(57)【要約】  アルポート症候群に罹患している対象の腎疾患を治療または予防する方法、および慢性腎臓疾患を治療または予防する方法が、本明細書に開示される。本方法は、それを必要とする対象に有効量のヒトアポリポタンパク質Ｍを投与することを含む。【選択図】図３Ａ、図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｄ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象の慢性腎臓疾患を治療または予防する方法であって、前記対象の慢性腎臓疾患を治療するのに有効な量でヒトアポリポタンパク質Ｍを投与することを含む、方法。
【請求項２】
アルポート症候群に罹患 している対象の腎疾患を治療または予防する方法であって、前記対象の前記腎疾患を治療するのに有効な量でヒトアポリポタンパク質Ｍを前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項３】
慢性腎臓疾患の治療または予防において使用するためのヒトアポリポタンパク質Ｍであって、前記慢性腎臓疾患を治療するのに有効な量および投与計画で投与される、ヒトアポリポタンパク質Ｍ。
【請求項４】
アルポート症候群に罹患している対象の腎疾患の治療または予防において使用するためのヒトアポリポタンパク質Ｍであって、前記腎疾患を治療するのに有効な量および投与計画で投与される、ヒトアポリポタンパク質Ｍ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、アルポート症候群に罹患している対象の慢性腎臓病および腎疾患を治療するための材料、および方法に関する。
【０００２】
関連出願、および電子的に提出された資料の参照による組み込みへの相互参照
本出願は、２０１８年７月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６９７，５５６号の利益を主張し、その全内容は参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【０００３】
本開示の一部である配列表は、明細書と同時にテキストファイルとして提出される。配列表を含むテキストファイルの名称は、「５３１８８＿Ｓｅｑｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」である。配列表は２０１９年７月２日に作成され、サイズは４，１４２バイトである。配列表の主題は、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
アルポート症候群は、３つのＩＶ型コラーゲン遺伝子である、ＣＯＬ４Ａ３、ＣＯＬ４Ａ４、およびＣＯＬ４Ａ５の変異によって引き起こされる遺伝性疾患である。この病気は、進行性腎不全、高血圧、タンパク尿、心血管疾患のリスクの大幅な増加、聴覚と視力の喪失を特徴としている。アルポート症候群の現在の治療法は、症状の緩和を目的としており、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬またはアンジオテンシン受容体拮抗薬（ＡＲＢ）が含まれる。このような治療は、腎臓機能の喪失を遅らせるか、または血圧を管理するだけであり、疾患の他の影響を治療または予防するものではない。
【０００５】
アルポート症候群および他のＣｏｌ４関連疾患に関連する腎機能障害の治療オプション、ならびに一般的な慢性腎臓病の治療オプションの必要性が残っている。
【発明の概要】
【０００６】
一態様において、本明細書に記載されているのは、対象の慢性腎臓病を治療または予防する方法である。本方法は、対象の慢性腎臓病を治療するのに有効な量でヒトアポリポタンパク質Ｍ（ｒｈＡＰＯＭ）を対象に投与することを含む。
【０００７】
別の態様において、本明細書に記載されているのは、アルポート症候群に罹患している対象の腎疾患を治療または予防する方法である。本方法は、対象の腎疾患を治療するのに有効な量で組換えヒトアポリポタンパク質Ｍを対象に投与することを含む。
【０００８】
さらに別の態様において、本明細書に記載されるのは、慢性腎臓病またはアルポート症候群に関連する腎疾患の治療または予防において使用するためのヒトアポリポタンパク質Ｍであり、ヒトアポリポタンパク質Ｍは、慢性腎臓病もしくは腎疾患を治療または予防するのに有効な量および投与計画で投与される。
【０００９】
本明細書で別段の定義がない限り、本願に関連して使用される科学的および技術的用語は、当業者によって一般的に理解される意味を有するものとする。さらに、文脈上別段の必要がない限り、単数形には複数形が含まれ、複数形には単数形が含まれるものとする。用語「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する」は、別途注記のない限り、開放型用語として解釈されるべきである。本発明の態様が特徴を「含むこと」として記載される場合、実施形態も特徴「からなる」または「から本質的になる」と企図される。特に要求されない限り、本明細書中に提供される任意のおよびあらゆる例、または例示的な言葉（例えば「など」）の使用は、本開示をより上手く説明することを意図したものにすぎず、本開示の範囲に限定をもたらすものではない。本明細書における言語は、本開示の実施に不可欠な任意の非請求要素を示すと解釈されるべきではない。動作例を除いて、または他に示されない場合、本明細書で使用される成分または反応条件の量を表すすべての数字は、「約」という用語は関連する分野の当業者によって解釈されるため、「約」という用語によってすべての場合に修飾されると理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ−１Ｃ】図１Ａ〜図１Ｃ：Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの糸球体におけるＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１、およびＡＰＯＭの発現低下。野生型コントロール（ＷＴ）と比較した場合、Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウス（ＫＯ）から分離された糸球体におけるＡＢＣＡ１（Ａ）、ＡＢＣＧ１（Ｂ）、およびＡＰＯＭ（Ｃ）の発現低下を示す定量的リアルタイムＰＣＲによるｍＲＮＡ発現の棒グラフ解析。＊＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図２Ａ−２Ｈ】図２Ａ〜図２Ｈ：組換えヒトＡＰＯＭ（ｒｈ−ＡＰＯＭ）によるＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの処置は、ＡＰＯＭ、Ｓ１Ｐ、およびトリグリセリドの正常な血清レベル、ならびに腎皮質および血清中のＳ１Ｐ含有量を回復させる。（Ａ）ＡＰＯＭ発現の有意な低下を示す腎皮質におけるＡＰＯＭ発現レベルの棒グラフ解析。Ｔ検定、＊ｐ＜０．０５（Ｂ、Ｃ）Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスは、ＡＰＯＭの血清レベル（Ｂ）および尿（Ｃ）レベルの有意な増加を示すが、ｒｈ−ＡＰＯＭによるＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの処置はＡＰＯＭの正常な血清および尿レベルを回復させる。Ｔ検定（血清）、＊ｐ＜０．０５、Ｆ検定尿：＊＊＊ｐ＜０．０００１。（Ｄ）ｒｈ−ＡＰＯＭによるＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの処置は、血清トリグリセリド含有量の生理学的血清レベルを回復させる。Ｔ検定、＊ｐ＜０．０５。（Ｅ、Ｆ）ｒｈ−ＡＰＯＭによるＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの処置がＳ１Ｐの生理学的レベルを回復させることを示す腎皮質におけるＳ１Ｐ発現（Ｅ）およびＳ１Ｐ血清含有量（Ｆ）の棒グラフ解析。＊ｐ＜０．０５。（Ｇ）尿ＡＰＯＭレベルがアルブミン／クレアチニン比と正の相関関係にあることを示す相関分析、Ｒ２＝０．８、ｐ＜０．０１。（Ｈ）腎臓ＡＰＯＭレベルが血清クレアチニンレベルと負の相関関係にあることを示す相関分析。Ｒ２＝０．８、ｐ＜０．０５。
【図３Ａ−３Ｆ】図３Ａ〜図３Ｆ：組換えヒトＡＰＯＭ（ｒｈ−ＡＰＯＭ）によるＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの処置は腎不全から保護する。（Ａ）Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスのｒｈ−ＡＰＯＭ処置は、未処置のＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスと比較して、アルブミン／クレアチニン比の有意な減少をもたらす。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。（Ｂ）血清クレアチニンレベルは、コントロールと比較してＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスで有意に増加する。ｒｈ−ＡＰＯＭ処置は、Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの血清クレアチニンレベルを大幅に減少させる。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｃ）血清（血中尿素窒素）ＢＵＮレベルは、コントロールと比較してＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスで有意に増加するが、ｒｈ−ＡＰＯＭ処置は、Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの血清ＢＵＮレベルの増加を防ぐ。＊＊ｐ＜０．０１。（Ｄ）Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスでは、コントロールと比較して体重が大幅に減少する。ｒｈ−ＡＰＯＭ処置は、Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの体重減少を防ぐ＊＊ｐ＜０．０１。（Ｅ）ｒｈ−ＡＰＯＭによるＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの処置は、ＷＴ、ＷＴ＋ｒｈＡＰＯＭ、および未処置のＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスで観察される糸球体硬化症、尿細管萎縮、および拡張の発症から保護する。過ヨウ素酸−シッフ染色（ＰＡＳ）染色された凍結腎臓切片の代表的な画像を示す。（Ｆ）Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯマウスがＷＴマウスと比較して有意に増加したメサンギウム拡大スコアを示し、ｒｈＡＰＯＭによるＣｏｌ４ａ３  ＫＯマウスの処置がメサンギウム拡大スコアを有意に減少させることを示す、メサンギウム拡大スコアの棒グラフ解析。Ｔ検定、＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図４】ヒトＡＰＯＭアミノ酸配列。
【図５】ヒトＡＰＯＭ核酸配列。
【図６Ａ−６Ｎ】図６Ａ〜図６Ｎ：ＡＰＯＭは、ヒト有足細胞およびヒト腎臓生検で発現され、Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯマウスにおけるＡＰＯＭ欠損は、Ｓ１Ｐ蓄積およびＣシグナル伝達の活性化に関連している。（Ａ）ＡＰＯＭがヒト有足細胞およびヒト腎臓生検で発現されることを示すＡＰＯＭ発現のＰＣＲ分析。Ｐ１、Ｐ２−ヒト有足細胞株；Ｈ−ＨｅｐＧ２細胞（ポジティブコントロール）；Ｋ１、Ｋ２−ヒト腎臓生検サンプル。（Ｂ）ＷＴマウスと比較してＣｏｌ４ａ３  ＫＯマウスにおけるＡＰＯＭタンパク質発現の低下を示すウエスタンブロット分析。（Ｃ）ＷＴマウスと比較した場合、Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯマウスにおけるＳＰＨＫ１の発現の有意な増加を示す定量的リアルタイムＰＣＲ分析。＊＊＊ｐ＜０．００１、ｔ検定。（Ｄ）ＷＴマウスと比較した場合、Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯの腎皮質におけるＳ１Ｐレベルの有意な増加を示すＥＬＩＳＡ。ｐ＜０．０５、ｔ検定。（Ｅ〜Ｉ）ＷＴマウスと比較した場合、Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯマウスの腎皮質におけるＳ１ＰＲ１（Ｅ）、Ｓ１ＰＲ２（Ｆ）、Ｓ１ＰＲ３（Ｇ）、Ｓ１ＰＲ４（Ｈ）、およびＳ１ＰＲ５（Ｉ）の発現の有意な増加を示す腎皮質から単離されたｍＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ分析。＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１  ｔ検定。（Ｊ〜Ｎ）ＷＴマウスと比較した場合に、Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯマウスの糸球体におけるＳ１ＰＲ４（Ｍ）の発現が有意に増加するが、Ｓ１ＰＲ１（Ｊ）、Ｓ１ＰＲ２（Ｋ）、Ｓ１ＰＲ３（Ｌ）、およびＳ１ＰＲ５（Ｎ）の発現は変化しないことを示す、糸球体から単離されたｍＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ分析。＊ｐ＜０．０５、ｔ検定。
【図７Ａ−７Ｆ】図７Ａ〜図７Ｆ：（Ａ、Ｂ）レンチウイルス感染により、ＡＰＯＭノックダウンが安定したヒト有足細胞株が樹立された。定量的リアルタイムＰＣＲ（Ａ）およびウエスタンブロット分析（Ｂ）が実施され、スクランブル感染（ＳＣ）有足細胞と比較してｓｉＡＰＯＭでのＡＰＯＭ  ｍＲＮＡおよびタンパク質発現の７５％ノックダウンが示された。ｎ＝１。（Ｃ）ＳＣ有足細胞と比較した場合、ｓｉＡＰＯＭ有足細胞におけるＲｈｏＡ発現の低下を示すウエスタンブロット分析。（Ｄ）定量的リアルタイムＰＣＲによって確立されたＳＣ有足細胞と比較して、ｓｉＡＰＯＭにおけるＡＢＣＣ１発現が有意に減少したことを示す棒グラフ解析。トリプリケート、ｎ＝１。（Ｅ）異なるインテグリンサブユニットの発現は、定量的リアルタイムＰＣＲを使用して決定された。ＳＣ有足細胞と比較して、ｓｉＡＰＯＭでＩＴＧＢ３の発現が増加していることを示す棒グラフ解析。トリプリケート、ｎ＝１。（Ｆ）Ｓ１Ｐ＋ＡＰＯＭで処置された有足細胞と比較した場合、Ｓ１Ｐ＋アルブミンで処置ではＳ１Ｐ依存的にアポトーシスが増加したことを示す棒グラフ解析。トリプリケート、ｎ＝１。
【図８Ａ−８Ｂ】図８Ａ〜図８Ｂ：Ｃｏｌ４ａ３ノックアウト（ＫＯ）マウスを組換えヒトＡＰＯＭ（ｒｈ−ＡＰＯＭ）で処置すると、確立された腎不全が改善される。（Ａ）Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスのｒｈ−ＡＰＯＭ処置は、未処置のＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスと比較して、アルブミン／クレアチニン比および（Ｂ）血漿クレアチニンレベルの有意な減少をもたらす。＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
本開示は、アルポート症候群に罹患している腎疾患の治療または予防を必要とする対象において腎疾患を治療または予防する方法、および慢性腎臓病の治療を必要とする対象において慢性腎臓病を治療する方法を提供する。本方法は、治療有効量のヒトアポリポタンパク質Ｍ（ＡＰＯＭ）を対象に投与することを含む。本開示はさらに、アルポート症候群に関連する腎疾患、ならびに慢性腎臓病の治療または予防において使用するためのヒトアポリポタンパク質Ｍを提供する。
【００１２】
「治療すること」および「治療」という用語は、治療される疾患または疾患の症状の改善を指す。したがって、「治療すること」および「治療」には、疾患の１つ以上の症状の完全な除去が含まれるが、これは必須ではない。当業者は、腎障害またはそれに関連する症状の任意の程度の緩和が、ヒト患者などの対象にとって有益であることを理解するであろう。患者の生活の質は、対象の症状の重症度を任意の程度軽減することによって改善される。「予防すること」または「予防」という用語は、障害を阻害すること、疾患の発症を遅らせること、または疾患の１つ以上の症状の出現を遅らせることを指す。「予防」は、発病の１００％阻害を必要としないが、これは企図されている。
【００１３】
アポリポタンパク質Ｍ
アポリポタンパク質Ｍ（ＡＰＯＭ）は、アポリポタンパク質であり、リポカリンタンパク質ファミリーのメンバーである。リポカリンは、配列相同性の限られた領域および共通の三次構造を共有する。それらは、８本鎖の逆平行対称バレルフォールドを有し、これは、本質的に、リガンド結合部位を収容する円筒形に丸められたベータシートである。リポカリンは、免疫応答、フェロモン輸送、生物学的プロスタグランジン合成、レチノイド結合、および癌細胞相互作用など、多くの生物学的プロセスに関連する。ＡＰＯＭは高密度リポタンパク質と関連しており、低密度リポタンパク質およびトリグリセリドに富むリポタンパク質とはそれほど関連していない。ＡＰＯＭは脂質輸送に関与し、スフィンゴシン−１−リン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、レチノール、オールトランスレチノイン酸、および９−シスレチノイン酸に結合することができる。ＡＰＯＭは、例えば、Ｚｈａｎｇら．，Ａｃｔａ  Ｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａ，２００３；１０５（１）：６７−７２、Ａｘｌｅｒら．，ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．２００８  Ｍａｒ  ５；５８２（５）：８２６−８にさらに記載されている。
【００１４】
ヒトＡＰＯＭのアミノ酸配列は配列番号１として提供される。様々な態様において、ヒトＡＰＯＭは、配列番号１と少なくとも９０％同一（例えば、少なくとも９５％、少なくとも９９％、または１００％同一）のアミノ酸配列を含む。あるいは、ＡＰＯＭは、配列番号２の核酸配列によってコードされる。様々な態様において、全長ＡＰＯＭタンパク質は必要とされない。任意選択で、ＡＰＯＭは、タンパク質の半減期または別の薬物動態特性を改善する部分に融合される。例えば、一実施形態において、ＡＰＯＭは、ＩｇＧ１抗体などの抗体のＦｃ領域と融合される。実際、好ましい実施形態において、ヒトＡＰＯＭは、ＩｇＧ１のＦｃ領域に融合された配列番号１のアミノ酸配列のＭｅｔ−１からＡｓｎ−１８８を含む。
【００１５】
組換えＡＰＯＭは、当技術分野で知られている方法を使用して生成することができる。
【００１６】
腎疾患
一態様において、本開示は、アルポート症候群に罹患している腎疾患の治療または予防を必要としている対象において、腎疾患を治療または予防する方法を提供する。したがって、特定の実施形態において、対象は、ヒト組換えアポリポタンパク質Ｍの投与前にアルポート症候群を有すると診断されている。アルポート症候群の診断は、対象の家族歴、臨床的特徴（タンパク尿、アルブミン尿、血尿、ＧＦＲ障害、難聴および／または眼の変化を含むがこれらに限定されない）、および組織生検の結果を含むがこれらに限定されないパラメータの評価を通じて達成され得る。腎臓生検は、ＩＶ型コラーゲンアルファ−３、アルファ−４、およびアルファ−５鎖の有無について検査することができる。さらに、糸球体の構造変化は、腎臓生検材料の電子顕微鏡検査によって検出することができる。皮膚生検は、ＩＶ型コラーゲンアルファ−５鎖の存在について検査することができ、これは通常、皮膚に存在し、Ｘ連鎖型のアルポート症候群の男性対象にはほとんど常に存在しない。アルポート症候群の診断には、Ｃｏｌ４ａ３、Ｃｏｌ４ａ４、またはＣｏｌ４ａ５遺伝子の１つ以上の変異のスクリーニングが含まれてもよい。
【００１７】
本明細書で使用される「腎疾患」または「腎臓病」という用語は、腎臓の正常な生理学および機能の変化を意味する。この用語には、腎症；原発性糸球体腎症（巣状分節性糸球体硬化症）、微小変化群、膜性ＧＮ、ＩｇＡ腎症；糸球体腎炎；多発性嚢胞腎；急性および慢性間質性腎炎、メソアメリカ腎症、腎肥大（片方または両方の腎臓の極端な肥大）；ネフローゼ症候群；腎炎症候群、末期腎疾患（ＥＳＲＤ）；急性および慢性腎不全；間質性疾患；腎炎；硬化症、例えば、疾患または傷害による炎症を含む原因に起因する組織および／または血管の硬結または硬化；腎線維症および瘢痕化；腎関連の増殖性障害；および他の一次または二次腎原性の状態が含まれるが、これらに限定されない。
【００１８】
本明細書で使用される「慢性腎臓病（ＣＫＤ）」という用語は、健康に影響を与える、３ヶ月以上存在する腎臓の構造または機能の異常として定義される。ＣＫＤは、全米腎臓財団に従って５つのステージを含む分類に分類されている。ステージ１は９０以上の正常なｅＧＦＲ（ｍＬ／分／１．７３ｍ２）を伴う腎臓損傷であり、ステージ２はＧＦＲの軽度の低下を伴う腎臓損傷であり（ＧＦＲ６０〜８９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）、ステージ３はＧＦＲの中程度の低下であり（ＧＦＲ３０〜５９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）、ステージ４はＧＦＲの深刻な低下であり（ＧＦＲ１５〜２９ｍＬ／分／１．７３ｍ２）、ステージ５は腎不全である（ＧＦＲ＜１５ｍＬ／分／１．７３ｍ２または透析）。ステージ３は、ＧＦＲの軽度〜中程度の低下であるステージ３Ａ（ＧＦＲ  ４５〜５９）と、ＧＦＲの軽度〜重度の低下であるステージ３Ｂ（ＧＦＲ  ３０〜４４）に細分化されている。
【００１９】
腎疾患または腎臓病はまた、一般的に「腎症」または「腎症（複数）」として定義され得る。「腎症」または「腎症（複数）」という用語は、腎線維症および／または糸球体疾患（例えば、糸球体硬化症または糸球体腎炎）および／または慢性腎不全を引き起こし、末期腎疾患および／または腎不全を引き起こす可能性がある、腎臓のすべての臨床病理学的変化を包含する。本開示のいくつかの態様は、高血圧性腎症、糖尿病性腎症、および鎮痛薬性腎症、免疫介在性糸球体症（例えば、ＩｇＡ腎症またはバーガー病、ループス腎炎）、虚血性腎症、ＨＩＶ関連腎症、膜性腎症、糸球体腎炎、糸球体硬化症、放射性造影剤誘発性腎症、毒性腎症、鎮痛薬誘発性腎毒性、シスプラチン腎症、移植腎症などの他のタイプの腎症、ならびに他の形態の糸球体異常もしくは傷害、あるいは糸球体毛細血管傷害（尿細管線維症）の予防および／または治療に関する。いくつかの実施形態において、「腎症」または「腎症（複数）」という用語は、特に、対象の尿中にタンパク質（すなわち、タンパク尿）が存在するか、および／または腎不全が存在するかのいずれかの障害または疾患を指す。
【００２０】
いくつかの実施形態において、対象は、アルブミン尿症またはタンパク尿症に罹患している。アルブミン尿症に関連する例示的な障害には、慢性腎臓病、増殖性糸球体腎炎（例えば、免疫グロブリンＡ腎症、膜増殖性糸球体腎炎、メサンギウム増殖性糸球体腎炎、抗ＧＢＭ疾患、腎血管炎、ループス腎炎、クリオグロブリン血症関連糸球体腎炎、細菌性心内膜炎、ヘノッホ・シェーンライン紫斑病、感染後糸球体腎炎、またはＣ型肝炎）、および非増殖性糸球体腎炎（例えば、膜性糸球体腎炎、微小変化群、原発巣状分節性糸球体腎炎（ＦＳＧＳ）、細線維性糸球体腎炎（ｆｉｂｒｉｌｌａｒｙ  ｇｌｏｍｅｒｕｌｏｎｅｐｈｒｉｔｉｓ）、免疫タクトイド糸球体症、アミロイドーシス、高血圧性腎硬化症、多発性骨髄腫および続発性巣状糸球体腎炎による軽鎖病）が含まれるが、これらに限定されない）。
【００２１】
本明細書で提供される実施形態のいずれかにおいて、対象は、腎臓機能を評価するために特定の試験を受けることができる。このような検査には、対象の血中尿素窒素の測定、対象の血中のクレアチニンを測定すること、対象の血液中のクレアチニンクリアランスを測定すること、対象のタンパク尿を測定すること、対象のアルブミン：クレアチニン比を測定すること、対象の糸球体濾過率を測定すること、および対象の尿量を測定することが含まれるが、これらに限定されない。様々な態様において、本開示の方法は、本明細書に記載の腎障害に罹患している対象におけるこれらの試験のうちの１つ以上の結果を改善する。
【００２２】
本明細書で提供される実施形態のいずれかにおいて、尿または血液中に存在するタンパク質を使用して、腎臓機能を評価することができる。腎臓機能のそのような試験には、対象の尿中の、アルブミン／クレアチニン尿比、総タンパク質／クレアチニン尿比、時間を測った採尿中のアルブミンまたは総タンパク質、Ｎ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニダーゼ（ＮＡＧ）タンパク質を測定すること、対象の尿中の好中球ゼラチナーゼ関連リポカリン（ＮＧＡＬ）タンパク質を測定すること、対象の尿中の腎臓傷害分子−１（ＫＩＭ−１）タンパク質を測定すること、対象の尿中のインターロイキン−１８（ＩＬ−１８）タンパク質を測定すること、対象の尿中の結合組織成長因子（ＣＴＧＦ）レベルを測定すること、対象の尿中の単球走化性タンパク質１（ＭＣＰ１）レベルを測定すること、対象の尿中のコラーゲンＩＶ（Ｃｏｌ  ＩＶ）フラグメントを測定すること、対象の尿中のコラーゲンＩＩＩ（Ｃｏｌ  ＩＩＩ）フラグメントレベルを測定すること、対象の血液中のシスタチンＣタンパク質を測定すること、対象の血液中のβ−微量タンパク質（ＢＴＰ）を測定すること、および対象の血液中の２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）を測定することが含まれるが、これらに限定されない。本明細書で提供される実施形態のいずれかにおいて、有足細胞傷害のマーカーは、尿にて測定することができる。このようなタンパク質には、ネフリンおよびポドシンが含まれる。タンパク質は、例えば、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、または市販のキットを使用するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）によって定量することができる。
【００２３】
投与のタイミングおよび投与量
いくつかの実施形態において、ヒトアポリポタンパク質Ｍの１回以上の投与は、例えば、約１週間〜約１８ヶ月（例えば、約１ヶ月〜約１２ヶ月、約１ヶ月〜約９ヶ月、または約１ヶ月〜約６ヶ月、または約１ヶ月〜約３ヶ月）の治療期間にわたって行われる。いくつかの実施形態において、対象は、本明細書に記載のヒトアポリポタンパク質Ｍの１回以上の用量を、例えば、約１ヶ月〜約１２ヶ月（５２週）（例えば、約２ヶ月、約３ヶ月、約４ヶ月、約５ヶ月、約６ヶ月、約７ヶ月、約８ヶ月、約９ヶ月、約１０ヶ月、または約１１ヶ月）の治療期間にわたって投与される。
【００２４】
さらに、特定のヒト対象のために選択された治療計画に応じて、ヒトアポリポタンパク質Ｍを複数回投与するか、または時間内において投与量を分けることが有利である可能性がある。いくつかの実施形態において、ヒトアポリポタンパク質Ｍは、１年（１２ヶ月、５２週間）以内（例えば、９ヶ月以内、６ヶ月以内、または３ヶ月以内）の期間にわたって定期的に投与される。これに関して、ヒトアポリポタンパク質Ｍは、任意選択で、約３日、または約７日、または約２週間、または約３週間、または約４週間、または約５週間、または約６週間、または約７週間、または約８週間、または約９週間、または約１０週間、または約１１週間、または約１２週間、または約１３週間、または約１４週間、または約１５週間、または約１６週間、または約１７週間、または約１８週間、または約１９週間、または約２０週間、または約２１週間、または約２２週間、または約２３週間、または約６ヶ月、または約１２ヶ月ごとに１回投与される。
【００２５】
いくつかの実施形態において、ヒトアポリポタンパク質Ｍの用量は、体重１キログラムあたり約１〜約５００ミリグラム（例えば、約１〜約４００ミリグラム、または約３〜約３００ミリグラム）（ｍｇ／ｋｇ）のヒトアポリポタンパク質Ｍを含む。例えば、ヒトアポリポタンパク質Ｍの用量は、少なくとも約１ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ、約２０ｍｇ／ｋｇ、約２５ｍｇ／ｋｇ、約２６ｍｇ／ｋｇ、約２７ｍｇ／ｋｇ、約２８ｍｇ／ｋｇ、約２９ｍｇ／ｋｇ、約３０ｍｇ／ｋｇ、約３１ｍｇ／ｋｇ、約３２ｍｇ／ｋｇ、約３３ｍｇ／ｋｇ、約３４ｍｇ／ｋｇ、約３５ｍｇ／ｋｇ、約３６ｍｇ／ｋｇ、約３７ｍｇ／ｋｇ、約３８ｍｇ／ｋｇ、約３９ｍｇ／ｋｇ、約４０ｍｇ／ｋｇ、約４１ｍｇ／ｋｇ、約４２ｍｇ／ｋｇ、約４３ｍｇ／ｋｇ、約４４ｍｇ／ｋｇ、約４５ｍｇ／ｋｇ、約４６ｍｇ／ｋｇ、約４７ｍｇ／ｋｇ、約４８ｍｇ／ｋｇ、または約４９ｍｇ／ｋｇ、または約５０ｍｇ／ｋｇ、約５５ｍｇ／ｋｇ、約６０ｍｇ／ｋｇ、約６５ｍｇ／ｋｇ、約７０ｍｇ／ｋｇ、約７５ｍｇ／ｋｇ、約８０ｍｇ／ｋｇ、約８５ｍｇ／ｋｇ、約９０ｍｇ／ｋｇ、約９５ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ、約１２５ｍｇ／ｋｇ、約１５０ｍｇ／ｋｇ、約１７５ｍｇ／ｋｇ、約２００ｍｇ／ｋｇ、約２２５ｍｇ／ｋｇ、約２５０ｍｇ／ｋｇ、約２７５ｍｇ／ｋｇ、約３００ｍｇ／ｋｇ、約３２５ｍｇ／ｋｇ、約３５０ｍｇ／ｋｇ、約３７５ｍｇ／ｋｇ、約４００ｍｇ／ｋｇ、約４５０ｍｇ／ｋｇ、または約５００ｍｇ／ｋｇのヒトアポリポタンパク質Ｍを含んでよい。これらの終点のいずれかおよびすべての間の範囲、例えば、約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ〜約７５ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇ、約１００ｍｇ／ｋｇ〜３００ｍｇ／ｋｇ、約５０ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、または約２００ｍｇ／ｋｇ〜約３００ｍｇ／ｋｇも検討される。
【００２６】
医薬組成物
いくつかの実施形態において、ヒトアポリポタンパク質Ｍは、薬学的に有効な希釈剤、担体、可溶化剤、乳化剤、防腐剤、および／またはアジュバントと共に組成物として製剤化される。医薬組成物には、液体、冷凍、および凍結乾燥組成物が含まれるが、これらに限定されない。
【００２７】
好ましくは、製剤材料は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して無毒である。特定の実施形態において、治療有効量のヒトアポリポタンパク質Ｍを含む医薬組成物が提供される。
【００２８】
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、例えば、組成物の、ｐＨ、浸透圧、粘度、透明度、色、等張性、臭い、無菌性、安定性、溶解もしくは放出の速度、吸着もしくは浸透を改変、維持または保存するための製剤材料を含む。そのような実施形態において、好適な製剤材料としては、アミノ酸（グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、プロリン、もしくはリシンなど）；抗菌剤；酸化防止剤（例えば、アスコルビン酸、亜硫酸ナトリウム、もしくは亜硫酸水素ナトリウムなど）；緩衝剤（ホウ酸塩、炭酸水素塩、トリス−ＨＣｌ、クエン酸塩、リン酸塩、もしくは他の有機酸など）；増量剤（マンニトールもしくはグリシンなど）；キレート剤（エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）など）；錯化剤（カフェイン、ポリビニルピロリドン、β−シクロデキストリン、もしくはヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンなど）；充填剤；単糖；二糖；および他の炭水化物（グルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど）；タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど）；着色剤、香味剤、および希釈剤；乳化剤；親水性ポリマー（ポリビニルピロリドンなど）；低分子量ポリペプチド；塩形成対イオン（ナトリウムなど）；防腐剤（塩化ベンザルコニウム、安息香酸、サリチル酸、チメロサール、フェネチルアルコール、メチルパラベン、プロピルパラベン、クロルヘキシジン、ソルビン酸、もしくは過酸化水素など）；溶媒（グリセリン、プロピレングリコール、もしくはポリエチレングリコールなど）；糖アルコール（マンニトールもしくはソルビトールなど）；懸濁剤；界面活性剤または湿潤剤（プルロニック、ＰＥＧ、ソルビタンエステル、ポリソルベート、例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベートなど、トリトン、トロメタミン、レシチン、コレステロール、チロキサパルなど）；安定性向上剤（ショ糖もしくはソルビトールなど）；張度増強剤（アルカリ金属ハロゲン化物、好ましくは、塩化ナトリウムもしくは塩化カリウム、マンニトール、ソルビトールなど）；送達ビヒクル；希釈剤；賦形剤、および／または薬学的アジュバントが挙げられるが、これらに限定されない。ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ  ＳＣＩＥＮＣＥＳ、第１８版（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｒｍｏ編）、１９９０，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙを参照されたい。
【００２９】
併用療法
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の方法は、腎症などの腎障害、または関連する障害もしくは合併症を予防または治療するための別の薬剤を投与することを含む。このような既知の化合物の例には、ＡＣＥ阻害薬（例えば、カプトプリル（カポテン（登録商標））、エナラプリル（イノバース（登録商標））、フォシノプリル（スタリル（登録商標））、リシノプリル（ゼストリル（登録商標））、ペリンドプリル（カバーシル（登録商標））、キナプリル（アキュプロ（登録商標））、トランダナロプリル（ゴプテン（登録商標））、ロテンシン、モエキシプリル、ラミプリル）；ＲＡＳ遮断薬；アンジオテンシン受容体遮断薬（ＡＲＢ）（例えば、オルメサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、バルサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、テルミサルタンなど）；プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）阻害剤（例えば、ルボキシスタウリン）；ＡＧＥ依存性経路の阻害剤（例えば、アミノグアニジン、ＡＬＴ−９４６、ピリドキサミン（ピロドドリン）、ＯＰＢ−９２９５、アラゲブリウム）；抗炎症剤（例えば、クリクロオキシゲナーゼ（clyclooxigenase）−２阻害剤、ミコフェノール酸モフェチル、ミゾリビン、ペントキシフィリン）、ＧＡＧ（例えば、スロデキシド（米国特許第５，４９６，８０７号））；ピリドキサミン（米国特許第７，０３０，１４６号）；エンドセリン拮抗薬（例えば、ＳＰＰ  ３０１）、ＣＯＸ−２阻害薬、ＰＰＡＲ−γ拮抗薬、およびアミホスチン（シスプラチン腎症に使用）、カプトプリル（糖尿病性腎症に使用）、シクロホスファミド（特発性膜性腎症に使用）、チオ硫酸ナトリウム（シスプラチン腎症に使用）、トラニラストなど（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ａｎｄ  Ｔｕｔｔｌｅ（２００５），Ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｃｈｒｏｎｉｃ  Ｋｉｄｎｅｙ  Ｄｉｓｅａｓｅ，１２（２）：２１２−２２２、Ｇｉｕｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００６），Ｍｉｎｅｒｖａ  Ｍｅｄｉｃａ，９７：２４１−６２）のような他の化合物が含まれるが、これらに限定されない。
【００３０】
さらに、本明細書に記載の方法はまた、脂質異常症、高血圧、肥満、神経障害、炎症および／または網膜症を含むがこれらに限定されない、腎障害の合併症に直接的または間接的に関連する別の疾患の治療のための少なくとも１つの他の治療薬の同時投与を含んでよい。そのような追加の治療薬には、コルチコステロイド、免疫抑制薬；抗生物質；降圧薬および利尿薬（チアジド系利尿薬およびＡＣＥ阻害薬またはβアドレナリン作動薬拮抗薬など）；胆汁封鎖樹脂、コレスチラミン、コレスチポール、ニコチン酸などの脂質低下剤、より具体的には、コレステロールおよびトリグリセリドを低減するために使用される薬物および薬剤（例えば、フィブレート（例えば、ゲムフィブロジル（登録商標））、およびロバスタチン（登録商標）、アトルバスタチン（登録商標）、フルバスタチン（登録商標）、レスコル（登録商標）、リピトール（登録商標）、メバコール（登録商標）、プラバコール（登録商標）、プラバスタチン（登録商標）、シンバスタチン（登録商標）、ゾコール（登録商標）、セリバスタチン（登録商標）などのＨＭＧ−ＣｏＡ阻害剤）；ニコチン酸；およびビタミンＤが含まれるが、これらに限定されない。
【００３１】
ヒトアポリポタンパク質Ｍと同時投与できる薬剤の追加の例には、免疫調節剤または免疫抑制剤（腎臓移植を受けた対象（例えば、腎症を発症した場合）によって使用されるものなど）、抗肥満剤、および食欲抑制剤（ゼニカル（商標）（Ｒｏｃｈｅ）、メリディア（商標）（Ａｂｂｏｔｔ）、アコンプリア（商標）（Ｓａｎｏｆｉ−Ａｖｅｎｔｉｓ）、および交感神経刺激薬フェンテルミンを含むがこれらに限定されない）、高カリウム血症を治療するためにおよび／または高カリウム血症によって引き起こされる心室細動のリスクを低減するために使用される薬剤（例えば、グルコン酸カルシウム、インスリン、重炭酸ナトリウム、サルブタモール（アルブテロール、ベントリン（登録商標））などのβ２−選択的カテコールアミン）、およびポリスチレンスルホン酸（カルシウム・レゾニウム、ケイキサレート））ならびにパチロマー（バルタッサ（登録商標））を含む。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「併用療法的治療」または「と併用して」という句における「併用」または「併用して」という用語は、第２の薬剤の存在下で第１の薬剤を投与することを含む。併用療法的治療法は、第１、第２、第３または追加の薬剤が同時投与される方法を含む。併用療法的治療法はまた、第１または追加の薬剤が第２または追加の薬剤の存在下で投与される方法を含み、第２または追加の薬剤は、例えば、以前に投与されていてもよい。併用療法的治療法は、異なる当事者によって段階的に実行され得る。例えば、１人の当事者が第１薬剤を対象に投与し、第２の当事者が対象に第２の薬剤を投与することができ、投与ステップが同時に、またはほぼ同時に、あるいは第１の薬剤（および／または追加の薬剤）が投与後において第２の薬剤（および／または追加の薬剤）の存在下にある限り、離れた時間に実行されてもよい。当事者と対象は同じ実体（例えば、ヒト）でよい。好ましくは、第１の薬剤は、ヒト組換えアポリポタンパク質Ｍ、またはヒト組換えアポリポタンパク質Ｍを含有する組成物である。第２の薬剤は、本明細書に記載の他の治療薬から選択され得る。
【実施例】
【００３３】
この実施例は、アルポート症候群の臨床的に関連するインビボモデルへのＡＰＯＭの投与が、腎不全および腎皮質の脂質含有量の異常を防ぐことを示す。
【００３４】
材料および方法
ヒト組換えＡＰＯＭタンパク質の構築および使用：タンパク質はＳｉｎｏ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ（１３４９５−Ｈ０２Ｈ）から購入した。ヒトＡＰＯＭタンパク質（Ｏ９５４４５）（Ｍｅｔ  １−Ａｓｎ  １８８）をコードするＤＮＡ配列を、Ｃ末端でヒトＩｇＧ１のＦｃ領域と融合させた。得られたヒト組換えＡＰＯＭタンパク質は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで測定される純度が８５％を超え、ＬＡＬ法で測定されるタンパク質１μｇあたりのエンドトキシン濃度が１．０ＥＵ未満であることが見出された。
【００３５】
製剤：タンパク質を滅菌ＰＢＳ、ｐＨ７．４から凍結乾燥し、通常５％〜８％のトレハロース、マンニトール、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０を保護剤として凍結乾燥前に添加した。各ＣＯＡのハードコピーには特定の濃度が含まれていた。注射用に、滅菌水をバイアルに加えて、０．２５ｍｇ／ｍｌのストック溶液を調製した。
【００３６】
ヒトＡＰＯＭタンパク質配列：０９５４４５（１−１８８）：ＭＦＨＱＩＷＡＡＬＬ  ＹＦＹＧＩＩＬＮＳＩ  ＹＱＣＰＥＨＳＱＬＴ  ＴＬＧＶＤＧＫＥＦＰ  ＥＶＨＬＧＱＷＹＦＩ  ＡＧＡＡＰＴＫＥＥＬ  ＡＴＦＤＰＶＤＮＩＶ  ＦＮＭＡＡＧＳＡＰＭ  ＱＬＨＬＲＡＴＩＲＭ  ＫＤＧＬＣＶＰＲＫＷ  ＩＹＨＬＴＥＧＳＴＤ  ＬＲＴＥＧＲＰＤＭＫ  ＴＥＬＦＳＳＳＣＰＧ  ＧＩＭＬＮＥＴＧＱＧ  ＹＱＲＦＬＬＹＮＲＳ  ＰＨＰＰＥＫＣＶＥＥ  ＦＫＳＬＴＳＣＬＤＳ  ＫＡＦＬＬＴＰＲＮＱ  ＥＡＣＥＬＳＮＮ（配列番号１）。
【００３７】
ＡＰＯＭの酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）：マウス−ＡＰＯＭ  ＥＬＩＳＡはＬＳＢｉｏ（＃ＬＳ−Ｆ２１４１５）から購入し、血清、尿、溶解物中のＡＰＯＭタンパク質濃度を製造者のプロトコルに従って測定した。
【００３８】
Ｓ１Ｐアッセイキット：Ｓ１ＰアッセイキットはＥｃｈｅｌｏｎ（＃Ｋ−１９００）から購入し、血清中のＳ１Ｐ濃度を製造者のプロトコルに従って測定した。
【００３９】
定量的リアルタイムＰＣＲ：ｑＰＣＲは、先行技術から知られている標準的なプロトコルに従って、Ａｂｃａ１、Ａｂｃｇ１、およびＡＰＯＭのプライマーを使用し、単離されたマウス糸球体由来のｃＤＮＡに対して実施した。使用したプライマー：Ａｂｃａ１−Ｆ：ＣＧＴＴＴＣＣＧＧＧＡＡＧＴＧＴＣＣＴＡ／Ａｂｃａ１−Ｒ：ＧＣＴＡＧＡＧＡＴＧＡＣＡＡＧＧＡＧＧＡＴＧＧＡ；Ａｂｃｇ１−Ｆ：ＡＧＧＴＣＴＣＡＧＣＣＴＴＣＴＡＡＡＧＴＴＣＣＴＣ／Ａｂｃｇ１−Ｒ：ＴＣＴＣＴＣＧＡＡＧＴＧＡＡＴＧＡＡＡＴＴＴＡＴＣＧ；Ａｐｏｍ−Ｆ：ＣＣＴＧＧＧＣＣＴＧＴＧ  ＧＴＡＣＴＴＴＡ、Ａｐｏｍ−Ｒ：ＣＣＡＴＧＴＴＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＴＣＡ（配列番号４〜９）。
【００４０】
腎疾患予防のためのマウスモデル（例えば、図３）：ＩＶ型コラーゲンのα３鎖のエクソン５が削除されたマウス（Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（＃００２９０８、１２９−Ｃｏｌ４ａ３ｔｍ１Ｄｅｃ／Ｊ）から入手した。Ｃｏｌ４ａ３ヘテロ接合同腹仔を繁殖させてＣｏｌ４ａ３  ＫＯマウスを生成した。１グループあたりｎ＝３〜４のマウスの３つのグループについて研究した。３つのグループは、１）野生型コントロール＋ビヒクル、２）Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯ＋ビヒクル、および４）Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯ＋ＡＰＯＭで構成されていた。ＡＰＯＭは、４週齢から毎週腹腔内注射により１００μｇのＡＰＯＭ、５週目に１００μｇ、６週目に７５μｇ、７週目に６７μｇを投与した。体重およびアルブミン尿は、４週齢〜１６週齢まで毎週モニターした。末期腎不全への進行が起こった８週齢でマウスを安楽死させた。
【００４１】
腎疾患の治療のためのマウスモデル（図８）：１グループあたりｎ＝３〜４のＣｏｌ４ａ３  ＫＯマウスの３つのグループについて研究した。３つのグループは、１）野生型コントロール（ＷＴ）＋ビヒクル、２）Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯ＋ビヒクル、４）Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯ＋ｒｈ−ＡＰＯＭで構成されていた。ｒｈＡＰＯＭは、週齢６と１／２から、週に１００ｍｇのＡＰＯＭを腹腔内注射することによって投与された。体重およびアルブミン尿は、４週齢〜８週齢まで毎週モニターした。末期腎不全への進行が起こった８週齢でマウスを安楽死させた。
【００４２】
アルブミン／クレアチニン比：すべてのアルブミン尿値は、μｇアルブミン／ｍｇクレアチニンとして表される。アルブミン／クレアチニンは、アルブミン検出のためのＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、およびクレアチニン検出のためのＪａｆｆｅ法（Ｓｔａｎｂｉｏ）に基づく生化学的アッセイにより、以前に述べた通り測定された。
【００４３】
血清学：安楽死させる直前に、マイアミ大学の比較実験室コア施設におけるＢＵＮ測定および脂質パネル分析のために血液サンプルを収集した。血清クレアチニンは、タンデム質量分析（ＵＡＢ−ＵＣＳＤ  Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  Ｃｏｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ、アラバマ大学）によって測定された。
【００４４】
マウス安楽死手術：８週齢でマウスを左心室からリン酸緩衝生理食塩水で灌流した。右腎臓を摘出し、片方の極を切除してＯＣＴに埋め込み、残りの腎臓をコレステロール含有量の測定および皮質からのｍＲＮＡ抽出のために使用した。左腎臓の２つの極を切除して４％ＰＦＡで固定し、一方の極をパラフィン包埋後組織学的分析に使用し、もう一方の極を電子顕微鏡用に、４％グルタルアルデヒドのＰＢＳ溶液で１２時間、後固定した。
【００４５】
メサンギウム拡大の評価：４μｍ厚の組織切片の過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ）染色を、標準的なプロトコルを使用して実施した。盲検化された２人の独立した研究者により実施された半定量分析（スケール０〜４）により、１切片あたり２０個の糸球体についてメサンギウム拡大を分析した。
【００４６】
統計解析：すべてインビトロ実験はトリプリケートにて実施され、３個の生物学的複製が実施され、すべてのインビボ実験では、１グループあたり３〜１０匹のマウスが分析された。統計解析は、Ｇｒａｐｈ  ＰａｄＰｒｉｓｍソフトウェアを使用して行われた。分散分析（ＡＮＯＶＡ）に続いて、ボンフェローニの事後検定またはスチューデントのｔ検定を使用して結果を解析した。
【００４７】
結果および考察
驚くべきことに、脂質誘発性腎臓傷害がアルポート症候群に関連して観察された。アルポート症候群（ＡＳ）における脂質誘発性腎臓傷害のこの役割は予想外であり、以前は認識されていなかった。Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウス（アルポート症候群の動物モデル）から単離された糸球体のｍＲＮＡ（メッセンジャーリボ核酸）レベルを調べると、ＡＢＣＡ１に加えて、ＡＢＣＧ１（ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＧメンバー１）およびアポリポタンパク質Ｍ（ＡＰＯＭ）の発現は、コントロールと比較してＡＳマウスでも減少したことが見出され、このことは、ＡＳの進行において３つのタンパク質すべてが果たし得る役割を示唆している。相乗的に機能する２つのＡＴＰ結合カセットトランスポータータンパク質であるＡＢＣＡ１とＡＢＣＧ１とは対照的に、ＡＰＯＭは主にＨＤＬ粒子に存在するタンパク質であり、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）代謝において重要な役割を果たすと考えられる。
【００４８】
図１に示すデータは、Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスにおけるＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１、およびＡＰＯＭの発現レベルの低下を示す。動物モデルにおける異常な発現レベルと腎臓傷害との間のこの相関関係は、アルポート症候群の進行におけるＡＢＣＡ１、ＡＢＣＧ１、およびＡＰＯＭの役割を示唆する。図２のデータは、臨床的に関連のあるインビボモデルであるＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスで観察された腎疾患の進行におけるＡＰＯＭ発現の低下の役割をさらに裏付ける。Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスは、ＡＰＯＭ発現レベルの低下（Ａ）、血清中のＡＰＯＭタンパク質レベルの低下（Ｂ）および尿中のＡＰＯＭタンパク質レベルの低下（Ｃ）、血清中のトリグリセリドレベルの上昇（Ｄ）、および腎皮質および血清中のスフィンゴシン−１−リン酸（Ｓ１Ｐ）レベルの上昇という複合表現型を示す。さらに、尿および腎臓のＡＰＯＭ発現は、Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯ（ＫＯ）マウスの腎機能のパラメータと相関することが見出された（図２Ｇおよび２Ｈ）。これらのデータは、ＡＰＯＭが血清中のトリグリセリドレベルならびに腎皮質および血清中のＳ１Ｐレベルを調節するために必要であることを示唆する。ヒトＡＰＯＭによるＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの処置後に続く血清中のＳ１Ｐとトリグリセリドおよび腎皮質のＳ１Ｐの正常レベルの回復は、アルポート症候群と臨床的に関連するこの動物モデルに存在する１つ以上の症状を治療するのにも、ＡＰＯＭが十分であることを示している。
【００４９】
図３に示すデータは、組換えヒトＡＰＯＭによる処置による正常なＡＰＯＭレベルの回復が、Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの腎臓組織の機能と構造にプラスの影響を与えたことを示している。パネル（Ａ）〜（Ｃ）は、ヒトＡＰＯＭで処置したＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスで、アルブミンのクレアチニンに対する比および血中尿素窒素（ＢＵＮ）レベルに関する腎臓機能が大幅に改善されたことを示している。体重減少は、ヒトＡＰＯＭで処置したＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスでも予防でき、一般的に健康な代謝状態を示している（パネル（Ｄ）を参照）。パネル（Ｅ）の染色組織スライスの比較が示すように、ヒトＡＰＯＭによる処置は、Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスのアルポート症候群における腎臓傷害に関連するいくつかの組織学的異常も予防した。特に、ヒトＡＰＯＭで処置されたＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウスは、未処置の同腹仔と比較して、糸球体硬化症、尿細管萎縮、および拡張とメサンギウム拡大のレベルの低下を示した。これらのデータは、ヒトＡＰＯＭによる処置が、Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウスの腎臓における機能的および構造的異常の発症を防ぎ、それによって処置された動物を腎不全から保護できることを示している。
【００５０】
図６Ａ〜６Ｎに示すデータは、ＡＰＯＭがヒト有足細胞およびヒト腎臓生検で発現し、Ｃｏｌ４ａ３  ＫＯマウスのＡＰＯＭ欠損がＳ１Ｐ蓄積およびＣシグナル伝達の活性化に関連することを示す。
【００５１】
図７に示すデータは、レンチウイルス感染によって確立された安定したＡＰＯＭノックダウン（ｓｉＡＰＯＭ）を伴うヒト有足細胞株を示し（図７Ａ〜７Ｂ）、スクランブルコントロールに対しｓｉＡＰＯＭ有足細胞におけるＲｈｏＡタンパク質発現（図７Ｃ）およびＡＢＣＣ１  ｍＲＮＡ発現（７Ｄ）の低下を示している。さらに、ｓｉＡＰＯＭにおいて、スクランブルコントロールに対しＩＴＧＢ３の発現の増加が検出された（図７Ｅ）。細胞内脂質をナイルレッド、およびセルマスク、およびファロイジンで標識して細胞を可視化した後、ＯＰＥＲＡハイコンテントスクリーニングシステムを使用して、代表的な画像を取得した。脂肪滴の増加は、Ｓ１Ｐ＋アルブミンで処置された有足細胞で用量依存的に検出されたが、Ｓ１Ｐ＋ＡＰＯＭで処置された有足細胞では同様の増加は検出されなかった（データは示していない）。Ｓ１Ｐ＋ＡＰＯＭで処置した有足細胞と比較した場合、Ｓ１Ｐ＋アルブミンで処置した場合には、アポトーシスの増加がＳ１Ｐ依存的に検出された（図７Ｆ）。
【００５２】
図８に示すデータは、週齢６と１／２のＣｏｌ４ａ３ノックアウト（ＫＯ）マウスを組換えヒトＡＰＯＭ（ｒｈ−ＡＰＯＭ）で処置すると、確立された腎不全が改善したことを示している。この場合、マウスは腎疾患（タンパク尿）の臨床的兆候を示しており、ｒｈ−ＡＰＯＭで処置されている。Ｃｏｌ４ａ３ノックアウトマウス（ＫＯ）のｒｈ−ＡＰＯＭ処置は、未処置のＣｏｌ４ａ３ノックアウトマウス（図８Ｂ）と比較して、アルブミン／クレアチニン比（図８Ａ）および血漿クレアチニンレベルの有意な減少をもたらした。
【００５３】
本明細書に記載のデータは、アルポート症候群のインビボモデル（Ｃｏｌ４ａ３マウス）へのＡＰＯＭの投与が、腎不全および腎皮質の脂質含有量の異常を防ぐことを示している。処置された動物はまた、より健康的な体重およびより良好な腎臓機能を有していた。本実施例は、アルポート症候群の根底にあるメカニズムにおけるＡＰＯＭの役割を示しており、腎臓疾患の治療または予防におけるＡＰＯＭの治療的使用の証拠を提供する。
【図１Ａ】
2021531271.tif 000003
【図１Ｂ】
2021531271.tif 000004
【図１Ｃ】
2021531271.tif 000005
【図２Ａ】
2021531271.tif 000006
【図２Ｂ】
2021531271.tif 000007
【図２Ｃ】
2021531271.tif 000008
【図２Ｄ】
2021531271.tif 000009
【図２Ｅ】
2021531271.tif 000010
【図２Ｆ】
2021531271.tif 000011
【図２Ｇ】
2021531271.tif 000012
【図２Ｈ】
2021531271.tif 000013
【図３Ａ】
2021531271.tif 000014
【図３Ｂ】
2021531271.tif 000015
【図３Ｃ】
2021531271.tif 000016
【図３Ｄ】
2021531271.tif 000017
【図３Ｅ】
2021531271.tif 000018
【図３Ｆ】
2021531271.tif 000019
【図４】
2021531271.tif 000020
【図５】
2021531271.tif 000021
【図６Ａ】
2021531271.tif 000022
【図６Ｂ】
2021531271.tif 000023
【図６Ｃ】
2021531271.tif 000024
【図６Ｄ】
2021531271.tif 000025
【図６Ｅ】
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【図６Ｆ】
2021531271.tif 000027
【図６Ｇ】
2021531271.tif 000028
【図６Ｈ】
2021531271.tif 000029
【図６Ｉ】
2021531271.tif 000030
【図６Ｊ】
2021531271.tif 000031
【図６Ｋ】
2021531271.tif 000032
【図６Ｌ】
2021531271.tif 000033
【図６Ｍ】
2021531271.tif 000034
【図６Ｎ】
2021531271.tif 000035
【図７Ａ】
2021531271.tif 000036
【図７Ｂ】
2021531271.tif 000037
【図７Ｃ】
2021531271.tif 000038
【図７Ｄ】
2021531271.tif 000039
【図７Ｅ】
2021531271.tif 000040
【図７Ｆ】
2021531271.tif 000041
【図８Ａ】
2021531271.tif 000042
【図８Ｂ】
2021531271.tif 000043
【配列表】
2021531271000001.app
【国際調査報告】
2021531271.tif 000044
2021531271.tif 000045
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