(57)【要約】多能性幹細胞の混入細胞において差次的に発現されていることが知られているmiRNAなどのノンコーディングRNAの集合体に対して、多能性幹細胞由来の細胞集団の試料を測定することで、細胞療法において使用するための多能性幹細胞由来の細胞集団における多能性幹細胞の混入細胞の有無及び細胞数を決定する方法であって、それによって、１００万細胞数のバックグラウンドにおいて１０細胞数以下及び５細胞数以下で残存・混入した多能性幹細胞数という、多能性幹細胞由来の細胞集団又は試料が、細胞療法において使用するために必要とされる安全性を満たすことが特定されうるような細胞数で、残存多能性幹細胞の混入を検出する方法。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
別用途のための多能性幹細胞由来の細胞集団における多能性幹細胞の混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数の決定のための方法であって、多能性幹細胞の混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAに対して、多能性幹細胞由来の前記細胞集団の試料を測定することを含む方法。
【請求項２】
１つの又は集合体を形成する２つ以上の前記した所定のノンコーディングRNAが、多能性幹細胞由来の細胞試料における多能性幹細胞の混入細胞に対するバイオマーカーである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ノンコーディングRNAがマイクロRNA(miRNA)である、請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
混入の有無及び/又は細胞数の前記決定が所定の混入細胞数に対してなされた、請求項１から３のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項５】
多能性幹細胞の混入細胞を既知の又は所定の細胞数に播種させた又は添加させた細胞の陽性コントロールに対して、多能性幹細胞由来の前記細胞集団の試料における多能性幹細胞の混入細胞数を決定することを含む方法であって、請求項１から４のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項６】
前記陽性コントロールが１００万細胞数あたり１０細胞数の細胞数で多能性幹細胞の混入細胞を播種させた又は添加させた細胞試料を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記陽性コントロールが、多能性幹細胞の混入細胞に対して好ましくない条件下において増殖させ又は継代させ、その次に多能性幹細胞の混入細胞を所定の細胞数に播種させた又は添加させた、多能性幹細胞由来の細胞試料を含む、請求項５又は請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記陽性コントロールを備えた多能性幹細胞由来の前記細胞集団の試料を測定することを含む方法であって、請求項５から７のうちいずれか１つに記載の方法。
【請求項９】
前記したノンコーディングRNAの集合体が２つから６つのノンコーディングRNAを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
１つの又はそれ以上の前記ノンコーディングRNAが、多能性幹細胞の混入細胞に特異的なノンコーディングRNAとして特定された及び実証された、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
１つの又はそれ以上の前記ノンコーディングRNAが、所定の混入細胞数における混入細胞の検出を可能にする検出感度を、使用された測定過程において有することが実証された、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
１つの又は集合体を形成する２つ以上の前記した所定のノンコーディングRNAが、下記するmiRNAから選択される１つの又はそれ以上のmiRNAを含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法：hsa-miR-367-3p, hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-302c-3p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-302a-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-663a, hsa-miR-1323, hsa-miR-373-3p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-96-5p, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-372-3p, hsa-miR-302c-5p, hsa-miR-124-3p, hsa-miR-517a-3p, hsa-miR-517b-3p, hsa-miR-150-3p, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-205-3p, hsa-miR-498, hsa-miR-371a-5p, hsa-miR-3149, hsa-miR-630, hsa-miR-371a-3p, hsa-miR-183-5p, hsa-miR-3692-5p, hsa-miR-32-3p, hsa-miR-34b-3p, hsa-miR-4327, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-519d-3p, hsa-miR-629-3p, hsa-miR-3141, hsa-miR-518b, hsa-miR-515-3p, hsa-miR-516b-5p及びhsa-miR-519b-3p。
【請求項１３】
１つの又は集合体を形成する２つ以上の前記した所定のノンコーディングRNAが、下記するmiRNAから選択される１つの又はそれ以上のmiRNAを含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法：hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-302c-3p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-367-3p, hsa-miR-371a-3p, hsa-miR-372-3p, hsa-miR-373-3p, hsa-miR-373-3p, hsa-miR-512-3p及びhsa-miR-520c-3p。
【請求項１４】
１つの又は集合体を形成する２つ以上の前記した所定のノンコーディングRNAが、下記するmiRNAから選択される１つの又はそれ以上のmiRNAを含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法：hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-302c-3p, hsa-miR-302d-3p及びhsa-miR-367-3p。
【請求項１５】
１つの又は集合体を形成する２つ以上の前記した所定のノンコーディングRNAが、下記するmiRNAから選択される１つの又はそれ以上のmiRNAを含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法：hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-302c-3p及びhsa-miR-302d-3p。
【請求項１６】
１つの又は集合体を形成する２つ以上の前記した所定のノンコーディングRNAがmiRNAのhsa-miR-302d-3pを含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
多能性幹細胞由来の前記細胞集団と多能性幹細胞の前記混入細胞との間に非特異的に又は非差次的に発現されている、１つの又はそれ以上の内因性ノンコーディングRNAに対する、多能性幹細胞由来の前記細胞集団の試料を、標準的な若しくは対照的な方法によって測定することをさらに含む方法であって、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記内因性ノンコーディングRNAがmiRNAである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記内因性ノンコーディングRNAがhsa-miR-107及びhsa-miR-130a-3pから選択されるmiRNAである、請求項１６又は請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
多能性幹細胞の混入細胞が混入していない細胞試料を含む陰性コントロールを備える多能性幹細胞由来の前記細胞集団の試料を測定することを含む方法であって、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
多能性幹細胞の混入細胞が混入していない前記細胞試料が、多能性幹細胞由来の前記細胞集団と分化状態及び/又は表現型が同じである細胞試料を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
多能性幹細胞の混入細胞が混入していない前記細胞試料が、多能性幹細胞由来の前記細胞集団の細胞源とは異なる細胞源の多能性細胞に由来する、請求項２０又は請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAに対する陽性コントロールを任意に備える、多能性幹細胞由来の前記細胞集団の試料を測定する段階が、以下の内容を含む、並びに、内因性コントロールが以下の内容を任意に含む、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法：
１つの又は集合体を形成する２つ以上の前記した所定のノンコーディングRNAの濃度を測定するための、前記試料及び任意の陽性コントロールの処理及び分析が、以下の内容を含む、並びに、内因性コントロールが以下の内容を任意に含む；
任意の陽性コントロール中に前記濃度を備える試料において、１つの又は集合体を形成する２つ以上の前記した所定のノンコーディングRNAの濃度を任意に比較することが、以下の内容を含む；及び
前記試料中の多能性幹細胞の混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数を、前記内容から決定すること。
【請求項２４】
前記した処理及び分析が、前記ノンコーディングRNAの塩基配列の少なくとも一部に対して、実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するプライマー及び/又はプローブを用いて、前記ノンコーディングRNAを検出することを含む、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記した処理及び分析の段階が、定量RT-PCR、デジタルPCR、ドロップレットデジタルPCR、シークエンシング、Luminex法による核酸増幅法、又は他のハイブリダイゼーションに基づく技術を含む、請求項２３又は請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記した処理及び分析の段階がドロップレットデジタルPCR(ddPCR)を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
多能性幹細胞の混入細胞の混入細胞数が、前記試料において１００万細胞数あたり１０細胞数以下の多能性幹細胞の混入細胞という基準を満たすか否かを決定するために構成されている、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
１００万細胞数あたり１０細胞数という細胞数に多能性幹細胞の混入細胞を播種させた又は添加させた細胞を含む陽性コントロールとの比較によって、多能性幹細胞の混入細胞数の決定に至る、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料中のノンコーディングRNAの濃度が、前記陽性コントロール中のノンコーディングRNAの濃度に満たない及びその測定誤差の許容限界の範囲外であると測定される場合、決定される多能性幹細胞の混入細胞の混入細胞数が、前記試料において１００万細胞数あたり１０細胞数以下の多能性幹細胞の混入細胞と判断される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記別用途が細胞療法を目的とする、請求項１〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
多能性幹細胞由来の前記細胞が間葉系幹細胞(MSC)である、請求項１〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記多能性幹細胞が人工多能性幹細胞(iPSC)である、請求項１〜３１のいずれか１項に記載のの方法。
【請求項３３】
多能性幹細胞の前記混入細胞が１つの又はそれ以上の未分化な多能性幹細胞及び不完全に分化した多能性幹細胞を含む、請求項１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記陽性コントロールが、１００万細胞数あたり１細胞数、１００万細胞数あたり５細胞数、及び/又は１００万細胞数あたり１０細胞数の細胞数で多能性幹細胞の混入細胞を播種させた又は添加させた細胞試料を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項３５】
多能性幹細胞の混入細胞の混入細胞数が、前記試料において１００万細胞数あたり５細胞数以下の多能性幹細胞の混入細胞数という基準を満たすか否かを決定するために構成されている、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
１００万細胞数あたり１細胞数、１００万細胞数あたり５細胞数、及び/又は１００万細胞数あたり１０細胞数という細胞数に多能性幹細胞の混入細胞を播種させた又は添加させた細胞を含む陽性コントロールとの比較によって、混入細胞数の決定に至る、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記試料中のノンコーディングRNAの濃度が、前記陽性コントロール中のノンコーディングRNAの濃度に満たない及びその測定誤差の許容限界の範囲外であると測定される場合、決定される多能性幹細胞の混入細胞の混入細胞数が、前記試料において１００万細胞数あたり５細胞数以下の多能性幹細胞の混入細胞と判断される、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
請求項１から３７のうちいずれか１つにおいて定義された、多能性幹細胞由来の細胞集団の多能性幹細胞の混入細胞の混入を決定するための前記方法を実施すること、並びに、多能性幹細胞の混入が全くない又は許容可能な混入細胞数との決定に基づいて、別用途のための多能性幹細胞由来の前記細胞集団を公開すること、を含む方法であって、多能性幹細胞由来の細胞集団のロット公開の方法。
【請求項３９】
許容可能な多能性幹細胞の混入細胞数が、多能性幹細胞由来の前記細胞集団の試料において１００万細胞数あたり１０細胞数以下の多能性幹細胞の混入細胞である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
多能性幹細胞の混入細胞において差次的に発現されていることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAを対象とした、ノンコーディングRNAの発現データ又は発現プロファイルの、別用途のための多能性幹細胞由来の細胞集団における多能性幹細胞の混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数を決定することを目的とする使用。
【請求項４１】
前記ノンコーディングRNAの集合体が２つから６つのノンコーディングRNAを含む、請求項４０に記載の使用。
【請求項４２】
前記した１つの又はそれ以上のノンコーディングRNAが、人工多能性幹細胞の混入細胞に特異的なノンコーディングRNAとして特定された及び実証された、請求項４０又は請求項４１に記載の使用。
【請求項４３】
前記した１つの又はそれ以上のノンコーディングRNAが、所定の混入細胞数における混入の検出を可能にする検出感度を、使用された測定過程において有することが実証された、請求項４２に記載の使用。
【請求項４４】
前記した１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAが、下記するmiRNAから選択される１つの又はそれ以上のmiRNAを含む、請求項４０から４３のうちいずれか１つに記載の使用：hsa-miR-367-3p, hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-302c-3p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-302a-5p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-663a, hsa-miR-1323, hsa-miR-373-3p, hsa-miR-363-3p, hsa-miR-205-5p, hsa-miR-96-5p, hsa-miR-512-3p, hsa-miR-372-3p, hsa-miR-302c-5p, hsa-miR-124-3p, hsa-miR-517a-3p, hsa-miR-517b-3p, hsa-miR-150-3p, hsa-miR-520c-3p, hsa-miR-205-3p, hsa-miR-498, hsa-miR-371a-5p, hsa-miR-3149, hsa-miR-630, hsa-miR-371a-3p, hsa-miR-183-5p, hsa-miR-3692-5p, hsa-miR-32-3p, hsa-miR-34b-3p, hsa-miR-4327, hsa-miR-525-5p, hsa-miR-519d-3p, hsa-miR-629-3p, hsa-miR-3141, hsa-miR-518b, hsa-miR-515-3p, hsa-miR-516b-5p及びhsa-miR-519b-3p。
【請求項４５】
前記した１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAが、下記するmiRNAから選択される１つの又はそれ以上のmiRNAを含む、請求項４０から４４のうちいずれか１つに記載の使用：hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-302c-3p, hsa-miR-302d-3p, hsa-miR-367-3p, hsa-miR-371a-3p, hsa-miR-372-3p, hsa-miR-373-3p, hsa-miR-373-3p, hsa-miR-512-3p及びhsa-miR-520c-3p。
【請求項４６】
前記した１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAが、下記するmiRNAから選択される１つの又はそれ以上のmiRNAを含む、請求項４０から４５のうちいずれか１つに記載の使用：hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-302c-3p, hsa-miR-302d-3p及びhsa-miR-367-3p。
【請求項４７】
前記した１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAが、下記するmiRNAから選択される１つの又はそれ以上のmiRNAを含む、請求項４０から４６のうちいずれか１つに記載の使用：hsa-miR-302a-3p, hsa-miR-302b-3p, hsa-miR-302c-3p 及びhsa-miR-302d-3p。
【請求項４８】
前記した１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAがmiRNAのhsa-miR-302b-3pを含む、請求項４０から４７のうちいずれか１つに記載の使用。
【請求項４９】
多能性幹細胞の混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAを対象とした、及び、多能性幹細胞の混入細胞において非特異的に又は非差次的に発現されている、１つの又はそれ以上の内因性ノンコーディングRNAを対象とした、ノンコーディングRNAの発現データ又は発現プロファイルの、別用途のための多能性幹細胞由来の細胞集団における多能性幹細胞の混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数を決定することを目的とする使用であって、請求項４０から４８のうちいずれか１つに記載の使用。
【請求項５０】
前記内因性ノンコーディングRNAがmiRNAである、請求項４９に記載の使用。
【請求項５１】
前記内因性ノンコーディングRNAがhsa-miR-107及びhsa-miR-130a-3pから選択されるmiRNAである、請求項４９又は請求項５０に記載の使用。
【請求項５２】
別用途のための多能性幹細胞由来の細胞集団における多能性幹細胞の混入細胞の混入細胞数が、１００万細胞数あたり１０細胞数以下の多能性幹細胞の混入細胞であると、多能性幹細胞由来の前記細胞集団から決定することができる、請求項４０から５１のうちいずれか１つに記載の使用。
【請求項５３】
別用途のための多能性幹細胞由来の細胞集団における多能性幹細胞の混入細胞の混入細胞数が、１００万細胞数あたり５細胞数以下の多能性幹細胞の混入細胞であると、多能性幹細胞由来の前記細胞集団から決定することができる、請求項４０から５１のうちいずれか１つに記載の使用。
【請求項５４】
前記したノンコーディングRNAの発現データ又は発現プロファイルが、ドロップレットデジタルPCRにより決定される、請求項４０から５３のうちいずれか１つに記載の使用。
【請求項５５】
請求項１から３９のうちいずれか１つの前記方法における、請求項４０から５４のうちいずれか１つに記載の使用。
【請求項５６】
多能性幹細胞の混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、所定のノンコーディングRNAに特徴的であるヌクレオチド配列を各々含む、１つ又は２つ以上のPCRプライマーを含むキットであって、多能性幹細胞由来の細胞試料中の対応する１つの又は２つ以上のノンコーディングRNAの濃度又は発現量の定量的な決定に使用するためのキット。
【請求項５７】
前記ノンコーディングRNAが、請求項４０から４８のうちいずれか１つにおいて定義された、いずれか１つ又はそれ以上のノンコーディングRNAである、請求項５６に記載のキット。
【請求項５８】
多能性幹細胞由来の細胞集団において多能性幹細胞の混入細胞の混入を検出するための方法であって、多能性幹細胞の混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、標的のノンコーディングRNAに対して相補的なヌクレオチドを含み、多能性幹細胞由来の前記細胞集団の試料から抽出されたノンコーディングRNA由来である、cDNA分子の濃度を増幅すること及び測定することを含む方法。
【請求項５９】
別用途のための多能性幹細胞由来の細胞集団における多能性幹細胞の混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数を決定するための、請求項１から３９のうちいずれか１つに記載の方法であって、ノンコーディングRNAのバイオマーカーに、好ましくはmiRNAのバイオマーカーに、依存しない異なる測定方法によって、多能性幹細胞の混入細胞の混入に対する多能性幹細胞由来の前記細胞を測定することをさらに含む方法。
【請求項６０】
細胞療法において使用するための多能性幹細胞由来の細胞集団であって、請求項１から３９のうちいずれか１つの前記方法によって決定された、１００万細胞数あたり１０細胞数以下の多能性幹細胞の混入細胞を含む、前記細胞集団。
【請求項６１】
細胞療法において使用するための多能性幹細胞由来の細胞集団であって、請求項１から３９のうちいずれか１つの前記方法によって決定された、１００万細胞数あたり５細胞数以下の多能性幹細胞の混入細胞を含む、前記細胞集団。
【請求項６２】
細胞療法において使用するための多能性幹細胞由来の細胞集団を製造する方法であって、以下の内容を含む方法：
多能性幹細胞由来の細胞集団を提供するために、多能性幹細胞(PSC)のPSC由来細胞への分化を誘発すること；
多能性幹細胞由来の前記細胞集団の試料を採取すること
前記細胞試料中の多能性幹細胞の混入細胞の有無及び細胞数を決定するために、前記試料を請求項１から３９のうちいずれか１つの前記方法で測定すること
多能性幹細胞の混入細胞の有無及び細胞数が、所定の混入細胞数に等しい又はそれ未満であるとの決定に基づき、細胞療法に適した又は入手可能な多能性幹細胞由来の前記細胞集団を特徴づけること；及び
多能性幹細胞由来の前記細胞をそれを必要とする患者に対して任意に投与すること。
【請求項６３】
前記した所定の混入細胞数が前記試料において１００万細胞数あたり１０細胞数の多能性幹細胞の混入細胞である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記した所定の混入細胞数が前記試料において１００万細胞数あたり５細胞数の多能性幹細胞の混入細胞である、請求項６２に記載の方法。
【請求項６５】
多能性幹細胞由来の細胞を用いる細胞療法によってそれを必要性とする患者を治療する方法であって、請求項６２、請求項６３、又は請求項６４の前記方法に従い、細胞療法において使用するための多能性幹細胞由来の細胞集団を製造することを含む方法であって、前記患者に対して多能性幹細胞由来の前記細胞集団の少なくとも一部を投与することをさらに含む方法。
【請求項６６】
多能性幹細胞を利用した細胞療法によって生じる奇形腫の危険性を低減させるための方法であって、請求項６５の前記方法に従い、前記細胞療法において使用するための多能性幹細胞由来の幹細胞集団を製造すること、並びに、前記細胞集団の少なくとも一部をそれを必要とする患者に対して投与すること、を含む方法。
【請求項６７】
多能性幹細胞の混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAを対象とする、ノンコーディングRNAの発現データ又は発現プロファイルの、多能性幹細胞由来の細胞療法における奇形腫の危険性を低減させることを目的とする使用。
【請求項６８】
多能性幹細胞の混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、少なくとも１つ又は２つ以上の所定のノンコーディングRNAを検出するための１組のポリヌクレオチド、及び、多能性幹細胞由来の細胞集団から採取した試料から抽出されたRNA、若しくは、多能性幹細胞由来の細胞集団から採取した試料から抽出されたRNAから逆転写されたcDNA、を含む方式。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は一般的に細胞混入及び細胞療法に関する。より詳細には、本発明は、細胞集団中の細胞混入の決定、このような決定において使用するための測定法、このような測定法において使用するためのキット、細胞集団、及び、このような細胞集団を使用する治療法、に関する。
【背景技術】
【０００２】
幹細胞を利用した治療法は多くのヒト疾患の効果的な治療として多大な期待が寄せられている。幹細胞は、成体幹細胞、及び、多能性幹細胞(PSC)を利用した細胞療法製品に、主に分類することができる。PSCは、ヒトの生体内において全種類の細胞へと分化することができ、幹細胞を利用した細胞療法の基礎として再生可能な細胞源を提供する、幹細胞である。
【０００３】
当該細胞療法の分野が発達するにつれて、PSCは、幹細胞を利用した細胞療法による治療を生み出す代表的な方法に益々なりつつあり、胚性幹細胞(ESC)又は人工多能性幹細胞(iPSC)でありうる。臨床試験においてPSCを利用した細胞療法製品の数はここ数年にわたり急速に増え続けており、この状況は続くものと推測されている。
【０００４】
PSCを利用した細胞療法製品に共通の課題として、幹細胞を利用した細胞製品内に残存した未分化なPSCが、奇形腫や他の腫瘍を生じさせうる点が挙げられ、このような治療法にとって重大な安全上の問題となっている。このように、これらの治療法を応用する上での重要な安全上の障害となっているのが、最終的な臨床製品内に残存・混入したPSCの細胞数を実証し、定量的に評価することができるための、必要な条件が制限されている点である。これはPSCを利用した細胞療法の進歩にとって重要な課題となっている。
【０００５】
今のところ、未分化なPSCの混入細胞数を評価するための確立された簡易な手段は存在しない。この問題に対処するための現段階における選択肢やアプローチは、時間を消費し、必要とされる感度を欠き、コストのかかるin vitro又はin vivoによる測定法であるため、日常の品質管理(QC)試験には一般的には適していない。特に、日常のQC試験やロット公開に適した、簡易で迅速な測定法のプラットフォームが、現時点では構築されていない。
【０００６】
日常のQC試験及びロット公開に適した、簡易で、高感度で、定量的な測定法が入手可能であることは、PSCを利用した治療法の臨床的な発展の継続的な成功にとって重要である。
【０００７】
マイクロRNA(miRNA)とは長さが約２１から２３ヌクレオチドの１本鎖ノンコーディングRNA分子である。miRNAは、特定の「標的」遺伝子産物を対象とすることで、mRNA転写産物に対するハイブリダイゼーションを介して、細胞内の遺伝子発現を調節しており、結果として、翻訳の抑制や転写産物の分解を生じさせる。細胞内において、１本鎖miRNAは複数の遺伝子(最大１０００まで)を調節することができ、各遺伝子は複数のmiRNAによって調節されうる。今のところ、２５８８のヒトmiRNAが知られており、これらは全ヒト遺伝子の最大６０％までを制御する調節ネットワークを形成すると推定されている。これらの低分子の調節因子は、複数の本質的な生物学的過程において、重要な役割を担っている。
【０００８】
本発明者は、マイクロRNA(miRNA)の発現又はプロファイルのデータを、簡易で高感度で定量的な測定法において、PSC由来細胞集団中のPSCの混入細胞数を決定するために使用することができるということを、特定した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００９】
細胞療法において使用するためのPSC由来の細胞集団中のPSCの混入を、検出する又は決定する上での改善が求められている。
【００１０】
本発明の目的は、細胞療法において使用するためのPSC由来の細胞集団中のPSCの混入を、検出する又は決定するための方法を、提供することにある。
【００１１】
本発明のさらなる目的は、細胞療法において使用するためのPSC由来の細胞集団における品質管理又はロット公開のための方法を、提供することにある。
【００１２】
さらなる目的は、細胞療法を受ける患者において奇形腫及び腫瘍が生じる危険性を低減する、細胞集団及び細胞療法を製造する方法を、提供することにある。
【００１３】
本発明の第１の態様によれば、別用途のためのPSC由来の細胞集団中のPSCの混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数（level、レベル）を決定するための方法であって、PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAに対して、PSC由来の当該細胞集団の試料を測定することを含む方法、が提供されている。
【００１４】
本発明の第２の態様において、PSC由来の細胞集団のロット公開の方法であって、PSC由来の細胞集団中のPSCの混入細胞の混入を上記で定義されたように決定するための該方法を実施すること、並びに、混入が全くない又は許容可能な混入細胞数であるとの決定に基づいて、別用途のためのPSC由来の当該細胞集団を公開すること、を含む方法が提供されている。
【００１５】
本発明の第３の態様において、PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAに対する、ノンコーディングRNAの発現データ又は発現プロファイルの、別用途のためのPSC由来の細胞集団中のPSCの混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数を決定するための、使用が提供されている。
【００１６】
本発明の第４の態様において、PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、所定のノンコーディングRNAに特徴的なヌクレオチド配列を各々含む、１つの又は２つ以上のPCRプライマーを含むキットであって、PSC由来の細胞試料中の対応する１つ又は２つ以上のノンコーディングRNAの濃度又は発現量を定量的に決定するのに使用するためのキット、が提供されている。
【００１７】
本発明の第５の態様において、PSC由来の細胞集団における混入を検出するための方法であって、PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された標的のノンコーディングRNAに対して相補的なヌクレオチドを含み、PSC由来の当該細胞集団の試料から抽出されたノンコーディングRNA由来である、cDNA分子の濃度を増幅すること及び測定することを含む方法、が提供されている。
【００１８】
本発明の第６の態様において、PSC由来の細胞集団のロット公開の方法であって、PSC由来の細胞集団のPSCの混入細胞の混入を上記で定義されたように決定するための該方法を実施すること、並びに、混入が全くない又は許容可能な混入細胞数であるとの決定に基づいて、別用途のためのPSC由来の当該細胞集団を公開すること、を含む方法が提供されている。
【００１９】
本発明の第７の態様において、細胞療法において使用するためのPSC由来の細胞集団であって、上記の方法によって決定されるように、１００万細胞数のPSC由来細胞あたり
１０細胞数以下のPSCの混入細胞を含む集団、が提供されている。
【００２０】
本発明の第８の態様において、細胞療法において使用するためのPSC由来の細胞集団を製造する方法であって、以下の内容を含む方法、が提供されている：
PSC由来の細胞集団を提供するために、多能性幹細胞(PSC)のPSC由来細胞への分化を誘発すること；
PSC由来の当該細胞集団の試料を採取すること
当該細胞試料中のPSCの混入細胞の有無及び細胞数を決定するために、該試料を上記方法で測定すること、及び、PSCの混入細胞の有無及び細胞数が所定の混入細胞数と等しい又はそれ未満であるとの決定に基づいて、細胞療法に適する又は入手可能なようにPSC由来の当該細胞集団を特徴付けること；並びに、PSC由来の該細胞をそれを必要とする患者に任意に投与すること。
【００２１】
本発明の第９の態様において、PSC由来の細胞を用いる細胞療法によりそれを必要とする患者を治療する方法であって、細胞療法において使用するためのPSC由来の細胞集団を上記の方法に従い製造することを含む方法であって、PSC由来の当該細胞集団の少なくとも一部を該患者に対して投与することをさらに含む方法、が提供されている。
【００２２】
本発明の第１０の態様において、PSCを利用した細胞療法で生じる奇形腫の危険性を低減するための方法であって、当該細胞療法において使用するためのPSC由来の幹細胞集団を上記の方法に従い製造すること、並びに、当該細胞集団の少なくとも一部をそれを必要とする患者に対して投与すること、を含む方法、が提供されている。
【００２３】
本発明の第１１の態様において、PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAに対する、ノンコーディングRNAの発現データ又は発現プロファイルの、PSCを利用した細胞療法における奇形腫の危険性を低減するための使用、が提供されている。
【００２４】
本発明の第１２の態様において、以下の内容を含む方式が提供されている：
PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、少なくとも１つの又は２つ以上の所定のノンコーディングRNAを検出するための、１組のポリヌクレオチド、及び、PSC由来の細胞集団から採取した試料から抽出されたRNA、若しくは、PSC由来の細胞集団から採取した試料から抽出されたRNAから逆転写されたcDNA。
【発明の効果】
【００２５】
本発明の方法、使用、及び方式は、適切なロット公開、及び、詳細には、PSC由来の当該細胞集団におけるPSCの混入細胞の有無及び細胞数の測定法又は評価法、を提供することで、細胞療法におけるPSC由来の細胞集団の安全な使用を可能とし、これらに基づき、細胞療法における使用に対して決定が下されうる。詳細には、該方法は、幹細胞由来の細胞集団の残存PSC細胞の混入の検出を、１００万細胞数のバックグランドにおいて１０細胞数以下の残存・混入したPSC細胞という細胞数で、及び、１００万細胞数のバックグラウンドにおいて５細胞数以下の残存・混入したPSC細胞という細胞数で、可能とする。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
【図１】iPSC特異的miRNAの発現密度及びその特定のマイクロアレイ分析データ
【図２】iPSC特異的miRNAの差次的発現を確認したQRT-PCR分析データ
【図３】iPSC特異的miRNAの細胞特異性を確認したマイクロアレイ分析データ
【図４】iPSC添加試料を用いたiPSC特異的miRNAのQRT-PCRによる感度分析データ
【図５】10〜100細胞数のiPSC添加試料を用いたiPSC特定的miRNA集合体を備える高感度ドロップレットデジタルPCR法の検出感度評価
【図６】10細胞数のiPSC添加試料を用いたiPSC特定的miRNA集合体を備える高感度ドロップレットデジタルPCR法の検出限界評価
【図７】1〜10細胞数のiPSC添加試料を用いたiPSC特異的miRNAを備える高感度ドロップレットデジタルPCR法の検出感度評価
【発明を実施するための形態】
【００２７】
本発明は、典型的には細胞療法などの別用途のためのPSC由来の細胞集団における多能性幹細胞(PSC)の混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数を決定するための、ノンコーディングRNAの発現データ、発現量、又は発現プロファイルの使用に関する。(以下において区別しないで用いられる)当該ノンコーディングRNAの発現データ、発現量、又は発現プロファイルは、(PSC由来の細胞と比べて)PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAに対するものである。
【００２８】
このように、当該ノンコーディングRNAの発現データは、細胞療法などの別用途のためのPSC由来の細胞集団におけるPSCの混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数を決定するための方法において、使用することができる。PSC由来の当該細胞集団の試料は、PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAに対して、測定されうる。
【００２９】
該当する１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAは、PSC由来の細胞試料におけるPSCの混入細胞に対するバイオマーカーと見なされうる。
【００３０】
「ノンコーディングRNA」という用語は、miRNA(マイクロRNA)又は他のノンコーディングRNAを含みうる。「ノンコーディングRNA」という用語は、タンパク質をコードしておらず、低分子の調節RNAのクラスを一般的に包含する、RNAのことに典型的には言及している。上記で言及した他のノンコーディングRNAは、例えば、small interfering RNA (siRNA)、piwi-interacting RNA (pi RNA)、small nuclear RNA (snRNA)、small nucleolar RNA (snoRNA)、extracellular RNA (exRNA)、Small Cajal body RNA (scaRNA)、及びshort hairpin RNA (shRNA)、でありうる。他のノンコーディングRNAは、ノンコーディングRNA発現のレポーター遺伝子として機能しうる遺伝子組み換えノンコーディングRNAを、さらに含みうる。他のノンコーディングRNAはエピソームRNAであることがあり、記載された方法及び/又は使用は、プロファイルされたノンコーディングRNAの全部又は一部を構成するノンコーディングRNAを製造するために、当該エピソームDNAが転写されうる、本明細書において記載された細胞に、エピソームDNAが導入される初期段階を、必要としうる。実施形態の１つにおいて、ノンコーディングRNAという用語は、teloRNAとして知られるノンコーディングRNAを含まない。
【００３１】
miRNA(マイクロRNA)という用語は、文脈から明らかなように、miRNA分子、並びに、miRNA前駆体及び成熟RNAの一方又は両方、を含みうるが、好ましくは成熟RNAである。
【００３２】
以下のように、本発明の実施形態(及びさらなる態様)は、miRNAに対する言及によって記載されている。以下に記載された本発明の実施形態のいずれか又は全てに対して代替的である任意の実施形態では、miRNAに対する言及は、(例えば、特定のmiRNAに対して言及した場合以外における)文脈によって許容される、(上記で定義されたノンコーディングRNAなどの)ノンコーディングRNA又は他のノンコーディングRNAに対する言及の代替的な表現でありうる。
【００３３】
好ましくは、本発明は、PSC由来の細胞集団におけるPSCの混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数を、所定の混入細胞数に対して事前に定義された(及び好ましくは特徴付けられた)miRNA発現量を用いて、決定するように方向づけられる。所定の混入細胞数は、治療法などの別用途に従い、より好ましくは特定の細胞療法や必要とされる投与量に従い、選択されうる。
【００３４】
多能性幹細胞(PSC)は胚性幹細胞(ESC)又は人工多能性幹細胞(iPSC)でありうる。
【００３５】
本明細書で用いられるPSCの混入細胞とは、残存したPSCの細胞、未分化なPSC、及び不完全に分化したPSCであると判断される。不完全に分化したPSCとは、多能性幹細胞由来の当該細胞集団の特定の細胞に完全には分化していないが、多能性を有する分化段階のような、ある中間段階に位置しうる、PSCを意味する。このようなPSCの混入細胞は、未分化なPSC又はPSC由来の前駆細胞を含みうる。PSCの混入細胞は、未分化なPSCの細胞からなるものとして、任意に定義されうる。
【００３６】
本発明の方法は、PSC由来の該細胞に分化する中間段階にあるPSCや多能性細胞のような、PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上のmiRNAに対して、PSC由来の当該細胞集団の試料を測定すること又は検査することを、好ましくは含む。これは、PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上のmiRNAの発現量(又は発現パターン)を、PSC由来の当該細胞集団の試料において、決定する(又は測定する)ために実施される、過程のことを意味する。
【００３７】
当該測定法の実施対象である１つの又は集合体を形成する２つ以上のmiRNAは、「集合体」の又は「標的」のmiRNAとして、区別しないで、本明細書において言及されうる。
【００３８】
好ましくは、PSC由来の当該細胞集団におけるPSCの混入細胞の混入の有無又は細胞数を決定するために、PSC由来の当該細胞集団の試料における標的miRNAのmiRNA発現は、所定の混入細胞数と比較して、並びに/又は、バックグランドの及び/若しくはコントロールの試料と比較して、決定される。
【００３９】
所定の混入細胞数は、細胞療法などの該細胞の別用途での必要性に従い、選択されうる。例えば、相対的に低用量で投与される細胞を必要とする細胞療法の適応に対しては、許容可能な所定の混入細胞数は相対的に高くなりうる。一方で、相対的に高用量の細胞を必要とする細胞療法では、特に、例えば、奇形腫又は腫瘍の形成に対して、より感受性の高い組織に投与する場合、許容可能な所定の混入細胞数は相対的に低くなりうる。所定の混入細胞数は、PSCの混入細胞が１５０細胞数未満である、任意には１００細胞数未満である、細胞の注入量に従い、任意に決定されうる。
【００４０】
好ましくは、該当する所定の混入細胞数が、PSC由来の当該細胞集団について１００万細胞数あたり１０００細胞数未満又はそれに等しい細胞数であり、PSC由来の当該細胞集団について、より好ましくは、１００万細胞数あたり５００細胞数未満又はそれに等しい細胞数であり、さらにより好ましくは、１００万細胞数あたり１００細胞数未満又はそれに等しい細胞数であり、さらにより好ましくは、１００万細胞数あたり５０細胞数未満又はそれに等しい細胞数であり、より好ましくは、１００万細胞数あたり２０細胞数であり、最も好ましくは、１００万細胞数あたり１０細胞数未満又はそれに等しい細胞数である。該当する所定の混入細胞数が、PSC由来の当該細胞集団について、１００万細胞数あたり９細胞数、１００万細胞数あたり８細胞数、１００万細胞数あたり７細胞数、１００万細胞数あたり６細胞数、１００万細胞数あたり５細胞数、又は１００万細胞数あたり４細胞数、であることが任意にありうる。好ましくは、該当する所定の混入細胞数が、１００万細胞数あたり５細胞数であると選択される。この好ましい実施形態によれば、試料は、この所定の混入細胞数に対して測定され、PSCの混入細胞数が所定の混入細胞数以上である場合は、好ましくは５細胞数以上の場合などは、結果として不適切であると判断される。
【００４１】
好ましくは、該方法は、PSC由来の当該細胞集団の試料中の標的miRNAの発現量を測定すること、並びに、陽性コントロールに対してなされた測定結果と比較すること、を含み、当該陽性コントロールは、既知の又は所定の細胞数にPSCの混入細胞を播種させた又は添加させた細胞を含むコントロール試料において、標的miRNA発現を測定したものでありうる。当該コントロール試料における、PSCの混入細胞のこのような所定の細胞数は、上記した所定の混入細胞数のような、PSC由来の細胞におけるPSCの混入細胞の(安全であると推定される又は判断される)所定の細胞数と、好ましくは一致する。好ましい実施形態においては、当該コントロール試料におけるPSCの混入細胞数は、１００万細胞数あたり１０細胞数である。より好ましい実施形態においては、PSCの混入細胞数は、１００万細胞数あたり５細胞数である。好ましくは、当該コントロール試料中の標的miRNAの発現の測定は、PSC由来の細胞試料に対する測定と同時に実施される。
【００４２】
陽性コントロールを表す当該コントロール試料は、細胞療法などの別用途のための細胞集団の推定された安全性に対する閾値として定義されることがあり、並びに、例えば、(すなわち、細胞療法等において使用するための次の処理段階のために公開される、細胞集団のバッチ又はロットの) ロット公開に対しても、同様に定義されうる。該閾値は、望ましい最大値を表す、又は、許容可能なあらゆる測定結果が必ず該閾値未満の値を表す、と見なされうる。当該コントロール試料では、PSCの混入細胞数は、好ましくは所定の閾値と一致する。実施形態の１つにおいて、(平均値が２回以上の測定によって、例えば、少なくとも３回以上の測定によって、算出されたと仮定すると、)標的miRNA濃度を測定した平均値が、当該コントロール試料の標的miRNAを測定した平均値未満である場合、又は、その平均値以下である場合、PSC由来の細胞試料では、混入細胞数が、所定の細胞数未満である、又は、(該閾値が許容可能な細胞数であるなら、)所定の閾値未満である、と判断される。他の実施形態において、PSC由来の細胞に対する標的miRNA発現の測定結果の平均値が、(又は、代替として、このような測定結果の最頻値が、若しくは、測定結果の全てが、)信頼区間又は標準偏差などのあらゆる適切な方法によって決定される、例えば平均値とその誤差として表されうる、閾値の範囲を逸脱している場合、統計的な誤差を調整するために、PSC由来の細胞試料は閾値未満の混入細胞数であると判断されうる。好ましくは、該閾値は、混入細胞数が検出不可能である及び/又は閾値未満である試料に対して測定可能なmiRNA発現量を、該閾値と区別することができるような、値である。好ましくは、該方法は、PSC由来の細胞集団におけるPSC混入細胞の混入細胞数が、検出不可能な混入細胞数である、(上記した範囲でありうる)該閾値以下の検出可能な混入細胞数である、該閾値と等しい(若しくは該閾値の誤差限界以内である)検出可能な混入細胞数である、若しくは、該閾値を超える検出可能な混入細胞数である、という決定を提供し、又は、該決定は、測定値の平均値についての統計的な誤差と一致する範囲を任意に有しうる、個別の混入細胞数を、提供しうる。
【００４３】
好ましくは、該方法は、上記したコントロール試料を用いた陽性コントロールにより、標的miRNAに対して該試料を測定することを含む。
【００４４】
当該陽性コントロールに対するコントロール試料は、PSCの混入細胞に対して好ましくない条件下で(好ましくは残存するPSCの存在を無視できる細胞数の条件下で)さらに培養させ続け、次にPSCの混入細胞を所定の細胞数に播種させた又は添加させた、PSC由来の細胞を含みうる。代替的には、当該陽性コントロールは、PSC由来の該細胞と同じ種類ではあるが、(例えば、骨髄細胞などの)体細胞のような代替的な細胞源に由来する、任意には、PSCの混入細胞を所定の細胞数に添加させた又は播種させた、当該細胞源に対して好ましくない条件下で増殖させた又は継代させた、細胞を含みうる。
【００４５】
好ましくは、該方法は、バックグラウンドのコントロール試料を用いたバックグラウンドコントロールにより、標的miRNAに対して該試料を測定することを含む。当該バックグランドコントロール試料は、混入が無視できる細胞数(例えば、所定の閾値と比較した場合に、例えば、該閾値の１０％未満、５％未満、又は１％未満)であると判断される、及び、好ましくは、未混入な試料であると判断されうる、細胞集団の試料を含みうる。好ましくは、当該バックグラウンドコントロール試料は、類似した分化状態及び/又は表現型を有する細胞のような、PSC由来の該細胞と類似した又は同種である細胞を含む。このようなバックグラウンドコントロール試料は、PSC由来の細胞集団の発生源である当該PSCに対して好ましくない条件下において増殖させた又は継代させた、PSC由来の細胞集団を含みうる。代替的には、当該バックグラウンドコントロール試料は、PSC由来の該細胞と同じ種類ではあるが、代替的な細胞源に対して好ましくない条件下において任意に増殖させた、(例えば、骨髄細胞などの)体細胞のような代替的な細胞源に由来する、細胞を含みうる。
【００４６】
その結果、当該バックグラウンドコントロールは、標的miRNAの発現を、好ましくはPSC由来の当該細胞試料と同時に、好ましくは陽性コントロール試料も同時に、測定しうる。好ましくは、当該バックグラウンドのシグナル値は、検出不可能な混入細胞数に一致する値(又は、繰り返し測定して、若しくは、統計的な分析によって、決定された範囲)として判断されうる。
【００４７】
好ましくは、該方法は、PSC由来の当該細胞集団、バックグラウンドコントロール試料、及び陽性コントロール試料、を測定することを含む
【００４８】
好ましくは、該方法は、PSC由来の当該細胞集団とPSCの当該混入細胞との間に、非特異的に発現された、好ましくは非差次的に発現された、１つ又はそれ以上の内因性ノンコーディングRNAに対して、好ましくはmiRNAに対して、PSC由来の当該細胞集団の、並びに、バックグラウンドの及び/又は陽性のあらゆるコントロールの、該試料を測定することをさらに含む。これは、例えば混入が全く検出されないという結果が有効であることを保証するために使用することができる、標準的な又は対照的な性質を当該測定法に対して提供する。
【００４９】
該方法は、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のmiRNA(標的miRNA)に対して、任意には内因性ノンコーディングRNA(好ましくは内因性miRNA)に対して、陽性コントロール及び/又はバックグラウンドコントロールを用いて、PSC由来の当該細胞集団の該試料を測定することを、好ましくは含み、当該測定段階は、当該標的miRNAについて、任意には当該内因性miRNAについて、その濃度を測定するために、該試料や任意の陽性コントロールを処理すること及び分析すること、該試料中の並びに陽性の及び/又はバックグラウンドのコントロール中の、標的miRNA及び内因性miRNAの発現量を比較すること、並びに、該試料中のPSCの混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数を決定すること、を含む。
【００５０】
本発明は、あらゆる適切な測定技術を用いて、好ましくは実施されうる。例えば、該方法は、逆転写、アミクロアレイ、PCR、定量PCR、次世代シークエンシング、ヌクレアーゼプロテクション法、プローブハイブリダイゼーション法、パイロシークエンシング、及びプライマー伸長法から選択される、少なくとも１つの技術を含みうる。
【００５１】
好ましくは、該方法は、当該標的miRNAを、標的miRNAの塩基配列の少なくとも一部と実質的に相補的なヌクレオチド配列を有するプライマー及び/又はプローブを用いて、検出すること又は測定することを含む、該試料を処理する及び分析する段階を含む。
【００５２】
任意には、当該miRNA発現の測定には、定量RT-PCR、デジタルPCR、ドロップレットデジタルPCR、シークエンシング、Luminex(商標)法による核酸増幅法、若しくは他のハイブリダイゼーションに基づく技術のうち、いずれか１つが又は幾つかを組み合わせて、用いられる。
【００５３】
上記したように、標的miRNAの発現量の定量的測定が実施されることが、好ましい。当該測定法は、定量RT-PCR、デジタルPCR、又はドロップレットデジタルPCRを含むことが、好ましい。
【００５４】
好ましくは、該方法はドロップレットデジタルPCR(ddPCR)を利用する。
【００５５】
該方法は、１本鎖の標的miRNA又はその集合体を使用しうる。当該集合体は、miRNAを任意の個数で含みうるが、好ましくは最大で２０、より好ましくは最大で１０、さらにより好ましくは２から６で、例えば３、４、又は５、といった個数である。任意には、１本鎖のmiRNAは、PSCの混入細胞のマーカーとして用いられうる。
【００５６】
好ましくは、当該標的miRNAは、PSCの混入細胞に特異的なmiRNAとして、特定及び実証されている。
【００５７】
好ましくは、当該標的miRNAは、本明細書において記載された方法に従い、選択される。
【００５８】
好ましくは、本発明の方法において使用するための標的miRNAの候補分子は、１００以上のmiRNA、好ましくは少なくとも２００のmiRNAを含みうる、１組のmiRNAによる包括的なmiRNAの測定法を用いることで、特定されうる。好ましくは、当該測定法は、PSC由来の細胞集団及びPSCの細胞集団の試料における包括的なmiRNA発現についての差次的発現の解析を備える、マイクロアレイである。PSC由来の当該細胞集団は、PSCの混入細胞を全く含まない細胞集団、又は、無視できる細胞数の細胞集団で、好ましくはあるべきであり、任意には、PSC由来の当該細胞集団は、例えば、PSCに対して不適切な条件下で増殖させたPSC由来の細胞を含む、上記したバックグラウンドの細胞集団のような細胞集団を含みうる。好ましくは、当該マイクロアレイは、アジレント・テクノロジー株式会社から入手可能であるような市販のmiRNAプラットフォーム上(例えば、SurePrint Human miRNA microarrays)で実施される。PSC由来の当該細胞試料では特異的に発現されているが、当該PSC試料では特異的に発現されていない、これらのmiRNAは、１つの又は２つ以上のmiRNAが、本発明における混入細胞の決定方法のために選択されうる、標的miRNAの候補集団を形成しうる。
【００５９】
好ましくは、PSCの混入の検出方法において使用するための標的miRNAを選択する方法であって、miRNAの大部分(例えば、少なくとも１００)についての測定法、好ましくは上記したようなマイクロアレイ、を実施することを含む方法、が提供されている。好ましくは、標的miRNAの候補集団は、定量逆転写PCR(qRT-PCR)などの適切な定量的な測定方法を用いる方法によって、差次的な発現という観点から実証されうる。好ましくは、標的miRNAの候補集団は、最大１００のmiRNA、好ましくは最大およそ５０のmiRNA、を含む。
【００６０】
好ましくは、以下のmiRNAから選択される、１つの又は集合体を形成する２つ以上のmiRNAを含む、標的miRNA：hsa-miR-367-3p、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302c-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302a-5p、hsa-miR-302d-3p、hsa-miR-663a、hsa-miR-1323、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-363-3p、hsa-miR-205-5p、hsa-miR-96-5p、hsa-miR-512-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-302c-5p、hsa-miR-124-3p、hsa-miR-517a-3p、hsa-miR-517b-3p、 hsa-miR-150-3p、hsa-miR-520c-3p、hsa-miR-205-3p、hsa-miR-498、hsa-miR-371a-5p、 hsa-miR-3149、hsa-miR-630、hsa-miR-371a-3p、hsa-miR-183-5p、hsa-miR-3692-5p、hsa-miR-32-3p、hsa-miR-34b-3p、hsa-miR-4327、hsa-miR-525-5p、hsa-miR-519d-3p、hsa-miR-629-3p、hsa-miR-3141、hsa-miR-518b、hsa-miR-515-3p、hsa-miR-516b-5p 及びhsa-miR-519b-3p。これは標的miRNAの好ましい候補集団である。
【００６１】
任意には、本発明の方法において使用するための１つ又はそれ以上の標的miRNAは、上記で定義された候補集団から選択されうる。任意には、当該候補集団は、最大２０のmiRNA、好ましくは最大１０のmiRNAの精製された候補集団を提供するため、発現量などの１つの又はそれ以上の因子に基づいて、精製されうる。任意には、精製された当該候補集団は、当該候補集団において最も高発現されている、例えば、20倍高発現されている、１０倍高発現されている、又は６倍高発現されている、当該候補集団のmiRNAを含む。
【００６２】
好ましい実施形態の１つにおいて、当該候補集団から最も高発現量であるとして選ばれうる標的miRNAは、以下のmiRNAから選択される、１つの又はそれ以上のmiRNAを、好ましくは含む：hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p、hsa-miR-302d-3p、hsa-miR-367-3p、hsa-miR-371a-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-512-3p及びhsa-miR-520c-3p。これは標的miRNAの精製された候補集団の例を表している。
【００６３】
好ましくは、当該候補集団又は精製された候補集団は、発現量の望ましい閾値におけるその感度という観点において実証されることがあり、好ましくは、これは実施される測定方法に対して実証される。１００万細胞数あたり１０細胞数のPSC由来の細胞という望ましい閾値が要求される、当該閾値における感度分析を、例えば、当該候補集団又は精製された候補集団は、好ましくは受ける。これは、１組の又はサブセットのmiRNA(例えば、精製された候補集団)に感度分析を受けさせることによって、好ましくは達成されうる。好ましくは、PCRに基づく測定法に対して、当該感度分析は、PCRを含み、好ましくは定量RT-PCR、ddPCR、又は他の定量法のうち１つを含み、好ましくはmiRNA測定に適したデジタルPCRの手法を含む。この好ましい実施形態によれば、選択された測定方法は、既知の混入細胞数を添加させた細胞試料、PSC由来の該細胞に相当する細胞(例えば、上記したようなバックグラウンドの細胞)においてPSCを含む、添加させた細胞試料に対して、実施される。任意には、この定量的な測定法は、PSCの混入細胞を添加させた細胞試料の複数の異なる濃度において実施され、その１組(例えば、精製された候補集団)における各miRNAを用いる測定法の感度が評価されうる。発現量の望ましい閾値において区別可能であると示されている、これらのmiRNAは、測定法において使用される、又は、１つの若しくはそれ以上の標的miRNAが使用のために選択されうる、感度が評価された標的miRNAの集団として選択されうる。
【００６４】
好ましい実施形態の１つにおいて、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAは、以下のmiRNAから選択される、１つの又はそれ以上のmiRNAを含む：hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p、hsa-miR-302d-3p及びhsa-miR-367-3p。これは、使用されうる、又は、１つ又はそれ以上のmiRNAが、本発明に従い混入細胞数を決定する方法において、使用するために選択されうる、感度が評価された標的miRNAの集合体の例である。
【００６５】
miRNA又はその集合体を選択する方法は、好ましくはddPCRである測定方法の選択において最適化手段を実行すること、感度が評価された(又は他の１組である)標的miRNAの候補集団の感度分析を実施すること、をさらに含みうる。実施されうる最適化の例は以下に記載されている。
【００６６】
好ましい実施形態の１つにおいて、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAは、miRNAの集合体を最適化させるddPCRであると好ましくは判断されうる、以下のmiRNAから選択される、１つの又はそれ以上のmiRNAを含む：hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p及びhsa-miR-302d-3p。好ましくは、PSC由来の細胞集団におけるPSCの混入細胞の混入を、１００万細胞数あたり１０細胞数以下という感度を求めて、ddPCRを用いて検出するための方法における使用に対して、単独で、又は、標的miRNAの集合体において、使用するためのmiRNAは、hsa-miR-302b-3pである。
【００６７】
実施形態の１つにおいて、内部コントロールとして使用するための内因性miRNAは、hsa-miR-107及びhsa-miR-130a-3pのうち、１つ又は両方から選択される。
【００６８】
本発明の好ましい実施形態の１つにおいて、該方法及び方式は、定量RT-PCRのような、最も好ましくは、ddPCRのような、定量PCRを利用する測定法を含む。このように、上記したようなバックグラウンドコントロール及び陽性コントロールを任意に用いる、１つの又はそれ以上の差次的に発現されている標的miRNA(及び、任意には内部コントロール)に対する測定によって、PSCの混入細胞のPSC由来の細胞集団における混入を検出するためのddPCRの使用は、さらなる態様や好ましい実施形態において、提供されている。好ましくは、当該測定法は、１００万細胞数あたり１０細胞数以下の、より好ましくは１００万細胞数あたり５細胞数の、PSCの混入細胞を検出することができる。好ましくは、当該標的miRNAは、望ましい閾値において高感度なものとして、選択される。好ましくは、当該ddPCRは、選択された１つ又はそれ以上の標的miRNAの望ましい閾値において、高感度な検出及び識別のために最適化される。
【００６９】
好ましくは、当該PCRの方式及び方法(好ましくは、当該ddPCRの方式及び方法)は、１つ又はそれ以上の以下の内容に従い最適化される：
・逆転写酵素による相補的DNA(RT cDNA)の合成段階は、RNAインプット及び/又はRT cDNAプライマーの濃度に対して、最適化される。
・PCR段階は、１つの又はそれ以上のcDNA濃度、PCRプライマーの濃度、及びアニーリング温度に対して、最適化される。
【００７０】
より好ましくは、該方法はddPCRであり、該方法はRNAインプット及びRT cDNAのプライマーの濃度に対して、最適化される。好ましくは、当該PCR段階も最適化され、好ましくはcDNA濃度及びPCRプライマーの濃度に対して、好ましくはアニーリング温度に対しても、最適化される。
【００７１】
特に好ましい実施形態において、該方法は、PSC由来の細胞試料(及び、任意には、バックグラウンドコントロール試料及び陽性コントロール試料)において、ddPCRを実施することを含み、好ましくは、該方法は、総RNAを抽出すること、標的miRNAに相当するcDNAを作製するために当該標的miRNAにおいて逆転写段階を(例えば標的miRNAに対するプローブやプライマーを用いて)実施すること、ddPCRによって当該cDNAを増幅すること、及び増幅させたシグナル値から個々の試料における標的miRNAの発現量を決定すること、を含む。
【００７２】
好ましくは、該方法は、miRNA RT assay(好ましくは、TaqMan miRNA assay又はその類似物、並びに、以下に提供されている一般的なプロトコル)内のmiRNA逆転写酵素成分、及び(好ましくは、市場で入手可能なドロップレットデジタルPCR方式、並びに、以下に提供されている一般的なプロトコルを用いる)ddPCR成分、を備えるddPCR法を含む。
【００７３】
特に好ましい実施形態において、本発明の方法及び方式は、好ましくは上記したようにより好ましく最適化されたddPCRによって、PSC由来細胞におけるPSC混入細胞の混入を検出する測定法において、前記した好ましい標的miRNA(例えば、好ましい候補集団、より好ましくは発現が評価された候補集団、さらにより好ましくは感度が評価された標的miRNA、及び、より好ましくは５、４、又は１の好ましい標的miRNAに対して言及されたもの、から選択されたmiRNA)の使用を含む。さらにより好ましくは、混入の閾値が、１００万細胞数あたり最大２０細胞数、さらにより好ましくは１００万細胞数あたり最大１５細胞数、及び最も好ましくは１００万細胞数あたり１０細胞数、に選ばれる、並びに、より好ましくは１００万細胞数あたり５細胞数から１０細胞数、好ましくは１００万細胞数あたり５細胞数、から選択される。
【００７４】
本発明の方法は、１００万細胞数あたり１０細胞数という閾値において、より好ましくは１００万細胞数あたり５細胞数という閾値において、及び、より好ましくは偽陽性や偽陰性という結果が全く生じない、該方法の好ましい実施形態における場合において、低い偽陽性率及び偽陰性率を好ましくは有する。このように該方法は高感度で高特異度な方法である。
【００７５】
本発明の他の態様は、PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、所定のノンコーディングRNAに特徴的なヌクレオチド配列を各々が含む、１つの又は２つ以上のPCRプライマーを好ましくは含み、PSC由来の細胞試料中の対応する１つの又は２つ以上のmiRNAの濃度又は発現量を定量的に決定するのに使用するための、キットに方向付けられる。好ましくは、当該キットはddPCRにおいて使用するためのものである。好ましくは、当該miRNAは上記で好ましいことが示されたmiRNAである。
【００７６】
本発明の他の態様において、方式は以下の内容を含む：PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、少なくとも１つの又は２つ以上の所定の標的miRNAを検出するための、１組のポリヌクレオチド、及び、PSC由来の細胞集団から採取した試料から抽出されたRNA、若しくは、PSC由来の細胞集団から採取した試料から抽出されたRNAから逆転写されたcDNA。該方式はddPCRのための装置又は方式を好ましくは含む。
【００７７】
PSC由来の当該細胞集団は、典型的には細胞療法のために使用することが意図される細胞集団(幹細胞由来の細胞製品)であり、PSCに由来するあらゆる細胞の種類でありうる。このようなPSC由来の細胞は例えば間葉系幹細胞(MSC)でありうる。好ましくは、PSC由来の該細胞はPSCの重要な特徴を欠いたものである。好ましくは、PSC由来の該細胞は多能性ではない。任意には、PSC由来の該細胞は多能性を有する特定の系統の細胞でありうる。任意には、PSC由来の該細胞は、PSC由来である、心臓細胞、網膜細胞、神経細胞、肝細胞等でありうる。任意には、PSC由来の該細胞は神経幹細胞、心臓幹細胞等でありうる。任意には、PSC由来の該細胞はT細胞又はCD4陽性細胞でありうる。好ましくは、(MSC以外の)PSC由来の該細胞は最終分化した細胞である。
【００７８】
実施形態の１つにおいて、PSC由来の該細胞はMSCである。実施形態の１つにおいて、PSC由来の該細胞は心筋細胞である。実施形態の１つにおいて、PSC由来の該細胞はドーパミン作動性神経細胞である。
【００７９】
実施形態の１つにおいて、当該PSC細胞はiPSCである。
【００８０】
好ましくは、PSC由来の当該細胞集団は細胞療法において使用するためのものである。
【００８１】
実施形態の１つにおいて、PSC由来の当該細胞集団は、移植片対宿主病、心臓療法、組織再灌流療法、脳卒中からの回復、１型糖尿病及び２型糖尿病、腎疾患及び腎移植からの回復、並びにアルツハイマー病などの、細胞療法において使用するためのMSCを含む。
【００８２】
他の実施形態において、PSC由来の該細胞は心血管症状のための心筋細胞である。
【００８３】
他の実施形態において、PSC由来の該細胞はパーキンソン病の治療のためのドーパミン作動性神経細胞である。
【００８４】
任意には、PSC由来の該細胞は細胞療法において使用するためのCD34陽性細胞又はT細胞である。
【００８５】
本発明のさらなる態様において、細胞療法において使用するためのPSC由来の細胞集団であって、１００万細胞数あたり１０細胞数以下、より好ましくは１００万細胞数あたり５細胞数から１０細胞数の範囲内である、１００万細胞数あたり５細胞数などの所定の閾値以下といった、上記方法によって決定される所定の閾値以下のPSCの混入細胞を含む集団、が提供されている。
【００８６】
さらに、細胞療法において使用するためのPSC由来の細胞集団を製造する方法であって、以下の内容を含む方法が提供されている：PSC由来の細胞集団を提供するために、多能性幹細胞(PSC)のPSC由来細胞への分化を誘発すること；PSC由来の当該細胞集団の試料を採取すること；当該細胞試料中のPSCの混入細胞の有無及び細胞数を決定するために、該試料を上記した該方法で測定すること、及び、PSCの混入細胞の有無及び細胞数が所定の混入細胞数と等しい又はそれ未満であるとの決定に基づいて、細胞療法に適する又は入手可能なようにPSC由来の当該細胞集団を特徴付けること；並びに、PSC由来の該細胞をそれを必要とする患者に任意に投与すること。好ましくは、所定の混入細胞数は、該試料について１００万細胞数あたり１０細胞数のPSC混入細胞、より好ましくは、該試料について１００万細胞数あたり５細胞数のPSC混入細胞である。
【００８７】
他の態様において、PSC由来の細胞を用いる細胞療法によって、それを必要とする患者を治療する方法であって、細胞療法において使用するためのPSC由来の細胞集団を上記方法に従い製造することを含む方法であって、該患者に対してPSC由来の当該細胞集団の少なくとも一部を投与することをさらに含む方法、が提供されている。
【００８８】
他の態様において、PSCを利用した細胞療法によって生じる奇形腫の危険性を低減するための方法であって、当該細胞療法において使用するためのPSC由来の幹細胞集団を上記方法に従い製造すること、並びに、当該細胞集団の少なくとも一部をそれを必要とする患者に対して投与すること、を含む方法、が提供されている。
【００８９】
本発明のさらなる態様において、それを必要とする人間の又は動物の患者を治療する方法であって、該患者に対して１回分の又は複数回分の細胞療法の投与量を投与することを含み、当該細胞療法の投与量が、１００万細胞数あたり１０細胞数又は１００万細胞数あたり５細胞数といった、所定の閾値以下のPSCの混入細胞数を含むように特徴付けられたPSC由来の細胞集団を含む、当該細胞療法の投与量によって、奇形腫及び/又は腫瘍を形成する危険性を低減させるのに該患者を治療する上で効果的である、方法が提供されている。
【００９０】
PSCの混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のmiRNAに対する、miRNAの発現データ又は発現プロファイルの、PSCを利用した細胞療法における奇形腫の危険性を低減させるための使用が、結果としてさらに提供されている。
【００９１】
以下の態様は別用途のための細胞源由来の細胞集団中の細胞源の混入細胞の混入の決定に関する。
【００９２】
さらなる態様の１つにおいて、別用途のための細胞源由来の細胞集団中の細胞源の混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数を決定するための方法であって、細胞源の混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAに対して、細胞源由来の当該細胞集団の試料を測定することを含む方法、が提供されている。
【００９３】
他のさらなる態様において、細胞源由来の細胞集団のロット公開の方法であって、細胞源由来の細胞集団の細胞源の混入細胞の混入を上記したように決定するための方法を実施すること、並びに、混入が全くない又は許容可能な混入細胞数であるとの決定に基づいて、別用途のための細胞源由来の当該細胞集団を公開すること、を含む方法が、提供されている。
【００９４】
本発明のさらなる態様において、細胞源の混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、１つの又は集合体を形成する２つ以上の所定のノンコーディングRNAに対する、ノンコーディングRNAの発現データ又は発現プロファイルの、別用途のための細胞源由来の細胞集団中の細胞源の混入細胞の混入の有無及び/又は細胞数を決定するための使用、が提供されている。
【００９５】
本発明のさらなる態様において、細胞源の混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、所定のノンコーディングRNAに特徴的なヌクレオチド配列を各々含む、１つの又は２つ以上のPCRプライマーを含み、細胞源由来の細胞試料中の対応する１つの又は２つ以上のノンコーディングRNAの濃度又は発現量を定量的に決定するのに使用するためのキット、が提供されている。
【００９６】
本発明のさらなる態様において、細胞源由来の細胞集団中の混入を検出するための方法であって、細胞源の混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、標的ノンコーディングRNAと相補的なヌクレオチドを含み、細胞源由来の細胞団の試料から抽出された当該標的miRNAであるノンコーディングRNA由来である、cDNA分子の濃度を増幅すること及び測定することを含む方法、が提供されている。
【００９７】
本発明のさらなる態様において、細胞源由来の細胞集団のロット公開の方法であって、細胞源由来の細胞集団の細胞源の混入細胞の混入を上記したように決定するための方法を実施すること、並びに、混入が全くない又は許容可能な混入細胞数であるとの決定に基づき、別用途のための細胞源由来の当該細胞集団を公開すること、を含む方法、が提供されている。
【００９８】
本発明のさらなる態様において、細胞療法において使用するための細胞源由来の細胞集団であって、上記した方法によって決定されるように、１００万細胞数の細胞源由来細胞あたり１０細胞数以下、より好ましくは１００万細胞数あたり５細胞数以下、である細胞源の混入細胞を含む集団、が提供されている。
【００９９】
本発明のさらなる態様において、細胞療法において使用するための細胞源由来の細胞集団を製造する方法であって、以下の内容を含む方法、が提供されている：
細胞源由来の細胞集団を提供するために、多能性又は複能性を有する細胞源のこれらに由来する細胞への分化を誘発すること；
細胞源由来の細胞集団の試料を採取すること
当該細胞試料中の細胞源の混入細胞の有無及び細胞数を決定するために、該試料を上記した方法で測定すること、及び、細胞源の混入細胞の有無及び細胞数が所定の混入細胞数と等しい又はそれ未満であるとの決定に基づき、細胞療法に適する又は入手可能なように細胞源由来の当該細胞集団を特徴付けること；並びに、細胞源由来の該細胞をそれを必要とする患者に対して任意に投与すること。
【０１００】
本発明のさらなる態様において、細胞源由来の細胞を用いる細胞療法によってそれを必要とする患者を治療する方法であって、細胞療法において使用するための細胞源由来の細胞集団を上記した方法に従い製造することを含む方法であって、細胞源由来の当該細胞集団の少なくとも一部を該患者に対して投与することをさらに含む方法、が提供されている。
【０１０１】
本発明のさらなる態様において、以下の内容を含む方式が提供されている：細胞源の混入細胞において差次的に発現されることが知られた又は決定された、少なくとも１つの又は２つ以上の所定のノンコーディングRNAを検出するための１組のポリヌクレオチド、及び、細胞源由来の細胞集団から採取した試料から抽出されたRNA、若しくは、細胞源由来の細胞集団から採取した試料から抽出されたRNAから逆転写されたcDNA。
【０１０２】
これらのさらなる態様において、細胞源は、細胞療法などの別用途のための細胞集団の細胞源を形成することがあり、別用途のための細胞集団が当該細胞源に由来する、細胞である。該誘導は、細胞源から分化すること、又は、分化によらなければ、遺伝情報の取り込みを介する形質転換若しくは他の変化によって、導き出されること、を含みうる。好ましくは、当該細胞源及び細胞源由来の当該細胞の両方は、安定であり、複製可能であり、特定できる表現型を有する、ということがある。好ましくは、当該細胞源は、成体由来の体性幹細胞(例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、骨格筋、子宮内膜、胎盤、ワルトンジェリー、若しくは歯髄)のような幹細胞である、又は、臍帯血若しくは臍帯に由来するようなヒト胚性幹細胞である、又は、人工多能性幹細胞か多能性細胞に由来する細胞である。任意には、該細胞は組織特異的な前駆細胞である。
【０１０３】
好ましくは、該細胞はヒト細胞である。好ましくは、該細胞は幹細胞又はT細胞である。
【０１０４】
該細胞は、特に幹細胞は、例えば、骨髄、脂肪組織、末梢血、骨格筋、子宮内膜、胎盤、臍帯血、臍帯、ワルトンジェリー、歯髄、及び多能性細胞由来の細胞でありうる、１つの又は複数の細胞源から供給されうる。
【０１０５】
PSC由来の細胞に関する方式、使用、及び方法に関連して上記され、標的miRNAの集合体又はバイオマーカーを決定する方法を含む、これらのさらなる態様のさらなる特徴は、
当該文脈が許容するこれらのさらなる態様にも適用する。
【０１０６】
miRNAに対する及び特定のmiRNAに対する本明細書における言及は、Biotechnology and Biological Sciences Research Council (BBSRC)から資金提供を受け、マンチェスター大学のグリフィス-ジョーンズ研究室によって運営されている、miRNAのレジストリデータベースである、www.mirbase.orgというURLのウェブサイト上に記載された命名規則に従い、miRNAの識別コード(miRNA識別子)を使用している。当該miRNA識別子は２０１８年１月１８日時点で有効な識別コードである。
【実施例】
【０１０７】
実施例は、幹細胞由来の細胞試料においてPSCの混入を検出するための特異的であり高感度な候補分子として使用するためのmiRNAを特定して特徴付けるための該過程を示すこと、並びに、好ましい測定過程に達する感度を示すこと、に対して提示されている。データを生成するために用いた全ての細胞はヒト細胞であった。
【０１０８】
方法と材料
iPSC由来のMSC試料の製造
iPSC由来のMSC試料中にiPSCが残存する可能性を最小化するため、本明細書において用いられる当該iPSCに由来する全てのMSCは、あらゆる残存するiPSCが増殖しないMSC培養培地におけるこれら細胞の培養時間を延長することによって、iPSCの混入するあらゆる可能性を最小化する方法において、製造された。このアプローチは、治療において使用するための幹細胞由来のMSCを日常的に製造する間は、不可能であったろうが、iPSCが混入するあらゆる可能性を最小化するために、本明細書において使用された。治療目的で用いられうるiPSC由来のMSCと区別するために、iPSC由来のMSCはderived propagated MSC(dp MSC)として言及するものとする。
【０１０９】
細胞添加試料の製造
iPSCに由来するMSCと比べてiPSCにおいて差次的に発現されているmiRNAを決定するための分析を実施するために、iPSC由来のdp MSCの細胞集団はiPSC混入が少ないように準備され、並びに、iPSC由来のdp MSCのiPSC添加試料を選択することで準備された。
【０１１０】
既知濃度に添加させたiPSCを含むdp MSCを備えた、独立した３組の細胞添加試料(A、B、C)は、連続希釈によって製造した。当該細胞添加試料は、１００００iPSC、１０００iPSC、１００iPSC、及び１０iPSCを各々含んでおり、各細胞数のiPSCを１００万細胞数のdp MSCに播種させた。これらの試料は、以下に記載された、定量逆転写PCR(QRT-PCR)による分析及びドロップレットデジタルPCR(ddPCR)による分析の両方における検出感度の評価に対して、用いられた。
【０１１１】
細胞ペレットの製造
分析された全ての細胞はヒト細胞であった。細胞ペレットは以下の様式における細胞から製造された。
【０１１２】
１×１０６細胞数の細胞アリコットを遠心分離後、当該上澄みをピペットを用いて取り除き、該細胞を氷冷させたpH７．０であるリン酸緩衝生理食塩水(PBS)５mLで再懸濁させ、４℃で３００×gで５分の条件下において遠心分離させた。この段階を繰り返し実施し、該細胞を氷冷させたPBS１mLで再懸濁させ、１．５mL用のマイクロチューブに移し替えた。このマイクロチューブを４℃で３００×gで５分の条件下において遠心分離させ、当該上澄みをピペットを用いて取り除いた。結果として生じる細胞ペレットは、残存するPBSを全て回収するために、４℃で３００×gで１分の条件下においてさらに遠心分離させた。回収されたPBSをピペットを用いて取り除き、該細胞ペレットを液体窒素中に急速冷凍させ、２週間という区切り以内にRNAの単離のために使用するまで、−８０℃で保存した。
【０１１３】
RNAの抽出
(miRNAのような小分子のノンコーディングRNAを含む、全てのRNA分子種を含む)総RNAは、Exiqon miRCURYTM RNA Isolation Kit-Cell & Plant (cat. no. 300110)を用いて、製造メーカーの２．２版の取扱説明書に従い、冷凍保存された細胞から取得した当該細胞ペレットから単離された。総RNA濃度はNanodropTM 1000 spectrophotometerを用いて測定された。RNAの純度及び品質は、２６０nm/２８０nm及び２６０nm/２３０nmの比に基づいて「純度が高い」として、及び、Agilent TapeStation 2200を用いて算出したRNA Integrity Numbers (RINs)が「大きい」ことで、評価された。
【０１１４】
マイクロRNAの発現分析―マイクロアレイ
ヒトのマイクロアレイを用いてmiRNA発現を分析するため、各細胞試料のRNAのアリコットをヌクレアーゼ非含有水を用いて５０ng/μLまで希釈し、分析までー８０℃で保存した。試料は、アジレント・テクノロジー株式会社のmiRNAマイクロアレイのプラットホーム(SurePrint G3 Human v16 microRNA 8x60K microarray slides; miRBase v16.0、 cat no. G4870A)上で、製造メーカーの１．７版の取扱説明書に従い、分析した。簡潔に説明すると、ヌクレアーゼ非含有水中で５０ng/μLである使用溶液から取得した、１００ngの総RNAを、マイクロアレイによる各実験に対するインプットとして使用した。各スライドは８つの個別のアレイを含み、各アレイは１３４９のマイクロRNAに相当し、このうち、１２０５がヒトのマイクロRNA(このうち１１９４のmiRNAがバージョン２０のmiRbaseにマップされている)、１４４がウィルスのマイクロRNAに相当する。
【０１１５】
当該マイクロアレイ処理の４つの重要な手順は以下の通りである：
１．単一色のCy3に基づく試薬によりRNAを標識する
２．標識RNA試料を当該マイクロアレイにハイブリダイゼーションさせる
３．洗浄段階
４．スライドの読み取り、データの取得、特徴の抽出(miRNA識別コードに対して、アレイスポットを適合させる)、結果画像とデータファイル上における品質管理の確認
【０１１６】
マイクロアレイデータの品質管理、前処理、正規化
全てのマイクロアレイデータは、アジレント社の(「good」から「excellent」までの)品質管理基準を満たしていた。次に、マイクロアレイデータの前処理及び正規化を、BioconductorのAgiMicroRNA packageを用いて実施した。
【０１１７】
アレイの品質管理は、以下の基準に基づき、棄却検定を用いて実施された：
・１アレイあたりの平均シグナル値
・１アレイあたりの平均バックグラウンド値
・％表示された存在比率(各アレイ上において検出されたmiRNA発現の存在比率)
・１試料あたり及び１対あたりのデータ分布
【０１１８】
定量逆転写PCRによる差次的発現の確認
当該マイクロアレイ分析において特定されたmiRNAの差次的発現パターンを確認するため、QRT-PCR分析は、以下に記載したマイクロアレイ分析で使用したものと同じRNA試料を用いて、実施された：
QRT-PCRを用いてmiRNA発現を分析するため、iPSC試料中のRNAやdp MSC試料中のRNAといった各試料のアリコットを、使用濃度が５ng/μLとなるよう、ヌクレアーゼ非含有水を用いて希釈した。試料をExiqon LNATM primer assays及びRoche’s Lightcycler(登録商標) 480 PCR systemを用いて分析した。当該QRT-PCRは製造メーカーの取扱説明書に従い実施した。簡潔に説明すると、10 ngのRNAを、１×反応緩衝液、１×逆転写酵素、104個のUniSp6スパイクインコピー(0.5 μL)を含む使用溶液中において、Exiqon’s LNA primer assay componentsを用いて逆転写した。当該逆転写サイクルの条件は、以下のように、42℃で60分及び95℃で5分であった。当該cDNAは、最終的に100倍希釈し、Exiqon’s ExiLENT SYBR（登録商標） Green mastermix及びRoche’s Lightcycler（登録商標） 480 PCR systemを用い、製造メーカーの取扱説明書に従い、分析した。簡潔に説明すると、100倍希釈したcDNAを、1×使用溶液中でExiLENT SYBR（登録商標） Green mastermixに添加し、これをExiqon’s Pick&Mix PCR panel arraysに添加した。
【０１１９】
発現量はsmall nucleolar RNAs C/D box (SNORDs)を用いて正規化した。５つのSNORDを候補正規因子として含んでいた。SNORDの48と38Bは変数が最も少ないGeNormアルゴリズムを用いて選択した。miRNAデータは発現量を(log2変換して)正規化して表し、各miRNAのCq値から算出した正規化因子のCq値の幾何平均を各試料に対して減算することで、デルタCqとして計算された。
【０１２０】
測定法の開発に適すると選択されたmiRNA候補分子の定量逆転写PCRを用いた感度評価
残存する未分化なiPSCの混入を検出するための測定法の開発に適したmiRNA候補分子を選択するため、QRT-PCR分析を、上記のように製造された既知濃度のiPSCスパイクインを含むdp MSCを備えた、細胞添加試料から抽出したRNAを用いて、実施した。上記したものと同様のQRT-PCR処理をこの分析において使用した。
【０１２１】
当該ddPCR法は、当業者によって理解され、並びに、当業者の能力の範囲内にある様式おいて、以下の内容を評価することで、開発され、最適化された：
・RNAインプット及びRT cDNAプライマー濃度に対して最適化された、逆転写酵素による相補的DNA(RT cDNA)の合成段階
・cDNA濃度、ddPCRプライマー濃度、及びアニーリング温度に対して最適化されたddPCR段階
・異なるオペレーター、装置試薬、及び試料を備える、２つの独立した実験施設において確認された上記内容物
最適化されたドロップレットデジタルPCR法の使用に適した選択方法の開発用のmiRNAの感度評価
【０１２２】
残存・混入した未分化なiPSCを検出するために最適化されたddPCR法を用いる、選択方法の開発用のmiRNAの感度評価が、QRT-PCRの感度評価の分析で用いたのと同じ試料を用いて、実施された。
【０１２３】
実施例１−iPSC特異的なmiRNAを特定するためのマイクロアレイ分析
(上記の方法と材料において記載したように製造された)純度の高いiPSC試料及び純度の高いdp MSC試料は、測定法開発用の候補分子の特定を目的とした研究において、マイクロアレイによって、全miRNA発現に対してプロファイルされた。全部で２３３のmiRNAがマイクロアレイデータセットに存在していた。iPSCにおいて特異的に発現されるが、dp MSCにおいては特異的に発現されない、miRNAを特定することを目的として、差次的発現分析を、iPSCにおいてのみ発現されたこれらのmiRNAを特定するために、実施した。この分析により、当該iPSCにおいてのみ発現され、当該iPSC由来MSCにおいては発現されていない(未検出)、３９のmiRNAからなる集合体が特定された。これらmiRNAの発現の密度やその特定は図１に示されている。図１は特にマイクロアレイのデータを示している：iPSCにおいて発現されるが、dp MSCにおいては発現されない、miRNAの発現密度は、箱ひげ図の形式で表されており、各箱内にある黒色の水平線は中央値を示しており、該箱は25パーセンタイル値から75パーセンタイル値までの範囲をとり、該ひげは当該データの最小値と最大値である。(iPSCはn=4、dp MSCはn=4)
【０１２４】
実施例２−選択されたiPSC特異的なmiRNAの差次的発現を確認するためのQRT-PCR分析
これらのmiRNAの差次的発現パターンを確認するため、マイクロアレイ分析に用いられたのと同じ試料を、39のmiRNAからなる集合体から取得した10のmiRNAの(発現量に基づき)選択されたサブセットを用いるQRT-PCRによって、分析した。このより高感度で定量的な技術基盤を用いて、この分析により、当該iPSCにおいて発現されているが、当該dp MSCにおいては発現されていない(未検出)、差次的発現のパターンが確認され、miRNA集合体の選択されたサブセットの発現順位も確認された。このデータは図２において示されている。
【０１２５】
図２は特にQRT-PCRのデータを示している：iPSCにおいてのみ発現されているが、 MSCにおいては発現されていない、選択された１組のmiRNAのQRT-PCRによる確認。箱ひげ図において、各箱内にある黒色の水平線は中央値を示しており、該箱は25パーセンタイル値から75パーセンタイル値までの範囲をとり、該ひげは当該データの最小値と最大値である。(iPSCはn=4、MSCはn=4)
【０１２６】
実施例３−選択されたiPSCに特異的なmiRNAの細胞特異性を確認するためのマイクロアレイ分析
PSC由来細胞製品において残存・混入した未分化なPSCに対する測定法開発用の候補分子としての、１０のmiRNA集合体選択されたサブセットの有用性を調べるため、他のPSCや他の非多能性由来の細胞の種類におけるこれらの発現は、マイクロアレイのデータから決定される。用いられた該試料は、iPSC特異的なmiRNAの特定に用いられるiPSC、及び、５つのリプログラミング技術や３つの異なる培養条件により、７種類の体細胞から取得されるiPSCであり、当該体細胞には、MSC(臍帯血由来、骨髄由来、脂肪組織由来)、脂肪細胞、MSC由来の軟骨細胞と骨細胞、初代脂肪細胞と初代軟骨細胞、CD34陽性細胞、初代内皮細胞、及び、CD4陽性Pan T細胞を含む、(しかし、これらだけに限定されるわけでない、)ESCと非多能性細胞がある。これにより、miRNA集合体の選択されたサブセットの５つが、すなわち、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p、hsa-miR-302d-3p、及びhsa-miR-367-3pが、測定した全てのPSCにおいて発現されているが、非多能性由来の細胞の種類には全く発現されていなかったこと、並びに、その結果として、PSC由来細胞製品中に残存・混入した未分化なPSCを検出するための、測定法開発の適切な候補分子であることが、確認された。この分析によって、選択されたサブ集合体中の残存miRNAが、すなわち、hsa-miR-371a-3p、hsa-miR-372-3p、hsa-miR-373-3p、hsa-miR-521-3p、及びhsa-miR-520c-3pが、測定された全ての非多能性細胞において発現されていないが、全てのPSCにおいて必ずしも発現されているとは限らない、ということも示された。これによって、PSC由来細胞製品中に残存・混入した未分化なPSCに対する測定法開発の候補分子として、これらmiRNAが除外されるとは限らないが、これらmiRNAは、測定法開発の候補分子としての可能性を、PSC由来細胞製品の製造に用いられた特定のPSC株に基づいて、個別にさらに調べなければならないだろう。
【０１２７】
図３は当該マイクロアレイのデータを示している。特に、図３は、iPSC、ESC、及び非多能性細胞において発現されたmiRNAの選択されたサブセットの、(QRT-PCRにより確認された、)正規化された発現密度を示している。箱ひげ図において、各箱内にある黒色の水平線は中央値を表し、当該箱は25パーセンタイル値から75パーセンタイル値の範囲をとり、該ひげは該データの最小値と最大値である。図３において、iPSC(測定法開発用の試料)はn=4、iPSC(追加試料)はn=40、ESCはn=8、非多能性細胞は細胞の各種類でn=3〜８である。
【０１２８】
実施例４−選択されたiPSCに特異的なmiRNAに対するQRT-PCRによる細胞添加試料を用いた感度分析
１０のmiRNA集合体の選択されたサブセット(QRT-PCRによって確認されたmiRNA)の感度を、PSC由来細胞製品中に残存・混入した未分化なPSCに対する測定法開発の候補分子に対して評価するため、これらの検出感度を、10000細胞数のiPSC、1000細胞数のiPSC、100細胞数のiPSC、及び10細胞数のiPSCを含み、各々を100万細胞数のdp MSCへ播種させた、３つの独立した細胞添加試料において、各々評価した。図４は、３つの独立した細胞添加試料中の、１０のmiRNA集合体の選択されたサブセットの相対的な発現量を示している。この分析により、１０のmiRNA集合体の選択されたサブセットのうち、4のmiRNAが、すなわち、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p、及びhsa-miR-302d-3pが、PSC由来細胞製品中に残存・混入した未分化な非常に少数のPSCを検出するための測定法開発の候補分子として、100万細胞数のiPSC由来MSCあたり10細胞数から100細胞数のiPSCを検出できる、最も高い検出感度を有している、ということが示された。
【０１２９】
図４において、測定法開発用の候補分子である、１０のmiRNA集合体の選択されたサブセットについての、A、B、Cの細胞添加試料を用いたQRT-PCR分析が、Log2変換により正規化させた相対的な発現量として表されている
菱形は10000細胞数のiPSCを100万細胞数のdp MSCへ播種させた群である；三角形は1000細胞数のiPSCを100万細胞数のdp MSCへ播種させた群である；四角形は100細胞数のiPSCを100万細胞数のdp MSCへ播種させた群である；円形は10細胞数のiPSCを100万細胞数のdp MSCへ播種させた群である
【０１３０】
実施例５−選択されたiPSC特定的miRNA集合体を用いた高感度ドロップレットデジタルPCR法の開発
マイクロアレイによる細胞特異的なデータ(図３)、及び、細胞添加試料におけるQRT-PCRの検出感度のデータ(図４)に基づき、以下のmiRNAが、すなわち、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p、及びhsa-miR-302d-3pが、さらに選択され、PSC由来細胞製品中に残存・混入した未分化な非常に少数のPSCを検出するための測定法開発用の候補遺伝子として優先された。細胞添加試料を用いた、これらmiRNAに対するQRT-PCRによって達成された、検出感度の限界値(図４)に基づき、絶対的な定量性能による、すなわち、ドロップレットデジタルPCRによる、より高感度な技術基盤への移行が決定付けられた。これら４つのiPSC特異的な測定法開発用の候補分子の使用を併用して、ddPCR法は開発され、最適化され、及び、方法と材料に記載したように評価された。最終的な検出感度、特異性、正確性、及び再現性の評価は、100細胞数のiPSC、10細胞数のiPSC、及び、iPSCを含まない細胞添加試料を用いて、実施された。この分析は、最適化された該方法は100万細胞数のMSCのバックグラウンド中で10細胞数以下のiPSCを一貫して検出可能であることを、図５及び図６において示したように、示していた。さらに、iPSCの混入細胞数が10細胞数である場合の、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p、及びhsa-miR-302d-3pに対する、ddPCRあたりの絶対複製数は、図６において示したように、推定された検出限界(LOD)を優に上回っていた。
【０１３１】
図５は以下の内容を示している：100細胞数のiPSC、10細胞数のiPSC、及び全くiPSCを含まない細胞添加試料における、選択され、優先された４つのmiRNAを備える適正化された測定法を用いた、実施例におけるddPCRデータは、dp MSC中に残存・混入したiPSCを検出できることを示している。統合されたデータは、３つの独立した細胞添加試料(A、B、C)に対して示され、並びに、ddPCRあたりのmiRNAの複製数の棒グラフが、log10変換したスケールにおいて平均値±標準偏差として表されている。100細胞数のiPSCは、100細胞数のiPSCを100万細胞数のdp MSCへ播種させたもの；10細胞数のiPSCは、10細胞数のiPSCを、100万細胞数のdp MSCへ播種させたもの；DP MSCは、iPSCを100万細胞数のdp MSCへ播種させなかったもの、である。
【０１３２】
図６は以下の内容を示している：10細胞数のiPSC及び全くiPSCを含まない細胞添加試料における、選択され、優先された４つのmiRNAを備える適正化された方法を用いた、実施例におけるddPCRデータは、dp MSC中に残存・混入したiPSCを検出できることを示している。統合されたデータは、３つの独立した細胞添加試料(A、B、C)に対して示され、並びに、ddPCRあたりのmiRNAの複製数の棒グラフが、均等なスケールにおいて平均値±標準偏差として表されている。95%信頼区間における推定LODは、点線で示され、LOD=MSC miRNA複製数/ddPCRの平均値 + (3.3×SD)として計算される。10細胞数のiPSCは、10細胞数のiPSCを100万細胞数のdp MSCへ播種させたもの；DP MSCは、iPSCを100万細胞数のdp MSCへ播種させなかったもの、である。
【０１３３】
実施例６−選択されたiPSC特異的なmiRNAに対するddPCRによる細胞添加試料を用いた感度分析
最も高感度な可能性がある上記で特定された4つのmiRNAの感度を、すなわち、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p、及びhsa-miR-302d-3pの感度を、PSC由来細胞製品中に残存・混入した未分化なPSCに対してさらに評価するため、これらの検出感度は、10細胞数のiPSC、5細胞数のiPSC、及び1細胞数のiPSCを含み、各々を100万細胞数のBM-MSC(骨髄MSC) (レーザーキャプチャーにより製造された細胞添加試料)へ播種させた、３つの独立した細胞添加試料において、並びに、iPSCを含まない100万細胞数のBM-MSCにおいても、さらに各々評価された。
【０１３４】
図７は以下の内容を示している：100万細胞数のMSCあたり10細胞数、5細胞数、又は1細胞数のiPSCを含む試料中のddPCR法の検出感度。バックグラウンドのシグナル値はBM-MSCに対して示されている。データは標的miRNA複製数/ng RNAとして表されている。箱ひげ図は最小値と最大値を示すひげを備えている。グラフは、10細胞数のiPSC (n=2)、5細胞数のiPSC(n=2)、1細胞数のiPSC(n=2)、及びBM-MSC(n=2)を含む、各試料に対して実施された２つの独立したcDNA合成反応の結果である。推定LODは、点線で示され、以下の式LOD=LOB+(1.645×1細胞数のiPSC試料の標準偏差)として計算され、LOBはLOB=BM-MSC試料の平均値+(1.645×BM-MSC試料の標準偏差)として計算される。
【０１３５】
この分析は、4つ全ての標的miRNAに対する、すなわち、hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302b-3p、hsa-miR-302c-3p、及びhsa-miR-302d-3pに対する、ddPCR法は、高感度であり、並びに、100万細胞数のBM-MSC中の5細胞数のiPSCを(100万細胞数のBM-MSCのバックグラウンドを超えて)明確に検出することができる、ということを示している。
【０１３６】
計算されたLODは、(hsa-miR-302a-3p、hsa-miR-302c-3p、及びhsa-miR-302d-3pにおいて、)100万細胞数のBM-MSC中に約1細胞数のiPSCに等しい、又は、(hsa-miR-302b-3pにおいて、)100万細胞数のBM-MSC中に1細胞数のiPSCを僅かに超える、細胞数に推定された。
【０１３７】
当該測定法の診断制度(感度と特異度)を評価するために、100万細胞数のBM-MSCのバックグラウンド中に10細胞数のiPSC及び5細胞数のiPSCを含む試料、及び、iPSCを全く含まない試料(100万細胞数のBM-MSCのみ)、において、実施された実験の全データが集められ、真陽性数、真陰性数、偽陰性数、及び偽陽性数が決定された。
【０１３８】
表−異なる細胞数の人工多能性幹細胞を添加した場合の診断用ドロップレットデジタルPCR法の感度と特異度の評価
【０１３９】
【表１】
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【０１４０】
この分析は、当該ddPCR法が、100万細胞数のBM-MSC中に10細胞数及び5細胞数のiPSCの両方を検出できる細胞数において、100%の感度(偽陰性がない)と100%の特異度(偽陽性がない)を有することを、明確に示している。
【０１４１】
本発明は好ましい実施形態に言及して記載されている。しかしながら、当該記載は、変動と変更が当業者によって本発明の要旨を逸脱しない範囲で達成されうることを、認めている。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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