(57)【要約】癌患者を治療するための組成物および方法、ならびに抗PD-1/PD-L1療法およびその他の抗癌および免疫調節療法による治療に応答する可能性が高い悪性腫瘍を有する患者を同定するための組成物および方法が開示される。2021503077.tif 000010
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗癌療法に応答性の対象を同定する方法であって、以下の工程を含む方法：
i）処置前に対象から採取される第一の生体試料を取得する工程、
ii）１種または複数種の抗癌剤を該対象に投与し、かつ該１種または複数種の抗癌剤で処置された該対象から第二の生体試料を採取する工程、
iii）該第一および第二の生体試料において、循環細胞外小胞PD-L1および／またはインターフェロンγ（IFNγ）のレベルを検出する工程、ならびに
iv）該第一の生体試料と比較して、該第二の生体試料において細胞外小胞PD-L1および／またはIFNγのレベルが増加している場合に、該対象が処置に応答性であると同定する工程。
【請求項２】
抗癌療法が、PD-1/PD-L1に指向しており、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、PD-1/PD-L1を免疫学的に特異的に標的とする抗体、および癌治療のためにPD-1/PD-L1を特異的に標的とする低分子からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
対象が、黒色腫、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、鼻咽頭癌、リンパ腫、メルケル細胞癌、ミスマッチ修復欠損を有する癌、または抗PD1/PDL1療法で治療され得るその他の癌のうち1つまたは複数に対する療法を受けている、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
抗癌療法が、PD-1経路またはPD-L1経路を標的とし、かつ前記第二の生体試料が、該療法後3〜9週間の間に採集され、前記方法が、処置前の血中細胞外小胞PD-L1タンパク質レベルと処置後の血中細胞外小胞PD-L1タンパク質レベルの比率を決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項５】
処置前のIFNγレベルと処置後のIFNγレベルの比率を決定する工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項６】
処置の前および後に、PD-L1レベルとIFNγレベルの比率が決定される、請求項4記載の方法。
【請求項７】
癌患者から取得した生体試料における、PD-L1エクソソーム、細胞外放出（shedding）小胞、エクトソーム、アポトーシス小体、およびオンコソームからなる群より選択される癌細胞由来PD-L1含有小胞を検出する方法であって、以下の工程を含む方法；
i）該試料を、PD-L1に特異的に結合する1つまたは複数の試薬と接触させる工程；および
ii）該癌由来PD-L1含有小胞に結合した該1つまたは複数の試薬を含む結合複合体の形成を検出する工程。
【請求項８】
前記結合複合体から前記PD-L1含有小胞を単離する工程をさらに含む、請求項7記載の方法。
【請求項９】
前記第一の生体試料と比較して、前記第二の生体試料においてエクソソームPD-L1および／またはIFNγレベルの比率が増加している場合に、対象が処置に応答性であると同定する工程を含む、請求項1記載の方法。
【請求項１０】
前記生体試料が、末梢血、血清、血漿、痰、尿、唾液、腹水、または涙から選択される、請求項1記載の方法。
【請求項１１】
前記PD-L1試薬が、フローサイトメトリー、免疫電子顕微鏡法、酵素結合免疫吸着測定法、または光散乱式ナノ粒子トラッキング解析法（NTA）によって検出される、請求項7記載の方法。
【請求項１２】
前記1つまたは複数のPD-L1試薬が、支持体に直接的または間接的に結合して検出される、請求項7記載の方法。
【請求項１３】
前記PD-L1試薬が、抗体を介して支持体に間接的に結合している、請求項7記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬が単量体、二量体、または四量体の抗体である、請求項7記載の方法。
【請求項１５】
検出剤が抗PD-L1抗体である、請求項7記載の方法。
【請求項１６】
抗PD-L1抗体が、非天然の量子ドットまたは蛍光色素で標識されている、請求項7記載の方法。
【請求項１７】
癌タンパク質含有エクソソームまたは癌タンパク質含有細胞外小胞を生体液試料から単離するための方法であって、
i）患者から試料を取得する工程、
ii）該試料を、該癌タンパク質に特異的に結合する試薬とともにインキュベートする工程、および
iii）該試薬を単離し、それによって癌タンパク質含有エクソソームを該試料から単離する工程
を含み、該癌タンパク質が、PD-L1、BRAF、NRAS、KRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、MET、RET、RHOA、ARID1A、PIK3CA、APC、MLL2、MLL3、RB1、NF1、MALAT、KEAP1、IDH1、ATRX、PDGFRA、NAV3、FBXW7、VHL、mTOR、BAP1、PBRM1、SETD2、およびCDH1、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、セルピンH1、VEGFC、R-RAS、HLA-G5、および癌に関連したそれらの変異タンパク質からなる群より選択され、該エクソソームまたは該細胞外小胞中の該癌タンパク質の存在が癌を示す、前記方法。
【請求項１８】
試料を、CD63またはCD274に特異的に結合する試薬とともにインキュベートする工程をさらに含む、請求項17記載の方法。
【請求項１９】
前記試薬が、磁気ビーズまたは固相支持体に付着している、請求項17記載の方法。
【請求項２０】
処置に対する患者の応答を予測するために前記比率が用いられる、請求項4または9記載の方法。
【請求項２１】
異常な循環エクソソームPD-L1レベルと関連する転移性癌を治療するための方法であって、以下の工程を含む方法：
a）患者から生体試料を取得する工程；
b）該試料を、血中PD-L1と特異的な結合対を形成する作用物質に接触させ、それによって結合複合体を形成させる工程であって、このPD-1/PD-L1が、エクソソームまたは細胞外小胞の中に存在する、工程；
c）該試料から該結合複合体を除去し、それによってPD-1/PD-L1の血中レベルを激減させる工程。
【請求項２２】
前記試料が血液であり、前記接触および除去が血漿交換中に起きる、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
ろ過された血液が対象に再注入される、請求項22記載の方法。
【請求項２４】
前記癌が、黒色腫、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、鼻咽頭癌、リンパ腫、メルケル細胞癌、ミスマッチ修復欠損を有する癌、または抗PD1/PDL1療法で治療され得るその他の癌からなる群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２５】
癌患者から取得した生体試料における、免疫細胞由来タンパク質含有エクソソーム、細胞外放出小胞、エクトソーム、アポトーシス小体、およびオンコソームからなる群より選択される免疫細胞由来タンパク質含有小胞を検出する方法であって、
i）該試料を、該免疫細胞由来タンパク質に特異的に結合する1つまたは複数の試薬に接触させる工程；および
ii）該免疫細胞由来タンパク質含有小胞に結合した該1つまたは複数の試薬を含む結合複合体の形成を検出する工程
を含み、該免疫細胞由来タンパク質が、CD109、CD151、CD276、CD44、CD46、CD47、CD55、CD58、CD59、CD70、CD9、CD95、CD97、CD99、およびB7H4からなる群より選択される、前記方法。
【請求項２６】
CD63およびCD81を含むエクソソームの単離をさらに含む、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
Akt、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、セルピンH1、VEGFC、R-RAS、およびHLA-G5のうち1つまたは複数、またはそれらの変異体を含むエクソソームの単離をさらに含み、該エクソソームが、抗癌療法の前および後に単離される、請求項4記載の方法。
【請求項２８】
BRAF、NRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、KRAS、MET、RET、RHOA、ARID1A、CDH1、またはそれらの変異体を含むエクソソームの単離をさらに含み、該エクソソームが、抗癌療法の前および後に単離される、請求項4記載の方法。
【請求項２９】
癌患者から取得した生体試料における、免疫細胞由来タンパク質含有エクソソーム、細胞外放出小胞、エクトソーム、アポトーシス小体、およびオンコソームからなる群より選択される免疫細胞由来タンパク質含有小胞を検出する方法であって、
i）該試料を、該免疫細胞由来タンパク質に特異的に結合する1つまたは複数の試薬に接触させる工程；および
ii）該免疫細胞由来タンパク質含有小胞に結合した該1つまたは複数の試薬を含む結合複合体の形成を検出する工程
を含み、該免疫細胞由来タンパク質が、CD3、CD4、CD8、CD11、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD25、CD27、CD38  CD45、CD68、CD80、CD86、CD138、CD152、CD160、CD223、CD244、CD274、CD276、およびCD366からなる群より選択され、該エクソソームまたは該細胞外小胞中の該免疫細胞タンパク質の存在が、該免疫細胞の種類または機能状態を示す、前記方法。
【請求項３０】
前記試料を、CD9、CD63、およびCD81に特異的に結合する試薬とともにインキュベートする工程をさらに含む、請求項29記載の方法。
【請求項３１】
癌患者から取得した生体試料における、免疫細胞由来タンパク質含有エクソソーム、細胞外放出小胞、エクトソーム、アポトーシス小体、およびオンコソームからなる群より選択される免疫細胞由来タンパク質含有小胞を検出する方法であって、
i）該試料を、該免疫細胞由来タンパク質に特異的に結合する1つまたは複数の試薬に接触させる工程；および
ii）該免疫細胞由来タンパク質含有小胞に結合した該1つまたは複数の試薬を含む結合複合体の形成を検出する工程
を含み、該免疫細胞由来タンパク質が、CD3、CD4、CD8、CD11、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD25、CD27、CD38  CD45、CD68、CD80、CD86、CD138、CD152、CD160、CD223、CD244、CD274、CD276、およびCD366からなる群より選択される、前記方法。
【請求項３１】
前記請求項いずれか一項記載の方法を実施するためのキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2017年11月9日に提出された米国仮出願第62/583,901号に対する優先権を主張するものであり、その全文が提示されているものとして、参照によりその全内容が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本発明は、米国衛生研究所助成金番号：GM085146およびCA174523の助成金による政府支援を受けてなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有している。
【０００３】
発明の分野
本発明は、腫瘍学、免疫療法、および医薬の各分野に関連する。より具体的には、本発明は、臨床医が、治療に対する応答をモニターしたり、治療から最も恩恵を受けそうな患者を同定したりするのを助けるバイオマーカー、およびそれらを使用する方法、ならびに癌の転移を阻害する新たな治療法を提供する。また、本明細書に開示されているマーカーは、癌治療に有用な治療薬を同定するためのアッセイにも役立つ。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
本発明が属する最新技術分野を説明するために、本明細書を通じていくつかの刊行物および特許文献が引用されている。それら引用文献の各々が、その全文が提示されているものとして、参照により本明細書に組み入れられる。
【０００５】
PD-L1、PD-L2、B7H3、およびB7H4などの免疫チェックポイントリガンドは、腫瘍細胞など様々な細胞型で発現されている膜貫通型タンパク質である。これらのタンパク質は、活性化されたT細胞上でPD-1などのレセプターに結合して免疫チェックポイント応答を誘導するため、免疫抑制において非常に重要な役割を果たしている（Dong et al., 2002）。免疫チェックポイントシグナル伝達経路が同定されたことから、多くの種類の癌を治療するために免疫チェックポイント阻害療法の開発が始まった。例えば、PD-L1/PD-1系を標的とする遮断抗体が、転移性黒色腫を含む、複数の固形腫瘍の治療において際立って有望であることが示されている（Chen and Han, 2015; Topalian et al., 2016）。しかしながら、ほんの少数の患者しかこの療法に応答せず、その応答はしばしば不完全または短期的である（Ribas et al., 2016; Zaretsky et al., 2016）。 
【０００６】
PD-L1を介した免疫抑制の最新モデルは、腫瘍細胞表面上のPD-L1とT細胞上のPD-1との直接の相互作用を中心にしている。この相互作用は、T細胞の機能的「消耗」またはアポトーシスを誘導する強力な阻害シグナルをもたらす（Chen and Han, 2015; Topalian et al., 2016）。癌細胞表面上のPD-L1は、免疫圧に対する適応応答として、免疫細胞を局所的に不活性化することができる（Juneja et al., 2017; Lau et al., 2017）。しかしながら、いくつかの臨床観察は、癌細胞表面PD-L1だけが生物学的に活性型のPD-L1ではないことも示唆している。PD-L1は、癌細胞の表面上だけでなく、細胞質中にも存在している（Chowdhury et al., 2016; Mahoney et al., 2015; Obeid et al., 2016; Sznol and Chen, 2013）。さらに、可溶性PD-L1タンパク質は、黒色腫、腎細胞癌、肝細胞癌、多発性骨髄腫、およびB細胞リンパ腫の患者の血液試料中においても確認されており、PD-L1タンパク質の血中レベルは、腫瘍の進行および患者の全生存期間と相関すると思われる（Finkelmeier et al., 2016; Frigola et al., 2011; Rossille et al., 2014; Wang et al., 2015; Zhou et al., 2017）。
【０００７】
免疫チェックポイント阻害療法の近年における成功にもかかわらず、患者の応答は、しばしば不完全または短期的である。腫瘍細胞と免疫系との相互作用をよりよく分子的に理解することが、現行の治療法を改善し、治療に応答する可能性が最も高い患者を同定するために必要である。
【発明の概要】
【０００８】
本発明において、抗癌療法に応答する対象を同定する方法が提供される。典型的な方法は、処置前に対象から採取される第一の生体試料を取得する工程、１種または複数種の抗癌剤を該対象に投与し、かつ処置された該対象から第二の生体試料を採取する工程、該第一および第二の生体試料における循環血液中の細胞外小胞PD-L1および／またはインターフェロンγ（IFNγ）のレベルを検出する工程、ならびに該第一の生体試料と比較して、該第二の生体試料において細胞外小胞PD-L1および／またはIFNγのレベルが増加している場合に、処置に応答する対象を同定する工程、および／または、該第一の生体試料と比較して、該第二の生体試料において細胞外小胞PD-L1とIFNγのレベルが増加している場合に、該対象が処置に応答性であると同定する工程を含む。
【０００９】
一つの局面において、癌は黒色腫であり、抗癌療法は、PD-1/PD-L1に対するものであって、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、癌治療のためにPD1/PDL1を免疫学的に特異的に標的とする抗体、および癌治療のためにPD1/PDL1を特異的に標的とする低分子を含むが、それらに限定されるわけではない。本明細書に記載される方法を用いて評価または治療されるその他の癌は、例えば、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌、食道癌、鼻咽頭癌、リンパ腫、メルケル細胞癌、ミスマッチ修復欠損を有する癌、または抗PD1/PDL1療法で治療され得るその他の癌を含む。
【００１０】
上記したように、第一および第二の試料は、処置の前後に採取される。また、この方法は、第二の試料を得た後、さらに引き続き試料を採取して、対象における病状をモニターする工程を含むこともできる。第二の試料は、癌を治療するために利用される治療計画および治療している癌の具体的なタイプに応じて、治療後数日内、数週間内、または数か月内に採取することができる。第二の試料は、第一の試料が採取されてから1週間、2週間、3週間、4週間、6週間、8週間、9週間、10週間、12週間、または16週間程度後に得ることができる。場合によっては、試料は治療後、例えば、2日、3日、4日、5日、6日、7日、または10日置いて取得することができる。
【００１１】
ある特定の態様において、該方法は、該処置前の血中細胞外小胞PD-L1タンパク質レベルと該処置後の血中細胞外小胞PD-L1タンパク質レベルの比率を決定する工程をさらに含む。また、該方法は、該処置前のIFNγレベルと該処置後のIFNγレベルの比率を決定する工程を含む。他の態様においては、処置の前および後に、PD-L1レベルとIFNγレベルの比率が決定される。上記の方法は、悪性の形質転換または進行に関連した１種または複数種のタンパク質、例えば、Akt、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、SerpinH1、VEGFC、R-RAS、HLA-G5、BRAF、NRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、KRAS、MET、RET、RHOA、ARID1A、CDH1、またはそれらの変異体を含むエクソソームを含む細胞外小胞を単離する工程であって、エクソソームを含む該細胞外小胞が、任意で抗癌療法の前と後に単離されていてもよい工程をさらに含む。
【００１２】
また、癌患者から得た生体試料において、PD-L1エクソソーム、細胞外小胞、エクトソーム、アポトーシス小体、およびオンコソームからなる群より選択される癌細胞由来PD-L1含有小胞を検出する方法も提供される。そのような方法の一つは、該試料を、PD-L1に特異的に結合する1つまたは複数の試薬と接触させる工程、および該癌由来PD-L1含有小胞に結合した該1つまたは複数の試薬を含む結合複合体の形成を検出する工程を含む。この方法は、該結合複合体から該PD-L1含有小胞を単離する工程をさらに含むことができる。
【００１３】
本発明の別の局面において、癌タンパク質含有エクソソームまたは癌タンパク質含有細胞外小胞を生体液試料から単離するための方法が提供される。例示的な方法は、患者から試料を取得する工程、その試料を、該癌タンパク質に特異的に結合する試薬とともにインキュベートする工程、およびその試薬を分離して、癌タンパク質を含むエクソソームまたは細胞外小胞を該試料から単離する工程を含み、ここで、該癌タンパク質は、BRAF、NRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、MET、RET、RHOA、ARID1A、およびCDH1、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、SerpinH1、VEGFC、R-RAS、HLA-G5、およびこれらの変異体からなる群より選択され、該エクソソーム内または該細胞外小胞中の該癌タンパク質の存在が、癌を示す。ある特定の態様において、このようなタンパク質の存在は転移性癌と関連している。この方法は、CD63またはCD274に特異的に結合する試薬とともに試料をインキュベートする工程をさらに含むことができる。
【００１４】
また、本発明は、循環細胞外小胞および／またはエクソソームの異常なPD-L1レベルを伴う転移性癌を治療する方法も提供する。例示的な方法は、患者から試料を得る工程；該試料を、血中PD-L1と特異的結合対を形成する作用物質に接触させ、それによって結合複合体を形成させる工程であって、このPD-1/PD-L1が、エクソソームまたは細胞外小胞の中に存在する、工程；該結合複合体を該試料から除去し、それによってPD-1/PD-L1の血中レベルを激減させる工程を含む。好適な態様において、試料は血液であり、上記の接触と除去は血漿交換中に起こる。この手法では、ろ過された血液が対象に再注入される。前記の方法を用いて治療される癌は、黒色腫、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌、リンパ腫、メルケル細胞癌、ミスマッチ修復欠損を有する癌、または抗PD1/PDL1療法で治療され得るその他の癌を含むが、それらに限定されるわけではない。
【００１５】
本発明の別の局面においては、癌患者から得た生体試料において免疫細胞由来タンパク質含有小胞を検出する方法が開示される。ある特定の態様において、小胞は、免疫細胞由来タンパク質含有エクソソーム、細胞外放出（shedding）小胞、エクトソーム、アポトーシス小体、およびオンコソームからなる群より選択される。単離は、該免疫細胞由来タンパク質に特異的に結合する1つまたは複数の試薬と接触させること、および該免疫細胞由来タンパク質含有小胞に結合した該1つまたは複数の試薬を含む結合複合体の形成を検出することによって行われ、ここで、該免疫細胞由来タンパク質は、CD109、CD151、CD276、CD44、CD46、CD47、CD55、CD58、CD59、CD70、CD9、CD95、CD97、CD99、およびB7H4のうちの1または複数からなる群より選択される。この方法は、CD63およびCD81を含むエクソソームの単離をさらに含むことができる。
【００１６】
また、免疫細胞由来タンパク質含有細胞外小胞を、癌患者から得た生体試料中から検出する方法も提供される。このような小胞は、免疫細胞由来タンパク質含有エクソソーム、細胞外放出小胞、エクトソーム、アポトーシス小体、およびオンコソームなどであるが、それらに限定されるわけではない。例示的な方法は、該試料を、免疫細胞由来タンパク質に特異的に結合する1つまたは複数の試薬と接触させる工程、および該免疫細胞由来タンパク質含有小胞に結合した該1つまたは複数の試薬を含む結合複合体の形成を検出する工程を含み、ここで、該免疫細胞由来タンパク質は、IFNγからなる群より選択され、該エクソソームまたは該細胞外小胞の中に該免疫細胞タンパク質が存在することが、該免疫細胞の種類または機能状態を示している。上記の方法は、さらに、CD9、CD63、およびCD81に特異的に結合する試薬とともに試料をインキュベートする工程を伴うことができる。検出される他の免疫細胞由来タンパク質含有小胞は、例えば、CD3、CD4、CD8、CD11、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD25、CD27、CD38 CD45、CD68、CD80、CD86、CD138、CD152、CD160、CD223、CD244、CD274、CD276およびCD366のうち1つまたは複数を含む。
【００１７】
さらに別の態様において、上記の方法いずれかを実施するためのキットが提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図1A〜1N：黒色腫細胞由来のエクソソームは、その表面にPD-L1タンパク質を担持する。（図１Ａ）ヒト黒色腫細胞の培養上清から精製されたエクソソームの典型的なTEM画像。（図１Ｂ）NanoSightナノ粒子トラッキングシステムを用いた精製エクソソームの特性評価。（図１Ｃ）逆相タンパク質アレイ（RPPA）データの色分け図であり、全細胞ライセート（「WCL」）、および原発性または転移性の黒色腫細胞株によって分泌されたエクソソーム（「EXO」）におけるPD-L1のレベルを示している（左図）。Log2変換したRPPAデータを右図に示す。統計的解析については図2A参照。（図１Ｄ）さまざまな転移性黒色腫細胞株由来の全細胞ライセート（「W」）および精製エクソソーム（「E」）におけるPD-L1に対する免疫ブロット。全細胞ライセートとエクソソームタンパク質は同量ずつロードした。CD63、Hrs、Alix、およびTSG101を、エクソソームのマーカーとして用いた。ローディング対照としてGAPDHを用いた。（図１Ｅ）転移性黒色腫細胞によって分泌されたPD-L1が、エクソソームマーカーCD63、Hrs、Alix、およびTSG101と共分画されたことを確認した密度勾配遠心。（図１Ｆ）PD-L1の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体でイムノゴールド標識した黒色腫細胞由来エクソソームの典型的なTEM画像。矢印は、5-nmの金粒子を示している。（図１Ｇ）CD63被覆ビーズによるエクソソームPD-L1のフローサイトメトリー解析の概略図（左図）。フローサイトメトリーによって決定された、ヒト黒色腫細胞による、エクソソーム表面上へのPD-L1タンパク質の分泌（右図）。代表的な実験から得たPD-L1+エクソソームつきのビーズのパーセンテージが示されている。（図１Ｈ）PD-L1の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体を用いた、エクソソームPD-L1のELISAの概略図（左図）。ELISAにより決定された、ヒト黒色腫細胞により分泌されたエクソソーム表面上のPD-L1（右図）。（図１Ｉ）ELISAにより測定された、IFN-γ処理したか、またはしなかった黒色腫細胞により分泌されたエクソソーム上のPD-L1レベル。（図１Ｊ）IFN-γ処理をしたか、またはしなかった黒色腫細胞により分泌されたエクソソームを用いたPD-1結合アッセイ。（図１Ｋ）IFN-γ処理細胞（「IFN」）によって分泌されたエクソソームにおいて、PD-L1のレベルが、対照細胞（「C」）と比較して増加することを示すウエスタンブロット解析。IFN-γ処理細胞と対照細胞から同量のエクソソームタンパク質をロードした。（図１Ｌ）細胞内PD-L1およびエクソソームマーカーCD63の免疫蛍光染色。（図１Ｍ）HRSをノックダウンした黒色腫細胞における、CD63とPD-L1の細胞内蓄積（WCLにおいて）、およびCD63とPD-L1のエクソソーム分泌の減少（EXOにおいて）を示すウエスタンブロッティング。（図１Ｎ）PD-L1とHrsの免疫共沈降。データは、3回（図1C、1I）または2回（図1G、1H、1J）の独立した生物学的反復実験の平均値±標準偏差を表している。独立t検定により、***はP < 0.001である（図1I）。
【図２】図2A〜2E：黒色腫細胞による、PD-L1を担持するエクソソームの分泌。（図２Ａ）原発性黒色腫細胞株に比べ、転移性黒色腫細胞株の方が、より高いレベルのエクソソームPD-L1を分泌することを示す、Log2変換したRPPAデータ。データは、4つの原発性黒色腫細胞株（WM1552C、WM35、WM793、WM902B）および転移性黒色腫細胞株（UACC-903、1205Lu、WM9、WM164）の平均値±標準偏差を表している。（図２Ｂ）マウス黒色腫B16-F10細胞由来の全細胞ライセート（「WCL」）および精製されたエクソソーム（「EXO」）におけるPD-L1に対する免疫ブロット。全細胞ライセートとエクソソームタンパク質は同量ずつロードした。Hrs、Alix、およびTSG101をエクソソームマーカーとして用いた。（図２Ｃ）細胞内PD-L1およびHrsの免疫蛍光染色。（図２Ｄ）HRSのノックダウンが、ヒト黒色腫WM9細胞におけるPD-L1蓄積をもたらすことを示すフローサイトメトリー解析。データは、3回の独立した生物学的反復実験の平均値±標準偏差を表している。（図２Ｅ）IFN-γ処理したWM9細胞の培養培地から免疫沈降させたPD-L1タンパク質の免疫ブロット。ウエスタンブロッティングは、PD-L1の細胞内ドメイン（クローンE1L3N）および細胞外ドメイン（クローンE1J2J）をそれぞれ標的とする2種類の異なるモノクローナル抗体を用いて行った。図2Eにおいて、三角は、グリコシル化された完全長PD-L1を示し、丸は、細胞外ドメインのみを含むPD-L1を示している。独立t検定により、*はP < 0.05、**は、P < 0.01である（図2A、2D）。
【図３】図3A〜3I：転移性黒色腫患者において、循環PD-L1タンパク質の大部分はエクソソーム上に担持されている。（図３Ａ）ヒト黒色腫異種移植片保有マウスまたは対照マウスに由来する血漿試料における、ヒトPD-L1タンパク質の細胞外ドメインを特異的に認識するモノクローナル抗体を用いた、ヒト黒色腫細胞由来エクソソームPD-L1のELISAの概略図。（図３Ｂ）ELISAにより測定された、対照ヌードマウス（n=10）またはヒト黒色腫異種移植片保有ヌードマウス（n=10）の血漿試料から単離されたエクソソーム上のPD-L1のレベル。（図３Ｃ）エクソソームPD-L1の血漿中レベルと、ヒト黒色腫異種移植片保有ヌードマウスにおける腫瘍負荷とのピアソン相関。（図３Ｄ）IV期黒色腫患者の血漿試料から精製された循環エクソソームの典型的なTEM画像。（図３Ｅ）12人のIV期黒色腫患者（「P1」から「P12」として示されている）の血漿試料から精製されたエクソソームにおけるPD-L1に対する免疫ブロット。Hrs、Alix、およびTSG101を含むエクソソームマーカー、ならびにTYRP-1、TYRP-2、およびMART-1を含む黒色腫特異的マーカーもテストされた。（図３Ｆ）患者血漿中で検出された全循環PD-L1のレベルで、エクソソームPD-L1のレベルを割り算して算出された、エクソソーム画分における循環PD-L1のパーセンテージ。（図３Ｇ）健常なドナー（「HD」と表示されている、n＝11）および黒色腫患者（「MP」と表示されている、n＝30）における循環エクソソームのPD-L1のレベルを示すELISA。（図３Ｈ）健常なドナー（n＝11）と比較した、転移性黒色腫患者（n＝30）における循環エクソソームのPD-L1レベルのROC曲線解析。（図３Ｉ）測定可能な腫瘍負荷を有する黒色腫患者（n＝30）またはそれを有さない者（n＝11）における、循環エクソソームのPD-L1レベルを示すELISA。データは、独立t検定による平均値±標準偏差、**はP < 0.01、***はP < 0.001を表している（図3B、3G、3I）。
【図４】図4A〜4D：黒色腫細胞は、エクソソームPD-L1を循環内に分泌する。（図４Ａ）ELISAにより解析したところ、ヒトPD-L1タンパク質の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体は、組換えヒトPD-L1タンパク質を特異的に認識したが、組換えマウスPD-L1タンパク質は認識しなかった。（図４Ｂ）ヒトPD-L1タンパク質の細胞外ドメインに対するモノクローナル抗体は、ヒトエクソソームPD-L1を特異的に検出するが、マウスエクソソームPD-L1 は検出しない。（図４Ｃ）ブラッドフォード・タンパク質アッセイ法により測定された、対照ヌードマウス（n=10）およびヒト黒色腫異種移植片保有ヌードマウス（n=10）の血漿中エクソソームのレベル。（図４Ｄ）対照ヌードマウス（n=10）およびヒト黒色腫異種移植片保有ヌードマウス（n=10）の血漿中の全循環エクソソームタンパク質１μg当たりの循環エクソソームPD-L1のレベル（ng）。（図４Ｅ）循環PD-L1タンパク質が、エクソソームマーカーHrsおよびTSG101（通常1.13から1.19 g/ml）、ならびに黒色腫特異的マーカーTYRP-2とともに共分画されることを示す標準密度勾配遠心解析。データは、独立t検定による平均値±標準偏差を示し（図4B〜4D）、*はP < 0.05、***はP < 0.001を示す（図4C〜4D）。
【図５】図5A〜5D：PD-L1発現を伴うかまたは伴わないMEL624細胞によって分泌されたエクソソームPD-L1の特性評価と定量化。（図５Ａ）対照（MEL624）またはPD-L1発現ヒト黒色腫MEL624細胞（PD-L1/MEL624）によって分泌されるエクソソームにおけるPD-L1のレベルを示すRPPAデータの色分け図。Log2変換されたデータを上部に示す。（図５Ｂ）MEL624細胞またはPD-L1/MEL624細胞からの全細胞ライセート（「W」）または精製されたエクソソーム（「E」）におけるPD-L1に対する免疫ブロット。各細胞株につき同量の全細胞ライセートおよびエクソソームタンパク質をロードした。CD63、Hrs、Alix、およびTSG101をエクソソームマーカーとして用いた。GAPDHをローディング対照として用いた。（図５Ｃ）ELISAにより決定された、MEL624細胞またはPD-L1/MEL624細胞によって分泌されたエクソソームの表面上のPD-L1。（図５Ｄ）ELISAにより測定された、MEL624細胞またはPD-L1/MEL624細胞によって分泌されたエクソソームのPD-L1レベル。データは、3回（図5A、5D）または2回（図5C）の独立した生物学的反復実験の平均値±標準偏差を表している。***は、独立t検定によるP < 0.001である（図5D）。
【図６】図6A〜6L：エクソソームPD-L1は、インビトロおよびインビボにおいてCD8 T細胞を阻害して黒色腫の進行を促進する。（図６Ａ）IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしにMEL624細胞由来エクソソームまたはPD-L1/MEL624細胞由来エクソソームで処理した後、Ki-67およびGzmBの発現について試験したヒト末梢CD8 T細胞の典型的な等高線プロット（左図）。抗CD3/CD28抗体により刺激されたKi-67+GzmB+ CD8 T細胞のパーセンテージを右図に示す。（図６Ｂ〜６Ｃ）IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしに黒色腫WM9細胞由来エクソソームで処理した後に、Ki-67およびGzmBの発現について試験したヒト末梢PD-1+ CD8 T細胞またはPD-1- CD8 T細胞（抗CD3/CD28抗体により刺激された細胞）の典型的な等高線プロット（図6B）、およびKi-67+GzmB+であるPD-1+ CD8 T細胞またはPD-1- CD8 T細胞のパーセンテージ（図6C）。（図６Ｄ）IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしにWM9細胞由来エクソソームで処理した後に、アネキシンVで染色した（抗CD3/CD28抗体により刺激された）ヒト末梢PD-1+ CD8 T細胞の典型的なヒストグラム（左図）。アネキシンV+ 細胞の割合を右図に示す。（図６Ｅ〜６Ｆ）CD8 T細胞介在性腫瘍細胞死滅アッセイを、MEL624細胞において行った。抗CD3/CD28によって刺激されたCD8 T細胞を、IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしにPBS（対照）、MEL624細胞由来エクソソーム、またはPD-L1/MEL624細胞由来エクソソームで処理した後に、MEL624細胞とともに96時間共培養した。生き残った腫瘍細胞をクリスタルバイオレット染色して可視化し（図6E）、腫瘍細胞（刺激されたCD8 T細胞と共培養されたもの）の相対的生存を算出した（図6F）。（図６Ｇ）IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしにB16-F10細胞由来エクソソームで処理したマウスにおけるPD-L1ノックダウンB16-F10腫瘍の体積を、細胞接種後2〜3日毎に測定した（各グループにつきn = 6）。（図６Ｈ〜６Ｉ）IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしにB16-F10細胞由来エクソソームで処理した後の担癌マウスの生存（各グループにつきn = 6）。全体のログランク（log-rank）P値が示されており（図6H）、二元配置比較にはウィルコクソン検定が用いられた（図6I）。（図６Ｊ）腫瘍組織におけるCD8 TILの典型的な免疫蛍光染色画像。（図６Ｋ）免疫蛍光染色によって決定された、PD-L1ノックダウンB16-F10腫瘍におけるCD8 TILの数。示されているのは10高倍率視野（HPF）から定量された細胞数である（平均値±標準偏差）。（図６Ｌ）IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしにB16-F10細胞由来エクソソームで処理した後にKi-67発現について試験されたCD8 TILまたは脾臓CD8 T細胞の典型的な等高線プロット（上図）。全細胞とKi-67+であるPD-1+ CD8 TILまたは脾臓CD8 T細胞の割合を下図に示す（各グループにつきn = 4〜6）。データは、2回（図6A、6C）または3回（図6D、6F）の独立した生物学的反復実験の平均値±標準偏差を表している。独立t検定（図6A、6C、6D、6F、6K、6L）または二元配置ANOVA（図6L）による*はP < 0.05、**はP < 0.01、***はP < 0.001である。「NS」は有意性なしを意味する。
【図７】図7A〜7C：エクソソームPD-L1によるCD8 T細胞の機能阻害。（図７Ａ）ヒト黒色腫WM9細胞由来エクソソームで処理した後に、Ki-67およびGzmBの発現について試験したヒト末梢CD8 T細胞の典型的な等高線プロット（左図）。Ki-67+GzmB+ CD8 T細胞（抗CD3/CD28抗体によって刺激された細胞）のパーセンテージを右図に示す。（図７Ｂ）抗PD-1遮断抗体の存在下または非存在下、WM9細胞由来エクソソームで処理した後、Ki-67およびGzmBの発現について試験したヒト末梢PD-1+ CD8 T細胞またはPD-1- CD8 T細胞（抗CD3/CD28抗体によって刺激された細胞）の典型的な等高線プロット（左図）。Ki-67+GzmB+であるPD-1+ CD8 T細胞またはPD-1- CD8 T細胞のパーセンテージを右図に示す。（図７Ｃ）CD8 T細胞介在性腫瘍細胞死滅をMEL624細胞においてアッセイした。抗CD3/CD28抗体によって刺激したCD8 T細胞を、IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしにPBS（対照）またはWM9細胞由来エクソソームで処理した後に、MEL624細胞とともに96時間共培養した。生き残った腫瘍細胞をクリスタルバイオレット染色によって可視化した。腫瘍細胞（刺激されたCD8 T細胞と共培養された細胞）の相対的生存を左下図に示す。データは、2回（図7A）または3回（図7B、7C）の独立した生物学的反復実験の平均値±標準偏差を表している。独立t検定による*はP < 0.05、**はP < 0.01、***はP < 0.001である（図7A〜7C）。
【図８】図8A〜8C：マウス黒色腫B16-F10細胞によって分泌されるエクソソームPD-L1は、マウス脾臓CD8 T細胞の阻害およびアポトーシスをもたらす。（図８Ａ）IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしにB16-F10細胞由来エクソソームで処理した後に、Ki-67およびGzmBの発現について試験したマウス脾臓の全細胞、PD-1+ CD8 T細胞またはPD-1- CD8 T細胞（抗CD3/CD28抗体で刺激した細胞）の典型的な等高線プロット（上図）。Ki-67+GzmB+である全細胞、PD-1+ CD8 T細胞またはPD-1- CD8 T細胞のパーセンテージを下図に示す。（図８Ｂ）B16-F10細胞由来エクソソームによって誘導された、マウス脾臓の全細胞、PD-1+ CD8 T細胞、またはPD-1- CD8 T細胞のアポトーシス。（図８Ｃ）IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしにB16-F10細胞由来エクソソームで処理した後に、アネキシンVで染色したマウス脾臓のPD-1+ CD8 T細胞の典型的なヒストグラム（上図）。アネキシンV+ 細胞のパーセンテージを下図に示す。データは、2回（図8A）または3回（図8B、8C）の独立した生物学的反復実験の平均値±標準偏差を表している。独立t検定による*はP < 0.05、**はP < 0.01である（図8A〜8C）。
【図９】図9A〜9E：エクソソームPD-L1は、インビボにおいてTリンパ球浸潤を減少させ、黒色腫の増殖を促進する。（図９Ａ）PD-L1ノックダウンを伴うか伴うことなしにPD-L1の発現について試験したB16-F10細胞の典型的なフローサイトメトリーヒストグラム（上図）。PD-L1に対するレンチウイルスshRNA（「shPD-L1」）または対照スクランブルshRNA（「shCTL」）を用いて、B16-F10細胞を、安定してPD-L1について枯渇させた。（図９Ｂ）対照（「shCTL」）B16-F10細胞またはPD-L1ノックダウン（「shPD-L1」）B16-F10細胞からの全細胞ライセート（「WCL」）および精製エクソソーム（「EXO」）におけるPD-L1に対する免疫ブロット。（図９Ｃ）細胞接種後23日目における、PD-L1ノックダウン（「shPD-L1」）B16-F10腫瘍または対照（「shCTL」）B16-F10腫瘍の体積（各グループにつきn = 6）。データは、独立t検定による平均値±標準偏差を表し、**はP < 0.01を表している。（図９Ｄ）PD-L1ノックダウン（「shPD-L1」）B16-F10腫瘍または対照（「shCTL」）B16-F10腫瘍を保有するマウスの生存（各グループにつきn = 6）。全体のログランクP値が示されている。（図９Ｅ）IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしにB16-F10細胞由来エクソソームで処理した後のC57BL/6マウスにおけるPD-L1ノックダウンB16-F10腫瘍の増殖を示す典型的な画像。
【図１０】図10A〜10K：循環エクソソームPD-L1のレベルによって、ペムブロリズマブに対する臨床応答者を非応答者から層別化する。（図１０Ａ）ペムブロリズマブに対する臨床応答を示す黒色腫患者と示さない黒色腫患者との間における、処置前の循環エクソソームPD-L1のレベルの比較。「R」：応答者、n = 11；「NR」:非応答者、n = 19。（図１０Ｂ）臨床非応答者と比較したときの応答者における、処置前の循環エクソソームPD-L1レベルに関するROC曲線解析。（図１０Ｃ）処置前の循環エクソソームPD-L1のレベルが多い患者と少ない患者に関する奏効率（「ORR」）。（図１０Ｄ）黒色腫患者の血漿におけるエクソソームPD-L1レベルに対するIFNγレベルのピアソン相関(n = 30)。（図１０Ｅ）処置前および処置中の連続した時点における循環エクソソームPD-L1のレベル（n = 23）。（図１０Ｆ）処置前および処置中の連続した時点での、臨床応答者（n = 10）と非応答者（n = 13）における循環エクソソームPD-L1のレベル。（図１０Ｇ）処置前および処置中の連続した時点での、臨床応答者におけるPD-1+Ki-67+ CD8 T細胞の頻度および循環エクソソームPD-L1のレベル。（図１０Ｈ）臨床応答者と非応答者における、6週目における循環エクソソームPD-L1レベルと3週目におけるPD-1+Ki-67+ CD8 T細胞の頻度とのピアソン相関。（図１０Ｉ）臨床応答者と非応答者における、6週目における循環エクソソームPD-L1レベルの変化倍率と、3週目におけるPD-1+Ki-67+ CD8 T細胞の変化倍率とのピアソン相関。（図１０Ｊ）臨床応答者と非応答者との間における、6週目の循環エクソソームPD-L1の変化倍率の比較。（図１０Ｋ）臨床非応答者と比較したときの応答者における6週目の循環エクソソームPD-L1の変化倍率に関するROC曲線解析。（図１０Ｌ）6週目における循環エクソソームPD-L1の変化倍率が大きい患者と小さい患者に関する奏効率。データは、独立t検定（図10A、10J）、対応t検定（図10E、10F）、またはフィッシャー直接検定（図10C、10L）による平均値±標準偏差を表し、*はP < 0.05、**はP < 0.01、***はP < 0.001であり、「NS」は有意性なしを表す。
【図１１】エクソソームPD-L1を介した免疫抑制のモデル。直接的な腫瘍細胞-T細胞相互作用に加えて、黒色腫細胞は、PD-L1タンパク質を表面上に担持する多数のエクソソームを分泌し、それらが、腫瘍微小環境内および循環内でT細胞と相互作用して、免疫系を全身において抑制する。IFNγは、エクソソームPD-L1をさらに上方制御して、腫瘍細胞が免疫系に適応するのにより有効な機構として働く。エクソソームPD-L1-T細胞相互作用は、抗PD-1抗体または抗PD-L1抗体によって遮断することができ、このことは、エクソソームPD-L1とT細胞PD-1との相互作用を破壊することが、最新のPD-L1/PD-1阻害療法に含まれていることを示唆している。
【図１２Ａ】図12A〜12C：循環エクソソームPD-L1は、抗PD-1療法の臨床転帰に関する、根拠に基づく臨床的に利用可能な予測因子である。抗PD-1処置前および処置中に循環エクソソームPD-L1のレベルを追跡することを利用して、早ければ処置に入って6週間で、抗PD-1療法に対する応答者（緑色）を非応答者（赤色）から層別化することができる。
【図１２Ｂ】図12A〜12C：循環エクソソームPD-L1は、抗PD-1療法の臨床転帰に関する、根拠に基づく臨床的に利用可能な予測因子である。抗PD-1療法に対する患者の応答を予測するために循環エクソソームPD-L1を適用するための概略図。抗PD-1療法に対し臨床応答する転移性黒色腫患者では、循環エクソソームPD-L1の処置前レベルは少ない。抗PD-1処置の6週間後、臨床応答者において循環エクソソームPD-L1のレベルが有意に増加するが、非応答者では増加しない。
【図１２Ｃ】図12A〜12C：循環エクソソームPD-L1は、抗PD-1療法の臨床転帰に関する、根拠に基づく臨床的に利用可能な予測因子である。処置前および処置中の両期間の循環エクソソームPD-L1レベルを追跡することで、療法の成功（緑色）または失敗（赤色）を判定するための指針が提供される。
【図１３】図13A〜13D：T細胞由来放出小胞の精製と特性評価。（図１３Ａ）NanoSightナノ粒子トラッキング解析（NTA）技術によって決定された、活性化T細胞および非活性化T細胞によって分泌された放出小胞とエクソソームのサイズ分布。「SV」：放出小胞；「EXO」：エクソソーム。（図１３Ｂ）NanoSightナノ粒子トラッキング解析（NTA）技術を用いた、活性化T細胞および非活性化T細胞によって分泌された放出小胞とエクソソームの定量化。（図１３Ｃ）Bio-Radブラッドフォード・タンパク質アッセイ法を用いた、活性化T細胞および非活性化T細胞によって分泌された放出小胞とエクソソームの総タンパク質レベルの測定。（図１３Ｄ）エクソソームマーカー、T細胞マーカー、および免疫調節タンパク質について、活性化T細胞および非活性化T細胞から精製された放出小胞およびエクソソームを免疫ブロッティングによって解析した。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
腫瘍細胞上のPD-L1は、リンパ球上のPD-1と相互作用して、免疫チェックポイント応答を引き起こす。本明細書に、本発明者らは、転移性黒色腫細胞も、PD-L1をその表面上に担持する高レベルのエクソソーム（以下、「PD-L1エクソソーム」と称する）を分泌することを報告する。
【００２０】
本発明者らは、エクソソームPD-L1タンパク質の分泌が、エンドソーム輸送選別複合体（ESCRT）機構の構成成分、特に、エンドソームタンパク質であるAlixによって制御されていることを報告する。さらに、インターフェロン-γ（IFN-γ）が、エクソソーム上のPD-L1のレベルを上方制御する。PD-L1エクソソームは、CD8 T細胞の機能を強力に抑制し、インビトロおよびインビボにおいて、腫瘍増殖を促進する。
【００２１】
転移性黒色腫の患者では、循環エクソソームPD-L1のレベルが、IFN-γのレベルと正に関連している。その上、処置前および処置中の循環エクソソームPD-L1のレベルはどちらも、抗PD-1療法に対する臨床応答と強く相関する。その結果、循環エクソソームPD-L1の変化パターンによって、臨床応答者と非応答者を層別化し、それよって、抗癌療法に対する応答の信頼できる予測因子が提供される。
【００２２】
エクソソームPD-L1タンパク質の同定と特性評価によって、黒色腫細胞が全身で免疫系と相互作用して戦う新たな分子機構が提示される。エクソソームPD-L1の免疫抑制機能を、このように同定することで、PD-L1/PD-1阻害療法の開発が促進され、この致死性の癌の進行を追跡するためのバイオマーカーが提供される。
【００２３】
以下の定義は、本発明を理解しやすくするために提示されるものである。
【００２４】
I．定義
本発明を目的とする場合において、単数形で表されている存在物は、1つまたは複数の存在物を意味する。例えば、「抗体」は、1つまたは複数のcDNAまたは少なくとも1つのcDNAを意味する。したがって、本明細書において、「1つの」、「1つまたは複数の」、および「少なくとも1つの」という用語は互換的に使用されている。「含む」、「包含する」、および「有する」という用語も、互換的に使用されている。さらに、「からなる群より選択される」化合物とは、その後に一覧されている化合物の1つまたは複数のものを意味し、それらの化合物の2つまたはそれよりも多いものの混合物（すなわち組み合わせたもの）を含む。本発明によれば、単離された、または生物学的に純粋な分子とは、その本来の環境から取り出された化合物のことである。そのため、「単離された」、または「生物学的に純粋な」とは、必ずしも、その化合物がどの程度精製されているのかを反映するものではない。本発明の単離された化合物は、その自然源から得ることができ、合成実験技術を用いて製造することができ、または、そのような任意の化学合成経路によって製造することができる。
【００２５】
「本質的に、…からなる」という語句は、特定のヌクレオチドまたはアミノ酸に言及する場合には、所与の配列番号（SEQ ID NO:）の性質を有する配列を意味する。例えば、アミノ酸配列に言及する場合には、この語句は、配列それ自体と、その配列の機能的かつ新規の特徴に影響を与えない分子改変とを含む。
【００２６】
「エクソソーム」および「細胞外小胞」という用語が、本明細書においては互換的に用いられており、さまざまな細胞型から放出される、エンドソームと原形質膜に由来する膜小胞を表現している。これらの細胞外小胞（EV）は、細胞間において、膜、ならびに細胞質のタンパク質、脂質、およびRNAを移送するための輸送手段として作用することで、細胞間コミュニケーションの重要な方法となっている。細胞外小胞すなわちエクソソームは、中間的細胞内区画（intermediate endocytic compartment）である多胞体（MVB）が原形質膜と融合すると細胞から放出される。このとき、腔内膜小胞（ILV）が細胞外環境内に遊離されて、エクソソームを放出する。アポトーシス小体やエクトソームなど別の種類の微小胞もあり、これらはそれぞれ、アポトーシスか原形質膜放出を起こした細胞に由来する。アポトーシス小体、エクトソーム、およびエクソソームはすべて、おおよそ同じ大きさ（通常40〜100 nm）であり、また、サイトゾルの「飲み込み（‘gulps’）」を含むが、小胞としては異種のものである。
【００２７】
「バイオマーカー」または「感受性マーカー」は、ある処置、例えば抗PD-1療法および／または抗PD-L1療法に対する示差的な感受性または応答性に関連するマーカーである。このようなマーカーは、核酸、それによってコードされるタンパク質、またはその他の低分子であるが、それらに限定されるわけではない。これらのマーカーを用いて、療法に対して応答する可能性が低い患者から、応答する可能性の高い患者を識別することができるという利益が得られる。また、それらは、療法への応答を調節するために標的とされることも可能であり、また、黒色腫やその他の癌を治療および管理する上で有効な、または協働的に作用する作用物質を同定するためのスクリーニングアッセイに用いることもできる。
【００２８】
バイオマーカーの検出は、標準的な組織学的方法および／または免疫検出法によって行うことができる。特定の態様において、マーカーは、任意のポリペプチド検出手段、またはポリペプチドの発現レベルの検出手段によって検出することができる。例えば、ポリペプチドは、任意の抗体検出法（例えば、免疫蛍光（IF）法、フローサイトメトリー、蛍光活性化細胞選別法（FACS））、抗原賦活化法、および／またはマイクロアレイ検出法を用いて検出することができる。マーカーポリペプチド、例えば、抗体、および抗体誘導体、および抗体断片に特異的に結合する試薬を用いることができる。その他用いることのできる技術は、例えば、捕捉アッセイ法（例えばELISA）、質量分析法（例えばLCMS/MS）、および／またはポリメラーゼ連鎖反応（例えばRT-PCR）などである。また、バイオマーカーは、そのバイオマーカーに対する抗体を標識した形で全身に投与した後、画像化することによって検出することもできる。
【００２９】
さらに別の手法において、エクソソームPD-L1タンパク質の検出法は、エクソソームの表面上にあるタンパク質を標識するための標識抗PD-L1など、蛍光標識または量子ドット標識された抗体を含む。エクソソームタンパク質を標識した後、NanoSight NS300分析装置を用いる光散乱式ナノ粒子トラッキング解析法（NTA）を利用して、10 nMほどの小ささの各小胞をモニターすることができる。タンパク質標識とサイズ測定をこうして組み合わせることで、懸濁液中のエクソソームタンパク質を可視化し、それらのブラウン運動を直接観察することが特異的にできるようになり、数分布による迅速で正確かつ高解像度のサイズデータ、およびデータ解析を目視により確認しつつ計数および濃度の測定値を得ることができる。
【００３０】
別の態様において、本明細書に記載されているような核酸検出技術によって、対象からの核酸試料を評価する。
【００３１】
別の態様において、バイオマーカーは、mRNA発現を測定することにより測定または検出される。定量的リアルタイムPCR （qRT-PCR）、Fluidigm、RNAseq (例えばIIlumina)、Affymetrix 遺伝子プロファイリング、NanoString nCounterプラットフォーム、またはナノポアシークエンシング（Oxford Nanopore Technologies）など数多くの技術が、自らの常識を用いてRNAレベルを測定する当業者によって用いられうる。
【００３２】
本明細書において用いられる場合、「固体マトリクス」という用語は、例えば、ビーズ、微小粒子、マイクロアレイ、微量滴定ウェルもしくは試験管の表面、試験紙もしくはフィルターなど、任意の様式を意味する。マトリクスの材料は、ポリスチレン、セルロース、ラテックス、ニトロセルロース、ナイロン、ポリアクリルアミド、またはアガロースであってもよい。
【００３３】
本明細書において用いられる場合、「標的核酸」とは、核酸の混合物中に存在する核酸の予め定義された領域であって、該定義された野生型領域が、病気と関連し得るかまたは関連し得るものではない少なくとも1つの既知のヌクレオチド変異を含む領域を意味する。核酸分子は、自然源からcDNAクローニングまたはサブトラクティブハイブリダイゼーションによって単離するか、人手によって合成することができる。核酸分子は、トリエステル合成法によって、または自動DNA合成装置を用いることによって、人手によって合成することができる。
【００３４】
本発明において用いられる核酸に関して、「単離された核酸」という用語が時々用いられる。この用語は、DNAについて用いられる場合、DNA分子は、それが由来する生物の本来のゲノム中で（5’から3’の方向に）直接隣接する配列から分離されたものを意味する。例えば、「単離された核酸」は、プラスミドやウイルスベクターなどのベクターに挿入されたDNA分子、または原核生物または真核生物のゲノムDNAに組み込まれたDNA分子を含んでいてもよい。また、「単離された核酸分子」はcDNA分子を含むこともできる。ベクター内に挿入された単離核酸分子は、本明細書において、時に、組換え核酸分子とも呼ばれる。
【００３５】
RNA分子に関し、「単離された核酸」という用語は、主に、上記定義のとおりの単離DNA分子によってコードされるRNA分子を意味する。あるいは、この用語は、「実質的に純粋な」形状で存在するよう、その天然の状態（すなわち、細胞または組織の中）で会合しているRNA分子から十分に分離されているRNA分子を意味することもできる。核酸について「豊富に」という用語を用いることは、特定のDNA配列またはRNA配列が、正常細胞またはその配列が由来する細胞におけるよりも、関心対象の細胞または溶液に存在する全DNAまたは全RNAに対して有意により高い（2〜5倍）割合を占めることを意味する。これは、存在する他のDNAまたはRNAの量を選択的に減少させるか、または、該特定のDNA配列またはRNA配列の量を選択的に増加させるか、または、これら2つを組み合わせることによって、人為的に引き起こすことができよう。しかしながら、「豊富に」は、別のDNA配列またはRNA配列が存在しないことを意味するものではなく、関心対象の配列の相対量が有意に増加していることを意味するにすぎない。
【００３６】
いくつかの目的にとっては、ヌクレオチド配列が精製された状態にあることが有利でもある。核酸について言うとき、「精製された」という用語は、絶対純度（均一な調製物など）を要求するものではなく、その配列が、本来の環境にあるときよりも相対的に純粋であるということを示すものである（本来のレベルと比較すると、このレベルは、例えばmg/mlという単位で、少なくとも2〜5倍多くなければならない）。cDNAライブラリーから単離された個々のクローンは、電気泳動的に均一になるまで精製することができる。これらのクローンから得られた、主張されるDNA分子は、全DNAまたは全RNAから直接得ることができる。cDNAクローンは天然には存在せず、むしろ、部分精製された天然物質（メッセンジャーRNA）を操作することを介して好適に得られる。mRNAからのcDNAライブラリー構築は、合成物質（cDNA）を作製することを含み、純粋な個々のcDNAクローンを、cDNAライブラリーを担う細胞をクローン選抜することによって、合成ライブラリーから単離することができる。こうして、mRNAからcDNAライブラリーを構築することと、他とは異なるcDNAクローンを単離することとを含む過程により、およそ天然のメッセージの10〜6倍の精製が得られる。すなわち、少なくとも一桁違う精製、好ましくは、二桁または三桁違う精製、より好ましくは、四桁または五桁違う精製が明確に想定される。したがって、「実質的に純粋な」という用語は、関心対象である化合物（例えば、核酸、オリゴヌクレオチドなど）を重量で少なくとも50〜60％含む調製物を意味する。より好ましくは、この調製物は、関心対象である化合物を少なくとも75重量％、最も好ましくは90〜99重量％含む。純度は、関心対象である化合物に適した方法で測定される。
【００３７】
「単離されたタンパク質」または「単離および精製されたタンパク質」という用語が、本明細書において何度か使用されている。この語は主に、本発明の単離された核酸分子の発現によって産生されるタンパク質を意味する。あるいは、この語は、天然ではそれと会合していると思われる他のタンパク質から十分に分離されていて、「実質的に純粋な」状態で存在しているタンパク質を意味する。「単離された」とは、他の化合物もしくは物質との人工もしくは合成の混合物を除外する意味でも、または基本的な活性の邪魔をしない不純物であって、例えば、不完全な精製、安定剤の添加、もしくは、例えば、免疫原製剤もしくは薬学的に許容される製剤に組み込んだせいで生じうる不純物が存在することを除外する意味でもない。
【００３８】
「PD-L1」は、この語が使われる文脈に応じて、ヒトPD-L1、または他の生物における相同体を意味しうる。ヒトPD-L1は、CD274、B7-H、B7H1、B7-H1、B7相同体1、MGC142294、MGC142296、PDCD1L1、PDCD1LG1、PDCD1リガンド1、PDL1、プログラム細胞死1リガンド1、およびプログラム細胞死リガンド1としても知られており、Uniprot番号Q9NZQ7およびNCBI遺伝子ID番号29126である。ヒトPD-L1は、ヒト9番染色体上のCD274遺伝子にコードされる290アミノ酸からなるI型膜貫通タンパク質である。マウスPD-L1のNCBI GenBank ID番号はADK70950.1である。
【００３９】
「癌タンパク質」は、悪性形質転換および悪性進行に関連するタンパク質である。このようなタンパク質は、変異を含んでいることもあり、含んでいないこともある。例示的な「癌タンパク質」は、BRAF、NRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、KRAS、MET、RET、RHOA、ARID1A、CDH1、Akt、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、セルピンH1、VEGFC、R-RAS、およびHLA-G5であるが、これらに限定されるわけではない。
【００４０】
免疫調節タンパク質は、免疫過程において悪性形質転換および悪性進行を調節する役割を果たすタンパク質である。このようなタンパク質は、例えば、CD109、CD151、CD276、CD44、CD46、CD47、CD55、CD58、CD59、CD70、CD9、CD95、CD97、CD99、およびB7H4であるが、これらに限定されるわけではない。
【００４１】
「相補的」という用語は、複数の好適な相互作用を互いに形成することができる2つのヌクレオチドを言い表す。例えば、アデニンとチミンは2つの水素結合を形成することができるため、これらは相補的である。同様に、グアニンとシトシンは3つの水素結合を形成することができるため相補的である。そのため、ある核酸配列が、チミン、アデニン、グアニン、およびシトシンという塩基配列を含む場合、この核酸分子に「相補」するものは、チミンの代わりにアデニン、シトシンの代わりにグアニン、グアニンの代わりにシトシン、およびシトシンの代わりにチミンを含む分子である。この相補分子は、元の核酸分子と最適な相互作用を形成する核酸配列を含むことができるため、このような相補分子は、その元の分子に対して、高い親和性をもって結合することができる。
【００４２】
単鎖核酸、特にオリゴヌクレオチドについて、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、当技術分野において一般的に用いられる所定の条件下で、そのようなハイブリダイゼーションを可能にするに足る相補的な（時に「実質的に相補的」といわれる）配列をもつ2つの単鎖ヌクレオチド分子間の会合を意味する。特に、この用語は、本発明の単鎖のDNA分子またはRNA分子の中に含まれる実質的に相補的な配列をもつオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを意味し、非相補的な配列の単鎖核酸をもつオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションを実質的に排除することを意味する。
【００４３】
例えば、特定の配列相同性をもつ核酸分子間におけるハイブリダイゼーションをもたらすのに必要とされるストリンジェンシー条件を計算するための1つの一般的な公式を以下に示す（Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory (1989)）：
Tm＝81.5℃＋16.6Log［Na+］＋0.41（％G+C）−0.63（％ホルムアミド）−600/二本鎖中の塩基対の数。
【００４４】
上記公式の例として、［Na+］=［0.368］および50％ホルムアミドを用い、GC含量を42％、そして、プローブの平均長を200塩基とすると、Tmは57℃である。二本鎖DNAのTmは、相同性が1％減少するごとに、1〜1.5℃ずつ低下する。したがって、42℃のハイブリダイゼーション温度を用いると、配列相同性が約75％よりも高い標的が観察と考えられる。
【００４５】
ハイブリダイゼーションと洗浄のストリンジェンシーは、主に、塩濃度と溶液の温度に依存する。一般的には、プローブがその標的にアニールする速度を最大化するためには、通常、ハイブリダイゼーションを、そのハイブリッドについて計算されたTmよりも20〜25℃低い塩条件と温度条件で行う。洗浄条件は、標的に対するプローブの同一性の程度にとって可能な限りストリンジェントにすべきである。一般的に、洗浄条件は、ハイブリッドのTmよりも約12〜20℃低くなるよう選択される。本発明の核酸に関し、中程度のストリンジェンシーでのハイブリダイゼーションは、6×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、および100μg/mlの変性サケ精子DNAの中で42℃にてハイブリダイゼーションを行い、2×SSCおよび0.5％SDSで55℃にて15分間洗浄するものであると定義される。高ストリンジェンシーハイブリダイゼーションは、6×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、および100μg/mlの変性サケ精子DNAの中で42℃にてハイブリダイゼーションを行い、1×SSCおよび0.5％SDSで65℃にて15分間洗浄するものであると定義される。非常に高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーションは、6×SSC、5×デンハルト溶液、0.5％SDS、および100μg/mlの変性サケ精子DNAの中で42℃にてハイブリダイゼーションを行い、0.1×SSCおよび0.5％SDSで65℃にて15分間洗浄するものであると定義される。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「オリゴヌクレオチド」という用語は、2個またはそれ以上の、好ましくは3個よりも多いリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドから構成される核酸分子であると定義される。オリゴヌクレオチドの正確なサイズは、様々な因子によって決まり、また、該オリゴヌクレオチドの具体的な適用および用途によって決まる。オリゴヌクレオチドは、プローブやプライマーを含むが、核酸分子の3個のヌクレオチドから全長に至る任意の長さであり得、ポリヌクレオチドの3個から全長に至る、あらゆる可能な数の連続した核酸を明示的に含む。好ましくは、オリゴヌクレオチドは、少なくとも長さ約10ヌクレオチドであり、より好ましくは、少なくとも長さ約15ヌクレオチドであり、より好ましくは、少なくとも長さ約20ヌクレオチドである。
【００４７】
ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）については、米国特許第4,683,195号、第4,800,195号、および第4,965,188号に記載されており、これらの文献の全開示内容が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「プローブ」という用語は、精製された制限酵素消化物におけるような天然に存在するものであると、合成により生産されたものであるとを問わず、該プローブに相補的な配列をもつ核酸にアニールするか、特異的にハイブリダイズすることができる、RNAまたはDNAのいずれかであるオリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、または核酸を意味する。プローブは、単鎖であっても二本鎖であってもよい。プローブの正確な長さは、温度、プローブの由来源、および使用する方法に応じて決められる。例えば、診察用途においては、標的配列の複雑さに応じ、オリゴヌクレオチドプローブは、典型的には、15ヌクレオチドから25、30、50、75、またはそれより多いヌクレオチドを含むが、より少ないヌクレオチドを含んでいてもよい。本明細書において、プローブは、特定の標的核酸配列の別々の鎖に相補的であるように選択される。これは、プローブが、一連の所定の条件下で、それぞれの標的鎖に「特異的にハイブリダイズ」またはアニールできるよう十分に相補的である必要があることを意味する。したがって、プローブの配列は、標的の完全な相補鎖を表す必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド断片が、プローブの5’末端または3’末端に付着していて、プローブ配列の残りの部分が、標的鎖に相補的であってもよい。あるいは、プローブ配列が、標的核酸の配列に特異的にアニールできるほどの相補性を持っているならば、非相補的な塩基やより長い配列が、プローブの中に散在していることも可能である。また、プローブは、標的を容易に検出できるよう、非天然標識で標識することもできる。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「プライマー」という用語は、RNAまたはDNAのいずれかであり、単鎖または二本鎖にいずれかであり、生体系に由来するか、制限酵素消化により作出されるか、または合成により生産されるオリゴヌクレオチドであって、適当な環境に置かれたときに鋳型依存性の核酸合成開始因子として機能的に作用することができるオリゴヌクレオチドを意味する。適当な核酸鋳型、核酸の適切なヌクレオシド三リン酸前駆体、ポリメラーゼ酵素、適切な補因子、ならびに適切な温度およびpHなどの条件を与えられると、プライマーは、ポリメラーゼの作用または類似の活性によるヌクレオチドの付加によって、その3’末端で伸長することができ、プライマー伸長産物を生じさせる。具体的な条件および用途上の必要性に応じて、プライマーの長さを変えることができる。例えば、診断用途においては、オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的には、15ヌクレオチドから25、30、50、75、またはそれより多いヌクレオチド長である。プライマーは、所望の鋳型に対して十分な相補性を有し、所望の伸長産物の合成を開始させ得るものでなければならない。すなわち、ポリメラーゼまたは類似の酵素による合成の開始に用いられるよう、プライマーの3’ヒドロキシル部分が適当に並置されるような仕方で所望の鋳型鎖にアニールできなければならない。プライマーの配列は、所望の鋳型の正確な相補鎖を表すものである必要はない。例えば、非相補的なヌクレオチド配列が、それ以外は相補的なプライマーの5’末端に付着していてもよい。あるいは、プライマー配列が、所望の鋳型鎖の配列に対して十分な相補性を有し、伸長産物を合成するための鋳型とプライマーの複合体を機能的にもたらすものであるならば、非相補的な塩基がオリゴヌクレオチドのプライマー配列中に散在していてもよい。
【００５０】
例えば、核酸またはタンパク質に関して「標識」または「検出可能部分」とは、核酸またはタンパク質に連結している場合、例えば、分光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、または化学的な手段によって、その核酸またはタンパク質を検出可能にする組成物を意味する。例示的な標識は、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光色素、酵素、ビオチン、ジゴキシゲニン、ハプテンなどがあるが、これらに限定されるわけではない。「標識された核酸またはオリゴヌクレオチドプローブ」とは、一般的に、リンカーまたは化学結合を介して共有的に、または、イオン結合、ファンデルワールス力、静電気引力、疎水性相互作用、もしくは水素結合を介して非共有的に標識に結合しているものであって、核酸またはプローブが存在することを、該核酸またはプローブに結合している標識の存在を検出することで検出できるようにするものである。
【００５１】
「化学療法剤」または「抗癌剤」とは、癌の治療に有効な化学物質である。化学療法剤の種類には、アルキル化剤、代謝拮抗剤、キナーゼ阻害剤、紡錘体毒性植物アルカロイド、細胞毒性／抗腫瘍性抗生物質、トポイソメラーゼ阻害剤、感光剤、抗エストロゲン剤および選択的エストロゲン受容体調節剤（SERM）、抗プロゲステロン剤、エストロゲン受容体下方調節剤（ERD）、エストロゲン受容体拮抗剤、黄体化ホルモン放出ホルモン拮抗剤、抗アンドロゲン剤、アロマターゼ阻害剤、EGFR阻害剤、VEGF阻害剤、RAF阻害剤、異常な細胞増殖または腫瘍増殖に関与する遺伝子の発現を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドが含まれるが、これらに限定されるわけではない。本発明の治療方法において有用な化学療法剤には、癌細胞の正常な機能の中のシグナル伝達経路における1つまたは複数の重要な段階を選択的に阻害してアポトーシスをもたらす作用物質が含まれうる。シグナル伝達阻害剤（STI）は、(i)例えば、STI 571（Gleevec）などのbcr/ablキナーゼ阻害剤；（ii）例えば、キナーゼ阻害剤（Iressa, SSI-774）および抗体（Imclone: C225 [Goldstein et al. (1995), Clin Cancer Res. 1:1311-1318]、およびAbgenix: ABX-EGF）などの上皮増殖因子（EGF）受容体阻害剤；（iii）例えば、Herceptin（商標）（トラスツズマブ）などのher-2/neu受容体阻害剤、および、例えば、L-744,832（Kohl et al. (1995), Nat Med. 1(8): 792-797）などのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）；（iv）例えば、ラパマイシン（例えば、Sekulic et al. (2000) Cancer Res. 60:3504-3513参照）など、AktファミリーキナーゼまたはAkt経路の阻害剤；（v）例えば、フラボピリドールおよびUCN-01などの細胞周期キナーゼ阻害剤（例えば、Sausville (2003) Curr. Med. Chem. Anti-Canc Agents 3:47-56参照）；ならびに（vi）例えば、LY294002（例えば、Vlahos et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:5241-5248参照）などのホスファチジルイノシトールキナーゼ阻害剤などであるが、これらに限定されるわけではない。特定の態様において、STIは、STI 571、SSI-774、C225、ABX-EGF、トラスツズマブ、L-744,832、ラパマイシン、LY294002、フラボピリドール、およびUNC-01からなる群より選択される。さらに別の態様において、STIはL-744,832である。
【００５２】
アルキル化剤として作用する化学療法剤は、クロラムブシル、シクロホスファミド、イソファミド（isofamide）、メクロレタミン、メルファラン、およびウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；チオテパなどのアジリジン；ブスルファンなどのメタンスルホン酸エステル；カルムスチン、ロムスチン、およびストレプトゾシンなどのニトロソウレア；シスプラチンおよびカルボプラチンなどの白金錯体；マイトマイシン、プロカルバジン、ダカルバジン、およびアルトレタミンなどの生体還元性アルキル化剤；DNA鎖切断剤（例えばブレオマイシン）；トポイソメラーゼII阻害剤（例えば、アムサクリン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、イダルビシン、ミトキサントロン、ドキソルビシン、エトポシド、およびテニポシド）；DNA副溝結合剤（例えばプリカミジン（plicamydin））；代謝拮抗剤（例えば、メトトレキサート、およびトリメトレキサートなどの葉酸拮抗剤；フルオロウラシル、フルオロデオキシウリジン、CB3717、アザシチジン、シタラビン、およびフロクスウリジンなどのピリミジン拮抗剤；メルカプトプリン、6−チオグアニン、フルダラビン、ペントスタチンなどのプリン拮抗剤；アスパラギナーゼ；ヒドロキシウレアなどのリボヌクレオチドレダクターゼ阻害剤）；チューブリン相互作用剤（例えば、ビンクリスチン、ビンブラスチン、およびパクリタクセル（タキソール））；ホルモン剤（例えば、エストロゲン、結合型エストロゲン；エチニルエストラジオール；ジエチルスチルベストロール；クロロトリアニセン；イデンエストロール；カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、メドロキシプロゲステロン、およびメゲストロールなどのプロゲスチン；ならびにテストステロン、プロピオン酸テストステロン、フルオキシメステロン、およびメチルテストステロンなどのアンドロゲン）；副腎皮質ステロイド（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン、メチルプレドニゾロン、およびプレドニゾロン）；黄体化ホルモン放出剤またはゴナドトロピン放出ホルモン拮抗剤（例えば、酢酸ロイプロリドおよび酢酸ゴセレリン）；ならびに抗ホルモン抗原（例えば、タモキシフェン、フルタミドなどの抗アンドロゲン剤；ならびにミトタンおよびアミノグルテチミドなどの抗アドレナリン剤）などであるが、これらに限定されるわけではない。好ましくは、化学療法剤は、パクリタクセル（Taxol（登録商標））、シスプラチン、ドセタキソール（docetaxol）、カルボプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、シクロホスファミド、CPT-11、5−フルオロウラシル（5-FU）、ゲムシタビン、エストラムスチン、カルムスチン、アドリアマイシン(ドキソルビシン)、エトポシド、亜ヒ酸、イリノテカン、およびエポチロン誘導体からなる群より選択される。PD-1/PD-L1指向性療法は、ペムブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、アベルマブ、デュルバルマブ、およびその他の開発中の抗PD1/PDL1抗体を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５３】
化合物または薬学的組成物の「治療有効量」とは、特定の障害または病気の症状を予防、抑制、または治療する上で有効な量を意味する。例えば、「治療有効量」は、動物、特にヒトにおける腫瘍の増殖または転移を調節するのに十分な量を意味することもでき、腫瘍の増殖やサイズを低下させること、または投与前に腫瘍が形成されていない動物において腫瘍増殖が生じるのを防止すること、すなわち予防的投与を含むが、これらに限定されるわけではない。
【００５４】
「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制当局により承認されていること、または米国薬局方もしくはその他一般に認知されている薬局方に、動物において、より具体的にはヒトにおいて使用できるものとしてリストされていることを表す。
【００５５】
「同時に」とは、（1）時間的に同時に、または（2）普通の治療スケジュールの過程の異なる時点でという意味である。
【００５６】
「連続的に」とは、方法の一成分を投与した後、別の成分を投与することを意味する。ある成分を投与した後、次の成分を、第一の成分の実質的に直後に投与するか、第一の成分の後、有効な期間を置いて次の成分を投与することができるが、ここで有効な期間とは、第一の成分を投与したことから最大限の恩恵を受けるのにかかる時間である。
【００５７】
「特異的な結合対」は、互いに特定の特異性を有し（または「特異的に結合し」）、正常な状態において、他の分子よりも優先的に互いに結合する特異的な結合メンバー（sbm）と結合相手（bp）とを含む。特異的な結合対の例は、抗原と抗体、リガンドと受容体、および相補的なヌクレオチド配列である。当業者は、その他多くの例を承知している。さらに、「特異的な結合対」または「特異的結合」という用語は、特異的結合メンバーとその結合相手の片方または両方が大きな分子の一部を含む場合にも適用することができる。特異的結合対が核酸配列を含む態様において、アッセイ条件下において互いにハイブリダイズする長さのものであり、好ましくは、10ヌクレオチド長よりも長く、より好ましくは、15または20ヌクレオチ長よりも長いであろう。
【００５８】
一般的に、免疫複合体形成の検出は、当技術分野において周知されており、数多くの手法を適用することによって行うことができる。これらの方法は、放射性タグ、蛍光タグ、生物学的タグ、および酵素タグのいずれかなどの標識またはマーカーを検出することに基づいている。このような標識の使用に関する米国特許は、米国特許第3,817,837号；第3,850,752号；第3,939,350号；第3,996,345号；第4,277,437号；第4,275,149号および第4,366,241号などであり、これらの各々が参照により本明細書に組み入れられる。当然ながら、当技術分野において知られているように、二次抗体などの二次結合リガンド、および／またはビオチン／アビジンリガンド結合配置（ligand binding arrangement）を用いることにより、さらなる利点を見出すことができよう。
【００５９】
「試料」、「患者試料」、または「生体試料」は、特定の分子、好ましくは感受性マーカー分子についてテストすることができる試料を一般的に意味する。試料には、細胞、血液などの体液、骨髄、血清、血漿、尿、唾液、涙、胸水などがあるが、これらに限定されるわけではない。
【００６０】
「診断マーカー」は、病気の検出、病気の進行や治療の効果の測定、または関心対象の過程の測定をする上で有用な特別の分子的特徴を有する、体内にある特異的な生化学物質である。
【００６１】
「対象」という用語は、動物およびヒトを指す。
【００６２】
「減少」、「減少している」、および「減少する」、ならびに「増加」、「増加している」、および「増加する」という用語は、あるパラメータの測定値が、適切な対照におけるそのパラメータの測定値と比較して、少なくとも10％、20％、30％, 40％、50％、60％、70％、80％、90％、100％、200％またはそれ以上変化する意味であることが意図される。
【００６３】
本明細書で使用される「抑制する」、「抑制」、「抑制している」、「低下した」、「低下」などという用語は、標的遺伝子産物の発現または機能のいずれかの減少を意味し、それまでの発現または機能の相対的減衰を含み、また、標的遺伝子産物の発現または機能の完全な停止も含む。
【００６４】
「抗体」または「抗体分子」は、特定の抗原に結合する任意の免疫グロブリンであり、抗体やそれらの断片を含む。この用語は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、キメラ抗体、単一ドメイン抗体（Dab）および二重特異性抗体を含む。本明細書において用いられる場合、抗体または抗体分子は、組換えによって作出された完全な免疫グロブリン分子、および免疫グロブリン分子の免疫学的活性部分、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、F(v)、scFv、scFv2、scFv-Fc、ミニボディ、ダイアボディ、テトラボディ、単一可変領域（例えば、可変重鎖領域、可変軽鎖領域）、二重特異性Affibody（登録商標）分子(Affibody, Bromma, Sweden)、およびペプタボディ（peptabodies）（Terskikh et al. (1997) PNAS 94:1663-1668）などであるが、これらに限定されるわけではないものを想定している。
【００６５】
本明細書において使用される場合、「免疫学的に特異的な」という用語は、関心対象のタンパク質または化合物の1つまたは複数のエピトープに結合するが、抗原性生体分子の混合集団を含む試料内の別の分子を実質的に認識して結合することのないタンパク質／ポリペプチド、特に抗体を意味する。
【００６６】
「薬学的に許容される」とは、連邦政府または州政府の規制当局により承認されていること、または米国薬局方もしくはその他一般に認知されている薬局方に、動物、より具体的にはヒトにおいて使用できるものとしてリストされていることを表す。
【００６７】
「担体」とは、例えば、本発明の活性薬剤とともに投与される希釈剤、免疫賦活剤、保存剤（例えばThimersol、ベンジルアルコール）、抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、可溶化剤（例えばTween 80、Polysorbate 80）、乳化剤、緩衝剤（例えばトリス塩酸、酢酸、リン酸）、増量物質（bulking substance）（例えばラクトース、マンニトール）、賦形剤、助剤、または媒体を意味する。薬学的に許容される担体は、水や油、例えば、ピーナッツ油、大豆油、鉱物油、ゴマ油など、石油、動物、植物、または合成に由来する油の滅菌液であることも可能である。水または塩水溶液、ならびにデキストロースおよびグリセロールの水溶液が、好ましくは担体として、特に注射用溶液用に使用される。組成物を、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の微粒子製剤の中に、またはリポソームもしくはミセルの中に取り込むことができる。このような組成物は、本発明の薬学的組成物の成分の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボクリアランス速度に影響する可能性がある。本発明の薬学的組成物は、例えば、液体状に調製したり、乾燥粉末状（例えば凍結乾燥状）に調製したりすることができる。適当な薬学的担体については、E.W. Martin著“Remington’s Pharmaceutical Sciences”（Mack Publishing Co., Easton, PA)；Gennaro, A. R., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott, Williams and Wilkins)；Liberman, et al., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y.; and Kibbe, et al., Eds., Handbook of Pharmaceutical Excipients, American Pharmaceutical Association, Washingtonにおいて説明されている。
【００６８】
本明細書において使用される「治療する」という用語は、病気にかかった患者に、患者の状態の改善（例えば、1つまたは複数の症状の改善）、病気の進行の遅延、および／または病気の治癒などの恩恵を与える、いずれかのタイプの処置を意味する。
【００６９】
II．癌を治療するための療法および組成物
本発明は、少なくとも1つの抗癌剤、好ましくは、薬学的に許容される担体に入れられたPD-1/PD-L1を特異的に標的とする作用物質を提供する。このような薬学的組成物は、癌を治療するため、それを必要としている患者に治療有効量で投与することができる。選択的にPD-1/PD-L1経路を標的とする作用物質は本明細書上記に提供されている。
【００７０】
薬学的組成物は、少なくとも1つのシグナル伝達阻害剤（STI）をさらに含むことができる（例えば、PCT/US04/05155およびPCT/US04/05154参照）。本明細書で上記したように、適当なSTIは、(i)例えば、STI 571（Gleevec）などのbcr/ablキナーゼ阻害剤；（ii）例えば、キナーゼ阻害剤（Iressa, SSI-774）および抗体（Imclone: C225 [Goldstein et al. (1995), Clin Cancer Res. 1:1311-1318]、および Abgenix: ABX-EGF）などの上皮増殖因子（EGF）受容体阻害剤；（iii）例えば、Herceptin（商標）（トラスツズマブ）などのher-2/neu受容体阻害剤、および、例えば、L-744,832（Kohl et al. (1995), Nat Med. 1(8): 792-797）などのファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（FTI）；（iv）例えば、ラパマイシン（例えば、Sekulic et al. (2000) Cancer Res. 60:3504-3513参照）など、AktファミリーキナーゼまたはAkt経路の阻害剤；（v）例えば、フラボピリドールおよびUCN-01などの細胞周期キナーゼ阻害剤（例えば、Sausville (2003) Curr. Med. Chem. Anti-Canc Agents 3:47-56参照）；ならびに（vi）例えば、LY294002（例えば、Vlahos et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:5241-5248参照）などのホスファチジルイノシトールキナーゼ阻害剤などであるが、これらに限定されるわけではない。あるいは、該少なくとも1つのPD-1/PD-L1剤および該少なくとも1つのSTIは、別々の薬学的組成物に入れることもできる。本発明の具体的な態様において、該少なくとも1つのPD-1/PD-L1剤および該少なくとも1つのSTIは、同時または連続的に患者に投与することができる。言い換えると、該少なくとも1つのPD-1/PD-L1剤をまず最初に投与するか、該少なくとも1つのSTIをまず最初に投与するか、または、該少なくとも1つのPD-1/PD-L1剤および該少なくとも1つのSTIを同時に投与することができる。さらに、複数のPD-1/PD-L1剤および/またはSTIを用いる場合には、それらの化合物はどのような順序で投与してもよい。
【００７１】
本発明の薬学的組成物は、少なくとも1つの化学療法剤をさらに含むことが可能である。適当な化学療法剤が、本明細書で上記されている。好ましい化学療法剤は、パクリタクセル（Taxol（登録商標））、シスプラチン、ドセタキソール、カルボプラチン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、メトトレキサート、シクロホスファミド、CPT-11、5−フルオロウラシル（5-FU）、ゲムシタビン、エストラムスチン、カルムスチン、アドリアマイシン(ドキソルビシン)、エトポシド、亜ヒ酸、イリノテカン、およびエポチロン誘導体などであるが、これらに限定されるわけではない。特定の態様において、化学療法剤はパクリタクセルである。別法として、該少なくとも1つの化学療法剤と該少なくとも1つのPD-1/PD-L1剤を別々の薬学的組成物に入れることも可能である。
【００７２】
本プロトコールを用いて治療することができる癌は、黒色腫、肺癌、肝臓癌、前立腺癌、結腸癌、腎臓癌、乳癌、頭頚部癌、膀胱癌、胃癌、リンパ腫、メルケル細胞癌、ミスマッチ修復欠損を有する癌、またはその他、抗PD-1/PDL-1療法で治療され得る癌などであるが、これらに限定されるわけではない。その他の癌は、神経膠芽腫、中皮腫、腎細胞癌、胃癌、肉腫、絨毛癌、皮膚基底細胞癌、および精巣上皮腫などであるが、これらに限定されるわけではない。
【００７３】
III．薬学的組成物および化合物の投与
本発明の薬学的組成物は、任意の適切な経路、例えば、注射によって、経口、経肺、局所、またはその他の投与方法で投与することができる。一般的に、本発明の薬学的組成物は、とりわけ、薬学的に許容される希釈剤、保存剤、可溶化剤、乳化剤、免疫賦活剤、および／または担体を含む。このような組成物は、さまざまな緩衝剤の内容物（例えば、トリス塩酸、酢酸、リン酸）、pHおよびイオン強度の希釈剤；ならびに界面活性剤および可溶化剤（例えば、Tween 80, Polysorbate 80）、抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム）、保存剤（例えば、Thimersol、ベンジルアルコール）および増量物質（例えば、ラクトース、マンニトール）などの添加剤を含むことも可能である。組成物を、ポリ乳酸、ポリグリコール酸などの高分子化合物の微粒子製剤の中に、またはリポソームの中に取り込むことも可能である。このような組成物は、本発明の薬学的組成物の成分の物理的状態、安定性、インビボ放出速度、およびインビボでのクリアランス速度に影響する可能性がある。例えば、参照により本明細書に組み入れられるRemington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. (1990, Mack Publishing Co., Easton, PA 18042), 1435-1712頁を参照。本発明の薬学的組成物は、例えば、液体状に調製したり、乾燥粉末状（例えば凍結乾燥状）に調製したりすることができる。
【００７４】
さらに別の態様において、本発明の薬学的組成物は、例えば、静脈内注入、埋め込み型浸透圧ポンプ、経皮吸収型貼付剤、リポソーム、またはその他の投与方法を用いる徐放性製剤にして送達することができる。特定の態様において、ポンプを使用することができる（Langer, 前記; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. (1987) 14:201; Buchwald et al., Surgery (1980) 88:507; Saudek et al., N. Engl. J. Med. (1989) 321:574参照)。別の態様において、高分子材料を用いることができる（Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Press: Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley: New York (1984); Ranger and Peppas, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. (1983) 23:61参照; また Levy et al., Science (1985) 228:190; During et al., Ann. Neurol. (1989) 25:351; Howard et al., J. Neurosurg. (1989) 71:105も参照)。さらに別の態様において、徐放性製剤を、動物の標的組織の近傍に置くことができ、したがって、必要となるのは全身投与量の一部のみである（例えば、Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, 前記, (1984) vol. 2, pp. 115-138参照)。特に、動物の体内の不適切な免疫活性化部位または腫瘍の近傍に徐放装置を導入することができる。その他の徐放性製剤については、Langerによる総説（Science (1990) 249:1527 1533）で検討されている。
【００７５】
IV．キットおよび製品
本明細書に開示されている方法を実施するための構成部品と試薬を含むキットが提供される。前記した生産物のいずれかを、本明細書に列記した癌タンパク質および免疫タンパク質に対して免疫学的に特異的な抗体を含むことのできるキットの中に組み込むことができ、キットは、PD-1/PD-L1、IFNγ、Akt、Wnt5A、MAPK1、HSP70、TRAP1、HSP90、セルピンH1、VEGFC、R-RAS、HLA-G5、BRAF、NRAS、KIT、TP53、PTEN、EGFR、HER2、ALK、AKT1、KRAS、MET、RET、RHOA、ARID1A、CDH1、CD109、CD151、CD276、CD44、CD46、CD47、CD55、CD58、CD59、CD70、CD9、CD95、CD97、CD99、B7H4、CD63、CD81、CD3、CD4、CD8、CD11、CD14、CD16、CD19、CD20、CD24、CD25、CD27、CD38 CD45、CD68、CD80、CD86、CD138、CD152、CD160、CD223、CD244、CD274、CD276およびCD366、または固相支持体上に固定された1つまたは複数のそのような抗体、オリゴヌクレオチド、ポリペプチド、ペプチド、抗体、非天然型の検出可能な標識、陽性対照マーカー、もしくはレポーター、薬学的に許容される担体、生理学的に許容される担体、使用説明書、採取用容器、投与用容器、アッセイ用基質、またはこれらの組み合わせを含むが、これらに限定されるわけではない。
【００７６】
以下の実施例は、本発明のある特定の態様を例示するために提示するものであり、決して発明を限定するように意図されたものではない。
【実施例】
【００７７】
実施例I：材料および方法
細胞培養
ヒト黒色腫細胞株MEL624、PD-L1/MEL624、WM1552C、WM35、WM902B、WM793、UACC-903、WM9、A375およびWM164を、10％（v/v）ウシ胎児血清（FBS）（Invitrogen）を添加したRPMI 1640培地（Invitrogen）で培養した。マウス黒色腫B16-F10細胞を、10％（v/v）FBSを添加したDMEM培地（Sigma）で培養した。IFN-γで刺激するには、細胞を、100 ng/mlの組換えヒトIFN-γ（Peprotech）とともに48時間インキュベートした。
【００７８】
安定的にHrsまたはPD-L1をノックダウンした黒色腫細胞の作製
ウイルスパッケージングプラスミドを同時導入した293T細胞を用いて、ヒトHRS（HGS）
2021503077.tif 000003
、マウスPD-L1（Cd274）
2021503077.tif 000004
に対する低分子ヘアピン型RNA（shRNA）、またはスクランブルshRNA対照（Addgene）をレンチウイルス粒子にパッケージングした。導入の48〜72時間後、レンチウイルス上清を回収した。フィルターろ過したレンチウイルスを細胞に感染させ、2μg/mlのピューロマイシンで選抜した。
【００７９】
患者および検体収集
30人のIII期からIV期の黒色腫患者（表１）が、ペンシルベニア州における拡大アクセスプログラム（http://clinicaltrials.gov identifier NCT02083484）の下でペムブロリズマブ（2 mg/kgを3週ごとに点滴で）または市販薬Keytrudaによる治療のために登録された。University of Pennsylvania Abramson Cancer Centerにおける黒色腫研究プログラム組織収集プロトコールUPCC 08607の下、施設内治験審査委員会（IRB protocol# 703001）に従って、患者から血液採取について同意を得た。12週の間、3週ごとにペムブロリズマブの各点滴の前にヘパリンナトリウム入り試験管に患者の血液を採取した。以前に記載したように（Huang et al., 2017）、二重盲検方式で独立して臨床応答の評価を行った。臨床応答は、一次元測定値を用い、免疫関連RECIST（irRECIST）に基づいて最良の応答であると判定した。
【００８０】
（表１）患者の構成および基本的な特徴
2021503077.tif 000005
【００８１】
患者のPBMCのフローサイトメトリーおよびインビトロ培養された腫瘍細胞
末梢血単核細胞（PBMC）を、フィコール勾配を用いて単離し、標準的なプロトコールを用いて保存した。前処理からの凍結保存PBMC試料で、1〜4サイクル（3〜12週目）のものを融解し、本発明者らが以前に記載したように(Huang et al., 2017)、フローサイトメトリーで解析した。簡潔に言うと、Live/Dead Fixable Aqua Dead Cell Stainキット（Life Technologies）を用いて生細胞／死細胞の判別を行った。細胞表面の染色は、4℃で30分間行った。細胞内の染色は、固定／透過キット（eBioscience）を用いた後、氷上で60分間行った。
【００８２】
培養された黒色腫細胞上のPD-L1の表面発現レベルを解析するには、1％FBS添加PBSで希釈したフルオロフォア標識抗PD-L1抗体で細胞を氷上30分間染色した。表面PD-L1と細胞内PD-L1をともに染色するには、まず、フルオロフォア標識抗PD-L1抗体で細胞を氷上30分間染色した。その後、表面染色された細胞を洗浄してから、固定および透過処理し、その後、フルオロフォア標識抗PD-L1抗体で氷上60分間染色した。全体が染色された細胞の平均蛍光強度（MFI）を表面のみ染色された細胞のMFIから差し引いて、PD-L1タンパク質の細胞内レベルを計算した。すべてのデータ取得は、BD Biosciences LSR IIフローサイトメーター上で行われ、FlowJoソフトウエア（TreeStar）を用いて解析された。
【００８３】
エクソソームの精製
細胞培養上清からエクソソームを精製するには、細胞を、エクソソーム除去した10％FBSを添加した培地で培養した。ウシエクソソームを100,000 gで一晩遠心分離して枯渇させた。48〜72時間細胞培養したものから上清を回収し、標準的な分画遠心分離プロトコール（8-10）によって精製した。簡潔に言うと、培養上清を2,000 gで20分間遠心分離して、細胞残屑と死細胞を除去した（Beckman Coulter, Allegra X-14R）。そして、上清を16,500 gで45分間遠心分離して（Beckman Coulter, J2-HS）、より大きな小胞を除去した。この上清を4℃にて2時間、100,000 gで超遠心分離（Beckman Coulter, Optima XPN-100）してエクソソームを沈降させた。沈降したエクソソームをPBSに懸濁し、4℃にて2時間、100,000 gで超遠心分離して回収した。
【００８４】
分画遠心分離によって循環エクソソームを精製するために、黒色腫患者または健常ドナーに由来するクエン酸化静脈血を1,550 gで30分間遠心分離して、細胞を含まない血漿を得た（Beckman Coulter, Allegra X-14R）。そして、得られた血漿1 mlを16,500 gで45分間遠心分離して、より大きな小胞を除去した（Eppendorf, 5418R）。回収した上清を4℃にて2時間、100,000 gで遠心分離(Beckman Coulter, Optima（商標）MAX-XP)してエクソソームを沈降させる。エクソソーム沈降物をPBSに懸濁し、4℃にて2時間、100,000 gで超遠心分離して回収した。エクソソーム単離キットを使用して循環エクソソームを精製するために、細胞を含まない血漿100μlを、まず、16,500 gで45分間遠心分離して、大きな膜小胞を前もって除去した（Eppendorf, 5418R）。そして、上清から、エクソソーム単離キット（Invitrogen, Cat# 4484450）を用いてエクソソームを精製した。
【００８５】
精製されたエクソソームの特性評価
フローサイトメトリーにより特性評価するために、精製したエクソソーム（25μg）を、20μlのCD63被覆磁気ビーズ（Invitrogen, Cat# 10606D）とともに、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を添加したPBS 100μl中で混合しながら4℃にて一晩インキュベートした。次に、エクソソームで被覆されたビーズを洗浄して、フルオロフォア標識抗体とともにインキュベートし、その後、LSR IIフローサイトメーター（BD Biosciences）上で解析した。
【００８６】
電子顕微鏡を用いて精製エクソソームを検証するために、PBSに懸濁した精製エクソソームを、フォルムバール（formvar）カーボンで被覆したニッケルグリッド上に滴下した。2％酢酸ウラニルで染色した後、グリッドを風乾し、JEM-1011透過型電子顕微鏡を用いて可視化した。イムノゴールド標識のために、PBSに懸濁した精製エクソソームを、フォルムバールカーボン被覆ニッケルグリッド上に置き、ブロッキングし、PD-L1の細胞外ドメインを認識するマウス抗ヒトモノクローナル抗体（クローン5H1-A3）とともにインキュベートし（Dong et al., 2002）、その後、プロテインA−金粒子（5 nm）に結合した抗マウス二次抗体とともにインキュベートした。各染色工程の後、5回ずつPBSで洗浄し、10回ずつddH2Oで洗浄した後、2％酢酸ウラニルで対比染色した。
【００８７】
高速ビデオキャプチャーソフトウエアと粒子追跡ソフトウエアを備えたNanoSight NS300（Malvern Instruments）を用いて、エクソソームのサイズを測定した。
【００８８】
イオジキサノール密度勾配遠心のために、分画遠心分離によって回収されたエクソソームを、不連続イオジキサノール勾配（5％、10％、20％、および40%：60％OptiPrep（商標）イオジキサノール水溶液を、0.25 Mスクロース入り10 mMトリスで希釈して作製した）の頂部に載せて、4℃にて18時間、100,000 gで遠心分離した。以前に示されているように、（Thery et al., 2006; Colombo et al, 2014; Tibes et al. 2006）、勾配の頂部から等容積の12の画分を回収したが、エクソソームは、濃度範囲1.13〜1.19 g/mlに分布していた。さらに、4℃にて2時間、100,000 gで超遠心分離して、エクソソームを沈降させた。
【００８９】
細胞培養上清からのPD-L1タンパク質の免疫沈降
黒色腫細胞によって分泌されるPD-L1タンパク質を解析するために、WM9細胞を、FBSを含まないRPMI 1640培地の中で48時間、IFN-γ（100 ng/ml）で処理した。この培養上清を回収し、2,000 gで20分間、次に、16,500 gで45分間遠心分離した。さらにエクソソームを単離するには、上清に対し、4℃にて2時間、100,000 gの超遠心分離を行った。PD-L1タンパク質の免疫沈降には、濃縮した上清を、5μg/mlのマウス抗ヒト5H1-A3モノクローナル抗体とプロテインA/Gアガロースとともに4℃で一晩インキュベートした。免疫沈降したタンパク質を、12％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ニトロセルロース膜に転写した。ブロットを、室温にて1時間、5％脱脂粉乳でブロッキングし、PD-L1の細胞内ドメイン（Cell Signaling Technology, Cat# 13684）および細胞外ドメイン（Cell Signaling Technology, Cat# 15165）をそれぞれ標的とする2種類の異なるウサギ抗ヒトモノクローナル抗体とともに4℃で一晩インキュベートし、その後、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合抗ウサギ二次抗体（Cell Signaling Technology, Cat# 7074）とともに室温にて1時間インキュベートした。このブロットを、ECL検出キット（Pierce）を用いて現像した。
【００９０】
ELISA
エクソソームPD-L1を検出するために、ELISAプレート（96ウェル）（Biolegend）を、ウェル（100μl）当たり0.25μgの抗PD-L1モノクローナル抗体（クローン5H1-A3）により、4℃で一晩被覆した。200μlのブロッキングバッファー（Pierce）で室温にて1時間、非特異的結合部位をブロックした。そして、血漿または細胞培養上清のいずれかから精製されたエクソソーム試料100μlを各ウェルに加え、4℃で一晩インキュベートした。ビオチン標識したモノクローナルPD-L1抗体（クローンMIH1、eBioscience）を加え、室温にて1時間インキュベートした。そして、0.1％BSA含有PBSで希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（BD Biosciences）を、各ウェル当たり全部で100μl加え、室温にて1時間インキュベートした。プレートをテトラメチルベンジジン（Pierce）で発色させ、0.5 N H2SO4で停止させた。BioTekプレート読み取り装置により、450 nmでプレートを読み取った。組換えヒトPD-L1タンパク質（R&D Systems, Cat# 156-B7）を用いて標準曲線を作成した。組換えP-セレクチン（R&D Systems, Cat# 137-PS）およびマウスPD-L1タンパク質（R&D Systems, Cat# 1019-B7）を陰性対照として用いて検出特異性を検証した。標準曲線の結果は、確証されたELISAが、0.2〜12 ng/mlの信頼できる線形範囲を示したことを示した。
【００９１】
PD-1-PD-L1結合アッセイ
エクソソームPD-L1がPD-1に結合することをテストするために、100μlの異なる濃度のエクソソーム試料を4℃で一晩インキュベートして、PD-L1抗体（クローン5H1-A3）で被覆した96ウェルELISAプレート上に捕捉させた。そして、100μlの4μg/mlビオチン標識PD-1タンパク質（BPS Bioscience, Cat# 71109）を加え、室温にて2時間インキュベートした。そして、0.1％BSA含有PBSで希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（BD Biosciences）を、各ウェル当たり全部で100μl加え、室温にて1時間インキュベートした。プレートをテトラメチルベンジジン（Pierce）で発色させ、0.5 N H2SO4で停止させた。BioTekプレート読み取り装置により、450 nmでプレートを読み取った。プレート上に直接被覆させた組換えヒトPD-L1タンパク質を陽性対照として用いた。
【００９２】
CD8 T細胞介在性腫瘍細胞死滅アッセイ
腫瘍細胞を死滅させるCD8 T細胞の能力に対する黒色腫細胞由来エクソソームの作用を判定するために、まず、抗CD3/CD28刺激CD8 T細胞を、IgGアイソタイプ抗体またはPD-L1抗体による遮断を伴うか伴うことなしに、PBS（対照）または黒色腫細胞由来エクソソームで前処理した。そして、異なる前処理をしたCD8 T細胞を黒色腫MEL624細胞とともに、エフェクター対標的（E:T）比10：1で96時間、12ウェルプレート内で共培養した。そして、ウェルをPBSで洗浄してT細胞を除去し、生存している腫瘍細胞を固定してクリスタルバイオレット染色により可視化した。乾燥させたプレートを画像化し、ImageJを用いて強度を定量した。
【００９３】
エクソソームによるCD8 T細胞の処理
エクソソーム表面上のPD-L1を遮断するために、精製エクソソームを、PD-L1遮断抗体またはIgGアイソタイプ抗体とともに100μlのPBS中でインキュベートし、次に、30 mlのPBSで洗浄し、超遠心により沈降させて、非結合の遊離抗体を除去した。ヒト末梢T細胞またはマウス脾臓T細胞を、抗CD3抗体（2μg/ml）および抗CD28抗体（2μg/ml）で48時間刺激してから、ヒト黒色腫細胞に由来するエクソソームまたはマウスB16-F10細胞に由来するエクソソームとともに、PD-L1遮断を伴うか伴うことなしに、36〜72時間インキュベートした。そして、この細胞を回収し、染色し、フローサイトメトリーによって解析した。
【００９４】
逆相タンパク質アレイ（RPPA）
MD Anderson Cancer Centerのコア施設において、1試料当たり50μgのタンパク質を用いてRPPAを行った。ウエスタンブロッティングによって、すべての抗体を確認した（Tibes et al., 2006）。
【００９５】
蛍光免疫染色
固定細胞またはホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）切片に対して蛍光免疫染色を行った。固定細胞については、ウシ血清アルブミン（BSA）バッファーで1時間ブロッキングする前に0.1％Triton X-100による透過処理を行った。FFPE切片については、ブロッキングの前にクエン酸バッファー（pH = 6.0）のスチーム処理による抗原賦活化を行った。固定細胞またはFFPE切片を、一次抗体とともに4℃で一晩インキュベートし、その後、フルオロフォア結合二次抗体とともに1時間インキュベートした。核をDAPIで染色した。Leica蛍光顕微鏡を63倍の倍率で用いて、試料を観察した。
【００９６】
ウエスタンブロット解析
全細胞ライセートまたはエクソソームタンパク質を、12％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。ブロットを、室温にて1時間、5％脱脂粉乳でブロッキングし、対応する一次抗体とともに供給業者が勧める希釈度で、4℃にて一晩インキュベートし、その後、HRP結合二次抗体（Cell Signaling Technology）とともに室温にて1時間インキュベートした。膜上のブロットを、ECL検出キット（Pierce）を用いて現像した。
【００９７】
マウスを用いたインビボ研究
すべての動物実験を、ペンシルベニア大学のInstitutional Animal Care and Use Committee （IACUC）によって承認されているプロトコールに従って行った。ヌードマウスにおいてヒト黒色腫異種移植片モデルを樹立するため、8週齢のメス胸腺欠損ヌードマウスの側腹部にWM9細胞（100μmの培地中5ｘ106細胞）を注入した。デジタル式ノギスを用いて腫瘍を測定し、(幅)2×長さ/2という公式によって腫瘍体積を算出した。細胞接種して30日後、または30日たつ前に腫瘍の最大幅が2.0 cmに達した時にマウスを安楽死させた。安楽死の直後、心穿刺によって血液試料を回収し、エクソソームを精製し、上記の方法を用いたELISAによって検出した。性別、週齢、および体重が一致し、異種移植片を持たない健常ヌードマウスから精製したエクソソームを対照として用いた。
【００９８】
C57BL/6マウスにおける同系マウス黒色腫モデルを樹立するには、B16-F10細胞またはB16-F10 PD-L1-KD細胞（100μlの培地中5×105細胞）を免疫正常性C57BL/6マウスに皮下注射した。細胞接種後、エクソソームの尾静脈注射(100μlのPBS中100μg)を3日毎に行った。3日毎にマウスの体重を測定した。デジタル式ノギスを用いて腫瘍を測定し、(幅)2×長さ/2という公式によって腫瘍体積を算出した。腫瘍の最大幅が2.0 cmに達するまでにマウスを安楽死させた。フローサイトメトリーのため、脾臓および腫瘍の試料を回収して、単細胞浮遊液を調製し、ACK溶解バッファーを用いて赤血球を溶解させた。
【００９９】
統計解析
M.D. Anderson Cancer Centerのプロトコールに従って、RPPAデータ解析を行った。具体的には、スライド（抗体）の「標準曲線」（スーパーカーブ（supercurve））から各希釈曲線を補間することによって、各試料についてタンパク質の相対レベルを決定した。スーパーカーブは、RPPAコア施設によって書かれたRスクリプト（a script in R）によって構築されている。これらの値は、スーパーカーブLog2値と定義される。すべてのデータ点を、タンパク質ローディングについて正規化し、線形値に変換して、「正規化線形」と名付けた。「正規化線形」値をLog2値に変換した後、さらに解析するために中央値を中心化した。すべての試料の所与のタンパク質における中央値を差し引いて、中央値中心化値を中心化した。上記処理手続はすべて、RPPAコア施設で行われた。RPPAコア施設によって提供された正規化データを、Cluster 3.0 （http://bonsai.ims.u-tokyo.ac.jp/~mdehoon/software/cluster/）によって解析し、Java TreeView 1.0.5（http://jtreeview.sourceforge.net/）を用いて可視化した。
【０１００】
その他すべての統計解析は、GraphPad Prism, バージョン6.0を用いて行った。分布の正規性を、D’Agostino−Pearsonオムニバス正規性検定によって判定し、グループ間の分散をF検定によって評価した。正規分布したデータについては、対応ありまたは対応なしの両側スチューデントt検定を用いて平均差の有意性を判定し、分散が異なるグループ間については、Welchの補正を用いた対応なしのt検定を行った。正規分布していないデータについては、ノンパラメトリックMann-Whitney U検定またはWilcoxonマッチドペア検定がそれぞれ、対応のない解析および対応のある解析に用いられた。相関をPearsonの係数によって判定した。二元配置ANOVAを用いて、異なったグループ間でマウスの腫瘍体積を比較した。ログランク検定およびWilcoxon検定を用いて、マウスの生存データを解析した。グラフで表したデータに示された誤差バーは、平均値±標準偏差を表している。両側値がP < 0.05のとき、統計的に有意であるとみなした。
【０１０１】
結果
エクソソームは、細胞から分泌される、直径50〜120 nmの脂質で覆われた小胞である。エクソソームは、局所的および循環系中で作用して細胞外環境や免疫系に影響を与える生理活性分子を運ぶ（Becker et al., 2016; Kalluri, 2016）。黒色腫の進行に果たすエクソソームの役割を理解するために、本発明者らは、ヒトの原発性および転移性の黒色腫細胞株のパネルから放出されるエクソソームを解析した。エクソソームを精製し、それらを放出小胞およびアポトーシス小体から分離するための標準的な方法である分画遠心分離によって、細胞培養上清からエクソソームを精製した（Colombo et al., 2014; Peinado et al., 2012; Thery et al., 2006）。精製したエクソソームが、直径50〜120 nmの膜結合小胞であることを、透過型電子顕微鏡法（TEM）および光散乱式ナノ粒子トラッキング解析法によって確認した（図1A〜1B）。そして、精製したエクソソームが担持するタンパク質を、大規模な抗体を用いる定量的プロテオミクス技術である逆相タンパク質アレイ（RPPA）によって解析した（Tibes et al., 2006）。このRPPAによって、PD-L1がエクソソームに豊富に存在することが明らかになり、そのレベルは、原発性黒色腫細胞に較べ、転移性黒色腫細胞に由来するエクソソームにおいて有意に高かく（図1C、図2A）、このことは、エクソソームによるPD-L1の分泌が黒色腫の進行に関連していることを示唆した。RPPAの結果をウエスタンブロッティングによって検証し、これにより、転移性黒色腫細胞によって分泌されるエクソソーム内で高レベルのPD-L1が検出された（図1D）。本発明者らは、イオジキサノール密度勾配遠心分離法を用いて、PD-L1がエクソソーム（以前に報告されているように（Colombo et al., 2014; Melo et al., 2015; Thery et al., 2006）、1.13〜1.19 g/mlの密度範囲で浮遊している）と共分画されること（図1E）をさらに確認した。ヒト細胞に加えて、マウス転移性黒色腫B16-F10細胞も、高レベルのPD-L1を担持するエクソソームを分泌した（図2B）。
【０１０２】
腫瘍細胞表面PD-L1は、活性化T細胞によって分泌されるIFN-γに応答して上方制御され得、PD-L1は、その細胞外ドメインを介してPD-1に結合してT細胞を不活性化させる（Chen & Han, 2015; Garcia-Diaz et al., 2017; Ribas et al., 2016）。本発明者らは、免疫電子顕微鏡法（図1F）、フローサイトメトリー（図1G）、および酵素結合免疫吸着測定法（ELISA）（図1H〜1I）を用いて、エクソソームPD-L1が、細胞表面PD-L1と同じ膜トポロジーを有し、その細胞外ドメインが表面に露出していることを発見した。この膜トポロジーによって、エクソソームPD-L1は、腫瘍細胞表面PD-L1と同じように濃度依存的にPD-1に結合できるようになり、また、この相互作用は、PD-L1遮断抗体によって破壊することができる（図1J）。本発明者らは、さらに、黒色腫細胞によって分泌されるエクソソームPD-L1のレベルが、IFN-γ処理によって有意に増加し、またそれに対応して、これらのエクソソームが、増加した結合能力をPD-1に対して示すことも発見した（図1G〜1K）。腫瘍細胞表面PD-L1に比べ、IFN-γが仲介するエクソソームPD-L1誘導は、後述するように、腫瘍細胞にとって、免疫圧に適応するためのより効果的な手段として役立つ。
【０１０３】
エクソソームは、決められた細胞内輸送経路を通って発生し放出される（Colombo et al., 2014; Kalluri, 2016; Thery et al., 2006）。そのため、本発明者らは、免疫蛍光法によって、黒色腫細胞におけるPD-L1の局在について検討した。PD-L1は、エクソソームマーカーであるCD63(図1L)、および、エクソソーム積荷を認識および選別するESCRTのサブユニットであるHrs（図2C）（Schmidt & Teis, 2012）と共局在する。ウエスタンブロッティングおよびフローサイトメトリーにより測定したところ、HRSをノックダウンすると、分泌されるエクソソームにおけるPD-L1レベルが低下し、同時に全細胞ライセートにおけるPD-L1が増加した（図1M、図2D）。Hrsは、エクソソーム中へのユビキチン化された積荷の選別を仲介するため（Schmidt & Teis, 2012）、またPD-L1の集団が、細胞内でユビキチン化されることが明らかになっていたため（Horita et al., 2017; Lim et al., 2016）、本発明者らは、PD-L1がHrsと相互作用するか否かをテストした。実際、PD-L1は、細胞ライセートからHrsと共沈降した（図1N）。これらのデータは、PD-L1をエクソソームから分泌するためのESCRT依存型経路があることを示唆するものである。
【０１０４】
黒色腫細胞がPD-L1を別の形態で分泌するか否かをテストするために、本発明者らは、黒色腫細胞培養上清からPD-L1タンパク質を免疫沈降させた。PD-L1の細胞外ドメイン（ECD）および細胞内ドメイン（ICD）をそれぞれ標的とする2種類の異なったモノクローナル抗体を用いたウエスタンブロッティングでは、免疫沈降したPD-L1タンパク質の大部分を45 kDの位置で検出したが、これは完全長のグリコシル化膜結合PD-L1の分子量の位置である（図2E）（Li et al., 2016）。これは、以前行った、細胞培養上清から得たPD-L1の特性評価（Chen et al., 2011; Frigola et al., 2011）と一致した。また、ECDに対する抗体は、40 kDのところでより少量のPD-L1も検出したが、これは、細胞表面から切断されたPD-L1タンパク質であるかもしれないし、選択的にスプライスされた、ICDと膜貫通ドメインを持たないPD-L1タンパク質であるかもしれない（Zhou et al., 2017）。
【０１０５】
次に、本発明者らは、ヌードマウスにおいてヒト黒色腫異種移植片を樹立して、インビボにおける黒色腫細胞によるエクソソームPD-L1の分泌をテストした。エクソソームの精製およびそれに続くELISAによるヒトPD-L1タンパク質の検出のため、ヒト黒色腫異種移植片を有するマウスと有さないマウスから血液試料を集めた（図3A）。ヒトPD-L1の細胞外ドメインを標的とするモノクローナル抗体（図4A〜4B）は、ヒト黒色腫異種移植片を保有するマウスから単離された循環エクソソーム上のヒトPD-L1を特異的に識別したが、対照マウスからのものは識別しなかった（図3B、図4C〜4D）。さらに、ヒト異種移植片を保有するマウスにおいて、循環エクソソームPD-L1のレベルが腫瘍サイズと正に相関していた（図3C）。
【０１０６】
近年、PD-L1が癌患者の血液試料から発見されている（(Finkelmeier et al., 2016; Frigola et al., 2011; Rossille et al., 2014; Zhou et al., 2017)。血液中のPD-L1がエクソソームによって運ばれているのかを調べるために、転移性黒色腫患者の血漿から循環エクソソームを精製して、TEM（図3D）およびイオジキサノール密度勾配遠心（図4E）によって検証した。PD-L1タンパク質は、循環エクソソームおよび黒色腫特異的エクソソームマーカーTYRP-2（Peinado et al., 2012）と共分画された（図4E）。ウエスタンブロット解析により、テストした患者すべての循環エクソソームの中にPD-L1が存在することが確認された（図3E）。これと一致して、精製された循環エクソソーム上にあるPD-L1のELISAも、エクソソームPD-L1が、患者血漿における全循環PD-L1のおよそ66％を占めることを明らかにした（図3F）。これらの結果によって、転移性黒色腫患者においては、大部分の循環PD-L1がエクソソーム上に担持されていることが確認された。
【０１０７】
本発明者らは、ELISAを用いて、転移性黒色腫患者からの循環エクソソーム上のPD-L1レベルが、健常ドナーからのそのレベルよりおよそ5倍高い（P < 0.001）ことも発見した（図6G）。受信者動作特性（ROC）曲線は、循環エクソソームPD-L1のレベルによって、曲線下面積（AUC）0.95、感度93.33％、および特異度100％で黒色腫患者を健常なドナーから区別したことを示唆している（図3H）。測定可能な腫瘍負荷を有する黒色腫患者における循環エクソソームのPD-L1レベルは、病期が一致する、病気の証拠がない（NED）黒色腫患者におけるそのレベルよりも有意に高い（図3I）。これらの結果は、循環エクソソームPD-L1レベルの上昇が、転移性黒色腫患者において機能的に重要であることを意味している。
【０１０８】
PD-L1を介した免疫抑制の最新モデルは、腫瘍細胞表面上のPD-L1とT細胞上のPD-1との的相互作用に基づいている。この相互作用は、T細胞の機能的な「消耗」またはアポトーシスを誘導する抑制シグナルをもたらす（Chen & Han, 2015; Dong et al., 2002; Topalian et al., 2016）。エクソソームPD-L1は、腫瘍細胞表面PD-L1と同じ膜トポロジーを持ち、PD-1に結合することができるため（図1F〜1J）、本発明者らは、それがCD8 T細胞を抑制できるか否かをテストした。まず、本発明者らは、内因性PD-L1を発現せず、他の免疫抑制タンパク質（例えばFasLおよびTRAIL）も発現しない黒色腫細胞株であるMEL624細胞を利用した（Dong et al., 2002）。内因性PD-L1を持たない親株であるMEL624細胞から精製したエクソソーム（図5A〜5D）とは対照的に、増殖マーカーKi-67および細胞傷害性タンパク質であるグランザイムB（GzmB）の発現低下によって示されるとおり（図6A）、PD-L1発現MEL624細胞（「PD-L1/MEL624」）に由来する、PD-L1に富むエクソソームは、活性化ヒトCD8 T細胞を有意に抑制した。抗PD-L1抗体でエクソソームを前処理すると、この作用はほぼ消失した。PD-L1/MEL624細胞以外に、内因性PD-L1を発現するヒト黒色腫WM9細胞（図1C〜1K）によって分泌されるエクソソームも、活性化CD8 T細胞において、Ki-67およびGzmBの発現の顕著な低下を誘導した（図7A）。抗PD-L1抗体または抗PD-1抗体を用いてエクソソームPD-L1とT細胞PD-1との間の相互作用を遮断すると、PD-1+ CD8 T細胞に対する抑制作用は有意に減弱したが、PD-1- CD8細胞に対してはごく僅かな作用を示しただけだった（図6B〜6C、図7B）。同様の作用が、マウス黒色腫B16-F10細胞に由来するエクソソームとともにインキュベートしたマウス脾臓CD8 T細胞を用いて観察された（図8A）。長期間エクソソーム処理されたCD8 T細胞はアポトーシスを起こしたが、これは、PD-1+ CD8 T 細胞においてより顕著であった。PD-L1遮断抗体は、この作用を有意に減弱させた（図6D、図8B〜8C）。さらに、本発明者らは、腫瘍細胞死滅アッセイ法を用いて、親株であるMEL624細胞ではなく、PD-L1/MEL624細胞およびWM9細胞に由来するエクソソームでCD8 T細胞を前処理すると、それらがMEL624細胞を死滅させる能力を有意に抑制したことを実証する（図6E〜6F、図7C）。これらのデータは、黒色腫由来エクソソームPD-L1が、CD8 T細胞の増殖と細胞傷害性を妨害することによって、これらをインビトロで抑制してアポトーシスを誘導することを示している。
【０１０９】
インビボにおけるエクソソームPD-L1の作用を試験するために、同系マウスB16-F10黒色腫モデルを免疫正常性C57BL/6マウスにおいて樹立した。B16-F10細胞は、PD-L1を担持するエクソソームを分泌（図2B）して、外部から適用したエクソソームの作用を覆い隠す可能性があるため、本発明者らは、レンチウイルスshRNAによりB16-F10細胞にある内因性PD-L1をノックダウンした（「B16-F10 PD-L1-KD」）（図9A〜9B）。PD-L1をノックダウンすると、C57BL/6マウスにおけるB16-F10腫瘍増殖が有意に抑制され（図9C）、それらの全生存期間が延長された（図9D）。親株であるB16-F10細胞に由来するエクソソームを注射すると、B16-F10 PD-L1-KD腫瘍の増殖が有意に促進され（図6G、図9E）、マウスの全生存期間が短縮された（図6H〜6I）。しかしながら、エクソソームを、IgGアイソタイプ抗体ではなく抗PD-L1抗体で前処理すると、腫瘍増殖からマウスを守り、それらの全生存期間を延長させた（図6G〜6I、図9E）。この観察された作用に関する機作をより良く理解するために、本発明者らは、CD8腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）の頻度および表現形質を調べた。腫瘍を蛍光免疫染色したところ、B16-F10エクソソームを注射した後にCD8 TILの数が有意に減少すること、抗体によってエクソソームPD-L1を遮断すると、この作用が減弱することが明らかになった（図6J〜6K）。フローサイトメトリー解析によって、エクソソーム処理は、CD8 TILの増殖の低下をもたらし、それは、PD-L1遮断によってレスキューされることが明らかになった（図6L）。これらのデータは、エクソソームPD-L1が、CD8 T細胞を抑制し、そのため、腫瘍進行を促進することを明らかにしている。
【０１１０】
次に、本発明者らは、エクソソームPD-L1が、全身性の免疫抑制作用を有するか否かを理解しようとした。本発明者らは、B16-F10 PD-L1-KDを保有するマウスから採った脾臓T細胞の表現型を決定した。B16-F10エクソソームは、増殖性の脾臓PD-1+ CD8 T細胞の割合を有意に低下させたが、PD-L1遮断抗体で前処理すると、この作用が減弱された（図6L）。これらのデータは、エクソソームPD-L1が、抗腫瘍免疫を全身において抑制することを実証している。
【０１１１】
エクソソームPD-L1は、免疫抑制を仲介し、また、患者血液においてELISAにより評価することができるので（図3F〜3I）、本発明者らは、循環エクソソームPD-L1のレベルが、転移性黒色腫患者における抗PD-1療法に対する臨床応答と関連するか否かについて調べ始めた。循環エクソソームPD-L1の前処理レベルは、抗PD-1抗体であるペムブロリズマブに応答できなかった患者において有意に高かった（図10A）。ROC解析は、前処理循環エクソソームPD-L1レベルによって、ペムブロリズマブに対する応答者と非応答者が、0.885のAUC、感度94.74％、および特異度81.82％で分離されたことを実証した（図10B）。1.41 ng/mlよりも多い前処理循環エクソソームPD-L1レベルは、奏効率（ORR）による不良臨床転帰と関連していた（図10C）。IFN-γは、エクソソームPD-L1を上方制御し（図1G〜1K）、また、本発明者らの最近のデータでは、ペムブロリズマブに応答しなかった患者ではIFN-γの前処理レベルが有意に高いことが明らかになっていた（Huang et al., 2017）ため、本発明者らは、循環エクソソームPD-L1とIFN-γとの間に相関関係があるか否かをテストした。実際、循環エクソソームPD-L1のレベルは、循環IFN-γのレベルと正に相関していた（図10D）。これらの結果は、治療前のより高いレベルの循環エクソソームPD-L1が、抗PD-1療法の予後不良の指標となることを示唆している。
【０１１２】
次に、本発明者らは、本発明者らの臨床試験においてペムブロリズマブ療法を受けている患者の循環エクソソームPD-L1について試験した。循環エクソソームPD-L1のレベルは、ペムブロリズマブ治療の間有意に増加し、6週目でピークに達した（図10E）。しかし、この効果は、臨床応答者で観察されただけであった（図10F）。そして、本発明者らは、これらの応答者におけるエクソソームPD-L1とCD8 T細胞再活性化の間にある関係を試験した。CD8 T細胞の増殖および再活性化は、本発明者らの過去の研究（Huang et al., 2017）と同じように、3週目にピークに達し、6週目でピークに達したエクソソームPD-L1に先んじた（図10G）。さらに、臨床応答者では、PD-1+ CD8 T細胞におけるKi-67の絶対値と変化倍率の両方が、エクソソームPD-L1のそれらと正に相関していた（図10H〜10I）。本発明者らは、循環エクソソームPD-L1の治療中の増加の大きさが、T細胞再活性化に対する腫瘍細胞の適応応答の潜在的な指標であり、臨床転帰と関連しているようだと予測していた。実際、臨床応答者では、治療開始後6週目に循環エクソソームPD-L1のレベルが大きく上昇した（図10J）。ROC解析により、6週目における循環エクソソームPD-L1量の上昇の大きさは、ペムブロリズマブに対する臨床応答が0.96のAUCで、感度92.31％および特異度100％を示すことによって、患者を層別化すると判定された（図10K）。臨床応答者における循環エクソソームPD-L1の有意な治療中増加は、治療中のT細胞再活性化の後に起こり、それと正に相関していたが、このことは、抗PD-1療法によって生じた免疫再活性化に対する腫瘍の適応応答を反映している。本発明者らの発見は、PD-1遮断により誘導された免疫再活性化に応答する腫瘍PD-L1の適応的発現とIFN-γ産生とが、良好な予後と相関することを明らかにした先行研究（Herbst et al., 2014; Shin et al., 2017; Zaretsky et al., 2016）と整合するものである。
【０１１３】
細胞生物学的、免疫学的、および臨床学的な研究に基づいて、本発明者らは、PD-L1/PD-1チェックポイント介在性腫瘍免疫回避の修正モデルを提示する（図11）。直接的な腫瘍細胞−CD8 T細胞の相互作用に加えて、腫瘍細胞は、腫瘍微環境においては、CD8 T細胞と相互作用する最前線の兵士として機能し、循環血液中では、抗腫瘍免疫と全身で戦うPD-L1エクソソームを分泌する。単一の腫瘍細胞が多数のエクソソームの多数のコピーを放出できるため（Peinado et al., 2012）、エクソソームとT細胞の相互作用は、腫瘍細胞にとって免疫系を抑制するための非常に有効な手段となる。エクソソームPD-L1が仲介するT細胞抑制は、抗PD-L1抗体および抗PD-1抗体の両方によって遮断することができる（図6A〜6J、図7〜9）ため、この新しいモデルは、エクソソームPD-L1とT細胞PD-1の間の相互作用を破壊することが、最新のPD-L1/PD-1遮断療法に関わる、今まで認識されていなかった機作である可能性を提起し、また、腫瘍表面にPD-L1発現が無い一部の癌患者が、それでも抗PD-1/PD-L1療法から恩恵を受けることができるという最近の観察結果を説明することができる（Larkin et al., 2015; Patel & Kurzrock, 2015）。また、本発明者らは、腫瘍細胞によって分泌されるエクソソーム上のPD-L1レベルが、IFN-γによって上方制御されていることも発見した。T細胞が分泌するIFN-γが、適応応答として、腫瘍細胞表面PD-L1の発現を上方制御することが明らかになっている（Chen & Han, 2015; Garcia-Diaz et al., 2017; Topalian et al., 2016）が、IFN-γに応答してエクソソーム上のPD-L1が増加することにより、空間的な制約をより受けない形で免疫チェックポイント機能を実行できるようになる。エクソソームPD-L1が、IFN-γを分泌する抗原経験T細胞を代表するPD-1+ CD8 T細胞を主に標的とすることを考えると、エクソソームPD-L1のレベルは、腫瘍細胞と免疫細胞の間の動的相互作用を表しているのかもしれない。PD-L1に加え、別のタンパク質も、黒色腫に由来するエクソソームによって誘導される免疫抑制作用に貢献している可能性がある。例えば、腫瘍細胞によって分泌されるエクソソームが、通常のアポトーシス経路を介してCD8 T細胞を抑制することができるタンパク質であるFasLを担持することが過去に報告されていた（Andreola et al., 2002; Taylor et al., 2003）。しかし、PD-L1は、エクソソームがPD-1+ CD8 T細胞を主に標的できるようにさせるため、腫瘍細胞は、より効果的に免疫圧に対抗できるようになる。
【０１１４】
本発明者らの臨床研究は、ペムブロリズマブ治療前と治療中の循環エクソソームPD-L1が、抗腫瘍免疫の異なる状態を反映している可能性があることを示唆している。治療前のレベルは、免疫機能障害および免疫調節異常におけるエクソソームPD-L1の顕著な役割を反映しているのかもしれない。臨界レベルを下回る治療前エクソソームPD-L1を有する患者は、抗PD-L1/PD-1療法に応答する可能性が高いが、一方、臨界レベルの、またはそれよりも高いエクソソームPD-L1を有する患者は何の応答も示さないだろう。より高いレベルのエクソソームPD-L1は、この治療によっては克服できなくなる限界点にまで患者のT細胞を「消耗」させるのかもしれない。しかし、循環エクソソームPD-L1の治療中のレベルについて、その増加は、抗PD-1療法によって誘発された抗腫瘍免疫に成功したことを反映すると考えられる。IFN-γに応答してエクソソームまたは腫瘍細胞上でPD-L1が上昇すると、腫瘍細胞がCD8 T細胞を適応的に不活性化できるようになるが、これは治療中には役に立たない。なぜなら、PD-L1/PD-1相互作用がペムブロリズマブによって遮断されるからである。非応答者では、エクソソームPD-L1の増加は見られなかった。過去の研究は、抗原提示の有害な増加を避け、また、IFN-γによって誘導される抗増殖作用を回避するために、非応答者の腫瘍細胞が、IFN-γに対するそれらの応答を適応的に下方制御した可能性を示唆している（Shin et al., 2017; Zaretsky et al., 2016）。
【０１１５】
本発明者らの研究は、循環エクソソームPD-L1を、抗PD-1療法の臨床転帰に対する早期治療中予測因子として採用するための論理的根拠を提示している（図12A〜12B）。また、これは、一部の患者において抗PD-1療法が成功しない原因として考えられるものに光を当ててもいる（図12C）。腫瘍PD-L1は、抗PD-1療法に対する臨床応答の予測的なバイオマーカーであると示唆されている（(Patel & Kurzrock, 2015; Reck et al., 2016）。腫瘍におけるPD-L1発現の不均一性と動的性質、および治療期間中繰り返し腫瘍生検を行ってPD-L1の変化を追跡する難しさを考えると、エクソソームPD-L1を血液バイオマーカーとして開発することが、抗PD-1療法の有効性をモニターし、エクソソームが仲介する癌細胞の免疫回避の機構を将来的に解明するための魅力的な選択肢を提供することになる。
【０１１６】
PD-L1/PD-1遮断免疫療法は、転移性黒色腫など、多くの種類の固形癌を治療するために非常に有望であることを示してきた（Chen & Han, 2015; Topalian et al., 2016）。しかし、一部の患者しか、この療法に応答しない（Ribas et al., 2016; Zaretsky et al., 2016）。黒色腫細胞が、このPD-L1/PD-1相互作用を利用してT細胞を抑制して免疫系を回避する機作をよりよく理解することが、免疫チェックポイント遮断療法の有効性を向上させるのに役立つであろう。黒色腫に加え、抗PD-1/PD-L1療法で治療される別の種類の癌にも、本発明者らの発見は適用される。
【０１１７】
実施例II：免疫細胞由来の放出小胞とエクソソームの単離、およびそれらを使用する方法
材料および方法
患者と検体収集
III期からIV期の黒色腫患者が、ペムブロリズマブまたは市販薬Keytruda（2 mg/kgを3週ごとに点滴で）による治療に登録された。University of Pennsylvania Abramson Cancer Centerにおける黒色腫研究プログラム組織収集プロトコールUPCC 08607の下、施設内治験審査委員会（IRB protocol# 703001）に従って、患者から血液採取についての同意を得た。12週の間、3週ごとにペムブロリズマブの各点滴の前にヘパリンナトリウム入り試験管に患者の血液を採取した。以前に記載したように（Huang et al., 2017）、二重盲検方式で独立して臨床応答の評価を行った。臨床応答は、一次元測定値を用い、免疫関連RECIST（irRECIST）に基づいて最良の応答であると判定した。
【０１１８】
ヒト末梢T細胞の単離と活性化
ヒト末梢血単核細胞（PBMC）を、フィコール勾配を用いて単離した。さらに、Dynabeads Untouched Human T Cells Kitを製造業者（Thermo Fisher Scientific）の使用説明書に従って用い、PBMCからT細胞を精製した。精製したT細胞を、10％のエクソソーム除去ウシ胎児血清（FBS）、100 mg/mLのストレプトマイシン／ペニシリン、2 mMのL-グルタミン、および1 mMのピルビン酸ナトリウム（Sigma-Aldrich, Sweden）を添加したRPMI1640中で、37℃、5％CO2にて培養した。T細胞の活性化するには、精製したT細胞を、抗CD3抗体（2μg/ml）および抗CD28抗体（2μg/ml）とともに72時間インキュベートした。
【０１１９】
放出小胞とエクソソームの精製および特性評価
T細胞によって分泌される放出小胞とエクソソームを精製するために、活性化T細胞と非活性化T細胞の両方から培養上清を回収した。培養上清を2,000 gで20分間遠心分離して、細胞残屑と死細胞を除去した（Beckman Coulter, Allegra X-14R）。そして、上清を、4℃にて60分間、20,500 gで遠心分離（Beckman Coulter, J2-HS）して、放出小胞を回収した。この上清を4℃にて2時間、100,000 gで超遠心分離（Beckman Coulter, Optima XPN-100）して、エクソソームを沈降させた。
【０１２０】
分画遠心分離によって循環放出小胞とエクソソームを精製するために、黒色腫患者または健常ドナーに由来するクエン酸化静脈血を1,550 gで30分間遠心分離して、細胞を含まない血漿を得た（Beckman Coulter, Allegra X-14R）。そして、得られた血漿の1 mlを、4℃にて60分間、20,500 gで遠心分離して、放出小胞を回収した（Eppendorf, 5418R）。回収した上清を4℃にて2時間、100,000 gで遠心分離して（(Beckman Coulter, Optima（商標）MAX-XP)、エクソソームを沈降させる。エクソソーム単離キットを使用して循環エクソソームを精製するために、細胞を含まない血漿100μlを、まず、4℃にて60分間、20,500 gで遠心分離して、放出小胞を回収した（Eppendorf, 5418R）。そして、上清から、エクソソーム単離キット（Invitrogen, Cat# 4484450）を用いてエクソソームを精製した。
【０１２１】
フローサイトメトリーにより特性評価するために、精製したエクソソームを、CD63、CD3、CD4、またはCD8で被覆した磁気ビーズとともに、0.1％ウシ血清アルブミン（BSA）を添加したPBS中で混合しながら4℃にて一晩インキュベートした。次に、エクソソームで被覆されたビーズを洗浄して、フルオロフォア標識抗体とともにインキュベートし、その後、LSR IIフローサイトメーター（BD Biosciences）上で解析した。
【０１２２】
電子顕微鏡を用いて精製エクソソームを検証するために、PBSに懸濁した精製エクソソームを、フォルムバール（formvar）カーボンで被覆したニッケルグリッド上に滴下した。2％酢酸ウラニルで染色した後、グリッドを風乾し、JEM-1011透過型電子顕微鏡を用いて可視化した。イムノゴールド標識のために、PBSに懸濁した精製エクソソームを、フォルムバールカーボン被覆ニッケルグリッド上に置き、ブロッキングし、一次抗体とともにインキュベートし、その後、プロテインA−金粒子（5 nm）に結合した抗マウス二次抗体とともにインキュベートした。各染色工程の後、5回ずつPBSで洗浄し、10回ずつddH2Oで洗浄した後、2％酢酸ウラニルで対比染色した。
【０１２３】
高速ビデオキャプチャーソフトウエアと粒子追跡ソフトウエアを備えたNanoSight NS300（Malvern Instruments）を用いて、エクソソームのサイズを測定した。
【０１２４】
イオジキサノール密度勾配遠心のために、分画遠心分離によって回収されたエクソソームを、不連続イオジキサノール勾配（5％、10％、20％、および40%：60％OptiPrep（商標）イオジキサノール水溶液を、0.25 Mスクロース入り10 mMトリスで希釈して作製した）の頂部に載せて、4℃にて18時間、100,000 gで遠心分離した。勾配の頂部から等容積の12の画分を回収した。さらに、4℃にて2時間、100,000 gで超遠心分離して、エクソソームを沈降させた。
【０１２５】
ELISA
T細胞由来の放出小胞上およびエクソソーム上の免疫調節タンパク質（例えば、CD276）を検出するために、ELISAプレートを、4℃で一晩、CD276に対するモノクローナル抗体で被覆した。200μlのブロッキングバッファー（Pierce）で室温にて1時間、非特異的結合部位をブロックした。そして、血漿または細胞培養上清のいずれかから精製されたエクソソーム試料100μlを各ウェルに加え、4℃で一晩インキュベートした。ビオチン標識したモノクローナルCD276抗体を加え、室温にて1時間インキュベートした。そして、0.1％BSA含有PBSに希釈した、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合ストレプトアビジン（BD Biosciences）を、各ウェル当たり全部で100μl加え、室温にて1時間インキュベートした。プレートを、テトラメチルベンジジン（Pierce）で発色させ、0.5 N H2SO4で停止させた。BioTekプレート読み取り装置を用いて、450 nmでプレートを読み取った。組換えヒトPD-1タンパク質を用いて標準曲線を作成した。
【０１２６】
ウエスタンブロット解析
全細胞ライセートまたは放出小胞もしくはエクソソームのタンパク質を、12％SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いて分離し、ニトロセルロース膜に転写した。ブロットを、室温にて1時間、5％脱脂粉乳でブロッキングし、対応する一次抗体とともに、供給業者の勧める希釈度で、4℃にて一晩インキュベートし、その後、HRP結合二次抗体（Cell Signaling Technology）とともに室温にて1時間インキュベートした。膜上のブロットを、ECL検出キット（Pierce）を用いて現像した。
【０１２７】
結果
T細胞によって分泌された放出小胞およびエクソソームを精製したものについて、まず、NanoSightナノ粒子トラッキング解析（NTA）技術によって、それぞれが、100〜1000 nmおよび40〜100 nmの膜小胞であることを確認した。このNTAの結果は、活性化T細胞および非活性化T細胞によって分泌された放出小胞とエクソソームの間でサイズ分布に有意な差はないことも実証していた（図13A）。しかし、非活性化T細胞と比較すると、活性化T細胞の方が、有意に多い放出小胞とエクソソームを分泌していた（図13B）。さらに、活性化T細胞によって分泌された放出小胞とエクソソームの方が、非活性化T細胞に由来するそれらの小胞よりも非常に高いタンパク質レベルを示した（図13C）。タンパク質品質結果と一致して、非活性化T細胞よりも活性化T細胞から精製された放出小胞とエクソソームの方で、エクソソームマーカーレベルの有意な増加が見られた（図13D）。これらの結果は、活性化T細胞に由来する放出小胞とエクソソームの方が、非活性化T細胞に由来するそれらの小胞よりも多くのタンパク質積荷を担持することを示している。
【０１２８】
活性化T細胞および非活性化T細胞によって分泌された放出小胞とエクソソームを、免疫ブロッティングによって、CD152、CD223、CD274、CD276、およびCD366などの免疫調節タンパク質の存在についてさらに解析した（図13D）。異なるレベルを示してはいたものの、活性化T細胞および非活性化T細胞のどちらによって分泌された放出小胞とエクソソームにおいても、T細胞表面マーカーであるCD3、CD4、およびCD8が明確に検出された。CD223、CD274、CD276、およびCD366は、もっぱら活性化T細胞に由来する放出小胞およびエクソソームにおいて検出された。しかし、CD152のレベルは、非活性化T細胞に較べ、活性化T細胞によって分泌される放出小胞において高く、エクソソームでは高くなかった。上記したこれらの結果は、T細胞、特に活性化T細胞が、免疫調節タンパク質を担持する、高レベルの細胞外小胞を分泌することを実証するものである。
【０１２９】
参考文献
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【０１３０】
本発明の一定の好ましい態様が上述され、具体的に例示されているが、これは、本発明を、それらの態様に限定しようと意図するものではない。以下の請求項に示されているように、本発明の範囲から逸脱することなく、さまざまな変更および修正を加えることが可能であることは、当業者にとって明らかであろう。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図１Ｇ】
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【図１Ｈ】
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【図１Ｉ】
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【図１Ｊ】
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【図１Ｋ】
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【図１Ｌ】
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【図１Ｍ】
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【図１Ｎ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図２Ｅ】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図４Ｅ】
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【図５】
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【図６−１】
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【図６−２】
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【図６−３】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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