(57)【要約】  抗原短鎖ペプチドは、１１〜１５個のアミノ酸残基を含み、インフルエンザウイルスに対する抗体を誘導する能力を有する。抗原ペプチドの配列は、ヘマグルチニン（ＨＡ）から選択される。抗原ペプチドは、ＪＪ（配列番号２）、ＪＪ−１（配列番号３）、ＪＪ−２（配列番号４）、ＪＪ−３（配列番号５）またはＪＪ−４（配列番号６）の配列を含む。インフルエンザウイルスに対する広域スペクトル免疫を誘導するための方法は、ワクチンを対象に投与することを含み、このワクチンは、上述の抗原ペプチドのうちの１つを含む。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＧＬＸＧＡＩＡＧＸＩＥ（配列番号７）の配列（配列中、Ｘは、独立して任意のアミノ酸残基である）を含み、インフルエンザウイルスに対する抗体を誘導する能力を有する
抗原ペプチドまたはタンパク質。
【請求項２】
前記インフルエンザウイルスは、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７亜型を含む
請求項１に記載の抗原ペプチドまたはタンパク質。
【請求項３】
ＪＪ（配列番号２）、ＪＪ−１（配列番号３）、ＪＪ−２（配列番号４）、ＪＪ−３（配列番号５）またはＪＪ−４（配列番号６）の配列を含む
請求項１に記載の抗原ペプチドまたはタンパク質。
【請求項４】
ＪＪ−１（配列番号３）、ＪＪ−２（配列番号４）、ＪＪ−３（配列番号５）またはＪＪ−４（配列番号６）の前記配列を含む
請求項１に記載の抗原ペプチドまたはタンパク質。
【請求項５】
前記抗原ペプチドまたはタンパク質は、経口ワクチンまたは注射ワクチンとして製剤化されている
請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチド。
【請求項６】
ワクチンをそれを必要とする対象に投与することを含む、インフルエンザウイルスに対する免疫を誘導するための方法であって、
前記ワクチンは、請求項１〜４のいずれか一項に記載の抗原ペプチドまたはタンパク質を含む
方法。
【請求項７】
前記インフルエンザウイルスは、Ｈ１、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７亜型を含む
請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記投与は経口投与による
請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記投与は注射による
請求項６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、インフルエンザに対するワクチンに関し、特にペプチドベースの広域スペクトルワクチンに関する。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザは、主としてワクチンの保護が不完全であり、抗ウイルス薬に対する耐性が徐々に広がっているために、ヒトの健康に脅威を与え続けている。なかでも、家畜からのインフルエンザウイルスは、このウイルスがヒトに感染する能力を獲得したとき、ヒトの死を招く恐れがある。そのような感染は、食料源に経済的損失をもたらすだけでなく、ヒトの健康も脅かす。インフルエンザウイルスの多様性のために、インフルエンザウイルスの大部分から保護することは不可能である。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、ヘマグルチニン（ＨＡ）を利用して標的細胞を結合する。「ヘマグルチニン」という名称は、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ、ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで凝集（ｃｌｕｍｐ  ｔｏｇｅｔｈｅｒ、ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｅ）させるこのタンパク質の能力に由来する。ＨＡは、ジスルフィド結合された２つのサブユニット、ＨＡ１（ヘッド）およびＨＡ２（ステム）を含む。ＨＡ１「ヘッド」サブユニットは、標的細胞上のシアル酸との相互作用によりウイルスを標的細胞に結合する役目を負う。結合した後、ウイルスは、エンドサイトーシスにより細胞に取り込まれる。エンドソームの酸性環境は、ＨＡ２「ステム」サブユニットの立体構造変化の引き金となって、ウイルス膜とエンドソーム膜が融合する。その結果、ウイルスゲノムが細胞質内に放出され、感染が進行する。
【０００４】
ウイルスが細胞に感染するのにＨＡが不可欠であるため、ＨＡは介入の標的となる。例えば、抗体を中和すると、ウイルスが細胞に結合するのを防ぎ、それによってウイルス感染を防ぐことができる。しかし、インフルエンザウイルス株の変異のために、ヘマグルチニンの多くの亜型が存在し、ワクチンは典型的には、相同なウイルス株に対してのみ有効である。インフルエンザウイルスに対する広域スペクトルワクチンの開発が非常に望ましい。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
広域スペクトルワクチンを作製する努力がなされてきたが、様々なタイプのインフルエンザウイルスに対するより安全で、より有効なワクチンが依然として必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の実施形態は、インフルエンザウイルスに対する万能ワクチンに関する。本発明のワクチンは、ペプチドベースであり、幅広いインフルエンザウイルス亜型に対して有効である。
【０００７】
本発明の１つの態様は、抗原短鎖ペプチドに関する。本発明の１つの実施形態による抗原短鎖ペプチドは、１１〜１５個のアミノ酸残基を含み、インフルエンザウイルスに対する抗体を誘導する能力を有する。抗原ペプチドの配列は、ヘマグルチニン（ＨＡ）から選択される。抗原ペプチドは、ＪＪ（配列番号２）、ＪＪ−１（配列番号３）、ＪＪ−２（配列番号４）、ＪＪ−３（配列番号５）およびＪＪ−４（配列番号６）の配列を含む。
【０００８】
本発明の１つの態様は、インフルエンザウイルスに対する広域スペクトル免疫を誘導するための方法に関する。本発明の１つの実施形態による方法は、ワクチンを対象に投与することを含み、このワクチンは、上述の抗原ペプチドのうちの１つを含む。
【０００９】
本発明の他の態様は、以下の説明、図面、および添付の特許請求の範囲により明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１】抗原ペプチドの位置を示す、ヘマグルチニンの構造を示す図である。
【００１１】
【図２Ａ】本発明のペプチドＪＪによる抗体（特異的抗ＪＪ  ＩｇＧ）の誘導を示す図である。
【図２Ｂ】本発明のペプチドＪＪ−１による抗体（特異的抗ＪＪ  ＩｇＧ）の誘導を示す図である。
【図２Ｃ】本発明のペプチドＪＪ−３による抗体（特異的抗ＪＪ３  ＩｇＧ）の誘導を示す図である。
【００１２】
【図３】ヘマグルチニンの様々な亜型に対する抗体価を示す図である。
【００１３】
【図４】本発明の抗体による赤血球凝集抑制の結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本発明の実施形態は、インフルエンザウイルスに対する万能ワクチンに関する。本発明の実施形態は、ウイルスヘマグルチニン（ＨＡ）に基づいて誘導されたペプチドワクチンであり、このペプチドは、このワクチンが経口ワクチンとして使用できるように、プロテアーゼ消化に耐えることができる。
【００１５】
本発明の実施形態によれば、ペプチド配列は、ウイルスヘマグルチニンの配列から選択される。この選択は、ＭＨＣクラスＩＩに結合する可能性のあるペプチド配列のコンピュータモデリングに基づく。このコンピュータモデリングでは、可能性のあるグリコシル化部位も分析する。選択されたペプチド配列は好ましくは、ＨＡ上のグリコシル化部位から離れている。
【００１６】
いくつかの計算手法をペプチド−ＭＨＣ結合の予測に利用できる。例えば、Ｂｕｕｓ（１９９９）およびＲｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）を参照されたい。
【００１７】
コンピュータモデリングの後、ペプチドを合成し、ＭＨＣ分子へのその結合について試験することができる。結合アッセイは、例えば、ＥＬＩＳＡにより実施することができる。
【００１８】
主要組織適合遺伝子複合体クラスＩＩ（ＭＨＣ−ＩＩ）は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面にある膜貫通ヘテロ二量体タンパク質である。これは、抗原ペプチドを結合し、ＣＤ４＋Ｔリンパ球に提示することにより、外来抗原に対する免疫応答に不可欠となっている。
【００１９】
例えば、インフルエンザウイルスによる感染後、一部のウイルスタンパク質（例えば、ヘマグルチニン）が抗原提示細胞（ＡＰＣ）により処理され得る。ＡＰＣによる処理後、抗原ペプチドはＭＨＣクラスＩＩ分子を結合する。次いで、ペプチド−ＭＨＣ複合体はＡＰＣの表面に提示され、この複合体がＣＤ４＋Ｔ細胞と相互作用して免疫応答の引き金となる。インフルエンザＡ型ウイルスからの、ヘマグルチニン（Ｈ３亜型）の残基３０７〜３１９に対応するＨＡの特定の断片、ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号１）は、ＭＨＣクラスＩＩ分子の特定の亜型と高い親和性で結合することが示された（表１参照）。
【表１】
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【００２０】
ペプチド複合ＭＨＣＩＩ分子の３Ｄシミュレーション構造は、ペプチド−ＭＨＣ結合が、ＭＨＣクラスＩＩの溝を引くポケットとペプチドの側鎖との間の相互作用、および非多型性ＭＨＣＩＩの側鎖とペプチド骨格との間の一連の水素結合に依拠することを明らかにした（Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  ＭＨＣ  ｃｌａｓｓ  ＩＩ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎ，”Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ．，１９９９，１（１）：４７−５９）。
【００２１】
ＭＨＣクラスＩＩ分子へのペプチド結合をモデル化することにより、本発明者らは、同じくＭＨＣクラスＩＩ分子を高い親和性で結合することができる、ＨＡからの新しいペプチド配列（「ペプチドＪＪ」；ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ、配列番号２）を見出した。いくつかのモデリング手法が、ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ結合の分析に利用できる。例えば、ＩＥＤＢ“ＭＨＣ−ＩＩ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ，”ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｍｈｃｉｉ／を参照されたい。
【００２２】
図１に示す通り、このＪＪペプチドは、ＰＫＹＶＫＱＮＴＬＫＬＡＴ（配列番号１）の領域と比較して、ＨＡ分子のステムポーション上の異なる領域内に位置する。さらに、このＪＪペプチド配列（ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ、配列番号２）は、ヘマグルチニンの様々な亜型のコンセンサス配列となる。したがって、この配列は、ヘマグルチニンの様々な亜型を結合することができる広域スペクトル抗体にとって有望なエピトープとなる。
【００２３】
ＨＡ上の可能性のあるグリコシル化部位は抗体結合に干渉する可能性があるため、本発明者らはそれも分析した。ＪＪペプチドの領域には、そのようなグリコシル化干渉の可能性はないようである。したがって、このエピトープ領域に対する抗体にはこの問題はないはずである。これは、後のセクションに記載の通り、ＪＪペプチドにより作製された抗体がヘマグルチニンの様々な亜型に結合することができるという観察により裏付けられる。
【００２４】
モデリングに基づいて、ＪＪペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩと強く結合すると予想される。これは、このペプチドが、動物を免疫するために使用されたとき、抗体形成を誘導することができることにより裏付けられる。
【００２５】
本発明の実施形態によれば、このペプチドは、インフルエンザ感染に対するワクチンとして使用することができる。ペプチドワクチンは、任意の適した経路を介して、例えば注射または経口により投与することができる。有効な経口ワクチンを作製するために、ペプチド抗原は、消化器系内の環境に耐えられるべきである。したがって、ＪＪペプチドに基づいて、プロテアーゼ耐性ペプチドが設計される。プロテアーゼ耐性は、当技術分野において既知の任意の方法により、例えばプロテアーゼ切断コンセンサス配列／認識配列を除去することにより、または天然アミノ酸残基を非天然アミノ酸残基（例えば、化学修飾アミノ酸またはＤ−アミノ酸）で置き換えることにより実現されてもよい。
【００２６】
一例として、ＪＪペプチド内のアミノ酸残基を置換して、プロテアーゼ切断認識配列を除去することができるであろう。ペプチド−ＭＨＣ−ＩＩ複合体の構造解析に基づいて、ペプチドとＭＨＣクラスＩＩの溝との間の主要な結合相互作用にはＰ１、Ｐ４、Ｐ６およびＰ９部位が必要であり、ここで、Ｐ１部位はＮ末端側に位置している。Ｐ２、Ｐ３、Ｐ５、Ｐ７およびＰ８部位はＭＨＣクラスＩＩ結合にはあまり重要ではないため、これらの部位に対応するＪＪペプチドのアミノ酸残基は、ＭＨＣクラスＩＩとの結合相互作用を著しく損なうことなく修飾することができる。したがって、これらの部位にある残基を置換して、既知のプロテアーゼ切断コンセンサス／認識配列を除去することができるであろう。
【００２７】
本発明の実施形態によれば、プロテアーゼ耐性ペプチドはＪＪペプチド（ＧＬＦＧＡＩＡＧＦＩＥ）（配列番号２）に基づいて設計することができる。本発明の発明者らは、ＪＪペプチド内のフェニルアラニン（Ｆ）残基を置換すると、そのプロテアーゼ感受性を実質的に除去することができることを見出した。３種のプロテアーゼ耐性ＪＪペプチドアナログがこうして得られた：ＪＪ−１（ＧＬＬＧＡＩＡＧＰＩＥＦ）（配列番号３）、ＪＪ−２（ＧＬＭＧＡＩＡＧＰＩＥＦ）（配列番号４）］、ＪＪ−３（ＧＬＬＧＡＩＡＧＰＩＥＧＧＷ）（配列番号５）およびＪＪ−４（ＧＬＨＧＡＩＡＧＬＩＥＮＧＷ）（配列番号６）。これらのペプチドは、抗体を誘導する（すなわち、ワクチンとして機能する）それらの能力について調査される。実際、これらのペプチドは、ＭＨＣクラスＩＩ分子を高い親和性で結合することが分かる。（表１参照）。
【００２８】
加えて、これらのペプチドがマウスを免疫するために使用されるとき、これらのペプチドは、ＨＡに対する抗体を高い効率で誘導することが分かった。図２Ａに示す通り、ペプチドＪＪは、抗体（ＩｇＧ）産生を３つの異なる用量条件（各群につき用量５μｇ、１５μｇまたは４５μｇ）で誘導した。同様に、図２Ｂは、ペプチドＪＪ−１がＩｇＧ産生を３つの異なる用量条件（各群につき用量５μｇ、１５μｇまたは４５μｇ）で効率的に誘導することを示す。これらの結果は、本発明のペプチドワクチンが実際に抗体の産生を誘導することができることを示す。図２Ｃは、３つの異なる用量（５μｇ、１５μｇまたは４５μｇ）でのペプチドＪＪ−３による抗体産生の誘導を示す。プレート上にコートされたペプチドＪＪ−３を使用したＥＬＩＳＡは明らかに、より高い用量（１５μｇおよび４５μｇ）でペプチドＪＪ−３が特異的抗ＪＪ３抗体の産生を誘導したことを示した。
【００２９】
抗体が交差反応し得るか試験するため、ペプチドＪＪおよびペプチドＪＪ−１によって誘導されたＩｇＧを、ＥＬＩＳＡプレート上にコートされたＪＪペプチドを使用したＥＬＩＳＡによりアッセイした。図２Ａおよび図２Ｂに示す通り、ＪＪペプチド（図２Ａ）またはＪＪ−１ペプチド（図２Ｂ）によって誘導されたＩｇＧは、ＥＬＩＳＡプレート上にコートされたＪＪペプチドを結合することが分かった。これらの結果は、ＪＪ−１ペプチドにより産生された抗体がＪＪペプチドと交差反応し得ることを示し、これは、本発明のペプチドによって誘導された抗体がヘマグルチニンの様々な亜型を認識することができるであろうことを示唆する。
【００３０】
実際、本発明のペプチドワクチンにより作製された抗体は、ヘマグルチニンの様々な亜型を結合することができる。図３に示す通り、ＪＪペプチドまたはＪＪ−１ペプチドにより作製された抗体は、ヘマグルチニンのＨ１、Ｈ３、Ｈ５およびＨ７亜型と反応した。これらの結果は、本発明のペプチドワクチンにより作製された抗体がヘマグルチニンの様々な亜型に対して広域スペクトルを有するであろうという考えを支持する。したがって、本発明のペプチドワクチンは、様々なインフルエンザウイルスに対する万能ワクチンである。
【００３１】
広域スペクトルのヘマグルチニン亜型に結合することに加えて、これらの抗体は、インフルエンザウイルスによって誘導される赤血球凝集を抑制することができることも分かった。図４に示す通り、これらの抗体は、Ｈ１、Ｈ３およびＨ５亜型のインフルエンザウイルスによって誘導される赤血球凝集を抑制することができた。加えて、これらの結果は、ＪＪおよびＪＪ−１によって誘導された抗体が、赤血球凝集の抑制において予備免疫のバックグラウンドよりも少なくとも４倍有効であることを示す。これらの結果は、本発明の手法を検証するものであり、本発明のペプチドを使用して、インフルエンザウイルス感染を防ぐことができる抗体を誘導することができることを証明するものである。本発明のペプチドによって誘導された抗体は、様々なヘマグルチニンに対して広域スペクトルを有する。したがって、本発明のペプチドワクチンは、広域スペクトル抗体を誘導することができる。
【００３２】
ＪＪペプチドの様々な変異体がすべて、広域スペクトルのＨＡ亜型と反応することができる抗体を誘導することができることは、特定のアミノ酸残基（例えば、ＪＪ内のＦ−３およびＦ−９）がＭＨＣクラスＩＩ結合に関与しないことを示している。これらの残基（例えば、ＪＪ内のＦ−３およびＦ−９）は、これらの残基において置換しても抗体を誘導するそれらの能力は損なわれなかったため、ＴＣＲとＭＨＣクラスＩＩ−ペプチド複合体との相互作用にも関与しない。表ＩＩは、これらのペプチドのアラインメントを示す：
【表２】
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【００３３】
配列アラインメント（表２）に基づいて、コンセンサス配列（ＧＬＸＧＡＩＡＧＸＩＥ、配列番号８、配列中、Ｘは任意のアミノ酸残基を表す）に達することができ、これは、広域スペクトルのＨＡ亜型に対する抗体を誘導するのに十分であろう。すなわち、このコンセンサス配列を有するペプチドは、広域スペクトルのＨＡ亜型に対する抗体を誘導するための良好なペプチドワクチンとなるであろう。コンセンサス配列はおそらく最小配列となるが、この最小配列を含むより長鎖のペプチドも使用されてもよいことを当業者なら理解するであろう。例えば、追加のアミノ酸残基がこれらのペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に加えられてもよい。同様に、これらのペプチドは、融合タンパク質の一部であってもよい。
【００３４】
本発明のペプチドはワクチンとして使用されてもよく、このワクチンは、経口的に、または他の経路（例えば、注射）により投与されてもよいことを当業者なら理解するであろう。加えて、これらのペプチドは、ワクチンとして機能するために、他の成分（例えば、アジュバントまたは他の処方剤）と一緒に使用されてもよい。
【００３５】
様々な手順のための方法が当技術分野において既知である。以下の具体例は例示的な実施形態を示す。しかし、これらの具体例は例示のためだけであること、および本発明の範囲から逸脱することなく修正または変形が可能であることを当業者なら理解するであろう。
【００３６】
ＨＡエピトープのＩｎ  Ｓｉｌｉｃｏ解析
いくつかのモデリング手法が、ペプチド−ＭＨＣクラスＩＩ結合の分析に利用できる。例えば、ヘマグルチニンの様々な亜型からの可能性のあるエピトープと、異なる対立遺伝子からのＭＨＣクラスＩＩ分子との結合をモデル化するために、ＩＥＤＢ“ＭＨＣ−ＩＩ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｓ，”ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｍｍｕｎｅｅｐｉｔｏｐｅ．ｏｒｇ／ｍｈｃｉｉ／で利用できるツールを使用することができる。
【００３７】
ペプチド（抗原）産生
本発明の抗原ペプチドは短鎖ペプチドであり、これは、１１〜１５残基を有するエピトープを含む。ワクチンとして使用するための実際のペプチドは１１〜１５残基長になることもあり、またはＮ末端および／もしくはＣ末端に追加の残基を有することもある。加えて、これらのペプチドは、バイオアベイラビリティおよび／または免疫原性を向上させる他の部分に結合されていてもよい。これらのペプチドは、化学的に容易に合成することができる。加えて、これらのペプチドは、宿主細胞からの発現により産生されてもよい。そのような産生のための手順は、当技術分野において日常的に利用できる。
【００３８】
抗体作製
この例では、本発明の実施形態によるペプチド抗原を使用して、マウスにおいて抗体形成を誘導した。ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＣ５７ＢＬ／６マウス（６〜８週齢）をＢｉｏＬＡＳＣＯ  Ｔａｉｗａｎ（台北、台湾）またはＮａｔｉｏｎａｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ（台北、台湾）から入手した。マウスを次の６群（各群にマウス３匹）にランダムに分けた：陰性対照群ＥＸＰ０（ＬＬＶＥＡＡＰＬＤＤＴＴ；配列番号８）、Ｅｘｐ１（ＪＪ−１）、Ｅｘｐ２（ＪＪ−２）、Ｅｘｐ３（ＪＪ−３）、Ｅｘｐ４（ＪＪ−４）およびＥｘｐ５（ＪＪ）。
【００３９】
４５ｕｇ／１００ｕｌの用量の各ペプチド（Ｅｘｐ０〜Ｅｘｐ５）をフロイント完全アジュバントと混合（体積比１：１）して、６種の異なる抗原溶液を得た。各群のマウスに異なるペプチド（Ｅｘｐ０〜Ｅｘｐ５）溶液を抗原として注射した。第１の免疫化については、１００μＬ（それぞれ４５μｇのペプチドを含む）の上述の調製抗原溶液を各マウスに皮下注射した。
【００４０】
第２の注射を第１の注射の１０〜１４日後に行った。各ペプチドをフロイント不完全アジュバント中で混合（６種の異なるペプチド、Ｅｘｐ０〜Ｅｘｐ５、それぞれ１：１混合）することにより、第２の注射用溶液を調製した。血清中で抗体を検出できるまで、以後の免疫化のために前の注射から１０〜１４日毎に注射を繰り返し、これには３〜６回の注射を要した。
【００４１】
マウス血清を以下の時点で採取した：予備免疫および隣接する２回の注射間の中間時点。抗体が血清中で検出できるようになったら、抗体がもはや検出されなくなるまで、血清採取を２週毎に実施し、これには典型的に約半年を要した。血清採取はマウスの頬から実施した。毎回、１００ｕＬ以下の血液を採取し、採取頻度はおよそ２週毎に１回であった。実験の最後に、マウスを二酸化炭素で安楽死させた。
【００４２】
免疫Ａｂ滴定
ＥＬＩＳＡを使用して抗体価を決定した。まず、捕捉抗体（例えば、ＪＪペプチドまたはヘマグルチニンの様々な亜型もしくはそれらの断片）を９６ウェルマイクロプレート上にコートした（１００μＬ／ウェルの希釈捕捉抗体）。このプレートをシールし、４℃で一晩インキュベートした。次に、１００μＬのサンプル（例えば、抗血清）またはサンプル希釈緩衝液中の標準をウェル毎に加えた。このプレートをシールし、室温で１時間インキュベートした。
【００４３】
インキュベーション後、抗体希釈緩衝液中に希釈した１００μＬの検出抗体（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合抗体）を各ウェルに加えた。このプレートをシールし、室温で１時間インキュベートした。次いで、２００μＬの基質溶液（３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ））を各ウェルに加えた。このプレートを直接光に曝さずに、反応混合物を室温で２０分間インキュベートした。
【００４４】
反応後、５０μＬの停止溶液（酸溶液）を各ウェルに加えた。次いで、４５０ｎｍに設定されたマイクロプレートリーダーを使用して、各ウェルの光学密度を直ちに測定した。
【００４５】
ＨＩアッセイ
赤血球凝集抑制（ＨＩ）アッセイは、赤血球（ＲＢＣ）を凝集させ、それによって赤血球の沈降を妨げる（インフルエンザウイルスの表面にある）ＨＡ抗原の能力に基づいている。（例えば、ヘマグルチニンのシアル酸結合領域またはステム領域で）ＨＡを特異的に結合する抗体は凝集を防ぐことができ、それによって沈降を可能にする。このアッセイは、動物から新たに調製したＲＢＣ（例えば、モルモットＲＢＣ）を含む９６ウェル丸底プレート内で実施することができる。
【００４６】
例えば、モルモットからの血液は、ＰＢＳで洗浄され、８００ｒｐｍで５分間の遠心分離により回収される。この洗浄はさらに２回繰り返される。次いで、洗浄された血液は、アッセイ用のＰＢＳ中の０．５〜０．７５％  ＲＢＣの最終作業溶液を調製するために、ＰＢＳで希釈される。
【００４７】
ＨＡ抗原をＰＢＳで希釈して段階希釈を行うことにより、ＨＡ抗原（例えば、Ｈ３ウイルス抗原）溶液を調製した。丸底９６ウェルマイクロプレート内でＨＡ抗原溶液をＲＢＣ溶液と穏やかに混合することにより、赤血球凝集アッセイを実施した。反応混合物を室温で３０〜６０分間インキュベートした。次いで、ＨＡ価を測定した。結果は観察によってスコア化される：凝集するとウェルが濁り（すなわち、ＲＢＣ沈降なし）、一方、凝集が抑制されるとＲＢＣを凝固および沈降させ、ウェルの底に赤血球の「ボタン」が生じる。
【００４８】
血清サンプルの抗ＨＡ価を分析するため、丸底９６ウェルマイクロプレート内で４〜８ＨＡ単位の上述のＨＡ抗原溶液をＰＢＳで希釈した。ウェルに２倍〜１２８倍希釈の範囲の段階希釈した抗血清を加えた。反応混合物を室温で１０〜１５分間インキュベートした。次いで、モルモットからの０．５〜０．７５％  ＲＢＣ溶液を加え、混合物を３０〜６０分間培養した。抗血清ＨＩ価を測定した。血清サンプルのＨＩ価は、凝集を防ぐ（すなわち、ボタンＲＢＣ沈降物が生成する）最終希釈度の逆数である。例えば、６４倍希釈でＲＢＣ沈降物のボタンが生成されるが、１２８倍希釈で生成されない場合は、ＨＩ価は６４である。
【００４９】
本発明の実施形態は、以下の利点のうちの１つまたは複数を有する。本発明の実施形態は、インフルエンザウイルスに対する抗体を誘導することができる短鎖ペプチドを使用する。このペプチドはプロテアーゼ耐性に作製することができ、それによって、これらのペプチドワクチンに経口投与経路を使用することが可能になる。本発明のワクチンは短鎖ペプチドを使用するが、これらの短鎖ペプチドは驚くべき抗原であり、抗ウイルス抗体を誘導することができる。
【００５０】
限られた数の例と共に本発明の実施形態を例示してきたが、これらの例は例示のためだけであること、および本発明の範囲から逸脱することなく他の修正または変形が可能であることを当業者なら理解するであろう。したがって、保護の範囲は、添付の特許請求の範囲によって限定されるべきである。
【図１】
2021516658.tif 000005
【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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