(57)【要約】  ジストロフィン異常症の治療のための組成物および方法が開示されている。組成物は、改変されたヒンジ１（Ｈ１）および／またはヒンジ４（Ｈ４）を有する改変ジストロフィンタンパク質をコードする改変ジストロフィンポリヌクレオチドを含む。改変されたヒンジ１（Ｈ１）および／または改変されたヒンジ４（Ｈ４）を有する改変ジストロフィンタンパク質をコードする組成物を投与することによる、ジストロフィン異常症の治療のための方法も開示される。
2021520196.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒンジ１（Ｈ１）領域の改変、ヒンジ４（Ｈ４）領域の改変、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つに対するヒンジ領域改変を含む、改変ジストロフィンをコードする核酸。
【請求項２】
前記ヒンジ１（Ｈ１）領域の改変は、ヒンジ１（Ｈ１）領域の完全欠失、およびヒンジ１（Ｈ１）領域の部分欠失から選択される、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記ヒンジ４領域の改変は、ヒンジ４（Ｈ４）領域の部分欠失である、請求項１に記載の核酸。
【請求項４】
ヒンジ１（Ｈ１）領域の改変、ヒンジ４（Ｈ４）領域の改変、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つに対するヒンジ領域改変を含む、改変ジストロフィンをコードする核酸を含むベクター。
【請求項５】
前記Ｈ１領域の改変は、ヒンジ１（Ｈ１）領域の完全欠失、およびヒンジ１（Ｈ１）領域の部分欠失から選択される、請求項４に記載のベクター。
【請求項６】
前記ヒンジ４（Ｈ４）領域の改変は、ヒンジ４（Ｈ４）領域の部分欠失である、請求項４に記載のベクター。
【請求項７】
前記ベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターから選択される、請求項４に記載のベクター。
【請求項８】
前記ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターから選択される、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
前記アデノ随伴ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＶＶ−１）、アデノ随伴ウイルス血清型５（ＡＶＶ−５）、アデノ随伴ウイルス血清型６（ＡＶＶ−６）、アデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＶＶ−８）、アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＶＶ−９）、アデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ７４（ＡＶＶ−ｒｈ７４）、アデノ随伴ウイルス２ｉ８（ＡＶＶ−２ｉ８）、アデノ随伴ウイルスＢ１（ＡＶＶ−Ｂ１）、アデノ随伴ウイルスＣＡＭ１３０（ＡＶＶ−ＣＡＭ１３０）、アデノ随伴ウイルスＭ４１（ＡＶＶ−Ｍ４１）、アデノ随伴ウイルスＭＴＰ（ＡＶＶ５８７ＭＴＰおよびＡＶＶ５８８ＭＴＰ）、アデノ随伴ウイルスＮＰ２２（ＡＶＶ−ＮＰ２２）、アデノ随伴ウイルスＮＰ６６（ＡＶＶ−ＮＰ６６）、アデノ随伴ウイルスＭＹＯ（ＡＶＶＭＹＯ）、アデノ随伴ウイルスチロシン変異体、および祖先アデノ随伴ウイルスベクター（ａｎｃＡＶＶ）から選択される、請求項８に記載のベクター。
【請求項１０】
組織特異的プロモーターをさらに含む、請求項４に記載のベクター。
【請求項１１】
前記組織特異的プロモーターは、筋特異的プロモーターおよび心臓特異的プロモーターから選択される、請求項１０に記載のベクター。
【請求項１２】
それを必要とする対象にベクターを投与することを含み、ここで、ベクターは改変ジストロフィンをコードする核酸を含み、改変ジストロフィンは、ヒンジ１（Ｈ１）領域、ヒンジ４（Ｈ４）領域、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つに対するヒンジ領域改変を含む、それを必要とする対象におけるジストロフィン異常症の治療のための方法。
【請求項１３】
前記ヒンジ領域の改変は、ヒンジ１（Ｈ１）領域の部分欠失、およびヒンジ１（Ｈ１）領域の完全欠失から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ヒンジ領域の改変は、ヒンジ４（Ｈ４）領域の部分欠失である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１５】
前記核酸は、ベクターに搭載されている、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
前記ベクターは、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターから選択される、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記アデノ随伴ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＶＶ−１）、アデノ随伴ウイルス血清型５（ＡＶＶ−５）、アデノ随伴ウイルス血清型６（ＡＶＶ−６）、アデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＶＶ−８）、アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＶＶ−９）、アデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ７４（ＡＶＶ−ｒｈ７４）、アデノ随伴ウイルス２ｉ８（ＡＶＶ−２ｉ８）、アデノ随伴ウイルスＢ１（ＡＶＶ−Ｂ１）、アデノ随伴ウイルスＣＡＭ１３０（ＡＶＶ−ＣＡＭ１３０）、アデノ随伴ウイルスＭ４１（ＡＶＶ−Ｍ４１）、アデノ随伴ウイルスＭＴＰ（ＡＶＶ５８７ＭＴＰおよびＡＶＶ５８８ＭＴＰ）、アデノ随伴ウイルスＮＰ２２（ＡＶＶ−ＮＰ２２）、アデノ随伴ウイルスＮＰ６６（ＡＶＶ−ＮＰ６６）、アデノ随伴ウイルスＭＹＯ（ＡＶＶＭＹＯ）、アデノ随伴ウイルスチロシン変異体、および祖先アデノ随伴ウイルスベクター（ａｎｃＡＶＶ）から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
それを必要とする対象に改変ジストロフィンタンパク質を投与することを含み、ここで、改変ジストロフィンタンパク質は、ヒンジ１（Ｈ１）領域、ヒンジ４（Ｈ４）領域、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つに対するヒンジ領域改変を含む、それを必要とする対象におけるジストロフィン異常症の治療のための方法。
【請求項１９】
前記ジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、およびＸ連鎖性拡張型心筋症（ＸＬＤＣ）から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記対象は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、およびＸ連鎖性拡張型心筋症（ＸＬＤＣ）から選択されるジストロフィン異常症の保因者である、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
この出願は、２０１８年４月３日に出願された米国仮出願第６２／６５１，７７２号の優先権を主張し、その開示は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
【０００２】
提出する配列表の援用における記載
配列表の紙のコピー、およびサイズが１５１，８８３バイト（ＭＩＣＲＯＳＯＦＴ  ＷＩＮＤＯＷＳ（登録商標）エクスプローラで測定される）である「１８ＵＭＣ０４６＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と名付けられたファイルを含む配列表のコンピュータ可読形式が本明細書に提供されており、参照により本明細書に組み込まれる。この配列表は、配列番号：１〜１８からなる。
【０００３】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所により授与されたＮＳ０９０６３４に基づく政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００４】
本開示は、ジストロフィン異常症の治療のための組成物および方法に関する。組成物は、改変されたヒンジ１（Ｈ１）および／またはヒンジ４（Ｈ４）を有する改変ジストロフィンタンパク質をコードする改変ジストロフィンポリヌクレオチドを含む。改変されたヒンジ１（Ｈ１）および／または改変されたヒンジ４（Ｈ４）を有する改変ジストロフィンタンパク質をコードする組成物を投与することによる、ジストロフィー症を治療するための方法も開示される。
【０００５】
ジストロフィン異常症は、ジストロフィン遺伝子の突然変異によって引き起こされる一群の疾患を指す。ジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、およびＸ連鎖性拡張型心筋症（ＸＬＤＣ）およびその保因者を含む。
【０００６】
ジストロフィン遺伝子（２．４ｍｂ）は、ゲノムにおける最大の遺伝子の１つである。ジストロフィンｍＲＮＡは１４ｋｂである。ジストロフィンタンパク質は４つの領域；アミノ末端（ＮＴ）、２４個のスペクトリン様リピート（Ｒ）領域を有するセントラルロッドドメイン、および４つのヒンジ（Ｈ）領域、システインリッチドメイン（ＣＲ）、およびカルボキシル末端（ＣＴ）ドメインからなる。ＮＴ、ＣＲ、およびＣＴ、ならびにロッドドメインのリピート、およびＨ２およびＨ３の生物学的機能は広範に調べられているが、Ｈ１およびＨ４の機能はほとんど知られていない。
【０００７】
ウイルス媒介性または非ウイルス媒介性の遺伝子送達により、変異したジストロフィン遺伝子を機能的遺伝子で置換することは、ジストロフィン異常症を治療するための非常に有望な戦略である。ジストロフィン遺伝子およびそのｃＤＮＡは、ウイルスベクター、特にアデノ随伴ウイルス（ＡＶＶ）ベクターにパッケージ化するには大きすぎる。このため、合成ミニ遺伝子およびマイクロ遺伝子の開発に多大な関心が寄せられている。ＡＡＶマイクロジストロフィン遺伝子治療は、特に重要である。ＡＡＶマイクロ遺伝子ベクターを使用して、いくつかの臨床試験が開始された。現在のジストロフィンマイクロ遺伝子を改良できる戦略は、ジストロフィン異常症の治療に有益である。
【０００８】
したがって、ジストロフィン異常症の治療のための代替ジストロフィンマイクロ遺伝子および方法のニーズが存在する。
【発明の概要】
【０００９】
開示の簡単な説明
一つの態様では、本開示は、ヒンジ１（Ｈ１）領域、ヒンジ４（Ｈ４）領域、およびそれらの組み合わせの少なくとも１つに対するヒンジ領域改変を含む、改変ジストロフィンをコードする核酸に関する。
【００１０】
一つの態様では、本開示は、ヒンジ１（Ｈ１）領域、ヒンジ４（Ｈ４）領域、およびそれらの組み合わせの少なくとも１つに対するヒンジ領域改変を含む、改変ジストロフィンをコードする核酸を含むベクターに関する。
【００１１】
一つの態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるジストロフィン異常症の治療のための方法に関する。当該方法は、改変ヒンジ領域を有する改変ジストロフィンを、それを必要とする対象に投与することを含む。
【００１２】
以下の発明の詳細な説明を考慮すると、本開示はよりよく理解され、上記以外の特徴、態様、および利点が明らかになるであろう。そのような発明の詳細な説明は、以下の図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
【図１】図１は、ｐＹＬ９０（全長マイクロジストロフィンを有するプラスミド）、およびｐＬＷ１（ΔＨ１マイクロジストロフィンを有するプラスミド）のタンパク質構造の略図である。
【図２】図２Ａおよび２Ｂは、ＢＬ６（対照）マウスおよび未処理のｍｄｘ（「Ｍｄｘ４ｃｖ  ｕｎｉｎｊ」）マウスと比較した、ＡＡＶウイルスＬＷ１処理（図２Ａ）およびＡＡＶウイルスＹＬ９０処理（図２Ｂ）ｍｄｘマウスの発現を検出するウエスタンブロットである。
【図３】図３は、ジストロフィン、およびジストロフィン結合タンパク質複合体のタンパク質について免疫染色したＹＬ９０、ＬＷ１、ＢＬ６、およびＭｄｘ４ｃｖマウス由来の筋肉の画像を示す。
【図４】図４は、同様の筋肉組織構造を示す、ＬＷ１処理およびＹＬ９０処理マウスのヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色した筋肉の画像を示す。各画像は１匹の独立した動物由来である。
【図５】図５Ａ〜５Ｃは、ＬＷ１処理ｍｄｘ４ｃｖマウス（「ＬＷ１  ｉｎｊ」）、ＹＬ９０処理ｍｄｘ４ｃｖマウス（「ＹＬ９０  ｉｎｊ」）、ＢＬ６（対照）マウス、および未処理ｍｄｘ４ｃｖマウス（「ｕｎｉｎｊ」）における、比単収縮力（図５Ａ）、比力収縮頻度（ｆｏｒｃｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ）（図５Ｂ）、およびストレッチ誘発性損傷（ｓｔｒｅｔｃｈ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄａｍａｇｅ）に対する抵抗（パーセント力低下［ｐｅｒｃｅｎｔ  ｆｏｒｃｅ  ｄｒｏｐ］）（図５Ｃ）を測定する筋力解析を示すグラフである。
【図６】図６は、ｐＹＬ９０、ｐＬＷ２、ｐＬＷ３、ｐＬＷ４、ｐＬＷ５、およびｐＬＷ６マイクロジストロフィンのタンパク質構造を示す略図である。
【図７】図７Ａ〜７Ｆは、ＹＬ９０（図７Ａ）、ＬＷ２（図７Ｂ）、ＬＷ３（図７Ｃ）、ＬＷ４（図７Ｄ）、ＬＷ５（図７Ｅ）、およびＬＷ６（図７Ｆ）Ｍｄｘ４ｃｖマウス由来のジストロフィンについて免疫染色した筋肉の画像である。
【図８】図８Ａ〜８Ｆは、Ｍｄｘ４ｃｖマウスにおけるＹＬ９０（図８Ａ）、ＬＷ２（図８Ｂ）、ＬＷ３（図８Ｃ）、ＬＷ４（図８Ｄ）、ＬＷ５（図８Ｅ）、およびＬＷ６（図８Ｆ）の発現を示すウエスタンブロットである。
【図９】図９Ａ〜９Ｆは、Ｍｄｘ４ｃｖマウスにおけるＹＬ９０（図９Ａ）、ＬＷ２（図９Ｂ）、ＬＷ３（図９Ｃ）、ＬＷ４（図９Ｄ）、ＬＷ５（図９Ｅ）、およびＬＷ６（図９Ｆ）由来のＨ＆Ｅ染色した筋肉の画像を示す。
【図１０】図１０は、ＢＬ６（対照）マウス、および未処理ｍｄｘ（「Ｍｄｘ４ｃｖ  ｕｎｉｎｊ」）マウスと比較した、ｐＹＬ９０（全長マイクロジストロフィンを有するプラスミド）、およびｐＬＷ３（Ｈ４において部分欠失を有するプラスミド）のタンパク質構造の略図である。
【図１１】図１１Ａおよび１１Ｂは、ＢＬ６マウスにおけるジストロフィンと比較した、ＬＷ３処理（図１１Ａ）およびＹＬ９０処理（図１１Ｂ）Ｍｄｘ４ｃｖマウスの発現を示すウエスタンブロットである。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｃは、ＬＷ３（図１２Ａ）およびビンキュリン（図１２Ｂ）の発現を示すウエスタンブロット、およびＬＷ３およびＹＬ９０の発現レベルを定量化するグラフである。
【図１３】図１３は、ジストロフィンおよびジストロフィン結合タンパク質複合体タンパク質について免疫染色したＹＬ９０，ＬＷ３、ＢＬ６、およびＭｄｘ４ｃｖマウスの筋肉の画像である。
【図１４】図１４は、同様の筋肉組織構造を示す、ＬＷ３処理およびＹＬ９０処理マウスのＨ＆Ｅ染色した筋肉の画像を示す。各画像は１匹の独立した動物由来である。
【図１５】図１５Ａおよび１５Ｂは、ＬＷ３処理ｍｄｘ４ｃｖマウス（「ＬＷ３」）、ＹＬ９０処理ｍｄｘ４ｃｖマウス（「ＹＬ９０」）、ＢＬ６（対照）マウス、および未処理ｍｄｘ４ｃｖマウスにおける、比単収縮力（図１５Ａ）、およびストレッチ誘発性損傷（ｓｔｒｅｔｃｈ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄａｍａｇｅ）に対する抵抗（パーセント力低下［ｐｅｒｃｅｎｔ  ｆｏｒｃｅ  ｄｒｏｐ］）（図１５Ｂ）を測定する筋力解析を示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１４】
本開示は、様々な改変形態および代替形態が可能であるが、その特定の実施形態が例として図面に示されており、本明細書で以下に詳細に説明される。しかしながら、特定の実施形態の説明は、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の趣旨および範囲に含まれるすべての改変、均等物、および代替物を網羅するように、本開示を限定することを意図しないことを理解されたい。
【００１５】
本開示の詳細な説明
別段の定義がない限り、本明細書で使用するすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。本明細書に記載されているものと類似または同等の任意の方法および材料を本開示の実施または試験に使用することができるが、好ましい方法および材料を以下に記載する。
【００１６】
本開示は、ジストロフィン異常症の治療のための組成物および方法に関する。
【００１７】
一つの態様では、本開示は、ヒンジ１（Ｈ１）領域、ヒンジ４（Ｈ４）領域、およびそれらの組み合わせの少なくとも１つに対するヒンジ領域改変を含む改変ジストロフィンをコードする核酸に関する。
【００１８】
ヒンジ１（Ｈ１）領域へのヒンジ領域改変は、ジストロフィンタンパク質のＨ１領域の部分欠失およびＨ１領域の完全欠失から選択（ｃｈｏｏｓｅ；または選択［ｓｅｌｅｃｔ］）することができる。Ｈ１領域の特に好適な欠失は、ジストロフィンタンパク質のＨ１領域の完全欠失であってもよい。Ｈ１領域の完全欠失または部分欠失は、参照配列（配列番号：１）としてヒトジストロフィンアミノ酸配列（ＧＩ：Ｍ１８５３３１．１）を使用して、２５３から３２７までのアミノ酸残基を含んでもよい。Ｈ１領域の完全欠失または部分欠失は、参照配列（配列番号：２）としてマウスジストロフィンのアミノ酸配列（ＧＩ：Ｍ６８８５９．１）を使用して、２５３から３２９までのアミノ酸残基を含んでもよい。配列番号：３は、ヒトジストロフィンＨ１領域のアミノ酸配列を提供する。配列番号：４は、マウスジストロフィンＨ１領域のアミノ酸配列を提供する。
【００１９】
ジストロフィンのヒンジ４（Ｈ４）領域へのヒンジ領域改変は、Ｈ４領域の部分欠失であってもよい。Ｈ４領域の部分欠失は、ヒトジストロフィンアミノ酸配列（ＧＩ：Ｍ１８５３３．１）を参照配列参照配列（配列番号：１）として使用して、アミノ酸残基３０１４からアミノ酸残基３１１２にわたるアミノ酸残基の欠失を含んでもよい。一つの実施形態では、Ｈ４領域の部分欠失は、ヒトジストロフィンアミノ酸配列（ＧＩ：Ｍ１８５３３．１）を参照配列（配列番号：１）として使用して、３０４１から３１１２までのアミノ酸残基を含んでもよい。一つの実施形態では、Ｈ４領域の部分欠失は、マウスジストロフィンアミノ酸配列（ＧＩ：Ｍ６８８５９．１）を参照配列（配列番号：２）として使用して、３０３４から３１０５のアミノ酸残基を含んでもよい。配列番号：５は、ヒトジストロフィンのＨ４領域のアミノ酸配列を提供する。配列番号：６は、マウスジストロフィンＨ４領域のアミノ酸配列を提供する。
【００２０】
好適な改変ジストロフィンは、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７の核酸配列を有してもよい。好適な改変ジストロフィンは、配列番号：７、配列番号：９、配列番号：１１、配列番号：１３、配列番号：１５、配列番号：１７と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を有してもよい。
【００２１】
２つの配列の同一性パーセントは、最適な比較のために配列をアラインさせることによって決定することができる。たとえば、第二の核酸配列との最適アラインメントのために、第一の核酸配列の配列にギャップを導入することができる。同じことは、アミノ酸配列の最適アラインメントのために行うことができる。次に、対応する位置のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を比較する。第一の配列の位置が、第二の配列の対応する位置と同じヌクレオチドまたはアミノ酸によって占められている場合、核酸またはアミノ酸はその位置で同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、配列によって共有される同一のヌクレオチドまたはアミノ酸の数の関数である。したがって、同一性パーセント＝［同一ヌクレオチドの数／重複する位置の総数］×１００、または同一性パーセント＝［同一アミノ酸の数／重複する位置の総数］×１００である。配列同一性のパーセンテージは、この式に従って、比較される２つの最適にアラインした配列を比較し、両方の配列で同一の核酸またはアミノ酸が出現する位置の数を決定して一致する位置の数（上記の式の「同一位置の数」）を得て、一致する位置の数を比較する一の総数（上記の式の「重複する位置の総数」）で除し、結果に１００を乗じてパーセント配列同一性を得ることで計算することができる。この比較では、配列は同じ長さでも、異なる長さでもよい。比較ウィンドウを決定するための配列の最適なアラインメントは、スミスおよびウォーターマンのローカルホモロジーアルゴリズム（１９８１）、ニードルマンおよびウンシュのホモロジーアラインメントアルゴリズム（１９７２）、ピアソンおよびリップマンのホモロジーアラインメントアルゴリズム（１９８８）、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ７．０，  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，  ５７５，  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または検査（ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ）によって行うことができる。
【００２２】
好適な改変ジストロフィンタンパク質は、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８のアミノ酸配列を有してもよい。好適なジストロフィンタンパク質は、配列番号：８、配列番号：１０、配列番号：１２、配列番号：１４、配列番号：１６、配列番号：１８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有してもよい。
【００２３】
一つの態様では、本開示は、ヒンジ１（Ｈ１）領域の改変、ヒンジ４（Ｈ４）領域の改変、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つに対するヒンジ領域改変を含む、改変ジストロフィンをコードする核酸を含むベクターに関する。
【００２４】
特に好適なベクター構築物は、発現ベクター構築物である。好適なベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む。好適なウイルスベクターは、レンチウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクターから選択（ｃｈｏｏｓｅ；または選択［ｓｅｌｅｃｔ］）することができる。好適なベクターは、たとえば、アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＶＶ−１）、アデノ随伴ウイルス血清型５（ＡＶＶ−５）、アデノ随伴ウイルス血清型６（ＡＶＶ−６）、アデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＶＶ−８）、アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＶＶ−９）、アデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ７４（ＡＶＶ−ｒｈ７４）、アデノ随伴ウイルス２ｉ８（ＡＶＶ−２ｉ８）、アデノ随伴ウイルスＢ１（ＡＶＶ−Ｂ１）、アデノ随伴ウイルスＣＡＭ１３０（ＡＶＶ−ＣＡＭ１３０）、アデノ随伴ウイルスＭ４１（ＡＶＶ−Ｍ４１）、アデノ随伴ウイルスＭＴＰ（ＡＶＶ５８７ＭＴＰおよびＡＶＶ５８８ＭＴＰ）、アデノ随伴ウイルスＮＰ２２（ＡＶＶ−ＮＰ２２）、アデノ随伴ウイルスＮＰ６６（ＡＶＶ−ＮＰ６６）、アデノ随伴ウイルスＭＹＯ（ＡＶＶＭＹＯ）、アデノ随伴ウイルスチロシン変異体、および祖先アデノ随伴ウイルスベクター（ａｎｃＡＶＶ）等のＡＡＶ血清型を含む。好適なベクターは、プラスミド、リポソーム、エキソソーム、およびナノ粒子も含む。
【００２５】
ベクター構築物の詳細は、当技術分野でよく知られているように、使用される特定の宿主細胞、ならびに発現系の所望の特性によって異なる。たとえば、細菌宿主と適合性のあるプロモーター配列は、企図される核酸セグメントの挿入のための一つまたは複数の便利な制限部位を含むプラスミドベクターに典型的に提供される。好適なプロモーターおよびベクターは、外因的に供給されるナリジクス酸によって誘導可能であるＲｅｃ７プロモーター、外因的に供給されるイソプロピル−β−Ｄ−チオガラクト−ピラノシド（ＩＰＴＧ）、によって誘導可能であるＪＨＥＸ２５（Ｐｒｏｍｅｇａ，  Ｍａｄｉｓｏｎ，  ＷＩから市販されている）、プラスミドベクターｐＫＫ２２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，  Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，  ＮＪから市販されている）に存在し、外因的に供給されるＴＰＴＧによって誘導可能であるｔａｃ（ｔｒｐおよびｌａｃプロモーター／オペレーターのハイブリッド）を含む。他の好適なプロモーターおよびプロモーター／オペレーターは、ａｒａＢ、ｔｒｐ、ｌａｃ、ｇａｌ、Ｔ７等を含む。Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）における生産において、本開示のトロンビン前駆体をコードする核酸は、Ｓ．セレビシエ（Ｓ．  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において作動可能であり、所望の特性（たとえば、誘導可能／抑制解除可能（ｄｅｒｅｐｒｅｓｓｉｂｌｅ）または構成的）を有するプロモーター、たとえばＧＡＬ１−１０、ＰＨＯＳ５、ＰＧＫ１、ＧＤＰ１、ＰＭＡ１、ＭＥＴ３、ＣＵＰ１、ＧＡＰ、ＴＰＩ、ＭＦα１、およびＭＦα２、ならびにハイブリッドプロモーターＰＧＫ／α２、ＴＰＩ／α２、ＧＡＰ／ＧＡＬ、ＰＧＫ／ＧＡＬ、ＧＡＰ／ＡＤＨ２、ＧＡＰ／ＰＨＯ５、ＡＤＨ２／ＰＨＯ５、ＣＹＣ１／ＧＲＥ、およびＰＧＫ／ＡＲＥ、および当該技術分野で既知の他のプロモーターと作動可能に連結して配置される。哺乳動物細胞株の場合、プロモーターは、ウイルスプロモーター／エンハンサー（たとえば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＴＫ）プロモーター、またはサルウイルスプロモーター（たとえば、ＳＶ４０初期または後期プロモーター）、またはアデノウイルス主要後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）またはマウス乳がんウイルス（ＭＭＴＶ）のロングターミナルリピート（ＬＴＲ）、たとえばＬＴＲ、または哺乳類プロモーター、好適には誘導性プロモーター、たとえばメタロチオネインまたはグルココルチコイド受容体プロモーター等であってもよい。筋肉の場合、好適なプロモーターは、内因性および合成の心臓特異的または筋特異的プロモーター（たとえば、ＳＰｃ５−１２、筋肉クレアチンキナーゼ（参照により組み込まれるＷａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００８  Ｎｏｖ；１５（２２）：１４８９−９９を参照のこと）、デスミン、ＭＹＯＤ１、およびＭＹＬＫ２を含む。
【００２６】
構築物は、意図される宿主細胞に適切なさらなる核酸を含んでもよい。たとえば、高等真核生物細胞株（たとえば、脊椎動物および昆虫細胞株）で使用するための発現構築物は、ポリアデニル化部位を含み、イントロンの存在により、多くの系（ｓｙｓｔｅｍ）において核からのｍＲＮＡの搬出（ｅｘｐｏｒｔ）が増加するように、イントロン（イントロンを処理するためのシグナルを含む）を含んでもよい。さらに、宿主細胞で作動可能な分泌シグナル配列を構築物の一部として含めてもよい。他の好適な分泌シグナル配列は、ヒト血清アルブミン、ヒトプロトロンビン、ヒト組織プラスミノーゲン活性化因子、およびプレプロインスリンから得ることができる。発現コンストラクトはまた、他の一般的に使用される制御因子（ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｅｌｅｍｅｎｔ）、たとえば非標的組織／細胞での発現を低下させるマイクロＲＮＡ標的部位を含んでもよい。発現構築物はまた、２つの導入遺伝子、たとえばＩＲＥＳおよび２Ａを発現するために使用する因子を含んでもよい。発現構築物の原核細胞での使用を意図する場合、発現構築物は、合成されたポリペプチドの細胞膜周辺腔への輸送を指示するシグナル配列を含んでもよく、または発現は細胞内に指示されてもよい。構築物はまた、構築物を含む宿主細胞を選択するための選択可能なマーカーであってもよい。選択可能なマーカーは、当技術分野でよく知られている。微生物の発現ベクターに含まれるマーカー遺伝子は、たとえば、宿主としての大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）のアンピシリン耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子；宿主としての酵母のＬｅｕ２遺伝子等であってもよい。動物細胞のための発現ベクターに含まれるマーカー遺伝子は、たとえば、アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ｎｅｏ）遺伝子、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ｄｈｆｒ）遺伝子、グルタミン合成酵素（ＧＳ）遺伝子等であってもよい。
【００２７】
好適な改変ジストロフィンは、本明細書に記載されるように、Ｈ１領域、Ｈ４領域、およびそれらの組み合わせに対する改変を含む。
【００２８】
別の態様では、本開示は、ベクターを含む宿主細胞を対象とし、ここでベクターは、改変ジストロフィンをコードする核酸を含む。
【００２９】
好適な宿主細胞は、たとえば、真核生物宿主細胞および原核生物宿主細胞を含む。好適な真核細胞は、初代培養筋細胞、初代培養心細胞、不死化筋細胞、および不死化心細胞を含む、筋細胞および心細胞を含む。好適な真核細胞は、昆虫細胞、たとえばＳｆ９、および哺乳動物細胞株、たとえばＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、２９３−ＥＢＮＡ、ＢＨＫ、ＨｅＬａ、ＮＩＨ／３Ｔ３等を含む。例示的な酵母宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、クルイベロミセス・ラクティス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シュワンニオミセス・オクシデンタリス（Ｓｃｈｗａｎｎｉｏｍｙｃｅｓ  ｏｃｃｉｄｅｎｔｉｓ）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ）、アークスラ・アデニニボランス（Ａｒｘｕｌａ  ａｄｅｎｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、カンジダ・ボイジニー（Ｃａｎｄｉｄａ  ｂｏｉｄｉｎｉｉ）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）、およびヤロウィア・リポリティカ（Ｙａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）を含む。好適な原核細胞は、たとえば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞、たとえば、例としてＢＬ２１（ＤＥ3）、ＸＬ−1、ＴＢ1、ＪＭ１０３、ＢＬＲ、ｐＵＣ８、ｐＵＣ９、ｐＢＲ３２９、ｐＰＬ、ＳＵＲＥ、ＳＵＲＥＩＩ、ＤＨ５ａ、Ｓｔｂｌ２、Ｓｔｂｌ３、Ｔｏｐ１０およびｐＫＫ２２３−３細胞、およびサルモネラ菌、たとえば、例としてＳ．チフィ（Ｓ．ｔｙｐｈｉ）、Ｓ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、およびＳ．チフィムリウム（Ｓ．ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）と大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のハイブリッドを含む細菌細胞である。
【００３０】
本開示の改変ジストロフィンポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸を発現ベクターに組み込み、得られた発現ベクターで好適な微生物または動物細胞を形質転換し、形質転換された微生物または動物細胞を培養して核酸によってコードされるポリペプチドを産生することにより調製できる。核酸によってコードされるポリペプチドの生産のために、ペプチド合成機を使用してもよい。
【００３１】
好適なベクターは、ウイルスベクターおよび非ウイルスベクターを含む。好適なベクターは、たとえば、ＡＡＶ血清型、たとえば、例として、アデノ随伴ウイルス血清型１（ＡＶＶ−１）、アデノ随伴ウイルス血清型５（ＡＶＶ−５）、アデノ随伴ウイルス血清型６（ＡＶＶ−６）、アデノ随伴ウイルス血清型８（ＡＶＶ−８）、アデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＶＶ−９）、アデノ随伴ウイルス血清型ｒｈ７４（ＡＶＶ−ｒｈ７４）、アデノ随伴ウイルス２ｉ８（ＡＶＶ−２ｉ８）、アデノ随伴ウイルスＢ１（ＡＶＶ−Ｂ１）、アデノ随伴ウイルスＣＡＭ１３０（ＡＶＶ−ＣＡＭ１３０）、アデノ随伴ウイルスＭ４１（ＡＶＶ−Ｍ４１）、アデノ随伴ウイルスＭＴＰ（ＡＶＶ５８７ＭＴＰおよびＡＶＶ５８８ＭＴＰ）、アデノ随伴ウイルスＮＰ２２（ＡＶＶ−ＮＰ２２）、アデノ随伴ウイルスＮＰ６６（ＡＶＶ−ＮＰ６６）、アデノ随伴ウイルスＭＹＯ（ＡＶＶＭＹＯ）、アデノ随伴ウイルスチロシン変異体、および祖先アデノ随伴ウイルスベクター（ａｎｃＡＶＶ）を含む。好適なベクターは、プラスミド、リポソーム、およびナノ粒子も含む。
【００３２】
本明細書に記載されるように、好適な改変ジストロフィンは、ヒンジ１（Ｈ１）領域、ヒンジ４（Ｈ４）領域の改変、およびそれらの組み合わせへの改変を含む。
【００３３】
微生物または動物細胞発現培養物における分泌のための分泌シグナル配列をコードする核酸は、改変ジストロフィンをコードする核酸に含まれてもよい。本開示の改変ジストロフィンは、発現されてもよく、そして培養培地中に分泌されてもよい。好適なシグナル配列は、たとえば、ｐｅｌ  Ｂシグナル；α因子シグナル；イムノグロブリンシグナルＳＧ−１、Ｃ２５シグナル等を含む。特に好適な分泌シグナル配列は、因子Ｖ（ｆａｃｔｏｒ  Ｖ）分泌ペプチドである。
【００３４】
タグのための配列は、本開示の改変ジストロフィンをコードする核酸に含まれてもよい。好適なタグは、精製用タグおよび標識であってもよい。好適な精製用タグは、ヒスチジン、ＨＰＣ４、ＧＳＴ、Ｃ−タグ、ｃ−ｍｙｃ、Ｔ７、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ、ＦＬＡＧ、ＨＡ、ＭＢＰ、ＣＢＰ、インテイン−ＣＢＤ、ストレプトアビジン／ビオチンベースのタグ、ＳＵＭＯ−タグ、およびＨａｌｏＴＡＧタグであってもよい。
【００３５】
制限酵素認識部位をコードする配列は、本開示の改変ジストロフィンをコードする核酸に含まれてもよい。
【００３６】
本明細書に記載されるように、様々な動物細胞を宿主細胞として使用することができる。宿主細胞は、たとえば、リン酸カルシウム法、ＤＥＡＥデキストラン法、たとえば、脂質ベースのトランスフェクション試薬（例：リポフェクチン）による沈殿、ポリエチレングリコールを用いたプロトプラストの融合、エレクトロポレーション、バイオリスティック等を含む任意の既知の方法によって形質転換することができる。トランスフェクションに特に好適な方法はＬＩＰＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）３０００である。
【００３７】
一つの態様では、本開示は、ジストロフィン異常症の治療のための方法に関する。この方法は、改変ヒンジ領域を有する改変ジストロフィンを投与することを含む。本明細書に記載されるように、好適な改変ヒンジ領域は、Ｈ１領域、Ｈ４領域、およびそれらの組み合わせに対する改変を含む。
【００３８】
好適な担体は、水、生理食塩水、等張生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、乳酸リンゲル液等を含む。
【００３９】
改変ジストロフィンを送達するための製剤はまた、他の成分、たとえば界面活性剤、保存剤、および賦形剤を含んでもよい。界面活性剤は、ジストロフィンマイクロ遺伝子の表面誘発凝集（ｓｕｒｆａｃｅ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を低減または防止することができる。好適な界面活性剤脂肪酸エステルおよびアルコール、ならびにポリオキシエチレンソルビトール脂肪酸エステル。量は一般に、製剤の約０．００１〜約４重量％の範囲である。薬学的に許容される防腐剤は、たとえば、フェノール、ｏ−クレゾール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸メチル、ｐ−ヒドロキシ安息香酸プロピル、２−フェノキシエタノール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸ブチル、２−フェニルエタノール、ベンジルアルコール、クロロブタノール、チオメロサール（ｔｈｉｏｍｅｒｏｓａｌ）、ブロノポール、安息香酸、イミド尿素、クロロヘキシジン（ｃｈｌｏｒｏｈｅｘｉｄｉｎｅ）、デヒドロ酢酸ナトリウム、クロロクレゾール、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エチル、塩化ベンゼトニウム、クロルフェネシン（ｃｈｌｏｒｐｈｅｎｅｓｉｎｅ；３ｐ−クロルフェノキシプロパン−１，２−ジオール）およびそれらの混合物を含む。防腐剤は、約０．１  ｍｇ／ｍｌ〜約１０  ｍｇ／ｍｌを含む、約０．１  ｍｇ／ｍｌ〜約２０  ｍｇ／ｍｌの範囲の濃度で存在してもよい。医薬組成物における防腐剤の使用は、当業者によく知られている。便宜上、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，  １９ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９９５を参照する。製剤は、好適なバッファー、たとえば酢酸ナトリウム、グリシルグリシン、ＨＥＰＥＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンエタンスルホン酸）、およびリン酸ナトリウムを含んでもよい。賦形剤は、製剤処方の調製において一般的に使用されるように、等張化のための成分、抗酸化剤、および安定剤を含む。他の不活性成分は、たとえば、Ｌ−ヒスチジン、Ｌ−ヒスチジン一塩酸塩一水和物、ソルビトール、ポリソルベート８０、クエン酸ナトリウム、塩化ナトリウム、およびＥＤＴＡ二ナトリウムを含む。
【００４０】
一つの実施形態では、担体は、薬学的に許容される担体である。当業者に理解されるように、薬学的に許容される担体、および場合により、他の治療成分および／または予防成分は、製剤の他の成分と適合し、そのレシピエントに対し有害ではないという意味で「許容」されなければならない。好適な薬学的に許容される担体溶液は、水、生理食塩水、等張生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、乳酸リンゲル液等を含む。本開示の組成物は、動物、好ましくは哺乳動物、特にヒトに、それ自体が治療薬として、互いの混合物として、または医薬製剤の形態で投与することができ、通常の薬学的に無害な賦形剤および添加剤に加えて、活性成分として有効量の活性剤を含む。
【００４１】
非経口投与（例：注射、たとえば、ボーラス注入または持続注入による）用の製剤は、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量注入、または防腐剤が添加されたおよび添加されていない複数回投与容器で、単位用量形態で提供されてもよい。製剤は、たとえば懸濁液、溶液、または油性または水性媒体中の乳濁液の形態をとってもよく、懸濁剤、安定剤、および／または分散剤などの製剤化剤を含んでもよい。
【００４２】
本開示の製剤の投与に好適な方法は、非経口（例：静脈内（ＩＶ）、筋肉内（ＩＭ）、皮下（ＳＣ）、または腹腔内（ＩＰ））経路によるものであり、通常投与される製剤は、許容される希釈剤、担体および／またはアジュバントと組み合わせた有効量の製品を含む。標準希釈剤、たとえばヒト血清アルブミンは、本明細書に記載される標準担体と同様に、本開示の医薬組成物のために企図される。
【００４３】
本明細書に記載されるように、「有効量」、「治療上有効量」、「予防上有効量」、および「診断的有効量」は、本明細書で使用される場合、「有効量」、「治療有効量」、「予防有効量」および「診断有効量」は、投与後に所望の生物学的反応を誘発するのに必要な本開示の改変ジストロフィンの量である。改変ジストロフィンの量は、改変ジストロフィンが改変ジストロフィンをコードする核酸（発現構築物および／またはベクターにパッケージ化されることを含む）として投与されるか、修飾ジストロフィンタンパク質として投与されるかなどの形態に依存する。
【００４４】
有効量は、使用される改変ジストロフィンおよび治療される特定の疾患、障害、または状態に応じて実質的に変化すると予想される。用量は、キログラムあたり約１０１０のベクターゲノムからキログラムあたり約１０１４のベクターゲノムの範囲であってもよい。本開示の方法での使用に好適な用量は、たとえば、個体の年齢および体重、特定のジストロフィン異常症、ジストロフィン異常症の重症度、組成物の性質、投与経路、およびそれらの組み合わせを含む多くの要因に依存する。最終的に、好適な用量は、当業者、たとえば、医師、獣医、科学者、ならびに他の医学および研究の専門家によって容易に決定することができる。たとえば、当業者は、所望の治療成績（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ）または治療成績（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔ）に到達するまで増加させることができる低用量から始めることができる。あるいは、当業者は、所望の治療成績（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ）または治療成績（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔ）を達成するために必要な最小用量に到達するまで減少させることができる高用量から始めることができる。
【００４５】
オフターゲット効果は、ＭＣＫ（たとえば、ｍｉｎｉＭＣＫ、ＣＫ５、ＣＫ６、ＣＫ７、ＣＫ８、ＣＫ８ｅ、ＣＫ９およびＭＨＣＫ７）遺伝子、ミオグロビン遺伝子およびデスミン遺伝子、心臓プロモーター（たとえば、ｃＴＮ１、ＮＣＸ１、ＭＬＣ−２ｖ、ａｌｐｈａ−１ｃ、ｍｉｎｉ−ａｌｐｈａＭＨＣ）、Ｐｉｔｘ３、骨格筋アルファアクチン、および合成プロモーター（たとえば、ＳＰｃ５−１２、ＳＫ−ＣＲＭ１、ＳＫ−ＣＲＭ２、ＳＫ−ＣＲＭ３、ＳＫ−ＣＲＭ４、ＳＫ−ＣＲＭ５、ＳＫ−ＣＲＭ６、ＳＫ−ＣＲＭ７、ＳＫ−ＣＲＭ−Ｄｅｓ、ＳＫ−ＣＲＭ−ＳＰｃ５−１２、ＳＫ４４８、およびＳＰ１−２８）に由来するもの等の筋特異的調節カセットを使用して最小化することができる。遺伝子発現は、より強力な調節カセットを使用し、コドン最適化され、機能的に強化されたｃＤＮＡを使用して向上できる。
【００４６】
本開示の製剤は、それを必要とする対象に投与することができる。本明細書で使用される場合、「対象」（「個体」および「患者」とも互換的に呼ばれる）は、ヒトおよび非ヒト動物を含む動物を指す。したがって、本明細書に開示される組成物および方法は、ヒトおよび獣医の用途、特にヒトおよび動物の医療用途に使用することができる。好適な対象は、ヒト、コンパニオンアニマル（たとえば、イヌ、ネコ）、ウシ、ウマ、マウス、ラット、ウサギ、霊長類、およびブタ、好ましくはヒト患者を含む温血哺乳動物宿主を含む。
【００４７】
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるジストロフィン異常症を治療するための方法に関する。本方法は、それを必要とする対象に改変ジストロフィンを投与することを含む。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「それを必要とする対象」（本明細書では「それを必要とする患者」と互換的に使用される）は、特定の疾患、障害、または状態になりやすい、またはそのリスクがある対象を指す。本明細書に開示される方法は、ジストロフィン異常症にかかりやすいか、またはジストロフィン異常症のリスクが高い対象のサブセットで使用することができる。本開示の方法の実施形態の一部は、特定された対象の特定のサブセットまたはサブクラス（すなわち、本明細書に記載の一つまたは複数の特定の状態に対処する際に支援（ａｓｓｉｓｔａｎｃｅ）を「必要としている」対象のサブセットまたはサブクラス）に関するため、すべての対象が、特定の疾患、障害または状態について本明細書に記載されている対象のサブセットまたはサブクラスに含まれるわけではない。一つの実施形態では、対象は、ジストロフィン異常症を有するか、または有すると疑われる。一つの実施形態では、対象は、ジストロフィン異常症の保因者である。本明細書で使用する場合、ジストロフィン異常症の「保因者」（または「遺伝性保因者」）は、ジストロフィン異常症を引き起こすことが知られているまたは考えられている遺伝的形質または突然変異の劣性アレルを受け継いだ対象を指す。保因者は、ジストロフィン異常症の症状を示さない場合もあれば、軽度の症状、たとえば筋力低下、けいれん、心筋症、およびそれらの組み合わせを示す場合もある。
【００４９】
ジストロフィン異常症は、ジストロフィン遺伝子の突然変異によって引き起こされるか、またはそれに起因する疾患を含む。好適なジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、Ｘ連鎖性拡張型心筋症（ＸＬＤＣ）、およびそれらの保因者を含む。
【００５０】
本開示の製剤の投与のための好適な方法は、本明細書に記載される非経口（たとえば、ＩＶ、ＩＭ、ＳＣ、またはＩＰ）経路による。
【００５１】
別の態様では、本開示は、それを必要とする対象におけるジストロフィン異常症の治療のための方法に関する。方法は、改変ジストロフィンを投与することを含み、ここで改変ジストロフィンタンパク質は、ヒンジ１（Ｈ１）領域、ヒンジ４（Ｈ４）領域、およびそれらの組み合わせのうちの少なくとも一つに対するヒンジ領域改変を含む。
【００５２】
ジストロフィン異常症は、ジストロフィン遺伝子の突然変異によって引き起こされるか、またはそれに起因する疾患を含む。本明細書に記載されるように、好適なジストロフィン異常症は、デュシェンヌ型筋ジストロフィー（ＤＭＤ）、ベッカー型筋ジストロフィー（ＢＭＤ）、Ｘ連鎖性拡張型心筋症（ＸＬＤＣ）、およびそれらの保因者を含む。
【００５３】
本開示の製剤の投与のための好適な方法は、本明細書に記載される非経口（例えば、ＩＶ、ＩＭ、ＳＣ、またはＩＰ）経路による。
【００５４】
改変ジストロフィンタンパク質は、本明細書中に記載されるような担体を含む組成物として送達できる。特に好適な担体はポリマーであってもよい。
【００５５】
本開示の方法での使用のための改変ジストロフィンタンパク質の好適な用量は、たとえば、個体の年齢および体重、特定のジストロフィン異常症、ジストロフィン異常症の重症度、組成物の性質、投与経路、およびそれらの組み合わせを含む多くの要因に依存する。最終的に、好適な用量は、当業者、たとえば、医師、獣医、科学者、ならびに他の医学および研究の専門家によって容易に決定することができる。たとえば、当業者は、所望の治療成績（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ）または治療成績（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔ）に到達するまで増加させることができる低用量から始めることができる。あるいは、当業者は、所望の治療成績（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｏｕｔｃｏｍｅ）または治療成績（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ  ｒｅｓｕｌｔ）を達成するために必要な最小用量に到達するまで減少させることができる高用量から始めることができる。
【００５６】
本開示の方法は、長い相互作用半減期を有するいくつかの相互作用の単離、および同定のために使用できるが、有利には、この方法はまた、弱く相互作用する分子の単離を可能にする。
【００５７】
本開示は、以下の非限定的な実施例を考慮すると、より完全に理解されるであろう。
【実施例】
【００５８】
材料および方法
ＬＷ１およびＬＷ３プラスミドの構築、ならびにｍｄｘ４ｃｖマウスへの筋肉内注射。元のプラスミドは、ＹＬ９０を初期のバックボーンとして使用し、ＰＣＲをベースにした欠損戦略（ｄｅｌｅｔｉｏｎ  ｓｔｒａｔｅｇｙ）を使用して作成する。ＹＬ９０は、Ｌａｉ，  Ｔｈｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  １１９：６２４−３５）に記載されるように調製した。ヒンジ１領域が完全欠失したＹＬ９０（ＬＷ１）、およびＨ４領域が部分欠失したＹＬ９０（ＬＷ３）を調製した。プラスミドをシークエンシングおよび診断消化（ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）によって確認した。ＬＷ１、ＬＷ３、またはＹＬ９０を運搬するアデノ随伴ウイルス血清型９（ＡＡＶ−９）を、これらのプラスミドを用いて、マウスにおける筋肉内注射のために作成した。すべての動物実験は、施設内動物管理使用委員会によって承認され、ＮＩＨガイドラインに準拠していた。ｍｄｘ４ｃｖマウスの前脛骨筋（ＴＡ）に、３ヶ月齢のマウスで１Ｅ１２ｖｇ／筋肉の用量で注射した。ＴＡの収縮特性は、注射後３ヶ月で評価した。
【００５９】
ＴＡ筋の機能評価。ＴＡ筋の筋力は、発明者らの発表したプロトコル（Ｈａｋｉｍ，  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７０９：７５−８９；Ｈａｋｉｍ，  Ｗａｓａｌａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ：  ｅ５０１８３）に従ってｉｎ  ｓｉｔｕで測定した。特に、２５  ｍｇ／ｍｌケタミン、２．５  ｍｇ／ｍｌキシラジン、および０．５  ｍｇ／ｍｌアセトプロマジンを２．５  μｌ／ｇ体重で含む混合物を腹腔内注射して、マウスに麻酔した。ＴＡ筋と坐骨神経を露出した。マウスを、フットプレート装置のカスタム設計された熱制御プラットフォームに移動した（Ｈａｋｉｍ，  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７０９：  ７５−８９；  Ｈａｋｉｍ，  Ｗａｓａｌａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ：  ｅ５０１８３）。平衡化の５分後、坐骨神経を１Ｈｚ（２０Ｖ、１，０００ｍＡ）の周波数で刺激し、２．０〜６．０ｇの静止張力でカスタムメイドの２５Ｇプラチナ電極を使用して単収縮筋収縮（ｔｗｉｔｃｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ｃｏｎｔｒａｃｔｉｏｎ）を誘発した。ＴＡ筋の筋長（Ｌｍ）は、電子デジタルキャリパー（Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｗａｌｔｈａｍ，  ＭＡ，  ＵＳＡ）を使用して、最大の単収縮力を生成する静止張力で測定した。この長さを、至適筋長（Ｌ０）として定義した。単収縮力を１Ｈｚの周波数で測定した後、５０、１００、１５０、および２００Ｈｚで力収縮頻度アッセイ（ｆｏｒｃｅ  ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ  ａｓｓａｙ）を行い、各収縮間に１分間休止した。比筋力は、最大等尺性収縮力（ｉｓｏｍｅｔｒｉｃ  ｔｅｔａｎｉｃ  ｆｏｒｃｅ）を筋断面積（ＣＳＡ）で割ることによって決定した。ＣＳＡは、以下の式、  ＣＳＡ＝（グラム単位の筋肉量）／［（ｃｍ単位の至適繊維長）×（ｇ／ｃｍ３単位の筋肉密度）］  に従って計算した。計算には１．０６  ｇ／ｃｍ３の筋肉密度を使用した。至適筋長は０．６０×Ｌ０と計算された。０．６０は、ＴＡ筋のＬ０に対する繊維長の比率を表す。収縮力測定後、筋肉を５分間休ませ、その後、以前に公開されたプロトコル（Ｈａｋｉｍ，  Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１１  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ７０９：  ７５−８９；  Ｈａｋｉｍ，  Ｗａｓａｌａ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ：  ｅ５０１８３）に従って、１０ラウンドの伸張性収縮に供した。簡単に言うと、強縮の後に、ＴＡ筋が０．５Ｌ０／秒の速度で１０％Ｌ０伸ばされた。伸張性収縮サイクルの間に筋肉を１分間休ませた。伸張性収縮の各ラウンド後の力低下のパーセンテージを記録した。３０５Ｃ−ＬＲデュアルモードサーボモータートランスデューサー（Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ．）を使用して、筋収縮および収縮力、および伸張性収縮プロファイルを測定した。データは、Ｌａｂ  ＶｉｅｗベースのＤＭＣおよびＤＭＡプログラム（Ｖｅｒｓｉｏｎ  ３．１２，  Ａｕｒｏｒａ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，  Ｉｎｃ.）を使用して処理した。
【００６０】
形態学的研究。一般組織学（ｇｅｎｅｒａｌ  ｈｉｓｔｏｌｏｇｙ）は、ヘマトキシリンおよびエオシン（ＨＥ）染色によって調べた。ジストロフィンの発現は、ＭＤＡ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｌｏｃａｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗｏｌｆｓｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ＲＪＡＨ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｏｓｗｅｓｔｒｙ，  ＵＫ  （ｗｗｗ．ｇｌｅｎｎｍｏｒｒｉｓ．ｏｒｇ．ｕｋ／ｍａｂｓ．ｈｔｍ）から入手した、エクソン４４に特異的なＭＡＮＥＸ４４Ａジストロフィン抗体（１：１００；クローン５Ｂ２）を用いた免疫蛍光染色により評価した。スライドは、Ｎｉｋｏｎ  Ｅ８００蛍光顕微鏡を使用して同じ露出設定で見た。顕微鏡写真はＱｉｍａｇｅ  ＲＥｔｉｇａ  １３００カメラで撮影した。
【００６１】
ウエスタンブロット。ＴＡ筋溶解物は、記載されているように調製した（Ｌｉ，  Ｌｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  ２００９  Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  １８：  １２０９−２０）。簡単に言うと、組織を液体窒素で瞬間凍結した。凍結した組織サンプルを液体窒素中で微粉に粉砕した後、１０％ＳＤＳ、５ｍＭ  ＥＤＴＡ、ｐＨ６．８の６２．５  ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、およびプロテアーゼ阻害剤混合物（Ｒｏｃｈｅ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  ＩＮ）を含むバッファーで均質化した。粗溶解物を９５℃で３分間加熱し、氷上で２分間冷却した後、１４，０００ｒｐｍで３分間遠心分離した。上清を全筋肉溶解物として収集した。ＤＣタンパク質アッセイキット（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，  Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，  ＣＡ）を使用してタンパク質濃度を測定し、１００  μｇのタンパク質を使用して、レーンごとにウエスタンブロットでロードした。ジストロフィンは、ＭＤＡ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  ｌｏｃａｔｅｄ  ａｔ  ｔｈｅ  Ｗｏｌｆｓｏｎ  Ｃｅｎｔｒｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌａｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ，  ＲＪＡＨ  Ｏｒｔｈｏｐａｅｄｉｃ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ，  Ｏｓｗｅｓｔｒｙ，  ＵＫから入手した、エクソン１０−１１（１：１００；クローン７Ｇ５、ＩｇＧ１）に特異的なＭＡＮＥＸ１０１１Ｄジストロフィン抗体で検出した。ウエスタンブロット定量化は、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｔｕｄｉｏ  Ｖｅｒｓｉｏｎ  5．０．２１ソフトウェアを使用して実行した。それぞれのタンパク質バンドの相対強度を、同じブロットの対応するローディングコントロールに対して正規化した。
【００６２】
実施例で使用されるように、ｐＸＸは、マイクロジストロフィンを含むプラスミドを指す。したがって、ｐＹＬ９０は全長のマイクロジストロフィンを含むプラスミドを指す。ｐＬＷ１は、ΔＨ１マイクロジストロフィン（Ｈ１の完全欠失）を含むプラスミドを指す。ｐＬＷ２は、Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３１１２が完全欠失したプラスミドを指す。ｐＬＷ３は、Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３０５５が部分欠失したプラスミドを指す。ｐＬＷ４は、Ｈ４のアミノ酸残基３０９３〜３１１２が部分欠失したプラスミドを指す。ｐＬＷ５は、Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３０５５および３０９３〜３１１２が欠失し、Ｄｐ４２７のＷＷドメインは保持されていたプラスミドを指す。および、ｐＬＷ６は、Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３０７５および３０９３〜３１１２が欠失し、Ｄｐ７１に存在するアミノ酸残基３０７６〜３０９２の部分的なＷＷドメインが保持されていたプラスミドを指す。実施例で使用されるように、ＸＸはマイクロジストロフィンを含むＡＡＶウイルスを指す。したがって、ＹＬ９０は全長のマイクロジストロフィンを有するＡＡＶウイルスを指す。ＬＷ１は、ΔＨ１マイクロジストロフィン（Ｈ１の完全欠失）を伴うＡＡＶウイルスを指す。ＬＷ２は、Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３１１２が完全欠失したＡＡＶウイルスを指す。ＬＷ３は、Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３０５５が部分欠失したＡＡＶウイルスを指す。ＬＷ４は、Ｈ４のアミノ酸残基３０９３〜３１１２が部分欠失したＡＡＶウイルスを指す。ＬＷ５は、Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３０５５および３０９３〜３１１２が欠失し、Ｄｐ４２７のＷＷドメインは保持されていたＡＡＶウイルスを指す。および、ＬＷ６は、Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３０７５および３０９３〜３１１２が欠失し、Ｄｐ７１に存在するアミノ酸残基３０７６〜３０９２の部分的なＷＷドメインが保持されていたＡＡＶウイルスを指す。
【００６３】
実施例１
本実施例では、マイクロジストロフィンにおけるヒンジ１領域に対する改変の効果を測定した。
【００６４】
特に、全長マイクロジストロフィン（ｐＹＬ９０）を親マイクロ遺伝子として使用した。ｐＹＬ９０のヒンジ１を完全に削除して、Ｈ１なしのｐＬＷ１マイクロジストロフィン（マイクロジストロフィン内のＨ１が完全欠失したプラスミド；ΔＨ１マイクロジストロフィン）を作成しました。図１は、ｐＹＬ９０およびｐＬＷ１のタンパク質構造を示す。
【００６５】
両方のマイクロジストロフィンを、ＣＭＶプロモーターの制御下でＡＡＶ９アデノウイルスベクターにパッケージ化して、ＡＡＶウイルスＹＬ９０およびＡＡＶウイルスｐＬＷ１を作成し、そして１ｅ１２ｖｇ／筋肉の投薬量で３ヶ月齢のオスのｍｄｘ４ｃｖマウスの前脛骨筋に注射した。筋力分析、免疫学的染色、および組織学的染色は、注射後３ヶ月で行った。
【００６６】
図２Ａおよび２Ｂに示されるように、ＬＷ１（ｐＬＷ１プラスミドを有するＡＡＶウイルスを意味する）の発現（図２Ａ）は、ＹＬ９０（ｐＹＬ９０プラスミドを有するＡＡＶウイルスを意味する）の発現（図２Ｂ）と同様であった。
【００６７】
ＢＬ６対照マウス、Ｍｄｘ４ｃｖマウス（ジストロフィン欠損）、ＬＷ１を注射したＭｄｘ４ｃｖマウス、およびＹＬ９０を注射したＭｄｘ４ｃｖマウス由来の筋組織を、ジストロフィン、ジストロブレビン（ｄｙｓｔｒｏｖｒｅｖｉｎ）、α−シントロフィン、β−サルコグリカン、およびβ−ジストログリカンに対する抗体で免疫染色し、ジストロフィン結合タンパク質複合体を視覚化した。図３に示すように、ＬＷ１とＹＬ９０は同様の染色パターンを示した。両方のタンパク質はＤＧＣも回復しました（図３）。ＬＷ１処理およびＹＬ９０処理マウスは、類似の筋肉組織学を示した（図４）。ＬＷ１処理（「ＬＷ１  ｉｎｊ」）およびＹＬ９０処理（「ＹＬ９０  ｉｎｊ」）マウスは、ＢＬ６マウスと同様の比単収縮力（図５Ａ）および比力−収縮頻度（図５Ｂ）を有していた。ＬＷ１処理（「ＬＷ１  ｉｎｊ」）およびＹＬ９０処理（「ＹＬ９０  ｉｎｊ」）マウスは、ストレッチ誘発性損傷（ｓｔｒｅｔｃｈ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｄａｍａｇｅ）（パーセント力低下）に対して同様の耐性を示した（図５Ｃ）。これらの結果は、ＬＷ１およびＹＬ９０がジストロフィン欠損マウスの筋力の回復に同等に効果的であることを示す。
【００６８】
実施例２
本実施例では、マイクロジストロフィンのヒンジ４領域に対する改変の効果を測定した。
【００６９】
上記の実施例１と同様に、全長マイクロジストロフィン（ｐＹＬ９０）を親マイクロ遺伝子として使用した。図６は、ｐＹＬ９０（全長マイクロジストロフィンを有するプラスミド）、ｐＬＷ２（Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３１１２が還元欠失したプラスミド）、ｐＬＷ３（Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３０５５が部分欠失したプラスミド）、ｐＬＷ４（Ｈ４のアミノ酸残基３０９３〜３１１２が部分欠失したプラスミド）、ｐＬＷ５（Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３０５５および３０９３〜３１１２が欠失し、Ｄｐ４２７のＷＷドメインは保持されていたプラスミド）、ｐＬＷ６（Ｈ４のアミノ酸残基３０４１〜３０７５および３０９３〜３１１２が欠失し、Ｄｐ７１に存在するアミノ酸残基３０７６〜３０９２の部分的なＷＷドメインが保持されていたプラスミド）のタンパク質構造を図示する。
【００７０】
図７に示されるように、免疫染色は、ＬＷ２、ＬＷ４、ＬＷ５およびＬＷ６ではなく、ＬＷ３の正常な筋鞘局在を明らかにした。ＬＷ２、ＬＷ４、ＬＷ５およびＬＷ６は、異なるレベルの細胞質凝集体形成をもたらした。図８Ａ〜８Ｂは、ＹＬ９０（図８Ａ）、ＬＷ２（図８Ｂ）、ＬＷ３（図８Ｃ）、ＬＷ４（図８Ｄ）、ＬＷ５（図８Ｅ）、およびＬＷ６（図８Ｆ）のウエスタンブロット評価を示す。図８Ｄに示されるように、ＬＷ４は発現の低下を示した。図８Ｆに示されるように、ＬＷ６マイクロジストロフィンは検出されなかった。ＹＬ９０（図８Ａ）、ＬＷ２（図８Ｂ）、ＬＷ３（図８Ｃ）、およびＬＷ５（図８Ｅ）は、同様のレベルの発現を示した。
【００７１】
図９Ａ〜９Ｆ（筋肉のＨ＆Ｅ染色）に示されるように、ＬＷ３（図９Ｃ）のみがＹＬ９０（図９Ａ）と同様の組織構造を示した。Ｈ＆Ｅ染色された筋肉の筋組織構造は、ＬＷ２（図９Ｂ）、ＬＷ４（図９Ｄ）、ＬＷ５（図９Ｅ）、およびＬＷ６（図９Ｆ）で悪化した。
【００７２】
ＬＷ３およびＹＬ９０マイクロジストロフィン（図１０）をＡＡＶ−９にパッケージ化し、３ヶ月齢のオスｍｄｘ４ｃｖマウスの前脛骨筋に１ｅ１２ｖｇ／筋肉で注射した。注射後３ヶ月で筋力分析、免疫学的および組織学的染色を行った。
【００７３】
図１１Ａおよび１１Ｂに示されるように、ＬＷ３発現（図１１Ａ）は、ＹＬ９０発現（図１１Ｂ）よりも高く出現した。図１１Ａおよび１１Ｂはまた、ＢＬ６マウスにおいてジストロフィンを示し、ＬＷ３またはＹＬ９０のいずれも注射されなかった（「Ｍｄｘ４ｃｖ  ｉｎｉｎｊ」レーン）Ｍｄｘ４ｃｖマウスにおいてジストロフィンを示さなかった。図１２Ａは、同じブロット上のＬＷ３またはＹＬ９０サンプルを用いたウエスタンブロットであり、ＬＷ３の発現がＹＬ９０の発現よりわずかに低かったことを示している。図１２Ｂは、ローディングコントロールを示すためにビンキュリンを検出するウエスタンブロット分析である。図１２Ｃは、ＬＷ３の発現がＹＬ９０の発現よりわずかに低かったが、統計的に有意ではなかったことを示している。
【００７４】
図１３に示されるように、ＬＷ３およびＹＬ９０は、免疫染色された筋肉において同様の染色パターンを示した。ＬＷ３およびＹＬ９０の両方がＤＧＣを回復した。ＬＷ３処理マウスおよびＹＬ９０処理マウスは、同様の筋肉組織構造を示した（図１４）。図１５に示されるように、ＬＷ３処理は、ＹＬ９０処理より高い筋力（比単収縮力［ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｗｉｔｃｈ  ｆｏｒｃｅ］および比収縮力［ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｔｅｔａｎｉｃ  ｆｏｒｃｅ］）をもたらした。
【００７５】
これらの結果は、本開示の方法および組成物を、ジストロフィン異常症を治療するために使用できることを示した。本開示のマイクロジストロフィンおよび方法は、ジストロフィン異常症を治療するための代替マイクロジストロフィンを提供する。
【００７６】
上記を考慮すると、本開示のいくつかの利点が達成され、他の有利な結果が得られることを理解するであろう。本開示の範囲から逸脱することなく上記の方法に様々な変更を加えることができるので、上記の記載に含まれ、添付の図面に示されるすべての事項は、限定ではなく例示として解釈されることを意図する。
【００７７】
本開示の要素またはその様々なバージョン、実施形態もしくは態様を紹介するとき、冠詞「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および「ｓａｉｄ」は、一つまたは複数の要素が存在することを意味することを意図する。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、および「有する」は、包括的であることを意図し、列挙された要素以外の追加の要素があり得ることを意味する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
2021520196.tif 000009
【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
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【図８Ｅ】
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【図８Ｆ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図９Ｄ】
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【図９Ｅ】
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【図９Ｆ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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