(57)【要約】  本発明は、１マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍの範囲の平均断面径を有するヒドロゲル粒子であって、１０００ナノメートル（ｎｍ）以下の流体力学半径を有する分子の、第１のポリマーネットワーク中への拡散を可能とする平均メッシュサイズを有する第１のポリマーネットワークを含み、ポリマーネットワークにより固定化されている１つ以上の結合分子を含む粒子に関する。ヒドロゲル粒子は、好ましくは、１０００ｎｍ超の平均流体力学半径を有する分子の、第１のポリマーネットワーク中への拡散を妨害する平均メッシュサイズを有する第１のポリマーネットワークを有し、好ましくは、メッシュサイズは、１００ｎｍ超、好ましくは、５ｎｍ超の平均流体力学半径を有する分子の拡散を妨害する。本発明は特に、記載のヒドロゲル粒子を使用することにより生物系中の１つ以上の可溶性生物分子のバイオアベイラビリティを低減させる方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍの範囲の平均断面径を有するヒドロゲル粒子であって、１０００ナノメートル（ｎｍ）以下の流体力学半径を有する分子の、第１のポリマーネットワーク中への拡散を可能とする平均メッシュサイズを有する第１のポリマーネットワークを含み、前記ポリマーネットワークにより固定化されている結合分子を含み、結合分子は、１０００ナノメートル（ｎｍ）以下の流体力学半径を有する分子に特異的に結合するヒドロゲル粒子。
【請求項２】
前記第１のポリマーネットワークが、１０００ｎｍ超の平均流体力学半径を有する分子の、前記第１のポリマーネットワーク中への拡散を妨害する平均メッシュサイズを有し、好ましくは、前記メッシュサイズは、１００ｎｍ超、好ましくは、５ｎｍ超の平均流体力学半径を有する分子の拡散を妨害する、請求項１に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項３】
前記第１のポリマーネットワークの前記メッシュサイズが、既知の平均流体力学半径を有する分子の拡散を計測することにより決定される、請求項１または２に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項４】
ポリマーが、生体適合性ポリマー、好ましくは、デキストラン；ヒアルロン酸；およびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の１つ以上である、請求項１〜３のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項５】
ヒドロゲルが、デキストラン−チラミンヒドロゲル；ヒアルロン酸−チラミンヒドロゲル；ＰＥＧ−チラミンヒドロゲルまたはそれらの組合せを含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項６】
前記結合分子が、結合ぺプチド；抗体若しくはその抗原結合部分；リガンド結合受容体；またはアプタマーである、請求項１〜５のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項７】
前記抗体またはその抗原結合部分が、単一ドメイン抗体である、請求項６に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項８】
前記単一ドメイン抗体が、ラクダまたは軟骨魚の単鎖重鎖抗体の可変ドメイン（それぞれＶＨＨおよびＶＮＡＲとも称される）である、請求項７に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項９】
前記第１のポリマーネットワークを包囲する第２のポリマーネットワークを含み、第２のポリマーネットワークは、前記結合分子を欠く、請求項１〜８のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１０】
前記第２のポリマーネットワークが、前記第１のポリマーネットワークの前記メッシュサイズと同一であり、またはそれよりも小さいメッシュサイズを有する、請求項９に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１１】
前記第２のポリマーネットワークが、１００ｎｍ超の平均流体力学半径を有する分子が浸透不能な、好ましくは、５ｎｍ超の平均流体力学半径を有する分子が浸透不能な、好ましくは、４ｎｍ超の平均流体力学半径を有する分子が浸透不能なメッシュサイズを有する、請求項９または１０に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１２】
前記第２のポリマーネットワークが、１ナノメートル〜４５０μｍの厚さを有する、請求項９〜１１のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１３】
前記第２のポリマーネットワークが、標的化部分または生物コンパートメント保持分子を含む、請求項９〜１２のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１４】
前記結合分子が、サイトカイン、可溶性抗原または自己抗体に結合し得る、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子。
【請求項１５】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子を含む水溶液、好ましくは、医薬溶液。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子を含む注射に好適な水溶液。
【請求項１７】
過剰活性免疫系、癌、または過剰活性ホルモンおよび／若しくはサイトカイン産生細胞を有する患者の治療における、好ましくは、炎症の治療における、好ましくは、関節炎症の治療における使用のための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子、または請求項１５若しくは１６に記載の水溶液。
【請求項１８】
生物系中の可溶性生物分子のバイオアベイラビリティを低減させる方法であって、前記系に請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子を提供することを含み、前記生物分子は、前記ポリマーネットワークに接近し得る流体力学半径を含み、前記結合分子は、前記生物分子に結合し得る方法。
【請求項１９】
生物系中の生物分子のバイオアベイラビリティを低減させるための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のヒドロゲル粒子または請求項１５若しくは１６に記載の水溶液の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、直接的環境から生物分子を除去する手段および方法に関する。より具体的には、生物分子に結合し、それを封鎖し得る内部固定化結合分子を有するヒドロゲル粒子に関する。この粒子を使用して生物分子の生物活性を低減させ、または阻害することができる。ヒドロゲル粒子は、好ましくは、注射可能である。
【背景技術】
【０００２】
多くの（慢性／進行性）炎症性、感染性、および遺伝性疾患／病態（例えば、骨関節炎、炎症性関節炎、関節リウマチ、クローン病、喘息、細菌感染、敗血症および全臓器不全、癌、および移植拒絶反応）は、細胞シグナリング分子（すなわち、炎症促進性および抗炎症性サイトカインおよび成長因子、成長因子アンタゴニスト；本明細書においてさらに可溶性因子と称される）を介して調節および維持されている。抗体を使用するこれらの可溶性因子の中和は、そのような疾患を安定化させ、またはさらには治癒するための強力な手法である。種々の可溶性因子中和方針がこの目的のために開発されており、一部は先進的臨床治療法においても実行されている。これらの可溶性因子中和療法は、典型的には、抗体または抗体放出剤／粒子のボーラス注射に依存し、例えば、全身性疾患、例えば、関節リウマチの治療に広範に使用されてきた。これらは、炎症、例えば、（膝）骨関節炎の症例の局所モジュレーションについても試験されてきた[1-3]。これらの病態において、中和抗体は、局所関節環境中で抗体を保持する目的で関節内注射される。しかしながら、これらの治療法は、関節内ボーラス注射の急速なクリアランスに起因して限定された効力を示している。類似の高レベルのクリアランスは、多数の他の部位において生じ、そこではボーラス注射された分子は血管およびリンパ系への、およびその中での体液循環を介して急速にクリアランスされる。さらに、ボーラス注射された抗体は、（免疫）細胞媒介食作用により急速にクリアランスされ得る。炎症の部位におけるボーラス注射は、体液中の抗体の急速な溶解に起因して大部分が無効であるとも考えられる。炎症の局所治療のために注射抗体の治療効果を延長させるため、より長期の関節内保持時間を有する種々の抗体放出粒子が調査されてきた[4-7]。或いは、抗体は、粒子の表面上に共有結合により係留されてきた[8-10]。まとめると、図１に模式的に示されるとおり、現在、サイトカイン中和抗体の制御提示についての２つのアプローチ：ｉ）サイトカイン中和部分の現場放出の制御、およびｉｉ）表面改質ナノ粒子を使用するサイトカインの捕捉が存在する。
【０００３】
技術水準の注射可能な薬物送達系は、サイトカイン中和剤（例えば、抗体）のインビボ／現場保持時間を延長させる。しかしながら、これらは依然として最適には程遠い。例えば、抗体は、過酷な（例えば、炎症化）インビボ環境中に直接放出され、または曝露される。結果的に、治療剤の生物学的機能は、例えば、タンパク質変性に起因して損なわれる。重要なことに、損傷した抗体は、増加した免疫原性を有することにより有害でさえあり得る。また、ナノ粒子は、酸化ストレスおよび炎症促進性応答を誘導し得、毒性効果をもたらし、比較的急速にクリアランスされ（例えば、炎症化組織中の「漏出血管系（ｌｅａｋｙ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）」を介して）、マイクロ粒子と比較して食作用によりスカベンジされる傾向が高い。表面上の抗体を有することが食作用をさらに容易にするため、これは表面上で形成される免疫複合体を介して媒介される。さらに、ナノまたはマイクロ粒子の表面上で提示される抗体は、体液との非特異的相互作用に対して保護されず、目的サイトカインに対して最適でない親和性をもたらす。
【０００４】
本発明は、選択される生物分子の局所封鎖または枯渇のための親和性ヒドロゲル粒子である「注射可能な生物分子シンク」を提供する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
１マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍの範囲の平均断面径を有するヒドロゲル粒子であって、１０００ナノメートル（ｎｍ）以下の流体力学半径を有する分子の、第１のポリマーネットワーク中への拡散を可能とする平均メッシュサイズを有する第１のポリマーネットワークを含み、ポリマーネットワークにより固定化されている結合分子を含む粒子が提供される。第１のポリマーネットワークは、好ましくは、１０００ｎｍ超、好ましくは、１００ｎｍ超の平均流体力学半径を有する分子が浸透不能なメッシュサイズを有する。結合分子は、好ましくは、生物分子に結合する。結合分子は、好ましくは、生物分子に特異的に結合する。このような結合分子は、特異的結合分子とも称される。第１のポリマーネットワークは、好ましくは、第１のポリマーネットワークにより固定化されている結合分子を含む。
【０００６】
本発明はさらに、１マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍの範囲の平均断面径を有するヒドロゲル粒子であって、１０００ナノメートル（ｎｍ）以下の流体力学半径を有する分子の、第１のポリマーネットワーク中への拡散を可能とする平均メッシュサイズを有する第１のポリマーネットワークを含み、ポリマーネットワークにより固定化されている結合分子を含み、結合分子は、前記分子に特異的に結合する粒子を提供する。前記分子は、１０００ナノメートル（ｎｍ）以下の流体力学半径を有する分子である。
【０００７】
ヒドロゲル粒子は、好ましくは、２つ以上の結合分子を含み、前記結合分子の少なくとも２つは、異なる標的生物分子に結合する。好ましい実施形態において、粒子は、３つ以上の結合分子を含み、前記結合分子の少なくとも３つは、異なる標的生物分子に結合する。本明細書に記載のヒドロゲル粒子の方法および使用は、粒子の周辺環境がいくつかの可溶性因子について同時に枯渇される場合に有用である状況で存在することが多い。このような場合、２つ以上の生物分子を粒子中に取り込むことが有用であり得る。
【０００８】
多くの目的のため、特にかなりの量の生物分子をより長い期間にわたり捕捉する目的のため複数の粒子が投与される。粒子は、程度の差はあるが同一であり得る。したがって、本発明はまた、本明細書に記載の複数のヒドロゲル粒子を含むヒドロゲル粒子の組成物を提供する。
【０００９】
本発明はまた、本明細書に記載のヒドロゲル粒子の少なくとも２つの集合体のプールを含む組成物であって、前記プールの少なくとも２つのヒドロゲル粒子は、異なる生物分子に結合する結合分子を含む組成物を提供する。
【００１０】
過剰活性免疫系、癌、または過剰活性ホルモンおよび／若しくはサイトカイン産生細胞を有する患者の治療における、好ましくは、炎症の治療における、好ましくは、関節炎症の治療における使用のための、本明細書に記載のヒドロゲル粒子または前記ヒドロゲル粒子を含む医薬溶液若しくは組成物または本明細書に記載のプールを含む組成物も提供される。過剰活性免疫系を有する患者は、自己免疫疾患患者、炎症を有する患者などであり得る。
【００１１】
本明細書に記載のヒドロゲル粒子を含む、注射に好適な水溶液も提供される。
【００１２】
生物系中の可溶性生物分子のバイオアベイラビリティを低減させる方法であって、前記系に本明細書に記載のヒドロゲル粒子を提供することを含み、生物分子は、前記ポリマーネットワークに接近し得る流体力学半径を含み、前記結合分子は、前記生物分子に結合し得る方法も提供される。
【００１３】
生物系中の生物分子のバイオアベイラビリティを低減させるための、本明細書に記載のヒドロゲル粒子または前記ヒドロゲル粒子を含む医薬溶液若しくは組成物の使用がさらに提供される。
【００１４】
ヒドロゲル粒子を含む水溶液、好ましくは、医薬溶液も提供される。
【００１５】
印刷するための、または製造用途のための添加剤としての、ヒドロゲル粒子を含む水溶液、好ましくは、インクの使用も提供される。
【００１６】
インビトロ細胞培養サプリメントとしての、本明細書に記載のヒドロゲル粒子または水溶液の使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】先行技術のヒドロゲル粒子の模式図。左側パネルは、結合分子の制御放出が意図されるヒドロゲル粒子中の結合分子の組織化を示す。右側パネルは、抗原に結合し、それを外側に提示することが意図されるナノ粒子の表面上に曝露される結合分子を示す。
【図２】Ａ）結合分子がヒドロゲルの内部に固定化されている本発明のヒドロゲル粒子の実施形態の模式図。Ｂ）結合分子がヒドロゲルの内部に固定化されており、ヒドロゲルが、結合分子を含有せず、粒子への標的分子の流入を可能とする篩として機能し、粒子へのより大きい分子の流入を妨害するメッシュサイズを有する第２のヒドロゲルにより包囲されている本発明のヒドロゲル粒子の実施形態の模式図。
【図３】ラマＶＨＨの模式的表示。ＶＨＨは、ループと連結している９つの抗平行βストランドで編成されている。これらのループの３つは、相補性決定領域（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）を形成する。ループＬ１、Ｌ２、Ｌ３およびＬ５は、ＣＤＲから離れて局在し、ＶＨＨのその抗原への結合を干渉せずにグリコシル化部位の導入およびグリコシル基の取り込みに好適である。ループＬ４はＣＤＲの近くに局在し、その操作はＶＨＨのその抗原への結合に影響し得る。
【図４】ｈＢＭＰ７を標的化するＶＨＨの特徴付け。（Ａ）ｈＢＭＰ７を標的化するＶＨＨ−Ｇ７のアミノ酸配列。フレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）は、Ｃｈｏｔｈｉａ［３９］に従って示される。（Ｂ）精製Ｇ７を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ分離し、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。分子量マーカー（ｋＤａ）を左側に示す。（Ｃ）ＥＬＩＳＡにおけるｈＢＭＰ７へのＶＨＨ−Ｇ７の特異的結合。データを少なくとも３つのレプリケートの平均＋／−標準偏差として表現する。
【図５】バイヘッド（ｂｉｈｅａｄ）Ｇ７−ＭＡ１０の構築および産生。（Ａ）ＶＨＨ  Ｇ７およびＭＡ１０のアミノ酸配列アラインメント。ＶＨＨのフレームワーク（ＦＲ）および相補性決定領域（ＣＤＲ）を、Ｃｈｏｔｈｉａ［２９］に従って示す。（Ｂ）遺伝子操作二価ＶＨＨを模式的に表示する。Ｎ末端におけるＧ７およびＣ末端におけるＭＡ１０並びにＧＳリンカーの位置を示す。（Ｃ）生成された二価Ｇ７−ＭＡ１０の予測３Ｄタンパク質モデルであり、ＧＳリンカーを黄色で強調し、Ｇ７およびＭＡ１０のＣＤＲ３を黒色で示す。（Ｄ）組換え発現されたＶＨＨ  Ｇ７、ＭＡ１０およびＧ７−ＭＡ１０を１５％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによりサイズ分離し、クーマシーブリリアントブルーにより染色した。分子量マーカー（ｋＤａ）を左側に示す。一価および二価ＶＨＨの計算分子量を右側に示す。（Ｅ）ＥＬＩＳＡによるＨＡに対するバイヘッドＶＨＨの結合特異性。データを少なくとも３つのレプリケートの平均＋／−標準偏差として表現する。
【図６】ＶＨＨおよびＢＭＰ７についての免疫組織化学染色。マウスに、石灰化骨および軟骨中のハイドロキシアパタイト並びにＢＭＰ７に同時に結合する二機能性（バイヘッド）ＶＨＨ、成長因子ＢＭＰ７またはプラセボを注射した。２０日目、屠殺前日、動物の半数に成長因子ＢＭＰ７を注射した。２１日目、動物を屠殺し、骨を単離し、抗ＶＨＨ抗体（左パネル）または抗ＢＭＰ７抗体を使用する免疫組織化学検査のために処理した。バイヘッドが注射されたマウスのみ、ＶＨＨが陽性に染色された（上段パネル）。２０日前にバイヘッドが注射されたマウスにおいてのみ、ＢＭＰ７が石灰化骨および軟骨中で特異的に濃縮された（上段右）。ＶＨＨがマウスにおける１回目の注射の３週間後にも依然としてＢＭＰ７に結合し得たことを実証するＶＨＨ染色と同時局在するＢＭＰ７染色。ＢＭＰ７のみ（中段パネル）またはプラセボ（下段パネル）の注射はＶＨＨ染色を示さず、石灰化骨および軟骨中でＢＭＰ７（中段パネル）の明らかな濃縮もＢＭＰ７の完全な不存在も示さなかった。
【図７】（ａ）シェル（例えば、ＲＧＤタイプぺプチド）により機能化され、その一方、コア中のビオチン部分がフリーのままであり、モジュラーマイクロ組織のさらなる現場機能化を可能としたＤｅｘ−ＴＡ−ビオチンマイクロゲル。（ｂ、ｃ）機能化シェルの厚さは、ビオチン化部分についての反応性基質として作用するｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎの拡散により制御することができた。（ｄ）この容易なマルチステップ機能化プロトコルを使用して、Ｄｅｘ−ＴＡ−ビオチンマイクロゲルのシェルおよびコアに別々の機能性部分を与えることができ、（ｅ）それぞれＦＩＴＣ−（すなわち、緑色）およびａｔｔｏ５６５標識（すなわち、赤色）シェルおよびコアを使用して実証される。このようなコア−シェルタイプ機能化は、とりわけ、非機能化または代替的に機能化されたシェルをエンジニアリングすることによりコア中の機能性部分をマイクロゲル外部から物理的に分離するために利用することができる。黒色スケールバー：１００μｍ。白色スケールバー：２０μｍ。
【図８】機能化シェル（すなわち、第２のポリマーネットワーク）厚さの制御。スケールバー：２０μｍ。
【図９】四価ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎを使用してデキストラン−チラミンマイクロゲルにカップリングしている蛍光標識デスチオビオチン（ＤＴＢ−ＦＩＴＣ）は、種々の目的ビオチン化分子、例として、ビオチン−ＢＭＰ７におけるＶＨＨにより置き換えられ、それは、ホストゲスト（すなわち、物理的）相互作用を使用して化学架橋マイクロゲルの良好な機能化を実証する。
【図１０】デキストラン−チラミンマイクロゲルを用いず（左側パネル）および用いて（右側パネル）培養されたヒト間葉幹（間質）細胞。マイクロゲルは、白色ドットとして可視的である。マイクロゲル（すなわち、「サイトカインシンク」）は、未影響の細胞形態により示されるとおり、インビトロ細胞培養物に影響しない。
【図１１】ＢＭＰ７におけるＶＨＨにより機能化されたデキストラン−ビオチンマイクロゲル（すなわち、「サイトカインシンク」）を用いるおよび用いないＢＭＰ７に応答するＢＭＰレポーター細胞系（Ｃ２Ｃ１２−ＢＲＥ−Ｌｕｃ）のインビトロルシフェラーゼ産生。ＶＨＨ機能化マイクロゲルは、局所的環境から成長因子（すなわち、サイトカイン）を枯渇させることにより細胞応答を妨害し得る。
【図１２】左から右パネルにかけて、ａ、ｂおよびｃである。近赤外線標識デキストランコンジュゲートを使用して３０μｍ直径のマイクロゲルを調製し、マウス膝の滑液腔中に注射した。（ａ）３週間後、マイクロゲルは、蛍光イメージングを使用して生存動物中で依然として追跡することができ、それはマイクロゲルが注射膝中に依然として存在することを示し、および（ｂ、ｃ）組織学的染色を使用して死後に追跡することができた。マイクロゲルは、パネルｃの左側における暗紫色ドットとして滑膜中で可視的となる。
【図１３】Ａ）異なる分子量（２０ｋＤａ、４０ｋＤａ、７０ｋＤａ、１５０ｋＤａ、５００ｋＤａ、２０００ｋＤａ）を有するＦＩＴＣコンジュゲートデキストランおよびＩｇＧとインキュベートされた中空ＰＥＧ−ＴＡ（ＰＥＧにより示される）およびＤｅｘＨＡ−ＴＡ（ＤｅｘＨＡまたはＤｅｘにより示される）マイクロゲルの共焦点スライス像。スケールバーは、２５０μｍを表す。Ｂ）パネルＡからの共焦点画像のデジタル画像分析によるマイクロゲルの透過性の定量。評価される分子の分子量および流体力学半径は、それぞれ、［２０ｋＤａのデキストラン−ＦＩＴＣ、４０ｋＤａのデキストラン−ＦＩＴＣ、７０ｋＤａのデキストラン−ＦＩＴＣ、１５０ｋＤａのデキストラン−ＦＩＴＣ、５００ｋＤａのデキストラン−ＦＩＴＣ、２０００ｋＤａのデキストラン−ＦＩＴＣ、１５０ｋＤａのＩｇＧ］および［約３．３ｎｍ、約４．５ｎｍ、約５．８ｎｍ、約８．５ｎｍ、約１４．７ｎｍ、約２７．０ｎｍ、５．３ｎｍ］である。*ＤｅｘＨＡ（−チラミン）ゲルはＩｇＧに対して透過性であるが、定量はゲルのコア中のＩｇＧ沈殿に起因して不可能であった。ｋは、キロダルトン（ｋＤａ）を示す。
【図１４】ＤＥＸおよびＨＡの修飾。ＤｅｘおよびＨＡの修飾を示す模式的表示。本発明者らは、チラミンおよびｍａｌ−アミンにコンジュゲートしているデキストランを合成し、次いでこのポリマーを使用してフリーチオール基と反応させる。ポリマーＶＨＨコンジュゲートは、現場架橋を用いて直接注射することができ、または最初にマイクロゲル中で処理し、次いでＶＨＨを負荷することができた。こうして調製されたマイクロゲルは、関節腔中に注射することができる。ポリマーＶＨＨコンジュゲートは、現場架橋を用いて直接注射することができ、または最初に注射することができるマイクロゲル中で処理することができた。
【図１５】ＰＮＣによるＮ−（２−アミノエチル）マレイミド塩酸塩の活性化の模式的表示（１Ｈ−ＮＭＲにより確認）。Ｄｅｘ−ＴＡとの後続の反応は、Ｄｅｘ−ＴＡ−マレイミドを生じさせた。
【図１６】産物の1Ｈ−ＮＭＲ分析は、Ｄｅｘ−ＴＡ−マレイミドの構造を裏付けた。Ｍａｌ−ＰＮＣの大多数は、Ｄｅｘ−ＴＡ中に存在するフェノール性残基と反応した。定量に使用されたピークをスペクトルで示す。左側の挿入図は、ＰＥＧ−ジチオールとのＤｅｘ−ＴＡ−マレイミドの架橋産物を示し、産物中のマレイミド残基の反応性を裏付ける。
【図１７】ＰＮＣによるデキストランの活性化によるＤｅｘ−ＴＡ−マレイミドの代替的合成の反応スキーム。続いて、Ｄｅｘ−ＰＮＣをチラミンおよびマレイミド−アミンの混合物と反応させ、Ｄｅｘ−ＴＡ−マレイミドを生じさせた。
【図１８】産物の1Ｈ−ＮＭＲ分析は、Ｄｅｘ−ＴＡ−マレイミドの構造を裏付けた。定量に使用されたピークをスペクトルで示す。
【図１９】ＤＭＴＭＭ存在下でのチラミンおよびマレイミドによるヒアルロン酸の機能化の反応スキーム。
【図２０】産物の1Ｈ−ＮＭＲ分析は、ＨＡ−ＴＡ−マレイミドの構造を裏付けた。丸の区域は、チラミンおよびマレイミド残基の定量に使用されたシグナルを示す。
【図２１】ＨＡ−ＴＡ−マレイミドへのフリーＣｙｓを有する蛍光標識ぺプチドの指向カップリングの模式的表示。良好なカップリングがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で裏付けられた。
【図２２】ＨＡ−ＴＡ−マレイミドへのフリーＣｙｓを有するＶＨＨの指向カップリングの模式的表示。良好なカップリングがＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で裏付けられた。
【図２３】細胞（１５ｕｍ）、近赤外線標識細胞を含有する３０および１００ｕｍのマイクロゲルを、健常および骨関節炎の膝を有するラット中で関節内注射した。健常膝におけるＮＩＲシグナルの保持がここのグラフに示される。ゲル中の標識細胞が少なくとも１１週間まで存在することを示す。
【図２４】骨関節炎の膝の組織学的分析は、ゲルが１２週間後に依然として多数存在することを示す。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
ポリマーヒドロゲルは、広範な用途、例えば、カプセル化薬物の徐放および／または宿主における不利な環境から材料を保護するためのカプセル化材料の遮蔽において極めて有用であることが証明されている。本発明のヒドロゲルは、別々の粒子に成形することができる。ヒドロゲル粒子は典型的には球状であるが、他の形状も考えられる。ヒドロゲル粒子は、好ましくは、球状粒子である。本明細書に記載のヒドロゲル粒子は、約１マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍの平均断面径を有し得る。本明細書に記載のヒドロゲル粒子は、好ましくは、約２〜１０００μｍの平均断面径を有し得る。平均断面径は、好ましくは、３〜１０００μｍ、好ましくは、５〜１０００μｍ、好ましくは、１０〜１０００μｍである。特に好ましい実施形態において、断面径は、１〜２５０μｍ、好ましくは、２〜２５０μｍ、好ましくは、３〜２５０μｍ、好ましくは、５〜２５０μｍ、より好ましくは、１０〜２５０μｍである。特に好ましい実施形態において、断面径は、１〜１００μｍ、好ましくは、２〜１００μｍ、好ましくは、３〜１００μｍ、好ましくは、５〜１００μｍ、より好ましくは、１０〜１００μｍである。一部の実施形態において、平均直径断面径は、５〜５００μｍである。特に好ましい実施形態において、断面径は、５〜２５０μｍ、好ましくは、１０〜２００μｍである。示されるサイズのヒドロゲル粒子は、顕著な剪断なしで容易に注射可能である。このようなヒドロゲル粒子は、注射部位、特に、別々の注射部位、例えば、腫瘍、炎症の部位、滑膜または他の空隙に好適な、および培養組織内の局所蓄積を容易にする。後者は、炎症を伴うことが多く、培養組織中の本発明の粒子の取り込みにより、１つ以上の不所望な生物分子の選択的な封鎖により移植部位が不利でない環境となる。ヒドロゲルは、関節内注射に特に好適である。２μｍ超、好ましくは、３μｍ超の直径を有する本発明のヒドロゲル粒子は、注射後に関節中でより効率的に保持される（Ｐｒａｄａｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１６：Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ４９８：１１９−１２９．ｈｔｔｐ：／／ｄｘ／ｄｏｉ．ｏｒｇ／１０．１０１６／ｊ．ｉｊｐｈａｒｍ．２０１５．１２．０１５）。好ましい実施形態において、直径は、少なくとも５μｍ、好ましくは、少なくとも１０μｍ、より好ましくは、少なくとも１５、３０または１００μｍである（図２３および図２４参照）。
【００１９】
ヒドロゲル粒子は、中空（すなわち、中空コアを有するシェル）であり得る。結合分子は、空洞中に存在し得、粒子外側への結合分子の拡散を妨害し、結合分子により結合された標的分子の拡散を可能とする第１のポリマーネットワークのメッシュサイズを設定することにより十分に固定化されている。次いで、ポリマーシェルは、抗体および／または結合分子の拡散を妨害する一方、封鎖すべき分子の拡散を可能とする。これは、サイトカインシンクとしても効率的に作用し、空間的捕捉に依存する。
【００２０】
ヒドロゲル直径は、水和状態（乾燥／膨潤）およびヒドロゲルが計測される溶媒に依存的である。本明細書に記載のヒドロゲル粒子の直径は、ヒドロゲル直径が平衡に到達するまでの生理学的水性食塩溶液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）中でのインキュベーション後、典型的には、約１〜２４時間後に計測される。ヒドロゲル粒子の断面径は、例えば、限定されるものではないが、動的光散乱、レーザ回折、（デジタル）画像分析、篩分析、沈降法、電気インピーダンス、または顕微鏡観察を使用して計測／決定することができる。本発明のため、断面径は、好ましくは、顕微鏡観察とデジタル画像分析との組合せにより、または実施例に記載のとおり計測される。粒子の集合体の平均断面径は、好ましくは、集合体中の粒子の代表的な無作為選択物の断面径から決定される。代表的な選択物は、典型的には、少なくとも１００個の粒子を含むが、これは必要により拡張することができる。集合体中の粒子の断面径は、典型的には、必須ではないが、ベル形状曲線（すなわち、正規分布）として分布し、平均からの標準偏差がベル形状曲線の幅を定める。ヒドロゲル粒子の断面径の代表的な選択物の分布は、本明細書において、「正規化サイズ分布」と称され、代表的な選択物の断面径の標準偏差を、代表的な選択物の平均断面径により割ったものと定義される。正規化サイズ分布は、９０％よりも小さく、好ましくは、７５％よりも小さく、好ましくは、５０％よりも小さく、好ましくは、２５％よりも小さく、好ましくは、１０％よりも小さく、好ましくは、５％よりも小さい。２つの異なる平均断面径および／または２つの異なる正規化標準分布を有するヒドロゲル粒子の集合体を組み合わせることができる。このような組成物は、ある断面径を有する粒子の数をプロットすることにより容易に同定される。このようなプロットは、粒子サイズを決定する任意の手段を使用して作成することができるが、好ましくは、顕微鏡観察とデジタル画像分析との組合せを使用して決定される。
【００２１】
本明細書に記載のヒドロゲル粒子は、それらの最小サイズに起因して、慣用の巨大材料と比較して溶質の改善された拡散速度および多くの標準的な顕微鏡観察技術との直接的な適合性を提供する。粒子サイズの低減は、例えば、細胞含有ゲルからの放出キネティクスを改善することが実証されている[19,20]。別件では、注射されたヒドロゲル粒子のインビボ生体分布は、それらのサイズと関連する。５μｍよりも大きいヒドロゲル粒子は、典型的には、保持時間の延長により特徴付けられる。それというのも、それらは、例えば、食作用、リンパ球流入、並びに侵入および溢出を介する注射の部位からの急速クリアランスの傾向がないためである[21,22]。
【００２２】
ヒドロゲル粒子製作プロセスは、２つのステップ：（１）別々の液滴中へのヒドロゲル前駆体（すなわち、ポリマー）溶液の分散および（２）現場架橋を介する液滴のゲル化を含む。ヒドロゲル前駆体液滴は、固体基板上／中でのパターニング若しくは成形、（非混和性）液体中での乳化、または気相中でのアトマイゼーションにより形成することができる[23,24]。ヒドロゲル架橋は、化学的または物理的性質のものであるポリマー間の分子相互作用に基づき分類することができる。化学的相互作用は、例えば、相補基を介して形成されている不可逆的な共有結合（例えば、マイケル型付加、ラジカル重合、酵素的架橋または放射線照射）であり得る[25]。
【００２３】
本明細書に記載のヒドロゲル粒子は、（慢性）炎症性、感染性、および他の病態、例えば、遺伝性病態を、それらのプロセスを推進／維持する生物分子を局所的に枯渇させることにより中断させ、低減させ、または縮小させる方法において使用することができる。ヒドロゲル粒子は、多孔性の安定的に架橋されたヒドロゲルネットワークを含む。生物分子の１つ以上に結合し得る結合分子は、ポリマーネットワーク（第１のポリマーネットワークとも称される）中で固定化されている。結合分子の内部位置は、結合した生物分子を粒子の局所環境から効率的に遮蔽し、それによりその活性を妨害する。結合分子は、種々の手法でポリマーネットワークに結合させることができる。ホストゲスト化学が結合分子に使用されることが多い。ホストゲスト化学は、完全共有結合の力以外の力によりユニークな構造関係で一緒に保持される２つ以上の分子またはイオンから構成される複合体を説明する。ホストゲスト化学は、非共有結合を介する分子認識および相互作用の着想を包含する。非共有結合は、大型分子、例えば、タンパク質の３Ｄ構造の維持において重要であり、大型分子が互いに特異的にではあるが一過的に結合する多くの生物プロセスに関与する。８つの一般に挙げられるタイプの非共有相互作用：金属配位結合、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、イオン−双極子、双極子−双極子、π−πスタッキングおよび疎水性相互作用が存在する。ホストゲスト化学の非限定的な例は、ビオチン／アビジン結合である。ビオチンは、アビジンファミリーのメンバーに高い親和性で結合し得る。この特徴は、有利には、多くの商業的および非商業的状況において使用される。例は、古典的ビオチン／ストレプトアビジンの組合せおよびより新しいデスチオビオチンおよび四価ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎの組合せである。ホストゲスト化学の他の例は、当業者が容易に利用可能である。一部の実施形態において、結合分子は、ホストゲスト化学を介してポリマーネットワークに結合している。他の実施形態において、結合分子は、ポリマーネットワークに共有（化学）結合している。いっそうさらなる実施形態において、結合分子は、ポリマーに結合しているのではなく、ポリマーネットワーク中で捕捉されている。これは、有利には、例えば、大型結合分子に使用することができる。
【００２４】
結合分子は、結合ぺプチドであり得る。このようなぺプチドは、典型的には、小型であり、並外れた特異性で標的に結合し得る。ぺプチドは、担体または足場に結合させることができる。このような担体または足場は、標的へのぺプチドの結合を支援し得るが、支援する必要はない。このような場合、担体または足場は、ぺプチドのフォールディングを拘束し得、その結合機能を容易にする。ぺプチドは、線状でも環状でもよい。結合分子、例えば、アプタマーおよびぺプチドアプタマーは、Ｒｅｖｅｒｄａｔｔｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１５；Ｃｕｒｒ  Ｔｏｐ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１５（１２）：１０８２−１１０１およびそれに引用される論文）に記載されている。結合分子は、抗体またはその抗原結合断片であり得る。これは、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ＦＡＢ断片、アンチカリン、いわゆるｎａｎｏｂｏｄｙ（商標）、二環式ぺプチドなどであり得る。本明細書において使用される用語「抗体」は、好ましくは、抗原上のエピトープに結合する１つ以上の可変ドメイン（そのようなドメインは、抗体の可変ドメインに由来し、またはそれと配列相同性を共有する）を含有する免疫グロブリンクラスのタンパク質に属するタンパク質性分子を意味する。抗体断片は、少なくとも抗体の可変ドメインを含む。結合分子は、リガンド／受容体ペアのメンバーでもよい。受容体は、典型的には、細胞と会合し、可溶性リガンドに結合し得るため、結合分子は受容体であることが好ましい。通常膜結合している受容体は、細胞外部分をＦｃテイルなどと会合させることにより改変され得ることが多い。このような改変タンパク質は、典型的には、ポリマーネットワークに容易に付着する。
【００２５】
ヒドロゲルのポリマーネットワークのメッシュサイズは、種々の手法で決定することができる。本発明において、メッシュサイズは、ヒドロゲル粒子中に拡散し得る分子のサイズを示すために挙げられる。一部の実施形態において、ある他の分子、または細胞は、ヒドロゲル粒子中への拡散を妨害されることが重要である。本発明において、メッシュサイズは、好ましくは、ある流体力学半径の分子の拡散ポテンシャルにより特徴付けられる。分子の流体力学半径は、動的光散乱（ＤＬＳ、Ｓｔｅｔｅｆｅｌｄ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｒｅｖ．２０１６  Ｄｅｃ；８（４）：４０９−４２７．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ１２５５１−０１６−０２１８−６）を使用して決定することができる。所与の流体力学半径を有する分子の、ポリマーネットワーク中への拡散は、種々の手法でモニタリングすることができる。これを行うことができる１つの手法は、ポリマーネットワークにより離隔された２つの液体コンパートメントを作出し、既知の流体力学半径を有する標識分子をネットワークの一方のコンパートメントに添加し、系を標識分子の分布に関して（ほぼ）平衡に到達させることによるものである。２つのコンパートメントを有する好適な系の例は、ネットワークから構成される壁部を有するカプセル（例えば、図１３およびその説明参照）またはポリマーネットワークにより離隔された２つの液体コンテナである。他方のコンパートメント中の標識の存在は、その分子がポリマーネットワークを介して拡散し得るか否かの尺度である。分子は、１００倍大きいメッシュサイズで得られる分子の最大量の２０％未満、好ましくは、１０％未満が、平衡に到達した後にネットワークの反対側上で検出される場合、ネットワークを介して拡散し得ないと判断される。２４時間後に平衡に到達しなかった場合、２４時間において観察された割合で平衡に到達したと解釈する。このような場合、ネットワークは、示される流体力学半径を有する分子の、ネットワークを介する拡散を妨害するメッシュサイズを有する。ネットワークは、そのような分子の浸透を可能としないメッシュサイズを有する。ネットワークは、所与の流体力学半径を有する分子の、ポリマーネットワーク中への拡散を妨害するサイズを有する。
【００２６】
分子は、１００倍大きいメッシュサイズで得られる分子の最大量の８０％超、好ましくは、９０％超が、平衡に到達した後にネットワークの反対側上で検出される場合、ネットワークを介して拡散し得ると判断される。２４時間後に平衡に到達しなかった場合、２４時間において観察された割合で平衡に到達したと解釈する。このような場合、ネットワークは、分子のネットワーク中への拡散を可能とするメッシュサイズを有する。
【００２７】
無論、比較試験は、類似の状況下で、異なるメッシュサイズを得るために要求される分子変化を除き同一であるネットワークを用いて実施される。
【００２８】
第１のポリマーネットワークは、１０００ナノメートル以下、好ましくは、５００ナノメートル以下、好ましくは、２５０ナノメートル以下、より好ましくは、１００ナノメートル以下の流体力学半径を有する分子が第１のポリマーネットワーク中に拡散するのを可能とする平均メッシュサイズを有し得る。第１のポリマーネットワークは、好ましくは、５０ナノメートル以下、好ましくは、２０ナノメートル以下、好ましくは、１０ナノメートル以下、より好ましくは、５ナノメートル以下、より好ましくは、４ナノメートル以下の流体力学半径を有する分子が第１のポリマーネットワーク中に拡散するのを可能とする平均メッシュサイズを有する。抗体捕捉または封鎖が望まれる場合、平均メッシュサイズは、好ましくは、ＩｇＧの平均サイズよりも大きく、好ましくは、１５ナノメートル超、好ましくは、２０ナノメートル超である。抗体を粒子外で保持すべき場合、平均メッシュサイズは、典型的には、抗体よりも小さいことが好ましい。好ましくは、１５ナノメートル以下、好ましくは、１２、１１または１０ナノメートル以下である。好ましくは、１０ナノメートルである。
【００２９】
第１のポリマーネットワークは、１０００ｎｍ超の平均流体力学半径を有する分子の、第１のポリマーネットワーク中への拡散を妨害する平均メッシュサイズを有し得、好ましくは、メッシュサイズは、５００ナノメートル超、好ましくは、２５０ナノメートル超、好ましくは、１００ナノメートル超、好ましくは、５０ナノメートル超、好ましくは、２０ナノメートル超、好ましくは、１０ナノメートル超、好ましくは、５ナノメートル超の平均流体力学半径を有する分子の拡散を妨害し、好ましくは、４ナノメートル超の平均流体力学半径を有する分子の、第１のポリマーネットワーク中への拡散を妨害する。より大型の分子の接近を制限するネットワークは、典型的には、より長期間活性である。より大型の分子の接近を制限するネットワークは、典型的には、体内でより耐摩耗性である。
【００３０】
第１のポリマーネットワークのメッシュサイズは、既知の平均流体力学半径を有する分子の拡散を計測することにより決定することができる。本発明に関して、ヒドロゲルのポリマーネットワークは、それが１０００ナノメートル以下の流体力学半径を有する分子がポリマーネットワーク中に拡散するのを可能とする場合、少なくとも１０００ナノメートルの平均メッシュサイズを有する。ヒドロゲルのポリマーネットワークは、それが５００ナノメートル以下の流体力学半径を有する分子がポリマーネットワーク中に拡散するのを可能とする場合、少なくとも５００ナノメートルの平均メッシュサイズを有する、などである。
【００３１】
本発明に関して、ヒドロゲルのポリマーネットワークは、それが１０００ｎｍ超の平均流体力学半径を有する分子の、第１のポリマーネットワーク中への拡散を妨害する場合、１０００ｎｍ以下の平均メッシュサイズを有する。ヒドロゲルのポリマーネットワークは、それが１００ｎｍ超の平均流体力学半径を有する分子の、ポリマーネットワーク中への拡散を妨害する場合、１００ｎｍ以下の平均メッシュサイズを有する、などである。
【００３２】
平均ヒドロゲルメッシュサイズは、機械的に、または分子放出に基づき決定することもできる（例えば、Ｇｒａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００９  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  Ｖｏｌ  １４  ｐｐ  ３００３−３０１７：ｄｏｉ：１０．３３９０／ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ１４０８３００３参照）。細孔サイズを決定するさらに別の手法は、理論的には、Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００５：Ｉｎｄ．Ｅｎｇ．Ｃｈｅｍ．Ｒｅｓ．Ｖｏｌ  ４４：ｐｐ  ８２１３−８２１７）により記載されているいわゆる「単一細孔半径（ｓｉｎｇｌｅ−ｐｏｒｅ−ｒａｄｉｕｓ）」モデルを使用するものである。これに関して、本明細書に記載のヒドロゲルは、もっぱら新たな方法により決定され、すなわち、所与の流体力学半径を有する粒子がネットワーク中に拡散し得るか否かを計測することにより決定されないメッシュサイズを有する。このような場合、１マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍの範囲の平均断面径を有するヒドロゲル粒子であって、好ましくは、Ｇｒａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ（前掲）に従って機械的に、またはＲｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ（前掲）による「単一細孔半径」モデルに従って決定される１０００ナノメートル以下、好ましくは、５００ナノメートル以下、好ましくは、２５０ナノメートル以下、より好ましくは、１００ナノメートル以下、好ましくは、５０ナノメートル以下、好ましくは、２０ナノメートル以下、好ましくは、１０ナノメートル以下、より好ましくは、５ナノメートル以下、より好ましくは、４以下の平均メッシュサイズを有する第１のポリマーネットワークを含み、ポリマーネットワークにより固定化されている結合分子を含む粒子が提供される。第１のポリマーネットワークは、好ましくは、１０００ナノメートル、好ましくは、５００ナノメートル、好ましくは、２５０ナノメートル、より好ましくは、１００ナノメートル、好ましくは、５０ナノメートル、好ましくは、２０ナノメートル、好ましくは、１０ナノメートル、より好ましくは、５ナノメートル、より好ましくは、４ナノメートルの平均メッシュサイズを有する。ヒドロゲルメッシュサイズを定義するさらに別の手法は、キロダルトン（ｋＤａ）の所与の分子量を有する分子がポリマーネットワーク中に拡散し得るか否かによるものである。粒子の半径および粒子の分子量についての相関は、式Ｒｍｉｎ＝０．０６６×Ｍ1/3により与えられる（Ｅｒｉｃｋｓｏｎ  ２００９，Ｂｉｏｌ．Ｐｒｏｃｅｄ  Ｏｎｌｉｎｅ  １１：３２−５１．Ｄｏ：１０．１００７／ｓ１２５７５−００９−９００８−ｘ）。この式において、変数Ｒｍｉｎは最小半径を意味し、Ｍはダルトンの分子量を意味する。したがって、本発明はまた、１マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍの範囲の平均断面径を有するヒドロゲル粒子であって、４３０ｇＤａ（ギガダルトン）以下、好ましくは、５４ｇＤａ以下、好ましくは、６．８ｇＤａ以下、好ましくは、４３５ＭＤａ（メガダルトン）以下、好ましくは、５４ＭＤａ以下、好ましくは、３．５ＭＤａ以下、好ましくは、４３５ｋＤａ（キロダルトン）以下、好ましくは、５４ｋＤａ以下、好ましくは、２８ｋＤａ以下の分子の拡散を可能とする平均メッシュサイズを有する第１のポリマーネットワークを含む粒子を提供する。
【００３３】
好ましい実施形態において、１マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍの範囲の平均断面径を有するヒドロゲル粒子であって、９００ｋＤａ以下、３２０ｋＤａ以下、２００ｋＤａ以下、１８０ｋＤａ以下、好ましくは、１５０ｋＤａ以下の分子の拡散を可能とする平均メッシュサイズを有する第１のポリマーネットワークを含む粒子が提供される。これらは、それぞれ、免疫グロブリン（Ｉｇ）Ｍ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＧの分子量である。このような粒子の利点は、結合分子および捕捉された生物分子が、挙げられる抗体種から効率的に遮蔽されることである。不測の宿主抗体対粒子（含有物）応答の効果は、存在するとしても、それぞれの抗体／メッシュサイズについて小さい。
【００３４】
本明細書に記載のヒドロゲル粒子中の第１のポリマーネットワークは、好ましくは、１００ｋＤａ、好ましくは、７０ｋＤａ、より好ましくは、約１５ｋＤａの分子量を有する生物分子の拡散を可能とするメッシュサイズを有する。ほとんどのサイトカインは、７０ｋＤａ未満の分子量を有する。
【００３５】
ヒドロゲル粒子は、好ましくは、架橋ヒドロゲルポリマーを含む。架橋は、２つ以上のポリマー鎖を結合するプロセスである。化学的架橋および物理的架橋の両方が存在する。さらに、ヒドロゲルを選択する場合、水についての高い親和性を有する天然ポリマー、例えば、タンパク質または合成ポリマーの両方を出発材料として使用することができる。種々の架橋法を、ヒドロゲルの設計のために実行することができる。定義により、架橋ポリマーゲルは、溶媒が溶解させない巨大分子である。ゲル微小構造中で架橋により作出されたポリマードメインに起因して、ゲルは、より大きい化学的安定性を獲得する。種々の架橋法、例えば、限定されるものではないが、化学的架橋、光架橋（典型的には、ＵＶ）、タンパク質相互作用、水素結合などが当分野において公知である。
【００３６】
架橋部分は、好ましくは、フェノール性化合物である。方法は、触媒（すなわち、ペルオキシダーゼ酵素、例えば、限定されるものではないが、セイヨウワサビペルオキシダーゼ）および酸化剤（例えば、過酸化水素）を使用するフェノール性化合物の別のフェノール性化合物への酵素媒介共有結合カップリングに利用可能であり、フェノール性化合物は、少なくとも１つのヒドロキシル置換芳香環系の存在により特徴付けられ、例として、限定されるものではないが、フェノールコンジュゲート巨大分子、フェノールコンジュゲート小分子、フェノール、チラミン、チロシン、ポリフェノール、ｐ−クマル酸、ユビキノール、ビタミンＥ、カテコール、フェルラ酸、カプサイシン、オイゲノール、レゾルシノール、ゲニステイン、エピカテキン、ピロガイロール（ｐｙｒｏｇａｉｌｏｌ）、没食子酸、没食子酸プロピル、ペンタＧ−Ｄ−グルコース、ビスフェノールＡ、ブチル化ヒドロキシトルエン、クレゾール、エストラジオール、グアイアコール、４−ノニルフェノール、オルトフェニルフェノール、トリニトロフェノール、フェノールナフタレイン、プロポフォール、セロトニン、アドレナリン、チモール、キシレノール、ジエチルスチルベストロール、Ｌ−ＤＯＰＡ、サリチル酸メチル、サリチル酸、２−ベンジル−４−クロロフェノール、４−クロロ−３，５−ジメチルフェノール、ブチル化ヒドロキシルアニソール、レゾルシノール、４−ヘキシルレゾルシノール、ヒドロキノン、１−ナフトール、カリックスアレーン、さらにはフェノール性基（すなわち、ヒドロキシル置換芳香環系）を天然に含有し、および／またはそれにより修飾されたぺプチド、合成または天然ポリマー、蛍光色素、薬物、ＤＮＡ、タンパク質、リポタンパク質、抗体、単一ドメイン抗体、アプタマー、ｎａｎｏｂｏｄｙ、および全ての他の分子、またはそれらの組合せである。好ましくは、架橋は、チラミン基を用いて行われる。
【００３７】
多数のポリマーを使用してヒドロゲルを調製することができる。本発明において、ポリマーは、生体適合性ポリマーである。ポリマーは、好ましくは、デキストラン；ヒアルロン酸；およびポリ−エチレングリコール（ＰＥＧ）の１つ以上である。
【００３８】
生体適合性ヒドロゲルポリマーは、顕著な有害効果を産生せずに生命系と接触する能力を有するヒドロゲルポリマーである。この文脈における生体適合性は、材料が前記生体材料に対する身体の有意な病理学的応答を誘発しないことまたは前記材料が患者に有害でないことを意味する。ポリマーヒドロゲルは長きにわたり使用されており、とりわけ、Ｌａｆｔａｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１１：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５０：１４，１４７５−１４８６）に概説されている。ヒドロゲルポリマーの好ましい例は、米国特許第８６４７２７１号明細書；米国特許出願公開第２００６０２５７４８８号明細書；国際公開第１９９９０１５２１１号パンフレット；国際公開第２０１１／０４９４４９号パンフレット；国際公開第２０１１／０５９３２５号パンフレット、国際公開第２０１３／０７３９４１号パンフレットおよび米国特許第８４４０２３１号明細書に記載されている。ヒドロゲルポリマーは、デキストラン−チラミン（Ｄｅｘ−ＴＡ）コンジュゲートがグラフトされたヒアルロン酸（ＨＡ）のコポリマーであり得る。Ｄｅｘ−ＴＡコンジュゲートは、好ましくは、１００個の無水グルコース環当たりのコンジュゲートチラミン部分の数として定義される、５〜２５の置換度（ＤＳ）を有する。前記Ｄｅｘ−ＴＡコンジュゲート中のデキストラン鎖は、好ましくは、５〜８０ｋＤａの平均分子量を有する。ヒドロゲルポリマーは、Ｄｅｘ−ＴＡコンジュゲートと、コラーゲン−チラミン；キトサン−チラミン；キトサン−フロレト酸およびゼラチン−チラミンおよびヒアルロン酸−チラミンからなる群から選択されるコンジュゲートとを含む組成物であり得る。ヒドロゲルポリマーは、好ましくは、コンジュゲートヒアルロン酸、キトサン、デキストラン、ヒアルロン酸、ヘパリンまたはヘパリンデンプン；ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリアルキレンオキシド−ポリアルキレ（ｐｏｌｙａｌｋｙｌｅ）−テレフタレートブロックコポリマー、（好ましくは、ポリエチレンオキシド−ポリブチレンテレフタレートブロックコポリマー）、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸／乳酸（ＰＧＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（アミドアミン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリエチレン；アルギネート、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドまたはポリエチレングリコールテレフタレートおよびポリブチレンテレフタレートのコポリマー（ＰＥＧＴ−ＰＢＴ、またはＰｏｌｙａｃｔｉｖｅ（登録商標））である。コンジュゲーションは、好ましくは、架橋基、好ましくは、少なくとも１つのチラミン、好ましくは、より多くのチラミンを用いるものである。
【００３９】
本明細書に記載のヒドロゲル粒子は、好ましくは、デキストラン−チラミンヒドロゲル；ヒアルロン酸−チラミンヒドロゲル；ＰＥＧ−チラミンヒドロゲルまたはそれらの組合せを含む。
【００４０】
ヒドロゲルは、化学的に安定性のヒドロゲルであり得る（Ｈｏｆｆｍａｎ，２０１２：Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６４：１８−２３）。ヒドロゲルは、それらが共有結合架橋ネットワークである場合、永久または化学ゲルと呼ばれる。
【００４１】
本発明はまた、ヒドロゲル粒子を含む水溶液に関する。溶液は、好ましくは、注射溶液、すなわち、医療においてヒトの身体に流体を投与するために使用される中空針を通過させることができる溶液である。針は、尖っている先端における小さい開口部を含有する鋭利な先端を有する薄い中空の管である皮下注射針であり得る。無針系も存在し、それらも本明細書に記載の注射水溶液を使用する。
【００４２】
生物分子についての結合分子の親和性は、極度に高い必要はない。結合した分子は、それが結合分子から不測的に放出される場合、粒子外への拡散が効率的に妨害される。それというのも、それはその結合分子に急速に再結合し、または別の利用可能な結合分子に結合するためである。
【００４３】
結合は、特異性および親和性に関して表現することができる。特異性は、どの抗原またはそのエピトープが結合ドメインにより特異的に結合されるかを定める。親和性は、抗原またはエピトープを含む特定の標的への結合の力の尺度である。特異的結合は、典型的には、エピトープ含有抗原についてのある親和性を要求する。本明細書において使用される結合分子に関して、結合は、エピトープ含有抗原が少なくとも１×１０ｅ−６Ｍ、より好ましくは、１×１０ｅ−７Ｍ、１×１０ｅ−８Ｍ、より好ましくは、１×１０ｅ−９Ｍ超の親和性（Ｋｄ）で結合されるという意味で特異的である。結合分子は、好ましくは、エピトープ含有抗原に１×１０ｅ−９Ｍ〜１００×１０ｅ−９Ｍの親和性（Ｋｄ）で結合する。結合分子は、典型的には、エピトープを有さない抗原に特異的に結合しない。このような分子への結合は、典型的には、エピトープ含有抗原についてのＫｄ未満である。典型的には、このような非特異的結合は、存在するとしても、１×１０ｅ−６Ｍ未満の力によるものである。結合分子は他の抗原に、そのような抗原がエピトープを含有する限り特異的に結合し得る。
【００４４】
結合分子は、好ましくは、生物分子に結合する。結合分子により結合される分子は、好ましくは、ぺプチドまたはタンパク質である。生物分子、ぺプチドまたはタンパク質は、好ましくは、体液中で可溶性である。このような分子は、粒子のポリマーネットワーク中に拡散し得る。ぺプチドまたはタンパク質は、マトリックス、例えば、関節中の炎症促進性マトリックス分解産物の放出部分であり得る。好ましい実施形態において、タンパク質は、サイトカイン、可溶性抗原または自己抗体である。好ましい実施形態において、タンパク質は、マトリックス分解産物である。このような産物は、炎症促進性であり得る。
【００４５】
好ましい実施形態において、結合分子は、サイトカインに特異的である。サイトカインは、細胞シグナリングにおいて重要な小タンパク質（約５〜７０ｋＤａ）のファミリーのメンバーである。これらの放出は、それらの周囲の細胞の挙動に対する効果を有する。サイトカインは、自己分泌シグナリング、傍分泌シグナリングおよび内分泌シグナリングに関与し得る。好ましいサイトカインとしては、ケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、および腫瘍壊死因子が挙げられるが、一般に、それにはホルモンも成長因子も含まれない。サイトカインは、広範な細胞、例として、免疫細胞、例えば、マクロファージ、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球および肥満細胞、並びに内皮細胞、線維芽細胞、および種々の間質細胞により産生され得；所与のサイトカインは、２つ以上のタイプの細胞により産生され得る。サイトカインは、典型的には、受容体を介して作用し、免疫系において特に重要である。サイトカインは、例えば、体液性免疫応答と細胞ベース免疫応答との間の平衡をモジュレートし得る。好ましいサイトカインは、関節炎症に関与するサイトカインである。サイトカインは、好ましくは、ＴＮＦアルファ、ＩＬ１ベータ、オンコスタチンＭ、ＩＬ−６、ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１７、ＩＬ−８、アラーミン、例えば、Ｓ１０８またはＳ１０９である。
【００４６】
結合分子は、成長因子または成長因子アンタゴニスト、例えば、Ｗｎｔ分子、Ｗｎｔアンタゴニスト、例えば、好ましくは、ＤＫＫ１、ＦＲＺＢまたはスクレロスチン、ＢＭＰ、ＢＭＰアンタゴニスト、例えば、好ましくは、Ｎｏｇｇｉｎ、ＧｒｅｍｌｉｎまたはＣｈｏｒｄｉｎ、ＴＧＦベータ、ＦＧＦまたはＮＧＦに特異的であり得る。
【００４７】
結合分子は、生物分子が粒子中で、好ましくは、ヒドロゲルの内部ネットワーク中で結合されることを確保する。結合している生物分子は、サイズに起因し、または結合パートナー、例えば、細胞受容体の限定された移動性に起因して粒子に浸透し得ない結合パートナーへの結合を効率的に妨害される。したがって、生物分子への結合分子の結合は、生物分子上の中和エピトープへの結合である必要はない。結合は中和エピトープへの結合であり得、その結果、結合分子が生物分子に結合している場合、生物分子は結合分子がヒドロゲルの内部ネットワーク中に存在せず、またはもはや存在しない場合でも結合パートナー、例えば、受容体に機能的に結合し得ない。結合分子は、生物分子上の中和エピトープに結合することが好ましい。この特徴は、粒子が生物分子の不活性化前に不測的に部分的または完全に分解される場合、その生物分子の活性が結合している結合分子により依然として阻害されることを確保する。
【００４８】
結合分子は、好ましくは、ポリマーネットワークに物理的または化学的に結合している。物理的結合は、多くの手法において考えられる。例えば、結合分子に、ネットワーク中のポリマーに直接的または間接的に結合し得る官能基を提供することによるものである。結合は、親和性結合、例えば、例示的なビオチン／アビジン結合または抗体結合であり得る。結合は、化学的結合、例えば、共有結合カップリングでもよい。ぺプチド／タンパク質結合化学は、現在高度に進化しており、多くの異なる方法が利用可能であり、非限定的な例は、アミン反応性架橋化学およびカルボジイミド架橋剤化学またはＳＨ基を標的化するマレイミド化学である。特に一般的な方法は、分子Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）または類似の分子、例えば、スルホ−ＮＨＳを利用する。このような方法は、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＳ）カップリング法において使用されることが多い。架橋のために標的化することができる他の反応基は、スルフヒドリル（−ＳＨ）およびカルボニル（ＣＨＯ）である。後者は、糖ぺプチドまたは糖タンパク質中の炭水化物基を酸化することにより作出することができる。
【００４９】
ヒドロゲル架橋は、化学的または物理的性質のものであり得るポリマー間の分子相互作用をベースとし得る。化学的相互作用は、永久的な共有結合を生じさせる化学的に反応する部分により形成される。慣習的に、化学ヒドロゲルは、架橋剤を使用する、反応性末端基を有する単量体のラジカル重合を介して形成される［Ｗｉｃｈｔｅｒｌｅ，Ｏ．ａｎｄ  ＬＩＭ，Ｄ．（１９６０）Ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ  Ｇｅｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｕｓｅ．Ｎａｔｕｒｅ  １８５（４７０６），１１７−１１８］。ラジカルベース架橋は、細胞毒性を伴い得るが、伴う必要はない。ラジカルは、例えば、フェノール性部分のペルオキシダーゼ媒介架橋において使用される酵素的架橋を介して効率的に消費され得る［Ｈｅｎｋｅ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｉｓ  Ｓｕｐｅｒｉｏｒ  ｏｖｅｒ  Ｉｏｎｉｃ  ｏｒ  ＵＶ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｏｎ−Ｃｈｉｐ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ−Ｌａｄｅｎ  Ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ  Ｂｉｏｓｃｉ  １６（１０），１５２４−１５３２］。便宜上、ラジカルベース単一細胞カプセル化も、ラジカル形成光開始剤を細胞含有ヒドロゲル前駆体相ではなく非混和性油相に添加することにより細胞適合性様式で達成されている。この方針は、外側から内側へのマイクロゲル架橋を可能とし、それにより細胞毒性ラジカルへのカプセル化細胞の曝露を最小化した［１１］。物理的結合は、可逆的（すなわち、非共有結合）であり、とりわけ、エンタングルメント、静電（すなわち、イオンまたは水素結合）、ファンデルワールス、疎水性相互作用、またはそれらの組合せ、例えば、ホストゲスト相互作用におけるものをベースとする。
【００５０】
結合分子は、好ましくは、結合タンパク質、好ましくは、単一ドメイン抗体である。単一ドメイン抗体は、好ましくは、ラクダまたは軟骨魚の単鎖重鎖抗体の可変ドメイン（それぞれＶＨＨおよびＶＮＡＲとも称される）である。結合分子は、好ましくは、ＶＨＨまたはＶＮＡＲである。これらの用語は、軽鎖を欠く単一重鎖可変ドメイン抗体を指す。好ましくは、ＶＨＨまたはＶＮＡＲは、天然で軽鎖を欠くラクダまたは軟骨魚に見出すことができるタイプの抗体のものである。ＶＨＨおよびＶＮＡＲは、現在、人工的に生成され、種々のＶＨＨまたはＶＮＡＲ様分子を有する大型ライブラリーから選択される。ＶＨＨまたはＶＮＡＲは、現在、合成により産生することもできる。用語ＶＨＨは、現在、機能的軽鎖の不存在下で機能するように改変された別の種の重鎖可変ドメインを指すために使用されることもある。ＶＨＨまたはＶＮＡＲは、好ましくは、ヒドロゲルのポリマーに化学的または物理的に、好ましくは、ＶＨＨまたはＶＮＡＲ上に存在し、またはそれに提供される官能基を介する化学的架橋を介して結合している。ＶＨＨについては、前記官能基は、好ましくは、ＶＨＨの短鎖ループ１、２、３、５の１つに存在するグリコシル基である（図３およびその説明参照）。官能基は、ＶＨＨの別の部分におけるもの、例えば、ＶＨＨのＣ末端におけるもの、好ましくは、Ｃ末端の最後の１０個のアミノ酸の１つ以上の置換におけるものでもよい。官能基は、ぺプチドとして前記ＶＨＨのＣ末端に付加することもできる。機能性残基は、Ｓ−Ｓ架橋またはアミン基を介して生体材料に直接結合するＣｙｓまたはＭｅｔ残基であり得る。官能基は、ＮＨＳ化学を介してポリマー中のそれぞれの残基に化学的に架橋し得るチラミン−アジドまたはチラミン−アルキンであり得る。
【００５１】
ヒドロゲル粒子は、数ダルトン（Ｄａ）から１５０ｋＤａまでのサイズ範囲の広範な分子の拡散を可能とする調整可能な多孔度を有し得る。サイトカインは、典型的には、５ｋＤａ〜７０ｋＤａの分子量サイズ範囲を有し、拡散を介してヒドロゲルに容易に流入し得る。これらはヒドロゲル中に流入したら、特異的親和性抗体断片により捕捉される。結合分子についての標的でない生物分子は、粒子外に自由に拡散する。高密度の結合分子、例えば、抗体断片および関連アビディティは、標的が流入し、ヒドロゲルポリマーネットワークに結合してから粒子から離脱するのを効率的に妨害する。高親和性抗体断片が存在しない他のサイトカインは、ヒドロゲルネットワーク内外を自由に拡散し得る。例えば、ＣｙｔｏＳｏｒｂを使用する血液吸着と比較して、本明細書に記載の少なくとも一部の方法は、特異的生物分子、例えば、サイトカインの捕捉におけるそれらの高い選択性および特異性、並びに結合分子が存在する分子のみを中和する能力により、それらを明確に際立たせる。ＣｙｔｏＳｏｒｂまたは同等の技術は、この区別をなし得ず、血清から全てのサイトカインを枯渇させる。それというのも、それらの技術は、本発明において使用される特異的結合分子に代えて非特異的相互作用に依存するためである。
【００５２】
本明細書に記載のヒドロゲル粒子は、いわゆるサイトカインシンクとして機能し得る。ヒドロゲルは、図２に示されるとおり、（有害な）目的生物分子の封鎖および／または枯渇を可能とする一方、（例えば、炎症化組織の）有害なインビボ条件から結合分子を保護する多孔性の注射可能なマイクロ粒子である。半透過性ヒドロゲルは、目的サイトカインに対するアビディティも増加させる。それというのも、それは、細胞外マトリックス関連タンパク質、細胞により、およびメッシュサイズに応じてヒドロゲルメッシュサイズよりも大きい非特異的相互作用タンパク質（例えば、内因性抗体／サイトカイン結合タンパク質）により到達され得ない抗体の高度に濃縮された微小環境を提供するためである。本発明の粒子の利点は、粒子がマイクロメートルサイズであり、より大きいことである。これは、他の粒子と比較して粒子の長期の存在を容易にする。ナノ粒子は、例えば、典型的には、より急速にクリアランスされ、および／または食作用を受ける。
【００５３】
生体適合性ヒドロゲルポリマーは、顕著な有害効果を産生せずに生命系と接触する能力を有するヒドロゲルポリマーである。この文脈における生体適合性は、材料が前記生体材料に対する身体の有意な病理学的応答を誘発しないことまたは前記材料が患者に有害でないことを意味する。ポリマーヒドロゲルは長きにわたり使用されており、とりわけ、Ｌａｆｔａｈ  ｅｔ  ａｌ（２０１１：Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ，Ｐｏｌｙｍｅｒ−Ｐｌａｓｔｉｃｓ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，５０：１４，１４７５−１４８６）に概説されている。ヒドロゲルポリマーの好ましい例は、米国特許第８６４７２７１号明細書；米国特許出願公開第２００６０２５７４８８号明細書；国際公開第１９９９０１５２１１号パンフレット；国際公開第２０１１／０４９４４９号パンフレット；国際公開第２０１１／０５９３２５号パンフレット、国際公開第２０１３／０７３９４１号パンフレットおよび米国特許第８４４０２３１号明細書に記載されている。ヒドロゲルポリマーは、デキストラン−チラミン（Ｄｅｘ−ＴＡ）コンジュゲートがグラフトされたヒアルロン酸（ＨＡ）のコポリマーであり得る。Ｄｅｘ−ＴＡコンジュゲートは、好ましくは、１００個の無水グルコース環当たりのコンジュゲートチラミン部分の数として定義される、５〜２５の置換度（ＤＳ）を有する。前記Ｄｅｘ−ＴＡコンジュゲート中のデキストラン鎖は、好ましくは、５〜８０ｋＤａの平均分子量を有する。ヒドロゲルポリマーは、Ｄｅｘ−ＴＡコンジュゲートと、コラーゲン−チラミン；キトサン−チラミン；キトサン−フロレト酸およびゼラチン−チラミンからなる群から選択されるコンジュゲートとを含む組成物であり得る。ヒドロゲルポリマーは、好ましくは、コンジュゲートヒアルロン酸、キトサン、デキストラン、ヒアルロン酸、ヘパリンまたはヘパリンデンプン；ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリアルキレンオキシド−ポリアルキレ−テレフタレートブロックコポリマー（好ましくは、ポリエチレンオキシド−ポリブチレンテレフタレートブロックコポリマー）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリ−Ｌ−乳酸（ＰＬＬＡ）、ポリグリコール酸／乳酸（ＰＧＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、ポリ（アミドアミン）、ポリ（カプロラクトン）、ポリエチレン；アルギネート、ポリ−Ｎ−イソプロピルアクリルアミドまたはポリエチレングリコールテレフタレートおよびポリブチレンテレフタレートのコポリマー（ＰＥＧＴ−ＰＢＴ、またはＰｏｌｙａｃｔｉｖｅ（登録商標））である。コンジュゲーションは、好ましくは、架橋基、好ましくは、チラミンを用いるものである。
【００５４】
本明細書に記載のヒドロゲル粒子は、前記第１のポリマーネットワークを包囲する第２のポリマーネットワークを含み得、第２のポリマーネットワークは、前記結合分子を欠く。第２のポリマーネットワークは、シェルとも称されることがあり、第１のポリマーネットワークを包囲し、第２のポリマーネットワークを介して拡散し得ない分子、粒子および細胞からそれを遮蔽し得る。第２のポリマーネットワークが選択的メッシュサイズを有する場合、第１のポリマーネットワークは、拡散時間を低減させるためのより大きいメッシュサイズを所望により有し得る。したがって、第２のポリマーネットワークは、第１のポリマーネットワークのメッシュサイズと同一のまたはそれよりも小さいメッシュサイズを有し得る。
【００５５】
本明細書に記載の第１および第２のポリマーネットワークを含むヒドロゲル粒子について、第２のポリマーネットワークは、第１のポリマーネットワークのメッシュサイズと同一のまたはそれよりも小さい平均メッシュサイズを有することが好ましい。このような場合、第１のポリマーネットワークは、好ましくは、１０００ナノメートル以下の流体力学半径を有する分子が第１のポリマーネットワーク中に拡散するのを可能とするメッシュサイズを有し、第２のポリマーネットワークは、１０００ナノメートル超の平均流体力学半径を有する分子の、第２のポリマーネットワーク中への拡散を妨害するメッシュサイズを有する。好ましくは、第２のポリマーネットワークのメッシュサイズは、５００超、好ましくは、２５０超、好ましくは、１００超、好ましくは、５０超、好ましくは、２０超、好ましくは、１０超、好ましくは、５超の平均流体力学半径を有する分子の、第２のポリマーネットワーク中への拡散を妨害する。好ましい実施形態において、第２のポリマーネットワークは、４ナノメートル超の平均流体力学半径を有する分子の、第２のポリマーネットワーク中への拡散を妨害するメッシュサイズを有する。第１のポリマーネットワークも、無論、１０００ナノメートル以下の流体力学半径を有する分子が第１のポリマーネットワーク中に拡散するのを可能とするメッシュサイズよりも小さいメッシュサイズを有し得る。例は、５００以下、２５０以下、１００以下、５０以下、２０以下、１０以下、５以下、好ましくは、４ナノメートル以下の流体力学半径を有する分子が第１のポリマーネットワーク中に拡散するのを可能とするメッシュサイズである。１マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍの範囲の平均断面径を有するヒドロゲル粒子であって、好ましくは、Ｇｒａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ（前掲）に従って機械的に決定され、またはＲｕｓｓｅｌ  ｅｔ  ａｌ（前掲）による「単一細孔半径」モデルに従って決定される１０００ナノメートル以下、好ましくは、５００ナノメートル以下、好ましくは、２５０ナノメートル以下、より好ましくは、１００ナノメートル以下、好ましくは、５０ナノメートル以下、好ましくは、２０ナノメートル以下、好ましくは、１０ナノメートル以下、より好ましくは、５ナノメートル以下、より好ましくは、４以下の平均メッシュサイズを有する第１のポリマーネットワークを含み、ポリマーネットワークにより固定化されている結合分子を含む粒子は、前記第１のポリマーネットワークを包囲する第２のポリマーネットワークも有し得、第２のポリマーネットワークは、結合分子を欠く。第２のポリマーネットワークは、好ましくは、第１のポリマーネットワークのメッシュサイズよりも小さい平均メッシュサイズを有する。第２のポリマーネットワークは、好ましくは、１０００ナノメートル以下、好ましくは、５００ナノメートル以下、好ましくは、２５０以下、好ましくは、１００以下、好ましくは、５０以下、好ましくは、２０以下、好ましくは、１０以下、好ましくは、５ナノメートル以下のメッシュサイズを有する。
【００５６】
１マイクロメートル（μｍ）〜１０００μｍの範囲の平均断面径を有するヒドロゲル粒子であって、４３０ｇＤａ（ギガダルトン）以下、好ましくは、５４ｇＤａ以下、好ましくは、６．８ｇＤａ以下、好ましくは、４３５ＭＤａ（メガダルトン）以下、好ましくは、５４ＭＤａ以下、好ましくは、３．５ＭＤａ以下、好ましくは、４３５ｋＤａ（キロダルトン）以下、好ましくは、５４ｋＤａ以下、好ましくは、２８ｋＤａ以下の分子の拡散を可能とする平均メッシュサイズを有する第１のポリマーネットワークを含む粒子は、前記第１のポリマーネットワークを包囲する第２のポリマーネットワークも有し得、第２のポリマーネットワークは、前記結合分子を欠く。第２のポリマーネットワークは、好ましくは、第１のポリマーネットワークのメッシュサイズよりも小さい平均メッシュサイズを有する。第２のポリマーネットワークは、好ましくは、４３０ｇＤａ（ギガダルトン）以下、好ましくは、５４ｇＤａ以下、好ましくは、６．８ｇＤａ以下、好ましくは、４３５ＭＤａ（メガダルトン）以下、好ましくは、５４ＭＤａ以下、好ましくは、３．５ＭＤａ以下、好ましくは、４３５ｋＤａ（キロダルトン）以下、好ましくは、５４ｋＤａ以下、好ましくは、２８ｋＤａ以下の分子の拡散を可能とするメッシュサイズを有する。
【００５７】
第２のポリマーネットワークは、好ましくは、１ｎｍ〜４５０マイクロメートル；１ｎｍ〜５０マイクロメートル；１ｎｍ〜５マイクロメートル；１ｎｍ〜５００ｎｍまたは１ｎｍ〜５０ｎｍの厚さを有する。第２のポリマーネットワークは、好ましくは、５ｎｍ〜４５０マイクロメートル；２５ｎｍ〜５０マイクロメートル；１００ｎｍ〜５マイクロメートル、１００ｎｍ〜５００ｎｍの厚さを有する。厚さは、好ましくは、０．５〜１００マイクロメートル、好ましくは、０．５〜５０マイクロメートル、より好ましくは、０．５〜２０マイクロメートルである。
【００５８】
第２のポリマーネットワークは、標的化部分または生物コンパートメント保持分子を含み得る。第２のポリマーネットワークは、第１のポリマーネットワークにおける内部に指向される表面および反対側上の外部に指向される表面を有する。標的化部分または生物コンパートメント保持分子は、好ましくは、外部に指向される表面において固定化されている。好ましい実施形態において、標的化部分または生物コンパートメント保持分子は、第２のポリマーネットワークに化学的または物理的に結合している。分子をポリマーネットワークに結合させる手段および方法は、本明細書の他箇所に記載されている。標的化部分は、好ましくは、目的部位において存在し、目的部位にまたはその付近で化学的または物理的に結合しているタンパク質性分子についての特異性を有する結合分子である。標的化部分は、好ましくは、細胞受容体または化学的若しくは物理的に結合しているマトリックスタンパク質についての特異性を有する結合分子である。標的化部分は、好ましくは、滑液腔中に存在し、それに化学的または物理的に結合しているタンパク質性分子に特異的である。このような標的化部分の例は、限定されるものではないが、抗体またはその抗原結合断片である。これは、単鎖Ｆｖ断片（ｓｃＦｖ）、ＦＡＢ断片、アンチカリン、いわゆるｎａｎｏｂｏｄｙ、二環式ぺプチドなどであり得る。本明細書において使用される用語「抗体」は、好ましくは、抗原上のエピトープに結合する１つ以上の可変ドメインを含有する免疫グロブリンクラスのタンパク質に属するタンパク質性分子を意味し、そのようなドメインは、抗体の可変ドメインに由来し、またはそれと配列相同性を共有する。抗体断片は、少なくとも抗体の可変ドメインを含む。結合分子は、リガンド／受容体ペアのメンバーでもよい。
【００５９】
本明細書に記載のヒドロゲル粒子を含む水溶液は、好ましくは、重合性溶液である。これは、例えば、生体インク（例えば、Ｋａｍｐｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ（Ａｄｖ．Ｈｅａｌｔｈ．Ｍａｔｅｒ．６；２０１７；１６００９１３参照）において有用である。他の使用としては、限定されるものではないが、体内のある位置におけるヒドロゲル粒子の保持の改善が挙げられる。さらなる重合性水溶液は、培養組織中で使用することができ、１つ以上のシンクを培養組織中に配置することにより不利な炎症性環境を移植物（培養組織）により適切とし得る。
【００６０】
本明細書に記載の水溶液は、好ましくは、本明細書に記載のヒドロゲル粒子および薬学的に許容可能な担体、または賦形剤を含む医薬溶液、好ましくは、医薬組成物である。水溶液、医薬溶液または医薬組成物は、好ましくは、注射溶液または組成物である。注射溶液は、医療においてヒトの身体に流体を投与するために使用される中空針を通過させることができる溶液である。針は、尖っている先端における小さい開口部を含有する鋭利な先端を有する薄い中空の管である皮下注射針であり得る。これは、一般にシリンジ、体内に物質を注射するためのプランジャを有する手動操作装置を用いて使用される。水溶液は、溶媒が水である溶液である。水溶液は、好ましくは、生理学的溶液である（すなわち、生物に適合性のオスモル濃度を含む。生理学的塩溶液（１リットル当たり９ｇの塩（０．９％）溶液）が使用されることが多い。これは、リン酸緩衝液により緩衝化される場合、リン酸緩衝生理食塩水またはＰＢＳとして公知である。
【００６１】
水溶液は、移植物の包囲環境から分子／サイトカインを除去し、枯渇させるためのサイトカインシンクとして作用する（サイトカインシンクマイクロゲルを（別々の／二次）インク／生体材料中に取り込むことにより不利な環境を不利でなくする）。
【００６２】
本発明はまた、過剰活性免疫系、癌、または過剰活性ホルモンおよび／若しくはサイトカイン産生細胞を有する患者の治療における、好ましくは、炎症の治療における、好ましくは、関節炎症の治療における使用のための、本明細書に記載のヒドロゲル粒子、医薬溶液、または医薬組成物を提供する。過剰活性免疫系を有する患者は、自己免疫疾患患者、炎症、微生物誘導免疫応答（例えば、細菌または酵母）、外傷誘導免疫応答（急性ストレスは炎症を惹起する）、組織変性誘導免疫応答（分解産物は炎症を誘導し得る）を有する患者などであり得る。
【００６３】
過剰活性免疫系は、免疫系が体内で細胞および組織の殺傷を開始する時の状態または免疫応答が一次症状が高熱、腫れ、発赤、過労、および悪心である「サイトカインストーム」モードの状態である。一部の場合、免疫反応は、致死性である。有効な免疫系が良好な健康状態を確保するために必要である一方、過剰活性免疫系はそれ自体が脅威である。免疫系は、我々の身体をあらゆる有害なウイルスおよび細菌から保護し続ける。しかしながら、我々の免疫系が消失し、我々自身の身体組織および細胞を攻撃し始め得る場合がある。これは、種々の自己免疫疾患、種々のショック症状およびアレルギーをもたらし得る。Ａｍｅｒｉｃａｎ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ  ｒｅｌａｔｅｄ  ｄｉｓｅａｓｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎは、自己免疫疾患のリストを維持する。これらのほとんどについて、炎症促進性サイトカインまたは可溶性アレルゲン若しくは抗原の（局所的）存在が典型的である。これらの因子の１つ以上を、体内の患部局所におけるそれらの因子の１つ以上に特異的な１つ以上の結合分子を有する本明細書に記載のヒドロゲル粒子、医薬溶液、または医薬組成物を注射することによりその局所から枯渇させることができる。局所的枯渇は、少なくともその局所における疾患の進行を少なくとも低減させる。局所的枯渇は、少なくともその場所における疾患の１つ以上の症状を低減させる。
【００６４】
癌は、１つの特異的原因を有さない。しかしながら、多くの癌の成長および維持の中核は、１つ以上の細胞外刺激に対するそれらの依存性である。癌細胞に標的化される抗体は、現在、臨床試験において評価されている。このような抗体は、典型的には、癌細胞または関連マトリックス上に存在する分子に指向される。本発明のヒドロゲル粒子の第１のポリマーネットワーク中の結合分子は、典型的には、そのような関連マーカーに指向されない。それというのも、それらは粒子のポリマーネットワーク中に拡散し得ない大型構造に結合しているためである。代わりに、結合分子は、好ましくは、腫瘍維持若しくは腫瘍成長効果または免疫応答阻害効果を有する可溶性ぺプチドまたはタンパク質に指向される。このような因子の非限定的な例は、種々の可溶性ＥＧＦまたはＥＧＦ様因子、種々のｒスポンジン、Ｂｍｐ、ＴＧＦｂ、ＷＮＴ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＣＸＣＬ、ＡＲＧ、ＣＣＬ、ＩＬ、ＴＮＦ、ＭＭＰ、ＡＤＡＭＴ、ＡＮＧ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＰｌＧＦ、および／またはＯＰＮである。これらの因子の１つ以上を、体内の患部局所におけるそれらの因子の１つ以上に特異的な１つ以上の結合分子を有する本明細書に記載のヒドロゲル粒子、医薬溶液、または医薬組成物を注射することによりその場所から枯渇させることができる。局所的枯渇は、少なくともその場所における癌の進行を少なくとも低減させる。局所的枯渇は、少なくともその場所における癌の１つ以上の症状を低減させる。
【００６５】
血管新生癌を治療する別の手法は、血管系刺激可溶性因子、例えば、ＶＥＧＦおよび／またはＦＧＦを局所的に封鎖し、および／または枯渇させることによるものである。封鎖することができる他の血管系刺激可溶性因子は、Ｂｍｐ、ＴＧＦｂ、ＷＮＴ、ＦＧＦ、ＶＥＧＦ、ＣＸＣＬ、ＡＲＧ、ＣＣＬ、ＩＬ、ＴＮＦ、ＭＭＰ、ＡＤＡＭＴ、ＡＮＧ、ＰＤＧＦ、ＩＧＦ、ＨＧＦ、ＰｌＧＦ、および／またはＯＰＮである。これは少なくとも、注射部位付近の新たな血管新生を低減させる。
【００６６】
炎症は、有害刺激、例えば、病原体、損傷細胞、または刺激物質に対する身体組織の生物学的応答の一部である。これは、免疫細胞、血管、および分子メディエーターが関与する保護的応答である。炎症は、典型的には、有害状況の減弱において有益である。しかしながら、炎症は、過剰に強力であり、または慢性的である場合、それ自体が有害であり得る。炎症は、細胞、マトリックスおよび構造の種々の相互作用を含むプロセスである。これは、いわゆる炎症促進性サイトカインも含む。これらのサイトカインの１つ以上を、体内の患部局所におけるそれらのサイトカインの１つ以上に特異的な１つ以上の結合分子を有する本明細書に記載のヒドロゲル粒子、医薬溶液、または医薬組成物を注射することによりその場所から枯渇させることができる。局所的枯渇は、少なくともその場所における炎症の進行を少なくとも低減させる。局所的枯渇は、少なくともその場所における炎症の１つ以上の症状を低減させる。
【００６７】
第１のポリマーネットワーク中に存在する結合分子を指向させることができるサイトカインの非限定的および好ましい例は、インターロイキン−１（ＩＬ−１）；ＩＬ−２；ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７およびＩＬ−１８、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮ−ガンマ）、ＩＦＮ−アルファ、並びに顆粒球マクロファージコロニー刺激因子である。
【００６８】
自己免疫疾患は、好ましくは、関節炎、好ましくは、関節リウマチである。炎症促進性サイトカインに特異的な結合分子を含むヒドロゲル粒子は、関節炎、好ましくは、関節リウマチにおける関節症状を治療するために特に好適である。
【００６９】
疾患は、好ましくは、関節リウマチ、クローン病、喘息、細菌感染、敗血症、全臓器不全、癌、または移植拒絶反応である。疾患は、好ましくは、培養組織または臓器の移植を介して治療することができる疾患である。
【００７０】
炎症促進性サイトカインに特異的な結合分子を含むヒドロゲル粒子は、関節炎症を治療するために特に好適である。
【００７１】
過剰活性免疫系、癌、または過剰活性ホルモンおよび／若しくはサイトカイン産生細胞を有する対象を治療する方法であって、それが必要とされる対象に、本明細書に記載のヒドロゲル粒子または前記ヒドロゲル粒子を含む医薬溶液若しくは組成物を投与することを含む方法も提供される。投与は、好ましくは、局所における注射によるものである。好ましくは、腫瘍、炎症の特定部位、例えば、関節炎の関節である。炎症は、好ましくは、関節炎症である。
【００７２】
マイクロ粒子は、高度に血管新生した区域、例えば、肝臓中に移植される場合、全身治療、または「インビボ透析」に使用することができる。例えば、門脈中での注射により、マイクロ粒子は肝臓の毛細血管床中で積層し、そこで、次いでそれらが血液から有害な／「不所望な」サイトカインを枯渇させ得る。この状況において、血液からアレルゲン、ヒスタミンまたはアレルギー産生サイトカインを捕捉することにより、これらをアレルギーの治療に使用することもできる。血管内注射は、肺の毛細血管床中での効率的な保持ももたらし、それを使用して例えば、炎症の緩和により疾病負荷を軽減することもできる。
【００７３】
細胞生物学の研究において、マイクロ粒子を使用して細胞、組織培養物、または培養組織から特異的成長因子またはサイトカインを枯渇させることができる。これは、例えば、細胞同時培養物における細胞または細胞タイプのクロストークに対する厳密な制御を可能とする。
【００７４】
サイトカインシンクは、（慢性）炎症に対する予防的治療として術中／術後に使用することもできる。注射に加え、親和性マイクロ粒子は、消化管の治療剤として最適化することもできる（例えば、腸内フローラ／高機能プロバイオティクスの調節）。獣医学的目的のため、の成長因子／抗生物質を全身枯渇させてから食肉／食品汚染を最小化する処理を行う。本明細書に記載のヒドロゲル粒子は、点眼薬、局所使用（クリーム剤／ローション剤）において使用することができる。多機能性サイトカインシンクまたは別々のサイトカインシンクの混合物を使用する組み合わせアプローチを使用することができる。血液からのサイトカインの特異的な枯渇を可能とする、血液吸着装置、例えば、ＣｙｔｏＳｏｒｂ中の樹脂の代替物として使用することができる。
【００７５】
注射は、腫瘍、炎症区域内、静脈内、筋肉内、腹腔内注射などであり得る。
【００７６】
本明細書に記載のヒドロゲル粒子のインビトロ投与は、流体を送達する任意の好適な手段、例えば、密閉可能なオリフィスを有する容器を用いて実施することができる。例えば、印刷ノズルまたは印刷装置である。
【００７７】
生物系中の可溶性生物分子のバイオアベイラビリティを低減させる方法であって、前記系に本明細書に記載のヒドロゲル粒子を提供することを含み、生物分子は、前記ポリマーネットワークに接近し得る流体力学半径を含み、前記結合分子は、前記生物分子に結合し得る方法がさらに提供される。生物系は、インビトロ細胞培養系であり得る。このような系は本質的に密閉され、ヒドロゲル粒子に局所的環境を提供する。粒子は、培養培地から１つ以上の不所望な可溶性タンパク質性因子を枯渇させるために特に好適である。成長が望まれない場合、因子は、培養されている細胞のタイプに応じた可溶性成長誘導因子であり得る。非限定的な例は、ＥＧＦおよびインスリン様成長因子である。成長が望まれる場合、因子は、培養されている細胞のタイプに応じた可溶性成長阻害因子であり得る。例えば、幹細胞を培養し、分化させる場合、培養物から、不所望な系統への分化を誘導する分化因子を枯渇させることにより所望の系統以外への分化を阻害することが有利であり得る。本発明はまた、生物系中の生物分子のバイオアベイラビリティを低減させるための、本明細書に記載のヒドロゲル粒子、医薬溶液または組成物の使用を提供する。
【００７８】
生物系は、ヒトでも非ヒト動物でもよい。生物系は、好ましくは、１つ以上の臓器から構成される臓器チップ、またはエクスビボ様式でヒト生物学の再現を目的とする培養生理学的系でもよい。
【００７９】
生物系中の生物分子のバイオアベイラビリティを低減させる方法であって、前記系に本明細書に記載のヒドロゲル粒子を提供することを含み、前記生物分子は、２００ダルトン〜１５０キロダルトンの分子量を有し、前記結合分子は、前記生物分子に結合する方法も提供される。
【００８０】
サイトカインシンクとしての、本明細書に記載のヒドロゲル粒子の使用も提供される。
【００８１】
本明細書に記載のヒドロゲル粒子は、多孔性表面および第１の内部ポリマーネットワーク中で固定化されている結合分子を含む第１のポリマーネットワークを有し得る。多孔性表面中の細孔は、約０．１ナノメートル（ｎｍ）〜１０００ｎｍの平均断面径を有し得る。多孔性表面中の細孔は、好ましくは、０．５〜１０００ｎｍ；好ましくは、２〜３００ｎｍ；好ましくは、２〜１００ｎｍ、より好ましくは、５〜５０ｎｍの平均断面径を有する。
【００８２】
ＩｇＧ抗体は、典型的には、１５０ｋＤａの分子量および１０ｎｍの範囲の断面径を有する。このような分子は、１００ｎｍの細孔を有するヒドロゲル粒子中に容易に拡散し得る。ＩｇＧ分子は、約５．５ｎｍの流体力学半径を有する。
【００８３】
粒子または細孔の断面径は、その最長軸に対して垂直に切断することにより形成される表面の直径である。表面がほぼ円形でない場合、直径は、断面上の２つの対向する点間の最長距離の長さおよび最短距離の長さの和の半数である。断面は、典型的には、最も幅広の点におけるものである。
【００８４】
本明細書に示される断面径は、水和ヒドロゲル粒子の、またはその中の直径を指す。好ましくは、ｐＨ７〜８の生理食塩水溶液、例えば、リン酸緩衝生理食塩水ｐＨ７．４を用いる。
【００８５】
ぺプチドは、タンパク質よりも少数のアミノ酸を有する。ぺプチドとタンパク質との間の異なるサイズは、任意であることが多い。本発明において、ぺプチドは、２〜５０個のアミノ酸からなる分子と定義される。タンパク質は、５０個超のアミノ酸を有する分子である。
【００８６】
生物分子は、生物体により産生され、または産生することができる分子である。ぺプチドおよびタンパク質は、それらが人工的に合成される場合でも本発明において生物分子とみなされる。
【００８７】
一部の実施形態において、ヒドロゲルは、例えば、標的生物分子に向かう粒子の「シンク」機能に加え、分子の徐放を提供するために、粒子外に拡散し得る分子をさらに含み得る。一実施形態において、ビオチンまたはビオチン化分子によるデスチオビオチン化分子の置換を、デスチオビオチン化分子のオンデマンドおよび／または制御放出に使用して、例えば、その局所的機能を遮断し、またはそのオンデマンドおよび／若しくは制御放出を達成することができる。
【００８８】
明確性および正確な説明の目的のため、特徴部は、同一または別個の実施形態の一部として本明細書に記載されるが、本発明の範囲は、記載される特徴部の全部または一部の組合せを有する実施形態を含み得ることが認識される。
【実施例】
【００８９】
とりわけｉ）ＶＨＨのインビボ適用および生物学的安定性；ｉｉ）ＶＨＨ機能化ヒドロゲル粒子の製作並びにそのインビトロおよびインビボ適用；並びにｉｉｉ）中空／コア−シェルヒドロゲル粒子の製作およびそのネットワークのメッシュサイズまたは分子量カットオフの計測を説明する３つの実施例を提供する。
【００９０】
実施例１
数週間の期間にわたりサイトカインシンクとして機能するヒドロゲルコンジュゲートＶＨＨの能力は、コンジュゲートＶＨＨが体内でそのような長い期間、生物学的に活性のままであることを要求する。体内でのＶＨＨの安定性を試験するため、本発明者らは、マウスに、骨中のヒドロキシアパタイトに、および成長因子ＢＭＰ７に同時に結合する二機能性ＶＨＨ（バイヘッド）を注射した。
【００９１】
材料および方法
ＢＭＰ７を標的化するＶＨＨのライブラリー構築および選択
全ての免疫は、Ｕｔｒｅｃｈｔ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ動物実験倫理委員会により承認された。２頭のラマを、組換えヒトＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、＃３５４−ＢＰ／ＣＦ）により免疫した。抗原をアジュバントＳｔｉｍｕｎｅ（ＣＥＤＩ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｌｅｌｙｓｔａｄ，ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）と混合し、０、１４、２８および３５日目に筋肉内注射した。４４日目、ＲＮＡ抽出およびライブラリー構築のために末梢血リンパ球を単離した。ＶＨＨファージディスプレイライブラリーを既に記載のとおり生成し［１〜３］、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｌｉ）株ＴＧ１［ｓｕｐＥ  ｈｓｄ＿５  ｔｈｉ（ｌａｃ−ｐｒｏＡＢ）Ｆ（ｔｒａＤ３６  ｐｒｏＡＢ＿ｌａｃＩｑ  ｌａｃＺ＿Ｍ１５）］にエレクトロポレーションにより移した。
【００９２】
ＢＭＰ７に結合するファージを、パニング法を介して選択した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）中の減少濃度のＢＭＰ７（５μｇ、２μｇおよび０．２μｇ）を、ＭａｘｉＳｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）のウェル中で４  において一晩コーティングした。約１０１０コロニー形成単位（ｃｆｕ）のファージを、コーティングしたＢＭＰ７と室温（ＲＴ）において２時間インキュベートし、ＰＢＳ中の４％のＭａｒｖｅｌ（乾燥無脂肪乳、Ｐｒｅｍｉｅｒ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｆｏｏｄｓ）によりブロッキングした。完全に洗浄した後、ＢＭＰ７に結合するファージを、それらを１００ｍＭのトリエチルアミン（ＴＥＡ）中でＲＴにおいて１５分間中でインキュベートすることにより溶出させた。溶出させたファージを、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５の添加を介して直ちに中和した。選択されたファージのＤＮＡ情報を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１株による感染および寒天プレート上のアンピシリン耐性についての後続の選択により、レスキューした。バクテリオファージ遺伝子ＩＩＩを有する融合タンパク質としてＶＨＨを発現する組換えバクテリオファージを得るため、レスキューされたＴＧ１大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）を対数期まで成長させ、次いでそれらにヘルパーファージＶＣＳＭ１３（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ，ＵＳＡ）を感染させた［４］。ファージ粒子をポリエチレングリコール（ＰＥＧ）により沈殿させ、上記のとおりＢＭＰ７によりコーティングされたウェル上で２回目の選択ラウンドにおいて使用した。２回目の選択ラウンドからの単一コロニーから選択されたファージを、シーケンシングした（Ｍａｃｒｏｇｅｎ）。いくつかのＶＨＨ候補クローンのうち、さらなる特徴付けのための分析後に選択されたものをＶＨＨ  Ｇ７（Ｇ７）と命名した。
【００９３】
ＨＡを標的化するＶＨＨの選択
ＨＡに結合するＶＨＨを、非免疫ラマＶＨＨファージライブラリー（ＢＡＣ  ＢＶにより寄贈されたもの）から選択した。非免疫ライブラリーの構築は既に記載されている［５］。２ラウンド選択をＨＡプレートに対して実施した。約１．５×１．５ｍｍの寸法および０．１ｍｍの厚さの純粋ＨＡプレートが、Ｐｌａｓｍａ  Ｂｉｏｔａｌ  Ｌｉｍｉｔｅｄ，ＵＫにより供給された。ファージを９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中で３つのＨＡプレートとインキュベートした。その後の手順は、ＶＨＨ  Ｇ７選択と同様であった。最後に、ＶＨＨ−ＭＡ１０（ＭＡ１０）と命名された１つのＶＨＨをさらなる試験のために選択した。
【００９４】
バイヘッドＧ７−ＭＡ１０を、ＢＭＰ７に結合するＶＨＨ、Ｇ７、およびＨＡに結合するＶＨＨ、ＭＡ１０をコードするｃＤＮＡの遺伝子融合により構築した（図５）。ＰＣＲを使用してＶＨＨ配列を増幅させた。異なるプライマーセットを設計してＮ末端において局在するＶＨＨ  Ｇ７、およびＣ末端において配置されるＶＨＨ  ＭＡ１０を増幅させて二価ＶＨＨを生成した。（Ｍ１３Ｒｅｖ：ＧＡＧＧＴＧＣＡＡＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧ；５ＧＳＢａｍＲｅｖ：ＡＧＴＡＧＧＡＴＣＣＧＣＣＡＣＣＴＣＣＴＧＡＧＧＡＧＡＣＣＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＣ；５ＧＳＢａｍＦｗｄ：ＴＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧ；ＴＶＳＳＲｅｖ：ＴＧＡＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＴＧＧＧＴＣＣＣ）。Ｎ末端ＶＨＨの３’およびＣ末端ＶＨＨの５’におけるプライマーは、ペンタぺプチド「Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ」として表されるフレキシブル配列（ＧＳリンカー）をコードした。プライマーは、ユニーク制限部位（ＢａｍＨＩ）を含有した。ＰＣＲ増幅後、生成された断片を、Ｎ末端において局在するＶＨＨについてはユニークＮ末端制限部位（ＳｆｉＩ）およびＢａｍＨＩにより、並びにＣ末端において局在するＶＨＨについてはＢａｍＨＩおよびユニークＣ末端制限部位（ＢｓｔＥＩＩ）により消化した。断片を発現ベクターｐＭＥＫ２２２中にライゲートし、それをＳｆｉＩおよびＢｓｔＥＩＩにより消化し、その後にそれらを発現のために大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中に形質転換した。
【００９５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）株ＴＧ１をプラスミドの維持、ファージによる感染およびタンパク質の発現に使用した。以下のアッセイにおける検出目的のため、異なるタグを有する２つのベクターを使用してＶＨＨを特異的に検出した。したがって、個々に選択され、単離されたＶＨＨのＤＮＡ情報を、Ｃ末端ＭｙｃおよびＨｉｓタグを含有するプラスミドｐＵＲ８１００（ＭＡ１０について）またはｐＭＥＫ２１９（Ｇ７について）、並びにＣ末端ＦＬＡＧおよびＨｉｓタグを含有するｐＭＥＫ２２２中にサブクローニングした。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１を、２％（ｗ／ｖ）のグルコースおよび１００μｇ／ｍｌにおけるアンピシリンを含有するルリアブロス（ＬＢ）または酵母エキスおよびトリプトン（ＹＴ）培地中で成長させた。ＶＨＨを、非静止条件下で３７℃における４時間のｌａｃプロモーターのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）誘導により大腸菌（Ｅ．Ｃｏｌｉ）ＴＧ１から産生した。ＶＨＨタンパク質をペリプラズム画分から、コバルト親和性クロマトグラフィー（ＴＡＬＯＮ  Ｈｉｓ−タグ精製樹脂、ＣｌｏｎＴｅｃｈ）によりＣ末端Ｈｉｓタグを介して精製した。精製ＶＨＨを、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）により分析した。最終ＶＨＨ濃度を、２８０ｎｍにおけるＵＶ吸収（ＮａｎｏＤｒｏｐ  １０００分光光度計、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および理論質量吸光係数に基づき決定した。
【００９６】
ＶＨＨ結合特異性
精製ＶＨＨ（Ｇ７、ＭＡ１０、Ｇ７−ＭＡ１０）の結合特異性を、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）結合アッセイにおいて試験した。骨へのＭＡ１０の結合をマウス胎児中足骨においてさらに試験した。
【００９７】
ＢＭＰ７へのＶＨＨ−Ｇ７またはバイヘッドＧ７−ＭＡ１０の結合特異性
ＭａｘｉＳｏｒｐプレートウェルを、ＰＢＳ中のＢＭＰ７（３０ｎＭ）により４℃において一晩コーティングし、その後にそれらをＰＢＳ中の２％のＢＳＡによりＲＴにおいて２時間ブロッキングして非特異的結合部位をブロッキングした。続いて、ウェルを、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ中のＶＨＨの段階希釈物（０〜７μＭの範囲）とＲＴにおいて２時間インキュベートした。ウェルをＰＢＳ  ｔｗｅｅｎ（ＰＢＳＴ）およびＰＢＳにより洗浄した。結合したＶＨＨを、ウサギ抗ＶＨＨ血清（Ｋ９７６）およびペルオキシダーゼにカップリングしているロバ抗ウサギ抗体とのインキュベーションにより検出した。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）の量を、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、１−Ｓｔｅｐ  Ｕｌｔｒａ  ＴＭＢ−ＥＬＩＳＡ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の添加により発色させた。反応をＨ2ＳＯ4の添加により停止させ、４５０ｎｍにおいて計測した（マイクロプレートリーダー）。解離定数（Ｋｄ）を、実験データと特異的結合モデルとの後続の関連付けから得た。データをＶＨＨなしの条件に正規化した。
【００９８】
ＨＡに対するＶＨＨ−ＭＡ１０またはバイヘッドＧ７ＧＳ１０ＭＡ１０の結合特異性
３つの純粋ＨＡプレートを含有するマイクロタイタープレートウェルを、ＰＢＳ中の２％のＢＳＡによりＲＴにおいて２時間ブロッキングして非特異的結合部位をブロッキングした。以降のステップはＢＭＰ７に対するＧ７と同様に実施した。
【００９９】
ＶＨＨ−ＭＡ１０は、マウス胎児中足骨に結合する
妊娠１７．５日目に、マウス胎児中足骨をＦＶＢマウス胚（時期対応（ｔｉｍｅ−ｐａｉｒｅｄ）、Ｈａｒｌａｎ）から単離した。（動物実験は、地域動物倫理委員会により承認された）。単離後、中足骨を２４ウェルプレートのウェル中で、１０％のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、１００ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび１％のＧｌｕｔａｍａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が補給された２００μｌのα−ＭＥＭ中で加湿雰囲気および５％のＣＯ２中で３７℃において４８時間個々に培養した。この平衡化期間後、中足骨をＶＨＨ（１μｇ／ｍｌ）の存在下で加湿雰囲気および５％のＣＯ２中で３７℃において２時間インキュベートした。インキュベーション前に可視化を可能とするため、ＶＨＨ  ＭＡ１０および対照ＶＨＨ  １Ｂ５を、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７により製造業者のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従って無作為に標識した。これは、ＶＨＨ  ＭＡ１０−６４７および１Ｂ５−６４７をもたらした。ＰＢＳによる十分な洗浄後、中足骨をＢＤ  Ｐａｔｈｗａｙ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）により６２８±４０ｎｍの励起フィルタおよび６９２±４０ｎｍの発光フィルタを用いて蛍光について評価した。
【０１００】
ＨＡおよびＢＭＰ７に対するバイヘッドＧ７ＧＳ１０ＭＡ１０の二重結合特異性
本発明者らは、二価ＶＨＨのＧ７部分がＨＡプレート上に固定化された後のＢＭＰ７に依然として結合し得るか否かをさらに試験した。この目的のため、純粋ＨＡプレートを、それらを２％のＢＳＡにより２時間ブロッキングし、続いて４％のＭａｒｖｅｌ（Ｍａｒｖｅｌオリジナル乾燥無脂肪乳）により１時間ブロッキングした後、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ中の段階濃度のＶＨＨ（０〜７μＭの範囲）とＲＴにおいて２時間インキュベートした。続いて、ＨＡプレートをｈＢＭＰ７（３００ｎｇ／ｍｌ）およびマウス抗ｈＢＭＰ７（１μｇ／ｍｌ）抗体とＲＴにおいて１時間インキュベートした。これらのステップ間で、ウェルをＰＢＳＴおよびＰＢＳにより洗浄した。結合した抗ｈＢＭＰ７を、ＰＢＳ中の１％のＢＳＡ中のＨＲＰにカップリングしているロバ抗マウス抗体とのインキュベーション（１時間、ＲＴ）により検出した。ＨＲＰの量を、Ｈ2Ｏ2の存在下でＯＰＤの添加により定量した（３０分間、ＲＴ）。反応をＨ2ＳＯ4の添加により停止させた。後続の計測を４９０ｎｍにおいて実施した。
【０１０１】
ＶＨＨ  Ｇ７およびバイヘッドＧ７−ＭＡ１０の生物学的活性
アルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）アッセイ
Ｃ２Ｃ１２細胞系を骨形成分化に使用した。細胞を１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｃａｍｂｒｅｘ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ）および１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）が補給されたＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中で培養し、３７℃において加湿雰囲気および５％のＣＯ２中でインキュベートした。分化アッセイを実施するため、細胞を１０，０００個の細胞／ｃｍ2の密度において播種した（０日目）。コンフルエンス到達時（４日目）、アスコルビン酸（５０μｇ／ｍｌ；Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を用いて細胞を３日間培養し、ＶＨＨ  Ｇ７（１μｇ／ｍｌ）またはＧ７ＧＳ１０ＭＡ１０の存在下または不存在下でＢＭＰ７（３００ｎｇ／ｍｌ；Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）により刺激した。７日目、細胞をＰＢＳにより洗浄し、ＣＤＰＳｔａｒ溶解緩衝液（Ｒｏｃｈｅ）により溶解させた。ＡＬＰ活性を評価するため、細胞溶解物をＣＤＰＳｔａｒ試薬（Ｒｏｃｈｅ）に添加し、Ｖｅｃｔｏｒマイクロプレートルミノメーター（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して発光を計測した。発光単位をＤＮＡ含有量について補正した。製造業者のプロトコル（ＣｙＱｕａｎｔ細胞増殖アッセイキット、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従う増殖アッセイを介してＤＮＡ濃度を決定した。
【０１０２】
ＡＬＰ染色およびイメージング
純粋ＨＡプレートを９６ウェルプレート（平底）中に配置し、７０％のエタノールにより２時間滅菌した。Ｃ２Ｃ１２培養培地をウェルに２時間添加した。バイヘッドＶＨＨ（１μＭ）をウェルにＰＢＳ中の１％のＢＳＡ中で添加し、ＲＴにおいて２時間保持した。ｈＢＭＰ７（３００ｎｇ／ｍｌ）をＰＢＳ中でウェルに添加し、２時間放置した。これらのステップ間で、ウェルをＰＢＳにより洗浄した。Ｃ２Ｃ１２細胞を１０，０００個の細胞／ウェルの播種密度において、アスコルビン酸と一緒にウェルに添加した。３日後、ＨＡプレート上でのＡＬＰ発現をＳｉｇｍａアルカリホスファターゼキットによりプロトコルに従って決定した。ヌクレアファストレッドにより細胞核を対比染色した後に実体顕微鏡により画像を撮影した。
【０１０３】
インビボ実験におけるＶＨＨ
近赤外ＩＲＤｙｅ８００ＣＷ（ＩＲ）によるＭＡ１０およびバイヘッドＧ７ＧＳ１０ＭＡ１０の標識
石灰化骨マトリックスへのＶＨＨ  ＭＡ１０およびバイヘッドＧ７ＧＳ１０ＭＡ１０結合の有望な結果に基づき、インビボマウスモデルにおけるさらなる検出のために近赤外ＩＲＤｙｅ８００ＣＷを選択してＶＨＨを標識した。ＶＨＨ  Ｊ３を非ＨＡ結合対照として使用した。ＶＨＨのＣ末端の部位特異的標識からなる直接標識方針を使用して抗原−抗体相互作用の干渉を回避した。これは、ＩＲＤｙｅ８００ＣＷを含有するマレイミドにコンジュゲートすることができるＶＨＨのＣ末端における不対システインの遺伝子導入を介して達成された（ＭＡ１０−ＣＹＳまたはＧ７ＧＳ１０ＭＡ１０−ＣＹＳ）。タンパク質モデリングのためにオンラインプログラムＩ−ＴＡＳＳＥＲを使用してＶＨＨ  ＭＡ１０−ＣＹＳおよびＧ７ＧＳ１０ＭＡ１０−ＣＹＳをモデリングした［６〜８］。得られたＶＨＨ  ＭＡ１０−ＩＲおよびＧ７ＧＳ１０ＭＡ１０−ＣＹＳ−ＩＲを、ＨＡへの結合またはＨＡおよびＢＭＰ７への同時の結合について試験して遺伝子改変および標識がＶＨＨの機能を妨害しないことを裏付けた。
【０１０４】
ＭＡ１０のインビボ性能
石灰化骨を標的化するＭＡ１０の可能性を評価するため、ＭＡ１０−ＩＲをｂａｌｂ  Ｃ  ｎｕ／ｎｕマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ，Ｆｒａｎｃｅ）の２つの群において静脈内注射した。一方の群にＶＨＨ  ＭＡ１０−ＩＲ（７０μｇ／１００μｌ）を注射し、他方に陰性対照ＶＨＨ  Ｊ３−ＩＲ（７０μｇ／１００μｌ）を注射した。ＰＥＡＲＬ  Ｉｍｐｕｌｓｅイメージングカメラ（Ｌｉ−Ｃｏｒ．Ｌｉｎｃｏｌｎ，Ｎｅｂｒａｓｋａ）を使用してマウスをイメージングした。マウスを２％のイソフルランにより麻酔し、注射の０、１、３、２４、４８および７２時間並びに７、１６および２０日後において腹部および背部位置においてイメージングした。結果をＰｅａｒｌ  Ｉｍｐｕｌｓｅソフトウェア３．０１により分析した。注射の２０日後にマウスをＣＯ2により屠殺した。臓器および骨格を単離し、イメージングした。
【０１０５】
Ｇ７ＧＳ１０ＭＡ１０のインビボ性能
この試験は４つの実験群を含む。それぞれの群からの６匹の動物を使用して骨およびＢＭＰ７に同時に結合したバイヘッドの二重活性を計測し、したがって、ＢＭＰ７はヒドロキシアパタイトを標的化するバイヘッドにより骨区域に指向された。群１からのマウスにＩＲ標識バイヘッド（２０ｕｇ／１００ｕｌ）を注射し、群２からのマウスにＢＭＰ７のみ（１５ｕｇ／１００ｕｌ）を注射し、群３からのマウスにＩＲ標識バイヘッドおよびＢＭＰ７（２０ｕｇのバイヘッドおよび１５ｕｇのＢＭＰ７／１００ｕｌ）の混合物を注射し；混合物を注射の２時間前に調製した。群４にＰＢＳ陰性対照に注射した。２０日目（屠殺２４時間前）、それぞれの群の３匹のマウスは、ＢＭＰ７（１５ｕｇ／１００ｕｌ）の別の注射を受容した。ＩＲイメージングを規則的な時間の間隔において実施した：腹部および背部位置において０日目、２時間、２４時間、７２時間、７日目、１４日目、２１日目。全ての群を注射２１日後に屠殺し、多数の臓器および骨格を回収し、イメージングした。
【０１０６】
ＩＲ−バイヘッド注射マウスの骨の顕微鏡画像
骨内部の蛍光シグナル位置を検出するため、メチルメタクリレート（ＭＭＡ）包埋後に顕微鏡イメージングを実施した。試料スライドを作製するため、骨格試料を屠殺の２４時間後に１０％のホルマリン中で固定した。試料をＰＢＳによりリンスし、組織処理装置中に置いて７０％のエタノールにおいて４時間、８０％のエタノールにおいて４時間、９０％のエタノールにおいて４時間、９６％のエタノールにおいて４時間、１００％のエタノールにおいて４時間、および１００％のエタノールにおいて４時間脱水した。脱水された骨格をＭＭＡ溶液（１３５ｍｌのＫ−プラスト（ｐｌａｓｔ）Ａ、１５ｍＬのＫ−プラストＢ、１．５ｇの開始剤）と４℃において１週間インキュベートし；溶液を２日ごとに交換した。ＭＭＡが骨格に完全に浸潤したら、ＭＭＡ包埋をＭＭＡ溶液とのインキュベーションにより４℃において一晩実施し、次いでＭＭＡが硬化するまで３７℃において水浴に供した。ＭＭＡ包埋骨格から３００μｍの切片をダイアモンドブレード（ＬＥＩＬＡ  ＳＰ１６００）によりスライスし、顕微鏡に接続されたＯｄｙｓｓｅｙ近赤外イメージングシステムを使用してイメージングした。
【０１０７】
ＩＲ−バイヘッド注射マウスの骨格についての免疫化学検査
注射されたＢＭＰ７がバイヘッドにより骨組織に指向され、その後にＢＭＰ７シグナル伝達をトリガーしたか否かを検出するため、ウサギ源抗ＶＨＨ（ＱＶＱ）、抗ＢＭＰ７（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）および抗ＳＭＡＤ１（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）抗体を、免疫化学検査の目的に使用した。ＥＤＴＡ溶液（溶液を１週間ごとに交換）中での３週間の脱灰後、注射されたマウス骨格をパラフィン中で包埋し、５μｍの切片をスライスした。スライドをキシレン中で脱パラフィン化し、等級化エタノールにより再水和させた。抗原をクエン酸緩衝液（１０ｍＭ  ｐＨ６．０）によりマイクロ波中で２分間賦活化させ、次いでＲＴに冷却した。これに続き、内因性ペルオキシダーゼを３％のＨ２Ｏ２溶液によりＲＴにおいて１５分間ブロッキングした。ＰＢＳ中の５％のＢＳＡ中での１時間のブロッキング後、試料を、ブロッキング緩衝液中で希釈された一次特異的抗体（抗ＶＨＨ  １０ｕｇ／ｍｌ、抗ＢＭＰ７  １０ｎｇ／ｍｌ、抗ＳＭＡＤ１  １０ｕｇ／ｍｌ）およびＩｇＧ対照抗体と４℃において一晩インキュベートした。次いで、ビオチン化ヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ａｂｃａｍ）を３０分間、およびＰＢＳ中のＨＲＰ−ｓｔｒｅｐ（２ｕｇ／ｍｌ）を３０分間添加した。試料をＤＡＢ溶液（Ａｂｃａｍ）中で１０分間インキュベートし、ヘマトキシリンを使用して核を１０秒間対比染色した。試料をそれぞれのステップ間でＰＢＳにより３回洗浄した。Ｎａｎｏｚｏｏｍｅｒを使用して画像を撮影した。
【０１０８】
統計的分析
Ｗｉｎｄｏｗｓ版ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．００、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して統計的分析を実施した。分析は、全ての試料のうちまたは試料と対照との間の一元ＡＮＯＶＡおよびテューキーの事後検定（ｐ＜０．０５）に基づいた。エラーバーは、標準偏差を示した。
【０１０９】
結果
ＢＭＰ７を標的化するＶＨＨ（ＶＨＨ−Ｇ７）の産生および特徴付け
組換えヒトＢＭＰ７により免疫されたラマのＰＢＬから単離されたＲＮＡから構築されたファージディスプレイライブラリーからＶＨＨを選択した。２回の選択ラウンド後、空のウェルと比較して抗原コーティングウェル上で明確な濃縮が見出された。ＢＭＰ７への結合を使用していくつかのクローンをさらなるスクリーニングのために選択した。１９０個のＶＨＨクローンの２つのマスタープレートから、制限パターンおよびＥＬＩＳＡ結合アッセイに基づきグループ化することにより個々のクローンの選択を縮小させた。ＶＨＨ  Ｇ７（Ｇ７）と命名された１つのクローンを、結合特異性に基づきさらなる特徴付けのために選択した。遺伝子配列を発現プラスミド中にサブクローニングし、材料および方法に示されるとおり産生し、精製した。クローンＧ７の配列を図４に示す。組換え産生ＶＨＨの純度を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびクーマシーブリリアントブルー染色により評価した（図４）。１６ｋＤａのサイズを有する明確なバンドが観察された。ｈＢＭＰ７へのＶＨＨ  Ｇ７の特異的結合を裏付けるため、ＥＬＩＳＡを実施した（図４）。データは、ＶＨＨ  Ｇ７がｈＢＭＰ７に２．２ｎＭのＫdで結合することを示した。
【０１１０】
ＨＡを標的化するＶＨＨ（ＶＨＨ  ＭＡ１０）の産生および特徴付け
非免疫ファージライブラリーからＶＨＨを選択した。選択は、９６ウェルマイクロタイタープレートのウェル中に配置されたＨＡプレートに対して実施した。合計２回の選択ラウンドをＨＡプレートに対して実施してＨＡプレートに結合するファージの濃縮を達成した。ＨＡへの結合を示した６つの単一クローンをスクリーニングの間に選択した。ＶＨＨ発現および配列決定後、クローンＭＡ１０をさらなる特徴付けのために選択した。ＴＡＬＯＮを使用してＶＨＨ  ＭＡ１０を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＴＧ１のペリプラズム画分から精製した。ＶＨＨのサイズおよび純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価し、１６ｋＤａの単一バンドが検出された。ＨＡへのＶＨＨ  ＭＡ１０の特異的結合をＥＬＩＳＡにより試験した。ＶＨＨ  ＭＡ１０は、Ｋd＝７３．９ｎＭの見かけの親和性で用量依存的にＨＡへの結合を示した。
【０１１１】
次に本発明者らは、外植された胎児マウス中足骨を使用して石灰化骨の可視化にＭＡ１０を使用することができるか否かを試験した。このため、ＶＨＨ  ＭＡ１０をＡｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ６４７により標識した。無関連ＶＨＨを陰性対照ＶＨＨ  １Ｂ５として使用し、それも標識した。得られた標識効率は、ＶＨＨ  ＭＡ１０−６４７および１Ｂ５−６４７についてそれぞれ３０％および５０％であった。次に、中足骨を両方のＶＨＨとインキュベートした。インタクト中足骨に対する蛍光顕微鏡観察により、ＶＨＨ  ＭＡ１０−６４７が一次骨化中心の石灰化軟骨マトリックスに特異的に結合していることが明らかになった。さらに、石灰化骨マトリックスが沈着している発育中の骨襟への結合が観察された。対照的に、石灰化細胞外マトリックスへのＶＨＨ  １Ｂ５−６４７結合が強力に低減され、但し、石灰化および肥大軟骨の境界における一部の非特異的蛍光を除き、骨襟におけるわずかな蛍光を伴った。興味深いことに、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ６４７は、６９２±４０ｎｍの発光フィルタを使用していかなる有意な自己蛍光も示さなかった。
【０１１２】
バイヘッドＧ７−ＭＡ１０の産生および特徴付け
生体材料表面の機能化において二重特異性を有するＶＨＨの潜在性を探索するため、抗ＢＭＰ７および抗ＨＡからなる二重特異的ＶＨＨを構築した。材料および方法に記載のとおりＰＣＲを使用して２つのＶＨＨの遺伝子を結合させ（図５）、それらの間にリンカー配列を導入した（図５）。得られたバイヘッドＶＨＨを図５に模式的に説明する。この構造は、ＩＴＡＳＳＥＲにより予測し、遺伝子融合が抗原結合に関与する相補性決定領域（ＣＤＲ）の曝露に影響しないことを実証した［１７〜１９］。Ｇ７ＧＳ１０ＭＡ１０の融合遺伝子を発現プラスミド中にサブクローニングし、材料および方法に示されるとおり産生し、精製した。図５に示されるとおり、産生されたバイヘッドＶＨＨのサイズは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより示されるとおり、１６ｋＤａの分子量を有する一価ＶＨＨの約２倍である３０ｋＤａの予測分子量を有した。
【０１１３】
二重特異的ＶＨＨにおけるＭＡ１０およびＧ７の組合せがＨＡへのバイヘッドＶＨＨのＭＡ１０部分の結合、およびそれに応じてＢＭＰ７へのＧ７部分の結合に影響するか否かを示すため、ＥＬＩＳＡを使用して結合特異性を決定した。図６に示されるとおり、バイヘッドＶＨＨは、６２．５９ｎＭのＫdの見かけの親和性でＨＡへの特異的結合、および０．４ｎＭのＫdの見かけの親和性でｈＢＭＰ７への特異的結合をそれぞれ示し、それは、ＨＡおよびｈＢＭＰ７についての個々の構成成分の親和性と一致する。バイヘッドＶＨＨがさらにＨＡおよびｈＢＭＰ７に同時に結合し得るか否かを示すため、最初にＨＡディスク上に固定化されたバイヘッドに対するｈＢＭＰ７についての結合曲線を得た。示されるとおり、バイヘッドは、ＨＡへの結合がｈＢＭＰ７についてのＧ７の親和性を低減させたものの、ＨＡおよびｈＢＭＰ７の両方に結合し得た。
【０１１４】
ＶＨＨ−Ｇ７またはバイヘッドＧ７−ＭＡ１０  ｈＢＭＰ７の生物学的活性を、Ｃ２Ｃ１２細胞において試験した。ＡＬＰは、骨形成分化の早期マーカーであり、それはｈＢＭＰ７により強力に誘導される。ここで、本発明者らは、７日間の期間にわたるアルカリホスファターゼ活性（ＡＬＰ）に対する、培養培地中のｈＢＭＰ７の存在下または不存在下でのＶＨＨ−Ｇ７または二価Ｇ７−ＭＡ１０の効果を決定した。ＡＬＰ活性は、ｈＢＭＰ７の存在下で約４００倍誘導された。興味深いことに、細胞をＶＨＨ−Ｇ７またはバイヘッドＧ７−ＭＡ１０の存在下でｈＢＭＰ７と同時処理した場合、ＡＬＰ活性の明らかに優れた誘導が観察された。両方のＶＨＨは、ＢＭＰ７により誘導されるＡＬＰ活性を１７７％で増加させた。Ｇ７とＧ７−ＭＡ１０との間に有意差は存在しなかった。
【０１１５】
次に本発明者らは、ｈＢＭＰ７活性に対するバイヘッドＧ７−ＭＡ１０の強化効果が、バイヘッドがＨＡに結合している場合に保存されるか否かを試験した。このため、Ｃ２Ｃ１２細胞を、バイヘッドおよび／またはｈＢＭＰ７とのプレインキュベーション後に純粋ＨＡプレート上で培養した。ＨＡプレートをステップ間でＰＢＳにより広範に洗浄してから細胞を頂部上で播種した。対照と比較して、ｈＢＭＰ７によるＨＡディスクの前処理は、ＡＬＰ活性をわずかに誘導した。ＡＬＰ活性のかなり強力な誘導は、バイヘッドおよびＢＭＰ７の両方により前処理されたディスクにおいて見出された。これは、バイヘッドが生体材料表面上の培地からｈＢＭＰ７を封鎖し得たことおよびこの局所的濃縮がＣ２Ｃ１２細胞中でＡＬＰ活性を誘導するために十分であることを示した。
【０１１６】
赤外線標識ＶＨＨ  ＭＡ１０は、石灰化骨格に結合する
骨組織の最適なイメージングのためのプローブとしてのＭＡ１０の潜在性を評価するため、近赤外線標識を使用してＭＡ１０を標識し、ＭＡ１０−ＩＲを生じさせた。標識プロセスは、ＥＬＩＳＡにより決定されたＨＡに対するＶＨＨの結合特異性に影響しなかった。次に、ヌードマウスに尾静脈中でＭＡ１０−ＩＲを静脈内注射し、注射後のいくつかの時点においてイメージングした。陰性対照としての非結合ＶＨＨ  Ｊ３−ＩＲを用いてリターメイトを同一の手法で処理し、２つの群の画像を比較した。早期の時点において撮影された画像は、ＭＡ１０−ＩＲ（注射７日後まで）の場合およびＪ３−ＩＲ（注射３日後まで）の場合、マウスの全身にわたりＩＲ蛍光を示した。２０日目、蛍光標識は、Ｊ３−ＩＲ注射マウスとは対照的に、ＭＡ１０−ＩＲが注射されたマウスの骨格中で依然として検出可能であった。屠殺後、骨格および臓器を単離し、イメージングした。腹部および背部画像は、ＭＡ１０−ＩＲについて計測された高蛍光で輪郭が明確な骨格を示した。ＭＡ１０−ＩＲの特異的蓄積は、石灰化骨中で生じた。対照的に、骨格中でＶＨＨ  Ｊ３−ＩＲについて蛍光は計測されなかった。両方のＶＨＨについて、肝臓、脾臓および腎臓は、２０日後に蛍光を示す。蛍光は、両方の群について腎臓において明らかに可視的であった。明らかに、Ｊ３−ＩＲは、ＭＡ１０−ＩＲよりもかなり速く身体からクリアランスされ、ヒドロキシアパタイトへの結合を介する骨格の標的化が体内のＶＨＨの保持時間を少なくとも２０日間まで大幅に拡張したことを示唆した。
【０１１７】
バイヘッドＶＨＨは、ヒドロキシアパタイトの標的化によりｈＢＭＰ７を骨に効率的に指向する
ＢＭＰ７およびＨＡへの同時のバイヘッドＧ７−ＭＡ１０の二重結合活性によりｈＢＭＰ７を骨区域に指向させることができるか否かを評価するため、バイヘッドＧ７−ＭＡ１０をＩＲにより標識してＧ７−ＭＡ１０−ＩＲにした。ＥＬＩＳＡ結果は、標識がＨＡに対するバイヘッドの結合特異性に影響しないことを示した。次に、ｈＢＭＰ７およびＩＲ標識バイヘッドのミックスをマウス中に注射した。ｈＢＭＰ７のみまたは標識バイヘッドのみを対照として注射した。２０日目（屠殺の２４時間前）、ＢＭＰ７の別の注射を実施した。早期の時点において、ＩＲ蛍光は全身に存在し；２週間後に蛍光シグナルは生存マウスにおいて計測することが困難であった。しかしながら、屠殺３週間後、蛍光は、標識バイヘッドを含有した群１および群３マウスの骨格または臓器、例えば、肝臓、脾臓および腎臓中で依然として検出可能であった。これは、バイヘッド−ＩＲの特異的蓄積が石灰化骨において生じたことを意味する。標識バイヘッド注射マウスのシグナルは、標識ＭＡ１０注射マウスと比較して弱いことが妥当である。それというのも、用量がＶＨＨ−ＭＡ１０−ＩＲのものよりも４倍低かったためである。骨内部の蛍光シグナル位置をさらに検出するため、顕微鏡イメージングを実施した。ほとんどの蛍光シグナルは骨梁に由来し、それはバイヘッドが活発な骨リモデリングの部位を標的化していることを強力に示した。
【０１１８】
免疫組織化学検査は、骨中のＶＨＨの存在を裏付けた。マウスの半数に、屠殺１日前に成長因子ＢＭＰ７を注射した。本発明者らは、免疫組織化学検査を実施して抗ＶＨＨ抗体を使用してＶＨＨを、および抗ＢＭＰ７抗体を使用してＢＭＰ７を検出した。図６に示されるとおり、二機能性ＶＨＨの注射の２０日後、ウサギ抗ＶＨＨ抗体を使用した免疫組織化学検査は、石灰化ヒドロキシアパタイト含有骨および軟骨中のＶＨＨの存在を実証する（左パネル、褐色染色）一方、予測されるとおり２０日前にＢＭＰ７またはプラセボのいずれかが注射されたマウスにおいて染色は観察されなかった。２０日目、マウスに屠殺１日前に尾静脈中でＢＭＰ７を注射した場合、免疫組織化学検査は、石灰化骨および軟骨中のＢＭＰ７の存在を実証した。ＢＭＰ７染色は、抗ＶＨＨ染色と同時局在した。さらに、２０日前にＢＭＰ７またはプラセボが注射されたマウスにおいてＢＭＰ７は見出されなかった。この実験は、ＶＨＨを、マトリックスに適切に標的化される場合、体内で保持され得ることおよびＶＨＨが生物学的に活性のままであることを実証する。これは、ＶＨＨがヒドロゲルマトリックスの骨格にコンジュゲートしている場合、および移植時、それらは、生物学的に活性のままであり、炎症促進性サイトカイン、成長因子、または成長因子アンタゴニストを長期間にわたる結合により依然として中和し得るという証拠を提供する。
【０１１９】
実施例２
材料
デキストラン（Ｄｅｘ；ＭＷ  １５〜２５ｋｇ／ｍｏｌ−Ｍｎ  １６ｋｇ／ｍｏｌ；凍結乾燥してから使用）、クロロギ酸４−ニトロフェニル（ＰＮＣ；昇華してから使用）、ＬｉＣｌ（１１０℃において乾燥させてから使用）、チラミン（ＴＡ）無水ピリジン、無水Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）、Ｎ−Ｂｏｃ−１，４−ブタンジアミン（ＮＨ２−Ｂｏｃ）、重炭酸ナトリウム（ＮａＨＣＯ３）、ビオチン−ａｔｔｏ５６５、ビオチン−４−フルオレセイン（ビオチン−ＦＩＴＣ）、６−アミノフルオレセイン、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ、ＶＩ型）、過酸化水素（Ｈ２Ｏ２；阻害剤を有する）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、カルセインＡＭ、エチジウムホモダイマー−１（ＥｔｈＤ−１）、緩衝ホルマリン、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、および全ての他の溶媒を、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。スクシンイミジル６−（ビオチンアミド）ヘキサノエート（ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ）をＡｐｅｘＢｉｏから購入した。Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド−デスチオビオチン（ＥＺ−Ｌｉｎｋ  ＮＨＳ−デスチオビオチン）および４’，６−ジアミジノ−２−フェニルインドール（ＤＡＰＩ）をＴｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）をＬｏｎｚａから購入した。ヌクレオシドを有する最小必須培地α（αＭＥＭ）、ペニシリンおよびストレプトマイシン、ＧｌｕｔａＭＡＸ、およびトリプシン−ＥＤＴＡをＧｉｂｃｏから購入した。塩基性線維芽細胞成長因子（ＩＳＯＫｉｎｅ  ｂＦＧＦ）をＮｅｕｒｏｍｉｃｓから購入した。ファロイジン−ＡＦ６４７をＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｂｅｓから購入した。ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ、Ｓｙｌｇａｒｄ１８４）をＤｏｗ  Ｃｏｒｎｉｎｇから購入した。ＡｑｕａｐｅｌをＶｕｌｃａｖｉｔｅから購入した。Ｎｏｖｅｃ  ７５００  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｌｕｉｄ中のＰｉｃｏ−Ｓｕｒｆ１およびＰｉｃｏ−Ｂｒｅａｋ１をＤｏｌｏｍｉｔｅから購入した。ガスタイトシリンジ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）、フッ素化エチレンプロピレンチューブ（ＦＥＰ、内径２５０μｍ、ＤｕＰｏｎｔ）およびコネクタをＩＤＥＸ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅから購入した。低圧シリンジポンプ（ｎｅＭＥＳＹＳ）をＣｅｔｏｎｉから購入した。
【０１２０】
Ｄｅｘ−ＴＡ−ビオチンの合成および特徴付け
最初に、既に記載のとおり［９、１０］、デキストランをチラミンおよび１，４−ブタンジアミンにより機能化した。簡潔に述べると、デキストランをＰＮＣにより活性化させ、続いてそれをチラミンおよびＢｏｃ保護１，４−ブタンジアミンにより置換し、ＴＦＡおよび３ｋＤａの分子量カットオフを有する膜を使用する透析を使用した後、Ｄｅｘ−ＴＡ−ＮＨ２を２０倍過剰のビオチン−ＬＣ−ＮＨＳと０．１Ｍの重炭酸緩衝液（ｐＨ約８．５）中で少なくとも１時間反応させることによりビオチンによりさらに機能化した。次いで、３ｋＤａの分子量カットオフを有するスピンフィルタカラムを使用してＤｅｘ−ＴＡ−ビオチンを精製し、濃縮した。ＤＭＳＯ−ｄ６またはＤ２Ｏにおける１Ｈ  ＮＭＲ（ＡＶＡＮＣＥ  ＩＩＩ  ＨＤ  ＮａｎｏＢａｙ  ４００ＭＨｚ、Ｂｒｕｋｅｒ）を使用してＤｅｘ−ＰＮＣ、Ｄｅｘ−ＴＡ−ＮＨ２、およびＤｅｘ−ＴＡ−ビオチンの良好な合成を確認した。１００個のデキストラン無水グルコース環当たりのコンジュゲートチラミンおよびブチルアミン部分の数を、デキストラン（δ４．０〜５．８ｐｐｍ）およびチラミン基（δ６．６６ｐｐｍおよびδ６．９８ｐｐｍ）からの積分シグナルの比、並びにデキストランおよびブチルアミン基（δ１．４〜１．５ｐｐｍ）の比をそれぞれ計算することにより決定した。１００個のデキストラン無水グルコース環当たりのコンジュゲートビオチン部分の数を、チラミン基（δ６．６６ｐｐｍおよびδ６．９８ｐｐｍ）およびカップリング６−アミノカプロン酸スペーサー（δ２．１３）からの積分シグナルの比を計算することにより決定した。
【０１２１】
液滴マイクロ流体力学を使用するヒドロゲル粒子の産生および特徴付け
標準的なソフトリトグラフィ技術を使用して全てのマイクロ流体チップをＰＤＭＳおよびガラスから製造した。マイクロ流体ミキサ、液滴生成器、およびＨ2Ｏ2拡散ベース架橋チップを、それぞれ約１００、約２５μｍ、および約１００μｍの高チャネルで製作した。Ａｑｕａｐｅｌをチップ中で導入してから使用してチャネル壁の疎水性を確保した。ＦＥＰチューブを使用して、チップを互いにおよびガスタイトシリンジに連結し、それを低圧シリンジポンプにより制御した。２％（ｗ／ｗ）のＰｉｃｏ−Ｓｕｒｆ１を含有するＮｏｖｅｃ  ７５００  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｆｌｕｉｄを使用して全てのエマルジョンを産生した。ヒドロゲル前駆体マイクロ液滴を生成するため、ＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ）のＤｅｘ−ＴＡ−ビオチン（約１ｍＭのビオチン）および２２Ｕ／ｍｌのＨＲＰを含有したＰＢＳ、並びにＰＢＳ中５％（ｗ／ｖ）のＤｅｘ−ＴＡ（ビオチンを有さない）および２２Ｕ／ｍｌのＨＲＰを含有したＰＢＳをマイクロ流体ミキサ中で合わせ、続いて油を含有する界面活性剤を１：６の流動比において使用して連結液滴生成器中で乳化した。ヒドロゲル前駆体マイクロエマルジョンを１４μｌ／分の総流量において連結拡散プラットフォームを介して流動させ、それに逆方向でＨ2Ｏ2流動も３０μｌ／分の流量において供給した。Ｈ2Ｏ2は、フィードチャネルからＰＤＭＳ壁を通りゲル前駆体マイクロエマルジョン中に拡散し、それにより既に記載のとおり［１１］、チラミンコンジュゲートポリマーの酵素的架橋をトリガーした。界面活性剤不含フルオロカーボン油により３回洗浄し、続いて保存のための０．０５％（ｗ／ｖ）のＮａＮ3並びに凝集およびスタッキングを防止するための１％（ｗ／ｖ）のＢＳＡを含有するＰＢＳの存在下でＰｉｃｏ−Ｂｒｅａｋ１を補給することによりマイクロエマルジョンを破壊した。実体顕微鏡セットアップ（Ｌｅｉｃａ  ＤＦＣ３００  ＦＸカメラを備えるＮｉｋｏｎ  ＳＭＺ８００）を使用してオンチップ液滴を可視化した。位相差顕微鏡観察を使用して賦活化ヒドロゲル粒子をイメージングし、Ｍａｔｌａｂソフトウェアを使用してサイズ分布を計測した。
【０１２２】
ヒドロゲル粒子の機能化および特徴付け
Ｄｅｘ−ＴＡ−ビオチンヒドロゲル粒子をＰＢＳ中の１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡからなる過剰の洗浄緩衝液により３回洗浄してＮａＮ3を除去した後、それらを洗浄緩衝液中で１μＭのｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎと連続的にインキュベートし、洗浄緩衝液により洗浄し、洗浄緩衝液中で１μＭのビオチン化またはデスチオビオチン化目的分子とインキュベートし、洗浄緩衝液により再度洗浄した。必要により、機能化プロトコルを繰り返して例えば、図７にさらに規定されるとおりコア−シェル機能化ヒドロゲル粒子を作出した。蛍光顕微鏡観察（ＥＶＯＳ  ＦＬ）、蛍光共焦点顕微鏡観察（Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０およびＮｉｋｏｎ  Ａ１＋）、および光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ；Ｚｅｉｓｓ  ＬＳＭ５１０）のため、ヒドロゲル粒子を、ビオチン−ａｔｔｏ５６５、ビオチン−ＦＩＴＣ、および／または１Ｍの重炭酸緩衝液（ｐＨ約８）中でデスチオビオチン−ＮＨＳを６−アミノフルオレセインにカップリングさせることによりインハウスで産生したデスチオビオチン−ＦＩＴＣにより機能化した。時間に応じて、退色前の退色速度補正平均強度について正規化されたバックグラウンドを減算した退色スポットの蛍光強度をプロットすることによりＦＲＡＰ曲線を得、退色速度は、退色前の平均強度について正規化された退色スポットに加え、試料の蛍光強度を正規化することにより決定した。デスチオビオチン−ビオチン置換を特徴付けするため、Ｄｅｘ−ＴＡ−ビオチンヒドロゲル粒子をｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎにより連続的に機能化し、洗浄し、デスチオビオチン−ＦＩＴＣにより機能化し、洗浄し、ビオチン−ａｔｔｏ５６５により機能化した一方、上記のとおり蛍光共焦点顕微鏡観察を使用してイメージングした。ＩｍａｇｅＪソフトウェアを使用して全ての蛍光画像の強度を計測した。
【０１２３】
細胞単離および拡大。ヒト間葉幹細胞（ＭＳＣ）を新鮮骨髄試料から単離し、既に記載のとおり培養した［１２］。患者材料の使用は、Ｍｅｄｉｓｃｈ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ  Ｔｗｅｎｔｅの地域倫理委員会により承認され、書面によるインフォームドコンセントを全ての試料について得た。簡潔に述べると、骨髄吸引液中の有核細胞を計数し、組織培養フラスコ中で５００，０００個の細胞／ｃｍ2の密度において播種し、αＭＥＭ中の１０％（ｖ／ｖ）のＦＢＳ、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１％（ｖ／ｖ）のＧｌｕｔａＭＡＸ、０．２ｍＭのアスコルビン酸、並びに１ｎｇ／ｍｌのｂＦＧＦ（新鮮添加）からなるＭＳＣ増殖培地中で培養した。細胞がほぼコンフルエンスに到達した時、０．２５％（ｗ／ｖ）のトリプシン−ＥＤＴＡを３７℃において使用して細胞を剥離し、続いて実験のために継代培養し、または使用した。
【０１２４】
モジュラー組織工学。モジュラー組織構築物を産生するため、約１ｍＭのビオチンを含有したＤｅｘ−ＴＡ−ビオチンマイクロゲルのシェルを最初にｃ（ＲＧＤｆＫ）ぺプチドにより永久的に機能化した。この目的のため、図７にも示されるとおりマイクロゲルを洗浄緩衝液中の１μＭのｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎと３０分間インキュベートし（上記セクション「マイクロゲルの機能化および特徴付け」参照）、洗浄し、続いて、洗浄緩衝液中の１μＭのビオチン化環式ＲＧＤぺプチドビオチン−（ＰＥＧ）2−ｃ（ＲＧＤｆＫ）と６０分間インキュベートした。同一の機能化プロトコルにより処理されたＤｅｘ−ＴＡ（すなわち、ビオチンを有さない）マイクロゲルおよびビオチン−（ＰＥＧ）2−ｃ（ＲＡＤｆＫ）により機能化されたＤｅｘ−ＴＡ−ビオチンマイクロゲルを対照として使用した。次いで、細胞接着マイクロゲルを細胞と、既に記載のとおり［１３］、脱塩水中の３％（ｗ／ｖ）の無菌アガロースをインハウス製作モールド上にキャスティングすることにより産生された非接着マイクロウェルチップ中に同時播種した。簡潔に述べると、ＭＳＣおよびマイクロゲルを、３０００個のマイクロウェル（２００×２００×２００μｍ）を含有するアガロース構築物（１．９ｃｍ2）中にマイクロウェル当たり５０単位（すなわち、細胞数＋ゲル数）の播種密度において均質に播種した。モジュラーマイクロ組織を増殖培地中で培養し、蛍光（共焦点）顕微鏡観察を使用して可視化した。Ｃ２Ｃ１２ＢＲＡ実験。ＰＢＳ中の２μＭのカルセインＡＭ（生存）および４μＭのＥｔｈＤ−１（死滅）により染色し、蛍光顕微鏡観察を使用して可視化することにより、細胞の生存率および代謝活性を分析した。追加の蛍光（共焦点）分析のため、構築物を最初にＰＢＳにより洗浄し、１０％の中性緩衝ホルマリンを使用して固定し、０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を使用して透過処理し、続いて２．５Ｕ／ｍｌのファロイジン−ＡＦ６４７および１μｇ／ｍｌのＤＡＰＩと３０分間インキュベートしてＦ−アクチンおよび核をそれぞれ染色した。
【０１２５】
統計：≧２７５個のマイクロゲルの直径を計測することによりマイクロゲルサイズ分布を得た。蛍光共焦点強度計測（ＦＲＡＰ計測を除く）を、条件ごとに≧５個のマイクロゲルに対して実施し、平均（ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ拡散実験の標本）または最大平均強度について正規化された平均±標準偏差（全ての他の実験）として報告した。条件ごとの≧２０個のマイクロウェル中の細胞およびマイクロゲルの当業者の計数により細胞播種分布を得、マイクロウェル当たりの単位（細胞数＋マイクロゲル数）の総平均数について正規化された平均±標準偏差として報告した。モジュラーマイクロ凝集体の直径、面積、真円度、および固体度を、ＩｍａｇｅＪの「面積」および「形の記述子」計測機能を使用して≧１０個の構築物から得、平均±標準偏差として報告した。ＯｒｉｇｉｎＰｒｏソフトウェアを使用して統計的有意性を分析するための線形回帰分析およびＡＶＯＶＡとボンフェローニの事後検定を実施した。
【０１２６】
結果
本発明者らは、細胞適合様式で生化学的に調整することができるマイクロメートルサイズのヒドロゲル粒子（マイクロゲル）をエンジニアリングすることに着手した。この目的のため、生体不活性であり、生体適合性であり、容易に修飾可能であり、それにより、さらなる機能化のための完全なテンプレート材料として作用するポリマー骨格としてデキストランを選択した［１４、１５］。それぞれ、完全にオルソゴナルおよび細胞適合様式で酵素的に架橋させ、ビオチン／アビジン相互作用を介してさらに機能化させることができる反応性側基としてチラミンおよびビオチンを選択した［１０、１６、１７］。既に記載のとおり［９、１０］、デキストランポリマーにチラミンおよび１，４−ブタンジアミンを付与し（すなわち、Ｄｅｘ−ＴＡ−ＮＨ2）、次いで長鎖スペーサーを含有するアミン反応性ビオチン（ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ）を使用してそれをさらに機能化した。1Ｈ  ＮＭＲを使用して良好なＤｅｘ−ＴＡ−ビオチン合成を裏付けた。デキストラン（δ４．０〜５．８ｐｐｍ）およびチラミン（δ６．６６ｐｐｍおよびδ６．９８ｐｐｍ）からの積分シグナルの比並びにチラミンおよびカップリング６−アミノカプロン酸スペーサー（δ２．１３）の比を計算することにより決定して、１００個のデキストラン無水グルコース環当たりのコンジュゲートチラミンおよびビオチン部分の数は、それぞれ１３および６つであった。チラミン機能化デキストランは、触媒としてのセイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）および酸化剤としてのＨ2Ｏ2を使用してチラミン−チラミン結合の形成を介して現場で架橋させることができた。マイクロ流体液滴生成器を使用して、５％（ｗ／ｖ）のＤｅｘ−ＴＡ−ビオチン（すなわち、約１ｍＭのビオチン）および２２Ｕ／ｍｌのＨＲＰから構成されるマイクロ液滴を生成した。本発明者らが近年報告した拡散ベースマイクロ流体架橋プラットフォーム［１１］を使用してこれらのマイクロゲル前駆体液滴をＨ2Ｏ2の制御補給により硬化させた。これは、２０．７±０．６μｍの直径を有する単分散Ｄｅｘ−ＴＡ−ビオチンマイクロゲルの形成をもたらした。
【０１２７】
酵素的架橋後、ビオチン部分は、超分子ビオチン／アビジン複合体化を介して後続のオルソゴナル機能化に利用可能のままであった（すなわち、酵素的に架橋されたヒドロゲルネットワークに影響しない）。具体的には、２ステップアプローチを使用してビオチン化マイクロゲルを、それらを四価ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ（すなわち、アビジンアナログ）およびフルオレセイン標識ビオチン（ビオチン−ＦＩＴＣ）とそれぞれインキュベートすることによりさらに機能化した。蛍光共焦点顕微鏡観察および光退色後蛍光回復（ＦＲＡＰ）は、ビオチン−ＦＩＴＣがＤｅｘ−ＴＡ−ビオチンマイクロゲルにカップリングしたが、非機能化（すなわち、Ｄｅｘ−ＴＡ）マイクロゲルにカップリングしなかったことを裏付け、それは、Ｄｅｘ−ＴＡ−ビオチンマイクロゲルの良好な生成および機能性を検証した。最終機能化度は、マイクロゲル中のビオチンの濃度または四価ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎを介してカップリングさせるビオチン化官能基のタイプおよび量のいずれかを変更することにより調整することができた。マイクロゲル中のビオチン濃度を制御するため、本発明者らは、液滴生成器のインレットに連結させたマイクロ流体ミックスチップを使用してＤｅｘ−ＴＡ−ビオチンおよびＤｅｘ−ＴＡヒドロゲル前駆体溶液の比を変えた。得られたマイクロゲル中のビオチン濃度は、ビオチン−ＦＩＴＣ（すなわち、緑色）またはビオチン−ａｔｔｏ５６５（すなわち、赤色）のいずれかをマイクロゲルにカップリングさせることにより計測して最終機能化度に線形相関した（Ｒ2＝０．９９）。或いは、生化学的組成は、ビオチン化ＦＩＴＣおよびａｔｔｏ５６５の比を変える一方、マイクロゲル中のビオチンの同一の濃度を維持することにより変更することができた。原則として、両方の方法を適用してマイクロゲルの生化学的特性を、それらの生体力学的特性を変更せずに調整することができた。
【０１２８】
次いで本発明者らは、目的分子を可逆的におよび連続的に提示し得るスマートマイクロゲルを作出することを目的とした。この目的のため、本発明者らは、超分子デスチオビオチン／アビジン複合体の可逆的性質を、デスチオビオチンをビオチンにより急速で高度に特異的な様式で置換することにより利用した。最初に、マイクロゲルにマイクロゲル中のフリービオチンに特異的に結合（Ｋd約１０-15）する豊富な量のｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎを付与した。次いで、マイクロゲルを洗浄し（ｔ＝０分）、継続して蛍光共焦点イメージングを使用して継続的にイメージングして可視化し、デスチオビオチン結合および置換を経時的に定量した。ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ標識マイクロゲルを、マイクロゲル中の四価ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎの残りのフリー結合ポケットに結合（Ｋd約１０-13）し得る１μＭのデスチオビオチン−ＦＩＴＣ（すなわち、緑色）とインキュベートした。蛍光強度がプラトーに到達した後（ｔ約４０分）、ビオチン−ａｔｔｏ５６５（すなわち、赤色）を最終濃度の１μＭまで導入した。ビオチンは、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎとより強力に相互作用し（Ｋd約１０-15）、それはビオチンによるデスチオビオチンの急速な置換をもたらした。デスチオビオチン−ＦＩＴＣの８０％超が、ビオチン添加後の最初の１０分以内にビオチン−ａｔｔｏ５６５により置き換えられ、約９５％が６０分以内に置き換えられた。
【０１２９】
本発明者らは、マイクロゲルに永久的で空間的に制御されたシェル（すなわち、第２のポリマーネットワーク）を付与することを目的とした。具体的には、本発明者らは、マイクロゲルのシェルをビオチン化環式ＲＧＤぺプチドビオチン−（ＰＥＧ）2−ｃ（ＲＧＤｆＫ）により機能化することにより、マイクロゲルが細胞と自己集合する一方、マイクロゲルのコア中のビオチンをさらなる現場機能化に利用可能のままとし（図７）、それにより粒子の環境からのコア中の分子を封鎖する一方、二次機能をシェルに提供することが可能となることを予測した。ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎの濃度およびインキュベーション時間を調整することにより、本発明者らは、マイクロゲル中へのその浸透深さを再現可能に制御することができた。この方針は、ビオチン化分子の後続のカップリングについての反応性基質として作用するｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎシェルの厚さを決定することにより、マイクロゲルの生化学的組成に対する２．５Ｄ制御を与えた。ビオチン−ＦＩＴＣ（すなわち、緑色）標識および後続の蛍光共焦点イメージングを使用してこの拡散ベース空間的テンプレート化を可視化し、定量した（図７および図８）。シェル機能化後、マイクロゲルのコアは、長期ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎインキュベーションステップを有する機能化プロトコルを繰り返すことにより別の部分を付与することができるフリービオチンを依然として含有した。例えば、コア−シェル多機能性マイクロゲルは、図７に記載のマルチステップ機能化プロトコルを使用するシェル機能化を適用することにより容易に調製することができた。蛍光標識を使用するコア−シェル機能化プロトコルの有効性を裏付けた後（図７）、同一のコア−シェル機能化方針を使用してマイクロゲルのシェルにｃ（ＲＧＤｆＫ）ぺプチドを永久的に付与してインテグリン媒介細胞接着を可能とし、ボトムアップ型自己集合を促進した。マイクロゲル中のビオチンおよび結果的にｃ（ＲＧＤｆＫ）の濃度を約１ｍＭに設定した。それというのも、これは細胞接着特性を有するヒドロゲルを提供するために有効であることが証明されているためである［１８、１９］。
【０１３０】
Ｄｅｘ−ＴＡ−ビオチンヒドロゲル粒子に、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎの濃度およびインキュベーション時間を制御することにより調整可能な厚さの機能性シェルを付与することができた。実際、ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎは、ビオチン−ＦＩＴＣ（すなわち、緑色：図８）を使用して実証されたとおり、ビオチン化目的分子の後続の係留のためのテンプレートとして作用した。
【０１３１】
或いは、シェルは、ヒドロゲル粒子産生後にヒドロゲル粒子の表面上で利用可能なチラミン部分の重合を介して機能化／保護することができる。
【０１３２】
デスチオビオチン（ＤＴＢ）／ビオチン置換方針を使用して、本発明者らは、ビオチン化単一ドメイン抗体（ＶＨＨ）をデキストラン−チラミン−ビオチンヒドロゲル粒子に結合させることができることを実証した（図９）。本発明者らは、ビオチンリンカーを介して遺伝子改変ＶＨＨを予め架橋させ、機能化デキストランベースヒドロゲルにカップリングさせた。個々のデキストランポリマーの架橋のために導入されるコンジュゲートに加え、それらの分子はビオチンコンジュゲートも含有する（図９）。ストレプトアビジン（または同様の分子）を多価（典型的には、四価）中間体として使用して、ビオチン化ＶＨＨをポリマー骨格に超分子相互作用で付着させる。
【０１３３】
指向カップリングを可能とするため、フリーＣｙｓをＶＨＨのＣ末端テイル中に導入し、それにマレイミド化学を使用してビオチン分子をコンジュゲートさせる。このフリーＣｙｓを使用して、ＶＨＨは、デキストラン骨格において導入される感受性反応性基に直接カップリングさせることもできる。
【０１３４】
ＶＨＨ機能化ヒドロゲル粒子は、局所的環境から成長因子（すなわち、サイトカイン）を枯渇させることにより細胞応答を妨害し得る（図１０および図１１参照）。材料および方法：Ｃ２Ｃ１２  ＢＲＥルシフェラーゼ細胞を成長培地（ＤＭＥＭ、２０％のＦＢＳ、１％のペニシリンおよびストレプトマイシン）中で１０．０００個の細胞／ｃｍ２において播種した。２４時間後、０．５％のＦＢＳを含有する成長培地中で細胞を１２時間飢餓状態にした。飢餓状態化に続き、飢餓培地中でＢＭＰ７（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ、３００ｎｇ／ｍｌ）により１０〜１５時間刺激した。ヒドロゲル粒子を細胞培養物に添加する前、ヒドロゲル粒子を１０％のＰＢＳ中で１時間インキュベートして非特異的結合をブロッキングした。ＢＭＰ７と同時に、ヒドロゲル粒子を１０倍過剰で添加した。刺激後、細胞を溶解させ、製造業者のプロトコル（Ｐｒｏｍｅｇａ、ルシフェラーゼアッセイシステム）を使用してルシフェラーゼ発現を決定した。
【０１３５】
関節内注射後のヒドロゲルマイクロ粒子の長期保持も実証された。近赤外線標識デキストランコンジュゲートを使用して直径３０μｍのマイクロゲルを調製し、マウス膝の滑液腔中に注射した。３週間後、蛍光イメージングを使用してマイクロゲルを生存動物中で依然として追跡することができ、それはマイクロゲルが注射膝中に依然として存在することを示し、および組織学的染色を使用して死後に追跡することができた（図１２）。マイクロゲルは、パネルｃの左側における暗紫色ドットとして滑膜中で可視的となる（図１２）。
【０１３６】
ある用途において、ビオチンまたはビオチン化分子によるデスチオビオチン化分子の置換をデスチオビオチン化分子のオンデマンドおよび／または制御放出に使用して、例えば、その局所的機能を遮断し、またはそのオンデマンドおよび／若しくは制御放出を達成することができる。
【０１３７】
実施例３
透過性
２０、４０、７０、１５０、５００および２０００ｋＤａの分子量を有するＦＩＴＣコンジュゲートデキストラン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ、１５０ｋＤａ、Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用してヒドロゲルネットワークの透過性を試験した。共焦点断面を作製し、カスタムメイドＭａｔｌａｂスクリプトを使用してゲルの中心の蛍光強度をバックグラウンドの蛍光強度と比較した。条件ごとに少なくとも５０個のゲルを分析した。
【０１３８】
分析は、ＤｅｘＨＡ−ＴＡカプセルが２０００ｋＤａまでの全てのＦＩＴＣコンジュゲートおよびＩｇＧについて透過性であることを示した（図１３）が、拡散はより大きい分子について約５０％遅延する。これは、ＤｅｘＨＡ−ＴＡベースマイクロヒドロゲルが透過性であり、インビボでほぼ全ての関連分子、例として、大型タンパク質に対して透過性である可能性が最も高いが、拡散が妨げられ得たことを示唆する。ＤｅｘＨＡ−ＴＡ中のＩｇＧ浸透の定量は、ゲルのコア中のＩｇＧ沈殿に起因して不可能であった。しかしながら、ＰＥＧ−ＴＡカプセルは、１５０ｋＤａまでのＦＩＴＣコンジュゲートにのみ透過性であった。ほぼバックグラウンドレベルであった＞５００ｋのデキストランおよびＩｇＧとインキュベートされたＰＥＧ−ＴＡカプセル中のコアの蛍光強度に基づき、大型分子の拡散は、それらのカプセル中で重度に損なわれると考えられた（図１３）。
【０１３９】
実施例４
ビオチン−ストレプトアビジン相互作用を介する抗体断片またはぺプチドの間接的カップリングに加え、チラミン機能化ポリマー、例えば、Ｄｅｘ−ＴＡおよびＨＡ−ＴＡの骨格への生物分子の直接および標的化カップリングの追加の方法を探索した。
【０１４０】
関節中で関節内注射することができるサイトカインシンクを得る一般的な方法を、図１４に挙げる。簡潔に述べると、反応性マレイミド基をポリマー−チラミンコンジュゲートの骨格にコンジュゲートさせる。このように、Ｄｅｘ−ＴＡ−マレイミドおよびＨＡ−ＴＡ−マレイミドポリマーコンジュゲートを得る。続いて、２つの方法を行うことができる。第１の方法において、フリー不対システイン残基を有する抗体またはぺプチド断片を、ポリマー−ＴＡ骨格におけるマレイミド基と反応させる。これは、ポリマー−ＴＡ−タンパク質コンジュゲートを作出する。これらのコンジュゲートは、注射部位、例えば、関節腔における直接注射に、セイヨウワサビペルオキシダーゼおよび微量の過酸化水素との組合せで使用することができる。これにより、注射部位、例えば、関節腔における現場マイクロおよびマクロゲル形成が可能となる。或いは、ポリマー−ＴＡ−タンパク質コンジュゲートを使用してｄｅｘ−ＴＡ−ビオチンポリマーについて記載のとおり最初にマイクロゲルを生成することができる。こうして生成されたマイクロゲルを関節腔中で直接注射することができる。さらなる方法において、ポリマー−ＴＡ−マレイミドコンジュゲートを、最初にマイクロゲル形成に使用し、その後にフリー不対システイン残基を有する特異的結合分子をマイクロゲルネットワーク中で拡散させ、ポリマー骨格におけるマレイミド残基と反応させる。
【０１４１】
２つの方法を使用してマレイミドおよびチラミン残基をデキストランの骨格中で導入した。最初に、マレイミド−ＰＮＣ中間体を形成した。続いて、この中間体をデキストラン−チラミンコンジュゲートと反応させた（図１５）。図１６に示されるとおり、Ｄｅｘ−ＴＡ−マレイミドコンジュゲートを得た。これに加え、マレイミド−ＰＮＣ中間体はフェノール性残基とも反応した（左側丸）。予測されるとおり、ポリマーコンジュゲートをポリ（エチレングリコール）ジチオール基と混合したら、マレイミド基は、急速なゲル形成により実証されるとおり依然として機能的であった。こうして調製されたＤｅｘ−ＴＡ−マレイミドコンジュゲートは、フリーシステインを有するぺプチドおよびタンパク質との反応に使用することができる。
【０１４２】
第２の方法において、デキストランを最初にＰＮＣと反応させてＤｅｘ−ＰＮＣ中間体コンジュゲートを得た。続いて、Ｄｅｘ−ＰＮＣをチラミンおよびマレイミド−アミンの混合物と反応させた（図１７）。図１８において、この方法は、チラミンについて８％およびマレイミドについて４〜５％の置換度を有するＤｅｘ−ＴＡ−マレイミドコンジュゲートをもたらしたことが示される（図１８）。
【０１４３】
ヒアルロン酸（ＨＡ）チラミン−マレイミドコンジュゲートを得るため、２ステップ反応を使用した。最初にヒアルロン酸をＤＭＴＭＭの存在下でチラミンと反応させ、ＨＡ−ＴＡの形成をもたらした。続いて、ＨＡ−ＴＡを再度ＤＭＴＭＭの存在下でマレイミド−アミンと反応させた（図１９）。これは、４．５％のＴＡの置換度を有するＨＡ−ＴＡコンジュゲートをもたらし、続いてそれをマレイミド官能基により１２％の置換度において改変した（図２０）。
【０１４４】
こうして生成されたマレイミド機能化ポリマーコンジュゲートは、フリー不対システイン残基を有するぺプチド（図２１）または組換えＤＮＡ技術を使用してタンパク質のＣ末端中に導入された遺伝子操作フリー不対システインを有する抗体断片（ＶＨＨ）（図２２）のコンジュゲーションに使用することができる。これを実証するため、フリー不対システイン残基を有するぺプチドを合成し、蛍光色素により標識した。このぺプチドをＨＡ−ＴＡ−マレイミドポリマーコンジュゲートと反応させた。こうして形成されたＨＡ−ＴＡ−ぺプチドコンジュゲートをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動に非コンジュゲートぺプチドと並べて供した。続いて、蛍光を可視化に使用した。図２１に示されるとおり、ＨＡ−ＴＡ−ぺプチドコンジュゲートの分子量は、非コンジュゲートぺプチドと比較して増加し、それは良好なコンジュゲーションを実証した。同様に、図２２において、ＨＡ−ＴＡ−マレイミドポリマーコンジュゲートは、不対システイン残基がＣ末端において遺伝子操作された抗体断片（ＶＨＨ）とも反応したことが示される。マレイミド化学を使用するＶＨＨへのポリマー−ＴＡコンジュゲートのコンジュゲーションは、全てのＶＨＨが反応したわけではないが、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル電気泳動に基づきフリー未反応ＶＨＨと比較してＶＨＨの分子量の増加を明らかに誘導した。
【０１４５】
本実施例は、サイトカインシンクの生成に使用することができるポリマーコンジュゲート、例えば、ヒアルロン酸およびデキストランポリマーをベースとするものを得るために異なる方針を用いることが可能であることを実証する。
【０１４６】
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２０．Ｈｅａｄｅｎ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃ−ｂａｓｅｄ  ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉｚｅ−ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ，ｂｉｏｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｃｅｌｌ  ｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６（１９），３００３−８．
２１．Ｐｒａｄａｌ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｐａｒｔｉｃｌｅ  ｓｉｚｅ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｂｉｏｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎａｎｏ−  ａｎｄ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｉｎｔｒａ−ａｒｔｉｃｕｌａｒ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．Ｉｎｔ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  ４９８（１−２），１１９−２９．
２２．Ｆｏｒｍｉｇａ，Ｆ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｈｅａｒｔ  ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ａ  ｒａｔ  ｍｏｄｅｌ  ｏｆ  ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ  ｉｓｃｈｅｍｉａ．Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｈａｒｍ  Ｂｉｏｐｈａｒｍ  ８５（３  Ｐｔ  Ａ），６６５−７２．
２３．Ｔｒａｎ，Ｖ．−Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１１）Ｗｈｙ  ａｎｄ  ｈｏｗ  ｔｏ  ｐｒｅｐａｒｅ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ，ｍｏｎｏｄｉｓｐｅｒｓｅｄ，ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ｍｉｃｒｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｆｉｅｌｄ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｙ？  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ  ４０７（１−２），１−１１．
２４．Ｌｉｍａ，Ａ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙｍｅｒｉｃ  ａｎｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌ  ｐａｒｔｉｃｌｅｓ  ｆｏｒ  ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  ９（２），２３１−４８．
２５．Ｂｕｗａｌｄａ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｉｎ  ａ  ｈｉｓｔｏｒｉｃａｌ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅ：ｆｒｏｍ  ｓｉｍｐｌｅ  ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｔｏ  ｓｍａｒｔ  ｍａｔｅｒｉａｌｓ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １９０，２５４−７３．
【０１４７】
実施例中の参照文献
１．Ｓｔｒｏｋａｐｐｅ，Ｎ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｌｌａｍａ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｅｐｉｔｏｐｅｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＣＤ４ｂｓ  ｎｅｕｔｒａｌｉｚｅ  ａ  ｂｒｏａｄ  ｒａｎｇｅ  ｏｆ  ＨＩＶ−１  ｓｕｂｔｙｐｅｓ  Ａ，Ｂ  ａｎｄ  Ｃ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ７（３），ｅ３３２９８．
２．Ｆｒｅｎｋｅｎ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｌａｍａ  ＶＨＨ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｈｉｇｈ  ｌｅｖｅｌ  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ．Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ７８（１），１１−２１．
３．Ｒｏｏｖｅｒｓ，Ｒ．Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ＥＧＦＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ａｎｄ  ｏｆ  ｔｕｍｏｕｒ  ｇｒｏｗｔｈ  ｂｙ  ａｎｔａｇｏｎｉｓｔｉｃ  ａｎｔｉ−ＥＦＧＲ  Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  ５６（３），３０３−３１７．
４．Ｅｌ  Ｋｈａｔｔａｂｉ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｌｌａｍａ  ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｔｈａｔ  ｂｌｏｃｋｓ  ｌｉｐｏｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ：ｐｒｏｓｐｅｃｔｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．Ｃｌｉｎ  Ｖａｃｃｉｎｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３（１０），１０７９−８６．
５．Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒｓ  ｗｉｔｈ  ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍａｇｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ．Ｊ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  Ｒｅｌｅａｓｅ  １７２（３），６０７−１７．
６．Ｚｈａｎｇ，Ｙ．（２００８）Ｉ−ＴＡＳＳＥＲ  ｓｅｒｖｅｒ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ３Ｄ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ９，４０．
７．Ｒｏｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｉ−ＴＡＳＳＥＲ：ａ  ｕｎｉｆｉｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ａｕｔｏｍａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ  ５（４），７２５−３８．
８．Ｒｏｙ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＣＯＦＡＣＴＯＲ：ａｎ  ａｃｃｕｒａｔｅ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｂａｓｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｎｏｔａｔｉｏｎ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４０（Ｗｅｂ  Ｓｅｒｖｅｒ  ｉｓｓｕｅ），Ｗ４７１−７．
９．Ｗａｎｇ，Ｒ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｉｎ−ｓｉｔｕ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ，Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  ＢｉｏＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｔｗｅｎｔｅ，Ｅｎｓｃｈｅｄｅ，２０１６，ｐ．１８０．
１０．Ｊｉｎ，Ｒ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｅｎｚｙｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｆａｓｔ  ｉｎ  ｓｉｔｕ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｒｏｍ  ｄｅｘｔｒａｎ−ｔｙｒａｍｉｎｅ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２８（１８），２７９１−８００．
１１．Ｋａｍｐｅｒｍａｎ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｃｅｎｔｅｒｉｎｇ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｇｅｌｓ  ｖｉａ  Ｄｅｌａｙｅｄ  Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｉｎｇ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ  Ｌｏｎｇ−Ｔｅｒｍ  ３Ｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  ｂｙ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｎｇ  Ｃｅｌｌ  Ｅｓｃａｐｅ．Ｓｍａｌｌ  １３（２２），１６０３７１１−ｎ／ａ．
１２．Ｂｏｔｈ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ａ  ｒａｐｉｄ  ａｎｄ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．Ｔｉｓｓｕｅ  Ｅｎｇ  １３（１），３−９．
１３．Ｍｏｒｅｉｒａ  Ｔｅｉｘｅｉｒａ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｈｉｇｈ  ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ｇｅｎｅｒａｔｅｄ  ｍｉｃｒｏ−ａｇｇｒｅｇａｔｅｓ  ｏｆ  ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅｓ  ｓｔｉｍｕｌａｔｅ  ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｆｏｒｍａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．Ｅｕｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍａｔｅｒ  ２３，３８７−９９．
１４．Ｃａｄｅｅ，Ｊ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｄｅｘｔｒａｎ−ｂａｓｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ５０（３），３９７−４０４．
１５．Ｄｅ  Ｇｒｏｏｔ，Ｃ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ｂｉｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｂｌｅ  ｄｅｘｔｒａｎ−ｂａｓｅｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｔｅｓｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２２（１１），１１９７−２０３．
１６．Ｓｅｇｕｒａ，Ｔ．ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ  ｈｙａｌｕｒｏｎｉｃ  ａｃｉｄ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ：ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｔｏ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅ  ａｎｄ  ｐａｔｔｅｒｎ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２６（４），３５９−７１．
１７．Ｓｅｉｄｌｉｔｓ，Ｓ．Ｋ．ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｈｉｇｈ−Ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎｉｎｇ  ｏｆＨｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｉｎ  Ｔｈｒｅｅ  Ｄｉｍｅｎｓｉｏｎｓ  ｕｓｉｎｇ  Ｄｉｒｅｃｔ−Ｗｒｉｔｅ  Ｐｈｏｔｏｆａｂｒｉｃａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  Ｃｅｌｌ  Ｇｕｉｄａｎｃｅ．Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  １９（２２），３５４３−３５５１．
１８．Ｃｈａｕｄｈｕｒｉ，Ｏ．ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｗｉｔｈ  ｔｕｎａｂｌｅ  ｓｔｒｅｓｓ  ｒｅｌａｘａｔｉｏｎ  ｒｅｇｕｌａｔｅ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｆａｔｅ  ａｎｄ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｎａｔ  Ｍａｔｅｒ  １５（３），３２６−３４．
１９．Ｂｕｒｄｉｃｋ，Ｊ．Ａ．ａｎｄ  Ａｎｓｅｔｈ，Ｋ．Ｓ．（２００２）Ｐｈｏｔｏｅｎｃａｐｓｕｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｓｔｅｏｂｌａｓｔｓ  ｉｎ  ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ  ＲＧＤ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＰＥＧ  ｈｙｄｒｏｇｅｌｓ  ｆｏｒ  ｂｏｎｅ  ｔｉｓｓｕｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｂｉｏｍａｔｅｒｉａｌｓ  ２３（２２），４３１５−２３．
【図１】
2021511431.tif 000002
【図２】
2021511431.tif 000003
【図３】
2021511431.tif 000004
【図４】
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【図５】
2021511431.tif 000006
【図６】
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【図７】
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【図８】
2021511431.tif 000009
【図９】
2021511431.tif 000010
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
2021511431.tif 000015
【図１５】
2021511431.tif 000016
【図１６】
2021511431.tif 000017
【図１７】
2021511431.tif 000018
【図１８】
2021511431.tif 000019
【図１９】
2021511431.tif 000020
【図２０】
2021511431.tif 000021
【図２１】
2021511431.tif 000022
【図２２】
2021511431.tif 000023
【図２３】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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2021511431.tif 000027
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