(57)【要約】  本発明は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む体力または運動能力向上用組成物に関するもので、より詳しくは肉荳蒄抽出物を有効成分として含む体力または運動能力向上用、筋肉減少症治療用、筋機能改善用および抗疲労用組成物に関するものである。  本発明の肉荳蒄抽出物はリグナン系化合物を高含有しているだけでなく、摂取時の運動能力向上、持久力向上及び筋力向上効果が極めて優れていて、筋肉減少症治療に効果があるだけでなく、体力または運動能力向上のための医薬品および食品などに有用に利用することができる。
2021520775.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
肉荳蒄抽出物を有効成分として含む体力または運動能力向上用食品組成物。
【請求項２】
前記の肉荳蒄抽出物は水、炭素数1ないし6つのアルコール(alcohol)、アセトン(acetone)、エーテル(ether)、ベンゼン(benzene)、クロロホルム(chloroform)、エチルアセテート(ethylacetate)、メチレンクロライド(methylene)、ヘキサン(hexane)、シクロヘキサン(cethyle)、石油エーテル、亜臨界流体及び超臨界流体からなる群から選択的された一つ以上の溶媒による抽出物であることを特徴とする第１項記載の薬学組成物。
【請求項３】
第１項において、前記運動能力向上は筋持久力増加又は筋力強化であることを特徴とする組成物。
【請求項４】
第１項において、前記の肉荳蒄抽出物は細胞水準でグリコーゲン水準を増加させる特性を追加して含む組成物。
【請求項５】
第１項において、前記組成物は中年以上の個体向けであることを特徴とする組成物。
【請求項６】
肉荳蒄抽出物を有効成分として含む体力または運動能力向上用薬学的組成物。
【請求項７】
肉荳蒄抽出物を有効成分として含む筋肉減少症予防または治療用薬学的組成物。
【請求項８】
肉荳蒄抽出物を有効成分として含む筋肉減少症予防又は改善用食品組成物。
【請求項９】
肉荳蒄抽出物を有効成分として含む筋機能改善用食品組成物。
【請求項１０】
肉荳蒄抽出物を有効成分として含む抗疲労用食品組成物。
【請求項１１】
肉荳蒄抽出物を有効成分として含む体力向上、運動能力向上または肉量増大用飼料添加用組成物。
【請求項１２】
体力または運動能力向上用製剤を製造するための肉荳蒄抽出物の用途。
【請求項１３】
肉荳蒄抽出物を有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを特徴とする体力又は運動能力向上方法。
【請求項１４】
筋肉減少症の予防又は改善用製剤を製造するための肉荳蒄抽出物の用途。
【請求項１５】
肉荳蒄抽出物を有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを特徴とする筋肉減少症の予防又は治療方法。
【請求項１６】
筋機能改善用製剤を製造するための肉荳蒄抽出物の用途。
【請求項１７】
肉荳蒄抽出物を有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを特徴とする筋機能改善方法。
【請求項１８】
抗疲労用製剤を製造するための肉荳蒄抽出物の用途。
【請求項１９】
肉荳蒄抽出物を有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを特徴とする抗疲労方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は2018年02月01日に出願された大韓民国特許出願第10-2018-0012986号を優先権として主張し、前記明細書全体は本出願の参考文献である。
【０００２】
本発明は、肉荳蒄抽出物を有効成分に含む体力または運動能力向上用組成物に関するもので、より詳しくは肉荳蒄抽出物を有効成分として含む体力または運動能力向上用、筋肉減少症治療用、筋機能改善用及び抗疲労用組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
現代人は美容と健康に多大な関心を有しているにもかかわらず、肥満、高血圧およびその他様々なの成人病に苦しんでいて、老化防止のため多くの努力にもかかわらず、大気汚染及び過重なストレスなどによりそれを予防できない実情にある。このような各種成人病及び老化を予防するためには、永らく運動を続けることが最も効果的で経済的であるが、運動できる時間が限られているため、運動効果を高められるようにするための様々な製剤が市販されている。また、運動選手等は新記録を樹立するために、運動種目に伴う科学的訓練、食餌療法及び運動能力増強補助剤(ergogenic aids)などを併行している。このうち運動能力補助剤は、運動遂行能力を向上させるだけでなく、身体活動時に体内に蓄積され、疲労を誘発する疲労要素の除去にも効果があるため、一般にも広く利用されている。運動能力向上のための機能性補助剤と関連した研究は、洋の東西を問わず活発に行われている。現在、市販されている製品の殆どはステロイド、カフェイン、炭酸水素ナトリウム及びクエン酸ナトリウムなどが含まれている。しかし、このような成分の効果は、一時的現象に過ぎず、耐性が生じて次第により多くの含量の成分が含まれた製品を求められるようになり健康に致命的副作用を齎すことでもある。
【０００４】
筋肉(Muscle)は人体で最も構成量が多い組織として人体の機能的能力(functional capacity)を維持し、代謝性疾患を予防するためには適正筋肉量の確保が不可欠となる。筋肉のサイズ(muscle size)は筋肉内で起こる同和作用(anabolism)や違和作用(catabolism)を誘導する細胞内信号伝達過程(signalling pathways)により調節される。筋肉蛋白質の分解より合成を誘導する信号伝達反応が多く起こる場合、筋肉内蛋白質の合成が増加され、結果的に筋肉の大きさが増加する筋肥大(hypertrophy)や筋繊維数の増加(hyperplasia)が発生する。
【０００５】
骨格筋は人体で最も大きな部分を占める器官で、総体重の40-50%を占め、エネルギーの恒常性及び熱生成などをはじめ、体内の様々な代謝機能にも重要な役割を果たしている。ヒトの筋肉は40歳以降から毎年1％以上ずつ減少し、80歳になると最大筋肉量の50％が減少するため、老年の筋肉量減少は全般的身体機能を低下させる最も重要な要素として認識されている。老化が進むにつれて筋肉と脂肪の含量、骨格歪曲などの体型変化を認識するようになるが、老年期の筋減少による肥満誘病率は、全世界的に30%以上の水準で持続的増加傾向を示している。インスリン分泌異常の場合、細胞にエネルギーをまともに供給できず、筋肉発達障害を起こす恐れがあり、一般人より糖尿病患者の方が筋肉減少症が増加する。筋肉の損失はさらに多くの慢性疾患及び老化過程によって引起される。体が老化するにつれて新たに生成される骨格筋の一部が繊維組織に代替される。したがって、ヒトの正常的老化は、弱体化及び退化の原因となる、筋肉減少症と呼ばれる状態の骨格筋量及び強度の進行性減少と関連する。また、年齢関連疾患、例えば高血圧、耐糖能障害および糖尿、肥満、異常脂質血症、アテロム性硬化症および心血管疾患も筋肉量の損失に関わる。また、癌、自己免疫疾患、感染疾患、HIV感染、AIDS、慢性炎症、関節炎、栄養失調、腎臓疾患、慢性閉鎖性肺疾患(COPD)、肺気腫、くる病、慢性下部脊椎痛症、末梢神経損傷、脊髄損傷、化学的損傷、中枢神経系(CNS)損傷のような他の疾患も筋肉損失と関連したり、筋肉損失を齎しかねない。最後に、筋肉損失を起こす状態は、疾病による長期固定のような廃用状態、または長期間の車椅子使用、長期寝床療養、骨折又は外傷のような無力さから起こり得る。手術後の寝床療養は週当たり約10％の骨格筋量の損失を起こすものと評価される。
【０００６】
また、筋肉の減少は関節炎、腰の痛み、慢性痛症をさらに増加させる原因となり、腹部肥満による尿失禁症状も悪化させる可能性があり、骨折による負傷は老年の鬱病を増加させて死亡に至ることもあるため、老年の筋減少症は様々な疾患と連携して生活の質を落とす主な原因となる。筋肉減少症は骨多孔症、インスリン抵抗性及び関節炎のような老人性慢性疾患とも密接な関係があるものと知られ、筋肉減少症の予防又は改善を通じて老化による身体活動力の減少を抑制することができる。世界の進行性運動失調症及び筋力弱化治療剤市場は2011年に約140億ドル規模を記録し、その後には9.4%の年平均複合成長率で成長し、2017年には約235億ドルに達すると見込まれている。筋肉減少症の治療法としてはミトコンドリア生成の増加、筋肉蛋白質分解抑制、抗炎剤などが提示されているが、はっきりした明白な治療薬がないのが実情である。また、高齢者の筋減少症を予防するために提示されている食餌法には、毎食25-30gの良質の蛋白質を摂取することであった。それは卵4〜5個、または鶏の胸肉約120ｇを毎食事ごとに摂取しなければならないもので、日常生活をする一般人は現実的に実践しにくい。従って、最近多くの人々が蛋白質補充剤を代案として選んでいるが、蛋白質補充剤は蛋白質の過剰摂取の原因となり、副作用の可能性が高い。
【０００７】
肉荳蒄(英語：Nutmeg)は双子葉植物キンポウゲ目肉荳蒄科の常緑樹と広葉樹の喬木で、学名はミリスティカ・フラグランス（Miristica fragrans）である。肉荳蒄（Myristica fragrans Houtt．またはNutmeg)の実は腹痛、下痢、口腔粘膜疾患、関節痛、不眠症などの治療のための漢方薬剤及び香辛料として使われている。また、肉荳蒄の実は抗炎症、抗菌、鎮痛、抗不安、肝機能の改善、抗突然変異など様々な薬理活性を有するものとして報告されている(Ozaki et al., Jpn J Pharmacol 1989; Olajide et al., Phytother Res 1999; Ram et al., J Ethnopharmacol, 1996; Sonavane et al., Pharmacol Biochem Behav 2002; Bhamarapravati et al., In Vivo, 2003; Akinboro et al., Acta Biochim Pol 2014)。しかし、現在まで肉荳蒄が運動能力、持久力、筋力向上に効果的に利用されることについては何らの報告もない。
【０００８】
そこで、本発明者等は新たな運動能力向上剤を開発するための努力を続けた結果、肉荳蒄抽出物がマウスの運動能力、筋力、持久力を向上させることを発見して本発明を完成させた。
【発明の概要】
【０００９】
［発明の詳細な説明］
［技術的課題］
そこで、本発明者等は体力または運動能力向上効果を示す安全な天然物素材を発掘するために研究していたところ、本発明の肉荳蒄抽出物を製造し、前記抽出物が筋力増加および持久力向上の効果が著しいことを確認して本発明を完成させた。
【００１０】
したがって、本発明の目的は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む体力または運動能力向上用組成物を提供することである。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分で構成される体力または運動能力向上用組成物を提供することである。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分として必須に構成される体力または運動能力向上用組成物を提供することである。
【００１１】
本発明の他の目的は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む筋肉減少症予防又は治療用組成物を提供することである。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分で構成される筋肉減少症予防または治療用組成物を提供することである。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分として必須に構成される筋肉減少症予防または治療用組成物を提供することである。
【００１２】
本発明のさらに他の目的は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む筋機能改善用組成物を提供することである。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分で構成される筋機能改善用組成物を提供することである。  また、肉荳蒄抽出物を有効成分として必須に構成される筋機能改善用組成物を提供することである。
【００１３】
本発明のさらに他の目的は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む抗疲労用組成物を提供することである。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分で構成される抗疲労用組成物を提供することである。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分として必須に構成される抗疲労用組成物を提供することである。
【００１４】
本発明のさらに他の目的は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む体力向上、運動能力向上、または肉量増大用の飼料添加用組成物を提供することである。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分として構成される体力向上、運動能力向上、または肉量増大用の飼料添加用組成物を提供することである。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分として必須に構成される体力向上、運動能力向上、または肉量増大用飼料添加用組成物を提供することである。
【００１５】
本発明のさらに他の目的は、体力又は運動能力向上用製剤、筋肉減少症予防又は治療用製剤、筋機能改善用製剤、又は抗疲労用製剤を製造するための肉荳蒄抽出物の用途を提供することである。
【００１６】
本発明のさらに他の目的は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを特徴とする体力又は運動能力向上方法、筋肉減少症予防又は治療方法、筋機能改善方法又は抗疲労方法を提供することである。
［課題解決の手段］
【００１７】
前記のような目的を達成するために、本発明は肉荳蒄抽出物を有効成分として含む体力または運動能力向上用組成物を提供する。
また、本発明は肉荳蒄抽出物を有効成分として構成される体力または運動能力向上用組成物を提供する。
また、本発明は肉荳蒄抽出物を有効成分として必須に構成される体力または運動能力向上用組成物を提供する。
【００１８】
本発明の他の目的を達成するため、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む筋肉減少症の予防又は治療用組成物を提供する。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分として構成される筋肉減少症予防または治療用組成物を提供する。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分として必須に構成される筋肉減少症予防または治療用の組成物を提供する。
【００１９】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は肉荳蒄抽出物を有効成分として含む筋機能改善用組成物を提供する。
また、本発明は肉荳蒄抽出物を有効成分として構成される筋機能改善用組成物を提供する。
また、本発明は肉荳蒄抽出物を有効成分として必須に構成される筋機能改善用組成物を提供する。
【００２０】
本発明のさらに他の目的を達成するために、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む抗疲労用組成物を提供する。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分で構成する抗疲労用組成物を提供する。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分として必須に構成される抗疲労用組成物を提供する。
【００２１】
本発明のさらに他の目的を達成するために、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む体力向上、運動能力向上、又は肉量増大用飼料添加用組成物を提供する。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分で構成する体力向上、運動能力向上、または肉量増大用の飼料添加用組成物を提供する。
また、肉荳蒄抽出物を有効成分として必須に構成される体力向上、運動能力向上、または肉量増大用飼料添加用組成物を提供する。
【００２２】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は体力又は運動能力向上用製剤、筋肉減少症予防又は治療用製剤、筋機能改善用製剤、又は抗疲労用製剤を製造するための肉荳蒄抽出物の用途を提供する。
【００２３】
本発明のさらに他の目的を達成するために、本発明は肉荳蒄抽出物を有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを特徴とする体力又は運動能力向上方法、筋肉減少症の予防又は治療方法、筋機能の改善方法、又は抗疲労方法を提供する。
以下、本発明を詳しく説明する。
【００２４】
前記肉荳蒄(Nutmeg)は双子葉植物キンポウゲ目肉荳蒄科の常緑樹と広葉樹の喬木で、学名はミリスティカ・フラグランス(Miristica fragrans)を意味するもので、前記肉荳蒄は、肉荳蒄の原型を壊さずそのまま使用するか、当業者が意図する工程速度及び工程効率を考慮して前処理過程を遂行した後使用することができ、前記の前処理過程としては例えば通常的選別、水洗、切断、粉末化、乾燥などの段階を経る。
【００２５】
本発明の肉荳蒄抽出物は、公知の天然物抽出方法により抽出することができる。望ましくは水、炭素数1ないし6個の有機溶媒及び亜臨界又は超臨界流体からなる群から選択された一つ以上の溶媒により抽出することができる。前記の炭素数1ないし6個の有機溶媒は、炭素数1ないし6個のアルコール(alcohol)、アセトン(acetone)、エーテル(ether)、ベンゼン(benzene)、クロロホルム(chloroform)、エチルアセテート(ethylacetate)、メチレンクロライド(methylenechloride)、ヘキサン(hexane)、シクロヘキサン(cychelole)、及び石油エーテル(petroleum ether)からなる郡から選ばれたものでもあるが、それに限られるものではない。本発明の肉荳蒄抽出物は、より望ましくはアルコールで抽出することができて、より望ましくはエタノール水溶液、さらに望ましくは10ないし30％エタノール水溶液から抽出されたものでもある。
【００２６】
本発明の一実施例では、肉荳蒄を様々な濃度のアルコール (エタノール)を溶媒として抽出物を製作することを特徴とする。このような本発明特有の抽出方法によって、ミリスティシン含量が低い肉荳蒄抽出物の収得が可能であることが特徴である。このような本発明の抽出物の製造方法の特異性は本発明の明細書の実施例 1によく示されている。
【００２７】
前記抽出工程の後、ろ過、遠心分離など抽出物の純度を高めるための精製過程を追加で含めることができる。また、濃縮過程を加えて含めることができ、前記の濃縮は当業界に公知された濃縮装置又は濃縮法によることができ、それに制限はされないが、例えば沈殿濃縮、蒸発濃縮、減圧濃縮、限外ろ過法、逆浸透法、遠心分離法でもあって望ましくは減圧濃縮でもある。
【００２８】
本発明の抽出物はろ過及び／または濃縮して液状として使用することができ、噴霧乾燥または凍結乾燥など通常の乾燥工程を通じて固形化して使用することができる。前記の乾燥工程では，噴霧乾燥又は凍結乾燥前のデキストリン等を混合して乾燥することができる。
【００２９】
前記本発明の肉荳蒄抽出物は運動能力向上効果が顕著であることがその特徴である。それは本発明の明細書の実施例によく示されている。したがって本発明は前記の肉荳蒄抽出物を有効成分として含むことを特徴とする体力または運動能力向上用組成物を提供する。
【００３０】
本発明の組成物は体力または運動遂行能力向上の効果を有することを特徴とする。
“体力”とは遊泳、動機付け及び調整力を含む概念で、遊泳実験で水が満たされたガラスタンクの片端から反対側の脱出プラットフォームまで遊泳する能力及び効率を測定したものである。
“運動遂行能力”とは、運動選手の競技力および記録向上と密接に関係することであり、心肺機能の改善、エネルギー代謝の促進、疲労回復および筋力増加を通じてそれを向上させることができる。 即ち、長期間トレーニング時に溜まる疲れを早く回復させ、運動時に持久力を増加させる方法を通じて、運動遂行能力が向上できる。
したがって、本発明の体力又は運動遂行能力向上の効果は、望ましくは筋持久力又は筋力強化効果を意味するものでもある。
【００３１】
本発明は、前記の肉豆蒄抽出物を有効成分に含む筋肉減少症(sarcopenia)の予防又は治療用組成物を提供する。
また、本発明は前記の肉豆蒄抽出物を有効成分で構成される筋肉減少症(sarcopenia)の予防または治療用組成物を提供する。
また、本発明は前記の肉豆蒄抽出物を有効成分として必須に構成される筋肉減少症(sarcopenia)の予防または治療用組成物を提供する。
【００３２】
本発明で前記治療とは、他に言及されない限り、前記用語が適用される疾患又は疾病、又は前記疾患若しくは疾病の一つ以上の症状を逆転させ、又は緩和させ、又はその進行を抑制し、又は予防することを意味して、本院で用いられた前記の“治療”とは、治療する行為をいう。 したがって、哺乳動物における筋肉減少症の治療又は治療療法は、下記の一つ以上を含めることができる。
(1)筋肉減少症を軽減する。
(2)筋肉減少症の再発は予防する，及び
(3)筋肉減少症の症状を緩和する(palliating)
【００３３】
本発明は、前記の肉豆蒄抽出物を有効成分として含む筋機能改善用の組成物を提供する。
また、本発明は前記の肉豆蒄抽出物を有効成分で構成する筋機能改善用の組成物を提供する。
また、本発明は前記の肉豆蒄抽出物を有効成分として必ず構成される筋機能改善用の組成物を提供する。
【００３４】
本発明で“筋”は、芯、筋肉、腱を包括的に指し、“筋機能”は筋肉の収縮によって力を発揮する能力を意味し、筋肉が抵抗に打ち勝つために最大限に収縮力を発揮できる能力である筋力、筋肉が与えられた重量にどれだけ長く、またはどれだけ何回も収縮と弛緩を繰り返せるかを表す能力である筋持久力、短時間内に強い力を発揮する能力である瞬発力を含む。 このような筋機能は肝臓が主観し、筋肉量に比例する。 用語“筋機能改善”は筋機能をより上手く向上させることをいう。
【００３５】
本発明は、前記の肉豆蒄抽出物を有効成分として含む抗疲労用組成物を提供する。
また、本発明は前記の肉豆蒄抽出物を有効成分で構成する抗ー疲労用組成物を提供する。
また、本発明は前記の肉豆蒄抽出物を有効成分として必須の抗疲労用組成物を提供する。
【００３６】
本発明の“疲労”は精神的疲労と肉体的疲労に分けられるが、本発明の“疲労”は運動遂行後筋肉に蓄積される肉体的疲労を意味し、それは筋肉内のグリコーゲン濃度、ピルビン酸濃度及び乳酸デヒドロゲナーゼ活性化などによって誘発されるものである。 本発明の組成物は筋肉細胞におけるグリコーゲン濃度を減少させ、クレアチンキナーゼ濃度を減少させることが一実施例に記載されている。
【００３７】
本発明の肉豆蒄抽出物はその効果が個体及び年齢に制限されないが、望ましくは40歳以上の対象者より、望ましくは50歳以上、最も望ましくは65歳以上に有効である。即ち、本発明の抽出物は成長が終了し、初期段階の老化が開始された中年層以上に効果的であって、望ましくは老年層以上に効果的でもある。
【００３８】
本発明で用いられた用語個体(subject)は哺乳動物、特に人間を含む動物又は前記動物の細胞、組織を意味する。
【００３９】
本発明の組成物は、年齢に関係なく運動能力向上、持久力向上、筋力向上などの効果を示すが、特にoldマウスに対する効果の著しい優秀さが一実施例に記載されている。
【００４０】
本発明の組成物は、肉豆蒄抽出物を単独で含有するか、または肉豆蒄抽出物と類似の機能を示す有効成分を１種以上含有することができる。 追加成分を含めると、本発明の組成物の体力向上/運動能力向上/筋肉減少症治療/筋機能改善/抗疲労効果がさらに増進される。 前記成分の追加時には、複合使用による皮膚の安全性、剤形化の容易性、有効成分の安定性が考えられる。
【００４１】
本発明の食品組成物は、機能性食品(functional food)、健康機能食品(health functional food)、栄養補助食品(nutritional supplement)、健康食品(health food)、および食品添加剤(food additives)などの全ての形態を含む。前記の食品組成物は，当業界に公知された通常の方法により，多くの形で製造することができる。
【００４２】
例え、健康食品としては、前記の肉豆蒄抽出物をお茶、ジュース及び飲料の形で製造し飲用させたり、顆粒化、カプセル化及び粉末化して摂取することができる。 また、本発明の肉豆蒄抽出物と皺改善、抗老化、肌の弾力増進及び肌の保湿効果があるとされる公知の活性成分と一緒に混合し、組成物の形で製造することができる。
【００４３】
また、機能性食品としては飲料（アルコール性飲料を含む）、果実およびその加工食品（例：フルーツ缶詰、瓶詰、ジャム、マーマレード等）、魚類、肉類およびその加工食品（例：ハム、ソーセージ、コーンビーフ等）、パン類および麺類（例：うどん、そば、ラーメン、スパゲッティ、マカロニ等）、果汁、各種ドリンク、クッキー、飴、乳製品（例：バター、チーズ等）、食用植物油脂、マーガリン、植物性蛋白質、レトルト食品、冷凍食品、各種調味料(例：味噌、醤油、ソース等)等に肉豆蒄抽出物を添加して製造することができる。 
【００４４】
具体的に、本発明は前記の肉豆蒄抽出物及び食品学的に許容可能な担体又は添加剤を含む健康機能食品(health functional food)を提供する。 本発明で定義される健康機能食品は、2008年に改正された健康機能食品に関する法律によって新たに定義された人体に対する機能性及び安全性が十分に確立され、食品医薬品安全庁食薬庁告示第2008-72号に規定された健康機能食品機能性原料認定に関する規定に収載された健康機能食品であることを意味する。
【００４５】
このような健康機能食品は、当該技術分野に公知されている通常の健康機能食品の剤型として製剤されうる。 前記の健康補助食品は、例え、散薬、顆粒剤、錠剤、丸剤、カッセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ剤、浸剤、液剤、抽出物剤、ガム、お茶、ゼリー、又は飲料等に製造することができる。 前記の食品学的に許容可能な担体又は添加剤としては、製造しようとする剤形の製造に当該技術分野で使用可能であると公知されている任意の担体又は添加剤が用いられる。
本発明の健康機能食品は、様々な栄養剤、ビタミン、鉱物 (電解質)、合成風味剤および天然風味剤などの風味剤、着色剤および増進剤 (チーズ、チョコレートなど)、ペクト酸およびその塩、アルギン酸およびその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、pH調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使用される炭酸化剤などが含まれる。
【００４６】
さらに多くの香味剤または天然炭水化物なども含められる。前記の天然炭水化物としては単糖類（例：ブドウ糖、果糖等）、二糖類（例：マルトーズ、スクローズ等）、多糖類（例：デキストリン、シクロデキストリン等）のような通常の糖及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトール等の糖アルコールが含まれることがある。また、香味剤として天然香味剤 (例：タウマチン、ステビア抽出物など)および合成香味剤 (例：サッカリン、アスパタムなど)を含有している。
また、本発明の肉荳蒄抽出物を食品添加剤の形で使用するためには粉末または濃縮液の形で製造し使用することができる。
【００４７】
本発明の食品組成物のうち、肉荳蒄抽出物の望ましい含量は、食品組成物の総重量に対して0.0001ないし90重量％、望ましくは0.01ないし50重量%の範囲で含まれることができる。
また、本発明は前記肉荳蒄抽出物を有効成分として含むことを特徴とする体力または運動能力向上用薬学的組成物を提供する。
【００４８】
本発明による薬学的組成物は、前記の本発明の肉荳蒄抽出物を単独で含有するか、または一つ以上の薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を加えて含有することができる。前記において“薬学的に許容される”とは、生理学的に許容され、ヒトに投与される際に活性成分の作用を阻害せず、通常には胃腸障害、めまいといったアレルギー反応又はそれと類似した反応を起こさない非毒性の組成物を意味する。
【００４９】
薬学的に許容される担体には、例えば、経口投与用担体又は非経口投与用担体を追加して含めることができる。経口投与用担体はラクトス、澱粉、セルロス誘導体、マグネシウムステアレート、ステアル酸等を含めることができる。また、非経口投与用担体は水、適したオイル、食塩水、水性グルコース及びグリコール等を含めることができ、安定化剤及び保存剤を追加して含められる。適した安定化剤としては亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム又はアスコルビン酸のような抗酸化剤がある。適した保存剤にはベンズアルコニウムクロライド、メチル又はプロピルパラベン及びクロロブタノールがある。本発明の薬学的組成物は前記の成分以外に潤滑剤、湿潤剤、甘味剤、香味剤、乳化剤、玄沢剤などを追加して含まれる。その他の薬学的に許容される担体及び製剤は、当業界に公知されているすべてのものを参考にすることができる。
【００５０】
本発明の組成物は、ヒトをはじめとする哺乳動物にいかなる方法でも投与することができる。例えば，経口又は非経口的に投与することができる。非経口的投与方法としては、それに限られてはないが、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下又は直腸内投与でもある。
本発明の薬学的組成物は、上述のような投与経路によって経口投与用又は非経口投与用製剤で剤形化することができる。経口投与用製剤の場合、本発明の組成物は粉末、顆粒、錠剤、丸剤、糖の錠剤、カプセル剤、液剤、ゲル剤、シロップ剤、スラリー剤、懸濁液等で当業界に公知された方法を用いて剤形化することができる。例えば、経口用製剤は、活性成分を固体添加剤と配合した上、それを粉砕して、適合な補助剤を添加した後、顆粒混加剤の例としては、ラクトーズ、デキストローズ、スクローズ、ソルビトール、マンニトール、エリストル及びマルチトール等を含む糖類と、玉蜀黍澱粉、小麦澱粉、小麦澱粉及びジャガイモ澱粉等を含む澱粉類、セルローズ、メチルセルローズ、ナトリウムカルボキシメチルセルローズ、及びハイドロキシプロピルメチルセルローズ等を含むセルローズ類、ゼラチン、ポリビニルピロリドン等のような充填剤を含む。また、場合によっては架橋結合ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸又はナトリウムアルギネート等を崩壊剤として添加することができる。さらに、本発明の薬学的組成物は抗凝集剤、潤滑剤、湿潤剤、香料、乳化剤及び防腐剤などを追加で加えることができる。
非経口投与用製剤の場合には、注射剤、クリーム剤、ローション剤、外用軟膏剤、オイル剤、保湿剤、ゲル剤、エアゾール及び鼻腔吸入剤の形態で当業界に公知された方法で剤形化することができる。それらの剤形は、全ての制約化学に一般的に公知された剤形を含めることができる。
【００５１】
本発明の組成物(treatment protocol)の総有効量は単一投与量(single dose)で患者に投与でき、多重投与量(multiple dose)で長期間投与される分割治療方法により投与できる。本発明の薬学的組成物は、疾患の程度によって有効成分の含量を異にすることができる。望ましいことに、本発明の薬学的組成物の望ましい全容量は、1日当たり患者体重1kg当たり約0.01μgないし1,000mg、最も望ましくは0.1μgないし500mgである。しかし、前記の薬学的組成物の用量は製剤化方法、投与経路及び治療回数だけでなく、患者の年齢、体重、健康状態、性別、疾患の重症度、食餌及び排泄率等、様々な要因を考慮して患者に対する有効投与量が決定されるものであるため、このような点を考慮するとき、当分野に通常の知識を有する者であれば、本発明の組成物の適切な有効投与量を決定することができる。本発明による薬学的組成物は、本発明の効果を示す限り、その剤形、投与経路及び投与方法に特に制限されない。
【００５２】
本発明は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む体力向上、運動能力向上、又は肉量増大用飼料添加用組成物を提供する。
また、本発明は肉荳蒄抽出物を有効成分として構成される体力向上、運動能力向上、又は肉量増大用飼料添加用組成物を提供する。
また、本発明は肉荳蒄抽出物を有効成分として必須に構成される体力向上、運動能力向上、または肉量増大用飼料添加用組成物を提供する。
【００５３】
本発明の用語“飼料”とは、動物が食べる任意の天然又は人工食、一食等又は一食の成分を意味し、本発明による体力又は運動能力向上用組成物を有効成分として含む飼料は、当業界に公知された多くの形態の飼料で製造可能であり、望ましくは濃厚飼料、組飼料及び／又は特殊飼料が含まれるがそれに限定されない。
【００５４】
本発明における用語、“飼料添加剤”とは、栄養素補充及び体重減少の予防、飼料内の繊維素の消化利用性の増進、乳質の改善、繁殖障害の予防及び受胎率の向上、夏季高温ストレス予防等、様々な効果を目的として飼料に添加する物質を含む。
【００５５】
本発明の飼料添加剤は、飼料管理法上の補助飼料に該当し、炭酸水素ナトリウム、ベントナイト(bentonite)、酸化マグネシウム、複合鉱物質などの鉱物質製剤、亜鉛、銅、コバルト、セレニウムなどの微量鉱物質であるミネラル製剤、ケロチン、ビタミンA、D、E、ニコチン酸、ビタミンB複合体などのビタミン剤、メチオニン、ライシンなどの保護アミノ酸剤、脂肪酸カルシウム塩等の保護脂肪酸剤、生菌剤(乳酸菌剤)、酵母培養物、黴醗酵物等の生菌、酵母剤などが追加して含められる。
【００５６】
濃厚飼料には、小麦、燕麦、玉蜀黍などの穀類を含む種子の実類、穀物を精製して得る副産物で、米糠、小麦ふすま、大麦糠などを含む、からめ、豆、菜種、ゴマ、亜麻仁、ココヤシなどを採油して得られる副産物であるエゴマ類とサツマイモ、ジャガイモなどから澱粉を除いた残りの澱粉残渣の主成分の残存澱粉質類などの残渣類、魚粉、魚類残渣、魚類から得た新鮮な抽出物を農畜させたもののフィッシュソルブル(fish soluble)、肉粉、血粉、羽毛粉、脱脂粉乳、牛乳からチーズ、脱脂乳からカゼインを製造する際の残液であるウェイ(whey)を乾燥させた乾燥ウェイなどの動物質飼料、酵母、クロレラ、海藻類があるが、それに限られない。
【００５７】
粗飼料には、野草、牧草、青刈りなどの生草飼料、飼料用かぶ、飼料用ビート、かぶの一種であるルーテルベアガーなどの根菜類、生草、青刈り作物、穀実などをサイロに詰めておいて乳酸発酵させた保存飼料であるサイリジ(silage)、野草、牧草を刈って乾燥させた乾草、種畜用作物の藁、豆と植物の葉があり、それに限られない。特殊飼料には牡蠣殻、岩塩などのミネラル飼料、尿素やその誘導体のジウレイドイソブタンなどの尿素飼料、天然飼料原料のみを配合した際に不足しがちな成分を補ったり、飼料の貯蔵性を高めるために配合飼料に微量添加する物質の飼料添加物、食餌補助剤があるが、それに制限されない。
【００５８】
本発明による前記飼料添加剤は、当業界に公知された数々の飼料の製造方法により、適切な有効濃度範囲で肉荳蒄抽出物を添加して製造可能である。
本発明による飼料添加剤は体力または運動能力向上、肉量増大を目的とする個体であれば制限なく適用できる。例えば、猿、犬、猫、兔、モルモット、ラット、マウス、牛、羊、豚、ヤギなどの非人間動物、鳥類および魚類など、いずれの個体にも適用可能である。
本発明の肉荳蒄抽出物はその効果が個体の年齢に限られないが、望ましくは成長が終了し、初期段階の老化が開始された中年層以上の個体に効果的であり、より望ましくは老年層以上に効果的である。
【００５９】
本発明の一実施例では粉砕肉荳蒄を利用してメタノール、熱水、エタノール抽出物を製造した。
本発明の他の一実施例では、肉荳蒄エタノール抽出物投与マウス群の体重を比較した結果、肉荳蒄抽出物がマウスの体重に影響を及ぼすことはなかった。
本発明の他の一例では、肉荳蒄エタノール抽出物が筋肉細胞のグリコーゲン含量を効果的に増加させた。
【００６０】
本発明の他の一実施例では、肉荳蒄にエタノール抽出物を投与したマウスにロタロード試験を実施した結果，肉荳蒄抽出物を投与したマウス群が対照群と比較して運動能力及び持久力がはるかに上昇された。
【００６１】
本発明の他の一実施例では、肉荳蒄エタノール抽出物を投与したマウスにwire hang試験を実施した結果、肉荳蒄抽出物を投与したマウス群が対照群と比較して最も長らくぶら下がった時間が長く、肉荳蒄抽出物がマウスの筋力強化を通じて運動能力及び持久力を向上させることが確認できた。
【００６２】
本発明の他の一実施例では、肉荳蒄エタノール抽出物を投与したマウスにMorriswatermaze試験を実施結果、肉荳蒄抽出物を投与したマウスの受容速度が効果的に向上したことを確認した。
本発明の他の一実施例では、肉荳蒄エタノール抽出物を投与したマウスにNeurological deficit試験を実施した結果、肉荳蒄抽出物を投与したマウス群がrodから落ちる個体数が対照群より少なく、マウスの運動能力、即ち筋持久力向上に効果的であることを確認した。
【００６３】
本発明の他の一実施例では、肉荳蒄抽出物を投与したマウスの大腿部を分離して筋肉の体積を測定した結果、肉荳蒄抽出物投与群において大腿部の体積が著しく増加することを確認した。
【００６４】
本発明の他の一実施例では、肉荳蒄エタノール抽出物を投与したマウスにrotarod試験を行った結果、肉荳蒄抽出物を投与したマウス群がrotarodから落ちない時間が対照群より長く、マウスの運動能力、即ち筋持久力向上に効果的であることを確認した。
また、正常マウスとクレアチンを長期間投与したマウス、肉荳蒄エタノール抽出物を長期間投与したマウスの肝臓を摘出して観察した結果、クレアチンは肝臓毒性を誘発するが、肉荳蒄エタノール抽出物は肝臓毒性を誘発しないことを確認した。
【００６５】
したがって、本発明の組成物は筋力、筋持久力を増加させることにより体力又は運動能力向上効果を有し、それによって筋肉減少症治療、筋機能改善及び抗疲労効果を有する。前記の筋力、筋持久力増加効果は筋肉の種類を制限しない。
【００６６】
本発明は、体力または運動能力向上用製剤を製造するための肉荳蒄抽出物の用途を提供する。
本発明は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを特徴とする体力又は運動能力向上の方法を提供する。
【００６７】
本発明は、筋肉減少症の予防または改善用製剤を製造するための肉荳蒄抽出物の用途を提供する。
本発明は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む組成物の有効量をそれを必要とする個体に投与することを特徴とする筋肉減少症の予防又は治療方法を提供する。
本発明は、筋機能改善用製剤を製造するための肉荳蒄抽出物の用途を提供する。
【００６８】
本発明は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与することを特徴とする筋機能改善方法を提供する。
本発明は、抗疲労用製剤を製造するための肉荳蒄抽出物の用途を提供する。
本発明は、肉荳蒄抽出物を有効成分として含む組成物の有効量を、それを必要とする個体に投与することを特徴とする抗疲労方法を提供する。
【００６９】
本発明の前記“有効量”とは、個体に投与したとき、運動能力、筋肉減少症、筋機能、疲労の改善、治療、予防、検出、診断又は運動能力向上、筋機能改善、疲労及び筋肉減少症の抑制効果を示す量を意味し、前記の“個体”とは動物、望ましくは哺乳動物、特にヒトを含む動物でもあって、動物から由来した細胞、組織、器官等でもある。前記の個体は前記の効果が必要な患者(patient)でもある。
本発明の前記“治療”とは、運動能力低下、筋肉減少症、筋機能低下、疲労又はそれらの症状を改善させることを包括的に指称し、それは、このような疾患又は症状を治癒したり、実質的に予防したり、又は状態を改善させることを含むことができて、運動能力低下、筋肉減少症、筋機能低下、疲労から始まった一つの症状又は殆どの症状を緩和させたり、治癒したり、又は予防することを含むがそれに制限されない。
【００７０】
本発明の用語“〜を含む(comprising)”とは、“含有する”又は“特徴とする”と同様に用いられ、組成物又は方法において、言及されていない追加的成分要素又は方法の段階等を排除しない。用語“〜から構成される(consisting of)”とは、別途記載されていない追加的要素、段階又は成分などを除くことを意味する。用語“必須に構成される(essentially consisting of)”とは、組成物又は方法の範囲において、記載された成分要素又は段階と共にそれの基本的特性に実質的に影響を及ぼさない成分要素又は段階等を含めることを意味する。
【発明の効果】
【００７１】
本発明の肉荳蒄抽出物はリグナン系化合物を高含有しているだけでなく、摂取時運動能力向上、持久力向上、及び筋力向上効果が極めて優れていて、筋肉減少症の治療に効果があるだけでなく、体力または運動能力向上のための医薬品及び食品などに有用に利用できる。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】図１は、本発明の肉荳蒄抽出物を筋肉細胞に処理した結果現れるグリコーゲンの含量を示したものである。
【図２】図２は、本発明の肉荳蒄抽出物を投与したマウスの体重変化を表したものである。
【図３】図３は、運動性及び体力に対する肉荳蒄抽出物の効果を確認するために、rotarod試験した結果を示したグラフである。
【図４】図４は、運動性及び体力に対する肉荳蒄抽出物の効果を確認するために、rotarod試験した結果を示したグラフであり、より具体的に筋肉強化による運動能力を判別するために低速で回転するrodからマウスの運動能力及び持久力を確認した結果である。
【００７３】
【図５】図５は、運動性及び体力に対する肉荳蒄抽出物の効果を確認するために、rotarod試験した結果を示したグラフであり、より具体的には高速に回転するrodからマウスの運動能力及び持久力を確認した結果である。
【図６】図６は、肉荳蒄抽出物投与によるOld mouseの筋肉強化による運動能力向上効果を確認したWire hang試験結果を示したものである。
【図７】図７は、肉荳蒄抽出物投与によるマウスのモーリスウォーターメイズ試験を行い、水泳速度を測定したグラフである。
【図８】図８は、Oldマウス群のモーリスウォーターメイズ試験で水泳速度を測定した結果グラフである。
【００７４】
【図９】図９は、強制遊泳持久力試験結果で、マウスの最大水泳持続時間を示した結果グラフである。
【図１０】図１０は、young mouseに肉荳蒄抽出物を投与した結果、マウスの大腿部の体積変化を示した写真である。
【図１１】図１１は、old mouseに肉荳蒄抽出物を投与した結果、マウスの大腿部の体積変化を示した写真である。
【図１２ａ】図１２ａは、マウスに肉荳蒄抽出物を投与したマウスにrotarod試験した結果を示したグラフで、低速で回転するrodからマウス達の運動能力及び持久力を確認した結果である。
【図１２ｂ】図１２ｂは、正常マウスとクレアチンを長期間投与したマウスの肝臓を摘出して観察した写真である。
【００７５】
図面内＊:p<0.05;＊＊:p<0.01,＊＊＊:p<0.001でそれぞれ有意な差であることを示す。
図面内の略語は次を意味する:
Y: Young, O: old, V: vehicle; Y-V: Y-vehicle, Y-10: Y-10mg/kg, Y-30: Y-30mg/kg,Y-100: Y-100mg/kg. O-V: O-vehicle, O-10: O-10mg/kg, O-30: O-30mg/kg, O-100: O-100mg/kg
［発明の実施のための形態］
【００７６】
以下、本発明を詳細に説明する。
但し、下記実施例は本発明を例示するのみ、本発明の内容が下記実施例に限定するものではない。
【００７７】
実験準備。
1.植物材料
乾燥したミリスティカフラグランス(Myristica fragrans Houtt)はインドネシア・ジャカルタで採集し、慶煕大学校韓方薬材料および製造学科 (龍仁、大韓民国)のぺク・ナムイン博士によって同定された。証拠標本は延世大学校生命工学科に寄託した (ソウル、大韓民国)。
【００７８】
2.試験物質及び試験系
C57BL/6雄マウスを月齢によって3ヶ月(Young)12匹及び20ヶ月(Old)16匹で準備し、投与量は10、30、及び100mg/kg、bw/dayに設定した。
実験動物倫理規定に基づき、(株)ジェイシーパーマ実験動物倫理委員会により承認された (審議番号：17-M001)。
投与経路は臨床予定経路を適用し、投与回数及び期間は1回／日、7日／週、試験終了時まで投与した。
表１には本発明のin vivo実験のための試験群構成を記載している。
【００７９】
【表１】
2021520775.tif 000003
【００８０】
試験物質は肉荳蒄30％エタノール抽出物 (基礎科学支援研究院生物災難チーム)を使用し、賦形剤 (陰性対照群)はPolyethylenglycol400(PEG400)(SAMCHUN CHEMICALS、P0638)を使用した。
【００８１】
3.統計分析
統計分析はGraphPad Prism7を使用し、有意水準はp<0.05に設定した。投与濃度によって分類された各試験群の測定値は対照群比パーセントに換算し、平均値(M)と標準誤差平均(SEM)を試験結果として用いた。各群間の差はOne-Way又はTwo-Way ANOVAで統計学分析し、事後検定分析でNeuman Keuls Test又はTukey testを実施した。各群の差はOne-Way又はTwo-Way ANOVAにより統計学的分析を実施し、有意な結果が示されたら事後検定分析を実施し、各群の有意性を評価した。
【００８２】
実施例１:肉荳蒄抽出物の製造
1-1.肉荳蒄抽出物の製造
粉砕された肉荳蒄100gを各溶媒(表２参照)500mlに入れて2時間の間3回にわたって超音波抽出器を使用して各溶媒条件に対する抽出物を製造した。分離された抽出物は同一濃度に製造して使用し、ミリスティシン標準品はシグマ社（製品番号：M9237)で購入した。それぞれの肉荳蒄溶媒抽出物とミリスティシン標準品はMeOH-H2O(0-32min:63%MeOH、32-37min:63→100%MeOH)条件のHPLC［Optima Pak C18 column 4.6×250mm、5μm粒子サイズ、流速1ml/min、UV detection:260nm］を利用して分析し、それぞれの肉荳蒄抽出物のミリスティシン含量は表1に示した。
【００８３】
【表２】
2021520775.tif 000004
【００８４】
表２に示した通り、30％エタノール水溶液抽出物のミリスティシン含量が、他の条件の抽出物より平均 3倍程度少なく抽出されることが確認された。また、各条件の肉荳蒄溶媒抽出物をMeOH-H2O(0-35min:60%MeOH、35-60min:60→100%MeOH)条件のHPLC［OptimaPak_C18column4.6x250mm、5μm粒子の大きさ、流速1ml/min、UVdetection:205,280nm］を利用してネクタンドリンBの含量を分析した結果(表2参照)、30%エタノール水溶液抽出物からネクタンドリンBが最も多く抽出されていることがわかった。したがって、活性物質の量を最大にしながら毒性物質の含量を最少にする条件は、30％以下エタノール水溶液で肉荳蒄を抽出することが確認できた。
【００８５】
1-2.肉荳蒄から抽出された化合物の確認
前記実施例1の30%エタノール水溶液肉荳蒄抽出物からHPLCを利用して2,5-ビス-アリル-3,4-ジメチルテトラヒドロピューランリグナン系化合物を分離した。
その結果、テトラヒドロプログアイアシン(Tetrahydrofuroguaiacin)、サウサネチンジオール(Saucernetindiol)、ベルコシン(Verrucosin)、ネクタンドリンB(Nectandrin B)、ネクタンドリンA(Nectandrin A)、フラグランシンC1(Fragransin C1)の6つの化合物を分離した。
【００８６】
実施例 2:マウスの体重変化測定
投与前 (入手及び群分離時)と投与開始日から実験終了時まで毎日体重を測定した。陽性対照群としてクレアチン120mg/kgを投与した。
図2に示した通り、肉荳蒄抽出物投与群の体重変化は賦形剤対照群と似ており、このような体重変化は試験されたYoung(Y)とOld(O)の年齢代において同一に現れた。
投与20日目にすべての試験群において一時的体重減少が観察されたが、それは肉荳蒄抽出物への投与によるneurological deficit試験を行うため、一日前に食餌供給を中断した結果によるものと判断され、一時的体重減少は食餌再供給により体重が回復したことを示している。
【００８７】
実施例 3:筋肉細胞からグリコーゲンの含量測定(in vitro)
C2C12 Cellを25cm2 flaskにDulbecco's Modified Eagle's Mediumに10% fetal bovine serum、Penicillin-Streptomycin-Glutamine、50μlSodium Pyruvate を添加したGrowth mediumを使用してcellを放つ。６時間後に成長培地を換える。50-70% confluencyを維持してcellを培養した後、100X20mm Dishでsubcultureする。こときcellの濃度は1:13-15 dilutionする。6 well plate に2.5 x 105/6 well の濃度でcellをseedingする。90% confluencyされるとDulbecco's Modified's Mediumに2% Horse Serum, Penicillin-Glutamineを添加したdifferentiation mediumで培地を換える。24時間毎にdifferentiation mediumで培地を換える（5日間）顕微鏡でdifferentiation を確認する（分化してmyotube形成するかを確認）分化が完了した後抽出物又は地表物質を処理する。
【００８８】
Glycogen assay Kit(Biovision)を利用して細胞のグリコーゲン含量を測定した。
具体的には、培養液が除去されたC2C12筋肉細胞を冷たいPBSで2回洗浄した後、氷の上にプレートを載せ、well当たり 200μlの蒸留水を入れて掻き、ep-tubeに入れた後、ultrasonicatorでlysisさせる。96 well plateを用いてwell当たり肉荳蒄抽出物試料(10mg/kg/day、20mg/kg/day)と標準溶液それぞれ50μlとhydrolysis enzyme 2μlを共に分注して常温で30分間反応させる。30分の反応終了後、reaction mixtureを50μlずつ分注した後、遮光された常温で30分間反応させた後、570nmで吸光度を測定する。その結果を図１に示した。
その結果、図1に示した通り、肉荳蒄抽出物の処理により分化筋肉細胞においてグリコーゲンの含量が著しく増加したことが確認できた。それは本発明の肉荳蒄抽出物が運動持続能力を示す直接的根拠と言える。
【００８９】
実施例 4:ロタロード試験(Rotarod test)
試験に使用した装置は、SB Technology 社のrotarodを使用し、マウス用ロードが装着されたrotarodで4又は 4〜40rpmの速度で回転する固定モード及び加速モードで試験した。試験は、投与後7日の試験開始前日に試験する実験室で1時間適応させた後、固定された4rpmの条件で 1分間pre-trainingを実施した。この時、１分以内に落ちたマウスは再びロードに乗せ、計１分間ロードで訓練させた。試験開始前、30分以上試験環境に適応させた後に試験を実施し、マウス個体当たり 4〜40rpmの速度で回転する加速モードで 5分試験を実施した。そしてrodの上で落ちる瞬間の時間を記録した。
【００９０】
その結果、図３ないし図５に示した通り、肉荳蒄メタノール抽出物を処理することによってマウスの運動能力及び持久力がはるかに上昇したことが確認できた。
図３に示した通り、肉荳蒄抽出物を投与しなかったYoung及びOldマウスは4rpmで回転するrotarodにおいて、運動能力及び持久力が肉荳蒄抽出物を投与したYoung及びOldマウスに比べて著しく落ちる結果を示した。即ち、肉荳蒄抽出物を投与したYoung及びOldマウスは濃度依存的で、rotarodにおける経験がないにもかかわらず、肉荳蒄抽出物を投与しないマウスに比べて著しい運動能力及び持久力があることを示した。
【００９１】
図４に示した通り、肉荳蒄抽出物投与による筋肉強化に伴う運動能力を判別するために低速で回転するrodで実験物質投与の有無に関係なく、YoungとOldマウス全てが似たような運動能力を示す基準を取るために低速の4rpmで持続的に訓練を実施した。訓練を実施した 3日後、すべてのマウスの運動能力及び持久力が相違しない条件を確保したことを図４で確認できた（F(7,20)=0.8985,p=0.5265)。
【００９２】
図５に示した通り、加速モードのrotarodにおいて試験した結果、肉荳蒄抽出物投与によりYoungとOldマウス全てから濃度依存的に運動能力及び持久力が向上した(F(7,19)=4.3180,p=0.0052)。Youngマウスの場合、肉荳蒄抽出物投与による運動能力の向上及び持久力の増加が濃度依存的効果を示しているが、統計的有意性は見られなかった。(F(3,8)=0.5841,p=0.6421)。Oldマウスの場合は、肉荳蒄抽出物の濃度依存的効果が統計的有意性を示した(F(3,11)=10.79,p=0.0013)。
【００９３】
結論的に、30及び100mg/kg、bwを投与したOldマウスは、肉荳蒄抽出物非投与Oldマウスに比べてそれぞれ2.3倍、2.6倍の運動能力及び持久力が統計学的に有意に向上したことを示している(p<0.01)。10mg/kg、bw投与Oldマウスにおいても1.4倍の運動能力及び持久力の増加を示している。特に、肉荳蒄抽出物30及び100mg/kg、bwを投与したOldマウスの場合は、Youngマウスと似た運動能力及び持久力を見せていて、本発明肉荳蒄抽出物の運動能力及び持久力向上効果を確認した。
肉荳蒄抽出物は、Oldマウスにおいて統計的に有意な濃度依存的運動能力が向上した結果は、筋肉弱化による運動能力が減少したOld肉荳蒄の運動能力を回復させ、Youngマウスにおいて現れた運動能力と同じ効果があることを意味する。また、肉荳蒄抽出物はYoungマウスの運動能力を向上させた結果は正常状態の筋力を強化できることを示唆する。
【００９４】
実施例 5:Wire hang試験
試験は高さ25cmに設置された直径2mmのワイヤー(wire)を用いて試験した。それぞれのマウスをワイヤーに前脚だけ使って位置させ、落ちずにぶら下がっている時間を測定した。マウスがぶら下がってから落ちる時間を測定し、試験は最大120秒間実施した。このような方法でそれぞれのマウスを約20分間隔で 3回繰り返した。3回の試験の内で1番目と最も長くぶら下がった時間の平均値を各マウスの成績で結果を分析した。肉荳蒄抽出物投与群及び賦形剤対照群のすべてのYoungマウスは、強い前脚の筋肉によってワイヤを引きつけて後脚でワイヤを掴んで上がる行動を見せ、純粋な前脚だけの運動能力を評価するのに不適であったため、Oldマウスでのみ試験を実施した。又、陽性対照群としてマウスにクレアチン120mg/kg(creatine-120)を投与し、同一の条件で試験を実施した。
【００９５】
図６に示した通り、その結果、筋肉強化に伴う運動能力及び持久力の向上が統計的に有意に肉荳蒄抽出物投与濃度依存的にすべて増加することが示された(F(3,11)=4.555,p=0.0262)。肉荳蒄抽出物投与による筋肉強化による運動能力増強効果は10,30及び100mg/kg,bwでそれぞれ25%、58%及び97%増加し、100mg/kg,bw投与群では統計的に有意な増加効果を示した(p<0.05)。
【００９６】
又、陽性対照群(creatine-120)の結果と比較したとき、老化マウス群より効果があることを確認したが、肉荳蒄抽出物10mg/kgを投与した場合には運動機能改善効果が類似したものに示された。一方、肉荳蒄抽出物をそれぞれ30mg/kg、100mg/kgを投与した場合には、陽性対照群に比べて運動機能の改善に著しい効果を示すことが確認された。
【００９７】
このような結果により、肉荳蒄抽出物が老化または退化したOldマウスの前脚の筋肉を強化することができ、それによる運動能力および持久力を向上させることができることを意味し、このような効果は運動に関連した筋肉に非特異的に関与することを示唆する。
【００９８】
実施例 6: Morris water maze 試験
Morris water mazeは特徴のない内部表面を有する円形のプールで泳ぐマウスが見られる多くの外部標識が付着した壁のある部屋に位置させた。水迷路の水温は室温または21℃に合わせて、脱脂粉乳を混ぜて水迷路の表面を不透明にし、水迷路の水中に逃れ得らる唯一のプラットフォームを円形水迷路の 4つの四分面のうち1つに位置させた。水迷路試験はpretraining とプラットフォームが水面で確認可能なvisible version で試験した。Pretrainingは全てのマウスを60秒間プラットフォームが設置されていない水迷路で自由に泳がせて各マウスの水泳速度を運動能力の指標として活用した。
図７に示した通り、Youngマウスにおいては肉荳蒄抽出物投与と関係なく水泳速度がすべての群において一定の結果を表した Oldマウスでは、統計的に有意に濃度依存的に肉荳蒄抽出物投与による水泳速度が向上している傾向を示した(F(7,20)=6.647,p=0.0004)。
図８に示した通り、肉荳蒄抽出物を処理していないYoungマウスとOldマウスのみを別々に統計分析した場合も同じ傾向を示している(F(4,14)=10.23,p=0.0004)。
【００９９】
実施例 7: Neurological deficit試験
肉荳蒄抽出物の投与によるneurological deficitの有無を判断するために 6rpm=で固定されたrotarodを用いた。摂取した飲食物との相互作用を排除するために、すべての実験動物は18時間絶食させ、肉荳蒄抽出物を100,300及び1,000mg/kgを投与した後、0.5,1及び 2時間に1分間、rotarodから落ちる実験動物の個体数を記録した。
【０１００】
その結果、表３に示した通り、肉荳蒄抽出物1,000mg/kg、bwをYoungとOldマウスのそれぞれに投与して時間帯別に試験した結果、Youngマウスでは試験されたすべてのマウスが成功的にrotarodから離れなかった。
Oldマウスにおいては、試験物質投与後0.5と1時間ですべてのマウスが試験された条件から離れなかったが、2時間にでは1匹だけが条件に満足されなかった。
【０１０１】
【表３】
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【０１０２】
また、Neurologic deficit試験結果は、肉荳蒄抽出物投与による神経系に及ぼす影響がないことを意味する。このような事実は、肉荳蒄抽出物がneurological deficitを示すtoxic dose 50％のTD50値が1,000mg/kg、bw以上と推定され、同時にrotarod実験結果をもとにYoung又はの運動能力を示すための肉荳蒄の50％濃度で最低10〜30mg/kgと予測した場合、protective index(PI)値は最低34以上と判断され、非常に安全な物質であることを示唆する。
【０１０３】
実施例 8:強制遊泳持久力試験
強制遊泳持久力試験はJacobとMichudの方法(Jacob J, Michud G. Action of variouspharmacological agents on the exhaustion time and behavior of mice swimming at 20 degree C. I. Description of the technic. Actions of amphetamine, cocaine, caffeine, hexobarbital and merprobamate. Arch. Int. Pharmacodyn. Ther.(1961) 133:101)を修正して実施した。直径120cmの円形水槽に水を30cmの深さに満たし、水温は21±1℃に保った。各マウスの体重の５％程度の錘をマウスの尾に付着させ群別に3〜4匹ずつ水槽に同時に入れて試験しながら泳いで脱力するまでの時間を測定した。試験は5分の限られた時間内で行った。
【０１０４】
その結果、図９に示した通り、肉荳蒄抽出物を投与したYoungとOldマウスのどちらも濃度依存的に遊泳持久力が増加した傾向を示した。強制遊泳持久力試験の間、YoungマウスはOldマウスに比べて多くの活動量を見せ、Oldマウスに比べて不適切なfloating行動はほとんど観察されなかった。
【０１０５】
実施例 9:肉荳蒄抽出物の筋肉量増加効果
3ヶ月及び10ヶ月のC57BL/6マウスを表１に従いそれぞれ 3匹ずつ総8群に任意に分けて実験に用いた。
【０１０６】
実験群としては、30％エタノール抽出物を10mg/kg、30mg/kg、100mg/kgの 3つの濃度で 1日 1回ずつ計22日間一定の時間に投与した。このとき、，対照群には賦形剤のポリエチレングリコールを使用した。試験終了後，マウスの大腿部を分離して体積を測定した。
【０１０７】
その結果、図１０及び図１１に示した通り、対照群と比較して肉荳蒄抽出物を投与した群においてマウスの年齢と関係なく筋肉量及び体積が全体的に増加し、特にoldマウスにおいて筋肉増加効果が優れた。それにより、本発明の肉荳蒄抽出物が筋肉量を増加させ、運動能力および筋力向上効果が極めて優れていることを確認した。
【０１０８】
実施例10:ロタロード試験(Rotarod test)及び肝毒性確認
前記実施例 4と同様の条件と方法でrotarod試験を実施した。このとき陽性対照群としてクレアチン120mg/kg(creatine-120)を投与したマウスを利用した。具体的には、投与後7日の試験開始前日に試験する実験室で1時間適応させた後、固定された4rpmの条件で 1分間 pre-training を実施した。その時、１分以内に落ちたマウスは再びロードに乗せ、計１分間ロードで訓練させた。試験開始前、30分以上試験環境に適応させた後で試験を実施し、マウスの個体当たり 4〜40rpmの速度で回転する加速モードにおいて試験を実施した。そしてrodの上から落ちるまでの時間を記録した。
その結果も12aに示した通り、クレアチンを投与した場合と肉荳蒄抽出物10mg/kgを投与した場合は、運動改善効果が類似していることが示された。一方、肉荳蒄抽出物を30mg/kg、100mg/kgの濃度で投与した場合には、クレアチンを投与した場合に比べて運動改善効果が顕著に現れたことを確認することができた。
【０１０９】
次に、肉荳蒄抽出物が肝臓に及ぼす影響を確認するために次の通り実験を実施した。
3ヶ月齢マウスを適応期間後、それぞれクレアチン120mg/kgを22日間経口投与したグループ、肉荳蒄抽出物100mg/kgを22日間経口投与したグループ、22日間正常食のみで実施したグループに分けた。その次に各マウスを犠牲にして肝臓を摘出して観察した。
その結果図１２ｂに示した通り、クレアチン投与した場合には肝葉が大きくなっていることを確認でき、長期間服用時に肝毒性が発生することが確認できた。一方、肉荳蒄抽出物を投与した場合には肝葉が大きくならず、肝臓の形が正常マウスと同じく示めされた (データ未図示)。
ここで肉荳蒄抽出物は長期間の服用にも肝臓毒性が現れないことが確認できた。
【産業上の利用可能性】
【０１１０】
以上察した通り、本発明の肉荳蒄抽出物はリグナン系化合物を高含有しているだけでなく、摂取時の運動能力向上、持久力向上、及び筋力向上効果が極めて優れていて筋肉減少症治療に効果があるだけでなく、体力または運動能力向上のための医薬品及び食品などに有用に利用することができる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【国際調査報告】
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