(57)【要約】【課題】ＰＤ−１結合抗体及びその使用。【解決手段】ヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離モノクローナル抗体又は抗原結合断片。該抗体又は抗原結合断片をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及び該抗体又は抗原結合断片の発現方法も提供する。本発明はさらに、該抗体又は抗原結合断片を含む免疫複合体、二重特異性分子、キメラ抗原受容体、腫瘍溶解性ウイルス及び医薬組成物、並びに本発明の抗ＰＤ−１抗体を用いた治療方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、上記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、
ＩＭＧＴナンバリングスキームで定義される場合、
（１−１）それぞれ配列番号１、２及び３、又は
（１−２）それぞれ配列番号４、５及び６、
Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームで定義される場合、
（２−１）それぞれ配列番号３７、３９及び４１、又は
（２−２）それぞれ配列番号４４、４６及び４８、あるいは
Ｋａｂａｔナンバリングスキームで定義される場合、
（３−１）それぞれ配列番号３８、４０及び４１、又は
（３−２）それぞれ配列番号４５、４７及び４８
のアミノ酸配列を有し、
上記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する、
単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域をさらに含み、上記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、
Ｋａｂａｔナンバリングスキーム又はＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームで定義される場合、
（１−１）それぞれ配列番号７、８及び９、又は
（１−２）それぞれ配列番号１０、１１及び１２、あるいは
ＩＭＧＴナンバリングスキームで定義される場合、
（２−１）それぞれ配列番号４２、４３及び９、又は
（２−２）それぞれ配列番号４９、５０及び１２
のアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の抗体又はその抗原結合部分。
【請求項４】
配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をさらに含む請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、上記重鎖及び軽鎖可変領域は、（１）それぞれ配列番号１３及び２７、（２）それぞれ配列番号１４及び２８、（３）それぞれ配列番号１５及び２８、（４）それぞれ配列番号１６及び２８、（５）それぞれ配列番号１７及び２８、（６）それぞれ配列番号１８及び２８、（７）それぞれ配列番号１９及び２８、（８）それぞれ配列番号２０及び２８、（９）それぞれ配列番号１４及び２９、（１０）それぞれ配列番号１４及び３０、（１１）それぞれ配列番号１４及び３１、（１２）それぞれ配列番号１４及び３２、（１３）それぞれ配列番号２１及び２８、（１４）それぞれ配列番号１４及び３３、（１５）それぞれ配列番号２１及び３３、（１６）それぞれ配列番号２２及び３４、（１７）それぞれ配列番号２３及び３５、（１８）それぞれ配列番号２４及び３５、（１９）それぞれ配列番号２５及び３５、（２０）それぞれ配列番号２３及び３６、（２１）それぞれ配列番号２６及び３５、又は（２２）それぞれ配列番号２６及び３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含む請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号５１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、及び／又は配列番号５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む請求項６に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
（ａ）ヒトＰＤ−１に結合し、（ｂ）サルＰＤ−１に結合し、（ｃ）ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害し、（ｄ）Ｔ細胞増殖を増加させ、（ｅ）免疫応答を刺激し、且つ／又は（ｆ）抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
マウス、ヒト、キメラ又はヒト化抗体である請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項１１】
請求項１０に記載の核酸を発現することができる発現ベクター。
【請求項１２】
請求項１０に記載の核酸又は請求項１１に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１２に記載の宿主細胞を用いて請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、（ｉ）上記宿主細胞において上記抗体又はその抗原結合部分を発現させる工程と、（ｉｉ）上記宿主細胞又は細胞培養物から上記抗体又はその抗原結合部分を単離する工程とを含む方法。
【請求項１４】
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異性分子、免疫複合体、キメラ抗原受容体、改変Ｔ細胞受容体又は腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１５】
請求項１に記載の抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１６】
抗腫瘍剤をさらに含む請求項１５に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
対象におけるがん疾患の予防及び／又は治療方法であって、上記対象に治療有効量の請求項１５に記載の医薬組成物を投与することを含む方法。
【請求項１８】
上記がん疾患は固形又は非固形腫瘍である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
上記がん疾患は、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、結腸腺がん、膵臓がん、結腸がん、胃腸がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、腎細胞がん、上咽頭がん、又はこれらの組み合わせである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、概して、高い親和性及び機能性でヒトＰＤ−１に特異的に結合する単離モノクローナル抗体、特にマウス、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体に関する。該抗体をコードする核酸分子、発現ベクター、宿主細胞、及び該抗体の発現方法も提供する。本発明はさらに、該抗体を含む免疫複合体、二重特異性分子及び医薬組成物、並びに本発明の抗ＰＤ−１抗体を用いた診断及び治療方法を提供する。
【背景技術】
【０００２】
ＰＤ−１又はＣＤ２７９としても知られるプログラム細胞死タンパク質１は、Ｔ細胞調節因子のＣＤ２８ファミリーのメンバーであり、活性化Ｂ細胞、Ｔ細胞及び骨髄細胞で発現される（非特許文献１、２及び３）。該タンパク質は、膜近位免疫受容体チロシン抑制モチーフ（ＩＴＩＭ）及び膜遠位チロシンベーススイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む（非特許文献４及び５）。ＰＤ−１に対する２つのリガンド（ＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２）が同定されており、いずれもＰＤ−１には結合するが他のＣＤ２８ファミリーメンバーには結合しないＢ７相同体である。
【０００３】
ＰＤ−１及びそのリガンドが免疫応答を負に調節することを示唆したいくつかの証拠がある。例えば、ＰＤ−１は、種々のヒトがんにおいて大量に存在することが分かった（非特許文献６）。さらに、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との相互作用によって、腫瘍浸潤リンパ球の減少及びＴ細胞受容体依存性増殖が起こり、がん細胞の免疫回避が誘導されることが報告されている（非特許文献７、８及び９）。また、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１との局所的相互作用を阻害することによって免疫抑制を逆転させることができ、同様にＰＤ−１とＰＤ−Ｌ２との相互作用を遮断した場合には効果が累積されることも研究から示された（非特許文献１０及び１１）。
【０００４】
ＰＤ−１欠損動物は、自己免疫心筋症、並びに関節炎及び腎炎を伴うループス様症候群を含む様々な自己免疫表現型を発症し得る（非特許文献１２及び１３）。加えて、ＰＤ−１は、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病及び関節リウマチにおいて何らかの役割を果たすことが分かっている（非特許文献１４、１５及び１６）。マウスＢ細胞腫瘍株において、ＰＤ−１のＩＴＳＭは、ＢＣＲ媒介性Ｃａ２＋フラックス及び下流エフェクター分子のチロシンリン酸化を遮断するのに必須であることが示された（非特許文献１７）。
【０００５】
ＰＤ−１受容体を標的とする多くのがん免疫療法剤が疾患治療のために開発されている。そのような抗ＰＤ−１抗体の一つはニボルマブ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  ＳｑｕｉｂｂからＯＰＤＩＶＯ（登録商標）の商品名で販売されている）であり、合計２９６人の患者を対象とした臨床試験において非小細胞肺がん、メラノーマ及び腎細胞がんの完全奏効又は部分奏効が得られた（非特許文献１８）。この抗体は転移性メラノーマの治療薬として２０１４年に日本で、２０１４年に米国ＦＤＡで承認された。別の抗ＰＤ−１抗体であるペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡＴＭ、ＭＫ−３４７５、Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．）はＰＤ−１受容体を標的とするものであるが、これも転移性メラノーマの治療薬として２０１４年に米国ＦＤＡで承認され、肺がん、リンパ腫及び中皮腫に対して米国で臨床試験中である。
【０００６】
既に開発され承認されている抗ＰＤ−１抗体はあるものの、ＰＤ−１への結合親和性が向上し、且つ他の望ましい薬学的特性も有するモノクローナル抗体がさらに求められている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６）Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ８：７６５−７２
【非特許文献２】Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９−８２
【非特許文献３】Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：７１１−８
【非特許文献４】Ｔｈｏｍａｓ，Ｍ．Ｌ．（１９９５）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １８１：１９５３−６
【非特許文献５】Ｖｉｖｉｅｒ，Ｅ  ａｎｄ  Ｄａｅｒｏｎ，Ｍ（１９９７）Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｔｏｄａｙ  １８：２８６−９１
【非特許文献６】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：７８７−９
【非特許文献７】Ｄｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．８１：２８１−７
【非特許文献８】Ｂｌａｎｋ  ｅｔ  ａｌ．，（２００５）Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．５４：３０７−３１４
【非特許文献９】Ｋｏｎｉｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１０：５０９４−１００
【非特許文献１０】Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９９：１２２９３−７
【非特許文献１１】Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：１２５７−６６
【非特許文献１２】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １１：１４１−５１
【非特許文献１３】Ｎｉｓｈｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９１：３１９−２２
【非特許文献１４】Ｓａｌａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（２００３）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９８：７１−７８
【非特許文献１５】Ｐｒｏｋｕｎｉｎａ  ａｎｄ  Ａｌａｒｃｏｎ−Ｒｉｑｕｅｌｍｅ（２００４）Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １３：Ｒ１４３
【非特許文献１６】Ｎｉｅｌｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｌｕｐｕｓ  １３：５１０
【非特許文献１７】Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００１）ＰＮＡＳ  ９８：１３８６６−７１
【非特許文献１８】Ｔｏｐａｌｉａｎ  ＳＬ  ｅｔ  ａｌ．，（２０１２）Ｔｈｅ  Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ．３６６（２６）：２４４３−５４
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
本発明は、ＰＤ−１（例えば、ヒトＰＤ−１及びサルＰＤ−１）に結合し、ニボルマブ等の既存の抗ＰＤ−１抗体と比較して、ＰＤ−１への親和性が向上し、且つより優れているとは言わないまでも同等の抗腫瘍効果を有する単離モノクローナル抗体、例えばマウス、ヒト、キメラ又はヒト化モノクローナル抗体を提供する。
【０００９】
本発明の抗体は、ＰＤ−１タンパク質の検出や、がん、自己免疫性心筋症、自己免疫性脳脊髄炎、全身性エリテマトーデス、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、Ｉ型糖尿病及び関節リウマチ等のＰＤ−１関連疾患の治療及び予防を含む様々な用途に使用することができる。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
したがって、一態様では、本発明は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を有し、且つＰＤ−１に結合する単離モノクローナル抗体（例えば、マウス、キメラ又はヒト化抗体）又はその抗原結合部分に関する。上記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、ＩＭＧＴナンバリングスキームで定義される場合、（１）それぞれ配列番号１、２及び３、又は（２）それぞれ配列番号４、５及び６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、上記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する。上記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームで定義される場合、（１）それぞれ配列番号３７、３９及び４１、又は（２）それぞれ配列番号４４、４６及び４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、上記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する。上記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、Ｋａｂａｔナンバリングスキームで定義される場合、（１）それぞれ配列番号３８、４０及び４１、又は（２）それぞれ配列番号４５、４７及び４８と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、上記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する。
【００１１】
一態様では、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含み、上記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する。配列番号１３、２１、２２及び２６は、それぞれ配列番号５５、５６、５７及び５８の核酸配列によってコードされてもよい。
【００１２】
一態様では、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域を含む。上記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、Ｋａｂａｔナンバリングスキーム又はＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームで定義される場合、（１）それぞれ配列番号７、８及び９、又は（２）それぞれ配列番号１０、１１及び１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、上記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する。上記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、ＩＭＧＴナンバリングスキームで定義される場合、（１）それぞれ配列番号４２、４３及び９、又は（２）それぞれ配列番号４９、５０及び１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、上記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する。
【００１３】
一態様では、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を含み、上記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する。配列番号２７、３３、３４及び３６は、それぞれ配列番号５９、６０、６１及び６２の核酸配列によってコードされてもよい。
【００１４】
一態様では、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、各々がＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、上記重鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３、並びに上記軽鎖可変領域ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３は、（１）それぞれ配列番号１、２、３、７、８及び９、又は（２）それぞれ配列番号４、５、６、１０、１１及び１２、又は（３）それぞれ配列番号１、２、３、４２、４３及び９、又は（４）それぞれ配列番号４、５、６、４９、５０及び１２、又は（５）それぞれ配列番号３７、３９、４１、７、８及び９、又は（６）それぞれ配列番号４４、４６、４８、１０、１１及び１２、又は（７）それぞれ配列番号３７、３９、４１、４２、４３及び９、又は（８）それぞれ配列番号４４、４６、４８、４９、５０及び１２、又は（９）それぞれ配列番号３８、４０、４１、７、８及び９、又は（１０）それぞれ配列番号４５、４７、４８、１０、１１及び１２、又は（１１）それぞれ配列番号３８、４０、４１、４２、４３及び９、又は（１２）それぞれ配列番号４５、４７、４８、４９、５０及び１２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、上記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する。
【００１５】
一実施形態では、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、上記重鎖可変領域及び上記軽鎖可変領域は、（１）それぞれ配列番号１３及び２７、（２）それぞれ配列番号１４及び２８、（３）それぞれ配列番号１５及び２８、（４）それぞれ配列番号１６及び２８、（５）それぞれ配列番号１７及び２８、（６）それぞれ配列番号１８及び２８、（７）それぞれ配列番号１９及び２８、（８）それぞれ配列番号２０及び２８、（９）それぞれ配列番号１４及び２９、（１０）それぞれ配列番号１４及び３０、（１１）それぞれ配列番号１４及び３１、（１２）それぞれ配列番号１４及び３２、（１３）それぞれ配列番号２１及び２８、（１４）それぞれ配列番号１４及び３３、（１５）それぞれ配列番号２１及び３３、（１６）それぞれ配列番号２２及び３４、（１７）それぞれ配列番号２３及び３５、（１８）それぞれ配列番号２４及び３５、（１９）それぞれ配列番号２５及び３５、（２０）それぞれ配列番号２３及び３６、（２１）それぞれ配列番号２６及び３５、又は（２２）それぞれ配列番号２６及び３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、上記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する。
【００１６】
一実施形態では、本発明の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分は、重鎖及び軽鎖を含み、上記重鎖は重鎖可変領域及び重鎖定常領域を含み、上記軽鎖は軽鎖可変領域及び軽鎖定常領域を含み、上記重鎖定常領域は、配列番号５１又は６５と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、上記軽鎖定常領域は、配列番号５２又は６６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、上記重鎖可変領域及び上記軽鎖可変領域は、上述したアミノ酸配列を有し、上記抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する。これらの配列番号５１、５２、６５及び６６のアミノ酸配列は、それぞれ配列番号６３、６４、６７及び６８の核酸配列によってコードされてもよい。
【００１７】
いくつかの実施形態における本発明の抗体は、２つの重鎖及び２つの軽鎖を含むか、それらからなり、各重鎖は、上述した重鎖定常領域、重鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み、各軽鎖は、上述した軽鎖定常領域、軽鎖可変領域又はＣＤＲ配列を含み、上記抗体はＰＤ−１に結合する。本発明の抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４アイソタイプ又はＦｃ改変ＩｇＧ等の全長抗体であってもよい。他の実施形態における本発明の抗体は、一本鎖抗体、又はＦａｂ若しくはＦａｂ’２断片等の抗体断片であってもよい。
【００１８】
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ニボルマブ等の従来の抗ＰＤ−１抗体よりもヒトＰＤ−１に対する結合親和性が高く、０．３〜４．０×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害する。また、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ニボルマブ等の既存の抗ＰＤ−１抗体と比較して、より優れているとは言わないまでも同等の抗腫瘍効果を発揮する。
【００１９】
本発明の抗体又はその抗原結合部分をコードする核酸分子、並びに該核酸を含む発現ベクター及び該発現ベクターを含む宿主細胞もまた本発明に包含される。上記発現ベクターを含む宿主細胞を用いて抗ＰＤ−１抗体を作製する方法であって、（ｉ）上記宿主細胞において上記抗体を発現させる工程と、（ｉｉ）上記宿主細胞又はその細胞培養物から上記抗体を単離する工程とを含む方法も提供する。
【００２０】
本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合部分を、細胞毒、細胞傷害性薬物等の治療剤に連結した免疫複合体を提供する。本発明はまた、本発明の抗体又はその抗原結合部分を、該抗体又はその抗原結合部分とは異なる結合特異性を有する第二の機能部分（例えば、第二の抗体、サイトカイン等）に連結した二重特異性分子を提供する。別の態様において、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の一部に構成することができる。また、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、腫瘍溶解性ウイルスによってコードされてもよく、あるいは腫瘍溶解性ウイルスと併用してもよい。
【００２１】
本発明の抗体若しくはその抗原結合部分、又は免疫複合体、二重特異性分子若しくはＣＡＲと、薬学的に許容される担体とを含む組成物も提供する。
【００２２】
さらに別の態様において、本発明は、対象における免疫応答を変化させる方法であって、対象に上記抗体又はその抗原結合部分を投与することで、上記対象における免疫応答を変化させることを含む方法を提供する。本発明の抗体は、上記対象における免疫応答を増強、刺激又は増加させることが好ましい。いくつかの実施形態において、本方法は、本発明の組成物、二重特異性分子、免疫複合体、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又は抗体をコードする若しくは抗体を有する腫瘍溶解性ウイルス、あるいは上記対象においてそれらを発現させることができる核酸分子を投与することを含む。
【００２３】
さらなる態様において、本発明は、対象における腫瘍増殖を阻害する方法であって、対象に治療有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部分を投与することを含む方法を提供する。上記腫瘍は、固形又は非固形腫瘍であってもよく、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、結腸腺がん、膵臓がん、結腸がん、胃腸がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、腎細胞がん及び上咽頭がんが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、本方法は、本発明の組成物、二重特異性分子、免疫複合体、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又は抗体をコードする若しくは抗体を有する腫瘍溶解性ウイルス、あるいは上記対象においてそれらを発現させることができる核酸分子を投与することを含む。
【００２４】
別の態様において、本発明は、対象における感染症を治療する方法であって、対象に治療有効量の本発明の抗体又はその抗原結合部分を投与することを含む方法を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、本発明の組成物、二重特異性分子、免疫複合体、ＣＡＲ−Ｔ細胞、又は抗体をコードする若しくは抗体を有する腫瘍溶解性ウイルス、あるいは上記対象においてそれらを発現させることができる核酸分子を投与することを含む。
【００２５】
さらに、本発明は、対象において抗原に対する免疫応答を増強する方法であって、対象に（ｉ）上記抗原及び（ｉｉ）上記抗体又はその抗原結合部分を投与することで、上記対象において抗原に対する免疫応答を増強することを含む方法を提供する。上記抗原は、例えば、腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、又は病原体由来の抗原であってもよい。
【００２６】
本発明の抗体は、免疫刺激抗体（例えば、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体）、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−２１）又は共刺激抗体（例えば、抗ＣＤ１３７及び／又は抗ＧＩＴＲ抗体）等の少なくとも１種の追加の薬剤と併用することができる。
【００２７】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び実施例から明らかであり、これらは本発明を限定するものと解釈すべきではない。本出願を通じて引用された全ての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋエントリー、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】ヒト化抗ＰＤ−１抗体又はコントロール薬剤を投与した群におけるマウス体重の変化を示す。
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、ヒト化抗ＰＤ−１抗体又はコントロール薬剤を（Ａ）１ｍｇ／ｋｇ、（Ｂ）３ｍｇ／ｋｇ又は（Ｃ）１０ｍｇ／ｋｇの用量で投与したマウスの腫瘍体積を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
本開示を理解しやすいように、まず特定の用語を定義する。さらなる定義は、詳細な説明中に記載される。
【００３０】
「ＰＤ−１」とは、プログラム細胞死タンパク質１を意味する。「ＰＤ−１」には、変異体、アイソフォーム、相同体、オルソログ及びパラログが含まれる。例えば、ヒトＰＤ−１タンパク質に特異的な抗体は、ある場合には、ヒト以外の種、例えばサルに由来するＰＤ−１タンパク質と交差反応してもよい。他の実施形態では、ヒトＰＤ−１タンパク質に特異的な抗体は、該ヒトＰＤ−１タンパク質に完全に特異的であって、他の種又は他の種類に対して交差反応性を示さなくてもよく、あるいは他の全ての種ではなく特定の他の種に由来するＰＤ−１と交差反応してもよい。
【００３１】
「ヒトＰＤ−１」とは、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００５００９．２を有するヒトＰＤ−１のアミノ酸配列等のヒト由来アミノ酸配列を有するＰＤ−１タンパク質を意味する。「サル又はアカゲザルＰＤ−１」及び「マウスＰＤ−１」とは、それぞれサル及びマウスＰＤ−１配列、例えば、それぞれＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿００１１０７８３０及びＣＡＡ４８１１３を有するアミノ酸配列を有するものを意味する。
【００３２】
「免疫応答」とは、例えば、リンパ球、抗原提示細胞、食細胞、顆粒球、及び上記細胞又は肝臓で産生される可溶性巨大分子（抗体、サイトカイン及び補体を含む）の作用であって、その結果、侵入病原体、病原体に感染した細胞若しくは組織、がん細胞、又は自己免疫若しくは病理学的炎症の場合には正常なヒト細胞若しくは組織の選択的損傷、破壊、又は人体からの除去が起こる作用を意味する。
【００３３】
「抗原特異的Ｔ細胞応答」とは、Ｔ細胞が特異的である抗原によるＴ細胞の刺激の結果生じるＴ細胞による応答を意味する。抗原特異的刺激に対するＴ細胞による応答の例としては、増殖、サイトカイン産生（例えばＩＬ−２産生）及び抗原陽性細胞の死滅が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で言及される「抗体」には、全抗体及びその任意の抗原結合断片（すなわち「抗原結合部分」）又は一本鎖が含まれる。全抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域からなる。重鎖定常領域は、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３という３つのドメインからなる。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域からなる。軽鎖定常領域は１つのドメインＣＬからなる。ＶＨ及びＶＬ領域は、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）が散在した超可変領域（相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる）にさらに細分することができる。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かってＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に並んでいる３つのＣＤＲ及び４つのＦＲからなる。重鎖及び軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えばエフェクター細胞）及び古典的補体系の第一成分（Ｃ１ｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介することができる。
【００３５】
本明細書で使用される、抗体の「抗原結合部分」（又は単に「抗体部分」）とは、抗原（例えばＰＤ−１タンパク質）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を意味する。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行できることが示されている。抗体の「抗原結合部分」に包含される結合断片の例としては、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片、（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片、（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の１本腕のＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（又はナノボディ）（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）、及び（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が挙げられる。また、Ｆｖ断片の２つのドメインＶＬ及びＶＨは、別々の遺伝子によってコードされているものの、組換え法を用いて、それらを単一のポリペプチド鎖にできる合成リンカーによって結合させることができ、ＶＬ及びＶＨ領域は対合して一価分子を形成する（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている；例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、及びＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３を参照されたい）。また、そのような一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」に包含されることが意図されている。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を用いて得られ、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００３６】
本明細書で使用される「単離抗体」とは、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を意味することを意図している（例えば、ＰＤ−１タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、ＰＤ−１タンパク質以外の抗原に特異的に結合する抗体を実質的に含まない）。しかしながら、ヒトＰＤ−１タンパク質に特異的に結合する単離抗体は、他の種由来のＰＤ−１タンパク質等の他の抗原に対して交差反応性を示してもよい。また、単離抗体は、他の細胞材料及び／又は化学物質を実質的に含まないものであってもよい。
【００３７】
本明細書で使用される「モノクローナル抗体」又は「モノクローナル抗体組成物」とは、単一分子組成の抗体分子の製剤を意味する。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。
【００３８】
本明細書で使用される「マウス抗体」には、フレームワーク及びＣＤＲ領域がいずれもマウス生殖系列免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体が含まれることが意図されている。また、抗体が定常領域を含む場合、該定常領域もマウス生殖系列免疫グロブリン配列に由来する。本発明のマウス抗体は、マウス生殖系列免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのランダム若しくは部位特異的突然変異誘発、又はｉｎ  ｖｉｖｏでの体細胞変異によって導入された変異）を含んでいてもよい。しかしながら、本明細書で使用される「マウス抗体」には、別の哺乳類種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がマウスフレームワーク配列に移植された抗体が含まれることは意図していない。
【００３９】
「キメラ抗体」とは、非ヒト由来遺伝子材料とヒト由来遺伝子材料とを組み合わせて作製される抗体を意味する。あるいはより一般的には、キメラ抗体は、特定の種に由来する遺伝子材料を別の種に由来する遺伝子材料と共に有する抗体である。
【００４０】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」とは、ヒトにおいて天然に産生される抗体変異体への類似性を高めるためにタンパク質配列が改変された非ヒト種由来の抗体を意味する。
【００４１】
「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えばＩｇＭ又はＩｇＧ１）を意味する。
【００４２】
「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という語は、本明細書では「抗原に特異的に結合する抗体」と交換可能に使用される。
【００４３】
本明細書で使用される「ヒトＰＤ−１に特異的に結合する」抗体とは、ヒトＰＤ−１タンパク質（及びおそらく１種以上の非ヒト種に由来するＰＤ−１タンパク質）には結合するが非ＰＤ−１タンパク質には実質的に結合しない抗体を意味することを意図している。好ましくは、上記抗体は、「高親和性」、すなわち１．０×１０−９Ｍ以下、より好ましくは３．０×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１タンパク質に結合する。
【００４４】
本明細書で使用される、タンパク質又は細胞に「実質的に結合しない」という語は、該タンパク質又は細胞に結合しない又は高親和性で結合しないこと、すなわち、１．０×１０−６Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０−５Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０−４Ｍ以上、より好ましくは１．０×１０−３Ｍ以上、さらにより好ましくは１．０×１０−２Ｍ以上のＫＤで該タンパク質又は細胞に結合することを意味する。
【００４５】
ＩｇＧ抗体への「高親和性」とは、標的抗原に対するＫＤが１．０×１０−６Ｍ以下、より好ましくは５．０×１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは１．０×１０−８Ｍ以下、さらにより好ましくは４．０×１０−９Ｍ以下、さらにより好ましくは１．０×１０−９Ｍ以下の抗体を意味する。しかしながら、他の抗体アイソタイプの場合、「高親和性」結合は変化する。例えば、ＩｇＭアイソタイプへの「高親和性」結合は、ＫＤが１０−６Ｍ以下、より好ましくは１０−７Ｍ以下、さらにより好ましくは１０−８Ｍ以下の抗体を意味する。
【００４６】
本明細書で使用される「Ｋａｓｓｏｃ」又は「Ｋａ」とは、特定の抗体抗原相互作用の会合速度を意味することを意図しており、一方、本明細書で使用される「Ｋｄｉｓ」又は「Ｋｄ」とは、特定の抗体抗原相互作用の解離速度を意味することを意図している。本明細書で使用される「ＫＤ」とは、Ｋａに対するＫｄの比（すなわちＫｄ／Ｋａ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される解離定数を意味することを意図している。抗体のＫＤ値は、当該技術分野で十分に確立された方法を用いて決定することができる。抗体のＫＤを決定するための好ましい方法は、表面プラズモン共鳴、好ましくはＢｉａｃｏｒｅＴＭシステム等のバイオセンサシステムを用いることによる。
【００４７】
「ＥＣ５０」とは、５０％効果濃度としても知られており、所定の曝露時間後にベースラインと最大値との中間の応答を誘導する抗体の濃度を意味する。
【００４８】
「ＩＣ５０」とは、５０％阻害濃度としても知られており、特定の生物学的又は生化学的機能を抗体の非存在下と比べて５０％阻害する抗体の濃度を意味する。
【００４９】
「対象」には、あらゆるヒト又は非ヒト動物が含まれる。「非ヒト動物」には、全ての脊椎動物、例えば、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ニワトリ、両生類及び爬虫類等の哺乳類及び非哺乳類が含まれるが、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウシ及びウマ等の哺乳類が好ましい。
【００５０】
「治療有効量」とは、疾患若しくは異常（例えばがん）に関連する症状を予防若しくは改善し、且つ／又は該疾患又は異常の重症度を軽減するのに十分な本発明の抗体の量を意味する。治療有効量は、実際の有効量が当業者に容易に認識される治療対象異常に関連して理解される。
【００５１】
本発明の様々な態様を以下の項においてさらに詳細に説明する。
【００５２】
＜ヒトＰＤ−１への結合親和性が増加し、抗腫瘍効果が向上した抗ＰＤ−１抗体＞
【００５３】
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、ヒトＰＤ−１に特異的に結合し、上述した抗ＰＤ−１抗体、特にニボルマブと比較して、結合親和性が向上し、且つより優れているとは言わないまでも同等の抗腫瘍効果を有する。
【００５４】
本発明の抗体又はその抗原結合部分は、好ましくは１．０×１０−９Ｍ以下のＫＤ、より好ましくは３．０×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１タンパク質に結合する。また、本発明の抗体は、約１．０×１０−８Ｍ〜１．０×１０−１０ＭのＫＤでカニクイザルＰＤ−１に結合する。
【００５５】
さらなる機能的特性として、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断する能力が挙げられる。本発明の抗体は、一実施形態において、ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１への結合をニボルマブと同様の濃度で阻害することができる。
【００５６】
他の機能的特性としては、抗原特異的Ｔ細胞応答等の免疫応答を刺激する抗体の能力が挙げられる。これは、例えば、抗原特異的Ｔ細胞応答においてインターロイキン−２（ＩＬ−２）産生を刺激する抗体の能力を評価することで試験できる。ある実施形態において、上記抗体はヒトＰＤ−１に結合し、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する。他の実施形態において、上記抗体はヒトＰＤ−１に結合するが、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激しない。免疫応答を刺激する抗体の能力を評価するための他の手段としては、ｉｎ  ｖｉｖｏ腫瘍移植片モデル等において腫瘍増殖を阻害する能力、又は自己免疫応答を刺激する能力、例えば、自己免疫モデルにおいて自己免疫疾患の発症を促進する能力（例えば、ＮＯＤマウスモデルにおいて糖尿病の発症を促進する能力）等を試験することが挙げられる。
【００５７】
本発明の好ましい抗体はヒトモノクローナル抗体である。加えて又は代わりに、上記抗体は、例えばキメラ又はヒト化モノクローナル抗体であってもよい。
【００５８】
＜モノクローナル抗ＰＤ−１抗体＞
【００５９】
本発明の好ましい抗体は、以下の説明及び下記実施例に記載されるように構造的及び化学的に特徴付けられるモノクローナル抗体である。該抗ＰＤ−１抗体のＶＨアミノ酸配列は、配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６に記載されている。該抗ＰＤ−１抗体のＶＬアミノ酸配列は、配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６に示されている。上記抗体の重鎖／軽鎖可変領域のアミノ酸配列は、下記表１にまとめられており、いくつかのクローンが同じＶＨ又はＶＬを共有している。全てのクローンの重鎖定常領域は、配列番号５１等に記載されているアミノ酸配列を有するヒトＩｇＧ１重鎖定常領域であってもよく、全てのクローンの軽鎖定常領域は、配列番号５２等に記載されているアミノ酸配列を有するヒトκ定常領域であってもよい。
【００６０】
当該技術分野でよく知られているように、上記抗体のＣＤＲ領域は、Ｋａｂａｔナンバリングシステム（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ  ＮＩＨ，１９８７）、Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングシステム（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）ＪＭＢ  ２７３，９２７−９４８）、接触定義法（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  Ｒ．Ｍ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２６２（５），７３２−７４５）等、抗体中の残基をナンバリングし、ＣＤＲを決定するための確立された方法によって決定することができる。当業者が利用できる他のＣＤＲ配列のナンバリング法として、「ＡｂＭ」法（バース大学）及び「接触」法（ユニバーシティ・カレッジ・ロンドン）が挙げられる。
【００６１】
表１の重鎖可変領域ＣＤＲ及び軽鎖可変領域ＣＤＲは、それぞれＩＭＧＴナンバリングスキーム及びＫａｂａｔナンバリングスキームで定義されたものである。異なるシステムで定義された特定のＣＤＲ配列を表２にまとめる。
【００６２】
【表１】
2021520850.tif 000002
【００６３】
【表２】
2021520850.tif 000003
【００６４】
ヒトＰＤ−１に結合する他の抗ＰＤ−１抗体のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）は、本発明の抗ＰＤ−１抗体のＶＨ及びＶＬ配列（又はＣＤＲ配列）と「組み合わせる」ことができる。好ましくは、ＶＨ及びＶＬ鎖（又は該鎖中のＣＤＲ）を組み合わせる場合、特定のＶＨ／ＶＬ対合のＶＨ配列を構造的に類似したＶＨ配列で置換する。同様に、特定のＶＨ／ＶＬ対合のＶＬ配列を構造的に類似したＶＬ配列で置換するのが好ましい。
【００６５】
したがって、一実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、
（ａ）上記表１に記載されたアミノ酸配列を有する重鎖可変領域と、
（ｂ）上記表１に記載されたアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域、又は別の抗ＰＤ−１抗体のＶＬとを含み、上記抗体はヒトＰＤ−１に特異的に結合する。
【００６６】
別の実施形態では、本発明の抗体又はその抗原結合部分は、
（ａ）上記表１／表２に記載された重鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域と、
（ｂ）上記表１／表２に記載された軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３領域、又は別の抗ＰＤ−１抗体のＣＤＲとを含み、上記抗体はヒトＰＤ−１に特異的に結合する。
【００６７】
さらに別の実施形態では、上記抗体又はその抗原結合部分は、抗ＰＤ−１抗体の重鎖可変ＣＤＲ２領域を、ヒトＰＤ−１に結合する他の抗体のＣＤＲ、例えば、異なる抗ＰＤ−１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ１及び／若しくはＣＤＲ３、並びに／又は軽鎖可変領域のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／若しくはＣＤＲ３と組み合わせたものを含む。
【００６８】
さらに、ＣＤＲ３ドメインは、ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２ドメインから独立して単独で同族抗原に対する抗体の結合特異性を決定できること、また、予想されるように、共通のＣＤＲ３配列に基づいて同じ結合特異性を有する複数の抗体を作製できることが当該技術分野において周知である。例えば、Ｋｌｉｍｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｊ．ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  ８３（２）：２５２−２６０（２０００）；Ｂｅｉｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９６：８３３−８４９（２０００）；Ｒａｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９５：８９１０−８９１５（１９９８）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１１６：２１６１−２１６２（１９９４）；Ｂａｒｂａｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：２５２９−２５３３（１９９５）；Ｄｉｔｚｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：７３９−７４９（１９９６）；Ｂｅｒｅｚｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，ＢＩＡｊｏｕｒｎａｌ  ８：Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｖｉｅｗ  ８（２００１）；Ｉｇａｒａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ（Ｔｏｋｙｏ）１１７：４５２−７（１９９５）；Ｂｏｕｒｇｅｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ  ７２：８０７−１０（１９９８）；Ｌｅｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：４３７４−８（１９９３）；Ｐｏｌｙｍｅｎｉｓ  ａｎｄ  Ｓｔｏｌｌｅｒ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２：５２１８−５３２９（１９９４）；及びＸｕ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｓ，Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １３：３７−４５（２０００）を参照されたい。また、米国特許第６，９５１，６４６号；第６，９１４，１２８号；第６，０９０，３８２号；第６，８１８，２１６号；第６，１５６，３１３号；第６，８２７，９２５号；第５，８３３，９４３号；第５，７６２，９０５号及び第５，７６０，１８５号も参照されたい。これらの参考文献はそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６９】
したがって、別の実施形態では、本発明の抗体は、抗ＰＤ−１抗体の重鎖可変領域のＣＤＲ２と、少なくとも、抗ＰＤ−１抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３、又は別の抗ＰＤ−１抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ３とを含み、上記抗体はヒトＰＤ−１に特異的に結合することができる。これらの抗体は、（ａ）ＰＤ−１との結合について競合し、（ｂ）機能的特性を保持し、（ｃ）同一のエピトープに結合し、且つ／又は（ｄ）本発明の抗ＰＤ−１抗体と類似した結合親和性を有することが好ましい。さらに別の実施形態では、上記抗体はさらに、抗ＰＤ−１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２、又は別の抗ＰＤ−１抗体の軽鎖可変領域のＣＤＲ２を含んでもよく、上記抗体はヒトＰＤ−１に特異的に結合することができる。別の実施形態では、本発明の抗体は、抗ＰＤ−１抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１、又は別の抗ＰＤ−１抗体の重鎖及び／若しくは軽鎖可変領域のＣＤＲ１を含んでもよく、上記抗体はヒトＰＤ−１に特異的に結合することができる。
【００７０】
＜保存的修飾＞
【００７１】
別の実施形態では、本発明の抗体は、１つ以上の保存的修飾によって本発明の抗ＰＤ−１抗体とは異なるＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列の重鎖及び／又は軽鎖可変領域配列を含む。抗原結合を取り除かない特定の保存的配列修飾を行えることが当該技術分野において理解される。例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ  ３２：１１８０−８；ｄｅ  Ｗｉｌｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｐｒｏｔ．Ｅｎｇ．１０：８３５−４１；Ｋｏｍｉｓｓａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：２６８６４−２６８７０；Ｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：１６０５−１２；Ｋｅｌｌｅｙ  ａｎｄ  Ｏ’Ｃｏｎｎｅｌｌ（１９９３）Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：６８６２−３５；Ａｄｉｂ−Ｃｏｎｑｕｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０：３４１−６；及びＢｅｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｃｌｉｎ．Ｃａｎ．Ｒｅｓ．６：２８３５−４３を参照されたい。
【００７２】
したがって、一実施形態において、上記抗体は、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、並びに／又はＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含み、
（ａ）上記重鎖可変領域ＣＤＲ１配列は、上記表１／表２に記載された配列、及び／又はその保存的修飾を含み、且つ／又は
（ｂ）上記重鎖可変領域ＣＤＲ２配列は、上記表１／表２に記載された配列、及び／又はその保存的修飾を含み、且つ／又は
（ｃ）上記重鎖可変領域ＣＤＲ３配列は、上記表１／表２に記載された配列、及びその保存的修飾を含み、且つ／又は
（ｄ）上記軽鎖可変領域ＣＤＲ１及び／又はＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３配列は、上記表１／表２に記載された配列、及び／又はその保存的修飾を含み、
（ｅ）上記抗体はヒトＰＤ−１に特異的に結合する。
【００７３】
本発明の抗体は、ヒトＰＤ−１への高親和性結合、及びＰＤ−１発現細胞に対してＡＤＣＣ又はＣＤＣを誘導する能力等の上記機能的特性の１つ以上を有する。
【００７４】
種々の実施形態において、上記抗体は、例えばマウス、ヒト、ヒト化又はキメラ抗体であってもよい。
【００７５】
本明細書で使用される「保存的配列修飾」とは、上記アミノ酸配列を有する抗体の結合特性に著しくは影響を及ぼさないか又は変化させないアミノ酸修飾を意味することを意図している。このような保存的修飾には、アミノ酸の置換、付加及び欠失が含まれる。修飾は、部位特異的突然変異誘発及びＰＣＲ媒介突然変異誘発等、当該技術分野で公知の標準的な技術によって、本発明の抗体に導入することができる。保存的アミノ酸置換は、アミノ酸残基が類似の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。類似の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは当該技術分野において定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン、トリプトファン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン）、β分岐側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を有するアミノ酸が含まれる。したがって、本発明の抗体のＣＤＲ領域内の１つ以上のアミノ酸残基は、同じ側鎖ファミリーの他のアミノ酸残基で置換することができ、改変された抗体は、本明細書に記載される機能アッセイを用いて、保持された機能（すなわち、上述した機能）について試験することができる。
【００７６】
＜改変及び修飾抗体＞
【００７７】
本発明の抗体は、修飾抗体を設計するための出発物質として本発明の抗ＰＤ−１抗体のＶＨ／ＶＬ配列の１つ以上を有する抗体を用いて作製することができる。抗体は、片方又は両方の可変領域（すなわち、ＶＨ及び／又はＶＬ）内、例えば１つ若しくは複数のＣＤＲ領域内及び／又は１つ若しくは複数のフレームワーク領域内の１個以上の残基を修飾することで改変することができる。加えて又は代わりに、抗体は、抗体のエフェクター機能を変化させること等を目的として、定常領域内の残基を修飾することで改変することができる。
【００７８】
特定の実施形態では、ＣＤＲ移植を行って、抗体の可変領域を改変することができる。抗体は、主に６つの重鎖及び軽鎖相補性決定領域（ＣＤＲ）に位置するアミノ酸残基を介して標的抗原と相互作用する。このため、ＣＤＲ内のアミノ酸配列は、ＣＤＲ外の配列よりも個々の抗体間の違いが大きい。ＣＤＲ配列は大部分の抗体抗原相互作用に関与するので、特定の天然抗体のＣＤＲ配列を異なる特性を有する異なる抗体のフレームワーク配列に移植した発現ベクターを構築することによって、該特定の天然抗体の特性を模倣する組換え抗体を発現させることが可能である（例えば、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７；Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８６）Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５；Ｑｕｅｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：１００２９−１００３３を参照されたい。また、米国特許第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号；及び第６，１８０，３７０号も参照されたい）。
【００７９】
したがって、本発明の別の実施形態は、上述したように本発明の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む重鎖可変領域、及び／又は上述したように本発明の配列を有するＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列を含む軽鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合部分に関する。これらの抗体は、本発明のモノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬＣＤＲ配列を含むが、異なるフレームワーク配列を含んでいてもよい。
【００８０】
このようなフレームワーク配列は、生殖系列抗体遺伝子配列を含む公的なＤＮＡデータベース又は公開された参考文献から得ることができる。例えば、ヒトの重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、「ＶＢａｓｅ」ヒト生殖系列配列データベースで見つけることができる（インターネットにおいてｗｗｗ．ｍｒｃ−ｃｐｅ．ｃａｍ．ａｃ．ｕｋ／ｖｂａｓｅで入手可能である他、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９１），前掲書；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６−７９８；及びＣｏｘ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７−８３６でも入手可能。それぞれの内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる）。別の例として、ヒトの重鎖及び軽鎖可変領域遺伝子の生殖系列ＤＮＡ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋデータベースで見つけることができる。例えば、ＨＣｏ７ＨｕＭＡｂマウスで見られる以下の重鎖生殖系列配列は、付随するＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１〜６９（ＮＧ−−００１０１０９、ＮＴ−−０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、３〜３３（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）及び３〜７（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）で入手可能である。別の例として、ＨＣｏ１２ＨｕＭＡｂマウスで見られる以下の重鎖生殖系列配列は、付随するＧｅｎｂａｎｋアクセッション番号１〜６９（ＮＧ−−００１０１０９、ＮＴ−−０２４６３７＆ＢＣ０７０３３３）、５〜５１（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）、４〜３４（ＮＧ−−００１０１０９＆ＮＴ−−０２４６３７）、３〜３０．３（ＣＡＪ５５６６４４）＆３〜２３（ＡＪ４０６６７８）で入手可能である。
【００８１】
当業者には周知のＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７），前掲書）と呼ばれる配列類似性検索法の１つを用いて、収集されたタンパク質配列データベースに対して抗体タンパク質配列を比較する。
【００８２】
本発明の抗体で使用するのに好ましいフレームワーク配列は、本発明の抗体により使用されるフレームワーク配列と構造的に類似しているものである。ＶＨＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３配列は、フレームワーク配列が由来する生殖系列免疫グロブリン遺伝子で見られるものと同一の配列を有するフレームワーク領域に移植することができるか、あるいはＣＤＲ配列は、生殖系列配列と比較して１つ以上の変異を含むフレームワーク領域に移植することができる。例えば、フレームワーク領域内の残基を変異させて、抗体の抗原結合能を維持又は増強することが有益な場合もあることが分かっている（例えば、米国特許第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号及び第６，１８０，３７０号を参照されたい）。
【００８３】
別のタイプの可変領域修飾は、ＶＨ及び／又はＶＬＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３領域内のアミノ酸残基を変異させ、それにより目的の抗体の１つ以上の結合特性（例えば親和性）を改善することである。部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ媒介突然変異誘発を行って変異を導入することができ、抗体結合に対する効果等の目的の機能的特性を当該技術分野で知られているようにｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏアッセイで評価することができる。保存的修飾（当該技術分野で知られているようなもの）を導入することが好ましい。変異は、アミノ酸の置換、付加又は欠失であってもよいが、置換であることが好ましい。また、典型的には、ＣＤＲ領域内の１個以下、２個以下、３個以下、４個以下又は５個以下の残基を変化させる。
【００８４】
したがって、別の実施形態では、本発明は、（ａ）本発明の配列又は１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ１領域、（ｂ）本発明の配列又は１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ２領域、（ｃ）本発明の配列又は１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＨＣＤＲ３領域、（ｄ）本発明の配列又は１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ１領域、（ｅ）本発明の配列又は１個、２個、３個、４個若しくは５個のアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ２領域、及び（ｆ）本発明の配列又は１個、２個、３個、４個もしくは５個のアミノ酸置換、欠失若しくは付加を有するアミノ酸配列を有するＶＬＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む単離抗ＰＤ−１モノクローナル抗体又はその抗原結合部分を提供する。
【００８５】
本発明の改変抗体には、抗体の特性を改善すること等を目的として、ＶＨ及び／又はＶＬ内のフレームワーク残基に修飾を施したものが含まれる。典型的には、そのようなフレームワーク修飾は、抗体の免疫原性を低下させるために行われる。例えば、一手法として、１個以上のフレームワーク残基を対応する生殖系列配列に「復帰変異」させることが挙げられる。より具体的には、体細胞変異を受けた抗体は、該抗体が由来する生殖系列配列とは異なるフレームワーク残基を含み得る。このような残基は、抗体フレームワーク配列を、抗体が由来する生殖系列配列と比較することによって同定することができる。
【００８６】
別のタイプのフレームワーク修飾では、フレームワーク領域内又は１つ以上のＣＤＲ領域内の１個以上の残基を変異させてＴ細胞エピトープを除去し、それにより抗体の潜在的免疫原性を低下させる。この手法は、「脱免疫化」とも呼ばれ、米国特許出願公開第２００３０１５３０４３号にさらに詳細に記載されている。
【００８７】
フレームワーク若しくはＣＤＲ領域内で行われる修飾に加えて又はその代わりに、本発明の抗体は、典型的には血清中半減期、補体固定、Ｆｃ受容体結合及び／又は抗体依存性細胞毒性等の抗体の１つ以上の機能的特性を変化させることを目的として、Ｆｃ領域内の修飾を含むように改変することができる。さらに、本発明の抗体は、化学的に修飾するか（例えば、１つ以上の化学的部分を抗体に結合させてもよい）、又はそのグリコシル化を変化させるよう修飾して、再び抗体の１つ以上の機能的特性を変化させてもよい。
【００８８】
一実施形態において、ＣＨ１のヒンジ領域は、ヒンジ領域におけるシステイン残基の数が変化するように、例えば増加又は減少するように修飾される。この手法は、さらに米国特許第５，６７７，４２５号に記載されている。ＣＨ１のヒンジ領域におけるシステイン残基の数は、例えば、軽鎖及び重鎖を会合しやすくするために、又は抗体の安定性を増加若しくは低下させるために変更される。
【００８９】
別の実施形態では、抗体のＦｃヒンジ領域を変異させて、抗体の生物学的半減期を減少させる。より具体的には、抗体がネイティブなＦｃヒンジドメインブドウ球菌タンパク質Ａ（ＳｐＡ）結合に対して損なわれたＳｐＡ結合を示すように、１つ以上のアミノ酸変異をＦｃヒンジ断片のＣＨ２−ＣＨ３ドメイン界面領域に導入する。この手法は、米国特許第６，１６５，７４５号にさらに詳細に記載されている。
【００９０】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、該抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化させることができる。そのような糖鎖修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を変化させることによって達成できる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除去し、それによりその部位でのグリコシル化を除去することとなる１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号を参照されたい。
【００９１】
加えて又は代わりに、フコシル残基量が減少した低フコシル化抗体、又はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加した抗体等、グリコシル化タイプが変化した抗体を作製することができる。このように変化したグリコシル化パターンによって、抗体のＡＤＣＣ能が増加することが明らかとなっている。このような糖鎖修飾は、例えば、グリコシル化機構を変化させた宿主細胞において抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構を変化させた細胞は当該技術分野で開示されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによりグリコシル化が変化した抗体を産生させる宿主細胞として使用できる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子ＦＵＴ８（α（１，６）−フコシルトランスフェラーゼ）を欠失しているため、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９細胞株で発現された抗体はそれらの糖鎖においてフコースを欠失している。２つの置換ベクターを用いたＣＨＯ／ＤＧ４４細胞におけるＦＵＴ８遺伝子の標的破壊によって、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９ＦＵＴ８−／−細胞株が作製された（米国特許出願公開第２００４０１１０７０４号、及びＹａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，（２００４）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ｂｉｏｅｎｇ  ８７：６１４−２２を参照されたい）。別の例として、欧州特許出願公開第１，１７６，１９５号には、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株が記載されており、そのような細胞株で発現される抗体は、α−１，６結合関連酵素を低減又は除去することで低フコシル化を示す。また、欧州特許出願公開第１，１７６，１９５号には、抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを付加するための酵素活性が低いか又は該酵素活性がない細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１６６２）が記載されている。国際公開第０３／０３５８３５号には、Ａｓｎ（２９７）結合糖鎖にフコースを結合する能力が低下した変異ＣＨＯ細胞株であるＬｅｃ１３細胞が記載されており、同様に、該宿主細胞で発現される抗体の低フコシル化が起こる（Ｓｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，（２００２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２６７３３−２６７４０も参照されたい）。修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、国際公開第０６／０８９２３１号に記載されているように、鶏卵でも産生させることができる。あるいは、修飾されたグリコシル化プロファイルを有する抗体は、Ｌｅｍｎａ等の植物細胞で産生させることができる。国際公開第９９／５４３４２号には、糖タンパク質修飾グリコシルトランスフェラーゼ（例えば、β（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩ））を発現するように改変された細胞株が記載されており、改変細胞株で発現された抗体はバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造が増加し、その結果、抗体のＡＤＣＣ活性が増加する（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９９）Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．１７：１７６−１８０も参照されたい）。あるいは、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を用いて切断することができ、例えば、フコシダーゼであるα−Ｌ−フコシダーゼは抗体からフコシル残基を除去する（Ｔａｒｅｎｔｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍ．１４：５５１６−２３）。
【００９２】
本開示によって企図される本明細書中の抗体の別の修飾としてはペグ化が挙げられる。抗体は、例えば、抗体の生物学的（例えば血清中）半減期を増加させるためにペグ化されてもよい。抗体をペグ化するためには、抗体又はその断片を、典型的には、１つ以上のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）基が抗体又は抗体断片に結合するような条件下でＰＥＧの反応性エステル又はアルデヒド誘導体等のＰＥＧと反応させる。ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して行われることが好ましい。本明細書で使用される「ポリエチレングリコール」には、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−又はアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミド等、他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧ形態がいずれも包含されることを意図している。ある実施形態において、ペグ化される抗体は非グリコシル化抗体である。タンパク質をペグ化する方法は当該技術分野で公知であり、本発明の抗体に適用することができる。例えば、欧州特許出願公開第０１５４３１６号及び第０４０１３８４号を参照されたい。
【００９３】
＜抗体の物理的特性＞
【００９４】
本発明の抗体は、それらの各種クラスを検出及び／又は区別するために、それらの様々な物理的特性によって特徴付けることができる。
【００９５】
例えば、抗体は、軽鎖又は重鎖可変領域のいずれかに１つ以上のグリコシル化部位を含んでいてもよい。そのようなグリコシル化部位によって、抗体の免疫原性が増加したり、抗原結合が変化することで抗体のｐＫが変化したりし得る（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ｅｔ  ａｌ（１９７２）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ４１：６７３−７０２；Ｇａｌａ  ａｎｄ  Ｍｏｒｒｉｓｏｎ（２００４）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７２：５４８９−９４；Ｗａｌｌｉｃｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８８）Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １６８：１０９９−１０９；Ｓｐｉｒｏ（２００２）Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌｏｇｙ  １２：４３Ｒ−５６Ｒ；Ｐａｒｅｋｈ  ｅｔ  ａｌ（１９８５）Ｎａｔｕｒｅ  ３１６：４５２−７；Ｍｉｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，（２０００）Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３７：６９７−７０６）。グリコシル化は、Ｎ−Ｘ−Ｓ／Ｔ配列を含むモチーフで起こることが知られている。場合によっては、可変領域グリコシル化を含まない抗ＰＤ−１抗体とすることが好ましい。これは、可変領域にグリコシル化モチーフを含まない抗体を選択すること、又はグリコシル化領域内の残基を変異させることのいずれかによって達成できる。
【００９６】
好ましい実施形態において、上記抗体はアスパラギン異性部位を含まない。アスパラギンの脱アミドはＮ−Ｇ又はＤ−Ｇ配列で起こり、その結果、ポリペプチド鎖にねじれを導入し、その安定性を低下させるイソアスパラギン酸残基が生じる（イソアスパラギン酸効果）。
【００９７】
各抗体は固有の等電点（ｐＩ）を有し、通常、ｐＨ範囲６〜９．５である。ＩｇＧ１抗体のｐＩは典型的にはｐＨ範囲７〜９．５であり、ＩｇＧ４抗体のｐＩは典型的にはｐＨ範囲６〜８である。正常範囲外のｐＩを有する抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏ条件下でいくらかアンフォールディング及び不安定性を示し得るという推測がある。したがって、正常範囲のｐＩ値を有する抗ＰＤ−１抗体とすることが好ましい。これは、正常範囲のｐＩを有する抗体を選択すること、又は荷電表面残基を変異させることのいずれかによって達成できる。
【００９８】
＜本発明の抗体をコードする核酸分子＞
【００９９】
別の態様において、本発明は、本発明の抗体の重鎖及び／又は軽鎖可変領域又はＣＤＲをコードする核酸分子を提供する。上記核酸は、全細胞中、細胞溶解物中、又は部分的に精製された若しくは実質的に純粋な形態で存在してもよい。核酸は、他の細胞成分又は他の混入物、例えば他の細胞核酸又はタンパク質から標準的な技術により精製されると、「単離される」又は「実質的に純粋化される」。本発明の核酸は、例えばＤＮＡ又はＲＮＡであってもよく、イントロン配列を含んでも含まなくてもよい。好ましい実施形態において、上記核酸はｃＤＮＡ分子である。
【０１００】
本発明の核酸は、標準的な分子生物学技術を用いて得ることができる。ハイブリドーマ（例えば、以下でさらに記載されるヒト免疫グロブリン遺伝子を有するトランスジェニックマウスから作製されたハイブリドーマ）により発現される抗体の場合、ハイブリドーマにより作製される抗体の軽鎖及び重鎖をコードするｃＤＮＡは、標準的なＰＣＲ増幅又はｃＤＮＡクローニング技術によって得ることができる。免疫グロブリン遺伝子ライブラリー（例えば、ファージディスプレイ法の使用）から得られる抗体の場合、該抗体をコードする核酸は、遺伝子ライブラリーから回収することができる。
【０１０１】
本発明の好ましい核酸分子には、ＰＤ−１モノクローナル抗体のＶＨ及びＶＬ配列又はＣＤＲをコードするものが含まれる。ＶＨ及びＶＬセグメントをコードするＤＮＡ断片が得られれば、該ＤＮＡ断片を標準的な組換えＤＮＡ技術によってさらに操作して、例えば、可変領域遺伝子を全長抗体鎖遺伝子、Ｆａｂ断片遺伝子又はｓｃＦｖ遺伝子に変換することができる。これらの操作において、ＶＬ又はＶＨをコードするＤＮＡ断片は、抗体定常領域又は可動性リンカー等の別のタンパク質をコードする別のＤＮＡ断片に作動可能に連結される。この文脈で使用される「作動可能に連結される」とは、２つのＤＮＡ断片によりコードされるアミノ酸配列がインフレームのままであるように２つのＤＮＡ断片が連結されることを意味することを意図している。
【０１０２】
ＶＨ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖定常領域（ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、全長重鎖遺伝子に変換することができる。ヒト重鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり、該領域を含むＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。上記重鎖定常領域は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＭ又はＩｇＤ定常領域であってもよいが、ＩｇＧ１又はＩｇＧ４定常領域であることが最も好ましい。Ｆａｂ断片重鎖遺伝子については、ＶＨをコードするＤＮＡを重鎖ＣＨ１定常領域のみをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することができる。
【０１０３】
ＶＬ領域をコードする単離ＤＮＡは、ＶＬをコードするＤＮＡを軽鎖定常領域ＣＬをコードする別のＤＮＡ分子に作動可能に連結することによって、全長軽鎖遺伝子（及びＦａｂ軽鎖遺伝子）に変換することができる。ヒト軽鎖定常領域遺伝子の配列は当該技術分野で公知であり、該領域を含むＤＮＡ断片は標準的なＰＣＲ増幅によって得ることができる。好ましい実施形態において、上記軽鎖定常領域はκ又はλ定常領域であってもよい。
【０１０４】
ｓｃＦｖ遺伝子を作製するために、ＶＨ及びＶＬをコードするＤＮＡ断片が、可動性リンカーをコードする別の断片、例えばアミノ酸配列（Ｇｌｙ４−Ｓｅｒ）３をコードする断片に作動可能に連結され、その結果、ＶＨ及びＶＬ配列は、ＶＬ及びＶＨ領域が可動性リンカーにより連結されている連続した一本鎖タンパク質として発現される（例えば、Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６；Ｈｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５４を参照されたい）。
【０１０５】
＜本発明のモノクローナル抗体の作製＞
【０１０６】
本発明のモノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、Ｋｏｈｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ（１９７５）Ｎａｔｕｒｅ  ２５６：４９５の周知の体細胞ハイブリダイゼーション（ハイブリドーマ）技術を用いて作製することができる。モノクローナル抗体を作製するための他の実施形態として、Ｂリンパ球のウイルス性又は発がん性形質転換及びファージディスプレイ法が挙げられる。キメラ又はヒト化抗体もまた当該技術分野で周知である。例えば、米国特許第４，８１６，５６７号；第５，２２５，５３９号；第５，５３０，１０１号；第５，５８５，０８９号；第５，６９３，７６２号及び第６，１８０，３７０号（それらの内容は、それらの全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）を参照されたい。
【０１０７】
＜本発明のモノクローナル抗体を産生するトランスフェクトーマの作製＞
【０１０８】
本発明の抗体はまた、当該技術分野で周知であるように組換えＤＮＡ技術と遺伝子トランスフェクション法との組み合わせを用いるなどして、宿主細胞トランスフェクトーマで産生させることができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｓ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２）。一実施形態において、標準的な分子生物学技術により得られた部分的又は全長軽鎖及び重鎖をコードするＤＮＡは、該遺伝子が転写及び翻訳調節配列に作動可能に連結されるように１つ以上の発現ベクターに挿入される。この文脈において、「作動可能に連結される」とは、ベクター内の転写及び翻訳制御配列が抗体遺伝子の転写及び翻訳を調節するという所期の機能を果たすように抗体遺伝子がベクターに連結されることを意味することを意図している。
【０１０９】
「調節配列」には、抗体遺伝子の転写又は翻訳を制御するプロモーター、エンハンサー及び他の発現制御エレメント（例えばポリアデニル化シグナル）が含まれることを意図している。そのような調節配列は、例えばＧｏｅｄｄｅｌ（Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０））に記載されている。哺乳類宿主細胞発現のための好ましい調節配列には、哺乳類細胞において高レベルのタンパク質発現を指示するウイルスエレメント、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、アデノウイルス（アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ）等）及びポリオーマに由来するプロモーター及び／又はエンハンサーが含まれる。あるいは、ユビキチンプロモーター又はβ−グロビンプロモーター等の非ウイルス調節配列を使用することができる。さらには、由来の異なる配列からなる調節エレメント、例えば、ＳＶ４０初期プロモーター及びヒトＴ細胞白血病ウイルス１型の長末端反復配列の配列を含むＳＲαプロモーター系が挙げられる（Ｔａｋｅｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．８：４６６−４７２）。発現ベクター及び発現制御配列は、使用する発現宿主細胞と適合するように選択される。
【０１１０】
抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子は、同一又は別々の発現ベクターに挿入することができる。好ましい実施形態において、上記可変領域は、ＶＨセグメントがベクター内のＣＨセグメントに作動可能に連結され、且つＶＬセグメントがベクター内のＣＬセグメントに作動可能に連結されるように、所望のアイソタイプの重鎖及び軽鎖定常領域を既にコードしている発現ベクターに挿入することによって任意の抗体アイソタイプの全長抗体遺伝子を作製するために使用される。加えて又は代わりに、組換え発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖の分泌を促進するシグナルペプチドをコードしていてもよい。シグナルペプチドが抗体鎖遺伝子のアミノ末端にインフレームで連結されるように抗体鎖遺伝子をベクターにクローニングすることができる。シグナルペプチドは免疫グロブリンシグナルペプチド又は異種シグナルペプチド（すなわち、非免疫グロブリンタンパク質のシグナルペプチド）であってもよい。
【０１１１】
抗体鎖遺伝子及び調節配列に加えて、本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞（複製起点等）におけるベクターの複製を調節する配列及び選択マーカー遺伝子等の追加の配列を有していてもよい。選択マーカー遺伝子によって、ベクターが導入された宿主細胞を選択しやすくなる（例えば、米国特許第４，３９９，２１６号；第４，６３４，６６５号及び第５，１７９，０１７号を参照されたい）。例えば典型的には、選択マーカー遺伝子は、ベクターが導入された宿主細胞にＧ４１８、ハイグロマイシン又はメトトレキサート等の薬物に対する耐性を付与する。好ましい選択マーカー遺伝子としては、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子（メトトレキサート選択／増幅を用いてｄｈｆｒ宿主細胞において使用される）及びｎｅｏ遺伝子（Ｇ４１８選択用）が挙げられる。
【０１１２】
軽鎖及び重鎖の発現では、重鎖及び軽鎖をコードする発現ベクターを標準的な技術によって宿主細胞にトランスフェクトする。「トランスフェクション」の種々の形態には、原核生物又は真核生物宿主細胞への外因性ＤＮＡの導入に一般的に使用される多種多様な技術、例えば、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラントランスフェクション等が包含されることを意図している。本発明の抗体を原核生物又は真核生物宿主細胞のいずれかで発現させることは理論的には可能であるが、真核生物細胞、最も好ましくは哺乳類宿主細胞での抗体の発現が最も好ましい。なぜなら、該真核生物細胞、特に哺乳類細胞は、原核生物細胞よりも、適切に折り畳まれた免疫学的に活性な抗体を構築し分泌する可能性が高いからである。
【０１１３】
本発明の組換え抗体を発現させるための好ましい哺乳類宿主細胞としては、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ細胞）（Ｒ．Ｊ．Ｋａｕｆｍａｎ  ａｎｄ  Ｐ．Ａ．Ｓｈａｒｐ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５９：６０１−６２１等に記載されているように、ＤＨＦＲ選択マーカーと共に使用されるｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞（Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，（１９８０）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６−４２２０に記載）等）、ＮＳＯ骨髄腫細胞、ＣＯＳ細胞及びＳＰ２細胞が挙げられる。特にＮＳＯ骨髄腫細胞で使用する場合、別の好ましい発現系は、国際公開第８７／０４４６２号、国際公開第８９／０１０３６号及び欧州特許出願公開第３３８，８４１号に開示されているＧＳ遺伝子発現系である。抗体遺伝子をコードする組換え発現ベクターが哺乳類宿主細胞に導入される場合、宿主細胞で抗体を発現させるのに十分な期間、又はより好ましくは宿主細胞が増殖される培地中へ抗体を分泌させるのに十分な期間、宿主細胞を培養することによって抗体が産生される。抗体は、標準的なタンパク質精製法を用いて培地から回収することができる。
【０１１４】
＜免疫複合体＞
【０１１５】
本発明の抗体は、治療剤に結合させることで、抗体薬物複合体（ＡＤＣ）等の免疫複合体を形成することができる。適切な治療剤としては、細胞毒、アルキル化剤、ＤＮＡマイナーグルーブバインダー、ＤＮＡインターカレーター、ＤＮＡ架橋剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、核外移行阻害剤、プロテアソーム阻害剤、トポイソメラーゼＩ又はＩＩ阻害剤、熱ショックタンパク質阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤、抗生物質及び有糸分裂阻害剤が挙げられる。ＡＤＣにおいて、抗体及び治療剤は、ペプチジル、ジスルフィド又はヒドラゾンリンカー等の切断可能なリンカーを介して結合されることが好ましい。上記リンカーは、Ｖａｌ−Ｃｉｔ、Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｖａｌ、Ｌｙｓ−Ｌｙｓ、Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｖａｌ、Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｖａｌ、Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓ、Ａｌａ−Ａｌａ−Ａｓｎ、Ｃｉｔ−Ｃｉｔ、Ｖａｌ−Ｌｙｓ、Ｌｙｓ、Ｃｉｔ、Ｓｅｒ又はＧｌｕ等のペプチジルリンカーであることがより好ましい。ＡＤＣは、米国特許第７，０８７，６００号；第６，９８９，４５２号；及び第７，１２９，２６１号；国際公開第０２／０９６９１０号；第０７／０３８，６５８号；第０７／０５１，０８１号；第０７／０５９，４０４号；第０８／０８３，３１２号；及び第０８／１０３，６９３号；米国特許出願公開第２００６００２４３１７号；第２００６０００４０８１号；及び第２００６０２４７２９５号（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように作製することができる。
【０１１６】
＜二重特異性分子＞
【０１１７】
別の態様において、本開示は、少なくとも２つの異なる結合部位又は標的分子に結合する二重特異性分子を作製するために少なくとも１つの他の機能性分子、例えば別のペプチド又はタンパク質（受容体に対する別の抗体又はリガンド等）に連結された本発明の１つ以上の抗体を含む二重特異性分子を特徴とする。したがって、本明細書で使用される「二重特異性分子」には、３つ以上の特異性を有する分子が含まれる。
【０１１８】
一実施形態において、二重特異性分子は、Ｆｃ結合特異性及び抗ＰＤ−１結合特異性に加えて、第三の特異性を有する。第三の特異性は、細胞傷害活性に関与する表面タンパク質に結合し、それにより標的細胞に対する免疫応答を増加させる分子等の抗増強因子（ＥＦ）に対するものであってもよい。例えば、抗増強因子は、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＰＤ−１又はＩＣＡＭ−１を介して）等の免疫細胞に結合することができ、その結果、標的細胞に対する免疫応答が増加する。
【０１１９】
二重特異性分子には、多くの異なるフォーマット及びサイズがある。サイズ範囲の一端において、二重特異性分子は、同一の特異性の２つの結合アームを有する代わりに、各々が異なる特異性を有する２つの結合アームを有することを除けば、伝統的な抗体フォーマットを保持する。その対極にあるのは、ペプチド鎖により連結された２つの一本鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）からなる二重特異性分子、いわゆるＢｓ（ｓｃＦｖ）２コンストラクトである。中程度の大きさの二重特異性分子には、ペプチジルリンカーにより連結された２つの異なるＦ（ａｂ）断片が含まれる。これら及び他のフォーマットの二重特異性分子は、遺伝子工学、体細胞ハイブリダイゼーション又は化学的方法によって作製することができる。例えば、Ｋｕｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，前掲書；Ｃａｏ  ａｎｄ  Ｓｕｒｅｓｈ，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，９（６），６３５−６４４（１９９８）；及びｖａｎ  Ｓｐｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ，２１（８），３９１−３９７（２０００）；及びそれらで引用された参考文献を参照されたい。
【０１２０】
＜抗体をコードする又は抗体を有する腫瘍溶解性ウイルス＞
【０１２１】
腫瘍溶解性ウイルスは、がん細胞に優先的に感染し死滅させる。本発明の抗体は、腫瘍溶解性ウイルスと共に使用することができる。あるいは、本発明の抗体をコードする腫瘍溶解性ウイルスを人体に導入することができる。
【０１２２】
＜医薬組成物＞
【０１２３】
別の態様において、本開示は、薬学的に許容される担体と共に処方される本発明の１つ以上の抗体を含む医薬組成物を提供する。該組成物は、場合によっては、別の抗体又は薬物（例えば抗腫瘍薬）等の１つ以上の追加の薬学的活性成分を含んでいてもよい。
【０１２４】
上記医薬組成物は任意の数の賦形剤を含んでいてもよい。使用できる賦形剤としては、担体、界面活性剤、増粘又は乳化剤、固体結合剤、分散又は懸濁助剤、可溶化剤、着色剤、フレーバー剤、コーティング剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、保存剤、等張剤、及びそれらの組み合わせが挙げられる。適切な賦形剤の選択及び使用は、Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，２０ｔｈ  Ｅｄ．（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ  ２００３）（その開示は参照により本明細書に組み込まれる）に教示されている。
【０１２５】
上記医薬組成物は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄又は表皮投与（例えば注射又は注入によるもの）に適していることが好ましい。投与経路に応じて、活性成分は、不活性化する恐れのある酸等の自然条件の作用から保護するために材料でコーティングすることができる。本明細書で使用される「非経口投与」とは、通常は注射による、経腸及び局所投与以外の投与方法を意味し、静脈内、筋肉内、動脈内、髄腔内、関節包内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、関節包下、くも膜下、脊髄内、硬膜外及び胸骨内注射及び注入が含まれるが、これらに限定されない。あるいは、本発明の抗体は、非経口でない経路、例えば局所、表皮又は粘膜投与経路（鼻腔内、経口、膣内、直腸、舌下又は局所投与等）を介して投与することができる。
【０１２６】
医薬組成物は、無菌水溶液又は分散液の形態であってもよい。また、マイクロエマルジョン、リポソーム等の高薬物濃度に適した秩序構造として処方することができる。
【０１２７】
単一の剤形を得るために担体材料と組み合わせられる活性成分の量は、治療される対象及び個々の投与方法に応じて異なり、通常、治療効果を発揮する組成物の量となる。通常、上記量は、１００％のうち、約０．０１％〜約９９％、好ましくは約０．１％〜約７０％、最も好ましくは約１％〜約３０％の範囲の活性成分が薬学的に許容される担体と組み合わせられる。
【０１２８】
最適な望ましい応答（例えば治療反応）が得られるように投与計画を調整する。例えば、単回ボーラスを投与することができ、数回に分けた用量を経時的に投与することができ、あるいは用量を治療状況の緊急性に示されるように比例的に減少又は増加させることができる。投与しやすさ及び投与量の均一性の観点で非経口組成物を投与単位形態で処方することが特に有利である。本明細書で使用される投与単位形態とは、治療される対象への単位用量として適した物理的に別個の単位を意味し、各単位は、必要とされる薬学的担体と共に所望の治療効果を発揮するよう算出された所定量の活性成分を含む。あるいは、抗体は徐放性製剤として投与することができ、その場合、より少ない頻度の投与でよい。
【０１２９】
抗体の投与について、投与量は、宿主体重に対して約０．０００１〜１００ｍｇ／ｋｇ、より一般的には０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲であってもよい。例えば、投与量は０．３ｍｇ／ｋｇ体重、１ｍｇ／ｋｇ体重、３ｍｇ／ｋｇ体重、５ｍｇ／ｋｇ体重又は１０ｍｇ／ｋｇ体重であっても、あるいは１〜１０ｍｇ／ｋｇの範囲内であってもよい。例示的な治療計画では、１週間に１回、２週間に１回、３週間に１回、４週間に１回、１ヵ月に１回、３ヵ月に１回、又は３〜６ヵ月に１回の投与を必要とする。本発明の抗ＰＤ−１抗体の好ましい投与計画として、静脈内投与による１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重とし、上記抗体を以下の投与スケジュールのうちの１つを用いて投与するものが挙げられる。（ｉ）４週間ごとに６回投与、次いで３ヵ月ごと；（ｉｉ）３週間ごと；（ｉｉｉ）３ｍｇ／ｋｇ体重を１回、その後３週間ごとに１ｍｇ／ｋｇ体重。いくつかの方法では、投与量は、約１〜１０００μｇ／ｍｌ、いくつかの方法では約２５〜３００μｇ／ｍｌの血漿中抗体濃度を達成するように調整される。
【０１３０】
本発明の抗ＰＤ−１抗体の「治療有効量」は、疾患症状の重症度の減少、疾患症状のない期間の頻度及び期間の増加、又は疾患苦痛による機能障害若しくは身体障害の防止をもたらすことが好ましい。例えば、腫瘍を有する対象の治療の場合、「治療有効量」は、好ましくは、腫瘍増殖を未治療対象と比較して少なくとも約２０％、より好ましくは少なくとも約４０％、さらにより好ましくは少なくとも約６０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％阻害する。治療有効量の治療用抗体は、典型的にはヒトであるか又は別の哺乳類であってもよい対象において腫瘍サイズを減少させるか、あるいは症状を改善することができる。
【０１３１】
上記医薬組成物は、インプラント、経皮パッチ及びマイクロカプセル化送達システム等の放出制御製剤であってもよい。エチレン酢酸ビニル、ポリ酸無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル及びポリ乳酸等の生分解性生体適合性ポリマーを使用することができる。例えば、Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ａｎｄ  Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９７８を参照されたい。
【０１３２】
治療用組成物は、（１）針なし皮下注射装置（例えば、米国特許第５，３９９，１６３号；第５，３８３，８５１号；第５，３１２，３３５号；第５，０６４，４１３号；第４，９４１，８８０号；第４，７９０，８２４号；及び第４，５９６，５５６号）、（２）マイクロインフュージョンポンプ（米国特許第４，４８７，６０３号）、（３）経皮吸収装置（米国特許第４，４８６，１９４号）、（４）輸液装置（米国特許第４，４４７，２３３号及び第４，４４７，２２４号）、及び（５）浸透圧装置（米国特許第４，４３９，１９６号及び第４，４７５，１９６号）（これらの開示は参照により本明細書に組み込まれる）等の医療装置を介して投与することができる。
【０１３３】
特定の実施形態において、本発明のモノクローナル抗体は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの適切な分布を確保できるように処方することができる。例えば、本発明の治療用抗体が血液脳関門を通過できるように、リポソームとして処方することができ、該リポソームは、特定の細胞又は器官への選択的輸送を増強する標的化部分をさらに含んでいてもよい。例えば、米国特許第４，５２２，８１１号；第５，３７４，５４８号；第５，４１６，０１６号；及び第５，３９９，３３１号；Ｖ．Ｖ．Ｒａｎａｄｅ（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．２９：６８５；Ｕｍｅｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．１５３：１０３８；Ｂｌｏｅｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３５７：１４０；Ｍ．Ｏｗａｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．３９：１８０；Ｂｒｉｓｃｏｅ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．１２３３：１３４；Ｓｃｈｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９：９０９０；Ｋｅｉｎａｎｅｎ  ａｎｄ  Ｌａｕｋｋａｎｅｎ（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４６：１２３；及びＫｉｌｌｉｏｎ  ａｎｄ  Ｆｉｄｌｅｒ（１９９４）Ｉｍｍｕｎｏｍｅｔｈｏｄｓ  ４：２７３を参照されたい。
【０１３４】
＜本発明の使用及び方法＞
【０１３５】
本発明の抗体（組成物、二重特異性抗体及び免疫複合体）は、ＰＤ−１の遮断による免疫応答の増強等を含む多くのｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ有用性を有する。該抗体は、培養中の細胞にｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｅｘ  ｖｉｖｏで、あるいはヒト対象に例えばｉｎ  ｖｉｖｏで投与することで、様々な状況において免疫を増強することができる。したがって、一態様において、本発明は、対象における免疫応答を改変する方法であって、対象に本発明の抗体又はその抗原結合部分を投与することで、上記対象における免疫応答を改変することを含む方法を提供する。上記応答は増強、刺激又はアップレギュレートされることが好ましい。
【０１３６】
好ましい対象としては、免疫応答の増強を必要とするヒト患者が挙げられる。本方法は、免疫応答（例えばＴ細胞媒介免疫応答）を増強させることで治療できる障害を有するヒト患者を治療するのに特に好適である。特定の実施形態において、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのがんの治療に特に好適である。免疫の抗原特異的増強を達成するために、上記抗ＰＤ−１抗体を目的の抗原と共に投与してもよいし、あるいは治療される対象に上記抗原が既に存在していてもよい（例えば、腫瘍を有する又はウイルスを有する対象）。ＰＤ−１に対する抗体が別の薬剤と共に投与される場合、両者を順番に又は同時に投与してもよい。
【０１３７】
ＰＤ−１のＰＤ−Ｌ１及び／又はＰＤ−Ｌ２分子への結合を阻害し、且つ抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する本発明の抗ＰＤ−１抗体の能力を考慮して、本発明はまた、上記抗体を使用して抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激、増強又はアップレギュレートするｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏ方法を提供する。例えば、本発明は、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する方法であって、上記Ｔ細胞を本発明の抗体と接触させることで、抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激することを含む方法を提供する。抗原特異的Ｔ細胞応答のいずれかの好適な指標を用いて、抗原特異的Ｔ細胞応答を測定することができる。
【０１３８】
そのような好適な指標の例として、抗体の存在下でのＴ細胞増殖の増加及び／又は抗体の存在下でのサイトカイン産生の増加が挙げられるが、これらに限定されない。好ましい実施形態において、抗原特異的Ｔ細胞によるインターロイキン−２産生が刺激される。
【０１３９】
本発明はまた、対象における免疫応答（例えば抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激する方法であって、対象に本発明の抗体を投与することで、上記対象における免疫応答（例えば抗原特異的Ｔ細胞応答）を刺激することを含む方法を提供する。好ましい実施形態において、上記対象は腫瘍を有する対象であり、該腫瘍に対する免疫応答が刺激される。別の好ましい実施形態において、上記対象はウイルスを有する対象であり、該ウイルスに対する免疫応答が刺激される。
【０１４０】
別の実施形態では、本発明は、対象における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、対象に本発明の抗体を投与することで、上記対象における腫瘍の増殖を阻害することを含む方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、対象におけるウイルス感染を治療する方法であって、対象に本発明の抗体を投与することで、上記対象におけるウイルス感染を治療することを含む方法を提供する。
【０１４１】
本発明のこれら及び他の方法は、以下でさらに詳細に議論される。
【０１４２】
＜がん＞
【０１４３】
抗体によるＰＤ−１の遮断によって、患者においてがん細胞に対する免疫応答を増強することができる。一態様において、本発明は、がん性腫瘍の増殖を阻害するために抗ＰＤ−１抗体を使用するｉｎ  ｖｉｖｏでの対象の治療に関する。抗ＰＤ−１抗体を単独で使用して、がん性腫瘍の増殖を阻害することができる。あるいは、抗ＰＤ−１抗体は、以下に記載されるように、がん治療で使用される他の免疫原性薬剤（例えば腫瘍溶解性ウイルス）又は他の抗体と共に使用してもよい。
【０１４４】
したがって、一実施形態において、本発明は、対象における腫瘍細胞の増殖の阻害方法又はがん疾患の予防及び／又は治療方法であって、対象に治療有効量の抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合部分を投与することを含む方法を提供する。上記抗体は、マウス、キメラ又はヒト化抗ＰＤ−１抗体であることが好ましい。
【０１４５】
本発明の抗体によって増殖を阻害できるがんとして、好ましくは、典型的に免疫療法に応答するがんが挙げられる。治療される好ましいがんの例として、原発性であるか転移性であるかに関わらず、メラノーマ（例えば転移性悪性メラノーマ）、腎がん（例えば明細胞がん）、前立腺がん（例えばホルモン不応性前立腺がん）、乳がん、結腸がん及び肺がん（例えば非小細胞肺がん）が挙げられるが、これらに限定されない。加えて、本発明には、本発明の抗体によって増殖を阻害できる難治性又は再発性悪性腫瘍が含まれる。
【０１４６】
本発明の方法によって治療できる他のがんの例としては、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭頸部がん、皮膚又は眼内悪性メラノーマ、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門部がん、胃がん、精巣がん、卵管がん、子宮内膜がん、子宮頚がん、膣がん、外陰部がん、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道がん、小腸がん、内分泌系がん、甲状腺がん、副甲状腺がん、副腎がん、軟部組織肉腫、尿道がん、陰茎がん、慢性又は急性白血病、例えば急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、小児固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱がん、腎がん又は尿管がん、腎盂がん、中枢神経系（ＣＮＳ）腫瘍、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管新生、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、環境誘発性がん、例えばアスベスト誘発性がん、及びこれらのがんの組み合わせが挙げられる。本発明はまた、転移性がん、特にＰＤ−Ｌ１を発現する転移性がんの治療に有用である（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３−１４４）。
【０１４７】
場合によっては、ＰＤ−１に対する抗体は、がん細胞、精製腫瘍抗原（組換えタンパク質、ペプチド及び糖分子を含む）、及び免疫刺激サイトカインをコードする遺伝子でトランスフェクトされた細胞等の免疫原性薬剤と組み合わせることができる（Ｈｅ  ｅｔ  ａｌ（２００４）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７３：４９１９−２８）。使用できる腫瘍ワクチンの例としては、ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原、Ｔｒｐ−２、ＭＡＲＴ１及び／又はチロシナーゼのペプチド等のメラノーマ抗原のペプチド、あるいはサイトカインＧＭ−ＣＳＦを発現するようトランスフェクトされた腫瘍細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４８】
ＰＤ−１遮断は、ワクチン接種プロトコルと組み合わせると、より効果的となりやすい。腫瘍に対する多くの実験的ワクチン接種戦略が考案されている（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，Ｓ．，２０００，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：６０−６２；Ｌｏｇｏｔｈｅｔｉｓ，Ｃ．，２０００，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：３００−３０２；Ｋｈａｙａｔ，Ｄ．２０００，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：４１４−４２８；Ｆｏｏｎ，Ｋ．２０００，ＡＳＣＯ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ  Ｂｏｏｋ  Ｓｐｒｉｎｇ：７３０−７３８を参照されたい。また、ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），１９９７，Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ中のＲｅｓｔｉｆｏ，Ｎ．ａｎｄ  Ｓｚｎｏｌ，Ｍ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｃｈ．６１，ｐｐ．３０２３−３０４３も参照されたい）。これらの戦略の１つにおいて、ワクチンは、自己又は同種腫瘍細胞を用いて作製される。これらの細胞ワクチンは、ＧＭ−ＣＳＦを発現するよう腫瘍細胞を形質導入した場合、最も効果的であることが示されている。ＧＭ−ＣＳＦは、腫瘍ワクチン接種のための強力な抗原提示活性化因子であることが示されている（Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：３５３９−４３）。
【０１４９】
種々の腫瘍における遺伝子発現及び大量遺伝子発現パターンの研究が、いわゆる腫瘍特異的抗原の定義につながった（Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ，ＳＡ（１９９９）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １０：２８１−７）。多くの場合、これらの腫瘍特異的抗原は、メラニン細胞抗原ｇｐ１００、ＭＡＧＥ抗原及びＴｒｐ−２等、腫瘍及び腫瘍が生じた細胞で発現される分化抗原である。さらに重要なことには、これらの抗原の多くは、宿主で見られる腫瘍特異的Ｔ細胞の標的であると示すことができる。腫瘍で発現される組換えタンパク質及び／又はペプチド群に対する免疫応答を生じさせるために、これらのタンパク質と共にＰＤ−１遮断を用いることができる。これらのタンパク質は、通常は免疫系によって自己抗原とみなされるので、それらに許容される。腫瘍抗原はタンパク質テロメラーゼを含んでもよく、該タンパク質テロメラーゼは、染色体のテロメアの合成に必要であり、８５％を超えるヒトがん及びほんの限られた数の体細胞組織において発現される（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６６：２０１１−２０１３）。これらの体細胞組織は、様々な手段によって免疫攻撃から保護することができる。腫瘍抗原は、タンパク質配列を変化させたり、２つの無関係な配列の融合タンパク質（すなわち、フィラデルフィア染色体のｂｃｒ−ａｂｌ）を生じさせたりする体細胞変異によってがん細胞で発現される「ネオ抗原」、又はＢ細胞腫瘍のイディオタイプであってもよい。
【０１５０】
他の腫瘍ワクチンとして、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、肝炎ウイルス（ＨＢＶ及びＨＣＶ）及びカポジヘルペス肉腫ウイルス（ＫＨＳＶ）等、ヒトがんに関与するウイルス由来のタンパク質を挙げることができる。ＰＤ−１遮断と共に使用できる別の形態の腫瘍特異的抗原として、腫瘍組織自体から単離された精製熱ショックタンパク質（ＨＳＰ）が挙げられる。該熱ショックタンパク質は腫瘍細胞由来のタンパク質断片を含み、該ＨＳＰは、腫瘍免疫を誘導するための抗原提示細胞への送達時に非常に効率的である（Ｓｕｏｔ＆Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ（１９９５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２６９：１５８５−１５８８；Ｔａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８：１１７−１２０）。
【０１５１】
樹状細胞（ＤＣ）は、抗原特異的応答のプライミングに使用できる強力な抗原提示細胞である。ＤＣは、ｅｘ  ｖｉｖｏで産生し、様々なタンパク質及びペプチド抗原並びに腫瘍細胞抽出物を負荷することができる（Ｎｅｓｔｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４：３２８−３３２）。ＤＣは、これらの腫瘍抗原も発現するように遺伝的手段によって形質導入することもできる。また、ＤＣは、免疫化の目的で腫瘍細胞に直接融合された（Ｋｕｇｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３３２−３３６）。ワクチン接種方法として、ＤＣ免疫化は、より強力な抗腫瘍応答を活性化するためにＰＤ−１遮断と効果的に組み合わせることができる。
【０１５２】
ＰＤ−１遮断は標準的ながん治療と組み合わせることもできる。ＰＤ−１遮断は化学療法計画と効果的に組み合わせることができる。これらの例において、投与される化学療法薬の用量を低減することが可能な場合がある（Ｍｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５８：５３０１−５３０４）。このような組み合わせの例として、メラノーマ治療のためのデカルバジンと組み合わせた抗ＰＤ−１抗体が挙げられる。このような組み合わせの別の例として、メラノーマ治療のためのインターロイキン−２（ＩＬ−２）と組み合わせた抗ＰＤ−１抗体が挙げられる。ＰＤ−１遮断と化学療法との併用の背後にある科学的根拠は、ほとんどの化学療法化合物の細胞毒性作用の結果である細胞死によって、抗原提示経路における腫瘍抗原レベルの増加が生じるはずだというものである。細胞死を介してＰＤ−１遮断との相乗効果を生じ得る他の併用療法として、放射線照射、手術及びホルモン遮断が挙げられる。これらのプロトコルではそれぞれ、宿主において腫瘍抗原の供給源を作製する。血管新生抑制剤をＰＤ−１遮断と組み合わせることもできる。血管新生の阻害によって、腫瘍抗原を宿主抗原提示経路に供給できる腫瘍細胞死が起こる。
【０１５３】
ＰＤ−１遮断抗体は、Ｆｃα又はＦｃγ受容体発現エフェクター細胞を腫瘍細胞に標的化する二重特異性抗体と併用することもできる（例えば、米国特許第５，９２２，８４５号及び第５，８３７，２４３号を参照されたい）。二重特異性抗体を使用して２つの別個の抗原を標的とすることができる。例えば、抗Ｆｃ受容体／抗腫瘍抗原（例えばＨｅｒ−２／ｎｅｕ）二重特異性抗体が、マクロファージを腫瘍部位に標的化するために使用されている。この標的化によって、腫瘍特異的応答をより効果的に活性化することができる。これらの応答のＴ細胞アームは、ＰＤ−１遮断を用いることで増強されるであろう。あるいは、腫瘍抗原及び樹状細胞特異的細胞表面マーカーに結合する二重特異性抗体を使用して、抗原をＤＣに直接送達することもできる。
【０１５４】
腫瘍は、多様なメカニズムによって宿主の免疫監視機構を回避する。これらのメカニズムの多くは、腫瘍により発現される免疫抑制的なタンパク質の不活性化によって克服することができる。これらとしては、特に、ＴＧＦ−β（Ｋｅｈｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７−１０５０）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ＆Ｏ’Ｇａｒｒａ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：１９８−２００）及びＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１３６３−１３６５）が挙げられる。これらのものそれぞれに対する抗体を抗ＰＤ−１と併用して、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による腫瘍免疫応答を促すことができる。
【０１５５】
宿主免疫応答性を活性化する他の抗体を抗ＰＤ−１と併用することができる。これらとしては、ＤＣ機能及び抗原提示を活性化する樹状細胞表面の分子が挙げられる。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に代替でき（Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８）、ＰＤ−１抗体と共に使用することができる（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１（５）５２７−４０）。ＣＴＬＡ−４（例えば米国特許第５，８１１，０９７号）、ＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：２１６０−２１６９）、４−１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：６８２−６８５（１９９７））及びＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６２−２６６）等のＴ細胞共刺激分子に対する抗体を活性化することによっても、Ｔ細胞活性化レベルを増加させることができる。
【０１５６】
また、腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞を刺激するために、抗原特異的Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ活性化及び増殖、並びに該細胞のレシピエントへの養子移入を含むいくつかの実験的治療プロトコルがある（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ＆Ｒｉｄｄｅｌｌ（１９９９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８５：５４６−５１）。これらの方法を用いて、ＣＭＶ等の感染病原体に対するＴ細胞応答を活性化することができる。抗ＰＤ−１抗体の存在下でのｅｘ  ｖｉｖｏ活性化によって、養子移入されたＴ細胞の頻度及び活性を増加させることができる。
【０１５７】
＜感染症＞
【０１５８】
本発明の他の方法は、特定の毒素又は病原体に曝露された患者を治療するために用いられる。したがって、本発明の別の態様は、対象における感染症を治療する方法であって、対象に抗ＰＤ−１抗体又はその抗原結合部分を投与することで、上記対象の感染症を治療することを含む方法を提供する。上記抗体はキメラ又はヒト化抗体であることが好ましい。
【０１５９】
上述したような腫瘍への適用と同様に、抗体媒介ＰＤ−１遮断を単独で、又はワクチンと組み合わせたアジュバントとして用いて、病原体、毒素及び自己抗原に対する免疫応答を刺激することができる。この治療手法が特に有用であり得る病原体の例としては、現在有効なワクチンが存在しない病原体、又は従来のワクチンが完全に有効ではない病原体が挙げられる。これらとしては、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ＆Ｃ）、インフルエンザ、ヘルペス、ジアルジア、マラリア、リーシュマニア、黄色ブドウ球菌、緑膿菌が挙げられるが、これらに限定されない。ＰＤ−１遮断は、感染の過程で抗原が変化するＨＩＶ等の病原体による確立された感染に対して特に有用である。これらの新規エピトープは、抗ヒトＰＤ−１投与時に異物と認識されるため、ＰＤ−１を介する負のシグナルにより弱められることのない強いＴ細胞応答を誘発する。
【０１６０】
本発明の方法で治療可能な感染症を引き起こす病原性ウイルスのいくつかの例として、ＨＩＶ、肝炎（Ａ、Ｂ又はＣ）、ヘルペスウイルス（例えば、ＶＺＶ、ＨＳＶ−１、ＨＡＶ−６、ＨＳＶ−ＩＩ、及びＣＭＶ、エプスタインバールウイルス）、アデノウイルス、インフルエンザウイルス、フラビウイルス、エコーウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルス、コロナウイルス、ＲＳウイルス、ムンプスウイルス、ロタウイルス、麻疹ウイルス、風疹ウイルス、パルボウイルス、ワクシニアウイルス、ＨＴＬＶウイルス、デングウイルス、パピローマウイルス、軟属腫ウイルス、ポリオウイルス、狂犬病ウイルス、ＪＣウイルス及びアルボウイルス脳炎ウイルスが挙げられる。
【０１６１】
本発明の方法で治療可能な感染症を引き起こす病原性細菌のいくつかの例として、クラミジア、リケッチア細菌、マイコバクテリア、ブドウ球菌、レンサ球菌、肺炎球菌、髄膜炎菌及び淋菌、クレブシエラ、プロテウス、セラチア、シュードモナス、レジオネラ、ジフテリア、サルモネラ、桿菌、コレラ、破傷風、ボツリヌス中毒、炭疽菌、ペスト、レプトスピラ症及びライム病細菌が挙げられる。
【０１６２】
本発明の方法で治療可能な感染症を引き起こす病原性真菌のいくつかの例として、Ｃａｎｄｉｄａ（ａｌｂｉｃａｎｓ、ｋｒｕｓｅｉ、ｇｌａｂｒａｔａ、ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ等）、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ（ｆｕｍｉｇａｔｕｓ、ｎｉｇｅｒ等）、Ｇｅｎｕｓ  Ｍｕｃｏｒａｌｅｓ（ｍｕｃｏｒ、ａｂｓｉｄｉａ、ｒｈｉｚｏｐｕｓ）、Ｓｐｏｒｏｔｈｒｉｘ  ｓｃｈｅｎｋｉｉ、Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ、Ｐａｒａｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓ、Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ、及びＨｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍが挙げられる。
【０１６３】
本発明の方法で治療可能な感染症を引き起こす病原性寄生虫のいくつかの例として、Ｅｎｔａｍｏｅｂａ  ｈｉｓｔｏｌｙｔｉｃａ、Ｂａｌａｎｔｉｄｉｕｍ  ｃｏｌｉ、Ｎａｅｇｌｅｒｉａ  ｆｏｗｌｅｒｉ、Ａｃａｎｔｈａｍｏｅｂａ  ｓｐ．、Ｇｉａｒｄｉａ  ｌａｍｂｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ  ｓｐ．、Ｐｎｅｕｍｏｃｙｓｔｉｓ  ｃａｒｉｎｉｉ、Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ、Ｂａｂｅｓｉａ  ｍｉｃｒｏｔｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ、Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ、Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｄｏｎｏｖａｎｉ、Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ、Ｎｉｐｐｏｓｔｒｏｎｇｙｌｕｓ  ｂｒａｓｉｌｉｅｎｓｉｓが挙げられる。
【０１６４】
上記方法の全てにおいて、ＰＤ−１遮断は、サイトカイン治療（例えば、インターフェロン、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−２）、又は腫瘍抗原の提示を増強できる二重特異性抗体療法等の他の形態の免疫療法と組み合わせることができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。
【０１６５】
＜自己免疫反応＞
【０１６６】
抗ＰＤ−１抗体は自己免疫応答を誘発し増幅することができる。実際、腫瘍細胞及びペプチドワクチンを用いた抗腫瘍応答の誘導によって、多くの抗腫瘍応答が抗自己反応性と関わっていることが明らかとなった（ｖａｎ  Ｅｌｓａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９４：４８１−４８９；Ｏｖｅｒｗｉｊｋ，ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９６：２９８２−２９８７；Ｈｕｒｗｉｔｚ，（２０００）前掲書；Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ＆Ｗｈｉｔｅ（１９９６）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １９（１）：８１−４）。したがって、疾患治療のために様々な自己タンパク質に対する免疫応答を効率的に生じさせるワクチン接種プロトコルを考案する目的で、これらの自己タンパク質と共に抗ＰＤ−１遮断を用いることが考えられる。
【０１６７】
アレルギー及び喘息の治療用のＩｇＥ、及び関節リウマチ用のＴＮＦα等、他の自己タンパク質を標的として使用することもできる。最後に、抗ＰＤ−１抗体を使用することで、種々のホルモンに対する抗体応答を誘導することができる。生殖ホルモンに対する中和抗体応答を避妊に用いることができる。特定の腫瘍の増殖に必要なホルモン等の可溶性因子に対する中和抗体応答もまた、ワクチン接種標的候補として考えられる。
【０１６８】
抗ＰＤ−１抗体の使用について上述したものと類似した方法を治療的自己免疫応答の誘導に用いて、ＴＮＦα及びＩｇＥのようなサイトカイン等の他の自己抗原の不適切な蓄積を示す患者を治療することができる。
【０１６９】
＜併用療法＞
【０１７０】
別の態様では、本発明は、本発明の抗ＰＤ−１抗体（又はその抗原結合部分）を、免疫応答を刺激するのに有効である１つ以上の追加の抗体と同時投与して、それにより対象における免疫応答をさらに増強、刺激又はアップレギュレートする併用療法の方法を提供する。一実施形態において、本発明は、対象における免疫応答を刺激する方法であって、対象に抗ＰＤ−１抗体と、抗ＬＡＧ−３抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体等の１つ以上の追加の免疫刺激抗体とを投与することで、上記対象における免疫応答を刺激して、例えば、腫瘍増殖を阻害する、又は抗ウイルス応答を刺激することを含む方法を提供する。別の実施形態において、上記対象に抗ＰＤ−１抗体及び抗ＬＡＧ−３抗体を投与する。さらに別の実施形態において、上記対象に抗ＰＤ−１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与する。さらに別の実施形態において、上記対象に抗ＰＤ−１抗体及び抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与する。別の実施形態では、上記少なくとも１つの追加の免疫刺激抗体（例えば、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体）はヒト抗体である。あるいは、上記少なくとも１つの追加の免疫刺激抗体は、例えばキメラ又はヒト化抗体（例えば、マウス抗ＬＡＧ−３、抗ＰＤ−Ｌ１及び／又は抗ＣＴＬＡ−４抗体から作製される）であってもよい。
【０１７１】
別の実施形態では、本発明は、過剰増殖性疾患（例えばがん）を治療する方法であって、対象にＰＤ−１抗体及びＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む方法を提供する。さらなる実施形態において、上記抗ＰＤ−１抗体を治療量以下の用量で投与するか、上記抗ＣＴＬＡ−４抗体を治療量以下の用量で投与するか、又は両方を治療量以下の用量で投与する。別の実施形態において、本発明は、免疫刺激剤による過剰増殖性疾患の治療に関連する有害事象を変化させる方法であって、対象に抗ＰＤ−１抗体及び治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４抗体を投与することを含む方法を提供する。ある実施形態において、上記対象はヒトである。他の実施形態では、上記抗ＣＴＬＡ−４抗体はヒト配列モノクローナル抗体１０Ｄ１（国際公開第０１／１４４２４号に記載されている）であり、上記抗ＰＤ−１抗体は、本明細書に記載の抗ＰＤ−１抗体Ｃ１Ｈ５等のマウス配列モノクローナル抗体である。本発明の方法に包含される他の抗ＣＴＬＡ−４抗体としては、例えば、国際公開第９８／４２７５２号；国際公開第００／３７５０４号；米国特許第６，２０７，１５６号；Ｈｕｒｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５（１７）：１００６７−１００７１；Ｃａｍａｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２２（１４５）：Ａｂｓｔｒａｃｔ  Ｎｏ．２５０５（ａｎｔｉｂｏｄｙ  ＣＰ−６７５２０６）；及びＭｏｋｙｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５８：５３０１−５３０４に開示されるものが挙げられる。特定の実施形態では、上記抗ＣＴＬＡ−４抗体は、５×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４に結合し、１×１０−８Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４に結合し、５×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４に結合し、又は１×１０−８Ｍ〜１×１０−１０Ｍ以下のＫＤでヒトＣＴＬＡ−４に結合する。
【０１７２】
別の実施形態では、本発明は、過剰増殖性疾患（例えばがん）を治療する方法であって、対象に抗ＰＤ−１抗体及び抗ＬＡＧ−３抗体を投与することを含む方法を提供する。
【０１７３】
別の実施形態では、本発明は、過剰増殖性疾患（例えばがん）を治療する方法であって、対象に抗ＰＤ−１抗体及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体を投与することを含む方法を提供する。
【０１７４】
ＰＤ−１と、ＣＴＬＡ−４及び／又はＬＡＧ−３及び／又はＰＤ−Ｌ１等の１つ以上の第二の標的抗原とを抗体により遮断することで、患者においてがん細胞に対する免疫応答を増強することができる。本開示の抗体によって増殖を阻害できるがんとして、典型的に免疫療法に応答するがんが挙げられる。本開示の併用療法で治療されるがんの代表的な例として、抗ＰＤ−１抗体による単剤療法の議論において具体的に上掲したがんが挙げられる。
【０１７５】
特定の実施形態では、本明細書に記載される治療用抗体の組み合わせは、薬学的に許容される担体中の単一組成物として同時に投与することも、薬学的に許容される担体中に各抗体を含む別々の組成物として同時に投与することもできる。別の実施形態では、上記治療用抗体の組み合わせを逐次投与することができる。
【０１７６】
さらに、併用療法の２用量以上を逐次投与する場合、逐次投与の順序は、投与の各時点で逆にしても、同じ順序に保ってもよく、逐次投与を同時投与又はそれらの任意の組み合わせと併用してもよい。
【０１７７】
腫瘍は、多様なメカニズムによって宿主の免疫監視機構を回避する。これらのメカニズムの多くは、腫瘍により発現される免疫抑制的なタンパク質の不活性化によって克服することができる。これらとしては、特に、ＴＧＦ−β（Ｋｅｈｒｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６３：１０３７−１０５０）、ＩＬ−１０（Ｈｏｗａｒｄ＆Ｏ’Ｇａｒｒａ（１９９２）Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｔｏｄａｙ  １３：１９８−２００）及びＦａｓリガンド（Ｈａｈｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７４：１３６３−１３６５）が挙げられる。別の例では、これらのものそれぞれに対する抗体をさらに、抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせと併用して、免疫抑制剤の効果を打ち消し、宿主による抗腫瘍免疫応答を促すことができる。
【０１７８】
宿主免疫応答性を活性化するために使用できる他の抗体を、抗ＰＤ−１抗体と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体との組み合わせとさらに併用することができる。これらとしては、ＤＣ機能及び抗原提示を活性化する樹状細胞表面の分子が挙げられる。抗ＣＤ４０抗体（Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．，前掲書）を、抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１との組み合わせと併用することができる（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，前掲書）。Ｔ細胞共刺激分子（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，前掲書、Ｍｅｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，前掲書、Ｈｕｔｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，前掲書）に対する他の活性化抗体もまた、Ｔ細胞活性化レベルを増加させることができる。
【０１７９】
上述のように、骨髄移植は現在、造血器由来の様々な腫瘍の治療に用いられている。ＰＤ−１とＣＴＬＡ−４及び／又はＬＡＧ−３及び／又はＰＤ−Ｌ１との遮断を組み合わせることによって、ドナー移植腫瘍特異的Ｔ細胞の有効性を高めることができる。
【０１８０】
いくつかの実験的治療プロトコルでは、抗原特異的Ｔ細胞のｅｘ  ｖｉｖｏ活性化及び増殖、並びに腫瘍に対する抗原特異的Ｔ細胞のレシピエントへの該細胞の養子移入が行われる（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ＆Ｒｉｄｄｅｌｌ，前掲書）。これらの方法を用いて、ＣＭＶ等の感染病原体に対するＴ細胞応答を活性化することもできる。抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体との存在下でのｅｘ  ｖｉｖｏ活性化によって、養子移入されたＴ細胞の頻度及び活性の増加が期待できる。
【０１８１】
特定の実施形態において、本発明は、免疫刺激剤による過剰増殖性疾患（例えばがん）の治療に関連する有害事象を変化させる方法であって、対象に抗ＰＤ−１抗体と、治療量以下の用量の抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とを投与することを含む方法を提供する。例えば、本発明の方法は、患者に非吸収性ステロイドを投与することで、免疫刺激治療用抗体誘発性大腸炎又は下痢の発生率を低下させる方法を提供する。免疫刺激治療用抗体を受ける患者はいずれも、該抗体により誘発される大腸炎又は下痢を発症するリスクがあるため、この全患者集団は、本発明の方法による治療に適している。ステロイドは、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）の治療やＩＢＤの増悪の予防のために投与されているが、ＩＢＤと診断されていない患者においてＩＢＤの予防（その発生率の低減）には使用されていない。非吸収性ステロイドであろうが、ステロイドに関連する重大な副作用のため、予防的使用は推奨されていない。
【０１８２】
さらなる実施形態において、ＰＤ−１とＣＴＬＡ−４及び／又はＬＡＧ−３及び／又はＰＤ−Ｌ１との遮断の組み合わせ（すなわち、免疫刺激治療用抗体抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３抗体及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体）は、任意の非吸収性ステロイドの使用とさらに併用することができる。本明細書で使用される「非吸収性ステロイド」とは、肝臓での代謝後、ステロイドのバイオアベイラビリティが低くなる、すなわち約２０％未満となるように高い初回通過代謝を示すグルココルチコイドである。本発明の一実施形態では、上記非吸収性ステロイドはブデソニドである。ブデソニドは、経口投与後、主に肝臓で高代謝される局所作用性グルココルチコステロイドである。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭ（Ａｓｔｒａ−Ｚｅｎｅｃａ）は、回腸及び結腸全体への薬物送達を最適化するために開発されたｐＨ及び時間依存性ブデソニド経口製剤である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭは、米国では回腸及び／又は上行結腸に影響を与える軽度〜中等度のクローン病の治療薬として承認されている。クローン病治療のためのＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭの通常の経口投与量は６〜９ｍｇ／日である。ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭは、腸管内に放出された後、腸粘膜に吸収及び保持される。腸粘膜標的組織を通過すると、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭは肝臓のチトクロムＰ４５０系で高代謝されて、グルココルチコイド活性がほとんど認められない代謝物となる。したがって、バイオアベイラビリティは低い（約１０％）。ブデソニドのバイオアベイラビリティが低いことによって、初回通過代謝がより低い他のグルココルチコイドと比較して治療比が改善される。ブデソニドでは、全身作用性コルチコステロイドよりも副作用が少なくなる（視床下部下垂体抑制の低下等）。しかしながら、ＥＮＴＯＣＯＲＴ  ＥＣＴＭの慢性投与によって、副腎皮質ホルモン過剰症及び副腎抑制等の全身性グルココルチコイド作用が生じ得る。ＰＤＲ  ５８ｔｈ  ｅｄ．２００４；６０８−６１０を参照されたい。
【０１８３】
さらに別の実施形態では、ＰＤ−１とＣＴＬＡ−４及び／又はＬＡＧ−３及び／又はＰＤ−Ｌ１との遮断の組み合わせ（すなわち、免疫刺激治療用抗体抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体）を非吸収性ステロイドと共に、さらにサリチル酸塩と併用することができる。サリチル酸塩としては、例えば、スルファサラジン（ＡＺＵＬＦＩＤＩＮＥＴＭ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆ＵｐＪｏｈｎ）；オルサラジン（ＤＩＰＥＮＴＵＭＴＭ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ＆ＵｐＪｏｈｎ）；バルサラジド（ＣＯＬＡＺＡＬＴＭ、Ｓａｌｉｘ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）；及びメサラミン（ＡＳＡＣＯＬＴＭ、Ｐｒｏｃｔｅｒ＆Ｇａｍｂｌｅ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ；ＰＥＮＴＡＳＡＴＭ、Ｓｈｉｒｅ  ＵＳ；ＣＡＮＡＳＡＴＭ、Ａｘｃａｎ  Ｓｃａｎｄｉｐｈａｒｍ，Ｉｎｃ．；ＲＯＷＡＳＡＴＭ、Ｓｏｌｖａｙ）等の５−ＡＳＡ剤が挙げられる。
【０１８４】
本発明の方法によれば、抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と非吸収性ステロイドと組み合わせて投与されるサリチル酸塩は、免疫刺激抗体により誘発される大腸炎の発生率を低下させる目的で、サリチル酸塩及び非吸収性ステロイドを重複又は逐次投与するものであってもよい。したがって、例えば、本発明に係る免疫刺激抗体により誘発される大腸炎の発生率を低下させる方法は、サリチル酸塩及び非吸収性物質を同時又は逐次投与すること（例えば、サリチル酸塩を非吸収性ステロイドの６時間後に投与する）、又はそれらの任意の組み合わせを包含する。さらに、本発明によれば、サリチル酸塩及び非吸収性ステロイドを同じ経路（例えば、両方とも経口投与する）又は異なる経路（例えば、サリチル酸塩を経口投与し、非吸収性ステロイドを直腸投与する）で投与することができる。該経路は、抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とを投与するために使用される経路とは異なっていてもよい。
【０１８５】
本開示を以下の実施例によりさらに説明するが、これらは本発明をさらに限定するものと解釈すべきではない。本出願を通して引用された全ての図面及び全ての参考文献、Ｇｅｎｂａｎｋ配列、特許及び公開特許出願の内容は、参照により本明細書に明示的に組み込まれる。
【実施例】
【０１８６】
＜実施例１  ハイブリドーマ技術を用いたマウス抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の作製＞
【０１８７】
免疫化
【０１８８】
Ｅ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄ．Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８に記載されている方法に従ってマウスを免疫化した。Ｃ末端にヒトＩｇＧ１  Ｆｃタグを有する組換えヒトＰＤ−１タンパク質（Ａｃｒｏ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＰＤ−１−Ｈ５２５７、細胞外ドメインＡＡ  Ｌｅｕ２５−Ｇｌｎ１６７を含む）を免疫原として使用した。抗血清力価の決定及び抗原特異的抗体を分泌するハイブリドーマのスクリーニングにヒトＰＤ−１−ｈｉｓタンパク質（Ｓｉｎｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１０３７７−Ｈ０８Ｈ）を用いた。
【０１８９】
具体的には、完全フロイトアジュバント（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）中２５μｇのヒトＰＤ１  Ｆｃタンパク質を各動物に注射し、次いで抗血清力価に応じて非完全フロイトアジュバント（Ｓｉｇｍａ、米国ミズーリ州セントルイス）中２５μｇのヒトＰＤ１  Ｆｃタンパク質を注射することで２〜３回追加免疫した。抗血清力価は、組換えヒトＰＤ１−ｈｉｓタンパク質を用いたＥＬＩＳＡベースのスクリーニングによって測定した。簡単に述べれば、希釈血清（６０μｌ）を各ウェルに加え、３７℃で４０分間インキュベートした。次いで、プレートを４回洗浄し、ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１１５−０３６−０７１）を検出に使用し、結合ＯＤを４５０ｎｍで観察した。力価が良好な動物には、腹腔内注射によって最終追加免疫を施してからハイブリドーマ融合した。
【０１９０】
ハイブリドーマ融合及びスクリーニング
【０１９１】
マウス骨髄腫細胞株（ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ−１５８１）の細胞を培養して、融合直前に対数増殖期に到達させた。Ｋｏｈｌｅｒ  Ｇ，ａｎｄ  Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  Ｃ，“Ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｏｆ  ｆｕｓｅｄ  ｃｅｌｌｓ  ｓｅｃｒｅｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｏｆ  ｐｒｅｄｅｆｉｎｅｄ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）に記載されている方法に従って、免疫化マウスの脾臓細胞を無菌調製し、骨髄腫細胞と融合させた。続いて、融合した「雑種細胞」をＤＭＥＭ／２０％ＦＣＳ／ＨＡＴ培地中９６ウェルプレートに分注した。生存しているハイブリドーマコロニーを融合後７〜１０日で顕微鏡下観察した。２週間後、各ウェルの上清を、組換えヒトＰＤ１−ｈｉｓタンパク質を用いたＥＬＩＳＡベースのスクリーニングに供した。簡単に述べれば、ＥＬＩＳＡプレートを６０μｌのヒトＰＤ１−ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１０３７７−Ｈ０８Ｈ、ＰＢＳ中２．０μｇ／ｍｌ）を用いて一晩４℃でコーティングした。プレートをＰＢＳＴで４回洗浄し、２００μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中５％無脂肪乳）でブロッキングした。希釈したハイブリドーマ上清（６０μｌ）を各ウェルに加え、３７℃で４０分間インキュベートした。次いで、プレートを４回洗浄し、ＨＲＰ−ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｃａｔ＃１１５−０３６−０７１）を検出に使用し、結合ＯＤを４５０ｎｍで観察した。次いで、ヒトＰＤ１−ｈｉｓに結合する抗体を分泌する陽性ハイブリドーマを選択し、２４ウェルプレートに移した。高い特異的結合及びＰＤ１／ＰＤＬ１遮断活性を示す抗体を産生するハイブリドーマクローンをサブクローニングし、サブクローンにより産生された抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。簡単に述べれば、ＰＢＳ緩衝液を用いて５〜１０カラム容量でプロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｃａｔ＃ＡＡ０２７３）を洗浄した。細胞上清をカラムに通し、次いで、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまで、ＰＢＳ緩衝液を用いてカラムを洗浄した。溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７）を用いてカラムを溶出し、直ちに中和緩衝液（１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を用いて１．５ｍｌ試験管に回収した。ＩｇＧを含む画分をプールし、ＰＢＳ中、一晩４℃で透析した。
【０１９２】
＜実施例２  ＢＩＡＣＯＲＥ表面プラズモン共鳴技術を用いたマウス抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の親和性決定＞
【０１９３】
実施例１のハイブリドーマクローンにより産生された抗ＰＤ−１マウスモノクローナル抗体（ｍＡｂ）の親和性及び結合速度をＢｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００システム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ）によって特徴付けた。
【０１９４】
簡単に述べれば、ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、Ｃａｔ＃ＢＲ１００８３９、Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｋｉｔ）を、Ｂｉａｃｏｒｅにより提供される標準的なアミンカップリングキット（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国ペンシルベニア州ピッツバーグ）を用いて１級アミンを介してＣＭ５チップ（カルボキシメチルデキストランでコーティングしたチップ）に共有結合させた。バイオセンサ表面の未反応部分をエタノールアミンでブロッキングした。次いで、濃度６６．７ｎＭの精製した抗ＰＤ−１抗体及びニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標））を１０μＬ／ｍｉｎの流速でチップに流した。その後、ＨＢＳ  ＥＰ緩衝液（Ｂｉａｃｏｒｅにより提供される）中の組換えヒトＰＤ−１−ｈｉｓ（Ｓｉｎｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ、＃１０３７７−Ｈ０８Ｈ）又はカニクイザルＰＤ−１−ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、＃ＰＤ−１−Ｃ５２２３）を３０μＬ／ｍｉｎの流速でチップに流した。抗原抗体会合速度を２分間追跡し、解離速度を１０分間追跡した。会合及び解離曲線は、ＢＩＡ評価ソフトウェアを用いて１：１Ｌａｎｇｍｕｉｒ結合モデルに適合させた。
【０１９５】
ｋａ、ｋｄ及びＫＤ値を測定し、下記表３に示した。
【０１９６】
【表３】
2021520850.tif 000004
【０１９７】
本発明の抗体は、ニボルマブと同様又はそれよりもはるかに低いＫＤでヒトＰＤ−１に結合したことから、ヒトＰＤ−１への同等以上の親和性が示された。
【０１９８】
＜実施例３  マウス抗ＰＤ−１モノクローナル抗体の結合活性＞
【０１９９】
９６ウェルマイクロプレートをＰＢＳ中２μｇ／ｍｌのヤギ抗マウスＩｇＧ  Ｆｃγ断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃１１５−００６−０７１、１００μｌ／ウェル）でコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳＴ）で４回洗浄し、次いで２００μｌ／ウェルのブロッキング緩衝液（ＰＢＳＴ中５％ｗ／ｖ無脂肪乳）を用いて３７℃で２時間ブロッキングした。プレートを再度洗浄し、１００μｌ／ウェルの実施例１の精製抗ＰＤ−１抗体及びニボルマブ（０．００４〜６６．７ｎＭ、ＰＢＳＴ中２．５％無脂肪乳による５倍段階希釈）と共に３７℃で４０分間インキュベートし、その後、再び４回洗浄した。捕捉された抗ＰＤ−１抗体を含むプレートをビオチン標識ヒトＰＤ−１  Ｆｃタンパク質（配列番号５３、ＰＢＳＴ中２．５％無脂肪乳中の６０ｎＭ、１００μｌ／ウェル）と共に３７℃で４０分間インキュベートし、４回洗浄し、ストレプトアビジン結合ＨＲＰ（ＰＢＳＴによる１：１００００希釈、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、＃０１６−０３０−０８４、１００μｌ／ウェル）と共に３７℃で４０分間インキュベートした。最後の洗浄後、プレートを１００μｌ／ウェルのＥＬＩＳＡ基質ＴＭＢ（Ｉｎｎｏｒｅａｇｅｎｔｓ）と共にインキュベートした。５０μｌ／ウェルの１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて２５℃で１５分以内に反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析し、ＥＣ５０値を報告した。
【０２００】
結果を下記表４にまとめた。
【０２０１】
【表４】
2021520850.tif 000005
【０２０２】
結果から、本発明の抗体が、ニボルマブよりもわずかに低いＥＣ５０値でヒトＰＤ−１に特異的に結合したことが示された。
【０２０３】
＜実施例４  ＥＬＩＳＡ及びレポートアッセイを用いた機能遮断アッセイ＞
【０２０４】
４−１：リガンドブロッキングＥＬＩＳＡ
【０２０５】
ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断する本発明の抗ＰＤ−１抗体の能力を競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。簡単に述べれば、ヒトＰＤ−Ｌ１−Ｆｃタンパク質（配列番号５４）を２μｇ／ｍＬ（ＰＢＳ）で９６ウェルマイクロプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０、ＰＢＳＴ）で洗浄し、ＰＢＳＴ中５％無脂肪乳を用いて３７℃で２時間ブロッキングした。次いで、プレートを洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。
【０２０６】
ビオチン標識ヒトＰＤ−１−Ｆｃ（配列番号５３、ＰＢＳＴ中２．５％無脂肪乳中の１０ｎＭ）による本発明の抗ＰＤ−１抗体又はニボルマブの希釈液（１００ｎＭから開始し、４倍段階希釈）を調製し、室温で４０分間インキュベートし、次いで、ＰＤ−Ｌ１でコーティングしたプレートに抗体／ＰＤ−１−Ｆｃ−ビオチン混合物（１００μｌ／ウェル）を加えた。３７℃で４０分間インキュベートした後、プレートを洗浄緩衝液を用いて４回洗浄した。次いで、１００μｌ／ウェルのストレプトアビジン結合ＨＲＰを添加し、３７℃で４０分間インキュベートして、ＰＤ−Ｌ１に結合したビオチン標識ヒトＰＤ−１を検出した。プレートを洗浄緩衝液を用いて再度洗浄した。最後に、ＴＭＢを添加し、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析し、ＩＣ５０値を報告した。
【０２０７】
４−２：ベンチマークブロッキングＥＬＩＳＡ
【０２０８】
ベンチマーク（ニボルマブ）−ヒトＰＤ−１結合を遮断する本発明の抗ＰＤ−１抗体の能力を競合ＥＬＩＳＡアッセイを用いて測定した。簡単に述べれば、ニボルマブをＰＢＳ中２μｇ／ｍＬで９６ウェルマイクロプレートにコーティングし、４℃で一晩インキュベートした。翌日、プレートを洗浄緩衝液で洗浄し、ＰＢＳＴ中５％無脂肪乳を用いて３７℃で２時間ブロッキングした。ブロッキング中、ビオチン標識ヒトＰＤ−１  Ｆｃ（配列番号５３、ＰＢＳＴ中２．５％無脂肪乳中の１０ｎＭ）を試験対象の各抗体（１３７ｐＭ〜１００ｎＭ、３倍段階希釈）と混合し、２５℃で４０分間インキュベートした。洗浄後、ＰＤ−１／抗体混合物（１００μｌ／ウェル）をニボルマブでコーティングしたプレートに加え、３７℃で４０分間インキュベートした。プレートを洗浄緩衝液で再度洗浄し、次いで１００μｌ／ウェルのＳＡ−ＨＲＰを添加し、３７℃で４０分間インキュベートして、Ｏｐｄｉｖｏ（登録商標）に結合したビオチン標識ヒトＰＤ−１を検出した。最後に、プレートを洗浄緩衝液を用いて洗浄した。ＴＭＢを添加し、１Ｍ  Ｈ２ＳＯ４を用いて反応を停止させ、吸光度を４５０ｎｍで読み取った。データはＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて解析し、ＩＣ５０値を報告した。
【０２０９】
４−３：細胞ベースの機能アッセイ
【０２１０】
細胞膜ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断する抗体の活性を細胞ベースのレポーターアッセイを用いて評価した。このアッセイは、ヒトＰＤ−１とＮＦＡＴ応答エレメント（ＮＦＡＴ−ＲＥ）で駆動されるルシフェラーゼレポーターとを安定的に発現するＰＤ−１エフェクター細胞株（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＧＳ−Ｊ２／ＰＤ−１）、並びにヒトＰＤ−Ｌ１と改変細胞表面タンパク質抗原ペプチド／主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）とを安定的に発現するＰＤ−Ｌ１細胞株（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ、ＧＳ−Ｃ２／ＰＤ−Ｌ１、ＡＰＣ細胞）という２種類の遺伝子改変細胞株で構成されていた。これら２種類の細胞株を共培養すると、ＰＤ−１エフェクター細胞のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）媒介ルシフェラーゼ発現（ＮＦＡＴ経路を介する）がＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１相互作用によって阻害された。
【０２１１】
細胞ベースの機能アッセイを以下のように実施した。簡単に述べれば、対数増殖期のＰＤ−Ｌ１細胞を５×１０５／ｍｌの密度で３８４ウェル細胞培養プレートに播種した。翌日、アッセイ緩衝液（ＲＰＭＩ１６４０＋１％ＦＢＳ）による本発明の抗ＰＤ−１抗体又はニボルマブの希釈液（３３３．３ｎＭから開始し、５倍段階希釈）を調製した。一方、３８４ウェルプレート中のＰＤ−Ｌ１細胞の培地を捨て、次いで、抗ＰＤ−１抗体（２０μｌ／ウェル）及びＰＤ−１エフェクター細胞（密度６．２５×１０５／ｍｌ、２０μｌ／ウェル）の希釈液を３８４ウェル細胞培養プレートに加えた。３７℃で６時間共培養した後、プレートをインキュベーターから取り出し、Ｏｎｅ−Ｇｌｏルシフェラーゼアッセイシステム（Ｐｒｏｍｅｇａ、＃Ｅ６１２０）を用いて製造者の指示に従って各ウェルの発光を読み取った。Ｇｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて用量反応曲線を解析し、ＥＣ５０値を報告した。
【０２１２】
３つのアッセイの結果を下記表５にまとめた。
【０２１３】
【表５】
2021520850.tif 000006
【０２１４】
本発明の抗体は、ヒトＰＤ−１−ヒトＰＤ−Ｌ１相互作用を遮断することができ、ニボルマブと同様又はそれより低いＥＣ５０又はＩＣ５０値を示したことが分かる。
【０２１５】
また、データから、本発明の抗体がヒトＰＤ−１−ニボルマブ相互作用を遮断することができたことから、ニボルマブの場合と同一又は類似のエピトープに結合したことが示された。
【０２１６】
＜実施例５  キメラ抗体の作製及び特徴付け＞
【０２１７】
抗ＰＤ１マウスｍＡｂＤ２Ｈ３及びＤ２Ａ４の重鎖及び軽鎖の可変ドメインをそれぞれヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトκ軽鎖定常領域（配列番号５１及び５２）にインフレームでクローニングした。上記重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、Ｄ２Ｈ３については配列番号１３及び２７、Ｄ２Ａ４については配列番号２２及び３４に記載されたアミノ酸配列を有していた。得られたキメラ抗体の活性は、上記実施例のプロトコルに従って結合捕捉ＥＬＩＳＡ、競合ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースの機能レポーターアッセイにおいて確認した。データから、キメラＤ２Ｈ３及びＤ２Ａ４抗体が、下記表６に示されるように、それぞれのマウス版と同等の活性を有することが示された。
【０２１８】
【表６】
2021520850.tif 000007
【０２１９】
＜実施例６  抗ＰＤ−１マウスモノクローナル抗体Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ａ４のヒト化＞
【０２２０】
マウス抗ＰＤ１抗体Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ｈ４をヒト化及びさらなる研究のために選択した。マウス抗体のヒト化は、以下に詳細に記載するように、十分に確立されたＣＤＲ移植法を用いて行った。
【０２２１】
マウス抗体Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ｈ４のヒト化のためのアクセプターフレームワークを選択するために、Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ｈ４の軽鎖及び重鎖可変領域配列をヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対してブラストした。Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ｈ４と最も高い相同性を有するヒト生殖系列ＩＧＶＨ及びＩＧＶＫをヒト化のためのアクセプターフレームワークとして選択した。選択したフレームワークにマウス抗体重鎖／軽鎖可変領域ＣＤＲを挿入し、フレームワーク中の残基を復帰変異させて、より多くの重鎖／軽鎖可変領域候補を得た。ヒト化Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ａ４可変重鎖及び軽鎖変異体をそれぞれ下記表７及び表８に示すように設計した。
【０２２２】
【表７】
2021520850.tif 000008
【０２２３】
【表８】
2021520850.tif 000009
【０２２４】
ヒト化Ｄ２Ｈ３／Ｄ２Ａ４重鎖／軽鎖可変領域並びにヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトκ軽鎖定常領域をコードする核酸配列を含むベクターを、１．２ｍｇ／ｍｌのＰＥＩを用いて、軽鎖と重鎖コンストラクトとの比が６０％：４０％となるようにして５０ｍｌの２９３Ｆ懸濁細胞培養物中に一過性にトランスフェクトした。振盪フラスコで６日間振盪後、細胞上清を回収し、細胞ペレットへとスピンダウンし、０．２２μｍフィルターで濾過した後、ＩｇＧ分離を行った。抗体をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。簡単に述べれば、ＰＢＳ緩衝液を用いて５〜１０カラム容量でプロテインＡセファロースカラム（ｂｅｓｔｃｈｒｏｍ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ製、Ｃａｔ＃ＡＡ０２７３）を洗浄した。細胞上清をカラムに通し、次いで、タンパク質の吸光度がベースラインに達するまで、ＰＢＳ緩衝液を用いてカラムを洗浄した。カラムを溶出緩衝液（０．１Ｍグリシン−ＨＣｌ、ｐＨ２．７）を用いて溶出し、直ちに中和緩衝液（１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ９．０）を用いて１．５ｍｌ試験管に回収した。ＩｇＧを含む画分をプールし、ＰＢＳ中、一晩４℃で透析した。
【０２２５】
Ｄ２Ｈ３については合計１４個（ｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１〜ｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４）、Ｄ２Ｈ４については合計６個（ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ１〜ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６）のヒト化抗体が得られた。これらの抗体の重鎖／軽鎖可変領域アミノ酸配列を上記表１にまとめ、ヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトκ軽鎖定常領域配列をそれぞれ配列番号５１及び５２に示した。
【０２２６】
得られたヒト化抗体の結合親和性は、実施例３に記載されているように捕捉結合ＥＬＩＳＡによってヒトＰＤ１への結合活性について評価し、結合ＥＣ５０値を表９−１〜表９−３及び表１０−１〜表１０−２にまとめた。１４個のヒト化Ｄ２Ｈ３抗体及び６個のヒト化Ｄ２Ａ４抗体は、それぞれキメラ抗体Ｄ２Ｈ３（ｃｈＤ２Ｈ３）及びＤ２Ａ４（ｃｈＤ２Ａ４）と同等の親和性を示した。
【０２２７】
【表９−１】
2021520850.tif 000010
【０２２８】
【表９−２】
2021520850.tif 000011
【０２２９】
【表９−３】
2021520850.tif 000012
【０２３０】
【表１０−１】
2021520850.tif 000013
【０２３１】
【表１０−２】
2021520850.tif 000014
【０２３２】
結果から、ヒト化Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ａ４抗体がヒトＰＤ−１に特異的に結合し、いくつかの抗体はニボルマブと比較して同様の又は低いＥＣ５０値を示したことが分かった。
【０２３３】
次に、ヒト化抗体ｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４及びｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６を、Ｂｉａｃｏｒｅ及び結合捕捉ＥＬＩＳＡによってヒト及びカニクイザルＰＤ１への親和性について試験し、また、実施例２〜４のプロトコルに従って、競合ＥＬＩＳＡ及び細胞ベースのレポーターアッセイによって機能活性についても試験した。表１１に示すように、ｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４及びｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６はいずれも、対応するマウス抗体と比較して同等のｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性を示したことから、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）と比較してＰＤ−１への親和性の増加及び機能の向上が見られた。
【０２３４】
【表１１】
2021520850.tif 000015
【０２３５】
＜実施例７  ヒト化Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ａ４抗体のｉｎ  ｖｉｖｏ抗腫瘍活性＞
【０２３６】
腫瘍増殖に対するヒト化抗ＰＤ−１抗体の効果をＭＣ３８異種移植モデルで評価した。簡単に述べれば、５〜８週齢の雌性Ｂ−ｈＰＤ−１＋マウスの右後側腹部に５×１０５個のＭＣ３８細胞を皮下注射した。腫瘍体積が約１００〜１５０ｍｍ３に達したら、マウスを無作為に１０群（８マウス／群）に分けた。同日（０日目と呼ばれる）、動物は投薬を受け始めた。具体的には、マウスにそれぞれＰＢＳ、ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６、ｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）を１ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ又は１０ｍｇ／ｋｇの用量で週２回３週間腹腔内注射した。詳細な投与計画を下記表１２に示した。ヒト化抗体ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６及びｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４は、それぞれ配列番号５１及び５２に示されるアミノ酸配列を有する重鎖及び軽鎖定常領域を含んでいた。週２回、マウス体重及び腫瘍体積を測定し記録した。腫瘍体積（Ｖ）は（長さ×幅２）／２として算出した。
【０２３７】
【表１２】
2021520850.tif 000016
【０２３８】
マウス体重を図１に示した。群間に差は認められなかったことから、全ての治療が腫瘍を有する動物に十分に許容されたことが示された。
【０２３９】
図２Ａ〜２Ｃには、異なる薬剤を異なる用量で投与した群におけるマウス腫瘍体積の変化を示した。ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６、ｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）を１ｍｇ／ｋｇ用量レベルで投与したマウスは、溶媒対照群よりも腫瘍体積が著しく小さかった（図２Ａ）。３ｍｇ／ｋｇの用量では、３剤全てが明らかな抗腫瘍効果を示し、ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６及びｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４群の腫瘍体積は、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）群よりわずかに小さかった（図２Ｂ）。さらに、図２Ｃに示すように、ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６、ｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）を一日量１０ｍｇ／ｋｇで投与した場合、最初の４週間で同様の抗腫瘍効果が得られたが、ｈｕＤ２Ｈ４−Ｖ６群のマウスでは、３０〜３３日目に他の２つの治療群よりも腫瘍体積がわずかに小さかった。ｈｕＤ２Ｈ４−Ｖ６の１０ｍｇ／ｋｇ群では、腫瘍は１匹のマウスで完全に消失し、別のマウスでは腫瘍の増殖が停止したが、これらは他群の動物では観察されなかった。
【０２４０】
本発明を１つ以上の実施形態に関連して上述したが、本発明はこれらの実施形態に限定されるものではなく、本明細書は、添付の特許請求の範囲の趣旨及び範囲内に含まれ得る全ての代替物、改変物及び均等物を包含するものであることを理解すべきである。本明細書で引用された全ての参考文献は、それらの全体が参照によりさらに組み込まれる。
【０２４１】
本出願における配列を以下にまとめる。
【０２４２】
【表１３−１】
2021520850.tif 000017
【０２４３】
【表１３−２】
2021520850.tif 000018
【０２４４】
【表１３−３】
2021520850.tif 000019
【０２４５】
【表１３−４】
2021520850.tif 000020
【０２４６】
【表１３−５】
2021520850.tif 000021
【０２４７】
【表１３−６】
2021520850.tif 000022
【図１】
2021520850.tif 000023
【図２】
2021520850.tif 000024
【配列表】
2021520850000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月16日(2020.10.16)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含む重鎖可変領域を含む単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片であって、上記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、
ＩＭＧＴナンバリングスキームで定義される場合、
（１−１）それぞれ配列番号１、２及び３、又は
（１−２）それぞれ配列番号４、５及び６、
Ｃｈｏｔｈｉａナンバリングスキームで定義される場合、
（２−１）それぞれ配列番号３７、３９及び４１、又は
（２−２）それぞれ配列番号４４、４６及び４８、あるいは
Ｋａｂａｔナンバリングスキームで定義される場合、
（３−１）それぞれ配列番号３８、４０及び４１、又は
（３−２）それぞれ配列番号４５、４７及び４８
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有し、
上記単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片はＰＤ−１に結合する、
単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項２】
配列番号１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５又は２６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を含む請求項１に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項３】
ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域を含む軽鎖可変領域をさらに含み、上記ＣＤＲ１領域、ＣＤＲ２領域及びＣＤＲ３領域は、
Ｋａｂａｔナンバリングスキーム又はＣｈｏｔｈｉａナンバリングスキームで定義される場合、
（１−１）それぞれ配列番号７、８及び９、又は
（１−２）それぞれ配列番号１０、１１及び１２、あるいは
ＩＭＧＴナンバリングスキームで定義される場合、
（２−１）それぞれ配列番号４２、４３及び９、又は
（２−２）それぞれ配列番号４９、５０及び１２
と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１又は２に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項４】
配列番号２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５又は３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域をさらに含む請求項１〜３のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項５】
重鎖可変領域及び軽鎖可変領域を含み、上記重鎖及び軽鎖可変領域は、（１）それぞれ配列番号１３及び２７、（２）それぞれ配列番号１４及び２８、（３）それぞれ配列番号１５及び２８、（４）それぞれ配列番号１６及び２８、（５）それぞれ配列番号１７及び２８、（６）それぞれ配列番号１８及び２８、（７）それぞれ配列番号１９及び２８、（８）それぞれ配列番号２０及び２８、（９）それぞれ配列番号１４及び２９、（１０）それぞれ配列番号１４及び３０、（１１）それぞれ配列番号１４及び３１、（１２）それぞれ配列番号１４及び３２、（１３）それぞれ配列番号２１及び２８、（１４）それぞれ配列番号１４及び３３、（１５）それぞれ配列番号２１及び３３、（１６）それぞれ配列番号２２及び３４、（１７）それぞれ配列番号２３及び３５、（１８）それぞれ配列番号２４及び３５、（１９）それぞれ配列番号２５及び３５、（２０）それぞれ配列番号２３及び３６、（２１）それぞれ配列番号２６及び３５、又は（２２）それぞれ配列番号２６及び３６と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する、請求項１〜４のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項６】
重鎖定常領域及び軽鎖定常領域をさらに含む請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項７】
配列番号５１と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する重鎖定常領域、及び／又は配列番号５２と少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の同一性を有するアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を含む請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項８】
（ａ）ヒトＰＤ−１に結合し、（ｂ）サルＰＤ−１に結合し、（ｃ）ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害し、（ｄ）Ｔ細胞増殖を増加させ、（ｅ）免疫応答を刺激し、且つ／又は（ｆ）抗原特異的Ｔ細胞応答を刺激する請求項１〜７のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項９】
１．０×１０−８Ｍ以下のＫＤでＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害する請求項１〜８のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１０】
０．３〜４．０×１０−９Ｍ以下のＫＤでヒトＰＤ−１に結合し、ＰＤ−Ｌ１のＰＤ−１への結合を阻害する請求項１〜９のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１１】
マウス、ヒト、キメラ又はヒト化抗体である請求項１〜１０のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１２】
上記その抗原結合断片はＦａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、Ｆｄ断片、Ｆｖ断片、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、又はナノボディである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片をコードする核酸。
【請求項１４】
請求項１３に記載の核酸を発現することができる発現ベクター。
【請求項１５】
請求項１３に記載の核酸又は請求項１４に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項１６】
請求項１５に記載の宿主細胞を用いて請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を作製する方法であって、（ｉ）上記宿主細胞において上記抗体又はその抗原結合断片を発現させる工程と、（ｉｉ）上記宿主細胞又は細胞培養物から上記抗体又はその抗原結合断片を単離する工程とを含む方法。
【請求項１７】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片を含む二重特異性分子、免疫複合体、キメラ抗原受容体、改変Ｔ細胞受容体又は腫瘍溶解性ウイルス。
【請求項１８】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片と、薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物。
【請求項１９】
抗腫瘍剤をさらに含む請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
対象におけるがん疾患の予防及び／又は治療のための医薬品の製造における請求項１〜１２のいずれか一項に記載の単離モノクローナル抗体又はその抗原結合断片、又は請求項１８又は１９に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２１】
上記がん疾患は固形又は非固形腫瘍である、請求項２０に記載の使用。
【請求項２２】
上記がん疾患は、リンパ腫、白血病、多発性骨髄腫、メラノーマ、結腸腺がん、膵臓がん、結腸がん、胃腸がん、前立腺がん、膀胱がん、腎臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、乳がん、肺がん、腎細胞がん、上咽頭がん、又はこれらの組み合わせである、請求項２０又は２１に記載の使用。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９０】
さらに別の実施形態では、抗体のグリコシル化を修飾する。例えば、非グリコシル化抗体を作製することができる（すなわち、該抗体はグリコシル化を欠いている）。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるように変化させることができる。そのような糖鎖修飾は、例えば、抗体配列内のグリコシル化の１つ以上の部位を変化させることによって達成できる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位を除去し、それによりその部位でのグリコシル化を除去することとなる１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。このような非グリコシル化によって、抗原に対する抗体の親和性を増加させることができる。例えば、米国特許第５，７１４，３５０号及び第６，３５０，８６１号を参照されたい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５５】
宿主免疫応答性を活性化する他の抗体を抗ＰＤ−１抗体と併用することができる。これらとしては、ＤＣ機能及び抗原提示を活性化する樹状細胞表面の分子が挙げられる。抗ＣＤ４０抗体は、Ｔ細胞ヘルパー活性を効果的に代替でき（Ｒｉｄｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９３：４７４−４７８）、ＰＤ−１抗体と共に使用することができる（Ｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１（５）５２７−４０）。ＣＴＬＡ−４（例えば米国特許第５，８１１，０９７号）、ＯＸ−４０（Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｍｍｕｎｏｌ  １６４：２１６０−２１６９）、４−１ＢＢ（Ｍｅｌｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ３：６８２−６８５（１９９７））及びＩＣＯＳ（Ｈｕｔｌｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．（１９９９）Ｎａｔｕｒｅ  ３９７：２６２−２６６）等のＴ細胞共刺激分子に対する抗体を活性化することによっても、Ｔ細胞活性化レベルを増加させることができる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８４】
本発明の方法によれば、抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体と非吸収性ステロイドと組み合わせたサリチル酸塩の投与は、免疫刺激抗体により誘発される大腸炎の発生率を低下させる目的で、サリチル酸塩及び非吸収性ステロイドを重複又は逐次投与するものであってもよい。したがって、例えば、本発明に係る免疫刺激抗体により誘発される大腸炎の発生率を低下させる方法は、サリチル酸塩及び非吸収性ステロイドを同時又は逐次投与すること（例えば、サリチル酸塩を非吸収性ステロイドの６時間後に投与する）、又はそれらの任意の組み合わせを包含する。さらに、本発明によれば、サリチル酸塩及び非吸収性ステロイドを同じ経路（例えば、両方とも経口投与する）又は異なる経路（例えば、サリチル酸塩を経口投与し、非吸収性ステロイドを直腸投与する）で投与することができる。該経路は、抗ＰＤ−１と抗ＣＴＬＡ−４及び／又は抗ＬＡＧ−３及び／又は抗ＰＤ−Ｌ１抗体とを投与するために使用される経路とは異なっていてもよい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２０】
マウス抗ＰＤ１抗体Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ａ４をヒト化及びさらなる研究のために選択した。マウス抗体のヒト化は、以下に詳細に記載するように、十分に確立されたＣＤＲ移植法を用いて行った。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２１】
マウス抗体Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ａ４のヒト化のためのアクセプターフレームワークを選択するために、Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ａ４の軽鎖及び重鎖可変領域配列をヒト免疫グロブリン遺伝子データベースに対してブラストした。Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ａ４と最も高い相同性を有するヒト生殖系列ＩＧＶＨ及びＩＧＶＫをヒト化のためのアクセプターフレームワークとして選択した。選択したフレームワークにマウス抗体重鎖／軽鎖可変領域ＣＤＲを挿入し、フレームワーク中の残基を復帰変異させて、より多くの重鎖／軽鎖可変領域候補を得た。ヒト化Ｄ２Ｈ３及びＤ２Ａ４可変重鎖及び軽鎖変異体をそれぞれ下記表７及び表８に示すように設計した。
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２２５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２２５】
Ｄ２Ｈ３については合計１４個（ｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１〜ｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４）、Ｄ２Ａ４については合計６個（ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ１〜ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６）のヒト化抗体が得られた。これらの抗体の重鎖／軽鎖可変領域アミノ酸配列を上記表１にまとめ、ヒトＩｇＧ１重鎖及びヒトκ軽鎖定常領域配列をそれぞれ配列番号５１及び５２に示した。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３４】
【表１１】
2021520850.tif 000025
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３９】
図２Ａ〜２Ｃには、異なる薬剤を異なる用量で投与した群におけるマウス腫瘍体積の変化を示した。ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６、ｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）を１ｍｇ／ｋｇ用量レベルで投与したマウスは、溶媒対照群よりも腫瘍体積が著しく小さかった（図２Ａ）。３ｍｇ／ｋｇの用量では、３剤全てが明らかな抗腫瘍効果を示し、ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６及びｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４群の腫瘍体積は、ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）群よりわずかに小さかった（図２Ｂ）。さらに、図２Ｃに示すように、ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６、ｈｕＤ２Ｈ３−Ｖ１４及びＯＰＤＩＶＯ（登録商標）を一日量１０ｍｇ／ｋｇで投与した場合、最初の４週間で同様の抗腫瘍効果が得られたが、ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６群のマウスでは、３０〜３３日目に他の２つの治療群よりも腫瘍体積がわずかに小さかった。ｈｕＤ２Ａ４−Ｖ６の１０ｍｇ／ｋｇ群では、腫瘍は１匹のマウスで完全に消失し、別のマウスでは腫瘍の増殖が停止したが、これらは他群の動物では観察されなかった。
【国際調査報告】
2021520850.tif 000026
2021520850.tif 000027
2021520850.tif 000028
2021520850.tif 000029