(57)【要約】細胞結合構成要素（ＣＢＣ）を使用する、微生物の迅速検出のための方法およびシステムが、本明細書で開示される。微生物を結合するためのＣＢＳの特異性は、目的の微生物の標的化されかつ高度に特異的な検出を可能にする。一局面において、本発明は、ＣＢＣを含む微生物検出プローブ（ＭＤＰ）を使用して、目的の微生物の存在に関してサンプルを試験するための方法を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中のわずか１個の目的の微生物を捕捉および検出する方法を含む。
2021516964.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
サンプル中のわずか１個の目的の微生物を捕捉および検出する方法であって、前記方法は、
前記サンプルを、前記目的の微生物に結合する複数の微生物検出プローブ（ＭＤＰ）とともにインキュベートする工程であって、ここで前記ＭＤＰは、前記微生物が前記複数のＭＤＰに結合するような条件の下で、インジケーター部分および細胞結合構成要素（ＣＢＣ）を含む工程；
結合していないＭＤＰを、細胞に結合したＭＤＰから分離する工程；ならびに
前記細胞に結合したＭＤＰ上の前記インジケーター部分を検出する工程であって、ここで前記インジケーター部分の陽性検出は、前記目的の微生物が前記サンプル中に存在することを示す工程、
を包含する方法。
【請求項２】
前記１個の微生物に結合した前記複数のＭＤＰは、少なくとも１×１０６である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＣＢＣは、グラム陰性細菌に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＣＢＣは、グラム陽性細菌に対して特異的である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記グラム陰性細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐまたはＥ．  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７である、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記グラム陽性細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐである、請求項４に記載の方法。
【請求項７】
前記ＣＢＣは、エンドリシンまたはスパニンまたは前記目的の微生物に対して特異的なレセプター結合タンパク質（ＲＢＰ）から単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記スパニンは、外膜スパニン（ＲＺ１）またはその短縮型改変体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＲＢＰは、尾部繊維タンパク質またはその短縮型改変体である、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＢＣは、エンドリシンから単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
前記エンドリシンから単離されたＣＢＣは、細胞結合ドメイン（ＣＢＤ）またはその短縮型改変体である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
結合ドメインは、以下のバクテリオファージ：ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＰＮ１Ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージ１０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージｅｐｓｉｌｏｎ１５、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＥＡ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳｐｎ１ｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＰ２２、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬｉｐＺ５、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ４０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ７０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＡ５１１、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＰ４Ｗ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＫ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＴｗｏｒｔ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＳＡ９７、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７ファージＣＢＡ１２０のうちの少なくとも１種のＣＢＣと≧９５％  相同性を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記分離する工程は、固体支持体上に前記目的の微生物を捕捉することを包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記固体支持体は、マルチウェルプレート、フィルター、ビーズ、ラテラルフローストリップ、フィルターストリップ、フィルターディスク、およびフィルターペーパーのうちの少なくとも１種を含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記捕捉された微生物を洗浄して、過剰な結合していないＭＤＰを除去する工程をさらに包含する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＭＤＰに結合した微生物は、蛍光顕微鏡法による検査のために固体支持体に固定される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＭＤＰは、組換えタンパク質または結合体化タンパク質である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記インジケーター部分は、発蛍光団、蛍光タンパク質、粒子、または酵素のうちの少なくとも１種を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記酵素は、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびグリコシダーゼのうちの少なくとも１種を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記ルシフェラーゼは、遺伝子操作されたルシフェラーゼである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記サンプルは、食品サンプル、環境サンプル、水サンプル、商業サンプル、または臨床サンプルである、請求項１に記載の方法。
【請求項２２】
前記方法は、食品安全産業のための標準サイズのサンプル中のわずか１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個の細菌を検出する、請求項１に記載の方法。
【請求項２３】
前記食品サンプルは、食肉または野菜を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２４】
前記サンプルは、９時間もしくはこれ未満、８時間もしくはこれ未満、７時間もしくはこれ未満、６時間もしくはこれ未満、５時間もしくはこれ未満、４時間もしくはこれ未満、３時間もしくはこれ未満、または２時間もしくはこれ未満の富化期間の間、成長を有利にする条件において最初にインキュベートされる、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
前記サンプルは、前記複数のＭＤＰとのインキュベーション前に富化されない、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
結果までの合計時間は、１２時間未満である、請求項１に記載の方法。
【請求項２７】
細胞結合構成要素（ＣＢＣ）およびインジケーター部分を含む、組換え微生物検出プローブ（ＭＤＰ）。
【請求項２８】
前記ＣＢＣは、グラム陰性細菌に対して特異的である、請求項２７に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項２９】
前記ＣＢＣは、グラム陽性細菌に対して特異的である、請求項２７に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項３０】
前記グラム陰性細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐまたはＥ．  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７である、請求項２７に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項３１】
前記グラム陽性細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐである、請求項２７に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項３２】
前記ＣＢＣは、エンドリシンまたはスパニンまたは前記目的の微生物に対して特異的なＲＢＰから単離される、請求項２７に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項３３】
前記スパニンは、外膜スパニン（ＲＺ１）またはその短縮型改変体である、請求項３２に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項３４】
前記ＲＢＰは、尾部繊維タンパク質またはその短縮型改変体である、請求項３２に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項３５】
前記ＣＢＣは、前記エンドリシンから単離される、請求項３２に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項３６】
前記エンドリシンから単離されたＣＢＣは、細胞結合ドメイン（ＣＢＤ）またはその短縮型改変体である、請求項２７に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項３７】
結合ドメインは、以下のバクテリオファージ：ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＰＮ１Ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージ１０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージｅｐｓｉｌｏｎ１５、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＥＡ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳｐｎ１ｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＰ２２、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬｉｐＺ５、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ４０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ７０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＡ５１１、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＰ４Ｗ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＫ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＴｗｏｒｔ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＳＡ９７、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７ファージＣＢＡ１２０のうちのいずれかのＣＢＣと≧９５％  相同性を有する、請求項２７に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項３８】
前記インジケーター部分は、内因性のシグナルを生成するか、または前記インジケーター部分は、基質との反応の際にシグナルを生成する酵素を含むか、または前記インジケーター部分は、１種もしくはこれより多くのさらなるシグナル生成構成要素との反応の際にシグナルを生成する補因子を含む、請求項２７に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項３９】
前記ＭＤＰは、組換え遺伝子生成物または結合体化タンパク質である、請求項２７に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項４０】
前記インジケーター部分は、発蛍光団、蛍光タンパク質、粒子、および酵素のうちの少なくとも１種を含む、請求項２７に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項４１】
前記酵素は、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびグリコシダーゼのうちの少なくとも１種を含む、請求項２７に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項４２】
前記ルシフェラーゼは、遺伝子操作されたルシフェラーゼである、請求項４１に記載の組換えＭＤＰ。
【請求項４３】
組換えＭＤＰを調製する方法であって、前記方法は、
野生型バクテリオファージまたは標的病原性細菌に特異的に感染するバクテリオファージの群のエンドリシン遺伝子、スパニン遺伝子、または尾部繊維遺伝子のうちの少なくとも１つに実質的に同一なＣＢＣを生成する工程；
前記ＣＢＣとインジケーター部分との融合遺伝子を調製する工程であって、ここで融合タンパク質生成物は、前記組換えＭＤＰである工程；
前記融合遺伝子を有する発現ベクターを形質転換して、前記組換えＭＤＰを合成する工程；および
前記組換えＭＤＰを精製する工程、
を包含する方法。
【請求項４４】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７を検出するためのキットであって、前記キットは、請求項２９〜４５のいずれか１項に記載の組換えＭＤＰを含むキット。
【請求項４５】
前記ＭＤＰのインジケーター部分と反応するための基質をさらに含む、請求項４４に記載のキット。
【請求項４６】
組換えＭＤＰを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７を検出するためのシステム。
【請求項４７】
サンプル中の１個またはこれより多くの目的の微生物を検出する方法であって、前記方法は、
前記サンプルと、装置の固体支持体と接触させる工程であって、ここで前記固体支持体は、あるとすれば、前記サンプル中の前記１個またはこれより多くの微生物を捕捉し、ここで前記装置は、バクテリオファージゲノムへと挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、ここで前記構築物は、プロモーターおよびインジケーター遺伝子を含む、第１の区画
を含む、工程；
前記第１の区画からの前記組換えバクテリオファージと、前記サンプルとを接触させ、前記組換えバクテリオファージは、前記サンプル中の前記１個またはこれより多くの微生物に感染し、それによって、インジケーター遺伝子生成物を生成する工程、ならびに
前記インジケーター遺伝子生成物を検出する工程、
を包含する方法。
【請求項４８】
前記装置は、基質を含む第２の区画をさらに含み、前記インジケーター遺伝子生成物を検出する工程は、前記インジケーター遺伝子生成物と基質とを接触させることによるものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記固体支持体はビーズである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記固体支持体は、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリビニルクロリド（ＰＶＣ）を含む、請求項４７〜４９のいずれかに記載の方法。
【請求項５１】
前記固体支持体は、細胞結合構成要素（ＣＢＣ）の１またはこれより多くの分子を含み、ここで前記ＣＢＣは、前記サンプル中の前記１個またはこれより多くの目的の微生物を認識する、請求項４７〜５０のいずれかに記載の方法。
【請求項５２】
前記ＣＢＣは、グラム陰性細菌に対して特異的である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＣＢＣは、グラム陽性細菌に対して特異的である、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記グラム陰性細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐまたはＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５５】
前記グラム陽性細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐである、請求項５３に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＣＢＣは、エンドリシンまたはスパニンまたは前記目的の微生物に対して特異的なレセプター結合タンパク質（ＲＢＰ）から単離される、請求項５１に記載の方法。
【請求項５７】
前記スパニンは、外膜スパニン（ＲＺ１）またはその短縮型改変体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記ＲＢＰは、尾部繊維タンパク質またはその短縮型改変体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＣＢＣは、前記エンドリシンから単離される、請求項５１に記載の方法。
【請求項６０】
前記エンドリシンから単離されたＣＢＣは、細胞結合ドメイン（ＣＢＤ）またはその短縮型改変体である、請求項５６に記載の方法。
【請求項６１】
前記装置は、基質を含む第２の区画をさらに含み、前記方法は、
前記第２の区画からの前記基質を、前記組換えバクテリオファージを添加すると同時にまたは添加した後に、前記サンプルに添加する工程、
をさらに包含する、請求項４７に記載の方法。
【請求項６２】
前記第１の区画はシールを含み、前記組換えバクテリオファージと前記サンプルとを接触させる工程は、前記シールを破損することによるものであり、ここで前記シールの破損は、前記第１の区画からの前記組換えバクテリオファージを、前記サンプルと接触させ、前記サンプル中の前記１個またはこれより多くの微生物に感染させ、それによって、インジケーター遺伝子生成物を生成する、請求項４７〜６１のいずれかに記載の方法。
【請求項６３】
前記バクテリオファージは凍結乾燥される、請求項４７に記載の方法。
【請求項６４】
前記装置は、増殖培地を含む第３の区画を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項６５】
前記方法は、前記目的の１個またはこれより多くの微生物を捕捉した前記固体支持体を、前記増殖培地中で、前記組換えバクテリオファージを添加する前の一定期間にわたってインキュベートする工程を包含する、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記装置は、前記培地、前記組換えバクテリオファージ、および前記基質と前記サンプルとを段階的に混合するためのストップ−ロックを含む、請求項４７または請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記固体支持体は、前記サンプルを接触させる前に乾燥している、請求項４７に記載の方法。
【請求項６８】
前記固体支持体は、前記サンプルを接触させる前に培地に浸漬されている、請求項４７に記載の方法。
【請求項６９】
前記１個またはこれより多くの微生物を捕捉した前記固体支持体は、前記組換えバクテリオファージと接触させる前に、前記第３の区画における前記増殖培地とともにインキュベートされる、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記インキュベーションは、０〜２時間である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記バクテリオファージは、前記インジケーター遺伝子生成物を検出する前に、前記サンプルと０．５〜３時間にわたって接触する、請求項４７〜７０のいずれかに記載の方法。
【請求項７２】
前記インジケーター遺伝子生成物は、発蛍光団、蛍光タンパク質、粒子、および酵素のうちの少なくとも１種を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７３】
前記酵素は、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびグリコシダーゼのうちの少なくとも１種を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７４】
前記ルシフェラーゼは、遺伝子操作されたルシフェラーゼである、請求項７３に記載の方法。
【請求項７５】
前記サンプルは、食品サンプル、環境サンプル、水サンプル、商業サンプル、または臨床サンプルである、請求項４７に記載の方法。
【請求項７６】
前記方法は、食品安全産業のための標準サイズのサンプル中のわずか１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個の細菌を検出する、請求項４７に記載の方法。
【請求項７７】
前記食品サンプルは、食肉または野菜を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項７８】
前記サンプルは、食品サンプル、水サンプル、酪農食品サンプル、環境サンプル、商業サンプル、または臨床サンプルである、請求項４７に記載の方法。
【請求項７９】
前記サンプルは、９時間もしくはこれ未満、８時間もしくはこれ未満、７時間もしくはこれ未満、６時間もしくはこれ未満、５時間もしくはこれ未満、４時間もしくはこれ未満、３時間もしくはこれ未満、または２時間もしくはこれ未満の富化期間の間、成長を有利にする条件において最初にインキュベートされる、請求項４７に記載の方法。
【請求項８０】
サンプル中の１個またはこれより多くの目的の微生物を検出する方法であって、前記方法は、
前記サンプルと、装置の固体支持体と接触させる工程であって、ここで前記固体支持体は、あるとすれば、前記サンプル中の前記１個またはこれより多くの微生物を捕捉し、ここで前記装置は、請求項１に記載のＭＤＰを含む第１の区画を含む、工程、
前記第１の区画からの前記ＭＤＰと前記サンプルとを接触させる工程、ならびに
前記インジケーター遺伝子生成物を検出する工程、
を包含する方法。
【請求項８１】
サンプル中の目的の微生物を検出するためのシステムであって、前記システムは、
バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、ここで前記構築物は、プロモーターおよびインジケーター遺伝子を含み、
ここで前記固体支持体は、細胞結合構成要素を含む、第１の区画、ならびに
シグナル検出構成要素であって、ここで前記シグナル検出構成要素は、前記サンプルを前記組換えバクテリオファージに感染させたことから生じる前記インジケーター遺伝子生成物を検出し得る、シグナル検出要素、
を含む装置を含む、システム。
【請求項８２】
前記シグナル検出構成要素は、携帯型ルミノメーターである、請求項８１に記載のシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１８年３月９日出願の米国仮特許出願第６２／６４０，７９３号および２０１９年１月３０日出願の同第６２／７９８，９８０号に基づく優先権を主張する。米国特許出願第１３／７７３，３３９号、同第１４／６２５，４８１号、同第１５／２６３，６１９号、同第１５／４０９，２５８号および米国仮特許出願第６２／６１６，９５６号、同第６２／６２８，６１６号、同第６２／６６１，７３９号、同第６２／６４０，７９３号および同第６２／７９８，９８０号の開示は、それらの全体において本明細書に参考として援用される。
【０００２】
発明の分野
本発明は、組換えタンパク質および／または結合体化タンパク質を使用して目的の微生物を検出するための方法、装置、システムに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
生物学的サンプル、食品サンプル、水サンプル、および臨床サンプル中の細菌、ウイルス、および他の微生物の検出のための速度および感度を改善することには、強い重要性がある。微生物病原体は、ヒトおよび家畜動物において実質的な病的状態、ならびに莫大な経済的損失を引き起こし得る。微生物の検出は、ある種の微生物（例えば、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉまたはＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐ）で汚染された食品の摂取によって引き起こされる生命を脅かすもしくは致命的な病気の大流行を考慮すると、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）および疾病対策センター（ＣＤＣ）にとっての優先順位は高い。
【０００４】
細菌を検出するための旧来からの微生物学的試験は、非選択的および選択的な富化培養、続いて、選択培地にプレーティングし、さらに試験して、疑わしいコロニーを確認することに依拠する。このような手順には、数日を要し得る。種々の迅速な方法が研究されてきており、時間要件を低減するために、実務に導入されてきた。しかし、現在まで、時間要件を低減する方法には欠点がある。例えば、直接的イムノアッセイもしくは遺伝子プローブを伴う技法は、一般に、適切な感度を得るために、一晩の富化工程を要するので、同日に結果を出す能力に欠けている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）試験はまた、増幅工程を包含し、従って、非常に高い感度および選択性の両方の能力がある；しかし、経済的に、ＰＣＲ試験に供され得るサンプルサイズは、制限される。ＰＣＲに供され得る薄い細菌懸濁物には、細胞がなく、従って、精製および／もしくは長々とした富化工程がなお必要とされる。
【０００５】
旧来の生物学的富化のために必要とされる時間は、上記サンプルの標的細菌集団の増殖速度によって、上記サンプルマトリクスの効果によって、および必要とされる感度によって、規定される。実際には、大部分の高感度法は、一晩のインキュベーションを使用し、全体的には約２４時間かかる。培養のために必要とされる時間に起因して、これらの方法は、同定される予定の生物および上記サンプルの供給源に依存して、最大で３日間かかり得る。この遅延時間（lag  time）は、一般に、このような遅延により、汚染された食品もしくは水または他の生成物が家畜もしくはヒトの中へと入り込んでしまうのを許容するので、不適切である。さらに、抗生物質耐性細菌および生体防御の懸念事項の増加により、水サンプル、食品サンプルおよび臨床サンプル中の細菌病原体の迅速同定が、世界的に欠くことのできない優先事項になっている。
【０００６】
従って、微生物（例えば、細菌および他の潜在的に病原性の微生物）のより迅速で簡単かつ感度の高い検出および同定が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
要旨
本発明の実施形態は、微生物の検出のための組成物、方法、装置、システムおよびキットを含む。ある種の実施形態において、細胞結合構成要素（ＣＢＣ）は、目的の微生物を検出するために使用される。本発明は、種々の方法で具現化され得る。
【０００８】
一局面において、本発明は、微生物検出プローブ（ＭＤＰ）を使用して、目的の微生物の存在に関してサンプルを試験するための方法を含む。いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中のわずか１個の目的の微生物を捕捉および検出する方法を含む。例えば、ある種の実施形態において、上記方法は、上記サンプルを、上記目的の微生物に結合する複数のＭＤＰとともにインキュベートする工程であって、ここで上記ＭＤＰは、上記微生物が上記複数のＭＤＰに結合するような条件の下で、インジケーター部分および細胞結合構成要素（ＣＢＣ）を含む工程；結合していないＭＤＰを、細胞に結合したＭＤＰから分離する工程；ならびに上記細胞に結合したＭＤＰ上で上記インジケーター部分を検出する工程を包含し得る。さらなる実施形態において、上記インジケーター部分の陽性検出は、上記目的の微生物が上記サンプル中に存在することを示す。いくつかの実施形態において、上記１個の微生物に結合した上記複数のＭＤＰは、少なくとも１×１０６である。さらなる実施形態において、上記ＣＢＣは、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌に対して特異的である。上記グラム陰性細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐまたはＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７であり得る。上記グラム陽性細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐであり得る。
【０００９】
他のさらなるおよび／または代替の局面において、本発明は、過剰な結合していないＭＤＰを細胞に結合したＭＤＰから分離するための方法を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記分離する工程は、固体支持体上に上記目的の微生物を捕捉する工程を包含する。例えば、上記固体支持体は、マルチウェルプレート、フィルター、ビーズ、ラテラルフローストリップ、フィルターストリップ、フィルターディスク、およびフィルターペーパーのうちの少なくとも１種を含み得る。上記方法はさらに、上記捕捉された微生物を洗浄して、過剰な結合していないＭＤＰを除去する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記ＭＤＰに結合した微生物は、蛍光顕微鏡法による検査のために固体支持体に固定される。
【００１０】
他のさらなるおよび／または代替の局面において、本発明は、低レベルの微生物を検出するために、微生物を結合し得るＭＤＰの高い特異性を利用する。いくつかの実施形態において、上記方法は、食品安全産業のための標準サイズのサンプル中のわずか１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個の細菌を検出する。他の実施形態において、上記サンプルは、９時間もしくはこれ未満、８時間もしくはこれ未満、７時間もしくはこれ未満、６時間もしくはこれ未満、５時間もしくはこれ未満、４時間もしくはこれ未満、３時間もしくはこれ未満、または２時間もしくはこれ未満の富化期間の間、成長を有利にする条件において最初にインキュベートされる。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、上記複数のＭＤＰとのインキュベーション前に富化されない。
【００１１】
別の局面において、本発明は、細胞結合構成要素（ＣＢＣ）およびインジケーター部分を含む組換え微生物検出プローブ（ＭＤＰ）を含む。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、グラム陰性細菌またはグラム陽性細菌に対して特異的である。上記ＣＢＣは、エンドリシン、またはスパニン、または上記目的の微生物に対して特異的な尾部繊維、もしくは尾部スパイクタンパク質から単離され得る。上記スパニンは、外膜スパニン（ＲＺ１）またはその短縮型改変体であり得る。エンドリシンから単離されたいくつかのＣＢＣは、細胞結合ドメイン（ＣＢＤ）またはその短縮型改変体をさらに含む。
【００１２】
いくつかの実施形態において、上記ＭＤＰは、組換え遺伝子生成物または結合体化タンパク質である。さらなる実施形態において、上記組換えＭＤＰは、以下のバクテリオファージ：ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＰＮ１Ｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージ１０、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージｅｐｓｉｌｏｎ１５、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳＥＡ１、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＳｐｎ１ｓ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａファージＰ２２、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬｉｐＺ５、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ４０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＰ７０、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＡ５１１、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＰ４Ｗ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＫ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＴｗｏｒｔ、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＳＡ９７、またはＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７ファージＣＢＡ１２０のうちのいずれかのＣＢＣと≧９５％  相同性を有する結合ドメインを含む。
【００１３】
組換えＭＤＰのある種の実施形態において、上記インジケーター部分は、内因性のシグナルを生成し得る。他の実施形態において、上記インジケーター部分は、基質との反応の際にシグナルを生成する酵素を含む。さらに他の実施形態において、上記インジケーター部分は、１種もしくはこれより多くのさらなるシグナル生成構成要素との反応の際にシグナルを生成する補因子を含む。例えば、上記インジケーター部分は、発蛍光団、蛍光タンパク質、粒子、および酵素のうちの少なくとも１種を含む。上記酵素は、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびグリコシダーゼのうちの少なくとも１種を含み得る。上記ルシフェラーゼ遺伝子は、天然に存在する遺伝子（例えば、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ、またはＲｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ）であり得るか、またはそれは、遺伝子操作された遺伝子であり得る。
【００１４】
本明細書においてまた、組換えＭＤＰを調製する方法であって、上記方法は、野生型バクテリオファージまたは標的病原性細菌に特異的に感染するバクテリオファージの群のエンドリシン遺伝子、スパニン遺伝子、または尾部繊維遺伝子のうちの少なくとも１つに実質的に同一なＣＢＣを生成する工程；上記ＣＢＣとインジケーター部分との融合遺伝子を調製する工程であって、ここで融合タンパク質生成物は、上記組換えＭＤＰである工程；上記融合遺伝子を有する発現ベクターを形質転換して、上記組換えＭＤＰを合成する工程；および上記組換えＭＤＰを精製する工程、を包含する方法が開示される。
【００１５】
さらなる実施形態は、組換えＭＤＰを含む、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、またはＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７を検出するためのシステムおよびキットを包含する。いくつかの実施形態は、上記ＭＤＰのインジケーター部分と反応するための基質をさらに含む。これらのシステムまたはキットは、本発明のバクテリオファージ、組成物、および方法に関して記載される特徴を含み得る。さらに他の実施形態において、本発明は、本発明による方法またはシステムとともに使用するための非一時的なコンピューター可読媒体を含む。
【００１６】
別の局面において、サンプル中の１個またはこれより多くの目的の微生物を検出する上記方法は、上記サンプルと、装置の固体支持体と接触させる工程であって、ここで上記固体支持体は、あるとすれば、上記サンプル中の上記１個またはこれより多くの微生物を捕捉し、ここで上記装置は、バクテリオファージゲノムへと挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、ここで上記構築物は、プロモーターおよびインジケーター遺伝子を含む、第１の区画を含む、工程；上記第１の区画からの上記組換えバクテリオファージと、上記サンプルとを接触させ、上記組換えバクテリオファージは、上記サンプル中の上記１個またはこれより多くの微生物に感染し、それによって、インジケーター遺伝子生成物を生成する工程、ならびに上記インジケーター遺伝子生成物を検出する工程、を包含する。
【００１７】
いくつかの実施形態において、上記装置は、基質を含む第２の区画をさらに含み、上記インジケーター遺伝子生成物を検出する工程は、上記インジケーター遺伝子生成物と基質とを接触させることによるものである。いくつかの実施形態において、上記固体支持体はビーズである。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリビニルクロリド（ＰＶＣ）を含む。
【００１８】
いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、細胞結合構成要素（ＣＢＣ）の１またはこれより多くの分子を含み、ここで上記ＣＢＣは、上記サンプル中の上記１個またはこれより多くの目的の微生物を認識する。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、グラム陰性細菌に対して特異的である。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、グラム陽性細菌に対して特異的である。いくつかの実施形態において、上記グラム陰性細菌は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐｐまたはＥ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７である。いくつかの実施形態において、上記グラム陽性細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｐｐまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐである。
【００１９】
いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、エンドリシンまたはスパニンまたは上記目的の微生物に対して特異的なレセプター結合タンパク質（ＲＢＰ）から単離される。いくつかの実施形態において、上記スパニンは、外膜スパニン（ＲＺ１）またはその短縮型改変体である。いくつかの実施形態において、上記ＲＢＰは、尾部繊維タンパク質またはその短縮型改変体である。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、上記エンドリシンから単離される。
【００２１】
いくつかの実施形態において、上記エンドリシンから単離されたＣＢＣは、細胞結合ドメイン（ＣＢＤ）またはその短縮型改変体である。
【００２２】
いくつかの実施形態において、上記装置は、基質を含む第２の区画をさらに含み、上記方法は、上記第２の区画からの上記基質を、上記組換えバクテリオファージを添加すると同時にまたは添加した後に、上記サンプルに添加する工程、をさらに包含する。
【００２３】
いくつかの実施形態において、上記第１の区画はシールを含み、上記組換えバクテリオファージと上記サンプルとを接触させる工程は、上記シールを破損することによるものであり、ここで上記シールの破損は、上記第１の区画からの上記組換えバクテリオファージを、上記サンプルと接触させ、上記サンプル中の上記１個またはこれより多くの微生物に感染させ、それによって、インジケーター遺伝子生成物を生成する。
【００２４】
いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは凍結乾燥される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、上記装置は、増殖培地を含む第３の区画を含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、上記方法は、上記目的の１個またはこれより多くの微生物を捕捉した上記固体支持体を、上記増殖培地中で、上記組換えバクテリオファージを添加する前の一定期間にわたってインキュベートする工程を包含する。
【００２７】
いくつかの実施形態において、上記装置は、上記培地、上記組換えバクテリオファージ、および上記基質と上記サンプルとを段階的に混合するためのストップ−ロックを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、上記サンプルを接触させる前に乾燥している。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、上記サンプルを接触させる前に培地に浸漬されている。
【００２９】
いくつかの実施形態において、上記１個またはこれより多くの微生物を捕捉した上記固体支持体は、上記組換えバクテリオファージと接触させる前に、上記第３の区画における上記増殖培地とともにインキュベートされる。
【００３０】
いくつかの実施形態において、上記インキュベーションは、０〜２時間である。いくつかの実施形態において、上記バクテリオファージは、上記インジケーター遺伝子生成物を検出する前に、上記サンプルと０．５〜３時間にわたって接触する。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上記インジケーター遺伝子生成物は、発蛍光団、蛍光タンパク質、粒子、および酵素のうちの少なくとも１種を含む。いくつかの実施形態において、上記酵素は、ルシフェラーゼ、ホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、およびグリコシダーゼのうちの少なくとも１種を含む。いくつかの実施形態において、上記ルシフェラーゼは、遺伝子操作されたルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、食品サンプル、環境サンプル、水サンプル、商業サンプル、または臨床サンプルである。
【００３２】
いくつかの実施形態において、上記方法は、食品安全産業のための標準サイズのサンプル中のわずか１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、２個または１個の細菌を検出する。いくつかの実施形態において、上記食品サンプルは、食肉または野菜を含む。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、食品サンプル、水サンプル、酪農食品サンプル、環境サンプル、商業サンプル、または臨床サンプルである。
【００３３】
いくつかの実施形態において、上記サンプルは、９時間もしくはこれ未満、８時間もしくはこれ未満、７時間もしくはこれ未満、６時間もしくはこれ未満、５時間もしくはこれ未満、４時間もしくはこれ未満、３時間もしくはこれ未満、または２時間もしくはこれ未満の富化期間の間、成長を有利にする条件において最初にインキュベートされる。
【００３４】
別の局面において、本開示は、サンプル中の目的の微生物を検出するためのシステムであって、上記システムは、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、ここで上記構築物は、プロモーターおよびインジケーター遺伝子を含み、ここで上記固体支持体は、細胞結合構成要素を含む、第１の区画、ならびにシグナル検出構成要素であって、ここで上記シグナル検出構成要素は、上記サンプルを上記組換えバクテリオファージに感染させたことから生じる上記インジケーター遺伝子生成物を検出し得る、シグナル検出要素、を含む装置を含む、システムを提供する。いくつかの実施形態において、上記シグナル検出構成要素は、携帯型ルミノメーターである。
【図面の簡単な説明】
【００３５】
本発明は、非限定的な図面を参照することによってよりよく理解され得る。
【００３６】
【図１】図１は、ＭＤＰを使用して目的の細菌を検出するための方法の一実施形態を示す。
【００３７】
【図２】図２は、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌に特異的なバクテリオファージによってコードされるエンドリシンの構造を示す。
【００３８】
【図３】図３は、固体支持体としてスワブを伴う自給式装置を使用するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ培養物の検出の結果を示す。上記細菌の存在に相当するシグナルを、Ｈｙｇｉｅｎａルミノメーター、ＧｌｏＭａｘルミノメーター、およびＧｌｏＭａｘ  ２０／２０ルミノメーターによって検出した。表１は、対数増殖期培養物からの結果を示し、表２は、一晩培養物からの結果を示す。
【００３９】
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、表１に示されるデータから生成したプロットである。図４Ａは、Ｈｙｇｉｅｎａを使用して検出されるシグナルの測定を示す。スワブを、示されたＣＦＵレベルにおいて対数増殖期の細胞に接種した。サンプルを直ぐに、Ｌｉｓｔｅｒｉａファージカクテルに４時間感染させた。基質を添加し、サンプルをＨｙｇｉｅｎａルミノメーターで読み取った。＞１０  ＲＬＵのシグナルを陽性とみなす。この方法では、陽性結果を生成するために、およそ２５，０００  ＣＦＵが必要とされる。
【００４０】
図４Ｂは、ＧｌｏＭａｘ  ２０／２０およびＧｌｏＭａｘ  （別名、ＧｌｏＭａｘ  ９６）ルミノメーターを使用して検出されるシグナルの測定を示す。スワブを、示されたＣＦＵレベルにおいて対数増殖期の細胞に接種した。サンプルを直ぐに、Ｌｉｓｔｅｒｉａファージカクテルに４時間感染させた。基質を添加し、サンプルを、ＧｌｏＭａｘ  ２０／２０ルミノメーター（１ｍＬのサンプル）またはＧｌｏＭａｘルミノメーター（１５０μｌのサンプル）のいずれかで読み取った。シグナル／バックグラウンド比＞３．０を、陽性とみなす。この方法では、陽性結果を生成するために、およそ５，０００  ＣＦＵが必要とされる。
【００４１】
【図５】図５は、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを接種したシチメンチョウ挽肉中でのＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出の結果を示す。表３は、非接種コントロールサンプルを示し、表４は、接種したシチメンチョウサンプルを示す。試験を、種々のインキュベーションおよび感染時間で反復した。
【００４２】
【図６】図６Ａおよび図６Ｂは、図５のデータから生成したプロットである。図４Ａは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ接種したシチメンチョウサンプルが、試験したあらゆるインキュベーションおよび感染時間で陽性として検出されたことを示す。そのシチメンチョウサンプルを、本出願で開示される方法で試験する前に、接種後２４時間、４１℃で増殖させた。相対的シグナルに関して：  ０時間インキュベーション、２時間感染＞１時間インキュベーション、０．５時間感染＞０時間インキュベーション、０．５時間感染。さらに、ＲＬＵシグナルの比較は、ＧｌｏＭａｘルミノメーターが、Ｈｙｇｉｅｎａルミノメーターのものより遙かに高いシグナルを有することを示す。
【００４３】
図６Ｂは、ＧｌｏＭａｘ  ２０／２０ルミノメーターおよびＧｌｏＭａｘルミノメーターを使用する検出が、同じサンプルに関して類似のシグナル／バックグラウンド比を生じたことを示す。ＧｌｏＭａｘ  ２０／２０は、より大きなシグナルを生じた（図６Ａ）が、そのバックグラウンドは、ＧｌｏＭａｘでのものより有意に高かった。従って、シグナル／バックグラウンドを決定する場合、その２種のルミノメーターは同様に機能する。
【００４４】
【図７】図７は、自給式装置を使用してアッセイする前にＳａｌｍｏｎｅｌｌａを接種した３つのシチメンチョウサンプル（サンプル２１、２４、および２６）におけるＳａｌｍｏｎｅｌｌａの検出のデータを示す。上記サンプルを、シグナルを検出する前に、示されたとおりの継続時間にわたって感染させた。
【００４５】
【図８】図８Ａ〜８Ｃは、図７に示されるデータから生成したプロットである。図８Ａ〜８Ｃは、３種の接種したシチメンチョウ挽肉サンプルを２４時間にわたって富化し、スワブサンプルを採取およびアッセイした実験の結果を示す。サンプル２４（図８Ｂ）および２６（図８Ｃ）は、３０分間ファージ感染を有したサンプルに関してはＨｙｇｉｅｎａ携帯型ルミノメーターでシグナルを示さなかったが、２時間感染を有したサンプルについてはシグナルを示した。ＧｌｏＭａｘ  ２０／２０ルミノメーターおよびＧｌｏＭａｘルミノメーターは、比較的低いシグナルを生成した。
【００４６】
【図９】図９Ａ〜９Ｃは、図７に示されるデータから生成したプロットである。上記プロットは、ＧｌｏＭａｘ  ２０／２０およびＧｌｏＭａｘの両方が、サンプル２１（図９Ａ）および２６（図９Ｂ）を３０分間感染で陽性として検出できた（シグナル／バックグラウンド比  ＞３．０は陽性である）が、サンプル２４（図９Ｃ）は、陽性結果を示すために２時間感染を要したことを示す。ＧｌｏＭａｘ  ２０／２０ルミノメーターおよびＧｌｏＭａｘルミノメーターの結果は同様であった。
【００４７】
【図１０】図１０は、表面に接種し、２４時間にわたって富化した、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ環境スポンジサンプルの検出のデータを示す。
【００４８】
【図１１】図１１は、上記装置を使用して、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ接種したシチメンチョウサンプル中の微生物の検出を示す。シグナルを、３種の異なるルミノメーター：ＧｌｏＭａｘ、３Ｍ、およびＨｙｇｉｅｎａを使用して測定した。
【００４９】
【図１２】図１２Ａおよび１２Ｂは、３つの区画を含む容器に挿入された、スワブ（図１２Ａ）または細胞結合構成要素（ＣＢＣ）の分子で被覆されたビーズ（図１２Ｂ）を有する、微生物を検出するための自給式装置システムの一実施形態の図を示す。各区画は、スナップアクションシールによって分離される。第１の区画はファージを含み、第２の区画は基質を含み、第３の区画は培地を含む。全ての図中のパネルＡは、固体支持体がスワブであるものを示す。
【００５０】
【図１３】図１３Ａおよび１３Ｂは、３つの区画を含む容器に挿入された、スワブ（図１３Ａ）または細胞結合構成要素（ＣＢＣ）の分子で被覆されたビーズ（図１３Ｂ）を有する、微生物を検出するための自給式装置システムの一実施形態の図を示す。各区画は、スナップアクションシールによって分離される。第１の区画はファージを含み、第２の区画は培地を含み、第３の区画は基質を含む。ファージおよび培地とのインキュベーション後、上記第２の区画および第３の区画を分離するシールは、破損され得る。
【００５１】
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、３つの区画を含む容器に挿入された、スワブ（図１４Ａ）または細胞結合構成要素（ＣＢＣ）の分子で被覆されたビーズ（図１４Ｂ）を有する、微生物を検出するための自給式装置システムの一実施形態の図を示す。各区画は、スナップアクションシールによって分離される。第１の区画は培地を含み、第２の区画はファージを含み、第３の区画は基質を含む。
【００５２】
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、３つの区画を含む容器に挿入された、スワブ（図１５Ａ）または細胞結合構成要素（ＣＢＣ）の分子で被覆されたビーズ（図１５Ｂ）を有する、微生物を検出するための自給式装置システムの一実施形態の図を示す。各区画は、スナップアクションシールによって分離される。第１の区画は培地を含み、第２の区画はファージを含み、第３の区画は基質を含む。上記装置は、試薬を段階的に混合するためのストップ−ロック機構を有する。
【００５３】
【図１６】図１６Ａおよび１６Ｂは、３つの区画を含む容器に挿入された、スワブ（図１６Ａ）または細胞結合構成要素（ＣＢＣ）の分子で被覆されたビーズ（図１６Ｂ）を有する、微生物を検出するための自給式装置システムの一実施形態の図を示す。各区画は、スナップアクションシールによって分離される。第１の区画は培地を含み、第２の区画はファージを含み、第３の区画は基質を含む。上記装置は、試薬を段階的に混合するためのストップ−ロック機構を有する。
【００５４】
【図１７】図１７は、微生物を検出するための自給式装置システムを利用する実施形態のフロー図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００５５】
発明の詳細な説明
定義
本明細書において別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語および専門用語は、当業者が一般に理解する意味を有するべきである。さらに、他に状況によって必要とされない限り、単数の用語は、複数を含むべきであり、複数の用語は、単数を含むべきである。一般に、本明細書に記載されている細胞および組織培養、分子生物学、免疫学、微生物学、遺伝学およびタンパク質および核酸化学およびハイブリダイゼーションとの関連で使用される命名法、ならびにこれらの技術は、当技術分野で周知であり、一般に使用されるものである。公知の方法および技術は、他に示さない限り、当技術分野で周知の通常の方法によって、および本明細書を通して考察される様々な一般のおよびより特定の参考文献において記載されているように一般に行われる。酵素反応および精製技術は、当技術分野で一般に達成されるように、または本明細書に記載のように、製造元の仕様によって行われる。本明細書に記載されている実験室の手順および技術に関連して使用される命名法は当技術分野で周知のものであり、一般に使用される。
【００５６】
下記の用語は、他に示さない限り、下記の意味を有すると理解すべきである：
【００５７】
本明細書において使用する場合、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、他に特に留意しない限り、１つまたは複数を指すことができる。
【００５８】
「または」という用語の使用は、代替物のみを言及することが明確に示されない限り、または代替物が相互排他的でない限り、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみおよび「および／または」を指す定義を支持する。本明細書において使用する場合、「別の」は、少なくとも第２またはそれ超を意味することができる。
【００５９】
本出願を通して、「約」という用語は、その値が、値を決定するために用いられているデバイス、方法についての固有の誤差の変動、または試料の間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００６０】
「固体支持体」または「支持体」という用語は、その上に生体分子が結合し得る基材および／または表面を提供する構造物を意味する。例えば、固体支持体は、アッセイウェル（すなわち、例えば、マイクロタイタープレートまたはマルチウェルプレート）であり得、または固体支持体は、フィルター、アレイ、または移動性の支持体（例えば、ビーズ）または膜（例えば、フィルタープレートまたはラテラルフローストリップ）上の位置であり得る。
【００６１】
用語「インジケーター」または「インジケーター部分」または「検出可能な部分」または「検出可能な生体分子」または「レポーター」または「標識」とは、定性的または定量的なアッセイにおいて測定され得るシグナルを提供する分子に言及する。例えば、インジケーター部分は、基質を、測定され得る生成物に変換するために使用され得る酵素を含み得る。インジケーター部分は、生物発光の放射を生じる反応を触媒する酵素（例えば、ルシフェラーゼ、ＨＲＰまたはＡＰ）であり得る。あるいは、インジケーター部分は、定量され得る放射性同位体であり得る。あるいは、インジケーター部分は、発蛍光団であり得る。あるいは、他の検出可能な分子が使用され得る。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「バクテリオファージ」もしくは「ファージ」とは、複数の細菌のウイルスのうちの１種またはそれより多くを含む。本開示において、用語「バクテリオファージ」および「ファージ」は、生きている細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物、酵母、および他の顕微鏡レベルの生存している生物に侵入し得るウイルスであって、そして上記生物を使用して、該ウイルス自体を複製するウイルスを指す、マイコバクテリオファージ（例えば、ＴＢおよびパラＴＢに関する）、マイコファージ（ｍｙｃｏｐｈａｇｅ）（例えば、真菌に関する）、マイコプラズマファージ、および任意の他の用語などのウイルスを含む。ここで、「顕微鏡レベルの」とは、最大寸法が１ミリメートルまたはそれ未満であることを意味する。バクテリオファージは、それらを複製する手段として、天然において細菌を使用するように進化したウイルスである。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「培養物富化」、「富化のために培養する」、「富化のために培養した」、または「富化のための培養」とは、旧来からの培養（例えば、微生物繁殖に都合のよい培地中でのインキュベーション）をいい、語句「富化」の他の考えられる使用（例えば、サンプルの液体構成要素を取り出して、その中に含まれる上記微生物を濃縮することによる富化）、または微生物繁殖の旧来の促進を含まない富化の他の形態と混同されるべきではない。短い期間にわたる富化のための培養は、本明細書で記載される方法のいくつかの実施形態において使用され得るが、必須ではなく、かつそれが少しでも使用されるならば、富化のための旧来からの培養より遙かに短い期間にわたる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「組換え（recombinant）」とは他の方法では見いだされ
ない遺伝的物質を一緒にするために、通常は実験室で行われる場合、遺伝的な（すなわち、核酸）改変をいう。この用語は、本明細書において用語「改変された」と交換可能に使用される。
【００６５】
本明細書において使用する場合、「ＲＬＵ」は、ルミノメーター（例えば、ＧＬＯＭＡＸ（登録商標）９６）または光を検出する類似の機器によって測定される、相対発光量を指す。例えば、ルシフェラーゼと適当な基質（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）とＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標））の間の反応物の検出が、検出されるＲＬＵでしばしば報告される。
【００６６】
概観
本発明は、サンプル中の特異的微生物の存在を検出および／または定量するために、高親和性で特定の微生物に結合し得る細胞結合構成要素（ＣＢＣ）の高特異性を利用する。
【００６７】
富化のための培養もなしに、もしくはいくつかの実施形態では最小限のインキュベーション時間（その間に、微生物が潜在的に増殖し得る）を伴って行われるアッセイを使用して、試験サンプル（例えば、食品サンプル、水サンプル、酪農製品サンプル、環境サンプル、商業サンプル、臨床サンプル、または他の生物学的サンプル）中の目的の微生物の検出の驚くべき感度および速度を示す組成物、方法、キット、およびシステムが、本明細書で開示される。本明細書で開示される実施形態は、少なくとも細胞結合構成要素（ＣＢＣ）およびインジケーター部分を含む微生物検出プローブ（ＭＤＰ）を含む。これらの組成物、方法、キット、およびシステムは、微生物の検出が、以前に可能と考えられた時間枠より短い時間枠で達成されることを可能にする。
【００６８】
本発明の組成物、方法、キット、およびシステムの実施形態は、食品サンプル、水サンプル、酪農製品サンプル、環境サンプル、商業サンプル、臨床サンプル、または他の生物学的サンプルからの病原体の検出があげられるが、これらに限定されない種々の環境における種々の微生物（例えば、細菌、真菌、酵母）の検出に適用され得る。本明細書で開示されるＭＤＰベースの検出実施形態は、任意の細菌または他の目的の微生物（例えば、病原性微生物）に適合され得、これは、ＣＢＣが利用可能であり、他の微生物と交差反応しない。本発明の方法は、高検出感度および特異性を迅速に提供し、旧来の生物学的富化（例えば、培養）の必要性がない。従って、種々の微生物は、本発明の方法を使用して検出され得る。
【００６９】
本発明の方法およびシステムの実施形態は、食品サンプル、水サンプル、酪農製品サンプル、環境サンプル、商業サンプル、臨床サンプル、または他の生物学的サンプルからの病原体の検出があげられるが、これらに限定されない種々の環境における種々の微生物（例えば、細菌、真菌、酵母）の検出および定量に適用され得る。本発明の方法は、高検出感度および特異性を迅速に提供し得、旧来の生物学的富化（例えば、培養）の必要性がなく、これは、所望の感度および特異性を有する全ての利用可能な方法が培養を要することから、驚くべき局面である。
【００７０】
試験サンプル（例えば、食品サンプル、水サンプル、酪農製品サンプル、環境サンプル、商業サンプル、臨床サンプル、または他の生物学的サンプル）中の微生物を検出するために、装置を使用するシステムおよび方法がまた、本明細書で開示される。その方法は、固体支持体を含み、サンプルを収集するために使用され得る自給式装置を使用する。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、上記サンプル中の目的の微生物に高親和性で結合する細胞結合構成要素で被覆される。これは、上記より多くの細菌が上記固体支持体に結合することを可能にし、アッセイ感度および特異性を増大させる。上記装置は、バクテリオファージゲノムに挿入された遺伝子構築物を有するバクテリオファージを含む第１の区画をさらに含み、ここで上記構築物は、プロモーターおよびインジケーター遺伝子を含む。上記方法は、その第１の区画からの組換えバクテリオファージとサンプルとを、上記組換えバクテリオファージが、上記サンプル中の１個またはこれより多くの微生物に感染するように接触させ、それによって、インジケーター遺伝子生成物（「インジケーター」）を生成する工程、および上記インジケーターを検出する工程を包含する。いくつかの局面において、上記装置は、第２の区画をさらに含み、上記区画は、上記インジケーターを検出するために特異的な基質を含む。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記バクテリオファージが感染しているサンプルと、上記基質とを接触させ、それによって、上記インジケーターを検出する工程をさらに包含する。これらの実施形態において、各区画は、スナップアクションシールによって直ぐに隣り合う区画から分離される。上記スナップアクションシールは、破損の際に、上記区画の内容物が上記区画から出て、上記サンプルからの内容物または他の区画からのまたは内容物と混合することを可能にする。例えば、ユーザーは、上記スナップアクションシールを破損し得、その結果、上記第１の区画からの組換えバクテリオファージは、上記固体支持体上のサンプルと接触し、それによって、上記支持体に結合した微生物に感染する。上記微生物に感染すると、上記インジケーター遺伝子は、インジケータータンパク質を生成するように発現され、上記インジケータータンパク質は、種々の検出デバイスによって検出され得る。上記シグナルの存在は、上記サンプル中の微生物の存在を示す。
【００７１】
本発明の装置、組成物、方法、キット、およびシステムの実施形態は、食品サンプル、水サンプル、酪農製品サンプル、環境サンプル、商業サンプル、臨床サンプル、または他の生物学的サンプルからの病原体の検出があげられるが、これらに限定されない種々の環境における種々の微生物（例えば、細菌、真菌、酵母）の検出に適用され得る。本明細書で開示される検出実施形態は、任意の細菌または他の目的の微生物（例えば、病原性微生物）に適合され得、これは、ＣＢＣが利用可能であり、他の微生物と交差反応しない。本発明の方法は、高検出感度および特異性を迅速に提供し、旧来の生物学的富化（例えば、培養）の必要性がない。これは、所望の感度および特異性を有する全ての利用可能な方法が培養を要することから、驚くべき局面である。上記自給式装置（これは、検出時まで別個の区画において上記微生物を検出するために必要とされる試薬を収容する）を使用するサンプル中の微生物の検出は、便利で効率的である。上記装置は使用しやすく、広範な訓練を要しない。
【００７２】
サンプル
本発明の組成物、方法、キット、およびシステムの実施形態の各々は、サンプル中の微生物の迅速な検出および／または定量を可能にする。例えば、本発明による方法は、優れた結果を伴って短期間で行われ得る。
【００７３】
ある種の実施形態において、細胞結合構成要素（ＣＢＣ）は、目的の微生物を検出するために使用される。本発明の組成物、方法、キット、およびシステムによって検出され得る微生物は、商業的、医学的、または獣医学的懸念のある病原体を含む。このような病原体としては、グラム陰性細菌、グラム陽性細菌、マイコプラズマ、真菌、原生動物、および酵母が挙げられる。特定の微生物に特異的な細胞結合構成要素（ＣＢＣ）が同定されている任意の微生物は、本発明の方法によって検出され得る。当業者は、必要な特異的細胞結合構成要素／微生物対の利用可能性以外に、本発明の方法の適用に限定がないことを認識する。
【００７４】
本発明によって検出可能な細菌細胞としては、食品由来または水由来の病原体である細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によって検出可能な細菌細胞としては、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａの全ての種、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７（およびＥ．ｃｏｌｉの他の志賀毒素およびエンテロトキシン生成株）が挙げられるが、これらに限定されないＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉの全ての種、Ｌｉｓｔｅｒｉａの全ての種（Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが挙げられるが、これに限定されない）、およびＣａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒの全ての種が挙げられるが、これらに限定されない。本発明によって検出可能な細菌細胞としては、医学的または獣医学的に重要な病原体である細菌細胞が挙げられるが、これらに限定されない。このような病原体としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．、Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ  ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ、Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ｓｐｐ．、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ、Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ  ｓｏｎｎｅｉ、Ｙｅｒｓｉｎｉａ  ｓｐｐ．、Ｖｉｂｒｉｏ  ｓｐｐ．  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ、およびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ。
【００７５】
上記サンプルは、環境サンプルもしくは食品サンプルもしくは水サンプルであり得る。いくつかの実施形態は、医学的サンプルもしくは獣医学的サンプルを含み得る。サンプルは、液体、固体、もしくは半固体であり得る。サンプルは、固体表面のスワブであり得る。サンプルとしては、環境物質（例えば、水サンプル）、またはサイクロンコレクターからの空気サンプルもしくはエアロゾルサンプルに由来するフィルターが挙げられ得る。サンプルとしては、牛肉、家禽、加工食品、ミルク、チーズ、または他の酪農製品のサンプルであり得る。医学的または獣医学的サンプルとしては、血液サンプル、喀痰サンプル、脳脊髄液サンプル、および糞便サンプルが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、サンプルは、種々のタイプのスワブであり得る。
【００７６】
いくつかの実施形態において、サンプルは、調製も、濃縮も、希釈もなしに、本発明の検出法において直接使用され得る。例えば、液体サンプル（ミルクおよびジュースが挙げられるが、これらに限定されない）は、直接アッセイされ得る。他の実施形態において、サンプルは、緩衝化溶液もしくは細菌培養培地が挙げられ得るが、これらに限定されない溶液中で希釈もしくは懸濁され得る。固体もしくは半固体であるサンプルは、液体中の固体を細かく刻むか、混合するかもしくは浸軟することによって、液体中に懸濁され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、上記宿主細菌細胞へのＭＤＰ付着を促進するｐＨ範囲内に維持されるべきである。いくつかの実施形態において、好ましいｐＨ範囲は、細菌細胞に付着したバクテリオファージに適切なものであり得る。サンプルはまた、２価カチオンおよび１価カチオン（Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、およびＫ＋が挙げられるが、これらに限定されない）の適切な濃度を含むべきである。
【００７７】
いくつかの実施形態において、上記サンプルは、上記サンプルに存在する任意の病原体細胞の生存性を維持する温度で維持される。バクテリオファージが細菌細胞に付着している工程の間に、上記サンプルは、バクテリオファージ活性を促進する温度で維持され得る。このような温度は、少なくとも約２５℃であり、約４５℃以下である。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、約３７℃で維持される。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、ＭＤＰが結合または付着する間に、穏やかな混合または振盪に供される。
【００７８】
微生物を検出するために組換えＭＤＰを使用する方法
アッセイは、種々の適切な非接種コントロールサンプルを含み得る。例えば、ＭＤＰを含まないコントロールサンプルは、および／または細菌なしのＭＤＰを含むコントロールサンプルは、バックグラウンドシグナルレベルに関するコントロールとしてアッセイされ得る。
【００７９】
本明細書で注記されるように、ある種の実施形態において、本発明は、微生物を検出するために、修飾またはシグナル付加した微生物検出プローブ（ＭＤＰ）を使用する方法を包含し得る。本発明の方法は、種々の方法で具現化され得る。
【００８０】
いくつかの局面において、本発明は、目的の微生物を検出するための方法を包含する。上記方法は、上記目的の微生物を検出するために、組換えＭＤＰまたは結合体化ＭＤＰを使用し得る。例えば、ある種の実施形態において、上記目的の微生物は細菌であり、上記細胞結合構成要素（ＣＢＣ）は、上記目的の細菌を特異的に認識するバクテリオファージに由来する。ある種の実施形態において、上記方法は、サンプルを、目的の細菌に結合し得る複数の組換えＭＤＰとともにインキュベートすることによって、サンプル中の目的の細菌の検出を包含し得る。１個の微生物に結合される複数のＭＤＰは、１より大きい任意の数であるが、好ましくは少なくとも５×１０４、または少なくとも１×１０５、または少なくとも１×１０６、または少なくとも１×１０８、または少なくとも１×１０９、または少なくとも１×１０１０  ＭＤＰである。
【００８１】
ある種の実施形態において、上記組換えＭＤＰは、インジケーター部分を含む。上記方法は、上記ＭＤＰのインジケーター部分を検出する工程を包含し得、ここで上記インジケーター部分の陽性検出は、上記目的の細菌が前記サンプル中に存在することを示す。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中のわずか１個の目的の微生物を検出する方法を包含し得、上記方法は、上記サンプルを、上記目的の微生物に結合する複数のＭＤＰ（ここで上記ＭＤＰは、インジケーター部分およびＣＢＣを含む）とともに、上記微生物が上記複数のＭＤＰに結合するような条件下でインキュベートする工程；結合していないＭＤＰを細胞に結合したＭＤＰから分離する工程；ならびに上記インジケーター部分を上記細胞に結合したＭＤＰ上で検出する工程であって、ここで上記インジケーター部分の陽性検出は、上記目的の微生物が上記サンプル中に存在することを示す工程を包含する。上記サンプルとともにインキュベートするＭＤＰの量は、１ｎｇ、または１０ｎｇ、または１００ｎｇ、または２５０ｎｇ、または５００ｎｇ、または１０００ｎｇであり得る。上記サンプルとともにインキュベートするＭＤＰの量は、少なくとも５×１０８、または少なくとも５×１０９、または少なくとも５×１０１０、または少なくとも５×１０１１、または少なくとも５×１０１２、または少なくとも５×１０１３であり得る。
【００８３】
いくつかの実施形態において、上記検出工程は、インジケーター酵素が作用する基質の添加を要する。他の実施形態において、上記検出工程は、酵素および上記インジケーター補因子が作用する基質の添加を要する。特定のインジケーターの選択は、本発明にとって重要ではなく、上記インジケーターは、それ自体が検出可能なシグナルを生成し得るか、または機器が検出可能であり得るか、１もしくはこれより多くのさらなるシグナル生成構成要素（例えば、酵素／基質シグナル生成システム）とともに検出可能であり得るかのいずれかである。
【００８４】
いくつかの実施形態において、複数のＭＤＰは１個の細菌に結合する。１個の微生物に結合した複数のＭＤＰは、１より大きい任意の数であるが、好ましくは少なくとも５×１０４、または少なくとも１×１０５、または少なくとも１×１０６、または少なくとも１×１０８、または少なくとも１×１０９、または少なくとも１×１０１０  ＭＤＰである。
【００８５】
ある種の実施形態において、上記アッセイは、ＭＤＰを利用して、特異的微生物の存在を同定するために行われ得る。上記アッセイは、種々のサンプルタイプまたはサイズ、およびアッセイフォーマットに合わせるために改変され得る。本発明の組換えＭＤＰを使用する実施形態は、サンプルタイプまたはサンプルサイズ、およびアッセイフォーマットに応じて、１．５時間、２．０時間、２．５時間、３．０時間、３．５時間、４．０時間、４．５時間、５．０時間、５．５時間、６．０時間、６．５時間、７．０時間、７．５時間、８．０時間、８．５時間、９．０時間、９．５時間、１０．０時間、１０．５時間、１１．０時間、１１．５時間、または１２時間未満の全アッセイ時間で、特定の細菌株の迅速検出を可能にし得る。例えば、必要とされる時間量は、上記ＭＤＰの親和性ならびに／または上記アッセイにおいて検出される細菌のタイプ、試験されるサンプルのタイプおよびサイズ、物理的／化学的環境の複雑性、ならびに内因性の非標的混在細菌の濃度に応じて、若干より短いかまたは長くてもよい。
【００８６】
図１は、本発明の実施形態によるＭＤＰ１１２を使用して目的の細菌を検出するためのアッセイの実施形態を図示する。ＭＤＰは、インジケーター部分１２０（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標））およびＣＢＣ１２１を含む。既知の量の細菌１１１を含む試験サンプルアリコートを、マルチウェルプレート１０４の個々のウェル１０２に分配する。ＭＤＰ１１２のアリコートを個々のウェル１０２に添加し、一定期間（例えば、３７℃で５〜６０分間）インキュベートする２０２。この実施形態において個々のウェルに添加したＭＤＰ１１２のアリコートは、少なくとも１×１０９  ＭＤＰである。複数のＭＤＰは、１個の細菌１１６に結合する。この実施形態において１個の目的の細菌に結合した上記複数のＭＤＰは、少なくとも１×１０６である。固体表面上の上記細菌の捕捉および上記捕捉した細菌２０３の洗浄は、過剰な結合していないＭＤＰ１１３の除去を可能にする。上記標的細菌に結合したＭＤＰを含むプレートウェルを、上記プレート１０４上のＭＤＰインジケーター活性を測定するためにアッセイし得る２０４（例えば、ルシフェラーゼアッセイ）。この方法を利用する実験を、本明細書に記載する。いくつかの実施形態において、上記試験サンプルは濃縮されない（例えば、遠心分離によって）が、ＭＤＰとともに一定期間にわたって直接インキュベートされ、インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ活性）に関してその後アッセイされ得る。他の実施形態において、種々のツール（例えば、遠心分離またはフィルター）を使用して、上記サンプルを濃縮してもよいし、富化する前にまたは試験する前に、サンプル中の微生物を捕捉してもよい。例えば、調製したサンプルの１０ｍＬ  アリコートを抽出し得、遠心分離して、細胞および大きなデブリをペレット化し得る。上記ペレットを、試験のために、より小さな容積で再懸濁し得る。いくつかの実施形態において、微生物細胞の再懸濁したペレットを、試験する前に富化してもよい。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本発明は、試験サンプルを、組換えまたは結合体化ＭＤＰとともにインキュベートする工程を包含する、目的の細菌を検出するための方法を包含する。いくつかの実施形態において、上記試験サンプルを、非常の高濃度のＭＤＰまたは過剰なＭＤＰとともにインキュベートする。驚くべきことに、高濃度のＭＤＰは、目的の微生物に結合するために適している。
【００８８】
本発明の方法は、感度を増大させるために種々の他の工程を包含し得る。例えば、本明細書でより詳細に考察されるように、上記方法は、捕捉するための工程、およびその捕捉しかつ結合した細菌を洗浄して、過剰なＭＤＰを除去し、シグナル対ノイズ比を増大させる工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記インジケーター部分の陽性検出は、上記インジケーター部分を検出することによって生成されるシグナル対バックグラウンドの比は、少なくとも２．０または少なくとも２．５であることを要する。
【００８９】
サンプルを試験するための方法のいくつかの実施形態において、大過剰なＭＤＰの使用は、上記サンプル中の任意のＭＤＰ結合した細菌または他のより大きな実体を、上記過剰な結合していないＭＤＰから分離することを要する。これは、当業者によって概して公知の多くの異なる方法において達成され得る。微生物細胞は、遠心分離、サイズによる濾過、または選択的固定化を通じて分離され得る。いくつかの実施形態において、サイズによる濾過は、フィルターウェルを通じて達成される。他の実施形態において、選択的固定化のために磁性分離が使用され得る。例えば、上記サンプルを、上記ＭＤＰとともにインキュベートする前または後のいずれかに、０．４５μｍまたは０．２２μｍ膜を通じて濾過して、標的微生物（例えば、細菌）を固体支持体上に捕捉し得る。次いで、上記捕捉された微生物を、上記固体支持体上で１回またはこれより多く洗浄して、特異的に結合したＭＤＰのみが残ることを確実にし得る。あるいは、特異的または非特異的結合の機構は、上記微生物をマイクロビーズまたは別の固体表面に捕捉するために使用され得る。標的微生物を修飾またはシグナル付加するための他のフォーマットおよび過剰な結合していないＭＤＰを除去するために洗浄するための方法は、可能である。
【００９０】
種々の固体支持体が使用され得る。ある種の実施形態において、上記固体支持体は、マルチウェルプレート、フィルター、ビーズ、ラテラルフローストリップ、フィルターストリップ、フィルターディスク、フィルターペーパー、または細胞を培養するためにデザインされた薄いフィルム（例えば、３ＭによるＰｅｔｒｉＦｉｌｍ）を含み得る。他の固体支持体がまた、適切であり得る。例えば、いくつかの実施形態において、上記試験サンプル微生物は、プレートの表面に結合することによって、または上記サンプルを細菌学的フィルター（例えば、０．４５μｍ孔サイズスピンフィルターまたはプレートフィルター）を通して濾過することによって捕捉され得る。一実施形態において、上記フィルターまたはプレート表面上で捕捉された微生物は、その後、過剰な結合していないＭＤＰを除去するために、１回またはこれより多く洗浄される。
【００９１】
あるいは、いくつかの実施形態において、上記捕捉する工程は、上記目的の微生物の他の特長（例えば、サイズ）に基づき得る。サイズベースの捕捉を利用する実施形態において、上記固体支持体は、スピンカラムフィルターであり得る。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、９６ウェルフィルタープレートを含む。あるいは、上記捕捉するための固体支持体は、アレイ、または可動式支持体（例えば、ビーズ）上の位置であり得る。
【００９２】
いくつかの実施形態において、上記サンプルは、成長を促進する条件においてインキュベートすることによって、試験前に富化され得る。このような実施形態において、上記富化期間は、上記サンプルタイプおよびサイズに応じて、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、または８時間まで、またはこれより長時間であり得る。
【００９３】
他の実施形態において、上記サンプルは、固体支持体上の細菌の捕捉後に富化され得る。このような実施形態において、上記富化期間は、上記サンプルタイプおよびサイズに応じて、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、または８時間まで、またはこれより長時間であり得る。
【００９４】
従って、いくつかの実施形態において、上記ＭＤＰは、検出可能なインジケーター部分を含み、１個の病原性細胞（例えば、細菌）への結合は、上記インジケーター部分を介して生成された、増幅されたシグナルによって検出され得る。従って、上記方法は、上記ＭＤＰのインジケーター部分を検出する工程を包含し得、ここで上記インジケーターの検出は、上記目的の細菌が前記サンプル中に存在することを示す。
【００９５】
本発明の方法のうちのいくつかの実施形態において、上記微生物は、サンプルからの上記微生物のいかなる単離も精製もなしに検出され得る。例えば、ある種の実施形態において、１個またはこれより多くの目的の微生物を含むサンプルは、アッセイ容器（例えば、スピンカラム、マイクロタイターウェル、またはフィルター）に直接適用され得、上記アッセイはそのアッセイ容器中で行われる。すなわち、微生物は、上記微生物が通過することを可能にするには小さい孔サイズを有する膜上に捕捉される。このようなアッセイの種々の実施形態は、本明細書に開示される。
【００９６】
試験サンプルアリコートは、マルチウェルプレートのウェルへと直接分配され得、ＭＤＰが添加され得、そして結合のための十分な期間の後、上記細胞は、固体表面（例えば、プレート、ビーズ、またはフィルター基材）上に捕捉され得、その結果、過剰な結合していないＭＤＰは、１回またはこれより多くのその後の洗浄工程において除去され得る。次いで、インジケーター部分のための基質（例えば、ルシフェラーゼインジケーターのためのルシフェラーゼ基質）が添加され、インジケーターシグナルの検出のためにアッセイされる。上記方法のうちのいくつかの実施形態は、フィルタープレート上で行われ得る。上記方法のうちのいくつかの実施形態は、ＭＤＰと結合する前に、上記サンプルの濃縮ありまたは濃縮なしで行われ得る。
【００９７】
例えば、多くの実施形態において、マルチウェルプレートは、上記アッセイを行うために使用される。プレート（もしくは検出する工程が行われ得る任意の他の容器）の選択は、上記検出する工程に影響を及ぼし得る。例えば、いくつかのプレートは、光の放射の検出に影響を及ぼし得る、着色したもしくは白色のバックグラウンドを含み得る。一般に、概して、白色のプレートは、より高い感度を有するが、より高いバックグラウンドシグナルをも生じる。他の色のプレートは、より低いバックグラウンドシグナルを生成し得るが、わずかにより低い感度を有し得る。さらに、バックグラウンドシグナルは、１つのウェルから別の隣接するウェルへの光の漏れから生じ得る。いくつかのプレートは、白色のウェルを有する一方で、上記プレートの残りは黒色であり、従って、ウェルからウェルへの光の漏れを防止すると同時に、上記ウェル内部の高いシグナルを可能にする。白色ウェルと黒色プレートとのこの組み合わせは、バックグラウンドシグナルを減少させ得る。従って、プレートまたは他のアッセイ容器の選択は、上記アッセイに関する感度およびバックグラウンドシグナルに影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態において、上記目的の微生物の検出は、上記サンプルを培養する必要性なく完了し得る。例えば、ある種の実施形態において、検出するために必要とされる総時間は、１２．０時間未満、１１．０時間未満、１０．０時間未満、９．０時間未満、８．０時間未満、７．０時間未満、６．０時間未満、５．０時間未満、４．０時間未満、３．０時間未満、２．５時間未満、２．０時間未満、１．５時間未満、１．０時間未満、４５分間未満、または３０分間未満である。結果までの時間を最小化することは、病原体に関する食品試験および環境試験において重要である。
【００９８】
当該分野で公知のアッセイとは対照的に、本発明の方法は、個々の微生物を検出し得る。従って、ある種の実施形態において、上記方法は、サンプルに存在する上記微生物の≦１０個の細胞（すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個の微生物）または≦２０個の細胞、または≦３０個の細胞、または≦４０個の細胞、または≦５０個の細胞、または≦６０個の細胞、または≦７０個の細胞、または≦８０個の細胞、または≦９０個の細胞、または≦１００個の細胞、または≦２００個の細胞、または≦５００個の細胞、または≦１０００個の細胞を検出し得る。例えば、ある種の実施形態において、上記ＭＤＰは、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉに対して非常に特異的である。一実施形態において、上記ＭＤＰは、１００個より多くの他のタイプの細菌の存在下で、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉを区別し得る。一実施形態において、上記ＭＤＰは、１００個より多くの他のタイプの細菌の存在下で、細菌の種内の特定の血清型（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７）を区別し得る。ある種の実施形態において、上記ＭＤＰは、上記サンプル中の特定のタイプの１個の細菌を検出するために使用され得る。ある種の実施形態において、上記組換えＭＤＰは、サンプル中の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個程度の少なさの特定の細菌を検出する。
【００９９】
従って、本発明の局面は、インジケーター部分を介して試験サンプル中の微生物の検出のための方法を提供する。いくつかの実施形態において、上記目的の微生物が細菌である場合、上記インジケーター部分は、ＭＤＰと関連づけられ得る。上記インジケーター部分は、基質と反応して、検出可能なシグナルを放射してもよいし、内因性のシグナル（例えば、蛍光タンパク質）を放射してもよい。蛍光タンパク質は、電子を含む蛍光部分が光子を吸収する場合に、光子としてエネルギーを放射することによって天然に蛍光を発する（内因性の蛍光または自家蛍光）。蛍光タンパク質（例えば、ＧＦＰ）は、融合タンパク質として発現され得る。いくつかの実施形態において、上記検出感度は、試験サンプル中の上記目的の微生物の１００個、５０個、２０個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、もしくは２個程度の少なさの細胞の存在を明らかにし得る。いくつかの実施形態において、上記目的の微生物の実に１個の細胞が、検出可能なシグナルを生じ得る。
【０１００】
特定のインジケーター部分の選択は、本発明にとって重要ではなく、上記インジケーター部分は、それ自体が検出可能なシグナルを生成し得るか、または機器が検出可能であり得るか、１もしくはこれより多くのさらなるシグナル生成構成要素（例えば、酵素／基質シグナル生成システム）とともに検出可能であり得るかのいずれかである。多くのＭＤＰは、上記インジケーター部分および／または上記ＭＤＰの特異的ＣＢＣのいずれかを変動させることによって形成され得る；上記選択が、検出される微生物および所望の検出手段の懸念事項を含むことは、当業者によって認識される。
【０１０１】
例えば、１またはこれより多くのシグナル生成構成要素は、検出可能なシグナルを生成するために、インジケーター部分と反応され得る。いくつかの実施形態において、上記インジケーターは、生物発光化合物であり得る。上記インジケーター部分が酵素である場合、上記検出可能なシグナルの増幅は、検出可能な反応生成物を生じるために、上記酵素と１種もしくはこれより多くの基質、またはさらなる酵素および基質とを反応させることによって得られる。代替のシグナル生成システムにおいて、上記インジケーターは、上記検出可能なシグナルを生成するために上記インジケーターの酵素操作が要求されない蛍光化合物であり得る。例えば、フルオレセインおよびローダミンならびにそれらの誘導体およびアナログが挙げられる蛍光分子は、このようなシステムにおけるインジケーターとしての使用に適している。さらに別の代替の実施形態において、上記インジケーター部分は、補因子であり得、上記検出可能なシグナルの増幅は、上記補因子と上記酵素および１もしくはこれより多くの基質またはさらなる酵素および基質とを反応させて、検出可能な反応生成物を生じることによって得られる。いくつかの実施形態において、上記検出可能なシグナルは、発色性である。
【０１０２】
上記検出可能なインジケーター部分は、ＭＤＰの重要な特徴であり、それは、直接的にまたは間接的に検出され得る。上記インジケーター部分は、検出可能なシグナルであって、それによって、上記結合反応がモニターされ、定性的および／または定量的な測定を提供するものを提供する。上記修飾されたまたはシグナル付加された微生物によって生成されるシグナルの相対的量および位置は、上記微生物の存在および／または量を示すように働き得る。上記インジケーター部分はまた、フローソーティングによって、または磁性分離媒体を使用して、修飾されたかまたはシグナル付加された微生物を選択および単離するために使用され得る。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、上記ＭＤＰのインジケーター部分は、直接的にまたは基質のインキュベーション後に検出可能であり得る。インジケーター部分としての使用に適切な、多くの異なるタイプの検出可能な生体分子が当該分野で公知であり、多くは、市販されている。いくつかの実施形態において、上記ＭＤＰは、上記インジケーター部分として働く酵素を含む。いくつかの実施形態において、上記ＭＤＰは、検出可能な酵素をコードする。上記インジケーター部分は、光を放射し得るおよび／または色の変化によって検出可能であり得る。種々の適切な酵素は市販されている（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ））。いくつかの実施形態において、これらの酵素は、上記インジケーター部分として働き得る。いくつかの実施形態において、ホタルルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、上記インジケーター部分である。他の工学技術で作製されたルシフェラーゼもしくは検出可能なシグナルを生成する他の酵素はまた、適切なインジケーター部分であり得る。
【０１０４】
従って、いくつかの実施形態において、上記方法、システムまたはキットの組換えＭＤＰは、野生型バクテリオファージの一部と、インジケータータンパク質（例えば、蛍光タンパク質またはルシフェラーゼタンパク質）の配列との融合物から調製される融合タンパク質である。
【０１０５】
バクテリオファージは、特定の細菌に感染し、これを溶解し得る。バクテリオファージゲノムは、３種のタンパク質をコードする；ホリン（ｈｏｌｉｎ）、エンドリシン、およびスパニン。これらは一緒に、ファージ溶解サイクルの間の子孫放出を担う。図２に示されるように、エンドリシン（ペプチドグリカンヒドロラーゼまたはムレインヒドロラーゼともいわれる）は、バクテリオファージが感染する細菌の特定のタイプの細胞壁に結合し、溶解する。ホリン分子は、細胞膜を破壊し、エンドリシンが細胞壁におけるペプチドグリカンにアクセスすることを可能にする。グラム陽性細菌では、エンドリシンは、上記細胞のペプチドグリカンに接触し得る；しかし、グラム陰性細菌の外膜は、エンドリシンと上記細胞壁との間の結合を防止する。概して、グラム陰性細菌に特異的なファージによって生成されるエンドリシンは、溶解を担う１個の触媒ドメインのみを有する。対照的に、グラム陽性細菌に特異的なファージによって生成されるエンドリシンは、２個のドメインを有する：溶解に関する酵素活性ドメイン（ＥＡＤ）、ならびに宿主認識および高親和性結合に関する細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）。より具体的には、上記エンドリシンのＣＢＤは、上記バクテリオファージが上記細菌を高特異性で認識することを可能にする（溶解機能は必要とされない）。いくつかの実施形態において、野生型バクテリオファージの一部は、エンドリシン配列、具体的には細胞結合ドメイン、またはその短縮型部分である。代表的には、上記ＣＢＤは、Ｃ末端に位置するが、Ｎ末端に、または場合によっては中心ドメインとして見出され得る。
【０１０６】
感染性因子の他のタイプは、特異性のために、細胞結合タンパク質を同様に使用する。いくつかの場合には、細胞結合を担う核酸配列は、グラム陰性細菌に特異的なバクテリオファージによってコードされるエンドリシンの１個の球状ＥＡＤ内で見出されている。第３のタイプのタンパク質であるスパニンは、グラム陰性宿主における外膜の破壊を担う。ＲＺ１は、スパニン複合体の外膜リポタンパク質である。溶解サイクルの間に、上記スパニン複合体は、上記エンドリシンによる細胞壁の破壊後に、外膜を破壊する。いくつかの実施形態において、上記細胞結合構成要素は、エンドリシンまたはスパニンのうちの少なくとも一方に由来する結合機能性を有する、保存されたアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
場合によっては、ファージは、レセプター結合タンパク質（ＲＢＰ）を通じて特定の細菌に結合する。ＲＢＰと細菌の細胞表面との間の相互作用は、ＲＢＰ特異性を決定する。いくらかのファージでは、ＲＢＰは、テールシャフト、尾部繊維、またはテールスパイクに位置する。ファージ尾部繊維タンパク質は、細胞表面への吸着およびポリサッカリド分解の両方において役割を果たす。テールスパイクタンパク質は、多くのバクテリオファージのテールの構成要素である。テールスパイクタンパク質は、細菌宿主の細胞表面に結合し、細菌宿主認識を媒介する。
【０１０８】
本発明がグラム陰性細菌を検出するために使用され得ることは、可能である。概して、グラム陰性細菌の外膜は、エンドリシンが細胞壁と接触しないように妨げる。しかし、上記外膜は破壊され得（例えば、ＥＤＴＡ、界面活性剤など…）、その結果、ＭＤＰは、グラム陰性細菌の細胞壁に付着し結合し得る。いくつかの実施形態において、ＣＢＣは、グラム陰性細菌に特異的なバクテリオファージによってコードされるエンドリシンの酵素ドメインから単離される。いくつかの実施形態において、酵素ドメイン内のアミノ酸の保存された配列は、細胞結合を担い、従って、ＣＢＣとして使用され得る。他の実施形態において、野生型バクテリオファージの一部は、ｏ−スパニン（ＲＺ１）、テールスパイク、または尾部繊維である。他の実施形態において、上記ＣＢＣは、以下のタンパク質のうちの少なくとも１種に由来する細胞結合機能性を有する保存されたアミノ酸配列を含む：エンドリシン、ホリン、スパニン、尾部繊維、またはテールスパイク。
【０１０９】
生物の特定のタイプに結合するＣＢＣは、特定の感染性因子に由来し得、試験サンプル中のその生物の存在を同定するためにインジケーターの一部として使用され得る。従って、本発明は、微生物細胞を修飾するかまたはシグナル付加するためにＭＤＰの使用を提唱する。ＭＤＰは、組換えタンパク質または結合体化タンパク質であり得るか、そうでなければ付着したインジケーター部分を有し得る。従って、本明細書で開示される発明の実施形態は、細胞結合部分およびインジケーター部分を有する修飾分子またはシグナル付加分子を含む。
【０１１０】
上記エンドリシンの溶解機能は、必要とされない−細胞結合機能のみを必要とする。従って、いくつかの実施形態において、上記インジケーター部分は、ＣＢＤに融合され、内因性のシグナル（例えば、蛍光タンパク質または生体発光タンパク質）を放射するタンパク質を含む。上記インジケーターは光を放射し得るおよび／または色の変化によって検出可能であり得る。例えば、蛍光タンパク質は、基質を必要とするのではなく、適切な装置（例えば、蛍光顕微鏡または蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ））で直接検出可能である。いくつかの実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、基質と相互作用してシグナルを発生する酵素（例えば、ルシフェラーゼ）をコードする。いくつかの実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、ルシフェラーゼ遺伝子である。いくつかの実施形態において、上記ルシフェラーゼ遺伝子は、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、Ｅｘｔｅｒｎａｌ  Ｇａｕｓｓｉａルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼまたは工学技術で作製されたルシフェラーゼ、例えばＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）、Ｒｌｕｃ８．６−５３５またはオレンジナノ−ランタンのうちの１つである。
【０１１１】
上記インジケーターを検出する工程は、光の放射を検出する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、ルミノメーターは、基質とのインジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）の反応を検出するために使用され得る。ＲＬＵの検出はルミノメーターで達成することができ、または、他の機械もしくはデバイスもまた、使用され得る。例えば、分光光度計、ＣＣＤカメラ、またはＣＭＯＳカメラが、色の変化および他の光の放射を検出し得る。検出にとって絶対ＲＬＵが重要であるが、単一細胞または少数の細胞が確実に検出されるためにはシグナル対バックグラウンド比も高い（例えば、＞２．０、＞２．５または＞３．０）ことが必要である。
【０１１２】
いくつかの実施形態において、インジケーター部分（例えば、ルシフェラーゼ）と基質との反応は、３０分またはそれより長くにわたって続き得、種々の時点での検出は、感度を最適化するために望ましいことであり得る。例えば、固体支持体として９６ウェルフィルタープレートをおよび上記インジケーターとしてルシフェラーゼを使用する実施形態において、ルミノメーター読み取りは、最初に、および反応が完了するまで３分間隔、または５分間隔、または１０分間隔、または１５分間隔で行われ得る。
【０１１３】
従って、ＭＤＰを利用するいくつかの実施形態において、本発明は、目的の微生物を検出するための方法であって、少なくとも1種のサンプル細菌を捕捉する工程；上記少なくとも1種の細菌を、複数のＭＤＰとともにインキュベートする工程；上記サンプル中の標的微生物へのＣＢＰの結合のための時間を与える工程；および上記インジケーター部分を検出する工程であって、ここで上記インジケーター部分の検出は、上記細菌が前記サンプル中に存在することを示す工程を包含する方法を含む。
【０１１４】
例えば、いくつかの実施形態において、上記試験サンプル細菌は、プレートの表面への結合によって、または細菌学的フィルター（例えば、０．４５μｍ孔サイズスピンフィルターまたはプレートフィルター）を通じてサンプルを濾過することによって、捕捉され得る。一実施形態において、上記ＭＤＰは、最小限のまたは若干の体積で、上記フィルター上に直接捕捉したサンプルに添加される。一実施形態において、上記フィルターまたはプレート表面に捕捉された微生物は、その後、過剰な結合されていないＭＤＰを除去するために1回またはこれより多く洗浄される。
【０１１５】
いくつかの実施形態において、細菌を含む試験サンプルのアリコートは、組換えＭＤＰとのインキュベーションおよび任意の過剰なＭＤＰを除去するために１回またはこれより多く洗浄した後に、スピンカラムに適用され得、検出されるインジケーターの量は、前記サンプル中に存在する標的化細菌の量に比例する。
【０１１６】
上記細菌に結合したインジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）は、次いで、測定され得、定量され得る。一実施形態において、上記溶液は、フィルターを通して遠心され、その濾液はアッセイ（例えば、ルミノメーターでの）のために新しい容器に収集され、その後、上記インジケーター酵素のための基質（例えば、ルシフェラーゼ基質）が添加される。あるいは、インジケーターシグナルは、フィルター上で直接測定され得る。
【０１１７】
一実施形態において、上記微生物は細菌であり、上記ＭＤＰは、バクテリオファージに由来するＣＢＣを含む。一実施形態において、上記インジケーター部分は、ルシフェラーゼである。従って、代替の一実施形態において、上記インジケーター基質（例えば、ルシフェラーゼ基質）は、フィルター上にあるままであるかまたはプレート表面に結合したままである上記サンプルの一部とともにインキュベートされ得る。よって、いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、９６ウェルフィルタープレート（もしくは通常の９６ウェルプレート）であり、上記基質反応は、上記プレートを上記ルミノメーターの中に直接置くことによって検出され得る。
【０１１８】
例えば、一実施形態において、本発明は、目的の病原性細菌を検出するための方法を包含し得、上記方法は、９６ウェルフィルタープレート上で捕捉された細胞を複数のＭＤＰと結合させる工程；過剰なＭＤＰを洗い流す工程；および基質を添加し、上記９６ウェルプレートにおいて直接、酵素活性を測定することによって、上記インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）を検出する工程であって、ここで酵素活性の検出は、上記目的の細菌が上記サンプル中に存在することを示す工程を包含する。
【０１１９】
別の実施形態において、本発明は、目的の微生物（例えば、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）を検出するための方法を包含し得、上記方法は、９６ウェルプレート中の液体溶液もしくは懸濁物中の細胞を、複数のＭＤＰと結合させる工程；結合していないＭＤＰを、結合したＭＤＰを有する細胞から洗い流す工程；および基質を添加し、上記９６ウェルプレートにおいて直接、酵素活性を測定することによって、上記インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）を検出する工程であって、ここで酵素活性の検出は、上記目的の細菌（例えば、Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ）が上記サンプル中に存在することを示す工程を包含する。いくつかの実施形態において、上記目的の微生物は、固体支持体上に（例えば、ビーズまたはフィルター上に）捕捉され得る。この捕捉する工程は、上記ＭＤＰとのインキュベーション間またはその後のいずれかに起こり得る。いくつかの実施形態において、捕捉する工程は、必須ではない。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、上記液体溶液または懸濁物は、消費可能な試験サンプル（例えば、野菜洗浄液）であり得る。いくつかの実施形態において、上記液体溶液または懸濁物は、濃縮されたＬＢブロス、Ｔｒｙｐｔｉｃ／Ｔｒｙｐｔｏｎｅ  Ｓｏｙブロス、ペプトン水または栄養ブロスで強化した野菜洗浄物であり得る。いくつかの実施形態において、上記液体溶液または懸濁物は、ＴＳＢブロス中で希釈した細菌であり得る。
【０１２１】
いくつかの実施形態において、標的微生物細胞は、適切な検出のために無傷である必要がある。すなわち、上記細胞は、生存している必要はないが、上記細胞壁は、構造的に無傷でなければならない。従って、上記検出工程の前に、上記細菌の溶解を最小限にすることは望ましい。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、上記サンプルの最初の濃縮工程は、有用である。すなわち、上記サンプル中の任意の微生物または他の相対的に大きな物質は、過剰な液体を除去するために濃縮される。しかし、最初の濃縮工程なしでアッセイを行うことは可能である。いくつかの実施形態は初期濃縮工程を含み、いくつかの実施形態において、この濃縮工程はより短い富化インキュベーション時間を可能にする。他の実施形態において、富化期間は不要である。
【０１２３】
試験方法のいくつかの実施形態は、確認アッセイをさらに含み得る。初期の結果を、通常は後の時点で確認するために、様々なアッセイが当該分野で公知である。例えば、上記サンプルが培養され得、（例えば、ＣＨＲＯＭＡＧＡＲ（登録商標）／ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）アッセイ）、ＰＣＲは、上記微生物ＤＮＡの存在を確認するために利用され得るか、または他の確認アッセイが、最初の結果を確認するために使用され得る。
【０１２４】
食品安全性アッセイの実施形態は、サンプル調製工程を包含する。いくつかの実施形態は、富化工程を包含し得る。例えば、サンプルタイプおよびサイズに応じて、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、または８時間の富化が必要とされ得る。これらのサンプル調製工程の後に、レポーターまたはインジケーターを含む高濃度の組換えＭＤＰとの結合は、種々のアッセイフォーマット（例えば、図１に示されるもの）で行われ得る。
【０１２５】
食品アッセイの実施形態は、サンプルタイプおよびサイズに応じて、少なくとも２０％、または少なくとも３０％、または少なくとも４０％、または少なくとも５０％、または少なくとも６０％の結果までの時間の低減を伴って、産業標準に相当するサンプルサイズにおいて１個の病原性細菌を検出し得る。
【０１２６】
従って、本発明のいくつかの実施形態は、細菌の存在を示す検出可能なシグナルを増幅するための組換えタンパク質ベースの方法を使用することによって必要性を解決する。ある種の実施形態において、わずか１個の細菌が検出される。本明細書で適用される原理は、種々の微生物の検出に適用され得る。微生物の表面上のシグナル生成ＭＤＰのための多くの結合部位が原因で、多くのＭＤＰの上記インジケーター部分は、上記微生物自体より容易に検出可能であり得る。このようにして、本発明の実施形態は、上記目的の微生物の実に１個の細胞からの非常に大きなシグナル増幅を達成し得る。
【０１２７】
本発明の局面は、サンプル中の特異的微生物を検出および／または定量する手段として、特定の微生物に結合し得る結合構成要素（例えば、感染性因子の認識および結合構成要素）の高い特異性を利用する。いくつかの実施形態において、本発明は、感染性因子（例えば、バクテリオファージ）の細胞結合ドメインの高い特異性を利用する。
【０１２８】
本明細書で開示されかつ記載される発明のいくつかの実施形態は、１個の微生物が非常に多くのＭＤＰに結合し得るという発見を利用する。この原理は、多くの小さなタンパク質による微生物表面の特異的認識に基づいて、１個または数個の細胞からのインジケーターシグナルの増幅を可能にする。例えば、実に１個の細菌細胞を複数のＭＤＰへと曝すことによって、上記インジケーターシグナルが増幅され、その結果、１個の細菌が検出可能である。
【０１２９】
微生物をＭＤＰで検出する前例のない速度および感度は、予測外の結果である。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、目的の微生物の検出のために、１２時間未満、１１時間未満、１０時間未満、９時間未満、８時間未満、７時間未満、６時間未満、５時間未満、４時間未満、３時間未満、または２時間未満しか要しない。これらは、以前に考えられていたより短い時間枠である。いくつかの実施形態において、上記方法は、１００個、５０個、２０個、１０個、９個、８個、７個、６個、５個、４個、３個、または２個程度の少なさの上記目的の細菌を検出し得る。いくつかの実施形態において、上記細菌の実に１個の細胞が検出可能である。さらなる実施形態において、本発明は、本明細書で開示される方法を行う、および／または本明細書で記載されるＭＤＰを使用するための構成要素を含むシステム（例えば、コンピューターシステム、自動化システムまたはキット）を含む。
【０１３０】
食品中の病原性細菌の検出のための既存のプロトコールは、複雑で、高価で、時間が遅く、労働集約的で、偽陽性を生じやすい。さらに、ファージベースの検出方法は、感染性試薬の追加された複雑性および関係規則を含む。所定の病原体に特異的な組換えＭＤＰでの検出は、有効で迅速、かつ単純な試験代替手段を提供する。
【０１３１】
組換えＭＤＰを調製する方法
ＭＤＰを作製するための方法のいくつかの実施形態は、上記細胞結合ドメインの配列のために野生型バクテリオファージの選択で開始する。いくつかのバクテリオファージは、標的細菌に高度に特異的である。このことは、高度に特異的な検出の機会を提供する。
【０１３２】
従って、本発明の方法は、特定の目的の微生物を認識し、結合する感染性因子と関連付けられた結合因子の高い特異性を利用する。多数のＭＤＰ分子が１個の微生物に結合する可能性は、インジケーターシグナルを増幅する手段を提供し、それによって、サンプル中に存在する低レベルの微生物（例えば、１個の微生物）の検出を可能にする。
【０１３３】
バクテリオファージは、特定の細菌に感染し、溶解し得る。バクテリオファージゲノムは、３種のタンパク質をコードする；ホリン、エンドリシン、およびスパニン。これらは一緒に、ファージ溶解サイクルの間の子孫放出を担う。図２に示されるように、エンドリシン（ペプチドグリカンヒドロラーゼまたはムレインヒドロラーゼともいわれる）は、バクテリオファージが感染する細菌の特定のタイプの細胞壁に結合し、溶解する。ホリン分子は、細胞膜を破壊し、エンドリシンが細胞壁におけるペプチドグリカンにアクセスすることを可能にする。グラム陽性細菌では、エンドリシンは、上記細胞のペプチドグリカンに接触し得る；しかし、グラム陰性細菌の外膜は、エンドリシンと上記細胞壁との間の結合を防止する。概して、グラム陰性細菌に特異的なファージによって生成されるエンドリシンは、溶解を担う１個の触媒ドメインのみを有する。グラム陽性細菌に特異的なファージによって生成されるエンドリシンは、２個のドメインを有する：溶解に関する酵素活性ドメイン（ＥＡＤ）、ならびに宿主認識および高親和性結合に関する細胞壁結合ドメイン（ＣＢＤ）。より具体的には、上記エンドリシンのＣＢＤは、上記バクテリオファージが上記細菌を高特異性で認識することを可能にする（溶解機能は必要とされない）。他のタイプの感染性因子は、特異性のために細胞結合タンパク質を同様に使用する。いくつかの場合には、細胞結合を担う核酸配列は、グラム陰性細菌に特異的なバクテリオファージによってコードされるエンドリシンの１個の球状ＥＡＤ内で見出されている。
【０１３４】
第３のタイプのタンパク質であるスパニンは、グラム陰性宿主における外膜の破壊を担う。ＲＺ１は、スパニン複合体の外膜リポタンパク質である。溶解サイクルの間に、上記スパニン複合体は外膜を破壊し、続いて、上記エンドリシンによる細胞壁を破壊する。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、以下のタンパク質：
エンドリシンホリン、スパニン、テールスパイク、または尾部繊維のうちの少なくとも１種に由来する細胞結合機能性を有する、保存されたアミノ酸配列を含む。他の実施形態において、上記ＣＢＣは、エンドリシンに由来する細胞結合機能性を有する保存されたアミノ酸配列、およびホリン、スパニン、テールスパイク、または尾部繊維のうちの少なくとも１種に由来する保存されたアミノ酸配列を含む。
【０１３５】
場合によっては、ファージは、レセプター結合タンパク質（ＲＢＰ）を通じて特定の細菌に結合し得る。ＲＢＰと、細菌の細胞表面との間の相互作用は、ＲＢＰ特異性を決定する。いくらかのファージでは、ＲＢＰは、テールシャフト、尾部繊維、またはテールスパイクに位置する。ファージ尾部繊維タンパク質は、細胞表面への吸着およびポリサッカリド分解の両方において役割を果たす。テールスパイクタンパク質は、多くのバクテリオファージのテールの構成要素である。テールスパイクタンパク質は、細菌宿主の細胞表面に結合し、細菌宿主認識を媒介する。ファージテールスパイクおよび／または尾部繊維タンパク質は、ファージを細菌に付着させることによって、細胞表面への吸着およびポリサッカリド分解の両方において役割を果たす。
【０１３６】
いくつかのファージ（ＣＢＡ１２０、Ｖｉｌ、およびＰ２２が挙げられる）は、テールスパイクを有する。他のファージ（例えば、Ｔ４、ＪＧ０４、ＳＥＡ１、Ｓａｋａ２、およびＳａｋａ４）は、尾部繊維を有する。細菌の特定のタイプに結合するＣＢＣは、特定の感染性因子に由来し得、試験サンプル中のその生物の存在を同定するために、インジケーターの一部として使用され得る。従って、本発明は、ＭＤＰを使用して、吸着によって微生物細胞を修飾またはシグナル富化することが提唱される。ＭＤＰは、組換えタンパク質または結合体化タンパク質であり得るか、またはそうでなければ、付着したインジケーター部分を有し得る。他の実施形態において、上記ＣＢＣは、エンドリシンに由来する細胞結合機能性を有する保存されたアミノ酸配列、およびホリン、スパニン、テールスパイク、または尾部繊維のうちの少なくとも１種に由来する保存されたアミノ酸配列を含む。従って、本明細書で開示される発明の実施形態は、細胞結合部分およびインジケーター部分を有する修飾分子またはシグナル付加分子を含む。
【０１３７】
感染性因子は、特定のタイプの微生物に非常に特異的であり得る。例えば、バクテリオファージは、特定の細菌属（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）に特異的であり得る。例えば、Ａ５１１バクテリオファージは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ属に特異的である。あるいは、バクテリオファージは、特定の細菌種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）に特異的であり得る。細菌のいくつかのタイプに関しては、バクテリオファージは、その生物の特定のサブタイプを高い特異性で認識し得ることすらある。例えば、ＣＢＡ１２０バクテリオファージは、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７に対して非常に特異的であり、φＹｅＯ３−１２バクテリオファージは、Ｙ．ｅｎｔｅｒｏｃｏｌｉｔｉｃａ  血清型Ｏ：３に対して非常に特異的である。
【０１３８】
本明細書で記載されるＭＤＰのいくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、組換えタンパク質または結合体化タンパク質の一局面である。エンドリシンをコードするバクテリオファージ遺伝子の特定のセグメントによってコードされる、特定のアミノ酸ストレッチは、高度に特異的な細胞タイプ標識の一部として働き得る。上記ＣＢＣは、以下に由来し得る：Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、ＡＲ１、Ａ５１１、Ａ１１８、Ａ００６、Ａ５００、ＰＳＡ、Ｐ３５、Ｐ４０、Ｂ０２５、Ｂ０５４，Ａ９７、ｐｈｉＳＭ１０１、ｐｈｉ３６２６、ＣＢＡ１２０、ＳＰＮ１Ｓ、１０、ｅｐｓｉｌｏｎ１５、Ｐ２２、ＬｉｐＺ５、Ｐ４０、ｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、Ｐ７０、Ａ５１１、Ｐ４Ｗ、Ｋ、Ｔｗｏｒｔ、またはＳＡ９７。ＭＤＰはまた、上記ＭＤＰがシグナルを生成することを可能にするインジケーター部分（例えば、蛍光部分、蛍光タンパク質、生体発光タンパク質、または酵素）を含む。組換えＭＤＰにおいて、種々のタイプのレポーターが、インジケーター部分として働くために、ＣＢＰに付着され得る。いくつかの実施形態において、上記ＭＤＰ融合タンパク質は、酵素（例えば、ルシフェラーゼ）のアミノ酸配列を含む。これは、適切な基質の添加の際に検出可能であるに過ぎない。例えば、ルシフェラーゼ、アルカリホスファターゼ、および他のレポーター酵素は、適切な基質と反応して、検出可能なシグナルを提供する。組換えＭＤＰのいくつかの実施形態は、野生型ルシフェラーゼまたは工学技術で作製された（engineered）ルシフェラーゼ（例えば、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標））を含む。他の実施形態は、蛍光タンパク質または別のレポータータンパク質を含む。
【０１３９】
種々の感染性因子が、研究され得る、および／または上記ＣＢＣの細胞結合ドメインのモデルとして役立ち得る。代替の実施形態において、バクテリオファージ、ファージ、マイコバクテリオファージ（例えば、ＴＢおよびパラＴＢに関して）、マイコファージ（ｍｙｃｏｐｈａｇｅ）（例えば、真菌に関して）、マイコプラズマファージ、ならびに生きている細菌、真菌、マイコプラズマ、原生動物、真菌および他の顕微鏡的な生きている生物に侵入し得る任意の他のウイルスは、目的の微生物を標的化するために研究され得るかまたはコピーされ得る。一実施形態において、上記目的の微生物が細菌である場合、上記ＣＢＣは、バクテリオファージに由来する細胞結合ドメインを含み得る。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの十分に研究されたファージとしては、Ｔ１、Ｔ２、Ｔ３、Ｔ４、Ｔ５、Ｔ７、およびラムダが挙げられる；ＡＴＣＣコレクションにおいて入手可能な他のＥ．ｃｏｌｉファージとしては、例えば、ｐｈｉ×１７４、Ｓ１３、Ｏｘ６、ＭＳ２、ｐｈｉＶ１、ｆｄ、ＰＲ７７２、およびＺＩＫ１が挙げられる。Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａファージとしては、ＳＰＮ１Ｓ、１０、ｅｐｓｉｌｏｎ１５、ＳＥＡ１、およびＰ２２が挙げられる。Ｌｉｓｔｅｒｉａファージとしては、ＬｉｐＺ５、Ｐ４０、ｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、Ｐ７０、およびＡ５１１が挙げられる。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージとしては、Ｐ４Ｗ、ウイルスＫ、Ｔｗｏｒｔ、ｐｈｉ１１、１８７、Ｐ６８、およびｐｈｉＷＭＹが挙げられる。
【０１４０】
組換えＭＤＰを調製するための方法のいくつかの実施形態は、それらの細胞結合構成要素の正確な位置および配列を確認するために、種々のバクテリオファージの公開された配列を配列決定するかまたは研究することを含む。上記配列は、既知の細胞結合構成要素と上記ファージ配列との間の相同性を見出すために特徴づけられる。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａファージのエンドリシンは、他のエンドリシン配列と比較した場合に、Ｌｉｓｔｅｒｉａファージ配列から推測される。従って、Ｌｉｓｔｅｒｉａ特異的細胞結合ドメインの配列は、選択されるかまたはデザインされ、Ｌｉｓｔｅｒｉａを検出するためのＭＤＰの一局面として使用される。
【０１４１】
本発明のいくつかの実施形態は、目的の細菌を結合しその検出を促進するために、迅速かつ感度の高い標的化のための組換えＭＤＰの結合の特異性を利用する。
【０１４２】
組換え微生物検出プローブ
本明細書でより詳細に記載されるように、本発明の組成物、方法、システムおよびキットは、病原性微生物の検出における使用のために、微生物検出プローブ（ＭＤＰ）を含み得る。ある種の実施形態において、本発明は、細胞結合構成要素（ＣＢＣ）およびインジケーターまたはレポーター遺伝子を有する組換えＭＤＰを含む。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、ＣＢＣをコードする遺伝子フラグメントは、検出の標的に特異的なバクテリオファージから単離される。いくつかの実施形態において、ＣＢＣは、バクテリオファージ（例えば、Ｔ７、Ｔ４または別の類似のファージ）に由来する。バクテリオファージＣＢＣはまた、Ｔ４様、Ｔ７様、ＶｉＩ、ＶｉＩ−ｌｉｋｅ、ＡＲ１、Ａ５１１、Ａ１１８、Ａ００６、Ａ５００、ＰＳＡ、Ｐ３５、Ｐ４０、Ｂ０２５、Ｂ０５４、Ａ９７、ｐｈｉＳＭ１０１、ｐｈｉ３６２６、ＣＢＡ１２０、ＳＰＮ１Ｓ、１０、ｅｐｓｉｌｏｎ１５、Ｐ２２、ＬｉｐＺ５、Ｐ４０、ｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、Ｐ７０、Ａ５１１、Ｐ４Ｗ、Ｋ、Ｔｗｏｒｔ、またはＳＡ９７に由来し得る。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、エンドリシンのＣＢＤまたは機能的結合ドメインとして作用するその一部であり得る。機能的結合ドメインは、結合機能／細菌特異性を担う上記ＣＢＤ内の保存されたアミノ酸配列であり得る。他の実施形態において、上記ＣＢＣは、機能的結合ドメインまたはバクテリオファージゲノムによってコードされる別のタイプのタンパク質（ｏ−スパニン、テールスパイク、および尾部繊維が挙げられるが、これらに限定されない）であり得る。いくつかの実施形態において、上記ｏ−スパニンはＲＺ１であり得る。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、ＤＮＡへと逆翻訳され得、インジケーター融合タンパク質へとクローニングするために合成され得る。小さなＭＤＰは、より多くの分子が１個の細胞に結合し、シグナルを生成することを可能にする。これを考慮すると、より小さなインジケーター遺伝子生成物が好ましいこともある（しかし、実に大きなＭＤＰが抗体より遙かに小さい可能性があることに注意のこと）。ＯｐＬｕｃおよびＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）タンパク質は、約２０ｋＤａ（コードするのにおよそ５００〜６００ｂｐ）に過ぎない一方で、ＦＬｕｃは、約６２ｋＤａであり、コードするのにおよそ１，７００ｂｐを要する。比較のために、Ｔ７のゲノムは、およそ４０ｋｂｐである一方で、Ｔ４ゲノムは、約１７０ｋｂｐである。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）融合プラスミドへとクローニングされる。いくつかの実施形態において、上記融合プラスミドは、停止コドンの変異および部位指向性変異誘発を介する制限エンドヌクレアーゼ部位の挿入によって作製される。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣ遺伝子フラグメントは、上記融合プラスミドの制限酵素部位へとクローニングされ、上記ＭＤＰ構築物を生じる。上記ＭＤＰ構築物は、Ｅ．ｃｏｌｉへと形質転換され、ＬＢ培地中で培養される。上記ＭＤＰの発現は、適切な誘導因子の添加によって誘導され得る。一実施形態において、イソプロピル１  β−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加を使用して、上記ＭＤＰの発現を誘導し得る。いくつかの実施形態において、上記培養物は、上記ＭＤＰの発現を誘導するために振盪され得る。
【０１４５】
さらに、上記インジケーターは、高いシグナル対バックグラウンド比を生じるべきであり、タイムリーに容易に検出可能であるべきである。ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、改変されたＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ（深海エビ）ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）、イミダゾピラジノン基質（フリマジン）と組み合わせたＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、低いバックグラウンドで頑健なシグナルを提供し得る。
【０１４６】
いくつかのＭＤＰ実施形態において、インジケーター部分は、上記ＣＢＣに融合される。インジケーターは、種々の生体分子のうちのいずれかであり得る。上記インジケーターは、検出可能な生成物、または検出可能な生成物を生じる酵素または検出可能な生成物を生じる酵素の補因子であり得る。いくつかの実施形態において、ＭＤＰの上記インジケーター部分はレポーター（例えば、検出可能な酵素）である。上記インジケーター遺伝子生成物は、光を放射し得るおよび／または色の変化によって検出可能であり得る。種々の適切な酵素が市販されている（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、またはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ））。例えば、一実施形態において、上記インジケーターは、ルシフェラーゼ酵素である。種々のタイプのルシフェラーゼが使用され得る。代替の実施形態において、および本明細書でより詳細に記載されるように、上記ルシフェラーゼは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼ、または工学技術で作製されたルシフェラーゼのうちの１種である。いくつかの実施形態において、上記ルシフェラーゼは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓに由来する。いくつかの実施形態において、上記インジケーターは、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）などの遺伝的に改変されたルシフェラーゼである。他の工学技術で作製されたルシフェラーゼまたは検出可能なシグナルを生成する他の酵素はまた、適切なインジケーター部分であり得る。いくつかの実施形態において、これらの酵素は、上記インジケーター部分として役立ち得る。
【０１４７】
代替のＭＤＰ実施形態は、結合体化インジケーター部分を含む。例えば、ＦＩＴＣは、機能的ＭＤＰを作製するためにＣＢＣに結合体化され得る。いくつかの実施形態において、ＭＤＰは、さらなる部分またはセグメント（例えば、結合したＭＤＰを結合していないＭＤＰから分離することを促進する固体支持体への結合のためのセグメント）を含み得る。インジケーター部分との結合体化は、上記ＣＢＤの、微生物に対する親和性に影響を及ぼさない。
【０１４８】
本発明の組成物は、１個またはこれより多くの野生型感染性因子（例えば、バクテリオファージ）および１個またはこれより多くのインジケーター部分に由来する１個またはこれより多くのＭＤＰを含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、同じまたは異なるインジケーターシグナルを生成し得る種々のＭＤＰのカクテルを含み得る。すなわち、微生物を検出するための組成物は、全て同じまたは異なるＭＤＰを含み得る。
【０１４９】
上記で記載されるように適用されるＭＤＰは、細胞結合構成要素（ＣＢＣ）の特異性に基づいて微生物の特異的検出を促進するＣＢＣを含む。特異性のためにＣＢＣを利用し得る別のアプローチにおいて、特定の細菌を認識および結合する組換えバクテリオファージを使用する以前に記載されたアッセイが、使用され得る。上記組換えバクテリオファージアッセイは、本明細書でさらに記載されるとおりの装置において行われ得る。
【０１５０】
組換えバクテリオファージ
本明細書でより詳細に記載されるように、本発明の装置、方法、システムおよびキットは、目的の微生物の検出における使用のための組換えバクテリオファージを含む。上記組換えバクテリオファージは、上記で開示される装置の第１の区画の中に含まれる。いくつかの実施形態において、本発明は、上記バクテリオファージのゲノムに組み込まれたインジケーター遺伝子を有する組換えバクテリオファージを含む組成物を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、上記バクテリオファージの天然のプロモーターでないプロモーターに作動可能に連結される。いくつかの実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、上記バクテリオファージの天然のプロモーターに作動可能に連結される。上記インジケーターまたはレポーター遺伝子を含む上記組換えバクテリオファージはまた、本開示においてインジケーターバクテリオファージとして言及される。
【０１５１】
組換えバクテリオファージは、レポーターまたはインジケーター遺伝子を含み得る。上記バクテリオファージのある種の実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、融合タンパク質をコードしない。例えば、ある種の実施形態において、宿主細菌の感染後のバクテリオファージ複製の間の上記インジケーター遺伝子の発現は、可溶性インジケータータンパク質生成物を生じる。ある種の実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、上記バクテリオファージの後期遺伝子領域に挿入され得る。後期遺伝子は構造タンパク質をコードするので、他のファージ遺伝子より高レベルで一般的に発現される。後期遺伝子領域はクラスＩＩＩ遺伝子領域であってよく、主要カプシドタンパク質のための遺伝子を含み得る。
【０１５２】
いくつかの実施形態は、上記主要カプシドタンパク質遺伝子の下流に相同組換えのための配列を設計する（および、必要に応じて調製する）ことを含む。他の実施形態は、主要カプシドタンパク質遺伝子の上流に相同組換えのための配列を設計する工程（および必要に応じて調製する工程）を含む。いくつかの実施形態において、上記配列は、非翻訳領域の後にコドン最適化レポーター遺伝子を含む。非翻訳領域は、ファージ後期遺伝子プロモーターおよびリボソーム進入部位を含み得る。
【０１５３】
いくつかの実施形態において、インジケーターバクテリオファージは、Ａ５１１、Ｐ１００、ＬｉｓｔｅｒｉａファージＬＭＴＡ−９４、ＬＭＡ４、ＬＭＡ８、Ｔ７、Ｔ４または別の類似のファージに由来する。インジケーターバクテリオファージはまた、Ｔ７、Ｔ７様、Ｔ４、Ｔ４様、Ｐ１００ｖｉｒｕｓ、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的、Ｌｉｓｔｅｒｉａ特異的もしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的なバクテリオファージ、ＶｉＩ、またはＶｉＩ様（またはＶｉ１ウイルス様（ＧｅｎＢａｎｋ／ＮＣＢＩによれば）バクテリオファージと少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％  相同性を有するゲノムを有するＰ１００ｖｉｒｕｓ、Ｔ４様、Ｔ７様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ特異的、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ特異的、Ｌｉｓｔｅｒｉａ特異的もしくはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的なバクテリオファージ、または別のバクテリオファージに由来し得る。いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージは、特定の病原性微生物に高度に特異的なバクテリオファージに由来する。遺伝的改変は、野生型遺伝子の欠失を回避し得、従って、上記改変されたファージは、多くの市販のファージより野生型バクテリオファージにより類似のままであり得る。環境に由来するバクテリオファージは、上記環境の中で見出される細菌に対して特異的であり得、よって、市販されるファージとは遺伝的に異なる。
【０１５４】
さらに、非必須であると考えられるファージ遺伝子は、認識されていない機能を有し得る。例えば、見かけは非必須の遺伝子は、アセンブリにおける巧妙な切断、適合、もしくはトリミング機能など、バーストサイズを上昇させることにおいて重要な機能を有し得る。それゆえ、遺伝子を欠失させてインジケーターを挿入することは、有害であり得る。大部分のファージは、それらの天然のゲノムより数パーセント大きいＤＮＡをパッケージし得る。この考察では、より小さなインジケーター遺伝子は、バクテリオファージ（特に、より小さなゲノムを有するバクテリオファージ）を改変するためのより適切な選択であり得る。ＯｐＬｕｃおよびＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）タンパク質は、わずか約２０ｋＤａ（コードするのに約５００〜６００ｂｐ）である一方で、ＦＬｕｃは、約６２ｋＤａ（コードするのに約１，７００ｂｐ）である。比較のために、Ｔ７のゲノムは約４０ｋｂｐである一方で、Ｔ４ゲノムは、約１７０ｋｂｐであり、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、ＳａｌｍｏｎｅｌｌａまたはＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ特異的なバクテリオファージのゲノムは約１５７ｋｂｐである。さらに、レポーター遺伝子は細菌によって内因的に発現されるべきでなく（すなわち、細菌ゲノムの一部でない）、高いシグナル対バックグラウンド比を生成するべきであり、タイムリーに容易に検出可能であるべきである。ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、改変されたＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓ  ｇｒａｃｉｌｉｒｏｓｔｒｉｓ（深海エビ）ルシフェラーゼである。いくつかの実施形態において、ＰｒｏｍｅｇａのＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）、イミダゾピラジノン基質（フリマジン）と組み合わせたＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、低いバックグラウンドで頑健なシグナルを提供し得る。
【０１５５】
いくつかのインジケーターファージ実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、野生型ファージ遺伝子を無傷のままにして、機能的遺伝子の破壊を回避するために非翻訳領域へと挿入され得、これは、非実験室株の細菌に感染させる場合に、より大きな適合をもたらし得る。さらに、３つ全てのリーディングフレームに終止コドンを含めることは、リードスルー（発現漏れ（ｌｅａｋｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）としても公知）を低減することによって、発現を増加させる一助になり得る。このストラテジーはまた、上記ファージから分離できないバックグラウンドシグナル（例えば、ルシフェラーゼ）として現れる融合タンパク質が低レベルで作られるという可能性を排除し得る。
【０１５６】
インジケーター遺伝子は、種々の生体分子を発現し得る。上記インジケーター遺伝子は、検出可能な生成物を発現する遺伝子もしくは検出可能な生成物を生成する酵素である。例えば、一実施形態において、上記インジケーター遺伝子は、ルシフェラーゼ酵素をコードする。種々のタイプのルシフェラーゼが使用され得る。代替の実施形態において、および本明細書でより詳細に記載されるように、ルシフェラーゼは、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼ、ホタルルシフェラーゼ、Ｌｕｃｉａルシフェラーゼ、Ｒｅｎｉｌｌａルシフェラーゼまたは工学技術で作製された（engineered）ルシフェラーゼのうちの１種である。いくつかの実施形態において、ルシフェラーゼ遺伝子はＯｐｌｏｐｈｏｒｕｓに由来する。いくつかの実施形態において、インジケーター遺伝子は、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）などの遺伝的に改変されたルシフェラーゼ遺伝子である。
【０１５７】
従って、いくつかの実施形態において、本発明は、上記後期（クラスＩＩＩ）遺伝子領域において非バクテリオファージインジケーター遺伝子を含む遺伝的に改変されたバクテリオファージを含む。いくつかの実施形態において、上記非天然のインジケーター遺伝子は、後期プロモーターの制御下にある。ウイルス後期遺伝子プロモーターを使用することは、上記レポーター遺伝子（例えば、ルシフェラーゼ）がウイルスカプシドタンパク質のように、高レベルで発現されるのみならず、内因性細菌遺伝子もしくはさらには初期ウイルス遺伝子のように停止もされないことを確実にする。
【０１５８】
いくつかの実施形態において、上記後期プロモーターは、Ｐ１００ｖｉｒｕｓ、Ｔ４様、Ｔ７様もしくはＶｉＩ様プロモーター、または選択された野生型ファージにおいて見いだされる、すなわち、遺伝的改変なしの、プロモーターに類似の別のファージプロモーターである。上記後期遺伝子領域は、クラスＩＩＩ遺伝子領域であり得、上記バクテリオファージは、Ｔ７、Ｔ４、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、Ｃｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＬｉｓｔｅｒｉａもしくはＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージ、またはＴ７、Ｔ４、Ｔ４様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様もしくはＣｒｏｎｏｂａｃｔｅｒ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、ＬｉｓｔｅｒｉａもしくはＳ．ａｕｒｅｕｓ特異的バクテリオファージと少なくとも７０、７５、８０、８５、９０もしくは９５％の相同性を有するゲノムを有する別の天然のバクテリオファージに由来し得る。
【０１５９】
バクテリオファージに対する遺伝的改変は、核酸の小さなフラグメント、遺伝子の実質的部分、もしくは遺伝子全体の挿入、欠失、もしくは置換を含み得る。いくつかの実施形態において、挿入もしくは置換された核酸は、非天然の配列を含む。非天然のインジケーター遺伝子は、バクテリオファージプロモーターの制御下にあるように、バクテリオファージゲノムへと挿入され得る。いくつかの実施形態において、上記非天然のインジケーター遺伝子は、融合タンパク質の一部ではない。すなわち、いくつかの実施形態において、遺伝的改変は、上記インジケータータンパク質生成物が上記野生型のバクテリオファージのポリペプチドを含まないように構成され得る。いくつかの実施形態において、上記インジケータータンパク質生成物は、可溶性である。いくつかの実施形態において、本発明は、目的の細菌を検出するための方法を包含し、上記方法は、試験サンプルをこのような組換えバクテリオファージとともにインキュベートする工程を包含する。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、宿主細菌の感染後の子孫バクテリオファージにおけるインジケーター遺伝子の発現は、遊離の可溶性タンパク質生成物をもたらす。いくつかの実施形態において、上記非天然のインジケーター遺伝子は、ファージ構造タンパク質をコードする遺伝子と連結していないので、融合タンパク質を生じない。カプシドタンパク質への検出部分の融合物（すなわち、融合タンパク質）を使用するシステムとは異なり、本発明のいくつかの実施形態は、可溶性インジケーターまたはレポーター（例えば、可溶性ルシフェラーゼ）を発現する。いくつかの実施形態において、上記インジケーターまたはレポーターは、理想的には、上記バクテリオファージ構造を含まない。すなわち、上記インジケーターまたはレポーターは、上記ファージ構造に結合されない。よって、上記インジケーターまたはレポーターの遺伝子は、上記組換えファージゲノムにおける他の遺伝子と融合されない。これは、上記アッセイの感度を大いに増大させ得（単一の細菌まで）、上記アッセイを単純化し得、上記アッセイが、検出可能な融合タンパク質を生成する構築物で必要とされるさらなる精製工程に起因する数時間とは対照的に、いくつかの実施形態に関しては、１時間未満で完了することを可能にする。さらに、融合タンパク質は、例えば、酵素活性部位のコンホメーションもしくは基質へのアクセスを変化させ得るタンパク質折り畳みの制約に起因して、可溶性タンパク質より活性が低い場合がある。
【０１６１】
さらに、定義による融合タンパク質は、上記バクテリオファージにおけるタンパク質のサブユニットに付着される部分の数を制限する。例えば、融合タンパク質のためのプラットフォームとして働くように設計された市販のシステムを使用すると、各Ｔ７バクテリオファージ粒子において遺伝子１０Ｂカプシドタンパク質の約４１５コピーに相当する、融合部分の約４１５コピーが生じる。この制約がなければ、感染した細菌は、上記バクテリオファージに適合し得るより多くの上記検出部分（例えば、ルシフェラーゼ）のコピーを発現すると予測され得る。さらに、大きな融合タンパク質（例えば、カプシド−ルシフェラーゼ融合物）は、上記バクテリオファージ粒子のアセンブリを阻害し得、そのようにして、より少ないバクテリオファージ子孫を生じる。従って、可溶性の非融合インジケーター遺伝子生成物が好ましいものであり得る。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、上記インジケーターファージは、検出可能な酵素などのレポーターをコードする。上記インジケーター遺伝子産物は、光を生じ得、そして／または色の変化によって検出可能であり得る。種々の適切な酵素は、市販されている（例えば、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、もしくはルシフェラーゼ（Ｌｕｃ））。いくつかの実施形態において、これらの酵素は、上記インジケーター部分として働き得る。いくつかの実施形態において、ホタルルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、Ｏｐｌｏｐｈｏｒｕｓルシフェラーゼは、上記インジケーター部分である。いくつかの実施形態において、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）は、上記インジケーター部分である。他の工学技術で作製されたルシフェラーゼもしくは検出可能なシグナルを生成する他の酵素もまた、適切なインジケーター部分であり得る。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、可溶性検出部分の使用は、汚染している親ファージを、上記感染したサンプル細胞の溶解物から除去する必要性を排除する。融合タンパク質システムを用いると、サンプル細胞に感染させるために使用される任意のバクテリオファージは、付着される検出部分を有し、上記検出部分も含む娘バクテリオファージから区別できない。サンプル細菌の検出は、新たに作り出された（デノボ合成された）検出部分の検出に依拠するので、融合構築物の使用は、古い（親）部分を新たに作り出された（娘バクテリオファージ）部分から分離するためにさらなる工程を要する。これは、上記バクテリオファージの生活環の完了の前に、上記感染した細胞を複数回洗浄する工程、物理的もしくは化学的手段によって感染後に過剰な親ファージを不活性化する工程、および／または上記親バクテリオファージを結合部分（例えば、ビオチン）で化学的に改変する工程（これは、次いで、結合および分離され得る（例えば、ストレプトアビジン被覆セファロースビーズによって））によって達成され得る。しかし、除去時にすべてのこれら試みを使用したとしても、親ファージは、少ない数のサンプル細胞の感染を保証するために高濃度の親ファージが使用される場合に残存することができ、感染した細胞の子孫ファージからのシグナルの検出を不明確にし得るバックグラウンドシグナルを作り出す。
【０１６４】
対照的に、本発明のいくつかの実施形態において発現される可溶性検出部分を用いると、最終溶解物からの上記親ファージの精製は不要である。なぜなら上記親ファージは、付着されるいかなる検出部分をも有しないからである。従って、感染後に存在する任意の検出部分は、感染した１個もしくは複数の細菌の存在を示して、新たに作り出されていなければならない。この利益を利用するために、親ファージの生成および調製は、細菌培養物中での親バクテリオファージの生成の間に生成された任意の遊離検出部分からの上記ファージの精製を含み得る。標準的なバクテリオファージ精製技術は、本発明に従うファージのいくつかの実施形態を精製するために使用され得る（例えば、スクロース密度勾配遠心分離、塩化セシウム等密度（isopycnic）密度勾配遠心分離、ＨＰＬＣ、サイズ排除クロマトグラフィー、および透析または派生技術（例えば、Ａｍｉｃｏｎブランドの濃縮器  −  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，  Ｉｎｃ．）。塩化セシウム等密度超遠心分離は、親ファージ粒子を、上記細菌宿主中のファージの増殖の際に生成される汚染するルシフェラーゼタンパク質から分離するために、本発明の組換えファージの調製の一部として用いられ得る。このようにして、本発明の親組換えバクテリオファージは、上記細菌における生成の間に生成される任意のルシフェラーゼが実質的ない。上記ファージストックに存在する残りのルシフェラーゼの除去は、上記組換えバクテリオファージが試験サンプルとともにインキュベートされる場合に観察されるバックグラウンドシグナルを実質的に低減し得る。
【０１６５】
改変されたバクテリオファージのいくつかの実施形態において、上記後期プロモーター（クラスＩＩＩプロモーター、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ特異的ファージ、Ｔ７、Ｔ４、もしくはＶｉＩ由来のもの）は、上記バクテリオファージ粒子へとアセンブルされる構造タンパク質の遺伝子を転写する同じバクテリオファージのＲＮＡポリメラーゼに対して高いアフィニティーを有する。これらのタンパク質は、各バクテリオファージ粒子が、これら分子の数十個もしくは数百個ものコピーを含むので、上記ファージによって作られる最も豊富なタンパク質である。ウイルス後期プロモーターの使用は、最適には、上記ルシェラーゼ検出部分の発現の高レベルを確実にし得る。上記インジケーターファージが由来する元の野生型バクテリオファージ（例えば、Ｔ４、Ｔ７もしくはＶｉＩベースのシステムを有するＬｉｓｔｅｒｉａ特異的ファージ、Ｔ４、Ｔ７もしくはＶｉＩ後期プロモーター）に由来するか、これに特異的か、またはこの下で活性な後期ウイルスプロモーターの使用は、上記検出部分の最適な発現をさらにさらに確実にし得る。標準的な細菌（非ウイルス／非バクテリオファージ）プロモーターの使用は、いくつかの場合では、発現に有害であり得る。なぜならこれらのプロモーターは、バクテリオファージ感染の間に（上記バクテリオファージがファージタンパク質生成のための細菌資源を優先するために）しばしばダウンレギュレートされるからである。従って、いくつかの実施形態において、上記ファージは、好ましくは、発現をファージ構造構成要素のサブユニットの数に制限しないゲノム内での配置を用いて、可溶性（遊離）インジケーター部分をコードし、高レベルで発現するように操作されている。
【０１６６】
本発明の組成物は、１種または複数種の野生型または遺伝的に改変されたバクテリオファージ（例えば、バクテリオファージ）および１種または複数種のインジケーター遺伝子を含み得る。いくつかの実施形態において、組成物は、同じまたは異なるインジケータータンパク質をコードおよび発現し得る、異なるインジケーターファージのカクテルを含み得る。いくつかの実施形態において、バクテリオファージのカクテルは、少なくとも２種の異なるタイプの組換えバクテリオファージを含む。
【０１６７】
装置
本発明の実施形態は、自給式装置を使用して目的の微生物を検出する方法に関する。上記装置は、上記目的の微生物を含むサンプルを集めるために使用され得る固体支持体を含む。いくつかの実施形態において、本発明による装置は、別個の区画（連続的にまたは分枝状の構成（例えば、チューブの「耳」）いずれかにおいて配置される）を有するチューブを含む。上記装置は、試薬の混合および方法の工程のタイミングの変動のために構成され得る多くの区画を含み得る。いくつかの実施形態において、上記チューブの最も上または上側の区画は、組換えバクテリオファージを含み、基質区画は、上記バクテリオファージ区画の下にある。いくつかの実施形態において、上記チューブは、増殖培地を含む。
【０１６８】
最も単純な実施形態において、第１の区画は、組換えバクテリオファージを含み、第２の区画は、基質または発色試薬を含む。いくつかのこのような実施形態において、両方の試薬が、サンプル（上記固体支持体上で捕捉される）と同時に混合される。他の実施形態において、サンプルは、感染を開始するために、上記第１の区画に最初に添加される。一定期間の後、上記第２の区画への導管は、上記感染サンプルへと上記基質または発色試薬を添加し、混合することを可能にするために開かれる。
【０１６９】
代替の実施形態において、上記第１の区画は、微生物検出プローブ（ＭＤＰ）を含み、第２の区画は、基質または発色試薬を含む。いくつかのこのような実施形態において、両方の試薬は、サンプル（上記固体支持体上に捕捉される）と同時に混合される。他の実施形態において、サンプルは、上記第１の区画に最初に添加される。一定期間の後に、上記第２の区画への導管は、上記感染サンプルへと上記基質または発色試薬を添加し、混合することを可能にするために開かれる。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、シールは、隣接する区画を分離し、上記ユーザーは、上記シールを破損し、基質およびファージの両方が、上記スワブに同時に遭遇する。ルシフェラーゼが生成され、上記基質と反応して、検出可能なシグナルを生じる。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、上記基質区画は、培地区画と組換えバクテリオファージ区画との間に配置され得る。ユーザーが上記シールを破損して、上記固体支持体に捕捉されたサンプルに試薬を適用する場合、両方の試薬が、同時に適用される。
【０１７２】
代替の実施形態において、上記基質区画は、培地区画とＭＤＰ区画との間に配置される。ユーザーが、上記シールを破損して、上記固体支持体上に捕捉されたサンプルに試薬を適用する場合、両方の試薬は、同時に適用される。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、固体支持体は、チューブであって、上記基質または発色剤が上記チューブの底にあるものに添加される；上記固体支持体は、上記酵素と基質または他のレポーターおよび対になった試薬との間の反応を開始するために、上記底へと押し込まれる。上記固体支持体は、取り扱いの容易さのために、シャフトへと付着されていてもよい。
【０１７４】
以下の図は、本発明の実施形態の例証的な例を提供する。
【０１７５】
一実施形態において、本開示は、自給式微生物検出装置システムを提供する。図１２は、装置１００という一実施形態を示す。上記装置は、固体支持体１６、および３つの区画を含む容器を含む。上記区画の各々は、スナップアクションシールによって分離される。上記第１の区画１０はファージを含み、上記第２の区画１２は基質を含み、上記第３の区画１４は培地を含む。この装置は、上記ファージおよび基質が、上記サンプルとともに同時にインキュベートされることを可能にする。
【０１７６】
図１３は、装置２００という第２の実施形態を示す。上記装置は、固体支持体２６および３つの区画を含む容器を含む。上記区画の各々は、スナップアクションシールによって分離される。上記第１の区画２０はファージを含み、上記第２の区画２２は培地を含み、上記第３の区画２４は基質を含む。実施形態において、図１３に示される装置を使用して、上記サンプルは、上記基質とともにインキュベートする前に、上記ファージとともに最初にインキュベートされる。図１３に示される装置を使用するさらなる実施形態において、上記固体支持体は、上記サンプルを収集する前に、培地に浸漬される。
【０１７７】
図１４は、装置３００という第３の実施形態を示す。上記装置は、固体支持体３６および３つの区画を含む容器を含む。上記区画の各々は、スナップアクションシールによって分離される。上記第１の区画３０は培地を含み、上記第２の区画３２はファージを含み、上記第３の区画３４は基質を含む。実施形態において、図１４に示される装置を使用して、上記サンプルは、上記基質とともにインキュベートする前に、上記ファージとともに最初にインキュベートされる。図１４に示される装置を使用するさらなる実施形態において、上記固体支持体は、上記サンプルを収集する前に、乾燥されている。
【０１７８】
図１５は、装置４００という第４の実施形態を示す。上記装置は、固体支持体４６および３つの区画を含む容器を含む。上記区画の各々は、スナップアクションシールによって分離される。上記第１の区画４０は培地を含み、上記第２の区画４２はファージを含み、上記第３の区画４６は基質を含む。上記装置は、試薬を段階的に混合するためのストップ−ロック機構を有する。実施形態において、図１５に示される装置を使用して、上記サンプルは、上記基質とともにインキュベートする前に、上記ファージとともに最初にインキュベートされる。図１５に示される装置を使用するさらなる実施形態において、上記固体支持体は、上記サンプルを収集する前に、培地に浸漬される。
【０１７９】
図１６は、装置５００という第５の実施形態を示す。上記装置は、固体支持体５６および３つの区画を含む容器を含む。上記区画の各々は、スナップアクションシールによって分離される。上記第１の区画５０は培地を含み、上記第２の区画５２はファージを含み、上記第３の区画５４は基質を含む。上記装置は、試薬を段階的に混合するためのストップ−ロック機構を有する。実施形態において、図１６に示される装置を使用して、上記サンプルは、上記基質とともにインキュベートする前に、上記ファージとともに最初にインキュベートされる。図１６に示される装置を使用するさらなる実施形態において、上記固体支持体は、上記サンプルを収集する前に、乾燥されている。
【０１８０】
図１７は、微生物を検出するための方法を記載し、上記方法は、（ｉ）サンプルを一晩富化する工程、（ｉｉ）自給式装置からの固体支持体を使用して、上記一晩富化されているサンプルを集める工程、（ｉｉｉ）上記サンプルを上記自給式装置の区画内に含まれるファージに感染させる工程、および（ｉｖ）上記感染工程によって生成されるシグナルを読み取る／検出することによって、微生物の存在を検出する工程、を包含する。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、上記中心チューブからの突出部または枝に含まれる区画は、例えば、「耳」の形態において２より多くの方向からの試薬の混合を可能にする。例えば、２つのスクイーズバルブ（ｓｑｕｅｅｚｅ  ｂｕｌｂ）を使用して、培地を添加し得、次いで、ファージを、主要な区画に逐次的にまたは同時に添加し得るか、または他の試薬を添加し得る。中心区画に関する他の区画の種々の配置は、より大きな隣接する区画への異なる試薬の添加および混合を可能にする。
【０１８２】
細胞結合構成要素で被覆された固体支持体
上記で考察されるように、本開示の装置は、固体支持体を含み得る。種々の固体支持体が使用され得る。ある種の実施形態において、上記固体支持体は、スワブ、フィルター、ビーズ、ラテラルフローストリップ、フィルターストリップ、フィルターディスク、フィルターペーパー、または細胞を培養するためにデザインされた薄いフィルム（例えば、３ＭによるＰｅｔｒｉＦｉｌｍ）を含み得る。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、プラスチック材料を含む。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリ乳酸（ＰＬＡ）およびポリビニルクロリド（ＰＶＣ）を含む。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、検出される微生物に対して高親和性を有する細胞結合構成要素で被覆される。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、ポリスチレンビーズまたは類似のまたは他の材料（例えば、ポリ乳酸）で作製されたビーズであり、その結果、上記ビーズは、タンパク質でコーティングされ得るが、上記アッセイにおいて他の構成要素と反応しない。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、上記ビーズは、特定の微生物に結合する複数の細胞結合構成要素（ＣＢＣ）は、上記ビーズに付着され得るように十分大きい。上記ビーズはまた、これが最初に上記装置のチューブの中に嵌まるように、適切なサイズのものであるべきである。例えば、上記ビーズは、直径が、０．１〜１００ｍｍ、１〜１０ｍｍ、または４〜８ｍｍ、または６〜７ｍｍのサイズ範囲に及び得る。上記固体支持体あたりのＣＢＣの量は、変動し得る。それは概して上記ビーズのサイズ、および上記サンプル中の上記最近の濃度にも依存する。いくつかの実施形態において、各ビーズ上のＣＢＣの量は、少なくとも５×１０７、または少なくとも５  ×１０８、または少なくとも５×１０１０、または少なくとも５×１０１３、または少なくとも５×１０１４、または少なくとも５×１０１６個の分子であり得る。
【０１８４】
上記装置の固体支持体上に被覆されたＣＢＣは、高親和性で目的の微生物に結合し得、従って、上記固体支持体が捕捉し得る微生物の量を富化し得る。例えば、ある種の実施形態において、上記ＣＢＣは、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉに高度に特異的である。一実施形態において、上記ＣＢＣは、１００種を超える細菌の他のタイプの存在下で、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、またはＥ．ｃｏｌｉを区別し得る。一実施形態において、上記ＣＢＣは、１００種を超える細菌の他のタイプの存在下で、細菌の種内の特定の血清型（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｏ１５７：Ｈ７）を区別し得る。ある種の実施形態において、上記ＣＢＣで被覆した固体支持体を含む装置を使用する方法は、上記サンプル中の特定のタイプの１個の細菌を検出するために使用され得る。ある種の実施形態において、上記ＣＢＣは、上記サンプル中の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１５個、２０個、３０個、４０個、５０個、６０個、７０個、８０個、９０個または１００個程度の少なさの特定の細菌を検出する。従って、ある種の実施形態において、上記方法は、サンプルに存在する上記微生物の≦１０個の細胞（すなわち、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個の微生物）、または≦２０個、または≦３０個、または≦４０個、または≦５０個、または≦６０個、または≦７０個、または≦８０個、または≦９０個、または≦１００個、または≦２００個、または≦５００個、または≦１０００個の細胞を検出し得る。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、タンパク質であり、本開示において微生物検出タンパク質ともいわれる。いくつかの実施形態において、ＣＢＣは、グラム陽性細菌の細胞壁に結合するタンパク質である。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、特異的微生物（グラム陰性細菌を含む）の外側表面に付着させるために使用されるファージテールタンパク質である。いくつかの実施形態において、上記ファージテールタンパク質は、ファージラムダテールタンパク質である。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、上記微生物の検出に特異的なバクテリオファージから単離された遺伝子フラグメントを発現させることによって生成されるタンパク質である。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、特定のタイプの微生物を捕捉するために使用されるＣＢＣは、特定のバクテリオファージ、例えば、Ｔ７、Ｔ４または別の類似のファージに由来し得る。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、上記細菌のファージによってコードされ、発現されるリシン（ｌｙｓｉｎ）であり得る。バクテリオファージＣＢＣはまた、Ｔ４様、Ｔ７様、ＶｉＩ、ＶｉＩ様、ＡＲ１、Ａ５１１、Ａ１１８、Ａ００６、Ａ５００、ＰＳＡ、Ｐ３５、Ｐ４０、Ｂ０２５、Ｂ０５４、Ａ９７、ｐｈｉＳＭ１０１、ｐｈｉ３６２６、ＣＢＡ１２０、ＳＰＮ１Ｓ、１０、ｅｐｓｉｌｏｎ１５、Ｐ２２、ＬｉｐＺ５、Ｐ４０、ｖＢ＿ＬｍｏＭ＿ＡＧ２０、Ｐ７０、Ａ５１１、Ｐ４Ｗ、Ｋ、Ｔｗｏｒｔ、またはＳＡ９７に由来し得る。
【０１８７】
場合によっては、上記ＣＢＣは、レセプター結合タンパク質であって、これを通じてファージが特定の細菌を結合し得るものであり得る。ＲＢＰと細菌の細胞表面との相互作用は、ＲＢＰ特異性を決定する。いくつかのファージにおいて、ＲＢＰは、テールシャフト、尾部繊維またはテールスパイクに位置する。ファージ尾部繊維タンパク質は、細胞表面への吸着およびポリサッカリド分解の両方において役割を果たす。テールスパイクタンパク質は、多くのバクテリオファージのテールの構成要素である。テールスパイクタンパク質は、細菌宿主の細胞表面に結合し、細菌宿主認識を媒介する。従って、いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、上記微生物に特異的なバクテリオファージの尾部繊維、テールスパイクであり得る。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、エンドリシン、ホリン、スパニン、または高親和性で上記微生物に結合し得るその機能的結合ドメインのうちの１種またはこれより多くであり得る。これらの３種のタンパク質は、バクテリオファージによってコードされ、一緒に、ファージ溶解サイクルの間の子孫放出を担う。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、エンドリシンの細胞壁結合ドメイン（「ＣＢＤ」）を含み、これは、上記バクテリオファージが高親和性で上記細菌を認識することを可能にする。いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、上記微生物を結合することを担う保存されたアミノ酸配列を含む。代表的には、上記ＣＢＤは、Ｃ末端に位置するが、Ｎ末端またはいくつかの場合には中央のドメインとしても見出され得る。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、エンドリシン、ホリン、スパニン、ｏ−スパニン（例えば、ＲＺ１）、テールスパイク、および尾部繊維、またはその機能的結合ドメインからなる群より選択されるタンパク質と実質的アミノ酸配列同一性を共有するタンパク質であり得る。機能的結合ドメインは、結合機能／細菌特異性を担うポリペプチド内の保存されたアミノ酸配列であり得る。例えば、上記ＣＢＣは、エンドリシン（配列番号１；またはＹＰ＿００１４６８４５９）もしくはエンドリシンのＣＢＤ（配列番号２）、または上記目的の微生物に対して高親和性を有することは公知のタンパク質のうちのいずれかと少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を共有し得る。上記エンドリシンのＣＢＤを発現する例示的方法は、実施例６に示される。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、上記ＣＢＣは、ＤＮＡへと逆転写され得、発現ベクターへとクローニングするために合成され得る。上記ＣＢＣ発現ベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉへと形質転換され得、ＬＢ培地中で培養され得る。上記ＣＢＣの発現は、適切な誘導因子の添加によって誘導され得る。一実施形態において、イソプロピル１  β−Ｄ−１チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加が、上記ＣＢＣの発煙を誘導するために使用され得る。
【０１９１】
固体支持体を被覆するための種々の方法は、当該分野で周知である。一実施形態において、上記固体支持体は、ストレプトアビジンおよびビオチン化ＣＢＣを含み得、上記固体支持体の被覆は、ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を含む。場合によっては、上記ＣＢＣは、上記固体支持体の表面に付着されているアビジンへの結合を促進するために、アミンへと結合体化され得る。
【０１９２】
微生物を検出するための装置を使用する方法
本明細書で注記されるように、ある種の実施形態において、本発明は、上記微生物を検出する方法を包含し得、上記方法は、上記サンプルと固体支持体とを接触させ、その結果、上記微生物が上記固体支持体上に捕捉される工程、上記第１の区画からの組換えバクテリオファージと上記固体支持体上に捕捉された微生物とを、例えば、上記第１の区画のスナップアクションシールを破損することによって、接触させる工程を包含する。上記感染の間および／または後に、上記バクテリオファージは、上記インジケーター遺伝子を発現して、インジケーターを生成し、このインジケーターは、種々の検出デバイスによって検出され得る。いくつかの実施形態において、上記インジケーターの検出は、上記インジケーターと反応して、検出可能なシグナルを生成する基質の添加を要し得る。上記シグナルの存在は、上記サンプル中の上記微生物の存在を示す。
【０１９３】
代替の実施形態において、本発明は、上記微生物を検出する方法を包含し得、上記方法は、上記サンプルと固体支持体とを接触させ、その結果、上記微生物が上記固体支持体上に捕捉される工程、上記第１の区画からのＭＤＰと、上記固体支持体上に捕捉された微生物とを、例えば、上記第１の区画のスナップアクションシールを破損することによって、接触させる工程を包含する。上記ＭＤＰのインジケーター部分は、種々の検出デバイスによって検出され得る。いくつかの実施形態において、上記インジケーターの検出は、上記インジケーターと反応して、検出可能なシグナルを生成する基質の添加を要し得る。上記シグナルの存在は、上記サンプル中の上記微生物の存在を示す。
【０１９４】
サンプリング
いくつかの実施形態では、サンプルは、調製も、濃縮も、希釈もなしに、本発明の検出法において直接使用され得る。例えば、液体サンプル（ミルクおよびジュースが挙げられるが、これらに限定されない）は、直接アッセイされ得る。他の実施形態において、サンプルは、緩衝化溶液または細菌培養培地が挙げられ得るが、これらに限定されない溶液中で希釈または懸濁され得る。固体または半固体であるサンプルは、液体中の固体を細かく刻むか、混合するかもしくは浸軟することによって、液体中に懸濁され得る。いくつかの実施形態において、サンプルは、上記宿主細菌細胞へのＣＢＣ付着を促進するｐＨ範囲内に維持されるべきである。いくつかの実施形態において、好ましいｐＨ範囲は、細菌細胞へのバクテリオファージ付着に適したものであり得る。サンプルはまた、２価カチオンおよび１価カチオン（Ｎａ＋、Ｍｇ２＋、およびＫ＋が挙げられるが、これらに限定されない）の適切な濃度を含むべきである。
【０１９５】
好ましくは検出アッセイ全体を通じて、上記サンプルは、上記サンプル中に存在する任意の病原体細胞の生存性を維持する温度で維持される。バクテリオファージが細菌細胞に付着している工程の間に、上記サンプルを、バクテリオファージ活性を促進する温度で維持することは、好ましい。このような温度は、少なくとも約２５℃および約４５℃以下である。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、約３７℃で維持される。いくつかの実施形態において、上記サンプルは、ＣＢＣ結合または付着の間に、穏やかな混合または振盪に供される。
【０１９６】
アッセイは、種々の適切な非接種コントロールサンプルを含み得る。例えば、細菌のない非接種コントロールサンプル、例えば、食品サンプルは、バックグラウンドシグナルレベルのコントロールとしてアッセイされ得る。
【０１９７】
サンプリングは、種々の方法を使用して行われ得る。いくつかの実施形態において、上記サンプル、例えば、食品サンプルは、最初に液化され、上記固体支持体、例えば、上記固体支持体またはビーズは、上記液体サンプルに浸漬される。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、サンプリングの前に、チューブ中の培養培地中に最初に浸漬される。いくつかの実施形態において、上記固体支持体は、サンプリングの前に乾燥している。いくつかの実施形態において、上記液体サンプルは、ある期間にわたって、例えば、２４時間未満、１２時間未満最初に培養され（「培養富化」）、９時間もしくはこれ未満、８時間もしくはこれ未満、７時間もしくはこれ未満、６時間もしくはこれ未満、５時間もしくはこれ未満、４時間もしくはこれ未満、３時間もしくはこれ未満、または２時間もしくはこれ未満の富化期間より短い。
【０１９８】
他の実施形態において、上記サンプルは、上記固体支持体上での上記微生物の捕捉後に富化され得る。いくつかの実施形態において、微生物を有する上記固体支持体は、上記微生物が数において拡大することを可能にするために。上記装置の第３の区画中の増殖培地中でインキュベートされる。この工程は、インキュベーション富化といわれる。このような実施形態において、上記富化期間は、上記サンプルタイプおよびサイズに応じて、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、または８時間までまたはこれより長い可能性がある。
【０１９９】
本発明の方法のいくつかの実施形態において、上記微生物は、サンプルからの上記微生物のいかなる単離も精製もなしに検出され得る。例えば、ある種の実施形態において、１個またはこれより多くの目的の微生物を含むサンプルは、上記固体支持体に直接適用され得、上記アッセイは、上記装置において行われる。
【０２００】
感染
本明細書で開示される方法は、上記装置を作動させて、上記組換えバクテリオファージに上記目的の微生物と接触させる工程を包含する。上記微生物の接触の際に、上記バクテリオファージは複製し、上記インジケーター遺伝子またはレポーター遺伝子を発現させる。「組換えバクテリオファージ」という標題の節を参照のこと。感染時間、すなわち、上記サンプルが最初にバクテリオファージと接触される時点と、上記基質が上記混合物に添加される時点との間の期間は、バクテリオファージのタイプおよび上記サンプル中の微生物の濃度に依存して変動し得る。上記細菌が固体支持体上に捕捉される装置を使用すると、感染に必要とされる時間が有意に低減され得る。例えば、上記感染時間は、１時間またはこれ未満であり得る一方で、固体支持体が上記細菌を捕捉するために使用されない標準的なアッセイでは、上記感染は、代表的には、少なくとも４時間であり、ある種の実施形態において、本明細書で開示される方法の感染時間は、６．０時間未満、５．０時間未満、４．０時間未満、３．０時間未満、２．５時間未満、２．０時間未満、１．５時間未満、１．０時間未満、４５分未満、または３０分未満である。いくつかの実施形態において、上記感染時間は、約１時間、約２時間、または約３時間である。
【０２０１】
シグナルの発生
上記インジケーターは、上記インジケーター遺伝子の発現によって生成され、当業者に周知の方法を使用して検出され得る。例えば、１個またはこれより多くのシグナル生成構成要素は、検出可能なシグナルを生成するために上記インジケーターと反応させられ得る。いくつかの実施形態において、上記インジケーターは、生体発光化合物であり得る。上記インジケーターが酵素である場合、上記検出可能なシグナルの増幅は、上記酵素と１種もしくはこれより多くの基質またはさらなる酵素および基質とを反応させて、検出可能な反応生成物を生成することによって得られる。代替のシグナル生成システムにおいて、上記インジケーターは、上記検出可能なシグナルを生成するために上記インジケーターの酵素操作が要求されない蛍光化合物であり得る。例えば、フルオレセインおよびローダミン、ならびにこれらの誘導体およびアナログが挙げられる蛍光分子は、このようなシステムにおいてインジケーターとしての使用に適している。さらに別の代替の実施形態において、上記インジケーター部分は、補因子であり得、上記検出可能なシグナルの増幅は、上記補因子と上記酵素および１種もしくはこれより多くの基質またはさらなる酵素および基質とを反応させて、検出可能な反応生成物を生成することによって得られる。いくつかの実施形態において、上記検出可能なシグナルは、発色性である。特定のインジケーターの選択は、本発明によって重要ではなく、上記インジケーターは、それ自体が検出可能なシグナルを生成し得るか、または機器が検出可能であり得るか、または１もしくはこれより多くのさらなるシグナル生成構成要素（例えば、酵素／基質シグナル生成システム）とともに検出可能であり得るかのいずれかであることが注記される。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、上記検出する工程は、上記インジケーター酵素が作用する基質の添加を必要とする。基質は、種々の方法で添加され得る。いくつかの実施形態において、上記基質は、上記装置の第２の区画に含まれ、上記スナップアクションシールを破損すると、上記ファージ（上記装置における第１の区画の中にある）および基質が、上記微生物（上記固体支持体上に捕捉される）と同時に接触することを引き起こす。図１２を参照のこと。いくつかの実施形態において、上記スナップアクションシールは、逐次的に破損され、上記基質と接触させる前に、上記微生物を上記バクテリオファージと接触させる。図１３Ａおよび１３Ｂを参照のこと。いくつかの実施形態において、上記方法は、上記ストップ−ロックを、段階的な混合を可能にするように操作して、その結果、上記微生物が、上記基質と接触させる前に、バクテリオファージと接触させる工程を包含する。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）と基質との反応は、３０分またはこれより長く継続し得、種々の時点での検出は、感度を最適化するために望ましいものであり得る。いくつかの実施形態において、ルミノメーター読み取りは、最初に、および反応が完了するまで３分間隔、または５分間隔、または１０分間隔、または１５分間隔で行われ得る。
【０２０４】
シグナルの検出
上記インジケーターによって生成されるシグナルの検出は、光の放射を検出する工程を包含し得る。いくつかの実施形態において、上記基質が上記試験サンプルと混合される装置の区画は、透明であり、その結果、上記感染およびその後の基質とのインキュベーションから生じる任意のシグナルは、目に見える。この場合に、上記シグナルは、上記区画の壁を通して検出され得る。いくつかの実施形態において、上記反応したサンプルを含む装置は、上記生じるシグナルを検出するための機器へと挿入される。他の実施形態において、検出機器は、上記反応したサンプルを含む装置をスキャンするために使用される。
【０２０５】
いくつかの実施形態において、ルミノメーターは、上記インジケーター（例えば、ルシフェラーゼ）を検出するために使用され得る（例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）のＧｌｏＭａｘ（登録商標）  ２０／２０およびＧｌｏＭａｘ（登録商標））。いくつかの実施形態において、分光光度計、ＣＣＤカメラ、またはＣＭＯＳカメラが、色の変化および他の光の放射を検出するために使用され得る。検出にとって絶対ＲＬＵが重要であるが、単一細胞または少数の細胞が確実に検出されるためにはシグナル対バックグラウンド比も高い（例えば、＞２．０、＞２．５または＞３．０）ことが必要である。上記バックグラウンドシグナルは、上記で記載されるものと同じ手順を使用して、微生物を含まない非接種コントロールサンプルを測定することによって得られ得る。いくつかの実施形態において、上記レポーターまたはインジケーター遺伝子からのシグナルの検出は、例えば、フォトダイオードまたはＰＭＴ（光電子倍増管）技術を使用する機器の使用を含み得る。いくつかの実施形態において、シグナルの検出のために携帯型ルミノメーターが使用され得る。適切なＰＭＴ携帯型ルミノメーターは、３Ｍ（Ｍａｐｌｅｗｏｏｄ，  ＭＮ）、ＢｉｏＣｏｎｔｒｏｌ（Ｓｅａｔｔｌｅ，  ＷＡ）、およびＣｈａｒｍ  Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｌａｗｒｅｎｃｅ，  ＭＡ）から入手可能である。適切なフォトダイオード携帯型ルミノメーターは、Ｈｙｇｉｅｎａ（Ｃａｍａｒｉｌｌｏ，  ＣＡ）およびＮｅｏｇｅｎ（Ｌａｎｓｉｎｇ，  ＭＩ）から入手可能である。これらの携帯型ルミノメーターは、代表的には、同じサンプルに関して、旧来のルミノメーター（ＧｌｏＭａｘまたはＧｌｏＭａｘ  ２０／２０）と比較して、遙かに低い読み取りを生じる。実施例に示されるように、多数の実験から、上記反応によって生成されるシグナルが、これらの携帯型ルミノメーターによって検出されるために十分であったことが示される。上記アッセイを、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａを含む異なるタイプの微生物で複数回反復したところ、類似の結果が毎回観察された。これは、上記装置を使用する検出方法が、十分に感度が高くかつ頑強であることを示す。これらの携帯型デバイスを使用して、上記微生物を検出できることはまた、旧来の非携帯型検出デバイスを使用する検出方法ではしばしば欠いている、便利さおよび融通性を提供する。
【０２０６】
本発明のシステムおよびキット
いくつかの実施形態において、本発明は、本明細書で開示される方法を行うための構成要素を含むシステム（例えば、自動化システムもしくはキット）を含む。いくつかの実施形態において、本発明によるシステムまたはキットには装置が含まれる。本明細書に記載される方法は、このようなシステムまたはキットも利用し得る。本明細書で記載されるいくつかの実施形態は、上記方法を行うために必要とされる試薬および材料の最小限の量を考慮すると、自動化もしくはキットに特に適している。ある種の実施形態において、上記キットの構成要素の各々は、第１の部位から第２の部位へと送達可能である自己充足式ユニットを含み得る。
【０２０７】
いくつかの実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物の迅速検出のためのシステムもしくはキットを含む。上記システムまたはキットは、ある種の実施形態において以下を含み得る：上記で記載されるとおりの装置であって、ここで上記固体支持体は、上記で記載されるとおりの細胞結合構成要素を含む装置、およびシグナル検出構成要素であって、ここで上記シグナル検出構成要素は、上記サンプルに上記組換えバクテリオファージを感染させることから生成される上記インジケーター遺伝子生成物を検出し得るシグナル検出構成要素。いくつかの実施形態において、上記シグナル検出構成要素は、携帯型デバイスである。いくつかの実施形態において、上記シグナル検出構成要素は、携帯型ルミノメーターである。
【０２０８】
従って、ある種の実施形態において、本発明は、以下を含むサンプル中の目的の微生物の迅速な検出のためのシステムまたはキットを含み得る：  バクテリオファージゲノムに挿入される遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画を含む装置であって、ここで上記構築物は、プロモーターおよびインジケーター遺伝子を含む装置。上記システムまたはキットは、基質を含む第２の区画および／または培地を含む第３の区画をさらに含む。これらの区画のうちの１つまたはこれより多くは、シールされ、上記装置の他の部分からスナップアクションシールによって分離され、上記スナップアクションシールを破損させると、上記区画からの内容物が上記区画から出て、上記サンプルと混合される。
【０２０９】
いくつかの実施形態において、上記システムは、上記目的の微生物を、上記サンプル中の他の構成要素から単離するための構成要素を含み得る。
【０２１０】
いくつかのシステムおよび／またはキットにおいて、同じ構成要素は、複数工程（multiple  steps）のために使用され得る。いくつかのシステムおよび／またはキットにおいて、上記工程は、ユーザーによってコンピューター入力を介して自動化もしくは制御され、そして／または液体取り扱いロボットが少なくとも１つの工程を行う。コンピューター化システムにおいて、上記システムは、完全に自動化されていても、半自動化されていても、もしくはコンピューターを介してユーザーによって指示されてもよい（もしくはこれらのいくつかの組み合わせ）。
【０２１１】
本発明のこれらのシステムおよびキットは、種々の構成要素を含む。本明細書で使用される場合、用語「構成要素」とは、広く定義され、記載される方法を実施するための任意の適した装置もしくは適した装置の集まりを含む。上記構成要素は、いかなる特定の方法においても互いに関して一体的に接続される必要も据え付けられる必要もない。本発明は、互いに関して上記構成要素の任意の適切な配置を含む。例えば、上記構成要素は、同じ空間の中に存在する必要はない。しかしいくつかの実施形態において、上記構成要素は、一体ユニットにおいて互いに接続される。いくつかの実施形態において、同じ構成要素は、複数機能を実行し得る。
【０２１２】
コンピューターシステムおよびコンピューター可読媒体
ある種の実施形態において、本発明は、システムを含み得る。上記システムは、本発明の組成物のうちの少なくともいくつかを含み得る。また、上記システムは、上記方法を行うために上記構成要素のうちの少なくともいくつかを含み得る。ある種の実施形態において、上記システムは、キットとして編成される（formulated）。従って、ある種の実施形態において、本発明は、サンプル中の目的の微生物の迅速検出のためのシステムを包含し得る。上記システムは、本発明の組成物のうちの少なくともいくつかを含み得る。また、上記システムは、上記方法を行うための構成要素のうちの少なくともいくつかを含み得る。ある種の実施形態において、上記システムは、キットとして編成される（formulated）。従って、ある種の実施形態において、本発明は、上記に記載されるとおりの装置を含む、サンプル中の目的の微生物の迅速検出のためのシステムを包含し得る。例えば、上記装置は、バクテリオファージゲノムに挿入される遺伝子構築物を有する組換えバクテリオファージを含む第１の区画であって、ここで上記構築物は、プロモーターおよびインジケーター遺伝子を含み；ここで上記固体支持体は細胞結合構成要素を含む第１の区画を含み得る。いくつかの実施形態において、上記システムはまた、携帯型検出デバイスを含む。
【０２１３】
上記システムは、現在の技術もしくはその構成要素のうちのいずれかにおいて記載されるように、コンピューターシステムの形態で具現化され得る。コンピューターシステムの代表例としては、汎用コンピューター、プログラムされたマイクロプロセッサ、マイクロコントローラー、周辺集積回路素子、および本技術の方法を構成する工程を実装し得る他のデバイスもしくはデバイスの配置が挙げられる。
【０２１４】
コンピューターシステムは、コンピューター、入力デバイス、ディスプレイユニット、および／もしくはインターネットを含み得る。上記コンピューターは、マイクロプロセッサをさらに含み得る。上記マイクロプロセッサは、通信バスへと接続され得る。上記コンピューターはまた、メモリを含み得る。上記メモリは、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）およびリードオンリーメモリ（ＲＯＭ）を含み得る。上記コンピューターシステムは、記憶デバイスをさらに含み得る。上記記憶デバイスは、ハードディスクドライブもしくはリムーバル記憶デバイス（例えば、フロッピー（登録商標）ディスクドライブ、光学ディスクドライブなど）であり得る。上記記憶デバイスはまた、コンピュータープログラムもしくは他の指示を上記コンピューターシステムへとロードするための他の類似の手段であり得る。上記コンピューターシステムはまた、通信ユニットを含み得る。上記通信ユニットは、Ｉ／Ｏインターフェイスを通じて、上記コンピューターが他のデータベースおよびインターネットに接続することを可能にする。上記通信ユニットは、他のデータベースへの転送、ならびに他のデータベースからのデータの受領を可能にする。上記通信ユニットは、モデム、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）カード、もしくは上記コンピューターシステムをデータベースおよびネットワーク（例えば、ＬＡＮ、ＭＡＮ、ＷＡＮおよびインターネット）に接続することを可能にする任意の類似のデバイスを含み得る。上記コンピューターシステムは、従って、Ｉ／Ｏインターフェイスを介して上記システムへとアクセス可能な入力デバイスを通じてユーザーからの入力を容易にし得る。
【０２１５】
コンピューティングデバイスは、代表的には、そのコンピューティングデバイスの一般管理およびオペレーションのための実行可能なプログラム指示を提供するオペレーティングシステムを含み、代表的には、サーバーのプロセッサによって実行される場合に、上記コンピューティングデバイスにその意図された機能を行わせる指示を記憶するコンピューター可読記憶媒体（例えば、ハードディスク、ランダムアクセスメモリ、リードオンリーメモリなど）を含む。上記オペレーティングシステムに適した実装および上記コンピューティングデバイスの一般的な機能性は、公知であるかもしくは市販されており、当業者によって、特に本明細書の開示に鑑みて、容易に実装される。
【０２１６】
上記コンピューターシステムは、入力データを処理するために、１以上の記憶素子の中に記憶される一群の指示を実行する。上記記憶素子はまた、記載されるとおりのデータもしくは他の情報を保持し得る。上記記憶素子は、処理機械に存在する情報ソースもしくは物理的メモリ素子の形態にあり得る。
【０２１７】
環境は、上記で考察されるとおりの種々のデータストアならびに他のメモリおよび記憶媒体を含み得る。これらは、種々の位置に存在し得る（例えば、上記コンピューターのうちの１以上にローカルな（および／もしくは中に存在する）、またはネットワーク全体にわたって記コンピューターのうちのいずれかもしくはすべてから遠隔にある記憶媒体において）。実施形態の特定の一群において、情報は、当業者が精通しているストレージエリアネットワーク（「ＳＡＮ」）に存在し得る。同様に、上記コンピューター、サーバー、もしくは他のネットワークデバイスに帰した機能を行うための任意の必須のファイルは、適切な場合、ローカルにおよび／もしくは遠隔に保存され得る。システムが、コンピューティングデバイスを含む場合、各々のこのようなデバイスは、バスを介して電気的に連結され得るハードウェア要素を含み得、上記要素は、例えば、少なくとも１つの中央処理装置（ＣＰＵ）、少なくとも１つの入力デバイス（例えば、マウス、キーボード、コントローラー、タッチスクリーン、もしくはキーパッド）、および少なくとも１つの出力デバイス（例えば、ディスプレイデバイス、プリンター、もしくはスピーカー）を含む。このようなシステムはまた、１つ以上の記憶デバイス（例えば、ディスクドライブ、光学記憶デバイス、およびソリッドステート記憶デバイス（例えば、ランダムアクセスメモリ（「ＲＡＭ」）もしくはリードオンリーメモリ（「ＲＯＭ」）、ならびにリムーバブルメディアデバイス、メモリカード、フラッシュカードなどを含み得る。
【０２１８】
このようなデバイスはまた、コンピューター可読記憶媒体リーダー、通信デバイス（例えば、モデム、ネットワークカード（無線もしくは有線）、赤外線通信デバイスなど）、および上記のとおりのワーキングメモリを含み得る。上記コンピューター可読記憶媒体リーダーは、遠隔、ローカル、固定、および／もしくはリムーバブル記憶デバイスを代表するコンピューター可読記憶媒体、ならびにコンピューター可読情報を一時的におよび／もしくはより恒久的に含む、記憶する、伝達する、および検索するための記憶媒体と接続され得るかまたはこれらを受容するように構成され得る。上記システムおよび種々のデバイスはまた、代表的には、オペレーティングシステムおよびアプリケーションプログラム（例えば、クライアントアプリケーションもしくはウェブブラウザ）を含む、少なくとも１つのワーキングメモリデバイス内に位置した多くのソフトウェアアプリケーション、モジュール、サービス、もしくは他の要素を含む。代替の実施形態が、上記のものからの多くのバリエーションを有し得ることは認識されるべきである。例えば、カスタマイズされたハードウェアがまた使用され得る、および／または特定の要素が、ハードウェア、ソフトウェア（ポータブルソフトウェア（例えば、アプレット）を含む）、または両方において実装され得る。さらに、他のコンピューティングデバイス（例えば、ネットワーク入力／出力デバイス）への接続が使用され得る。
【０２１９】
コード、もしくはコードの一部を含むための非一時的な記憶媒体およびコンピューター可読媒体としては、当該分野で公知であるかもしくは使用される任意の適切な媒体（記憶媒体および通信媒体（例えば、コンピューター可読の指示、データ構造、プログラムモジュール、もしくは他のデータなどの情報の記憶および／または伝達のための任意の方法または技術において実装される、揮発性および不揮発性、リムーバブルおよび非リムーバブルの媒体が挙げられるが、これらに限定されない）を含む）が挙げられ得、これらとしては、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリもしくは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多目的ディスク（ＤＶＤ）もしくは他の光学記憶、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶もしくは他の磁気記憶デバイス、または所望の情報を記憶するために使用され得、上記システムデバイスによってアクセスされ得る任意の他の媒体が挙げられる。上記開示および本明細書に提供される教示に基づいて、当業者は、上記種々の実施形態を実装するための他のやり方および／または方法を認識する。
【０２２０】
コンピューター可読媒体は、プロセッサにコンピューター可読指示を提供することができる電子式、光学式、磁気、もしくは他の記憶デバイスを含み得るが、これらに限定されない。他の例としては、以下が挙げられるが、これらに限定されない：フロッピー（登録商標）ディスク、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク、メモリチップ、ＲＯＭ、ＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＲＡＭ、連想メモリ（「ＣＡＭ」）、ＤＤＲ、フラッシュメモリ（例えば、ＮＡＮＤフラッシュもしくはＮＯＲフラッシュ、ＡＳＩＣ、構成されたプロセッサ、光学記憶媒体、磁気テープもしくは他の磁気記憶媒体、またはコンピュータープロセッサが指示を読み得る任意の他の媒体。一実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、コンピューター可読媒体（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ））の単一タイプを含み得る。他の実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、コンピューター可読媒体（例えば、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、ディスクドライブ、およびキャッシュ）のうちの２またはそれより多くのタイプを含み得る。上記コンピューティングデバイスは、１またはそれより多くの外付けのコンピューター可読媒体（例えば、外付けハードディスクドライブ、または外付けＤＶＤもしくはブルーレイドライブ）と通信状態にあり得る。
【０２２１】
上記で考察されるように、上記実施形態は、コンピューター実行可能なプログラム指示を実行および／またはメモリに記憶された情報にアクセスするように構成されているプロセッサを含む。上記指示は、任意の適切なコンピュータープログラミング言語（例えば、Ｃ、Ｃ＋＋、Ｃ＃、Ｖｉｓｕａｌ  Ｂａｓｉｃ、Ｊａｖａ（登録商標）、Ｐｙｔｈｏｎ、Ｐｅｒｌ、ＪａｖａＳｃｒｉｐｔ（登録商標）、およびＡｃｔｉｏｎＳｃｒｉｐｔ（Ａｄｏｂｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，  Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，  Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる）で書かれたコードから、コンパイラおよび／もしくはインタープリターによって生成されたプロセッサ特異的指示を含み得る。一実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、単一のプロセッサを含む。他の実施形態において、上記デバイスは、２またはそれより多くのプロセッサを含む。このようなプロセッサは、マイクロプロセッサ、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、および状態機械を含み得る。このようなプロセッサは、プログラマブル電子デバイス（例えば、ＰＬＣ）、プログラマブル割り込みコントローラー（ＰＩＣ）、プログラマブルロジックデバイス（ＰＬＤ）、プログラマブルリードオンリーメモリ（ＰＲＯＭ）、電子的にプログラム可能なリードオンリーメモリ（electronically  programmable  read-only  memory）（ＥＰＲＯＭもしくはＥＥＰＲＯＭ）、または他の類似のデバイスをさらに含み得る。
【０２２２】
上記コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェイスを含む。いくつかの実施形態において、上記ネットワークインターフェイスは、有線もしくは無線の通信リンクを介して通信するように構成されている。例えば、上記ネットワークインターフェイスは、Ｅｔｈｅｒｎｅｔ（登録商標）、ＩＥＥＥ  ８０２．１１（Ｗｉ−Ｆｉ）、８０２．１６（Ｗｉ−Ｍａｘ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ（登録商標）、赤外線などを介して、ネットワーク上での通信を可能にし得る。別の例として、ネットワークインターフェイスは、ネットワーク（例えば、ＣＤＭＡ、ＧＳＭ（登録商標）、ＵＭＴＳ、もしくは他の携帯通信ネットワーク（ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎ  ｎｅｔｗｏｒｋ））上での通信を可能にし得る。いくつかの実施形態において、上記ネットワークインターフェイスは、別のデバイスでの、例えば、ユニバーサルシリアルバス（ＵＳＢ）、１３９４  ＦｉｒｅＷｉｒｅ、シリアル接続もしくはパラレル接続、または類似のインターフェイスを介したポイントツーポイント接続を可能にし得る。適切なコンピューティングデバイスのいくつかの実施形態は、１以上のネットワーク上での通信のための２以上のネットワークインターフェイスを含み得る。いくつかの実施形態において、上記コンピューティングデバイスは、ネットワークインターフェイスに加えてもしくはその代わりに、データストアを含み得る。
【０２２３】
適切なコンピューティングデバイスのいくつかの実施形態は、多くの外付けもしくは内部デバイス（例えば、マウス、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、キーボード、ディスプレイ、オーディースピーカー、１以上のマイクロフォン、または任意の他の入力もしくは出力デバイス）を含み得るかまたはこれらと通信状態にあり得る。例えば、上記コンピューティングデバイスは、種々のユーザーインターフェイスデバイスおよびディスプレイと通信状態にあり得る。上記ディスプレイは、任意の適切な技術（ＬＣＤ、ＬＥＤ、ＣＲＴなどが挙げられるが、これらに限定されない）を使用し得る。
【０２２４】
上記コンピューターシステムによる実行のための指示セットは、特定のタスク（例えば、本技術の方法を構成する工程）を行うための処理機械を指示する種々のコマンドを含み得る。上記指示セットは、ソフトウェアプログラムの形態にあり得る。さらには、上記ソフトウェアは、本技術におけるように、別個のプログラムの集まり、より大きなプログラムを有するプログラムモジュールもしくはプログラムモジュールの一部の形態にあり得る。上記ソフトウェアはまた、オブジェクト指向プログラミングの形態でのモジュラープログラミングを含み得る。処理機械による入力データの処理は、ユーザーコマンド、以前の処理の結果、もしくは別の処理機械によって作成されたリクエストに応じ得る。
【０２２５】
本発明は、ある種の実施形態を参照して開示されてきた一方で、記載される実施形態に対する多くの改変、変化および変更は、添付の特許請求の範囲で定義されるように、本発明の範囲および趣旨から逸脱することなく可能である。よって、本発明は、上記記載される実施形態に限定されないことは意図されるが、以下の特許請求の範囲の文言およびその均等物によって定義される全範囲を有する。
【実施例】
【０２２６】
以下の実施例は、結果までの時間が短縮された、少数の細胞、さらに単一細菌の検出を記載し、本発明を例証するが、限定しない。
【０２２７】
実施例１．  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓを検出するための組換えＭＤＰの作製
ＣＢＣをコードする遺伝子フラグメントを、ＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓファージＴｗｏｒｔ（ＧｅｎＢａｎｋ：  ＣＡＡ  ６９０２１．１）から単離し、ＤＮＡへと逆翻訳し、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）融合プラスミドへのクローニングのために商業的に合成した。Ｈｉｓ−ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐＥＴ−１５ｂ融合プラスミドを、停止コドンの変異および部位指向性変異誘発を介する制限エンドヌクレアーゼＸｈｏＩ部位の挿入によって作製した。次いで、７５アミノ酸をコードする上記ＣＢＣ遺伝子フラグメントを、ＨＩＳ−ＮＡＮＯＬＵＣ−ｐＥＴ１５ｂプラスミドのＢａｍＨＩ−ＸｈｏＩ制限酵素部位へとクローニングしたところ、Ｎ末端ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）−Ｓ．Ａｕｒｅｕｓ  ＣＢＣ構築物（ＭＤＰ）が生じた。上記ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）−ＣＢＣ構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株（ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳへと形質転換した。上記形質転換した細胞を、液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃において光学密度（ＯＤ）０．５〜１．０になるように培養した。上記ＭＤＰの発現を、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導した。上記培養物を、３７℃で５時間、インキュベートしながら振盪した。
【０２２８】
実施例２．  スピンカラムフィルターを使用した、ＭＤＰを介する細菌検出
例示的実験において、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ａ３００を、Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉブロス（ＬＢ）中、３７℃で振盪しながら増殖させた。ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）−ＣＢＣを、１μｇ／ｍｌに希釈した。
【０２２９】
サンプル各１ｍＬにつき、０．１ｍＬをフィルターに三連で添加した。フィルターを６００ｇで１分間遠心した。次に、ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）−ＣＢＣ融合タンパク質の各々４０μＬを、各フィルターに添加し、続いて、室温において１５分間インキュベートした。フィルターを、４００μＬ  ＰＢＳを添加することによって２回洗浄し、続いて、６００ｇにおいて１分間遠心分離した。次に、１５０μＬ  ＬＢを添加し、懸濁物をＬＵＭＩＴＲＡＣ（登録商標）  ２００  ９６ウェルルミノメータープレートに移し、ルシフェラーゼアッセイを、１００μＬ  ＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）を注入して、Ｐｒｏｍｅｇａルミノメーターにおいて行った。シグナル対バックグラウンド比を、各ウェルのシグナルをゼロ細胞コントロールのシグナルの平均によって除算することによって得た。
【０２３０】
実施例３  ９６ウェルフィルタープレートを使用した、ＭＤＰを介する細菌検出
ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）−ＣＢＣ融合タンパク質を、１μｇ／ｍｌに希釈した。各サンプルにつき、０．１５０ｍＬを９６ウェルフィルタープレートの多数のウェルに添加した。上記９６ウェルフィルタープレートを、１２００ｒｐｍ（２６３ｒｃｆ）において３分間遠心した。次に、１００μＬの１μｇ／ｍｌ  ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）−ＣＢＣ  ＭＤＰを各フィルターに添加し、室温において１５分間インキュベートした。上記細胞を、３００μＬ  ＰＢＳの添加によって２回洗浄し、続いて、６００ｇにおいて１分間遠心分離して、結合していないＭＤＰを除去した。上記ルシフェラーゼアッセイを、１００μＬ  ＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）を注入して、Ｐｒｏｍｅｇａルミノメーターを使用して、元のフィルタープレートの中で直接行い、プレートを、ＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）基質の添加の３分後に読み取った。シグナル対バックグラウンド比を、各ウェルのシグナルをゼロ細胞コントロールのシグナルの平均によって除算することによって得た。
【０２３１】
実施例４  ９６ウェルプレートを使用した、ＭＤＰを介するＬｉｓｔｅｒｉａ検出
ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）−ＣＢＣ融合タンパク質を、１μｇ／ｍｌに希釈する。１００μＬ  サンプルを、ＧｔｘＬｉｓｔｅｒｉａで被覆した９６ウェルプレートに移す。サンプルの最小細胞濃度は、１０細胞／ｍｌである。１０細胞／ｍＬ未満の細胞濃度を有するサンプルを、試験する前に富化する。次いで、サンプルを、上記９６ウェルプレートにおいて３０分間、３０℃でインキュベートする。インキュベーション後、上記プレートを、３００μｌ  ＰＢＳで３回洗浄する。次に、１００μＬの１μｇ／ｍｌ  ＮＡＮＯＬＵＣ（登録商標）−ＣＢＣ  ＭＤＰを各ウェルに添加し、室温において１５分間、インキュベートする。上記細胞を、３００μＬ  ＰＢＳを添加することによって２回洗浄して、結合していないＭＤＰを除去する。上記ルシフェラーゼアッセイを、１００μＬ  ＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）を注入して、Ｐｒｏｍｅｇａルミノメーターを使用して、元のプレートの中で直接行い、プレートを、ＮＡＮＯ−ＧＬＯ（登録商標）基質の添加の３分後に読み取る。シグナル対バックグラウンド比を、各ウェルのシグナルをゼロ細胞コントロールのシグナルの平均によって除算することによって得る。
【０２３２】
実施例５．細菌培養物中の目的の微生物の検出
この実施例は、上記装置の使用が、細菌培養物中に存在する細菌を検出し得ることを実証する。
【０２３３】
装置のアセンブリ
１００μｌ  Ａ５１１／Ｐ１００ファージカクテル（１．２×１０ｅ９  Ｐｆｕ／ｍＬ）および１００μｌ  ＢＨＩ培地  ＋１ｍＭ  ＣａＣｌ２を、上記装置の一番上のバルブ（第１の区画）に添加した。Ａ５１１／ｐ１００ファージは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｃｙｔｏｇｅｎｅｓを標的化するファージである。固体支持体プレスを使用して、上記装置の一番上の構成要素を一緒に押し込んだ。上記装置チューブに、９００μｌ  ＢＨＩ培地  ＋  １ｍＭ  ＣａＣｌ２を満たした。次いで、上記固体支持体を上記装置チューブの中に配置して、いくらかの培地を吸収した。次いで、上記アセンブリした装置（培地中に浸漬した固体支持体を含む）を、４℃で一晩維持した。
【０２３４】
細菌培養物の増殖
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｃｙｔｏｇｅｎｅｓを、振盪インキュベーターにおいて、ＢＨＩ培地（Ｂｅｃｋｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，  Ｓｐａｒｋｓ，  ＭＤ，  ＵＳＡ）中で一晩増殖させた。次いで、上記一晩培養物を、ＢＨＩ培地中で対数増殖期まで３７℃において継代した。次いで、対数増殖期の細胞を、適切な細胞数へと希釈した（図３を参照のこと）。上記固体支持体を上記装置から除去し、希釈した培養物を、示されたＣＦＵレベルで上記固体支持体上に添加した。次いで、細菌または培地単独（コントロール）を添加した上記固体支持体を、装置チューブの中に戻し、上記チューブを穏やかに振盪して、内容物を混合した（図３，  表１）。
【０２３５】
類似の実験において、２つの固体支持体に、各々１０  ＣＦＵの上記細菌を添加した。非接種サンプルをコントロールとして使用した。これらのサンプルを３５℃で一晩インキュベートして、感染および基質曝露の前に細菌数を拡大させた（図３，  表２）。
【０２３６】
感染
次いで、スナップ−バルブを、固体支持体を固く保持し、拇指と示指とでバルブを破損することによって破損させた。ファージ（６×１０ｅ８  Ｐｆｕ／ｍＬが２００μｌ）を、固体支持体チューブの上で上記バルブを絞ることによって排出させた。上記固体支持体チューブ中の内容物を、くるくると渦を巻かせることによって穏やかに混合した。次いで、上記固体支持体を、上記細菌のファージ感染のために３０℃のインキュベーター中に４時間置いた。上記ＮａｎｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を、７０％  エタノールで１：４希釈し、１０μｌの希釈した基質を固体支持体チューブに添加した。上記装置チューブの内容物を、ボルテックスにかけることによって混合し、次いで、３分間静置した。
【０２３７】
検出
３種の検出方法を使用した。上記固体支持体チューブを、Ｈｙｇｉｅｎａ携帯型ルミノメーターへと挿入した。上記感染混合物のうちの１ｍＬを取り出し、１．５ｍＬ  微小遠心分離チューブに移して、ＧｌｏＭａｘ  ２０／２０ルミノメーター（「ＧｌｏＭａｘ  ２０／２０」）で読み取り、上記感染混合物のうちの１５０μｌを、９６ウェルプレートに移して、ＧｌｏＭａｘルミノメーター（「ＧｌｏＭａｘ」）で読み取った。
【０２３８】
次いで、検出を、培地中に一晩浸漬した固体支持体で、感染時間２時間で行った。上記結果を図５、表１および表２に示し、結果のグラフ表示を、図４Ａおよび４Ｂに示す。上記結果は、増殖富化なし（上記固体支持体で捕捉する前に上記サンプルの一晩培養なし）で、上記試験が、Ｈｙｇｉｅｎａ携帯型ルミノメーターで２５，０００  ＣＦＵを検出し（図４Ａ）（細菌接種サンプルの読み取りは、陽性サンプルに関する１０  相対発光単位（ＲＬＵ）基準という検出閾値を全て上回った）、ＧｌｏＭａｘ  ２０／２０またはＧｌｏＭａｘでおよそ５，０００  ＣＦＵを検出する（図４Ｂ）ために十分感度が高いことを示す。
【０２３９】
実施例６．シチメンチョウサンプル中での微生物の検出
装置のアセンブリ
上記装置を、一番上のバルブを１００μｌ  ＳＥＡ１／ＴＳＰ１ファージカクテル（１．２×１０ｅ７  Ｐｆｕ／ｍＬ）および１００μｌ  ＴＳＢ培地（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｏｘｏｉｄ，  Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎ，  ＮＹ  ＵＳＡ）で満たし、上記装置チューブを１ｍＬ  ＴＳＢ培地で満たしたことを除いて、実施例１に記載されるようにアセンブリした。ＳＥＡ１／ＴＳＰ１ファージは、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａを標的化するファージである。
【０２４０】
シチメンチョウ挽肉の細菌接種
Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ培養物を一晩増殖させ、以下で記載されるように高ＣＦＵサンプルおよび低ＣＦＵサンプルのために希釈した。
【０２４１】
シチメンチョウ挽肉の試験部分２５ｇを、３群に分けた：：  非接種群（５サンプル）、高接種群（５サンプル）、および低接種群（２０サンプル）。上記高接種群の２５ｇ  サンプルの各々に、２〜１０  ＣＦＵのＳａｌｍｏｎｅｌｌａを接種し、上記低接種群の各サンプルに、０．２〜２  ＣＦＵのＳａｌｍｏｎｅｌｌａを接種した。次いで、サンプルを、濾過した（ｆｉｌｔｅｒｅｄ）サンプルバッグに入れ、４℃において４８〜７２時間貯蔵した。
【０２４２】
接種したシチメンチョウ挽肉における細菌の富化
予め加温したＴＳＢ培地（４１℃）を、サンプル対培地比１：３において各サンプルに添加した。次いで、上記サンプルを、ＳＴＯＭＡＣＨＥＲ（登録商標）で、３０秒間ｈｉｇｈでブレンドし、次いで、振盪することなく２４時間、４１℃においてインキュベートして、上記サンプルにおいて細菌を富化した。
【０２４３】
サンプリング
上記試験サンプルを、上記固体支持体を各富化したサンプルへと浸し、１０秒間くるくると渦を巻かせて、サンプルの最大量を吸着させることによって得た。上記固体支持体を、ＴＳＢ培地で満たした装置チューブへと入れた。上記チューブを穏やかに振盪して、上記チューブ中の内容物を混合し、次いで、直ぐに感染させるか、または感染前に３７℃にさらに１時間置くかのいずれかを行った。
【０２４４】
感染
次いで、上記バクテリオファージを収容する区画のスナップバルブを、固体支持体をしっかりと保持し、拇指と示指とでバルブを破損することによって破損した。上記ファージ（６×１０ｅ６  Ｐｆｕ／ｍＬを２００μｌ）を、上記バルブを装置チューブの一番上で絞ることによって、上記チューブの中に出した。上記装置チューブ中の内容物を、くるくると渦を巻かせることによって穏やかに混合した。次いで、上記固体支持体を、上記細菌のファージ感染のために、３７℃のインキュベーター中に３０分間または２時間置いた。ＮａｎｏＧｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩ）を、７０％  エタノールで１：４希釈し、１０μｌの希釈した基質を上記装置チューブへと添加した。上記装置チューブの内容物を、ボルテックスにかけることによって混合し、次いで、３分間静置した。シグナルを、実施例１に記載されるように検出した。非接種サンプル（コントロール群）からの結果を表３に示し、接種サンプル（実験群）からの結果を表４に示す。上記結果のグラフ表示を、図６Ａおよび図６Ｂに示す。
【０２４５】
上記結果は、上記使用した３種の検出デバイスの各々が、２４時間培養富化の後にＳａｌｍｏｎｅｌｌａに関して陽性であった全シチメンチョウサンプルを検出できたことを示す。ＧｌｏＭａｘおよびＧｌｏＭａｘ  ２０／２０のシグナルは、Ｈｙｇｉｅｎａルミノメーターより遙かに高かった。インキュベーション時間（すなわち、上記細菌を捕捉している上記固体支持体と感染前の培地とのインキュベーション）および感染時間は、シグナル強度に影響を及ぼし得る要因である。試験した種々のさらなるインキュベーション時間および感染時間のうち、０時間のインキュベーション時間および２時間の感染時間が、最高のＲＬＵを生じ、続いて、１時間のインキュベーション時間および０．５時間の感染時間を有するサンプル、次いで、０時間のインキュベーション時間および０．５時間の感染時間を有するサンプルが続いた。上記結果はまた、０時間のインキュベ-ションおよび２時間の感染が、最低のバックグラウンドシグナルを有することを示す。
【０２４６】
実施例７．アッセイの感度に対する感染時間の影響を試験するためのさらなる研究
実験を、上記固体支持体を上記細菌のシチメンチョウサンプルに浸した後に、上記固体支持体を培地中に置き、直ぐに感染を行う、すなわち、上記固体支持体上の細菌を増殖させるためのインキュベーション時間がないことを除いて、実施例２に記載されるように設定した。感染時間は、３０分間から２時間まで変動させた。シグナルを、上記のように検出した。３種のサンプルの結果を図７に示し、データを図８Ａ〜８Ｃにプロットする。上記結果は、２時間の感染がサンプル２４およびサンプル２６に示されるようにシグナルを増大させ得ることを示し、３０分間では、Ｈｙｇｉｅｎａにおいてシグナルを示さなかったが、２時間の感染に関しては示した。
【０２４７】
図９Ａ〜９Ｃは、ＧｌｏＭａｘデバイスとＧｌｏＭａｘ  ２０／２０の異なるデバイスとの間での比較を示す。ＧｌｏＭａｘおよびＧｌｏＭａｘ  ２０／２０は、類似の結果を示した。
【０２４８】
実施例８．Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １９１１５環境スポンジサンプルの試験
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを、セラミックタイル表面に接種し、乾燥させ、室温において１８〜２４時間静置した。サンプルスポンジを使用して、上記セラミックタイルを拭い、スポンジを、３５℃で２４時間にわたって富化のためにバッグの中に入れた。次いで、上記固体支持体を使用して、実施例２に記載されるように上記富化したサンプルをサンプリングした。１００μｌ  Ｌｉｓｔｅｒｉａファージ（濃度１．２×１０ｅ８  ＰＦＵ／ｍｌ）を使用して、３０℃において１時間、上記細菌のシチメンチョウ培養物に感染させた。シグナルを、ＧｌｏＭａｘおよびＨｙｇｉｅｎａを使用して検出した。結果を図１０に示した。上記結果は、Ｈｙｇｉｅｎａ携帯型が、Ｌ．ｍｏｎｃｙｔｏｇｅｎｅｓ汚染された環境サンプルを検出し得ることを示す。
【０２４９】
実施例９．異なる検出デバイス
実験を、実施例２に記載されるように設定した。ファージ感染時間は、３７℃において１時間であった。シグナルを、ＧｌｏＭａｘ、３Ｍ携帯型ルミノメーター（「３Ｍ」）、およびＨｙｇｉｅｎａで読み取った。結果を図１１に示す。３Ｍが、シグナルを検出するにあたってより高感度であることを示す。
【０２５０】
実施例１０．微生物を検出するためのＣＢＣの作製
エンドリシンのＣＢＤをコードする遺伝子フラグメント（ＮＣＢＩアクセッションＹＰ＿００１４６８４５９）を、Ａ５１１ファージのゲノムＤＮＡに対して正方向プライマー：  ｔｔｔａｇｃｇｇｇｃａｇｔａｇｃｇｇａｇｇｇＴＡＴＧＣＴＴＡＣＴＴＡＡＧＣＴＣＡＴＧおよび逆方向プライマー：  ｔｃｇｔｃａｇｔｃａｇｔｃａｃｇａｔｇｃＴＴＡＴＴＴＴＴＴＧＡＴＡＡＣＴＧＣＴＣＣＴＧを使用してＰＣＲを行うことによって得た。次いで、上記配列を、ｐＧＥＸ４Ｔ−３発現ベクターへとＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙを使用して製造業者の説明書に従ってサブクローニングして、ＧＳＴ−Ａ５１１−ＣＢＤ融合タンパク質を生成した。上記ＧＳＴ−Ａ５１１−ＣＢＤ発現プラスミドのマップを、図１６に示す。次いで、エンドリシンのＣＢＤをコードする構築物を、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１株（ＤＥ３）  ｐＬｙｓＳへと形質転換した。上記形質転換した細胞を、液体Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ（ＬＢ）培地中、３７℃において光学密度（ＯＤ）０．５〜１．０になるように培養した。上記ＣＢＣの発現を、イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導した。上記培養物を、振盪しながら２５℃において５時間インキュベートした。
【０２５１】
細胞を上記培養物から採取し、溶解し、上記ＧＳＴ−Ａ５１１−ＣＢＤ融合タンパク質を、ＧＥグルタチオンセファロース４Ｂ樹脂を使用して精製した。上記樹脂からの溶離画分をプールし、タンパク質濃度を２８０ｎｍにおいて検出し、アリコートに分け、−２０℃で貯蔵した。
【０２５２】
次いで、上記ＧＳＴ−Ａ５１１−ＣＢＤタンパク質をビオチン化し、ストレプトアビジン磁性ビーズ（Ｄｙｎａｂｅａｄ  Ｍ−２８０  Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  ｂｅａｄｓ）に結合させるために使用した。
【０２５３】
実施例１１．上記固体支持体としてビーズを使用する微生物の検出
実施例１に記載されるように調製した１〜２ｍｌのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ汚染されたシチメンチョウサンプルを、チューブへと移す。上記で記載されるように上記エンドリシンタンパク質のＣＢＤで被覆したビーズを、上記サンプルへと浸す。上記ビーズを、細菌の最大量を捕捉するために、一定期間にわたって上記サンプル中に保持する。次いで、上記ビーズを上記装置チューブへと戻し、培地を添加する。固体支持体を、細菌の数を拡大するために培地中でインキュベートし得るか、またはファージを、感染サイクルを開始するために添加し得るかのいずれかである。感染サイクルが完了した後、基質を添加し、サンプルを携帯型ルミノメーターで読み取る。
【０２５４】
例証的な配列
配列番号１  エンドリシン（ＹＰ＿００１４６８４５９）
【化１】
2021516964.tif 000003
配列番号２  エンドリシンのＣＢＤドメイン
【化２】
2021516964.tif 000004
【図１】
2021516964.tif 000005
【図２】
2021516964.tif 000006
【図３】
2021516964.tif 000007
【図４】
2021516964.tif 000008
【図５】
2021516964.tif 000009
【図６】
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【図７】
2021516964.tif 000011
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021516964.tif 000014
【図１１】
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【図１２】
2021516964.tif 000016
【図１３】
2021516964.tif 000017
【図１４】
2021516964.tif 000018
【図１４−２】
2021516964.tif 000019
【図１５】
2021516964.tif 000020
【図１６】
2021516964.tif 000021
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月10日(2020.11.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021516964000001.app
【国際調査報告】
2021516964.tif 000022
2021516964.tif 000023
2021516964.tif 000024
2021516964.tif 000025
2021516964.tif 000026
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