(57)【要約】本願発明は、エキソソームおよびエキソソームのバイオマーカーを検出および定量するための方法、組成物、およびキット、ならびに種々の疾患および障害の診断および予後診断方法におけるエキソソームおよびエキソソームのバイオマーカーの使用に関する。本願発明の疾患および障害は、神経学的障害、免疫学的障害、胎盤疾患、癌、血液学的障害、腎臓疾患、胃腸疾患、肝疾患、および筋骨格疾患を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）小胞を含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的に小胞に結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該小胞を捕獲すること；ｃ）小胞と固形支持体の間、および小胞膜結合バイオマーカーと小胞膜の間の接触を維持しながら、小胞を溶解または透過化すること；およびｄ）捕獲された小胞から小胞コアを単離すること
を含む、方法。
【請求項２】
生物学的試料が、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、涙液、唾液、脳脊髄液、細胞および／または細菌培養上澄み、子宮頸管スワブ、口腔スワブ、組織、器官、および環境材料からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
小胞が、エキソソーム、微小粒子、微小小胞、ナノソーム、細胞外小胞、エクトソーム、およびアポトーシス体からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
エキソソームが、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性ニューロン由来エキソソーム、コリン作動性ニューロン由来エキソソーム、セロトニン作動性ニューロン由来エキソソーム、ヒスタミン作動性ニューロン由来エキソソーム、グルタミン作動性ニューロン由来エキソソーム、グリシン作動性ニューロン由来エキソソーム、アドレナリン作動性ニューロン由来エキソソーム、ＧＡＢＡ作動性ニューロン由来エキソソーム、オピオイド作動性（opipoidergic）ニューロン由来エキソソーム、癌由来エキソソーム、骨髄由来エキソソーム、リンパ節由来エキソソーム、前立腺由来エキソソーム、肺由来エキソソーム、肝臓由来エキソソーム、膵臓由来エキソソーム、卵巣由来エキソソーム、胃腸由来エキソソーム、腎臓および尿路由来エキソソーム、皮膚由来エキソソーム、骨由来エキソソーム、筋肉由来エキソソーム、末梢神経由来エキソソーム、脂肪組織由来エキソソーム、結合組織由来エキソソーム、雄性または雌性器官由来エキソソーム、脾臓由来エキソソーム、内分泌由来エキソソーム、および血管由来エキソソームからなる群より選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
固形支持体が、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェーハ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、またはチューブ、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、ピペットチップ、もしくはマイクロ流体デバイスの表面である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
固形支持体が、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、アガロース、ハイドロゲル、またはレジンを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
捕獲剤が、小胞に特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、アプタマー、受容体、またはリガンドである、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
抗体が、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ１７１、ＮＣＡＭ、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧ、ＣＤ１１ｂ、タウ、アミロイドベータ、アルファ−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、および／またはＳＯＤに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
小胞コアから１つ以上のカーゴおよび／または細胞質バイオマーカーを検出することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
バイオマーカーが、変異タンパク質、過剰発現または過少発現タンパク質、修飾タンパク質、器官／組織特異的タンパク質、疾患関連タンパク質、タンパク質モノマーおよび／またはオリゴマー、酵素、キナーゼ、ホルモン、成長因子、転写因子、サイトカインおよび／またはケモカイン、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、神経伝達物質、小分子、代謝物、脂質および／またはリポタンパク質、金属、異物、および／または対照マーカーである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
修飾タンパク質が、リン酸化タンパク質、メチル化タンパク質、グリコシル化タンパク質、アセチル化タンパク質、またはユビキチン化タンパク質である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
疾患関連タンパク質が、タウ、アミロイドベータ、アルファ−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＳＯＤのモノマー、オリゴマー、またはリン酸化型からなる群から選択される、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
対照マーカーが、総タンパク質、シナプスタンパク質、ＧＡＰＤＨ、ＧＦＡＰ、およびＭＢＰを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
検出が、イムノアッセイ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、クロマトグラフィー、質量分析、配列決定、および／または核酸染料との反応を含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１５】
生物学的試料が、神経学的障害、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性顆粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症、パーキンソン病を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
生物学的試料が、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を該疾患または障害について治療することをさらに含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１８】
ａ）エキソソームを含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的にエキソソームに結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該エキソソームを捕獲すること；ｃ）エキソソーム膜と捕獲剤の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること；およびｄ）エキソソームから内膜結合バイオマーカーを検出すること
を含む、方法。
【請求項１９】
内膜結合バイオマーカーが、タウ、シナプトフィジン、シナプトタグミン、シナプトポディン、ＳＮＡＰ２５、ニューロフィラメント、アミロイドベータ、アルファ−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＳＯＤアポトーシスタンパク質（SOD aptic protein）、細胞骨格タンパク質、膜受容体関連タンパク質および／またはキナーゼのモノマー、オリゴマー、リン酸化型からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
エキソソームが、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソーム、癌由来エキソソーム、骨髄由来エキソソーム、リンパ節由来エキソソーム、前立腺由来エキソソーム、肺由来エキソソーム、肝臓由来エキソソーム、膵臓由来エキソソーム、卵巣由来エキソソーム、胃腸由来エキソソーム、腎臓および尿路由来エキソソーム、皮膚由来エキソソーム、骨由来エキソソーム、筋肉由来エキソソーム、末梢神経由来エキソソーム、脂肪組織由来エキソソーム、結合組織由来エキソソーム、雄性または雌性器官由来エキソソーム、脾臓由来エキソソーム、内分泌由来エキソソーム、および血管由来エキソソームからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
固定化抗体を含む固形支持体上で小胞を含む試料をインキュベートすることを含む飽和酵素連結免疫吸着アッセイであって、固形支持体上の固定化抗体は試料中の小胞により一般に飽和される、飽和酵素連結免疫吸着アッセイ。
【請求項２２】
固定化抗体の実質的に全てが、試料からの標的抗原に結合している、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２３】
小胞膜と固形支持体の間の接触を維持しながら小胞を溶解または透過化すること、および捕獲された小胞からのカーゴまたは細胞質バイオマーカーまたは内膜結合バイオマーカーを検出することをさらに含む、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２４】
カーゴまたは細胞質バイオマーカーまたは内膜結合バイオマーカーが、神経伝達物質およびそれらの代謝物、神経伝達物質合成および分解を含む種々の酵素、シナプスタンパク質（複数）、細胞骨格、サイトカイン、ケモカイン、モノマーおよび／またはオリゴマータウ、リン酸化タウ、シナプスタンパク質（単数）、細胞骨格タンパク質、および膜受容体関連タンパク質および／またはキナーゼからなる群から選択される、請求項２３に記載のアッセイ。
【請求項２５】
エキソソームが、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される、請求項２１に記載のアッセイ。
【請求項２６】
小胞が、エキソソーム、微小粒子、微小小胞、ナノソーム、細胞外小胞、エクトソーム、およびアポトーシス体からなる群から選択される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２７】
エキソソームが、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性ニューロン由来エキソソーム、コリン作動性ニューロン由来エキソソーム、セロトニン作動性ニューロン由来エキソソーム、ヒスタミン作動性ニューロン由来エキソソーム、グルタミン作動性ニューロン由来エキソソーム、グリシン作動性ニューロン由来エキソソーム、アドレナリン作動性ニューロン由来エキソソーム、ＧＡＢＡ作動性ニューロン由来エキソソーム、オピオイド作動性ニューロン由来エキソソーム、癌由来エキソソーム、骨髄由来エキソソーム、リンパ節由来エキソソーム、前立腺由来エキソソーム、肺由来エキソソーム、肝臓由来エキソソーム、膵臓由来エキソソーム、卵巣由来エキソソーム、胃腸由来エキソソーム、腎臓および尿路由来エキソソーム、皮膚由来エキソソーム、骨由来エキソソーム、筋肉由来エキソソーム、末梢神経由来エキソソーム、脂肪組織由来エキソソーム、結合組織由来エキソソーム、雄性または雌性器官由来エキソソーム、脾臓由来エキソソーム、内分泌由来エキソソーム、および血管由来エキソソームからなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年１月１８日に出願された米国仮特許出願第６２／６１９，０８０号に対する優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本願発明は、エキソソームおよびエキソソームバイオマーカーを検出および定量するための方法、組成物、およびキット、ならびに種々の疾患および障害の診断および予後診断方法におけるエキソソームおよびエキソソームバイオマーカーの使用に関する。本願発明の疾患および障害は、神経学的障害、免疫学的障害、胎盤疾患、癌、血液学的障害、腎臓疾患、胃腸疾患、肝疾患、および筋骨格疾患を含む。
【背景技術】
【０００３】
生物学的流体中のエキソソームは、発生する母細胞およびそれらの母細胞の近くの微小環境の生理学的および病理学的材料（タンパク質、代謝物、ＲＮＡ、小分子等）をエキソソームが運ぶため、種々の疾患の診断に有用である可能性がある。エキソソームは診断のための貴重なリソースとして認識されるが、エキソソームを分析する現在の分析方法は、診断試験における日常的な使用にはあまりに複雑で高価である。
【０００４】
５４０万人を超えるアメリカ人および世界中の３５００万人の人々が、最も一般的な形態の認知症であるアルツハイマー病を有する。現在、アルツハイマー病を診断する唯一の決定的な方法は、患者の死亡後の脳組織の直接検査による。医師は、脳イメージング、行動の評価、精神医学的試験、および他の手段を使用して、アルツハイマー病を有する疑いのある患者における疾患を診断するが、高度に正確であるものはなく、そして多くは費用がかかるかまたは実用的でない。
【０００５】
２０１７年に、米国において推定１，６８８，７８０件の新たな診断された癌症例および６００，９２０件の癌死亡があるだろう。最も一般的な癌は、乳癌、肺および気管支癌、前立腺癌、結腸直腸癌、膀胱癌、皮膚黒色腫、非ホジキンリンパ腫、甲状腺癌、腎臓および腎盂癌、白血病、子宮内膜癌、および膵臓癌である。同様に、何百万人ものアメリカ人が、免疫学的障害および免疫系の機能不全により引き起こされる疾患に苦しむ。
【０００６】
したがって、および疾患および例えば、神経学的障害、癌、免疫学的障害、および胎盤疾患等の他の障害を診断するためのバイオマーカーおよび方法に対する当該技術分野における必要性がある。さらに、エキソソームおよびエキソソームバイオマーカーを検出するための組成物、ならびに疾患および他の障害を治療するために有用な組成物および方法に対する当該技術分野における必要性がある。本願発明は、エキソソームおよびエキソソームバイオマーカーを検出するための新規の方法を提供することにより、該必要性を満たす。本願発明は、種々の疾患および障害を診断、予後診断、予測、および治療するための方法、アッセイ、バイオマーカー、キット、および組成物をさらに提供する。
【発明の概要】
【０００７】
本願発明は、小胞（例えば、エキソソーム）および小胞バイオマーカーを検出および定量するための新規の方法、組成物、およびキットに関する。いくつかの実施形態において、本発明は、以下を含む方法を提供する：ａ）小胞を含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的に小胞に結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該小胞を捕獲すること；ｃ）小胞と固形支持体の間、および小胞膜結合バイオマーカーと小胞膜の間の接触を維持しながら、小胞を溶解または透過化すること；およびｄ）捕獲された小胞から小胞コアを単離すること。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、涙液、唾液、脳脊髄液、細胞および／または細菌培養上澄み、子宮頸管スワブ、口腔スワブ、組織、器官、および環境材料からなる群から選択される。他の実施形態において、小胞は、エキソソーム、微小粒子、微小小胞、ナノソーム、細胞外小胞、エクトソーム、およびアポトーシス体からなる群から選択される。さらに他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性ニューロン由来エキソソーム、コリン作動性ニューロン由来エキソソーム、セロトニン作動性ニューロン由来エキソソーム、ヒスタミン作動性ニューロン由来エキソソーム、グルタミン作動性ニューロン由来エキソソーム、グリシン作動性ニューロン由来エキソソーム、アドレナリン作動性ニューロン由来エキソソーム、ＧＡＢＡ作動性ニューロン由来エキソソーム、オピオイド作動性ニューロン由来エキソソーム、癌由来エキソソーム、骨髄由来エキソソーム、リンパ節由来エキソソーム、前立腺由来エキソソーム、肺由来エキソソーム、肝臓由来エキソソーム、膵臓由来エキソソーム、卵巣由来エキソソーム、胃腸由来エキソソーム、腎臓および尿路由来エキソソーム、皮膚由来エキソソーム、骨由来エキソソーム、筋肉由来エキソソーム、末梢神経由来エキソソーム、脂肪組織由来エキソソーム、結合組織由来エキソソーム、雄性または雌性器官由来エキソソーム、脾臓由来エキソソーム、内分泌由来エキソソーム、および血管由来エキソソームからなる群から選択される。なお他の実施形態において、固形支持体は、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェーハ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、またはチューブの表面、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、ピペットチップ、もしくはマイクロ流体デバイスである。いくつかの実施形態において、固形支持体は、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、アガロース、ハイドロゲル、またはレジンを含む。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本願発明の方法において使用される捕獲剤は、小胞に特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、アプタマー、受容体、またはリガンドである。他の実施形態において、本願発明の方法において使用される抗体は、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ９、ＣＤ１７１、ＮＣＡＭ、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧ、ＣＤ１１ｂ、タウ、アミロイドベータ、アルファ−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、および／またはＳＯＤに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体である。なお他の実施形態において、本発明の方法は、小胞コアから１つ以上のカーゴおよび／または細胞質バイオマーカーを検出することをさらに含む。他の実施形態において、バイオマーカーは、変異タンパク質、過剰発現または過少発現タンパク質、修飾タンパク質、器官／組織特異的タンパク質、疾患関連タンパク質、タンパク質モノマーおよび／またはオリゴマー、酵素、キナーゼ、ホルモン、成長因子、転写因子、サイトカインおよび／またはケモカイン、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ノンコーディングＲＮＡ、神経伝達物質、小分子、代謝物、脂質および／またはリポタンパク質、金属、異物、および／または対照マーカーである。他の実施形態において、修飾タンパク質は、リン酸化タンパク質、メチル化タンパク質、グリコシル化タンパク質、アセチル化タンパク質、またはユビキチン化タンパク質である。さらに他の実施形態において、疾患関連タンパク質は、タウ、アミロイドベータ、アルファ−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＳＯＤのモノマー、オリゴマー、またはリン酸化型からなる群から選択される。他の実施形態において、対照マーカーは、総タンパク質、シナプスタンパク質、ＧＡＰＤＨ、ＧＦＡＰ、ＭＢＰを含む。いくつかの実施形態において、検出は、イムノアッセイ、ウエスタンブロット、ノーザンブロット、クロマトグラフィー、質量分析、配列決定、および／または核酸染料との反応を含む。さらに他の実施形態において、生物学的試料は、神経学的障害、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症（tangle-predominant senile dementia）、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症、パーキンソン病を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。なお他の実施形態において、生物学的試料は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮ��）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、本願発明の方法は、対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療することをさらに含む。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本願発明は、以下を含む方法を提供する：ａ）エキソソームを含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的にエキソソームに結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該エキソソームを捕獲すること；ｃ）エキソソーム膜と捕獲剤の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること；およびｄ）エキソソームから内膜結合バイオマーカーを検出すること。いくつかの実施形態において、内膜結合バイオマーカーは、タウ、シナプトフィジン、シナプトタグミン、シナプトポディン、ＳＮＡＰ２５、ニューロフィラメント、アミロイドベータ、アルファ−シヌクレイン、ＴＤＰ−４３、ＳＯＤアポトーシスタンパク質、細胞骨格タンパク質、膜受容体関連タンパク質および／またはキナーゼのモノマー、オリゴマー、リン酸化型からなる群から選択される。他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミンからなる群から選択される作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソーム、癌由来エキソソーム、骨髄由来エキソソーム、リンパ節由来エキソソーム、前立腺由来エキソソーム、肺由来エキソソーム、肝臓由来エキソソーム、膵臓由来エキソソーム、卵巣由来エキソソーム、胃腸由来エキソソーム、腎臓および尿路由来エキソソーム、皮膚由来エキソソーム、骨由来エキソソーム、筋肉由来エキソソーム、末梢神経由来エキソソーム、脂肪組織由来エキソソーム、結合組織由来エキソソーム、雄性性雌性性由来エキソソーム、脾臓由来エキソソーム、内分泌由来エキソソーム、および血管由来エキソソームからなる群から選択される。
【００１０】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下の工程を含む方法を提供する：ａ）エキソソームを含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的にエキソソームに結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該エキソソームを捕獲すること；ｃ）エキソソームと固形支持体の間、およびエキソソーム膜結合バイオマーカーとエキソソーム膜の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること；およびｄ）固形支持体からエキソソームコアおよび／またはカーゴを単離すること。いくつかの実施形態において、方法は、エキソソームコアからカーゴおよび／または細胞質バイオマーカーを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、変異タンパク質、過剰発現または過少発現タンパク質、修飾タンパク質（例えば、リン酸化タンパク質、メチル化タンパク質、グリコシル化タンパク質、アセチル化タンパク質、またはユビキチン化タンパク質）、器官／組織特異的タンパク質（例えば、ニューロンのニューロフィラメント、アストロサイトのＧＦＡＰ、肺のサーファクタントタンパク質、前立腺のＰＳＡ）、疾患特異的タンパク質（例えば、タウまたはＡベータ）、タンパク質モノマーおよび／またはオリゴマー、酵素、キナーゼ、ホルモン、成長因子、転写因子、サイトカインおよび／またはケモカイン、ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および／またはノンコーディングＲＮＡ）、神経伝達物質（例えば、アセチルコリン、ドーパミン、セロトニン、オピオイド）、小分子（例えば、薬物または一酸化窒素）、代謝物、脂質および／またはリポタンパク質、金属、または異物（例えば、細菌および／またはウイルス由来の生体分子）。いくつかの実施形態において、バイオマーカーはタウモノマーおよび／またはオリゴマーである。他の実施形態において、バイオマーカーはアルファ−シヌクレインである。さらに他の実施形態において、バイオマーカーはリン酸化タウまたはＡベータモノマーおよび／またはオリゴマーである。なお他の実施形態において、バイオマーカーはＴＤＰ−４３またはＳＯＤである。いくつかの実施形態において、固形支持体は、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェーハ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、またはチューブ、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、もしくはマイクロ流体デバイスの表面である。他の実施形態において、固形支持体は、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、ハイドロゲル、またはレジンを含む。さらに他の実施形態において、固形支持体は、エキソソームまたは内膜結合エキソソームバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる捕獲剤を含む。なお他の実施形態において、捕獲剤は、エキソソームに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、エキソソームコアからの１つ以上のカーゴまたは細胞質バイオマーカーの検出は、１つ以上の検出剤を使用することを含む。他の実施形態において、検出剤は、エキソソームからの内膜結合バイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。さらに他の実施形態において、検出剤は、検出可能なラベルをさらに含む。なお他の実施形態において、検出可能なラベルは、蛍光ラベル、化学発光ラベル、電気化学発光ラベル、生物発光ラベル、同位体ラベル、または放射性ラベルである。いくつかの実施形態において、エキソソームコアからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーの検出は、イムノアッセイを実行することを含む。他の実施形態において、イムノアッセイは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）である。なお他の実施形態において、エキソソームを含む生物学的試料は対象または細胞培養上澄みからである。さらに他の実施形態において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、子宮頸管スワブ、涙液、唾液、口腔スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症、またはパーキンソン病等の神経学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍等の癌を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、生物学的試料は、免疫学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。さらに他の実施形態において、生物学的試料は、胎盤疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。なお他の実施形態において、生物学的試料は、血液学的障害、腎臓疾患、胃腸疾患、肝疾患、または筋骨格疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、対象は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウサギ、モルモット、および齧歯類からなる群から選択される。他の実施形態において、本願発明の方法は、疾患または障害を有する対象を診断することをさらに含む。他の実施形態において、本願発明の方法は、対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療することをさらに含む。
【００１１】
いくつかの実施形態において、本発明は、固形支持体上でエキソソームを選択的に捕獲し、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化し、そして捕獲されたエキソソームからの内膜結合バイオマーカーを検出する方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、固形支持体上でエキソソームを選択的に捕獲し、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化し、そして捕獲されたエキソソームからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出する方法を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、固形支持体上でエキソソームを選択的に捕獲し、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化し、そして捕獲されたエキソソームからのｍｉＲＮＡを検出する方法を提供する。なお他の実施形態において、本発明は、エキソソームおよびエキソソームバイオマーカーを検出するための飽和酵素連結免疫吸着アッセイを提供する。一定の実施形態において、アッセイは、固定化抗体を含む固形支持体上でエキソソームを含む試料をインキュベートすることを含み、固形支持体上の固定化抗体は、試料中のエキソソームにより一般に飽和される。一定の実施形態において、固定化抗体の実質的に全ては、試料からの標的抗原に結合している。本実施形態の特定の態様において、方法は、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化すること、および捕獲されたエキソソームからカーゴバイオマーカーまたは内膜結合バイオマーカーを検出することをさらに含む。
【００１２】
エキソソームおよびエキソソームバイオマーカーの測定は、種々の疾患の診断および予後診断方法において有用である。特に、本願発明は、対象における疾患または障害を診断または予後診断する方法、疾患または障害の危険性がある対象を特定する方法、または疾患または障害を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。一定の実施形態において、本願発明は、対象における神経学的障害を診断または予後診断する方法、神経学的障害の危険性がある対象を特定する方法、または神経学的障害を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。他の実施形態において、本願発明は、対象における癌を診断または予後診断する方法、癌の危険性がある対象を特定する方法、または癌を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。他の実施形態において、本願発明は、対象における胎盤疾患を診断または予後診断する方法、胎盤疾患の危険性がある対象を特定する方法、または胎盤疾患を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。他の実施形態において、本願発明は、対象における血液学的障害を診断または予後診断する方法、血液学的障害の危険性がある対象を特定する方法、または血液学的障害を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。他の実施形態において、本願発明は、対象における腎臓疾患を診断または予後診断する方法、腎臓疾患の危険性がある対象を特定する方法、または腎臓疾患を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。他の実施形態において、本願発明は、対象における胃腸疾患を診断または予後診断する方法、胃腸疾患の危険性がある対象を特定する方法、または胃腸疾患を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。他の実施形態において、本願発明は、対象における肝疾患を診断または予後診断する方法、肝疾患の危険性がある対象を特定する方法、または肝疾患を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。他の実施形態において、本願発明は、対象における筋骨格疾患を診断または予後診断する方法、筋骨格疾患の危険性がある対象を特定する方法、または筋骨格疾患を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。
【００１３】
１つの態様において、本発明は、以下を含む方法を提供する：ａ）エキソソームを含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的にエキソソームに結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該エキソソームを捕獲すること；ｃ）エキソソーム膜と捕獲剤の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること；およびｄ）エキソソームから内膜結合バイオマーカーを検出すること。いくつかの実施形態において、内膜結合バイオマーカーは、モノマーおよび／またはオリゴマータウ、リン酸化タウ、シナプスタンパク質、細胞骨格タンパク質、および膜受容体関連タンパク質および／またはキナーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、シナプスタンパク質は、シナプトフィジン、シナプトタグミン、シナプトポディン、またはＳＮＡＰ２５である。他の実施形態において、細胞骨格タンパク質はニューロフィラメントである。他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される。一定の実施形態において、固形支持体は、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェーハ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、またはチューブ、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、もしくはマイクロ流体デバイスの表面である。固形支持体は、例えば、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、ハイドロゲル、またはレジンを含むことができる。一定の実施形態において、固形支持体は、それに関連する捕獲剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームまたは内膜結合エキソソームバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる捕獲剤を含む。一定の実施形態において、固形支持体で捕獲されたエキソソームからの内膜結合バイオマーカーの検出は、検出剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームからの異なる内膜結合バイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる検出剤を使用することを含む。一定の実施形態において、捕獲剤は、エキソソームに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。他の実施形態において、検出剤は、エキソソームからの内膜結合バイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。捕獲剤および検出剤は、抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片を含んでもよい。一定の実施形態において、検出剤は、検出可能なラベル、例えば、蛍光、化学発光、電気化学発光、生物発光、同位体、または放射性ラベルをさらに含む。一定の実施形態において、エキソソームからの内膜結合バイオマーカーを検出することは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイを実施することを含む。エキソソームを含む生物学的試料は、対象または細胞培養上澄みからであってもよい。一定の実施形態において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、子宮頸管スワブ、涙液、唾液、口腔スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。一定の実施形態において、生物学的試料は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症、またはパーキンソン病等の神経学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍等の癌を有すると診断を受けたか疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、免疫学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、生物学的試料は、胎盤疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液学的障害、腎臓疾患、胃腸疾患、肝疾患、または筋骨格疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、対象は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウサギ、モルモット、および齧歯類からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、疾患または障害を有する対象を診断することをさらに含む。他の実施形態において、方法は、対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療することをさらに含む。
【００１４】
１つの態様において、本発明は、以下を含む方法を提供する：ａ）エキソソームを含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的にエキソソームに結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該エキソソームを捕獲すること；ｃ）エキソソーム膜と捕獲剤の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること；およびｄ）エキソソームからカーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出すること。いくつかの実施形態において、カーゴまたは細胞質バイオマーカーは、神経伝達物質およびそれらの代謝物、神経伝達物質合成および分解を含む種々の酵素、シナプスタンパク質、細胞骨格、サイトカイン、およびケモカインからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、カーゴまたは細胞質バイオマーカーは、α−シヌクレイン、β−アミロイド、タウまたはリン酸化タウである。他の実施形態において、神経伝達物質は、アセチルコリン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミン、グルタミン、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、およびオピオイドからなる群から選択される。他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される。一定の実施形態において、固形支持体は、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェーハ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、またはチューブ、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、もしくはマイクロ流体デバイスの表面である。固形支持体は、例えば、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、ハイドロゲル、またはレジンを含むことができる。一定の実施形態において、固形支持体は、それに関連する捕獲剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームまたはカーゴまたは細胞質エキソソームバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる捕獲剤を含む。一定の実施形態において、固形支持体上で捕獲されたエキソソームからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーの検出は、検出剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームからの異なるカーゴまたは細胞質バイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる検出剤を使用することを含む。一定の実施形態において、捕獲剤は、エキソソームに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。他の実施形態において、検出剤は、エキソソームからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。捕獲剤および検出剤は、抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体��ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片を含んでもよい。一定の実施形態において、検出剤は、検出可能なラベル、例えば、蛍光、化学発光、電気化学発光、生物発光、同位体、または放射性ラベルをさらに含む。一定の実施形態において、エキソソームからカーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出することは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイを実施することを含む。エキソソームを含む生物学的試料は、対象または細胞培養上澄みからであってもよい。一定の実施形態において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、子宮頸管スワブ、涙液、唾液、口腔スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。一定の実施形態において、生物学的試料は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症、またはパーキンソン病等の神経学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍等の癌を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、免疫学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、生物学的試料は、胎盤疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液学的障害、腎臓疾患、胃腸疾患、肝疾患、または筋骨格疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、対象は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウサギ、モルモット、および齧歯類からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、疾患または障害を有する対象を診断することをさらに含む。他の実施形態において、方法は、対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療することをさらに含む。
【００１５】
１つの態様において、本発明は、以下を含む方法を提供する：ａ）エキソソームを含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的にエキソソームに結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該エキソソームを捕獲すること；ｃ）エキソソーム膜と捕獲剤の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること；およびｄ）エキソソームからｍｉＲＮＡを検出すること。他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される。一定の実施形態において、固形支持体は、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェーハ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、またはチューブ、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、もしくはマイクロ流体デバイスの表面である。固形支持体は、例えば、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、ハイドロゲル、またはレジンを含むことができる。一定の実施形態において、固形支持体は、それに関連する捕獲剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームまたはエキソソームｍｉＲＮＡに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる捕獲剤を含む。いくつかの実施形態において、方法は、エキソソームとトリゾールとのインキュベーションをさらに含む。一定の実施形態において、固形支持体で捕獲されたエキソソームからのｍｉＲＮＡの検出は、検出剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームからの異なるｍｉＲＮＡに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる検出剤を使用することを含む。一定の実施形態において、捕獲剤は、エキソソームに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。他の実施形態において、検出剤は、エキソソームからのｍｉＲＮＡに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、方法は、エタノール抽出、磁性ビーズ分離、またはスピンカラム抽出により、試料からｍｉＲＮＡを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲＮＡを増幅すること、ＲＮＡを配列決定すること、ハイブリダイゼーション、または遺伝子チップを含むｍｉＲＮＡのレベルを決定することをさらに含む。捕獲剤および検出剤は、抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片を含んでもよい。一定の実施形態において、検出剤は、検出可能なラベル、例えば、蛍光、化学発光、電気化学発光、生物発光、同位体、または放射性ラベルをさらに含む。一定の実施形態において、エキソソームからのｍｉＲＮＡの検出は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイを実施することを含む。エキソソームを含む生物学的試料は、対象または細胞培養上澄みからであってもよい。一定の実施形態において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、子宮頸管スワブ、涙液、唾液、口腔スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。一定の実施形態において、生物学的試料は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症、またはパーキンソン病等の神経学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍など癌を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、免疫学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、生物学的試料は、胎盤疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液学的障害、腎臓疾患、胃腸疾患、肝疾患、または筋骨格疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、対象は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウサギ、モルモット、および齧歯類からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、疾患または障害を有する対象を診断することをさらに含む。他の実施形態において、方法は、対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療することをさらに含む。
【００１６】
他の実施形態において、本願発明は、固定化抗体を含む固形支持体上で小胞を含む試料をインキュベートすることを含む飽和酵素連結免疫吸着アッセイを提供し、固形支持体上の固定化抗体は、試料中の小胞により一般に飽和される。いくつかの実施形態において、固定化抗体の実質的に全ては、試料からの標的抗原に結合している。他の実施形態において、方法は、小胞膜と固形支持体の間の接触を維持しながら小胞を溶解または透過化すること、および捕獲された小胞からカーゴまたは細胞質バイオマーカーまたは内膜結合バイオマーカーを検出することをさらに含む。さらに他の実施形態において、カーゴまたは細胞質バイオマーカーまたは内膜結合バイオマーカーは、神経伝達物質およびそれらの代謝物、神経伝達物質合成および分解を含む種々の酵素、シナプスタンパク質（複数）、細胞骨格、サイトカイン、ケモカイン、モノマーおよび／またはオリゴマータウ、リン酸化タウ、シナプスタンパク質（単数）、細胞骨格タンパク質、および膜受容体関連タンパク質および／またはキナーゼからなる群から選択される。なお他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、小胞は、エキソソーム、微小粒子、微小小胞、ナノソーム、細胞外小胞、エクトソーム、およびアポトーシス体からなる群から選択される。他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性ニューロン由来エキソソーム、コリン作動性ニューロン由来エキソソーム、セロトニン作動性ニューロン由来エキソソーム、ヒスタミン作動性ニューロン由来エキソソーム、グルタミン作動性ニューロン由来エキソソーム、グリシン作動性ニューロン由来エキソソーム、アドレナリン作動性ニューロン由来エキソソーム、ＧＡＢＡ作動性ニューロン由来エキソソーム、オピオイド作動性ニューロン由来エキソソーム、癌由来エキソソーム、骨髄由来エキソソーム、リンパ節由来エキソソーム、前立腺由来エキソソーム、肺由来エキソソーム、肝臓由来エキソソーム、膵臓由来エキソソーム、卵巣由来エキソソーム、胃腸由来エキソソーム、腎臓および尿路由来エキソソーム、皮膚由来エキソソーム、骨由来エキソソーム、筋肉由来エキソソーム、末梢神経由来エキソソーム、脂肪組織由来エキソソーム、結合組織由来エキソソーム、雄性または雌性器官由来エキソソーム、脾臓由来エキソソーム、内分泌由来エキソソーム、および血管由来エキソソームからなる群から選択される。
【００１７】
他の実施形態において、本願発明は、エキソソームおよびエキソソームバイオマーカーを検出するための飽和酵素連結免疫吸着アッセイを提供する。いくつかの実施形態において、アッセイは、固定化抗体を含む固形支持体上でエキソソームを含む試料をインキュベートすることを含み、固形支持体上の固定化抗体は、試料中のエキソソームにより一般に飽和される。一定の実施形態において、固定化抗体の実質的に全ては、試料からの標的抗原に結合している。本実施形態の特定の態様において、方法は、エキソソーム膜と固形支持体との間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること、および捕獲されたエキソソームからカーゴまたは細胞質バイオマーカーまたは内膜結合バイオマーカーを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、カーゴまたは細胞質バイオマーカーまたは内膜結合バイオマーカーは、モノマーおよび／またはオリゴマータウ、リン酸化タウ、シナプスタンパク質、細胞骨格タンパク質、および膜受容体関連タンパク質および／またはキナーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、シナプスタンパク質は、シナプトフィジン、シナプトタグミン、シナプトポディン、またはＳＮＡＰ２５である。他の実施形態において、細胞骨格タンパク質はニューロフィラメントである。いくつかの実施形態において、カーゴまたは細胞質バイオマーカーは、神経伝達物質およびそれらの代謝物、神経伝達物質合成および分解を含む種々の酵素、シナプスタンパク質、細胞骨格、サイトカイン、およびケモカインからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、カーゴまたは細胞質バイオマーカーは、α−シヌクレイン、β−アミロイド、タウまたはリン酸化タウである。他の実施形態において、神経伝達物質は、アセチルコリン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミン、グルタミン、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、およびオピオイドからなる群から選択される。他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される。一定の実施形態において、固形支持体は、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェーハ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、またはチューブ、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、もしくはマイクロ流体デバイスの表面である。固形支持体は、例えば、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、ハイドロゲル、またはレジンを含むことができる。一定の実施形態において、固形支持体は、それに関連する捕獲剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームまたは内膜結合またはカーゴまたは細胞質エキソソームバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１��、２０、またはそれを超える異なる捕獲剤を含む。一定の実施形態において、固体支持体上で捕獲されたエキソソームからの内膜結合、カーゴまたは細胞質バイオマーカーの検出は、検出剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームからの異なる内膜結合、カーゴまたは細胞質バイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる検出剤を使用することを含む。一定の実施形態において、捕獲剤は、エキソソームに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。他の実施形態において、検出剤は、エキソソームからの内膜結合、カーゴまたは細胞質バイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。捕獲剤および検出剤は、抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片を含んでもよい。一定の実施形態において、検出剤はさらに、検出可能なラベル、例えば、蛍光、化学発光、電気化学発光、生物発光、同位体、または放射性ラベルを含む。一定の実施形態において、エキソソームから内膜結合、カーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出することは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイを実施することを含む。エキソソームを含む生物学的試料は、対象または細胞培養上澄みからであってもよい。一定の実施形態において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、子宮頸管スワブ、涙液、唾液、口腔スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。一定の実施形態において、生物学的試料は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症、またはパーキンソン病等の神経学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍等の癌を有すると診断されたかまたは疑われ��いる対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、免疫学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、生物学的試料は、胎盤疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液学的障害、腎臓疾患、胃腸疾患、肝疾患、または筋骨格疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、対象は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウサギ、モルモット、および齧歯類からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、疾患または障害を有する対象を診断することをさらに含む。他の実施形態において、方法は、対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療することをさらに含む。
【００１８】
一定の実施形態において、バイオマーカーは、エキソソーム上の内膜結合タンパク質または吸着されたタンパク質である。他の実施形態において、バイオマーカーは、エキソソーム表面マーカー（例えば、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ１７１）、ニューロン特異的タンパク質（例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、リン酸化タウ、αβ−４２、およびシナプトフィジン）、アストロサイト特異的タンパク質（例えば、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸輸送体１（ＥＡＡＴ１））、小膠細胞特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ））、希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、またはケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）であってもよい。別の実施態様において、バイオマーカーは代謝物である。他の実施形態において、バイオマーカーはドーパミン輸送体（ＤＡＴ）である。別の実施態様において、方法は、固形支持体で捕獲されたエキソソームからの細胞質タンパク質（例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬ）を検出することをさらに含む。別の実施態様において、方法は、固形支持体で捕獲されたエキソソームからの１つ以上のバイオマーカーを検出することをさらに含む。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、ＣＤ８１、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、ＣＴＳＤ、ＲＥ１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、シナプトタグミン（ＳＹＴ）、ＮＧＲＮ、単球走化性タンパク質１（ＣＣＬ２）、ＩＬ３４、グリコーゲン合成酵素（ＧＹＳ）、（ＯＲ）、死受容体６（ＤＲ６）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ＩＬ１２ベータ、ａｌｐｈＡベータ（Ａβ）、ベータ−セクレターゼ（ＢＡＣＥ）、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５．Ｂ１、Ｂ２）、グルタミン酸受容体（１および２）、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、死受容体５および６）、神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭからなる群から選択される。
【００１９】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、ニューロン特異的タンパク質、アストロサイト特異的タンパク質、小膠細胞特異的タンパク質、または希突起膠細胞特異的タンパク質である。他の実施形態において、バイオマーカーは、細胞質タンパク質、分泌タンパク質、受容体タンパク質、または内膜タンパク質である。いくつかの実施形態において、細胞質タンパク質は、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＳＮＣＡ、チロシンヒドロキシゲナーゼ（ＴＨ）、αβ−４２、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬからなる群から選択される。他の実施形態において、分泌タンパク質は、サイトカイン、成長因子、ケモカイン、およびインターロイキンからなる群から選択される。特定の態様において、サイトカインは、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＩＬ６、ＩＬ８、ＩＬ１６、ＩＬ２３Ａ、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＣＸ３ＣＬ１、ＣＣＬ２、ＣＸＣＬ１２、ＴＮＦアルファ、ＴＮＦＳＦ１０、ＩＬ１２Ｂ、ノシセプチン、ＧｎＲＨ、ＦａｓＬ、およびＴＮＦＳＦ１３からなる群から選択される。他の実施形態において、神経伝達物質受容体は、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５．Ｂ１、Ｂ２）、グルタミン酸受容体（１および２）、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、死受容体５および６）、および神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）からなる群から選択される。他の実施形態において、内膜タンパク質は、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１、Ｓ３９６）、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、およびＮＣＡＭからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、神経伝達物質およびそれらの代謝物、神経伝達物質合成および分解を含む種々の酵素、シナプスタンパク質、細胞骨格、サイトカイン、およびケモカインからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、カーゴまたは細胞質バイオマーカーは、α−シヌクレイン、β−アミロイド、タウまたはリン酸化タウである。他の実施形態において、神経伝達物質は、アセチルコリン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミン、グルタミン、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、およびオピオイドからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、モノマーおよび／またはオリゴマータウ、リン酸化タウ、シナプスタンパク質、細胞骨格タンパク質、および膜受容体関連タンパク質および／またはキナーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、シナプスタンパク質は、シナプトフィジン、シナプトタグミン、シナプトポディン、またはＳＮＡＰ２５である。他の実施形態において、細胞骨格タンパク質はニューロ���ィラメントである。
【００２０】
１つの態様において、本発明は、対象における疾患または障害を診断および治療する方法を提供し、この方法は以下を含む：ａ）エキソソームを含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的にエキソソームに結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該エキソソームを捕獲すること；ｃ）エキソソーム膜と捕獲剤の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること；ｄ）エキソソームから内膜結合バイオマーカーを検出すること；ｅ）バイオマーカーのレベルをバイオマーカーの対照レベルと比較することにより、疾患または障害を有する対象を診断すること；およびｆ）対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療すること。いくつかの実施形態において、内膜結合バイオマーカーは、モノマーおよび／またはオリゴマータウ、リン酸化タウ、シナプスタンパク質、細胞骨格タンパク質、および膜受容体関連タンパク質および／またはキナーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、シナプスタンパク質は、シナプトフィジン、シナプトタグミン、シナプトポディン、またはＳＮＡＰ２５である。他の実施形態において、細胞骨格タンパク質はニューロフィラメントである。他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される。一定の実施形態において、固形支持体は、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェーハ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、またはチューブ、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、もしくはマイクロ流体デバイスの表面である。固形支持体は、例えば、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、ハイドロゲル、またはレジンを含むことができる。一定の実施形態において、固形支持体は、それに関連する捕獲剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームまたは内膜結合エキソソームバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる捕獲剤を含む。一定の実施形態において、固形支持体で捕獲されたエキソソームからの内膜結合バイオマーカーの検出は、検出剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームからの異なる内膜結合バイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる検出剤を使用することを含む。一定の実施形態において、捕獲剤は、エキソソームに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。他の実施形態において、検出剤は、エキソソームからの内膜結合バイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。捕獲剤および検出剤は、抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片を含んでもよい。一定の実施形態において、検出剤は、検出可能なラベル、例えば、蛍光、化学発光、電気化学発光、生物発光、同位体、または放射性ラベルをさらに含む。一定の実施形態において、エキソソームから内膜結合バイオマーカーを検出することは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイを実施することを含む。エキソソームを含む生物学的試料は、対象または細胞培養上澄みからであってもよい。一定の実施形態において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、子宮頸管スワブ、涙液、唾液、口腔スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。一定の実施形態において、生物学的試料は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症、またはパーキンソン病等の神経学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍等の癌を有すると診断されたか疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、免疫学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、生物学的試料は、胎盤疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液学的障害、腎臓疾患、胃腸疾患、肝疾患、または筋骨格疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、対象は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウサギ、モルモット、および齧歯類からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、疾患または障害を有する対象を診断することをさらに含む。他の実施形態において、方法は、対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療することをさらに含む。
【００２１】
１つの態様において、本発明は、対象における疾患または障害を診断および治療する方法を提供し、この方法は以下を含む：ａ）エキソソームを含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的にエキソソームに結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該エキソソームを捕獲すること；ｃ）エキソソーム膜と捕獲剤の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること；ｄ）エキソソームからカーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出すること；ｅ）バイオマーカーのレベルをバイオマーカーの対照レベルと比較することにより、疾患または障害を有する対象を診断すること；およびｆ）対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療すること。いくつかの実施形態において、カーゴまたは細胞質バイオマーカーは、神経伝達物質およびそれらの代謝物、神経伝達物質合成および分解を含む種々の酵素、シナプスタンパク質、細胞骨格、サイトカイン、およびケモカインからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、カーゴまたは細胞質バイオマーカーは、α−シヌクレイン、β−アミロイド、タウまたはリン酸化タウである。他の実施形態において、神経伝達物質は、アセチルコリン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミン、グルタミン、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、およびオピオイドからなる群から選択される。他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される。一定の実施形態において、固形支持体は、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェーハ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、またはチューブ、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、もしくはマイクロ流体デバイスの表面である。固形支持体は、例えば、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、ハイドロゲル、またはレジンを含むことができる。一定の実施形態において、固形支持体は、それに関連する捕獲剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームまたはカーゴまたは細胞質エキソソームバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる捕獲剤を含む。一定の実施形態において、固形支持体上で捕獲されたエキソソームのカーゴまたは細胞質バイオマーカーの検出は、検出剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームからの異なるカーゴまたは細胞質バイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる検出剤を使用することを含む。一定の実施形態において、捕獲剤は、エキソソームに特異的に結合する��体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。他の実施形態において、検出剤は、エキソソームからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。捕獲剤および検出剤は、抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片を含んでもよい。一定の実施形態において、検出剤は、検出可能なラベル、例えば、蛍光、化学発光、電気化学発光、生物発光、同位体、または放射性ラベルをさらに含む。一定の実施形態において、エキソソームからカーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出することは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイを実施することを含む。エキソソームを含む生物学的試料は、対象または細胞培養上澄みからであってもよい。一定の実施形態において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、子宮頸管スワブ、涙液、唾液、口腔スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。一定の実施形態において、生物学的試料は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症、またはパーキンソン病等の神経学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍等の癌を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、免疫学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、生物学的試料は、胎盤疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液学的障害、腎臓疾患、胃腸疾患、肝疾患、または筋骨格疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、対象は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウサギ、モルモット��および齧歯類からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、疾患または障害を有する対象を診断することをさらに含む。他の実施形態において、方法は、対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療することをさらに含む。
【００２２】
１つの態様において、本発明は、対象の疾患または障害を診断および治療する方法を提供し、この方法は以下を含む：ａ）エキソソームを含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的にエキソソームに結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該エキソソームを捕獲すること；ｃ）エキソソーム膜と捕獲剤の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること；ｄ）エキソソームからｍｉＲＮＡを検出すること；ｅ）バイオマーカーのレベルをバイオマーカーの対照レベルと比較することにより、疾患または障害を有する対象を診断すること；およびｆ）対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療すること。他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される。一定の実施形態において、固形支持体は、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェーハ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、またはチューブ、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、もしくはマイクロ流体デバイスの表面である。固形支持体は、例えば、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、ハイドロゲル、またはレジンを含むことができる。一定の実施形態において、固形支持体は、それに関連する捕獲剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームまたはエキソソームｍｉＲＮＡに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる捕獲剤を含む。いくつかの実施形態において、方法は、エキソソームとトリゾールとのインキュベーションをさらに含む。一定の実施形態において、固形支持体で捕獲されたエキソソームからのｍｉＲＮＡの検出は、検出剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームからの異なるｍｉＲＮＡに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる検出剤を使用することを含む。一定の実施形態において、捕獲剤は、エキソソームに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。他の実施形態において、検出剤は、エキソソームからのｍｉＲＮＡに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。いくつかの実施形態において、方法は、エタノール抽出、磁性ビーズ分離、またはスピンカラム抽出により、試料からｍｉＲＮＡを単離することをさらに含む。いくつかの実施形態において、方法は、ｍｉＲＮＡを増幅することを含むｍｉＲＮＡのレベルを決定すること、ＲＮＡを配列決定すること、ハイブリダイゼーション、または遺伝子チップをさらに含む。捕獲剤および検出剤は、抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片を含んでもよい。一定の実施形態において、検出剤は、検出可能なラベル、例えば、蛍光、化学発光、電気化学発光、生物発光、同位体、または放射性ラベルをさらに含む。一定の実施形態において、エキソソームからのｍｉＲＮＡの検出は、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイを実施することを含む。エキソソームを含む生物学的試料は、対象または細胞培養上澄みからであってもよい。一定の実施形態において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、子宮頸管スワブ、涙液、唾液、口腔スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。一定の実施形態において、生物学的試料は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症、またはパーキンソン病等の神経学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍等の癌を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、免疫学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、生物学的試料は、胎盤疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液学的障害、腎臓疾患、胃腸疾患、肝疾患、または筋骨格疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、対象は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウサギ、モルモット、および齧歯類からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、疾患または障害を有する対象を診断することをさらに含む。他の実施形態において、方法は、対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療することをさらに含む。
【００２３】
１つの態様において、本発明は、対象の疾患または障害を診断および治療する方法を提供し、該方法は以下を含む：固定化抗体を含む固形支持体上でエキソソームを含む試料をインキュベートすること、ここで固形支持上の固定化抗体は一般に、試料中のエキソソームにより飽和される；エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること；エキソソームからカーゴまたは細胞質バイオマーカーまたは内膜結合バイオマーカーを検出すること；およびバイオマーカーのレベルをバイオマーカーの対照レベルと比較することにより、疾患または障害を有する対象を診断すること；および対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療すること。一定の実施形態において、固定化抗体の実質的に全ては、試料からの標的抗原に結合している。いくつかの実施形態において、内膜結合バイオマーカーは、モノマーおよび／またはオリゴマータウ、リン酸化タウ、シナプスタンパク質、細胞骨格タンパク質、および膜受容体関連タンパク質および／またはキナーゼからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、シナプスタンパク質は、シナプトフィジン、シナプトタグミン、シナプトポディン、またはＳＮＡＰ２５である。他の実施形態において、細胞骨格タンパク質はニューロフィラメントである。他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、カーゴまたは細胞質バイオマーカーは、神経伝達物質およびそれらの代謝物、神経伝達物質合成および分解を含む種々の酵素、シナプスタンパク質、細胞骨格、サイトカイン、およびケモカインからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、カーゴまたは細胞質バイオマーカーは、α−シヌクレイン、β−アミロイド、タウまたはリン酸化タウである。他の実施形態において、神経伝達物質は、アセチルコリン、エピネフリン、ノルエピネフリン、ドーパミン、セロトニン、ヒスタミン、グルタミン、ガンマ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）、およびオピオイドからなる群から選択される。一定の実施形態において、固形支持体は、プレート、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、フィルター、スライド、ウェーハ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、またはチューブ、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、もしくはマイクロ流体デバイスの表面である。固形支持体は、例えば、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、ハイドロゲル、またはレジンを含むことができる。一定の実施形態において、固形支持体は、それに関連する捕獲剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームまたは内膜結合またはカーゴまたは細胞質エキソソームバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３��４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる捕獲剤を含む。一定の実施形態において、固形支持体上で捕獲されたエキソソームからの内膜結合、カーゴまたは細胞質バイオマーカーの検出は、検出剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソームからの異なる内膜結合、カーゴまたは細胞質バイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる検出剤を使用することを含む。一定の実施形態において、捕獲剤は、エキソソームに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。他の実施形態において、検出剤は、エキソソームからの内膜結合、カーゴまたは細胞質バイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。捕獲剤および検出剤は、抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、またはｓｃＦｖ断片を含んでもよい。一定の実施形態において、検出剤は、検出可能なラベル、例えば、蛍光、化学発光、電気化学発光、生物発光、同位体、または放射性ラベルをさらに含む。一定の実施形態において、エキソソームから内膜結合、カーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出することは、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）等のイムノアッセイを実施することを含む。エキソソームを含む生物学的試料は、対象または細胞培養上澄みからであってもよい。一定の実施形態において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、子宮頸管スワブ、涙液、唾液、口腔スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。一定の実施形態において、生物学的試料は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症、またはパーキンソン病等の神経学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍等の癌��有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、免疫学的障害を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、生物学的試料は、胎盤疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、血液学的障害、腎臓疾患、胃腸疾患、肝疾患、または筋骨格疾患を有すると診断されたかまたは疑われている対象から得られる。他の実施形態において、対象は、ヒト、サル、イヌ、ブタ、ウシ、ウサギ、モルモット、および齧歯類からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、方法は、疾患または障害を有する対象を診断することをさらに含む。他の実施形態において、方法は、対象が疾患または障害を有すると診断される場合、対象を疾患または障害について治療することをさらに含む。
【００２４】
いくつかの実施形態において、生物学的試料中のエキソソーム上の１つ以上のバイオマーカーのレベルは、対照試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルと比較され、生物学的試料の１つ以上のバイオマーカーは、対照試料と比較して上昇している。いくつかの実施形態において、生物学的試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルは、対照試料中の１つ以上のバイオマーカーのレベルと比較され、生物学的試料の１つ以上のバイオマーカーのレベルは、対照試料と比較して減少している。いくつかの実施形態において、バイオマーカーレベルは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％特異性を有する対象の疾患または障害状態を決定する。いくつかの実施形態において、疾患または障害は、神経学的障害、免疫学的障害、胎盤疾患、癌、血液学的障害、腎臓病、胃腸疾患、肝疾患、または筋骨格疾患である。いくつかの実施形態において、神経学的障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、多系統萎縮症およびパーキンソン病からなる群から選択される。他の実施形態において、生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、子宮頸管スワブ、涙液、唾液、口腔スワブ、皮膚、脳組織、および脳脊髄液からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、癌は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌、小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、または脊髄腫瘍である。
【００２５】
本願発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書の開示に照らして、当業者に容易に生じるであろうし、全てのかかる実施形態は、特異的に熟考される。
【００２６】
本発明の制限のそれぞれは、本発明の種々の実施形態を包含することができる。したがって、任意の１つの要素または要素の組み合わせを含む本発明の制限のそれぞれが、本発明の各態様に含まれることができることが予想される。本発明は、その用途において、以下の記載において示される構成の詳細および構成要素の配置に制限されない。本発明は、他の実施形態が可能であり、そして種々の方法で実施または実行することができる。また、本明細書で使用される表現および用語は、説明を目的とするものであり、制限するものと見なされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、抗ＤＡＴ固定化抗体ＥＬＩＳＡプレートへのエキソソーム結合に対する溶解バッファーの影響を示すデータを示す。
【００２８】
【図２】図２は、エキソソームからの内膜結合バイオマーカーの検出を示すデータを示す。
【００２９】
【図３−１】図３Ａ〜３Ｅは、対照と比較した、神経学的疾患を有する患者からの血漿試料中のエキソソームからの内膜結合バイオマーカーの検出を示すデータを示す。
【図３−２】図３Ａ〜３Ｅは、対照と比較した、神経学的疾患を有する患者からの血漿試料中のエキソソームからの内膜結合バイオマーカーの検出を示すデータを示す。
【図３−３】図３Ａ〜３Ｅは、対照と比較した、神経学的疾患を有する患者からの血漿試料中のエキソソームからの内膜結合バイオマーカーの検出を示すデータを示す。
【００３０】
【図４】図４は、抗ＳＮＡＰ固定化固形支持体へのエキソソーム結合を示すデータを示す。
【００３１】
【図５】図５は、抗ＳＮＡＰ固定化固形支持体へのエキソソーム結合を示すデータを示す。
【００３２】
【図６】図６は、ＤＡＴ＋エキソソームからの細胞質ＳＮＣＡレベルを示すデータを示す。
【００３３】
【図７】図７Ａ〜７Ｃは、ＥＬＩＳＡによるＧＡＰＤＨ、総タウおよびｐ−タウＴ１８１のエキソソーム捕獲および細胞質タンパク質検出を示すデータを示す。
【００３４】
【図８−１】図８Ａ〜８Ｄは、ＳＮＣＡのエキソソームレベルを検出するための飽和ＥＬＩＳＡを示すデータを示す。
【図８−２】図８Ａ〜８Ｄは、ＳＮＣＡのエキソソームレベルを検出するための飽和ＥＬＩＳＡを示すデータを示す。
【００３５】
【図９−１】図９Ａ〜９Ｄは、チロシンヒドロキシゲナーゼのエキソソームレベルを検出するための飽和ＥＬＩＳＡを示すデータを示す。
【図９−２】図９Ａ〜９Ｄは、チロシンヒドロキシゲナーゼのエキソソームレベルを検出するための飽和ＥＬＩＳＡを示すデータを示す。
【００３６】
【図１０−１】図１０Ａ〜１０Ｄは、抗ＤＡＴプレート上のエキソソーム膜を定量するための飽和ＥＬＩＳＡを示すデータを示す。
【図１０−２】図１０Ａ〜１０Ｄは、抗ＤＡＴプレート上のエキソソーム膜を定量するための飽和ＥＬＩＳＡを示すデータを示す。
【００３７】
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＳＮＡＰ２５＋、ＥＡＡＴ１＋、およびＤＡＴ＋エキソソームにおけるＳＮＣＡのエキソソームレベルを検出するための飽和ＥＬＩＳＡを示すデータを示す。
【図１１−２】図１１Ａ〜１１Ｄは、ＳＮＡＰ２５＋、ＥＡＡＴ１＋、およびＤＡＴ＋エキソソームにおけるＳＮＣＡのエキソソームレベルを検出するための飽和ＥＬＩＳＡを示すデータを示す。
【００３８】
【図１２】図１２は、標準的なＥＬＩＳＡを使用したエキソソーム単離および調製の現在の制限を示すデータを示す。
【００３９】
【図１３】図１３は、本願発明の方法によるエキソソームコア単離を示すデータを示す。
【００４０】
【図１４−１】図１４Ａ〜１４Ｂは、本願発明の方法によるエキソソームコア単離を示すデータを示す。
【図１４−２】図１４Ａ〜１４Ｂは、本願発明の方法によるエキソソームコア単離を示すデータを示す。
【００４１】
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｂは、本願発明の方法によるエキソソームコア単離を示すデータを示す。
【図１５−２】図１５Ａ〜１５Ｂは、本願発明の方法によるエキソソームコア単離を示すデータを示す。
【００４２】
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｄは、単離されたエキソソームコアからのバイオマーカーの検出を示すデータを示す。
【００４３】
【図１７】図１７は、単離されたエキソソームコアおよびエキソソーム膜におけるバイオマーカーの検出を示すデータを示す。
【００４４】
【図１８】図１８は、エキソソーム膜およびエキソソームコアにおける総タンパク質濃度を示すデータを示す。
【００４５】
【図１９−１】図１９Ａ〜１９Ｃは、エキソソーム膜およびエキソソームコアにおける重金属含有量を示すデータを示す。
【図１９−２】図１９Ａ〜１９Ｃは、エキソソーム膜およびエキソソームコアにおける重金属含有量を示すデータを示す。
【００４６】
発明の説明
本発明は、本明細書に記載の特定の方法論、プロトコル、細胞株、アッセイ、および試薬は変化してもよいため、これらに制限されないことが理解されるべきである。本明細書で使用される用語は、本願発明の特定の実施形態を説明することを意図しており、添付の特許請求の範囲に記載される本願発明の範囲を制限することを決して意図されないことも理解されるべきである。
【００４７】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が他に明確に指示しない限り、複数の参照を含むことに留意しなければならない。ゆえに、例えば、「断片」への参照は、複数のかかる断片を含み、「抗体」への参照は、１つ以上の抗体および当業者に既知のそれらの同等物への参照であり、その他も同様である。
【００４８】
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野における当業者が通常理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等のいかなる方法および材料も本発明の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法、デバイス、および材料がここに記載される。本明細書で引用された全ての出版物は、本発明に関連して使用され得る出版物において報告された方法論、試薬、およびツールを説明して開示する目的で、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本明細書において、先行発明により本発明がかかる開示に先行する権利がないことを認めるものとして解釈されるべきものはない。
【００４９】
本願発明の実施は、他に明記しない限り、当該技術分野の範囲内の化学、生化学、分子生物学、細胞生物学、遺伝学、免疫学および薬理学の従来の方法を使用する。かかる技術は文献において完全に説明される。例えば、Gennaro, A.R., 編(1990) Remington’s Pharmaceutical Sciences, 第１８版, Mack Publishing Co.; Colowick, S. ら, 編, Methods In Enzymology, Academic Press, Inc.; Handbook of Experimental Immunology, Vols. I-IV (D.M. WeirおよびC.C. Blackwell, 編, 1986, Blackwell Scientific Publications); Maniatis, T. ら, 編 (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 第２版, Vols. I-III, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. ら, 編 (1999) Short Protocols in Molecular Biology, 第４版, John Wiley & Sons; Ream ら, 編 (1998) Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), 第２版 (Newton & Graham 編, 1997, Springer Verlag)を参照ください。
【００５０】
本願発明は、部分的には、エキソソームおよびエキソソームのバイオマーカーを検出および定量するための効率的な方法の開発に関する。いくつかの実施形態において、本発明は、固形支持体上でエキソソームを選択的に捕獲し、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化し、そして捕獲されたエキソソームからの内膜結合バイオマーカーを検出する方法を提供する。他の実施形態において、本発明は、固形支持体上でエキソソームを選択的に捕獲し、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化し、そして捕獲されたエキソソームからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出する方法を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、固形支持体上でエキソソームを選択的に捕獲し、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化し、そして捕獲されたエキソソームからのmiRNAを検出する方法を提供する。さらに他の実施形態において、本発明は、エキソソームおよびエキソソームのバイオマーカーを検出するための飽和酵素連結免疫吸着アッセイを提供する。特定の実施形態において、アッセイは、固定化抗体を含む固形支持体上でエキソソームを含む試料をインキュベートすることを含み、固形支持体上の固定化抗体は、試料中のエキソソームにより一般に飽和される。特定の実施形態において、固定化抗体の実質的に全ては、試料からの標的抗原に結合している。本実施形態の特定の態様において、方法は、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること、および捕獲されたエキソソームからのカーゴバイオマーカーまたは内膜結合バイオマーカーを検出することをさらに含む。
【００５１】
さらに、本願発明は、本明細書に記載の方法における使用のための組成物を提供する。かかる組成物は、固形支持体、固形支持体上でエキソソームからのバイオマーカー（例えば、内膜結合タンパク質または細胞質タンパク質）に特異的に結合する捕獲剤、エキソソームからのバイオマーカーに特異的に結合する検出剤、イムノアッセイを実施するための試薬、および本明細書で記載される方法を実施するための他の試薬を含んでもよい。
【００５２】
本願発明は、エキソソームからのバイオマーカーを検出するためのキットをさらに提供する。キットは、固形支持体、固形支持体上でエキソソームを特異的に結合および捕獲する１つ以上の捕獲剤、エキソソームからのバイオマーカーに特異的に結合する１つ以上の検出剤、および所望により、本明細書に記載された方法を実施するためのイムノアッセイ試薬および他の試薬、生物学的試料を収集および/または保持するための1つ以上の容器、およびキットを使用するための説明書を含んでもよい。
【００５３】
本願発明は、エキソソームバイオマーカーをアッセイして、例えば、アルツハイマー病（ＡＤ）、多発性硬化症（ＭＳ）、および前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）を含む神経学的障害を有するかまたは発症しそうな対照を特定するという発見にさらに関する。
【００５４】
本願発明は、神経学的疾患（例えば、アルツハイマー病）を有する対象の循環中に存在するエキソソームにおける特定のバイオマーカーの予期しない減少または増加の発見に部分的に基づく。本願発明は、これらのバイオマーカーのエキソソームレベルをアッセイして、神経学的疾患を有する対象における神経学的障害を診断してもよいことを実証する。本願発明は、対象からのエキソソーム中の特定のバイオマーカーの測定が、神経学的疾患のその後の発症を予測する（例えば、神経学的障害を発症する危険性のある対象を特定する）ために使用されてもよいことをさらに示す。
【００５５】
セクション見出しは、本明細書では組織化の目的でのみ使用され、本明細書で説明される主題を制限するものとして決して解釈されるべきではない。
【００５６】
生物学的試料
エキソソームを含む生物学的試料は、対象から得られてもよい。対象から得られる生物学的試料は、典型的には血液であるが、分析されるエキソソームを含む体液、組織または細胞からの任意の試料であることができる。生物学的試料は、全血、血清、血漿、尿、間質液、腹膜液、脳脊髄液、子宮頸管スワブ、涙液、唾液、口腔スワブ、皮膚、器官、および生検を含んでもよいが、これらに制限されない。あるいは、エキソソームは、周囲の培養培地からの分泌されたエキソソームの収集により、培養細胞から得ることができる。
【００５７】
いくつかの実施形態において、本発明の生物学的試料は血液から得られる。いくつかの実施形態において、対象から約１−１０ｍＬの血液が採取される。他の実施形態において、対象から約１０−５０ｍＬの血液が採取される。血液は、腕、脚、または中心静脈カテーテルを介してアクセス可能な血液を含む体の任意の適切な領域から採取できる。いくつかの実施形態において、血液は治療または活動（activity）後に収集される。例えば、血液は健康診断の後に収集できる。収集のタイミングを調整して、試料中に存在するエキソソームの数および/または組成を増やすこともできる。例えば、血液は、運動または血管拡張を誘導する治療後に収集できる。
【００５８】
収集後に血液を種々の成分と組み合わせて、その後の技術のために試料を保存または調製してもよい。例えば、いくつかの実施形態において、血液は、収集後に抗凝固剤、細胞固定剤、プロテアーゼ阻害剤、ホスファターゼ阻害剤、タンパク質、ＤＮＡ、またはＲＮＡ保存剤で処理される。いくつかの実施形態において、血液は、ＥＤＴＡまたはヘパリン等の抗凝固剤を含有する真空収集チューブを使用して静脈穿刺により収集される。血液は、ヘパリンコーティングされたシリンジおよび皮下注射針を使用して収集することもできる。血液は、細胞培養に有用である成分と組み合わせることもできる。例えば、いくつかの実施形態において、血液は、細胞培養培地または補足された細胞培養培地（例えば、サイトカイン）と組み合わされる。
【００５９】
エキソソームの濃縮または単離
試料は、ポジティブ選択、ネガティブ選択、またはポジティブ選択およびネガティブ選択の組み合わせによりエキソソームについて濃縮できる。いくつかの実施形態において、エキソソームは直接捕獲される。他の実施形態において、残りの生物学的試料から血球は捕獲され、エキソソームは収集される。いくつかの実施形態において、生物学的試料中の濃縮されたエキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される。
【００６０】
試料は、エキソソームの生化学的特性の違いに基づいて、エキソソームについて濃縮されることもできる。例えば、試料は、抗原、核酸、代謝、遺伝子発現、またはエピジェネティックな違いに基づいて、エキソソームについて濃縮できる。抗原の違いに基づく一部の実施形態において、磁場勾配における抗体コンジュゲート磁性ビーズまたは常磁性ビーズ、またはフローサイトメトリーによる蛍光標識抗体が使用される。核酸の違いに基づく実施形態のいくつかにおいて、フローサイトメトリーが使用される。代謝の違いに基づく実施形態のいくつかにおいて、フローサイトメトリーまたは別のソーティング技術により測定された色素取り込み／排除が使用される。遺伝子発現に基づく実施形態のいくつかにおいて、サイトカインを用いた細胞培養が使用される。試料は、当該技術分野において既知の他の生化学的特性に基づいて、エキソソームについて濃縮されることもできる。例えば、試料は、ｐＨまたは運動性に基づいてエキソソームについて濃縮できる。さらに、いくつかの実施形態において、１を超える方法を使用してエキソソームについて濃縮する。他の実施形態において、試料は、抗体、リガンド、または可溶性受容体を使用して、エキソソームについて濃縮される。
【００６１】
他の実施形態において、表面マーカーは、試料中のエキソソームをポジティブに濃縮するために使用される。他の実施形態において、ＮＣＡＭ、ＣＤ１７１、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＯＭＧ、ニューロン特異的エノラーゼ、多様なニューロンまたはアストロサイト接着タンパク質、小膠細胞ｌＣＤ１８／１１、またはＣＤ３  Ｔ細胞膜細胞表面マーカーは、エキソソームについて濃縮するために使用される。いくつかの実施形態において、エキソソーム集団上で見出されない細胞表面マーカーは、細胞集団を枯渇させることによりエキソソームをネガティブに濃縮するために使用される。フローサイトメトリーソーティングは、蛍光ラベルにコンジュゲートした細胞表面マーカーまたは細胞内または細胞外マーカーを使用して、エキソソームについてさらに濃縮するために使用されてもよい。細胞内および細胞外マーカーは、エキソソーム中で優先的に発現される細胞内または細胞外タンパク質に対する核染色または抗体を含んでもよい。細胞表面マーカーは、エキソソーム（例えば、ＮＣＡＭ）上で優先的に発現される細胞表面抗原に対する抗体を含んでもよい。いくつかの実施形態において、細胞表面マーカーは、例えば、ＮＣＡＭまたはＣＤ１７１を含むニューロン由来エキソソーム表面マーカーである。いくつかの実施形態において、モノクローナルＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼまたはＣＤ１７１抗体は、試料からエキソソームを濃縮または単離するために使用される。特定の態様において、ＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼまたはＣＤ１７１抗体はビオチン化される。該実施形態において、ビオチン化ＮＣＡＭまたはＣＤ１７１抗体は、ストレプトアビジン−アガロースレジンまたはビーズを使用してその後単離できる抗体−エキソソーム複合体を形成できる。他の実施形態において、ＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼまたはＣＤ１７１抗体は、抗ヒトＮＣＡＭ、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ニューロン特異的エノラーゼまたはＣＤ１７１抗体である。他の実施形態において、細胞表面マーカーは、ニューロン特異的タンパク質（例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、リン酸化タウ、αβ−４２、およびシナプトフィジン）、アストロサイト特異的タンパク質（例えば、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸輸送体１（ＥＡＡＴ１））、小膠細胞特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、細胞質タンパク質（例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬ）、またはケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）である。
【００６２】
いくつかの実施形態において、生物学的試料からの濃縮されたエキソソームは、その後、特異的タイプのエキソソームについて濃縮される。例えば、生物学的試料は、エキソソームについて濃縮され、次いで濃縮されたエキソソームは、神経由来のエキソソームについて濃縮される。いくつかの実施形態において、生物学的試料は、エキソソームの個々の神経細胞源について濃縮される。特定の態様において、エキソソームの神経細胞源は、小膠細胞、ニューロン、またはアストロサイトである。
【００６３】
他の実施形態において、エキソソームは、以下を含む方法により、生物学的試料から単離または濃縮される：生物学的試料を、前記生物学的試料中に存在するエキソソームが薬剤に結合してエキソソーム−薬剤複合体を形成する条件下で、前記薬剤と接触させること；および前記エキソソーム−薬剤複合体から前記エキソソームを単離して、前記エキソソームを含有する試料を得ること、ここで、前記試料中に存在するエキソソームの純度は、前記生物学的試料中に存在するエキソソームの純度よりも高い。一定の実施形態において、薬剤は抗体またはレクチンである。エキソソーム−レクチン複合体を形成するのに有用なレクチンは、米国特許出願公開第２０１２／００７７２６３号に記載される。他の実施形態において、エキソソームは、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームからなる群から選択される。いくつかの実施形態において、多重単離または濃縮工程が実施される。本実施形態の特定の態様において、エキソソームは、固形支持体を使用してエキソソームを含む血液試料から単離され、捕獲されたエキソソームは、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらその後溶解または透過化され、そしてエキソソームバイオマーカーが、エキソソームから検出される。
【００６４】
固形支持体でのエキソソームの捕獲および検出
他の実施形態において、エキソソームは、固形支持体上での捕獲剤固定化を使用して生物学的試料中の他の分子から分離される。かかる捕獲剤は、エキソソーム上の表面マーカー（例えば、膜タンパク質または吸着されたタンパク質）に選択的に結合して、捕獲剤が表面マーカーを有するエキソソームを「捕獲」できるようにする。「捕獲」は、エキソソーム上の表面マーカーへの捕獲剤の結合により、標的エキソソームが試料中の他の分子から分離できることを意味する。
【００６５】
捕獲剤の特異性は、固形支持体上で捕獲された生物学的試料からのエキソソームのサブセットを決定する。１つ以上の捕獲剤は、異なる表面マーカーを有するエキソソームを捕獲するために組み合わせて使用できる。例えば、固形支持体は、それに関連する捕獲剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソーム上の異なるバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる捕獲剤を含んでもよい。
【００６６】
いくつかの実施形態において、捕獲剤は、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソームに選択的に結合する。例えば、エキソソームを一般に捕獲するためにエキソソーム表面マーカー（例えば、ＣＤ８１）、ニューロン由来エキソソームを捕獲するためにニューロン特異的タンパク質（例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、リン酸化タウ、αβ−４２、およびシナプトフィジン）、アストロサイト由来エキソソームを捕獲するためにアストロサイト特異的タンパク質（例えば、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸輸送体１（ＥＡＡＴ１）、小膠細胞由来エキソソームを捕獲するために小膠細胞特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、希突起膠細胞由来エキソソームを捕獲するために希突起膠細胞特異的タンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）または希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ））、脳由来エキソソームを捕獲するために細胞質タンパク質（例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）またはカテプシンＤ（ＣＴＳＤ））、またはケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）タンパク質に選択的に結合する捕獲剤が、選択できる。
【００６７】
典型的に、捕獲剤は、直接的または間接的に、固形支持体と関連する。捕獲剤は、プレート、スライド、ウェーハ、非磁性ビーズ、磁性ビーズ、ロッド、粒子、ストランド、ディスク、膜、フィルム、またはチューブ、チャネル、カラム、フロー細胞デバイス、もしくはマイクロ流体デバイスの内面などではあるがこれらに制限されない固形支持体の表面に固定化されてもよい。固形支持体は、ガラス、石英、シリコン、金属、セラミック、プラスチック、ナイロン、ポリアクリルアミド、アガロース、レジン、多孔質高分子モノリス、ハイドロゲル、およびそれらの複合物を含むがこれらに制限されない種々の材料を含んでもよい。さらに、基板を固形支持体の表面に追加して、捕獲剤の付着を容易にしてもよい。
【００６８】
固形支持体上で捕獲されると、エキソソームは、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながら、溶解または透過処理でき、そして検出剤を使用してエキソソームから１つ以上のバイオマーカーを検出できる。かかる検出剤は、エキソソームからのバイオマーカーに選択的に結合する。一定の実施形態において、検出剤は、ニューロン特異的タンパク質（例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、αβ−４２、タウ、リン酸化タウ、およびシナプトフィジンに結合する）、アストロサイト特異的タンパク質（例えば、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸輸送体１（ＥＡＡＴ１））、小膠細胞特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、希突起膠細胞特異的タンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）、細胞質タンパク質（例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬ）、ケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）、ＣＴＳＤ、ＧＡＰＤＨ、ＣＤ８１、ＣＤ６３、またはＣＤ１７１、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ベータ、Ａβ、またはＢＡＣＥに選択的に結合する。一定の実施形態において、固形支持体上で捕獲されたエキソソーム上のバイオマーカーの検出は、検出剤の１を超えるタイプ、例えば、エキソソーム上の異なるバイオマーカーに選択的に結合する少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超える異なる検出剤を使用することを含む。
【００６９】
いくつかの実施形態において、本発明は、以下の工程を含む方法を提供する：ａ）エキソソームを含む生物学的試料を提供すること；ｂ）それに関連する捕獲剤が選択的にエキソソームに結合する条件下で、該捕獲剤を含む固形支持体を生物学的試料と接触させ、それにより固形支持体上で該エキソソームを捕獲すること；ｃ）エキソソームと固形支持体の間、およびエキソソーム膜結合バイオマーカーとエキソソーム膜の間の接触を維持しながら、エキソソームを溶解または透過化すること；およびｄ）エキソソームコアまたはカーゴを固形支持体から単離すること。いくつかの実施形態において、方法は、エキソソームコアからカーゴおよび／または細胞質バイオマーカーを検出することをさらに含む。エキソソームコアの単離および単離されたエキソソームコアからのカーゴおよび／または細胞質バイオマーカーの検出は、実施例５において開示される。
【００７０】
捕獲剤および検出剤は、例えば、エキソソーム上で表面マーカー（例えば、膜結合または吸着されたタンパク質）に特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含んでもよい。「特異的に（または選択的に）結合する」なる句は、タンパク質および他の生物製剤の不均一な集団におけるエキソソーム上の表面マーカーの存在を決定する結合反応を指す。ゆえに、指定されたアッセイ条件下で、特定された捕獲剤または検出剤は、エキソソーム上の特定の表面マーカーにバックグラウンドの少なくとも２倍で結合し、試料中に存在する他のタンパク質に有意な量で実質的に結合しない。捕獲剤および検出剤は、例えば、エキソソーム上の内膜結合バイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含んでもよい。捕獲剤および検出剤は、例えば、エキソソーム上のカーゴまたは細胞質バイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含んでもよい。
【００７１】
一定の実施形態において、捕獲剤または検出剤は、エキソソーム上の表面マーカー、エキソソームからの内膜結合バイオマーカー、またはエキソソームからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーに特異的に結合する抗体を含む。ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体、ハイブリッド抗体、改変抗体、キメラ抗体、およびヒト化抗体、並びに：ハイブリッド（キメラ）抗体分子(例えば, Winter ら. (1991) Nature 349:293-299; および U.S. Pat. No. 4,816,567を参照); F(ab’)2 and F(ab) Fragments; Fv molecules (noncovalent heterodimers,例えば、 Inbar ら. (1972) Proc Natl Acad Sci USA 69:2659-2662; およびEhrlich ら. (1980) Biochem 19:4091-4096を参照); single-chain Fv molecules (sFv) (例えば, Huston ら. (1988) Proc Natl Acad Sci USA 85:5879-5883を参照); nanobody or single-domain antibodies (sdAb) (例えば、 Wang ら. (2016) Int J Nanomedicine 11:3287-3303, Vincke ら. (2012) Methods Mol Biol 911:15-26を参照）; dimeric and trimeric antibody fragment constructs; minibodies (例えば, Pack ら. (1992) Biochem 31:1579-1584; Cumber ら. (1992) J Immunology 149B:120-126を参照); humanized antibody molecules (例えば, Riechmann ら. (1988) Nature 332:323-327; Verhoeyan ら. (1988) Science 239:1534-1536; および英国特許公開番号GB 2,276,169, 1994年9月21日に公開を参照)；および、かかる分子から得られる任意の機能的断片であって、親抗体分子の特異的結合特性を保持する（すなわち、エキソソーム上の標的表面マーカーに特異的に結合する）断片を含む、任意のタイプの抗体が使用されてもよい。
【００７２】
他の実施形態において、捕獲剤または検出剤は、エキソソーム上の標的表面マーカー、エキソソームからの内膜結合バイオマーカー、またはエキソソームからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーに特異的に結合するアプタマーを含む。標的抗体アイソタイプに特異的に結合するＤＮＡ、ＲＮＡ、ゼノ核酸（ＸＮＡ）、またはペプチドアプタマーを含む任意のタイプのアプタマーが使用されてもよい。かかるアプタマーは、例えば、コンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより特定できる。選択的に標的抗体に結合する核酸アプタマー（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡアプタマー）は、指数選択的濃縮（ＳＥＬＥＸ）によるリガンドのインビトロ選択または系統的進化を繰り返し行うことにより製造できる。標的抗体アイソタイプに結合するペプチドアプタマーは、コンビナトリアルライブラリーから単離され、誘導された突然変異または突然変異生成および選択の繰り返しにより改善されてもよい。アプタマーを製造する方法の記載について、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Aptamers: Tools for Nanotreatment and Molecular Imaging (R.N. Veedu 編, Pan Stanford, 2016), Nucleic Acid and Peptide Aptamers: Methods and Protocols (Methods in Molecular Biology, G. Mayer 編, Humana Press, 2009), Nucleic Acid Aptamers: Selection, Characterization, and Application (Methods in Molecular Biology, G. Mayer 編, Humana Press, 2016), Aptamers Selected by Cell-SELEX for Theranostics (W. Tan, X. Fang 編, Springer, 2015), Cox ら. (2001) Bioorg. Med. Chem. 9(10):2525-2531; Cox ら. (2002) Nucleic Acids Res. 30(20): e108, Kenan ら. (1999) Methods Mol Biol. 118:217-231; Platella ら. (2016) Biochim. Biophys. Acta Nov 16 pii: S0304-4165(16)30447-0, および Lyu ら. (2016) Theranostics 6(9):1440-1452を参照してください。
【００７３】
さらに他の実施形態において、捕獲剤または検出剤は、抗体模倣物を含む。以下を含むがそれらに制限されない任意のタイプの抗体模倣物が使用されてもよい：アフィボディ分子(Nygren (2008) FEBS J. 275 (11):2668-2676)、アフィリン(Ebersbach ら. (2007) J. Mol. Biol. 372 (1):172-185)、アフィマー(Johnson ら. (2012) Anal. Chem. 84 (15):6553-6560)、アフィチン(Krehenbrink ら. (2008) J. Mol. Biol. 383 (5):1058-1068)、アルファボディ(Desmet ら. (2014) Nature Communications 5:5237)、アンチカリン(Skerra (2008) FEBS J. 275 (11):2677-2683)、アビマー(Silverman ら. (2005) Nat. Biotechnol. 23 (12):1556-1561)、ダーピン(Stumpp ら. (2008) Drug Discov. Today 13 (15-16):695-701)、フィノマー(Grabulovski ら. (2007) J. Biol. Chem. 282 (5):3196-3204)、およびモノボディ(Koide ら. (2007) Methods Mol. Biol. 352:95-109)。
【００７４】
検出剤は、エキソソームからのバイオマーカーの検出および/または定量を容易にするための検出可能なラベルをさらに含んでもよい。検出可能なラベルは、特異的結合剤（例えば、エキソソーム上の膜結合または吸着バイオマーカーに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマー）に付加される蛍光、化学発光、電気化学発光、または生物発光タグ、金属、染料、放射性核種等を含む。
【００７５】
神経学的障害
本願発明は、対象における神経学的障害を診断または予後診断する方法、神経学的障害の危険性のある対象を特定する方法、または神経学的障害を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。いくつかの実施形態において、本願発明は、対象における神経学的障害の異なる診断のための方法を提供する。
【００７６】
いくつかの実施形態において、神経学的障害は、アルツハイマー病（ＡＤ）、血管疾患認知症、前頭側頭型認知症（ＦＴＤ）、皮質基底核変性（ＣＢＤ）、進行性核上性麻痺（ＰＳＰ）、レビー小体型認知症、神経原繊維変化優位型老年期認知症、ピック病（ＰｉＤ）、好銀性粒病、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）、他のモーターニューロン疾患、グアムパーキンソン−認知症症候群、ＦＴＤＰ−１７、Ｌｙｔｉｃｏ−Ｂｏｄｉｇ病、多発性硬化症、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、脳卒中、うつ病、双極性疾患、てんかん、自閉症、統合失調症、脳腫瘍、白質病、脳萎縮、精神遅滞、小脳失調症、パーキンソン病からなる群から選択される。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本願発明は、医師が対象における１つ以上の神経学的障害を診断または予後診断することを可能にする。他の実施形態において、本願発明は、医師が診断可能性として１つ以上の神経学的疾患を除外または排除することを可能にする。他の実施形態において、本願発明の方法は、医師がアルツハイマー病からＦＴＤのいくつかの形態を区別することを可能にする。さらに他の実施形態において、本願発明は、医師が神経学的障害を発症する危険性のある対象を特定することを可能にする。他の実施形態において、本願発明は、医師が対象が後に神経学的障害を発症するかどうかを予測することを可能にする。さらなる実施形態において、本願発明は、医師が神経学的障害を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測することを可能にする。
【００７８】
癌
本発明は、対象における癌を診断または予後診断する方法、癌を発症する危険性のある対象を特定する方法、または癌を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。一般に、癌は体内のどこにでも異常細胞が無秩序に増殖することを特徴とする。異常細胞は、癌細胞、悪性細胞、または腫瘍細胞と呼ばれてもよい。癌はヒトに限られず；動物および他の生物が癌になることができる。
【００７９】
いくつかの場合において、癌は悪性であってもよい。あるいは、癌は良性であってもよい。癌は再発および/または難治性癌であってもよい。ほとんどの癌は、癌腫、肉腫、白血病、リンパ腫、骨髄腫、または中枢神経系癌に分類できる。
【００８０】
癌は肉腫であってもよい。肉腫は、骨、軟骨、脂肪、筋肉、血管の癌、または以下を含むがそれらに制限されない他の結合性もしくは支持性の組織肉腫である：骨癌、線維肉腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性血管内皮腫、悪性神経鞘腫、両側前庭神経鞘腫、骨肉腫、軟組織肉腫（例えば、歯槽軟部肉腫、血管肉腫、膀胱肉腫葉状組織、皮膚線維肉腫、デスモイド腫瘍、類上皮肉腫、骨格外骨肉腫、線維肉腫、血管周囲細胞腫、血管肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、リンパ肉腫、悪性線維性組織球腫、神経線維肉腫、横紋筋肉腫、および滑膜肉腫）。
【００８１】
あるいは、癌は癌腫であってもよい。癌腫は、体の表面を覆い、ホルモンを産生し、腺を構成する細胞である上皮細胞から発生する癌である。非限定的な例として、癌腫は、乳癌、膵臓癌、肺癌、大腸癌、結腸直腸癌、直腸癌、腎臓癌、膀胱癌、胃癌、前立腺癌、肝臓癌、卵巣癌、脳癌、膣癌、外陰癌、子宮癌、口腔癌、陰茎癌、精巣癌、食道癌、皮膚癌、卵管の癌、頭頸部癌、消化管間質癌、腺癌、皮膚または眼内黒色腫、肛門部の癌小腸の癌、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、副腎の癌、尿道の癌、腎盂の癌、尿管の癌、子宮内膜の癌、子宮頸癌、下垂体の癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、脳幹神経膠腫、および脊髄腫瘍を含む。いくつかの場合において、癌は、基底細胞癌、扁平上皮、黒色腫、非黒色腫、または光線性（太陽）角化症等の皮膚癌である。好ましくは、癌は前立腺癌である。あるいは、癌は甲状腺癌、膀胱癌、または膵臓癌であってもよい。
【００８２】
いくつかの場合において、癌は肺癌である。肺癌は、気管から分岐して肺（気管支）または肺の小さな気嚢（肺胞）を供給する気道から始まることができる。肺癌は、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、小細胞肺癌、および中皮症を含む。ＮＳＣＬＣの例は、扁平上皮癌、腺癌、および大細胞癌を含む。中皮腫は、肺および胸腔の裏打ち（胸膜）または腹部の裏打ち（腹膜）の癌性腫瘍であってもよい。中皮腫はアスベストへの曝露が原因であってもよい。癌は神経膠芽腫等の脳癌であってもよい。
【００８３】
あるいは、癌は中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍であってもよい。ＣＮＳ腫瘍は、神経膠腫または非神経膠腫として分類されてもよい。神経膠腫は、悪性神経膠腫、高悪性度神経膠腫、びまん性内因性橋神経膠腫であってもよい。神経膠腫の例は、星状細胞腫、乏突起神経膠腫（または乏突起膠腫および星細胞腫要素の混合物）、および上衣腫を含む。星状細胞腫は、低悪性度星細胞腫、未分化星細胞腫、多形性膠芽腫、毛様細胞性星細胞腫、多形性黄色星状細胞腫、および上衣下巨細胞星細胞腫を含むがそれらに制限されない。乏突起神経膠腫は、低悪性度の乏突起神経膠腫（または乏突起星細胞腫）および未分化の乏突起神経膠腫を含む。非神経膠腫は、髄膜腫、下垂体腺腫、原発性ＣＮＳリンパ腫、および髄芽腫を含む。いくつかの場合において、癌は髄膜腫である。
【００８４】
癌は白血病であってもよい。白血病は、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、または慢性骨髄性白血病であってもよい。さらなるタイプの白血病は、有毛細胞白血病、慢性骨髄単球性白血病、および若年性骨髄単球性白血病を含む。
【００８５】
いくつかの場合において、癌はリンパ腫である。リンパ腫は、リンパ球の癌であり、ＢまたはＴリンパ球のいずれかから発生してもよい。リンパ腫の２つの主要なタイプは、以前はホジキン病として知られていたホジキンリンパ腫および、非ホジキンリンパ腫である。ホジキンリンパ腫は、リードシュテルンベルク細胞の存在により特徴付けられる。非ホジキンリンパ腫は、ホジキンリンパ腫ではない全てのリンパ腫である。非ホジキンリンパ腫は、無痛性リンパ腫および侵攻性リンパ腫であってもよい。非ホジキンリンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、濾胞性リンパ腫、粘膜関連リンパ組織リンパ腫（ＭＡＬＴ）、小細胞リンパ球性リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、バーキットリンパ腫、縦隔大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、結節性辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫（ＮＭＺＬ）、脾臓辺縁帯リンパ腫（ＳＭＺＬ）、節外辺縁帯Ｂ細胞リンパ腫、血管内大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、原発性滲出液リンパ腫、およびリンパ腫様肉芽腫症を含むがそれらに制限されない。
【００８６】
いくつかの実施形態において、本願発明は、医師が対象における１つ以上の癌を診断または予後診断することを可能にする。他の実施形態において、本願発明は、医師が診断の可能性として１つ以上の癌を除外または排除することを可能にする。他の実施形態において、本願発明の方法は、医師が癌の起源を特定することを可能にする。さらに他の実施形態において、本願発明は、医師が癌を発症する危険性のある対象を特定することを可能にする。他の実施形態において、本願発明は、医師が対象が後に癌を発症するかどうかを予測することを可能にする。さらなる実施形態において、本願発明は、医師が癌を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療から利益を予測することを可能にする。癌の診断および予後診断において有用な本願発明の例示的なバイオマーカーは、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９を含むがそれらに制限されない。
【００８７】
免疫学的障害
本願発明は、対象における免疫学的障害を診断または予後診断する方法、免疫学的障害を発症する危険性のある対象を特定する方法、または免疫学的障害を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。免疫学的障害は、免疫系の機能不全により引き起こされる疾患または状態であり、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、自己炎症症候群および免疫不全症候群を含む。
【００８８】
いくつかの実施形態において、本願発明は、医師が対象における１つ以上の免疫学的障害を診断または予後診断することを可能にする。他の実施形態において、本願発明は、医師が診断可能性として１つ以上の免疫学的障害を除外または排除することを可能にする。さらに他の実施形態において、本願発明は、医師が免疫学的障害を発症する危険性のある対象を特定することを可能にする。他の実施形態において、本願発明は、医師が対象が後に免疫学的障害を発症するかどうかを予測することを可能にする。さらなる実施形態において、本願発明は、医師が免疫学的障害を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測することを可能にする。免疫学的障害の診断および予後診断において有用な本願発明の例示的なバイオマーカーは、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、およびＴＲＥＭ２を含むがそれらに制限されない。
【００８９】
胎盤疾患および胎児評価
本願発明は、対象における胎盤疾患を診断または予後診断する方法、胎盤疾患を発症する危険性のある対象を特定する方法、または胎盤疾患を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測する方法を提供する。一般に、胎盤疾患は、胎盤の任意の疾患、障害、または病理である。本願発明の方法およびバイオマーカーはまた、胎児評価、または例えば、胎児アルコール症候群または胎児遺伝的異常等の胎児障害の診断のために使用されてもよい。胎盤疾患または胎児評価の診断および予後診断において有用な本願発明の例示的なバイオマーカーは、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、およびＰＳＧ１を含むがそれらに制限されない。
【００９０】
バイオマーカー
エキソソームからのバイオマーカーのレベルは、疾患を有するかまたは有する危険性のある対象から得られる生物学的試料においてアッセイされる。いくつかの実施形態において、エキソソームからのバイオマーカーレベルは、神経学的障害（例えば、アルツハイマー病）を有するかまたは有する危険性のある対象から得られる生物学的試料においてアッセイされる。他の実施形態において、エキソソームからのバイオマーカーのレベルは、癌を有するかまたは有する危険性のある対象から得られる生物学的試料においてアッセイされる。さらに他の実施形態において、エキソソームからのバイオマーカーレベルは、免疫学的障害を有するかまたは有する危険性のある対象から得られる生物学的試料においてアッセイされる。なお他の実施形態において、エキソソームからのバイオマーカーレベルは、胎盤障害を有するかまたは有する危険性のある対象から得られる生物学的試料においてアッセイされる。いくつかの実施形態において、１つ以上のバイオマーカーは、ニューロン特異的タンパク質（例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、およびシナプトフィジン）、アストロサイト特異的タンパク質（例えば、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸輸送体１（ＥＡＡＴ１））、小膠細胞特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、および希突起膠細胞特異的タンパク質（例えば、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ））からなる群から選択される。別の実施態様において、バイオマーカーは、ＣＤ１７１、リン酸化タウＴ１８１、ＳＮＣＡ、およびＮＲＧＮである。他の実施形態において、バイオマーカーは、アセチルコリンエステラーゼ（ＡｃｈＥ）、リソソーム関連膜タンパク質１（ＬＡＭＰ１）、ＣＴＳＤ、ＲＥ１サイレンシング転写因子（ＲＥＳＴ）、シナプトタグミン（ＳＹＴ）、単球走化性タンパク質１（ＣＣＬ２）、ＩＬ３４、グリコーゲンシンターゼ（ＧＹＳ）、（ＯＲ）、死受容体６（ＤＲ６）、熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）、ＩＬ１２ベータ、ａｌｐｈＡベータ（Ａβ）、およびベータセクレターゼ（ＢＡＣＥ）である。いくつかの実施形態において、１つ以上のバイオマーカーは、細胞質タンパク質、分泌タンパク質、膜タンパク質および受容体、および凝集体および変異体を含むそれらの病理学的形態からなる群から選択される。本願発明のバイオマーカーは、例えば、ドーパミン受容体（Ｄ１およびＤ２）、セロトニン受容体（２Ａ、２Ｃ、および３Ｂ）、ＧＡＢＡ受容体（１−６、５．Ｂ１、Ｂ２）、およびグルタミン酸受容体（１および２）等の神経伝達物質受容体を含む。本願発明の他の受容体バイオマーカーは、インスリン受容体、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリー（ＴＲＡＬ、ＴＮＦ受容体、死受容体５および６）、および神経ペプチド受容体（オレキシン受容体、オピオイド受容体ＫＯＲ）を含む。本願発明のバイオマーカーは、例えば、ＥｐＣＡＭ、ＰＤ−Ｌ１、ＥｒｂＢ２、ＣＫ１９、ＴＣＲ、ＣＤ１６、ＣＤ２８、ＣＤ３２、ＣＤ７９ａ、ＴＲＥＭ２、ＮＣＡＭ等の膜タンパク質を含む。他の既知の神経学的障害バイオマーカーは、本願発明���バイオマーカーと組み合わせて使用されてもよい。かかるバイオマーカーの例は、米国特許出願公開第２０１５／０１１９２７８号に提供され、その内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【００９１】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、変異タンパク質、過剰発現または過少発現タンパク質、修飾タンパク質（例えば、リン酸化タンパク質、メチル化タンパク質、グリコシル化タンパク質、アセチル化タンパク質、またはユビキチン化タンパク質）、器官／組織特異的タンパク質（例えば、ニューロンのニューロフィラメント、アストロサイトのＧＦＡＰ、肺のサーファクタントタンパク質、前立腺のＰＳＡ）、疾患特異的タンパク質（例えば、タウまたはＡベータ）、タンパク質モノマーおよび／またはオリゴマー、酵素、キナーゼ、ホルモン、成長因子、転写因子、サイトカインおよび／またはケモカイン、ＲＮＡ（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、および／またはノンコーディングＲＮＡ）、神経伝達物質（例えば、アセチルコリン、ドーパミン、セロトニン、オピオイド）、小分子（例えば、薬物または一酸化窒素）、代謝物、脂質および／またはリポタンパク質、金属、または異物（例えば、細菌および／またはウイルス起源生体分子）である。いくつかの実施形態において、バイオマーカーはタウモノマーおよび／またはオリゴマーである。他の実施形態においてバイオマーカーはアルファ−シヌクレインである。さらに他の実施形態において、バイオマーカーはリン酸化タウまたはＡベータモノマーおよび／またはオリゴマーである。なお他の実施形態において、バイオマーカーはＴＤＰ−４３またはＳＯＤである。
【００９２】
当業者は、本発明のマーカーの検出および分析のために利用可能ないくつかの方法およびデバイスを有する。患者試験試料中のエキソソーム上のポリペプチドまたはタンパク質に関して、イムノアッセイデバイスおよび方法がしばしば使用される。これらのデバイスおよび方法は、標識された分子を種々のサンドイッチ、競合、または非競合アッセイ形式において利用して、目的の分析物の存在または量に関連するシグナルを生成できる。さらに、バイオセンサーおよび光学イムノアッセイ等の特定の方法およびデバイスを使用して、標識された分子に対する必要性なしに分析物の存在または量を決定してもよい。
【００９３】
好ましくは、マーカーはイムノアッセイを使用して分析されるが、他の方法（例えば、マーカーＲＮＡレベルの測定）は当業者に周知である。マーカーの存在または量は一般的に、各マーカーに対して特異的である抗体を使用し、そして特異的結合を検出して決定される。任意の適切なイムノアッセイ、例えば、酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光アッセイ（ＩＦＡ）、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、電気化学発光イムノアッセイ（ＥＣＬＩＡ）、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、競合結合アッセイ、平面導波路技術などが利用されてもよい。マーカーへの抗体の特異的な免疫学的結合は、直接的または間接的に検出できる。直接的ラベルは、抗体に付加される蛍光または発光タグ、金属、染料、放射性核種などを含む。間接的ラベルは、アルカリホスファターゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ等の当該技術分野において既知の種々の酵素を含む。
【００９４】
エキソソームからのバイオマーカーについて特異的な固定化抗体の使用もまた、本発明により熟考される。抗体は、磁性またはクロマトグラフィーマトリックス粒子、アッセイ場所の表面（マイクロタイターウェルなど）、固体基板材料（プラスチック、ナイロン、紙など）の断片など、さまざまな固形支持体上に固定化できる。アッセイストリップは、固形支持体上にアレイ状に抗体または複数の抗体をコーティングすることにより調製できる。次いで、該ストリップを試験試料中に浸して、表面マーカーへの結合を介してエキソソームを捕獲し、次いで上記のように、洗浄および検出試薬での検出工程を介してすばやく処理し、色付きのスポット等の測定可能なシグナルを生成できる。
【００９５】
複数のバイオマーカーの分析は、１つの試験試料を用いて別々にまたは同時に行ってもよい。エキソソームからのいくつかのマーカーは、試料の多重の効率的な処理のために、1つの試験において多重捕獲剤および/または検出剤の組み合わせを使用して、捕獲および/または検出されてもよい。さらに、当業者は、同じ個体からの（たとえば、連続した時点での）試験多重試料の価値を認識するだろう。連続試料のかかる試験は、バイオマーカーレベルの経時変化の特定を可能にする。バイオマーカーレベルの増加または減少、およびバイオマーカーレベルの変化がないことは、事象の開始からのおよその時間、救済可能な組織の存在および量、薬物療法の適切性、種々の治療の有効性、事象の重症度の特定、疾患の重症度の特定、および将来の事象の危険性を含む患者の転帰の特定を特定することを含むがそれらに制限されない、疾患状態についての有用な情報を提供するだろう。
【００９６】
本発明において参照されるバイオマーカーの組み合わせからなるアッセイは、異なる診断に関連する関連情報を提供するように構築されてもよい。かかるパネルは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、またはそれを超えるまたは個々のバイオマーカーを使用して構築されてもよい。マーカーのより大きなパネルを含む単一のバイオマーカーまたはバイオマーカーのサブセットの分析は、種々の臨床設定における臨床感度または特異性を最適化するために、本発明内に記載された方法で実行され得る。
【００９７】
エキソソームバイオマーカーの分析は、同様に様々な物理的形式において実行され得る。例えば、マイクロタイタープレートまたは自動化の使用は、多数の試験試料の処理を容易にするために使用され得る。あるいは、単一試料形式を開発して、例えば、移動中の輸送または緊急治療室設定において、即時の治療および診断をタイムリーに容易にし得る。特に有用な物理形式は、複数の異なる分析物の検出のための複数の個別のアドレス可能な場所を有する表面を含む。かかる形式は、タンパク質マイクロアレイ、または「タンパク質チップ」およびキャピラリーデバイスを含む。
【００９８】
本願発明のバイオマーカーは、疾患および障害（例えば、アルツハイマー病）の早期検出およびモニタリングにおいて重要な役割を果たす。かかる障害のバイオマーカーは典型的に、体試料において見いだされる測定可能な物質である。測定される量は、根本的な障害または疾患病態生理学、神経学的障害の存在または不在、将来の神経学的障害の可能性と相関できる。状態の治療を受けている患者において、測定される量は治療への反応性とも相関する。いくつかの実施形態において、本願発明の１つ以上のバイオマーカーのレベルの減少または増加は、神経学的障害の指標である。例えば、本明細書の実施例１に示されるように、エキソソームからの内膜結合タウレベルの増加は、アルツハイマー病の指標である。したがって、本願発明の方法は、アルツハイマー病の診断に有用である。
【００９９】
いくつかの実施形態において、バイオマーカーは、免疫組織化学、免疫細胞化学、免疫蛍光、免疫沈降、電気化学発光イムノアッセイ、ラジオイムノアッセイ、免疫ポリメラーゼ連鎖反応、ウエスタンブロッティング、およびＥＬＩＳＡからなる群から選択される方法により測定される。
【０１００】
臨床アッセイ性能
本願発明の方法は、対象における神経学的障害を診断または予後診断し、神経学的障害の危険性のある対象を特定し、および／または神経学的障害を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測するために、臨床アッセイにおいて使用されてもよい。臨床アッセイ性能は、アッセイの感度、特異性、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）、精度、ポジティブ予測値（ＰＰＶ）、およびネガティブ予測値（ＮＰＶ）を決定することにより評価できる。対象における神経学的障害を診断または予後診断する、神経学的障害の危険性のある対象を特定する、または神経学的障害を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測するためのアッセイが、本明細書で開示される。
【０１０１】
アッセイの臨床性能は、感度に基づいてもよい。本願発明のアッセイの感度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％であってもよい。アッセイの臨床性能は、特異性に基づいてもよい。本願発明のアッセイの特異性は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％であってもよい。アッセイの臨床性能は、ＲＯＣ曲線下面積（ＡＵＣ）に基づいてもよい。本願発明のアッセイのＡＵＣは、少なくとも約０．５、０．５５、０．６、０．６５、０．７、０．７５、０．８、０．８５、０．９、または０．９５であってもよい。アッセイの臨床性能は、精度に基づいてもよい。本願発明のアッセイの精度は、少なくとも約４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、または１００％であってもよい。
【０１０２】
組成物
本願発明の方法において有用な組成物は、疾患または障害に関連するバイオマーカーを特異的に認識する組成物を含む。かかる組成物は、例えば、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、αβ−４２、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、リン酸化タウ、およびシナプトフィジン等のニューロン特異的タンパク質バイオマーカー、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸輸送体１（ＥＡＡＴ１）等のアストロサイト特異的タンパク質バイオマーカー、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）および希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）等の希突起膠細胞特異的タンパク質バイオマーカー、小膠細胞特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、細胞質タンパク質（例えば、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、アルファ−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）、カテプシンＤ（ＣＴＳＤ）、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＧＹＳ、ＨＳＰ７０、ＢＡＣＥ、ＳＹＭＰＯ、ＮＥＦＬ、カスパーゼ、ユビキチン、ＰＳＥＮ１、ＧＳＫ、ＰＬＡＰ、ＣＳＨ１、ＰＳＧ１、またはＦａｓＬ）、またはケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）を認識する捕獲剤および／または検出剤を含んでもよい。
【０１０３】
さらに他の実施形態において、組成物は、ペプチド、核酸、抗体、および小分子からなる群から選択される。
【０１０４】
一定の実施形態において、本願発明は、疾患または障害に関連するバイオマーカーを特異的に検出する組成物に関する。本明細書の他の場所で詳述されるように、本願発明は、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ、シナプトフィジン、αβ−４２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＳＮＣＡ、ＣＤ１１ｂ、ＯＭＧ、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、およびＢＡＣＥが、ＡＤおよび他の神経学的障害についてのバイオマーカーとして使用できるという知見に基づく。いくつかの実施形態において、本願発明の組成物は、かかるバイオマーカーに特異的に結合して検出する。例えば、組成物は、ＣＤ８１、ＣＤ６３、ＣＤ１７１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、ＣＤ１１ｂ、またはＯＭＧに選択的に結合するそれに関連する捕獲剤を含む固形支持体を含んでもよい。別の例において、組成物は、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ、シナプトフィジン、αβ−４２、ＳＮＣＡ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＯＭＧ、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、および／またはＢＡＣＥに選択的に結合する検出剤を含んでもよい。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、組成物は抗体を含み、抗体は本発明のバイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合する。本明細書で使用され以下でさらに説明される「抗体」なる用語は、バイオマーカーまたはエキソソームとも特異的に反応するその断片を含むように意図される。抗体は、従来の技術を使用して断片化でき、断片は、全抗体について上記と同じ方法で有用性についてスクリーニングできる。例えば、Ｆ（ａｂ）２断片は、抗体をペプシンで処理することにより生成できる。得られたＦ（ａｂ）２断片を処理してジスルフィド架橋を還元し、Ｆａｂ断片を生成できる。抗原結合部分は、組み換えＤＮＡ技術またはインタクトな抗体の酵素的または化学的開裂によりも生成される。抗原結合部分は、特に、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、および相補性決定領域（ＣＤＲ）断片、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体、二重特異性抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ダイアボディおよびポリペプチドへの特異的な抗原結合を与えるのに十分な免疫グロブリンの一部を少なくとも含有するポリペプチドを含む。一定の実施形態において、抗体は、それに付加されて検出できるラベルをさらに含む（例えば、ラベルは、放射性同位元素、蛍光化合物、酵素または酵素補因子であることができる）。
【０１０６】
一定の実施形態において、本発明の抗体は抗原抗体であり、一定の実施形態において、本発明は、本発明のバイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合する新規の抗体を生成する方法を利用可能にする。例えば、バイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を生成する方法は、検出可能な免疫応答を刺激するのに有効なバイオマーカーまたはエキソソームまたはその断片を含む免疫原性組成物の量をマウスに投与すること、マウスから抗体産生細胞（例えば、脾臓からの細胞）を得て、骨髄腫細胞と抗体産生細胞を融合させて抗体産生ハイブリドーマを得ること、および抗体産生ハイブリドーマを試験して、バイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを特定することを含んでもよい。ハイブリドーマは、得られると、細胞培養中で、所望によりハイブリドーマ由来の細胞がバイオマーカーまたはエキソソームに特異的に結合するモノクローナル抗体を産生する培養状態において増殖できる。モノクローナル抗体は、細胞培養から精製されてもよい。
【０１０７】
抗体に関して使用される「・・と特異的に反応する」なる用語は、当該技術分野において一般に理解されるように、目的の抗原（例えば、バイオマーカーまたはエキソソーム）と目的でない他の抗原との間で抗体が十分に選択的であることを意味するように意図される。治療用途等の抗体を使用する特定の方法において、結合におけるより高い程度の特異性が望ましくてもよい。（ポリクローナル抗体と比較して、）モノクローナル抗体は一般に、所望の抗原と交差反応するポリペプチドの間を効果的に区別する傾向がより強い。抗体：抗原相互作用の特異性に影響を与える1つの特徴が、抗原に対する抗体の親和性である。所望の特異性はさまざまな異なる親和性で達成されてもよく、一般に好ましい抗体は、約10-6、10-7、10-8、10-9以下の親和性（解離定数）を有する。
【０１０８】
抗体は、例えば、ニューロン由来エキソソーム、アストロサイト由来エキソソーム、希突起膠細胞由来エキソソーム、小膠細胞由来エキソソーム、ドーパミン作動性、コリン作動性、セロトニン作動性、ヒスタミン作動性、グルタミン作動性、グリシン作動性、アドレナリン作動性、ＧＡＢＡ作動性、およびオピオイド作動性ニューロン由来エキソソーム、またはシナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）、ニューログラニン（ＮＲＧＮ）、タウ、リン酸化ｔａｒ、およびシナプトフィジンからなる群から選択されるニューロン特異的タンパク質、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）および興奮性アミノ酸輸送体１（ＥＡＡＴ１）からなる群から選択されるアストロサイト特異的タンパク質、およびミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）および希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）からなる群から選択される希突起膠細胞特異的タンパク質、小膠細胞特異的タンパク質（ＣＤ１１ｂ）、およびケモカイン（ＣＸ３ＣＬ１）またはサイトカイン（ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＦａｓＬ、またはＩＬ１２Ｂ）を含む本願発明のエキソソームまたはバイオマーカーのエピトープに特異的に結合するように生成できる。別の実施態様において、生成される抗体は、抗ＣＤ１７１抗体、抗シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５）抗体、抗ニューログラニン（ＮＲＧＮ）抗体、抗タウ抗体、抗シナプトフィジン抗体、および抗ＣＤ６３抗体、抗αβ−４２抗体、抗ＣＤ８１抗体、抗ＣＴＤ抗体、抗ＧＡＰＤＨ抗体、抗ＩＬ１ｂ抗体、抗ＩＬ３４抗体、抗ＣＸ３ＣＬ１抗体、抗グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）抗体、抗興奮性アミノ酸輸送体１（ＥＡＡＴ１）抗体、抗ＳＮＣＡ抗体、抗ＣＤ１１ｂ抗体、抗ミエリン基本タンパク質（ＭＢＰ）抗体、抗希突起膠細胞ミエリン糖タンパク質（ＯＭＧ）抗体、抗ＡｃｈＥ抗体ＡｃｈＥ、抗ＬＡＭＰ１抗体ＬＡＭＰ１、抗ＲＥＳＴ抗体ＲＥＳＴ、抗ＳＹＴ抗体ＳＹＴ、抗ＣＣＬ２抗体ＣＣＬ２、抗ＩＬ３４抗体ＩＬ３４、抗ＧＹＳ抗体ＧＹＳ、抗ＯＲ抗体ＯＲ、抗ＤＲ６抗体ＤＲ６、抗ＨＳＰ抗体ＨＳＰ、抗ＩＬ１２ｂ抗体ＩＬ１２ｂ、抗Ａβ抗体Ａβ、または抗ＢＡＣＥ抗体ＢＡＣＥである。
【０１０９】
さらに、望ましい抗体を特定するために抗体をスクリーニングするために使用される技術は、得られる抗体の特性に影響し得る。特に望ましい抗体を特定するために、抗体と抗原の間の試験相互作用のためにさまざまな異なる技術が利用可能である。かかる技術は、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴結合アッセイ（例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ結合アッセイ、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＡＢ、Ｕｐｐｓａｌａ、Ｓｗｅｄｅｎ）、サンドイッチアッセイ（例えば、ＩＧＥＮ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ，Ｉｎｃ．、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，Ｍｄ．の常磁性ビーズシステム）、ウエスタンブロット、免疫沈降アッセイ、免疫細胞化学、および免疫組織化学を含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、本願発明は、疾患または障害を治療または防止するために使用される組成物に関する。本明細書の他の場所で詳述されるように、本願発明は、ＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＳＮＣＡ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、および／またはＢＡＣＥが、例えば、アルツハイマー病等のさまざまな疾患および障害の病理に関与するという知見に基づく。
【０１１１】
いくつかの実施形態において、内膜結合バイオマーカーに加えて、エキソソーム内のバイオマーカーが分析される。一定の実施形態において、本願発明は、対象から得られる生物学的試料中のエキソソームを溶解または透過化するための組成物に関する。本願発明の方法において有用な溶解剤は以下を含む：ＲＩＰＡバッファー；Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ６．８）；グリセロール；ＳＤＳ；２−メルカプトエタノール；Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００；Ｍ−ＰＥＲ試薬；Ｔ−ＰＥＲ溶液；ＴＲＩＳＯＬ、およびＣＨＡＰＳ。溶解剤を生物学的試料とインキュベートして、本願発明のエキソソームの膜を破壊し、その後の分析のためにエキソソームカーゴ（例えば、エキソソームタンパク質）を放出してもよい。
【０１１２】
治療の方法
本発明は、有効量の組成物を対象に投与することを含む対象における疾患または障害を治療する方法を提供し、組成物は、対象中のＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＳＮＣＡ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、またはＩＬ３４のレベルを増加、減少、または維持する。さらに他の実施形態において、組成物はＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＳＮＣＡ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、またはＢＡＣＥレベルの増加または減少を防止する。他の実施形態において、本願発明は、対象に有効量の組成物を投与することを含む対象における疾患または障害を治療する方法を提供し、組成物は、ＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、シナプトフィジン、ＣＤ６３、αβ−４２、ＳＮＣＡ、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、および／またはＢＡＣＥのレベルを基準レベルに標準化する。
【０１１３】
キット
結合捕獲剤を有する固形支持体、検出剤、および所望によりＥＬＩＳＡ、ＩＦＡ、免疫ポリメラーゼ連鎖反応アッセイ、ＥＣＬＩＡまたはＲＩＡ等のイムノアッセイを実施するための試薬を含む上記のアッセイ試薬は、上記のように、エキソソーム上のバイオマーカーを検出するためのアッセイを行うために、適切な指示および他の必要な試薬と共に、キットにおいて提供できる。キットは通常、結合捕獲剤を有する固形支持体、検出剤、対照製剤（ポジティブおよび／またはネガティブ）、およびアッセイ形式が必要とする他の試薬を別個の容器中に含有する。通常、アッセイを行うための指示（例えば、書面、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、ブルーレイ、フラッシュドライブ、デジタルダウンロードなど）がキット中に含まれる。キットは、使用される特定のアッセイに応じて、他のパッケージ化された試薬および材料（すなわち、洗浄バッファーなど）を含有することもできる。上記のようなアッセイは、これらのキットを使用して行うことができる。
【０１１４】
別の実施態様において、本発明は、対象における疾患または障害を検出またはモニターするためのキットを包含する。異なる構成要素を有する様々なキットが、本発明により熟考される。一般的に言えば、キットは、対象における1つ以上のバイオマーカーを定量するための手段を含む。別の実施態様において、キットは、生物学的試料を収集するための手段、生物学的試料中の１つ以上のバイオマーカーを定量するための手段、およびキット内容の使用のための指示を含む。一定の実施形態において、キットは生物学的試料中のエキソソームを濃縮または単離するための手段を含む。さらなる態様において、キットは、生物学的試料からエキソソームを単離するための結合捕獲剤を有する固形支持体を含む。特定の態様において、キットは、バイオマーカーの量を定量するための手段を含む。さらなる態様において、バイオマーカーの量を定量するための手段は、バイオマーカーの量を検出するのに必要な試薬を含む。
【０１１５】
別の実施態様において、本発明は、対象における疾患または障害を診断または予後診断する、疾患または障害の危険性のある対象を特定する、または疾患または障害を有する対象において治療レジメンを処方するかまたは治療からの利益を予測するためのキットを含み、該キットは以下を含む：ａ）それに関連する捕獲剤を含む固形支持体、ここで、少なくとも１つの捕獲剤はＣＤ１７１、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、またはＯＭＧに選択的に結合する、固形支持体；およびｂ）１つ以上の検出剤、ここで１つ以上の検出剤はエキソソームの表面上のＣＤ８１、ＧＡＰＤＨ、ＣＴＳＤ、ＮＲＧＮ、ＭＢＰ、ＧＦＡＰ、タウ、リン酸化タウ（例えば、Ｔ１８１）、ＣＤ６３、αβ−４２、ＣＸ３ＣＬ１、ＩＬ１ｂ、ＩＬ３４、ＡｃｈＥ、ＬＡＭＰ１、ＲＥＳＴ、ＳＹＴ、ＣＣＬ２、ＩＬ３４、ＧＹＳ、ＯＲ、ＤＲ６、ＨＳＰ、ＩＬ１２ｂ、Ａβ、またはＢＡＣＥに選択的に結合する、検出剤。一定の実施形態において、少なくとも１つの捕獲剤または検出剤は、ＣＤ１７１、リン酸化タウＴ１８１、またはニューログラニンに特異的に結合する抗体、抗体断片、抗体模倣物、またはアプタマーを含む。一定の実施形態において、抗体は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、キメラ抗体、ナノボディ、抗体の組み換え断片、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｖ断片、およびｓｃＦｖ断片からなる群から選択される。別の実施態様において、キットは、抗ニューログラニン抗体、抗リン酸化タウＴ１８１抗体、および抗ＣＤ１７１抗体を含む。
【０１１６】
本願発明のこれらおよび他の実施形態は、本明細書の開示を考慮して、当業者に容易に生じるであろう。
【発明を実施するための形態】
【０１１７】
実施例
本発明は、本発明を純粋に例示することを意図される以下の実施例への参照によりさらに理解される。これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される発明を説明するためにのみ提供される。本願発明は、発明の単一の態様のみを説明するものとして意図される例示された実施形態による範囲に限定されない。機能的に同等であるいずれの方法も、本発明の範囲内にある。本明細書に記載されるものに加えて、本発明の種々の修正は、前述の記載から当業者に明らかになる。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【実施例１】
【０１１８】
エキソソームからの内膜結合バイオマーカーの検出
エキソソームの内膜結合バイオマーカーを、以下のように検出した。４つの血漿試料を抗ＤＡＴ固定化（ドーパミン輸送体）ＥＬＩＳＡプレート上のデュプリケートウェルに添加して、エキソソームを捕獲した。ビオチン化抗ＣＤ８１プローブと反応させる前に、各試料の１つのウェルを溶解バッファーに曝露し、該試料のもう１つのウェルをＰＢＳバッファー中に懸濁した。全てのウェルのインキュベーションを１時間続けた。次に、ビオチン化抗ＣＤ８１抗体を全てのウェルに添加してエキソソームと反応させ、続いて化学発光ＥＬＩＳＡのためにストレプトアビジン−ホースラディッシュペルオキシダーゼ反応を行った。
【０１１９】
図１に示すように、ＣＤ８１シグナルを、溶解バッファーで処理されたウェル中で検出し、これは溶解バッファーが適用されてもエキソソームがＥＬＩＳＡプレート上に維持されることを実証した。
【０１２０】
別の一連の実験において、血漿試料を抗ＳＮＡＰ２５固定化ＥＬＩＳＡプレート上のウェルに添加して、エキソソームを捕獲した。エキソソームを捕獲した後、種々のバイオマーカーに対する標識抗体と反応させる前に、ＥＬＩＳＡウェルをＰＢＳまたは溶解バッファーに曝露した（図２中のＹ軸を参照）。ＥＬＩＳＡ読み取り値（ＲＬＵ）を使用して、１００％を超えるパーセント変化を算出し、これはバイオマーカーがエキソソームの内膜中に存在することを示した。図２に示すように、いくつかのエキソソームバイオマーカーは変化せず、これは、非常に低レベルのこれらのバイオマーカーがエキソソームの内膜中に見出されることを意味した。しかしながら、タウは有意に増加し、これは、タウがエキソソーム内膜に結合することを示した。
【０１２１】
これらの結果は、本願発明の方法が、固形支持体上でエキソソームを選択的に捕獲し、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化し、そして捕獲されたエキソソームからの内膜結合バイオマーカーを検出するのに有用であることを示した。
【０１２２】
別の一連の実験において、血漿試料を、アルツハイマー病（ＡＤ）を有する患者から得た。血漿試料を抗ＳＮＡＰ２５固定化ＥＬＩＳＡプレート上のウェルに添加して、エキソソームを捕獲した。エキソソームを捕獲した後、タウ、リン酸化タウＴ１８１、およびリン酸化タウＳ３９６に対するビオチン化抗体と反応させる前に、ＥＬＩＳＡウェルを、ＰＢＳまたは溶解バッファーに曝露した。図３に示すように、いくつかのエキソソームバイオマーカーを、エキソソームの内膜中で見出した。タウ、Ｔ１８１、およびＳ３９６を全て、捕獲されたエキソソームの内膜中で見出した。さらに、内膜結合エキソソームタウ濃度は、アルツハイマー病を有する患者からの試料中で増加した。
【０１２３】
これらの結果は、内膜結合エキソソームバイオマーカーの検出を示した。これらの結果は、本願発明の方法が、固形支持体上のエキソソームを選択的に捕獲し、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化し、そして捕獲されたエキソソームからの内膜結合バイオマーカーを検出するのに有用であることをさらに示した。これらの結果は、本願発明の方法が神経学的疾患（例えば、アルハイマー病）を診断するのに有用であることをさらに示した。
【実施例２】
【０１２４】
エキソソームからの細胞質バイオマーカーの検出
細胞質バイオマーカーを、以下のようにエキソソームから検出した。血漿試料を抗ＳＮＡＰ２５固定化ＥＬＩＳＡプレートに適用して、エキソソームを捕獲した。エキソソームを抗ＳＮＡＰ２５固定化ＥＬＩＳＡプレート上で捕獲した後、各ウェルをさまざまなｐＨレベル（ｐＨ７からｐＨ１．８）を有する溶出溶液で洗浄し、続いて標識された抗ＣＤ８１抗体と反応させた。結果を、ｐＨ７での値を１００％、血漿なし対照を０％とする％対照として表した。図４に示すように、ＥＬＩＳＡシグナルはｐＨを下げることにより減少したが、ｐＨ１．８でもおよそ４０％のシグナルが残っており、これは、固形支持体からエキソソームを溶出することの困難性を示唆した。
【０１２５】
別の一連の実験において、血漿試料を、抗ＳＮＡＰ２５抗体固定化ありまたはなしで、種々の体積の磁性ビーズとインキュベートした。次に、上澄みを抗ＳＮＡＰ２５固定化ＥＬＩＳＡプレートに適用し、続いて標識化抗ＣＤ８１抗体と反応させた。図５に示すように、抗ＳＮＡＰ２５結合磁性ビーズはＳＮＡＰ２５＋ＣＤ８１＋シグナルを用量依存的に吸着したが、一方で対照ビーズは変化せず、これは、抗体結合磁性ビーズによるＳＮＡＰ２４＋ＣＤ８１＋エキソソームの捕獲を示す。ゆえに、溶解バッファーをＳＮＡＰ２５−固定化磁性ビーズに曝露することにより、全エキソソーム溶解物を、細胞質バイオマーカーの分析のために得ることができる。
【０１２６】
α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）は、パーキンソン病（ＰＤ）における病理学的タンパク質として既知である。別の一連の実験において、エキソソームを上記の方法を使用して捕獲し、細胞質ＳＮＣＡレベルを以下のように決定した。２つの血漿試料（ＩＲ３０６およびＥＱ３）を、抗ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）抗体の固定化ありまたはなし（それぞれＤＡＴ（＋）マグおよびＤＡＴ（−）マグ）で、磁性ビーズに適用した。広範囲に洗浄して非特異的に結合したいかなる材料をも除去した後、磁性ビーズを溶解バッファーに曝露した。得られた溶解物をＥＬＩＳＡに使用した（モノクローナル抗ＳＮＣＡ固定化ＥＬＩＳＡプレート、続いて標識化抗ＳＮＣＡ抗体の別のクローン）。図６に示すように、ＳＮＣＡをＤＡＴ（＋）マグに適用された血漿試料中で検出したが、対照ビーズＤＡＴ（−）マグからは検出しなかった。
【０１２７】
これらの結果は、本願発明の方法がエキソソームからの細胞質バイオマーカーの検出に有用であることを示した。該結果は、本願発明が、固形支持体上のエキソソームを選択的に捕獲し、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化し、そして捕獲されたエキソソームからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出するのに有用であることをさらに実証した。
【０１２８】
別の一連の実験において、エキソソームは捕獲され、細胞質タンパク質はアルツハイマー病（ＡＤ）を有する患者からの血漿試料中で検出された。ＡＤおよび対照血漿試料を抗ＳＮＡＰ２５固定化ＥＬＩＳＡプレートに適用して、エキソソームを捕獲した。広範囲に洗浄して非特異的に結合したいかなる材料をも除去した後、ＥＬＩＳＡプレートを溶解バッファーに曝露した。得られた溶解物を使用して、ＧＡＰＤＨ、総タウ、およびｐ−タウＴ１８１をそれぞれＥＬＩＳＡにより定量した。図７Ａ−７Ｃに示すように、タウおよびＴ１８１を全ての試料中で検出し、感度が低いため、ＧＡＰＤＨを１９試料のうち１２試料中で検出した。これらのデータは、アルツハイマー病を有する患者からの試料中で細胞質外因性カーゴをうまく検出したことを示した。これらの結果は、本願発明の方法がエキソソームからの細胞質バイオマーカーを検出するのに有用であることを示した。該結果は、本願発明が固形支持体上のエキソソームを選択的に捕獲し、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化し、そして捕獲されたエキソソームからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出するのに有用であることをさらに実証した。
【実施例３】
【０１２９】
エキソソームからのｍｉＲＮＡの検出
ｍｉＲＮＡを、以下のようにエキソソームから検出した。血漿試料を、抗ＳＮＡＰ２５抗体磁性ビーズおよび対照抗体を含まない磁性ビーズとインキュベートした。広範囲に洗浄して非特異的に結合したいかなる材料をも除去した後、磁性ビーズをＴｒｉｚｏｌに曝露した。得られた溶解物をＲＮＡゲル電気泳動に使用した。ｍｉＲＮＡを、抗ＳＮＡＰ２５結合磁性ビーズに適用された血漿試料中で検出したが、対照抗体を含まない磁性ビーズからは検出しなかった。これらの結果は、本願発明の方法がエキソソームからのｍｉＲＮＡの検出に有用であることを示した。これらの結果は、本願発明の方法が、固形支持体上のエキソソームを選択的に捕獲し、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触を維持しながらエキソソームを溶解または透過化し、そして捕獲されたエキソソームからのｍｉＲＮＡを検出するのに有用であることをさらに示した。
【実施例４】
【０１３０】
エキソソームバイオマーカーを検出するための飽和酵素連結免疫吸着アッセイ
酵素連結免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）は、種々のバイオマーカーのレベルを検出および定量するための最も通常のイムノアッセイの１つである。標的バイオマーカーのレベルを定量するために、ＥＬＩＳＡに適用される試料中の標的分析物のレベルは、飽和量未満であり、標準の線形範囲内に留まる必要がある。試料中の可飽和量の分析物を意図的にＥＬＩＳＡに適用する方法または推奨はない。
【０１３１】
カーゴタンパク質の分析のためのエキソソーム飽和に対する固定化抗体の量を、以下のように決定した。ドーパミン輸送体（ＤＡＴ）に対する抗体が固定化されたＥＬＩＳＡプレートに、種々の体積（２０、１０、５および０ｕＬ）の４つの異なる血漿試料（ＩＲ４６０、ＩＲ３０６、ＩＲ３２３、およびＥＱ４）のを適用した。抗ＤＡＴ抗体の濃度は、それぞれ１／４００（＝５００ｎｇ／ｍＬ）、１／８００（２５０ｎｇ／ｍＬ）、１／１６００（１２５ｎｇ／ｍＬ）、および１／３２００（６２．５ｎｇ／ｍＬ）であった。一晩のインキュベーション後、各ウェルを洗浄バッファーで２回洗浄し、次いで４℃でさらに１時間、プロテアーゼ阻害剤およびホスファターゼ阻害剤の両方をそれぞれ１×補足した５０μＬ溶解バッファーに曝露した。上澄みのそれぞれ２０マイクロリットルを、α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）（図８Ａ〜８Ｄ）およびチロシンヒドロキシゲナーゼ（ＴＨ）（図９Ａ〜９Ｄ）のＥＬＩＳＡキットにそれぞれ移した。ＳＮＣＡおよびＴＨ  ＥＬＩＳＡのどちらも従来のサンドイッチＥＬＩＳＡであり、飽和ＥＬＩＳＡではなかった。溶解物をＳＮＣＡおよびＴＨ  ＥＬＩＳＡに移した後、各ウェルを洗浄バッファーで２回洗浄し、ビオチン化抗ＣＤ８１に曝露して、抗ＤＡＴプレート上のエキソソーム膜を定量した（図１０Ａ〜１０Ｄ）。
【０１３２】
図１０Ａ−１０Ｄに示すように、エキソソーム膜マーカーＣＤ８１の値は、全ての抗ＤＡＴ希釈（１／４００−１／３２００）で３血漿（ＩＲ４６０、ＩＲ３０６、ＩＲ３２３）の５−２０ｕＬから飽和したが、一方で１０−２０ｕＬ  ＥＱ４血漿は１／８００−１／３２００希釈から飽和したが１／４００希釈では飽和しなかった。エキソソームカーゴ中のＳＮＣＡ（図８Ａ〜８Ｄ）およびＴＨ（図９Ａ〜９Ｄ）の値はまた、抗ＤＡＴ抗体を１／４００でなく飽和を示す１／８００を超えて希釈した場合、１０および２０ｕＬ血漿の値が類似であることを示した。しかしながら、ＳＮＣＡおよびＴＨの値は抗ＤＡＴ抗体の濃度依存的であり、１／１６００および１／３２００希釈の値は１／８００希釈よりも低かった。ゆえに、最適な抗ＤＡＴ濃度は１／８００希釈（２５０ｎｇ／ｍＬ）であった。
【０１３３】
別の一連の実験において、エキソソームカーゴタンパク質分析のための種々の固定化抗体の量を決定した。マウス対照ＩｇＧ、シナプトソーム関連タンパク質２５（ＳＮＡＰ２５、ニューロンマーカー）、ＥＡＡＴ１、およびＤＡＴに対する３１３ｎｇ／ｍＬ、１５６ｎｇ／ｍＬ、および０ｎｇ／ｍＬ抗体を固定化したＥＬＩＳＡプレートに、種々の体積（４０、２０、１０、および０ｕＬ）の血漿試料（ＩＲ４６０）を適用した。エキソソームをＥＬＩＳＡプレート上で捕獲した後、各ウェルを溶解バッファーに暴露してカーゴタンパク質を放出させた。次に、得られた溶解物を別個のＳＮＣＡ  ＥＬＩＳＡプレートに移した。図１１Ａ−１１Ｄに示すように、ＩＲ４６０血漿は、ＳＮＡＰ２５、ＥＡＡＴ１、およびＤＡＴに対する１５６ｎｇ／ｍＬ抗体で２０〜４０ｍＬで飽和したが、３１３ｎｇ／ｍＬでは飽和しなかった。対照マウスＩｇＧは陰性であり、これは該アッセイが抗体特異的であることを示す。
【０１３４】
これらの結果は、本願発明の飽和酵素連結免疫吸着アッセイが、エキソソームおよびエキソソームバイオマーカーを検出するのに有用であることを示した。これらの結果は、本願発明の方法は、エキソソームを含む試料を、固形支持体上の固定化抗体が試料中のエキソソームにより一般に飽和される固定化抗体を含む固形支持体上でインキュベートし、そして捕獲されたエキソソームからのバイオマーカーを検出するのに有用であることをさらに示した。
【実施例５】
【０１３５】
エキソソームコアの単離
図１２に示すように、エキソソーム単離に使用される標準的なＥＬＩＳＡアッセイは、最終調製物中の非特異的バイオマーカーによる汚染をもたらすことができる。該標準ＥＬＩＳＡの制限は、図１３に示すようなエキソソームコアの単離により克服できる。この実施形態において、エキソソームは透過性化された一方、エキソソームは固形支持体に結合し、エキソソーム表面に結合した生体分子もエキソソームに結合した。得られたコアまたはカーゴは、外来起源バイオマーカーのコンタミネーションがない（または最小限の）母細胞特異的である。
【０１３６】
一連の実験において、コア抽出中にエキソソームが固形支持体上に留まることが実証される。ドーパミン作動性ニューロン由来エキソソームを、抗ドーパミン作動体（ＤＡＴ）を固定化した固形支持体上に捕獲した。２つの異なるドナーの血漿試料の多重セットを固形支持体に適用してエキソソームを捕獲し、結合していない材料を洗い流した。血漿試料の１セットを、コントロールバッファー、リン酸緩衝生理食塩水に暴露し、他のセットを種々の界面活性剤、Ｎ−ＰＥＲ、Ｍ−ＰＥＲ、Ｃ１３Ｅ１０、ＣＨＡＰＳ、ＤＤＭ、ＯＧＰ、ＯＴＧ、ＳＢ１−１−、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ、およびＮＳＸに暴露した。これらの界面活性剤およびＰＢＳを洗浄した後、各固形支持体をビオチン化抗ＣＤ８１（エキソソーム通常マーカー）と反応させ、続いて化学発光ＥＬＩＳＡを行って、相対光単位（ＲＬＵ）を得た（図１５Ａを参照）。エキソソームが固形支持体から離れている場合は、ＲＬＵを減らす必要がある。図１４Ｂに示すように、全ての界面活性剤がＲＬＵを減少させ、これは、エキソソームが固形支持体から解離したことを示す。しかしながら、ＮＳＸは、高いＲＬＵを維持し、これはエキソソーム解離が最小限であり、エキソソームがコア抽出中に固形支持体上に留まることを示す。
【０１３７】
別の一連の実験において、抗ＣＤ８１を抗−α−シヌクレイン（ＳＮＣＡ）に置き換えて、エキソソームの表面上でのＳＮＣＡの存在を実証した（図１５Ａを参照）。上記の実施例と同様に、表面結合ＳＮＣＡがエキソソームから離れている場合、ＲＬＵを減らす必要がある。
【０１３８】
図１５Ｂに示すように、全ての界面活性剤はＲＬＵを減少させ、これはＳＮＣＡが固形支持体から解離されたことを示す。しかしながら、ＮＳＸは、高いＲＬＵを維持し、これはＳＮＣＡがエキソソームから解離されなかったことを示す。抗グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）を使用することにより類似の結果を得た（データは示さず）。
【０１３９】
次の図１６Ａ−Ｄにおいて
【０１４０】
別の一連の実験において、単離されたエキソソームコアからのバイオマーカーを、以下のように検出および測定した。ＳＮＡＰ２５（一般的なニューロン）、ＤＡＴ（ドーパミン作動性ニューロン）、ＥＡＡＴ１（アストロサイトマーカー）、およびＣＤ８１（エキソソーム共通マーカー）に対する抗体、ならびに抗体陰性対照を磁性ビーズに固定化し、次いでエキソソームコア試料を、ＮＳＸ試薬を使用することにより調製した。これらのコア試料をＥＬＩＳＡウェル上に固定化し、次いでニューロンマーカータウおよびアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）、アストロサイトマーカーＧＦＡＰ、および陽性対照ＧＡＰＤＨに対するビオチン化抗体でプローブした。ＳＮＡＰ２５、ＤＡＴおよびＣＤ８１のＧＡＰＤＨ値（ＲＬＵ）は、抗体対照のないものより高く（図１６Ｃ参照）、これは、調製されたコア試料が空ではなく、少なくとも陽性対照ハウスキーピングＧＡＰＤＨを含有したことを示す。抗ＥＡＡＴ１により単離されたアストロサイト由来エキソソーム（ＡＤＥ）中のＧＡＰＤＨのレベルは低かったが、陰性対照よりわずかに高かった（図１６Ｃを参照）。しかしながら、ＡＤＥは高レベルのアストロサイト特異的ＧＦＡＰタンパク質を示し、これは、ＡＤＥコアが少なくともアストロサイト特異的ＧＦＡＰタンパク質を含有したことを示す（図１６Ｄを参照）。類似して、ＳＮＡＰ２５およびＤＡＴの両方におけるニューロン由来エキソソーム（ＮＤＥ）は、高レベルのニューロン特異的タンパク質タウおよびＡＰＰを示した（図１６Ａおよび１６Ｂを参照）。これらのデータは、我々の方法により調製されたエキソソームコアが母細胞由来バイオマーカーを含有することを明確に示す。これらの結果は、本願発明の方法が、エキソソームと固形支持体の間、およびエキソソーム膜結合バイオマーカーとエキソソーム膜の間の接触を維持するのに有用であることを説明した。これらの結果は、本願発明の方法が固形支持体からエキソソームコアまたはカーゴを単離するのに有用であることをさらに示した。これらの結果はまた、本願発明の方法が、エキソソームコアからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出するのに有用であることを示した。
【０１４１】
別の一連の実験において、エキソソームコアおよび膜を、ＳＮＡＰ２５（ＮＤＥ）およびＥＡＡＴ１（ＡＤＥ）に対する２つの異なる捕獲抗体を使用して調製した。血漿試料を、アルツハイマー病を有する２人のヒト対象（Ａ１およびＡ２）および２人の健常対象（Ｃ１およびＣ２）から得た。これらの試料を、ＡＰＰに対する抗体でプローブされたウエスタンブロットにより分析した。結果を図１７に示す。インタクトなＡＰＰの分子重量は１１０〜１３５ＫＤａであり；該分子重量を有する試料を１つだけ見出した（Ｃ２  ＡＤＥ膜）。アミロイドベータ１−４２の分子重量は４．５ＫＤａ、そのオリゴマーは４０〜２００ＫＤａである。図１７に示すように、５８〜６３ＫＤａのバンドが、３つのコア試料からのおよび８つ全ての膜試料からのウエスタンブロット中に存在した。これらの結果は、ＮＤＥおよびＡＤＥの両方におけるコアおよび膜がアミロイドオリゴマーを含有すること、およびコアと比較して膜における量がより多いことを示す。
【０１４２】
別の一連の実験において、エキソソームコア試料中のドーパミンレベルを以下のように決定した。エキソソームコア試料を、抗ＳＮＡＰ２５および抗ＤＡＴ固定化磁性ビーズを使用して調製した。ドーパミンレベルを、質量分析により決定した。下の表１に示すように、抗ＳＮＡＰ２５および抗ＤＡＴ固定化磁性ビーズから調製されたエキソソームコア試料は、ドーパミンを含有した。逆に、対照抗体磁性ビーズにより調製した試料中には、ドーパミンを検出しなかった。これらの結果は、ニューロン由来エキソソーム（ＮＤＥ）コアが神経伝達物質ドーパミンを含有することを示した。これらの結果は、ＳＮＡＰ２５＋エキソソームがニューロンに由来したことをさらに示した。
【０１４３】
【表１】
2021511510.tif 000002
【０１４４】
別の一連の実験において、ＳＮＡＰ２５＋エキソソーム膜およびコアの両方における総タンパク質濃度を以下のように決定した。ＳＮＡＰ２５＋エキソソーム膜およびコアを、上記のような磁性ビーズにより単離した。総タンパク質濃度を、ＳＮＡＰ２５＋エキソソーム膜およびコア試料の両方においてマイクロＢＣＡ法により決定した。エキソソーム膜画分を、エキソソームコアが放出された後、０．５％ＳＤＳを添加することにより調製した。ＮＳＸおよびＳＤＳはどちらもマイクロＢＣＡアッセイに影響しなかった。量は２つのドナー試料間で非常に異なっていたが、膜画分中のタンパク質含有量はコアより１０〜１００倍多かった。これらの結果は、エキソソーム膜バイオマーカーのバイオマーカーがエキソソームコア中のバイオマーカー含有量を汚染するおよび／または覆い隠すことを示した。
【０１４５】
別の一連の実験において、エキソソーム膜およびエキソソームコア中の重金属含有量を決定した。血漿試料を３人の異なるドナーから得た。ＳＮＡＰ２５＋エキソソームコアおよび膜画分を、上記のように調製した。調製した画分試料を質量分析に適用して重金属を分析した。ＮＳＸバッファーおよびＳＤＳで処理された試料は一部の金属を含有した（図１９Ａ〜１９Ｃの薄い灰色の棒）が、エキソソームコア中のＣｒはＮＳＸバッファー単独よりも高いが、一方でエキソソームコア中のＰｂおよびＵ２３８はＮＳＸバッファーよりも高くなかった（図１９Ａ〜１９Ｃを参照）。対照的に、ＰｂおよびＵ２３８レベルは、３つ全てのドナー試料柱でＳＤＳバッファー単独よりも高く、これはＮＡＰ２５＋ＮＤＥ膜がＰｂおよびＵ２３８を含有することを示した。しかしながら、Ｃｒは、３つの膜画分試料のうちの１つにおいて陽性であるのみであった。これらの結果は、エキソソームコアおよび膜画分が金属分析のための質量分析に適用可能であったことを示した。該結果はまた、エキソソームコア中の重金属レベルがエキソソーム膜中のレベルと同一ではなく、膜組成物がコア組成物と異なることを示した。これらの結果はまた、本願発明の方法が、エキソソームコアからのカーゴまたは細胞質バイオマーカーを検出するのに有用であることを示した。
【０１４６】
本明細書に示され、記載されるものに加えて、本発明の種々の修正は、前述の記載から当業者には明らかとなる。かかる修正は、添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。これらの結果は、本願発明の方法および組成物が、捕獲されたエキソソームが溶解または透過化され、エキソソーム膜と固形支持体の間の接触が維持される固形支持体上で捕獲されたエキソソームからのバイオマーカーを同定、検出、および測定するのに有用であることを示した。これらの結果は、本願発明の方法および組成物が、対象における疾患または障害を診断するのに有用であろうことをさらに示唆した。
【０１４７】
本明細書で引用される全ての文献は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021511510.tif 000003
【図２】
2021511510.tif 000004
【図３−１】
2021511510.tif 000005
【図３−２】
2021511510.tif 000006
【図３−３】
2021511510.tif 000007
【図４】
2021511510.tif 000008
【図５】
2021511510.tif 000009
【図６】
2021511510.tif 000010
【図７】
2021511510.tif 000011
【図８−１】
2021511510.tif 000012
【図８−２】
2021511510.tif 000013
【図９−１】
2021511510.tif 000014
【図９−２】
2021511510.tif 000015
【図１０−１】
2021511510.tif 000016
【図１０−２】
2021511510.tif 000017
【図１１−１】
2021511510.tif 000018
【図１１−２】
2021511510.tif 000019
【図１２】
2021511510.tif 000020
【図１３】
2021511510.tif 000021
【図１４−１】
2021511510.tif 000022
【図１４−２】
2021511510.tif 000023
【図１５−１】
2021511510.tif 000024
【図１５−２】
2021511510.tif 000025
【図１６】
2021511510.tif 000026
【図１７】
2021511510.tif 000027
【図１８】
2021511510.tif 000028
【図１９−１】
2021511510.tif 000029
【図１９−２】
2021511510.tif 000030
【国際調査報告】
2021511510.tif 000031