(57)【要約】  本発明は、ＮＫ細胞培養用組成物、及びそれを利用してＮＫ細胞を培養する方法に関するものであり、一態様によれば、末梢血単核細胞でＮＫ細胞を培養するにおいて、ＮＫ細胞を、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２７を含むＮＫ細胞培養用組成物を含む培地で培養し、大量に増殖させ、ＮＫ細胞の活性化を促進させることができ、従って、それを利用する場合、癌細胞のアポトーシス又は殺傷能が促進され、癌の予防又は治療に効果的な養子免疫細胞治療剤として使用することができる。【選択図】図７
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はそれらの組み合わせを含むＮＫ（ナチュラルキラー）細胞培養用組成物。
【請求項２】
ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレニウム）をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記培養は、ＮＫ細胞の増殖又は活性化のためであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
細胞培養培地において、前記ＩＬ−１５の濃度は、０．１ｎｇ／ｍｌないし１，０００ｎｇ／ｍｌ、ＩＬ−１８の濃度は、０．２５ｎｇ／ｍｌないし２，５００ｎｇ／ｍｌ、及びＩＬ−２７の濃度は、０．２０ｎｇ／ｍｌないし２，０００ｎｇ／ｍｌであることを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項５】
前記ＮＫ細胞は、ＣＤ３−及びＣＤ５６＋の表面抗原特性を有することを特徴とする請求項１に記載の組成物。
【請求項６】
ＮＫ（ナチュラルキラー）細胞を、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２７を含むＮＫ細胞培養用組成物を含む培地で培養する工程を含むＮＫ細胞を培養する方法。
【請求項７】
前記培養する工程前に、
末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得る工程と、
得られたＰＢＭＣからＮＫ細胞を分離する工程と、
をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記培養は、７日間ないし３０日間行われることを特徴とする請求項６に記載の方法。
【請求項９】
請求項６に記載の方法によって製造されたＮＫ細胞。
【請求項１０】
請求項６に記載の方法によって製造されたＮＫ細胞を含む癌予防用又は癌治療用の組成物。
【請求項１１】
癌予防用又は癌治療用の医薬製造に使用するための請求項６に記載の方法によって製造されたＮＫ細胞の用途。
【請求項１２】
有効量の、請求項６に記載の方法によって製造されたＮＫ細胞を投与する工程を含む、癌を予防又は治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１１月２４日に出願された大韓民国特許出願第１０−２０１７−０１５８５７７号を優先権として主張し、前記明細書全体は、本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明は、ＮＫ細胞培養用組成物、及びそれを利用してＮＫ細胞を培養する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
現在、癌の一般的な治療法は、外科的手術（surgery）、放射線療法（radiation therapy）、抗癌化学療法（chemotherapy）などがあり、癌の種類及び病期により、単独あるいは複合的に使用されているが、患者にはなはだしい副作用と苦痛とを伴わせている。完璧な癌治療法は、正常細胞は、損傷させず、癌細胞だけ選んでなくす方法であるだろう。しかし、既存治療法は、正常細胞にある程度の損傷を及ぼす。最近になって注目されている癌免疫治療法（cancer immunotherapy）は、人体固有の免疫システムを活用し、正常細胞の損傷を最小化させ、癌細胞をさらに特異的に除去する治療法であり、さまざまな詳細分野（抗体治療法、免疫細胞治療法、ウイルス免疫治療法、ナノ技術免疫治療法など）の研究が活発に進められている。そのうち、免疫細胞治療は、患者の血液から得られたリンパ球（lymphocyte）のうち、ナチュラルキラー細胞（ＮＫ（natural killer） cell）、ナチュラルキラーＴ細胞（natural killer Ｔ cell）、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞（dendritic cell）のような細胞数を増やし、体外で（in vitro）機能を強化させ、それをさらに患者の体に戻すことにより、癌を治療する方法である。そのような免疫細胞を利用した治療法は、免疫反応調節治療に好ましい効果を示し、毒性及び安全性の面からすぐれると評価されている。そのうち、ＮＫ細胞は、先天免疫（innate immunity）を担当する重要な細胞であり、Ｔ細胞と異なり、肝臓（liver）、骨髄（bone marrow）で成熟される。特に、ウイルスに感染された細胞や腫瘍細胞（tumorcells）のような非正常細胞を自ら識別して死滅させる機能を有する。これまでの１０年余りの間、患者の免疫システムを利用した腫瘍免疫治療が続けて発展し、それを利用した「細胞治療剤（cell therapy product）」も商業化されている。該細胞治療剤は、自家（autologous）、同種（allogeneic）あるいは異種（xenogeneic）の細胞を体外で増殖、選別する方法を介して、細胞の生物学的特性を変化させる一連の行為を介し、治療、診断、予防の目的に使用する医薬品と定義される（食品医薬安全処公示第２００３−２６号第２条）。
【０００４】
癌のような難治性疾患の治療のための細胞治療剤として、免疫拒否反応を解消することができ、患者誂え型細胞治療を提供することができる、ＮＫ細胞を大量に増殖する方法、及び活性が強化されたＮＫ細胞を培養する方法が要求される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
一態様は、ＮＫ細胞培養用組成物を提供する。
【０００６】
他の態様は、前記ＮＫ細胞培養用組成物を利用してＮＫ細胞を培養する方法を提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はそれらの組み合わせを含むＮＫ細胞培養用組成物を提供する。
【０００８】
前記培養用組成物は、ＩＴＳ（インスリン−トランスフェリン−セレニウム；insulin−transferrin−selenium）をさらに含んでもよい。
【発明の効果】
【０００９】
一態様によれば、末梢血単核細胞でＮＫ細胞を培養するにおいて、ＮＫ細胞を、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２７を含むＮＫ細胞培養用組成物を含む培地で培養し、大量に増殖させ、ＮＫ細胞の活性化を促進することができる。従って、それを利用する場合、癌細胞アポトーシス能又は殺傷能が促進され、癌の予防又は治療に効果的な養子免疫細胞治療剤として使用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】健康な正常人から分離されたＰＢＭＣ及びＮＫ細胞を計数した結果である。
【図２Ａ】健康な正常人から分離されたＰＢＭＣ中のＮＫ細胞を分離した直後（Ｄ０）及び培養２１日後（Ｄ２１）、ＮＫ細胞の表現型を分析したＦＡＣＳ結果である。
【図２Ｂ】健康な正常人から分離されたＰＭＢＣ、ＮＫ細胞を分離した直後（Ｄ０）及び培養２１日後（Ｄ２１）、ＣＤ３−ＣＤ５６＋であるＮＫの分布を分析した結果である。
【図２Ｃ】健康な正常人から分離されたＰＢＭＣ中のＮＫ細胞を分離した直後（Ｄ０）及び培養２１日後（Ｄ２１）、ＮＫ細胞の純度を計算した結果である。
【図３Ａ】本発明のＮＫ細胞培養用組成物において、ＮＫ細胞を、３日（Day ３）、７日（Day ７）、１７日（Day １７）及び２１日（Day ２１）の間培養した結果を示した写真である。
【図３Ｂ】本発明のＮＫ細胞培養用組成物において、ＮＫ細胞を、３日（Day ３）、７日（Day ７）、１７日（Day １７）及び２１日（Day ２１）の間培養したＮＫ細胞の細胞数を示したグラフである。
【図３Ｃ】サイトカインカクテルによる、０日目（Ｄ０）、３日目（Ｄ３）、１３日目（Ｄ１３）及び２１日目（Ｄ２１）における、ＮＫ細胞の増殖程度を示したグラフである。
【図４】本発明のＮＫ細胞培養用組成物がＮＫ細胞の活性度（activity）に及ぼす影響を確認した結果である。
【図５Ａ】ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−１８（ＩＬ−１５／１８）、並びにＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２７（ＩＬ−１５／１８／２７）を含む培養液にＩＴＳを添加するか（＋ＩＴＳ）、あるいは添加せず（−ＩＴＳ）、２１日間培養したＮＫ細胞の写真である。
【図５Ｂ】０〜５日培養には、６−ウェルプレートを使用し、５〜１２日培養には、Ｔ２５フラスコを使用した後、培養２１日にＴ７５フラスコに細胞を移し、２１日まで培養した結果、ＮＫ細胞の細胞数及び増殖結果のグラフである。
【図５Ｃ】図５Ｂのように培養するとき、細胞生存率を確認した結果である。
【図６Ａ】サイトカインＩＬ−１５，ＩＬ−１８及びＩＬ−２７とＩＴＳとの混合培養液を利用したＮＫ細胞培養時、ＮＫ細胞形態写真である。
【図６Ｂ】サイトカインＩＬ−１５，ＩＬ−１８及びＩＬ−２７とＩＴＳとの混合培養液を利用したＮＫ細胞培養時、ＮＫ細胞の成長曲線及び増殖を示したグラフである。
【図６Ｃ】サイトカインＩＬ−１５，ＩＬ−１８及びＩＬ−２７とＩＴＳとの混合培養液を利用したＮＫ細胞培養時、ＮＫ細胞の生存率を示したグラフである。
【図７】本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞毒性を確認した結果である。
【図８】ＮＫ細胞培養時、７日目（Ｄ７）、１４日目（Ｄ１４）及び２１日目（Ｄ２１）に分泌されるＩＦＮ−γの程度を、ＥＬＩＳＡで測定した結果を示したグラフである。
【図９】本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞毒性を確認した結果である。
【図１０】本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞と共培養された癌細胞に対し、カスパーゼ−３（caspase−３）の活性、発現態様、及び発現レベルを確認した結果である。
【図１１】本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞と共培養された癌細胞に対するカスパーゼ−３の発現レベル及び発現位置を確認したイメージである。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
一態様は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はそれらの組み合わせを含むＮＫ細胞培養用組成物を提供する。
【００１２】
前記培養用組成物は、ＩＴＳ（insulin−transferrin−selenium）をさらに含んでもよい。
【００１３】
ＮＫ（natural killer）細胞は、リンパ球の一種である巨大顆粒型リンパ球（ＬＧＬ：large granular lymphocytes）であり、感染されたウイルス、及び腫瘍細胞をなくす能力にすぐれ、ほとんどの正常細胞は、殺さない特性を有する。従って、ＮＫ細胞は、活性細胞毒性Ｔリンパ球が多量に生成される前、ウイルス感染あるいは腫瘍形成初期段階において、重要な役割を行う。例えば、ＮＫ細胞が標的細胞と接触する場合、いくつかの分子は、標的細胞の膜に孔を形成して細胞を溶解させ、他の分子は、標的細胞に入っていき、核ＤＮＡの断片化を増加させ、懐死（necrosis）、アポトーシス（apotosis；細胞死滅）又は細胞予定死（programmed cell death）を引き起こす。
【００１４】
それにより、ＮＫ細胞は、特定ウイルスに感染された細胞と、癌細胞とを、先刺激なしに溶解させることができる。ＴＣＲの発現を介し、抗原特異的に認識する細胞毒性Ｔリンパ球と異なり、ＮＫ細胞は、抗原特異的受容体が欠如している。ＮＫ細胞は、正常細胞のＭＨＣクラスＩと結合する殺害細胞抑制受容体（ＫＩＲ：killer cell immunoglobulin-like receptor）を発現する。殺害細胞抑制受容体は、ＭＨＣクラスＩと結合すれば、特定転写因子の抑制を誘導する細胞内シグナルが生成される。その結果、ＮＫ細胞の活性化、標的細胞の分解及び破壊が抑制される。ウイルス感染細胞又は癌細胞は、それらの表面に、ＭＨＣクラスＩ分子が大きく低減している。従って、そのような細胞がＮＫ細胞に出合えば、効果的に殺害細胞抑制受容体と結合することができないために、ＮＫ細胞媒介細胞毒性に露出されて溶解される。
【００１５】
前記ＮＫ細胞は、例えば、哺乳動物、ヒト、猿、豚、馬、牛、羊、犬、猫、マウス又は兎などに由来したものでもある。前記ＮＫ細胞は、正常人又は癌患者から得られたものでもある。前記ＮＫ細胞は、血液、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ：peripheral blood mononuclear cell）から分離されたものでもある。血液を分離する方法、そこからＰＢＭＣを分離する方法、そこからＮＫ細胞を分離する方法は、公知された方法によって遂行されるものでもある。
【００１６】
前記組成物は、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はそれらの組み合わせを含んでもよいが、ＩＬ−１５は、ＮＫ細胞で発現されるＩＬ−１５受容体を介し、ＮＫ細胞の成長及び分化を直接増進させるものでもあり、ＩＬ−１８は、ＮＫ細胞のインターフェロンガンマ生産を誘導し、細胞毒性を増進させるものでもあり、ＩＬ−２７は、免疫反応を調節し、ＮＫ細胞の生存率を上昇させ、インターフェロンガンマの発現を増進させるものでもある。
【００１７】
前記組成物は、ＩＴＳをさらに含んでもよいが、ＩＴＳは、前述のＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７、又はそれらの組み合わせを含むＮＫ細胞培養用組成物のＮＫ細胞増殖能を向上させることができる。
【００１８】
ＮＫ細胞培養培地において、前記ＩＬ−１５の濃度は、約０．１ｎｇ／ｍｌないし約１，０００ｎｇ／ｍｌ、約０．２ｎｇ／ｍｌないし約５００ｎｇ／ｍｌ、約０．５ｎｇ／ｍｌないし約２００ｎｇ／ｍｌ、約１．０ｎｇ／ｍｌないし約１００ｎｇ／ｍｌ、約２．０ｎｇ／ｍｌないし約５０ｎｇ／ｍｌ、又は約５．０ｎｇ／ｍｌないし約２０ｎｇ／ｍｌでもあり、ＩＬ−１８の濃度は、約０．２５ｎｇ／ｍｌないし約２，５００ｎｇ／ｍｌ、約０．５ｎｇ／ｍｌないし約１，２５０ｎｇ／ｍｌ、約１．２５ｎｇ／ｍｌないし約５００ｎｇ／ｍｌ、約２．５ｎｇ／ｍｌないし約２５０ｎｇ／ｍｌ、約５．０ｎｇ／ｍｌないし約１２５ｎｇ／ｍｌ、約１２．５ｎｇ／ｍｌないし約５０ｎｇ／ｍｌでもあり、ＩＬ−２７の濃度は、約０．２０ｎｇ／ｍｌないし約２，０００ｎｇ／ｍｌ、約０．４０ｎｇ／ｍｌないし約１，０００ｎｇ／ｍｌ、約１．０ｎｇ／ｍｌないし約４００ｎｇ／ｍｌ、約２．０ｎｇ／ｍｌないし約２００ｎｇ／ｍｌ、約４．０ｎｇ／ｍｌないし約１００ｎｇ／ｍｌ、約１０．０ｎｇ／ｍｌないし約４０ｎｇ／ｍｌでもある。
【００１９】
前記組成物は、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、又はそれらの組み合わせをさらに含むものでもある。ＩＬ−２１は、骨髄からのＮＫ細胞前駆体の成熟を誘導し、特に、ＮＫ細胞のサイトカイン生成能及びアポトーシス能のようなエフェクター機能（effector functions）を増大させるものでもある。ＩＬ−７は、ＮＫ細胞前駆体の成熟を誘導し、Ｔ細胞の増殖を調節するものでもある。ただし、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、又はそれらの組み合わせを含まないとしても、ＮＫ細胞の増殖又は活性化を促進させることができる。
【００２０】
前記ＩＬ−７の濃度は、約０．０５ｎｇ／ｍｌないし約５００ｎｇ／ｍｌ、約０．１０ｎｇ／ｍｌないし約２５０ｎｇ／ｍｌ、約０．２５ｎｇ／ｍｌないし約１００ｎｇ／ｍｌ、約０．５ｎｇ／ｍｌないし約５０ｎｇ／ｍｌ、約１．０ｎｇ／ｍｌないし約２５ｎｇ／ｍｌ、約２．５ｎｇ／ｍｌないし約１０ｎｇ／ｍｌでもあり、ＩＬ−２１の濃度は、約０．０５ないし約５００ｎｇ／ｍｌ、約０．１０ないし約２５０ｎｇ／ｍｌ、約０．２５ないし約１００ｎｇ／ｍｌ、約０．５０ないし約５０ｎｇ／ｍｌ、約２．５ないし約１０ｎｇ／ｍｌでもある。
【００２１】
前記培地は、体外で（in vitro）、細胞の成長及び生存を支持させる物質を意味する。前記培地は、細胞培養に利用されることができるものであるならば、特別に制限されるものではなく、例えば、ＤＭＥＭ（Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium）、ＭＥＭ（Minimal Essential Medium）、ＢＭＥ（Basal Medium Eagle）、ＲＰＭＩ １６４０、Ｆ−１０、Ｆ−１２、ＤＭＥＭ／Ｆ１２、ＭＥＭ−α（Minimal Essential Medium−α）、Ｇ−ＭＥＭ（Glasgow’s Minimal Essential Medium）、ＩＭＤＭ（Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium）、MacCoy’s ５Ａ培地、ＡｍｎｉｏＭａｘ完全（complete）培地、ＡｍｉｎｏＭａｘＩＩ完全（complete）培地、ＥＢＭ（Endothelial Basal Medium）培地及びChang’s Medium培地からなる群から選択された１以上を含むものでもある。
【００２２】
前記ＮＫ細胞は、ＣＤ３−及びＣＤ５６＋の表面抗原特性を有するものでもある。
【００２３】
前記培養は、ＮＫ細胞の増殖又は活性化のためのものでもある。前記ＮＫ細胞の増殖は、細胞数の増加を意味するが、成長と混用されもする。前記ＮＫ細胞の活性化は、前述のＮＫ細胞が本来の機能を遂行することを意味し、ＣＤ２２６＋、ＣＤ６９＋、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ１６＋、又はそれらの組み合わせの表面抗原特性を有するものでもある。
【００２４】
前記表面抗原特性は、免疫学的特性と同一意味であり、流細胞分析又は免疫細胞化学のような技法を使用し、細胞表面標識（例えば、組織特異的又は細胞標識特異的な抗体で細胞を染色する）、又は光学顕微鏡若しくは共焦点顕微鏡を使用し、細胞表面標識を観察したり、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ：polymerase chain reaction）、又は遺伝子発現プロファイルのような当該分野に広く公知された技法を使用し、遺伝子発現上の変化を測定したりすることによっても確認される。
【００２５】
前述の「陽性又は＋」は、細胞標識（マーカー）と係わり、その標識が基準になる他の細胞と比較したとき、さらに多量、又はさらに高濃度で存在することを意味するものでもある。細胞は、ある標識が細胞の内部又は表面に存在するために、その標識を利用し、その細胞を１以上の他の細胞類型と区別することができれば、その標識に対して陽性にもなる。また、細胞が背景値よりさらに大きい値で、シグナル、例えば、細胞測定装置のシグナルを出すことができるほどの量にその標識を有しているということを意味するものでもある。例えば、細胞を、ＣＤ５６に特異的な抗体で検出可能に標識することができ、その抗体からのシグナルが、対照群（例えば、背景値）より検出可能にさらに大きければ、その細胞は、「ＣＤ５６に対して陽性」又は「ＣＤ５６＋」と示すことができる。用語「陰性又は−」は、特定細胞表面標識に特異的な抗体を使用しても、背景値に比較し、その標識を検出することができないということを意味するものでもある。例えば、ＣＤ３に特異的な抗体で細胞を検出することができるように標識することができなければ、その細胞は、「ＣＤ３に対して陰性」又は「ＣＤ３−」で示すことができる。
【００２６】
他の態様は、ＮＫ細胞を、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２７を含むＮＫ細胞培養用組成物を含む培地で培養する工程を含むＮＫ細胞を培養する方法を提供する。
【００２７】
前記培養する方法は、ＮＫ細胞を大量増殖する方法、又はＮＫ細胞を活性化させる方法でもある。
【００２８】
前記方法は、前記培養する工程前、末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を得る工程と、得られたＰＢＭＣからＮＫ細胞を分離する工程と、をさらに含むものでもある。
【００２９】
前記工程は、ＣＤ３＋の表面抗原特性を有する細胞を除去する工程をさらに含むものでもある。
【００３０】
血液を分離する方法、そこからＰＢＭＣを分離する方法、そこからＮＫ細胞を分離する方法、及び特定表面抗原特性を有する細胞を分離又は除去する方法は、特定抗体を利用するというような公知された方法によっても遂行される。
【００３１】
前記方法によれば、ＮＫ細胞を長期間培養したり、あるいは数回継代培養する場合にも、ＮＫ細胞の増殖能が、他のサイトカインを投与して培養した群に比べてすぐれ、ＮＫ細胞を大量に得ることができる。
【００３２】
前記方法によれば、前記組成物を投与して培養されたＮＫ細胞は、他のサイトカインを投与して培養した群に比べ、ＩＦＮ−ガンマ（interferon-gamma）の分泌が増加されたものでもある。また、前記組成物を投与して培養されたＮＫ細胞は、他のサイトカインを投与して培養した群に比べて、癌細胞に対する細胞毒性が増大したものでもあり、癌細胞のアポトーシスを促進させるものでもある。
【００３３】
前記培養は、約７日ないし約２ヵ月、７日ないし約３０日、約１４日ないし約３０日、約１５日ないし約２７日、約１６日ないし約２６日、約１７日ないし約２５日、約１８日ないし約２４日、約１９日ないし約２３日、又は約２０日ないし約２２日の間遂行されるものでもある。
他の態様は、前記ＮＫ細胞を培養する方法によって製造されたＮＫ細胞を提供する。
他の態様は、前記ＮＫ細胞を培養する方法によって製造されたＮＫ細胞を含む癌予防用又は癌治療用の組成物を提供する。
【００３４】
他の態様は、癌予防用又は癌治療用の薬学的組成物又は製剤の製造に使用するための前記ＮＫ細胞を培養する方法によって製造されたＮＫ細胞の用途を提供する。
【００３５】
他の態様は、疾病、例えば、癌の予防用医薬又は治療用医薬の製造に使用するための前記ＮＫ細胞を培養する方法によって製造されたＮＫ細胞の用途を提供する。前記癌は、固形癌、肺癌、肝臓癌、乳癌、子宮癌、血液癌などでもあるが、それらに制限されるものではない。癌患者において、そのようなＮＫ細胞が肺癌（Carrega P, et al., Cancer, 112, 863-875, 2008）、肝臓癌（Jinushi M, et al., J Hepatol., 43, 1013-1020, 2005）、乳癌（Bauernhofer T, et al., Eur J Immunol., 33, 119-124, 2003）、子宮癌（Mocchegiani E., et al., Br j Cancer., 79, 244-250, 1999）、血液癌（Tajima F., et al, Lekemia, 10, 478-482, 1996）などの疾患発生と深い関連性があると報告されている。
【００３６】
前記組成物は、薬学的に許容可能な担体を含むものでもある。前記組成物において、「許容可能な担体」は、活性成分の適用の一助とするために、活性成分と組み合わされて使用される物質、一般的には、不活性物質を示す。前記担体は、賦形剤、崩壊剤、結合剤、滑沢剤、希釈剤、又はそれらの組み合わせでもある。前記賦形剤は、微結晶セルロース、乳糖、低置換度ヒドロキシセルロース、又はそれらの組み合わせでもある。前記崩壊剤は、澱粉グリコール酸ナトリウム、無水リン酸一水素カルシウム、又はそれらの組み合わせでもある。前記結合剤は、ポリビニルピロリドン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、又はそれらの組み合わせでもある。前記滑沢剤は、ステアリン酸マグネシウム、二酸化ケイ素、タルク、又はそれらの組み合わせでもある。
【００３７】
他の態様は、前記ＮＫ細胞を培養する方法によって製造されたＮＫ細胞の治療学的又は薬剤学的な有効量を個体に投与する工程を含む癌を治療する方法を提供する。
【００３８】
前記「投与」は、ある適切な方法で個体に所定物質を導入することを意味し、物質の投与経路は、目的組織に逹することができるある一般的な経路を介しても投与される。腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、皮内投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与又は直腸内投与でもあるが、それらに制限されるものではない。また、該投与は、標的細胞に移動することができる任意の装置によっても遂行される。投与量は、癌の類型、投与経路、患者の年齢及び性別、並びに疾病の程度によっても適切に選択されるが、平均的な成人の場合、約１ｘ１０６ないし約１ｘ１０１１細胞で投与することができる。
【００３９】
前記「治療学的有効量」は、治療を必要とする個体又は細胞に投与される場合、治療効果を示すに十分な量を意味する。「治療」は、個体、例えば、ヒトを含んだ哺乳動物において、疾患又は医学的症状を治療することを意味し、それは、次を含む：（ａ）疾患又は医学的症状の発生を予防、すなわち、患者の予防的治療、（ｂ）疾患又は医学的症状の緩和、すなわち、患者において、疾患又は医学的症状の除去又は回復を引き起こし、（ｃ）疾患又は医学的症状の抑剤、すなわち、個体において、疾患又は医学的症状の進行を遅延させたり停止させたりすること、又は（ｄ）個体において、疾患又は医学的症状を軽減させること。
【実施例】
【００４０】
以下、本発明について、実施例を介してさらに詳細に説明する。しかし、それら実施例は、本発明について例示的に説明するためのものであり、本発明の範囲は、それら実施例に限定されるものではない。
【００４１】
実施例１：ＮＫ細胞分離用及びＮＫ細胞培養用の組成物を利用してＮＫ細胞を培養した後の、ＮＫ細胞の増殖能、ＮＫ細胞の活性度、及び癌細胞に対する毒性活性の確認
【００４２】
１．ＮＫ細胞分離用及びＮＫ細胞培養用の組成物を利用したＮＫ細胞培養
（１．１）研究対象選定、血液及びＰＢＭＣの分離、ＮＫ細胞分離
満２０歳ないし６５歳の健康な男性及び女性であった、本研究のための採血に同意した対象者を対象にし、問診、体重、バイタルサインを測定し、研究対象適合者を選定した。適合者は、下記のような基準で選定した。
１）問診を介して、以下の除外条件がない者
−高血圧などの心血管系疾患、腎臓疾患、糖尿病、癌診断を受けた過去歴がある者
−宗教的な理由などで輸血ができない者
−妊婦
２）体重は、男性５０ｋｇ以上、及び女性４５ｋｇ以上である者
３）バイタルサインは、下記の条件を満足する者
−血圧（ｍｍＨｇ）：収縮期９０〜１７９、弛緩期１００未満
−体温（℃）：３７．５℃以下
−脈拍（回／分）：５０〜１００
【００４３】
研究対象適合者に選定された対象に対し、訪問当日、１回総１００ｍｌを採血し、ヘパリン（heparin）が入っているチューブに収集した。
【００４４】
採血された血液において、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ，１７−１４４０−０２）を利用し、次のような方法で、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を分離した。採血された全血を、リン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ：phosphate buffered saline）（ｐＨ７．４、Thermo Fisher Scientific）と１：１に希釈し、Ficoll上層に、希釈された血液を注意深く添加した。次に、２，５００ｒｐｍで２２分間、２５℃で遠心分離し、ＰＢＭＣを分離した。分離されたＰＢＭＣをＰＢＳで洗浄した。その後、ＮＫ細胞分離前まで、ＰＢＭＣ状態で保管した。また、分離過程から出る血漿（plasma）を収集して共に保管した。
【００４５】
分離されたＰＢＭＣにおいて、ＮＫ細胞分離キット（ＮＫ Cell isolation kit，Miltenyi Biotec，１３０−０９２−６５７）及びＣＤ３＋磁気ビーズ（Miltenyi Biotec）を利用し、次のような方法でＮＫ細胞を分離し、ＣＤ３＋細胞を除去した。分離されたＰＢＭＣを、１ｘ１０７個の細胞当たり４０μｌのＭＡＣＳランニングバッファー（ＭＡＣＳランニングバッファー、ＰＢＳ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、０．５％ ＢＳＡ）を添加し、ＰＢＭＣ細胞ペレットを崩した後、１ｘ１０７個の細胞当たり２０μｌのＣＤ３＋磁気ビーズを添加し、４℃で１０分間反応させた。次に、ＭＡＣＳバッファーで洗浄した後、ＭＡＣＳ細胞分離器（Miltenyi Biotec）を利用し、ＣＤ３−ＣＤ５６＋のＮＫ細胞を回収した。
【００４６】
図１及び表１は、健康な正常人から分離されたＰＢＭＣ、及びＮＫ細胞を計数した結果である。図１は、健康な正常人から分離されたＰＢＭＣを計数した結果（ＰＢＭＣ）、及び健康な正常人から分離されたＮＫ細胞を計数した結果（ＮＫ）である。図１及び表１に示されているように、血液中のＰＢＭＣにおいて、ＣＤ３−ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞は、平均約８〜２０％ほど分布することが観察された。性別による違いは観察されず、年齢によるＮＫ細胞の統計的に有意な増加あるいは減少は、観察されていない。
【００４７】
【表１】
2021502796.tif 000003
【００４８】
次に、分離されたＰＢＭＣ中のＮＫ細胞、及び回収されたＮＫ細胞が、ＣＤ３−ＣＤ５６＋の特性を有することを、ＦＡＣＳ（Fluorescence-activated cell sorting（蛍光標識細胞選別）、ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ）を利用して確認した。
【００４９】
図２は、健康な正常人から分離されたＰＢＭＣ中のＮＫ細胞、及び回収されたＮＫ細胞の表現型を分析したＦＡＣＳ結果である。図２Ａは、ＮＫ細胞を分離した直後（Ｄ０）及び培養２１日後（Ｄ２１）、ＮＫ細胞の表現型を分析した結果である。図２Ｂは、ＰＭＢＣ、ＮＫ細胞を分離した直後（Ｄ０）及び培養２１日後（Ｄ２１）、ＣＤ３−ＣＤ５６＋であるＮＫの分布を分析した結果である。
【００５０】
図２を参照すれば、健康な正常人（対象＃８）から回収されたＮＫ細胞（ＣＤ３−ＣＤ５６＋）は、９５％以上の純度を有し、Ｔ細胞、Ｂ細胞及び単核球（monocyte）などは、約１ないし２％に分布した。培養２１日後（D２１）には、ＮＫ細胞は、９８％以上の純度を有する。
【００５１】
（１．２）ＮＫ細胞培養用組成物を利用したＮＫ細胞培養
（１）で得られたＮＫ細胞を、１ｘ１０５細胞／ｍｌ濃度で、１２又は２４−ウェルのティッシュ培養プレート（tissue culture plate）の各ウェルに入れた後、ＣｅｌｌＧｒｏ（Ｒ）無血清培地（serum-free medium）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、米国）、１０％ヒト血清（human serum）（Sigma Aldrich、米国）、１０，０００Ｕ／ｍＬペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐｅｎ／Ｓｔｒｅｐ）（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）、サイトカイン（ＩＬ−１５、ＩＬ−２７、１〜１００ｎｇ／ｍｌ；Peperotech，Ｉｎｃ．ＮＪ、米国；ＩＬ−１８、１〜１００ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ Systems Ｉｎｃ．，ＭＮ、米国）、ＩＴＳ（ｉｎｓｕｌｉｎ−ｔｒａｎｓｆｅｒｒｉｎ−ｓｅｌｅｎｉｕｍ−Ｇ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ  １００Ｘ，ＧｉｂｃｏＴＭ）を添加し、３７℃、５％のＣＯ２恒温器で２１日間培養した。
【００５２】
具体的には、サイトカイン混合処理群４セット、混合処理群１−１：ＩＬ−７（５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１８（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２１（５ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−２７（２０ｎｇ／ｍｌ）、混合処理群１−２：ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１８（２５ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−２１（５ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−２７（２０ｎｇ／ｍｌ）、及び混合処理群１−３：ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１８（２５ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−２７（２０ｎｇ／ｍｌ）、混合処理群１−４：ＩＬ−１５（１０ｎｇ／ｍｌ）及びＩＬ−１８（２５ｎｇ／ｍｌ）のそれぞれを新たな培地に混合させた後、培地を交換する時期である２ないし３日に１回ずつ、培養中のＮＫ細胞に添加して培養した。サイトカインを除き、培地の他の組成は、前述のところと同一である。
【００５３】
図２Ｃは、ＮＫ細胞を分離した直後（Ｄ０）及び培養２１日後（Ｄ２１）における、ＮＫ細胞の純度を分析した結果である。図２Ｃによれば、健康な正常人（対象＃８）から回収されたＮＫ細胞は、混合処理群１−３のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養された後にも、約９５％以上の純度を有するということが分かる。
【００５４】
２．ＮＫ細胞培養用組成物を添加し、ＮＫ細胞培養後ＮＫ細胞の増殖能及びＮＫ細胞の活性度の確認
（２．１）ＮＫ細胞培養用組成物を添加し、ＮＫ細胞培養後のＮＫ細胞の増殖能確認
（１．２）のように培養している間、増殖されたＮＫ細胞の数は、初期６−ウェル組織培養プレートに、１ｘ１０５〜１ｘ１０６／ｍｌのＮＫ細胞培養を始まりに、２〜３日間隔で、Ｔ２５、Ｔ７５、そして最終的にＢＡＧ（ＮＩＰＲＯ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂａｇｓ，Ａ−１０００ＮＬ，Ａ−３５０ＮＬ，Ｆｕｎａｋｏｓｈｉ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）を利用して大量培養した。生存率は、増殖されたＮＫ細胞数をトリパンブルー（trypan blue）染色剤（Thermo Fisher Scientific、米国）を利用して染色した後、血球計算板（hemocytometer）を利用して測定した。
【００５５】
図３は、本発明のＮＫ細胞培養用組成物が、ＮＫ細胞の増殖及び生存率（viability）に及ぼす影響を確認した結果である。図３Ａは、本発明のＮＫ細胞培養用組成物において、ＮＫ細胞を、３日（Day ３）、７日（Day ７）、１７日（Day １７）及び２１日（Day ２１）の間培養した結果を示した写真である。図３Ａに示されているように、本発明のＮＫ細胞培養用組成物において、混合処理群１−３をＮＫ細胞に加えて培養した場合（刺激：stimulated）、一次（primary）のＮＫ細胞は、クラスタを形成しながら持続的に成長し、培養する２１日間、細胞の生存率が、平均約８５ないし９０％と高かった。図３Ｂは、ＮＫ細胞の細胞数を示したグラフである。図３Ｂに示されているように、健康な正常人（対象＃１２）のＮＫ細胞は、培養前に比べ、混合処理群１−３をＮＫ細胞に加えて培養した２１日後、ＮＫ細胞の数が、約６ｘ１０６から１．５８ｘ１０８と、約２６倍増加した。また、健康な正常人（対象＃２）のＮＫ細胞は、細胞数が、混合処理群１−２を添加して培養した場合、約４０倍、混合処理群１−３を添加して培養した場合、約５３．３倍増加した。図３Ｃは、サイトカインカクテル（混合剤）により、０日目（Ｄ０）、３日目（Ｄ３）、１３日目（Ｄ１３）及び２１日目（Ｄ２１）において、ＮＫ細胞の増殖程度を示したグラフである。図３Ｃに示されているように、ＮＫ細胞の増殖した程度は、細胞数が、混合処理群１−３を添加し、２１日間培養した場合、有意に高かった。正常人間の違いは、少しずつ観察された。
【００５６】
（２．２）ＮＫ細胞培養用組成物を添加し、ＮＫ細胞培養後、ＮＫ細胞の活性度確認
（１．２）のように培養している間、ＮＫ細胞の活性度（activity）と受容体（receptor）の発現程度との差を確認した。
【００５７】
ＮＫ細胞を培養する過程中、ＮＫ細胞を回収し、１ｘ１０５のＮＫ細胞をＦＡＣＳチューブ（Falcon（Ｒ） ５ｍＬ Round Bottom Polystyrene Test Tube）に分注した。前記ＦＡＣＳチューブに、ターゲット因子（target gene）の抗体（antibody）を入れた後、３０分間反応させた。その後、ＦＡＣＳバッファーを利用して洗浄し、蛍光標識細胞選別（ＦＡＣＳ：fluorescence-activated cell sorting，ＢＤ ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒＴＭ）を利用し、表現抗原特性を分析した。データ分析は、ＦｌｏｗＪｏプログラムを利用した。
【００５８】
【表２】
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【００５９】
図４は、本発明のＮＫ細胞培養用組成物が、ＮＫ細胞の活性度に及ぼす影響を確認した結果である。図４を参照すれば、ＮＫ細胞の活性受容体（activating receptor）のうち一つであるＣＤ２２６の発現レベルは、培養前（Ｄ０）に比べ、混合処理群１−３を添加して培養した後（Ｄ２１）、約１２．３％から約９５．７％に増加した。また、活性化の指標であるＣＤ６９の発現レベルは、培養前（Ｄ０）に比べ、混合処理群１−３を添加して培養した後（Ｄ２１）、約３．３％から約９１．４％に増加した。フィーダー（feeder）を使用せず、少数のサイトカインのみを使用することでも、多数のＮＫ細胞を誘導増殖させることができるということが分かる。
【００６０】
（２．３）ＩＴＳ添加によるＮＫ細胞の増殖効果確認
ＮＫ細胞を培養している間、ＩＴＳを添加し、ＮＫ細胞の増殖効果が増大するか否かということを確認した。ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−１８、並びにＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２７をそれぞれ添加した３個の培養液に、ＩＴＳ（insulin-transferrin-selenium−Ｇ Supplement １００Ｘ、GibcoＴＭ）を追加したり、追加しなかったりして、２１日間培養した。その培養結果を図５に示した。
【００６１】
図５Ａは、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−１８（ＩＬ−１５／１８）、並びにＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２７（ＩＬ−１５／１８／２７）を含む培養液に、ＩＴＳを添加するか（＋ＩＴＳ）、あるいは添加せず（−ＩＴＳ）、２１日間培養したＮＫ細胞の写真である。
【００６２】
図５Ａに示されているように、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−１８、並びにＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２７を含む培養液にＩＴＳを添加する場合、ＮＫ細胞の増殖がさらに活発であり、クラスタが良好に形成されたので、相乗効果が発生したということを確認した。
【００６３】
図５Ｂは、０〜５日培養には、６−ウェルプレートを使用し、５〜１２日培養には、Ｔ２５フラスコを使用した後、培養２１日にＴ７５フラスコに細胞を移し、２１日まで培養した結果、ＮＫ細胞の細胞数及び増殖結果のグラフである。
【００６４】
図５Ｂに示されているように、ＮＫ細胞の増殖においては、ＩＴＳにより、ＮＫ細胞増殖の向上が観察された。ＩＬ−１５／ＩＬ−１８／ＩＬ−２７のみ処理した場合、初期に比べ、１３．７６倍（２．０６４Ｘ１０７）の増加が観察された一方、ＩＬ−１５／ＩＬ−１８／ＩＬ−２７とＩＴＳとを混合して培養した場合、２７．８８倍（４．１８２５Ｘ１０７）の増加が観察された。
【００６５】
図５Ｃは、前述のように培養するとき、細胞生存率を確認した結果である。
【００６６】
図５Ｃに示されているように、２つの細胞とも９５％以上の生存率及びクラスタが観察された。  従って、ＩＴＳを使用しても、細胞の生存率には、影響を与えないということを確認した。
従って、ＩＴＳを追加して添加する場合、本発明による培養用組成物において、ＮＫ細胞増殖効果をさらに向上させることができるということを確認した。
【００６７】
（２．４）培養バッグでのＮＫ細胞培養確認
前述のところで確認したＮＫ細胞の培養方法を、ＮＫ細胞の大量生産に適用することができるか否かということを確認した。具体的には、同一対象者からのＮＫ細胞を利用し、初期０〜７日に、ＩＬ−１５／１８／２７を利用してＮＫ細胞を活性化させた後、既存ＮＫ細胞培養液にＩＴＳを添加し、Ｔ２５プレートで培養した。その後、７〜１２日に、いくつかのＴ２５プレートに細胞を移して培養した。培養１２〜１４日に、培養バッグに細胞を移し、２１日まで培養した。
【００６８】
図６は、培養バッグでＮＫ細胞を培養した結果を示した写真である。
【００６９】
図６Ａは、サイトカインＩＬ−１５，ＩＬ−１８及びＩＬ−２７とＩＴＳとの混合培養液を利用したＮＫ細胞培養時、ＮＫ細胞形態写真である。
【００７０】
図６Ｂは、サイトカインＩＬ−１５，ＩＬ−１８及びＩＬ−２７とＩＴＳとの混合培養液を利用したＮＫ細胞培養時、ＮＫ細胞の成長曲線及び増殖を示したグラフである。
【００７１】
図６Ａ及び図６Ｂに示されているように、プレートを利用した培養と同様に、培養バッグにおいても、ＮＫ細胞がクラスタを形成した。また、細胞成長も、２．８４Ｘ１０８と、初期ＮＫ細胞数に比べ、３１．５３倍ほど増加することが観察され、２１日間持続的に成長が観察されたことを確認した。
【００７２】
図６Ｃは、サイトカインＩＬ−１５，ＩＬ−１８及びＩＬ−２７とＩＴＳとの混合培養液を利用したＮＫ細胞培養時、ＮＫ細胞の生存率を示したグラフである。
【００７３】
図６Ｃに示されているように、９８％以上の高い細胞生存率を示した。
【００７４】
従って、本発明による培養用組成物を利用して培養する場合、プレートだけではなく、培養バッグにおいても、ＮＫ細胞の増殖効果が示されたので、前記培養用組成物は、大量生産時にも活用されうるということを確認した。
【００７５】
３．ＮＫ細胞培養用組成物を利用したＮＫ細胞の癌細胞に対する毒性活性確認
（３．１）ＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞毒性の確認１
（３．１．１）細胞毒性分析（cytotoxicity assay）
細胞毒性は、ＮＫ細胞に対する感受性が高く、ＮＫ細胞の活性測定に主に使用されているＫ５６２細胞（ヒト慢性骨髄性白血病細胞系統；human chronic myelogenous leukemia cell line）を対象に、PromegaのＣｙｔｏｔＴｏｘ−ＧｌｏＴＭ細胞毒性分析キットを利用し、細胞毒性分析を行った。それは、損傷された細胞膜から遊離された酵素を測定する方法であり、ルミノジェニックペプチド基質（luminogenic peptide substrate）（アラニル−アラニル−フェニルアラニル−アミノルシフェリン；alanyl-alanyl-phenylalanyl-aminoluciferin，ＡＡＦ−Ｇｌｏ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ）を測定することにより、死んだ細胞の酵素反応を測定することができる方法である。
【００７６】
ポリ−Ｄ−リシン（poly−Ｄ−lysine）がコーティングされた９６−ウェルプレートの各ウェルに、Ｋ５６２細胞を１ｘ１０４細胞で分注し、細胞毒性を測定するＮＫ９２とＮＫ細胞とを、０：１、１．２５：１、２．５：１、５：１、１０：１のＥ：Ｔ比率（ratio）で入れ、４時間反応させた。その後、５０μＬのＣｙｔｏｔＴｏｘ−ＧｌｏＴＭ細胞毒性分析試薬（cytotoxicity assay reagent）を入れ、常温で１５分間反応させた後、ルミノメーター（luminometer）を使用し、死んだ細胞の酵素量を測定した。次に、５０μＬの溶解バッファー（lysis buffer）を添加し、１５分間反応させ、全体細胞数を確認した後、全体細胞に対する死んだ細胞の比率を算出し、細胞毒性を分析した。そのとき、得られたデータは、Microsoft ExcelとＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ５．０とを利用して分析した。
【００７７】
図７は、本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞毒性を確認した結果である。図７を参照すれば、培養７日目（Ｄ７）、１４日目（Ｄ１４）及び２１日目（Ｄ２１）のいずれにもおいて、ＩＬ−２単独、ＩＬ−１５単独、ＩＬ−１５及びＩＬ−１８（ＩＬ−１５／１８）、ＩＬ−１５及びＩＬ−２７（ＩＬ−１５／２７）、ＩＬ−１８及びＩＬ−２７（ＩＬ−１８／２７）、並びにＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２７（ＩＬ−１５／１８／２７）を混合して培養した結果、サイトカイン単独を使用した場合に比べ、サイトカインを２種以上組み合わせてＮＫ細胞を培養した場合、培養後、ＮＫ細胞毒性が顕著に上昇するということが観察された。特に、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７を混合して培養するとき、長期間（２１日）のＮＫ細胞培養過程中にも、細胞毒性程度が最も高く維持された。それは、ＮＫ−９２細胞株との比較実験においても、細胞毒性測定値（ＲＬＵ）が、ＮＫ−９２に比べて２倍以上高いということを確認した。それを介して、ＩＬ−２，ＩＬ−１５単独刺激より、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８、ＩＬ−２７の混合使用により、刺激されたＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞毒性は、さらに上昇するということを確認した。
【００７８】
追加して、ＮＫ細胞が分泌するＩＦＮ−γの発現程度の差を測定し、細胞毒性を確認した。具体的には、ＮＫ細胞を培養する過程中、７日間隔で、培養中のＮＫ細胞培養液を１ｍｌずつ採取した。前記採取した培養液において、ＩＦＮ−γの発現程度は、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ、ＭＮ、米国、酵素免疫分析法、enzyme-linked immunosorbent assay）技法を利用し、ＥＬＩＳＡ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ機器を利用して結果を分析し、図８に示した。
【００７９】
図８は、ＮＫ細胞培養時、７日目（Ｄ７）、１４日目（Ｄ１４）及び２１日目（Ｄ２１）に分泌されるＩＦＮ−γの程度を、ＥＬＩＳＡで測定した結果を示したグラフである。
【００８０】
図８に示されているように、ＩＬ−２単独、ＩＬ−１５単独、ＩＬ−１５及びＩＬ−１８（ＩＬ−１５／１８）、ＩＬ−１５及びＩＬ−２７（ＩＬ−１５／２７）、並びにＩＬ−１５、ＩＬ−１８及びＩＬ−２７（ＩＬ−１５／１８／２７）をそれぞれ処理した場合、他のサイトカイン処理群に比べ、ＩＬ−１５／１８／２7処理群において、ＮＫ細胞が分泌するＩＦＮ−γの発現レベルが高く観察された。
【００８１】
従って、サイトカインを使用したＮＫ細胞刺激が、血液に存在する免疫細胞を効果的に活性化させ、ＩＦＮ−γを分泌させるということを示す。また、それは、ＮＫ細胞による細胞毒性結果と有意の相関関係があるので、ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ分泌能を測定することがＮＫ細胞の細胞毒性を代弁することができるということが分かる。
【００８２】
（３．２．２）Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ分析
ポリ−Ｄ−リシンがコーティングされた６−ウェルプレートの各ウェルに、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Thermo Fisher Scientific）で染色されたＫ５６２細胞を１ｘ１０５細胞で分注し、細胞毒性を測定するＮＫ９２とＮＫ細胞とを、０：１、１．２５：１、２．５：１、５：１、１０：１のＥ：Ｔ比率で入れ、２１日間共培養した。その後、Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ放出分析（release assay）を介して、Ｋ５６２細胞がＮＫ細胞によって溶解（lysis）される程度を、蛍光顕微鏡（zeiss microscope）を利用して観察した。
【００８３】
図９は、本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞毒性を確認した結果である。緑色に染色された領域は、Ｋ５６２細胞を示す。図９に示されているように、ＮＫ細胞（エフェクター；effector）の比率が高いほど、生きているＫ５６２細胞の数が減少した。それは、ＮＫ細胞とＫ５６２細胞とが相互作用（interaction）することにより、Ｋ５６２細胞がアポトーシスすると推測される。
【００８４】
（３．３）ＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞の癌細胞に対する細胞毒性の確認2
（３．３．１）カスパーゼ−３免疫ブロット
本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞のインビトロ毒性を評価するために、卵巣癌細胞とＮＫ細胞とを培養した後、卵巣癌細胞でのカスパーゼ−３（caspase−３）の活性レベル及び発現レベルを確認した。
【００８５】
ポリ−Ｄ−リシンがコーティングされた６−ウェルプレートの各ウェルに、卵巣癌細胞（Ａ２７８０、ＳＫＯＶ３）を１ｘ１０５細胞で分注し、翌日、細胞毒性を測定するＮＫ９２細胞と本発明のＮＫ細胞との１ｘ１０５個を、前記卵巣癌細胞と３時間培養した後、培養液とＮＫ細胞は、取り除き、残っている卵巣癌細胞のみを回収し、溶解バッファーを利用して細胞を溶解させた。細胞溶解物を９５℃で１０分間加熱した後、１３，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、蛋白質を分離した。得られた蛋白質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動；ＳＤＳ−polyacrylamide gel electrophoresis）ゲルを利用して分離し、分離された蛋白質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンフルオリド；polyvinylidene fluoride）メンブレン（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ、米国）に移動させた。前記ＰＶＤＦメンブレンを、５％の脱脂乳（skim milk）でインキュベーションし、非特異的な抗体結合を遮断（blocking）した。次に、ＰＶＤＦメンブレンを、一次抗体、抗カスパーゼ−３（anti−caspase−３）及び抗アクチン（anti−actin）それぞれと４℃で一晩反応させた。翌日、一次抗体が結合されたＰＶＤＦメンブレンを、ペルオキシダーゼ（peroxidase）が結合された二次抗体と常温で１時間反応させた。蛋白質バンドを増大された化学発光（ＥＣＬ：enhanced chemiluminescence）キットシステム（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を使用し、可視化して定量した。
【００８６】
図１０は、本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞と共培養された癌細胞に対し、カスパーゼ−３の活性、発現態様、及び発現レベルを確認した結果である。カスパーゼ−３は、アポトーシスが進むにつれ、完全形態（whole form）が減少し、切断形態（cleaved form）が増加する。図１０に示されているように、本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞と共培養された癌細胞（対象＃９）は、切断形態のカスパーゼ−３の蛋白質量が増加し、癌細胞に対する細胞毒性が有意に上昇したということが分かる。また、本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞と共培養された癌細胞での切断形態のカスパーゼ−３の発現レベルは、ＮＫ９２細胞と共培養された癌細胞でのカスパーゼ−３の発現レベルより、約５％ないし１０％上昇した。
【００８７】
（３．３．２）カスパーゼ−３免疫蛍光染色
次に、癌細胞内アポトーシス進行いかんを確認した。
【００８８】
ポリ−Ｄ−リシンがコーティングされたチャンバースライド（chamber slide）に、卵巣癌細胞（Ａ２７８０、ＳＫＯＶ３）を分注し、翌日、同数のＮＫ９２細胞と本発明のＮＫ細胞とをそれぞれ前記卵巣癌細胞と３時間培養した後、培養液とＮＫ細胞は、取り除き、残っている卵巣癌細胞に免疫蛍光染色（immunofluorescence）を行った。一次抗体としては、抗カスパーゼ−３と抗アクチンとを使用し、二次抗体としては、Ａｌｅｘａ  ４８８ヤギ抗ウサギ（goat anti-rabbit）とAlexa ５４６ヤギ抗マウス（goat anti-mouse）とを使用した。アクチンとＤＡＰＩは、対照群として使用した。染色後、スライドをマウンティングし、共焦点レーザー走査顕微鏡（confocal laser-scanning microscope）で観察した。
【００８９】
図１１は、本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞と共培養された癌細胞でのカスパーゼ−３の発現レベル及び発現位置を確認したイメージである。
【００９０】
図１１に示されているように、本発明のＮＫ細胞培養用組成物を添加して培養されたＮＫ細胞と共培養された癌細胞に対し、カスパーゼ−３の活性度が、対照群に比べ、約５０％以上高く、他の対照群であるＮＫ９２細胞と共培養された癌細胞に比べ、約１０％以上高かった。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図６Ｃ】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【国際調査報告】
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