(57)【要約】  ｍＴＯＲ阻害剤、薬物組成物及びその応用を開示する。前記ｍＴＯＲ阻害剤はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、またはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。その薬物組成物は、ｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物を第２活性成分としてさらに含む。ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲ経路関連疾患の細胞に対して明らかな抑制作用を有し、ｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物の調製に用いられる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、またはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含むことを特徴とする、ｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項２】
ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるタンパクのアロステリック阻害剤または触媒阻害剤であり；
好ましくは、前記触媒阻害剤はキナーゼ阻害剤であり；
好ましくは、ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の活性化を抑制し；
好ましくは、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制する；ことを特徴とする、請求項１に記載のｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項３】
ｍＴＯＲシグナル経路に作用する抗腫瘍薬、及び／または糖尿病治療薬、及び／またはアルツハイマー治療薬、及び／または老化を遅らせる薬であることを特徴とする、請求項１または２に記載のｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項４】
ｍＴＯＲシグナル経路に作用する抗腫瘍薬であり、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制することを特徴とする、請求項３に記載のｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項５】
ｍＴＯＲシグナル経路に作用する糖尿病治療薬であり、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制することを特徴とする、請求項３に記載のｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項６】
ｍＴＯＲシグナル経路に作用するアルツハイマー治療薬であり、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制することを特徴とする、請求項３に記載のｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項７】
ｍＴＯＲシグナル経路に作用する老化を遅らせる薬であって、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制することを特徴とする、請求項３に記載のｍＴＯＲ阻害剤。
【請求項８】
請求項１または２に記載のｍＴＯＲ阻害剤並びに薬学的に許容可能な担体及び／または活性成分を含み；
好ましくは、ｍＴＯＲ阻害剤の用量範囲は１〜１００００ｍｇ／ｋｇ；好ましくは１０〜５０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ；より好ましくは１００〜５００ｍｇ／ｋｇであり；
好ましくは、第１活性成分及び第２活性成分を含み、前記第１活性成分は請求項１または２に記載のｍＴＯＲ阻害剤を含み、前記第２活性成分はｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物を含み；
好ましくは、薬学的に許容可能ないかなる剤形も含み、好ましくは、剤形は散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤を含む；ことを特徴とする薬物組成物。
【請求項９】
請求項１または２に記載のｍＴＯＲ阻害剤或いは請求項８に記載の薬物組成物を含む第１薬剤を含み；
好ましくは、第２薬剤も含み；
好ましくは、前記第２薬剤はｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物を含む；ことを特徴とする配合剤。
【請求項１０】
ｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物の調製における、請求項１または２に記載のｍＴＯＲ阻害剤或いは請求項８に記載の薬物組成物或いは請求項９に記載の配合剤の使用方法であって、
好ましくは、カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、或いはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せは、ｍＴＯＲを標的とする方式により、代謝微小環境を制御して、ｍＴＯＲ経路関連疾患を抑制する；
好ましくは、ｍＴＯＲ経路関連疾患は、加齢に伴う疾患、移植拒絶関連の疾患、慢性炎症性疾患、糖原病関連の疾患、ハンチントン病、悪性腫瘍、転移癌、全身性エリテマトーデス、炎症及び免疫活性化関連の疾患、白血球減少の関連疾患、貧血症、血小板減少症、ステントコーティングに関連する疾患、腎不全、肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪肝関連疾患、疾患による体重低下、多嚢胞性腎、パーキンソン病及び線維症の少なくとも１つから選択される；
好ましくは、加齢に伴う疾患は、サルコペニア、皮膚委縮症、筋ジストロフィ、脳萎縮、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、肺気腫、骨粗しょう症、骨関節炎、高血圧、勃起不全、認知症、アルツハイマー病、白内障、加齢性黄斑変性、前立腺癌、脳卒中、寿命の低下、腎機能障害及び加齢性難聴、老化に伴う移動障害、認知機能の後退、記憶障害、腱硬直、心肥大及び収縮、拡張機能障害などの心機能障害、免疫機能の老化から選択される；
好ましくは、前記線維症は肝線維症、心筋線維症、心血管線維症、肺線維症、膵線維症、腎線維症または脾線維症を含む；
好ましくは、前記悪性腫瘍は、リンパ系の造血腫瘍、骨髄系造血腫瘍、間葉由来腫瘍、中枢及び末梢神経系の腫瘍、黒色腫、精上皮腫、奇形腫、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、甲状腺濾胞癌及びカポジ肉腫から選択される；
好ましくは、リンパ系の造血腫瘍は、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、骨髄腫及びバーキットリンパ腫から選択され；骨髄系造血腫瘍は急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群及び前骨髄球性白血病を含み；間葉由来腫瘍は線維肉腫及び横紋筋肉腫を含み；中枢及び末梢神経系の腫瘍は星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及び神経鞘腫を含む；
好ましくは、前記悪性腫瘍はさらに膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、中皮腫、腎臓癌、肝癌、肺癌、頭頚部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓腺癌、胃癌、リンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、甲状腺癌、前立腺癌、皮膚癌、口腔癌を含む；
好ましくは、ｍＴＯＲ阻害剤が抑制する悪性腫瘍細胞は、ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２、ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０及びＨ１２９９、ヒト腎淡明細胞癌細胞７８６−Ｏ、ヒト腎細胞癌細胞７６９−Ｐ、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１、ヒト神経膠芽腫細胞Ａ１７２、ヒト組織リンパ腫細胞Ｕ９３７、ヒト子宮頸癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト膵臓腺癌細胞ＰＡＮＣ−１、ヒト食道癌細胞ＴＥ−１、ヒト胃腺癌細胞ＳＧＣ７９０１、ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９、ヒト前骨髄球性白血病細胞ＨＬ−６０を含む；
好ましくは、ｍＴＯＲ阻害剤はヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９を抑制する；使用方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は薬物分野に属し、具体的に、ｍＴＯＲ阻害剤、薬物組成物及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍は一般的で、よく見られる疾患である。人体の組織細胞内外における各種発癌性因子の長期的作用下で、細胞に遺伝子の突然変異が生じて、その成長及び分化が正常に制御されなくなり、クローン性異常増殖及び分化が生じて形成される新生物または病的増殖物である。腫瘍は良性腫瘍及び悪性腫瘍に分けられ、悪性腫瘍はさらに上皮組織由来の癌、間葉組織由来の肉腫及び癌肉腫の３種に細分される。通常、人々が言う「癌」は、一般的にすべての悪性腫瘍を指す。
【０００３】
悪性腫瘍は人々の健康を脅かす最も主要な悪性疾患の１つであり、現在、全世界で死因第１位である。最新データでは、２００７年、全世界で総死亡数の１３％を占める約７９０万人が各種癌で亡くなり、１２００万を超える腫瘍症例が診断された。このうち７２％以上の腫瘍患者及び致死症例はいずれも発展途上国で発生しており、上昇し続ける傾向を呈している。２０１５年、全世界の腫瘍による致死数は９００万人まで増加し、２０３０年には１２００万人を超えると推定されている。現在、中国では毎年癌発症数が約２８０万で、死亡数は４０万人を超え、中国の各種疾病による致死原因の１位となっており、上昇し続ける傾向を呈している。社会の生活リズムが速くなるのに伴い、競争のストレスは増大している。さらに人々の生活方式及び環境の変化により、腫瘍発症率及び死亡数は年々増加し、悪性腫瘍はすでに現代社会で一般的で発症率が高い疾患となっている。患者の生活の質に深刻な影響を及ぼすだけでなく、家庭及び社会に重い経済的、精神的負担をもたらす。全世界を悩ます重大な社会問題でもあり、癌の治療及び予防は一貫して全世界で最も切実な問題の１つである。
【０００４】
哺乳類ラパマイシン標的タンパク質（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｔａｒｇｅｔ  ｏｆ  ｒａｐａｍｙｃｉｎ、ｍＴＯＲ）は非定型セリン／スレオニンプロテインキナーゼであり、ホスホイノシタイド３キナーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｉｎｏｓｉｔｉｄｅ３ｋｉｎａｓｅ、ＰＩ３Ｋ）関連プロテインキナーゼファミリーの１つである。ｍＴＯＲは、生物体内でｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２という２種の複合体の形態で存在する。ｍＴＯＲは栄養、エネルギー及び成長因子など数種の細胞外シグナルを統合することができ、遺伝子の転写、タンパク質の翻訳、リボソームの合成及び細胞骨格の合成など生物プロセスに関与し、細胞成長、増殖、アポトーシス及び代謝において極めて重要な作用を発揮する。シグナル経路を活性化する開始因子は、主にアミノ酸、各種成長因子及び低酸素などである。ｍＴＯＲは、生物体内でｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２という２種の複合体の形態で存在する。
【０００５】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路は、哺乳動物において細胞活動を調節するシグナル経路であり、この経路は細胞の生存、成長及び増殖に対して重要な意義を有する。重要なマイトジェン（インスリン、ホルモン、成長因子など）は細胞膜における細胞質に近い側に位置する分子を活性化させ、さらにはｍＴＯＲ経路における重要分子ＰＩ３Ｋを活性化させる。活性化したＰＩ３Ｋはホスファチジルイノシトール−４，５−二リン酸（ＰＩＰ２、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（４，５）−ｂｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）からホスファチジルイノシトール−３，４，５−三リン酸（ＰＩＰ３、ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｉｎｏｓｉｔｏｌ（３，４，５）−ｔｒｉｐｈｏｓｐｈａｔｅ）への変換を促進する。後者はＡｋｔのＰＨドメインと結合すると同時に、その他のキナーゼとＡｋｔをリン酸化する。最終的に結節性硬化症複合体１及び２（ＴＳＣ１／２、ｔｕｂｅｒｏｕｓ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｃｏｍｐｌｅｘ１  ａｎｄ  ２）の分解及び／またはＰＲＡＳ４０（ｐｒｏｌｉｎｅ  ｒｉｃｈ  ＡＫＴ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ  ４００００）のリン酸化を引き起こしてｍＴＯＲＣ１を上方制御する。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル経路の異常は、非小細胞肺癌、子宮内膜癌、子宮頸癌などを含む数種の腫瘍型で頻繁に発生する。
【０００６】
このほか、その他の環境ストレス源もｍＴＯＲシグナル経路を調節することができる。例えば細胞代謝に不可欠な酸素が長期的に欠乏すると、エネルギー欠乏が引き起こされ、セリン／スレオニンキナーゼの肝キナーゼＢ１（ＬＫＢ１、ｌｉｖｅｒ  ｋｉｎａｓｅＢ１）またはＡＭＰＫがｍＴＯＲＣ１を抑制する。エネルギーの有効性も、ｍＴＯＲ活性の重要な調節要素である。ＡＭＰ活性化プロテインキナーゼ（ＡＭＰＫ、ＡＭＰ−ａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ）は、ｍＴＯＲＣ１の「エネルギーセンサ」とすることができる。エネルギーが欠乏したとき、細胞内のＡＭＰレベルが上昇して、ＡＭＰＫと結合し、上流のキナーゼを介してＡＭＰＫが活性化される。ＡＭＰＫは一旦活性化されると、ＴＳＣ２をリン酸化することができ、エネルギーを生成する分解過程を増加させ、エネルギーを消費する合成過程、例えばタンパク質の合成などを低下させる。
【０００７】
ｍＴＯＲＣ１活性化の最も重要な特徴は、タンパク質の合成である。ｍＴＯＲＣ１はリボソームタンパク質Ｓ６キナーゼ１（ｐ７０  ｒｉｂｏｓｏｍａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓ６  ｋｉｎａｓｅ１、Ｓ６Ｋ１）の疎水性基Ｔｈｒ３８９を直接リン酸化することにより、ＰＤＫ１に作用してその後のタンパク質をリン酸化させる。Ｓ６Ｋ１のリン酸化は下流のいくつかの基質を活性化し、これによりｍＲＮＡの翻訳の開始を促進する。これにはｅＩＦ４Ｆ複合体を上方制御するｅＩＦ４Ｂが含まれる。ｍＴＯＲＣ１は下流の真核細胞翻訳開始因子結合タンパク（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ  ｆａｃｔｏｒ  ４Ｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１、４Ｅ−ＢＰ１）を直接リン酸化する。４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化はこれがキャップ結合タンパク質ｅＩＦ４Ｅに結合するのを阻止するため、ｅＩＦ４Ｅはキャップ依存性翻訳の開始に必要なｅＩＦ４Ｆ複合体の形成に関与することができる。Ｓ６Ｋ１及び４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化はｍＲＮＡの翻訳を活性化し、これにより各種反応物の活性レベルを増加させる。ｍＴＯＲＣ１はｍＲＮＡの翻訳において非常に重要な意義を有し、ｍＴＯＲの活性部位阻害剤はｍＴＯＲＣ１の機能を完全に抑制することができ、これにより細胞中のタンパク質合成を低下させる。ｍＴＯＲＣ１はタンパク質の合成を調節する以外に、細胞膜に必要な脂質の合成も制御し、さらにｍＴＯＲＣ１は細胞代謝及びＡＴＰの合成も積極的に媒介する。
【０００８】
ｍＴＯＲＣ２はｍＴＯＲ、ｍＬＳＴ８、Ｄｅｐｔｏｒ、Ｒｉｃｔｏｒ（ｒａｐａｍｙｃｉｎ−ｉｎｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｃｏｍｐａｎｉｏｎ  ｏｆ  ｍＴＯＲ）、哺乳類ストレス活性化プロテインキナーゼ相互作用タンパク質１（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｔｒｅｓｓａｃｔｉｖａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ１、ｍＳＩＮ１）及びＰｒｏｔｏｒ  １／２（ｐｒｏｔｅｉｎ  ｏｂｓｅｒｖｅｄ  ｗｉｔｈ  Ｒｉｃｔｏｒ−１／２）からなる。ｍＳＩＮ１及びプロテインキナーゼＣ−α（ＰＫＣα）を介して、アクチンの調節及び細胞骨格の形成に関与することができる。ｍＴＯＲＣ２の高発現は細胞の生存を促進することができ、低発現はアポトーシスを誘導する。
【０００９】
ｍＴＯＲＣ２経路の重要なステップは、プロテインホスファターゼ（ＰＴＥＮ、ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ  ａｎｄ  ｔｅｎｓｉｎ  ｈｏｍｏｌｏｇｕｅ  ｄｅｌｅｔｅｄ  ｏｎ  ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ１０）により、ＰＩＰ２からＰＩＰ３への変換を調節及び抑制することである。ｍＴＯＲＣ１はリボソームの生合成、オートファジーの抑制を介したリボソームの翻訳の活性化により、ｍＴＯＲＣ２を間接的に活性化させることができる。ｍＴＯＲＣ２の活性化によりＡｋｔ４７３位のセリン（Ｓｅｒ４７３）のリン酸化が生じ、Ａｋｔの活性化はＳＩＮ１−Ｔ８６のリン酸化をさらに誘導する。ｍＴＯＲＣ２の活性が増強すると、ｍＴＯＲＣ２の順方向環状経路の形成が促されるが、ＴＳＣ１／２複合体が抑制されるとき、該過程は弱まる。
【００１０】
ヒトの数種の腫瘍において、ｍＴＯＲはいずれも異常に活性化する。ｍＴＯＲ阻害剤を使用すると、肺癌、乳腺癌、膵臓腺癌、胃癌、黒色腫、神経膠腫、肝癌など数種の腫瘍細胞を異常に活性化するＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路を効果的に抑制することができ、さらには腫瘍細胞の遊走及び侵襲並びに上皮間葉転換を抑制する。癌患者の多くはｍＴＯＲＣ１上流の発癌経路に突然変異が存在し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路及びＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路の２つの経路の突然変異により、ｍＴＯＲＣ１の過度の活性化が生じる。他に、よく見られる腫瘍阻害因子ＴＰ５３及びＬＢＫ１は、ｍＴＯＲＣ１上流のＴＳＣ１及びＴＳＣ２のネガティブ調節因子である。ｍＴＯＲＣ１の下流因子も腫瘍の発生に関与し、ｅＩＦ４Ｅ及びＳ６Ｋ１遺伝子及びタンパクの過剰発現は多くの癌に存在する。このうち４Ｅ−ＢＰ１のリン酸化が最も重要であり、ＡＫＴ及びＥＲＫが誘導するいくつかの腫瘍細胞株はいずれも４ＥＢＰのリン酸化に依存する。ｍＴＯＲ阻害剤は４ＥＢＰ及びｅＩＦ４Ｅの発現比率を変化させることができ、これによりこの種の細胞に対して比較的強い増殖抑制作用が生じる。
【００１１】
ｍＴＯＲＣ２シグナルも癌に関わる。高い程度でｍＴＯＲＣ２シグナルがＡｋｔを活性化し、活性化したＡｋｔはグルコース摂取及び解糖系などの増殖過程を促進し、同時にアポトーシスを抑制する。実際に、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔが誘導するいくつかの腫瘍もｍＴＯＲＣ２活性に依存する。前立腺癌マウスモデルにはＰＴＥＮ欠損が存在し、同様にヒト前立腺癌細胞系中にもＰＴＥＮ欠損が存在する。
【００１２】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル変換経路の活性化は、数種の刺激に誘発されるアポトーシスを抑制することができ、細胞周期の進行、細胞の生存及び増殖を促進し、同時に血管の形成、腫瘍の侵襲及び転移に関わり、腫瘍の形成過程で重要な役割を果たす。ＡＫＴは複数のアポトーシス関連タンパクを制御してアポトーシスを抑制することができ、ＡＫＴの過剰発現はアポトーシス抑制因子１（Ｄａｐ−１）の発現を増加させ、これによりアポトーシスを抑制する作用を発揮する。ＡＫＴはｍＴＯＲ及びその下流分子Ｓ６Ｋ１、４Ｅ−ＢＰ１をリン酸化することにより生存シグナルを伝達することもでき、Ｐ５３に依存しないアポトーシスを抑制し、細胞の生存を促進する。近年、数種の腫瘍において、ｅＩＦ−４Ｅが体外で細胞の形質転換及び抗アポトーシス活性を有することが発見されており、ｅＩＦ−４Ｅの過剰発現は細胞にいくつかのプロアポトーシス効果の影響を及ぼさないようにすることができる。
【００１３】
細胞外シグナル調節キナーゼ（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｉｎａｓｅｓ、ＥＲＫ）はＥＲＫ１及びＥＲＫ２を含み、シグナルを表面受容体から細胞核に伝える鍵である。リン酸化により活性化したＥＲＫ１／２は細胞質から核内に移行し、さらにはＥｌｋ−１、ＡＴＦ、Ａｐ−１、ｃ−ｆｏｓ及びｃ−Ｊｕｎを介した転写を活性化させ、細胞増殖及び分化、細胞形態の維持、細胞骨格の構築、アポトーシス及び細胞の癌化などに関与する。ＥＲＫは細胞の増殖、分化及び生存を調節しており、数種の成長因子（ＥＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦなど）の下流タンパクである。ＥＲＫ及びそのシグナル経路は、腫瘍の侵襲及び転移過程でシグナルの仲介及び増幅作用を示す。一方では成長因子、マイトジェン、環境刺激などからの大量のシグナルを受け、もう一方ではＥＲＫシグナルカスケード反応により、ＡＰ−１、ＮＦ−κＢなどの該転写因子に作用し、遺伝子発現を制御する。多くの人の癌（口腔癌、黒色腫、乳腺癌など）において、ＥＲＫの過剰な活性化を発見することができる。その典型的な経路はＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＲ／ＥＲＫである。
【００１４】
さらに留意すべきことは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ及びＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル経路間に、複数のクロストーク現象が存在して複雑な相互作用を形成することである。この２つの経路間の相互作用は相互に抑制することも、相互に活性化することもできる。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ及びＥＲＫ／ＭＡＰＫシグナル経路は、腫瘍細胞の成長、増殖、分化、侵襲、転移及び薬剤耐性に対して重要な作用を有し、その機能及び制御機構は異常に複雑である。このうちの１つの経路を抑制しても、理想的な治療効果を得ることができず、主な原因はそれらの間に形成される複雑なクロストークの関係にある。
【００１５】
ｍＴＯＲ阻害剤、例えばラパマイシン及びその誘導体「ｒａｐａｌｏｇ」は、ｍＴＯＲＣ１を特異的に抑制することができ、数種の腫瘍細胞の成長に対して濃度及び時間依存的阻害作用を有する。化学療法薬に対する腫瘍細胞の感受性を高めることができ、アポトーシスを誘導し、さらに相乗効果が生じる。
【００１６】
カリマイシン（Ｃａｒｒｉｍｙｃｉｎ）はバイトスピラマイシン（Ｂｉｔｅｓｐｉｒａｍｙｃｉｎ）、Ｓｈｅｎｇｊｉｍｙｃｉｎとも呼ばれる。中国医科院生物技術研究所及び本出願人が協力し、遺伝子組み換え技術によりカルボマイシン産生菌の４’’イソバレリルトランスフェラーゼ遺伝子（４’’−ｏ−ａｃｙｌ−ｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅ）をスピラマイシン産生菌中にクローニングし、スピラマイシンの４’’−ＯＨを一定方向でアシル化し、４’’位にイソバレリル基側鎖を付加して形成した、４’’イソバレリルスピラマイシンを主要成分とした新規の抗生物質である。
【００１７】
【化１】
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【００１８】
カリマイシンは、数種のスピラマイシン誘導体からなり、主要な活性成分であるイソバレリルスピラマイシン（Ｉ＋ＩＩ＋ＩＩＩ）の総含量は６０％以上、アシル化スピラマイシンの総含量は８０％以上であり、薬学的に許容可能な薬物組成物である。中心構造は１６員環のマクロライド環で、１分子のホロサミン、１分子のミカミノース及び１分子のミカロースと結合してなる。その主要成分のイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩが、スピラマイシンの構造と異なる部分は、ミカロースの４’’位に結合するのがイソバレリル基であり、ヒドロキシ基でないことである。化学構造は式（１）に示す通りであり、全部で１０余りの成分を含む。現在、カリマイシン製品の組成基準はイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ≧３０％、イソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩの比率の総和≧６０％、総アシル化スピラマイシンの比率≧８０％、その他不明な組成の総和≦５％である。
【００１９】
カリマイシンは１６員環マクロライド系抗生物質に属し、活性基のカルボキシル基、アルコキシ基、エポキシ基、ケトン基及びアルデヒド基、並びに１対の共役したＣ＝Ｃを有し、分子量は約８８４〜９８２である。似た化学構造を有するため、カリマイシン及びマクロライド系抗生物質は多くの共通性を有する。つまり、エステル類、アセトン、クロロホルム、アルコール類など多くの有機溶媒に易溶であり、石油エーテルに微溶であり、水に難溶である。分子構造中に２つのジメチルアミン基を含んで弱アルカリ性を呈し、酸性水溶液に易溶である。溶解度が温度の上昇に伴って低下する「負の溶解性」の性質を有する。カリマイシンの主要成分であるイソバレリルスピラマイシンの４’’位の炭素鎖は比較的長く、親水性が劣るため、水への溶解度はスピラマイシン及び４’’−アセチルスピラマイシンより低い。
【００２０】
カリマイシンは白色の非結晶粉末であり、吸湿性を少し有し、比旋光度は約−８０．８°、紫外線の最大吸収波長は２３１〜２３２ｎｍである。それ自体に弱い蛍光発色基を持ち、濃硫酸または塩酸で紫色を呈し、強い紫色の蛍光を発生させる。２３１〜２３２ｎｍ部分に最大吸光度を有する。該薬は親油性が良好で、組織浸透力が高く、内服吸収が速く、体内維持時間が長く、持続的な抗生物質持続効果を有する。薬効及び化学的立体配座の関係に基づくと、マクロライド系抗生物質の４’’位をアシル化すると、その親油性及び体内活性が上昇し、体内の抗菌活性及び臨床治療効果はいずれも顕著に上昇する。さらに抗生物質の体内における安定性は、４’’ヒドロキシエステルの炭素鎖の伸長に伴って高くなり、すなわちイソバレリルスピラマイシン＞ブチリルスピラマイシン＞プロピオニルスピラマイシン＞アセチルスピラマイシンである。
【００２１】
予備的な体内外での薬力学試験は、該薬が多くのＧ陽性菌に対して比較的良好な抗菌活性を有するだけでなく、一部のＧ陰性菌にも一定の作用を有することを示している。各技術指標はアジスロマイシン、エリスロマイシン、アセチルスピラマイシン、ミデカマイシンより明らかに優れており、特に肺炎マイコプラズマに対する抗菌活性が最も高い。エリスロマイシン耐性菌、淋菌、肺炎球菌、黄色ブドウ球菌、緑膿菌、インフルエンザ菌、インフルエンザ菌、バクテロイデスフラジリス、レジオネラ菌、不活性の桿菌及びウェルシュ菌に対しても一定の抗菌活性を有し、エリスロマイシンに臨床的耐性を有する黄色ブドウ球菌に対してわずかな交差耐性を有する。カリマイシンは、主にグラム陽性菌感染症、特に上気道感染症の治療に用いられ、泌尿器系の感染などに用いられ得る。
【００２２】
薬物動態学の研究結果は、カリマイシン中に活性の有効成分を有し、主にイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩであることを表している。カリマイシンが体内に侵入すると、すぐにスピラマイシンに代謝され、親薬物のイソバレリルスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ及び活性代謝物のスピラマイシンＩ、ＩＩ、ＩＩＩのＡＵＣ０−ｔの総和で計算すると、その内服の絶対的バイオアベイラビリティの平均は９１．６％である。文献では、スピラマイシンを人が内服したときの絶対的バイオアベイラビリティは３０〜４０％（Ｆｒｙｄｍａｎ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８８，２２（ｓｕｐｐｌ  Ｂ）：９０−１０３）であると報告されている。イソバレリルスピラマイシンの構造が活性成分のスピラマイシンのバイオアベイラビリティを明らかに改善したことを説明している。カリマイシンを１度服用するとゆっくりと消失し、Ｔ１／２βは２３〜２７時間の間である。
【００２３】
本出願人は最近の研究で、カリマイシン、カリマイシンにおける単一の活性成分または組合せが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路のタンパクを抑制することができることを予期せず発見した。ｍＴＯＲ阻害剤として使用することができ、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路関連疾患に対して治療効果を有し、重要な経済的及び社会的効果及び利益を備える。
【００２４】
このことを考慮して、特に本発明を示す。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００２５】
【非特許文献１】Ｆｒｙｄｍａｎ  ＡＭ  ｅｔ  ａｌ  Ｊ  Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９８８，２２（ｓｕｐｐｌ  Ｂ）：９０−１０３
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２６】
本発明が解決しようとする技術的問題は既存技術の不足を克服し、ｍＴＯＲ阻害剤、薬物組成物及びその応用を提供することである。本発明で提供するｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲ経路関連疾患の細胞に対して明らかな抑制作用を有し、ｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物の調製におけるｍＴＯＲ阻害剤の応用、並びに臨床的普及のために理論的根拠を提供し、さらに重要な経済的及び社会的効果及び利益を備える。
【課題を解決するための手段】
【００２７】
上記技術的問題を解決するため、本発明が採用する技術案の基本的な構想は以下の通りである。
【００２８】
本発明の第１の目的はｍＴＯＲ阻害剤を提供することであり、前記ｍＴＯＲ阻害剤はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、またはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。
【００２９】
カリマイシンは数種の活性成分の混合物であり、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの３種の活性成分を含む以外に、その他の不純物も含む。
【００３０】
カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの４種は、いずれもｍＴＯＲ阻害剤として単独で使用することができる。イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩは、任意に組み合わせて使用することもできる。
【００３１】
さらなる案として、前記ｍＴＯＲ阻害剤はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるタンパクのアロステリック阻害剤または触媒阻害剤である。
【００３２】
さらなる案として、前記触媒阻害剤はキナーゼ阻害剤であり、例えばＡＫＴ阻害剤である。
【００３３】
さらなる案として、前記ｍＴＯＲ阻害剤はｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の活性化を抑制する。
【００３４】
さらなる案として、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制する。
【００３５】
さらなる案として、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲシグナル経路に作用する抗腫瘍薬、及び／または糖尿病治療薬、及び／またはアルツハイマー治療薬、及び／または老化を遅らせる薬である。
【００３６】
さらなる案として、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲシグナル経路に作用する抗腫瘍薬であり、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制する。
【００３７】
さらなる案として、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲシグナル経路に作用する糖尿病治療薬であり、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制する。
【００３８】
さらなる案として、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲシグナル経路に作用するアルツハイマー治療薬であり、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制する。
【００３９】
さらなる案として、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ｍＴＯＲシグナル経路に作用する老化を遅らせる薬であり、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制する。
【００４０】
本発明の第２の目的は薬物組成物を提供することであり、前記薬物組成物は上記のいずれか１つの案のｍＴＯＲ阻害剤及び薬学的に許容可能な担体を含む。
【００４１】
好ましくは、ｍＴＯＲ阻害剤の用量範囲は１〜１００００ｍｇ／ｋｇ；好ましくは１０〜５０００ｍｇ／ｋｇ、好ましくは５０〜１０００ｍｇ／ｋｇ；より好ましくは１００〜５００ｍｇ／ｋｇである。
別の案として、薬物組成物は第１活性成分及び第２活性成分を含む。前記第１活性成分は上記のようなｍＴＯＲ阻害剤を含み、前記第２活性成分はｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物を含む。
【００４２】
さらに、合剤を製造するとき、第１活性成分及び第２活性成分の用量比は１〜９９：９９〜１、好ましくは５〜９５：９５〜５、より好ましくは１０〜９０：９０〜１０、さらに好ましくは２０〜８０：８０〜２０である。
【００４３】
さらなる案として、前記薬物組成物は薬学的に許容可能ないかなる剤形も含む。好ましくは、剤形は散薬、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、液剤、乳剤、懸濁剤などを含む。
【００４４】
本発明において、前記ｍＴＯＲ阻害剤における活性成分のイソバレリルスピラマイシンＩは、既存技術の方法に基づいて分離、調製することができる。例えば、中国特許出願公開第１０１７８５７７８号明細書の実施例１の方法に基づいて分離、調製する。
【００４５】
本発明の第３の目的は配合剤を提供することであり、前記配合剤は第１薬剤を含み、前記第１薬剤は上記のようなｍＴＯＲ阻害剤または上記のような薬物組成物を含む。
【００４６】
さらなる案として、前記配合剤は第２薬剤も含む。
【００４７】
さらなる案として、前記第２薬剤はｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物を含む。
【００４８】
該案におけるｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物は、これらの疾患を治療する主な薬物を指す。例えば糖尿病に対して、第２薬剤はインスリン及びその類似体、スルホニルウレア系分泌促進剤、メトホルミン類、α−グルコシダーゼ阻害剤、チアゾリジンジオン系誘導体増感剤、アントラニル酸系誘導体分泌促進剤、ＧＬＰ−１受容体アゴニスト、ＤＰＰ−４酵素阻害剤及び漢方製剤でよい。
【００４９】
併用投与するとき、第１薬剤及び第２薬剤の用量比は１〜９９：９９〜１、好ましくは５〜９５：９５〜５、より好ましくは１０〜９０：９０〜１０、さらに好ましくは２０〜８０：８０〜２０である。
【００５０】
併用投与するとき、第１薬剤及び第２薬剤の投薬順は、先に第１薬剤を使用しても、先に第２薬剤を使用しても、２つの薬剤を同時に使用してもよい。
本発明の第４の目的は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む抗腫瘍薬を提供することである。前記ｍＴＯＲ阻害剤はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、またはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。
【００５１】
好ましくは、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるタンパクのアロステリック阻害剤または触媒阻害剤である。
【００５２】
好ましくは、前記触媒阻害剤はキナーゼ阻害剤である。
【００５３】
好ましくは、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制する。
【００５４】
腫瘍と密接に関係する複数の細胞機能、例えば細胞増殖、細胞周期、タンパク合成、細胞遊走などは、いずれもｍＴＯＲの調節に制御される。現在、すでに乳腺癌、前立腺癌、肺癌など多くの腫瘍で、ｍＴＯＲシグナル経路の調節異常が発見されている。カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、またはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せをｍＴＯＲ阻害剤とし、ｍＴＯＲＣ１の活性を抑制し、さらにはその下流で、ｍＴＯＲＣ１に制御されるｐ７０Ｓ６Ｋ、ＡＴＧ１３、４ＥＢＰ１、ＨＩＦ−１、ＰＧＣ−１α、ＰＰＡＲｒなどを含む標的分子に影響を及ぼす。ｍＴＯＲＣ１の活性が低下するとき、ｐ７０Ｓ６Ｋはネガティブ調節され、細胞成長が阻害されるが、ＡＴＧ１３は阻害されず、これにより細胞のアポトーシス及びオートファジー作用が促進される。本発明の阻害剤は細胞周期を抑制することができる以外に、アポトーシス及びオートファジー作用を介して腫瘍細胞の死亡を引き起こすこともできる。
【００５５】
本発明の第５の目的は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む糖尿病治療薬を提供することである。前記ｍＴＯＲ阻害剤はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、またはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。
【００５６】
好ましくは、前記ｍＴＯＲ阻害剤はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるタンパクのアロステリック阻害剤または触媒阻害剤である。
【００５７】
好ましくは、前記触媒阻害剤はキナーゼ阻害剤である。
【００５８】
好ましくは、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制する。
【００５９】
他に、ｍＴＯＲは異なる機能複合体（ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２）を形成して、インスリンシグナル経路の活性を制御することができ、膵島β細胞の発育、アポトーシス及びインスリン分泌に影響を及ぼす。糖代謝に密接に関係するｇｈｒｅｌｉｎ／ｎｅｓｆａｔｉｎ−１などのホルモンの分泌を調節し、骨格筋、脂肪などの末梢器官の糖摂取など、数種の経路における血糖の制御に影響を及ぼす。ｍＴＯＲＣ１のインスリン感受性に対する作用機構は複雑であり、一方では成長因子が典型的なＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル経路によりｍＴＯＲを活性化することができ、もう一方ではｍＴＯＲ／Ｓ６Ｋ１シグナルがネガティブフィードバック機構によりインスリン感受性を低下させることができる。本発明のｍＴＯＲ阻害剤はｍＴＯＲ及びＳ６Ｋ１の過剰なリン酸化を抑制し、インスリン抵抗を逆転させた状態でＩＲＳのセリンをリン酸化し、脂肪細胞の糖吸収を高め、脂肪の蓄積を抑制する。
【００６０】
本発明の第６の目的は、ｍＴＯＲ阻害剤を含むアルツハイマー治療薬を提供することである。前記ｍＴＯＲ阻害剤はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、またはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。
【００６１】
好ましくは、前記ｍＴＯＲ阻害剤はＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるタンパクのアロステリック阻害剤または触媒阻害剤である。
【００６２】
好ましくは、前記触媒阻害剤はキナーゼ阻害剤である。
【００６３】
好ましくは、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクの１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制する。
【００６４】
神経系において、ｍＴＯＲの過剰な活性化により脳腫瘍が生じることがある。他に、アルツハイマー病（ＡＤ）、パーキンソン病、ハンチントン病などいくつかの神経変性疾患において、ｍＴＯＲシグナル経路に異常が存在することを多くのエビデンスが示している。これらの疾患には共通した特徴が１つ存在し、つまり大脳中の一定領域に大量のニューロン欠損が存在する。これはｍＴＯＲ経路の異常と関係する可能性がある。ＡＤは、主に老年期に発症する進行性認知症を主な特徴とする神経変性疾患である。ＡＤの最も典型的な病理的特徴は、ニューロン外のアミロイドβ−タンパク（β−ａｍｙｌｏｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎ、Ａβ）が凝集して老人斑が形成され、ニューロン内の過剰にリン酸化したタンパクから神経原線維変化が形成され、さらにニューロンの欠損により、臨床的に学習及び記憶機能の変化が現れる。ＡＤの発病機序は非常に複雑であり、現在の研究では、ｍＴＯＲ経路に２種の異なる変化（上方制御／下方制御）が出現する。ｍＴＯＲ経路の下方制御は神経毒性作用を有するいくつかのタンパク（例えばｔａｕタンパク）の合成を減少させることができるため、ｍＴＯＲの阻害剤は神経変性疾患を治療する有効な薬物となる可能性がある。
【００６５】
本発明の第７の目的は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む老化を遅らせる薬を提供することである。前記ｍＴＯＲ阻害剤はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、またはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。
【００６６】
好ましくは、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるタンパクのアロステリック阻害剤または触媒阻害剤である。
【００６７】
好ましくは、前記触媒阻害剤はキナーゼ阻害剤である。
【００６８】
好ましくは、前記ｍＴＯＲ阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるＰＩ３Ｋタンパク、ＡＫＴタンパク、ｍＴＯＲタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパク、４ＥＢＰ１タンパクにおける１つまたは複数の活性化を少なくとも抑制する。
【００６９】
ｍＴＯＲ／Ｓ６Ｋシグナル経路を抑制して老化を遅らせることができ、さらにミトコンドリアの生成を増加、及び呼吸鎖活性を改善することができ、小胞体ストレスを軽減し、オートファジー作用を促進して細胞内のダメージを受けた構造を排除する。ｍＴＯＲ阻害剤はｍＴＯＲ／Ｓ６Ｋシグナル経路を抑制して、オートファジー関連シグナル経路を顕著に増強させることができる。ｍＴＯＲＣ１が抑制されると、オートファジー作用が増強し、代謝副産物を排除する能力がこれに伴って増強し、最終的に寿命が延びる。他に、ｍＴＯＲはミトコンドリアの酸化呼吸機能を維持し、ＰＰＡＲｒ及びＰＧＣ１レベルを上方制御することにより、ミトコンドリア関連遺伝子の発現、ミトコンドリアの生成及び組織の酸素消費の増加を促進する。ｍＴＯＲＣ１が抑制されると、保護機能を示す遺伝子群を活性化することができ、ミトコンドリアの呼吸を制限することにより、活性酸素による損傷を減少させ、これにより人体の寿命を延長させる。
【００７０】
本発明の第８の目的は、ｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物の調製における上記ｍＴＯＲ阻害剤または薬物組成物または配合剤の応用を提供することである。
さらなる案として、前記カリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩは、ｍＴＯＲを標的とする方式により、代謝微小環境を制御して、ｍＴＯＲ経路関連疾患を抑制する。
【００７１】
さらなる案として、ｍＴＯＲ経路関連疾患は、加齢に伴う疾患、移植拒絶関連の疾患、慢性炎症性疾患、糖原病関連の疾患、ハンチントン病、悪性腫瘍、転移癌、全身性エリテマトーデス、炎症及び免疫活性化関連の疾患、白血球減少の関連疾患、貧血症、血小板減少症、ステントコーティングに関連する疾患、腎不全、肥満、糖尿病、非アルコール性脂肪肝関連疾患、疾患による体重低下、多嚢胞性腎、パーキンソン病及び線維症の少なくとも１つから選択される。
【００７２】
さらなる案として、加齢に伴う疾患は、サルコペニア、皮膚委縮症、筋ジストロフィ、脳萎縮、アテローム性動脈硬化、動脈硬化、肺気腫、骨粗しょう症、骨関節炎、高血圧、勃起不全、認知症、アルツハイマー病、白内障、加齢性黄斑変性、前立腺癌、脳卒中、寿命の低下、腎機能障害及び加齢性難聴、老化に伴う移動障害、認知機能の後退、記憶障害、腱硬直、心肥大及び収縮、拡張機能障害などの心機能障害、免疫機能の老化から選択される。
【００７３】
さらなる案として、前記線維症は肝線維症、心筋線維症、心血管線維症、肺線維症、膵線維症、腎線維症または脾線維症を含む。
【００７４】
さらなる案として、前記悪性腫瘍は、リンパ系の造血腫瘍、骨髄系造血腫瘍、間葉由来腫瘍、中枢及び末梢神経系の腫瘍、黒色腫、精上皮腫、奇形腫、骨肉腫、色素性乾皮症、ケラトアカントーマ、甲状腺濾胞癌及びカポジ肉腫から選択される；
【００７５】
好ましくは、リンパ系の造血腫瘍は、白血病、急性リンパ性白血病、急性リンパ芽球性白血病、Ｂ−細胞リンパ腫、Ｔ−細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、骨髄腫及びバーキットリンパ腫から選択され；骨髄系造血腫瘍は急性及び慢性骨髄性白血病、骨髄異形成症候群及び前骨髄球性白血病を含み；間葉由来腫瘍は線維肉腫及び横紋筋肉腫を含み；中枢及び末梢神経系の腫瘍は星状細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫及び神経鞘腫を含む。
【００７６】
さらなる案として、悪性腫瘍はさらに膀胱癌、乳腺癌、結腸癌、中皮腫、腎臓癌、肝癌、肺癌、頭頚部癌、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓腺癌、胃癌、リンパ腫、子宮頸癌、結腸癌、甲状腺癌、前立腺癌、皮膚癌、口腔癌を含む。
【００７７】
さらなる案として、ｍＴＯＲ阻害剤が抑制する悪性腫瘍細胞は、ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２またはマウス肝癌細胞Ｈ２２、ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０及びＨ１２９９、ヒト腎淡明細胞癌細胞７８６−Ｏ、ヒト腎細胞癌細胞７６９−Ｐ、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１、ヒト神経膠芽腫細胞Ａ１７２、ヒト組織リンパ腫細胞Ｕ９３７、ヒト子宮頸癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト膵臓腺癌細胞ＰＡＮＣ−１、ヒト食道癌細胞ＴＥ−１、ヒト胃腺癌細胞ＳＧＣ７９０１、ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９、ヒト前骨髄球性白血病細胞ＨＬ−６０を含む。
【００７８】
最も好適には、ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９が引き起こす肺癌である。
【００７９】
本発明は、さらに生体内試験により、イソバレリルスピラマイシンＩがマウス肝癌細胞Ｈ２２、非小細胞肺癌細胞Ａ５４９の成長に対して明らかな阻害作用を有することを明らかにする。
【００８０】
本発明で使用するｍＴＯＲ阻害剤に基づいて行う治療は、１つまたは複数のその他の癌治療と組み合わせて行うことができる。前記その他の癌治療は外科治療、放射線療法（例えばγ−放射、中性子線治療、電子線治療、陽子線治療、近接照射治療（ｂｒａｃｈｙｔｈｅｒａｐｙ）及び全身放射性同位体治療など）、内分泌療法、生物学的反応修飾物質療法（例えば、このうちのいくつかの名称はインターフェロン、インターロイキン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）である）、温熱療法、凍結療法、緩和薬（例えば抗嘔吐剤）及びその他の癌化学療法薬の有害反応を含む。前記その他の薬物は本発明で提供するｍＴＯＲ阻害剤を使用する前、使用する過程または使用した後に投与することができ、さらに本文で提供するｍＴＯＲ阻害剤と同じまたは異なる製剤、投与経路及び用量で投与する。
【００８１】
本発明のｍＴＯＲ阻害剤及び薬物組成物は、その他の薬物（例えばインヒビン、鎮痛剤、制吐薬、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦなど）、及び／またはその他の適した化学療法薬と共に使用して副作用を緩和することができる。前記その他の薬物は以下の１つまたは複数を含むが、これらに限定されない。つまり抗腫瘍アルキル化剤または挿入剤（例えば窒素マスタード、クロラモブシル、シクロホスファミド、メルファラン及びイホスファミド）；代謝拮抗薬（例えばメトトレキサート）；プリン拮抗薬またはピリミジン拮抗薬（例えば６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル、シタラビン、カペシタビン及びゲムシタビン）；紡錘体毒（例えばビンブラスチン、ビンクリスチン、ビノレルビン及びパクリタキセル）；ポドフィロトキシン（例えばエトポシド、イリノテカン、トポテカン）；抗生物質（例えばドキソルビシン、ブレオマイシン及びマイトマイシン）；ニトロソウレア（例えばカルムスチン、ロムスチン）；無機イオン（例えばシスプラチン、カルボプラチン、オキサリプラチンまたはｏｘｉｐｌａｔｉｎ）；酵素（例えばアスパラギナーゼ）；ホルモン（例えばタモキシフェン、酢酸リュープロレリン、フルタミド及びメゲストロール）；プロテアソーム阻害剤（例えばＶｅｌｃａｄｅ、その他のプロテアソーム阻害剤または例えばＩｋＫ阻害剤を含むその他のＮＦ−ｋＢ阻害剤）；その他のキナーゼ阻害剤（例えばＳｒｃ、ＢＲＣ／Ａｂｌ、ｋｄｒ、ｆｌｔ３、ａｕｒｏｒａ−２及びグリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ−３）、ＥＧＦ−Ｒキナーゼ（例えばＩｒｅｓｓａ、Ｔａｒｃｅｖａなど）、ＶＥＧＦ−Ｒキナーゼ、ＰＤＧＦ−Ｒキナーゼなど）；癌に関わる受容体またはホルモンの可溶性受容体またはその他の受容体に拮抗する抗体（含まれる受容体はＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ２、ＶＥＧＦＲ、ＰＤＧＦＲ及びＩＧＦ−Ｒである。例えばトラスツズマブ（またはその他の抗Ｈｅｒ２抗体）、ベバシズマブ、セツキシマブなどの薬物）などである。
【００８２】
その他の治療薬の例は、アロプリノール、アレムツズマブ、アルトレタミン、アミフォスチン、ｎａｓｔｒｏｚｏｌｅ、前立腺特異的膜抗原の抗体（例えばＭＬＮ−５９１、ＭＬＮ５９１ＲＬ及びＭＬＮ２７０４）、三酸化二ヒ素、ベキサロテン、ブレオマイシン、ブスルファン、カペシタビン、Ｇｌｉａｄｅｌ  Ｗａｆｅｒ、セレコキシブ、クロラモブシル、シスプラチン−エピネフリンゲル、クラドリビン、シタラビンリポソーム、ダウノルビシンリポソーム、ダウノルビシン、ダウノマイシン、デクスラゾキサン、ドセタキセル、ドキソルビシン、Ｅｌｌｉｏｔｔ  Ｂ溶液、エピルビシン、エストラムスチン、リン酸エトポシド、エトポシド、エキセメスタン、フルダラビン、５−フルオロウラシル、フルベストラント、ゲムシタビン、ゲムツズマブ−オゾガマイシン、酢酸ゴセレリン、ヒドロキシカルバミド、イダルビシン、イダルビシン、デメトキシダウノルビシン、イホスファミド、メシル酸イマチニブ、イリノテカン（またはそれに代わるトポイソメラーゼ阻害剤、ＭＬＮ５７６（ＸＲ１１５７６）のような抗体を含む）、レトロゾール、フォリン酸、レバミゾールフォリン酸、ダウノルビシンリポソーム、メルファラン、Ｌ−ＰＡＭ、メスナ、メトトレキサート、メトキサレン、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ＭＬＮ５１８またはＭＬＮ６０８（若しくはｆｌｔ−３受容体型チロシンキナーゼ、ＰＤＦＧ−Ｒ、ｃ−ｋｉｔその他の阻害剤）、ｉｔｏｘａｎｔｒｏｎｅ、パクリタキセル、ペガデマーゼ、ペントスタチン、ポルフィマーナトリウム、リツキシマブ（  ）、タルク、タモキシフェン、テモゾロミド、テニポシド、ＶＭ−２６、トポテカン、トレミフェン、２Ｃ４（またはＨＥＲ２が介在するシグナル伝達を阻害するその他の抗体）、トレチノイン、レチノイン酸、バルルビシン、ビノレルビンまたはパミドロネートまたはゾレドロネート（ｚｏｌｅｄｒｏｎａｔｅ）またはジホスホネート化合物を含む。
【００８３】
本発明におけるｍＴＯＲ阻害剤による治療は、細胞毒性剤の１つまたは複数と組み合わせて共に使用し、治療案の一部分とすることができる。細胞毒性剤の組合せは、ＣＨＯＰＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）；ＣＨＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン）；ＣＯＰ（シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン）；ＣＡＰ−ＢＯＰ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、プロカルバジン、ブレオマイシン、ビンクリスチン及びプレドニゾン）；ｍ−ＢＡＣＯＤ（メトトレキサート、ブレオマイシン、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、デキサメタゾン及びフォリン酸）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＭＯＰＰ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、フォリン酸、ナイトロミン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）；ＰｒｏＭＡＣＥ−ＣｙｔａＢＯＭ（プレドニゾン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、エトポシド、フォリン酸、シタラビン、ブレオマイシン及びビンクリスチン）；ＭＡＣＯＰ−Ｂ（メトトレキサート、ドキソルビシン、シクロホスファミド、ビンクリスチン、プレドニゾン、ブレオマイシン及びフォリン酸）；ＭＯＰＰ（ナイトロミン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）；ＡＢＶＤ（ドキソルビシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン及びダカルバジン）；ＭＯＰＰ（ナイトロミン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）及びＡＢＶ（ドキソルビシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン及びビンブラスチン）を交互に使用する；ＭＯＰＰ（ナイトロミン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びプロカルバジン）及びＡＢＶＤ（ドキソルビシン／ドキソルビシン、ブレオマイシン、ビンブラスチン及びダカルバジン）を交互に使用する；ＣｈｌＶＰＰ（クロラモブシル、ビンブラスチン、プロカルバジン及びプレドニゾン）；ＩＭＶＰ−１６（イホスファミド、メトトレキサート及びエトポシド）；ＭＩＭＥ（ミトグアゾン、イホスファミド、メトトレキサート及びエトポシド）；ＤＨＡＰ（デキサメタゾン、高用量ｃｙｔａｒｉｂｉｎｅ及びシスプラチン）；ＥＳＨＡＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、高用量シタラビン及びシスプラチン）；ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾン及びブレオマイシン）；ＣＡＭＰ（ロムスチン、ミトキサントロン、シタラビン及びプレドニゾン）；ＣＶＰ−１（シクロホスファミド、ビンクリスチン及びプレドニゾン）；ＥＳＨＯＰ（エトポシド、メチルプレドニゾロン、高用量シタラビン、ビンクリスチン及びシスプラチン）；ＥＰＯＣＨ（大容量のシクロホスファミド及び経口プレドニゾンと共に、エトポシド、ビンクリスチン及びドキソルビシンを９６時間使用する）；ＩＣＥ（イホスファミド、シクロホスファミド及びエトポシド）、ＣＥＰＰ（Ｂ）（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン、プレドニゾン及びブレオマイシン）、ＣＨＯＰ−Ｂ（シクロホスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、プレドニゾン及びブレオマイシン）、ＣＥＰＰ−Ｂ（シクロホスファミド、エトポシド、プロカルバジン及びブレオマイシン）、及びＰ／ＤＯＣＥ（エピルビシンまたはドキソルビシン、ビンクリスチン、シクロホスファミド及びプレドニゾン）から選択される。
【発明の効果】
【００８４】
上記技術案を採用すると、本発明は既存技術と比較して以下の有益な効果を有する。
【００８５】
１、本発明のｍＴＯＲ阻害剤はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの１つ、またはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種の組合せを含む。上記各活性成分は、それぞれまたは組み合わせてＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるいくつかのタンパク活性に対して抑制作用を示すことができる。従って、本発明のｍＴＯＲ阻害剤はｍＴＯＲ経路関連疾患の細胞に対して明らかな抑制作用を有し、ｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物の調製における応用、並びに臨床的普及のために理論的な根拠を提供している。
【００８６】
２、本発明のｍＴＯＲ阻害剤は特に比較的良好な抗腫瘍作用を有し、特に乳腺癌、肝癌、肺癌、リンパ腫、子宮頸癌、前立腺癌、結腸癌または白血病などの腫瘍に対して、比較的良好な治療効果を有する。ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路におけるタンパク活性を抑制することにより、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。抗腫瘍薬の調製における該ｍＴＯＲ阻害剤の応用、及びその臨床的普及のために理論的な根拠を提供し、さらに重要な経済的及び社会的効果及び利益を備える。
以下、図を組み合わせて本発明の具体的な実施方式について、さらに詳細に記載する。
図は本発明の一部分とし、本発明をさらに理解するために使用される。本発明の概要的実施例及びその説明は本発明を説明するのに用いるが、本発明を不当に限定しない。以下の記載において図はいくつかの実施例に過ぎず、当業者が、創造的労働を行わない前提で、これらの図に基づいてその他の図を得ることができることは明らかである。
【図面の簡単な説明】
【００８７】
【図１】図１は、ウェスタンブロッティング法でｐ−ＰＩ３ｋ／ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＡＫＴ／ＡＫＴ、ｐ−ｍＴＯＲ／ｍＴＯＲ、ｐ−Ｓ６Ｋ１／Ｓ６Ｋ１、ｐ−４ＥＢＰ１／４ＥＢＰ１、β−ａｃｔｉｎなどＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路関連タンパク及びリン酸化タンパクレベルを測定した定量結果である。このうち、Ａ１−Ａ２はｐ−ＰＩ３ｋ／ＰＩ３Ｋの結果、Ｂ１−Ｂ２はｐ−ＡＫＴ／ＡＫＴの結果、Ｃ１−Ｃ２はｐ−ｍＴＯＲ／ｍＴＯＲの結果、Ｄ１−Ｄ２はｐ−Ｓ６Ｋ１／Ｓ６Ｋ１の結果、Ｅ１−Ｅ２はｐ−４ＥＢＰ１／４ＥＢＰ１の結果である。
【図２】図２は、ウェスタンブロッティング法でｐ−ＰＩ３ｋ／ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＡＫＴ／ＡＫＴ、ｐ−ｍＴＯＲ／ｍＴＯＲ、ｐ−Ｓ６Ｋ１／Ｓ６Ｋ１、ｐ−４ＥＢＰ１／４ＥＢＰ１、β−ａｃｔｉｎなどＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路関連タンパクの発現レベルを測定した結果である。
【図３】図３は、カリマイシンでＡ５４９細胞を２４ｈ及び４８ｈ処理した後の成長抑制の結果である。
【図４】図４は、カリマイシンでＡ５４９細胞を２４ｈ及び４８ｈ処理した後、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル経路関連タンパクの発現レベルをウェスタンブロッティング法で測定した結果である。
【図５】図５は、カリマイシンで処理したＡ５４９細胞のＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル経路関連タンパクの発現レベルをウェスタンブロッティング法で定量した結果であり；Ａ〜Ｅはそれぞれｐ−ＰＩ３ｋ／ＰＩ３Ｋ、ｐ−ｍＴＯＲ／ｍＴＯＲ、ｐ−４ＥＢＰ１／４ＥＢＰ１、ｐ−ＡＫＴ／ＡＫＴ、ｐ−Ｓ６Ｋ１／Ｓ６Ｋ１の結果である。
【図６】図６は、カリマイシンによるＡ５４９細胞のオートファジーの誘導をフローサイトメータで測定した結果であり、誘導後、ＭＤＣ染色の陽性率は増加する。このうち図６ａは２４ｈの結果、図６ｂは４８ｈの結果である。
【図７】図７は、カリマイシンでＡ５４９細胞を２４ｈ及び４８ｈ処理した後、Ｐ６２及びＬＣ３の発現レベルをウェスタンブロッティング法で測定した定量測定結果である。
【図８】図８は、オートファジー阻害剤３−ＭＡを添加した後のＡ５４９細胞に対するカリマイシンの成長抑制の結果である。
【図９】図９は、２４ｈ及び４８ｈ処理した後の細胞形態の変化を位相差顕微鏡で観察した結果である。
【図１０】図１０は、カリマイシンでＡ５４９細胞を２４ｈ及び４８ｈ処理し、ＡＶ−ＰＩ染色した後のフローサイトメトリーによる測定結果である。
【図１１】図１１は、カリマイシンでＡ５４９細胞を２４ｈ及び４８ｈ処理した後、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔでｐｒｏ−ｃａｓｐａｓｅ３、ｃａｓｐａｓｅ３、ＰＡＲＰタンパクレベルを測定した結果である。
【図１２】図１２は、Ａ５４９細胞内のｃａｓｐａｓｅ３の酵素活性を測定した結果である。
【図１３】図１３は、異なる濃度のカリマイシンでＡ５４９細胞を２４時間及び４８時間処理した後、ＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ−Ａタンパクレベルを定量分析した結果である。
【図１４】図１４は、異なる濃度のカリマイシンでＡ５４９細胞を２４時間及び４８時間処理した後、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ｐ−ＥＲＫ／ＥＲＫタンパクレベルを定量分析した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００８８】
説明する必要があることは、これらの図及び記載が本発明の構想範囲を制限することを目的とはせず、特定の実施例を参考にすることにより、当業者に本発明の概念を説明することである。
【００８９】
本発明の実施例の目的、技術案及び利点をさらに明確にするため、以下、本発明の実施例中の図を組み合わせて、実施例中の技術案について明確、完全に記載する。以下の実施例は本発明の説明に用いるが、本発明の範囲を制限するものではない。
【実施例１】
【００９０】
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ錠
規格：２００ｍｇ／３５０ｍｇ 
裸錠の処方：
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ                    ２００ｇ
微結晶セルロース                          １１０ｇ
カルボキシメチルデンプンナトリウム        ２２ｇ
ポビドンＫ３０（５％）                      １５ｇ
ステアリン酸マグネシウム                  ３ｇ        
製造                                    １０００錠
コーティング液の処方：
オパドライＩＩ      ２１ｇ
蒸留水              適量      
製造              １０５ｍｌ
【００９１】
調製工程：
裸錠の調製：主薬及び添加剤をそれぞれ１００メッシュに通し、処方量のイソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、微結晶セルロース及び処方の１／２量のカルボキシメチルデンプンナトリウムを均一に混合する。その後５％ポビドンＫ３０水溶液を添加して練合物を作製し、１８メッシュで造粒し、湿潤顆粒を６０℃の通風条件下で２ｈ乾燥させる。乾燥後１８メッシュで整粒し、さらに処方の１／２量のカルボキシメチルデンプンナトリウム及びステアリン酸マグネシウムを添加して均一に混合した後、直径１１ｍｍの臼で打錠すると、重量が３５０ｍｇ、硬度が６．５ｋｇの薬物含有裸錠が得られる。
【００９２】
コーティング液の調製：調製容器中に必要なオパドライＩＩ（白色）を量り、必要量の水を添加する。何回かに分けて添加し、すべて添加した後、撹拌速度を低下させて渦を消失させ、引き続き３０ｍｉｎ撹拌して得られる。
【００９３】
フィルムコーティング錠の調製：裸錠をコーティングパン内に入れる。コーティング条件を確定し、主機の速度２０ｒ／ｍｉｎ、給気温度４０℃、排気温度３０℃、噴霧圧力０．０２ＭＰａ、噴霧流量１ｍｌ／ｍｉｎでコーティングを行う。安定すると、錠剤表面が滑らかで、色合いが均等になるまで噴霧コーティングを１．５ｈ続け、フィルムコーティングの検査基準に符合すると合格である。コーティングで重量が５％前後増す。
【実施例２】
【００９４】
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ素錠（１００００錠で計算）
処方：
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ原料粉末                １０００ｇ
低置換度ヒドロキシプロピルセルロース（５％）  ９２．５ｇ
カルボキシメチルデンプンナトリウム（３％）    ５５．５ｇ
ステアリン酸マグネシウム（１％）              １８．５ｇ
デンプン                                総重量−その他の原料、添加剤の重量
総重量                                        １８５０ｇ
【００９５】
調製工程：適量のデンプンを秤取して１５％濃度まで希釈し、糊状になるまで加熱して接着剤を作製する。主原料のイソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、添加剤のデンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウムをそれぞれ１００メッシュに通し、処方量に応じて、必要な主原料及び添加剤を秤取する。イソバレリルスピラマイシンＩ、デンプン、低置換度ヒドロキシプロピルセルロースを均一になるまで十分に混合した後、１５％濃度のデンプン糊で練合物を作製する。１４メッシュで造粒し、５０〜６０℃で乾燥させて、水分を３〜５％に制御し、１４メッシュで整粒する。カルボキシメチルデンプンナトリウム、ステアリン酸マグネシウムを加えて混合し、顆粒の含量を測定する。顆粒の含量に基づいて錠剤の重量を計算し、打錠（Φ９ｍｍの臼）して、錠剤重量の差を測定する。検査に合格後、包装する。
【実施例３】
【００９６】
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩカプセル剤（１００００粒で計算）
処方：
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ原料粉末            １０００ｇ
デンプン                                  １０８０−イソバレリルスピラマイシンＩ原料粉末の重量
薬用３号カプセル                          １０００粒
流動パラフィン                            ５０ｍｌ
【００９７】
調製工程：主原料のイソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ、添加剤の薬用デンプンを工程の処方量に応じてそれぞれ秤取した後、混合器に入れて１．５〜２時間十分に混合する。サンプリングし、含量を測定して得られたデータは、理論データと基本的に一致するべきである（各カプセルに詰める重量は約０．１０５ｇである）。検査に合格した薬用３号カプセル及び混合した原料を全自動カプセル充填機の操作の要求に応じ、それぞれローディング装置に入れて充填し、充填したカプセルに対して有意検定を行う（±１０％以内、＜０．３ｇ）。溶出率は要求に符合する。検査後、要求に符合するカプセルを艶出し機内に入れ、流動パラフィンを添加して１５〜２０分間艶出しを行った後、取り出して完成品の包装及び検査を行う。
【実施例４】
【００９８】
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩドライシロップ（１００００袋で計算）
処方：
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ原料粉末            １２５０ｇ
クエン酸（０．５％）                      １５ｇ
スクロース                                総重量−その他の原料、添加剤
総重量                                    約５０００ｇ
色素（クルクミン）                        約１ｇ
【００９９】
調製工程：イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ原料粉末、クエン酸、スクロースをそれぞれ高速気流粉砕機で粉砕し、顆粒の８５％が３００メッシュを、１５％が１８０メッシュを通るようにする。その後粉砕した微粉を処方量に応じて秤取後、１〜１．５時間十分に混合し、その含量を測定し、容量（理論容量は各袋５００ｍｇ）を計算する。その後混合物を包装機中に入れ、アルミ箔を取り付け、包装機の操作の要求に応じて包装する。容量の差は±５％以内であり、包装後、検査に合格したものの外部包装を行う。
【実施例５】
【０１００】
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ顆粒剤（１００００袋で計算）
処方：
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ原料粉末            １２５０ｇ
粉糖                                      ２００００ｇ
デキストリン                              ９０００ｇ
５％ＰＶＰ−Ｋ３０                          適量
【０１０１】
調製工程：イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ原料粉末、粉糖、デキストリンを１２０メッシュに通し、処方量に応じてイソバレリルスピラマイシンＩ、粉糖、デキストリンを秤取して均一に混合する。均一に混合した上記材料を５％ＰＶＰ−Ｋ３０溶液を用いて練合物にし、振動造粒機で造粒し、７０℃で乾燥させて整粒する。検査に合格後、包装する。
【実施例６】
【０１０２】
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ凍結乾燥粉末注射剤
【０１０３】
イソバレリルスピラマイシンＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩまたはイソバレリルスピラマイシンＩＩＩ原料粉末５００ｍｇ及び等モルのアジピン酸を秤取して均一に混合した後、５ｍｌの水中に溶解すると、淡黄色の透明な溶液が得られ、ｐＨは４．６〜５．６の間である。さらに凍結乾燥支持剤としてマンニトール４０ｍｇを添加し、低温で９ｈ急速冷凍させた後、凍結乾燥させると、淡黄色の軟らかな塊が得られる。使用前に１０ｍｌの滅菌水で溶解する。
【実施例７】
【０１０４】
イソバレリルスピラマイシンＩ及びイソバレリルスピラマイシンＩＩ凍結乾燥粉末注射剤
イソバレリルスピラマイシンＩ２５０ｍｇ及びイソバレリルスピラマイシンＩＩ原料粉末２５０ｍｇ、並びに等モルのアジピン酸を秤取して均一に混合した後、５ｍｌ水中に溶解すると、淡黄色の透明な溶液が得られ、ｐＨは４．６〜５．６の間である。さらに凍結乾燥支持剤としてマンニトール４０ｍｇを添加し、低温で９ｈ急速冷凍させた後、凍結乾燥させると、淡黄色の軟らかな塊が得られる。使用前に１０ｍｌの滅菌水で溶解する。
【実施例８】
【０１０５】
カリマイシン凍結乾燥粉末注射剤
カリマイシン５００ｍｇ、及び等モルのアジピン酸を秤取して均一に混合した後、５ｍｌの水中に溶解すると、淡黄色の透明な溶液が得られ、ｐＨは４．６〜５．６の間である。さらに凍結乾燥支持剤としてマンニトール４０ｍｇを添加し、低温で９ｈ急速冷凍させた後、凍結乾燥させると、淡黄色の軟らかな塊が得られる。使用前に１０ｍｌの滅菌水で溶解する。
【０１０６】
試験例１、抗腫瘍活性のバイオアッセイ
測定の目的は、測定試料の体外での細胞増殖抑制作用または細胞毒性活性を評価することである。
細胞株：
ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２、ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０及びＨ１２９９、ヒト腎淡明細胞癌細胞７８６−Ｏ、ヒト腎細胞癌細胞７６９−Ｐ、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１、ヒト神経膠芽腫細胞Ａ１７２、ヒト組織リンパ腫細胞Ｕ９３７、ヒト子宮頸癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト膵臓腺癌細胞ＰＡＮＣ−１、ヒト食道癌細胞ＴＥ−１、ヒト胃腺癌細胞ＳＧＣ７９０１、ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９、ヒト前骨髄球性白血病細胞ＨＬ−６０はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）で購入する。
試薬：
ＲＰＭＩ１６４０培地、ＭＥＭ培地、ＤＭＥＭ低グルコース培地、ウシ胎児血清は米国Ｇｉｂｃｏ社から購入し、トリプシン、グルタミン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、メチルチアゾリルテトラゾリウム（ＭＴＴ）は、米国Ｓｉｇｍａ社から購入する。
機器：
炭酸ガスインキュベータ（Ｓａｎｙｏ、Ｊａｐａｎ）、酵素免疫測定装置（Ｔｅｃａｎ、Ａｕｓｔｒｉａ）、９６ウェル培養プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、ＵＳＡ）、倒立顕微鏡（Ｍｏｔｉｃ、Ｃｈｉｎａ）。
【０１０７】
操作の工程は以下の通りである。
接着細胞：
ＭＣＦ−７、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＨｅｐＧ２、Ａ５４９、Ｈ４６０、Ｈ１２９９、７８６−Ｏ、７６９−Ｐ、Ｕ２５１、Ａ１７２、ＨｅＬａ、ＰＣ３、ＰＡＮＣ−１、ＴＥ−１、ＳＧＣ７９０１、ＨＴ−２９は接着細胞である。対数期の接着腫瘍細胞を選択し、パンクレアチンで消化した後、１０％ウシ胎児血清を含む培地で４〜５×１０４／ｍｌの細胞懸濁液を調製する。９６ウェル細胞プレート中に各ウェル１００μｌで接種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４ｈ培養する。実験群は異なる濃度の測定試料カリマイシンを含む新しい培地に交換し、対照群は同体積の溶媒を含む培地に交換する。各群に３つの平行ウェルを設け、３７℃、５％ＣＯ２で４８ｈ培養する。上清液を捨て、ＰＢＳで慎重に３回洗浄し、各ウェルに０．５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含む新しく調製した培地を１００μＬ添加し、３７℃で続けて４ｈ培養する。慎重に上清を除去し、１５０ｍＬのＤＭＳＯを添加し、小型振盪器で１０ｍｉｎ均一に混合した後、マイクロプレートリーダを用いて４９２ｎｍ部分の光学密度値を測定する。
【０１０８】
浮遊細胞：
Ｕ９３７、ＨＬ−６０は浮遊細胞である。対数期の細胞を選択し、１０％仔牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０培地で２×１０５／ｍｌの細胞懸濁液を調製する。９６ウェル培養プレート中に各ウェル５０μｌで接種し、３７℃、５％ＣＯ２で２４ｈ培養する。実験群に異なる濃度の測定試料カリマイシンを含む培地５０μＬを添加し、対照群は同体積の溶媒を含む培地を添加する。各群に３つの平行ウェルを設け、３７℃、５％ＣＯ２で４８ｈ培養する。各ウェルに５ｍｇ／ｍｌのＭＴＴを含む新しく調製した培地を１０μＬ添加し、３７℃で続けて４ｈ培養する。溶解液（ＳＤＳ１０ｇ、０．１ｍＬの１０ＭＨＣｌ、イソブタノール５ｍＬを蒸留水で１００ｍＬに希釈する）１００μＬで結晶を溶解し、３７℃で１２ｈ培養する。マイクロプレートリーダを用いて４９２ｎｍ部分の光学密度値を測定する。
【０１０９】
結果の評価：下式により、腫瘍細胞の成長に対する薬物の抑制率を計算する。
腫瘍細胞成長抑制率（％）＝[Ａ４９２（陰性対照）−Ａ４９２（投与群）]／Ａ４９２（陰性対照）×１００％
これから試料の半数阻害濃度（ＩＣ５０）を求める。
【０１１０】
結果：ヒト乳腺癌細胞ＭＣＦ−７及びＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ヒト肝癌細胞ＨｅｐＧ２、ヒト非小細胞肺癌細胞Ａ５４９、ヒト大細胞肺癌細胞Ｈ４６０及びＨ１２９９、ヒト腎淡明細胞癌細胞７８６−Ｏ、ヒト腎細胞癌細胞７６９−Ｐ、ヒト神経膠腫細胞Ｕ２５１、ヒト神経膠芽腫細胞Ａ１７２、ヒト組織リンパ腫細胞Ｕ９３７、ヒト子宮頸癌細胞ＨｅＬａ、ヒト前立腺癌細胞ＰＣ３、ヒト膵臓腺癌細胞ＰＡＮＣ−１、ヒト食道癌細胞ＴＥ−１、ヒト胃腺癌細胞ＳＧＣ−７９０１、ヒト結腸癌細胞ＨＴ−２９、ヒト前骨髄球性白血病細胞ＨＬ−６０を実験対象とする。試料に対して行う体外での抗増殖活性の評価結果は下表１に示す通りである。
【０１１１】
【表１】
2021516663.tif 000003
【０１１２】
結果は、測定した細胞に対して、試料が良好な抗増殖活性を有することを示している。
【０１１３】
試験例２、イソバレリルスピラマイシンＩがＰＩ３ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を抑制する
細胞株：
Ａ５４９細胞はＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ、ＵＳＡ）から購入する。細胞は１０％ウシ胎児血清、２％グルタミン、ペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）を含むＤＭＥＭ培地中で培養し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータ中で培養する。実験で用いる細胞は、いずれも対数期の細胞である。
試薬：
ラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ）は、アメリカＳｉｇｍａ社（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）から購入する。
【０１１４】
操作工程は以下の通りである：
Ａ５４９は接着細胞である。対数期の細胞を用い、異なる濃度（０．０５、５、１７、５０μｇ／ｍｌ）のイソバレリルスピラマイシンＩ及び対照薬物のラパマイシン（Ｒａｐａｍｙｃｉｎ、２０μｇ／ｍｌ）を添加し、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベータで２４ｈ培養する。細胞を収集して、ウェスタンブロッティング法で測定する。
【０１１５】
ウェスタンブロッティング法：
１  溶液の調製
１）３０％ポリアクリルアミド溶液：
試薬の名称                      用量
アクリルアミド                ２９０ｇ
メチレンビスアクリルアミド      １０ｇ
ｄｄＨ２Ｏ                    １，０００ｍｌ
ｄｄＨ２Ｏを添加して１，０００ｍｌに定容する必要があり、褐色瓶に入れて４℃で保存する。
２）Ｔｒｉｓ緩衝液は、Ｔｒｉｓ塩基を脱イオン水に完全に溶解した後、ＨＣｌで溶液のｐＨ値を調節する。
分離ゲル用緩衝液：１．５ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．８）；
スタッキングゲル用緩衝液：１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）。
３）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）：脱イオン水で１０％のストック液を調製して室温で保存し、使用に備える。
４）過硫酸アンモニウム（ＡＰ）：脱イオン水で少量の１０％（ｗ／ｖ）ストック液を調製して４℃で保存する。過硫酸アンモニウムはゆっくりと分解するため、隔週で新しく調製しなければならない。
５）５×Ｔｒｉｓ−グリシン電気泳動バッファー：
試薬の名称                        用量
Ｔｒｉｓ                        ７．５５ｇ
１０％（ｗ／ｖ）のＳＤＳ        ２５ｍＬ
グリシン                          ４７ｇ
ｄｄＨ２Ｏ                ５００ｍＬに定容する
４℃の冷蔵庫で保存して使用に備え、使用するときｄｄＨ２Ｏで１×バッファーに希釈して使用する。
６）細胞溶解液：５０ｍＭのＨｅｐｅｓ（ｐＨ７．４）、１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、１００ｍＭのＮａＦ、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのオルトバナジン酸ナトリウム、１ｍＭのＰＭＳＦ、１０ｍｇ／ｍｌのａｐｒｏｔｉｎｉｎ、１０ｍｇ／ｍｌのｌｅｕｐｅｐｔｉｎ、１０ｍｇ／ｍｌのｐｅｐｓｔａｔｉｎＡ。
７）５×ローディングバッファー
試薬の名称                      用量（ｍＬ）
Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ（ｐＨ６．８）    ０．６
グリセリン（５０％）                ５
ＳＤＳ（１０％）                    ２
β−メルカプトエタノール          ０．５
ブロモフェノールブルー（１％）      １
８）転写バッファー：
試薬の名称                        用量
Ｔｒｉｓ−Ｂａｓｅ              ４．５５ｇ
グリシン                        ２１．６５ｇ
ｄｄＨ２Ｏ                      １２００ｍＬ
メタノール                      ３００ｍＬ
９）ブロッキング液：
試薬の名称              用量
脱脂粉乳                ５ｇ
ＰＢＳＴ              １００ｍＬ
【０１１６】
２  タンパク質電気泳動
１）各チューブの細胞に６０〜１００μｌの細胞溶解液を添加し、４℃のアイスボックス内で１ｈ氷浴する。１２，０００ｒ／ｍｉｎで１０〜１５ｍｉｎ遠心分離し、上清を０．５ｍｌＥＰチューブに取り、Ｂｉｏ−Ｒａｄでタンパク質を測定、定量する。その後、５×ローディングバッファーを加え、沸騰水浴に３〜５ｍｉｎ入れ、−８０℃で凍結保存する。
２）Ｔａｂ．２−１に基づいて１５％、１２％または１０％のアクリルアミド分離ゲルを調製する。順番に各成分を混合し、ＴＥＭＥＤ及びＡＰを添加すると、すぐに混合物を高速で回転させて電気泳動槽の２枚のガラス板の間にスタッキングゲルに必要な空間を残して流し込む。分離ゲル上を１層のイソプロパノールで覆い、ゲルを垂直にして室温で約３０ｍｉｎ置く。
３）分離ゲルが完全に重合すると、イソプロパノールを除き、脱イオン水で１０回洗浄し、ろ紙で水を吸い取る。Ｔａｂ．２−２に基づいてスタッキングゲルを調製し、電気泳動槽の２枚のガラス板の間に流し込んだ後、すぐにきれいなサンプルコームを挿入する。
４）スタッキングゲルが完全に重合した後、電気泳動装置中に１×電気泳動バッファーを満たし、試料を所定の順序で試料ウェルに入れて電気泳動を開始する。試料がスタッキングゲルにあるとき、電圧は５０〜６０Ｖ、試料が分離ゲルまで泳動すると、電圧を１００〜１４０Ｖに調整する。
【０１１７】
３  ウェスタンブロッティング
１）ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動が終了すると、ゲルを転写バッファー中に３０ｍｉｎ浸漬し、８枚のＷｈａｔｍａｎ３ＭＭろ紙及び１枚のニトロセルロースメンブレンをゲルの大きさに合わせて切る。ニトロセルロースメンブレンをメタノール中に１ｍｉｎ浸し、ニトロセルロースメンブレンを脱イオン水中に浸して気泡を除去する。
２）ゲルを「サンドイッチ」状に重ね、転写タンク中に入れ、ゲルの一面を陰極に接続する。１００ｍＡで３ｈ行う。
３）転写後のニトロセルロースメンブレンをポンソーＳ溶液中に５〜１０ｍｉｎ入れ、その間は軽く揺らす。タンパクのバンドが出現すると、脱イオン水で数回洗浄し、染色液で基準のタンパク分子量の位置を標識する。
４）ブロッキング液を入れたシャーレにメンブレンを入れ、２ｈブロッキングする。
５）さらに０．１ｍｌ／ｃｍ２で第１抗体を含むブロッキング液を加え、４℃で一夜置く（各種抗体の希釈倍数はＴａｂ．２−２の通り）。
６）第１抗体を回収し、ＰＢＳＴでメンブレンを１回あたり１０ｍｉｎで３回洗浄する。メンブレンを１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む溶液中に移して１０ｍｉｎ揺らす。
７）０．１ｍｌ／ｃｍ２で第２抗体を含み、リン酸塩及びアジ化ナトリウムを含まないブロッキング液中にメンブレンを入れる。ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識した第２抗体は１，０００倍に希釈する。
８）１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍｍｏｌ／ｌのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）を含む溶液を用いて、メンブレンを１回あたり１０ｍｉｎで３回洗浄する。暗室でＥＣＬキットを用いて呈色させ、写真をスキャンして保存する。
【０１１８】
【表２】
2021516663.tif 000004
【０１１９】
【表３】
2021516663.tif 000005
【０１２０】
【表４】
2021516663.tif 000006
【０１２１】
結果：
イソバレリルスピラマイシンＩをＡ５４９細胞に２４時間作用させた後、ウェスタンブロッティング法を採用してＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路のタンパク及びそのリン酸化型のレベルを考察した。結果は図１及び図２に示す通りである。
【０１２２】
イソバレリルスピラマイシンＩが、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ及びｍＴＯＲ基質のＳ６Ｋ１、４ＥＢＰ１、並びにその活性化形式のｐ−ＰＩ３Ｋ、ｐ−ＡＫＴ、ｐ−ｍＴＯＲ、ｐ−Ｓ６Ｋ１、ｐ−４ＥＢＰ１のタンパクレベルの発現に対して及ぼす影響は図１及び図２に示す通りである。結果は、イソバレリルスピラマイシンＩがＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路のタンパクの活性化を抑制することができ、特にＰＩ３Ｋタンパク、４ＥＢＰ１タンパク、ｍＴＯＲタンパクの活性化を抑制し、ＡＫＴタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパクの発現及びその活性化タンパクの発現を抑制することを表す。
【０１２３】
他に、図１及び図２から、ラパマイシンと比較して、本発明のｍＴＯＲ阻害剤であるイソバレリルスピラマイシンＩのＡＫＴ、Ｓ６Ｋ１及び４ＥＢＰ１に対する阻害作用はより優れていることもわかる。本発明のｍＴＯＲ阻害剤であるイソバレリルスピラマイシンＩが、ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路に対して優れた阻害作用を示すことができることを表す。ｍＴＯＲ経路関連疾患を治療及び／または予防する薬物の調製におけるｍＴＯＲ阻害剤の応用、並びに臨床的普及のために理論的な根拠を提供し、重要な経済的及び社会的効果及び利益を備える。
【０１２４】
このほか、出願人はカリマイシン、イソバレリルスピラマイシンＩＩ及びイソバレリルスピラマイシンＩＩＩを単独で利用するか、またはイソバレリルスピラマイシンＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩ、イソバレリルスピラマイシンＩＩＩの２種若しくは３種を組み合わせて利用し、Ａ５４９細胞に２４時間作用させた後、ウェスタンブロッティング法でＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル経路のタンパク及びそのリン酸化型のレベルを考察した。その結果は試験例２と類似し、ＰＩ３Ｋタンパク、４ＥＢＰ１タンパク、ｍＴＯＲタンパクの活性化を抑制することができ、ＡＫＴタンパク、Ｓ６Ｋ１タンパクの発現及びその活性化タンパクの発現を抑制するが、ここでは詳述しない。
【０１２５】
試験例３、カリマイシンは非小細胞肺癌Ａ５４９の増殖を抑制する
（１）ＭＴＴ法でカリマイシンの体外での腫瘍細胞生存率に対する影響を測定する
Ａ５４９細胞を４×１０３個／ｍＬの密度で９６ウェルプレートに各ウェル１００μＬで接種し、２４または４８ｈ培養する。その後、異なる濃度のカリマイシンを添加し、５％ＣＯ２のインキュベータに入れて３７℃で異なる時間引き続き培養した後、各ウェルに濃度が５ｍｇ／ｍＬのＭＴＴを１００μＬ添加して２〜３ｈ培養する。その後、上清液を除去し、１５０μＬのＤＭＳＯを添加し、マイクロシェーカで１０ｍｉｎ振とうさせて結晶を完全に溶解させ、マイクロプレートリーダで各ウェルの吸光度（Ａ値）を測定する。発光波長は４９２ｎｍである。同時にラパマイシンを陽性対照とし、以下の公式に基づいて細胞に対する薬物の成長抑制率を計算する：抑制率（％）＝［Ａ４９２（ｃｏｎｔｒｏｌ）−Ａ４９２（カリマイシン）］／［Ａ４９２（ｃｏｎｔｒｏｌ）−Ａ４９２（ｂｌａｎｋ）］×１００％
【０１２６】
結果は、カリマイシンが濃度依存的にＡ５４９細胞の増殖を抑制することができ、その２４及び４８ｈのＩＣ５０はそれぞれ２４．８８μｇ／ｍＬ及び１７．８４μｇ／ｍｌであることを示している。
【０１２７】
（２）カリマイシンはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を抑制することができる
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲシグナル経路の異常は、数種の腫瘍型で頻繁に発生する。ＰＩ３Ｋは細胞内ホスファチジルイノシトールキナーゼであり、ＰＩ３Ｋプロテインファミリーは細胞増殖、分化、アポトーシス及びグルコース輸送など数種の細胞機能の調節に関与する。ＡＫＴ（プロテインキナーゼＢ）はＰＩ３Ｋ下流の主要なエフェクターであり、ＡＫＴはｍＴＯＲを直接リン酸化することにより、またはＴＳＣ２（結節性硬化症複合体２）を不活性化することにより、ｍＴＯＲＣ１を活性化することができる。ｍＴＯＲＣ１は下流の真核生物翻訳開始因子結合タンパク４Ｅ−ＢＰ１及びリボソームタンパクＳ６キナーゼ１Ｓ６Ｋ１を直接リン酸化し、これにより細胞の生合成及び増殖を調節する。
【０１２８】
異なる濃度のカリマイシンを使用してＡ５４９細胞を２４及び４８ｈ処理し、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ法により細胞中のｍＴＯＲタンパクレベル及びその上下流のタンパクレベルを考察した。結果から、５μｇ／ｍｌ以上のカリマイシンをＡ５４９細胞に２４ｈ作用させると、ｍＴＯＲ並びに下流の４Ｅ−ＢＰ１及びＳ６Ｋ１のタンパクリン酸化レベルを低下させることができ、さらにＰＩ３Ｋ、ＡＫＴのリン酸化レベルも下方制御することを発見した。
【０１２９】
５、１７、５０μｇ／ｍｌのカリマイシンでＡ５４９細胞を４８ｈ処理すると、ｍＴＯＲのリン酸化レベルは顕著に低下し、さらにｍＴＯＲの下流タンパクのリン酸化レベルを顕著に抑制する。５、１７μｇ／ｍｌのカリマイシンはＰＩ３Ｋ及びＡＫＴのリン酸化レベルを上昇させたのに対し、５０μｇ／ｍｌのカリマイシンはＰＩ３Ｋ及びＡＫＴのリン酸化レベルを顕著に低下させることができる。
【０１３０】
上記の結果は、カリマイシンがｍＴＯＲ及び下流タンパクのリン酸化レベルを抑制することにより、細胞のタンパク質合成を抑制し、これによりＡ５４９細胞の増殖を抑制することを証明している。結果は、中低濃度のカリマイシンのｍＴＯＲＣ１に対する抑制度が比較的高く、４８ｈ作用させるとｍＴＯＲＣ２に対するネガティブフィードバックの活性化が存在することを説明している。高濃度のカリマイシンは同時にｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の二重阻害剤とすることができ、さらにネガティブフィードバックの活性化作用が生じることはない（図４及び図５に示す）。
【０１３１】
（３）カリマイシンはＡ５４９細胞のオートファジーを誘導する
方法：蛍光顕微鏡及びフローサイトメトリーで細胞のオートファジーを測定する
ダンシルカダベリン（Ｄａｎｓｙｌｃａｄａｖｅｒｉｎｅ、ＭＤＣ）は、蛍光色素で、好酸性染色剤である。通常、オートファゴソーム形成の測定に用いられる特異的標識染色剤の酸性リソソームの凝集は、一定程度にオートファジーのレベルを反映することができる。
【０１３２】
対数期のＡ５４９細胞を、６ウェルプレートに各ウェル２×１０５個で接種する。２４ｈ培養後、培地を除去し、異なる薬物を添加して２４または４８ｈ作用させる。その後、ＰＢＳで１回洗浄し、０．０５ＭのＭＤＣを含む同体積の培地を添加し、３７℃で遮光して２０ｍｉｎインキュベートする。ＰＢＳで１回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察するかフローサイトメトリーで測定する。
【０１３３】
結果：ｍＴＯＲＣ１はＵＬＫ１複合体と結合することによりオートファジーを抑制することができるため、我々はカリマイシンで２４及び４８ｈ処理した細胞のオートファジーレベルを考察した。ＭＤＣ染色の結果により、対照群細胞は均一な緑色の蛍光を発し、カリマイシン濃度の上昇に伴って、細胞に明らかな明るい蛍光緑色の凝集した顆粒が出現したことがわかる。フローサイトメトリーの結果は、薬物処理後、ＭＤＣ染色の陽性率が増加することを示し、２４ｈ及び４８ｈの結果と一致する（図６ａ及び図６ｂに示す）。
【０１３４】
ＬＣ３はオートファジーマーカータンパクであり、細胞にオートファジーが生じたとき、細胞内のＬＣ３Ｉ型からＩＩ型への変換レベルは明らかに増加する。Ｐ６２はオートファジーの基質であり、細胞にオートファジーが生じたとき、Ｐ６２はオートファジー基質及びオートファゴソームを結合させ、さらにはオートファジー基質と共に包まれ、リソソームに進入して分解される。従って、細胞にオートファジーが生じたとき、細胞内のＰ６２の発現レベルは低下する。Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法で測定することにより、カリマイシンを添加すると、オートファジー基質Ｐ６２レベルを低下させることができ、オートファジー関連タンパクＬＣ３Ｉ型からＩＩ型への変換が増加し、２４ｈ及び４８ｈの結果と一致することを発見した（図７に示す）。以上の結果は、いずれもカリマイシンがＡ５４９細胞のオートファジーを誘導することができることを証明している。
【０１３５】
細胞のオートファジーは腫瘍細胞に対して二重の作用を有し、細胞を保護することも、細胞を殺傷することもできる。従って、我々はカリマイシンが誘導する細胞のオートファジーに対して、オートファジーの阻害剤３−ＭＡを使用して、Ａ５４９細胞の死亡過程で示す作用を考察した。オートファジー阻害剤３−ＭＡを添加すると、カリマイシンのＡ５４９細胞に対する成長抑制作用を低下させ（図８）、カリマイシンが誘導するオートファジーがＡ５４９細胞の増殖を抑制したことを説明している。
【０１３６】
（４）カリマイシンはＡ５４９細胞のアポトーシスを誘導する
方法：ＡｎｎｅｘｉｎＶは分子量が３５ｋＤａのＣａ２＋依存性リン脂質結合タンパク質であり、ホスファチジルセリン（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｓｅｒｉｎｅ、ＰＳ）に特異的に結合することができる。ホスファチジルセリンは主に細胞膜の内側に分布し、細胞にアポトーシスが生じたとき、細胞はホスファチジルセリンを細胞表面、すなわち細胞膜外側に移動させる。ＦＩＴＣ標識ＡｎｎｅｘｉｎＶプローブ、すなわちＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣは、これらの移動したホスファチジルセリンに特異的に結合することができ、フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡で非常に簡単で直接的に、細胞にアポトーシスが生じた状況を確認する。
【０１３７】
ヨウ化プロピジウム（Ｐｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅ、ＰＩ）は核酸染色剤であるが、正常な細胞膜を通過することはできない。細胞が壊死またはアポトーシスの中、後期にある状態では、細胞は膜の完全性を失い、ヨウ化プロピジウムが細胞内部に進入し、細胞核内の核酸と結合する。フローサイトメトリーまたは蛍光顕微鏡により、細胞膜の完全な状態を反映する情報を確認する。従ってＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣをＰＩと共に使用し、異なるアポトーシスの時期にある細胞を区分する。
【０１３８】
対数期のＡ５４９細胞を６ウェルプレートに各ウェル２×１０５個で接種する。２４ｈ培養後、培地を除去し、異なる薬物を添加して２４または４８ｈ作用させる。その後、ＰＢＳで１回洗浄し、調製したアポトーシス染色液（２５０μｌのＢｉｎｄｉｎｇ  ｂｕｆｆｅｒ、７．５μｌのＡｎｎｅｘｉｎＶ−ＦＩＴＣ、１０μｌのＰｒｏｐｉｄｉｕｍ  Ｉｏｄｉｄｅを均一に混合する）を添加する。室温で遮光して１５ｍｉｎインキュベートし、すぐに蛍光顕微鏡での観察及びフローサイトメトリーでの測定を行う。
【０１３９】
結果：カリマイシンがＡ５４９細胞に作用する機構を確認するため、ＡＶ−ＰＩ染色を採用して考察し、さらにフローサイトメトリーを使用して正常細胞、初期アポトーシス細胞、後期アポトーシス細胞及び壊死細胞を区分する。Ｃａｓｐａｓｅファミリーはアポトーシスの過程で非常に重要な作用を示し、このうちｃａｓｐａｓｅ３はアポトーシスの下流実行タンパクとして、ＤＮＡ断裂、クロマチン凝縮及びアポトーシス小体の形成と関係する。従って、我々はキット及びＷｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を使用して、ｃａｓｐａｓｅ３のプロテアーゼ活性及びタンパクレベルを考察した。
【０１４０】
結果から、カリマイシンでＡ５４９細胞を２４ｈ処理すると、１７、５０μｇ／ｍｌは緑色の蛍光が出現し始め、赤色の蛍光はないことを発見し、フローサイトメトリーでは５０μｇ／ｍｌ濃度の細胞に初期アポトーシスの細胞が出現し（図１０）、ｃａｓｐａｓｅ３のタンパクレベルは明らかな増加はせず、プロトタイプＰＡＲＰは切断されない（図１１Ａ）ことを発見した。カリマイシンでＡ５４９細胞を４８ｈ処理すると、濃度の増加に伴って、細胞の細胞質が収縮し始め、アポトーシス小体が出現する（図９）。ＡＶ−ＰＩの結果は、５及び１７μｇ／ｍｌで明らかな緑色の蛍光が出現し、５０μｇ／ｍｌの細胞核に明らかな赤色の蛍光が出現したことを示し、フローサイトメトリーにより５及び１７μｇ／ｍｌで初期アポトーシスの細胞数が上昇し、５０μｇ／ｍｌで大量の後期アポトーシス細胞が出現する（図１０）ことを発見した。ｃａｓｐａｓｅ３は前駆体から活性化型への変換が増加し、基質とするＰＡＲＰは切断され（図１１Ｂ）、ｃａｓｐａｓｅ３の酵素活性が増加し（図１２）、細胞にアポトーシスが生じたことを証明している。
【０１４１】
（５）カリマイシンはＨＩＦ−１αタンパクレベルを低下させる
低酸素及びその他のインスリン、成長因子などの要素は、ＨＩＦ−１αの発現を誘導することができる。過剰に活性化したｍＴＯＲも酸素が十分な条件下で、転写レベルからＨＩＦ−１αの発現を活性化させることができ、さらにはその下流の血管内皮増殖因子ＶＥＧＦなど血管形成遺伝子の転写をもたらし、血管透過性の増加、細胞外マトリックスの変性、血管内皮細胞の遊走、増殖及び血管形成などを促進する作用を有する。
【０１４２】
Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法での測定により、カリマイシンでＡ５４９細胞を２４及び４８ｈ処理すると、血管生合成タンパクＨＩＦ−１α、ＶＥＧＦ−Ａのタンパクレベルが顕著に低下する（図１３）ことを発見した。カリマイシンがＡ５４９の低酸素誘導因子のタンパクレベルを抑制することにより、腫瘍細胞の増殖抑制作用を発揮し得ることを示す。
【０１４３】
（６）ＥＲＫシグナル伝達経路に対するカリマイシンの影響
Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫシグナル経路は、細胞外シグナルを細胞核内に伝達する最も重要なシグナル経路の１つであり、細胞の生存、増殖、分化、アポトーシス、代謝などを制御する機能において、重要な作用を有する。
【０１４４】
カリマイシンでＡ５４９細胞を２４ｈ処理すると、Ｒａｓ、Ｒａｆタンパクレベル及びＥＲＫのタンパクリン酸化レベルを上昇させることができる。さらに、カリマイシンでＡ５４９細胞を４８ｈ処理すると、Ｒａｓ、Ｒａｆタンパクレベルを上昇させることができ、中濃度薬物はＥＲＫのリン酸化レベルを顕著に上昇させることができるが、高濃度での薬物処理はＥＲＫのリン酸化レベルを低下させた。結果は図１４の通りである。
【０１４５】
（７）Ａ５４９細胞周期に対するカリマイシンの影響
異なる濃度のカリマイシンでそれぞれＡ５４９を２４及び４８ｈ処理した後、ＰＩフローサイトメトリーを使用してその細胞周期の分布を測定した。２４ｈ薬物処理しても、細胞周期に明らかな影響がないことを発見した。４８ｈ薬物処理すると、対照群と比較して、１．７μｇ／ｍｌ、５μｇ／ｍｌ、１７μｇ／ｍｌ及び５０μｇ／ｍｌのＳ期細胞はそれぞれ１．８６％、９．３９％、４．７５％、２４．３８％増加した。データをまとめると、カリマイシンで４８ｈ処理すると、Ａ５４９細胞のＳ期停止を濃度依存的に誘導する。
【０１４６】
以上の試験例から、Ａ５４９細胞にカリマイシンを添加して２４ｈ後、ｍＴＯＲのリン酸化レベルは顕著に低下し、ｍＴＯＲ下流の真核細胞翻訳開始因子結合タンパク４Ｅ−ＢＰ１及びリボソームタンパクＳ６キナーゼ１Ｓ６Ｋ１のリン酸化レベルを顕著に抑制し、腫瘍細胞のタンパク生合成を低下させることにより、腫瘍細胞の増殖速度を低下させること、さらにＰＩ３Ｋのリン酸化レベルを下方制御しても、ＡＫＴのリン酸化レベルに明らかな影響がないことがわかる。カリマイシンでＡ５４９細胞を４８ｈ処理した後も、依然としてｍＴＯＲ経路のタンパクリン酸化レベルを下方制御することができるが、中濃度はＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路をフィードバック的に活性化し、ＰＩ３Ｋ及びＡＫＴのリン酸化レベルが顕著に上昇する。しかしながら高濃度（５０μｇ／ｍｌ）時はＰＩ３Ｋ及びＡＫＴタンパクのリン酸化レベルを再び抑制した。従って、カリマイシンはｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の２重阻害剤であると考えられ、中低濃度条件下で、カリマイシンのｍＴＯＲＣ１に対する抑制度は比較的高いが、薬物を４８ｈ作用させると比較的高いネガティブフィードバック調節が存在し；高濃度条件下では、ｍＴＯＲＣ２に対しても一定の阻害作用を有すると大胆に推測される。
【０１４７】
カリマイシン処理を４８ｈ行った後のＡ５４９細胞を位相差顕微鏡で観察することにより、細胞収縮、クロマチン凝縮を観察することができる。明らかなアポトーシス小体及びアポトーシス小胞が形成され、ＪＣ−１染色の結果は、薬物濃度の上昇に伴って、緑色の蛍光を呈する細胞の比率が次第に増加することを示し、カリマイシンがＡ５４９細胞のミトコンドリア膜電位を濃度依存的に低下させることができることを表している。我々は、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ法を使用してアポトーシス関連タンパクのレベルを測定した。Ｐｒｏｃａｓｐａｓｅ−３タンパクレベルが低下し、ｃｌｅａｖｅｄ−ｃａｐｌａｓｅ３タンパクレベルが上昇すると同時に、ｃａｓｐａｓｅ−３基質のＰＡＲＰが分解され、これはカリマイシンがＡ５４９細胞のアポトーシスを誘導し、ｃａｓｐａｓｅカスケード反応を活性化したことを表している。Ｂａｘレベルが増加すると、Ｂｃｌ−ＸＬ及びＢｃｌ−２レベルは低下する。従って、カリマイシンで４８ｈ処理すると、Ａ５４９細胞のアポトーシスを誘導することにより、腫瘍細胞の増殖を抑制する。以上のデータは、カリマイシンで２４ｈ処理しても、生じるアポトーシス現象が明らかでないが、４８ｈでは明らかな濃度依存的なアポトーシス現象が出現し、初期アポトーシスから後期アポトーシスに転換することを表している。
【０１４８】
カリマイシンはｍＴＯＲの阻害剤として、Ａ５４９細胞のＬＣＩ型からＩＩ型への変換を明らかに上昇させることができ、オートファジー基質Ｐ６２のタンパクレベルを下方制御し、同時にＭＤＣ染色及びフローサイトメトリーでもオートファジーの増加を証明した。オートファジー阻害剤３−ＭＡを添加すると、カリマイシンのＡ５４９に対する抑制作用は低下し、カリマイシンがＡ５４９細胞の損傷的なオートファジーを誘導することを証明した。すなわちカリマイシンが細胞のオートファジーレベルを増加させることにより、Ａ５４９細胞の増殖を抑制し、２４ｈ及び４８ｈではいずれも比較的明らかなオートファジー現象が出現する。細胞のアポトーシスが生じる前、カリマイシンは主にオートファジーを誘導することにより細胞の生存を抑制することができる。本発明においてカリマイシンでＡ５４９細胞を２４ｈ処理すると、ＥＲＫのタンパクリン酸化レベルは顕著に上昇するため、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路を抑制してＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ経路が活性化したと考えられる。
【０１４９】
要するに、カリマイシンはヒト非小細胞肺癌Ａ５４９の増殖を濃度依存的に抑制することができ、アポトーシスを誘導する。ｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２の二重阻害剤として、中低濃度下ではｍＴＯＲＣ１の抑制を主とし、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴのネガティブフィードバックを活性化し、高濃度下ではｍＴＯＲＣ２を抑制することができ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴのタンパクリン酸化レベルを下方制御する。Ａ５４９細胞のオートファジーを誘導することができ、オートファジーは細胞を殺傷する作用を示す。Ａ５４９細胞のＳ期停止を引き起こすことができる。他に、カリマイシンはＲａｓ／Ｒａｆ／ＥＲＫ経路も活性化し、Ｒａｓ、Ｒａｆタンパクレベルを上方制御し、ＥＲＫのリン酸化レベルが上昇する。
【０１５０】
以上の記載は本発明の好ましい実施例に過ぎず、本発明をどのような形式でも制限しない。本発明は好ましい実施例により上記のように開示したが、本発明を限定するものではない。当業者は本発明の技術案を逸脱しない範囲内で、上記に提示した技術内容を利用して等価変更した同等の実施例に変更または修飾することができるが、いずれも本発明の技術案の内容を逸脱しない。本発明の技術的本質に基づいて、以上の実施例に対して行う簡単な修正、等価変更及び修飾は、いずれも本発明案の範囲内に属する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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