(57)【要約】目的の対象核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養するための組成物及び方法が本明細書で説明される。一般には、対象核酸及びアミノ酸の生合成に関与する酵素分子をコードする配列を含む核酸が、細胞に導入される。その後、導入された核酸を含む細胞が成長することができるように、細胞を、アミノ酸を欠く培地で成長させる。一部の場合、細胞は、選択の厳密性を増大させるために酵素分子の阻害剤をさらに含む【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法であって、
ａ）（ｉ）前記対象核酸配列と、
（ｉｉ）発現した場合、アミノ酸の合成経路、例えばプロリン合成経路の酵素の高レベルの活性をもたらす核酸配列、例えば前記活性を含む酵素分子をコードする核酸配列と
を含む異種の核酸、例えばベクター、例えば複製可能ベクター又は統合ベクターを含む細胞を用意するステップと、
ｂ）前記核酸配列を含む前記細胞を、前記核酸配列を含む細胞の成長を可能にするために十分な条件下で、高活性を有しない前記細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルの前記アミノ酸、例えばプロリンを有する培地の存在下で培養するステップと
を含み、それによって、前記異種の核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法。
【請求項２】
前記異種の核酸が、ベクターを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記異種の核酸が、複製可能ベクター、例えば自己複製可能ベクターを含む、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
前記異種の核酸が、統合ベクターを含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記培地が、前記酵素の活性の阻害剤をさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記阻害剤が、前記アミノ酸である、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記阻害剤が、前記アミノ酸ではない、請求項５に記載の方法。
【請求項８】
異種の核酸配列を含む細胞を特定するステップを含む請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
異種の核酸配列を含む細胞を選択するステップを含む請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
異種の核酸配列を含む細胞を培養するステップを含む請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記異種の核酸が、複数のベクターを含む（例えば、前記対象核酸及び酵素の高レベルの活性をもたらす前記核酸が複数のベクターに、例えば異なるベクターに含まれる）、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記異種の核酸が、複数の統合ベクターを含む（例えば、前記対象核酸及び酵素の高レベルの活性をもたらす前記核酸が複数の統合ベクターに、例えば異なるベクターに含まれる）、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記異種の核酸が、複数の自己複製ベクターを含む（例えば、前記対象核酸及び酵素の高レベルの活性をもたらす前記核酸が複数の自己複製ベクターに、例えば異なるベクターに含まれる）、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記異種の核酸が、前記細胞のゲノム、例えば染色体ゲノムに統合される、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記アミノ酸が、天然アミノ酸を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記アミノ酸が、表１に列挙されるアミノ酸を含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記アミノ酸が、アラニンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アミノ酸が、ロイシンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記アミノ酸が、イソロイシンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記アミノ酸が、メチオニンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記アミノ酸が、バリンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記アミノ酸が、フェニルアラニンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記アミノ酸が、アスパラギンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記アミノ酸が、システインである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記アミノ酸が、グルタミンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記アミノ酸が、セリンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２７】
前記アミノ酸が、トレオニンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２８】
前記アミノ酸が、アスパラギン酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項２９】
前記アミノ酸が、グルタミン酸である、請求項１６に記載の方法。
【請求項３０】
前記アミノ酸が、アルギニンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３１】
前記アミノ酸が、ヒスチジンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３２】
前記アミノ酸が、リジンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３３】
前記アミノ酸が、グリシンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項３４】
前記アミノ酸が、プロリン、チロシン及びトリプトファンから選択される、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記アミノ酸が、プロリンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記アミノ酸が、チロシンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３７】
前記アミノ酸が、トリプトファンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記阻害剤が、前記酵素に結合する、例えば、前記阻害剤が、前記酵素に結合し、これを阻害する、請求項５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記阻害剤が、前記酵素の転写を阻害する、請求項５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記阻害剤が、前記酵素の翻訳を阻害する、請求項５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記阻害剤が、核酸、例えばＲＮＡ、例えばアンチセンス又はｓｉＲＮＡを含む、請求項５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記阻害剤が、アプタマーを含む、請求項５〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記阻害剤が、小分子を含む、請求項５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記阻害剤が、前記酵素の基質のアナログである、請求項５〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記阻害剤が、前記アミノ酸のアナログ、例えばプロリン、チロシン又はトリプトファンのアナログである、請求項５〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記阻害剤が、競合的阻害剤を含む、請求項５〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記阻害剤が、前記アミノ酸の合成の律速酵素を阻害する、例えば、前記阻害剤が、前記培地での前記アミノ酸の合成のための律速酵素を阻害する、請求項５〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記アミノ酸が、プロリンを含む、請求項１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記酵素が、ピロリン−５−カルボン酸シンターゼ（Ｐ５ＣＳ）分子を含む、請求項１〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記異種の核酸配列が、Ｐ５ＣＳ分子をコードする配列を含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記阻害剤が、前記酵素の基質、又はそのアナログ、バリアント若しくは誘導体である、請求項５〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記阻害剤が、プロリンのアナログ、例えばＬ−アゼチジン−２−カルボン酸、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリン又はＬ−４−チアゾリジンカルボン酸である、請求項１〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記アミノ酸が、プロリンを含み、前記酵素及び阻害剤が、表１から選択される、請求項５〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記アミノ酸が、チロシンを含み、前記酵素及び／又は阻害剤が、表１から選択される、請求項５〜１６、３４及び３８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記異種の核酸配列が、ポリペプチド及び／又はチロシン生合成酵素の阻害剤をコードする配列を含む、請求項５〜１６、３４、３８〜４７及び５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記阻害剤が、前記酵素の基質のアナログである、請求項５４又は５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記阻害剤が、チロシンのアナログである、請求項５〜１６、３４、３８〜４７及び５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記アミノ酸が、チロシンを含み、前記酵素及び阻害剤が、表１から選択される、請求項５〜１６、３４、３８〜４７及び５４〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記アミノ酸が、トリプトファンを含み、前記酵素及び／又は阻害剤が、表１から選択される、請求項５〜１６、３４及び３８〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記異種の核酸配列が、ポリペプチド及び／又はトリプトファン生合成酵素の阻害剤をコードする配列を含む、請求項５〜１６、３４、３８〜４７及び５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記阻害剤が、前記酵素の基質のアナログである、請求項５９又は６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記阻害剤が、トリプトファンのアナログである、請求項５〜１６、３４、３８〜４７及び５９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記アミノ酸が、トリプトファンを含み、前記酵素及び阻害剤が、表１から選択される、請求項５〜１６、３４、３８〜４７及び５９〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
高酵素活性を有しない細胞を、高活性を有する前記細胞と共に培養するステップを含む請求項１〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
高活性を有する前記細胞が、高活性を有しない細胞よりも迅速に、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００又は１０，０００倍迅速に成長する、請求項１〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
選択された、例えば成長に基づいて選択された前記細胞の約０．０１、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は５０パーセント未満が、前記核酸を欠く、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
成長を示す細胞を選択するステップをさらに含む請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記細胞が、真核細胞を含む、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記細胞が、動物細胞を含む、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記細胞が、哺乳動物細胞を含む、請求項１〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記細胞が、げっ歯類細胞を含む、請求項１〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記細胞が、ＣＨＯ細胞を含む、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記細胞が、ＧＳＫＯ  ＣＨＯ細胞を含む、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記酵素をコードする配列の内因性コピーが、不活性化されている、例えば構造領域又は制御領域の欠失を含む、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
第２のアミノ酸合成酵素をコードする配列の内因性コピーが、不活性化されている、例えば構造領域又は制御領域の欠失を含む、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
ＧＳをコードする配列の内因性コピーが、不活性化されている、例えば構造領域又は制御領域の欠失を含む、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記対象核酸配列が、ペプチド分子をコードする、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記対象核酸配列が、異種である、請求項１〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
異種のペプチド分子が、表５〜８のうちのいずれかから選択される、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記培地で成長する細胞を選択するステップを含む請求項１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記培地が、阻害剤を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
１）前記培地で成長する細胞を選択するステップと、
２）培養条件の第２のセット下で、例えば第２の培地で前記細胞を培養する、例えば選択した前記細胞を第２の選択に供するステップと
を含む請求項１〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
１）の前記培地が、前記阻害剤を含み、
２）の前記第２の培地が、前記阻害剤を含む、
請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
１）前記培地で成長する細胞を選択するステップと、
２）培養条件の第２のセット下で、例えば第２の培地で前記細胞を培養する、例えば選択した前記細胞を第２の選択に供するステップと
を含み、１）及び２）のうちの一方の前記培地の前記阻害剤の濃度が、１）及び２）のうちの他方の前記阻害剤の濃度よりも大きい、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
１）の前記阻害剤の濃度が、２）の阻害剤の濃度よりも大きい、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
２）の前記阻害剤の濃度が、１）の阻害剤の濃度よりも大きい、請求項８４に記載の方法。
【請求項８７】
より低い濃度の前記阻害剤を有する前記ステップの前記培地が、本質的に阻害剤を含まない、請求項８４〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
（ｉｉ）の前記核酸配列が、制御配列、例えばプロモーターに作動可能に連結されている、請求項１〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記制御配列が、ＳＶ４０、ｍＣＭＶ、ｈＣＭＶ若しくはＰＧＫプロモーター又はそれらのバリアントから選択される配列を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記制御配列が、ＬＭＭの発現を制御する、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記制御配列及びＬＭＭが、表３の任意の単一の行に列挙される通りである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記制御配列が、ＳＶ４０プロモーターを含み、前記ＬＭＭが、マウスＳＣＤ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９３】
前記制御配列が、ＳＶ４０プロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＣＤ１、例えばＣＨＯ  ＳＣＤ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９４】
前記制御配列が、ＳＶ４０プロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢＦ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９５】
前記制御配列が、ＳＶ４０プロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢ４１１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９６】
前記制御配列が、ｍＣＭＶプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、マウスＳＣＤ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９７】
前記制御配列が、ｍＣＭＶプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＣＤ１、例えばＣＨＯ  ＳＣＤ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９８】
前記制御配列が、ｍＣＭＶプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢＦ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項９９】
前記制御配列が、ｍＣＭＶプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢ４１１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項１００】
前記制御配列が、ｈＣＭＶプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、マウスＳＣＤ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０１】
前記制御配列が、ｈＣＭＶプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＣＤ１、例えばＣＨＯ  ＳＣＤ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０２】
前記制御配列が、ｈＣＭＶプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢＦ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０３】
前記制御配列が、ｈＣＭＶプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢ４１１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０４】
前記制御配列が、ＰＧＫプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、マウスＳＣＤ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０５】
前記制御配列が、ＰＧＫプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＣＤ１、例えばＣＨＯ  ＳＣＤ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０６】
前記制御配列が、ＰＧＫプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢＦ１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０７】
前記制御配列が、ＰＧＫプロモーターを含み、前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢ４１１である、請求項９０に記載の方法。
【請求項１０８】
前記制御配列が、ＬＭＭの発現を制御し、前記培地が、前記酵素の活性の阻害剤を含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項１０９】
前記制御配列、ＬＭＭ及び阻害剤（例えばＰ５ＣＳ阻害剤）が、表４の任意の単一の行に列挙される通りである、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記培地が、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を含む、請求項８８〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記培地が、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを含む、請求項８８〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記培地が、Ｌ−４−チアゾリジンカルボン酸を含む、請求項８８〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記対象核酸配列の生成物を回復するステップをさらに含む請求項１〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
培地から生成物を回復するステップを含む請求項１〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記細胞から生成物を回復するステップを含む請求項１〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
ｉ）前記培地で成長する細胞を選択するステップと、
ｉｉ）培養条件の第２のセット下で、例えば第２の培地で前記細胞を培養する、例えば選択した前記細胞を第２の選択に供するステップと、
ｉｉｉ）前記細胞又は第２の培地から生成物を回復するステップと
を含む請求項１〜１１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
対象核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法であって、
ａ）（ｉ）前記対象核酸配列と、
（ｉｉ）発現した場合、アミノ酸の合成経路、例えばプロリン合成経路の酵素の高レベルの活性をもたらす核酸配列、例えば前記活性を含む酵素分子をコードする核酸配列と
を含む核酸、例えばベクター、例えば複製可能ベクターを含む細胞を用意するステップと、
ｂ）前記核酸配列を含む前記細胞を、前記核酸配列を含む細胞の成長を可能にするために十分な条件下で、高活性を有しない前記対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルの前記アミノ酸、例えばプロリンを有する第１の培地（及び前記酵素の阻害剤を任意選択で含む前記第１の培地）の存在下で培養するステップと、
ｃ）前記核酸配列を含む前記細胞を、前記核酸配列を含む細胞の成長を可能にするために十分な条件下で、高活性を有しない前記対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルの第２のアミノ酸、例えばチロシンを含む第２の培地（及び第２の酵素の阻害剤を任意選択で含む前記第２の培地）の存在下で培養するステップと
を含み、それによって、異種の核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法。
【請求項１１８】
ステップｂが、ステップｃの開始前に開始される、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
ステップｂが、ステップｃの前に行われる、請求項１１７又は１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
ステップｂ及びステップｃが、同時に行われる、請求項１１７又は１１８に記載の方法。
【請求項１２１】
ステップｂ及びステップｃが、同じ培地で行われる、請求項１１７〜１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
ステップｂ及びステップｃが、同じ容器内で行われる、請求項１１７〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
ステップｂの選択及びステップｃの選択が、同じ培地で行われ、前記培地が、
（ａ）高活性を有しない前記対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルの前記アミノ酸、例えばプロリンを有し、
（ｂ）前記第２の酵素の高活性を有しない前記対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルの前記第２のアミノ酸、例えばチロシンを有する、
請求項１１７〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記細胞が、
（ｉｉｉ）発現した場合、アミノ酸の合成経路の第２の酵素の高レベルの活性をもたらす核酸配列、例えば前記活性を含む酵素分子をコードする核酸配列
をさらに含む、請求項１１７〜１２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記細胞が、前記酵素の前記活性の阻害剤を有する培地で培養される、請求項１１７〜１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記細胞が、前記第２の酵素の活性の阻害剤を有する培地で培養される、請求項１１７〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記第２の酵素が、（ｉｉ）の前記酵素と同じ経路、例えばプロリン合成経路に存在する、請求項１１７〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
前記第２の酵素が、同じアミノ酸の合成経路に存在し、例えば前記活性を含む酵素分子をコードする核酸配列であり、
ｂ）の前記培地が、
ｉｖ）前記第２の酵素の活性の阻害剤
をさらに含む、
請求項１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記第２の酵素が、（ｉｉ）の前記酵素とは異なる経路に存在する、例えば、前記酵素が、プロリン合成経路に存在し、前記第２の酵素が、プロリン以外の経路、例えばチロシン又はトリプトファン経路に存在する、請求項１１７〜１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記第２の酵素が、第２のアミノ酸の合成経路に存在する、例えば前記活性を含む酵素分子をコードする核酸配列であり、
ｂ）の前記培地が、
ｉｉｉ）高活性を有しない前記対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルの前記第２のアミノ酸、例えばプロリン以外のアミノ酸と、
ｉｖ）前記第２の酵素の活性の阻害剤と
をさらに含む、
請求項１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
ＳＶ４０プロモーター配列、ｍＣＭＶプロモーター配列又はＰＧＫプロモーター配列のうちのいずれかからの制御領域を含む配列、例えばプロモーター配列に作動可能に連結された異種の脂質代謝変更因子（ＬＭＭ）をコードする配列を含む細胞。
【請求項１３２】
前記ＬＭＭが、表２に列挙される経路を変更する、請求項１３１に記載の細胞。
【請求項１３３】
前記ＬＭＭが、ステロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）を含む、請求項１３１又は１３２に記載の細胞。
【請求項１３４】
前記ＬＭＭが、ステロール調節エレメント結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）を含む、請求項１３１又は１３２に記載の細胞。
【請求項１３５】
前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１の切断型アイソフォーム（例えば調節ドメインを欠くＳＲＥＢＦ１の切断型アイソフォーム、例えばＳＲＥＢ４１１）を含む、請求項１３１又は１３２に記載の細胞。
【請求項１３６】
異種の脂質代謝変更因子（ＬＭＭ）をコードする前記配列が、ベクターに配置されている、請求項１３１〜１３５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３７】
前記ベクターが、選択可能マーカー、例えば、存在する場合、規定の培地での生存又は成長を可能にするマーカーをコードする配列をさらに含む、請求項１３１〜１３６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３８】
前記ベクターが、存在する場合、栄養素、例えばアミノ酸を欠く培地での生存又は成長を可能する選択可能マーカーをコードする配列をさらに含む、請求項１３１〜１３７のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１３９】
前記栄養素が、アミノ酸、例えば表１に列挙されるアミノ酸から選択されるアミノ酸である、請求項１３８に記載の細胞。
【請求項１４０】
前記栄養素が、プロリンを含む、請求項１３９に記載の細胞。
【請求項１４１】
前記マーカーが、ピロリン−５−カルボン酸シンターゼ（Ｐ５ＣＳ）分子を含む、請求項１３７〜１４０のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４２】
前記栄養素が、チロシンを含む、請求項１３８〜１４１のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４３】
前記栄養素が、トリプトファンを含む、請求項１３８〜１４２のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４４】
前記マーカーが、表１から選択される、請求項１３１〜１４３のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４５】
前記マーカーが、グルタミンシンテターゼを含む、請求項１３７〜１４４のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４６】
前記ＬＭＭをコードする前記配列が、ＳＶ４０プロモーター配列をコードする配列に作動可能に連結されている、請求項１３１〜１４５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４７】
前記ＬＭＭをコードする前記配列が、ｍＣＭＶプロモーター配列をコードする配列に作動可能に連結されている、請求項１３１〜１４５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４８】
前記ＬＭＭをコードする前記配列が、ＰＧＫプロモーター配列をコードする配列に作動可能に連結されている、請求項１３１〜１４５のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１４９】
前記ＬＭＭが、ＳＣＤ１である、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５０】
前記ＬＭＭが、マウスＳＣＤ１である、請求項１４９に記載の細胞。
【請求項１５１】
前記ＬＭＭが、ＣＨＯ  ＳＣＤ１である、請求項１４９に記載の細胞。
【請求項１５２】
前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１である、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５３】
前記ＬＭＭが、ＣＨＯ  ＳＲＥＢＦ１である、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５４】
前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１である、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５５】
前記ＬＭＭが、ＣＨＯ  ＳＲＥＢ４１１である、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５６】
前記ＬＭＭが、ステロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）を含み、前記プロモーターが、ＳＶ４０プロモーター配列を含む、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５７】
前記ＬＭＭが、ステロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）を含み、前記プロモーターが、ｍＣＭＶプロモーター配列を含む、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５８】
前記ＬＭＭが、ステロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）を含み、前記プロモーターが、ＰＧＫプロモーター配列を含む、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１５９】
前記ＬＭＭが、ステロール調節エレメント結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）を含み、前記プロモーターが、ＳＶ４０プロモーター配列を含む、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６０】
前記ＬＭＭが、ステロール調節エレメント結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）を含み、前記プロモーターが、ｍＣＭＶプロモーター配列を含む、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６１】
前記ＬＭＭが、ステロール調節エレメント結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）を含み、前記プロモーターが、ＰＧＫプロモーター配列を含む、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６２】
前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１を含み、前記プロモーターが、ＳＶ４０プロモーター配列を含む、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６３】
前記ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１を含み、前記プロモーターが、ｍＣＭＶプロモーター配列を含む、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６４】
前記ＬＭＭが、ステロールＳＲＥＢ４１１を含み、前記プロモーターが、ＰＧＫプロモーター配列を含む、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６５】
前記培地が、表１又は４に列挙される阻害剤を含む、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６６】
前記培地が、Ｐ５ＣＳ阻害剤を含む、請求項１３１〜１４８のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項１６７】
前記Ｐ５ＣＳ阻害剤が、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸である、請求項１６６に記載の細胞。
【請求項１６８】
前記Ｐ５ＣＳ阻害剤が、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンである、請求項１６６に記載の細胞。
【請求項１６９】
前記Ｐ５ＣＳ阻害剤が、Ｌ−４−チアゾリジンカルボン酸である、請求項１６６に記載の細胞。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、対象核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養するための方法及び組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
成長に必要な必須化合物について栄養要求性である真核細胞は、生成物の発現を、必須化合物の合成を可能にする異所性酵素の発現とカップリングさせることによって、異種の生成物の発現のために利用することができる。例えば、チミジン栄養要求性である変異マウス細胞は、外的に供給されたチミジンの非存在下では成長することができない（Ａｙｕｓａｗａら（１９８１）Ｓｏｍａｔｉｃ  Ｃｅｌｌ  Ｇｅｎｅｔ．７（５）：５２３〜５３４）。チミジル酸シンターゼ活性が回復した復帰変異体は、チミジン枯渇条件下で成長することができた。
【０００３】
哺乳動物細胞発現系は、治療用生物製剤等の組換え生物由来生成物の産生のために通常使用される。しかしながら、そのような生成物のラージスケール産生は、大量の所望の生成物を効率的に発現する安定な細胞株を効率的に生成することの困難のために、高い初期コストを伴う。したがって、組換え生物由来生成物を産生するために使用され得る細胞の産生のための方法及び組成物の改善について、当該技術分野において要求が存在している。
【０００４】
〔発明の概要〕
目的の対象核酸配列（例えば、１つ又は複数の目的の対象核酸配列）を含む細胞を特定、選択又は培養するための組成物及び方法が、本明細書で説明される。一般的に、対象核酸とアミノ酸の生合成に関与する酵素分子をコードする配列とを含む核酸を、細胞に導入する。その後、導入された核酸を含む細胞が成長することができるように、細胞を、アミノ酸を欠く培地で成長させる。一部の場合、細胞は、選択の厳密性を増大させるために酵素分子の阻害剤をさらに含む。アミノ酸以外の化合物（例えば、微量金属、小分子、核酸又は当該技術分野で公知の他の代謝産物）についての栄養要求性は、本明細書で説明される選択方法において使用することができることが企図される。
【０００５】
一態様では、本発明は、対象核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法であって、
ａ）（ｉ）対象核酸配列と、
（ｉｉ）発現した場合、アミノ酸の合成経路、例えばプロリン合成経路の酵素の高レベルの活性をもたらす核酸配列、例えば活性を含む酵素分子をコードする核酸配列と
を含む核酸、例えばベクター、例えば複製可能ベクター又は統合ベクターを含む細胞を用意するステップと、
ｂ）核酸配列を含む細胞を、核酸配列を含む細胞の成長を可能にするために十分な条件下で、高活性を有しない細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルのアミノ酸、例えばプロリンを有する培地の存在下で培養するステップと
を含み、それによって、異種の核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法を特徴とする。
一態様では、本発明は、対象核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法であって、
ａ）（ｉ）対象核酸配列と、
（ｉｉ）発現した場合、アミノ酸の合成経路、例えばプロリン合成経路の酵素の高レベルの活性をもたらす核酸配列、例えば活性を含む酵素分子をコードする核酸配列と
を含む核酸、例えばベクター、例えば複製可能ベクターを含む細胞を用意するステップと、
ｂ）核酸配列を含む細胞を、核酸配列を含む細胞の成長を可能にするために十分な条件下で、高活性を有しない対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルのアミノ酸、例えばプロリンを有する培地（及び酵素の阻害剤を任意選択で含む培地）の存在下で培養するステップと、
ｃ）核酸配列を含む細胞を、核酸配列を含む細胞の成長を可能にするために十分な条件下で、高活性を有しない対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルの第２のアミノ酸、例えばチロシンを有する第２の培地（及び第２の酵素の阻害剤を任意選択で含む培地）の存在下で培養するステップと
を含み、それによって、異種の核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法を特徴とする。
【０００６】
一態様では、本発明は、ＳＶ４０プロモーター配列、ｍＣＭＶプロモーター配列又はＰＧＫプロモーター配列のうちのいずれかからの制御領域を含む配列、例えばプロモーター配列に作動可能に連結された異種の脂質代謝変更因子（ＬＭＭ：ｌｉｐｉｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ｍｏｄｉｆｉｅｒ）をコードする配列を含む細胞を特徴とする。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】図１は、哺乳動物プロリン合成経路の律速段階を示す概略図である。疑問符は、グルタミン酸塩のグルタミン酸５−セミアルデヒドへの変換を阻害するために使用され得る可能性のある阻害剤を指す。
【図２】図２は、Ｐ５ＣＳ及びｅＧＦＰ遺伝子を保有する例示的なベクターのプラスミドマップを示す図である。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｂは、様々な培地（完全培地（６ｍＭグルタミン）、グルタミン欠損培地（グルタミンなし）及びプロリン欠損培地（プロリンなし））で培養されたＧＳＫＯ細胞の成長プロファイルを示す一連のグラフである。図３Ａは、生細胞濃度を示し、図３Ｂは、培養物生存率を示す。
【図３Ｂ】図３Ａ〜３Ｂは、様々な培地（完全培地（６ｍＭグルタミン）、グルタミン欠損培地（グルタミンなし）及びプロリン欠損培地（プロリンなし））で培養されたＧＳＫＯ細胞の成長プロファイルを示す一連のグラフである。図３Ａは、生細胞濃度を示し、図３Ｂは、培養物生存率を示す。
【図４Ａ】図４Ａ〜４Ｃは、エタネルセプト遺伝子（図４Ａ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ：ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）及びｅＧＦＰ遺伝子（図４Ｂ）又はＰ５ＣＳ及びｅＧＦＰ遺伝子（図４Ｃ）を含む例示的なベクターのプラスミドマップを示す一連のグラフである。
【図４Ｂ】図４Ａ〜４Ｃは、エタネルセプト遺伝子（図４Ａ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ：ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）及びｅＧＦＰ遺伝子（図４Ｂ）又はＰ５ＣＳ及びｅＧＦＰ遺伝子（図４Ｃ）を含む例示的なベクターのプラスミドマップを示す一連のグラフである。
【図４Ｃ】図４Ａ〜４Ｃは、エタネルセプト遺伝子（図４Ａ）、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ：ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ）及びｅＧＦＰ遺伝子（図４Ｂ）又はＰ５ＣＳ及びｅＧＦＰ遺伝子（図４Ｃ）を含む例示的なベクターのプラスミドマップを示す一連のグラフである。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｄは、図４で示される例示的なベクターのうちの１つを一過的にトランスフェクトし、その後、ＣＤ−ＣＨＯ（６ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するように補完されている）、チロシン非含有（チロシンなし）又はプロリン非含有（プロリンなし）培地で培養した細胞培養物の効果を示す一連のグラフである。トランスフェクション後７２時間及び１６８時間における、生細胞濃度（図５Ａ）、培養物生存率（図５Ｂ）、ｅＧＦＰ蛍光シグナル平均値（図５Ｃ）及び所定のｅＧＦＰ蛍光強度閾値を超える細胞の百分率（図５Ｄ）が示される。エラーバーは、平均値の標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図５Ｂ】図５Ａ〜５Ｄは、図４で示される例示的なベクターのうちの１つを一過的にトランスフェクトし、その後、ＣＤ−ＣＨＯ（６ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するように補完されている）、チロシン非含有（チロシンなし）又はプロリン非含有（プロリンなし）培地で培養した細胞培養物の効果を示す一連のグラフである。トランスフェクション後７２時間及び１６８時間における、生細胞濃度（図５Ａ）、培養物生存率（図５Ｂ）、ｅＧＦＰ蛍光シグナル平均値（図５Ｃ）及び所定のｅＧＦＰ蛍光強度閾値を超える細胞の百分率（図５Ｄ）が示される。エラーバーは、平均値の標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図５Ｃ】図５Ａ〜５Ｄは、図４で示される例示的なベクターのうちの１つを一過的にトランスフェクトし、その後、ＣＤ−ＣＨＯ（６ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するように補完されている）、チロシン非含有（チロシンなし）又はプロリン非含有（プロリンなし）培地で培養した細胞培養物の効果を示す一連のグラフである。トランスフェクション後７２時間及び１６８時間における、生細胞濃度（図５Ａ）、培養物生存率（図５Ｂ）、ｅＧＦＰ蛍光シグナル平均値（図５Ｃ）及び所定のｅＧＦＰ蛍光強度閾値を超える細胞の百分率（図５Ｄ）が示される。エラーバーは、平均値の標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図５Ｄ】図５Ａ〜５Ｄは、図４で示される例示的なベクターのうちの１つを一過的にトランスフェクトし、その後、ＣＤ−ＣＨＯ（６ｍＭ  Ｌ−グルタミンを含有するように補完されている）、チロシン非含有（チロシンなし）又はプロリン非含有（プロリンなし）培地で培養した細胞培養物の効果を示す一連のグラフである。トランスフェクション後７２時間及び１６８時間における、生細胞濃度（図５Ａ）、培養物生存率（図５Ｂ）、ｅＧＦＰ蛍光シグナル平均値（図５Ｃ）及び所定のｅＧＦＰ蛍光強度閾値を超える細胞の百分率（図５Ｄ）が示される。エラーバーは、平均値の標準偏差（ｎ＝３）を表す。
【図６Ａ】図６Ａ〜６Ｃは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。図６Ａは、フローサイトメトリー分析を使用して得られたヒストグラムを示す。図６Ｂ及び６Ｃ各々は、共焦点顕微鏡により生成した蛍光画像を示し；示されるチャネルは、ＤＡＰＩ、Ｐ５ＣＳ：ＴＲＩＴＣ及びｅＧＦＰである。図６Ｃは、Ｐ５ＣＳ生成プールとＧＳＫＯ宿主との間の比較を示す。
【図６Ｂ】図６Ａ〜６Ｃは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。図６Ａは、フローサイトメトリー分析を使用して得られたヒストグラムを示す。図６Ｂ及び６Ｃ各々は、共焦点顕微鏡により生成した蛍光画像を示し；示されるチャネルは、ＤＡＰＩ、Ｐ５ＣＳ：ＴＲＩＴＣ及びｅＧＦＰである。図６Ｃは、Ｐ５ＣＳ生成プールとＧＳＫＯ宿主との間の比較を示す。
【図６Ｃ】図６Ａ〜６Ｃは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。図６Ａは、フローサイトメトリー分析を使用して得られたヒストグラムを示す。図６Ｂ及び６Ｃ各々は、共焦点顕微鏡により生成した蛍光画像を示し；示されるチャネルは、ＤＡＰＩ、Ｐ５ＣＳ：ＴＲＩＴＣ及びｅＧＦＰである。図６Ｃは、Ｐ５ＣＳ生成プールとＧＳＫＯ宿主との間の比較を示す。
【図７】図７は、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連のウェスタンブロット画像である。また、細胞プール構築に使用されるベクターは、ｅＧＦＰ遺伝子（ｅＧＦＰ）、発現がＳＶ４０プロモーターによって駆動されるＳＣＤ１遺伝子（ＳＶ４０  ＳＣＤ１）、又は発現がｍＣＭＶプロモーターによって駆動されるＳＣＤ１遺伝子（ｍＣＭＶ  ＳＣＤ１）のいずれかを含有した。ウェスタンブロット分析を行って、Ｐ５ＣＳ、ＴＡＴ及びＳＣＤ１（目的の遺伝子）の発現を特定した。
【図８Ａ】図８Ａ〜８Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−アゼチジン−２−カルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図８Ａ）及び培養物生存率（図８Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図８Ｃ）、及び１０２（図８Ｄ）及び１０３（図８Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図８Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図８Ｂ】図８Ａ〜８Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−アゼチジン−２−カルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図８Ａ）及び培養物生存率（図８Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図８Ｃ）、及び１０２（図８Ｄ）及び１０３（図８Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図８Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図８Ｃ】図８Ａ〜８Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−アゼチジン−２−カルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図８Ａ）及び培養物生存率（図８Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図８Ｃ）、及び１０２（図８Ｄ）及び１０３（図８Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図８Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図８Ｄ】図８Ａ〜８Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−アゼチジン−２−カルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図８Ａ）及び培養物生存率（図８Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図８Ｃ）、及び１０２（図８Ｄ）及び１０３（図８Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図８Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図８Ｅ】図８Ａ〜８Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−アゼチジン−２−カルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図８Ａ）及び培養物生存率（図８Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図８Ｃ）、及び１０２（図８Ｄ）及び１０３（図８Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図８Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図８Ｆ】図８Ａ〜８Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−アゼチジン−２−カルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図８Ａ）及び培養物生存率（図８Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図８Ｃ）、及び１０２（図８Ｄ）及び１０３（図８Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図８Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤である３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンの存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図９Ａ）及び培養物生存率（図９Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図９Ｃ）、及び１０２（図９Ｄ）及び１０３（図９Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図９Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図９Ｂ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤である３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンの存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図９Ａ）及び培養物生存率（図９Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図９Ｃ）、及び１０２（図９Ｄ）及び１０３（図９Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図９Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図９Ｃ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤である３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンの存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図９Ａ）及び培養物生存率（図９Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図９Ｃ）、及び１０２（図９Ｄ）及び１０３（図９Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図９Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図９Ｄ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤である３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンの存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図９Ａ）及び培養物生存率（図９Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図９Ｃ）、及び１０２（図９Ｄ）及び１０３（図９Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図９Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図９Ｅ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤である３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンの存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図９Ａ）及び培養物生存率（図９Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図９Ｃ）、及び１０２（図９Ｄ）及び１０３（図９Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図９Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図９Ｆ】図９Ａ〜９Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤である３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンの存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図９Ａ）及び培養物生存率（図９Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図９Ｃ）、及び１０２（図９Ｄ）及び１０３（図９Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図９Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−４−チアゾリジンカルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−４−チアゾリジンカルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１０Ａ）及び培養物生存率（図１０Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１０Ｃ）、及び１０２（図１０Ｄ）及び１０３（図１０Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図１０Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図１０Ｂ】図１０Ａ〜１０Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−４−チアゾリジンカルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−４−チアゾリジンカルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１０Ａ）及び培養物生存率（図１０Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１０Ｃ）、及び１０２（図１０Ｄ）及び１０３（図１０Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図１０Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図１０Ｃ】図１０Ａ〜１０Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−４−チアゾリジンカルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−４−チアゾリジンカルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１０Ａ）及び培養物生存率（図１０Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１０Ｃ）、及び１０２（図１０Ｄ）及び１０３（図１０Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図１０Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図１０Ｄ】図１０Ａ〜１０Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−４−チアゾリジンカルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−４−チアゾリジンカルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１０Ａ）及び培養物生存率（図１０Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１０Ｃ）、及び１０２（図１０Ｄ）及び１０３（図１０Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図１０Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図１０Ｅ】図１０Ａ〜１０Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−４−チアゾリジンカルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−４−チアゾリジンカルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１０Ａ）及び培養物生存率（図１０Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１０Ｃ）、及び１０２（図１０Ｄ）及び１０３（図１０Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図１０Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図１０Ｆ】図１０Ａ〜１０Ｆは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−４−チアゾリジンカルボン酸の存在下で培養した細胞プールを示す一連の図である。Ｌ−４−チアゾリジンカルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を９６ウェル深型プレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１０Ａ）及び培養物生存率（図１０Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１０Ｃ）、及び１０２（図１０Ｄ）及び１０３（図１０Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。図１０Ｆは、指定された時点で回収し、且つＰ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰタンパク質を強調するためにプローブした可溶化液のウェスタンブロット分析を示す。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｅは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−アゼチジン−２−カルボン酸の存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を静置用２４ウェルプレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１１Ａ）及び培養物生存率（図１１Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１１Ｃ）、及び１０２（図１１Ｄ）及び１０３（図１１Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。
【図１１Ｂ】図１１Ａ〜１１Ｅは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−アゼチジン−２−カルボン酸の存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を静置用２４ウェルプレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１１Ａ）及び培養物生存率（図１１Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１１Ｃ）、及び１０２（図１１Ｄ）及び１０３（図１１Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。
【図１１Ｃ】図１１Ａ〜１１Ｅは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−アゼチジン−２−カルボン酸の存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を静置用２４ウェルプレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１１Ａ）及び培養物生存率（図１１Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１１Ｃ）、及び１０２（図１１Ｄ）及び１０３（図１１Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。
【図１１Ｄ】図１１Ａ〜１１Ｅは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−アゼチジン−２−カルボン酸の存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を静置用２４ウェルプレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１１Ａ）及び培養物生存率（図１１Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１１Ｃ）、及び１０２（図１１Ｄ）及び１０３（図１１Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。
【図１１Ｅ】図１１Ａ〜１１Ｅは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤であるＬ−アゼチジン−２−カルボン酸の存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を様々な異なる濃度で添加し、細胞を静置用２４ウェルプレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１１Ａ）及び培養物生存率（図１１Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１１Ｃ）、及び１０２（図１１Ｄ）及び１０３（図１１Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｅは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤である３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンの存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを様々な異なる濃度で添加し、細胞を静置用２４ウェルプレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１２Ａ）及び培養物生存率（図１２Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１２Ｃ）、及び１０２（図１２Ｄ）及び１０３（図１２Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。
【図１２Ｂ】図１２Ａ〜１２Ｅは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤である３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンの存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを様々な異なる濃度で添加し、細胞を静置用２４ウェルプレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１２Ａ）及び培養物生存率（図１２Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１２Ｃ）、及び１０２（図１２Ｄ）及び１０３（図１２Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。
【図１２Ｃ】図１２Ａ〜１２Ｅは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤である３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンの存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを様々な異なる濃度で添加し、細胞を静置用２４ウェルプレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１２Ａ）及び培養物生存率（図１２Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１２Ｃ）、及び１０２（図１２Ｄ）及び１０３（図１２Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。
【図１２Ｄ】図１２Ａ〜１２Ｅは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤である３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンの存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを様々な異なる濃度で添加し、細胞を静置用２４ウェルプレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１２Ａ）及び培養物生存率（図１２Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１２Ｃ）、及び１０２（図１２Ｄ）及び１０３（図１２Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。
【図１２Ｅ】図１２Ａ〜１２Ｅは、Ｐ５ＣＳ過剰発現を使用して生成し、プロリンの非存在下、且つＰ５ＣＳ阻害剤である３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンの存在下で培養した細胞プールの分析を示す一連の図である。３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを様々な異なる濃度で添加し、細胞を静置用２４ウェルプレートで９日間培養した。これらの細胞を、生細胞濃度（図１２Ａ）及び培養物生存率（図１２Ｂ）によって測定して、細胞成長について分析した。また、細胞を、培養物蛍光平均値（図１２Ｃ）、及び１０２（図１２Ｄ）及び１０３（図１２Ｅ）の所定の閾値を超える細胞の百分率について分析した。
【図１３】図１３は、示されるプロモーター（ＳＶ４０、ｍＣＭＶ又はＰＧＫプロモーター）の制御下の示される脂質代謝変更因子（ＬＭＭ）遺伝子（ＳＣＤ１、ＳＲＥＢＦ１又はＳＲＥＢ４１１）を有する例示的なベクター、及び示される目的の組換えタンパク質（エタネルセプト、セルグツズマブ（Ｃｅｒｇｕｔｕｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ又はｃＢ７２．３）をコードする遺伝子を有する第２の例示的なベクターをコトランスフェクトした培養物の回復速度（日）を示す図である。
【図１４Ａ】図１４Ａ〜１４Ｄは、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１４Ａ）、セルグツズマブ（図１４Ｂ）、インフリキシマブ（図１４Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１４Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞の１０６／ｍｌでの平均生細胞濃度（ＶＣＣ：ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を示す一連のグラフである。細胞培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。
【図１４Ｂ】図１４Ａ〜１４Ｄは、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１４Ａ）、セルグツズマブ（図１４Ｂ）、インフリキシマブ（図１４Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１４Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞の１０６／ｍｌでの平均生細胞濃度（ＶＣＣ：ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を示す一連のグラフである。細胞培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。
【図１４Ｃ】図１４Ａ〜１４Ｄは、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１４Ａ）、セルグツズマブ（図１４Ｂ）、インフリキシマブ（図１４Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１４Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞の１０６／ｍｌでの平均生細胞濃度（ＶＣＣ：ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を示す一連のグラフである。細胞培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。
【図１４Ｄ】図１４Ａ〜１４Ｄは、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１４Ａ）、セルグツズマブ（図１４Ｂ）、インフリキシマブ（図１４Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１４Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした細胞の１０６／ｍｌでの平均生細胞濃度（ＶＣＣ：ｖｉａｂｌｅ  ｃｅｌｌ  ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を示す一連のグラフである。細胞培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。
【図１５Ａ】図１５Ａ〜１５Ｄは、簡易的流加回分過剰成長（ａＦＯＧ：ａｂｒｉｄｇｅｄ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｏｖｅｒｇｒｏｗ）中の細胞の１０６／ｍｌでの平均生細胞濃度（ＶＣＣ）を示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１５Ａ）、セルグツズマブ（図１５Ｂ）、インフリキシマブ（図１５Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１５Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。細胞培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。
【図１５Ｂ】図１５Ａ〜１５Ｄは、簡易的流加回分過剰成長（ａＦＯＧ：ａｂｒｉｄｇｅｄ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｏｖｅｒｇｒｏｗ）中の細胞の１０６／ｍｌでの平均生細胞濃度（ＶＣＣ）を示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１５Ａ）、セルグツズマブ（図１５Ｂ）、インフリキシマブ（図１５Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１５Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。細胞培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。
【図１５Ｃ】図１５Ａ〜１５Ｄは、簡易的流加回分過剰成長（ａＦＯＧ：ａｂｒｉｄｇｅｄ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｏｖｅｒｇｒｏｗ）中の細胞の１０６／ｍｌでの平均生細胞濃度（ＶＣＣ）を示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１５Ａ）、セルグツズマブ（図１５Ｂ）、インフリキシマブ（図１５Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１５Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。細胞培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。
【図１５Ｄ】図１５Ａ〜１５Ｄは、簡易的流加回分過剰成長（ａＦＯＧ：ａｂｒｉｄｇｅｄ  ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ  ｏｖｅｒｇｒｏｗ）中の細胞の１０６／ｍｌでの平均生細胞濃度（ＶＣＣ）を示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１５Ａ）、セルグツズマブ（図１５Ｂ）、インフリキシマブ（図１５Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１５Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。細胞培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。
【図１６Ａ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ａＦＯＧ中のＬＭＭ遺伝子及び目的の遺伝子を発現する細胞培養物の特定の生産性のバブルプロットを示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１６Ａ）、セルグツズマブ（図１６Ｂ）、インフリキシマブ（図１６Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１６Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。タンパク質Ａバイオセンサーを伴うＯｃｔｅｔ器具を使用して、生産性を測定した。示される各データ点は、個々の培養物に対応し；各データ点の直径は、その培養物について達成された生成物濃度を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ａＦＯＧ中のＬＭＭ遺伝子及び目的の遺伝子を発現する細胞培養物の特定の生産性のバブルプロットを示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１６Ａ）、セルグツズマブ（図１６Ｂ）、インフリキシマブ（図１６Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１６Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。タンパク質Ａバイオセンサーを伴うＯｃｔｅｔ器具を使用して、生産性を測定した。示される各データ点は、個々の培養物に対応し；各データ点の直径は、その培養物について達成された生成物濃度を示す。
【図１６Ｃ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ａＦＯＧ中のＬＭＭ遺伝子及び目的の遺伝子を発現する細胞培養物の特定の生産性のバブルプロットを示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１６Ａ）、セルグツズマブ（図１６Ｂ）、インフリキシマブ（図１６Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１６Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。タンパク質Ａバイオセンサーを伴うＯｃｔｅｔ器具を使用して、生産性を測定した。示される各データ点は、個々の培養物に対応し；各データ点の直径は、その培養物について達成された生成物濃度を示す。
【図１６Ｄ】図１６Ａ〜１６Ｄは、ａＦＯＧ中のＬＭＭ遺伝子及び目的の遺伝子を発現する細胞培養物の特定の生産性のバブルプロットを示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１６Ａ）、セルグツズマブ（図１６Ｂ）、インフリキシマブ（図１６Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１６Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。培養物を深型ウェルプレートで成長させ、各培養物／ウェルのＣｅｌｉｇｏ細胞カウントによりＶＣＣを測定した。タンパク質Ａバイオセンサーを伴うＯｃｔｅｔ器具を使用して、生産性を測定した。示される各データ点は、個々の培養物に対応し；各データ点の直径は、その培養物について達成された生成物濃度を示す。
【図１７Ａ】図１７Ａ〜１７Ｄは、ａＦＯＧ中のＬＭＭ遺伝子及び目的の遺伝子を発現する細胞培養物の生成物濃度の９５％信頼区間プロットを示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１７Ａ）、セルグツズマブ（図１７Ｂ）、インフリキシマブ（図１７Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１７Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。タンパク質Ａバイオセンサーを伴うＯｃｔｅｔを使用して、生産性を測定した。各データ点は、ｐ＝０．９５の信頼区間での示される培養物の生産性の平均値を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａ〜１７Ｄは、ａＦＯＧ中のＬＭＭ遺伝子及び目的の遺伝子を発現する細胞培養物の生成物濃度の９５％信頼区間プロットを示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１７Ａ）、セルグツズマブ（図１７Ｂ）、インフリキシマブ（図１７Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１７Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。タンパク質Ａバイオセンサーを伴うＯｃｔｅｔを使用して、生産性を測定した。各データ点は、ｐ＝０．９５の信頼区間での示される培養物の生産性の平均値を示す。
【図１７Ｃ】図１７Ａ〜１７Ｄは、ａＦＯＧ中のＬＭＭ遺伝子及び目的の遺伝子を発現する細胞培養物の生成物濃度の９５％信頼区間プロットを示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１７Ａ）、セルグツズマブ（図１７Ｂ）、インフリキシマブ（図１７Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１７Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。タンパク質Ａバイオセンサーを伴うＯｃｔｅｔを使用して、生産性を測定した。各データ点は、ｐ＝０．９５の信頼区間での示される培養物の生産性の平均値を示す。
【図１７Ｄ】図１７Ａ〜１７Ｄは、ａＦＯＧ中のＬＭＭ遺伝子及び目的の遺伝子を発現する細胞培養物の生成物濃度の９５％信頼区間プロットを示す一連のグラフである。細胞に、示されるプロモーターの制御下の示されるＬＭＭ遺伝子、及びエタネルセプト（図１７Ａ）、セルグツズマブ（図１７Ｂ）、インフリキシマブ（図１７Ｃ）又はｃＢ７２．３（図１７Ｄ）をコードする遺伝子をトランスフェクトした。タンパク質Ａバイオセンサーを伴うＯｃｔｅｔを使用して、生産性を測定した。各データ点は、ｐ＝０．９５の信頼区間での示される培養物の生産性の平均値を示す。
【図１８】図１８は、Ｐ５ＣＳ代謝選択系を使用して単離したＳＣＤ１又はＳＲＥＢＦ１操作導入ＣＨＯ細胞、及び培地中のプロリンの非存在下で成長させた細胞からの細胞可溶化液の一連のウェスタンブロットである。
【図１９Ａ】図１９Ａ〜１９Ｄは、これらの脂質代謝変更（ＬＭＭ）遺伝子の様々な量の発現を有し、次に選択マーカーグルタミンシンテターゼとともにエタネルセプト又はインフリキシマブのいずれか及び組換えタンパク質分子の分泌発現についての遺伝子をトランスフェクトした、ＳＲＥＢＦ１又はＳＣＤ１操作導入ＣＨＯ細胞プールの、グルタミン又はプロリンの非存在下の流加回分条件下でミニチュアバイオリアクターにてアセスメントした、ＩＶＣに対する細胞特異的生産性（Ｑｐ）の一連のグラフを示す。
【図１９Ｂ】図１９Ａ〜１９Ｄは、これらの脂質代謝変更（ＬＭＭ）遺伝子の様々な量の発現を有し、次に選択マーカーグルタミンシンテターゼとともにエタネルセプト又はインフリキシマブのいずれか及び組換えタンパク質分子の分泌発現についての遺伝子をトランスフェクトした、ＳＲＥＢＦ１又はＳＣＤ１操作導入ＣＨＯ細胞プールの、グルタミン又はプロリンの非存在下の流加回分条件下でミニチュアバイオリアクターにてアセスメントした、ＩＶＣに対する細胞特異的生産性（Ｑｐ）の一連のグラフを示す。
【図１９Ｃ】図１９Ａ〜１９Ｄは、これらの脂質代謝変更（ＬＭＭ）遺伝子の様々な量の発現を有し、次に選択マーカーグルタミンシンテターゼとともにエタネルセプト又はインフリキシマブのいずれか及び組換えタンパク質分子の分泌発現についての遺伝子をトランスフェクトした、ＳＲＥＢＦ１又はＳＣＤ１操作導入ＣＨＯ細胞プールの、グルタミン又はプロリンの非存在下の流加回分条件下でミニチュアバイオリアクターにてアセスメントした、ＩＶＣに対する細胞特異的生産性（Ｑｐ）の一連のグラフを示す。
【図１９Ｄ】図１９Ａ〜１９Ｄは、これらの脂質代謝変更（ＬＭＭ）遺伝子の様々な量の発現を有し、次に選択マーカーグルタミンシンテターゼとともにエタネルセプト又はインフリキシマブのいずれか及び組換えタンパク質分子の分泌発現についての遺伝子をトランスフェクトした、ＳＲＥＢＦ１又はＳＣＤ１操作導入ＣＨＯ細胞プールの、グルタミン又はプロリンの非存在下の流加回分条件下でミニチュアバイオリアクターにてアセスメントした、ＩＶＣに対する細胞特異的生産性（Ｑｐ）の一連のグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
定義
別に定義しない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって通常理解される意味と同じ意味を有する。本明細書で説明される方法及び材料と同様又は均等の方法及び材料は、本発明の実施又は試験において使用することができるが、好適な方法及び材料は、以下に説明される。本明細書で言及される全ての出版物、特許出願、特許及び他の参考文献は、それらを全体として参照により組み込む。加えて、材料、方法及び例は、単に例示であり、限定であるとは意図されない。見出し、副見出し又は番号要素若しくは文字要素、例えば（ａ）、（ｂ）、（ｉ）等は、単に読み易さのために示される。この文書中の見出し又は番号要素若しくは文字要素の使用は、ステップ又は要素がアルファベット順に行われること、又はステップ又は要素が必ずしも互いに分離されることを必要としない。本発明の他の特徴、目的及び利点は、説明及び図面、並びに特許請求の範囲から明らかである。また、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明する目的のためのみであり、限定であるとは意図されないことが理解されるべきである。
【０００９】
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、冠詞の文法的目的物のうちの１つ又は１つよりも多く（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。一部の実施形態では、冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、冠詞の文法的目的物のうちの単一の１つを指す。一部の実施形態では、冠詞「ａ」又は「ａｎ」は、複数の（例えば１つよりも多い、例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれよりも多い）冠詞の文法的目的物を指す。例として、「ａ  ｃｅｌｌ（細胞）」は、１つの細胞又は１つよりも多い（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００又はそれよりも多い）細胞を意味し得る。
【００１０】
「約」という用語は、量、一時的な持続期間等の測定可能な値について言及する場合、変動が、開示される方法を行うために適切であるとき、指定された値からの±２０％、又は一部の場合±１０％、又は一部の場合±５％、又は一部の場合±１％、又は一部の場合±０．１％のそのような変動を包含することを意味する。
【００１１】
本明細書で使用される場合、「複数（ｐｌｕｒａｌｉｔｙ）」という用語は、冠詞の文法的目的物のうちの１つよりも多く（例えば２つ又はそれよりも多く）を指す。例として、「複数の細胞」とは、２つの細胞又は２つよりも多い細胞を意味し得る。
【００１２】
本明細書で使用される場合、「内因性」という用語は、生物、細胞、組織又は系からの任意の材料、又はこれらの内側で天然に産生された任意の材料を指す。
【００１３】
本明細書で使用される場合、「異種の」という用語は、生物、細胞、組織又は系に導入された任意の材料、及び／又はこれらの外側で産生された任意の材料を指す。したがって、「異種の核酸」とは、生物、細胞、組織又は系に導入された核酸、及び／又はこれらの外側で産生された核酸を指す。一部の実施形態では、異種の核酸の配列は、異種の核酸が導入される生物、細胞、組織又は系の内側で天然に産生されないか、又は天然に見出すことができない。一部の実施形態では、異種の核酸の配列は、生物、細胞、組織又は系の内側で天然に見出すことができる（例えば、細胞で天然に見られる、例えば本明細書で説明される酵素又はＬＭＭをコードする核酸（ここでは、その後、核酸は細胞内で発現して、酵素又はＬＭＭの追加のコピーを産生する））。同様に、「異種のポリペプチド」とは、生物、細胞、組織又は系に導入されたポリペプチド、及び／又はこれらの外側で産生されたポリペプチドを指す。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば異種の核酸配列からの発現によって、異種のポリペプチドが導入される生物、細胞、組織又は系の内側で天然に産生されないか、又は天然に見出すことができない。一部の実施形態では、異種のポリペプチドは、生物、細胞、組織又は系の内側で天然に見出すことができる（例えば、細胞で異所的にも発現される、細胞で天然に見られる、例えば本明細書で説明される酵素又はＬＭＭ）。ある特定の実施形態では、異種の核酸又はポリペプチドは、同じポリペプチド又は核酸の内因性コピーを含む生物、細胞、組織又は系に導入され、それによって、生物、細胞、組織又は系におけるポリペプチド又は核酸の量を増大する。ある特定の場合、「異種の」という用語は、異なる種からの生物、細胞、組織又は系に導入された場合の１つの種からの任意の材料を指し得る。一部の場合、「異種の」及び「外因性」という用語は、互換的に使用される。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「酵素分子」という用語は、目的の酵素活性を有するポリペプチドを指す。酵素分子は、目的の酵素活性を有する酵素と構造的類似性（例えば配列相同性）を共有し得る。一部の場合、酵素分子は、目的の酵素活性を有する酵素に対する少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性（例えば少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性）を有する。一部の場合、「分子」という用語は、酵素（例えばピロリン−５−カルボン酸シンターゼ（Ｐ５ＣＳ：ｐｙｒｒｏｌｉｎｅ−５−ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ））についての識別子で使用される場合、特定された酵素の酵素活性を有するポリペプチドを指す。例として、「Ｐ５ＣＳ分子」という用語は、本明細書で使用される場合、Ｐ５ＣＳの酵素活性を有するポリペプチドを指す。一部の場合、Ｐ５ＣＳ分子は、Ｐ５ＣＳ酵素（例えば哺乳動物Ｐ５ＣＳ）に対する少なくとも５０％のアミノ酸配列同一性（例えば少なくとも約５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性）を有する。
【００１５】
本明細書で使用される場合、「核酸」、「ポリヌクレオチド」又は「核酸分子」という用語は、互換的に使用され、一本鎖又は二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ：ｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）若しくはリボ核酸（ＲＮＡ：ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ）又はそのＤＮＡ若しくはＲＮＡの組合せ及びそのポリマーを指す。「核酸」という用語には、遺伝子、ｃＤＮＡ又はＲＮＡ配列（例えばｍＲＮＡ）が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、核酸分子は、合成（例えば化学合成又は人工）又は組換えである。特に限定しない限り、この用語は、参照核酸と類似する結合特性を有し、天然又は非天然ヌクレオチドと類似する様式で代謝される天然ヌクレオチドのアナログ又は誘導体を含有する分子を包含する。別に示さない限り、また、特定の核酸配列は、明確に示される配列はもちろん、その保存的改変バリアント（例えば縮重コドン置換）、対立遺伝子、オルソログ、ＳＮＰ及び相補配列を暗に包含する。特に、縮重コドン置換は、１つ又は複数の選択される（又は全ての）コドンの第３番目の位置が混合塩基及び／又はデオキシイノシン残基により置換されている配列を生成することによって達成され得る（Ｂａｔｚｅｒら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１９：５０８１（１９９１）；Ｏｈｔｓｕｋａら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６０：２６０５〜２６０８（１９８５）；及びＲｏｓｓｏｌｉｎｉら、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｐｒｏｂｅｓ  ８：９１〜９８（１９９４））。本明細書で使用される場合、「対象核酸」により、本明細書で説明されるように細胞内に望ましく導入され得るか、又は細胞内に存在し得る、例えば本明細書で説明される生成物をコードする配列を含む、任意の目的の核酸を意味する。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「ペプチド」、「ポリペプチド」及び「タンパク質」という用語は、互換的に使用され、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって共有結合されたアミノ酸残基からなる化合物を指す。タンパク質又はペプチドは、少なくとも２つのアミノ酸を含有しなければならず、タンパク質の配列又はペプチドの配列を構成し得るアミノ酸の最大数についての限定はない。一実施形態では、タンパク質は、１つよりも多い、例えば２、３、４、５つ又はそれよりも多いポリペプチドからなる場合があり、各ポリペプチドは、共有結合又は非共有結合／相互作用のいずれかによって別のポリペプチドと会合している。ポリペプチドは、ペプチド結合によって、又はペプチド結合以外の手段によって互いに接合された２つ又はそれよりも多いアミノ酸を含む任意のペプチド又はタンパク質を含む。本明細書で使用される場合、この用語は、当該技術分野で例えばペプチド、オリゴペプチド及びオリゴマーとも通常呼ばれる短鎖、及び当該技術分野でタンパク質と一般的に呼ばれ、タンパク質には多くの種類がある長鎖の両方を指す。「ポリペプチド」には、数ある中で、例えば、生物学的に活性な断片、実質的に相同のポリペプチド、オリゴペプチド、ホモダイマー、ヘテロダイマー、ポリペプチドのバリアント、改変ポリペプチド、誘導体、アナログ、融合タンパク質が含まれる。
【００１７】
「生成物」とは、その用語が本明細書で使用される場合、細胞、例えば生成物を産生するように改変又は操作された細胞によって産生される、例えば発現される分子、例えばポリペプチド、例えばタンパク質、例えば糖タンパク質、核酸、脂質、糖、多糖又はそれらの任意のハイブリッドを指す。一実施形態では、生成物は、タンパク質又はポリペプチド生成物である。一実施形態では、生成物は、天然生成物を含む。一実施形態では、生成物は、非天然生成物を含む。一実施形態では、生成物の一部分は天然であり、一方で、生成物の別の部分は非天然である。一実施形態では、生成物は、ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドである。一実施形態では、生成物は、診断的使用又は前臨床使用に好適である。別の実施形態では、生成物は、治療的使用のため、例えば疾患の治療のために好適である。一部の実施形態では、生成物は、タンパク質生成物である。一部の実施形態では、生成物は、本明細書で説明される、例えば表５〜８の、組換えタンパク質又は治療用タンパク質である。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、コード配列をプロモーターに作動可能に連結することがコード配列の発現をもたらすような十分な配列、例えば天然プロモーター又は操作されたプロモーターからの十分な配列を有する配列を指す。例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ：ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）プロモーターは、ＣＭＶプロモーターの全て又は活性断片、例えば任意選択でイントロンＡ及び／又はＵＴＲ配列を含むＣＭＶプロモーターの全て又は活性断片を含む。一実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、天然又は操作されたバリアントＣＭＶプロモーターとは５、１０、２０、３０、５０又は１００個以下のヌクレオチドにおいて異なる。一実施形態では、ＣＭＶプロモーターは、天然又は操作されたバリアントＣＭＶプロモーターとはそのヌクレオチドの１、５、１０又は５０％以下において異なる。プロモーターは、本明細書で使用される場合、プロモーターが含むプロモーター配列の構成的特性、調節された特性、抑制特性、強い特性、弱い特性又は他の特性であり得る。一実施形態では、プロモーターは、コード配列、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドのコード配列の５’又は３’配列を含み得る。一実施形態では、プロモーターは、遺伝子、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ又は複数のイントロン内の配列を含み得る。一実施形態では、プロモーターは、部分的に、又はその全体として、コード配列、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドのコード配列の５’又は３’配列内に含まれ得る。一実施形態では、プロモーターは、部分的に、又はその全体として、コード配列、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドのコード配列内に含まれ得る。一実施形態では、プロモーターは、部分的に、又はその全体として、遺伝子、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ又は複数のイントロン内に含まれ得る。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結された」という用語は、ポリペプチドをコードする配列及び制御エレメントが、制御エレメントが生成物（例えばポリペプチド）をコードする配列の発現を調節するために好適な様式で配置されている場合、それらが作動可能に連結されている、生成物（例えばポリペプチド）をコードする核酸配列と制御エレメントとの間の関係を指す。したがって、様々な制御エレメントについて、作動可能に連結されたものは、制御エレメントに対する生成物（例えばポリペプチド）をコードする配列の様々な配置を構成する。例えば、プロモーターエレメント及び生成物（例えばポリペプチド）をコードする配列が互いに近位に、且つ同じ核酸上に配置されている場合、生成物（例えばポリペプチド）をコードする配列は、プロモーターエレメントを含む制御エレメントに作動可能に連結され得る。別の例では、エンハンサー配列及び生成物（例えばポリペプチド）をコードする配列が同じ核酸上で好適な塩基数離れているか、又はさらには別個及び別々の核酸上に配置されている場合、生成物（例えばポリペプチド）をコードする配列は、遠位に作動するエンハンサー配列を含む制御エレメントに作動可能に連結され得る。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「制御エレメント」という用語は、コード配列、例えば遺伝子の発現を調節する（例えば増大又は減少させる）ために好適な核酸を指す。制御エレメントは、プロモーター配列、エンハンサー配列、又はプロモーター配列及びエンハンサー配列の両方を含み得る。制御エレメントは、連続核酸配列、非連続核酸配列（他のコード又は非コード核酸配列によって中断された配列）又はこれらの両方を含み得る。単一の制御エレメントは、単一の核酸又は１つよりも多い核酸に含まれ得る。一実施形態では、制御エレメントは、コード配列、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドのコード配列の５’又は３’配列を含み得る。一実施形態では、制御エレメントは、遺伝子、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ又は複数のイントロン内の配列を含み得る。一実施形態では、制御エレメントは、部分的に、又はその全体として、コード配列、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドのコード配列の５’又は３’配列内に含まれ得る。一実施形態では、制御エレメントは、部分的に、又はその全体として、コード配列、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドのコード配列内に含まれ得る。一実施形態では、制御エレメントは、部分的に、又はその全体として、遺伝子、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子の１つ又は複数のイントロン内に含まれ得る。一実施形態では、単一の制御エレメントは、ｉ）遺伝子、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子に近位の（例えば遺伝子に隣接するか、又は遺伝子内に含有される）核酸配列、又はｉｉ）遺伝子、例えば組換えポリペプチド、治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドをコードする遺伝子に遠位の（例えば１０若しくはそれよりも多い、１００若しくはそれよりも多い、１０００若しくはそれよりも多い又は１０，０００若しくはそれよりも多い塩基によって分離されているか、又は別個又は別々の核酸に配置されている）核酸配列を含み得る。
【００２１】
「脂質代謝変更因子」又は「ＬＭＭ」は、本明細書で使用される場合、以下のこと：脂質代謝経路に関与する成分の発現（例えば転写又は翻訳）；脂質代謝経路に関与する成分、例えば遺伝子産物の活性（例えば酵素活性）；細胞内に存在する脂質のレベル若しくは量；脂質ラフトのレベル若しくは量又は脂質ラフト形成速度；細胞膜、例えば形質膜若しくは細胞小器官膜の流動性、浸透性若しくは厚さ；飽和脂質の不飽和脂質への変換若しくはその逆の変換；細胞内の飽和脂質若しくは不飽和脂質、例えば一不飽和脂質のレベル若しくは量；ＥＲの活性に好ましい影響を有する好ましい脂質組成を達成するための脂質組成；ＥＲの拡張；ゴルジ体の拡張；分泌小胞若しくは分泌小胞形成のレベル若しくは量；分泌のレベル若しくは速度；膜受容体（例えばＡＴＲ（例えばＴｈｅ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｏｆ  ｃｅｌｌ−ｍｅｍｂｒａｎｏｕｓ  ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｕｎｓａｔｕｒａｔｅｄ  ｆａｔｔｙ  ａｃｉｄ  ｒｅｓｉｄｕｅｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐ５３  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＡＴＲ．  Ｚｈａｎｇ  ＸＨ、Ｚｈａｏ  Ｃ、Ｍａ  ＺＡ．  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．  ２００７年１２月１日；１２０（Ｐｔ２３）：４１３４〜４３  ＰＭＩＤ：１８０３２７８６；ＡＴＲ（ａｔａｘｉａ  ｔｅｌａｎｇｉｅｃｔａｓｉａ  ｍｕｔａｔｅｄ−  ａｎｄ  Ｒａｄ３−ｒｅｌａｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ）  ｉｓ  ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｂｙ  ｍｉｌｄ  ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ  ｉｎ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｌｙ  ａｃｔｉｖａｔｅｓ  ｐ５３．  Ｒｏｏｂｏｌ  Ａ、Ｒｏｏｂｏｌ  Ｊ、Ｃａｒｄｅｎ  ＭＪ、Ｂａｓｔｉｄｅ  Ａ、Ｗｉｌｌｉｓ  ＡＥ、Ｄｕｎｎ  ＷＢ、Ｇｏｏｄａｃｒｅ  Ｒ、Ｓｍａｌｅｓ  ＣＭ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．  ２０１１年４月１５日；４３５（２）：４９９〜５０８．  ｄｏｉ：１０．１０４２／ＢＪ２０１０１３０３．  ＰＭＩＤ：２１２８４６０３を参照のこと）及びＳＲＥＰＢ（例えばＩｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｓｃｉ．  ２０１６年３月２１日；１２（５）：５６９〜７９．  ｄｏｉ：１０．７１５０／ｉｊｂｓ．１４０２７．  ｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ２０１６．  Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐａｔｈｗａｙ  Ｉｓ  Ｉｎｖｏｌｖｅｄ  ｉｎ  Ｌｉｐｉｄ  Ｄｉｓｏｒｄｅｒ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ  Ｏｒｇａｎ  Ｉｎｊｕｒｙ．  Ｚｈａｎｇ  Ｙ、Ｍａ  ＫＬ、Ｒｕａｎ  ＸＺ、Ｌｉｕ  ＢＣを参照のこと）並びに追加の受容体（例えばＢｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．  ２０１６年３月１７日  ｐｉｉ：Ｓ１３８８〜１９８１（１６）３００７１〜３．  ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｂｂａｌｉｐ．２０１６．０３．０１９を参照のこと）の活性化若しくは不活性化；並びに／又は小胞体ストレス応答（ＵＰＲ：ｕｎｆｏｌｄｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ）のうちの１つ又は複数を変更する、例えば増大又は減少させる分子、遺伝子産物、ポリペプチド又は酵素を指す。一実施形態では、ＬＭＭは、ポリペプチドを含む。一実施形態では、ＬＭＭは、転写レギュレーター、例えば転写因子を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＲＥＢＦ１又はその機能的断片（例えばＳＲＥＢＦ−４１０）を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、酵素を含む。一実施形態では、ＬＭＭは、ＳＣＤ１又はその機能的断片を含む。
【００２２】
細胞を特定、選択又は培養する方法
一態様では、本開示の発明は、細胞を特定、選択及び／又は培養する方法に関する。一部の実施形態では、本方法は、
ａ）（ｉ）対象核酸配列と、
（ｉｉ）発現した場合、アミノ酸の合成経路の酵素の高レベルの活性をもたらす核酸配列、例えば活性を含む酵素分子をコードする核酸配列と
を含む核酸、例えばベクター、例えば複製可能ベクター又は統合ベクターを含む細胞を用意するステップと、
ｂ）核酸配列を含む細胞を、核酸配列を含む細胞の成長を可能にするために十分な条件下で、高活性を有しない細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルのアミノ酸を有する培地の存在下で培養するステップと
を含み、それによって、異種の核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する。
【００２３】
一部の実施形態では、酵素分子は、アミノ酸の生合成経路の律速段階を触媒する。他の実施形態では、酵素分子は、アミノ酸の生合成経路の非律速段階を触媒する。実施形態では、アミノ酸は、プロリン、チロシン又はトリプトファンである。
【００２４】
一部の実施形態では、細胞は、酵素分子の活性の阻害剤をさらに含む。阻害剤は、例えば、対象核酸配列を含む核酸を取り込まない細胞が低レベル又は検出不能なレベルの内因性酵素分子活性を示すように、内因性酵素分子活性を低減又は防止することによって、選択プロセスの厳密性を増大させるために使用され得る。低レベル又は検出不能なレベルの内因性酵素分子活性を示す細胞は、合成に酵素分子の活性を必要とするアミノ酸（例えばプロリン、チロシン又はトリプトファン）の外部供給の非存在下では成長及び／又は生存することができない場合がある。一部の実施形態では、阻害剤は、酵素分子に結合し、例えば阻害剤は、酵素分子に結合し、これを阻害する。実施形態では、阻害剤は、酵素分子のアロステリック阻害剤である。実施形態では、阻害剤は、酵素分子の競合的阻害剤である。一部の実施形態では、阻害剤は、酵素分子の転写又は翻訳、例えば酵素分子の内因性転写又は翻訳を阻害する。一部の実施形態では、阻害剤は、プロリン、チロシン又はトリプトファンの生合成経路の酵素分子を阻害する。実施形態では、阻害剤は、ピロリン−５−カルボン酸シンターゼ（Ｐ５ＣＳ）分子の活性を阻害する。実施形態では、阻害剤は、Ｐ５ＣＳの活性を阻害する。実施形態では、阻害剤は、プロリンアナログである。実施形態では、阻害剤は、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリン又はＬ−４−チアゾリジンカルボン酸である。
【００２５】
一部の実施形態では、本方法は、１つ又は複数の追加の培養ステップをさらに含む。一部の実施形態では、１つ又は複数の追加の培養ステップは、第２の培地（例えば第１の培養ステップで使用された培地組成と同じ培地組成、又は第１の培養ステップで使用された培地とは異なる培地）の存在下で細胞を培養することを含む。実施形態では、第１の培養ステップは、不十分なレベルの第１のアミノ酸（例えばプロリン）を含む培地、例えば第１のアミノ酸を欠く培地を利用し、第２の培養ステップは、不十分なレベルの第２のアミノ酸（例えばチロシン又はトリプトファン）を含む培地、例えば第２のアミノ酸を欠く培地を利用する。実施形態では、細胞が目的の対象核酸をさらに含む場合のみ、細胞は、第１のアミノ酸の産生を救済する酵素分子及び／又は第２のアミノ酸の産生を救済する酵素分子を含む。この手法は、追加の培養ステップに拡張することができ、各培養ステップは、不十分なレベルのアミノ酸（例えば第１又は第２の培養培地に含まれないアミノ酸と同じ又は異なるアミノ酸）を含む培地、例えばアミノ酸を欠く培地、及びアミノ酸（例えば第１又は第２の培養培地に含まれないアミノ酸と同じ又は異なるアミノ酸）の産生を救済することができる酵素分子を含む細胞を含むことが企図される。実施形態では、追加の培養ステップで使用される培地は、追加の培養ステップで使用される培養物に含まれないアミノ酸の阻害剤を含む。一部の実施形態では、培養ステップは、同時に、例えば不十分なレベルの複数のアミノ酸を含む培地、例えば複数のアミノ酸を欠く培地を使用して、行われ得る。一部の実施形態では、１サブセットの培養ステップのみが、酵素分子の阻害剤を使用することを含む。例えば、第１の培養ステップは、酵素分子の阻害剤を使用することを含み、酵素分子の阻害剤を使用することを含まない培養ステップがこれに続いてもよい。
【００２６】
一部の実施形態では、本方法は、異種の核酸を含む細胞、例えば生成物、例えばポリペプチド生成物、例えば抗体を産生するために有用な細胞を生成するために使用することができる。
【００２７】
酵素分子及びその阻害剤
本発明は一般には、アミノ酸の生合成に関与する酵素分子の発現を選択することによって、核酸が導入された細胞を選択するための方法及び組成物を特徴とする。酵素分子は、対象核酸とともに細胞に導入され得る。例えば、酵素分子が細胞内で発現されるように、対象核酸及び酵素分子をコードする遺伝子の両方を含む核酸が、細胞に導入され得る。一部の実施形態では、対象核酸を含む細胞は、対象核酸を欠く細胞と比較して、高い酵素分子活性を示す。一部の実施形態では、酵素分子活性のレベルは、対象核酸を欠く細胞において検出可能な酵素分子活性と比較して、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、２００％、５００％、１０００％又はそれよりも高く増大する。一部の実施形態では、高活性を有する細胞は、対象核酸を欠く細胞よりも迅速に成長し得る。一部の実施形態では、細胞は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、５００、１０００、５０００、１０，０００コピー又はそれよりも多いコピーの、酵素をコードする核酸を含む。実施形態では、高活性を有する細胞は、アミノ酸を欠く培地で、対象核酸を欠く細胞よりも少なくとも約１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、５０００又は１０，０００倍迅速に成長する。その後、細胞は、対象核酸を取り込んだ細胞を選択するためにアミノ酸を欠く培地で成長させることができる。一部の実施形態では、選択は、アミノ酸を欠く培地で成長を示す１つ又は複数の細胞を選択することを含む。
【００２８】
酵素分子阻害剤
本明細書で説明される細胞は、一部の実施形態では、細胞に導入された核酸（例えば対象核酸又は第２の核酸）によって発現される酵素分子の阻害剤をさらに含み得る。阻害剤は、例えば、細胞によって内因的に産生される酵素分子の活性を低減若しくは封鎖するため、及び／又は復帰変異細胞の成長を低減若しくは封鎖するためにはたらき、それによって、例えば本明細書で説明される選択方法の厳密性を増大させるように作用し得る。一部の実施形態では、細胞内の阻害剤のレベルは、内因性酵素分子活性を、阻害剤を欠く細胞で観察される活性の約０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％又は５０％未満に低減させるために十分である。一部の実施形態では、アミノ酸を欠く培地における成長に基づいて選択された細胞の約０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、５％又は１０％未満が対象核酸を含まない。一部の実施形態では、細胞内の酵素分子と阻害剤分子との比は、約１：１０００、１：５００、１：２５０、１：２００、１：１００、１：９０、１：８０、１：７０、１：６０、１：５０、１：４０、１：３０、１：２０、１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１、１０：１、１５：１、２０：１、３０：１、４０：１、５０：１、６０：１、７０：１、８０：１、９０：１、１００：１、２００：１、２５０：１、５００：１又は１０００：１である。
【００２９】
阻害剤は、例えばアミノ酸若しくはそのアナログ、ポリペプチド、核酸又は小分子であり得る。一部の実施形態では、阻害剤は、酵素分子が参加する生合成経路によって産生されたアミノ酸のアナログである。一部の実施形態では、阻害剤は、抗体分子（例えば、例えば本明細書で説明される、抗体又は抗体断片）、融合タンパク質、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、糖タンパク質、リポタンパク質、レポータータンパク質、治療用ペプチド、アプタマー又はこれらのいずれかの構造的断片及び／若しくは機能的断片又はハイブリッドである。一部の実施形態では、阻害剤は、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ又は長鎖非コードＲＮＡである。
【００３０】
本明細書で説明される組成物及び方法で使用され得る酵素分子及びその阻害剤の非限定的な例は、表１で列挙される酵素分子及びその阻害剤を含む。
【００３１】
【表１】
2021511781.tif 000002
2021511781.tif 000003
2021511781.tif 000004
2021511781.tif 000005
2021511781.tif 000006
2021511781.tif 000007
2021511781.tif 000008
2021511781.tif 000009
2021511781.tif 000010
2021511781.tif 000011
【００３２】
一部の実施形態では、阻害剤は、アミノ酸、例えばプロリン、チロシン又はトリプトファンの生合成経路の酵素分子を阻害する。実施形態では、阻害剤は、アミノ酸の生合成経路の律速段階を触媒する酵素分子を阻害する。
【００３３】
一部の実施形態では、阻害剤は、プロリン生合成経路の酵素分子、例えばプロリン生合成経路の律速段階を触媒する酵素分子を阻害する。実施形態では、阻害剤は、ピロリン−５−カルボン酸シンターゼ（Ｐ５ＣＳ）分子の活性を阻害する。実施形態では、阻害剤は、Ｐ５ＣＳの活性を阻害する。実施形態では、阻害剤は、プロリン又はプロリンアナログである。実施形態では、阻害剤は、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリン又はＬ−４−チアゾリジンカルボン酸である。
【００３４】
一部の実施形態では、阻害剤は、チロシン生合成経路の酵素分子、例えばチロシン生合成経路の律速段階を触媒する酵素分子を阻害する。実施形態では、阻害剤は、チロシンアナログである。
【００３５】
一部の実施形態では、阻害剤は、トリプトファン生合成経路の酵素分子、例えばトリプトファン生合成経路の律速段階を触媒する酵素分子を阻害する。実施形態では、阻害剤は、トリプトファンアナログである。
【００３６】
脂質代謝変更因子
本開示は、異種の核酸を含む細胞を産生するための方法及び組成物を特徴とする。一部の場合、細胞は、細胞内で脂質代謝を変更することができる、一般にプロモーターの制御下の脂質代謝変更因子（ＬＭＭ）をさらに含む。実施形態では、ＬＭＭは、脂質代謝、例えば新規脂質生成、脂肪酸再エステル化、脂肪酸飽和化又は不飽和化、脂肪酸伸長及びリン脂質生合成経路に関与する経路又はプロセスの多数の局面に影響を及ぼす包括的レギュレーターを含む。例として、包括的レギュレーターがいくつかの、例えば２つ又はそれよりも多い脂質代謝の下流プロセス又は下流成分に影響を及ぼすように、包括的レギュレーターは１つ又は複数の脂質代謝経路又はプロセスの上流に存在する。一実施形態では、包括的レギュレーターは、異なる脂質代謝プロセス又は経路に関与する１つよりも多い、例えば２つ又はそれよりも多い標的遺伝子の発現を活性化し得る転写因子である。したがって、任意の理論に束縛されるものではないが、本明細書で説明される包括的レギュレーターの使用は、脂質代謝の単一の標的又は他の成分のみを変更する下流エフェクターの使用と比較して、細胞の産生能、頑健性及び生存のより大きな増大をもたらし得る。任意の理論に束縛されるものではないが、多数の脂質代謝経路の包括的又はより広範な変更は、細胞の産生能、生成物品質及び頑健性の改善に関与するより多くのプロセスに影響を及ぼすことによって、細胞の産生能を増大させると考えられる。
【００３７】
本明細書で説明される脂質代謝経路は、脂質又は脂質関連分子の合成、分解、変換又は改変に関するプロセスを指す。脂質分子には、脂肪酸、グリセロ脂質、グリセロリン脂質、リン脂質、サッカロリピド（ｓａｃｃｈａｒｏｌｉｐｉｄｓ）、スフィンゴリピド及びステロール脂質、例えばコレステロール、並びにポリケチドが含まれるが、これらに限定されない。脂質代謝経路の例には、新規脂質生成、脂肪酸再エステル化、脂肪酸飽和化、脂肪酸不飽和化、脂肪酸伸長及びリン脂質生合成が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、本明細書で説明される方法は、脂質代謝を変更する改変を含む細胞を提供する。脂質代謝を変更する改変は、脂質代謝に関与する成分の発現を増大又は減少させる剤であり得る。一実施形態では、脂質代謝を変更する改変は、脂質代謝変更因子（ＬＭＭ）をコードする外因性核酸を含む。そのような実施形態では、ＬＭＭをコードする外因性核酸は、本明細書で説明される核酸送達方法又は技術のいずれか、例えば形質導入又はトランスフェクションによって細胞に導入される。
【００３８】
一部の実施形態では、本明細書で説明される方法は、脂質代謝を変更する１つ又は複数、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０個の改変を含む細胞を提供する。細胞が脂質代謝を変更する２つ又はそれよりも多い改変を含む実施形態では、脂質代謝を変更する各改変は、ＬＭＭをコードする外因性核酸を含む。一実施形態では、ＬＭＭをコードする２つ又はそれよりも多い外因性核酸の各々は、同じ核酸分子内に位置してもよく、又は２つ又はそれよりも多い異なる核酸分子に位置する。細胞がＬＭＭをコードする２つ又はそれよりも多い核酸配列を含むそのような実施形態では、ＬＭＭは互いに異なり、例えば異なるポリペプチド配列をコードするか、又は異なる機能を有する。一部の実施形態では、複数の様々な異種のＬＭＭ（例えば２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００個又はそれよりも多い、例えば本明細書で説明されるＬＭＭ）が細胞内で発現される。ある特定の実施形態では、異種のＬＭＭのうちの１つ又は複数は、細胞によって天然に発現される。ある特定の実施形態では、異種のＬＭＭのうちの１つ又は複数は、細胞によって天然に発現されない。
【００３９】
一実施形態では、脂質代謝を変更する改変は、１つ又は複数の脂質代謝経路に関与する成分の発現又は活性を増大又は減少させる。一部の実施形態では、細胞の脂質代謝の変更は、細胞内の脂質の空間的分布、例えば細胞膜（例えば脂質ラフト内）、細胞小器官（例えば小胞体、ゴルジ体、核、リソソーム、ペルオキシソーム、液胞及び／又はミトコンドリア）、エキソソーム、液滴、又は脂質を含む細胞の他の任意の領域若しくは区画内の脂質の空間的分布の変更をもたらす。脂質代謝を変更する改変が発現、例えば転写又は翻訳の増大、又は脂質代謝経路の成分の活性の増大をもたらす実施形態では、成分は、脂質代謝経路の正のレギュレーターである。脂質代謝を変更する改変が発現、例えば転写、翻訳、ターンオーバー及び／又は分解の減少、又は脂質代謝経路の成分の活性の減少をもたらす実施形態では、成分は、脂質代謝経路の負のレギュレーターである。脂質代謝経路の遺伝子の発現、例えば転写及び／又は翻訳を定量するためのアッセイは、当該技術分野で公知であり、遺伝子をコードするｍＲＮＡの量の定量；若しくは遺伝子産物若しくはポリペプチドの量の定量；ＰＣＲベースアッセイ、例えば定量的リアルタイムＰＣＲ；ノーザンブロット；又はマイクロアレイを含む。脂質代謝経路の成分、例えば脂質代謝経路の酵素の活性を定量するためのアッセイは、脂質代謝経路の特定の成分に特異的である。
【００４０】
細胞の脂質代謝の変更が細胞内の脂質のレベル又は量の増大をもたらす実施形態では、細胞内の脂質の全レベル又は全量は、増大され得る。一部の実施形態では、細胞の脂質代謝の変更は、細胞内の脂質の空間的分布、例えば細胞膜（例えば脂質ラフト内）、細胞小器官（例えば小胞体、ゴルジ体、核、リソソーム、ペルオキシソーム、液胞及び／又はミトコンドリア）、エキソソーム、液滴、又は脂質を含む細胞の他の任意の領域若しくは区画内の脂質の空間的分布の変更をもたらす。一実施形態では、脂質代謝を変更する改変は、細胞生存の増大をもたらす。一実施形態では、脂質代謝を変更する改変は、培養物生存率の増大をもたらす。一実施形態では、脂質代謝を変更する改変は、細胞増殖の増大をもたらす。一実施形態では、脂質代謝を変更する改変は、産生能、例えば産生される生成物の量（ａｍｏｕｎｔ）、量（ｑｕａｎｔｉｔｙ）若しくは収率又は産生速度の増大をもたらす。一実施形態では、脂質代謝を変更する改変は、生成物の品質、例えば凝集、糖鎖付加状態若しくは異種性、断片化、適切な折り畳み若しくはアセンブリ、翻訳後修飾又はジスルフィド結合スクランブリングの増大をもたらす。
【００４１】
一実施形態では、ＬＭＭは、例えばＬＭＭをコードする異種の核酸（例えば細胞外に由来する核酸、例えばＬＭＭをコードする遺伝子を含む核酸構築物）を導入することによって、又はプロモーターエレメント又は他の調節性転写エレメントを導入することにより発現を増大させることによって、細胞内で過剰発現される。一部の実施形態では、細胞は、細胞内で過剰発現されたＬＭＭの内因性コピーを含む。他の実施形態では、細胞は、細胞内で過剰発現されたＬＭＭの内因性コピーを含まない。別の実施形態では、ＬＭＭの発現又は活性は、例えばＬＭＭの阻害剤又は外因性阻害性核酸、例えばＲＮＡ干渉剤を導入することによって、阻害又は減少される。阻害性核酸の例には、ＬＭＭをターゲットにする短干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ）及び短ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ：ｓｈｏｒｔ  ｈａｉｒｐｉｎ  ＲＮＡ）、例えばＬＭＭをコードするｍＲＮＡが含まれる。一実施形態では、ＬＭＭの活性又は発現は、翻訳後修飾、又はＬＭＭ活性又は発現を調節する他の内因性調節機構を変更することによって増大又は減少される。翻訳後修飾による調節には、ＬＭＭ発現又は活性を増大又は減少し得るリン酸化、ＳＵＭＯ化、ユビキチン化、アセチル化、メチル化又は糖鎖付加が含まれるが、これらに限定されない。例として、翻訳後修飾の調節は、翻訳後修飾がより頻繁に、又は構成的に起こり得ないような、又は起こるような、ＬＭＭを変更する酵素又は分子の変更、又はＬＭＭの改変を通して達成され得る。また、ＬＭＭの調節は、ＬＭＭ発現又は活性を増大又は減少させ得る、例えばｍｉＲＮＡ調節、タンパク質切断、特異的アイソフォームの発現、選択的スプライシング及び分解のうちの１つ又は複数を増大又は減少させ得る、内因性調節機構を変更することを含み得る。一実施形態では、ＬＭＭは、脂質代謝経路の成分の発現、例えば転写、又は活性を変更する、例えば増大又は減少させる。別の実施形態では、ＬＭＭは、脂質又は脂質関連分子の合成、分解、伸長又は構造的コンフォメーション（例えば飽和化若しくは不飽和化又はエステル化）を変更する、例えば増大又は減少させる。例示的なＬＭＭ及び／又は脂質代謝経路の成分を列挙するが、表２に列挙されるものに限定されない。
【００４２】
【表２】
2021511781.tif 000012
2021511781.tif 000013
2021511781.tif 000014
【００４３】
実施形態では、ＬＭＭは、例えば表２に提供される、脂質代謝経路に関与する成分、例えば遺伝子産物と少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％のアミノ酸配列同一性又は相同性を含むか；又は例えば表２に提供される、脂質代謝経路に関与する成分、例えば遺伝子産物のアミノ酸配列とは１、２若しくは３つ又はそれよりも多いアミノ酸残基分、ただし、５０、４０、３０、２０、１５又は１０個以下のアミノ酸残基分異なる。
【００４４】
実施形態では、ＬＭＭは、例えば表２に提供される、脂質代謝経路に関与する成分の機能的断片を含む。本明細書で説明されるＬＭＭの機能的断片は、ＬＭＭの１つ又は複数の機能的ドメインを含み得る。例として、転写因子であるＬＭＭの機能的断片は、ＤＮＡ結合ドメイン及びトランス活性化ドメインを含む。例として、酵素であるＬＭＭの機能的断片は、酵素活性を有するドメインを含む。本明細書で説明されるＬＭＭの機能的断片は、全長ＬＭＭの機能的活性、例えば少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％又は９０％の機能的活性を保持する。ＬＭＭの機能的断片は、当業者が実験的に決定してもよく、又は機能的ドメインの配列相同性に基づくアルゴリズムを使用して予測してもよい。例示的なＬＭＭを、以下にさらに説明する。
【００４５】
本明細書で説明される方法の実施形態のいずれかにおいて、ＬＭＭは、転写レギュレーターであり得る。実施形態では、ＬＭＭは、ＤＮＡに結合するか、又はＤＮＡに結合する複合体において会合し、脂質代謝に関与する１つ又は複数の遺伝子産物の転写のためのＲＮＡポリメラーゼを動員するか、又はこれを動員する複合体において会合する転写因子又は転写アクチベーターである。実施形態では、ＬＭＭは、ステロール結合エレメント及び／又はＥ−ｂｏｘプロモーター配列に結合する。実施形態では、ＬＭＭは、ステロール調節エレメント結合因子１（ＳＲＥＢＦ１：ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  １）若しくはステロール調節エレメント結合因子２（ＳＲＥＢＦ２：ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｆａｃｔｏｒ  ２）又はその機能的断片若しくはアイソフォームを含む。
【００４６】
一部の実施形態では、ＬＭＭは、包括的転写アクチベーター又は転写因子を含む。実施形態では、ＬＭＭは、例えば表３又は４のいずれかにおいて提供される、脂質代謝経路の２つ又はそれよりも多い、例えば２、３、４、５、６つ又はそれよりも多い成分の転写を変更することができる。実施形態では、ＬＭＭは、２つ又はそれよりも多い脂質代謝経路の１つ又は複数の、例えば１、２、３、４若しくは５つ又はそれよりも多い成分、例えば表２に提供される成分及び経路の転写を変更することができる。
【００４７】
ステロール調節エレメント結合因子１（ＳＲＥＢＦ１）は、標的遺伝子のプロモーター領域に存在するステロール調節エレメント（ＳＲＥ：ｓｔｅｒｏｌ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ）及びＥ−ｂｏｘプロモーター配列（Ｈａｇｅｎ、Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｃｕｅｎｃａら  ２０１０）に結合することによって、脂質生成、脂肪酸再エステル化、脂肪酸不飽和化及び伸長、並びにリン脂質生合成に関与する遺伝子の転写をアップレギュレートする包括的転写アクチベーターである。ＳＲＥＢＦ１遺伝子それ自体の転写は、遺伝子のプロモーター領域の他の転写調節エレメントの中で、ステロール調節エレメント（ＳＲＥ）の存在によって内因的に調節される。この上、リン酸化、ユビキチン化、ＳＵＭＯ化、アセチル化、脂肪酸媒介改変及びタンパク質分解プロセッシングを含む多数の翻訳後調節機構は、ＳＲＥＢＦ１の周囲に固定された、堅固に制御されているが、適応可能なホメオスタシス系に資する。
【００４８】
実施形態では、ＬＭＭは、酵素を含む。実施形態では、ＬＭＭは、飽和脂肪酸を不飽和脂肪酸に変換する酵素を含む。実施形態では、ＬＭＭは、飽和脂肪酸を一不飽和脂肪酸、例えば１つの二重結合を有する脂肪酸に変換する酵素を含む。実施形態では、ＬＭＭは、飽和脂肪酸を多不飽和脂肪酸、例えば１つよりも多い、例えば２、３、４、５つ又はそれよりも多い二重結合を有する脂肪酸に変換する酵素を含む。実施形態では、ＬＭＭは、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ１（ＳＣＤ１：ｓｔｅａｒｏｙｌ  ＣｏＡ  ｄｅｓａｔｕｒａｓｅ  １）、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ２（ＳＣＤ２）、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ３（ＳＣＤ３）、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ４（ＳＣＤ４）、ステアロイルＣｏＡデサチュラーゼ５（ＳＣＤ５）、そのアイソフォーム又はその機能的断片を含む。
【００４９】
一部の実施形態では、本明細書で説明される細胞内に存在するＬＭＭは、プロモーターの制御下にある。プロモーターは、細胞によるＬＭＭの産生を最大限にするためにＬＭＭ遺伝子と適合されることが望ましい。ＬＭＭの発現を調節するために使用され得るプロモーターの非限定的な例には、ＳＶ４０、ｍＣＭＶ及びＰＧＫプロモーターが含まれる。例えば、例えば本明細書で説明される方法又は組成物（例えば細胞）のいずれかにおいて使用され得る、プロモーターとＬＭＭ遺伝子との組合せの非限定的な例は、表３に示される。これらの組合せの各々は、例えば本明細書で説明される方法に従って細胞に導入された場合、Ｐ５ＣＳを含む細胞内に存在し得ることが企図される。
【００５０】
【表３】
2021511781.tif 000015
【００５１】
本明細書で説明されるプロモーターとＬＭＭとの組合せのいずれかは、例えば、本明細書で説明される細胞、核酸又は他の組成物のいずれかにおいて、酵素分子をコードする遺伝子とのさらなる組合せで存在し得る。例えば、本明細書で説明されるプロモーターとＬＭＭとの組合せのいずれかは、Ｐ５ＣＳ分子をコードし、且つ本明細書で説明される対象核酸を含む核酸をさらに含む細胞内に存在し得る。さらに、本明細書で説明されるプロモーターとＬＭＭとの組合せのいずれかは、アミノ酸生合成酵素分子（例えば酵素分子もまた細胞内に存在する）の阻害剤を有する細胞内に存在し得る。例えば、本明細書で説明されるプロモーターとＬＭＭとの組合せのいずれかは、（ｉ）Ｐ５ＣＳ分子をコードし、且つ本明細書で説明される対象核酸を含む核酸、及び（ｉｉ）Ｐ５ＣＳ阻害剤、例えばＬ−アゼチジン−２−カルボン酸、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリン又はＬ−４−チアゾリジンカルボン酸をさらに含む細胞内に存在し得る。例えば、例えば本明細書で説明される方法又は組成物（例えば細胞）のいずれかにおいて使用され得るプロモーターとＬＭＭとＰ５ＣＳ阻害剤との組合せの非限定的な例は、表４に示される。これらの組合せの各々は、例えば本明細書で説明される方法に従って細胞に導入された場合、Ｐ５ＣＳを含む細胞内に存在し得ることが企図される。
【００５２】
【表４】
2021511781.tif 000016
2021511781.tif 000017
【００５３】
細胞及び細胞培養
一態様では、本開示は、生成物、例えば本明細書で説明される組換えポリペプチド若しくは治療用ポリペプチド又は核酸分子を産生する細胞又は細胞株を評価、分類、特定、選択又は製造するための方法に関する。別の態様では、本開示は、生産性及び生成物品質の改善、例えば増大を有する細胞又は細胞株を評価、分類、特定、選択又は製造するための方法及び組成物に関する。一般には、本明細書の方法は、（ｉ）目的の生成物をコードする対象核酸配列と（ｉｉ）アミノ酸の生合成経路に参加する酵素分子をコードする核酸配列とを含む核酸構築物（例えばゲノムに統合されたベクター又は異種の核酸）を含む細胞又は細胞株を産生するために使用することができ、細胞又は細胞株は、酵素分子を内因的に発現しない。
【００５４】
実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。他の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞以外の細胞である。一実施形態では、細胞は、マウス、ラット、チャイニーズハムスター、シリアンハムスター、サル、類人猿、イヌ、ウマ、フェレット又はネコからの細胞である。実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、例えばヒト細胞、又はげっ歯類細胞、例えばハムスター細胞、マウス細胞若しくはラット細胞である。別の実施形態では、細胞は、アヒル、オウム、魚類、昆虫、植物、真菌又は酵母からの細胞である。
【００５５】
実施形態では、細胞は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ：Ｃｈｉｎｅｓｅ  ｈａｍｓｔｅｒ  ｏｖａｒｙ）細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えばＧＳＫＯ細胞）は、例えばＣＨＯ−Ｋ１ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えばポテリジェント（Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ）（登録商標）ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＦＵＴ８ノックアウト（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，  Ｉｎｃ．）である。
【００５６】
実施形態では、細胞は、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＰＥＲ．Ｃ６、ＢＨＫ（仔ハムスター腎細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＮＳ０、ＹＢ２／０、Ｙ０、ＥＢ６６、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＣＨＯＫ１、ＣＨＯＫ１ＳＶ、ポテリジェント（商標）（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＦＵＴ８−ＫＯ）、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト、エクシード（Ｘｃｅｅｄ）（商標）（ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ）、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＤＧ４４、ＣＨＯ  ＤＸＢ１１及びＣＨＯＺＮ又はそれらに由来する任意の細胞である。
【００５７】
実施形態では、真核細胞は、幹細胞である。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ：ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ：ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）、組織特異的幹細胞（例えば造血幹細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ：ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ）を含む多能性幹細胞であり得る。
【００５８】
実施形態では、細胞は、本明細書で説明される細胞のうちのいずれかの分化した形態である。一実施形態では、細胞は、培養物中の任意の初代細胞に由来する細胞である。
【００５９】
実施形態では、細胞は、ヒト肝細胞、動物肝細胞又は非実質細胞等の肝細胞である。例えば、細胞は、播種可能代謝用ヒト肝細胞、播種可能誘導用ヒト肝細胞、播種可能クオリストトランスポーターサーティファイド（Ｑｕａｌｙｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ）（商標）ヒト肝細胞、懸濁用ヒト肝細胞（１０人のドナー及び２０人のドナーからプールした肝細胞を含む）、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星細胞、イヌ肝細胞（単一の、及びプールしたビーグル肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ−１及びＣ５７Ｂｌ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎ及びＷｉｓｔａｒ肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザル又はアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（イエネコ短毛種肝細胞を含む）及びウサギ肝細胞（ニュージーランドホワイト種肝細胞を含む）であり得る。例示的な肝細胞は、Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、ＬＬＣ、６  Ｄａｖｉｓ  Ｄｒｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ  ２７７０９から市販されている。
【００６０】
一部の実施形態では、細胞は、グルタミン合成酵素（ＧＳ）のノックアウトを含む。実施形態では、細胞は、機能的ＧＳ遺伝子を含まない。実施形態では、細胞は、ＧＳ遺伝子を含まない。実施形態では、細胞内のＧＳ遺伝子は、遺伝子が機能的ＧＳタンパク質をコードすることができないようにする変異を含む。
【００６１】
実施形態では、真核細胞は、例えば酵母細胞（例えばピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属（例えばピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ピキア・メタノリカ（Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ）、ピキア・クルイベリ（Ｐｉｃｈｉａ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）及びピキア・アンガスタ（Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ））、コマガタエラ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）属（例えばコマガタエラ・パストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、コマガタエラ・シュードパストリス（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｓｅｕｄｏｐａｓｔｏｒｉｓ）又はコマガタエラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ））、サッカロマイセス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えば出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、出芽酵母、サッカロマイセス・クルイベリ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ）、サッカロマイセス・ウバラム（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｕｖａｒｕｍ））、クルイベロマイセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属（例えばクルイベロマイセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロマイセス・マルキシアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｍａｒｘｉａｎｕｓ））、キャンディダ（Ｃａｎｄｉｄａ）属（例えばトルラ酵母（Ｃａｎｄｉｄａ  ｕｔｉｌｉｓ）、キャンディダ・カカオイ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｃａｃａｏｉ）、キャンディダ・ボイディニ（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ））、ゲオトリクム（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ）属（例えばゲオトリクム・ファーメンタンス（Ｇｅｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｆｅｒｍｅｎｔａｎｓ））、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、ヤロウイア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）又は分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ））等の低級真核細胞である。ピキア・パストリス種は好ましい。ピキア・パストリス系統の例は、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ及びＣＢＳ７４３５である。
【００６２】
実施形態では、真核細胞は、真菌細胞（例えばコウジカビ菌種（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）（クロコウジカビ（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガータス（Ａ．ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、ニホンコウジカビ（Ａ．ｏｒｚｙａｅ）、偽巣性コウジ菌（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）等）、アクレモニウム菌種（Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ  ｓｐ．）（アクレモニウム・サーモフィラム（Ａ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）等）、ケタマカビ菌種（Ｃｈａｅｔｏｍｉｕｍ  ｓｐ．）（ケトミウム・サーモフィラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）等）、クリソスポリウム菌種（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｓｐ．）（クリソスポリウム・サーモフィラム（Ｃ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｍ）等）、冬虫夏草菌種（Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ  ｓｐ．）（サナギタケ（Ｃ．ｍｉｌｉｔａｒｉｓ）等）、コリナスカス菌種（Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ  ｓｐ．）、クテノマイセス菌種（Ｃｔｅｎｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、フサリウム菌種（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｓｐ．）（フサリウム・オキシスポラム（Ｆ．ｏｘｙｓｐｏｒｕｍ）等）、グロメレラ菌種（Ｇｌｏｍｅｒｅｌｌａ  ｓｐ．）（イネ科炭疽病菌（Ｇ．ｇｒａｍｉｎｉｃｏｌａ）等）、ボタンタケ菌種（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｓｐ．）（ハイポクレア・ジェコリーナ（Ｈ．ｊｅｃｏｒｉｎａ）等）、マグナポルテ菌種（Ｍａｇｎａｐｏｒｔｈｅ  ｓｐ．）（イモチ病菌（Ｍ．ｏｒｚｙａｅ）等）、マイセリオフトーラ菌種（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｓｐ．）（マイセリオフトーラ・サーモフィル（Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）等）、アカツブタケ菌種（Ｎｅｃｔｒｉａ  ｓｐ．）（ネクトリア・ヘマトコッカ（Ｎ．ｈｅａｍａｔｏｃｏｃｃａ）等）、アカパンカビ菌種（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｓｐ．）（アカパンカビ（Ｎ．ｃｒａｓｓａ）等）、アオカビ菌種（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）、スポロトリクム菌種（Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｓｐ．）（スポロトリクム・サーモフィル（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅ）等）、ティエラビア菌種（Ｔｈｉｅｌａｖｉａ  ｓｐ．）（ティエラビア・テレストリス（Ｔ．ｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）、ティエラビア・ヘテロタリカ（Ｔ．ｈｅｔｅｒｏｔｈａｌｌｉｃａ）等）、トリコデルマ菌種（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｓｐ．）（トリコデルマ・リーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）等）又はバーティシリウム菌種（Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｓｐ．）（バーティシリウム・ダリエ（Ｖ．ｄａｈｌｉａｅ）等））である。
【００６３】
実施形態では、真核細胞は、昆虫細胞（例えばＳｆ９、ミミック（Ｍｉｍｉｃ）（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ハイファイブ（Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ）（商標）（ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４）又はＢＴ１−Ｅａ８８細胞）、藻類細胞（例えばアンフォラ属種（Ａｍｐｈｏｒａ  ｓｐ．）、珪藻類の属種（Ｂａｃｉｌｌａｒｉｏｐｈｙｃｅａｅ  ｓｐ．）、ドナリエラ属種（Ｄｕｎａｌｉｅｌｌａ  ｓｐ．）、クロレラ属種（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｓｐ．）、コナミドリムシ属種（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、藍藻類の属種（Ｃｙａｎｏｐｈｙｔａ  ｓｐ．）（シアノバクテリア）、ナンノクロロプシス属種（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｓｐ．）、スピルリナ属種（Ｓｐｉｒｕｌｉｎａ  ｓｐ．）又はオクロモナス属種（Ｏｃｈｒｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）の細胞）又は植物細胞（例えば単子葉植物（例えばトウモロコシ、イネ、コムギ又はエノコログサ種（Ｓｅｔａｒｉａ  ｓｐ．））から、又は双子葉植物（例えばキャッサバ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アルファルファ、ニセツリガネゴケ（Ｐｈｙｓｃｏｍｉｔｒｅｌｌａ  ｐａｔｅｎｓ）又はシロイヌナズナ種（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｓｐ．））からの細胞）である。
【００６４】
実施形態では、細胞は、細菌又は原核細胞である。
【００６５】
実施形態では、原核細胞は、桿菌種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）、ストレプトマイセス種（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）、連鎖状球菌種（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）、ブドウ球菌種（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）又は乳酸桿菌種（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐ．）等のグラム陽性細胞である。使用され得る桿菌種は、例えば枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、バチルス・リケニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、納豆菌（Ｂ．ｎａｔｔｏ）又は巨大菌（Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）である。実施形態では、細胞は、枯草菌３ＮＡ及び枯草菌１６８等の枯草菌である。桿菌種は、例えばＢａｃｉｌｌｕｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ、Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ５５６、４８４  Ｗｅｓｔ  １２ｔｈ  Ａｖｅｎｕｅ、Ｃｏｌｕｍｂｕｓ  ＯＨ  ４３２１０−１２１４から得ることができる。
【００６６】
実施形態では、原核細胞は、サルモネラ菌種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｓｐ．）又は大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ    ｃｏｌｉ）等のグラム陰性細胞、例えばＴＧ１、ＴＧ２、Ｗ３１１０、ＤＨ１、ＤＨＢ４、ＤＨ５ａ、ＨＭＳ１７４、ＨＭＳ１７４（ＤＥ３）、ＮＭ５３３、Ｃ６００、ＨＢ１０１、ＪＭ１０９、ＭＣ４１００、ＸＬ１−Ｂｌｕｅ及びＯｒｉｇａｍｉ等、並びに大腸菌Ｂ系統由来のもの、例えばＢＬ−２１又はＢＬ２１（ＤＥ３）若しくはＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ等であり、それらの全ては市販されている。
【００６７】
好適な宿主細胞は、例えば、ＤＳＭＺ（Ｄｅｕｔｓｃｈｅ  Ｓａｍｍｌｕｎｇ  ｖｏｎ  Ｍｉｋｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｎ  ａｎｄ  Ｚｅｌｌｋｕｌｔｕｒｅｎ  ＧｍｂＨ、Ｂｒａｕｎｓｃｈｗｅｉｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）又はＡＴＣＣ（米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ））等の微生物株保存機関から市販されている。
【００６８】
実施形態では、細胞は、異種の核酸、例えば、組換えポリペプチド、例えば表５〜８から選択される組換えポリペプチドをコードする対象核酸を含む本明細書で説明される細胞のうちの任意の１つである。
【００６９】
本明細書で説明される細胞は、当該技術分野で公知の任意の方法に従って培養され得る。一部の実施形態では、培養培地は、アミノ酸（例えば表１に列挙されるアミノ酸のうちの１つ又は複数）を欠く。実施形態では、培養培地は、細胞が対象核酸を取り込んだ場合生合成が救済され得るアミノ酸を欠く。実施形態では、細胞培養は、回分培養、流加回分培養、簡易的流加回分過剰成長（ａＦＯＧ）、ドロー・アンド・フィル培養又は連続培養として行われる。一実施形態では、細胞培養は、懸濁培養である。一実施形態では、細胞又は細胞培養物は、組換えポリペプチドの発現のためにｉｎ  ｖｉｖｏに置かれ、例えばモデル生物又はヒト対象に置かれる。
【００７０】
一実施形態では、培養培地は、血清を含まない。血清非含有、タンパク質非含有及び既知組成動物成分非含有（ＣＤＡＣＦ：ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ−ｄｅｆｉｎｅｄ  ａｎｉｍａｌ  ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ−ｆｒｅｅ）培地は、例えばＬｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓから市販されている。
【００７１】
一部の実施形態では、脂質添加物（例えばコレステロール、オレイン酸、リノール酸又はこれらの組合せを含む）は、培養培地に添加され得る。
【００７２】
哺乳動物細胞株のための好適な培地及び培養法は、例えば米国特許第５６３３１６２号で説明されるように、当該技術分野で周知である。研究用フラスコ又は低密度細胞培養のための、且つ特定の細胞種の要求に適合させた標準の細胞培養培地の例は、例えばロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ：Ｒｏｓｗｅｌｌ  Ｐａｒｋ  Ｍｅｍｏｒｉａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）１６４０培地（Ｍｏｒｒｅ，Ｇ．、Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９、５１９ページ  ｆ．  １９６７）、Ｌ−１５培地（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ，Ａ．ら、Ａｍｅｒ．  Ｊ．  ｏｆ  Ｈｙｇｉｅｎｅ、７８、１ページ  １７３ｆｆ、１９６３）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｅｄｉｕｍ）、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ：Ｅａｇｌｅ’ｓ  ｍｉｎｉｍａｌ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  ｍｅｄｉｕｍ）、ハムＦ１２培地（Ｈａｍ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ．５３、２８８ページ  ｆｆ．  １９６５）又はアルブミン、トランスフェリン及びレシチン非含有イスコフ改変ＤＭＥＭ（Ｉｓｃｏｖｅｓら、Ｊ．Ｅｘｐ．ｍｅｄ．１、９２３ページ  ｆｆ．、１９７８）である。例えば、ハムＦ１０又はＦ１２培地は、ＣＨＯ細胞培養のために特別に設計された。ＣＨＯ細胞培養に特別に適合された他の培地は、ＥＰ−４８１７９１で説明されている。そのような培養培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ（ｆｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）、ウシ胎児血清ＦＣＳ（ｆｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）とも呼ばれる）を補充してもよく、ウシ胎児血清は、過剰のホルモン及び成長因子の天然供給源を提供することが公知である。哺乳動物細胞の細胞培養は、今日、科学教本及びマニュアルにおいて十分に説明されているルーチン作業であり、それは、例えば、Ｒ．Ｉａｎ  Ｆｒｅｓｎｅｙ、Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｏｆ  Ａｎｉｍａｌ  ｃｅｌｌｓ，ａ  ｍａｎｕａｌ、第４版、Ｗｉｌｅｙ−Ｌｉｓｓ／Ｎ．Ｙ．、２０００で詳細に扱われている。本明細書で説明される細胞培養培地のうちのいずれかは、特定のアミノ酸（例えば表１に列挙されるアミノ酸）、例えば細胞が対象核酸を取り込んだ場合生合成が救済され得るアミノ酸を欠くように調合され得る。
【００７３】
他の好適な培養法は、当業者に公知であり、組換えポリペプチド生成物及び利用される宿主細胞に依存し得る。細胞によって発現される組換えポリペプチド又は治療用ポリペプチドの発現及び産生に好適な条件を決定又は最適化することは、当業者の技術の範囲内である。
【００７４】
所望のポリペプチド又はタンパク質を発現するように細胞を遺伝子改変又は遺伝子操作するための方法は、当該技術分野で周知であり、例えば、例えば核酸、例えばベクターの細胞へのトランスフェクション、形質導入（例えばウイルス形質導入）又はエレクトロポレーションを含む。核酸、例えば本明細書で説明される異種の核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための物理的方法の例には、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、微粒子銃、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション等が含まれるが、これらに限定されない。ベクター及び／又は外因性核酸を含む細胞を産生するための方法は、当該技術分野で周知である。例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、２０１２、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ）を参照されたい。核酸、例えば本明細書で説明される異種の核酸又はベクターを宿主細胞に導入するための化学的手段の例には、高分子複合体等のコロイド分散系；ナノカプセル；ミクロスフェア；ビーズ；及び水中油エマルション、ミセル、混合ミセル及びリポソームを含む脂質ベース系が含まれるが、これらに限定されない。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ及びｉｎ  ｖｉｖｏでの送達媒体としての使用のための例示的なコロイド系は、リポソーム（例えば人工膜小胞）である。ターゲティングナノ粒子又は他の好適なミクロン以下の大きさの送達系によるポリヌクレオチドの送達等の最先端の核酸ターゲティング送達の他の方法が、使用可能である。
【００７５】
核酸
本明細書で説明される生成物、例えば組換えポリペプチドをコードする核酸、例えば対象核酸も、本明細書で提供される。所望の組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、標準の技法を使用して、例えば所望の核酸配列、例えば遺伝子を発現する細胞からのライブラリーをスクリーニングすることによる、所望の核酸配列を含むことが公知のベクターから核酸配列を派生させることによる、又は所望の核酸配列を含有する細胞及び組織から直接単離することによる等の当該技術分野で公知の組換え法を使用して、得ることができる。或いは、組換えポリペプチドをコードする核酸は、クローニングではなく、合成で産生され得る。組換えＤＮＡ技法及び技術は、当該技術分野で高度に進行しており、十分に確立されている。したがって、本明細書で説明される組換えポリペプチドのアミノ酸配列を知っている当業者は、組換えポリペプチドをコードし得る核酸配列を容易に想起又は生成し得る。
【００７６】
組換えポリペプチドの発現は典型的に、組換えポリペプチド又はその部分をコードする核酸をプロモーターに作動可能に連結し、構築物を発現ベクターに組み込むことによって達成される。ベクターは、真核生物又は原核生物での複製及び統合に好適であり得る。典型的なクローニングベクターは、所望の核酸配列の発現の調節に有用な転写及び翻訳ターミネーター、開始配列並びにプロモーター等の他の調節エレメントを含有する。
【００７７】
実施形態では、生成物、例えば異種の治療用ポリペプチドは、多数のポリペプチド鎖、例えば重鎖及び軽鎖を含む抗体又は抗体断片を含む。多数のポリペプチド鎖をコードする核酸配列は、ともに配置されてもよく（例えば、配列をコードする各ポリペプチド鎖が同じ核酸に配置されている）、別々に配置されてもよい（例えば、配列をコードする各ポリペプチド鎖が異なる核酸に配置されている）。多数のポリペプチド鎖を含む異種の治療用ポリペプチドをコードする配列は、単一の制御エレメント、例えば第１の制御エレメントに作動可能に連結されてもよく、別個の別々の制御エレメントに作動可能に連結されてもよい（例えば、配列をコードする各ポリペプチド鎖が、それ自体の第１の制御エレメントに作動可能に連結されている）。多数のポリペプチド鎖を含む異種の治療用ポリペプチドをコードする配列が別個の別々の制御エレメントに作動可能に連結されている一実施形態では、制御エレメントのうちの１つ又は複数（例えば１、２、３、４、５、６つ又は全て）は、第１の条件下での第１のレベルの活性及び第２の条件下での第２のレベルの活性を有する場合があり、制御エレメントのうちの１つ又は複数（例えば１、２、３、４、５、６つ又はそれよりも多く）は、構成的であり得る。
【００７８】
組換えポリペプチドをコードする核酸配列は、いくつかの種類のベクターにクローニングすることができる。例えば、核酸は、非限定的にプラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミドを含むベクターにクローニングされ得る。特定の目的のベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター及びシークエンシングベクターを含む。実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクターの形態で細胞に提供され得る。ウイルスベクター技術は、当該技術分野で周知であり、例えばＳａｍｂｒｏｏｋら、２０１２、ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ、１〜４巻、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、ＮＹ並びに他のウイルス学及び分子生物学マニュアルにおいて説明されている。ベクターとして有用なウイルスには、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルス及びレンチウイルスが含まれるが、これらに限定されない。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物において機能的な複製起点、プロモーターエレメントと任意選択でエンハンサーエレメントとを含む制御エレメント、便利な制限エンドヌクレアーゼ部位及び１つ又は複数の選択可能マーカーを含有する（例えば国際公開第０１／９６５８４号、同第０１／２９０５８号及び米国特許第６３２６１９３号）。ウイルス由来のベクターは導入遺伝子の長期安定統合及び娘細胞におけるその成長を可能にするので、ウイルス由来のベクターは長期遺伝子移行を達成するために好適なツールである。
【００７９】
また、ベクターは、例えば分泌を促進するシグナル配列、ポリアデニル化シグナル及び転写ターミネーター（例えばウシ成長ホルモン（ＢＧＨ：Ｂｏｖｉｎｅ  Ｇｒｏｗｔｈ  Ｈｏｒｍｏｎｅ）遺伝子から）、エピソーム複製及び原核生物における複製を可能にするエレメント（例えばＳＶ４０起点及びＣｏｌＥ１又は当該技術分野で公知のその他のもの）並びに／又は選択を可能にするエレメント、例えば選択マーカー若しくはレポーター遺伝子を含んでもよい。
【００８０】
企図されるベクターは、ポリペプチド、例えば外因性治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドをコードする配列を挿入するために好適な挿入部位を含み得る。
【００８１】
挿入部位は、制限エンドヌクレアーゼ部位を含み得る。
【００８２】
挿入部位は、組換え標的部位を含む場合があり、組換え標的部位は、ポリペプチド、例えば外因性治療用ポリペプチド又はリプレッサーポリペプチドをコードする配列に隣接する。一実施形態では、組換え標的部位は、ｌｏｘ部位である。組換え標的部位がｌｏｘ部位である場合、宿主細胞は、乗換え又は組換え事象を達成するためにＣｒｅリコンビナーゼの存在及び発現を必要とする。
【００８３】
実施形態では、本明細書で説明される生成物、例えばポリペプチド、例えば組換えポリペプチドをコードする核酸配列を含むベクターは、選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む。実施形態では、選択マーカーは、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）；ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ：ｄｉｈｙｄｒｏｆｏｌａｔｅ  ｒｅｄｕｃｔａｓｅ）、例えばメトトレキセート（ＭＴＸ：ｍｅｔｈｏｔｒｅｘａｔｅ）に対する抵抗性を与える酵素；プロリン；又は抗生物質マーカー、例えばハイグロマイシン、ネオマイシン（Ｇ４１８）、ゼオシン、ピューロマイシン又はブラストサイジン等の抗生物質に対する抵抗性を与える酵素を含む。実施形態では、選択マーカーは、セレクシス（Ｓｅｌｅｘｉｓ）選択系（例えばＳｅｌｅｘｉｓ  ＳＡから市販されているシュアテクノロジープラットフォーム（ＳＵＲＥｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｐｌａｔｆｏｒｍ）（商標）及びセレクシスジェネティックエレメント（Ｓｅｌｅｘｉｓ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ）（商標））又はカタラント（Ｃａｔａｌａｎｔ）選択系を含むか、又はこれらと適合性である。
【００８４】
実施形態では、本明細書で説明される組換え生成物をコードする核酸配列を含むベクターは、本明細書で説明される組換え生成物をコードする核酸を含む細胞（単数又は複数）の特定において有用な選択マーカーを含む。別の実施形態では、選択マーカーは、本明細書で説明される通り、組換え生成物をコードする核酸配列のゲノムへの統合を含む細胞（単数又は複数）の特定において有用である。組換えタンパク質をコードする核酸配列を統合した細胞（単数又は複数）の特定は、生成物を安定に発現する細胞又は細胞株の選択及び操作に有用であり得る。
【００８５】
生成物
高収率の生成物、例えばポリペプチド、例えば治療用ポリペプチドを産生することができる細胞又は細胞株を特定、選択又は培養するための組成物及び方法が、本明細書で提供される。本開示により包含される生成物には、例えば細胞における発現によって産生され得る分子、核酸（例えば非コード核酸、例えば非コードＲＮＡ分子、例えばアンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｔＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｅｘＲＮＡ、ｓｃａＲＮＡ又は長鎖非コードＲＮＡ、例えばイグジスト（Ｘｉｓｔ）又はホットエア（ＨＯＴＡＩＲ））、ポリペプチド（例えば組換えポリペプチド及び／又は治療用ポリペプチド）又はそれらのハイブリッドが含まれるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、細胞は、生成物を産生するように操作又は改変される。そのような改変は、生成物の産生を制御するか、又はもたらす分子の導入を含む。例えば、細胞は、ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドをコードする異種の核酸を導入することによって改変され、細胞は、ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドの産生、例えば発現及び分泌に好適な条件下で培養される。別の例では、細胞が、例えば非改変細胞で内因的に産生されるレベル又は量より高レベル又はより高い量のポリペプチドを産生するように、細胞は、細胞によって内因的に発現されるポリペプチドの発現を制御する、例えば増大させる異種の核酸を導入することによって改変される。実施形態では、本明細書で説明される方法によって特定、選択又は生成される細胞又は細胞株は、健康状態、障害又は疾患の治療において有用な生成物、例えば組換えポリペプチドを産生する。健康状態、障害又は疾患の例には、代謝疾患又は障害（例えば代謝酵素欠陥）、内分泌障害（例えばホルモン欠陥）、止血、血栓症、造血障害、肺障害、胃腸障害、免疫調節（例えば免疫欠陥）、不妊症、移植、がん及び感染性疾患が含まれるが、これらに限定されない。
【００８６】
ポリペプチド
一部の実施形態では、生成物は、ポリペプチド、例えば組換えポリペプチドである。ポリペプチド生成物は、一部の実施形態では、本明細書で説明される組成物（例えば細胞）及び方法のうちのいずれかにおいて使用され得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば本明細書で説明される通り、例えば酵素分子の、阻害剤を含む培地において成長した細胞によって産生される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば本明細書で説明される通り、ＬＭＭを含む細胞によって産生される。実施形態では、ＬＭＭは、例えば本明細書で説明される通り、プロモーターの制御下で発現される。一部の実施形態では、ポリペプチドは、例えば本明細書で説明される通り、ＬＭＭを含む培地において成長した細胞によって産生される。
【００８７】
実施形態では、ポリペプチドは、異種のポリペプチド、例えば異種のタンパク質、例えば細胞によって天然に発現されないタンパク質である。ポリペプチドは、例えば薬物スクリーニングに有用な、治療用タンパク質又は診断用タンパク質であり得る。治療用タンパク質又は診断用タンパク質は、抗体分子、例えば抗体若しくは抗体断片、融合タンパク質、ホルモン、サイトカイン、成長因子、酵素、糖タンパク質、リポタンパク質、レポータータンパク質、治療用ペプチド、アプタマー又は構造的断片及び／若しくは機能的断片、又はこれらのうちのいずれかのハイブリッドであり得る。実施形態では、生成物、例えば異種の治療用ポリペプチドは、多数のポリペプチド鎖、例えば重鎖及び軽鎖を含む抗体又は抗体断片を含む。
【００８８】
一部の実施形態では、生成物、例えば組換えポリペプチドは、抗体分子である。本明細書に包含される生成物は、画像化技法に有用な診断用抗体分子、例えばモノクローナル抗体又はその抗体断片、及び例えば疾患又は障害の治療に有用な、対象への投与に好適な治療用抗体分子である。抗体分子は、抗原に特異的に結合する免疫グロブリン分子に由来するタンパク質又はポリペプチド配列である。一実施形態では、抗体分子は、全長抗体又は抗体断片である。抗体及び多様式タンパク質は、ポリクローナル若しくはモノクローナル、多数鎖若しくは単鎖又はインタクトな免疫グロブリンであってもよく、天然供給源に由来しても、組換え供給源に由来してもよい。抗体は、免疫グロブリン分子の四量体であり得る。一実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体である。抗体は、ヒト又はヒト化抗体であり得る。一実施形態では、抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ又はＩｇＥ抗体である。一実施形態では、抗体は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３又はＩｇＧ４抗体である。
【００８９】
「抗体断片」とは、インタクトな抗体の少なくとも一部分、又はその組換えバリアントを指し、抗体断片の、抗原等の標的についての認識及び特異的結合を与えるために十分な、インタクトな抗体の抗原結合ドメイン、例えば抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例には、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片、ｓｃＦｖ抗体断片、直鎖抗体、ｓｄＡｂ（ＶＬ又はＶＨのいずれか）等のシングルドメイン抗体、ラクダ類ＶＨＨドメイン、及びヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片等の抗体断片から形成された多特異的抗体、並びに抗体の単離されたＣＤＲ又は他のエピトープ結合断片が含まれるが、これらに限定されない。また、抗原結合断片は、シングルドメイン抗体、マキシボディ、ミニボディ、ナノボディ、細胞内抗体、二重特異性抗体、三重特異性抗体、四重特異性抗体、ｖ−ＮＡＲ及びビス−ｓｃＦｖに組み込まれ得る（例えばＨｏｌｌｉｎｇｅｒ及びＨｕｄｓｏｎ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３：１１２６〜１１３６、２００５を参照のこと）。また、抗原結合断片は、フィブロネクチンＩＩＩ型（Ｆｎ３）等のポリペプチドに基づくスキャフォールドにグラフト化され得る（フィブロネクチンポリペプチドミニボディを説明している米国特許第６７０３１９９号を参照のこと）。
【００９０】
実施形態では、ポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）は、例えばボトックス（ＢＯＴＯＸ）、マイオブロック（Ｍｙｏｂｌｏｃ）、ニューロブロック（Ｎｅｕｒｏｂｌｏｃ）、ディスポート（Ｄｙｓｐｏｒｔ）（又はボツリヌス神経毒の他の血清型）、アルグルコシダーゼアルファ、ダプトマイシン、ＹＨ−１６、絨毛性ゴナドトロピンアルファ、フィルグラスチム、セトロレリクス、インターロイキン−２、アルデスロイキン、テセロイキン（ｔｅｃｅｌｅｕｌｉｎ）、デニロイキンジフチトクス、インターフェロンアルファ−ｎ３（注射）、インターフェロンアルファ−ｎ１、ＤＬ−８２３４、インターフェロン、サントリー（Ｓｕｎｔｏｒｙ）（ガンマ−１ａ）、インターフェロンガンマ、チモシンアルファ１、タソネルミン、ディジファブ（ＤｉｇｉＦａｂ）、ビペラタブ（ＶｉｐｅｒａＴＡｂ）、エチタブ（ＥｃｈｉＴＡｂ）、クロファブ（ＣｒｏＦａｂ）、ネシリチド、アバタセプト、アレファセプト、レビフ（Ｒｅｂｉｆ）、エプトテルミンアルファ、テリパラチド、カルシトニン、エタネルセプト、ヘモグロビングルタマー２５０（ウシ）、ドロトレコギンアルファ、コラゲナーゼ、カルペリチド、組換えヒト上皮成長因子、ＤＷＰ４０１、ダルベポエチンアルファ、エポエチンオメガ、エポエチンベータ、エポエチンアルファ、デシルジン、レピルジン、ビバリルジン、ノナコグアルファ、モノナイン（Ｍｏｎｏｎｉｎｅ）、エプタコグアルファ（活性化）、組換え第ＶＩＩＩ因子＋ＶＷＦ、リコネイト（Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｅ）、組換え第ＶＩＩＩ因子、第ＶＩＩＩ因子（組換え）、アルファネート（Ａｌｐｈｎｍａｔｅ）、オクトコグアルファ（ｏｃｔｏｃｏｇ  ａｌｐｈａ）、第ＶＩＩＩ因子、パリフェルミン、インジキナーゼ（Ｉｎｄｉｋｉｎａｓｅ）、テネクテプラーゼ、アルテプラーゼ、パミテプラーゼ、レテプラーゼ、ナテプラーゼ、モンテプラーゼ、フォリトロピンアルファ、ｒＦＳＨ、ｈｐＦＳＨ、ミカファンギン、ペグフィルグラスチム、レノグラスチム、ナルトグラスチム、セルモレリン、グルカゴン、エキセナチド、プラムリンチド、イミグルセラーゼ（ｉｎｉｇｌｕｃｅｒａｓｅ）、ガルスルファーゼ、リューコトロピン（Ｌｅｕｃｏｔｒｏｐｉｎ）、モルグラモスチム（ｍｏｌｇｒａｍｏｓｔｉｒｎ）、トリプトレリンアセテート、ヒストレリン（ヒドロン（Ｈｙｄｒｏｎ））、デスロレリン、ヒストレリン、ナファレリン、ロイプロリド（アトリゲル（ＡＴＲＩＧＥＬ））、ロイプロリド（デュロス（ＤＵＲＯＳ））、ゴセレリン、ユートロピン（Ｅｕｔｒｏｐｉｎ）、ソマトロピン、メカセルミン、エンフビルチド（ｅｎｌｆａｖｉｒｔｉｄｅ）、Ｏｒｇ−３３４０８、インスリングラルギン、インスリングルリジン、インスリン（吸入型）、インスリンリスプロ、インスリンデテミル（ｄｅｔｅｒｎｉｒ）、インスリン（ラピッドミスト（ＲａｐｉｄＭｉｓｔ））、メカセルミンリンファベート、アナキンラ、セレモロイキン、９９ｍＴｃ−アプシタイド、ミエロピド、ベタセロン（Ｂｅｔａｓｅｒｏｎ）、グラチラマーアセテート、ジェポン（Ｇｅｐｏｎ）、サルグラモスチム���オプレルベキン、ヒト白血球由来アルファインターフェロン、ビリブ（Ｂｉｌｉｖｅ）、インスリン（組換え）、組換えヒトインスリン、インスリンアスパルト、メカセルミン（ｍｅｃａｓｅｎｉｎ）、ロフェロン（Ｒｏｆｅｒｏｎ）−Ａ、インターフェロン−アルファ２、アルファフェロン（Ａｌｆａｆｅｒｏｎｅ）、インターフェロンアルファコン−１、インターフェロンアルファ、アボネックス（Ａｖｏｎｅｘ）組換えヒト黄体形成ホルモン、ドルナーゼアルファ、トラフェルミン、ジコノチド、タルチレリン、ジボテルミンアルファ、アトシバン、ベカプレルミン、エプチフィバチド、ゼマイラ（Ｚｅｍａｉｒａ）、ＣＴＣ−１１１、シャンバック（Ｓｈａｎｖａｃ）−Ｂ、オクトレオチド、ランレオチド、アンセスチム（ａｎｃｅｓｔｉｒｎ）、アガルシダーゼベータ、アガルシダーゼアルファ、ラロニダーゼ、プレザチド（ｐｒｅｚａｔｉｄｅ）酢酸銅、ラスブリカーゼ、ラニビズマブ、アクティミューン（Ａｃｔｉｍｍｕｎｅ）、ペグイントロン（ＰＥＧ−Ｉｎｔｒｏｎ）、トリコミン（Ｔｒｉｃｏｍｉｎ）、組換えヒト副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ：ｐａｒａｔｈｙｒｏｉｄ  ｈｏｒｍｏｎｅ）１〜８４、エポエチンデルタ、トランスジェニックアンチトロンビンＩＩＩ、グランディトロピン（Ｇｒａｎｄｉｔｒｏｐｉｎ）、ビトラーゼ（Ｖｉｔｒａｓｅ）、組換えインスリン、インターフェロン−アルファ、ＧＥＭ−２１Ｓ、バプレオチド、イデュルスルファーゼ、オマパトリラト（ｏｍｎａｐａｔｒｉｌａｔ）、組換え血清アルブミン、セルトリズマブペゴル、グルカルピダーゼ、ヒト組換えＣ１エステラーゼ阻害剤、ラノテプラーゼ、組換えヒト成長ホルモン、エンフビルチド、ＶＧＶ−１、インターフェロン（アルファ）、ルシナクタント、アビプタジル、イカチバント、エカランチド、オミガナン、オーログラブ（Ａｕｒｏｇｒａｂ）、ペキシガナンアセテート、ＡＤＩ−ＰＥＧ−２０、ＬＤＩ−２００、デガレリクス、シントレデキンベスドトクス（ｃｉｎｔｒｅｄｅｌｉｎｂｅｓｕｄｏｔｏｘ）、ファブイド（Ｆａｖｌｄ）、ＭＤＸ−１３７９、ＩＳＡｔｘ−２４７、リラグルチド、テリパラチド、チファコギン、ＡＡ４５００、Ｔ４Ｎ５リポソームローション、カツマキソマブ、ＤＷＰ４１３、ＡＲＴ−１２３、クリサリン（Ｃｈｒｙｓａｌｉｎ）、デスモテプラーゼ、アメジプラーゼ（ａｍｅｄｉｐｌａｓｅ）、コリフォリトロピンアルファ、ＴＨ−９５０７、テデュグルチド、ダイアミド（Ｄｉａｍｙｄ）、ＤＷＰ−４１２、成長ホルモン、組換えＧ−ＣＳＦ、インスリン、インスリン（テクノスフィア（Ｔｅｃｈｎｏｓｐｈｅｒｅ））、インスリン（ＡＥＲｘ）、ＲＧＮ−３０３、ディアペップ（ＤｉａＰｅｐ）２７７、インターフェロンベータ、インターフェロンアルファ−ｎ３、ベラタセプト、経皮インスリンパッチ、ＡＭＧ−５３１、ＭＢＰ−８２９８、ゼレセプト（Ｘｅｒｅｃｅｐｔ）、オペバカン（ｏｐｅｂａｃａｎ）、エイズバックス（ＡＩＤＳＶＡＸ）、ＧＶ−１００１、リンフォスキャン（ＬｙｍｐｈｏＳｃａｎ）、ランピルナーゼ、リポキシサン（Ｌｉｐｏｘｙｓａｎ）、ルスプルチド、ＭＰ５２、シプロイセル−Ｔ、ＣＴＰ−３７、インセジア（Ｉｎｓｅｇｉａ）、ビテ��ペン、ヒトトロンビン、トロンビン、トランスミド（ＴｒａｎｓＭＩＤ）、アルフィメプラーゼ（ａｌｆｉｍｅｐｒａｓｅ）、プリカーゼ（Ｐｕｒｉｃａｓｅ）、テルリプレシン、ＥＵＲ−１００８Ｍ、組換えＦＧＦ−Ｉ、ＢＤＭ−Ｅ、ロチガプチド、ＥＴＣ−２１６、Ｐ−１１３、ＭＢＩ−５９４ＡＮ、デュラマイシン、ＳＣＶ−０７、ＯＰＩ−４５、エンドスタチン（Ｅｎｄｏｓｔａｔｉｎ）、アンギオスタチン（Ａｎｇｉｏｓｔａｔｉｎ）、ＡＢＴ−５１０、ボーマン・バーク（Ｂｏｗｍａｎ  Ｂｉｒｋ）型阻害剤、ＸＭＰ−６２９、９９ｍＴｃ−Ｈｙｎｉｃ−アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ、カハラリドＦ、ＣＴＣＥ−９９０８、テベレリックス（ｔｅｖｅｒｅｌｉｘ）、オザレリックス、ロミデプシン（ｒｏｒｎｉｄｅｐｓｉｎ）、ＢＡＹ−５０４７９８、インターロイキン４、ＰＲＸ−３２１、ペプスキャン（Ｐｅｐｓｃａｎ）、イボクタデキン、ｒｈラクトフェリン、ＴＲＵ−０１５、ＩＬ−２１、ＡＴＮ−１６１、シレンジタイド、アルブフェロン（Ａｌｂｕｆｅｒｏｎ）、バイファシックス（Ｂｉｐｈａｓｉｘ）、ＩＲＸ−２、オメガインターフェロン、ＰＣＫ−３１４５、ＣＡＰ−２３２、パシレオチド、ｈｕＮ９０１−ＤＭＩ、ＳＢ−２４９５５３、オンコバックス（Ｏｎｃｏｖａｘ）−ＣＬ、オンコバックス−Ｐ、ＢＬＰ−２５、サーバックス（ＣｅｒＶａｘ）−１６、マート（ＭＡＲＴ）−１、ｇｐ１００、チロシナーゼ、ネミフィチド、ｒＡＡＴ、ＣＧＲＰ、ペグスネルセプト、チモシンベータ４、プリチデプシン（ｐｌｉｔｉｄｅｐｓｉｎ）、ＧＴＰ−２００、ラモプラニン、グラスパ（ＧＲＡＳＰＡ）、ＯＢＩ−１、ＡＣ−１００、サケカルシトニン（エリゲン（ｅｌｉｇｅｎ））、エキサモレリン（ｅｘａｍｏｒｅｌｉｎ）、カプロモレリン（ｃａｐｒｏｍｏｒｅｌｉｎ）、カルデバ（Ｃａｒｄｅｖａ）、ベラフェルミン、１３１Ｉ−ＴＭ−６０１、ＫＫ−２２０、Ｔ−１０、ウラリチド、デペレスタット（ｄｅｐｅｌｅｓｔａｔ）、ヘマタイド、クリサリン、ｒＮＡＰｃ２、組換え第ＶＩＩＩ因子（ＰＥＧ化リポソーム）、ｂＦＧＦ、ＰＥＧ化組換えスタフィロキナーゼバリアント、Ｖ−１０１５３、ソノリシスプロライズ（ＳｏｎｏＬｙｓｉｓ  Ｐｒｏｌｙｓｅ）、ニューロバックス（ＮｅｕｒｏＶａｘ）、ＣＺＥＮ−００２、ｒＧＬＰ−１、ＢＩＭ−５１０７７、ＬＹ−５４８８０６、エキセナチド（制御放出、メディソーブ（Ｍｅｄｉｓｏｒｂ））、ＡＶＥ−００１０、ＧＡ−ＧＣＢ、アボレリン（ａｖｏｒｅｌｉｎ）、ＡＣＭ−９６０４、リナクロチドアセテート、ＣＥＴｉ−１、ヘモスパン（Ｈｅｍｏｓｐａｎ）、ＶＡＬ、速効性インスリン（注射用、ヴィアデル（Ｖｉａｄｅｌ））、インスリン（エリゲン）、組換えメチオニルヒトレプチン、ピトラキンラ、マルチカイン（Ｍｕｌｔｉｋｉｎｅ）、ＲＧ−１０６８、ＭＭ−０９３、ＮＢＩ−６０２４、ＡＴ−００１、ＰＩ−０８２４、Ｏｒｇ−３９１４１、Ｃｐｎ１０、タラクトフェリン（ｔａｌａｃｔｏｆｅｒｒｉｎ）、ｒＥＶ−１３１、ｒＥＶ−１３１、組換えヒトインスリン、ＲＰＩ−７８Ｍ、オプレルベキン、ＣＹＴ−９９００７  ＣＴＬＡ４−Ｉｇ、ＤＴＹ−００１、バラテグラスト（ｖａｌａｔｅｇｒａｓｔ）、イ��ターフェロンアルファ−ｎ３、ＩＲＸ−３、ＲＤＰ−５８、タウフェロン（Ｔａｕｆｅｒｏｎ）、胆汁酸塩刺激リパーゼ、メリスパーゼ（Ｍｅｒｉｓｐａｓｅ）、アルカリフォスファターゼ（ａｌａｌｉｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）、ＥＰ−２１０４Ｒ、メラノタン（Ｍｅｌａｎｏｔａｎ）−ＩＩ、ブレメラノチド（ｂｒｅｍｅｌａｎｏｔｉｄｅ）、ＡＴＬ−１０４、組換えヒトマイクロプラスミン、ＡＸ−２００、セマックス（ＳＥＭＡＸ）、ＡＣＶ−１、Ｘｅｎ−２１７４、ＣＪＣ−１００８、ダイノルフィンＡ、ＳＩ−６６０３、ＬＡＢ  ＧＨＲＨ、ＡＥＲ−００２、ＢＧＣ−７２８、ＡＬＴＵ−１３５、組換えノイラミニダーゼ、Ｖａｃｃ−５ｑ、Ｖａｃｃ−４ｘ、Ｔａｔトキソイド、ＹＳＰＳＬ、ＣＨＳ−１３３４０、ＰＴＨ（１〜３４）（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、オスタボリン（Ｏｓｔａｂｏｌｉｎ）−Ｃ、ＰＴＨアナログ、ＭＢＲＩ−９３．０２、ＭＴＢ７２Ｆ、ＭＶＡ−Ａｇ８５Ａ、ＦＡＲＡ０４、ＢＡ−２１０、組換えペストＦＩＶ、ＡＧ−７０２、ＯｘＳＯＤｒｏｌ、ｒＢｅｔＶ１、Ｄｅｒ−ｐ１／Ｄｅｒ−ｐ２／Ｄｅｒ−ｐ７、ＰＲ１ペプチド抗原、変異体ｒａｓワクチン、ＨＰＶ−１６  Ｅ７リポペプチドワクチン、ラビリンチン（ｌａｂｙｒｉｎｔｈｉｎ）、ＷＴ１−ペプチド、ＩＤＤ−５、ＣＤＸ−１１０、ペントリス（Ｐｅｎｔｒｙｓ）、ノレリン（Ｎｏｒｅｌｉｎ）、サイトファブ（ＣｙｔｏＦａｂ）、Ｐ−９８０８、ＶＴ−１１１、イクロカプチド（ｉｃｒｏｃａｐｔｉｄｅ）、テルベルミン（ｔｅｌｂｅｒｍｉｎ）、ルピントリビル、レティキュロース（ｒｅｔｉｃｕｌｏｓｅ）、ｒＧＲＦ、ＨＡ、アルファ−ガラクトシダーゼＡ、ＡＣＥ−０１１、ＡＬＴＵ−１４０、ＣＧＸ−１１６０、アンギオテンシン、Ｄ−４Ｆ、ＥＴＣ−６４２、ＡＰＰ−０１８、ｒｈＭＢＬ、ＳＣＶ−０７、ＤＲＦ−７２９５、ＡＢＴ−８２８、ＥｒｂＢ２−特異的免疫毒素、ＤＴ３ＳＳＩＬ−３、ＴＳＴ−１００８８、ＰＲＯ−１７６２、コンボトックス（Ｃｏｍｂｏｔｏｘ）、コレシストキニン−Ｂ／ガストリン受容体結合ペプチド、１１１Ｉｎ−ｈＥＧＦ、ＡＥ−３７、トラスツズマブ（ｔｒａｓｎｉｚｕｍａｂ）−ＤＭ１、アンタゴニストＧ、ＩＬ−１２、ＰＭ−０２７３４、ＩＭＰ−３２１、ｒｈＩＧＦ−ＢＰ３、ＢＬＸ−８８３、ＣＵＶ−１６４７、Ｌ−１９ベースのｒａ、Ｒｅ−１８８−Ｐ−２０４５、ＡＭＧ−３８６、ＤＣ／１５４０／
ＫＬＨ、ＶＸ−００１、ＡＶＥ−９６３３、ＡＣ−９３０１、ＮＹ−ＥＳＯ−１（ペプチド）、ＮＡ１７．Ａ２ペプチド、ＣＢＰ−５０１、組換えヒトラクトフェリン、ＦＸ−０６、ＡＰ−２１４、ＷＡＰ−８２９４Ａ、ＡＣＰ−ＨＩＰ、ＳＵＮ−１１０３１、ペプチドＹＹ［３〜３６］、ＦＧＬＬ、アタシセプト、ＢＲ３−Ｆｃ、ＢＮ−００３、ＢＡ−０５８、ヒト副甲状腺ホルモン１〜３４、Ｆ−１８−ＣＣＲ１、ＡＴ−１１００、ＪＰＤ−００３、ＰＴＨ（７〜３４）（Ｎｏｖａｓｏｍｅ）、デュラマイシン、ＣＡＢ−２、ＣＴＣＥ−０２１４、ＧｌｙｃｏＰＥＧ化エリスロポエチン、ＥＰＯ−Ｆｃ、ＣＮＴＯ−５２８、ＡＭＧ−１１４、ＪＲ−０１３、第ＸＩＩＩ因子、アミノカンジン（ａｍｉｎｏｃａｎｄｉｎ）、ＰＮ−９５１、７１６１５５、ＳＵＮ−Ｅ７００１、ＴＨ−０３１８、ＢＡＹ−７３−７９７７、テベレリックス、ＥＰ−５１２１６、ｈＧＨ、ＯＧＰ−Ｉ、シフビルチド、ＴＶ４７１０、ＡＬＧ−８８９、Ｏｒｇ−４１２５９、ｒｈＣＣ１０、Ｆ−９９１、チモペンチン、ｒ（ｍ）ＣＲＰ、肝選択的インスリン、スバリン（ｓｕｂａｌｉｎ）、Ｌ１９−ＩＬ−２融合タンパク質、エラフィン、ＮＭＫ−１５０、ＡＬＴＵ−１３９、ＥＮ−１２２００４、ｒｈＴＰＯ、トロンボポエチン受容体アゴニスト、ＡＬ−１０８、ＡＬ−２０８、神経成長因子アンタゴニスト、ＳＬＶ−３１７、ＣＧＸ−１００７、ＩＮＮＯ−１０５、テリパラチド（エリゲン）、ＧＥＭ−ＯＳ１、ＡＣ−１６２３５２、ＰＲＸ−３０２、ＬＦｎ−ｐ２４融合、ＥＰ−１０４３、ｇｐＥ１、ｇｐＥ２、ＭＦ−５９、ｈＰＴＨ（１〜３４）、７６８９７４、ＳＹＮ−１０１、ＰＧＮ−００５２、アビスクミン（ａｖｉｓｃｕｍｎｉｎｅ）、ＢＩＭ−２３１９０、多エピトープチロシナーゼペプチド、エンカスチム（ｅｎｋａｓｔｉｍ）、ＡＰＣ−８０２４、ＧＩ−５００５、ＡＣＣ−００１、ＴＴＳ−ＣＤ３、血管ターゲティングＴＮＦ、デスモプレシン、オネルセプト（ｏｎｅｒｃｅｐｔ）及びＴＰ−９２０１である。
【００９１】
一部の実施形態では、ポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）は、アダリムマブ（ヒュミラ（ＨＵＭＩＲＡ））、インフリキシマブ（レミケード（ＲＥＭＩＣＡＤＥ）（商標））、リツキシマブ（リツキサン（ＲＩＴＵＸＡＮ）（商標）／マブセラ（ＭＡＢ  ＴＨＥＲＡ）（商標））、エタネルセプト（エンブレル（ＥＮＢＲＥＬ）（商標））、ベバシズマブ（アバスチン（ＡＶＡＳＴＩＮ）（商標））、トラスツズマブ（ハーセプチン（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）（商標））、ペグフィルグラスチム（ｐｅｇｒｉｌｇｒａｓｔｉｍ）（ニューラスタ（ＮＥＵＬＡＳＴＡ）（商標））又はバイオ後続品及びバイオ改良品を含む他の任意の好適なポリペプチドである。
【００９２】
他の好適なポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）には、以下の表５及び米国特許出願公開第２０１６／００９７０７４号の表１に列挙されるポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【００９３】
【表５】
2021511781.tif 000018
2021511781.tif 000019
2021511781.tif 000020
2021511781.tif 000021
2021511781.tif 000022
【００９４】
実施形態では、ポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）は、例えば表６で示される通り、ホルモン、凝血／血液凝固因子、サイトカイン／成長因子、抗体分子、融合タンパク質、タンパク質ワクチン又はペプチドである。
【００９５】
【表６】
2021511781.tif 000023
2021511781.tif 000024
2021511781.tif 000025
2021511781.tif 000026
【００９６】
実施形態では、ポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）は、多重特異性タンパク質、例えば二重特異性抗体である。実施形態では、多重特異性タンパク質は、表７で示される通りである。
【００９７】
【表７】
2021511781.tif 000027
2021511781.tif 000028
2021511781.tif 000029
2021511781.tif 000030
2021511781.tif 000031
2021511781.tif 000032
2021511781.tif 000033
2021511781.tif 000034
2021511781.tif 000035
2021511781.tif 000036
【００９８】
実施形態では、ポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）は、表８で列挙されるポリペプチドである。
【００９９】
【表８】
2021511781.tif 000037
2021511781.tif 000038
2021511781.tif 000039
2021511781.tif 000040
2021511781.tif 000041
2021511781.tif 000042
2021511781.tif 000043
【０１００】
一部の実施形態では、ポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）は、がん細胞によって発現される抗原である。一部の実施形態では、組換えポリペプチド又は治療用ポリペプチドは、腫瘍関連抗原又は腫瘍特異的抗原である。一部の実施形態では、組換えポリペプチド又は治療用ポリペプチドは、ＨＥＲ２、ＣＤ２０、９−Ｏ−アセチル−ＧＤ３、βｈＣＧ、Ａ３３抗原、ＣＡ１９−９マーカー、ＣＡ−１２５マーカー、カルレティキュリン、炭酸脱水酵素ＩＸ（ＭＮ／ＣＡ  ＩＸ）、ＣＣＲ５、ＣＣＲ８、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２５、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＣＤ４４ｖ６、ＣＤ６３、ＣＤ７０、ＣＣ１２３、ＣＤ１３８、癌腫胎児性抗原（ＣＥＡ：ｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ；ＣＤ６６ｅ）、デスモグレイン４、Ｅ−カドヘリンネオエピトープ、エンドシアリン、エフリンＡ２（ＥｐｈＡ２：ｅｐｈｒｉｎ  Ａ２）、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ：ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ：ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ａｄｈｅｓｉｏｎ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）、ＥｒｂＢ２、胎児性アセチルコリン受容体、線維芽細胞活性化抗原（ＦＡＰ：ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ａｎｔｉｇｅｎ）、フコシルＧＭ１、ＧＤ２、ＧＤ３、ＧＭ２、ガングリオシドＧＤ３、グロボＨ、糖タンパク質１００、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、インスリン様成長因子受容体１、Ｌｅｗｉｓ−Ｙ、ＬＧ、Ｌｙ−６、黒色腫特異的コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＣＰ：ｍｅｌａｎｏｍａ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｏｎｄｒｏｉｔｉｎ−ｓｕｌｆａｔｅ  ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎ）、メソセリン、ＭＵＣ１、ＭＵＣ２、ＭＵＣ３、ＭＵＣ４、ＭＵＣ５ＡＣ、ＭＵＣ５Ｂ、ＭＵＣ７、ＭＵＣ１６、ミュラー管抑制因子（ＭＩＳ：Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）受容体ＩＩ型、血漿細胞抗原、ポリＳＡ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ：ｓｏｎｉｃ  ｈｅｄｇｅｈｏｇ）、ＳＡＳ、ＳＴＥＡＰ、ｓＴｎ抗原、ＴＮＦ−アルファ前駆体及びこれらの組合せから選択される。
【０１０１】
一部の実施形態では、ポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）は、活性化受容体であり、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、α４β１インテグリン、β２インテグリン、ＣＤ２、ＣＤ１６、ＣＤ２７、ＣＤ３８、ＣＤ９６、ＣＤ１００、ＣＤ１６０、ＣＤ１３７、ＣＥＡＣＡＭ１（ＣＤ６６）、ＣＲＴＡＭ、ＣＳ１（ＣＤ３１９）、ＤＮＡＭ−１（ＣＤ２２６）、ＧＩＴＲ（ＴＮＦＲＳＦ１８）、ＫＩＲの活性化形態、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ｅ、１つ又は複数の自然細胞傷害性受容体、ＮＴＢ−Ａ、ＰＥＮ−５及びこれらの組合せから選択され、任意選択でβ２インテグリンは、ＣＤ１１ａ−ＣＤ１８、ＣＤ１１ｂ−ＣＤ１８又はＣＤ１１ｃ−ＣＤ１８を含み、任意選択でＫＩＲの活性化形態は、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ４又はＫＩＲ−Ｓを含み、任意選択で自然細胞傷害性受容体は、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６又はＮＫｐ８０を含む。
【０１０２】
一部の実施形態では、ポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）は、阻害性受容体であり、ＫＩＲ、ＩＬＴ２／ＬＩＲ−１／ＣＤ８５ｊ、ＫＩＲの阻害性形態、ＫＬＲＧ１、ＬＡＩＲ−１、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＲ−ＰＩＡ、Ｓｉｇｌｅｃ−３、Ｓｉｇｌｅｃ−７、Ｓｉｇｌｅｃ−９及びこれらの組合せから選択され、任意選択でＫＩＲの阻害性形態は、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２又はＫＩＲ−Ｌを含む。
【０１０３】
一部の実施形態では、ポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）は、活性化受容体であり、ＣＤ３、ＣＤ２（ＬＦＡ２、ＯＸ３４）、ＣＤ５、ＣＤ２７（ＴＮＦＲＳＦ７）、ＣＤ２８、ＣＤ３０（ＴＮＦＲＳＦ８）、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ８４（ＳＬＡＭＦ５）、ＣＤ１３７（４−１ＢＢ）、ＣＤ２２６、ＣＤ２２９（Ｌｙ９、ＳＬＡＭＦ３）、ＣＤ２４４（２Ｂ４、ＳＬＡＭＦ４）、ＣＤ３１９（ＣＲＡＣＣ、ＢＬＡＭＥ）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＲＴＡＭ（ＣＤ３５５）、ＤＲ３（ＴＮＦＲＳＦ２５）、ＧＩＴＲ（ＣＤ３５７）、ＨＶＥＭ（ＣＤ２７０）、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴβＲ（ＴＮＦＲＳＦ３）、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、ＮＫＧ２Ｄ、ＳＬＡＭ（ＣＤ１５０、ＳＬＡＭＦ１）、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδγ、ＴＩＭ１（ＨＡＶＣＲ、ＫＩＭ１）及びこれらの組合せから選択される。
【０１０４】
一部の実施形態では、ポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）は、阻害性受容体であり、ＰＤ−１（ＣＤ２７９）、２Ｂ４（ＣＤ２４４、ＳＬＡＭＦ４）、Ｂ７１（ＣＤ８０）、Ｂ７Ｈ１（ＣＤ２７４、ＰＤ−Ｌ１）、ＢＴＬＡ（ＣＤ２７２）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５、ＮＫ２８）、ＣＤ３５２（Ｌｙ１０８、ＮＴＢＡ、ＳＬＡＭＦ６）、ＣＤ３５８（ＤＲ６）、ＣＴＬＡ−４（ＣＤ１５２）、ＬＡＧ３、ＬＡＩＲ１、ＰＤ−１Ｈ（ＶＩＳＴＡ）、ＴＩＧＩＴ（ＶＳＩＧ９、ＶＳＴＭ３）、ＴＩＭ２（ＴＩＭＤ２）、ＴＩＭ３（ＨＡＶＣＲ２、ＫＩＭ３）及びこれらの組合せから選択される。
【０１０５】
他の例示的なポリペプチド（例えば細胞によって産生されるポリペプチド及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生されるポリペプチド）には、Ｌｅａｄｅｒら、「Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ：ａ  ｓｕｍｍａｒｙ  ａｎｄ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ」、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００８、７：２１〜３９（参照により本明細書に組み込む）の表１〜１０に記載される任意のタンパク質；又は本明細書で説明される組換えポリペプチドの任意のコンジュゲート、バリアント、アナログ若しくは機能的断片が含まれるが、これらに限定されない。
【０１０６】
他の組換えタンパク質生成物（例えば細胞によって産生される生成物及び／又は本明細書で説明される方法に従って産生される生成物）には、非限定的に、ＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ（ａｆｆｉｂｏｄｙ）及びアドネクチン（ａｄｎｅｃｔｉｎ）等の非抗体スキャフォールド又は足場タンパク質代用品が含まれる。そのような非抗体スキャフォールド又は足場タンパク質代用品は、１つ若しくは２つ又はそれよりも多い、例えば１、２、３、４若しくは５つ又はそれよりも多い様々な標的又は抗原を認識するか、又はこれに結合するように操作され得る。
【０１０７】
適用
本明細書で開示される細胞を特定、選択及び／又は培養する方法は、様々な生成物を産生するために有用な細胞を生成し、様々な細胞株を評価するため、又はバイオリアクター又は加工容器若しくはタンクにおける、又はより一般には任意の供給源による使用のための様々な細胞株の産生を評価するために使用され得る。本明細書で説明される組成物及び方法は、例えば原核細胞株及び／又は真核細胞株を含む、任意の所望の細胞株を培養するために好適である。さらに、実施形態では、本明細書で説明される組成物及び方法は、懸濁細胞又は足場依存性（接着性）細胞を培養するために好適であり、ポリペプチド生成物、核酸生成物（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）、又は細胞療法及び／若しくはウイルス療法で使用されるもの等の細胞及び／若しくはウイルス等の医薬製品及びバイオ医薬製品の産生のために構成された産生作業に好適である。
【０１０８】
実施形態では、細胞は、組換え治療用生成物又は診断用生成物等の生成物を発現又は産生する。以下により詳細に説明される通り、細胞によって産生される生成物の例には、抗体分子（例えばモノクローナル抗体、二重特異性抗体）、抗体ミメティックス（例えばＤＡＲＰｉｎ、アフィボディ、アドネクチン又はＩｇＮＡＲ等の、抗原に特異的に結合するが、抗体に構造的に関連しないポリペプチド分子）、融合タンパク質（例えばＦｃ融合タンパク質、キメラサイトカイン）、他の組換えタンパク質（例えば糖鎖付加タンパク質、酵素、ホルモン）、ウイルス治療薬（例えば抗がん腫瘍溶解性ウイルス、遺伝子療法及びウイルス免疫療法のためのウイルスベクター）、細胞治療薬（例えば多能性幹細胞、間葉系幹細胞及び成体幹細胞）、ワクチン若しくは脂質被包粒子（例えばエキソソーム、ウイルス様粒子）、ＲＮＡ（例えばｓｉＲＮＡ等）若しくはＤＮＡ（例えばプラスミドＤＮＡ等）、抗生物質又はアミノ酸が含まれるが、これらに限定されない。実施形態では、本明細書で説明される組成物及び方法は、バイオ後続品を産生するために使用され得る。
【０１０９】
言及される通り、実施形態では、本明細書で説明される組成物及び方法は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞、又は例えば酵母細胞又は糸状菌細胞等の下等真核細胞、又はグラム陽性又はグラム陰性細胞等の原核細胞の産生、及び／又は真核細胞又は原核細胞の生成物、例えばタンパク質、ペプチド、抗生物質、アミノ酸、核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ等）がラージスケール様式で真核細胞によって合成されることを可能にする。本明細書で別に示さない限り、本明細書で説明される組成物及び方法は、非限定的にベンチスケール、パイロットスケール及び完全産生スケール容量を含む、任意の所望の体積又は産生容量を含み得る。
【０１１０】
さらに、且つ本明細書で別に示さない限り、本明細書で説明される組成物及び方法は、非限定的に撹拌タンク、気泡ポンプ、繊維、マイクロファイバー、中空繊維、セラミックマトリックス、流動床、固定床及び／又は噴流床バイオリアクターを含む任意の好適なリアクター（複数可）により使用され得る。本明細書で使用されるとき、「リアクター」とは、発酵槽若しくは発酵ユニット又は他の任意の反応容器を含む場合があり、「リアクター」という用語は、「発酵槽」と互換的に使用される。例えば、一部の態様では、バイオリアクターユニットは、以下のこと：栄養素及び／又は炭素供給源の供給、好適な気体（例えば酸素）の注入、発酵又は細胞培養培地の出入口流動、気相と液相との分離、温度の維持、酸素及びＣＯ２レベルの維持、ｐＨレベルの維持、かき混ぜ（例えば撹拌）及び／又は清浄化／滅菌のうちの１つ若しくは複数又は全てを行い得る。発酵ユニット等の例のリアクターユニットが、ユニット内に多数のリアクターを含有する場合、例えばユニットが、各ユニットに１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０若しくは１００個又はそれよりも多いバイオリアクターを有する場合、及び／又は設備が、設備内に単一又は多数のリアクターを有する多数のユニットを含有する場合がある。様々な実施形態では、バイオリアクターは、回分、半流加回分、流加回分、灌流及び／又は連続発酵プロセスに好適であり得る。任意の好適なリアクター直径を使用することができる。実施形態では、バイオリアクターは、約１００ｍＬ〜約５０，０００Ｌの体積を有し得る。非限定的な例には、１００ｍＬ、２５０ｍＬ、５００ｍＬ、７５０ｍＬ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、５リットル、６リットル、７リットル、８リットル、９リットル、１０リットル、１５リットル、２０リットル、２５リットル、３０リットル、４０リットル、５０リットル、６０リットル、７０リットル、８０リットル、９０リットル、１００リットル、１５０リットル、２００リットル、２５０リットル、３００リットル、３５０リットル、４００リットル、４５０リットル、５００リットル、５５０リットル、６００リットル、６５０リットル、７００リットル、７５０リットル、８００リットル、８５０リットル、９００リットル、９５０リットル、１０００リットル、１５００リットル、２０００リットル、２５００リットル、３０００リットル、３５００リットル、４０００リットル、４５００リットル、５０００リットル、６０００リットル、７０００リットル、８０００リットル、９０００リットル、１０，０００リットル、１５，０００リットル、２０，０００リットル及び／又は５０，０００リットルの体積が含まれる。加えて、好適なリアクターは、多数回使用、単回使用、使い捨て又は非使い捨てであってもよく、ステンレススチール（例えば３１６Ｌ又は他の任意の好適なステンレススチール）及びインコネル等の金属合金、プラスチック及び／又はガラスを含む任意の好適な材料から形成され得る。一部の実施形態では、好適なリアクターは、円形、例えば円筒形であり得る。一部の実施形態では、好適なリアクターは、四角形、例えば長方形であり得る。四角形のリアクターは、一部の場合、使用（例えば技術者によるローディング及び設定）の容易さ、リアクター内容物のより大きな混合及び均一性並びにより少ない占有床面積等の円形リアクターに優る利点を提供し得る。
【０１１１】
実施形態では、且つ本明細書で別に示さない限り、本明細書で説明される組成物及び方法は、そのような生成物の分離、精製及び単離のための操作及び／又は機器等の、別に言及されていない任意の好適な単位操作及び／又は機器により使用され得る。伝統的な現場組立設備、モジュール式、移動式及び一時的設備又は他の任意の好適な構築物、設備及び／若しくはレイアウト等の任意の好適な設備及び環境を使用することができる。例えば、一部の実施形態では、モジュール式クリーンルームを使用することができる。加えて、且つ別に示さない限り、本明細書で説明される組成物及び方法は、単一の場所若しくは設備で収容及び／若しくは実施されるか、又は或いは、別々の、若しくは多数の場所及び／若しくは設備で収容及び／若しくは実施され得る。
【０１１２】
非限定的な例として、且つ限定ではなく、米国特許出願公開第２０１３／０２８０７９７号、同第２０１２／００７７４２９号、同第２０１１／０２８０７９７号、同第２００９／０３０５６２６号並びに米国特許第８２９８０５４号、同第７６２９１６７号及び同第５６５６４９１号は、本明細書で説明される組成物及び方法での使用に好適であり得る例示的な設備、機器及び／又は系を説明し、当該特許及び特許出願はその全体を参照により本明細書に組み込む。
【０１１３】
本明細書で説明される組成物及び方法は、広範なスペクトルの細胞を利用することができる。実施形態では、細胞は、真核細胞、例えば哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞は、例えばヒト又はげっ歯類若しくはウシ細胞株又は細胞系統であり得る。そのような細胞、細胞株又は細胞系統の例は、例えばマウス骨髄腫（ＮＳ０）細胞株、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ  Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（仔ハムスター腎細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えばＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＨＥＫ−２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解細胞株又はハイブリドーマ細胞株である。好ましくは、哺乳動物細胞は、ＣＨＯ細胞株である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ細胞である。一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えばＧＳＫＯ細胞）は、例えばＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えばポテリジェント（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。また、真核細胞は、例えばＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６又はＥＢｖ１３等の鳥類細胞、細胞株又は細胞系統であり得る。
【０１１４】
一実施形態では、真核細胞は、幹細胞である。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば造血幹細胞）及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む多能性幹細胞であり得る。
【０１１５】
一実施形態では、細胞は、本明細書で説明される細胞のうちのいずれかの分化した形態である。一実施形態では、細胞は、培養物中の任意の初代細胞に由来する細胞である。
【０１１６】
実施形態では、細胞は、ヒト肝細胞、動物肝細胞又は非実質細胞等の肝細胞である。例えば、細胞は、播種可能代謝用ヒト肝細胞、播種可能誘導用ヒト肝細胞、播種可能クオリストトランスポーターサーティファイド（商標）ヒト肝細胞、懸濁用ヒト肝細胞（１０人のドナー及び２０人のドナーからプールした肝細胞を含む）、ヒト肝クッパー細胞、ヒト肝星細胞、イヌ肝細胞（単一の、及びプールしたビーグル肝細胞を含む）、マウス肝細胞（ＣＤ−１及びＣ５７Ｂｌ／６肝細胞を含む）、ラット肝細胞（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎ及びＷｉｓｔａｒ肝細胞を含む）、サル肝細胞（カニクイザル又はアカゲザル肝細胞を含む）、ネコ肝細胞（イエネコ短毛種肝細胞を含む）及びウサギ肝細胞（ニュージーランドホワイト種肝細胞を含む）であり得る。例の肝細胞は、Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｓ、ＬＬＣ、６  Ｄａｖｉｓ  Ｄｒｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎｏｒｔｈ  Ｃａｒｏｌｉｎａ、ＵＳＡ  ２７７０９から市販されている。
【０１１７】
一実施形態では、真核細胞は、例えば酵母細胞（例えばピキア属（例えばピキア・パストリス、ピキア・メタノリカ、ピキア・クルイベリ及びピキア・アンガスタ）、コマガタエラ属（例えばコマガタエラ・パストリス、コマガタエラ・シュードパストリス又はコマガタエラ・ファフィ）、サッカロマイセス属（例えば出芽酵母、出芽酵母、サッカロマイセス・クルイベリ、サッカロマイセス・ウバラム）、クルイベロマイセス属（例えばクルイベロマイセス・ラクティス、クルイベロマイセス・マルキシアヌス）、キャンディダ属（例えばトルラ酵母、キャンディダ・カカオイ、キャンディダ・ボイディニ）、ゲオトリクム属（例えばゲオトリクム・ファーメンタンス）、ハンセヌラ・ポリモルファ、ヤロウイア・リポリティカ又は分裂酵母）等の低級真核細胞である。ピキア・パストリス種は好ましい。ピキア・パストリス系統の例は、Ｘ３３、ＧＳ１１５、ＫＭ７１、ＫＭ７１Ｈ及びＣＢＳ７４３５である。
【０１１８】
一実施形態では、真核細胞は、真菌細胞（例えばコウジカビ属（クロコウジカビ、アスペルギルス・フミガータス、ニホンコウジカビ、偽巣性コウジ菌等）、アクレモニウム属（アクレモニウム・サーモフィラム等）、ケタマカビ属（ケトミウム・サーモフィラム等）、クリソスポリウム属（クリソスポリウム・サーモフィラム等）、冬虫夏草属（サナギタケ等）、コリナスカス属、クテノマイセス属、フサリウム属（フサリウム・オキシスポラム等）、グロメレラ属（イネ科炭疽病菌等）、ボタンタケ属（ハイポクレア・ジェコリーナ等）、マグナポルテ属（イモチ病菌等）、マイセリオフトーラ属（マイセリオフトーラ・サーモフィル等）、アカツブタケ属（ネクトリア・ヘマトコッカ等）、アカパンカビ属（アカパンカビ等）、アオカビ属、スポロトリクム属（スポロトリクム・サーモフィル等）、ティエラビア属（ティエラビア・テレストリス、ティエラビア・ヘテロタリカ等）、トリコデルマ属（トリコデルマ・リーセイ等）又はバーティシリウム属（バーティシリウム・ダリエ等））である。
【０１１９】
一実施形態では、真核細胞は、昆虫細胞（例えばＳｆ９、ミミック（商標）Ｓｆ９、Ｓｆ２１、ハイファイブ（商標）（ＢＴ１−ＴＮ−５Ｂ１−４）又はＢＴ１−Ｅａ８８細胞）、藻類細胞（例えばアンフォラ属、珪藻類の属、ドナリエラ属、クロレラ属、コナミドリムシ属、藍藻類の属（シアノバクテリア）、ナンノクロロプシス属、スピルリナ属又はオクロモナス属の細胞）又は植物細胞（例えば単子葉植物（例えばトウモロコシ、イネ、コムギ又はエノコログサ属）から、又は双子葉植物（例えばキャッサバ、ジャガイモ、ダイズ、トマト、タバコ、アルファルファ、ニセツリガネゴケ又はシロイヌナズナ属）からの細胞）である。
【０１２０】
実施形態では、培養細胞は、治療的使用のための、タンパク質、例えば抗体、例えばモノクローナル抗体及び／又は組換えタンパク質を産生するために使用される。実施形態では、培養細胞は、ペプチド、アミノ酸、脂肪酸又は他の有用な生化学中間体若しくは代謝産物を産生する。例えば、実施形態では、約４０００ダルトン〜約１４０，０００ダルトンを超える分子量を有する分子が産生され得る。実施形態では、これらの分子は、ある程度の複雑さを有する場合があり、糖鎖付加を含む翻訳後修飾を含み得る。
【０１２１】
番号付き実施形態
本発明は、例えば以下の番号付き段落のうちのいずれかにおいて定義される通り、定義され得る。
１．対象核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法であって、
ａ）（ｉ）対象核酸配列と、
（ｉｉ）発現した場合、アミノ酸の合成経路、例えばプロリン合成経路の酵素の高レベルの活性をもたらす核酸配列、例えば活性を含む酵素分子をコードする核酸配列と
を含む異種の核酸、例えばベクター、例えば複製可能ベクター又は統合ベクターを含む細胞を用意するステップと、
ｂ）核酸配列を含む細胞を、核酸配列を含む細胞の成長を可能にするために十分な条件下で、高活性を有しない細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルのアミノ酸、例えばプロリンを有する培地の存在下で培養するステップと
を含み、それによって、異種の核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法。
【０１２２】
２．異種の核酸が、ベクターを含む、実施形態１に記載の方法。
【０１２３】
３．異種の核酸が、複製可能ベクター、例えば自己複製可能ベクターを含む、実施形態１又は２に記載の方法。
【０１２４】
４．異種の核酸が、統合ベクターを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１２５】
５．培地が、酵素の活性の阻害剤をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１２６】
６．阻害剤が、アミノ酸である、実施形態５に記載の方法。
【０１２７】
７．阻害剤が、アミノ酸ではない、実施形態５に記載の方法。
【０１２８】
８．異種の核酸配列を含む細胞を特定するステップを含む前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１２９】
９．異種の核酸配列を含む細胞を選択するステップを含む前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１３０】
１０．異種の核酸配列を含む細胞を培養するステップを含む前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１３１】
１１．異種の核酸が、複数のベクターを含む（例えば、対象核酸及び酵素の高レベルの活性をもたらす核酸が複数のベクターに、例えば異なるベクターに含まれる）、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１３２】
１２．異種の核酸が、複数の統合ベクターを含む（例えば、対象核酸及び酵素の高レベルの活性をもたらす核酸が複数の統合ベクターに、例えば異なるベクターに含まれる）、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１３３】
１３．異種の核酸が、複数の自己複製ベクターを含む（例えば、対象核酸及び酵素の高レベルの活性をもたらす核酸が複数の自己複製ベクターに、例えば異なるベクターに含まれる）、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１３４】
１４．異種の核酸が、細胞のゲノム、例えば染色体ゲノムに統合される、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１３５】
１５．アミノ酸が、天然アミノ酸を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１３６】
１６．アミノ酸が、表１に列挙されるアミノ酸を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１３７】
１７．アミノ酸が、アラニンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１３８】
１８．アミノ酸が、ロイシンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１３９】
１９．アミノ酸が、イソロイシンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１４０】
２０．アミノ酸が、メチオニンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１４１】
２１．アミノ酸が、バリンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１４２】
２２．アミノ酸が、フェニルアラニンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１４３】
２３．アミノ酸が、アスパラギンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１４４】
２４．アミノ酸が、システインである、実施形態１６に記載の方法。
【０１４５】
２５．アミノ酸が、グルタミンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１４６】
２６．アミノ酸が、セリンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１４７】
２７．アミノ酸が、トレオニンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１４８】
２８．アミノ酸が、アスパラギン酸である、実施形態１６に記載の方法。
【０１４９】
２９．アミノ酸が、グルタミン酸である、実施形態１６に記載の方法。
【０１５０】
３０．アミノ酸が、アルギニンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１５１】
３１．アミノ酸が、ヒスチジンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１５２】
３２．アミノ酸が、リジンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１５３】
３３．アミノ酸が、グリシンである、実施形態１６に記載の方法。
【０１５４】
３４．アミノ酸が、プロリン、チロシン及びトリプトファンから選択される、実施形態１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
【０１５５】
３５．アミノ酸が、プロリンである、実施形態３４に記載の方法。
【０１５６】
３６．アミノ酸が、チロシンである、実施形態３４に記載の方法。
【０１５７】
３７．アミノ酸が、トリプトファンである、実施形態３４に記載の方法。
【０１５８】
３８．阻害剤が、酵素に結合する、例えば、阻害剤が、酵素に結合し、これを阻害する、実施形態５〜３７のいずれか１つに記載の方法。
【０１５９】
３９．阻害剤が、酵素の転写を阻害する、実施形態５〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【０１６０】
４０．阻害剤が、酵素の翻訳を阻害する、実施形態５〜３９のいずれか１つに記載の方法。
【０１６１】
４１．阻害剤が、核酸、例えばＲＮＡ、例えばアンチセンス又はｓｉＲＮＡを含む、実施形態５〜４０のいずれか１つに記載の方法。
【０１６２】
４２．阻害剤が、アプタマーを含む、実施形態５〜４１のいずれか１つに記載の方法。
【０１６３】
４３．阻害剤が、小分子を含む、実施形態５〜４２のいずれか１つに記載の方法。
【０１６４】
４４．阻害剤が、酵素の基質のアナログである、実施形態５〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０１６５】
４５．阻害剤が、アミノ酸のアナログ、例えばプロリン、チロシン又はトリプトファンのアナログである、実施形態５〜４４のいずれか１つに記載の方法。
【０１６６】
４６．阻害剤が、競合的阻害剤を含む、実施形態５〜４５のいずれか１つに記載の方法。
【０１６７】
４７．阻害剤が、アミノ酸の合成の律速酵素を阻害する、例えば、阻害剤が、培地でのアミノ酸の合成のための律速酵素を阻害する、実施形態５〜４６のいずれか１つに記載の方法。
【０１６８】
４８．アミノ酸が、プロリンを含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１６９】
４９．酵素が、ピロリン−５−カルボン酸シンターゼ（Ｐ５ＣＳ）分子を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１７０】
５０．異種の核酸配列が、Ｐ５ＣＳ分子をコードする配列を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１７１】
５１．阻害剤が、酵素の基質、又はそのアナログ、バリアント若しくは誘導体である、実施形態５〜５０のいずれか１つに記載の方法。
【０１７２】
５２．阻害剤が、プロリンのアナログ、例えばＬ−アゼチジン−２−カルボン酸、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリン又はＬ−４−チアゾリジンカルボン酸である、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１７３】
５３．アミノ酸が、プロリンを含み、酵素及び阻害剤が、表１から選択される、実施形態５〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【０１７４】
５４．アミノ酸が、チロシンを含み、酵素及び／又は阻害剤が、表１から選択される、実施形態５〜１６、３４又は３８〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
５５．異種の核酸配列が、ポリペプチド及び／又はチロシン生合成酵素の阻害剤をコードする配列を含む、実施形態５〜１６、３４、３８〜４７又は５４のいずれか１つに記載の方法。
【０１７６】
５６．阻害剤が、酵素の基質のアナログである、実施形態５４又は５５に記載の方法。
【０１７７】
５７．阻害剤が、チロシンのアナログである、実施形態５〜１６、３４、３８〜４７又は５４〜５６のいずれか１つに記載の方法。
【０１７８】
５８．アミノ酸が、チロシンを含み、酵素及び阻害剤が、表１から選択される、実施形態５〜１６、３４、３８〜４７又は５４〜５７のいずれか１つに記載の方法。
【０１７９】
５９．アミノ酸が、トリプトファンを含み、酵素及び／又は阻害剤が、表１から選択される、実施形態５〜１６、３４又は３８〜４７のいずれか１つに記載の方法。
【０１８０】
６０．異種の核酸配列が、ポリペプチド及び／又はトリプトファン生合成酵素の阻害剤をコードする配列を含む、実施形態５〜１６、３４、３８〜４７又は５９のいずれか１つに記載の方法。
【０１８１】
６１．阻害剤が、酵素の基質のアナログである、実施形態５９又は６０に記載の方法。
【０１８２】
６２．阻害剤が、トリプトファンのアナログである、実施形態５〜１６、３４、３８〜４７又は５９〜６１のいずれか１つに記載の方法。
【０１８３】
６３．アミノ酸が、トリプトファンを含み、酵素及び阻害剤が、表１から選択される、実施形態５〜１６、３４、３８〜４７又は５９〜６２のいずれか１つに記載の方法。
【０１８４】
６４．高酵素活性を有しない細胞を、高活性を有する細胞と共に培養するステップを含む前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１８５】
６５．高活性を有する細胞が、高活性を有しない細胞よりも迅速に、例えば約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、７５、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００又は１０，０００倍迅速に成長する、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１８６】
６６．選択された、例えば成長に基づいて選択された細胞の約０．０１、０．１、０．５、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０又は５０パーセント未満が、核酸を欠く、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１８７】
６７．成長を示す細胞を選択するステップをさらに含む前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１８８】
６８．細胞が、真核細胞を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１８９】
６９．細胞が、動物細胞を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９０】
７０．細胞が、哺乳動物細胞を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９１】
７１．細胞が、げっ歯類細胞を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９２】
７２．細胞が、ＣＨＯ細胞を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９３】
７３．細胞が、ＧＳＫＯ  ＣＨＯ細胞を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９４】
７４．酵素をコードする配列の内因性コピーが、不活性化されている、例えば構造領域又は制御領域の欠失を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９５】
７５．第２のアミノ酸合成酵素をコードする配列の内因性コピーが、不活性化されている、例えば構造領域又は制御領域の欠失を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９６】
７６．ＧＳをコードする配列の内因性コピーが、不活性化されている、例えば構造領域又は制御領域の欠失を含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９７】
７７．対象核酸配列が、ペプチド分子をコードする、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９８】
７８．対象核酸配列が、異種である、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０１９９】
７９．異種のペプチド分子が、表５〜８のうちのいずれかから選択される、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２００】
８０．培地で成長する細胞を選択するステップを含む前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０１】
８１．培地が、阻害剤を含む、実施形態８０に記載の方法。
【０２０２】
８２．１）培地で成長する細胞を選択するステップと、
２）培養条件の第２のセット下で、例えば第２の培地で細胞を培養する、例えば選択した細胞を第２の選択に供するステップと
を含む前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０３】
８３．１）の培地が、阻害剤を含み、
２）の第２の培地が、阻害剤を含む、
実施形態８２に記載の方法。
【０２０４】
８４．１）培地で成長する細胞を選択するステップと、
２）培養条件の第２のセット下で、例えば第２の培地で細胞を培養する、例えば選択した細胞を第２の選択に供するステップと
を含み、１）及び２）のうちの一方の培地の阻害剤の濃度が、１）及び２）のうちの他方の阻害剤の濃度よりも大きい、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０５】
８５．１）の阻害剤の濃度が、２）の阻害剤の濃度よりも大きい、実施形態８４に記載の方法。
【０２０６】
８６．１）の阻害剤の濃度が、２）の阻害剤の濃度よりも大きい、実施形態８４に記載の方法。
【０２０７】
８７．より低い濃度の阻害剤を有するステップの培地が、本質的に阻害剤を含まない、実施形態８４〜８６のいずれか１つに記載の方法。
【０２０８】
８８．（ｉｉ）の核酸配列が、制御配列、例えばプロモーターに作動可能に連結されている、前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２０９】
８９．制御配列が、ＳＶ４０、ｍＣＭＶ、ｈＣＭＶ若しくはＰＧＫプロモーター又はそれらのバリアントから選択される配列を含む、実施形態８８に記載の方法。
【０２１０】
９０．制御配列が、ＬＭＭの発現を制御する、実施形態８８に記載の方法。
【０２１１】
９１．制御配列及びＬＭＭが、表３の任意の単一の行に列挙される通りである、実施形態９０に記載の方法。
【０２１２】
９２．制御配列が、ＳＶ４０プロモーターを含み、ＬＭＭが、マウスＳＣＤ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２１３】
９３．制御配列が、ＳＶ４０プロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＣＤ１、例えばＣＨＯ  ＳＣＤ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２１４】
９４．制御配列が、ＳＶ４０プロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢＦ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２１５】
９５．制御配列が、ＳＶ４０プロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢ４１１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２１６】
９６．制御配列が、ｍＣＭＶプロモーターを含み、ＬＭＭが、マウスＳＣＤ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２１７】
９７．制御配列が、ｍＣＭＶプロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＣＤ１、例えばＣＨＯ  ＳＣＤ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２１８】
９８．制御配列が、ｍＣＭＶプロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢＦ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２１９】
９９．制御配列が、ｍＣＭＶプロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢ４１１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２２０】
１００．制御配列が、ｈＣＭＶプロモーターを含み、ＬＭＭが、マウスＳＣＤ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２２１】
１０１．制御配列が、ｈＣＭＶプロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＣＤ１、例えばＣＨＯ  ＳＣＤ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２２２】
１０２．制御配列が、ｈＣＭＶプロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢＦ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２２３】
１０３．制御配列が、ｈＣＭＶプロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢ４１１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２２４】
１０４．制御配列が、ＰＧＫプロモーターを含み、ＬＭＭが、マウスＳＣＤ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２２５】
１０５．制御配列が、ＰＧＫプロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＣＤ１、例えばＣＨＯ  ＳＣＤ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２２６】
１０６．制御配列が、ＰＧＫプロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢＦ１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２２７】
１０７．制御配列が、ＰＧＫプロモーターを含み、ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１、例えばＣＨＯ  ＳＲＥＢ４１１である、実施形態９０に記載の方法。
【０２２８】
１０８．制御配列が、ＬＭＭの発現を制御し、培地が、酵素の活性の阻害剤を含む、実施形態８８に記載の方法。
【０２２９】
１０９．制御配列、ＬＭＭ及び阻害剤（例えばＰ５ＣＳ阻害剤）が、表４の任意の単一の行に列挙される通りである、実施形態１０８に記載の方法。
【０２３０】
１１０．培地が、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を含む、実施形態８８〜１０９のいずれか１つに記載の方法。
【０２３１】
１１１．培地が、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを含む、実施形態８８〜１１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２３２】
１１２．培地が、Ｌ−４−チアゾリジンカルボン酸を含む、実施形態８８〜１１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２３３】
１１３．対象核酸配列の生成物を回復するステップをさらに含む前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２３４】
１１４．培地から生成物を回復するステップを含む前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２３５】
１１５．細胞から生成物を回復するステップを含む前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２３６】
１１６．ｉ）培地で成長する細胞を選択するステップと、
ｉｉ）培養条件の第２のセット下で、例えば第２の培地で細胞を培養する、例えば選択した細胞を第２の選択に供するステップと、
ｉｉｉ）細胞又は第２の培地から生成物を回復するステップと
を含む前記実施形態のいずれか１つに記載の方法。
【０２３７】
１１７．対象核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法であって、
ａ）（ｉ）対象核酸配列と、
（ｉｉ）発現した場合、アミノ酸の合成経路、例えばプロリン合成経路の酵素の高レベルの活性をもたらす核酸配列、例えば活性を含む酵素分子をコードする核酸配列と
を含む核酸、例えばベクター、例えば複製可能ベクターを含む細胞を用意するステップと、
ｂ）核酸配列を含む細胞を、核酸配列を含む細胞の成長を可能にするために十分な条件下で、高活性を有しない対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルのアミノ酸、例えばプロリンを有する第１の培地（及び酵素の阻害剤を任意選択で含む第１の培地）の存在下で培養するステップと、
ｃ）核酸配列を含む細胞を、核酸配列を含む細胞の成長を可能にするために十分な条件下で、高活性を有しない対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルの第２のアミノ酸、例えばチロシンを含む第２の培地（及び第２の酵素の阻害剤を任意選択で含む第２の培地）の存在下で培養するステップと
を含み、それによって、異種の核酸配列を含む細胞を特定、選択又は培養する方法。
【０２３８】
１１８．ステップｂが、ステップｃの開始前に開始される、実施形態１１７に記載の方法。
【０２３９】
１１９．ステップｂが、ステップｃの前に行われる、実施形態１１７又は１１８に記載の方法。
【０２４０】
１２０．ステップｂ及びステップｃが、同時に行われる、実施形態１１７又は１１８に記載の方法。
【０２４１】
１２１．ステップｂ及びステップｃが、同じ培地で行われる、実施形態１１７〜１２０のいずれか１つに記載の方法。
【０２４２】
１２２．ステップｂ及びステップｃが、同じ容器内で行われる、実施形態１１７〜１２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２４３】
１２３．ステップｂの選択及びステップｃの選択が、同じ培地で行われ、培地が、
（ａ）高活性を有しない対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルのアミノ酸、例えばプロリンを有し、
（ｂ）第２の酵素の高活性を有しない対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルの第２のアミノ酸、例えばチロシンを有する、
実施形態１１７〜１２２のいずれか１つに記載の方法。
【０２４４】
１２４．細胞が、
（ｉｉｉ）発現した場合、アミノ酸の合成経路の第２の酵素の高レベルの活性をもたらす核酸配列、例えば活性を含む酵素分子をコードする核酸配列
をさらに含む、実施形態１１７〜１２３のいずれか１つに記載の方法。
【０２４５】
１２５．細胞が、酵素の活性の阻害剤を有する培地で培養される、実施形態１１７〜１２４のいずれか１つに記載の方法。
【０２４６】
１２６．細胞が、第２の酵素の活性の阻害剤を有する培地で培養される、実施形態１１７〜１２５のいずれか１つに記載の方法。
【０２４７】
１２７．第２の酵素が、（ｉｉ）の酵素と同じ経路、例えばプロリン合成経路に存在する、実施形態１１７〜１２６のいずれか１つに記載の方法。
【０２４８】
１２８．第２の酵素が、同じアミノ酸の合成経路に存在する、例えば活性を含む酵素分子をコードする核酸配列であり、
ｂ）の培地が、
ｉｖ）第２の酵素の活性の阻害剤
をさらに含む、
実施形態１２７に記載の方法。
【０２４９】
１２９．第２の酵素が、（ｉｉ）の酵素とは異なる経路に存在する、例えば、酵素が、プロリン合成経路に存在し、第２の酵素が、プロリン以外の経路、例えばチロシン又はトリプトファン経路に存在する、実施形態１１７〜１２８のいずれか１つに記載の方法。
【０２５０】
１３０．第２の酵素が、第２のアミノ酸の合成経路に存在し、例えば活性を含む酵素分子をコードする核酸配列であり、
ｂ）の培地が、
ｉｉｉ）高活性を有しない対象細胞と同じである細胞の成長を支持するためには不十分なレベルの第２のアミノ酸、例えばプロリン以外のアミノ酸と、
ｉｖ）第２の酵素の活性の阻害剤と
をさらに含む、
実施形態１２９に記載の方法。
【０２５１】
１３１．ＳＶ４０プロモーター配列、ｍＣＭＶプロモーター配列又はＰＧＫプロモーター配列のうちのいずれかからの制御領域を含む配列、例えばプロモーター配列に作動可能に連結された異種の脂質代謝変更因子（ＬＭＭ）をコードする配列を含む細胞。
【０２５２】
１３２．ＬＭＭが、表２に列挙される経路を変更する、実施形態１３１に記載の細胞。
【０２５３】
１３３．ＬＭＭが、ステロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）を含む、実施形態１３１又は１３２に記載の細胞。
【０２５４】
１３４．ＬＭＭが、ステロール調節エレメント結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）を含む、実施形態１３１又は１３２に記載の細胞。
【０２５５】
１３５．ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１の切断型アイソフォーム（例えば調節ドメインを欠くＳＲＥＢＦ１の切断型アイソフォーム、例えばＳＲＥＢ４１１）を含む、実施形態１３１又は１３２に記載の細胞。
【０２５６】
１３６．異種の脂質代謝変更因子（ＬＭＭ）をコードする配列が、ベクターに配置されている、前記実施形態のいずれか１つに記載の細胞。
【０２５７】
１３７．ベクターが、選択可能マーカー、例えば、存在する場合、規定の培地での生存又は成長を可能にするマーカーをコードする配列をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の細胞。
【０２５８】
１３８．ベクターが、存在する場合、栄養素、例えばアミノ酸を欠く培地での生存又は成長を可能する選択可能マーカーをコードする配列をさらに含む、前記実施形態のいずれか１つに記載の細胞。
【０２５９】
１３９．栄養素が、アミノ酸、例えば表１に列挙されるアミノ酸から選択されるアミノ酸である、実施形態１３８に記載の細胞。
【０２６０】
１４０．栄養素が、プロリンを含む、実施形態１３９に記載の細胞。
【０２６１】
１４１．マーカーが、ピロリン−５−カルボン酸シンターゼ（Ｐ５ＣＳ）分子を含む、実施形態１３７〜１４０のいずれか１つに記載の方法。
【０２６２】
１４２．栄養素が、チロシンを含む、実施形態１３８〜１４１のいずれか１つに記載の細胞。
【０２６３】
１４３．栄養素が、トリプトファンを含む、実施形態１３８〜１４２のいずれか１つに記載の細胞。
【０２６４】
１４４．マーカーが、表１から選択される、実施形態１３１〜１４３のいずれか１つに記載の細胞。
【０２６５】
１４５．マーカーが、グルタミンシンテターゼを含む、実施形態１３７〜１４４のいずれか１つに記載の細胞。
【０２６６】
１４６．ＬＭＭをコードする配列が、ＳＶ４０プロモーター配列をコードする配列に作動可能に連結されている、実施形態１３１〜１４５のいずれか１つに記載の細胞。
【０２６７】
１４７．ＬＭＭをコードする配列が、ｍＣＭＶプロモーター配列をコードする配列に作動可能に連結されている、実施形態１３１〜１４５のいずれか１つに記載の細胞。
【０２６８】
１４８．ＬＭＭをコードする配列が、ＰＧＫプロモーター配列をコードする配列に作動可能に連結されている、実施形態１３１〜１４５のいずれか１つに記載の細胞。
【０２６９】
１４９．ＬＭＭが、ＳＣＤ１である、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２７０】
１５０．ＬＭＭが、マウスＳＣＤ１である、実施形態１４９に記載の細胞。
【０２７１】
１５１．ＬＭＭが、ＣＨＯ  ＳＣＤ１である、実施形態１４９に記載の細胞。
【０２７２】
１５２．ＬＭＭが、ＳＲＥＢＦ１である、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２７３】
１５３．ＬＭＭが、ＣＨＯ  ＳＲＥＢＦ１である、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２７４】
１５４．ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１である、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２７５】
１５５．ＬＭＭが、ＣＨＯ  ＳＲＥＢ４１１である、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２７６】
１５６．ＬＭＭが、ステロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）を含み、プロモーターが、ＳＶ４０プロモーター配列を含む、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２７７】
１５７．ＬＭＭが、ステロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）を含み、プロモーターが、ｍＣＭＶプロモーター配列を含む、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２７８】
１５８．ＬＭＭが、ステロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）を含み、プロモーターが、ＰＧＫプロモーター配列を含む、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２７９】
１５９．ＬＭＭが、ステロール調節エレメント結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）を含み、プロモーターが、ＳＶ４０プロモーター配列を含む、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２８０】
１６０．ＬＭＭが、ステロール調節エレメント結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）を含み、プロモーターが、ｍＣＭＶプロモーター配列を含む、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２８１】
１６１．ＬＭＭが、ステロール調節エレメント結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）を含み、プロモーターが、ＰＧＫプロモーター配列を含む、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２８２】
１６２．ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１を含み、プロモーターが、ＳＶ４０プロモーター配列を含む、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２８３】
１６３．ＬＭＭが、ＳＲＥＢ４１１を含み、プロモーターが、ｍＣＭＶプロモーター配列を含む、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２８４】
１６４．ＬＭＭが、ステロールＳＲＥＢ４１１を含み、プロモーターが、ＰＧＫプロモーター配列を含む、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２８５】
１６５．培地が、表１又は４に列挙される阻害剤を含む、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２８６】
１６６．培地が、Ｐ５ＣＳ阻害剤を含む、実施形態１３１〜１４８のいずれか１つに記載の細胞。
【０２８７】
１６７．Ｐ５ＣＳ阻害剤が、Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸である、実施形態１６６に記載の細胞。
【０２８８】
１６８．Ｐ５ＣＳ阻害剤が、３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンである、実施形態１６６に記載の細胞。
【０２８９】
１６９．Ｐ５ＣＳ阻害剤が、Ｌ−４−チアゾリジンカルボン酸である、実施形態１６６に記載の細胞。
【実施例】
【０２９０】
実施例１：ピロリン−５−カルボン酸シンターゼ発現及びプロリン代謝哺乳動物選択系における使用のための阻害剤の調査
ピロリン−５−カルボン酸シンターゼ（Ｐ５ＣＳ）は、グルタミン酸塩からのプロリン合成の原因である律速酵素である。この経路を単純化した図を、図１に示す。プロリン代謝は、細胞生存にとって必須であるので、プロリン非含有培地で培養した細胞は、生存することができないはずである。或いは、豊富なＰ５ＣＳ発現及びしたがって、グルタミン酸塩からプロリンを効率的に生成する能力を有する細胞は、これらの条件下での細胞生存を可能にし、したがって所望の細胞の適切な選択を促進するはずである。
【０２９１】
この仮説を評価するために、Ｐ５ＣＳ遺伝子を保有するベクターを最初に合成し、この目的の遺伝子及びｅＧＦＰレポーター遺伝子を包含する構築物を生成するためにクローニングした（図２）。トランスフェクションに際して、このベクターは、ＣＨＯ細胞で内因的に観察される発現レベルを超えるＰ５ＣＳ発現レベルを誘導し、高率のプロリン合成を可能にし、したがって通常は培地に存在する外的プロリンの非存在下での細胞生存を促進するはずである。理論では、構築物のトランスフェクションのために豊富なＰ５ＣＳを発現するそれらの細胞は、ｅＧＦＰ遺伝子も発現するはずである。
【０２９２】
Ｐ５ＣＳの過剰発現は、プロリンの非存在下で細胞を選択するために十分であり得るが、この酵素の阻害剤は、この系の厳密性を改善し得る。プロリンは、ＣＨＯ細胞における内因性フィードバックループの部分であるので、プロリンそれ自体が、Ｐ５ＣＳの有効な阻害剤である。この系における使用に特定された阻害剤は、プロリンのアナログを含む。Ｐ５ＣＳのｉｎ  ｖｉｔｒｏ活性の有効な阻害剤として例示的な阻害剤を、本明細書に示す。
【０２９３】
プロリンの非存在下での細胞成長
一実験では、内因性グルタミンシンテターゼ発現をノックアウトするように操作した細胞（ＧＳＫＯ細胞）を、このことが成長に対して有する効果を決定するためにプロリンの非存在下で培養した。ＧＳＫＯ細胞を、１２５ｍｌのエルレンマイヤー（Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒ）フラスコ中に２０ｍｌの全培養体積で０．２ｘ１０６個の細胞／ｍｌにて播種した。細胞を、Ｌ−グルタミンを伴う（６ｍＭ  Ｇｌｕｔ）、若しくは伴わない（Ｇｌｕｔなし）ＣＤ−ＣＨＯを使用して、又はプロリンを伴わない（Ｐｒｏなし）が、６ｍＭ  Ｌ−グルタミンを伴うＣＭ７６培地で培養した。ＶｉＣｅｌｌ器具を使用して２４時間毎に生細胞カウント及び培養物生存率を測定した。
【０２９４】
ＧＳＫＯ細胞は、プロリンの非存在下で培養した場合、成長することができなかった（図３）。しかしながら、Ｌ−グルタミンの非存在下で培養した細胞は、経時的に培養物生存率の減少を示した。これらの細胞は、グルタミン生成の律速酵素であるグルタミンシンテターゼの内因的発現をノックアウトするように操作されていたので、このことは予測されていた。
【０２９５】
プロリンの非存在下で培養した細胞の復帰速度
プロリン非含有培地でインキュベートした培養物から生じる復帰変異細胞数を決定して、選択系における使用にプロリン代謝を利用する適合性を評価した。簡潔に説明すると、ＬｏｎｚａのＧＳＫＯ細胞を、６ｍＭ  Ｌ−グルタミンを伴うＣＤ−ＣＨＯ、Ｌ−グルタミンを伴わないＣＤ−ＣＨＯ、又は６ｍＭ  Ｌ−グルタミンを伴い、プロリンを伴わないＣＭ７６に、９６ウェルプレート中の１ウェル当たり１，０００又は５，０００個の細胞のいずれかで、培養体積が１ウェル当たり２００μｌに等しくなるように播種した。全部で３０枚のプレートの各培地に播種し、１５枚は１ウェル当たり１，０００個の細胞で培養し、１５枚は１ウェル当たり５，０００個の細胞で培養した。顕微鏡を使用して１１日後に観察して、復帰変異コロニーを特定した。
【０２９６】
６ｍＭ  Ｌ−グルタミンを伴うＣＤ  ＣＨＯに播種したウェルの１００％が、１１日後にコンフルエントであったが、Ｌ−グルタミン非含有培地で培養した場合、復帰変異コロニーは観察されなかった。プロリンの非存在下で培養した全部で８．６４×１０６個の細胞のうち、１５個の復帰変異コロニーが観察され、１３個は１ウェル当たり５，０００個の細胞で播種したプレートで観察され、２個のコロニーは１ウェル当たり１，０００個の細胞で播種したプレートで観察された。
【０２９７】
目的の遺伝子を発現する細胞を選択するためのＰ５ＣＳの過剰発現
培養培地からのプロリンの除外は、ＧＳＫＯ細胞の成長の欠損をもたらすことが上記で示された。内因性プロリン合成の律速酵素であるピロリン−５−カルボン酸シンターゼ（Ｐ５ＣＳ）の過剰発現は、外因性プロリンの非存在下での成長を回復させるために十分であり、それによって、有効な選択系を提供すると仮定した。この仮定を評価するために、細胞にＰ５ＣＳ遺伝子を保有するプラスミドをトランスフェクトして、その過剰発現を促進し、プロリンの非存在下で培養した。簡潔に説明すると、プラスミドを、グルタミンシンテターゼ（ＧＳ）又はＰ５ＣＳのいずれか、及びｅＧＦＰレポーター遺伝子を含むように構築した。任意の「選択」遺伝子又はレポーターを含有しない対照ベクターも含めた；対照ベクターは、この実験に含まれる他のプラスミドと同様の細胞負荷を誘導するためのエタネルセプト遺伝子のみのベクターを含む。使用したベクターの概略図を、図４に示す。構築したプラスミドをエレクトロポレーションにより一過的にＧＳＫＯ細胞にトランスフェクトし、様々な培地；ＣＤ−ＣＨＯ、チロシンを伴わないＣＭ７６培地、又はプロリンを伴わないＣＭ７６培地（これらの全てを最終濃度６ｍＭのＬ−グルタミンを含むように補充した）で培養した。３７℃で１４０ｒｐｍにて振盪する１２５ｍｌエルレンマイヤーフラスコ中の全培養体積は２０ｍｌであり（元々、０．２ｘ１０６個の細胞／ｍｌで播種した）、トランスフェクション後７２及び１６８時間で、フローサイトメトリーによるカウント及び分析のために試料を採取した。
【０２９８】
図５は、図４で概略されるベクターを一過的にトランスフェクトし、次に特定の培地で培養したＧＳＫＯ細胞のトランスフェクション後に得られたデータを示す。チロシン非含有又はプロリン非含有培地のいずれかで培養した細胞は、どのプラスミドを導入したかにかかわらず、ＣＤ−ＣＨＯで培養した細胞と比較してトランスフェクション後７２時間で成長速度の低減を示す（図５Ａ）。この観察は、上記に概略されるパターンと一致する。しかしながら、Ｐ５ＣＳ含有ベクターによるトランスフェクション後１６８時間でプロリン非含有培地において、他の任意のベクターが使用された場合と比較して、生細胞濃度の増大が観察された。さらに、このベクターの導入は、チロシン非含有培地で達成される生細胞数の増大はもたらさず、Ｐ５ＣＳは、特に外因性プロリンの非存在を補うことができることを示唆した。
【０２９９】
生細胞濃度における観察可能な差にもかかわらず、培養物生存率は、概して様々な培地での培養に際して有意に影響を受けなかった（図５Ｂ）。Ｐ５ＣＳ含有構築物によるトランスフェクション、及びその後の次の７２時間の培養は、同じ培地で培養した別のトランスフェクションで得られた値よりも低かったことは、注目に値する。これは、使用可能なチロシンの欠損に加えてプロリン合成の増大のためにこれらの細胞に対して課された追加の細胞負荷のためであった可能性がある。この傾向は、１６８時間の時点では観察されなかった。ＣＤ−ＣＨＯで培養した細胞の生存率は概して、１６８時間の時点でより低かったが、これは、これらの細胞の典型的な成長プロファイルのためであるようであり、これらの細胞は、典型的な成長傾向に従わなかった他の培地で培養した細胞とは対照的に、この時点で減退相にあると予想される。
【０３００】
フローサイトメトリーを使用した分析は、Ｐ５ＣＳ含有プラスミドによるトランスフェクションと次のプロリン非含有培地での培養との組合せは、両方の時点にわたり測定された条件の中で最も高い蛍光平均値をもたらすことを示した（図５Ｃ）。一般に、プロリンの非存在下で培養した細胞は、外因性チロシンを伴わずに培養した細胞よりも高い蛍光平均値を示し、一過性プラスミドにおけるＰ５ＣＳの包含及び次のチロシン非含有培地での培養は、代わりにＧＳが包含された場合よりも高い蛍光平均値を示し、このことは、Ｐ５ＣＳの過剰発現は、ｅＧＦＰ発現の増大に対して広範な影響を有し得ることを示唆する。しかしながら、Ｐ５ＣＳ過剰発現の組合せは、次にプロリン非含有培地で培養した細胞に対してより大きな効果を有することが明らかであり、このことは、蛍光平均値の大きな増大により確認され、所定の蛍光強度閾値を超える細胞の百分率において観察された大きく増大した値により補強される（図５Ｄ）。
【０３０１】
これらのデータをまとめると、ＧＳＫＯ細胞をプロリンの非存在下で培養した場合に観察される抑止された細胞成長は、Ｐ５ＣＳ遺伝子の過剰発現を通して回復することができるという仮説を支持する。さらに、これは、全体的な発現及び一過性集団内のレポーター遺伝子を発現する細胞の百分率の両方の点で、レポーター遺伝子の発現に対して有意な効果を有し得る。
目的の遺伝子を発現する安定な細胞プールの生成
プロリン／Ｐ５ＣＳ系の組換え細胞プールを生成する能力をアセスメントするために、組換え細胞プールを生成する試みで、Ｐ５ＣＳ遺伝子及び目的の遺伝子を含むベクターを細胞にトランスフェクトし、次にプロリンの非存在下で培養した。簡潔に説明すると、最初にＰｖｕＩ制限酵素（ＮＥＢ）を使用して直鎖化し、酢酸ナトリウム及びエタノール沈殿を使用して精製した２０μｇのプラスミドを、１ｘ１０７個のＬｏｎｚａのＧＳＫＯ細胞にエレクトロポレーションした。使用した構築物は、選択マーカーとしての評価のためのＰ５ＣＳ遺伝子、及びレポーター遺伝子としてのｅＧＦＰの両方を含有した。プロリンの非存在下であるが、６ｍＭの最終濃度を達成するようにＬ−グルタミンを補充したＣＭ７６培地で、トランスフェクションを行った。その後、細胞をＴ７５フラスコ中で２５ｍｌのこの培地にて１０日間培養し、その後、ここでもまたプロリン非含有培地での１０ｍｌ懸濁培養に移した。得られたプールを、フローサイトメトリーを使用して分析した。細胞試料を最初に１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、５００μｌのＰＢＳに再懸濁した。その後、試料をファクスカリバー（ＦＡＣＳｃａｌｉｂｕｒ）（商標）（ＢＤ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）のプローブ上にロードし、細胞カウントと関連して蛍光強度を測定した。Ｅ−１増幅器を使用して前方散乱（ＦＳＣ：ｆｏｒｗａｒｄ  ｓｃａｔｔｅｒ）を測定し、側方散乱（ＳＳＣ：ｓｉｄｅ  ｓｃａｔｔｅｒ）を４６５に、一方でＦＬ１記録細胞を４７３に設定し；全ての設定はログスケールに変換した。懸濁細胞の付着性を促進するために、カバーガラスを最初にポリ−Ｌ−リジンに浸し、室温で１５分間インキュベートした。その後、カバーガラスを除去し、滅菌環境下で乾燥させ、その後、２４ウェルプレートに移した。細胞を３７℃で一晩培養して、細胞のカバーガラスへの付着を促進し、その後、培地を吸引し、２５０μｌのＰＢＳ中の４％パラホルムアルデヒドを添加し、３７℃で２０分間インキュベートして細胞を固定した。次に、１ｍｌのＰＢＳ洗浄を２回行い、その後、２５０μｌのＰＢＳ中の０．１％トライトンＸ１００を添加し、室温で５分間インキュベートして、細胞を透過処理した。固定し、透過処理した細胞を、１ウェル当たり２５０μｌのＰＢＳ中の３％ＢＳＡを添加することによって封鎖し、室温で３０分間インキュベートした。これを吸引し、カバーガラスをウェルから外し、以前に調製した１００μｌのＰＢＳの液滴上に表を下にして置き、これをさらに３回繰り返した。カバーガラスを、縁をティッシュペーパーに接触させることによって乾燥させ、２５μｌの適切な一次抗体の液滴に移した。これを、４℃で一晩インキュベートした。適切な二次抗体をＰＢＳ中の３％ＢＳＡ中に適宜に希釈した。カバーガラスを、１００μｌのＰＢＳ中の０．１％ツイーン（Ｔｗｅｅｎ）液滴上に表を下にして置き、５分間置いた。その後、これらを新しい液滴に４回移し、最後の２回の移行間は１０分間置いた。その後、それらを、２５μｌの二次抗体液滴上に置き、２時間そのままにし、４℃の暗室に置いた。５つの逐次的な１００μｌの液滴を使用して５回の最終洗浄を行った。ＤＡＰＩ染色が必要な場合、カバーガラスを各々、���２のＰＢＳ液滴と第３のＰＢＳ液滴との間で５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌのＤＡＰＩ液滴に移した。最後に、細胞をＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ褐色防止台紙（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して細胞スライドに乗せ、一晩置いて定着させた。Ｚｅｉｓｓ共焦点顕微鏡を使用して画像を収集した。宿主細胞が１０１蛍光強度値を超えないようにフローサイトメーター器具を較正し、したがって、この所定の閾値を超える細胞は、ｅＧＦＰを発現していると考えられる。
【０３０２】
図６Ａは、Ｐ５ＣＳベース選択系を使用して生成したプールからフローサイトメトリーを使用して得られたヒストグラムを示す。多くの細胞は、１０１閾値を超える蛍光強度を有するので、Ｐ５ＣＳ選択系は、目的の遺伝子を発現する細胞を選択することができることが明らかである。しかしながら、１０１未満の蛍光強度値を有する細胞集団が存在しており、このことは、プール中に非発現細胞がまだ存在していることを示唆する。系の厳密性を増大させることが重要であり得る。図６Ｂは、蛍光顕微鏡を使用して得た、合成したプールの画像を示す。様々なｅＧＦＰ発現レベルを有する細胞集団が存在しており、存在している全ての細胞が必ずしもｅＧＦＰレポーター遺伝子を発現しているわけではないので、この画像は、図６Ａで示されるデータを支持する。
【０３０３】
図６Ｂ及び６Ｃの両方は、Ｐ５ＣＳ遺伝子の発現パターンを示す。これらの画像は、以前に文献で報告されたミトコンドリアにおけるＰ５ＣＳの局在化と一致する点状スポットを示す。さらに、図６Ｃは、Ｐ５ＣＳ／ｅＧＦＰプールのＧＳＫＯ宿主との比較を示す。画像は、選択したプールが、宿主よりも高いＰ５ＣＳ発現レベルを有することを示すが、この観察は、ｅＧＦＰレポーター遺伝子を発現する細胞について排他的ではない。宿主細胞の一部分は、プロリンの非存在下で復帰変異することができることが示されたので、トランスフェクトされたベクターを含有しない細胞が、Ｐ５ＣＳの過剰発現を必要とすることなく概略される選択プロセスを生き残ることができた可能性がある。また、おそらく、プロリンの非存在は、十分なＰ５ＣＳを内因的に発現する細胞を選択する。
【０３０４】
Ｐ５ＣＳ系を使用して構築した細胞プールを、細胞プールから採取した可溶化試料のウェスタンブロット分析によって調べた。これらのプールを生成するために使用したベクターは全て、Ｐ５ＣＳ、及び標識される通りｅＧＦＰ又はＳＣＤ１（ＳＶ４０又はｍＣＭＶプロモーターのいずれかによって駆動される）のいずれかのうちの１つの遺伝子を含有し、対照試料は、Ｐ５ＣＳのみを含有するベクターを使用して構築した。ＧＳＫＯ細胞に、エレクトロポレーションにより上記に挙げた直鎖化ベクターをトランスフェクトし、次にプロリンの非存在下で２週間培養し、その後、懸濁培養に移した。図７で示される通り、得られた細胞プールからの可溶化液のウェスタンブロットは、ｅＧＦＰ及び空対照と比較して、ＳＣＤ１が関連細胞プール（ＳＶ４０  ＳＣＤ１及びｍＣＭＶ  ＳＣＤ１）で過剰発現していることを示し、Ｐ５ＣＳ系が細胞株構築プロセスに好適であることを示した。加えて、Ｐ５ＣＳ遺伝子を欠く対照ベクターもトランスフェクトしたが、得られた細胞は、プロリンの非存在下で成長せず、Ｐ５ＣＳの過剰発現は、細胞の生存にきわめて重要であることを示した。
【０３０５】
Ｐ５ＣＳ阻害剤の存在下で成長させた細胞プール
深型９６ウェルプレートで成長させた細胞プール
Ｐ５ＣＳ／ｅＧＦＰベクターを使用して構築した（上記に概略される通り）細胞プールから、プロリンを欠くが、様々な濃度のＰ５ＣＳ阻害剤Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を補充した培地で培養した場合のデータを得た。細胞を深型９６ウェルプレートで培養し、０．２ｘ１０６個の細胞／ｍｌで懸濁液に播種した。生細胞数（図８Ａ）、培養物生存率（図８Ｂ）、蛍光平均値（図８Ｃ）、１０２の所定の蛍光閾値を超えて発現する細胞（図８Ｄ）及び１０３の所定の蛍光閾値を超えて発現する細胞（図８Ｅ）を全て、２４、９６、１６８及び２１６培養時間で決定した。阻害剤濃度の増大は、より遅い細胞成長をもたらしたが、より高い蛍光平均値も観察され、阻害剤の添加は、既存のポリクローナル集団からのｅＧＦＰ発現を富化することができることを示した。図８Ｆは、同じ時点で採取した可溶化試料からのウェスタンブロット分析を示す。Ｐ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰを強調するためにブロットをプローブした。
【０３０６】
Ｐ５ＣＳ／ｅＧＦＰベクターを使用して構築した（上記に概略される通り）細胞プールから、プロリンを欠くが、様々な濃度のＰ５ＣＳ阻害剤３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを補充した培地で培養した場合のデータを得た。細胞を深型９６ウェルプレートで培養し、０．２ｘ１０６個の細胞／ｍｌで懸濁液に播種した。生細胞数（図９Ａ）、培養物生存率（図９Ｂ）、蛍光平均値（図９Ｃ）、１０２の所定の蛍光閾値を超えて発現する細胞（図９Ｄ）及び１０３の所定の蛍光閾値を超えて発現する細胞（図９Ｅ）を全て、２４、９６、１６８及び２１６培養時間で決定した。阻害剤濃度の増大は、より遅い細胞成長をもたらしたが、より高い蛍光平均値も観察され、阻害剤の添加は、既存のポリクローナル集団からのｅＧＦＰ発現を富化することができることを示した。図９Ｆは、同じ時点で採取した可溶化試料からのウェスタンブロット分析を示す。Ｐ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰを強調するためにブロットをプローブした。
【０３０７】
Ｐ５ＣＳ／ｅＧＦＰベクターを使用して構築した（上記に概略される通り）細胞プールから、プロリンを欠くが、様々な濃度のＰ５ＣＳ阻害剤Ｌ−４−チアゾリジンカルボン酸を補充した培地で培養した場合のデータを得た。細胞を深型９６ウェルプレートで培養し、０．２ｘ１０６個の細胞／ｍｌで懸濁液に播種した。生細胞数（図１０Ａ）、培養物生存率（図１０Ｂ）、蛍光平均値（図１０Ｃ）、１０２の所定の蛍光閾値を超えて発現する細胞（図１０Ｄ）及び１０３の所定の蛍光閾値を超えて発現する細胞（図１０Ｅ）を全て、２４、９６、１６８及び２１６培養時間で決定した。阻害剤濃度の増大は、より遅い細胞成長をもたらしたが、より高い蛍光平均値も観察され、阻害剤の添加は、既存のポリクローナル集団からのｅＧＦＰ発現を富化することができることを示した。図１０Ｆは、同じ時点で採取した可溶化試料からのウェスタンブロット分析を示す。Ｐ５ＣＳ、β−アクチン及びｅＧＦＰを強調するためにブロットをプローブした。
【０３０８】
２４ウェルプレートで成長させた細胞プール
Ｐ５ＣＳ／ｅＧＦＰベクターを使用して構築した（上記に概略される通り）細胞プールから、プロリンを欠くが、様々な濃度のＰ５ＣＳ阻害剤Ｌ−アゼチジン−２−カルボン酸を補充した培地で培養した場合のデータを得た。細胞を固定２４ウェルプレートで培養し、最初に０．２ｘ１０６個の細胞／ｍｌで播種した。生細胞数（図１１Ａ）、培養物生存率（図１１Ｂ）、蛍光平均値（図１１Ｃ）、１０２の所定の蛍光閾値を超えて発現する細胞（図１１Ｄ）及び１０３の所定の蛍光閾値を超えて発現する細胞（図１１Ｅ）を全て、２４、９６、１６８及び２１６培養時間で決定した。阻害剤濃度の増大は、より遅い細胞成長をもたらしたが、より高い蛍光平均値も観察され、阻害剤の添加は、既存のポリクローナル集団からのｅＧＦＰ発現を富化することができることを示した。
【０３０９】
Ｐ５ＣＳ／ｅＧＦＰベクターを使用して構築した（上記に概略される通り）細胞プールから、プロリンを欠くが、様々な濃度のＰ５ＣＳ阻害剤３，４−デヒドロ−Ｌ−プロリンを補充した培地で培養した場合のデータを得た。細胞を固定２４ウェルプレートで培養し、最初に０．２ｘ１０６個の細胞／ｍｌで播種した。生細胞数（図１２Ａ）、培養物生存率（図１２Ｂ）、蛍光平均値（図１２Ｃ）、１０２の所定の蛍光閾値を超えて発現する細胞（図１２Ｄ）及び１０３の所定の蛍光閾値を超えて発現する細胞（図１２Ｅ）を全て、２４、９６、１６８及び２１６培養時間で決定した。阻害剤濃度の増大は、より遅い細胞成長をもたらしたが、より高い蛍光平均値も観察され、阻害剤の添加は、既存のポリクローナル集団からのｅＧＦＰ発現を富化することができることを示した。
【０３１０】
実施例２：宿主細胞抗体産生を改善するための脂質代謝変更因子
脂質代謝変更因子（ＬＭＭ）ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）、ステロール調節エレメント結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）、及び核に遊走するＳＲＥＢＦ１の部分を含み、ＳＲＥＢＦ１の調節ドメインを欠く切断型ＳＲＥＢＦ１アイソフォームであるＳＲＥＢ４１１の操作は、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ宿主産生、及び複合体タンパク質及び標準ｍＡｂの生成物品質を改善することが示されている。
【０３１１】
これらのＬＭＭの発現が産業現行ｃＧＭＰ様式でＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ宿主において改変された場合、それは、生成物タイター及び品質の有意な改善をもたらし得ると仮定された。目的は、所望のＬＭＭ遺伝子を既存の細胞株に挿入すること、又は市販のＧＳ選択系はインタクトのままでＬＭＭ遺伝子のうちの１つを発現する新しい宿主細胞株を創出することができることである。
【０３１２】
この目的を達成し、仮説を検定するために、発現レベル、及びＬＭＭ遺伝子のうちのどれが最も適用可能であり得るかを決定しなければならなかった。この目標を達成するために、いくつかのベクター：組換えタンパク質及びＧＳ選択マーカーを発現する４つのベクター（Ａ〜Ｄ）、及び特定のプロモーター＋ＬＭＭ遺伝子の組合せを発現する１０個のベクター（１〜１０）を産生した（表９）。
【０３１３】
【表９】
2021511781.tif 000044
【０３１４】
その後、これらのベクターの全ての組合せは、１つの組換え分子ベクター及び１つのプロモーター＋ＬＭＭ遺伝子ベクターをコトランスフェクトすることによって、スクリーニングされ得る。トランスフェクションは、４Ｄ−ヌクレオフェクター（Ｎｕｌｃｏｆｅｃｔｏｒ）（Ｌｏｎｚａ）及び後続の標準プロトコールを使用して行った；これは、１条件（コトランスフェクション）当たり９６個の反復培養物を産生し得る。その後、これらのトランスフェクト細胞の反復プールを、培養中の細胞成長及び流加回分条件における組換えタンパク質産生についてアセスメントし得る。その後、これらのデータを分析して、どのプロモーター＋ＬＭＭの組合せがさらなる分析及び／又は細胞株構築のための好適な候補になり得るかを決定し得る。
ＧＳＫＯ細胞の成長及びトランスフェクション
ＧＳ−ＫＯ  ＣＨＯ細胞を、ＣＤ−ＣＨＯ＋６ｍＭ  Ｌ−グルタミンで培養した。４日毎に、培養物を継代し；０．６ｍｌの各親培養物をＶｉｃｅｌｌ−ＸＲ機を使用してカウントし、１つの培養物当たり５０枚の画像を記録した。娘培養物は０．２ｘ１０６個の生細胞／ｍｌで播種し；その後、培養物に５％ＣＯ２を注入し、３６．５℃、１４０ｒｐｍでインキュベートした。
【０３１５】
継代２又は３日目に、ＧＳ−ＫＯ細胞をＶｉｃｅｌｌ−ＸＲを使用してカウントし；その後、２ｘ１０７個の生細胞／ｍｌに等しい体積を採取し、１００ｇで１０分間スピンに供した。遠心分離後、ピペッティングにより上清を捨て、ペレットを２００μｌのＳＦ溶液（４Ｄ−ヌクレオフェクターキットで提供される）に再懸濁した。その後、トランスフェクションからの所望のベクターを、１ベクター（ＬＭＭベクター及び組換えタンパク質）当たり６μｇを与える体積で２００μｌの細胞／ＳＦ懸濁液に添加した。その後、ＤＮＡ／細胞／ＳＦ懸濁液を等しく半分に分け、キュベット内に任意の泡沫の形成を引き起こさないように注意して４Ｄヌクレオフェクターキュベットにピペットで入れた。キュベットに添加された体積は、ＤＮＡベクターの添加後の全体積に依存した（通常、１０３〜１０８μｌの間）。
【０３１６】
その後、キュベットを４Ｄ−ヌクレオフェクターに入れ、パルスコードＤＵ１５８を使用してパルスに供した。両方のパルスが失敗した場合（ディスプレイ上に赤色の「−」により示される）、新しい２×１０７個の細胞の体積を採取し、方法を再開始した。パルスが通過した場合（ディスプレイ上に緑色の「＋」により示される）、事前に温めた（３７℃）４０ｍｌのトランスフェクション培地（４０ｍｌ  ＣＤ−ＣＨＯ、０．４ｍｌ  ＳＰ４、０．０４ｍｌ濃縮（ｘ１０００）フェノールレッド）の約５００μｌをキュベットにピペットで入れ、その後、培養物の全体積を４０ｍｌのトランスフェクション培地に移し；その後、パスツールピペットを使用して、トランスフェクション培地を使用してキュベットから任意の残留の細胞を「フラッシュ」した。その後、トランスフェクタント細胞培養物を２つの９６ウェルプレートに移し（１ウェル当たり１００μｌの培養物）、３６．５℃、１０％ＣＯ２で一晩インキュベートした。
【０３１７】
トランスフェクション後１日目に、１ウェル当たり１００μｌのトランスフェクション培地＋１００μＭ  ＭＳＸを、トランスフェクトした培養物の各プレートに添加した。その後、プレート／培養物を３６．５℃、１０％ＣＯ２で６日間インキュベートした。トランスフェクション後７日目に、１ウェル／培養物当たり１５０μｌをトランスフェクトした培養物の各プレートから慎重に除去し、新鮮なトランスフェクション培地＋５０μＭ  ＭＳＸを各ウェル／培養物に添加した。その後、培養物をトランスフェクション後の回復についてモニターした。
【０３１８】
トランスフェクション後約１０日から、トランスフェクション後の細胞回復を観察した。これは、目視検査によって各ウェルのコンフルエンスをアセスメントするために、トランスフェクション培地の色を観察すること、及びクローニングミラーを使用することによって行った。細胞が成長したウェルの底は、不透明に見える場合があり、トランスフェクション培地中のフェノールレッドは、乳酸の産生に際して黄色に変わる場合があり、これを、細胞成長の指標として使用した。培養物の７５％よりも多くが、７５〜８０％を超えるコンフルエントと考えられると、プレート中の培養物は回復したと考えられ、深型ウェルプレートに移した。
【０３１９】
図１３で示される通り、組換えタンパク質間の回復速度は、セルグツズマブを除いては、同様であるように見えた。これは、セルグツズマブの構造の性質のためであった可能性があり；セルグツズマブは、抗体構造のＦｃ領域に結合したＩＬ−２（インターロイキン−２）分子を有する。このＩＬ−２は、トランスフェクト細胞の成長速度を阻害している可能性がある（おそらく、セルグツズマブ分子が細胞から分泌された後の細胞に対するその分子作用によって）。また、それはｍＡｂ−ＩＬ−２の構築が細胞リソースを制限し、このことが回復速度を遅延させるためであることもあり得る。
【０３２０】
深型ウェルプレートでのトランスフェクト細胞プールの成長
培養物が回復すると、各ウェルをピペッティングにより混合して、底に沈んだ細胞を懸濁した。細胞を培養物中で懸濁すると、１５０μｌを、ＤＷＰ中の１５０μｌの新鮮な培地（ＣＤ  ＣＨＯ、１％  ＳＰ４、５０μＭ  ＭＳＸ）に移した。その後、細胞培養物を有する深型ウェルプレートを３６．５℃、５％ＣＯ２、２００ｒｐｍ及び９０％湿度でインキュベートした。
【０３２１】
培養物の成長速度に依存して、４、５又は６日目のいずれかに最初のＤＷＰ継代を行った。細胞をＣｅｌｉｇｏによりカウントし；その後、細胞を、０．５ｘ１０６個の生細胞／ｍｌの濃度で３００μｌのＣＭ６６＋５０μＭ  ＭＳＸに播種した。その後、娘ＤＷＰを３６．５℃、５％ＣＯ２、２００ｒｐｍ及び９０％湿度でインキュベートした。その後、４日スケジュールで次の継代を行った。Ｃｅｌｉｇｏ系を使用して、個々の培養物／ウェルをカウントし；その後、カウントを条件にわたり平均化して、図１４の結果を生成した。第１の継代で、培地をトランスフェクション培地から成長培地に変え、継代３代目で、成長培地を産生培地に変えて、簡易的流加回分過剰成長（ａＦＯＧ）を開始させた。
【０３２２】
図１４Ａ〜１４Ｄは、深型ウェルプレート培養物中の全ての回復したトランスフェクト細胞の平均生細胞濃度（ＶＣＣ）を示す。エタネルセプト＋ｍＣＭＶ  ＳＲＥＢ４１１及びエタネルセプト＋ｍＣＭＶ  ＳＲＥＢＦ１（図１４Ａ）は、他の条件よりも遅い速度で回復した。他の条件を継代する実務的な理由のために、１回の余分の時間により、全ての条件が同じ時間にａＦＯＧに入ることを可能にすることを決定した。これが、エタネルセプト＋ＬＭＭ条件について記録された余分の継代の理由であった。
【０３２３】
概して、条件にわたる培養物の平均ＶＣＣは、およそ第３継代で安定化／同等化するように見え、全ての条件で平均ＶＣＣは寄り集まった。
【０３２４】
トランスフェクタントプールの簡易的流加回分過剰成長
ＬＭＭ細胞プールの生産性をアセスメントするために、プールを流加回分過剰成長に供して、バイオリアクタースケールでの条件をシミュレートした。簡潔に説明すると、ＤＷＰ中での第３継代に際して、細胞を、Ｃｅｌｉｇｏを使用してカウントし、次に３００μｌのＣＭ７１に０．３ｘ１０６個の生細胞／ｍｌの濃度で播種した。細胞を３６．５℃、５％ＣＯ２、２００ｒｐｍ及び９０％湿度で１２日間インキュベートした。４日目及び８日目に、培養物に流加し、細胞濃度をＣｅｌｉｇｏによりカウントした。１２日目に、プレートを３００ｒｐｍで１０分間遠心分離し；２００μｌの上清を収集して滅菌９６ウェルプレートに入れた。残留の細胞ペレット上清を２００μｌのＰＢＳで洗浄し、５００ｒｐｍで１０分間遠心分離し；その後、ＰＢＳ洗浄の可能な限り多く（約２００μｌ）を除去し、細胞ペレットを−２０℃に移した。収集した上清を３０００ｒｐｍで遠心分離し、その後、１８０μｌを新しい９６ウェルプレートに移した。その後、収集した上清を４℃で一晩保存し、翌日Ｏｃｔｅｔ器具により分析した。
【０３２５】
細胞を、ルーチン継代よりも低い細胞密度（０．３ｘ１０６ＶＣＣ／ｍｌ：ａＦＯＧ；０．５ｘ１０６ＶＣＣ／ｍｌ：継代）で、継代成長培地に非常に類似する産生培地に播種し、それゆえ、培地の変化のための成長プロファイルの任意の変化は最小限であるはずである（図１５Ａ〜１５Ｄ）。流加及び回収と同日にＶＣＣの測定を取り；これは、産生中の条件の各々の成長プロファイルの大まかな概略を可能にした。この方法は、限定的な成長データを提供し、それゆえ、条件のうちの一部について成長ピークを逃している可能性がある。これらの欠損データは、ＩＶＣ（１ミリリットル当たりの１時間当たりの培養物中の生細胞濃度の時間積分）及びＱｐ（ｐｇ／細胞／時としての特異的生産性）の計算に影響を及ぼし；全ての培養物及び条件は同じ限定を有するので、データは同等であると考えられ得る。
【０３２６】
エタネルセプト及びインフリキシマブでの条件のうちのいくつかの成長プロファイルは、ＶＣＣが４〜８日目の間にピークに達することを示唆する。ＳＲＥＢＦ１の発現は、４日目の後培養物の成長を遅延させ得る。これは、ＳＶ４０／ＰＧＫ  ＳＲＥＢＦ１条件の成長によって示唆される。
【０３２７】
各時点での変動は多分、カウントされた培養物が各々、トランスフェクト細胞のプールであるという事実のためであり；それゆえ、両方のベクターのコピー数は変動し、これは細胞成長に影響を及ぼす。１つの条件当たり９６個の個々の培養物を使用し、平均を取ることによって、変動の軽減を達成した。これにより、プロモーター、ＬＭＭ遺伝子及び組換えタンパク質の組合せが、有意な影響を有した場合、その条件の変動全体はシフトし得ることが期待される。
ａＦＯＧ後の生成物濃度の測定
【０３２８】
Ｏｃｔｅｔでタンパク質Ａバイオセンサーを使用して、生成物濃度を測定した。Ｏｃｔｅｔは、９６ウェルフォーマットの個々のウェルを探索することができるが、２つの列はプレート標準及び対照のために必要とされ；そのゆえ、１回のＯｃｔｅｔラン当たり最多で８０個の試料を測定することが可能であった。１００〜５ｍｇ／Ｌの間で標準を調製し、プレート間対照を２５ｍｇ／Ｌに希釈し、各プールの回収上清をＣＤ  ＣＨＯで希釈して、作出した標準曲線にフィットさせた。
【０３２９】
試料は、タンパク質Ａバイオセンサーに結合した生成物を定量するためにＯｃｔｅｔセンサーについての最小濃度を必要とする。定量可能な培養物数は、各条件間で変動し；定量した培養物の総数は、表１０に列挙される。これらのデータは、組換えタンパク質条件にわたる一部のＬＭＭ遺伝子条件における定量可能な全培養物の変化を示す、すなわち、ＳＶ４０  ＳＲＥＢ４１１は、全ての組換えタンパク質条件にわたり定量可能な培養物の減少を示し；ＳＶ４０  ＳＲＥＢＦ１条件も変化を示し、定量可能な培養物の同等の数又は改善した数を示す。
【０３３０】
【表１０】
2021511781.tif 000045
【０３３１】
トランスフェクト細胞のプールを使用したので、各プールの１細胞当たりの各トランスフェクトされたベクターのコピー数及び固有の生産性の差があり得ることが予想されうる。この変動性を軽減し、且つ各条件における細胞成長及び生産性のより正確な状況を得るために、１条件当たり最多で８０個の細胞プールを産生した。定量可能な反復の数は、１４〜８０プールの間で変動した。
【０３３２】
特定の生産性の計算
全てのタンパク質Ａ及び成長データを集めると、各培養物についての特定の生産性を計算することが可能であった。これは、１時間当たりの１細胞当たりのピクトグラム（Ｑｐ）、及び１ミリリットル当たりの１時間当たりの培養物中の生細胞濃度の時間積分（ＩＶＣ）を計算することによって行い、ＩＶＣは培養物の各々についての成長曲線下面積を解くことによって計算した。その後、これらのデータは、Ｑｐ対ＩＶＣのバブルプロットで表現することができ、各バブル（データ点）は、バブルの直径によって生成物タイターを示す。得られたプロットは、図１６Ａ〜１６Ｄで見ることができる。
【０３３３】
表１１に示される生産性平均値データについての９５％信頼区間を、各ＲＰＬＣ（組換えタンパク質＋プロモーター＋ＬＭＭ条件）の平均値について分析し；これらのデータは表１２に示し、得られた区間は表１３に示す。
【０３３４】
【表１１】
2021511781.tif 000046
【０３３５】
【表１２】
2021511781.tif 000047
【０３３６】
その後、図１７Ａ〜１７Ｄに示す通り、表１３に示すデータを、各組換えタンパク質トランスフェクションについてプロットした。
【０３３７】
考察
特定の生産性プロット及び９５％信頼区間プロット（ＣＩＰ：ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ  ｐｌｏｔ）の両方を考慮することによって、これらの条件下で組換えタンパク質発現の改善を示すプロモーター＋ＬＭＭの組合せを特定することが可能であった。
【０３３８】
エタネルセプト
これらのデータは、平均してＰＧＫ＋ＳＲＥＢＦ１条件が、エタネルセプトタイターを増大することを示した。これは、トランスフェクト細胞の８０個のプールの平均から観察された。
【０３３９】
セルグツズマブ
ＳＶ４０＋ＳＲＥＢ４１１条件は、９５％ＣＩＰでタイターの増大を示した。
【０３４０】
インフリキシマブ
インフリキシマブについての測定可能な培養物数は概して、エタネルセプト及びｃＢ７２．３条件と比較した場合、より低かった。
【０３４１】
ＰＧＫ／ＳＶ４０＋ＳＲＥＢＦ１は、インフリキシマブのタイターの増大を示した。インフリキシマブバブルプロットにおいて、Ｑｐ＝１を超えるデータ点の大多数が、それらの条件からのデータ点であるように見えた。ＰＧＫ＋ＳＲＥＢＦ１条件は、ＳＶ４０＋ＳＲＥＢＦ１条件よりも低いＩＶＣを有したが、ＰＧＫ＋ＳＲＥＢＦ１条件は、より大きな平均タイターを有し、このことはＱｐ＝１を超えるデータ点の数の比較によっても見ることができる。また、これらの２つの条件は、測定可能な反復の数の増大を示し、これらのレベルでのＳＲＥＢＦ１の発現は、インフリキシマブを発現する場合、細胞生存可能性を増大することを示唆した。
【０３４２】
ｃＢ７２．３
ｃＢ７２．３組換えタンパク質は、標準モノクローナル抗体であり、本明細書で考察される他の組換えタンパク質と比較して細胞が発現することがより容易であった。
【０３４３】
９５％ＣＩＰは、ＳＲＥＢＦ１の発現を増大することが、これらの条件下での最終タイターを増大し得ることを示唆した。ＳＶ４０／ＰＧＫ＋ＳＲＥＢＦ１条件の両方は、タイターの有意な増大を示した。ＰＧＫ＋ＳＣＤ１条件も、タイターの増大を示した。ｃＢ７２．３バブルプロットＳＶ４０＋ＳＲＥＢＦ１データは、より高いＱｐ及びより低いＩＶＣへ向かう傾向があり、一方で、ＰＧＫ＋ＳＲＥＢＦ１条件についてはその逆が真実であった。ＳＣＤ１条件は、Ｑｐ＝０．５〜３及びＩＶＣ＝５００〜１２５０の間にグループ化できるように見えた。対照条件は、より低いＱｐ及びより高いＩＶＣへ向かう傾向があった。
【０３４４】
プロモーターとＬＭＭとの組合せ選択
ＳＶ４０／ＰＧＫ＋ＳＲＥＢＦ１の組合せは、それらがトランスフェクトされた培養物の生成物タイター及びＱｐ又はＩＶＣのいずれかの改善を示した。ＳＣＤ１についてのマウス配列とＣＨＯ配列との間の差は、ｈＣＭＶ又はｍＣＭＶ等の強いプロモーターで望ましく探索することができる。これらのプロモーターの組合せは、生成物タイターを改善することが企図される。
【０３４５】
実施例３：安定にＬＭＭを操作導入したＧＳ−ＫＯ  ＣＨＯ細胞プールの生成のためのピロリン−５−カルボン酸シンターゼプロリン代謝選択系の適用
脂質代謝変更因子（ＬＭＭ）ステアロイル−ＣｏＡデサチュラーゼ−１（ＳＣＤ１）、ステロール調節エレメント結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）、及び核に遊走するＳＲＥＢＦ１の部分を含み、ＳＲＥＢＦ１の調節ドメインを欠く切断型ＳＲＥＢＦ１アイソフォームであるＳＲＥＢ４１１の操作は、上記の例によって、ＣＨＯＫ１ＳＶ  ＧＳ−ＫＯ宿主産生、及び複合体タンパク質及び標準ｍＡｂの生成物品質を改善することが示されている。それゆえ、様々なプロモーターの制御下でＳＣＤ１又はＳＲＥＢＦ１のいずれかを過剰発現する安定的発現ＬＭＭ改変ＧＳ−ＫＯ  ＣＨＯ細胞プールを生成するために、Ｐ５ＣＳプロリン代謝選択を利用した。
【０３４６】
プロリンを欠くＬｏｎｚａ専売既知組成タンパク質非含有培地で、Ｐ５ＣＳ選択系を使用してＰＧＫ  ＳＣＤ１（ＣＨＯ）若しくはＰＧＫ  ＳＲＥＢＦ１、又はＰＧＫ  ＳＣＤ１（マウス）若しくはＳＶ４０  ＳＲＥＢＦ１のいずれかを、ＧＳ−ＫＯ  ＣＨＯ宿主にエレクトロポレーションによってトランスフェクトした。その後、トランスフェクト細胞を、３つの９６ウェルプレートに播種し（１ウェル当たり１００μｌの培養物）、３６．５℃、１０％ＣＯ２でインキュベートした。トランスフェクション後７日目に、トランスフェクトした培養物の各プレートから１ウェル／培養物当たり１５０μｌを除去し、プロリンを欠く新鮮な培地を各ウェル／培養物に添加した。その後、培養物をトランスフェクション後の成長及び回復についてモニターした。トランスフェクション後およそ１４日から、トランスフェクション後の細胞回復が観察された。培養物の７５％よりも多くが、７５〜８０％を超えるコンフルエントと考えられると、プレート中の培養物は回復したと考えられ、深型９６ウェルプレートに移した。
【０３４７】
深型９６ウェルプレートでの継代後、細胞ペレット試料を収集し、タンパク質可溶化液を生成し、Ｐ５ＣＳ発現及び対照として作用するβ−アクチンと共に、標的ＬＭＭ（ＳＣＤ１又はＳＲＥＢＦ１）の発現についてウェスタンブロットによって分析した。得られた分析から、各ウェルの細胞プールを、互いに、及び対照と比較して「高」、「中」又は「低」量の標的ＬＭＭを発現するものとして分類した。その後「最も高い」１０個の発現細胞ウェルを組み合わせて「高」発現細胞プールを生成し、「中」発現体にわたる１０〜１５個のウェルを集めて「中」発現ＬＭＭプールを生成し、「低」発現体にわたる１０〜１５個のウェルを組み合わせて「低」発現ＬＭＭプールを生成した。中及び低プールの場合、３つのプレートの各々からウェルを採取した。その後、これらのＬＭＭ操作導入細胞プールを、振盪フラスコに拡張し、プロリンを含まないＬｏｎｚａ専売培地で成長させた。その後、細胞可溶化液を収集して、操作導入細胞プールのＬＭＭ及びＰ５ＣＳ発現をアセスメントした。
【０３４８】
図１８は、生成した細胞プールのウェスタンブロット分析を示し、宿主対照ＧＳ−ＫＯ  ＣＨＯ細胞株におけるＰ５ＣＳ発現がないか、又は非常に低いこと、及び様々なＬＭＭプールにおけるＰ５ＣＳ発現の同様の量を確認する。これは、Ｐ５ＣＳ選択系がＰ５ＣＳ酵素を発現する細胞の単離をもたらすことを確認する。チューブリンを、ローディング対照として使用した。図１８に示される通り、ＳＣＤ１量は、低プールと比較して、中及び高ＰＧＫ  ＳＣＤ１  ＣＨＯプールにおいて上昇することが示され、一方で、細胞に操作導入された前駆体ＳＲＥＢＦ１分子は、低プールと比較して、中及び高ＰＧＫ  ＳＲＥＢＦ１プールにおいて上昇した。ＰＧＫ  ＳＣＤ１マウス及びＳＶ４０  ＳＲＥＢＦ１操作導入細胞について同様の観察がなされた。したがって、図１８は、ＬＭＭ発現とカップリングさせたＰ５ＣＳに基づくプロリン代謝選択系は、ＬＭＭ量の増大を伴う、プロリンを欠く培地で成長するＰ５ＣＳ発現細胞の単離の成功をもたらしたことを示す。
【０３４９】
その後、様々なＬＭＭ発現プールに、組換え生物由来治療薬（エタネルセプト及びインフリキシマブ）及びＧＳのベクターをトランスフェクトし、上記実施例２に説明される通りにトランスフェクトし、その後、９６ウェルプレートにおいてプロリン及びグルタミン非含有培地で回復させた。トランスフェクション後およそ１４日から、トランスフェクション後の細胞回復が観察された。培養物の７５％よりも多くが、７５〜８０％を超えるコンフルエントと考えられると、プレート中の培養物は回復したと考えられ、深型ウェルプレートに移した。次に細胞を継代し、Ｏｃｔｅｔ器具を使用してタイターをアセスメントし、その後、ＬＭＭを操作導入したトランスフェクトした各プールからの最も高い１０個のウェルを組み合わせ、振盪フラスコで成長させた。その後、ミニチュアバイオリアクターにおいて流加回分培養条件下で、これらの生産性及び成長特徴をアセスメントした。
【０３５０】
図１９Ａ〜１９Ｄは、ＬＭＭを操作導入し、次に組換え分子をトランスフェクトし、ａｍｂｒ（商標）１５ミニチュアバイオリアクターにおける流加回分条件下での培養９日目の二重培養物での生産性及び成長についてアセスメントした各プールについての、積分生細胞濃度（ＩＶＣ）に対するＱｐのプロットを示す（ＩＶＣ，１ミリリットル当たりの１時間当たりの培養物中の生細胞濃度の時間積分、及びＱｐ，ｐｇ／細胞／時としての特異的生産性）。
【０３５１】
図１９Ａ上部の凡例は、（上から下へ）対照Ｅ１、対照Ｅ２、ＳＶ４０−ＳＢＦ１高Ｅ１、ＳＶ４０−ＳＢＦ１高Ｅ２、ＳＶ４０−ＳＢＦ１中Ｅ１、ＳＶ４０−ＳＢＦ１中Ｅ２、ＳＶ４０−ＳＢＦ１低Ｅ１、ＳＶ４０−ＳＢＦ１低Ｅ２を示す。ｙ軸は、下から０で始まり、Ｑｐ（ｐｇ／細胞／時）と標識される０．１、０．２、０．３、０．４、０．５及び０．６に進む。ｘ軸は、左から０で始まり、ＩＶＣ（１０６個の細胞ｘ時／ｍｌ）と標識される５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００及び３５００に進む。図１９Ａ下部の凡例は、（上から下へ）対照Ｉ１、対照Ｉ２、ＳＶ４０−ＳＢＦ１高Ｉ１＊、ＳＶ４０−ＳＢＦ１高Ｉ２、ＳＶ４０−ＳＢＦ１中Ｉ１＊、ＳＶ４０−ＳＢＦ１低Ｉ１、ＳＶ４０−ＳＢＦ１低Ｉ２を示す。ｙ軸は、下から０で始まり、Ｑｐ（ｐｇ／細胞／時）と標識される０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５及び０．３に進む。ｘ軸は、左から０で始まり、ＩＶＣ（１０６個の細胞ｘ時／ｍｌ）と標識される５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００及び４０００に進む。図１９Ｂ上部の凡例は、（上から下へ）対照Ｅ１、対照Ｅ２、ＰＧＫ−ＳＢＦ１高Ｅ１、ＰＧＫ−ＳＢＦ１高Ｅ２、ＰＧＫ−ＳＢＦ１中Ｅ１＊＊、ＰＧＫ−ＳＢＦ１中Ｅ２、ＰＧＫ−ＳＢＦ１低Ｅ１、ＰＧＫ−ＳＢＦ１低Ｅ２を示す。ｙ軸は、下から０で始まり、Ｑｐ（ｐｇ／細胞／時）と標識される０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６及び０．７に進む。ｘ軸は、左から０で始まり、ＩＶＣ（１０６個の細胞ｘ時／ｍｌ）と標識される５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００及び３５００に進む。図１９Ｂ下部の凡例は、（上から下へ）対照Ｉ１、対照Ｉ２、ＰＧＫ−ＳＢＦ１高Ｉ２、ＰＧＫ−ＳＢＦ１高Ｉ１、ＰＧＫ−ＳＢＦ１中Ｉ１、ＰＧＫ−ＳＢＦ１低Ｉ２、ＰＧＫ−ＳＢＦ１低Ｉ１、ＰＧＫ−ＳＢＦ１中Ｉ２を示す。ｙ軸は、下から−０．０５で始まり、Ｑｐ（ｐｇ／細胞／時）と標識される０、０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３及び０．３５に進む。ｘ軸は、左から０で始まり、ＩＶＣ（１０６個の細胞ｘ時／ｍｌ）と標識される５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００及び４０００に進む。図１９Ｃ上部の凡例は、（上から下へ）対照Ｅ１、対照Ｅ２、ＰＧＫ−ＭＳＣＤ高Ｅ１、ＰＧＫ−ｍＳＣＤ高Ｅ２、ＰＧＫ−ｍＳＣＤ中Ｅ１、ＰＧＫ−ｍＳＣＤ中Ｅ２、ＰＧＫ−ｍＳＣＤ低Ｅ１、ＰＧＫ−ｍＳＣＤ低Ｅ２を示す。ｙ軸は、下から０で始まり、Ｑｐ（ｐｇ／細胞／時）と標識される０．１、０．２、０．３、０．４、０．５及び０．６に進む。ｘ軸は、左から０で始まり、ＩＶＣ（１０６個の細胞ｘ時／ｍｌ）と標識される５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００及び３５００に進む。図１９Ｃ下部の凡例は、（上から下へ）対照Ｉ１、対照Ｉ２、ＰＧＫ−ｍＳＣＤ中Ｉ２＊、ＰＧＫ−ｍＳＣＤ低Ｉ２、ＰＧＫ−ｍＳＣＤ高Ｉ１を示す。ｙ軸は、下から０で始まり、Ｑｐ（ｐｇ／細胞／時）と標識される０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５及び０．４に進む。ｘ軸は、左から０で始まり、ＩＶＣ（１０６個の細胞ｘ時／ｍｌ）と標識される５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００及び４０００に進む。図１９Ｄ上部の凡例は、（上から下へ）対照Ｅ１、対照Ｅ２、ＰＧＫ−ＳＣＤ高Ｅ１、ＰＧＫ−ＳＣＤ高Ｅ２、ＰＧＫ−ＳＣＤ中Ｅ１、ＰＧＫ−ＳＣＤ中Ｅ２、ＰＧＫ−ＳＣＤ低Ｅ１、ＰＧＫ−ＳＣＤ低Ｅ２を示す。ｙ軸は、下から０で始まり、Ｑｐ（ｐｇ／細胞／時）と標識される０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５、０．３、０．３５、０．４及び０．４５に進む。ｘ軸は、左から０で始まり、ＩＶＣ（１０６個の細胞ｘ時／ｍｌ）と標識される５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００及び４０００に進む。図１９Ｄ下部の凡例は、（上から下へ）対照Ｉ１、対照Ｉ２、ＰＧＫ−ＳＣＤ中Ｉ１＊、ＰＧＫ−ＳＣＤ中Ｉ２、ＰＧＫ−ＳＣＤ高Ｉ１、ＰＧＫ−ＳＣＤ高Ｉ２、ＰＧＫ−ＳＣＤ低Ｉ１、ＰＧＫ−ＳＣＤ低Ｉ２を示す。ｙ軸は、下から０で始まり、Ｑｐ（ｐｇ／細胞／時）と標識される０．０５、０．１、０．１５、０．２、０．２５及び０．３に進む。ｘ軸は、左から０で始まり、ＩＶＣ（１０６個の細胞ｘ時／ｍｌ）と標識される５００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００及び４０００に進む。
【０３５２】
対照細胞（黒丸、図１９、非ＬＭＭ操作導入）のＩＶＣは概して、最も高いＩＶＣの中の１つであったが、各場合に、タンパク質を発現することが困難なモデルを発現する場合に、対照よりも高いＱｐ及び対照と同様のＩＶＣを有するいくつかのＬＭＭプールがあった（「＊」は、容器が１２日目に回収されたことを示し、「＊＊」は、１４日目に回収されたことを示す）。これは、Ｐ５ＣＳ選択法を使用して産生及び培養したＬＭＭ操作導入細胞は、発現することが困難なタンパク質を産生する場合のＱｐの増大、及び同様の条件下での非ＬＭＭ操作導入細胞に匹敵するＩＶＣを有し得るという見解と一致する。
【０３５３】
本明細書で引用される各特許、特許出願及び出版物並びにどの特許、特許出願及び出版物の開示も、それらの全体を参照により本明細書に組み込む。本発明は、特定の態様に関して開示されているが、本発明の他の態様及び変形は、本発明の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得ることが明らかである。附属の特許請求の範囲は、全てのそのような態様及び均等な変形を含むと解釈されることが意図される。
【０３５４】
〔関連出願の相互参照〕
本出願は、米国特許仮出願第６２／６２５７７３号（２０１８年２月２日出願）の優先権及び利益を主張し、当該出願の内容は、その全体を参照により本明細書に組み込む。
【図１】
2021511781.tif 000048
【図２】
2021511781.tif 000049
【図３Ａ】
2021511781.tif 000050
【図３Ｂ】
2021511781.tif 000051
【図４Ａ】
2021511781.tif 000052
【図４Ｂ】
2021511781.tif 000053
【図４Ｃ】
2021511781.tif 000054
【図５Ａ】
2021511781.tif 000055
【図５Ｂ】
2021511781.tif 000056
【図５Ｃ】
2021511781.tif 000057
【図５Ｄ】
2021511781.tif 000058
【図６Ａ】
2021511781.tif 000059
【図６Ｂ】
2021511781.tif 000060
【図６Ｃ】
2021511781.tif 000061
【図７】
2021511781.tif 000062
【図８Ａ】
2021511781.tif 000063
【図８Ｂ】
2021511781.tif 000064
【図８Ｃ】
2021511781.tif 000065
【図８Ｄ】
2021511781.tif 000066
【図８Ｅ】
2021511781.tif 000067
【図８Ｆ】
2021511781.tif 000068
【図９Ａ】
2021511781.tif 000069
【図９Ｂ】
2021511781.tif 000070
【図９Ｃ】
2021511781.tif 000071
【図９Ｄ】
2021511781.tif 000072
【図９Ｅ】
2021511781.tif 000073
【図９Ｆ】
2021511781.tif 000074
【図１０Ａ】
2021511781.tif 000075
【図１０Ｂ】
2021511781.tif 000076
【図１０Ｃ】
2021511781.tif 000077
【図１０Ｄ】
2021511781.tif 000078
【図１０Ｅ】
2021511781.tif 000079
【図１０Ｆ】
2021511781.tif 000080
【図１１Ａ】
2021511781.tif 000081
【図１１Ｂ】
2021511781.tif 000082
【図１１Ｃ】
2021511781.tif 000083
【図１１Ｄ】
2021511781.tif 000084
【図１１Ｅ】
2021511781.tif 000085
【図１２Ａ】
2021511781.tif 000086
【図１２Ｂ】
2021511781.tif 000087
【図１２Ｃ】
2021511781.tif 000088
【図１２Ｄ】
2021511781.tif 000089
【図１２Ｅ】
2021511781.tif 000090
【図１３】
2021511781.tif 000091
【図１４Ａ】
2021511781.tif 000092
【図１４Ｂ】
2021511781.tif 000093
【図１４Ｃ】
2021511781.tif 000094
【図１４Ｄ】
2021511781.tif 000095
【図１５Ａ】
2021511781.tif 000096
【図１５Ｂ】
2021511781.tif 000097
【図１５Ｃ】
2021511781.tif 000098
【図１５Ｄ】
2021511781.tif 000099
【図１６Ａ】
2021511781.tif 000100
【図１６Ｂ】
2021511781.tif 000101
【図１６Ｃ】
2021511781.tif 000102
【図１６Ｄ】
2021511781.tif 000103
【図１７Ａ】
2021511781.tif 000104
【図１７Ｂ】
2021511781.tif 000105
【図１７Ｃ】
2021511781.tif 000106
【図１７Ｄ】
2021511781.tif 000107
【図１８】
2021511781.tif 000108
【図１９Ａ】
2021511781.tif 000109
【図１９Ｂ】
2021511781.tif 000110
【図１９Ｃ】
2021511781.tif 000111
【図１９Ｄ】
2021511781.tif 000112
【国際調査報告】
2021511781.tif 000113
2021511781.tif 000114
2021511781.tif 000115
2021511781.tif 000116
2021511781.tif 000117
2021511781.tif 000118
2021511781.tif 000119
2021511781.tif 000120
2021511781.tif 000121