ＨＥＫ２９３細胞における活性化可能抗体の発現レベルは親抗体と同様であり、タンパク質Ａ樹脂後のそれらの精製収率もまた同様であり、マスキング及び切断ペプチドの存在が哺乳動物細胞における抗体発現に悪影響を及ぼさないことを示唆した。
【０２６８】
マスキング効率の測定
ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ９６システム（Ｐａｌｌ、ＵＳＡ）を使用して、マスキングペプチドの効率を迅速に評価した。簡潔に言えば、活性化可能抗体（及びそれらの親抗体、ＴＹ２１５８０）をＫＢ緩衝液（０．０２％のＴｗｅｅｎ  ２０及び０．１％のＢＳＡで補充されたＰＢＳ緩衝液）中で３０μｇ／ｍＬに希釈し、並行して抗ヒトＩｇＧ捕捉（ＡＨＣ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ、ＵＳＡ）によって捕捉した。次いで、センサーを、Ｈｉｓタグ化ＣＴＬＡ４タンパク質（２５ｎＭ）と３００秒間会合させ、次いで、ＫＢ緩衝液中でさらに３００秒間解離させた。製造業者のガイドラインに従って、ＦｏｒｔｅＢｉｏ  Ｄａｔａ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ７．１（Ｐａｌｌ、ＵＳＡ）を使用して、会合及び解離曲線を１：１のＬａｎｇｍｕｉｒ結合モデルにフィッティングした。図３４Ａ〜Ｂに示すように、活性化可能抗体で達成された応答は、親抗体の応答よりも有意に低く、マスキングペプチドが抗体のその抗原への結合を効果的に遮断したことを示唆した。しかしながら、４つの活性化可能抗体のうち、ＴＹ２２４０１は効果が低く、以下に考察されるＥＬＩＳＡアッセイの結果と一致した。
【０２６９】
組換えヒトＣＴＬＡ４−ＦｃをＰＢＳ中で１μｇ／ｍＬに希釈し、Ｍａｘｉｓｏｒｐプレート上に４℃で一晩塗布した。プレートを、３％の無脂肪乳で補充されたＰＢＳを用いて、３７℃で１時間遮断した。洗浄後、１００μＬの３倍段階希釈抗体を各ウェルに添加した。３７℃で１時間インキュベートした後、プレートを４回洗浄し、１００μＬのＨＲＰコンジュゲート抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）（１：６０００希釈）を各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１時間インキュベートして、４回洗浄し、次いで、５０μＬのＴＭＢ基質溶液を各ウェルに添加して、プレートを室温でインキュベートした。反応をウェルあたり５０μＬのＨ２ＳＯ４で停止した後、４５０ｎｍの吸光度を測定した。ＥＣ５０を、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアの非対称シグモイド（５パラメータロジスティック方程式）モデルを使用してＥＬＩＳＡデータをフィッティングすることによって評価した。活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、及びＴＹ２２４０４の実験を２回実施することにより、これらの活性化可能抗体のそれぞれについて、２つの計算されたマスキング効率を得た。各活性化可能抗体のマスキング効率を、活性化可能抗体の結合のＥＣ５０を、親抗体（ＴＹ２１５８０）のＥＣ５０で除算することによって計算した。図３５Ａ〜Ｂ及び表１５に示すように、親抗体と比較して、全ての活性化可能抗体がその抗原への結合の劇的な低下を示し、計算されたマスキング効率は４８〜２２１３の範囲であった。マスキング効率における差異は、ＥＣ５０値の測定値とデータフィッティングのばらつきに起因する可能性が高く、各活性化可能抗体のマスキング効率は計算された範囲内である可能性が高い（例えば、活性化可能抗体ＴＹ２２４０２のマスキング効率は３７７〜２２１３である）。これらの結果は、ＣＰＬから特定された複数のマスキングペプチドが、哺乳動物細胞において、及び完全なＩｇＧ分子の一部として発現された場合、それらのマスキング効率を維持したことを示した。
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【０２７０】
マスキングペプチドの除去は、抗体活性を回復する。
精製された活性化可能抗体を、切断配列を認識するプロテアーゼで処理し、次いで、マスキングペプチドの除去がそれらの活性を回復するかどうかを決定するために試験した。例として、２０μｇのＴＹ２２４０４（０．５ｍｇ／ｍＬ）を反応緩衝液（５０ｍＭのトリスＨＣｌ、０．０１％のＴｗｅｅｎ  ２０、ｐＨ８．５）中の１μｇの組換えヒトｕＰＡ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＰＬＵ−Ｈ５２２９）で処理したか、またはＴＹ２２４０４を反応緩衝液（５０ｍＭのトリス、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＣａＣｌ２、２０μＭのＺｎＣｌ２、ｐＨ７．５）中の５または１０単位の組換えヒトＭＭＰ−９（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、＃７８６７−５００）で処理した。反応は３７℃で２１時間行った。マスキングペプチドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析によって軽鎖から除去されていることが確認された図３６Ａ。次いで、マスキング効率を上記のとおりＥＬＩＳＡによって測定した。図３６Ｂ及び表１６に示すように、マスキングペプチドを除去した後、活性化可能抗体は抗原への結合において親抗体と区別がつかなくなった。
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【０２７１】
活性化可能抗体の開発可能性プロファイル
製造目的のために、発見された活性化可能抗体が良好な開発可能性プロファイルを有することが重要である。哺乳動物細胞中に発現した精製された活性化可能抗体を用いていくつかの異なる試験を実施した。活性化可能抗体を、ｐＨ５．５の２０ｍＭのヒスチジン中で１ｍｇ／ｍＬに調整し、抗体品質分析を、Ｗａｔｅｒｓ  ２９９６  ＵＶ検出器を備えたＷａｔｅｒｓ  ２６９５及びＴＳＫｇｅｌ  ｇ３０００  ＳＷＸＬカラム（３００ｍｍ×７．８ｍｍ）（Ｔｏｓｏｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を使用した分析サイズ排除クロマトグラフィーを使用して実施した。各アッセイについて、１０μｇの抗体を注入し、緩衝液（ｐＨ７．０の２００ｍＭのリン酸ナトリウム）中で０．５ｍＬ／分の流速で分画を実施した。
【０２７２】
３つの加速ストレス試験：活性化可能抗体の５０℃で７日間のインキュベーション、活性化可能抗体の４０℃で２８日間のインキュベーション、及び６サイクルの凍結融解を実施した。凍結融解試験を、１００μＬの試料（２０ｍＭのヒスチジン中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５）を−８０℃で３０分間凍結し、続いて室温で６０分間融解することによって実施した。図３７Ａ〜Ｃに示すように、全ての活性化可能抗体は安定したままであり、５０℃で７日間または４０℃で２８日間保存した後、ほとんど凝集を示さなかった。６サイクルの凍結融解後、わずかな劣化を示したが、単量体メインピークは９５％付近のままであり、これらの活性化可能抗体が、これらの加速ストレス試験下で非常に安定していたことを示した。理論に拘束されることを望むものではないが、活性化可能抗体は大規模な緩衝液最適化プロセスをまだ経ておらず、したがって、活性化可能抗体の安定性は最適化された緩衝液及び賦形剤を用いてさらに改善され得るということは注目に値する。
【０２７３】
次に、活性化可能抗体を、ｐＨ５．５の２０ｍＭのヒスチジン中で１５０ｍｇ／ｍＬ超に濃縮した（表１７）。活性化可能な抗体の沈殿は観察されず、試料の粘度は非常に管理しやすかった。次いで、濃縮された活性化可能抗体を、高分子量（ＨＭＷ）種の分析のために２０ｍｇ／ｍＬまたは１ｍｇ／ｍＬのいずれかに希釈した。図３８及び表１７に示すように、ＨＭＷ種の明らかな増加は観察されず、これらの活性化可能抗体が、高濃度になるまで、試験された緩衝液中で非常に溶解性及び安定性であったことを示唆した。
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【０２７４】
低ｐＨでの活性化可能抗体の安定性を研究するために、精製された活性化可能抗体（２０ｍＭのヒスチジン中１０ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５）をクエン酸で１ｍｇ／ｍＬに滴定し、ｐＨを３．７に調整して、室温で３０分及び６０分間保持した。その後、試料を１Ｍのトリス塩基でｐＨ７．０に中和した。活性化可能抗体のマスキング効率を、上記のようにＦｏｒｔｅＢｉｏで測定した。図３９に示すように、マスキング効率は、３０または６０分間の低ｐＨインキュベーション後も変化しないままであり、マスキングペプチドがその遮断効果を低ｐＨインキュベーション後も保持することを示唆した。
【０２７５】
まとめると、データは、発見された活性化可能抗体が様々なストレス条件下で安定したままであり、したがって、それらが良好な開発可能性プロファイルを有することを示している。
【０２７６】
実施例９：ＣＴＬＡ４を標的化する活性化可能抗体のインビトロ及びインビボ特性評価
Ｔ細胞におけるＣＴＬＡ−４活性は、第１（ＴＣＲ／ＣＤ３）のシグナル及びＢ７−ＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４に関与する第２のシグナル関連していることが知られている。
【０２７７】
インビトロ機能的特性評価
ここで、ＣＴＬＡ４を標的化する活性化可能抗体の活性を、ヒトＰＭＢＣ活性化に対する低濃度の抗ＣＤ３抗体の存在下で評価した。ヒトＰＢＭＣを、Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７（Ｓｉｇｍａ）を使用した密度勾配遠心分離によって、健康なドナー（＃４４）の血液から新たに単離した。抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）抗体を９６ウェルプレート上に４℃で一晩塗布した。洗浄後、１×１０＾５の新たに単離したヒトＰＢＭＣを各ウェルに添加し、続いて、異なる濃度で試験品を添加した。ＩＬ−２の誘導を、ヒトＩＬ−２  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを使用して刺激から４８時間後に測定した。上清中のＩＦＮ−γを、ヒトＩＦＮ−γ  ＥＬＩＳＡ  Ｒｅａｄｙ−ＳＥＴ−Ｇｏ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）キットを使用して測定した。図４０Ａ〜Ｂに示すように、高濃度で、ＴＹ２２４０４はＩＬ−２産生を誘導し、ＴＹ２２４０１はＩＦＮ−γ産生を誘導した。それにもかかわらず、活性化可能な抗体の活性は、親抗体ＴＹ２１５８０の活性よりも有意に低かった。
【０２７８】
次に、活性化可能抗体の抗体依存性細胞傷害活性を試験し、親抗体ＴＹ２１５８０のそれと比較した。ＡＤＣＣレポーター遺伝子アッセイを使用して、活性化可能抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。ヒトＣＴＬＡ４を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ／ｈＣＴＬＡ−４細胞）を標的細胞として使用し、ＣＤ１６ａ及びＮＦＡＴ−Ｌｕｃを過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ／ＣＤ１６ａ細胞）をエフェクター細胞として使用した。１×１０＾５個のＪｕｒｋａｔ／ＣＤ１６ａ細胞及び１×１０＾４個のＨＥＫ２９３Ｆ／ｈＣＴＬＡ−４細胞（Ｅ：Ｔ比１０：１）を異なる濃度の抗体と混合した。６時間インキュベートした後、１００μＬのＯｎｅ−Ｇｌｏ試薬を細胞に添加し、細胞を１０分間溶解した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘプレートリーダーを使用して発光測定のために上清を除去した。図４１に示すように、活性化可能抗体は、親抗体ＴＹ２１５８０よりも数対数低いＡＤＣＣ活性を示した。ＴＹ２２４０１のＡＤＣＣ活性は、ＴＹ２２４０２及びＴＹ２２４０４の活性よりも高かった。まとめると、インビトロのデータは、より良好にマスキングされた活性化可能抗体が、より低いＡＤＣＣ活性を有したことを示している。
【０２７９】
次に、活性化可能抗体の抗腫瘍活性を評価し、ＭＣ３８結腸直腸腫瘍モデル、ＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデル、Ｈ２２肝臓腫瘍モデル、及び３ＬＬ肺腫瘍モデルを含む複数の同系マウス腫瘍モデルにおいて親抗体ＴＹ２１５８０の抗腫瘍活性と比較した。
【０２８０】
ＭＣ３８結腸直腸腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝８、雌、６〜８週齢）に、ＭＣ３８（ＮＴＣＣ−ＭＣ３８）マウス結腸癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（７０ｍｍ３）、治療を、週に２回、腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、または３つの活性化可能抗体のうちの１つを用いて開始した。腫瘍増殖を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．（図４２Ａ）及び個々の腫瘍増殖曲線（図４２Ｂ）を評価した。図４２Ａ〜Ｂに示すように、３つ全ての活性化可能抗体が、ＭＣ３８同系マウス腫瘍モデルにおいて親抗体ＴＹ２１５８０に匹敵する強力な抗腫瘍活性を示した。
【０２８１】
ＣＴ２６結腸直腸腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝８、雌、７〜８週齢）に、ＣＴ２６（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）マウス結腸癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（１００ｍｍ３）、治療を、週に２回、腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、または３つの活性化可能抗体のうちの１つを５ｍｇ／ｋｇで用いて開始した。腫瘍増殖を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として報告した。図４３に示すように、３つ全ての活性化可能抗体が、ＣＴ２６同系マウス腫瘍モデルにおいて親抗体ＴＹ２１５８０に匹敵する強力な抗腫瘍活性を示した。
【０２８２】
Ｈ２２肝臓腫瘍モデルにおける抗腫瘍効果
ＢＡＬＢ／ｃマウス（群あたりｎ＝８、雌、７〜８週齢）に、Ｈ２２（Ｃｈｉｎａ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）マウス肝臓癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（１００ｍｍ３）、治療を、週に２回、腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、または３つの活性化可能抗体のうちの１つを５ｍｇ／ｋｇで用いて開始した。腫瘍増殖を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．として報告した。図４４に示すように、３つ全ての活性化可能抗体が、Ｈ２２同系マウス腫瘍モデルにおいて親抗体ＴＹ２１５８０に匹敵する強力な抗腫瘍活性を示した。
【０２８３】
３ＬＬ肺癌モデルにおける抗腫瘍効果
Ｃ５７ＢＬ／６マウス（群あたりｎ＝１０、雌、６〜８週齢）に、３ＬＬ（ＪＣＲＢ）マウス肺癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（７５ｍｍ３）、治療を、週に２回、腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、または３つの活性化可能抗体のうちの１つを用いて開始した。腫瘍増殖を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ｓ．ｅ．ｍ．（図４５Ａ）及び個々の腫瘍増殖曲線（図４５Ｂ）を評価した。図４５Ａ〜Ｂに示すように、３つ全ての活性化可能抗体が、３ＬＬ同系マウス腫瘍モデルにおいて親抗体ＴＹ２１５８０に匹敵する強力な抗腫瘍活性を示した。
【０２８４】
薬物動態分析
薬物動態研究を、生後約８週間の雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて実行した。１群あたり３匹のマウスに、試験品を１０ｍｇ／ｋｇで腹腔内注射した。血液試料（試料あたり約５０ｕｌ）を、投薬から３、６、２４、４８、９６、及び１６８時間後に採取した。ブランク対照血液を、抗体を投与されていない３匹の未処置の雌のマウスから採取した。各試験抗体の血清濃度をＥＬＩＳＡによって決定し、抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃを捕捉に使用し、ＨＲＰ標識抗ヒトＩｇＧ（Ｆａｂ特異的）抗体（Ｓｉｇｍａ）を検出に使用した（図４６Ａ〜Ｃ）。親抗体ＴＹ２１５８０について収集された以前のデータと比較して、活性化可能抗体ＴＹ２２４０１（図４６Ａ）、ＴＹ２２４０２（図４６Ｂ）、及びＴＹ２２４０４（図４６Ｃ）は、はるかに遅いクリアランス時間及びはるかに長い半減期を有した。ＴＹ２２４０１は１９６時間の半減期を有し、１６８時間での薬物濃度は約５５μｇ／ｍＬであった。ＴＹ２２４０２は１３４時間の半減期を有し、１６８時間での薬物濃度は約４０μｇ／ｍＬであった。ＴＹ２２４０４は２５４時間の半減期を有し、１６８時間での薬物濃度は約４５μｇ／ｍＬであった。比較すると、親抗体ＴＹ２１５８０は１０７時間の半減期を有し、１６８時間での薬物濃度は約１７μｇ／ｍＬであった。
【０２８５】
反復投与毒性試験
ＮＯＤマウスにおける糖尿病発症年齢に対するＴＹ２１５８０の効果を評価しているときに、高投与量のＴＹ２１５８０はＮＯＤの動物の死亡につながり得るが、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスでは起こらないことを見出した。ここで、ＮＯＤマウスモデルを使用して、ＴＹ２１５８０の安全性と比較して、活性化可能抗体の安全性を評価した。ＮＯＤマウス（群あたりｎ＝５、雌、６週齢）を、０、３、７、及び１２日目に、腹腔内注射により、５０ｍｇ／ｋｇでアイソタイプ対照抗体、親抗体ＴＹ２１５８０、または３つの活性化可能抗体のうちの１つを用いて治療した。ＴＹ２１５８０治療群では、３回目の投薬後に１匹が死亡し、４回目の投薬後に３匹が死亡した。図４７に示すように、アイソタイプ対照または３つの活性化可能抗体のいずれかで治療された全ての動物は、研究の終了時に生存しており、健康であった。これらのデータは、活性化可能抗体が、マウスにおいて許容できる安全性／毒性プロファイルを有し、かつ、ＮＯＤマウスにおいて、活性化可能抗体が親抗体ＴＹ２１５８０よりもはるかに安全であることを示した。
【０２８６】
実施例１０：ＣＴＬＡ４を標的化する活性化可能抗体の追加のインビボ特性評価
親抗体ＴＹ２１５８０に関するこれまでの研究では、ＴＹ２１５８０の反復投与が、雌雄両方の正常なＢＡＬＢ／ｃマウスにおいて脾臓サイズの増大をもたらすことが見出された。それ以外では、ＴＹ２１５８０は、多くの臓器の重量、肝臓の病理組織学、血液学、及び血液生化学を含む、他の評価されたパラメータに対して有意な副作用を示さなかった。したがって、脾臓サイズに対するいくつかの活性化可能抗体の効果を評価し、親抗体ＴＹ２１５８０の効果と比較した。
【０２８７】
活性化可能抗体の反復投与毒性を、正常なＢＡＬＢ／ｃマウスで以下のとおり実行した。５０ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ対照抗体、ＴＹ２１５８０親抗体、または活性化可能抗体ＴＹ２２４０２、ＴＹ２２５６６、もしくはＴＹ２２４０１を、１、４、７、及び１１日目に腹腔内投与（１０ｍＬ／ｋｇ）した。５匹の雌のマウス（５週齢）を各群に含んだ。マウスを異常な行動及び症状について毎日モニターし、食物摂取量及び体重を毎日測定した。１４日目に、死後検査及びその他の分析のために動物を安楽死させた。興味深いことに、活性化可能抗体ＴＹ２２４０２（図４８Ａ）またはＴＹ２２５６６（図４８Ｂ）の投与は、アイソタイプ対照と比較してマウスの脾臓サイズをわずかに増加させたが、これらの活性化可能抗体は、親抗体ＴＹ２１５８０の投与と比較して、脾臓サイズに対して有意に低い効果を示した。活性化可能抗体ＴＹ２２４０１の投与は、アイソタイプ対照と比較して脾臓サイズを有意に増加させたが、それでも親抗体ＴＹ２１５８０を使用して観察されたよりも程度は小さかった（図４８Ｃ）。
【０２８８】
ＣＴＬＡ４はＴｒｅｇ細胞で構成的に発現するため、全血及び脾臓の両方のＴｒｅｇ細胞、ＣＤ４＋Ｔ細胞、及びＣＤ８＋Ｔ細胞に対する活性化可能抗体ＴＹ２２４０２、ＴＹ２２５６６、またはＴＹ２２４０１の効果を評価し、親抗体ＴＹ２１５８０と比較した。全血または脾細胞からの単球を染色し、以下の抗体：抗ＣＤ４５−ＢＶ４２１、抗ＣＤ３−ＡＦ４８８、抗ＣＤ４−ＢＶ５１０、抗ＣＤ８ａ−ＰｅｒＣＰ−ｃｙ５．５、抗ＣＤ２５−ＡＰＣ、及び抗ＦｏｘＰ３−ＰＥを使用してゲートした。Ｔｒｅｇ細胞を、ＣＤ４５＋ＣＤ３＋ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３＋として定義した。表１８に示すように、アイソタイプ対照と比較して、親抗体ＴＹ２１５８０は脾臓のＴｒｅｇ細胞の割合を増加させたが、活性化可能抗体ＴＹ２２４０２及びＴＹ２２５６６は、脾臓のＴｒｅｇの割合に影響を及ぼさなかった。全血では、ＴＹ２１５８０、ＴＹ２２４０２、及びＴＹ２２５６６は、アイソタイプ対照と比較して、Ｔｒｅｇ細胞の割合をわずかに増加させた。活性化可能な抗体ＴＹ２２４０１は、脾臓及び全血中のＴｒｅｇ細胞の割合を増加させた。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞の割合は、ＴＹ２１５８０、ＴＹ２２４０２、ＴＹ２２５６６、またはＴＹ２２４０１によって有意に変化しなかった（データ未掲載）。
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【０２８９】
実施例１１：追加の活性化可能抗体の開発可能性アッセイ
哺乳動物細胞中に発現した精製された活性化可能抗体を用いていくつかの異なる試験を実施し、それらの開発可能性プロファイルを決定した。３つの加速ストレス試験を実施した。最初に、活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、またはＴＹ２２５６６を、５０℃で７日間インキュベートし、それらの安定性をＳＥＣによって決定してアイソタイプ対照と比較した（図４９）。５０℃で７日間インキュベートした後の活性化可能抗体では、高分子量（ＨＭＷ）凝集体または低分子量（ＬＭＷ）断片において、存在する場合、わずかな増加のみが観察された（表１９）。
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【０２９０】
次に、活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、またはＴＹ２２５６６を、４０℃で７、１４、２１、または２８日間インキュベートし、それらの安定性をＳＥＣによって決定してアイソタイプ対照と比較した（図５０）。様々な時点で４０℃でインキュベートした後の活性化可能抗体では、高分子量（ＨＭＷ）凝集体または低分子量（ＬＭＷ）断片において、存在する場合、わずかな増加のみが観察された（表２０）。
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【０２９１】
さらに、活性化可能抗体ＴＹ２２４０１、ＴＹ２２４０２、またはＴＹ２２５６６を、６サイクルの凍結融解に供した。凍結融解試験を、１００μＬの試料（２０ｍＭのヒスチジン中１ｍｇ／ｍＬ、ｐＨ５．５）を−８０℃で３０分間凍結し、続いて室温で６０分間融解することによって実施し、安定性をＳＥＣによって測定してアイソタイプ対照と比較した（図５１）。これらの凍結融解サイクル後の活性化可能抗体では、高分子量（ＨＭＷ）凝集体において、存在する場合、わずかな増加のみが観察された（表２１）。
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【０２９２】
次に、活性化可能抗体を、ｐＨ５．５の２０ｍＭのヒスチジン中で１１５ｍｇ／ｍＬ超に濃縮した。次いで、濃縮された活性化可能抗体を、高分子量（ＨＭＷ）種の分析のために２０ｍｇ／ｍＬに希釈した。図５２及び表２２に示すように、ＨＭＷ種の明らかな増加は観察されず、これらの活性化可能抗体が、高濃度になるまで、試験された緩衝液中で非常に溶解性及び安定性であったことを示唆した。
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【０２９３】
まとめると、データは、発見された活性化可能抗体が様々なストレス条件下で安定したままであり、したがって、処方最適化を伴わないとしても、それらが良好な開発可能性プロファイルを有することを示している（図５３）。
【０２９４】
実施例１２：ＴＹ２１５８０及びイピリムマブのＣＴＬＡ４に対するエピトープ結合及び交差反応性
ヒトＣＴＬＡ４のＦシート、ＦＧループ、及びＧシートは、ＣＴＬＡ４のそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用に重要なほとんどの接触残基を含有する（図５４、図５５Ａ及び５５Ｂ）。例えば、ヒトＣＴＬＡ−４／ＣＤ８６界面は、ＣＴＬＡ４の正面βシート上の残基Ｅ３３、Ｒ３５、Ｔ５３、Ｅ９７、Ｍ９９、Ｙ１００、Ｐ１０１、Ｐ１０２、Ｐ１０３、Ｙ１０４、Ｙ１０５、Ｌ１０６によって形成され（Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０（６８２８）：６０４−６０８）、ＣＴＬＡ４（９９ＭＹＰＰＰＹＹ１０５）のＦＧループ内の残基のアラニン置換は、ＣＤ８０への結合を減少または消滅する（Ｓｔａｍｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｎａｔｕｒｅ  ４１０（６８２８）：６０８−６１１）。
【０２９５】
抗ＣＴＬＡ４抗体であるイピリムマブはまた、Ｆ及びＧ鎖（残基Ｉ９３、Ｋ９５、Ｅ９７、Ｌ１０６、及びＩ１０８）、ＦＧループ（残基９９ＭＹＰＰＰＹ１０４）、及びＣＣ’ループ（残基Ｌ３９、Ｖ４６、及びＩ９３；ＦＧループの反対側に位置する）で、ＣＴＬＡ４の正面βシート上のＣＴＬＡ４と接合する。以前の研究は、ヒトＣＴＬＡ４の残基Ｓ２０、Ｒ３５、Ｒ４０、Ｑ７６、Ｄ８８、Ｋ９５、Ｅ９７、Ｙ１０４、Ｌ１０６、及びＩ１０８の変異がイピリムマブ結合の有意な損失をもたらし、残基Ｒ３５、Ｋ９５、Ｅ９７、Ｙ１０４、及びＩ１０８における変異がＣＴＬＡ４結合において深刻な損失を示すことを示した。さらに、イピリムマブは、イピリムマブ−ＣＴＬＡ４結晶構造においてＣＴＬＡ４の残基Ｒ３５、Ｋ９５、Ｅ９７、Ｙ１０４、Ｌ１０６、及びＩ１０８に直接接触することが示された（Ｒａｍａｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１４（２１）：４２２３−４２３２）。さらに、結晶構造は、イピリムマブのエピトープが、受容体−リガンド界面（ＣＴＬＡ−４／ＣＤ８０では１，２５５Å２、及びＣＴＬＡ−４／ＣＤ８６では１，２１２Å２）よりも大きな界面面積（ＣＴＬＡ４／イピリムマブでは１，８８０Å２）を有するＣＴＬＡ４のＣＤ８０／ＣＤ８６結合部位を部分的に占めることを明らかにした（Ｒａｍａｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１４（２１）：４２２３−４２３２、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ  Ｃｏｍｍｕｎ  ７（１３３５４）、Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ８：６７１２９−６７１３９）。
【０２９６】
抗ＣＴＬＡ４抗体ＴＹ２１５８０及びイピリムマブのエピトープ結合特性を調査した。体系的なアプローチを取り、重要なＣＴＬＡ４エピトープモチーフならびにＣＴＬＡ４に結合するＴＹ２１５８０及びイピリムマブの残基を絞り込んだ。最初に、低コピー数のＣＥＮ／ＡＲＳベースのベクターを使用して、酵母Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ中に、細胞表面提示のための誘導性ＧＡＬ１−１０プロモーターの制御下で、マウスＣＴＬＡ４、ヒトＣＴＬＡ４、または様々なヒトＣＴＬＡ４変異タンパク質を発現させた（Ｂｏｄｅｒ  ａｎｄ  Ｗｉｔｔｒｕｐ（１９９７）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５（６）：５５３−７）。変異体ＣＴＬＡ４ベクターでは、ヒトＣＴＬＡ４の特定のモチーフまたは残基が、アラニンまたはマウスＣＴＬＡ４の対応する残基に変異した。ＴＹ２１５８０またはイピリムマブを、ＣＴＬＡ４を提示する細胞に添加し、抗体結合をフローサイトメトリーによって評価した。
【０２９７】
比較のために、ＣＴＬＡ４−ＣＤ８０（ＰＤＢＩＤ：１Ｉ８Ｌ）、ＣＴＬＡ４−ＣＤ８６（ＰＤＢＩＤ：１Ｉ８５）、及びＣＴＬＡ４−イピリムマブ（ＰＤＢＩＤ：５ＸＪ３、５ＴＲＵ）結晶構造（分子間界面から４ÅのＣ−アルファ原子内）からのＣＴＬＡ４上の接触残基を、図５４に示す。それらの相互作用するＣ−アルファ原子によって定義される接触残基を、対応するＸ線構造に由来するそれらのヒト配列において灰色の残基としてマークする。
【０２９８】
図５６Ａ及び５６Ｂに示すように、ＴＹ２１５８０とイピリムマブの交差反応性における差異は顕著であり、ＴＹ２１５８０はヒト及びマウスＣＴＬＡ４の両方に結合し、イピリムマブはヒトＣＴＬＡ４に結合するが、マウスＣＴＬＡ４には結合しない。比較のために、ヒトＣＤ８０（図５６Ｃ）、ヒトＣＤ８６（図５６Ｄ）、及びマウスＣＤ８６（図５６Ｅ）は、ヒト及びマウスＣＴＬＡ４の両方と相互作用する。
【０２９９】
イピリムマブ及びＴＹ２１５８０のＣＴＬＡ４に対するエピトープ結合プロファイルをさらに調査するために、ヒトＣＴＬＡ４の様々なモチーフを変異させ、結合について評価した。ＴＹ２１５８０、イピリムマブ、ヒトＣＤ８０、ヒトＣＤ８６、及びマウスＣＤ８６は、野生型ＣＴＬＡ４と比較して、ＡＤＳ４２ＡＡＡ  ＣＴＬＡ４変異体と同様の結合能力を維持した（図５６Ａ〜５６Ｅ）。しかしながら、ヒトＣＴＬＡ４  ＣＣ’ループモチーフ（４２ＡＤＳＱＶＴ４７）がマウスＣＴＬＡ４  ＣＣ’ループモチーフ（４２ＴＮＤＱＭＴ４７）に変異した場合、ＴＹ２１５８０は、イピリムマブ、ヒトＣＤ８０、ヒトＣＤ８６、及びマウスＣＤ８６の変異体への結合と比較して、２倍強力に変異体に結合した（図５６Ａ〜５６Ｅ）。ＣＤ８０及びＣＤ８６はこのＣＣ’ループモチーフに直接結合しないことが一貫して観察されている（例えば、図５４参照）。イピリムマブはヒトＣＴＬＡ４においてこのモチーフと直接接触しているが（図５４、Ｒａｍａｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１４（２１）：４２２３−４２３２）、ＣＣ’ループの変異的変化に対するヒトＣＴＬＡ４結合の影響は最小限である（図５６ＢのヒトＷＴ対ＡＤＳＱＶＴ４２ＴＮＤＱＭＴを参照）。まとめると、これらの結果は、ＣＣ’ループモチーフが、ヒトＣＴＬＡ４に対するイピリムマブまたはＴＹ２１５８０の結合親和性に有意に寄与しないことを示唆する。
【０３００】
エピトープマッピングデータからの最も興味深い観察の１つは、変異がヒトＣＴＬＡ４中の残基１０５〜１０８に導入された場合の、ＣＴＬＡ４への結合についてのイピリムマブとＴＹ２１５８０との間の顕著な差異である。例えば、ＹＬ１０５ＡＡ及びＬＧＩ１０６ＡＡＡがヒトＣＴＬＡ４に導入された場合、イピリムマブはＣＴＬＡ４に結合するその能力を失い（図５６Ｂ）、図５４に示すイピリムマブのヒトＣＴＬＡ４への結合に重要な既知の接触アミノ酸と一致した。さらに、図５６Ａ及び５６Ｃ〜５６Ｅに示すように、ＴＹ２１５８０、ヒトＣＤ８０、ヒトＣＤ８６、及びマウスＣＤ８６のＣＴＬＡ４  ＹＬ１０５ＡＡ変異体への結合親和性は弱まった。ヒトＣＤ８０、ヒトＣＤ８６、及びマウスＣＤ８６のＬＧＩ１０６ＡＡＡとの結合親和性も弱まったが、ＴＹ２１５８０のＬＧＩ１０６ＡＡＡとの結合親和性は有意に強化した。これは、イピリムマブのＬＧＩ１０６ＡＡＡとの結合親和性の完全損失とは対照的である。
【０３０１】
ＴＹ２１５８０及びイピリムマブによるＣＴＬＡ４の結合部位のエピトープマッピングでは、ヒトＣＴＬＡ４の特定の部位に変異を導入した。変異誘発のために選択された部位は、ヒト及びマウスＣＴＬＡ４配列間で大きな配列変動を有したイピリムマブ、ＣＤ８０、及びＣＤ８６（それらの結晶構造に基づく、図５４を参照）によるＣＴＬＡ４の既知の接触部位であった。例えば、図５５Ａ及び５５Ｂは、ＣＤ８０及びＣＤ８６のヒトＣＴＬＡ４との複合体構造の正面図を示し、Ｉ１０８は強調表示され、球として示される。Ｉ１０８は、イピリムマブと接触する最も重要な部位の１つであるが、ＣＤ８０及びＣＤ８６接触領域から遠く離れている。図５４に示すように、Ｇ鎖は、ヒトＣＴＬＡ４とマウスＣＴＬＡ４との間で有意に異なる、イピリムマブ、ＣＤ８０、及びＣＤ８６と接触している残基の大部分を含有する。ＣＣ’ループモチーフは、ヒトＣＴＬＡ４とマウスＣＴＬＡ４との間で分岐しているイピリムマブとの接触残基も含有しているが、図５６Ａ〜５６Ｅの結果は、ＣＣ’ループモチーフに導入された変異体が、イピリムマブ、ＴＹ２１５８０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６のＣＴＬＡ４への全体的な結合に有意に寄与しないことを示した。したがって、Ｇ鎖モチーフのイピリムマブ、ＴＹ２１５８０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６への結合の寄与をさらに評価するために、ヒトＣＴＬＡ４（１０５ＹＬＧＩＧ１０９）のＧ鎖をマウスＣＴＬＡ４（１０５ＦＶＧＭＧ１０９）に変異させた。
【０３０２】
図５６Ｂに示すように、イピリムマブは、ＹＬＧＩＧ１０５ＦＶＧＭＧ変異体に対する結合親和性の深刻な喪失を被った。対照的に、ＴＹ２１５８０、ヒトＣＤ８０、ヒトＣＤ８６、及びマウスＣＤ８６は、この変異が導入されたときに結合能力を保持した（図５６Ａ、５６Ｃ〜５６Ｅ）。これは、ヒトＣＴＬＡ４とマウスＣＴＬＡ４との間のＧ鎖結合におけるこの差異により、ＴＹ２１５８０がイピリムマブとは異なる結合エピトープを有することを示す。
【０３０３】
さらに、ヒトＣＴＬＡ４のＧ鎖中の他のアミノ酸は、対応するマウス配列または他のアミノ酸に置換され、それらのイピリムマブ、ＴＹ２１５８０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６との相互作用を調べた。Ｉ１０８は、イピリムマブ結合に極めて重要なアミノ酸として知られている。この予想と一致して、イピリムマブはＩ１０８Ａ、Ｉ１０８Ｓ、Ｉ１０８Ｅ、Ｉ１０８Ｋ及びＩ１０８Ｒ  ＣＴＬＡ４変異体に対する結合親和性を失った（図５６Ｂ）。対照的に、Ｉ１０８変異体（Ｉ１０８Ａ、Ｉ１０８Ｓ、Ｉ１０８Ｅ、Ｉ１０８Ｋ、及びＩ１０８Ｒ）は、ＴＹ２１５８０、ＣＤ８０、またはＣＤ８６の結合親和性に対して影響を及ぼさず、イピリムマブの最も重要な結合部位の１つであるＩ１０８によって示されるように、イピリムマブと比較したＴＹ２１５８０、ＣＤ８０、及びＣＤ８６の結合エピトープにおける重要な差異を強調した（Ｒａｍａｇｏｐａｌ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １１４（２１）：４２２３−４２３２）。図５５Ａ及び５５Ｂの複合体構造は、Ｉ１０８が実際にＣＴＬＡ４とそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６との間の結合部位から物理的に離れているため、ＣＤ８０／ＣＤ８６とＣＴＬＡ４との間の結合に有意な影響を及ぼさない場合があることを示す。観察により、ＴＹ２１５８０はＣＤ８０／ＣＤ８６とのその結合エピトープにおいてより類似性があり、イピリムマブによってエピトープと区別されることを確認している。したがって、ＴＹ２１５８０は、ヒトＣＴＬＡ４のアミノ酸残基Ｙ１０５及びＬ１０６を含むがＩ１０８は含まないエピトープに特異的に結合すると考えられている。
【０３０４】
実施例１３：ＣＴＬＡ４リガンド結合遮断に対するＴＹ２１５８０及びイピリムマブの効果
実施例３（ＥＬＩＳＡによるリガンド競合結合）に記載されているようなＥＬＩＳＡベースの実験を通して、ＴＹ２１５８０及びイピリムマブを、ＣＴＬＡ４のその同族リガンドＣＤ８０及びＣＤ８６への結合を遮断するそれらの能力について試験した。簡潔に言えば、ある実験では、ＥＬＩＳＡマイクロプレートに組換えヒトＣＴＬＡ４タンパク質（１μｇ／ｍＬ）を塗布し、ビオチン化ＣＴＬＡ４リガンド（１μｇ／ｍＬでＣＤ８０、または２μｇ／ｍＬでＣＤ８６）を、ＴＹ２１５８０、イピリムマブ、またはアイソタイプ対照抗体のいずれかの段階希釈液とともに各ウェルに添加した（図５７Ａ及び５７Ｂ）。別の実験では、ＥＬＩＳＡマイクロプレートに組換えＣＤ８０またはＣＤ８６タンパク質（１μｇ／ｍＬ）を塗布し、ビオチン化ヒトＣＴＬＡ４（０．２μｇ／ｍＬまたは１μｇ／ｍＬ）を、ＴＹ２１５８０、イピリムマブ、またはアイソタイプ対照抗体のいずれかの段階希釈液とともに各ウェルに添加した（図５７Ｃ及び５７Ｄ）。両方の実験において、ヒトＣＴＬＡ４とＣＤ８０またはＣＤ８６のいずれかとの間の結合レベルを、実施例３に記載されているようにＨＲＰ標識ニュートラアビジンを使用して検出した（ＥＬＩＳＡによるリガンド競合結合）。
【０３０５】
図５７Ａ及び５７Ｂに示すように、ＣＴＬＡ４をマイクロプレート上に固定した場合、ＴＹ２１５８０及びイピリムマブは用量依存性の様式でＣＤ８０及びＣＤ８６のＣＴＬＡ４への結合を遮断したが、アイソタイプ対照抗体はアッセイ特異性を示す遮断活性を示さなかった。図５７Ｃ及び５７Ｄに示すように、ＣＤ８０またはＣＤ８６をマイクロプレート上に固定した場合、ＴＹ２１５８０及びイピリムマブは用量依存性の様式でＣＤ８０及びＣＤ８６のＣＴＬＡ４への結合を再び遮断したが、アイソタイプ対照抗体は遮断活性を示さなかった。表２３に示すように、ＴＹ２１５８０及びイピリムマブの両方がＣＴＬＡ４へのリガンド結合を遮断するが、ＴＹ２１５８０及びイピリムマブの用量依存性遮断活性は、ＣＤ８０またはＣＤ８６がマイクロプレートに固定化された場合と比較して、ヒトＣＴＬＡ４がマイクロプレートに固定化された場合と顕著に異なった。これらの結果は、ＴＹ２１５８０及びイピリムマブが、ＣＴＬＡ４固定化条件下で類似のＩＣ５０を有する同等のリガンド遮断活性を呈することを示す。しかしながら、図５７Ｃ及び５７Ｄならびに表２３に示すように、ＣＤ８０またはＣＤ８６リガンド固定化条件下で、イピリムマブは、ＣＤ８０及びＣＤ８６の両方について、ＴＹ２１５８０よりもはるかに強力なリガンド遮断活性を示した。しかしながら、追加の実験は、飽和濃度で抗ＣＴＬＡ４抗体を添加する際に、ＣＴＬＡ４のそのリガンドとの相互作用の完全遮断が腫瘍拒絶に必要ではないことを示唆し、ひいては、ＴＹ２１５８０がＣＤ８０またはＣＤ８６を完全に遮断することなく、依然としてＴ細胞を活性化し、強力な抗腫瘍効果を有することができることを意味した。実際、図５８に示すように、ＴＹ２１５８６は、イピリムマブと同様にＣＤ８０及びＣＤ８６の完全な遮断を示した。しかしながら、ＴＹ２１５８６及びイピリムマブは、試験した他の抗体よりもはるかに低いＡＤＣＣレポーター活性を有し（図５９）、したがって、ＡＤＣＣ効果を介してＴｒｅｇ細胞を枯渇させるにはあまり効果的でない（Ｔａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．８（３０）：１−３も参照）。理論に拘束されることを望むものではないが、ＣＤ２８依存性Ｔ細胞活性化（例えば、ＣＴＬＡ４活性の遮断による）は、効果的な腫瘍拒絶に重要であると考えられているが、Ｔ細胞の過剰刺激は有害であり得る。したがって、ＴＹ２１５８０で観察されたより弱いリガンド遮断は、イピリムマブのより強力なリガンド遮断活性よりも有利であり得る。
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【０３０６】
これらの差異の根底にあるメカニズムは現在不明であるが、結果はＴＹ２１５８０及びイピリムマブの特性の間に固有の差異があることを示している。まとめると、これらの結果は、ＴＹ２１５８０がその抑制性受容体ＣＴＬＡ４へのＣＤ８０及びＣＤ８６の結合を破壊することにより、リガンド遮断剤として機能できることを示唆する。理論に拘束されることを望むものではないが、弱いリガンド遮断を介してＣＴＬＡ４隔離からＣＤ８０及びＣＤ８６を解放すると、これらのリガンドがＴ細胞活性化中に共刺激受容体ＣＤ２８を介してシグナル伝達し、Ｔ細胞免疫活性化中の有効性及び安全性を高めることができると考えられる。
【０３０７】
実施例１４：ＣＤ２８経路活性化のＣＴＬＡ４遮断に対するＴＹ２１５８０及びイピリムマブの効果
Ｐｒｏｍｅｇａ（カタログ番号ＪＡ３００１及びＪＡ３００５）によって開発された細胞ベースのＣＴＬＡ４遮断バイオアッセイを使用して、ＴＹ２１５８０及びイピリムマブのＣＴＬＡ４遮断機能を評価した。このアッセイは、ＴＹ２１５８０またはイピリムマブの存在下または非存在下で２つの遺伝子組換え細胞株を共培養し、次いでＢｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子によって生成される生物発光シグナルを測定することを含んだ。共培養された２つの細胞株は、（１）ＣＴＬＡ４エフェクター細胞−ヒトＣＴＬＡ４を発現するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞及びＴＣＲ／ＣＤ２８活性化に応答するネイティブプロモーターによって駆動されるルシフェラーゼレポーター、ならびに（２）ａＡＰＣ／Ｒａｊｉ細胞−ＣＴＬＡ４リガンドＣＤ８０及びＣＤ８６を内因的に発現し、さらにＴＣＲを抗原非依存性の様式で活性化するように設計された細胞表面タンパク質を発現するＲａｊｉ細胞である。これらの２種類の細胞を共培養すると、ＣＴＬＡ４はＣＤ８０及びＣＤ８６の結合に関してＣＤ２８と競合し、これによりＣＤ２８経路の活性化が阻害され、プロモーター媒介発光の低下につながる。このシステムへの抗ＣＴＬＡ４抗体の添加は、ＣＴＬＡ４とそのリガンドＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用を遮断し、より高いＴＣＲ／ＣＤ２８活性化及びそれに続くプロモーター媒介発光をもたらし得る。
【０３０８】
図５８に示すように、全ての試験された抗体は、抗体濃度が上昇するにつれてレポーター遺伝子シグナル（すなわち、発光）が増加することによって証明されるように、用量依存性の様式でＴＣＲ／ＣＤ２８経路を活性化した。比較において、アイソタイプ対照抗体は活性を示さなかった。これらの結果は、これらの異なる抗ＣＴＬＡ４抗体による様々なＣＴＬＡ４機能遮断活性を示す。抗体のＥＣ５０はいくらか類似しているが（表２４）、これらの抗体によって刺激された機能的シグナル伝達活性化の大きさは、イピリムマブ及びＴＹ２１５８６が試験された最も強力なＣＴＬＡ４遮断剤であり、ＴＹ２１６８０、ＴＹ２１５８０、及びＴＹ２１６８７がそれに続くことを示した（図５８）。ＴＹ２１６９１は、試験した抗体のうち、ＣＴＬＡ４遮断剤として最も弱い活性を有した。これらの結果は、全ての試験された抗体がＣＴＬＡ４のＣＤ８０及びＣＤ８６との相互作用を遮断することができ、結果として用量依存性の様式でＴＣＲ／ＣＤ２８経路活性を下流にすることを示す。理論に拘束されることを望むものではないが、結果は、全ての試験された抗体がＴ細胞活性化を増加させ、がんの治療に有利であり得ることを示唆している。上記で考察したように、強い結合剤と比較してＴ細胞を過剰刺激するリスクが低いため、ＴＹ２１５８０などのより弱いリガンド遮断剤は、がんの治療において特に効果的であり得る。
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【０３０９】
実施例１５：抗ＣＴＬＡ４抗体のＡＤＣＣ活性
イピリムマブ、ＴＹ２１５８０、ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１６８７、ＴＹ２１６８０、及びＴＹ２１６９１の抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）活性を試験して比較した。ＡＤＣＣレポーター遺伝子アッセイを使用して、活性化可能抗体のＡＤＣＣ活性を評価した。ヒトＣＴＬＡ４を過剰発現するＨＥＫ２９３Ｆ細胞（ＨＥＫ２９３Ｆ／ｈＣＴＬＡ４細胞）を標的細胞として使用し、ＣＤ１６及びＮＦＡＴ−Ｌｕｃを過剰発現するＪｕｒｋａｔ細胞株（Ｊｕｒｋａｔ／ＣＤ１６ａ細胞）をエフェクター細胞として使用した。１．２×１０５個のＪｕｒｋａｔ／ＣＤ１６ａ細胞及び２×１０４個のＨＥＫ２９３Ｆ／ｈＣＴＬＡ４細胞（Ｅ：Ｔ比６：１）を、段階希釈された抗ＣＴＬＡ４抗体の存在下または非存在下で９６ウェル組織培養マイクロプレート中で混合した。６時間インキュベートした後、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ試薬を細胞に添加し、細胞を溶解した。レポーター遺伝子活性を測定するために、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３ｘプレートリーダーを使用して発光測定のために上清を除去した。ヒトＩｇＧ１アイソタイプ対照抗体を陰性対照として使用した。
【０３１０】
図５９に示すように、全ての試験された抗体が用量依存性の様式で様々な程度のＡＤＣＣシグナル伝達活性化を示したが、アイソタイプ対照はＡＤＣＣ活性を全く示さなかった。これらの結果は、これらの異なる抗ＣＴＬＡ４抗体による様々なＡＤＣＣシグナル伝達／刺激性活性を示す。シグナル伝達活性化の大きさ（図５９）及びＥＣ５０（表２５）の両方によって示されるように、ＴＹ２１５８０は全ての試験された抗体の中で最も強力なＡＤＣＣシグナル伝達活性を誘導した。ＴＹ２１６９１は、ＡＤＣＣシグナル伝達の誘導において最も活性の低い抗体であった。以前のデータは、これらの抗体が１桁のｎＭのＫＤでヒトＣＴＬＡ４と同様の結合親和性を有することを示したが、これらのＡＤＣＣレポーターの結果は、試験された抗体の結合エピトープがそれらの結合親和性よりもＡＤＣＣ活性に有意に影響を及ぼす可能性があることを示唆している。ＴＹ２１５８６、ＴＹ２１６８０、ＴＹ２１５８０、ＴＹ２１６８７、及びＴＹ２１６９１は交差反応性であるが、上記の結果はリガンド遮断及びＡＤＣＣ活性におけるそれらの有効性が劇的に異なることを示しており、抗体エピトープ結合部位における微妙な差異が、抗腫瘍活性における有意な差をもたらし得ることを示唆していることが留意されるべきである。
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【０３１１】
実施例１６：マウスＭＣ３８結腸直腸腫瘍モデルにおけるＴＹ２１５８０及びイピリムマブの抗腫瘍効果
ＴＹ２１５８０及びイピリムマブの抗腫瘍効果を決定するために、ヒトＣＴＬＡ４ノックインＣ５７ＢＬ／６マウス（１群あたりｎ＝６、雌、生後５〜９週間）にＭＣ３８マウス結腸癌細胞を皮下接種した。腫瘍が定着した場合（９９ｍｍ３）、マウスを、週２回、２週間の腹腔内注射により、アイソタイプ対照抗体（１ｍｇ／ｋｇ）、ＴＹ２１５８０（１ｍｇ／ｋｇもしくは０．２ｍｇ／ｋｇ）、またはイピリムマブ（１ｍｇ／ｋｇもしくは０．２ｍｇ／ｋｇ）で治療した。群平均腫瘍増殖（図６０Ａ）及び異なる群の各マウスの個々の腫瘍増殖（図６０Ｂ）を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ＳＥＭとして報告した。図６０Ａ及び６０Ｂに示すように、ＴＹ２１５８０は１ｍｇ／ｋｇ（群２）及び０．２ｍｇ／ｋｇ（群３）の用量で完全な抗腫瘍効果を示し、これらのマウスにおける全ての腫瘍は、１匹のマウスにおいて最初の投薬後３２日目に残された非常に小さな腫瘍を除いて完全に消滅した。イピリムマブはまたは、１ｍｇ／ｋｇの用量（群４）でも完全な抗腫瘍効果を示したが、低用量のイピリムマブ（０．２ｍｇ／ｋｇ、群５）で治療された腫瘍の半分（３／６）は、最初の投薬後３２日目に腫瘍抑制から逃避した。これは、ＴＹ２１５８０が抗腫瘍活性の点でイピリムマブよりも有効であることを示す。ＴＹ２１５８０及びイピリムマブの両方が良好な耐容性を示し、研究中に死亡した動物はおらず、試験された用量レベルではマウスにおける有意な体重減少は観察されなかった。要約すると、これらの結果は、ＴＹ２１５８０がイピリムマブよりも強力な抗がん活性を有する、安全で効果的な抗がん剤であることを示唆している。
【０３１２】
実施例１７：マウスＭＣ３８結腸癌モデルにおける腫瘍内制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞レベルに対するＴＹ２１５８０及びイピリムマブの効果
ＴＹ２１５８０またはイピリムマブでの治療後のＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団におけるＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋）の割合を、皮下ＭＣ３８マウス結腸癌同系モデルにおいて評価した（図６１Ａ）。腫瘍担持動物を、１ｍｇ／ｋｇ（Ｑ３ｄ×３用量）のＴＹ２１５８０またはイピリムマブで治療した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を腫瘍から単離し、次いで腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及び末梢細胞（すなわち、ＰＢＭＣ及び脾臓細胞）をこれらのＣＤ４＋Ｔ細胞から亜集団として単離した。
【０３１３】
ＴＩＬでは、ＴＹ２１５８０治療後にＴｒｅｇ細胞の割合が有意に減少した（ＴＹ２１５８０治療群では１５．２％に対して、アイソタイプ対照群では４１．６％、Ｐ＜０．００１）。イピリムマブ治療後のＴｒｅｇ細胞の有意な減少はなかった（イピリムマブでは２８．４％に対して、アイソタイプ対照では４１．６％、Ｐ＝ｎｓ）。これは、イピリムマブが微小腫瘍環境内のＦＯＸＰ３＋Ｔｒｅｇ細胞を有意に変化または枯渇させないという観察と一致した（Ｓｈａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．オンライン出版のみ、ＰＭＩＤ３００５４２８１、Ｆｅｒｒａｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１８）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．）。ＰＢＭＣでは、ＴＹ２１５８０治療後にＴｒｅｇ細胞の割合がわずかに増加したが（ＴＹ２１５８０群では６．２％に対して、アイソタイプ対照群では３．９％、Ｐ＝０．０１）、イピリムマブ治療後にはこの効果は見られなかった（イピリムマブ群では４．８％に対して、アイソタイプ対照群では３．９％）。Ｈａ  ｅｔ  ａｌ．ＰＮＡＳ（２０１９）１１６（２）：６０９−６１８も参照されたい。脾臓細胞では、ＴＹ２１５８０治療及びイピリムマブ治療の両方ともＴｒｅｇ細胞の割合に影響を及ぼさなかった（アイソタイプ対照群では８．６％、ＴＹ２１５８０群では７．８％、イピリムマブ群では９．４％）。
【０３１４】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋Ｔ細胞）のＴｒｅｇ細胞に対する比率（すなわち、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比）も評価した）（図６１Ｂ）。ＴＩＬでは、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比は、ＴＹ２１５８０での治療後に増加した（ＴＹ２１５８０では１８．７に対して、アイソタイプ対照では３．７、Ｐ＝０．０５１７、０．０５に近似）。ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比に対するイピリムマブ治療の効果は、アイソタイプ対照と比較して有意ではなく、最大でもＴＹ２１５８０の効果よりも弱かった。ＰＢＭＣ及び脾臓細胞では、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比は、ＴＹ２１５８０治療またはイピリムマブ治療後に有意に変化しなかった。これらの結果は、ＴＹ２１５８０が、特に腫瘍浸潤細胞（すなわち、ＴＩＬ）においてＴｒｅｇ細胞の枯渇を誘導し、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比を増加させる活性を示すが、末梢細胞（すなわち、ＰＢＭＣ及び脾臓細胞）においては示さないことを示す。
【０３１５】
Ｔ細胞に対するＴＹ２１５８０抗ＣＴＬＡ４抗体の調節活性は、ＴＹ２１５８０インビボ抗腫瘍効果の機構的理解を提供する。理論に拘束されることを望むものではないが、この結果は、ＴＹ２１５８０が腫瘍微小環境において免疫抑制性Ｔｒｅｇ活性を低下させ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋Ｔ細胞）活性を増強させて、抗腫瘍反応を媒介することを示唆している。腫瘍Ｔｒｅｇの枯渇及びＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比におけるＴＹ２１５８０とイピリムマブとの間の定量的な差異はまた、ＴＹ２１５８０がインビボでイピリムマブよりも優れた抗腫瘍活性を示すことも示す。
【０３１６】
実施例１８：マウスＣＴ２６結腸癌モデルにおける腫瘍内制御性Ｔ（Ｔｒｅｇ）細胞レベルに対するＴＹ２１５８０の効果
ＴＹ２１５８０での治療後のＣＤ４＋Ｔ細胞亜集団におけるＴ制御性（Ｔｒｅｇ）細胞の割合を、皮下ＣＴ２６マウス結腸癌同系モデルにおいて評価した（図６２Ａ）。腫瘍担持動物を、ＴＹ２１５８０（０日目及び３日目に５ｍｇ／ｋｇ）で治療した。ＣＤ４＋Ｔ細胞を腫瘍から単離し、次いで腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）及び末梢細胞（すなわち、ＰＢＭＣ及びリンパ節（ＬＮ）細胞）をこれらのＣＤ４＋Ｔ細胞から亜集団として単離した。
【０３１７】
図６２Ａに示すように、ＴＹ２１５８０は、アイソタイプ対照と比較して、ＴＩＬにおいてＴｒｅｇ細胞の割合を有意に減少させた（ＴＹ２１５８０では１２．６％に対して、アイソタイプ対照では３８．５％、Ｐ＜０．００１）。しかしながら、ＴＹ２１５８０は、アイソタイプ対照と比較して、末梢リンパ球（すなわち、ＰＢＭＣ及びリンパ節（ＬＮ）細胞）ではＴｒｅｇ細胞の割合に影響を及ぼさなかった。ＰＢＭＣにおけるＴｒｅｇ細胞の割合は、ＴＹ２１５８０治療後は５．８％だったのに対して、アイソタイプ対照治療後は４．９％であった（Ｐ＞０．０５）。リンパ節細胞におけるＴｒｅｇ細胞の割合は、ＴＹ２１５８０治療後は８．１％だったのに対して、アイソタイプ対照治療後は７．７％であった（Ｐ＞０．０５）。
【０３１８】
細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋Ｔ細胞）のＴｒｅｇ細胞に対する比率（すなわち、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比）も評価した。図６２Ｂに示すように、ＴＹ２１５８０はまた、アイソタイプ対照と比較して、ＴＩＬにおいてＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ比を有意に増加させた（ＴＹ２１５８０では８．０％に対して、アイソタイプ対照では０．６％、Ｐ＜０．０１）。しかしながら、ＴＹ２１５８０は、末梢リンパ球ではＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ比に有意な影響を及ぼさなかった。ＰＢＭＣでは、ＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ比は、ＴＹ２１５８０治療後は５．３％だったのに対して、アイソタイプ対照治療後は６．３％であった（Ｐ＞０．０５）。リンパ節細胞では、ＣＤ８＋Ｔ／Ｔｒｅｇ比は、ＴＹ２１５８０治療後は４．９％だったのに対して、アイソタイプ対照治療後は４．７％であった（Ｐ＞０．０５）。
【０３１９】
さらに、ＴＹ２１５８０治療群からのＦｏｘｐ３＋ＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞のＣＴＬＡ４発現レベルは、ＴＩＬではアイソタイプ対照群の細胞よりも有意に低かった（ＴＹ２１５８０では８９８５．２ＭＦＩに対して、アイソタイプ対照では２０９４８．０ＭＦＩ；図６３）。しかしながら、ＣＴＬＡ４発現レベルは、ＰＢＭＣ（ＴＹ２１５８０では２０４６．７ＭＦＩに対して、アイソタイプ対照では２７４０．９ＭＦＩ）、またはリンパ節（ＴＹ２１５８０では３０６２．０ＭＦＩに対して、アイソタイプ対照では３２４７．９ＭＦＩ）では変化しなかった。ＴＩＬにおけるＴｒｅｇ細胞はまた、末梢細胞（すなわち、ＰＢＭＣ及びＬＮ）におけるＴｒｅｇ細胞よりもはるかに高いＣＴＬＡ４発現レベルを示し、ＣＴＬＡ４発現はＴＹ２１５８０治療後のＴＩＬにおけるＴｒｅｇ細胞で有意に低かった。
【０３２０】
まとめると、これらの結果は、ＴＹ２１５８０が、特に腫瘍細胞（すなわち、ＴＩＬ）においてＴｒｅｇの枯渇を誘導し、ＣＤ８＋／Ｔｒｅｇ比を増加させる活性を示すが、末梢細胞（すなわち、ＰＢＭＣまたはリンパ節細胞）においては示さないことを示す。Ｔ細胞に対するＴＹ２１５８０のそのような調節活性は、ＴＹ２１５８０の強力なインビボ抗腫瘍効果の機構的理解を提供する。理論に拘束されることを望むものではないが、これらの結果は、ＴＹ２１５８０が腫瘍微小環境において免疫抑制性Ｔｒｅｇ活性を低下させ、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋Ｔ細胞）活性を増強させて、抗腫瘍反応を媒介することを示唆している。
【０３２１】
実施例１９：大型Ｈ２２肝臓腫瘍モデルにおけるＴＹ２１５８０の抗腫瘍効果
大型腫瘍におけるＴＹ２１５８０の抗腫瘍効果を決定するために、雌のＢＡＬＢ／ｃマウスにマウスＨ２２肝臓癌細胞を皮下接種した。比較的大型の腫瘍が約５００ｍｍ３または約８００ｍｍ３のいずれかで定着した場合、マウスを、週２回（ＢＩＷ）、４用量の腹腔内注射により、５ｍｇ／ｋｇのＴＹ２１５８０で治療した。アイソタイプ抗体を対照として使用した。群平均腫瘍増殖（図６４Ａ）及び異なる群の各マウスの個々の腫瘍増殖（図６４Ｂ〜６４Ｄ）を週２回モニターし、経時的な平均腫瘍体積±ＳＥＭとして報告した。
【０３２２】
群平均腫瘍増殖については図６４Ａに、個々の腫瘍増殖については図６４Ｂ〜６４Ｄに示したように、大型Ｈ２２腫瘍の有意な退縮を、アイソタイプ対照抗体治療群（図６４Ａ及び６４Ｂ）と比較して、両方のＴＹ２１５８０治療群（すなわち、腫瘍が、図６４Ａ及び６４Ｃに示したように約５００ｍｍ３、または図６４Ａ及び６４Ｄに示したように約８００ｍｍ３のいずれかのサイズに達したときに治療が開始された群）において観察した。これらの結果は、大型腫瘍の抑制におけるＴＹ２１５８０の顕著な有効性を示した。
【０３２３】
実施例２０：マスキング効率に対するマスキングペプチドの長さの効果
２つの活性化可能抗体、ＴＹ２２４０２及びＴＹ２２４０４を選択して、マスキングペプチドの長さに対するマスキング効率の依存性を試験し、それらの特定の用途に適合させた。ＴＹ２２４０２及びＴＹ２２４０４のマスキングペプチドを、Ｎ末端から残基を除去することによって２１残基から１６または１２残基に短縮し、マスキングペプチド中の第１のシステイン残基の前に５または２残基のみを残した（表２６）。これらの活性化可能抗体を哺乳動物細胞から発現及び精製して、それらのマスキング効率を実施例８に記載のとおり測定し、親抗体ＴＹ２１５８０と比較した。２つの実験からの結果は、第１のシステイン残基の前に２〜１１残基の範囲の長さを有する異なるマスキングペプチドを使用してこれらの活性化可能抗体を作製し、抗体のマスキング効率を調節することができることを示した（図６５Ａ及び６５Ｂ；表２７及び２８）。これは、コアマスキングモチーフがシステインループ及びそのすぐ隣接する残基を含有し、マスキング効率を維持するのに十分であることを示唆すると考えられる。
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【０３２４】
表２７は、図６５Ａ中の抗体のマスキング効率を示す。表２８は、図６５Ｂ中の抗体のマスキング効率を示す。
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【０３２５】
実施例２１：マスキング効率に対する切断ペプチドの長さの効果
ＴＹ２２４０４を選択して、切断ペプチドの長さに対するマスキング効率の依存性を試験し、それらの特定の用途に適合させた。ＴＹ２２４０４の切断ペプチドを、様々な長さに短縮した（表２９）。活性化可能抗体を哺乳動物細胞から発現及び精製して、それらのマスキング効率を実施例８に記載のとおり測定し、親抗体ＴＹ２１５８０と比較した。図６６及び表３０に示すように、結果は、５〜２０残基の範囲の長さを有する異なる切断ペプチドを使用してこれらの活性化可能抗体を作製し、抗体のマスキング効率を調節することができることを示した。マスキングモチーフと切断モチーフとの間の強い相関は顕著であり、ＴＹ２３２９１のマスキング効率は、ペプチド長が４１〜１７個のアミノ酸に短縮されている場合、ＴＹ２２４０４と比較して少なくとも３０倍増強されている。これらの結果は、いくつかの新規マスキングペプチドが設計及び操作され得ることを示す。さらに、マスキングモチーフと切断モチーフとの間のカップリングをさらに探究することができる。
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【０３２６】
表３０は、図６６中の抗体のマスキング効率を示す。
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−Ｂ】
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【図５Ｃ−Ｄ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６Ａ−Ｂ】
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【図５６Ｃ−Ｅ】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０Ａ】
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【図６０Ｂ】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４Ａ】
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【図６４Ｂ−Ｄ】
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【図６５】
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【図６６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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