(57)【要約】  本発明は、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合よりもＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を優先的に阻害する抗体を提供又は改良するために、抗ＶＥＧＦ抗体を改良する方法、及びこの方法により提供される抗体に関する。
2021508471.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＶＨドメインとＶＬドメインの同族ペアによって形成された抗原結合部位を含むＶＥＧＦに結合する抗体のＶＥＧＦＲ遮断選択性を改善する方法であって、前記抗体は、ＶＥＧＦ分子のＶＥＧＦ−Ｒ１結合領域及びＶＥＧＦ−Ｒ２結合領域と重複するＶＥＧＦのエピトープに結合し、前記方法が、
（ａ）ＶＥＧＦに結合する前記抗体の第１及び第２の抗原結合部位によって結合されたＶＥＧＦ二量体の複合体（ＶＥＧＦ二量体抗体複合体）の三次構造の分析を提供するステップと、
（ｂ）前記抗体の前記ＶＨドメイン又は前記ＶＬドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸残基を同定するステップであって、前記第１の抗原結合部位内のアミノ酸残基及び前記第２の抗原結合部位内のアミノ酸残基が、前記ＶＥＧＦ二量体抗原複合体において空間的に近接して配置されている、同定するステップと、
（ｃ）ステップｂ）で同定された前記少なくとも１つのアミノ酸残基を、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸で置換するステップと
を含む、方法。
【請求項２】
前記抗体が、配列番号０１のＶＨ及び配列番号０２のＶＬを特徴とする抗体と同じ又は重複するエピトープに結合する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記抗体が、ＶＥＧＦ−Ａ１２１の二量体上の立体配座エピトープに結合し、ＶＥＧＦ−Ａ１２１が、配列番号３６のアミノ酸配列を含み、前記エピトープが、
−  前記ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子の一方にアミノ酸Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｒ２３、Ｙ２５、Ｈ２７、Ｐ２８、Ｉ２９、Ｅ３０、Ｍ５５、Ｎ６２、Ｌ６６、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｃ１０２、Ｅ１０３、Ｃ１０４、Ｒ１０５及びＰ１０６、及び
−  前記ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子のもう一方にアミノ酸Ｅ３０、Ｋ４８、Ｍ８１及びＱ８７
を含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
より大きな側鎖体積を有する前記アミノ酸が、芳香族アミノ酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの置換されたアミノ酸残基が、前記抗体の重鎖可変ドメインに位置する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記少なくとも１つの置換されたアミノ酸残基が、前記抗体の重鎖ＣＤＲ内に位置する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記少なくとも１つの置換されたアミノ酸残基が、前記抗体のＨ−ＣＤＲ２内に位置する、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記置換された少なくとも１つのアミノ酸残基が、前記抗体の重鎖ＦＲ内に位置する、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記置換された少なくとも１つのアミノ酸残基が、前記抗体のＨ−ＦＲ３内に位置する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記抗体が、（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、（ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３とを含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記抗体が、配列番号０１を含むＶＨと、配列番号０２を含むＶＬとを含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法により提供されるＶＥＧＦに結合する抗体。
【請求項１３】
ＶＥＧＦに結合する抗体であって、ＶＥＧＦへの前記抗体の結合が、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法により提供されるＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害する、抗体。
【請求項１４】
請求項１〜１３の方法により提供される抗体をコードする単離された核酸。
【請求項１５】
請求項１４に記載の核酸を含む宿主細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合よりもＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を優先的に阻害する抗体を提供又は改良するために、抗ＶＥＧＦ抗体を改良する方法、及びこの方法により提供される抗体に関する。
【背景技術】
【０００２】
Avastin（登録商標）やLucentis（登録商標）などの臨床応用が承認されている抗ＶＥＧＦ抗体は、両方の受容体であるＶＥＧＦ−Ｒ１（ＦＬＴ−１、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ）及びＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１、胎児肝キナーゼ）へのＶＥＧＦ結合を阻害する。ＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２は密接に関連する受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＶＥＧＦ−Ｒ２が主にＶＥＧＦを介した血管新生の原因であると仮定されている一方で（Holash,J.et al.,Proc Natl Acad Sci U S A.2002 Aug 20;99(17):11393-8）、ＶＥＧＦ−Ｒ１は、例えば破骨細胞の分化において、血管新生とは関係のない他の重要な生物学的役割を有することが知られている（Aldridge,S.E.et al.,Biochem Biophys Res Commun.2005 Sep 30;335(3):793-8）。
【０００３】
ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を優先的に阻害するが、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害しないいくつかの抗ＶＥＧＦ抗体が報告されているが、まだ臨床的に成功していない（国際公開公報第２０００６４９４６号は「２Ｃ３」と呼ばれる抗体について記載し、国際公開公報第２００９０６０１９８号は「ｒ８４」と呼ばれる抗体について記載し、国際公開公報第２０１２０８９１７６号は「Ｌ３Ｈ６」と呼ばれる抗体について記載し、欧州特許第３００６４６５号は「ＨＦ２−１、ＨＦ２−５、ＨＦ２−９、及びＨＦ２−１１」と呼ばれる抗体について記載している）。ＶＥＧＦ−Ｒ１ではなくＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を遮断することにより、抗体は改善された安全性プロファイルを有し、抗ＶＥＧＦ療法に関連する通常の毒性関連の副作用を示さないと説明されている（Brekken,R.A.,et al.,Cancer Res.2000 Sep 15;60(18):5117-24;Sullivan,L.A.,et al.,PLoS One,2010 Aug 6;5(8):e12031）。
【０００４】
有望な臨床抗体候補を提供するために、抗ＶＥＧＦ抗体、特にＶＥＧＦＲ遮断選択性を改善する方法が必要である。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、ＶＨ及びＶＬドメインの同族ペアによって形成される抗原結合部位を含むＶＥＧＦに結合する抗体のＶＥＧＦＲ遮断選択性を改善する方法に関し、ここで、抗体は、ＶＥＧＦ分子のＶＥＧＦ−Ｒ１結合領域及びＶＥＧＦ−Ｒ２結合領域と重複するＶＥＧＦのエピトープに結合する。本発明の方法は、（ａ）ＶＥＧＦに結合する抗体の第１及び第２の抗原結合部位によって結合されたＶＥＧＦ二量体の複合体（ＶＥＧＦ二量体抗体複合体）の三次構造の分析を提供することと、（ｂ）抗体のＶＨドメイン又はＶＬドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸残基を同定することであって、第１の抗原結合部位内のアミノ酸残基及び第２の抗原結合部位内のアミノ酸残基が、ＶＥＧＦ二量体抗原複合体において空間的に近接して配置されている、同定することと、（ｃ）工程ｂ）で同定された少なくとも１つのアミノ酸残基を、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸で置換することとを含む。
【０００６】
本発明の方法を用いて、特定の抗ＶＥＧＦ抗体のＶＥＧＦＲ遮断選択性は、それらのアミノ酸配列、特に抗原結合に関与しない領域におけるいくつかの修飾により改善され得る。そのような抗体は、例えば、ＶＥＧＦ−Ｒ１を介したＶＥＧＦシグナル伝達の遮断により引き起こされる副作用を回避又は低減することにより、改善された安全性プロファイルを示す可能性がある。
【０００７】
一実施形態では、抗体はＶＥＧＦ−Ａ１２１の二量体上の立体配座エピトープに結合し、ここで、ＶＥＧＦ−Ａ１２１は配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ここで、エピトープは、ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子の一方にアミノ酸Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｒ２３、Ｙ２５、Ｈ２７、Ｐ２８、Ｉ２９、Ｅ３０、Ｍ５５、Ｎ６２、Ｌ６６、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｃ１０２、Ｅ１０３、Ｃ１０４、Ｒ１０５及びＰ１０６を含み、ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子のもう一方にアミノ酸Ｅ３０、Ｋ４８、Ｍ８１及びＱ８７を含む。一実施形態では、エピトープは、Ｘ線結晶学によって測定される。
【０００８】
一実施形態では、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸は、芳香族アミノ酸である。
【０００９】
一実施形態では、少なくとも１つの置換アミノ酸残基は、抗体の重鎖可変ドメインに位置する。
【００１０】
本発明の別の態様は、本発明の１つの方法によって提供されるＶＥＧＦに結合する抗体である。
【００１１】
本発明の別の態様はＶＥＧＦに結合する抗体であり、ＶＥＧＦへの抗体の結合は、本発明の方法により提供されるＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害する。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】ＶＥＧＦ−Ｒ１ドメイン２（赤）並びにＶＥＧＦ−Ｒ２ドメイン２及び３（青）と複合したＶＥＧＦ二量体（紫）の結晶構造を示す。
【図２】実施例２に記載される抗体Ｆａｂ断片（ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦ−Ｒ２／Ｒ１阻害ＥＬＩＳＡ）の存在下でのＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害を示す。
【図３】実施例３に従ってＸ線結晶学によって決定された、抗ＶＥＧＦ抗体ＶＥＧＦ−００８９と複合したＶＥＧＦ二量体（紫）の結晶構造を示す。赤い丸は、近接するＶＥＧＦ−００８９のＶＨドメインの領域を強調表示している。
【図４】実施例３に従ってＸ線結晶学により決定された、ＶＥＧＦ−Ａ１２１（配列番号３６）の二量体中のＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片により結合されたエピトープアミノ酸を示す。５Åの距離内でＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片と接触しているＶＥＧＦ−Ａ１２１分子の各々に含まれるアミノ酸位置は、黒で強調表示されている。
【図５】実施例３で測定された、ＶＥＧＦ−Ｒ１ドメイン２と複合したヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１−二量体とＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂと複合したヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１−二量体の結晶構造のオーバーレイを示す。
【図６】実施例３で測定された、ＶＥＧＦ−Ｒ２ドメイン２及び３と複合したヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１−二量体並びにＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂと複合したヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１−二量体の結晶構造のオーバーレイを示す。
【図７】実施例４に記載されている抗ＶＥＧＦ抗体（０．３４nM  ＶＥＧＦ）の存在下でのＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害を示す。
【図８】実施例４に記載されている抗ＶＥＧＦ抗体（０．７nM  ＶＥＧＦ）の存在下でのＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害を示す。
【図９】実施例４に記載されている抗ＶＥＧＦ抗体（０．３４nM  ＶＥＧＦ）の存在下でのＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害を示す。
【図１０】実施例４に記載されている抗ＶＥＧＦ抗体（０．７nM  ＶＥＧＦ）の存在下でのＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
１．定義
本明細書で別段の定義がない限り、本発明に関連して使用される科学用語及び技術用語は、当業者によって通常理解されている意味を有するものとする。さらに、文脈で特に必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含み、複数形の用語は単数形を含むものとする。本開示の方法及び技術は、一般的に、当技術分野で周知の従来の方法に従って実行される。一般的に、本明細書に記載されている生化学、酵素学、分子生物学、細胞生物学、微生物学、遺伝学、タンパク質及び核酸化学並びにハイブリダイゼーションに関連して使用される命名法は、当技術分野で周知であり、通常使用されているものである。
【００１４】
本明細書で別段の定義がない限り、「構成する（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ  ｏｆ）」という用語は、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という用語を含むものとする。
【００１５】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で使用され、モノクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及びそれらが所望の抗原結合活性を示す限り抗体断片を含むがこれらに限定されないさまざまな抗体構造を包含する。
【００１６】
無傷の抗体のパパイン消化により、各々が重鎖及び軽鎖可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）、並びに重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含有する「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片が生成される。したがって、「Ｆａｂ断片」という用語は、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖と、ＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖断片とを含む抗体断片を指す。
【００１７】
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。いくつかの実施形態において、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）法によって決定されるように、９５％又は９９％を超える純度に精製される。抗体純度の評価方法の概説については、例えば、Flatman et al.,J.Chromatogr.B 848:79-87(2007)を参照されたい。
【００１８】
「抗体断片」は、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の一部を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、二特異性抗体、線形抗体、一本鎖抗体分子（例えばｓｃＦｖ）、及び抗体断片から形成された多重特異性抗体が含まれるがこれらに限定されない。
【００１９】
「可変領域」又は「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖又は軽鎖のドメインを指す。ネイティブ抗体の重鎖及び軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）は一般的に類似の構造を持ち、各ドメインは４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む（例えば、Kindt et al.Kuby Immunology,6th ed.,W.H.Freeman and Co.,page 91(2007)を参照）。
【００２０】
本明細書で互換的に使用される「パラトープ」又は「抗原結合部位」は、抗原を認識して結合する抗体の一部を指す。抗原結合部位は、Ｆｖ領域の三次構造内で空間的に近接して配置されている、配置された抗体の重鎖及び軽鎖可変ドメインからのいくつかの個々のアミノ酸残基によって形成される。一実施形態では、抗原結合部位は、同族のＶＨ／ＶＬペアに含まれる６つのＣＤＲのセットとして定義される。
【００２１】
本明細書で使用される「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」という用語は、配列が超可変であり、かつ抗原接触残基を含有する抗体可変ドメインの各領域を指す。一般的に、抗体は、ＶＨドメインに３つ（ＣＤＲ−Ｈ１、ＣＤＲ−Ｈ２、ＣＤＲ−Ｈ３）及びＶＬドメインに３つ（ＣＤＲ−Ｌ１、ＣＤＲ−Ｌ２、ＣＤＲ−Ｌ３）の６つのＣＤＲを含む。特に明記しない限り、本明細書では、可変ドメイン内のＣＤＲ残基及び他の残基（例えばＦＲ残基）は、カバットナンバリングシステム（Kabat et al.,Sequences of Proteins of Immunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991）に従って番号が付けられている。
【００２２】
本明細書の目的のための「受容体ヒトフレームワーク」は、以下に定義されているように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークに由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。
【００２３】
本明細書で使用する「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、ＣＤＲ残基以外の可変ドメインアミノ酸残基を指す。可変ドメインのフレームワークは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４の４つのフレームワークドメインからなる。したがって、ＣＤＲ及びＦＲアミノ酸配列は、一般的に、（ａ）ＶＨドメイン：ＦＲ１−ＣＤＲ−Ｈ１−ＦＲ２−ＣＤＲ−Ｈ２−ＦＲ３−ＣＤＲ−Ｈ３−ＦＲ４、及び（ｂ）ＶＬドメイン：ＦＲ１−ＣＤＲ−Ｌ１−ＦＲ２−ＣＤＲ−Ｌ２−ＦＲ３−ＣＤＲ−Ｌ３−ＦＲ４の配列に現れる。
【００２４】
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、増殖因子のシスチンノットファミリーのホモ二量体メンバーである。本明細書で使用される「ＶＥＧＦ」という用語は、他に示さない限り、霊長類（例えばヒト）及びげっ歯類（例えばマウス及びラット）などの哺乳動物を含む、任意の脊椎動物起源の任意の天然ＶＥＧＦを指す。この用語は、「完全長」の未処理のＶＥＧＦだけでなく、細胞での処理の結果として生じるＶＥＧＦの任意の形態を包含する。この用語はまた、ＶＥＧＦの天然に存在する変異体、例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体を包含する。例示的なヒトＶＥＧＦのアミノ酸配列は、配列番号３３に示されている。本明細書で使用される「ＶＥＧＦ二量体」という用語は、２つの同一のＶＥＧＦ分子のホモ二量体を指す。ＶＥＧＦ二量体に結合される２つの同一の抗体分子によって形成される複合体は、本明細書では「ＶＥＧＦ二量体抗体複合体」と呼ばれる。
【００２５】
ＶＥＧＦ二量体抗体複合体に含まれる「第１及び第２の抗原結合部位」は、ＶＥＧＦ二量体抗体複合体に含まれる２つの抗体の各々のＶＨ／ＶＬペアに含まれる抗原結合部位を指す。例えば、ＶＥＧＦ二量体抗体複合体の２つの抗ＶＥＧＦ抗体の一方の抗原結合部位は「第１の抗原結合部位」であり、２つの抗ＶＥＧＦ抗体のもう一方の抗原結合部位は自動的に「第２の抗原結合部位」である。
【００２６】
ＶＥＧＦは、細胞表面のチロシンキナーゼ受容体（ＶＥＧＦ受容体、又は「ＶＥＧＦＲ」）に結合することにより細胞応答を刺激し、異なる部位、時間、及び程度ではあるが、二量化し、トランスリン酸化によって活性化される。ＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２は密接に関連する受容体型チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＶＥＧＦ−ＡはＶＥＧＦＲ−１に結合し（Ｆｌｔ−１）、ＶＥＧＦ−Ｒ１のドメイン２と相互作用し、ＶＥＧＦＲ−２に結合し（ＫＤＲ／Ｆｌｋ−１）、ＶＥＧＦ−Ｒ２のドメイン２及び３と相互作用する（図１を参照）。
【００２７】
本明細書で使用されるＶＥＧＦ分子又はＶＥＧＦ二量体の「ＶＥＧＦ−Ｒ１結合領域」及び「ＶＥＧＦ−Ｒ２結合領域」は、ＶＥＧＦ−Ｒ１のドメイン２又はＶＥＧＦ−Ｒ２のドメイン２又は３と相互作用するＶＥＧＦ上のアミノ酸を指す。
【００２８】
「抗ＶＥＧＦ抗体」及び「ＶＥＧＦに結合する抗体」という用語は、抗体がＶＥＧＦを標的化する際の診断及び／又は治療剤として有用であるように、十分な親和性でＶＥＧＦに結合することができる抗体を指す。一実施形態において、無関係の非ＶＥＧＦタンパク質に対する抗ＶＥＧＦ抗体の結合の程度は、例えば表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって測定されるように、ＶＥＧＦへの抗体の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、ＶＥＧＦに結合する抗体は、≦１nM、又は≦０．１５nMの解離定数（ＫＤ）を有する。抗体のＫＤが１μM以下の場合、抗体はＶＥＧＦに「特異的に結合」すると言われる。
【００２９】
「ＶＥＧＦＲ遮断選択性」は、ＶＥＧＦ二量体に結合したときにＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合よりもＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を優先的に阻害する抗ＶＥＧＦ抗体の特性を指す場合、略語として本明細書で使用される。ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を完全に遮断できるが、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を完全には遮断できない抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ−Ｒ１を介してではなくＶＥＧＦ−Ｒ２を介してＶＥＧＦシグナリングを選択的に遮断する、すなわち「ＶＥＧＦＲ遮断選択性」を示すと考えられる。
【００３０】
タンパク質の「三次構造」は、タンパク質の三次元形状である。三次構造は、１つ以上のタンパク質二次構造、タンパク質ドメインを有する単一のポリペプチド鎖「バックボーン」を示す。アミノ酸側鎖は、いくつかの方法で相互作用及び結合し得る。特定のタンパク質内の側鎖の相互作用と結合は、その三次構造を決定する。本明細書で使用される「ＶＥＧＦ二量体抗体複合体の三次構造」は、複合体の三次元形状を意味する。
【００３１】
ＶＥＧＦ二量体抗体複合体の三次構造内に「近接」して位置するアミノ酸残基は、その複合体の三次元形状においてそれらの距離が５Åまでであるように空間的に配置されている両方の抗ＶＥＧＦ抗体に由来するアミノ酸残基である。これは、それぞれの抗ＶＥＧＦ抗体の個々のドメインのアミノ酸配列、すなわちＶＨ又はＶＬにおいて、互いに隣接するアミノ酸を含まない。
【００３２】
「親和性」は、分子（例えば抗体）の単一の結合部位とその結合パートナー（例えば抗原）との間の非共有相互作用の合計の強さを指す。特に明記しない限り、本明細書で使用される「結合親和性」は、結合ペアのメンバー（例えば、抗体と抗原）間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのパートナーＹに対する親和性は、一般的に解離定数（ＫＤ）で表すことができる。親和性は、本明細書に記載されているものを含む、当技術分野で既知の通常の方法によって測定することができる。結合親和性を測定するための特定の説明的かつ例示的な実施形態は、本明細書に記載されている。
【００３３】
「エピトープ」という用語は、抗ＶＥＧＦ抗体が結合するタンパク質性又は非タンパク質性のいずれかの抗原上の部位を示す。エピトープは、連続したアミノ酸ストレッチ（線形エピトープ）から形成することができるか、又は例えば抗原の折りたたみにより、すなわちタンパク質性抗原の三次折りたたみにより、空間的に近接して来る非連続的なアミノ酸（立体配座エピトープ）から構成することができる。線形エピトープは、典型的にはタンパク質性抗原を変性剤に曝露した後も抗ＶＥＧＦ抗体によってなおも結合されるが、立体配座エピトープは、典型的には変性剤での処理により破壊される。エピトープは、独特の空間的立体配座で少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、又は８〜１０のアミノ酸を含む。
【００３４】
特定のエピトープに結合する抗体（すなわち、同じエピトープに結合する抗体）のスクリーニングは、例えば、限定ではないが、アラニンスキャニング、ペプチドブロット（Meth.Mol.Biol.248(2004)443-463を参照）、ペプチド切断分析、エピトープ切り出し、エピトープ抽出、抗原の化学修飾（Prot.Sci.9(2000)487-496を参照）、及びクロスブロッキング（“Antibodies”,Harlow and Lane(Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harb.,NYを参照）などの本技術分野で慣例的な方法を使用して行うことができる。
【００３５】
修飾補助プロファイリング（ＭＡＰ）としても知られる抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）により、ＶＥＧＦに特異的に結合する多数のモノクローナル抗体を、その多数のものから各抗体の化学的又は酵素的に修飾された抗原表面への結合プロファイルに基づいて、ビン化することを可能にする（例えば、米国特許第２００４／０１０１９２０号を参照）。各ビン内の抗体は同じエピトープに結合し、これは、別のビンによって表されるエピトープとは明らかに異なるか、又は部分的に重複している独自のエピトープであり得る。
【００３６】
また、競合的結合を使用して、抗体が参照抗ＶＥＧＦ抗体と同じＶＥＧＦのエピトープに結合するか、又は参照抗ＶＥＧＦ抗体との結合について競合するかを簡単に決定できる。例えば、参照抗ＶＥＧＦ抗体と「同じエピトープに結合する抗体」は、競合アッセイにおける参照抗ＶＥＧＦ抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおける抗体のその抗原への結合を５０％以上遮断する抗体を指す。また例えば、抗体が参照抗ＶＥＧＦ抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体は飽和条件下でＶＥＧＦに結合することができる。過剰の参照抗ＶＥＧＦ抗体を除去した後、問題の抗ＶＥＧＦ抗体がＶＥＧＦに結合する能力が評価される。抗ＶＥＧＦ抗体が参照抗ＶＥＧＦ抗体の飽和結合後にＶＥＧＦに結合できる場合、問題の抗ＶＥＧＦ抗体は参照抗ＶＥＧＦ抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。しかし、問題の抗ＶＥＧＦ抗体が参照抗ＶＥＧＦ抗体の飽和結合後にＶＥＧＦに結合できない場合、問題の抗ＶＥＧＦ抗体は、参照抗ＶＥＧＦ抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。問題の抗体が同じエピトープに結合するか、又は立体的な理由により結合が妨げられているかを確認するには、慣例的な実験を使用できる（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリ又は当技術分野で利用可能なその他の定量的又は定性的抗体結合アッセイ）。このアッセイは、２つの設定、すなわち、両方の抗体が飽和抗体である状態で実行する必要がある。両方の設定で、最初の（飽和）抗体のみがＶＥＧＦに結合できる場合、問題の抗ＶＥＧＦ抗体と参照抗ＶＥＧＦ抗体がＶＥＧＦへの結合をめぐって競合すると結論付けることができる。
【００３７】
いくつかの実施形態では、一方の抗体の１、５、１０、２０、又は１００倍過剰が他方の結合を、競合結合アッセイで測定して少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、又はさらには９９％以上阻害する場合、２つの抗体は同じ又は重複するエピトープに結合すると見なされる（例えば、Junghans et al.,Cancer Res.50(1990)1495-1502を参照）。
【００３８】
一部の実施形態では、一方の抗体の結合を低減又は排除する抗原中の本質的にすべてのアミノ酸変異が他方の結合も低減又は排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合すると見なされる。一方の抗体の結合を低減又は排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を低減又は排除する場合、２つの抗体は「重複エピトープ」を有すると見なされる。
【００３９】
「単離された」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、通常は核酸分子を含有する細胞に含有される核酸分子を含むが、核酸分子は、染色体外に、又はその本来の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００４０】
抗体を「コードする単離された核酸」とは、単一のベクター又は別々のベクター中のそのような核酸分子、及び宿主細胞の１つ以上の場所に存在するそのような核酸分子を含む、抗体の重鎖及び軽鎖（又はその断片）をコードする１つ以上の核酸分子を指す。
【００４１】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが作動可能に連結されている核酸の発現を指示することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。
【００４２】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養」という用語は互換的に使用され、そのような細胞の子孫を含む、外因性核酸が導入された細胞を指す。宿主細胞には、「形質転換体」及び「形質転換細胞」が含まれ、継代数に関係なく、初代形質転換細胞及びそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞との核酸含量が完全に同一ではない場合があるが、突然変異を含んでいる場合がある。最初に形質転換された細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物活性を有する変異子孫が本明細書に含まれる。
【００４３】
アミノ酸は、通常の側鎖の特性に従って、（１）疎水性側鎖：ノルロイシン、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｉｌｅ（Ｉ）；非荷電親水性側鎖（当技術分野では「中性」親水性側鎖とも呼ばれる）：Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ｇｌｎ（Ｑ）；負に帯電した側鎖（当技術分野では「酸性」側鎖とも呼ばれる）：Ａｓｐ（Ｄ）、Ｇｌｕ（Ｅ）；正に帯電した側鎖（当技術分野では「塩基性」側鎖とも呼ばれる）：Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ａｒｇ（Ｒ）；芳香族側鎖：Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｐｈｅ（Ｆ）；及び鎖の向きに影響を与える残基を含む側鎖：Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｐｒｏ（Ｐ）のようにグループ化され得る。
【００４４】
アミノ酸修飾に言及する場合、「より大きな側鎖体積を有する」アミノ酸は、修飾される位置にある元のアミノ酸よりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸を指す。特定の実施形態では、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸は、トリプトファン、チロシン及びフェニルアラニンを含む芳香族アミノ酸である。
【００４５】
２．本発明の実施形態の詳細な説明
本発明は、ＶＨ及びＶＬドメインの同族ペアによって形成される抗原結合部位を含む、ＶＥＧＦに結合する抗体のＶＥＧＦＲ遮断選択性を改善する方法に関し、ここで、抗体は、ＶＥＧＦ分子のＶＥＧＦ−Ｒ１結合領域及びＶＥＧＦ−Ｒ２結合領域と重複するＶＥＧＦのエピトープに結合する。本発明の方法は、（ａ）ＶＥＧＦに結合する抗体の第１及び第２の抗原結合部位によって結合されたＶＥＧＦ二量体の複合体（ＶＥＧＦ二量体抗体複合体）の三次構造の分析を提供することと、（ｂ）抗体のＶＨドメイン又はＶＬドメインに位置する少なくとも１つのアミノ酸残基を同定することであって、第１の抗原結合部位内のアミノ酸残基及び第２の抗原結合部位内のアミノ酸残基が、ＶＥＧＦ二量体抗原複合体において空間的に近接して配置されている、同定することと、（ｃ）工程（ｂ）で同定された少なくとも１つのアミノ酸残基を、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸で置換することとを含む。本発明の方法を用いて、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合よりもＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を優先的に阻害する（ＶＥＧＦＲ遮断選択性）抗体が提供される。
【００４６】
本発明の方法は、ＶＥＧＦ分子中のＶＥＧＦ−Ｒ１結合領域及びＶＥＧＦ−Ｒ２結合領域と重複するＶＥＧＦのエピトープに結合する抗ＶＥＧＦ抗体を改良するためのものである。一実施形態では、このエピトープは、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ−Ｒ１に結合される場合、ＶＥＧＦ−Ｒ１のドメイン２と相互作用するアミノ酸を含む。一実施形態では、このエピトープは、ＶＥＧＦがＶＥＧＦ−Ｒ１に結合される場合、ＶＥＧＦ−Ｒ２のドメイン２及び３と相互作用するアミノ酸を含む。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号０１のＶＨ及び配列番号０２のＶＬ（本明細書に記載の抗体ＶＥＧＦ−００８９）によって特徴付けられる抗体が結合するエピトープと重複するエピトープに結合する。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｘ線結晶学によって測定されるように、本明細書に記載されている抗体ＶＥＧＦ−００８９と同じエピトープに結合する。一実施形態では、抗ＶＥＧＦ抗体は、実施例３に記載のＸ線結晶学によって測定されるように、本明細書に記載の抗体ＶＥＧＦ−００８９と同じエピトープに結合する。一実施形態では、エピトープはＶＥＧＦ−Ａ１２１の二量体内の立体配座エピトープであり、ここで、ＶＥＧＦ−Ａ１２１は配列番号３６のアミノ酸配列を含み、ここで、エピトープは、ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子の一方にアミノ酸Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｒ２３、Ｙ２５、Ｈ２７、Ｐ２８、Ｉ２９、Ｅ３０、Ｍ５５、Ｎ６２、Ｌ６６、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｃ１０２、Ｅ１０３、Ｃ１０４、Ｒ１０５及びＰ１０６を含み、ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子のもう一方にアミノ酸Ｅ３０、Ｋ４８、Ｍ８１及びＱ８７を含む。ナンバリングは、配列番号３６に示されているＶＥＧＦ−Ａ１２１のアミノ酸配列におけるアミノ酸の位置に基づいている（図４も参照）。
【００４７】
本発明の方法内で、ＶＥＧＦ二量体抗体複合体の三次構造の分析が提供される。三次構造は、当技術分野で既知の方法によって提供され得る。一実施形態では、三次構造は、例えば本明細書の実施例３に記載されているようなＸ線結晶学によって提供される。
【００４８】
本発明の方法において、抗体のＶＨドメイン及び/又はＶＬドメイン中のアミノ酸残基は、ＶＥＧＦ二量体抗体複合体内で近接していることが確認されている。一実施形態では、「近接」は、１０Å以下の距離を指す。一実施形態では、「近接」は、５Å以下の距離を指す。この少なくとも１つのアミノ酸残基は、修飾に適していると考えられる。
【００４９】
一実施形態では、工程（ｂ）で同定されるそのような少なくとも１つのアミノ酸残基は、抗体の重鎖可変ドメインに位置する。一実施形態では、工程（ｂ）で同定される少なくとも１つのアミノ酸残基は、抗体の重鎖ＣＤＲ内に位置する。一実施形態では、工程（ｂ）で同定される少なくとも１つのアミノ酸残基は、抗体のＨ−ＣＤＲ２内に位置する。一実施形態では、工程（ｂ）で同定される少なくとも１つのアミノ酸残基は、抗体の重鎖ＦＲ内に位置する。一実施形態では、工程（ｂ）で同定される少なくとも１つのアミノ酸残基は、抗体のＨ−ＦＲ３内に位置する。
【００５０】
本発明の方法において、そのようなアミノ酸残基は、改良されるべき抗ＶＥＧＦ抗体に含まれるアミノ酸残基よりも大きな側鎖体積を有するアミノ酸によって置換される。一実施形態では、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸は、芳香族アミノ酸である。一実施形態では、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸は、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、又はＰｈｅ（Ｆ）である。
【００５１】
一実施形態では、工程ａ）の抗ＶＥＧＦ抗体は、ヒトＶＥＧＦＡに結合する。一実施形態では、工程ａ）の抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号３３のヒトＶＥＧＦに結合する。
【００５２】
一態様では、本発明の方法によって改良された抗ＶＥＧＦ抗体は、（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、（ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と、（ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、（ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、（ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３とを含む。このＣＤＲアミノ酸配列のセットを含む１つの例示的な抗体は、本明細書で「ＶＥＧＦ−００８９」と呼ばれる抗体である。一実施形態では、この抗体は、配列番号０１を含むＶＨ及び配列番号０２を含むＶＬを特徴とする。
【００５３】
この態様の一実施形態では、工程（ｂ）で同定される少なくとも１つのアミノ酸残基は、抗体のＨ−ＣＤＲ２内に位置する。一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基は、カバット位置５２ａ、５２ｃ及び５４から選択される。一実施形態では、カバット位置５２ａ、５２ｃ及び５４の１つ、２つ又は３つのアミノ酸が修飾される。一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基は、カバット位置５２ａ、５２ｃ及び５４から選択され、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、又はＰｈｅ（Ｆ）での置換により修飾される。一実施形態では、工程ｃ）はＮ５２ａＳ、Ｇ５２ｃＰ及びＩ５４Ｆの置換の１つ以上を含む。
【００５４】
この態様の一実施形態では、工程（ｂ）で同定される少なくとも１つのアミノ酸残基は、抗体のＨ−ＦＲ３内に位置する。一実施形態では、少なくとも１つのアミノ酸残基はカバット位置７４である。一実施形態では、少なくともカバット位置７４のアミノ酸残基は、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、又はＰｈｅ（Ｆ）での置換により修飾される。一実施形態では、工程ｃ）は、置換Ｓ７４Ｗを含む。
【００５５】
本発明はまた、本発明の方法により提供される抗ＶＥＧＦ抗体に関する。本発明はさらに、抗ＶＥＧＦ抗体に関し、ＶＥＧＦへの抗体の結合は、本発明の方法により提供されるＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害することなく、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害する。一実施形態では、本発明の方法によって提供される抗体は、単離された抗体である。
【００５６】
そのような抗ＶＥＧＦ抗体は、例えば米国特許第４，８１６，５６７号に記載されているような当技術分野で既知の組換え法、例えば、実施例１に記載されているＨＥＫ２９３細胞などの真核細胞における組換え発現を用いて産生され得る。これらの方法のために、抗体をコードする１つ以上の単離された核酸が提供される。
【００５７】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、抗体断片である。一実施形態では、抗体断片は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、又はＦ（ａｂ’）２断片、特にＦａｂ断片である。
【００５８】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、全長抗体である。
【００５９】
一実施形態では、抗体はＩｇＧ１抗体である。
【００６０】
本発明はさらに、本発明の方法によって提供される抗ＶＥＧＦ抗体をコードする核酸に関する。本発明はさらに、本発明の核酸を含む宿主細胞に関する。
【００６１】
【表１】
2021508471.tif 000003
2021508471.tif 000004
2021508471.tif 000005
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2021508471.tif 000008
2021508471.tif 000009
【実施例】
【００６２】
以下の実施例は、本発明の理解を助けるために提供され、その真の範囲は、添付の特許請求の範囲に示される。本発明の精神から逸脱することなく、記載された手順に変更を加えることができることが理解される。
【００６３】
実施例１
ヒト抗ＶＥＧＦ抗体（抗体ＶＥＧＦ−００８９）の生成
ＶＥＧＦ−Ｒ１ドメイン２並びにＶＥＧＦ−Ｒ３ドメイン２及び３と複合したヒトＶＥＧＦ二量体の結晶構造のオーバーレイが図１に示されている。この重ね合わせは、両方のＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦ二量体の非常に類似した領域に結合すること、したがって、ＶＥＧＦ−Ｒ１とＶＥＧＦ−Ｒ２の両方の受容体へのＶＥＧＦ結合を同じように阻害しないＶＥＧＦに結合する抗体を生成することが非常に難しいように見えることを示している。これと一致して、当技術分野で既知の複数の抗ＶＥＧＦ抗体のうち、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合ではなくＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を選択的に遮断する抗体はわずかしか報告されていない。
【００６４】
本明細書に記載される抗体ＶＥＧＦ−００８９は、ＶＥＧＦ由来の抗原で免疫化するとヒト化抗体レパートリーを発現するＲｏｃｈｅ独自のトランスジェニックウサギに由来した。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックウサギは、国際公開公報第２０００／４６２５１号、第２００２／１２４３７号、第２００５／００７６９６号、第  ２００６／０４７３６７号、米国特許第２００７／００３３６６１号、及び国際公開公報第２００８／０２７９８６号に報告されている。動物は、ＡＡＡＬＡＣ認定の動物施設で付録Ａ「動物の宿泊と世話のガイドライン」に従って収容された。すべての動物の免疫化プロトコルと実験は、オーバーバイエルン州政府（許可番号５５．２−１−５４−２５３２−９０−１４）によって承認され、ドイツ動物福祉法と欧州議会及び理事会の指令２０１０／６３に従って実施された。
【００６５】
トランスジェニックウサギの免疫化
簡単に言うと、１２〜１６週齢のウサギ（ｎ＝３）を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）（自社製）に結合した組換えヒトＶＥＧＦ−１２１タンパク質で免疫した。すべての動物を、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）で乳化されたタンパク質４００μgで皮内投与により０日目に免疫し、続いて１、２、６、１１、１４週目にタンパク質エマルジョン２００μgによる交互の筋肉内注射及び皮下注射で免疫した。採血は、４回目の免疫化から免疫処置後４日目、５日目、及び６日目に行った。ＥＬＩＳＡによる免疫原特異的ウサギ及びヒト特異的免疫グロブリン力価測定のために血清を調製し、末梢単核細胞を分離してＢ細胞クローニングプロセスで抗原特異的Ｂ細胞の供給源として使用した。
【００６６】
トランスジェニックウサギからのＢ細胞クローニング
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の分離：免疫したウサギの血液サンプルを採取した。全血を含むＥＤＴＡを１×ＰＢＳ（ＰＡＡ）で２倍に希釈した後、ｌｙｍｐｈｏｌｙｔｅ  ｍａｍｍａｌ（Cedarlane Laboratories）を製造元の仕様に従って使用して密度遠心分離を行った。ＰＢＭＣを１×ＰＢＳで２回洗浄した。
【００６７】
ＥＬ−４  Ｂ５培地：１０％ＦＣＳ（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）、グルタミン ２mM、１％ペニシリン/ストレプトマイシン溶液（Ｇｉｂｃｏ）、ピルビン酸ナトリウム ２mM、ＨＥＰＥＳ １０mM（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）及びｂ−メルカプトエタノール ０．０５mM（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を追加したＲＰＭＩ  １６４０（Ｐａｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用した。
【００６８】
プレートのコーティング：滅菌細胞培養６ウェルプレートを、炭酸緩衝液（重炭酸ナトリウム ０.１Ｍ、二水素炭酸水素ナトリウム ３４mM、ｐＨ９．５５）中のＫＬＨ ２μg/mlで４℃で一晩コーティングした。使用前にプレートを滅菌ＰＢＳで３回洗浄した。
【００６９】
マクロファージ/単球又はヒトＦｃバインダーのディプリーション：ＰＢＭＣを無菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）に播種して、非特異的接着によりマクロファージと単球をディプリーションさせた。各ウェルに最大４mlの培地と免疫したウサギからのＰＢＭＣ最大６×１０ｅ６を入れ、インキュベータ内で３７℃で１時間結合させた。上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を、抗原パンニング工程に使用した。
【００７０】
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリ：抗ＩｇＧ  ＦＩＴＣ（ＡｂＤ  Ｓｅｒｏｔｅｃ）及び抗ｈｕＣｋ  ＰＥ（Ｄｉａｎｏｖａ）抗体を単一細胞のソーティングに使用した。表面染色のために、ディプリーションとエンリッチメントの工程からの細胞を、ＰＢＳ中の抗ＩｇＧ  ＦＩＴＣ及び抗ｈｕＣｋ  ＰＥ抗体とインキュベートし、暗所において４℃で４５分間インキュベートした。染色後、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳに再懸濁し、すぐにＦＡＣＳ分析にかけた。死細胞と生細胞を区別するために、ＦＡＣＳ分析の前に、濃度５μg/mlのヨウ化プロピジウム（ＢＤ  Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）を添加した。コンピュータとＦＡＣＳＤｉｖａソフトウェア（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を備えたＢｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  ＦＡＣＳＡｒｉａを使用して、単一細胞のソートを行った。
【００７１】
Ｂ細胞培養：ウサギＢ細胞の培養は、Seeber et al.(S Seeber et al.PLoS One 9(2),e86184.2014 Feb 04）に記載されている方法で行った。簡単に言えば、単一のソートされたウサギＢ細胞を、パンソルビン細胞（１：１０００００）（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ）、５％ウサギ胸腺細胞上清（ＭｉｃｒｏＣｏａｔ）、及びガンマ線を照射したマウスＥＬ−４  Ｂ５胸腺腫細胞（５×１０ｅ５細胞/ウェル）を含有するＥＬ−４  Ｂ５培地 ２００μl／ウェルと共に、９６ウェルプレートでインキュベータ内３７℃で７日間インキュベートした。Ｂ細胞培養の上清をスクリーニングのために除去し、残りの細胞をすぐに収集し、ＲＬＴ緩衝液 １００μl（Ｑｉａｇｅｎ）中で−８０℃で凍結させた。
【００７２】
抗体のＶドメインをコードするＲＮＡを単離した。抗体の組換え発現のために、ＶＨ又はＶＬをコードするＰＣＲ産物をｃＤＮＡとして発現ベクターにクローニングし、ＨＥＫ−２９３細胞に一過性に形質転換した。
【００７３】
スクリーニングから、配列番号０１のＶＨドメインと配列番号０２のＶＬドメインとを含む抗体が選択された。この抗体は、本明細書では、抗体「ＶＥＧＦ−００８９」とも呼ばれる。その後の分析のために、抗体ＶＥＧＦ−００８９は、ヒトＶＨ及びＶＬドメイン並びに軽鎖（ＣＬｋａｐｐａ）及び重鎖（ＣＨ１）のウサギ由来の定常ドメインを有するＦａｂ断片として生成された（本明細書では「ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片」又は単に「ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ」と呼ばれる）。ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片の重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１０である。ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片の軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１１である。
【００７４】
実施例２
生成されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体（抗体ＶＥＧＦ−００８９）の特徴
抗体ＶＥＧＦ−００８９のＦａｂ断片のＶＥＧＦ結合を、下記のように表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価した。
【００７５】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による抗体結合親和性の決定
抗Ｈｉｓ捕捉抗体（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ２８９９５０５６）を、標準のアミンカップリング化学を用いてシリーズＳセンサチップＣ１（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  ２９１０４９９０）に固定化し、５００〜１０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度を得た。ランニング及び希釈緩衝液として、ＨＢＳ−Ｐ＋（ＨＥＰＥＳ １０mM、ＮａＣｌ １５０mM、ｐＨ７．４、０．０５％Ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ  Ｐ２０）を使用し、測定温度をそれぞれ２５℃及び３７℃に設定した。ｈＶＥＧＦ−Ａ１２１は表面に捕捉され、５〜３５RUの範囲の捕捉レベルが得られた。抗ＶＥＧＦ抗体の希釈系列（０．３７〜３０nm）を１２０秒間注入し、解離を流速３０μl／分で少なくとも６００秒間監視した。表面は、グリシン １０mM、ｐＨ１．５を６０秒間注入することにより再生された。バルク屈折率の差は、ブランク注入を差し引くことにより、及び捕捉されたｈＶＥＧＦ−Ａ１２１なしの対照フローセルから得られた応答を差し引くことにより修正した。速度定数は、Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェア内のＬａｎｇｍｕｉｒ  １：１結合モデルを使用して計算した。
【００７６】
その結果、ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片のＫＤは、１３４pM（温度２５℃）であると決定された。
【００７７】
抗体のさらなる特徴付けのために、ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片の存在下でのその受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害を、以下に記載するように評価した。
【００７８】
抗体Ｆａｂ断片の存在下でのＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害（ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦ−Ｒ２／Ｒ１阻害ＥＬＩＳＡ）
３８４ウェルのストレプトアビジンプレート（Ｎｕｎｃ／Ｍｉｃｒｏｃｏａｔ＃１１９７４９９８００１）を、ビオチン化ＶＥＧＦ−Ｒ１  ０．２５μg/ml又はビオチン化ＶＥＧＦ−Ｒ２ ０．５μg/ml（社内生産、ＤＰＢＳ（１×）中各２５μl／ウェル）（ＰＡＮ、＃Ｐ０４−３６５００））でコーティングした。プレートを室温で１時間インキュベートした。並行して、濃度０．７nmのＶＥＧＦ−１２１−Ｈｉｓ（自社生産）をさまざまな希釈（５００nmの濃度から始めて１２×１：２希釈段階）で抗体とインキュベートした。このプレインキュベーション工程は、３８４ウェルＰＰプレート（Ｗｅｉｄｍａｎｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、＃２３４９０−１０１）で１×ＯＳＥＰ緩衝液（ビデスト水、１０×、Ｒｏｃｈｅ、＃１１  ６６６  ７８９  ００１＋０．５％ウシ血清アルブミン画分Ｖ、無脂肪酸、Ｒｏｃｈｅ、＃１０  ７３５  ０８６  ００１＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）中で行った。プレートを室温で１時間インキュベートした。ＶＥＧＦ−Ｒ１／ＶＥＧＦ−Ｒ２でコーティングしたストレプトアビジンプレートをＰＢＳＴ緩衝液 ９０μl／ウェル（ビデスト水、１０×ＰＢＳ  Ｒｏｃｈｅ＃１１６６６７８９００１＋０．１％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で３回洗浄した後、ＶＥＧＦ抗体プレインキュベーションプレートからのサンプル２５μlを、コーティングしたストレプトアビジンプレートに移し、その後室温で１時間インキュベートした。ＰＢＳＴ緩衝液 ９０μl／ウェルで３回洗浄した後、１×ＯＳＥＰ中の検出抗体 ２５μl／ウェル（抗Ｈｉｓ  ＰＯＤ、Ｂｅｔｈｙｌ、＃Ａ１９０−１１４Ｐ、１：１２０００）に加えた。室温で１時間インキュベートした後、プレートをＰＢＳＴ緩衝液 ９０μlで３回洗浄した。ＴＭＢ ２５μl（Ｒｏｃｈｅ、＃１１  ８３５  ０３３  ００１）をすべてのウェルに同時に加えた。室温で１０分間インキュベートした後、Ｔｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２リーダーの３７０nm／４９２nmで信号が検出された。
【００７９】
診療所で使用される先行技術の抗ＶＥＧＦ抗体の対照及び代表として、Lucentis（登録商標）（ラニビズマブ、配列番号３４の重鎖アミノ酸配列、配列番号３５の軽鎖アミノ酸配列）を同じ条件下で評価した。結果は図２に示されている。
【００８０】
結果は、ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片がＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を完全に遮断できることを示す。ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片は、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を完全には遮断しなかった。その結果、ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片は、ＶＥＧＦ−Ｒ１を介さずにＶＥＧＦ−Ｒ２を介してＶＥＧＦシグナル伝達を選択的にブロックすると考えられる。図２に示されているように、先行技術の抗体Lucentis（登録商標）は、ＶＥＧＦ−Ｒ２とＶＥＧＦ−Ｒ１の両方の受容体へのＶＥＧＦ結合を完全に遮断できる。
【００８１】
実施例３
ＶＥＧＦ二量体と複合した抗体ＶＥＧＦ−００８９のＸ線結晶学及びエピトープ決定
上記のようなＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片の結晶構造を、当該分野で既知の標準的な方法に従って分析した。
【００８２】
ＶＥＧＦ−Ａ１２１と複合したＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片のＸ線結晶学は、次のように行った。
二量体複合体ＶＥＧＦ−Ａ１２１−ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂの複合体形成及び精製複合体形成のために、ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片とヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１．１：１のモル比で混合した。４℃で一晩１６時間インキュベートした後、ＭＥＳ ２０mM、ＮａＣｌ １５０mM、ｐＨ６．５のＳｕｐｅｒｄｅｘ２００（１６／６００）カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーにより複合体を精製した。二量体複合体を含有する画分をプールし、１．４４mg/mlに濃縮した。
【００８３】
二量体ＶＥＧＦ−Ａ１２１−ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ複合体の結晶化最初の結晶化試験は、２１℃、タンパク質濃度１１．５mg/mlのシッティングドロップ蒸気拡散セットアップで実行した。結晶は、０．１M  Ｔｒｉｓ  ｐＨ８．５、０．２M  ＬｉＳＯ４、１．２６M（ＮＨ４）２ＳＯ４から１日以内に現れた。板状の結晶は、１週間で最終サイズ１５０×１００×３０μｍまで成長した。結晶は、さらに最適化することなく、スクリーニングプレートから直接採取した。
【００８４】
データ収集と構造決定データ収集のために、結晶を、凍結防止剤として１５％エチレングリコールを添加した沈殿剤溶液中で１００Ｋでフラッシュ冷却した。回折データは、Ｓｗｉｓｓ  Ｌｉｇｈｔ  Ｓｏｕｒｃｅ（Ｖｉｌｌｉｇｅｎ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のビームラインＸ１０ＳＡでＰＩＬＡＴＵＳ  ６Ｍ検出器を使用して、１．００００Åの波長で収集した。データをＸＤＳ（Kabsch, W.Acta Cryst.D66, 133-144(2010)）で処理し、ＳＡＤＡＢＳ（ＢＲＵＫＥＲ）でスケーリングした。結晶は空間グループＣ２に属し、セル軸はａ＝２２７．６１Å、ｂ＝６６．９７Å、ｃ＝２１８．３１Å、β＝１０４．５４°であり、２．１７Åの分解能で回折した。構造は、ＰＨＡＳＥＲ（McCoy, AJ, Grosse-Kunstleve, RW, Adams, PD, Storoni, L.C.,and Read, RJJAppl.Cryst.40, 658-674(2007)）の分子置換を使用し、検索モデルとしてＦａｂ断片及びＶＥＧＦの関連するインハウス構造の座標を使用して決定した。プログラムは、ＣＣＰ４スイート（Collaborative Computational Project,Number 4 Acta Cryst.D50,760-763(1994))and Buster(Bricogne,G.,Blanc,E.,Brandl,M.,Flensburg,C.,Keller,P.,Paciorek,W.,Roversi,P.,Sharff,A.,Smart,O.S.,Vonrhein,C.,Womack,T.O.(2011)からのものであった。その後のデータの精密化には、Ｂｕｓｔｅｒ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．９．５  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ：（Ｇｌｏｂａｌ  Ｐｈａｓｉｎｇ  Ｌｔｄ）を使用した。異なる電子密度を使用したタンパク質の手動再構築は、ＣＯＯＴ（Emsley,P.,Lohkamp,B.,Scott,W.G.and Cowtan,K.Acta Cryst D66,486-501(2010)）を使用して行った。両方の構造のデータ収集及び精密化の統計を次の表にまとめる。すべてのグラフィックプレゼンテーションはＰＹＭＯＬ（DeLano Scientific,Palo Alto,CA,2002）で準備した。
【００８５】
【表２】
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【００８６】
ヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１二量体と複合した２つのＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片の結晶構造の模式図が図３に示されている。抗体ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片と５Å以内の距離で接触しているＶＥＧＦ−Ａ１２１二量体のアミノ酸残基は、ＶＥＧＦ−Ａ１２１二量体上のＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂによって結合された立体配座エピトープを形成する。ＶＥＧＦ−Ａ１２１のアミノ酸配列は、配列番号３６である。ＶＥＧＦ二量体内の両方のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子のエピトープに含まれるアミノ酸の図が図４に強調表示されている。
【００８７】
抗体ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂは、
−ＶＥＧＦ二量体アミノ酸Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｒ２３、Ｙ２５、Ｈ２７、Ｐ２８、Ｉ２９、Ｅ３０、Ｍ５５、Ｎ６２、Ｌ６６、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｃ１０２、Ｅ１０３、Ｃ１０４、Ｒ１０５及びＰ１０６内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子の一方、並びに
−ＶＥＧＦ二量体アミノ酸Ｅ３０、Ｋ４８、Ｍ８１及びＱ８７内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子のもう一方
でＶＥＧＦ−Ａ１２１二量体上のエピトープに結合する。
【００８８】
ＶＥＧＦ−Ｒ１ドメイン２並びにＶＥＧＦ−Ｒ３ドメイン２及び３と複合したヒトＶＥＧＦ二量体の結晶構造のオーバーレイが図１に示されている。この重ね合わせは、両方のＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦ二量体上の非常に類似した領域に結合することを示す。
【００８９】
ＶＥＧＦ−Ｒ１ドメイン２と複合し、ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片と複合したヒトＶＥＧＦ二量体の結晶構造のオーバーレイが図５に示されている。この重ね合わせは、本発明のＶＥＧＦ−００８９抗体の軽鎖がＶＥＧＦ−Ｒ１のドメイン２と重なることを示す。ＶＥＧＦ−Ｒ２ドメイン２及び３と複合し、ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ断片と複合したヒトＶＥＧＦ二量体の結晶構造のオーバーレイが図６に示されている。この重ね合わせは、本発明のＶＥＧＦ−００８９抗体の軽鎖がＶＥＧＦ−Ｒ２のドメイン２と重なることを示す。
【００９０】
その結果、Ｘ線データは、ＶＥＧＦ−００８９抗体が結合するエピトープが、ＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２に結合するＶＥＧＦの領域と重複することを示している。得られた構造情報から、ＶＥＧＦへのＶＥＧＦ−００８９抗体の結合が、ＶＥＧＦへのＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２の両方の結合における同様の阻害をもたらすことが予想される。これは驚くべきことに、上記の実施例２と図２で示されているケースではない。それどころか、抗体ＶＥＧＦ−００８９は、ＶＥＧＦのＶＥＧＦ−Ｒ１への結合よりもむしろＶＥＧＦのＶＥＧＦ−Ｒ２への結合を優先的に阻害する。
【００９１】
この理論に拘束されることなく、この観察は、２つの受容体であるＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２に対するＶＥＧＦの異なる親和性に起因している可能性がある。ＶＥＧＦ−Ｒ１は強い親和性でＶＥＧＦに結合されることが知られているが、ＶＥＧＦ−Ｒ２は弱い親和性でＶＥＧＦに結合されることが知られている。ＶＥＧＦは二量体形態で存在するため、ＶＥＧＦ二量体に結合された抗体分子の数が、ＶＥＧＦ−Ｒ１への結合に影響を与えると考えられている。１つの抗体分子のみがＶＥＧＦ二量体に結合している場合、低親和性受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２への結合が阻害される一方で、ＶＥＧＦ二量体は依然として高親和性受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１に結合することができると考えられている。
【００９２】
実施例４
ＶＥＧＦ−００８９の改良型変異体の提供
実施例３に記載の理論に基づいて、２つの抗体分子ではなく優先的に１つの抗体分子のみがＶＥＧＦ二量体に同時に結合できることを促進するために、ＶＥＧＦ−００８９抗体を改変した。図３に示すＶＥＧＦ二量体抗体複合体の三次構造から、抗体のＶＨドメイン内の２つの領域、すなわちＨ−ＣＤＲ２とＨ−ＦＲ３が、互いに空間的に近接していることがわかる。ＶＥＧＦ二量体への２つの抗体分子の同時結合を回避するために、この領域のより小さな側鎖体積を有するアミノ酸を置換するためにより大きなアミノ酸を使用するアミノ酸置換によって、これらの領域を改変した。実施例では、芳香族アミノ酸を使用して、元のＶＥＧＦ−００８９アミノ酸配列に含まれるアミノ酸を置換した。理論は、この場合２つの抗体分子のＶＥＧＦ二量体への結合が立体的に妨げられ、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合ではなく、ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の観察される優先的阻害がさらに顕著になるというものであった。
【００９３】
この理論に基づいて、抗体ＶＥＧＦ−００８９の以下の抗体変異体が生成された。候補抗体ＶＥＧＦ−００１３、ＶＥＧＦ−００１４、ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＤ８６７５、ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２０及びＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２１は、Ｈ−ＣＤＲ２、Ｈ−ＦＲ３又はその両方に芳香族アミノ酸残基によるアミノ酸置換を含む。列挙された対照抗体は、ＶＥＧＦＲ遮断選択性に影響を及ぼさないか、又は有害な影響を与えるとさえ予想されたアミノ酸置換を含む。
【００９４】
【表３】
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【００９５】
抗体のＦａｂ断片は、実施例１に記載されるようにクローン化され、発現された。重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列は表２に示されている。
【００９６】
【表４】
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【００９７】
実施例４
ＶＥＧＦ−００８９の改良型変異体のＶＥＧＦＲ遮断選択性
改良された抗体Ｆａｂ断片の存在下でのＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦの結合を、実施例２に記載されるように試験した。表２に列挙されているすべての抗体Ｆａｂ断片を試験した。結果は図７〜図１０に示されている。
【００９８】
実施例５
ＶＥＧＦ−００８９の改良型変異体のＶＥＧＦ結合親和性
抗体の親和性を、実施例２に記載されている方法と同じ方法を使用してＳＰＲによって決定した。表２に列挙されているすべての抗体Ｆａｂ断片を試験した。結果は表３に示されている。
【００９９】
【表５】
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【０１００】
実施例６
ＶＥＧＦ−００８９の改良型変異体の化学的安定性
改良された抗体Ｆａｂ断片の化学的安定性を以下のように試験した。
【０１０１】
化学分解試験：
抗体サンプルをＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ ２０mM、ＮａＣｌ １４０mM、ｐＨ６．０で調合し、３つのアリコートに分け、１つのアリコートはそれぞれＰＢＳに再緩衝し、２つのアリコートは元の調合のままにした。ＰＢＳアリコートと１つのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌアリコートを１mg/mlで４０℃（Ｈｉｓ／ＮａＣｌ）又は３７℃（ＰＢＳ）で２週間（２ｗ）インキュベートし、ＰＢＳサンプルは合計４週間（４ｗ）までさらにインキュベートした。３つ目の対照アリコートサンプルは−８０℃で保存した。インキュベーションが終了した後、サンプルを相対的な活性濃度（Ｂｉａｃｏｒｅ；各バインダーの両方のストレスを加えたアリコートの活性濃度をストレスのない４℃のアリコートに正規化）、凝集（ＳＥＣ）及び断片化（キャピラリー電気泳動又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ）について分析し、未処理の対照と比較した。
【０１０２】
サイズ排除ＵＨＰＬＣ（＝ＳＥＣ）の場合、ＴＳＫｇｅｌ  ＵＰ−ＳＷ３０００などのクロマトグラフィーゲルを使用して、溶液中の分子サイズに応じてタンパク質を分離した。この方法では、タンパク質溶液を、モノマー、高分子種（凝集体、二量体、不純物など）及び低分子種（分解生成物、不純物など）の相対含有量に関して分析した。リン酸カリウム ０．２Ｍ、ＫＣｌ ０．２５Ｍ、ｐＨ６．２を移動相として使用した。約５０μのタンパク質を５μlの体積に注入するなどしてタンパク質溶液を希釈し、２５℃、流量０．３ml／分で分析した。タンパク質の検出は２８０nmで行った。ピーク定義とピーク積分は、製品固有の情報文書の典型的なクロマトグラムに示されているように実行した。
【０１０３】
表２に列挙されているすべての抗体Ｆａｂ断片を試験した。結果は表４及び表５に示されている。
【０１０４】
【表６】
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【０１０５】
【表７】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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