(57)【要約】本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第一の核酸配列を含む第一のＡＡＶベクター及び第二の核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターを含み；第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第二の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；第一の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３５９７に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、第二の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み；第一の核酸配列及び第二の核酸配列はそれぞれ、他方と重複する配列の領域を含み；配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。疾患の予防または処置におけるＡＡＶベクターシステムの使用も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムであって、第一の核酸配列を含む第一のＡＡＶベクター及び第二の核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターを含み；
前記第一の核酸配列が、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、前記第二の核酸配列が、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、前記５’末端部分及び前記３’末端部分が一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；
前記第一の核酸配列が、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３５９７に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み；
前記第二の核酸配列が、配列番号１のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み；
前記第一の核酸配列及び前記第二の核酸配列がそれぞれ、他方と重複する配列の領域を含み；
配列重複の前記領域が、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む、前記ＡＡＶベクターシステム。
【請求項２】
配列重複の前記領域が、２０〜５５０ヌクレオチド長である、請求項１に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項３】
配列重複の前記領域が、５０〜２５０ヌクレオチド長である、請求項１に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項４】
配列重複の前記領域が、１７５〜２２５ヌクレオチド長である、請求項１に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項５】
配列重複の前記領域が、１９５〜２１５ヌクレオチド長である、請求項１に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項６】
配列重複の前記領域が、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約５０個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項７】
配列重複の前記領域が、少なくとも約７５個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項８】
配列重複の前記領域が、少なくとも約１００個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項９】
配列重複の前記領域が、少なくとも約１５０個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項１０】
配列重複の前記領域が、少なくとも約２００個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項１１】
配列重複の前記領域が、２０８個の連続ヌクレオチドを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項１２】
前記第一の核酸配列が、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、
前記第二の核酸配列が、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項１３】
前記第一の核酸配列が、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分に作動可能に連結されたＧＲＫ１プロモーターを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項１４】
前記第一の核酸配列が、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分に作動可能に連結されたＣＢＡプロモーターを含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項１５】
前記第一の核酸配列が、ＣＭＶエンハンサーをさらに含む、請求項１４に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項１６】
前記第一の核酸配列が、イントロン及びエクソンをさらに含む、請求項１４または１５に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項１７】
前記第一の核酸配列が、ＣＡＧプロモーターを含む、請求項１４〜１６のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項１８】
前記第一の核酸配列が、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分の上流に位置する非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項１９】
前記第二の核酸配列が、転写後応答要素（ＰＲＥ）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項２０】
前記第二の核酸配列が、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答要素（ＷＰＲＥ）を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項２１】
前記第二の核酸配列が、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項２２】
前記第一のＡＡＶベクターが、配列番号９の核酸配列を含み、前記第二のＡＡＶベクターが、配列番号１０の核酸配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項２３】
標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるための方法であって、機能性ＡＢＣＡ４タンパク質が前記標的細胞において発現されるように、前記標的細胞を、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターを用いて形質導入することを含む、前記方法。
【請求項２４】
ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分を含み、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの前記５’末端部分が、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる、核酸配列を含む、ＡＡＶベクター。
【請求項２５】
前記ＡＡＶベクターが、配列番号９の核酸配列を含む、請求項１１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２６】
ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの前記３’末端部分が、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる、核酸配列を含む、ＡＡＶベクター。
【請求項２７】
前記ＡＡＶベクターが、配列番号１０の核酸配列を含む、請求項１３に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２８】
前記第一の核酸配列または前記第二の核酸配列が、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
【請求項２９】
５’ＩＴＲをコードする前記配列が、血清型２ＡＡＶ（ＡＡＶ２）から単離または誘導された野生型配列を含む、請求項２８に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３０】
前記５’ＩＴＲをコードする前記配列が、配列番号２７の配列またはその欠失変異体を含む、請求項２８または２９に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３１】
３’ＩＴＲをコードする前記配列が、ＡＡＶ２から単離または誘導された野生型配列を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３２】
前記３’ＩＴＲをコードする前記配列が、配列番号３０の配列またはその欠失変異体を含む、請求項３１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３３】
前記欠失変異体が、１０、２０、３０、４０、５０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１４４ヌクレオチドまたは間の任意の数のヌクレオチドを含むまたはそれからなる、請求項３０または３２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３４】
前記欠失変異体が、１つまたは複数の欠失を含む、請求項３０、３２、または３３のいずれか１項に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３５】
前記欠失変異体が、少なくとも２つの欠失を含む、請求項３４に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３６】
前記少なくとも２つの欠失が、連続していない、請求項３５に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３７】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の第一の核酸配列を含む、核酸。
【請求項３８】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の第二の核酸配列を含む、核酸。
【請求項３９】
配列番号９の核酸配列を含むまたはそれからなる、核酸。
【請求項４０】
配列番号１０の核酸配列を含むまたはそれからなる、核酸。
【請求項４１】
請求項１〜３６のいずれか１項に記載の第一のＡＡＶベクター及び請求項１〜２６のいずれかに記載の第二のＡＡＶベクターを含む、キット。
【請求項４２】
請求項１〜３６のいずれかに記載のＡＡＶベクターシステム及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項４３】
遺伝子治療で使用するための、請求項１〜４２のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項４４】
遺伝子治療で使用するための、請求項４３に記載の医薬組成物。
【請求項４５】
網膜細胞の分解を特徴とする疾患の予防または処置に使用するための、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項４６】
シュタルガルト病の予防または処置に使用するための、請求項１〜３６のいずれか１項に記載のＡＡＶベクターシステム。
【請求項４７】
網膜細胞の分解を特徴とする疾患の予防または処置に使用するための、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４８】
シュタルガルト病の予防または処置に使用するための、請求項４２に記載の医薬組成物。
【請求項４９】
網膜細胞の分解を特徴とする疾患を予防または処置するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項１〜３６のいずれかに記載のＡＡＶベクターシステムを投与することを含む、前記方法。
【請求項５０】
網膜細胞の分解を特徴とする疾患を予防または処置するための方法であって、それを必要とする対象に、有効量の請求項４２に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５１】
前記疾患が、シュタルガルト病である、請求項４９または５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
この出願は、２０１８年４月５日に出願された仮特許出願ＵＳＳＮ６２／６５３，０８５、２０１８年８月１６日に出願されたＵＳＳＮ６２／７６５，１８１、２０１８年９月２１日に出願されたＵＳＳＮ６２／７３４，４７９、及び２０１８年１１月３０日に出願されたＵＳＳＮ６２／７７４，００４の利益を主張するものであり、そのそれぞれの内容は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【０００２】
配列表の組込み
２０１９年４月３日に作製された「ＮＩＧＨ−０１０／００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ．ｔｘｔ」という名称で２７９ＫＢのサイズのテキストファイルの内容は、参照によりその全体が本明細書に組込まれる。
【０００３】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステム及びＡＡＶベクターに関する。本開示のＡＡＶベクターシステム及びＡＡＶベクターは、シュタルガルト病などの網膜細胞の分解に関連する疾患の予防または処置に使用され得る。
【背景技術】
【０００４】
シュタルガルト病は、眼内の感光性光受容体細胞の破壊を通して失明をもたらし得る網膜の遺伝性疾患である。この疾患は、一般に、小児期に出現し、若年者に失明をもたらす。
【０００５】
シュタルガルト病の最も一般的な形態は、タンパク質ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー４（ＡＢＣＡ４）をコードする遺伝子における突然変異に連結する劣性疾患である。シュタルガルト病では、ＡＢＣＡ４遺伝子における突然変異により、網膜細胞内の機能性ＡＢＣＡ４タンパク質が欠如する。これは次にビスレチノイド副産物の形成と蓄積をもたらし、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞においてリポフスチンの毒性顆粒を産生する。これは、ＲＰＥ細胞の分解及び最終的には破壊を引き起こし、これにより視覚の進行性喪失及び最終的な失明を引き起こす光受容体の喪失がもたらされる。
【０００６】
シュタルガルト病の根本的な原因に対処する、シュタルガルト病への効果的な処置に対する長年にわたり満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第一の核酸配列を含む第一のＡＡＶベクター及び第二の核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターを含み；第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第二の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；第一の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３５９７に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、第二の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み；第一の核酸配列及び第二の核酸配列はそれぞれ、他方と重複する配列の領域を含み；配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。
【０００８】
配列重複の領域は、２０〜５５０ヌクレオチド長；好ましくは、５０〜２５０ヌクレオチド長；より好ましくは、１７５〜２２５ヌクレオチド長；そして最も好ましくは、１９５〜２１５ヌクレオチド長であり得る。
【０００９】
配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約５０個の連続ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約７５個の連続ヌクレオチド；より好ましくは、少なくとも約１００個の連続ヌクレオチド；さらにより好ましくは、少なくとも約１５０個の連続ヌクレオチド；そして最も好ましくは、少なくとも約２００個の連続ヌクレオチドも含み得る。
【００１０】
一部の実施形態では、第一の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３５９７からなる連続ヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、第二の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド３８０６〜６９２６からなる連続ヌクレオチドの配列を含む。
【００１１】
一部の実施形態では、第一の核酸配列は、配列番号２のヌクレオチド１０５〜３５９７からなる連続ヌクレオチドの配列を含む。一部の実施形態では、第二の核酸配列は、配列番号２のヌクレオチド３８０６〜６９２６からなる連続ヌクレオチドの配列を含む。
【００１２】
一部の実施形態では、配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５からなる核酸配列の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、配列重複の領域は、配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５からなる核酸配列の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５からなる核酸配列の少なくとも約５０個の連続ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約７５個の連続ヌクレオチド；より好ましくは、少なくとも約１００個の連続ヌクレオチド；さらにより好ましくは、少なくとも約１５０個の連続ヌクレオチド；そして最も好ましくは、少なくとも約２００個の連続ヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、配列重複の領域は、配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５からなる核酸配列の少なくとも約５０個の連続ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約７５個の連続ヌクレオチド；より好ましくは、少なくとも約１００個の連続ヌクレオチド；さらにより好ましくは、少なくとも約１５０個の連続ヌクレオチド；そして最も好ましくは、少なくとも約２００個の連続ヌクレオチドを含む。
【００１４】
一部の実施形態では、第一の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み；第二の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含む。
【００１５】
一部の実施形態では、第一の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５からなる連続ヌクレオチドの配列を含み；第二の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６からなる連続ヌクレオチドの配列を含む。
【００１６】
一部の実施形態では、第一の核酸配列は、配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５からなる連続ヌクレオチドの配列を含み；第二の核酸配列は、配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６からなる連続ヌクレオチドの配列を含む。
【００１７】
第一のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分に作動可能に連結されたＧＲＫ１プロモーターを含み得る。
【００１８】
第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分の上流に位置する非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み得る。
【００１９】
第二の核酸配列は、転写後応答要素（ＰＲＥ）；好ましくはウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答要素（ＷＰＲＥ）を含み得る。
【００２０】
第二の核酸配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化配列を含み得る。
【００２１】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるための方法を提供し、該方法は、機能性ＡＢＣＡ４タンパク質が標的細胞において発現されるように、標的細胞を、上記に定義する第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターを用いて形質導入するステップを含む。
【００２２】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。一部の実施形態では、このＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５からなる。一部の実施形態では、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５からなる。
【００２３】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。一実施形態では、このＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列を含む。一実施形態では、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６からなる。一実施形態では、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６からなる。
【００２４】
本開示は、上に定義する第一の核酸配列を含む核酸を提供する。
【００２５】
本開示は、上に定義する第二の核酸配列を含む核酸を提供する。
【００２６】
本開示は、配列番号９の核酸配列を含む核酸、及び配列番号１０の核酸配列を含む核酸を提供する。
【００２７】
本開示は、上記の通りのＡＡＶベクターシステム、または上記の通りの上流ＡＡＶベクター及び下流ＡＡＶベクターを含む、キットを提供する。
【００２８】
本開示は、上記の通りの、第一の核酸配列を含む核酸及び第二の核酸配列を含む核酸、または上記の通りの、配列番号９の核酸配列を含む核酸及び配列番号１０の核酸配列を含む核酸を含む、キットを提供する。
【００２９】
本開示は、上記の通りのＡＡＶベクターシステム及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００３０】
本開示は、網膜細胞の分解を特徴とする疾患の予防または処置に使用するため、好ましくはシュタルガルト病の予防または処置に使用するための、上記の通りのＡＡＶベクターシステム、上記の通りのキット、または上記の通りの医薬組成物を提供する。
【００３１】
本開示は、シュタルガルト病などの網膜細胞の分解を特徴とする疾患を予防または処置するための方法を提供し、それを必要とする対象に、有効量の上記の通りのＡＡＶベクターシステム、上記の通りのキット、または上記の通りの医薬組成物を投与することを含む。
【００３２】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第一の核酸配列を含む第一のＡＡＶベクター及び第二の核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターを含み；第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第二の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；第一の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３５９７に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列を含み；第二の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列を含み；第一の核酸配列及び第二の核酸配列はそれぞれ、他方と重複する配列の領域を含み；配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する核酸配列の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。
【００３３】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第一の核酸配列を含む第一のＡＡＶベクター及び第二の核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターを含み、第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第二の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列からなる。
【００３４】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列からなる。
【００３５】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列からなる。
【００３６】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第一の核酸配列を含む第一のＡＡＶベクター及び第二の核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターを含み；第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第二の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；第一の核酸配列は、配列番号２のヌクレオチド１０５〜３５９７に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列を含み；第二の核酸配列は、配列番号２のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列を含み；第一の核酸配列及び第二の核酸配列はそれぞれ、他方と重複する配列の領域を含み；配列重複の領域は、配列番号２のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する核酸配列の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。
【００３７】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第一の核酸配列を含む第一のＡＡＶベクター及び第二の核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターを含み、第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第二の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列からなる。
【００３８】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号２のヌクレオチド１０５〜３８０５に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列からなる。
【００３９】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号２のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する配列からなる。
【００４０】
本開示は、配列番号９に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する核酸配列を含む核酸、及び配列番号１０に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８、９９．９または１００％）配列同一性を有する核酸配列を含む核酸を提供する。
【００４１】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第一の核酸配列を含む第一のＡＡＶベクター及び第二の核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターを含み；第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第二の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；第一の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３５９７に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み；第二の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み；第一の核酸配列及び第二の核酸配列はそれぞれ、他方と重複する配列の領域を含み；配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。ＡＡＶベクターシステムの一部の実施形態では、配列重複の領域は、２０〜５５０ヌクレオチド長；好ましくは、５０〜２５０ヌクレオチド長；好ましくは１７５〜２２５ヌクレオチド長；または好ましくは１９５〜２１５ヌクレオチド長である。ＡＡＶベクターシステムの一部の実施形態では、配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約５０個の連続ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約７５個の連続ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約１００個の連続ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約１５０個の連続ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約２００個の連続ヌクレオチド；または好ましくは２０８個全ての連続ヌクレオチドを含む。
【００４２】
本開示のＡＡＶベクターシステムの一部の実施形態では、第一の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み；第二の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含む。
【００４３】
本開示のＡＡＶベクターシステムの一部の実施形態では、第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分に作動可能に連結されたＣＢＡプロモーターを含む。一部の実施形態では、第一の核酸配列は、イントロンをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、第一の核酸配列は、エクソンをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、第一の核酸配列は、イントロン及びエクソン（ＩｎｔＥｘ）をコードする配列をさらに含む。
【００４４】
本開示のＡＡＶベクターシステムの一部の実施形態では、第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分の上流に位置する非翻訳領域（ＵＴＲ）を含む。一部の実施形態では、ＵＴＲは、エンハンサーをコードする配列を含む。一部の実施形態では、エンハンサーをコードする配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から単離または誘導された配列（ＣＭＶエンハンサー）を含む。一部の実施形態では、エンハンサーをコードする配列は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から単離または誘導された配列（ＣＭＶエンハンサー）を含まない。
【００４５】
一部の実施形態では、第一の核酸配列は、イントロン及びエクソン（ＩｎｔＥｘ）をコードする配列ならびにＵＴＲをさらに含み、ここで、ＵＴＲは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）から単離または誘導された配列（ＣＭＶエンハンサー）を含まない。
【００４６】
本開示のＡＡＶベクターシステムの一部の実施形態では、第二の核酸配列は、転写後応答要素（ＰＲＥ）；好ましくはウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答要素（ＷＰＲＥ）を含む。
【００４７】
本開示のＡＡＶベクターシステムの一部の実施形態では、第二の核酸配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化配列を含む。
【００４８】
本開示のＡＡＶベクターシステムの一部の実施形態では、第一の核酸配列または第二の核酸配列は、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２ＡＡＶ（ＡＡＶ２）から単離または誘導された野生型配列を含む。一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、配列番号２７の配列またはその欠失変異体を含む。一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２から単離または誘導された野生型配列を含む。一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、配列番号３０の配列またはその欠失変異体を含む。一部の実施形態では、欠失変異体は、１０、２０、３０、４０、５０、７０、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１４４ヌクレオチドまたは間の任意の数のヌクレオチドを含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、欠失変異体は、１つまたは複数の欠失を含む。一部の実施形態では、欠失変異体は、少なくとも２つの欠失を含む。一部の実施形態では、少なくとも２つの欠失は連続していない。一部の実施形態では、１つまたは複数の欠失は、５’または３’末端のいずれかにてＩＴＲの短縮化を含む。一部の実施形態では、欠失変異体は、配列番号２７のヌクレオチドのいずれか１つの欠失を含む。一部の実施形態では、欠失変異体は、配列番号２７の、任意の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または間の任意の数のヌクレオチドの欠失を含む。一部の実施形態では、欠失変異体は、配列番号３０のヌクレオチドのいずれか１つの欠失を含む。一部の実施形態では、欠失変異体は、配列番号３０の、任意の２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または間の任意の数のヌクレオチドの欠失を含む。
【００４９】
本開示のＡＡＶベクターシステムの一部の実施形態では、第一の核酸配列または第二の核酸配列は、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２ＡＡＶ（ＡＡＶ２）から単離または誘導された野生型配列を含む。一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＡＡＡＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３６）の配列を含む。一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２から単離または誘導された野生型配列を含む。一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧ（配列番号３７）の配列を含む。
【００５０】
本開示のＡＡＶベクターシステムの一部の実施形態では、第一の核酸配列または第二の核酸配列は、５’逆位末端反復（ＩＴＲ）をコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列をさらに含む。一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、血清型２ＡＡＶ（ＡＡＶ２）から単離または誘導された野生型配列を含む。一部の実施形態では、５’ＩＴＲをコードする配列は、ＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＧＧＧＣＧＴＣＧＧＧＣＧＡＣＣＴＴＴＧＧＴＣＧＣＣＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＡＡＣＴＣＣＡＴＣＡＣＴＡＧＧＧＧＴＴＣＣＴ（配列番号３４）の配列を含む。一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＡＶ２から単離または誘導された野生型配列を含む。一部の実施形態では、３’ＩＴＲをコードする配列は、ＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＧＴＧＡＴＧＧＡＧＴＴＧＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＣＴＣＴＧＣＧＣＧＣＴＣＧＣＴＣＧＣＴＣＡＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧＣＣＴＣＡＧＴＧＡＧＣＧＡＧＣＧＡＧＣＧＣＧＣＡＧ（配列番号３５）の配列を含む。
【００５１】
本開示は、本開示のＡＡＶベクターを含む細胞を提供する。
【００５２】
本開示は、本開示のＡＡＶベクターをコードするヌクレオチドを含む細胞を提供する。
【００５３】
本開示は、本開示の組成物を含む細胞を提供する。
【００５４】
本開示の細胞の一部の実施形態では、細胞は、網膜細胞である。一部の実施形態では、細胞は、神経細胞である。一部の実施形態では、細胞は、光受容体細胞である。一部の実施形態では、細胞は、網膜色素上皮（ＲＰＥ）の六角形細胞である。
【００５５】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるための方法を提供し、該方法は、機能性ＡＢＣＡ４タンパク質が標的細胞において発現されるように、標的細胞を、本開示の第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターを用いて形質導入するステップを含む。
【００５６】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分を含む核酸配列を提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。
【００５７】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。
【００５８】
本開示は、本開示のＡＡＶベクターまたはＡＡＶベクターシステム及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む、医薬組成物を提供する。
【００５９】
本開示は、遺伝子治療において使用するための本開示の核酸、ベクター、ＡＡＶベクター、組成物、ＡＡＶベクターシステム、または医薬組成物を提供する。
【００６０】
本開示は、網膜細胞の分解を特徴とする疾患の予防または処置に使用するための、本開示の核酸、ベクター、ＡＡＶベクター、組成物、ＡＡＶベクターシステム、または医薬組成物を提供する。
【００６１】
本開示は、シュタルガルト病の予防または処置に使用するための、本開示の核酸、ベクター、ＡＡＶベクター、組成物、ＡＡＶベクターシステム、または医薬組成物を提供する。
【００６２】
本開示は、それを必要とする対象に、有効量の本開示の核酸、ベクター、ＡＡＶベクター、組成物、ＡＡＶベクターシステム、または医薬組成物を投与することを含む、網膜細胞の分解を特徴とする疾患を予防または処置するための方法を提供する。
【００６３】
本開示は、それを必要とする対象に、有効量の本開示の核酸、ベクター、ＡＡＶベクター、組成物、ＡＡＶベクターシステム、または医薬組成物を投与することを含む、シュタルガルト病を予防または処置するための方法を提供する。
【００６４】
本特許または出願書類は、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含有する。カラー図面（複数可）を伴う本特許または特許出願公開の複写は、要請及び必要な費用の支払いにより特許庁より提供されるだろう。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】組合わさって完全なＡＢＣＡ４導入遺伝子を形成する上流及び下流導入遺伝子構造を示す概略図である。
【図２】ＡＢＣＡ４重複デュアルベクターシステムを用いた形質導入後の導入遺伝子の結果の一連の図である。Ａは、上流及び下流導入遺伝子一本鎖ＤＮＡ形態を示す。Ｂは、これらを相補的な導入遺伝子上の相同性の領域を介して一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）によってアニーリングすることができることを示す。Ｃは、その後、完全に組換えられた大型導入遺伝子を生成することができることを示す。略語：ＣＤＳ＝コード配列；ＤＳＢ＝二本鎖切断；ＨＲ＝相同組換え；ＩＴＲ＝逆位末端反復；ｐＡ＝ポリＡシグナル；ＳＳＡ＝一本鎖アニーリング；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素。
【図３】追加のＵＴＲ配列を伴う（５’Ｃ）及び伴わない（Ｃ）デュアルベクター変異体Ｃを用いた注射６週後のＡｂｃａ４−／−網膜におけるＡＢＣＡ４タンパク質検出を示すプロットである。単位は、非注射ＫＯ試料と対比した倍率増加を表す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析、テューキーの事後検定、ｐ＝＊＊０．００９。
【図４】重複する上流及び下流デュアルベクターを示す概略図、ならびに注射Ａｂｃａ４−／−眼（ｎ＝４）からのデュアルベクター変異体の重複ゾーンにまたがる領域を標的とするＡＢＣＡ４の増幅を示すゲルである。上流導入遺伝子のＡＢＣＡ４  ＣＤＳと結合する順方向プライマー及び下流導入遺伝子のＡＢＣＡ４  ＣＤＳと結合する逆方向プライマーを使用して、組換え導入遺伝子からの転写産物を増幅した。アンプリコンを配列決定して、正しいＡＢＣＡ４  ＣＤＳが転写産物の重複領域にわたって含有されていることを確認した。Ｂ／Ｃ＝デュアルベクター変異体ＢまたはＣを注射した眼（表２を参照されたい）；５’Ｂ＝上流導入遺伝子が５’ＵＴＲを含有するデュアルベクター変異体Ｂを注射した眼；Ｂｘ＝下流導入遺伝子がＷＰＲＥを伴わないデュアルベクター変異体Ｂを注射した眼；ＣＤＳ＝コード配列；ＧＦＰ＝ＧＲＫ１．ＧＦＰ．ｐＡ  ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆを注射した眼；ＫＯ＝非注射Ａｂｃａ４−／−眼；Ｕｐ＝上流Ｂのみを注射した眼；Ｕｐ＋Ｄｏ＝上流ベクターのみを注射した眼及び下流ベクターのみを注射した眼からのプールされたｃＤＮＡ；＋＝ＡＢＣＡ４プラスミド対照。
【図５】重複する上流及び下流デュアルベクターを示す一連の図、ならびにデュアルベクター５’Ｃ注射Ａｂｃａ４−／−プール網膜（ｎ＝４）からの５’ＵＴＲスプライシングを確認するＰＣＲ産物のゲルである。ＧＲＫ１転写開始部位（ＴＳＳ）のすぐ下流に結合する順方向プライマー及び上流ＡＢＣＡ４  ＣＤＳ内で結合する逆方向プライマーを使用して、デュアルベクターＣ注射眼及びデュアルベクター５’Ｃ注射眼（上記の変異体）からの転写産物形態を評価した。デュアルベクターＣ注射眼からのＡＢＣＡ４転写産物は、元来の参照配列を表す単一のアンプリコンを生成した。デュアルベクター５’Ｃ注射眼からの転写産物は、３つの定義される産物を生成し、これらを配列決定し、スプライスされていない、部分的にスプライスされた、完全にスプライスされた変異体であることが確認された。
【図６】ＷＰＲＥを伴う及び伴わないデュアルベクター変異体Ｂで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からの完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出を示すグラフである。ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆデュアルベクター変異体Ｂ（Ｂ）を用いて処置された試料は、ＷＰＲＥを伴わないデュアルベクター変異体Ｂ（Ｂｘ）を用いて処置されたものよりも多くのＡＢＣＡ４を生成した（対応のない両側パラメトリックｔ検定、ｎ＝３、＊ｐ＝０．０１、Ｆ（２，２）＝１７．０６）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図７】重複変異体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＸを構成するデュアルベクター上流及び下流導入遺伝子からのタンパク質産生を示す一対のプロットである。Ａは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで異なる重複ゾーンベクター変異体を用いた形質導入後のＡＢＣＡ４タンパク質検出を示す。Ｂは、ｉｎ  ｖｉｖｏで異なる重複ゾーンベクター変異体を用いた形質導入後のＡＢＣＡ４タンパク質検出を示す。単位は、未処置試料と対比した倍率増加を表す（−＝未処置ＨＥＫ２９３Ｔ細胞；ＫＯ＝非注射Ａｂｃａ４−／−網膜）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。一元配置分散分析、テューキーの事後解析により、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでは、デュアルベクター変異体Ｂ及びＣが、全ての他の試料よりも多くのＡＢＣＡ４タンパク質を生成したが、Ｂ及びＣ間に有意差はなかったことが明らかになった。ｉｎ  ｖｉｖｏでは、デュアルベクター変異体Ｃが、全ての他の変異体（Ｂを除く）よりも多くのＡＢＣＡ４タンパク質を生成したことが明らかとなった。
【図８Ａ】ＡＢＣＡ４発現を見る一対のゲルである。非組換え下流ベクターを用いて処置されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞において検出可能な短縮型ＡＢＣＡ４タンパク質変異体。
【図８Ｂ】デュアルベクター５’Ｂまたは５’Ｃを注射したＡｂｃａ４−／−網膜試料において検出された短縮型及び完全長のＡＢＣＡ４タンパク質。
【図８Ｃ】ＡＢＣＡ４発現を見る表である。表は、注射網膜のウエスタンブロットによって検出された総ＡＢＣＡ４タンパク質集団に存在する完全長ＡＢＣＡ４の割合（％）を表す。
【図８Ｄ】ＡＢＣＡ４発現を見るプロットである。転写産物及びタンパク質レベルでの重複Ｃデュアルベクター変異体注射網膜及び重複Ｂデュアルベクター変異体注射網膜間のＡＢＣＡ４発現の倍率変化の差。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図９Ａ】デュアルベクター上流及び下流変異体Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｇ、及びＸを示す図、ならびに異なるデュアルベクター重複変異体からのＡＢＣＡ４発現のレベルを示す、ゲル及びプロットである。上流及び下流ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆ  ＡＢＣＡ４デュアルベクターの最適な組合わせの評価を示す。完全長及び短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）のレベルは、デュアルベクターシステムの重複領域により影響された。完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）／試料に正規化され、未処置陰性対照試料を超えるレベルとして表した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のデュアルベクター形質導入は、完全長ＡＢＣＡ４の生成に成功した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆデュアルベクター形質導入は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＡＢＣＡ４のレベルに対する重複領域の有意な影響を同定した（一元配置分散分析、ｎ＝６、ｐ＜０．０００１、Ｆ（６，３５）＝１２．８１）。変異体Ａは、変異体Ｆ及びＸよりも有意に多くのＡＢＣＡ４を生成し、変異体Ｂ及びＣは、変異体Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＸよりも有意に多くのＡＢＣＡ４を生成した（一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定、Ａ＊ｐ≦０．０３、Ｂ＊＊＊ｐ≦０．０００２、Ｃ＊ｐ≦０．０４）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図９Ｂ】異なるデュアルベクター重複変異体からのＡＢＣＡ４発現のレベルを示す、ゲル及びプロットである。上流及び下流ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆ  ＡＢＣＡ４デュアルベクターの最適な組合わせの評価を示す。完全長及び短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）のレベルは、デュアルベクターシステムの重複領域により影響された。完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）／試料に正規化され、未処置陰性対照試料を超えるレベルとして表した。Ａｂｃａ４−／−マウスに、ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆデュアルベクター変異体を網膜下注射し、ＡＢＣＡ４発現を、注射６週後に評価した。重複領域は、検出されたＡＢＣＡ４のレベルに影響した（一元配置分散分析、ｎ＝３〜１６、ｐ＝０．００１、Ｆ（６，３６）＝４．４５３）。十分に機能している変異体（５’Ｃ）の用量を１×１０９から１×１０１０（５’Ｃ＋）ゲノムコピー／眼に増加させることで、ＡＢＣＡ４のレベルが改善した（一元配置分散分析、５’Ｃ対５’Ｃ＋＊＊ｐ＝０．００６）。イントロンを伴わない（Ｂ、Ｃ、Ｄ）及び伴う（５’Ｂ、５’Ｃ、５’Ｄ）変異体を注射した眼のグループ化解析により、重複領域の影響を確認し、ＡＢＣＡ４発現レベルに対するイントロンの影響を同定した（二元配置分散分析、重複ｐ＝０．０１、イントロンｐ＝０．０４、相互作用  有意差無し）。
【図９Ｃ】異なるデュアルベクター重複変異体からのＡＢＣＡ４発現のレベルを示す、ゲル及びプロットである。上流及び下流ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆ  ＡＢＣＡ４デュアルベクターの最適な組合わせの評価を示す。完全長及び短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）のレベルは、デュアルベクターシステムの重複領域により影響された。完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）／試料に正規化され、未処置陰性対照試料を超えるレベルとして表した。下流導入遺伝子構築物でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）の生成が、導入遺伝子変異体により影響され（クラスカルウォリス、ｎ＝６、ｐ＝０．０００３）、変異体Ａ及びＢのみが、検出可能なレベルのｔＡＢＣＡ４を生成することを明らかにした。
【図９Ｄ】異なるデュアルベクター重複変異体からのＡＢＣＡ４発現のレベルを示す、プロットである。上流及び下流ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆ  ＡＢＣＡ４デュアルベクターの最適な組合わせの評価を示す。完全長及び短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）のレベルは、デュアルベクターシステムの重複領域により影響された。（ａ）からの処置細胞における完全長及びｔＡＢＣＡ４形態の割合（％）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；Ｄｏ＝下流導入遺伝子変異体；ＧＡＰＤＨ＝グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ｔＡＢＣＡ４＝短縮型ＡＢＣＡ４；ＵＴＣ＝非形質導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞；５’＝上流導入遺伝子にイントロンを含有するデュアルベクター変異体；５’Ｃ＋＝全ての他の試料の１０倍の用量でのデュアルベクター変異体５’Ｃ（１×１０１０ゲノムコピー／眼）。
【図９Ｅ】異なるデュアルベクター重複変異体からのＡＢＣＡ４発現のレベルを示す、プロットである。上流及び下流ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆ  ＡＢＣＡ４デュアルベクターの最適な組合わせの評価を示す。完全長及び短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）のレベルは、デュアルベクターシステムの重複領域により影響された。完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）／試料に正規化され、未処置陰性対照試料を超えるレベルとして表した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のデュアルベクター形質導入は、完全長ＡＢＣＡ４の生成に成功した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆデュアルベクター形質導入は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成されたＡＢＣＡ４のレベルに対する重複領域の有意な影響を同定した（一元配置分散分析、ｎ＝６、ｐ＜０．０００１、Ｆ（６，３５）＝１２．８１）。変異体Ａは、変異体Ｘよりも有意に多くのＡＢＣＡ４を生成し、変異体Ｂ及びＣは、変異体Ｘよりも有意に多くのＡＢＣＡ４を生成した（一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定、Ａ＊＊ｐ＝０．００４、Ｂ＊＊＊ｐ＜０．０００１、Ｃ＊＊＊ｐ≦０．０００４）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図９Ｆ】異なるデュアルベクター重複変異体からのＡＢＣＡ４発現のレベルを示す、ゲルである。上流及び下流ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆ  ＡＢＣＡ４デュアルベクターの最適な組合わせの評価を示す。完全長及び短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）のレベルは、デュアルベクターシステムの重複領域により影響された。デュアルベクター重複変異体ＩｎＣを、Ａｂｃａ４−／−マウス眼に注射し、注射６週後に完全長ＡＢＣＡ４の一貫した検出が達成された（ｎ＝１眼／レーン）。＋＝ｐＣＡＧ．ＡＢＣＡ４でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞；ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；Ｄｏ＝下流ベクターのみを注射したＡｂｃａ４−／−眼；ＧＡＰＤＨ＝グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ；Ｉｎ＝上流ベクターにイントロンを含有するデュアルベクター変異体；ＫＯ＝非注射Ａｂｃａ４−／−眼；Ｕｐ＝上流ベクターのみを注射したＡｂｃａ４−／−眼；ＵＴＣ＝非形質導入ＨＥＫ２９３Ｔ細胞；ＷＴ＝ＳＶＥＶ  １２９野生型眼。
【図１０Ａ】非組換え下流ベクターからの短縮型ＡＢＣＡ４検出を示すゲル及びプロットである。短縮型ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、ＧＡＰＤＨ／試料に正規化され、未処置陰性対照を超えるレベルとして表す。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）産生の評価のために、異なる下流導入遺伝子を有するプラスミドでトランスフェクトした。検出されたｔＡＢＣＡ４のレベルは、下流導入遺伝子変異体により影響された（一元配置分散分析、ｎ＝３、ｐ＜０．０００１、Ｆ（７，１６）＝９７．０４）。下流変異体Ａは、変異体Ｂｘ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＸよりも多くのｔＡＢＣＡ４を生成し、変異体Ｂは、全ての他の下流変異体よりも多くのｔＡＢＣＡ４を生成した（一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定、＊ｐ＜０．０１／＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
【図１０Ｂ】非組換え下流ベクターからの短縮型ＡＢＣＡ４検出を示すプロットである。短縮型ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、ＧＡＰＤＨ／試料に正規化され、未処置陰性対照を超えるレベルとして表す。ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆデュアルベクター変異体Ａ〜Ｄで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から同定された完全長ＡＢＣＡ４及びｔＡＢＣＡ４形態の割合（％）を示す。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図１１】Ａは、デュアルベクター重複変異体を示す図、ならびに上流導入遺伝子に５’ＵＴＲを伴う場合と伴わない場合の４つのデュアルベクター変異体のＡｂｃａ４−／−眼における網膜下注射後のＡＢＣＡ４検出を比較するゲル及びプロットである。各導入遺伝子に含まれているＡＢＣＡ４コード配列（配列番号１１）のヌクレオチドを示す。完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、ＧＡＰＤＨ／試料に正規化され、未処置陰性対照試料を超えるレベルとして表した。ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆ変異体を注射したＡｂｃａ４−／−眼を、注射６週後に評価し、ＡＢＣＡ４レベルは、５’ＵＴＲを上流導入遺伝子に追加したときに評価した（二元配置分散分析、ｎ＝３（Ｂｘ／５’Ｄ）、５（Ｂ／Ｃ）、６（５’Ｂｘ／Ｄ）、７（５’Ｂ／５’Ｃ）、５’ＵＴＲの影響ｐ＝０．０３、重複の影響ｐ＝０．００５、相互作用  有意差無し、ｎｓ）。Ｂは、Ａｂｃａ４−／−眼における網膜下注射後のＡＢＣＡ４検出を比較するプロットである。完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、ＧＡＰＤＨ／試料に正規化され、未処置陰性対照試料を超えるレベルとして表した。完全長ＡＢＣＡ４対短縮型ＡＢＣＡ４を、最適化したデュアルベクター変異体５’Ｃの２Ｅ＋１０総ゲノムコピーを網膜下注射したＡｂｃａ４−／−眼から検出し、２Ｅ＋９総ゲノムコピーを受けた眼と比較した。（対応のないノンパラメトリックマンホイットニー検定、ｎ＝９＆１７、＊ｐ＝０．０１）。
【図１２Ａ】インフレームＡＵＧコドンの前にアウトオブフレームＡＵＧコドンを有する重複Ｃ配列を示す図である。
【図１２Ｂ】重複ゾーンＣ及びＢの予測二次構造を示す図である。
【図１３】上流ベクターのみで処置された試料から単離されたＡＢＣＡ４転写産物を示す図、プロット（１３Ａ）及びゲル（１３Ｂ）である。図は、上流導入遺伝子変異体Ｂからのヌクレオチド配列のセグメントを示す。ＳｗａＩ部位からの配列は、全ての上流導入遺伝子変異体で一貫しており、潜在的なクリプティックポリＡシグナルの特徴を強調表示する。Ａは、ＷＴまたはコドン最適化ＡＡＶ２／２上流ベクターを用いて処置されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞からのＡＢＣＡ４転写産物の検出を示す（ｎ＝１）。Ｂは、上流ベクターのみを注射したＡｂｃａ４−／−眼から単離されたＡＢＣＡ４転写産物を示し（ｎ＝４）、ＲＴ  ＰＣＲによって転写産物長さに関して評価した。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの始めにて結合する順方向プライマー及びＳｗａＩ部位を超えて結合する逆方向プライマーを使用した。ＣＯ＝コドン最適化ＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含有する上流ＡＡＶ２／２ベクターを用いて処置されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞；ＫＯ＝Ａｂｃａ４−／−眼；Ｏｖ＝重複ＰＣＲ；Ｕｐ＝上流ＰＣＲ；ＷＴ＝野生型ＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含有する上流ＡＡＶ２／２ベクターを用いて処置されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞。
【図１４】単一ベクターを注射したＡｂｃａ４−／−眼からのＡＢＣＡ４  ｍＲＮＡ転写の検出を示す一連のプロットである。Ａは、上流ベクター変異体Ｂまたは５’Ｂ（５’ＵＴＲを含む）のみを注射した眼からのＡＢＣＡ４転写産物検出を示す。上流ベクターＢに５’ＵＴＲ配列を含めると、検出されたＡＢＣＡ４転写産物のレベルが減少した（対応のない両側ｔ検定、ｎ＝３〜４、＊＊＊ｐ＝０．０００３）。Ｂは、下流ベクターＢからＷＰＲＥを削除（Ｂｘ）すると、単一ベクター注射眼から検出されたＡＢＣＡ４転写産物のレベルが減少したことを示す（クラスカルウォリス、ダンの多重比較検定、ｎ＝３、＊ｐ＝０．０３）。Ｂ／Ｃ＝上流または下流ベクター変異体ＢまたはＣを注射した眼（表２を参照されたい）；５’Ｂ＝追加の５’ＵＴＲ配列を伴う上流ベクターＢを注射した眼；Ｂｘ＝ＷＰＲＥを伴わない下流ベクターＢを注射した眼。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図１５Ａ】上流ベクターのみで処置した試料からの短縮型ＡＢＣＡ４タンパク質の不在を示す２つのゲル及びプロットである。ＨＥＫ２９３Ｔ試料を、ＦＬＡＧタグ付き上流導入遺伝子を有するプラスミドでトランスフェクトし、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの上流領域に向けられたプライマーを使用してＡＢＣＡ４転写産物の存在について評価した（グラフ及びＲＴ−ＰＣＲの上のパネル）。ＡＢＣＡ４転写産物は豊富であった（ｎ＝３）が、ウエスタンブロットにより短縮型タンパク質は検出されなかった。ｐＤ＝下流導入遺伝子プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞；ｐＦ＝ＦＬＡＧタグ付き上流導入遺伝子プラスミドでトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞；ＵＴＣ＝トランスフェクトしたＨＥＫ２９Ｔ細胞；＋＝陽性対照。
【図１５Ｂ】上流ベクターのみで処置した試料からの短縮型ＡＢＣＡ４タンパク質の不在を示す２つのゲル及びプロットである。Ａｂｃａ４−／−眼に、ＦＬＡＧタグ付き上流ベクターＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆを注射し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの上流領域に向けられたプライマーを使用してＡＢＣＡ４  ｍＲＮＡ転写産物の存在について評価した（グラフ及びＲＴ−ＰＣＲの上のパネル）。ＡＢＣＡ４転写産物は、上流ベクターのみを注射した眼において豊富であった（ｎ＝２）が、ウエスタンブロットにより短縮型タンパク質は検出されなかった。エラーバーは、ＳＥＭを表す。Ｄ＝下流ベクターのみを注射した眼；Ｆ＝ＦＬＡＧタグ付き上流ベクターのみを注射した眼；ＫＯ＝非注射Ａｂｃａ４−／−眼；−＝空のレーン；＋＝陽性対照。
【図１６】注射６週後に回収されたＡｂｃａ４−／−網膜における光受容体細胞の外節におけるＡＢＣＡ４（緑）の染色を示す一連の画像である。ＨＣＮ１（赤）染色は、内節をマークする。ＷＴ網膜における天然Ａｂｃａ４局在の染色例も含まれており、非注射Ａｂｃａ４−／−網膜には染色がないという証拠も含まれている。
【図１７】野生型（ＷＴ）及びＡｂｃａ４−／−眼におけるＡｂｃａ４／ＡＢＣＡ４（緑）及びＨｃｎ１（赤）染色を示す一連の画像である。
【図１８】野生型（ＷＴ）及びＡｂｃａ４−／−眼の光受容体細胞外節におけるＡｂｃａ４／ＡＢＣＡ４（緑）及びロドプシン（赤）染色を示す一連の画像である。
【図１９】野生型（ＷＴ）及びＡｂｃａ４−／−眼におけるａｂｃａ４／ＡＢＣＡ４（緑）及びロドプシン（赤）頂端ＲＰＥ染色の一連の画像である。右下の囲んだ画像は、野生型（ＷＴ）及びＡｂｃａ４−／−眼におけるＧＦＰ（緑）及びロドプシン（赤）頂端ＲＰＥ染色を図示す。
【図２０】ＡＢＣＡ４のＣ末端に対して向けられたポリクローナル抗体を使用して外節タンパク質ＡＢＣＡ４（緑）に関して及び内節マーカータンパク質Ｈｃｎ１（赤）に関して（Ａ〜Ｆ）、またはＲｈｏ（赤）（Ｇ〜Ｈ）もしくはＡＢＣＡ４単独（Ｉ〜Ｊ）に関して染色されたマウス眼の切片の一連の２８個の画像である。核は、ヘキスト（青）で染色した。ＡＢＣＡ４は、光受容体外節をマークし、Ｈｃｎ１は、内節を標識する。全ての眼は、４〜５週齢で注射され、注射６週後に回収した。Ａは、ＷＴ  ＳＶＥＶ  １２９の光受容体外節におけるＡＢＣＡ４染色を示す；Ｂは、非注射Ａｂｃａ４−／−眼におけるＡＢＣＡ４染色の不在を示す；Ｃは、上流ベクター注射Ａｂｃａ４−／−眼におけるＡｂｃａ４／ＡＢＣＡ４の不在を示す；Ｄは、下流ベクター注射Ａｂｃａ４−／−眼におけるＡＢＣＡ４染色の不在を示す；Ｅ〜Ｆは、デュアルベクター注射Ａｂｃａ４−／−眼（２つの異なる眼）の光受容体外節におけるＡＢＣＡ４染色を示す；Ｇは、ＷＴ  ＳＶＥＶ  １２９の光受容体外節におけるＲｈｏ及びＡｂｃａ４共局在を示す；Ｈは、デュアルベクター注射Ａｂｃａ４−／−眼の光受容体外節におけるＲｈｏ及びＡＢＣＡ４共局在を示す；Ｉは、注射６ヶ月後の下流ベクター注射Ａｂｃａ４−／−眼におけるＡＢＣＡ４染色の不在を示す；Ｊは、注射６ヶ月後のデュアルベクター注射Ａｂｃａ４−／−の光受容体外節におけるＡＢＣＡ４染色を示す。Ａｂｃａ４／ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；デュアル＝デュアルベクター注射Ａｂｃａ４−／−眼；下流＝下流ベクター注射Ａｂｃａ４−／−；Ｈｃｎ１＝過分極活性化環状ヌクレオチドゲートカリウムチャネル１；ＩＳ＝内節；ＫＯ＝Ａｂｃａ４−／−；ＯＮＬ＝外核層；ＯＳ＝外節；ＲＰＥ＝網膜色素上皮；上流＝上流ベクター注射Ａｂｃａ４−／−；ＷＴ＝ＳＶＥＶ  １２９野生型。上流ＫＯ（５’末端に単一ＡＡＶベクター）、下流ＫＯ（３’末端から単一ＡＡＶベクター）は、予想通りＡＢＣＡ４生成を示さないが、デュアルＫＯ（組合わせたＡＡＶベクター）は、強いＡＢＣＡ４タンパク質発現につながる（Ｆ及びＨ）。
【図２１】注射Ａｂｃａ４−／−眼におけるＡＢＣＡ４染色（緑）及びロドプシン染色（赤）を示す一連の８個の画像である。核は、ヘキストで染色した。Ａは、注射６ヶ月後の下流ベクターのみを注射したＡｂｃａ４−／−眼におけるＡＢＣＡ４染色の不在を示す。Ｂは、注射６ヶ月後のデュアルベクター注射Ａｂｃａ４−／−眼の光受容体外節におけるＡＢＣＡ４染色を示す。Ｃは、ＡＡＶ２／２  ＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡ注射Ａｂｃａ４−／−眼におけるＲＰＥ  ＧＦＰ発現を示す。Ｄは、ＷＴ  ＳＶＥＶ  １２９におけるＲＰＥ細胞の頂端領域におけるＲｈｏ及びＡｂｃａ４の共局在を示す。Ｅは、デュアルベクター注射Ａｂｃａ４−／−におけるＲＰＥ細胞の頂端領域におけるＲｈｏ及びＡＢＣＡ４の共局在を示す。Ｆは、非注射Ａｂｃａ４−／−におけるＲＰＥ細胞の頂端領域におけるＲｈｏ染色を示す。Ａｂｃａ４／ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；デュアル＝デュアルベクター注射Ａｂｃａ４−／−；ＫＯ＝Ａｂｃａ４−／−；Ｒｈｏ＝ロドプシン；ＲＰＥ＝網膜色素上皮；ＷＴ＝ＳＶＥＶ  １２９野生型。白い矢印は、ＲＰＥ細胞の頂端領域におけるＡｂｃａ４／ＡＢＣＡ４及びＲｈｏの共局在を示す。
【図２２】例示的な重複ベクターを示す図である。
【図２３】正常なレチノイドサイクルを図の左手側に示す図である。Ａｂｃａ４欠損マウス及びヒトにおいて増強された程度で生じるビスレチノイド及びＡ２Ｅの生成を右側に示す。図の右手側で囲まれて強調表示されている分子は、Ａｂｃａ４−／−マウスにおいて評価した。（実施例６）。
【図２４】偽注射または処置注射を与えた１３匹のＡｂｃａ４−／−マウスの対となる眼におけるビスレチノイド及びＡ２Ｅアイソフォームのレベルのプロットである。偽眼及び処置眼間でビスレチノイド及びＡ２Ｅレベルにおける低減が観察された（ｐ＝０．０１７、Ｆ＝５．８４９）。さらに、全てのビスレチノイド及びＡ２Ｅ測定値に関して、最低レベルはデュアルベクター処置眼において見られた。（実施例６）。
【図２５Ａ】対となる偽（Ａ）注射眼と比較して最適化されたデュアルベクター（処置）を注射されたＡｂｃａ４−／−眼におけるビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルを示すプロットである。例示的なクロマトグラムトレースを、偽注射眼に関して示す。
【図２５Ｂ】対となる偽（Ａ）注射眼と比較して最適化されたデュアルベクター（処置）を注射されたＡｂｃａ４−／−眼におけるビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルを示す表である。標識されたピークを表に示す。
【図２５Ｃ】対となる偽（Ａ）注射眼と比較して最適化されたデュアルベクター（処置）を注射されたＡｂｃａ４−／−眼におけるビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルを示すプロットである。例示的なクロマトグラムトレースを、処置注射眼に関して示す。
【図２５Ｄ】対となる偽（Ａ）注射眼と比較して最適化されたデュアルベクター（処置）を注射されたＡｂｃａ４−／−眼におけるビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルを示すプロットである。偽注射を受けたものと比較したデュアルベクター処置を受けた眼からのビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルを示す。ビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルにおける減少は、偽注射を受けた眼と比較して、デュアルベクター処置を受けた眼において観察された（値が一致する二元配置分散分析、ｎ＝１３、処置効果ｐ＝０．０３、Ｆ（１，６０）＝４．５１６）。対となる眼におけるＡ２ＰＥ−Ｈ２レベル間の差も観察された（二元配置分散分析、シダックの多重比較検定、ｎ＝１３、ｐ＝０．０１）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ａｔＲＡＬｄｉ−ＰＥ＝オールトランスレチナール二量体ホスファチジルエタノールアミン；Ａ２ＰＥ−Ｈ２＝ジ−ヒドロ−Ａ２ＰＥ；Ａ２ＰＥ＝Ｎ−レチニリデン−Ｎ−レチニルホスファチジルエタノールアミン；Ａ２Ｅ＝コンジュゲートしたＮ−レチニリデン−Ｎ−レインチルホスファチジルエタノールアミン；ｉｓｏ−Ａ２Ｅ＝Ａ２Ｅの二重結合異性体；ＷＴ＝ＳＶＥＶ  １２９対照。
【図２６】上流ベクター用量対照（偽）を注射した眼と比較した、デュアルベクター（処置）を注射したＡｂｃａ４−／−眼におけるビスレチノイド及びＡ２Ｅレベルの減少を示すプロットである。マウスの２つの群（ｎ＝１１）は、一方の眼に処置または偽注射を与え、対となる眼は注射しないままとした。ビスレチノイド及びＡ２Ｅのレベルを、注射３ヶ月後に各眼で評価し、眼間のレベル／マウスの倍率変化として表した。偽群と比較した処置群におけるビスレチノイド及びＡ２Ｅレベルの倍率変化の差を同定した（二元配置分散分析、ｎ＝１１、ｐ＝０．０５、Ｆ（１，１００）＝３．６９５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図２７】Ａは、それぞれが、一方の眼に２Ｅ＋１０総ゲノムコピーのデュアルベクターを（処置、左画像）、対側の眼にＰＢＳ注射（偽、右画像）を受けた、注射６ヶ月後のＡｂｃａ４−／−マウスからのリポフスチン関連４８８ｎｍ及びメラニン関連７９０ｎｍの自家蛍光平均グレー値を示す、一連の画像である。Ｂは、それぞれが、一方の眼に２Ｅ＋１０総ゲノムコピーのデュアルベクターを（処置、左画像）、対側の眼にＰＢＳ注射（偽、右画像）を受けた、注射６ヶ月後のＡｂｃａ４−／−マウスからのリポフスチン関連４８８ｎｍ及びメラニン関連７９０ｎｍの自家蛍光平均グレー値を示す、プロットである。４つの偽注射野生型ＳＶＥＶ  １２９眼の平均グレー値の平均と比較した平均グレー値の差。デュアルベクター処置により、注射６ヶ月後のＡｂｃａ４−／−マウスにおけるリポフスチン及びメラニン関連自家蛍光が減少した（一元配置分散分析、ｎ＝１２、処置の影響ｐ＝０．０１、Ｆ（１，２）＝６．７６２）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。４８８ｎｍ＝リポフスチン関連自家蛍光；７９０ｎｍ＝メラニン関連自家蛍光；Ｓｈａｍ＝ＰＢＳ注射Ａｂｃａ４−／−；処置＝デュアルベクター注射Ａｂｃａ４−／−マウス；ＷＴ＝野生型ＳＶＥＶ  １２９マウス。
【図２８Ａ】野生型（ＷＴ）またはコドン最適化（ＣＯ）ＡＢＣＡ４コード配列を用いた処置後のＡＢＣＡ４タンパク質検出を示すゲル及びプロットである。完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、ＧＡＰＤＨ／試料に正規化され、未処置陰性対照試料を超えるレベルとして表した。ＷＴまたはＣＯ  ＡＢＣＡ４コード配列を含有すること以外は同一であるプラスミドを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトし、その後のＡＢＣＡ４タンパク質レベルにおける差を決定した（両側の対応のないｔ検定、ｎ＝４、＊＊＊ｐ＝０．０００２、Ｆ（３，３）＝２．９７３）。
【図２８Ｂ】野生型（ＷＴ）またはコドン最適化（ＣＯ）ＡＢＣＡ４コード配列を用いた処置後のＡＢＣＡ４タンパク質検出を示すゲル及びプロットである。完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、ＧＡＰＤＨ／試料に正規化され、未処置陰性対照試料を超えるレベルとして表した。ＷＴまたはＣＯ  ＡＢＣＡ４コード配列を含有すること以外は同一であるＡＡＶ２／２重複デュアルベクターを使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をトランスフェクトしたが、その後のＡＢＣＡ４タンパク質レベルにおいて差は観察されなかった（両側の対応のないｔ検定、ｎ＝３、Ｆ（２，２）＝１８．７４）。
【図２８Ｃ】野生型（ＷＴ）またはコドン最適化（ＣＯ）ＡＢＣＡ４コード配列を用いた処置後のＡＢＣＡ４タンパク質検出を示す一連のゲル及びプロットである。完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、ＧＡＰＤＨ／試料に正規化され、未処置陰性対照試料を超えるレベルとして表した。Ａｂｃａ４−／−マウスに、ＷＴまたはＣＯ  ＡＢＣＡ４コード配列のいずれかを含有するＡＡＶ２／８重複デュアルベクターを網膜下注射した。デュアルベクターシステムにおいて使用したコード配列は、検出されたＡＢＣＡ４のレベルに影響を有した（二元配置分散分析、ｎ＝８〜９、コード配列の影響ｐ＝０．０４、時点の影響  有意差無し、相互作用ｐ＝０．０１）。注射６週後、ＷＴ注射眼は、ＣＯ注射眼よりも多くのＡＢＣＡ４を有し（二元配置分散分析、シダックの多重比較検定、＊＊ｐ＝０．００５）、ＷＴ注射眼におけるＡＢＣＡ４検出は、注射２週後よりも６週後で高かった（二元配置分散分析、シダックの多重比較検定、＊ｐ＝０．０５）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；ＣＯ＝コドン最適化ＡＢＣＡ４コード配列を含有する導入遺伝子を用いて処置した試料；ＣＯｄ＝ＣＯ下流ベクターを注射した眼；ＣＯｕ＝ＣＯ上流ベクターを注射した眼；ＧＡＰＤＨ＝グリセルアルデヒド３−リン酸デヒドロゲナーゼ；ＫＯ＝非注射Ａｂｃａ４−／−網膜ライセート；ｔＡＢＣＡ４＝短縮型ＡＢＣＡ４；ＵＴＣ＝非形質導入ＨＫＥ２９３Ｔ細胞ライセート；ＷＴ＝野生型ＡＢＣＡ４コード配列を含有する導入遺伝子を用いて処置した試料；ＷＴｄ＝ＷＴ下流ベクターを注射した眼；ＷＴｕ＝ＷＴ上流ベクターを注射した眼；＋＝ＡＢＣＡ４でトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞ライセート。
【図２９】同一の導入遺伝子を有するＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／８  Ｙ７７３Ｆデュアルベクターを注射したＡｂｃａ４−／−眼におけるＡＢＣＡ４発現レベルの比較を示すプロットである。ｍＲＮＡ転写産物を、Ａｂｃａ４−／−注射網膜から、注射６週後に単離し、ｃＤＮＡに対してｑＰＣＲ解析を行った。ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆデュアルベクター注射眼からより多くのＡＢＣＡ４転写産物が検出された（マンホイットニー両側検定、ｎ＝４、＊＊＊ｐ＝０．０００２）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【図３０Ａ】ＡＢＣＡ４デュアルベクターシステムの開発の図である。導入遺伝子及びベクターキャプシドの遺伝子要素及び構造ならびに用量など、ベクター設計の異なる態様を検討及び評価した。
【図３０Ｂ】ＡＢＣＡ４デュアルベクターシステムの開発の図である。重複する長さが異なるデュアルベクター変異体を比較して、２つの導入遺伝子間の組換えに最適な領域を決定した。ＡＡＶ＝アデノ随伴ウイルス；ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；Ｄｏ＝下流導入遺伝子変異体；ＧＲＫ１＝ヒトロドプシンキナーゼプロモーター；Ｉｎ＝イントロン；ＩＴＲ＝逆位末端反復；ｐＡ＝ポリＡシグナル；Ｕｐ＝上流導入遺伝子変異体；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素。
【図３１Ａ−１】実験のフローチャート（上段）、２つの例示的なクロマトグラフトレース、ピークの表（中段）及びプロット（下）であり、注射された処置Ａｂｃａ４−／−眼のビスレチノイド蓄積及び眼底自家蛍光における減少として観察されたデュアルベクター治療効果を示す。データは、Ａｂｃａ４−／−マウスモデルにおけるデュアルベクター治療効果の証拠を示す。デュアルベクター治療効果は、注射３ヶ月後に、処置されたＡｂｃａ４−／−眼のビスレチノイド蓄積における減少として観察された。例示的なクロマトグラムトレースを、上流ベクター（偽）及びデュアルベクター（処置）注射眼に関して示す。ＷＴ眼のビスレチノイドレベルは、参照のためにのみグラフに提示し、解析には含まなかった。偽注射を受けた眼と比較して、デュアルベクター処置を受けた眼では、ビスレチノイドレベルの有意な減少が観察された（値が一致する二元配置分散分析、ｎ＝１３、処置の効果ｐ＝０．０３、Ｆ（１，６０）＝４．５１６）。対となる眼のＡ２ＰＥ−Ｈ２レベル間の有意差も観察された（二元配置分散分析、シダックの多重比較検定、ｎ＝１３、＊ｐ＝０．０１）。自家蛍光の増加は、シュタルガルト病の初期の特徴である。７９０ｎｍ自家蛍光は、Ａｂｃａ４−／−眼において経時的に増加したが、対となるＰＢＳ（偽）注射眼と比較して、デュアルベクター（処置）を受けた眼において観察された増加には有意差があった（対応のあるｔ検定、ｎ＝１２、＊ｐ＝０．０４）。デュアルベクター治療効果は、注射６ヶ月後に、７９０ｎｍ自家蛍光の減少として観察された。Ａｂｃａ４−／−眼を、注射３ヶ月及び６ヶ月後に、走査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）により画像化し、対となるＰＢＳ（偽）注射眼と比較して、デュアルベクター（処置）を受けた眼において７９０ｎｍ自家蛍光は有意に減少した（対応のあるｔ検定、ｎ＝１２、＊ｐ＝０．０４）。デュアルベクター処置マウスは、生理食塩水を注射した対照と比較して、網膜の自家蛍光の減少を示す。マウスは、成体初期（＜３ヶ月）に処置し、網膜自家蛍光イメージング（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ）は、３ヶ月及び６ヶ月に行った。
【図３１Ａ−２】実験のフローチャート（上段）、２つの例示的なクロマトグラフトレース、ピークの表（中段）及びプロット（下）であり、注射された処置Ａｂｃａ４−／−眼のビスレチノイド蓄積及び眼底自家蛍光における減少として観察されたデュアルベクター治療効果を示す。データは、Ａｂｃａ４−／−マウスモデルにおけるデュアルベクター治療効果の証拠を示す。デュアルベクター治療効果は、注射３ヶ月後に、処置されたＡｂｃａ４−／−眼のビスレチノイド蓄積における減少として観察された。例示的なクロマトグラムトレースを、上流ベクター（偽）及びデュアルベクター（処置）注射眼に関して示す。ＷＴ眼のビスレチノイドレベルは、参照のためにのみグラフに提示し、解析には含まなかった。偽注射を受けた眼と比較して、デュアルベクター処置を受けた眼では、ビスレチノイドレベルの有意な減少が観察された（値が一致する二元配置分散分析、ｎ＝１３、処置の効果ｐ＝０．０３、Ｆ（１，６０）＝４．５１６）。対となる眼のＡ２ＰＥ−Ｈ２レベル間の有意差も観察された（二元配置分散分析、シダックの多重比較検定、ｎ＝１３、＊ｐ＝０．０１）。自家蛍光の増加は、シュタルガルト病の初期の特徴である。７９０ｎｍ自家蛍光は、Ａｂｃａ４−／−眼において経時的に増加したが、対となるＰＢＳ（偽）注射眼と比較して、デュアルベクター（処置）を受けた眼において観察された増加には有意差があった（対応のあるｔ検定、ｎ＝１２、＊ｐ＝０．０４）。デュアルベクター治療効果は、注射６ヶ月後に、７９０ｎｍ自家蛍光の減少として観察された。Ａｂｃａ４−／−眼を、注射３ヶ月及び６ヶ月後に、走査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）により画像化し、対となるＰＢＳ（偽）注射眼と比較して、デュアルベクター（処置）を受けた眼において７９０ｎｍ自家蛍光は有意に減少した（対応のあるｔ検定、ｎ＝１２、＊ｐ＝０．０４）。デュアルベクター処置マウスは、生理食塩水を注射した対照と比較して、網膜の自家蛍光の減少を示す。マウスは、成体初期（＜３ヶ月）に処置し、網膜自家蛍光イメージング（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ）は、３ヶ月及び６ヶ月に行った。
【図３１Ｂ】偽及び処置眼の一連の１２個の画像（上）及びプロット（下）であり、注射された処置Ａｂｃａ４−／−眼のビスレチノイド蓄積及び眼底自家蛍光における減少として観察されたデュアルベクター治療効果を示す。データは、Ａｂｃａ４−／−マウスモデルにおけるデュアルベクター治療効果の証拠を示す。自家蛍光の増加は、シュタルガルト病の初期の特徴である。７９０ｎｍ自家蛍光は、Ａｂｃａ４−／−眼において経時的に増加したが、対となるＰＢＳ（偽）注射眼と比較して、デュアルベクター（処置）を受けた眼において観察された増加には有意差があった（対応のあるｔ検定、ｎ＝１２、＊ｐ＝０．０４）。デュアルベクター治療効果は、注射６ヶ月後に、７９０ｎｍ自家蛍光の減少として観察された。Ａｂｃａ４−／−眼を、注射３ヶ月及び６ヶ月後に、走査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）により画像化し、対となるＰＢＳ（偽）注射眼と比較して、デュアルベクター（処置）を受けた眼において７９０ｎｍ自家蛍光は有意に減少した（対応のあるｔ検定、ｎ＝１２、＊ｐ＝０．０４）。デュアルベクター処置マウスは、生理食塩水を注射した対照と比較して、網膜の自家蛍光の減少を示す。マウスは、成体初期（＜３ヶ月）に処置し、網膜自家蛍光イメージング（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ）は、３ヶ月及び６ヶ月に行った。
【図３１Ｃ】偽及び処置眼の追加の４個の画像であり、注射された処置Ａｂｃａ４−／−眼のビスレチノイド蓄積及び眼底自家蛍光における減少として観察されたデュアルベクター治療効果を示す。データは、Ａｂｃａ４−／−マウスモデルにおけるデュアルベクター治療効果の証拠を示す。自家蛍光の増加は、シュタルガルト病の初期の特徴である。７９０ｎｍ自家蛍光は、Ａｂｃａ４−／−眼において経時的に増加したが、対となるＰＢＳ（偽）注射眼と比較して、デュアルベクター（処置）を受けた眼において観察された増加には有意差があった（対応のあるｔ検定、ｎ＝１２、＊ｐ＝０．０４）。デュアルベクター治療効果は、注射６ヶ月後に、７９０ｎｍ自家蛍光の減少として観察された。Ａｂｃａ４−／−眼を、注射３ヶ月及び６ヶ月後に、走査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）により画像化し、対となるＰＢＳ（偽）注射眼と比較して、デュアルベクター（処置）を受けた眼において７９０ｎｍ自家蛍光は有意に減少した（対応のあるｔ検定、ｎ＝１２、＊ｐ＝０．０４）。デュアルベクター処置マウスは、生理食塩水を注射した対照と比較して、網膜の自家蛍光の減少を示す。マウスは、成体初期（＜３ヶ月）に処置し、網膜自家蛍光イメージング（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ）は、３ヶ月及び６ヶ月に行った。
【図３１Ｄ】追加のプロットであり、注射された処置Ａｂｃａ４−／−眼のビスレチノイド蓄積及び眼底自家蛍光における減少として観察されたデュアルベクター治療効果を示す。データは、Ａｂｃａ４−／−マウスモデルにおけるデュアルベクター治療効果の証拠を示す。自家蛍光の増加は、シュタルガルト病の初期の特徴である。７９０ｎｍ自家蛍光は、Ａｂｃａ４−／−眼において経時的に増加したが、対となるＰＢＳ（偽）注射眼と比較して、デュアルベクター（処置）を受けた眼において観察された増加には有意差があった（対応のあるｔ検定、ｎ＝１２、＊ｐ＝０．０４）。デュアルベクター治療効果は、注射６ヶ月後に、７９０ｎｍ自家蛍光の減少として観察された。Ａｂｃａ４−／−眼を、注射３ヶ月及び６ヶ月後に、走査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）により画像化し、対となるＰＢＳ（偽）注射眼と比較して、デュアルベクター（処置）を受けた眼において７９０ｎｍ自家蛍光は有意に減少した（対応のあるｔ検定、ｎ＝１２、＊ｐ＝０．０４）。デュアルベクター処置マウスは、生理食塩水を注射した対照と比較して、網膜の自家蛍光の減少を示す。マウスは、成体初期（＜３ヶ月）に処置し、網膜自家蛍光イメージング（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｓｐｅｃｔｒａｌｉｓ）は、３ヶ月及び６ヶ月に行った。（Ｅ）比較のために、視神経のすぐ下の強調表示した領域を、高倍率で示している。ａｔＲＡＬｄｉ−ＰＥ＝オールトランスレチナール二量体ホスファチジルエタノールアミン；Ａ２ＰＥ−Ｈ２＝ジ−ヒドロ−Ａ２ＰＥ；Ａ２ＰＥ＝Ｎ−レチニリデン−Ｎ−レチニルホスファチジルエタノールアミン；Ａ２Ｅ＝コンジュゲートしたＮ−レチニリデン−Ｎ−レインチルホスファチジルエタノールアミン；ｉｓｏ−Ａ２Ｅ＝Ａ２Ｅの二重結合異性体；ＳＬＯ＝走査型レーザー検眼鏡；ＷＴ＝ＳＶＥＶ  １２９年齢一致対照。
【図３２Ａ】注射されたＡｂｃａ４−／−眼（ｎ＝４、プール）からのＡＢＣＡ４のＲＴ−ＰＣＲを示す図及びゲルであり、組換え導入遺伝子からの転写産物が、イントロンの除去に成功した重複領域にて正しいコード配列を有したことを確認した。上流導入遺伝子によって提供されるＡＢＣＡ４  ＣＤＳと結合する順方向プライマー及び下流導入遺伝子のＡＢＣＡ４  ＣＤＳと結合する逆方向プライマーを使用して、組換え導入遺伝子からの転写産物を増幅した。アンプリコンの配列を決定して、転写産物の重複領域にわたって正しいＡＢＣＡ４  ＣＤＳが含有されていることを確認した。
【図３２Ｂ】注射されたＡｂｃａ４−／−眼（ｎ＝４、プール）からのＡＢＣＡ４のＲＴ−ＰＣＲを示す図及びゲルであり、組換え導入遺伝子からの転写産物が、イントロンの除去に成功した重複領域にて正しいコード配列を有したことを確認した。予測されたＧＲＫ１転写開始部位（ＴＳＳ）の下流と結合する順方向プライマー及び上流ＡＢＣＡ４  ＣＤＳ内で結合する逆方向プライマーを使用して、デュアルベクターＣ注射眼及びデュアルベクター５’Ｃ注射眼からの転写産物形態を評価した。デュアルベクターＣ注射眼からのＡＢＣＡ４転写産物は、元来の参照配列を表す単一のアンプリコンを生成した。デュアルベクター５’Ｃ注射眼からの転写産物は、３つの定義される産物を生成し、これらを配列決定し、スプライスされていない、部分的にスプライスされている及び完全にスプライスされている変異体であると確認した。ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；Ｂ／Ｃ＝デュアルベクター変異体ＢまたはＣを注射した眼（表２を参照されたい）；５’Ｂ＝上流導入遺伝子がイントロンを含有するデュアルベクター変異体Ｂを注射した眼；ＣＤＳ＝コード配列；ＧＦＰ＝ＧＲＫ１．ＧＦＰ．ｐＡ  ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆを注射した眼；ＩＴＲ＝逆位末端反復；ＫＯ＝非注射Ａｂｃａ４−／−眼；ｐＡ＝ポリＡシグナル；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素；Ｕｐ＝Ｕｐ１のみを注射した眼；Ｕｐ＋Ｄｏ＝上流ベクターのみを注射した眼及び下流ベクターのみを注射した眼からのプールされたｃＤＮＡ；＋＝ＡＢＣＡ４プラスミド対照。
【図３３】ＡＢＣＡ４上流配列の発現を駆動するために使用できるプロモーター及び追加の配列の図である。ＲＫ＝ＧＲＫ１プロモーター、ＩｎｔＥｘ＝イントロン及びエクソン配列、ＣＭＶ＝サイトメガロウイルス初期エンハンサー；ＣＢＡ＝ニワトリベータアクチンプロモーター；ＳＡ／ＳＤ＝スプライスアクセプター及びスプライスドナー。
【図３４】ＡＢＣＡ４上流配列またはＧＦＰを発現するために使用したＡＡＶベクターの図である。ＩＴＲ＝逆位末端反復、ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素、ＧＦＰ＝緑色蛍光タンパク質、ＩｎｔＥｘ＝イントロン及びエクソン配列、ＣＢＡ＝ニワトリベータアクチンプロモーター、ＣＭＶ＝サイトメガロウイルスエンハンサー、ＲＫ＝ロドプシンキナーゼプロモーター（ＧＲＫ１プロモーター）、ＲＢＧ＝ウサギベータグロビン、ＳＡ／ＳＤ＝スプライスアクセプター及びスプライスドナー配列。
【図３５−１】ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１７）。
【図３５−２】ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１７）。
【図３６−１】ＣＭＶＣＢＡ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１８）。
【図３６−２】ＣＭＶＣＢＡ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１８）。
【図３７−１】ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１９）。
【図３７−２】ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１９）。
【図３７−３】ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号１９）。
【図３８−１】ＣＡＧ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号２０）。
【図３８−２】ＣＡＧ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号２０）。
【図３８−３】ＣＡＧ．ＧＦＰ．ｐＡベクターの配列である（配列番号２０）。
【図３９−１】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２１）。
【図３９−２】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２１）。
【図３９−３】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２１）。
【図４０−１】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２２）。
【図４０−２】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２２）。
【図４０−３】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２２）。
【図４０−４】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２２）。
【図４０−５】ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２２）。
【図４１−１】ＡＡＶ．５’ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２３）。
【図４１−２】ＡＡＶ．５’ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２３）。
【図４１−３】ＡＡＶ．５’ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２３）。
【図４１−４】ＡＡＶ．５’ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクターの配列である（配列番号２３）。
【図４２】本開示の例示的なＡＢＣＡ４発現構築物を示す一連の概略図である。
【図４３−１】ｐＡＡＶ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎ（配列番号２６）のＩＴＲからＩＴＲ部分の配列であり、５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＲＫプロモーターをコードする配列（配列番号２８）、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）イントロン／エクソン（Ｉｎｔ／Ｅｘ）をコードする配列（配列番号３９）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の５’部分をコードする配列（配列番号２９）、及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３０）を含む。
【図４３−２】ｐＡＡＶ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎ（配列番号２６）のＩＴＲからＩＴＲ部分の配列であり、５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＲＫプロモーターをコードする配列（配列番号２８）、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）イントロン／エクソン（Ｉｎｔ／Ｅｘ）をコードする配列（配列番号３９）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の５’部分をコードする配列（配列番号２９）、及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３０）を含む。
【図４４−１】ｐＡＡＶ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎのＩＴＲからＩＴＲ部分の配列（配列番号３０）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の３’部分をコードする配列（配列番号３１）、ＷＰＲＥをコードする配列（配列番号３２）、ｂＧＨポリＡをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３３）を含む。
【図４４−２】ｐＡＡＶ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎのＩＴＲからＩＴＲ部分の配列（配列番号３０）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の３’部分をコードする配列（配列番号３１）、ＷＰＲＥをコードする配列（配列番号３２）、ｂＧＨポリＡをコードする配列及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３３）を含む。
【図４５】中期シュタルガルト病患者の眼の眼底の画像である。
【図４６】Ｓｅａｒｓ  ｅｔ  ａｌ．ＴＶＳＴ  ６（５）：６（２０１７）から適応した図であり、光受容体細胞におけるＡＢＣＡ４の局在及びレチノイドサイクル（視覚サイクルと呼ばれることもある）を示す。ＡＢＣＡ４は、桿体及び錐体光受容体の外節円盤膜に局在する。ＯＳ、感光性外節；ＣＣ、結合線毛；ＩＳ、内節。
【図４７】Ａ〜Ｃは、二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）によってコードされる導入遺伝子の１本鎖センス及びアンチセンスＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）への変換、及びＡＡＶウイルス粒子におけるｓｓＤＮＡのキャプシド形成を示す一連の図である。
【図４８Ａ】核によるセンス及びアンチセンスｓｓＤＮＡを含有するＡＡＶウイルス粒子の取り込みを示す図である。
【図４８Ｂ】ウイルス粒子からのセンス及びアンチセンス鎖の放出を示す図である。
【図４８Ｃ】ｄｓＤＮＡを再生するための相補鎖の合成を示す図である。
【図４８Ｄ】導入遺伝子の転写を示す図である。
【図４９Ａ】一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通したＡＡＶデュアルベクターシステムにおける大型導入遺伝子のキャプシド形成、形質導入、及び再形成を示す一連の図である。大型導入遺伝子は、最初はｄｓＤＮＡとしてコードされている。
【図４９Ｂ】一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通したＡＡＶデュアルベクターシステムにおける大型導入遺伝子のキャプシド形成、形質導入、及び再形成を示す一連の図である。大型導入遺伝子は、最初はｄｓＤＮＡとしてコードされている。
【図４９Ｃ】一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通したＡＡＶデュアルベクターシステムにおける大型導入遺伝子のキャプシド形成、形質導入、及び再形成を示す一連の図である。続いて、大型導入遺伝子の重複する５’及び３’断片のｓｓＤＮＡは、ＡＡＶウイルス粒子によってキャプシド形成される。大型導入遺伝子の５’及び３’断片の相補鎖を含むウイルス粒子が生成され、これらのｓｓＤＮＡは、相補的な重複配列の領域を含む（赤で示す）。この例では、５’断片のアンチセンスｓｓＤＮＡ及び３’のセンス鎖が示されている。
【図４９Ｄ】一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通したＡＡＶデュアルベクターシステムにおける大型導入遺伝子のキャプシド形成、形質導入、及び再形成を示す一連の図である。ｓｓＤＮＡを含むＡＡＶ粒子が形質導入される。
【図４９Ｅ】一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通したＡＡＶデュアルベクターシステムにおける大型導入遺伝子のキャプシド形成、形質導入、及び再形成を示す図である。ｓｓＤＮＡがウイルス粒子から核へと放出される。
【図４９Ｆ】一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通したＡＡＶデュアルベクターシステムにおける大型導入遺伝子のキャプシド形成、形質導入、及び再形成を示す図である。５’及び３’断片は、核環境において相補的な重複配列でハイブリダイズする。
【図４９Ｇ】一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通したＡＡＶデュアルベクターシステムにおける大型導入遺伝子のキャプシド形成、形質導入、及び再形成を示す図である。大型導入遺伝子全体のｄｓＤＮＡが第二鎖合成を通して生成される。
【図４９Ｈ】一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通したＡＡＶデュアルベクターシステムにおける大型導入遺伝子のキャプシド形成、形質導入、及び再形成を示す図である。このｄｓＤＮＡがその後転写され、導入遺伝子が発現する。
【図５０】本開示のＡＢＣＡ４重複デュアルベクターシステムの概要である。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入遺伝子の要素を、「上流」及び「下流」の２つの独立した導入遺伝子に分割した。上流導入遺伝子は、プロモーター及びＡＢＣＡ４コード配列の上流断片を含み、下流導入遺伝子は、ＡＢＣＡ４コード配列の下流断片に加えてＷＰＲＥ及びウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ｐＡシグナルを有した。示している最適化された重複デュアルベクターシステムでは、両方の導入遺伝子は、ＡＢＣＡ４コード配列塩基３，４９４〜３，７０１から形成された２０７ｂｐ領域の重複を有した。同じ宿主細胞核内に入ると、２つの導入遺伝子は整列し、重複領域を介して組換えする。ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；ＧＲＫ１＝ヒトロドプシンキナーゼプロモーター；Ｉｎ＝イントロン；ＩＴＲ＝逆位末端反復；ｐＡ＝ポリＡシグナル；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素。
【図５１】試験したデュアルベクターの組合わせの導入遺伝子の詳細を示す表である。最後の行には、最適化された重複デュアルベクターシステムの詳細を含有した。ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；ｂｐ＝塩基対；ＣＤＳ＝コードＤＮＡ配列；ＧＲＫ１＝ヒトロドプシンキナーゼプロモーター；ｐＡ＝ポリＡシグナル；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素。
【図５２−１】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＲ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４０）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４１）、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド１７６〜３５０９、配列番号４２）、ＷＰＲＥをコードする配列（ヌクレオチド３５１６〜４１０８、配列番号４３）、ＢＧＨポリＡをコードする配列（ヌクレオチド４１１５〜４２７８、配列番号４４）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４４２２〜４５４２、配列番号４５）を含む。
【図５２−２】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＲ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４０）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４１）、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド１７６〜３５０９、配列番号４２）、ＷＰＲＥをコードする配列（ヌクレオチド３５１６〜４１０８、配列番号４３）、ＢＧＨポリＡをコードする配列（ヌクレオチド４１１５〜４２７８、配列番号４４）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４４２２〜４５４２、配列番号４５）を含む。
【図５２−３】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＲ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４０）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４１）、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド１７６〜３５０９、配列番号４２）、ＷＰＲＥをコードする配列（ヌクレオチド３５１６〜４１０８、配列番号４３）、ＢＧＨポリＡをコードする配列（ヌクレオチド４１１５〜４２７８、配列番号４４）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４４２２〜４５４２、配列番号４５）を含む。
【図５２−４】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＲ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４０）であり、５’ＩＴＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４１）、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド１７６〜３５０９、配列番号４２）、ＷＰＲＥをコードする配列（ヌクレオチド３５１６〜４１０８、配列番号４３）、ＢＧＨポリＡをコードする配列（ヌクレオチド４１１５〜４２７８、配列番号４４）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４４２２〜４５４２、配列番号４５）を含む。
【図５３−１】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＩｎＥｘ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４６）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４７）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号４８）、イントロンをコードする配列（ヌクレオチド４６８〜５９０、配列番号４９）、エクソンをコードする配列（ヌクレオチド５９１〜６３０、配列番号５０）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド６５０〜４３５１、配列番号５１）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４３８９〜４５０９、配列番号５２）を含む。
【図５３−２】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＩｎＥｘ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４６）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４７）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号４８）、イントロンをコードする配列（ヌクレオチド４６８〜５９０、配列番号４９）、エクソンをコードする配列（ヌクレオチド５９１〜６３０、配列番号５０）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド６５０〜４３５１、配列番号５１）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４３８９〜４５０９、配列番号５２）を含む。
【図５３−３】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＩｎＥｘ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４６）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４７）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号４８）、イントロンをコードする配列（ヌクレオチド４６８〜５９０、配列番号４９）、エクソンをコードする配列（ヌクレオチド５９１〜６３０、配列番号５０）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド６５０〜４３５１、配列番号５１）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４３８９〜４５０９、配列番号５２）を含む。
【図５３−４】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＩｎＥｘ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号４６）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４７）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号４８）、イントロンをコードする配列（ヌクレオチド４６８〜５９０、配列番号４９）、エクソンをコードする配列（ヌクレオチド５９１〜６３０、配列番号５０）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド６５０〜４３５１、配列番号５１）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４３８９〜４５０９、配列番号５２）を含む。
【図５４−１】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＲＢＧ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５３）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号５４）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号５５）、ＲＧＢイントロンをコードする配列（ヌクレオチド７０４〜８７６、配列番号５６）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド９１９〜４６２０、配列番号５７）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６５８〜４７７８、配列番号５８）を含む。
【図５４−２】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＲＢＧ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５３）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号５４）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号５５）、ＲＧＢイントロンをコードする配列（ヌクレオチド７０４〜８７６、配列番号５６）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド９１９〜４６２０、配列番号５７）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６５８〜４７７８、配列番号５８）を含む。
【図５４−３】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＲＢＧ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５３）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号５４）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号５５）、ＲＧＢイントロンをコードする配列（ヌクレオチド７０４〜８７６、配列番号５６）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド９１９〜４６２０、配列番号５７）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６５８〜４７７８、配列番号５８）を含む。
【図５４−４】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＲＢＧ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５３）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号５４）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号５５）、ＲＧＢイントロンをコードする配列（ヌクレオチド７０４〜８７６、配列番号５６）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド９１９〜４６２０、配列番号５７）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６５８〜４７７８、配列番号５８）を含む。
【図５５−１】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５９）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６０）、ＣＭＶエンハンサーをコードする配列（ヌクレオチド３２２〜５５６、配列番号６１）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド５７１〜８４９、配列番号６２）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド８５６〜４５５７、配列番号６３）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４５９５〜４７１５、配列番号６４）を含む。
【図５５−２】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５９）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６０）、ＣＭＶエンハンサーをコードする配列（ヌクレオチド３２２〜５５６、配列番号６１）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド５７１〜８４９、配列番号６２）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド８５６〜４５５７、配列番号６３）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４５９５〜４７１５、配列番号６４）を含む。
【図５５−３】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５９）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６０）、ＣＭＶエンハンサーをコードする配列（ヌクレオチド３２２〜５５６、配列番号６１）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド５７１〜８４９、配列番号６２）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド８５６〜４５５７、配列番号６３）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４５９５〜４７１５、配列番号６４）を含む。
【図５５−４】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号５９）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６０）、ＣＭＶエンハンサーをコードする配列（ヌクレオチド３２２〜５５６、配列番号６１）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド５７１〜８４９、配列番号６２）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド８５６〜４５５７、配列番号６３）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４５９５〜４７１５、配列番号６４）を含む。
【図５６−１】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６５）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６６）、ＲＫプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１８６〜３８４、配列番号６７）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド５７６〜４２６７、配列番号６８）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４２７５〜４４２５、配列番号６９）を含む。
【図５６−２】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６５）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６６）、ＲＫプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１８６〜３８４、配列番号６７）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド５７６〜４２６７、配列番号６８）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４２７５〜４４２５、配列番号６９）を含む。
【図５６−３】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６５）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６６）、ＲＫプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１８６〜３８４、配列番号６７）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド５７６〜４２６７、配列番号６８）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４２７５〜４４２５、配列番号６９）を含む。
【図５６−４】例示的なプラスミドｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎの注釈付き配列（配列番号６５）であり、５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６６）、ＲＫプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１８６〜３８４、配列番号６７）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド５７６〜４２６７、配列番号６８）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４２７５〜４４２５、配列番号６９）を含む。
【図５７】内節、外節、またはそれらの組合わせの光受容体細胞を含む、対象の網膜細胞を直接視覚化するための例示的なＡＯＳＬＯシステムを示す概略図である。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
配列表
配列番号１  ヒトＡＢＣＡ４核酸配列。配列番号１、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３５０．２に対応。
【００６７】
配列番号２  ヒトＡＢＣＡ４核酸配列変異体。配列番号２は、以下の突然変異：ヌクレオチド１６４０Ｇ＞Ｔ、ヌクレオチド５２７９Ｇ＞Ａ、ヌクレオチド６１７３Ｔ＞Ｃを除いて、配列番号１と同一である。
【００６８】
配列番号３  ５’ＩＴＲ、プロモーター、ＣＤＳ、３’ＩＴＲを含む、上流ベクター配列の例。
【００６９】
配列番号４  ５’ＩＴＲ、ＣＤＳ、転写後応答要素、ポリアデニル化配列、３’ＩＴＲを含む、下流ベクター配列の例。
【００７０】
配列番号５  ＧＲＫ１プロモーター配列。
【００７１】
配列番号６  ＵＴＲ配列。
【００７２】
配列番号７  ウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答要素（ＷＰＲＥ）。
【００７３】
配列番号８  ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列。
【００７４】
配列番号９  プロモーター、ＣＤＳを含む、部分的な上流ベクター配列の例。
【００７５】
配列番号１０  ＣＤＳ、転写後応答要素、ポリアデニル化配列を含む、部分的な下流ベクター配列の例。
【００７６】
配列番号１１  ヒトＡＢＣＡ４  ｃＤＮＡ配列。この配列は、ＮＭ＿０００３５０．２（配列番号１）のヌクレオチド１０５〜６９２６に対応する。
【００７７】
配列番号１２  ＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列。この配列は、ＧｅｎＢａｎｋレコードＡＦ５１３８５２．１のＡＡＶ８キャプシドタンパク質配列に対応する。
【００７８】
配列番号１３  イントロン。
【００７９】
配列番号１４  エクソン。
【００８０】
配列番号１５  ＣＭＶエンハンサー。
【００８１】
配列番号１６  ＣＢＡプロモーター。
【００８２】
配列番号１７  ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＧＦＰ．ポリ（Ａ）ベクター配列。
【００８３】
配列番号１８  ＣＭＶＣＢＡ．ＧＦＰ．ポリ（Ａ）ベクター配列。
【００８４】
配列番号１９  ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＧＦＰ．ポリ（Ａ）ベクター配列。
【００８５】
配列番号２０  ＣＡＧ．ＧＦＰ．ポリ（Ａ）ベクター配列。
【００８６】
配列番号２１  ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．Ｉｎ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクター配列。
【００８７】
配列番号２２  ＡＡＶ．５’ＣＭＶＣＢＡ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクター配列。
【００８８】
配列番号２３  ＡＡＶ．５’ＣＢＡ．ＩｎｔＥｘ．ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎベクター配列。
【００８９】
配列番号２４  ＣＢＡプロモーター。
【００９０】
配列番号２５  ウシ成長ホルモンポリアデニル化配列。
【００９１】
配列番号２６  ５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＲＫプロモーターをコードする配列（配列番号２８）、ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）イントロン／エクソン（Ｉｎｔ／Ｅｘ）をコードする配列（配列番号３９）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の５’部分をコードする配列（配列番号２９）、及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３０）を含む、ｐＡＡＶ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎのＩＴＲからＩＴＲ部分。
【００９２】
配列番号２７  例示的な５’ＩＴＲをコードする配列
【００９３】
配列番号２８  ＲＫプロモーターをコードする配列
【００９４】
配列番号２９  ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の５’部分をコードする配列
【００９５】
配列番号３０  ５’ＩＴＲをコードする配列（配列番号２７）、ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の３’部分をコードする配列（配列番号３１）、ＷＰＲＥをコードする配列（配列番号３２）、ｂＧＨポリＡをコードする配列（配列番号３８）及び３’ＩＴＲをコードする配列（配列番号３３）を含む、ｐＡＡＶ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎのＩＴＲからＩＴＲ部分。
【００９６】
配列番号３１  ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列の３’部分をコードする配列
【００９７】
配列番号３２  ＷＰＲＥをコードする配列
【００９８】
配列番号３３  例示的な３’ＩＴＲをコードする配列
【００９９】
配列番号３４  例示的な５’ＩＴＲをコードする配列
【０１００】
配列番号３５  例示的な３’ＩＴＲをコードする配列
【０１０１】
配列番号３６  例示的な５’ＩＴＲをコードする配列
【０１０２】
配列番号３７  例示的な３’ＩＴＲをコードする配列
【０１０３】
配列番号３８  ｂＧＨポリＡをコードする配列
【０１０４】
配列番号３９  ウサギベータグロビン（ＲＢＧ）イントロン／エクソン（Ｉｎｔ／Ｅｘ）をコードする配列
【０１０５】
配列番号４０  ５’ＩＴＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４１）、３’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド１７６〜３５０９、配列番号４２）、ＷＰＲＥをコードする配列（ヌクレオチド３５１６〜４１０８、配列番号４３）、ＢＧＨポリＡをコードする配列（ヌクレオチド４１１５〜４２７８、配列番号４４）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４４２２〜４５４２、配列番号４５）を含む、ｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＲ．３’ＡＢＣＡ４．ＷＰＲＥ．ｋａｎ。
【０１０６】
配列番号４１  ５’ＩＴＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、配列番号４０のヌクレオチド１６〜１３０）
【０１０７】
配列番号４２  ３’ＡＢＣＡ４をコードする配列（配列番号４０のヌクレオチド１７６〜３５０９）
【０１０８】
配列番号４３  ＷＰＲＥをコードする配列（配列番号４０のヌクレオチド３５１６〜４１０８）
【０１０９】
配列番号４４  ＢＧＨポリＡをコードする配列（配列番号４０のヌクレオチド４１１５〜４２７８）
【０１１０】
配列番号４５  ３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ由来ＩＴＲ、配列番号４０のヌクレオチド４４２２〜４５４２）
【０１１１】
配列番号４６  ５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号４７）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号４８）、イントロンをコードする配列（ヌクレオチド４６８〜５９０、配列番号４９）、エクソンをコードする配列（ヌクレオチド５９１〜６３０、配列番号５０）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド６５０〜４３５１、配列番号５１）、及び３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド４３８９〜４５０９、配列番号５２）を含む、ｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＩｎＥｘ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎ。
【０１１２】
配列番号４７  ５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、配列番号４６のヌクレオチド１６〜１３０）
【０１１３】
配列番号４８  ＣＢＡプロモーターをコードする配列（配列番号４６のヌクレオチド１９０〜４６７）
【０１１４】
配列番号４９  イントロンをコードする配列（配列番号４６のヌクレオチド４６８〜５９０）
【０１１５】
配列番号５０  エクソンをコードする配列（配列番号４６のヌクレオチド５９１〜６３０）
【０１１６】
配列番号５１  ５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（配列番号４６のヌクレオチド６５０〜４３５１）
【０１１７】
配列番号５２  ３’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、配列番号４６のヌクレオチド４３８９〜４５０９）
【０１１８】
配列番号５３  ５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号５４）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１９０〜４６７、配列番号５５）、ＲＧＢイントロンをコードする配列（ヌクレオチド７０４〜８７６、配列番号５６）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド９１９〜４６２０、配列番号５７）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４６５８〜４７７８、配列番号５８）を含む、ｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＢＡ．ＲＢＧ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎ
【０１１９】
配列番号５４  ５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、配列番号５３のヌクレオチド１６〜１３０）
【０１２０】
配列番号５５  ＣＢＡプロモーターをコードする配列（配列番号５３のヌクレオチド１９０〜４６７）
【０１２１】
配列番号５６  ＲＧＢイントロンをコードする配列（配列番号５３のヌクレオチド７０４〜８７６）
【０１２２】
配列番号５７  ５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（配列番号５３のヌクレオチド９１９〜４６２０）
【０１２３】
配列番号５８  ３’ＩＲをコードする配列（配列番号５３のヌクレオチド４６５８〜４７７８）
【０１２４】
配列番号５９  ５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６０）、ＣＭＶエンハンサーをコードする配列（ヌクレオチド３２２〜５５６、配列番号６１）、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド５７１〜８４９、配列番号６２）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド８５６〜４５５７、配列番号６３）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４５９５〜４７１５、配列番号６４）を含む、ｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＣＭＶ．ＣＢＡ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎ。
【０１２５】
配列番号６０  ５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、配列番号５９のヌクレオチド１６〜１３０）
【０１２６】
配列番号６１  ＣＭＶエンハンサーをコードする配列（配列番号５９のヌクレオチド３２２〜５５６）
【０１２７】
配列番号６２  ＣＢＡプロモーターをコードする配列（配列番号５９のヌクレオチド５７１〜８４９）
【０１２８】
配列番号６３  ５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（配列番号５９のヌクレオチド８５６〜４５５７）
【０１２９】
配列番号６４  ３’ＩＲをコードする配列（配列番号５９のヌクレオチド４５９５〜４７１５）
【０１３０】
配列番号６５  ５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、ヌクレオチド１６〜１３０、配列番号６６）、ＲＫプロモーターをコードする配列（ヌクレオチド１８６〜３８４、配列番号６７）、５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（ヌクレオチド５７６〜４２６７、配列番号６８）、及び３’ＩＲをコードする配列（ヌクレオチド４２７５〜４４２５、配列番号６９）を含む、ｐＡＡＶ．ｓｔｂＩＴＲ．ＲＫ．５’ＡＢＣＡ４．ｋａｎ。
【０１３１】
配列番号６６  ５’ＩＲをコードする配列（ＡＡＶ２由来ＩＴＲ、配列番号６５のヌクレオチド１６〜１３０）
【０１３２】
配列番号６７  ＲＫプロモーターをコードする配列（配列番号６５のヌクレオチド１８６〜３８４）
【０１３３】
配列番号６８  ５’ＡＢＣＡ４をコードする配列（配列番号６５のヌクレオチド５７６〜４２６７）
【０１３４】
配列番号６９  ３’ＩＲをコードする配列（配列番号６５のヌクレオチド４２７５〜４４２５）
【０１３５】
配列番号７０  ＡＢＣＡ４タンパク質をコードするアミノ酸配列（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０００３４１．２として示す）
【０１３６】
詳細な説明
シュタルガルト病は、眼における感光性光受容体細胞の破壊を通して失明をもたらし得る網膜の遺伝性疾患である。この疾患は、一般に、小児期に出現し、若年者に失明をもたらす。小児期及び青年期のシュタルガルト病の発症は、２０代前半で患者に重度の視力喪失をもたらし得る。シュタルガルト病は、遺伝性の若年性黄斑ジストロフィーの最も一般的な形態である。シュタルガルト病は、およそ１０，０００人に１人が罹患する希少疾患である。米国、フランス、ドイツ、イタリア、スペイン、及び英国に、６５，０００人のシュタルガルト病患者がいる。
【０１３７】
シュタルガルト病の最も一般的な形態は、タンパク質ＡＴＰ結合カセット、サブファミリーＡ、メンバー４（ＡＢＣＡ４）をコードする遺伝子の突然変異に連結する劣性疾患である。ＡＢＣＡ４は、網膜細胞内の光感受性色素の再循環において役割を担う大きな膜貫通タンパク質である。ＡＢＣＡ４膜貫通タンパク質は、視覚サイクルからの有毒な副産物の排除において重要な役割を担う。シュタルガルト病では、ＡＢＣＡ４遺伝子の突然変異により、網膜細胞における機能性ＡＢＣＡ４タンパク質が欠如する。これは次いでビスレチノイド副産物の形成及び蓄積をもたらし、網膜色素上皮（ＲＰＥ）細胞においてリポフスチンの毒性顆粒を産生する。これは、ＲＰＥ細胞の分解及び最終的には破壊を引き起こし、これにより視覚の進行性喪失及び最終的な失明を引き起こす光受容体の喪失がもたらされる。機能性ＡＢＣＡ４の欠如は、光受容体の変性につながる。進行性の光受容体変性は、失明につながる。
【０１３８】
本開示の組成物及び方法が開発される前は、処置の選択肢は存在しなかった。本開示の組成物及び方法が開発される前は、シュタルガルト病の根本的な原因に対処する、シュタルガルト病への効果的な処置に対する長年にわたり満たされていない必要性が存在した。
【０１３９】
遺伝子治療は、シュタルガルト病に対する有望な処置である。遺伝子治療の目的は、ベクターを使用して機能性ＡＢＣＡ４遺伝子を罹患した光受容体細胞へと導入することでＡＢＣＡ４機能を回復させることにより、疾患の根底にある欠損を矯正することである。
【０１４０】
本開示は、網膜遺伝子治療のためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターを提供する。ＡＡＶは非常に低い免疫原性を提示する小型ウイルスであり、いかなる公知のヒト疾患にも関連していない。付随する免疫反応がないということは、ＡＡＶを眼の中に注射しても網膜損傷を引き起こさないことを意味する。
【０１４１】
ＡＡＶキャプシドのサイズは、その中にパッケージできるＤＮＡの量に制限を課し得る。ＡＡＶゲノムは、およそ４．７キロベース（ｋｂ）のサイズであり、一部のＡＡＶベクター及び血清型に関しては、ＡＡＶにおけるＤＮＡパッケージングに関して対応する上限サイズは、およそ５ｋｂであり得る。ゆえに、制限因子には、５ｋｂ以下でのエンコード可能なＡＡＶ導入遺伝子のサイズ制限が含まれる。シュタルガルト病は、劣性遺伝性失明の最も蔓延している形態であり、ＡＢＣＡ４における突然変異によって引き起こされる。
【０１４２】
ＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列は、およそ６．８ｋｂのサイズである（遺伝子発現のためにはさらなる遺伝要素を伴う）。ゆえに、さらなる遺伝要素を伴うＡＢＣＡ４遺伝子のコード配列のサイズは、標準的なＡＡＶベクターの上限サイズよりも大きいように思われる。
【０１４３】
この上限サイズを克服し、ＡＡＶベクターからＡＢＣＡ４などの大型遺伝子を発現させるためのいくつかの手法を、本明細書に記載する。これらの手法には、「特大」ベクター手法及び「デュアル」ベクター手法が含まれる。
【０１４４】
「特大」ベクター
天然の４．７ｋｂゲノムよりもかなり大きな遺伝子をＡＡＶベクターの中に詰め込むために多くの試みがなされ、標的細胞を形質導入することに一部成功している。例として、Ａｌｌｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌ．（Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．ｖｏｌ．１１８，Ｎｏ．５，Ｍａｙ  ２００８）は、マウスＡＢＣＡ４及びヒトＭＹＯ７Ａ遺伝子をパッケージングする特大ＡＡＶベクターを調製し、マウス網膜細胞の形質導入後のタンパク質発現を実証した。しかしながら、ある特定のＡＡＶキャプシドが最大で８．９ｋｂまで収容し得ることがＡｌｌｏｃｃａ  ｅｔ  ａｌによって提言された一方で、その後の研究により、「特大」手法は実際にはパッケージング上限サイズを克服するのではなく、むしろランダムな様式で導入遺伝子のトランケーションをもたらし、各々が導入遺伝子の断片を含むＡＡＶベクターの不均一な集団をもたらすことが見出された（Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１８，Ｎｏ．１，Ｊａｎ  ２０１０）。所与の集団における特大ベクターの一部は、断片間で重複する領域が存在し、標的細胞の形質導入後に完全長遺伝子への再構成を可能にするような、特大導入遺伝子の十分大きな断片をパッケージングすると考えられている。しかしながら、この方法は、予測不能及び非効率的であり、パッケージング制御を欠いており、その後の組換えの失敗は、一貫した検出可能な成功への重大な障害をもたらす。
【０１４５】
「デュアル」ベクター
より成功した手法は、デュアルベクターシステムを調製することであり、デュアルベクターシステムでは、およそ５ｋｂ限界よりも大きな導入遺伝子が、規定された配列の２つの別々のベクター：導入遺伝子の５’部分を含有する「上流」ベクター、及び導入遺伝子の３’部分を含有する「下流」ベクターへと、概ね半分に分割されている。上流ベクター及び下流ベクターの両方による標的細胞の形質導入によって、完全長導入遺伝子が様々な細胞内機構を使用して２つの断片から再構成されることが可能になる。
【０１４６】
いわゆる「トランススプライシング」デュアルベクター手法では、スプライスドナーシグナルが上流導入遺伝子断片の３’末端に置かれ、スプライスアクセプターシグナルが下流導入遺伝子断片の５’末端に置かれる。デュアルベクターによって標的細胞を形質導入すると、ＡＡＶゲノム中に存在する逆位末端反復（ＩＴＲ）配列が、導入遺伝子断片のヘッドトゥーテールコンカテマー化を媒介し、転写産物のトランススプライシングは、完全長ｍＲＮＡ配列の産生をもたらし、完全長タンパク質発現が可能となる。
【０１４７】
代替のデュアルベクターシステムは、「重複」手法を使用する。重複デュアルベクターシステムでは、上流コード配列部分の３’末端のコード配列の部分は、下流コード配列部分の５’の相同配列と重複する。ＡＡＶは、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）をパッケージする。重複デュアルベクター手法では、二本鎖導入遺伝子が、５’部分（センス、上流）及び３’部分（アンチセンス、下流）に分割され、これは５’部分の３’末端及び３’部分の５’末端にて重複する。５’部分及び３’部分は、それぞれＡＡＶウイルス粒子にｓｓＤＮＡとしてキャプシド化されている、ＡＡＶベクター（上流ベクター及び下流ベクター）によってそれぞれコードされている。上流ＡＡＶ粒子及び下流ＡＡＶ粒子による細胞の形質導入の際に、感染した細胞またはその核は、上流ＡＡＶベクター及び下流ＡＡＶベクターを含む。同じ感染細胞が相補的な上流ＡＡＶベクター及び下流ＡＡＶベクターを含み、それぞれが、他方がハイブリダイズできる一本鎖配列を有する場合、５’部分及び３’部分をコードする相補的なｓｓＤＮＡは、完全長導入遺伝子を生成することができる。
【０１４８】
いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、完全長導入遺伝子（例えば、ＡＢＣＡ４）は、第二鎖合成、その後の相同組換えにより、重複デュアルベクターシステムから生成され得る。上流ＡＡＶ粒子及び下流粒子による細胞の形質導入の際に、対応するｓｓＤＮＡ上流ＡＡＶベクター及び下流ＡＡＶベクターは、細胞またはその核へと放出され、導入遺伝子の５’（上流）部分及び導入遺伝子の３’（下流）部分を含むｄｓＤＮＡは、第二鎖合成によってｓｓＤＮＡのそれぞれから生成される。次いで、ｄｓＤＮＡは、コード配列の上流部分及び下流部分の間の重複の領域にて相同組換えを受け、これにより完全長導入遺伝子の再作製が可能になり、これから対応するｍＲＮＡが転写され、完全長タンパク質が発現され得る。例えば、ＷＯ２０１４／１７０４８０は、ヒトＡＢＣＡ４タンパク質をコードするデュアルＡＡＶベクターシステムを記載している（その内容は、その全体が本明細書に組込まれる）。
【０１４９】
本開示の組成物及び方法の一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の５’部分を含む。一部の実施形態では、第二のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の３’部分を含む。一部の実施形態では、５’末端部分及び３’末端部分は、少なくとも約２０個のヌクレオチドで重複する。一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターはそれぞれ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の配列及び／またはＡＢＣＡ４コード配列に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、第二のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の配列及び／またはＡＢＣＡ４コード配列に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、５’ＡＢＣＡ４コード配列の配列及び３’ＡＢＣＡ４コード配列の一部分に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、第二のＡＡＶベクターは、３’ＡＢＣＡ４コード配列の配列及び５’ＡＢＣＡ４コード配列の一部分に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターは、第二鎖合成を受けて、第一のｄｓＤＮＡ  ＡＡＶベクター及び第二のｄｓＤＮＡ  ＡＡＶベクターを生成する。一部の実施形態では、第一のｄｓＤＮＡ  ＡＡＶベクター及び第二のｄｓＤＮＡ  ＡＡＶベクターは、相同組換えを通して完全長ＡＢＣＡ４導入遺伝子を生成する。
【０１５０】
いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、完全長導入遺伝子はまた、一本鎖アニーリング及び第二鎖合成を通して、重複デュアルベクターシステムから生成され得る。上流ＡＡＶベクター及び下流ＡＡＶベクターによる細胞の形質導入の際、上流ＡＡＶベクター及び下流ＡＡＶベクターのそれぞれは、ｓｓＤＮＡを含み、上流ＡＡＶベクターは導入遺伝子の５’部分をコードする配列を含み、下流ＡＡＶベクターは導入遺伝子の３’部分をコードする配列を含み、相補的な上流ベクター及び下流ベクターは、細胞またはその核へと放出される。一部の実施形態では、上流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の５’部分をコードする配列及び導入遺伝子の３’部分に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、上流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の５’部分をコードするセンス配列及び導入遺伝子の３’部分に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、上流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の５’部分をコードするアンチセンス配列及び導入遺伝子の３’部分に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、下流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の３’部分をコードする配列及び導入遺伝子の５’部分に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、下流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の３’部分をコードするアンチセンス配列及び導入遺伝子の５’部分に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、下流ＡＡＶベクターは、導入遺伝子の３’部分をコードするセンス配列及び導入遺伝子の５’部分に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、上流ベクター及び下流ベクターは、相補性の領域にてハイブリダイズ（重複）する。ハイブリダイゼーションに続いて、完全長導入遺伝子が第二鎖合成によって生成される。
【０１５１】
本開示の組成物及び方法の一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の５’部分を含み、第二のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の３’部分を含み、５’部分及び３’部分は少なくとも２０個の連続ヌクレオチドで重複する。一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターはそれぞれ、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を含む。一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の配列を含み、第二のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、第二のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列の配列を含み、第一のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４コード配列に相補的な配列を含む。一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターは、相補的な重複領域でアニーリングして、続く第二鎖合成によって完全長ｄｓＤＮＡ  ＡＢＣＡ４導入遺伝子を生成する。一部の実施形態では、完全長ｄｓＤＮＡ  ＡＢＣＡ４導入遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ（細胞内または対象内）で生成される。
【０１５２】
本開示は、特許請求の範囲に記載する通りのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムを提供することにより、上記の先行技術の問題に対処する。
【０１５３】
デュアルベクター手法は、ＡＡＶ遺伝子治療の能力を増大させるが、治療効果を達成するには不十分であり得る標的タンパク質のレベルを実質的に減少させることもあり得る。デュアルベクターシステムの一部の実施形態では、デュアルベクターの組換えの効率は、プラス鎖及びマイナス鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖）間のＤＮＡ重複の長さに依存する。ＡＢＣＡ４コード配列のサイズにより、大型遺伝子における突然変異によって引き起こされる障害の処置に最適なデュアルベクター戦略に関するゾーンを同定するための、プラス鎖及びマイナス鎖間の重複の様々な長さの探索が可能となる。これらの戦略は、治療効果を提供するのに十分な標的タンパク質の産生をもたらすことができる。シュタルガルトマウスモデルでは、標的タンパク質であるＡＢＣＡ４が、網膜の光受容体細胞において豊富に必要であり、その欠如がビスレチノイド化合物の蓄積を誘発し、それが７９０ｎｍ自家蛍光の増加につながるため、治療効果を容易に評価できる。重複デュアルベクターシステムの治療可能性は、処置後のこのビスレチノイド蓄積及び後続の７９０ｎｍ自家蛍光レベルにおける減少を観察することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで検証できる。
【０１５４】
有利なことに、本開示のＡＡＶベクターシステムは、形質導入された細胞において完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の驚くほど高いレベルの発現を提供し、ＡＢＣＡ４の不要な短縮断片の生成は限定的である。最適化された組換えを用いると、完全長ＡＢＣＡ４タンパク質は、Ａｂｃａ４−／−マウスの光受容体外節にて、ビスレチノイドの形成を減少させ、網膜イメージングでの自家蛍光表現型を矯正するのに十分なレベルで発現される。これらの所見は、シュタルガルト病を処置するためのＡＡＶ遺伝子治療のデュアルベクター手法を支持する。
【０１５５】
ＡＢＣＡ４遺伝子における突然変異から生じるシュタルガルト病は、最も一般的な遺伝性黄斑ジストロフィーであり、８，０００〜１０，０００人に１人が罹患し、ＡＢＣＡ４遺伝子における突然変異から生じる。シュタルガルト病ならびに他の錐体及び錐体桿体ジストロフィーの原因となるＡＢＣＡ４突然変異。ＡＢＣＡ４遺伝子における突然変異から生じるシュタルガルト病は、先進国の小児における失明の最も一般的な原因である。この疾患は、しばしば小児期に発症し、患者の生涯にわたって進行的に悪化するため、任意の時点での治療的介入は、さらなる視力喪失を防止または遅延し得る。この疾患は進行性であり、小児期だが視覚発達の期間の後に、症候性になることが多く、このことはさらなる視力喪失を予防または遅延させるための治療的介入の十分な機会を提供する。
【０１５６】
ＡＢＣＡ４は、光受容体外節円盤から有毒な代謝物を排除する。機能性ＡＢＣＡ４の欠如は、光受容体の変性につながる。光受容体外節円盤は、感光性タンパク質ロドプシン及び膜貫通タンパク質ＡＢＣＡ４を含む。ＡＢＣＡ４は、ある特定の有毒な視覚サイクル副産物の排出を制御している。視覚色素は、オプシン及び発色団、例えば、１１−シス−レチナールなどのレチノイドを含む。レチノイドサイクルと称されることもある視覚サイクルでは、レチノイドは漂白され、光受容体及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）の間で再循環される。光伝達中にロドプシンが活性化されると、１１−シス−レチナールは異性化されてオール−トランス−レチナールとなり、オプシンから解離する。オール−トランス−レチナールはＲＰＥへと輸送され、保存されるかまたは１１シスレチナールに変換し戻され、光受容体へと輸送され戻り、視覚サイクルが完了する。
【０１５７】
ＡＢＣＡ４における突然変異は、光受容体細胞円盤外膜から網膜色素上皮（ＲＰＥ）へのレチノイドの輸送を妨げ、これが、光受容体外節における望ましくないレチノイド誘導体の蓄積をもたらす。光受容体外節が絶えず生成されるため、古い円盤がより末端になると、ＲＰＥによって消費される。突然変異した、非機能性ＡＢＣＡ４を有する光受容体細胞では、円盤膜中に保持されたビスレチノイドがＲＰＥ細胞中に蓄積され、リポフスチンの重要な要素である毒性化合物Ａ２Ｅの形成につながるさらなる生化学的プロセスが起こる。ＡＢＣＡ４突然変異は、光受容体及びＲＰＥにおける毒素の蓄積に関連する。例示的な毒素には、限定されないが、オール−トランス−レチナール、ビスレチノイド及びリポフスチンが含まれる。
【０１５８】
機能性ＡＢＣＡ４の欠如は、内腔から光受容体細胞円盤外膜の細胞質側への遊離レチンアルデヒドの輸送を妨げ、レチノイド二量体（ビスレチノイド）の形成の増加または形成の増幅がもたらされる。網膜色素上皮（ＲＰＥ）による光受容体細胞の遠位外節の日常的な食作用の際に、レチノイド誘導体がさらに処理され、ビスレチノイドが蓄積される。レチノイド誘導体は処理されるが、不溶性であり蓄積する。この蓄積の結果として、ＲＰＥ細胞が機能不全となり最終的には死に、その後、変性及び後続する死を通して上にある光受容体が二次的に喪失される。本発明者らは、色素沈着Ａｂｃａ４−／−マウスモデルにおける眼底変化を特徴評価し、眼底蛍光及びビスレチノイド蓄積に対する重水素化ビタミンＡの正の効果について記した。本開示では、本発明者らは、重複ＡＡＶデュアルベクターシステムを使用するＡｂｃａ４−／−マウスモデルの光受容体へのＡＢＣＡ４の送達が、毒性ビスレチノイドの蓄積を減少し、シュタルガルト病を有する患者におけるこのような効果が、ＲＰＥ細胞の死及びそれらが支持する光受容体細胞の変性及び死を防ぎ得ることを示す。
【０１５９】
本開示の組成物及び方法の一部の実施形態では、本開示のＡＡＶデュアルベクターシステムは、対象の眼の１つまたは複数の細胞において完全長ＡＢＣＡ４導入遺伝子として生成する。一部の実施形態では、対象は、シュタルガルト病を有する。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は、光受容体細胞を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は、ＲＰＥ細胞を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、またはそれらの組合わせを含む。
【０１６０】
本開示の組成物及び方法の一部の実施形態では、対象の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現は、光受容体細胞の変性を遅延する。一部の実施形態では、１つまたは複数の細胞は、ＲＰＥ細胞、光受容体細胞、またはそれらの組合わせを含む。一部の実施形態では、対象の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現は、光受容体細胞の死を防ぐ。一部の実施形態では、対象の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現は、光受容体細胞の変性を防ぐ。一部の実施形態では、対象の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現は、光受容体細胞を健常または生存可能な光受容体細胞に回復させる。
【０１６１】
一部の実施形態では、対象の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現は、ＲＰＥ細胞の死を防ぐ。一部の実施形態では、対象の眼の１つまたは複数の細胞におけるＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現は、ＲＰＥ細胞の死及び光受容体細胞の変性を防ぐ。
【０１６２】
ウイルスベクターは、野生型ウイルスに由来し、これは非天然の核酸配列（または導入遺伝子）をウイルスゲノムへと組込むように組換え核酸技術を使用して改変されている。ウイルスが特定の細胞を標的として感染する能力を使用して、導入遺伝子を標的細胞へと送達し、遺伝子の発現及びコードされる遺伝子産物の産生をもたらす。
【０１６３】
本開示は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来するベクターに関する。
【０１６４】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの潜在的な制限因子は、５ｋｂ以下でのエンコード可能なＤＮＡ導入遺伝子のサイズ制限である。
【０１６５】
シュタルガルト病は、劣性遺伝性失明の最も蔓延している形態であり、ＡＢＣＡ４における突然変異によって引き起こされ、これは６．８ｋｂのコード配列長さを有する。デュアルベクター手法は、ＡＡＶ遺伝子治療の能力を増大させるが、生成される標的タンパク質のレベルが治療効果を達成するのに十分であるか否かに関して疑問が提起されている。加えて、デュアルベクターは、一般的に不要な短縮型タンパク質を産生する。ここで、本発明者らは、ヒトＡＢＣＡ４の６．８ｋｂコード配列の送達のために、重複ＡＡＶデュアルベクターシステムを最適化するための体系的な手法を記載する。ＡＢＣＡ４における突然変異は、若年者における劣性遺伝性失明の最も一般的な形態であるシュタルガルト病を引き起こす。本開示のデータは、完全長ＡＢＣＡ４を、Ａｂｃａ４−／−マウスの光受容体外節に、短縮化タンパク質形態を検出不可能なレベルに減少させながら治療効果を可能にするレベルにて、送達するための最適化された重複デュアルベクター戦略を実証する。
【０１６６】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ評価により、重複デュアルベクターを用いた形質導入後に完全長ＡＢＣＡ４タンパク質が生成され、重複の最適領域を同定し、上流導入遺伝子に５’非翻訳領域及び下流導入遺伝子にウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素を含めることにより改善が達成された。短縮型ＡＢＣＡ４は、下流導入遺伝子における特定の配列選択を通して減少した。最適化された重複デュアルベクターシステムは、Ａｂｃａ４−／−マウスの光受容体外節において機能性ＡＢＣＡ４タンパク質を生成し、治療効果をもたらした。これは、注射３ヶ月後の処置眼におけるビスレチノイド及びＡ２Ｅレベルにおける減少ならびに注射６ヶ月後のリポフスチン及びメラニン関連自家蛍光における減少によって定量化した。これらの所見は、シュタルガルト病を処置するためにＡＡＶ遺伝子治療を使用する将来の臨床試験におけるデュアルベクター手法を支持する。
【０１６７】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第一の核酸配列を含む第一のＡＡＶベクター及び第二の核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターを含み；第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第二の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；第一の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３５９７に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、第二の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み；第一の核酸配列及び第二の核酸配列はそれぞれ、他方と重複する配列の領域を含み；配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。
【０１６８】
一般にＡＡＶベクターは当該技術分野で周知であり、当業者は、この分野における当業者の共通の一般知識から、それらの調製に好適な一般的な技術に精通している。当業者の知識は、目的の核酸配列をＡＡＶベクターのゲノムへと組込むのに好適な技術を含む。
【０１６９】
「ＡＡＶベクターシステム」という用語は、第一及び第二のＡＡＶベクターが相補的な様式で共に作用することが意図されるという事実を包含するように使用される。
【０１７０】
本開示のＡＡＶベクターシステムの第一及び第二のＡＡＶベクターは、一緒になってＡＢＣＡ４導入遺伝子全体をコードする。ゆえに、標的細胞におけるコードされたＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現には、第一（上流）及び第二（下流）のベクターの両方で標的細胞を形質導入することが必要である。
【０１７１】
本開示のＡＡＶベクターシステムのＡＡＶベクターは、ＡＡＶ粒子（ビリオンとも称される）の形態であることができる。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶゲノムである核酸のコアを囲むタンパク質コート（キャプシド）を含む。本開示はまた、本明細書に記載のＡＡＶベクターシステムのＡＡＶベクターゲノムをコードする核酸配列を包含する。
【０１７２】
配列番号１は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３５０．２に対応するヒトＡＢＣＡ４核酸配列である。配列番号１は、ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００３５０．２と同一である。ＡＢＣＡ４コード配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜６９２６にわたる。
【０１７３】
第一のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分を含む第一の核酸配列を含む。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、その５’末端を含むＡＢＣＡ４  ＣＤＳの一部である。それはＣＤＳの一部にすぎないため、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳではない（すなわち、全体ではない）。ゆえに、第一の核酸配列（ゆえに、第一のＡＡＶベクター）は、完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０１７４】
第二のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含む第二の核酸配列を含む。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、その３’末端を含むＡＢＣＡ４  ＣＤＳの一部である。それはＣＤＳの一部にすぎないため、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳではない（すなわち、全体ではない）。ゆえに、第二の核酸配列（ゆえに、第二のＡＡＶベクター）は、完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０１７５】
５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含する（後述されるように、配列が重複する領域を伴う）。ゆえに、完全長ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは、本開示のＡＡＶベクターシステムに含有され、第一及び第二のＡＡＶベクターにわたって分割され、第一及び第二のＡＡＶベクターを用いた標的細胞の形質導入後に標的細胞において再構築されることができる。
【０１７６】
上記の通りの第一の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３５９７に対応する連続ヌクレオチドの配列を含む。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは、配列番号１のヌクレオチド１０５で始まる。
【０１７７】
上記の通りの第二の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド３８０６〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含む。
【０１７８】
ＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含するために、第一及び第二の核酸配列はそれぞれ、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの少なくとも一部をさらに含み、第一及び第二の核酸配列が整列した場合に配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの全体が包含されるようにする。ゆえに、整列すると、第一及び第二の核酸配列は一緒になって、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含する。
【０１７９】
さらに、第一及び第二の核酸配列は、本開示の第一及び第二のＡＡＶベクターで形質導入された標的細胞内の完全長導入遺伝子の一部としてＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体の再構築を可能にする配列重複の領域を含む。
【０１８０】
第一及び第二の核酸配列が互いに整列している場合、第一の核酸配列の３’末端の領域は、第二の核酸配列の５’末端の対応する領域と重複する。ゆえに、第一及び第二の核酸配列の両方が、配列重複の領域を形成するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの一部を含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、第一及び第二の核酸配列間の重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの部分の少なくとも約２０個の連続ヌクレオチドを含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、重複の領域は、前記２０個の連続ヌクレオチドの上流及び／または下流に伸びてよい。ゆえに、重複の領域は、２０ヌクレオチド長を超えてよい。
【０１８３】
重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８に対応する位置の上流のヌクレオチドを含んでよい。あるいは、または加えて、重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３８０５に対応する位置の下流のヌクレオチドを含んでよい。
【０１８４】
あるいは、核酸配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応するＡＢＣＡ４  ＣＤＳの部分内に含有されてよい。
【０１８５】
ゆえに、一実施形態では、核酸配列重複の領域は、２０〜５５０ヌクレオチド長；好ましくは、５０〜２５０ヌクレオチド長；好ましくは、１７５〜２２５ヌクレオチド長；好ましくは、１９５〜２１５ヌクレオチド長である。
【０１８６】
一実施形態では、核酸配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する核酸配列の少なくとも約５０個の連続ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約７５個の連続ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約１００個の連続ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約１５０個の連続ヌクレオチド；好ましくは、少なくとも約２００個の連続ヌクレオチド；好ましくは、２０８個全ての連続ヌクレオチドを含む。
【０１８７】
ある特定の好ましい実施形態では、核酸配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８に対応するヌクレオチドで開始する。「開始する」という用語は、核酸配列重複の領域が、配列番号１のヌクレオチド３５９８に対応するヌクレオチドから始まり５’から３’への方向に走ることを意味する。ゆえに、好ましい実施形態では、核酸配列重複の領域の最も５’のヌクレオチドは、配列番号１のヌクレオチド３５９８に対応する。
【０１８８】
ある特定の好ましい実施形態では、第一の核酸配列及び第二の核酸配列ベクター間の核酸配列重複の領域は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜３８０５に対応する。
【０１８９】
上記の通りの核酸配列重複の領域を含むデュアルＡＡＶベクターの構築は、不要な短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの翻訳レベルを減少させることができる。
【０１９０】
短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの翻訳の問題は、翻訳が下流ベクターのみに由来するｍＲＮＡ転写産物から開始される場合に、デュアルＡＡＶベクターシステムにて生じ得る。この点について、ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲなどのＡＡＶ  ＩＴＲは、プロモーター活性を有し得る。これは、（後述されるような）ＷＰＲＥ及びｂＧＨポリアデニル化配列の下流ベクターにおける存在と共に、非組換え下流ベクターからの安定したｍＲＮＡ転写産物の生成をもたらし得る。野生型ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは、その下流部分に複数のインフレームＡＵＧコドンを有し、これはアミノ酸配列を変更することなく他のコドンに置き換えることはできない。これにより、短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの存在につながる、安定した転写産物からの翻訳が生じる可能性が創出される。
【０１９１】
核酸配列重複の領域が、配列番号１のヌクレオチド３５９８に対応するヌクレオチドで開始する本開示のある特定の好ましい実施形態では、重複ゾーンの開始配列は、翻訳機構が非組換え下流のみの転写産物の翻訳をアウトオブフレーム部位から開始することを促進するために、（潜在的なコザックコンセンサス配列に関して）より弱いコンテクストのインフレームＡＵＧコドンよりも前に良好なコンテクストのアウトオブフレームＡＵＧ（開始）コドンを含む。本開示のある特定の特に好ましい実施形態では、インフレームＡＵＧの前に、様々なコンテクストで合計４つのアウトオブフレームＡＵＧコドンが存在する。これらは全て、１０アミノ酸以内で終始コドンに翻訳され、ゆえに不要な短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの翻訳を防止する。
【０１９２】
ある特定の好ましい実施形態では、第一の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、第二の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列を含み、そうして上記の通りの核酸配列重複の領域を包含する。
【０１９３】
ゆえに、ある特定の好ましい実施形態では、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。
【０１９４】
ある特定の好ましい実施形態では、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６からなる。
【０１９５】
ゆえに、ある特定の好ましい実施形態では、本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第一の核酸配列を含む第一のＡＡＶベクター及び第二の核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターを含み、第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第二の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。
【０１９６】
ある特定の好ましい実施形態では、本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるためのＡＡＶベクターシステムを提供し、該ＡＡＶベクターシステムは、第一の核酸配列を含む第一のＡＡＶベクター及び第二の核酸配列を含む第二のＡＡＶベクターを含み、第一の核酸配列は、ＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の５’末端部分を含み、第二の核酸配列は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含み、５’末端部分及び３’末端部分は一緒になってＡＢＣＡ４  ＣＤＳ全体を包含し；ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５からなり、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６からなる。
【０１９７】
「からなる」という用語に従い、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分及びＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分が上記の通りの連続ヌクレオチドの特定の配列からなる実施形態では、第一の核酸配列及び第二の核酸配列はそれぞれ、追加のＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０１９８】
ある特定の実施形態では、第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターのそれぞれは、５’及び３’逆位末端反復（ＩＴＲ）を含む。
【０１９９】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶの天然由来の血清型、分離株またはクレードのＡＡＶゲノムは、少なくとも１つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ配列は、シスで作用して複製の機能的起点を提供し、細胞のゲノムからのベクターの組込み及び切除を可能にする。ＡＡＶ  ＩＴＲは、例えば、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼの作用による一本鎖ベクターＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換後、ＡＡＶ感染細胞の核におけるコンカテマー形成を助けると考えられている。そのようなエピソームコンカテマーの形成は、宿主細胞の生存期間中にベクター構築物を保護するのに役立ち得、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの導入遺伝子の長期発現を可能にする。
【０２００】
ゆえに、一部の実施形態では、ＩＴＲは、ＡＡＶ  ＩＴＲ（すなわち、ＡＡＶゲノムにおいて見出されるＩＴＲ配列に由来するＩＴＲ配列）である。
【０２０１】
本開示のＡＡＶベクターシステムの第一及び第二のＡＡＶベクターは一緒になって、両方のベクターによる形質導入後に、標的細胞において完全機能性ＡＢＣＡ４導入遺伝子が再構成されるために必要な全ての構成要素を含む。当業者は、ウイルスベクター形質導入細胞において導入遺伝子の発現を保証するために一般に使用される追加の遺伝要素を把握している。これらは、発現制御配列と称され得る。ゆえに、本開示のＡＡＶウイルスベクターシステムのＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４導入遺伝子をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された発現制御配列（例えば、プロモーター配列を含む）を含み得る。
【０２０２】
５’発現制御配列構成要素は、ウイルスベクターシステムの第一の（「上流」）ＡＡＶベクターに位置することができ、一方で、３’発現制御配列は、ウイルスベクターシステムの第二の（「下流」）ＡＡＶベクターに位置することができる。
【０２０３】
ゆえに、一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る。プロモーターは、その性質上、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’に位置する必要があり得、従って第一のＡＡＶベクターにおけるその位置も同様である。
【０２０４】
任意の好適なプロモーターを使用してよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。プロモーター配列は、恒常活性型（すなわち、任意の宿主細胞バックグラウンドで作動するもの）であり得る、またあるいは、特定の宿主細胞環境でのみ活性であり、ゆえに特定の細胞型で導入遺伝子の標的発現を可能とするものであり得る（例えば、組織特異的プロモーター）。プロモーターは、別の因子、例えば宿主細胞に存在する因子の存在に応じて誘導可能な発現を示し得る。ベクターが治療用に投与される実施形態では、プロモーターは標的細胞バックグラウンドにおいて機能性であるべきである。
【０２０５】
一部の実施形態では、プロモーターは、導入遺伝子が網膜細胞集団でのみ発現されることを可能にするために、網膜細胞特異的発現を示す。ゆえに、プロモーターからの発現は、網膜細胞特異的、例えば、網膜神経感覚上皮及び網膜色素上皮の細胞にのみ限定されるものであり得る。
【０２０６】
本開示での使用に好適な例示的なプロモーターは、任意選択でサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー要素と組合わせた、ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。本開示で使用するための別の例示的なプロモーターは、ハイブリッドＣＢＡ／ＣＡＧプロモーター、例えばｒＡＶＥ発現カセットにおいて使用されるプロモーターである（ＧｅｎｅＤｅｔｅｃｔ．ｃｏｍ）。
【０２０７】
網膜特異的遺伝子発現を誘導するヒト配列に基づくプロモーターの例には、桿体及び錐体に関してはロドプシンキナーゼ、錐体のみに関してはＰＲ２．１、ならびに網膜色素上皮に関してはＲＰＥ６５が含まれる。
【０２０８】
遺伝子発現は、ＧＲＫ１プロモーターを使用して達成され得る。ゆえに、ある特定の実施形態では、プロモーターは、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーターである。
【０２０９】
一部の実施形態では、本開示のＧＲＫ１プロモーター配列は、１９９ヌクレオチド長を含むまたはそれからなり、ＧＲＫ１遺伝子のヌクレオチド−１１２〜＋８７を含むまたはそれからなる。ある特定の好ましい実施形態では、プロモーターは、配列番号５の核酸配列または配列番号５に対して、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を含むまたはそれからなる。
【０２１０】
ＡＢＣＡ４タンパク質の発現を増加させるために、本開示の上流及び下流ベクターの両方に要素を含んでよい。例えば、本開示の上流ベクターなどのベクターにイントロンを含めることにより、そのベクターからのＲＮＡまたは目的のタンパク質の発現を増加させることができる。イントロンは、ＲＮＡ成熟中にＲＮＡスプライシングによって除去される遺伝子内のヌクレオチド配列である。イントロンの長さは、数十の塩基対から複数のメガベースまで変動できる。しかしながら、スプライセオソーム型イントロン（すなわち、真核生物のスプライセオソームによってスプライスされるイントロン）は、イントロンの５’末端にスプライスドナー（ＳＤ）部位、イントロン３’末端近くに分岐部位、及び３’末端にスプライスアクセプター（ＳＡ）部位を含み得る。これらのイントロン要素は、適切なイントロンスプライシングを促進する。ＳＤ部位は、イントロンの５’末端にコンセンサスＧＵを含み得、イントロンの３’末端にあるＳＡ部位は「ＡＧ」で終了し得る。ＳＡ部位の上流、イントロンは、分岐点アデニンヌクレオチド及びＳＡの間に、ピリミジンの多い領域を含有することが多い。いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、イントロンの存在は、ＲＮＡ転写の速度、核外輸送、またはＲＮＡ転写の安定性に影響を与え得る。さらに、イントロンの存在は、ｍＲＮＡ翻訳の効率を増加させ、目的のタンパク質（例えば、ＡＢＣＡ４）をより多くもたらし得る。図３３及び３４は、ＡＢＣＡ４デュアルベクター、ＩｎｔＥｘ及びＲＢＧ  ＳＡ／ＳＤと共に使用するための２つの例示的なイントロン（及び付随するエクソン）を示している。しかしながら、本開示は、本開示の構築物における、遺伝子発現を増強し、真核細胞におけるスプライシングを促進する任意のイントロンの使用を包含する。
【０２１１】
本開示のベクターの一部の実施形態では、イントロン、ＩｎｔＥｘまたはＳＡ／ＳＤ（ＲＢＤ  ＳＡ／ＳＤを含む）は、ベクターからのタンパク質発現を増加させるように機能するいくつかの要素のうちの１つであってよい。例えば、プロモーター及び、任意選択で、エンハンサーは、遺伝子発現の細胞または組織特異性だけでなく、ベクターから転写されるｍＲＮＡのレベルにも影響を与え得る。プロモーターは、ＲＮＡ転写を開始するＤＮＡの領域である。プロモーターの特定の配列要素に応じて、プロモーターは、強度及び組織特異性が変動し得る。エンハンサーは、ＲＮＡポリメラーゼを動員して転写を開始するプロモーターの能力に影響を与えることにより、プロモーターからの転写を制御するＤＮＡ配列である。それゆえ、ベクターにおけるプロモーターの選択、及び任意選択で、エンハンサーの組込み及び／またはエンハンサー自体の選択は、ベクターがコードする遺伝子の発現に大きな影響を与えることができる。ロドプシンキナーゼプロモーターまたはニワトリベータアクチンプロモーターなどの例示的なプロモーターは、任意選択で、ＣＭＶエンハンサーと組合わされる、これらは図３３及び３４に示している。一部の実施形態では、本開示のベクターは、ロドプシンキナーゼプロモーターまたはニワトリベータアクチンプロモーターなどの例示的なプロモーターを含む一方で、エンハンサー要素の使用を除外する。一部の実施形態では、本開示のベクターは、ニワトリベータアクチンプロモーターなどの例示的なプロモーターを含む一方で、ＣＭＶエンハンサー要素などのエンハンサー要素の使用を除外する。一部の実施形態では、本開示のベクターは、ロドプシンキナーゼプロモーターまたはニワトリベータアクチンプロモーターなどの例示的なプロモーターを含む一方で、エンハンサー要素の使用を除外し、一方でイントロン、ＩｎｔＥｘまたはＳＤ／ＳＡを含む。一部の実施形態では、本開示のベクターは、ニワトリベータアクチンプロモーターなどの例示的なプロモーターを含む一方で、ＣＭＶエンハンサー要素などのエンハンサー要素の使用を除外し、一方でイントロン、ＩｎｔＥｘまたはＳＤ／ＳＡを含む。
【０２１２】
ｍＲＮＡ転写産物自体の非コード配列内の要素も、ベクター内でコードされる配列のタンパク質レベルに影響を与えることができる。いずれの特定の理論にも縛られることを望まないが、ｍＲＮＡ非翻訳領域（ＵＴＲ）内の配列要素は、ｍＲＮＡの安定性に影響を与えることができ、ひいては、タンパク質翻訳のレベルに影響を与える。例示的な配列要素は、ｍＲＮＡの安定性を増加させる、転写後制御要素（ＰＲＥ）（例えば、ウッドチャック肝炎ＰＲＥ（ＷＰＲＥ））である。例示的なプロモーター、エンハンサー、ＰＲＥ、及び本開示のベクターにおけるこれらの要素の配置を、図３３及び３４に示す。
【０２１３】
本開示の第一のＡＡＶベクターの一部の実施形態では、プロモーターは、イントロン及びエクソン配列と作動可能に連結され得る。本開示の第一のＡＡＶベクターの一部の実施形態では、核酸配列は、プロモーター、イントロン及びエクソン配列を含み得る。イントロン及びエクソン配列は、プロモーター配列の下流にあり得る。イントロン及びエクソン配列は、プロモーター配列及び上流ＡＢＣＡ４核酸配列（ＵＳ−ＡＢＣＡ４）の間に配置され得る。イントロン及びエクソンの存在は、タンパク質発現のレベルを増加させ得る。一部の実施形態では、イントロンは、プロモーター及びエクソンの間に配置される。イントロンがプロモーター及びエクソンの間に配置されている実施形態を含む一部の実施形態では、エクソンは、ＵＳ−ＡＢＣＡ４配列の５’に配置される。一部の実施形態では、プロモーターは、脊椎動物遺伝子から単離または誘導されたプロモーターを含む。一部の実施形態では、プロモーターは、ＧＲＫ１プロモーターまたはニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターである。
【０２１４】
エクソンは、コード配列、非コード配列、または両方の組合わせを含み得る。一部の実施形態では、エクソンは、非コード配列を含む。一部の実施形態では、エクソンは、哺乳動物遺伝子から単離または誘導される。実施形態では、哺乳動物は、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）である。一部の実施形態では、哺乳動物遺伝子は、ウサギベータグロビン遺伝子またはその一部を含む。一部の実施形態では、エクソンは、
【化１】
2021520231.tif 000002
（配列番号１４）の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０２１５】
一部の実施形態では、エクソンは、
【化２】
2021520231.tif 000003
（配列番号１４）の核酸配列に対して１００％同一性を有する核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０２１６】
イントロンは、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、または分岐点を含み得る。イントロンは、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、及び分岐点を含み得る。例示的なスプライスアクセプター部位は、イントロンの５’末端にヌクレオチド「ＧＴ」（プレｍＲＮＡでは「ＧＵ」）を含む。例示的なスプライスアクセプター部位は、イントロンの３’末端に「ＡＧ」を含む。一部の実施形態では、分岐点は、イントロンの３’末端の上流に、端点を含めて、２０〜４０ヌクレオチドのアデノシン（Ａ）を含む。イントロンは、人工または非天然に生じる配列を含み得る。あるいは、イントロンは、脊椎動物遺伝子から単離または誘導され得る。イントロンは、２つの配列の融合をコードする配列を含み得、その各々は、脊椎動物遺伝子から単離または誘導され得る。一部の実施形態では、イントロン核酸配列またはその一部が由来する脊椎動物遺伝子には、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）遺伝子を含む。一部の実施形態では、ニワトリ遺伝子は、ニワトリベータアクチン遺伝子を含む。一部の実施形態では、イントロン核酸配列またはその一部が由来する脊椎動物遺伝子には、ウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）遺伝子を含む。一部の実施形態では、ウサギ遺伝子は、ウサギベータグロビン遺伝子またはその一部を含む。一部の実施形態では、イントロンは、
【化３】
2021520231.tif 000004
の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一性を有する核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０２１７】
一部の実施形態では、イントロンは、
【化４】
2021520231.tif 000005
の核酸配列に対して、１００％同一性を有する核酸配列を含むかまたはそれからなる。
【０２１８】
第一の（または上流）ＡＡＶベクターの一部の実施形態では、プロモーターは、ハイブリッドプロモーター（ニワトリベータアクチン（ＣＢＡ）プロモーターを伴うサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサー）を含む。一部の実施形態では、ＣＭＶエンハンサー配列は、
【化５】
2021520231.tif 000006
の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくともその間にある任意の同一性の割合（％）を有する核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０２１９】
一部の実施形態では、第一の（または上流）ＡＡＶベクターをコードする配列は、ＣＢＡプロモーターをコードする配列（ＣＭＶエンハンサー要素を伴わない）、イントロンをコードする配列及びエクソンをコードする配列を含む。一部の実施形態では、ＣＢＡプロモーター配列は、
【化６】
2021520231.tif 000007
の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくともその間にある任意の同一性の割合（％）を有する核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０２２０】
一部の実施形態では、ＣＢＡプロモーター配列は、
【化７】
2021520231.tif 000008
の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくともその間にある任意の同一性の割合（％）を有する核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０２２１】
一部の実施形態では、イントロンをコードする配列は、配列番号１３の核酸配列を含むまたはそれからなる。一部の実施形態では、エクソンをコードする配列は、配列番号１４の核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０２２２】
第一のＡＡＶベクターは、プロモーター及び上流ＡＢＣＡ４核酸配列間に位置する非翻訳領域（ＵＴＲ）を含み得る（すなわち、５’ＵＴＲ）。
【０２２３】
任意の好適なＵＴＲ配列を使用してよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。
【０２２４】
ＵＴＲは、以下の要素：Ｇａｌｌｕｓ  β−アクチン（ＣＢＡ）イントロン１またはその一部、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  β−グロビン（ＲＢＧ）イントロン２またはその一部、及びＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  β−グロビンエクソン３またはその一部のうちの１つまたは複数を含むまたはそれからなる。
【０２２５】
ＵＴＲは、コザックコンセンサス配列を含み得る。任意の好適なコザックコンセンサス配列を使用してよい。
【０２２６】
ある特定の好ましい実施形態では、ＵＴＲは、配列番号６で指定された核酸配列、少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％、９９．７％、９９．８％または９９．９％）配列同一性を有するその変異体または一部を含む。
【０２２７】
配列番号６のＵＴＲは、１８６ヌクレオチド長であり、Ｇａｌｌｕｓ  β−アクチン（ＣＢＡ）イントロン１断片（予測されるスプライスドナー部位を伴う）、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  β−グロビン（ＲＢＧ）イントロン２断片（予測される分岐点及びスプライスアクセプター部位を含む）、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  β−グロビンエクソン３断片及びその直後にコザックコンセンサス配列を含む。
【０２２８】
上記のＵＴＲ、具体的には、配列番号６で指定されたＵＴＲ配列または少なくとも９０％の配列同一性を有するその変異体の存在は、ＡＢＣＡ４導入遺伝子からの翻訳収量を増加させ得る。
【０２２９】
本開示のＡＡＶベクターシステムの第二の（「下流」）ＡＡＶベクターは、転写後応答要素（転写後制御要素としても知られる）またはＰＲＥを含み得る。任意の好適なＰＲＥを使用してよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。ある特定の実施形態では、好適なＰＲＥの存在は、ＡＢＣＡ４導入遺伝子の発現を増強し得る。
【０２３０】
ある特定の好ましい実施形態では、ＰＲＥは、ウッドチャック肝炎ウイルスＰＲＥ（ＷＰＲＥ）である。ある特定の特に好ましい実施形態では、ＷＰＲＥは、配列番号７で指定される配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を有する。
【０２３１】
第二のＡＡＶベクターは、下流ＡＢＣＡ４核酸配列の３’に位置するポリアデニル化配列を含み得る。任意の好適なポリアデニル化配列を使用してよく、その選択は当業者によって容易に行われ得る。ある特定の好ましい実施形態では、ポリアデニル化配列は、ウシ成長ホルモン（ｂＧＨ）ポリアデニル化配列である。特に好ましい実施形態では、ｂＧＨポリアデニル化配列は、配列番号８で指定される配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を有する。ある特定の実施形態では、ポリアデニル化配列をコードする配列は、
【化８】
2021520231.tif 000009
の核酸配列に対して、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または少なくともその間にある任意の同一性の割合（％）を有する核酸配列を含むまたはそれからなる。
【０２３２】
本開示のＡＡＶベクターシステムのある特定の好ましい実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列を含み、第二のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列を含む。
【０２３３】
本開示のＡＡＶベクターシステムのある特定の好ましい実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、配列番号３の核酸配列を含み、第二のＡＡＶベクターは、配列番号４の核酸配列を含む。
【０２３４】
本開示のＡＡＶベクターシステムは、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるために好適であり得る。
【０２３５】
本開示は、標的細胞においてヒトＡＢＣＡ４タンパク質を発現させるための方法を提供し、該方法は、機能性ＡＢＣＡ４タンパク質が標的細胞において発現されるように、標的細胞を、上記の通りの第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターを用いて形質導入するステップを含む。
【０２３６】
ヒトＡＢＣＡ４タンパク質の発現には、標的細胞が第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターの両方で形質導入される必要がある。ある特定の実施形態では、標的細胞は、任意の順序で（第一のＡＡＶベクターの後に第二のＡＡＶベクター、または第二のＡＡＶベクターの後に第一のＡＡＶベクター）、または同時に第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターで形質導入され得る。
【０２３７】
標的細胞をＡＡＶベクターで形質導入するための方法は、当該技術分野で公知であり、当業者は精通しているだろう。
【０２３８】
標的細胞は、眼の細胞、好ましくは網膜細胞（例えば、神経光受容体細胞、桿体細胞、錐体細胞、または網膜色素上皮細胞）であり得る。
【０２３９】
本開示はさらに、上で定義した通りの、第一のＡＡＶベクターを提供する。上で定義した通りの、第二のＡＡＶベクターも提供される。
【０２４０】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの５’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド１０５〜３８０５に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。ある特定の実施形態では、このＡＡＶベクターは、連続ヌクレオチドの前記配列を超える追加のＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０２４１】
第一のＡＡＶベクターは、５’及び３’ＩＴＲ、好ましくはＡＡＶ  ＩＴＲ；プロモーター、例えば、ＧＲＫ１プロモーター；及び／またはＵＴＲを含み得る；前記要素は、本開示のＡＡＶベクターシステムに関して上記の通りである。
【０２４２】
一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列を含む。
【０２４３】
一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２４４】
一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド１６４０に対応する位置のヌクレオチドがＧであるという条件で、配列番号９の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２４５】
一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、配列番号３の核酸配列を含む。
【０２４６】
一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、配列番号３の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２４７】
一部の実施形態では、第一のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド１６４０に対応する位置のヌクレオチドがＧであるという条件で、配列番号３の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２４８】
本開示は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分を含む核酸配列を含むＡＡＶベクターを提供し、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの３’末端部分は、配列番号１のヌクレオチド３５９８〜６９２６に対応する連続ヌクレオチドの配列からなる。一部の実施形態では、このＡＡＶベクターは、連続ヌクレオチドの前記配列を超える追加のＡＢＣＡ４  ＣＤＳを含まない。
【０２４９】
第二のベクターは、５’及び３’ＩＴＲ、好ましくはＡＡＶ  ＩＴＲ；ＰＲＥ、好ましくはＷＰＲＥ；及び／またはポリアデニル化配列、好ましくはｂＧＨポリアデニル化配列を含み得；前記要素は、本開示のＡＡＶベクターシステムに関して上記の通りである。
【０２５０】
一部の実施形態では、第二のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列を含む。
【０２５１】
一部の実施形態では、第二のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２５２】
一部の実施形態では、第二のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド５２７９に対応する位置のヌクレオチドがＧであり、配列番号１のヌクレオチド６１７３に対応する位置のヌクレオチドがＴであるという条件で、配列番号１０の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２５３】
一部の実施形態では、第二のＡＡＶベクターは、配列番号４の核酸配列を含む。
【０２５４】
一部の実施形態では、第二のＡＡＶベクターは、配列番号４の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２５５】
一部の実施形態では、第二のＡＡＶベクターは、配列番号１のヌクレオチド５２７９に対応する位置のヌクレオチドがＧであり、配列番号１のヌクレオチド６１７３に対応する位置のヌクレオチドがＴであるという条件で、配列番号４の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２５６】
本開示はさらに、上記の核酸配列を含む核酸を提供する。本開示は、上記の通りのＡＡＶベクターから誘導可能なＡＡＶベクターゲノムも提供する。
【０２５７】
上記の通りの第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターを含むキットも提供する。ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ粒子の形態でキットにおいて提供され得る。
【０２５８】
上記の通りの、第一の核酸配列を含む核酸及び第二の核酸配列を含む核酸を含むキットをさらに提供する。
【０２５９】
本開示は、上記の通りのＡＡＶベクターシステム及び医薬的に許容可能な賦形剤を含む医薬組成物も提供する。
【０２６０】
本開示のＡＡＶベクターシステム、本開示のキット、及び本開示の医薬組成物は、遺伝子治療において使用され得る。例えば、本開示のＡＡＶベクターシステム、本開示のキット、及び本開示の医薬組成物は、疾患の予防または処置に使用され得る。
【０２６１】
一部の実施形態では、疾患を予防または処置するための本開示の組成物及び方法の使用は、ＡＢＣＡ４タンパク質の発現を提供するための、第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターの標的細胞への投与を含む。
【０２６２】
一部の実施形態では、予防または処置される疾患は、網膜細胞の分解を特徴とする。そのような疾患の例は、シュタルガルト病である。一部の実施形態では、本開示の第一及び第二のＡＡＶベクターは、患者の眼、例えば眼の網膜組織に投与され得、その結果、機能性ＡＢＣＡ４タンパク質が発現されて、疾患に存在する突然変異（複数可）を代償する。
【０２６３】
本開示のＡＡＶベクターは、医薬組成物または薬剤として製剤化され得る。
【０２６４】
本開示の例示的なＡＡＶベクターシステムは、第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターを含み、第一のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列を含み、第二のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列を含む。
【０２６５】
本開示のさらなる例示的なＡＡＶベクターシステムは、第一のＡＡＶベクター及び第二のＡＡＶベクターを含み、第一のＡＡＶベクターは、配列番号９の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を含み、第二のＡＡＶベクターは、配列番号１０の核酸配列または少なくとも９０％（例えば、少なくとも９０、９５、９６、９７、９８、９９、９９．１、９９．２、９９．３、９９．４、９９．５、９９．６、９９．７、９９．８または９９．９％）配列同一性を有するその変異体を含む。
【０２６６】
一部の実施形態では、本開示の方法及び使用は、配列番号１の代わりに配列番号２が参照配列として使用される場合にも実施され得る。
【０２６７】
これに関して、配列番号２は、以下の突然変異：ヌクレオチド１６４０Ｇ＞Ｔ、ヌクレオチド５２７９Ｇ＞Ａ、ヌクレオチド６１７３Ｔ＞Ｃを除いて、配列番号１と同一である。これらの突然変異は、コードされるアミノ酸配列を変更せず、ゆえに配列番号２によってコードされるＡＢＣＡ４タンパク質は、配列番号１によってコードされるＡＢＣＡ４タンパク質と同一である。
【０２６８】
ゆえに、本開示の代替の実施形態では、配列番号１への上記の参照は、配列番号２への参照で置き換えてよい。
【０２６９】
配列の対応
本明細書で使用する場合、所与の核酸配列中のヌクレオチドに関して使用される場合の「に対応する」という用語は、特定の配列番号への参照によってヌクレオチドの位置を規定する。しかしながら、そのような参照がなされる場合、本開示は、参照される特定の配列番号に示される正確な配列に限定されず、その変異配列を含むことが理解されるであろう。配列番号１のヌクレオチド位置に対応するヌクレオチドは、配列アライメントプログラムを使用することなどによる配列アライメントによって容易に決定することができ、その使用は当該技術分野で周知である。これに関して、当業者は、遺伝暗号の縮重の性質が、コードされたポリペプチドのアミノ酸配列を変更することなく、所与のポリペプチドをコードする核酸配列の変異が存在し得ることを意味することを容易に理解するであろう。ゆえに、他のＡＢＣＡ４コード配列におけるヌクレオチド位置の同定が企図される（すなわち、当業者が考えるだろう位置のヌクレオチドは、例えば、配列番号１で同定された位置に対応する）。
【０２７０】
例として、配列番号２は、上記のように、３つの特定の突然変異を除いて配列番号１と同一である（これらの３つの突然変異は、コードされるＡＢＣＡ４ポリペプチドのアミノ酸配列を変更しない）。それゆえ、この場合、当業者は、配列番号２の所与のヌクレオチド位置が、配列番号１の同じ番号が付けられたヌクレオチド位置に対応すると考えるであろう。
【０２７１】
ＡＡＶベクター
本開示のウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。本開示のＡＡＶベクターは、成熟ＡＡＶ粒子またはビリオン、すなわち、ＡＡＶタンパク質キャプシドによって囲まれた核酸の形態であり得る。
【０２７２】
ＡＡＶベクターは、ＡＡＶゲノムまたはその誘導体を含み得る。
【０２７３】
ＡＡＶゲノムは、一部の実施形態では、ＡＡＶ粒子の産生のための機能をコードし得るポリヌクレオチド配列である。これらの機能には、例えば、ＡＡＶゲノムのＡＡＶ粒子へのキャプシド形成を含む、宿主細胞におけるＡＡＶの複製及びパッケージングサイクルで機能する機能が含まれる。天然に生じるＡＡＶは、複製欠損であり、複製及びパッケージングのサイクルを完了するために、トランスのヘルパー機能の提供に依存している。従って、本開示のベクターのＡＡＶゲノムは、複製欠損であり得る。
【０２７４】
ＡＡＶゲノムは、ポジティブまたネガティブセンスのいずれかの一本鎖形態、あるいは二本鎖形態であり得る。一部の実施形態では、二本鎖形態の使用は、標的細胞におけるＤＮＡ複製ステップを省くことが可能になり、そのため導入遺伝子発現を加速し得る。
【０２７５】
一部の実施形態では、本開示のベクターのＡＡＶゲノムは、一本鎖形態であり得る。
【０２７６】
ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶの任意の天然由来の血清型、分離株、またはクレードに由来し得る。ゆえに、ＡＡＶゲノムは、天然に生じるＡＡＶの完全なゲノムであり得る。当業者に知られているように、天然に生じるＡＡＶは、様々な生物学的システムに従って分類され得る。
【０２７７】
ＡＡＶは、その血清型に関して称される。血清型は、キャプシド表面抗原の発現のプロファイルのために、他の変異亜種と区別するために使用できる独自の反応性を有する、ＡＡＶの変異亜種に対応する。特定のＡＡＶ血清型を有するウイルスは、任意の他のＡＡＶ血清型に特異的な中和抗体と効率的に交差反応しない。
【０２７８】
ＡＡＶ血清型には、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０及びＡＡＶ１１、ならびに近年霊長類脳から同定されたＲｅｃ２及びＲｅｃ３などの組換え血清型も含まれる。これらのＡＡＶ血清型のいずれかを本開示で使用してよい。ゆえに、本開示の一実施形態では、本開示のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、Ｒｅｃ２またはＲｅｃ３  ＡＡＶから誘導され得る。
【０２７９】
ＡＡＶ血清型の概説は、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｕｒｒ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：２９９−３１０及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １４：３１６−２７に見出され得る。ＡＡＶゲノムの配列、またはＩＴＲ配列、ｒｅｐもしくはｃａｐ遺伝子を含むＡＡＶゲノムの要素の配列は、ＡＡＶ全ゲノム配列に関する以下のアクセッション番号から誘導してよい：アデノ随伴ウイルス１  ＮＣ＿００２０７７、ＡＦ０６３４９７；アデノ随伴ウイルス２  ＮＣ＿００１４０１；アデノ随伴ウイルス３  ＮＣ＿００１７２９；アデノ随伴ウイルス３Ｂ  ＮＣ＿００１８６３；アデノ随伴ウイルス４  ＮＣ＿００１８２９；アデノ随伴ウイルス５  Ｙ１８０６５、ＡＦ０８５７１６；アデノ随伴ウイルス６  ＮＣ＿００１８６２；トリＡＡＶ  ＡＴＣＣ  ＶＲ−８６５  ＡＹ１８６１９８、ＡＹ６２９５８３、ＮＣ＿００４８２８；トリＡＡＶ株ＤＡ−１  ＮＣ＿００６２６３、ＡＹ６２９５８３；ウシＡＡＶ  ＮＣ＿００５８８９、ＡＹ３８８６１７。
【０２８０】
ＡＡＶは、クレードまたはクローンに関しても称され得る。これは、例えば、天然由来ＡＡＶの系統学的関係、または共通の祖先まで遡ることができるＡＡＶの系統群を指し、その全ての子孫を含む。加えて、ＡＡＶは、特定の分離株、すなわち天然に見出される特定のＡＡＶの遺伝的分離株に関しても称され得る。遺伝的分離株という用語は、他の天然に生じるＡＡＶとの限定的な遺伝的混合を受け、それによって遺伝子レベルで認識可能な別個の集団を定義するＡＡＶの集団を表す。
【０２８１】
当業者は、彼らの共通の一般的知識に基づいて、本開示で使用するためのＡＡＶの適切な血清型、クレード、クローンまたは分離株を選択することができる。例えば、ＡＡＶ５キャプシドは、遺伝性の色覚異常の矯正に成功したことからも明らかなように、霊長類の錐体光受容体を効率的に形質導入することが示されている（Ｍａｎｃｕｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４６１：７８４−７）。
【０２８２】
ＡＡＶ血清型は、ＡＡＶウイルスの感染の組織特異性（または向性）を決定することができる。従って、一部の好ましい実施形態では、本開示の患者に投与されるＡＡＶで使用するためのＡＡＶ血清型は、眼内の標的細胞に対する天然指向性または高い感染効率を有するものである。一実施形態では、本開示で使用するためのＡＡＶ血清型は、神経感覚網膜、網膜色素上皮及び／または脈絡膜の細胞に感染するものである。
【０２８３】
一部の実施形態では、ＡＡＶの天然由来の血清型、分離株またはクレードのＡＡＶゲノムは、少なくとも１つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含む。ＩＴＲ配列は、シスで作用して機能的な複製起点を提供し、細胞のゲノムからのベクターの組込み及び切除を可能にする。ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ粒子のパッケージング機能をコードするｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子などのパッケージング遺伝子も含む。ｒｅｐ遺伝子は、タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２及びＲｅｐ４０またはその変異体のうちの１つまたは複数をコードする。ｃａｐ遺伝子は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３などの１つまたは複数のキャプシドタンパク質またはその変異体をコードする。これらのタンパク質は、ＡＡＶ粒子のキャプシドを構成し得る。キャプシド変異体を、以下に考察する。
【０２８４】
一部の実施形態では、プロモーターは、パッケージング遺伝子のそれぞれに作動可能に連結されることができる。そのようなプロモーターの具体的な例には、ｐ５、ｐ１９、及びｐ４０プロモーターが含まれる（Ｌａｕｇｈｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７６：５５６７−５５７１）。例えば、ｐ５及びｐ１９プロモーターを使用して、ｒｅｐ遺伝子を発現させてよく、ｐ４０プロモーターを使用して、ｃａｐ遺伝子を発現させてよい。
【０２８５】
一部の実施形態では、本開示のベクターで使用されるＡＡＶゲノムは、それゆえ、天然に生じるＡＡＶの完全なゲノムであり得る。例えば、完全なＡＡＶゲノムを含むベクターを使用して、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでＡＡＶベクターを調製してよい。一部の実施形態では、そのようなベクターは、原則として患者に投与され得る。一部の好ましい実施形態では、ＡＡＶゲノムは、患者への投与を目的として誘導化されるだろう。そのような誘導体化は当該技術分野で公知であり、本開示は、ＡＡＶゲノムの任意の既知の誘導体、及び当該技術分野で公知の技術を適用することによって生成され得る誘導体の使用を包含する。ＡＡＶゲノム及びＡＡＶキャプシドの誘導体化は、Ｃｏｕｒａ  ａｎｄ  Ｎａｒｄｉ（２００７）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ４：９９ならびに上記で参照されたＣｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．及びＷｕ  ｅｔ  ａｌ．に概説されている。
【０２８６】
ＡＡＶゲノムの誘導体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの本開示のベクターからの導入遺伝子の発現を可能にする、ＡＡＶゲノムの任意の短縮型または改変型を含む。一部の実施形態では、最小のウイルス配列を含むが上記の機能を保持するようにＡＡＶゲノムを切り詰めることが可能である。これは、例えばベクターと野生型ウイルスとの組換えのリスクを減少し、標的細胞内のウイルス遺伝子タンパク質の存在による細胞性免疫応答の誘発を回避することにより、ＡＡＶゲノムの安全性に寄与し得る。
【０２８７】
ＡＡＶゲノムの誘導体は、少なくとも１つの逆位末端反復配列（ＩＴＲ）を含み得る。一部の実施形態では、ＡＡＶゲノムの誘導体は、２つ以上のＩＴＲなどの複数のＩＴＲを含み得る。ＩＴＲのうちの１つまたは複数は、異なる血清型を有するＡＡＶゲノムから誘導され得る、またはキメラまたは突然変異型ＩＴＲであり得る。例示的な突然変異型ＩＴＲは、ｔｒｓ（末端分解部位）の欠失を有するものである。この欠失により、ゲノムの継続的な複製が可能になり、コード配列及び相補配列の両方を含有する一本鎖ゲノム、すなわち自己相補的なＡＡＶゲノムが生成される。これにより、標的細胞におけるＤＮＡ複製を省くことが可能になり、導入遺伝子発現の加速を可能にする。
【０２８８】
１つまたは複数のＩＴＲを含めることは、例えば、宿主細胞ＤＮＡポリメラーゼの作用による一本鎖ベクターＤＮＡの二本鎖ＤＮＡへの変換後、宿主細胞の核における本開示のベクターのコンカテマー形成を補助し得る。そのようなエピソームコンカテマーの形成は、宿主細胞の生存期間中にベクター構築物を保護し、それによって、ｉｎ  ｖｉｖｏでの導入遺伝子の長期発現を可能にする。
【０２８９】
一部の好ましい実施形態では、ＩＴＲ要素は、誘導体において天然ＡＡＶゲノムから保持される唯一の配列である。ゆえに、誘導体は、天然ゲノムのｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子ならびに天然ゲノムの任意の他の配列を含まない場合がある。これはまた、宿主細胞ゲノムへのベクターの組込みの可能性を減少させ得る。加えて、ＡＡＶゲノムのサイズを小さくすると、導入遺伝子に加えて、ベクター内に他の配列要素（例えば制御要素）を組込む際の柔軟性の増加が可能になる。
【０２９０】
以下の部分：１つの逆位末端反復（ＩＴＲ）配列、複製（ｒｅｐ）及びキャプシド（ｃａｐ）遺伝子は、本開示の誘導体において除去され得る。しかしながら、一部の実施形態では、誘導体は、１つまたは複数のｒｅｐ及び／またはｃａｐ遺伝子あるいはＡＡＶゲノムの他のウイルス配列を追加で含み得る。天然に生じるＡＡＶは、ヒト第１９染色体上の特定の部位に高頻度で組込まれ、無視できる頻度のランダム組込みを示し、これにより、組込み能力をベクター中に保持することが治療設定において許容され得る。
【０２９１】
誘導体がキャプシドタンパク質、すなわちＶＰ１、ＶＰ２及び／またはＶＰ３を含む場合、誘導体は、１つまたは複数の天然に生じるＡＡＶのキメラ、シャッフル、またはキャプシド修飾誘導体であり得る。本開示は、同じベクター（すなわち、偽型ベクター）内のＡＡＶの異なる血清型、クレード、クローン、または分離株からのキャプシドタンパク質配列の提供を包含する。
【０２９２】
キメラ、シャッフルまたはキャプシド修飾誘導体を選択して、ウイルスベクターに１つまたは複数の機能性を提供し得る。例えば、これらの誘導体は、ＡＡＶ２のものなどの天然に生じるＡＡＶゲノムを含むＡＡＶベクターと比較して、遺伝子送達効率の増加、免疫原性（体液性または細胞性）の低減、向性範囲の変更、及び／または特定の細胞型の標的化の改善を提示し得る。遺伝子送達の効率の増加は、細胞表面での受容体または共受容体の結合の改善、内在化の改善、細胞内及び核への輸送の改善、ウイルス粒子のアンコーティングの改善ならびに一本鎖ゲノムの二本鎖型への変換の改善によってもたらされ得る。効率の増加はまた、向性範囲の変更または特定の細胞集団の標的化にも関連し得、そのためベクター用量はそれが必要とされない組織への投与によって希釈されない。
【０２９３】
キメラキャプシドタンパク質には、天然に生じるＡＡＶ血清型の２つ以上のキャプシドコード配列間の組換えによって生成されるものが含まれる。これは、例えば、ある血清型の非感染性キャプシド配列が異なる血清型のキャプシド配列と同時トランスフェクトされるマーカーレスキュー手法によって実施され得るものであり、所望の特性を有するキャプシド配列に関して選択するために定方向選択が使用される。異なる血清型のキャプシド配列を細胞内での相同組換えによって変更して新規のキメラキャプシドタンパク質を産生することができる。
【０２９４】
本開示のキメラキャプシドタンパク質はまた、特定のキャプシドタンパク質ドメイン、表面ループ、または特定のアミノ酸残基を、２つ以上のキャプシドタンパク質間、例えば、異なる血清型の２つ以上のキャプシドタンパク質間で転移させるためのキャプシドタンパク質配列の操作によって生成されるものを含む。
【０２９５】
シャッフルまたはキメラキャプシドタンパク質は、ＤＮＡシャッフリングまたはエラープローンＰＣＲによっても生成され得る。ハイブリッドＡＡＶキャプシド遺伝子は、関連するＡＡＶ遺伝子、例えば複数の異なる血清型のキャプシドタンパク質をコードするものの配列を無作為に断片化し、次いでその後、配列相同性の領域における交差も引き起こし得る、自己プライミングポリメラーゼ反応において断片を再構成することによって作製することができる。いくつかの血清型のキャプシド遺伝子をシャッフルすることによってこのようにして作製されたハイブリッドＡＡＶ遺伝子のライブラリーを、スクリーニングして、所望の機能性を有するウイルスクローンを同定することができる。同様に、エラープローンＰＣＲを使用して、ＡＡＶキャプシド遺伝子を無作為に突然変異させて、変異体の多様なライブラリーを作製してよく、次いで、これを所望の特性について選択してよい。
【０２９６】
キャプシド遺伝子の配列を遺伝子修飾して、天然の野生型配列に関して特定の欠失、置換または挿入を導入してもよい。例えば、キャプシド遺伝子を、キャプシドコード配列のオープンリーディングフレーム内、あるいはキャプシドコード配列のＮ末端及び／またはＣ末端にて、無関係なタンパク質またはペプチドの配列の挿入によって修飾してよい。
【０２９７】
無関係のタンパク質またはペプチドは、特定の細胞型に対するリガンドとして作用し、それにより標的細胞への結合の改善または特定の細胞集団へのベクターの標的化の特異性の改善をもたらすものであり得る。無関係のタンパク質はまた、産生プロセスの一部としてウイルス粒子の精製を助けるもの、すなわち、エピトープまたはアフィニティータグであり得る。挿入の部位は、ウイルス粒子の他の機能、例えば、ウイルス粒子の内在化、輸送を妨害しないように選択され得る。当業者は、彼らの共通の一般知識に基づいて挿入に好適な部位を同定することができる。具体的な部位は、上記で参照したＣｈｏｉ  ｅｔ  ａｌに開示されている。
【０２９８】
本開示は、天然ＡＡＶゲノムの配列とは異なる順序及び構成でのＡＡＶゲノムの配列の提供を、追加で包含する。本開示は、１つまたは複数のＡＡＶ配列または遺伝子を、別のウイルス由来の配列で、または複数のウイルス由来の配列で構成されるキメラ遺伝子で置き換えることも包含する。そのようなキメラ遺伝子は、異なるウイルス種の２つ以上の関連するウイルスタンパク質由来の配列から構成され得る。
【０２９９】
本開示のＡＡＶベクターは、ある血清型のＩＴＲを有するＡＡＶゲノムまたは誘導体が異なる血清型のキャプシドにパッケージされているトランスキャプシド化形態を含む。本開示のＡＡＶベクターは、２つ以上の異なる血清型由来の非修飾キャプシドタンパク質の混合物がウイルスキャプシドを構成するモザイク形態も含む。ＡＡＶベクターは、キャプシド表面に吸着されたリガンドを担持する化学的に修飾された形態も含み得る。例えば、そのようなリガンドは、特定の細胞表面受容体を標的とするための抗体を含み得る。
【０３００】
ゆえに、例えば、本開示のＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ２キャプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／２）、ＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ５キャプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／５）、ならびにＡＡＶ２ゲノム及びＡＡＶ８キャプシドタンパク質を有するもの（ＡＡＶ２／８）を含み得る。
【０３０１】
本開示のＡＡＶベクターは、突然変異型ＡＡＶキャプシドタンパク質を含み得る。一実施形態では、本開示のＡＡＶベクターは、突然変異型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質を含む。一部の実施形態では、突然変異型ＡＡＶ８キャプシドタンパク質は、ＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆキャプシドタンパク質である。一部の実施形態では、ＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆ突然変異型キャプシドタンパク質は、配列番号１２の７３３位でチロシンをフェニルアラニンに置換した、配列番号１２に対して少なくとも９５％同一性を有するアミノ酸配列を含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆ突然変異型キャプシドタンパク質は、配列番号１２の７３３位でチロシンをフェニルアラニンに置換した、配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
【０３０２】
投与方法
本開示のウイルスベクターは、網膜下、直接網膜、脈絡膜上または硝子体内注射によって対象の眼に投与され得る。
【０３０３】
当業者は、個々の網膜下、直接網膜、脈絡膜上または硝子体内注射に精通しており、十分に実行することができるであろう。
【０３０４】
網膜下注射
網膜下注射は、網膜下腔、すなわち神経感覚網膜の下への注射である。網膜下注射の間、注射される物質は、光受容体細胞及び網膜色素上皮（ＲＰＥ）層に向けられ、その間に空間を作製する。
【０３０５】
小さな網膜切開を通して注射を行うと、網膜剥離が作製され得る。注射物質によって生成された網膜の、剥離して持ち上げられた層は、「ブレブ」と称される。
【０３０６】
網膜下注射によって作製された穴は、注射溶液が投与後に硝子体腔に著しく逆流しないほど十分に小さくあり得る。そのような逆流は、薬剤を注射する場合には、薬剤の効果が標的ゾーンから逸れることになるため、問題となるだろう。好ましくは、注射は、神経感覚網膜に自己封鎖する入口点を作製する、すなわち、注射針が取り外されると、針によって作製された穴が再封鎖され、注射物質がほとんどまたは実質的にまったく穴を通して放出されなくなる。
【０３０７】
このプロセスを容易にするために、専用の網膜下注射針が市販されている（例えば、ＤＯＲＣ  ４１Ｇテフロン（登録商標）網膜下注射針、Ｄｕｔｃｈ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｃｅｎｔｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＢＶ，Ｚｕｉｄｌａｎｄ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）。これらは、網膜下注射を行うために設計された針である。
【０３０８】
一部の実施形態では、網膜下注射は、ハミルトンシリンジ及び３４ゲージ針（ＥＳＳ  ｌａｂｓ，ＵＫ）を用いて、後極から上網膜まで通した強膜トンネル手法を含む。あるいは、または加えて、網膜下注射は、ＷＰＩシリンジ及びベベル３５Ｇ針システム（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を使用する網膜下注射の前に３３Ｇ針を用いて前房穿刺を行うことを含むことができる。
【０３０９】
動物対象は、例えば、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を含有する腹腔内注射によって麻酔することができ、瞳孔は、トロピカミド点眼薬（Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ  １％，Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ，ＵＫ）及びフェニレフリン点眼薬（塩酸フェニレフリン２．５％，Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ，ＵＫ）で完全に拡張させた。プロキシメタカイン点眼薬（プロキシメタカイン塩酸塩０．５％，Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ，ＵＫ）も、網膜下注射の前に適用することができる。注射後、クロラムフェニコール点眼薬を適用でき（クロラムフェニコール０．５％，Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ，ＵＫ）、麻酔は、アチパメゾール（２ｍｇ／ｋｇ）で逆転させ、白内障の形成を防ぐためにカルボマーゲル（Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ，ＵＫ）を適用した。
【０３１０】
注射中に網膜への損傷が発生しない限り、そして十分に小さい針が使用される限り、注射物質は、剥離した神経感覚網膜及びＲＰＥ間の局所的な網膜剥離の部位に局在したままである（すなわち、硝子体腔へと逆流しない）。実際、短い時間枠にわたるブレブの持続は、注射物質が硝子体にほとんど漏れないだろうことを示している。注射物質が吸収されるにつれ、ブレブはより長い時間枠にわたって消散し得る。
【０３１１】
眼、例えば網膜の可視化を、例えば光干渉断層法を使用して手術前に行ってよい。
【０３１２】
２段階網膜下注射
一部の実施形態では、本開示のＡＡＶベクターは、第一の溶液の網膜下注射によって局所的な網膜剥離が作製される２段階方法を使用することによって、正確及び安全に送達され得る。第一の溶液は、ベクターを含まない。次いで、第二の網膜下注射を使用して、第一の網膜下注射によって作製されたブレブの網膜下液中にベクターを含む薬剤を送達する。薬剤を送達する注射が網膜を剥離するために使用されていないため、この第二のステップでは特定の容量の溶液が注射され得る。
【０３１３】
本開示のＡＡＶベクターは、
（ａ）溶液を、少なくとも部分的に網膜を剥離して網膜下ブレブを形成するのに有効な量で網膜下注射により対象に投与すること、ここで溶液はベクターを含まない；及び
（ｂ）ステップ（ａ）により形成されたブレブへの網膜下注射により薬剤組成物を投与すること、ここで薬剤はベクターを含む、によって送達され得る。
【０３１４】
網膜を少なくとも部分的に剥離させるためにステップ（ａ）で注射する溶液の容量は、例えば、約１０〜１０００μＬ、例えば、約５０〜１０００、１００〜１０００、２５０〜１０００、５００〜１０００、１０〜５００、５０〜５００、１００〜５００、２５０〜５００μＬであってよい。容量は、例えば、約１０、５０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００または１０００μＬであってよい。
【０３１５】
ステップ（ｂ）で注射する薬剤組成物の容量は、例えば、約１０〜５００μＬ、例えば、約５０〜５００、１００〜５００、２００〜５００、３００〜５００、４００〜５００、５０〜２５０、１００〜２５０、２００〜２５０、または５０〜１５０μＬであってよい。容量は、例えば、約１０、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０または５００μＬであってよい。一部の好ましい実施形態では、ｙ、ステップ（ｂ）で注射する薬剤組成物の容量は、１００μＬである。容量が大きくなると、網膜が伸びるリスクが増加し得るが、容量が小さくなると、見ることが困難になり得る。
【０３１６】
薬剤を含まない溶液（すなわち、ステップ（ａ）の「第一の溶液」）は、下記の通りに、薬剤を含む溶液と同様に製剤化され得る。薬剤を含まない例示的な溶液は、網膜下腔のｐＨ及び浸透圧に適合させた平衡生理食塩水（ＢＳＳ）、ＴＭＮ  ２００または類似の緩衝液である。
【０３１７】
手術中の網膜の可視化
一部の実施形態では、例えば、末期網膜変性の間、網膜が、薄く、透明であり、網膜の下にある破壊されて重度に色素沈着した上皮に対して見ることが難しいため、網膜を同定することは困難である。青色生体色素（例えば、Ｂｒｉｌｌｉａｎｔ  Ｐｅｅｌ（登録商標）、Ｇｅｕｄｅｒ；ＭｅｍｂｒａｎｅＢｌｕｅ−Ｄｕａｌ（登録商標）、Ｄｏｒｃ）を使用することで、網膜剥離手順（すなわち、本開示の２段階網膜下注射法におけるステップ（ａ））のために作成された網膜の穴の同定を容易にし、薬剤を、硝子体腔中に逆流するリスクを伴わずに同一の穴を通じて投与できるようにする。
【０３１８】
青色生体色素の使用は、肥厚した内境界膜または網膜上膜が存在する場合は、網膜の任意の領域も同定し得る。これは、これらの構造のいずれかを通して注射すれば、網膜下腔へのクリーンなアクセスが妨げられ得るためである。さらに、手術直後の期間におけるこれらの構造のいずれかの収縮は、網膜入口穴を引き伸ばしてしまう可能性があり、これは、硝子体腔への薬剤の逆流をもたらし得る。
【０３１９】
脈絡膜上注射
本開示のベクターまたは組成物は、脈絡膜上注射を介して投与され得る。脈絡膜上注射の任意の手段は、本開示のベクターまたは組成物のための潜在的な送達システムとして想定される。脈絡膜上注射は、脈絡膜及び強膜の間の空間である脈絡膜上腔への注射である。ゆえに、脈絡膜上腔への注射は、網膜、網膜色素上皮（ＲＰＥ）または黄斑などの近接する眼の構造に組成物を送達するための潜在的な投与経路である。一部の実施形態では、脈絡膜上腔への注射は、マイクロニードル、マイクロカニューレ、またはマイクロカテーテルを使用して眼の前部にて行われる。眼の前部は、眼の赤道の前の領域を含み得るまたはそれからなり得る。ベクター組成物またはＡＡＶウイルス粒子は、脈絡膜上経路を介して注射部位から後方に拡散し得る。一部の実施形態では、後眼の脈絡膜上腔は、カテーテルシステムを使用して直接注射される。この実施形態では、脈絡膜上腔は、毛様体扁平部の切開を介してカテーテル挿入され得る。一部の実施形態では、脈絡膜上経路を介した注射または注入は、脈絡膜、ブルッフ膜及び／またはＲＰＥ層を横断して、本開示のベクターまたは組成物を網膜下腔に送達する。本開示のベクターまたは組成物が脈絡膜上経路を介して網膜下腔に送達されるものを含む、一部の実施形態では、１つまたは複数の注射は、強膜、毛様体扁平部、脈絡膜、ブルッフ膜、及びＲＰＥ層のうちの少なくとも１つに行われる。本開示のベクターまたは組成物が脈絡膜上経路を介して網膜下腔に送達されるものを含む、一部の実施形態では、２段階手順を使用して、脈絡膜上または網膜下腔にブレブを作成してから、本開示のベクターまたは組成物を送達する。
【０３２０】
医薬組成物及び注射溶液
本開示のＡＡＶベクター及びＡＡＶベクターシステムは、医薬組成物に製剤化され得る。これらの組成物は、薬剤に加えて、医薬的に許容可能な担体、希釈剤、賦形剤、緩衝液、安定剤、または当該技術分野で周知の他の物質を含んでよい。そのような物質は、非毒性であるべきであり、活性成分の有効性を妨害するべきではない。担体または他の物質の正確な性質は、当業者によって、投与経路、例えば、網膜下、直接網膜、脈絡膜上または硝子体内注射に従って決定され得る。
【０３２１】
医薬組成物は、液体形態であってよい。液体医薬組成物は、水、石油、動物または植物油、鉱油または合成油などの液体担体を含む。生理食塩水、塩化マグネシウム、デキストロースもしくは他の糖類溶液、またはエチレングリコール、プロピレングリコールもしくはポリエチレングリコールなどのグリコールを含んで良い。
【０３２２】
罹患の部位での注射に関しては、活性成分は、発熱物質を含まず、好適なｐＨ、等張性及び安定性を有する水溶液の形態であってよい。当業者は、例えば、等張性ビヒクル、例えば塩化ナトリウム注射液、リンガー注射液もしくは乳酸リンガー注射液またはＴＭＮ２００を使用して、好適な溶液を調製することが十分に可能である。防腐剤、安定剤、緩衝剤、酸化防止剤及び／または他の添加剤を、必要に応じて含んで良い。
【０３２３】
緩衝液は、保存及びＡＡＶ遺伝子治療のために注射装置を通過した後の、本開示のウイルスベクター及びベクター粒子の安定性及び生体適合性に影響を有し得る。一部の実施形態では、本開示のウイルスベクター及びベクター粒子は、生体適合性及び安定性を維持するために、ＴＭＮ２００緩衝液に希釈され得る。ＴＭＮ２００緩衝液は、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨを８．０に調整）、１ｍＭ  ＭｇＣｌ２、及び２００ｍＭ  ＮａＣｌをｐＨ８にて含む。
【０３２４】
物理的なウイルスゲノム力価の決定は、ウイルスベクターまたはウイルス粒子の特徴決定の一部に含まれる。一部の実施形態では、物理的なウイルスゲノム力価の決定は、遺伝子治療中のウイルスベクター及びウイルス粒子の効力及び安全性を確実にするステップを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶ力価を決定する方法は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）を含む。標準として使用されるＤＮＡの立体構造または試料調製中の酵素分解などの、結果に影響を与えることができる様々な変数がある。その力価が測定されるウイルスベクターまたは粒子調製物は、プラスミドを使用して生成された標準希釈曲線に対して比較され得る。一部の実施形態では、標準曲線において使用されるプラスミドＤＮＡは、スーパーコイル構造である。一部の実施形態では、標準曲線において使用されるプラスミドＤＮＡは、線状構造である。線状化プラスミドは、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素での消化により調製し、アガロースゲル電気泳動により可視化し、製造元の指示に従ってＱＩＡｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して精製することができる。標準曲線を生成するために使用されるプラスミド内で切断する他の制限酵素も適切であり得る。一部の実施形態では、標準としてのスーパーコイルプラスミドの使用は、線状化プラスミドの使用と比較して、ＡＡＶベクターの力価を増加させた。
【０３２５】
ＡＡＶゲノム力価を定量化するために精製ＡＡＶベクターからＤＮＡを抽出するには、２つの酵素的方法を使用できる。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＤＮａｓｅ  Ｉで一重消化され得る。一部の実施形態では、ＡＡＶベクターは、ＤＮａｓｅ  Ｉ及び追加のプロテイナーゼＫ処置で二重消化され得る。次いで、ＱＰＣＲを、導入遺伝子配列に特異的なプライマー及びＴａｑｍａｎプローブを使用して、ＣＦＸ  ＣｏｎｎｅｃｔリアルタイムＰＣＲ検出システム（ＢｉｏＲａｄ）で実行できる。
【０３２６】
遅延放出に関しては、薬剤は、徐放用に製剤化された医薬組成物、例えば生体適合性ポリマーから形成されたマイクロカプセルまたは当技術分野で公知の方法に従ったリポソーム担体系に含まれ得る。
【０３２７】
処置方法
処置に対する本明細書の言及は全て、治癒的、緩和的及び予防的処置を含むことが理解されたい。ただし、本開示の文脈では、防止に対する言及は、予防的処置に関連している。処置は、疾患の重症度の進行を停止することも含み得る。
【０３２８】
ヒトを含む全ての哺乳動物の処置が想定されている。しかしながら、ヒト及び獣医学的処置の両方が、本開示の範囲内にある。
【０３２９】
変異体、誘導体、類似体、相同体及び断片
本明細書で言及される特定のタンパク質及びヌクレオチドに加えて、本開示は、その変異体、誘導体、類似体、相同体及び断片の使用も包含する。本開示の文脈では、任意の所与の配列の変異体は、問題のポリペプチドまたはポリヌクレオチドが実質的にその機能を保持する様式で、残基（アミノ酸または核酸残基にかかわらず）の特定の配列が修飾されている配列である。変異体配列は、例えば、天然に生じるタンパク質に存在する少なくとも１つの残基の追加、欠失、置換、修飾、置き換え及び／または変異によって取得できる。
【０３３０】
本開示のタンパク質またはポリペプチドに関連して本明細書で使用する場合、「誘導体」という用語は、結果得られるタンパク質またはポリペプチドがその内因性機能の少なくとも１つを実質的に保持することを条件として、配列からまたは配列に対する１つ（または複数）のアミノ酸残基の任意の置換、変異、修飾、置き換え、欠失及び／または追加を含む。
【０３３１】
ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関連して本明細書で使用する場合、「類似体」という用語は、任意の模倣体、すなわち、それが模倣するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの内因性機能の少なくとも１つを有する化学化合物を含む。
【０３３２】
修飾された配列が必要な活性または能力を実質的に保持するという条件で、アミノ酸置換に、例えば、１、２または３から１０、２０またはそれ以上の置換を行ってよい。アミノ酸置換は、天然には生じない類似体の使用を含んでよい。本開示で使用されるタンパク質は、サイレント変化を生み出し、機能的に同等のタンパク質をもたらす、アミノ酸残基の欠失、挿入、または置換も有し得る。
【０３３３】
内因性機能が保持される限り、残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性及び／または両親媒性の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行ってよい。例えば、負に荷電したアミノ酸には、アスパラギン酸及びグルタミン酸が含まれ；正に荷電したアミノ酸には、リジン及びアルギニンが含まれ；同様の親水性値を有する非荷電極性頭部基を有するアミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン及びチロシンが含まれる。
【０３３４】
保存的置換は、例えば、以下の表に従って行われてよい。２列目の同じブロックにあるアミノ酸、好ましくは３列目の同じ行にあるアミノ酸は、互いに置換され得る。
【表１】
2021520231.tif 000010
【０３３５】
本明細書で使用する場合、「相同体」という用語は、野生型アミノ酸配列及び野生型ヌクレオチド配列とある特定の相同性を有する実体を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同一視することができる。
【０３３６】
相同配列は、対象配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９７％または９９％同一であり得るアミノ酸配列を含み得る。例えば、相同体は、対象のアミノ酸配列と同じ活性部位などを含むだろう。相同性は、類似性（すなわち、類似した化学的性質／機能を有するアミノ酸残基）に関しても考慮することができるが、本開示の文脈では、相同性は、配列同一性に関しても表現することができる。
【０３３７】
相同配列は、対象配列に対して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％または９０％同一、好ましくは少なくとも９５％または９７％または９９％同一であり得るヌクレオチド配列を含み得る。相同性は、類似性に関しても考慮することができるが、本開示の文脈では、相同性は、配列同一性に関しても表現することができる。
【０３３８】
本明細書に詳述する配列番号のいずれか１つに対してパーセント同一性を有する配列への参照は、参照された配列番号の全長にわたって所定のパーセント同一性を有する配列を指す。
【０３３９】
相同性の比較は、目視で、または簡単に利用可能な配列比較プログラムを用いて行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間の相同性または同一性の割合（％）を計算できる。
【０３４０】
相同性の割合（％）は、連続配列にわたって計算することができる、すなわち、ある配列を他の配列と整列させ、ある配列の各アミノ酸を、一度に１残基ずつ、他の配列の対応するアミノ酸と直接比較する。これは「ギャップのない」アライメントと称される。このようなギャップのないアライメントは、比較的短い数の残基に対してのみ実行され得る。
【０３４１】
これは非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、それ以外は同一の配列のペアでは、ヌクレオチド配列の１つの挿入または欠失により、以降のコドンが整列しなくなる可能性があることを考慮に入れることができず、ゆえに全体的なアライメントを実行すると、パーセント相同性が大幅に減少する可能性がある。その結果、大部分の配列比較法は、全体的な相同性のスコアに過度にペナルティを与えることなく、考えられる挿入および欠失を考慮に入れた、最適なアラインメントを生み出すように設計されている。これは、配列アライメントに「ギャップ」を挿入して、局所的な相同性を最大化しようとすることで達成される。
【０３４２】
しかしながら、これらのより複雑な方法では、アラインメント中に存在するそれぞれのギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てるため、同じ数の同一のアミノ酸に対して、２つの比較する配列間のより高い関係を反映するできるだけ少ないギャップを有する配列アラインメントは、多くのギャップを有する配列アラインメントより高いスコアを得るであろう。「アフィンギャップコスト」は、ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップ内の後続の各残基に対してより小さなペナルティを課すために使用され得る。これは、最も一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは当然ながら、少ないギャップを有する最適アラインメントを生み出すであろう。ほとんどのアライメントプログラムでは、ギャップペナルティの修正が可能である。しかしながら、そのようなソフトウェアを配列比較に使用する場合は、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティーは、ギャップに関して−１２、およびそれぞれのエクステンションに関して−４である。
【０３４３】
それゆえ、最大の相同性の割合（％）の計算は、最初に、ギャップペナルティを考慮した最適なアライメントの産生を含む。そのようなアライメントを実行するための好適なコンピュータープログラムは、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ．；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１２：３８７）である。配列比較を実行できる他のソフトウェアの例としては、限定されないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書−Ｃｈ．１８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）及びＧＥＮＥＷＯＲＫＳスイートの比較ツールが挙げられる。ＢＬＡＳＴとＦＡＳＴＡの両方が、オフライン及びオンラインの検索用に利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）同書、ｐａｇｅｓ７−５８〜７−６０を参照されたい）。しかしながら、一部のアプリケーションに関しては、ＧＣＧ  Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用できる。ＢＬＡＳＴ  ２  Ｓｅｑｕｅｎｃｅと呼ばれる別のツールも、タンパク質及びヌクレオチド配列の比較のために利用可能である（ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７４：２４７−５０；ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．（１９９９）１７７：１８７−８を参照されたい）。最終的なパーセント相同性を同一性の観点から測定することはできるが、アライメントプロセスそのものは、オール−オア−ナッシングの対比較に基づくものではないだろう。代わりに、化学的類似性または進化距離に基づいて各ペアワイズ比較にスコアを割り当てる、スケールによる類似性スコアマトリックスを使用し得る。このようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックスであり、これは、ＢＬＡＳＴスイートのプログラムのデフォルトマトリクスである。ＧＣＧウィスコンシンプログラムは、公開デフォルト値、または供給される場合は慣例の記号比較表を使用する（さらなる詳細に関しては、ユーザマニュアルを参照されたい）。一部のアプリケーションでは、ＧＣＧパッケージの公開デフォルト値を、または、他のソフトウェアの場合は、ＢＬＯＳＵＭ６２などのデフォルトマトリックスを使用する。
【０３４４】
ソフトウェアにより最適なアライメントが生成されると、パーセント相同性、好ましくはパーセント配列同一性を計算することが可能である。ソフトウェアは、配列比較の一部としてこれを実行し、数値結果を生成し得る。
【０３４５】
「断片」も変異体であり、本用語は、機能的に、または例えば、アッセイにおいて、対象となるポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択された領域を指し得る。ゆえに、「断片」は、完全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸または核酸配列を指す。
【０３４６】
そのような変異体は、部位特異的突然変異誘発などの標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して調製され得る。挿入が行われる場合、挿入部位のいずれかの側の天然に生じる配列に対応する５’及び３’隣接領域とともに挿入をコードする合成ＤＮＡが作成され得る。隣接領域は、その配列が適切な酵素（複数可）で切断され合成ＤＮＡが切断部に連結され得るように、天然に生じる配列における部位に対応する好都合な制限部位を含有するだろう。次いで、ＤＮＡは、本開示に従って発現され、コードされたタンパク質を作成する。これらの方法は、ＤＮＡ配列の操作のための当該技術分野で知られている多くの標準的な技術の単なる例示であり、他の既知の技術も使用され得る。
【０３４７】
コドン最適化
本開示は、本明細書に記載の核酸配列のコドン最適化変異体を包含する。
【０３４８】
コドン最適化は、遺伝暗号の冗長性の利点を活かし、コードされるタンパク質の同じアミノ酸配列を維持しながらヌクレオチド配列を変更することを可能にする。
【０３４９】
コドン最適化は、コードされるタンパク質の発現の増加または低減を促進するために実施され得る。これは、ヌクレオチド配列中のコドン使用頻度を特定の細胞型のそれに合わせて調整することによってもたらされ得、ゆえに、細胞型における特定のｔＲＮＡの相対的存在量の偏りに対応する細胞のコドンの偏りを利用する。対応するｔＲＮＡの相対的存在量に一致するように調整されるようにヌクレオチド配列中のコドンを変更することにより、発現を増加させることが可能である。逆に、対応するｔＲＮＡが特定の細胞型では希少であることが知られているコドンを選択することにより、発現を低減させることが可能である。核酸配列のコドン最適化のための方法は、当該技術分野で公知であり、当業者は精通しているだろう。
【０３５０】
ほぼ暗闇でのアジリティ迷路（Ｎｅａｒ  Ｄａｒｋｎｅｓｓ  Ａｇｉｌｉｔｙ  Ｍａｚｅ）
本開示の対象のベースライン視力または視力の改善は、対象を、低光または暗条件を特徴とし、対象者が回避するための１つまたは複数の障害物を含む囲い地を通過させることによって測定され得る。対象は、任意選択で、本開示の処置方法によって提供される、本開示の組成物を必要とし得る。対象は、任意選択で、本開示の処置方法によって提供される、本開示の組成物を、一方または両方の眼に、１つまたは複数の用量及び／または手順／注射で受けている。囲い地は、屋内または屋外にあり得る。囲い地は、日光を再現するレベルから完全な暗闇をシミュレートするレベルまでの管理された光レベルを特徴とする。この範囲内で、囲い地の管理された光レベルは、本開示の組成物を受ける前の本開示の対象の視力が低減している可能性がある自然の夕暮れまたは夕方の光レベルを再現するように設定されることが好ましい。本開示の組成物の投与後、対象は、全ての光レベルで視力が改善されている可能性があるが、改善は、自然の夕暮れまたは夕方の光レベル（屋内または屋外）を再現するものを含む、より低い光レベルで測定されることが好ましい。
【０３５１】
囲い地の一部の実施形態では、１つまたは複数の障害物は、囲い地内にある１つまたは複数の指定された経路及び／またはコースと並んでいる。対象による囲い地の通過の成功には、指定された経路を横断すること、及び指定されていない経路の横断を回避することが含まれ得る。対象による囲い地の通過の成功には、経路内または経路の近くに配置された１つまたは複数の障害物との接触を回避しながら、指定された経路を含む任意の経路を横断することを含み得る。対象による囲い地の通過の成功または改善には、（例えば、正常な視力を有する健常個体と比較した場合または対象による以前の横断と比較した場合に）指定された開始位置から指定された終了位置までの経路を横切るために必要な時間を低減させて、経路内または経路の近くに配置された１つまたは複数の障害物との接触を回避しながら、指定された経路を含む任意の経路を横断することを含み得る。一部の実施形態では、囲い地は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０の経路または指定された経路を含み得る。指定された経路は、意図された開始位置及び意図された終了位置を含有するものとして実験者が指定された経路を特定することにより、指定されていない経路とは異なり得る。
【０３５２】
囲い地の一部の実施形態では、１つまたは複数の障害物は、本開示の表面に固定されていない。一部の実施形態では、１つまたは複数の障害物は、本開示の表面に固定されている。一部の実施形態では、１つまたは複数の障害物は、囲い地の床、壁、及び天井を含むがこれらに限定されない囲い地の内面に固定されている。一部の実施形態では、１つまたは複数の障害物は、固体物体を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の障害物は、液体物体（例えば、「障害池」）を含む。一部の実施形態では、１つまたは複数の障害物は、任意の組合わせまたは配列で、少なくとも１つの経路に沿って、または経路のすぐ近くに、対象が迂回するべき物体；対象が踏み越えるべき物体；歩行するまたは立つことによりバランスをとるべき物体；上り坂、下り坂、またはそれらの組合わせを有する物体；触れるべき物体（例えば、対象の見る能力を決定する及び／または奥行き知覚を判断するため）；その下を歩行するまたは立つことにより横断するべき物体（例えば、物体を回避するために１つまたは複数の方向を曲げることを含む）を含む。囲い地の一部の実施形態では、１つまたは複数の障害物は、指定された順序で対象者が遭遇しなければならない。
【０３５３】
ある特定の実施形態では、対象のベースライン視力または視力の改善は、対象を、低光または暗条件を特徴とし、対象者が回避するための１つまたは複数の障害物を含むコースまたは囲い地を通過させることによって測定され得、ここでコースまたは囲い地は、施設内に存在する。特定の実施形態では、施設は、モジュール式照明システム及び一連の異なるモビリティコースフロアレイアウトを含む。ある特定の実施形態では、１つの部屋が、１組の照明装置を備えた全てのモビリティコースを収容する。例えば、モビリティ試験中に一度に１つのコースを設定してよく、同じ部屋／照明装置は、使用中のコース（フロアレイアウト）に関係なく、モビリティ試験に使用できる。特定の実施形態では、試験のために提供される異なるモビリティコースは、難度が異なるように設計されており、より難度が高いコースは、経路のコントラストが低く障害物を見るのが困難であり、より簡単なコースは、経路のコントラストが高く、障害物を見やすい。
【０３５４】
囲い地の一部の実施形態では、対象は、例えば、精度及び／または速度のベースライン測定値を確立するため、あるいは対象を、網膜疾患を有するまたは網膜疾患を発症するリスクがあると診断するために、本開示の組成物の投与前に試験されてよい。一部の実施形態では、対象は、（例えば、視力を改善する組成物の有効性をモニターする及び／または試験するために）ベースライン測定値からの変化を決定するまたは健常個体からのスコアと比較するために、本開示の組成物の投与後に試験されてよい。
【０３５５】
補償光学適用走査型レーザー検眼鏡（ＡＯＳＬＯ）
本開示の対象の網膜細胞生存率のベースライン測定値または改善された測定値は、１つまたは複数のＡＯＳＬＯ技術によって測定され得る。走査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）を使用して、対象の眼の網膜の個別の層を観察し得る。好ましくは、補償光学（ＡＯ）をＳＬＯに組込んで（ＡＯＳＬＯ）、眼の角膜及び水晶体を含むがこれらに限定されない前眼部の構造によって通常引き起こされるＳＬＯのみからの画像におけるアーティファクトを補正する。ＳＬＯのみを使用することにより生成されるアーティファクトは、結果得られる画像の解像度を低減させる。補償光学は、網膜の層の単一の細胞の解像度を可能にし、正常またはインタクトな網膜細胞（例えば、正常またはインタクトな光受容体細胞）からの方向性後方散乱光（導波光）を検出する。
【０３５６】
本開示の一部の実施形態では、ＡＯＳＬＯ技術を使用して、インタクトな細胞が導波及び／または検出可能な信号を生成する。一部の実施形態では、インタクトでない細胞は、導波及び／または検出可能な信号を生成しない。
【０３５７】
ＡＯＳＬＯは、対象の網膜またはその一部を画像化するために、及び好ましくは評価するために使用され得る。一部の実施形態では、対象は、一方または両方の網膜を、ＡＯＳＬＯ技術を使用して画像化される。一部の実施形態では、対象は、一方または両方の網膜を、（例えば、処置後の後続の比較のためのベースライン測定値を決定する及び／または、網膜疾患の存在及び／または重症度を決定するために）本開示の組成物の投与前に、ＡＯＳＬＯ技術を使用して画像化される。一部の実施形態では、対象は、一方または両方の網膜を、（例えば、組成物の有効性を決定するため及び／または処置から結果得られた改善に関して投与後の対象をモニターするために）本開示の組成物の投与後に、ＡＯＳＬＯ技術を使用して画像化される。
【０３５８】
本開示の一部の実施形態では、網膜を、共焦点または非共焦点（分割検出器）ＡＯＳＬＯのいずれかによって画像化して、１つまたは複数の網膜細胞の密度を評価する。一部の実施形態では、１つまたは複数の網膜細胞は、光受容体細胞を含むがこれに限定されない。一部の実施形態では、１つまたは複数の網膜細胞は、錐体光受容体細胞を含むがこれに限定されない。一部の実施形態では、１つまたは複数の網膜細胞は、桿体光受容体細胞を含むがこれに限定されない。一部の実施形態では、密度は、細胞の数／ミリメートルとして測定される。一部の実施形態では、密度は、生細胞または生存細胞の数／ミリメートルとして測定される。一部の実施形態では、密度は、インタクトな細胞の数／ミリメートル（本開示のＡＡＶ粒子または導入遺伝子配列を含む細胞）として測定される。一部の実施形態では、密度は、応答性細胞の数／ミリメートルとして測定される。一部の実施形態では、応答性細胞は、機能性細胞である。
【０３５９】
一部の実施形態では、ＡＯＳＬＯを使用して、対象の網膜内の光受容体細胞のモザイクの画像をキャプチャし得る。一部の実施形態では、モザイクは、インタクトな細胞、インタクトでない細胞、またはそれらの組合わせを含む。一部の実施形態では、モザイクは、網膜全体、内節、外節、またはその一部を表す画像の合成またはモンタージュを含む。一部の実施形態では、モザイクの画像は、本開示の組成物を含むまたはそれに接触する網膜の一部を含む。一部の実施形態では、モザイクの画像は、本開示の組成物を含むまたはそれに接触する網膜の一部に並置する網膜の一部を含む。一部の実施形態では、モザイクの画像は、処置領域及び未処置領域を含み、処置領域は、本開示の組成物を含むまたはそれに接触し、未処置領域は、本開示の組成物を含まないまたはそれに接触しない。
【０３６０】
一部の実施形態では、ＡＯＳＬＯを単独でまたは光干渉断層法（ＯＣＴ）と組合わせて使用して、対象の網膜、網膜の一部または網膜細胞を直接可視化し得る。一部の実施形態では、補償光学をＯＣＴと組合わせて（ＡＯ−ＯＣＴ）使用して、対象の網膜、網膜の一部、または網膜細胞を直接可視化し得る。
【０３６１】
本開示の一部の実施形態では、外節または内節を共焦点または非共焦点（分割検出器）ＡＯＳＬＯのいずれかによって画像化して、その中の細胞の密度または、外節、内側節、もしくはその組合わせの完全性のレベルを評価する。一部の実施形態では、ＡＯＳＬＯを使用して、内節、外節、またはその組合わせの直径を検出し得る。
【０３６２】
例示的なＡＯＳＬＯシステムを図５７に示す。
【０３６３】
ＡＯＳＬＯ及び様々な技術の追加の説明は、少なくともＧｅｏｒｇｉｏｕ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｒ  Ｊ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  ２０１７；０：１−８；Ｓｃｏｌｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０１４；５５：４２４４−４２５１；及びＴａｎｎａ  ｅｔ  ａｌ．Ｉｎｖｅｓｔ  Ｏｐｔｈａｌｍｏｌ  Ｖｉｓ  Ｓｃｉ．２０１７；５８：３６０８−３６１５に記載されているだろう。
【０３６４】
配列
配列番号１
【化９】
2021520231.tif 000011
【化１０】
2021520231.tif 000012
【化１１】
2021520231.tif 000013
【０３６５】
配列番号２
【化１２】
2021520231.tif 000014
【化１３】
2021520231.tif 000015
【化１４】
2021520231.tif 000016
【０３６６】
配列番号３
【化１５】
2021520231.tif 000017
【化１６】
2021520231.tif 000018
【化１７】
2021520231.tif 000019
【０３６７】
配列番号４
【化１８】
2021520231.tif 000020
【化１９】
2021520231.tif 000021
【０３６８】
配列番号５
【化２０】
2021520231.tif 000022
【０３６９】
配列番号６
【化２１】
2021520231.tif 000023
【０３７０】
配列番号７
【化２２】
2021520231.tif 000024
【０３７１】
配列番号８
【化２３】
2021520231.tif 000025
【０３７２】
配列番号９
【化２４】
2021520231.tif 000026
【化２５】
2021520231.tif 000027
【０３７３】
配列番号１０
【化２６】
2021520231.tif 000028
【化２７】
2021520231.tif 000029
【０３７４】
配列番号１１
【化２８】
2021520231.tif 000030
【化２９】
2021520231.tif 000031
【化３０】
2021520231.tif 000032
【０３７５】
配列番号１２
【化３１】
2021520231.tif 000033
【化３２】
2021520231.tif 000034
【０３７６】
配列番号１３
【化３３】
2021520231.tif 000035
【０３７７】
配列番号１４
【化３４】
2021520231.tif 000036
【０３７８】
配列番号１５
【化３５】
2021520231.tif 000037
【０３７９】
配列番号１６
【化３６】
2021520231.tif 000038
【０３８０】
配列番号２４
【化３７】
2021520231.tif 000039
【０３８１】
配列番号２５
【化３８】
2021520231.tif 000040
【化３９】
2021520231.tif 000041
【０３８２】
配列番号４０
【化４０】
2021520231.tif 000042
【化４１】
2021520231.tif 000043
【化４２】
2021520231.tif 000044
【０３８３】
配列番号４６
【化４３】
2021520231.tif 000045
【化４４】
2021520231.tif 000046
【化４５】
2021520231.tif 000047
【０３８４】
配列番号５３
【化４６】
2021520231.tif 000048
【化４７】
2021520231.tif 000049
【化４８】
2021520231.tif 000050
【０３８５】
配列番号５９
【化４９】
2021520231.tif 000051
【化５０】
2021520231.tif 000052
【化５１】
2021520231.tif 000053
【０３８６】
配列番号６５
【化５２】
2021520231.tif 000054
【化５３】
2021520231.tif 000055
【化５４】
2021520231.tif 000056
【０３８７】
配列番号７０
【化５５】
2021520231.tif 000057
【化５６】
2021520231.tif 000058
【実施例】
【０３８８】
実施例１：上流及び下流ＡＡＶベクターの調製
所与のＡＡＶベクターの生成には、３つのプラスミド：ｐＴｒａｎｓｇｅｎｅ、ｐＲｅｐＣａｐ及びｐＨｅｌｐｅｒを含んだ。ｐＴｒａｎｓｇｅｎｅは、以下に詳述するように、上流または下流ＡＢＣＡ４導入遺伝子のいずれかを含有する（ＩＴＲの統合性を確認した）。ｐＲｅｐＣａｐは、ＡＡＶゲノムのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を含有する。ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ２ゲノム由来であり、一方でｃａｐ遺伝子は、血清型要件によって変動する。ｐＨｅｌｐｅｒは、ＡＡＶ生成の成功に欠かせない必要なアデノウイルス遺伝子を含有する。プラスミドを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）と複合体化し、トリプルトランスフェクションミックスを作成し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に適用し、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、典型的なＰＥＩプロトコルを使用してトランスフェクトして、必要なプラスミド：ｐＲｅｐＣａｐ、ｐＨｅｌｐｅｒ（ｐＤｅｌｔａＡｄＦ６）及びｐＴｒａｎｓｇｅｎｅを送達した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋｓ（ＳＬＳ，ＵＫ）において増殖させ、典型的なＰＥＩプロトコルを使用してトランスフェクトして、合計５００μｇの必要なプラスミド：ｐＲｅｐＣａｐ、ｐＨｅｌｐｅｒ（ｐＤｅｌｔａＡｄＦ６）、及びｐＴｒａｎｓｇｅｎｅを送達した。トランスフェクションの３日後に細胞を回収し、溶解し、イオジキサノール勾配を用いた超遠心分離、その後のＡｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １００Ｋフィルターユニット（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＫ）における精製によってＡＡＶ集団を単離した。トランスフェクションの３日後、細胞を回収して溶解した。ライセートをベンゾナーゼで処理し、清澄化してから、１５％、２５％、４０％及び６０％相から構成されるイオジキサノール勾配にかけた。勾配を、５９，０００ｒｐｍで１時間３０分間回転させ、次いで４０％画分を取り出した。次いで、このＡＡＶ相を、Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ−１５  １００Ｋフィルターユニットを使用して、精製及び濃縮した。このステップの後、１００〜２００μｌの精製ＡＡＶを、ＰＢＳ中に得た。最終調製物は、ＰＢＳ中に収集した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を使用して、各調製物の良好な精製を確認し、ｑＰＣＲ力価を、ＡＢＣＡ４コード配列の上流（ＦＷ  ５’ＧＣＡＣＣＴＴＧＧＣＣＧＴＡＴＴＴＧＧＡＣＡＧ、ＲＥＶ  ５’ＴＧＡＧＴＣＡＧＡＣＡＧＧＣＣＧＡＴＧＴ）または下流（ＦＷ  ５’ＴＧＧＣＧＣＡＧＡＴＣＧＴＧＣＴ、ＲＥＶ  ５’ＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡ）部分のいずれかを標的とするプライマーを使用して決定した。プライマーセットは、９５〜１０５％効率を有することを確認した。
【０３８９】
実施例２−例示的なＡＡＶベクターの構造及びクローニング
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、網膜構造内の様々な細胞層を通して拡散する能力、低い免疫原性、光受容体細胞への優れた向性、及び様々な前臨床モデルにおける広範な概念実証のために、網膜遺伝子治療のために現在選択されているベクターである。ヒト臨床試験は、網膜におけるＡＡＶベクターでの安全性及び有効性を示しており、複数の条件での遺伝子治療試験が過去１０年間に報告されており、さらに現在進行中である。シュタルガルト病などの一部の疾患に関しては、治療用遺伝子が大きすぎて、単一のＡＡＶキャプシドにパッケージングできる導入遺伝子内に収まらない。それゆえ、これらの疾患に対する遺伝子治療の代わりは、興味深い課題である。ＡＡＶのパッケージング収容力が制限されていることを考えると、「大型遺伝子」疾患を処置する可能性は、当初限られているように思われたが、より最近の研究は、２つまたはそれより多くのＡＡＶ粒子を使用する３．５ｋｂを超えるサイズの遺伝子のＡＡＶ遺伝子治療送達が十分になされ得ることを示している。
【０３９０】
異なるＡＡＶデュアルベクターシステムが存在する：１．断片化されたＡＡＶ（ｆＡＡＶ）；２．トランス−スプライシングデュアルベクター；３．重複デュアルベクター；及び４．ハイブリッドデュアルベクター。しかしながら、ｆＡＡＶ及びトランス−スプライシング法の両方の予測不能性は、規制上の懸念を引き起こす可能性が高い。断片化された導入遺伝子を使用する元来のデュアルベクター手法は、無作為なトランケーション及び組換えに関連する懸念のために支持されなくなった。代替のハイブリッド及び重複デュアルベクターシステムは、２つの導入遺伝子間の相同重複の領域に依存する。重複手法は、これらの戦略の中で最も探索されていないが、最も単純なデュアルベクター設計である。２つの導入遺伝子間の相同重複の領域に依存するデュアルベクター戦略は、正確に予測できる及び複製できる。
【０３９１】
ハイブリッド及び重複デュアルベクターシステムは、２つの導入遺伝子間の相同重複の領域に依存する。重複の領域は、導入遺伝子再形成の成功に影響を与えることが示されている。以前の研究は、重複手法の成功は、相同組換え（ＨＲ）に依存することを示しており、それにはＤＮＡ修復機構に関与する様々な形態があり、これらのサブ経路の１つを通して２つの重複するデュアルベクター導入遺伝子が（プラス鎖及びマイナス鎖で）組換えられ得る。これらの分子機構の有効性は、組織依存性であり得る。シュタルガルト病の場合、標的細胞は、最終分化した光受容体であり、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）及び相同組換え（ＨＲ）の両方の機構が、マウスの桿体光受容体細胞で活性である。より大きな導入遺伝子の一貫した正しい再形成が起こる場合、それは関与している相同組換え（ＨＲ）経路の指標である。異なる重複領域を評価する体系的なベクターデザインのバリエーション、コード配列のコドン最適化、及び非翻訳遺伝要素の組込み（図３０）により、本発明者らは、本発明の標的タンパク質の治療レベルを達成し、デュアルベクター戦略において問題であると知られている短縮型タンパク質形態の産生を減少させた。重複デュアルベクターシステムの体系的な設計のバリエーションにより、標的タンパク質、ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４（ＡＢＣＡ４）の治療レベルが達成され、デュアルベクター戦略の既知の副作用である短縮型タンパク質形態の産生が減少した。
【０３９２】
通常の組換えＡＡＶシナリオでは、二本鎖導入遺伝子は、一本鎖アニーリング（ＳＳＡ）による対応するプラス及びマイナス一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）導入遺伝子形態の動員によって、または二本鎖合成によって形成される。それゆえ、２つの重複導入遺伝子間の組換えの機構は、対向する導入遺伝子の相補領域のＳＳＡによっても発生し得る（図２）。結果として生じる構造は、ＨＲ  ＤＮＡ修復ＲＡＤ５１非依存性機構を必要とする状況を模倣し得るが、ＲＡＤ５０依存性機構も、ｆＡＡＶ手法に関係しているように、理論的には可能であり得る。
【０３９３】
本開示は、例えば、デュアル重複ベクターによって送達される場合の、異なる長さの重複領域を探索することによって、ＡＢＣＡ４タンパク質のレベルを増加させるための組成物及び方法を提供する。加えて、本開示は、コドン最適化コード配列の使用及び非翻訳領域（ＵＴＲ）を含めることにより、組換えに成功した導入遺伝子からの発現を増加させることを目的とする。コドン最適化は、所与のコード配列の翻訳率を高めることができ、最近の前臨床研究は、遺伝子治療導入遺伝子におけるそのような潜在的な利点を示している。５’ＵＴＲ構造、特にプロモーター及びコード配列間のスプライシング可能なイントロンは、導入遺伝子からの発現を増強することができる。スプライスされたｍＲＮＡは、スプライシングを通して生成されなかった同一のｍＲＮＡと比較して、翻訳効率が増強し得、導入遺伝子の５’ＵＴＲにウサギβ−グロビン（ＲＢＧ）遺伝子のイントロン２を追加すると、以前には、タンパク質発現を５００倍増加させた。５’ＵＴＲ含有スプライス可能イントロン／エクソン要素を、３’ＵＴＲウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）と組合わせて含んだ結果を、評価した。ＷＰＲＥは、前臨床研究において、転写産物の安定性を増加させ、導入遺伝子の発現を増強することが以前に示されている。
【０３９４】
シュタルガルト病の処置のための重複デュアルベクターシステムの成功を増強できる様々な要素がある。ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４（ＡＢＣＡ４）における突然変異は、光受容体細胞円盤外膜から網膜色素上皮（ＲＰＥ）へのレチノイドの輸送を妨げ、これが、光受容体外節における望ましくないレチノイド誘導体の蓄積をもたらす。光受容体外節が絶えず生成されるため、古い円盤がより末端になると、ＲＰＥによって消費される。突然変異した、非機能性ＡＢＣＡ４を有する光受容体細胞では、円盤膜中に保持されたビスレチノイドがＲＰＥ細胞中に蓄積され、リポフスチンの重要な要素である毒性化合物Ａ２Ｅの形成につながるさらなる生化学的プロセスが起こる。この蓄積の結果、ＲＰＥ細胞が死に、その後生存のためにＲＰＥ細胞に依存する光受容体細胞が変性し得る及び死に得る。色素沈着Ａｂｃａ４−／−マウスモデルにおいて眼底変化が以前に特徴決定されており、重水素化ビタミンＡは、眼底蛍光及びビスレチノイド蓄積に正の効果を有する。従って、このマウスは、ヒト条件に関連する治療効果を評価するために適切なモデルである。機能性ＡＢＣＡ４を、Ａｂｃａ４−／−マウスの光受容体外節に、ビスレチノイド／Ａ２Ｅ／リポフスチンの蓄積を減少させ得る有効性のレベルまで送達することは、シュタルガルト病の患者では、ＲＰＥ細胞の死及びＲＰＥ細胞が支持する光受容体細胞の変性を防ぎ得る。
【０３９５】
標的細胞の内因性ＤＮＡ修復経路を利用して、遺伝子治療用の機能性の大きなＡＢＣＡ４導入遺伝子を再構成する、重複デュアルＡＡＶベクターシステムの実施形態を以下に説明する。
【０３９６】
ＡＢＣＡ４コード配列ＮＭ＿０００３５０を、アミノ酸配列に影響を与えなかった以下のヌクレオチド変化：１，５３６Ｇ＞Ｔ；５，１７５Ｇ＞Ａ；６，０６９Ｔ＞Ｃ（ＡＢＣＡ４コード配列、配列番号１１に従って番号付けした）を除いて、ＷＴ形態として使用した。このＡＢＣＡ４コード配列のコドン最適化は、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ，ＵＳ）によって実行及び生成した。ＷＴ及びＣＯ  ＡＢＣＡ４完全長コード配列（６，８２２ヌクレオチド）を、ＡＡＶ２  ＩＴＲを含有するプラスミドへと挿入して、ＣＡＧ．ＡＢＣＡ４．ｐＡ及びＣＡＧ．ｃｏＡＢＣＡ４．ｐＡを生成した。デュアルベクターｉｎ  ｖｉｔｒｏ比較のための上流導入遺伝子には、ＡＢＣＡ４コード配列断片の前に、ＣＭＶ．ＣＢＡエンハンサー／プロモーター要素のみを使用したＣＡＧの短縮バージョンを含有した。これらの構築物は、ＣＡＧのＣＭＶ．ＣＢＡ要素を増幅し、それらを所望のＡＢＣＡ４コード配列断片に（表２を参照されたい）ＰＣＲにより付加してから、ＳｗａＩ制限部位を使用してＡＡＶ２  ＩＴＲの間に断片全体をクローニングすることによって生成した。ｉｎ  ｖｉｖｏ実験用の上流導入遺伝子は、ＧＲＫ１プロモーターを増幅し、所望のＡＢＣＡ４コード配列断片にＰＣＲにより付加してから、ＡＡＶプラスミドへとライゲート（挿入）したことを除いて、同じ方法で調製した。最適化された上流導入遺伝子に関しては、ＣＡＧイントロン／エクソン領域の１７６ヌクレオチドを増幅し、ＰＣＲ技術によってＧＲＫ１プロモーターの末端に付加した。次いで、このアンプリコンを、ＰＣＲを使用して所望のＡＢＣＡ４コード配列に付加し、ＳｗａＩを使用してＩＴＲ間に挿入した。下流導入遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ使用に関して同一であり、ＡＢＣＡ４コード配列の所望の断片（表２を参照されたい）を増幅し、ＰＣＲによってＷＰＲＥ及びウシ成長ホルモンポリＡシグナルに付加してから、ＳｗａＩ制限部位を使用してＩＴＲ含有プラスミドに挿入した。
【０３９７】
上流ベクター
このベクターは、プロモーター、非翻訳領域（ＵＴＲ）、及びＡＢＣＡ４  ＣＤＳの上流セグメントを含有し、導入遺伝子の各末端にＡＡＶ２  ＩＴＲを伴う（図１）。ＡＢＣＡ４は、網膜の光受容体細胞において発現され、それゆえヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーター要素が組込まれている。上流ベクターに含有される特定のＧＲＫ１プロモーター配列は、Ｋｈａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｖｅ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｖｉｓｕａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，４８（９），３９５４−３９６１，２００７）に記載される通りであり、ＧＲＫ１遺伝子のヌクレオチド−１１２から＋８７までを含み、光受容体細胞を標的とする遺伝子治療のための前臨床試験で使用されてきた。
【０３９８】
１９９ヌクレオチドのＧＲＫ１プロモーターの後に、１８６ヌクレオチド長の非翻訳領域（ＵＴＲ）が続く。このヌクレオチド配列は、ＲＥＰ１臨床試験ベクターに含有されるより大きなＵＴＲ（４４３ヌクレオチド）から選択された（ＭａｃＬａｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）。具体的には、選択された配列は、Ｇａｌｌｕｓ  β−アクチン（ＣＢＡ）イントロン１断片（予測されるスプライスドナー部位を伴う）、Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  β−グロビン（ＲＢＧ）イントロン２断片（予測される分岐点及びスプライスアクセプター部位を含む）及びＯｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ  β−グロビンエクソン３断片、その直後にコザックコンセンサスを含み、これがＡＢＣＡ４  ＣＤＳへとつながる。このＵＴＲ断片は、翻訳収量を増加させるために元来のＧＲＫ１プロモーター要素に追加されている（Ｒａｆｉｑ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｃｈａｔｔｅｒｊｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。それ自体では、ＧＲＫ１プロモーターは、光受容体細胞において非常に良好な遺伝子発現能力を示している。
【０３９９】
デュアルベクター注射Ａｂｃａ４−／−網膜の比較により、上流ベクターがＧＲＫ１．５’ＵＴＲ要素を有する眼から、ＧＲＫ１プロモーター要素単独と比較して、より多くのＡＢＣＡ４タンパク質が生成されることが明らかになる（図３）。
【０４００】
組換え効率を改善し、ｔＡＢＣＡ４の産生を制限する、ヒトＡＢＣＡ４コード配列内の最適な重複配列を決定した後、デュアルベクターシステムを最適化して、組換えに成功した導入遺伝子からの完全長ＡＢＣＡ４発現レベルをさらに増加させた。ｉｎ  ｖｉｖｏ評価のための元の導入遺伝子の設計は、上流導入遺伝子にＧＲＫ１プロモーター要素とＡＢＣＡ４コード配列の一部を、下流導入遺伝子にＡＢＣＡ４コード配列、ＷＰＲＥ及びポリＡシグナルを含んでいた。ＧＲＫ１プロモーターが、マウスの光受容体細胞で良好な発現を駆動する一方で、さまざまな要素が収率を改善し得る。導入遺伝子内にイントロンを含めることは、翻訳収量を改善することが示されており、デュアルベクターシステムの場合、これは、治療効果を誘発するために必要とされる標的タンパク質のレベルを達成することに貢献し得る。スプライス可能な要素を含有する５’ＵＴＲ配列の影響を調査するために、ＡＡＶ２／２  ＣＡＧベクターで使用されるイントロンに類似した５’ＵＴＲからの領域を挿入した。
【０４０１】
５’ＵＴＲの効果は、図１１で見ることができる。１７６ヌクレオチドを、上流導入遺伝子変異体ＢのＧＲＫ１プロモーター及びコザックコンセンサスの間に挿入した。選択した配列は、予測されるスプライスドナー部位を伴うニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ）β−アクチン（ＣＢＡ）イントロン１断片；予測される分岐点及びスプライスアクセプター部位を含むウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）β−グロビン（ＲＢＧ）イントロン２断片、及びウサギ（Ｏｒｙｃｔｏｌａｇｕｓ  ｃｕｎｉｃｕｌｕｓ）β−グロビンエクソン３断片、その直後にコザックコンセンサス及びヒトＡＢＣＡ４コード配列を含んだ。この追加した特性の影響を、ｉｎ  ｖｉｖｏで、上流導入遺伝子に５’ＵＴＲを伴う場合と伴わない場合の４つのデュアルベクター変異体：重複Ｂ（Ｂ）、ＷＰＲＥを伴わない重複Ｂ（Ｂｘ）、重複Ｃ（Ｃ）及び重複Ｄ（Ｄ）による処置後に達成されたＡＢＣＡ４発現を比較することにより試験した。注射６週後のウエスタンブロットによるＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、重複領域及び上流導入遺伝子に５’ＵＴＲを含めることの両方に影響を受けた（図１１）。図１１は、上流導入遺伝子に５’ＵＴＲを伴う場合と伴わない場合の４つのデュアルベクター変異体のＡｂｃａ４−／−眼における網膜下注射後のＡＢＣＡ４検出の比較を示す。各導入遺伝子に含まれるＡＢＣＡ４  ｃＤＮＡ配列のヌクレオチドを示す。完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出は、ＧＡＰＤＨ／試料に正規化され、未処置陰性対照試料を超えるレベルとして表した。図１１ａでは、ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆ変異体を注射したＡｂｃａ４−／−眼を、注射６週後に評価し、上流導入遺伝子における５’ＵＴＲの効果についてＡＢＣＡ４レベルを評価した（二元配置分散分析、ｎ＝３（Ｂｘ／５’Ｄ）、５（Ｂ／Ｃ）、６（５’Ｂｘ／Ｄ）、７（５’Ｂ／５’Ｃ）、５’ＵＴＲの影響ｐ＝０．０３、重複の影響ｐ＝０．００５、相互作用  有意差無し）。図１１ｂでは、最適化したデュアルベクター変異体５’Ｃの２Ｅ＋１０総ゲノムコピーを網膜下注射したＡｂｃａ４−／−眼から、２Ｅ＋９総ゲノムコピーを受けた眼と比較して、より多くの完全長ＡＢＣＡ４が検出された（対応のないノンパラメトリックマンホイットニー検定、ｎ＝９＆１７、＊ｐ＝０．０１）。
【０４０２】
神経網膜を、ｍＲＮＡ抽出用に回収し、その後の重複ゾーンにわたるＲＴ−ＰＣＲ及び配列解析により、組換え導入遺伝子から生成されたＡＢＣＡ４転写産物に突然変異がないことを確認した（図３２Ａ）。さらなるＲＴ−ＰＣＲにより、最適化されたデュアルベクターシステム（５’Ｃ）に含まれたイントロンが、ｍＲＮＡ転写産物からのスプライシングに成功したことが確認された（図３２Ｂ）。重複ゾーンにわたるＲＴ−ＰＣＲ解析により、組換え導入遺伝子からのｍＲＮＡ  ＡＢＣＡ４転写産物が存在し、正しい配列であったことが確認された（図４）。さらにＲＴ−ＰＣＲを行って、最適化されたデュアルベクターシステムを注射した眼における５’ＵＴＲのスプライシングを確認した（図５）。上流導入遺伝子で使用するために選択された５’ＵＴＲ配列は、スプライス可能な要素であると予測され、これを確認するために、デュアルベクター変異体Ｃまたは変異体５’Ｃのいずれかを注射した４つのＡｂｃａ４−／−眼からプールされたｃＤＮＡを、ＧＲＫ１転写開始部位（ＴＳＳ）の下流に結合する順方向プライマー及びＡＢＣＡ４コード配列内で結合する逆方向プライマーを使用して増幅した。５’ＵＴＲスプライシングを評価するための例示的なプライマーには、ＦＷ  ５’ＣＣＡＣＴＣＣＴＡＡＧＣＧＴＣＣＴＣ及びＲＥＶ  ５’ＣＡＧＧＧＡＴＴＧＴＴＣＡＣＡＴＴＧＣを含む。変異体Ｃ注射眼からのｃＤＮＡは、配列決定によりＧＲＫ１  ＴＳＳからＡＢＣＡ４コード配列までの参照配列と正確に一致することが確認された単一のアンプリコンを生成した。最適化されたデュアルベクター変異体５’Ｃを注射した眼からのｃＤＮＡの増幅により、３つの産物が生成された。配列決定により、これらは３つのスプライスバリエーションであると決定した：第一形態は、ＴＳＳ及びＡＢＣＡ４コード配列間で５’ＵＴＲがインタクトなままでスプライスされていない；第二の産物は、部分的にスプライシングされた形態を表す；最後の増幅産物は、５’ＵＴＲの完全な除去を呈し、変異体Ｃ注射眼からのｃＤＮＡ配列と一致した。
【０４０３】
上流ベクターにおいてコザックコンセンサスの後は、ヌクレオチド１〜３，７０１（ＮＣＢＩ参照ファイルＮＭ＿０００３５０では１０５〜３，８０５）のＡＢＣＡ４  ＣＤＳである。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの最後の２０８ヌクレオチドは、下流ベクターに含有されるＣＤＳの最初の２０８ヌクレオチドを形成し、重複ゾーンとして機能する。上流ベクターに含有されるコード配列断片は、ヌクレオチド１，５３６での塩基変化（ＮＭ＿０００３５０  １，６４０）Ｇ＞Ｔを除いて参照配列ＮＭ＿０００３５０と一致する。これは、コドンの３番目の塩基であり、アミノ酸配列の変化をもたらさない。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは、エクソン２５内で短縮され、その下流に３’ＩＴＲがある。
【０４０４】
下流ベクター
このベクターは、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの下流セグメント、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後応答要素（ＷＰＲＥ）及びウシ成長ホルモンポリアデニル化シグナル（ｂＧＨ  ポリＡ）を含有し、導入遺伝子の各末端にＡＡＶ２  ＩＴＲを伴う（図１及び図２）。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは５’ＩＴＲの下流の位置３，４９４（ＮＭ＿０００３５０  ３，５９８）で始まり、６，８２２（ＮＭ＿０００３５０  ６，９２６）の終止コドンまで続く。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの最初の２０８ヌクレオチドは上流ベクターに含有される最後の２０８個のＡＢＣＡ４  ＣＤＳヌクレオチドと同じであり、導入遺伝子間の重複ゾーンとして機能する。下流ベクターに含有されるコード配列断片は、ヌクレオチド５，１７５（ＮＭ＿０００３５０  ５，２７９）Ｇ＞Ａ及び６，０６９（ＮＭ＿０００３５０  ６，１７３）Ｔ＞Ｃの塩基変化を除いて、参照配列ＮＭ＿０００３５０と一致する。これらの変化は両方とも、コドンの３番目の塩基で生じ、アミノ酸配列の変化をもたらさない。
【０４０５】
制限部位ＨｉｎｄＩＩＩは、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳ終止コドンをＷＰＲＥから分離する。この要素は５９３ヌクレオチド長であり、ＲＥＰ１臨床試験ベクターに含有されるＸ抗原不活化ＷＰＲＥと一致する。次いで、ＳｐｈＩに対する制限部位が、２６９ヌクレオチド長であり、ＲＥＰ１臨床試験ベクターに存在するｂＧＨポリＡシグナルと一致するｂＧＨポリＡシグナルからＷＰＲＥを分離する。次いで３’ＩＴＲは、ポリＡシグナルの下流にある。
【０４０６】
ＡＡＶ２  ５’ＩＴＲは、プロモーター活性を有することが知られており、下流導入遺伝子内にＷＰＲＥ及びｂＧＨポリＡシグナルを伴うと、安定な転写産物が、非組換え下流ベクターから生成されるだろう。下流導入遺伝子に含有される野生型ＡＢＣＡ４  ＣＤＳは、アミノ酸配列を変えることなく他のコドンに置換することができない複数のインフレームＡＵＧコドンを有する。これにより、安定した転写産物から翻訳が生じる可能性が生まれ、ウエスタンブロットにより検出可能な短縮型ＡＢＣＡ４ペプチドの存在がもたらされる（図８ａ）。選択された重複ゾーンの開始配列は、翻訳機構がアウトオブフレーム部位から開始することを促進するために、（潜在的なコザックコンセンサスに関して）より弱いコンテクストのインフレームＡＵＧコドンよりも前に良好なコンテクストのアウトオブフレームＡＵＧコドンを含むように、注意深く選択された（図１２ａ）。インフレームＡＵＧの前には、様々なコンテクストで合計４つのアウトオブフレームＡＵＧコドンがある。これらは全て、１０アミノ酸以内で終始コドンに翻訳されるだろう。これらのアウトオブフレームＡＵＧコドンの存在は、非組換え下流導入遺伝子からの短縮型ＡＢＣＡ４タンパク質の翻訳を妨げ得る。
【０４０７】
デュアル重複ベクターの一部の実施形態では、ＷＰＲＥの存在または不在は、デュアル重複ベクターからのタンパク質発現に影響を与えた。重複ゾーンＢを伴うベクターからのタンパク質発現を、図６に示す。完全長ＡＢＣＡ４タンパク質が、ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆデュアルベクター変異体Ｂで形質導入されたＨＥＫ２９３Ｔ細胞から検出された。ＷＰＲＥを伴うデュアルベクター変異体Ｂは、ＷＰＲＥを伴わないデュアルベクター変異体Ｂ（Ｂｘ）で処置したものよりも、多くのＡＢＣＡ４を生成した（対応のない両側パラメトリックｔ検定、ｎ＝３、＊ｐ＝０．０１、Ｆ（２，２）＝１７．０６）。エラーバーは、ＳＥＭを表す。
【０４０８】
実施例３−重複ゾーンの評価
組換えに使用する最適なベクター及びＡＢＣＡ４配列を同定した後、プラス鎖及びマイナス鎖間の塩基対合の重複長さを変動させることの影響を評価した。
【０４０９】
【表２】
2021520231.tif 000059
【０４１０】
表２には、ＡＢＣＡ４コード配列（配列番号１１）対して番号付けした、試験したデュアルベクター組合わせに関する導入遺伝子の詳細を含有する。最後の行には、最適化された重複デュアルベクターシステムの詳細を含有した。ＡＢＣＡ４＝ＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質ファミリーメンバー４；ＣＤＳ＝コード配列；ＧＲＫ１＝ヒトロドプシンキナーゼプロモーター；ｐＡ＝ポリＡシグナル；ＷＰＲＥ＝ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素。
【０４１１】
導入遺伝子の長さは、ＡＡＶのパッケージング効率に影響し、それゆえ力価に影響する。それゆえ、４．９ｋｂの最大導入遺伝子サイズを標的とした（表２）。６つの重複変異体（Ａ〜Ｆ）と、導入遺伝子間に重複領域を有さないように設計した追加の変異体（Ｘ）を調製し、ＡＢＣＡ４コード配列内の最適な重複ゾーンの同定を試みた（図９及び３０Ｂ、表２）。追加の変異体（Ｘ）は、導入遺伝子間の重複領域を有さないように設計され、陰性対照として機能した（表２及び図５１）。重複変異体の詳細を、表２及び図５１に示す。６つの重複変異体を調製し（図５１Ａ〜Ｆを参照されたい）、ＡＡＶ導入遺伝子内での可能な最長（１，１７３ｂｐ）から、特異性の維持と一致する最小（２３ｂｐ）までの範囲を重複させた。重複変異体Ｂ〜Ｘは、同じ上流導入遺伝子（Ｕｐ２）を共有し、その下流導入遺伝子に含有されるＡＢＣＡ４コード配列においてのみ異なった。変異体Ａに関しては最大重複ゾーンを得るために、拡張された上流導入遺伝子が必要であった（Ｕｐ１）。下流ベクターの最大コード容量に達した後、上流導入遺伝子をさらに３’方向に拡張して、最大１，１７３ｂｐ重複ゾーンを変異体Ａに関して得た。
【０４１２】
最適な重複ゾーンは、６つの重複変異体のｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ評価に従って決定した（それぞれ、図７ａ及び７ｂ）。これらは、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ及びＦと称され、以下の重複ゾーンを表す（Ｘは、重複無しを表す）：Ａ．１，１７３ヌクレオチド（３２５９〜４４３０）；Ｂ．５０６ヌクレオチド（３３００〜３８０５）；Ｃ．２０８ヌクレオチド（３５９８〜３８０５）；Ｄ．９９ヌクレオチド（３７０７〜３８０５）；Ｅ．４９ヌクレオチド（３７５７〜３８０５）及び；Ｆ．２４ヌクレオチド（３７８２〜３８０５）。（ここでの重複ゾーンは、配列番号１に対して番号付けしている）。重複ゾーンＢ〜Ｘの下流導入遺伝子は、全て同じ上流導入遺伝子と対になる。重複変異体Ｂ及びＣは、他の全ての変異体よりもパフォーマンスが良く、同様の程度であったが、様々な理由からデュアルベクターバージョンＣを選択した。１つ目は、非組換え下流導入遺伝子からの短縮型ＡＢＣＡ４の産生が限定されているためである（図８ａ）。Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＸ変異体からの非組換え下流導入遺伝子は、ＡまたはＢバージョンよりも減少したレベルの短縮型ＡＢＣＡ４タンパク質を生成する。デュアルベクター状況では、重複Ｃは、完全長ＡＢＣＡ４と比較して短縮型ＡＢＣＡ４が生成される割合が最も低い（図８ｂ及び８ｃ）。これは、重複Ｃ導入遺伝子設計が、非組換え導入遺伝子からの不要な発現を限定するだけでなく、重複Ｂよりも組換えの効率が高いことを示す。これのさらなる証拠は、重複Ｃ及びＢ注射ＡＢＣＡ４−／−網膜間の転写産物倍率変化及びタンパク質倍率変化を比較することにより生じる。ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの上流部分を標的とするプライマー（それゆえ、組換え導入遺伝子からの完全長ＡＢＣＡ４転写産物に加えて、非組換え上流導入遺伝子からの転写産物を検出する）は、重複Ｂ及びＣデュアルベクター注射網膜の両方に存在する非常に高レベルの転写産物を検出した。しかしながら、重複Ｃは、重複Ｂの半分未満のレベルの転写産物を生成し、１．５倍のレベルのＡＢＣＡ４タンパク質を産生した（図８ｄ）。両方が同じ上流ベクターを共有し、その下流導入遺伝子配列のみが異なることを考えると、これは、重複Ｃに関して選択された重複ゾーンが、重複Ｂよりも高い効率で組換えすることを示す。
【０４１３】
選択した重複ゾーンのＧＣ含有率は５２％で、遊離エネルギー予測は−１９．６０ｋｃａｌ／ｍｏｌであり、これは、−５５．６０ｋｃａｌ／ｍｏｌ（ＧＣ含有率５３％）の重複ゾーンＢの約３分の１である、図１２ｂ。遊離エネルギーのこの減少は、非組換え重複Ｃによって形成された二次構造が、重複Ｂの場合よりも容易に分解されるだろうことを示す。本発明者らは、これにより、重複Ｃが対向する導入遺伝子上の重複ゾーンとの相互作用により利用しやすくなると予測する。
【０４１４】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０，０００のＭＯＩで各デュアルベクター重複変異体（発現は、ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモーター要素から駆動される）で形質導入した。細胞を、形質導入５日後に回収し、ウエスタンブロット解析によってＡＢＣＡ４発現を測定し、ＡＢＣＡ４検出レベルをＧＡＰＤＨに正規化し、非形質導入試料のバックグラウンドレベルを超える値として表した。重複領域は、生成されるＡＢＣＡ４のレベルに有意な影響を有することが観察された（ｐ＜０．０００１、図９Ａ）。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆデュアルベクター形質導入により、生成されるＡＢＣＡ４のレベルに対する重複領域の影響を同定した（一元配置分散分析、ｎ＝３、ｐ＝０．０００１、Ｆ（６，１４）＝１０．８９）。変異体Ｂは、変異体Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＸよりも多くのＡＢＣＡ４を生成し、変異体Ｃは、変異体Ｄ、Ｅ、Ｆ、及びＸよりも多くのＡＢＣＡ４を生成した（一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定、ｎ＝３、Ｘ＊＊＊ｐ＝０．００９／Ｄ、Ｅ、Ｆ＊＊ｐ≦０．００９／Ａ＊ｐ≦０．０４）。デュアルベクター変異体Ｂは、変異体Ａ、Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＸよりも多くのＡＢＣＡ４を生成し、デュアルベクター変異体Ｃは、変異体Ｄ、Ｅ、Ｆ及びＸよりも多くのＡＢＣＡ４を生成した（図９ａ）。
【０４１５】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を各デュアルベクター重複変異体で形質導入し、ＡＢＣＡ４発現を、ウエスタンブロット解析により測定した。重複領域は、生成されるＡＢＣＡ４のレベルに有意な影響を有することが観察された（ｐ＜０．０００１、図９）。重複変異体Ａ、Ｂ及びＣは、重複Ｘ処置細胞よりも、それぞれ、４．２（ｐ＝０．００４）、７．２（ｐ＜０．０００１）及び５．２（ｐ＝０．０００４）倍多くの完全長ＡＢＣＡ４を提供した（図９Ｅ）。これらのデュアルベクター変異体を、Ａｂｃａ４−／−マウスの網膜下腔に注射し、神経網膜を除去して、ＡＢＣＡ４を検出した。ｉｎ  ｖｉｖｏでの有効性を、全てのデュアルベクター変異体Ａ〜Ｆでウエスタンブロットにより明らかとなった完全長ＡＢＣＡ４産生で確認した。
【０４１６】
次いで、デュアルベクター変異体を、Ａｂｃａ４−／−マウスの網膜下腔に注射し、神経網膜を、注射６週後に除去して、ＡＢＣＡ４を検出した。データは、合計３〜１６眼／デュアルベクターで複数の注射群から編集した。これらの網膜試料におけるＡＢＣＡ４タンパク質レベルの比較は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ研究と同様に、重複領域が生成されるＡＢＣＡ４のレベルに影響することを示した。（ｐ＝０．００１、図９ｂ）。ＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆデュアルベクター変異体を網膜下注射したＡｂｃａ４−／−マウスは、ＡＢＣＡ４発現を注射６週後に評価した。重複領域は、検出されるＡＢＣＡ４のレベルに影響し（一元配置分散分析、ｎ＝５（Ａ／Ｂ／Ｃ）、６（Ｄ／Ｅ／Ｘ）または３（Ｆ）、ｐ＝０．００１、Ｆ（６，３６）＝４．４５３）、変異体Ｃ及びＤは、対照変異体Ｘよりも多くのＡＢＣＡ４をもたらした（一元配置分散分析、テューキーの多重比較検定、それぞれ、＊＊＊ｐ＝０．０００３及び＊ｐ＝０．０４）。デュアルベクター変異体Ｃ及びＤは、ｉｎ  ｖｉｖｏで変異体Ｘよりも多くのＡＢＣＡ４を生成したが、全ての変異体Ａ〜Ｆは、ＡＢＣＡ４の検出可能なレベルをもたらし、これは、Ａ〜Ｄデュアルベクター重複変異体が検出可能なＡＢＣＡ４を生成したｉｎ  ｖｉｔｒｏ試料とは異なった（図９）。プロモーター及び開始コドン間にイントロンを含めることも、ベクターの用量と同様に、ＡＢＣＡ４のレベルに有意に影響を有した（それぞれ、ｐ＝０．０４及びｐ＝０．００６、図９Ｂ）。
【０４１７】
遺伝子発現を増強する可能性がある、プロモーターの直後にイントロンを追加することの効果を探索した。プロモーター及び開始コドン間にイントロン（Ｉｎ）を含めることは、達成される完全長ＡＢＣＡ４のレベルに有意な影響を有し、ＷＰＲＥ要素の存在下で、重複ベクター変異体を用いた処置後に観察される検出が最小で１．５倍増加した（ｐ＝０．００４）。最適化されたデュアルベクター変異体ＩｎＣをその後注射することにより、Ａｂｃａ４−／−注射眼における完全長ＡＢＣＡ４の一貫した検出が明らかとなった（図９Ｆ）。
【０４１８】
神経網膜を、ｍＲＮＡ抽出用に回収し、その後の重複ゾーンにわたるＲＴ−ＰＣＲ及び配列解析により、組換え導入遺伝子から生成されたＡＢＣＡ４転写産物に突然変異がないことを確認した。さらなるＲＴ−ＰＣＲにより、最適化されたデュアルベクターシステムに含まれたイントロン（ＩｎＣ）が、ｍＲＮＡ転写産物からのスプライシングに成功したことが確認された。従って、デュアルベクターシステムは、キャプシド、重複ゾーン、導入遺伝子制御要素に関して最適化されている。
【０４１９】
データは、野生型キャプシドと比較してＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆを使用してマウス網膜の光受容体細胞に導入遺伝子を送達する場合の、形質導入における改善の以前の所見を裏付けているが、重複デュアルベクター戦略の一態様は、２つの導入遺伝子間の組換えの事象である。２つの導入遺伝子間の組換えの事象は、重複領域の長さを変更することによって影響を受ける。１．１ｋｂ〜０．０２ｋｂまでの６つの異なる重複領域を比較した（図９）。全ての重複変異体は、ＡＢＣＡ４の発現をもたらし、最もパフォーマンスの高い変異体はＢ及びＣであり、それぞれ０．５ｋｂ及び０．２ｋｂの重複長さを表している。６つの異なる重複領域は、１，１７３〜２３ｂｐの範囲であり、最もパフォーマンスが高い２０７〜５０５ｂｐと比較した。最近の報告では、重複デュアルベクターシステムにおいてｌａｃＺ遺伝子の１．０ｋｂ、０．６ｋｂ及び０．３ｋｂの重複領域を比較し、最大の重複領域を、最も効率的であると同定した。しかしながら、別の報告では、０．０７ｋｂのＦ１ファージ由来配列が、光受容体細胞においてハイブリッドデュアルベクター間の組換えを達成するのに効率的であることが証明されている。しかしながら、データセットに提示される重複長さに対する特定の調査がないため、最大１．１ｋｂのｌａｃＺ重複が最良の再構成効率を提供する理由は不明である。現在のところ、何が組換えにて領域を効率的にするのかについての明確に定義された特徴はない。１つの可能性は、ＧＣ含有率が寄与し得ることである。最良の重複変異体のＧＣ含有率は、変異体Ｂで５４％、変異体Ｃで５２％と同等であったが、２つの領域間の立体障害はかなり異なり得る。重複の領域がより長いと、分子間相互作用の機会が増加するということが論理的であるように思われるが、長いと、二次構造が形成されるため、そのような相互作用に利用されにくくなり得、一方で、重複がより短いと、対向する導入遺伝子への結合の強さにおいて問題が生じ得る。重複が短ければ、必要となる、相補的結合に利用できるヌクレオチドの連なりが短くなり、二次構造の形成による妨害が少なくなり得る。短い重複が問題になり得るとすれば、それは対向する導入遺伝子分子への結合の強さであるだろう。これは、この研究で特定された最適な重複配列が、なぜ試験された重複領域の範囲の真ん中であると決定されたかについての理由を提供する。この研究は、所与のデュアルベクターシステムに最適な配列を決定するために、複数の重複領域を評価することの重要性を強調する。
【０４２０】
実施例４−実験プロトコル
図３、７ｂ、８ｂ：Ａｂｃａ４−／−マウスに、各ベクターの１Ｅ＋９ゲノムコピー／眼を送達する、デュアルベクターミックス（１：１）を２μｌ網膜下注射した。眼球の摘出を、注射６週後に行い、神経網膜を眼杯から切り離し、ＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。組織を均質化し、遠心分離後に上清を抽出した。上清を、変性ローディング緩衝液と混合し、変性条件下で７．５％ＴＧＸゲルで泳動した。タンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、ＡＢＣＡ４をウサギポリクローナル抗ＡＢＣＡ４（Ａｂｃａｍ）で検出し、Ｇａｐｄｈをマウスモノクローナル抗ＧＡＰＤＨ（Ｏｒｉｇｅｎｅ）で検出した。バンドは、ＬＩＣＯＲイメージングシステムを使用して、可視化及び解析した。ＡＢＣＡ４レベルを各試料に関してＧａｐｄｈに正規化し、次いで、非注射Ａｂｃａ４−／−眼と対比して表した。
【０４２１】
図７ａ：全てのｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞で行い、これは標準プロトコルを使用して継代し、ＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ，ＵＳ）を使用して、等モル濃度のプラスミドで６０〜７０％コンフルエンスでトランスフェクトした。細胞を４８時間３７℃にて５％ＣＯ２とインキュベートし、その後培地を除去し、細胞層を冷ＰＢＳで穏やかにすすぎ、吸引した。細胞を緩め、新しい容量の冷ＰＢＳに持ち上げ、１，０００ｘｇで１０分間、４℃にてスピンさせた後、ＰＢＳを除去し、新しい容量の冷ＰＢＳに再懸濁し、再度スピンさせた。ＰＢＳを除去し、必要になるまで、細胞ペレットを−８０℃で凍結した。
【０４２２】
形質導入は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞をプレーティングすることにより行い、次いで、プレーティングの２４時間後に（８０〜９０％コンフルエンスである）細胞の１つのウェルを持ち上げて、１つのウェル内の細胞を計数した。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、６つのウェル培養プレートに２Ｅ５細胞／ウェルで播種した。２４時間後、細胞の１つのウェルを持ち上げて計数した。この計数を使用して、２０，０００の感染多重度（ＭＯＩ）／ベクターを与えるために、各ウェルに提供するベクターの適切な量を決定した。各ＡＡＶは、この計数に基づいて、２０，０００のＭＯＩで適用した。各ＡＡＶは、この計数に基づいて、２０，０００のＭＯＩで適用した。ＡＡＶベクターを、所望のＭＯＩにて、ＦＢＳを含まず２００ｎＭドキソルビシンを含む培養培地（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，ＵＫ）の半分のウェル容量まで加えた。ウェルを吸引し、ＡＡＶ及びドキソルビシンを含有する容量を細胞に加え、これを３７℃、５％ＣＯ２にて１時間インキュベートした。次いで、残りの容量の培養培地を、２０％ＦＢＳを含有する各ウェルに加え、細胞を３７℃、５％ＣＯ２でインキュベートし、形質導入の２及び４日後に培地交換を実施した。形質導入の４８時間後に培地を除去し、１０％ＦＢＳを含有する新しい培地を適用した。細胞を、さらに４８時間インキュベートした後、別の培地交換を行った。２４時間後、細胞を回収し、穏やかな遠心分離サイクルを使用して冷ＰＢＳ中で３回洗浄した。最後のＰＢＳ洗浄液を除去し、細胞ペレットを凍結した。細胞ペレットを氷上で解凍し、次いでＲＩＰＡ緩衝液に溶解した。細胞を、形質導入の１週間後に上記の通りに回収した。ライセートを、ウエスタンブロット解析に関して上記した網膜試料と同様に処置した。
【０４２３】
図８ａ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して、６つのウェル培養プレートに１Ｅ６細胞／ウェルで播種した。２４時間後、トランスフェクション試薬ＬＴ１（ＧｅｎｅＦｌｏｗ）に複合化した１μｇのプラスミドを含有するトランスフェクションミックスを、細胞に適用した。試験プラスミドは、ＡＡＶベクターの作製に使用した下流導入遺伝子を有した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を洗浄し、回収し、上記の通りにウエスタンブロットにより評価した。
【０４２４】
図８ｄ：ＡＢＣＡ４タンパク質レベルを、図３に記載する通りにウエスタンブロット解析から獲得し、倍率変化を、重複変異体Ｃ及びＢデュアルベクター処置間で比較した。転写レベルの比較のために、組織試料を、ＲＮＡｌａｔｅｒ（Ａｍｂｉｏｎ）にて収集し、ｍＲＮＡを、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ−ｏｌｉｇｏｄＴ  ｍＲＮＡ  ＤＩＲＥＣＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して抽出した。ｃＤＮＡ合成を、５００ｎｇ  ｍＲＮＡを用いて、ｏｌｉｇｏｄＴプライマー及びＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を使用して行った。試料を、ＰＣＲ精製スピンカラム（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して浄化し、５０μｌ  ＤＥＰＣ処理水にて溶出した。ｃＤＮＡは、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの上流部分を標的とするｑＰＣＲによって評価した。ＡＢＣＡ４のレベルを、アクチンレベルに正規化し、非注射Ａｂｃａ４−／−試料と対比して表した。次いで、重複変異体Ｃ及びＢデュアルベクター処置間のＡＢＣＡ４転写レベルの倍率変化を比較した。
【０４２５】
ｉｎ  ｖｉｖｏ実験：全ての動物の飼育及び実験手順は、地方及び国の倫理及び法務当局の承認の下で実施され、ＡＲＶＯ  ｓｔａｔｅｍｅｎｔ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌｓ  ｉｎ  Ｏｐｈｔｈａｌｍｉｃ  ａｎｄ  Ｖｉｓｉｏｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに従って実施した。色素沈着Ａｂｃａ４−／−マウス（１２９Ｓ４／ＳｖＪａｅ−Ａｂｃａ４ｔｍ１Ｇｈｔ）は、Ｇａｂｒｉｅｌ  Ｔｒａｖｉｓ（Ｄａｖｉｄ  Ｇｅｆｆｅｎ  Ｓｃｈｏｏｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ，Ｌｏｓ  Ａｎｇｅｌｅｓ，ＣＡ）により提供され、Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｏｘｆｏｒｄで飼育した。色素沈着ＷＴ対照マウス（１２９Ｓ２／ＳｖＨｓｄ）は、ＥＮＶＩＧＯ（Ｈｉｌｌｃｒｅｓｔ，ＵＫ）から購入した。動物は、１２時間の明（＜１００ルクス）／暗サイクルで、食餌と水は自由摂取にて飼育した。網膜下注射は、手術顕微鏡（Ｌｅｉｃａ  Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、直接視覚ガイダンスの下で、２μｌの試薬を送達することによって行った。初期の実験では、後極から上方網膜を通る強膜トンネル手法を、ハミルトンシリンジ及び３４ゲージ針（ＥＳＳ  ｌａｂｓ，ＵＫ）を用いて使用し、この注射システム及び方法は、図２８で評価した眼に使用した。その後の全ての網膜下注射は、３３Ｇ針を用いて前房穿刺を行ってから、ＷＰＩシリンジ及びベベル３５Ｇ針システム（Ｗｏｒｌｄ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，ＵＫ）を使用して網膜下注射することを伴った。動物を、ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）及びキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を含有する腹腔内注射により麻酔し、瞳孔は、トロピカミド点眼薬（Ｍｙｄｒｉａｔｉｃｕｍ１％，Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ，ＵＫ）及びフェニレフリン点眼薬（塩酸フェニレフリン２．５％，Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ，ＵＫ）で完全に拡張させた。プロキシメタカイン点眼薬（プロキシメタカイン塩酸塩０．５％，Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ，ＵＫ）も、網膜下注射の前に適用した。注射後、クロラムフェニコール点眼薬を適用し（クロラムフェニコール０．５％，Ｂａｕｓｃｈ＆Ｌｏｍｂ，ＵＫ）、麻酔は、アチパメゾール（２ｍｇ／ｋｇ）で逆転させ、白内障の形成を防ぐためにカルボマーゲル（Ｖｉｓｃｏｔｅａｒｓ，Ｎｏｖａｒｔｉｓ，ＵＫ）を適用した。
【０４２６】
転写産物解析：試料は、ＨＥＫ２９３Ｔ凍結細胞ペレットまたはＲＮＡｌａｔｅｒに保存された神経網膜（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＵＫ）のいずれかとした。神経網膜試料は、眼球摘出後の眼杯の解剖によって得られ、解剖直後にＲＮＡに入れた。試料を氷上で解凍し、ｍＲＮＡを、ｍＲＮＡ  ＤＩＲＥＣＴ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ−ｏｌｉｇｏｄＴ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＵＫ）を使用して、５００ｎｇのｍＲＮＡで抽出し、次いで、製造業者のガイドラインに従って、ｏｌｉｇｏｄＴプライマーを用いたＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  ｃＤＮＡ合成反応に使用した。ｃＤＮＡは、ＱＩＡＧＥＮスピンカラムで浄化し、５０μｌ  ＤＥＰＣ処置水で溶出した。転写産物は、２μｌの各ｃＤＮＡ調製物（上記のｑＰＣＲプライマー）を使用したｑＰＣＲによって評価した。ＡＢＣＡ４レベルは、ＡＣＴＩＮ／Ａｃｔｉｎレベルに正規化した。ＲＴ−ＰＣＲに関しては、２μｌのｃＤＮＡを使用して、上流のみの転写産物の長さ（ＦＷ  ５’ＧＡＴＴＡＣＡＡＡＧＡＴＧＡＣＧ（配列番号７１）、ＲＥＶ  ５’ＧＣＡＡＴＴＣＡＧＴＣＧＡＴＡＡＣＴＡ（配列番号７２））、重複（ＦＷ  ５’ＡＣＣＴＴＧＡＴＣＡＧＧＴＧＴＴＴＣＣＡ（配列番号：７３）、ＲＥＶ  ５’ＡＣＡＧＡＡＧＧＡＧＴＣＴＴＣＣＡ（配列番号７４））及び５’ＵＴＲ評価（ＦＷ  ５’ＣＣＡＣＴＣＣＴＡＡＧＣＧＴＣＣＴＣ、ＲＥＶ  ５’ＣＡＧＧＧＡＴＴＧＴＴＣＡＣＡＴＴＧＣ（配列番号７５））を同定した。配列解析用のアンプリコンは、サンガーシーケンシングの前にＰＣＲ精製またはクローン化及び精製した。
【０４２７】
ウエスタンブロット評価：試料は、ＨＥＫ２９３Ｔ凍結細胞ペレットまたは凍結神経網膜組織のいずれかとした。神経網膜試料は、眼球摘出後の眼杯の解剖によって得られ、解剖直後にドライアイス上の溶解緩衝液（ＲＩＰＡ緩衝液（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＫ）とプロテアソーム阻害剤（Ｒｏｃｈｅ，ＵＫ））にて凍結した。試料を氷上で解凍し、ハンドヘルドホモジナイザーを使用して溶解し、４℃で１時間回転させた後、１７，０００ｘｇで３０分間、４℃にてスピンさせた。上清を除去し、２０μｌを、５μｌのタンパク質ローディング緩衝液（ＧｅｎｅＦｌｏｗ，ＵＫ）に加えた。これを、室温で１５分間放置してから、７．５％ＴＧＸゲル（ＢｉｏＲａｄ，ＵＫ）にロードした。タンパク質を、ＴｒａｎｓＢｌｏｔＴｕｒｂｏを使用してＰＶＤＦ膜に転写し、その後ＡＢＣＡ４／Ａｂｃａ４（ａｂ７２９５５，Ａｂｃａｍ，ＵＫ）及びＧＡＰＤＨ／Ｇａｐｄｈ検出（ＴＡ８０２５１９，Ｏｒｉｇｅｎｅ，ＵＳ）を、ＳＮＡＰｉＤシステム（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＫ）を使用して行った。図２８のブロットは、ＨＲＰコンジュゲート二次抗体（Ａｂｃａｍ，ＵＫ）を使用し、Ｌｕｍｉｎａｔａ  Ｆｏｒｔｅ  ＨＲＰ基質（ＭｅｒｃｋＭｉｌｌｉｐｏｒｅ，ＵＫ）で用いて展開した。他のブロットは、ＩＲＤｙｅ蛍光二次抗体（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）を使用して検出した。膜シグナルは、Ｏｄｙｓｓｅｙイメージングシステム（ＬＩ−ＣＯＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，ＵＫ）で記録し、バンド密度は、Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｌｉｔｅソフトウェアを使用して評価し、ＡＢＣＡ４／Ａｂｃａ４レベルはＧＡＰＤＨ／Ｇａｐｄｈレベルに正規化し、値は、陰性対照試料のバックグラウンド測定値と対比して表した。
【０４２８】
データセットを、正規分布（シャピロウィルク検定）及び分散（ブラウンフォーサイス検定）について評価した。比較のためのＦｆデータは、不等分散（歪曲した及び、対応のない）を呈し、次いでノンパラメトリック検定を行った（マンホイットニーのＵ検定またはクラスカルウォリス）。分散が等しければ（データは正規分布され、対応がある）、パラメトリック検定を使用した（スチューデントのｔ検定または分散分析）。複数の比較を、テューキーまたはシダックの比較検定（分散分析の場合）またはダンの比較（クラスカルウォリスの場合）を使用して補正して実行した。図面の簡単な説明は、必要に応じて提供されるｎ、ｐ、及びＦ値を用いて各特定のデータセットを解析するために使用された試験を示している。データは、平均及びＳＥＭとして示す。
【０４２９】
実施例５−重複デュアルベクター戦略を使用した、Ａｂｃａ４−／−マウスの光受容体へのＡＢＣＡ４のＡＡＶ媒介性送達
この実施例で提示されたデータは、本開示の重複デュアルベクターシステムを用いた網膜下注射後に、Ａｂｃａ４−／−マウスモデルの光受容体外節に特異的に局在するＡＢＣＡ４タンパク質の発現を実証する。
【０４３０】
導入遺伝子の設計及び産生：重複ＡＢＣＡ４導入遺伝子を、ＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆキャプシドにパッケージングした。上流導入遺伝子には、ヒトロドプシンキナーゼ（ＧＲＫ１）プロモーター及び、ＡＡＶ２逆位反復配列（ＩＴＲ）間にＡＢＣＡ４コード配列（ＣＤＳ）の上流部分を含有した。下流導入遺伝子には、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳの下流部分、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後制御要素（ＷＰＲＥ）及びポリＡシグナル（ｐＡ）を含有した。上流及び下流両方の導入遺伝子は、ＡＢＣＡ４  ＣＤＳ重複の領域を有した。
【０４３１】
注射：Ａｂａｃ４−／−マウスに、上流及び下流ベクターの１：１混合物（１×１０１３ｇｃ／ｍｌ）を含有する２μｌ網膜下注射を、４〜５週齢で与えた。眼を、注射６週後に回収して、免疫組織化学（ＩＨＣ）評価を行った。
【０４３２】
初回の網膜下注射は、２Ｅ＋９総ゲノムコピーの様々なデュアルベクター組合わせを送達した。２Ｅ＋９または２Ｅ＋１０総ゲノムコピーを注射したＡｂｃａ４−／−眼を、達成されたＡＢＣＡ４タンパク質レベルに関連して比較した。より多くのＡＢＣＡ４が、高用量を受けた眼において検出され（図１１ｂ）、このことは導入遺伝子の送達の増加が、組換え事象をより成功させることができたことを示している。全てのその後のｉｎ  ｖｉｖｏ研究は、２Ｅ＋１０用量を用いて実施した。
【０４３３】
免疫組織化学的染色：水晶体を除去した眼杯全体を、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）中で２０分間室温にて固定した。眼杯を、１０％ショ糖溶液に１時間移し、その後２０％溶液に１時間移した後、３０％ショ糖中で４℃にて一晩インキュベートした。眼杯を、Ｏ．Ｃ．Ｔ．コンパウンド（ＶＷＲ，ＵＫ）に入れ、３０分間インキュベートした後、ドライアイス上で凍結し、−８０℃で保存した。眼を、クライオスタットを使用して切片化し、一晩スライド上で室温にて暗条件下で乾燥させてから使用した。組織薄片を一晩室温にて乾燥させ、次いで、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で５分間、３回すすいだ。試料を、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００で２０分間透過処理し、次いで、ＰＢＳで３回洗浄した後、１０％ロバ血清（ＤＳ）、１０％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）と１時間インキュベートした。抗体を、１％ＤＳ、０．１％ＢＳＡで１／２００希釈し、切片に適用し、２時間室温にてまたは一晩４℃にて放置した。Ａｂｃａ４／ＡＢＣＡ４検出を、ヤギ抗ＡＢＣＡ４（ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＯｎｌｉｎｅ）で達成し、過分極活性化環状ヌクレオチドゲートカリウムチャネル１（Ｈｃｎ１）検出を、マウス抗Ｈｃｎ１（Ａｂｃａｍ）で、ロドプシン検出を、マウス抗１Ｄ４（Ａｂｃａｍ）で行った。切片を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回すすぎ、次いで二次抗体を、２時間暗条件下で室温にて適用した（１／４００希釈）。切片を、０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で２回すすぎ、次いでヘキスト染色と（１／１，０００）３０分間インキュベートした。切片をＰＢＳですすぎ、次いで風乾させた。ＰｒｏＬｏｎｇ  Ｄｉａｍｏｎｄ褪色防止用封入剤を各切片に適用し、スライドをイメージング前に一晩放置した。使用した一次抗体は：ＡＢＣＡ４／Ａｂｃａ４検出（ＡＢＩＮ３４３０５２，ＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓＯｎｌｉｎｅ，Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｈｃｎ１検出（マウスモノクローナルａｂ８４８１６，Ａｂｃａｍ，ＵＫ）、Ｒｈｏ検出（ａｂ５４１７，Ａｂｃａｍ，ＵＫ）であった。抗ＡＢＣＡ４特異性を、ｐＣＡＧ．ＡＢＣＡ４．ｐＡトランスフェクトＨＥＫ２９３Ｔライセート、野生型マウス網膜ライセート及び市販のヒトＡＢＣＡ４ペプチド（Ａｂｃａｍ，ａｂ１１４６６０）を使用したウエスタンブロット解析によって確認した。使用した二次抗体は、全てロバＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ：抗ヤギ４８８（ａｂ１０５０１２９，Ａｂｃａｍ，ＵＫ）及び抗マウス５６８（ａｂ１７５４７２，Ａｂｃａｍ，ＵＫ）であった。
【０４３４】
ＡＢＣＡ４の発現は、光受容体細胞の外節に局在した。
図１７は、野生型（ＷＴ）及びＡｂｃａ４−／−眼におけるＡｂｃａ４／ＡＢＣＡ４（緑）及びＨｃｎ１（赤）染色を示す。ＷＴ  ＳＶＥＶ  １２９、非注射及び注射Ａｂｃａ４−／−眼を、光受容体内節マーカーＨｃｎ１及びＡｂｃａ４／ＡＢＣＡ４に関して染色した。ＷＴ及びデュアルベクター処置Ａｂｃａ４−／−眼は、光受容体細胞外節におけるＡｂｃａ４／ＡＢＣＡ４の特異的な局在化を明らかにした。
【０４３５】
ＡＢＣＡ４は、翻訳後修飾を受ける大きく複雑な折り畳まれたタンパク質であり、光受容体外節の特殊なコンパートメントの細胞膜に輸送されるため、免疫組織化学的局在は、ウエスタンブロットを超えたタンパク質構造に関する追加の間接的な情報を提供する。免疫組織化学染色を行って、網膜下注射によるデュアルベクター形質導入後の網膜の光受容体細胞外節におけるＡＢＣＡ４の正しい局在を確認した。抗Ｈｃｎ１を使用して、光受容体内節の境界を強調した。画像を共焦点顕微鏡で撮影し、外節に焦点を合わせてＲＰＥ層をマスクした。これは、染色を観察するために異なる焦点面での画像化を必要としたため、ＲＰＥ画像は個別に表す（図２１）。図２０に関しては、眼を注射６週後に回収し、免疫組織化学染色のために調製した。正しいＡＢＣＡ４局在が主に外節構造で予想され得るため、抗Ｈｃｎ１を使用して、光受容体内節の境界を強調した。ＳＶＥＶ  １２９野生型（ＷＴ）眼を、陽性対照として使用し、光受容体細胞外節に豊富なＡｂｃａ４が存在することを明らかにした（図２０ａ）。非注射Ａｂｃａ４−／−眼及び上流または下流ベクターいずれかのみの網膜下注射を受けた眼は、検出可能なＡＢＣＡ４染色を呈さなかった（それぞれ、図２０ｂ、ｃ＆ｄ）。下流ベクター注射眼における染色の欠如は、最適化された下流ベクターＣ変異体を用いたウエスタンブロット解析により観察された短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）の減少と一致した。非組換え下流導入遺伝子からの短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）産生の特徴は、細胞特異的プロモーターが存在しない場合に非特異的発現パターンを生成し得ることである。最大で注射６ヶ月後まで、下流ベクターのみを注射したマウスの眼杯において短縮型ＡＢＣＡ４染色は観察されなかった（図２１Ａ）。最適化されたデュアルベクターシステムを注射したＡｂｃａ４−／−眼に関しては、ＡＢＣＡ４染色は、光受容体細胞の外節において明らかであり（図２０Ｆ）、発現は最大で注射６ヶ月後まで検出された。
【０４３６】
ロドプシンとのＡＢＣＡ４共局在。
図１８は、野生型（ＷＴ）及びＡｂｃａ４−／−眼の光受容体細胞外節におけるＡｂｃａ４／ＡＢＣＡ４（緑）及びロドプシン（赤）染色を示す。ＷＴ及びデュアルベクター処置Ａｂｃａ４−／−眼は、光受容体細胞外節におけるロドプシン及びＡｂｃａ４／ＡＢＣＡ４の共局在を明らかにした。
【０４３７】
図１９は、野生型（ＷＴ）及びＡｂｃａ４−／−眼におけるＡｂｃａ４／ＡＢＣＡ４（緑）及びロドプシン（赤）頂端ＲＰＥ染色を示す。ＷＴ及びデュアルベクター処置Ａｂｃａ４−／−眼は、ＲＰＥ細胞の頂端領域におけるロドプシン及びＡｂｃａ４／ＡＢＣＡ４の共局在を明らかにし、これは脱落した外節円板から生じるという仮説が立てられた。デュアルベクターで処置しなかったＡｂｃａ４−／−眼は、ＲＰＥ細胞の頂端領域において、ロドプシン染色のみを示した。囲んだ画像は、形質導入されたＲＰＥ細胞から達成された発現パターンを示し（緑でのＧＦＰ染色）、Ａｂｃａ４／ＡＢＣＡ４／ｒｈｏ染色とは対照的な拡散した染色パターンを明らかにした。
【０４３８】
最適化されたデュアルベクターシステム（５’Ｃ）を注射したＡｂｃａ４−／−眼に関しては、ＡＢＣＡ４染色は、光受容体細胞の外節で明らかであり（図２０ｅ＆ｆ）、ロドプシンと共局在し（図２０ｈ）、最大で注射６ヶ月後まで検出可能であることが示された（図２０ｊ）。一部のデュアルベクター注射眼では、ＲＰＥの頂端領域でＡＢＣＡ４染色が観察されたが、染色は、ＲＰＥ細胞全体に拡散していなかった（図２０ｆ）。このＡＢＣＡ４染色が、ＲＰＥ細胞内から発生する発現によるものである場合、ＡＢＣＡ４は細胞全体に存在し、頂端領域において単離されないと本発明者らは予測し得る（図２１Ｃ）。例えば、ＲＰＥ細胞をＣＡＧ．ＧＦＰ．ＷＰＲＥ．ｐＡ  ＡＡＶ２レポーターベクターで形質導入すると、細胞全体にＧＦＰ染色が拡散する（図２１ａ）。それゆえ、ＡＢＣＡ４の頂端染色は、ＲＰＥ細胞と接触している、剪断されたまたは脱落した光受容体外節円盤から生じるという仮説を立てた。これを確認するために、ロドプシン染色を行い、Ａｂｃａ４と共局在するＷＴ眼における同一の染色パターンを明らかにした（図２１Ｄ）。この共局在は、いくつかのデュアルベクター注射Ａｂｃａ４−／−眼においても観察され（図２１Ｅ）、同様のパターンの頂端ロドプシン染色が、非注射Ａｂｃａ４−／−眼で観察された（図２１Ｆ）。
【０４３９】
最適化された重複デュアルベクターシステムを使用して、光受容体細胞においてＡＢＣＡ４発現を生成することができ、この場合ＡＢＣＡ４は、ＩＨＣによって検出可能なレベルで所望の外節構造へと輸送される。
【０４４０】
実施例６−デュアルベクター処置Ａｂｃａ４−／−マウスにおけるビスレチノイド／Ａ２Ｅ評価
ビスレチノイドの蓄積は、シュタルガルト病の特徴であり、ヒトにおける網膜変性において主要な役割を果たす、またはその主要な駆動因子であると考えられている。これらの分子の減少は、Ａｂｃａ４−／−マウスにおけるデュアルベクターＡＡＶシステムの有効性を評価するための機能アッセイで提供する。Ａｂｃａ４−／−光受容体細胞の外節円盤へのデュアルベクター送達ＡＢＣＡ４の特異的な局在は、特に、２つの膜貫通ドメイン（ＴＭＤ）が２つのベクターにまたがってコードされている、上流ベクターのＴＭＤ１及び下流のＴＭＤ２、ことを考えると、完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の正しい折り畳みを示している。この研究では、少なくとも最大で１歳までの、有意な光受容体細胞喪失を伴わないマウスモデルである、色素沈着Ａｂｃａ４−／−を使用した。この研究で使用した色素沈着マウスモデルは、網膜変性を起こしておらず、検出可能なＥＲＧ表現型も有さない。しかしながら、これらのマウスの一貫した特徴は、経時的な定量化可能なビスレチノイドの大量蓄積であり、ゆえに、ヒト疾患の病理学的特徴を再現する。
【０４４１】
Ａｂｃａ４−／−マウスモデルは、野生型マウスと比較して、年齢とともにビスレチノイド及びＡ２Ｅのレベルの増加を呈する。しかしながら、ヒトとは対照的に、ビスレチノイドの増加は、任意の深刻な網膜変性を引き起こすのに必要とされ得るレベルには到達しない。これは、Ａｂｃａ４欠損マウスの眼に他の代償機構が存在する可能性があることを示唆している。野生型網膜では、Ａｂｃａ４は、再循環のための光受容体細胞外節円盤膜からの網膜の移動を促進する。機能性ＡＢＣＡ４が存在しない場合、Ａｂｃａ４−／−マウスモデルと同様に、レチナールが外節円盤膜内に維持され、そこで生化学的変化を受けて様々なビスレチノイドの形態になる（図２３）。光受容体細胞は、常に新しい外節円盤を生成し、そうすることで、ＲＰＥ細胞に向かって古いより遠位の円盤の動きがあり、その後、それらが食作用によって分解される。Ａｂｃａ４欠損マウスでは、貪食された円盤は、上昇したレベルのビスレチノイドを含有する。ＲＰＥ細胞内で、これらはさらにＡ２Ｅアイソフォームに変換され、その蓄積がリポフスチンをもたらす。従って、Ａｂｃａ４欠損マウスにおけるビスレチノイドの蓄積は、網膜変性を引き起こすには不十分だが、それでも結果生じるベースラインを超える上昇したレベルは定量化し得、ゆえにＡｂｃａ４機能のバイオマーカーを提供し得る。
【０４４２】
ビスレチノイド及びＡ２Ｅ化合物は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により、正確に測定できる。ＡＢＣＡ４遺伝子治療を用いて処置したマウスの治療効果の尺度は、それゆえ、未処置眼と比較した、ビスレチノイド及びＡ２Ｅのレベルにおける減少を達成することであるだろう。しかしながら、対処する必要がある、２つの考慮事項がある。最初の例では、臨床適用のために、本発明者らは、ヒトＡＢＣＡ４コード配列及びヒト光受容体プロモーターを使用する必要があり、これは、マウスではそれほど効果的ではない可能性が高い。さらに、ＨＰＬＣ測定は、網膜下注射によってベクターに曝露された領域だけでなく、全眼から取得される。従って、Ａｂｃａ４欠損マウスにおけるビスレチノイドの全体的な減少は、野生型レベルに達する可能性は低い。２番目の考慮事項は、網膜下注射であり、これは外節円盤の損傷につながる可能性がある。これらの構造はビスレチノイドが豊富であるため、ＡＢＣＡ４遺伝子治療の効果を、同様の偽注射と比較する必要がある。理想的には、同じマウスの対側の眼をこれに使用して、ビスレチノイド蓄積に影響を与え得る、目のサイズ及び生涯の光曝露を管理するべきである。
【０４４３】
この理由のために、本発明者らは、一方の眼に偽注射を、対側の眼に同様の処置注射をしたＡｂｃａ４−／−マウスのコホートにおけるビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルを比較した。各偽眼は、対となるデュアルベクター処置眼が受けたものと同じ合計ＡＡＶ用量で上流ベクターを受けた。それゆえ、各マウスの両眼に、２μｌの網膜下注射を行い、ＡＡＶベクターの２×１０１０ゲノム粒子を含有するブレブを形成した。
【０４４４】
合計１３匹のＡｂｃａ４ノックアウトマウスに、４〜５週齢で注射し、注射３ヶ月後に、眼球を回収した。処置Ａｂｃａ４−／−マウスの光受容体外節に存在するＡＢＣＡ４が機能している及び治療効果を提供しているか否かを調査するために、眼をＨＰＬＣ解析により、ビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルに関して評価した。マウスを、１６時間暗順応させてから組織を採取したが、これは暗赤色灯の下で暗所にて行った。
【０４４５】
完全に盲検化した研究では、処置Ａｂｃａ４−／−マウスの全眼を回収し、次いで匿名化し、凍結してＪｕｌｅｓ  Ｓｔｅｉｎ  Ｅｙｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅに輸送し、Ａｂｃａ４−／−マウスにおける、オールトランスレチナール二量体ホスファチジルエタノールアミン（ａｔＲＡＬｄｉ−ＰＥ）、Ｎ−レチニリデン−Ｎ−レチニルホスファチジルエタノールアミン（Ａ２ＰＥ）、ジ−ヒドロ−Ａ２ＰＥ（Ａ２ＰＥ−Ｈ２）、コンジュゲートしたＮ−レチニリデン−Ｎ−レチニルホスファチジルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）及びＡ２Ｅの二重結合異性体（ｉｓｏＡ２Ｅ）のレベルを処理した。１３匹のＡｂｃａ４−／−マウスの匿名化した眼は、一方の眼に上流ベクターのみ（偽）、対側の眼にデュアルベクター（処置）を与え、各眼には同じ合計ＡＡＶ用量を与えた。眼を、暗条件において回収し、処理し、別のセンター（ＪＳＥＩ）にて高速液体クロマトグラフィーによって解析して、オールトランスレチナール二量体ホスファチジルエタノールアミン（ａｔＲＡＬｄｉ−ＰＥ）、Ｎ−レチニリデン−Ｎ−レチニルホスファチジルエタノールアミン（Ａ２ＰＥ）、ジ−ヒドロ−Ａ２ＰＥ（Ａ２ＰＥ−Ｈ２）、コンジュゲートしたＮ−レチニリデン−Ｎ−レチニルホスファチジルエタノールアミン（Ａ２Ｅ）及びその主要なシス異性体（ｉｓｏ−Ａ２Ｅ）のレベルを決定した。各全眼を摘出し、解剖することなく処理した。これらの評価は、各眼の識別をマスクして行った。眼球摘出を、暗赤色灯の下で実施し、眼はすぐに凍結し、光から保護して−８０℃で保存した。眼をその後、Ｗｏｒｌｄ  Ｃｏｕｒｉｅｒ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓによって−７０℃で冷凍輸送した。移動時間は４８時間未満であり、温度ログにより、標本が全体を通して凍結したままであったことが確認された。前述のように、ビスレチノイドの抽出及びＨＰＬＣによる評価を眼に対して行った。２６個全ての眼のＨＰＬＣ評価の後、識別をその後明らかにして、各処置眼のビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルを、それらの対となる偽注射眼と比較した。二元配置分散分析により、対となる偽注射眼と比較して、デュアルベクター処置眼においてビスレチノイド／Ａ２Ｅの減少が観察され、処置がビスレチノイド／Ａ２Ｅのレベルに対して効果を有することが決定された（ｐ＝０．０１７１）、図２４。
【０４４６】
最初の研究は、１１匹のマウスの２群からなり、第一群は非注射眼及びデュアルベクター処置眼を有し、第二群は非注射眼に加えて偽注射眼を有した。偽注射には、デュアルベクター注射群で受けたものと同じ合計用量（２Ｅ＋１０総ゲノムコピー）の上流ベクターのみを含有した。非注射眼における各ビスレチノイドマーカーのレベルを、各マウスの対となる注射眼のレベルと比較し、眼間の倍率変化として表し、それゆえ「１」は対となる非注射眼におけるビスレチノイド値を表している（図２６）。偽処置群と比較した処置群におけるビスレチノイドレベルの倍率変化における差を同定した（ｐ＝０．０５、図２６）。ベースラインのビスレチノイドレベルにおける変動性が、非注射対照眼の間で認められたため、二次的な確認研究を実施した。
【０４４７】
ベースラインビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルにおける変動性が、非注射対照眼の間で認められた。年齢が異なる動物の眼杯サイズの差に関連し得る、この自然変動の影響を減少させるために、二次的な確認研究を行い、これには各動物の僚眼を内部対照として使用した。二次研究では、Ａｂｃａ４−／−マウスの一方の眼に上流ベクターを（偽）、対側の眼にデュアルベクター（処置）を与え、各眼には同じ合計ＡＡＶ用量を与えた。１３匹のマウスの一方の眼に上流ベクター（偽）、対側の眼にデュアルベクター（処置）を与え、両眼ともに２Ｅ＋１０ゲノムコピーの同じ合計ベクター用量を与えた。対となる目で検出された各バイオマーカーのレベルの比較としてデータを表して、同じビスレチノイドを評価した。処置は、偽注射眼と比較して、Ａｂｃａ４−／−マウス眼におけるビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルに影響を有することが観察された（ｐ＝０．０３、図３１Ａ）。実施された２つの実験からの偽注射及び処置眼のデータを組合わせて、三元配置分散分析を使用して、実験間で比較して、処置の影響が、ｐ＝０．０００２を有すると同定した。これは、シュタルガルト病に対するデュアルベクター処置がＡｂｃａ４−／−マウスモデルの生化学に影響を与えるという最初の提示であり、機能性ＡＢＣＡ４が光受容体細胞に送達されて、陽性治療効果を誘導することを示すものである。
【０４４８】
実施例７−上流及び下流導入遺伝子関連発現
ＡＢＣＡ４タンパク質のＣ末端に対して指向する抗体を使用して、ウエスタンブロット評価により、Ａｂｃａ４−／−マウスにおける下流ベクター単独注射後に約１３５ｋＤａの追加の短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）タンパク質が同定された。（図２８ｃ）。単一ベクター注射網膜のＱＰＣＲ評価により、安定したｍＲＮＡ転写産物が、上流及び下流ベクターから生成されたことが確認された（図１４）。ｍＲＮＡが、転写産物のポリＡテールを使用して全ての試料から直接抽出されたことを考えると、これらのデータは、非組換え上流導入遺伝子からの転写産物へのポリＡテールの付加を可能にする要素の存在を示した。これらの上流導入遺伝子に含有されたヌクレオチド配列の解析により、それぞれ、ＡＢＣＡ４コード配列（配列番号１１）のヌクレオチド５０２及び１，７５０で始まるＡＴＴＡＡＡという、２つの潜在的なクリプティックなポリＡシグナルが明らかになった。これらの部位のいずれかが安定した転写産物形成を担っている場合、ＣＯバージョンはこれらのクリプティックな要素を削除するように修飾されているため、短いｍＲＮＡ転写産物はＷＴ上流ベクターからのみ予測されるだろう。ＷＴ及びＣＯ  ＡＢＣＡ４ベクターのｉｎ  ｖｉｔｒｏ試験は、転写産物がいずれかの変異体で処置された上流ベクター単独処置ＨＥＫ２９３Ｔ細胞試料から存在することを示し（図１３）、転写産物の長さのｉｎ  ｖｉｖｏ評価は、転写産物がこれらの内部クリプティックなポリＡ部位を超えて拡張することを示した（図１３）。これらのデータは、全ての上流導入遺伝子変異体で一貫している導入遺伝子構造の別のクリプティックな要素が、転写産物へのポリＡテールの付加を可能にし得ることを示す。可能性の高い特徴は、ＡＢＣＡ４コード配列の外側のＳｗａＩ制限部位（ＡＴＴＴＡＡＡＴ、配列番号７６）であると決定され、クローニングプロセスにおいて使用した。ＡＡＴＡＡＡ（配列番号７７）及びＡＴＴＡＡＡ（配列番号７８）が最も一般的なポリＡシグナルであるが、ＴＴＴＡＡＡも、潜在的なポリＡヘキサマーでもある。この配列は全ての上流導入遺伝子で一貫しており、ＴＴＴＡＡＡ配列の１０ヌクレオチド下流に潜在的なＣＡ切断点が追加で存在することを考えると（図１３）、これは全ての上流導入遺伝子におけるポリＡ部位としてもっともらしいと考えられた。
【０４４９】
デュアルベクターシステムの最適化における一態様は、非組換え導入遺伝子からの不要な発現を制限することであった。上流ベクター単独注射眼からのＡＢＣＡ４  ｍＲＮＡ転写産物の検出にもかかわらず、ＡＢＣＡ４タンパク質形態は検出されなかった（図１５）。短縮型ＡＢＣＡ４タンパク質形態が存在しないことは、Ｎ末端ＦＬＡＧタグを含有する構築物で確認した。しかしながら、Ｃ末端に指向するポリクローナル抗体を使用したウエスタンブロット評価では、Ａｂｃａ４−／−マウスにおいてデュアル及び下流ベクター単独注射後に約１３５ｋＤａの短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）タンパク質が同定された（図２８Ｃ）。短縮型ＡＢＣＡ４転写産物は、下流ベクターを用いた形質導入後にも同定された。非組換え下流導入遺伝子からの発現は、ＡＡＶ２  ＩＴＲの天然プロモーター活性から生じると予想され、これは次いで、ポリＡシグナルに読み出すことができる。下流ベクター導入遺伝子Ａ及びＢに含有されるＡＢＣＡ４コード配列は、結果得られるｍＲＮＡ転写産物のＡＢＣＡ４終止コドンへの翻訳が予想され得る５’ＩＴＲから離れてインフレームＡＴＧコドンを有し、Ａ及びＢの両方の非組換え下流構築物が、ｔＡＢＣＡ４（５’ＩＴＲ  Ｄ配列の１００〜２００ヌクレオチド内のＡＵＧ、図９）を生成した。下流導入遺伝子に含有されるＡＢＣＡ４コード配列は、短縮型ＡＢＣＡ４のレベルに有意に影響を与え、Ａ及びＢ非組換え下流構築物でのみ一貫して検出可能な短縮型ＡＢＣＡ４を生成した（ｐ＝０．０００３）。元来のベクター設計は、変異体Ａ及びＢであり、両方ともｔＡＢＣＡ４を生成した（図１０）。下流構築物ＣからＸを、５’ＩＴＲのすぐ下流のＡＢＣＡ４コード配列が、インフレームＡＴＧコドンの前にアウトオブフレームＡＴＧコドンを含有するようにその後設計した。これは、天然のＡＢＣＡ４コード配列に変更を加える必要がなく、生成されるｔＡＢＣＡ４のレベルに有意に影響した（ｐ＝０．００３、図９Ｃ）。ＡＢＣＡ４コード配列の詳細な評価を通して、本発明者らは、ＡＢＣＡ４コード配列に含有される良好なコンテクストにある、すなわちコザックコンセンサスに似ている、アウトオブフレーム及びインフレームＡＴＧを同定した。下流ベクター上にパッケージされるＡＢＣＡ４コード配列の断片を、これらの評価に基づいて選択し、良好なコンテクストにあるアウトオブフレームＡＴＧが、良好なコンテクストにある任意のインフレームＡＴＧの前に５’ＩＴＲの１００〜２００ヌクレオチド以内で存在することを確実にした。これらの基準を使用して新しい下流導入遺伝子を設計することは、元来の非組換え下流Ａ及びＢ導入遺伝子が全ての他の変異体よりも高いレベルのｔＡＢＣＡ４タンパク質を生成したため、観察されるｔＡＢＣＡ４のレベルに影響した（図１０ａ）。デュアルベクター状況では、変異体Ａ〜Ｄは、検出可能なＡＢＣＡ４形態（図９ａ）を生成し、検出された総ＡＢＣＡ４集団の中で、変異体Ａ及びＢで処置した細胞はそれぞれ、２１±５％及び２５±０．８％のｔＡＢＣＡ４率を達成し、変異体Ｃ及びＤ処置試料からの短縮型ＡＢＶＡ４（ｔＡＢＣＡ４）集団は、それぞれ、４±２％及び３±３％であった（図９Ｄ）。
【０４５０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＡＡＶ用量は、全ての変異体で一貫しており、Ａｂｃａ４−／−眼には、各ベクターの１×１０９ゲノムコピー／眼を与えたが、デュアルベクター変異体Ａは、その導入遺伝子のサイズがより大きいために効率が低くパッケージ化されており、そのため最終用量は８×１０８ゲノムコピー／眼とした。デュアルベクター変異体５’Ｃを最適なデュアルベクターシステムとして同定し、１×１０１０ゲノムコピー／眼の高用量で使用すると、ＡＢＣＡ４のレベルにおける有意な改善が達成された（ｐ＝０．００６、図９Ｂ）。これらのデータは、下流導入遺伝子変異体Ｃ〜Ｘに実装された変更が、非組換え導入遺伝子からのｔＡＢＣＡ４形態の生成を制限することを示した。下流構築物Ａ及びＢにおけるインフレームＡＴＧコドンの存在とは対照的に、変異体Ｃ〜Ｘは、５’ＩＴＲの下流に、任意のインフレームＡＴＧコドンの前にコザックコンセンサスを伴うアウトオブフレームＡＴＧコドンを含有した。
【０４５１】
ある場合では、下流ベクターからの短縮型ＡＢＣＡ４の発現を減らすために、重複Ｃ（２０７ｂｐ）を選択した。重複Ｃは、Ｂ（５０５ｂｐ）よりもわずかに効率が低いが、より純粋なＡＢＣＡ４タンパク質を提供し、臨床シナリオで安全性の利点を有し得る。それゆえ、重複Ｃを、イントロン含有上流ベクターと組合わせ、両方をＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆキャプシドにパッケージした。このデュアルベクター組合わせは、Ａｂｃａ４−／−マウスにおいて１×１０１０ゲノムコピー／眼にてｉｎ  ｖｉｖｏでのその後の試験に使用した。
【０４５２】
ＷＰＲＥがＡＡＶ転写産物の発現レベルを増加させるという根拠に基づいて、本発明者らは、最初にこの要素を本発明の下流導入遺伝子設計に含んだ。しかしながら、非組換え下流導入遺伝子から生成されるｍＲＮＡ転写産物及び短縮型タンパク質の観察により、本発明者らは、この不要な発現を制限する可能性があるためにＷＰＲＥを取り除くことを企図した。変異体ＢからＷＰＲＥを取り除いた場合（変異体Ｂｘ）、短縮型ＡＢＣＡ４タンパク質のレベルはｉｎ  ｖｉｔｒｏで減少した（図１０ａ）。さらに、下流ベクターのみを注射したＡｂｃａ４−／−眼は、下流Ｂ及びＢｘ処置眼間の短縮型ＡＢＣＡ４  ｍＲＮＡ転写産物レベルにおける減少を明らかにした（図１４ｂ）。それゆえ、ＷＰＲＥを取り除くと、短縮型ＡＢＣＡ４の発現レベルが減少した。しかしながら、下流の導入遺伝子の設計も、ｔＡＢＣＡ４の生産の減少を可能にした。
【０４５３】
デュアルベクターシステムの安全性の評価には、非組換え導入遺伝子からの不要な副産物の同定を含んだ。上流または下流ベクター（組合わせていない）のいずれかを使用した評価により、非組換え状態の各ベクターが、短縮型ＡＢＣＡ４ｍＲＮＡ転写産物形態を生成できることが明らかになった。上流導入遺伝子ヌクレオチド配列は、ヒト遺伝子の１〜２％におけるポリＡシグナルとして同定されているクリプティックなポリＡシグナル：ＴＴＴＡＡＡとして作用し得る、クローニング目的で使用されるＳｗａＩ制限部位を含有した。上流ベクターを用いた処置後の任意のタンパク質検出の不在は、結果得られたｍＲＮＡ転写産物におけるインフレーム終止コドンの欠如に起因し得、これは任意の生成されたペプチドの分解につながり得る。短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）タンパク質は、元来の下流ベクター設計から検出された（図９）。デュアルベクターからの不要なタンパク質産生を減少させるための１つの手法は、導入遺伝子設計に追加の遺伝子配列を含めることである。別の手法では、コザックコンセンサス配列を伴うアウトオブフレームＡＴＧコドンを、５’ＩＴＲの１００塩基以内でインフレームＡＴＧコドンの前に有するコード領域の配列選択を採用し、短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）を無視できるレベルにまで減少させた（図９）。下流ベクターに含まれるＡＢＣＡ４コード配列を解析し、アウトオブフレームＡＴＧコドンを５’ＩＴＲの１００塩基以内でインフレームＡＴＧコドンの前に有するコード配列を特異的に選択した。この配列設計は、リボソームが良好なコンテクストで遭遇する最初のＡＵＧコドンからの翻訳開始を支持するという根拠に基づいた。リボソームがアウトオブフレームＡＵＧで非組換え下流導入遺伝子から翻訳を開始しようとした場合、アウトオブフレーム終止コドンに達する前に短いペプチドのみが形成され、そのような短いペプチドがそのサイズのために細胞により分解され得ることを本発明者らは予測し得る。このように設計された５つの新しい下流導入遺伝子変異体が、高用量の単一ベクター導入遺伝子を提供したにもかかわらず、ｔＡＢＣＡ４産生をほとんど無視できるレベルにまで減少させたことを明らかにしたため、この戦略は成功であった。対照的に、元来の下流導入遺伝子（Ａ及びＢ）は両方ともｔＡＢＣＡ４を生成し、両方とも良好なコンテクストで任意のアウトオブフレームＡＴＧコドンの前にインフレームＡＴＧコドンを有した。この導入遺伝子設計の特徴は、他のデュアルベクター戦略において実装できる。所与のコード配列が任意のインフレームコドンの前にアウトオブフレームコドンを有しない場合、選択されたコドン最適化は価値のあるオプションとなり得る。これが、翻訳率を増加させることが示され、Ｘ連鎖性網膜色素変性症に関する最近開始された第一相／第二相臨床試験（ＮＣＴ０３１１６１１３）を含むコドン最適化遺伝子配列を使用する臨床試験が開始されたため、完全配列コドン最適化が将来的に採用される可能性もあり得る。
【０４５４】
組換え効率が改善し、ＷＴ  ＡＢＣＡ４配列を使用して最適な重複領域が決定されたため、組換え導入遺伝子からの発現を増加させるさらなる方法を実証した。導入遺伝子構造にＷＰＲＥを含めると、組換え導入遺伝子からのＡＢＣＡ４発現が増加し得ることを示す証拠がある。しかしながら、この遺伝的要素を含める際の追加の問題は、初期の導入遺伝子設計では、ＷＰＲＥを含有した非組換え下流ベクターから短縮型（ｔＡＢＣＡ４）の不要なタンパク質発現が観察されたことである。ＷＰＲＥを除去すると、ｔＡＢＣＡ４のレベルは減少したが、ＡＢＣＡ４の治療レベルを達成するデュアルベクター手法の可能性は、所与の組換え導入遺伝子からタンパク質の最大量を生成することに依存し得るため、ＷＰＲＥの維持も有効であった。下流導入遺伝子設計に対するその後の変更により、構築物内にＷＰＲＥを維持しながら、短縮型ＡＢＣＡ４を無視できるレベルにまで減少することができた。
【０４５５】
スプライス可能な５’ＵＴＲ要素を含めると、デュアルベクター処置後に達成される完全長ＡＢＣＡ４タンパク質のレベルが改善した。プロモーターの近くのイントロンがプレｍＲＮＡ合成を増大し、ポリアデニル化機構と相乗的に相互作用して、３’末端転写産物プロセシングを増強できることが以前に示されている。研究により、スプライシングを受けるｍＲＮＡ転写産物は同等のイントロンを含まない転写産物よりも高い翻訳収量を呈し、プロモーターの近くにイントロンを配置すると、コード配列内で使用する場合よりも遺伝子発現が増強されることが示されている。このデータは、これらの所見を支持及び補強し、ベクター導入遺伝子におけるイントロンの標準的な使用を奨励及び支持する。
【０４５６】
他のデュアルベクター手法及びナノ粒子送達により、成体Ａｂｃａ４−／−マウスにおけるＡＢＣＡ４の発現が成功し、ＡＢＣＡ４発現に帰属する正の効果の証拠を提供した。この研究は、初めて、最適化された重複デュアルベクターシステムを注射した後の成体Ａｂｃａ４−／−マウス網膜の光受容体外節におけるＡＢＣＡ４の発現を確証的なものにした。このＡＢＣＡ４は、疾患モデルにおいて蓄積するビスレチノイドのレベルを減少させることによって機能的活性を呈する、これはマウスモデルにおける２つの独立したｉｎ  ｖｉｖｏ試験で確認された効果である。シュタルガルト病の患者では、ビスレチノイドの蓄積がＲＰＥ細胞の死を引き起こし、続いて光受容体細胞の変性及び死を引き起こし、失明をもたらす。この障害の進行性の変性性質を考えると、あらゆる年齢で治療的介入を提供することが、網膜の生存細胞を保存することにより有益であると期待され得る。重複するデュアルベクターシステムを最適化して、標的細胞に送達される治療用タンパク質のレベルを増加し、重要なことに、デュアルベクター戦略で生じることが多い不要な産物の発現を減少させることにより、シュタルガルト病に対するＡＡＶ遺伝子治療の臨床試験の展望が現在ますます達成可能に見えている。
【０４５７】
実施例８−コドン最適化
ＡＢＣＡ４タンパク質レベルの最初の比較は、野生型及びコドン最適化ＡＢＣＡ４コード配列から比較した：一部の場合では、タンパク質生産は、コドン最適化（ＣＯ）ＡＢＣＡ４コード配列の使用を通して増強され得る。プラスミドは、ＷＴまたはＣＯコード配列を含むこと以外が同一の発現カセットを有して生成された。試料を、トランスフェクションの４８時間後に回収し、ライセートを、ウエスタンブロット解析によって評価し、ＡＢＣＡ４検出をＧＡＰＤＨ試料レベルに標準化し、データを（トランスフェクションした試料の）バックグラウンドを超える値として表した。野生型（ＷＴ）またはコドン最適化（ＣＯ）ＡＢＣＡ４コード配列を含むこと以外は同一である構築物を比較し、ＷＴコード配列と比較してＣＯコード配列から生成されたＡＢＣＡ４タンパク質における有意な３．１倍の増加を明らかにした（図２８ａ）。プラスミドは、ＷＴまたはＣＯ  ＡＢＣＡ４コード配列以外は同一とした。生成されたＡＢＣＡ４タンパク質レベルの差を決定した（両側の対応のないｔ検定、ｎ＝４、＊＊＊ｐ＝０．０００２、Ｆ（３，３）＝２．９７３）。
【０４５８】
コドン最適化によるＡＢＣＡ４タンパク質生成の増加が、デュアルベクターシナリオでも達成できるか否かを調査するために、重複デュアルベクター（ＷＴまたはＣＯコード配列を含むこと以外は同一である）を使用するＡＡＶ２／２  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ形質導入を行った。これらの試料からのタンパク質解析により、ＡＢＣＡ４レベルに差がないことが明らかになった（図２８ｂ、両側の対応のないｔ検定、ｎ＝３、Ｆ（２，２）＝１８．７４）。
【０４５９】
ＣＯコード配列のそのような正の効果をｉｎ  ｖｉｖｏで達成できるか否かを決定するために、Ａｂｃａ４−／−マウスに、コード配列がＷＴまたはＣＯであること以外は同一であり、発現がＧＲＫ１プロモーターにより駆動される導入遺伝子を有するＡＡＶ２／８重複デュアルベクターを網膜下注射した（導入遺伝子は表２に詳述する）。両方のデュアルベクターシステムの重複ゾーンは、ＡＢＣＡ４  ｃＤＮＡの３，１５４位で始まり、ヌクレオチド４，３２６で終わり、ＷＴ配列及びＣＯ配列の両方の重複領域のＧＣ含有率は、５５％であった（表２）。単離した網膜からのＡＢＣＡ４検出を、注射２週後及び６週後にて評価し、コード配列の影響を観察した（ｐ＝０．０４、図２８ｃ）。注射２週後では、ＷＴまたはＣＯ重複デュアルベクター注射眼から検出されたＡＢＣＡ４タンパク質のレベルに差は見られなかった。注射６週後には、ＣＯ注射試料よりもＷＴ注射試料からより多くのＡＢＣＡ４タンパク質が検出され、この時点でのＷＴ注射網膜からのＡＢＣＡ４検出は、注射２週後よりも一貫して多かった。（ｐ＝０．００５、図２ｃ）。これらのデータは、それ以外は同一長さのデュアルベクター重複内で塩基対を変更すると、タンパク質発現が変化することを示した。この所見は、塩基対合の効率が、（単なるコドンバイアスではなく）デュアルベクター組換えに寄与する因子であり得ることを示した。重複デュアルベクターシステムにおいてＣＯ  ＡＢＣＡ４コード配列を使用してもＡＢＣＡ４産生に増強は観察されなかったため、本発明者らは、以降の最適化ではＷＴコード配列を使用することにした。
【０４６０】
インタクトな完全長ＷＴ及びＣＯ  ＡＢＣＡ４コード配列のサイドバイサイド比較により、ＡＢＣＡ４のコドン最適化は、より高い翻訳率を可能にしたことが示された。しかしながら、コード配列をデュアルベクターシステムの重複領域として使用したことを考慮すると、ＣＯ変異体のコード配列に加えた変更が、組換えの成功に影響を与えた可能性がある。ＣＯ導入遺伝子がＷＴバージョンと同じくらい効率的に組換えしている場合、同等の数の導入遺伝子から、ＣＯ変異体がより多くのタンパク質を産生すると予想されるだろう。だが、ｉｎ  ｖｉｖｏで試験した場合、ＷＴコード配列を含有するデュアルベクターは、同等のＣＯデュアルベクターシステムよりも多くのＡＢＣＡ４を生成した。これは、ＷＴデュアルベクター注射眼が、ＣＯデュアルベクター注射眼よりも多く組換えに成功した導入遺伝子を含有したことを示し得る。あるいは、導入遺伝子は、同程度に組換えられたが、ＣＯ  ＡＢＣＡ４コード配列が、マウス光受容体細胞では翻訳の効率が低かった可能性がある。コドン最適化は、ヒト発現に重点を置いていたため、マウスでの翻訳率が負の影響を受けた可能性がある。しかしながら、使用したＷＴ配列はヒト由来であり、マウス細胞での使用に理想的であり得るものとは異なるコドンバイアスの優先も有し得るため、配列は両方とも、マウス細胞で翻訳されるには不利であると見なすことができる。別の考慮事項は、ＷＴ及びＣＯデュアルベクターシステムの重複領域を１つしか比較しておらず、重複デュアルベクターシステムの成功における重複領域の重要性が示されていることである。最後に、このシナリオにおけるコドン変更は、ｍＲＮＡ翻訳に限らず、ＤＮＡ修復でもあり、これは、第二鎖合成がデュアルベクター戦略の成功に寄与し、これは曝露されているある特定のヌクレオチドにより支持され得るためである。
【０４６１】
ＡＢＣＡ４検出は、コドン最適化構築物をプラスミド形態で使用した場合に高かったが、デュアルベクターＡＡＶ組換えに関しては、野生型の配列の方がより有効であることが見出された。一部の実施形態では、コドンの変更は、ＤＮＡ塩基対合にも影響を与える、従って、このシナリオにおけるデュアルベクター組換えに直接影響する。
【０４６２】
重複デュアルベクターシステムにおいてＣＯ  ＡＢＣＡ４コード配列を使用してもＡＢＣＡ４生産に増強は観察されなかったため、本発明者らは、以降の最適化ではＷＴコード配列を使用することにした。ＷＴまたはＣＯコード配列のいずれかである下流ベクターのみを注射した網膜から、約１３５ｋＤａの短縮型ＡＢＣＡ４（ｔＡＢＣＡ４）タンパク質が検出可能であった（図２８ｃ）。このタンパク質バンドは、一部のデュアルベクター注射眼でも明らかであったが、全ての試料で簡単に同定できるわけではなかった。
【０４６３】
実施例９−リポフスチン及びメラニン関連自家蛍光の減少
Ａｂｃａ４−／−マウスにおいてビスレチノイドレベルを直接測定することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでの治療効果の定量化可能な評価を可能にした。処置Ａｂｃａ４−／−マウスのビスレチノイド／Ａ２Ｅレベルを注射３ヶ月後に直接測定することに加えて、メラニン蓄積に関連することが示されている７９０ｎｍ波長を使用して、注射３ヶ月後及び６ヶ月後に自家蛍光の走査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）評価も行った。自家蛍光の走査型レーザー検眼鏡（ＳＬＯ）評価はまた、メラノリポフスチン蓄積のｉｎ  ｖｉｖｏ測定として７９０ｎｍ波長を使用して行った。自家蛍光のＳＬＯ評価は、潜在的なヒト臨床試験のエンドポイントである。マウスモデルは、ＷＴ対照マウスと比較して、リポフスチン及びメラニン関連の自家蛍光における経時的な増加を呈する。４８８ｎｍ波長の自家蛍光測定は、リポフスチンの蓄積を反映することが示されたが、７９０ｎｍ波長の自家蛍光は、メラニン蓄積と関連していた。
【０４６４】
このコホートでは、網膜剥離の作用を管理するために、マウスの一方の眼に偽注射（ＰＢＳ）を注射し、対側の眼には最適化された重複デュアルベクターシステム（２Ｅ＋１０総ゲノムコピー）を与え、これはリポフスチン及びメラニン関連の自家蛍光における処置関連の低減を観察することを目的とした。以前の研究に基づいた標準化されたＳＬＯプロトコルを使用し（５２）、各画像の平均グレー値を抽出するとき、標準化された測定領域は下網膜からのみ取得して、外科的損傷または上半網膜における注射の部位周囲の外科的に引き起こされる変化を原因とする自家蛍光の撹乱を回避した。１２匹のマウスにそれぞれ、一方の眼に偽注射を、対側の眼に処置を与えた。処置を受けた眼は、対となる偽注射眼と比較して、４８８ｎｍ及び７９０ｎｍ波長の両方で平均グレー値の減少を示した（４８８ｎｍ偽２２１．４±４．７及び処置２０５．９±６．３；７９０ｎｍ偽１１９．９±５．２及び処置１０１．４±７．１）。注射３〜６ヶ月後の間に、眼は７９０ｎｍ自家蛍光における増加を呈したが、対となるデュアルベクター注射眼と比較して、偽注射眼における増加の方が大きかった（ｐ＝０．０４、図３１Ｂ）。これらの眼では、７９０ｎｍ自家蛍光のレベルの増加は、対となる偽注射眼と比較してＡＢＣＡ４デュアルベクター注射眼において有意に減衰した。これらのデータは、Ａｂｃａ４−／−マウスにおけるリポフスチン及びメラニン関連自家蛍光のレベルに対する処置の影響を反映した（図２７）。
【０４６５】
共焦点走査型レーザー検眼鏡（ｃＳＬＯ；ＳｐｅｃｔｒａｌｉｓＨＲＡ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用したマウス眼底自家蛍光（ＡＦ）イメージングを、標準化されたプロトコルを使用して行った。蛍光を、４８８ｎｍアルゴンレーザーまたは７９０ｎｍダイオードレーザーを使用して励起した。記載の通りに、動物に麻酔をかけ、瞳孔を完全に拡張させた。カスタムメイドのコンタクトレンズを角膜上に乗せ、ヒプロメロース点眼薬（ヒプロメロース点眼薬１％，Ａｌｃｏｎ，ＵＫ）を、粘性カップリング流体として用いた。ＮＩＲ反射率画像（８２０ｎｍダイオードレーザー）を使用して、瞳孔に対して眼底カメラを位置合わせし、外側網膜で反射率が最も高い共焦点面に焦点を合わせた。画像は、「自動リアルタイム」（ＡＲＴ）モードを使用して記録し、信号対ノイズ比を減少するためにリアルタイムで２４枚の連続画像を平均するように設定した。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して視神経乳頭中心から半径２５０〜５００ピクセル間の標準化されたリング形状の領域を測定することにより、４８８ｎｍ及び７９０ｎｍ  ＡＦ画像の平均グレー値を抽出した。次いで、各画像をカットして、上網膜を除去し、標準化されたリングを下網膜にのみ適用した。
【０４６６】
実施例１０−キャプシド変異体
最初のｉｎ  ｖｉｖｏ実験は、ＡＡＶ２／８血清型を使用した。例えば、ＷＴ対ＣＯ比較には、ＡＡＶ８ベクターを採用した。しかしながら、２つの別々のＡＡＶベクターから放出された重複するプラス鎖及びマイナス鎖の相同組換えの成功は、ベクターが細胞内に長く留まる場合に最適化され得る。一部の実施形態では、フェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に置換することによるＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸への変化は、プロテアソーム分解を遅くするが、向性に影響を及ぼさないことが示されている。一部の実施形態では、フェニルアラニン（Ｆ）をチロシン（Ｙ）に置換することによるＡＡＶキャプシドタンパク質アミノ酸への変化は、形質導入及びＡｂｃａ４−／−網膜において改善することが示されている。ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆキャプシドのいずれかにパッケージされた同一の導入遺伝子を使用するＡｂｃａ４−／−網膜における重複デュアルベクター手法の成功を比較した。図２９は、ＡＡＶ２／８またはＡＡＶ２／８  Ｙ７３３Ｆキャプシドのいずれかにパッケージされた同一の導入遺伝子を使用したＡｂｃａ４−／−網膜における重複デュアルベクター手法を比較している。ＡＢＣＡ４転写産物レベルを、アクチンレベル／試料に正規化し、非注射眼と対比した倍率増加として表す。ＡＡＶ２／８デュアルベクターを注射したＡｂｃａ４−／−網膜において検出されたＡＢＣＡ４転写産物はより少なかった（ｐ＝０．００２、図２９）。３１．３±７．８倍多くのＡＢＣＡ４転写産物が、ＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆデュアルベクターを注射したＡｂｃａ４−／−網膜で検出された。
【０４６７】
この研究は、シュタルガルト病に対するデュアルベクター重複ＡＡＶ処置戦略の成功を改善するための段階的な調査を実証することにより、大型遺伝子の突然変異によって引き起こされる障害の処置のための改善されたデュアルベクター戦略の必要性に対処している。以前は、これらの戦略が治療効果を提供するのに十分な標的タンパク質の産生につながるか否かに関して疑問が提起されていた。シュタルガルト病に対する処置法の開発は、標的タンパク質であるＡＢＣＡ４が網膜の光受容体細胞に豊富に必要であるため、治療効果を達成する可能性を評価する良い例である。この作業で達成された最適化には、ＡＡＶ遺伝子治療に普遍的に適用できるものを含むが、他のデュアルベクター戦略における実装に関して、提示された特定の増強も推奨され得る。
【０４６８】
このデータは、デュアルベクター導入遺伝子においてＡＢＣＡ４コード配列を送達するために、ＡＡＶ８キャプシドと比較してＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆを使用する際の、形質導入における改善の以前の所見を確認した。キャプシド及び用量選択によって光受容体細胞における導入遺伝子の送達及び生存を増強することは、導入遺伝子間の分子間相互作用の機会を増加させるためのデュアルベクター処置の成功に影響を与える。これは、より高い用量が完全長ＡＢＣＡ４タンパク質の検出の増加をもたらした、異なる用量でデュアルベクターを注射された眼の比較によってさらに強調された。用量の増加によるデュアルベクターの成功の改善は、ハイブリッドデュアルベクター手法で以前に示されており、このデータは、最適化された重複デュアルベクターシステムを使用して同様の結果を示している。
【０４６９】
実施例１１−Ａｂｃａ４  ＫＯマウスモデルにおけるＡＡＶデュアルベクター安全性の評価
Ａｂｃａ４  ＫＯマウスモデルは、加齢に伴う変化を除いて網膜電図（ＥＲＧ）表現型または組織学的変性を提示せず、そのため毒性の兆候を、網膜機能の変化及び網膜構造の喪失によって測定できる。
【０４７０】
盲検研究では、Ａｂｃａ４  ＫＯマウスに、４〜５週齢で右目の上網膜に網膜下注射をした（ｎ＝８〜１１／群）。試験した注射物質は次のとおりである：ＡＡＶ希釈剤（ＰＢＳ  ＰＦ６８  ０．００１％）；ＧＲＫ１．ＧＦＰ．ｐＡ高用量（２Ｅ＋１０ゲノムコピー）；上流ベクター低用量（２Ｅ＋９ゲノムコピー）；上流ベクター高用量（２Ｅ＋１０ゲノムコピー）；下流ベクター（１Ｅ＋１０ゲノムコピー）；デュアルベクター低用量（２Ｅ＋９総ゲノムコピー）；デュアルベクター高用量（２Ｅ＋１０総ゲノムコピー）。全てのベクターは、ＡＡＶ８  Ｙ７３３Ｆとした。標準化された光干渉断層法（ＯＣＴ）及びＥＲＧ評価を、注射３ヶ月後及び６ヶ月後にて行った。
【０４７１】
全てのコホートのマウスは、様々な程度の注射後損傷を明らかにした。網膜下注射を行うと、注射３ヶ月後及び６ヶ月後の両方で、注射されていない対となる眼と比較して、上網膜全層厚に有意な影響を有した（３ヶ月の二元配置分散分析：眼ｐ＜０．００１、コホートｐ＝０．７０１２、相互作用ｐ＝０．６２０３；６ヶ月の二元配置分散分析：眼ｐ＜０．００１、コホートｐ＝０．６８５８、相互作用ｐ＝０．６２３０）。網膜全層厚の減少は、注射物質には影響されず、ＡＡＶ希釈剤のみを与えたマウスと比較して、ベクター注射マウスにおける追加の喪失は観察されなかった。全てのコホートは、注射及び非注射眼間で、１ｃｄ．ｓ／ｍ２にてＥＲＧ振幅の有意な減少を呈した（３ヶ月の二元配置分散分析：眼ｐ＜０．０００１、コホートｐ＝０．０１７３、相互作用ｐ＝０．５９５４；６ヶ月の二元配置分散分析：眼ｐ＜０．０００１、コホートｐ＝０．０１０２、相互作用ｐ＝０．４４３７）。対となる眼の間の反応の大きさの変化は、いずれの時点でもコホート間で有意差はなかった（二元配置分散分析：時点ｐ＝０．８５０７、コホートｐ＝０．４０１４、相互作用ｐ＝０．０４９１）。
【０４７２】
Ａｂｃａ４  ＫＯマウスに網膜下注射を行うと、網膜全層厚の喪失及びＥＲＧ振幅の落ち込みがもたらされた。このような変化の大きさは、デュアルベクター注射マウスとＡＡＶ希釈剤のみを与えたマウスにおいて差はなかった。
【０４７３】
上記明細書にて言及した全ての刊行物は、参照により本明細書に組込まれる。記載する本開示の生産物、システム、使用、プロセス及び方法の種々の変更及び変形は、本開示の範囲及び精神から逸脱することなく当業者には明白であるだろう。本開示を特定の好ましい実施形態に関連して記載してきたが、特許請求される本開示は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、本開示を実施するための記載の様式のさまざまな変更は、生化学及び生物工学または関連分野における当業者に明らかであり、以下の添付の特許請求の範囲内にあることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２５Ｄ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２８Ｃ】
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【図２９】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３１Ａ−１】
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【図３１Ａ−２】
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【図３１Ｂ】
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【図３１Ｃ】
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【図３１Ｄ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３８−１】
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【図３８−２】
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【図３８−３】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図３９−３】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４０−３】
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【図４０−４】
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【図４０−５】
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【図４１−１】
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【図４１−２】
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【図４１−３】
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【図４１−４】
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【図４２】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８Ａ】
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【図４８Ｂ】
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【図４８Ｃ】
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【図４８Ｄ】
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【図４９Ａ】
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【図４９Ｂ】
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【図４９Ｃ】
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【図４９Ｄ】
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【図４９Ｅ】
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【図４９Ｆ】
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【図４９Ｇ】
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【図４９Ｈ】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２−１】
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【図５２−２】
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【図５２−３】
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【図５２−４】
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【図５３−１】
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【図５３−２】
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【図５３−３】
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【図５３−４】
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【図５４−１】
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【図５４−２】
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【図５４−３】
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【図５４−４】
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【図５５−１】
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【図５５−２】
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【図５５−３】
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【図５５−４】
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【図５６−１】
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【図５６−２】
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【図５６−３】
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【図５６−４】
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【図５７】
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【配列表】
2021520231000001.app
【国際調査報告】
2021520231.tif 000181
2021520231.tif 000182