(57)【要約】  末梢血リンパ球（ＰＢＬ）及び骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を含む腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を、リンパ腫及び白血病を含む液性腫瘍などの血液悪性腫瘍を有する患者の血液及び／又は骨髄から拡大培養する方法、並びにキメラ抗原受容体、遺伝子改変Ｔ細胞受容体及び他の遺伝子改変を組み込むための、拡大培養されたＴＩＬ、ＰＢＬ及びＭＩＬの遺伝子改変、並びにそのような拡大培養及び／又は改変されたＴＩＬ、ＰＢＬ及びＭＩＬの、癌及び血液悪性腫瘍などの疾患の処置における使用が本明細書に開示される。
2021503885.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養する方法であって、
ａ．患者の末梢血からＰＢＭＣのサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存され、及び前記患者は、任意選択により、ＩＴＫで前処置される、入手すること；
ｂ．ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択し且つ取り出すことにより、前記サンプルからＰＢＬを分離し、且つ任意選択により、０．１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のＩＴＫ阻害剤で前記ＰＢＬを前処理すること；
ｃ．前記ＰＢＬを前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞と２〜５日間の期間にわたって共培養すること；
ｄ．第１の細胞培養培地中のガス透過性容器に約２．５×１０５〜約５×１０５個の細胞を添加し、且つ３〜６日間の期間にわたり、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及びビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体並びに任意選択により０．１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のＩＴＫ阻害剤で前記ＰＢＬを刺激すること；
ｅ．前記第１の細胞培養培地を第２の細胞培養培地及び約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度の追加のＩＬ−２並びに任意選択により０．１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のＩＴＫ阻害剤に交換すること；
ｆ．ＩＬ−２及びビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体並びに任意選択により０．１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のＩＴＫ阻害剤と共に、３〜６日間の追加の期間にわたってステップ（ｅ）からの前記ＰＢＬを培養すること；
ｇ．前記第２の細胞培養培地を第３の細胞培養培地に交換し、且つ３０００ＩＵ／ｍＬの濃度の追加のＩＬ−２及び任意選択により０．１ｎＭ〜２００ｎＭの濃度のＩＴＫ阻害剤を添加し、且つ２〜５日間の追加の期間にわたって前記細胞を培養すること；
ｈ．ステップ（ｇ）の培養物から前記抗体結合ＰＢＬを分離すること；
ｉ．ステップ（ｈ）で分離された前記ＰＢＬから前記抗体を取り出すこと；及び
ｊ．前記ＰＢＬを回収すること
を含み、前記ＩＴＫ阻害剤は、任意選択により、ＩＴＫに共有結合するＩＴＫ阻害剤であり、更に、前記ＰＢＬは、任意選択により、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合された単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで形質導入され得る、方法。
【請求項２】
血液悪性腫瘍を処置する方法であって、
ａ．血液悪性腫瘍に罹患している患者の末梢血からＰＢＭＣのサンプルを入手すること；
ｂ．ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択し且つ取り出すことにより、前記サンプルからＰＢＬを分離すること；
ｃ．任意選択により、前記ＰＢＬを前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞と共培養すること；
ｄ．第１の細胞培養培地中の前記ＰＢＬを、ガス透過性容器内において、約２〜約６日間の期間にわたってＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激すること；
ｅ．約２〜約６日間の期間にわたり、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でステップ（ｄ）からの前記ＰＢＬを培養すること；
ｆ．ステップ（ｅ）の培養物から前記抗体結合ＰＢＬを分離すること；
ｇ．ステップ（ｆ）で分離された前記ＰＢＬから前記抗体を取り出すこと；及び
ｈ．前記ＰＢＬを回収すること；
ｉ．任意選択により、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合された単鎖可変断片抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸を含む発現ベクターで前記ＰＢＬを形質導入するか、又は任意選択により、遺伝子操作されたＴ細胞受容体を含む発現ベクターで前記ＰＢＬを形質導入すること；及び
ｊ．前記血液悪性腫瘍を処置するために前記ＰＢＬを治療有効量で患者に投与すること
を含む方法。
【請求項３】
前記患者は、ＰＢＭＣサンプルを入手する前にＩＴＫ阻害剤で前処置される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルンダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリル−インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブＢＭＳ５０９７４４、ＣＴＡ０５６、ＧＳＫ２２５０６６５Ａ、ＰＦ０６４６５４６９（（Ｒ）−３−（１−（１−アクリロイルピペリジン−３−イル）−４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−Ｎ−（３−メチル−４−（１−メチルエチル））ベンズアミド）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブである、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記患者は、イブルチニブレジメンの少なくとも１つのラウンドで前処置される、請求項２に記載の方法。
【請求項８】
前記血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リヒタートランスフォーメーションを伴うＣＬＬ（又はリヒター症候群）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項９】
前記血液悪性腫瘍は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）である、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１１】
ステップ（ｄ）後、追加のＩＬ−２は、添加され、及び前記細胞培養培地は、第２の細胞培養培地と交換される、請求項２に記載の方法。
【請求項１２】
ステップ（ｅ）後、追加のＩＬ−２は、添加され、及び前記第２の細胞培養培地は、第３の細胞培養培地と交換される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記第３の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記第１の細胞培養培地と前記第２の細胞培養培地とは、異なる、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１の細胞培養培地と前記第２の細胞培養培地とは、同じである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
ステップ（ｃ）におけるＢ細胞とＰＢＬとの比は、約０．１：１〜約１０：１（Ｂ細胞：ＰＢＬ）である、請求項２に記載の方法。
【請求項１８】
ステップ（ｃ）におけるＢ細胞とＰＢＬとの比は、０．１：１、１：１及び１０：１（Ｂ細胞：ＰＢＬ）からなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項１９】
ステップ（ｄ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約１×１０５〜約１０×１０５個のＰＢＬが存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項２０】
ステップ（ｄ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも約２．５×１０５〜１０×１０５個のＰＢＬが存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項２１】
ステップ（ｄ）の開始時、前記ガス透過性容器内に少なくとも５×１０５個のＰＢＬが存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項２２】
前記ＩＬ−２は、ステップ（ｄ）及び（ｅ）において１０００ＩＵ／ｍｌ〜６０００ＩＬ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＩＬ−２は、約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びＰＢＬ：ビーズ比は、ステップ（ｄ）及び（ｅ）のそれぞれにおいて約１：１である、請求項２に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＰＢＬは、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＰＢＬの量で投与される、請求項２に記載の方法。
【請求項２６】
前記血液悪性腫瘍は、リヒタートランスフォーメーション（又はリヒター症候群）を伴うＣＬＬである、請求項８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
[0001]  本願は、２０１８年５月１０日に提出された国際特許出願番号ＰＣＴ／米国特許出願公開第１８／０３２１０９の一部継続出願であり、２０１７年５月１０日に提出された米国仮特許出願第６２／５０４，３３７号；２０１７年７月１０日に提出された米国仮特許出願第６２／５３０，６８１号；２０１７年８月２５日に提出された米国仮特許出願第６２／５５０，３９８号；２０１７年１１月２２日に提出された米国仮特許出願第６２／５９０，０３４号；２０１８年１月２４日に提出された米国仮特許出願第６２／６２１，４６２号；２０１８年１月２５日に提出された米国仮特許出願第６２／６２１，７９８号；及び２０１８年３月２３日に提出された米国仮特許出願第６２／６４７，３６７号に対する優先権を主張し、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
[0002]  リンパ腫及び白血病を含む液性腫瘍などの血液悪性腫瘍を有する患者の血液及び／又は骨髄に由来する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を拡大培養する方法並びにそれから入手されるＴＩＬの集団を含む組成物が本明細書に開示される。更に、そのような血液悪性腫瘍の処置を含む、液性腫瘍などの血液悪性腫瘍を有する患者の血液又は骨髄から拡大培養されたＴＩＬの治療的使用が本明細書に開示される。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
[0003]  腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の養子自己移植を用いたかさ高い難治性の癌の処置は、予後不良の患者に対する治療への強力なアプローチとなる。Gattinoni, et al., Nat.Rev. Immunol.2006, 6, 383-393。ＴＩＬは、Ｔ細胞が優勢であり、ＩＬ−２に基づくＴＩＬ拡大培養とそれに続く「急速拡大培養プロセス」（ＲＥＰ）とは、そのスピード及び効率のためにＴＩＬ拡大培養のための好ましい方法となっている。Dudley, et al., Science 2002, 298, 850-54；Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2005, 23, 2346-57；Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-39；Riddell, et al., Science 1992, 257, 238-41；Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42。黒色腫におけるＴＩＬ療法に対する応答を改善し、ＴＩＬ療法を他の種類の腫瘍に拡大培養するためのいくつかのアプローチが探求されているが、成功が限られており、この分野は、依然として課題となっている。Goff, et al., J. Clin.Oncol.2016, 34, 2389-97；Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-39；Rosenberg, et al., Clin.Cancer Res.2011, 17, 4550-57。Ｂ細胞リンパ腫からのＴＩＬの拡大培養への以前のアプローチは、ＴＩＬ拡大培養の１２の試みの２つのみが腫瘍に対する潜在的な活性を提供するという不十分な結果を得た。Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211。急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）及び慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を含む多くの血液悪性腫瘍に対し、より効果的な治療を提供する緊急の必要性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
[0004]  本発明は、ＴＩＬ拡大培養プロセスが、リンパ腫又は白血病を含む液性腫瘍などの血液悪性腫瘍から入手される有効なＴＩＬ集団をもたらし得るという驚くべき発見を提供する。
【０００５】
発明の概要
[0005]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて患者における癌を処置する方法であって
（ａ）任意選択により、少なくとも１つのキナーゼ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ；
（ｂ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｃ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、腫瘍又は腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数は、ＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含み、初期拡大培養は、２１日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、第２の拡大培養の開始から７日後、ＴＩＬの第３の集団の数は、ＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を患者に投与するステップ；
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０００６】
[0006]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて患者における癌を処置する方法であって、
（ａ）任意選択により、少なくとも１つのキナーゼ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ；
（ｂ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｃ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、腫瘍又は腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数は、ＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含み、初期拡大培養は、２１日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、第２の拡大培養の開始から７日後、ＴＩＬの第３の集団の数は、ＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの第３の集団の治療有効部分を患者に投与するステップ；
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０００７】
[0007]  本発明の一実施形態において、方法は、ＩＴＫ阻害剤の添加を更に含む。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ステップ（ｄ）及び（ｅ）の少なくとも１つ中に細胞培養培地に添加される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、共有結合的及び不可逆的にＩＴＫに結合する共有結合ＩＴＫ阻害剤である。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ＩＴＫに結合するアロステリックＩＴＫ阻害剤である。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルンダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリル−インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブＢＭＳ５０９７４４、ＣＴＡ０５６、ＧＳＫ２２５０６６５Ａ、ＰＦ０６４６５４６９（（Ｒ）−３−（１−（１−アクリロイルピペリジン−３−イル）−４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−Ｎ−（３−メチル−４−（１−メチルエチル））ベンズアミド）及びそれらの組み合わせである。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、１−［（３Ｒ）−３−［４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル］−１−ピペリジニル］−２−プロペン−１−オンとしても知られるイブルチニブである。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、（Ｒ）−３−（１−（１−アクリロイルピペリジン−３−イル）−４−アミノ−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−３−イル）−Ｎ−（３−メチル−４−（１−メチルエチル））ベンズアミドである。前述のＩＴＫ阻害剤は、Tocris Bioscience, Inc.（Minneapolis, MN, USA）、Selleckchem, Inc.（Houston, TX, USA）及びAK Scientific, Inc.（Union City, CA, USA）を含むさまざまな供給元から市販されている。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．１ｎＭ〜約５μＭの濃度で添加される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．１ｎＭ〜約５μＭの濃度で添加される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．１ｎＭ〜約１００ｎＭの濃度で添加される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．５ｎＭ〜約５０ｎＭの濃度で添加される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約１ｎＭ〜約１０ｎＭの濃度で添加される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．０１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、２ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ及び５０μＭの濃度で添加される。
【０００８】
[0008]  本発明の一実施形態において、末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養する方法は、
ａ．末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択し且つ取り出すことにより、前記サンプルからＰＢＬを分離すること；
ｃ．任意選択により、前記ＰＢＬを前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞と共培養すること；
ｄ．第１の細胞培養培地中の前記ＰＢＬを、ガス透過性容器内において、約２〜約６日間の期間にわたってＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激すること；
ｅ．約２〜約６日間の期間にわたり、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でステップ（ｄ）からのＰＢＬを培養すること；
ｆ．ステップ（ｅ）の培養物から抗体結合ＰＢＬを分離すること；
ｇ．ステップ（ｅ）で分離されたＰＢＬから抗体を取り出すこと；及び
ｈ．ＰＢＬを回収すること
を含む。
【０００９】
[0009]  本発明の一実施形態において、方法は、ステップ（ｄ）後にＩＬ−２を添加し、且つ第１の培地を第２の細胞培地に交換することを更に含む。別の実施形態において、方法は、ステップ（ｅ）後にＩＬ−２を添加し、且つ第２の培地を第３の細胞培地に交換することを更に含む。一実施形態において、第１の細胞培養培地、第２の細胞培養培地又は第３の培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群から選択される。別の実施形態において、第１及び第２の細胞培養培地は、同じである。別の実施形態において、第１及び第２の細胞培養培地は、異なる。本発明の一実施形態において、第１、第２及び第３の細胞培養培地の１つ以上は、同じである。別の実施形態において、第１、第２及び第３の細胞培養培地は、全て異なる。
【００１０】
[0010]  一実施形態において、前記ＰＢＬと前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞との任意選択による共培養は、１時間〜３日間の期間にわたって実施される。
【００１１】
[0011]  本発明の一実施形態において、ステップ（ｃ）におけるＴ細胞とＢ細胞との比は、約０．１：１〜約１０：１（Ｂ細胞：Ｔ細胞）である。別の実施形態において、ステップ（ｃ）におけるＢ細胞とＴ細胞との比は、０．１：１、１：１及び１０：１（Ｂ細胞：Ｔ細胞）からなる群から選択される。
【００１２】
[0012]  本発明の一実施形態において、ステップ（ｄ）の開始時のＰＢＬの開始細胞数は、少なくとも約１×１０５〜約１０×１０５個のＰＢＬである。別の実施形態において、ステップ（ｄ）の開始時のＰＢＬの開始細胞数は、少なくとも約２．５×１０５〜１０×１０５個のＰＢＬである。別の実施形態において、ステップ（ｄ）の開始時のＰＢＬの開始細胞数は、少なくとも５×１０５個のＰＢＬである。
【００１３】
[0013]  本発明の一実施形態において、ステップ（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれにおけるＩＬ−２は、約１０００ＩＵ／ｍＬ〜約６０００ＩＵ／ｍＬの濃度で使用される。別の実施形態において、ステップ（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれにおけるＩＬ−２は、約３０００ＩＵ／ｍＬの濃度で使用される。
【００１４】
[0014]  本発明の一実施形態において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、ビーズ上にコーティングされる。本発明の一実施形態において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でコーティングされたビーズは、DynaBeads（登録商標）である。一実施形態において、方法は、ステップ（ｃ）及び（ｄ）のそれぞれにおいて、約１：１のビーズ：ＰＢＬ比で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体ビーズをＰＢＬと共培養することを含む。
【００１５】
[0015]  本発明の一実施形態において、方法は、ＩＴＫ阻害剤を添加することを含む。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ステップ（ｃ）、（ｄ）及び（ｅ）の少なくとも１つ中に添加される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルンダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリル−インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ダサチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブＢＭＳ５０９７４４、ＣＴＡ０５６、ＧＳＫ２２５０６６５Ａ、ＰＦ０６４６５４６９及びそれらの組み合わせである。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブである。
【００１６】
[0016]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬを調製するための前述の方法のいずれかは、閉鎖滅菌系で実施される。
【００１７】
[0017]  本発明の一実施形態において、末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養する方法は、
ａ．末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択し且つ取り出すことにより、前記サンプルからＰＢＬを分離すること；
ｃ．前記ＰＢＬを前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞と４日間の期間にわたって共培養すること；
ｄ．ＣＭ−２細胞培養培地中のガス透過性容器に約２．５×１０５〜約５×１０５個のＰＢＬを添加し、且つ約４日間の期間にわたり、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及びビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で前記ＰＢＬを刺激すること；
ｅ．ＣＭ−２細胞培養培地をＡＩＭ−Ｖ細胞培養培地及び約３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２と交換すること；
ｆ．ＩＬ−２及びビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共に、約３日間の追加の期間にわたってステップ（ｅ）からのＡＩＭ−Ｖ細胞培養培地中のＰＢＬを培養すること；
ｇ．ステップ（ｆ）の培養物から抗体結合ＰＢＬを分離すること；
ｈ．ステップ（ｇ）で分離されたＰＢＬから抗体を取り出すこと；及び
ｉ．ＰＢＬを回収すること
を含む。
【００１８】
[0018]  本発明の一実施形態において、血液悪性腫瘍を処置する方法は、
ａ．血液悪性腫瘍に罹患している患者の末梢血から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手すること；
ｂ．ＣＤ１９＋Ｂ細胞を選択し且つ取り出すことにより、前記サンプルからＰＢＬを分離すること；
ｃ．任意選択により、前記ＰＢＬを前記ＣＤ１９＋Ｂ細胞と共培養すること；
ｄ．第１の細胞培養培地中の前記ＰＢＬを、ガス透過性容器内において、少なくとも約４日間の期間にわたってＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で刺激すること；
ｅ．３日間の期間にわたり、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でステップ（ｄ）からのＰＢＬを培養すること；
ｆ．ステップ（ｅ）の培養物から抗体結合ＰＢＬを分離すること；
ｇ．ステップ（ｅ）で分離されたＰＢＬから抗体を取り出すこと；及び
ｈ．ＰＢＬを回収すること；及び
ｉ．前記血液悪性腫瘍を処置するためにＰＢＬを治療有効量で患者に投与すること
を含む。
【００１９】
[0019]  本発明の一実施形態において、方法は、ＩＴＫ阻害剤で前処置された患者からＰＢＭＣサンプルを入手することを更に含む。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルンダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリル−インドール系阻害剤、チエノピラゾール阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブ、ＢＭＳ５０９７４４、ＣＴＡ０５６、ＧＳＫ２２５０６６５Ａ、ＰＦ０６４６５４６９及びそれらの組み合わせである。別の実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イブルチニブである。別の実施形態において、患者は、イブルチニブレジメンの少なくとも３つのラウンドで前処置される。
【００２０】
[0020]  本発明の一実施形態において、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リヒタートランスフォーメーションを伴うＣＬＬ（リヒター症候群）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される。別の実施形態において、血液悪性腫瘍は、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）である。本発明の一実施形態において、ＰＢＬは、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＰＢＬの量で投与される。
【００２１】
[0021]  本発明の一実施形態において、骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する方法は、
ａ．骨髄から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＰＢＭＣのサンプルから、ＭＩＬを含むＣＤ３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ２０＋及びＣＤ１４＋細胞画分（ＭＩＬ細胞画分）並びに非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋、非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽細胞画分）を選別すること；
ｃ．任意選択により、ＡＭＬ芽細胞画分を破砕すること；
ｄ．任意選択により破砕されたＡＭＬ芽細胞画分をＭＩＬ細胞画分に約０．１：１〜約１０：１の細胞数比で添加すること；
ｅ．ＡＭＬ芽細胞画分を伴うか又は伴わないＭＩＬ細胞画分を、ＩＬ−２を含む第１の細胞培養培地中のガス透過性容器内で培養すること；
ｆ．抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でＭＩＬを刺激して、ＭＩＬの拡大培養を入手すること；
ｇ．約２〜約６日間の追加の期間にわたり、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でＭＩＬを再刺激すること；
ｈ．約１〜約３日間の追加の期間にわたり、追加のＩＬ−２と共にＭＩＬを培養すること；及び
ｉ．前記ＭＩＬを回収すること
を含む。
【００２２】
[0022]  本発明の一実施形態において、方法は、ステップ（ｅ）後にＩＬ−２を添加し、且つ第１の細胞培養培地を第２の細胞培養培地に交換することを更に含む。一実施形態において、第１の細胞培養培地及び第２の細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４及びＡＩＭ−Ｖからなる群からそれぞれ個別に選択される。別の実施形態において、第１及び第２の細胞培養培地は、同じである。別の実施形態において、第１及び第２の細胞培養培地は、異なる。
【００２３】
[0023]  一実施形態において、ステップ（ｅ）の開始時、ガス透過性容器内に少なくとも約２×１０４〜約５×１０５個のＭＩＬが存在する。別の実施形態において、ステップ（ｅ）の開始時、ガス透過性容器内に少なくとも約２．８×１０４〜３．４×１０５個のＭＩＬが存在する。別の実施形態において、ステップ（ｅ）の開始時、ガス透過性容器内に少なくとも５×１０５個のＭＩＬが存在する。
【００２４】
[0024]  本発明の一実施形態において、ＩＬ−２は、ステップ（ｅ）において１０００ＩＵ／ｍｌ〜６０００ＩＬ／ｍｌの濃度で存在する。別の実施形態において、ＩＬ−２は、約６０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。別の実施形態において、ＩＬ−２は、ステップ（ｇ）において約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。別の実施形態において、ＩＬ−２は、ステップ（ｈ）において約３０００ＩＵ／ｍｌの濃度で存在する。
【００２５】
[0025]  一実施形態において、ステップ（ｅ）における培養は、約３日の期間にわたって行われる。一実施形態において、ステップ（ｆ）における刺激は、約４日の期間にわたって行われる。一実施形態において、ステップ（ｇ）における刺激は、約７日の期間にわたって行われる。
【００２６】
[0026]  本発明の一実施形態において、任意選択により破砕されたＡＭＬ芽細胞画分は、超音波処理、均質化、ボルテックス、振動及び溶解からなる群から選択される方法を使用して破砕される。本発明の一実施形態において、非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋、非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽細胞画分）は、高温溶解、化学溶解（有機アルコールなど）、酵素溶解及び当技術分野で公知の他の細胞溶解方法を含む適切な溶解方法を使用して溶解される。
【００２７】
[0027]  本発明の一実施形態において、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体は、ビーズ上にコーティングされ、及びＭＩＬ：ビーズ比は、ステップ（ｆ）及び（ｇ）のそれぞれにおいて約１：１である。
【００２８】
[0028]  本発明の一実施形態において、方法は、閉鎖滅菌系で実施される。
【００２９】
[0029]  本発明の一実施形態において、骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する方法は、
ａ．骨髄から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＰＢＭＣのサンプルから、ＭＩＬを含むＣＤ３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ２０＋及びＣＤ１４＋細胞画分（ＭＩＬ細胞画分）並びに非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋、非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽細胞画分）を選別すること；
ｃ．ＡＭＬ芽細胞画分を破砕し、且つ破砕されたＡＭＬ芽細胞画分を約１：１の細胞数比でＭＩＬ細胞画分に添加すること；
ｄ．約６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を含む第１の細胞培養培地を有するガス透過性容器内に含有される細胞培養物中のＭＩＬ及びＡＭＬ芽細胞画分を約３日間の期間にわたって培養すること；
ｅ．ビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体を約１：１（ＭＩＬ：ビーズ）の比率で細胞培養物に添加し、且つ約１日間の期間にわたってＭＩＬ及び抗体を培養すること；
ｆ．第１の細胞培養培地を、約３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を含む第２の細胞培養培地に交換すること；
ｇ．約３日間の追加の期間にわたって抗体及びＭＩＬを培養すること；
ｈ．少なくとも約４日間の追加の期間にわたり、ＩＬ−２及びビーズに固定化された抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でＭＩＬを再刺激すること；
ｉ．第２の細胞培養培地を、約３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を含む第３の細胞培養培地に交換し、且つ少なくとも約３日間の追加の期間にわたって培養すること；
ｊ．前記ＭＩＬを回収すること
を含む。
【００３０】
[0030]  本発明の一実施形態において、患者における血液悪性腫瘍を処置する方法は、
ａ．患者の骨髄から末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）のサンプルを入手することであって、前記サンプルは、任意選択により、凍結保存される、入手すること；
ｂ．ＰＢＭＣのサンプルから、ＭＩＬを含むＣＤ３＋、ＣＤ３３＋、ＣＤ２０＋及びＣＤ１４＋細胞画分（ＭＩＬ細胞画分）並びに非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋、非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽細胞画分）を選別すること；
ｃ．任意選択により、ＡＭＬ芽細胞画分を破砕すること；
ｄ．任意選択により破砕されたＡＭＬ芽細胞画分をＭＩＬ細胞画分に約０．１：１〜約１０：１の細胞数比で添加すること；
ｅ．ＡＭＬ芽細胞画分を伴うか又は伴わないＭＩＬ細胞画分を、ＩＬ−２を含む第１の細胞培養培地中のガス透過性容器内で培養すること；
ｆ．抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でＭＩＬを刺激すること；
ｇ．少なくとも約４日間の追加の期間にわたり、ＩＬ−２及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体でＭＩＬを再刺激すること；
ｈ．少なくとも約３日間の追加の期間にわたり、追加のＩＬ−２と共にＭＩＬを培養すること；
ｉ．前記ＭＩＬを回収すること；及び
ｊ．血液悪性腫瘍を処置するために前記ＭＩＬを治療有効量で患者に投与すること
を含む。
【００３１】
[0031]  本発明の一実施形態において、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リヒタートランスフォーメーションを伴うＣＬＬ（リヒター症候群）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される。別の実施形態において、血液悪性腫瘍は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）である。本発明の一実施形態において、ＭＩＬは、約４×１０８〜約２．５×１０９個のＭＩＬの量で投与される。
【００３２】
図面の簡単な説明
[0032]  前述の概要及び以下の発明の詳細な説明は、添付の図面と併せて読むことでよりよく理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】[0033]リンパ腫腫瘍の病理情報を示す。
【図２】[0034]リンパ腫及び黒色腫ＴＩＬの異なるサブセットの比較を示し、これは、リンパ腫ＴＩＬのエフェクターメモリー（ＥＭ）サブセットが黒色腫ＴＩＬのＥＭサブセットよりも有意に高いことを示している。
【図３】[0035]リンパ腫及び黒色腫ＴＩＬの異なるサブセットの比較を示し、これは、リンパ腫ＴＩＬのＣＤ２８＋ＣＤ４＋サブセットが黒色腫ＴＩＬのこれらのサブセットよりも有意に高いことを示している。
【図４】[0036]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、分化マーカーを示している。グラフの赤線は、中央値を表す。ＣＭは、セントラルメモリーＴ細胞を指し、ＥＭは、エフェクターメモリーＴ細胞を指し、ＴＥＭＲＡは、エフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を指す。
【図５】[0037]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、分化マーカーを示している。グラフの赤線は、中央値を表す。ＣＭは、セントラルメモリーＴ細胞を指し、ＥＭは、エフェクターメモリーＴ細胞を指し、ＴＥＭＲＡは、エフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋Ｔ細胞を指す。
【図６】[0038]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、枯渇マーカーを示している。グラフの赤線は、中央値を表す。ＬＡＧ３は、リンパ球活性化遺伝子３を指し、ＰＤ１は、プログラム死１を指し、ＴＩＧＩＴは、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体を指す。
【図７】[0039]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬのＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの比較を示し、これは、枯渇マーカーを示している。グラフの赤線は、中央値を表す。ＬＡＧ３は、リンパ球活性化遺伝子３を指し、ＰＤ１は、プログラム死１を指し、ＴＩＧＩＴは、Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体を指す。
【図８】[0040]非ホジキンリンパ腫ＴＩＬと黒色腫ＴＩＬとの間の細胞型の比較を示す。ＮＫは、ナチュラルキラー細胞を指し、ＴＣＲａｂは、アルファ及びベータ鎖を有するＴ細胞受容体を発現する細胞を指す。
【図９】[0041]生物発光リダイレクト溶解アッセイ（ＢＲＬＡ）の結果を示す。
【図１０】[0042]リンパ腫ＴＩＬ対黒色腫ＴＩＬのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す。
【図１１】[0043]リンパ腫ＴＩＬの酵素結合免疫スポット（ELIspot）アッセイの結果を示す。
【図１２】[0044]黒色腫ＴＩＬのELIspotアッセイ結果を示す。
【図１３】[0045]NANOSTRING NCOUNTER分析の結果を示し、これは、リンパ腫ＴＩＬが、黒色腫ＴＩＬと比較してより高いレベルのＲＯＲＣ  ＩＬ１７Ａ（ＴＨ１７表現型）及びＧＡＴＡ３（Ｔｈ２表現型）を発現することを示している。各遺伝子は、ヒートマップの赤枠で強調表示される。
【図１４】[0046]ＴＩＬ拡大培養及び処置プロセスを示す。ステップ１は、１０個のG-Rex 10フラスコへの４つの腫瘍断片の添加を指す。ステップ２では、およそ４０×１０６ＴＩＬ以上が入手される。ステップ３では、ＲＥＰのために３６個のG-Rex 100フラスコへの分割が生じる。ステップ４では、ＴＩＬを遠心分離によって回収する。新鮮なＴＩＬ生成物は、およそ４３日の合計プロセス時間後にステップ５で入手され、その時点でＴＩＬが患者に注入され得る。
【図１５】[0047]本開示のリンパ腫から入手したＴＩＬを伴う使用のための処置プロトコルを示す。手術（及び腫瘍切除）は、開始時に行われ、リンパ球枯渇化学療法は、本明細書の他の箇所に記載されているように、化学療法を伴う骨髄非破壊的リンパ球枯渇を指す。
【図１６Ａ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。ナイーブＴ細胞サブセットを示す。Ｐ値は、両側Mann-Whitney検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１６Ｂ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。セントラルメモリーＴ細胞サブセット（ＣＭ）合を示す。Ｐ値は、両側Mann-Whitney検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１６Ｃ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。エフェクターメモリーＴ細胞サブセット（ＥＭ）を示す。Ｐ値は、両側Mann-Whitney検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１６Ｄ】[0048]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ２を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ２を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ８  Ｔ細胞の異なるサブ集団を表す。最終分化エフェクターメモリー（ＴＥＭＲＡ）Ｔ細胞サブセットのＣＤ４及びＣＤ８細胞の割合を示す。Ｐ値は、両側Mann-Whitney検定（不対）を使用して計算された。細胞サブセットの平均割合は、水平バーで表される。
【図１７Ａ】[0049]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ１を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ１を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ９  Ｔ細胞の異なるＣＤ２７＋サブ集団を表し、これは、リンパ腫ＴＩＬにおける共刺激分子ＣＤ２８発現ＣＤ４  Ｔ細胞の割合が高いことを示す。Ｐ値は、両側Mann-Whitney検定（不対）を使用して計算された。
【図１７Ｂ】[0049]以下の実施例４に記載される標準表現型パネルＤＦ１を使用したフローサイトメトリー分析の結果を示す。リンパ腫及び黒色腫のＴＩＬは、実施例４に記載されているように標準表現型パネルＤＦ１を使用して染色された。示されるデータは、ＴＩＬの総ＣＤ４及びＣＤ９  Ｔ細胞の異なるＣＤ２８＋サブ集団を表し、これは、リンパ腫ＴＩＬにおける共刺激分子ＣＤ２８発現ＣＤ４  Ｔ細胞の割合が高いことを示す。Ｐ値は、両側Mann-Whitney検定（不対）を使用して計算された。
【図１８Ａ】[0050]以下の実施例４に従って実施されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）試験の結果を示す。ELIspotを使用した結果を示す。ELIspotデータは、１０６個のＴＩＬあたりのＩＦＮ−γ産生細胞として表される。Ｐ値は、両側Mann-Whitney検定（不対）を使用して計算された。
【図１８Ｂ】[0050]以下の実施例４に従って実施されたインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）試験の結果を示す。ＥＬＩＳＡを使用した結果を示す。ＥＬＩＳＡデータは、ＥＬＩＳＡ（対数目盛）により測定される５×１０５ＴＩＬ／ウェルのＴＩＬ培養物の上清におけるＩＦＮ−γレベルとして表される。Ｐ値は、両側Mann-Whitney検定（不対）を使用して計算された。
【図１９Ａ】[0051]ＴＩＬの溶解能力を示す。共培養（ＴＩＬエフェクター細胞とＧＦＰ＋Ｐ８１５標的細胞）における４時間で１０６ＴＩＬに正規化された標的細胞のＬＵ５０を示す。
【図１９Ｂ】[0051]ＴＩＬの溶解能力を示す。共培養（ＴＩＬエフェクター細胞とＧＦＰ＋Ｐ８１５標的細胞）における２４時間で１０６ＴＩＬに正規化された標的細胞のＬＵ５０を示す。
【図２０Ａ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。同種異系の５２６の標的細胞に対する黒色腫ＴＩＬの細胞溶解活性を示す。図２０Ａのデータは、エフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率が５０：１の共培養における死細胞パーセントとして示されている。
【図２０Ｂ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。７−ＡＡＤ取り込みにより決定された自己腫瘍細胞に対するリンパ腫ＴＩＬの細胞溶解活性を示す。図２０Ｂのデータは、エフェクター細胞：標的細胞（Ｅ：Ｔ）の比率が５０：１の共培養における死細胞パーセントとして示されている。
【図２０Ｃ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。黒色腫ＴＩＬによって誘導された標的細胞の殺傷パーセントを表す。
【図２０Ｄ】[0052]同種異系及び自己腫瘍タイプに対する異なるＴＩＬの細胞溶解活性を示す。異なるＥ：Ｔ比でのリンパ腫ＴＩＬによって誘導された標的細胞の殺傷パーセントを表す。
【図２１】[0053]リンパ腫及び黒色腫ＴＩＬの遺伝子発現プロファイルを示すヒートマップである。発現プロファイルは、NanoStringの５７９プレックスnCounter GX Human Immunology V2 CSOパネルによって決定された。ヒートマップは、黒色腫ＴＩＬと比較したリンパ腫ＴＩＬの特定の遺伝子セットの発現における変化を示し、リンパ腫由来ＴＩＬからのＩＬ−１７Ａ及びＲＯＲＣのより高い発現を示唆している。この図に示される癌は、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）及びマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）を含む。
【図２２】[0054]ＴＩＬの調製、回収及び出荷スケジュールの２Ａプロセスを示す概略図である。
【図２３】[0055]ＴＩＬを準備するための２Ａプロセスを示すフローチャートである。
【図２４Ａ】[0056]末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養するための３つの異なる方法を示すフローチャートである。
【図２４Ｂ】[0056]末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養するための３つの異なる方法を示すフローチャートである。
【図２４Ｃ】[0056]末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養するための３つの異なる方法を示すフローチャートである。
【図２５Ａ】[0057]骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する３つの異なる方法を表す。
【図２５Ｂ】[0057]骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する３つの異なる方法を表す。
【図２５Ｃ】[0057]骨髄から骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する３つの異なる方法を表す。
【図２６】[0058]新鮮な末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及び凍結保存されたＰＢＭＣから分離されたＰＢＬの拡大倍数のグラフを表す。凍結保存されたＰＢＭＣは、イブルチニブレジメンで処置されていない（プレＲｘ  ＰＢＬ）又は処置された（ポストＲｘ  ＰＢＬ）、ＣＬＬを有する患者に由来する。図２６〜３４について、各点は、１人の患者である。影付きの点は、ＰＢＬ方法１を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；中空の点は、ＰＢＬ方法２を使用してＰＢＬが拡大培養された患者であり；黒点は、ＰＢＬ方法３を使用してＰＢＬが拡大培養された患者である。
【図２７】[0059]新鮮なＰＢＭＣ及び凍結保存されたＰＢＭＣから分離されたＰＢＬのＩＦＮ−γ産生細胞のグラフを表す。凍結保存されたＰＢＭＣ内でプレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬも表される。
【図２８】[0060]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの割合を表す。
【図２９Ａ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットとの間の比較を示す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図２９Ｂ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットとの間の比較を示す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図２９Ｃ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットとの間の比較を示す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図２９Ｄ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットとの間の比較を示す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図３０Ａ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットとの間の比較を示す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図３０Ｂ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットとの間の比較を示す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図３０Ｃ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットとの間の比較を示す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図３０Ｄ】[0061]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットとの間の比較を示す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図３１Ａ】[0062]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４サブセットのＣＤ２７サブセットとの間の比較を示す。
【図３１Ｂ】[0062]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８サブセットのＣＤ２７サブセットとの間の比較を示す。
【図３２Ａ】[0063]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４サブセットのＣＤ２８サブセットとの間の比較を示す。
【図３２Ｂ】[0063]コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８サブセットのＣＤ２８サブセットとの間の比較を示す。
【図３３Ａ】[0064]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ４集団内のＬＡＧ３＋サブセットの比較を示す。
【図３３Ｂ】[0064]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ８集団内のＬＡＧ３＋サブセットの比較を示す。
【図３４Ａ】[0065]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ４集団内のＰＤ１＋サブセットの比較を示す。
【図３４Ｂ】[0065]プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方のＣＤ８集団内のＰＤ１＋サブセットの比較を示す。
【図３５Ａ】[0066]自己腫瘍殺傷アッセイを使用して測定されたプレＲｘ  ＰＢＬの細胞溶解活性の結果を示す。細胞傷害性は、ＬＵ５０（標的細胞の５０％を殺傷するのに必要なＰＢＬの数）として測定される。
【図３５Ｂ】[0066]自己腫瘍殺傷アッセイを使用して測定されたポストＲｘ  ＰＢＬの細胞溶解活性の結果を示す。細胞傷害性は、ＬＵ５０（標的細胞の５０％を殺傷するのに必要なＰＢＬの数）として測定される。
【図３６Ａ】[0067]ＡＭＬ患者の骨髄（ＭＩＬ）又は末梢血（ＰＢＬ）のいずれかから分離されたＭＩＬの拡大倍数のグラフを表す。ＭＩＬ１．１は、ＭＩＬ方法１を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．２は、ＭＩＬ方法２を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ２及びＭＩＬ３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。全てのＰＢＬは、ＰＢＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ１．３の開始細胞数は、１３８，０００個の細胞であり、ＭＩＬ２の開始細胞数は、６２，０００個であり、ＭＩＬ３の開始細胞数は、２８，０００個の細胞であった。ＰＢＬ２の開始細胞数は、３３８，０００であり、ＰＢＬ３の開始細胞数は、３３６，０００であった。
【図３６Ｂ】[0067]ＡＭＬ患者の骨髄（ＭＩＬ）又は末梢血（ＰＢＬ）のいずれかから分離されたＰＢＬの拡大倍数のグラフを表す。ＭＩＬ１．１は、ＭＩＬ方法１を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．２は、ＭＩＬ方法２を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ２及びＭＩＬ３は、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養された。全てのＰＢＬは、ＰＢＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ１．３の開始細胞数は、１３８，０００個の細胞であり、ＭＩＬ２の開始細胞数は、６２，０００個であり、ＭＩＬ３の開始細胞数は、２８，０００個の細胞であった。ＰＢＬ２の開始細胞数は、３３８，０００であり、ＰＢＬ３の開始細胞数は、３３６，０００であった。
【図３７Ａ】[0068]ＭＩＬのそれぞれのＩＦＮ−γ産生細胞を示す。
【図３７Ｂ】[0068]ＰＢＬのそれぞれのＩＦＮ−γ産生細胞を示す。
【図３８Ａ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＴ細胞メモリーサブセットを示すグラフを表す。ＴＣＲαβ＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｂ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＴ細胞メモリーサブセットを示すグラフを表す。ＣＤ４＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｃ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＴ細胞メモリーサブセットを示すグラフを表す。ＣＤ８サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｄ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＴ細胞メモリーサブセットを示すグラフを表す。ＴＣＲαβ＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｅ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＴ細胞メモリーサブセットを示すグラフを表す。ＣＤ４＋サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３８Ｆ】[0069]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＴ細胞メモリーサブセットを示すグラフを表す。ＣＤ８サブセットを示す。ＰＢＬは、０日目及び１４日目に示される。
【図３９Ａ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図３９Ｂ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図３９Ｃ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図３９Ｄ】[0070]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４０Ａ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４０Ｂ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４０Ｃ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４０Ｄ】[0071]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４１Ａ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４１Ｂ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４１Ｃ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４１Ｄ】[0072]ＡＭＬ患者から分離されたＭＩＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４２Ａ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４２Ｂ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４２Ｃ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示す。
【図４２Ｄ】[0073]ＡＭＬ患者から分離されたＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットを示すグラフを表す。最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。
【図４３Ａ】[0074]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２７サブセットを示すグラフを表す。
【図４３Ｂ】[0074]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２７サブセットを示すグラフを表す。
【図４４Ａ】[0075]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２８サブセットを示すグラフを表す。
【図４４Ｂ】[0075]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＣＤ２８サブセットを示すグラフを表す。
【図４５Ａ】[0076]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＰＤ１＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４５Ｂ】[0076]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＰＤ１＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４６Ａ】[0077]ＭＩＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＬＡＧ３＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４６Ｂ】[0077]ＰＢＬのＣＤ４及びＣＤ８細胞集団のＬＡＧ３＋サブセットを示すグラフを表す。
【図４７】[0078]ＰＢＬ方法１及びＰＢＬ方法３の例示的な実施形態を示すタイムラインである。この図において、ＩＬ−２の添加は、プロセス中の任意の時点で、例示的な実施形態において、括弧で囲まれた領域上で発生し得る。
【図４８】[0079]ＭＩＬ方法３の例示的な実施形態を示すタイムラインである。この図において、ＩＬ−２の添加は、プロセス中の任意の時点で、例示的な実施形態において、括弧で囲まれた領域上で発生し得る。
【図４９】[0080]本明細書に記載されるように、ＣＬＬなどの血液悪性腫瘍の処置に有用なＰＢＬ（イブルチニブで前処置された患者からのＰＢＬを含む）を拡大培養する方法を示す、本発明の例示的な実施形態である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
配列表の簡単な説明
[0081]  配列番号１は、ムロモナブの重鎖のアミノ酸配列である。
【００３５】
[0082]  配列番号２は、ムロモナブの軽鎖のアミノ酸配列である。
【００３６】
[0083]  配列番号３は、組換えヒトＩＬ−２タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３７】
[0084]  配列番号４は、アルデスロイキンのアミノ酸配列である。
【００３８】
[0085]  配列番号５は、組換えヒトＩＬ−４タンパク質のアミノ酸配列である。
【００３９】
[0086]  配列番号６は、組換えヒトＩＬ−７タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４０】
[0087]  配列番号７は、組換えヒトＩＬ−１５タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４１】
[0088]  配列番号８は、組換えヒトＩＬ−２１タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４２】
発明の詳細な説明
[0089]  他に定義されない限り、本明細書中で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書で言及された全ての特許及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４３】
定義
[0090]  本明細書で使用される「共投与」、「共投与すること」、「〜と組み合わせて投与される」、「〜と組み合わせて投与すること」、「同時（simultaneous）」及び「同時（concurrent）」という用語は、活性医薬成分及び／又はそれらの代謝産物の両方が同時に対象内に存在するための、対象への２つ以上の活性医薬成分の投与を包含する。共投与には、別々の組成物中での同時投与、別々の組成物中での異なる時点における投与又は２つ以上の活性医薬成分が存在する組成物での投与が含まれる。別々の組成物での同時投与及び両方の薬剤が存在する組成物での投与が好ましい。
【００４４】
[0091]  「インビボ」という用語は、哺乳動物対象の体内で起こる事象を指す。
【００４５】
[0092]  「エクスビボ」という用語は、人工環境において哺乳動物対象の体の外側で起こる事象を指す。
【００４６】
[0093]  「インビトロ」という用語は、試験系で起こる事象を指す。インビトロアッセイは、生存細胞又は死細胞が使用され得る細胞ベースのアッセイを包含し、無傷細胞が使用されない無細胞アッセイも包含し得る。
【００４７】
[0094]  「急速拡大培養」という用語は、１週間の期間にわたって少なくとも約３倍（又は４倍、５倍、６倍、７倍、８倍又は９倍）、より好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１０倍（又は２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍又は９０倍）又は最も好ましくは１週間の期間にわたって少なくとも約１００倍の抗原特異的ＴＩＬの数の増加を意味する。いくつかの急速拡大培養プロトコルが本明細書に記載されている。
【００４８】
[0095]  腫瘍を破砕するプロセスを説明するために本明細書で使用される「断片化」、「断片」及び「断片化された」という用語には、腫瘍組織の破砕、スライス、分割及び細切並びに腫瘍組織の物理的構造を破砕する任意の他の方法などの機械的断片化方法が含まれる。
【００４９】
[0096]  「末梢血単核細胞」及び「ＰＢＭＣ」という用語は、リンパ球（Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞）及び単球を含む、円形核を有する末梢血細胞を指す。任意選択により、末梢血単核細胞は、照射同種異系末梢血単核細胞である。ＰＢＭＣは、抗原提示細胞を含む。「ＰＢＬ」という用語は、末梢血リンパ球を指し、末梢血から拡大培養したＴ細胞である。ＰＢＬ及びＴＩＬという用語は、本明細書において互換的に使用される。
【００５０】
[0097]  「抗ＣＤ３抗体」という用語は、抗体又はその変異体、例えばモノクローナル抗体を指し、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体中のＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含む。抗ＣＤ３抗体には、ムロモナブとしても知られるＯＫＴ−３及びＵＣＨＴ−１が含まれる。他の抗ＣＤ３抗体には、例えば、オテリキシズマブ、テプリズマブ及びビジリズマブが含まれる。
【００５１】
[0098]  「ＯＫＴ−３」（本明細書では「ＯＫＴ３」とも称される）という用語は、成熟Ｔ細胞のＴ細胞抗原受容体中のＣＤ３受容体に対して指向されたヒト、ヒト化、キメラ又はマウス抗体を含むモノクローナル抗体若しくはバイオシミラー又はその変異体を指し、ＯＫＴ−３（３０ｎｇ／ｍＬ、MACS GMP CD3 pure、Miltenyi Biotech, Inc., San Diego, CA, USA）及びムロモナブ又はその変異体、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム若しくはバイオシミラーなどの市販の形態を含む。ムロモナブの重鎖及び軽鎖のアミノ酸配列を表１に示す（配列番号１及び配列番号２）。ＯＫＴ−３を産生することができるハイブリドーマは、American Type Culture Collectionに寄託されており、ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ  ８００１が割り当てられている。ＯＫＴ−３を産生することができるハイブリドーマもEuropean Collection of Authenticated Cell Cultures（ＥＣＡＣＣ）に寄託されており、カタログ番号８６０２２７０６が割り当てられている。
【００５２】
【表１】
2021503885.tif 000003
【００５３】
[0099]  「ＩＬ−２」（本明細書では「ＩＬ２」とも称される）という用語は、インターロイキン−２として知られるＴ細胞増殖因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びその変異体を含む全ての形態のＩＬ−２を含む。ＩＬ−２は、例えば、Nelson, J. Immunol.2004, 172, 3983-88及びMalek, Annu.Rev. Immunol.2008, 26, 453-79に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−２のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号３）。例えば、ＩＬ−２という用語は、アルデスロイキン（PROLEUKIN、１つの単回使用バイアルあたり２２００万ＩＵで複数の供給元から市販されている）並びにCellGenix, Inc., Portsmouth, NH, USA（CELLGRO GMP）又はProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-209-b）から市販で供給される組換えＩＬ−２の形態及び他の販売業者からの他の市販の均等物などのＩＬ−２のヒト組換え型を包含する。アルデスロイキン（デス−アラニル−１、セリン−１２５ヒトＩＬ−２）は、分子量およそ１５ｋＤａの非グリコシル化ヒト組換え型ＩＬ−２である。本発明における使用に適したアルデスロイキンのアミノ酸配列を表２に示す（配列番号４）。ＩＬ−２という用語は、本明細書に記載されているように、Nektar Therapeutics, South San Francisco, CA, USAから入手可能なペグ化ＩＬ２プロドラッグＮＫＴＲ−２１４を含むペグ化形態のＩＬ−２も包含する。本発明での使用に好適なＮＫＴＲ−２１４及びペグ化ＩＬ−２が米国特許出願公開第２０１４／０３２８７９１Ａ１号及び国際公開第２０１２／０６５０８６Ａ１号（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。本発明での使用に適したコンジュゲートＩＬ−２の代替形態は、米国特許第４，７６６，１０６号、同第５，２０６，３４４号、同第５，０８９，２６１号及び同第４，９０２，５０２号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明における使用に適したＩＬ−２の製剤は、米国特許第６，７０６，２８９号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００５４】
【表２】
2021503885.tif 000004
【００５５】
[00100]  「ＩＬ−４」（本明細書では「ＩＬ４」とも称される）という用語は、インターロイキン４として知られるサイトカインを指し、これは、Ｔｈ２  Ｔ細胞により、且つ好酸球、好塩基球及び肥満細胞により産生される。ＩＬ−４は、ナイーブヘルパーＴ細胞（Ｔｈ０細胞）のＴｈ２  Ｔ細胞への分化を調節する。Steinke and Borish, Respir.Res.2001, 2, 66-70。ＩＬ−４によって活性化されると、Ｔｈ２  Ｔ細胞は、続いて、ポジティブフィードバックループにおいて、更なるＩＬ−４を産生する。ＩＬ−４は、Ｂ細胞増殖及びクラスＩＩ  ＭＨＣ発現も刺激し、Ｂ細胞からのＩｇＥ及びＩｇＧ１発現へのクラス切り替えを誘導する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−４は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-211）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号Gibco CTP0043）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−４のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号５）。
【００５６】
[00101]  用語「ＩＬ−７」（本明細書では「ＩＬ７」とも称される）は、インターロイキン７として知られるグリコシル化組織由来サイトカインを指し、これは、間質及び上皮細胞並びに樹状細胞から入手し得る。Fry and Mackall, Blood 2002, 99, 3892-904。ＩＬ−７は、Ｔ細胞の発現を刺激することができる。ＩＬ−７は、胸腺内のＴ細胞発生及び末梢内での生存に重要な一連のシグナルにおいて、ＩＬ−７受容体アルファ及び一般的なガンマ鎖受容体からなるヘテロ二量体であるＩＬ−７受容体に結合する。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−７は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-254）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−７組換えタンパク質、カタログ番号Gibco PHC0071）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−７のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号６）。
【００５７】
[00102]  「ＩＬ−１５」（本明細書では「ＩＬ１５」とも称される）という用語は、インターロイキン−１５として知られるＴ細胞増殖因子を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びその変異体を含む全ての形態のＩＬ−１５を含む。ＩＬ−１５は、例えば、Fehniger and Caligiuri, Blood 2001, 97, 14-32に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−１５は、β及びγシグナル伝達受容体サブユニットをＩＬ−２と共有する。組換えヒトＩＬ−１５は、分子量１２．８ｋＤａの１１４個のアミノ酸（及びＮ末端メチオニン）を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−１５は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-230-b）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−１５組換えタンパク質、カタログ番号34-8159-82）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−１５のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号７）。
【００５８】
[00103]  「ＩＬ−２１」（本明細書では「ＩＬ２１」とも称される）という用語は、インターロイキン−２１として知られる多面発現性サイトカインタンパク質を指し、ヒト及び哺乳動物の形態、保存的アミノ酸置換、グリコフォーム、バイオシミラー及びその変異体を含む全ての形態のＩＬ−２１を含む。ＩＬ−２１は、例えば、Spolski and Leonard, Nat.Rev. Drug.Disc.2014, 13, 379-95に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＩＬ−２１は、主にナチュラルキラーＴ細胞及び活性化ヒトＣＤ４＋Ｔ細胞によって産生される。組換えヒトＩＬ−２１は、分子量１５．４ｋＤａの１３２個のアミノ酸を含有する単一の非グリコシル化ポリペプチド鎖である。組換えヒトＩＬ−２１は、ProSpec-Tany TechnoGene Ltd., East Brunswick, NJ, USA（カタログ番号CYT-408-b）及びThermoFisher Scientific, Inc., Waltham, MA, USA（ヒトＩＬ−２１組換えタンパク質、カタログ番号14-8219-80）を含む複数の供給元から市販されている。本発明における使用に適した組換えヒトＩＬ−２１のアミノ酸配列を表２に示す（配列番号８）。
【００５９】
[00104]  「薬学的に許容される担体」又は「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、あらゆる溶媒、分散媒体、コーティング、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤並びに不活性成分を含むことを意図している。活性医薬成分のためのそのような薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤の使用は、当技術分野において周知である。任意の従来の薬学的に許容される担体又は薬学的に許容される賦形剤が活性医薬成分と適合しない場合を除いて、本発明の治療用組成物におけるその使用が企図される。他の薬物などの追加の活性医薬成分も記載の組成物及び方法に組み込むことができる。
【００６０】
[00105]  １つの「抗体」及び複数の「抗体」という用語は、免疫グロブリン全体及び任意の抗原結合断片（「抗原結合部分」）又はそれらの単鎖を指す。「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互連結された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖及び２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質又はその抗原結合部分を更に指す。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと略す）及び重鎖定常領域で構成される。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２及びＣＨ３で構成される。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと略す）及び軽鎖定常領域で構成される。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬで構成される。抗体のＶＨ及びＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）又は超可変領域（ＨＶＲ）と称され、より保存された領域（フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる）に分散することができる、超可変性を有する領域に更に細分化され得る。各ＶＨ及びＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端に向かって、ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順に配置された３つのＣＤＲ及び４つのＦＲで構成される。重鎖及び軽鎖の可変領域は、１つ又は複数の抗原エピトープと相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えば、エフェクター細胞）及び古典的補体系の第１の成分（Ｃｌｑ）を含む宿主組織又は因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【００６１】
[00106]  「抗原」という用語は、免疫応答を誘導する物質を指す。一部の実施形態において、抗原は、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子によって提示される場合、抗体又はＴＣＲによって結合され得る分子である。本明細書で使用される場合、「抗原」という用語は、Ｔ細胞エピトープも包含する。抗原は、免疫系によって更に認識され得る。一部の実施形態において、抗原は、Ｂリンパ球及び／又はＴリンパ球の活性化をもたらす体液性免疫応答又は細胞性免疫応答を誘導することができる。一部の場合、これは、抗原がＴｈ細胞エピトープを含有するか又はそれに結合していることを要し得る。抗原は、１つ以上のエピトープ（例えば、Ｂエピトープ及びＴエピトープ）も有し得る。一部の実施形態において、抗原は、好ましくは、典型的には高度に特異的且つ選択的な態様でその対応する抗体又はＴＣＲと反応し、他の抗原によって誘導され得る多数の他の抗体又はＴＣＲと反応しない。
【００６２】
[00107]  「モノクローナル抗体」、「ｍＡｂ」、「モノクローナル抗体組成物」という用語又はそれらの複数形は、単一分子組成の抗体分子の調製物を指す。モノクローナル抗体組成物は、特定のエピトープに対して単一の結合特異性及び親和性を示す。特定の受容体に特異的なモノクローナル抗体は、試験対象に適切な抗原を注射し、次いで所望の配列又は機能的特徴を有する抗体を発現するハイブリドーマを分離するという当技術分野における知識及び技術を用いて作製することができる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することにより）容易に分離及び配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。ＤＮＡは、分離されると発現ベクター中に入れられ得、次いで、これを、大腸菌（E. coli）細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又は他の方法では免疫グロブリンタンパク質を産生しない骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトして、組換え宿主細胞中でモノクローナル抗体の合成を入手する。抗体の組換え産生は、以下により詳細に記載される。
【００６３】
[00108]  本明細書で使用される場合、抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」（又は単に「抗体部分」若しくは「断片」）という用語は、特異的に抗原に結合する能力を保持する抗体の１つ以上の断片を指す。抗体の抗原結合機能は全長抗体の断片によって行われ得ることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に包含される結合断片の例には、（ｉ）ＶＬ、ＶＨ、ＣＬ及びＣＨ１ドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨ又はＶＬドメインからなり得るドメイン抗体（ｄＡｂ）断片（Ward, et al., Nature, 1989, 341, 544-546）；並びに（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）が含まれる。更に、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬ及びＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、それらは、組換え法を用いて、ＶＬ及びＶＨ領域ペアが単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる一価分子を形成する単一のタンパク質鎖として、それらが作製されることを可能にする合成リンカーによって連結され得る；例えば、Bird, et al., Science 1988, 242, 423-426；及びHuston, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1988, 85, 5879-5883を参照されたい）。そのようなｓｃＦｖ抗体は、抗体の「抗原結合部分」又は「抗原結合断片」という用語内に包含されることも意図している。これらの抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して入手され、断片は、無傷の抗体と同じ方法で有用性についてスクリーニングされる。
【００６４】
[00109]  本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図している。更に、抗体が定常領域を含有する場合、定常領域もヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する。本発明のヒト抗体は、ヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダム又は部位特異的変異誘発又はインビボでの体細胞変異によって導入された変異）を含み得る。本明細書で使用される「ヒト抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を含むことを意図しない。
【００６５】
[00110]  「ヒトモノクローナル抗体」という用語は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域の両方がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する単一の結合特異性を示す抗体を指す。一実施形態において、ヒトモノクローナル抗体は、トランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから入手され、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子及び軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。
【００６６】
[00111]  本明細書で使用される「組換えヒト抗体」という用語は、（ａ）ヒト免疫グロブリン遺伝子のトランスジェニック若しくはトランス染色体である動物（マウスなど）又はそれから調製されたハイブリドーマ（以下で更に説明する）から分離された抗体、（ｂ）ヒト抗体を発現するように形質転換された宿主細胞、例えばトランスフェクトーマから分離された抗体、（ｃ）組換えコンビナトリアルヒト抗体ライブラリーから分離された抗体、及び（ｄ）ヒト免疫グロブリン遺伝子配列の他のＤＮＡ配列へのスプライシングを含む任意の他の手段により調製、発現、生成又は分離された抗体など、組換え手段によって調製、発現、生成又は分離された全てのヒト抗体を含む。そのような組換えヒト抗体は、フレームワーク領域及びＣＤＲ領域がヒト生殖細胞系免疫グロブリン配列に由来する可変領域を有する。しかしながら、特定の実施形態において、そのような組換えヒト抗体は、インビトロ変異誘発（又はヒトＩｇ配列についてトランスジェニックな動物を使用する場合、インビボ体細胞変異誘発）に供することができ、従って、組換え抗体のＶＨ及びＶＬ領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞系のＶＨ及びＶＬ配列に由来し、それらに関係している一方、インビボでのヒト抗体生殖細胞系レパートリー内に天然に存在し得ない配列である。
【００６７】
[00112]  本明細書で使用される場合、「アイソタイプ」とは、重鎖定常領域遺伝子によってコードされる抗体クラス（例えば、ＩｇＭ又はＩｇＧ１）を指す。
【００６８】
[00113]  「抗原を認識する抗体」及び「抗原に特異的な抗体」という句は、本明細書において「抗原に特異的に結合する抗体」という用語と互換的に使用される。
【００６９】
[00114]  「ヒト抗体誘導体」という用語は、抗体と別の活性医薬成分又は抗体とのコンジュゲートを含む、ヒト抗体の任意の変異形態を指す。「コンジュゲート」、「抗体−薬物コンジュゲート」、「ＡＤＣ」又は「イムノコンジュゲート」という用語は、別の治療部分にコンジュゲートされた抗体又はその断片を指し、これは、当技術分野で利用可能な方法を使用して本明細書に記載の抗体にコンジュゲートすることができる。
【００７０】
[00115]  １つの「ヒト化抗体」又は複数の「ヒト化抗体」及び「ヒト化」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖細胞系に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植されている抗体を指すことを意図する。ヒトフレームワーク配列内で更なるフレームワーク領域の改変がなされ得る。ヒト化形態の非ヒト（例えば、マウス）抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含有するキメラ抗体である。ほとんどの部分について、ヒト化抗体は、レシピエントの超可変領域由来の残基が、所望の特異性、親和性及び能力を有する、マウス、ラット、ウサギ又は非ヒト霊長類などの非ヒト種の１５個の超可変領域（ドナー抗体）由来の残基によって置換されている、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）である。一部の例では、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にもドナー抗体にも見られない残基を含み得る。これらの改変は、抗体性能を更に改良するために行われる。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ここで、超可変ループの全て又は実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全て又は実質的に全てがヒト免疫グロブリン配列のものである。ヒト化抗体は、任意選択により、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものも含む。更なる詳細については、Jones, et al., Nature 1986, 321, 522-525；Riechmann, et al., Nature 1988, 332, 323-329；及びPresta, Curr.Op.Struct.Biol. 1992, 2, 593-596を参照されたい。本明細書に記載の抗体は、エフェクター機能及び／又はＦｃＲ結合に改善（例えば、減少）を付与することも知られている任意のＦｃ変異体を使用するように改変され得る。Ｆｃ変異体は、例えば、国際公開第１９８８／０７０８９Ａ１号、同第１９９６／１４３３９Ａ１号、同第１９９８／０５７８７Ａ１号、同第１９９８／２３２８９Ａ１号、同第１９９９／５１６４２Ａ１号、同第９９／５８５７２Ａ１号、同第２０００／０９５６０Ａ２号、同第２０００／３２７６７Ａ１号、同第２０００／４２０７２Ａ２号、同第２００２／４４２１５Ａ２号、同第２００２／０６０９１９Ａ２号、同第２００３／０７４５６９Ａ２号、同第２００４／０１６７５０Ａ２号、同第２００４／０２９２０７Ａ２号、同第２００４／０３５７５２Ａ２号、同第２００４／０６３３５１Ａ２号、同第２００４／０７４４５５Ａ２号、同第２００４／０９９２４９Ａ２号、同第２００５／０４０２１７Ａ２号、同第２００５／０７０９６３Ａ１号、同第２００５／０７７９８１Ａ２号、同第２００５／０９２９２５Ａ２号、同第２００５／１２３７８０Ａ２号、同第２００６／０１９４４７Ａ１号、同第２００６／０４７３５０Ａ２号及び同第２００６／０８５９６７Ａ２号；及び米国特許第５，６４８，２６０号；同第５，７３９，２７７号；同第５，８３４，２５０号；同第５，８６９，０４６号；同第６，０９６，８７１号；同第６，１２１，０２２号；同第６，１９４，５５１号；同第６，２４２，１９５号；同第６，２７７，３７５号；同第６，５２８，６２４号；同第６，５３８，１２４号；同第６，７３７，０５６号；同第６，８２１，５０５号；同第６，９９８，２５３号；及び同第７，０８３，７８４号に開示されるアミノ酸置換のいずれか１つを含み得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
[00116]  「キメラ抗体」という用語は、可変領域配列がマウス抗体に由来し、定常領域配列がヒト抗体に由来する抗体など、可変領域配列が１つの種に由来し、定常領域配列が別の種に由来する抗体を指すことを意図する。
【００７２】
[00117]  「ダイアボディ」は、２つの抗原結合部位を有する小さい抗体断片である。断片は、同じポリペプチド鎖（ＶＨ−ＶＬ又はＶＬ−ＶＨ）内の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）に接続された重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含む。同一鎖上の２つのドメイン間で対形成させるには短すぎるリンカーを使用することにより、そのドメインは、別の鎖の相補的ドメインと対形成し、２つの抗原結合部位を生成することを強いられる。ダイアボディは、例えば、欧州特許第４０４，０９７号、国際公開第９３／１１１６１号；及びBolliger, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1993, 90, 6444-6448に更に十分に記載されている。
【００７３】
[00118]  「グリコシル化」という用語は、抗体の改変誘導体を指す。アグリコシル化抗体は、グリコシル化を欠く。グリコシル化は、例えば、抗原に対する抗体の親和性を増加させるために改変することができる。そのような炭水化物改変は、例えば、抗体配列内の１つ以上のグリコシル化部位を変えることによって達成することができる。例えば、１つ以上の可変領域フレームワークグリコシル化部位の除去をもたらし、それによってその部位でのグリコシル化を除去する１つ以上のアミノ酸置換を行うことができる。米国特許第５，７１４，３５０号及び同第６，３５０，８６１号に記載されているように、アグリコシル化は、抗原に対する抗体の親和性を増加させ得る。追加的又は代替的に、減少したフコシル残基の量を有する低フコシル化抗体又は増加したバイセクティング（bisecting）ＧｌｃＮａｃ構造を有する抗体など、グリコシル化の種類が変更された抗体を作製することができる。そのような改変されたグリコシル化パターンは、抗体の能力を増大させることが実証されている。そのような炭水化物改変は、例えば、グリコシル化機構を変えて宿主細胞中で抗体を発現させることによって達成することができる。グリコシル化機構が改変された細胞は当技術分野において記載されており、本発明の組換え抗体を発現させ、それによって改変されたグリコシル化を有する抗体を産生するための宿主細胞として使用することができる。例えば、細胞株Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９は、フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８（アルファ（１，６）フコシルトランスフェラーゼ）を欠いているため、Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９細胞株で発現される抗体は、それらの炭水化物上でフコースを欠いている。Ｍｓ７０４、Ｍｓ７０５及びＭｓ７０９  ＦＵＴ８−／−細胞株は、２つの置換ベクターを使用して、ＣＨＯ／ＤＧ４４細胞中のＦＵＴ８遺伝子を標的とした破壊によって生成された（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１１０７０４号又はYamane-Ohnuki, et al., Biotechnol.Bioeng., 2004, 87, 614-622を参照されたい）。別の例として、欧州特許第１，１７６，１９５号には、そのような細胞株で発現される抗体が、アルファ１，６結合関連酵素を減少させる又は排除することにより低フコシル化を示すように、フコシルトランスフェラーゼをコードする機能的に破壊されたＦＵＴ８遺伝子を有する細胞株が記載されており、また抗体のＦｃ領域に結合するＮ−アセチルグルコサミンにフコースを加える酵素活性が低いか又は酵素活性を有しない細胞株、例えばラット骨髄腫細胞株ＹＢ２／０（ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６６２）も記載されている。国際公開第０３／０３５８３５号には、Ａｓｎ（２９７）が連結した炭水化物にフコースを結合する能力が低下し、またその宿主細胞で発現した抗体の低フコシル化をもたらす変異体ＣＨＯ細胞株、Ｌｅｃ１３細胞が記載されている（Shields, et al., J. Biol Chem.2002, 277, 26733-26740も参照されたい。国際公開第９９／５４３４２号には、操作された細胞株で発現された抗体が、抗体のＡＤＣＣ活性の増加をもたらす増加したバイセクティングＧｌｃＮａｃ構造を示すように、糖タンパク質改変グリコシルトランスフェラーゼを発現するよう操作された細胞株（例えば、ベ��タ（１，４）−Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩＩ（ＧｎＴＩＩＩ））が記載されている（Umana, et al., Nat.Biotech.1999, 17, 176-180も参照されたい）。代わりに、抗体のフコース残基は、フコシダーゼ酵素を使用して切断し得る。例えば、フコシダーゼであるアルファ−Ｌ−フコシダーゼは、Tarentino, et al., Biochem.1975, 14, 5516-5523に記載されるように、抗体由来のフコシル残基を除去する。
【００７４】
[00119]  「ペグ化」とは、１つ以上のＰＥＧ基が抗体又は抗体断片に結合するようになる条件下において、典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の反応性エステル又はアルデヒド誘導体などのＰＥＧと反応する修飾抗体又はその断片を指す。ペグ化は、例えば、抗体の生物学的（例えば、血清）半減期を増加させ得る。好ましくは、ペグ化は、反応性ＰＥＧ分子（又は類似の反応性水溶性ポリマー）とのアシル化反応又はアルキル化反応を介して行われる。本明細書で使用される場合、「ポリエチレングリコール」という用語は、モノ（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ−若しくはアリールオキシ−ポリエチレングリコール又はポリエチレングリコール−マレイミドなどの他のタンパク質を誘導体化するために使用されているＰＥＧの形態のいずれも包含することを意図する。ペグ化される抗体は、アグリコシル化抗体であり得る。ペグ化の方法は、当技術分野において公知であり、例えば欧州特許第０１５４３１６号及び同第０４０１３８４号並びに米国特許第５，８２４，７７８号に記載されているように、本発明の抗体に適用することができ、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
[00120]  「融合タンパク質」又は「融合ポリペプチド」という用語は、２つ以上の個々のタンパク質の特性を組み合わせたタンパク質を指す。そのようなタンパク質は、直接又はアミノ酸リンカーを介して共有結合した少なくとも２つの異種ポリペプチドを有する。融合タンパク質を形成するポリペプチドは、典型的にはＣ末端からＮ末端に連結しているが、Ｃ末端からＣ末端、Ｎ末端からＮ末端又はＮ末端からＣ末端に連結することもできる。融合タンパク質のポリペプチドは、任意の順序であり得、構成ポリペプチドのいずれか２つ以上又は両方を含み得る。この用語は、融合タンパク質を構成する抗原の、保存的に改変された変異体、多型変異体、対立遺伝子、突然変異体、部分配列、種間同族体及び免疫原性断片を包含する。本開示の融合タンパク質は、成分抗原又はその免疫原性断片の更なるコピーも含み得る。融合タンパク質は、互いに結合し、ＩｇＧ  ＦｃドメインなどのＦｃドメインに更に結合した１つ以上の結合ドメインを含み得る。融合タンパク質は、モノクローナル抗体を模倣し、６つ以上の結合ドメインを提供するために、共に更に連結され得る。融合タンパク質は、当技術分野において公知であるように、組換え法によって産生され得る。融合タンパク質の調製は、当技術分野で公知であり、例えば国際公開第１９９５／０２７７３５Ａ１号、同第２００５／１０３０７７Ａ１号、同第２００８／０２５５１６Ａ１号、同第２００９／００７１２０Ａ１号、同第２０１０／００３７６６Ａ１号、同第２０１０／０１００５１Ａ１号、同第２０１０／０７８９６６Ａ１号、米国特許出願公開第２０１５／０１２５４１９Ａ１号及び同第２０１６／０２７２６９５Ａ１号並びに米国特許第８，９２１，５１９号に記載されており、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
[00121]  核酸又はタンパク質の部分に関して使用される場合の「異種」という用語は、その核酸又はタンパク質が、天然には互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す。例えば、核酸は、典型的には組換え的に産生され、新しい機能性核酸を作製するように配置された無関係の遺伝子由来の２つ以上の配列、例えば１つの供給源からのプロモーター及び別の供給源からのコーディング領域又は異なる供給源からのコーディング領域を有する。同様に、異種タンパク質は、そのタンパク質が、天然には互いに同じ関係で見出されない２つ以上の部分配列を含むことを示す（例えば、融合タンパク質）。
【００７７】
[00122]  「保存的アミノ酸置換」という用語は、抗体又は融合タンパク質の抗原への結合を無効にしないアミノ酸配列改変を意味する。保存的アミノ酸置換には、あるクラスのアミノ酸の同じクラスのアミノ酸での置換が含まれ、ここで、クラスは、例えば、標準Dayhoff頻度交換行列又はBLOSUM行列によって決定されるように、一般的な物理化学的アミノ酸側鎖特性及び天然に見られる相同タンパク質における高い置換頻度によって定義される。６つの一般的なクラスのアミノ酸側鎖が分類されており、クラスＩ（Ｃｙｓ）；クラスＩＩ（Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ａｌａ、Ｇｌｙ）；クラスＩＩＩ（Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｇｌｎ、Ｇｌｕ）；クラスＩＶ（Ｈｉｓ、Ａｒｇ、Ｌｙｓ）；クラスＶ（Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｍｅｔ）；及びクラスＶＩ（Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ）を含む。例えば、Ａｓｎ、Ｇｌｎ又はＧｌｕなど、別のクラスＩＩＩ残基へのＡｓｐの置換は、保存的置換である。従って、抗体中の予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは、同じクラスからの別のアミノ酸残基で置換される。抗原結合を排除しないアミノ酸保存的置換を同定する方法は、当技術分野において周知である（例えば、Brummell, et al., Biochemistry 1993, 32, 1180-1187；Kobayashi, et al., Protein Eng.1999, 12, 879-884 (1999)；及びBurks, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1997, 94, 412-417を参照されたい。
【００７８】
[00123]  ２つ以上の核酸又はポリペプチドに関連して、「配列同一性」、「パーセント同一性」及び「配列パーセント同一性」（又はそれらの同義語、例えば「９９％同一」）という用語は、配列同一性の一部として保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大限の対応について比較し、整合させた場合（必要に応じてギャップを導入する）、同じであるか、同じヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくはアルゴリズムを使用するか、又は目視検査によって測定することができる。アミノ酸又はヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用することができる様々なアルゴリズム及びソフトウェアが当技術分野において公知である。パーセント配列同一性を決定するための適切なプログラムには、例えば、米国政府の国立バイオテクノロジー情報センター（National Center for Biotechnology Information）のＢＬＡＳＴウェブサイトから入手可能なＢＬＡＳＴプログラム一式が含まれる。２つの配列間の比較は、ＢＬＡＳＴＮ又はＢＬＡＳＴＰアルゴリズムのいずれかを使用して実施することができる。ＢＬＡＳＴＮは、核酸配列を比較するために使用される一方、ＢＬＡＳＴＰは、アミノ酸配列を比較するために使用される。ALIGN、ALIGN-2（Genentech, South San Francisco, California）又はDNASTARから入手可能なMegAlignは、配列を整合するために使用することができる、公に入手可能な更なるソフトウェアプログラムである。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアによって最大アラインメントのための適切なパラメータを決定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメータが使用される。
【００７９】
[00124]  本明細書で使用される「変異体」という用語は、参照抗体のアミノ酸配列内又はそれに隣接する特定の位置での１つ以上の置換、欠失及び／又は付加により、参照抗体のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む抗体又は融合タンパク質を包含するが、これに限定されるものではない。変異体は、参照抗体のアミノ酸配列と比較して、そのアミノ酸配列中に１つ以上の保存的置換を含み得る。保存的置換は、例えば、同様に荷電又は非荷電であるアミノ酸の置換を含み得る。変異体は、参照抗体の抗原に特異的に結合する能力を保持している。変異体という用語は、ペグ化抗体又はタンパク質も含む。
【００８０】
[00125]  核酸配列は、明示的に示される配列と同様に、その保存的に改変された変異体（例えば、縮重コドン置換）及び相補的配列も非明示的に包含する。具体的には、縮重コドン置換は、１つ以上の選択された（又は全ての）コドンの第３の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基で置換されている配列を生成することによって達成され得る。Batzer, et al., Nucleic Acid Res.1991, 19, 5081；Ohtsuka, et al., J. Biol.Chem.1985, 260, 2605-2608；Rossolini, et al., Mol.Cell.Probes 1994, 8, 91-98。核酸という用語は、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドと互換的に使用される。
【００８１】
[00126]  「バイオシミラー」という用語は、モノクローナル抗体又はタンパク質を含む生物学的産物を意味し、これは、臨床的に不活性な成分におけるわずかな違いにかかわらず、米国の認可された参照生物学的製品と高度に類似しており、製品の安全性、純度及び効力の点で生物学的製品と参照製品との間に臨床的に有意義な違いはない。更に、類似の生物学的又は「バイオシミラー」医薬は、欧州医薬品庁により使用がすでに認可されている、別の生物学的医薬と類似の生物学的医薬である。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。生物学的製剤又は生物学的医薬品は、細菌又は酵母などの生物学的供給源によって作製されるか又はそれに由来する医薬品である。それらは、ヒトインスリン又はエリスロポエチンなどの比較的小さい分子又はモノクローナル抗体などの複雑な分子からなり得る。例えば、参照ＩＬ−２タンパク質がアルデスロイキン（PROLEUKIN）である場合、アルデスロイキンに関して医薬品規制当局によって承認されたタンパク質は、アルデスロイキン「に対するバイオシミラー」又はアルデスロイキンの「そのバイオシミラー」である。欧州では、類似の生物学的又は「バイオシミラー」医薬は、欧州医薬品庁（ＥＭＡ）により使用がすでに認可されている、別の生物学的医薬と類似の生物学的医薬である。ヨーロッパにおける同様の生物学的用途の関連法的根拠は、改正された規則（ＥＣ）Ｎｏ７２６／２００４の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０条（４）であり、従って、ヨーロッパでは、バイオシミラーは、規則（ＥＣ）Ｎｏ７２６／２００４の第６条及び指令２００１／８３／ＥＣの第１０（４）条の下で認可され得るか、認可が承認され得るか又は認可申請の対象であり得る。ヨーロッパでは、すでに認可されている元の生物学的医薬品は、「参照医薬品」と呼ばれることがある。バイオシミラーと見なされる製品の要件のいくつかは、類似生物学的医薬品におけるCHMPガイドラインに概説されている。更に、モノクローナル抗体バイオシミラーに関するガイドラインを含む製品固有のガイドラインは、ＥＭＡによって製品ごとに提供され、そのウェブサイトに公開されている。本明細書に記載のバイオシミラーは、品質特性、生物学的活性、作用機序、安全性プロファイル及び／又は有効性として、参照医薬品と類似し得る。更に、バイオシミラーは、参照医薬品と同じ状態を処置するために使用されるか又は使用を意図され得る。従って、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した品質特性を有すると見なし得る。代わりに又は更に、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した生物学的活性を有すると見なし得る。代わりに又は更に、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した安全性プロファイルを有すると見なし得る。代わりに又は更に、本明細書に記載のバイオシミラーは、参照医薬品と類似した又は非常に類似した有効性を有すると見なし得る。本明細書に記載されるように、ヨーロッパにおけるバイオシミラーは、ＥＭＡによって認可されている参照医薬品と比較される。しかしながら、一部の場合、バイオ��ミラーは、特定の研究において欧州経済地域外で認可されている生物学的医薬品（ＥＥＡ非認可の「コンパレータ」）と比較され得る。そのような試験には、例えば、特定の臨床試験及びインビボ非臨床試験が含まれる。本明細書で使用される場合、「バイオシミラー」という用語は、非ＥＥＡ認可コンパレータと比較された又は比較され得る生物学的医薬品にも関する。特定のバイオシミラーは、抗体、抗体断片（例えば、抗原結合部分）及び融合タンパク質などのタンパク質である。タンパク質バイオシミラーは、ポリペプチドの機能に有意に影響を及ぼさない、アミノ酸構造にわずかな改変（例えば、アミノ酸の欠失、付加及び／又は置換を含む）を有するアミノ酸配列を有し得る。バイオシミラーは、その参照医薬品のアミノ酸配列に対して９７％以上、例えば９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。バイオシミラーは、相違が医薬品の安全性及び／又は有効性において変化をもたらさないことを条件として、参照医薬品の翻訳後改変と異なる１つ以上の翻訳後改変、例えば、限定されるものではないが、グリコシル化、酸化、脱アミド化及び／又は切断を含み得る。バイオシミラーは、参照医薬品と同一又は異なるグリコシル化パターンを有し得る。排他的ではないが、特に相違が参照医薬品に関する安全性の懸念に対処するか又は対処することを意図している場合、バイオシミラーは、異なるグリコシル化パターンを有し得る。更に、バイオシミラーは、医薬品の安全性及び有効性が損なわれない場合、例えばその強度、医薬形態、製剤、賦形剤及び／又は提示において参照医薬品から逸脱し得る。バイオシミラーは、例えば、参照医薬品と比較した場合の薬物動態（ＰＫ）及び／又は薬力学（ＰＤ）プロファイルにおける相違を含み得るが、依然として承認されるか又は承認に適していると見なされるために、参照医薬品と十分に類似していると認められる。特定の状況において、バイオシミラーは、参照医薬品と比較して異なる結合特性を示し、ここで、異なる結合特性は、ＥＭＡなどの規制当局により、類似の生物学的製品としての認可に対する障壁ではないと見なされる。「バイオシミラー」という用語は、他の国及び地域の規制機関によっても同義的に使用される。
【００８２】
[00127]  「血液悪性腫瘍」という用語は、血液、骨髄、リンパ節及びリンパ系の組織を含むが、これらに限定されない、哺乳動物の癌及び造血系及びリンパ系組織の腫瘍を指す。血液悪性腫瘍は、「液性腫瘍」の形成をもたらし得る。血液悪性腫瘍には、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性リンパ腫（ＣＬＬ）、小リンパ性リンパ腫（ＳＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）、急性単球性白血病（ＡＭｏＬ）、ホジキンリンパ腫及び非ホジキンリンパ腫が含まれるが、これらに限定されるものではない。「Ｂ細胞血液悪性腫瘍」という用語は、Ｂ細胞に影響を及ぼす血液悪性腫瘍を指す。
【００８３】
[00128]  「液性腫瘍」という用語は、本来流動性である異常な細胞塊を指す。液性腫瘍癌としては、白血病、骨髄腫及びリンパ腫並びに他の血液悪性腫瘍が挙げられるが、これらに限定されるものではない。骨髄内に存在する液性腫瘍を含む、液性腫瘍から入手したＴＩＬは、本明細書では骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）とも称され得る。末梢血中を循環する液性腫瘍を含む液性腫瘍から入手したＴＩＬは、本明細書ではＰＢＬとも称され得る。ＭＩＬ、ＴＩＬ及びＰＢＬという用語は、本明細書において互換的に使用され、細胞が由来する組織タイプによってのみ異なる。
【００８４】
[00129]  「生検」という用語は、骨髄生検を含む、癌細胞を入手するために使用されるあらゆる医療処置を指す。
【００８５】
[00130]  「急性骨髄性（myeloid）白血病」又は「ＡＭＬ」という用語は、当技術分野で急性骨髄性（myelogenous）白血病及び急性非リンパ性白血病としても知られている骨髄性血液細胞株の癌を指す。ＡＭＬは、液性腫瘍であるが、緑色腫などの髄外所見を含むＡＭＬの一部の所見は、固形腫瘍の特性を示すが、本明細書では液性腫瘍として分類される。
【００８６】
[00131]  本明細書で使用される「微小環境」という用語は、全体としての固形又は血液腫瘍微小環境又は微小環境内の細胞の個々のサブセットを指し得る。本明細書で使用される腫瘍微小環境は、Swartz, et al., Cancer Res., 2012, 72, 2473に記載されているように、「新生物性形質転換を促進し、腫瘍の成長及び浸潤をサポートし、腫瘍を宿主の免疫から保護し、治療抵抗性を培い、優勢な転移を成功させるニッチを提供する、細胞、可溶性因子、シグナル伝達分子、細胞外マトリックス及び機械的手がかり」の複合的な混合物を指す。腫瘍は、Ｔ細胞によって認識されるべき抗原を発現するが、免疫系による腫瘍の排除は、微小環境による免疫抑制のため、希少である。
【００８７】
[00132]  「有効量」又は「治療有効量」という用語は、疾患処置を含むが、これに限定されない、意図された用途を達成するのに十分である、本明細書に記載の化合物又は化合物の組み合わせの量を指す。治療有効量は、意図される用途（インビトロ又はインビボ）又は処置されている対象及び疾患状態（例えば、対象の体重、年齢及び性別）、疾患状態の重症度又は投与方法によって変動し得る。この用語は、標的細胞において特定の応答（例えば、血小板接着及び／又は細胞遊走の減少）を誘導する用量にも適用される。特定の用量は、選択された特定の化合物、従うべき投与レジメン、化合物が他の化合物と組み合わせて投与されるかどうか、投与のタイミング、それが投与される組織及び化合物が運ばれる物理的送達システムによって変動する。
【００８８】
[00133]  「治療効果」は、その用語が本明細書で使用される場合、治療上の利益及び／又は予防上の利益を包含する。予防効果は、疾患若しくは状態の出現を遅らせるか若しくは排除すること、疾患若しくは状態の症状の発症を遅らせるか若しくは排除すること、疾患若しくは状態の進行を遅らせるか、停止させるか若しくは逆行させること又はそれらの任意の組み合わせを含む。
【００８９】
[00134]  用語「処置」、「処置している」、「処置する」などは、所望の薬理学的及び／又は生理学的効果を達成することを指す。効果は、疾患若しくはその症状を完全に若しくは部分的に防ぐという意味で予防的であり得、及び／又は疾患及び／又は疾患に起因する有害作用を部分的に若しくは完全に治癒するという意味で治療的であり得る。「処置」は、本明細書で使用されるとき、哺乳類、特にヒトにおける疾患の任意の処置を包含し、（ａ）疾患の素因があり得るが、依然としてそれを有すると診断されてない対象において疾患の発生を防ぐこと；（ｂ）疾患を阻害すること、即ちその発症又は進行を止めること；及び（ｃ）疾患を軽減すること、即ち疾患の退縮を生じさせること及び／又は１つ以上の疾患症状を軽減することが含まれる。「処置」は、疾患又は病態がない場合でも薬理学的効果を提供するための薬剤の送達を包含することも意図される。例えば、「処置」は、例えば、ワクチンの場合、疾患状態がないなかで免疫応答を誘発するか又は免疫を付与することのできる組成物の送達を包含する。
【００９０】
[00135]  「ＱＤ」、「ｑｄ」又は「ｑ．ｄ．」という用語は、１日に１回、１日１回又は毎日１回を意味する。「ＢＩＤ」、「ｂｉｄ」又は「ｂ．ｉ．ｄ．」という用語は、１日に２回、１日２回又は毎日２回を意味する。「ＴＩＤ」、「ｔｉｄ」又は「ｔ．ｉ．ｄ．」という用語は、１日に３回、１日３回又は毎日３回を意味する。「ＱＩＤ」、「ｑｉｄ」又は「ｑ．ｉ．ｄ．」という用語は、１日に４回、１日４回又は毎日４回を意味する。
【００９１】
[00136]  本明細書における「腫瘍浸潤リンパ球」又は「ＴＩＬ」とは、対象の血流を離れて腫瘍に遊走した、白血球として元来入手される細胞の集団を意味する。ＴＩＬとしては、限定はされないが、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞（リンパ球）、Ｔｈ１及びＴｈ１７  ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ナチュラルキラー細胞、樹状細胞及びＭ１マクロファージが挙げられる。ＴＩＬは、初代及び二次ＴＩＬの両方を含む。「初代ＴＩＬ」は、本明細書に概説される通り患者組織サンプルから入手されるものであり（「新鮮に回収された」と称されることもある）、及び「二次ＴＩＬ」は、限定はされないが、バルクＴＩＬ、拡大培養ＴＩＬ（「ＲＥＰ  ＴＩＬ」）並びに本明細書で考察する通りの「ｒｅＲＥＰ  ＴＩＬ」を含め、本明細書で考察する通り拡大培養又は増殖された任意のＴＩＬ細胞集団である。
【００９２】
[00137]  ＴＩＬは、一般的に、細胞表面マーカーを使用して生化学的に、又は腫瘍に浸潤し処置に影響を及ぼすそれらの能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、一般的に、次のバイオマーカー：ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲ  αβ、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ５６、ＣＣＲ７、ＣＤ４５Ｒａ、ＣＤ９５、ＰＤ−１及びＣＤ２５の１つ以上を発現することによって分類することができる。追加的及び代替的に、ＴＩＬは、患者への再導入時に固形腫瘍に浸潤するそれらの能力によって機能的に定義することができる。ＴＩＬは、更に効力によって特徴付けられ得る  −  例えば、ＴＩＬは、例えば、インターフェロン（ＩＦＮ）遊離が約５０ｐｇ／ｍＬより高い、約１００ｐｇ／ｍＬより高い、約１５０ｐｇ／ｍＬより高い又は約２００ｐｇ／ｍＬより高い場合に効力があると見なすことができる。
【００９３】
[00138]  本明細書において「凍結保存ＴＩＬ」（又は凍結保存されたＭＩＬ若しくはＰＢＬ）とは、初代、バルク又は拡大培養（ＲＥＰ  ＴＩＬ）のいずれかのＴＩＬが約−１５０℃〜−６０℃の範囲で処置及び保存されることを意味する。凍結保存のための一般的な方法も、実施例を含む本明細書の他の箇所に記載されている。明確性のために、「凍結保存ＴＩＬ」は、初代ＴＩＬの供給源として使用され得る凍結組織サンプルと区別可能である。
【００９４】
[00139]  本明細書において「解凍した凍結保存ＴＩＬ」（又は解凍したＭＩＬ若しくはＰＢＬ）とは、以前に凍結保存され、次いで細胞培養温度又はＴＩＬが患者に投与され得る温度を含むが、これらに限定されない、室温以上に戻るように処置されたＴＩＬの集団を意味する。
【００９５】
[00140]  本明細書における「細胞の集団」（ＴＩＬを含む）とは、共通の形質を共有するいくつかの細胞を意味する。一般的に、集団は、一般に１×１０６〜１×１０１０の数の範囲であり、異なるＴＩＬ集団は異なる数を含む。例えば、ＩＬ−２の存在下での初代ＴＩＬの初期増殖は、およそ１×１０８個の細胞のバルクＴＩＬの集団をもたらす。ＲＥＰ拡大培養は、一般的に、注入のために１．５×１０９〜１．５×１０１０個の細胞の集団を提供するために行われる。
【００９６】
[00141]  一般に、ＴＩＬは、初めに患者腫瘍サンプルから入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団に拡大培養され、任意選択により凍結保存され、本明細書に概説される通り再刺激され、且つ任意選択によりＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
【００９７】
[00142]  一般に、回収された細胞懸濁液は、「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」細胞集団と呼ばれる。
【００９８】
[00143]  一般に、本明細書で考察する通り、ＴＩＬは、初めに、本明細書で考察する通り患者から切除された腫瘍から初代ＴＩＬ集団を入手することにより調製される（「初代細胞集団」又は「第１の細胞集団」）。これに続き、細胞をＩＬ−２と培養することを利用した初期バルク拡大培養が行われ、第２の細胞集団が形成される（本明細書において「バルクＴＩＬ集団」又は「第２の集団」と称されることもある）。
【００９９】
[00144]  用語「細胞傷害性リンパ球」には、細胞傷害性Ｔ（ＣＴＬ）細胞（ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球及びＣＤ４＋  Ｔ−ヘルパーリンパ球を含む）、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。細胞傷害性リンパ球には、例えば、腫瘍関連抗原によって活性化され、及び／又は腫瘍特異的キメラ抗原受容体又はＴ細胞受容体で形質導入された末梢血由来のαβ  ＴＣＲ陽性Ｔ細胞若しくはγδ  ＴＣＲ陽性Ｔ細胞並びに腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）が含まれ得る。
【０１００】
[00145]  用語「セントラルメモリーＴ細胞」は、ヒトではＣＤ４５ＲＯ＋であり、且つＣＣＲ７（ＣＣＲ７ｈ  ｉ）及びＣＤ６２Ｌ（ＣＤ６２  ｈｉ）を構成的に発現するＴ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型は、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）及びＩＬ−１５Ｒも含む。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子は、ＢＣＬ−６、ＢＣＬ−６Ｂ、ＭＢＤ２及びＢＭＩ１を含む。セントラルメモリーＴ細胞は、ＴＣＲトリガー後にエフェクター分子として主にＩＬ−２及びＣＤ４０Ｌを分泌する。セントラルメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ４区画において優勢であり、ヒトではリンパ節及び扁桃腺において比例的に濃縮されている。
【０１０１】
[00146]  用語「エフェクターメモリーＴ細胞」は、セントラルメモリーＴ細胞と同様にＣＤ４５Ｒ０＋であるが、ＣＣＲ７の構成的発現が欠損しており（ＣＣＲ７ｌｏ）、且つＣＤ６２Ｌ発現が不均一であるか又は低い（ＣＤ６２Ｌｌｏ）、ヒト又は哺乳類Ｔ細胞のサブセットを指す。セントラルメモリーＴ細胞の表面表現型は、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＣＤ１２７（ＩＬ−７Ｒ）及びＩＬ−１５Ｒも含む。セントラルメモリーＴ細胞の転写因子は、ＢＬＩＭＰ１を含む。エフェクターメモリーＴ細胞は、抗原刺激後、インターフェロン−γ、ＩＬ−４及びＩＬ−５を含む高レベルの炎症性サイトカインを急速に分泌する。エフェクターメモリーＴ細胞は、血中のＣＤ８区画において優勢であり、ヒトでは肺、肝臓及び腸において比例的に濃縮されている。ＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞は、大量のパーフォリンを保有する。「閉鎖系」という用語は、外部環境に対して閉鎖された系を指す。細胞培養方法に適した任意の閉鎖系を本発明の方法と共に使用することができる。閉鎖系としては、例えば、密閉Ｇ容器（G-container）が挙げられるが、これに限定されるものではない。腫瘍セグメントが閉鎖系に添加されると、ＴＩＬが患者に投与される準備ができるまで、系は、外部環境に対して開放されない。
【０１０２】
[00147]  一部の実施形態において、本開示の方法は、腫瘍組織又は腫瘍組織からの細胞を標準的な実験用培地（限定なしに、ＲＰＭＩを含む）で成長させて、照射フィーダー細胞及び抗ＣＤ３抗体などの試薬で処置することにより、ＴＩＬ数の増加及び／又は所望の細胞表面マーカー又は他の構造的、生化学的若しくは機能的特徴を含む細胞に関する集団のエンリッチメントなど、所望の効果を実現する「プレＲＥＰ」段階を更に含む。プレＲＥＰ段階は、ＴＩＬ産生を改善するための代替戦略を取り入れ易くなるように、実験グレードの試薬を（実験グレードの試薬が後のＲＥＰ段階中に希釈されるという仮定の下に）利用し得る。従って、一部の実施形態において、プレＲＥＰ段階中、培養培地中には、開示されるＴＬＲアゴニスト及び／又はペプチド又はペプチドミメティクスが含まれ得る。プレＲＥＰ培養は、一部の実施形態において、ＩＬ−２を含み得る。本発明は、好ましい態様において、新鮮に回収したＴＩＬ又は再刺激ＴＩＬ（本明細書において「ｒｅＴＩＬ」と称されることもある）のための解凍した凍結保存ＴＩＬと比較したとき、意外にもメモリーエフェクターＴ細胞サブセットを含めたメモリーＴ細胞サブセットの拡大につながり、及び／又は解糖系呼吸の著しい亢進につながる、本明細書において「再刺激急速拡大培養プロトコル」又は「ｒｅＲＥＰ」とも称される、１つ以上の追加的な再刺激プロトコルでＲＥＰを増強する新規方法に関する。即ち、凍結保存ＴＩＬに対してｒｅＲＥＰ手順を用いることにより、患者は、高度に代謝的に活性で健康なＴＩＬを受け取ることができ、より良好な転帰につながり得る。
【０１０３】
[00148]  「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」又は「治療量」が示されている場合、投与される本発明の組成物の正確な量は、年齢、体重、腫瘍サイズ、感染又は転移の程度及び患者（対象）の状態の個人差を考慮して医師によって決定され得る。一般的に、本明細書に記載される遺伝子改変された細胞傷害性リンパ球を含む医薬組成物は１０４〜１０１１個の細胞／ｋｇ体重（例えば、１０５〜１０６、１０５〜１０１０、１０５〜１０１１、１０６〜１０１０、１０６〜１０１１，１０７〜１０１１、１０７〜１０１０、１０８〜１０１１、１０８〜１０１０、１０９〜１０１１又は１０９〜１０１０個の細胞／ｋｇ体重）（これらの範囲内にある全ての整数値を含む）の投薬量で投与され得ると言うことができる。遺伝子改変された細胞傷害性リンパ球組成物はまた、これらの投薬量で複数回投与され得る。遺伝子改変された細胞傷害性リンパ球は、免疫療法で一般に公知の注入技法を用いることにより投与し得る（例えば、Rosenberg et al., New Eng.J. of Med. 319:1676, 1988を参照されたい）。特定の患者に対する最適な投与量及び処置レジメンは、疾患の徴候について患者をモニターし、それに応じて処置を調整することにより、医学の当業者によって容易に決定され得る。
【０１０４】
[00149]  疑義を回避するために、本明細書では、本発明の特定の態様、実施形態又は例と併せて記載された特定の特徴（例えば、整数、特性、値、使用、疾患、式、化合物又は基）は、不適合でない限り、本明細書に記載の任意の他の態様、実施形態又は例にも適用可能であると理解されるべきであることを意図する。従って、そのような特徴は、必要に応じて、本明細書で定義された定義、特許請求の範囲又は実施形態のいずれかと共に使用することができる。本明細書に開示されている全ての特徴（任意の添付の請求項、要約及び図面を含む）及び／又はそのように開示されている任意の方法若しくはプロセスの全てのステップは、少なくとも一部の特徴及び／又はステップが相互に排他的である組み合わせを除いて、任意の組み合わせで組み合わされ得る。本発明は、いかなる開示された実施形態のいかなる詳細にも限定されるものではない。本発明は、本明細書に開示されている特徴（任意の添付の請求項、要約及び図面を含む）の任意の新規なもの若しくは新規な組み合わせ又はそのように開示された任意の方法若しくはプロセスのステップの任意の新規なもの若しくは任意の新規な組み合わせに及ぶ。
【０１０５】
[00150]  「約」及び「およそ」という用語は、統計的に有意義な値の範囲内を意味する。そのような範囲は、所与の値又は範囲の一桁以内、好ましくは５０％以内、より好ましくは２０％以内、更に好ましくは１０％以内、更により好ましくは５％以内であり得る。「約」又は「およそ」という用語によって包含される許容される変動は、研究下の特定のシステムに依存し、当業者によって容易に理解され得る。更に、本明細書で使用される場合、「約」及び「およそ」という用語は、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状並びに他の量及び特性が正確でなく且つ正確である必要はないが、公差、換算係数、四捨五入、測定誤差など、及び当業者に知られている他の要因を反映して、必要に応じて近似及び／又はより大きい若しくはより小さくてもよいことを意味する。一般的に、寸法、サイズ、配合、パラメータ、形状又は他の量若しくは特性は、そうであると明示的に述べられているかどうかにかかわらず、「約」又は「およそ」である。非常に異なるサイズ、形状及び寸法の実施形態が、記載された機構を採用し得ることに留意されたい。
【０１０６】
[00151]  元の形式及び修正された形式において、添付の特許請求の範囲で使用される場合、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行的な用語は、記載されていない特許請求の範囲の更なる要素又はステップが存在する場合、特許請求の範囲の対象から除外されるものに関し、特許請求の範囲の対象を定義する。「含む」という用語は、包含的であるか又はオープンエンドであることが意図されており、いかなる追加の列挙されていない要素、方法、ステップ又は材料も排除するものではない。「からなる」という用語は、特許請求の範囲に明記されたもの及び材料の場合には明記された材料に関連する通常の不純物以外のいかなる要素、ステップ又は材料も排除する。「から本質的になる」という用語は、特許請求の範囲を、特定の要素、ステップ又は材料並びに特許請求の範囲に記載された発明の基本的及び新規な特徴に実質的に影響を及ぼさないものに限定する。本発明を具体化する本明細書に記載された全ての組成物、方法及びキットは、代替性の実施形態において、「含む」、「から本質的になる」及び「からなる」という移行的な用語のいずれかにより、より具体的に定義することができる。
【０１０７】
末梢血（ＰＢＬ）及び／又は骨髄（ＭＩＬ）を含む治療用Ｔ細胞を拡大培養する方法の実施形態
末梢血から末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を拡大培養する方法
[00152]  ＰＢＬ方法１．本発明の一実施形態において、本明細書で説明するプロセスを使用して、ＰＢＬを拡大培養する。本発明の一実施形態において、方法は、全血からＰＢＭＣサンプルを入手することを含む。一実施形態において、方法は、非ＣＤ１９＋画分のネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから純粋なＴ細胞を分離することによりＴ細胞を濃縮することを含む。０日目に、純粋Ｔ細胞を１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に培養する。４日目に、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、培養物を再び１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））で刺激し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を培養物に添加する。１４日目にＰＢＬを回収し、ビーズを取り出し、ＰＢＬを計数し、フェノタイピングする。一実施形態において、方法は、非ＣＤ１９＋画分の磁気ビーズに基づくネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから純粋なＴ細胞を分離することによりＴ細胞を濃縮することを含む。
【０１０８】
[00153]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法１は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣサンプルが解凍され、ＰＢＭＣが計数される。Ｔ細胞は、Human Pan T-cell Isolation Kit及びＬＳカラム（Miltenyi Biotec）を使用して分離される。分離したＴ細胞を計数し、GRex  ２４ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０５個の細胞を播種し、１ウェルあたり合計８ｍｌのＣＭ２培地中、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と１：１の比率で、DynaBeads（登録商標）（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８）と共培養する。４日目に、各ウェル中の培地を、ＣＭ２から、３０００ＩＵ／ｍｌの新鮮なＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖに交換する。７日目に、拡大培養した細胞を回収し、計数し、次いで、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及び１：１の比率（ビーズ：細胞）のDynaBeads（登録商標）と共に、合計１００ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、GRex  １０Ｍフラスコで、１フラスコあたり１５×１０６個の細胞で培養する。１１日目に、培地を新鮮なＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで補充したＣＭ−４培地に交換する。１４日目に、DynaMag Magnet（DynaMag（商標）-15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、細胞が計数される。
【０１０９】
[00154]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法１は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣサンプルが解凍され、ＰＢＭＣが計数される。Ｔ細胞は、Human Pan T-cell Isolation Kit及びＬＳカラム（Miltenyi Biotec）を使用して分離される。分離したＴ細胞を計数し、GRex  ２４ウェルプレートの１ウェルあたり５×１０５個の細胞を播種し、１ウェルあたり合計８ｍｌのＣＭ２培地中、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と１：１の比率で、DynaBeads（登録商標）（抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８）と共培養する。４日目に、各ウェル中の培地を、ＣＭ２から、３０００ＩＵ／ｍｌの新鮮なＩＬ−２を含むＡＩＭ−Ｖに交換する。７日目に、ＰＢＬを回収し、計数し、次いで、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及び１：１の比率（ビーズ：細胞）のDynaBeads（登録商標）と共に、合計８ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、新しいGRex−２４ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０６個の細胞で再播種する。１１日目に、培地を新鮮なＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで補充したＣＭ−４培地に交換する。１４日目に、DynaMag Magnet（DynaMag（商標）-15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、細胞が計数される。
【０１１０】
[00155]  ＰＢＬ方法２．本発明の一実施形態において、ＰＢＬは、全血からＰＢＭＣサンプルを入手することを含むＰＢＬ方法２を使用して拡大培養される。ＰＢＭＣからのＴ細胞は、ＰＢＭＣを３７℃で少なくとも３時間インキュベートし、次いで非接着細胞を分離することにより、濃縮される。非接着細胞は、ＰＢＬ方法１と同様に拡大培養する、即ち０日目に、非接着細胞を１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に培養する。４日目に、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、培養物を再び１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））で刺激し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を培養物に添加する。１４日目にＰＢＬを回収し、ビーズを取り出し、ＰＢＬを計数し、フェノタイピングする。
【０１１１】
[00156]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法２は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存したＰＭＢＣサンプルを解凍し、ＰＢＭＣ細胞をＣＭ−２培地中の６ウェルプレートに１ウェルあたり６００万細胞で播種し、３７℃で３時間インキュベートする。３時間後、ＰＢＬである非接着細胞を取り出し、計数する。ＰＢＬは、１ウェルあたり１×１０６個の細胞で、１：１のビーズ：細胞の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  DynaBeads（登録商標）及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に、GRex  ２４ウェルプレートの各ウェル中、合計７ｍｌのＣＭ−２培地で培養する。４日目に、各ウェル中の培地を、ＡＩＭ−Ｖ培地及び３０００ＩＵ／ｍｌの新鮮なＩＬ−２と交換する。７日目に、拡大培養した細胞を回収し、計数し、次いで、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及び１：１の比率（Ｔ細胞：ビーズ）のDynaBeads（登録商標）と共に、合計１００ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、GRex  １０Ｍフラスコで、１フラスコあたり１５×１０６個の細胞で培養する。１１日目に、培地をＣＭ−４培地に交換し、新鮮なＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍｌ）を補充する。１４日目に、DynaMag（商標）Magnet（DynaMag（商標）-15）を使用してDynaBeadsが取り出され、細胞が計数される。
【０１１２】
[00157]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法２は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存したＰＭＢＣサンプルを解凍し、ＰＢＭＣ細胞をＣＭ−２培地中の６ウェルプレートに１ウェルあたり６００万細胞で播種し、３７℃で３時間インキュベートする。３時間後、ＰＢＬである非接着細胞を取り出し、計数する。ＰＢＬは、１ウェルあたり１×１０６個の細胞、１：１のビーズ：細胞の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８  DynaBeads（登録商標）及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に、GRex  ２４ウェルプレートの各ウェル中、合計７ｍｌのＣＭ−２培地で培養する。４日目に、各ウェル中の培地を、ＡＩＭ−Ｖ培地及び３０００ＩＵ／ｍｌの新鮮なＩＬ−２と交換する。７日目に、拡大培養した細胞を回収し、計数し、次いで、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２及び１：１の比率（Ｔ細胞：ビーズ）のDynaBeads（登録商標）と共に、合計８ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、新しいGRex  ２４ウェルプレートの１ウェルあたり１×１０６個の細胞で培養する。１１日目に、培地をＣＭ−４培地に交換し、新鮮なＩＬ−２（３０００ＩＵ／ｍｌ）を補充する。１４日目に、DynaMag（商標）Magnet（DynaMag（商標）-15）を使用してDynaBeadsが取り出され、細胞が計数される。
【０１１３】
[00158]  ＰＢＬ方法３．本発明の一実施形態において、ＰＢＬは、末梢血からＰＢＭＣサンプルを入手することを含むＰＢＬ方法３を使用して拡大培養される。Ｂ細胞はＣＤ１９＋選択を使用して分離され、Ｔ細胞はＰＢＭＣサンプルの非ＣＤ１９＋画分のネガティブ選択を使用して選択される。０日目に、Ｔ細胞及びＢ細胞を、１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共培養する。４日目に、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、培養物を再び１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））で刺激し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を培養物に添加する。１４日目にＰＢＬを回収し、ビーズを取り出し、ＰＢＬを計数し、フェノタイピングする。
【０１１４】
[00159]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法３は、以下のように実施される：０日目に、末梢血に由来する凍結保存されたＰＢＭＣを解凍し、計数する。ＣＤ１９＋  Ｂ細胞は、CD19 Multisort Kit, Human（Miltenyi Biotec）を使用して選別される。非ＣＤ１９＋細胞画分のうち、Ｔ細胞は、Human Pan T-cell Isolation Kit及びＬＳカラム（Miltenyi Biotec）を使用して精製される。Ｔ細胞（ＰＢＬ）及びＢ細胞は、約３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で約８ｍｌのＣＭ２培地中、Grex  ２４ウェルプレートで異なる比率で共培養される。Ｂ細胞：Ｔ細胞の比率は０．１：１、１：１及び１０：１である。Ｔ細胞／Ｂ細胞共培養は、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））により１：１の比率（ビーズ：細胞）で刺激される。４日目に、培地をＣＭ２からＡＩＭ−Ｖ培地に交換し、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、細胞を回収し、計数し、ＡＩＭ−Ｖ培地の新しいGrex  ２４ウェルプレートに、１ウェルあたり約１．５×１０５〜約４×１０５個の細胞の細胞範囲で再播種し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２と共に、１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））により刺激する。１４日目に、DynaMag（商標）Magnet（DynaMag（商標）-15）を使用してDynaBeadsが取り出され、細胞が計数される。
【０１１５】
[00160]  一実施形態において、ＰＢＭＣは、全血サンプルから分離される。一実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、ＰＢＬを拡大培養するための出発材料として使用される。一実施形態において、サンプルは、拡大培養プロセス前に凍結保存される。別の実施形態において、新鮮なサンプルは、ＰＢＬを拡大培養するための出発材料として使用される。本発明の一実施形態において、Ｔ細胞は、当技術分野で公知の方法を使用してＰＢＭＣから分離される。一実施形態において、Ｔ細胞は、Human Pan T-cell Isolation Kit及びＬＳカラムを使用して分離される。本発明の一実施形態において、Ｔ細胞は、当技術分野で公知の抗体選択方法、例えばＣＤ１９ネガティブ選択を使用してＰＢＭＣから分離される。
【０１１６】
[00161]  本発明の一実施形態において、プロセスは、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間又は約１４日間にわたって実施される。別の実施形態において、プロセスは、約７日間にわたって実施される。別の実施形態において、プロセスは、約１４日間にわたって実施される。
【０１１７】
[00162]  本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣは抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共に培養される。一実施形態において、任意の利用可能な抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８製品が本発明において有用である。本発明の一実施形態において、使用される市販の製品はDynaBeads（登録商標）である。一実施形態において、DynaBeads（登録商標）は、１：１の比率（ビーズ：細胞）のＰＢＭＣと共に培養される。別の実施形態において、抗体は、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１又は５：１の比率（ビーズ：細胞）でＰＢＭＣと共に培養されたDynaBeads（登録商標）である。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップ及び／又は抗体で細胞を再刺激するステップは、約２〜約６日間、約３〜約５日間又は約４日間の期間にわたって実施される。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップは、約２日、３日、４日、５日又は６日の期間にわたって実施される。
【０１１８】
[00163]  一実施形態において、ＰＢＭＣサンプルはＩＬ−２と共に培養される。本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣからのＰＢＬの拡大培養に使用される細胞培養培地は、約１００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約５００ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ、約７００ＩＵ／ｍＬ、約８００ＩＵ／ｍＬ、約９００ＩＵ／ｍＬ、約１，０００ＩＵ／ｍＬ、約１，１００ＩＵ／ｍＬ、約１，２００ＩＵ／ｍＬ、約１，３００ＩＵ／ｍＬ、約１，４００ＩＵ／ｍＬ、約１，５００ＩＵ／ｍＬ、約１，６００ＩＵ／ｍＬ、約１，７００ＩＵ／ｍＬ、約１，８００ＩＵ／ｍＬ、約１，９００ＩＵ／ｍＬ、約２，０００ＩＵ／ｍＬ、約２，１００ＩＵ／ｍＬ、約２，２００ＩＵ／ｍＬ、約２，３００ＩＵ／ｍＬ、約２，４００ＩＵ／ｍＬ、約２，５００ＩＵ／ｍＬ、約２，６００ＩＵ／ｍＬ、約２，７００ＩＵ／ｍＬ、約２，８００ＩＵ／ｍＬ、約２，９００ＩＵ／ｍＬ、約３，０００ＩＵ／ｍＬ、約３，１００ＩＵ／ｍＬ、約３，２００ＩＵ／ｍＬ、約３，３００ＩＵ／ｍＬ、約３，４００ＩＵ／ｍＬ、約３，５００ＩＵ／ｍＬ、約３，６００ＩＵ／ｍＬ、約３，７００ＩＵ／ｍＬ、約３，８００ＩＵ／ｍＬ、約３，９００ＩＵ／ｍＬ、約４，０００ＩＵ／ｍＬ、約４，１００ＩＵ／ｍＬ、約４，２００ＩＵ／ｍＬ、約４，３００ＩＵ／ｍＬ、約４，４００ＩＵ／ｍＬ、約４，５００ＩＵ／ｍＬ、約４，６００ＩＵ／ｍＬ、約４，７００ＩＵ／ｍＬ、約４，８００ＩＵ／ｍＬ、約４，９００ＩＵ／ｍＬ、約５，０００ＩＵ／ｍＬ、約５，１００ＩＵ／ｍＬ、約５，２００ＩＵ／ｍＬ、約５，３００ＩＵ／ｍＬ、約５，４００ＩＵ／ｍＬ、約５，５００ＩＵ／ｍＬ、約５，６００ＩＵ／ｍＬ、約５，７００ＩＵ／ｍＬ、約５，８００ＩＵ／ｍＬ、約５，９００ＩＵ／ｍＬ、約６，０００ＩＵ／ｍＬ、約６，５００ＩＵ／ｍＬ、約７，０００ＩＵ／ｍＬ、約７，５００ＩＵ／ｍＬ、約８，０００ＩＵ／ｍＬ、約８，５００ＩＵ／ｍＬ、約９，０００ＩＵ／ｍＬ、約９，５００ＩＵ／ｍＬ及び約１０，０００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度のＩＬ−２を含む。
【０１１９】
[00164]  本発明の実施形態において、拡大培養プロセスのためのＰＢＭＣの開始細胞数は、約２５，０００〜約１，０００，０００、約３０，０００〜約９００，０００、約３５，０００〜約８５０，０００、約４０、０００〜約８００，０００、約４５，０００〜約８００，０００、約５０，０００〜約７５０，０００、約５５，０００〜約７００，０００、約６０，０００〜約６５０，０００、約６５，０００〜約６００，０００、約７０，０００〜約５５０，０００、好ましくは、約７５，０００〜約５００，０００、約８０，０００〜約４５０，０００、約８５，０００〜約４００，０００、約９０，０００〜約３５０，０００、約９５，０００〜約３００，０００、約１００，０００〜約２５０，０００、約１０５，０００〜約２００，０００又は約１１０，０００〜約１５０，０００である。本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約１３８，０００、１４０，０００、１４５，０００又はそれを超える数である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約２８，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約６２，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約３３８，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約３３６，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、１００万、２００万、３００万、４００万、５００万、６００万、７００万、８００万、９００万、１０００万又はそれを超える数である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、１００万〜１０００万、２００万〜９００万、３００万〜８００万、４００万〜７００万又は５００万〜６００万である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約４００万である。更に別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、少なくとも約４００万、少なくとも約５００万若しくは少なくとも約６００万又はそれを超える数である。
【０１２０】
[00165]  本発明の一実施形態において、細胞は、GRex  ２４ウェルプレートで増殖される。本発明の一実施形態において、同等のウェルプレートが使用される。一実施形態において、拡大培養のための出発材料は、１ウェルあたり約５×１０５個のＴ細胞である。本発明の一実施形態において、１ウェルあたり１×１０６個の細胞が存在する。本発明の実施形態において、１ウェルあたりの細胞数は、ウェルに播種し、Ｔ細胞を拡大培養するのに十分な数である。
【０１２１】
[00166]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬの拡大倍数は、約２０％〜約１００％、２５％〜約９５％、３０％〜約９０％、３５％〜約８５％、４０％〜約８０％、４５％〜約７５％、５０％〜約１００％又は２５％〜約７５％である。本発明の一実施形態において、拡大倍数は約２５％である。本発明の別の実施形態において、拡大倍数は約５０％である。別の実施形態において、拡大倍数は約７５％である。
【０１２２】
[00167]  本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は、プロセス全体を通して１日以上培養物に添加され得る。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は４日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は７日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は１１日目に追加される。他の実施形態において、追加のＩＬ−２は４日目、７日目及び／又は１１日目に追加される。本発明の一実施形態において、細胞培養培地は、細胞培養プロセスを通して１日以上で交換され得る。一実施形態において、細胞培養培地は、プロセスの４日目、７日目及び／又は１１日目に交換される。本発明の一実施形態において、ＰＢＬは、追加のＩＬ−２と共に、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又は１４日間の期間にわたって培養される。本発明の一実施形態において、ＰＢＬは、ＩＬ−２の各添加後３日間の期間にわたって培養される。
【０１２３】
[00168]  一実施形態において、細胞培養培地は、方法中に少なくとも一度交換される。一実施形態において、細胞培養培地は、追加のＩＬ−２が加えられるのと同時に交換される。別の実施形態において、細胞培養培地は、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目又は１４日目の少なくとも１つで交換される。本発明の一実施形態において、方法全体で使用される細胞培養培地は、同じであるか又は異なり得る。本発明の一実施形態において、細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４又はＡＩＭ−Ｖである。
【０１２４】
[00169]  本発明の一実施形態において、Ｔ細胞は、１４日間の拡大培養プロセスを通して１日以上、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体で再刺激され得る。一実施形態において、Ｔ細胞は７日目に再刺激される。一実施形態において、GRex 10Mフラスコが再刺激ステップに使用される。本発明の一実施形態において、同等のフラスコが使用される。
【０１２５】
[00170]  本発明の一実施形態において、DynaMag（商標）Magnetを使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、細胞が計数され、細胞は、以下の実施例で更に説明する表現型及び機能分析を使用して分析される。本発明の一実施形態において、抗体は、当技術分野で公知の方法を使用してＰＢＬ又はＭＩＬから分離される。前述の実施形態のいずれにおいても、ＴＩＬ、ＰＢＬ又はＭＩＬの磁気ビーズベースの選択が使用される。
【０１２６】
[00171]  本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、非接着細胞を識別するのに有効な所望の温度で一定期間インキュベートされる。本発明の一実施形態において、インキュベーション時間は約３時間である。本発明の一実施形態において、温度は約３７℃である。次いで、非接着細胞は、上記のプロセスを使用して拡大培養される。
【０１２７】
[00172]  本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣは、イブルチニブ又は本明細書の他の箇所に記載のＩＴＫ及びキナーゼ阻害剤などの別のＩＴＫ又はキナーゼ阻害剤で処置された患者から入手される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、共有結合的及び不可逆的にＩＴＫに結合する共有結合ＩＴＫ阻害剤である。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ＩＴＫに結合するアロステリックＩＴＫ阻害剤である。本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣは、ＰＢＬ方法１、ＰＢＬ方法２又はＰＢＬ方法３を含む前述の方法のいずれかで使用するＰＢＭＣサンプルを入手する前に、イブルチニブ又は本明細書の他の箇所に記載のＩＴＫ阻害剤を含む他のＩＴＫ阻害剤で処置された患者から入手される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤処置は、少なくとも１回、少なくとも２回又は少なくとも３回又はそれを超えて投与されている。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置された患者から拡大培養されたＰＢＬは、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置されなかった患者から拡大培養されたものより少ないＬＡＧ３＋、ＰＤ−１＋細胞を含む。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置された患者から拡大培養されたＰＢＬは、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置されなかった患者から拡大培養されたものより増加したレベルのＩＦＮγ産生を含む。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置された患者から拡大培養されたＰＢＬは、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置されなかった患者から拡大培養されたものより低いエフェクター：標的細胞比で増加した溶解活性を含む。本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置された患者は、未処置の患者と比較して、より高い拡大倍数を有する。
【０１２８】
[00173]  本発明の一実施形態において、方法は、細胞培養にＩＴＫ阻害剤を添加するステップを含む。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、プロセスの０日目、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目又は１４日目の１つ以上で添加される。一実施形態において、細胞培養培地が交換される方法中の日に、ＩＴＫ阻害剤が添加される。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、０日目及び細胞培養培地が交換されるときに添加される。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ＩＬ−２が添加される方法中に添加される。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、方法の０日目、４日目、７日目及び任意選択により１１日目に添加される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、方法の０日目及び７日目に添加される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は当技術分野で公知のものである。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は本明細書の他の部分に記載されているものである。
【０１２９】
[00174]  本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．１ｎＭ〜約５ｕＭの濃度で本方法に使用される。一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、約０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、１０ｎＭ、２０ｎＭ、３０ｎＭ、４０ｎＭ、５０ｎＭ、６０ｎＭ、７０ｎＭ、８０ｎＭ、９０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭ、２００ｎＭ、２５０ｎＭ、３００ｎＭ、３５０ｎＭ、４００ｎＭ、４５０ｎＭ、５００ｎＭ、５５０ｎＭ、６００ｎＭ、６５０ｎＭ、７００ｎＭ、７５０ｎＭ、８００ｎＭ、８５０ｎＭ、９００ｎＭ、９５０ｎＭ、１ｕＭ、２ｕＭ、３ｕＭ、４ｕＭ又は５ｕＭの濃度で本方法に使用される。
【０１３０】
[00175]  本発明の一実施形態において、方法は、ＰＢＭＣが、イブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤処置への以前の曝露を有しない患者に由来する場合、ＩＴＫ阻害剤を添加するステップを含む。
【０１３１】
[00176]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで任意選択により前処置された対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、腫瘍サンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置された対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置され、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月又は１年又はそれを超えて、処置を受けた、対象又は患者からのものである。別の実施形態において、ＰＢＭＣは、イブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤レジメンを現在受けている患者に由来する。
【０１３２】
[00177]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置されており、キナーゼ阻害剤又はイブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤での処置に不応性である対象又は患者からのものである。
【０１３３】
[00178]  一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置されているが、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤での処置をもはや受けていない対象又は患者からのものである。一部の実施形態において、ＰＢＭＣサンプルは、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで前処置されているが、キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤での処置をもはや受けておらず、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも３ヶ月、少なくとも４ヶ月、少なくとも５ヶ月、少なくとも６ヶ月若しくは少なくとも１年又はそれを超えて、処置を受けていない、対象又は患者からのものである。別の実施形態において、ＰＢＭＣは、ＩＴＫ阻害剤への以前の曝露を有するが、少なくとも３ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも９ヶ月又は少なくとも１年処置されていない患者に由来する。
【０１３４】
[00179]  本発明の一実施形態において、０日目に、ＣＤ１９＋について細胞が選択され、適宜選別される。本発明の一実施形態において、選択は抗体結合ビーズを使用して行われる。本発明の一実施形態において、純粋Ｔ細胞は、ＰＢＭＣから０日目に分離される。本発明の一実施形態において、０日目に、ＣＤ１９  ＋Ｂ細胞及び純粋Ｔ細胞を、最低４日間、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共培養する。本発明の一実施形態において、４日目に、培養物にＩＬ−２が添加される。本発明の一実施形態において、７日目に、培養物は抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体及び追加のＩＬ−２で再刺激される。本発明の一実施形態において、１４日目に、ＰＢＬが回収される。
【０１３５】
[00180]  本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置されていない患者について、１０〜１５ｍｌのバフィーコートは約５×１０９個のＰＢＭＣを生成し、これは、約５．５×１０７個の開始細胞材料及び拡大培養プロセスの終了時に約１１×１０９個のＰＢＬを生成する。本発明の一実施形態において、約５４×１０６個のＰＢＭＣは、約６×１０５個の出発材料及び約１．２×１０８個のＭＩＬ（約２０５倍の拡大倍数）を生成する。
【０１３６】
[00181]  本発明の一実施形態において、イブルチニブ又は他のＩＴＫ阻害剤で前処置された患者について、拡大培養プロセスは、約２０×１０９個のＰＢＬを生成する。本発明の一実施形態において、４０．３×１０６個のＰＢＭＣは、約４．７×１０５個の開始細胞材料及び約１．６×１０８個のＰＢＬ（約３３８倍の拡大倍数）を生成する。
【０１３７】
[00182]  本発明の一実施形態において、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する患者に対する本発明において有用なＰＢＬの臨床用量は、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＰＢＬ、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＰＢＬ、約０．１２×１０９〜約１２×１０９個のＰＢＬ、約０．１５×１０９〜約１１×１０９個のＰＢＬ、約０．２×１０９〜約１０×１０９個のＰＢＬ、約０．３×１０９〜約９×１０９個のＰＢＬ、約０．４×１０９〜約８×１０９個のＰＢＬ、約０．５×１０９〜約７×１０９個のＰＢＬ、約０．６×１０９〜約６×１０９個のＰＢＬ、約０．７×１０９〜約５×１０９個のＰＢＬ、約０．８×１０９〜約４×１０９個のＰＢＬ、約０．９×１０９〜約３×１０９個のＰＢＬ又は約１×１０９〜約２×１０９個のＰＢＬである。
【０１３８】
[00183]  前述の実施形態のいずれにおいても、ＰＢＭＣは、全血サンプルから、アフェレーシスにより、バフィーコートから、又はＰＢＭＣを入手するための当技術分野で公知の任意の他の方法から得られ得る。
【０１３９】
骨髄由来のＰＢＭＣから骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）を拡大培養する方法
[00184]  ＭＩＬ方法１．本発明の一実施形態において、骨髄由来のＰＢＭＣからＭＩＬを拡大培養する方法が記載される。本発明の一実施形態において、方法は、１４日間にわたって実施される。一実施形態において、方法は、骨髄ＰＢＭＣを入手し、且つＰＢＭＣを凍結保存することを含む。０日目に、ＰＢＭＣを１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に培養する。４日目に、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、培養物を再び１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））で刺激し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を培養物に添加する。１４日目にＭＩＬを回収し、ビーズを取り出し、任意選択によりＭＩＬを計数し、フェノタイピングする。
【０１４０】
[00185]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬ方法１は、以下のように実施される：０日目に、骨髄由来の凍結保存されたＰＢＭＣサンプルが解凍され、ＰＢＭＣが計数される。ＰＢＭＣは、GRex  ２４ウェルプレートで、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、１ウェルあたり約８ｍｌのＣＭ−２細胞培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０、ヒトＡＢ血清、１−グルタミン、２−メルカプトエタノール、硫酸ゲンタマイシン、ＡＩＭ−Ｖ培地から構成される）中、１ウェルあたり５×１０５個の細胞で、１：１の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））と共培養される。４日目に、細胞培養培地を、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を添加したＡＩＭ−Ｖと交換する。７日目に、拡大培養したＭＩＬを計数する。１ウェルあたり１×１０６個の細胞を新しいGRex  ２４ウェルプレートに移し、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、１ウェルあたり約８ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、１：１の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））と共に培養する。１１日目に、細胞培養培地を、ＡＩＭ−ＶからＣＭ−４（ＡＩＭ−Ｖ培地、２ｍＭのGlutamax及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ２から構成される）に交換する。１４日目に、DynaMag Magnet（DynaMag（商標）15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、ＭＩＬが計数される。
【０１４１】
[00186]  ＭＩＬ方法２．本発明の一実施形態において、方法は、７日間にわたって実施される。一実施形態において、この方法は、骨髄に由来するＰＭＢＣを入手し、且つＰＢＭＣを凍結保存することを含む。０日目に、ＰＢＭＣを３：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に培養する。７日目にＭＩＬを回収し、ビーズを取り出し、任意選択によりＭＩＬを計数し、フェノタイピングする。
【０１４２】
[00187]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬ方法２は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣサンプルが解凍され、ＰＢＭＣが計数される。ＰＢＭＣは、GRex  ２４ウェルプレートで、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、１ウェルあたり約８ｍｌのＣＭ−２細胞培養培地（ＲＰＭＩ−１６４０、ヒトＡＢ血清、１−グルタミン、２−メルカプトエタノール、硫酸ゲンタマイシン、ＡＩＭ−Ｖ培地から構成される）中、１ウェルあたり５×１０５個の細胞で、１：１の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））と共培養される。７日目に、DynaMag Magnet（DynaMag（商標）15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、ＭＩＬが計数される。
【０１４３】
[00188]  ＭＩＬ方法３．本発明の一実施形態において、方法は、骨髄からＰＢＭＣを入手することを含む。０日目に、ＣＤ３＋／ＣＤ３３＋／ＣＤ２０＋／ＣＤ１４＋についてＰＢＭＣが選択され、選別され、非ＣＤ３＋／ＣＤ３３＋／ＣＤ２０＋／ＣＤ１４＋細胞画分が超音波処理され、超音波処理された細胞画分の一部が選択された細胞画分に戻される。ＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで細胞培養物に添加する。３日目に、ＰＢＭＣを１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に培養する。４日目に、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、培養物を再び１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））で刺激し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を培養物に添加する。１１日目に、ＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。１４日目にＭＩＬを回収し、ビーズを取り出し、任意選択によりＭＩＬを計数し、フェノタイピングする。
【０１４４】
[00189]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬ方法３は、以下のように実施される：０日目に、選別方法によってＣＤ４５ｈｉＣＤ３＋細胞（免疫細胞画分）についてＰＢＭＣが選択され、ＣＤ４５ｌｏｗＣＤ３−画分（ＡＭＬ芽細胞画分）が超音波処理され、超音波処理された細胞画分の一部が選択された細胞画分に戻される。ＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで細胞培養物に添加する。３日目に、ＰＢＭＣを１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２と共に培養する。４日目に、追加のＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。７日目に、培養物を再び１：１の比率（ビーズ：細胞）の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））で刺激し、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を培養物に添加する。１１日目に、ＩＬ−２を３０００ＩＵ／ｍｌで培養物に添加する。１４日目にＭＩＬを回収し、ビーズを取り出し、任意選択によりＭＩＬを計数し、フェノタイピングする。
【０１４５】
[00190]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬ方法３は、以下のように実施される：０日目に、凍結保存されたＰＢＭＣのサンプルが解凍され、ＰＢＭＣが計数される。細胞をＣＤ３、ＣＤ３３、ＣＤ２０及びＣＤ１４抗体で染色し、Ｓ３ｅ細胞選別（Bio-Rad）を使用して選別する。細胞は、免疫細胞画分（又はＭＩＬ画分）（ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）とＡＭＬ芽細胞画分（非ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）の２つの画分に選別される。Grex  ２４ウェルプレートに播種される免疫細胞画分（又はＭＩＬ画分）からの細胞数とほぼ等しいＡＭＬ芽細胞画分からの細胞数を、１００ｕｌの培地に懸濁し、超音波処理する。この例では、ＡＭＬ芽細胞画分から約２．８×１０４〜約３．３８×１０５個の細胞を取り、１００ｕｌのＣＭ２培地に懸濁し、３０秒間超音波処理する。超音波処理したＡＭＬ芽細胞画分の１００ｕｌをGrex  ２４ウェルプレートの免疫細胞画分に添加する。免疫細胞は、６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、１ウェルあたり約８ｍｌのＣＭ−２細胞培養培地中に、１ウェルあたり約２．８×１０４〜約３．３８×１０５個の細胞の量で存在し、ＡＭＬ芽細胞画分の一部と共に約３日間培養される。３日目に、１：１の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））を各ウェルに加え、約１日間培養する。４日目に、細胞培養培地を、３０００ＩＵ／ｍｌの追加のＩＬ−２を添加したＡＩＭ−Ｖと交換する。７日目に、拡大培養したＭＩＬを計数する。１ウェルあたり約１．５×１０５〜４×１０５個の細胞を新しいGRex  ２４ウェルプレートに移し、３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下、１ウェルあたり約８ｍｌのＡＩＭ−Ｖ培地中、１：１の比率の抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体（DynaBeads（登録商標））と共に培養する。１１日目に、細胞培養培地を、ＡＩＭ−ＶからＣＭ−４（３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２を補充）に交換する。１４日目に、DynaMag Magnet（DynaMag（商標）15）を使用してDynaBeads（登録商標）が取り出され、任意選択によりＭＩＬが計数される。
【０１４６】
[00191]  本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣは骨髄から入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣは、アフェレーシス、吸引、針生検又は当技術分野で公知の他の同様の手段を通じて骨髄から入手される。一実施形態において、ＰＢＭＣは新鮮である。別の実施形態において、ＰＢＭＣは凍結保存されている。
【０１４７】
[00192]  本発明の一実施形態において、方法は、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間又は約１４日間にわたって実施される。別の実施形態において、方法は、約７日間にわたって実施される。別の実施形態において、方法は、約１４日間にわたって実施される。
【０１４８】
[00193]  本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣは抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８抗体と共に培養される。一実施形態において、任意の利用可能な抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８製品が本発明において有用である。本発明の一実施形態において、使用される市販の製品はDynaBeads（登録商標）である。一実施形態において、DynaBeads（登録商標）は、１：１の比率（ビーズ：細胞）のＰＢＭＣと共に培養される。別の実施形態において、抗体は、１．５：１、２：１、２．５：１、３：１、３．５：１、４：１、４．５：１又は５：１の比率（ビーズ：細胞）でＰＢＭＣと共に培養されたDynaBeads（登録商標）である。前述の実施形態のいずれにおいても、免疫細胞画分（又はＭＩＬ画分）（ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）又はＡＭＬ芽細胞画分（非ＣＤ３＋ＣＤ３３＋ＣＤ２０＋ＣＤ１４＋）の磁気ビーズベースの選択が使用される。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップ及び／又は抗体で細胞を再刺激するステップは、約２〜約６日間、約３〜約５日間又は約４日間の期間にわたって実施される。本発明の一実施形態において、抗体培養ステップは、約２日、３日、４日、５日又は６日の期間にわたって実施される。
【０１４９】
[00194]  本発明の一実施形態において、ＡＭＬ芽細胞画分からの細胞数と免疫細胞画分（又はＭＩＬ画分）からの細胞数の比率は、約０．１：１〜約１０：１である。別の実施形態において、比率は約０．１：１〜約５：１、約０．１：１〜約２：１又は約１：１である。本発明の一実施形態において、ＡＭＬ芽細胞画分は、細胞凝集を破壊するために、任意選択により破砕される。一実施形態において、ＡＭＬ芽細胞画分は、超音波処理、均質化、細胞溶解、ボルテックス又は振動を使用して破砕される。別の実施形態において、ＡＭＬ芽細胞画分は、超音波処理を使用して破砕される。本発明の一実施形態において、非ＣＤ３＋、非ＣＤ３３＋、非ＣＤ２０＋、非ＣＤ１４＋細胞画分（ＡＭＬ芽球画分）は、高温溶解、化学溶解（有機アルコールなど）、酵素溶解及び当技術分野で公知の他の細胞溶解方法を含む適切な溶解方法を使用して溶解される。
【０１５０】
[00195]  本発明の一実施形態において、ＡＭＬ芽細胞画分からの細胞は、１００ｕＬあたり約０．２×１０５〜約２×１０５個の細胞の濃度で懸濁され、免疫細胞画分と共に細胞培養物に添加される。別の実施形態において、濃度は、１００ｕＬあたり約０．５×１０５〜約２×１０５個の細胞、１００ｕＬあたり約０．７×１０５〜約２×１０５個の細胞、１００ｕＬあたり約１×１０５〜約２×１０５個の細胞又は１００ｕＬあたり約１．５×１０５〜約２×１０５個の細胞である。
【０１５１】
[00196]  一実施形態において、ＰＢＭＣサンプルはＩＬ−２と共に培養される。本発明の一実施形態において、ＭＩＬの拡大培養に使用される細胞培養培地は、約１００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約５００ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ、約７００ＩＵ／ｍＬ、約８００ＩＵ／ｍＬ、約９００ＩＵ／ｍＬ、約１，０００ＩＵ／ｍＬ、約１，１００ＩＵ／ｍＬ、約１，２００ＩＵ／ｍＬ、約１，３００ＩＵ／ｍＬ、約１，４００ＩＵ／ｍＬ、約１，５００ＩＵ／ｍＬ、約１，６００ＩＵ／ｍＬ、約１，７００ＩＵ／ｍＬ、約１，８００ＩＵ／ｍＬ、約１，９００ＩＵ／ｍＬ、約２，０００ＩＵ／ｍＬ、約２，１００ＩＵ／ｍＬ、約２，２００ＩＵ／ｍＬ、約２，３００ＩＵ／ｍＬ、約２，４００ＩＵ／ｍＬ、約２，５００ＩＵ／ｍＬ、約２，６００ＩＵ／ｍＬ、約２，７００ＩＵ／ｍＬ、約２，８００ＩＵ／ｍＬ、約２，９００ＩＵ／ｍＬ、約３，０００ＩＵ／ｍＬ、約３，１００ＩＵ／ｍＬ、約３，２００ＩＵ／ｍＬ、約３，３００ＩＵ／ｍＬ、約３，４００ＩＵ／ｍＬ、約３，５００ＩＵ／ｍＬ、約３，６００ＩＵ／ｍＬ、約３，７００ＩＵ／ｍＬ、約３，８００ＩＵ／ｍＬ、約３，９００ＩＵ／ｍＬ、約４，０００ＩＵ／ｍＬ、約４，１００ＩＵ／ｍＬ、約４，２００ＩＵ／ｍＬ、約４，３００ＩＵ／ｍＬ、約４，４００ＩＵ／ｍＬ、約４，５００ＩＵ／ｍＬ、約４，６００ＩＵ／ｍＬ、約４，７００ＩＵ／ｍＬ、約４，８００ＩＵ／ｍＬ、約４，９００ＩＵ／ｍＬ、約５，０００ＩＵ／ｍＬ、約５，１００ＩＵ／ｍＬ、約５，２００ＩＵ／ｍＬ、約５，３００ＩＵ／ｍＬ、約５，４００ＩＵ／ｍＬ、約５，５００ＩＵ／ｍＬ、約５，６００ＩＵ／ｍＬ、約５，７００ＩＵ／ｍＬ、約５，８００ＩＵ／ｍＬ、約５，９００ＩＵ／ｍＬ、約６，０００ＩＵ／ｍＬ、約６，５００ＩＵ／ｍＬ、約７，０００ＩＵ／ｍＬ、約７，５００ＩＵ／ｍＬ、約８，０００ＩＵ／ｍＬ、約８，５００ＩＵ／ｍＬ、約９，０００ＩＵ／ｍＬ、約９，５００ＩＵ／ｍＬ及び約１０，０００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度のＩＬ−２を含む。
【０１５２】
[00197]  本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は、方法全体を通して１日以上培養物に添加され得る。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は４日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は７日目に追加される。本発明の一実施形態において、追加のＩＬ−２は１１日目に追加される。別の実施形態において、追加のＩＬ−２は４日目、７日目及び／又は１１日目に追加される。本発明の一実施形態において、ＭＩＬは、追加のＩＬ−２と共に、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間又は１４日間、培養される。本発明の一実施形態において、ＭＩＬは、ＩＬ−２の各添加後３日間の期間にわたって培養される。
【０１５３】
[00198]  一実施形態において、細胞培養培地は、方法中に少なくとも一度交換される。一実施形態において、細胞培養培地は、追加のＩＬ−２が加えられるのと同時に交換される。別の実施形態において、細胞培養培地は、１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、８日目、９日目、１０日目、１１日目、１２日目、１３日目又は１４日目の少なくとも１つで交換される。本発明の一実施形態において、方法全体で使用される細胞培養培地は、同じであるか又は異なり得る。本発明の一実施形態において、細胞培養培地は、ＣＭ−２、ＣＭ−４又はＡＩＭ−Ｖである。本発明の一実施形態において、１１日目の細胞培養培地交換ステップは任意選択による。本発明の一実施形態において、拡大培養プロセスのためのＰＢＭＣの開始細胞数は、約２５，０００〜約１，０００，０００、約３０，０００〜約９００，０００、約３５，０００〜約８５０，０００、約４０、０００〜約８００，０００、約４５，０００〜約８００，０００、約５０，０００〜約７５０，０００、約５５，０００〜約７００，０００、約６０，０００〜約６５０，０００、約６５，０００〜約６００，０００、約７０，０００〜約５５０，０００、好ましくは、約７５，０００〜約５００，０００、約８０，０００〜約４５０，０００、約８５，０００〜約４００，０００、約９０，０００〜約３５０，０００、約９５，０００〜約３００，０００、約１００，０００〜約２５０，０００、約１０５，０００〜約２００，０００又は約１１０，０００〜約１５０，０００である。本発明の一実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約１３８，０００、１４０，０００、１４５，０００又はそれを超える数である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約２８，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約６２，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約３３８，０００である。別の実施形態において、ＰＢＭＣの開始細胞数は、約３３６，０００である。
【０１５４】
[00199]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬの拡大倍数は、約２０％〜約１００％、２５％〜約９５％、３０％〜約９０％、３５％〜約８５％、４０％〜約８０％、４５％〜約７５％、５０％〜約１００％又は２５％〜約７５％である。本発明の一実施形態において、拡大倍数は約２５％である。本発明の別の実施形態において、拡大倍数は約５０％である。別の実施形態において、拡大倍数は約７５％である。
【０１５５】
[00200]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬは、１０〜５０ｍｌの骨髄吸引液から拡大培養される。本発明の一実施形態において、１０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、２０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、３０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、４０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。別の実施形態において、５０ｍｌの骨髄吸引液が患者から入手される。
【０１５６】
[00201]  本発明の一実施形態において、約１０〜５０ｍｌの骨髄吸引液から得られるＰＢＭＣの数は、約５×１０７〜約１０×１０７個のＰＢＭＣである。別の実施形態において、得られるＰＭＢＣの数は、約７×１０７個のＰＢＭＣである。
【０１５７】
[00202]  本発明の一実施形態において、約５×１０７〜約１０×１０７個のＰＢＭＣから、約０．５×１０６〜約１．５×１０６個の拡大培養開始細胞材料が得られる。本発明の一実施形態において、約１×１０６個の拡大培養開始細胞材料が得られる。
【０１５８】
[00203]  本発明の一実施形態において、拡大培養期間の終わりに回収されるＭＩＬの総数は、約０．０１×１０９〜約１×１０９個、約０．０５×１０９〜約０．９×１０９個、約０．１×１０９〜約０．８５×１０９個、約０．１５×１０９〜約０．７×１０９個、約０．２×１０９〜約０．６５×１０９個、約０．２５×１０９〜約０．６×１０９個、約０．３×１０９〜約０．５５×１０９個、約０．３５×１０９〜約０．５×１０９個又は約０．４×１０９〜約０．４５×１０９個である。
【０１５９】
[00204]  本発明の一実施形態において、骨髄吸引液に由来する１２×１０６個のＰＢＭＣは、およそ１．４×１０５個の開始細胞材料を生成し、これは拡大培養プロセスの終わりに約１．１×１０７個のＭＩＬを生成する。
【０１６０】
[00205]  本発明の一実施形態において、上記のＭＩＬ方法３を使用して骨髄ＰＢＭＣから拡大培養されたＭＩＬは、ＭＩＬ方法１又はＭＩＬ方法２を使用して拡大培養されたＭＩＬと比較して、高い割合のＣＤ８＋細胞及びより少ない数のＬＡＧ３＋及びＰＤ１＋細胞を含む。本発明の一実施形態において、上記のＭＩＬ方法３を使用して血液ＰＢＭＣから拡大培養されたＰＢＬは、ＭＩＬ方法１又はＭＩＬ方法２を使用して拡大培養されたＰＢＬと比較して、高い割合のＣＤ８＋細胞及び増加したレベルのＩＦＮγ産生を含む。
【０１６１】
[00206]  本発明の一実施形態において、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者に有用なＭＩＬの臨床用量は、約４×１０８〜約２．５×１０９個のＭＩＬの範囲内である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、９．５×１０８個のＭＩＬである。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、４．１×１０８個である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、２．２×１０９個である。
【０１６２】
[00207]  前述の実施形態のいずれにおいても、ＰＢＭＣは、全血サンプルから、骨髄から、アフェレーシスにより、バフィーコートから、又はＰＢＭＣを入手するための当技術分野で公知の任意の他の方法から得られ得る。
【０１６３】
「２Ａプロセス」を使用したＴＩＬの拡大培養方法
[00208]  本発明の一実施形態において、本発明は、骨髄及び／又は末梢血に由来するＴ細胞を拡大培養するための装置及び方法を提供する。本発明の一実施形態において、Ｔ細胞は、ポリクローナルであるが高度に腫瘍特異的な様式で、骨髄微小環境からの高められた腫瘍特異性を有する。一実施形態において、骨髄微小環境は、Ｔ細胞を維持及び拡大培養するために使用される。本発明の一実施形態において、７日間又は１４日間の拡大培養プロセスで、ＴＩＬのおよそ２５〜１００倍の拡大倍数がある。一実施形態において、ＴＩＬの拡大倍数は約３０〜９０倍である。一実施形態において、拡大倍数は約３５〜８５倍である。一実施形態において、拡大倍数は約４０〜８０倍である。一実施形態において、拡大倍数は約４５〜７５倍である。別の実施形態において、拡大倍数は約４０〜７０倍である。別の実施形態において、拡大倍数は約４５〜６５倍である。別の実施形態において、拡大倍数は、約２５倍、約３０倍、約３５倍、約４０倍、約４５倍及び５０倍、約５５倍、約６０倍、約６５倍、約７０倍、約７５倍、約８０倍、約８５倍、約９０倍、約９５倍又は約１００倍の拡大倍数である。
【０１６４】
[00209]  本発明の一実施形態において、Ｔ細胞製造プロセスは、腫瘍特異性を選択するためのいかなる介入も必要としない。本発明の一実施形態において、Ｔ細胞製造プロセスは、Ｔ細胞拡大培養時に骨髄及び／又は末梢血中に腫瘍が存在することを要しない。一実施形態において、Ｔ細胞は、ほぼ完全な骨髄の存在下で拡大培養される。
【０１６５】
[00210]  一実施形態において、本発明は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２０１０／０６２７４２号に記載の実施例、特に実施例２１に記載の骨髄及び／又は末梢血からＴ細胞を抽出する方法を提供する。一実施形態において、本発明は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Noonan, et al., 2005, Cancer Res. 65:2026-2034に記載されるように、骨髄及び／又は末梢血からＴ細胞を抽出する方法を提供する。
【０１６６】
[00211]  一実施形態において、当業者に知られている骨髄及び／又は末梢血を入手するための方法は、本発明において有用である。本発明の一実施形態において、骨髄及び／又は末梢血は、針吸引を使用して入手される。本発明の一実施形態において、患者からの骨髄がヘパリン含有シリンジに吸引され、室温で一晩保存される。本発明の一実施形態において、保存後、シリンジの内容物を一緒に滅菌容器にプールし、品質を試験する。骨髄は、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）及びCOBE Spectraによる遠心分離を使用して、単核細胞（ＭＮＣ）が濃縮されている。勾配内の細胞は赤血球まで収集され、ＨＢＳＳを使用して洗浄される。ＭＮＣは、２％  ＨＳＡ及び５％  ＤＭＳＯが添加されたヘタスターチ系凍結保護剤を使用して凍結保存され、品質管理のためにＭＮＣの一部が確保されている。ＱＣバイアルを解凍して、ＭＮＣ製品のＣＤ３＋及びＣＤ３８＋／１３８＋の細胞含有量を測定する。骨髄の収集が本発明を限定するものではないことに留意することが重要である。
【０１６７】
[00212]  本発明の一実施形態において、骨髄を吸引及びリンパ球分離培地密度勾配で分画し、細胞をほぼ赤血球ペレットのレベルまで収集する。一実施形態において、この分画法は、赤血球及び好中球を実質的に除去し、ほぼ完全な骨髄を提供する。一実施形態において、結果として生じる分画された材料は、Ｔ細胞及び腫瘍細胞である。本発明の一実施形態において、方法は、Ｔ細胞特異的分離ステップなし及び腫瘍細胞分離ステップなしで、例えば抗体又は他の細胞タイプ特異的検出可能標識でＴ細胞を標識することなく、且つ蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を使用した選別なしで、実施され得る。
【０１６８】
[00213]  本発明の一実施形態において、入手した骨髄がフィコールされるか、又は末梢血が２００μＬ／ウェルのＡＩＭ−Ｖ培地中に、１×１０６個の細胞／ｍＬで、無血清条件で懸濁される。
【０１６９】
[00214]  本発明の一実施形態において、骨髄は完全寛解にない対象から収集される。本発明の一実施形態において、骨髄は完全寛解にある対象から収集される。
【０１７０】
[00215]  本発明の一実施形態において、骨髄を入手し、凍結し得る。一実施形態において、骨髄を入手し、直ちに使用してＴ細胞を抽出し得る。
【０１７１】
[00216]  更なる実施形態において且つ上記のいずれかに従って、本発明は、ＴＩＬを拡大培養する方法であって、方法が、液性腫瘍から入手した少なくとも１つのＴＩＬを含むＴＩＬの集団を接触させることを含む、方法を提供する。本明細書におけるＴＩＬの拡大培養に関する全ての議論は、骨髄、末梢血及び／又は液性腫瘍を含む血液悪性腫瘍から入手したＴＩＬの拡大培養に適用可能である。
【０１７２】
[00217]  一実施形態において、本発明は、癌から入手した腫瘍から腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を調製するためのプロセスであって、
（ａ）ＴＩＬの第１の集団を含む断片化した腫瘍を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｂ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養（プレＲＥＰ）を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数は、ＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｃ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、第２の拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数は、ＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｄ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、血液悪性腫瘍である、プロセスを提供する。
【０１７３】
[00218]  一実施形態において、本発明は、第１のプレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）プロセス、次いで第２の拡大培養プロセス（急速拡大培養プロセス−ＲＥＰであり得る）を含む、ＴＩＬの集団を拡大培養させるためのプロセスであって、拡大培養に使用される細胞培養培地は、１００ＩＵ／ｍＬ〜１０，０００ＩＵ／ｍＬ、２００ＩＵ／ｍＬ〜５，０００ＩＵ／ｍＬ、３００ＩＵ／ｍＬ〜４，８００ＩＵ／ｍＬ、４００ＩＵ／ｍＬ〜４，６００ＩＵ／ｍＬ、５００ＩＵ／ｍＬ〜４，４００ＩＵ／ｍＬ、６００ＩＵ／ｍＬ〜４，２００ＩＵ／ｍＬ、７００ＩＵ／ｍＬ〜４，０００ＩＵ／ｍＬ、８００ＩＵ／ｍＬ〜３，８００ＩＵ／ｍＬ、９００ＩＵ／ｍＬ〜３，６００ＩＵ／ｍＬ、１，０００ＩＵ／ｍＬ〜３，４００ＩＵ／ｍＬ、１，１００ＩＵ／ｍＬ〜３，２００ＩＵ／ｍＬ、１，２００ＩＵ／ｍＬ〜３，０００ＩＵ／ｍＬ、１，３００ＩＵ／ｍＬ〜２，８００ＩＵ／ｍＬ、１，４００ＩＵ／ｍＬ〜２，６００ＩＵ／ｍＬ、１，５００ＩＵ／ｍＬ〜２，４００ＩＵ／ｍＬ、１，６００ＩＵ／ｍＬ〜２，２００ＩＵ／ｍＬ、１，７００ＩＵ／ｍＬ〜２，０００ＩＵ／ｍＬ、５，５００ＩＵ／ｍＬ〜９，５００ＩＵ／ｍＬ、６，０００ＩＵ／ｍＬ〜９，０００ＩＵ／ｍＬ、６５００ＩＵ／ｍＬ〜８，５００ＩＵ／ｍＬ、７，０００ＩＵ／ｍＬ〜８，０００ＩＵ／ｍＬ及び７，５００ＩＵ／ｍＬ〜８，０００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度のＩＬ−２を含む、プロセスを提供する。
【０１７４】
[00219]  一実施形態において、本発明は、プレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）プロセス及び急速拡大培養プロセス（ＲＥＰ）を含む、ＴＩＬの集団を拡大培養させるためのプロセスであって、拡大培養に使用される細胞培養培地は、約１００ＩＵ／ｍＬ、約２００ＩＵ／ｍＬ、約３００ＩＵ／ｍＬ、約４００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約１００ＩＵ／ｍＬ、約５００ＩＵ／ｍＬ、約６００ＩＵ／ｍＬ、約７００ＩＵ／ｍＬ、約８００ＩＵ／ｍＬ、約９００ＩＵ／ｍＬ、約１，０００ＩＵ／ｍＬ、約１，１００ＩＵ／ｍＬ、約１，２００ＩＵ／ｍＬ、約１，３００ＩＵ／ｍＬ、約１，４００ＩＵ／ｍＬ、約１，５００ＩＵ／ｍＬ、約１，６００ＩＵ／ｍＬ、約１，７００ＩＵ／ｍＬ、約１，８００ＩＵ／ｍＬ、約１，９００ＩＵ／ｍＬ、約２，０００ＩＵ／ｍＬ、約２，１００ＩＵ／ｍＬ、約２，２００ＩＵ／ｍＬ、約２，３００ＩＵ／ｍＬ、約２，４００ＩＵ／ｍＬ、約２，５００ＩＵ／ｍＬ、約２，６００ＩＵ／ｍＬ、約２，７００ＩＵ／ｍＬ、約２，８００ＩＵ／ｍＬ、約２，９００ＩＵ／ｍＬ、約３，０００ＩＵ／ｍＬ、約３，１００ＩＵ／ｍＬ、約３，２００ＩＵ／ｍＬ、約３，３００ＩＵ／ｍＬ、約３，４００ＩＵ／ｍＬ、約３，５００ＩＵ／ｍＬ、約３，６００ＩＵ／ｍＬ、約３，７００ＩＵ／ｍＬ、約３，８００ＩＵ／ｍＬ、約３，９００ＩＵ／ｍＬ、約４，０００ＩＵ／ｍＬ、約４，１００ＩＵ／ｍＬ、約４，２００ＩＵ／ｍＬ、約４，３００ＩＵ／ｍＬ、約４，４００ＩＵ／ｍＬ、約４，５００ＩＵ／ｍＬ、約４，６００ＩＵ／ｍＬ、約４，７００ＩＵ／ｍＬ、約４，８００ＩＵ／ｍＬ、約４，９００ＩＵ／ｍＬ、約５，０００ＩＵ／ｍＬ、約５，１００ＩＵ／ｍＬ、約５，２００ＩＵ／ｍＬ、約５，３００ＩＵ／ｍＬ、約５，４００ＩＵ／ｍＬ、約５，５００ＩＵ／ｍＬ、約５，６００ＩＵ／ｍＬ、約５，７００ＩＵ／ｍＬ、約５，８００ＩＵ／ｍＬ、約５，９００ＩＵ／ｍＬ、約６，０００ＩＵ／ｍＬ、約６，５００ＩＵ／ｍＬ、約７，０００ＩＵ／ｍＬ、約７，５００ＩＵ／ｍＬ、約８，０００ＩＵ／ｍＬ、約８，５００ＩＵ／ｍＬ、約９，０００ＩＵ／ｍＬ、約９，５００ＩＵ／ｍＬ及び約１０，０００ＩＵ／ｍＬからなる群から選択される濃度のＩＬ−２を含む、プロセスを提供する。
【０１７５】
[00220]  一実施形態において、本発明は、プレ急速拡大培養（プレＲＥＰ）プロセスを含む、ＴＩＬの集団を拡大培養させるためのプロセスを提供する。一実施形態において、本発明は、ＴＩＬの集団を拡大培養させるプレＲＥＰプロセスであって、液性腫瘍から入手したＴＩＬの集団を細胞培養培地と接触させるステップを含み、細胞培養培地は、初期濃度１０００ＩＵ／ｍＬ〜６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を更に含む、プレＲＥＰプロセスを提供する。
【０１７６】
[00221]  一実施形態において、本発明は、ＴＩＬの集団を拡大培養するためのプレＲＥＰプロセスであって、液性腫瘍から入手したＴＩＬの集団を細胞培養培地と接触させるステップを含み、細胞培養培地は、初期濃度約６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を更に含む、プレＲＥＰプロセスを提供する。
【０１７７】
[00222]  一実施形態において、ＲＥＰは、任意の適切な方法によって本開示による液性腫瘍から入手したＴＩＬを使用して、ガス透過性容器内で実施することができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下での非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激は、例えば、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３、モノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil, Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech, Auburn, CAから市販）を含み得る。ＴＩＬは、任意選択により３００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２又はＩＬ−１５などのＴ細胞成長因子の存在下において、任意選択によりヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチド、例えば０．３μＭ  ＭＡＲＴ−１：２６−３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ  ００：２０９−２１７（２１０Ｍ）などのベクターから発現させることができる、癌のエピトープなどのその抗原部分を含む１つ以上の抗原を用いてインビトロでＴＩＬを更に刺激することによって急速拡大培養させることができる。他の適切な抗原としては、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＳＳＸ−２及びＶＥＧＦＲ２又はそれらの抗原部分が挙げられ得る。ＴＩＬは、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、ＴＩＬは、例えば、例として照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ−２によって更に再刺激することができる。
【０１７８】
[00223]  一実施形態において、ＴＩＬを拡大培養させるための方法は、約５０００ｍＬ〜約２５０００ｍＬの細胞培養培地、約５０００ｍＬ〜約１００００ｍＬの細胞培養培地又は約５８００ｍＬ〜約８７００ｍＬの細胞培養培地を使用することを含み得る。一実施形態において、ＴＩＬを拡大培養させるための方法は、約１０００ｍＬ〜約２０００ｍＬの細胞培地、約２０００ｍＬ〜約３０００ｍＬの細胞培養培地、約３０００ｍＬ〜約４０００ｍＬの細胞培養培地、約４０００ｍＬ〜約５０００ｍＬの細胞培養培地、約５０００ｍＬ〜約６０００ｍＬの細胞培養培地、約６０００ｍＬ〜約７０００ｍＬの細胞培養培地、約７０００ｍＬ〜約８０００ｍＬの細胞培養培地、約８０００ｍＬ〜約９０００ｍＬの細胞培養培地、約９０００ｍＬ〜約１００００ｍＬの細胞培養培地、約１００００ｍＬ〜約１５０００ｍＬの細胞培養培地、約１５０００ｍＬ〜約２００００ｍＬの細胞培養培地又は約２００００ｍＬ〜約２５０００ｍＬの細胞培養培地を使用することを含み得る。一実施形態において、ＴＩＬの数を拡大するには、１種類以下の細胞培養培地を使用する。任意の適切な細胞培養培地、例えばＡＩＭ−Ｖ細胞培地（Ｌ−グルタミン、５０μＭ硫酸ストレプトマイシン及び１０μＭ硫酸ゲンタマイシン）の細胞培養培地（Invitrogen, Carlsbad CA）が使用され得る。これに関して、本発明の方法は、ＴＩＬの数を拡大するために必要とされる培地の量及び培地の種類の数を有利に減少させる。一実施形態において、ＴＩＬの数を拡大することは、３日又は４日に１回以下の頻度で細胞にフィードすることを含み得る。ガス透過性容器内の細胞数を増やすことは、細胞を拡大培養するのに必要なフィード頻度を減らすことによって細胞数を増やすのに必要な手順を単純化する。
【０１７９】
[00224]  一実施形態において、第２の拡大培養は、ガス透過性容器を使用して行われる。そのような実施形態は、細胞集団が約５×１０５個の細胞／ｃｍ２から１０×１０６〜３０×１０６個の細胞／ｃｍ２に拡大培養することを可能にする。一実施形態において、この拡大培養はフィードなしで発生する。一実施形態において、この拡大培養は、培地がガス透過性フラスコ内で約１０ｃｍの高さにある限り、フィードなしで発生する。一実施形態において、これは、フィードなしであるが、１つ以上のサイトカインの添加を伴う。一実施形態において、サイトカインを培地と混合する必要なく、サイトカインをボーラスとして添加することができる。そのような容器、装置及び方法は、当技術分野において公知であり、ＴＩＬの拡大培養に使用されており、米国特許出願公開第２０１４／０３７７７３９Ａ１号、国際公開第２０１４／２１００３６Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１１５６１７Ａ１号、国際公開第２０１３／１８８４２７Ａ１号、米国特許出願公開第２０１１／０１３６２２８Ａ１号、米国特許第８，８０９，０５０号、国際公開第２０１１／０７２０８８Ａ２号、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２１６Ａ１号、米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号、国際公開第２０１２／１２９２０１Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１０２０７５Ａ１号、米国特許第８，９５６，８６０号、国際公開第２０１３／１７３８３５Ａ１号及び米国特許出願公開第２０１５／０１７５９６６Ａ１号に記載されているものを含み、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。そのようなプロセスは、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292にも記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１８０】
[00225]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 10フラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、１０ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、４０ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、２回の培地交換後に、１億〜３億個のＴＩＬを提供する。
【０１８１】
[00226]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 100フラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、１００ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、４５０ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、２回の培地交換後に、１０億〜３０億個のＴＩＬを提供する。
【０１８２】
[00227]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 100Mフラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、１００ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、１０００ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、培地交換なしで１０億〜３０億個のＴＩＬを提供する。
【０１８３】
[00228]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 100Lフラスコ（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、１００ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、２０００ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、培地交換なしで１０億〜３０億個のＴＩＬを提供する。
【０１８４】
[00229]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 24ウェルプレート（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、２ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、８ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、２回の培地交換後に、１ウェルあたり２０００万〜６０００万個の細胞を提供する。
【０１８５】
[00230]  一実施形態において、ガス透過性容器は、G-Rex 6ウェルプレート（Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USA）である。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、１０ｃｍ２のガス透過性培養表面を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、ウェルを有するプレートを含み、各ウェルは、４０ｍＬの細胞培養培地容量を含む。一実施形態において、ガス透過性容器は、２回の培地交換後に、１ウェルあたり１億〜３億個の細胞を提供する。
【０１８６】
[00231]  一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は濾過されていない。濾過されていない細胞培地の使用は、細胞数を拡大培養させるために必要な手順を単純化し得る。一実施形態において、第１及び／又は第２のガス透過性容器内の細胞培地は、ベータ−メルカプトエタノール（ＢＭＥ）を欠いている。
【０１８７】
[00232]  一実施形態において、哺乳類から腫瘍組織サンプルを入手すること；細胞培地が中に入った第１のガス透過性容器内で腫瘍組織サンプルを培養すること；腫瘍組織サンプルからＴＩＬを入手すること；細胞培地が中に入った第２のガス透過性容器内でＴＩＬ数を、約１４〜約４２日間、例えば約２８日間拡大することを含む、本方法の所要期間である。
【０１８８】
[00233]  一実施形態において、細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
【０１８９】
[00234]  一実施形態において、細胞培養培地は、ＯＫＴ−３抗体を含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。
【０１９０】
[00235]  一実施形態において、ＴＩＬはガス透過性容器内で拡大培養する。米国特許出願公開第２００５／０１０６７１７Ａ１号に記載されているものを含む、当技術分野で公知の方法、組成物及び装置を使用して、ＰＢＭＣを使用してＴＩＬを拡大培養するために、ガス透過性容器が使用されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬはガス透過性バッグ内で拡大培養する。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W25（GE Healthcare）など、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、ＴＩＬは、Xuri Cell Expansion System W5（GE Healthcare）としても知られるWAVE Bioreactor Systemなど、ガス透過性バッグ内でＴＩＬを拡大培養する細胞拡大培養システムを使用して拡大培養される。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約１００ｍＬ、約２００ｍＬ、約３００ｍＬ、約４００ｍＬ、約５００ｍＬ、約６００ｍＬ、約７００ｍＬ、約８００ｍＬ、約９００ｍＬ、約１Ｌ、約２Ｌ、約３Ｌ、約４Ｌ、約５Ｌ、約６Ｌ、約７Ｌ、約８Ｌ、約９Ｌ、約１０Ｌ、約１１Ｌ、約１２Ｌ、約１３Ｌ、約１４Ｌ、約１５Ｌ、約１６Ｌ、約１７Ｌ、約１８Ｌ、約１９Ｌ、約２０Ｌ、約２５Ｌ及び約３０Ｌからなる群から選択される容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、５０〜１５０ｍＬ、１５０〜２５０ｍＬ、２５０〜３５０ｍＬ、３５０〜４５０ｍＬ、４５０〜５５０ｍＬ、５５０〜６５０ｍＬ、６５０〜７５０ｍＬ、７５０〜８５０ｍＬ、８５０〜９５０ｍＬ及び９５０〜１０５０ｍＬからなる群から選択される範囲の容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、１Ｌ〜２Ｌ、２Ｌ〜３Ｌ、３Ｌ〜４Ｌ、４Ｌ〜５Ｌ、５Ｌ〜６Ｌ、６Ｌ〜７Ｌ、７Ｌ〜８Ｌ、８Ｌ〜９Ｌ、９Ｌ〜１０Ｌ、１０Ｌ〜１１Ｌ、１１Ｌ〜１２Ｌ、１２Ｌ〜１３Ｌ、１３Ｌ〜１４Ｌ、１４Ｌ〜１５Ｌ、１５Ｌ〜１６Ｌ、１６Ｌ〜１７Ｌ、１７Ｌ〜１８Ｌ、１８Ｌ〜１９Ｌ及び１９Ｌ〜２０Ｌからなる群から選択される範囲の容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、０．５Ｌ〜５Ｌ、５Ｌ〜１０Ｌ、１０Ｌ〜１５Ｌ、１５Ｌ〜２０Ｌ、２０Ｌ〜２５Ｌ及び２５Ｌ〜３０Ｌからなる群から選択される範囲の容積を有するガス透過性細胞バッグを含む。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約３０分、約１時間、約２時間、約３時間、約４時間、約５時間、約６時間、約７時間、約８時間、約９時間、約１０時間、約１１時間、約１２時間、約２４時間、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、約２０日、約２１日、約２２日、約２３日、約２４日、約２５日、約２６日、約２７日及び約２８日の揺動時間を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、３０分〜１時間、１時間〜１２時間、１２時間〜１日、１日〜７日、７日〜１４日、１４日〜２１日及び２１日〜２８日の揺動時間を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養���ステムは、約２揺動／分、約５揺動／分、約１０揺動／分、約２０揺動／分、約３０揺動／分及び約４０揺動／分の揺動速度を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、２揺動／分〜５揺動／分、５揺動／分〜１０揺動／分、１０揺動／分〜２０揺動／分、２０揺動／分〜３０揺動／分及び３０揺動／分〜４０揺動／分の揺動速度を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、約２°、約３°、約４°、約５°、約６°、約７°、約８°、約９°、約１０°、約１１°及び約１２°の揺動角を用いる。一実施形態において、細胞拡大培養システムは、２°〜３°、３°〜４°、４°〜５°、５°〜６°、６°〜７°、７°〜８°、８°〜９°、９°〜１０°、１０°〜１１°及び１１°〜１２°の揺動角を用いる。
【０１９１】
[00236]  一実施形態において、液性腫瘍から入手したＴＩＬを拡大培養する方法は、ＴＩＬが優れた腫瘍反応性について選択されるステップを更に含む。当技術分野で公知の任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法が、優れた腫瘍応答性に関するＴＩＬの選択に用いられ得る。
【０１９２】
[00237]  一実施形態において、本発明は、液性腫瘍からＴＩＬの集団を拡大培養する方法を提供し、この方法は、Jin, et al., J. Immunotherapy 2012, 35, 283-292に記載されているようなステップを含み、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。例えば、腫瘍又はその一部を酵素培地に入れ、およそ１分間機械的に分離させ得る。次いで、混合物を５％  ＣＯ２中３７℃で３０分間インキュベートし、次いでおよそ１分間再び機械的に破砕し得る。５％  ＣＯ２中、３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍又はその一部を、３回目におよそ１分間機械的に破砕し得る。３回目の機械的破砕後、大きい組織片が存在する場合、５％  ＣＯ２中、３７℃で更に３０分のインキュベーションを伴って又は伴わず、１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用し得る。最終インキュベーションの終わりに、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにフィコールを用いた密度勾配分離を行うことができる。ＴＩＬ培養は、２４ウェルプレート（Costar  ２４ウェル細胞培養クラスター、平底；Corning Incorporated, Corning, NY）で開始され、各ウェルに、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp., Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の腫瘍消化細胞又はおよそ１〜８ｍｍ３のサイズの１つの腫瘍断片が播種され得る。ＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加した、GlutaMAXを含むRoswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）1640緩衝液を含む。培養は、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２のガス透過性シリコン底を有するガス透過性フラスコ（G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton内で開始され得、各フラスコに、ＩＬ−２を含む１０〜４０ｍＬのＣＭ中、１０〜４０×１０６個の生存可能な腫瘍消化細胞又は５〜３０個の腫瘍断片が充填され得る。G-Rex 10及び２４ウェルプレートは、５％  ＣＯ２中３７℃で、加湿インキュベーター内でインキュベートされ得、培養開始の５日後、培地の半分は、取り出され、新鮮なＣＭ及びＩＬ−２と交換され得、５日目の後、培地の半分は、２〜３日ごとに交換され得る。本開示の液性腫瘍から入手したＴＩＬを使用して、本明細書の他の箇所に記載されるように、T-175フラスコ及びガス透過性バッグ又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して、ＴＩＬの第２の拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）が行われ得る。T-175フラスコ中のＲＥＰでは、１×１０６個のＴＩＬが各フラスコ中の１５０ｍＬの培地に懸濁され得る。ＴＩＬは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３）を添加したＣＭ及びＡＩＭ−Ｖ培地（５０／５０培地）の１対１の混合物で培養し得る。T-175フラスコは、５％  ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、５日目に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０／５０培地を用いて交換され得る。７日目に、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグ中で混合し、５％ヒトＡＢ血清を含む３００ｍＬのＡＩＭ−Ｖ及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加し得る。各バッグ中の細胞数を毎日又は隔日で計数し得、新鮮な培地を添加して細胞数を０．５〜２．０×１０６個の細胞／ｍＬに保ち得る。１００ｃｍ��のガス透過性シリコン底を有する５００ｍＬ容量のフラスコ（例えば、本明細書の他の箇所に記載されるように、G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing）中のＲＥＰでは、５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬは、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３抗体（ＯＫＴ−３）を添加した、４００ｍＬの５０／５０培地中で培養され得る。G-Rex 100フラスコは５％  ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心分離ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心分離し得る。入手したＴＩＬペレットを３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮な５０／５０培地に再懸濁し、G-Rex 100フラスコに戻し添加し得る。ＴＩＬをG-Rex 100フラスコ中で連続的に拡大培養する場合、７日目に各G-Rex 100中のＴＩＬは各フラスコに存在する３００ｍＬの培地に懸濁され、細胞懸濁液は、３つのG-Rex 100フラスコに接種するために使用され得る、３つの１００ｍＬアリコートに分割され得る。次いで、５％ヒトＡＢ血清を含む約１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖ及び１ｍＬあたり３０００ＵＩ／ｍＬのＩＬ−２を各フラスコに添加し得る。次いで、G-Rex 100フラスコを５％  ＣＯ２中３７℃でインキュベートし、４日後に、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を有する１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各G-Rex 100フラスコに加え得る。この後、培養１４日目に細胞を回収することにより、ＲＥＰが完了され得る。
【０１９３】
[00238]  一実施形態において、癌を拡大培養又は処置する方法は、ＴＩＬが患者の腫瘍サンプルから入手されるステップを含む。患者の腫瘍サンプルは、当技術分野において公知の方法を使用して入手され得る。例えば、ＴＩＬは、酵素的腫瘍消化物及び鋭的切開による腫瘍断片（サイズ約１〜約８ｍｍ３）から培養され得る。そのような腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Roswell Park Memorial Institute（RPMI）1640緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて機械的分離（例えば、組織分離剤を使用）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍をおよそ１分間機械的に分離した後、続いて５％  ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織のみが存在するまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。このプロセスの終わりに、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号に記載されているものなど、当技術分野で公知の代替的方法を使用し得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、ＴＩＬを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
【０１９４】
[00239]  一実施形態において、前述のように、T-175フラスコ及びガス透過性バッグを使用して（Tran, et al., J. Immunother.2008, 31, 742-51；Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42）又はガス透過性培養器具（G-Rexフラスコ、Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販）を使用して、ＴＩＬの第２の／ＲＥＰ拡大培養プロセスが実施され得る。T-175フラスコ中のＴＩＬ拡大培養では、１５０ｍＬの培地中に懸濁した１×１０６個のＴＩＬが各T-175フラスコに添加され得る。ＴＩＬは、１ｍＬあたり３０００ＩＵ（国際単位）のＩＬ−２及び抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ−３）の１ｍＬあたり３０ｎｇを添加したＣＭ及びＡＩＭ−Ｖ培地の１対１の混合物で培養し得る。T-175フラスコは、５％  ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、５日目に、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む５０／５０培地を用いて交換され得る。７日目に、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグ中で混合し、５％ヒトＡＢ血清を含む３００ｍＬのＡＩＭ  Ｖ及び１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を３００ｍｌのＴＩＬ懸濁液に添加した。各バッグ中の細胞数を毎日又は隔日で計数し、新鮮な培地を添加して細胞数を０．５〜２．０×１０６個の細胞／ｍＬに保った。
【０１９５】
[00240]  一実施形態において、１００ｃｍ２のガス透過性シリコン底を有する５００ｍＬ容量のガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販）中の第２の／ＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養では、５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬは、５％ヒトＡＢ血清、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２及び１ｍＬあたり３０ｎｇの抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）を添加した、４００ｍＬの５０／５０培地中で培養され得る。G-Rex 100フラスコは５％  ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心分離ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（毎分回転数；４９１×ｇ）で１０分間遠心分離し得る。ＴＩＬペレットを、５％ヒトＡＢ血清、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮培地で再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し添加し得る。ＴＩＬをG-Rex 100フラスコ中で連続的に拡大培養する場合、７日目に各G-Rex 100フラスコ中のＴＩＬは各フラスコに存在する３００ｍＬの培地に懸濁され得、細胞懸濁液は、３つのG-Rex 100フラスコに接種するために使用され得る、３つの１００ｍＬアリコートに分割され得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコを５％  ＣＯ２中３７℃でインキュベートし、４日後に、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を有する１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各G-Rex 100フラスコに加え得る。細胞は、培養１４日目に回収され得る。
【０１９６】
[00241]  一実施形態において、ＴＩＬは以下のように調製され得る。２ｍｍ３の腫瘍断片を、２ｍＭグルタミン（Mediatech, Inc. Manassas, VA）、１００Ｕ／ｍＬペニシリン（Invitrogen Life Technologies）、１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Invitrogen Life Technologies）、５％熱不活性化ヒトＡＢ血清（Valley Biomedical, Inc. Winchester, VA）及び６００ＩＵ／ｍＬ  ｒｈＩＬ−２（Chiron, Emeryville, CA）を添加したＡＩＭ−Ｖ培地（Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA）を含む完全培地（ＣＭ）中で培養する。液性腫瘍の酵素的消化のために、腫瘍標本をさいの目に切りRPMI-1640へ入れ、洗浄し、１５〜２２℃で５分間、８００ｒｐｍで遠心分離し、酵素的消化緩衝液（ＲＰＭＩ−１６４０中０．２ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ及び３０単位／ｍｌのＤＮａｓｅ）に再懸濁し、続いて室温で一晩回転させる。断片から作製されたＴＩＬをＣＭ中で３〜４週間増殖させ、新鮮に拡大培養させるか、又は１０％ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む熱不活性化ＨＡＢ血清中で凍結保存し、研究時まで−１８０℃で保存し得る。腹水採取から入手した腫瘍関連リンパ球（ＴＡＬ）をＣＭ中２４ウェルプレートの３×１０６個の細胞／ウェルで播種した。低倍率倒立顕微鏡を使用して、ＴＩＬの増殖を隔日で検査した。
【０１９７】
ＴＩＬ製造プロセス（「２Ａプロセス」）の例示的な実施形態
[00242]  プロセス２Ａとして知られる例示的なＴＩＬ製造／拡大培養プロセスは、図２２に概略的に示されている。特定の態様において、本方法は、対象／患者への投与時に複製サイクルを増加させることができるＴＩＬを産生し、従って成熟ＴＩＬ（即ち被験者／患者への投与前に更に多くの回数の複製を受けたＴＩＬ）を超える追加の治療上の利点を提供し得る。幼若ＴＩＬの特徴が文献に記載されている。例えば、Donia, at al., Scandinavian Journal of Immunology, 75:157-167 (2012)；Dudley et al., Clin Cancer Res, 16:6122-6131 (2010)；Huang et al., J Immunother, 28(3):258-267 (2005)；Besser et al., Clin Cancer Res, 19(17):OF1-OF9 (2013)；Besser et al., J Immunother 32:415-423 (2009)；Robbins, et al., J Immunol 2004；173:7125-7130；Shen et al., J Immunother, 30:123-129 (2007)；Zhou, et al., J Immunother, 28:53-62 (2005)；及びTran, et al., J Immunother, 31:742-751 (2008)であり、これらの全ては、全体として参照により本明細書に組み込まれる。
【０１９８】
[00243]  本明細書において考察される通り、本発明は、患者への移植前に凍結保存ＴＩＬを再刺激することによりその代謝活性、従って相対的健康を増加させること及び前記代謝的健康の試験方法に関するステップを含み得る。一般的に本明細書に概説される通り、ＴＩＬは、一般的に患者サンプルから採取し、操作することにより、患者への移植前にその数が拡大される。一部の実施形態において、ＴＩＬは任意選択により、以下に考察する通り、遺伝的に操作され得る。
【０１９９】
[00244]  一部の実施形態において、ＴＩＬは凍結保存され得る。解凍後、ＴＩＬは、患者への注入前に、その代謝を高めるために再刺激され得る。
【０２００】
[00245]  一部の実施形態において、以下並びに実施例及び図で詳細に考察する通り、第１の拡大培養（プレＲＥＰと称されるプロセスを含む）は、従来の拡大培養法と比較して、７〜１４日に短縮され、第２の拡大培養（ＲＥＰと称されるプロセスを含む）は、７〜１４日間に短縮される。
【０２０１】
[00246]  図２３は、例示的な２Ａプロセスを示す。図２３で示すように且つ以下で更に詳細に説明されるように、一部の実施形態において、第１の拡大培養（ステップＢ）は１１日間に短縮され、第２の拡大培養（ステップＤ）は１１日間に短縮される。一部の実施形態において、本明細書で詳細に考察されるように、第１及び第２の拡大培養（ステップＢ及びステップＤ）の組み合わせは２２日間に短縮される。理解されるように、図２３に示され且つ以下に説明されるプロセスは、例示的なものであり、本明細書で説明する方法は、説明したステップへの変更及び追加並びに任意の組み合わせを包含する。このプロセスの例示的な実施形態は、米国特許出願公開第２０１８／０２８２６９４Ａ１号に記載されており、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【０２０２】
ステップＡ：患者腫瘍サンプルの入手
[00247]  一般に、ＴＩＬは、初めに患者腫瘍サンプルから入手され（「初代ＴＩＬ」）、次に本明細書に記載される通りの更なる操作のためより大きい集団に拡大培養され、任意選択により凍結保存され、本明細書に概説される通りに再刺激され、且つ任意選択によりＴＩＬの健康の指標として表現型及び代謝パラメータが判定される。
【０２０３】
[00248]  患者腫瘍サンプルは当技術分野において公知の方法を用いて、一般的に、外科的切除、針生検、アフェレーシス又は腫瘍とＴＩＬ細胞との混合物を含む他のサンプルを入手するための手段によって入手され得る。一般に、腫瘍サンプルは、原発腫瘍、浸潤性腫瘍又は転移性腫瘍を含めた任意の固形腫瘍からのものであり得る。腫瘍サンプルは、血液悪性腫瘍から入手された腫瘍など、液性腫瘍でもあり得る。固形腫瘍は、限定はされないが、乳癌、膵癌、前立腺癌、結腸直腸癌、肺癌、脳癌、腎癌、胃癌及び皮膚癌（限定はされないが、扁平上皮癌、基底細胞癌及び黒色腫を含む）を含めた任意の癌型のものであり得る。一部の実施形態において、有用なＴＩＬは、特に高レベルのＴＩＬを有すると報告されていることに伴い悪性黒色腫腫瘍から入手される。一部の実施形態において、腫瘍は約１．５ｃｍより大きく、約４ｃｍより小さい。一部の実施形態において、腫瘍は４ｃｍ未満である。
【０２０４】
[00249]  入手後、腫瘍サンプルは、一般的に鋭的剥離を用いて１〜約８ｍｍ３の小片に断片化され、約２〜３ｍｍ３が特に有用である。ＴＩＬは酵素的腫瘍消化物を使用してこれらの断片から培養される。そのような腫瘍消化物は、酵素培地（例えば、Roswell Park Memorial Institute（ＲＰＭＩ）1640緩衝液、２ｍＭグルタメート、１０ｍｃｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０単位／ｍＬのＤＮａｓｅ及び１．０ｍｇ／ｍＬのコラゲナーゼ）中でのインキュベーション、続いて機械的分離（例えば、組織分離剤を使用）によって産生され得る。腫瘍消化物は、腫瘍を酵素培地中に置き、腫瘍をおよそ１分間機械的に分離した後、続いて５％  ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、続いてごく小さい組織片のみが存在するまで前述の条件下で機械的分離及びインキュベーションのサイクルを繰り返すことにより作製され得る。このプロセスの終わりに、細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有する場合、これらの細胞を除去するためにFICOLL分岐親水性多糖を用いた密度勾配分離を行うことができる。米国特許出願公開第２０１２／０２４４１３３Ａ１号に記載されているものなど、当技術分野で公知の代替的方法を使用し得、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。前述の任意の方法は、ＴＩＬを拡大培養する方法又は癌を処置する方法のために、本明細書に記載の任意の実施形態において使用され得る。
【０２０５】
[00250]  一般に、回収された細胞懸濁液は「初代細胞集団」又は「新鮮に採取した」細胞集団と呼ばれる。
【０２０６】
[00251]  一実施形態において、ＴＩＬは、初めに、患者から入手された酵素的腫瘍消化物及び腫瘍断片から培養することができる。
【０２０７】
[00252]  一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍断片から入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は鋭的剥離で入手される。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約２ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約３ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約４ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約６ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約７ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約９ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８〜２７ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１０〜２５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１５〜２５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８〜２０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１５〜２０ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８〜１５ｍｍ３である。一部の実施形態において、腫瘍断片は約８〜１０ｍｍ３である。
【０２０８】
[00253]  一部の実施形態において、腫瘍断片の数は、約４０〜約５０個の腫瘍断片である。一部の実施形態において、腫瘍断片の数は、約４０個の腫瘍断片である。一部の実施形態において、腫瘍断片の数は、約５０個の腫瘍断片である。一部の実施形態において、腫瘍断片サイズは約８〜２７ｍｍ３であり、約５０未満の腫瘍断片が存在する。
【０２０９】
[00254]  一部の実施形態において、ＴＩＬは腫瘍消化物から入手される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、酵素培地中、例えば、限定はされないが、ＲＰＭＩ  １６４０、２ｍＭ  GlutaMAX、１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシン、３０Ｕ／ｍＬ  ＤＮａｓｅ及び１．０ｍｇ／ｍＬコラゲナーゼ中におけるインキュベーションと、それに続く機械的分離（GentleMACS、Miltenyi Biotec, Auburn, CA）によって作製した。腫瘍を酵素培地に置いた後、腫瘍をおよそ１分間機械的に分離し得る。次に溶液を５％  ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートし、次にそれを再びおよそ１分間機械的に破壊し得る。再び５％  ＣＯ２下３７℃で３０分間インキュベートした後、腫瘍を３回目におよそ１分間機械的に破壊し得る。一部の実施形態において、３回目の機械的破壊後に大型の組織片が存在した場合、５％  ＣＯ２下３７℃での更に３０分間のインキュベーションを伴う又は伴わない１回又は２回の更なる機械的分離をサンプルに適用した。一部の実施形態において、最終回のインキュベーションの終了時に細胞懸濁液が多数の赤血球又は死細胞を含有した場合、フィコールを使用した密度勾配分離を実施して、そうした細胞を除去し得る。
【０２１０】
ステップＢ：第１の拡大培養
[00255]  ステップＡにおける腫瘍断片の剥離又消化後、得られた細胞は、腫瘍及び他の細胞よりもＴＩＬの成長に有利な条件下で血清含有ＩＬ−２において培養される。一部の実施形態において、腫瘍消化物は、２ｍＬウェルにおいて、不活性化ヒトＡＢ血清を６０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２と共に含む培地中でインキュベートされる。この初代細胞集団は、数日、一般的に３〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、一般的に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、７〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、一般的に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、１０〜１４日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、一般的に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約１１日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、一般的に約１×１０８個のバルクＴＩＬ細胞が得られる。一部の実施形態において、この初代細胞集団は、約１１日の期間にわたって培養され、それによりバルクＴＩＬ集団、一般的に約２００×１０６個以下のバルクＴＩＬ細胞が得られる。
【０２１１】
[00256]  好ましい一実施形態において、以下及び本明細書で説明するように、初期バルクＴＩＬ拡大培養ステップ（プレＲＥＰと称されるプロセスを含み得る図２３に示されるステップＢ）、その後の、以下ステップＤの下及び本明細書に記載されているように、第２の拡大培養（ステップＤ、急速拡大培養プロトコル（ＲＥＰ）ステップと称されるプロセスを含む）、その後の、任意選択の凍結保存及び以下及び本明細書で説明するように、その後の第２のステップＤ（再刺激ＲＥＰステップと称されるプロセスを含む）を使用してＴＩＬの拡大培養を実施することができる。このプロセスによって入手したＴＩＬは、任意選択により、本明細書に記載される通り表現型特徴及び代謝パラメータが特徴付けられ得る。
【０２１２】
[00257]  実施形態において、ＴＩＬ培養が２４ウェルプレートで、例えばCostar  ２４ウェル細胞培養クラスター、平底（Corning Incorporated, Corning, NYを使用して開始される場合、各ウェルには、ＩＬ−２（６０００ＩＵ／ｍＬ；Chiron Corp., Emeryville, CA）を含む２ｍＬの完全培地（ＣＭ）中、１×１０６個の腫瘍消化物細胞又は１個の腫瘍断片を播種することができる。一部の実施形態において、腫瘍断片は約１ｍｍ３〜１０ｍｍ３である。
【０２１３】
[00258]  一部の実施形態において、ステップＢのＣＭは、１０％ヒトＡＢ血清、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ及び１０ｍｇ／ｍＬゲンタマイシンを添加したGlutaMAX含有ＲＰＭＩ  １６４０からなる。培養が、４０ｍＬ容量及び１０ｃｍ２ガス透過性シリコン底のガス透過性フラスコ（例えば、G-Rex 10；Wilson Wolf Manufacturing, New Brighton, MN）内で開始される実施形態において（図１）、各フラスコに、１０〜４０ｍＬのＩＬ−２含有ＣＭ中の１０〜４０×１０６個の腫瘍消化物生細胞又は５〜３０個の腫瘍断片を充填した。G-Rex 10及び２４ウェルプレートのいずれも、加湿インキュベーターにおいて５％  ＣＯ２下３７℃でインキュベートし、培養開始から５日後に培地の半分を取り出して、新鮮なＣＭ及びＩＬ−２と置き換え、５日目以降は２〜３日毎に培地の半分を交換した。
【０２１４】
[00259]  一実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬの間のＩＬ−２を含む。
【０２１５】
[00260]  一部の実施形態において、実施例及び図で考察されているように、第１の拡大培養（プレＲＥＰと称されるプロセスを含む；ステップＢ）プロセスは３〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察し、図４及び５に示すように、ステップＢの第１の拡大培養は７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察するように、ステップＢの第１の拡大培養は１０〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、実施例で考察するように、ステップＢの第１の拡大培養は１１日間に短縮される。
【０２１６】
[00261]  一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１並びにそれらの組み合わせは、本明細書に記載のように、ステップＢプロセス中に含められ得る。
【０２１７】
[00262]  一部の実施形態において、ステップＢは閉鎖系バイオリアクターで実施される。一部の実施形態において、本明細書に記載される通り、ＴＩＬ拡大培養のために閉鎖系が用いられる。一部の実施形態において、単一のバイオリアクターが用いられる。一部の実施形態において、用いられる単一のバイオリアクターは、例えば、G-REX-10又はG-REX-100である。
【０２１８】
ステップＣ：第１の拡大培養から第２の拡大培養への移行
[00263]  一部の実施形態において、ステップＢからのバルクＴＩＬ集団は、当技術分野で公知であり且つ及び本明細書に記載される方法を使用して、直ちに凍結保存することができる。代わりに、バルクＴＩＬ集団は、以下で考察する通り、第２の拡大培養（ＲＥＰ）に供し、次に凍結保存し得る。
【０２１９】
[00264]  一部の実施形態において、ステップＢのＴＩＬは保存されず、ステップＢのＴＩＬはステップＤに直接進む。一部の実施形態において、本明細書に更に記載される通り、移行は閉鎖系で行われる。
【０２２０】
ステップＤ：第２の拡大培養
[00265]  一部の実施形態において、ＴＩＬ細胞集団は回収及び初期バルク処理後（即ちステップＡ及びステップＢ後）に数が拡大される。これは、本明細書において第２の拡大培養と称され、当技術分野では一般的に急速拡大培養プロセス（ＲＥＰ）と称される拡大培養プロセスを含み得る。第２の拡大培養は、一般的に、フィーダー細胞、サイトカイン源及び抗ＣＤ３抗体を含め、幾つもの成分を含むガス透過性容器内の培養培地を使用して達成することができる。一部の実施形態において、第２の拡大培養は、第２の拡大培養で入手されるＴＩＬの数を増加させるためにスケールアップすることを含み得る。
【０２２１】
[00266]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、本開示の方法を使用して、ガス透過性容器内で行うことができる。例えば、ＴＩＬは、インターロイキン−２（ＩＬ−２）又はインターロイキン−１５（ＩＬ−１５）の存在下で非特異的Ｔ細胞受容体刺激を用いて急速に拡大培養することができる。非特異的Ｔ細胞受容体刺激としては、例えば、約３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３、マウスモノクローナル抗ＣＤ３抗体（Ortho-McNeil, Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech, Auburn, CAから市販されている）を挙げることができる。ＴＩＬは、任意選択により３００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２又はＩＬ−１５など、Ｔ細胞成長因子の存在下において、ヒト白血球抗原Ａ２（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチド、例えば０．３μＭ  ＭＡＲＴ−１：２６−３５（２７Ｌ）又はｇｐｌ  ００：２０９−２１７（２１０Ｍ）など、任意選択によりベクターから発現させることのできる、エピトープなど、その抗原性部分を含めた癌の１つ以上の抗原によるインビトロでのＴＩＬの更なる刺激により、急速に拡大培養することができる。他の適切な抗原としては、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、チロシナーゼ癌抗原、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＳＳＸ−２及びＶＥＧＦＲ２又はそれらの抗原部分が挙げられ得る。ＴＩＬは、ＨＬＡ−Ａ２発現抗原提示細胞にパルスした癌の同じ抗原による再刺激によっても急速に拡大培養し得る。代わりに、ＴＩＬは、例えば、照射自己リンパ球によるか、又は照射ＨＬＡ−Ａ２＋同種異系リンパ球及びＩＬ−２によって更に再刺激することができる。
【０２２２】
[00267]  ある実施形態において、細胞培養培地はＩＬ−２を更に含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、約１０００ＩＵ／ｍＬ、約１５００ＩＵ／ｍＬ、約２０００ＩＵ／ｍＬ、約２５００ＩＵ／ｍＬ、約３０００ＩＵ／ｍＬ、約３５００ＩＵ／ｍＬ、約４０００ＩＵ／ｍＬ、約４５００ＩＵ／ｍＬ、約５０００ＩＵ／ｍＬ、約５５００ＩＵ／ｍＬ、約６０００ＩＵ／ｍＬ、約６５００ＩＵ／ｍＬ、約７０００ＩＵ／ｍＬ、約７５００ＩＵ／ｍＬ又は約８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。一実施形態において、細胞培養培地は、１０００〜２０００ＩＵ／ｍＬ、２０００〜３０００ＩＵ／ｍＬ、３０００〜４０００ＩＵ／ｍＬ、４０００〜５０００ＩＵ／ｍＬ、５０００〜６０００ＩＵ／ｍＬ、６０００〜７０００ＩＵ／ｍＬ、７０００〜８０００ＩＵ／ｍＬ又は８０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む。
【０２２３】
[00268]  一実施形態において、細胞培養培地はＯＫＴ３抗体を含む。好ましい一実施形態において、細胞培養培地は、約３０ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ−３抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約２．５ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約６０ｎｇ／ｍＬ、約７０ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約５００ｎｇ／ｍＬ及び約１μｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。ある実施形態において、細胞培養培地は、０．１ｎｇ／ｍＬ〜１ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ〜５ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ〜１０ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ〜２０ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ〜３０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ〜４０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ〜５０ｎｇ／ｍＬ及び５０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬのＯＫＴ３抗体を含む。
【０２２４】
[00269]  一部の実施形態において、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１並びにそれらの組み合わせは、本明細書に記載のように、ステップＤプロセスにおける第２の拡大培養中に含められ得る。
【０２２５】
[00270]  一部の実施形態において、第２の拡大培養は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３及び抗原提示フィーダー細胞を含む添加細胞培養培地で実施され得る。
【０２２６】
[00271]  一部の実施形態において、抗原提示フィーダー細胞（ＡＰＣ）はＰＢＭＣである。ある実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣ及び／又は抗原提示細胞との比は、約１：２５、約１：５０、約１：１００、約１：１２５、約１：１５０、約１：１７５、約１：２００、約１：２２５、約１：２５０、約１：２７５、約１：３００、約１：３２５、約１：３５０、約１：３７５、約１：４００又は約１：５００である。ある実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：５０〜１：３００である。ある実施形態において、急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養におけるＴＩＬとＰＢＭＣとの比は、１：１００〜１：２００である。
【０２２７】
[00272]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる（一般的に新鮮培地による呼吸を介した３分の２の培地補充）。別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察する通りのGRexフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
【０２２８】
[00273]  一部の実施形態において、第２の拡大培養（ＲＥＰプロセスとも称される）は、実施例及び図で考察されるように、７〜１４日間に短縮される。一部の実施形態において、第２の拡大培養は１１日間に短縮される。
【０２２９】
[00274]  ある実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、前述のように（Tran, et al., J. Immunother.2008, 31, 742-51；Dudley, et al., J. Immunother.2003, 26, 332-42）T-175フラスコ及びガス透過性バッグ又はガス透過性培養器具（G-Rexフラスコ）を使用して実施し得る。T-175フラスコ中のＴＩＬ急速拡大培養及び／又は第２の拡大培養では、１５０ｍＬの培地中に懸濁した１×１０６個のＴＩＬが各T-175フラスコに添加され得る。ＴＩＬは、ＩＬ−２の１ｍＬあたり３０００ＩＵ及び抗ＣＤ３の１ｍＬあたり３０ｎｇを添加したＣＭ及びＡＩＭ−Ｖ培地の１対１の混合物で培養し得る。T-175フラスコは、５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートされ得る。培地の半分は、５日目に、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む５０／５０培地を用いて交換され得る。７日目に、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグ中で混合し、５％ヒトＡＢ血清を含む３００ｍＬのＡＩＭ  Ｖ及び１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に添加した。各バッグ中の細胞数を毎日又は隔日で計数し、新鮮な培地を添加して細胞数を０．５〜２．０×１０６細胞／ｍＬに保った。
【０２３０】
[00275]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、１００ｃｍのガス透過性シリコン底を有する５００ｍＬ容量のガス透過性フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf Manufacturing Corporation, New Brighton, MN, USAから市販）中で実施され得、５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬは、５％ヒトＡＢ血清、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３（ＯＫＴ−３）を添加した、４００ｍＬの５０／５０培地中で、ＰＢＭＣと共に培養され得る。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートし得る。５日目、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１×ｇ）で１０分間遠心し得る。ＴＩＬペレットを、５％ヒトＡＢ血清、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮培地で再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに戻し添加し得る。G-Rex 100フラスコ内でＴＩＬを連続的に拡大培養するときは、７日目に各G-Rex 100のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し得、且つ細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割し得、それらを３つのG-Rex 100フラスコの播種に使用し得る。次に、５％ヒトＡＢ血清及び１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各フラスコに加え得る。G-Rex 100フラスコを５％ＣＯ２中３７℃でインキュベートし、４日後に、１ｍＬあたり３０００ＩＵのＩＬ−２を有する１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各G-Rex 100フラスコに加え得る。細胞は、培養１４日目に回収され得る。
【０２３１】
[00276]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、バルクＴＩＬを１５０ｍｌ培地中の１００倍又は２００倍過剰の不活性化フィーダー細胞、３０ｍｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２と混合してフラスコ内で実施される。細胞を別の成長チャンバに移すまで培地補充が行われる（一般的に新鮮培地による呼吸を介した３分の２の培地補充）。別の成長チャンバには、以下に更に十分に考察する通りのGRexフラスコ及びガス透過性容器が含まれる。
【０２３２】
[00277]  一実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養が実施され、これは優れた腫瘍応答性に関してＴＩＬを選択するステップを更に含む。当技術分野で公知の任意の選択方法が使用され得る。例えば、米国特許出願公開第２０１６／００１００５８Ａ１号（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載される方法が、優れた腫瘍応答性に関するＴＩＬの選択に用いられ得る。
【０２３３】
[00278]  ＴＩＬのＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養は、先述の通りT-175フラスコ及びガス透過性バッグ（Tran KQ, Zhou J, Durflinger KH, et al., 2008, J Immunother., 31:742-751及びDudley ME, Wunderlich JR, Shelton TE, et al. 2003, J Immunother., 26:332-342）又はガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施することができる。一部の実施形態において、ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養はフラスコを使用して実施される。一部の実施形態において、ＲＥＰはガス透過性G-Rexフラスコを使用して実施される。T-175フラスコにおけるＴＩＬ  ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養について、約１×１０６個のＴＩＬを約１５０ｍＬの培地中に懸濁し、これを各T-175フラスコに加える。ＴＩＬは、「フィーダー」細胞としての照射（５０Ｇｙ）された同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養し、及び細胞は、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加したＣＭとＡＩＭ−Ｖ培地との１対１混合物（５０／５０培地）で培養した。T-175フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートする。一部の実施形態において、培地の半分は、５日目に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む５０／５０培地を使用して交換される。一部の実施形態において、７日目、２つのT-175フラスコからの細胞を３Ｌバッグに合わせ、その３００ｍＬのＴＩＬ懸濁液に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む３００ｍＬのＡＩＭ−Ｖを加える。各バッグの細胞数は、毎日又は２日毎に計数し得、新鮮培地を加えて細胞数を約０．５〜約２．０×１０６細胞／ｍＬに保ち得る。
【０２３４】
[00279]  １００ｃｍ２ガス透過性シリコン底の５００ｍＬ容量フラスコ（G-Rex 100、Wilson Wolf）中でのＴＩＬ  ＲＥＰ及び／又は第２の拡大培養について、３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２及び３０ｎｇ／ｍＬの抗ＣＤ３を添加した４００ｍＬの５０／５０培地中で、約５×１０６又は１０×１０６個のＴＩＬを照射同種異系ＰＢＭＣと１対１００の比で培養する。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされる。一部の実施形態において、５日目に、２５０ｍＬの上清を取り出して遠心ボトルに入れ、１５００ｒｐｍ（４９１ｇ）で１０分間遠心する。次に３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬの新鮮５０／５０培地にＴＩＬペレットを再懸濁し、元のG-Rex 100フラスコに加え戻し得る。ＴＩＬがG-Rex 100フラスコ内で連続的に拡大培養される実施形態において、７日目に各G-Rex 100内のＴＩＬを各フラスコ内に存在する３００ｍＬの培地に懸濁し、且つ細胞懸濁液を３つの１００ｍＬアリコートに分割しており、それらを３つのG-Rex 100フラスコの播種に使用する。次に、５％ヒトＡＢ血清及び３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを各フラスコに加える。G-Rex 100フラスコは５％ＣＯ２下３７℃でインキュベートされ、４日後、各G-Rex 100フラスコに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む１５０ｍＬのＡＩＭ−Ｖを加える。細胞は培養１４日目に回収される。
【０２３５】
フィーダー細胞及び抗原提示細胞
[00280]  ある実施形態において、本明細書に記載される第２の拡大培養手順（ステップＤ、ＲＥＰを含む）には、ＲＥＰ  ＴＩＬ拡大培養中及び／又は第２の拡大培養中に、過剰量のフィーダー細胞が必要である。多くの実施形態において、フィーダー細胞は、健常供血者からの標準的な全血ユニットから入手される末梢血単核球（ＰＢＭＣ）である。ＰＢＭＣは、Ficoll-Paque勾配分離などの標準方法を用いて入手される。
【０２３６】
[00281]  一般に、同種異系ＰＢＭＣは、照射又は熱処理のいずれかにより不活性化され、実施例、特に照射同種異系ＰＢＭＣの複製能力を評価するための例示的なプロトコルを提供する実施例１４に記載されるように、ＲＥＰ手順で使用される。
【０２３７】
[00282]  一部の実施形態において、１４日目の生細胞の総数がＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目に培養（即ち第２の拡大培養の開始日）に移行した初期生細胞数より少ない場合、ＰＢＭＣは複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。
【０２３８】
[00283]  一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ−２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、３０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び３０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。
【０２３９】
[00284]  一部の実施形態において、ＯＫＴ３及びＩＬ−２の存在下で培養された生細胞の総数が、７日目及び１４日目に、ＲＥＰの０日目及び／又は第２の拡大培養の０日目（即ち第２の拡大培養の開始日）に培養に移行した初期生細胞数から増加していない場合、ＰＢＭＣは複製不能と見なされ、本明細書に記載のＴＩＬ拡大培養手順での使用が認められる。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、５〜６０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び１０００〜６０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、１０〜５０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００〜５０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２０〜４０ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２０００〜４０００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。一部の実施形態において、ＰＢＭＣは、２５〜３５ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３抗体及び２５００〜３５００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２の存在下で培養される。
【０２４０】
[00285]  ある実施形態において、人工抗原提示細胞は、ＰＢＭＣの代替として又はそれと組み合わせて、ＲＥＰ段階で使用される。
【０２４１】
サイトカイン
[00286]  本明細書に記載の拡大培養方法は、一般に、当技術分野において公知の通り、高用量のサイトカイン、特にＩＬ−２を含む培養培地を使用する。
【０２４２】
[00287]  代わりに、ＴＩＬの急速拡大培養及び又は第２の拡大培養にサイトカインの組み合わせを使用することが更に可能であり、ＩＬ−２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の２つ以上の組み合わせについて、一般的に米国特許出願公開第２０１７／０１０７４９０Ａ１号、国際公開第２０１５／１８９３５６号、米国特許出願公開第２０１７／０１０７４９０Ａ１号及び国際公開第２０１５／１８９３５７号（それぞれ本明細書に全体として参照により明示的に組み込まれる）に概説される通りである。従って、可能な組み合わせとしては、ＩＬ−２とＩＬ−１５、ＩＬ−２とＩＬ−２１、ＩＬ−１５とＩＬ−２１とＩＬ−２、ＩＬ−１５とＩＬ−２１が挙げられ、後者には多くの実施形態において特定の使用が見出される。これらの明細書に記載される通り、サイトカインの組み合わせを使用することは、特にリンパ球、詳細にはＴ細胞の生成に有利である。
【０２４３】
抗ＣＤ３抗体
[00288]  一部の実施形態において、本明細書に記載の拡大培養方法で使用される培養培地（ＲＥＰを含む）は、抗ＣＤ３抗体も含む。抗ＣＤ３抗体をＩＬ−２と併用すると、ＴＩＬ集団においてＴ細胞活性化及び細胞分裂が誘導される。この効果は完全長抗体並びにＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２断片で見ることができ、前者が一般的に好ましい；例えば、Tsoukas et al., J.Immunol.1985, 135, 1719（本明細書によって全体として参照により組み込まれる）を参照されたい。
【０２４４】
[00289]  当業者は理解するであろう通り、本発明において使用が見出される好適な抗ヒトＣＤ３抗体は、限定はされないが、ネズミ科動物、ヒト、霊長類、ラット及びイヌ科動物抗体を含めた、様々な哺乳類からの抗ヒトＣＤ３ポリクローナル及びモノクローナル抗体を含め、幾つも存在する。詳細な実施形態において、ＯＫＴ３抗ＣＤ３抗体が使用される（Ortho-McNeil, Raritan, NJ又はMiltenyi Biotech, Auburn, CAから市販されている）。
【０２４５】
ステップＥ：ＴＩＬの回収
[00290]  第２の拡大培養ステップ後、細胞は回収することができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは、１、２、３、４回又はそれ以上の第２の拡大培養ステップ後に回収される。
【０２４６】
[00291]  ＴＩＬは、例えば、遠心によることを含め、任意の適切な且つ滅菌された方法で回収することができる。ＴＩＬ回収方法は当技術分野において周知であり、本プロセスと共に任意のかかる公知の方法を用いることができる。一部の実施形態において、ＴＩＬは自動化系を使用して回収する。一部の実施形態において、ＴＩＬは半自動化系を使用して回収する。一部の実施形態において、ＴＩＬは半自動化系を使用して回収される。一部の実施形態において、第２の拡大培養からのＴＩＬは半自動化装置を使用して回収される。一部の実施形態において、ＬＯＶＯシステムが使用される（例えば、Benchmark Electronicsから市販）。一部の実施形態において、回収ステップは、ＴＩＬを洗浄すること、ＴＩＬを配合すること及び／又はＴＩＬを分取することを含む。一部の実施形態において、細胞は、任意選択により、回収後又は回収の一部として凍結される。
【０２４７】
ステップＦ：最終的な製剤化／輸注バッグへの移動
[00292]  ステップＡ〜Ｅが完了した後、細胞は患者への投与における使用のため容器に移される。
【０２４８】
[00293]  ある実施形態において、本開示のＡＰＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示のＰＢＭＣを使用して拡大培養したＴＩＬは、当技術分野において公知の通りの任意の好適な経路によって投与され得る。一部の実施形態において、Ｔ細胞は単回動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、約３０〜６０分間継続される。他の好適な投与経路としては、腹腔内、髄腔内及びリンパ内が挙げられる。
【０２４９】
追加の拡大培養ステップ
[00294]  理解されるように、上記のステップＡ〜Ｆのいずれも、何度でも繰り返すことができ、更に上記と異なる順序で実施され得る。
【０２５０】
[00295]  一部の実施形態において、１つ以上の拡大培養ステップを最終製剤ステップＦ前に繰り返し得る。そのような追加の拡大培養ステップは、上記の第１及び／又は第２の拡大培養ステップの要素を含み得る（例えば、細胞培養培地に記載の成分を含む）。追加の拡大培養ステップは、追加の拡大培養ステップ前及び／又は中に細胞培養培地に補充される細胞培養培地中の追加の成分を含む追加の要素を更に含み得る。
【０２５１】
[00296]  更なる実施形態において、図２３及び上記の段落に記載されたいずれかの拡大培養ステップに、拡大培養ステップ中に生成された細胞が、製造／拡大培養プロセスの残りのステップに必要になるまで、保存のために当技術分野で公知の方法を使用して保存される、凍結保存ステップが先行又は後続し得る。
【０２５２】
ＴＩＬ、ＭＩＬ及びＰＢＬの医薬組成物、投与量及び投与レジメン
[00297]  一実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＴＩＬを拡大培養する任意の方法により調製され、任意選択により、改変されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、及び／又は改変されたＴ細胞受容体を発現し、及び／又は本明細書に記載のように一過性若しくは安定な態様で１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を抑制若しくは低減する、ＴＩＬの治療的集団を提供する。
【０２５３】
[00298]  別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＭＩＬを拡大培養する任意の方法により調製され、任意選択により、改変されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、及び／又は改変されたＴ細胞受容体を発現し、及び／又は本明細書に記載のように１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を抑制若しくは低減する、ＭＩＬの治療的集団を提供する。
【０２５４】
[00299]  別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＰＢＬを拡大培養する任意の方法により調製され、任意選択により、改変されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、及び／又は改変されたＴ細胞受容体を発現し、及び／又は本明細書に記載のように１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を抑制若しくは低減する、ＰＢＬの治療的集団を提供する。
【０２５５】
[00300]  別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＴＩＬを拡大培養する任意の方法により調製され、任意選択により、改変されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、及び／又は改変されたＴ細胞受容体を発現し、及び／又は本明細書に記載のように１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を抑制若しくは低減する、ＴＩＬの治療的集団と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【０２５６】
[00301]  別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＭＩＬを拡大培養する任意の方法により調製され、任意選択により、改変されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、及び／又は改変されたＴ細胞受容体を発現し、及び／又は本明細書に記載のように１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を抑制若しくは低減する、ＭＩＬの治療的集団と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【０２５７】
[00302]  別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＰＢＬを拡大培養する任意の方法により調製され、任意選択により、改変されて、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現し、及び／又は改変されたＴ細胞受容体を発現し、及び／又は本明細書に記載のように１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を抑制若しくは低減する、ＰＢＬの治療的集団と、薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物を提供する。
【０２５８】
[00303]  一実施形態において、本開示の方法を使用して拡大培養させたＴＩＬは医薬組成物として患者に投与される。一実施形態において、医薬組成物は滅菌緩衝液中のＴＩＬの懸濁液である。本開示の方法を使用して拡大培養されたＴＩＬは、当技術分野において公知の任意の適切な経路によって投与され得る。好ましくは、ＴＩＬは単一の動脈内又は静脈内注入として投与され、これは、好ましくは、およそ３０〜６０分続く。他の適切な投与経路には、腹腔内投与、髄腔内投与及びリンパ管内投与が含まれる。
【０２５９】
[00304]  任意の適切な用量のＴＩＬを投与することができる。特に癌が血液悪性腫瘍である場合、好ましくは、平均が約７．８×１０１０ＴＩＬである約２．３×１０１０〜約１３．７×１０１０ＴＩＬが投与される。一実施形態において、約１．２×１０１０〜約４．３×１０１０のＴＩＬが投与される。
【０２６０】
[00305]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２及び５×１０１２〜１×１０１３個の範囲である。本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、約４×１０８〜約２．５×１０９の範囲内である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、９．５×１０８である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、４．１×１０８である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの数は、２．２×１０９である。
【０２６１】
[00306]  本発明の一実施形態において、本発明の医薬組成物で提供されるＴＩＬの数は、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＴＩＬ、約０．１×１０９〜約１５×１０９個のＴＩＬ、約０．１２×１０９〜約１２×１０９個のＴＩＬ、約０．１５×１０９〜約１１×１０９個のＴＩＬ、約０．２×１０９〜約１０×１０９個のＴＩＬ、約０．３×１０９〜約９×１０９個のＴＩＬ、約０．４×１０９〜約８×１０９個のＴＩＬ、約０．５×１０９〜約７×１０９個のＴＩＬ、約０．６×１０９〜約６×１０９個のＴＩＬ、約０．７×１０９〜約５×１０９個のＴＩＬ、約０．８×１０９〜約４×１０９個のＴＩＬ、約０．９×１０９〜約３×１０９個のＴＩＬ又は約１×１０９〜約２×１０９個のＴＩＬの範囲である。
【０２６２】
[00307]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、例えば、医薬組成物の１００％、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより低い。
【０２６３】
[00308]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１９．７５％、１９．５０％、１９．２５％、１９％、１８．７５％、１８．５０％、１８．２５％、１８％、１７．７５％、１７．５０％、１７．２５％、１７％、１６．７５％、１６．５０％、１６．２５％、１６％、１５．７５％、１５．５０％、１５．２５％、１５％、１４．７５％、１４．５０％、１４．２５％、１４％、１３．７５％、１３．５０％、１３．２５％、１３％、１２．７５％、１２．５０％、１２．２５％、１２％、１１．７５％、１１．５０％、１１．２５％、１１％、１０．７５％、１０．５０％、１０．２５％、１０％、９．７５％、９．５０％、９．２５％、９％、８．７５％、８．５０％、８．２５％、８％、７．７５％、７．５０％、７．２５％、７％、６．７５％、６．５０％、６．２５％、６％、５．７５％、５．５０％、５．２５％、５％、４．７５％、４．５０％、４．２５％、４％、３．７５％、３．５０％、３．２５％、３％、２．７５％、２．５０％、２．２５％、２％、１．７５％、１．５０％、１２５％、１％、０．５％、０．４％、０．３％、０．２％、０．１％、０．０９％、０．０８％、０．０７％、０．０６％、０．０５％、０．０４％、０．０３％、０．０２％、０．０１％、０．００９％、０．００８％、０．００７％、０．００６％、０．００５％、０．００４％、０．００３％、０．００２％、０．００１％、０．０００９％、０．０００８％、０．０００７％、０．０００６％、０．０００５％、０．０００４％、０．０００３％、０．０００２％又は０．０００１％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖより高い。
【０２６４】
[00309]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．０００１％〜約５０％、約０．００１％〜約４０％、約０．０１％〜約３０％、約０．０２％〜約２９％、約０．０３％〜約２８％、約０．０４％〜約２７％、約０．０５％〜約２６％、約０．０６％〜約２５％、約０．０７％〜約２４％、約０．０８％〜約２３％、約０．０９％〜約２２％、約０．１％〜約２１％、約０．２％〜約２０％、約０．３％〜約１９％、約０．４％〜約１８％、約０．５％〜約１７％、約０．６％〜約１６％、約０．７％〜約１５％、約０．８％〜約１４％、約０．９％〜約１２％又は約１％〜約１０％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
【０２６５】
[00310]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの濃度は、医薬組成物の約０．００１％〜約１０％、約０．０１％〜約５％、約０．０２％〜約４．５％、約０．０３％〜約４％、約０．０４％〜約３．５％、約０．０５％〜約３％、約０．０６％〜約２．５％、約０．０７％〜約２％、約０．０８％〜約１．５％、約０．０９％〜約１％、約０．１％〜約０．９％ｗ／ｗ、ｗ／ｖ又はｖ／ｖの範囲内である。
【０２６６】
[00311]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、１０ｇ、９．５ｇ、９．０ｇ、８．５ｇ、８．０ｇ、７．５ｇ、７．０ｇ、６．５ｇ、６．０ｇ、５．５ｇ、５．０ｇ、４．５ｇ、４．０ｇ、３．５ｇ、３．０ｇ、２．５ｇ、２．０ｇ、１．５ｇ、１．０ｇ、０．９５ｇ、０．９ｇ、０．８５ｇ、０．８ｇ、０．７５ｇ、０．７ｇ、０．６５ｇ、０．６ｇ、０．５５ｇ、０．５ｇ、０．４５ｇ、０．４ｇ、０．３５ｇ、０．３ｇ、０．２５ｇ、０．２ｇ、０．１５ｇ、０．１ｇ、０．０９ｇ、０．０８ｇ、０．０７ｇ、０．０６ｇ、０．０５ｇ、０．０４ｇ、０．０３ｇ、０．０２ｇ、０．０１ｇ、０．００９ｇ、０．００８ｇ、０．００７ｇ、０．００６ｇ、０．００５ｇ、０．００４ｇ、０．００３ｇ、０．００２ｇ、０．００１ｇ、０．０００９ｇ、０．０００８ｇ、０．０００７ｇ、０．０００６ｇ、０．０００５ｇ、０．０００４ｇ、０．０００３ｇ、０．０００２ｇ又は０．０００１ｇ以下である。
【０２６７】
[00312]  一部の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＴＩＬの量は、０．０００１ｇ、０．０００２ｇ、０．０００３ｇ、０．０００４ｇ、０．０００５ｇ、０．０００６ｇ、０．０００７ｇ、０．０００８ｇ、０．０００９ｇ、０．００１ｇ、０．００１５ｇ、０．００２ｇ、０．００２５ｇ、０．００３ｇ、０．００３５ｇ、０．００４ｇ、０．００４５ｇ、０．００５ｇ、０．００５５ｇ、０．００６ｇ、０．００６５ｇ、０．００７ｇ、０．００７５ｇ、０．００８ｇ、０．００８５ｇ、０．００９ｇ、０．００９５ｇ、０．０１ｇ、０．０１５ｇ、０．０２ｇ、０．０２５ｇ、０．０３ｇ、０．０３５ｇ、０．０４ｇ、０．０４５ｇ、０．０５ｇ、０．０５５ｇ、０．０６ｇ、０．０６５ｇ、０．０７ｇ、０．０７５ｇ、０．０８ｇ、０．０８５ｇ、０．０９ｇ、０．０９５ｇ、０．１ｇ、０．１５ｇ、０．２ｇ、０．２５ｇ、０．３ｇ、０．３５ｇ、０．４ｇ、０．４５ｇ、０．５ｇ、０．５５ｇ、０．６ｇ、０．６５ｇ、０．７ｇ、０．７５ｇ、０．８ｇ、０．８５ｇ、０．９ｇ、０．９５ｇ、１ｇ、１．５ｇ、２ｇ、２．５、３ｇ、３．５、４ｇ、４．５ｇ、５ｇ、５．５ｇ、６ｇ、６．５ｇ、７ｇ、７．５ｇ、８ｇ、８．５ｇ、９ｇ、９．５ｇ又は１０ｇ超である。
【０２６８】
[00313]  本発明の医薬組成物において提供されるＴＩＬは、広い投与量範囲にわたって有効である。正確な投与量は、投与経路、化合物が投与される形態、処置されるべき対象の性別及び年齢、処置されるべき対象の体重並びに担当医の選好及び経験に依存するであろう。臨床的に確立されたＴＩＬの投与量も適切な場合に使用され得る。ＴＩＬの投与量など、本明細書の方法を使用して投与される医薬組成物の量は、処置されるヒト又は哺乳動物、疾患又は状態の重症度、投与速度、活性医薬成分の性質及び処方医の裁量に依存するであろう。
【０２６９】
[00314]  一部の実施形態において、ＴＩＬは単回投与で投与され得る。そのような投与は、注射、例えば静脈内注射によるものであり得る。一部の実施形態において、ＴＩＬは複数回投与で投与され得る。投与は、１年に１回、２回、３回、４回、５回、６回又は６回を超え得る。投与は、月に１回、２週間に１回、週に１回又は隔日に１回であり得る。ＴＩＬの投与は必要な限り継続し得る。
【０２７０】
[00315]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０１２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、９×１０１２、１×１０１３、２×１０１３、３×１０１３、４×１０１３、５×１０１３、６×１０１３、７×１０１３、８×１０１３及び９×１０１３個である。一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、１×１０６〜５×１０６、５×１０６〜１×１０７、１×１０７〜５×１０７、５×１０７〜１×１０８、１×１０８〜５×１０８、５×１０８〜１×１０９、１×１０９〜５×１０９、５×１０９〜１×１０１０、１×１０１０〜５×１０１０、５×１０１０〜１×１０１１、５×１０１１〜１×１０１２、１×１０１２〜５×１０１２及び５×１０１２〜１×１０１３個の範囲である。
【０２７１】
[00316]  本発明の一実施形態において、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）を有する患者に有用なＭＩＬの臨床用量は、約４×１０８〜約２．５×１０９個のＭＩＬの範囲内である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、９．５×１０８ＭＩＬである。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、４．１×１０８である。別の実施形態において、本発明の医薬組成物中に提供されるＭＩＬの数は、２．２×１０９である。
【０２７２】
[00317]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約４．３ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約２．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約０．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．３ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ〜約１．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．４５ｍｇ／ｋｇ〜約１ｍｇ／ｋｇ、約０．５５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８５ｍｇ／ｋｇ、約０．６５ｍｇ／ｋｇ〜約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約０．７５ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ〜約２．１５ｍｇ／ｋｇ、約０．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１．８５ｍｇ／ｋｇ、約１．１５ｍｇ／ｋｇ〜約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇｍｇ〜約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．３５ｍｇ／ｋｇ〜約１．５ｍｇ／ｋｇ、約２．１５ｍｇ／ｋｇ〜約３．６ｍｇ／ｋｇ、約２．３ｍｇ／ｋｇ〜約３．４ｍｇ／ｋｇ、約２．４ｍｇ／ｋｇ〜約３．３ｍｇ／ｋｇ、約２．６ｍｇ／ｋｇ〜約３．１５ｍｇ／ｋｇ、約２．７ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ、約２．８ｍｇ／ｋｇ〜約３ｍｇ／ｋｇ又は約２．８５ｍｇ／ｋｇ〜約２．９５ｍｇ／ｋｇの範囲内である。
【０２７３】
[00318]  一部の実施形態において、ＴＩＬの有効投与量は、約１ｍｇ〜約５００ｍｇ、約１０ｍｇ〜約３００ｍｇ、約２０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約２５ｍｇ〜約２００ｍｇ、約１ｍｇ〜約５０ｍｇ、約５ｍｇ〜約４５ｍｇ、約１０ｍｇ〜約４０ｍｇ、約１５ｍｇ〜約３５ｍｇ、約２０ｍｇ〜約３０ｍｇ、約２３ｍｇ〜約２８ｍｇ、約５０ｍｇ〜約１５０ｍｇ、約６０ｍｇ〜約１４０ｍｇ、約７０ｍｇ〜約１３０ｍｇ、約８０ｍｇ〜約１２０ｍｇ、約９０ｍｇ〜約１１０ｍｇ又は約９５ｍｇ〜約１０５ｍｇ、約９８ｍｇ〜約１０２ｍｇ、約１５０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、約１６０ｍｇ〜約２４０ｍｇ、約１７０ｍｇ〜約２３０ｍｇ、約１８０ｍｇ〜約２２０ｍｇ、約１９０ｍｇ〜約２１０ｍｇ、約１９５ｍｇ〜約２０５ｍｇ又は約１９８〜約２０７ｍｇの範囲内である。
【０２７４】
[00319]  有効量のＴＩＬは、鼻腔内及び経皮経路、動脈内注射、静脈内、腹腔内、非経口、筋肉内、皮下、局所、移植若しくは腫瘍への直接注射又は吸入を含む、同様の有用性を有する薬剤の許容される投与様式のいずれかにより、単回投与又は複数回投与のいずれかで投与され得る。
【０２７５】
任意選択によるＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの遺伝子操作
[00320]  一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、拡大培養ステップ前、その間又はその後に更に操作され、これは、一過性の態様でタンパク質発現を変化させるために、それぞれが本明細書で提供される、閉鎖滅菌製造プロセス中を含む。一部の実施形態において、一過性に変化したタンパク質発現は、一過性の遺伝子編集によるものである。一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、転写因子（ＴＦ）、及び／又はＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子で処置される。一部の実施形態において、タンパク質発現を一過性に変化させることができるＴＦ及び／又は他の分子は、腫瘍抗原の発現の変化及び／又はＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の変化を提供する。
【０２７６】
[00321]  特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子編集することを含む。特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの第１の集団、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの第２の集団、及び／又はＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの第３の集団を遺伝子編集することを含む。
【０２７７】
[00322]  一部の実施形態において、本発明は、１つ以上のタンパク質の発現の促進又は１つ以上のタンパク質の発現の阻害及びタンパク質の１つのセットの促進とタンパク質の別のセットの阻害との両方の同時の組み合わせのための、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又は低分子（又は短鎖）干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）の挿入を含む、リボ核酸（ＲＮＡ）挿入など、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団へのヌクレオチド挿入を介した遺伝子編集を含む。
【０２７８】
[00323]  一部の実施形態において、本発明の拡大培養されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、タンパク質発現の一過性の変化を受ける。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、拡大培養プロセス前、その間又はその後の任意の時に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、拡大培養プロセス中の任意のステップで発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、第１の拡大培養前にバルクＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、第１の拡大培養中に発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、第１の拡大培養後に発生し、これは、例えば、第１の拡大培養と第２の拡大培養中の移行中のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ集団（例えば、本明細書に記載のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの第２の集団におけるものを含む。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、第２の拡大培養前にバルクＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ集団で発生する。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、第２の拡大培養中に発生し、これは、例えば、拡大培養されるＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ集団（例えば、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの第３の集団）におけるものを含む。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、第２の拡大培養後に発生する。
【０２７９】
[00324]  一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、エレクトロポレーションのステップを含む。エレクトロポレーション法は当技術分野で公知であり、例えばTsong, Biophys.J.1991, 60, 297-306及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７Ａ１号に記載されており、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションのステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング及びエンドサイトーシス）は当技術分野で公知であり、Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467；Wigler, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.1979, 76, 1373-1376；及びChen及びOkayarea, Mol.Cell.Biol.1987, 7, 2745-2752；並びに米国特許第５，５９３，８７５号に記載されており、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、リポソームトランスフェクションのステップを含む。濾過水中のカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスフォチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を使用する方法などのリポソームトランスフェクション法は当技術分野で公知であり、Rose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525及びFelgner, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1987, 84, 7413-7417並びに米国特許第５，２７９，８３３号；米国特許第５，９０８，６３５号；米国特許第６，０５６，９３８号；米国特許第６，１１０，４９０号；米国特許第６，５３４，４８４号；及び米国特許第７，６８７，０７０号に記載されており、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団におけるタンパク質発現を一過性に変化させる方法は、米国特許第５，７６６，９０２号；米国特許第６，０２５，３３７号；米国特許第６，４１０，５１７号；米国特許第６，４７５，９９４号；及び米国特許第７，１８９，７０５号に記載の方法を使用したトランスフェクションのステップを含み、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２８０】
[00325]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、幹細胞様メモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）の増加をもたらす。ＴＳＣＭは、抗原を経験したセントラルメモリーＴ細胞の初期前駆細胞である。ＴＳＣＭは、一般的に、幹細胞を定義する長期生存、自己再生及び多分化能を示し、効果的なＴＩＬ産物の生成について一般的に望ましい。ＴＳＣＭは、養子細胞移植のマウスモデルにおいて、他のＴ細胞サブセットと比較して抗腫瘍活性の増強を示している（Gattinoni et al.Nat Med 2009, 2011；Gattinoni, Nature Rev. Cancer, 2012；Cieri et al.Blood 2013）。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、高い割合のＴＳＣＭを含む組成物を伴うＴＩＬ集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭの割合の増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＬ集団において、少なくとも１倍、２倍、３倍、４倍、５倍又は１０倍のＴＳＣＭの増加をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭを伴うＴＩＬ集団をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、少なくとも、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％のＴＳＣＭを伴う治療的ＴＩＬ集団をもたらす。
【０２８１】
[00326]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、抗原を経験したＴ細胞の幼若化をもたらす。一部の実施形態において、幼若化には、例えば、増殖の増加、Ｔ細胞活性化の増加及び／又は抗原認識の増加が含まれる。
【０２８２】
[00327]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを保存するために、Ｔ細胞の大部分における発現を変化させる。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを変化させない。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、腫瘍由来のＴＣＲレパートリーを維持する。
【０２８３】
[00328]  一部の実施形態において、タンパク質の一過性の変化は、特定の遺伝子の変化した発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１（ＰＤＣＤ１又はＣＣ２７９とも称される）、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１及び／又はｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を含むが、これらに限定されない遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＴＧＦＢＲ２、ＣＣＲ４／５、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）、ＣＩＳＨ、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２１、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２、ＣＳＣＲ３、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２、ＣＣＬ１７、ＣＸＣＬ１／ＣＸＣＬ８、ＶＨＬ、ＣＤ４４、ＰＩＫ３ＣＤ、ＳＯＣＳ１及び／又はｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）からなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦＢＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４／５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−１２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−１５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−２１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＧＩＴを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＧＦβを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１を標的とする���一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ４を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ５を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＲ２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＳＣＲ３を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＸＣＬ８を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ２２を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＬ１７を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＶＨＬを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤを標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１を標的とする。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）を標的とする。
【０２８４】
[00329]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、一過性のタンパク質発現によって過剰発現されるケモカイン受容体は、ＣＣＬ２（ＭＣＰ−１）、ＣＣＬ３（ＭＩＰ−１α）、ＣＣＬ４（ＭＩＰ１−β）、ＣＣＬ５（ＲＡＮＴＥＳ）、ＣＸＣＬ１、ＣＸＣＬ８、ＣＣＬ２２及び／又はＣＣＬ１７を含むが、これに限定されないリガンドを有する受容体を含む。
【０２８５】
[00330]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβＲ２及び／又はＴＧＦβの減少及び／又は発現低下をもたらす（例えば、ＴＧＦβ経路の遮断をもたらすことを含む）。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＢＬＢ（ＣＢＬ−Ｂ）の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。
【０２８６】
[00331]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、例えば、腫瘍部位へのＴＩＬの輸送又は移動を改善するために、ケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ（キメラ共刺激受容体）の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＣＲ１、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ１、ＣＸＣＲ２及び／又はＣＳＣＲ３からなる群から選択されるケモカイン受容体の増加及び／又は過剰発現をもたらす。
【０２８７】
[00332]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、インターロイキンの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＩＬ−２、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５及び／又はＩＬ−２１からなる群から選択されるインターロイキンの増加及び／又は過剰発現をもたらす。
【０２８８】
[00333]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＶＨＬの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＤ４４の増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＩＫ３ＣＤの増加及び／又は過剰発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＳＯＣＳ１の増加及び／又は過剰発現をもたらす。
【０２８９】
[00334]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ｃＡＭＰタンパク質キナーゼＡ（ＰＫＡ）の減少及び／又は発現低下をもたらす。
【０２９０】
[00335]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びその組み合わせからなる群から選択される１つの分子の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びその組み合わせからなる群から選択される２つの分子の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１と、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びその組み合わせからなる群から選択される１つの分子との減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びその組み合わせの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１と、ＬＡＧ−３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びその組み合わせの１つとの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１及びＬＡＧ３の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＬＡＧ３及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＰＤ−１の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＬＡＧ３の減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＩＳＨの減少及び／又は発現低下をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＴＩＭ３及びＣＢＬＢの減少及び／又は発現低下をもたらす。
【０２９１】
[00336]  一部の実施形態において、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びそれらの組み合わせからなる群から選択される接着分子は、ガンマレトロウイルス又はレンチウイルス法により、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの第１の集団、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの第２の集団又は回収されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団に挿入される（例えば、接着分子の発現が増加する）。
【０２９２】
[00337]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びその組み合わせからなる群から選択される１つの分子の減少及び／又は発現低下並びにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びその組み合わせの増加及び／又は増強された発現をもたらす。一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ及びその組み合わせからなる群から選択される１つの分子の減少及び／又は発現低下並びにＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１及びその組み合わせの増加及び／又は増強された発現をもたらす。
【０２９３】
[00338]  一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の低下が存在する。
【０２９４】
[00339]  一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の増加が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の増加が存在する。
【０２９５】
[00340]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、転写因子（ＴＦ）、及び／又はＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬにおけるタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子による、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの処置によって誘導される。一部の実施形態において、ＳＱＺベクターフリーのマイクロ流体プラットフォームは、転写因子（ＴＦ）及び／又はタンパク質発現を一過性に変化させることができる他の分子の細胞内送達のために利用される。転写因子を含むタンパク質を、Ｔ細胞を含む様々な初代ヒト細胞に送達する能力を実証するそのような方法（Sharei et al.PNAS 2013並びにSharei et al.PLOS ONE 2015及びGreisbeck et al.J. Immunology vol. 195, 2015）が説明されている。例えば、国際公開第２０１３／０５９３４３Ａ１号、国際公開第２０１７／００８０６３Ａ１号及び国際公開第２０１７／１２３６６３Ａ１号（これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。国際公開第２０１３／０５９３４３Ａ１号、国際公開第２０１７／００８０６３Ａ１号及び国際公開第２０１７／１２３６６３Ａ１号に記載されるそのような方法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を転写因子（ＴＦ）、及び／又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子に曝露するために、本発明と共に利用することができ、ここで、前記ＴＦ及び／又は一過性のタンパク質発現を誘導することができる他の分子は、腫瘍抗原の発現の増加及び／又はＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団における腫瘍抗原特異的Ｔ細胞の数の増加を提供し、従ってＴＩＬ集団の初期化及び初期化されたＴＩＬ集団の初期化されていないＴＩＬ集団と比較した治療効果の増加をもたらす。一部の実施形態において、初期化は、本明細書に記載されるような、開始集団又はＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの前集団（即ち初期化前）集団と比較した、エフェクターＴ細胞及び／又はセントラルメモリーＴ細胞のサブ集団の増加をもたらす。
【０２９６】
[00341]  一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ＴＣＦ−１、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ及び／又はＭＹＢを含むが、これらに限定されるものではない。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）はＴＣＦ−１である。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）はＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤである。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）はＭＹＢである。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、追加のＴＩＬ初期化を誘導するために、市販のKNOCKOUT Serum Replacement（Gibco／ThermoFisher）などの人工多能性幹細胞培養物（ｉＰＳＣ）と共に投与される。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、追加のＴＩＬ初期化を誘導するためにｉＰＳＣカクテルと共に投与される。一部の実施形態において、転写因子（ＴＦ）は、ｉＰＳＣカクテルなしで投与される。一部の実施形態において、初期化は、ＴＳＣＭの割合の増加をもたらす。一部の実施形態において、初期化により、ＴＳＣＭの割合において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％のＴＳＣＭ増加が生じる。
【０２９７】
[00342]  一部の実施形態において、上記のように、タンパク質発現を一過性に変化させる方法は、１つ以上のタンパク質を産生するための遺伝子の安定した組み込みのステップを含む、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法と組み合わされ得る。特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変するステップを含む。特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの第１の集団、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの第２の集団、及び／又はＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの第３の集団を遺伝子改変することを含む。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レトロウイルス形質導入のステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レンチウイルス形質導入のステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは当技術分野で公知であり、例えばLevine, et al., Proc.Nat’l Acad.Sci.2006, 103, 17372-77；Zufferey, et al., Nat.Biotechnol.1997, 15, 871-75；Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71及び米国特許第６，６２７，４４２号に記載されており、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入のステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入システムは当技術分野で公知であり、例えばCepko and Pear, Cur.Prot.Mol.Biol.1996, 9.9.1-9.9.16に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子移入のステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子移入システムは、当技術分野で公知であり、トランスポサーゼの長期発現がトランスジェニック細胞で発生しないように、トランスポサーゼがＤＮＡ発現ベクターとして、又は発現可能なＲＮＡ又はタンパク質、例えばｍＲＮＡ（例えば、キャップ及びポリＡテールを含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポサーゼとして提供されるシステムを含む。ＳＢ１０、ＳＢ１１及びＳＢ１００ｘ並びに酵素活性が増加した人工酵素など、サケ科型のＴｅｌ様トランスポサーゼ（ＳＢ又はSleeping Beautyトランスポザーゼ）を含む適切なトランスポゾン媒介遺伝子移入システムは、例えば、Hackett, et al., Mol.Therapy 2010, 18, 674-83及び米国特許第６，４８９，４５８号に記載されており、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９８】
[00343]  一部の実施形態において、タンパク質発現の一過性の変化は、２０ヌクレオチドのアンチセンス（ガイド）鎖と、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを使用してその３’末端でコレステロールに結合した１３〜１５塩基のセンス（パッセンジャー）鎖を含む、高い２’−ＯＨ置換率を有する（典型的にはフッ素又は−ＯＣＨ３）化学的に合成された非対称ｓｉＲＮＡ二重鎖である、自己送達ＲＮＡ干渉（ｓｄＲＮＡ）によって誘導される発現の低下である。一部の実施形態において、方法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団におけるタンパク質発現の一過性の変化を含み、これは２０ヌクレオチドのアンチセンス（ガイド）鎖と、テトラエチレングリコール（ＴＥＧ）リンカーを使用してその３’末端でコレステロールに結合した１３〜１５塩基のセンス（パッセンジャー）鎖を含む、高い２’−ＯＨ置換率を有する（典型的にはフッ素又は−ＯＣＨ３）化学的に合成された非対称ｓｉＲＮＡ二重鎖である、自己送達ＲＮＡ干渉（ｓｄＲＮＡ）の使用を含む。ｓｄＲＮＡの使用方法は、Khvorova and Watts, Nat.Biotechnol.2017, 35, 238-248；Byrne, et al., J. Ocul.Pharmacol.Ther.2013, 29, 855-864；及びLigtenberg, et al., Mol.Therapy, 2018, 26, 1482-1493に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、エレクトロポレーション、ＳＱＺ又は他の方法を使用せず、代わりに、ＴＩＬ集団が培地中１μＭ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１〜３日間の期間を使用して達成される。特定の実施形態において、方法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ集団にｓｄＲＮＡを送達することを含み、これは、培地中で１〜３日間の期間にわたり、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ集団を１μＭ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露することを含む。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中１０μＭ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１〜３日間の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中５０μＭ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１〜３日間の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ〜５０μＭ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１〜３日間の期間を使用して達成される。一実施形態において、ＴＩＬ集団へのｓｄＲＮＡの送達は、ＴＩＬ集団が培地中０．１μＭ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ〜５０μＭ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの濃度でｓｄＲＮＡに曝露される１〜３日間の期間を使用して達成され、ここで、ｓｄＲＮＡへの曝露は、培地に新鮮なｓｄＲＮＡを添加することにより、２、３、４又は５回行われる。他の適切なプロセスは、例えば、米国特許出願公開第２０１１／００３９９１４Ａ１号、米国特許出願公開第２０１３／０１３１１４１Ａ１号及び米国特許出願��開第２０１３／０１３１１４２Ａ１号並びに米国特許第９，０８０，１７１号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９９】
[00344]  一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、製造中にＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団に挿入される。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＮＯＴＣＨ  １／２  ＩＣＤ、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４  ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＴＩＧＩＴ、ＴＧＦβ、ＴＧＦＢＲ２、ｃＡＭＰプロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）、ＢＡＦＦ  ＢＲ３、ＣＩＳＨ及び／又はＣＢＬＢに干渉するＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、発現の減少は、例えば、フローサイトメトリー及び／又はｑＰＣＲによって評価されるような遺伝子サイレンシングのパーセンテージに基づいて決定される。一部の実施形態において、約５％、約１０％、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％、約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％、約９０％又は約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約８５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９０％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９５％の発現の低下が存在する。一部の実施形態において、少なくとも約９９％の発現の低下が存在する。
【０３００】
[00345]  本明細書に記載されるように、ｓｉＲＮＡの化学修飾に基づく自己送達可能なＲＮＡｉ技術を本発明の方法と共に利用して、ｓｄＲＮＡをＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬに問題なく送達することができる。バックボーン修飾と非対称ｓｉＲＮＡ構造及び疎水性リガンドとの組み合わせ（例えば、Ligtenberg, et al., Mot.Therapy, 2018及び米国特許出願公開第２０１６０３０４８７３号）は、ｓｄＲＮＡのヌクレアーゼ安定性を利用して、培養培地に単純に添加することにより、ｓｄＲＮＡが追加の製剤及び方法なしで培養した哺乳動物細胞に浸透することを可能にする。この安定性は、単純に培地中のｓｄＲＮＡの活性濃度を維持することにより、ＲＮＡｉが媒介する標的遺伝子活性の一定レベルの低下のサポートを許容する。理論に拘束されるものではないが、ｓｄＲＮＡのバックボーン安定化は、非分裂細胞において数ヶ月間にわたり続き得る遺伝子発現効果の大幅な低下を提供する。
【０３０１】
[00346]  一部の実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの９５％を超えるトランスフェクション効率並びに様々な特定のｓｄＲＮＡによる標的の発現の低下が発生する。一部の実施形態において、いくつかの未修飾リボース残基を含有するｓｄＲＮＡを完全に修飾された配列で置換して、ＲＮＡｉ効果の効力及び／又は寿命を増加させた。一部の実施形態において、発現効果の低下は、１２時間、２４時間、３６時間、４８時間、５日間、６日間、７日間若しくは８日間又はそれを超えて維持される。一部の実施形態において、発現効果の低下は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬのｓｄＲＮＡ処置後１０日以上で減少する。一部の実施形態において、標的発現の発現の７０％を超える低下が維持される。一部の実施形態において、標的発現の発現の７０％を超える低下が、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬにおいて維持される。一部の実施形態において、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路での発現の低下により、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、より強力なインビボ効果を示すことができ、これは、一部の実施形態では、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の抑制効果の回避によるものである。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡによるＰＤ−１の発現の減少は、ＴＩＬ増殖の増加をもたらす。
【０３０２】
[00347]  低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）は、短鎖干渉ＲＮＡ又はサイレンシングＲＮＡとしても知られる場合があり、一般的には長さが１９〜２５塩基対の、二本鎖ＲＮＡ分子である。ｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）で使用され、相補的なヌクレオチド配列を持つ特定の遺伝子の発現に干渉する。
【０３０３】
[00348]  二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、一般的にセンス（パッセンジャー）及びアンチセンス（ガイド）鎖である、ＲＮＡの相補鎖の対を含む任意の分子を定義するために一般的に使用することができ、これは一本鎖オーバーハング領域を含み得る。ｓｉＲＮＡと対比されるｄｓＲＮＡという用語は、一般的に、ダイサーを含む切断酵素システムの作用により、より大きいｄｓＲＮＡ分子から放出されるｓｉＲＮＡ分子の配列を含む前駆体分子を指す。
【０３０４】
[00349]  ｓｄＲＮＡ（自己送達可能なＲＮＡ）は、細胞に侵入するのに送達ビヒクルを必要とせず、従来のｓｉＲＮＡと比較して向上した薬理を有する、共有結合的に修飾されたＲＮＡｉ化合物の新しいクラスである。「自己送達可能なＲＮＡ」又は「ｓｄＲＮＡ」は、疎水的に修飾されたＲＮＡ干渉アンチセンスハイブリッドであり、初代細胞においてインビトロで、局所投与の場合インビボで、非常に効果的であることが実証されている。毒性のない強力な取り込み及び／又はサイレンシングが実証されている。ｓｄＲＮＡは、一般的に、最小限の二本鎖領域を有する、化学的に修飾された非対称の核酸分子である。ｓｄＲＮＡ分子は、典型的には、一本鎖領域及び二本鎖領域を含有し、分子の一本鎖領域及び二本鎖領域の両方に様々な化学修飾を含有し得る。更に、ｓｄＲＮＡ分子は、本明細書に記載されるように、従来の及び先端的なステロール型分子などの疎水性結合に付着させることができる。ｓｄＲＮＡ及びそのようなｓｄＲＮＡを作製するための関連する方法は、例えば、米国特許出願公開第２０１６０３０４８７３号、国際公開第２０１００３３２４６号、国際公開第２０１７０７０１５１号、国際公開第２００９１０２４２７号、国際公開第２０１１１１９８８７号、国際公開第２０１００３３２４７Ａ２号、国際公開第２００９０４５４５７号、国際公開第２０１１１１９８５２号にも広範に記載されており、これらの全ては、全ての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。ｓｄＲＮＡの構造、化学、標的位置、配列の優先度などを最適化するために、独自のアルゴリズムが開発され、ｓｄＲＮＡの効力予測に利用されている（例えば、米国特許出願公開第２０１６０３０４８７３号を参照されたい）。これらの分析に基づいて、機能的なｓｄＲＮＡ配列は、一般的に、４０％を超える確率で、１μＭの濃度での発現において７０％を超える低下を有するものとして定義されている。
【０３０５】
[00350]  一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の７０％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の７５％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の８０％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の８５％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９０％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９５％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、標的遺伝子の発現の９９％の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．２５μＭ〜約４μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約０．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約１．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約２．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．２５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部の実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約３．７５μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。一部��実施形態において、本発明で使用されるｓｄＲＮＡ配列は、約４．０μＭの濃度で送達された場合、標的遺伝子の発現の低下を示す。
【０３０６】
[00351]  一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、治療剤の安定性及び／又は有効性を増加させ、処置される細胞又は組織へのオリゴヌクレオチドの効率的な送達を果たすための１つ以上の修飾を含む。そのような修飾には、２’−Ｏ−メチル修飾、２’−Ｏ−フルオロ修飾、ジホスホロチオエート修飾、２’Ｆ修飾ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾及び／又は２’デオキシヌクレオチドが含まれ得る。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、ステロール、コレステロール、ビタミンＤ、ナフチル、イソブチル、ベンジル、インドール、トリプトファン及び／又はフェニルを含む１つ以上の疎水性修飾を含むように修飾される。更なる特定の実施形態において、化学的に修飾されたヌクレオチドは、ホスホロチオエート、２’−Ｏ−メチル、２’デオキシ、疎水性修飾及びホスホロチオエートの組み合わせである。一部の実施形態において、糖は修飾することができ、修飾された糖は、Ｄ−リボース、２’−Ｏ−アルキル（２’−Ｏ−メチル及び２’−Ｏ−エチルを含む）、即ち２’−アルコキシ、２’−アミノ、２’−Ｓ−アルキル、２’−ハロ（２’−フルオロを含む）、Ｔ−メトキシエトキシ、２’−アリルオキシ（−ＯＣＨ２ＣＨ＝ＣＨ２）、２’−プロパルギル、２’−プロピル、エチニル、エテニル、プロペニル及びシアノなどを含み得るが、これらに限定されるものではない。一実施形態において、糖部分は、ヘキソースであり得、記載されるように、オリゴヌクレオチドに組み込まれ得る（Augustyns, K., et al., Nucl.Acids.Res.18:4711 (1992)）。
【０３０７】
[00352]  一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖であり、即ち分子のいずれかの末端に突出する一本鎖配列がない、即ち平滑末端である。一部の実施形態において、個々の核酸分子は、異なる長さであり得る。換言すれば、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、その全長にわたって二本鎖ではない。例えば、２つの別個の核酸分子が使用される場合、分子の１つ、例えばアンチセンス配列を含む第１の分子は、それにハイブリダイズする第２の分子より長いものであり得る（分子の一部が一本鎖のままである）。一部の実施形態において、単一の核酸分子が使用される場合、いずれかの端の分子の一部は一本鎖のままであり得る。
【０３０８】
[00353]  一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、ミスマッチ及び／又はループ又はバルジを含有するが、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約７０％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約８０％にわたって二本鎖である。別の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９０％〜９５％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの長さの少なくとも約９６％〜９８％にわたって二本鎖である。一部の実施形態において、本発明の二本鎖オリゴヌクレオチドは、少なくとも又は最大１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のミスマッチを含有する。
【０３０９】
[00354]  一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、例えば、３’又は５’結合を修飾することにより、ヌクレアーゼから実質的に保護することができる（例えば、米国特許第５，８４９，９０２号及び国際公開第９８／１３５２６号）。例えば、オリゴヌクレオチドは、「ブロッキング基」を含めることによって耐性とすることができる。本明細書で使用される「ブロッキング基」という用語は、合成のための保護基又はカップリング基のいずれかとして、オリゴヌクレオチド又はヌクレオモノマーに結合できる置換基（例えば、ＯＨ基以外）を指す（例えば、ＦＩＴＣ、プロピル（ＣＨ２−ＣＨ２−ＣＨ３）、グリコール（−Ｏ−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ−）リン酸（ＰＯ３２’’）、ホスホン酸水素又はホスホルアミダイト）。「ブロッキング基」は、修飾ヌクレオチド及び非ヌクレオチドエキソヌクレアーゼ耐性構造を含む、オリゴヌクレオチドの５’及び３’末端を保護する「末端ブロッキング基」又は「エキソヌクレアーゼブロッキング基」も含み得る。
【０３１０】
[00355]  一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ内の隣接するポリヌクレオチドの少なくとも一部は、置換結合、例えばホスホロチオエート結合によって結合される。
【０３１１】
[00356]  一部の実施形態において、化学修飾は、少なくとも、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１４５、１５０、１５５、１６０、１６５、１７０、１７５、１８０、１８５、１９０、１９５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００の細胞取り込みの増強を導く。一部の実施形態において、Ｃ又はＵ残基の少なくとも１つは、疎水性修飾を含む。一部の実施形態において、複数のＣ及びＵが疎水性修飾を含有する。一部の実施形態において、少なくとも１０％、１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％又は少なくとも９５％のＣ及びＵは、疎水性修飾を含有し得る。一部の実施形態において、Ｃ及びＵの全てが疎水性修飾を含有する。
【０３１２】
[00357]  一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ−ｒｘＲＮＡは、プロトン化可能なアミンの組み込みにより、ｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子のエンドソーム放出の増強を示す。一部の実施形態において、プロトン化可能なアミンは、センス鎖に組み込まれる（ＲＩＳＣローディング後に切り捨てられる分子の部分において）。一部の実施形態において、本発明のｓｄＲＮＡ化合物は、二重鎖領域（１０〜１５塩基長の効率的なＲＩＳＣエントリーに必要）及び４〜１２ヌクレオチド長の一本鎖領域を、１３ヌクレオチドの二本鎖と共に含む、非対称化合物を含む。一部の実施形態において、６ヌクレオチドの一本鎖領域が利用される。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡの一本鎖領域は、２〜１２個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合（ホスホロチオエート修飾と称される）を含む。一部の実施形態において、６〜８個のホスホロチオエートヌクレオチド間結合が利用される。一部の実施形態において、本発明のｓｄＲＮＡ化合物は、安定性を提供し、ＲＩＳＣエントリーと適合性である、特有の化学修飾パターンも含む。
【０３１３】
[00358]  例えば、ガイド鎖は、ＲＩＳＣエントリーに干渉することなく安定性を確認する任意の化学修飾によっても修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の化学修飾パターンは、Ｃ及びＵヌクレオチドの大部分が２’Ｆ修飾されており、５’末端がリン酸化されていることを含む。
【０３１４】
[00359]  一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ−ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％が修飾されている。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ−ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの少なくとも３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％が修飾されている。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ又はｓｄ−ｒｘＲＮＡのヌクレオチドの１００％が修飾されている。
【０３１５】
[00360]  一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ分子は最小の二本鎖領域を有する。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、８〜１５ヌクレオチド長の範囲である。一部の実施形態において、二本鎖である分子の領域は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、二本鎖領域は１３ヌクレオチド長である。ガイド鎖とパッセンジャー鎖は１００％相補性であり得るか、又はガイド鎖とパッセンジャー鎖との間で１つ以上のミスマッチがあり得る。一部の実施形態において、二本鎖分子の端部で、分子は平滑末端であるか、又は１ヌクレオチドのオーバーハングを有する。分子の一本鎖領域は、一部の実施形態において、４〜１２ヌクレオチド長である。一部の実施形態において、一本鎖領域は、４、５、６、７、８、９、１０、１１又は１２ヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態において、一本鎖領域は、４ヌクレオチド長未満又は１２ヌクレオチド長超でもあり得る。特定の実施形態において、一本鎖領域は、６又は７ヌクレオチド長である。
【０３１６】
[00361]  一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡ分子は増加した安定性を有する。一部の例において、化学修飾されたｓｄＲＮＡ又はｓｄ−ｒｘＲＮＡ分子は、任意の中間値を含み、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間より長いか、又は２４時間を超える培地中での半減期を有する。一部の実施形態において、ｓｄ−ｒｘＲＮＡは、１２時間より長い培地中での半減期を有する。
【０３１７】
[00362]  一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、効力の増大及び／又は毒性の低下について最適化される。一部の実施形態において、ガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖のヌクレオチド長及び／又はガイド鎖及び／又はパッセンジャー鎖におけるホスホロチオエート修飾の数は、一部の態様においてＲＮＡ分子の効力に影響し得、２’−フルオロ（２’Ｆ）修飾の２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）修飾での置換は、一部の態様において分子の毒性に影響し得る。一部の実施形態において、分子の２’Ｆ含有量の低下は、分子の毒性を低下させると予測される。一部の実施形態において、ＲＮＡ分子におけるホスホロチオエート修飾の数は、細胞への分子の取り込み、例えば細胞への分子の受動的取り込みの効率に影響し得る。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは２’Ｆ修飾を有しないが、細胞取り込み及び組織浸透における同等の効力を特徴とする。
【０３１８】
[00363]  一部の実施形態において、ガイド鎖は、長さがおよそ１８〜１９ヌクレオチドであり、およそ２〜１４のリン酸修飾を有する。例えば、ガイド鎖は、リン酸修飾された２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１４を超えるヌクレオチドを含有し得る。ガイド鎖は、ＲＩＳＣエントリーに干渉することなく安定性の増加を付与する１つ以上の修飾を含有し得る。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドなどのリン酸修飾ヌクレオチドは、３’末端、５’末端にあるか、又はガイド鎖全体に広がり得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の３’末端の１０ヌクレオチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含有する。ガイド鎖は、分子全体にも位置し得る、２’Ｆ及び／又は２’ＯＭｅ修飾を含有し得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の１位のヌクレオチド（ガイド鎖の最も５’位のヌクレオチド）は、２’ＯＭｅ修飾及び／又はリン酸化されている。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドは２’Ｆ修飾され得る。例えば、１９ｎｔのガイド鎖の２〜１０位（又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’Ｆ修飾され得る。ガイド鎖内のＣ及びＵヌクレオチドはまた、２’ＯＭｅ修飾され得る。例えば、１９ｎｔのガイド鎖の１１〜１８位（又は異なる長さのガイド鎖の対応する位置）のＣ及びＵヌクレオチドは、２’ＯＭｅ修飾され得る。一部の実施形態において、ガイド鎖の最も３’末端のヌクレオチドは修飾されていない。特定の実施形態において、ガイド鎖内のＣ及びＵの大部分は２’Ｆ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の実施形態において、１位及び１１〜１８位のＣ又はＵは２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されている。他の実施形態において、１位及び１１〜１８位のＣ又はＵは２’ＯＭｅ修飾されており、ガイド鎖の５’末端はリン酸化されており、２〜１０位のＣ又はＵは２’Ｆ修飾されている。
【０３１９】
[00364]  自己送達可能なＲＮＡｉ技術は、追加の製剤又は技術を必要とすることなく、ＲＮＡｉ剤で細胞を直接トランスフェクトする方法を提供する。トランスフェクトが困難な細胞株をトランスフェクトする能力、高いインビボ活性及び使用の簡単さは、従来のｓｉＲＮＡベースの技術に対して有意な機能的利点を提供する組成物及び方法の特徴であり、そのため、ｓｄＲＮＡ方法は、本発明のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬにおける標的遺伝子の発現を低下させる方法に関するいくつかの実施形態で利用される。ｓｄＲＮＡｉ方法は、化学合成された化合物を、エクスビボとインビボの両方で、広範な初代細胞及び組織に直接送達することを可能にする。本明細書の本発明の一部の実施形態に記載されているｓｄＲＮＡは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。
【０３２０】
[00365]  ｓｄＲＮＡは、疎水的に修飾されたｓｉＲＮＡ−アンチセンスオリゴヌクレオチドハイブリッド構造として形成され、例えば全体として参照により本明細書に援用されるByrne et al.,December 2013, J. Ocular Pharmacology and Therapeutics, 29(10):855-864に開示される。
【０３２１】
[00366]  一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドは、滅菌エレクトロポレーションを使用して、本明細書に記載のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬに送達され得る。特定の実施形態において、方法は、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドを送達するためのＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団の滅菌エレクトロポレーションを含む。
【０３２２】
[00367]  一部の実施形態において、オリゴヌクレオチドは、膜貫通送達システムと組み合わせて細胞に送達することができる。一部の実施形態において、この膜貫通送達システムは、脂質、ウイルスベクターなどを含む。一部の実施形態において、オリゴヌクレオチド剤は、いかなる送達剤も必要としない自己送達ＲＮＡｉ剤である。特定の実施形態において、方法は、ｓｄＲＮＡオリゴヌクレオチドをＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団に送達するための膜貫通送達システムの使用を含む。
【０３２３】
[00368]  オリゴヌクレオチド及びオリゴヌクレオチド組成物は、本明細書に記載のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬと接触し（例えば、接触させられ、本明細書では投与又は送達とも称される）、取り込まれ、これはＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬによる受動的取り込みを通したものを含む。ｓｄＲＮＡは、第１の拡大培養中、例えばステップＢ、第１の拡大培養後、例えばステップＣ中、第２の拡大培養前又は中、例えばステップＤ前又は中、ステップＤ後且つステップＥでの回収前、ステップＦでの回収中又は後、ステップＦでの最終製剤及び／又は輸注バッグへの移動前又は中並びにステップＦでの任意選択による任意の凍結保存ステップ前に、本明細書に記載されるようにＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬに添加され得る。更に、ｓｄＲＮＡは、ステップＦでの任意の凍結保存ステップから解凍した後に追加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の１つ以上のｓｄＲＮＡ標的化遺伝子は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ並びに他の薬剤を１００ｎＭ〜２０ｍＭ、２００ｎＭ〜１０ｍＭ、５００ｎｍ〜１ｍＭ、１μＭ〜１００μＭ及び１μＭ〜１００μＭからなる群から選択される濃度で含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の１つ以上のｓｄＲＮＡ標的化遺伝子は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ並びに他の薬剤を、０．１μＭ  ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ／１００μＬ培地、０．５μＭ  ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ／１００μＬ培地、０．７５μＭ  ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ／１００μＬ培地、１μＭ  ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ／１００μＬ培地、１．２５μＭ  ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ／１００μＬ培地、１．５μＭ  ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ／１００μＬ培地、２μＭ  ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ／１００μＬ培地、５μＭ  ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ／１００μＬ培地又は１０μＭ  ｓｄＲＮＡ／１０，０００ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ／１００μＬ培地からなる群から選択される量で含む細胞培養培地に添加され得る。一実施形態において、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＩＳＨ及びＣＢＬＢを含む、本明細書に記載の１つ以上のｓｄＲＮＡ標的化遺伝子は、プレＲＥＰ又はＲＥＰ段階中、１日２回、１日１回、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと又は７日ごとにＴＩＬ培養物に添加され得る。
【０３２４】
[00369]  ｓｄＲＮＡを含む本発明のオリゴヌクレオチド組成物は、例えば、細胞培養培地中に高濃度でｓｄＲＮＡを溶解し、受動的取り込みが発生するのに十分な時間を与えることにより、拡大培養プロセス中に本明細書に記載のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬと接触させることができる。特定の実施形態において、本発明の方法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド組成物と接触させることを含む。特定の実施形態において、方法は、オリゴヌクレオチド、例えば細胞培養培地中のｓｄＲＮＡを溶解し、細胞培養培地をＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団と接触させることを含む。ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、本明細書に記載されるように、第１の集団、第２の集団及び／又は第３の集団であり得る。
【０３２５】
[00370]  一部の実施形態において、細胞へのオリゴヌクレオチドの送達は、リン酸カルシウム、ＤＭＳＯ、グリセロール又はデキストラン、エレクトロポレーションを含む、技術分野で認められた適切な方法により、又はトランスフェクション、例えば当技術分野で公知の方法を使用するカチオン性、アニオン性若しくは中性脂質組成物又はリポソームを使用するトランスフェクションにより増強され得る（例えば、国際公開第９０／１４０７４号；国際公開第９１／１６０２４号；国際公開第９１／１７４２４号；米国特許第４，８９７，３５５号；Bergan et a 1993.Nucleic Acids Research.21 :3567を参照されたい）。
【０３２６】
[00371]  一部の実施形態において、標的遺伝子の発現を低下させるために２つ以上のｓｄＲＮＡが使用される。一部の実施形態において、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨ標的化ｓｄＲＮＡの１つ以上が一緒に使用される。一部の実施形態において、ＰＤ−１  ｓｄＲＮＡは、２つ以上の遺伝子標的の発現を低下させるために、ＴＩＭ−３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨの１つ以上と共に使用される。一部の実施形態において、ＬＡＧ３  ｓｄＲＮＡは、両方の標的の遺伝子発現を減少させるために、ＣＩＳＨ標的化ｓｄＲＮＡと組み合わせて使用される。一部の実施形態において、本明細書のＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＣＢＬＢ、ＬＡＧ３及び／又はＣＩＳＨの１つ以上を標的とするｓｄＲＮＡは、Advirna LLC, Worcester, MA, USAから市販されている。
【０３２７】
[00372]  一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡは、ＰＤ−１を標的とし、別のｓｄＲＮＡは、ＬＡＧ３、ＴＩＭ３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＫＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせからなる群から選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせから選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、ｓｄＲＮＡは、ＰＤ−１と、ＬＡＧ３、ＣＩＳＨ、ＣＢＬＢ、ＴＩＭ３及びそれらの組み合わせの１つとから選択される遺伝子を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ−１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ−１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ−１を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＰＤ−１を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＬＡＧ３を標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＩＳＨを標的とする。一部の実施形態において、１つのｓｄＲＮＡはＴＩＭ３を標的とし、１つのｓｄＲＮＡはＣＢＬＢを標的とする。
【０３２８】
[00373]  上述のように、本発明の実施形態は、それらの治療効果を増強するために、遺伝子編集を介して遺伝子改変されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを提供する。本発明の実施形態は、１つ以上のタンパク質の発現の促進及び１つ以上のタンパク質の発現の阻害の両方並びにそれらの組み合わせのために、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団へのヌクレオチド挿入（ＲＮＡ又はＤＮＡ）による遺伝子編集を包含する。本発明の実施形態は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを治療集団に拡大培養するための方法も提供し、方法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを遺伝子編集することを含む。本発明に従う使用に適した、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変するために使用され得るいくつかの遺伝子編集技術が存在する。
【０３２９】
[00374]  一部の実施形態において、方法は、１つ以上のタンパク質を産生するための遺伝子の安定した組み込みのステップを含む、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法を含む。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レトロウイルス形質導入のステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、レンチウイルス形質導入のステップを含む。レンチウイルス形質導入システムは当技術分野で公知であり、例えばLevine, et al., Proc.Nat’l Acad.Sci.2006, 103, 17372-77；Zufferey, et al., Nat.Biotechnol.1997, 15, 871-75；Dull, et al., J. Virology 1998, 72, 8463-71及び米国特許第６，６２７，４４２号に記載されており、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、ガンマレトロウイルス形質導入のステップを含む。ガンマレトロウイルス形質導入システムは当技術分野で公知であり、例えばCepko and Pear, Cur.Prot.Mol.Biol.1996, 9.9.1-9.9.16に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、トランスポゾン媒介遺伝子移入のステップを含む。トランスポゾン媒介遺伝子移入システムは、当技術分野で公知であり、トランスポサーゼの長期発現がトランスジェニック細胞で発生しないように、トランスポサーゼがＤＮＡ発現ベクターとして、又は発現可能なＲＮＡ又はタンパク質、例えばｍＲＮＡ（例えば、キャップ及びポリＡテールを含むｍＲＮＡ）として提供されるトランスポサーゼとして提供されるシステムを含む。ＳＢ１０、ＳＢ１１及びＳＢ１００ｘ並びに酵素活性が増加した人工酵素など、サケ科型のＴｅｌ様トランスポサーゼ（ＳＢ又はSleeping Beautyトランスポザーゼ）を含む適切なトランスポゾン媒介遺伝子移入システムは、例えば、Hackett, et al., Mol.Therapy 2010, 18, 674-83及び米国特許第６，４８９，４５８号に記載されており、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３３０】
[00375]  一実施形態において、方法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団、例えば本明細書に記載の第１の集団、第２の集団及び／又は第３の集団を遺伝子改変する方法を含む。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、１つ以上のタンパク質を産生又は阻害（例えば、サイレンシング）するための遺伝子の安定した組み込みのステップを含む。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、エレクトロポレーションのステップを含む。エレクトロポレーション法は当技術分野で公知であり、例えばTsong, Biophys.J.1991, 60, 297-306及び米国特許出願公開第２０１４／０２２７２３７Ａ１号に記載されており、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第５，０１９，０３４号；同第５，１２８，２５７号；同第５，１３７，８１７号；同第５，１７３，１５８号；同第５，２３２，８５６号；同第５，２７３，５２５号；同第５，３０４，１２０号；同第５，３１８，５１４号；同第６，０１０，６１３号及び同第６，０７８，４９０号（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているものなど、当技術分野で公知の他のエレクトロポレーション法を使用し得る。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、滅菌エレクトロポレーション法である。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、パルスエレクトロポレーション法である。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬをパルス電界で処理して、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの定義及び制御された恒久性又は一過性の変化を変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、オペレーターが制御する、独立してプログラムされた、少なくとも３つの単一のＤＣ電気パルスの一連をＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬに適用するステップを含み、ここで、少なくとも３つのＤＣ電気パルスの一連は、以下の特徴の１つ、２つ又は３つを有する：（１）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる；（２）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる；及び（３）少なくとも３つのパルスの２つの第１のセットの第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスの２つの第２のセットの第２のパルス間隔と異なる。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬをパルス電界で処理して、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの定義及び制御された恒久性又は一過性の変化を変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、オペレーターが制御する、独立してプログラムされた、少なくとも３つの単一のＤＣ電気パルスの一連をＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬに適用するステップを含み、ここで、少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なっている。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬをパルス電界で処理して、ＴＩＬ、ＰＢ��及び／又はＭＩＬの定義及び制御された恒久性又は一過性の変化を変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、オペレーターが制御する、独立してプログラムされた、少なくとも３つの単一のＤＣ電気パルスの一連をＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬに適用するステップを含み、ここで、少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なっている。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬをパルス電界で処理して、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの定義及び制御された恒久性又は一過性の変化を変更、操作又は引き起こすステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、オペレーターが制御する、独立してプログラムされた、少なくとも３つの単一のＤＣ電気パルスの一連をＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬに適用するステップを含み、ここで、少なくとも３つのパルスの２つの第１のセットの第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスの２つの第２のセットの第２のパルス間隔と異なる。一実施形態において、エレクトロポレーション法は、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬをパルス電界で処理して、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬにおける細孔形成を誘導するステップを含む、パルスエレクトロポレーション法であり、これは、１００Ｖ／ｃｍ以上の電界強度を有する、少なくとも３つのＤＣ電気パルスの一連をＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬに適用するステップを含み、ここで、少なくとも３つのＤＣ電気パルスの一連は、誘導された細孔が比較的長期間持続するように、且つＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの生存率が維持されるように、以下の特徴の１つ、２つ又は３つを有する：（１）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス振幅が互いに異なる；（２）少なくとも３つのパルスの少なくとも２つは、パルス幅が互いに異なる；及び（３）少なくとも３つのパルスの２つの第１のセットの第１のパルス間隔は、少なくとも３つのパルスの２つの第２のセットの第２のパルス間隔と異なる。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションのステップを含む。リン酸カルシウムトランスフェクション法（リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿、細胞表面コーティング及びエンドサイトーシス）は当技術分野で公知であり、Graham and van der Eb, Virology 1973, 52, 456-467；Wigler, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.1979, 76, 1373-1376；及びChen and Okayarea, Mol.Cell.Biol.1987, 7, 2745-2752；並びに米国特許第５，５９３，８７５号に記載されており、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、リポソームトランスフェクションのステップを含む。濾過水中のカチオン性脂質Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−ｎ，ｎ，ｎ−トリメチルアンモニウムクロライド（ＤＯＴＭＡ）及びジオレオイルホスフォチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）の１：１（ｗ／ｗ）リポソーム製剤を使用する方法などのリポソームトランスフェ���ション法は当技術分野で公知であり、Rose, et al., Biotechniques 1991, 10, 520-525及びFelgner, et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1987, 84, 7413-7417並びに米国特許第５，２７９，８３３号；米国特許第５，９０８，６３５号；米国特許第６，０５６，９３８号；米国特許第６，１１０，４９０号；米国特許第６，５３４，４８４号；及び米国特許第７，６８７，０７０号に記載されており、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。一実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子改変する方法は、米国特許第５，７６６，９０２号；米国特許第６，０２５，３３７号；米国特許第６，４１０，５１７号；米国特許第６，４７５，９９４号；及び米国特許第７，１８９，７０５号に記載の方法を使用したトランスフェクションのステップを含み、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、本明細書に記載されるように、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの第１の集団、第２の集団及び／又は第３の集団であり得る。
【０３３１】
[00376]  一実施形態によると、遺伝子編集プロセスは、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子における二本鎖又は一本鎖切断の生成を媒介するプログラム可能なヌクレアーゼの使用を含み得る。このようなプログラム可能なヌクレアーゼは、特定のゲノム遺伝子座に切断を導入することにより、正確なゲノム編集を可能にする。即ち、それらは、ゲノム内の特定のＤＮＡ配列の認識に依存して、ヌクレアーゼドメインをこの位置に標的化し、標的配列での二本鎖切断の生成を媒介する。ＤＮＡにおける二本鎖切断は、その後、内因性修復機構を切断部位に動員して、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同性指向修復（ＨＤＲ）によるゲノム編集を媒介する。従って、切断の修復は、標的遺伝子産物を破壊（例えば、サイレンシング、抑制又は増強）する、挿入／欠失変異の導入をもたらし得る。
【０３３２】
[00377]  部位特異的なゲノム編集を可能にするために開発されたヌクレアーゼの主要なクラスには、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様ヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）及びＣＲＩＳＰＲ関連ヌクレアーゼ（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）が含まれる。これらのヌクレアーゼシステムは、ＤＮＡ認識のモードに基づいて、大きく２つのカテゴリに分類できる。ＺＦＮ及びＴＡＬＥＮはタンパク質−ＤＮＡ相互作用を介して特定のＤＮＡ結合を達成し、その一方で、Ｃａｓ９などのＣＲＩＳＰＲシステムは、標的ＤＮＡと直接塩基対を形成する短鎖ＲＮＡガイド分子により、且つタンパク質−ＤＮＡ相互作用により、特定のＤＮＡ配列に標的化される。例えば、Cox et al., Nature Medicine, 2015, Vol. 21, No. 2を参照されたい。
【０３３３】
[00378]  本発明のＴＩＬ拡大培養方法に従って使用され得る遺伝子編集方法の非限定的な例には、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法及びＺＦＮ法が含まれ、これらは以下により詳細に記載される。一実施形態によると、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを治療集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、ＧＥＮ３プロセス）に従って又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されるように実行され得、ここで、方法は、増強された治療効果を提供できるＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを生成するために、ＣＲＩＳＰＲ法、ＴＡＬＥ法又はＺＦＮ法の１つ以上によるＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの少なくとも一部の遺伝子編集を更に含む。一実施形態によると、遺伝子編集されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、それらをインビトロで非修飾ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬと比較することにより、例えばインビトロでのエフェクター機能、サイトカインプロファイルなどを、未修飾のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬと比較して評価することにより、治療効果の改善について評価され得る。特定の実施形態において、方法は、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥ及び／又はＺＦＮ法を使用して、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子編集することを含む。
【０３３４】
[00379]  本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションは、ＣＲＩＳＰＲ、ＴＡＬＥＮ及びＺＦＮシステムなどの遺伝子編集システムの送達に使用される。本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションシステムは、フローエレクトロポレーションシステムである。本発明の一部の実施形態での使用に適した適切なフローエレクトロポレーションシステムの例は、市販のMaxCyte STXシステムである。BTX-Harvard Apparatusから市販のAgilePulseシステム若しくはECM 830、Cellaxess Elektra （Cellectricon）、Nucleofector（Lonza/Amaxa）、GenePulser MXcell（BIORAD）、iPorator-96（Primax）又はsiPORTer96（Ambion）など、本発明での使用に適している可能性のあるいくつかの代替の市販のエレクトロポレーション機器が存在する。本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションシステムは、ＴＩＬ拡大培養方法の残部を備えた閉鎖滅菌システムを形成する。本発明の一部の実施形態において、エレクトロポレーションシステムは、本明細書に記載のパルスエレクトロポレーションシステムであり、ＴＩＬ拡大培養方法の残部を備えた閉鎖滅菌システムを形成する。
【０３３５】
[00380]  ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを治療集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、プロセスＧＥＮ３）に従って又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されるように実行され得、方法は、ＣＲＩＳＰＲ法（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９又はＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１）によるＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの少なくとも一部の遺伝子編集を更に含む。特定の実施形態によると、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＣＲＩＳＰＲ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの治療集団の少なくとも一部において、サイレンシングさせるか、又は低下させる。代わりに、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＣＲＩＳＰＲ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの治療集団の少なくとも一部において、増強させる。
【０３３６】
[00381]  ＣＲＩＳＰＲは、「クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート」を表す。遺伝子編集にＣＲＩＳＰＲシステムを使用する方法は、本明細書ではＣＲＩＳＰＲ法とも称される。ＲＮＡ及びＣａｓタンパク質を組み込んでおり、本発明に従って使用され得る３つのタイプのＣＲＩＳＰＲシステム：タイプＩ、ＩＩ及びＩＩＩが存在する。タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ（Ｃａｓ９により例示される）は、最もよく特徴付けられたシステムの１つである。
【０３３７】
[00382]  ＣＲＩＳＰＲ技術は、細菌及び古細菌（単細胞微生物のドメイン）の天然の防御メカニズムから適応された。これらの生物は、ＣＲＩＳＰＲ由来のＲＮＡ及びＣａｓ９を含む様々なＣａｓタンパク質を使用して、外来の侵入者のＤＮＡを切り刻んで破壊することにより、ウイルス及び他の異物による攻撃を阻止する。ＣＲＩＳＰＲは、ヌクレオチド反復及びスペーサーの存在という２つの異なる特徴を持つＤＮＡの特殊な領域である。ヌクレオチドの反復配列はＣＲＩＳＰＲ領域全体に分布し、外来ＤＮＡ（スペーサー）の短いセグメントが反復配列間に散在している。タイプＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、スペーサーがＣＲＩＳＰＲゲノム遺伝子座内に統合され、転写されて短いＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）に処理される。これらのｃｒＲＮＡは、トランス活性化ｃｒＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）にアニーリングし、Ｃａｓタンパク質による病原性ＤＮＡの配列特異的な切断及びサイレンシングを指示する。Ｃａｓ９タンパク質による標的認識には、ｃｒＲＮＡ内の「シード」配列及びｃｒＲＮＡ結合領域の上流にある保存されたジヌクレオチド含有プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列が必要である。これにより、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムを再標的化して、ｃｒＲＮＡを再設計することにより、事実上あらゆるＤＮＡ配列を切断することができる。天然のシステムにおけるｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡは、遺伝子工学における使用のために、およそ１００ヌクレオチドの単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）に単純化することができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムは、Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼ及び必要なｃｒＲＮＡ成分を発現するプラスミドの同時送達により、ヒト細胞に直接移植することができる。Ｃａｓタンパク質の異なるバリアントは、標的化の制限を減らすために使用され得る（例えば、Ｃｐｆ１などのＣａｓ９のオルソログ）。
【０３３８】
[00383]  ＣＲＩＳＰＲ法を介してＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを恒久的に遺伝子編集することによりサイレンシング又は阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ−３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ−Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。
【０３３９】
[00384]  ＣＲＩＳＰＲ法を介してＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを恒久的に遺伝子編集することにより増強され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１が含まれる。
【０３４０】
[00385]  本発明の実施形態に従って使用され得る、ＣＲＩＳＰＲ法による標的遺伝子配列の発現を変化させるためのシステム、方法及び組成物の例は、米国特許第８，６９７，３５９号；米国特許第８，９９３，２３３号；米国特許第８，７９５，９６５号；米国特許第８，７７１，９４５号；米国特許第８，８８９，３５６号；米国特許第８，８６５，４０６号；米国特許第８，９９９，６４１号；米国特許第８，９４５，８３９号；米国特許第８，９３２，８１４号；米国特許第８，８７１，４４５号；米国特許第８，９０６，６１６号；及び米国特許第８，８９５，３０８号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み込まれる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９及びＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１を発現するためのプラスミドなど、ＣＲＩＳＰＲ法を実行するための資源は、GenScriptなどの企業から市販されている。
【０３４１】
[00386]  一実施形態において、本明細書に記載されるＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団の遺伝子改変は、米国特許第９７９０４９０号（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１システムを使用して実行され得る。
【０３４２】
[00387]  ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを治療集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、プロセス２Ａ）に従って又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されるように実行され得、方法は、ＴＡＬＥ法によるＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの少なくとも一部の遺伝子編集を更に含む。特定の実施形態によると、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＴＡＬＥ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの治療集団の少なくとも一部において、サイレンシングさせるか、又は低下させる。代わりに、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のＴＡＬＥ法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの治療集団の少なくとも一部において、増強させる。
【０３４３】
[00388]  ＴＡＬＥは、「転写アクティベーター様エフェクター」タンパク質を表し、これは、ＴＡＬＥＮ（「転写アクティベーター様エフェクターヌクレアーゼ」）を含む。遺伝子編集にＴＡＬＥシステムを使用する方法は、本明細書ではＴＡＬＥ法とも称され得る。ＴＡＬＥは、植物病原性細菌のキサントモナス（Xanthomonas）属からの天然に存在するタンパク質であり、それぞれが単一の塩基対を認識する一連の３３〜３５−アミノ酸反復ドメインで構成されるＤＮＡ結合ドメインを含有する。ＴＡＬＥの特異性は、反復可変二残基（ＲＶＤ）として知られる２つの超可変アミノ酸によって決定される。モジュラーＴＡＬＥ反復は、隣接するＤＮＡ配列を認識するために連結されている。ＤＮＡ結合ドメインにおける特定のＲＶＤは、標的遺伝子座の塩基を認識し、予測可能なＤＮＡ結合ドメインを組み立てるための構造的特徴を提供する。ＴＡＬＥのＤＮＡ結合ドメインは、ＩＩＳ型ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼの触媒ドメインに融合されて、標的化可能なＴＡＬＥヌクレアーゼが作製される。部位特異的変異を誘導するために、１４〜２０塩基対のスペーサー領域で分離された２つの個別のＴＡＬＥＮアームがＦｏｋＩモノマーを近接させて、二量体化して標的化された二本鎖切断を生成する。
【０３４４】
[00389]  様々な組み立て方法を利用したいくつかの大規模で体系的な研究により、ＴＡＬＥ反復を組み合わせて、事実上あらゆるユーザー定義の配列を認識することができることが示されている。カスタム設計のＴＡＬＥアレイは、Cellectis Bioresearch（Paris, France）、Transposagen Biopharmaceuticals（Lexington, KY, USA）及びLife Technologies（Grand Island, NY, USA）からも市販されている。本発明における使用に適したＴＡＬＥ及びＴＡＬＥＮ法は、米国特許出願公開第２０１１／０２０１１１８Ａ１号；同第２０１３／０１１７８６９Ａ１号；同第２０１３／０３１５８８４Ａ１号；同第２０１５／０２０３８７１Ａ１号及び同第２０１６／０１２０９０６Ａ１号に記載されており、その開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４５】
[00390]  ＴＡＬＥ法を介してＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを恒久的に遺伝子編集することによりサイレンシング又は抑制され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ−３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ−Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。
【０３４６】
[00391]  ＴＡＬＥ法を介してＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを恒久的に遺伝子編集することにより増強され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１が含まれる。
【０３４７】
[00392]  本発明の実施形態に従って使用され得る、ＴＡＬＥ法による標的遺伝子配列の発現を変化させるためのシステム、方法及び組成物の例は、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３４８】
[00393]  ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを治療集団に拡大培養する方法は、本明細書に記載される方法の任意の実施形態（例えば、プロセスＧＥＮ３）に従って又はＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１７／０５８６１０号、ＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６０５号若しくはＰＣＴ／米国特許出願公開第２０１８／０１２６３３号に記載されるように実行され得、方法は、ジンクフィンガー又はジンクフィンガーヌクレアーゼ法によるＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの少なくとも一部の遺伝子編集を更に含む。特定の実施形態によると、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のジンクフィンガー法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの治療集団の少なくとも一部において、サイレンシングさせるか、又は低下させる。代わりに、ＴＩＬ拡大培養プロセス中のジンクフィンガー法の使用は、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子の発現を、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの治療集団の少なくとも一部において、増強させる。
【０３４９】
[00394]  個々のジンクフィンガーには、保存されたββα構成でおよそ３０アミノ酸が含有される。α−ヘリックスの表面にあるいくつかのアミノ酸は、典型的には、ＤＮＡの主要な溝の３ｂｐと、異なる選択性のレベルで接触する。ジンクフィンガーは、２つのタンパク質ドメインを有する。第１のドメインは、真核生物の転写因子を含み、ジンクフィンガーを含有するＤＮＡ結合ドメインである。第２のドメインは、ヌクレアーゼドメインであり、ＦｏｋＩ制限酵素を含み、ＤＮＡの触媒的切断の原因である。
【０３５０】
[00395]  個別のＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインは、典型的には３〜６個の個別のジンクフィンガー反復を含有し、それぞれ９〜１８塩基対を認識できる。ジンクフィンガードメインが目的の標的部位に特異的である場合、合計１８塩基対を認識する１組の３フィンガーＺＦＮでも、理論的には哺乳動物ゲノムの単一の遺伝子座を標的とすることができる。新しいジンクフィンガーアレイを生成する方法の１つは、既知の特異性を有する小さいジンクフィンガー「モジュール」を組み合わせることである。最も一般的なモジュラー組み立てプロセスは、３塩基対のＤＮＡ配列をそれぞれ認識できる３つの別個のジンクフィンガーを組み合わせて、９塩基対の標的部位を認識できる３フィンガーアレイを生成することを含む。代わりに、オリゴマー化プールエンジニアリング（ＯＰＥＮ）などの選択ベースのアプローチを使用して、近接するフィンガー間の状況依存的相互作用を考慮した無作為化ライブラリーから新しいジンクフィンガーアレイを選択することができる。設計されたジンクフィンガーは市販されており、Sangamo Biosciences（Richmond, CA, USA）は、Sigma-Aldrich（St. Louis, MO, USA）と提携して、ジンクフィンガー構築物のための適切なプラットフォーム（CompoZr（登録商標））を開発した。
【０３５１】
[00396]  ジンクフィンガー法を介してＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを恒久的に遺伝子編集することによりサイレンシング又は阻害され得る遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ−３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ−Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。
【０３５２】
[00397]  ジンクフィンガー法を介してＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬを恒久的に遺伝子編集することにより増強され得る遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ−２、ＩＬ１２、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１が含まれる。
【０３５３】
[00398]  本発明の実施形態に従って使用され得る、ジンクフィンガー法による標的遺伝子配列の発現を変化させるためのシステム、方法及び組成物の例は、米国特許第６，５３４，２６１号、米国特許第６，６０７，８８２号、米国特許第６，７４６，８３８号、米国特許第６，７９４，１３６号、米国特許第６，８２４，９７８号、米国特許第６，８６６，９９７号、米国特許第６，９３３，１１３号、米国特許第６，９７９，５３９号、米国特許第７，０１３，２１９号、米国特許第７，０３０，２１５号、米国特許第７，２２０，７１９号、米国特許第７，２４１，５７３号、米国特許第７，２４１，５７４号、米国特許第７，５８５，８４９号、米国特許第７，５９５，３７６号、米国特許第６，９０３，１８５号及び米国特許第６，４７９，６２６号に記載されており、これらは、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３５４】
[00399]  本発明の実施形態に従って使用され得る、ジンクフィンガー法による標的遺伝子配列の発現を変化させるためのシステム、方法及び組成物の他の例は、Beane, et al., Mol.Therapy, 2015, 23 1380-1390に記載されており、この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０３５５】
キメラ抗原受容体及び遺伝子改変Ｔ細胞受容体
[00400]  一部の実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、任意選択により、限定されるものではないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えばＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ−ＥＳＯ−１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えば、ＣＤ１９）に結合するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含め、追加的な機能性を含むように遺伝子改変される。特定の実施形態において、方法は、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えばＭＡＧＥ−１、ＨＥＲ２若しくはＮＹ−ＥＳＯ−１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲ又は腫瘍関連細胞表面分子（例えば、メソテリン）若しくは系統限定的細胞表面分子（例えば、ＣＤ１９）に結合するＣＡＲを含むように、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子操作することを含む。特定の実施形態において、方法は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ１９及びＣＤ２０（二重特異性）、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ１２３、ＰＳＭＡ、メソテリン、ＣＥ７、ＨＥＲ２／ｎｅｕ  ＢＣＭＡ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２／ＣＭＶ、ＩＬ１３Ｒα２、ヒトＣ４葉酸受容体−アルファ（αＦＲ）又はＧＤ２に特異的なＣＡＲを含むように、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団を遺伝子編集することを含む。
【０３５６】
[00401]  一部の実施形態において、本発明の方法に従って拡大培養されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、ＣＡＲの発現を通じて抗原を標的とするように遺伝子改変される。一部の実施形態において、本発明のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、Ｔ細胞シグナル伝達分子の少なくとも１つのエンドドメインに融合された単鎖可変断片抗体を含むＣＡＲをコードする核酸を含む発現ベクターで形質導入される。一部の実施形態において、形質導入ステップは、拡大培養プロセス中のいつでも行われる。一部の実施形態において、形質導入ステップは、拡大培養した細胞が回収された後に行われる。一部の実施形態において、本発明のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、ＣＡＲの発現が可能なポリヌクレオチドを含む。
【０３５７】
[00402]  一実施形態において、ＣＡＲ又はＣＡＲをコードするヌクレオチドは、米国特許第９，３２８，１５６号；同第８，３９９，６４５号；同第７，４４６，１７９号；同第６，４１０，３１９号；同第７，４４６，１９０号及び米国特許出願公開第２０１５／００３８６８４号；同第２０１５／００３１６２４号；同第２０１４／０３０１９９３Ａ１号；同第２０１４／０２７１５８２Ａ１号；同第２０１５／００５１２６６Ａ１号；同第２０１４／０３２２２７５Ａ１号；及び同第２０１４／０００４１３２Ａ１号の開示に従って調製及び形質導入され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。米国特許第９，３２８，１５６号では、Ｂ細胞リンパ腫、特にＣＬＬを有する患者を処置するためにＣＡＲ−Ｔ細胞が調製され、そこで考察されている実施形態は本発明において有用である。例えば、ＣＤ１９抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、４−１ＢＢ共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを発現するＣＡＲ−Ｔ細胞は、本発明において有用である。本発明の一実施形態において、ＣＡＲは、標的特異的結合要素又は抗体結合ドメイン、膜貫通ドメイン及び細胞質ドメインを含む。造血器腫瘍抗原（抗体結合ドメイン用）は当技術分野で周知であり、例えばＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＲＯＲ１、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＭＡ、糖脂質Ｆ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１  ＴＣＲ、ＭＡＧＥ  Ａ３  ＴＣＲなどを含む。一実施形態において、膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ、ベータ又はゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４を含み、合成であり得る。一実施形態において、細胞質又はシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ又はＣＤ６６ｄドメインの一部又は全てを含む。本発明の一実施形態において、細胞質又はシグナル伝達ドメインは、共刺激分子、例えばＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＰＤ−１、ＩＣＯＳ、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＭＣ又はＣＤ８３と特異的に結合するリガンドなども含み得る。
【０３５８】
[00403]  本発明の一実施形態において、ＣＡＲ改変ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、抗原結合ドメイン、共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。本発明の一実施形態において、ＣＡＲ改変ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、ＣＤ１９に向けられた抗原結合ドメイン、４−１ＢＢ又はＣＤ２８共刺激シグナル伝達領域及びＣＤ３ゼータシグナル伝達ドメインを含む。本発明の一実施形態において、ＣＡＲ改変ＴＩＬは、自殺スイッチ（カスパーゼ−９／リミデュシッド（rimiducid）など）又は活性化スイッチ（誘導性ＭｙＤ８８／ＣＤ４０活性化スイッチなど）を含む。本発明の一実施形態において、ＣＡＲ改変ＴＩＬは、ＣＡＲを発現するレンチウイルスベクターを使用して改変される。
【０３５９】
[00404]  本発明の一部の実施形態において、本発明の方法に従って拡大培養されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、遺伝子改変されたＴＣＲを含むＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を使用して細胞におけるシグナル伝達を改変する方法において使用される。一部の実施形態において、本発明のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、限定されるものではないが、高親和性Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）、例えばＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＭＡＧＥ−Ａ１０、ＭＡＲＴ−１、ＣＥＡ、ｇｐ１００、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＨＥＲ２、ＰＲＡＭＥ、ＣＴ８３、ＳＳＸ２又はＮＹ−ＥＳＯ−１などの腫瘍関連抗原を標的とするＴＣＲを含め、追加的な機能性を含むように改変される。ＴＣＲを改変する方法及び人工ＴＣＲを作製する方法は、当技術分野で公知であり、例えば米国特許第６，８１１，７８５号；同第７，５６９，６６４号；同第７，６６６，６０４号；同第８，１４３，３７６号；同第８，２８３，４４６号；同第９，１８１，５２７号；同第７，３２９，７３１号；同第７，０７０，９９５号；同第７，２６５，２０９号；同第８，３６１，７９４号；及び同第８，６９７，８５４号；並びに米国特許出願公開第２０１７／００５１０３６Ａ１号；同第２０１０／００３４８３４Ａ１号；同第２０１１／００１４１６９Ａ１号；同第２０１６／０２００８２４Ａ１号；及び同第２００２／００５８２５３Ａ１号に開示され、そのそれぞれの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本発明の一部の実施形態において、本発明の方法に従って拡大培養されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、腫瘍関連抗原に対する改変ＴＣＲを使用して細胞におけるシグナル伝達を改変する方法において使用される。本発明の一部の実施形態において、本発明の方法に従って拡大培養されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、改変ＴＣＲを使用して細胞におけるシグナル伝達を改変する方法において使用され、これは、内因性ＴＣＲの存在を減少させるためにＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬが改変された遺伝子改変ＴＣＲを含む。
【０３６０】
[00405]  本発明の一部の実施形態において、本発明の方法に従って拡大培養されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、ＭＡＧＥ−Ａ抗原などの癌精巣抗原に特異的であるように改変されたＴＣＲなどの一過性又は安定的に改変されたＴＣＲを含む。一部の実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、改変された相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む少なくとも１つのＴＣＲを含み得る。一部の実施形態において、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、ＴＣＲ親和性を増加させるためにベータ鎖に野生型配列を保持した、改変ＣＤＲ２を含む少なくとも１つのＴＣＲを含み得る。一部の実施形態では、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、天然のＴＣＲα鎖可変ドメイン及び／又はβ鎖可変ドメインと比較して、少なくとも１つのＣＤＲ（ＣＤＲ２など）、可変ドメインフレームワーク領域又はＴＣＲの可変ドメイン内の他の超可変領域（超可変４（ＨＶ４）領域など）において、変異体が高親和性ＴＣＲを生成するように変異している（図１ｂ及び配列番号２を参照されたい）ＴＣＲを含み得る。ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、膜貫通配列によって膜に固定された少なくとも１つのＴＣＲを含み得、米国特許第８，３６１，７９４号（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるように、前記ＴＣＲは、天然のＴＣＲには存在しない細胞外定常ドメイン残基間の鎖間ジスルフィド結合を含む。一部の実施形態では、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、特定のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）−Ａ１複合体に結合する特性を有し、親和性を増加させるためにＴＣＲアルファ可変ドメイン及び／又はＴＣＲベータ可変ドメインに特定の変異を有する特定の野生型ＴＣＲを含む、少なくとも１つのＴＣＲを含み得る。本発明の一部の実施形態において、本発明の方法に従って拡大培養されたＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬは、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＲＴ−１、ＣＥＡ、ｇｐ１００、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、ＨＥＲ２、ＰＲＡＭＥ（メラノーマで優先的に発現される抗原）、ＣＴ８３、ＳＳＸ２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＭＡＧＥ−Ａ３、ＭＡＧＥ−Ａ４又はＭＡＧＥ−Ａ１０への親和性が増加した安定的に改変されたＴＣＲを含む。
【０３６１】
免疫チェックポイント
[00406]  本発明の一実施形態において、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子が改変され得る。免疫チェックポイントは、阻害又は刺激経路を介して免疫応答を調節するリンパ球によって発現される分子である。癌の場合において、免疫チェックポイント経路は、活性化されて抗腫瘍応答を阻害することが多い。即ち、悪性細胞による特定の免疫チェックポイントの発現は抗腫瘍免疫を阻害し、癌細胞の増殖にとって好ましい。例えば、Marin-Acevedo et al., Journal of Hematology & Oncology (2018) 11:39を参照されたい。従って、特定の阻害性チェックポイント分子は、本発明の免疫療法の標的として機能する。特定の実施形態によると、細胞はＣＡＲ又はＴＣＲを介して改変されて、特定の免疫チェックポイント経路を遮断又は刺激し、それにより腫瘍に対する身体の免疫学的活性を増強する。
【０３６２】
[00407]  最も広く研究されているチェックポイントには、プログラム細胞死受容体−１（ＰＤ−１）及び細胞傷害性Ｔリンパ球関連分子−４（ＣＴＬＡ−４）が含まれ、これらは、阻害性リガンドと相互作用する場合、主要なエフェクター機能（例えば、活性化、増殖、サイトカイン放出、細胞傷害性など）を阻害する免疫細胞上の阻害性受容体である。以下でより詳細に説明するように、ＰＤ−１及びＣＴＬＡ−４に加えて、多数のチェックポイント分子が免疫療法の潜在的な標的として浮上している。
【０３６３】
[00408]  サイレンシング又は抑制され得る免疫チェックポイント遺伝子の非限定的な例には、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＨＡＶＣＲ２（ＴＩＭ−３）、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ、ＰＫＡ、ＣＢＬ−Ｂ、ＰＰＰ２ＣＡ、ＰＰＰ２ＣＢ、ＰＴＰＮ６、ＰＴＰＮ２２、ＰＤＣＤ１、ＢＴＬＡ、ＣＤ１６０、ＴＩＧＩＴ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）、ＣＤ９６、ＣＲＴＡＭ、ＬＡＩＲ１、ＳＩＧＬＥＣ７、ＳＩＧＬＥＣ９、ＣＤ２４４、ＴＮＦＲＳＦ１０Ｂ、ＴＮＦＲＳＦ１０Ａ、ＣＡＳＰ８、ＣＡＳＰ１０、ＣＡＳＰ３、ＣＡＳＰ６、ＣＡＳＰ７、ＦＡＤＤ、ＦＡＳ、ＳＭＡＤ２、ＳＭＡＤ３、ＳＭＡＤ４、ＳＭＡＤ１０、ＳＫＩ、ＳＫＩＬ、ＴＧＩＦ１、ＩＬ１０ＲＡ、ＩＬ１０ＲＢ、ＨＭＯＸ２、ＩＬ６Ｒ、ＩＬ６ＳＴ、ＥＩＦ２ＡＫ４、ＣＳＫ、ＰＡＧ１、ＳＩＴ１、ＦＯＸＰ３、ＰＲＤＭ１、ＢＡＴＦ、ＧＵＣＹ１Ａ２、ＧＵＣＹ１Ａ３、ＧＵＣＹ１Ｂ２及びＧＵＣＹ１Ｂ３が含まれる。例えば、サイレンシング又は阻害され得る免疫チェックポイント遺伝子は、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、Ｃｉｓｈ、ＴＧＦβ及びＰＫＡを含む群から選択され得る。ＢＡＦＦ（ＢＲ３）は、出版されたBloom, et al., J. Immunother., 2018に記載されている。別の例によると、本発明のＴＩＬにおいてサイレンシング又は阻害され得る免疫チェックポイント遺伝子は、ＰＤ−１、ＬＡＧ−３、ＴＩＭ−３、ＣＴＬＡ−４、ＴＩＧＩＴ、ＣＩＳＨ、ＴＧＦβＲ２、ＰＲＡ、ＣＢＬＢ、ＢＡＦＦ（ＢＲ３）及びそれらの組み合わせを含む群から選択され得る。
【０３６４】
ＰＤ−１
[00409]  チェックポイント遮断の誘導について最も研究されている標的の１つは、Ｔ細胞レギュレーターのＣＤ２８スーパーファミリーのメンバーであるプログラム死受容体（ＰＤ１又はＰＤ−１、ＰＤＣＤ１としても知られる）である。そのリガンドであるＰＤ−Ｌ１及びＰＤ−Ｌ２は、黒色腫を含むさまざまな腫瘍細胞に発現している。ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１の相互作用は、Ｔ細胞のエフェクター機能を阻害し、慢性刺激の設定でＴ細胞の枯渇を引き起こし、腫瘍微小環境でＴ細胞のアポトーシスを誘導する。ＰＤ１は、免疫監視からの腫瘍特異的エスケープにおいても役割を果たし得る。
【０３６５】
[00410]  特定の実施形態によると、ＴＩＬにおけるＰＤ１の発現は、本発明の組成物及び方法に従ってサイレンシング又は低減される。
【０３６６】
ＣＴＬＡ−４
[00411]  ＣＴＬＡ−４の発現は、活性化Ｔ細胞においてＴ細胞活性化時に誘導され、抗原提示細胞活性化抗原ＣＤ８０及びＣＤ８６との結合について競合する。ＣＴＬＡ−４とＣＤ８０又はＣＤ８６との相互作用は、Ｔ細胞の阻害を引き起こし、免疫応答のバランスを維持する役割を果たす。しかしながら、ＣＤ８０又はＣＤ８６とのＣＴＬＡ−４相互作用の阻害は、Ｔ細胞活性化を延長し、従って癌抗原に対する免疫応答のレベルを増加させ得る。
【０３６７】
[00412]  特定の実施形態によると、ＴＩＬにおけるＣＴＬＡ−４の発現は、本発明の組成物及び方法に従ってサイレンシング又は低減される。
【０３６８】
ＬＡＧ−３
[00413]  リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ−３、ＣＤ２２３）は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ結紮後、Ｔ細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞によって発現される。そのメカニズムは不明なままであるが、その調節はＴ細胞機能に対する負の制御効果を引き起こし、組織の損傷及び自己免疫を防ぐ。ＬＡＧ−３及びＰＤ−１は、ＴＩＬで頻繁に共発現及び上方制御され、免疫の枯渇及び腫瘍の成長につながる。従って、ＬＡＧ−３遮断は抗腫瘍応答を改善する。例えば、Marin-Acevedo et al., Journal of Hematology & Oncology (2018) 11:39を参照されたい。
【０３６９】
[00414]  特定の実施形態によると、ＴＩＬにおけるＬＡＧ−３の発現は、本発明の組成物及び方法に従ってサイレンシング又は低減される。
【０３７０】
ＴＩＭ−３
[00415]  Ｔ細胞免疫グロブリン３（ＴＩＭ−３）は、Ｔ細胞の直接的な負のレギュレーターであり、ＮＫ細胞及びマクロファージに発現している。ＴＩＭ−３は、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）の拡大培養を誘導することにより、間接的に免疫抑制を促進する。そのレベルは、機能不全で枯渇したＴ細胞で特に上昇していることが分かり、これは悪性腫瘍における重要な役割を示唆している。
【０３７１】
[00416]  特定の実施形態によると、ＴＩＬにおけるＴＩＭ−３の発現は、本発明の組成物及び方法に従ってサイレンシング又は低減される。
【０３７２】
Ｃｉｓｈ
[00417]  サイトカインシグナル伝達（ＳＯＣＳ）ファミリーのサプレッサーのメンバーであるＣｉｓｈは、ＣＤ８＋Ｔ細胞のＴＣＲ刺激によって誘導され、腫瘍に対する機能的結合活性を阻害する。ＣＤ８＋Ｔ細胞におけるＣｉｓｈの遺伝的欠失は、それらの拡大培養、機能的結合活性及びサイトカインの多機能性を増強し、確立された腫瘍の顕著な持続的退行をもたらし得る。例えば、Palmer et al., Journal of Experimental Medicine, 212 (12):2095 (2015)を参照されたい。
【０３７３】
[00418]  特定の実施形態によると、ＴＩＬにおけるＣｉｓｈの発現は、本発明の組成物及び方法に従ってサイレンシング又は低減される。
【０３７４】
ＴＧＦβ
[00419]  ＴＧＦβシグナル伝達経路は、細胞の成長、分化、アポトーシス、運動性及び浸潤、細胞外マトリックスの生成、血管新生並びに免疫応答を調節することにおいて複数の機能を有する。ＴＧＦβシグナル伝達の調節解除は腫瘍で頻繁に発生し、腫瘍の発生、発達及び転移に重要な役割を有する。微小環境レベルでは、ＴＧＦβ経路は、発癌全体にわたり、腫瘍成長及び転移に好ましい微小環境を生成することに貢献する。例えば、Neuzillet et al., Pharmacology & Therapeutics, Vol. 147, pp. 22-31 (2015)を参照されたい。
【０３７５】
[00420]  特定の実施形態によると、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬにおけるＴＧＦβの発現は、本発明の組成物及び方法に従ってサイレンシング又は低減される。
【０３７６】
ＰＫＡ
[00421]  プロテインキナーゼＡ（ＰＫＡ）は、セリン−スレオニンプロテインキナーゼスーパーファミリーの周知のメンバーである。ＰＫＡは、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼとしても知られ、ｃＡＭＰ結合時の活性化を通じてＧタンパク質共役型受容体のシグナル伝達を媒介するマルチユニットプロテインキナーゼである。これは、代謝から、イオンチャネル活性化、細胞の成長及び分化、遺伝子発現並びにアポトーシスまで、広く様々な細胞プロセスの制御に関与している。重要なことに、ＰＫＡは多くの腫瘍の発生及び進行に関与している。例えば、Sapio et al., EXCLI Journal; 2014; 13:843-855を参照されたい。
【０３７７】
[00422]  特定の実施形態によると、ＴＩＬにおけるＰＫＡの発現は、本発明の組成物及び方法に従ってサイレンシング又は低減される。
【０３７８】
ＣＢＬＢ
[00423]  ＣＢＬＢ（又はＣＢＬ−Ｂ）は、Ｅ３ユビキチンタンパク質リガーゼであり、Ｔ細胞活性化の負のレギュレーターである。Bachmaier, et al., Nature, 2000, 403, 211-216；Wallner, et al., Clin.Dev.Immunol.2012, 692639。
【０３７９】
[00424]  特定の実施形態によると、ＴＩＬにおけるＣＢＬＢの発現は、本発明の組成物及び方法に従ってサイレンシング又は低減される。
【０３８０】
[00425]  共刺激受容体又は接着分子の過剰発現
【０３８１】
[00426]  追加の実施形態によると、１つ以上の免疫チェックポイント遺伝子が増強される。増強された発現を示し得る免疫チェックポイント遺伝子の非限定的な例には、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１など、特定のケモカイン受容体及びインターロイキンが含まれる。
【０３８２】
ＣＣＲ
[00427]  養子Ｔ細胞免疫療法を有効にするには、Ｔ細胞をケモカインによって腫瘍に適切に輸送する必要がある。腫瘍細胞によって分泌されるケモカイン、末梢に存在するケモカイン及びＴ細胞によって発現されるケモカイン受容体間の一致は、Ｔ細胞の腫瘍床への輸送の成功に重要である。
【０３８３】
[00428]  特定の実施形態によると、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３及びＣＸ３ＣＲ１の１つ以上など、ＴＩＬにおける特定のケモカイン受容体の発現の増加が企図される。ＣＣＲの過剰発現は、養子移入後のエフェクター機能及びＴＩＬの増殖を促進するのに役立つ。
【０３８４】
[00429]  特定の実施形態によると、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ２、ＣＸＣＲ３及びＣＸ３ＣＲ１の１つ以上の発現が増強される。
【０３８５】
[00430]  一実施形態において、ＣＣＲ４及び／又はＣＣＲ５接着分子は、本明細書に記載されるようなガンマレトロウイルス又はレンチウイルス法を使用してＴＩＬ集団に挿入される。一実施形態において、ＣＸＣＲ２接着分子は、Forget, et al., Frontiers Immunology 2017, 8, 908又はPeng, et al., Clin.Cancer Res.2010, 16, 5458（これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されるようなガンマレトロウイルス又はレンチウイルス法を使用してＴＩＬ集団に挿入される。
【０３８６】
インターロイキン
[00431]  更なる実施形態によると、本発明の遺伝子編集方法は、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の１つ以上など、特定のインターロイキンの発現を増加させるために使用され得る。特定のインターロイキンは、Ｔ細胞のエフェクター機能を増強し、腫瘍制御を媒介することが実証されている。
【０３８７】
[00432]  特定の実施形態によると、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＩＬ−１５及びＩＬ−２１の１つ以上の発現は、本発明の組成物及び方法に従って増強される。
【０３８８】
[00433]  適切には、ＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬの集団は、本明細書に記載されるように、第１の集団、第２の集団及び／又は第３の集団であり得る。
【０３８９】
癌を処置する方法
[00434]  上記のＴＩＬ、ＰＢＬ及び／又はＭＩＬ（及びそれらの集団）の組成物及び組み合わせは、過剰増殖性障害を処置するための方法において使用することができる。好ましい一実施形態において、それらは癌の処置に使用するためのものである。好ましい実施形態において、本発明は、癌が、液性腫瘍などの血液悪性腫瘍である、癌の処置方法を提供する。好ましい一実施形態において、本発明は、癌を処置する方法を提供し、癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リヒタートランスフォーメーションを伴うＣＬＬ（又はリヒター症候群）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍であり、イブルチニブを含むＢＴＫ阻害剤による処置に対して不応性、不耐性又はそれから再発した、前述の疾患を有する患者のサブ集団を含む。
【０３９０】
[00435]  本発明の一実施形態において、イブルチニブで前処置されたＣＬＬ患者は、本発明のＰＢＬでの処置に成功し得る患者のサブ集団を表す。特に、イブルチニブで前処置され、イブルチニブ処置にもはや応答しないＣＬＬ患者は、本発明のＰＢＬでの処置に成功し得る患者のサブ集団を表す。別の実施形態において、イブルチニブで前処置され、リヒタートランスフォーメーション（又はリヒター症候群）を発症したＣＬＬ患者は、本発明のＰＢＬでの処置に成功し得る患者のサブ集団を表す。別の実施形態において、イブルチニブで前処置され、リヒタートランスフォーメーション（又はリヒター症候群）を発症し、イブルチニブ治療にもはや応答しないＣＬＬ患者は、本発明のＰＢＬでの処置に成功し得る患者のサブ集団を表す。
【０３９１】
[00436]  一実施形態において、本発明は、癌の処置方法であって、癌は、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、デュルバルマブ、アベルマブ又はアテゾリズマブを含むＰＤ−１及び／又はＰＤ−Ｌ１阻害剤による治療に応答する血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０３９２】
[00437]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて患者における癌を処置する方法であって、
（ａ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、腫瘍又は腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｃ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数は、ＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｄ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、第２の拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数は、ＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｅ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ、及び
（ｆ）ＴＩＬの前記第３の集団の治療有効部分を患者に投与するステップ
を含み、前記腫瘍は、液性腫瘍であり、前記癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０３９３】
[00438]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて患者における癌を処置する方法であって、
（ａ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｂ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、腫瘍又は腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｃ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数は、ＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｄ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、第２の拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数は、ＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｅ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ、及び
（ｆ）ＴＩＬの前記第３の集団の治療有効部分を患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リヒタートランスフォーメーションを伴うＣＬＬ（又はリヒター症候群）小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０３９４】
[00439]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて患者における癌を処置する方法であって、
（ａ）キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ；
（ｂ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｃ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、腫瘍又は腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数は、ＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、第２の拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数は、ＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの前記第３の集団の治療有効部分を患者に投与するステップ
を含み、前記腫瘍は、液性腫瘍であり、前記癌は、血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０３９５】
[00440]  一実施形態において、本発明は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の集団を用いて患者における癌を処置する方法であって、
（ａ）キナーゼ阻害剤又はＩＴＫ阻害剤を含むレジメンで患者を前処置するステップ；
（ｂ）切除、生検、針吸引又はアフェレーシスによって患者から腫瘍を入手するステップであって、腫瘍は、ＴＩＬの第１の集団を含む、ステップ；
（ｃ）任意選択により、腫瘍を断片化又は分離して腫瘍断片を入手し、腫瘍又は腫瘍断片を第１の細胞培養培地と接触させるステップ；
（ｄ）第１の細胞培養培地中でＴＩＬの第１の集団の初期拡大培養を行ってＴＩＬの第２の集団を入手するステップであって、ＴＩＬの第２の集団の数は、ＴＩＬの第１の集団よりも少なくとも５倍多く、第１の細胞培養培地は、ＩＬ−２を含む、ステップ；
（ｅ）第２の細胞培養培地中でＴＩＬの第２の集団の第２の急速拡大培養を行ってＴＩＬの第３の集団を入手するステップであって、第２の拡大培養の開始から７日後にＴＩＬの第３の集団の数は、ＴＩＬの第２の集団よりも少なくとも５０倍多く、第２の細胞培養培地は、ＩＬ−２、ＯＫＴ−３（抗ＣＤ３抗体）及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含み、第２の拡大培養は、１４日以下の期間にわたって行われる、ステップ；
（ｆ）ＴＩＬの第３の集団を回収するステップ；及び
（ｇ）ＴＩＬの前記第３の集団の治療有効部分を患者に投与するステップ
を含み、腫瘍は、液性腫瘍であり、癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リヒタートランスフォーメーションを伴うＣＬＬ（又はリヒター症候群）小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である、方法を提供する。
【０３９６】
[00441]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＭＩＬ方法１を使用して拡大培養され、本発明に従って患者に投与される。
【０３９７】
[00442]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＭＩＬ方法２を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０３９８】
[00443]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＭＩＬ方法３を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０３９９】
[00444]  本発明の一実施形態において、ＭＩＬ方法１、ＭＩＬ方法２又はＭＩＬ方法３を使用して拡大培養されたＴＩＬは、ＡＭＬを処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０４００】
[00445]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＰＢＬ方法２を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０４０１】
[00446]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＰＢＬ方法２を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０４０２】
[00447]  本発明の一実施形態において、ＴＩＬは、ＰＢＬ方法２を使用して拡大培養され、癌を処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０４０３】
[00448]  本発明の一実施形態において、ＰＢＬ方法１、ＰＢＬ方法２又はＰＢＬ方法３を使用して拡大培養されたＴＩＬは、ＣＬＬを処置するために本発明に従って患者に投与される。
【０４０４】
[00449]  本発明の前述の実施形態のいずれかにおいて、キナーゼ阻害剤による前処置が記載されている。一実施形態において、キナーゼ阻害剤は、イマチニブ、ダサチニブ、イブルチニブ、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ又は当技術分野で公知の他のキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤若しくはセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤からなる群から選択される。一実施形態において、キナーゼ阻害剤による前処置レジメンは、当技術分野で知られている通り、及び／又は医師によって指示されている通りである。
【０４０５】
[00450]  本発明の前述の実施形態のいずれかにおいて、ＩＬ−２誘導性Ｔ細胞キナーゼ阻害剤（ＩＴＫ）による前処置が記載されている。インターロイキン２誘導性Ｔ細胞キナーゼ（ＩＴＫ）は、Ｔ細胞で発現する非受容体チロシンキナーゼであり、さまざまな経路を調節する。当技術分野で公知の任意のＩＴＫ阻害剤が、本発明の実施形態で使用され得る（例えば、Lo, et al., Expert Opinion on Therapeutic Patents, 20:459-469 (2010)；Vargas, et al., Scandinavian Journal of Immunology, 78(2):130-139 (2013)；国際公開第２０１５１１２８４７号；国際公開第２０１６１１８９５１号；国際公開第２００７１３６７９０号、米国特許出願公開第２０１２００５８９８４Ａ１号及び米国特許第９，５３１，６８９号及び９，６９５，２００号；これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、共有結合的及び不可逆的にＩＴＫに結合する共有結合ＩＴＫ阻害剤である。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、ＩＴＫに結合するアロステリックＩＴＫ阻害剤である。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、アミノチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、５−アミノメチルベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、（４又は５−アリール）ピラゾリル−インドール系ＩＴＫ阻害剤、ベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノベンズイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリミジン系ＩＴＫ阻害剤、アミノピリジン系ＩＴＫ阻害剤、ジアゾロジアジン系ＩＴＫ阻害剤、トリアゾール系ＩＴＫ阻害剤、３−アミノピリド−２−オン系ＩＴＫ阻害剤、インドリルインダゾール系ＩＴＫ阻害剤、インドール系ＩＴＫ阻害剤、アザインドール系ＩＴＫ阻害剤、ピラゾリルインドール系阻害剤、チエノピラゾール系ＩＴＫ阻害剤、複素環ＩＴＫ阻害剤及びＡＴＰポケット内のシステイン−４４２を標的とするＩＴＫ阻害剤（イブルチニブなど）、アザベンゾイミダゾール系ＩＴＫ阻害剤、ベンゾチアゾール系ＩＴＫ阻害剤、インドール系ＩＴＫ阻害剤、ピリドン系ＩＴＫ阻害剤、スルホキシミン置換ピリミジンＩＴＫ阻害剤、アリールピリジノン系ＩＴＫ阻害剤及び当技術分野で公知の任意の他のＩＴＫ阻害剤からなる群から選択される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤による前処置レジメンは、当技術分野で知られている通り、及び／又は医師によって指示されている通りである。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、
【化１】
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【化２】
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【化３】
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【化４】
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【化５】
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【化６】
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【化７】
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【化８】
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【化９】
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【化１０】
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及びその組み合わせからなる群から選択される。本発明の一実施形態において、ＩＴＫ阻害剤は、イマチニブ、ダサチニブ（ＢＭＳ−３５４８２５）、スプリセル［Ｎ−（２−クロロ−６−メチルフェニル）−２−（６−（４−（２−ヒドロキシエチル）−ピペラジン−１−イル）−２−メチルピリミジン−４−イルアミノ）チアゾール−５−カルボキサミド）、イブルチニブ（（１−｛（３Ｒ）−３−［４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル］ピペリジン−１−イル｝プロプ−２−エン−１−オン）、ボスチニブ、ニロチニブ、エルロチニブ、１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］シンノリン−３−オール、ＣＴＡ０５６（７−ベンジル−１−（３−（ピペリジン−１−イル）プロピル）−２−（４−（ピリジン−４−イル）フェニル）−１Ｈ−イミダゾ［４，５−ｇ］キノキサリン−６（５Ｈ）−オン）、化合物１０（Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al., Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008)）、化合物１９（Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al., Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008)）、化合物２７（Boehringer Ingelheim from Moriarty, et al., Bioorg Med Chem Lett, 18:5537-40 (2008)）、化合物２６（Boehringer Ingelheim from Winters, et al., Bioorg Med Chem Lett., 18:5541-4 (2008)）、化合物３７（Boehringer Ingelheim from Cook, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009)）、化合物４１（Boehringer Ingelheim from Cook, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009)）、化合物４８（Boehringer Ingelheim from Cook, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009)）、化合物５１（Boehringer Ingelheim from Cook, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19:773-7 (2009)）、化合物１０ｎ（Boehringer Ingelheim from Riethe, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19: 1588-91 (2009)）、化合物１０ｏ（Boehringer Ingelheim from Riethe, et al., Bioorg Med Chem Lett., 19: 1588-91 (2009)）、化合物７ｖ（Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011)）、化合物７ｗ（Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011)）、化合物７ｘ（Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011)）、化合物７ｙ（Vertex from Charrier, et al., J Med Chem., 54:2341-50 (2011)）、化合物４４（Bayer Schering Pharma from vonBonin, et al., Exp Dermatol., 20:41-7 (2011)）、化合物１３（Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010)）、化合物２４（Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010)）、化合物３４（Nycomed from Velankar, et al., Bioorg Med Chem., 18:4547-59 (2010)）、化合物１０ｏ（Nycomed from Herdemann, et al., Bioorg Med Chem Lett., 21:1852-6 (2011)）、化合物３（Sanofi US from McLean, et al., Bioorg Med Chem Lett., 22:3296-300 (2012)）、化合物７（Sanofi US from McLean, et al., Bioorg Med Chem Lett., 22:3296-300 (2012)）及び／又は当技術分野で公知の他のキナーゼ阻害剤、チロシンキナーゼ阻害剤若しくはセリン／スレオニンキナーゼ阻害剤並びにそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。
【０４０６】
[00451]  前述の実施形態のいずれかにおいて、イブルチニブ（ＩＭＢＲＵＶＩＣＡとして市販され、化学名１−［（３Ｒ）−３−［４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル］−１−ピペリジニル］−２−プロペン−１−オン）を有する）を含む前処置レジメンは、約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月又は６ヶ月の期間にわたり、１４０ｍｇカプセル１つを１日４回（ｑ．ｄ．）経口投与すること、１４０ｍｇカプセル２つを１日４回経口投与すること、１４０ｍｇカプセル３つを１日４回経口投与すること又は１４０ｍｇカプセル４つを１日４回経口投与することを含む。前述の実施形態において、イブルチニブを含む前処置レジメンは、２５ｍｇ、５０ｍｇ、７５ｍｇ、１００ｍｇ、１２５ｍｇ、１５０ｍｇ、１７５ｍｇ、２００ｍｇ、２２５ｍｇ、２５０ｍｇ、２７５ｍｇ、３００ｍｇ、３２５ｍｇ、３５０ｍｇ、３７５ｍｇ、４００ｍｇ、４２５ｍｇ、４５０ｍｇ及び５００ｍｇから選択されるイブルチニブ用量を経口投与することも含み得、ここで、投与は、１日１回、１日２回、１日３回又は１日４回行われ、投与期間は、約１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、２週間、３週間、１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、４ヶ月、５ヶ月及び６ヶ月からなる群から選択される。
【０４０７】
[00452]  任意の前述の実施形態において、処置される癌は、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、マントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、活性化Ｂ細胞（ＡＢＣ）ＤＬＢＣＬ、胚中心Ｂ細胞（ＧＣＢ）ＤＬＢＣＬ、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、リヒタートランスフォーメーションを伴うＣＬＬ（又はリヒター症候群）、小リンパ球性白血病（ＳＬＬ）、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、ホジキンリンパ腫、再発性及び／又は難治性ホジキンリンパ腫、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、成熟Ｂ−ＡＬＬ、バーキットリンパ腫、ワルデンストローム型マクログロブリン血症（ＷＭ）、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群、骨髄線維症、慢性骨髄性白血病、濾胞中枢リンパ腫、無痛性ＮＨＬ、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫並びにエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）関連Ｂ細胞リンパ腫からなる群から選択される血液悪性腫瘍である。
【０４０８】
[00453]  示された疾患又は障害の処置、予防及び／又は管理における、本明細書に記載の方法及び組成物の有効性は、当技術分野において公知の様々な動物モデルを使用して試験することができる。
【０４０９】
化学療法による骨髄非破壊的リンパ球枯渇
[00454]  一実施形態において、本発明は、ＴＩＬ集団で癌を処置する方法を提供し、ここで、患者は、本開示に係るＴＩＬの注入前に骨髄非破壊的化学療法で前処置される。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、１つ以上の化学療法剤である。一実施形態において、骨髄非破壊的化学療法は、２日間（ＴＩＬ注入の２７日前及び２６日前）のシクロホスファミド６０ｍｇ／ｋｇ／日及び５日間（ＴＩＬ注入の２７〜２３日前）のフルダラビン２５ｍｇ／ｍ２／日である。一実施形態において、本開示による骨髄非破壊的化学療法及びＴＩＬ注入（０日目）後、患者は生理学的許容量まで８時間ごとに７２０，０００ＩＵ／ｋｇでＩＬ−２の静脈内注入を受ける。
【０４１０】
[00455]  実験的知見は、腫瘍特異的Ｔリンパ球の養子移入前のリンパ球枯渇が、調節性Ｔ細胞及び免疫系の競合要素（「サイトカインシンク」）を排除することによって処置効果を高めるのに重要な役割を果たすことを示す。従って、本発明の一部の実施形態は、本発明のＴＩＬを導入する前に、患者においてリンパ球枯渇ステップ（「免疫抑制調整」とも称される）を利用する。
【０４１１】
[00456]  一般的に、リンパ球枯渇はフルダラビン又はシクロホスファミド（活性型はマホスファミドと称される）及びその組み合わせの投与を使用して達成される。そのような方法は、Gassner, et al., Cancer Immunol.Immunother.2011, 60, 75-85、Muranski, et al., Nat.Clin.Pract.Oncol, 2006, 3, 668-681、Dudley, et al., J. Clin.Oncol.2008, 26, 5233-5239及びDudley, et al., J. Clin.Oncol.2005, 23, 2346-2357に記載されており、これらの全ては、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４１２】
[00457]  一部の実施形態において、フルダラビンは、０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１μｇ／ｍＬフルダラビンの濃度で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、フルダラビンは、１０ｍｇ／ｋｇ／日、１５ｍｇ／ｋｇ／日、２０ｍｇ／ｋｇ／日、２５ｍｇ／ｋｇ／日、３０ｍｇ／ｋｇ／日、３５ｍｇ／ｋｇ／日、４０ｍｇ／ｋｇ／日又は４５ｍｇ／ｋｇ／日の投与量で投与される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間実施される。一部の実施形態において、フルダラビン処置は、２５ｍｇ／ｋｇ／日で４〜５日間実施される。
【０４１３】
[00458]  一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により０．５μｇ／ｍＬ〜１０μｇ／ｍＬの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミドの活性型であるマホスファミドは、シクロホスファミドの投与により１μｇ／ｍＬの濃度で入手される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、１日、２日、３日、４日、５日、６日又は７日以上にわたって実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは、１００ｍｇ／ｍ２／日、１５０ｍｇ／ｍ２／日、１７５ｍｇ／ｍ２／日、２００ｍｇ／ｍ２／日、２２５ｍｇ／ｍ２／日、２５０ｍｇ／ｍ２／日、２７５ｍｇ／ｍ２／日又は３００ｍｇ／ｍ２／日の投与量で投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドは静脈内（即ちｉ．ｖ．）投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、３５ｍｇ／ｋｇ／日で２〜７日間実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で、４〜５日間実施される。一部の実施形態において、シクロホスファミド処置は、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で、４日間実施される。
【０４１４】
[00459]  一部の実施形態において、リンパ球枯渇は、フルダラビン及びシクロホスファミドを共に患者に投与することによって行われる。一部の実施形態において、４日間にわたって、フルダラビンは２５ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与され、シクロホスファミドは、２５０ｍｇ／ｍ２／日、ｉ．ｖ．で投与される。
【０４１５】
[00460]  一実施形態において、リンパ球枯渇は、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間フルダラビンを投与することにより行われる。骨髄又は末梢血から入手したＴＩＬを拡大培養するいくつかの方法が本明細書に記載される。本発明の一実施形態において、リンパ球枯渇は、６０ｍｇ／ｍ２／日の用量で２日間シクロホスファミドを投与し、続いて２５ｍｇ／ｍ２／日の用量で５日間フルダラビンを投与することにより行われる。骨髄又は末梢血から入手したＴＩＬを拡大培養するいくつかの方法が本明細書に記載される。
【実施例】
【０４１６】
実施例
[00461]  本明細書に包含される実施形態は、以下の実施例を参照して説明される。これらの実施例は、説明のみを目的として提供され、本明細書に包含される開示は、決してこれらの実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ本明細書に提供される教示の結果として明らかになるあらゆる変形形態を包含すると解釈されるべきである。
【０４１７】
実施例１  −  非ホジキンリンパ腫からのＴＩＬの拡大培養
[00462]  ＴＩＬは、図１に示される病態を有する５つの非ホジキンリンパ腫腫瘍（１つのマントル細胞リンパ腫腫瘍、３つの濾胞性リンパ腫腫瘍及び１つのＡＢＣ型びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫腫瘍）からプレＲＥＰ段階でＩＬ−２を１１〜１４日間使用して拡大培養し、続いてＩＬ−２、マイトジェン抗ＣＤ３抗体及び照射同種異系末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）フィーダーを使用して１４日間ＲＥＰを行った。ＴＩＬは、５つのリンパ腫腫瘍全てから成功して生成され、最大拡大培養指数は６８０倍であり、これは他の方法を使用して以前に観察されたものよりも有意に高かった。Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211。更に、平均ＣＤ３＋Ｔ細胞集団は９５％であった（Schwartzentruber, et al., Blood 1993, 82, 1204-1211の方法を使用した７５％に対して）。
【０４１８】
[00463]  細胞選別及びフローサイトメトリーは、Becton, Dickinson & Co. (BD) FACS CANTO IIシステムを使用して実施した。フローサイトメトリー分析により、黒色腫ＴＩＬのものと同等のエフェクターメモリー細胞の著しい相対的増加が観察された（図２）。黒色腫ＴＩＬ培養物と比較して、リンパ腫において、エフェクターメモリーＣＤ４５ＲＡ＋（ＴＥＭＲＡ）細胞（ｐ＝０．００１３；ＣＤ４、ＣＤ８）及びＣＤ２８＋ＣＤ４＋（ｐ＝０．００８）サブセットの有意な増加が観察された（図３）。
【０４１９】
[00464]  ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットにおけるＴ細胞分化の表現型マーカーの比較が図４及び図５にそれぞれ示されている。ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットにおけるＴ細胞枯渇の表現型マーカーの比較が図６及び図７にそれぞれ示されている。
【０４２０】
[00465]  図８は、非ホジキンリンパ腫ＴＩＬと黒色腫ＴＩＬとの間の細胞型の比較を示す。黒色腫ＴＩＬと比較したリンパ腫ＴＩＬのＣＤ４＋Ｔ細胞数の増加傾向が示されている。
【０４２１】
[00466]  図９は、生物発光リダイレクト溶解アッセイ（ＢＲＬＡ）の結果を示す。黒色腫ＴＩＬ（１１〜７５ＬＵ５０、４時間）と比較して、リンパ腫ＴＩＬにおいて、ＬＵ５０／１０６としてＢＲＬＡで測定したＴＩＬの最小細胞溶解活性は、４時間で１未満〜６ＬＵ５０及び２４時間で１〜３９ＬＵ５０の範囲であった。
【０４２２】
[00467]  図１０は、リンパ腫ＴＩＬ対黒色腫ＴＩＬのインターフェロン−γ（ＩＦＮ−γ）酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）の結果を示す。比較可能な結果を示す。リンパ腫ＴＩＬのELIspotアッセイの結果を図１１に示し、図１２の黒色腫ＴＩＬの同じアッセイの結果と比較する。ELIspotアッセイでは、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート／イオノマイシン、抗ＣＤ３抗体又はＣＤ３／ＣＤ２８／４−１ＢＢビーズで刺激すると、リンパ腫ＴＩＬによる広範なＩＦＮ−γ産生が観察され、これらの条件下で一部のリンパ腫ＴＩＬによって産生されるＩＦＮ−γは、黒色腫ＴＩＬによって産生されるＩＦＮ−γと同等であり、一部の場合、リンパ腫ＴＩＬにおけるＩＦＮ−γ産生がはるかに高かった。
【０４２３】
[00468]  図１３は、NANOSTRING NCOUNTER分析（Nanostring Technologies, Inc., Seattle, WA）の結果を示し、これはリンパ腫ＴＩＬが、黒色腫ＴＩＬと比較して、より高いレベルのＲＯＲＣ ＩＬ１７Ａ（ＴＨ１７表現型）及びＧＡＴＡ３（Ｔｈ２表現型）を発現することを示している。この発見は、リンパ腫反応性Ｔ細胞が主にＴＨ２及びＴＨ１７であるという観察と一致している。
【０４２４】
[00469]  全体として、結果は、ＴＩＬ細胞療法がリンパ腫患者の処置に使用され得るという証拠を提供する。
【０４２５】
実施例２  −  ＡＭＬ患者の骨髄から増殖した骨髄浸潤リンパ球（ＭＩＬ）及びＡＭＬ患者の末梢血から増殖した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の表現型及び機能的特徴付け
[00470]  骨髄のサンプル及び入手可能な関連血液サンプルが、イブルチニブ（１−［（３Ｒ）−３−［４−アミノ−３−（４−フェノキシフェニル）−１Ｈ−ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジン−１−イル］−１−ピペリジニル］−２−プロペン−１−オン）を含むレジメンの少なくとも３つのラウンドで前処置された患者を含む、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）の患者から、患者の年齢、性別、ステージ、腫瘍タイプ、癌の部位、処置歴、匿名化した病理報告及び実施された分子検査（例えば、ＭＳＩ発現及びＲａｆ／Ｒａｓ発現）に関する情報を伴い、入手される。ＭＩＬ及びＰＢＬは、ＭＩＬ方法１、ＭＩＬ方法２若しくはＭＩＬ方法３又はＰＢＬ方法１、ＰＢＬ方法２若しくはＰＢＬ方法３の１つを使用して拡大培養され、ＭＩＬ及びＰＢＬの表現型及び機能が特徴付けられた。
【０４２６】
[00471]  図３６Ａ及び３６Ｂは、ＭＩＬ及びＰＢＬの拡大倍数を示す。図３６Ａは、３人の患者（ＭＩＬ１、ＭＩＬ２、ＭＩＬ３）の拡大倍数を示し、図３６Ｂは、患者２及び３（ＰＢＬ２、ＰＢＬ３）の一致したＰＢＬの拡大倍数を示す。ＭＩＬ １．１はＭＩＬ方法１を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．２はＭＩＬ方法２を使用して拡大培養され、ＭＩＬ１．３はＭＩＬ方法３を使用して拡大培養され、ＰＢＬは、ＰＢＬ方法３を使用して拡大培養された。ＭＩＬ１の拡大倍数は、ＭＩＬ１内の各サンプルで２５（ＭＩＬ１．１）、５０（ＭＩＬ１．２）及び７５（ＭＩＬ１．３）倍の増加を示す。これは、ＭＩＬ方法３が好ましい拡大培養方法であり得ることを予備的に示している。ＭＩＬ２及びＭＩＬ３の拡大倍数データは不十分なようである。これは開始細胞数が少ないためである可能性がある。比較のために、患者ＭＩＬ１（ＭＩＬ１．３）のサンプル３の開始細胞数は１３８，０００細胞であったのに対し、ＭＩＬ２とＭＩＬ３の開始細胞数はそれぞれ６２，０００と２８，０００であった。ＭＩＬ２とＭＩＬ３について図３６Ｂに示されるＰＢＬの拡大倍数は、それぞれ約１０倍と４０倍で、同様の開始細胞数（ＰＢＬ２について３３８，０００、ＰＢＬ３について３３６，０００）であった。
【０４２７】
[00472]  図３７Ａ及び３７Ｂは、ＭＩＬ（図３７Ａ）及び適合ＰＢＬ（図３７Ｂ）のＩＦＮ−γ産生細胞の数を示す。ＭＩＬ１．３、ＭＩＬ２及びＭＩＬ３は、ＩＦＮ−γ分泌の有意な増加を示し、ＭＩＬ方法３が好ましい拡大培養方法であることを示す。ＰＢＬのデータは不確定である。
【０４２８】
[00473]  図３８Ａ〜３８Ｆは、ＭＩＬ及びＰＢＬのＴＣＲαβ＋、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋サブセットを示す。図３８Ａ及び３８Ｄは、３つ全ての方法（ＭＩＬ１．１、ＭＩＬ１．２、ＭＩＬ１．３）を使用して拡大培養されたＭＩＬ（図３８Ａ）及びＰＢＬ方法３を使用して拡大培養されたＰＢＬ（図３８Ｄ）のＴＣＲａｂ＋サブセットを示す。データは、ＴＣＲαβ＋サブセットが全てのＭＩＬ及びＰＢＬでほぼ１００％であることを示し、これは、ほぼ全てのＴ細胞の拡大培養において拡大培養プロセスが成功したことを示す。図３８Ｂ及び３８Ｅは、ＭＩＬ方法３によって拡大培養されたＭＩＬについてＣＤ４サブセットが減少することを示す（これは、図３８ＣにおけるＣＤ８サブセットの増加に相関する）。図３８Ｅ及び３８ＦのＰＢＬデータは、ＭＩＬ１．３データと一致しているようである。
【０４２９】
[00474]  図３９Ａ〜Ｄ及び４０Ａ〜Ｄは、ＭＩＬ（図３９）及びＰＢＬ（図４０）のＣＤ４サブセットのデータを示す。図３９Ａ及び４０Ａは、ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示し；図３９Ｂ及び４０Ｂは、セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図３９Ｃ及び４０Ｃは、エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図３９Ｄ及び４０Ｄは、最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。ＭＩＬ方法３（ＭＩＬ１．３）及びＰＢＬ方法３（ＰＢＬ２及びＰＢＬ３）を使用して拡大培養された全てのサンプルは、コンパレータである黒色腫ＴＩＬのＣＤ４サブセットと一致している。
【０４３０】
[00475]  図４１Ａ〜Ｄ及び４２Ａ〜Ｄは、ＭＩＬ（図４１）及びＰＢＬ（図４２）のＣＤ８サブセットのデータを示す。図４１Ａ及び４２Ａは、ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示し；図４１Ｂ及び４２Ｂは、セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図４１Ｃ及び４２Ｃは、エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図４１Ｄ及び４２Ｄは、最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。ＭＩＬ方法３（ＭＩＬ１．３）を使用して拡大培養されたサンプルは、コンパレータである黒色腫ＴＩＬのＣＤ４サブセットと一致している。ＰＢＬ２及びＰＢＬ３のデータを対照として使用した。
【０４３１】
[00476]  図４３Ａ及び４３Ｂは、ＭＩＬ（図４３Ａ）及びＰＢＬ（図４３Ｂ）のＣＤ４ＣＤ２７及びＣＤ８ＣＤ２７サブセットのデータを示す。図４４Ａ及び４４Ｂは、ＭＩＬ（図４４Ａ）及びＰＢＬ（図４４Ｂ）のＣＤ４ＣＤ２８及びＣＤ８ＣＤ２８サブセットのデータを示す。ＰＢＬのデータは、黒色腫ＴＩＬと比較して、各サンプルの拡大培養プロセスの０日目と１４日目に示されている。ＭＩＬのデータは、黒色腫ＴＩＬと比較して、ＭＩＬ１．３のみについて０日目及び１４日目に示されている。ＭＩＬ及びＰＢＬのＣＤ２８サブセットは、黒色腫ＴＩＬに類似している。
【０４３２】
[00477]  図４５Ａ及び４５Ｂは、ＭＩＬ（図４５Ａ）及びＰＢＬ（図４５Ｂ）のＣＤ４及びＣＤ８サブセットのそれぞれの内のＰＤ１＋細胞の比較を表す。図４６Ａ及び４６Ｂは、ＭＩＬ（図４６Ａ）及びＰＢＬ（図４６Ｂ）のＣＤ４及びＣＤ８サブセットのそれぞれの内のＬＡＧ３＋細胞の比較を表す。ＰＤ１＋及びＬＡＧ３＋の両方のデータは、０日目の測定値に対するＭＩＬ１．３サンプルの大幅な減少を示す一方、ＭＩＬ１．１及びＭＩＬ１．２は、０日目に対するＰＤ１及びＬＡＧ３の両方は増加傾向にあるようであった。ＰＢＬデータを対照として使用した。
【０４３３】
[00478]  この実施例の実験は、ＭＩＬ方法３で拡大培養されたＭＩＬが、より高い拡大倍数を有し、機能性が高く、より高いＣＤ８サブセットの割合を有し、より少ないＬＡＧ３＋及びＰＤ１＋Ｔ細胞サブセットを有していたことを示す。データは、メモリーサブセットが黒色腫ＴＩＬに類似していることも示した。データは、凍結保存されたサンプルが、新鮮なサンプルと比較して、より高い拡大倍数を有するようであることも示した。ＰＢＬサンプルのデータの多くは、小さいサンプルサイズに基づいているようであり、不確定なもののようである。
【０４３４】
実施例３  −  ＴＩＬを拡大培養し、拡大培養したＴＩＬを用いて癌を処置する方法
[00479]  骨髄は、針吸引を使用して入手される。骨髄サンプルをヘパリン含有シリンジに吸引し、室温で一晩保存する。貯蔵後、シリンジの内容物を一緒に滅菌容器にプールし、品質を試験する。骨髄は、リンパ球分離培地（ＬＳＭ）及びCOBE Spectraによる遠心分離を使用して、単核細胞（ＭＮＣ）が濃縮されている。勾配内の細胞は赤血球まで収集され、ＨＢＳＳを使用して洗浄される。ＭＮＣは、２％ＨＳＡ及び５％ＤＭＳＯが添加されたヘタスターチ系凍結保護剤を使用して凍結保存され、品質管理のためにＭＮＣの一部が確保されている。ＱＣバイアルを解凍して、ＭＮＣ製品のＣＤ３＋及びＣＤ３８＋／１３８＋の細胞含有量を測定する。
【０４３５】
[00480]  骨髄を吸引及びリンパ球分離培地密度勾配で分画し、細胞をほぼ赤血球ペレットのレベルまで収集する。この分画法は、赤血球及び好中球を実質的に除去し、ほぼ完全な骨髄を提供する。結果として生じる分画された材料は、Ｔ細胞及び腫瘍細胞である。骨髄はフィコール処理され（Ficolled）、ＴＩＬは、当技術分野において公知の方法及び本明細書に記載の任意の方法を用いて拡大培養される。例えば、ＴＩＬを拡大培養させるための例示的な方法が図１４に示される。ＴＩＬを拡大培養するための、且つ拡大培養したＴＩＬで癌患者を処置するための例示的な方法を図１５に示す。
【０４３６】
実施例４  −  非ホジキンリンパ腫腫瘍から増殖した腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の表現型及び機能的特徴付け
[00481]  この実施例で説明する実験の目標には、治療的有効性を有するＴＩＬをＮＨＬ腫瘍から分離及び培養できるかどうかを決定し、ＮＨＬ由来ＴＩＬの特性を黒色腫由来ＴＩＬと比較することが含まれる。
【０４３７】
[00482]  患者からのＴＩＬの抽出及び拡大培養のための材料及び方法は、本明細書に記載されている通りである。患者のＴＩＬは、病変、この場合にはリンパ組織の、外科的切除を介して、抑制性腫瘍微小環境から抽出された。本明細書に開示される拡大培養プロセスを使用してＴＩＬを拡大培養し、１０９〜１０１１個のＴＩＬを得た。
【０４３８】
[00483]  ＮＨＬ由来のＴＩＬ（１つのマントル細胞リンパ腫（ＭＣＬ）、３つの濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、３つのびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ））を、フローサイトメトリーを使用して黒色腫由来のＴＩＬに対する分化のマーカーについて分析した。抗ＣＤ５６、抗ＴＣＲａｂ、抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ８、抗ＣＤ２７及び抗ＣＤ２８抗体についてＴＩＬを分析した。これらの抗体は、分化パネル１（ＤＦ１）として使用された。抗ＣＤ３、抗ＣＤ４、抗ＣＤ９、抗ＣＤ３８、抗ＨＬＡ−ＤＲ、抗ＣＣＲ７及び抗ＣＤ４５ＲＡ抗体を分化パネル２（ＤＦ２）として使用した。ＤＦ２を使用して、次のＴ細胞サブセットを特定した。ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）；セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）；エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）；及び最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）。
【０４３９】
[00484]  図１６は、異なる癌タイプでの異なる細胞サブ集団におけるＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞を示す。黒色腫（四角）、マントル細胞（影付き丸）、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（白丸）及び濾胞性リンパ腫（黒丸）の癌タイプを試験した。図１６Ａ〜１６Ｄは、黒色腫ＴＩＬと比較して、リンパ腫ＴＩＬがより増殖性が高く、従ってより高い抗腫瘍活性を有する傾向を一般的に示す。同様に、図１７Ｂは、ＣＤ４／ＣＤ２８発現リンパ腫Ｔ細胞がＣＤ４／ＣＤ２８発現黒色腫Ｔ細胞よりも高い増殖能力を有することを示す。
【０４４０】
[00485]  ＴＩＬによるインターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）産生は、ｍＡＢコーティングされたDynabeads（商標）（ＣＤ３、ＣＤ２８及びＣＤ１３７）でＴＩＬを刺激し、ELIspot（商標）（Immunospot CTL）を使用することによって測定し、Immunospot（商標）S6エントリーアナライザーを使用して、また、DuoSet（商標）ＥＬＩＳＡキット（製造者の指示に従うＲ＆Ｄシステム）を使用したＥＬＩＳＡによって列挙した。
【０４４１】
[00486]  図１８Ａ及び１８Ｂは、ＮＨＬ  ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬによるＩＦＮγ産生が類似していることを示しており、２つのＴＩＬタイプ間で同様の細胞傷害性機能を示す。
【０４４２】
[00487]  ＴＩＬの溶解能力は、生物発光リダイレクト溶解アッセイ（ＢＲＬＡ）を使用して決定した。ｅＧＦＰ及びホタルルシフェラーゼをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＰ８１５細胞を標的細胞として使用した。ＴＩＬ及び標的細胞をＯＫＴ３の存在下で４時間／２４時間共培養した。次いで、ルシフェリンを添加し、細胞を５分間インキュベートした。生物発光はルミノメーターを使用して測定された。パーセント生存率及びパーセント細胞傷害性は次のように計算された。
％生存率＝（実験的生存率−最小）／（最大シグナル−最小シグナル）×１００
％細胞傷害性＝１００−（％生存率）
【０４４３】
[00488]  ＴＩＬの溶解能力は、エフェクター細胞によって誘導される標的細胞の５０パーセント細胞傷害性を表す溶解単位ＬＵ５０として表された。
【０４４４】
[00489]  自己腫瘍及び同種異系腫瘍の両方に対する腫瘍殺傷能力を測定するために、ＴＩＬをアッセイした。ＴＩＬは、異なるエフェクター細胞対標的細胞比（Ｅ：Ｔ比）（１０：１、２０：１、５０：１又は１００：１のいずれか）で、自己リンパ腫細胞又は同種異系黒色腫細胞株（５２６黒色腫細胞株）と混合された。共培養前にCellTrace Violet色素（ThermoFisher）で腫瘍細胞を標識した。２４時間後、細胞を７−ＡＡＤで染色して細胞死を判定した。ＴＩＬによって殺傷された腫瘍細胞の割合は、リンパ腫細胞ではＣＤ１９に対してCellTrace Violet色素、黒色腫細胞ではＭＣＳＰに対してCellTrace Violetでゲートされた７−ＡＡＤ陽性腫瘍細胞として表された。
【０４４５】
[00490]  図１９は、ＮＨＬ  ＴＩＬ及び黒色腫ＴＩＬが４時間（図１９Ａ）及び２４時間（図１９Ｂ）で同種異系腫瘍及び自己腫瘍の両方に対して同様の細胞傷害性機能を有することを示す。
【０４４６】
[00491]  遺伝子発現解析は、nCounter GX Human Immunology V2パネル（NanoString, Seattle）を使用してＴＩＬでも実行された。製造者の指示に従って、１００ｎｇの総ＲＮＡをアッセイした。データは、各サンプルの組み込みコントロール遺伝子プローブの幾何平均でスケーリングすることにより正規化された。データは、黒色腫遺伝子発現に対してマッピングされ、比較された。
【０４４７】
[00492]  図２１は、遺伝子発現解析の結果を示す。ヒートマップは、黒色腫ＴＩＬにわたる遺伝子発現の倍数変化を示す。リンパ腫由来のＴＩＬからのＩＬ１７Ａ及びＲＯＲＣの発現は、黒色腫由来のＴＩＬと比較して、より高い発現を示した。
【０４４８】
[00493]  全体として、この実験の結果は、リンパ腫由来のＴＩＬの機能的特徴が黒色腫由来のＴＩＬと類似していることを実証し、リンパ腫由来のＴＩＬの使用がリンパ腫癌の処置に成功するであろうことを示す。
【０４４９】
実施例５  −  慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）を有する患者の末梢血から増殖した末梢血リンパ球（ＰＢＬ）の表現型及び機能的特徴付け。
[00494]  ＰＢＭＣは、３つのラウンドのイブルチニブによる処置前及び処置後のＣＬＬを有する患者から収集された。
【０４５０】
[00495]  図２４及び本明細書の他の箇所で説明するように、３つの異なる方法、ＰＢＬ方法１、ＰＢＬ方法２及びＰＢＬ方法３を使用してＴ細胞を拡大培養した。特定のサンプルは新鮮なＰＢＭＣから得られ、特定のサンプルは凍結保存されたＰＢＭＣから得られた。細胞が拡大培養及び回収されると、上記の実施例４及び本明細書の他の箇所に記載された方法を使用して、フェノタイピングし、機能的に特徴付けた。この実施例の目標は、ＰＢＬの最適な拡大培養プロセスを決定し、イブルチニブ処置サンプルから拡大培養したＰＢＬが未処置サンプルから拡大培養したＰＢＬよりも強力かどうかを決定することであった。
【０４５１】
[00496]  ＰＢＬの拡大倍数を図２６に示す。ＰＢＬ方法１、ＰＢＬ方法２及びＰＢＬ方法３を使用して拡大培養されたＰＢＬの結果が示される。未処置のＰＢＬ（プレＲｘ  ＰＢＬ）は、平均１７９倍の拡大倍数を示し、イブルチニブ処理ＰＢＬ（ポストＲｘ  ＰＢＬ）は平均３０６倍の拡大倍数を示した。新鮮なＰＢＭＣに由来するＰＢＬ（ＰＢＬ）は、平均８２倍の拡大倍数のみを示した。ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬとの間では、ｐ＝０．００６。ＰＢＬとプレＲｘ  ＰＢＬとの間では、ｐ＝０．３及びプレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬとの間では、ｐ＝０．１。全体として、ＰＢＬ及びプレＲｘ  ＰＢＬの両方の全てのグループに比べて、全てのポストＲｘ  ＰＢＬグループで平均拡大倍数の増加が見られる。
【０４５２】
[00497]  図２７は、ＰＢＬ、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）産生細胞を示す。ＰＢＬについて、ＩＦＮ−γ産生細胞の平均数は約１８６４であった。プレＲｘ  ＰＢＬについて、ＩＦＮ−γ産生細胞の平均数は約７５３０であり、ポストＲｘ  ＰＢＬについて、ＩＦＮ−γ産生細胞の平均数は約１１９８４であった。ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬとの間では、ｐ＝０．００６。ＰＢＬとプレＲｘ  ＰＢＬとの間では、ｐ＝０．００６及びプレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬとの間では、ｐ＝０．０１。全体として、ＰＢＬ及びプレＲｘ  ＰＢＬの両方の全てのグループと比較して、全てのポストＲｘ  ＰＢＬグループでＩＦＮ−γ産生細胞の平均数の有意な増加が見られる。
【０４５３】
[00498]  各サンプルで表現型の特徴付けを実施した。図２８は、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬにおけるＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの割合を表し、コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用する。ここで、データは、ＣＤ４サブセット（左に示す）が、どの方法が細胞の拡大培養に使用されたかに関係なく、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方間で同等であることを示す。プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４サブセットは、黒色腫ＴＩＬよりも高いことが示された（それぞれｐ＝０．０００６）。ＣＤ８サブセット（右に示す）は、細胞の拡大培養に使用されるプロセスに関係なく、プレＲＸ  ＰＢＬ及びポストＲＸ  ＰＢＬの両方で低かった。プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８サブセットは、黒色腫ＴＩＬよりも低いことが示された（それぞれｐ＝０．０００６）。より低いＣＤ８サブセットは単に癌のタイプの派生物であると仮定される（即ち、ＣＬＬでは、ＣＤ４サブセットは典型的には拡大培養される）。
【０４５４】
[00499]  図２９Ａ〜２９Ｄは、コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセット間の比較を示す。図２９Ａは、ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示し；図２９Ｂは、セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図２９Ｃは、エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図２９Ｄは、最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。図２９は、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４メモリーサブセットが、黒色腫ＴＩＬで見られるものと同等であることを示す。
【０４５５】
[00500]  図３０Ａ〜３０Ｄは、コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセット間の比較を示す。図３０Ａは、ナイーブ（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示し；図３０Ｂは、セントラルメモリーｔ細胞（ＣＭ）（ＣＣＲ７＋／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図３０Ｃは、エフェクターメモリーＴ細胞（ＥＭ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ−）のデータを示し；図３０Ｄは、最終分化エフェクターメモリー細胞（ＴＥＭＲＡ）（ＣＣＲ７−／ＣＤ４５ＲＡ＋）のデータを示す。図３０は、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ８メモリーサブセットが、黒色腫ＴＩＬで見られるものと同等であることを示す。
【０４５６】
[00501]  図３１Ａ及び３１Ｂは、コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、ＣＤ４細胞（図３１Ａ）及びＣＤ８細胞（図３１Ｂ）のＣＤ２７サブセットの比較を表す。ＣＤ４ＣＤ２７細胞サブセットは、黒色腫ＴＩＬと比較して、プレＲｘ  ＰＢＬ（ｐ＝０．０３）とポストＲｘ  ＰＢＬ（ｐ＝０．０２）の両方で有意に高かった。ＣＤ８ＣＤ２７細胞サブセットは、黒色腫ＴＩＬと比較して、プレＲｘ  ＰＢＬ（ｐ＝０．００２）とポストＲｘ  ＰＢＬ（ｐ＝０．００１）の両方で有意に高かった。
【０４５７】
[00502]  図３２Ａ及び３２Ｂは、コンパレータとして黒色腫ＴＩＬを使用した、ＣＤ４細胞（図３０Ａ）及びＣＤ８細胞（図３０Ｂ）のＣＤ２８サブセットの比較を表す。ＣＤ４ＣＤ２８細胞サブセット及びＣＤ８ＣＤ２８細胞サブセットは、黒色腫ＴＩＬと比較して、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬの両方で同等であることが示された。
【０４５８】
[00503]  図３３Ａ及び３３Ｂは、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４＋（図３３Ａ）及びＣＤ８＋（図３３Ｂ）集団内のＬＡＧ３＋サブセットの比較を示す。データは、ポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４＋（ｐ＝０．０６）及びＣＤ８＋（ｐ＝０．０１）集団の両方でＬＡＧ３＋サブセットの有意な平均減少を示す。
【０４５９】
[00504]  図３４Ａ及び３４Ｂは、プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４＋（図３４Ａ）及びＣＤ８＋（図３４Ｂ）集団内のＰＤ１＋サブセットの比較を示す。データは、ポストＲｘ  ＰＢＬのＣＤ４＋及びＣＤ８＋集団の両方でＰＤ１＋サブセットの平均減少を示すが、減少は有意でなかった。
【０４６０】
[00505]  図３５Ａ及び３５Ｂは、生物発光再溶解アッセイ（ＢＲＬＡ）を使用して測定されたプレＲｘ  ＰＢＬ（図３５Ａ）及びポストＲｘ  ＰＢＬ（図３５Ｂ）の細胞溶解活性の結果を示す。CelllTrace（商標）Violet Cell Proliferation Kit（Invitrogen）を使用して、以下のようにアッセイを実施した。ＰＢＬであるエフェクター細胞は、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識された。標的細胞（自己ＣＤ１９＋腫瘍細胞）をミトシイン（mitocyin）Ｃとインキュベートし、CellTrace（商標）Vioet Cell Proliferation Kitの指示に従ってCellTrace（商標）Violet（ＣＴＶ）で標識した。エフェクター細胞と標的細胞を２：１、５：１、２０：１の比率で２４時間インキュベートした（Ｅ：Ｔ細胞）。カウントブライト（countbright）ビーズを加え、細胞をアネキシンＶ−ＰＩで染色し、ＣＴＶ＋／アネキシン−Ｖ  ＰＩ＋細胞（死細胞の数を提供する）を分析した。ポストＲｘ  ＰＢＬは、標的腫瘍細胞の５０％を殺傷するのに必要な細胞がより少ないため（即ち、ＬＵ５０は、ポストＲｘ  ＰＢＬの方がプレＲｘ  ＰＢＬよりも低い）、より強力であると思われる。
【０４６１】
[00506]  この実施例で実施された実験は、次の結果を示した：新鮮なＣＬＬ  ＰＢＭＣから拡大培養されたＰＢＬは、凍結保存されたＰＢＭＣ（プレＲｘ  ＰＢＬ及びポストＲｘ  ＰＢＬ）から拡大培養されたＰＢＬと比較して、より低い拡大倍数及び有意により低いＩＦＮ−□産生を示し；ポストＲｘ  ＰＢＬは、プレＲｘ  ＰＢＬと比較して、一貫してより高い拡大倍数及びＩＦＮ−□産生の有意な増加を示し；プレＲｘ  ＰＢＬとポストＲｘ  ＰＢＬの両方は、自己（ＣＤ１９＋）腫瘍細胞に対して溶解活性を示したが、ポストＲｘ  ＰＢＬはプレＲｘ  ＰＢＬよりも低いＬＵ５０を有していた。
【０４６２】
[00507]  実施例６  −  ＣＬＬ患者のＰＢＭＣからＰＢＬを選択及び拡大培養する例示的な実施形態
【０４６３】
[00508]  ＰＢＭＣは患者から収集され、（任意選択により、イブルチニブなどのＩＴＫ阻害剤で前処置された）使用前に凍結されるか又は新鮮に使用される。本発明の方法において、出発物質として少なくとも約４００，０００，０００（４００ｘ１０６）のＰＢＭＣを産生するために十分量の末梢血を収集する。方法の０日目に、６ｘ１０６ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を新鮮に調製するか、解凍し、使用できるまで４℃又は氷上で保存した。２００ｍＬのＣＭ２培地は、１００ｍＬのＣＭ１培地（GlutaMAX（登録商標）を含む）を組み合わせ、それを１００ｍＬ（１：１）でＡＩＭ−Ｖで希釈してＣＭ２を作製することによって調製される。ＣＭ２は光から保護されており、使用しないときは堅く密閉されている。
【０４６４】
[00509]  以下の工程は、全て滅菌細胞培養条件下で行われる。ＣＭ２の５０ｍｌのアリコートを凍結したＰＢＭＣサンプルの解凍及び／又は洗浄に使用するために３７℃の水浴中の５０ｍＬのコニカルチューブで温める。凍結したＰＢＭＣサンプルを使用する場合、サンプルを冷凍庫から取り出し、解凍の準備ができるまでドライアイスで保存する。ＰＢＭＣクライオバイアルを解凍する準備ができたら、５ｍＬのＣＭ２培地を滅菌５０ｍＬコニカルチューブに入れる。ＰＢＭＣサンプルのクライオバイアルを、氷の結晶がごくわずかにのみ残るまで３７℃の水浴中に入れる。加温したＣＭ２培地を、サンプルバイアルに、サンプル：培地（約１ｍＬ）の体積比１：１で滴下する。内容物全体をクライオバイアルから取り出し、５０ｍＬコニカルチューブ内の残りのＣＭ２培地に移す。更に１〜２ｍＬのＣＭ２培地を使用してクライオバイアルを洗浄し、クライオバイアルの内容物全体を取り出して５０ｍＬのコニカルチューブに移す。次に、コニカルチューブの容量を追加のＣＭ２培地で１５ｍＬに調製し、穏やかに渦巻かせて細胞を洗浄する。次に、コニカルチューブを室温で、４００ｇで５分間遠心分離し、細胞ペレットを収集する。
【０４６５】
[00510]  上清をペレットから除去し、コニカルチューブに蓋をし、次に例えば粗い表面に沿ってチューブをこすることにより細胞ペレットを破壊する。約１ｍＬのＣＭ２培地を細胞ペレットに添加し、ペレットと培地をピペットで５〜１０回上下に吸引して細胞ペレットを分解する。更に３〜５ｍＬのＣＭ２培地をチューブに添加し、ピペットで混合して細胞を懸濁する。この時点で、細胞懸濁液の量を記録する。Nexcelom Cellometer K2などの自動セルカウンターで細胞を計数するために、チューブから細胞懸濁液１００ｍＬを取り出す。サンプル中の生細胞の数を測定し、記録する。
【０４６６】
[00511]  フェノタイピング及び他の特性評価実験のために、最低５ｘ１０６細胞を保存する。細胞ペレットを収集するために、保存された細胞を４００ｇで、５分間室温で回転させる。細胞ペレットを凍結培地（２０％ＤＭＳＯを含む滅菌熱不活化ＦＢＳ）に再懸濁する。保存された細胞の１つ又は２つのアリコートを凍結培地で凍結し、各アリコートは、クライオバイアル中に１ｍＬの凍結培地中の２〜５ｘ１０６個の細胞で構成され、−８０℃の冷凍庫の細胞凍結容器（Mr.Frosty）で緩慢凍結する。−８０℃で最低２４時間後、液体窒素保管庫に移す。
【０４６７】
[00512]  次の工程では、事前に冷却した溶液を使用し、迅速に作業して、セルを低温に保つ。次の工程は、ＰＢＭＣサンプルのＴ細胞分画を精製することである。これは、Pan T-cell Isolation Kit（Miltenyi、カタログ番号１３０−０９６−５３５）を使用して完了する。ＰＢＳ、０．５％ＢＳＡ及びｐＨ７．２の２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む滅菌フィルター洗浄緩衝液で細胞を洗浄することにより、細胞を精製のために調製する。ＰＢＭＣサンプルを４００ｇで５分間遠心分離して、細胞ペレットを収集する。上清を吸引除去し、細胞ペレットを細胞１０７個ごとに４０ｕＬの洗浄緩衝液に再懸濁する。１０７細胞ごとに１０μＬのPanT細胞ビオチン抗体カクテルを添加する。よく混合し、冷蔵庫内又は氷上で５分間インキュベートする。１０７細胞ごとに３０μＬの洗浄緩衝液を添加する。１０７細胞ごとに２０μＬのPanT細胞マイクロビーズカクテルを添加する。よく混合し、冷蔵庫内又は氷上で１０分間インキュベートする。ＬＳカラムを調製し、マイクロビーズから細胞を磁気的に分離する。ＬＳカラムをQuadroMACS磁場中に配置する。ＬＳカラムを３ｍＬの冷たい洗浄緩衝液で洗浄し、洗浄液を収集して廃棄する。細胞懸濁液をカラムに入れ、フロースルー（未標識細胞）を収集する。このフロースルーは濃縮Ｔ細胞分画（ＰＢＬ）である。３ｍＬの洗浄緩衝液でカラムを洗浄し、最初のフロースルーと同じチューブにフロースルーを収集する。チューブに蓋をして、氷の上に置く。これは、Ｔ細胞分画、つまりＰＢＬである。磁場からＬＳカラムを取り外し、５ｍＬの洗浄緩衝液でカラムを洗浄し、非Ｔ細胞分画（磁気標識細胞）を別のチューブに収集する。両分画を４００ｇで５分間遠心分離して、細胞ペレットを収集する。上清を両方のサンプルから吸引し、ペレットを破壊し、各ペレットに３０００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を補充した１ｍＬのＣＭ２培地に細胞を再懸濁し、ピペットで５〜１０回上下にピペッティングしてペレットを分解する。各サンプルに１〜２ｍＬのＣＭ２を添加し、各サンプルをよく混合し、次の工程のために組織培養インキュベーターに保存する。各サンプルから約５０ｕＬのアリコートを取り出し、細胞を計数し、数と生存率を記録する。
【０４６８】
[00513]  次に、Ｔ細胞（ＰＢＬ）をDunabeads（商標） Human T-Expander CD3/CD28で培養する。Dynabeadsのストックバイアルを中速で３０秒間ボルテックスする。必要とするビーズのアリコートをストックバイアルから取り出し、滅菌１．５ｍＬのマイクロチューブに入れる。ビーズを含む１．５ｍＬマイクロチューブに１ｍＬのビーズ洗浄液を添加することにより、ビーズをビーズ洗浄液で洗浄する。穏やかに混合する。チューブをDynaMag（商標）-2磁石の上に置き、ビーズが磁石に向かって引き寄せられる間、３０分間放置する。ビーズから洗浄液を吸引除去し、磁石からチューブを取り外す。３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充した１ｍＬのＣＭ２培地をビーズに添加する。マイクロチューブの内容物全体を１５又は５０ｍＬのコニカルチューブに移す。ＩＬ−２を含むＣＭ２培地を使用して、ビーズの最終濃度を約５００，０００／ｍＬにする。
【０４６９】
[00514]  Ｔ細胞（ＰＢＬ）及びビーズは、次のように一緒に培養される。０日目：G-Rex２４ウェルプレートで、１ウェルあたり合計７ｍＬで、５００，０００個のＴ細胞、５００，０００個のＣＤ３／ＣＤ２８Dynabeads及びＩＬ−２が補充されたＣＭ２を添加する。G-Rexプレートをそのプロセスの次に工程（４日目）まで加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れた。残りの細胞は、Mr.Frosty細胞凍結容器を使用して、ＣＳ１０凍結保存培地で凍結される。Mr.Frosty細胞凍結容器を使用して、細胞の非Ｔ細胞分画をＣＳ１０凍結保存培地で凍結する。４日目に培地を交換する。培地の半分（約３．５ｍＬ）をG-rexプレートの各ウェルから取り除く。３７℃に加温した３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充した十分な量（約３．５ｍＬ）のＣＭ４培地を添加して、各サンプルウェルから除去した培地を交換する。G-rexプレートをインキュベーターに戻す。
【０４７０】
[00515]  ７日目に、細胞はＲＥＰによる拡大培養のために調製される。G-rexプレートをインキュベーターから取り出し、培地の半分を各ウェルから取り出して廃棄する。細胞を残りの培地に再懸濁し、１５ｍＬのコニカルチューブに移す。ウェルを、３７℃に温めた３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充した各ＣＭ４を１ｍＬで洗浄し、洗浄培地を同じ１５ｍＬチューブに細胞と共に移す。細胞の代表的なサンプルを除去し、自動セルカウンターを使用して計数する。１ｘ１０６未満の生細胞がある場合、０日目のDynabead拡大培養プロセスが繰り返される。細胞の残りは、バックアップ拡大培養のため又はフェノタイピング及び他の特性研究のために凍結される。１ｘ１０６以上の生細胞がある場合、ＲＥＰ拡大培養は、０日目からのプロトコルに従って複製で設定される。代わりに、十分な細胞を用いて、拡大培養は、G-Rex１０Ｍ培養フラスコで、１フラスコあたり１０〜１５ｘ１０６のＰＢＬを使用し、３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充した最終容量１００ｍＬ／ウェルのＣＭ４培地で１：１の比率のDynabeads:ＰＢＬを使用して、設定される。プレート及びフラスコをインキュベーターに戻す。過剰なＰＢＬは、−８０℃の冷凍庫内のMr.Frosty細胞凍結容器で小分けにしてゆっくりと凍結し、−８０℃で最低２４時間後に液体窒素貯蔵に移し得る。これらのＰＢＬは、拡大培養若しくはフェノタイピング又は他の特性研究のためのバックアップサンプルとして使用し得る。
【０４７１】
[00516]  １１日目に、培地を交換する。培地の半分をG-rexプレートの各ウェル又はフラスコから取り出し、３７℃で３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充した同量の新しいＣＭ４培地と交換する。
【０４７２】
[00517]  １４日目に、ＰＢＬを回収する。G-rexプレートを使用する場合、培地の約半分がプレートの各ウェルから取り除かれ、廃棄される。ＰＢＬとビーズを残りの培地に懸濁し、滅菌された１５ｍＬのコニカルチューブ（チューブ１）に移す。３７℃に温めた１〜２ｍＬの新しいＡＩＭ−Ｖ培地でウェルを洗浄し、洗浄液をチューブ１に移す。チューブ１に蓋をして、DynaMag（商標）-15磁石に１分間入れ、ビーズを磁石に引き寄せる。細胞懸濁液を新しい１５ｍＬチューブ（チューブ２）に移し、ビーズを２ｍＬの新しいＡＩＭ−Ｖで、３７℃で洗浄する。チューブ１を更に１分間磁石に戻し、その後、洗浄培地をチューブ２に移す。必要に応じて、最終の洗浄の工程後にウェルを混合し得る。細胞の代表的なサンプルを取り出し、計数し、数と生存率を記録する。計数している間、チューブをインキュベーターに入れ得る。細胞が非常に密に見える場合、追加のＡＩＭ−Ｖ培地をチューブ２に添加し得る。フラスコが使用する場合、フラスコの容量を約１０ｍＬに減らすべきである。フラスコの内容物を混合し、１５ｍＬのコニカルチューブ（チューブＡ）に移す。上記のようにフラスコを２ｍＬのＡＩＭ−Ｖ培地で洗浄し、洗浄培地もチューブＡに移す。チューブＡに蓋をして、DynaMag（商標）-15磁石に１分間入れ、ビーズを磁石に引き寄せる。細胞懸濁液を新しい１５ｍＬチューブ（チューブＢ）に移し、ビーズを２ｍＬの新しいＡＩＭ−Ｖで、３７℃で洗浄する。チューブＡを更に１分間磁石に戻し、その後、洗浄培地をチューブＢに移す。最後の洗浄工程後、必要に応じてウェルを混合し得る。細胞の代表的なサンプルを取り出し、計数し、数と生存率を記録する。計数している間、チューブをインキュベーターに入れ得る。細胞が非常に密に見える場合、追加のＡＩＭ−Ｖ培地をチューブＢに添加し得る。細胞は、新鮮な状態で使用するか、又は目的の濃度で、ＣＳ１０保存培地で凍結して使用し得る。
【０４７３】
実施例７  −  ＰＢＭＣからＰＢＬを選択及び拡大培養する例示的な実施形態
[00518]  ＣＬＬ患者又は本明細書に記載されている他の疾患の患者から得られたＰＢＭＣからのＰＢＬの拡大培養には、以前にイブルチニブ若しくはＩＴＫ阻害剤を投与された、又はイブルチニブ再発若しくは難治性ＣＬＬのＣＬＬ患者を含む、以下の手順を使用し得る。全ての工程で、生物学的安全キャビネット（ＢＳＣ）又は同様の筐体で滅菌技術を使用する必要がある。
【０４７４】
[00519]  ０日目、６ｘ１０６ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を調製する。アリコートが利用できる場合、新しいアリコートを解凍し、使用できるまで４℃の冷蔵庫又は氷上で放置する。ＣＭ２培地の小容量（例えば、２００ｍＬ）を調製する。最初に、１００ｍＬのＣＭ１培地を準備し、手順でグルタミンをGlutaMAXに置き換えて、ＡＩＭ Ｖで１：１に希釈し、ＣＭ２を作製する。この実験を実行している間、ＣＭ２を３７℃の水浴中に入れ、キャップを堅く閉じ、光から保護する。フード内で使用する場合、キャップを外しておいたり緩めておいたりしてはならない。３７℃の水浴中で、ＣＬＬサンプルの解凍と洗浄に使用する５０ｍＬのコニカルチューブで、ＣＭ２（ＩＬ−２なし）のアリコートを温める。ＬＮ２冷凍庫からＣＬＬ  ＰＢＭＣサンプルを含むクライオバイアルを取り出し、解凍の準備ができるまでサンプルをドライアイス上に保持するか、新しいＣＬＬ  ＰＢＭＣを使用する。解凍を開始する直前に、加温した培地のアリコートをＢＳＣに入れる。新しく、滅菌されたラベル付きの５０ｍＬコニカルチューブに５ｍＬの培地を添加する。ごくわずかな氷晶がクライオバイアルに残るまで、３７℃の水浴中にクライオバイアルを入れサンプルを解凍する。解凍されたサンプルを含むクライオバイアルをＢＳＣに移す。滅菌トランスファーピペットを用いて、等量の温めた培地をＣＬＬサンプルのクライオバイアル（約１ｍＬ）に滴下する。同じトランスファーピペットを使用して、クライオバイアルからサンプルを取り出し、準備した５０ｍＬコニカルチューブに滴下する。追加の１〜２ｍＬのＣＭ２でチューブを洗浄し、５０ｍＬのコニカルチューブに移す。容量を１５ｍＬにし、サンプルを穏やかに渦巻かせて細胞を十分にすすぎ、次にサンプルを高速遠心分離機で、室温で５分間、４００ｘｇ遠心して細胞ペレットを収集する。ＢＳＣにサンプルを戻し、細胞ペレットを乱さないように注意しながら、ペレットから上清を吸引除去する。チューブに蓋をして、粗い表面（チューブラックなど）に沿ってそれをこすり、細胞ペレットを分解する。１ｍＬのピペッターとチップを使用して、新しい１ｍＬのＣＭ２を細胞ペレットに添加し、細胞を５〜１０回上下に穏やかに吸引して細胞ペレットを分解する。細胞懸濁液にＣＭ２を更に３〜５ｍＬ添加する。サンプルをよく混合するために数回上下にピペッティングする。細胞懸濁液の容量を記録する。計数をするために、チューブから代表的な量の細胞懸濁液をチューブから取り出す（例えば、１００μＬ）。Nexcelom Cellometer K2などの自動セルカウンターを使用して、適切な手順で細胞を計数する。サンプル中の生細胞の総数を測定する。フェノタイピング及び他の実験のために少なくとも５ｘ１０６細胞を保存する。保存されたサンプルを４００ｘｇ、５分間室温で遠心した。保存されたサンプルの１つ又は２つのアリコートを冷凍培地（２０％ＤＭＳＯを含む滅菌熱不活化ウシ胎仔血清）で凍結する。−８０℃の冷凍庫に入れられたMr.Frosty細胞凍結容器の細胞サンプルを緩慢凍結する。−８０℃で最低２４時間後、ＬＮ２保管庫に移す。
【０４７５】
[00520]  分離の工程を進めるには、事前に冷却した溶液を使用し、細胞を低温に保ちながら迅速に作業をする。Pan T-cell Isolation Kit（Miltenyi、カタログ番号１３０−０９６−５３５）を使用してＣＬＬサンプルのＴ細胞分画を精製する。手順開始前に洗浄緩衝液を調製する。洗浄緩衝液：リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．２、０．５％ウシ血清アルブミン及び２ｍＭ  ＥＤＴＡを含む。ｐＨを読み取り、必要に応じて調製する。滅菌フィルター；４℃で保存する。細胞ペレットを収集するために、サンプルを４００ｘｇ、５分間遠心する。培地上清を吸引除去し、細胞総数１０７ごとに細胞ペレットを４０μＬの洗浄緩衝液に再懸濁する。細胞総数１０７ごとに１０μＬのPanT細胞ビオチン抗体カクテルを添加する。サンプルをよく混合し、冷蔵庫又は氷上で５分間インキュベートする。細胞総数１０７ごとに、サンプルに３０μＬの洗浄緩衝液を添加する。細胞総数１０７ごとに２０μＬのPanT細胞マイクロビーズカクテルを添加する。よく混合し、冷蔵庫又は氷上で１０分間インキュベートする。磁気細胞分離に進む。この手順では、ＬＳカラムとQuadroMACS磁石を使用する。各ＬＳカラムの最大容量は、細胞総数２ｘ１０９である。使用するＬＳカラムを準備する。次の工程に進む前に、常にカラムリザーバーが空になるまで待つ。QuadroMACS磁石の磁場中にＬＳカラムを置く。ＬＳカラムを３ｍＬの調製された冷たい洗浄緩衝液で洗浄する。１５ｍＬコニカルチューブに洗浄液を収集する。洗浄液を廃棄する。ＬＳカラムの下に「Ｔ細胞分画」というラベル付きの新しいチューブを置く。細胞懸濁液をカラムに充填する。未標識細胞を含むフロースルーを収集する−これは濃縮Ｔ細胞分画である。３ｍＬの洗浄緩衝液でカラムを洗浄する。カラムを洗浄する未標識の細胞を同じ１５ｍＬコニカル「Ｔ細胞分画」チューブに収集する。チューブに蓋をし、氷上に置く。QuadroMACS磁石からＬＳカラムを取り外し、「非Ｔ細胞分画」というラベル付きの新しい１５ｍＬコニカルチューブに配置する。５ｍＬの洗浄緩衝液をカラムにピペットで移し、プランジャー（ＬＳカラムに付属）をカラムにしっかりと押し込んで、磁気標識された非Ｔ細胞をすぐに洗い流す。「Ｔ細胞分画」及び「非Ｔ細胞分画」の両方のチューブを遠心分離機に入れ、４００ｘｇで５分間遠心し細胞ペレットを収集する。両方のサンプルから上清を吸引除去し、チューブにキャップを付け、粗い表面に沿ってチューブをこすり付けることにより各ペレットを再懸濁する。１ｍＬのピペッター及びチップを使用して、３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２を補充した１ｍＬのＣＭ２培地を各ペレットに添加する。ペレットを更に細かく分解するために、５〜１０回上下に穏やかにピペッティングして、各ペレットを再懸濁する。各サンプルに１〜２ｍＬの新鮮な培地を加え、各サンプルをよく混合する。各サンプルから少量の代表的なアリコート（例えば、５０μＬ）を取り出す。細胞サンプルを組織培養インキュベーターに入れ、キャップを緩める。細胞を計数し、カウント及び生存率を記録する。Dynabeads（商標）Human T-Expander ＣＤ３／ＣＤ２８を少量使用するために調製する。ボルテックスミキサーで、中速で３０秒間、ＣＤ３／ＣＤ２８ Dynabeadsのストックバイアルをボルテックスする。必要なアリコートのビーズをストックバイアルから滅菌１．５ｍＬマイクロチューブに取り出す。ビーズを含む１．５ｍＬマイクロチューブに１ｍＬの洗浄液を追加して、ビーズ洗浄液でビーズを洗浄する。チューブを軽くたたいて、サンプルを混合する。ビーズを含むチューブをDynaMag（商標）-2磁石の上に置き、ビーズが磁石に引き寄せられている間、チューブを３０秒間静置する。DynaMag磁石の反対側のマイクロチューブ側面から洗浄液を吸引除去する。磁石からマイクロチューブを取り外し、チューブラックに置く。１ｍＬのピペッター及びチップを使用して、ビーズにＩＬ−２が補充された１ｍｌのＣＭ２を追加する。「ビーズ、５００，０００／ｍＬ」というラベル付きの新しい１５ｍＬ（又は５０ｍＬ）コニカルチューブにビーズ溶液を移す。ビーズを、５００，０００ビーズ／ｍｌの濃度になる最終容量にする（例えば、１０ｘ１０６ビーズを最終容量２０ｍＬにする）。次のように、１サンプルあたり最低１ウェルとして細胞培養を設定する。十分な細胞がある場合、より多くのウェルを設定できる。G-Rex２４ウェルプレートで、１ウェルあたり合計７ｍＬで、５００，０００個のＴ細胞、５００，０００個のＣＤ３／ＣＤ２８Dynabeads（１ｍＬの５００，０００ビーズ／ｍＬ懸濁液）及び３０００ＩＵ／ｍｌ  ＩＬ−２が補充されたＣＭ２を添加する。G-Rex ２４ウェルプレートを加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れる。十分な細胞がある場合、ＲＥＰの繰り返しのため又は他の実験のために、Mr.Frosty細胞凍結容器を使用してＣＳ１０凍結保存培地でサンプルを凍結するＴ細胞分画の少量を保存する。細胞の非Ｔ細胞分画を計数し、Mr.Frosty細胞凍結容器を使用して、ＣＳ１０凍結保存培地で凍結する。
【０４７６】
[00521]  ４日目、次のように培地交換を行う。十分な量のＣＭ４（３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充）を調製して、サンプルウェルの培地の半分を交換し、水浴で３７℃に温める。G-Rex２４ウェルプレートをインキュベーターからＢＳＣに移す。各ウェルから培地の半分の量（３．５ｍＬ）を取り除く。各ウェルに等量（３．５ｍＬ）の新しい培地を添加する。G-Rex ２４ウェルプレートを加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに戻す。
【０４７７】
[00522]  ７日目、次のようにＲＥＰを使用した拡大培養が行われる。ＣＭ４（３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充）の小容量を調製し、培養ウェルの洗浄を行う。３７℃の水浴中で温める。G-Rex２４ウェルプレートをインキュベーターからＢＳＣに移す。各ウェルから培地の半分の量を取り除き、廃棄する。残りの細胞を再懸濁し、ラベル付きの滅菌した１５ｍＬコニカルチューブに移す。１ｍＬの調製したＣＭ４でよく洗浄し、洗浄液を同じ１５ｍＬコニカルチューブに移す。G-Rex ２４ウェルプレートを組織培養フードに保管する。同じプレートの未使用のウェルをＰＢＬサンプルの拡大培養に使用することがきでる。代表的な細胞量を取り除き、自動セルカウンターを使用して計数する。ＰＢＬを拡大培養するために必要なウェル又は培養容器の数を測定する。総生細胞が１ｘ１０６以下である場合：G-Rex２４ウェルプレートの１つのウェルで、５００，０００ＰＢＬを使用し、工程９．１６のように７ｍＬのＣＭ４（３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充）で調製された１：１の比率のDynabeads（商標）Human T-ExpanderＣＤ３／ＣＤ２８を使用して拡大培養を設定する。バックアップ拡大培養又はフェノタイピング及び他の補助的な手順のために細胞の残りを凍結する。総生細胞が１ｘ１０６以上の場合：G-Rex ２４ウェルプレートの複製ウェルで、１ウェルあたり５００，０００ＰＢＬを使用し、工程９．１６のように最終容量７ｍｌ／ウェルＣＭ４（３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充）で調製された１：１の比率のDynabeads（商標）Human T-ExpanderＣＤ３／ＣＤ２８を使用して拡大培養を設定する。又は、余分なサンプルを使用して、G-Rex１０Ｍ培養フラスコで１フラスコあたり１０〜１５ｘ１０６ＰＢＬを使用し、工程９．１６のように最終容量１００ｍｌ／ウェルＣＭ４（３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充）で調製された１：１の比率のDynabeads（商標）Human T-ExpanderＣＤ３／ＣＤ２８を使用して拡大培養を設定する。−８０℃のMr.Frosty細胞凍結容器に入れられたラベル付きのクライオバイアル内の７日目の余分なＰＢＬサンプルを緩慢凍結する。−８０℃で最低２４時間後、ＬＮ２保管庫に移す。これらのサンプルは、拡大培養又はフェノタイピング及び他の補助的な手順のバックアップサンプルとして使用することができる。（７日目に保管することが推奨されるセルの最小数：２ｘ１０６〜５ｘ１０６。） 培養プレート又はフラスコを加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れる。
【０４７８】
[00523]  １１日目、次のように培地交換を行う。十分な量のＣＭ４（３０００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２を補充）を調製して、各培養ウェル又は容器の半分の量を交換し、３７℃の水浴で保温する。培養容器をインキュベーターからＢＳＣへ移す。各ウェル又はフラスコから培地の半分の量を取り除き、廃棄する。各培養ウェル又はフラスコに等量を添加する。培養容器を加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに戻す。
【０４７９】
[00524]  １４日目、次のようにＲＥＰ回収が行われる。３７℃の水浴中で少容量のＡＩＭ Ｖ培地を温め、次の工程の洗浄に使用する。サンプルを回収する準備が整ったら、ＢＳＣに移す。培養容器をインキュベーターからＢＳＣへ移す。培養液がG-Rex２４ウェルプレートにある場合、各ウェルから約半分の量を取り除き、廃棄する。より大規模培養の場合、次の段落の「ＲＥＰが完了した」工程に進む。血清ピペットを使用しサンプルを混合し、細胞をラベル付きの滅菌した１５ｍＬコニカルチューブに移す。１〜２ｍＬの新鮮な温めた培地でウェルを洗浄する。１５ｍＬのコニカルチューブに蓋をし、DynaMag（商標）-15磁石に入れる。磁気ビーズが磁石に引き寄せられるように、サンプルを磁石に１分間置く。５ｍＬの血清ピペットを使用し、細胞懸濁液を新しいラベル付きの１５ｍＬコニカルチューブに移す。磁石から最初の１５ｍＬチューブを取り外し、最低２ｍＬの新しいＡＩＭ Ｖでビーズを洗浄する。チューブを磁石に戻し、１分間放置する。５ｍＬの血清ピペットを使用し、２番目のラベル付き１５ｍＬコニカルチューブに洗浄培地を移す。１サンプルあたり複数のウェルで調整した場合、ビーズ洗浄後、同じ条件の全てのウェルを混合することができる。培養液がG-Rex１０Ｍフラスコ内にある場合、吸引により容量を合計約１０ｍＬに減らす。１０ｍＬの血清ピペットを使用しサンプルを混合し、細胞をラベル付きの滅菌した１５ｍＬコニカルチューブに移す。２ｍＬの新鮮な温めた培地でフラスコを洗浄する。１５ｍＬのコニカルチューブに蓋をし、DynaMag（商標）-15磁石に入れる。磁気ビーズが磁石に引き寄せられるように、サンプルを磁石に１分間置く。５ｍＬの血清ピペットを使用し、細胞懸濁液を新しいラベル付きの１５ｍＬコニカルチューブに移す。磁石から最初の１５ｍＬチューブを取り外し、最低２ｍＬの新しいＡＩＭ Ｖでビーズを洗浄する。チューブを磁石に戻し、１分間放置する。５ｍＬの血清ピペットを使用し、２番目のラベル付き１５ｍＬコニカルチューブに洗浄培地を移す。１サンプルあたり複数のフラスコで調製した場合、ビーズ洗浄後、全てを混合することができる。細胞が非常に密になっているように見える場合、余分に予備加温したＡＩＭ Ｖ培地を培養液に添加できる。代表的な細胞量を取り除き、自動セルカウンターを使用して計数する。細胞数及び生存率を記録する。細胞を計数する間、キャップを緩めた細胞を含むチューブを加湿した３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れる。
【０４８０】
[00525]  この時点で、ＲＥＰは完了する。ＰＢＬのポストＲＥＰの試験は、新鮮なサンプル又は凍結したサンプルで行うことができる。ＣＳ１０凍結保存培地のＰＢＬサンプルを凍結するか、必要に応じて患者への送達のために代替製剤で調製する。フローサイトメトリー及び共培養アッセイによるフェノタイピングには、より低い濃度の細胞（例えば、５ｘ１０６細胞／バイアル）を使用できるため、６〜１０個のバイアルを低濃度で、残りを高濃度で保存することを勧める（３０〜５０ｘ１０６細胞／バイアル）。前述の手順は、当業者に明らかであるように、規制遵守のために必要に応じて（米国食品医薬品局及び他の規制当局が採用した、製造管理及び品質管理の基準及び調和国際会議ガイダンスを満たすことを含む）、スケーリング、調整又は最適化及び適合させ得る。
【０４８１】
[00526]  上記に示す例は、本発明の組成物、システム及び方法の実施形態をどのように作製及び使用し得るかについて当業者に完全な開示及び説明を付与するために提供され、本発明者らがその発明と見なすものの範囲を限定することを意図されない。当業者に明らかな本発明を実施するための上述の態様の変形形態は、以下の特許請求の範囲内にあることが意図される。本明細書において言及される全ての特許及び刊行物は、本発明が関係する技術分野の当業者の技能水準の指標である。
【０４８２】
[00527]  全ての見出し及びセクション表示は、明確にするために、且つあくまでも参考として使用され、決して限定するものと考えられてはならない。例えば、当業者は、異なる見出し及びセクションからの様々な態様を、本明細書に記載される本発明の趣旨及び範囲に従って適宜組み合わせることの有用性を理解するであろう。
【０４８３】
[00528]  本明細書に引用する全ての参考文献は、各個別の刊行物、又は特許、又は特許出願があらゆる目的のために全体として参照により組み込まれると具体的且つ個別的に指示されたものと見なすのと同程度に、本明細書によって全体として及びあらゆる目的のために参照により本明細書に組み込まれる。
【０４８４】
[00529]  当業者に明らかであろう通り、本願の多くの改良形態及び変形形態は、その趣旨及び範囲から逸脱することなくなされ得る。本明細書に記載される具体的な実施形態及び例は、単に例として提供され、本願は、特許請求の範囲に認められる均等物の全範囲と共に、添付の特許請求の範囲の用語によってのみ限定されるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１６Ｃ】
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【図１６Ｄ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２０Ｃ】
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【図２０Ｄ】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５Ａ】
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【図２５Ｂ】
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【図２５Ｃ】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図２９Ｄ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３０Ｄ】
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【図３１Ａ】
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【図３１Ｂ】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３Ａ】
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【図３３Ｂ】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５Ａ】
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【図３５Ｂ】
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【図３６Ａ】
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【図３６Ｂ】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３８Ｄ】
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【図３８Ｅ】
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【図３８Ｆ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図３９Ｃ】
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【図３９Ｄ】
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【図４０Ａ】
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【図４０Ｂ】
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【図４０Ｃ】
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【図４０Ｄ】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４２Ｃ】
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【図４２Ｄ】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４Ａ】
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【図４４Ｂ】
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【図４５Ａ】
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【図４５Ｂ】
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【図４６Ａ】
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【図４６Ｂ】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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