(57)【要約】【解決手段】  本発明は、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及び慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）を効果的に治療するための化合物、組成物及び方法に関する。３-フェニル-Ｎ-［２，２，２-トリクロロ-１-［［（８-キノリニルアミノ）チオキソメチル］アミノ］エチル］-２-プロペンアミド及び／又はグアナベンツを治療有効量で投与した結果、外傷性脳損傷の影響が緩和され、及び／又は慢性外傷性脳症の発症が減少又は抑制される。【選択図】図１
2021532174.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒトにおける外傷性脳損傷を軽減する又は慢性外傷性脳症の発症を軽減する方法において、
以下の構造Ｉ
【化７】
2021532174.tif 000009
を有する３-フェニル-Ｎ-［２，２，２-トリクロロ-１-［［（８-キノリニルアミノ）チオキソメチル］アミノ］エチル］-２-プロペンアミド又は薬学的に許容されるその塩を、治療有効量でヒトに投与する工程を含む、方法。
【請求項２】
投与は、注射、非経口及び経口からなる群から選択される１又は複数の手法を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
治療有効量は１日投与量である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
治療有効量は１乃至１００ｍｇの用量である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
外傷性脳損傷を軽減する又は慢性外傷性脳症の発症を軽減する方法において、
医薬組成物を調製する工程であって、
以下の構造Ｉ
【化８】
2021532174.tif 000010
を有する３-フェニル-Ｎ-［２，２，２-トリクロロ-１-［［（８-キノリニルアミノ）チオキソメチル］アミノ］エチル］-２-プロペンアミド又は薬学的に許容されるその塩の活性化合物を得る工程と、
前記活性化合物を薬学的に許容される担体又は賦形剤と組み合わせる工程と、
外傷性脳損傷及び慢性外傷性脳症の少なくとも一方を有するヒトに、治療有効量の前記医薬組成物を投与する工程と、
を含む方法。
【請求項６】
前記薬学的に許容される担体又は賦形剤は、固体及び液体からなる群から選択される形態である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記担体又は賦形剤は、不活性充填剤、希釈剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、吸収剤、着色剤、及び、それらの混合物又は組合せからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。     
【請求項８】
前記結合剤は、デンプン、ゼラチン、グルコース、β-ラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカント、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス、及び、それらの混合物又は組合せからなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記医薬組成物は錠剤の形態である、請求項５に記載の方法。
【請求項１０】
前記医薬組成物は、前記活性化合物を０．０５重量％乃至９５重量％含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１１】
前記医薬組成物は、薬剤、医薬品、アジュバント、希釈剤、ビヒクル、及び、それらの混合物又は組合せからなる群から選択される添加剤を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項１２】
ヒトにおける外傷性脳損傷を軽減する又は慢性外傷性脳症の発症を軽減する方法において、
（ｉ）以下の構造Ｉ
【化９】
2021532174.tif 000011
を有する３-フェニル-Ｎ-［２，２，２-トリクロロ-１-［［（８-キノリニルアミノ）チオキソメチル］アミノ］エチル］-２-プロペンアミド、又は薬学的に許容されるその塩、及び
（ii）下記の構造ＩＩ
【化１０】
2021532174.tif 000012
を有するグアナベンツ、又は薬学的に許容されるその塩
からなる群から選択された少なくとも１つの化合物をヒトに投与する工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
＜関連出願の相互参照＞
本願は、２０１８年７月１０日に出願された米国仮出願第６２／６９５，９８９号、発明の名称「ＴＲＥＡＴＭＥＮＴ  ＯＦ  ＣＨＲＯＮＩＣ  ＴＲＡＵＭＡＴＩＣ  ＥＮＣＥＰＨＡＬＯＰＡＴＨＹ」について、３５  Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づく優先権の利益を主張しており、その内容は、参照により本明細書の一部となる。
＜技術分野＞
本発明は、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）の治療に関するものであり、より詳細には、ＣＴＥ、特に外傷性脳損傷（ＴＢＩ）の患者におけるＣＴＥの発生及び／又は進行を安定させる、後退させる、又は妨げるための化合物、組成物及び方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は深刻な健康被害をもたらし、毎年３，０００万人を超えるアメリカ人がＴＢＩを経験している。ＴＢＩの最も一般的な形態である、微小で恐らく無害である軽度のＴＢＩでさえ、長期的な影響を及ぼし、莫大な医療費の一因となり得る。最近まで、損傷が時間とともに拡大及び進行する機構はよく理解されていなかった。研究における技術の進歩により、認知機能低下の長期的な臨床症状に何が寄与している可能性があるのかを調べられるようになってきた。
【０００３】
ＴＢＩの症状は、ＣＴＥとして知られる疾患に現れる。ＣＴＥは神経変性性で進行性の疾患である。この疾患は誰にでも発症する可能性があり、特に兵士やアスリートなど、反復性頭部外傷の影響を受けやすい人に発症する可能性がある。ＣＴＥの持続的な症状には、衝動性、攻撃性、運動機能障害などがある。長期的な症状には、記憶喪失や認知機能の低下が挙げられる。ＣＴＥ患者の脳の死後評価では、脳の別々の領域や溝の深部内にてタウ神経原線維変化が血管周囲に蓄積していることが認められている。タウ神経原線維変化は、微小管構造を制御する過リン酸化タウタンパク質の凝集体である。
【０００４】
脳震とう又は脳震とうに至らない程度の（sub-concussive）反復性損傷の結果としてのＣＴＥの発症については、これまでほとんど理解されていなかった。前述のように、ＣＴＥは、凝集したタウ神経原線維変化の存在を特徴としている。しかしながら、ＴＢＩがどのようにして過リン酸化タウの発生とＣＴＥへの進行とを引き起こすのかは不明である。従って、ＴＢＩがどのようにしてＣＴＥに繋がるのかを解明し、ひいてはＴＢＩのＣＴＥへの進行を最小限に抑える又は阻止するために、タウのリン酸化と脱リン酸化（夫々、キナーゼとホスファターゼ）を制御する機構を解明する差し迫った必要が存在している。
【０００５】
タウリン酸化制御に関与する機構は、アルツハイマー病（ＡＤ）におけるタンパク質凝集について行われた研究で明らかにされている。タンパク質凝集によって誘発される機構の一つは、小胞体（ＥＲ）ストレスとして知られる細胞ストレス応答である。ＥＲストレスのマーカーは、ＡＤのモデルにおいて上昇することが示されており、神経原線維変化の発生前に、過リン酸化タウと共局在化するか、又は同じ細胞内に存在することが示されている。一旦変化が形成されると、恐らく不可逆的なステップを示す変化の形成に起因して、ＥＲストレスとの関連は失われる。治療の観点からは、早期の時点でのＥＲストレスの調節は、妥当な治療介入と保護戦略とを提示する可能性がある。ＡＤの前臨床試験では、サルブリナールがＥＲストレスの調節に関して有望な結果を示している。サルブリナールは、ｅｌＦ２α（真核生物の翻訳開始因子２αサブユニット）ホスファターゼ酵素の特異的な阻害剤として作用し、ＥＲストレス誘導アポトーシスの特異的阻害剤である。
【０００６】
当該分野では、ＣＴＥの進行を治療又は緩和するために、ＴＢＩの影響を治療又は緩和するのに有効な方法を開発する必要性がある。更に、ＴＢＩ及びＣＴＥの発症を防止するために又はその影響を緩和するために、過リン酸化タウが最小化される又は抑制されるような、タウのリン酸化及び脱リン酸化を調節する機構を開発する必要性がある。
【発明の概要】
【０００７】
ある態様において、本発明は、ヒトにおける外傷性脳損傷を緩和する又は慢性外傷性脳症の発症を減少させる方法に関する。当該方法は、以下の構造Ｉを有する３-フェニル-Ｎ-［２，２，２-トリクロロ-１-［［（８-キノリニルアミノ）チオキソメチル］アミノ］エチル］-２-プロペンアミド、又はその薬学的に許容される塩を治療有効量でヒトに投与する工程を含む。
【化１】
2021532174.tif 000003
【０００８】
ヒトに投与する工程は、注射、非経口及び経口からなる群から選択される１又は複数の手法を含んでよい。
【０００９】
特定の実施形態では、治療有効量は１日投与量である。
【００１０】
特定の実施形態では、治療有効量は、静脈内注射で１０ｍｇ、腹腔内注射で５０ｍｇ、経口で１００ｍｇの用量である。
【００１１】
別の態様では、本発明は、外傷性脳損傷を緩和する又は慢性外傷性脳症の発症を減少させる方法に関する。当該方法は、医薬組成物を調製する工程を含み、当該工程は、以下の構造Ｉを有する３-フェニル-Ｎ-［２，２，２-トリクロロ-１-［［（８-キノリニルアミノ）チオキソメチル］アミノ］エチル］-２-プロペンアミド、又はその薬学的に許容される塩の活性化合物を得る工程と、
【化２】
2021532174.tif 000004
当該活性化合物を薬学的に許容される担体又は賦形剤と組み合わせる工程と、医薬組成物の治療有効量を、外傷性脳損傷及び慢性外傷性脳症のうちの少なくとも１つを有するヒトに投与する工程とを含む。
【００１２】
薬学的に許容される担体又は賦形剤は、固体及び液体からなる群から選択される形態であってもよい。好ましい賦形剤は固体である。
【００１３】
好ましい賦形剤は、１，４-ジヒドロ-Ｎ-メチルニコチン酸（ジヒドロトリゴネリン）であって、これは血液脳関門透過性を高めるために選択される。
【００１４】
担体又は賦形剤は、不活性充填剤、希釈剤、結合剤、潤滑剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、吸収剤、着色剤、及び、それらの混合物又は組合せからなる群から選択されてよい。結合剤は、デンプン、ゼラチン、グルコース、β-ラクトース、トウモロコシ甘味料、アカシア、トラガカント、アルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、ポリエチレングリコール、ワックス、及びそれらの混合物又は組合せからなる群から選択されてよい。好ましい混合物は、脳への浸透性を高めるために親油性である。
【００１５】
本発明の医薬組成物は、錠剤の形態であってよい。
【００１６】
特定の実施形態では、医薬組成物は、０．０５重量％乃至９５重量％の活性化合物を含んでよい。
【００１７】
医薬組成物は、薬剤、医薬品、アジュバント、希釈剤、ビヒクル、及びそれらの混合物又は組合せからなる群から選択される添加剤を含んでよい。
【００１８】
本発明の更に別の態様は、ヒトにおける外傷性脳損傷を緩和する又はＣＴＥの発生を減少させる方法である。当該方法は、（ｉ）下記構造Ｉを有する３-フェニル-Ｎ-［２，２，２-トリクロロ-１-［［（８-キノリニルアミノ）チオキソメチル］アミノ］エチル］-２-プロペンアミド、又はその薬学的に許容される塩、
【化３】
2021532174.tif 000005
及び
（ii）下記の構造ＩＩを有するグアナベンツ、又はその薬学的に許容される塩、
【化４】
2021532174.tif 000006
からなる群から選択される少なくとも１種の化合物を治療有効量でヒトに投与する工程を含む。
【図面の簡単な説明】
【００１９】
本発明の更なる理解は、添付の図と併せて読むと、好ましい実施形態の以下の説明から得ることができる。
【００２０】
【図１】図１は、ＣＴＥと診断されたナショナルフットボールリーグ（ＮＦＬ）選手、ＣＴＥと診断されたＷＷＥレスラー、及び対照（ＣＴＲＬ）サンプルにおけるＵＰＲ脳のＥＲストレスカスケードの増加を示す画像及びグラフである。Ｘｂｏｘ結合タンパク質１（ＸＢＰ１）はアーム２を示し、ｐ-ｅＩＦ２はアーム１を示し、ＡＴＦ６はアーム３を示す。
【００２１】
【図２】図２は、ＥＲストレスマーカーイノシトール要求性酵素（inositol requiring enzyme）１α（ＩＲＥ１）が、図１と同じＣＴＥサンプルにおいて神経原線維変化マーカーＡＴ２７０と有意に共局在化していることを示す画像である。
【００２２】
【図３】図３は、病理学的タウリン酸化と同じ領域におけるタウキナーゼＧＳＫ３の増加を示す画像である。
【００２３】
【図４】図４は、データを生成するために使用したラットの空気加速損傷モデル（air acceleration injury model）を示す画像及びグラフである。
【００２４】
【図５】図５は、単一の爆風損傷の２４時間後にサルブリナールがＣＨＯＰ及びＧＡＤＤ３４（ＥＲストレスのマーカー）を有意に減少させたこと示すグラフである。
【００２５】
【図６】図６は、免疫組織化学による爆風後（post-blast）サルブリナール投与の保護効果を示す画像及びグラフである。
【００２６】
【図７】図７は、ＥＲストレスカスケードを変化させることにより、受傷後２４時間でサルブリナールが酸化ストレスを減少させたことを示す画像及びグラフである。
【００２７】
【図８】図８は、サルブリナールが、ＥＲストレスカスケードを効果的に終了させることにより、受傷後２４時間後に神経炎症を減少させたことを示す画像である。
【００２８】
【図９】図９は、爆風の繰り返しが、コントラクー（contre-coup）脳半球（対側）における最終的な損傷の後１ヶ月で、タウオパチーマーカーＡＴ８及びＡＴ２７０の増加を引き起こしたことを示す画像及びグラフである。
【００２９】
【図１０】図１０は、ＥＲストレスの広域阻害剤（ＤＨＡ）が、損傷の繰り返し後３週間で、ＥＲストレス活性化因子ＢｉＰ及びタウキナーゼＧＳＫ３を阻害したことを示す画像及びグラフである。
【００３０】
【図１１】図１１は、１回の損傷の７日後にサルブリナールが衝動様行動（impulsive-like behavior）を減少させたこと示す画像及びグラフである。
【００３１】
【図１２】図１２は、サルブリナールが、損傷の繰り返し後７２時間に、高架式十字迷路のオープンアームで過ごす時間を妨げることで衝動様行動を減少させたことを示す画像及びグラフである。
【００３２】
【図１３】図１３は、ＥＲストレス阻害が、モリス水迷路で測定した損傷後の認知学習を改善し（パネルＤ）、そして、探索試行で測定した学習イベントの保持力を向上させた（パネルＥ）ことを示す画像及びグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、慢性外傷性脳症（ＣＴＥ）の発症を治療し、減少させ、又は予防するための化合物、組成物及び方法に関する。外傷性脳損傷（ＴＢＩ）がＣＴＥの発症及び進行をもたらす可能性があることが分かっている。従って、本発明の目的は、ＴＢＩの進行を緩和し、ＣＴＥの発症又は進行をできるだけ少なくすることである。
【００３４】
ＣＴＥは、過リン酸化タウタンパク質及び神経原線維変化の存在によって特徴付けられ得る。従って、過リン酸化が低減される又は妨げられるようにタウタンパク質のリン酸化を調節又は制御する機構を特定することで、ＣＴＥの発症又は進行を低減又は予防することができる。しかしながら、一般的に、タンパク質のリン酸化は、実質的に全ての生物学的プロセスを調節しており、そして、タンパク質キナーゼはよく知られた薬物標的であるが、タンパク質ホスファターゼを標的とすることは困難であることが証明されている。
【００３５】
特定の理論に拘束されることは意図しないが、小胞体（ＥＲ）ストレスがＴＢＩやＣＴＥの発症及び進行に関与していると考えられる。ＥＲは、タンパク質フォールディングを司る細胞小器官である。新たに合成されたアンフォールド又はミスフォールドタンパク質がＥＲ内腔に蓄積されることでＥＲがストレスを受けると、アンフォールドタンパク質応答（ＵＰＲ）が活性化される。ＵＰＲは、ＥＲストレスに応答して真核細胞で活性化されるシグナル伝達機構である。ＵＰＲは、ＥＲ内の恒常性を回復及び維持して細胞の生存を促進し、ＥＲストレスが軽減されないままである場合にはアポトーシスを誘導する。
【００３６】
神経炎症及びＥＲストレスは、多くの神経疾患と関連している。故に、ヒト、例えばＴＢＩ患者に、治療有効量のＥＲストレス阻害化合物を投与して、ＥＲストレスを調節又は阻害し、例えばＥＲストレスを減少させ又は防止し、ひいてはＣＴＥを安定させ、後退させ、又は妨げることが本発明の目的である。
【００３７】
本発明によれば、神経原線維変化の発生を導く機構が特定され、その変化に寄与する経路、即ちＥＲストレスが標的化され、それにより、ＣＴＥ患者における短期的及び長期的な症状及び性状が低減される。ＥＲストレスには、様々な形態の摂動後における急性細胞恒常性（acute cellular homeostasis）の回復に役割を果たす３つの異なるアーム、即ちシグナル伝達ブランチがある。第１のアーム、第２のアーム、第３のアームは以下の通りである。（１）タンパク質キナーゼＲ（ＰＫＲ）様小胞体キナーゼ（ＰＥＲＫ）、（２）イノシトール要求性酵素１（ＩＲＥ-１）、（３）活性化転写因子６（ＡＴＦ６）である。
【００３８】
一般に、ＥＲストレスは、ＥＲシャペロンＢｉＰとＥＲ内腔内のミスフォールドタンパク質との結合を増加させ、ＥＲストレストランスデューサーＰＥＲＫ、ＩＲＥ-１及びＡＴＦ６からＢｉＰを解離させ、それらの活性化を引き起こす。活性化された（リン酸化された）ＰＥＲＫはｅＩＦ２αをリン酸化し、それによってタンパク質翻訳を減弱させ、ストレス時のＥＲ負荷を軽減する。並行して、ｅＩＦ２αのリン酸化はＡＴＦ４の翻訳を促進する。ＡＴＦ４は、シャペロン及びＣＨＯＰの転写を誘導する。ＣＨＯＰは、ＧＡＤＤ３４の発現を誘導する。ＩＲＥ-１の活性化（リン酸化）は、ＸＢＰ１ ｍＲＮＡのスプライシングを引き起こして、転写因子ｓＸＢＰ１を生成する。
【００３９】
ＥＲストレスが持続する又は慢性的に活性化すると、タウキナーゼＧＳＫ３βは過剰活性化し、タウの過リン酸化、その後の凝集、細胞蓄積の触媒として機能する。この経路は最終的には神経炎症を助長し、それによって損傷が持続し、時間の経過とともに進行し、進行性の神経変性をもたらす可能性がある。
【００４０】
本発明によって、ＣＴＥを有するヒトの脳では、ＣＴＥを有しないヒトの脳と比較して、ＵＰＲのＥＲストレスカスケードの３つのアーム全てが増加する可能性があることが明らかになった。
【００４１】
本発明の一実施形態では、サルブリナールが、ヒト、例えば患者に投与され、ＴＢＩの影響を治療又は緩和し、ＣＴＥ発症の可能性を予防又は低減し、ＣＴＥの進行を治療又は緩和する。一般に、サルブリナールは、ｅＩＦ２の作用に関連した真核細胞におけるストレス応答を研究するために、主に実験的に使用されてきた。サルブリナールは、ｅＩＦ２の脱リン酸化の選択的阻害剤である。サルブリナールは、骨粗鬆症を治療し、骨の治癒を促進する可能性があるという研究がある。「サルブリナール」は、市販薬の商品名として使用されている。本発明で使用される「サルブリナール」の化学名は、３-フェニル-Ｎ-［２，２，２-トリクロロ-１-［［（８-キノリニルアミノ）チオキソメチル］アミノ］エチル］-２-プロペンアミド（Ｃ２１Ｈ１７Ｃｌ３Ｎ４ＯＳ）であり、化学構造は以下の通りである。
【化５】
2021532174.tif 000007
【００４２】
本発明によれば、化学構造Ｉ（化合物Ｉ）又はその薬学的に許容される塩は、治療有効量で患者に投与され、ＥＲストレス経路を安全且つ選択的に標的化するために使用される。ＴＢＩ及びＣＴＥの治療としての化合物Ｉの投与により、患者における発症及び進行を安定させ、後退させ、減少させ、又は妨げることができる。
【００４３】
当業者によって理解されるように、治療有効量の化合物Ｉは、限定ではないが、注射、非経口及び経口を含む当該分野で知られている任意の手段によって患者に投与することができる。個々の患者について治療有効量を構成するであろう投与量とこの投与量の頻度を決定することは、当該分野において実践している者の技能の範囲内であろう。
【００４４】
幾つかの実施形態では、化合物１の治療有効量は、１乃至１００ｍｇの用量である。幾つかの実施形態では、化合物１の治療有効量は、静脈内（ＩＶ）注射で１０ｍｇ、腹腔内（ＩＰ）注射で５０ｍｇ、又は経口で１００ｍｇとして投与される。更に、投与量は１日単位であってよい。
【００４５】
本発明の化合物は、医薬組成物として調合されてよく、当該組成物は、通常、従来の医薬担体又は賦形剤と、活性剤としての化合物１（又はその薬学的に許容される塩）とを含む。更に、組成物は、他の薬剤、医薬品、担体、アジュバント、希釈剤、ビヒクル、又はそれらの組合せを含んでよい。このような薬学的に許容される賦形剤、担体、又は添加剤と、様々なモード又は投与のための医薬組成物を製造する方法とは、当業者にはよく知られている。使用される担体又は賦形剤は、組成物の他の成分と相溶性があるという観点で許容され、患者に有害であってはならない。担体又は賦形剤は、固体又は液体、或いはその両方であってよく、好ましくは、本発明の化合物を単位用量組成物、例えば錠剤として調製し、活性化合物を０．０５重量％から９５重量％まで含有してよい。このような担体又は賦形剤としては、不活性充填剤又は希釈剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、溶解遅延剤、吸収促進剤、吸収剤、及び着色剤が挙げられる。適切な結合剤としては、デンプンと、ゼラチンと、グルコース又はβ-ラクトースなどの天然糖と、トウモロコシ甘味料と、アカシア、トラガカント又はアルギン酸ナトリウムなどの天然及び合成ガムと、カルボキシメチルセルロースと、ポリエチレングリコールと、ワックスと、これらと同類のものとが挙げられる。滑沢剤としては、オレイン酸ナトリウムと、ステアリン酸ナトリウムと、ステアリン酸マグネシウムと、安息香酸ナトリウムと、酢酸ナトリウムと、塩化ナトリウムと、これらと同類のものとが挙げられる。崩壊剤としては、デンプンと、メチルセルロースと、寒天と、ベントナイトと、キサンタンガムと、これらと同類のものとが挙げられる。
【００４６】
薬学的に許容される担体及び賦形剤は、前述の全ての添加剤等を含む。
【００４７】
幾つかの実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、固体の形態であるのが好ましい。
【００４８】
幾つかの実施形態では、好ましい賦形剤は、１，４-ジヒドロ-Ｎ-メチルニコチン酸（ジヒドロトリゴネリン）であって、血液脳関門透過性を高めるために選択される。
【００４９】
本明細書で提供される説明は、主に化合物１に焦点を当てている。しかしながら、本発明は化合物１の使用に限定されない。化合物１と同じ又は類似の阻害活性（ＥＲストレス経路を標的とする）を提供する他の化合物又は組成物を、化合物１の代替物又は置換物として、或いは、化合物１と相補的に使用してもよいことは理解及び予期される。例えば、本発明はまた、以下の化学構造を有するグアナベンツ（Ｃ８Ｈ８Ｃｌ２Ｎ４）、又はその薬学的に許容される塩の使用を含む。
【化６】
2021532174.tif 000008
【００５０】
この化合物は、商品名ＷＹＴＥＮＳＩＮとして入手可能である。化合物ＩＩは、α-２アドレナリン受容体のαアゴニストであり、抗高血圧薬と呼ばれる医薬品の一般的なクラスに属する。特定の神経経路に沿った神経インパルスを制御し、血管を弛緩させ、血液がより容易に通るようにすることで、高血圧を治療するために化合物ＩＩを使用することが知られている。
【００５１】
本発明の特定の実施形態が詳細に記載されているが、本開示の全体的な教示に照らして、これらの詳細に対する様々な変更例及び代替例を開発できることは、当業者には理解されるであろう。従って、開示された特定の実施形態は、例示的であることを意図しており、添付の特許請求の範囲及びその全ての均等物の完全な範囲を与えられるべき本発明の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【００５２】
＜ＴＢＩ及びＣＴＥにおけるＥＲストレスの役割＞
ＴＢＩの評価には動物モデルを用い、ＣＴＥの評価には神経病理学的標本（脳損傷研究所の脳バンクから提供された）を用いた。ＴＢＩは、動物モデルにおいて爆風誘発された。爆風誘発性ＴＢＩ（ｂＴＢＩ）に関して、ＥＲストレスが急激に、即ち受傷後２４時間以内に上昇していることが試験データから示された。受傷後、サルブリナールを動物モデルに投与した。ＥＲストレスは、サルブリナールの使用により調節された。サルブリナールの投与は、神経変性及びアポトーシスのマーカーを減少させることが分かった。
【００５３】
ｂＴＢＩ前にサルブリナールを投与することも動物モデルで評価された。サルブリナールの使用は、高架式十字迷路テスト／プロトコルで測定された衝動様行動と、モリス水迷路テスト／プロトコルで測定された空間記憶の形で神経精神損傷を改善した。
【００５４】
ＣＴＥの神経病理学的サンプルを用いると、試験データは、ＣＴＥのない脳、即ち対照（「ＣＴＲＬ」）脳と比較してＥＲストレスが有意に上昇することを示し、ＥＲストレスが過リン酸化タウと共局在化していることが分かった。
【００５５】
ｂＴＢＩ動物モデル及びＣＴＥ神経病理学的標本の結果は、ＥＲストレスがＴＢＩとＣＴＥの発症との間の機構的リンクを示していることを実証した。更に、サルブリナールを用いたＥＲストレスの調節は、ＴＢＩの影響を緩和して、ＣＴＥの発症及び進行の可能性を抑制する又は減少させるための治療的アプローチとなる。
【００５６】
＜実施例１＞
死後ＣＴＥと診断されたアスリートの嗅内皮質からヒトの脳標本を採取した。標本は、ＥＲストレスのマーカーのみについて染色され、タウオパチーのマーカーと共局在化していた。ＥＲストレス及び病理学的タウに特異的な一次抗体と、付随する（accompanying）蛍光性二次抗体とを用いて、従来の免疫組織化学を行った。共局在化ソフトウェア（即ち、ＩｍａｇｅＪ）を用いて、重複する領域を検出した。補正総細胞蛍光分析（corrected total cell fluorescence analysis）にはＡＮＯＶＡを使用した。Ｐ＜０．０５は統計的に有意と判断された。（＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、及び＊＊＊＝ｐ＜０．００１）。
【００５７】
結果は、ヒトＣＴＥ標本では、ＥＲストレス経路の３つのアーム全てが増加していることを明らかにした。更に、タウオパチーが観察された同じ部位でＥＲストレスが増加していることが発見され、ＥＲストレスを疾患過程に関与させていることが示唆された。これは、ＥＲストレスに関連する触媒的タウキナーゼであるグリコーゲン合成酵素キナーゼβであるＧＳＫ３を染色し、タウマーカーと共局在化していることを確認することで確かめられた。
【００５８】
図１は、免疫組織化学の結果を画像Ａ-Ｆ、画像Ｈ-Ｍ、及び画像Ｏ-Ｔと、夫々に対応するグラフＧ、グラフＮ、及びグラフＵとで示しており、ＣＴＥを発症していないヒトの対照（ＣＴＲＬ）サンプルと比較して、ＣＴＥと診断されたナショナルフットボールリーグ（ＮＦＬ）選手の脳とＣＴＥと診断されたＷＷＥレスラーの脳とにおいて、アンフォールドタンパク質応答のＥＲストレスカスケードの３つのアーム全てが増加したことを示している。Ａ-Ｇは、ヒトＣＴＲＬサンプルと比較して、ＣＴＥサンプル（ＥＲストレス経路の第２のアーム）においてＸ-ｂｏｘ結合タンパク質１（ＸＢＰ１）が増加したことを示す。Ｈ-Ｎは、リン酸化伸長開始因子（phosphorylated elongation initiation factor）２α（ｐ-ｅＩＦ２α）が、ヒトＣＴＲＬサンプルと比較して、ＣＴＥサンプル（ＥＲストレス経路の第１のアーム、そして、サルブリナールの標的）において増加したことを示す。更に、活性化転写因子６（ＡＴＦ６）も、Ｏ-Ｕで示されているＣＴＥサンプル（ＥＲストレス経路の第３のアーム）において、ヒトＣＴＲＬサンプルと比較して増加した。ｐ-ｅＩＦ２は阻害の主要な標的であるため、重要である。
【００５９】
図２の画像Ｍ-Ｒ及びＡ-Ｆは、イノシトール要求性酵素１α（ＩＲＥ１）が、小胞体ストレスのマーカーであり、ＮＦＬ選手及びＷＷＥレスラーの同じＣＴＥサンプルとヒトＣＴＲＬサンプルの夫々において、神経原線維変化マーカーであるＡＴ２７０と有意に共局在化していたことを示している。オーバーレイパネルの画像Ａａ-Ｄｄにおける染色は、ＥＲストレスが同じ神経細胞のタウオパチーと関連していることを示唆している。オーバーラップ係数は、ＮＦＬ選手及びＷＷＥレスラーの両方のＣＴＥ症例の脳において約０．９であり、細胞内における共局在性が高いことを示している。
【００６０】
図３の画像Ｍ-Ｒ及びＡ-Ｆは夫々、病理学的タウリン酸化（ＡＴ１００）が観察された同じ領域において、タウキナーゼＧＳＫ３が有意に増加したことを示す。オーバーレイパネルの画像Ａａ-Ｄｄの染色は、タウキナーゼとリン酸化の関連性を示唆している。オーバーラップ係数は０．８８であり、細胞内における共局在性が高いことを示している。一般に、タウキナーゼはタウの過リン酸化を引き起こし、その結果、コンフォメーション形状を変化させ、細胞内に蓄積させる。
【００６１】
＜実施例２＞
本実施例は、ＴＢＩ後のＥＲストレスのターゲッティングの成功を評価した。図４の画像Ａ及びＢに示すように、卓上空気加速損傷モデルを開発した。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（登録商標）ラットを、末梢臓器の損傷を防ぐために保護管に配置して、加速波を発生させてラットの頭蓋骨に衝突させた。加圧窒素ガスで破裂させる膜の厚さを減少又は増加させることで、損傷の度合を段階的に調節した。５０ＰＳＩの損傷パラダイムが選択された。これは、ＣＴＥに繋がりがある損傷の最も一般的なタイプである人間の脳震とうと相関する。図４において、グラフＤのピークは、５０ＰＳＩの圧力波を示している。Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットには、１回の損傷、又は２週間にわたって６回の損傷の何れかを与えた。ＥＲストレスとタウオパチーのマーカーを見るために、様々な殺害時点を選択した。
【００６２】
ＥＲストレスを標的として、損傷後のラットにサルブリナールを投与した。サルブリナールは、１ｍｇ／ｋｇの用量で損傷後３０分後にＩＰ注射で投与された。サルブリナールは、ＧＡＤＤ３４を阻害してＥＲストレスを変化させ、死誘発（pro-death）シグナルＣＨＯＰの急増を抑制し、ＧＳＫ３活性を低下させ、初期のタウオパチーカスケードを抑制することが分かった。サルブリナールを介したＣＨＯＰの減少は、切断された場合に、ＥＲを介したアポトーシス又は細胞死と関連しているカスパーゼ１２のプロフォーム（pro-form）の保存と関連している可能性がある。サルブリナールによるＣＨＯＰの減少はまた、持続的な酸化ストレス及び神経炎症の減少をもたらす可能性がある。
【００６３】
図５乃至９に示すように、ウエスタンブロット分析、免疫組織化学、及びＰＣＲを、受傷後の様々な時点で使用した。ＬＩＣＯＲウエスタンブロットプロトコル、ＩＨＣワールド免疫組織化学プロトコル、及びＡｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓのＰＣＲプロトコルをアッセイに使用した。ＡＮＯＶＡは分析のために使用され、ｐ＜０．０５を統計的に有意とした。＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１であった。薬剤群と損傷群を比較した場合、＃＝ｐ＜０．０５、＃＃＝ｐ＜０．０１、＃＃＝ｐ＜０．００１であった。
【００６４】
図５のグラフは、サルブリナール（ＳＡＬ＋ｂＴＢＩ）が、１回の爆風損傷（ｂＴＢＩ２４ｈ）の２４時間後に、ＥＲストレスのマーカーであるＣＨＯＰ（グラフＣを参照）及びＧＡＤＤ３４（グラフＥを参照）を有意に減少させて、ＥＲストレス応答を効果的に終了させたことを示す。
【００６５】
図６は、免疫組織化学の結果により、爆風損傷後サルブリナール投与（ＳＡＬ-ｂＴＢＩ）の保護効果を確認する画像及びグラフを示す。ＣＨＯＰは有意に減少し、これはまた、切断されたカスパーゼ３（アポトーシスに関連する活性型）の減少と関連していた。このように、爆風誘発性ＴＢＩ（ｂＴＢＩ）と、ｂＴＢＩ後にサルブリナールを投与した場合（ＳＡＬ-ｂＴＢＩ）のグラフＡ及びグラフＣに示されているように、サルブリナールは、ＣＨＯＰと、プロアポトーシスマーカーであるカスパーゼ-３とを減少させた。
【００６６】
図７の画像及びグラフは、サルブリナールが、ＥＲストレスカスケードを変化させることで、受傷後２４時間時点にて酸化ストレス減少させたことを示す。測定された成分には、カルボニル（グラフＡ）、スーパーオキシド（グラフＢ）、活性酸素種（ＲＯＳ）（グラフＣ）、及びＮＡＤＰＨオキシダーゼ４（ＮＯＸ４）（グラフＤ）が挙げられる。グラフＡ、Ｂ及びＤに夫々示すように、サルブリナール（ｓＴＢＩ＋ＳＡＬ）の投与は、タンパク質カルボニル、スーパーオキシド、及び総酸化ストレス産生を減少させた。
【００６７】
図８のグラフは、サルブリナールが、ＥＲストレスカスケードを効果的に終了させることにより、損傷後２４時間後にて神経炎症を減少させたことを示す。測定された成分には、ＮＦκＢ（グラフＡ）、誘導性一酸化窒素合成酵素（ｉＮＯＳ）（グラフＢ）、インターロイキン１β（ＩＬ-１β）（グラフＣ）、及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）（グラフＤ）が挙げられる。グラフＡ、Ｃ及びＤに夫々示されているように、サルブリナール投与（ｓＴＢＩ＋ＳＡＬ）は、プロ炎症性マーカーＮＦＢ、ＩＬ-１及びＴＮＦを減少させた。
【００６８】
図９の画像及びグラフは、爆風の繰り返しが、１ヶ月後及び最終的な損傷後に、コントルクープ脳半球（対側）におけるタウオパチーマーカーＡＴ８（グラフＡ及びグラフＢ）及びＡＴ２７０（グラフＥ及びグラフＦ）の増加を引き起こしたことを示す。
【００６９】
図１０の画像及びグラフは、ＥＲストレスの広域阻害剤（ＤＨＡ）が、反復損傷後３週間にてＥＲストレス活性化因子ＢｉＰ及びタウキナーゼＧＳＫ３を阻害したことを、グラフＡ及びグラフＢにおいて夫々示す。
【００７０】
＜実施例３＞
この実施例では、損傷モデルと、モリス水迷路及び高架式十字迷路の標準プロトコルとを用いて、行動改善におけるＥＲストレスを標的化（オフにする）することによる効果を調べた。モリス水迷路では認知能力の低下を検出し、高架式十字迷路では衝動様行動を評価した。その結果は、ＥＲストレスを標的とする場合、受傷後にもたらされると、衝動様行動が減少し、認知パフォーマンスが改善することを示した。統計解析にはＡＮＯＶＡを用い、＊＝ｐ＜０．０５、＊＊＝ｐ＜０．０１、＊＊＊＝ｐ＜０．００１とした。薬剤群を損傷群と比較した場合では、＃＝ｐ＜０．０５、＃＃＝ｐ＜０．０１、＃＃＃＝ｐ＜０．００１であった。
【００７１】
図１１の画像及びグラフは、高架式十字迷路のオープンアームでの時間の減少によって測定されたように、受傷後のサルブリナール投与（ＳＡＬ＋ｂＴＢＩ）が、１回の損傷の７日後に衝動様行動を減少させたことを示す。グラフＡは、オープンアームでの時間の減少、例えば移動を示している。
【００７２】
図１２の画像及びグラフは、受傷後のサルブリナール投与（ｒＴＢＩ＋ＳＡＬ）が、損傷の繰り返し後７２時間後において高架式十字迷路のオープンアームで過ごす時間を抑制することで、衝動様行動を減少させたことを示す。
【００７３】
図１３のグラフは、ＥＲストレス（ＤＨＡ）阻害が、モリス水迷路で測定した受傷後の認知学習を改善したこと（パネルＤ）と、プローブトレイルで測定した学習事象の保持力を向上させたこと（パネルＥ）とを示す。
【００７４】
＜結果／結論＞
ＥＲストレスが、ヒトにおけるＴＢＩ後の慢性神経変性の発生の重要な経路として特定された。実施例では、この経路をげっ歯類モデル（ｂＴＢＩ）で標的化し、その結果は、その後における酸化ストレス及び神経炎症の活性化が抑制されることを示した。サルブリナールを投与してＥＲストレス経路を効果的に遮断（終止）することで、行動が改善された。特に、ＥＲストレスカスケードを阻害することで、衝動様障害及び認知機能の低下が有意に減少した。サルブリナールを投与してＥＲストレスを標的とすることの利点は、ＴＢＩ患者の診断及び治療法としての可能性を提供する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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