(57)【要約】  ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の中枢神経系（ＣＮＳ）の脳脊髄液に、完全ヒトグリコシル化（ＨｕＧｌｙ）α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）を送達するための組成物及び方法を記載する。【選択図】図４
2021531276.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、前記ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒト神経細胞によって生産された治療有効量の組換えヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）を送達することを含む、前記方法。
【請求項２】
ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象の治療方法であって、前記ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒトグリア細胞によって生産された治療有効量の組換えヒトＩＤＵＡを送達することを含む、前記方法。
【請求項３】
前記ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することをさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のα２，６−シアル酸付加ヒトＩＤＵＡを送達することと、
前記ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項５】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なＮｅｕＧｃを含まない治療有効量のグリコシル化ヒトＩＤＵＡを送達することと、
前記ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項６】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まない治療有効量のグリコシル化ヒトＩＤＵＡを送達することと、
前記ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項７】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に、チロシン硫酸化を含む治療有効量のヒトＩＤＵＡを送達することと、
前記ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項８】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、前記ＩＤＵＡがヒト不死化神経細胞において前記発現ベクターから発現される際にα２，６−シアル酸付加される、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項９】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、前記ＩＤＵＡがヒト不死化神経細胞において前記発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃを含まない、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項１０】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、前記ＩＤＵＡがヒト不死化神経細胞において前記発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まない、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項１１】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、前記ＩＤＵＡがヒト不死化神経細胞において前記発現ベクターから発現される際にチロシン硫酸化される、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項１２】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α２，６−シアル酸付加グリカンを含む前記ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項１３】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃを含まないグリコシル化ヒトＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項１４】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まないグリコシル化ヒトＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項１５】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果チロシン硫酸化を含む前記ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、前記方法。
【請求項１６】
前記免疫抑制治療が、前記ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、（ａ）タクロリムス及びミコフェノール酸、（ｂ）ラパマイシン及びミコフェノール酸、または（ｃ）タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び／またはメチルプレドニゾロンの組合わせを前記対象に投与し、かつその後継続することを含む、請求項３〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記免疫抑制治療を１８０日後に中止する、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ヒトＩＤＵＡが配列番号１のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記免疫抑制治療が、前記ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、（ａ）タクロリムス及びミコフェノール酸、（ｂ）ラパマイシン及びミコフェノール酸、または（ｃ）タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び／またはメチルプレドニゾロンの組合わせを前記対象に投与することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記免疫抑制治療を１８０日後に中止する、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
α２，６−シアル酸付加グリカンを含む前記ＩＤＵＡの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、請求項１２に記載の方法。
【請求項２２】
検出可能なＮｅｕＧｃを含まない前記グリコシル化ＩＤＵＡの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、請求項１３に記載の方法。
【請求項２３】
検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まない前記グリコシル化ＩＤＵＡの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、請求項１４に記載の方法。
【請求項２４】
チロシン硫酸化を含む前記ＩＤＵＡの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を前記組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、請求項１５に記載の方法。
【請求項２５】
生産をマンノース−６−リン酸の存在下及び非存在下で確認する、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記発現ベクターまたは組換えヌクレオチド発現ベクターが、シグナルペプチドをコードする、請求項８〜１５及び２１〜２５のいずれか１項に記載の方法、または請求項８〜１５のいずれか１項に直接的もしくは間接的に従属する場合の請求項１６〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α２，６−シアル酸付加グリカンを含む前記ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含み、
前記組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、前記細胞培養中で前記α２，６−シアル酸付加グリカンを含む前記ＩＤＵＡを生産する、前記方法。
【請求項２８】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃを含まないグリコシル化ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含み、
前記組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、前記細胞培養中でグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃを含まない前記ＩＤＵＡを生産する、前記方法。
【請求項２９】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まないグリコシル化ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含み、
前記組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、前記細胞培養中でグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まない前記ＩＤＵＡを生産する、前記方法。
【請求項３０】
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
前記ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果チロシン硫酸化を含む前記ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、前記投与することと、
前記発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、前記対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含み、
前記組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、前記細胞培養中でチロシン硫酸化された前記ＩＤＵＡを生産する、前記方法。
【請求項３１】
前記免疫抑制治療が、前記ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、（ａ）タクロリムス及びミコフェノール酸、（ｂ）ラパマイシン及びミコフェノール酸、または（ｃ）タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び／またはメチルプレドニゾロンの組合わせを前記対象に投与し、かつその後継続することを含む、請求項２７〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫抑制治療を１８０日後に中止する、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記ヒト対象が３歳未満である、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ヒト対象が３歳未満であり、前記発現ベクターまたは前記組換えヌクレオチド発現ベクターが、２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量、１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、または５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量で投与される、請求項８〜１５及び２１〜３３のいずれか１項に記載の方法、または請求項８〜１５のいずれか１項に直接的もしくは間接的に従属する場合の請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ヒト対象が３歳未満であり、前記発現ベクターまたは前記組換えヌクレオチド発現ベクターが、２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量〜１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の範囲の用量で投与される、請求項８〜１５及び２１〜３３のいずれか１項に記載の方法、または請求項８〜１５のいずれか１項に直接的もしくは間接的に従属する場合の請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ヒト対象が３歳未満であり、前記発現ベクターまたは前記組換えヌクレオチド発現ベクターが、1×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量〜５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の範囲の用量で投与される、請求項８〜１５及び２１〜３３のいずれか１項に記載の方法、または請求項８〜１５のいずれか１項に直接的もしくは間接的に従属する場合の請求項１６〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年７月１８日出願の米国仮特許出願第６２／６９９，９２３号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出された配列表の参照
本願は、２０１９年７月８日に作成されて、８１，９２０バイトのサイズを有する「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ＿Ｌｉｓｔｉｎｇ＿１２６５６−１１３−２２８．ｔｘｔ」という名のテキストファイルとして本出願とともに提出された配列表を参照により組み込む。
【０００３】
１．導入
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の中枢神経系（ＣＮＳ）の脳脊髄液に、完全ヒトグリコシル化（ＨｕＧｌｙ）α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）を送達するための組成物及び方法を記載する。
【背景技術】
【０００４】
２．発明の背景
ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）は、発生率が１００，０００件の出生のうち１件と推定されている稀な劣性遺伝疾患である（Ｍｏｏｒｅ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．２００８，Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３）。ＭＰＳ  Ｉは、遍在する複合多糖類、ヘパラン硫酸及びデルマタン硫酸のリソソーム異化に必要な酵素である、α−ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）の欠損によって生じる。これらの多糖類はグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）と呼ばれ、ＭＰＳ  Ｉ患者の組織に蓄積されて、特徴的な貯蔵病変及び多様な疾患後遺症をもたらす。患者は、低身長、骨及び関節の変形、顔の特徴の粗雑化、肝脾腫、心臓弁膜疾患、閉塞性睡眠時無呼吸、再発性上気道感染症、聴覚障害、手根管症候群、及び角膜混濁による視覚障害を呈し得る（Ｂｅｃｋ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｔｈｅ  ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｏｆ  ＭＰＳ  Ｉ：ｇｌｏｂａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ＭＰＳ  Ｉ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６（１０）：７５９−７６５）。さらに、多くの患者は水頭症、脊髄圧迫症、及び一部の患者では認知障害を含み得る中枢神経系におけるＧＡＧの貯蔵に関連した症状を発症する。
【０００５】
ＭＰＳ  Ｉ患者は、広範囲の疾患重症度及びＣＮＳ障害の程度に及ぶ。この重症度の多様性は、残存するＩＤＵＡの発現と相関する；活性酵素の発現をもたらさない２つの突然変異を有する患者（ナンセンス突然変異、欠失、及びいくつかのミスセンス突然変異を含む）は、典型的に２歳になる前に症状を示し、正常な発達初期の後に例外なく重度の認知機能低下を示す（Ｔｅｒｌａｔｏ  ＮＪ  ＆  Ｃｏｘ  ＧＦ，２００３，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ５（４）：２８６−２９４）。この重症型形態のＭＰＳ  Ｉは、ハーラー（Ｈ）症候群とも呼ばれる。少量の活性ＩＤＵＡの生産をもたらす少なくとも１つの突然変異を有する患者は、ハーラー−シャイエ（ＨＳ）症候群またはシャイエ症候群と呼ばれる軽症型表現型を示す。これらの患者は、幼少期の初期に症状を示し得るか、または人生の最初の１０年を経た後まで特定できない場合もある。概して、発症が遅れ、重症度が低下し得るものの、軽症形態のＭＰＳ  Ｉを有する患者は、ハーラー症候群を有する患者と同じあらゆる身体的特徴を経験し得る（Ｖｉｊａｙ  Ｓ＆Ｗｒａｉｔｈ  ＪＥ，２００５，Ａｃｔａ  Ｐａｅｄｉａｔｒｉｃａ  ９４（７）：８７２−８７７）。また、減弱型ＭＰＳ  Ｉを有する患者は、高い割合で脊髄圧迫及び水頭症を含む神経学的合併症を経験する。減弱型ＭＰＳ  Ｉを有すると分類された患者のおよそ３０％において、認知障害が報告されている（Ｂｅｃｋ  Ｍ，ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ｉｎ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ：ｏｆｆｉｃｉａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １６（１０）：７５９−７６５）。
【０００６】
酵素補充療法（ＥＲＴ）［Ａｌｄｕｒａｚｙｍｅ（登録商標）（ラロニダーゼ）］は、ＭＰＳ  Ｉの全身症状の標準治療として認められているが、ＣＮＳ症状発現を治療しない（ｄｅ  Ｒｕ  ＭＨ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ６：９；Ｗｒａｉｔｈ  ＪＥ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃｓ  １２０（１）：Ｅ３７−Ｅ４６）。造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）は、ＭＰＳ  Ｉの神経認知症状に影響を与えるが、手順に重大な制約がある。ＭＰＳ  ＩのためのＨＳＣＴは、相当な病的状態及び最大２０％の死亡率に関連付けられ、ＩＤＵＡ発現が安定してもなお患者はＨＳＣＴの最長１年後に神経認知機能の低下に直面するため、治療は不完全である（ｄｅ  Ｒｕ  ＭＨ，ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｏｒｐｈａｎｅｔ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｒａｒｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ６：９；Ｆｌｅｍｉｎｇ  ＤＲ，ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２（４）：２９９−３０４；Ｂｏｅｌｅｎｓ  ＪＪ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ４０（３）：２２５−２３３；Ｓｏｕｉｌｌｅｔ  Ｇ，ｅｔ  ａｌ．，２００３，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ３１（１２）：１１０５−１１１７；Ｗｈｉｔｌｅｙ  ＣＢ，ｅｔ  ａｌ．，１９９３，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ４６（２）：２０９−２１８）。移植に成功した患者において、知性は典型的には、正常より著しく下回ったままである。
【発明の概要】
【０００７】
３．発明の概要
本発明はハーラー、ハーラー−シャイエ、またはシャイエ症候群と診断された患者を含むが、これらに限定されないムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の中枢神経系の脳脊髄液（ＣＳＦ）に完全ヒトグリコシル化（ＨｕＧｌｙ）α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＨｕＧｌｙＩＤＵＡ）を送達することを含む。好ましい実施形態において、治療は遺伝子治療を介して、例えば、ヒトＩＤＵＡ（ｈＩＤＵＡ）またはｈＩＤＵＡの誘導体をコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトをＭＰＳ  Ｉと診断された患者（ヒト対象）のＣＳＦに投与して、継続的に完全ヒトグリコシル化導入遺伝子産物をＣＮＳに供給する形質導入細胞の永続的なデポーを作製することにより、達成される。デポーからＣＳＦに分泌されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡは、ＣＮＳ中の細胞によってエンドサイトーシスされて、レシピエント細胞における酵素欠損を「横断修正（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）」する。代替の実施形態において、ＨｕＧｌｙＩＤＵＡを細胞培養で生産して、酵素補充療法（「ＥＲＴ」）として、例えば酵素を注入することにより投与することができる。しかしながら、遺伝子治療アプローチは、ＥＲＴを上回るいくつかの利点を提供する−酵素は血液脳関門を通過することができないため、酵素の全身送達によってはＣＮＳは治療されず；かつ本発明の遺伝子治療アプローチとは異なり、ＣＮＳへの酵素の直接の送達には、大きな負担となるだけでなく感染のリスクを生む反復注入が必要となるであろう。
【０００８】
導入遺伝子によってコードされるＨｕＧｌｙＩＤＵＡは、これらに限定はされないが、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＤＵＡ（ｈＩＤＵＡ）（図１に示す）、ならびにアミノ酸の置換、欠失、または付加を有する、例えばこれらに限定はされないが、図２に示すＩＤＵＡのオーソログ中に対応する非保存的残基から選択されるアミノ酸置換を含む、ｈＩＤＵＡの誘導体を含むことができる（ただし、そのような突然変異が、図３に示す（その全体が参照により本明細書に組み込まれているＳａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  １１１：１０７−１１２の５７個のＭＰＳ  Ｉ突然変異を列記する表３より）、またはその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているＶｅｎｔｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ＃５２２  Ｏｎｌｉｎｅ（「Ｖｅｎｔｕｒｉ  ２００２」）、もしくはＢｅｒｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ３２：Ｅ２１８９−Ｅ２２１０（「Ｂｅｒｔｏｌａ  ２０１１」）によって報告された、重度の、中程度に重度の、中程度の、もしくは軽症型ＭＰＳ  Ｉ表現型において同定されたいずれの突然変異も含まないことを条件とする）。
【０００９】
例えば、ｈＩＤＵＡの特定位置でのアミノ酸置換は図２（その全体が参照により本明細書に組み込まれているＭａｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ  １１０：１４６２８、図Ｓ８に報告されたオーソログのアラインメントを示す）に表されるＩＤＵＡオーソログにおけるその位置に見出される対応する非保存的アミノ酸残基から選択することができる（ただし、そのような置換は図３に示されるか、または上記Ｖｅｎｔｕｒｉ  ２００２もしくはＢｅｒｔｏｌａ  ２０１１において報告される有害な突然変異のいずれも含まないことを条件とする）。結果として得られる導入遺伝子産物は、細胞培養または試験動物で、突然変異がＩＤＵＡ機能を損なわないことを保証するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの従来のアッセイを使用して試験することができる。選択される好ましいアミノ酸置換、欠失、または付加は、細胞培養または動物モデルにおけるＭＰＳ  Ｉのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの従来のアッセイによって試験されるＩＤＵＡの酵素活性、安定性、または半減期を維持するか、または増加させるものとするべきである。例えば、導入遺伝子産物の酵素活性は基質として４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−イズロニドを用いる従来の酵素アッセイを使用して評価することができる（使用可能な例示的なＩＤＵＡ酵素アッセイについては、例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ９２：２５７−２６５；Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５２：２１−２８；及びＫａｋｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐ  Ｐｕｒｉｆ  ５：２２５−２３２を参照のこと）。導入遺伝子産物がＭＰＳ  Ｉ表現型を修正する能力は、例えば、培養中でＭＰＳ  Ｉ細胞にｈＩＤＵＡまたは誘導体をコードするウイルスベクターもしくは他のＤＮＡ発現コンストラクトを形質導入することにより、培養中のＭＰＳ  Ｉ細胞にｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡもしくは誘導体を加えることにより、またはＭＰＳ  Ｉ細胞をｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡもしくは誘導体を発現及び分泌するように操作したヒト宿主細胞と共培養することにより、細胞培養中で評価し、例えば、培養中のＭＰＳ  Ｉ細胞におけるＩＤＵＡ酵素活性及び／またはＧＡＧ貯蔵量の低下を検出することにより、ＭＰＳ  Ｉ培養細胞の欠陥の修正を決定することができる（例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているＭｙｅｒｏｗｉｔｚ＆Ｎｅｕｆｅｌｄ，１９８１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５６：３０４４−３０４８；及びＡｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：３７１−３７９を参照のこと）。
【００１０】
ＭＰＳ  Ｉのための動物モデルは、マウス（例えば、Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ６（４）：５０３−５１１を参照のこと）、短毛の雑種ネコ（例えば、Ｈａｓｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  １３（１１）：１２９４−９７を参照のこと）、及びいくつかの品種のイヌ（例えば、Ｍｅｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４（３）：７６３−７６８；Ｓｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １０９（２）：２４４−２４８を参照のこと）について記載されている。イヌのＭＰＳ  Ｉモデルは、ＩＤＵＡ突然変異により検出可能なタンパク質が喪失するため、ＭＰＳ  Ｉの最も重度の形態であるハーラー症候群に類似している。ＩＤＵＡタンパク質間の遺伝子相同性が高いこと（図２のアラインメントを参照のこと）は、ｈＩＤＵＡが動物において機能的であることを意味し、ｈＩＤＵＡを包含する治療はこれらの動物モデルで試験することができる。
【００１１】
好ましくは、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡ導入遺伝子は、神経細胞及び／またはグリア細胞において機能する発現制御エレメント、例えば、ＣＢ７プロモーター（ニワトリβ−アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー）によって制御されるべきであり、かつベクターによって駆動される導入遺伝子の発現を増強する他の発現制御エレメント（例えば、ニワトリβ−アクチンイントロン及びウサギβ−グロビンポリＡシグナル）を含むことができる。ｈＩＤＵＡ導入遺伝子のためのｃＤＮＡコンストラクトには、形質導入されたＣＮＳ細胞による適切な翻訳中及び翻訳後プロセシング（グリコシル化及びタンパク質硫酸化）を保証するシグナルペプチドのためのコード配列を含めるべきである。ＣＮＳ細胞によって使用されるそのようなシグナルペプチドには：
オリゴデンドロサイト−ミエリン糖タンパク質（ｈＯＭＧ）シグナルペプチド：
ＭＥＹＱＩＬＫＭＳＬＣＬＦＩＬＬＦＬＴＰＧＩＬＣ（配列番号２）
Ｅ１Ａ刺激遺伝子の細胞リプレッサー２（ｈＣＲＥＧ２）シグナルペプチド：
ＭＳＶＲＲＧＲＲＰＡＲＰＧＴＲＬＳＷＬＬＣＣＳＡＬＬＳＰＡＡＧ（配列番号３）
Ｖ−セット及び膜貫通ドメイン含有２Ｂ（ｈＶＳＴＭ２Ｂ）シグナルペプチド：ＭＥＱＲＮＲＬＧＡＬＧＹＬＰＰＬＬＬＨＡＬＬＬＦＶＡＤＡ（配列番号４）
プロトカドヘリンα−１（ｈＰＣＡＤＨＡ１）シグナルペプチド：
ＭＶＦＳＲＲＧＧＬＧＡＲＤＬＬＬＷＬＬＬＬＡＡＷＥＶＧＳＧ（配列番号５）
ＦＡＭ１９Ａ１（ＴＡＦＡ１）シグナルペプチド：
ＭＡＭＶＳＡＭＳＷＶＬＹＬＷＩＳＡＣＡ（配列番号６）
インターロイキン−２シグナルペプチド：
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＩＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号１４）があり得るが、これらに限定されない。
シグナルペプチドは本明細書において、リーダー配列またはリーダーペプチドとも呼ぶことができる。
【００１２】
導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、神経細胞及び／またはグリア細胞を含むがこれらに限定されない、ＣＮＳの細胞への向性を有するべきである。そのようなベクターは非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクター（「ｒＡＡＶ」）を含むことができ、特にＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを有するウイルスベクターが好ましい。これらに限定されないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第７，９０６，１１１号においてＷｉｌｓｏｎによって記載された、特に好ましくはＡＡＶ／ｈｕ．３１及びＡＡＶ／ｈｕ．３２を有する、ＡＡＶバリアントキャプシド、ならびにその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，６２８，９６６号、米国特許第８，９２７，５１４号、及びＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２２：１６２５−１６３４においてＣｈａｔｔｅｒｊｅｅによって記載されたＡＡＶバリアントキャプシドを使用することができる。しかしながら、「ネイキッドＤＮＡ」コンストラクト（５．２節を参照のこと）と呼ばれるレンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または非ウイルス性発現ベクターを含むがこれらに限定されない、他のウイルスベクターを使用することができる。
【００１３】
ＣＳＦへの投与に好適な医薬組成物は、生理的に適合性の水性緩衝剤、界面活性剤、及び任意の賦形剤を含む製剤化緩衝液中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡベクターの懸濁液を含む。ある実施形態において、医薬組成物は、髄腔内投与に好適である。ある実施形態において、医薬組成物は、大槽内投与（大槽内への注入）に好適である。ある実施形態において、医薬組成物は、Ｃ１−２穿刺を介した、くも膜下腔内への注入に好適である。ある実施形態において、医薬組成物は、脳室内投与に好適である。ある実施形態において、医薬組成物は、腰椎穿刺を介する投与に好適である。
【００１４】
組換えベクターの治療有効用量は、くも膜下腔内投与を介して（すなわち、くも膜下腔内へ注入して、組換えベクターがＣＳＦを通じて散布され、ＣＮＳの細胞が形質導入されるようにする）、ＣＳＦに投与すべきである。このことは、いくつかの方法で、例えば、頭蓋内（大槽または脳室内）注入、または腰椎槽への注入によって達成することができる。例えば、（大槽内への）大槽内（ＩＣ）注入は、ＣＴガイド後頭下穿刺によって実施することができ、または、患者に実行できそうな場合は、Ｃ１−２穿刺を介してくも膜下腔への注入を実施することができ、または、腰椎穿刺（典型的にＣＳＦの試料を収集するために実施される診断手順）を、ＣＳＦにアクセスするために使用することができる。あるいは、脳室内（ＩＣＶ）投与（血液脳関門を透過しない抗感染剤または抗がん剤の導入に使用される、より侵襲的な技術）を使用して、組換えベクターを直接脳室内に滴下することができる。あるいは、鼻腔内投与を使用して、ＣＮＳに組換えベクターを送達してもよい。ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＣＳＦ濃度を少なくとも９．２５μｇ／ｍＬのＣｍｉｎ、または９．２５〜２７７μｇ／ｍＬの範囲の濃度に維持する用量を使用すべきである。
【００１５】
ＣＳＦ濃度は、後頭部または腰椎穿刺から得られるＣＳＦ流体中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの濃度を直接測定することによってモニタリングし、または患者の血清において検出されたｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの濃度から外挿によって推定することができる。ある実施形態において、血清中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡが１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬであることは、ＣＳＦ中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡが１〜３０ｍｇであることを示す。ある実施形態において、組換えベクターは、血清中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡを１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬに維持する用量で、ＣＳＦに投与する。
【００１６】
背景として、ヒトＩＤＵＡは、６５３アミノ酸のポリペプチドとして翻訳され、図１において表される６つの可能性のある部位（Ｎ１１０、Ｎ１９０、Ｎ３３６、Ｎ３７２、Ｎ４１５、及びＮ４５１）でＮ−グリコシル化される。シグナル配列が除去され、ポリペプチドはリソソーム内で成熟形態にプロセシングされる：７５ｋＤａの細胞内前駆体は数時間で７２ｋＤａまでトリミングされ、最終的に、４〜５日かけて６６ｋＤａの細胞内形態にプロセシングされる。ＩＤＵＡの分泌形態（使用するアッセイに応じて７６ｋＤａまたは８２ｋＤａ）は、マンノース−６−リン酸受容体を介して細胞に容易にエンドサイトーシスされ、より小さい細胞内形態と同様にプロセシングされる。（その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｙｅｒｏｗｉｔｚ＆Ｎｅｕｆｅｌｄ，１９８１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５６：３０４４−３０４８；Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２５９：１９９−２０８；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２７４：２６３−２６８；及びＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２２７５８−２２７６５を参照のこと）。
【００１７】
ｈＩＤＵＡの全体の構造は、３つのドメインからなる：残基４２−３９６は、古典的な（β／α）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＩＭ）バレルドメインを形成し、残基２７−４２及び３９７−５４５は、短いへリックス−ループ−へリックス（４８２−５０８）を有するβ−サンドイッチドメインを形成し、かつ残基５４６−６４２は、Ｉｇ様ドメインを形成する。最後に挙げた２つのドメインは、Ｃ５４１及びＣ５７７間のジスルフィド架橋によって連結される。β−サンドイッチ及びＩｇ様ドメインは、ＴＩＭバレルの１番目、７番目、及び８番目のα−へリックスに結合される。β−ヘアピン（β１２−β１３）は、ＴＩＭバレルの８番目のβ−ストランド及び８番目のα−へリックスの間に挿入され、これは基質結合及び酵素活性に要求されるＮ−グリコシル化Ｎ３７２を含む。（図１、及びその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているＭａｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ  １１０：１４６２８−１４６３３，及びＳａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  １１１：１０７−１１２に記載の結晶構造を参照のこと）。
【００１８】
本発明は部分的に、以下の原理に基づく：
（ｉ）ＣＮＳの神経細胞及びグリア細胞はＣＮＳにおけるロバストなプロセスである、グリコシル化及びチロシン−Ｏ−硫酸化を含む分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を有する分泌細胞である。ヒトＣＮＳ細胞が行う翻訳後修飾についての、その各々の全体が参照により組み込まれている、例えばヒト脳マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）グリコプロテオームについて記載され、脳が他の組織に見出されるよりはるかに多くの個々のアイソフォームを有するより多くのタンパク質及びマンノース−６−リン酸化タンパク質を含むことを注記した、Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５：１５２０−１５３２、及びＳｌｅａｔ  １９９６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１９１９１−９８、ならびに神経細胞によって分泌されたチロシン硫酸化糖タンパク質の産生を報告しているＫａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．８９：５５９−５６７及びＫａｎａｎ＆Ａｌ−Ｕｂａｉｄｉ，２０１５，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１３３：１２６−１３１を参照のこと。
（ｉｉ）ｈＩＤＵＡは、図１と特定される６つのアスパラギン（「Ｎ」）のグリコシル化部位を有する（Ｎ１１０ＦＴ；Ｎ１９０ＶＳ；Ｎ３３６ＴＴ；Ｎ３７２ＮＴ；Ｎ４１５ＨＴ；Ｎ４５１ＲＳ）。Ｎ３７２のＮ−グリコシル化は、基質との結合及び酵素活性に要求され、かつマンノース−６−リン酸化は分泌された酵素の細胞取り込み及びＭＰＳ  Ｉ細胞の横断修正に要求される。Ｎ−結合型グリコシル化部位は、複合型、ハイマンノース型、及びリン酸化マンノース糖質部分を含むが（図４）、分泌形態のみが細胞によって取り込まれる（Ｍｙｅｒｏｗｉｔｚ＆Ｎｅｕｆｅｌｄ，１９８１，上記）。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定した場合に７６〜８２ｋＤａの（使用するアッセイに応じて）、２，６−シアル酸付加され、及びマンノース−６リン酸化された、ＩＤＵＡ糖タンパク質の継続的分泌をもたらすべきである。分泌されたグリコシル化／リン酸化ＩＤＵＡは、ＣＮＳの形質導入されていない神経細胞及びグリア細胞によって取り込まれ、かつ正しくプロセシングされるべきである。
（ｉｉｉ）リソソームタンパク質の細胞性及び細胞内輸送／取り込みは、Ｍ６Ｐを介する。Ｄａｎｉｅｌｅ  ２００２（Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ  １５８８（３）：２０３−９）においてイズロン酸−２−スルファターゼ酵素について行われたように、分泌タンパク質のＭ６Ｐ含有量を測定することは、可能である。（例えば、５ｍＭの）抑制性Ｍ６Ｐの存在下では、非神経細胞または非グリア細胞、例えばＤａｎｉｅｌｅ  ２００２の遺伝子操作された腎細胞によって生成された酵素前駆体の取り込みは、Ｄａｎｉｅｌｅ  ２００２に示されたように、対照細胞のレベルに近いレベルまで減少すると予測される。抑制性Ｍ６Ｐの存在下であっても、脳細胞、例えば神経細胞及びグリア細胞によって生成される酵素前駆体の取り込みは、取り込み量が対照細胞より４倍高く、抑制性Ｍ６Ｐの非存在下で遺伝子操作された腎細胞によって生成された酵素前駆体の酵素活性（すなわち、取り込み）のレベルと同等であったＤａｎｉｅｌｅ  ２００２に示されたように高レベルを維持すると予測される。このアッセイを用いると、脳細胞によって生成される酵素前駆体のＭ６Ｐ含有量を予測し、特に、異なる種類の細胞によって生成される酵素前駆体中のＭ６Ｐ含有量を比較することが可能となる。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、そのようなアッセイにおいて抑制性Ｍ６Ｐの存在下で、高レベルで神経細胞及びグリア細胞に取り込まれ得る、ｈＩＤＵＡの継続的分泌をもたらすべきである。
（ｉｖ）Ｎ−結合型グリコシル化部位に加えて、ｈＩＤＵＡは、結合及び活性のために要求されるＮ３７２を含有するドメインの近くに、チロシン（「Ｙ」）硫酸化部位（ＡＤＴＰＩＹ２９６ＮＤＥＡＤＰＬＶＧＷＳ）を含有する。（例えば、その全体が参照により組み込まれている、タンパク質チロシン硫酸化を受けるチロシン残基を取り囲むアミノ酸の解析についてのＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０：２１３８−２１６４、特に、ｐ．２１５４を参照のこと。「規則」は、以下の通りに要約することができる：Ｙ残基がＹの＋５〜−５位内にＥまたはＤを有し、かつＹの−１位が中性または酸性荷電アミノ酸であるが、硫酸化を無効化する塩基性アミノ酸、例えばＲ、Ｋ、またはＨではない）。いかなる理論に束縛されることも意図するものではないが、チロシン硫酸化領域内の突然変異（例えば、Ｗ３０６Ｌ）が酵素活性の減少及び疾患と関連することは公知であるため、ｈＩＤＵＡのこの部位の硫酸化は活性にきわめて重要となり得る。（Ｍａｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ  １１０：１４６２８、ｐｐ．１４６３２−１４６３３を参照のこと）。
（ｖ）ＣＮＳのヒト細胞によるｈＩＤＵＡのグリコシル化により、安定性、半減期を向上させ、かつ導入遺伝子産物の望まない凝集を減らすことができるグリカンが付加される。大事なことに、本発明のＨｕＧｌｙＩＤＵＡに付加されるグリカンは２，６−シアル酸を含み、Ｎｅｕ５Ａｃ（「ＮＡＮＡ」）を組み込むが、そのヒドロキシル化誘導体ＮｅｕＧｃ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸、すなわち「ＮＧＮＡ」または「Ｎｅｕ５Ｇｃ」）を組み込まない高度にプロセシングされた複合型二分岐Ｎ−グリカンである。そのようなグリカンは、この翻訳後修飾を行うのに要求される２，６−シアリルトランスフェラーゼを有さず、バイセクティングＧｌｃＮＡｃも産生しないが、Ｎｅｕ５Ａｃ（ＮＡＮＡ）の代わりにヒトにとって典型的でない（かつ潜在的に免疫原性の）シアル酸であるＮｅｕ５Ｇｃ（ＮＧＮＡ）を付加するＣＨＯ細胞において作製されるラロニダーゼには存在しない。例えば、Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３６（６）：１１１０−１１２２（Ｅａｒｌｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  ｐｐ．１−１３、ｐ．５）、及びＨａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ  １９：２６１２−２６３０（「ＣＨＯ細胞株は、α２，６−シアリルトランスフェラーゼの欠如のため、グリコシル化に関して『表現形上制限されている』と考えられている」）を参照のこと。さらに、ＣＨＯ細胞は大部分の個体に存在する抗α−Ｇａｌ抗体と反応して、高濃度でアナフィラキシーを誘発し得る免疫原性グリカン、α−Ｇａｌ抗原も生産し得る。例えば、Ｂｏｓｑｕｅｓ，２０１０，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２８：１１５３−１１５６を参照のこと。本発明のＨｕＧｌｙＩＤＵＡのヒトグリコシル化パターンは、導入遺伝子産物の免疫原性を低下させ、かつ効力を向上させるべきである。
（ｖｉ）ヒトＣＮＳ細胞におけるロバストな翻訳後プロセスである、ｈＩＤＵＡのチロシン硫酸化は、導入遺伝子産物のプロセシング及び活性を向上させるべきである。リソソームタンパク質のチロシン硫酸化の意義は、明らかにされていない；しかし、他のタンパク質では、タンパク質−タンパク質相互作用（抗体及び受容体）のアビディティが増大し、タンパク質分解性プロセシング（ペプチドホルモン）が促進されることが示されている。（Ｍｏｏｒｅ，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２４２４３−４６；及びＢｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：３０７３−７９を参照のこと）。チロシン硫酸化（ＩＤＵＡプロセシングの最終ステップとして起こる場合がある）を担うチロシンタンパク質スルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ１）は、明らかに脳（ＴＰＳＴ１のための遺伝子発現データは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｇｘａ／ｈｏｍｅにてアクセス可能なＥＭＢＬ−ＥＢＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｔｌａｓに見出すことができる）でより高いレベル（ｍＲＮＡに基づいて）で発現する。そのような翻訳後修飾は、最高でも、ＣＨＯ細胞産物であるラロニダーゼにおいて少数しか存在しない。ヒトＣＮＳ細胞とは異なり、ＣＨＯ細胞は、分泌細胞ではなく、翻訳後チロシン硫酸化のための能力が限られている。（例えば、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ＆Ｅｚｂａｎ，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１５３３−１５３７、特にｐ．１５３７の考察を参照のこと）。
（ｖｉｉ）導入遺伝子産物の免疫原性は、患者の免疫状態、注入されたタンパク質薬物の構造及び特徴、投与経路、ならびに治療の持続時間を含む様々な因子によって誘導され得る。プロセス関連不純物、例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞ＤＮＡ、及び化学的残留物、ならびに産物関連不純物、例えばタンパク質分解物及び構造特製、例えばグリコシル化、酸化、及び凝集（肉眼不可視粒子）は免疫反応を増強するアジュバントとしての機能を果たすことによって免疫原性を増加させる場合がある。プロセス関連及び産物関連不純物の量は、製造プロセス：商業的に製造されるＩＤＵＡ産物に影響を及ぼし得る細胞培養、精製、製剤化、保存、及び取扱いの影響を受け得る。遺伝子治療では、タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏで生産され、その結果、プロセス関連不純物は存在せず、タンパク質産物は組換え技術によって生産されるタンパク質と関連した生産物関連不純物／分解物、例えばタンパク質凝集物及びタンパク質酸化物を含む可能性は低い。凝集は、例えば、タンパク質生産及び貯蔵と関連付けられ、高いタンパク質濃度、製造装置及び容器との表面相互作用、ならびに特定の緩衝液システムを用いた精製プロセスに起因する。しかし、導入遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させる場合、凝集を促進するこれらの条件は存在しない。また、酸化、例えばメチオニン、トリプトファン、及びヒスチジンの酸化は、タンパク質生産及び貯蔵と関連付けられ、例えばストレス負荷された細胞培養条件、金属及び空気との接触、ならびに緩衝液及び賦形剤中の不純物によって引き起こされる。ｉｎ  ｖｉｖｏで発現されるタンパク質は、ストレス負荷条件下で酸化され得るが、ヒトは多くの生物と同様に、抗酸化防衛システムを備えており、それにより酸化ストレスが低下するだけでなく、酸化を修復、及び／または逆行させもする。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで生産されるタンパク質が、酸化形態にある可能性は低い。凝集及び酸化は両方とも、効力、ＰＫ（クリアランス）に影響を及ぼし得、免疫原となる懸念を増大させ得る。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、商業的に製造された産物と比較して免疫原性の低下したｈＩＤＵＡの継続的分泌をもたらすべきである。
【００１９】
前述の理由のために、ＨｕＧｌｙＩＤＵＡの生産は、例えば、ＭＰＳ  Ｉ疾患（ハーラー、ハーラー−シャイエ、またはシャイエを含むが、これらに限定はされない）と診断される患者（ヒト対象）のＣＳＦにＨｕＧｌｙＩＤＵＡをコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトを投与して、形質導入されたＣＮＳ細胞によって分泌される完全ヒトグリコシル化、マンノース−６−リン酸化、硫酸化導入遺伝子産物を継続的に供給するＣＮＳ中の永続的なデポーを作製することによる、遺伝子治療によって達成されるＭＰＳ  Ｉの治療のための「バイオベター」分子をもたらすべきである。デポーからＣＳＦ中に分泌されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡ導入遺伝子産物は、ＣＮＳ中の細胞によりエンドサイトーシスされ、ＭＰＳ  Ｉレシピエント細胞における酵素欠陥を「横断修正」する。
【００２０】
遺伝子治療またはタンパク質治療アプローチにおいて生産される全てのｈＩＤＵＡ分子が完全にグリコシル化され、硫酸化されることは、必須ではない。むしろ、生産される糖タンパク質の集団は、有効性を実証するのに十分なグリコシル化（２，６−シアル酸付加及びマンノース−６−リン酸化を含む）及び硫酸化を受けるべきである。本発明の遺伝子治療処置の目的は、疾患の進行を減速させ、または停止させることである。有効性は、認知機能（例えば、神経認知機能の低下の防止もしくは減少）；ＣＳＦ及び／もしくは血清中の疾患バイオマーカー（例えば、ＧＡＧ）の低下；及び／または、ＣＳＦ及び／もしくは血清のＩＤＵＡ酵素活性の増加を測定することによってモニタリングすることができる。炎症の徴候及び他の安全事象をモニタリングすることもできる。
【００２１】
遺伝子治療に対する代替または追加治療として、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡ糖タンパク質は組換えＤＮＡ技術によってヒト細胞株で生産することができ、糖タンパク質は、ＥＲＴのために、全身的に及び／またはＣＳＦに、ＭＰＳ  Ｉと診断された患者に投与することができる。そのような組換え糖タンパク質生産のために使用することができるヒト細胞株は、これらに限定されないが、数例を挙げればＨＴ−２２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＣＮ−１Ａ、ＨＣＮ−２、ＮＴ２、ＳＨ−ＳＹ５ｙ、ｈＮＳＣ１１、ＲｅＮｃｅｌｌ  ＶＭ、ヒト胎児腎２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、線維肉腫ＨＴ−１０８０、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰ、ＨｕＨ−７、及び網膜細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＲＰＥを含む（例えば、その全体が参照により組み込まれている、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡ糖タンパク質の組換え生産のために使用することができるヒト細胞株の総説についてのＤｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３６（６）：１１１０−１１２２の「Ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ：  ｈｉｓｔｏｒｙ，ｓｔａｔｕｓ，ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ」を参照のこと）。完全なグリコシル化、特にシアル酸付加及びチロシン硫酸化を保証するために、生産に使用する細胞株をチロシン−Ｏ−硫酸化を担うα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（またはα−２，３−及びα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの両方）及び／またはＴＰＳＴ−１及びＴＰＳＴ−２酵素を共発現するように宿主細胞を操作することによって強化することができる。
【００２２】
ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの送達が免疫反応を最小化すべきである一方、ＣＮＳ関連遺伝子治療に関する毒性の最も明白な潜在的源は、遺伝的にＩＤＵＡを欠損しており、したがってタンパク質及び／または導入遺伝子を送達するために用いるベクターを潜在的に寛容しないヒト対象において、発現されたｈＩＤＵＡタンパク質に対する免疫が発生する。
【００２３】
したがって、好ましい実施形態では、患者を免疫抑制治療で共治療することは、特にＩＤＵＡのレベルが０に近い重度の疾患（例えば、ハーラー）を有する患者を治療する場合に、適切である。タクロリムスまたはラパマイシン（シロリムス）を、例えばミコフェノール酸と組合わせた、もしくはプレドニゾロン及び／またはメチルプレドニゾロンなどのコルチコステロイドと組合わせたレジメン、または組織移植手順において使用される他の免疫抑制レジメンを伴う免疫抑制治療を、利用することができる。そのような免疫抑制治療は、遺伝子治療の過程で投与することができ、ある実施形態において、免疫抑制治療による前処理が好ましい場合がある。免疫抑制治療は、治療医師の判断に基づいて、遺伝子治療処置の後も継続することができ、その後、免疫寛容が誘発された場合、例えば、１８０日後に、中止してもよい。
【００２４】
他の利用可能な治療の送達を伴うＣＳＦへのＨｕＧｌｙＩＤＵＡの送達の組合わせは、本発明の方法に包含される。追加治療は、遺伝子治療処置の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。本発明の遺伝子治療と併用することができるＭＰＳ  Ｉのための利用可能な治療には、これらに限定はされないが、全身的に、もしくはＣＳＦに投与されるラロニダーゼを使用する酵素補充療法及び／またはＨＳＣＴ療法が挙げられる。
（例示的実施形態）
１．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒト神経細胞によって生産された治療有効量の組換えヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）を送達することを含む、方法。
２．ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒトグリア細胞によって生産された治療有効量の組換えヒトＩＤＵＡを送達することを含む、方法。
３．該ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、免疫抑制治療を該対象に施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することをさらに含む、パラグラフ１または２に記載の方法。
４．ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象の治療方法であって、
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のα２，６−シアル酸付加ヒトＩＤＵＡを送達することを含む、方法。
５．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なＮｅｕＧｃを含まない治療有効量のグリコシル化ヒトＩＤＵＡを送達することを含む、方法。
６．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まない治療有効量のグリコシル化ヒトＩＤＵＡを送達することと、
該ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、免疫抑制治療を該対象に施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む、方法。
７．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
該ヒト対象の脳の脳脊髄液にチロシン硫酸化を含む治療有効量のヒトＩＤＵＡを送達することを含む、方法。
８．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、該ＩＤＵＡがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にα２，６−シアル酸付加される、投与することを含む、方法。
９．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、該ＩＤＵＡがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃを含まない、投与することを含む、方法。
１０．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、該ＩＤＵＡがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まない、投与することを含む、方法。
１１．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、該ＩＤＵＡがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にチロシン硫酸化される、投与することを含む、方法。
１２．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α２，６−シアル酸付加グリカンを含む該ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することを含む、方法。
１３．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃを含まないグリコシル化ヒトＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することを含む、方法。
１４．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まないグリコシル化ヒトＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することを含む、方法。
１５．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に、治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することにより、チロシン硫酸化を含む前記ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することを含む、方法。
１６．該ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、該対象に、（ａ）タクロリムス及びミコフェノール酸、（ｂ）ラパマイシン及びミコフェノール酸、または（ｃ）タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び／またはメチルプレドニゾロンの組合わせを投与することを含む、免疫抑制療法を該対象に施し、かつその後も継続することをさらに含む、パラグラフ３〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．該免疫抑制治療を１８０日後に中止する、パラグラフ１６に記載の方法。
１８．該ヒトＩＤＵＡが配列番号１のアミノ酸配列を含む、パラグラフ１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
１９．該ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、該対象に、（ａ）タクロリムス及びミコフェノール酸、（ｂ）ラパマイシン及びミコフェノール酸、または（ｃ）タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び／またはメチルプレドニゾロンの組合わせを投与することを含む、免疫抑制療法を該対象に施すことをさらに含む、パラグラフ１８に記載の方法。
２０．該免疫抑制治療を１８０日後に中止する、パラグラフ１９に記載の方法。
２１．α２，６−シアル酸付加グリカンを含む該ＩＤＵＡの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を該組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、パラグラフ１２に記載の方法。
２２．検出可能なＮｅｕＧｃを含まない該グリコシル化ＩＤＵＡの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を該組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、パラグラフ１３に記載の方法。
２３．検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まない該グリコシル化ＩＤＵＡの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を該組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、パラグラフ１４のいずれか１つに記載の方法。
２４．チロシン硫酸化を含む該ＩＤＵＡの生産を、細胞培養中でヒト神経細胞株を該組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認する、パラグラフ１５に記載の方法。
２５．生産をマンノース−６−リン酸の存在下及び非存在下で確認する、パラグラフ２１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．該発現ベクターまたは組換えヌクレオチド発現ベクターが、シグナルペプチドをコードする、パラグラフ８〜１５及び２１〜２５のいずれか１つに記載の方法、またはパラグラフ８〜１５のいずれか１つに直接的もしくは間接的に従属する場合のパラグラフ１６〜１７のいずれか１つに記載の方法。
２７．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α２，６−シアル酸付加グリカンを含む該ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することと、を含み、
該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中で該α２，６−シアル酸付加グリカンを含む該ＩＤＵＡを生産する、方法。
２８．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃを含まないグリコシル化ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することを含み、該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃを含まない該ＩＤＵＡを生産する、方法。
２９．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まないグリコシル化ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することを含み、該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まない該ＩＤＵＡを生産する、方法。
３０．ムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の治療方法であって、
該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果チロシン硫酸化を含む該ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することを含み、
該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でチロシン硫酸化された該ＩＤＵＡを生産する、方法。
３１．該ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、該対象に、（ａ）タクロリムス及びミコフェノール酸、（ｂ）ラパマイシン及びミコフェノール酸、または（ｃ）タクロリムス、ラパマイシン、及びコルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び／またはメチルプレドニゾロンの組合わせを投与することを含む、免疫抑制療法を該対象に施し、かつその後も継続することをさらに含む、パラグラフ２７〜３０のいずれかに記載の方法。
３２．該免疫抑制治療を１８０日後に中止する、パラグラフ３１に記載の方法。
３３．該ヒト対象が３歳未満である、パラグラフ１〜３２のいずれか１つに記載の方法。
３４．該ヒト対象が３歳未満であり、該発現ベクターまたは該組換えヌクレオチド発現ベクターが、２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量、１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量、または５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量（例えば、単回固定用量）の用量で投与される（例えば、ＩＣ投与（例えば、後頭下注入によって））、パラグラフ８〜１５及び２１〜３３のいずれか１つに記載の方法、または請求項８〜１５のいずれか１項に直接的もしくは間接的に従属する場合のパラグラフ１６〜２０のいずれか１つに記載の方法。
３５．該ヒト対象が３歳未満であり、該発現ベクターまたは該組換えヌクレオチド発現ベクターが、２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量〜１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量（例えば、単回固定用量）の用量で投与される（例えば、ＩＣ投与（例えば、後頭下注入によって））、パラグラフ８〜１５及び２１〜３３のいずれか１つに記載の方法、または請求項８〜１５のいずれか１項に直接的もしくは間接的に従属する場合のパラグラフ１６〜２０のいずれか１つに記載の方法。
３６．該ヒト対象が３歳未満であり、該発現ベクターまたは該組換えヌクレオチド発現ベクターが、１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量〜５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量（例えば、単回固定用量）の用量で投与される（例えば、ＩＣ投与（例えば、後頭下注入によって））、パラグラフ８〜１５及び２１〜３３のいずれか１つに記載の方法、または請求項８〜１５のいずれか１項に直接的もしくは間接的に従属する場合のパラグラフ１６〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
（４．図面の簡単な説明）
【図１】ヒトＩＤＵＡのアミノ酸配列である。６つのＮ−結合型グリコシル化部位（Ｎ）は、太字にして下線を引いてある；１つのチロシン−Ｏ−硫酸化部位（Ｙ）は太字にして下線を引き、完全な硫酸化部位配列は網掛けをつけてある；かつジスルフィド結合（２つのシステイン残基；Ｃ）は、太字にして、下線を引いてある。ＣＨＯ細胞中で作製される分泌型組換え産物のＮ末端はＡ２６であるが、ヒト肝臓のネイティブ細胞内酵素のＮ末端はＥ２７である（Ｋａｋｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐ  Ｐｕｒｉｆ  ５：２２５−２３２，ｐ．２３０を参照のこと）。
【００２６】
【図２】ｈＩＤＵＡの公知のオーソログとのマルチプル配列アラインメントである。配列は、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ  ｖｅｒ．２を使用してアラインした（Ｌａｒｋｉｎ  ＭＡ，ｅｔ  ａｌ．，２００７，Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ  ａｎｄ  Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｘ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ２．０．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２３（２１）：２９４７−２９４８）。種の名前及びタンパク質ＩＤは、以下の通りである：ヒト（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ；ＮＰ＿０００１９４．２）、イヌ（Ｃａｎｉｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ；Ｍ８１８９３．１）、ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ；ＸＰ＿００２６８８４９２．１）、マウス（Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ；ＮＰ＿０３２３５１．２）、ラット（Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；ＮＰ＿００１１６５５５５．１）、カモノハシ（Ｏｒｎｉｔｈｏｒｈｙｎｃｈｕｓ  ａｎａｔｉｎｕｓ；ＸＰ＿００１５１４１０２．２）、ニワトリ（Ｇａｌｌｕｓ  ｇａｌｌｕｓ；ＮＰ＿００１０２６６０４．１）、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ；ＮＰ＿００１０８７０３１．１）、ゼブラフィッシュ（Ｄａｎｉｏ  ｒｅｒｉｏ；ＸＰ＿００１９２３６８９．３）、ウニ（Ｓｔｒｏｎｇｙｌｏｃｅｎｔｒｏｔｕｓ  ｐｕｒｐｕｒａｔｕｓ；ＸＰ＿７９６８１３．３）ユウレイボヤ（Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ；ＸＰ＿００２１２０９３７．１）、及びショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；ＮＰ＿６０９４８９．１）。ヒトタンパク質（Ｎ１１０、Ｎ１９０、Ｎ３３６、Ｎ３７２、Ｔ３７４、Ｎ４１５、Ｎ４５１）のＮ−グリコシル化部位；基質結合に関与する残基（Ｒ８９、Ｈ９１、Ｎ１８１、Ｅ１８２、Ｈ２６２、Ｋ２６４、Ｅ２９９、Ｄ３４９、及びＲ３６３）及びＮ３７２でのＮ−グリカンとの相互作用に関与する残基（Ｐ５４、Ｈ５８、Ｗ３０６、Ｓ３０７、Ｙ３５５、Ｒ３６８及びＱ３７０）は、網掛けによって示す。（適応元：Ｍａｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ  １１０：１４６２８−１４６３３；Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ  Ｍａｔｅｒｉａｌ，Ｆｉｇ．Ｓ８）。
【００２７】
【図３】ＭＰＳ  Ｉ突然変異、ＩＤＵＡの構造変化及び表現型である。（Ｓａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  １１１：１０７−１１２，Ｔａｂｌｅ  ３より）。
【００２８】
【図４】ＣＨＯ細胞によって分泌された組換えヒトα−Ｌ−イズロニダーゼの６つのグリコシル化部位のオリゴ糖である。Ｃは複合型；Ｍはハイマンノース型；Ｐは、リン酸化されたハイマンノース型である。大文字はよく識別された、主要なオリゴ糖を意味するが、小文字は軽微なまたは不完全に特徴づけられた構成要素を意味する。（Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２２７５８−２２７６５より）。
【００２９】
【図５】ＡＡＶキャプシド１〜９のＣｌｕｓｔａｌマルチプル配列アラインメントである（配列番号１６〜２６）。他のアラインされたＡＡＶキャプシドの対応する位置からアミノ酸残基を「動員する」ことによって、アミノ酸置換（一番下の列に太字で示す）がＡＡＶ９及びＡＡＶ８キャプシドになされ得る。「ＨＶＲ」＝超可変領域と呼ばれる配列領域である。
【発明の詳細な説明】
【００３０】
５．発明の詳細な説明
本発明はハーラー、ハーラー−シャイエ、またはシャイエ症候群と診断された患者を含むが、これらに限定されないムコ多糖症Ｉ型（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象の中枢神経系の脳脊髄液（ＣＳＦ）に完全ヒトグリコシル化（ＨｕＧｌｙ）α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＨｕＧｌｙＩＤＵＡ）を送達することを含む。好ましい実施形態において、治療は遺伝子治療を介して、例えば、ヒトＩＤＵＡ（ｈＩＤＵＡ）またはｈＩＤＵＡの誘導体をコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトをＭＰＳ  Ｉと診断された患者（ヒト対象）のＣＳＦに投与して、継続的に完全ヒトグリコシル化導入遺伝子産物をＣＮＳに供給する形質導入細胞の永続的なデポーを作製することにより、達成される。デポーからＣＳＦに分泌されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡは、ＣＮＳ中の細胞によってエンドサイトーシスされて、レシピエント細胞における酵素欠損を「横断修正（ｃｒｏｓｓ−ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ）」する。代替の実施形態において、ＨｕＧｌｙＩＤＵＡを細胞培養で生産して、酵素補充療法（「ＥＲＴ」）として、例えば酵素を注入することにより投与することができる。しかしながら、遺伝子治療アプローチは、ＥＲＴを上回るいくつかの利点を提供する−酵素は血液脳関門を通過することができないため、酵素の全身送達によってはＣＮＳは治療されず；かつ本発明の遺伝子治療アプローチとは異なり、ＣＮＳへの酵素の直接の送達には、大きな負担となるだけでなく感染のリスクを生む反復注入が必要となるであろう。
【００３１】
導入遺伝子によってコードされるＨｕＧｌｙＩＤＵＡは、これらに限定はされないが、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＤＵＡ（ｈＩＤＵＡ）（図１に示す）、ならびにアミノ酸の置換、欠失、または付加を有する、例えばこれらに限定はされないが、図２に示すＩＤＵＡのオーソログ中に対応する非保存的残基から選択されるアミノ酸置換を含む、ｈＩＤＵＡの誘導体を含むことができる（ただし、そのような突然変異が、図３に示す（その全体が参照により本明細書に組み込まれているＳａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  １１１：１０７−１１２の５７個のＭＰＳ  Ｉ突然変異を列記する表３より）、またはその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているＶｅｎｔｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ＃５２２  Ｏｎｌｉｎｅ（「Ｖｅｎｔｕｒｉ  ２００２」）、もしくはＢｅｒｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ３２：Ｅ２１８９−Ｅ２２１０（「Ｂｅｒｔｏｌａ  ２０１１」）によって報告された、重度の、中程度に重度の、中程度の、もしくは軽症型ＭＰＳ  Ｉ表現型において同定されたいずれの突然変異も含まないことを条件とする）ｈＩＤＵＡの誘導体を含むことができる。
【００３２】
例えば、ｈＩＤＵＡの特定位置でのアミノ酸置換は図２（その全体が参照により本明細書に組み込まれているＭａｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ  １１０：１４６２８、図Ｓ８に報告されたオーソログのアラインメントを示す）に表されるＩＤＵＡオーソログにおけるその位置に見出される対応する非保存的アミノ酸残基から選択することができる（ただし、そのような置換は図３に示されるか、または上記Ｖｅｎｔｕｒｉ  ２００２もしくはＢｅｒｔｏｌａ  ２０１１において報告される有害な突然変異のいずれも含まないことを条件とする）。結果として得られる導入遺伝子産物は、細胞培養または試験動物で、突然変異がＩＤＵＡ機能を損なわないことを保証するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの従来のアッセイを使用して試験することができる。選択される好ましいアミノ酸置換、欠失、または付加は、細胞培養または動物モデルにおけるＭＰＳ  Ｉのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの従来のアッセイによって試験されるＩＤＵＡの酵素活性、安定性、または半減期を維持するか、または増加させるものとするべきである。例えば、導入遺伝子産物の酵素活性は基質として４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−イズロニドを用いる従来の酵素アッセイを使用して評価することができる（使用可能な例示的なＩＤＵＡ酵素アッセイについては、例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ９２：２５７−２６５；Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５２：２１−２８；及びＫａｋｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐ  Ｐｕｒｉｆ  ５：２２５−２３２を参照のこと）。導入遺伝子産物がＭＰＳ  Ｉ表現型を修正する能力は、例えば、培養中でＭＰＳ  Ｉ細胞にｈＩＤＵＡまたは誘導体をコードするウイルスベクターもしくは他のＤＮＡ発現コンストラクトを形質導入することにより、培養中のＭＰＳ  Ｉ細胞にｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡもしくは誘導体を加えることにより、またはＭＰＳ  Ｉ細胞をｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡもしくは誘導体を発現及び分泌するように操作したヒト宿主細胞と共培養することにより、細胞培養中で評価し、例えば、培養中のＭＰＳ  Ｉ細胞におけるＩＤＵＡ酵素活性及び／またはＧＡＧ貯蔵量の低下を検出することにより、ＭＰＳ  Ｉ培養細胞の欠陥の修正を決定することができる（例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているＭｙｅｒｏｗｉｔｚ＆Ｎｅｕｆｅｌｄ，１９８１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５６：３０４４−３０４８；及びＡｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：３７１−３７９を参照のこと）。
【００３３】
ＭＰＳ  Ｉのための動物モデルは、マウス（例えば、Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ６（４）：５０３−５１１を参照のこと）、短毛の雑種ネコ（例えば、Ｈａｓｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  １３（１１）：１２９４−９７を参照のこと）、及びいくつかの品種のイヌ（例えば、Ｍｅｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４（３）：７６３−７６８；Ｓｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １０９（２）：２４４−２４８を参照のこと）について記載されている。イヌのＭＰＳ  Ｉモデルは、ＩＤＵＡ突然変異により検出可能なタンパク質が喪失するため、ＭＰＳ  Ｉの最も重度の形態であるハーラー症候群に類似している。ＩＤＵＡタンパク質間の遺伝子相同性が高いこと（図２のアラインメントを参照のこと）は、ｈＩＤＵＡが動物において機能的であることを意味し、ｈＩＤＵＡを包含する治療はこれらの動物モデルで試験することができる。
【００３４】
好ましくは、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡ導入遺伝子は、神経細胞及び／またはグリア細胞において機能する発現制御エレメント、例えば、ＣＢ７プロモーター（ニワトリβ−アクチンプロモーター及びＣＭＶエンハンサー）によって制御されるべきであり、かつベクターによって駆動される導入遺伝子の発現を増強する他の発現制御エレメント（例えば、ニワトリβ−アクチンイントロン及びウサギβ−グロビンポリＡシグナル）を含むことができる。ｈｕＩＤＵＡ導入遺伝子のためのｃＤＮＡコンストラクトには、形質導入されたＣＮＳ細胞による適切な翻訳中及び翻訳後プロセシング（グリコシル化及びタンパク質硫酸化）を保証するシグナルペプチドのためのコード配列を含めるべきである。ＣＮＳ細胞によって使用されるそのようなシグナルペプチドには：
オリゴデンドロサイト−ミエリン糖タンパク質（ｈＯＭＧ）シグナルペプチド：
ＭＥＹＱＩＬＫＭＳＬＣＬＦＩＬＬＦＬＴＰＧＩＬＣ（配列番号２）
Ｅ１Ａ刺激遺伝子の細胞リプレッサー２（ｈＣＲＥＧ２）シグナルペプチド：
ＭＳＶＲＲＧＲＲＰＡＲＰＧＴＲＬＳＷＬＬＣＣＳＡＬＬＳＰＡＡＧ（配列番号３）
Ｖ−セット及び膜貫通ドメイン含有２Ｂ（ｈＶＳＴＭ２Ｂ）シグナルペプチド：ＭＥＱＲＮＲＬＧＡＬＧＹＬＰＰＬＬＬＨＡＬＬＬＦＶＡＤＡ（配列番号４）
プロトカドヘリンα−１（ｈＰＣＡＤＨＡ１）シグナルペプチド：
ＭＶＦＳＲＲＧＧＬＧＡＲＤＬＬＬＷＬＬＬＬＡＡＷＥＶＧＳＧ（配列番号５）
ＦＡＭ１９Ａ１（ＴＡＦＡ１）シグナルペプチド：
ＭＡＭＶＳＡＭＳＷＶＬＹＬＷＩＳＡＣＡ（配列番号６）
インターロイキン−２シグナルペプチド：
ＭＹＲＭＱＬＬＳＣＩＡＬＩＬＡＬＶＴＮＳ（配列番号１４）があり得るが、これらに限定されない。
シグナルペプチドは本明細書において、リーダー配列またはリーダーペプチドとも呼ぶことができる。
【００３５】
導入遺伝子を送達するために使用される組換えベクターは、神経細胞及び／またはグリア細胞を含むがこれらに限定されない、ＣＮＳの細胞への向性を有するべきである。そのようなベクターは非複製組換えアデノ随伴ウイルスベクター（「ｒＡＡＶ」）を含むことができ、特にＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０キャプシドを有するウイルスベクターが好ましい。これらに限定されないが、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第７，９０６，１１１号においてＷｉｌｓｏｎによって記載された、特に好ましくはＡＡＶ／ｈｕ．３１及びＡＡＶ／ｈｕ．３２を有する、ＡＡＶバリアントキャプシド、ならびにその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第８，６２８，９６６号、米国特許第８，９２７，５１４号、及びＳｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２２：１６２５−１６３４においてＣｈａｔｔｅｒｊｅｅによって記載されたＡＡＶバリアントキャプシドを使用することができる。しかしながら、「ネイキッドＤＮＡ」コンストラクト（５．２節を参照のこと）と呼ばれるレンチウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、または非ウイルス性発現ベクターを含むがこれらに限定されない、他のウイルスベクターを使用することができる。
【００３６】
ＣＳＦへの投与に好適な医薬組成物は、生理的に適合性の水性緩衝剤、界面活性剤、及び任意の賦形剤を含む製剤化緩衝液中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡベクターの懸濁液を含む。ある実施形態において、医薬組成物は、大槽内投与（大槽内への注入）に好適である。ある実施形態において、医薬組成物は、Ｃ１−２穿刺を介した、くも膜下腔内への注入に好適である。ある実施形態において、医薬組成物は、髄腔内投与に好適である。ある実施形態において、医薬組成物は、脳室内投与に好適である。ある実施形態において、医薬組成物は、腰椎穿刺を介する投与に好適である。
【００３７】
組換えベクターの治療有効用量は、くも膜下腔内投与を介して（すなわち、くも膜下腔内へ注入して、組換えベクターがＣＳＦを通じて散布され、ＣＮＳの細胞が形質導入されるようにする）、ＣＳＦに投与すべきである。このことは、いくつかの方法で、例えば、頭蓋内（大槽または脳室内）注入、または腰椎槽への注入によって達成することができる。例えば、（大槽内への）大槽内（ＩＣ）注入は、ＣＴガイド後頭下穿刺によって実施することができ、または、患者に実行できそうな場合は、Ｃ１−２穿刺を介してくも膜下腔への注入を実施することができ、または、腰椎穿刺（典型的にＣＳＦの試料を収集するために実施される診断手順）を、ＣＳＦにアクセスするために使用することができる。あるいは、脳室内（ＩＣＶ）投与（血液脳関門を透過しない抗感染剤または抗がん剤の導入に使用される、より侵襲的な技術）を使用して、組換えベクターを直接脳室内に滴下することができる。あるいは、鼻腔内投与を使用して、ＣＮＳに組換えベクターを送達してもよい。ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＣＳＦ濃度を少なくとも９．２５μｇ／ｍＬのＣｍｉｎ、または９．２５〜２７７μｇ／ｍＬの範囲の濃度に維持する用量を使用すべきである。
【００３８】
ＣＳＦ濃度は、後頭部または腰椎穿刺から得られるＣＳＦ流体中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの濃度を直接測定することによってモニタリングし、または患者の血清において検出されたｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの濃度から外挿によって推定することができる。ある実施形態において、血清中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡが１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬであることは、ＣＳＦ中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡが１〜３０ｍｇであることを示す。ある実施形態において、組換えベクターは、血清中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡを１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬに維持する用量で、ＣＳＦに投与する。
【００３９】
背景として、ヒトＩＤＵＡは、６５３アミノ酸のポリペプチドとして翻訳され、図１において表される６つの可能性のある部位（Ｎ１１０、Ｎ１９０、Ｎ３３６、Ｎ３７２、Ｎ４１５、及びＮ４５１）でＮ−グリコシル化される。シグナル配列が除去され、ポリペプチドはリソソーム内で成熟形態にプロセシングされる：７５ｋＤａの細胞内前駆体は数時間で７２ｋＤａまでトリミングされ、最終的に、４〜５日かけて６６ｋＤａの細胞内形態にプロセシングされる。ＩＤＵＡの分泌形態（使用するアッセイに応じて７６ｋＤａまたは８２ｋＤａ）は、マンノース−６−リン酸受容体を介して細胞に容易にエンドサイトーシスされ、より小さい細胞内形態と同様にプロセシングされる。（その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｍｙｅｒｏｗｉｔｚ＆Ｎｅｕｆｅｌｄ，１９８１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５６：３０４４−３０４８；Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２５９：１９９−２０８；Ｔａｙｌｏｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ．２７４：２６３−２６８；及びＺｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７２：２２７５８−２２７６５を参照のこと）。
【００４０】
ｈＩＤＵＡの全体の構造は、３つのドメインからなる：残基４２−３９６は、古典的な（β／α）トリオースリン酸イソメラーゼ（ＴＩＭ）バレルドメインを形成し、残基２７−４２及び３９７−５４５は、短いへリックス−ループ−へリックス（４８２−５０８）を有するβ−サンドイッチドメインを形成し、かつ残基５４６−６４２は、Ｉｇ様ドメインを形成する。最後に挙げた２つのドメインは、Ｃ５４１及びＣ５７７間のジスルフィド架橋によって連結される。β−サンドイッチ及びＩｇ様ドメインは、ＴＩＭバレルの１番目、７番目、及び８番目のα−へリックスに結合される。β−ヘアピン（β１２−β１３）は、ＴＩＭバレルの８番目のβ−ストランド及び８番目のα−へリックスの間に挿入され、これは基質結合及び酵素活性に要求されるＮ−グリコシル化Ｎ３７２を含む。（図１、及びその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているＭａｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ  １１０：１４６２８−１４６３３，及びＳａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  １１１：１０７−１１２に記載の結晶構造を参照のこと）。
【００４１】
本発明は部分的に、以下の原理に基づく：
（ｉ）ＣＮＳの神経細胞及びグリア細胞はＣＮＳにおけるロバストなプロセスである、グリコシル化及びチロシン−Ｏ−硫酸化を含む分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を有する分泌細胞である。ヒトＣＮＳ細胞が行う翻訳後修飾についての、その各々の全体が参照により組み込まれている、例えばヒト脳マンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）グリコプロテオームについて記載され、脳が他の組織に見出されるよりはるかに多くの個々のアイソフォームを有するより多くのタンパク質及びマンノース−６−リン酸化タンパク質を含むことを注記した、Ｓｌｅａｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ  ５：１５２０−１５３２、及びＳｌｅａｔ  １９９６，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７１：１９１９１−９８、ならびに神経細胞によって分泌されたチロシン硫酸化糖タンパク質の産生を報告しているＫａｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００９，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．８９：５５９−５６７及びＫａｎａｎ＆Ａｌ−Ｕｂａｉｄｉ，２０１５，Ｅｘｐ．Ｅｙｅ  Ｒｅｓ．１３３：１２６−１３１を参照のこと。
（ｉｉ）ｈＩＤＵＡは、図１と特定される６つのアスパラギン（「Ｎ」）のグリコシル化部位を有する（Ｎ１１０ＦＴ；Ｎ１９０ＶＳ；Ｎ３３６ＴＴ；Ｎ３７２ＮＴ；Ｎ４１５ＨＴ；Ｎ４５１ＲＳ）。Ｎ３７２のＮ−グリコシル化は、基質との結合及び酵素活性に要求され、かつマンノース−６−リン酸化は分泌された酵素の細胞取り込み及びＭＰＳ  Ｉ細胞の横断修正に要求される。Ｎ−結合型グリコシル化部位は、複合型、ハイマンノース型、及びリン酸化マンノース糖質部分を含むが（図４）、分泌形態のみが細胞によって取り込まれる。（Ｍｙｅｒｏｗｉｔｚ＆Ｎｅｕｆｅｌｄ，１９８１，上記）。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって測定した場合に７６〜８２ｋＤａの（使用するアッセイに応じて）、２，６−シアル酸付加され、及びマンノース−６リン酸化された、ＩＤＵＡ糖タンパク質の継続的分泌をもたらすべきである。分泌されたグリコシル化／リン酸化ＩＤＵＡは、ＣＮＳの形質導入されていない神経細胞及びグリア細胞によって取り込まれ、かつ正しくプロセシングされるべきである。
（ｉｉｉ）リソソームタンパク質の細胞性及び細胞内輸送／取り込みは、Ｍ６Ｐを介する。Ｄａｎｉｅｌｅ  ２００２においてイズロン酸−２−スルファターゼ酵素について行われたように、分泌タンパク質のＭ６Ｐ含有量を測定することは、可能である。（例えば、５ｍＭの）抑制性Ｍ６Ｐの存在下では、非神経細胞または非グリア細胞、例えばＤａｎｉｅｌｅ  ２００２の遺伝子操作された腎細胞によって生成された酵素前駆体の取り込みは、Ｄａｎｉｅｌｅ  ２００２に示されたように、対照細胞のレベルに近いレベルまで減少すると予測される。抑制性Ｍ６Ｐの存在下であっても、脳細胞、例えば神経細胞及びグリア細胞によって生成される酵素前駆体の取り込みは、取り込み量が対照細胞より４倍高く、抑制性Ｍ６Ｐの非存在下で遺伝子操作された腎細胞によって生成された酵素前駆体の酵素活性（すなわち、取り込み）のレベルと同等であったＤａｎｉｅｌｅ  ２００２に示されたように高レベルを維持すると予測される。このアッセイを用いると、脳細胞によって生成される酵素前駆体のＭ６Ｐ含有量を予測し、特に、異なる種類の細胞によって生成される酵素前駆体中のＭ６Ｐ含有量を比較することが可能となる。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、そのようなアッセイにおいて抑制性Ｍ６Ｐの存在下で、高レベルで神経細胞及びグリア細胞に取り込まれ得る、ｈＩＤＵＡの継続的分泌をもたらすべきである。
（ｉｖ）Ｎ−結合型グリコシル化部位に加えて、ｈＩＤＵＡは、結合及び活性のために要求されるＮ３７２を含有するドメインの近くに、チロシン（「Ｙ」）硫酸化部位（ＡＤＴＰＩＹ２９６ＮＤＥＡＤＰＬＶＧＷＳ）を含有する。（例えば、その全体が参照により組み込まれている、タンパク質チロシン硫酸化を受けるチロシン残基を取り囲むアミノ酸の解析についてのＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０：２１３８−２１６４、特に、ｐ．２１５４を参照のこと。「規則」は、以下の通りに要約することができる：Ｙ残基がＹの＋５〜−５位内にＥまたはＤを有し、かつＹの−１位が中性または酸性荷電アミノ酸であるが、硫酸化を無効化する塩基性アミノ酸、例えばＲ、Ｋ、またはＨではない）。いかなる理論に束縛されることも意図するものではないが、チロシン硫酸化領域内の突然変異（例えば、Ｗ３０６Ｌ）が酵素活性の減少及び疾患と関連することは公知であるため、ｈＩＤＵＡのこの部位の硫酸化は活性にきわめて重要となり得る。（Ｍａｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ  １１０：１４６２８、ｐｐ．１４６３２−１４６３３を参照のこと）。
（ｖ）ＣＮＳのヒト細胞によるｈＩＤＵＡのグリコシル化により、安定性、半減期を向上させ、かつ導入遺伝子産物の望まない凝集を減らすことができるグリカンが付加される。大事なことに、本発明のＨｕＧｌｙＩＤＵＡに付加されるグリカンは２，６−シアル酸を含み、Ｎｅｕ５Ａｃ（「ＮＡＮＡ」）を組み込むが、そのヒドロキシル化誘導体ＮｅｕＧｃ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸、すなわち「ＮＧＮＡ」または「Ｎｅｕ５Ｇｃ」）を組み込まない高度にプロセシングされた複合型二分岐Ｎ−グリカンである。そのようなグリカンは、この翻訳後修飾を行うのに要求される２，６−シアリルトランスフェラーゼを有さず、バイセクティングＧｌｃＮＡｃも産生しないが、Ｎｅｕ５Ａｃ（ＮＡＮＡ）の代わりにヒトにとって典型的でない（かつ潜在的に免疫原性の）シアル酸であるＮｅｕ５Ｇｃ（ＮＧＮＡ）を付加するＣＨＯ細胞において作製されるラロニダーゼには存在しない。例えば、Ｄｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３６（６）：１１１０−１１２２（Ｅａｒｌｙ  Ｏｎｌｉｎｅ  ｐｐ．１−１３、ｐ．５）、及びＨａｇｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８  Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒ  １９：２６１２−２６３０（「ＣＨＯ細胞株は、α２，６−シアリルトランスフェラーゼの欠如のため、グリコシル化に関して『表現形上制限されている』と考えられている」）を参照のこと。さらに、ＣＨＯ細胞は大部分の個体に存在する抗α−Ｇａｌ抗体と反応して、高濃度でアナフィラキシーを誘発し得る免疫原性グリカン、α−Ｇａｌ抗原も生産し得る。例えば、Ｂｏｓｑｕｅｓ，２０１０，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２８：１１５３−１１５６を参照のこと。本発明のＨｕＧｌｙＩＤＵＡのヒトグリコシル化パターンは、導入遺伝子産物の免疫原性を低下させ、かつ効力を向上させるべきである。
（ｖｉ）ヒトＣＮＳ細胞におけるロバストな翻訳後プロセスである、ｈＩＤＵＡのチロシン硫酸化は、導入遺伝子産物のプロセシング及び活性を向上させるべきである。リソソームタンパク質のチロシン硫酸化の意義は、明らかにされていない；しかし、他のタンパク質では、タンパク質−タンパク質相互作用（抗体及び受容体）のアビディティが増大し、タンパク質分解性プロセシング（ペプチドホルモン）が促進されることが示されている。（Ｍｏｏｒｅ，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２４２４３−４６；及びＢｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：３０７３−７９を参照のこと）。チロシン硫酸化（ＩＤＵＡプロセシングの最終ステップとして起こる場合がある）を担うチロシンタンパク質スルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ１）は、明らかに脳（ＴＰＳＴ１のための遺伝子発現データは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｇｘａ／ｈｏｍｅにてアクセス可能なＥＭＢＬ−ＥＢＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｔｌａｓに見出すことができる）でより高いレベル（ｍＲＮＡに基づいて）で発現する。そのような翻訳後修飾は、最高でも、ＣＨＯ細胞産物であるラロニダーゼにおいて少数しか存在しない。ヒトＣＮＳ細胞とは異なり、ＣＨＯ細胞は、分泌細胞ではなく、翻訳後チロシン硫酸化のための能力が限られている。（例えば、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ＆Ｅｚｂａｎ，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１５３３−１５３７、特にｐ．１５３７の考察を参照のこと）。
（ｖｉｉ）導入遺伝子産物の免疫原性は、患者の免疫状態、注入されたタンパク質薬物の構造及び特徴、投与経路、ならびに治療の持続時間を含む様々な因子によって誘導され得る。プロセス関連不純物、例えば宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、宿主細胞ＤＮＡ、及び化学的残留物、ならびに産物関連不純物、例えばタンパク質分解物及び構造特製、例えばグリコシル化、酸化、及び凝集（肉眼不可視粒子）は免疫反応を増強するアジュバントとしての機能を果たすことによって免疫原性を増加させる場合がある。プロセス関連及び産物関連不純物の量は、製造プロセス：商業的に製造されるＩＤＵＡ産物に影響を及ぼし得る細胞培養、精製、製剤化、保存、及び取扱いの影響を受け得る。遺伝子治療では、タンパク質はｉｎ  ｖｉｖｏで生産され、その結果、プロセス関連不純物は存在せず、タンパク質産物は組換え技術によって生産されるタンパク質と関連した生産物関連不純物／分解物、例えばタンパク質凝集物及びタンパク質酸化物を含む可能性は低い。凝集は、例えば、タンパク質生産及び貯蔵と関連付けられ、高いタンパク質濃度、製造装置及び容器との表面相互作用、ならびに特定の緩衝液システムを用いた精製プロセスに起因する。しかし、導入遺伝子をｉｎ  ｖｉｖｏで発現させる場合、凝集を促進するこれらの条件は存在しない。また、酸化、例えばメチオニン、トリプトファン、及びヒスチジンの酸化は、タンパク質生産及び貯蔵と関連付けられ、例えばストレス負荷された細胞培養条件、金属及び空気との接触、ならびに緩衝液及び賦形剤中の不純物によって引き起こされる。ｉｎ  ｖｉｖｏで発現されるタンパク質は、ストレス負荷条件下で酸化され得るが、ヒトは多くの生物と同様に、抗酸化防衛システムを備えており、それにより酸化ストレスが低下するだけでなく、酸化を修復、及び／または逆行させもする。したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏで生産されるタンパク質が、酸化形態にある可能性は低い。凝集及び酸化は両方とも、効力、ＰＫ（クリアランス）に影響を及ぼし得、免疫原となる懸念を増大させ得る。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチは、商業的に製造された製品と比較して免疫原性が低下したｈＩＤＵＡの継続的分泌をもたらすべきである。
【００４２】
前述の理由のために、ＨｕＧｌｙＩＤＵＡの生産は、例えば、ＭＰＳ  Ｉ疾患（ハーラー、ハーラー−シャイエ、またはシャイエを含むが、これらに限定はされない）と診断される患者（ヒト対象）のＣＳＦにＨｕＧｌｙＩＤＵＡをコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトを投与して、形質導入されたＣＮＳ細胞によって分泌される完全ヒトグリコシル化、マンノース−６−リン酸化、硫酸化導入遺伝子産物を継続的に供給するＣＮＳ中の永続的なデポーを作製することによる、遺伝子治療によって達成されるＭＰＳ  Ｉの治療のための「バイオベター」分子をもたらすべきである。デポーからＣＳＦ中に分泌されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡ導入遺伝子産物は、ＣＮＳ中の細胞によりエンドサイトーシスされ、ＭＰＳ  Ｉレシピエント細胞における酵素欠陥を「横断修正」する。
【００４３】
遺伝子治療またはタンパク質治療アプローチにおいて生産される全てのｈＩＤＵＡ分子が完全にグリコシル化され、硫酸化されることは、必須ではない。むしろ、生産される糖タンパク質の集団は、有効性を実証するのに十分なグリコシル化（２，６−シアル酸付加及びマンノース−６−リン酸化を含む）及び硫酸化を受けるべきである。本発明の遺伝子治療処置の目的は、疾患の進行を減速させ、または停止させることである。有効性は、認知機能（例えば、神経認知機能の低下の防止もしくは減少）；ＣＳＦ及び／もしくは血清中の疾患バイオマーカー（例えば、ＧＡＧ）の低下；及び／または、ＣＳＦ及び／もしくは血清のＩＤＵＡ酵素活性の増加を測定することによってモニタリングすることができる。炎症の徴候及び他の安全事象をモニタリングすることもできる。
【００４４】
遺伝子治療に対する代替または追加治療として、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡ糖タンパク質は組換えＤＮＡ技術によってヒト細胞株で生産することができ、糖タンパク質は、ＥＲＴのために、全身的に及び／またはＣＳＦに、ＭＰＳ  Ｉと診断された患者に投与することができる。そのような組換え糖タンパク質生産のために使用することができるヒト細胞株は、これらに限定されないが、数例を挙げればＨＴ−２２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＣＮ−１Ａ、ＨＣＮ−２、ＮＴ２、ＳＨ−ＳＹ５ｙ、ｈＮＳＣ１１、ＲｅＮｃｅｌｌ  ＶＭ、ヒト胎児腎２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、線維肉腫ＨＴ−１０８０、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰ、ＨｕＨ−７、及び網膜細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＲＰＥを含む（例えば、その全体が参照により組み込まれている、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡ糖タンパク質の組換え生産のために使用することができるヒト細胞株の総説についてのＤｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３６（６）：１１１０−１１２２の「Ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ：  ｈｉｓｔｏｒｙ，ｓｔａｔｕｓ，ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ」を参照のこと）。完全なグリコシル化、特にシアル酸付加及びチロシン硫酸化を保証するために、生産に使用する細胞株をチロシン−Ｏ−硫酸化を担うα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（またはα−２，３−及びα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの両方）及び／またはＴＰＳＴ−１及びＴＰＳＴ−２酵素を共発現するように宿主細胞を操作することによって強化することができる。
【００４５】
ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの送達が免疫反応を最小化すべきである一方、ＣＮＳ関連遺伝子治療に関する毒性の最も明白な潜在的源は、遺伝的にＩＤＵＡを欠損しており、したがってタンパク質及び／または導入遺伝子を送達するために用いるベクターを潜在的に寛容しないヒト対象において、発現されたｈＩＤＵＡタンパク質に対する免疫が発生する。
【００４６】
したがって、好ましい実施形態では、患者を免疫抑制治療で共治療することは、特にＩＤＵＡのレベルが０に近い重度の疾患（例えば、ハーラー）を有する患者を治療する場合に、適切である。タクロリムスまたはラパマイシン（シロリムス）を、例えばミコフェノール酸と組合わせた、及び／またはプレドニゾロン及び／またはメチルプレドニゾロンなどのコルチコステロイドと組合わせたレジメン、または組織移植手順において使用される他の免疫抑制レジメンを伴う免疫抑制治療を、利用することができる。そのような免疫抑制治療は、遺伝子治療の過程で投与することができ、ある実施形態において、免疫抑制治療による前処理が好ましい場合がある。免疫抑制治療は、治療医師の判断に基づいて、遺伝子治療処置の後も継続することができ、その後、免疫寛容が誘発された場合、例えば、１８０日後に、中止してもよい。
【００４７】
一実施形態において、免疫抑制は、コルチコステロイド、例えばプレドニゾロン及び／またはメチルプレドニゾロンの投与、ならびに任意にＭＭＦとともに投与されるタクロリムス及び／またはシロリムスのレジメンを含む。例えば、１回のコルチコステロイド、例えばメチルプレドニゾロンを注入し、その後、経口コルチコステロイドを投与し、１２週の経過にわたり段階的に漸減し、続いて中断する。同時に、タクロリムス及びシロリムスを組合わせで低用量（例えば、４〜８ｎｇ／ｍＬの血清濃度を維持する）で、またはラベル用量で単独で、２４〜４８週にわたって経口投与することができる。タクロリムスまたはシロリムスは、ＭＭＦと組合わせてラベル用量で投与されることもできる。したがって、患者は直ちに利用可能なステロイドの初期の注入を受け、このステロイドは続いて経口投与によって維持されて、１２週までに漸減される。さらなる免疫抑制は、任意にＭＭＦと組合わせて、タクロリムス及び／またはシロリムスによって４８週を通じて維持される。
【００４８】
他の利用可能な治療の送達を伴うＣＳＦへのＨｕＧｌｙＩＤＵＡの送達の組合わせは、本発明の方法に包含される。追加治療は、遺伝子治療処置の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。本発明の遺伝子治療と併用することができるＭＰＳ  Ｉのための利用可能な治療には、これらに限定はされないが、全身的に、もしくはＣＳＦに投与されるラロニダーゼを使用する酵素補充療法及び／またはＨＳＣＴ療法が挙げられる。
【００４９】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療するための方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒト神経細胞によって生産される治療有効量の組換えヒトＩＤＵＡを送達することを含む方法が、本明細書に記載される。ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療するための方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液にヒトグリア細胞によって生産される治療有効量の組換えヒトＩＤＵＡを送達することを含む方法が、本明細書に記載される。
【００５０】
ある実施形態において、ムコ多糖症Ｉ（ＭＰＳ  Ｉ）と診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のα２，６−シアル酸付加ヒトα−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）を送達することと、ヒトＩＤＵＡによる治療の前または同時に、免疫抑制療法を該対象に施し、かつその後も免疫抑制療法を継続することと、を含む方法が、本明細書において提供される。
【００５１】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なＮｅｕＧｃを含まない治療有効量のグリコシル化ヒトＩＤＵＡを送達することと、ヒトＩＤＵＡによる治療の前または同時に、免疫抑制療法を該対象に施し、かつその後も免疫抑制療法を継続することと、を含む方法が、本明細書において提供される。
【００５２】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まない治療有効量のグリコシル化ヒトＩＤＵＡを送達することと、ヒトＩＤＵＡによる治療の前または同時に、免疫抑制療法を該対象に施し、かつその後も免疫抑制療法を継続することと、を含む方法が、本明細書において提供される。
【００５３】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に、チロシン硫酸化を含む治療有効量のヒトＩＤＵＡを送達することと、ヒトＩＤＵＡによる治療の前または同時に、免疫抑制療法を該対象に施し、かつその後も免疫抑制療法を継続することと、を含む方法が、本明細書において提供される。
【００５４】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、該ＩＤＵＡがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にα２，６−シアル酸付加される、投与することと、
【００５５】
該発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む方法が、本明細書に記載される。
【００５６】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、該ＩＤＵＡがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃを含まない、投与することと、該発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む方法が、本明細書において提供される。
【００５７】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、ａ）該ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、該ヒトＩＤＵＡがヒトまたは不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まない、投与する工程と、ｂ）該発現ベクターの投与の前に、及び／またはそれと同時に、及び／またはその後に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続する工程と、を含む方法が、本明細書において提供される。
【００５８】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳にヒトＩＤＵＡをコードする発現ベクターを投与することであって、該ＩＤＵＡがヒト不死化神経細胞において該発現ベクターから発現される際にチロシン硫酸化される、投与することと、該発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む方法が、本明細書において提供される。
【００５９】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α２，６−シアル酸付加グリカンを含む該ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することと、該発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む方法が、本明細書において提供される。
【００６０】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃを含まないグリコシル化ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することと、該発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む方法が、本明細書において提供される。
【００６１】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まないグリコシル化ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することと、該発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む方法が、本明細書において提供される。
【００６２】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果チロシン硫酸化を含む該ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することと、該発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含む方法が、本明細書において提供される。
【００６３】
ある実施形態において、α２，６−シアル化グリカンを含むＩＤＵＡの生産は、細胞培養中でヒト神経細胞株を組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認される。ある実施形態において、検出可能なＮｅｕＧｃを含まないグリコシル化ＩＤＵＡの生産は、細胞培養中でヒト神経細胞株を組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認される。ある実施形態において、検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まないグリコシル化ＩＤＵＡの生産は、細胞培養中でヒト神経細胞株を組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認される。ある実施形態において、チロシン硫酸化を含むＩＤＵＡの生産は、細胞培養中でヒト神経細胞株を組換えヌクレオチド発現ベクターを用いて形質導入することにより確認される。具体的な実施形態において、ＩＤＵＡ導入遺伝子はシグナルペプチドをコードする。ある実施形態において、ヒト神経細胞株は、ＨＴ−２２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＣＮ−１Ａ、ＨＣＮ−２、ＮＴ２、ＳＨ−ＳＹ５ｙ、ｈＮＳＣ１１、またはＲｅＮｃｅｌｌＶＭである。
【００６４】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果α２，６−シアル酸付加グリカンを含む該ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することと、該発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含み、該組換えベクターが、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中で該α２，６−シアル酸付加グリカンを含む該ＩＤＵＡを生産する、方法が、本明細書において提供される。ある実施形態において、ヒト神経細胞は、ＨＴ−２２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＣＮ−１Ａ、ＨＣＮ−２、ＮＴ２、ＳＨ−ＳＹ５ｙ、ｈＮＳＣ１１、またはＲｅＮｃｅｌｌＶＭ細胞である。
【００６５】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃを含まないグリコシル化ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することと、該発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含み、該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃを含まない該ＩＤＵＡを生産する、方法が、本明細書において提供される。ある実施形態において、ヒト神経細胞は、ＨＴ−２２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＣＮ−１Ａ、ＨＣＮ−２、ＮＴ２、ＳＨ−ＳＹ５ｙ、ｈＮＳＣ１１、またはＲｅＮｃｅｌｌＶＭ細胞である。
【００６６】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まないグリコシル化ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することと、該発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含み、該組換えベクターは、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でグリコシル化されるが検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ抗原を含まない該ＩＤＵＡを生産する、方法が、本明細書において提供される。ある実施形態において、ヒト神経細胞は、ＨＴ−２２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＣＮ−１Ａ、ＨＣＮ−２、ＮＴ２、ＳＨ−ＳＹ５ｙ、ｈＮＳＣ１１、またはＲｅＮｃｅｌｌＶＭ細胞である。
【００６７】
ある実施形態において、ＭＰＳ  Ｉと診断されたヒト対象を治療する方法であって、該ヒト対象の脳の脳脊髄液に治療有効量のヒトＩＤＵＡをコードする組換えヌクレオチド発現ベクターを投与することであって、その結果チロシン硫酸化を含む該ＩＤＵＡを放出するデポーが形成される、投与することと、該発現ベクターの投与の前に、またはそれと同時に、該対象に免疫抑制治療を施し、かつその後も免疫抑制治療を継続することと、を含み、該組換えベクターが、培養中でヒト神経細胞への形質導入に使用する場合、該細胞培養中でチロシン硫酸化を含む該ＩＤＵＡを生産する、方法が、本明細書において提供される。ある実施形態において、ヒト神経細胞は、ＨＴ−２２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＣＮ−１Ａ、ＨＣＮ−２、ＮＴ２、ＳＨ−ＳＹ５ｙ、ｈＮＳＣ１１、またはＲｅＮｃｅｌｌＶＭ細胞である。
【００６８】
ある実施形態において、ヒトＩＤＵＡは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、免疫抑制治療は、ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、（ａ）タクロリムス及びミコフェノール酸、または（ｂ）ラパマイシン及びミコフェノール酸の組合わせを対象に投与し、かつその後も継続することを含む。ある実施形態において、免疫抑制療法は１８０日後に中止される。
【００６９】
好ましい実施形態において、グリコシル化ＩＤＵＡは、検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌを含まない。本明細書で使用する語句「検出可能なＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ」は、ＮｅｕＧｃ及び／またはα−Ｇａｌ部分が当技術分野において公知の標準アッセイ方法によって検出可能であることを意味する。例えば、ＮｅｕＧｃは、ＮｅｕＧｃを検出する方法について参照により本明細書に組み込まれているＨａｒａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，“Ｈｉｇｈｌｙ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−ａｎｄ  Ｎ−Ｇｌｙｃｏｌｙｌｎｅｕｒａｍｉｎｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ  ａｎｄ  Ｕｒｉｎｅ  ａｎｄ  Ｒａｔ  Ｓｅｒｕｍ  ｂｙ  Ｒｅｖｅｒｓｅｄ−Ｐｈａｓｅ  Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  ｗｉｔｈ  Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．” Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒ．，Ｂ：Ｂｉｏｍｅｄ．３７７：１１１−１１９に従ったＨＰＬＣによって検出することができる。あるいは、ＮｅｕＧｃは、質量分析によって検出することができる。α−Ｇａｌは、ＥＬＩＳＡを使用して（例えば、Ｇａｌｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，“Ａ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ａｌｐｈａ−Ｇａｌ  ｅｐｉｔｏｐｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｎ  ｃｅｌｌｓ  ｂｙ  ａ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉ−Ｇａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｙ．”Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ．６５（８）：１１２９−３２を参照のこと）、または質量分析により（例えば、Ａｙｏｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，“Ｃｏｒｒｅｃｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｇｌｙｃｏ−ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ，ｍｉｄｄｌｅ−ｕｐ，ｍｉｄｄｌｅ−ｄｏｗｎ  ａｎｄ  ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ  ＥＳＩ  ａｎｄ  ＭＡＬＤＩ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．” Ｌａｎｄｅｓ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．５（５）：６９９−７１０を参照のこと）検出することができる。また、Ｐｌａｔｔｓ−Ｍｉｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，“Ａｎａｐｈｙｌａｘｉｓ  ｔｏ  ｔｈｅ  Ｃａｒｂｏｈｙｄｒａｔｅ  Ｓｉｄｅ−Ｃｈａｉｎ  Ａｌｐｈａ−ｇａｌ”  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ａｌｌｅｒｇｙ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．３５（２）：２４７−２６０において引用されている参考文献も参照のこと。
【００７０】
（５．１Ｎ−グリコシル化及びチロシン硫酸化）
（５．１．１．Ｎ−グリコシル化）
ＣＮＳの神経細胞及びグリア細胞は、グリコシル化及びチロシン−Ｏ−硫酸化を含む分泌タンパク質の翻訳後プロセシングのための細胞機構を備える分泌細胞である。ｈＩＤＵＡは、図１において特定される６つのアスパラギン（「Ｎ」）グリコシル化部位（Ｎ１１０ＦＴ；Ｎ１９０ＶＳ；Ｎ３３６ＴＴ；Ｎ３７２ＮＴ；Ｎ４１５ＨＴ；Ｎ４５１ＲＳ）を有する。Ｎ３７２のＮ−グリコシル化は、基質との結合及び酵素活性に要求され、かつマンノース−６−リン酸化は分泌された酵素の細胞取り込み及びＭＰＳ  Ｉ細胞の横断修正に要求される。Ｎ−結合型グリコシル化部位は、複合型、ハイマンノース型、及びリン酸化マンノース糖質部分を含むが（図４）、分泌形態のみが細胞によって取り込まれる。本明細書に記載の遺伝子治療アプローチでは、２，６シアル酸付加され、かつマンノース−６リン酸化されたＩＤＵＡ糖タンパク質の継続的分泌をもたらすべきである。分泌されたグリコシル化／リン酸化ＩＤＵＡは、ＣＮＳの形質導入されていない神経細胞及びグリア細胞によって取り込まれ、かつ正しくプロセシングされるべきである。
【００７１】
ＣＮＳのヒト細胞によるｈＩＤＵＡのグリコシル化により、安定性、半減期を向上させ、かつ導入遺伝子産物の望まない凝集を減らすことができるグリカンが付加される。大事なことに、本発明のＨｕＧｌｙＩＤＵＡに付加されるグリカンは２，６−シアル酸を含み、Ｎｅｕ５Ａｃ（「ＮＡＮＡ」）を組み込むが、そのヒドロキシル化誘導体ＮｅｕＧｃ（Ｎ−グリコリルノイラミン酸、すなわち「ＮＧＮＡ」または「Ｎｅｕ５Ｇｃ」）を組み込まない高度にプロセシングされた複合型二分岐Ｎ−グリカンである。そのようなグリカンは、この翻訳後修飾を行うのに要求される２，６−シアリルトランスフェラーゼを有さず、バイセクティングＧｌｃＮＡｃも産生しないが、Ｎｅｕ５Ａｃ（ＮＡＮＡ）の代わりにヒトにとって典型的でない（かつ潜在的に免疫原性の）シアル酸であるＮｅｕ５Ｇｃ（ＮＧＮＡ）を付加するＣＨＯ細胞において作製されるラロニダーゼには存在しない。さらに、ＣＨＯ細胞は大部分の個体に存在する抗α−Ｇａｌ抗体と反応して、高濃度でアナフィラキシーを誘発し得る免疫原性グリカン、α−Ｇａｌ抗原も生産し得る。例えば、Ｂｏｓｑｕｅｓ，２０１０，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２８：１１５３−１１５６を参照のこと。本発明のＨｕＧｌｙＩＤＵＡのヒトグリコシル化パターンは、導入遺伝子産物の免疫原性を低下させ、かつ効力を向上させるべきである。
【００７２】
遺伝子治療またはタンパク質治療アプローチにおいて生産される全ての分子が完全にグリコシル化され、硫酸化されることは、必須ではない。むしろ、生産される糖タンパク質の集団は、有効性を実証するのに十分なグリコシル化及び硫酸化を受けるべきである。
【００７３】
具体的な実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡは、神経細胞またはグリア細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させた場合、そのＮ−グリコシル化部位の１００％でグリコシル化され得る。しかしながら、当業者であれば、グリコシル化のメリットが達成されるためには、必ずしも全てのＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＮ−グリコシル化部位がＮ−グリコシル化される必要はないことを認識されよう。むしろ、グリコシル化のメリットは、Ｎ−グリコシル化部位の一定の割合のみがグリコシル化される場合、及び／または発現されたＩＤＵＡ分子の一定の割合のみがグリコシル化される場合に実現され得る。したがって、ある実施形態において、本明細書に記載の方法に従って使用されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡは、神経細胞またはグリア細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させた場合、その利用可能なＮ−グリコシル化部位の１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％でグリコシル化される。ある実施形態において、神経細胞またはグリア細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させた場合、本明細書に記載の方法に従って使用されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡ分子の１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または９０％〜１００％は、それらの利用可能なＮ−グリコシル化部位の少なくとも１つでグリコシル化される。
【００７４】
具体的な実施形態において、ＨｕＧｌｙＩＤＵＡを神経細胞またはグリア細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させた場合、本明細書に記載の方法に従って使用されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡに存在するＮ−グリコシル化部位の少なくとも１０％、２０％  ３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％はＮ−グリコシル化部位に存在するＡｓｎ残基（または他の関連した残基）でグリコシル化される。すなわち、結果として生じるＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＮ−グリコシル化部位の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または９９％は、グリコシル化される。
【００７５】
別の具体的な実施形態において、ＨｕＧｌｙＩＤＵＡを神経細胞またはグリア細胞においてｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで発現させた場合、本明細書に記載の方法に従って使用されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡ分子に存在するＮ−グリコシル化部位の少なくとも１０％、２０％  ３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％は、Ｎ−グリコシル化部位に存在するＡｓｎ残基（または他の関連した残基）に結合される同一の結合されたグリカンによりグリコシル化される。すなわち、結果として生じるＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＮ−グリコシル化部位の少なくとも５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％は、同一の結合されたグリカンを有する。
【００７６】
重要なことに、本明細書に記載の方法に従って使用されるＩＤＵＡタンパク質が神経細胞またはグリア細胞において発現される場合、原核生物宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）または真核生物宿主細胞（例えば、ＣＨＯ細胞）におけるｉｎ  ｖｉｔｒｏ生産の必要性は回避される。その代わりに、本明細書に記載の方法の結果（例えば、ＩＤＵＡを発現させるための神経細胞またはグリア細胞の使用）、ＩＤＵＡタンパク質のＮ−グリコシル化部位は、有利なことにヒトの治療に関連及び有益なグリカンで修飾される（ｄｅｃｏｒａｔｅｄ）。ＣＨＯ細胞またはＥ．ｃｏｌｉがタンパク質生産に利用される場合、そのような利点には到達できない；それは、例えばＣＨＯ細胞は、（１）２，６シアリルトランスフェラーゼを発現せず、したがってＮ−グリコシル化の間、２，６シアル酸を付加することができず、かつ（２）シアル酸としてＮｅｕ５Ａｃの代わりにＮｅｕ５Ｇｃを付加することができるためであり、ならびにＥ．ｃｏｌｉは天然にはＮ−グリコシル化に必要な構成要素を含まないためである。したがって、一実施形態において、神経細胞またはグリア細胞において発現され、本明細書に記載の治療方法において使用されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡを生じるＩＤＵＡタンパク質は、ヒト神経細胞またはグリア細胞においてタンパク質がＮ−グリコシル化される様式でグリコシル化されるが、ＣＨＯ細胞においてタンパク質がグリコシル化される様式でグリコシル化されるのではない。別の実施形態において、神経細胞またはグリア細胞において発現されて本明細書に記載の治療方法において使用されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡを生じるＩＤＵＡタンパク質は、神経細胞またはグリア細胞においてタンパク質がＮ−グリコシル化される様式でグリコシル化され、そのようなグリコシル化は、原核生物宿主細胞を使用して、例えばＥ．ｃｏｌｉを使用した場合は手を加えずには不可能である。
【００７７】
タンパク質のグリコシル化パターンを決定するためのアッセイは、当技術分野において公知である。例えば、ヒドラジン分解は、グリカンを分析するために使用することができる。第一に、多糖を、ヒドラジンとのインキュベーションによって、その会合するタンパク質から放出させる（Ｌｕｄｇｅｒ  Ｌｉｂｅｒａｔｅヒドラジン分解グリカン放出キット，Ｏｘｆｏｒｄｓｈｉｒｅ，ＵＫを使用することができる）。求核剤であるヒドラジンは、多糖及びキャリアタンパク質間のグリコシド結合を攻撃して、結合したグリカンを放出させる。Ｎ−アセチル基は、この処理の間、失われて、再Ｎ−アセチル化によって再構成されなければならない。遊離グリカンは、炭素カラム上で精製され、続いて蛍光色素分子である２−アミノベンズアミドを用いて還元末端を標識することができる。標識多糖は、Ｒｏｙｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２００２，３０４（１）：７０−９０のＨＰＬＣプロトコルに従ってＧｌｙｃｏＳｅｐ−Ｎカラム（ＧＬ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）上で分離することができる。結果として生じる蛍光クロマトグラムは、多糖の長さ及び繰り返し単位の数を示す。構造情報は、個々のピークを収集し、引き続きＭＳ／ＭＳ分析を実施することによって集めることができる。それにより、繰り返し単位の単糖の組成及び配列を確認することができ、さらに多糖の組成の均一性を特定することができる。低分子量の特定のピークは、ＭＡＬＤＩ−ＭＳ／ＭＳによって分析でき、その結果を使用してグリカン配列を確認することができる。各ピークは、特定の数の繰り返し単位及びその断片からなるポリマーに対応する。従って、クロマトグラムを用いれば、ポリマー長の分布の測定が可能となる。溶出時間はポリマー長の指標である一方、蛍光強度はそれぞれのポリマーのためのモル存在量と相関する。
【００７８】
タンパク質と会合するグリカンパターンの均一性は、グリカン長及びグリコシル化部位全体に存在するグリカンの数と関係しているため、この均一性は当技術分野で公知の方法、例えばグリカン長及び流体力学半径を測定する方法を使用して評価することができる。サイズ排除ＨＰＬＣは、流体力学半径の測定を可能にする。タンパク質中のグリコシル化部位の数が多いほど、グリコシル化部位がより少ないキャリアと比較して、流体力学半径のばらつきがより大きくなる。しかしながら、単一のグリカン鎖が分析される場合、それらは長さがより高度に制御されているために、より均一になり得る。グリカン長は、ヒドラジン分解、ＳＤＳ  ＰＡＧＥ、及びキャピラリーゲル電気泳動によって測定することができる。さらに、また、均一であることは、特定のグリコシル化部位の使用パターンがより広い／より狭い範囲に変化することを意味し得る。これらの因子は、糖ペプチドＬＣ−ＭＳ／ＭＳで測定することができる。
【００７９】
Ｎ−グリコシル化は、本明細書に記載の方法で使用されるＨｕＧｌｙＩＤＵＡに多くのメリットを付与する。そのようなメリットは、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるタンパク質生産によっては到達不能である。それは、Ｅ．ｃｏｌｉは、Ｎ−グリコシル化に必要とされる構成要素を天然には有しないためである。さらに、いくつかのメリットは例えば、ＣＨＯ細胞におけるタンパク質生産によっては到達不能である。それは、ＣＨＯ細胞が特定のグリカン（例えば、２，６シアル酸）の付加に必要な構成要素を欠いており、かつヒトにとって典型的でないグリカン、例えばＮｅｕ５Ｇｃ及び大部分の個体において免疫原性であり、かつ高濃度ではアナフィラキシーを誘発し得るα−Ｇａｌ抗原を付加し得るためである。従って、ヒト神経細胞またはグリア細胞におけるＩＤＵＡの発現により、そうせずにＣＨＯ細胞または、Ｅ．ｃｏｌｉにおいて生産された場合はタンパク質と会合していないであろう有益なグリカンを含むＨｕＧｌｙＩＤＵＡが生産される。
【００８０】
（５．１．２．チロシン硫酸化）
Ｎ−結合型グリコシル化部位に加えて、ｈＩＤＵＡは、結合及び活性のために要求されるＮ３７２を含有するドメインの近くに、チロシン（「Ｙ」）硫酸化部位（ＡＤＴＰＩＹ２９６ＮＤＥＡＤＰＬＶＧＷＳ）を含有する。（例えば、その全体が参照により組み込まれている、タンパク質チロシン硫酸化を受けるチロシン残基を取り囲むアミノ酸の解析についてのＹａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０：２１３８−２１６４、特に、ｐ．２１５４を参照のこと。「規則」は、以下の通りに要約することができる：Ｙ残基がＹの＋５〜−５位内にＥまたはＤを有し、かつＹの−１位が中性または酸性荷電アミノ酸であるが、硫酸化を無効化する塩基性アミノ酸、例えばＲ、Ｋ、またはＨではない）。いかなる理論に束縛されることも意図するものではないが、チロシン硫酸化領域内の突然変異（例えば、Ｗ３０６Ｌ）が酵素活性の減少及び疾患と関連することは公知であるため、ｈＩＤＵＡのこの部位の硫酸化は活性にきわめて重要となり得る。（Ｍａｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ  １１０：１４６２８、ｐｐ．１４６３２−１４６３３を参照のこと）。
【００８１】
重要なことに、チロシン硫酸化タンパク質は、チロシン硫酸化に要求される酵素を天然には有しないＥ．ｃｏｌｉでは生産することができない。さらに、ＣＨＯ細胞は、チロシン硫酸化について欠陥がある−この細胞は、分泌細胞ではなく、翻訳後のチロシン硫酸化のための能力が限定されている。例えば、Ｍｉｋｋｅｌｓｅｎ＆Ｅｚｂａｎ，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３０：１５３３−１５３７を参照のこと。有利なことに、本明細書において提供する方法は、分泌型であり、かつチロシン硫酸化のための能力を備える神経細胞またはグリア細胞におけるＩＤＵＡ、例えばＨｕＧｌｙＩＤＵＡの発現を必要とする。チロシン硫酸化を検出するためのアッセイは、当技術分野において公知である。例えば、Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ２０：２１３８−２１６４を参照のこと。
【００８２】
ヒトＣＮＳ細胞におけるロバストな翻訳後プロセスである、ｈＩＤＵＡのチロシン硫酸化は、導入遺伝子産物のプロセシング及び活性を向上させるべきである。リソソームタンパク質のチロシン硫酸化の意義は、明らかにされていない；しかし、他のタンパク質では、タンパク質−タンパク質相互作用（抗体及び受容体）のアビディティが増大し、タンパク質分解性プロセシング（ペプチドホルモン）が促進されることが示されている。（Ｍｏｏｒｅ，２００３，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：２４２４３−４６；及びＢｕｎｄｅｇａａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｔｈｅ  ＥＭＢＯ  Ｊ  １４：３０７３−７９を参照のこと）。チロシン硫酸化（ＩＤＵＡプロセシングの最終ステップとして起こる場合がある）を担うチロシンタンパク質スルホトランスフェラーゼ（ＴＰＳＴ１）は、明らかに脳（ＴＰＳＴ１のための遺伝子発現データは、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／ｇｘａ／ｈｏｍｅにてアクセス可能なＥＭＢＬ−ＥＢＩ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ａｔｌａｓに見出すことができる）でより高いレベル（ｍＲＮＡに基づいて）で発現する。そのような翻訳後修飾は、最高でも、ＣＨＯ細胞産物であるラロニダーゼにおいて少数しか存在しない。
【００８３】
（５．２コンストラクト及び製剤化）
α−Ｌ−イズロニダーゼ（ＩＤＵＡ）、例えばヒトＩＤＵＡ（ｈＩＤＵＡ）をコードするウイルスベクターまたは他のＤＮＡ発現コンストラクトは、本明細書において提供する方法における使用のためのものである。本明細書において提供するウイルスベクター及び他のＤＮＡ発現コンストラクトは、脳脊髄液（ＣＳＦ）に、導入遺伝子を送達するための任意の好適な方法を含む。導入遺伝子の送達の手段には、ウイルスベクター、リポソーム、他の脂質を含む複合体、他の高分子複合体、合成修飾ｍＲＮＡ、非修飾ｍＲＮＡ、小分子、非生物活性分子（例えば、金粒子）、重合分子（例えば、デンドリマー）、ネイキッドＤＮＡ、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、またはエピソームが挙げられる。いくつかの実施形態において、ベクターは、標的化ベクター、例えば、神経細胞を標的とするベクターである。
【００８４】
いくつかの態様において、本開示は、ＩＤＵＡ、例えばｈＩＤＵＡをコードする使用のための核酸を提供し、該核酸はサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ＭＭＴプロモーター、ＥＦ−１αプロモーター、ＵＢ６プロモーター、ニワトリβ−アクチンプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＲＰＥ６５プロモーター、及びオプシンプロモーターからなる群から選択されるプロモーターと作用可能に連結されている。
【００８５】
ある実施形態において、１以上の核酸（例えば、ポリヌクレオチド）を含む組換えベクターについて本明細書において提供される。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＤＮＡ及びＲＮＡの組合わせを含むことができる。ある実施形態において、ＤＮＡは、プロモーター配列、関心対象の遺伝子配列（導入遺伝子、例えば、ＩＤＵＡ）、非翻訳領域、及び終結配列からなる群から選択される１以上の配列を含む。ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、関心対象の遺伝子と作用可能に連結されたプロモーターを含む。
【００８６】
ある実施形態において、本明細書に開示する核酸（例えば、ポリヌクレオチド）及び核酸配列は、例えば、当業者に公知の任意のコドン−最適化技術を介して、コドン最適化することができる（例えば、Ｑｕａｘ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  ５９：１４９−１６１を参照のこと）。
【００８７】
（５．２．１．ｍＲＮＡ）
ある実施形態において、本明細書において提供するベクターは、関心対象の遺伝子（例えば、導入遺伝子、例えば、ＩＤＵＡ）をコードしている修飾ｍＲＮＡである。ＣＳＦへの導入遺伝子の送達のための修飾及び非修飾ｍＲＮＡの合成は、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＨｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２７（７）：４７８−４９６において教示される。ある実施形態において、ＩＤＵＡ、例えば、ｈＩＤＵＡをコードしている修飾ｍＲＮＡについて本明細書に記載する。
【００８８】
（５．２．２．ウイルスベクター）
ウイルスベクターには、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ９）、レンチウイルス、ヘルパー依存的アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、センダイウイルス（ｈｅｍａｇｇｌｕｔｉｎｉｎ  ｖｉｒｕｓ  ｏｆ  Ｊａｐａｎ）（ＨＶＪ）、アルファウイルス、ワクシニアウイルス、及びレトロウイルスベクターがある。レトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）及びヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ベースのベクターがある。アルファウイルスベクターには、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）及びシンドビスウイルス（ＳＩＮ）がある。ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、組換えウイルスベクターである。ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、ヒトにおいて複製欠損型となるように、改変される。ある実施形態において、ウイルスベクターは、ハイブリッドベクター、例えば、「ヘルプレス」アデノウイルスベクターに配置されるＡＡＶベクターである。ある実施形態において、第１のウイルスからのウイルスキャプシド及び第２のウイルスからのウイルスエンベロープタンパク質を含むウイルスベクターが、本明細書において提供される。具体的な実施形態において、第２のウイルスは、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ）である。より具体的な実施形態において、エンベロープタンパク質は、ＶＳＶ−Ｇタンパク質である。
【００８９】
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、ＨＩＶベースのウイルスベクターである。ある実施形態において、本明細書において提供するＨＩＶベースのベクターは少なくとも２つのポリヌクレオチドを含み、ｇａｇ及びｐｏｌ遺伝子はＨＩＶゲノム由来のものとし、ｅｎｖ遺伝子は別のウイルス由来のものとする。
【００９０】
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、単純ヘルペスウイルスベースのウイルスベクターである。ある実施形態において、本明細書において提供する単純ヘルペスウイルスベースのベクターは、１以上の前初期（ＩＥ）遺伝子を含まず、そのために細胞傷害性がなくなるように改変する。
【００９１】
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、ＭＬＶベースのウイルスベクターである。ある実施形態において、本明細書において提供するＭＬＶベースのベクターは、ウイルス遺伝子の代わりに最高８ｋｂの異種ＤＮＡを含む。
【００９２】
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、レンチウイルスベースのウイルスベクターである。ある実施形態において、本明細書において提供するレンチウイルスベクターは、ヒトレンチウイルスに由来する。ある実施形態において、本明細書において提供するレンチウイルスベクターは、非ヒトレンチウイルスに由来する。ある実施形態において、本明細書において提供するレンチウイルスベクターは、レンチウイルスキャプシドにパッケージングされる。ある実施形態において、本明細書において提供するレンチウイルスベクターは、以下のエレメント：長い末端反復配列、プライマー結合部位、ポリプリントラクト、ａｔｔ部位、及びキャプシド化部位の１以上を含む。
【００９３】
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、アルファウイルスベースのウイルスベクターである。ある実施形態において、本明細書において提供するアルファウイルスベクターは、組換え、複製欠損アルファウイルスである。ある実施形態において、本明細書において提供するアルファウイルスベクターのアルファウイルスレプリコンは、それらのビリオン表面に機能的な異種リガンドを提示することによって、特定の細胞種に標的化される。
【００９４】
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、ＡＡＶベースのウイルスベクターである。好ましい実施形態では、本明細書において提供するウイルスベクターは、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０ベースのウイルスベクターである。ある実施形態において、本明細書において提供するＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０ベースのウイルスベクターは、ＣＮＳ細胞への向性を保持する。複数のＡＡＶ血清型が特定されている。ある実施形態において、本明細書において提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶの１以上の血清型に由来する成分を含む。ある実施形態において、本明細書において提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶｒｈ１０、またはＡＡＶ１１の１以上に由来する成分を含む。好ましい実施形態において、本明細書において提供するＡＡＶベースのベクターは、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０またはＡＡＶ１１血清型の１以上に由来する成分を含む。ＡＡＶ９ベースのウイルスベクターは、本明細書に記載の方法で使用する。ＡＡＶベースのウイルスベクターの核酸配列ならびに組換えＡＡＶ及びＡＡＶキャプシドの作製方法は、例えばその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、米国特許第７，２８２，１９９  Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９  Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０  Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２  Ｂ２号、及び国際特許出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６号において教示される。一態様において、導入遺伝子（例えば、ＩＤＵＡ）をコードするＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９またはＡＡＶｒｈ１０）ベースのウイルスベクターが、本明細書において提供される。具体的な実施形態において、ＩＤＵＡをコードするＡＡＶ９ベースのウイルスベクターが、本明細書において提供される。より具体的な実施形態において、ｈＩＤＵＡをコードするＡＡＶ９ベースのウイルスベクターが、本明細書において提供される。
【００９５】
（ｉ）調節エレメントの制御下にあり、ＩＴＲと隣接している導入遺伝子を含む発現カセット；及び（ｉｉ）ＡＡＶ９キャプシドタンパク質のアミノ酸配列を有するか、またはＡＡＶ９キャプシドタンパク質（配列番号２６）のアミノ酸配列と少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または９９．９％同一であり、同時にＡＡＶ９キャプシドの生物学的機能を保持するウイルスキャプシド：を含む人工ゲノムを含むＡＡＶ９ベクターを、特定の実施形態において提供する。ある実施形態において、コードされたＡＡＶ９キャプシドは、配列番号２６の配列に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有し、かつＡＡＶ９キャプシドの生物学的機能を保持する。図５は、ＳＵＢＳと表示された列における比較に基づくアラインされた配列の特定の位置で置換され得る潜在的アミノ酸を有する異なるＡＡＶ血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較アラインメントを提供する。したがって、具体的な実施形態において、ＡＡＶ９ベクターは、ネイティブＡＡＶ９配列中のその位置に存在しない図５のＳＵＢＳ列において特定される１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個のアミノ酸置換を有するＡＡＶ９キャプシドバリアントを含む。
【００９６】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法で使用するＡＡＶは、その全体が参照により組み込まれているＺｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．１２（６）：１０５６−１０６８に記載の通り、Ａｎｃ８０またはＡｎｃ８０Ｌ６５である。ある実施形態において、本明細書に記載の方法で使用するＡＡＶは、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第９，１９３，９５６号、第９４５８５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載の通り、以下のアミノ酸挿入：ＬＧＥＴＴＲＰまたはＬＡＬＧＥＴＴＲＰのうちの１つを含む。ある実施形態において、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第９，１９３，９５６号、第９，４５８，５１７号、及び第９，５８７，２８２号、ならびに米国特許出願公開第２０１６／０３７６３２３号に記載の通り、本明細書に記載の方法で使用するＡＡＶは、ＡＡＶ．７ｍ８である。ある実施形態において、本明細書に記載の方法で使用するＡＡＶは、米国特許第９，５８５，９７１号において開示される任意のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ）である。ある実施形態において、本明細書に記載の方法で使用するＡＡＶは、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている以下の特許及び特許出願：米国特許第７，９０６，１１１号；第８，５２４，４４６号；第８，９９９，６７８号；第８，６２８，９６６号；第８，９２７，５１４号；第８，７３４，８０９号；米国第９，２８４，３５７号；第９，４０９，９５３号；第９，１６９，２９９号；第９，１９３，９５６号；第９４５８５１７号；及び第９，５８７，２８２号、米国特許出願公開第２０１５／０３７４８０３号；第２０１５／０１２６５８８号；第２０１７／００６７９０８号；第２０１３／０２２４８３６号；第２０１６／０２１５０２４号；第２０１７／００５１２５７号；及び国際特許出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０３４７９９；ＰＣＴ／ＥＰ２０１５／０５３３３５のいずれかにおいて開示されるＡＡＶである。
【００９７】
ある実施形態において、一本鎖ＡＡＶ（ｓｓＡＡＶ）は、上記の通り使用することができる。ある実施形態において、自己相補的ベクター、例えば、ｓｃＡＡＶを使用することができる（例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているＷｕ，２００７，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１８（２）：１７１−８２，ＭｃＣａｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ，２００１，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ｖｏｌ  ８，Ｎｕｍｂｅｒ  １６，Ｐａｇｅｓ  １２４８−１２５４；及び米国特許第６，５９６，５３５号；第７，１２５，７１７号；及び第７，４５６，６８３号を参照のこと）。
【００９８】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるウイルスベクターは、アデノウイルスベースのウイルスベクターである。組換えアデノウイルスベクターは、ＩＤＵＡの導入に使用することができる。組換えアデノウイルスは、Ｅ１欠失を有し、Ｅ３欠失を有していてもいなくてもよく、かつ発現カセットがいずれかの欠失した領域に挿入されている第一世代のベクターとし得る。組換えアデノウイルスは、Ｅ２及びＥ４領域の完全または部分的欠失を含む第二世代のベクターとし得る。ヘルパー依存型アデノウイルスは、アデノウイルス逆位末端反復配列及びパッケージングシグナル（φ）のみを保持する。導入遺伝子は、パッケージングシグナル及び３’ＩＴＲの間に挿入され、およそ３６ｋｂの野生型のサイズの近くに人工ゲノムを維持するスタッファー配列があってもなくてもよい。アデノウイルスベクターの生産のための例示的なプロトコルは、その全体が参照により本明細書に組み込まれているＡｌｂａ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，“Ｇｕｔｌｅｓｓ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ：ｌａｓｔ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ，”Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １２：Ｓ１８−Ｓ２７に見出すことができる。
【００９９】
ある実施形態において、本明細書に記載の方法で使用されるウイルスベクターは、レンチウイルスベースのウイルスベクターである。組換えレンチウイルスベクターは、ＩＤＵＡの導入に使用することができる。４つのプラスミドを、コンストラクト：Ｇａｇ／ｐｏｌ配列を含むプラスミド、Ｒｅｖ配列を含むプラスミド、エンベロープタンパク質を含むプラスミド（すなわち、ＶＳＶ−Ｇ）、ならびにパッケージングエレメント及びＩＤＵＡ遺伝子を有するＣｉｓプラスミドを作製するために使用する。
【０１００】
レンチウイルスベクター作製のため、とりわけポリエチレンイミンまたはリン酸カルシウムをトランスフェクション薬剤として使用し得ることにより、４つのプラスミドを細胞（すなわち、ＨＥＫ２９３ベースの細胞）に共トランスフェクションする。続いて、上清中のレンチウイルスを採取する（レンチウイルスは、活性を示すために細胞から出芽する必要があるため、細胞からの採取は行う必要がないし、するべきではない）。上清を濾過し（０．４５μｍ）、続いて、塩化マグネシウム及びベンゾナーゼを加える。さらに下流のプロセスは、非常に様々なものがあり得、ＴＦＦ及びカラムクロマトグラフィーの使用が最もＧＭＰに適合するプロセスである。他のプロセスでは、超遠心分離が使用され、カラムクロマトグラフィーを伴ってもよいし、伴わなくてもよい。レンチウイルスベクターの作製のための例示的なプロトコルは、その両方とも全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｌｅｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｉｎ  ２９３Ｔ  ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｅｌｌｓ  ｗｉｔｈ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８：５３１−５３８、及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２，“Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＧＭＰ−Ｇｒａｄｅ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ  Ｉｎｔ．１０（２）：３２−４３に見出すことができる。
【０１０１】
具体的な実施形態において、本明細書に記載の方法に用いられるベクターはＩＤＵＡ（例えば、ｈＩＤＵＡ）をコードするベクターであり、ＣＮＳの細胞または関連した細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの神経細胞）に形質導入した際に、ＩＤＵＡのグリコシル化バリアントが形質導入された細胞によって発現されるようになっている。具体的な実施形態において、本明細書に記載の方法に用いられるベクターはＩＤＵＡ（例えば、ｈＩＤＵＡ）をコードするベクターであり、ＣＮＳの細胞または関連した細胞（例えば、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏの神経細胞）に形質導入した際に、ＩＤＵＡの硫酸化バリアントが細胞によって発現されるようになっている。
【０１０２】
（５．２．３．遺伝子発現のプロモーター及び修飾物質（ｍｏｄｉｆｉｅｒｓ））
ある実施形態において、本明細書において提供するベクターは、遺伝子送達または遺伝子発現（例えば、「発現制御エレメント」）を調節する構成要素を含む。ある実施形態において、本明細書において提供するベクターは、遺伝子発現を調節する構成要素を含む。ある実施形態において、本明細書において提供するベクターは、細胞との結合に影響を及ぼすかまたは細胞を標的とする構成要素を含む。ある実施形態において、本明細書において提供するベクターは、取り込みの後、細胞内でのポリヌクレオチド（例えば、導入遺伝子）の局在化に影響を及ぼす構成要素を含む。ある実施形態において、本明細書において提供するベクターは、例えば、ポリヌクレオチドを取り込んだ細胞を検出するか、または選択するための検出可能な、または選択可能なマーカーとして使用することができる構成要素を含む。
【０１０３】
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、１以上のプロモーターを含む。ある実施形態において、プロモーターは、構成的プロモーターである。代替の実施形態において、プロモーターは、誘導性プロモーターである。ネイティブのＩＤＵＡ遺伝子は、大部分のハウスキーピング遺伝子と同様に、主にＧＣリッチプロモーターを使用する。好ましい実施形態において、ｈＩＤＵＡの持続的な発現を提供する強力な構成的プロモーターを使用する。そのようなプロモーターには、「Ｃ」−サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）初期エンハンサーエレメント；「Ａ」−ニワトリβアクチン遺伝子のプロモーターならびに第一エキソン及びイントロン；ならびに「Ｇ」−ウサギβ−グロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む「ＣＡＧ」合成プロモーターがある（Ｍｉｙａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｇｅｎｅ  ７９：２６９−２７７、及びＮｉｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  １０８：１９３−１９９を参照のこと）。
【０１０４】
ある実施形態において、プロモーターはＣＢ７プロモーターである（その全体が参照により本明細書に組み込まれているＤｉｎｃｕｌｅｓｃｕ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  １６：６４９−６６３を参照のこと）。いくつかの実施形態において、ＣＢ７プロモーターは、ベクターによって駆動される導入遺伝子の発現を増強する他の発現制御エレメントを含む。ある実施形態において、他の発現制御エレメントには、ニワトリβ−アクチンイントロン及び／またはウサギβ−グロビンｐｏｌＡシグナルがある。ある実施形態において、プロモーターは、ＴＡＴＡボックスを含む。ある実施形態において、プロモーターは、１以上のエレメントを含む。ある実施形態において、１以上のプロモーターエレメントは、互いに対して逆向きにしても、位置を変えてもよい。ある実施形態において、プロモーターのエレメントは、協働的に機能するように配置する。ある実施形態において、プロモーターのエレメントは、独立して機能するように配置する。ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、ヒトＣＭＶ前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳ）長鎖末端反復配列、及びラットインスリンプロモーターからなる群から選択される１以上のプロモーターを含む。ある実施形態において、本明細書において提供するベクターは、ＡＡＶ、ＭＬＶ、ＭＭＴＶ、ＳＶ４０、ＲＳＶ、ＨＩＶ−１、及びＨＩＶ−２  ＬＴＲからなる群から選択される１以上の長鎖末端反復配列（ＬＴＲ）プロモーターを含む。ある実施形態において、本明細書において提供するベクターは、１以上の組織特異的プロモーター（例えば、神経細胞特異的なプロモーター）を含む。
【０１０５】
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、１以上のプロモーター以外の調節エレメントを含む。ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、エンハンサーを含む。ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、リプレッサーを含む。ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、イントロンまたはキメライントロンを含む。ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、ポリアデニル化配列を含む。
【０１０６】
（５．２．４．シグナルペプチド）
ある実施形態において、本明細書において提供するベクターは、タンパク質送達を調節する構成要素を含む。ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、１以上のシグナルペプチドを含む。ある実施形態において、シグナルペプチドは、導入遺伝子産物（例えば、ＩＤＵＡ）の細胞内での適切なパッケージング（例えば、グリコシル化）を達成することを可能にする。ある実施形態において、シグナルペプチドは、導入遺伝子産物（例えば、ＩＤＵＡ）が細胞内で適切な局在化を達成することを可能にする。ある実施形態において、シグナルペプチドは、導入遺伝子産物（例えば、ＩＤＵＡ）が細胞からの分泌を達成することを可能にする。ベクターに関連して使用されるシグナルペプチドの例及び本明細書において提供する導入遺伝子は、表３に見出すことができる。シグナルペプチドはまた、本明細書において、リーダー配列またはリーダーペプチドと呼ばれ得る。
表３．本明細書において提供するベクターとともに使用するためのシグナルペプチド。
【表１】
2021531276.tif 000003
2021531276.tif 000004
【０１０７】
（５．２．５．非翻訳領域）
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、１以上の非翻訳領域（ＵＴＲ）（例えば、３’及び／または５’ＵＴＲ）を含む。ある実施形態において、ＵＴＲは、タンパク質発現の所望のレベルのために最適化される。ある実施形態において、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡ半減期のために最適化される。ある実施形態において、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡの安定性のために最適化される。ある実施形態において、ＵＴＲは、導入遺伝子のｍＲＮＡの二次構造のために最適化される。
【０１０８】
（５．２．６．逆位末端反復配列）
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、１以上の逆位末端反復（ＩＴＲ）配列を含む。ＩＴＲ配列は、ウイルスベクターのビリオンに組換え遺伝子発現カセットをパッケージングするために使用することができる。ある実施形態において、ＩＴＲは、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ９）に由来するものである（その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、例えばＹａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７９（１）：３６４−３７９；米国特許第７，２８２，１９９  Ｂ２号、米国特許第７，７９０，４４９  Ｂ２号、米国特許第８，３１８，４８０  Ｂ２号、米国特許第８，９６２，３３２  Ｂ２号、及び国際特許出願番号ＰＣＴ／ＥＰ２０１４／０７６４６６を参照のこと）。
【０１０９】
（５．２．７．導入遺伝子）
ある実施形態において、本明細書において提供するベクターは、ＩＤＵＡ導入遺伝子をコードする。具体的な実施形態において、ＩＤＵＡは、神経細胞における発現に適当な発現制御エレメントによって制御される：ある実施形態において、ＩＤＵＡ（例えば、ｈＩＤＵＡ）導入遺伝子は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。ある実施形態において、ＩＤＵＡ（例えば、ｈＩＤＵＡ）導入遺伝子は、配列番号１に記載の配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一のアミノ酸配列を含む。
【０１１０】
導入遺伝子によってコードされるＨｕＧｌｙＩＤＵＡは、これらに限定はされないが、配列番号１のアミノ酸配列を有するヒトＩＤＵＡ（ｈＩＤＵＡ）（図１に示す）、ならびにアミノ酸の置換、欠失、または付加を有する、例えばこれらに限定はされないが、図２に示すＩＤＵＡのオーソログ中に対応する非保存的残基から選択されるアミノ酸置換を含む、ｈＩＤＵＡの誘導体を含むことができる（ただし、そのような突然変異が、図３に示す（その全体が参照により本明細書に組み込まれているＳａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  １１１：１０７−１１２の５７個のＭＰＳ  Ｉ突然変異を列記する表３より）、またはその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているＶｅｎｔｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ＃５２２  Ｏｎｌｉｎｅ（「Ｖｅｎｔｕｒｉ  ２００２」）、もしくはＢｅｒｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ３２：Ｅ２１８９−Ｅ２２１０（「Ｂｅｒｔｏｌａ  ２０１１」）によって報告された、重度の、中程度に重度の、中程度の、もしくは軽症型ＭＰＳ  Ｉ表現型において同定されたいずれの突然変異も含まないことを条件とする）ｈＩＤＵＡの誘導体を含むことができる。
【０１１１】
例えば、ｈＩＤＵＡの特定位置でのアミノ酸置換は図２（その全体が参照により本明細書に組み込まれているＭａｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，ＰＮＡＳ  １１０：１４６２８、図Ｓ８に報告されたオーソログのアラインメントを示す）に表されるＩＤＵＡオーソログにおけるその位置に見出される対応する非保存的アミノ酸残基から選択することができる（ただし、そのような置換は図３に示されるか、または上記Ｖｅｎｔｕｒｉ  ２００２もしくはＢｅｒｔｏｌａ  ２０１１において報告される有害な突然変異のいずれも含まないことを条件とする）。結果として得られる導入遺伝子産物は、細胞培養または試験動物で、突然変異がＩＤＵＡ機能を損なわないことを保証するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの従来のアッセイを使用して試験することができる。選択される好ましいアミノ酸置換、欠失、または付加は、細胞培養または動物モデルにおけるＭＰＳ  Ｉのためのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの従来のアッセイによって試験されるＩＤＵＡの酵素活性、安定性、または半減期を維持するか、または増加させるものとするべきである。例えば、導入遺伝子産物の酵素活性は基質として４−メチルウンベリフェリルα−Ｌ−イズロニドを用いる従来の酵素アッセイを使用して評価することができる（使用可能な例示的なＩＤＵＡ酵素アッセイについては、例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれている、Ｈｏｐｗｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｃｌｉｎ  Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ９２：２５７−２６５；Ｃｌｅｍｅｎｔｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １５２：２１−２８；及びＫａｋｋｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｐｒｏｔ  Ｅｘｐ  Ｐｕｒｉｆ  ５：２２５−２３２を参照のこと）。導入遺伝子産物がＭＰＳ  Ｉ表現型を修正する能力は、例えば、培養中でＭＰＳ  Ｉ細胞にｈＩＤＵＡまたは誘導体をコードするウイルスベクターもしくは他のＤＮＡ発現コンストラクトを形質導入することにより、培養中のＭＰＳ  Ｉ細胞にｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡもしくは誘導体を加えることにより、またはＭＰＳ  Ｉ細胞をｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡもしくは誘導体を発現及び分泌するように操作したヒト宿主細胞と共培養することにより、細胞培養中で評価し、例えば、培養中のＭＰＳ  Ｉ細胞におけるＩＤＵＡ酵素活性及び／またはＧＡＧ貯蔵量の低下を検出することにより、ＭＰＳ  Ｉ培養細胞の欠陥の修正を決定することができる（例えば、その各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているＭｙｅｒｏｗｉｔｚ＆Ｎｅｕｆｅｌｄ，１９８１，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２５６：３０４４−３０４８；及びＡｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９２，Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  ３：３７１−３７９を参照のこと）。
【０１１２】
（５．２．８．コンストラクト）
ある実施形態において、本明細書において提供されるウイルスベクターは、以下の順序で以下のエレメント：ａ）第１のＩＴＲ配列、ｂ）第１のリンカー配列、ｃ）プロモーター配列、ｄ）第２のリンカー配列、ｅ）イントロン配列、ｆ）第３のリンカー配列、ｇ）導入遺伝子（例えば、ＩＤＵＡ）をコードする配列、ｈ）第４のリンカー配列、ｉ）ポリＡ配列、ｊ）第５のリンカー配列、及びｋ）第２のＩＴＲ配列を含む。
【０１１３】
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、以下の順序で以下のエレメント：ａ）プロモーター配列、及びｂ）導入遺伝子（例えば、ＩＤＵＡ）をコードする配列を含む。ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、以下の順序で以下のエレメント：ａ）プロモーター配列、及びｂ）導入遺伝子（例えば、ＩＤＵＡ）をコードする配列を含み、ここで導入遺伝子はシグナルペプチドを含む。
【０１１４】
ある実施形態において、本明細書において提供するウイルスベクターは、以下の順序で以下のエレメント：ａ）第１のＩＴＲ配列、ｂ）第１のリンカー配列、ｃ）プロモーター配列、ｄ）第２のリンカー配列、ｅ）イントロン配列、ｆ）第３のリンカー配列、ｇ）第１のＵＴＲ配列、ｈ）導入遺伝子（例えば、ＩＤＵＡ）をコードする配列、ｉ）第２のＵＴＲ配列、ｊ）第４のリンカー配列、ｋ）ポリＡ配列、ｌ）第５のリンカー配列、及びｍ）第２のＩＴＲ配列を含む。
【０１１５】
ある実施形態において、本明細書において提供されるウイルスベクターは、以下の順序で以下のエレメント：ａ）第１のＩＴＲ配列、ｂ）第１のリンカー配列、ｃ）プロモーター配列、ｄ）第２のリンカー配列、ｅ）イントロン配列、ｆ）第３のリンカー配列、ｇ）第１のＵＴＲ配列、ｈ）導入遺伝子（例えば、ＩＤＵＡ）をコードする配列、ｉ）第２のＵＴＲ配列、ｊ）第４のリンカー配列、ｋ）ポリＡ配列、ｌ）第５のリンカー配列、及びｍ）第２のＩＴＲ配列を含み、ここで導入遺伝子はシグナルペプチドを含み、かつ導入遺伝子はｈＩＤＵＡをコードする。
【０１１６】
（５．２．９．ベクターの製造及び試験）
本明細書において提供するウイルスベクターは、宿主細胞を使用して製造することができる。本明細書において提供するウイルスベクターは、哺乳動物の宿主細胞、例えば、Ａ５４９、ＷＥＨＩ、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ１、ＣＯＳ７、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０、ＢＭＴ  １０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、２９３、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２、初代線維芽細胞、肝細胞、及び筋芽細胞を使用して製造することができる。本明細書において提供するウイルスベクターは、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、またはハムスターから宿主細胞を使用して製造することができる。
【０１１７】
宿主細胞は、導入遺伝子及び関連するエレメント（すなわち、ベクターゲノム）、及びウイルスを宿主細胞で生産する手段、例えば、複製及びキャプシド遺伝子（例えば、ＡＡＶのｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子）をコードする配列を用いて安定的に形質転換する。ＡＡＶ８キャプシドを有する組換えＡＡＶベクターを生産する方法については、その全体が参照により本明細書に組み込まれている米国特許第７，２８２，１９９  Ｂ２号の詳細な説明の第ＩＶ節を参照のこと。上記ベクターのゲノムコピー力価は、例えばＴＡＱＭＡＮ（登録商標）分析によって決定することができる。ビリオンは、例えばＣｓＣｌ２沈降によって回収することができる。
【０１１８】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイ、例えば細胞培養アッセイは、本明細書に記載のベクターからの導入遺伝子発現を測定するために使用することができ、従って例えば、ベクターの効力を示すことができる。例えば、ＨＴ−２２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＣＮ−１Ａ、ＨＣＮ−２、ＮＴ２、ＳＨ−ＳＹ５ｙ、ｈＮＳＣ１１、もしくはＲｅＮｃｅｌｌ  ＶＭ細胞株、または神経細胞もしくはグリア細胞、または神経細胞もしくはグリア細胞の前駆細胞に由来する他の細胞株を、導入遺伝子発現を評価するために使用することができる。発現されると、ＨｕＧｌｙＩＤＵＡと関連したグリコシル化及びチロシン硫酸化のパターンの決定を含む、発現された産物（すなわち、ＨｕＧｌｙＩＤＵＡ）の特徴を決定することができる。
【０１１９】
（５．２．１０．組成物）
本明細書に記載の導入遺伝子をコードしているベクター及び好適な担体を含む組成物を記載する。好適な担体（例えば、ＣＳＦ、及び例えば神経細胞への投与のために）は、当業者によって容易に選択される。
【０１２０】
（５．３遺伝子治療）
ＭＰＳ  Ｉを有するヒト対象への、治療有効量の導入遺伝子コンストラクトの投与のための方法を記載する。より詳細には、ＭＰＳ  Ｉを有する患者に、治療有効量の導入遺伝子コンストラクトを、投与するため、特にＣＳＦに投与のための方法を記載する。特定の実施形態において、そのような治療有効量の導入遺伝子コンストラクトのＣＳＦへの投与方法は、ハーラー症候群またはハーラー−シャイエ症候群を有する患者を治療するために使用することができる。
【０１２１】
（５．３．１．標的患者集団）
ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターをＭＰＳ  Ｉと診断された患者に投与する。具体的な実施形態において、患者は、ハーラー−シャイエ症候群と診断された。具体的な実施形態において、患者は、シャイエ症候群と診断された。具体的な実施形態において、患者は、ハーラー症候群と診断された。
【０１２２】
ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、重度のＭＰＳ  Ｉと診断された患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、減弱型ＭＰＳ  Ｉと診断された患者に投与する。
【０１２３】
ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、ＭＰＳ  Ｉと診断され、ＩＤＵＡ（例えば、ｈＩＤＵＡ）を用いた治療に反応すると特定された患者に投与する。
【０１２４】
ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、小児患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、３歳未満である患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、２〜４歳である患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、３〜８歳である患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、８〜１６歳である患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、６〜１８歳である患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、６歳以上の患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、３歳未満の患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、４ヶ月齢以上であるが９ヶ月齢未満である患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、９ヶ月齢以上であるが１８ヶ月齢未満である患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、１８ヶ月以上であるが３歳未満である患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、１０歳を超える患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、青年期の患者に投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、成人の患者に投与する。
【０１２５】
ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターを、ＭＰＳ  Ｉと診断され、遺伝子治療処置の前にＣＳＦに注入されたＩＤＵＡ、例えばｈＩＵＡによる治療に反応すると特定された患者に投与する。
【０１２６】
（５．３．２．投薬量及び投与様式）
ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターは、くも膜下腔内投与（すなわち、くも膜下腔に注入して、組換えベクターがＣＳＦを通じて散布され、ＣＮＳの細胞が形質導入されるようにする）を介して、ＣＳＦに投与する。このことは、いくつかの方法で、例えば、頭蓋内（大槽または脳室内）注入、または腰椎槽への注入によって達成することができる。ある実施形態において、くも膜下腔内投与は、大槽内（ＩＣ）注入（例えば、大槽に）により実施する。具体的な実施形態において、大槽内注入は、ＣＴガイド後頭下穿刺によって実施する。具体的な実施形態において、くも膜下腔内注入は、腰椎穿刺によって実施する。具体的な実施形態において、患者に実行できそうな場合は、くも膜下腔への注入はＣ１−２穿刺によって実施する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターは、鼻腔内投与を介してＣＮＳに投与する。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターは、脳実質内注入によりＣＮＳに投与する。ある実施形態において、脳実質内注入は、線条体を標的とする。ある実施形態において、脳実質内注入は、白質を標的とする。ある実施形態において、治療有効用量の組換えベクターは、当技術において公知の任意の手段、例えばその全体が参照により本明細書に組み込まれているＨｏｃｑｕｅｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２７（７）：４７８−４９６において開示された任意の手段によって、ＣＳＦに投与する。
【０１２７】
組換えベクターは、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＣＳＦ濃度を少なくとも９．２５〜２７７μｇ／ｍＬのＣｍｉｎに維持する用量で、ＣＳＦに投与するべきである。ある実施形態において、組換えベクターは、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＣＳＦ濃度を少なくとも９．２５、１６、４６、９２、１８５、または２７７μｇ／ｍＬ）のＣｍｉｎに維持する用量で、ＣＳＦに投与する。ある実施形態において、組換えベクターは、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＣＳＦ濃度を少なくとも９．２５、１６、４６、９２、１８５、または２７７μｇ／ｍＬ）のＣｍｉｎに維持する用量で、ＣＳＦに投与する。ある実施形態において、組換えベクターは、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＣＳＦ濃度を少なくとも９．２５μｇ／ｍＬのＣｍｉｎに維持する用量で、ＣＳＦに投与する。ある実施形態において、組換えベクターは、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＣＳＦ濃度を少なくとも１６μｇ／ｍＬのＣｍｉｎに維持する用量で、ＣＳＦに投与する。ある実施形態において、組換えベクターは、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＣＳＦ濃度を少なくとも４６μｇ／ｍＬのＣｍｉｎに維持する用量で、ＣＳＦに投与する。ある実施形態において、組換えベクターは、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＣＳＦ濃度を少なくとも９２μｇ／ｍＬのＣｍｉｎに維持する用量で、ＣＳＦに投与する。ある実施形態において、組換えベクターは、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＣＳＦ濃度を少なくとも１８５μｇ／ｍＬのＣｍｉｎに維持する用量で、ＣＳＦに投与する。ある実施形態において、組換えベクターは、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡのＣＳＦ濃度を少なくとも２７７μｇ／ｍＬのＣｍｉｎに維持する用量で、ＣＳＦに投与する。
【０１２８】
ある実施形態において、小児患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの１．００〜３０．００ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、小児患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの１．００、１．７４、５．００、１０．００、２０．００、または３０．００ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、小児患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの１．００ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、小児患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの１．７４ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、小児患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中に総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの５．００ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、小児患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの１０．００ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、小児患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの２０．００ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、小児患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの３０．００ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。
【０１２９】
ある実施形態において、成人患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの１．２９〜３８．８８ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、成人患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの１．２９、２．２５、８．４０、１２．９６、２５．９３、または３８．８８ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、成人患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの１．２９ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、成人患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの２．２５ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、成人患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの８．４０ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、成人患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの１２．９６ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、成人患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの２５．９３ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。ある実施形態において、成人患者の場合、組換えベクターは、ＣＳＦ中の総ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡ３８．８８ｍｇを維持する用量でＣＳＦに投与される。
【０１３０】
くも膜下腔内投与について、治療有効用量の組換えベクターは、注入容量を好ましくは最高約２０ｍＬとしてＣＳＦに投与するべきである。くも膜下腔内注入に好適な担体、例えばＥｌｌｉｏｔｔｓ  Ｂ溶液は、組換えベクターのためのビヒクルとして使用するべきである。Ｅｌｌｉｏｔｓ  Ｂ溶液（一般名：塩化ナトリウム、重炭酸ナトリウム、無水デキストロース、硫酸マグネシウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及びリン酸ナトリウム）は、静菌保存剤を含んでいない無菌の、非発熱性の、等張溶液であり、化学療法薬のくも膜下腔内投与のための希釈剤として使用する。
【０１３１】
ＣＳＦ濃度は、後頭部または腰椎穿刺から得られるＣＳＦ流体中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの濃度を直接測定することによってモニタリングし、または患者の血清において検出されたｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの濃度から外挿によって推定することができる。ある実施形態において、血清中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡが１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬであることは、ＣＳＦ中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡが１〜３０ｍｇであることを示す。ある実施形態において、組換えベクターは、血清中のｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡを１０ｎｇ／ｍＬ〜１００ｎｇ／ｍＬに維持する用量で、ＣＳＦに投与する。
【０１３２】
ある実施形態において、投薬量は、患者のＣＳＦに投与される（例えば、後頭下穿刺または腰椎穿刺を介して注入される）ゲノムコピーの数により測定する。ある実施形態において、１×１０１２〜２×１０１４ゲノムコピーを投与する。ある実施形態において、５×１０１２〜２×１０１４のゲノムコピーを投与する。具体的な実施形態において、１×１０１３〜１×１０１４のゲノムコピーを投与する。具体的な実施形態において、１×１０１３〜２×１０１３のゲノムコピーを投与する。具体的な実施形態において、６×１０１３〜８×１０１３のゲノムコピーを投与する。具体的な実施形態において、１．２×１０１２のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、２．０×１０１２のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、２．２×１０１２のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、６．０×１０１２のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、１．０×１０１３のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、１．１×１０１３のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、３．０×１０１３のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、５．０×１０１３のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、５．５×１０１３のゲノムコピーを投与する。具体的な実施形態において、１．２×１０１２〜６．０×１０１２のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、２．０×１０１２〜１．０×１０１３のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、２．２×１０１２〜１．１×１０１３のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、６．０×１０１２〜３．０×１０１３のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、１．０×１０１３〜５．０×１０１３のゲノムコピーを投与する。別の具体的な実施形態において、１．１×１０１３〜５．５×１０１３のゲノムコピーを投与する。
【０１３３】
ある実施形態において、１×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。ある実施形態において、５．６×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。ある実施形態において、１×１０１２〜５．６×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。ある実施形態において、１×１０１３〜５．６×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。具体的な実施形態において、１．２×１０１２のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、２．０×１０１２のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、２．２×１０１２のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、６．０×１０１２のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、１．０×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、１．１×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、３．０×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、５．０×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、５．５×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。具体的な実施形態において、１．２×１０１２〜６．０×１０１２のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、２．０×１０１２〜１．０×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、２．２×１０１２〜１．１×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、６．０×１０１２〜３．０×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、１．０×１０１３〜５．０×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。別の具体的な実施形態において、１．１×１０１３〜５．５×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、小児患者に投与する。ある実施形態において、２．６×１０１２のゲノムコピーの固定用量を、成人患者に投与する。ある実施形態において、１．３×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、成人患者に投与する。ある実施形態において、１．４×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、成人患者に投与する。ある実施形態において、７．０×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、成人患者に投与する。ある実施形態において、１．４×１０１３〜７．０×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、成人患者に投与する。ある実施形態において、１×１０１２〜５．６×１０１３のゲノムコピーの固定用量を、成人患者に投与する。
【０１３４】
ある実施形態において、投薬量は、患者のＣＳＦに脳質量のグラム当たりで投与される（例えば、後頭下穿刺または腰椎穿刺を介して注入される）ゲノムコピーの数により測定する。ある実施形態において、脳質量のグラム当たり２×１０９のゲノムコピーを投与する。ある実施形態において、脳質量のグラム当たり１×１０１０のゲノムコピーを投与する。ある実施形態において、脳質量のグラム当たり５×１０１０のゲノムコピーを投与する。ある実施形態において、脳質量のグラム当たり１×１０９〜２×１０１０のゲノムコピーを投与する。ある実施形態において、脳質量のグラム当たり２×１０９〜１×１０１０のゲノムコピーを投与する。ある実施形態において、脳質量のグラム当たり５×１０９〜２×１０１０のゲノムコピーを投与する。具体的な実施形態において、脳質量のグラム当たり９×１０９〜１×１０１０のゲノムコピーを投与する。具体的な実施形態において、脳質量のグラム当たり１×１０１０〜１．５×１０１０のゲノムコピーを投与する。具体的な実施形態において、脳質量のグラム当たり１×１０１０〜５×１０１０のゲノムコピーを投与する。具体的な実施形態において、脳質量のグラム当たり５×１０１０〜６×１０１０のゲノムコピーを投与する。
【０１３５】
一実施形態において、ｈＩＤＵＡ発現カセットを含む血清型９キャプシドの非複製組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）を、治療用に使用する。ＡＡＶ９血清型を用いると、ＩＣ投与の後、ＣＮＳ中でｈＩＤＵＡタンパク質の効率的発現が可能となる。ベクターゲノムは、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接したｈＩＤＵＡ発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的プロモーターによって駆動される。
【０１３６】
ある実施形態において、本明細書に記載の組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）は、１．４×１０１３ＧＣ（１．１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）〜７．０×１０１３ＧＣ（５．６×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）の範囲にわたる単回固定用量（好ましくは、約５〜２０ｍｌの容量、または約５ｍｌ以下の容量中）として、（後頭下注入によって）ＩＣ投与することができる。患者がＡＡＶに対する中和抗体を有する場合、高い範囲の用量を使用することができる。ある実施形態において、本明細書に記載の組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）は、２．６×１０１２ＧＣ（２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量）〜１．３×１０１３ＧＣ（１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）の範囲にわたる単回固定用量（好ましくは、約５〜２０ｍｌの容量、または約５ｍｌ以下の容量中）として、（後頭下注入によって）ＩＣ投与することができる。患者が４ヶ月齢以上であるが９ヶ月齢未満の場合、一実施形態において、本明細書に記載の組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）は、６．０×１０１２ＧＣ（１．０×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）〜３．０×１０１３ＧＣ（５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）の範囲にわたる単回固定用量として（好ましくは、約５〜２０ｍｌの容量、または約５ｍｌ以下の容量中）、ＩＣで（後頭下注入によって）投与することができ、別の実施形態において、本明細書に記載の組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）は、１．２×１０１２ＧＣ（２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量）〜６．０×１０１２ＧＣ（１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）の範囲にわたる単回固定用量（好ましくは、約５〜２０ｍｌの容量、または約５ｍｌ以下の容量中）として、（後頭下注入によって）ＩＣ投与することができる。患者が９ヶ月齢以上であるが１８ヶ月齢未満の場合、一実施形態において、本明細書に記載の組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）は、１．０×１０１３ＧＣ（１．０×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）〜５．０×１０１３ＧＣ（５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）の範囲にわたる単回固定用量として（好ましくは、約５〜２０ｍｌの容量、または約５ｍｌ以下の容量中）、ＩＣで（後頭下注入によって）投与することができ、別の実施形態において、本明細書に記載の組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）は、２．０×１０１２ＧＣ（２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量）〜１．０×１０１３ＧＣ（１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）の範囲にわたる単回固定用量（好ましくは、約５〜２０ｍｌの容量、または約５ｍｌ以下の容量中）として、（後頭下注入によって）ＩＣ投与することができる。患者が１８ヶ月齢以上であるが３歳未満の場合、一実施形態において、本明細書に記載の組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）は、１．１×１０１３ＧＣ（１．０×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）〜５．５×１０１３ＧＣ（５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）の範囲にわたる単回固定用量として（好ましくは、約５〜２０ｍｌの容量、または約５ｍｌ以下の容量中）、ＩＣで（後頭下注入によって）投与することができ、別の実施形態において、本明細書に記載の組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）は、２．２×１０１２ＧＣ（２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量）〜１．１×１０１３Ｇ���（１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）の範囲にわたる単回固定用量（好ましくは、約５〜２０ｍｌの容量、または約５ｍｌ以下の容量中）として、（後頭下注入によって）ＩＣ投与することができる。具体的な実施形態において、本明細書に記載の組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）は、以下の表１に列記され、それに従って、用量１または用量２で単回固定用量として（後頭下注入によって）ＩＣ投与することができる。別の具体的な実施形態において、本明細書に記載の組換えベクター（例えば、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）は、以下の表２に列記され、それに従って、用量１または用量２で単回固定用量として（後頭下注入によって）ＩＣ投与することができる。
【０１３７】
表１．投薬時の患者の年齢に基づいて患者に投与する用量。
【表２】
2021531276.tif 000005
【０１３８】
表２．投薬時の患者の年齢に基づいて患者に投与する用量
【表３】
2021531276.tif 000006
【０１３９】
（５．４併用療法）
（５．４．１．免疫抑制との併用療法）
ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡの送達が免疫反応を最小化すべきである一方、ＣＮＳ関連遺伝子治療に関する毒性の最も明白な潜在的源は、遺伝的にＩＤＵＡを欠損しており、したがってタンパク質及び／または導入遺伝子を送達するために用いるベクターを潜在的に寛容しないヒト対象において、発現されたｈＩＤＵＡタンパク質に対する免疫が発生する。したがって、好ましい実施形態では、患者を免疫抑制治療で共治療することは、特にＩＤＵＡのレベルが０に近い重度の疾患（例えば、ハーラー症候群を有する患者）を有する患者を治療する場合に望ましい。タクロリムスまたはラパマイシン（シロリムス）を、ミコフェノール酸と組合わせたレジメン、または組織移植手順において使用される他の免疫抑制レジメンを伴う免疫抑制治療を、利用することができる。そのような免疫抑制治療は、遺伝子治療の過程で投与することができ、ある実施形態において、免疫抑制治療による前処理が好ましい場合がある。免疫抑制治療は、治療医師の判断に基づいて、遺伝子治療処置の後も継続することができ、その後、免疫寛容が誘発された場合、例えば、１８０日後に、中止してもよい。
【０１４０】
ある実施形態において、本明細書において提供する治療方法は、プレドニゾロン、ミコフェノール酸、及びタクロリムスを含む免疫抑制レジメンとともに施す。ある実施形態において、本明細書において提供する治療方法は、プレドニゾロン、ミコフェノール酸、及びラパマイシン（シロリムス）を含む免疫抑制レジメンとともに施す。ある実施形態において、本明細書において提供する治療方法は、タクロリムスを含まない免疫抑制レジメンとともに施す。ある実施形態において、本明細書において提供する治療方法は、１以上のコルチコステロイド、例えばメチルプレドニゾロン及び／またはプレドニゾロン、ならびにタクロリムス及び／またはシロリムスを含む免疫抑制レジメンとともに施す。ある実施形態において、免疫抑制治療は、ヒトＩＤＵＡによる治療の前に、またはそれと同時に、対象に（ａ）タクロリムス及びミコフェノール酸、または（ｂ）ラパマイシン及びミコフェノール酸の組合わせを投与し、かつその後も継続することを含む。ある実施形態において、免疫抑制療法は１８０日後に中止される。ある実施形態において、免疫抑制治療は、３０、６０、９０、１２０、１５０、または１８０日後に中止する。
【０１４１】
ある実施形態において、タクロリムスは、血清濃度を５〜１０ｎｇ／ｍＬとする用量で投与する。ある実施形態において、タクロリムスは、血清濃度を４〜８ｎｇ／ｍＬとする用量で投与する。ある実施形態において、特に、患者が３歳未満である場合、タクロリムスは、血清濃度を２〜４ｎｇ／ｍＬとする用量で投与する。ある実施形態において、ＭＭＦは、血清濃度を２〜３．５μｇ／ｍＬとする用量で投与する。ある実施形態において、タクロリムスは、血清濃度を５〜１０ｎｇ／ｍＬとする用量で投与し、かつＭＭＦは、血清濃度を２〜３．５μｇ／ｍＬとする用量で投与する。ある実施形態において、血清濃度は、タクロリムス及び／またはＭＭＦのトラフレベルの測定後、タクロリムス及び／またはＭＭＦのタイトレーションによって達成する。
【０１４２】
ある実施形態において、メチルプレドニゾロンは、１０ｍｇ／ｋｇの用量で１回静脈内投与する。ある実施形態において、プレドニゾロンは、０．５ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回経口投与する。ある実施形態において、プレドニゾロンは、段階的に漸減し、その後中断する。ある実施形態において、タクロリムスは、４〜８ｎｇ／ｍｌの目標血中レベルを維持するために、１日２回１ｍｇを経口投与する。ある実施形態において、特に、患者が３歳未満である場合、タクロリムスは、２〜４ｎｇ／ｍｌの目標血中レベルを維持するために１日２回０．０５ｍｇ／ｋｇを経口投与する。ある実施形態において、シロリムスも投与する。患者にシロリムスを事前投与し、続いてレジメンの間、目標血中レベルを４〜８ｎｇ／ｍｌに維持する。しかしながら、ある実施形態において、患者が３歳未満である場合、好ましくは患者にシロリムスを事前投与し、続いてレジメンの間、目標血中レベルを１〜３ｎｇ／ｍｌに維持する。ある実施形態において、メチルプレドニゾロンを１０ｍｇ／ｋｇの用量で１回静脈内投与し、プレドニゾロンを０．５ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回経口投与し、タクロリムスを１日１回０．２ｍｇ／ｋｇ経口投与し、かつシロリムスを投与する。
【０１４３】
ある実施形態において、ラパマイシンを２または４ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回経口投与する。ある実施形態において、ＭＭＦを２５ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与する。ある実施形態において、ラパマイシンを２または４ｍｇ／ｋｇの用量で１日１回経口投与し、かつＭＭＦを２５ｍｇ／ｋｇの用量で１日２回経口投与する。ある実施形態において、ラパマイシンは、血清濃度を５〜１５ｎｇ／ｍＬとする用量で投与する。ある実施形態において、ＭＭＦは、血清濃度を２〜３．５μｇ／ｍＬとする用量で投与する。ある実施形態において、ラパマイシンは血清濃度を５〜１５ｎｇ／ｍＬとする用量で投与し、かつＭＭＦは血清濃度を２〜３．５μｇ／ｍＬとする用量で投与する。ある実施形態において、血清濃度は、ラパマイシン及び／またはＭＭＦのトラフレベルの測定後、ラパマイシン及び／またはＭＭＦのタイトレーションによって達成する。
【０１４４】
（５．４．２．標準治療を含む他の治療との共治療）
ＣＳＦへのＨｕＧｌｙＩＤＵＡの投与及びこれに伴う他の利用可能な治療を施すことの組合わせは、本発明の方法に包含される。追加治療は、遺伝子治療処置の前に、それと同時に、またはその後に投与することができる。本発明の遺伝子治療と併用することができるＭＰＳ  Ｉのための利用可能な治療には、これらに限定はされないが、全身的に、もしくはＣＳＦに投与されるラロニダーゼを使用する酵素補充療法（ＥＲＴ）及び／またはＨＳＣＴ療法が挙げられる。別の実施形態において、ＥＲＴは、組換えＤＮＡ技術によってヒト細胞株において生産されたｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡ糖タンパク質を使用して投与することができる。そのような組換え糖タンパク質生産のために使用することができるヒト細胞株は、これらに限定されないが、数例を挙げればＨＴ−２２、ＳＫ−Ｎ−ＭＣ、ＨＣＮ−１Ａ、ＨＣＮ−２、ＮＴ２、ＳＨ−ＳＹ５ｙ、ｈＮＳＣ１１、ＲｅＮｃｅｌｌ  ＶＭ、ヒト胎児腎２９３細胞（ＨＥＫ２９３）、線維肉腫ＨＴ−１０８０、ＨＫＢ−１１、ＣＡＰ、ＨｕＨ−７、及び網膜細胞株、ＰＥＲ．Ｃ６、またはＲＰＥを含む（例えば、その全体が参照により組み込まれている、ｒＨｕＧｌｙＩＤＵＡ糖タンパク質の組換え生産のために使用することができるヒト細胞株の総説についてのＤｕｍｏｎｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６，Ｃｒｉｔｉｃａｌ  Ｒｅｖ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３６（６）：１１１０−１１２２の「Ｈｕｍａｎ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  ｂｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ：ｈｉｓｔｏｒｙ，ｓｔａｔｕｓ，ａｎｄ  ｆｕｔｕｒｅ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ」を参照のこと）。完全なグリコシル化、特にシアル酸付加及びチロシン硫酸化を保証するために、生産に使用する細胞株をチロシン−Ｏ−硫酸化を担うα−２，６−シアリルトランスフェラーゼ（またはα−２，３−及びα−２，６−シアリルトランスフェラーゼの両方）及び／またはＴＰＳＴ−１及びＴＰＳＴ−２酵素を共発現するように宿主細胞を操作することによって強化することができる。
【０１４５】
（５．５バイオマーカー／採取／モニタリング効率）
有効性は、認知機能（例えば、神経認知機能の低下の防止もしくは減少）；ＣＳＦ及び／もしくは血清中の疾患バイオマーカー（例えば、ＧＡＧ）の低下；及び／または、ＣＳＦ及び／もしくは血清のＩＤＵＡ酵素活性の増加を測定することによってモニタリングすることができる。炎症の徴候及び他の安全事象をモニタリングすることもできる。
【０１４６】
（５．５．１．疾患マーカー）
ある実施形態において、組換えベクターによる治療の有効性は、患者における疾患バイオマーカーのレベルを測定することによってモニタリングする。ある実施形態において、疾患バイオマーカーのレベルは、患者のＣＳＦにおいて測定する。ある実施形態において、疾患バイオマーカーのレベルは、患者の血清において測定する。ある実施形態において、疾患バイオマーカーのレベルは、患者の尿において測定する。ある実施形態において、疾患バイオマーカーは、ＧＡＧである。ある実施形態において、疾患バイオマーカーは、ＩＤＵＡ酵素活性である。ある実施形態において、疾患バイオマーカーは、炎症である。ある実施形態において、疾患バイオマーカーは、安全事象である。
【０１４７】
（５．５．２．神経認知機能の試験）
ある実施形態において、組換えベクターによる治療の有効性は、患者の認知機能のレベルを測定することによってモニタリングする。認知機能は、当業者に知られている任意の方法で測定することができる。ある実施形態において、認知機能は、知能指数（ＩＱ）を測定するための認証された機器を介して測定する。具体的な実施形態において、ＩＱは、Ｗｅｃｈｓｌｅｒ  Ａｂｂｒｅｖｉａｔｅｄ  Ｓｃａｌｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（ＷＡＳＩ−ＩＩ）によって測定する。ある実施形態において、認知機能は、記憶力を測定するための認証された装置を介して測定する。具体的な実施形態において、記憶力は、ホプキンス言語学習試験（ＨＶＬＴ）によって測定する。ある実施形態において、認知機能は、注意力を測定するための認証された装置を介して測定する。具体的な実施形態において、注意力は、注意変数試験（ＴＯＶＡ）によって測定する。ある実施形態において、認知機能は、ＩＱ、記憶力、及び注意力の１以上を測定するための認証された装置を介して測定する。
【０１４８】
（５．５．３．身体的変化）
ある実施形態において、組換えベクターによる治療の有効性は、患者のリソソーム蓄積症に関連する身体的な特徴を測定することによってモニタリングする。ある実施形態において、身体的な特徴は、保存障害（ｓｔｏｒａｇｅ  ｌｅｓｉｏｎ）である。ある実施形態において、身体的な特徴は、低身長である。ある実施形態において、身体的な特徴は、顔の特徴の粗雑化である。ある実施形態において、身体的な特徴は、閉塞性睡眠無呼吸である。ある実施形態において、身体的な特徴は、聴覚障害である。ある実施形態において、身体的な特徴は、視覚障害である。具体的な実施形態において、視覚障害は、角膜混濁に起因する。ある実施形態において、身体的な特徴は、水頭症である。ある実施形態において、身体的な特徴は、脊髄圧迫症である。ある実施形態において、身体的な特徴は、肝脾腫である。ある実施形態において、身体的な特徴は、骨及び関節の変形である。ある実施形態において、身体的な特徴は、心臓弁膜疾患である。ある実施形態において、身体的な特徴は、再発性上気道感染症である。ある実施形態において、身体的な特徴は、手根管症候群である。ある実施形態において、身体的な特徴は、巨舌症（舌の肥大）である。ある実施形態において、身体的な特徴は、声帯肥大及び／または変声である。そのような身体的な特徴は、当業者に公知の任意の方法によって測定することができる。
配列表
【表４】
2021531276.tif 000007
2021531276.tif 000008
2021531276.tif 000009
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2021531276.tif 000012
2021531276.tif 000013
2021531276.tif 000014
【実施例】
【０１４９】
（６．実施例）
（６．１実施例１：ｈＩＤＵＡ  ｃＤＮＡ）
ｈＩＤＵＡ（配列番号１）を含む導入遺伝子を含むｈＩＤＵＡ  ｃＤＮＡベースのベクターが構築される。また、導入遺伝子は、表３に列記される群から選択されるシグナルペプチドを含む核酸を含む。任意に、ベクターは、さらにプロモーターを含む。
【０１５０】
（６．２実施例２：置換ｈＩＤＵＡ  ｃＤＮＡ）
配列番号１のｈＩＤＵＡ配列と比較してアミノ酸置換、欠失、または付加を有する、例えばこれに限定はされないが、図２に示すＩＤＵＡのオーソログ中の対応する非保存的残基から選択されるアミノ酸置換を含むｈＩＤＵＡを含む、導入遺伝子を含むｈＩＤＵＡ  ｃＤＮＡベースのベクターを構築する（ただし、そのような突然変異が図３に示す（その全体が参照により本明細書に組み込まれているＳａｉｔｏ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  Ｍｅｔａｂ  １１１：１０７−１１２、５７個のＭＰＳ  Ｉ突然変異を列記する表３より）；またはその各々の全体が参照により本明細書に組み込まれているＶｅｎｔｕｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ＃５２２  Ｏｎｌｉｎｅ（“Ｖｅｎｔｕｒｉ  ２００２”）、もしくはＢｅｒｔｏｌａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１  Ｈｕｍａｎ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  ３２：Ｅ２１８９−Ｅ２２１０（“Ｂｅｒｔｏｌａ  ２０１１”）によって報告された、重度の、中程度に重度の、中程度の、もしくは軽症型ＭＰＳ  Ｉ表現型において同定されたいずれの突然変異も含まないことを条件とする）。また、導入遺伝子は、表３に列記される群から選択されるシグナルペプチドを含む核酸を含む。任意に、ベクターは、さらにプロモーターを含む。
【０１５１】
（６．３実施例３：ｈＩＤＵＡまたは置換ｈＩＤＵＡを用いた動物モデルにおけるＭＰＳ  Ｉの治療）
導入遺伝子として発現される場合、ｈＩＤＵＡ  ｃＤＮＡベースのベクターはＭＰＳ  Ｉの治療に有用であると考えられる。ＭＰＳ  Ｉのための動物モデル、例えば、Ｃｌａｒｋｅ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ６（４）：５０３−５１１（マウス）、Ｈａｓｋｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９７９，Ｐｅｄｉａｔｒ  Ｒｅｓ  １３（１１）：１２９４−９７（雑種のイエネコ）、Ｍｅｎｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９２，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  １４（３）：７６３−７６８（イヌ）、またはＳｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９８２，Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ  １０９（２）：２４４−２４８（イヌ）に記載される動物モデルに、導入遺伝子産物を送達し、動物のＣＳＦ中でＣｍｉｎを少なくとも９．２５μｇ／ｍＬの濃度に維持するのに十分な用量で、くも膜下腔内にｈＩＤＵＡをコードする組換えベクターを投与する。治療の後、動物を、特定の動物モデルの疾患と一致した症状の改善について評価する。
【０１５２】
（６．４実施例４：ｈＩＤＵＡまたは置換ｈＩＤＵＡを用いたＭＰＳ  Ｉの治療）
導入遺伝子として発現される場合、ｈＩＤＵＡ  ｃＤＮＡベースのベクターはＭＰＳ  Ｉの治療に有用であると考えられる。ＭＰＳ  Ｉを呈する対象に導入遺伝子産物を送達し、ＣＳＦ中でＣｍｉｎを少なくとも９．２５μｇ／ｍＬの濃度に維持するのに十分な用量で、くも膜下腔内にｈＩＤＵＡをコードするｃＤＮＡベースのベクターを投与する。治療の後、対象を、ＭＰＳ  Ｉの症状の改善について評価する。ｈＩＤＵＡをコードするｃＤＮＡベースのベクターの投与の前に、それと同時に、またはその後に、患者に、ラパマイシン、ＭＭＦ、及びプレドニゾロンを含む免疫抑制治療薬を投与する。
【０１５３】
（６．５実施例５：ＭＰＳ  Ｉ治療の臨床プロトコル）
以下の実施例は、ＭＰＳ  Ｉを治療するためにヒト対象をｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０１５４】
患者集団。治療されることとなる患者は：
血漿、線維芽細胞、または白血球において測定された酵素活性によって確認されるＭＰＳ  Ｉの診断、
任意の他の神経学的または精神医学的な因子によって説明可能でない場合、以下のいずれかとして定義されるＭＰＳ  Ｉに起因する初期段階の神経認知機能低下：
ＩＱ試験での、または神経心理的機能（言語理解、記憶力、注意力、または知覚推理）の１つの領域において平均を下回る標準偏差≧１のスコア、
逐次試験での標準偏差が＞１低下していることを証明する文書化された過去の証拠（医療記録）、を有する男性または女性を含み得る。
【０１５５】
患者には、ＥＲＴ（例えば、ＡＬＤＵＲＡＺＹＭＥ［ラロニダーゼ］ＩＶ）の安定レジメンを受けている患者を含み得る。出産可能性のある女性は、治療の日に血清妊娠試験陰性であるべきである。性的に活発な対象（女性及び男性の両方とも）は、ベクター投与の２４週間後まで医学的に認められたバリア避妊法（例えば、コンドーム、ダイアフラム、または禁欲法）を使用するべきである。大槽内（ＩＣ）治療から除外され得る患者には、ＩＣ注入または腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。ＩＣ注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる：
過去の頭部／頸部手術の既往歴の結果、ＩＣ注入が禁忌となっている、
ＣＴ（もしくは造影剤）または全身麻酔に任意の禁忌を有する、
ＭＲＩ（またはガドリニウム）に任意の禁忌を有する、
推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を有する。
【０１５６】
いずれかの時にＩＴ治療を受けて、ＩＴ投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ＩＣで治療されるべきではない。
【０１５７】
治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではない（例えば、好中球の絶対数が＜１．３×１０３／μＬ、血小板数＜１００×１０３／μＬ、及びヘモグロビン＜１２ｇ／ｄＬ［男性］または＜１０ｇ／ｄＬ［女性］）。代替免疫抑制レジメンは、シロリムス、ＭＭＦ、またはプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の既往歴を有する任意の患者に対し使用すべきである。
【０１５８】
リンパ腫または皮膚の扁平上皮細胞または基底細胞癌以外の別のがんの病歴を有する患者は、治療前少なくとも３ヶ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０１５９】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が＞３×正常値上限（ＵＬＮ）であるか、または総ビリルビンが＞１．５×ＵＬＮである患者は、対象が過去ギルバート症候群の既往歴を有する、及び総ビリルビンの＜３５％の抱合型ビリルビンを示す分画ビリルビンを有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０１６０】
感染症または薬物乱用の既往歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）試験陽性の既往歴、活動性もしくは再発性のＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎、またはＢ型肝炎、Ｃ型肝炎、もしくはＨＩＶスクリーニング試験陽性の既往歴；治療前１年以内のアルコールまたは薬物乱用の既往歴である。
【０１６１】
一実施形態において、患者は、成人の患者である。別の実施形態において、患者は、小児患者である。
【０１６２】
施される治療−免疫抑制治療による前治療。遺伝子治療の前に、患者は、導入遺伝子及び／またはＡＡＶキャプシドへの免疫反応を防止するために、免疫抑制治療で治療すべきである。そのような免疫抑制治療は、プレドニゾロン（−２〜８日に６０ｍｇを１日１回、経口）、ＭＭＦ（第−２〜６０日に１ｇを１日２回、経口）、及びシロリムス（第−２日に６ｍｇを経口で、その後第−１日〜第４８週まで２ｍｇを１日１回）を含む。シロリムスの用量は、全血トラフ濃度を１６〜２４ｎｇ／ｍＬ以内に維持するように調整する。大部分の対象において、用量調整は、式：新規用量＝現在の用量×（目標濃度／現在の濃度）に基づくことができる。対象は、さらなる用量調整前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも７〜１４日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。好中球減少症を発症する場合（絶対好中球数＜１．３×１０３／μＬ）、ＭＭＦの投薬は中断するか、または用量を低下させるべきである。
【０１６３】
遺伝子治療。ｈＩＤＵＡ発現カセット（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）を含む血清型９キャプシドの非複製組換えＡＡＶを、治療に使用する。ＡＡＶ９血清型を用いると、ＩＣ投与の後、ＣＮＳ中でｈＩＤＵＡタンパク質の効率的発現が可能となる。ベクターゲノムは、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接したｈＩＤＵＡ発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的ＣＡＧプロモーターによって駆動する。ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターは、くも膜下腔内注入のためのＥｌｌｉｏｔｔｓ  Ｂ溶液中に懸濁させる。
【０１６４】
ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡは、ＩＣ投与による単回固定用量として投与する：１．４×１０１３ＧＣ（１．１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）の低用量、または７．０×１０１３ＧＣ（５．６×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量）の高用量を、約５〜２０ｍｌの容量中で使用することができる。患者がＡＡＶに対する中和抗体を有する場合、高用量を使用することができる。
【０１６５】
ｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡの投与のために、対象を全身麻酔下におく。腰椎穿刺を行い、最初にＣＳＦを５ｃｃ除去し、その後、造影剤をＩＴ注入して大槽の視覚化を助ける。ＣＴ（造影剤を伴う）を利用して、針挿入及び後頭下空間への選択された用量のｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡの投与をガイドする。
【０１６６】
（６．６実施例６：ＭＰＳ  Ｉ治療の臨床プロトコル）
以下の実施例は、ＭＰＳ  Ｉを治療するためにヒト対象をｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０１６７】
患者集団。治療されることとなる患者は：
血漿、線維芽細胞、または白血球において測定された酵素活性によって確認されるＭＰＳ  Ｉの診断（これには、過去にＨＳＣＴを受けたことがあり、または過去もしくは現在ラロニダーゼ治療を受けている患者を含む）、
任意の他の神経学的または精神医学的な因子によって説明可能でない場合、以下のいずれかとして定義されるＭＰＳ  Ｉに起因する初期段階の神経認知機能低下：
ＩＱ試験での、または神経心理的機能（言語理解、注意力、または知覚推理）の１つの領域において平均を下回る標準偏差≧１のスコア、
逐次試験での＞１の標準偏差の低下、を有する６歳以上の男性または女性を含み得る。
【０１６８】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０１６９】
出産可能性のある女性は、治療の日に血清妊娠試験陰性であるべきである。全ての性的に活発な対象は、スクリーニング受診からベクター投与の２４週間後まで医学的に認められたバリア避妊法を進んで使用しなければならない。性的に活発な女性は、スクリーニング受診からシロリムスの最後の投与後１２週間のいずれか遅い方まで、効果的な避妊方法を進んで使用しなければならない。大槽内（ＩＣ）治療から除外され得る患者には、ＩＣ注入または腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。ＩＣ注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる：
過去の頭部／頸部手術の既往歴の結果、ＩＣ注入が禁忌となっている、
ＣＴ（もしくは造影剤）または全身麻酔に任意の禁忌を有する、
ＭＲＩ（またはガドリニウム）に任意の禁忌を有する、
推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を有する。
【０１７０】
いずれかの時にＩＴ治療を受けて、ＩＴ投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ＩＣで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではない（例えば、絶対好中球数＜１．３×１０３／μＬ、血小板数＜１００×１０３／μＬ、及びヘモグロビン＜１２ｇ／ｄＬ［男性］または＜１０ｇ／ｄＬ［女性］）。代替免疫抑制レジメンは、シロリムス、ＭＭＦ、またはプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の既往歴を有する任意の患者に対し使用すべきである。
【０１７１】
リンパ腫または皮膚の扁平上皮細胞または基底細胞癌以外の別のがんの病歴を有する患者は、治療前少なくとも３ヶ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０１７２】
最大限の医学的治療にもかかわらず、コントロール不良高血圧症（収縮期ＢＰ＞１８０ｍｍＨｇ、拡張期ＢＰ＞１００ｍｍＨｇ）の患者は治療するべきではない。
【０１７３】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が＞３×正常値上限（ＵＬＮ）であるか、または総ビリルビンが＞１．５×ＵＬＮである患者は、対象が過去ギルバート症候群の既往歴を有する、及び総ビリルビンの＜３５％の抱合型ビリルビンを示す分画ビリルビンを有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０１７４】
感染症または薬物乱用の既往歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウイルス感染の既往歴、またはＢ型肝炎表面抗原もしくはＢ型肝炎コア抗体、またはＣ型肝炎もしくはＨＩＶ抗体のスクリーニング試験陽性の履歴；スクリーニング前１年以内のアルコールまたは薬物乱用の履歴である。
【０１７５】
３０日以内または５半減期前のいずれか長い方の期間内にいずれかの治験薬を投与された患者は、事前にいつでも投与可能なＩＴラロニダーゼを投与された患者を除き、治療するべきではない。
【０１７６】
妊娠中の患者、産後６週未満の患者、スクリーニング時に授乳中の患者、または５２週目までの間に妊娠を予定している患者は、治療するべきではない。
【０１７７】
臨床的に重要なＥＣＧ異常があり、対象の安全が損なわれるような患者は、治療するべきではない。対象の安全を損なうような重篤または不安定な医学的または精神的状態の患者は、治療するべきではない。
【０１７８】
施される治療−免疫抑制治療による前治療。遺伝子治療の前に、患者は、導入遺伝子及び／またはＡＡＶキャプシドへの免疫反応を防止するために、免疫抑制治療で治療すべきである。そのような免疫抑制治療は、プレドニゾロン（−２〜８日に６０ｍｇを１日１回、経口）、ＭＭＦ（第−２〜６０日に１ｇを１日２回、経口）、及びシロリムス（第−２日に６ｍｇを経口で、その後第−１日〜第４８週まで２ｍｇを１日１回）を含む。シロリムスの用量は、全血トラフ濃度を１６〜２４ｎｇ／ｍＬ以内に維持するように調整する。大部分の対象において、用量調整は、式：新規用量＝現在の用量×（目標濃度／現在の濃度）に基づくことができる。対象は、さらなる用量調整前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも７〜１４日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。
【０１７９】
免疫抑制レジメンの基本的原則は、免疫を完全に抑制するためにコルチコステロイドを投与することである−用量を負荷するためのＩＶメチルプレドニゾロンから始まり、徐々に漸減する経口プレドニゾロンが続き、患者は１２週までにステロイドをやめる。コルチコステロイド治療は、タクロリムス（２４週間）及び／またはシロリムス（１２週間）によって補なわれ、さらにＭＭＦで補うことができる。タクロリムス及びシロリムスの両方を使用する場合、それぞれの用量は、４〜８ｎｇ／ｍｌの血中トラフレベルを維持するように調整された低用量であるべきである。薬剤を１つだけ使用する場合は、ラベル用量（高用量）を使用するべきであり、例えば、タクロリムスを０．１５〜０．２０ｍｇ／ｋｇ／日を１２時間ごとに２回に分けて投与、及び１ｍｇ／ｍ２／日でシロリムス；その負荷用量は３ｍｇ／ｍ２であるべきである。ＭＭＦがレジメンに追加された場合、作用機序が異なるため、タクロリムス及び／またはシロリムスの用量を維持することができる。
【０１８０】
遺伝子治療。ｈＩＤＵＡ発現カセット（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）を含む血清型９キャプシドの非複製組換えＡＡＶを、治療に使用する。ＡＡＶ９血清型を用いると、ＩＣ投与の後、ＣＮＳ中でｈＩＤＵＡタンパク質の効率的発現が可能となる。ベクターゲノムは、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接したｈＩＤＵＡ発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的ＣＡＧプロモーターによって駆動する。ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターは、くも膜下腔内注入のためのＥｌｌｉｏｔｔｓ  Ｂ溶液中に懸濁させる。
【０１８１】
ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡは、ＩＣ投与による単回固定用量：２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量（２．６×１０１２ＧＣ）の用量、または１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量（１．３×１０１３ＧＣ）の用量のいずれか、として投与する。用量は、約５〜２０ｍｌの容量にすることができる。
【０１８２】
ｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０１８３】
（６．７実施例７：ＭＰＳ  Ｉ治療の臨床プロトコル）
以下の実施例は、ＭＰＳ  Ｉを治療するためにヒト対象をｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０１８４】
患者集団。治療されることとなる患者は：
血漿、線維芽細胞、または白血球で測定された酵素活性によって確認されたＭＰＳ  Ｉの診断（これには、過去または現在ＨＳＣＴまたはラロニダーゼ治療を受けた可能性のある患者を含む）、
任意の他の神経学的または精神医学的な因子によって説明可能でない場合、以下のいずれかとして定義されるＭＰＳ  Ｉに起因する初期段階の神経認知機能低下：
ＩＱ試験での、または神経心理的機能（言語理解、注意力、または知覚推理）の１つの領域において平均を下回る標準偏差≧１のスコア、
逐次試験での＞１の標準偏差の低下、を有する男性または女性を含み得る。
【０１８５】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０１８６】
出産可能性のある女性は、治療の日に血清妊娠試験陰性であるべきである。全ての性的に活発な対象は、スクリーニング受診からベクター投与の２４週間後まで医学的に認められたバリア避妊法を進んで使用しなければならない。性的に活発な女性は、スクリーニング受診からシロリムスの最後の投与後１２週間のいずれか遅い方まで、効果的な避妊方法を進んで使用しなければならない。大槽内（ＩＣ）治療から除外され得る患者には、ＩＣ注入または腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。ＩＣ注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる：
過去の頭部／頸部手術の既往歴の結果、ＩＣ注入が禁忌となっている、
ＣＴ（もしくは造影剤）または全身麻酔に任意の禁忌を有する、
ＭＲＩ（またはガドリニウム）に任意の禁忌を有する、
推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を有する。
【０１８７】
いずれかの時にＩＴ治療を受けて、ＩＴ投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ＩＣで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではない（例えば、絶対好中球数＜１．３×１０３／μＬ、血小板数＜１００×１０３／μＬ、及びヘモグロビン＜１２ｇ／ｄＬ［男性］または＜１０ｇ／ｄＬ［女性］）。
【０１８８】
代替免疫抑制レジメンは、タクロリムス、シロリムス、またはプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の既往歴を有する任意の患者に対し使用すべきである。原発性免疫不全症、脾臓摘出術、または感染症に罹患しやすい基礎疾患の既往歴のある患者は、免疫抑制療法で治療するべきではない。帯状疱疹、サイトメガロウイルス、またはエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）感染症の患者で、スクリーニング前の少なくとも１２週間は完全に解消されていない場合は、免疫抑制療法で治療するべきではない。（１）２回目の受診の少なくとも８週間前に消散しておらず、入院または親世代抗感染症薬による治療を必要とする任意の感染症を有する患者、または（２）２回目の受診前１０日以内に経口抗感染症薬（抗ウイルス薬を含む）を必要とする任意の活発な感染症、もしくは活発な結核の既往歴を有する患者、または（３）スクリーニングの間のＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ＿ＴＢ  Ｇｏｌｄ試験で陽性となった患者、または（４）インフォームドコンセント用紙に署名をする前８週間以内に任意の生ワクチンを受けた患者、または（５）インフォームドコンセントに署名をする前８週間以内に大手術を行った患者、または（６）試験期間中に大手術を予定している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。好中球の絶対数が＜１．３×１０３／μＬである患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。
【０１８９】
リンパ腫または皮膚の扁平上皮細胞または基底細胞癌以外の別のがんの病歴を有する患者は、治療前少なくとも３ヶ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０１９０】
最大限の医学的治療にもかかわらず、コントロール不良高血圧症（収縮期ＢＰ＞１８０ｍｍＨｇ、拡張期ＢＰ＞１００ｍｍＨｇ）の患者は治療するべきではない。
【０１９１】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が＞３×正常値上限（ＵＬＮ）であるか、または総ビリルビンが＞１．５×ＵＬＮである患者は、対象が過去ギルバート症候群の既往歴を有する、及び総ビリルビンの＜３５％の抱合型ビリルビンを示す分画ビリルビンを有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０１９２】
感染症または薬物乱用の既往歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウイルス感染の既往歴、またはＢ型肝炎表面抗原もしくはＢ型肝炎コア抗体、またはＣ型肝炎もしくはＨＩＶ抗体のスクリーニング試験陽性の履歴；スクリーニング前１年以内のアルコールまたは薬物乱用の履歴である。
【０１９３】
一実施形態において、患者は、成人の患者である。別の実施形態において、患者は、小児患者である。
【０１９４】
施される治療−免疫抑制治療による前治療。遺伝子治療の前に、患者は、導入遺伝子及び／またはＡＡＶキャプシドへの免疫反応を防止するために、免疫抑制治療で治療すべきである。そのような免疫抑制治療は、コルチコステロイド（第１日にメチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇを１回静脈内［ＩＶ］に前投与し、第２日に経口プレドニゾンを０．５ｍｇ／ｋｇ／日から開始し、段階的に漸減させて、第１２週までに中断する）、タクロリムス（第２日から第２４週まで１日２回［ＢＩＤ］１ｍｇを経口的に［ＰＯ］、目標血中レベルを４〜８ｎｇ／ｍＬとし、第２４週から第３２週にかけての８週間にわたり漸減する）、及びシロリムス（第−２日に４時間ごとに１ｍｇ／ｍ２×３用量の負荷用量、続いて第−１日からシロリムス０．５ｍｇ／ｍ２／日をＢＩＤに分けて、第４８週まで目標血中レベルを４〜８ｎｇ／ｍｌとして投薬する）を含む。神経学的評価及びタクロリムス／シロリムス血中レベルのモニタリングを実施する。シロリムス及びタクロリムスの用量は、目標範囲の血中レベルを維持するように調整する。４８週の経過後は、免疫抑制治療は予定されない。大部分の対象において、用量調整は、式：新規用量＝現在の用量×（目標濃度／現在の濃度）に基づくことができる。対象は、さらなる用量調整前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも７〜１４日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。
【０１９５】
遺伝子治療。ｈＩＤＵＡ発現カセット（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）を含む血清型９キャプシドの非複製組換えＡＡＶを、治療に使用する。ＡＡＶ９血清型を用いると、ＩＣ投与の後、ＣＮＳ中でｈＩＤＵＡタンパク質の効率的発現が可能となる。ベクターゲノムは、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接したｈＩＤＵＡ発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的ＣＡＧプロモーターによって駆動する。ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターは、くも膜下腔内注入のためのＥｌｌｉｏｔｔｓ  Ｂ溶液中に懸濁させる。
【０１９６】
ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡは、ＩＣ投与による単回固定用量：２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量（２．６×１０１２ＧＣ）の用量、または１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量（１．３×１０１３ＧＣ）の用量のいずれか、として投与する。用量は、約５〜２０ｍｌの容量にすることができる。
【０１９７】
ｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０１９８】
（６．８実施例８：ＭＰＳ  Ｉ治療の臨床プロトコル）
以下の実施例は、ＭＰＳ  Ｉを治療するためにヒト対象をｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０１９９】
患者集団。治療されることとなる患者は：
血漿、線維芽細胞、または白血球で測定された酵素活性によって確認されたＭＰＳ  Ｉの診断（これには、過去または現在ＨＳＣＴまたはラロニダーゼ治療を受けた可能性のある患者を含む）、
任意の他の神経学的または精神医学的な因子によって説明可能でない場合、以下のいずれかとして定義されるＭＰＳ  Ｉに起因する初期段階の神経認知機能低下：
ＩＱ試験での、または神経心理的機能（言語理解、注意力、または知覚推理）の１つの領域において平均を下回る標準偏差≧１のスコア、
逐次試験での＞１の標準偏差の低下、を有する、６歳以上の男性または女性を含み得る。
【０２００】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０２０１】
出産可能性のある女性は、治療の日に血清妊娠試験陰性であるべきである。全ての性的に活発な対象は、スクリーニング受診からベクター投与の２４週間後まで医学的に認められたバリア避妊法を進んで使用しなければならない。性的に活発な女性は、スクリーニング受診からシロリムスの最後の投与後１２週間のいずれか遅い方まで、効果的な避妊方法を進んで使用しなければならない。大槽内（ＩＣ）治療から除外され得る患者には、ＩＣ注入または腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。ＩＣ注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる：
過去の頭部／頸部手術の既往歴の結果、ＩＣ注入が禁忌となっている、
ＣＴ（もしくは造影剤）または全身麻酔に任意の禁忌を有する、
ＭＲＩ（またはガドリニウム）に任意の禁忌を有する、
推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を有する。
【０２０２】
いずれかの時にＩＴ治療を受けて、ＩＴ投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ＩＣで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではない（例えば、好中球数の絶対数が＜１．３×１０３／μＬ、血小板数＜１００×１０３／μＬ、及びヘモグロビン＜１２ｇ／ｄＬ［男性］または＜１０ｇ／ｄＬ［女性］）。
【０２０３】
代替免疫抑制レジメンは、タクロリムス、シロリムス、またはプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の既往歴を有する任意の患者に対し使用すべきである。原発性免疫不全症、脾臓摘出術、または感染症に罹患しやすい基礎疾患の既往歴のある患者は、免疫抑制療法で治療するべきではない。帯状疱疹、サイトメガロウイルス、またはエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）感染症の患者で、スクリーニング前の少なくとも１２週間は完全に解消されていない場合は、免疫抑制療法で治療するべきではない。（１）２回目の受診の少なくとも８週間前に消散しておらず、入院または親世代抗感染症薬による治療を必要とする任意の感染症を有する患者、または（２）２回目の受診前１０日以内に経口抗感染症薬（抗ウイルス薬を含む）を必要とする任意の活発な感染症、もしくは活発な結核の既往歴を有する患者、または（３）スクリーニングの間のＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ＿ＴＢ  Ｇｏｌｄ試験で陽性となった患者、または（４）インフォームドコンセント用紙に署名をする前８週間以内に任意の生ワクチンを受けた患者、または（５）インフォームドコンセントに署名をする前８週間以内に大手術を行った患者、または（６）試験期間中に大手術を予定している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。好中球数の絶対数が＜１．３×１０３／μＬである患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。
【０２０４】
リンパ腫または皮膚の扁平上皮細胞または基底細胞癌以外の別のがんの病歴を有する患者は、治療前少なくとも３ヶ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０２０５】
最大限の医学的治療にもかかわらず、コントロール不良高血圧症（収縮期ＢＰ＞１８０ｍｍＨｇ、拡張期ＢＰ＞１００ｍｍＨｇ）の患者は治療するべきではない。
【０２０６】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が＞３×正常値上限（ＵＬＮ）であるか、または総ビリルビンが＞１．５×ＵＬＮである患者は、対象が過去ギルバート症候群の既往歴を有する、及び総ビリルビンの＜３５％の抱合型ビリルビンを示す分画ビリルビンを有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０２０７】
感染症または薬物乱用の既往歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウイルス感染の既往歴、またはＢ型肝炎表面抗原もしくはＢ型肝炎コア抗体、またはＣ型肝炎もしくはＨＩＶ抗体のスクリーニング試験陽性の履歴；スクリーニング前１年以内のアルコールまたは薬物乱用の履歴である。
【０２０８】
施される治療−免疫抑制治療による前治療。遺伝子治療の前に、患者は、導入遺伝子及び／またはＡＡＶキャプシドへの免疫反応を防止するために、免疫抑制治療で治療すべきである。そのような免疫抑制治療は、コルチコステロイド（第１日にメチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇを１回静脈内［ＩＶ］に前投与し、第２日に経口プレドニゾンを０．５ｍｇ／ｋｇ／日から開始し、段階的に漸減させて、第１２週までに中断する）、タクロリムス（第２日から第２４週まで１日２回［ＢＩＤ］１ｍｇを経口的に［ＰＯ］、目標血中レベルを４〜８ｎｇ／ｍＬとし、第２４週から第３２週にかけての８週間にわたり漸減する）、及びシロリムス（第−２日に４時間ごとに１ｍｇ／ｍ２×３用量の負荷用量、続いて第−１日からシロリムス０．５ｍｇ／ｍ２／日をＢＩＤに分けて、第４８週まで目標血中レベルを４〜８ｎｇ／ｍｌとして投薬する）を含む。神経学的評価及びタクロリムス／シロリムス血中レベルのモニタリングを実施する。シロリムス及びタクロリムスの用量は、目標範囲の血中レベルを維持するように調整する。４８週の経過後は、免疫抑制治療は予定されない。大部分の対象において、用量調整は、式：新規用量＝現在の用量×（目標濃度／現在の濃度）に基づくことができる。対象は、さらなる用量調整前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも７〜１４日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。
【０２０９】
遺伝子治療。ｈＩＤＵＡ発現カセット（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）を含む血清型９キャプシドの非複製組換えＡＡＶを、治療に使用する。ＡＡＶ９血清型を用いると、ＩＣ投与の後、ＣＮＳ中でｈＩＤＵＡタンパク質の効率的発現が可能となる。ベクターゲノムは、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接したｈＩＤＵＡ発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的ＣＡＧプロモーターによって駆動する。ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターは、くも膜下腔内注入のためのＥｌｌｉｏｔｔｓ  Ｂ溶液中に懸濁させる。
【０２１０】
ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡは、ＩＣ投与による単回固定用量：２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量（２．６×１０１２ＧＣ）の用量、または１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量（１．３×１０１３ＧＣ）の用量のいずれか、として投与する。用量は、約５〜２０ｍｌの容量にすることができる。
【０２１１】
ｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０２１２】
（６．９実施例９：ＭＰＳ  Ｉ治療の臨床プロトコル）
以下の実施例は、ＭＰＳ  Ｉを治療するためにヒト対象をｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０２１３】
患者集団。治療されることとなる患者は：
血漿、線維芽細胞、または白血球で測定された酵素活性によって確認されたＭＰＳ  Ｉの診断（これには、過去または現在ＨＳＣＴまたはラロニダーゼ治療を受けた可能性のある患者を含む）、
任意の他の神経学的または精神医学的な因子によって説明可能でない場合、以下のいずれかとして定義されるＭＰＳ  Ｉに起因する初期段階の神経認知機能低下：
ＩＱ試験での、または神経心理的機能（言語理解、注意力、または知覚推理）の１つの領域において平均を下回る標準偏差≧１のスコア、
逐次試験での＞１の標準偏差の低下、を有する、６歳以上の男性または女性及び３歳未満の男性または女性を含み得る。
３歳未満の患者は、神経認知機能低下を伴うハーラー症候群をもたらすことが知られる突然変異（複数可）によって確認される、重度形態のＭＰＳ  Ｉ（ハーラー症候群）を有する。
【０２１４】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０２１５】
出産可能性のある女性は、治療の日に血清妊娠試験陰性であるべきである。全ての性的に活発な対象は、スクリーニング受診からベクター投与の２４週間後まで医学的に認められたバリア避妊法を進んで使用しなければならない。性的に活発な女性は、スクリーニング受診からシロリムスの最後の投与後１２週間のいずれか遅い方まで、効果的な避妊方法を進んで使用しなければならない。大槽内（ＩＣ）治療から除外され得る患者には、ＩＣ注入または腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。ＩＣ注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる：
過去の頭部／頸部手術の既往歴の結果、ＩＣ注入が禁忌となっている、
ＣＴ（もしくは造影剤）または全身麻酔に任意の禁忌を有する、
ＭＲＩ（またはガドリニウム）に任意の禁忌を有する、
推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を有する。
【０２１６】
いずれかの時にＩＴ治療を受けて、ＩＴ投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ＩＣで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではない（例えば、好中球数の絶対数が＜１．３×１０３／μＬ、血小板数＜１００×１０３／μＬ、及びヘモグロビン＜１２ｇ／ｄＬ［男性］または＜１０ｇ／ｄＬ［女性］）。
【０２１７】
代替免疫抑制レジメンは、任意の患者に使用すべきであるか、またはタクロリムス、シロリムス、もしくはプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の既往歴を有する患者を除外すべきである。原発性免疫不全症、脾臓摘出術、または感染症に罹患しやすい基礎疾患の既往歴のある患者は、免疫抑制療法で治療するべきではない。帯状疱疹、サイトメガロウイルス、またはエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）感染症の患者で、スクリーニング前の少なくとも１２週間は完全に解消されていない場合は、免疫抑制療法で治療するべきではない。（１）２回目の受診の少なくとも８週間前に消散しておらず、入院または親世代抗感染症薬による治療を必要とする任意の感染症を有する患者、または（２）２回目の受診前１０日以内に経口抗感染症薬（抗ウイルス薬を含む）を必要とする任意の活発な感染症、もしくは活発な結核の既往歴を有する患者、または（３）スクリーニングの間のＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ＿ＴＢ  Ｇｏｌｄ試験で陽性となった患者、または（４）インフォームドコンセント用紙に署名をする前８週間以内に任意の生ワクチンを受けた患者、または（５）インフォームドコンセントに署名をする前８週間以内に大手術を行った患者、または（６）試験期間中に大手術を予定している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。好中球数の絶対数が＜１．３×１０３／μＬである患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。
【０２１８】
リンパ腫または皮膚の扁平上皮細胞または基底細胞癌以外の別のがんの病歴を有する患者は、治療前少なくとも３ヶ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０２１９】
最大限の医学的治療にもかかわらず、コントロール不良高血圧症（収縮期ＢＰ＞１８０ｍｍＨｇ、拡張期ＢＰ＞１００ｍｍＨｇ）の患者は治療するべきではない。
【０２２０】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が＞３×正常値上限（ＵＬＮ）であるか、または総ビリルビンが＞１．５×ＵＬＮである患者は、対象が過去ギルバート症候群の既往歴を有する、及び総ビリルビンの＜３５％の抱合型ビリルビンを示す分画ビリルビンを有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０２２１】
感染症または薬物乱用の既往歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウイルス感染の既往歴、またはＢ型肝炎表面抗原もしくはＢ型肝炎コア抗体、またはＣ型肝炎もしくはＨＩＶ抗体のスクリーニング試験陽性の履歴；スクリーニング前１年以内のアルコールまたは薬物乱用の履歴である。
【０２２２】
施される治療−免疫抑制治療による前治療。遺伝子治療の前に、患者は、導入遺伝子及び／またはＡＡＶキャプシドへの免疫反応を防止するために、免疫抑制治療で治療すべきである。そのような免疫抑制治療は、６歳以上の患者に対し、コルチコステロイド（第１日にメチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇを１回静脈内［ＩＶ］に前投与し、第２日に経口プレドニゾンを０．５ｍｇ／ｋｇ／日から開始し、段階的に漸減させて、第１２週までに中断する）、タクロリムス（第２日から第２４週まで１日２回［ＢＩＤ］１ｍｇを経口的に［ＰＯ］、目標血中レベルを４〜８ｎｇ／ｍＬとし、第２４週から第３２週にかけての８週間にわたり漸減する）、及びシロリムス（第−２日に４時間ごとに１ｍｇ／ｍ２×３用量の負荷用量、続いて第−１日からシロリムス０．５ｍｇ／ｍ２／日をＢＩＤに分けて、第４８週まで目標血中レベルを４〜８ｎｇ／ｍｌとして投薬する）を含む。そのような免疫抑制治療は、３歳未満の患者に対し、コルチコステロイド（第１日にメチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇを１回静脈内［ＩＶ］に前投与し、第２日に経口プレドニゾンを０．５ｍｇ／ｋｇ／日から開始し、段階的に漸減させて、第１２週までに中断する）、タクロリムス（第２日から第２４週まで１日２回［ＢＩＤ］０．０５ｍｇ／ｋｇを経口的に［ＰＯ］、目標血中レベルを２〜４ｎｇ／ｍＬとし、第２４週から第３２週にかけての８週間にわたり漸減する）、及びシロリムス（第−２日に４時間ごとに１ｍｇ／ｍ２×３用量の負荷用量、続いて第−１日からシロリムス０．５ｍｇ／ｍ２／日をＢＩＤに分けて、第４８週まで目標血中レベルを１〜３ｎｇ／ｍｌとして投薬する）を含む。神経学的評価及びタクロリムス／シロリムス血中レベルのモニタリングを実施する。シロリムス及びタクロリムスの用量は、目標範囲の血中レベルを維持するように調整する。４８週の経過後は、免疫抑制治療は予定されない。大部分の対象において、用量調整は、式：新規用量＝現在の用量×（目標濃度／現在の濃度）に基づくことができる。対象は、さらなる用量調整前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも７〜１４日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。
【０２２３】
遺伝子治療。ｈＩＤＵＡ発現カセット（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）を含む血清型９キャプシドの非複製組換えＡＡＶを、治療に使用する。ＡＡＶ９血清型を用いると、ＩＣ投与の後、ＣＮＳ中でｈＩＤＵＡタンパク質の効率的発現が可能となる。ベクターゲノムは、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接したｈＩＤＵＡ発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的ＣＡＧプロモーターによって駆動する。ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターは、くも膜下腔内注入のためのＥｌｌｉｏｔｔｓ  Ｂ溶液中に懸濁させる。
【０２２４】
６歳以上の患者の場合、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡは、ＩＣ投与による単回固定用量：２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量（２．６×１０１２ＧＣ）の用量、または１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量（１．３×１０１３ＧＣ）の用量のいずれか、として投与する。用量は、約５ｍｌ以下の容量にすることができる。
【０２２５】
３歳未満の患者の場合、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡは、ＩＣ投与による単回固定用量：１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量（４ヶ月齢以上であるが９ヶ月齢未満の患者については６．０×１０１２ＧＣ；９ヶ月齢以上であるが１８ヶ月齢未満の患者については１．０×１０１３ＧＣ；１８ヶ月以上であるが３歳未満の患者については１．１×１０１３ＧＣ）、または５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量（４ヶ月齢以上であるが９ヶ月齢未満の患者については３．０×１０１３ＧＣ；９ヶ月齢以上であるが１８ヶ月齢未満の患者については５．０×１０１３ＧＣ；１８ヶ月以上であるが３歳未満の患者については５．５×１０１３ＧＣ）のいずれか、として投与する。用量は、約５ｍｌ以下の容量にすることができる。
【０２２６】
ｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０２２７】
（６．１０実施例１０：ＭＰＳ  Ｉ治療の臨床プロトコル）
以下の実施例は、ＭＰＳ  Ｉを治療するためにヒト対象をｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０２２８】
患者集団。治療されることとなる患者は：
ＭＰＳ  Ｉ−Ｈに適合する臨床的徴候及び症状、及び／または重度表現型に排他的に関連する突然変異のホモ接合性もしくは複合ヘテロ接合性の存在によって確認される重度ＭＰＳ  Ｉ−ハーラーの診断、
５５以上の知能指数（ＩＱ）スコア、を有する３歳未満の男性または女性を含み得る。
【０２２９】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０２３０】
大槽内（ＩＣ）治療から除外され得る患者には、ＩＣ注入または腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。ＩＣ注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる：
過去の頭部／頸部手術の既往歴の結果、ＩＣ注入が禁忌となっている、
ＣＴ（もしくは造影剤）または全身麻酔に任意の禁忌を有する、
ＭＲＩ（またはガドリニウム）に任意の禁忌を有する、
推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を有する。
【０２３１】
いずれかの時にＩＴ治療を受けて、ＩＴ投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ＩＣで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではなく（例えば、好中球数の絶対数が＜１．３×１０３／μＬ、血小板数＜１００×１０３／μＬ）、ヘモグロビンを評価する。
【０２３２】
代替免疫抑制レジメンは、任意の患者に使用すべきであるか、またはタクロリムス、シロリムス、もしくはプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の既往歴を有する患者を除外すべきである。原発性免疫不全症、脾臓摘出術、または感染症に罹患しやすい基礎疾患の既往歴のある患者は、免疫抑制療法で治療するべきではない。帯状疱疹、サイトメガロウイルス、またはエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）感染症の患者で、スクリーニング前の少なくとも１２週間は完全に解消されていない場合は、免疫抑制療法で治療するべきではない。（１）２回目の受診の少なくとも８週間前に消散しておらず、入院または親世代抗感染症薬による治療を必要とする任意の感染症を有する患者、または（２）２回目の受診前１０日以内に経口抗感染症薬（抗ウイルス薬を含む）を必要とする任意の活発な感染症、もしくは活発な結核の既往歴を有する患者、または（３）スクリーニングの間のＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ＿ＴＢ  Ｇｏｌｄ試験で陽性となった患者、または（４）インフォームドコンセント用紙に署名をする前８週間以内に任意の生ワクチンを受けた患者、または（５）インフォームドコンセントに署名をする前８週間以内に大手術を行った患者、または（６）試験期間中に大手術を予定している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。好中球数の絶対数が＜１．３×１０３／μＬである患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。
【０２３３】
リンパ腫または皮膚の扁平上皮細胞または基底細胞癌以外の別のがんの病歴を有する患者は、治療前少なくとも３ヶ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０２３４】
最大限の医学的治療にもかかわらず、コントロール不良高血圧症（収縮期ＢＰ＞１８０ｍｍＨｇ、拡張期ＢＰ＞１００ｍｍＨｇ）の患者は治療するべきではない。
【０２３５】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が＞３×正常値上限（ＵＬＮ）であるか、または総ビリルビンが＞１．５×ＵＬＮである患者は、対象が過去ギルバート症候群の履歴を有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０２３６】
感染症または薬物乱用の既往歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウイルス感染の既往歴、またはＢ型肝炎表面抗原もしくはＢ型肝炎コア抗体、またはＣ型肝炎もしくはＨＩＶ抗体のスクリーニング試験陽性の履歴；スクリーニング前１年以内のアルコールまたは薬物乱用の履歴である。
【０２３７】
施される治療−免疫抑制治療による前治療。遺伝子治療の前に、患者は、導入遺伝子及び／またはＡＡＶキャプシドへの免疫反応を防止するために、免疫抑制治療で治療すべきである。プレドニゾンの投薬は、０．５ｍｇ／ｋｇ／日から開始し、第１２週の受診まで段階的に漸減させる。タクロリムスの用量は、最初の２４週にわたり全血中トラフ濃度を２〜４ｎｇ／ｍＬ以内に維持するように調整する。第２４週に、用量をおよそ５０％まで減少させる。第２８週に、用量をおよそ５０％までさらに減少させる。タクロリムスは、第３２週に中断する。シロリムスの用量は、全血中トラフ濃度を１〜３ｎｇ／ｍＬ以内に維持するように調整する。大部分の対象において、用量調整は、式：新規用量＝現在の用量×（目標濃度／現在の濃度）に基づくことができる。対象は、さらなる用量調整前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも７〜１４日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。さらなる詳細については以下を参照のこと。
【０２３８】
コルチコステロイド
【０２３９】
ベクター投与（第１日、前投与）の朝において、患者に、少なくとも３０分間にわたるメチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇ（最大５００ｍｇ）をＩＶで与える。メチルプレドニゾロンは、ＩＰの腰椎穿刺及びＩＣ注入の前に投与するべきである。アセトアミノフェン及び抗ヒスタミン剤による前投薬は、治験責任医師の裁量で任意に行う。
【０２４０】
第１２週までにプレドニゾンを中断することを目標として、第２日に経口プレドニゾンを開始する。プレドニゾンの用量は、以下の通りである：
第２日から第２週の終わりまで：０．５ｍｇ／ｋｇ／日
第３週及び４週：０．３５  ｍｇ／ｋｇ／日
第５週〜８週：０．２ｍｇ／ｋｇ／日
第９週〜１２週：０．１ｍｇ／ｋｇ
プレドニゾンは、第１２週の後に中断する。プレドニゾンの正確な用量は、一段階高めた臨床上実用的な用量に調整することができる。
【０２４１】
シロリムス
【０２４２】
ベクター投与の２日前（第−２日）：４時間ごとに１ｍｇ／ｍ２×３用量のシロリムスの負荷用量を投与する。
【０２４３】
第−１日から：目標血中レベルを１〜３ｎｇ／ｍｌとする、１日２回の投薬に分割した０．５ｍｇ／ｍ２／日のシロリムス。
【０２４４】
シロリムスを、第４８週の受診後に中断する。
【０２４５】
タクロリムス
【０２４６】
第２日（ＩＰ投与の次の日）にタクロリムスを１日２回０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で開始し、２４週間にわたり２〜４ｎｇ／ｍＬの血中レベルを達成するように調整した。
【０２４７】
タクロリムスは第２４週の受診から開始し、８週にわたって漸減する。第２４週に、用量をおよそ５０％まで減少させる。第２８週に、用量をおよそ５０％までさらに減少させる。タクロリムスは、第３２週に中断する。
【０２４８】
遺伝子治療。ｈＩＤＵＡ発現カセット（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）を含む血清型９キャプシドの非複製組換えＡＡＶを、治療に使用する。ＡＡＶ９血清型を用いると、ＩＣ投与の後、ＣＮＳ中でｈＩＤＵＡタンパク質の効率的発現が可能となる。ベクターゲノムは、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接したｈＩＤＵＡ発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的ＣＡＧプロモーターによって駆動する。ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターは、くも膜下腔内注入のためのＥｌｌｉｏｔｔｓ  Ｂ溶液中に懸濁させる。
【０２４９】
ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡは、ＩＣ投与による単回固定用量：１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量（４ヶ月齢以上であるが９ヶ月齢未満の患者については６．０×１０１２ＧＣ；９ヶ月齢以上であるが１８ヶ月齢未満の患者については１×１０１３ＧＣ；１８ヶ月以上であるが３歳未満の患者については１．１×１０１３ＧＣ）、または５×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量（４ヶ月齢以上であるが９ヶ月齢未満の患者については３×１０１３ＧＣ；９ヶ月齢以上であるが１８ヶ月齢未満の患者については５×１０１３ＧＣ；１８ヶ月以上であるが３歳未満の患者については５．５×１０１３ＧＣ）のいずれか、として投与する。用量は、約５〜２０ｍｌの容量にすることができる。
【０２５０】
ｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０２５１】
（６．１１実施例１１：ＭＰＳ  Ｉ治療の臨床プロトコル）
以下の実施例は、ＭＰＳ  Ｉを治療するためにヒト対象をｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０２５２】
患者集団。治療されることとなる患者は：
血漿、線維芽細胞、または白血球で測定された酵素活性によって確認されたＭＰＳ  Ｉの診断（これには、過去または現在ＨＳＣＴまたはラロニダーゼ治療を受けた可能性のある患者を含む）、
任意の他の神経学的または精神医学的な因子によって説明可能でない場合、以下のいずれかとして定義されるＭＰＳ  Ｉに起因する初期段階の神経認知機能低下：
ＩＱ試験での、または神経心理的機能（言語理解、注意力、または知覚推理）の１つの領域において平均を下回る標準偏差≧１のスコア、
逐次試験での＞１の標準偏差の低下、を有する、６歳以上の男性または女性及び３歳未満の男性または女性を含み得る。
３歳未満の患者は、神経認知機能低下を伴うハーラー症候群をもたらすことが知られる突然変異（複数可）によって確認される、重度形態のＭＰＳ  Ｉ（ハーラー症候群）を有する。
【０２５３】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０２５４】
出産可能性のある女性は、治療の日に血清妊娠試験陰性であるべきである。全ての性的に活発な対象は、スクリーニング受診からベクター投与の２４週間後まで医学的に認められたバリア避妊法を進んで使用しなければならない。性的に活発な女性は、スクリーニング受診からシロリムスの最後の投与後１２週間のいずれか遅い方まで、効果的な避妊方法を進んで使用しなければならない。大槽内（ＩＣ）治療から除外され得る患者には、ＩＣ注入または腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。ＩＣ注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる：
過去の頭部／頸部手術の既往歴の結果、ＩＣ注入が禁忌となっている、
ＣＴ（もしくは造影剤）または全身麻酔に任意の禁忌を有する、
ＭＲＩ（またはガドリニウム）に任意の禁忌を有する、
推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を有する。
【０２５５】
いずれかの時にＩＴ治療を受けて、ＩＴ投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ＩＣで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではない（例えば、好中球数の絶対数が＜１．３×１０３／μＬ、血小板数＜１００×１０３／μＬ、及びヘモグロビン＜１２ｇ／ｄＬ［男性］または＜１０ｇ／ｄＬ［女性］）。
【０２５６】
代替免疫抑制レジメンは、任意の患者に使用すべきであるか、またはタクロリムス、シロリムス、もしくはプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の既往歴を有する患者を除外すべきである。原発性免疫不全症、脾臓摘出術、または感染症に罹患しやすい基礎疾患の既往歴のある患者は、免疫抑制療法で治療するべきではない。帯状疱疹、サイトメガロウイルス、またはエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）感染症の患者で、スクリーニング前の少なくとも１２週間は完全に解消されていない場合は、免疫抑制療法で治療するべきではない。（１）２回目の受診の少なくとも８週間前に消散しておらず、入院または親世代抗感染症薬による治療を必要とする任意の感染症を有する患者、または（２）２回目の受診前１０日以内に経口抗感染症薬（抗ウイルス薬を含む）を必要とする任意の活発な感染症、もしくは活発な結核の既往歴を有する患者、または（３）スクリーニングの間のＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ＿ＴＢ  Ｇｏｌｄ試験で陽性となった患者、または（４）インフォームドコンセント用紙に署名をする前８週間以内に任意の生ワクチンを受けた患者、または（５）インフォームドコンセントに署名をする前８週間以内に大手術を行った患者、または（６）試験期間中に大手術を予定している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。好中球数の絶対数が＜１．３×１０３／μＬである患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。
【０２５７】
リンパ腫または皮膚の扁平上皮細胞または基底細胞癌以外の別のがんの病歴を有する患者は、治療前少なくとも３ヶ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０２５８】
最大限の医学的治療にもかかわらず、コントロール不良高血圧症（収縮期ＢＰ＞１８０ｍｍＨｇ、拡張期ＢＰ＞１００ｍｍＨｇ）の患者は治療するべきではない。
【０２５９】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が＞３×正常値上限（ＵＬＮ）であるか、または総ビリルビンが＞１．５×ＵＬＮである患者は、対象が過去ギルバート症候群の既往歴を有する、及び総ビリルビンの＜３５％の抱合型ビリルビンを示す分画ビリルビンを有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０２６０】
感染症または薬物乱用の既往歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウイルス感染の既往歴、またはＢ型肝炎表面抗原もしくはＢ型肝炎コア抗体、またはＣ型肝炎もしくはＨＩＶ抗体のスクリーニング試験陽性の履歴；スクリーニング前１年以内のアルコールまたは薬物乱用の履歴である。
【０２６１】
施される治療−免疫抑制治療による前治療。遺伝子治療の前に、患者は、導入遺伝子及び／またはＡＡＶキャプシドへの免疫反応を防止するために、免疫抑制治療で治療すべきである。そのような免疫抑制治療は、６歳以上の患者に対し、コルチコステロイド（第１日にメチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇを１回静脈内［ＩＶ］に前投与し、第２日に経口プレドニゾンを０．５ｍｇ／ｋｇ／日から開始し、段階的に漸減させて、第１２週までに中断する）、タクロリムス（第２日から第２４週まで１日２回［ＢＩＤ］１ｍｇを経口的に［ＰＯ］、目標血中レベルを４〜８ｎｇ／ｍＬとし、第２４週から第３２週にかけての８週間にわたり漸減する）、及びシロリムス（第−２日に４時間ごとに１ｍｇ／ｍ２×３用量の負荷用量、続いて第−１日からシロリムス０．５ｍｇ／ｍ２／日をＢＩＤに分けて、第４８週まで目標血中レベルを４〜８ｎｇ／ｍｌとして投薬する）を含む。そのような免疫抑制治療は、３歳未満の患者に対し、コルチコステロイド（第１日にメチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇを１回静脈内［ＩＶ］に前投与し、第２日に経口プレドニゾンを０．５ｍｇ／ｋｇ／日から開始し、段階的に漸減させて、第１２週までに中断する）、タクロリムス（第２日から第２４週まで１日２回［ＢＩＤ］０．０５ｍｇ／ｋｇを経口的に［ＰＯ］、目標血中レベルを２〜４ｎｇ／ｍＬとし、第２４週から第３２週にかけての８週間にわたり漸減する）、及びシロリムス（第−２日に４時間ごとに１ｍｇ／ｍ２×３用量の負荷用量、続いて第−１日からシロリムス０．５ｍｇ／ｍ２／日をＢＩＤに分けて、第４８週まで目標血中レベルを１〜３ｎｇ／ｍｌとして投薬する）を含む。神経学的評価及びタクロリムス／シロリムス血中レベルのモニタリングを実施する。シロリムス及びタクロリムスの用量は、目標範囲の血中レベルを維持するように調整する。４８週の経過後は、免疫抑制治療は予定されない。大部分の対象において、用量調整は、式：新規用量＝現在の用量×（目標濃度／現在の濃度）に基づくことができる。対象は、さらなる用量調整前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも７〜１４日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。
【０２６２】
遺伝子治療。ｈＩＤＵＡ発現カセット（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）を含む血清型９キャプシドの非複製組換えＡＡＶを、治療に使用する。ＡＡＶ９血清型を用いると、ＩＣ投与の後、ＣＮＳ中でｈＩＤＵＡタンパク質の効率的発現が可能となる。ベクターゲノムは、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接したｈＩＤＵＡ発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的ＣＡＧプロモーターによって駆動する。ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターは、くも膜下腔内注入のためのＥｌｌｉｏｔｔｓ  Ｂ溶液中に懸濁させる。
【０２６３】
６歳以上の患者の場合、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡは、ＩＣ投与による単回固定用量：２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量（２．６×１０１２ＧＣ）の用量、または１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量（１．３×１０１３ＧＣ）の用量のいずれか、として投与する。用量は、約５ｍｌ以下の容量にすることができる。
【０２６４】
３歳未満の患者の場合、ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡは、ＩＣ投与による単回固定用量：２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量の用量（４ヶ月齢以上であるが９ヶ月齢未満の患者については１．２×１０１２ＧＣ；９ヶ月齢以上であるが１８ヶ月齢未満の患者については２．０×１０１２ＧＣ；１８ヶ月以上であるが３歳未満の患者については２．２×１０１２ＧＣ）、または１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量（４ヶ月齢以上であるが９ヶ月齢未満の患者については６．０×１０１２ＧＣ；９ヶ月齢以上であるが１８ヶ月齢未満の患者については１．０×１０１３ＧＣ；１８ヶ月以上であるが３歳未満の患者については１．１×１０１３ＧＣ）のいずれか、として投与する。用量は、約５ｍｌ以下の容量にすることができる。
【０２６５】
ｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０２６６】
（６．１２実施例１２：ＭＰＳ  Ｉ治療の臨床プロトコル）
以下の実施例は、ＭＰＳ  Ｉを治療するためにヒト対象をｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターで治療するために使用することができるプロトコルを記載する。
【０２６７】
患者集団。治療されることとなる患者は：
ＭＰＳ  Ｉ−Ｈに適合する臨床的徴候及び症状、及び／または重度表現型に排他的に関連する突然変異のホモ接合性もしくは複合ヘテロ接合性の存在によって確認される重度ＭＰＳ  Ｉ−ハーラーの診断、
５５以上の知能指数（ＩＱ）スコア、を有する３歳未満の男性または女性を含み得る。
【０２６８】
患者は、補助具の有無にかかわらず、要求されるプロトコル試験を完了するのに十分な聴覚的及び視覚的能力を有し、適用できる場合、試験日に進んで補助具を着用することに従うべきである。
【０２６９】
大槽内（ＩＣ）治療から除外され得る患者には、ＩＣ注入または腰椎穿刺についての禁忌を有する対象が含まれ得る。ＩＣ注入のための禁忌には、以下のいずれかを含むことができる：
過去の頭部／頸部手術の既往歴の結果、ＩＣ注入が禁忌となっている、
ＣＴ（もしくは造影剤）または全身麻酔に任意の禁忌を有する、
ＭＲＩ（またはガドリニウム）に任意の禁忌を有する、
推算糸球体濾過量（ｅＧＦＲ）＜３０ｍＬ／分／１．７３ｍ２を有する。
【０２７０】
いずれかの時にＩＴ治療を受けて、ＩＴ投与に関係すると考えられる重大な有害反応を経験した患者は、ＩＣで治療されるべきではない。治療医師が免疫抑制治療に適当でないと考える任意の状態を有する患者は、治療を受けるべきではなく（例えば、好中球数の絶対数が＜１．３×１０３／μＬ、血小板数＜１００×１０３／μＬ）、ヘモグロビンを評価する。
【０２７１】
代替免疫抑制レジメンは、任意の患者に使用すべきであるか、またはタクロリムス、シロリムス、もしくはプレドニゾロンに対する過敏性反応の任意の既往歴を有する患者を除外すべきである。原発性免疫不全症、脾臓摘出術、または感染症に罹患しやすい基礎疾患の既往歴のある患者は、免疫抑制療法で治療するべきではない。帯状疱疹、サイトメガロウイルス、またはエプスタイン・バール・ウイルス（ＥＢＶ）感染症の患者で、スクリーニング前の少なくとも１２週間は完全に解消されていない場合は、免疫抑制療法で治療するべきではない。（１）２回目の受診の少なくとも８週間前に消散しておらず、入院または親世代抗感染症薬による治療を必要とする任意の感染症を有する患者、または（２）２回目の受診前１０日以内に経口抗感染症薬（抗ウイルス薬を含む）を必要とする任意の活発な感染症、もしくは活発な結核の既往歴を有する患者、または（３）スクリーニングの間のＱｕａｎｔｉｆｅｒｏｎ＿ＴＢ  Ｇｏｌｄ試験で陽性となった患者、または（４）インフォームドコンセント用紙に署名をする前８週間以内に任意の生ワクチンを受けた患者、または（５）インフォームドコンセントに署名をする前８週間以内に大手術を行った患者、または（６）試験期間中に大手術を予定している患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。好中球数の絶対数が＜１．３×１０３／μＬである患者は、免疫抑制治療で治療するべきではない。
【０２７２】
リンパ腫または皮膚の扁平上皮細胞または基底細胞癌以外の別のがんの病歴を有する患者は、治療前少なくとも３ヶ月にわたって完全寛解にない限り、治療するべきではない。
【０２７３】
最大限の医学的治療にもかかわらず、コントロール不良高血圧症（収縮期ＢＰ＞１８０ｍｍＨｇ、拡張期ＢＰ＞１００ｍｍＨｇ）の患者は治療するべきではない。
【０２７４】
アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）もしくはアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）が＞３×正常値上限（ＵＬＮ）であるか、または総ビリルビンが＞１．５×ＵＬＮである患者は、対象が過去ギルバート症候群の履歴を有することが分かっている場合を除いては、治療するべきではない。
【０２７５】
感染症または薬物乱用の既往歴を有する患者は、治療の候補とすることはできない。例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）もしくはＢ型肝炎もしくはＣ型肝炎ウイルス感染の既往歴、またはＢ型肝炎表面抗原もしくはＢ型肝炎コア抗体、またはＣ型肝炎もしくはＨＩＶ抗体のスクリーニング試験陽性の履歴；スクリーニング前１年以内のアルコールまたは薬物乱用の履歴である。
【０２７６】
施される治療−免疫抑制治療による前治療。遺伝子治療の前に、患者は、導入遺伝子及び／またはＡＡＶキャプシドへの免疫反応を防止するために、免疫抑制治療で治療すべきである。プレドニゾンの投薬は、０．５ｍｇ／ｋｇ／日から開始し、第１２週の受診まで段階的に漸減させる。タクロリムスの用量は、最初の２４週にわたり全血中トラフ濃度を２〜４ｎｇ／ｍＬ以内に維持するように調整する。第２４週に、用量をおよそ５０％まで減少させる。第２８週に、用量をおよそ５０％までさらに減少させる。タクロリムスは、第３２週に中断する。シロリムスの用量は、全血中トラフ濃度を１〜３ｎｇ／ｍＬ以内に維持するように調整する。大部分の対象において、用量調整は、式：新規用量＝現在の用量×（目標濃度／現在の濃度）に基づくことができる。対象は、さらなる用量調整前に、濃度をモニタリングしながら少なくとも７〜１４日間にわたり新しい維持用量を継続するべきである。さらなる詳細については以下を参照のこと。
【０２７７】
コルチコステロイド
【０２７８】
ベクター投与（第１日、前投与）の朝において、患者に、少なくとも３０分間にわたるメチルプレドニゾロン１０ｍｇ／ｋｇ（最大５００ｍｇ）をＩＶで与える。メチルプレドニゾロンは、ＩＰの腰椎穿刺及びＩＣ注入の前に投与するべきである。アセトアミノフェン及び抗ヒスタミン剤による前投薬は、治験責任医師の裁量で任意に行う。
【０２７９】
第１２週までにプレドニゾンを中断することを目標として、第２日に経口プレドニゾンを開始する。プレドニゾンの用量は、以下の通りである：
第２日から第２週の終わりまで：０．５ｍｇ／ｋｇ／日
第３週及び４週：０．３５ｍｇ／ｋｇ／日
第５週〜８週：０．２ｍｇ／ｋｇ／日
第９週〜１２週：０．１ｍｇ／ｋｇ
プレドニゾンは、第１２週の後に中断する。プレドニゾンの正確な用量は、一段階高めた臨床上実用的な用量に調整することができる。
【０２８０】
シロリムス
【０２８１】
ベクター投与の２日前（第−２日）：４時間ごとに１ｍｇ／ｍ２×３用量のシロリムスの負荷用量を投与する。
【０２８２】
第−１日から：目標血中レベルを１〜３ｎｇ／ｍｌとする、１日２回の投薬に分割した０．５ｍｇ／ｍ２／日のシロリムス。
【０２８３】
シロリムスを、第４８週の受診後に中断する。
【０２８４】
タクロリムス
【０２８５】
第２日（ＩＰ投与の次の日）にタクロリムスを１日２回０．０５ｍｇ／ｋｇの用量で開始し、２４週間にわたり２〜４ｎｇ／ｍＬの血中レベルを達成するように調整した。
【０２８６】
タクロリムスは第２４週の受診から開始し、８週にわたって漸減する。第２４週に、用量をおよそ５０％まで減少させる。第２８週に、用量をおよそ５０％までさらに減少させる。タクロリムスは、第３２週に中断する。
【０２８７】
遺伝子治療。ｈＩＤＵＡ発現カセット（ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡ）を含む血清型９キャプシドの非複製組換えＡＡＶを、治療に使用する。ＡＡＶ９血清型を用いると、ＩＣ投与の後、ＣＮＳ中でｈＩＤＵＡタンパク質の効率的発現が可能となる。ベクターゲノムは、ＡＡＶ２の逆位末端反復配列（ＩＴＲ）と隣接したｈＩＤＵＡ発現カセットを含む。カセットからの発現は、強力な構成的ＣＡＧプロモーターによって駆動する。ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡベクターは、くも膜下腔内注入のためのＥｌｌｉｏｔｔｓ  Ｂ溶液中に懸濁させる。
【０２８８】
ｒＡＡＶ９．ｈＩＤＵＡは、ＩＣ投与による単回固定用量：２×１０９ＧＣ／ｇ脳質量の用量（４ヶ月齢以上であるが９ヶ月齢未満の患者については１．２×１０１２ＧＣ；９ヶ月齢以上であるが１８ヶ月齢未満の患者については２．０×１０１２ＧＣ；１８ヶ月以上であるが３歳未満の患者については２．２×１０１２ＧＣ）、または１×１０１０ＧＣ／ｇ脳質量の用量（４ヶ月齢以上であるが９ヶ月齢未満の患者については６．０×１０１２ＧＣ；９ヶ月齢以上であるが１８ヶ月齢未満の患者については１．０×１０１３ＧＣ；１８ヶ月以上であるが３歳未満の患者については１．１×１０１３ＧＣ）のいずれか、として投与する。用量は、約５〜２０ｍｌの容量にすることができる。
【０２８９】
ｒＡＡＶ９．ＩＤＵＡの投与のために、対象を全身麻酔下におく。
【０２９０】
均等物
本発明がその具体的な実施形態に関して詳細に記載されるにもかかわらず、機能的に等価である変形が本発明の範囲内にあることが理解されよう。実際、本明細書において示され、説明される発明に加え、本発明の様々な修正が、上記明細書及び添付される図面から当業者にとって明らかとなるであろう。そのような修正は、添付の特許請求の範囲の範囲内にあることを意図する。当業者であれば、本明細書に記載の発明の具体的な実施形態との多くの等価物を認識するかまたは定型的な実験の範囲の域でこれを使用し、確認することが可能である。そのような等価物は、以下の特許請求の範囲に包含されることを意図する。
【０２９１】
この明細書に言及のある全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願の全体が参照により本明細書に組み込まれていることが具体的かつ個別的に示されているのと同程度に、明細書中に参照により本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021531276.tif 000015
【図２−１】
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【図２−２】
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【図２−３】
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【図２−４】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図４】
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【図５−１】
2021531276.tif 000024
【図５−２】
2021531276.tif 000025
【図５−３】
2021531276.tif 000026
【図５−４】
2021531276.tif 000027
【図５−５】
2021531276.tif 000028
【図５−６】
2021531276.tif 000029
【図５−７】
2021531276.tif 000030
【手続補正書】
【提出日】令和3年4月12日(2021.4.12)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021531276000001.app
【国際調査報告】
2021531276.tif 000031
2021531276.tif 000032
2021531276.tif 000033
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