(57)【要約】  本開示は、粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）、及びｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチドを含み、複合体は天然に生じない非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。本開示はまた、目的配列を細胞の染色体中に導入する方法を提供する。最後に、本開示は、シームレス突然変異誘発を使用して１つ以上のヌクレオチドを改変する方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）；及び
ｂ）前記ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（前記ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチド
を含み；
前記複合体は天然に生じない
非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項２】
ａ）粘着末端を生成し得、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）；及び
ｂ）前記ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチド
を含み；
前記複合体は天然に生じない
非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項３】
ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列；及び
ｂ）前記ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（前記ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列
を含み；
前記複合体は天然に生じない
非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項４】
ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列；及び
ｂ）前記ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列
を含み；
（ａ）及び（ｂ）の前記ヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターの制御下であり、前記複合体は天然に生じない
非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項５】
前記ガイドポリヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項６】
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む別個のポリヌクレオチドをさらに含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項７】
前記ガイドポリヌクレオチド、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び前記ｓｔｉＣａｓ９が、複合体を形成し得、前記複合体は天然に生じない、請求項６に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項８】
ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に結合している調節エレメント；及び
ｂ）前記ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（前記ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチド
を含み；
前記複合体は天然に生じない
１つ以上のベクターを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項９】
ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に結合している調節エレメント（前記調節エレメントは、真核生物調節エレメントである）；及び
ｂ）前記ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチド
を含み；
前記複合体は天然に生じない
１つ以上のベクターを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１０】
前記ガイドポリヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列をさらに含む、請求項８又は９に記載の非天然発生ベクター。
【請求項１１】
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列をさらに含む、請求項９又は１０に記載の非天然発生ベクター。
【請求項１２】
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の１０ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の系。
【請求項１３】
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の系。
【請求項１４】
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の系。
【請求項１５】
前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’に存在し、前記ＰＡＭは、３’Ｇリッチモチーフを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の系。
【請求項１６】
前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’に存在し、前記ＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴである）である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の系。
【請求項１７】
前記粘着末端が、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の系。
【請求項１８】
前記粘着末端が、４〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の系。
【請求項１９】
前記粘着末端が、５〜１５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の系。
【請求項２０】
前記ｓｔｉＣａｓ９が、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の系。
【請求項２１】
前記ｓｔｉＣａｓ９が、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれか１つと少なくとも９５％の同一性を有するドメインを含む、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の系。
【請求項２２】
前記ｓｔｉＣａｓ９が、１Ｅ−５のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の系。
【請求項２３】
前記ｓｔｉＣａｓ９が、１Ｅ−１０のＥ値カットオフを用いて前記ＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の系。
【請求項２４】
前記細菌種が、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＨＴＣＣ５０１５、パラサテレラ・エキスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、スルフロスピリラム属種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、ルミノバクター属種（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ８７、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１＿１＿４７、バクテロイデス・オーラル・タクソン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ）２７４株Ｆ００５８、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＹＬ４５、ルミノバクター・アミロフィラス（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）Ｐ０１１１、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ９２６１、カンピロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株ＲＭ８００１、カンプリロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株Ｐ０１２１、ツリシモナス・ムリス（Ｔｕｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｍｕｒｉｓ）、レジオネラ・ロンジニエンシス（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｌｏｎｄｉｎｉｅｎｓｉｓ）、サリニビブリオ・シャルメンシス（Ｓａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｓｈａｒｍｅｎｓｉｓ）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）単離株ＦＷ．０３０、モリテラ属種（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｓｐ．）単離株ＮＯＲＰ４６、エンドゾイコモナス属種（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｓ−Ｂ４−１Ｕ、タミルナドゥイバクター・サリナス（Ｔａｍｉｌｎａｄｕｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｎｕｓ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、アルコバクター・スキロウイイ（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｋｉｒｒｏｗｉｉ）、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）、フランシセラ・ヒスパニエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ）、又はパレンドゾイコモナス・ハリクロナエ（Ｐａｒｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｉｃｌｏｎａｅ）である、請求項２３に記載の系。
【請求項２５】
前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’に存在し、前記ＰＡＭ配列は、ＹＧ（Ｙは、ピリミジンである）であり、前記ｓｔｉＣａｓ９が、細菌種Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）に由来する、請求項２４に記載の系。
【請求項２６】
前記ｓｔｉＣａｓ９が、１つ以上の核局在化シグナルを含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の系。
【請求項２７】
前記真核細胞が、動物又はヒト細胞である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の系。
【請求項２８】
前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の系。
【請求項２９】
前記真核細胞が、植物細胞である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の系。
【請求項３０】
前記ガイド配列が、ダイレクトリピート配列に結合している、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の系。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の系を含む送達粒子。
【請求項３２】
前記ｓｔｉＣａｓ９及び前記ガイドポリヌクレオチドが、複合体中に存在する、請求項３１に記載の送達粒子。
【請求項３３】
前記複合体が、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３２に記載の送達粒子。
【請求項３４】
脂質、糖、金属、又はタンパク質をさらに含む、請求項３２又は２２に記載の送達粒子。
【請求項３５】
請求項１〜３０のいずれか一項に記載の系を含むベシクル。
【請求項３６】
前記ｓｔｉＣａｓ９及び前記ガイドポリヌクレオチドが、複合体中に存在する、請求項３５に記載のベシクル。
【請求項３７】
ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む、請求項３６に記載のベシクル。
【請求項３８】
前記ベシクルが、エキソソーム又はリポソームである、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載のベシクル。
【請求項３９】
前記ｓｔｉＣａｓ９をコードする前記１つ以上のヌクレオチド配列が、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている、請求項５〜９のいずれか一項に記載の系。
【請求項４０】
Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記ガイドポリヌクレオチドが、単一ベクター上に存在する、請求項５〜３０又は３９のいずれか一項に記載の系。
【請求項４１】
Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードする前記ヌクレオチド配列及び前記ガイドポリヌクレオチドが、単一核酸分子上に存在する、請求項５〜３０又は３９のいずれか一項に記載の系。
【請求項４２】
請求項５〜３０又は３９〜４１のいずれか一項に記載の系を含むウイルスベクター。
【請求項４３】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのものである、請求項４２に記載のウイルスベクター。
【請求項４４】
ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）、及び
ｂ）前記ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（前記ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得る）を含むガイドポリヌクレオチド
を含み；
前記複合体は天然に生じない
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む真核細胞。
【請求項４５】
粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）（前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する）を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む真核細胞。
【請求項４６】
真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって、
ａ）前記細胞中に、
ｉ．粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）；及び
ｉｉ．前記ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（前記ガイド配列は、前記真核細胞中の前記標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチド（前記複合体は天然に生じない）
を導入すること；並びに
ｂ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及び前記ガイドポリヌクレオチドにより前記標的配列中の粘着末端を生成すること；並びに
ｃ）
ｉ．前記粘着末端を一緒に、又は
ｉｉ．目的ポリヌクレオチド配列（ＳｏＩ）を前記粘着末端に
ライゲートすること
を含み；
それにより前記標的配列を改変する方法。
【請求項４７】
真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって、
ａ）前記細胞中に、
ｉ．粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードするヌクレオチド配列；及び
ｉｉ．前記ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（前記ガイド配列は、前記真核細胞中の前記標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチド（前記複合体は天然に生じない）
を導入すること；並びに
ｂ）前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及び前記ガイドポリヌクレオチドにより前記標的配列中の粘着末端を生成すること；並びに
ｃ）
ｉ．前記粘着末端を一緒に、又は
ｉｉ．目的ポリヌクレオチド配列（ＳｏＩ）を前記粘着末端に
ライゲートすること
を含み；
それにより前記標的配列を改変する方法。
【請求項４８】
前記ガイドポリヌクレオチドが、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列をさらに含む、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記細胞中に、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項４６又は４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記ガイドポリヌクレオチド、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及び前記ｓｔｉＣａｓ９が、複合体を形成し得、前記複合体は天然に生じない、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の１０ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、請求項４６〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記複合体が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る、請求項４６〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的配列が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’に存在し、前記ＰＡＭは、３’Ｇリッチモチーフを含む、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記標的配列が、ＰＡＭの５’に存在し、前記ＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴである）である、請求項４６〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記粘着末端が、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項４６〜５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記粘着末端が、４〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項４６〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記粘着末端が、５〜１５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む、請求項４６〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ｓｔｉＣａｓ９が、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する、請求項４６〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記真核細胞が、動物又はヒト細胞である、請求項４６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記真核細胞が、ヒト細胞である、請求項４６〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記真核細胞が、植物細胞である、請求項４６〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記改変が、前記標的配列の少なくとも一部の欠失である、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記改変が、前記標的配列の突然変異である、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記改変が、前記標的配列中への目的配列の挿入である、請求項４６〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
エキソヌクレアーゼを導入して前記ｓｔｉＣａｓ９により生成されたオーバーハングを除去することをさらに含む、請求項４６〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記エキソヌクレアーゼが、Ｃａｓ４、Ａｒｔｅｍｉｓ、又はＴＲＥＸ２である、請求項６６に記載の方法。
【請求項６８】
前記Ｃａｓ４が、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記複合体の構成成分をコードするポリヌクレオチドを、１つ以上のベクター上に導入する、請求項４６〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
細胞中の染色体中に目的配列（ＳｏＩ）を導入する方法であって、
前記染色体は、領域１及び領域２を含む標的配列（ＴＳＣ）を含み、前記細胞中に、
ａ）標的配列（ＴＳＶ）を含むベクター（前記ＴＳＶは、領域２及び領域１並びにＳｏＩを含む）；
ｂ）前記ＴＳＣ中の粘着末端を生成し得る第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体（前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、前記ＴＳＣの領域１において開裂させ、前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、領域２において開裂させる）；及び
ｃ）前記ＴＳＶ中の粘着末端を生成し得る第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体（前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、前記ＴＳＶの領域２において開裂させ、前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の二量体は、領域１において開裂させる）
を導入することを含み；
前記細胞中への（ａ）の前記ベクター、（ｂ）の前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び（ｃ）の前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の導入は、前記細胞の前記染色体中への前記ＳｏＩの挿入をもたらす方法。
【請求項７１】
細胞中の染色体中に目的配列（ＳｏＩ）を導入する方法であって、
前記染色体は、領域１及び領域２を含む標的配列（ＴＳＣ）を含み；前記細胞中に、
ａ）標的配列（ＴＳＶ）（前記ＴＳＶは、領域２及び領域１並びに前記ＳｏＩを含む）を含むベクター（前記ベクターは、粘着末端を含む）；
ｂ）前記ＴＳＣ中の粘着末端を生成し得る第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体（前記Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、前記ＴＳＣの領域１において開裂させ、前記Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、領域２において開裂させる）
を導入することを含み；
前記細胞中への（ａ）の前記ベクター及び（ｂ）の前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の導入は、前記細胞の前記染色体中への前記ＳｏＩの挿入をもたらす方法。
【請求項７２】
前記第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体が同一である、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体が異なる、請求項７０又は７１に記載の方法。
【請求項７４】
前記細胞中に、前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第１の単量体との複合体を形成し、第１のガイド配列（前記第１のガイド配列は、領域１を含む前記ＴＳＣにハイブリダイズするが、前記ベクターにハイブリダイズしない）を含む第１のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記細胞中に、前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第１の単量体との複合体を形成し、第１のガイド配列（前記第１のガイド配列は、前記ＴＳＣ及び前記ＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第１のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項７０〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記細胞中に、前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第２の単量体との複合体を形成し、第２のガイド配列（前記第２のガイド配列は、領域２を含む前記ＴＳＣにハイブリダイズするが、前記ベクターにハイブリダイズしない）を含む第２のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記細胞中に、前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第２の単量体との複合体を形成し、第２のガイド配列（前記第２のガイド配列は、前記ＴＳＣ及び前記ＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第２のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項７０〜７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記細胞中に、前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体との複合体を形成し、第３のガイド配列（前記第３のガイド配列は、領域２を含む前記ＴＳＶにハイブリダイズするが、前記染色体にハイブリダイズしない）を含む第３のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項７０〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記細胞中に、前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第１の単量体との複合体を形成し、第３のガイド配列（前記第３のガイド配列は、前記ＴＳＣ及び前記ＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第３のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項７０〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞中に、前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第２の単量体との複合体を形成し、第４のガイド配列（前記第４のガイド配列は、領域１を含む前記ＴＳＶにハイブリダイズするが、前記染色体にハイブリダイズしない）を含む第４のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項７０〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞中に、前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第２の単量体との複合体を形成し、第４のガイド配列（前記第４のガイド配列は、前記ＴＳＣ及び前記ＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第４のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項７０〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記細胞中に、前記第１、第２、第３、及び第４のガイドポリヌクレオチドを導入することを含む、請求項７０〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記細胞中に、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを導入することをさらに含む、請求項７０〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第１の単量体及び前記第２の単量体中の前記エンドヌクレアーゼが、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである、請求項７０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第１の単量体及び前記第２の単量体中の前記エンドヌクレアーゼが、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである、請求項７０〜８３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである、請求項７０〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、ＢｂｖＩ、ＢｇｃＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｐＩ、ＢｓｐＭＩ、ＣｓｐＣＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、及びＰｌｅＩからなる群から独立して選択される、請求項７０〜８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩである、請求項７０〜８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体を、前記細胞中に、前記第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチドとして導入する、請求項７０〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードする前記ポリヌクレオチドが、１つのベクター上に存在する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
前記第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードする前記ポリヌクレオチドが、２つ以上のベクター上に存在する、請求項８９に記載の方法。
【請求項９２】
前記第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体が、改変Ｃａｓ９を含む、請求項７０〜９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体が、触媒的に不活性なＣａｓ９を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
前記第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩである、請求項９３に記載の方法。
【請求項９５】
前記第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体が、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９６】
前記第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩである、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体が、野生型Ｃａｓ９に対してＣａｓ９中の単一アミノ酸置換を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９８】
前記第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の前記エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩである、請求項９７に記載の方法。
【請求項９９】
前記単一アミノ酸置換が、Ｄ１０Ａ又はＨ８４０Ａである、請求項９７又は９８に記載の方法。
【請求項１００】
前記単一アミノ酸置換が、Ｄ１０Ａである、請求項９７又は９８に記載の方法。
【請求項１０１】
前記単一アミノ酸置換が、Ｈ８４０Ａである、請求項９７又は９８に記載の方法。
【請求項１０２】
前記Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体が、野生型Ｃａｓ９に対して二重アミノ酸置換を含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項１０３】
前記二重アミノ酸置換が、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記野生型Ｃａｓ９が、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、プラノコッカス・アンタルクティカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、コリバクテリウム・グロメランス（Ｃｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、ラクトバシラス・ファーシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｔｓｕｏｋａｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、オエノコッカス・キタハラ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｉｔａｈａｒａ）、フルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）、ベイロネラ・アチピカ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ａｔｙｉｐｃａ）、ソロバクテリウム・モオレイ（Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｏｒｅｉ）、アシドアミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｄ２１、ユーバクテリウム・ユリ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｙｕｒｒｉ）、コプロコッカス・カタス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ）、ペプトニフィラス・ドゥエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、又はトレポネマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）に由来する、請求項９７に記載の方法。
【請求項１０５】
前記粘着末端が、５’オーバーハングを含む、請求項７０〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記粘着末端が、３’オーバーハングを含む、請求項７０〜１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０７】
前記第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体が、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する、請求項７０〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体が、４〜３０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する、請求項７０〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体が、５〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する、請求項７０〜１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
前記挿入時、前記染色体中の前記標的配列及び前記プラスミド中の前記標的配列を再構成させない、請求項７０〜１０９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記細胞が、真核細胞である、請求項７０〜１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記細胞が、動物又はヒト細胞である、請求項７０〜１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記細胞が、植物細胞である、請求項７０〜１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
（ａ）の前記ベクター、（ｂ）の前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、（ｃ）の前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体又はそれらの組合せを、前記細胞中に、送達粒子、ベシクル、又はウイルスベクターを介して導入する、請求項７０〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
（ａ）の前記ベクター、（ｂ）の前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、（ｃ）の前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体又はそれらの組合せを、前記細胞中に、送達粒子を介して導入する、請求項７０〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記送達粒子が、脂質、糖、金属、又はタンパク質を含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
（ａ）の前記ベクター、（ｂ）の前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、（ｃ）の前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体又はそれらの組合せを、前記細胞中に、ベシクルを介して導入する、請求項７０〜１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記ベシクルが、エキソソーム又はリポソームである、請求項１１７に記載の方法。
【請求項１１９】
（ｂ）、（ｃ）又はそれらの組合せを発現し得るポリヌクレオチドを、前記細胞中に、ウイルスベクターを介して導入する、請求項７０〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
（ａ）の前記ベクターが、ウイルスベクターである、請求項７０〜１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記ウイルスベクターが、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスである、請求項１１９又は１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第１の単量体が、前記第１のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成し、前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第２の単量体が、前記第２のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成する、請求項７０〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第１の単量体が、前記第３のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成し、前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第２の単量体が、前記第４のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成する、請求項７０〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第１の単量体が、前記第１のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成し、前記第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第２の単量体が、前記第２のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成する、請求項７０〜１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第１の単量体が、前記第３のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成し、前記第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の前記第２の単量体が、前記第４のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成する、請求項７０〜１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体が、核局在化シグナルを含む、請求項７０〜１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記細胞が、幹細胞又は幹細胞系を含む、請求項７０〜１２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２８】
細胞中の標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドを改変する方法であって、
ａ）前記細胞中に、挿入カセット（ＩＣ）を含むベクター（ＩＣは、５’〜３’方向で、
ｉ．前記標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第１の領域、
ｉｉ．前記標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドの突然変異を含む第２の領域、
ｉｉｉ．第１のヌクレアーゼ結合部位、
ｉｖ．マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、
ｖ．第２のヌクレアーゼ結合部位、
ｖｉ．前記標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドの突然変異を含む第３の領域、及び
ｖｉｉ．前記標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第４の領域を含み、前記第１の領域及び前記第４の領域は、前記標的ポリヌクレオチド配列のそれらのそれぞれの一部と９５％〜ｌ００％同一である）を導入すること；
ｂ）相同組換えを介して前記標的ポリヌクレオチド配列中に前記ＩＣを挿入して第１の改変標的ポリヌクレオチドを生成すること；
ｃ）前記マーカー遺伝子を発現する細胞を選択すること；
ｄ）前記第１の改変標的ポリヌクレオチドを部位特異的ヌクレアーゼに供して粘着末端を有する第２の改変標的ポリヌクレオチドを生成すること；及び
ｅ）粘着末端を有する前記第２の改変標的ポリヌクレオチドをリガーゼ（前記リガーゼは、前記第２の領域及び前記第３の領域において前記粘着末端をライゲートする）に供して前記標的ポリヌクレオチド配列と比較して１つ以上の改変ヌクレオチドを含むライゲートされた改変標的核酸を作出すること
を含む方法。
【請求項１２９】
前記第１の改変標的核酸を、（ｃ）の後に前記細胞から単離する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、前記細胞に対して外因性である、請求項１２８又は１２９に記載の方法。
【請求項１３１】
前記リガーゼが、前記細胞に対して外因性である、請求項１２８〜１３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記第１の改変標的タンパク質が、（ｃ）の後に前記細胞中に存在する、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３３】
前記部位特異的ヌクレアーゼを、前記細胞中に、前記部位特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとして導入する、請求項１３２に記載の方法。
【請求項１３４】
前記リガーゼを、前記細胞中に、リガーゼをコードするポリヌクレオチドとして導入する、請求項１３２又は１３３に記載の方法。
【請求項１３５】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、組換え部位特異的ヌクレアーゼである、請求項１２８〜１３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記リガーゼが、組換えリガーゼである、請求項１２８〜１３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質である、請求項１２８〜１３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
前記Ｃａｓ９エフェクタータンパク質が、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９である、請求項１３７に記載の方法。
【請求項１３９】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質である、請求項１２８〜１３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質中の前記エンドヌクレアーゼが、ＩＩＳ型ヌクレアーゼである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４１】
前記Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質中の前記エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩである、請求項１３９に記載の方法。
【請求項１４２】
前記Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質が、改変Ｃａｓ９を含む、請求項１３９〜１４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
前記改変Ｃａｓ９が、触媒的に不活性なＣａｓ９を含む、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４４】
前記エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩである、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４５】
前記Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質が、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９を含み、前記エンドヌクレアーゼが、ＦｏｋＩである、請求項１４２に記載の方法。
【請求項１４６】
前記Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質が、Ｄ１０Ａ置換を有するＣａｓ９を含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４７】
前記Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質が、Ｈ８４０Ａ置換を有するＣａｓ９を含む、請求項１４３に記載の方法。
【請求項１４８】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、又はＣａｓ９−ＦｏｋＩである、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１４９】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質である、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１５０】
（ｄ）の前記第２の改変標的ポリヌクレオチドの前記粘着末端が、５’オーバーハングを含む、請求項１２８〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
（ｄ）の前記第２の改変標的ポリヌクレオチドの前記粘着末端が、３’オーバーハングを含む、請求項１２８〜１４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
前記部位特異的ヌクレアーゼが、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成し得る、請求項１２８〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５３】
前記ヌクレアーゼが、４〜３０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成し得る、請求項１２８〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５４】
前記ヌクレアーゼが、５〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成し得る、請求項１２８〜１５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５５】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、プラスミド中に存在する、請求項１２８〜１５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５６】
前記標的ポリヌクレオチド配列が、染色体中に存在する、請求項１２８〜１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
ｓｔｉＣａｓ９タンパク質との複合体を形成する遺伝子操作ガイドＲＮＡであって、
ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列；及び
ｂ）前記Ｃａｓ９タンパク質に結合し得るｔｒａｃｒＲＮＡ配列（前記ｔｒａｃｒＲＮＡは、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも１０ヌクレオチドだけ異なる）
を含み、
前記Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ効率を改善する遺伝子操作ガイドＲＮＡ。
【請求項１５８】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡよりも少なくとも１０個少ないヌクレオチドを有する、請求項１５７に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡ。
【請求項１５９】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡよりも少なくとも１０個多いヌクレオチドを有する、請求項１５７に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡ。
【請求項１６０】
前記ガイド配列が、配列番号１０４〜１２５又は１９６〜１９９のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１５７に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡ。
【請求項１６１】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列が、配列番号１４８〜１７１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１５７に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡ。
【請求項１６２】
前記ガイドＲＮＡが、配列番号１７２〜１９１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を含む、請求項１５７に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡ。
【請求項１６３】
前記ｔｒａｃｒＲＮＡが、前記ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ中の１つ以上の改変を含む、請求項１５７〜１５９のいずれか一項に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡ。
【請求項１６４】
前記改変が、前記ステムループの伸長を含む、請求項１６３に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡ。
【請求項１６５】
前記改変が、前記ステムループの短縮を含む、請求項１６３に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡ。
【請求項１６６】
前記改変が、前記ステムループ中の１つ以上のヌクレオチド置換を含む、請求項１６３に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡ。
【請求項１６７】
前記Ｃａｓ９タンパク質の前記ヌクレアーゼ効率の改善が、生化学的アッセイ、シーケンシングアッセイ、及び／又は親和性試験により決定される、請求項１５７〜１６６のいずれか一項に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡ。
【請求項１６８】
請求項１５７〜１６３のいずれか一項に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１６９】
図４０Ｂに見出されるＣａｓ９、ガイド配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列の任意の組合せを含む遺伝子操作Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体。
【請求項１７０】
別個のポリヌクレオチド上のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない、請求項１６３に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【請求項１７１】
Ｃａｓ９タンパク質に結合する遺伝子操作ガイドＲＮＡを産生する方法であって、
ａ．真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列を提供すること；
ｂ．天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を、前記ｔｒａｃｒＲＮＡ配列から少なくとも１０個のヌクレオチドを除去することにより改変して改変ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を形成すること；及び
ｃ．前記ガイド配列を前記改変ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に結合させて前記遺伝子操作ガイドＲＮＡを生成すること
を含む方法。
【請求項１７２】
ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）；及び
ｂ）前記ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドＲＮＡ（前記ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）；
を含み；
前記複合体は天然に生じず、
別個のポリヌクレオチド上のｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない
非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により全体として本明細書に組み込まれる配列表を含有する。前記ＡＳＣＩＩコピーは２０１８年１１月１６日に作成され、００９８−０００２ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔと命名され、１，１０５，０１４バイトのサイズである。
【０００２】
本開示は、粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）、及びｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチドを含み、複合体は天然に生じない非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【背景技術】
【０００３】
クラスター化された規則的に間隔が空いた短鎖回文反復配列（ＣＲＩＳＰＲ）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）系は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）中でＩｓｈｉｎｏにより最初に発見された原核生物免疫系である（非特許文献１、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。この免疫系は、ウイルス及びプラスミドの核酸を配列特異的に標的化することによりウイルス及びプラスミドに対する免疫を提供する。参照により全体として本明細書に組み込まれる非特許文献２も参照。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、３つの主な型：Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型に分類されている。別々の型を決定付ける主な特徴は、用いられる種々のｃａｓ遺伝子、及びそれらがコードするそれぞれのタンパク質である。ｃａｓ１及びｃａｓ２遺伝子は、３つの主な型にわたりユニバーサルであると思われる一方、ｃａｓ３、ｃａｓ９、及びｃａｓ１０は、それぞれＩ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型の系に特異的と考えられる。例えば、参照により全体として本明細書に組み込まれる非特許文献３参照。
【０００４】
この免疫系に関与する２つの主なステージが存在し、第１のステージは獲得であり、第２のステージは干渉である。第１のステージは、侵入ウイルス及びプラスミドのゲノムの切断並びに生物のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中へのこのセグメントの組込みを含む。ゲノム中に組み込まれるセグメントは、プロトスペーサーとして公知であり、同一のウイルス又はプラスミドによる後続の攻撃からの生物の保護に役立つ。第２のステージは、侵入ウイルス又はプラスミドへの攻撃を含む。このステージは、ＲＮＡに転写されているプロトスペーサーに依存し、このＲＮＡはいくらかのプロセシング後に侵入ウイルス又はプラスミドのＤＮＡ中の相補的配列とハイブリダイズする一方、そのＤＮＡを有効に開裂させるタンパク質、又はタンパク質複合体とも会合する。
【０００５】
細菌種に応じて、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡプロセシングは異なって進行する。例えば、細菌の化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）において最初に記載されたＩＩ型系においては、転写されたＲＮＡはトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）と対合してからＲＮアーゼＩＩＩにより開裂されて個々のＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）が形成される。ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる結合後にさらにプロセシングされて成熟ｃｒＲＮＡが産生される。続いて、ｃｒＲＮＡ／Ｃａｓ９複合体は捕捉領域（プロトスペーサーと称される）に相補的な配列を含有するＤＮＡに結合する。次いで、Ｃａｓ９タンパク質は、ＤＮＡの両方の鎖を部位特異的に開裂させ、二本鎖分解（ＤＳＢ）を形成する。これはＤＮＡベースの「記憶」を提供し、反復曝露及び／又は感染時にウイルス又はプラスミドＤＮＡの急速な分解をもたらす。天然ＣＲＩＳＰＲ系は、包括的に概説されている（例えば、非特許文献３参照）。
【０００６】
その最初の発見以降、複数のグループが遺伝子操作、例として、遺伝子編集におけるＣＲＩＳＰＲ系の潜在的用途に関して集中的な研究を行ってきた（非特許文献４；非特許文献５；及び非特許文献６；それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。１つの主な開発は、ｔｒａｃｒＲＮＡに融合しているＣＲＩＳＰＲアレイからの個々の単位前後で設計されたＣａｓ９タンパク質を標的化するためのキメラＲＮＡの利用であった。これは、プロトスペーサー領域中の配列の改変がＣａｓ９タンパク質を部位特異的に標的化し得る小分子ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）と呼ばれる単一ＲＮＡ種を作出する。オフターゲット効果を予測し、評価するために高度に関連するキメラＲＮＡと標的部位との間の塩基対合相互作用の性質、及びミスマッチに対するそのトレランスを理解するためにかなりの作業が行われてきた（例えば、非特許文献７（補助資料を含む）参照、参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【０００７】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９遺伝子編集系は、野生型Ｃａｓ９タンパク質を使用してＤＳＢ形成を誘導するため、又はＣａｓ９ｎ／Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａと称される突然変異タンパク質を使用して単一ＤＮＡ鎖をニッキングするための両方で広範な生物及び細胞系において良好に使用されている（例えば、非特許文献６及び非特許文献８参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。ＤＳＢ形成が遺伝子機能を破壊し得る小さい挿入及び欠失（インデル）の作出をもたらす一方、Ｃａｓ９ｎ／Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａニッカーゼは、内因性相同組換え機構を刺激しながらインデル作出を回避する（非相同末端結合を介する修復の結果）。したがって、Ｃａｓ９ｎ／Ｃａｓ９  Ｄ１０Ａニッカーゼを使用してＤＮＡ領域をゲノム中に高いフィデリティで挿入することができる。
【０００８】
ゲノム編集に加え、ＣＲＩＳＰＲ系は、複数の他の用途、例として、とりわけ調節遺伝子発現、遺伝子回路構築、及び機能的ゲノミクスを有する（非特許文献８に概説）。
【０００９】
開示が参照により全体として本明細書に組み込まれる種々の刊行物が本明細書に引用される。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｉｓｈｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １６９（１２）：５４２９−５４３３（１９８７）
【非特許文献２】Ｓｏｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，“ＣＲＩＳＰＲ−ａ  ｗｉｄｅｓｐｒｅａｄ  ｓｙｓｔｅｍ  ｔｈａｔ  ｐｒｏｖｉｄｅｓ  ａｃｑｕｉｒｅｄ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ａｇａｉｎｓｔ  ｐｈａｇｅｓ  ｉｎ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ａｎｄ  ａｒｃｈａｅａ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６（３）：１８１−１８６（２００８）
【非特許文献３】Ｂａｒｒａｎｇｏｕ  ａｎｄ  Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，“ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ：ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ  ｕｐｇｒａｄｅ  ｔｏ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ”，Ｃｅｌｌ  ５４（２）：２３４−２４４（２０１４）
【非特許文献４】Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｐｒｏｇｒａｍｍａｂｌｅ  ｄｕａｌ−ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ＤＮＡ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｎ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｂａｃｔｅｒｉａｌ  ｉｍｍｕｎｉｔｙ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７（６０９６）：８１６−８２１（２０１２）
【非特許文献５】Ｃｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８１９−８２３（２０１３）
【非特許文献６】Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｖｉａ  Ｃａｓ９”，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３９（６１２１）：８２３−８２６（２０１３）
【非特許文献７】Ｆｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ｕｓｉｎｇ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２（３）：２７９−２８４（２０１４）
【非特許文献８】Ｓａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｊｏｕｎｇ，“ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ｆｏｒ  ｅｄｉｔｉｎｇ，ｒｅｇｕｌａｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｇｅｎｏｍｅｓ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２（４）：３４７−３５５（２０１４）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
一部の実施形態において、本開示は、粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）、及びｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチドを含み、複合体は天然に生じない非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【００１２】
一部の実施形態において、本開示は、粘着末端を生成し得、核局在化配列（ＮＬＳ）を含むＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）、及びｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドを含み、複合体は天然に生じない非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【００１３】
一部の実施形態において、本開示は、粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列、及びｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含み、複合体は天然に生じない非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【００１４】
一部の実施形態において、本開示は、（ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列、及び（ｂ）ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列を含み、（ａ）及び（ｂ）のヌクレオチド配列は、真核生物プロモーターの制御下であり、複合体は天然に生じない非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【００１５】
一部の実施形態において、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドポリヌクレオチド、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列及びｓｔｉＣａｓ９は複合体を形成し得、複合体は天然に生じない。
【００１６】
一部の実施形態において、本開示は、粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に結合している調節エレメント、及びｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチドを含み、複合体は天然に生じない１つ以上のベクターを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【００１７】
一部の実施形態において、本開示は、粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に結合している調節エレメント（調節エレメントは、真核生物調節エレメントである）、及びｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドを含み、複合体は天然に生じない１つ以上のベクターを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【００１８】
一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態において、本開示の非天然発生ベクターは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列をさらに含む。
【００１９】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の１０ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。
【００２０】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’に存在し、ＰＡＭは、３’Ｇリッチモチーフを含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の実施形態において、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’に存在し、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴである）である。
【００２１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、粘着末端は、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、粘着末端は、４〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、粘着末端は、５〜１０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。
【００２２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれかと少なくとも８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性又は９５％の同一性を有するドメインを含む。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、１Ｅ−５のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、１Ｅ−１０のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。
【００２３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９が由来する細菌種は、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＨＴＣＣ５０１５、パラサテレラ・エキスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、スルフロスピリラム属種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、ルミノバクター属種（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ８７、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１＿１＿４７、バクテロイデス・オーラル・タクソン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ）２７４株Ｆ００５８、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＹＬ４５、ルミノバクター・アミロフィラス（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）Ｐ０１１１、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ９２６１、カンピロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株ＲＭ８００１、カンプリロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株Ｐ０１２１、ツリシモナス・ムリス（Ｔｕｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｍｕｒｉｓ）、レジオネラ・ロンジニエンシス（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｌｏｎｄｉｎｉｅｎｓｉｓ）、サリニビブリオ・シャルメンシス（Ｓａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｓｈａｒｍｅｎｓｉｓ）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）単離株ＦＷ．０３０、モリテラ属種（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｓｐ．）単離株ＮＯＲＰ４６、エンドゾイコモナス属種（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｓ−Ｂ４−１Ｕ、タミルナドゥイバクター・サリナス（Ｔａｍｉｌｎａｄｕｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｎｕｓ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、アルコバクター・スキロウイイ（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｋｉｒｒｏｗｉｉ）、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）、フランシセラ・ヒスパニエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ）、又はパレンドゾイコモナス・ハリクロナエ（Ｐａｒｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｉｃｌｏｎａｅ）である。
【００２４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’に存在し、ＰＡＭ配列は、ＹＧ（Ｙは、ピリミジンである）であり、ｓｔｉＣａｓ９は、細菌種Ｆ．ノビシダ（Ｆ．ｎｏｖｉｃｉｄａ）に由来する。
【００２５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、１つ以上の核局在化シグナルを含む。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、真核細胞は、ヒト細胞である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、真核細胞は、植物細胞である。
【００２６】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、ガイド配列は、ダイレクトリピート配列に結合している。
【００２７】
一部の実施形態において、送達粒子は、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、送達粒子内の複合体中に存在する。
【００２８】
一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列をさらに含む。一部の実施形態において、送達粒子内の複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。
【００２９】
一部の実施形態において、送達粒子は、脂質、糖、金属、又はタンパク質さらに含む。
【００３０】
一部の実施形態において、ベシクルは、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。
【００３１】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、ベシクル内の複合体中に存在する。
【００３２】
一部の実施形態において、ベシクル内の複合体は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドをさらに含む。一部の実施形態において、ベシクルは、エキソソーム又はリポソームである。
【００３３】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。
【００３４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド及びガイドポリヌクレオチドは、単一ベクター上に存在する。
【００３５】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の一部の実施形態において、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド及びガイドポリヌクレオチドは、単一核酸分子である。
【００３６】
一部の実施形態において、ウイルスベクターは、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのものである。
【００３７】
一部の実施形態において、本開示は、粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）、及びｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得る）を含むガイドポリヌクレオチドを含み、複合体は天然に生じないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む真核細胞を提供する。
【００３８】
一部の実施形態において、本開示は、粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）（Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する）を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む真核細胞を提供する。
【００３９】
一部の実施形態において、本開示は、真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって、（１）細胞中に、（ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）、及び（ｂ）ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチド（複合体は天然に生じない）を導入すること；（２）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドにより標的配列中の粘着末端を生成すること；並びに（３）（ａ）粘着末端を一緒に、又は（ｂ）目的ポリヌクレオチド配列（ＳｏＩ）を粘着末端にライゲートすることを含み、それにより標的配列を改変する方法を提供する。
【００４０】
一部の実施形態において、本開示は、真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって、（１）細胞中に、（ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードするヌクレオチド配列、及び（ｂ）ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチド（複合体は天然に生じない）を導入すること；（２）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドにより標的配列中の粘着末端を生成すること；並びに（３）（ａ）粘着末端を一緒に、又は（ｂ）目的ポリヌクレオチド配列（ＳｏＩ）を粘着末端にライゲートすることを含み、それにより標的配列を改変する方法を提供する。
【００４１】
一部の実施形態において、真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法は、細胞中に、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００４２】
方法の一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチド、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及びｓｔｉＣａｓ９は、複合体を形成し得、複合体は天然に生じない。
【００４３】
方法の一部の実施形態において、複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の１０ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。方法の一部の実施形態において、複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。方法の一部の実施形態において、複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の３ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。
【００４４】
方法の一部の実施形態において、標的配列は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の５’に存在し、ＰＡＭは、３’Ｇリッチモチーフを含む。方法の一部の実施形態において、標的配列は、ＰＡＭの５’に存在し、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｇ、又はＴである）である。
【００４５】
方法の一部の実施形態において、粘着末端は、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。方法の一部の実施形態において、粘着末端は、４〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。方法の一部の実施形態において、粘着末端は、５〜１０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。
【００４６】
方法の一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。
【００４７】
方法の一部の実施形態において、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。方法の一部の実施形態において、真核細胞は、ヒト細胞である。方法の一部の実施形態において、真核細胞は、植物細胞である。
【００４８】
方法の一部の実施形態において、改変は、標的配列の少なくとも一部の欠失である。方法の実施形態において、改変は、標的配列の突然変異である。方法の一部の実施形態において、改変は、標的配列中への目的配列の挿入である。
【００４９】
一部の実施形態において、方法は、エキソヌクレアーゼを導入してｓｔｉＣａｓ９から生成されたオーバーハングを除去することをさらに含む。
【００５０】
方法の一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、Ｃａｓ４、Ａｒｔｅｍｉｓ、又はＴＲＥＸ４である。方法の一部の実施形態において、Ｃａｓ４は、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。
【００５１】
方法の一部の実施形態において、複合体の構成成分をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上のベクター上に導入する。
【００５２】
一部の実施形態において、本開示は、細胞中の染色体中に目的配列（ＳｏＩ）を導入する方法であって、染色体は、領域１及び領域２を含む標的配列（ＴＳＣ）を含み、細胞中に、
（ａ）標的配列（ＴＳＶ）を含むベクター（ＴＳＶは、領域２及び領域１並びにＳｏＩを含む）；
（ｂ）ＴＳＣ中の粘着末端を生成し得る第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体（第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、ＴＳＣの領域１において開裂させ、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、領域２において開裂させる）；及び
（ｃ）ＴＳＶ中の粘着末端を生成し得る第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体（第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、ＴＳＶの領域２において開裂させ、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、領域１において開裂させる）
を導入することを含み；
（ａ）のベクター、（ｂ）の第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び（ｃ）の第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の導入は、細胞の染色体中へのＳｏＩの挿入をもたらす方法を対象とする。
【００５３】
一部の実施形態において、本開示は、細胞中の染色体中に目的配列（ＳｏＩ）を導入する方法であって、染色体は、領域１及び領域２を含む標的配列（ＴＳＣ）を含み、細胞中に、
（ａ）標的配列（ＴＳＶ）（ＴＳＶは、領域２及び領域１並びにＳｏＩを含む）を含むベクター（ベクターは、粘着末端を含む）；
（ｂ）ＴＳＣ中の粘着末端を生成し得る第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体（第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、ＴＳＣの領域１において開裂させ、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、領域２において開裂させる）
導入することを含み；
（ａ）のベクター及び（ｂ）の第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の導入は、細胞の染色体中へのＳｏＩの挿入をもたらす方法を対象とする。
【００５４】
一部の実施形態において、第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、同一である。一部の実施形態において、第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、異なる。
【００５５】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体との複合体を形成し、第１のガイド配列（第１のガイド配列は、領域１を含むＴＳＣにハイブリダイズするが、ベクターにハイブリダイズしない）を含む第１のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００５６】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体との複合体を形成し、第１のガイド配列（第１のガイド配列は、ＴＳＣ及びＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第１のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００５７】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体との複合体を形成し、第２のガイド配列（第２のガイド配列は、領域２を含むＴＳＣにハイブリダイズするが、ベクターにハイブリダイズしない）を含む第２のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００５８】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体との複合体を形成し、第２のガイド配列（第２のガイド配列は、ＴＳＣ及びＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第２のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００５９】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体との複合体を形成し、第３のガイド配列（第３のガイド配列は、領域２を含むＴＳＶにハイブリダイズするが、染色体にハイブリダイズしない）を含む第３のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００６０】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体との複合体を形成し、第３のガイド配列（第３のガイド配列は、ＴＳＣ及びＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第３のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００６１】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体との複合体を形成し、第４のガイド配列（第４のガイド配列は、領域１を含むＴＳＶにハイブリダイズするが、染色体にハイブリダイズしない）を含む第４のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００６２】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体との複合体を形成し、第４のガイド配列（第４のガイド配列は、ＴＳＣ及びＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第４のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００６３】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第１、第２、第３、及び第４のガイドポリヌクレオチドを導入することを含む。
【００６４】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【００６５】
一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体及び第２の単量体中のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体及び第２の単量体中のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。
【００６６】
一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＢｂｖＩ、ＢｇｃＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｐＩ、ＢｓｐＭＩ、ＣｓｐＣＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、及びＰｌｅＩからなる群から独立して選択される。一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。一部の実施形態において、第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、細胞中に、第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチドとして導入する。
【００６７】
一部の実施形態において、第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチドは、１つのベクター上に存在する。一部の実施形態において、第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチドは、２つ以上のベクター上に存在する。
【００６８】
一部の実施形態において、第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、改変Ｃａｓ９を含む。一部の実施形態において、第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、触媒的に不活性なＣａｓ９を含む。一部の実施形態において、第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。一部の実施形態において、第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９を含む。一部の実施形態において、第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。
【００６９】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、野生型Ｃａｓ９に対してＣａｓ９中の単一アミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換は、Ｄ１０Ａ又はＨ８４０Ａである。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換は、Ｄ１０Ａである。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換は、Ｈ８４０Ａである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、野生型Ｃａｓ９に対して二重アミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、二重アミノ酸置換は、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａである。
【００７０】
一部の実施形態において、野生型Ｃａｓ９は、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、プラノコッカス・アンタルクティカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、コリバクテリウム・グロメランス（Ｃｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、ラクトバシラス・ファーシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｔｓｕｏｋａｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、オエノコッカス・キタハラ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｉｔａｈａｒａ）、フルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）、ベイロネラ・アチピカ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ａｔｙｉｐｃａ）、ソロバクテリウム・モオレイ（Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｏｒｅｉ）、アシドアミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｄ２１、ユーバクテリウム・ユリ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｙｕｒｒｉ）、コプロコッカス・カタス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ）、ペプトニフィラス・ドゥエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、又はトレポネマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）に由来する。
【００７１】
一部の実施形態において、粘着末端は、５オーバーハングを含む。一部の実施形態において、粘着末端は、３オーバーハングを含む。一部の実施形態において、第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、４〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、５〜１５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する。
【００７２】
方法の一部の実施形態において、挿入時、染色体中の標的配列及びプラスミド中の標的配列は、再構成させない。
【００７３】
一部の実施形態において、細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、細胞は、動物又はヒト細胞である。一部の実施形態において、細胞は、植物細胞である。
【００７４】
細胞中の染色体中に目的配列（ＳｏＩ）を導入する方法の一部の実施形態において、（ａ）のベクター、（ｂ）の第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、（ｃ）の第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体又はそれらの組合せは、細胞中に、送達粒子、ベシクル、又はウイルスベクターを介して導入する。一部の実施形態において、（ａ）のベクター、（ｂ）の第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、（ｃ）の第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体又はそれらの組合せは、細胞中に、送達粒子を介して導入する。一部の実施形態において、送達粒子は、脂質、糖、金属、又はタンパク質を含む。
【００７５】
細胞中の染色体中に目的配列（ＳｏＩ）を導入する方法の一部の実施形態において、（ａ）のベクター、（ｂ）の第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、（ｃ）の第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体又はそれらの組合せは、細胞中に、ベシクルを介して導入する。一部の実施形態において、ベシクルは、エキソソーム又はリポソームである。
【００７６】
細胞中の染色体中に目的配列（ＳｏＩ）を導入する方法の一部の実施形態において、（ａ）のベクター、（ｂ）の第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、（ｃ）の第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体又はそれらの組合せを発現し得るポリヌクレオチドは、細胞中に、ウイルスベクターを介して導入する。一部の実施形態において、（ａ）のベクターは、ウイルスベクターである。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスである。
【００７７】
一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第１のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成し、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第２のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成する。一部の実施形態において、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第３のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成し、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第４のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成する。一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第１のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成し、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第２のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成する。一部の実施形態において、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第３のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成し、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第４のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成する。一部の実施形態において、第１、第２又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、核局在化シグナルを含む。
【００７８】
細胞中の染色体中に目的配列（ＳｏＩ）を導入する方法の一部の実施形態において、細胞は、幹細胞又は幹細胞系を含む。
【００７９】
一部の実施形態において、本開示は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドを改変する方法であって、
（ａ）細胞中に、挿入カセット（ＩＣ）を含むベクター（ＩＣは、５’−３’方向で、
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第１の領域、
（ｉｉ）１つ以上のヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の突然変異を含む第２の領域、
（ｉｉｉ）第１のヌクレアーゼ結合部位、
（ｉｖ）マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、
（ｖ）第２のヌクレアーゼ結合部位、
（ｖｉ）１つ以上のヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の突然変異を含む第３の領域、及び
（ｖｉｉ）標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第４の領域を含み、第１の領域及び第４の領域は、標的ポリヌクレオチド配列と９５％〜ｌ００％同一である）を導入すること；
（ｂ）相同組換えを介して標的ポリヌクレオチド配列中にＩＣを挿入して第１の改変標的ポリヌクレオチドを生成すること；
（ｃ）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択すること；
（ｄ）第１の改変標的ポリヌクレオチドを部位特異的ヌクレアーゼに供して粘着末端を有する第２の改変標的ポリヌクレオチドを生成すること；及び
（ｅ）粘着末端を有する第２の改変標的ポリヌクレオチドをリガーゼ（リガーゼは、第２の領域及び第３の領域において粘着末端をライゲートする）に供して標的ポリヌクレオチド配列と比較して１つ以上の改変ヌクレオチドを含むライゲートされた改変標的核酸を作出すること
を含む方法を対象とする。
【００８０】
細胞中の標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドを改変する方法の一部の実施形態において、第１の改変標的核酸は、（ｃ）の後に細胞から単離する。
【００８１】
一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、細胞に対して外因性である。一部の実施形態において、リガーゼは、細胞に対して外因性である。一部の実施形態において、第１の改変標的タンパク質は、（ｃ）の後に細胞中に存在する。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、細胞中に、部位特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとして導入する。一部の実施形態において、リガーゼは、細胞中に、リガーゼをコードするポリヌクレオチドとして導入する。
【００８２】
一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、組換え部位特異的ヌクレアーゼである。一部の実施形態において、リガーゼは、組換えリガーゼである。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９である。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質中のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。
【００８３】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、改変Ｃａｓ９を含む。一部の実施形態において、改変Ｃａｓ９は、触媒的に不活性なＣａｓ９を含む。一部の実施形態において、触媒的に不活性なＣａｓ９は、ＦｏｋＩエンドヌクレアーゼに融合している。
【００８４】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９を含み、エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｄ１０Ａ置換を有するＣａｓ９を含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｈ８４０Ａ置換を有するＣａｓ９を含む。
【００８５】
一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１エフェクタータンパク質である。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、又はＣａｓ９−ＦｏｋＩである。
【００８６】
細胞中の標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドを改変する方法の一部の実施形態において、（ｄ）の第２の改変標的ポリヌクレオチドの粘着末端は、５’オーバーハングを含む。一部の実施形態において、（ｄ）の第２の改変標的ポリヌクレオチドの粘着末端は、３’オーバーハングを含む。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成し得る。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、４〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成し得る。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、５〜１５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成し得る。
【００８７】
細胞中の標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドを改変する方法の一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、プラスミド中に存在する。一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、染色体中に存在する。
【００８８】
一部の実施形態において、本開示は、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質との複合体を形成する遺伝子操作ガイドＲＮＡであって、（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列；及び（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質に結合し得るｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み、ｔｒａｃｒＲＮＡは、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも１０ヌクレオチドだけ異なり、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ効率を改善する遺伝子操作ガイドＲＮＡを対象とする。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡよりも少なくとも１０個少ないヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡよりも少なくとも１０個多いヌクレオチドを有する。一部の実施形態において、ガイド配列は、配列番号１０４〜１２５又は１９６〜１９９のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１４８〜１７１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を含む。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号１７２〜１９１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を含む。
【００８９】
一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を対象とする。一部の実施形態において、系は、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない。
【００９０】
一部の実施形態において、本開示は、図４０Ｂに見出されるＣａｓ９、ガイド配列、及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列の任意の組合せを含む遺伝子操作Ｃａｓ９−ガイドＲＮＡ複合体を対象とする。一部の実施形態において、本開示は、Ｃａｓ９タンパク質に結合する遺伝子操作ガイドＲＮＡを産生する方法であって、（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列を提供すること；（ｂ）天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列から少なくとも１０個のヌクレオチドを除去することにより改変して改変ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を形成すること；及び（ｃ）ガイド配列を改変ｔｒａｃｒＲＮＡ配列に結合させて遺伝子操作ガイドＲＮＡを生成することを含む方法を対象とする。一部の実施形態において、本開示は、（ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）；及び（ｂ）ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドＲＮＡ（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含み；複合体は天然に生じず、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含まない非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を対象とする。
【図面の簡単な説明】
【００９１】
【図１】Ｃａｓ９による異なる修復機序の模式図である。図１ａは、遺伝子ノックアウトを表す。図１ｂは、塩基編集を表す。図１ｃは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路による遺伝子ノックインを表す。図１ｄは、相同性配向型組換え（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）（ＨＤＲ）経路による遺伝子ノックインを表す。
【図２】Ｃａｓ９による異なる遺伝子挿入機序の模式図である。相同性配向型組換え（ＨＤＲ）を左側に示す。非相同末端結合（ＮＨＥＪ）を右側に示す。
【図３】異なるＣａｓ９エフェクタータンパク質を使用する遺伝子挿入についての模式図及びその結果の表示である。図３ａ〜ｂは、平滑末端を生成するＣａｓ９により媒介される遺伝子挿入を示す。図３ｃ〜ｄは、オーバーハング（すなわち、「付着末端」）を生成するＣａｓ９により媒介される遺伝子挿入を示す。図３の下段パネルは、相同性非依存的標的化挿入（Ｈｏｍｏｌｏｇｙ−Ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ）（ＨＩＴＩ）を使用する３ａ〜３ｆにおける異なるＣａｓ９タンパク質による遺伝子挿入頻度の表示である。
【図４Ａ−Ｂ】Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５：１６９−１８２（２０１７）により記載されているものである。図４Ａは、異なる型のＣＲＩＳＰＲ系の系統樹及びそれぞれの型のＣＲＩＳＰＲ系を有する代表的な細菌種である。図４Ｂは、ＩＩ型及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ系の拡大図を示し、矢印はｃａｓ４遺伝子を含有するオペロンを示す。
【図５Ａ−Ｅ】Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２（１０）：６０９１−６１０５（２０１４）により記載されているものである。図５Ａ〜Ｄは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の系統樹を表す。図５Ｅは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系のそれぞれのサブファミリーと関連する異なるシグネチャー遺伝子を示す。
【図６Ａ−Ｃ】図６Ａは、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）からのＣａｓ９タンパク質を使用するＤＮＡ開裂について得られた結果を表す。フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）からのＣａｓ９及び化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９により標的化される遺伝子操作ＨＥＫ２９３細胞系中のゲノム遺伝子座についての突然変異シグネチャーを比較する。図６Ａは、配列番号２０４〜２０５及び２８４をそれぞれ出現の順に開示する。図６Ｂ〜Ｃは、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系の系統樹である。インビトロバリデーションのために選択されたＣａｓ９タンパク質はイタリックで示す。
【図７】米国特許第９，５６７，６０８号明細書に記載のジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を使用する遺伝子挿入のためのＯｂＬｉＧａＲｅ法の模式的表示である。
【図８】Ｓａｋｕｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  １１（１）：１１８−１３３（２０１６）により記載の遺伝子挿入のためのＣａｓ９−ＰｉＴＣＨ法の模式的表示である。
【図９】３つの異なるＣａｓ９−ＦｏｋＩ融合タンパク質の模式的表示である。図９ａ：酵素的に不活性なＣａｓ９（ｄｅａｄＣａｓ９）とＦｏｋＩとの融合体；図９ｂ：Ｄ１０Ａ突然変異を有するＣａｓ９（Ｃａｓ９ｎＤ１０Ａ）とＦｏｋＩとの融合体；図９ｃ：Ｈ８４０Ａを有するＣａｓ９（Ｃａｓ９ｎＨ８４０Ａ）とＦｏｋＩとの融合体。図９ａ〜ｃは、配列番号２０６を開示する。
【図１０】図９及び１０の異なるＣａｓ９−ＦｏｋＩ融合タンパク質により生成される異なるＤＮＡ分解の模式的表示である。図１０は、配列番号２０６を「ＴＣＣＣＣＴＣＣＡＣＣＣＣＡＣＡＧＴＧＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧＧＧＡＣＡＧＧＡＴＴＧＧＴＧＡＣＡＧＡＡＡＡＧＣＣＣＣＡＴＣＣＴＴＡＧＧＣＣＴ」として開示し、開裂配列を配列番号２８５〜２８９としてそれぞれ出現の順に開示する。
【図１１】Ｃａｓ９ｎＤ１０Ａ−ＦｏｋＩにより生成される開裂部位の模式的表示である。図１１は、配列番号２０６を開示する。
【図１２】Ｃａｓ９ｎＤ１０Ａ−ＦｏｋＩ．ｇＲＮＡ：ガイドＲＮＡ；ＰＡＭ；プロトスペーサー隣接モチーフを使用する遺伝子挿入法の模式的表示である。図１２は、「ゲノム」配列を配列番号２０６〜２０８として、「ベクター」配列を配列番号２０９〜２１１として、及び「ノックイン」配列を配列番号２１２として、全てそれぞれ出現の順に開示する。
【図１３】Ｃａｓ９ｎＨ８４０Ａ−ＦｏｋＩにより生成される開裂部位の模式的表示である。図１３は、配列番号２０６を開示する。
【図１４】Ｃａｓ９ｎＨ８４０Ａ−ＦｏｋＩ．ｇＲＮＡ：ガイドＲＮＡ；ＰＡＭ；プロトスペーサー隣接モチーフを使用する遺伝子挿入法の模式的表示である。図１４は、「ゲノム」配列を配列番号２０６及び２１３〜２１４として、「ベクター」配列を配列番号２１５〜２１７として、及び「ノックイン」配列を配列番号２１８として、全てそれぞれ出現の順に開示する。
【図１５】実施例１に記載の実験に関する。図１５は、Ｃａｓ９ｎＤ１０Ａ−ＦｏｋＩ（図１５）及びＣａｓ９ｎＨ８４０Ａ−ＦｏｋＩ（図１５）を使用する遺伝子挿入法の模式的表示である。図１５ａ〜ｂは、配列番号２０６を開示する。
【図１６】実施例１に記載の実験に関する。標的部位（ＡＡＶＳ１遺伝子座）を表す。「プランＡ」はＣａｓ９ｎＤ１０Ａ−ＦｏｋＩを使用する遺伝子挿入法を指し；「プランＢ」はＣａｓ９ｎＨ８４０Ａ−ＦｏｋＩを使用する遺伝子挿入法を指す。図１６は、配列番号２１９を開示する。
【図１７】実施例１に記載の実験に関する。Ｃａｓ９ｎＤ１０Ａ−ＦｏｋＩを使用する遺伝子挿入法から得られた代表的な配列を示す。図１７は、配列番号２２０〜２３５をそれぞれ出現の順に開示する。
【図１８】実施例１に記載の実験に関する。Ｃａｓ９ｎＨ８４０Ａ−ＦｏｋＩを使用する遺伝子挿入法から得られた代表的な配列を示す。図１８は、配列番号２３６〜２５８をそれぞれ出現の順に開示する。
【図１９】実施例２に記載の実験に関する。図１９は、ＡＡＶＳ１遺伝子座を標的化するために使用される１０個のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）のセットの設計を示す。
【図２０】実施例２に記載の実験に関する。図２０のｇＲＮＡを使用してＡＡＶＳ１遺伝子座中に挿入すべき遺伝子を含有する「ドナー」プラスミドのプラスミドマップである。
【図２１】実施例２に記載の実験に関する。正確に挿入された遺伝子を含有する細胞（ｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞）を選択する手順の模式図である。
【図２２】実施例２に記載の実験に関する。異なる長さのスペーサーを用いる遺伝子挿入頻度の結果を示す。
【図２３】実施例３に記載の実験に関する。図２３は、ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子座中に挿入すべき遺伝子を含有する「ドナー」プラスミドのプラスミドマップである。
【図２４】実施例３に記載の実験に関する。ｄｅａｄＣａｓ９−ＦｏｋＩを使用する遺伝子挿入法の模式的表示である。図２４は、配列番号２０６を開示する。
【図２５】実施例２〜４に記載の標的化遺伝子挿入に使用された様々な方法の効率の比較である。
【図２６】実施例４に記載の実験に関する。図２６は、シームレス突然変異誘発の模式図である。
【図２７】実施例４に記載の実験に関する。シームレス突然変異誘発の第１のステップ：ホモロジーアームを使用する標的配列中への耐性マーカーを含有するカセットの組換えの模式図である。
【図２８】実施例４に記載の実験に関する。標的配列中に組み込まれるカセット：ヌクレアーゼ結合部位及びヌクレアーゼ切断部位により両側でフランキングされた耐性マーカーの模式図である。
【図２９】実施例４に記載の実験に関する。シームレス突然変異誘発の第２のステップ：耐性マーカーの除去及びシームレスに生成された突然変異をもたらす切断部位（図２８に示される）におけるヌクレアーゼ消化及び後続のライゲーションの模式図である。
【図３０】種々のシーケンシングされた種、例として、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＨＴＣＣ５０１５、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、スルフロスピリラム属種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、ルミノバクター属種（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ８７、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１＿１＿４７、バクテロイデス・オーラル・タクソン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ）２７４株Ｆ００５８、及びウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１０〜８０）が含まれる。
【図３１】種々のシーケンシングされた細菌、例として、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）、ツリシモナス・ムリス（Ｔｕｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｍｕｒｉｓ）、サリニビブリオ・シャルメンシス（Ｓａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｓｈａｒｍｅｎｓｉｓ）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）、モリテラ属種（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｓｐ．）、エンドゾイコモナス属種（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ  ｓｐ．）、タミルナドゥイバクター・サリナス（Ｔａｍｉｌｎａｄｕｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｎｕｓ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、ルミノバクター・アミロフィラス（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、ビブリオ・サガイエンシス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｓａｇａｉｅｎｓｉｓ）、アルコバクター・ポルシナス（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｐｏｒｃｉｎｕｓ）、デスルホフスティス属種（Ｄｅｓｕｌｆｏｆｕｓｔｉｓ  ｓｐ．）、及びスクシナティモナス属種（Ｓｕｃｃｉｎａｔｉｍｏｎａｓ  ｓｐ．）からのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列（配列番号８１〜９７）が含まれる。
【図３２】ＭＨ０２４５＿ＧＬ０１６１８３０＿１からのＣａｓ９タンパク質に関して実施例８に記載の実験において使用されたガイドＲＮＡ配列、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列、及びｃｒＲＮＡ配列のヌクレオチド配列（配列番号１０１〜１０３）が含まれる。
【図３３Ａ−Ｂ】図３３Ａは、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質により生成される例示的な４−ヌクレオチド５’オーバーハングを示す。図３３Ａは、配列番号２５９を開示する。図３３Ｂは、例示的なＩＩ−Ｂ型ｃａｓオペロンを示す。ｃａｓ９、ｃａｓ１、ｃａｓ２、及びｃａｓ４遺伝子を矢印により表す。ＣＲＩＳＰＲアレイをオペロンの下流に標識する。
【図３４Ａ−Ｃ】実施例７に記載の実験に関する。図３４Ａは、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）からのＣａｓ９タンパク質（ＦｎＣａｓ９）のインビトロヌクレアーゼ活性を実証する電気泳動ゲル画像を示す。図３４Ｂは、ＦｎＣａｓ９が５’オーバーハングを有する粘着末端を生成することを示すサンガーシーケンシングプロットを示す。図３４Ｂは、配列番号２０４〜２０５及び２８４をそれぞれ出現の順に開示する。図３４Ｃは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質（ＳｐｙＣａｓ９）及びＦｎＣａｓ９間の突然変異パターンのＲＩＭＡ比較を示す。
【図３５Ａ−Ｃ】実施例８に記載の実験に関する。図３５Ａは、配列腸内メタゲノムＭＨ０２４５からのＣａｓ９タンパク質（ＭＨＣａｓ９）のインビトロヌクレアーゼ活性を実証する電気泳動ゲル画像を示す。図３５Ｂは、ＭＨＣａｓ９が５’オーバーハングを有する粘着末端を生成することを示すサンガーシーケンシングプロットを示す。図３５Ｂは、配列番号２６０〜２６２をそれぞれ出現の順に開示する。図３５Ｃは、セル１（Ｃｅｌｌ１）アッセイによりバリデートされたＨＥＫ２９３−ＲＥＭＩＮＤＥＬ細胞におけるＭＨＣａｓ９活性を実証する電気泳動ゲル画像を示す。
【図３６Ａ−Ｃ】実施例８に記載の実験に関する。図３６Ａは、ＭＨＣａｓ９からのｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの配列を示す。図３６Ａは、配列番号２６３を開示する。図３６Ｂは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡ二次構造の模式図を示す。図３６Ｃは、スルフロスピリラム属種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ（ｓｓＣａｓ９）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）（ＷｓＣａｓ９）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（ＬｐＣａｓ９）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）（ＦｎＣａｓ９）、及びＭＨ０２４５（ＭＨＣａｓ９）からのＣａｓ９タンパク質を有する切り取られた系統樹を示す。
【図３７】本明細書に記載の種々の細菌種からのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列から作成された系統樹を示す。配列アラインメントは、ＭＵＳＣＬＥアルゴリズム、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ｖ．９を使用して実施した。
【図３８】カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）属の種々の種からのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列から作成された系統樹である。配列アラインメントは、ＭＵＳＣＬＥアルゴリズム、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ｖ．９を使用して実施した。
【図３９】本明細書に記載の種々のＣａｓ９タンパク質のためのｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１０４〜１４７）が含まれる。
【図４０Ａ】本明細書に記載の種々のＣａｓ９タンパク質のためのｔｒａｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１４８〜１７１）が含まれる。
【図４０Ｂ】Ｃａｓ９タンパク質、ｃｒＲＮＡ（＋）、ｃｒＲＮＡ（−）及びｔｒａｃｒＲＮＡの種々の組合せが含まれる。
【図４１Ａ−Ｔ】実施例９に記載の方法により設計された種々のｓｇＲＮＡ（「キメラｇＲＮＡ」とも称される）、例として、ｓｇＲＮＡの配列（配列番号１７２〜１９１）を説明する。図４１Ａはまたヘアピン配列を配列番号２６４として開示する。
【図４２Ａ−Ｌ】実施例９に記載のｓｇＲＮＡの最適化及びトリミング、並びにさらなる改変のために考えられる標的部位を説明する。図４２Ａは、配列番号２６５〜２６６をそれぞれ出現の順に開示する。図４２Ｂは、配列番号２６７〜２６８をそれぞれ出現の順に開示する。図４２Ｃは、配列番号２６９及び１７３をそれぞれ出現の順に開示する。図４２Ｄは、配列番号２７０〜２７１をそれぞれ出現の順に開示する。図４２Ｅは、配列番号１７８及び２７２をそれぞれ出現の順に開示する。図４２Ｆは、配列番号１７９及び２７３をそれぞれ出現の順に開示する。図４２Ｇは、配列番号１８０及び２７４をそれぞれ出現の順に開示する。図４２Ｈは、配列番号１７６及び２７５をそれぞれ出現の順に開示する。図４２Ｉは、配列番号１７４及び２７６をそれぞれ出現の順に開示する。図４２Ｊは、配列番号１９１及び２７７をそれぞれ出現の順に開示する。図４２Ｋは、配列番号１８４及び２７８をそれぞれ出現の順に開示する。図４２Ｌは、配列番号２７９〜２８０をそれぞれ出現の順に開示する。
【図４３】ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の二方向性発現構築物を説明する。挿入図に示されるとおり、トップ鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含まない単一ガイドＲＮＡのためのｃｒＲＮＡ及びスペーサーを発現する。ボトム鎖は、ｔｒａｃｒＲＮＡを含む二重ガイドＲＮＡのためのｃｒＲＮＡ及びスペーサーを発現する。図４３は、配列番号１３７、２８１及び１９１をそれぞれ出現の順に開示する。
【図４４】本明細書に記載のＣａｓ９タンパク質のための単一ガイドＲＮＡ足場の予測二次構造を示す。図４４は、配列番号１３７、１３９、２８２、１２２、１１０、１２９、１２０、１２４及び１０４をそれぞれ出現の順に開示する。
【図４５】４つの異なる遺伝子操作ＲＮＡ、及びＭＨＣａｓ９によるそれぞれの切断効率を一般に記載する。
【図４６】３つの異なるＣａｓ９系ＳｐｙＣａｓ９、Ｃｌ１Ｃａｓ９及びＭＨＣａｓ９による長さ１９、２０、２１、２２及び２３のガイドＲＮＡの切断効率及び機能性を実証する。
【図４７】種々のシーケンシングされた細菌、例として、アルコバクター・スキロウイイ（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｋｉｒｒｏｗｉｉ）、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）、フランシセラ・ヒスパニエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ）、及びパレンドゾイコモナス・ハリクロナエ（Ｐａｒｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｉｃｌｏｎａｅ）からのＣａｓ９タンパク質のアミノ酸配列（配列番号１９２〜１９５）が含まれる。
【図４８】本明細書に記載の種々のＣａｓ９タンパク質のためのｃｒＲＮＡのヌクレオチド配列（配列番号１９６〜２０３）が含まれる。
【図４９Ａ−Ｂ】実施例１１に関する。図４９Ａは、Ｃａｓ９タンパク質のＰＡＭ配列を決定する例示的な方法を示す。図４９Ａは、配列番号２８３を開示する。図４９Ｂは、図４９Ａに示される方法により決定されたＳｐＣａｓ９（上段）及びＭＨＣａｓ９（下段）のための好ましいＰＡＭ配列を示す。
【図５０Ａ−Ｂ】実施例１２に関する。図５０Ａは、正確に修復されるＣａｓ９切断の模式図を示す。図５０Ｂは、不正確な修復及び改変の増加をもたらすエキソヌクレアーゼ、例えば、ＴＲＥＸ２又はＡｒｔｅｍｉｓによる末端プロセシングとの組合せのＣａｓ９切断の模式図を示す。
【図５１Ａ−Ｂ】実施例１２に関する。図５１Ａは、３つの異なるガイドＲＮＡを用いた、種々のＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９、ＦｎＣａｓ９、Ｃｌ１Ｃａｓ９、又はＭＨＣａｓ９）への末端プロセシング酵素（ＦｎＣａｓ４又はＴＲＥＸ２）の添加の効果を試験する方法の概要を示す。図５１Ｂは、モック末端プロセシング酵素、ＦｎＣａｓ４、又はＴＲＥＸ２のいずれかを用いた、及び３つのガイドＲＮＡのそれぞれを用いたＣａｓ９タンパク質のそれぞれについての結果を示す。
【図５２Ａ−Ｃ】実施例１３に関する。図５２Ａ、５２Ｂ、及び５２Ｃは、それぞれ、ＳｐＣａｓ９、Ｃｌ１Ｃａｓ９、又はＭＨＣａｓ９により生成された異なるタイプの突然変異を、３つ全てのＣａｓ９タンパク質が同一配列において切断した場合で示す。図５２Ａ〜Ｃは、配列番号２９０を開示する。
【図５３Ａ−Ｂ】実施例１３に関する。図５３Ａは、平滑又は単一ヌクレオチドオーバーハングを生成する、ガイドＲＮＡと複合体化している二本鎖ＤＮＡ配列を切断するＩＩ−Ａ型Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインの模式図を示す。図５３Ｂは、３又は４ヌクレオチドオーバーハングを有する付着末端を生成する、ガイドＲＮＡとの複合体化している二本鎖ＤＮＡ配列を切断するＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインの模式図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００９２】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、標的化二本鎖分解を形成するそれらの能力のため、遺伝子編集において広範に使用される。Ｃａｓ９タンパク質は開裂時に平滑末端を生成し、それが標的配列の挿入及び／又は改変について粘着末端と比較して低い特異性を提供することが公知である。粘着末端を生成し得るＣａｓ９タンパク質は、ｓｔｉＣａｓ９とも称され、本明細書に記載される。標的配列の挿入及び／又は改変のためにｓｔｉＣａｓ９タンパク質を使用する利点は、本明細書に記載される。
【００９３】
本開示は、非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系；ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む真核細胞；標的配列の部位特異的改変を提供する方法；細胞中の染色体中に目的配列を導入する方法；及び細胞中の標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドを改変する方法を提供する。
【００９４】
定義
本明細書において使用される「ａ」又は「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本明細書及び特許請求の範囲において本明細書において使用され、語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」と同時に使用される場合、語「ａ」又は「ａｎ」は、１つ又は２つ以上を意味し得る。本明細書において使用される「別の」又は「さらなる」は、少なくとも第２のもの以上を意味し得る。
【００９５】
本出願全体にわたり、用語「約」は、値が、その値を決定するために用いられている方法／装置についての誤差の固有の変動、又は試験対象間で存在する変動を含むことを示すために使用される。典型的には、この用語は、状況に応じておよそ又は１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％又は２０％未満の変動性を包含することを意味する。
【００９６】
特許請求の範囲における用語「又は」の使用は、代替物のみを指すと明示されない限り、又はその代替物が相互に排他的でない限り、「及び／又は」を意味するために使用されるが、本開示は、代替物のみ及び「及び／又は」を指す定義を支持する。
【００９７】
本明細書及び特許請求の範囲において使用される語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（及び含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（及び有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「有する（ｈａｖｅ）」及び「有する（ｈａｓ）」）、「例として（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（及び例として（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」及び「挙げられる（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）又は「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（及び含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」及び「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」）は、包含的又はオープンエンドであり、追加の引用されない要素も方法ステップも排除するものではない。本明細書において考察される任意の実施形態は、本開示の任意の方法、系、宿主細胞、発現ベクター、及び／又は組成物に関して実行することができることが企図される。さらに、本開示の組成物、系、宿主細胞、及び／又はベクターを使用して本開示の方法及びタンパク質を達成することができる。
【００９８】
用語「例えば」及びその対応する略語「ｅ．ｇ．（イタリックかそうでないかを問わない）」の使用は、引用される規定の用語が、特に明示されない限り、参照され、又は引用される具体例に限定されるものではない本開示の代表例及び実施形態であることを意味する。
【００９９】
「核酸」、「核酸分子」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「オリゴヌクレオチド」、又は「ポリヌクレオチド」は、共有結合ヌクレオチドを含むポリマー化合物を意味する。用語「核酸」には、リボ核酸（ＲＮＡ）及びデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）が含まれ、その両方とも一本鎖でも二本鎖でもよい。ＤＮＡとしては、限定されるものではないが、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ、プラスミド又はベクターＤＮＡ、及び合成ＤＮＡが挙げられる。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に開示のポリペプチドのいずれか１つをコードするポリヌクレオチドを提供し、例えば、Ｃａｓタンパク質又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを対象とする。
【０１００】
「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするヌクレオチドの集合体を指し、それにはｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡ核酸分子が含まれる。「遺伝子」は、コード配列に先行（５’非コード配列）及び後行（３’非コード配列）する調節配列として作用し得る核酸断片も指す。
【０１０１】
核酸分子は、温度及び溶液イオン強度の適切な条件下で核酸分子の一本鎖形態が他の核酸分子にアニールし得る場合、別の核酸分子、例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、又はＲＮＡに「ハイブリダイズ可能である」又は「ハイブリダイズされる」。ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は周知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ（１９８９）、特にそのＣｈａｐｔｅｒ  １１及びＴａｂｌｅ  １１．１（参照により全体として本明細書に組み込まれる）に例示されている。温度及びイオン強度の条件は、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェンシー」を決定する。ストリンジェンシー条件は、中程度に類似する断片、例えば、遠縁生物からの相同配列を、高度に類似する断片、例えば、密接に関連する生物からの機能的酵素を複製する遺伝子に対してスクリーニングするように調整することができる。相同核酸の予備スクリーニングのため、５５℃のＴｍに対応する低ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、例えば、５×ＳＳＣ、０．１％のＳＤＳ、０．２５％のミルク、及びホルムアミドなし；又は３０％のホルムアミド、５×ＳＳＣ、０．５％のＳＤＳを使用することができる。中程度のストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、より高いＴｍ、例えば、４０％のホルムアミドと５×又は６×ＳＣＣに対応する。高いストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件は、最大Ｔｍ、例えば、５０％のホルムアミド、５×又は６×ＳＣＣに対応する。ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的配列を含有することを要求するが、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーに応じて塩基間のミスマッチが考えられる。
【０１０２】
用語「相補的」は、互いにハイブリダイズし得るヌクレオチド塩基間の関係を記載するために使用される。例えば、ＤＮＡに関して、アデノシンはチミンに相補的であり、シトシンはグアニンに相補的である。したがって、本開示には、本明細書に開示され、又は使用される完全配列に相補的な単離核酸断片及びそれらと実質的に類似する核酸配列も含まれる。
【０１０３】
ＤＮＡ「コード配列」は、適切な調節配列の制御下で配置される場合、インビトロ又はインビボで細胞中で転写され、ポリペプチドに翻訳される二本鎖ＤＮＡ配列である。「好適な調節配列」は、コード配列の上流（５’非コード配列）に、その中に、又はその下流（３’非コード配列）に局在し、転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性、又は関連コード配列の翻訳に影響するヌクレオチド配列を指す。調節配列としては、プロモーター、翻訳リーダー配列、イントロン、ポリアデニル化認識配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造を挙げることができる。コード配列の境界は、５’（アミノ）末端における開始コドン及び３’（カルボキシル）末端における翻訳終止コドンにより決定される。コード配列としては、限定されるものではないが、原核生物配列、ｍＲＮＡからのｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ配列、及びさらには合成ＤＮＡ配列を挙げることができる。コード配列が真核細胞中の発現を目的とされる場合、ポリアデニル化シグナル及び転写終結配列は、通常、コード配列に対して３’に局在させる。
【０１０４】
「オープンリーディングフレーム」は、ＯＲＦと略され、翻訳開始シグナル又は開始コドン、例えば、ＡＴＧ又はＡＵＧ、及び終止コドンを含み、ポリペプチド配列に潜在的に翻訳され得る長さの核酸配列、ＤＮＡ、ｃＤＮＡ又はＲＮＡのいずれかを意味する。
【０１０５】
用語「相同組換え」は、外来ＤＮＡ配列の別のＤＮＡ分子中への挿入、例えば、染色体中のベクターの挿入を指す。好ましくは、ベクターは、相同組換えについて特異的な染色体部位を標的化する。特異的相同組換えのため、ベクターは、相補的結合及び染色体中へのベクターの取り込みを可能とするために染色体の配列と相同性の十分に長い領域を含有する。より長い相補性の領域、及びより大きい配列類似性の程度は、相同組換えの効率を増加させ得る。
【０１０６】
当分野において公知の方法を使用して本開示によるポリヌクレオチドを伝播させることができる。好適な宿主系及び成長条件を確立したら、組換え発現ベクターを伝播させ、多量に調製することができる。本明細書に記載の、使用することができる発現ベクターとしては、限定されるものではないが、以下のベクター又はそれらの誘導体が挙げられる：ヒト又は動物ウイルス、例えば、ワクシニアウイルス又はアデノウイルス；昆虫ウイルス、例えば、バキュロウイルス；酵母ベクター；バクテリオファージベクター（例えば、ラムダ）、並びにプラスミド及びコスミドＤＮＡベクター。
【０１０７】
本明細書において使用される「プロモーター」、「プロモーター配列」、又は「プロモーター領域」は、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、下流コード又は非コード配列の転写の開始に関与し得るＤＮＡ調節領域／配列を指す。本開示の一部の例において、プロモーター配列は、転写開始部位を含み、バックグラウンドを超えて検出可能なレベルにおいて転写を開始するために使用される最小数の塩基又はエレメントを含むように上流に伸びる。一部の実施形態において、プロモーター配列は、転写開始部位、及びＲＮＡポリメラーゼの結合を担うタンパク質結合ドメインを含む。真核生物プロモーターは、常にではないが、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有することが多い。種々のプロモーター、例として、誘導性プロモーターを使用して本開示の種々のベクターをドライブすることができる。
【０１０８】
「ベクター」は、宿主細胞中に核酸をクローニングし、及び／又は移行させる任意の手段である。ベクターは、別のＤＮＡセグメントを付着させて付着セグメントの複製を生じさせることができるレプリコンであり得る。「レプリコン」は、インビボでＤＮＡ複製の自律的単位として機能する、すなわち、それ自体の制御下で複製し得る任意の遺伝子エレメント（例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、染色体、ウイルス）である。本開示の一部の実施形態において、ベクターは、例えば、非対称分配により多数の細胞世代後に細胞の集団から除去／消失されるエピソーマルベクターである。用語「ベクター」には、インビトロ、エクスビボ、又はインビボで細胞中に核酸を導入するためのウイルス及び非ウイルス手段の両方が含まれる。当分野において公知の多数のベクターを使用して核酸を操作し、応答エレメント及びプロモーターを遺伝子中に取り込むことなどができる。考えられるベクターとしては、例えば、プラスミド又は改変ウイルス、例として、例えば、バクテリオファージ、例えば、ラムダ誘導体、又はプラスミド、例えば、ＰＢＲ３２２若しくはｐＵＣプラスミド誘導体、又はＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔベクターが挙げられる。例えば、好適ベクター中への、応答エレメント及びプロモーターに対応するＤＮＡ断片の挿入は、相補的粘着末端を有する選択ベクター中に適切なＤＮＡ断片をライゲートすることにより達成することができる。或いは、ＤＮＡ分子の末端を酵素的に改変することができ、又はヌクレオチド配列（リンカー）をＤＮＡ末端中にライゲートすることにより任意の部位を産生することができる。このようなベクターは、細胞ゲノム中にマーカーを取り込んだ細胞の選択を提供する選択マーカー遺伝子を含有するように遺伝子操作することができる。このようなマーカーは、マーカーを取り込み、そのマーカーによりコードされるタンパク質を発現する宿主細胞の同定及び／又は選択を可能とする。
【０１０９】
ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、細胞、及び生存動物対象における広範な遺伝子送達用途において使用されている。使用することができるウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックス、バキュロウイルス、ワクシニア、単純ヘルペス、エプスタインバール、アデノウイルス、ジェミニウイルス、及びカリモウイルスベクターが挙げられる。非ウイルスベクターとしては、限定されるものではないが、プラスミド、リポソーム、荷電脂質（ｃｙｔｏｆｅｃｔｉｎ）、ＤＮＡ−タンパク質複合体、及び生体ポリマーが挙げられる。ベクターは、核酸に加え、核酸移行結果（移行する組織、発現の継続期間など）の選択、計測、及びモニタリングにおいて有用な１つ以上の調節領域、及び／又は選択マーカーも含み得る。
【０１１０】
ベクターは、周知の方法、例として、限定されるものではないが、形質移入、形質導入、細胞融合、及びリポフェクションにより所望の宿主細胞中に導入することができる。ベクターは、種々の調節エレメント、例として、プロモーターを含み得る。一部の実施形態において、ベクター設計は、Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃａｓ９  ａｓ  ａ  ｖｅｒｓａｔｉｌｅ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｙ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０：９５７−６３（２０１３）により設計された構築物をベースとすることができる。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載のポリヌクレオチドのいずれかを含む発現ベクター、例えば、Ｃａｓタンパク質又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。一部の実施形態において、本開示は、Ｃａｓ９タンパク質又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを提供する。
【０１１１】
用語「プラスミド」は、細胞の中央代謝の一部でない遺伝子を担持することが多く、通常、環状二本鎖ＤＮＡ分子の形態である外部染色体エレメントを指す。このようなエレメントは、任意の資源に由来する自律複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列、線状、環状、又はスーパーコイルドの一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ又はＲＮＡであり得、その中では多数のヌクレオチド配列が、適切な３’非翻訳配列とともに選択遺伝子産物についてのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を細胞中に導入し得るユニーク構築物中に結合し、又は組換えされている。
【０１１２】
本明細書において使用される「形質移入」は、細胞中への外因性核酸分子、例として、ベクターの導入を意味する。「形質移入」細胞は、細胞内部の外因性核酸分子を含み、「形質転換」細胞は、細胞内の外因性核酸分子が細胞の表現型変化を誘導する細胞である。形質移入核酸分子は、宿主細胞のゲノムＤＮＡ中に組み込むことができ、及び／又は一時的若しくは長期間にわたり染色体外で細胞により維持させることができる。外因性核酸分子又は断片を発現する宿主細胞又は生物は、「組換え」、「形質転換」、又は「トランスジェニック」生物と称される。一部の実施形態において、本開示は、本明細書に記載の発現ベクターのいずれか、例えば、Ｃａｓタンパク質又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態において、本開示は、Ｃａｓ９タンパク質又はそのバリアントをコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
【０１１３】
用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、それとしては、コード及び非コードアミノ酸、化学的若しくは生化学的改変又は誘導体化アミノ酸、並びに改変ペプチド骨格を有するポリペプチドを挙げることができる。
【０１１４】
本明細書において使用される「アミノ酸」は、カルボキシル（−ＣＯＯＨ）及びアミノ（−ＮＨ２）基の両方を含有する化合物を指す。「アミノ酸」は、天然及び非天然、すなわち、合成アミノ酸の両方を指す。３文字及び１文字略記を有する天然アミノ酸としては、アラニン（Ａｌａ；Ａ）；アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）；アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）；アスパラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）；システイン（Ｃｙｓ；Ｃ）；グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）；グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）；グリシン（Ｇｌｙ；Ｇ）；ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）；イソロイシン（Ｉｌｅ；Ｉ）；ロイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）；リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）；メチオニン（Ｍｅｔ；Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）；プロリン（Ｐｒｏ；Ｐ）；セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）；トレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）；トリプトファン（Ｔｒｐ；Ｗ）；チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）；及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）が挙げられる。
【０１１５】
「アミノ酸置換」は、野生型又は天然発生アミノ酸の、その野生型又は天然発生アミノ酸に対して異なるアミノ酸によるそのアミノ酸残基における１つ以上の置換を含むポリペプチド又はタンパク質を指す。置換アミノ酸は、合成又は天然発生アミノ酸であり得る。一部の実施形態において、置換アミノ酸は、Ａ、Ｒ、Ｎ、Ｄ、Ｃ、Ｑ、Ｅ、Ｇ、Ｈ、Ｉ、Ｌ、Ｋ、Ｍ、Ｆ、Ｐ、Ｓ、Ｔ、Ｗ、Ｙ、及びＶからなる群から選択される天然発生アミノ酸である。置換突然変異体は、略記体系を使用して記載することができる。例えば、５番目のアミノ酸残基が置換されている置換突然変異は「Ｘ５Ｙ」と略記することができ、「Ｘ」は、置き換えられるべき野生型又は天然発生アミノ酸であり、「５」は、タンパク質又はポリペプチドのアミノ酸配列内のアミノ酸残基位置であり、「Ｙ」は、置換、又は非野生型又は非天然発生アミノ酸である。
【０１１６】
「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又は核酸は、その天然環境から取り出された分子である。「単離」ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、又は核酸は賦形剤、例えば、希釈剤又は助剤と配合することができ、依然として単離されているとみなされることも理解すべきである。
【０１１７】
用語「組換え」は、核酸分子、ペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に関して使用される場合、天然に存在することが公知でない遺伝子材料の新たな組合せのそれら、又はその組合せから生じるそれらを意味する。組換え分子は、組換え技術の分野において利用可能な周知技術のいずれか、例として、限定されるものではないが、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、遺伝子スプライシング（例えば、制限エンドヌクレアーゼを使用）、及び核酸分子、ペプチド、又はタンパク質の固相合成により産生することができる。
【０１１８】
用語「ドメイン」は、ポリペプチド又はタンパク質に関して使用される場合、タンパク質中の区別される機能的及び／又は構造的単位を意味する。ドメインは、タンパク質の全体的な役割に寄与する特定の機能又は相互作用を担う場合がある。ドメインは、種々の生物学的コンテクストで存在し得る。類似のドメインは、異なる機能を有するタンパク質中で見出すことができる。或いは、低い配列同一性（すなわち、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２０％未満、約１０％未満、約５％未満、又は約１％未満の配列同一性）を有するドメインは、同一の機能を有し得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ドメインは、１Ｅ−５のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチする。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ドメインは、１Ｅ−１０のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチする。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ドメインは、ＲｕｖＣドメインである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ドメインは、ＨＮＨドメインである。
【０１１９】
本明細書において使用される用語「配列類似性」又は「％類似性」は、核酸配列間又はアミノ酸配列間の同一性又は対応性の程度を指す。本明細書において使用される「配列類似性」は、１つ以上のヌクレオチド塩基の変化が１つ以上のアミノ酸の置換をもたらすが、ＤＮＡ配列によりコードされるタンパク質の機能的特性に影響しない核酸配列を指す。「配列類似性」は、得られる転写産物の機能的特性に実質的に影響しない核酸の改変、例えば、１つ以上のヌクレオチド塩基の欠失又は挿入も指す。したがって、本開示は、規定の例示的な配列よりも多くのものを包含することが理解される。提案される改変のそれぞれは、コードされる産物の生物学的活性の保持の決定と同様に十分に当分野における定型的な技能の範囲内である。
【０１２０】
さらに、当業者は、本開示により包含される類似の配列が、ストリンジェントな条件下で本明細書に例示される配列とハイブリダイズするそれらの能力によっても定義されることを認識する。本開示の類似の核酸配列は、ＤＮＡ配列が本明細書に開示の核酸のＤＮＡ配列と少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又は少なくとも９９％同一である核酸である。本開示の類似の核酸配列は、ＤＮＡ配列が本明細書に開示の核酸のＤＮＡ配列と約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一である核酸である。
【０１２１】
本明細書において使用される「配列類似性」は、アミノ酸の約４０％超が同一であり、又はアミノ酸の約６０％超が機能的に同一である２つ以上のアミノ酸配列を指す。機能的に同一又は機能的に類似のアミノ酸は、化学的に類似の側鎖を有する。例えば、アミノ酸は、機能的類似性に従って以下のようにグループ分けすることができる：
正荷電側鎖：Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ；
負荷電側鎖：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
極性非荷電側鎖：Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
疎水性側鎖：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ；
その他：Ｃｙｓ、Ｇｌｙ、Ｐｒｏ。
【０１２２】
一部の実施形態において、本開示の類似のアミノ酸配列は、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９９％同一であるアミノ酸を有する。
【０１２３】
一部の実施形態において、本開示の類似のアミノ酸配列は、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％機能的に同一であるアミノ酸を有する。一部の実施形態において、本開示の類似のアミノ酸配列は、約４０％、少なくとも約４０％、約４５％、少なくとも約４５％、約５０％、少なくとも約５０％、約５５％、少なくとも約５５％、約６０％、少なくとも約６０％、約６５％、少なくとも約６５％、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％同一であるアミノ酸を有する。
【０１２４】
一部の実施形態において、本開示の類似のアミノ酸配列は、約６０％、少なくとも約６０％、約６５％、少なくとも約６５％、約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％、又は約１００％機能的に同一であるアミノ酸を有する。
【０１２５】
配列類似性は、当分野における定型的な方法を使用する配列アラインメント、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＭＵＳＣＬＥ、Ｃｌｕｓｔａｌ（例として、ＣｌｕｓｔａｌＷ及びＣｌｕｓｔａｌＸ）、及びＴ−Ｃｏｆｆｅｅ（変種、例えば、Ｍ−Ｃｏｆｆｅｅ、Ｒ−Ｃｏｆｆｅｅ、及びＥｘｐｒｅｓｓｏなどを含む）などにより決定される。
【０１２６】
核酸配列又はアミノ酸配列に関する用語「配列同一性」又は「％同一性」は、配列を規定の比較窓にわたりアラインした場合に同一である比較配列中の残基の割合を指す。一部の実施形態において、２つ以上の配列の規定の一部のみをアラインして配列同一性が決定される。一部の実施形態において、２つ以上の配列の規定のドメインのみをアラインして配列類似性が決定される。比較窓は、配列をアラインし、比較することができる少なくとも１０個〜１０００個超の残基、少なくとも２０〜約１０００個の残基、又は少なくとも５０〜５００個の残基のセグメントであり得る。配列同一性の決定のためのアラインメントの方法は周知であり、公的に利用可能なデータベース、例えば、ＢＬＡＳＴを使用して実施することができる。「パーセント同一性」又は「％同一性」は、アミノ酸配列を指す場合、当分野において公知の方法により決定することができる。例えば、一部の実施形態において、２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７（１９９３）のとおり修正されたＫａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）のアルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、ＢＬＡＳＴプログラム、例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２１５：４０３−４１０（１９９０）に記載のＢＬＡＳＴ＋又はＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム中に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、プログラム、例えば、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長さ＝３などを用いて実施して本開示のタンパク質分子と相同であるアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間のギャップが存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴをＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２５（１７）：３３８９−３４０２（１９９７）に記載のとおり利用することができる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。
【０１２７】
一部の実施形態において、ポリペプチド又は核酸分子は、それぞれ参照ポリペプチド又は核酸分子（又は参照ポリペプチド若しくは核酸分子の断片）と７０％、少なくとも７０％、７５％、少なくとも７５％、８０％、少なくとも８０％、８５％、少なくとも８５％、９０％、少なくとも９０％、９５％、少なくとも９５％、９７％、少なくとも９７％、９８％、少なくとも９８％、９９％、又は少なくとも９９％又は１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、ポリペプチド又は核酸分子は、それぞれ参照ポリペプチド又は核酸分子（又は参照ポリペプチド若しくは核酸分子の断片）と約７０％、少なくとも約７０％、約７５％、少なくとも約７５％、約８０％、少なくとも約８０％、約８５％、少なくとも約８５％、約９０％、少なくとも約９０％、約９５％、少なくとも約９５％、約９７％、少なくとも約９７％、約９８％、少なくとも約９８％、約９９％、少なくとも約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。
【０１２８】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系
一部の実施形態において、本開示は、（ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（「付着末端Ｃａｓ９」又は「ｓｔｉＣａｓ９」）；及び（ｂ）ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチドを含み；複合体は天然に存在しない非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【０１２９】
一般に、ＣＲＩＳＰＲ又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、標的配列の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメント（内因性ＣＲＩＳＰＲ系に関してプロトスペーサーとも称される）により特徴付けされる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成に関して、「標的配列」は、ガイドポリヌクレオチドが標的化するように、例えば、相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列及びガイドポリヌクレオチド間のハイブリダイゼーションがＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列に対する相補性が開裂活性に重要であり得るガイドポリヌクレオチドのセクションは、本明細書においてガイド配列と称される。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得、目的標的遺伝子座内に局在し得る。一部の実施形態において、標的配列は、細胞の核又は細胞質中に局在する。一部の実施形態において、標的配列は、染色体上に局在する（ＴＳＣ）。一部の実施形態において、標的配列は、ベクター上に局在する（ＴＳＶ）。
【０１３０】
本明細書に記載のＣａｓタンパク質は、とりわけ、ゲノム編集、遺伝子調節、遺伝子回路構築、及び機能的ゲノミクスに使用することができるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の構成成分である。Ｃａｓ１及びＣａｓ２タンパク質は現在同定されている全てのＣＲＩＳＰＲ系にユニバーサルであると考えられている一方、Ｃａｓ３、Ｃａｓ９及びＣａｓ１０タンパク質は、それぞれＩ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系に特異的であると考えられている。
【０１３１】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（ＩＩ型系）についての最初の公開後、Ｃａｓ９バリアントが一連の細菌種において同定され、番号は機能的に特徴付けされた。例えば、Ｃｈｙｌｉｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｙｐｅ  ＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２（１０）：６０９１−６１０５（２０１４）、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９”，Ｎａｔｕｒｅ  ５２０（７５４６）：１８６−９１（２０１５）、及びＥｓｖｅｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｏｒｔｈｏｇｏｎａｌ  Ｃａｓ９  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｆｏｒ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｄｉｔｉｎｇ”，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  １０（１１）：１１１６−１１２１（２０１３）参照、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１３２】
本開示は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の新規エフェクタータンパク質を包含し、そのうちＣａｓ９が例示的なエフェクタータンパク質である。したがって、用語「Ｃａｓ９」、「Ｃａｓ９タンパク質」及び「Ｃａｓ９エフェクタータンパク質」は、互換的であり、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系において使用される場合に粘着末端を提供し得るエフェクタータンパク質を記載するために本明細書において使用される。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９を指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、遺伝子操作Ｃａｓ９バリアント、例えば、ｄｅａｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ、Ｃａｓ９ｎＤ１０Ａ−ＦｏｋＩ、及びＣａｓ９ｎＨ８４０Ａ−ＦｏｋＩなどを指す。
【０１３３】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、インビトロ、インビボ、又はエクスビボ用途において原核又は真核細胞中で機能的である。
【０１３４】
用語Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、一般に、ＲｕｖＣ及びＨＮＨヌクレアーゼドメインの両方を有するＣａｓ９様機能を有するエフェクタータンパク質を指し得る。一部の実施形態において、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインは、それぞれ、二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。したがって、例えば、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインが同一位置におけるそれぞれの鎖を開裂させる場合、開裂の結果は、平滑末端を有する二本鎖標的ＤＮＡである。ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインが異なる位置におけるそれぞれの鎖を開裂させる（すなわち、「オフセット」において切断する）場合、開裂の結果は、オーバーハングを有する二本鎖標的ＤＮＡである。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは、３−ヌクレオチドオフセットにおいて切断する。実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは、４−ヌクレオチドオフセットにおいて切断する。実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは、５−ヌクレオチドオフセットにおいて切断する。実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、又は約４０ヌクレオチドのオフセットにおいて切断する。
【０１３５】
一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインを有するＣａｓ９を指し、ＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインは、二本鎖標的ＤＮＡのそれぞれの鎖上の異なる位置において開裂させる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＲｕｖＣドメインは、ＰＡＭから約−１０、約−９、約−８、約−７、又は約−６ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖（例えば、「非標的鎖」と称することができる）を開裂させ、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＨＮＨドメインは、ＰＡＭから−５、約−４、約−３、約−２、又は約−１ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの他方の鎖（例えば、「標的鎖」と称することができる）を開裂させる。
【０１３６】
一部の実施形態において、ＲｕｖＣドメインは、ＰＡＭから約−８ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。一部の実施形態において、ＲｕｖＣドメインは、ＰＡＭから約−７ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。一部の実施形態において、ＲｕｖＣドメインは、ＰＡＭから約−６ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。一部の実施形態において、ＨＮＨドメインは、ＰＡＭから約−４ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。一部の実施形態において、ＨＮＨドメインは、ＰＡＭから約−３ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。一部の実施形態において、ＨＮＨドメインは、ＰＡＭから約−２ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。
【０１３７】
一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＨＭＭＥＲ検索、具体的には、プログラムｈｍｍｓｃａｎ（ＨＭＭＥＲバージョン３．１ｂ２）により同定されるＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーを有するＣａｓ９を指す。本開示はまた、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系と関連するエフェクタータンパク質の同定及び遺伝子操作に関する。一部の実施形態において、エフェクタータンパク質は、単一サブユニットエフェクターモジュールを含む。一部の実施形態において、野生型Ｃａｓ９エフェクター又はＣａｓ９タンパク質の遺伝子操作バージョンは、１つ又は複数の機能ドメイン、例えば、核局在化シグナル（ＮＬＳ）及びＦｏｋＩヌクレアーゼなどに融合している。本開示は、新たなＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を予測し、その構成成分を同定するためのコンピュータ計算法及びアルゴリズムを包含する。
【０１３８】
一部の実施形態において、新規ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座を同定するコンピュータ計算法は、下記の、及びＳｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  １５，１６９−１８２（２０１７）に既に記載の方法を含む。所与のヌクレオチド配列中のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の存在及び局在は、例えば、０．０１のＥ値カットオフを使用するヌクレオチド配列に対するＴＢＬＡＳＴＮにおいてシードとして公知のＣａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ１の１つのタンパク質配列を使用することにより同定することができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の存在及び局在を同定するための別のアプローチは、プログラム、例えば、デフォルトパラメータを用いるＣＲＩＳＰＲｆｉｎｄｅｒ又はＰＩＬＥＲ−ＣＲなどの使用によりヌクレオチド配列中のＣＲＩＳＰＲアレイを検索することである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座が同定されたら、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座の上流及び下流の最大１０ｋｂｐを含む配列を抽出することができる。抽出されたヌクレオチド配列中の遺伝子の存在は、ソフトウェア、例えば、デフォルトパラメータを使用するＧｅｎｅＭａｒｋ又はＭｅｔａＧｅｎｅＭａｒｋを用いて具現化することができる。次いで、同定された遺伝子をタンパク質配列に翻訳させ、アノテートして公知の機能を有するタンパク質（すなわち、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、Ｃａｓ４、Ｃａｓ９など）のデータベースに対する相同性検索、例えば、ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ、又はＨＭＭＲを使用してそれらの予測機能を示す。
【０１３９】
上記方法を用いて同定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座を、同一のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座中のＣａｓ９及びＣａｓ４タンパク質の両方の存在について調査した。それというのも、それらはＩＩＢ型のＣａｓ９を含有する可能性がかなり高いためである。ＩＩＢ型Ｃａｓ９の確率をさらに増加させるため、ＴＩＧＲＦＡＭ：ＴＩＧＲ０３０３１ファミリーへの所属についてｈｍｍｓｃａｎを用いてＣａｓ９タンパク質を検索した。
【０１４０】
一部の実施形態において、新規ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座を同定する方法は、Ｃａｓ４タンパク質と同一の遺伝子座中のＣａｓ９タンパク質を同定することを含む。一部の実施形態において、新規ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座を同定する方法は、公的に利用可能なメタゲノム遺伝子カタログをアミノ酸配列に翻訳させ、ＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリープロファイルを有するそれぞれのアミノ酸配列をスキャンして所定のカットオフＥ値、例えば、１Ｅ−５〜１Ｅ−１０などを超えるマッチを同定することを含む。
【０１４１】
ＴＩＧＲＦＡＭは、配列相同性によるタンパク質の自動化機能同定を支援するために設計された、キュレートされた複数配列アラインメント、隠れマルコフモデル、及び関連情報を特徴とするタンパク質ファミリーのコレクションである。配列アラインメントに適用される隠れマルコフモデル（ＨＭＭ）は、タンパク質複数配列アラインメントの連続カラムについての統計的モデルを指す。典型的には、タンパク質プロファイルＨＭＭは、キュレートされた複数配列アラインメントから、アミノ酸のそれぞれについての位置に基づくスコアリング、配列の長さにわたる挿入、及び欠失を用いて展開させる。スコアは、情報のビットで、及びＥ値として報告される。「信頼性のあるカットオフ」又は「信頼性のある限界値」、例えば、０．００１未満などのＥ値は、陽性「ヒット」又は陽性同定と認識される。したがって、低いＥ値カットオフを用いて同定された配列は、特異的タンパク質ファミリーに属する可能性が高い。一部の実施形態において、Ｅ値カットオフは、１Ｅ−１０である。一部の実施形態において、Ｅ値カットオフは、１Ｅ−５である。一部の実施形態において、信頼のあるカットオフＥ値は、少なくとも１Ｅ−１０、少なくとも１Ｅ−９、少なくとも１Ｅ−８、少なくとも１Ｅ−７、少なくとも１Ｅ−６、少なくとも１Ｅ−５、少なくとも１Ｅ−４、少なくとも１Ｅ−３、少なくとも１Ｅ−２、又は少なくとも１Ｅ−１である。
【０１４２】
一部の実施形態において、全ての予測タンパク質コード遺伝子の同定は、同定された遺伝子をＣａｓタンパク質特異的プロファイルと比較し、それらをＮＣＢＩ  Ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＣＤＤ）（古代ドメイン及び全長タンパク質について十分にアノテートされた複数配列アラインメントモデルのコレクションからなるタンパク質アノテーション資源である）に従ってアノテートすることにより実施される。これらは、ＲＰＳ−ＢＬＡＳＴを介するタンパク質配列中の保存ドメインの迅速な同定のための位置特異的スコア行列（ＰＳＳＭ）として利用可能である。ＣＤＤコンテンツはＮＣＢＩキュレートされたドメインを含み、それは３Ｄ構造情報を使用してドメイン境界を明確に定義し、配列／構造／機能の関係、並びに多数の外部資源データベース（Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、ＣＯＧ、ＰＲＫ、ＴＩＧＲＦＡＭ）からインポートされるドメインモデルに関する洞察を提供する。タンパク質データベースは、例えば、Ｆｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ  ４４：Ｄ２７９−Ｄ２８５（２０１６）；Ｌｅｔｕｎｉｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｄｏｉ：ｇｋｘ９２２（２０１７）；Ｔａｔｕｓｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７８（５３３８）：６３１−６３７（１９９７）；及びＨａｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｄａｔａｂａｓｅ  Ｉｓｓｕｅ  ４１：Ｄ３８７−Ｄ３９５（２０１３）に記載されており、それらのそれぞれは全体として本明細書に組み込まれる。
【０１４３】
一部の実施形態において、新規ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座は、保存ドメインを検索するためのＨＭＭＥＲ（又はＨＭＭＥＲの任意のバージョン、例えば、ＨＭＭＥＲ２又はＨＭＭＥＲ３）を使用して同定される。ＨＭＭＥＲは無料であり、配列分析、相同タンパク質又はヌクレオチド配列の同定、及び配列アラインメントに一般に使用されるソフトウェアパッケージである。ＨＭＭＥＲは、プロファイル隠れマルコフモデルと呼ばれる確率モデルを実装する。ＨＭＭＥＲは、プロファイルデータベース、例えば、Ｐｆａｍ、ＳＭＡＲＴ、ＣＯＧ、ＰＲＫ、又はＴＩＧＲＦＡＭを用いて使用することができる。ＨＭＭＥＲは、クエリ配列を用いて、例えば、データベースに対するタンパク質クエリ配列の検索（すなわち、ｐｈｍｍｅｒ）又は反復検索（すなわち、ｊａｃｋｈｍｍｅｒ）を用いて使用することもできる。一部の実施形態において、新規ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子座は、特異的タンパク質ファミリー中の特異的ドメインの存在を検索することにより同定される。一部の実施形態において、ＴＩＧＲＦＡＭタンパク質ファミリーは、ＴＩＧＲＦＡＭ：ＴＩＧＲ０３０３１である。一部の実施形態において、特異的ドメインは、少なくとも１Ｅ−１０、少なくとも１Ｅ−９、少なくとも１Ｅ−８、少なくとも１Ｅ−７、少なくとも１Ｅ−６、少なくとも１Ｅ−５、少なくとも１Ｅ−４、少なくとも１Ｅ−３、少なくとも１Ｅ−２、又は少なくとも１Ｅ−１のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチする。一部の実施形態において、特異的ドメインは、本明細書に同定されるＴＩＧＲ０３０３１ドメインのいずれかと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列類似性を有する。一部の実施形態において、特異的ドメインは、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれか１つと少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列類似性を有する。一部の実施形態において、特異的ドメインは、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれか１つと少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。
【０１４４】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。一部の実施形態において、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ｃａｓ４遺伝子を含む。本明細書において考察されるＣＲＩＳＰＲ系は、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＩＩ型と分類されている。全てのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ｃａｓオペロン上のｃａｓ１、ｃａｓ２、及びｃａｓ９遺伝子を含む。ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ−Ａ型、ＩＩ−Ｂ型、及びＩＩ−Ｃ型にさらにカテゴリー化される。一部の実施形態において、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系は、ｃａｓオペロン上のｃａｓ４遺伝子の存在により同定される。ｃａｓ４遺伝子は、ＩＩ−Ａ型ＣＲＩＳＰＲ系においてもＩＩ−Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ系においても見出されない。
【０１４５】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系は、個々のｃａｓ遺伝子の配列、例えば、ｃａｓ９の配列及び／又はドメインに従って分類することもできる。タンパク質ドメインは、保存配列又は保存モチーフにより同定し、ファミリー、スーパーファミリー、及びサブファミリーに分類することができる。例えば、タンパク質ドメインは、ＰＦＡＭ又はＴＩＧＲＦＡＭに従って分類することができる。したがって、Ｃａｓタンパク質は、タンパク質ドメインにより同定し、分類することができる。例えば、ＩＩ−Ａ型Ｃａｓ９タンパク質、例として、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９は、ＴＩＧＲ０１８６５  ＴＩＧＲＦＡＭタンパク質ファミリーのものである。対照的に、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質は、ＴＩＧＲ０３０３１  ＴＩＧＲＦＡＭタンパク質ファミリーのものである。
【０１４６】
したがって、一部の実施形態において、本開示のｓｔｉＣａｓ９は、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれかと少なくとも９５％の配列類似性を有するドメインを含む。一部の実施形態において、本開示のｓｔｉＣａｓ９は、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれかと少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の配列類似性を有するドメインを含む。一部の実施形態において、本開示のｓｔｉＣａｓ９は、少なくとも１Ｅ−１０、少なくとも１Ｅ−９、少なくとも１Ｅ−８、少なくとも１Ｅ−７、少なくとも１Ｅ−６、少なくとも１Ｅ−５、少なくとも１Ｅ−４、少なくとも１Ｅ−３、少なくとも１Ｅ−２、又は少なくとも１Ｅ−１のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。
【０１４７】
一部の実施形態において、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９は、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する任意の種に由来する。一部の実施形態において、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９は、以下の細菌種に由来する：レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＨＴＣＣ５０１５、パラサテレラ・エキスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、スルフロスピリラム属種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、ルミノバクター属種（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ８７、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１＿１＿４７、バクテロイデス・オーラル・タクソン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ）２７４株Ｆ００５８、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＹＬ４５、ルミノバクター・アミロフィラス（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）Ｐ０１１１、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ９２６１、カンピロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株ＲＭ８００１、カンプリロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株Ｐ０１２１、ツリシモナス・ムリス（Ｔｕｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｍｕｒｉｓ）、レジオネラ・ロンジニエンシス（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｌｏｎｄｉｎｉｅｎｓｉｓ）、サリニビブリオ・シャルメンシス（Ｓａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｓｈａｒｍｅｎｓｉｓ）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）単離株ＦＷ．０３０、モリテラ属種（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｓｐ．）単離株ＮＯＲＰ４６、エンドゾイコモナス属種（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｓ−Ｂ４−１Ｕ、タミルナドゥイバクター・サリナス（Ｔａｍｉｌｎａｄｕｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｎｕｓ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、アルコバクター・スキロウイイ（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｋｉｒｒｏｗｉｉ）、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）、フランシセラ・ヒスパニエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ）、又はパレンドゾイコモナス・ハリクロナエ（Ｐａｒｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｉｃｌｏｎａｅ）。
【０１４８】
一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＨＴＣＣ５０１５  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、パラサテレラ・エキスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、スルフロスピリラム属種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、ルミノバクター属種（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ８７  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１＿１＿４７  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、バクテロイデス・オーラル・タクソン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ）２７４株Ｆ００５８  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＹＬ４５  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、ルミノバクター・アミロフィラス（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）株ＤＳＭ１３６１  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）Ｐ０１１１  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ９２６１  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、カンピロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株ＲＭ８００１  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形��において、用語Ｃａｓ９は、カンプリロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株Ｐ０１２１  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、ツリシモナス・ムリス（Ｔｕｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｍｕｒｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、レジオネラ・ロンジニエンシス（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｌｏｎｄｉｎｉｅｎｓｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、サリニビブリオ・シャルメンシス（Ｓａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｓｈａｒｍｅｎｓｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）単離株ＦＷ．０３０  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、モリテラ属種（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｓｐ．）単離株ＮＯＲＰ４６  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、エンドゾイコモナス属種（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｓ−Ｂ４−１Ｕ  Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、タミルナドゥイバクター・サリナス（Ｔａｍｉｌｎａｄｕｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｎｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）Ｃａｓ９タンパク質のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、アルコバクター・スキロウイイ（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｋｉｒｒｏｗｉｉ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、フランシセラ・ヒスパニエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、パレンドゾイコモナス・ハリクロナエ（Ｐａｒｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｉｃｌｏｎａｅ）Ｃａｓ９のアミノ酸配列を含むポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、メタゲノム配列カタログからのＣａｓ９ポリペプチドを指す。一部の実施形態において、用語Ｃａｓ９は、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれかを含むポリペプチドを指す。図３０、配列番号１０〜８０；図３１、配列番号８１〜９７；及び図４７、配列番号１９２〜１９５参照。
【０１４９】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質は、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％の同一性の配列を有するドメインを含む。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質は、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は約１００％同一である。
【０１５０】
本明細書において使用される用語「粘着末端」、「段違い末端」、又は「付着末端」は、不均等の長さの鎖を有する核酸断片を指す。「平滑末端」と対照的に、粘着末端は、核酸、典型的にはＤＮＡ上の段違い切断により産生される。付着又は粘着末端は、非対合ヌクレオチド、又は「オーバーハング」、例えば、３’又は５’オーバーハングを有する突出一本鎖を有する。それぞれのオーバーハングは、別の相補的オーバーハングとアニールして塩基対を形成し得る。２つの相補的粘着末端は、相互作用、例えば、水素結合を介して一緒にアニールし得る。アニールされる粘着末端の安定性は、対合オーバーハングの融解温度に依存する。２つの相補的粘着末端は、化学的又は酵素的ライゲーションにより、例えば、ＤＮＡリガーゼにより一緒に結合させることができる。
【０１５１】
Ｃａｓ９タンパク質は、平滑末端で二本鎖ＤＮＡ分解を生成することが既に公知であった（例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２参照）。本開示は、本明細書において「ｓｔｉＣａｓ９」又は「付着Ｃａｓ９」とも称される粘着末端を生成し得るＣａｓ９タンパク質を提供する。粘着末端を有するＤＮＡ断片は、さらなる用途、例えば、断片間の核酸の挿入及び全体的な断片の再結合などにおいて、平滑末端と比べて利点を提供する。平滑末端を有するＤＮＡ配列は、核酸の挿入についての特異性を提供せず、すなわち、核酸は、いずれかの平滑末端において挿入することができる。他方、粘着末端は、相補的粘着末端とのみ対合し、したがって好ましい方向での導入遺伝子の組込みを可能とする。一部の実施形態において、粘着末端は、非相同末端結合及びマイクロホモロジー媒介末端結合法を介するＤＮＡの挿入を容易にする。
【０１５２】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９により生成される粘着末端は、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９により生成される粘着末端は、４〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９により生成される粘着末端は、５〜１５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９により生成される粘着末端は、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、又は４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９により生成される粘着末端は、５’オーバーハングである。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９により生成される粘着末端は、３’オーバーハングである。
【０１５３】
本明細書に記載の組成物及び方法は、ガイドポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、ＲＮＡ分子である。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分に結合し、それらを標的ＤＮＡ内の特異的局在に標的化するＲＮＡ分子は、本明細書において「ガイドＲＮＡ」、「ｇＲＮＡ」、又は「小分子ガイドＲＮＡ」と称され、本明細書において「ＤＮＡ標的化ＲＮＡ」と称することもできる。ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡは、少なくとも２つのヌクレオチドセグメント：少なくとも１つの「ＤＮＡ結合セグメント」及び少なくとも１つの「ポリペプチド結合セグメント」を含む。「セグメント」は、分子の一部、セクション、又は領域、例えば、ガイドポリヌクレオチド分子のヌクレオチドの連続ストレッチを意味する。「セグメント」の定義は、特に具体的に定義されない限り、規定数の総塩基対に限定されない。
【０１５４】
一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのＤＮＡ結合セグメントは、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列とハイブリダイズしない。本明細書において使用される細菌細胞中の配列は、細菌生物に由来するポリヌクレオチド配列、すなわち、天然発生細菌ポリヌクレオチド配列、又は細菌由来の配列を指す。例えば、配列は、細菌染色体若しくは細菌プラスミド、又は細菌細胞中で天然に見出される任意の他のポリヌクレオチド配列であり得る。
【０１５５】
一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのポリペプチド結合セグメントは、Ｃａｓ９に結合する。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのポリペプチド結合セグメントは、ｓｔｉＣａｓ９に結合する。
【０１５６】
一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、１０〜１５０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、２０〜１２０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、３０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、４０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、１０〜３５ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、１５〜３０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、２０〜２５ヌクレオチドである。
【０１５７】
ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡは、標的細胞中に、単離分子、例えば、ＲＮＡ分子として導入することができ、又は細胞中に、ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを使用して導入する。
【０１５８】
ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡの「ＤＮＡ結合セグメント」（又は「ＤＮＡ標的化配列」）は、標的ＤＮＡ内の特異的配列に相補的なヌクレオチド配列を含む。
【０１５９】
本開示のガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡは、ポリペプチド結合配列／セグメントを含み得る。ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡのポリペプチド結合セグメント（又は「タンパク質結合配列」）は、本開示のＣａｓタンパク質のポリヌクレオチド結合ドメインと相互作用する。このようなポリペプチド結合セグメント又は配列は当業者に公知であり、例えば、それらは米国特許出願公開第２０１４／００６８７９７号明細書、同第２０１４／０２７３０３７号明細書、同第２０１４／０２７３２２６号明細書、同第２０１４／０２９５５５６号明細書、同第２０１４／０２９５５５７号明細書、同第２０１４／０３４９４０５号明細書、同第２０１５／００４５５４６号明細書、同第２０１５／００７１８９８号明細書、同第２０１５／００７１８９９号明細書、及び同第２０１５／００７１９０６号明細書に開示されており、それらの開示は全体として本明細書に組み込まれる。
【０１６０】
本開示の一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、複合体を形成し得る。「複合体」は、２つ以上の会合している核酸及び／又はポリペプチドの群である。一部の実施形態において、複合体は、複合体の全ての構成成分が一緒に存在する場合に形成され、すなわち、自己集合複合体である。一部の実施形態において、複合体は、複合体の異なる構成成分間の化学的相互作用、例えば、水素結合などを介して形成される。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、ｓｔｉＣａｓ９によるガイドポリヌクレオチドの二次構造認識を介してｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成する。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質は、それがガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成するまで不活性であり、すなわち、ヌクレアーゼ活性を示さない。ガイドＲＮＡの結合は、ｓｔｉＣａｓ９の立体構造変化を誘導してｓｔｉＣａｓ９を不活性形態から活性形態、すなわち、触媒的に活性な形態に変換する。本開示の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドの複合体は天然に生じない。
【０１６１】
一部の実施形態において、本開示は、粘着末端を生成し得、核局在化シグナル（ＮＬＳ）を含むＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）、及びｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドを含み、複合体は天然に生じない非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【０１６２】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、１つ以上の核局在化シグナルを含む。「核局在化シグナル」又は「核局在化配列」（ＮＬＳ）は、核輸送による細胞核中への輸送のためにタンパク質を「タグ付けする」アミノ酸配列であり、すなわち、ＮＬＳを有するタンパク質は、細胞核中に輸送される。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面上で露出される正荷電Ｌｙｓ又はＡｒｇ残基を含む。例示的な核局在化配列としては、限定されるものではないが、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ｗ、ＥＧＬ−１３、ｃ−Ｍｙｃ、及びＴＵＳタンパク質からのＮＬＳが挙げられる。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２）を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３）を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号４）を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号５）を含む。他の核局在化配列としては、限定されるものではないが、ｈｎＲＮＰ  Ａ１の酸性Ｍ９ドメイン、酵母転写抑制因子Ｍａｔα２中の配列ＫＩＰＩＫ（配列番号６）、及びＰＹ−ＮＬＳが挙げられる。
【０１６３】
一部の実施形態において、本開示は、（ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードする１つ以上のヌクレオチド；及び（ｂ）ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドをコードするヌクレオチド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含み、複合体は天然に生じない非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【０１６４】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質は、１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡである。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＲＮＡである。
【０１６５】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＨＴＣＣ５０１５  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、パラサテレラ・エクスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、スルフロスピリラム属種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ルミノバクター属種（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ８７  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１＿１＿４７  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、バクテロイデス・オーラル・タクソン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ）２７４株Ｆ００５８  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＹＬ４５  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ルミノバクター・アミロフィラス（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）株ＤＳＭ１３６１  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）Ｐ０１１１  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ９２６１  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、カンピロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株ＲＭ８００１  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、カンプリロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株Ｐ０１２１  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ツリシモナス・ムリス（Ｔｕｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｍｕｒｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、レジオネラ・ロンジニエンシス（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｌｏｎｄｉｎｉｅｎｓｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、サリニビブリオ・シャルメンシス（Ｓａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｓｈａｒｍｅｎｓｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）単離株ＦＷ．０３０  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、モリテラ属種（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｓｐ．）単離株ＮＯＲＰ４６  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、エンドゾイコモナス属種（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｓ−Ｂ４−１Ｕ  Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、タミルナドゥイバクター・サリナス（Ｔａｍｉｌｎａｄｕｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｎｕｓ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、アルコバクター・スキロウイイ（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｋｉｒｒｏｗｉｉ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、フランシセラ・ヒスパニエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、パレンドゾイコモナス・ハリクロナエ（Ｐａｒｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｉｃｌｏｎａｅ）Ｃａｓ９タンパク質に由来する１つ以上のポリヌクレオチドによりコードされる。
【０１６６】
一部の実施形態において、本開示のｓｔｉＣａｓ９は、少なくとも１Ｅ−１０、少なくとも１Ｅ−９、少なくとも１Ｅ−８、少なくとも１Ｅ−７、少なくとも１Ｅ−６、少なくとも１Ｅ−５、少なくとも１Ｅ−４、少なくとも１Ｅ−３、少なくとも１Ｅ−２、又は少なくとも１Ｅ−１のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。
【０１６７】
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、ＤＮＡ標的化配列である。
【０１６８】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。コドン最適化配列の例は、この例において、真核生物、例えば、ヒト（すなわち、ヒト中の発現のために最適化されている）中の、又は本明細書において考察される別の真核生物、動物、若しくは哺乳動物のための発現のために最適化された配列である；例えば、コドン最適化配列の例として国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレットにおけるＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列参照（当分野及び本開示における知識から、特にエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ９）に関する（１つ以上の）コドン最適化コード核酸分子は、当業者の技能の範囲内である）。他の例が考えられ、ヒト以外の宿主種のためのコドン最適化、又は規定の器官のためのコドン最適化が公知である。一部の実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡ標的化Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、特定の生物、例えば、植物又は哺乳動物、例として、限定されるものではないが、ヒト、又は本明細書において考察される非ヒト真核生物若しくは動物若しくは哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、若しくは非ヒト哺乳動物若しくは霊長類の細胞又はそれらに由来する細胞であり得る。一部の実施形態において、ヒト又は動物へのいかなる実質的な医学的利益もなしで苦痛を引き起こす可能性が高いヒトの生殖系列遺伝的同一性を改変する方法及び／又は動物の遺伝的同一性を改変する方法、及びさらにはそのような方法から生じる動物は除外される。一般に、コドン最適化は、天然アミノ酸配列を維持しながら目的宿主細胞の遺伝子においてより高い頻度又は最大頻度で使用されるコドンにより天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約又は約１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上を超えるコドン）を置き換えることにより目的宿主細胞中の発現向上のために核酸配列を改変する方法を指す。種々の種は、特定のアミノ酸のあるコドンについての特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン頻度の差）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率と相関することが多く、それは同様にとりわけ翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存的であると考えられる。細胞中の選択ｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最大頻度で使用されるコドンの反映である。したがって、遺伝子は、コドン最適化に基づき所与の生物中の最適な遺伝子発現のためにテーラーメードすることができる。コドン頻度表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」（ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／）において容易に利用可能であり、それらの表は多数の手法で適合させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｔａｂｕｌａｔｅｄ  ｆｒｏｍ  ｔｈｅ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｙｅａｒ  ２０００，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２９２（２０００）参���。特定の宿主細胞中の発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズムも利用可能である。一部の実施形態において、ＤＮＡ／ＲＮＡ標的化Ｃａｓタンパク質をコードする配列中の１つ以上のコドン（例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、２５、５０個以上又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸についての最大頻度で使用されるコドンに対応する。酵母におけるコドン頻度に関しては、オンラインＹｅａｓｔ  Ｇｅｎｏｍｅデータベース（ｗｗｗ．ｙｅａｓｔｇｅｎｏｍｅ．ｏｒｇ／ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ／ｃｏｄｏｎ＿ｕｓａｇｅ．ｓｈｔｍｌ）、又はＢｅｎｎｅｔｚｅｎ  ａｎｄ  Ｈａｌｌ，“Ｃｏｄｏｎ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｙｅａｓｔ，”Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２５７（６）：３０２６−３１（１９８２）を参照されたい。植物、例として、藻類におけるコドン頻度に関しては、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ａｎｄ  Ｇｏｗｒｉ，“Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｈｉｇｈｅｒ  ｐｌａｎｔｓ，ｇｒｅｅｎ  ａｌｇａｅ，ａｎｄ  ｃｙａｎｏｂａｃｔｅｒｉａ，”Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  ９２（１）：１−１１（１９９０）；及びＭｕｒｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｄｏｎ  ｕｓａｇｅ  ｉｎ  ｐｌａｎｔ  ｇｅｎｅｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １７（２）：４７７−９８（１９８９）；又はＭｏｒｔｏｎ，“Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｃｏｄｏｎ  ｂｉａｓ  ｏｆ  ｃｈｌｏｒｏｐｌａｓｔ  ａｎｄ  ｃｙａｎｅｌｌｅ  ｇｅｎｅｓ  ｉｎ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ  ｐｌａｎｔ  ａｎｄ  ａｌｇａｌ  ｌｉｎｅａｇｅｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ４６（４）：４４９−５９（１９９８）を参照されたい。一部の実施形態において、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５の１つ以上が、コドン最適化されている。
【０１６９】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列は、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列は、動物細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列は、ヒト細胞中の発現のためにコドン最適化されている。ｓｔｉＣａｓ９をコードするヌクレオチド配列は、植物細胞中の発現のためにコドン最適化される。コドン最適化は、組換え又は異種タンパク質発現の収量及び効率を増加させるためにその発現を宿主のｔＲＮＡ存在量にマッチさせるようにコドンを調整することである。コドン最適化法は当分野において定型であり、ソフトウェアプログラム、例えば、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＣｏｄｏｎ  Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎツール、ＥｎｔｅｌｅｃｈｏｎのＣｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｔａｂｌｅ分析ツール、ＧＥＮＥＭＡＫＥＲのＢｌｕｅ  Ｈｅｒｏｎソフトウェア、ＡｐｔａｇｅｎのＧｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅソフトウェア、ＤＮＡ  Ｂｕｉｌｄｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｇｅｎｅｒａｌ  Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓソフトウェア、公的に利用可能なＯＰＴＩＭＩＺＥＲソフトウェア、及びＧｅｎｓｃｒｉｐｔのＯｐｔｉｍｕｍＧｅｎｅアルゴリズムなどを使用して実施することができる。
【０１７０】
一部の実施形態において、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含む。「ｔｒａｃｒＲＮＡ」又はトランス活性化ＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡ、又はプレＣＲＩＳＰＲ−ＲＮＡとのＲＮＡ二本鎖を形成し、次いでＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼＲＮアーゼＩＩＩにより開裂されてｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが形成される。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを含む。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分は、Ｃａｓ９タンパク質を活性化させる。
【０１７１】
本開示の一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、複合体を形成し得る。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡの複合体は、天然に生じない。
【０１７２】
一部の実施形態において、本開示は、（ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に結合している調節エレメント；（ｂ）ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチドを含み、複合体は天然に生じない１つ以上のベクターを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。「ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチド」を含むベクターには、ガイドポリヌクレオチドに転写させることができるポリヌクレオチド配列を含むベクターも含まれることが当業者により理解される。例えば、ガイドＲＮＡ配列を生成するようにＤＮＡベクターを転写させることができる。
【０１７３】
一部の実施形態において、本開示は、粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に作動可能に結合している調節エレメント（調節エレメントは、真核生物調節エレメントである）、及びｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列を含むガイドポリヌクレオチドを含み、複合体は天然に生じない１つ以上のベクターを含む非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。
【０１７４】
一部の実施形態において、調節エレメントは、プロモーターである。一部の実施形態において、調節エレメントは、細菌プロモーターである。一部の実施形態において、調節エレメントは、ウイルスプロモーターである。一部の実施形態において、調節エレメントは、真核生物調節エレメント、すなわち、真核生物プロモーターである。一部の実施形態において、真核生物調節エレメントは、哺乳動物プロモーターである。
【０１７５】
「作動可能に結合している」は、目的ヌクレオチド、すなわち、Ｃａｓ９タンパク質をコードするヌクレオチドが、ヌクレオチド配列の発現を可能とする様式で調節エレメントに結合していることを意味する。したがって、一部の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。
【０１７６】
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含むベクターのガイドポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態において、ヌクレオチド配列は、ＤＮＡである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列は、ＤＮＡ標的化配列である。
【０１７７】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、複合体を形成し得る。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドの複合体は天然に生じない。
【０１７８】
一部の実施形態において、ベクターは、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含むヌクレオチド配列をさらに含む。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを含む。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分は、Ｃａｓ９タンパク質を活性化させる。
【０１７９】
一部の実施形態において、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、プロトスペーサー隣接モチーフの１０ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。プロトスペーサー隣接モチーフ、又はＰＡＭは、ガイドＲＮＡに相補的な領域の１ヌクレオチド以内に局在する２〜６塩基対ヌクレオチド配列である。Ｃａｓ９タンパク質が活性化される場合（例えば、ガイドポリヌクレオチドとの複合体の形成により）、それはそのＰＡＭ配列にマッチする配列との結合により標的ＤＮＡを探索する。例えば、Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，“ＤＮＡ  ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ  ｂｙ  ｔｈｅ  ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  Ｃａｓ９，”Ｎａｔｕｒｅ  ５０７（７４９０）：６２−６７（２０１４）参照、それは参照により全体として本明細書に組み込まれる。適切なＰＡＭを有する潜在的な標的配列が認識され、ガイドＲＮＡがその標的領域と適切に対合した場合、Ｃａｓ９のヌクレアーゼドメイン（すなわち、ＲｕｖＣ及びＨＮＨドメイン）が標的ＤＮＡを切断する。
【０１８０】
一部の実施形態において、本開示のＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインはそれぞれ、標的ＤＮＡ配列の一方の鎖を切断する。実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインの切断部位は、オフセットであり、すなわち、それぞれのドメインは、標的ＤＮＡのそのそれぞれの鎖上の異なる位置において切断し、オーバーハングをもたらす。実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは、３−ヌクレオチドオフセットにおいて切断する。実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは、４−ヌクレオチドオフセットにおいて切断する。実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは、５−ヌクレオチドオフセットにおいて切断する。実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは、約１、約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、又は約４０ヌクレオチドのオフセットにおいて切断する。
【０１８１】
一部の実施形態において、本開示のＣａｓ９エフェクタータンパク質のＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインは、二本鎖標的ＤＮＡのそれぞれの鎖上の異なる位置において開裂させる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＲｕｖＣドメインは、ＰＡＭから約−１０、約−９、約−８、約−７、又は約−６ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖（例えば、「非標的鎖」と称することができる）を開裂させ、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質のＨＮＨドメインは、ＰＡＭから−５、約−４、約−３、約−２、又は約−１ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの他方の鎖（例えば、「標的鎖」と称することができる）を開裂させる。
【０１８２】
一部の実施形態において、ＲｕｖＣドメインは、ＰＡＭから約−８ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。一部の実施形態において、ＲｕｖＣドメインは、ＰＡＭから約−７ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。一部の実施形態において、ＲｕｖＣドメインは、ＰＡＭから約−６ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。一部の実施形態において、ＨＮＨドメインは、ＰＡＭから約−４ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。一部の実施形態において、ＨＮＨドメインは、ＰＡＭから約−３ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。一部の実施形態において、ＨＮＨドメインは、ＰＡＭから約−２ヌクレオチドにおける二本鎖標的ＤＮＡの一方の鎖を開裂させる。
【０１８３】
本開示の一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の１０ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む複合体は、ＰＡＭの５ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む複合体は、ＰＡＭの３ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。一部の実施形態において、ＰＡＭは、標的配列の下流（すなわち、３’方向）に存在する。一部の実施形態において、標的配列の上流（すなわち、５’方向）に存在する。一部の実施形態において、ＰＡＭは、標的配列内に局在する。
【０１８４】
異なる細菌種は、異なるＰＡＭ配列を認識する。本開示のＣａｓ９タンパク質に好ましいＰＡＭ配列を同定する１つの方法は図４９Ａに説明され、例えば、標的配列に隣接する種々のＰＡＭ配列のプラスミドライブラリーを生成すること、プラスミドライブラリーをＣａｓ９タンパク質と接触させること、次いでプラスミドライブラリーをシーケンシングしてどのＰＡＭ配列が「枯渇」したか（すなわち、シーケンシング結果において検出されない）を決定することを含む。「枯渇」ＰＡＭ配列は、Ｃａｓ９タンパク質により認識され、影響を受ける（すなわち、開裂される）配列である。
【０１８５】
例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）のＣａｓ９により認識されるＰＡＭ配列は、５’−ＮＧＧ−３’ （Ｎは、任意のヌクレオチドである）である。異なるＰＡＭは、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、トレポネマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）、及びストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）のＣａｓ９タンパク質と会合する。フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）のＣａｓ９タンパク質は、ＰＡＭ５’−ＹＧ−３’（Ｙは、ピリミジンである）を認識するように遺伝子操作されている。
【０１８６】
一部の実施形態において、ＰＡＭは、３’Ｇリッチモチーフを含む。一部の実施形態において、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、又はＧである）である。一部の実施形態において、ＰＡＭ配列は、ＮＧＡ（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、又はＧである）である。一部の実施形態において、ＰＡＭ配列は、ＹＧ（Ｙは、ピリミジン（すなわち、Ｃ、Ｔ、又はＵ）である）である。
【０１８７】
一部の実施形態において、標的配列は、ＰＡＭの５’に存在し、ＰＡＭは、３’Ｇ−リッチモチーフを含む。一部の実施形態において、標的配列は、ＰＡＭの５’に存在し、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、又はＧである）である。一部の実施形態において、標的配列は、ＰＡＭの５’に存在し、ＰＡＭ配列は、ＹＧ（Ｙは、ピリミジンである）であり、ｓｔｉＣａｓ９は、細菌種フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）に由来する。
【０１８８】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、１つ以上の核局在化シグナルを含む。「核局在化シグナル」又は「核局在化配列」（ＮＬＳ）は、核輸送による細胞核中への輸送のためにタンパク質を「タグ付けする」アミノ酸配列であり、すなわち、ＮＬＳを有するタンパク質は、細胞核中に輸送される。典型的には、ＮＬＳは、タンパク質表面上で露出される正荷電Ｌｙｓ又はＡｒｇ残基を含む。例示的な核局在化配列としては、限定されるものではないが、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ＥＧＬ−１３、ｃ−Ｍｙｃ、及びＴＵＳタンパク質からのＮＬＳが挙げられる。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２）を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３）を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号４）を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号５）を含む。他の核局在化配列としては、限定されるものではないが、ｈｎＲＮＰ  Ａ１の酸性Ｍ９ドメイン、酵母転写抑制因子Ｍａｔα２中の配列ＫＩＰＩＫ（配列番号６）、及びＰＹ−ＮＬＳが挙げられる。
【０１８９】
一部の実施形態において、本開示のガイドポリヌクレオチドは、真核細胞中の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を有する。一部の実施形態において、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。一部の実施形態において、真核細胞は、ヒト又はげっ歯類又はウシ細胞系又は細胞株である。このような細胞、細胞系、又は細胞株の例としては、限定されるものではないが、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵母（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ  Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及びＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＨＥＫ−２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解又はハイブリドーマ細胞系が挙げられる。一部の実施形態において、真核細胞は、ＣＨＯ細胞系である。一部の実施形態において、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。一部の実施形態において、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ１１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。真核細胞は、鳥類細胞、細胞系又は細胞株、例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６、又はＥＢｖｌ３などでもよい。
【０１９０】
一部の実施形態において、真核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態において、ヒト細胞は、幹細胞である。幹細胞は、例えば、多能性幹細胞、例として、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、成体幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）及び間充織幹細胞（ＭＳＣ）であり得る。一部の実施形態において、ヒト細胞は、本明細書に記載の細胞のいずれかの分化形態である。一部の実施形態において、真核細胞は、培養下の任意の初代細胞に由来する細胞である。
【０１９１】
一部の実施形態において、真核細胞は、肝細胞、例えば、ヒト肝細胞、動物肝細胞、又は非実質細胞である。例えば、真核細胞は、付着型代謝試験用ヒト肝細胞、付着型誘導試験用ヒト肝細胞、付着型Ｑｕａｌｙｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（商標）ヒト肝細胞、懸濁液試験用ヒト肝細胞（例として、１０−ドナー及び２０−ドナープール肝細胞）、ヒト肝臓クッパー細胞、ヒト肝臓星細胞、イヌ肝細胞（例として、単一及びプールビーグル肝細胞）、マウス肝細胞（例として、ＣＤ−１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞）、ラット肝細胞（例として、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎ、及びＷｉｓｔａｒ肝細胞）、サル肝細胞（例として、カニクイザル又はアカゲザル肝細胞）、ネコ肝細胞（例として、ドメスティックショートヘア肝細胞）、及びウサギ肝細胞（例として、ニュージーランドホワイト肝細胞）であり得る。
【０１９２】
一部の実施形態において、真核細胞は、植物細胞である。例えば、植物細胞は、作物植物、例えば、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、又はイネのものであり得る。植物細胞は、藻類、樹木、又は野菜のものであり得る。植物細胞は、単子葉若しくは双子葉植物のもの、又は作物若しくは穀類植物、生産植物、果実、若しくは野菜のものであり得る。例えば、植物細胞は、樹木、例えば、柑橘樹木、例えば、オレンジ、グレープフルーツ、又はレモン樹木；モモ又はネクタリン樹木；リンゴ又はナシ樹木；ナッツ樹木、例えば、アーモンド又はクルミ又はピスタチオ樹木；ナス科植物、例えば、ジャガイモ、ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物、ラクツカ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物；スピナシア属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；カプシカム属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；ワタ、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、ショウガ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココアなどのものであり得る。
【０１９３】
一部の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のガイドポリヌクレオチドは、ダイレクトリピート配列に結合している。ダイレクトリピート、又はＤＲ配列は、非反復配列（スペーサー）の短鎖ストレッチが介在しているＣＲＩＳＰＲ遺伝子座中の反復配列のアレイである。スペーサー配列は、標的配列上のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を標的化する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座の非コード部分（すなわち、ガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡ）が転写される場合、転写産物は、ＤＲ配列において個々のスペーサー配列を含有する短鎖ｃｒＲＮＡに開裂され、それがＣａｓ９ヌクレアーゼをＰＡＭに指向する。一部の実施形態において、ＤＲ配列は、ＲＮＡである。一部の実施形態において、ＤＲ配列は、核酸によりコードされる。一部の実施形態において、ＤＲ配列は、ガイドポリヌクレオチドに結合している。一部の実施形態において、ＤＲ配列は、ガイドポリヌクレオチドのガイド配列に結合している。一部の実施形態において、ＤＲ配列は、二次構造を含む。一部の実施形態において、ＤＲ配列は、ステムループ構造を含む。一部の実施形態において、ＤＲ配列は、１０〜２０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ＤＲ配列は、少なくとも１６ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ＤＲ配列は、少なくとも１６ヌクレオチドであり、単一ステムループを含む。一部の実施形態において、ＤＲ配列は、ＲＮＡアプタマーを含む。一部の実施形態において、ＤＲの二次構造又はステムループは、開裂のためのヌクレアーゼにより認識される。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、リボヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、ＲＮアーゼＩＩＩである。
【０１９４】
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の送達についての種々の手段が当分野において公知である。一部の実施形態において、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、送達粒子により送達する。送達粒子は、粒子を含む生物送達系又は配合物である。本明細書に定義される「粒子」は、約１００ミクロン（μｍ）の最大直径を有する実体である。一部の実施形態において、粒子は、約１０μｍの最大直径を有する。一部の実施形態において、粒子は、約２０００ナノメートル（ｎｍ）の最大直径を有する。一部の実施形態において、粒子は、約１０００ｎｍの最大直径を有する。一部の実施形態において、粒子は、約９００ｎｍ、約８００ｎｍ、約７００ｎｍ、約６００ｎｍ、約５００ｎｍ、約４００ｎｍ、約３００ｎｍ、約２００ｎｍ、又は約１００ｎｍの最大直径を有する。一部の実施形態において、粒子は、約２５ｎｍ〜約２００ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、粒子は、約５０ｎｍ〜１５０ｎｍの直径を有する。一部の実施形態において、粒子は、約７５ｎｍ〜約１００ｎｍの直径を有する。
【０１９５】
送達粒子は、任意の形態、例として、限定されるものではないが、固体、半固体、エマルション、又はコロイド粒子で提供することができる。一部の実施形態において、送達粒子は、脂質ベース系、リポソーム、ミセル、マイクロベシクル、エキソソーム、又は遺伝子銃である。一部の実施形態において、送達粒子は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。一部の実施形態において、送達粒子は、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。一部の実施形態において、送達粒子は、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含み、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。一部の実施形態において、送達粒子は、ｓｔｉＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。一部の実施形態において、送達粒子は、ｓｔｉＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。
【０１９６】
一部の実施形態において、送達粒子は、脂質、糖、金属又はタンパク質をさらに含む。一部の実施形態において、送達粒子は、脂質エンベロープである。脂質エンベロープ又は脂質を含む送達粒子を使用するｍＲＮＡの送達は、例えば、Ｓｕ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｍＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｕｓｉｎｇ  ｌｉｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ  ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｐｏｌｙｍｅｒ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ，”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ８（３）：７７４−７８４（２０１１）に記載されている。
【０１９７】
一部の実施形態において、送達粒子は、糖ベース粒子、例えば、ＧａｌＮＡｃである。糖ベース粒子は、国際公開第２０１４／１１８２７２号パンフレット及びＮａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３６（４９）：１６９５８−１６９６１（２０１４）に記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０１９８】
一部の実施形態において、送達粒子は、ナノ粒子である。本開示に包含されるナノ粒子は、様々な形態で、例えば、固体ナノ粒子（例えば、金属、例えば、銀、金、鉄、チタン）、非金属、脂質ベース固体、ポリマー、ナノ粒子の懸濁液、又はそれらの組合せとして提供することができる。金属、誘電体、及び半導体ナノ粒子、並びにハイブリッド構造（例えば、コア−シェルナノ粒子）を調製することができる。半導体材料製のナノ粒子は、それらが電子エネルギーレベルの量子化が生じるほど十分に小さい場合（典型的には１０ｎｍ未満）、標識量子ドットであってもよい。このようなナノスケール粒子は、生物医学用途において薬物担体又はイメージング剤として使用され、本開示における類似の目的に適合させることができる。
【０１９９】
送達粒子の調製は、米国特許出願公開第２０１１／０２９３７０３号明細書、同第２０１２／０２５１５６０号明細書、及び同第２０１３／０３０２４０１号明細書；並びに米国特許第５，５４３，１５８号明細書、同第５，８５５，９１３号明細書、同第５，８９５，３０９号明細書、同第６，００７，８４５号明細書、及び同第８，７０９，８４３号明細書にさらに記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０２００】
一部の実施形態において、ベシクルは、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。「ベシクル」は、脂質二重層により封入される流体を有する小部屋内の小型構造である。一部の実施形態において、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ベシクルにより送達する。一部の実施形態において、ベシクルは、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ベシクルは、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含み、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。一部の実施形態において、ベシクルは、ｓｔｉＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。一部の実施形態において、ベシクルは、ｓｔｉＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。
【０２０１】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むベシクルは、エキソソーム又はリポソームである。一部の実施形態において、ベシクルは、エキソソームである。一部の実施形態において、エキソソームを使用して本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を送達する。エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送し、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達し得る内因性ナノベシクル（すなわち、約３０〜約１００ｎｍの直径を有する）である。標的器官中への外因性生物材料の送達用の遺伝子操作エキソソームが、例えば、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：３４１（２０１１），Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７：２１１２−２１１６（２０１２）、及びＷａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０（１７）：ｅｌ３０（２０１２）により記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０２０２】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含むベシクルは、リポソームである。一部の実施形態において、リポソームを使用して本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を送達する。リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層を有する球状ベシクル構造であり、栄養及び医薬物の投与用ベシクルとして使用することができる。リポソームは、リン脂質、特にホスファチジルコリンから構成されることが多いが、他の脂質、例えば、卵ホスファチジルエタノールアミンからも構成される。リポソームの型としては、限定されるものではないが、マルチラメラベシクル、スモールユニラメラベシクル、ラージユニラメラベシクル、及び渦巻き型ベシクルが挙げられる。例えば、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９（２０１１）参照。生物材料、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分の送達用のリポソームは、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（８）：１００２−１００７（２００５）、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４１：１１１−１１４（２００６）、及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９：７７５−７８０（２０１２）により記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０２０３】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド及びガイドポリヌクレオチドは、単一ベクター上に存在する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド（又はガイドポリヌクレオチドに転写され得るヌクレオチド）、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一ベクター上に存在する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド（又はガイドポリヌクレオチドに転写され得るヌクレオチド）、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びダイレクトリピート配列は、単一ベクター上に存在する。一部の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ヒト発現ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、植物発現ベクターである。
【０２０４】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド及びガイドポリヌクレオチドは、単一核酸分子である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、単一核酸分子である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９をコードするヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチド、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びダイレクトリピート配列は、単一核酸分子である。一部の実施形態において、単一核酸分子は、発現ベクターである。一部の実施形態において、単一核酸分子は、哺乳動物発現ベクターである。一部の実施形態において、単一核酸分子は、ヒト発現ベクターである。一部の実施形態において、単一核酸分子は、植物発現ベクターである。
【０２０５】
一部の実施形態において、ウイルスベクターは、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。一部の実施形態において、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ウイルスベクターにより送達する。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含み、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ｓｔｉＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ｓｔｉＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのものである。ウイルスベクターの例は、本明細書に提供される。
【０２０６】
一部の実施形態において、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及び／又はレンチウイルスは、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のエレメントを含むウイルスベクターとして使用することができる。本開示の一部の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、ウイルスベクターにより形質導入された細胞により細胞内で発現される。
【０２０７】
本開示により想定されるものを含む多くの治療方針のため、Ｃａｓタンパク質発現は、一過的に要求され得るにすぎない。結果として、本開示の一部の実施形態において、細胞中へのＣａｓタンパク質の送達は、非組込みウイルスベクターを使用して達成される。他の実施形態において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系構成成分の発現は、例えば、標的細胞のゲノム中に永久的に組み込まれる遺伝子回路において使用される場合、長期間のために要求される。このような用途は、Ａｇｕｓｔｉｎ−Ｐａｖｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ  ｂｒａｉｎ，”Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ  ３６（１０）：９７９−９９０（２０１４）により考察されており、それは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０２０８】
一部の実施形態において、本開示のＣａｓタンパク質及び方法は、エクスビボ遺伝子編集、例えば、ＣＡＲ−Ｔ型療法において使用される。これらの実施形態は、ヒトドナーからの細胞の改変を含み得る。これらの例において、ウイルスベクターを使用することもでき；しかしながら、培養細胞中にＣａｓタンパク質を（インビトロ転写ガイドＲＮＡ及びドナーＤＮＡとともに）直接形質移入する追加の任意選択が存在する。
【０２０９】
一部の実施形態において、本開示は、（ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）、及び（ｂ）ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得る）を含むガイドポリヌクレオチドを含み、複合体は天然に生じないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む真核細胞を提供する。一部の実施形態において、真核細胞は、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含むベクターを含む。
【０２１０】
一部の実施形態において、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。一部の実施形態において、真核細胞は、動物細胞である。一部の実施形態において、真核細胞は、ヒト細胞、例として、ヒト幹細胞である。一部の実施形態において、真核細胞は、植物細胞である。種々の型の真核細胞の例は、本明細書に提供される。
【０２１１】
一部の実施形態において、本開示は、粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）（Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する）を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む真核細胞を提供する。一部の実施形態において、真核細胞は、少なくとも１Ｅ−１０、少なくとも１Ｅ−９、少なくとも１Ｅ−８、少なくとも１Ｅ−７、少なくとも１Ｅ−６、少なくとも１Ｅ−５、少なくとも１Ｅ−４、少なくとも１Ｅ−３、少なくとも１Ｅ−２，又は少なくとも１Ｅ−１のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含むｓｔｉＣａｓ９を含む。一部の実施形態において、真核細胞は、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列類似性のポリペプチド配列を含むｓｔｉＣａｓ９を含む。一部の実施形態において、真核細胞は、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれか１つと少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含むｓｔｉＣａｓ９を含む。
【０２１２】
一部の実施形態において、本開示のＣａｓ９タンパク質は、１つ以上の異種タンパク質ドメイン（例えば、Ｃａｓ９タンパク質の他に約又は少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、若しくは１０個以上のドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。Ｃａｓ９融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、及び場合により、任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。Ｃａｓ９タンパク質に融合させることができるタンパク質ドメインの例としては、限定されるものではないが、エピトープタグ、レポーター遺伝子配列、並びに以下の活性の１つ以上：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、及び核酸結合活性を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）、ベータ−ガラクトシダーゼ、ベータ−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、自己蛍光タンパク質、例として、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、及びｍＣｈｅｒｒｙが挙げられる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ分子に結合し、又は他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片、例として、限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ  Ａ  ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）、ＧＡＬ４  ＤＮＡ結合ドメイン、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質に融合している。Ｃａｓ９タンパク質を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書に記載されており、それは参照により全体として本明細書に組み込まれる。一部の実施形態において、タグ付けされたＣａｓ９タンパク質を使用して標的配列の局在を同定する。
【０２１３】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、誘導性系の構成成分を形成し得る。系の誘導性質は、エネルギーの形態を使用する遺伝子編集又は遺伝子発現の時空間制御を可能とする。エネルギーの形態としては、限定されるものではないが、電磁放射線、音響エネルギー、化学エネルギー、及び熱エネルギーを挙げることができる。誘導性系の非限定的な例としては、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子ツーハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）、又は光誘導性系（フィトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が挙げられる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、配列特異的に転写活性の変化を指向するための光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部である。光の構成成分は、Ｃａｓ９タンパク質、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、アラビドプシス・タリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ  ｔｈａｌｉａｎａ）からのもの）、及び転写活性化／抑制ドメインを含み得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びそれらの使用方法のさらなる例は、国際特許出願公開の国際公開第２０１４／０１８４２３号パンフレット及び国際公開第２０１４／０９３６３５号パンフレット；米国特許第８，８８９，４１８号明細書及び同第８，８９５，３０８号明細書；並びに米国特許出願公開第２０１４／０１８６９１９号明細書、同第２０１４／０２４２７００号明細書、同第２０１４／０２７３２３４号明細書、及び同第２０１４／０３３５６２０号明細書に提供されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０２１４】
部位特異的改変の方法
一部の実施形態において、本開示は、真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって、（１）細胞中に、（ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）、及び（ｂ）ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチド（複合体は天然に生じない）を導入すること；（２）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドにより標的配列中の粘着末端を生成すること；並びに（３）（ａ）粘着末端を一緒に、又は（ｂ）目的ポリヌクレオチド配列（ＳｏＩ）を粘着末端にライゲートすることを含み、それにより標的配列を改変する方法を提示する。
【０２１５】
標的配列の「改変」は、核酸の単一ヌクレオチド置換、複数ヌクレオチド置換、挿入（すなわち、ノックイン）及び欠失（すなわち、ノックアウト）、フレームシフト突然変異、及び他の核酸改変を包含する。
【０２１６】
一部の実施形態において、改変は、標的配列の少なくとも一部の欠失である。標的配列は、２つの異なる部位において開裂させ、相補的粘着末端を生成することができ、相補的粘着末端を再ライゲートさせ、それによりその２つの部位間の配列部分を除去することができる。
【０２１７】
一部の実施形態において、改変は、標的配列の突然変異である。真核細胞における部位特異的突然変異誘発は、目的突然変異を含有する外因性ポリヌクレオチドテンプレート（「ドナーポリヌクレオチド」又は「ドナーベクター」とも呼ばれる）の相同組換えを促進する部位特異的ヌクレアーゼの使用により達成される。一部の実施形態において、目的配列（ＳｏＩ）は、目的突然変異を含む。
【０２１８】
一部の実施形態において、改変は、標的配列中への目的配列（ＳｏＩ）の挿入である。ＳｏＩは、外因性ポリヌクレオチドテンプレートとして導入することができる。一部の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、粘着末端を含む。一部の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、標的配列中の粘着末端に相補的な粘着末端を含む。
【０２１９】
外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、任意の好適な長さ、例えば、約又は少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００若しくは１０００以上のヌクレオチド長さのものであり得る。一部の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、最適にアラインされる場合、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約又は少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００以上のヌクレオチド）と重複する。一部の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドテンプレート及び標的配列を含むポリヌクレオチドは、最適にアラインされる場合、外因性ポリヌクレオチドテンプレートの最近傍ヌクレオチドは、標的配列から約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１００、１５００、２０００、２５００、５０００、１００００以上のヌクレオチド以内に存在する。
【０２２０】
一部の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、線状一本鎖又は二本鎖ＤＮＡ片、オリゴヌクレオチド、ＰＣＲ断片、ネイキッド核酸、又は送達ビヒクル、例えば、リポソームと複合体化している核酸などである。
【０２２１】
一部の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路を使用して標的配列中に挿入される。内因性ＤＮＡ修復経路としては、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路、及び相同性配向型修復（ＨＤＲ）経路が挙げられる。ＮＨＥＪ、ＭＭＥＪ、及びＨＤＲ経路は、二本鎖ＤＮＡ分解を修復する。ＮＨＥＪにおいて、相同テンプレートは、ＤＮＡにおける分解の修復に要求されない。ＮＨＥＪ修復は、エラープローンであり得るが、エラーは、ＤＮＡ分解が適合性オーバーハングを含む場合に減少する。ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪは、それらのそれぞれに関与するＤＮＡ修復酵素の異なるサブセットにより機序的に区別されるＤＮＡ修復経路である。エラープローンと同程度に正確であり得るＮＨＥＪとは異なり、ＭＭＥＪは、常にエラープローンであり、修復下の部位における欠失及び挿入の両方をもたらす。ＭＭＥＩ関連欠失は、二本鎖分解の両側におけるマイクロホモロジー（２〜１０塩基対）に起因する。対照的に、ＨＤＲは、修復を指向するための相同テンプレートを要求するが、ＨＤＲ修復は、典型的には、高いフィデリティであり、低いエラープローンである。一部の実施形態において、ＮＨＥＪ及びＭＭＥＪ修復のエラープローン性質を活用して標的配列中の非特異的ヌクレオチド置換を導入する。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ＨＤＲ修復を容易にする様式で標的配列を切断する。
【０２２２】
修復プロセスの間、ＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチドテンプレートを標的配列中に導入することができる。一部の実施形態において、上流配列及び下流配列によりフランキングされたＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチドテンプレートを細胞中に導入し、上流及び下流配列は、標的配列中の組込みの部位のいずれかの側と配列類似性を共有する。一部の実施形態において、ＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチドは、例えば、突然変異遺伝子を含む。一部の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、細胞に対して内因性又は外因性である配列を含む。一部の実施形態において、ＳｏＩは、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は非コード配列、例えば、マイクロＲＮＡなどを含む。一部の実施形態において、ＳｏＩは、調節エレメントに作動可能に結合している。一部の実施形態において、ＳｏＩは、調節エレメントである。一部の実施形態において、ＳｏＩは、耐性カセット、例えば、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含む。一部の実施形態において、ＳｏＩは、野生型標的配列の突然変異を含む。一部の実施形態において、ＳｏＩは、フレームシフト突然変異又はヌクレオチド置換を作出することにより標的配列を破壊し、又は補正する。一部の実施形態において、ＳｏＩは、マーカーを含む。標的配列中へのマーカーの導入は、標的化組込みのスクリーニングを容易にし得る。一部の実施形態において、マーカーは、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択マーカーである。一部の実施形態において、ＳｏＩは、ＳｏＩを含むベクターとして導入する。
【０２２３】
外因性ポリヌクレオチドテンプレート中の上流及び下流配列は、標的配列及び外因性ポリヌクレオチド間の相同組換えを促進するように選択される。上流配列は、組込みのための標的化部位の上流の配列（すなわち、標的配列）との配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組込みのための標的化部位の下流の配列との配列類似性を共有する核酸配列である。したがって、一部の実施形態において、ＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、上流及び下流配列において相同組換えにより標的配列中に挿入する。一部の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドテンプレート中の上流及び下流配列は、標的化ゲノム配列の上流及び下流配列とそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、上流又は下流配列は、約２０〜２０００塩基対、又は約５０〜１７５０塩基対、又は約１００〜１５００塩基対、又は約２００〜１２５０塩基対、又は約３００〜１０００塩基対、又は約４００〜約７５０塩基対、又は約５００〜６００塩基対を有する。一部の実施形態において、上流又は下流配列は、約５０、約１００、約２５０、約５００、約１００、約１２５０、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、又は約２５００塩基対を有する。
【０２２４】
一部の実施形態において、標的配列中の改変は、細胞中の標的配列の発現の不活性化である。例えば、標的配列へのＣＲＩＳＰＲ複合体の結合時、標的配列は不活性化され、その結果、その配列は転写されず、コードされるタンパク質は産生されず、又は配列は、その野生型配列が機能するようには機能しない。例えば、タンパク質又はマイクロＲＮＡコード配列は不活性化され得、その結果、タンパク質は産生されない。
【０２２５】
一部の実施形態において、調節配列は、それが調節配列としてもはや機能しないように不活性化させることができる。調節配列の例としては、本明細書に記載のプロモーター、転写終結因子、エンハンサー、及び他の調節エレメントが挙げられる。不活性化標的配列としては、欠失突然変異（すなわち、１つ以上のヌクレオチドの欠失）、挿入突然変異（すなわち、１つ以上のヌクレオチドの挿入）、又はナンセンス突然変異（すなわち、終止コドンが導入されるような別のヌクレオチドでの単一ヌクレオチドの置換）を挙げることができる。一部の実施形態において、標的配列の不活性化は、標的配列の「ノックアウト」をもたらす。
【０２２６】
一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは複合体を形成し、ガイドポリヌクレオチドは改変すべき標的配列にハイブリダイズする。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ガイドポリヌクレオチドにハイブリダイズされる標的配列中の粘着末端を生成する。
【０２２７】
方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９により生成される粘着末端は、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９により生成される粘着末端は、４〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９により生成される粘着末端は、５〜１５ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドオーバーハングを含む。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９により生成される粘着末端は、５’オーバーハングである。
【０２２８】
方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９は、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する細菌種に由来する。本明細書において考察されるＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質は、ＴＩＧＲ０３０３１  ＴＩＧＲＦＡＭタンパク質ファミリーに属する。したがって、一部の実施形態において、本開示のｓｔｉＣａｓ９は、１Ｅ−５プロファイルカットオフ値を用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。一部の実施形態において、本開示のｓｔｉＣａｓ９は、１Ｅ−１０プロファイルカットオフ値を用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。一部の実施形態において、本開示のｓｔｉＣａｓ９は、少なくとも１Ｅ−１０、少なくとも１Ｅ−９、少なくとも１Ｅ−８、少なくとも１Ｅ−７、少なくとも１Ｅ−６、少なくとも１Ｅ−５、少なくとも１Ｅ−４、少なくとも１Ｅ−３、少なくとも１Ｅ−２、又は少なくとも１Ｅ−１のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。
【０２２９】
方法の実施形態において、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質は、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系を有する任意の種に由来する。一部の実施形態において、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９は、以下の細菌種に由来する：レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＨＴＣＣ５０１５、パラサテレラ・エキスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、スルフロスピリラム属種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、ルミノバクター属種（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ８７、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１＿１＿４７、バクテロイデス・オーラル・タクソン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ）２７４株Ｆ００５８、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＹＬ４５、ルミノバクター・アミロフィラス（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）Ｐ０１１１、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ９２６１、カンピロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株ＲＭ８００１、カンプリロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株Ｐ０１２１、ツリシモナス・ムリス（Ｔｕｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｍｕｒｉｓ）、レジオネラ・ロンジニエンシス（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｌｏｎｄｉｎｉｅｎｓｉｓ）、サリニビブリオ・シャルメンシス（Ｓａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｓｈａｒｍｅｎｓｉｓ）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）単離株ＦＷ．０３０、モリテラ属種（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｓｐ．）単離株ＮＯＲＰ４６、エンドゾイコモナス属種（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｓ−Ｂ４−１Ｕ、タミルナドゥイバクター・サリナス（Ｔａｍｉｌｎａｄｕｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｎｕｓ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、アルコバクター・スキロウイイ（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｋｉｒｒｏｗｉｉ）、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）、フランシセラ・ヒスパニエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ）、又はパレンドゾイコモナス・ハリクロナエ（Ｐａｒｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｉｃｌｏｎａｅ）。
【０２３０】
方法の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、ガイドＲＮＡである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも２つのヌクレオチドセグメント：少なくとも１つの「ＤＮＡ結合セグメント」又は「ガイド配列」及び少なくとも１つの「ポリペプチド結合セグメント」を含む。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのＤＮＡ結合セグメントは真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列とハイブリダイズしない。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのポリペプチド結合セグメントは、Ｃａｓ９に結合する。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのポリペプチド結合セグメントは、ｓｔｉＣａｓ９に結合する。
【０２３１】
方法の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、１０〜３５ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、１５〜３０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、２０〜２５ヌクレオチドである。
【０２３２】
方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、複合体を形成し得る。一部の実施形態において、複合体は、複合体の全ての構成成分が一緒に存在する場合に形成され、すなわち、自己集合複合体である。一部の実施形態において、複合体は、複合体の異なる構成成分間の化学的相互作用、例えば、水素結合などを介して形成される。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、ｓｔｉＣａｓ９によるガイドポリヌクレオチドの二次構造認識を介してｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成する。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質は、それがガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成するまで不活性であり、すなわち、ヌクレアーゼ活性を示さない。ガイドＲＮＡの結合は、ｓｔｉＣａｓ９の立体構造変化を誘導してｓｔｉＣａｓ９を不活性形態から活性、すなわち、触媒的に活性な形態に変換する。方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドの複合体は天然に生じない。
【０２３３】
方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９により生成される粘着末端は、一緒にライゲートさせる（すなわち、一緒に化学的に結合させる）。ライゲーションは、例えば、ＤＮＡリガーゼ、例えば、Ｔ４リガーゼ又はＤＮＡリガーゼＩＶにより実施することができる。一部の実施形態において、粘着末端は、１つ以上のヌクレオチド置換を導入するエラープローンリガーゼと一緒にライゲートさせる。一部の実施形態において、目的ポリヌクレオチド配列（ＳｏＩ）を粘着末端にライゲートさせる。一部の実施形態において、ＳｏＩは、目的突然変異を含む。
【０２３４】
方法の実施形態において、粘着末端は、標的配列中で生成される粘着末端に相補的なＳｏＩ中で生成させる。一部の実施形態において、ＳｏＩ中の粘着末端は、ｓｔｉＣａｓ９により生成させる。一部の実施形態において、ＳｏＩは、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路を使用して粘着末端中にライゲートさせる。内因性ＤＮＡ修復経路は、本明細書に記載される。
【０２３５】
一部の実施形態において、本開示は、真核細胞中の標的配列の部位特異的改変を提供する方法であって、（１）細胞中に、（ａ）粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）をコードするヌクレオチド配列、及び（ｂ）ｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチド（複合体は天然に生じない）を導入すること；（２）Ｃａｓ９エフェクタータンパク質及びガイドポリヌクレオチドにより標的配列中の粘着末端を生成すること；並びに（３）（ａ）粘着末端を一緒に、又は（ｂ）目的ポリヌクレオチド配列（ＳｏＩ）を粘着末端にライゲートすることを含み、それにより標的配列を改変する方法を提供する。
【０２３６】
方法の実施形態においてｓｔｉＣａｓ９は、ヌクレオチド配列によりコードされる。一部の実施形態において、ヌクレオチドは、ＤＮＡである。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質は、配列番号１０〜９７又は１９２〜１９５のいずれかのヌクレオチド配列と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の同一性を有する配列を含むドメインを含む。
【０２３７】
方法の実施形態において、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ｔｒａｃｒＲＮＡをさらに含む。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを含む。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡのｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分は、Ｃａｓ９タンパク質を活性化させる。方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、複合体を形成し得る。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡの複合体は天然に生じない。
【０２３８】
方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む複合体は、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の１０ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む複合体は、ＰＡＭの５ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。一部の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む複合体は、ＰＡＭの３ヌクレオチド以内の部位において開裂させ得る。一部の実施形態において、ＰＡＭは、標的配列の下流（すなわち、３’方向）に存在する。一部の実施形態において、ＰＡＭは、標的配列の上流（すなわち、５’方向）に存在する。一部の実施形態において、ＰＡＭは、標的配列内に局在する。
【０２３９】
方法の実施形態において、ＰＡＭは、３’Ｇリッチモチーフを含む。一部の実施形態において、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、又はＧである）である。一部の実施形態において、ＰＡＭ配列は、ＮＧＡ（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、又はＧである）である。一部の実施形態において、ＰＡＭ配列は、ＹＧ（Ｙは、ピリミジン（すなわち、Ｃ、Ｔ、又はＵ）である）である。方法の実施形態において、標的配列は、ＰＡＭの５’に存在し、ＰＡＭは、３’Ｇリッチモチーフを含む。一部の実施形態において、標的配列は、ＰＡＭの５’に存在し、ＰＡＭ配列は、ＮＧＧ（Ｎは、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｕ、はＧである）である。
【０２４０】
方法の実施形態において、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。一部の実施形態において、真核細胞は、動物細胞である。一部の実施形態において、真核細胞は、ヒト細胞、例として、ヒト幹細胞である。一部の実施形態において、真核細胞は、植物細胞である。種々の型の真核細胞の例は、本明細書に提供される。方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、真核細胞中に、送達粒子を介して導入する。方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、真核細胞中に、ベシクルを介して導入する。方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、真核細胞中に、ベクターを介して導入する。方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドは、真核細胞中に、ウイルスベクターを介して導入する。方法の実施形態において、ｓｔｉＣａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む複合体の構成成分をコードするポリヌクレオチドは、１つ以上のベクター上に導入する。ベクター及び細胞中へのベクター送達の方法（例えば、形質移入）の例は、本明細書に提供される。
【０２４１】
一部の実施形態において、本開示の方法は、真核細胞中にエキソヌクレアーゼを導入してｓｔｉＣａｓ９から生成されたオーバーハングを除去することをさらに含む。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、５’〜３’エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、３’〜５’エキソヌクレアーゼである。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、方法のライゲーションステップ前に添加する。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、方法のライゲーションステップに代えて添加する。５’〜３’エキソヌクレアーゼの非限定的な例としては、ラムダエキソヌクレアーゼ、ＲｅｃＪ、エキソヌクレアーゼＶ、エキソヌクレアーゼＶＩＩＩ、Ｔ５エキソヌクレアーゼ、Ｔ７エキソヌクレアーゼ、Ａｒｔｅｍｉｓ、及びＣａｓ４が挙げられる。３’〜５’エキソヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＴＲＥＸ１、ＴＲＥＸ２、ウェルナー症候群（ＷＲＮ）タンパク質、ｐ５３、ＭＲＥ１１、ＲＡＤ１、ＲＡＤ９、ＡＰＥ１、及びＶＤＪＰタンパク質が挙げられる。一部の実施形態において、エキソヌクレアーゼは、Ｃａｓ４、Ａｒｔｅｍｉｓ、又はＴＲＥＸ２である。
【０２４２】
Ｃａｓ４、Ａｒｔｅｍｉｓ、ＴＲＥＸ２、又は他の類似のエキソヌクレアーゼの導入は、ライゲーションが生じる前の粘着末端の末端プロセシングを可能とし、それにより、正確なライゲーションの機会を減少させ、したがって、突然変異誘発の効率を増加させ、内因性ＤＮＡ修復酵素と競合して他の修復経路（例えば、ＮＨＥＪ又はＭＭＥＪ）の１つに修復を偏らせ、突然変異パターンをモジュレートする。例えば、Ｃａｓ４、Ａｒｔｅｍｉｓ、又はＴＲＥＸ２は、内因性末端プロセシング酵素と競合し、したがって、エラープローン修復を促進することにより突然変異誘発の効率を増加させ得る。Ｃａｓ４、Ａｒｔｅｍｉｓ、又はＴＲＥＸ２は、一本鎖オーバーハングを伸長させることによりＨＤＲ修復も容易にし得る。Ｃａｓ４、Ａｒｔｅｍｉｓ、又はＴＲＥＸ２についてのさらなる役割は、例えば、より望ましいインデルへの突然変異パターンの変化を含み得る。
【０２４３】
部位特異的遺伝子挿入の方法（ＯｂＬｉＧａＲｅ  ２．０）
一部の実施形態において、本開示は、米国特許第９，５６７，６０８号明細書に記載のＯｂＬｉＧａＲｅ法の派生法に基づき細胞中の染色体中に目的配列（ＳｏＩ）を導入する方法を提供する。ＯｂＬｉＧａＲｅ（偏性ライゲーションゲート型組換え）は、Ｌａｔｉｎ  ｖｅｒｂ  ｏｂｌｉｇａｒｅ（直接ライゲートすること）の語源的意味を反映する。これは、様々な細胞系において広く適用可能であり、遺伝子操作のための追加のアプローチを提供する。米国特許第９，５６７，６０８号明細書はジンクフィンガーヌクレアーゼを用いて標的配列を標的化し、開裂させる一方、本明細書の開示は、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、例えば、Ｃａｓ９−ＦｏｋＩ、及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の使用を提供する。本明細書に記載の部位特異的遺伝子挿入の方法は、米国特許第９，５６７，６０８号明細書に記載のＯｂＬｉＧａＲｅ法とそれを区別するために略語として「ＯｂＬｉＧａＲｅ  ２．０」と情報的に称される。
【０２４４】
一部の実施形態において、本開示は、細胞中の染色体中に目的配列（ＳｏＩ）を導入する方法であって、染色体は、領域１及び領域２を含む標的配列（ＴＳＣ）を含み、細胞中に、（ａ）標的配列（ＴＳＶ）を含むベクター（ＴＳＶは、領域２及び領域１並びにＳｏＩを含む）；（ｂ）ＴＳＣ中の粘着末端を生成し得る第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体（第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、ＴＳＣの領域１において開裂させ、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の二量体は、領域２において開裂させる）；及び（ｃ）ＴＳＶ中の粘着末端を生成し得る第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体（第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、ＴＳＶの領域２において開裂させ、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、領域１において開裂させる）を導入することを含み、（ａ）のベクター、（ｂ）の第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び（ｃ）の第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の導入は、細胞の染色体中へのＳｏＩの挿入をもたらす方法を提供する。
【０２４５】
一部の実施形態において、本開示は、細胞中の染色体中に目的配列（ＳｏＩ）を導入する方法であって、染色体は、領域１及び領域２を含む標的配列（ＴＳＣ）を含み、細胞中に、（ａ）標的配列（ＴＳＶ）（ＴＳＶは、領域２及び領域１並びにＳｏＩを含む）を含むベクター（ベクターは、粘着末端を含む）；及び（ｂ）ＴＳＣ中の粘着末端を生成し得る第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体（第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、ＴＳＣの領域１において開裂させ、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、領域２において開裂させる）を導入することを含み；（ａ）のベクター及び（ｂ）の第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の導入は、細胞の染色体中へのＳｏＩの挿入をもたらす方法を対象とする。
【０２４６】
本開示の方法は、ベクター（又は「ドナープラスミド」）中の相同性を用いない効率的及び正確な遺伝子標的化を提供する。本開示の方法は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又はマイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）経路を使用する部位特異的遺伝子挿入の方針を提供する。ベクター中の開裂部位（すなわち、領域１及び領域２）の設計及び局在は、ゲノム部位中の開裂部位（すなわち、領域１及び領域２）、すなわち、細胞の染色体中の標的配列（ＴＳＣ）中のベクターの正確な末端結合を達成するために十分なものである。
【０２４７】
一部の実施形態において、ＴＳＶは、環状ベクター、すなわち、プラスミドである。一部の実施形態において、ＴＳＶは、線状化ベクター又は線状ＤＮＡ、例えば、ＰＣＲ産物、又は開裂後にＴＳＣに相補的な末端を有するアニール化オリゴヌクレオチド二本鎖などである。一部の実施形態において、ＴＳＶは、粘着末端を含む。一部の実施形態において、ＴＳＶ中の粘着末端は、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体により生成される。一部の実施形態において、ＴＳＶ中の粘着末端は、細胞中へのＴＳＶの導入前に生成される。一部の実施形態において、ＴＳＶ中の粘着末端は、細胞中へのＴＳＶの導入後に生成される。
【０２４８】
一部の実施形態において、染色体上の標的配列（ＴＳＣ）は、５’−３’様式で領域１及び領域２を含む。本明細書において使用される配列の方向性（例えば、５’−３’）は、二本鎖ＤＮＡ配列の「コード」鎖又は「センス」鎖（典型的には、二本鎖ＤＮＡ配列のトップ鎖として提示される）を読み取る場合の方向を指す。
【０２４９】
図１２は、本開示の実施形態を表す。図１２において、ＴＳＣは、「ゲノム」枠（左側）中の配列により表され、「コード」鎖（トップ鎖として示される）上の領域１及び領域２（その一部は領域１と重複している）を含む。
【０２５０】
図１２の「ゲノム」枠に示されるとおり、領域１の上流（すなわち、コード鎖に関して５’）及び「非コード」又は「アンチセンス」ＤＮＡ鎖（ボトム鎖として示される）上に第１のＰＡＭ配列が存在する。非コード鎖は、第１のガイドポリヌクレオチド（「ｇＲＮＡ１」）にハイブリダイズする領域を含む。ｇＲＮＡ１は、第１のＰＡＭ配列の上流（すなわち、非コード鎖に関して５’）の配列にハイブリダイズする。このｇＲＮＡ１ハイブリダイゼーション配列は、領域１の一部及びさらに領域１外側の数ヌクレオチドを含む。矢印の方向により示されるとおり、ｇＲＮＡ１は、標的配列の非コード鎖とハイブリダイズする。
【０２５１】
図１２の「ゲノム」枠に示されるとおり、領域２の下流（すなわち、コード鎖に関して３’）及びコード鎖上に第２のＰＡＭ鎖が存在する。コード鎖は、第２のガイドポリヌクレオチド（「ｇＲＮＡ２」）にハイブリダイズする領域を含む。ｇＲＮＡ２は、第２のＰＡＭ配列の上流（すなわち、コード鎖に関して５’）の配列にハイブリダイズする。このｇＲＮＡ２ハイブリダイゼーション配列は、領域２の一部及びさらに領域２外側の数ヌクレオチドを含む。矢印の方向により示されるとおり、ｇＲＮＡ２は、標的配列のコード鎖とハイブリダイズする。
【０２５２】
一部の実施形態において、ベクター上の標的配列（ＴＳＶ）は、５’−３’様式で領域２、その直後に続く領域１、及びＳｏＩを含む。図１２は、本開示の実施形態を表す。図１２において、ＴＳＶは、「ベクター」枠（右側）中の配列により表され、「コード」鎖上の領域２、それに続く領域１（その２つの領域間にはいかなる重複もない）を含む。
【０２５３】
図１２の「ベクター」枠に示されるとおり、領域２の上流（すなわち、コード鎖に関して５’）及び「非コード」上に第３のＰＡＭ配列が存在する。非コード鎖は、第３のガイドポリヌクレオチド（「ｇＲＮＡ３」）にハイブリダイズする領域を含む。ｇＲＮＡ３は、第３のＰＡＭ配列の上流（すなわち、非コード鎖に関して５’）の配列にハイブリダイズする。このｇＲＮＡ３ハイブリダイゼーション配列は、領域２の一部及びさらに領域２外側の数ヌクレオチドを含む。矢印の方向により示されるとおり、ｇＲＮＡ３は、標的配列の非コード鎖とハイブリダイズする。
【０２５４】
図１２の「ベクター」枠に示されるとおり、領域１の下流（すなわち、コード鎖に関して３’）及びコード鎖上に第４のＰＡＭ配列が存在する。コード鎖は、第４のガイドポリヌクレオチド（「ｇＲＮＡ４」）にハイブリダイズする領域を含む。ｇＲＮＡ４は、第４のＰＡＭ配列の上流（すなわち、コード鎖に関して５’）の配列にハイブリダイズする。このｇＲＮＡ４ハイブリダイゼーション配列は、領域１の一部及びさらに領域１外側の数ヌクレオチドを含む。矢印の方向により示されるとおり、ｇＲＮＡ４は、標的配列のコード鎖とハイブリダイズする。
【０２５５】
図１４は、本開示の別の実施形態を表す。図１４は、図１４と類似であるが、ＴＳＣ上の領域１及び領域２間の数ヌクレオチドのギャップが存在すること、並びにＴＳＶ上の領域２及び領域１間の数ヌクレオチドのギャップが存在することを除く。しかしながら、互いに対する領域の配置、及びガイドポリヌクレオチドの方向性は、図１４及び図１２において同一である。
【０２５６】
したがって、一部の実施形態において、染色体上の標的配列（すなわち、ＴＳＣ）は、領域１及び領域２を含み、領域１の一部は、領域２の一部と重複する。他の実施形態において、ＴＳＣは、領域１及び領域２を含み、領域１及び領域２は、１つ以上のヌクレオチドだけ離隔している。一部の実施形態において、領域１及び領域２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヌクレオチドだけ重複する。一部の実施形態において、領域１及び領域２は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヌクレオチドだけ離隔している。
【０２５７】
一部の実施形態において、ベクター上の標的配列（すなわち、ＴＳＶ）は、領域２及び領域１を含み、領域２は、領域１の直前に、それらの間のいかなるヌクレオチドもなしで先行する。他の実施形態において、ＴＳＶは、領域２及び領域１を含み、領域２及び領域１は、１つ以上のヌクレオチドだけ離隔している。一部の実施形態において、領域２及び領域１は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０以上のヌクレオチドだけ離隔している。
【０２５８】
方法の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、標的配列中の粘着末端を生成する。本明細書に記載されるＣａｓ９タンパク質は、核酸中の部位特異的分解を生成する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、ＤＮＡ中の部位特異的二本鎖分解を生成する。核酸中の特異的配列を標的化するＣａｓ９の能力（すなわち、部位特異性）は、規定の配列とハイブリダイズするガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡと複合体化するＣａｓ９により達成される。したがって、Ｃａｓ９及びガイドポリヌクレオチドを含む複合体は、少なくとも２つの区別される機能：（１）核酸配列の特異的標的化、及び（２）標的化される核酸配列又はその近傍における分解を生成するヌクレアーゼ活性を有する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−ガイドポリヌクレオチド複合体は、それが２つの機能の一方のみを実行するように改変されている。一部の実施形態において、Ｃａｓ９は、ヌクレアーゼ活性を除去するが、Ｃａｓ９が依然として特異的核酸配列を標的化し得るようにガイドポリヌクレオチドと複合体化する能力を保持するように改変されている。
【０２５９】
本明細書に記載の野生型Ｃａｓ９は、核酸結合ドメイン（ガイドポリヌクレオチドと相互作用する）及び開裂ドメイン（標的核酸を開裂させる）を含む単量体タンパク質である。ある例において、二量体ヌクレアーゼ、すなわち、二量体の両方の単量体が標的配列において存在するまで活性でないヌクレアーゼを使用してより高度の標的化特異性を達成することが有利である。天然発生ヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９など）の結合ドメイン及び開裂ドメイン、並びにヌクレアーゼ結合特異的標的部位を作出するために融合させることができるモジュラー結合ドメイン及び開裂ドメインは、当業者に周知である。例えば、ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９）の結合ドメイン、又は不活性ＤＮＡ開裂ドメインを有するＣａｓ９タンパク質を、結合ドメイン（例えば、ｇＲＮＡに結合して標的部位への結合を指向する）として使用して所望の標的部位に特異的に結合させ、開裂ドメイン、例えば、エンドヌクレアーゼＦｏｋＩの開裂ドメインに融合させ、又はコンジュゲートさせて標的領域を開裂させる遺伝子操作ヌクレアーゼを作出することができる。Ｃａｓ９−ＦｏｋＩ融合タンパク質は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／００７１８９９号明細書及びＧｕｉｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｆｕｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｔａｌｙｔｉｃａｌｌｙ  ｉｎａｃｔｉｖｅ  Ｃａｓ９  ｔｏ  ＦｏｋＩ  ｎｕｃｌｅａｓｅ  ｉｍｐｒｏｖｅｓ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｏｆ  ｇｅｎｏｍｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３２：５７７−５８２（２０１４）にさらに記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０２６０】
一部の実施形態において、遺伝子操作ヌクレアーゼは、回文二本鎖標的部位、例えば、二本鎖ＤＮＡ標的部位を認識する。多くの天然発生ヌクレアーゼ、例えば、天然発生ＤＮＡ制限ヌクレアーゼなどの標的部位は、当業者に周知である。一部の実施形態において、ＤＮＡヌクレアーゼ、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、又はＢａｍＨＩなどは、４〜１０塩基対長さの回文二本鎖ＤＮＡ標的部位を認識し、２つのＤＮＡ鎖のそれぞれを標的部位内の特異的位置において切断する。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸標的部位を対称的に切断し、すなわち、両方の鎖を同一位置において切断し、その結果、末端は本明細書において平滑末端とも称される塩基対合ヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、エンドヌクレアーゼは、二本鎖核酸標的部位を非対称的に切断し、すなわち、それぞれの鎖を異なる位置において切断し、その結果、末端は不対合ヌクレオチド、すなわち、粘着末端又はオーバーハングを含む。一部の実施形態において、オーバーハングは、５’−オーバーハングであり、すなわち、不対合ヌクレオチドは、ＤＮＡ鎖の５’末端を形成する。一部の実施形態において、オーバーハングは、３’−オーバーハングであり、すなわち、不対合ヌクレオチドは、ＤＮＡ鎖の３’末端を形成する。オーバーハングは、相補的不対合ヌクレオチドを含む他の二本鎖ＤＮＡ分子末端に「付着」（すなわち、それと結合）し得る。
【０２６１】
一部の実施形態において、２つドメイン：（ｉ）ＲＮＡプログラマブルヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ９タンパク質、又はその断片）ドメインを（ｉｉ）ヌクレアーゼドメインに融合又は結合させて含む融合タンパク質が提供される。例えば、一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質（例えば、融合タンパク質のＣａｓ９ドメイン）は、ＲＮＡ（ｇＲＮＡ）結合活性を保持し、したがってｇＲＮＡに相補的な標的部位に結合し得るヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９（例えば、ＤＮＡ開裂活性を欠くＣａｓ９；「ｄＣａｓ９」）を含む。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９ドメインに融合しているヌクレアーゼは、標的核酸（例えば、ＤＮＡ）を開裂させるために二量体化（例えば、ヌクレアーゼの２つの単量体の一体化）を要求する任意のヌクレアーゼである。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ不活性化Ｃａｓ９に融合しているヌクレアーゼは、ＦｏｋＩ  ＤＮＡ開裂ドメインの単量体であり、それによりＣａｓ９−ＦｏｋＩと称されるＣａｓ９バリアントを産生する。ＦｏｋＩ  ＤＮＡ開裂ドメインは公知であり、実施形態において、ＦｏｋＩ（ＮＣＢＩアクセッション番号Ｊ０４６２３）のアミノ酸３８８〜５８３に対応する。一部の実施形態において、ＦｏｋＩ  ＤＮＡ開裂ドメインは、ＦｏｋＩのアミノ酸３００〜５８３、３２０〜５８３、３４０〜５８３、又は３６０〜５８３に対応する。（Ｗａｈ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ｏｆ  ＦｏｋＩ  ｈａｓ  ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｃｌｅａｖａｇｅ，”  Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９５（１８）：１０５６４−９（１９９６）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“ＴＡＬ  ｎｕｃｌｅａｓｅｓ（ＴＡＬＮｓ）：ｈｙｂｒｉｄ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｃｏｍｐｏｓｅｄ  ｏｆ  ＴＡＬ  ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ＦｏｋＩ  ＤＮＡ−ｃｌｅａｖａｇｅ  ｄｏｍａｉｎ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３９（１）：３５９−７２  （２０１１）；Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｈｙｂｒｉｄ  ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ  ｅｎｚｙｍｅｓ：ｚｉｎｃ  ｆｉｎｇｅｒ  ｆｕｓｉｏｎｓ  ｔｏ  ＦｏｋＩ  ｃｌｅａｖａｇｅ  ｄｏｍａｉｎ，”Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ａｃａｄｅｍｙ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ＵＳＡ  ９３：１１５６−１１６０（１９９６）も参照；それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる）。
【０２６２】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質の二量体、例えば、Ｃａｓ９−ＦｏｋＩの二量体が提供される。例えば、一部の実施形態において、Ｃａｓ９−ＦｏｋＩ融合タンパク質は、それ自体との二量体を形成して標的核酸の開裂を媒介する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質、又はその二量体は、１つ以上のｇＲＮＡと会合している。一部の実施形態において、二量体は、それぞれｇＲＮＡ結合活性を有するＣａｓ９ドメインを有する２つの融合タンパク質を含有するため、標的核酸は、核酸標的の２つの区別される領域と相補性を示す２つの区別されるｇＲＮＡ配列を使用して標的化される。例えば、図１０及び１１参照。したがって、一部の実施形態において、標的核酸の開裂は、両方の融合タンパク質が標的核酸に結合し（例えば、ｇＲＮＡ：標的核酸塩基対合により特定される）、ヌクレアーゼドメインが二量体化する（例えば、ＦｏｋＩ  ＤＮＡ開裂ドメイン；融合タンパク質のＣａｓ９：ｇＲＮＡドメインの結合に基づくそれらの近接の結果として）まで生じず、例えば、結合Ｃａｓ９融合タンパク質間の領域中の標的核酸を開裂させる。これは、図１０及び１１に示される模式図により例示される。このアプローチは、野生型Ｃａｓ９及び他のＣａｓ９バリアント、例えば、核酸を開裂させるためにヌクレアーゼドメインの二量体化を要求しないニッカーゼと比べて顕著な改善を表す（Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ，“Ｄｏｕｂｌｅ  Ｎｉｃｋｉｎｇ  ｂｙ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  ＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９  ｆｏｒ  Ｅｎｈａｎｃｅｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｅｄｉｔｉｎｇ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，”Ｃｅｌｌ  １５４：１３８０−１３８９（２０１３）；Ｍａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，“ＣＡＳ９  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｔａｒｇｅｔ  ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ  ａｎｄ  ｐａｉｒｅｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ  ｆｏｒ  ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３１：８３３−８３８（２０１３））。これらのニッカーゼバリアントは、核酸への単一ニッカーゼの結合時に開裂、又はニッキングを誘導し得、それはオン及びオフターゲット部位において生じ得、ニッキングは突然変異誘発を誘導することが公知である。本明細書に提供されるバリアントは、標的核酸開裂を誘導するために互いに近接する２つのＣａｓ９バリアントの結合を要求するため、オフターゲット開裂を誘導する機会が低減される。一部の実施形態において、ヌクレアーゼドメインに融合しているＣａｓ９バリアント（例えば、Ｃａｓ９−ＦｏｋＩ）は、野生型Ｃａｓ９又は他のＣａｓ９バリアント（例えば、ニッカーゼ）のオンターゲット：オフターゲット改変比よりも少なくとも２倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも６０倍、少なくとも７０倍、少なくとも８０倍、少なくとも９０倍、少なくとも１００倍、少なくとも１１０倍、少なくとも１２０倍、少なくとも１３０倍、少なくとも１４０倍、少なくとも１５０倍、少なくとも１７５倍、少なくとも２００倍���少なくとも２５０倍以上高いオンターゲット：オフターゲット改変比を有する。一部の実施形態において、ヌクレアーゼドメインに融合しているＣａｓ９バリアント（例えば、Ｃａｓ９−ＦｏｋＩ）は、野生型Ｃａｓ９又は他のＣａｓ９バリアントのオンターゲット：オフターゲット改変比よりも約６０〜１８０倍、約８０〜１６０倍、約１００〜１５０倍、又は約１２０〜１４０倍高いオンターゲット：オフターゲット改変比を有する。オンターゲット：オフターゲット改変比を決定する方法は、公知である。一部の実施形態において、オンターゲット：オフターゲット改変比は、ある遺伝子中の公知のＣａｓ９オフターゲット部位の改変の数又は量を計測することにより決定される。例えば、ＣＬＴＡ、ＥＭＸ、及びＶＥＧＦ遺伝子のＣａｓ９オフターゲット部位が公知であり、それらの部位における改変を試験タンパク質及び対照間で計測し、比較することができる。標的部位及びその対応する公知のオフターゲット部位は、特定のＣａｓ９タンパク質又はバリアントにより処理された細胞（例えば、ＨＥＫ２９３）から単離されたゲノムＤＮＡから増幅される。次いで、改変は、ハイスループットシーケンシングにより分析される。潜在的ゲノムオフターゲット部位中の２つ以上の塩基対の挿入又は欠失を含有し、対照ｇＲＮＡ処理試料に対して標的ｇＲＮＡ処理試料中で有意に多い数（ｐ値＜０．００５、フィッシャーの正確確率検定）で存在する配列は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ誘導ゲノム改変とみなされる。
【０２６３】
一部の実施形態において、本開示の方法は、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ単量体及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ単量体を含むＣａｓ９−エンドヌクレアーゼの二量体を提供する。方法の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼのエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の第１の単量体のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の第２の単量体のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の第１の単量体及び第２の単量体のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の第１の単量体のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の第２の単量体のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の第１の単量体及び第２の単量体のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。
【０２６４】
エンドヌクレアーゼ、又は制限酵素は、サブユニット組成、開裂位置、配列特異性、及び補因子条件に基づき４つの型に慣習的に分類される。しかしながら、アミノ酸シーケンシングにより、制限酵素間の莫大な多様性が見出され、分子レベルにおいて４つよりもかない多い異なる型が存在することが明らかになった。
【０２６５】
「ＩＩＳ型」エンドヌクレアーゼは、片側に対してそれらの認識配列の外側を開裂させるＦｏｋＩ及びＡｌｗＩなどである。ＩＩＳ型制限酵素は、中間サイズ、４００〜６５０アミノ酸長さであり、それらは、連続的及び非対称的な配列を認識する。これらは２つの区別されるドメインを含み、一方はＤＮＡ結合のため、他方はＤＮＡ開裂のためのものである。これらは、大部分、単量体としてＤＮＡに結合するが、隣接酵素分子の開裂ドメインの二量体化を介してＤＮＡを協調的に開裂させることが考えられる。この理由のため、一部のＩＩＳ型酵素は、複数の認識部位を含有するＤＮＡ分子に対してさらに高い活性を示す。ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの非限定的な例としては、ＡｃｕＩ、ＡｌｗＩ、ＢａｅＩ、ＢｂｓＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｃｇＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｃｏＤＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓａＸＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＢＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｐＱＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＣＩ、ＢｔｓＩ、ＣｓｐＣＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＦａｕＩ、ＦｏｋＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、ＭｂｏＩＩ、ＭｌｙＩ、ＭｍｅＩ、ＭｎｌＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＰｌｅＩ、ＳａｐＩ、及びＳｆａＮＩが挙げられる。一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＢｂｖＩ、ＢｇｃＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｐＩ、ＢｓｐＭＩ、ＣｓｐＣＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、及びＰｌｅＩからなる群から独立して選択される。一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。ＦｏｋによるＤＮＡ開裂は、２つのＦｏｋＩ単量体の二量体化時にのみ生じる。ＤＮＡのＦｏｋＩ開裂は、４塩基対オーバーハングを有する粘着末端を生成する。
【０２６６】
Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質中のエンドヌクレアーゼは、遺伝子操作ＦｏｋＩヌクレアーゼ、例えば、遺伝子操作ＦｏｋＩ二量体であってもよい。一部の実施形態において、遺伝子操作ＦｏｋＩ二量体は、偏性ヘテロ二量体、すなわち、２つの非同一単量体が機能的（触媒的に活性な）二量体を形成するために要求される。
【０２６７】
一部の実施形態において、第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、同一である。一部の実施形態において、第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、異なる。
【０２６８】
一部の実施形態において、本方法は、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、改変Ｃａｓ９を含むことを提供する。一部の実施形態において、改変Ｃａｓ９は、触媒的に不活性なＣａｓ９（「ｄｅａｄＣａｓ９」）である。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、触媒的に不活性なＣａｓ９を含む。触媒的に不活性なＣａｓ９は、ＤＮＡを開裂させ得ず（すなわち、Ｃａｓ９の開裂ドメインが不活性化している）；しかしながら、それらは、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）との複合体を形成することにより核酸配列を標的化する能力を保持する。触媒的な不活性なＣａｓ９は、当分野において、例えば、Ｊｉｎｅｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）及びＱｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ  ＣＲＩＳＰＲ  ａｓ  ａｎ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｐｌａｔｆｏｒｍ  ｆｏｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，”Ｃｅｌｌ  １５２（５）：１１７３−１１８３（２０１３）により記載されている。一部の実施形態において、触媒的に不活性なＣａｓ９は、野生型Ｃａｓ９に対して二重アミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、野生型Ｃａｓ９に対して二重アミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、二重アミノ酸置換は、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａである。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであり、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のＣａｓ９は、触媒的に不活性なＣａｓ９である（「ｄｅａｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ」）。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであり、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のＣａｓ９は、Ｄ１０Ａ／Ｈ８４０Ａ二重アミノ酸置換を含む。
【０２６９】
一部の実施形態において、改変Ｃａｓ９は、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９（「Ｃａｓ９ニッカーゼ」又は「Ｃａｓ９ｎ」）である。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９を含む。Ｃａｓ９ニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを開裂させ得る（すなわち、ＤＮＡを「ニッキングする」）。Ｃａｓ９ニッカーゼは、例えば、Ｃｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅｓ  ａｎｄ  ｎｉｃｋａｓｅｓ，”Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２４：１３２−１４１（２０１３）、Ｒａｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｅｌｌ  ２０１３）、及びＭａｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２０１３）に記載されている。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、野生型Ｃａｓ９に対して単一アミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、野生型Ｃａｓ９に対して単一アミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換は、Ｄ１０Ａである（「Ｃａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）」）。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換は、Ｈ８４０Ａである（「Ｃａｓ９ｎ（Ｈ８４０Ａ）」）。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであり、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のＣａｓ９は、Ｃａｓ９ニッカーゼである。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであり、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のＣａｓ９は、Ｄ１０Ａ単一アミノ酸置換を含む（「Ｃａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）−ＦｏｋＩ」）。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩであり、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中のＣａｓ９は、Ｈ８４１０Ａ単一アミノ酸置換を含む（「Ｃａｓ９ｎ（Ｈ８４０Ａ）−ＦｏｋＩ」）。
【０２７０】
一部の実施形態において、野生型Ｃａｓ９は、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、スタフィロコッカス・シュードインターメディウス（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｓｅｕｄｉｎｔｅｒｍｅｄｉｕｓ）、プラノコッカス・アンタルクティカス（Ｐｌａｎｏｃｏｃｃｕｓ  ａｎｔａｒｃｔｉｃｕｓ）、ストレプトコッカス・サングイニス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓａｎｇｕｉｎｉｓ）、ストレプトコッカス・サーモフィラス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、ストレプトコッカス・ムタンス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｍｕｔａｎｓ）、コリバクテリウム・グロメランス（Ｃｏｒｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｏｍｅｒａｎｓ）、ラクトバシラス・ファーシミニス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆａｒｃｉｍｉｎｉｓ）、カテニバクテリウム・ミツオカイ（Ｃａｔｅｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｉｔｓｕｏｋａｉ）、ラクトバシラス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｂｉｆｉｄｕｍ）、オエノコッカス・キタハラ（Ｏｅｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｋｉｔａｈａｒａ）、フルクトバシラス・フルクトサス（Ｆｒｕｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｆｒｕｃｔｏｓｕｓ）、フィネゴルディア・マグナ（Ｆｉｎｅｇｏｌｄｉａ  ｍａｇｎａ）、ベイロネラ・アチピカ（Ｖｅｉｌｌｏｎｅｌｌａ  ａｔｙｉｐｃａ）、ソロバクテリウム・モオレイ（Ｓｏｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｍｏｏｒｅｉ）、アシドアミノコッカス属種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．）Ｄ２１、ユーバクテリウム・ユリ（Ｅｕｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｙｕｒｒｉ）、コプロコッカス・カタス（Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｃａｔｕｓ）、フソバクテリウム・ヌクレアタム（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｎｕｃｌｅａｔｕｍ）、フィリファクター・アロシス（Ｆｉｌｉｆａｃｔｏｒ  ａｌｏｃｉｓ）、ペプトニフィラス・ドゥエルデニイ（Ｐｅｐｔｏｎｉｐｈｉｌｕｓ  ｄｕｅｒｄｅｎｉｉ）、又はトレポネマ・デンティコラ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｄｅｎｔｉｃｏｌａ）に由来する。
【０２７１】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼにより生成される粘着末端は、５’オーバーハングを含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼにより生成される粘着末端は、３’オーバーハングを含む。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、４〜３０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、５〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、又は約３０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、ｄｅａｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ二量体は、４−ヌクレオチド５’オーバーハングを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９（Ｄ１０Ａ）−ＦｏｋＩ二量体は、２７−ヌクレオチド５’オーバーハングを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）−ＦｏｋＩ二量体は、２３−ヌクレオチド３’−オーバーハングを含む粘着末端を生成する。
【０２７２】
方法の実施形態において、目的配列（ＳｏＩ）は、ドナープラスミドにより含まれる。ドナープラスミドは、任意の好適な長さ、例えば、約又は少なくとも約１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、１５０、２００、２５０、５００若しくは１０００以上のヌクレオチド長さのものであり得る。一部の実施形態において、ドナープラスミドは、ＴＳＣを含む染色体の一部に相補的である。ドナープラスミドテンプレートは、最適にアラインされる場合、ＴＳＣの１つ以上のヌクレオチド（例えば、約又は少なくとも約１、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、６０、７０、８０、９０、若しくは１００以上のヌクレオチド）と重複する。一部の実施形態において、ドナープラスミド及びＴＳＣを含む染色体が最適にアラインされる場合、ドナープラスミドの最近傍ヌクレオチドは、ＴＳＣから約１、５、１０、１５、２０、２５、５０、７５、１００、２００、３００、４００、５００、１００、１５００、２０００、２５００、５０００、１００００以上のヌクレオチド以内に存在する。
【０２７３】
一部の実施形態において、ＳｏＩは、ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、線状ＤＮＡ片、ＰＣＲ断片、ネイキッド核酸、又は送達ビヒクル、例えば、リポソームと複合体化している核酸などである。
【０２７４】
一部の実施形態において、ＳｏＩは、細胞の内因性ＤＮＡ修復経路を使用してＴＳＣ中に挿入される。一部の実施形態において、ＳｏＩは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）修復経路の構成成分を使用してＴＳＣ中に挿入される。修復プロセスの間、ＳｏＩを含むドナープラスミドをＴＳＣ中に導入することができる。
【０２７５】
一部の実施形態において、上流配列及び下流配列によりフランキングされたＳｏＩを含むドナープラスミドを細胞中に導入し、上流及び下流配列は、ＴＳＣ中の組込みの部位のいずれかの側と配列類似性を共有する。一部の実施形態において、ＳｏＩを含む外因性ポリヌクレオチドは、例えば、突然変異遺伝子を含む。一部の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドは、細胞に対して内因性又は外因性である配列を含む。一部の実施形態において、ＳｏＩは、タンパク質をコードするポリヌクレオチド、又は非コード配列、例えば、マイクロＲＮＡなどを含む。一部の実施形態において、ＳｏＩは、調節エレメントに作動可能に結合している。一部の実施形態において、ＳｏＩは、調節エレメントである。一部の実施形態において、ＳｏＩは、耐性カセット、例えば、抗生物質に対する耐性を付与する遺伝子を含む。一部の実施形態において、ＳｏＩは、野生型標的配列の突然変異を含む。一部の実施形態において、ＳｏＩは、フレームシフト突然変異又はヌクレオチド置換を作出することにより標的配列を破壊する。一部の実施形態において、ＳｏＩは、マーカーを含む。標的配列中へのマーカーの導入は、標的化組込みのスクリーニングを容易にし得る。一部の実施形態において、マーカーは、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択マーカーである。一部の実施形態において、ＳｏＩは、ＳｏＩを含むベクターとして導入する。
【０２７６】
外因性ポリヌクレオチドテンプレート中の上流及び下流配列は、標的配列及び外因性ポリヌクレオチド間の相同組換えを促進するように選択される。上流配列は、組込みのための標的部位の上流の配列（すなわち、標的配列）との配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組込みのための標的部位の下流の配列との配列類似性を共有する核酸配列である。したがって、一部の実施形態において、Ｓｏｌを含む外因性ポリヌクレオチドテンプレートは、上流及び下流配列において相同組換えにより標的配列中に挿入する。一部の実施形態において、外因性ポリヌクレオチドテンプレート中の上流及び下流配列は、標的化ゲノム配列の上流及び下流配列とそれぞれ少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、上流又は下流配列は、約２０〜２０００塩基対、又は約５０〜１７５０塩基対、又は約１００〜１５００塩基対、又は約２００〜１２５０塩基対、又は約３００〜１０００塩基対、又は約４００〜約７５０塩基対、又は約５００〜６００塩基対を有する。一部の実施形態において、上流又は下流配列は、約５０、約１００、約２５０、約５００、約１００、約１２５０、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、又は約２５００塩基対を有する。
【０２７７】
一部の実施形態において、ＳｏＩの挿入時、染色体中の標的配列及びプラスミド中の標的配列は、再構成させない。すなわち、一部の実施形態において、染色体中の得られた配列（すなわち、ＳｏＩの挿入から得られた配列）は、第１、第２、第３、又は第４のガイドポリヌクレオチドのいずれにもハイブリダイズしない。したがって、一部の実施形態において、ＳｏＩを含む染色体中の得られた配列は、第１又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、又は第１若しくは第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体中の単量体のいずれかによる開裂に感受性でない。図１３及び１５に例示されるとおり、得られた「ノックイン」配列（「予測５’ジャンクション」）は、「ゲノム」及び「ベクター」配列と異なる配列であり、「ノックイン」配列は、ｇＲＮＡ１、ｇＲＮＡ２、ｇＲＮＡ３、又はｇＲＮＡ４のいずれにもハイブリダイズ可能な配列を有さない。
【０２７８】
一部の実施形態において、本開示の方法は、細胞中に、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体との複合体を形成し、第１のガイド配列（第１のガイド配列は、領域１を含むＴＳＣにハイブリダイズするが、ベクターにハイブリダイズしない）を含む第１のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。図１３及び１５により例示されるとおり、第１のガイド配列（「ｇＲＮＡ１」として示される）は、ゲノム中の標的ＤＮＡの非コード鎖上の領域１の一部及び領域１外側の数ヌクレオチドに結合する。ｇＲＮＡ１は、ゲノム又はベクター中の任意の他の配列にハイブリダイズしない。一部の実施形態において、第１のガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９の結合ドメインとの相互作用により第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体との複合体を形成する。
【０２７９】
一部の実施形態において、本開示の方法は、細胞中に、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体との複合体を形成し、第２のガイド配列（第２のガイド配列は、領域２を含むＴＳＣにハイブリダイズするが、ベクターにハイブリダイズしない）を含む第２のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。図１３及び１５により例示されるとおり、第２のガイド配列（「ｇＲＮＡ２」として示される）は、ゲノム中の標的ＤＮＡのコード鎖上の領域２の一部に結合する。ｇＲＮＡ２は、ゲノム又はベクター中の任意の他の配列にハイブリダイズしない。一部の実施形態において、第２のガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９の結合ドメインとの相互作用により第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体との複合体を形成する。
【０２８０】
一部の実施形態において、本開示の方法は、細胞中に、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体との複合体を形成し、第３のガイド配列（第３のガイド配列は、領域２を含むＴＳＶにハイブリダイズするが、ゲノムにハイブリダイズしない）を含む第３のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。図１３及び１５により例示されるとおり、第３のガイド配列（「ｇＲＮＡ３」として示される）は、ベクター中の標的ＤＮＡの非コード鎖上の領域２の一部及び領域２外側の数ヌクレオチドに結合する。ｇＲＮＡ３は、ゲノム又はベクター中の任意の他の配列にハイブリダイズしない。一部の実施形態において、第３のガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９の結合ドメインとの相互作用により第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体との複合体を形成する。
【０２８１】
一部の実施形態において、本開示の方法は、細胞中に、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体との複合体を形成し、第４のガイド配列（第４のガイド配列は、領域１を含むＴＳＣにハイブリダイズするが、ゲノムにハイブリダイズしない）を含む第４のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。図１３及び図１５により例示されるとおり、第４のガイド配列（「ｇＲＮＡ４」として示される）は、ベクター中の標的ＤＮＡのコード鎖上の領域１の一部に結合する。ｇＲＮＡ４は、ゲノム又はベクター中の任意の他の配列にハイブリダイズしない。一部の実施形態において、第４のガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９の結合ドメインとの相互作用により第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体との複合体を形成する。
【０２８２】
一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、ＴＳＣ及びＴＳＶの両方に結合し得る。したがって、一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体との複合体を形成し、第１のガイド配列（第１のガイド配列は、ＴＳＣ及びＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第１のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【０２８３】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体との複合体を形成し、第２のガイド配列（第２のガイド配列は、ＴＳＣ及びＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第２のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【０２８４】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体との複合体を形成し、第３のガイド配列（第３のガイド配列は、ＴＳＣ及びＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第３のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【０２８５】
一部の実施形態において、方法は、細胞中に、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体との複合体を形成し、第４のガイド配列（第４のガイド配列は、ＴＳＣ及びＴＳＶにハイブリダイズする）を含む第４のガイドポリヌクレオチドを導入することをさらに含む。
【０２８６】
一部の実施形態において、第１、第２、第３、及び／又は第４のガイドポリヌクレオチドは、同一である。一部の実施形態において、第１、第２、第３、及び／又は第４のガイドポリヌクレオチドは、異なる。
【０２８７】
一部の実施形態において、本開示の方法は、細胞中に、第１、第２、第３、及び第４のガイドポリヌクレオチドを導入することを含む。一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第１のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成し、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第２のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成する。一部の実施形態において、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第３のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成し、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第４のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成する。
【０２８８】
一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第１のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成し、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第２のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成し、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第３のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成し、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第４のガイドポリヌクレオチドとの複合体を形成する。一部の実施形態において、第１及び第２のガイドポリヌクレオチドは、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体を細胞の染色体上の標的配列にガイドし、第３及び第４のガイドポリヌクレオチドは、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体を細胞中に導入されたベクター上の標的配列にガイドする。
【０２８９】
一部の実施形態において、本開示の方法は、細胞中に、ｔｒａｃｒＲＮＡを導入することをさらに含む。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを含む。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのｔｒａｃｒＲＮＡ構成成分は、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼのＣａｓ９を活性化させる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡは、複合体を形成し得る。一部の実施形態において、複合体は、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ、２つのガイドポリヌクレオチド、及び２つのｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡの複合体は天然に生じない。
【０２９０】
一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第１のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成し、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第２のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成する。一部の実施形態において、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第３のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成し、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第４のガイドポリヌクレオチド配列及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列との複合体を形成する。
【０２９１】
一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第１のガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体を形成し、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第２のガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体を形成し、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１の単量体は、第３のガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体を形成し、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第２の単量体は、第４のガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡとの複合体を形成する。一部の実施形態において、第１のガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡ並びに第２のガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡは、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体を細胞の染色体上の標的配列にガイドし、第３のガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡ並びに第４のガイドポリヌクレオチド及びｔｒａｃｒＲＮＡは、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体を細胞中に導入されたベクター上の標的配列にガイドする。
【０２９２】
方法の実施形態において、ＴＳＶ、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、細胞中に、第１及び第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチドとして導入する。一部の実施形態において、ＴＳＶ、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチドは、真核細胞中の発現のためにコドン最適化されている。一部の実施形態において、ＴＳＶ、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞中の発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化法及び技術は、本明細書に記載される。
【０２９３】
一部の実施形態において、ＴＳＶ、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、細胞中に、単一核酸分子として導入する。一部の実施形態において、ＴＳＶ、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチドは、単一ベクター上に存在する。一部の実施形態において、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチド、並びに１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、単一ベクター上に存在する。一部の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、真核生物発現ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ヒト発現ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、植物発現ベクターである。
【０２９４】
一部の実施形態において、ＴＳＶ、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチドは、２つ以上のベクター上に存在する。一部の実施形態において、ＴＳＶ、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体をコードするポリヌクレオチド、１つ以上のガイドポリヌクレオチド、並びに１つ以上のｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、２つ以上のベクター上に存在する。一部の実施形態において、ベクターは、発現ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、真核生物発現ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、ヒト発現ベクターである。一部の実施形態において、ベクターは、植物発現ベクターである。
【０２９５】
方法の実施形態において、細胞は、真核細胞である。一部の実施形態において、真核細胞は、動物又はヒト細胞である。一部の実施形態において、真核細胞は、ヒト又はげっ歯類又はウシ細胞系又は細胞株である。このような細胞、細胞系、又は細胞株の例としては、限定されるものではないが、マウス骨髄腫（ＮＳＯ）細胞系、チャイニーズハムスター卵母（ＣＨＯ）細胞系、ＨＴ１０８０、Ｈ９、ＨｅｐＧ２、ＭＣＦ７、ＭＤＢＫ  Ｊｕｒｋａｔ、ＮＩＨ３Ｔ３、ＰＣ１２、ＢＨＫ（ベビーハムスター腎臓細胞）、ＶＥＲＯ、ＳＰ２／０、ＹＢ２／０、Ｙ０、Ｃ１２７、Ｌ細胞、ＣＯＳ、例えば、ＣＯＳ１及び  ＣＯＳ７、ＱＣ１−３、ＨＥＫ−２９３、ＶＥＲＯ、ＰＥＲ．Ｃ６、ＨｅＬＡ、ＥＢ１、ＥＢ２、ＥＢ３、腫瘍溶解又はハイブリドーマ細胞系が挙げられる。一部の実施形態において、真核細胞は、ＣＨＯ細胞系である。一部の実施形態において、真核細胞は、ＣＨＯ細胞である。一部の実施形態において、細胞は、ＣＨＯ−Ｋ１細胞、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ細胞、ＤＧ４４  ＣＨＯ細胞、ＤＵＸＢ  １１  ＣＨＯ細胞、ＣＨＯＳ、ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯ  ＦＵＴ８  ＧＳノックアウト細胞、ＣＨＯＺＮ、又はＣＨＯ由来細胞である。ＣＨＯ  ＧＳノックアウト細胞（例えば、ＧＳＫＯ細胞）は、例えば、ＣＨＯ−Ｋ１  ＳＶ  ＧＳノックアウト細胞である。ＣＨＯ  ＦＵＴ８ノックアウト細胞は、例えば、Ｐｏｔｅｌｌｉｇｅｎｔ（登録商標）ＣＨＯＫ１  ＳＶ（Ｌｏｎｚａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，Ｉｎｃ．）である。真核細胞は、鳥類細胞、細胞系又は細胞株、例えば、ＥＢｘ（登録商標）細胞、ＥＢ１４、ＥＢ２４、ＥＢ２６、ＥＢ６６、又はＥＢｖｌ３などでもよい。
【０２９６】
一部の実施形態において、真核細胞は、ヒト細胞である。一部の実施形態において、ヒト細胞は、幹細胞である。幹細胞は、例えば、多能性幹細胞、例として、胚性幹細胞、成体幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、組織特異的幹細胞（例えば、造血幹細胞）及び間充織幹細胞（ＭＳＣ）であり得る。一部の実施形態において、ヒト細胞は、本明細書に記載の細胞のいずれかの分化形態である。一部の実施形態において、真核細胞は、培養下の任意の初代細胞に由来する細胞である。一部の実施形態において、細胞は、幹細胞又は幹細胞系である。
【０２９７】
一部の実施形態において、真核細胞は、肝細胞、例えば、ヒト肝細胞、動物肝細胞、又は非実質細胞である。例えば、真核細胞は、付着型代謝試験用ヒト肝細胞、付着型誘導試験用ヒト肝細胞、付着型Ｑｕａｌｙｓｔ  Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ  Ｃｅｒｔｉｆｉｅｄ（商標）ヒト肝細胞、懸濁液試験用ヒト肝細胞（例として、１０−ドナー及び２０−ドナープール肝細胞）、ヒト肝臓クッパー細胞、ヒト肝臓星細胞、イヌ肝細胞（例として、単一及びプールビーグル肝細胞）、マウス肝細胞（例として、ＣＤ−１及びＣ５７ＢＩ／６肝細胞）、ラット肝細胞（例として、Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ、Ｗｉｓｔａｒ  Ｈａｎ、及びＷｉｓｔａｒ肝細胞）、サル肝細胞（例として、カニクイザル又はアカゲザル肝細胞）、ネコ肝細胞（例として、ドメスティックショートヘア肝細胞）、及びウサギ肝細胞（例として、ニュージーランドホワイト肝細胞）であり得る。
【０２９８】
一部の実施形態において、真核細胞は、植物発現である。例えば、植物細胞は、作物植物、例えば、キャッサバ、トウモロコシ、モロコシ、コムギ、又はイネのものであり得る。植物細胞は、藻類、樹木、又は野菜のものであり得る。植物細胞は、単子葉若しくは双子葉植物のもの、又は作物若しくは穀類植物、生産植物、果実、若しくは野菜のものであり得る。例えば、植物細胞は、樹木、例えば、柑橘樹木、例えば、オレンジ、グレープフルーツ、又はレモン樹木；モモ又はネクタリン樹木；リンゴ又はナシ樹木；ナッツ樹木、例えば、アーモンド又はクルミ又はピスタチオ樹木；ナス科植物、すなわち、ジャガイモ；ブラシカ属（Ｂｒａｓｓｉｃａ）の植物、ラクツカ属（Ｌａｃｔｕｃａ）の植物、スピナシア属（Ｓｐｉｎａｃｉａ）の植物；カプシカム属（Ｃａｐｓｉｃｕｍ）の植物；ワタ、タバコ、アスパラガス、ニンジン、キャベツ、ブロッコリー、カリフラワー、トマト、ナス、ショウガ、レタス、ホウレンソウ、イチゴ、ブルーベリー、ラズベリー、ブラックベリー、ブドウ、コーヒー、ココアなどのものであり得る。
【０２９９】
方法の実施形態において、ＴＳＣ中の粘着末端を生成し得る第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体及びＴＳＶ中の粘着末端を生成し得る第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、細胞中に、送達粒子、ベシクル、又はウイルスベクターを介して導入する。
【０３００】
一部の実施形態において、ＴＳＶ、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、細胞中に、送達粒子を介して送達する。送達粒子の例は、本明細書に提供される。一部の実施形態において、送達粒子は、脂質ベース系、リポソーム、ミセル、マイクロベシクル、エキソソーム、又は遺伝子銃である。一部の実施形態において、送達粒子は、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の両方の単量体を含む。一部の実施形態において、送達粒子は、両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の両方の単量体を含む。一部の実施形態において、送達粒子は、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、送達粒子は、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。一部の実施形態において、送達粒子は、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、送達粒子は、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態において、送達粒子は、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、第１、第２、第３、及び／又は第４のガイドポリヌクレオチド、並びにｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態において、送達粒子は、１つ以上のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、第１、第２、第３、及び／又は第４のガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、並びにｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３０１】
一部の実施形態において、送達粒子は、脂質、糖、金属又はタンパク質をさらに含む。一部の実施形態において、送達粒子は、脂質エンベロープである。一部の実施形態において、送達粒子は、糖ベース粒子、例えば、ＧａｌＮＡｃである。一部の実施形態において、送達粒子は、ナノ粒子である。ナノ粒子の例は、本明細書に記載される。送達粒子の調製は、米国特許出願公開第２０１１／０２９３７０３号明細書、同第２０１２／０２５１５６０号明細書、及び同第２０１３／０３０２４０１号明細書；並びに米国特許第５，５４３，１５８号明細書、同第５，８５５，９１３号明細書、同第５，８９５，３０９号明細書、同第６，００７，８４５号明細書、及び同第８，７０９，８４３号明細書にさらに記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０３０２】
一部の実施形態において、ＴＳＶ、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、細胞中に、ベシクルを介して送達する。「ベシクル」は、脂質二重層により封入される流体を有する小部屋内の小型構造である。ベシクルの例は、本明細書に提供される。一部の実施形態において、ベシクルは、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の両方の単量体を含む。一部の実施形態において、ベシクルは、両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の両方の単量体を含む。一部の実施形態において、ベシクルは、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ベシクルは、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。一部の実施形態において、ベシクルは、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ベシクルは、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ、ガイドポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ベシクルは、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、第１、第２、第３、及び／又は第４のガイドポリヌクレオチド、並びにｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ベシクルは、１つ以上のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、第１、第２、第３、及び／又は第４のガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、並びにｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３０３】
一部の実施形態において、ベシクルは、エキソソーム又はリポソームである。一部の実施形態において、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、細胞中に、エキソソームを介して送達する。エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送し、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達し得る内因性ナノベシクル（すなわち、約３０〜約１００ｎｍの直径を有する）である。標的器官中への外因性生物材料の送達のための遺伝子操作エキソソームが、例えば、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９：３４１（２０１１）、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ７：２１１２−２１１６（２０１２）、及びＷａｈｌｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０（１７）：ｅ１３０（２０１２）により記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０３０４】
一部の実施形態において、ＴＳＶ、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、細胞中に、リポソームを介して送達する。リポソームは、少なくとも１つの脂質二重層を有する球状ベシクル構造であり、栄養及び医薬物の投与用ベシクルとして使用することができる。リポソームは、リン脂質、特にホスファチジルコリンから構成されることが多いが、他の脂質、例えば、卵ホスファチジルエタノールアミンからも構成される。リポソームの型としては、限定されるものではないが、マルチラメラベシクル、スモールユニラメラベシクル、ラージユニラメラベシクル、及び渦巻き型ベシクルが挙げられる。例えば、Ｓｐｕｃｈ  ａｎｄ  Ｎａｖａｒｒｏ，“Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ  ｆｏｒ  Ｔａｒｇｅｔｅｄ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ（Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ  ａｎｄ  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ），Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ  ＩＤ  ４６９６７９（２０１１）参照。生物材料、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分の送達用のリポソームは、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２３（８）：１００２−１００７（２００５）、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４４１：１１１−１１４（２００６）、及びＬｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １９：７７５−７８０（２０１２）により記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０３０５】
方法の実施形態において、ＴＳＶ、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、細胞中に、ウイルスベクターを介して送達する。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の両方の単量体を含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の両方の単量体を含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ＴＳＶを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチドを含み、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ及びガイドポリヌクレオチドは、複合体中に存在する。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、及びｔｒａｃｒＲＮＡを含むポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、第１及び／又は第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体、第１、第２、第３、及び／又は第４のガイドポリヌクレオチド、並びにｔｒａｃｒＲＮＡを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、１つ以上のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、第１、第２、第３、及び／又は第４のガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、並びにｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態において、ウイルスベクターは、ＴＳＶ、及び１つ以上のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、第１、第２、第３、及び／又は第４のガイドポリヌクレオチドをコードするポリヌクレオチド、並びにｔｒａｃｒＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを含む。
【０３０６】
一部の実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、又はアデノ随伴ウイルスのものである。ウイルスベクターの例は、本明細書に提供される。アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）及びレンチウイルスベクターによるウイルス形質移入（投与は、局所性、標的化又は全身性であり得る）が、インビボ遺伝子療法の送達法として使用されている。本開示の実施形態において、Ｃａｓタンパク質は、形質導入された細胞により細胞内で発現される。
【０３０７】
一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体は、核局在化シグナルを含む。一部の実施形態において、第１のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１、第２、又は両方の単量体は、核局在化シグナルを含む。一部の実施形態において、第２のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１、第２、又は両方の単量体は、核局在化シグナルを含む。一部の実施形態において、第１、第２、又は両方のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ二量体の第１、第２、又は両方の単量体は、核局在化シグナルを含む。核局在化シグナル（「ＮＬＳ」）は、本明細書に記載される。例示的な核局在化配列としては、限定されるものではないが、ＳＶ４０ラージＴ抗原、ヌクレオプラスミン、ＥＧＬ−１３、ｃ−Ｍｙｃ、及びＴＵＳタンパク質からのＮＬＳが挙げられる。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号１）を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＡＶＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫＬＤ（配列番号２）を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ（配列番号３）を含む。
【０３０８】
一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＭＳＲＲＲＫＡＮＰＴＫＬＳＥＮＡＫＫＬＡＫＥＶＥＮ（配列番号４）を含む。一部の実施形態において、ＮＬＳは、配列ＫＬＫＩＫＲＰＶＫ（配列番号５）を含む。他の核局在化配列としては、限定されるものではないが、ｈｎＲＮＰＡ１の酸性Ｍ９ドメイン、酵母転写抑制因子Ｍａｔα２中の配列ＫＩＰＩＫ（配列番号６）、及びＰＹ−ＮＬＳが挙げられる。
【０３０９】
シームレス突然変異誘発の方法
一部の実施形態において、本開示は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドをシームレスに改変する方法を提供する。「シームレス突然変異誘発」は、例えば、突然変異を導入するために使用される選択遺伝子の存在下でのいかなる他の隣接変化も伴わない部位特異的突然変異誘発（すなわち、１つ以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は挿入）を指す。タンパク質コード領域における突然変異誘発のためのシームレスＤＮＡ遺伝子操作は、有利である。それというのも、突然変異誘発ステップの間に導入される任意の外部配列がタンパク質発現を妨害し得るためである。本開示は、２ステップ選択／対抗選択方針を使用するシームレス突然変異誘発であって、選択カセット、例えば、抗生物質耐性遺伝子とそれに伴う対抗選択遺伝子の標的部位における挿入を最初に含むシームレス突然変異誘発を提供する。続いて、カセットは、通常、小分子、例えば、ストレプトマイシン又は糖の投与を含む対抗選択遺伝子に対する選択により所望の配列によりシームレスに置き換える。対抗選択マーカーの通例の任意選択としては、ｓａｃＢ、ｒｐｓＬ、並びに適切な宿主バックグラウンドにおいて選択し、及び対抗して選択することができるマーカー、例として、ｇａｌＫ、ｔｈｙＡ及びｔｏｌＣが挙げられる。シームレス突然変異誘発の従来の方法は、例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ｓｅａｍｌｅｓｓ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ  ｂｙ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｃｃｄＢ  ｆｏｒ  ｃｏｕｎｔｅｒｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４２（５）：ｅ３７（２０１４）；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  ｎｅｗ  ｌｏｇｉｃ  ｆｏｒ  ＤＮＡ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２０（２）：１２３−１２８（１９９８）；Ｗｅｓｔｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｏｕｎｔｅｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  ｇｅｎｏｍｅ：ａ  ｓｔｒａｔｅｇｙ  ｆｏｒ  ｓｅａｍｌｅｓｓ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｐｅａｔ−ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ＢＡＣｓ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３８：ｅ１６６（２０１０）；Ｗｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｅａｍｌｅｓｓ  ＤＮＡ  ｒｅｃｏｍｂｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  Ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ，”Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３３：ｅ５９（２００５）に記載され、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０３１０】
一部の実施形態において、本開示は、細胞中の標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドを改変する方法であって、（１）細胞中に、挿入カセット（ＩＣ）を含むベクター（ＩＣは、５’−３’方向で、（ａ）標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第１の領域、（ｂ）標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドの突然変異を含む第２の領域、（ｃ）第１のヌクレアーゼ結合部位、（ｄ）マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、（ｅ）第２のヌクレアーゼ結合部位、（ｆ）標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上の突然変異を含む第３の領域、及び（ｇ）標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第４の領域を含み、第１の領域及び第４の領域は、標的ポリヌクレオチド配列のそれらのそれぞれの一部と９５％〜１００％同一である）を導入すること；（２）相同組換えを介して標的ポリヌクレオチド配列中にＩＣを挿入して第１の改変標的ポリヌクレオチドを生成すること；（３）マーカー遺伝子を発現する細胞を選択すること；（４）第１の改変標的ポリヌクレオチドを部位特異的ヌクレアーゼに供して粘着末端を有する第２の改変標的ポリヌクレオチドを生成すること；及び（５）粘着末端を有する第２の改変標的ポリヌクレオチドをリガーゼ（リガーゼは、第２の領域及び第３の領域において粘着末端をライゲートする）に供して標的ポリヌクレオチド配列と比較して１つ以上の改変ヌクレオチドを含むライゲートされた改変標的核酸を作出することを含む方法を提供する。
【０３１１】
一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドの改変は、ヌクレオチド置換、すなわち、単一ヌクレオチド置換又は複数ヌクレオチド置換である。標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドの改変は、ポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列の変化をもたらし得る。標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドの改変は、細胞中の下流ポリヌクレオチド配列の発現の不活性化ももたらし得る。例えば、下流配列は不活性化され、その結果、その配列は転写されず、コードされるタンパク質は産生されず、又は配列は、その野生型配列が機能するようには機能しない。一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、調節配列である。一部の実施形態において、調節配列は、それが調節配列としてもはや機能しないように不活性化させることができる。調節配列の例は、本明細書に記載される。
【０３１２】
シームレス突然変異誘発を介して細胞中の標的ポリヌクレオチド配列中の１つ以上のヌクレオチドを改変する方法は、挿入カセットを利用する。一部の実施形態において、挿入カセット（ＩＣ）は、ベクター上に存在する。ベクターの例は、本明細書に提供される。本明細書に記載のＩＣは、
（ｉ）標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第１の領域、
（ｉｉ）１つ以上のヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の突然変異を含む第２の領域、
（ｉｉｉ）第１のヌクレアーゼ結合部位、
（ｉｖ）マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチド配列、
（ｖ）第２のヌクレアーゼ結合部位、
（ｖｉ）１つ以上のヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の突然変異を含む第３の領域、及び
（ｖｉｉ）標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第４の領域を含み、第１の領域及び第４の領域は、標的ポリヌクレオチド配列のそれらのそれぞれの一部と９５％〜ｌ００％同一である。
【０３１３】
例示的なＩＣは、図２８に示される。図２８において、ＩＣは、５’−３’（二本鎖ＤＮＡの「トップ」又は「コード」鎖に関して）方向で、第１のヌクレアーゼ切断部位、第１のヌクレアーゼ結合部位、耐性マーカー、第２のヌクレアーゼ結合部位、及び第２のヌクレアーゼ切断部位を含む。第１及び第２のヌクレアーゼ切断部位は、標的ポリヌクレオチド配列内の所望のヌクレオチド突然変異を含む。
【０３１４】
図２７に示されるとおり、「ホモロジーアーム」（「ＨＡ」）は、第１のヌクレアーゼ切断部位の上流及び第２のヌクレアーゼ切断部位の下流に存在する。「ホモロジーアーム」は、標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である領域を含む。一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同であるＩＣの第１の領域は、第１のヌクレアーゼ切断部位の上流のＨＡを含む。一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同であるＩＣの第４の領域は、第２のヌクレアーゼ切断部位の下流のＨＡを含む。
【０３１５】
一部の実施形態において、ＩＣは、標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第１の領域を含む。一部の実施形態において、ＩＣは、標的ポリヌクレオチド配列の一部と相同である第４の領域を含む。一部の実施形態において、ＩＣ中の第１及び第４の領域は、標的ポリヌクレオチド配列のそれらのそれぞれの一部と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、又は１００％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、ＩＣ中の第１及び第４領域のＨＡは、約１０〜５０００塩基対、約２０〜２０００塩基対、又は約５０〜１７５０塩基対、又は約１００〜１５００塩基対、又は約２００〜１２５０塩基対、又は約３００〜１０００塩基対、又は約４００〜約７５０塩基対、又は約５００〜６００塩基対を有する。一部の実施形態において、ＩＣ中の第１及び第４の領域のＨＡは、約５、約１０、約２０、約３０、約４０、約５０、約１００、約２５０、約５００、約１００、約１２５０、約１５００、約１７５０、約２０００、約２２５０、又は約２５００塩基対を有する。
【０３１６】
一部の実施形態において、ＩＣは、１つ以上のヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の突然変異を含む第２の領域を含む。一部の実施形態において、ＩＣは、１つ以上のヌクレオチドの標的ポリヌクレオチド配列の突然変異を含む第３の領域を含む。図２８及び２９に示されるとおり、ヌクレアーゼ切断部位は、標的ポリヌクレオチド配列内の１つ以上のヌクレオチドの突然変異を含む。一部の実施形態において、ヌクレアーゼ切断部位は、任意の好適なヌクレアーゼの開裂部位である。例えば、ヌクレアーゼ切断部位は、制限酵素、例えば、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＢａｍＨＩ、ＥｃｏＲＩ、ＢｂｖＩ、ＦｏｋＩ、ＭｍｅＩなどの開裂部位であり得る。一部の実施形態において、ＩＣの第２の領域は、所望の突然変異を含む第１のヌクレアーゼ切断部位を含む。一部の実施形態において、ＩＣの第３の領域は、所望の突然変異を含む第２のヌクレアーゼ切断部位を含む。一部の実施形態において、ＩＣの第２及び第３の領域は、同一であり、又は実質的に同一である。
【０３１７】
一部の実施形態において、ＩＣは、第１及び第２のヌクレアーゼ結合部位を含む。ヌクレアーゼ結合部位は、任意の好適なヌクレアーゼの結合部位であり得る。例えば、制限酵素、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮ（転写活性化因子様エンドヌクレアーゼ）、又はＣａｓ９のヌクレアーゼ結合部位である。例えば、ヌクレアーゼがＣａｓ９である場合、ガイドＲＮＡは、ＰＡＭの上流（すなわち、関連ＤＮＡ鎖に関して５’）の任意の配列にハイブリダイズするように設計することができる。したがって、一部の実施形態において、ヌクレアーゼ結合部位は、ＰＡＭの上流に存在する。一部の実施形態において、第１及び第２のヌクレアーゼ結合部位は、同一であり、又は実質的に同一である。
【０３１８】
一部の実施形態において、ＩＣは、マーカー遺伝子をコードするポリヌクレオチドを含む。「マーカー」遺伝子は、核酸配列が標的配列中に良好に挿入されたか否かを決定するために使用する。マーカー遺伝子は、選択マーカー（例えば、耐性又は選択マーカー）又はスクリーニング可能マーカー（例えば、蛍光又は比色マーカー）であり得る。
【０３１９】
耐性／選択マーカーの非限定的な例としては、抗生物質耐性遺伝子（例えば、アンピシリン耐性遺伝子、カナマイシン耐性遺伝子など）及び他の抗生物質耐性遺伝子；栄養要求性マーカー（例えば、ＵＲＡ３、ＨＩＳ３）及び／又は他の宿主細胞選択マーカー；ドナー核酸中への挿入を容易にするための核酸、例えば、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）ゲノム中への転位のための、例えば、トランスポゼース及び逆向き反復配列；宿主細胞中の複製及び分離を支援するための核酸、例えば、自律複製配列（ＡＲＳ）又はセントロメア配列（ＣＥＮ）が挙げられる。
【０３２０】
スクリーニング可能マーカーは、マーカー遺伝子を含有する細胞を異なる外見とする。スクリーニング可能マーカーの非限定的な例としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びそのバリアント（例えば、黄色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質など）；細胞をその青色染色により検出するためにＧＵＳアッセイにおいて使用されるβ−グルクロニダーゼ；及び当業者に周知のブルー／ホワイトスクリーンにおいて使用されるＸ−ｇａｌが挙げられる。
【０３２１】
マーカー遺伝子を発現する細胞の選択方法は、使用されるマーカーに応じて変動する。例えば、抗生物質耐性マーカーを使用する場合、選択は、抗生物質を含有する培養培地中で細胞の集団を成長させ、生存細胞を回収することを含む。スクリーニング可能マーカー、例えば、ＧＦＰを使用する場合、選択は、緑色である細胞を回収することを含む。細胞の回収は、例えば、培養プレートからコロニーを手作業によりピックすることにより、又はフローサイトメトリー装置、例えば、蛍光活性化細胞ソーティング（ＦＡＣＳ）を使用してソートすることにより実施することができる。
【０３２２】
シームレス突然変異誘発の方法の実施形態において、方法の第１のステップは、細胞中に、ＩＣを含むベクターを導入することを含む。ベクターは、細胞中に、当分野において定型的な方法、例えば、形質移入、形質導入、細胞融合、及びリポフェクションなどを使用して導入することができる。細胞中へのベクターの導入は、本明細書にさらに記載される。
【０３２３】
シームレス突然変異誘発の方法の実施形態において、方法の第２のステップは、相同組換えを介して標的ポリヌクレオチド配列中にＩＣを挿入して第１の改変標的ポリヌクレオチドを生成することを含む。図２７に例示されるとおり、相同組換えを介して標的ポリヌクレオチド配列中に耐性カセットを挿入する（「ＧＡＴＣ」配列のいずれかの側上の交差により示される）。特異的相同組換えについて本明細書に記載のベクターは、染色体中へのベクターの相補的結合及び取り込みを可能とするための染色体の配列と相同性の十分に長い領域（すなわち、ＩＣ中の第１及び第４の領域）を含有する。本明細書に記載の、より長い相同性の領域、及びより大きい配列類似性の程度は、相同組換えの効率を増加させ得る。
【０３２４】
シームレス突然変異誘発の方法の実施形態において、方法の第３のステップは、マーカー遺伝子を発現する細胞を選択することを含む。本明細書に記載の、マーカー遺伝子を発現する細胞の選択方法は、選択マーカーに依存する。選択方法、及び種々の型のマーカー遺伝子は、本明細書に記載される。
【０３２５】
シームレス突然変異誘発の方法の実施形態において、方法の第４のステップは、第１の改変標的ポリヌクレオチド（すなわち、上記ステップ（２）から生成された第１の改変標的ポリヌクレオチド）を部位特異的ヌクレアーゼに供して粘着末端を有する第２の改変標的ポリヌクレオチドを生成することを含む。一部の実施形態において、粘着末端は、ＩＣの第２及び第３の領域に存在する。部位特異的ヌクレアーゼは、粘着末端を生成する任意の部位特異的ヌクレアーゼ、例として、限定されるものではないが、制限酵素、本明細書に記載のＣａｓ９−エンドヌクレアーゼ、又は本明細書に記載のｓｔｉＣａｓ９であり得る。一部の実施形態において、ヌクレアーゼは、粘着末端を含む二本鎖ＤＮＡ分解を生成する。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、細胞に対して外因性であり、すなわち、部位特異的ヌクレアーゼは、細胞中で天然に生じない。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、細胞中に導入する。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、細胞中に、部位特異的ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドとして導入する。ポリヌクレオチド（例えば、ベクターなど）を導入する方法は、本明細書に記載され、それとしては、例えば、形質移入、形質導入、細胞融合、及びリポフェクションが挙げられる。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、組換え部位特異的ヌクレアーゼである。本明細書に記載の、組換えタンパク質は、それらを産生する細胞に由来しないタンパク質、又は天然で存在することが公知でない遺伝子材料の新たな組合せから生じる配列を有するタンパク質、例えば、細胞中に導入された外因性核酸から発現されるタンパク質などを指す。一部の実施形態において、組換え部位特異的ヌクレアーゼは、細胞に由来しない核酸から発現させる。
【０３２６】
一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質である。Ｃａｓ９タンパク質は、本明細書に記載される。一部の実施形態において、Ｃａｓ９エフェクタータンパク質は、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９である。ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質は、本明細書に記載され、粘着末端を生成し得る。本明細書に記載の、ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系は、とりわけ、ｃａｓオペロン上のｃａｓ４遺伝子の存在により同定され、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質は、ＴＩＧＲ０３０３１  ＴＩＧＲＦＡＭタンパク質ファミリーのものである。したがって、一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、ＴＩＧＲ０３０３１  ＴＩＧＲＦＡＭタンパク質ファミリーのものである。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、１Ｅ−５のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、１Ｅ−１０のＥ値カットオフを用いてＴＩＧＲ０３０３１タンパク質ファミリーにマッチするドメインを含む。ＩＩ−Ｂ型ＣＲＩＳＰＲ系は、細菌種、例えば、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）、ガンマプロテオバクテリア（ｇａｍｍａ  ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＨＴＣＣ５０１５、パラサテレラ・エキスクレメンティホミニス（Ｐａｒａｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｅｘｃｒｅｍｅｎｔｉｈｏｍｉｎｉｓ）、サテレラ・ワズワーセンシス（Ｓｕｔｔｅｒｅｌｌａ  ｗａｄｓｗｏｒｔｈｅｎｓｉｓ）、スルフロスピリラム属種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣ、ルミノバクター属種（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ８７、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）１＿１＿４７、バクテロイデス・オーラル・タクソン（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｔｅｓ  ｏｒａｌ  ｔａｘｏｎ）２７４株Ｆ００５８、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）、バークホルデリア・バクテリウム（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａｌｅｓ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＹＬ４５、ルミノバクター・アミロフィラス（Ｒｕｍｉｎｏｂａｃｔｅｒ  ａｍｙｌｏｐｈｉｌｕｓ）、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）Ｐ０１１１、カンピロバクター属種（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐ．）ＲＭ９２６１、カンピロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株ＲＭ８００１、カンプリロバクター・ラニエナエ（Ｃａｍｐｌｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｌａｎｉｅｎａｅ）株Ｐ０１２１、ツリシモナス・ムリス（Ｔｕｒｉｃｉｍｏｎａｓ  ｍｕｒｉｓ）、レジオネラ・ロンジニエンシス（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｌｏｎｄｉｎｉｅｎｓｉｓ）、サリニビブリオ・シャルメンシス（Ｓａｌｉｎｉｖｉｂｒｉｏ  ｓｈａｒｍｅｎｓｉｓ）、レプトスピラ属種（Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）単離株ＦＷ．０３０、モリテラ属種（Ｍｏｒｉｔｅｌｌａ  ｓｐ．）単離株ＮＯＲＰ４６、エンドゾイコモナス属種（Ｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓｓｐ．）Ｓ−Ｂ４−１Ｕ、タミルナドゥイバクター・サリナス（Ｔａｍｉｌｎａｄｕｉｂａｃｔｅｒ  ｓａｌｉｎｕｓ）、ビブリオ・ナトリエゲンス（Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ）、アルコバクター・スキロウイイ（Ａｒｃｏｂａｃｔｅｒ  ｓｋｉｒｒｏｗｉｉ）、フランシセラ・フィロミラギア（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｐｈｉｌｏｍｉｒａｇｉａ）、フランシセラ・ヒスパニエンシス（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｈｉｓｐａｎｉｅｎｓｉｓ）、又はパレンドゾイコモナス・ハリクロナエ（Ｐａｒｅｎｄｏｚｏｉｃｏｍｏｎａｓ  ｈａｌｉｃｌｏｎａｅ）などに見出される。
【０３２７】
一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質である。Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼタンパク質は、本明細書に記載される。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｃａｓ９のＤＮＡ標的化ドメイン及びエンドヌクレアーゼのヌクレアーゼドメインを含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質中のエンドヌクレアーゼは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼである。ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼの例は、本明細書に提供され、それとしては、ＢｂｖＩ、ＢｇｃＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｐＩ、ＢｓｐＭＩ、ＣｓｐＣＩ、ＦｏｋＩ、ＭｂｏＩＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、及びＰｌｅＩが挙げられる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質中のエンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。ＦｏｋＩによるＤＮＡ開裂は、２つのＦｏｋＩ単量体の二量体化時にのみ生じる。ＤＮＡのＦｏｋＩ開裂は、４塩基対オーバーハングを有する粘着末端を生成する。
【０３２８】
一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、改変Ｃａｓ９を含む。改変Ｃａｓ９は、本明細書に記載され、触媒的に不活性なＣａｓ９及びニッカーゼ活性を有するＣａｓ９を含む。一部の実施形態において、改変Ｃａｓ９は、触媒的に不活性なＣａｓ９（「ｄｅａｄＣａｓ９」）である。触媒的に不活性なＣａｓ９は、ＤＮＡを開裂させ得ず（すなわち、Ｃａｓ９の開裂ドメインが不活性化されている）；しかしながら、それらは、ガイドポリヌクレオチド（例えば、ガイドＲＮＡ）との複合体を形成することにより核酸配列を標的化する能力を保持する。触媒的に不活性なＣａｓ９は、本明細書に記載される。一部の実施形態において、触媒的に不活性なＣａｓ９は、野生型Ｃａｓ９に対して二重アミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、二重アミノ酸置換は、Ｄ１０Ａ及びＨ８４０Ａである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、触媒的に不活性なＣａｓ９を含み、エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。
【０３２９】
一部の実施形態において、改変Ｃａｓ９は、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９（「Ｃａｓ９ニッカーゼ」又は「Ｃａｓ９ｎ」）である。Ｃａｓ９ニッカーゼは、二本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみを開裂させ得る（すなわち、ＤＮＡを「ニッキングする」）。Ｃａｓ９ニッカーゼは、本明細書に記載される。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ニッカーゼは、野生型Ｃａｓ９に対して単一アミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換は、Ｄ１０Ａ（「Ｃａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）」）である。一部の実施形態において、単一アミノ酸置換は、Ｈ８４０Ａ（「Ｃａｓ９ｎ（Ｈ８４０Ａ）」）である。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、ニッカーゼ活性を有するＣａｓ９を含み、エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｄ１０Ａ突然変異を有するＣａｓ９を含み、エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。一部の実施形態において、Ｃａｓ９−エンドヌクレアーゼ融合タンパク質は、Ｈ８４０Ａ突然変異を有するＣａｓ９を含み、エンドヌクレアーゼは、ＦｏｋＩである。
【０３３０】
一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃｐｆ１である。Ｃｐｆ１（セントロメアプロモーター因子１）は、粘着末端を生成し得るＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系に見出される単一ＲＮＡガイド型エンドヌクレアーゼである。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系と相似である。しかしながら、Ｃａｓ９及びＣｐｆ１間のいくつかの有意差が存在する。Ｃｐｆ１は、ｔｒａｃｒＲＮＡを利用しない。Ｃｐｆ１タンパク質は、Ｃａｓ９と異なるＰＡＭ配列を認識する。Ｃｐｆ１のＰＡＭ配列は、５’Ｔリッチモチーフ、例えば、５’−ＴＴＴＮ−３’（Ｎは、Ａ、Ｔ、Ｃ、又はＧである）などである。Ｃｐｆ１は、Ｃａｓ９と異なる部位において開裂させる。Ｃａｓ９がＰＡＭに隣接する配列において開裂させる一方、Ｃｐｆ１は、ＰＡＭからさらに遠い配列において開裂させる。Ｃｐ１タンパク質は、例えば、外国特許出願公開の英国特許出願公開第１５０６５０９．７号明細書、米国特許第９，５８０，７０１号明細書、米国特許出願公開第２０１６／０２０８２４３号明細書、及びＺｅｔｓｃｈｅ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｃｐｆ１  Ｉｓ  ａ  Ｓｉｎｇｌｅ  ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ  Ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ  ｏｆ  ａ  Ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  Ｓｙｓｔｅｍ，”Ｃｅｌｌ  １６３（３）：７５９−７７１（２０１５）にさらに記載されており、それらのそれぞれは参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【０３３１】
一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、Ｃａｓ９、Ｃｐｆ１、又はＣａｓ９−ＦｏｋＩである。
【０３３２】
一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼにより生成される粘着末端は、５’オーバーハングを含む。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼにより生成される粘着末端は、３’オーバーハングを含む。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、３〜４０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、４〜３０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、５〜２０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、約５ヌクレオチド、約１０ヌクレオチド、約１５ヌクレオチド、約２０ヌクレオチド、約２５ヌクレオチド、又は約３０ヌクレオチドの一本鎖ポリヌクレオチドを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、ｄｅａｄＣａｓ９−ＦｏｋＩ二量体は、４−ヌクレオチド５’オーバーハングを含む粘着末端を生成する。一部の実施形態において、Ｃａｓ９ｎ（Ｄ１０Ａ）−ＦｏｋＩ二量体は、２７−ヌクレオチド５’オーバーハングを含む粘着末端を含む。一部の実施形態において、Ｃａｓ９（Ｈ８４０Ａ）−ＦｏｋＩ二量体は、２３−ヌクレオチド３’オーバーハングを含む粘着末端を生成する。
【０３３３】
方法の実施形態において、方法の第５のステップは、粘着末端を有する第２の改変標的ポリヌクレオチドをリガーゼ（リガーゼは、第２の領域及び第３の領域において粘着末端をライゲートする）に供して標的ポリヌクレオチド配列と比較して１つ以上の改変ヌクレオチドを含むライゲートされた改変標的核酸を作出することを含む。リガーゼは、化学結合の形成により２つ以上の核酸断片の結合を触媒する酵素である。一部の実施形態において、リガーゼは、ホスホジエステル結合の形成を触媒することにより２つ以上のＤＮＡ断片を一緒に結合させる。任意の好適なリガーゼを使用することができ、好適なリガーゼは当業者により決定することができる。リガーゼの非限定的な例としては、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）リガーゼ、バクテリオファージＴ４からのＴ４ＤＮＡリガーゼ、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、及び熱安定性リガーゼ、例えば、Ａｍｐｌｉｇａｓｅ（登録商標）ＤＮＡリガーゼが挙げられる。リガーゼは、平滑末端又は粘着末端をライゲートし得る。一部の実施形態において、リガーゼは、粘着末端をライゲートする。一部の実施形態において、リガーゼは、ＤＮＡ断片をライゲートするためにＡＴＰを要求する。
【０３３４】
一部の実施形態において、リガーゼは、細胞に対して外因性であり、すなわち、リガーゼは、細胞中で天然に生じない。一部の実施形態において、リガーゼは、細胞中に導入する。一部の実施形態において、リガーゼは、細胞中に、リガーゼをコードするポリヌクレオチドとして導入する。ポリヌクレオチド（例えば、ベクターなど）を導入する方法は、本明細書に記載される。一部の実施形態において、リガーゼは、組換えリガーゼ、すなわち、細胞に由来しない核酸から発現されるリガーゼである。
【０３３５】
一部の実施形態において、ライゲートされた改変標的核酸は、標的ポリヌクレオチド配列と比較して１つ以上の改変ヌクレオチドを含むが、標的ポリヌクレオチド配列の上流又は下流にマーカー遺伝子もいかなる追加のヌクレオチドも含まず、すなわち、標的ポリヌクレオチド配列をシームレスに突然変異させた。
【０３３６】
方法の実施形態において、第１の改変標的核酸は、第３のステップ後に細胞から単離する。細胞から核酸を単離する方法は、当分野において十分確立されており、それとしては、例えば、フェノール／クロロホルム抽出、低ｐＨ／高塩条件下の沈殿、及び固相抽出が挙げられる。市販の核酸単離用キット、例えば、ＱＩＡＧＥＮ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｐｒｅｐ（登録商標）Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔ、及びＺｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ＺＹＭＯＰＵＲＥ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｍｉｎｉｐｒｅｐ  Ｋｉｔを使用することができる。
【０３３７】
方法の実施形態において、第１の改変標的核酸は、第３のステップ後に細胞中に存在し、すなわち、核酸は、細胞から単離しない。一部の実施形態において、方法のステップ（１）〜（５）は、同一細胞内で実施する。一部の実施形態において、方法の構成成分は、細胞中に導入する。一部の実施形態において、挿入カセットを含むベクター、部位特異的ヌクレアーゼ、及びリガーゼを細胞中に導入する。ベクター及びタンパク質を細胞中に導入する方法は、本明細書に記載され、それとしては、例えば、送達粒子、ベシクル、及び／又はベクター、例として、ウイルスベクターを介する送達が挙げられる。
【０３３８】
方法の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、プラスミド中に存在する。プラスミド及びその例は、本明細書に記載される。一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列を含有するプラスミドは、天然細菌プラスミド（すなわち、細菌細胞中で天然に生じるプラスミド）である。一部の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列を含有するプラスミドは、細胞中に導入される外因性プラスミドである。一部の実施形態において、細胞は、細菌細胞である。一部の実施形態において、プラスミドは、遺伝子操作プラスミドである。一部の実施形態において、プラスミド中の１つ以上のヌクレオチドの改変は、細胞の挙動の改変をもたらす。挙動の改変は、改変タンパク質の発現、より高い又は低いレベルの１つ以上のタンパク質の発現、抗生物質に対する耐性又は感受性の増加、小分子及び／又はタンパク質に対する応答の変更、小分子及び／又はタンパク質の産生の変更などであり得る。
【０３３９】
方法の実施形態において、標的ポリヌクレオチド配列は、染色体中に存在する。染色体は、原核生物染色体でも真核生物染色体でもよい。一部の実施形態において、染色体は、真核細胞のものである。一部の実施形態において、染色体は、ヒト細胞のものである。一部の実施形態において、染色体は、動物細胞のものである。一部の実施形態において、染色体は、植物細胞のものである。一部の実施形態において、染色体中の１つ以上のヌクレオチドの改変は、細胞の挙動の改変をもたらす。挙動の改変は、改変タンパク質の発現、より高い又は低いレベルの１つ以上のタンパク質の発現、抗生物質に対する耐性又は感受性の増加、小分子及び／又はタンパク質に対する応答の変更、小分子及び／又はタンパク質の産生の変更などであり得る。
【０３４０】
遺伝子操作ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）
一部の実施形態において、本開示は、ｓｔｉＣａｓ９タンパク質との複合体を形成する遺伝子操作ガイドＲＮＡであって、（ａ）真核細胞中の標的配列にハイブリダイズし得るガイド配列；及び（ｂ）Ｃａｓ９タンパク質に結合し得るｔｒａｃｒＲＮＡ配列を含み、ｔｒａｃｒＲＮＡは、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡ配列と少なくとも１０ヌクレオチドだけ異なり、Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ効率を改善する遺伝子操作ガイドＲＮＡを提供する。
【０３４１】
一部の実施形態において、本明細書に記載のガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡは、Ｃａｓ９タンパク質との複合体を形成し、すなわち、一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、Ｃａｓ９に結合する。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドのＤＮＡ結合セグメントは、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズするが、細菌細胞中の配列とハイブリダイズしない。
【０３４２】
一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、１０〜１５０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、２０〜１２０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、３０〜１００ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、４０〜８０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、５０〜６０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、１０〜３５ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、１５〜３０ヌクレオチドである。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、２０〜２５ヌクレオチドである。
【０３４３】
ガイドポリヌクレオチドは、標的細胞中に、単離分子、例えば、ＲＮＡ分子として導入することができ、又は細胞中に、ガイドポリヌクレオチドをコードするＤＮＡを含有する発現ベクターを使用して導入する。
【０３４４】
天然発生ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列に相補的な領域を含有するｃｒＲＮＡ、及びＣａｓ９タンパク質に結合し、ｃｒＲＮＡともハイブリダイズするｔｒａｃｒＲＮＡを利用する。ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドは、標的配列へのｃｒＲＮＡ部分の結合及びＣａｓ９タンパク質へのｔｒａｃｒＲＮＡ部分の結合を可能とするＲＮＡ二次構造を形成する。ＲＮＡ二次構造の非限定的な例としては、ヘリックス、ステムループ、及びシュードノットが挙げられる。一部の実施形態において、Ｃａｓ９タンパク質は、結合のためにｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド中の少なくとも１つのステムループを認識する。
【０３４５】
遺伝子操作ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、例えば、本開示のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系などにおいて、標的配列との相補性及びＣａｓ９タンパク質への結合の両方を示し得る単一ガイドポリヌクレオチドを利用することが有利であり得る。したがって、一部の実施形態において、本開示は、粘着末端を生成し得るＣａｓ９エフェクタータンパク質（ｓｔｉＣａｓ９）；及びｓｔｉＣａｓ９との複合体を形成し、ガイド配列（ガイド配列は、真核細胞中の標的配列とハイブリダイズし得るが、細菌細胞中の配列にハイブリダイズしない）を含むガイドポリヌクレオチドを含み；複合体は天然に生じず、ｔｒａｃｒＲＮＡを含まない非天然発生ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供する。一部の実施形態において、ガイドポリヌクレオチドは、少なくとも１つの二次構造を形成する。一部の実施形態において、少なくとも１つの二次構造は、ステムループ、ヘリックス、又はシュードノットの１つである。
【０３４６】
本明細書に記載の遺伝子操作ガイドポリヌクレオチドを最適化してＣａｓ９タンパク質に対する結合親和性を改善し、及び／又は標的配列に対する標的化効率を増加させることが有利であり得る。例えば、Ｄａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １６：２８０（２０１５）；Ｎｏｗａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４４（２０）：９５５５−９５６４（２０１６）；及びＶｅｊｎａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ  Ｐｒｏｔｏｃ，ｄｏｉ：ｌ０．１１０ｌ／ｐｄｂ．ｔｏｐ０９０８９４（２０１６）参照。一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡは、天然発生ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの組合せよりも短い。一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドＲＮＡは、天然発生ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの組合せよりも少なくとも５ヌクレオチド短く、少なくとも６ヌクレオチド短く、少なくとも７ヌクレオチド短く、少なくとも８ヌクレオチド短く、少なくとも８ヌクレオチド短く、少なくとも９ヌクレオチド短く、少なくとも１０ヌクレオチド短く、少なくとも１１ヌクレオチド短く、少なくとも１２ヌクレオチド短く、少なくとも１３ヌクレオチド短く、少なくとも１４ヌクレオチド短く、少なくとも１５ヌクレオチド短く、少なくとも１６ヌクレオチド短く、少なくとも１７ヌクレオチド短く、少なくとも１８ヌクレオチド短く、少なくとも１９ヌクレオチド短く、少なくとも２０ヌクレオチド短く、少なくとも２１ヌクレオチド短く、少なくとも２２ヌクレオチド短く、少なくとも２３ヌクレオチド短く、少なくとも２４ヌクレオチド短く、少なくとも２５ヌクレオチド短く、少なくとも２６ヌクレオチド短く、少なくとも２７ヌクレオチド短く、少なくとも２８ヌクレオチド短く、少なくとも２９ヌクレオチド短く、又は少なくとも３０ヌクレオチド短い。
【０３４７】
一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡ配列よりも少なくとも５ヌクレオチド短く、少なくとも６ヌクレオチド短く、少なくとも７ヌクレオチド短く、少なくとも８ヌクレオチド短く、少なくとも８ヌクレオチド短く、少なくとも９ヌクレオチド短く、少なくとも１０ヌクレオチド短く、少なくとも１１ヌクレオチド短く、少なくとも１２ヌクレオチド短く、少なくとも１３ヌクレオチド短く、少なくとも１４ヌクレオチド短く、少なくとも１５ヌクレオチド短く、少なくとも１６ヌクレオチド短く、少なくとも１７ヌクレオチド短く、少なくとも１８ヌクレオチド短く、少なくとも１９ヌクレオチド短く、少なくとも２０ヌクレオチド短く、少なくとも２１ヌクレオチド短く、少なくとも２２ヌクレオチド短く、少なくとも２３ヌクレオチド短く、少なくとも２４ヌクレオチド短く、少なくとも２５ヌクレオチド短く、少なくとも２６ヌクレオチド短く、少なくとも２７ヌクレオチド短く、少なくとも２８ヌクレオチド短く、少なくとも２９ヌクレオチド短く、又は少なくとも３０ヌクレオチド短い。
【０３４８】
一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドポリヌクレオチドは、天然発生ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの組合せよりも５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、又は３９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短い。
【０３４９】
一部の実施形態において、遺伝子操作ｔｒａｃｒＲＮＡは、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡよりも５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、１９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、２９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、３８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短く、又は３９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド短い。
【０３５０】
一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドポリヌクレオチド、例えば、ガイドＲＮＡは、天然発生ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの組合せよりも長い。一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドＲＮＡは、天然発生ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの組合せよりも少なくとも５ヌクレオチド長く、少なくとも６ヌクレオチド長く、少なくとも７ヌクレオチド長く、少なくとも８ヌクレオチド長く、少なくとも８ヌクレオチド長く、少なくとも９ヌクレオチド長く、少なくとも１０ヌクレオチド長く、少なくとも１１ヌクレオチド長く、少なくとも１２ヌクレオチド長く、少なくとも１３ヌクレオチド長く、少なくとも１４ヌクレオチド長く、少なくとも１５ヌクレオチド長く、少なくとも１６ヌクレオチド長く、少なくとも１７ヌクレオチド長く、少なくとも１８ヌクレオチド長く、少なくとも１９ヌクレオチド長く、少なくとも２０ヌクレオチド長く、少なくとも２１ヌクレオチド長く、少なくとも２２ヌクレオチド長く、少なくとも２３ヌクレオチド長く、少なくとも２４ヌクレオチド長く、少なくとも２５ヌクレオチド長く、少なくとも２６ヌクレオチド長く、少なくとも２７ヌクレオチド長く、少なくとも２８ヌクレオチド長く、少なくとも２９ヌクレオチド長く、又は少なくとも３０ヌクレオチド長い。
【０３５１】
一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡ配列よりも少なくとも５ヌクレオチド長く、少なくとも６ヌクレオチド長く、少なくとも７ヌクレオチド長く、少なくとも８ヌクレオチド長く、少なくとも８ヌクレオチド長く、少なくとも９ヌクレオチド長く、少なくとも１０ヌクレオチド長く、少なくとも１１ヌクレオチド長く、少なくとも１２ヌクレオチド長く、少なくとも１３ヌクレオチド長く、少なくとも１４ヌクレオチド長く、少なくとも１５ヌクレオチド長く、少なくとも１６ヌクレオチド長く、少なくとも１７ヌクレオチド長く、少なくとも１８ヌクレオチド長く、少なくとも１９ヌクレオチド長く、少なくとも２０ヌクレオチド長く、少なくとも２１ヌクレオチド長く、少なくとも２２ヌクレオチド長く、少なくとも２３ヌクレオチド長く、少なくとも２４ヌクレオチド長く、少なくとも２５ヌクレオチド長く、少なくとも２６ヌクレオチド長く、少なくとも２７ヌクレオチド長く、少なくとも２８ヌクレオチド長く、少なくとも２９ヌクレオチド長く、又は少なくとも３０ヌクレオチド長い。
【０３５２】
一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドポリヌクレオチドは、天然発生ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの組合せよりも５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、又は３９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長い。
【０３５３】
一部の実施形態において、遺伝子操作ｔｒａｃｒＲＮＡは、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡよりも５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、１９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、２９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３０ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３２ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３３ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３４ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３５ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３６ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３７ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、３８ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長く、又は３９ヌクレオチド〜４０ヌクレオチド長い。
【０３５４】
一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドポリヌクレオチドは、天然発生ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡの組合せと少なくとも１つのヌクレオチドだけ異なり、その結果、遺伝子操作ガイドポリヌクレオチドの結合親和性及び／又は標的化効率は、天然発生ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドのものよりも高い。一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドポリヌクレオチドは、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドと少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、又は少なくとも３０ヌクレオチドだけ異なる。一部の実施形態において、遺伝子操作ｔｒａｃｒＲＮＡは、天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡと少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、又は少なくとも３０ヌクレオチドだけ異なる。
【０３５５】
一部の実施形態において、改変を天然発生ｔｒａｃｒＲＮＡに対して行ってＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ効率を改善する。一部の実施形態において、改変は、ｔｒａｃｒＲＮＡのステムループ中に存在する。一部の実施形態において、改変は、ステムループの伸長である。一部の実施形態において、改変は、ステムループの短縮である。一部の実施形態において、改変は、ステムループ中の１つ以上のヌクレオチド置換である。一部の実施形態において、改変は、図４１に示されるステムループに対するものである。
【０３５６】
一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドＲＮＡを用いるＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ効率は、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、又は少なくとも約１００％だけ改善する。一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドＲＮＡを用いるＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ効率は、少なくとも約２倍、少なくとも約３倍、少なくとも約４倍、少なくとも約５倍、少なくとも約６倍、少なくとも約７倍、少なくとも約８倍、少なくとも約９倍、又は少なくとも約１０倍だけ改善する。
【０３５７】
Ｃａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ効率を計測して例えば、天然発生ガイドＲＮＡと複合体化しているＣａｓ９タンパク質のヌクレアーゼ効率を、本明細書に記載の遺伝子操作ガイドＲＮＡと複合体化しているＣａｓ９タンパク質と比較することができる。一部の実施形態において、計測方法は、生化学的アッセイ、例えば、線状又は環状テンプレートに対するインビトロＣａｓ９ヌクレアーゼ活性の割合の計測などである。一部の実施形態において、計測方法は、例えば、次世代シーケンシング、Ｔ７エンドヌクレアーゼＩアッセイ、及び／又はＣｅｌＩアッセイを使用してＣａｓ９タンパク質の標的化効率を計測する。一部の実施形態において、計測方法は、例えば、ＢＩＡＣＯＲＥシステムを使用するＣａｓ９タンパク質及びｔｒａｃｒＲＮＡ間の親和性試験である。
【０３５８】
一部の実施形態において、ガイド配列は、配列番号１０４〜１２５又は１９６〜１９９のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を含む。一部の実施形態において、ｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１４８〜１７１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を含む。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡは、配列番号１７２〜１９１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を含む。
【０３５９】
一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドＲＮＡ、又はガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１０４〜１２５又は１９６〜１９９のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、ガイドＲＮＡ、又はガイドＲＮＡのｃｒＲＮＡ部分は、配列番号１０４〜１２５又は１９６〜１９９のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０３６０】
一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドポリヌクレオチドのタンパク質結合セグメント、又はｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、配列番号１０２及び１４８〜１７１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有する。一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドポリヌクレオチドのタンパク質結合セグメントは、配列番号１０２及び１４８〜１７１のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０３６１】
一部の実施形態において、本開示は、配列番号１７２〜１９１のいずれか１つと少なくとも９０％の配列同一性を有するＣａｓ９タンパク質のための遺伝子操作ガイドポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態において、遺伝子操作ガイドポリヌクレオチドは、配列番号１７２〜１９１のいずれか１つと少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、又は少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【０３６２】
本明細書に記載のガイドポリヌクレオチドは、生化学的バリデーションを用いるバイオインフォマティクスツールを使用して設計することができる。ガイドポリヌクレオチドを設計する例示的な方法は、以下のとおりである：（１）タンパク質ＢＬＡＳＴを使用して関連ＣＲＩＳＰＲオペロンを見出し；（２）ゲノム中で既にアノテートされているｃｒＲＮＡを探索し、又は例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｆｉｎｄｅｒを使用してＣＲＩＳＰＲをアノテートし；（３）アラインメントツール、例えば、ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用してｔｒａｃｒＲＮＡの考えられる局在を決定し；（４）ｃｒＲＮＡとの類似性を有する領域に近接するＴＡＴＡＡボックスを探索し；（５）アラインメントの間に見出されるｃｒＲＮＡ及び考えられる全てのｔｒａｃｒＲＮＡの二次構造を試験し、所望の二次構造を作製するｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドを選択し；（６）ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをトリミングして短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を作出する。例えば、本明細書に記載のｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を組み合わせてｓｇＲＮＡを生成することができる。一部の実施形態において、ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列は、表１に示されるとおり組み合わせてｓｇＲＮＡを生成する。
【０３６３】
【表１】
2021503279.tif 000002
【実施例】
【０３６４】
実施例１−ＡＡＶＳ１遺伝子座における標的化遺伝子挿入
本実施例は、本明細書に開示のシームレス突然変異誘発（ＯｂＬｉＧａＲｅ２．０系）を使用するＡＡＶＳ１遺伝子座中への遺伝子挿入を保証する。
【０３６５】
２つのＣａｓ９ｎ−ＦｏｋＩバリアント、Ｃａｓ９ｎＤ１０Ａ及びＣａｓ９ｎＨ８４０Ａを図１２及び１４に示されるとおり生成した。ＳＡ−２Ａ−Ｐｕｒｏ選択カセットの上流のＯｂＬｉＧａＲｅ２．０標的部位（図中、領域２及び領域１と示される）を含有する２つのドナーベクターを図１３及び１５に示されるとおり生成した。ドナーベクターのサイズは、６ｋｂであった。ＯｂＬｉＧａＲｅ２．０標的部位は、図１６に示されるとおりＡＡＶＳ１遺伝子座に基づき設計した。
【０３６６】
Ｃａｓ９ｎ−ＦｏｋＩバリアントの１つをコードするプラスミド、４つの別個にクローニングされたガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、及び対応するドナーベクターを、ＨＥＫ２９３細胞中に同時形質移入した。ピューロマイシン耐性カセット（ドナープラスミド上の目的遺伝子）のゲノム挿入を、図１５に模式的に示した。
【０３６７】
ピューロマイシン耐性を有する細胞を選択し、ピューロマイシン耐性細胞のゲノムＤＮＡを回収し、ジャンクションＰＣＲに供した。ＰＣＲ産物をＴＯＰＯクローニングし、サンガーシーケンシングによりシーケンシングしてジャンクションにおける正確性を決定した。
【０３６８】
Ｃａｓ９ｎＤ１０Ａ−ＦｏｋＩを使用する遺伝子挿入のための５’ジャンクションの配列を、図１７に示した。Ｃａｓ９ｎＨ８４０Ａ−ＦｏｋＩを使用する遺伝子挿入のための５’ジャンクションの配列を、図１８に示した。したがって、ＯｂＬｉＧａＲｅ２．０システムを使用して導入遺伝子カセットはＡＡＶＳ１遺伝子座中に、予測ジャンクションに関して高い正確性で良好にノックインされた。
【０３６９】
実施例２−抗生物質選択を用いない標的化挿入の効率、及び遺伝子挿入効率に対するスペーサー長さの影響の評価
本実施例において、抗生物質選択を要求しない実験設定を使用して遺伝子挿入効率に対するスペーサー長さ（２つのｇＲＮＡのオフセット配列）の影響を試験した。
【０３７０】
標的部位としてＡＡＶＳ１−エキソン２遺伝子座を選択した。スペーサーの長さが異なる１０個の標的部位の標的化に要求されるｇＲＮＡを図１９に示されるとおり設計し、クローニングした。したがって、設計されたＯｂＬｉＧａＲｅ２．０標的部位及びｍＣｈｅｒｒｙ（ＥＦ１ａプロモーターの制御下）を含有する１０個のドナーベクターを、図２０に示されるとおり生成した。
【０３７１】
Ｃａｓ９ｎＨ８４０Ａ−ＦｏｋＩをコードするプラスミド及び２ＡＧＦＰ、ｇＲＮＡの２つ、並びにドナーベクターを、ＨＥＫ２９３細胞中に同時形質移入した。選択を以下のとおり実施した：細胞を、活性Ｃａｓ９ｎ−ＦｏｋＩの導入を示すＧＦＰ発現についてＦＡＣＳにより最初にソートした。次いで、細胞を少なくとも１０回の継代にわたり継代培養し、次いで標的部位におけるｍＣｈｅｒｒｙの挿入を示すｍＣｈｅｒｒｙ発現についてＦＡＣＳによりソートした。この模式図を図２１に示した。
【０３７２】
スペーサー長さ（塩基対で示す）に対するｍＣｈｅｒｒｙを有する細胞の割合についての結果を、図２２に示した。１７ｂｐのスペーサー長さは、ｍＣｈｅｒｒｙ挿入の最大効率を示した（約２０％）。したがって、抗生物質選択を適用せずにＯｂＬｉＧａＲｅ２．０を用いて導入遺伝子挿入の高い効率が達成された。
【０３７３】
実施例３−異なる遺伝子挿入法の効率の比較
本実施例において、ＯｂＬｉＧａＲｅ（ジンクフィンガーヌクレアーゼを使用する）、及びＯｂＬｉＧａＲｅ２．０を使用する遺伝子挿入を比較した。
【０３７４】
ＯｂＬｉＧａＲｅ遺伝子挿入は、ＡＡＶＳ１−ｉｎｔ１遺伝子座中への遺伝子挿入に使用した。Ｃａｓ９ｎ−ＦｏｋＩバリアントを使用するＯｂＬｉＧａＲｅ２．０は、ＡＡＶＳ１−ｉｎｔ１及びＳＥＲＰＩＮＡ１−イントロン１遺伝子座中の３つの部位を標的化する２又は４つのｇＲＮＡと使用した。ｄｅａｄＣａｓ９−ＦｏｋＩを使用するＯｂＬｉＧａＲｅ２．０も試験した。実験手順を実施例２に記載のとおり実施した（抗生物質選択なし、及びｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞のＦＡＣＳ計測に基づく細胞選択）。ＳＥＲＰＩＮＡ１遺伝子座についてのドナープラスミドを図２３に示す。ｄｅａｄＣａｓ９−ＦｏｋＩを使用するドナープラスミド上の目的遺伝子のゲノム挿入を、図２４に示した。
【０３７５】
試験された遺伝子挿入法のそれぞれについて得られた結果を、図２５に示した。結果は、１つの実験における３つの独立した生物学的複製物から得た。エラーバーはＳ．Ｅ．Ｍ．を示した。ＡＡＶＳ１−ｉｎｔ１遺伝子座におけるジンクフィンガーヌクレアーゼベースのＯｂＬｉＧａＲｅ（「ＡＡＶＳ１−ｉｎｔ−ＺＦＮ」）及びＣａｓ９ｎＤ１０Ａ−ＦｏｋＩ（ＡＡＶＳ１−ｉｎｔ−Ｃ９ｎＦ−Ａ」）についての効率は、同等であった。異なる遺伝子座にわたるＯｂＬｉＧａＲｅ２．０効率の変動は、ｇＲＮＡの効率に起因し得た。高い遺伝子挿入効率の取得は、標的部位及び異なるスペーサー長さの組合せを評価することにより達成される。
【０３７６】
実施例４−シームレス突然変異誘発
本実施例において、本明細書の開示に提供されるシームレス突然変異誘発の一般的方法を記載する。シームレス突然変異誘発についての所望の結果を図２６に示し、突然変異は標的部位において標的中のいかなる配列の変化もなしで作製する。
【０３７７】
方法のステップ１を図２７に示す。ホモロジーアームによりフランキングされた耐性カセットを、標的配列を有する細胞中に導入し、相同組換えにより標的領域中に挿入する。耐性カセットを含有する細胞を選択する。
【０３７８】
耐性カセットの拡大図を図２８に示す。ヌクレアーゼ切断部位及びヌクレアーゼ結合部位は、耐性カセットの両側上に存在する。オーバーハングを生成し得るヌクレアーゼ、例えば、Ｃｐｆ１又はＣａｓ９は、ヌクレアーゼ切断部位において開裂させ、所望の点突然変異を含むオーバーハングを生成する。
【０３７９】
方法のステップ２を図２９に示す。インビトロ又はインビボライゲーションは、ヌクレアーゼにより生成された適合性オーバーハングを使用して耐性カセットを除去する。したがって、点突然変異は、いかなる「痕跡」も、すなわち、いかなる余分配列も残さずに挿入する。核酸消化及びライゲーションについてのプロトコルを実施例５に記載する。
【０３８０】
実施例５−Ｃｐｆ１を使用するシームレス突然変異誘発についてのプロトコル
本実施例において、核酸消化及びライゲーションを以下のとおり実施する：
【０３８１】
消化
１．ＲＮアーゼ不含の０．５ｍＬチューブ中で、
１μＬのＣａｓ９  １０×緩衝液
１μＬのＣｐｆ１タンパク質（１０μｇ／μＬ）
１μＬのｇＲＮＡ
１０μＬまでのＲＮアーゼ不含Ｈ２Ｏ（この量は、ステップ３において添加されるＤＮＡの量により決定する）
を一緒に添加する。
２．室温において５分間インキュベートする。
３．切断すべき２〜２．５μｇのプラスミドＤＮＡを添加する（この容量は濃度に応じて変動し；それに従ってステップ１における水の量を調整する）。
４．３７℃において２時間インキュベートする。
５．消化後、１５０Ｖにおいて１．５％のアガロースゲルを用いてゲル電気泳動を実施する。
【０３８２】
ゲル抽出
６．適切な長さを有するＤＮＡをゲルから切断する。
７．Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（例えば、ＱＩＡＧＥＮ製）を使用してＤＮＡをゲルから抽出する。
８．ＮＡＮＯＤＲＯＰ上でＤＮＡ濃度を計測する。
【０３８３】
ライゲーション
９．ＰＣＲチューブ中で、
２５〜３０ｎｇのプラスミドＤＮＡ（この容量は濃度に応じて変動する）
１μＬのＤＴＴ
１μＬの１０×Ｔ４リガーゼ緩衝液
１μＬのＴ４リガーゼ
１０μＬまでのＨ２Ｏ
を一緒に添加する。
１０．１６℃において２時間インキュベートする。
１１．形質転換のために１０μｌを使用する。
【０３８４】
形質転換
１２．ＮＥＢ１０β細胞（ＮＥＷ  ＥＮＧＬＡＮＤ  ＢＩＯＬＡＢＳ）を氷上で１０分間配置することにより−８０℃の冷凍庫から解凍する。それぞれのバイアルは、５０μＬ（３つの形質転換に十分）を含有する。ＳＯＣ培地を解凍する。
１３．１０μＬのライゲーション反応物を１．５ｍＬのＥＰＰＥＮＤＯＲＦチューブに添加し、氷上に配置して冷却する。
１４．解凍後、１５μＬのＮＥＢ１０β細胞をライゲーション反応物に添加する。
１５．氷上で３０分間放置する。４２℃の水浴を加温する。
１６．細胞を水浴中で４２℃において３０秒間配置することにより熱ショック処理し、次いで氷上で２分間配置する。
１７．３００μＬのＳＯＣ培地を細胞に添加し、３７℃において４５分間インキュベートする。
１８．１００μＬの細胞をプレート上の１／３に、又は３００μＬをプレート上の全体にプレーティングし；プレートは、適切な抗生物質を含有する。
【０３８５】
実施例６−Ｃａｓ９インビトロ消化プロトコル
本実施例において、Ｃａｓ９による基質ＤＮＡのインビトロ消化を以下のとおり実施する（３０μＬの反応物用）：
１．反応物を室温において以下の順：
２０μＬのヌクレアーゼ不含水
３μＬの１０×Ｃａｓ９ヌクレアーゼ反応緩衝液
３μＬの３００ｎＭのｓｇＲＮＡ（３０ｎＭの最終濃度）
１μＬの１μＭのＣａｓ９ヌクレアーゼ（約３０ｎＭの最終濃度）
で集め、
２５℃において１０分間プレインキュベートし、次いで
３μＬの３０ｎＭの基質ＤＮＡ
を添加する。
２．十分に混合し、微小遠心管中でパルススピン（ｐｕｌｓｅ−ｓｐｉｎ）する。
３．３７℃において１５分間インキュベートする。
４．１μＬのプロテイナーゼＫをそれぞれの試料に添加する。十分に混合し、微小遠心管中でパルススピンする。
５．室温において１０分間インキュベートする。
６．断片分析に移行する。
【０３８６】
実施例７−Ｃａｓ９開裂後のＤＮＡ修復プロファイルの分析
本実施例において、コンピュータ計算分析を使用してオペロン中のｃａｓ４の存在を検索することによりＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９オペロンを同定した。フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）からのＣａｓ９タンパク質（ＦｎＣａｓ９）を産生のために選択した。ヌクレアーゼ活性は、図３４Ａに示されるとおりインビトロ開裂アッセイにおいて実証した。開裂産物のサンガーシーケンシングにより、図３４Ｂに示されるとおりＦｎＣａｓ９がインビトロで５’粘着末端を生成することが明らかになった。タンパク質発現構築物を、ＨＥＫ２９３ヒト細胞系中でバリデートした。ＲＩＭＡを使用して図３４Ｃに示されるとおりＦｎＣａｓ９及び化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９タンパク質（ＳｐｙＣａｓ９）における突然変異パターンを比較した。
【０３８７】
実施例８−Ｃａｓ９処理後のＤＮＡ切断プロファイルの分析
フランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）からのＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９バリアント（ＦｎＣａｓ９）は、実施例７に記載のとおり哺乳動物細胞において低い編集効率で粘着末端を形成することが示された。ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９ファミリーの他のメンバーを、粘着末端の生成について試験した。シーケンシングされた腸内メタゲノムＭＨ０２４５からの新たなＣａｓ９バリアントが同定された（ＭＨＣａｓ９）。ＭＨＣａｓ９のために設計されたガイドＲＮＡ、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及びｃｒＲＮＡの配列を図３３に示す。インビトロアッセイは、図３５Ａに示されるとおりＭＨＣａｓ９がＤＮＡ断片を開裂させ得ることを示した。サンガーシーケンシングにより、ＭＨＣａｓ９が図３５Ｂに示されるとおりインビトロで５’オーバーハングを生成することが明らかになった。さらに、セル１アッセイを実施して図３５Ｃに示されるとおりＭＨＣａｓ９がＨＥＫ２９３−ＲＥＭＩＮＤＥＬヒト細胞系においても機能的であることをバリデートした。
【０３８８】
ＭＨＣａｓ９からのｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡの配列を図３６Ａに示す。二次構造を示すｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡの模式図を図３６Ｂに示す。図３６Ｃの切り取られた系統樹は、ＭＨＣａｓ９と他のＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９、例として、スルフロスピリラム属種（Ｓｕｌｆｕｒｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ  ｓｐ．）ＳＣＡＤＣｈ（ｓｓＣａｓ９）、ウォリネラ・スクシノゲネス（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ  ｓｕｃｃｉｎｏｇｅｎｅｓ）（ＷｓＣａｓ９）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）（ＬｐＣａｓ９）からのＣａｓ９及びＦｎＣａｓ９とのアラインメントを示す。系統樹により示されるとおり、ＦｎＣａｓ９及びＭＨＣａｓ９は、かなりの多様性を示す。しかしながら、実施例７及び本実施例に記載の実験結果は、ＭＨＣａｓ９及びＦｎＣａｓ９が同一の開裂機序を共有することを示す。
【０３８９】
実施例９−ｓｇＲＮＡの設計
本実施例において、ｓｇＲＮＡの設計方法を記載する：
１．タンパク質ＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ、ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ？ＰＡＧＥ＝Ｐｒｏｔｅｉｎｓ）を使用して関連ＣＲＩＳＰＲオペロンを見出す。検索に現れる種のそれぞれについて、ＲｅｆＳｅｑの１つをさらなる分析のために選択する。ＢＬＡＳＴは、種々の入力及び異なる設定で数回ランする。
２．既にアノテートされたＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）を確認する。そうでなければ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｆｉｎｄｅｒ（ｃｒｉｓｐｒ．ｉ２ｂｃ．ｐａｒｉｓ−ｓａｃｌａｙ．ｆｒ／Ｓｅｒｖｅｒ／）を使用してｃｒＲＮＡをアノテートする。
３．ＣＬＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ  ｖ．９．５（ＱＩＧＥＮ）の「Ｃｒｅａｔｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ」を使用してｔｒａｃｒＲＮＡの考えられる局在を見出す。ｃｒＲＮＡの両方の鎖をＣａｓ４及びＣＲＩＳＰＲ反復配列間の配列にアラインする。
４．ｃｒＲＮＡとの類似性を示す領域に近接するＴＡＴＡＡボックスを探索する。
５．（アラインメントにおいて見出される）全ての考えられるｔｒａｃｒＲＮＡを有するｃｒＲＮＡの二次構造を試験し、所望の構造を作製するものを選択する。
６．ｃｒＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡをトリミングして短鎖ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を作製する。
【０３９０】
図４１Ａ〜Ｔは、本明細書に記載の方法により設計される種々のｓｇＲＮＡを説明する。図４２Ａ〜Ｌは、トリミングによるｓｇＲＮＡ（「キメラｇＲＮＡとも称される）の最適化、及びさらなる改変にために考えられる標的部位を説明する。
【０３９１】
実施例１０−改変ｓｇＲＮＡのインビトロ消化アッセイ
図４５（ガイド−１、ガイド−２、ガイド−３、ガイド−４）に概略されるとおり種々のヌクレオチドを除去することにより４つの異なるガイドＲＮＡを遺伝子操作した。次いで、インビトロ消化アッセイにおいて改変ガイドＲＮＡを元のガイドＲＮＡと比較した。図４５は、一部の改変がＭＨＣａｓ９の消化効率を改善したことを実証する。
【０３９２】
ガイドＲＮＡ長さを３つの異なるＣａｓ９系：ＳｐｙＣａｓ９、Ｃｌ１Ｃａｓ９及びＭＨＣａｓ９においてさらに調査した。長さ１９〜２３のガイドＲＮＡを調製し、次いで新たなＣａｓ９バリアント及び遺伝子操作ガイドＲＮＡをレポーター細胞系中に形質移入し、Ｓｕｒｖｅｙｏｒ（商標）ヌクレアーゼアッセイ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｋｏｋｉｅ，ＩＬ）に供した。図４６は、新たなＣａｓ９変異型Ｃｌ１及びＭＨのインビトロでの切断効率及び機能性を実証する。
【０３９３】
実施例１１−ＭＨＣａｓ９のためのＰＡＭ配列
図４９Ａに模式的に示される方法を使用してＭＨＣａｓ９に好ましいＰＡＭ配列を調査した。種々のＰＡＭ配列組合せ及び標的開裂部位をカバーするプールされた６４個のプラスミドのライブラリーを生成した。ＳｐＣａｓ９及びＭＨＣａｓ９を使用してライブラリーを別個に消化した。プラスミド用のフォワード及びリバースプライマーを使用して標的開裂部位及びＰＡＭを含有する領域を増幅させ、次いで増幅させた領域を次世代シーケンシングによりシーケンシングした。ＳｐＣａｓ９又はＭＨＣａｓ９のいずれかに好ましいＰＡＭ配列を含有するプラスミドは消化され、したがって、増幅もシーケンシングもされなかった。他方、ＳｐＣａｓ９又はＭＨＣａｓ９に好ましくないＰＡＭ配列を含有するプラスミドは消化されず、増幅させることができた。
【０３９４】
ＳｐＣａｓ９及びＭＨＣａｓ９のための「枯渇」ＰＡＭ配列についての結果を図４９Ｂに示す。ＳｐＣａｓ９と比較して、ＭＨＣａｓ９は、「ＮＧＧ」ＰＡＭ配列についての低いストリンジェントな優先性を有する。
【０３９５】
実施例１２−Ｃａｓ９タンパク質とエキソヌクレアーゼとの組合せ
ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質による開裂を、末端プロセシングエキソヌクレアーゼ酵素と組み合わせて編集効率を増加させた。方法の模式図を図５０に説明する。図５０Ａに示されるとおり、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９による開裂により生成されたオーバーハングは、細胞により正確に修復されて元の配列に戻され、したがって、挿入−欠失又は置換改変が望まれる場合に編集効率が制限され得る。図５０Ｂにおいて、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９による開裂後、末端プロセシングエキソヌクレアーゼ酵素Ａｒｔｅｍｉｓ又はＴＲＥＸ２を導入し、それがＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９切断部位における開裂オーバーハングをさらにプロセシングする。これらのプロセシングされた末端の細胞修復は、元の配列に対して不正確な修復（すなわち、挿入−欠失又は置換改変の数の増加）をもたらし、それにより編集効率を増加させる。
【０３９６】
Ｃａｓ９とエキソヌクレアーゼとの組合せの効果を試験するため、末端プロセシング酵素を用いて又は用いずにＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９をヒト細胞系における活性について試験した。図５１Ａは、実験手順の模式的概要を示す。種々のＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質（ＦｎＣａｓ９、Ｃｌ１Ｃａｓ９、ＭＨＣａｓ９）及びＩＩ−Ａ型ＳｐＣａｓ９をコードするプラスミドを、末端プロセシング酵素ＦｎＣａｓ４又はＴＲＥＸ２をコードするプラスミド及び３つの異なるガイドＲＮＡ配列をコードするプラスミドとともにＨＥＫ２９３細胞中に導入した。ＨＥＫ２９３細胞からのゲノムＤＮＡを形質移入の７２時間後に回収し、次世代シーケンシングにより分析した。
【０３９７】
結果を図５１Ｂに示す。対照プラスミドが形質移入された細胞は、改変のバックグラウンドレベル（シーケンシングにおける自然変異に起因する）のみを示した。ＦｎＣａｓ９、ＭＨＣａｓ９、及びＳｐＣａｓ９は、全て、末端プロセシング酵素の存在又は不存在下のいずれでも変動量のゲノム改変を示した。一般に、末端プロセシング酵素を用いるＣａｓ９の導入は、末端プロセシング酵素を用いない場合に対して改変の数の増加を示した。
【０３９８】
実施例１３−Ｃａｓ９タンパク質の突然変異パターン分析
異なるＣａｓ９により作製された切断についての突然変異パターン分析を実施した。ＨＥＫ２９３細胞にＳｐＣａｓ９、Ｃｌ１Ｃａｓ９、又はＭＨＣａｓ９及びそれらのそれぞれのガイドＲＮＡを形質移入した。７２時間後に細胞を溶解させ、ゲノムＤＮＡを抽出し、次世代アンプリコンシーケンシングに供した。バイオインフォマティックツールを使用してシーケンシングリードを分析して検出された改変リード間のそれぞれの突然変異の相対頻度を定量した。
【０３９９】
結果を図５２に示す。図５２Ａ、５２Ｂ、及び５２Ｃはそれぞれ、ＳｐＣａｓ９、Ｃｌ１Ｃａｓ９、及びＭＨＣａｓ９を使用した切断の誘導後の同一標的配列についての突然変異パターンを示す。標的配列をパネルのそれぞれの上段に示す。これらの結果は、異なるＣａｓ９タンパク質を使用した切断の誘導後の同一遺伝子座における突然変異パターンが異なることを示し、異なるＣａｓ９についての異なる様式のヌクレアーゼ活性を示す。
【０４００】
ヌクレアーゼ活性の差についての１つの非限定的な仮定は、ＲｕｖＣ及びＨＮＨヌクレアーゼドメイン立体構造がＩＩ−Ａ型及びＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９タンパク質間で異なることであり得る。図５３に説明されるとおり、ＩＩ−Ａ型Ｃａｓ９（パネルＡ）は、そのＲｕｖＣ及びＨＮＨドメインについての同一切断部位（例えば、ＮＧＧ  ＰＡＭ配列の上流のおよそ３ヌクレオチド）を示し、それが平滑末端又は単一ヌクレオチドオーバーハングをもたらす。他方、ＩＩ−Ｂ型Ｃａｓ９（パネルＢ）は、ＲｕｖＣ及びＨＮＨについてのオフセット切断部位（例えば、それぞれ、ＮＧＧ  ＰＡＭ配列の上流のおよそ７及び３ヌクレオチド）を示し、それが「付着」末端、すなわち、３〜４ヌクレオチドオーバーハングをもたらす。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ−Ｂ】
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【図５Ａ−Ｅ−１】
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【図５Ａ−Ｅ−２】
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【図５Ａ−Ｅ−３】
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【図５Ａ−Ｅ−４】
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【図５Ａ−Ｅ−５】
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【図６Ａ−Ｃ−１】
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【図６Ａ−Ｃ−２】
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【図６Ａ−Ｃ−３】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０−１】
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【図３０−２】
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【図３０−３】
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【図３０−４】
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【図３０−５】
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【図３０−６】
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【図３０−７】
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【図３０−８】
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【図３０−９】
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【図３０−１０】
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【図３０−１１】
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【図３０−１２】
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【図３０−１３】
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【図３０−１４】
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【図３０−１５】
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【図３０−１６】
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【図３０−１７】
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【図３０−１８】
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【図３０−１９】
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【図３０−２０】
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【図３０−２１】
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【図３０−２３】
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【図３０−２４】
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【図３０−２５】
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【図３１−１】
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【図３１−２】
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【図３１−３】
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【図３１−４】
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【図３１−５】
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【図３１−６】
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【図３２】
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【図３３Ａ−Ｂ】
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【図３４Ａ−Ｃ】
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【図３５Ａ−Ｃ】
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【図３６Ａ−Ｃ】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図３９−３】
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【図４０Ａ−１】
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【図４０Ａ−２】
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【図４０Ｂ】
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【図４１Ａ−Ｔ−１】
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【図４１Ａ−Ｔ−２】
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【図４１Ａ−Ｔ−３】
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【図４１Ａ−Ｔ−４】
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【図４１Ａ−Ｔ−５】
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【図４１Ａ−Ｔ−６】
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【図４１Ａ−Ｔ−７】
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【図４１Ａ−Ｔ−８】
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【図４１Ａ−Ｔ−９】
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【図４１Ａ−Ｔ−１０】
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【図４２Ａ−Ｌ−１】
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【図４２Ａ−Ｌ−２】
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【図４２Ａ−Ｌ−３】
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【図４２Ａ−Ｌ−４】
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【図４２Ａ−Ｌ−５】
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【図４２Ａ−Ｌ−６】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７−１】
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【図４７−２】
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【図４８】
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【図４９Ａ−Ｂ】
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【図５０Ａ−Ｂ】
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【図５１Ａ−Ｂ】
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【図５２Ａ−Ｃ】
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【図５３Ａ−Ｂ】
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【配列表】
2021503279000001.app
【国際調査報告】
2021503279.tif 000110
2021503279.tif 000111
2021503279.tif 000112
2021503279.tif 000113
2021503279.tif 000114