(57)【要約】  抗ＶＥＧＦ剤を使用する血管新生障害の治療のための方法および組成物が提供される。抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦ結合ドメインを含み、硝子体に結合する能力を有する。強力なヘパリン結合特性を有するＶＥＧＦ結合ドメインを有するＦＣ−ＩＧＧ融合タンパク質、分裂促進活性の強力な阻害、および改善された薬物動態、すなわち、抗ＶＥＧＦ剤のより長い半減期、および結果的により少ない投与頻度の例示的な実施形態が提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｆｃ−ＩｇＧに作動可能に連結されたＶＥＧＦ結合部分を含む抗ＶＥＧＦ剤であって、前記ＶＥＧＦ結合部分が、ＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン２である少なくとも１つのＶＥＧＦ結合ドメインを含み、前記抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れたＶＥＧＦ刺激有糸分裂阻害能力を有する、抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項２】
前記抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れた硝子体結合能力を有する、請求項１に記載の抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項３】
前記抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れた硝子体結合ＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖阻害能力を有する、請求項２に記載の抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項４】
前記薬剤が、アフリベルセプトと比較して、インビボで増加した半減期を有する、請求項３に記載の抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項５】
前記ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン１、２、および３（Ｖ1-2-3）からなる、請求項４に記載の抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項６】
前記抗ＶＥＧＦ剤が、配列番号１で定義されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項７】
前記ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン２および３（Ｖ2-3）からなる、請求項４に記載の抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項８】
前記抗ＶＥＧＦ剤が、配列番号３で定義されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項９】
前記ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン１、２、３、および３（Ｖ1-2-3-3）からなる、請求項４に記載の抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項１０】
前記抗ＶＥＧＦ剤が、配列番号５で定義されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項１１】
前記ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン２、３、および３（Ｖ2-3-3）からなる、請求項４に記載の抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項１２】
前記抗ＶＥＧＦ剤が、配列番号７で定義されるアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の抗ＶＥＧＦ剤。
【請求項１３】
治療有効量の、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ＶＥＧＦ剤および薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項１４】
治療を必要とする対象におけるＶＥＧＦ関連障害を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１〜１２のいずれかに記載の抗ＶＥＧＦ剤を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１５】
前記抗ＶＥＧＦ剤が、罹患組織または臓器に直接注射される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記罹患組織または臓器が、眼である、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＶＥＧＦ関連障害が、新生血管加齢性黄斑変性症、近視に続発する脈絡膜新生血管、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症などの網膜血管閉塞、眼腫瘍、フォンヒッペル・リンダウ症候群、未熟児網膜症、ポリープ状脈絡膜血管症、結腸直腸癌、肺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎臓癌、神経鞘腫、神経膠腫、上衣腫、および抗ＶＥＧＦ療法から恩恵を受ける腫瘍性または非腫瘍性障害を含む群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
治療を必要とする対象におけるＶＥＧＦ関連障害を治療する方法であって、治療有効量の、請求項１３に記載の医薬組成物を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
前記抗ＶＥＧＦ剤が、罹患組織または臓器に直接注射される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記罹患組織または臓器が、眼である、請求項２０に記載の方法。
【請求項２１】
前記ＶＥＧＦ関連障害が、新生血管加齢性黄斑変性症、近視に続発する脈絡膜新生血管、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症などの網膜血管閉塞、眼腫瘍、ポリープ状脈絡膜血管症、フォンヒッペル・リンダウ症候群、未熟児網膜症、結腸直腸癌、肺癌、子宮頸癌、卵巣癌、子宮内膜癌、腎臓癌、神経鞘腫、神経膠腫、上衣腫、および抗ＶＥＧＦ療法から恩恵を受ける腫瘍性または非腫瘍性障害を含む群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年１月２６日に提出された米国仮出願第６２／６２２，３８２号の優先権の利益を主張し、この出願は参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
【０００２】
本出願には、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出された配列表が含まれ、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０１９年１月２５日に作成された上記のＡＳＣＩＩコピーの名称は２４９７８−０４７０＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは５０，９６０バイトである。
【背景技術】
【０００３】
血管は、組織および臓器に栄養素を運び、異化産物を除去するため、新生血管供給または血管新生の発達は、重要な恒常性維持の役割を果たす1。しかしながら、血管の制御不能な成長は、腫瘍および眼内血管障害を含む多数の疾患プロセスを促進するか、または容易にする可能性がある1。いくつかの血管新生因子が最初に同定され、特徴付けられたが（例えば、ＥＧＦ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ａＦＧＦ、ｂＦＧＦ、アンジオゲニン）2、過去３０年間にわたって行われた研究は、正常および病的な血管新生におけるＶＥＧＦ−Ａ（以下、ＶＥＧＦ）の重要な役割を確立した3 4。ＶＥＧＦは、ＰｌＧＦ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、およびＶＥＧＦ−Ｄも含む遺伝子ファミリーのメンバーである。３つの関連する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）がＶＥＧＦリガンド：ＶＥＧＦＲ−１、ＶＥＧＦＲ−２、およびＶＥＧＦＲ−３に結合することが報告されている5。ＰｌＧＦおよびＶＥＧＦ−Ｂは、ＶＥＧＦＲ−１と選択的に相互作用し、ＶＥＧＦは、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の両方に結合する。このＲＴＫファミリーの第３のメンバーであるＶＥＧＦＲ−３6は、リンパ血管新生に関与しているＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄに結合する。このＲＴＫクラスの各メンバーは、細胞外部分に７つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインを有する7。ＶＥＧＦＲ−２がＶＥＧＦ5の主要なシグナル伝達受容体であると考えられている。しかしながら、ＶＥＧＦＲ−１は、ＶＥＧＦＲ−２よりも実質的に高い結合親和性でＶＥＧＦに結合する7。
【０００４】
ＶＥＧＦ阻害剤は、複数の腫瘍の標準的な治療法となり、重度の視力低下および法的盲の主な原因である、新生血管型の加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）、増殖性糖尿病性網膜症、および網膜静脈閉塞症などの眼内新生血管障害の治療に革命をもたらした8 4。現在、ベバシズマブ、ラニビズマブ、およびアフリベルセプトの３つの抗ＶＥＧＦ薬が、眼科的適応症に米国で広く使用されている4。ベバシズマブは、ＶＥＧＦを標的とする全長ＩｇＧ抗体である9。ベバシズマブは眼科的適応症用に開発されていないが、その低コストにより適応外で広く使用されている。ラニビズマブは、親和性成熟抗ＶＥＧＦ  Ｆａｂである10。アフリベルセプトは、ＩｇＧ−Ｆｃ融合タンパク質であり11 12、ＶＥＧＦ、ＰＩＧＦ、およびＶＥＧＦ−Ｂに結合するＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２からの要素を有する13。コンベルセプトは、構造的にアフリベルセプトに関連する可溶性ＶＥＧＦ受容体であり、中国で眼内新生血管の治療として広く使用されている14。世界中の何百万人もの患者がこれらの薬物で治療されている。重要なことに、ラニビズマブまたはベバシズマブで５年間治療した後、新生血管ＡＭＤ患者の約半数は良好な視力、すなわち視力２０／４０以上を示し、抗ＶＥＧＦ剤が利用可能になる前には到達できなかったであろう転帰である15。
【０００５】
しかしながら、実際の臨床設定では、多くの患者は臨床試験よりも少ない抗ＶＥＧＦ注射を受けており、これが視覚的転帰不良と相関している可能性があるとの仮説が立てられている16。実際、比較的頻繁な硝子体内注射を行う必要性が、特に一部の国では、患者のコンプライアンスを妨げ、最終的には療法の利点を妨げてきた16。したがって、眼に注射した場合に持続時間がより長い薬剤を開発し、結果として注射の頻度を減らす必要があり、この目的のために多くのアプローチが試みられてきた17、18。アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）は、２ｍｇの用量を８週間ごとに投与することにより、毎月のラニビズマブ（０．５ｍｇ）の有効性に匹敵する可能性があることを示す臨床試験に基づいて承認された。しかしながら、アフリベルセプトに切り替えることによって硝子体内注射の回数が減ると予測されているにもかかわらず、最近の研究ではそうではないことが示唆されている19。したがって、半減期が改善された硝子体内抗ＶＥＧＦ剤に対する未だ満たされていない医学的必要性が依然として残っている。
【０００６】
１９９６年、Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈら20（米国特許第５，９５２，１９９号も参照されたい）は、ＶＥＧＦＲ−１のドメイン（Ｄ）２がＶＥＧＦおよびＰＩＧＦの重要な結合要素であることを報告した。Ｄ２を削除すると、結合が完全に破壊された。ＶＥＧＦＲ−３のＤ２をＶＥＧＦＲ−１  Ｄ２で置き換えることにより、ＶＥＧＦＲ−３にＶＥＧＦＲ−１のリガンド特異性が付与された20。その後の研究は、Ｘ線結晶学によってＤ２とＶＥＧＦ（またはＰｌＧＦ）との間の相互作用を実証した21-23。
【０００７】
最初の研究は、Ｆｃ−ＩｇＧに融合したＶＥＧＦＲ−１の最初の３つのＩｇ様Ｄ（Ｆｌｔ−１−３−ＩｇＧ）を含む、完全なＶＥＧＦ結合特性を有する構築物の設計につながった20。Ｆｌｔ−１−３−ＩｇＧは、インビトロおよびインビボでＶＥＧＦを中和する強力な能力を示した24-27。しかしながら、この分子の全身半減期は、塩基性残基のクラスターの存在によりヘパリン親和性が大きく、さまざまな組織でＨＳＰＧへの結合をもたらすＤ３の存在によって妨げられた。２００２年、Ｈｏｌａｓｈら13（米国特許第７，０７０，９５９号）は、ＶＥＧＦＲ−１  Ｄ３と比較して非常に弱いヘパリン親和性を有する、ＶＥＧＦＲ−１  Ｄ２（結合要素）およびＶＥＧＦＲ２のＤ３から構成されるＩｇＧ融合構築物を説明した。現在アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡとして販売されている）として既知であるこの分子は、全身投与後のＦｌｔ−（１−３−ｌｇＧ）と比較して半減期が長いことが報告されており13、例えば、眼科的適応症を対象とした治療に明らかに有利である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、ＶＥＧＦの活性を阻害し、同時に強力なヘパリン結合特性を有し、それにより優れた薬物動態を提供する、すなわち、硝子体内投与後の治療薬の半減期がより長い抗ＶＥＧＦ剤を投与することを含む、血管新生を阻害するための、および加齢性黄斑変性症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、近視に続発する脈絡膜新生血管、未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、ポリープ状脈絡膜血管症を含むが、これらに限定されない眼疾患などのＶＥＧＦ関連状態を治療するための組成物および方法を提供する。
【０００９】
実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤の局所直接投与が有益である状態を治療する、例えば、内皮細胞増殖状態または血管新生を治療および予防する、例えば、限定されないが、膠芽腫における頭蓋内投与などの固形腫瘍を治療する組成物および方法を提供する。
【００１０】
実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤を提供し、この抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦ結合特性を有するドメインおよびヘパリンプロテオグリカンに結合するドメインを融合させるＦｃ−ＩｇＧ構築物である。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤を提供し、この抗ＶＥＧＦ剤は、ヘパリンに結合する能力を有し、ＶＥＧＦ結合特性を有する１つ以上のドメインを含有するＦｃ−ＩｇＧ構築物である。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤を提供し、この抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦおよびヘパリンへの結合について改善された効力を有する融合タンパク質である。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤を提供し、この抗ＶＥＧＦ剤は、内毒素レベルが非常に低い融合タンパク質である。
【００１１】
実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤を提供し、この抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦ受容体の要素を含むＩｇＧキメラタンパク質である。実施形態では、本発明は、ＩｇＧキメラタンパク質を提供し、このＩｇＧキメラタンパク質は、ＶＥＧＦチロシンキナーゼ受容体の細胞外部分に７つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインのうちの１つ以上の断片を含む。実施形態では、本発明は、ＩｇＧキメラタンパク質を提供し、このＩｇＧキメラタンパク質は、Ｆｃ−ＩｇＧと融合したＶＥＧＦＲ−１の１つ以上の細胞外ドメイン断片を含む。実施形態では、本発明は、少なくとも１つのＶＥＧＦ結合ドメインＶＥＧＦＲ−１ドメイン２および少なくとも１つの追加のＶＥＧＦＲ−１ドメイン１または３を含み、ドメイン４を含まないＩｇＧキメラタンパク質を提供する。実施形態では、本発明は、ＩｇＧキメラタンパク質を提供し、このＩｇＧキメラタンパク質は、Ｆｃ−ＩｇＧと融合したＶＥＧＦＲ−２の１つ以上の細胞外ドメイン断片を含む。実施形態では、本発明は、ＩｇＧキメラタンパク質を提供し、このＩｇＧキメラタンパク質は、Ｆｃ−ＩｇＧと融合したＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２の１つ以上の細胞外ドメイン断片を含む。
【００１２】
実施形態では、本発明は、Ｆｃ−ＩｇＧに作動可能に連結されたＶＥＧＦ結合部分を含む抗ＶＥＧＦ剤を提供し、このＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン２である少なくとも１つのＶＥＧＦ結合ドメインを含み、この抗ＶＥＧＦ剤は、アフリベルセプトよりも優れたＶＥＧＦ刺激有糸分裂阻害能力を有する。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れた硝子体結合能力を有することを提供する。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れた硝子体結合ＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖阻害能力を有することを提供する。実施形態では、本発明は、薬剤が、アフリベルセプトと比較して、インビボで増加した半減期を有することを提供する。
【００１３】
実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン１、２、および３（Ｖ1-2-3）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号１で定義されるアミノ酸配列を含む。
【００１４】
実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン２および３（Ｖ2-3）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号３で定義されるアミノ酸配列を含む。
【００１５】
実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン１、２、３、および３（Ｖ1-2-3-3）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号５で定義されるアミノ酸配列を含む。
【００１６】
実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン２、３、および３（Ｖ2-3-3）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号７で定義されるアミノ酸配列を含む。
【００１７】
実施形態では、本発明は、治療有効量の、特許請求の範囲に定義される抗ＶＥＧＦ剤および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。実施形態では、本発明は、治療有効量の、定義される抗ＶＥＧＦ剤を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象におけるＶＥＧＦ関連障害を治療する方法を提供する。抗ＶＥＧＦ剤は、眼などの罹患組織または臓器に直接注射することができる。
【００１８】
実施形態では、本発明は、眼疾患を治療するための方法を提供し、抗ＶＥＧＦ剤は、ＶＥＧＦと比較して２：１のモル比に対応する投薬量で眼に局所的に投与される。実施形態では、本発明は、眼疾患を治療するための方法を提供し、抗ＶＥＧＦ剤は、硝子体内注射によって投与される。実施形態では、本発明は、眼疾患を治療するための方法を提供し、抗ＶＥＧＦ剤は、４〜６週間ごとに投与され、他の実施形態では、治療は少なくとも１年間継続される。
【００１９】
一実施形態によれば、本発明は、治療有効量の抗ＶＥＧＦ剤を眼に局所的に投与することを含む、眼疾患を治療するための方法を提供し、治療は、潜在型（ｏｃｃｕｌｔ）、古典的最小型（ｍｉｎｉｍａｌｌｙ  ｃｌａｓｓｉｃ）、および古典的優性型（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ  ｃｌａｓｓｉｃ）の滲出型黄斑変性症の治療に有効であり、薬剤は融合タンパク質である。
【００２０】
実施形態では、本発明を使用して、新生血管加齢性黄斑変性症、近視に続発する脈絡膜新生血管、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症などの網膜血管閉塞、眼腫瘍、フォンヒッペル・リンダウ症候群、未熟児網膜症、ポリープ状脈絡膜血管症、結腸直腸癌、肺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎臓癌、神経鞘腫、神経膠腫、上衣腫（ｅｐｅｎｄｉｍｏｍａｓ）、および抗ＶＥＧＦ療法から恩恵を受ける腫瘍性または非腫瘍性障害を含む多種多様なＶＥＧＦ関連疾患を治療することができる。
【００２１】
別の態様によれば、本発明は、眼などへの局所投与のための薬学的に許容される担体製剤中に抗ＶＥＧＦ剤を含む医薬製剤を提供する。
【００２２】
実施形態では、本発明は、新規構築物を開示し、この構築物は、ＶＥＧＦの活性を強く中和すると同時に、強力なヘパリン結合特性を有する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
本開示の特徴および利点のよりよい理解は、本開示の原理が利用される例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明および添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【図１】Ｆｃ−ＩｇＧ（Ｆｃ）に融合したＶＥＧＦＲ−１（Ｖ）のさまざまなＩｇ様細胞外ドメインを用いた例示的な構築された融合タンパク質の模式図を示す。以下の構築物が示される：Ｖ1-2-3−Ｆｃ；Ｖ2-3−Ｆｃ；Ｖ1-2-3-3−Ｆｃ；Ｖ2-3-3−Ｆｃ；Ｖ1-2-3-4−Ｆｃ；Ｖ2-3-4−Ｆｃ；Ｖ1-2-4−Ｆｃ、およびＶ2-4−Ｆｃ。
【図２】プラスミドの構築および発現の戦略を示す。
【図３】構築物Ｖ1-2-3のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号１および配列番号２。
【図４】構築物Ｖ2-3のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号３および配列番号４。
【図５】構築物Ｖ1-2-3-3のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号５および配列番号６。
【図６】構築物Ｖ2-3-3のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号７および配列番号８。
【図７】構築物Ｖ1-2-3-3-4のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号９および配列番号１０。
【図８】構築物Ｖ2-3-4のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号１１および配列番号１２。
【図９】構築物Ｖ2-4のアミノ酸配列および核酸配列を示す。それぞれ、配列番号１３および配列番号１４。
【図１０】２９３細胞におけるＶＥＧＦＲ−１構築物の発現を示す。
【図１１】ＥＹＬＥＡと比較した２００ｎｇの各ＶＥＧＦＲ−１  Ｆｃ融合タンパク質の還元および非還元条件下での銀染色ＰＡＧＥゲルを示す。
【図１２】ＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖に対するＶＥＧＦ受容体キメラタンパク質の阻害効果を示す。
【図１３】ＶＥＧＦＲ１可溶性受容体に結合するビオチン化ＶＥＧＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）についてのＶＥＧＦの競合を示す。
【図１４】ビオチン化ＶＥＧＦおよびウシ硝子体に結合するＶＥＧＦＲ−１可溶性受容体を示す。
【図１５】ウシ硝子体結合Ｖ1-2-3-3が生物学的に活性であることを示す。
【図１６】脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）領域に対する対照ＩｇＧ、ＥＹＬＥＡ、またはＶＥＧＦＲ−１  Ｆｃ融合タンパク質の効果を示す。各タンパク質は、レーザー治療の１日前に、２．５ｍｇの用量でマウスの硝子体内に注射された。ＥＹＬＥＡも２５ｍｇで試験された。アスタリスクは、適切なＩｇＧ対照群と比較した有意差（スチューデントのｔ検定）を示す（＊＊ｐ＜０．０１、＊ｐ＜０．０５）。
【図１７Ａ】レーザー治療の１日、７日、または１４日前の単回硝子体内投与（２．５ｍｇ）後のＣＮＶ領域に対するＥＹＬＥＡ、Ｖ1、2、3、3、または対照ＩｇＧの効果を示す。アスタリスクは、ＩｇＧ対照群と比較した有意差（ｐ＜０．０５、スチューデントのｔ検定）を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ｂは、図１７Ａの群の代表的なＣＤ３１免疫蛍光画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本明細書で言及されるすべての出版物、特許、および特許出願は、各個々の出版物、特許、または特許出願が参照により組み込まれることが具体的かつ個別に示されるのと同程度に参照により本明細書に組み込まれる。
【００２５】
本明細書に記載される本発明の態様および実施形態は、態様および実施形態「〜からなる」および／または「本質的に〜からなる」を含むことが理解される。本発明の他の目的、利点、および特徴は、添付の図面と併せて以下の明細書から明らかになるであろう。
【００２６】
本発明またはその好ましい実施形態（複数可）の要素を紹介するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、要素のうちの１つ以上が存在することを意味することが意図される。「備える」、「含む」、および「有する」という用語は、包括的であることを意図し、列記される要素以外の追加の要素が存在する可能性があることを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「備える（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｓ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「特徴とする」、またはそれらの任意の他の変形は、別途明示的に示される任意の制限を条件とする、列挙される構成成分の非排他的な包括を包含することを意図する。例えば、要素（例えば、構成成分、特徴、またはステップ）のリストを「含む」、融合タンパク質、医薬組成物、および／または方法は、必ずしもそれらの要素（または構成成分もしくはステップ）のみに限定されないが、明示的に列記されていない、または融合タンパク質、医薬組成物および／もしくは方法に固有ではない他の要素（または構成成分もしくはステップ）を含み得る。
【００２８】
本明細書で使用する場合、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」および「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という移行句は、指定されていない任意の要素、ステップ、または構成成分を除外する。例えば、特許請求の範囲で使用される「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」または「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」は、通常関連する不純物（つまり、所定の構成成分内の不純物）を除いて、特許請求の範囲に具体的に列挙される構成成分、材料、またはステップに特許請求の範囲を限定する。「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」または「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語句が、プリアンブルの直後ではなく、特許請求の範囲の本文の節に出現する場合、「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｏｆ）」または「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という句は、その節に記載される要素（または構成成分もしくはステップ）のみを限定し、他の要素（または構成成分）は、全体として特許請求の範囲から除外されない。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」および「本質的に〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」という移行句は、文字通りに開示されるものに加えて、材料、ステップ、特徴、構成成分、または要素を含む、融合タンパク質、医薬組成物、および／または方法を定義するために使用されるが、但し、これらの追加の材料、ステップ、特徴、構成成分、または要素が、特許請求された発明の基本的かつ新規の特性（複数可）に実質的に影響を与えないものとする。「本質的に〜からなる」という用語は、「備える」と「〜からなる」との間の妥協点を占める。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、以下に記載される１つ以上の治療薬または薬物、および１つ以上の薬学的に許容される賦形剤、担体、またはビヒクルを含む組成物を企図する。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤、担体、またはビヒクル」という用語は、任意の許容される材料、および／または当技術分野で既知の任意の１つ以上の添加剤を含む。本明細書で使用される場合、「賦形剤」、「担体」、または「ビヒクル」という用語は、当技術分野で既知のさまざまな従来の投与経路による薬物投与に適した材料を指す。本明細書で有用な賦形剤、担体、およびビヒクルは、非毒性であり、組成物の他の構成成分と有害な方法で相互作用しない、当技術分野で既知の任意のそのような材料を含み、一般に、活性剤または薬物が一緒に投与される、賦形剤、希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、アジュバント、および／またはビヒクルを指す。そのような担体は、落花生油、大豆油、鉱油、胡麻油などの石油、動物、植物、または合成起源のものを含む、水および油などの無菌液体、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、または他の合成溶剤であり得る。ベンジルアルコールまたはメチルパラベンなどの抗菌剤；アスコルビン酸または重亜硫酸ナトリウムなどの抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸などのキレート剤；および塩化ナトリウムまたはデキストロースなどの張度を調整するための薬剤もまた、担体であり得る。担体と組み合わせて組成物を製造する方法は、当業者に既知である。いくつかの実施形態では、「薬学的に許容される担体」という用語は、医薬投与に適合する、ありとあらゆる溶剤、分散媒、コーティング、等張剤、および吸収遅延剤などを含むことを意図する。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および薬剤の使用は、当技術分野で周知である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「治療有効量」という用語は、対象の状態の性質および重症度を考慮してその特定の対象に投与した場合に、所望の治療効果を有するそれらの量、例えば、標的状態を治癒、予防、阻害、または少なくとも部分的に停止させる、または部分的に予防する量を指す。いくつかの実施形態では、「治療有効量」または「有効量」という用語は、単独で、または追加の治療薬または薬物と組み合わせて、細胞、組織、臓器、または対象に投与した場合に、加齢性黄斑変性症、増殖性糖尿病性網膜症、網膜静脈閉塞症、近視に続発する脈絡膜新生血管；未熟児網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、ポリープ状脈絡膜血管症、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、膵臓癌、および前立腺癌を含むがこれらに限定されない眼疾患および癌を予防または寛解させるのに有効である治療薬または薬物の量を指す。治療有効量はさらに、症状の寛解、例えば、関連する医学的状態の治療、治癒、予防、もしくは寛解、またはそのような状態の治療、治癒、予防、もしくは寛解の速度の増加をもたらすのに十分な治療薬または薬物の量を指す。単独で投与される個々の活性成分に適用される場合、治療有効量はその成分のみを指す。組み合わせに適用される場合、治療有効量は、組み合わせて、連続して、または同時に投与されたかどうかにかかわらず、治療効果をもたらす活性成分の組み合わせた量を指す。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「治療する（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」、「治療（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、または「緩和」という用語は、標的の病的状態または障害を治癒しないか、または状態の再発を予防しない場合、目的が緩徐化（減少）することである治療的処置を指す。治療量の治療薬または薬物を受けた後、対象が特定の状態のうちの１つ以上の徴候および症状の観察可能なおよび／または測定可能な低減またはその不在を示す場合、対象は無事に「治療」されている。状態の徴候または症状の低減は、対象によっても感じられ得る。対象が安定した状態を経験する場合、対象はやはり治療されたと見なされる。いくつかの実施形態では、治療薬または薬物による治療は、治療後３ヶ月、好ましくは治療後６ヶ月、より好ましくは１年、さらにより好ましくは２年以上、対象が無症状であるのに有効である。治療の成功および状態の改善を評価するためのこれらのパラメーターは、当業者によく知られている日常的な手順によって容易に測定可能である。
【００３４】
本明細書で使用される場合、「予防的」治療は、状態または状態の症状の発症の延期、現れる可能性のある症状の抑制、または状態もしくは症状の発症または再発のリスクの低減を示すことを意味する。「治癒的」治療には、既存の症状もしくは状態の重症度の低減、またはその悪化の抑制が含まれる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、「治療薬」、「抗ＶＥＧＦ剤」、「融合タンパク質」、「キメラタンパク質」、または「組換えタンパク質」という用語は、第２のポリペプチドに作動可能に連結された第１のポリペプチドを含み、「治療薬」、「抗ＶＥＧＦ剤」、「融合タンパク質」、「キメラタンパク質」、または「組換えタンパク質」は、ＶＥＧＦの活性を阻害する。キメラタンパク質は、第１または第２のポリペプチドに作動可能に連結された第３、第４、もしくは第５、または他のポリペプチドを任意選択的に含み得る。キメラタンパク質は、２つ以上の異なるポリペプチドを含み得る。キメラタンパク質は、同じポリペプチドの複数のコピーを含み得る。キメラタンパク質はまた、ポリペプチドのうちの１つ以上に１つ以上の変異を含み得る。キメラタンパク質を作製する方法は、当技術分野で周知である。いくつかの実施形態では、「治療薬」、「融合タンパク質」、「キメラタンパク質」、または「組換えタンパク質」という用語は、Ｉｇ様ドメインのうちの１つ以上、またはＦｃ−ＩｇＧを有するＶＥＧＦＲ−１および／もしくはＶＥＧＦＲ−２のドメイン断片を作動可能に連結するペプチドまたはタンパク質を含むがこれらに限定されない、発現または合成される任意の構築物を指す。
【００３６】
「Ｉｇ様ドメイン」という用語は、ＶＥＧＦＲ−１およびＶＥＧＦＲ−２のＩｇ様ドメイン１〜７を指す。「Ｉｇ様ドメイン断片」という用語は、全長ドメインの一部、一般的にはヘパリンおよび／またはそのＶＥＧＦ結合もしくは可変領域を含む。ドメイン断片の例には、全長ドメインの少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、最も好ましくは９９％のセグメントを含み、１００％の配列同一性およびその変化を含むアミノ酸配列が含まれる。本開示により包含されるように、融合タンパク質のアミノ酸配列における変化が企図されるが、但し、アミノ酸配列の変化が少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％、９０％、９５％、および最も好ましくは９９％を維持するものとする。７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、および９９％の配列同一性など、中間のある特定の割合が含まれる。特に、保存的アミノ酸置換が企図される。保存的置換は、側鎖に関連しているアミノ酸のファミリー内で起こる置換である。遺伝的にコード化されたアミノ酸は一般にファミリーに分けられる：（１）酸性アミノ酸は、アスパラギン酸、グルタミン酸であり、（２）塩基性アミノ酸は、リジン、アルギニン、ヒスチジンであり、（３）非極性アミノ酸は、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファンであり、（４）非荷電極性アミノ酸は、グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、スレオニン、チロシンである。親水性アミノ酸には、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、ヒスチジン、リジン、セリン、およびスレオニンが含まれる。疎水性アミノ酸には、アラニン、システイン、イソロイシン、ロイシン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、トリプトファン、チロシン、およびバリンが含まれる。アミノ酸の他のファミリーには、（ｉ）脂肪族ヒドロキシファミリーであるセリンおよびスレオニン、（ｉｉ）アミド含有ファミリーであるアスパラギンおよびグルタミン、（ｉｉｉ）脂肪族ファミリーであるアラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシン、ならびに（ｉｖ）芳香族ファミリーであるフェニルアラニン、トリプトファン、およびチロシンが含まれる。例えば、ロイシンをイソロイシンまたはバリンで、アスパラギン酸をグルタミン酸で、スレオニンをセリンで単独置換する、またはアミノ酸を構造的に関連するアミノ酸で類似置換することは、特に置換がフレームワーク部位内のアミノ酸を伴わない場合、得られる分子の結合または特性に大きな影響を及ぼさないと予想することは妥当である。アミノ酸変化が機能的な融合タンパク質をもたらすかどうかは、融合タンパク質誘導体の比活性をアッセイすることによって容易に決定することができる。融合タンパク質の断片または類似体は、当業者により容易に調製され得る。断片または類似体の好ましいアミノおよびカルボキシ末端は、機能的ドメインの境界の近くに存在する。
【００３７】
本明細書で使用される場合、「単離された」または「精製された」融合タンパク質は、融合タンパク質が存在する主要な種（すなわち、モルベースで、組成物中の任意の他の個々の種よりも豊富である）であり、好ましくは実質的に精製された画分が、融合タンパク質が存在するすべての高分子種の少なくとも約５０％（モルベースで）を含む組成物であることを意味する。一般的に、精製された組成物は、組成物中に存在するすべての高分子種の約８０％超、より好ましくは約８５％、９０％、９５％、および９９％超を構成する。最も好ましくは、融合タンパク質は、本質的に均一になるまで精製され（汚染物質種は従来の検出方法では組成物において検出することができない）、組成物は本質的に単一の高分子種からなる。
【００３８】
値または範囲は、本明細書では、「約」、「約」１つの特定の値から、および／または「約」別の特定の値までとして表され得る。そのような値または範囲が表される場合、開示される他の実施形態は、１つの特定の値から、および／または他の特定の値まで、列挙された特定の値を含む。同様に、先行詞「約」を使用することによって値が近似値として表される場合、特定の値が別の実施形態を形成することが理解されよう。本明細書で開示される値がいくつかあり、各値が、本明細書では、値自体に加えて、「約」その特定の値としても開示されることがさらに理解されよう。実施形態では、「約」は、例えば、列挙された値の１０％以内、列挙された値の５％以内、または列挙された値の２％以内を意味するために使用され得る。
【００３９】
一態様では、本発明は、治療薬を含む組成物を開示し、この治療薬は、ＶＥＧＦＲ−１またはＶＥＧＦＲ−２の１つ以上のヘパリン結合ドメイン、および１つ以上のＶＥＧＦ結合ドメインを含み、それにより、ＶＥＧＦのその同族受容体への結合を阻害する。
【００４０】
実施形態では、本発明は、Ｆｃ−ＩｇＧに作動可能に連結されたＶＥＧＦ結合部分を含む抗ＶＥＧＦ剤を提供し、このＶＥＧＦ結合部分は、ＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン２である少なくとも１つのＶＥＧＦ結合ドメインを含み、この抗ＶＥＧＦ剤は、アフリベルセプトよりも優れたＶＥＧＦ刺激有糸分裂阻害能力を有する。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れた硝子体結合能力を有することを提供する。実施形態では、本発明は、抗ＶＥＧＦ剤が、アフリベルセプトよりも優れた硝子体結合ＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖阻害能力を有することを提供する。実施形態では、本発明は、薬剤が、アフリベルセプトと比較して、インビボで増加した半減期を有することを提供する。
【００４１】
実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン１、２、および３（Ｖ1-2-3）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号１で定義されるアミノ酸配列を含む。
【００４２】
実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン２および３（Ｖ2-3）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号３で定義されるアミノ酸配列を含む。
【００４３】
実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン１、２、３、および３（Ｖ1-2-3-3）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号５で定義されるアミノ酸配列を含む。
【００４４】
実施形態では、本発明は、ＶＥＧＦ結合部分が、本質的にＶＥＧＦＲ−１のＩｇＧ様ドメイン２、３、および３（Ｖ2-3-3）からなることを提供する。実施形態では、抗ＶＥＧＦ剤は、配列番号７で定義されるアミノ酸配列を含む。
【００４５】
実施形態では、本発明は、治療有効量の、特許請求の範囲に定義される抗ＶＥＧＦ剤および薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。実施形態では、本発明は、治療有効量の、定義される抗ＶＥＧＦ剤を対象に投与することを含む、治療を必要とする対象におけるＶＥＧＦ関連障害を治療する方法を提供する。抗ＶＥＧＦ剤は、眼などの罹患組織または臓器に直接注射することができる。
【００４６】
実施形態では、本発明を使用して、新生血管加齢性黄斑変性症、近視に続発する脈絡膜新生血管、増殖性糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞症などの網膜血管閉塞、眼腫瘍、フォンヒッペル・リンダウ症候群、未熟児網膜症、ポリープ状脈絡膜血管症、結腸直腸癌、肺癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、卵巣癌、腎臓癌、神経鞘腫、神経膠腫、上衣腫、および抗ＶＥＧＦ療法から恩恵を受ける腫瘍性または非腫瘍性障害を含む多種多様なＶＥＧＦ関連疾患を治療することができる。
【００４７】
いくつかの実施形態では、治療薬は、治療薬、および追加の賦形剤、担体、アジュバント、溶剤、または希釈剤を含む投与可能な剤形である。
【００４８】
いくつかの実施形態では、本発明は、対象を治療する、および／または予防的に治療するのに好適な医薬組成物を開示し、この治療薬は、その意図する目的を達成するのに有効な量で含まれる。
【００４９】
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される治療薬または組成物は、注射によって投与される。ある特定の実施形態では、組成物または治療薬は、罹患臓器または組織に直接注射される。いくつかの実施形態では、治療薬は、例えば、罹患臓器または組織へのパッチもしくは直接適用によって、またはイオン導入によって局所投与することができる。治療薬は、例えば、米国特許第５，６７２，６５９号および第５，５９５，７６０号に記載されるものなどの徐放性組成物で提供されてもよい。即時または徐放性組成物の使用は、治療される状態の性質に依存する。状態が急性または過急性（ｏｖｅｒ−ａｃｕｔｅ）の障害からなる場合、即時放出型による治療は、徐放性組成物よりも好ましい。あるいは、ある特定の予防的または長期的治療については、徐放性組成物が適切であり得る。
【００５０】
治療薬はまた、眼内インプラントなどであるがこれに限定されないインプラントを使用して送達されてもよい。そのようなインプラントは、生分解性および／または生体適合性のインプラントであり得るか、または非生分解性のインプラントであり得る。インプラントは、活性剤に透過性または不透過性であり得る。治療薬を送達するための特定のインプラントは、罹患組織または臓器、ならびに治療される状態の性質の両方に依存する。そのようなインプラントの使用は、当技術分野で周知である。
【００５１】
本発明に記載の阻害剤は、特定の組織への正確な送達を提供し、また放出制御療法を提供するために、ナノ粒子または他の薬物製剤に製剤化され得る。
【００５２】
この出願に記載されている阻害剤は、精製された組換えタンパク質としてだけでなく、遺伝子療法アプローチによっても送達することができる。組換えアデノ随伴ベクター（ｒＡＡＶ）または他の好適なベクターを使用して、網膜下または硝子体内送達によってＶＥＧＦ阻害剤を送達することができる43,44。
【００５３】
関連する態様では、本発明は、対象におけるＶＥＧＦ関連または新生血管障害を治療するための方法を提供し、この方法は、対象に、（ａ）有効量の、ヘパリンに結合し、望ましくない新生血管の発達を減少または予防することができる融合タンパク質を投与することを伴う。融合タンパク質は、ＶＥＧＦに特異的な抗体または抗体断片、ＶＥＧＦ受容体に特異的な抗体、チロシンキナーゼシグナル伝達を阻害、制御、および／または調節する化合物、ＶＥＧＦポリペプチド、核酸レベルでＶＥＧＦ発現を阻害するオリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスＲＮＡ、ならびに血管新生阻害活性を有するさまざまな有機化合物および他の薬剤を含むが、これらに限定されない他の抗ＶＥＧＦ剤と組み合わせることができる。
【００５４】
本発明は、ＶＥＧＦＲ１の  Ｄ３（または他のＩｇ様ドメイン）によって媒介されるヘパリン結合28が、全身投与には不利であるが、硝子体内（または他の局所）投与に重要な利点を付与することができることを提供する。実際、細胞外マトリックスの主要構成成分であるＨＧＰＳＧに結合する能力29は、硝子体における蓄積および網膜浸透を促進する30。本発明は、ＨＳＰＧと相互作用する異なる能力を有する一連のＶＥＧＦＲ−１  Ｆｃ融合構築物を提供する。これにより、異なる臨床条件下で有用である、眼における持続時間／半減期が異なるＶＥＧＦ阻害剤を選択することができる。
【００５５】
本発明の特徴および他の詳細は、ここでより具体的に記載され、好ましい技術および実験結果を記載する以下の実施例において示される。実施例は、本発明を例示する目的で提供され、限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【００５６】
したがって、実施形態では、本発明は、強力なヘパリン結合特性と組み合わされた高い生物学的効力により、新規であり、アフリベルセプトを含む既存の抗ＶＥＧＦ剤を改善する抗ＶＥＧＦ剤を開示する。ヘパリン結合は、より長い半減期および結果としての投与頻度の低減を予測する。
【００５７】
本発明は、ＶＥＧＦＲ１のＤ３（または他のＩｇ様ドメイン）によって媒介されるヘパリン結合28が、全身投与には不利であるが、硝子体内（または他の局所）投与に重要な利点を付与することができることを提供する。実際、細胞外マトリックスの主要構成成分であるＨＧＰＳＧに結合する能力29は、硝子体における蓄積および網膜浸透を促進し得る30。本発明は、ＨＳＰＧと相互作用する異なる能力を有する一連のＶＥＧＦＲ−１  Ｆｃ融合構築物を提供する。
【００５８】
図１は、ここで用いられた構築物の略図を提供する。図２は、用いられたベクターおよびクローニング戦略を図示する。図３〜９は、生成された構築物の核酸およびアミノ酸配列を示す。
【００５９】
実施例は、ほとんどの構築物の発現レベルが低いことを示す。Ｖ1-2-3-4、Ｖ1-2-3-3、Ｖ2-3-4、およびＶ1-2-4は、馴化培地ではほとんど全く検出されなかった。以前の研究では、ヘパリン（ＶＥＧＦ189またはＶＥＧＦ206）に高い親和性を有するＶＥＧＦアイソフォームが、トランスフェクトされた細胞の馴化培地では検出されず、細胞表面または細胞外マトリックスに密接に結合したことを示した31 32。しかしながら、それらはヘパリンまたはヘパリナーゼの添加により可溶性形態で放出され得、結合部位がＨＳＰＧからなる31 32ことを示す。この実施例は、ヘパリンの添加が組換えＶＥＧＦＲ−１融合タンパク質のレベルにも影響を及ぼし得るかどうかを決定しようとした。実際、６ウェルプレートのトランスフェクトされた細胞の培地にヘパリンを添加すると、培地中の組換えタンパク質の濃度が用量依存的に増加した（図１０）。
【００６０】
組換えタンパク質を精製しようとした際に、従来のプロテインＡ（ＰＡ）親和性クロマトグラフィーだけで予想される質量の主要なバンドが得られたが、宿主細胞由来のＨＳＰＧおよび他の分子との組換えタンパク質の相互作用を反映している可能性が高い多数の小さいバンドがあった。方法に記載されているように、そのような不純物を取り除くプロトコルが開発された。タンパク質がＰＡに結合されるときに、１．２ＭのＮａＣｌの存在下で高ｐＨ（例えば、９．２）で洗浄すると、多数の汚染物質が放出された。次のステップのＨｉ−Ｔｒａｐ  Ｑを用いた陰イオン交換クロマトグラフィーは、精製されたタンパク質がフロースルー状態である間に、汚染物質および凝集物の大部分を除去するのに非常に効果的であった。最終精製調製物のＬＰＳレベルは＜０．１ＥＵ／ｍｇ（範囲０．０２〜０．０８）であり、前臨床研究との互換性のレベルは非常に低かった33。図１１に示すように、銀染色ＳＤＳ／ＰＡＧＥゲルで評価した組換えタンパク質の純度は、＞９５％であり、ＦＤＡ承認薬物のＥＹＬＥＡの純度と同等であった。
【００６１】
組換えタンパク質は、ウシ脈絡膜内皮細胞におけるＶＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）によって刺激された有糸分裂を阻害する能力について試験された。組換えタンパク質には阻害効果があり、ＩＣ50値は、約１ｎＭの範囲であったが、Ｖ１−２−４およびＶ２−４はそれほど強力ではなかった（図１２）。興味深いことに、ＥＹＬＥＡは、試験された最高濃度でも、ＶＥＧＦ刺激による増殖の約８０％以下しか阻害しなかった（図１２）。対照的に、本ＶＥＧＦＲ−１構築物（Ｖ1-2-4およびＶ2-4を除く）は、ＶＥＧＦ誘導増殖を完全に遮断した（図１２）。結合アッセイは、可溶性ＶＥＧＦ受容体とビオチン化ＶＥＧＦとの間の相互作用、およびＶＥＧＦが結合を置き換える能力を実証した（図１３、１４）。
【００６２】
治療に関連する相互作用をさらに定義するために、組換えタンパク質がインビトロでウシ硝子体に結合するかどうかを評価しようとした。図１４に図示するように、ＥＹＬＥＡまたは対照ＩｇＧは、ほとんどまたはまったく結合しなかったが、本タンパク質は有意な結合を示した。最強の結合剤は、Ｖ１−２−３−３、Ｖ２−３−３、およびＶ１−２−３−４、続いてＶ１−２−３であった。Ｖ２−３は、ＥＹＬＥＡ（または対照ＩｇＧ）とＶ1-2-3-3との中間的な結合特性を示した。眼内新生血管の治療に一般的に使用されるモノクローナル抗体であるＡＶＡＳＴＩＮ9も、ほとんどまたはまったく結合しなかった。
【００６３】
硝子体に結合したＶＥＧＦＲ−１  ＦＣ融合が生物学的に活性であるかどうかを決定するために、プレートをウシの硝子体でコーティングした。ＥＹＬＥＡまたは対照ＩｇＧではなく、Ｖ１−２−３−３を添加すると、外因的に添加されたＶＥＧＦが内皮細胞の増殖を刺激する能力が阻害された（図１５）。
【００６４】
組換えタンパク質をマウスＣＮＶアッセイで試験し、対照ＩｇＧまたはＥＹＬＥＡと比較した。各タンパク質は、レーザー治療の１日前に２．５μｇの用量で硝子体内に注射された。ＥＹＬＥＡも２５μｇで試験された。２．５μｇの用量で、Ｖ1-2-3、Ｖ2-3、Ｖ1-2-3-3、およびＶ2-3-3は、２５μｇのＥＹＬＥＡで達成されたものと同等以上の阻害の程度を示した。しかしながら、Ｄ４を含有する構築物はいずれも、試験された状況下で有意な阻害を示さなかった（図１６）。
【００６５】
ヘパリン結合が単回投与後に永続的治療効果をもたらすかどうかを決定するために、Ｖ1-2-3-3、ＥＹＬＥＡ、または対照ＩｇＧを、レーザー誘導損傷の１日、７日、または１４日前に硝子体内に注射した（２．５μｇ）。図１７に示されるように、ＥＹＬＥＡは、損傷の１日前に投与した場合にのみ有意な阻害をもたらした。しかしながら、Ｖ1-2-3-3は、損傷の７日または１４日前に投与した場合にも有意な阻害をもたらした。
【００６６】
さまざまなインビトロおよびインビボアッセイで評価されたいくつかの新規ＶＥＧＦＲ−１−Ｆｃ構築物が開示されている。組換えタンパク質を精製するために、多段階プロトコルを使用した。これは、放出を改善するために培地にヘパリンを添加する必要がある、一過性発現２９３細胞における比較的低い発現レベルによって大部分が決定された。しかしながら、ヘパリンを使用する必要性は、異なる宿主細胞（例えば、ＨＳＰＧまたはその変異体の異なる組成を有する）によって、または増幅された安定した細胞株などにおけるより高い発現レベルによって、部分的にまたは完全に取り除かれ得る。
【００６７】
Ｖ２−４を除くすべての構築物は、ＶＥＧＦの活性を強力に中和し、同時に強力なヘパリン結合特性を有し、これにより硝子体内投与後の長い半減期を予測することができる。この例は、これらのタンパク質がウシの硝子体に結合することを実証する。最強の結合剤は、Ｖ１−２−３−３、Ｖ２−３−３、Ｖ１−２−３−４、続いてＶ１−２−３であった。Ｖ２−３は有意であったが、硝子体結合が低かった。対照ＩｇＧ、ＥＹＬＥＡ、またはＡＶＡＳＴＩＮでは、代わりに結合が最小限であった。最強の硝子体結合剤の１つであるＶ１−２−３−３を選択して、硝子体マトリックスに結合したＶＥＧＦＲ１  Ｆｃ構築物が生物学的に活性であり得るという仮説を試験した。図１５に示されるように、ウシの硝子体でコーティングされたプレートに、ＥＹＬＥＡまたは対照ＩｇＧではなく、Ｖ１−２−３−３を添加すると、外因的に添加されたＶＥＧＦが内皮細胞の増殖を刺激する能力が阻害された。
【００６８】
次に、組換えタンパク質を、マウスのＣＮＶモデルで、レーザー誘導新生血管を阻害する能力について試験した。ＥＹＬＥＡを陽性対照として、ヒトＩｇＧ１を陰性対照として使用した。インビボ試験には、さまざまな構築物間の効力の違いを明らかにするのに最適である比較的低用量が選択された。また、ＩｇＧ１アイソタイプの比較的高用量の抗体の硝子体内投与は、硝子体内に注射した場合、ＦｃｇＲＩ（ＣＤ６４）およびｃ−Ｃｂｌによって媒介されるオフターゲット阻害効果を有し得ることが報告されている34。用いられる用量は、そのようなオフターゲット効果を回避し、真の特異的効果を検出するはずである。
【００６９】
図１６に示されるように、ＥＹＬＥＡは、２．５μｇの用量で約３０％の阻害、２５μｇで約５０％の阻害をもたらした。これらの知見は、発表された文献とほぼ一致する。Ｓａｉｓｈｉｎらは、約５μｇのアフリベルセプトの硝子体内注射により、マウスのＣＮＶ領域が約３０％阻害されたと報告した35。実際、４０μｇの用量は、マウスＣＮＶモデルにおいて最大効果を達成するために一般的に使用される36。我々の研究で予想外の知見だったのは、我々のＶ１−２−３、Ｖ２−３、Ｖ１−２−３−３、およびＶ２−３−３の構築物のいくつかの効力が高かったことである。損傷の１日前にこれらの構築物を２．５μｇ投与すると、２５μｇのＥＹＬＥＡで達成された阻害レベルと一致するか、それを超えた。ＥＹＬＥＡではなくＶ１−２−３−３が、損傷の７日または１４日前に投与した場合にＣＮＶの予防に有意な効果があるという知見（図１７）は、効果の永続性および治療的価値を実証する。
【００７０】
予想外の知見は、これらの分子（Ｖ2-4を除く）がインビトロでＶＥＧＦ刺激有糸分裂を遮断する能力を示したという事実にもかかわらず、Ｄ４を含有する構築物（Ｖ１−２−３−４、Ｖ２−３−４、Ｖ１−２−４、Ｖ２−４）のいずれもインビボで顕著な阻害をもたらさなかった（少なくとも試験した用量で）ことである。しかしながら、これらの構築物はすべて、非還元条件下のＳＤＳ／ＰＡＧＥゲル（図１１）またはサイズ排除クロマトグラフィー（図示せず）によって評価されるように、多量体または凝集体を形成する傾向を示した。初期の研究37では、Ｄ４（Ｄ７と一緒に）がＶＥＧＦＲ−１二量体化の要件として同定されたが、そのような効果はリガンド依存性であることが既知である。結晶構造研究は、そのような同型相互作用の原因となるＤ４のループを明らかにした23。高濃度および／またはＦｃ構築物によって課せられる強制的な二量体化がリガンド非依存性相互作用をもたらし、凝集をもたらす可能性があると考えられる。いずれにしても、炎症および免疫原性の可能性を考えると、凝集体は望ましい医薬品ではない38、39。したがって、本発明の態様は、実施形態では、Ｄ４ではなく、ＶＥＧＦＲ−１  Ｄ２／Ｄ３を有する構築物の同定である。
【００７１】
エフェクター機能を低減する、当業者に周知の十分に特徴付けられたＦｃ変異は、抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）ならびにＣ１ｑとの相互作用および補体カスケードの開始を最小にするために、本発明の有用な追加となり得ることは注目に値する40。
【００７２】
結論として、アフリベルセプトは、腫瘍学的適応症の全身半減期を改善するために、ヘパリン結合ヘパリンドメインを排除するように設計された。本研究で説明される構築物は、代わりに硝子体における結合および保持を促進して、より持続的で治療に関連する相互作用を確実にするように設計されている。
【００７３】
方法
ＶＥＧＦＲ−１ECD−Ｆｃ発現プラスミドの構築のために、シグナルペプチドをコードする核酸断片およびさまざまな細胞外Ｉｇ様ドメイン（ＶＥＧＲＦ−１（遺伝子ＩＤ：２３２１）の１〜４）20が、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．によって合成された。さまざまな細胞外Ｉｇ様ドメイン構築物は次のとおりである：Ｖ１２３は、Ｄ１、２、および３を含有し、Ｖ２３は、Ｄ１およびＤ２を含有し、Ｖ１２３４は、Ｄ１、２、３、および４を含有し、Ｖ１２３３は、Ｄ１、２、３、および３を含有し、Ｖ２３４は、Ｄ２、３、および４を含有し、Ｖ１２４は、Ｄ１、２、および４を含有し、Ｖ２４は、Ｄ２および４を含有し、Ｆ７は、ＥＣＤ２、２、および３を含有し、Ｆ８は、ＥＣＤ２および３を含有する。合成された断片は、ＥｃｏＲＩおよびＢｇＩＩＩ部位でｐＦＵＳＥ−ｈＩｇＧ１−Ｆｃベクター（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ、＃ｐｆｕｓｅ−ｈｇｉｆｃ１）に挿入され、さまざまなＦｌｔ１  ＥＣＤを含有するプラスミドが生成された。次に、ＰｒｉｎｅＳＴＡＲ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  Ｂａｓａｌ  Ｋｉｔ（Ｔａｋａｒａ、Ｒ０４６Ａ）を使用して、ＥＣＤとＦｃ断片との間のインターバルアミノ酸ＲおよびＳ（ＢｇＩＩＩ部位）を除去し、２２７アミノ酸ヒトＩｇＧ１−Ｆｃを有するＦｌｔ１  ＥＣＤの融合タンパク質を発現するプラスミド（Ｆ１〜Ｆ８）を生成した。
【００７４】
トランスフェクションおよび馴化培地の調製
製造業者の指示に従い、Ｅｘｐｉ２９３発現系（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ａ１４５２４）を使用して、精製用の馴化培地を生成した。簡潔に、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を、８％ＣＯ２の加湿雰囲気中、３７oＣで、Ｅｘｐｉ２９３（商標）発現培地中で懸濁培養した。細胞密度が２５０万／ｍｌに達したら、プラスミドＤＮＡおよびＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３試薬を混合し、５分間インキュベートし、細胞に添加した。ＤＮＡおよびトランスフェクトされた試薬の最終濃度は、それぞれ、１μｇおよび２．７μｌ／ミリリットルであった。トランスフェクションの５時間後、１００μｇ／ｍｌのヘパリン（Ｓｉｇｍａ、Ｈ３１４９）およびプロテアーゼ阻害剤カクテル１：４００（Ｓｉｇｍａ、Ｐ１８６０）を細胞に添加した。トランスフェクションの１６時間後、エンハンサー試薬１および２を添加した。トランスフェクションの９６時間後、馴化培地を採取した。製造業者の指示に従い、ヒトＦｃ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｓｙｄ  Ｌａｂｓ、ＥＫ００００９５−ＨＵＦＣ−２）を使用して、Ｆｃ融合タンパク質濃度についてアリコートを試験した。プロテアーゼ阻害剤をバルクに添加し（１：５００）、さらに使用するまで−８０oＣで保存した。
【００７５】
組換えタンパク質の精製
発熱物質不含試薬を使用した。使用する前に、カラムおよび機器（Ａｋｔａ  Ｅｘｐｌｏｒｅｒ  Ｓｙｓｔｅｍ）を０．５  ＮのＮａＯＨに約４５分間曝露して消毒した。トランスフェクトされた細胞からの馴化培地を、ＰＢＳ、０．０１％のポリソルベート（ＰＳ）２０に調整した。ＰＳ２０を、すべてのステップで緩衝液に添加した。２０，０００  ｘｇで３０分間遠心分離した後、上清を、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  ＭａｂＳｅｌｅｃｔ  ＳｕＲｅ（５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用するプロテインＡ（ＰＡ）親和性クロマトグラフィーにかけた。ローディング後、カラムを、２０ｍＭジエタノールアミン、ｐＨ９．２、１．２ＭのＮａＣｌで洗浄した後、０．１Ｍのクエン酸、ｐＨ  ３．０で溶出し、これをすぐに中和した。次に、ＰＡ溶出プールを、２０ｍＭのジエタノールアミン、ｐＨ  ９．２に希釈し、Ｈｉ−Ｔｒａｐ  Ｑ（５ｍｌ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）陰イオン交換カラムに適用した。結合した物質を、ＮａＣｌの勾配で溶出した。精製された組換えタンパク質を含有するフロースルーを、直ちに２０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．８に調整し、ヘパリン−セファロース（Ｈｉ−Ｔｒａｐ（商標）−ＨＳ）への結合により濃縮した。０．２〜０．４５ＭのＮａＣｌ（構築物に依存）で洗浄した後、組換えＶＥＧＦＲ１融合タンパク質を１ＭのＮａＣｌで溶出した。最終的な研磨ステップは、例えば、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  Ｉｎｃｒｅａｓｅ、１０／３００  ＧＬ、またはＨｉ−Ｌｏａｄ  １６／６００  Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００  ｐｇ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅを使用するサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）からなった。最後に、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ６．８、１０ｍＭのヒスチジン、１％のスレアロース（ｔｈｒｅａｌｏｓｅ）、４０ｍＭのＮａＣｌ、０．０１％のＰＳ２０への透析により、タンパク質を緩衝液交換した。内毒素レベルを決定するために、ＴｏｘｉｎＳｅｎｓｏｒ  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃ  ＬＡＬ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、Ｌ００３５０）を、製造業者のプロトコルに従って使用した。
【００７６】
細胞増殖アッセイ
ウシ内皮細胞増殖アッセイは、本質的に以前に記載されているように実施された41。対数増殖期のウシ脈絡膜内皮細胞（ＢＣＥＣ）（継代数＜１０）をトリプシン処理し、再懸濁し、１０％のウシ胎児血清、２ｍＭのグルタミン、および抗生物質を補充した低グルコースＤＭＥＭの９６ウェルプレート（コーティングなし）に、２００μｌ容量で１０００細胞／ウェルの密度で播種した。ｒｈＶＥＧＦ165（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を１０ｎｇ／ｍｌの濃度で添加した。アフリベルセプト（ＥＹＬＥＡ）は薬局から購入した。阻害剤は、リガンドを添加する前に、図に示されるように、さまざまな濃度で細胞に添加された。５または６日後、細胞をＡｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅと４時間インキュベートした。蛍光は、５３０ｎｍの励起波長および５９０ｎｍの発光波長で測定された。
【００７７】
固相ＶＥＧＦＲ−１バリアント結合アッセイ
Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡストリップウェル（＃２５９２、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ，Ｋｅｎｎｅｂｕｎｋ，ＭＥ）を、４℃で一晩、コーティング緩衝液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，＃４２１７０１）中の精製されたＶＥＧＦ受容体タンパク質（２５０ｎｇ／ウェル）でコーティングした。ＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ８９５００３）で１回洗浄した後、ストリップを、室温（ＲＴ）で１時間、ＰＢＳ中の２％のＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ，Ａ６００３）とインキュベートして、非特異的結合部位を遮断した。次にストリップを３回洗浄し、続いて、３７℃で２時間、ビオチン化ヒトＶＥＧＦ165（Ｇ＆Ｐ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，ＣＡ）をアッセイ希釈液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃４２１２０３）に単独で、またはさまざまな濃度の非ビオチン化ヒトＶＥＧＦ１６５（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）と組み合わせて添加した。３回洗浄した後、ＶＥＧＦＲ１に結合したビオチン化ヒトＶＥＧＦ165を、室温で１時間、ＨＲＰストレプトアビジン（１：１０００、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃４０５２１０）とインキュベートすることにより検出した。ストリップを５回洗浄した後に、ＴＭＢ高感度基質溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃４２１５０１）と３０分間インキュベートし、等量の停止溶液（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、＃７７３１６）を添加した後に、４５０ｎｍでの吸光度を測定した。すべての実験は、２つのウェルで行われ、少なくとも２回繰り返された。
【００７８】
ウシの硝子体へのインビトロ結合
ウシの硝子体（ＩｎＶｉｓｉｏｎ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ）を４℃で解凍した。材料を最初にＰＢＳで１：１に希釈し、０．２２μｍフィルターでろ過し、等分し、−８０℃で保存した。ウシの硝子体材料の総タンパク質濃度は、Ｐｉｅｒｃｅ  ＢＣＡタンパク質アッセイによって測定された。Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡストリップウェルを、室温で４時間、ウシの硝子体（１μｇ／ウェル）でコーティングし、続いてＥＬＩＳＡ洗浄緩衝液で１回洗浄した。非特異的結合部位は、室温で１時間、ＰＢＳに２％のＢＳＡを添加し、続いて、０．０１％のＰＢＳ−Ｔで３回洗浄することにより遮断された。各ウェルに、５０ｕｌのＶＥＧＦＲ１または対照タンパク質を、４℃で一晩添加した。翌日、プレートを０．０１％ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄し、続いて、室温で１時間、１００ｕｌのＡＰコンジュゲートヤギ抗ヒトＦｃ（１：２０００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、＃Ａ１８８３２））とインキュベートした。プレートを、０．０１％のＰＢＳ−Ｔでさらに５回洗浄した後、室温で１５〜３０分間、５０ｕｌの１ステップＰＮＰＰ基質（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，＃３７６２１）を添加した。ＯＤは４０５ｎｍで測定された。
【００７９】
Ｃｏｓｔａｒ  ９６ウェルＥＩＡ／ＲＩＡストリップウェルのＶＥＧＦ刺激内皮細胞増殖に対する硝子体結合ＶＥＧＦＲ１の効果は、最初に１時間ＵＶ滅菌され、続いて、室温で４時間、ＰＢＳに希釈された１μｇ／ウェルのウシの硝子体でコーティングされた。プレートを、ＰＢＳで１回洗浄し、４oＣで、２％のＢＳＡで遮断し、バイオセーフティーフード内でＰＢＳで２回洗浄した。等量の可溶性受容体または対照ＩｇＧをプレートに添加し、４℃のＰＢＳ  Ｏ／Ｎに希釈した（５０μｌ／ウェル）。次にプレートをＰＢＳで１回洗浄し、続いて、１０％のＢＣＳを含有するアッセイ培地で１回洗浄した。１００μｌの培地を各ウェルに添加し、続いて５ｎｇ／ｍｌのＶＥＧＦ、またはＶＥＧＦなしの対照としてＰＢＳのみを添加した。プレートをＶＥＧＦまたはＰＢＳと１時間インキュベートし、続いて、１００μｌのＢＣＥＣ細胞懸濁液を添加した（最終的に２５００細胞／ウェル）。４８時間後、Ａｌａｍａｒ  Ｂｌｕｅを添加して増殖を測定した。
【００８０】
レーザー誘導脈絡膜新生血管（ＣＮＶ）
雄のＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（６〜８週）を、レーザー治療の前にケタミン／キシラジンカクテルで麻酔した。ＣＮＶ病変は、ダイオードレーザー（ＩＲＩＤＥＸ，Ｏｃｕｌｉｇｈｔ  ＧＬ）、ならびにスポットサイズ５０μｍ、出力１８０ｍＷ、および露光時間１００ｍｓの細隙灯（Ｚｅｉｓｓ）を使用するレーザー光凝固によって誘導された。36,42．典型的には、４つのレーザー火傷が、各眼の視神経乳頭の周りの３、６、９、および１２時の位置で誘導された。異なる構築物またはＩｇＧアイソタイプ対照を、１μｌの容量の２．５μｇ／眼の用量で硝子体内に注射した。ＥＹＬＥＡは、２．５または２５μｇで陽性対照として使用された。注射の１日後にレーザー治療を行い、レーザー治療の７日後に、眼を摘出し、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で１５分間固定した。別の一連の研究では、レーザー治療の１日、７日、または１４日前に、選択された構築物を１回注射した。脈絡膜−強膜複合体および網膜を分離し、網膜および脈絡膜組織の両方の全体マウント染色により血管系を証明するために抗ＣＤ３１免疫蛍光法（ＩＦ）を実施した。ＣＤ３１  ＩＦの場合、ラット抗マウス抗体ＢＤ  ５５０２７４を、１：１００に希釈し、４oＣで一晩インキュベートした。二次抗ラット抗体（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ａ１１００６）との４時間のインキュベーション後、全体マウントを４８８ｎｍで撮像した。病変領域の新生血管および網膜の血管密度の定量化は、ＩｍａｇｅＪによって行われた。Ｐ値は、スチューデントのｔ検定によって評価された（有意な変化、ｐ＜０．０５）。
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［１７］Ｒｅｇｕｌａ  ＪＴ，Ｌｕｎｄｈ  ｖｏｎ  Ｌｅｉｔｈｎｅｒ  Ｐ，Ｆｏｘｔｏｎ  Ｒ，Ｂａｒａｔｈｉ  ＶＡ，Ｃｈｅｕｎｇ  ＣＭ，Ｂｏ  Ｔｕｎ  ＳＢ，Ｗｅｙ  ＹＳ，Ｉｗａｔａ  Ｄ，Ｄｏｓｔａｌｅｋ  Ｍ，Ｍｏｅｌｌｅｋｅｎ  Ｊ，Ｓｔｕｂｅｎｒａｕｃｈ  ＫＧ，Ｎｏｇｏｃｅｋｅ  Ｅ，Ｗｉｄｍｅｒ  Ｇ，Ｓｔｒａｓｓｂｕｒｇｅｒ  Ｐ，Ｋｏｓｓ  ＭＪ，Ｋｌｅｉｎ  Ｃ，Ｓｈｉｍａ  ＤＴ，Ｈａｒｔｍａｎｎ  Ｇ：Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｋｅｙ  ａｎｇｉｏｇｅｎｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｗｉｔｈ  ａ  ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣｒｏｓｓＭＡｂ  ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  ｆｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｙｅ  ｄｉｓｅａｓｅｓ．ＥＭＢＯ  Ｍｏｌ  Ｍｅｄ  ２０１６，８：１２６５−８８．
［１８］Ｒｏｄｒｉｇｕｅｓ  ＧＡ，Ｍａｓｏｎ  Ｍ，Ｃｈｒｉｓｔｉｅ  ＬＡ，Ｈａｎｓｅｎ  Ｃ，Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ  ＬＭ，Ｂｕｒｋｅ  Ｊ，Ｌｕｈｒｓ  ＫＡ，Ｈｏｈｍａｎ  ＴＣ：Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｂｉｃｉｐａｒ−Ｐｅｇｏｌ，ａｎ  Ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ＤＡＲＰｉｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｔｈａｔ  Ｐｏｔｅｎｔｌｙ  Ｉｎｈｉｂｉｔｓ  Ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２０１８，５９：５８３６−４６．
［１９］Ｖｏｒｕｍ  Ｈ，Ｏｌｅｓｅｎ  ＴＫ，Ｚｉｎｃｋ  Ｊ，Ｈｅｄｅｇａａｒｄ  Ｍ：Ｒｅａｌ  ｗｏｒｌｄ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｏｆ  ａｎｔｉ−ＶＥＧＦ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  Ｄｅｎｍａｒｋ．Ｃｕｒｒ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  Ｏｐｉｎ  ２０１６：１−３２．
［２０］Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ  Ｔ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｐａｒｋ  Ｊ，Ｐｒｅｓｔａ  ＬＧ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ：Ｔｈｅ  ｓｅｃｏｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ−ｌｉｋｅ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＶＥＧＦ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｆｌｔ−１  ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｍａｙ  ｉｎｉｔｉａｔｅ  ａ  ｓｉｇｎａｌ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｃａｓｃａｄｅ．ＥＭＢＯ  Ｊｏｕｒｎａｌ  １９９６，１５：４９１９−２７．
［２１］Ｗｉｅｓｍａｎｎ  Ｃ，Ｆｕｈ  Ｇ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ  ＨＷ，Ｅｉｇｅｎｂｒｏｔ  Ｃ，Ｗｅｌｌｓ  ＪＡ，ｄｅ  Ｖｏｓ  ＡＭ：Ｃｒｙｓｔａｌ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｔ  １．７  Ａ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＶＥＧＦ  ｉｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ｄｏｍａｉｎ  ２  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｌｔ−１  ｒｅｃｅｐｔｏｒ．Ｃｅｌｌ  １９９７，９１：６９５−７０４．
［２２］Ｃｈｒｉｓｔｉｎｇｅｒ  ＨＷ，Ｆｕｈ  Ｇ，ｄｅ  Ｖｏｓ  ＡＭ，Ｗｉｅｓｍａｎｎ  Ｃ：Ｔｈｅ  Ｃｒｙｓｔａｌ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  Ｐｌａｃｅｎｔａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  Ｄｏｍａｉｎ  ２  ｏｆ  Ｖａｓｃｕｌａｒ  Ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｆａｃｔｏｒ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ−１．Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２００４，２７９：１０３８２−８．
［２３］Ｍａｒｋｏｖｉｃ−Ｍｕｅｌｌｅｒ  Ｓ，Ｓｔｕｔｔｆｅｌｄ  Ｅ，Ａｓｔｈａｎａ  Ｍ，Ｗｅｉｎｅｒｔ  Ｔ，Ｂｌｉｖｅｎ  Ｓ，Ｇｏｌｄｉｅ  ＫＮ，Ｋｉｓｋｏ  Ｋ，Ｃａｐｉｔａｎｉ  Ｇ，Ｂａｌｌｍｅｒ−Ｈｏｆｅｒ  Ｋ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｆｕｌｌ−ｌｅｎｇｔｈ  ＶＥＧＦＲ−１  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｄｏｍａｉｎ  ｉｎ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  ｗｉｔｈ  ＶＥＧＦ−Ａ．Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２０１７，２５：３４１−５２．
［２４］Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ，Ｃｈｅｎ  Ｈ，Ｄａｖｉｓ−Ｓｍｙｔｈ  Ｔ，Ｇｅｒｂｅｒ  Ｈ−Ｐ，Ｎｇｕｙｅｎ  Ｔ−Ｎ，Ｐｅｅｒｓ  Ｄ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ  Ｖ，Ｈｉｌｌａｎ  ＫＪ，Ｓｃｈｗａｌｌ  ＲＨ：Ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｉｓ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｆｏｒ  ｃｏｒｐｕｓ  ｌｕｔｅｕｍ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９９８，４：３３６−４０．
［２５］Ｇｅｒｂｅｒ  ＨＰ，Ｖｕ  ＴＨ，Ｒｙａｎ  ＡＭ，Ｋｏｗａｌｓｋｉ  Ｊ，Ｗｅｒｂ  Ｚ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ：ＶＥＧＦ  ｃｏｕｐｌｅｓ  ｈｙｐｅｒｔｒｏｐｈｉｃ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｏｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｄｕｒｉｎｇ  ｅｎｄｏｃｈｏｎｄｒａｌ  ｂｏｎｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄ  １９９９，５：６２３−８．
［２６］Ｇｅｒｂｅｒ  ＨＰ，Ｈｉｌｌａｎ  ＫＪ，Ｒｙａｎ  ＡＭ，Ｋｏｗａｌｓｋｉ  Ｊ，Ｋｅｌｌｅｒ  Ｇ−Ａ，Ｒａｎｇｅｌｌ  Ｌ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＢＤ，Ｒａｄｔｋｅ  Ｆ，Ａｇｕｅｔ  Ｍ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ：ＶＥＧＦ  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｓｕｒｖｉｖａｌ  ｉｎ  ｎｅｏｎａｔａｌ  ｍｉｃｅ．Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  １９９９，１２６：１１４９−５９．
［２７］Ｇｅｒｂｅｒ  ＨＰ，Ｋｏｗａｌｓｋｉ  Ｊ，Ｓｈｅｒｍａｎ  Ｄ，Ｅｂｅｒｈａｒｄ  ＤＡ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ：Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｈａｂｄｏｍｙｏｓａｒｃｏｍａ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔ  ｇｒｏｗｔｈ  ａｎｄ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｏｆ  ｂｏｔｈ  ｔｕｍｏｒ  ａｎｄ  ｈｏｓｔ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０００，６０：６２５３−８．
［２８］ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ  Ｃ，Ｅｓｃｏｂｅｄｏ  ＪＡ，Ｕｅｎｏ  Ｈ，Ｈｏｕｃｋ  Ｋ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＬＴ：Ｔｈｅ  ｆｍｓ−ｌｉｋｅ  ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ，ａ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｆｏｒ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９２，２５５：９８９−９１．
［２９］Ｓａｒｒａｚｉｎ  Ｓ，Ｌａｍａｎｎａ  ＷＣ，Ｅｓｋｏ  ＪＤ：Ｈｅｐａｒａｎ  ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ．Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｅｒｓｐｅｃｔ  Ｂｉｏｌ  ２０１１，３．
［３０］Ｗｏｏｄａｒｄ  ＫＴ，Ｌｉａｎｇ  ＫＪ，Ｂｅｎｎｅｔｔ  ＷＣ，Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ＲＪ：Ｈｅｐａｒａｎ  Ｓｕｌｆａｔｅ  Ｂｉｎｄｉｎｇ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅａｌｌｙ  Ｄｅｌｉｖｅｒｅｄ  Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｒｅｔｉｎａ  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｂｕｔ  Ｗｅａｋｌｙ  Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅｓ  Ｔｒｏｐｉｓｍ．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ２０１６，９０：９８７８−８８．
［３１］Ｈｏｕｃｋ  ＫＡ，Ｌｅｕｎｇ  ＤＷ，Ｒｏｗｌａｎｄ  ＡＭ，Ｗｉｎｅｒ  Ｊ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ：Ｄｕａｌ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ  ｂｙ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ．Ｊ−Ｂｉｏｌ−Ｃｈｅｍ  １９９２、２６７：２６０３１−７。
［３２］Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ：Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ  ａｎｄ  ｐｒｏｔｅｏｌｙｔｉｃ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ：ｔｗｏ  ｋｅｙ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ａｃｔｉｏｎ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  Ｃｅｌｌ  ２０１０  ２１：６８７−９０．
［３３］Ｍａｌｙａｌａ  Ｐ，Ｓｉｎｇｈ  Ｍ：Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  ｌｉｍｉｔｓ  ｉｎ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｓｃｉ  ２００８，９７：２０４１−４．
［３４］Ｂｏｇｄａｎｏｖｉｃｈ  Ｓ，Ｋｉｍ  Ｙ，Ｍｉｚｕｔａｎｉ  Ｔ，Ｙａｓｕｍａ  Ｒ，Ｔｕｄｉｓｃｏ  Ｌ，Ｃｉｃａｔｉｅｌｌｏ  Ｖ，Ｂａｓｔｏｓ−Ｃａｒｖａｌｈｏ  Ａ，Ｋｅｒｕｒ  Ｎ，Ｈｉｒａｎｏ  Ｙ，Ｂａｆｆｉ  ＪＺ，Ｔａｒａｌｌｏ  Ｖ，Ｌｉ  Ｓ，Ｙａｓｕｍａ  Ｔ，Ａｒｐｉｔｈａ  Ｐ，Ｆｏｗｌｅｒ  ＢＪ，Ｗｒｉｇｈｔ  ＣＢ，Ａｐｉｃｅｌｌａ  Ｉ，Ｇｒｅｃｏ  Ａ，Ｂｒｕｎｅｔｔｉ  Ａ，Ｒｕｖｏ  Ｍ，Ｓａｎｄｏｍｅｎｉｃｏ  Ａ，Ｎｏｚａｋｉ  Ｍ，Ｉｊｉｍａ  Ｒ，Ｋａｎｅｋｏ  Ｈ，Ｏｇｕｒａ  Ｙ，Ｔｅｒａｓａｋｉ  Ｈ，Ａｍｂａｔｉ  ＢＫ，Ｌｅｕｓｅｎ  ＪＨ，Ｌａｎｇｄｏｎ  ＷＹ，Ｃｌａｒｋ  ＭＲ，Ａｒｍｏｕｒ  ＫＬ，Ｂｒｕｈｎｓ  Ｐ，Ｖｅｒｂｅｅｋ  ＪＳ，Ｇｅｌｆａｎｄ  ＢＤ，Ｄｅ  Ｆａｌｃｏ  Ｓ，Ａｍｂａｔｉ  Ｊ：Ｈｕｍａｎ  ＩｇＧ１  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｓｕｐｐｒｅｓｓ  ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｉｎ  ａ  ｔａｒｇｅｔ−ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｍａｎｎｅｒ．Ｓｉｇｎａｌ  Ｔｒａｎｓｄｕｃｔ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｔｈｅｒ  ２０１６，１．
［３５］Ｓａｉｓｈｉｎ  Ｙ，Ｔａｋａｈａｓｈｉ  Ｋ，Ｌｉｍａ  ｅ  Ｓｉｌｖａ  Ｒ，Ｈｙｌｔｏｎ  Ｄ，Ｒｕｄｇｅ  ＪＳ，Ｗｉｅｇａｎｄ  ＳＪ，Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ  ＰＡ：ＶＥＧＦ−ＴＲＡＰ（Ｒ１Ｒ２）  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＶＥＧＦ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｒｅａｋｄｏｗｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂｌｏｏｄ−ｒｅｔｉｎａｌ  ｂａｒｒｉｅｒ．Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００３，１９５：２４１−８．
［３６］Ｓｉｌｖａ  ＲＬＥ，Ｋａｎａｎ  Ｙ，Ｍｉｒａｎｄｏ  ＡＣ，Ｋｉｍ  Ｊ，Ｓｈｍｕｅｌｉ  ＲＢ，Ｌｏｒｅｎｃ  ＶＥ，Ｆｏｒｔｍａｎｎ  ＳＤ，Ｓｃｉａｍａｎｎａ  Ｊ，Ｐａｎｄｅｙ  ＮＢ，Ｇｒｅｅｎ  ＪＪ，Ｐｏｐｅｌ  ＡＳ，Ｃａｍｐｏｃｈｉａｒｏ  ＰＡ：Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｂｌｏｃｋｉｎｇ  ｃｏｌｌａｇｅｎ  ＩＶ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ  ｏｃｕｌａｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｌｅａｋａｇｅ．Ｓｃｉ  Ｔｒａｎｓｌ  Ｍｅｄ  ２０１７，９．
［３７］Ｂａｒｌｅｏｎ  Ｂ，Ｔｏｔｚｋｅ  Ｆ，Ｈｅｒｚｏｇ  Ｃ，Ｂｌａｎｋｅ  Ｓ，Ｋｒｅｍｍｅｒ  Ｅ，Ｓｉｅｍｅｉｓｔｅｒ  Ｇ，Ｍａｒｍｅ  Ｄ，Ｍａｒｔｉｎｙ−Ｂａｒｏｎ  Ｇ：Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｉｔｅｓ  ｆｏｒ  ｌｉｇａｎｄ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｄｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ  ａｔ  ｔｈｅ  ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｄｏｍａｉｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ＦＬＴ−１．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７，２７２：１０３８２−８．
［３８］Ｒｏｂｅｒｔｓ  ＣＪ：Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ：ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，ｄｅｓｉｇｎ，ａｎｄ  ｃｏｎｔｒｏｌ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２０１４，３２：３７２−８０．
［３９］Ｒａｔａｎｊｉ  ＫＤ，Ｄｅｒｒｉｃｋ  ＪＰ，Ｄｅａｒｍａｎ  ＲＪ，Ｋｉｍｂｅｒ  Ｉ：Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｃｏｌ  ２０１４，１１：９９−１０９．
［４０］Ｗａｎｇ  Ｘ，Ｍａｔｈｉｅｕ  Ｍ，Ｂｒｅｚｓｋｉ  ＲＪ：ＩｇＧ  Ｆｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｔｏ  ｍｏｄｕｌａｔｅ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｅｆｆｅｃｔｏｒ  ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｃｅｌｌ  ２０１８，９：６３−７３．
［４１］Ｙｕ  Ｌ，Ｗｕ  Ｘ，Ｃｈｅｎｇ  Ｚ，Ｌｅｅ  ＣＶ，Ｌｅｃｏｕｔｅｒ  Ｊ，Ｃａｍｐａ  Ｃ，Ｆｕｈ  Ｇ，Ｌｏｗｍａｎ  Ｈ，Ｆｅｒｒａｒａ  Ｎ：Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  ｂｅｔｗｅｅｎ  Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ  ａｎｄ  Ｍｕｒｉｎｅ  ＶＥＧＦ−Ａ：Ａ  Ｒｅａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ  ２００８，４９：５２２−７．
［４２］Ｌａｍｂｅｒｔ  Ｖ，Ｌｅｃｏｍｔｅ  Ｊ，Ｈａｎｓｅｎ  Ｓ，Ｂｌａｃｈｅｒ  Ｓ，Ｇｏｎｚａｌｅｚ  ＭＬ，Ｓｔｒｕｍａｎ  Ｉ，Ｓｏｕｎｎｉ  ＮＥ，Ｒｏｚｅｔ  Ｅ，ｄｅ  Ｔｕｌｌｉｏ  Ｐ，Ｆｏｉｄａｒｔ  ＪＭ，Ｒａｋｉｃ  ＪＭ，Ｎｏｅｌ  Ａ：Ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｃｈｏｒｏｉｄａｌ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒｉｚａｔｉｏｎ  ｍｏｄｅｌ  ｔｏ  ｓｔｕｄｙ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ２０１３，８：２１９７−２１１．
［４３］Ｈｅｉｅｒ  Ｊ．Ｓ．，Ｋｈｅｒａｎｉ  Ｓ．，Ｄｅｓａｉ  Ｓ．，Ｄｕｇｅｌ  Ｐ．，Ｋａｕｓｈａｌ  Ｓ．，Ｃｈｅｎｇ  Ｓ．Ｈ．，Ｄｅｌａｃｏｎｏ  Ｃ．，Ｐｕｒｖｉｓ  Ａ．，Ｒｉｃｈａｒｄｓ  Ｓ．，Ｌｅ−Ｈａｌｐｅｒｅ  Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔｒａｖｉｔｒｅｏｕｓ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＡＶ２−ｓＦＬＴ０１  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：ａ  ｐｈａｓｅ  １，ｏｐｅｎ−ｌａｂｅｌ  ｔｒｉａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ３９０，２０１７，５０−６１．
［４４］Ｈｅｉｅｒ  Ｒａｋｏｃｚｙ  Ｅ．Ｐ．，Ｌａｉ  Ｃ．Ｍ．，Ｍａｇｎｏ  Ａ．Ｌ．，Ｗｉｋｓｔｒｏｍ  Ｍ．Ｅ．，Ｆｒｅｎｃｈ  Ｍ．Ａ．，Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃ．Ｍ．，Ｓｃｈｗａｒｔｚ  Ｓ．Ｄ．，Ｂｌｕｍｅｎｋｒａｎｚ  Ｍ．Ｓ．，Ｃｈａｌｂｅｒｇ  Ｔ．Ｗ．，Ｄｅｇｌｉ−Ｅｓｐｏｓｔｉ  Ｍ．Ａ．  ａｎｄ  Ｃｏｎｓｔａｂｌｅ  Ｉ．Ｊ．，Ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｎｅｏｖａｓｃｕｌａｒ  ａｇｅ−ｒｅｌａｔｅｄ  ｍａｃｕｌａｒ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ：１  ｙｅａｒ  ｆｏｌｌｏｗ−ｕｐ  ｏｆ  ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ，Ｌａｎｃｅｔ  ３８６，２０１５，２３９５−２４０３．
【図１】
2021511061.tif 000003
【図２】
2021511061.tif 000004
【図３】
2021511061.tif 000005
【図４】
2021511061.tif 000006
【図５】
2021511061.tif 000007
【図６】
2021511061.tif 000008
【図７】
2021511061.tif 000009
【図８】
2021511061.tif 000010
【図９】
2021511061.tif 000011
【図１０】
2021511061.tif 000012
【図１１】
2021511061.tif 000013
【図１２】
2021511061.tif 000014
【図１３】
2021511061.tif 000015
【図１４】
2021511061.tif 000016
【図１５】
2021511061.tif 000017
【図１６】
2021511061.tif 000018
【図１７Ａ】
2021511061.tif 000019
【図１７Ｂ】
2021511061.tif 000020
【配列表】
2021511061000001.app
【国際調査報告】
2021511061.tif 000021
2021511061.tif 000022