(57)【要約】本発明は、エクソソームの内腔で富化されることが新たに確認されたタンパク質を使用して、治療エクソソームを調製する方法に関する。具体的には、本発明は、エクソソーム中に、治療ペプチドまたはタンパク質を局在化させる方法を提供する。本方法は、高濃度のエクソソームタンパク質、エクソソームタンパク質の改変体もしくは断片、またはエクソソームタンパク質及び治療もしくはカーゴタンパク質の融合タンパク質のうちの１つ以上を含む、内腔操作エクソソームの生成を含む。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
標的タンパク質を含むエクソソームであって、前記標的タンパク質の少なくとも一部が、外因性配列から発現され、前記標的タンパク質が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片もしくは改変体を含む、前記エクソソーム。
【請求項２】
前記標的タンパク質が、異なるエクソソーム中の異なる標的タンパク質よりも高い密度で、前記エクソソーム中に存在し、前記異なる標的タンパク質が、従来のエクソソームタンパク質またはその多様体を含む、請求項１に記載のエクソソーム。
【請求項３】
前記従来のエクソソームタンパク質が、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、及びそれらの断片からなる群より選択される、請求項２に記載のエクソソーム。
【請求項４】
前記エクソソームが、前記外因性配列を含むように遺伝的に改変された細胞から産生され、任意に、前記細胞が、ＨＥＫ２９３細胞である、請求項１〜３のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項５】
前記細胞が、前記外因性配列を含むプラスミドを含む、請求項４に記載のエクソソーム。
【請求項６】
前記細胞が、前記細胞のゲノムに挿入された前記外因性配列を含む、請求項４に記載のエクソソーム。
【請求項７】
前記外因性配列が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に対して３’または５’に位置するゲノム部位に挿入されている、請求項６に記載のエクソソーム。
【請求項８】
前記外因性配列が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に挿入されている、請求項６に記載のエクソソーム。
【請求項９】
前記標的タンパク質が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片を含む、及び治療ペプチドを含む融合タンパク質である、請求項１〜８のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項１０】
前記治療ペプチドが、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される、請求項９に記載のエクソソーム。
【請求項１１】
前記治療化合物が、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び小分子からなる群より選択される、請求項９に記載のエクソソーム。
【請求項１２】
前記治療ペプチドが、抗体またはその断片もしくは改変体である、請求項９に記載のエクソソーム。
【請求項１３】
前記治療ペプチドが、酵素、リガンド、受容体、転写因子、またはその断片もしくは改変体である、請求項９に記載のエクソソーム。
【請求項１４】
前記治療ペプチドが、抗菌ペプチドまたはその断片もしくは改変体である、請求項９に記載のエクソソーム。
【請求項１５】
さらに第２の標的タンパク質を含み、前記第２の標的タンパク質が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項１６】
さらに第２の標的タンパク質を含み、前記第２の標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはその断片を含む、請求項１〜１４のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項１７】
前記標的タンパク質が、（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）のペプチドを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項１８】
前記標的タンパク質が、（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない）のペプチドを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項１９】
前記標的タンパク質が、（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない）のペプチドを含む、請求項１〜１５のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項２０】
前記標的タンパク質が、配列番号４〜１１０のいずれか１項に記載のペプチドを含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項２１】
前記標的タンパク質が、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）（配列番号１１６）のペプチドを含む、請求項１７〜１９のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項２２】
前記標的タンパク質が、配列番号１１０のペプチドを含む、請求項２１に記載のエクソソーム。
【請求項２３】
前記標的タンパク質が、配列番号１３のペプチドを含む、請求項２０に記載のエクソソーム。
【請求項２４】
前記標的タンパク質がさらに、カーゴペプチドを含む、請求項１〜２３のいずれかに記載のエクソソーム。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれかに記載のエクソソーム及び賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項２６】
巨大分子を実質的に含まず、前記巨大分子が、核酸、外因性タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、及びそれらの組み合わせから選択される、請求項２５に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれかに記載のエクソソームを産生するための細胞の集団。
【請求項２８】
ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片もしくは改変体を含む前記標的タンパク質をコードする外因性配列を含む、請求項２７に記載の細胞の集団。
【請求項２９】
さらに第２の標的タンパク質をコードする第２の外因性配列を含み、前記第２の標的タンパク質が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片もしくは改変体を含む、請求項２８に記載の細胞の集団。
【請求項３０】
さらに第２の標的タンパク質をコードする第２の外因性配列を含み、前記第２の標的タンパク質が、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはその断片を含む、請求項２８に記載の細胞の集団。
【請求項３１】
前記外因性配列が、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に挿入されており、前記外因性配列及び前記ゲノム配列が前記標的タンパク質をコードする、請求項２７〜３０のいずれかに記載の細胞の集団。
【請求項３２】
前記外因性配列が、プラスミド中にある、請求項２７〜３０のいずれかに記載の細胞の集団。
【請求項３３】
前記外因性配列が、治療ペプチドをコードする、請求項２７〜３２のいずれかに記載の細胞の集団。
【請求項３４】
前記治療ペプチドが、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される、請求項３３に記載の細胞の集団。
【請求項３５】
前記治療化合物が、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び小分子からなる群より選択される、請求項３３に記載の細胞の集団。
【請求項３６】
前記治療ペプチドが、抗体またはその断片もしくは改変体である、請求項３３に記載の細胞の集団。
【請求項３７】
前記治療ペプチドが、酵素、リガンド、受容体、転写因子、またはその断片もしくは改変体である、請求項３３に記載の細胞の集団。
【請求項３８】
前記治療ペプチドが、抗菌ペプチドまたはその断片もしくは改変体である、請求項３３に記載の細胞の集団。
【請求項３９】
前記外因性配列が、標的化部分をコードする、請求項３１に記載の細胞の集団。
【請求項４０】
前記標的化部分が、器官、組織、または細胞に特異的である、請求項３９に記載の細胞の集団。
【請求項４１】
前記第２の標的タンパク質がさらに、標的化部分を含む、請求項３０に記載の細胞の集団。
【請求項４２】
前記標的化部分が、器官、組織、または細胞に特異的である、請求項４１に記載の細胞の集団。
【請求項４３】
エクソソームを改変するためのポリペプチドであって、（ｉ）（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）、（ｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない）、または、（ｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない）の配列を含む、前記ポリペプチド。
【請求項４４】
配列番号４〜１１０のいずれかの配列を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４５】
配列番号１３の配列を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４６】
配列番号１１０の配列を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４７】
ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）（配列番号１１６）の配列を含む、請求項４３に記載のポリペプチド。
【請求項４８】
前記ポリペプチドが、カーゴペプチドに融合している、請求項４３〜４７のいずれかに記載のポリペプチド。
【請求項４９】
前記ポリペプチドが、前記カーゴペプチドのＮ末端に融合している、請求項４８に記載のポリペプチド。
【請求項５０】
請求項４３〜４９のいずれかに記載のポリペプチドをコードするコード配列を含む、ポリヌクレオチド構築物。
【請求項５１】
前記コード配列が、コドン最適化されている、請求項５０に記載のポリヌクレオチド構築物。
【請求項５２】
操作エクソソームの作製方法であって、
ａ．（ｉ）ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片もしくは改変体をコードする第１の配列、及び、（ｉｉ）カーゴペプチドをコードする第２の配列、を含む融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を細胞に導入するステップ、
ｂ．前記細胞に前記融合ポリペプチドを発現させることが可能な条件下に、前記細胞を維持するステップ、ならびに
ｃ．前記細胞から、前記融合ポリペプチドを含む前記操作エクソソームを得るステップ、を含む、前記方法。
【請求項５３】
前記第１の配列が、（ｉ）（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）、（ｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない）、または、（ｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない）の配列を含む、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記第１の配列が、配列番号４〜１１０のいずれかを含む、請求項５２〜５３のいずれかに記載の方法。
【請求項５５】
前記第１の配列が、配列番号１３を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１の配列が、配列番号１１０を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記第１の配列が、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（式中、Ｘは、任意のアミノ酸である）（配列番号１１６）を含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５８】
前記融合ポリペプチドが、異なるエクソソーム中の異なる標的タンパク質よりも高い密度で、前記操作エクソソームの前記内腔に存在し、前記異なる標的タンパク質が、従来のエクソソームタンパク質またはその多様体を含む、請求項５２〜５７のいずれかに記載の方法。
【請求項５９】
前記融合ポリペプチドが、前記異なるエクソソーム中の前記異なる標的タンパク質の２倍を超える高い密度で存在する、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記融合ポリペプチドが、前記異なるエクソソーム中の前記異なる標的タンパク質の４倍、１６倍、１００倍、または１０，０００倍を超える高い密度で存在する、請求項５９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月１７日に出願された米国仮特許出願第６２／５８７，７６７号、及び２０１８年２月２３日に出願された米国仮特許出願第６２／６３４，７５０号の利益を主張し、これらの開示は、あらゆる目的のために全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子提出された配列表を含み、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。２０１８年１１月１５日に作成された該ＡＳＣＩＩコピーは、４１４０６ＵＳ＿ＣＲＦ＿ｓｅｑｕｅｎｃｅｌｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔと名付けられ、サイズが５７，８３７バイトである。
【背景技術】
【０００３】
エクソソームは、細胞間情報伝達の重要なメディエーターである。それらは、がん等の多くの疾患の診断及び予後における重要なバイオマーカーでもある。薬物送達ビヒクルとして、エクソソームは、多くの治療分野における新しい処置モダリティとして、従来の薬物送達方法よりも多くの利点を提供する。
【０００４】
エクソソームの最も重要な特徴は、内部空間または内腔内に生物学的に活性なペイロードを含有する能力である。エクソソームが、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、炭水化物、及び脂質を含む内因性ペイロードを含有することがよく知られているが、所望の治療ペイロードを特異的に直接搭載する能力は現在制限されている。産生細胞において所望の治療ペイロードを過剰発現させることによりエクソソームに搭載させ得るが、この搭載は多くの場合、細胞エクソソーム処理センターへのペイロードの確率的な局在に起因して、制限された効率のものである。あるいは、精製されたエクソソームでは、例えば、エレクトロポレーションによりｅｘ  ｖｉｖｏで搭載され得る。これらの方法は、低い効率の問題があり得、またはｓｉＲＮＡ等の小さなペイロードに限定され得る。それ故、高効率であり、はっきりと定義された搭載エクソソームを生成するための好適な方法が、エクソソームベースの技術の治療のための使用及び他の適用をより可能にするのに必要とされる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
本発明の態様は、治療使用のために、エクソソームに搭載する新規方法に関する。具体的には、方法は、エクソソームの内腔から新たに同定されたタンパク質マーカーを使用する。特に、一群のタンパク質（例えば、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、及び脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１））が、エクソソームの内腔で高度に富化されることを確認した。さらに、ＢＡＳＰ１のアミノ末端の短い配列が、蛍光タンパク質カーゴ分子の高効率な搭載を導くのに、全長ＢＡＳＰ１タンパク質と同程度に十分であることが示された。１０アミノ酸未満のこの断片は、操作エクソソーム搭載の分野における重要な進歩を提示し、ｅｘ  ｖｉｖｏで操作の追加のステップのない、エクソソームの内腔への任意の治療タンパク質カーゴの効率的で再現可能な搭載を可能にする。本明細書に記載の融合タンパク質を使用したエクソソームへの搭載は、これまでに記載されている他の遺伝子工学的方法と比較して大いに高いレベルのカーゴを有する操作エクソソームを産生する。
【０００６】
エクソソームから新たに同定されたタンパク質及びペプチド配列が、本発明の種々の実施形態で使用される。例えば、一部の実施形態は、エクソソームタンパク質またはタンパク質断片及び治療関連タンパク質をコンジュゲートすることにより融合タンパク質を生成すること、ならびに、エクソソームの内腔に融合タンパク質を含有するエクソソームを産生することに関する。天然全長タンパク質または治療関連タンパク質の生物学的に活性な断片を、エクソソームで富化されたタンパク質またはタンパク質断片にコンジュゲートすることにより、エクソソームの内腔に輸送することができる。
【０００７】
本発明はさらに、より効率的な搭載のための、またはエクソソームの内腔への治療関連タンパク質の搭載のための、内腔操作エクソソームの生成または使用に関する。例えば、エクソソーム内腔は、より高い濃度の天然全長エクソソームタンパク質及び／または内腔中の天然エクソソームタンパク質の断片もしくは改変されたタンパク質を含有するように改変することができる。
【０００８】
本発明の一部の実施形態は、そのような内腔操作エクソソームを産生するための産生細胞、または産生細胞を生成する方法に関する。外因性ポリヌクレオチドを、産生細胞から内腔操作エクソソームを産生させるために、一時的または安定的に産生細胞に導入することができる。
【０００９】
従って、一態様では、本発明は、標的タンパク質を含むエクソソームを提供し、標的タンパク質の少なくとも一部は、外因性配列から発現され、標的タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片もしくは改変体を含む。
【００１０】
一部の実施形態では、標的タンパク質は、異なるエクソソーム中の異なる標的タンパク質よりも高い密度で、エクソソーム中に存在し、異なる標的タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質またはその多様体を含む。一部の実施形態では、従来のエクソソームタンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、及びそれらの断片からなる群より選択される。
【００１１】
一部の実施形態では、エクソソームは、外因性配列を含むように遺伝子改変された細胞から産生され、任意に、細胞は、ＨＥＫ２９３細胞である。
【００１２】
一部の実施形態では、細胞は、外因性配列を含むプラスミドを含む。
【００１３】
一部の実施形態では、外因性配列は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に対して３’または５’に位置するゲノム部位に挿入されている。一部の実施形態では、外因性配列は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に挿入されている。
【００１４】
一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片、及び治療ペプチドを含む融合タンパク質である。
【００１５】
一部の実施形態では、治療ペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される。一部の実施形態では、治療化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び小分子からなる群より選択される。一部の実施形態では、治療ペプチドは、抗体またはその断片もしくは改変体である。一部の実施形態では、治療ペプチドは、酵素、リガンド、受容体、転写因子、またはその断片もしくは改変体である。一部の実施形態では、治療ペプチドは、抗菌ペプチドまたはその断片もしくは改変体である。
【００１６】
一部の実施形態では、エクソソームはさらに、第２の標的タンパク質を含み、第２の標的タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片を含む。一部の実施形態では、エクソソームはさらに、第２の標的タンパク質を含み、第２の標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはその断片を含む
【００１７】
一部の実施形態では、標的タンパク質は、（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）のペプチドを含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）のペプチドを含み、式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない。一部の実施形態では、標的タンパク質は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）のペプチドを含み、式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない。
【００１８】
一部の実施形態では、標的タンパク質は、配列番号４〜１１０のいずれか１つのペプチドを含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫのペプチドを含むみ、式中、Ｘは、任意のアミノ酸である（配列番号１１６）。一部の実施形態では、標的タンパク質は、配列番号１１０のペプチドを含む。一部の実施形態では、標的タンパク質は、配列番号１３のペプチドを含む。
【００１９】
一部の実施形態では、標的タンパク質はさらに、カーゴペプチドを含む。
【００２０】
別の態様では、本発明は、エクソソーム及び賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【００２１】
一部の実施形態では、医薬組成物は、巨大分子を実質的に含まず、巨大分子は、核酸、外因性タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、及びそれらの組み合わせから選択される。
【００２２】
さらに別の態様では、本発明は、本明細書で提供されるエクソソームを産生するための細胞の集団を提供する。
【００２３】
一部の実施形態では、細胞の集団は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片もしくは改変体を含む標的タンパク質をコードする外因性配列を含む。一部の実施形態では、細胞の集団はさらに、第２の標的タンパク質をコードする第２の外因性配列を含み、第２の標的タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片もしくは改変体を含む。一部の実施形態では、細胞の集団はさらに、第２の標的タンパク質をコードする第２の外因性配列を含み、第２の標的タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーターまたはその断片を含む。
【００２４】
一部の実施形態では、外因性配列は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１をコードするゲノム配列に挿入されており、外因性配列及びゲノム配列は、標的タンパク質をコードする。一部の実施形態では、外因性配列は、プラスミド中にある。
【００２５】
一部の実施形態では、外因性配列は、治療ペプチドをコードする。一部の実施形態では、治療ペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される。一部の実施形態では、治療化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、及び小分子からなる群より選択される。一部の実施形態では、治療ペプチドは、抗体またはその断片もしくは改変体である。一部の実施形態では、治療ペプチドは、酵素、リガンド、受容体、転写因子、またはその断片もしくは改変体である。一部の実施形態では、治療ペプチドは、抗菌ペプチドまたはその断片もしくは改変体である。
【００２６】
一部の実施形態では、外因性配列は、標的化部分をコードする。一部の実施形態では、標的化部分は、器官、組織、または細胞に特異的である。
【００２７】
一部の実施形態では、第２の標的タンパク質はさらに、標的化部分を含む。一部の実施形態では、標的化部分は、器官、組織、または細胞に特異的である。
【００２８】
一態様では、本発明は、（ｉ）（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）、（ｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない）、または、（ｉｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない）の配列を含む、エクソソームを改変するためのポリペプチドを提供する。
【００２９】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号４〜１１０のいずれかの配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１３の配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１１０の配列を含む。一部の実施形態では、ポリペプチドは、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫの配列を含み、式中、Ｘは、任意のアミノ酸である（配列番号１１６）。
【００３０】
一部の実施形態では、ポリペプチドは、カーゴペプチドに融合している。一部の実施形態では、ポリペプチドは、カーゴペプチドのＮ末端に融合している。
【００３１】
一態様では、本発明は、本明細書で提供されるポリペプチドをコードするコード配列を含むポリヌクレオチド構築物を提供する。一部の実施形態では、コード配列は、コドン最適化されている。
【００３２】
別の態様では、本発明は、操作エクソソームを作製する方法を提供し、該方法は、ａ．（ｉ）ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片もしくは改変体をコードする第１の配列、及び、（ｉｉ）カーゴペプチドをコードする第２の配列、を含む融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を細胞に導入するステップ、ｂ．細胞に融合ポリペプチドを発現させることが可能な条件下で、細胞を維持するステップ、ならびに、ｃ．該細胞から融合ポリペプチドを含む操作エクソソームを得るステップを含む。
【００３３】
一部の実施形態では、第１の配列は、（ｉ）（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）、（ｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない）、または、（ｉｉｉ）（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない）の配列を含む。
【００３４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号４〜１１０のいずれかの配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１３の配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１１０の配列を含む。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫの配列を含み、式中、Ｘは、任意のアミノ酸である（配列番号１１６）。
【００３５】
一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、異なるエクソソーム中の異なる標的タンパク質よりも高い密度で、操作エクソソームの内腔に存在し、異なる標的タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質またはその多様体を含む。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、異なるエクソソーム中の異なる標的タンパク質の２倍を超える密度で存在する。一部の実施形態では、融合ポリペプチドは、異なるエクソソーム中の異なる標的タンパク質の４倍、１６倍、１００倍、または１０，０００倍高い密度で存在する。
【００３６】
図は、単に例示を目的として本発明の種々の実施形態を示す。本明細書に例示する構造及び方法の代替実施形態が、本明細書に記載の本発明の原理から逸脱することなく用いられ得ることを、当業者は以下の考察から容易に認識するであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】超遠心分離後の試料含有Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配の画像を提供する。括弧でマークされているのは、エクソソームを含む上部画分（「上部」）、細胞破片を含む中間画分（「中間」）、ならびに高密度凝集体及び細胞破片を含有する下部画分（「下部」）である。
【図２】Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）超遠心分離の上部画分から同定されたタンパク質（Ｙ軸）及び下部画分から同定されたタンパク質（Ｘ軸）を示すドットグラフである。点線より上にプロットされたタンパク質は、エクソソームで富化されたタンパク質（ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＨＳＬ１、及びＢＡＳＰ１を含む）を表すが、点線より下のものは、エクソソームに特異的ではないタンパク質を表す。
【図３】ＭＡＲＣＫＳ（配列番号１）のトリプシンペプチドカバレッジマップを提供する。
【図４】ＭＡＲＣＫＳＬ１（配列番号２）のトリプシンペプチドカバレッジマップを提供する。
【図５】ＢＡＳＰ１（配列番号３）のトリプシンペプチドカバレッジマップを提供する。
【図６】Ａは、ＨＥＫ２９３細胞から収集された全細胞溶解物（左）及び精製されたエクソソーム集団（右）のタンパク質ブロッティングの写真を示す。Ａに提供されるゲルのウェスタンブロッティングは、ＭＡＲＣＫＳ（Ｂ）、ＭＡＲＣＫＳＬ１（Ｃ）、及びＢＡＳＰ１（Ｄ）が、精製エクソソームに局在し、全細胞溶解物中で検出されないか、またはエクソソームと比較して細胞溶解物中で実質的に低いレベルであること示す。
【図７】アミノ酸１〜３０を含有するＭＡＲＣＫＳの断片、ＣＤ８１、またはｐＤｉｓｐｌａｙに融合しているＧＦＰを含有する精製されたエクソソームの蛍光強度を示す。
【図８】全長ＭＡＲＣＫＳＬ１、アミノ酸１〜３０を含有するＭＡＲＣＫＳＬ１の断片、ＣＤ８１、またはｐＤｉｓｐｌａｙに融合しているＧＦＰを含有する精製されたエクソソームの蛍光強度を示す。
【図９】全長ＢＡＳＰ１、アミノ酸１〜３０を含有するＢＡＳＰ１の断片、ＣＤ８１、またはｐＤｉｓｐｌａｙに融合しているＧＦＰを含有する精製されたエクソソームの蛍光強度を示す。
【図１０】エクソソームに搭載するのに十分である最小のＢＡＳＰ１  Ｎ末端配列を決定するために使用された融合タンパク質の概略図を示す（それぞれ出現順に配列番号１２２〜１３４）。融合タンパク質には、「ｐＣＢ」で提供される番号が割り当てられる。
【図１１】ＧＦＰに融合しているＢＡＳＰ１断片を発現するように操作されたエクソソームの蛍光シグナルを測定するナノフローサイトメトリーのグラフを示す。ｘ軸は、図１０に提供されるように、種々の融合タンパク質に割り当てられた番号に従って番号付けされる。
【図１２】染色されたタンパク質ゲルの写真を示し、これは、ＧＦＰに融合しているＢＡＳＰ１断片が搭載されたエクソソームへの搭載が等しいことを示す。点線の矢印は、ＢＡＳＰ１融合タンパク質の移動位置を示す。レーンは、図１０に提供されるように、種々の融合タンパク質に割り当てられた番号に従って番号付けされる。
【図１３】全タンパク質を標識するクーマシーブルーで染色されたタンパク質ゲルの写真を示す。点線の矢印は、ＢＡＳＰ１融合タンパク質の移動位置を示す。レーンは、図１０に提供されるように、種々の融合タンパク質に割り当てられた番号で標識される。
【図１４】ＦＬＡＧ及びＧＦＰに融合しているＢＡＳＰ１断片を含有する精製されたエクソソームの抗ＦＬＡＧタンパク質ブロットの写真を示す。レーンは、図１０に提供されるように、種々の融合タンパク質に割り当てられた番号に従って番号付けされる。
【図１５】ＦＬＡＧ及びＧＦＰに融合しているＢＡＳＰ１断片を含有する精製されたエクソソームの抗Ａｌｉｘタンパク質ブロットの写真を示し、これにより、タンパク質搭載が等しいことを確認される。レーンは、図１０に示されるタンパク質配列に従って番号付けされる。
【図１６Ａ】ＦＬＡＧタグ及びＧＦＰに融合しているＢＡＳＰ１断片を含む融合タンパク質の配列（それぞれ出現順に配列番号１３５〜１４２）を示す。
【図１６Ｂ】図１６Ａの融合タンパク質の１つを安定的に発現する細胞から精製されたエクソソームの抗ＦＬＡＧウェスタンブロット結果を示す。
【図１７Ａ】ＦＬＡＧタグならびにＧＦＰに融合しているＢＡＳＰ１断片（１〜３０）由来の配列（配列番号４）及びその改変体（１〜３０−Ｓ６Ｄ、１〜３０−Ｓ６Ａ、及び１〜３０−Ｌ５Ｑ）（出現順にそれぞれ配列番号１４３〜１４５）を示す。
【図１７Ｂ】図１７Ａの融合タンパク質の１つを安定的に発現する細胞から精製されたエクソソームの抗ＦＬＡＧウェスタンブロット結果を示す。
【図１８】全長ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、または、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜３０を安定的に発現する細胞から精製されたエクソソーム試料を含むクーマシー染色タンパク質ゲルの画像を示し、全ては、ＦＡＬＧ−ＧＦＰに融合している。画像上の黒矢印は、融合タンパク質に対応するバンドを示す。
【図１９】ＢＡＳＰ１の最初の２８個のアミノ酸（保存領域１）、ＭＡＲＣＫＳのアミノ酸１〜７及び１５２〜１７３（保存領域２）、ならびに、ＭＡＲＣＫＳＬ１のアミノ酸１〜７及び８７〜１１０（保存領域３）間のタンパク質配列アラインメントを示す。
【図２０Ａ】ＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜３０（「ＢＡＳＰ１〜３０」）（配列番号４）ならびにＭＡＲＣＫＳのＰＳＤドメインまたはその改変体に融合しているＭＡＲＣＫＳのアミノ酸１〜３またはその改変体を含む融合タンパク質（「ＭＡＲＣＫＳ−ＭＧ−ＰＳＤ」、「ＭＡＲＣＫＳ−ＭＡ−ＰＳＤ」、「ＭＡＲＣＫＳ−ＭＧ−ＰＳＤ−Ｋ６Ｓ」、及び「ＭＡＲＣＫＳ−ＭＧ−ＰＳＤ−Ｋ６Ａ」）（それぞれ出現順に配列番号１４６〜１４９）の配列を示す。ＭＡＲＣＫＳ配列に導入されている点変異は、太字である。
【図２０Ｂ】図２０Ａのアミノ酸配列及びＦＬＡＧを含む融合タンパク質を安定的に発現する細胞から精製されたエクソソームの抗ＦＬＡＧウェスタンブロッティング結果を示す。
【図２１】ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１の機能試験に由来する３つの異なるコンセンサス配列、ならびに、エクソソームの内腔にカーゴを搭載するための配列のそれぞれのアミノ酸要件（配列番号１１８）を示す。
【図２２Ａ】天然エクソソームまたはＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜１０もしくは１〜３０に融合しているＣａｓ９を安定的に発現する細胞から精製されたエクソソーム、及び漸減量の組み換えＣａｓ９の全タンパク質（上）及び抗Ｃａｓ９ウェスタンブロット（下）を示す。
【図２２Ｂ】上の図は、図２２Ａのウェスタンブロット結果のＣａｓ９デンシトメトリーに由来する標準曲線を示す。下の図は、さらに、標準曲線に基づいて推定された、ＢＡＳＰ１の１〜３０アミノ酸または１〜１０アミノ酸断片にコンジュゲートされた融合タンパク質として、それぞれの精製されたエクソソームごとに搭載されたＣａｓ９の量を提供する。
【図２３Ａ】オボアルブミンに融合しているＢＡＳＰ１  Ｎ末端（アミノ酸１〜１０）融合体（「ＢＡＳＰ１（１〜１０）−ＯＶＡ」）を発現する構築物で安定的にトランスフェクトされた細胞、または２つの構築物（一方は、オボアルブミンへのＢＡＳＰ１  Ｎ末端（アミノ酸１〜１０）融合体を発現し、他方は、膜貫通タンパク質ＰＴＧＦＲＮに融合しているＣＤ４０Ｌを発現する）（「ＢＡＳＰ１（１〜１０）−ＯＶＡ、３ＸＣＤ４０Ｌ−ＰＴＧＦＲＮ」）で安定的にトランスフェクトされた細胞から精製されたエクソソームのタンパク質ゲル画像を示す。さらに、漸減量の組み換えＯＶＡをロードするタンパク質ゲル搭載の画像を示す。
【図２３Ｂ】図２３Ａの試料の抗オボアルブミンウェスタンブロット結果を示す。
【図２４Ａ】ＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜１０及びＦＬＡＧタグに融合しているＧＦＰに対するラクダ科動物ナノボディの配列（配列番号１５０）を示す。
【図２４Ｂ】図２４Ａの融合タンパク質（「ＢＡＳＰ１（１〜１０）−ナノボディ」）またはＢＡＳＰ１配列を欠くタンパク質（「ナノボディ」）を安定的に発現する細胞から精製されたエクソソームのタンパク質ゲル及び抗ＦＬＡＧウェスタンブロット結果を示す。
【図２５】（ｉ）ＦＬＡＧ及び単量体または二量体ＭＣＰ多様体（１ＸＭＣＰ（Ｖ２９Ｉ）（「８１５」、配列番号１１１）、１ＸＭＣＰ（Ｖ２９Ｉ／Ｎ５５Ｋ）（「８１７」、配列番号１１２）、２ＸＭＣＰ（Ｖ２９Ｉ）（「８１９」、配列番号１１３）、または２ＸＭＣＰ（Ｖ２９Ｉ／Ｎ５５Ｋ））（「８２１」、配列番号１１４）に融合しているＢＡＳＰ１（１〜３０）、ならびに、（ｉｉ）３ｘＭＳ２ヘアピンループを含有するシフェラーゼｍＲＮＡ（「ルシフェラーゼ−ＭＳ２  ｍＲＮＡ」または「８１１」、配列番号１１５）、を含有するエクソソームｍＲＮＡ搭載システムの概略図を示す。
【図２６Ａ】図２５に記載のｍＲＮＡ搭載構築物（種々のＢＡＳＰ１融合タンパク質（８１５、８１７、または８１９）と組み合わせたルシフェラーゼｍＲＮＡ（８１１））を含有するエクソソームのタンパク質ゲルを示す。
【図２６Ｂ】図２６Ａの試料の抗ＦＬＡＧウェスタンブロットを示す。
【図２７Ａ】図２５に示されるｍＲＮＡ搭載構築物を含有する細胞（上）またはエクソソーム（下）中のルシフェラーゼｍＲＮＡの量のＲＴ−ｑＰＣＲの結果を示す。
【図２７Ｂ】図２７Ａの試料から精製されたエクソソーム中のルシフェラーゼｍＲＮＡの量を定量する表を示し、これは、ルシフェラーゼｍＲＮＡの確率的な搭載からの倍率富化を含む。
【図２８】エクソソーム内腔に固定された貫通タンパク質の外表面提示を可能にする、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１のＮ末端断片に融合しているＣＤ４０Ｌ三量体の概略図を示す。
【図２９Ａ】ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１のＮ末端断片に融合したＣＤ４０Ｌ表面発現エクソソームと共にインキュベートされた培養物におけるマウスＢ細胞活性化の結果を示す。
【図２９Ｂ】ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１のＮ末端断片に融合したＣＤ４０Ｌ表面発現エクソソームと共にインキュベートされた培養物におけるヒトＢ細胞活性化の結果を示す。
【図２９Ｃ】ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、または全長ＰＴＧＦＲＮのＮ末端配列に融合した時の、異なるＣＤ４０Ｌ表面提示エクソソームの相対的効力のチャートを示す。
【図３０】異なる起源の種々の細胞株（ＨＥＫ２９３ＳＦ：腎臓、ＨＴ１０８０：結合組織、Ｋ５６２：骨髄、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：乳房、Ｒａｊｉ：リンパ芽球、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）：骨髄）から精製されたエクソソーム中の内腔タンパク質（ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１）ならびに従来のエクソソームタンパク質（ＣＤ８１及びＣＤ９）のペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）の数を示す。
【図３１】チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞由来のみのエクソソーム、または、ＦＬＡＧ−ＧＦＰに融合しているＢＡＳＰ１もしくはＢＡＳＰ１  Ｎ末端断片（１〜３０または１〜８）を過剰発現する細胞からのエクソソームのタンパク質ゲル（左）及び抗ＦＬＡＧウェスタンブロット（右）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
定義
別途記載のない限り、本明細書で使用される全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般に理解する意味を有する。本明細書で使用される場合、以下の用語は、下記のそれらに帰する意味を有する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「細胞外小胞」または「ＥＶ」という用語は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小胞を指す。細胞外小胞は、それらが由来する細胞より小さな直径を有する全て膜に包まれた小胞を含む。一般に、細胞外小胞は、２０ｎｍ〜１０００ｎｍの範囲の直径を有し、細胞外小胞の外表面上に提示され及び／または膜を貫通する種々の巨大分子ペイロードを内部空間内に含み得る。該ペイロードは、核酸、タンパク質、炭水化物、脂質、小分子、及び／またはそれらの組み合わせを含み得る。限定ではなく例として、細胞外小胞は、アポトーシス小体、細胞の断片、直接的または間接的な操作により（例えば、連続的な押し出しまたはアルカリ溶液を用いる処理により）細胞から誘導される小胞、小胞化したオルガネラ、及び生細胞から（例えば、直接的な原形質膜の発芽または後期エンドソームの原形質膜との融合により）産生される小胞を含む。細胞外小胞は、生きているもしくは死んだ生物、外植した組織もしくは器官、及び／または培養した細胞から誘導することができる。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「エクソソーム」という用語は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小さな（２０〜３００ｎｍの直径、より好ましくは、４０〜２００ｎｍの直径）小胞を指し、これは、直接的な原形質膜出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合により該細胞から生じる。エクソソームは、細胞外小胞の一種である。エクソソームは、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意に、ペイロード（例えば、治療薬）、レシーバ（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖、もしくはグリカン）または他の分子を含む。エクソソームは、産生細胞から誘導することができ、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づき、産生細胞から単離することができる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、「ナノ小胞」という用語は、内部空間を囲む膜を含む細胞由来の小さな（２０〜２５０ｎｍの直径、より好ましくは３０〜１５０ｎｍの直径）小胞を指し、これは、直接的または間接的な操作により該細胞から生じ、その結果、該ナノ小胞は、該操作なしには該産生細胞から産生されないであろう。該産生細胞の好適な操作は、限定されないが、連続的な押し出し、アルカリ溶液を用いる処理、超音波処理、またはそれらの組み合わせを含む。ナノ小胞の産生は、一部の場合では、該産生細胞の破壊をもたらし得る。好ましくは、ナノ小胞の集団は、原形質膜からの直接的出芽または後期エンドソームの原形質膜との融合の手段による産生細胞に由来する小胞を実質的に含まない。ナノ小胞は、脂質または脂肪酸及びポリペプチドを含み、任意に、ペイロード（例えば、治療薬）、レシーバ（例えば、標的化部分）、ポリヌクレオチド（例えば、核酸、ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）、糖（例えば、単糖、多糖、もしくはグリカン）または他の分子を含む。ナノ小胞は、一旦該操作に従って産生細胞から生じると、そのサイズ、密度、生化学的パラメータ、またはそれらの組み合わせに基づき、産生細胞から単離されてもよい。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「内腔操作エクソソーム」という用語は、組成が改変された内部の内腔空間を有するエクソソームを指す。例えば、内腔は、タンパク質、脂質、小分子、炭水化物、等の組成が改変されている。組成は、化学的、物理的、もしくは生物学的方法により、または化学的、物理的、もしくは生物学的方法により以前に改変された細胞から産生されることにより、変化させることができる。具体的には、組成は、遺伝子工学により、または遺伝子工学により以前に改変された細胞から産生されることにより、変化させることができる。
【００４３】
本明細書で使用される場合、タンパク質の「改変体」という用語は、タンパク質の非変異型アミノ酸配列と少なくとも１５％同一性を有するタンパク質を指す。タンパク質の改変体は、タンパク質の断片または多様体を含む。タンパク質の改変体はさらに、タンパク質の断片または多様体への化学的または物理的改変体を含み得る。
【００４４】
本明細書で使用される場合、タンパク質の「断片」という用語は、天然に生じるタンパク質と比較して、Ｎ末端及び／またはＣ末端が欠失しているタンパク質を指す。好ましくは、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１の断片は、エクソソームの内腔を特異的に標的とする能力を保持する。このような断片は、「機能性断片」とも称される。断片がその意味において機能性断片であるか否かは、ウェスタンブロット、ＦＡＣＳ分析、及び、例えば、ＧＦＰのような自家蛍光タンパク質との断片の融合を含む、エクソソームのタンパク質内容物を決定する任意の既知の方法で評価することができる。特定の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１の断片は、天然に存在するＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、またはＢＡＳＰ１がエクソソームを特異的に標的とする能力の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％を保持する。特定の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１の多様体、または、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１の断片の能力は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１がそれぞれエクソソームの内腔を特異的に標的する能力の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％である。この能力は、実験セクションで説明されるアッセイ、例えば、蛍光標識された多様体により評価することができる。
【００４５】
本明細書で使用される場合、タンパク質の「多様体」という用語は、当該技術分野で既知の方法によるアラインメント時に、別のタンパク質と、特定のアミノ酸配列同一性を共有するタンパク質を指す。タンパク質の多様体は、別のタンパク質における置換、挿入、欠失、フレームシフト、または再編成を含み得る。特定の実施形態では、多様体は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、または、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１の断片と少なくとも７０％の同一性を有する多様体である。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳの多様体または断片の多様体は、配列番号１に従うＭＡＲＣＫＳまたはその機能性断片と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１の多様体または断片の多様体は、配列番号２に従うＭＡＲＣＫＳＬ１またはその機能性断片と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％配列同一性を共有する。一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１の多様体または断片の多様体は、配列番号３に従うＢＡＳＰ１またはその機能性断片と、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％配列同一性を共有する。上記場合のそれぞれでは、多様体または断片の多様体は、エクソソームの内腔を特異的に標的とする能力を保持することが好ましい。
【００４６】
比較のための配列のアラインメント法は、当該技術分野で周知である。種々のプログラム及びアラインメントアルゴリズムは、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏ．４８：４４３（１９７０）、Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，Ｇｅｎｅ  ７３：１５  ２３７−４４（１９８８）、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ，ＣＡＢＩＯＳ  ５：１５１−３（１９８９）Ｃｏｒｐｅｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：１０８８１−９０（１９８８）、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｍｐ．Ａｐｐｌ．ＢｉｏＳｃｉ．８：１５５−６５（１９９２）、及びＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１（１９９４）に記載される。ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）［Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ２０  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０（１９９０）Ｊは、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＢＣｌ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．）を含むいくつかの供給源、ならびにインターネット上から入手可能であり、配列解析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｍ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ及びｔｂｌａｓｔｘに関連して使用される。ＢＬＡＳＴ及びプログラムを使用した配列同一性を決定する方法の説明は、ＮＩＨ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）下のＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）の公式ウェブサイトでアクセスすることができる。
【００４７】
本明細書で提供される任意のタンパク質の列挙は、タンパク質の機能性多様体を包含する。タンパク質の「機能的多様体」という用語は、エクソソームの内腔を特異的に標的とする能力を保持するタンパク質の多様体を指す。特定の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１の機能的多様体、または、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、もしくはＢＡＳＰ１の断片の能力は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１がそれぞれエクソソームの内腔を特異的に標的とする能力の少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％である。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「産生細胞」という用語は、エクソソームを生成するために使用される細胞を指す。産生細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで培養された細胞、またはｉｎ  ｖｉｖｏの細胞とし得る。産生細胞は、限定されないが、エクソソームの生成に有効であると知られている細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、及び間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む。
【００４９】
本明細書で使用される場合、「標的タンパク質」または「標的ペプチド」という用語は、エクソソームの内腔を標的とし得るタンパク質またはペプチドを指す。標的タンパク質またはペプチドは、エクソソーム内腔を自然に標的とする非変異型タンパク質、または非変異型タンパク質の断片もしくは改変体とし得る。標的タンパク質は、ｆｌａｇタグ、治療ペプチド、標的化部分、あるいは、非変異型タンパク質または非変異型タンパク質の改変体もしくは断片に結合している他のペプチドを含有する融合タンパク質とし得る。標的タンパク質は、ミリストイル化、プレニル化、もしくはパルミトイル化等の改変、またはリンカーにより膜の内部小葉に結合している可溶性タンパク質を含み得る。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「カーゴタンパク質」または「カーゴペプチド」という用語は、任意のタンパク質もしくはペプチド、またはその断片もしくは改変体を指し、これらは、エクソソームまたは操作エクソソーム中に搭載することができるものを指す。カーゴタンパク質またはペプチドは、エクソソームと接触する標的（例えば、標的細胞）に作用する治療ペプチドまたはタンパク質を含んでもよい。カーゴタンパク質は、カーゴ融合タンパク質がエクソソーム内腔を標的とし得るように、上記のような標的化タンパク質もしくはペプチドまたはその断片もしくは改変体を含む融合タンパク質であってよい。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「夾雑タンパク質」という用語は、エクソソームと関連しないタンパク質を指す。例えば、夾雑タンパク質は、エクソソームに囲まれておらず且つエクソソームの膜に結合していないかまたは組み込まれていないタンパク質を含む。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「単離」、「単離された」、及び「単離すること」、または、「精製」、「精製された」、及び「精製すること」、ならびに、「抽出された」及び「抽出すること」は、互換的に使用され、精製の１つ以上のプロセスを受けている所望のＥＶの調製物の状態（例えば、複数の既知または未知の量及び／または濃度）、例えば、所望のエクソソーム調製物の選択または富化を指す。一部の実施形態では、単離することまたは精製することは、本明細書で使用される場合、産生細胞を含有する試料からエクソソーム（例えば、画分）を取り出す、部分的に取り出すプロセスである。一部の実施形態では、単離されたエクソソーム組成物は、検出可能な望ましくない活性を有さない、またあるいは、望ましくない活性のレベルもしくは量が許容可能なレベルもしくは量以下である。他の実施形態では、単離されたエクソソーム組成物は、許容可能な量及び／または濃度以上の所望のエクソソームの量及び／または濃度を有する。他の実施形態では、単離されたエクソソーム組成物は、その組成物が得られた出発物質（例えば、産生細胞調製物）と比較して富化される。この富化は、出発物質と比較して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．９％、９９．９９％、９９．９９９％、９９．９９９９％、または９９．９９９９％超とし得る。一部の実施形態では、単離されたエクソソーム調製物は、残留生物由来物質を実質的に含まない。一部の実施形態では、単離されたエクソソーム調製物は、任意の夾雑生物質を、１００％含まない、９９％含まない、９８％含まない、９７％含まない、９６％含まない、９５％含まない、９４％含まない、９３％含まない、９２％含まない、９１％含まない、または９０％含まない。残留生物由来物質は、非生物的物質（化学的な物質を含む）もしくは不要な核酸、タンパク質、脂質、または代謝産物を含み得る。残留生物由来物質を実質的に含まないということは、エクソソーム組成物が、検出可能な産生細胞を含有せず、エクソソームのみが検出可能であることも意味し得る。
【００５３】
「賦形剤」または「担体」という用語は、化合物の投与をさらに容易にするために医薬組成物に添加される不活性物質を指す。「薬学的に許容される担体」または「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、ヒトを含む動物における使用に関して米国連邦政府の規制当局によって承認されたまたは米国薬局方において列挙された任意の薬剤、ならびに著しい刺激を対象に引き起こさず、投与された化合物の生物学的活性及び特性を抑制しない、任意の担体または希釈剤を包含する。医薬組成物の調製において有用であり、一般に安全で、非毒性であり、望ましい賦形剤及び担体を含む。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「ペイロード」という用語は、ＥＶと接触している標的（例えば、標的細胞）に作用する治療薬を指す。エクソソーム及び／または産生細胞に導入することができるペイロードは、ヌクレオチド（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含むか、または転写を阻害するヌクレオチド）、核酸（例えば、酵素等のポリペプチドをコードするＤＮＡもしくｍＲＮＡ分子、またはｍｉＲＮＡ、ｄｓＤＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、及びｓｉＲＮＡ等の制御機能を有するＲＮＡ分子）、アミノ酸（例えば、検出可能な部分もしくは毒素を含むか、または翻訳を阻害するアミノ酸）、ポリペプチド（例えば、酵素）、脂質、炭水化物、ウイルス及びウイルス粒子（例えば、アデノ随伴ウイルス及びウイルス粒子、レトロウイルス、アデノウイルス等）、ならびに、小分子（例えば、ＭＬ−ＲＲ  Ｓ２及び３’−３’ｃＡＩＭＰｄＦＳＨ等の環状ジヌクレオチドを含む小分子ＳＴＩＮＧアゴニストを含む小分子薬及び毒素）等の治療薬を含む。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「哺乳動物対象」は、限定されないが、ヒト、家畜（例えば、イヌ、ネコ等）、家畜（例えば、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ等）及び実験動物（例えば、サル、ラット、マウス、ウサギ、モルモット等）を含む全ての哺乳動物を含む。
【００５６】
「個体」、「対象」、「宿主」、及び「患者」という用語は、本明細書で互換可能に使用され、診断、処置、または治療が望まれる任意の哺乳動物対象、特にヒトを指す。本明細書に記載の方法は、ヒト治療及び獣医学の両方の用途に適用可能である。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物であり、他の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「実質的に含まない」という用語は、エクソソームを含む試料が、質量／体積（ｍ／ｖ）百分率濃度で１０％未満の巨大分子を含むことを意味する。一部の画分は、０．００１％未満、０．０１％未満、０．０５％未満、０．１％未満、０．２％未満、０．３％未満、０．４％未満、０．５％未満、０．６％未満、０．７％未満、０．８％未満、０．９％未満、１％未満、２％未満、３％未満、４％未満、５％未満、６％未満、７％未満、８％未満、９％未満、または１０％未満（ｍ／ｖ）の巨大分子を含有してもよい。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「巨大分子」という用語は、核酸、外因性タンパク質、脂質、炭水化物、代謝産物、またはそれらの組み合わせを意味する。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「従来のエクソソームタンパク質」という用語は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリンＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、その断片、またはそれに結合するペプチドを含むがこれらに限定されない、エクソソームにおいて富化すると以前に知られているタンパク質を意味する。誤解を避けるために、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはその断片もしくは多様体は、従来のエクソソームタンパク質ではない。
【００６０】
他の解釈に関する規定
本明細書に列挙された範囲は、列挙された端点を含む、範囲内の全ての値の略記であると理解される。例えば、１〜５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、及び５０からなる群の任意の数、数の組み合わせ、または下位範囲を含むと理解される。
【００６１】
別途指示のない限り、１つ以上の立体中心を有する化合物への言及は、その各立体異性体、及び立体異性体の全ての組み合わせを意図する。
【００６２】
エクソソームタンパク質
本発明の一部の実施形態は、エクソソーム内腔中で高度に富化されたエクソソームタンパク質の同定、使用、及び改変に関する。このようなエクソソームタンパク質は、高度に精製されたエクソソームを、質量分析または当該技術分野で既知の他の方法を用いて、分析することにより同定することができる。
【００６３】
タンパク質は、エクソソーム膜上で富化された膜貫通タンパク質、内在性タンパク質、及び末梢タンパク質等の種々の内腔タンパク質または膜タンパク質を含む。具体的には、タンパク質は、限定されないが、（１）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、（２）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）；及び、（３）脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）を含む。
【００６４】
本明細書で同定された１つ以上のエクソソームタンパク質は、エクソソームの産生細胞、産生条件、精製方法、または意図される用途に応じて選択的に使用することができる。特定のサイズ範囲、標的化部分、電荷密度、ペイロード等を有する、特定のエクソソームの内腔で富化されたエクソソームタンパク質を、本発明の一部の実施形態では、同定及び使用することができる。一部の実施形態では、治療エクソソームの生成及び単離のために、複数のエクソソームタンパク質を同時にまたはその後に使用することができる。
【００６５】
内腔操作エクソソーム
本発明の別の態様は、内腔操作エクソソームの生成及び使用に関する。内腔操作エクソソームは、組成が改変された内部空間を有する。例えば、内腔の組成は、内腔のタンパク質、脂質、またはグリカンの含有量を変更することにより変更することができる。
【００６６】
一部の実施形態では、内腔操作エクソソームは、ＰＥＧ誘導融合及び／または超音波融合等の化学的及び／または物理的方法により生成される。
【００６７】
他の実施形態では、内腔操作エクソソームは、遺伝子操作により生成される。遺伝子改変された産生細胞または遺伝子改変された細胞の後代から産生されたエクソソームは、改変された内腔組成を含有し得る。一部の実施形態では、内腔操作エクソソームは、より高いもしくはより低い密度のエクソソームタンパク質を有するか、または、エクソソームタンパク質の改変体もしくは断片を含む。
【００６８】
例えば、内腔操作エクソソームは、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の改変体もしくは断片をコードする外因性配列で形質転換された細胞から産生することができる。外因性配列から発現されたタンパク質を含むエクソソームは、改変された内腔タンパク質組成を含み得る。
【００６９】
エクソソームタンパク質の種々の改変体または断片は、本発明の実施形態に使用することができる。例えば、エクソソーム内腔をより効果的に標的とするように改変されたタンパク質を使用することができる。エクソソーム内腔への特異的且つ効果的な標的化に必要な最小限の断片を含むように改変されたタンパク質を使用することもできる。
【００７０】
治療活性を有する融合タンパク質を使用することもできる。例えば、融合タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその改変体、特に、その断片または多様体、及び治療ペプチドまたはカーゴタンパク質もしくはペプチドを含み得る。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＢＡＳＰ１のアミノ末端の断片を含む。
【００７１】
治療ペプチドは、天然ペプチド、組み換えペプチド、合成ペプチド、または治療化合物へのリンカーからなる群より選択される。治療化合物は、ヌクレオチド、アミノ酸、脂質、炭水化物、または小分子とし得る。治療ペプチドは、抗体、酵素、リガンド、抗原（例えば、腫瘍抗原、または、細菌、ウイルス、真菌、もしくは原生動物等の感染性因子由来の抗原）、受容体、抗菌ペプチド、転写因子、あるいはその断片または改変体とし得る。融合タンパク質は、エクソソームの内腔に提示することができ、エクソソームに治療活性を提供する。
【００７２】
一部の実施形態では、治療ペプチドは、ゲノム編集複合体の構成成分である。一部の実施形態では、該ゲノム編集複合体は、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬエフェクターヌクレアーゼもしくはＴＡＬＥＮ）；ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）；リコンビナーゼ；ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９複合体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１複合体、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃ２ｃ１、Ｃ２ｃ２もしくはＣ２ｃ３複合体、ＣＲＩＳＰＲ／ＣａｓＹもしくはＣａｓＸ複合体、または当該技術分野で既知の他の任意の適切なＣＲＩＳＰＲ複合体；または、当該技術分野で既知の他の任意の適切なゲノム編集複合体、あるいは、それらの任意の組み合わせである。
【００７３】
一部の実施形態では、治療ペプチドは、膜貫通型ペプチドである。本明細書に記載の膜貫通ペプチドは、本明細書に記載の配列のいずれか、またはその任意の断片もしくは多様体への融合タンパク質として発現されてもよい。一部の実施形態では、膜貫通タンパク質は、エクソソームの内腔の内腔配列に融合している第１の端部及びエクソソームの表面上で発現した第２末端を有する。一部の実施形態では、膜貫通タンパク質は、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはその断片もしくは多様体を含む。
【００７４】
一部の実施形態では、治療ペプチドは、核酸結合タンパク質である。一部の実施形態では、核酸結合タンパク質は、ダイサー、アルゴノートタンパク質、ＴＲＢＰ、ＭＳ２バクテリオファージコートタンパク質である。一部の実施形態では、核酸結合タンパク質はさらに、１つ以上のＲＮＡまたはＤＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、１つ以上のＲＮＡは、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ガイドＲＮＡ、ｌｉｎｃＲＮＡ、ｍＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｄｓＲＮＡ、またはそれらの組み合わせである。
【００７５】
一部の実施形態では、治療ペプチドは、タンパク質−タンパク質相互作用系の一部である。一部の実施形態では、タンパク質−タンパク質相互作用系は、ＦＲＢ−ＦＫＢＰ相互作用系、例えば、Ｂａｎａｓｚｙｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ．２００５  Ａｐｒ  ６；１２７（１３）：４７１５−２１に記載のようなＦＲＢ−ＦＫＢＰ相互作用系を含む。
【００７６】
融合タンパク質は、エクソソームの内腔を標的とし、治療活性をエクソソームに提供することができる。
【００７７】
一部の実施形態では、標的化部分を有する融合タンパク質を使用する。例えば、融合タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片もしくは改変体、及び標的化部分を含み得る。標的化部分は、エクソソームを使用する処置のために、エクソソームを特定の器官、組織、または細胞に標的化するために使用することができる。一部の実施形態では、標的化部分は、抗体またはその抗原結合断片である。抗体及びその抗原結合断片は、全抗体、ポリクローナル、モノクローナル、及び組み換え抗体、その断片を含み、さらに単鎖抗体、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ、マウス−ヒト、マウス−霊長類、霊長類−ヒトモノクローナル抗体、抗イディオタイプ抗体、抗体断片、例えば、ｓｃＦｖ、（ｓｃＦｖ）２、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ１）２、Ｆｖ、ｄＡｂ、及びＦｄ断片、ダイアボディ、ならびに抗体関連ポリペプチドを含む。抗体及びその抗原結合断片は、所望の生物学的活性または機能を呈する限り、二重特異性抗体及び多特異性抗体も含む。
【００７８】
一部の実施形態では、ウイルスタンパク質を含む融合タンパク質が使用される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ウイルスカプシドまたはエンベロープタンパク質を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、エクソソームの内腔に保持されるインタクトなウイルスの組み立てを可能にする。
【００７９】
一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、配列番号４〜１０９のいずれか、またはその改変体、特に、その断片または多様体、を含む融合タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、配列番号４〜１０９のいずれか、もしくはその改変体、特に、その断片もしくは多様体、を欠く融合タンパク質の発現と比較して、または、従来のエクソソームタンパク質を含む融合タンパク質と比較して、エクソソームにおける融合タンパク質の富化をもたらす。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、配列番号４〜１０９のいずれか、またはその断片もしくは改変体を含む融合タンパク質は、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（式中、Ｘは、アラニンもしくは他のアミノ酸である）（配列番号１１７）の配列を有するペプチド、または、（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない）の配列を有するペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない）の配列を有するペプチドを含む。一部の実施形態では、従来のエクソソームタンパク質は、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ＬＡＭＰ２、ＬＡＭＰ２Ｂ、及びその断片からなるリストから選択される。一部の実施形態では、エクソソーム中にＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、配列番号４〜１０９のいずれか、またはその断片もしくは改変体を含む融合タンパク質の富化は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、配列番号４〜１０９のいずれか、またはその断片もしくは改変体を欠く融合タンパク質よりも、あるいは、従来のエクソソームタンパク質を含む融合タンパク質と比較して、２倍超、４倍超、８倍超、１６倍超、２５倍超、５０倍超、１００倍超、２００倍超、５００倍超、７５０倍超、１，０００倍超、２，０００倍超、５，０００倍超、７，５００倍超、１０，０００倍超高い。一部の実施形態では、配列番号１〜１０９のいずれかのタンパク質配列は、エクソソームに融合タンパク質を搭載するのに十分である。
【００８０】
一部の実施形態では、外因性配列及び本明細書で新たに同定されたエクソソーム内腔タンパク質を含有する融合タンパク質を含む内腔操作エクソソームは、当該技術分野で既知の従来のエクソソームタンパク質（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＰＤＧＦＲ、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリンＬＡＭＰ２、及びＬＡＭＰ２Ｂ、その断片、またはそれに結合するペプチド）にコンジュゲートされた外因性配列を含む同様に操作されたエクソソームよりも高密度の融合タンパク質を有する。一部の実施形態では、本明細書で新たに同定されたエクソソームタンパク質を含有する該融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質を使用して同様に改変された他のエクソソーム内腔の融合タンパク質の２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度でエクソソーム内腔に存在する。一部の実施形態では、本明細書で新たに同定されたエクソソームタンパク質を含有する該融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質を使用して同様に改変された他のエクソソーム内腔の融合タンパク質の２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍、またはそれより高い密度でエクソソーム内腔に存在する。
【００８１】
一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ９を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ６３を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ８１を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＧＰＩアンカータンパク質を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ラクトアドヘリンを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２Ｂを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、従来のタンパク質を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質の多様体を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。
【００８２】
一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ９を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ６３を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ８１を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＧＰＩアンカータンパク質を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ラクトアドヘリンを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２Ｂを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、従来のタンパク質を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質の多様体を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。
【００８３】
一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ９を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ６３を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ８１を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＧＰＩアンカータンパク質を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ラクトアドヘリンを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２Ｂを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、従来のタンパク質を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質の多様体を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。
【００８４】
一部の実施形態では、配列番号１〜１０９のいずれか、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ９を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、配列番号１〜１０９のいずれか、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ６３を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、配列番号１〜１０９のいずれか、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＣＤ８１を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、配列番号１〜１０９のいずれか、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＰＤＧＦＲを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、配列番号１〜１０９のいずれか、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＧＰＩアンカータンパク質を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、配列番号１〜１０９のいずれか、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ラクトアドヘリンを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、配列番号１〜１０９のいずれか、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、配列番号１〜１０９のいずれか、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、ＬＡＭＰ２Ｂを使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、配列番号１〜１０９のいずれか、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、従来のタンパク質を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。一部の実施形態では、配列番号１〜１０９のいずれか、その多様体、断片、断片の多様体、または改変体を含む融合タンパク質は、従来のエクソソームタンパク質の多様体を使用して同様に改変されたエクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で存在する。
【００８５】
一部の実施形態では、本明細書に記載の内腔操作エクソソームは、当該技術分野で既知の内腔操作エクソソームと比較して優れた特徴を示す。例えば、本明細書で提供される新たに同定されたエクソソームタンパク質を使用することにより産生された内腔操作エクソソームは、先行技術のエクソソーム、例えば、従来のエクソソームタンパク質を使用して産生されたものよりも、内腔で高度に富化された改変タンパク質を含有する。さらに、本発明の内腔操作エクソソームは、当該技術分野で既知の内腔操作エクソソームと比較して、より大きいか、より特異的か、または、より制御された生物活性を有し得る。例えば、本明細書に記載のエクソソームタンパク質またはその断片に融合している治療的または生物学的に関連する外因性配列（例えば、ＢＡＳＰ１またはその断片）を含む内腔操作エクソソームは、当該技術分野で既知の足場への融合よりも望ましい操作された特性を多く有し得る。当該技術分野で既知の足場タンパク質は、テトラスパニン分子（例えば、ＣＤ６３、ＣＤ８１、ＣＤ９、及びその他のもの）、リソソーム関連膜タンパク質２（ＬＡＭＰ２及びＬＡＭＰ２Ｂ）、血小板由来成長因子受容体（ＰＤＧＦＲ）、ＧＰＩアンカータンパク質、ラクトアドヘリン及びその断片、ならびに、これらのタンパク質またはその断片のいずれかに対して親和性を有するペプチドを含む。誤解を避けるために、ＰＴＧＦＲＮ、ＢＳＧ、ＩＧＳＦ２、ＩＧＳＦ３、ＩＧＳＦ８、ＩＴＧＢ１、ＩＴＧＡ４、ＳＬＣ３Ａ２、ＡＴＰトランスポーター、またはその断片もしくは多様体は、従来のエクソソームタンパク質ではない。従来は、内腔操作エクソソームを産生するための外因性タンパク質の過剰発現は、エクソソーム中への外因性タンパク質の確率的またはランダムな配置に依存していた。これは、エクソソームの外因性タンパク質の低レベルで予測不可能な密度をもたらした。このように、本明細書に記載のエクソソームタンパク質及びその断片は、新規エクソソーム組成物及びその作成方法に重要な進歩を提供する。
【００８６】
本明細書で提供される融合タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片もしくは多様体、及び追加のペプチドを含み得る。追加のペプチドは、エクソソームタンパク質またはその断片もしくは多様体のＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合することができる。
【００８７】
一部の実施形態では、本明細書で提供される融合タンパク質は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＢＡＳＰ１、またはその断片もしくは多様体、及び２つの追加のペプチドを含む。２つの追加のペプチドの両方が、エクソソームタンパク質またはその断片もしくは多様体のＮ末端またはＣ末端のいずれかに結合することができる。一部の実施形態では、２つの追加のペプチドのうちの一方は、エクソソームタンパク質またはその断片もしくは多様体のＮ末端に結合しており、２つの追加のペプチドのうちの他方は、それらのＣ末端に結合している。
【００８８】
一部の実施形態では、本明細書に記載の内腔操作細胞外小胞を生成する組成物及び方法は、ナノ小胞を含む。
【００８９】
内腔操作エクソソームの産生のための産生細胞
本発明のエクソソームは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成長させた細胞または対象の体液から産生することができる。エクソソームがｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養から産生される場合、種々の産生細胞、例えば、ＨＥＫ２９３細胞を、本発明に使用することができる。本明細書に記載の内腔操作エクソソームの産生に使用することができる追加の細胞型は、間葉系幹細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、及びがん細胞株を含むが、これらに限定されない。
【００９０】
産生細胞は、内腔操作エクソソームを産生する１つ以上の外因性配列を含むように遺伝子改変することができる。遺伝子改変産生細胞は、一過性のまたは安定した形質転換により外因性配列を含有し得る。外因性配列は、プラスミドとして形質転換することができる。外因性配列は、標的部位またはランダムな部位において、産生細胞のゲノム配列に安定的に統合することができる。一部の実施形態では、内腔操作エクソソームの産生のための安定した細胞株が生成される。
【００９１】
外因性配列は、エクソソームタンパク質をコードする内因性配列の上流（５’末端）または下流（３’末端）内に位置する産生細胞のゲノム配列に挿入することができる。当該技術分野で既知の種々の方法を、産生細胞への外因性配列の導入に使用することができる。例えば、種々の遺伝子編集方法（例えば、相同組み換え、トランスポゾン媒介システム、ｌｏｘＰ−Ｃｒｅシステム、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、またはＴＡＬＥＮを使用する方法）を使用して改変された細胞は、本発明の範囲内である。
【００９２】
外因性配列は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の改変体または断片をコードする配列を含み得る。エクソソームタンパク質をコードする配列の余分なコピーは、より高い密度のエクソソームタンパク質を有する内腔操作エクソソームを産生するために導入することができる。エクソソームタンパク質の改変体または断片をコードする外因性配列は、エクソソームタンパク質の改変体または断片を含有する内腔操作エクソソームを産生するために導入することができる。親和性タグをコードする外因性配列は、エクソソームタンパク質に結合した親和性タグを含む融合タンパク質を含有する内腔操作エクソソームを産生するために導入することができる。
【００９３】
一部の実施形態では、内腔操作エクソソームは、同じまたは同様の産生細胞型から単離された天然エクソソームよりも高い密度のエクソソームタンパク質を有する。一部の実施形態では、該エクソソームタンパク質は、該天然エクソソームの２倍、４倍、８倍、１６倍、３２倍、６４倍、１００倍、２００倍、４００倍、８００倍、１，０００倍、またはそれより高い密度で該内腔操作エクソソーム上に存在する。一部の実施形態では、該エクソソームタンパク質は、該天然エクソソームの２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍、またはそれより高い密度で該内腔操作エクソソーム上に存在する。一部の実施形態では、エクソソームタンパク質を含む融合タンパク質は、該天然エクソソーム上の未改変エクソソームタンパク質の２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍、またはそれより高い密度で該内腔操作エクソソーム上に存在する。一部の実施形態では、エクソソームタンパク質の断片または多様体は、該天然エクソソーム上の未改変エクソソームタンパク質の２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍、またはそれより高い密度で該内腔操作エクソソーム上に存在する。
【００９４】
特定の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳの断片もしくは多様体、またはその改変体は、該天然エクソソーム上の未改変ＭＡＲＣＫＳの２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍、またはそれより高い密度で該内腔操作エクソソーム上に存在する。一部の実施形態では、ＭＡＲＣＫＳＬ１、ＭＡＲＣＫＳＬ１の断片もしくは多様体、またはその改変体は、該天然エクソソーム上の未改変ＭＡＲＣＫＳＬ１の２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍、またはそれより高い密度で該内腔操作エクソソーム上に存在する。一部の実施形態では、ＢＡＳＰ１、ＢＡＳＰ１の断片もしくは多様体、またはその改変体は、該天然エクソソーム上の未改変ＢＡＳＰ１の２〜４倍、４〜８倍、８〜１６倍、１６〜３２倍、３２〜６４倍、６４〜１００倍、１００〜２００倍、２００〜４００倍、４００〜８００倍、８００〜１，０００倍、またはそれより高い密度で該内腔操作エクソソーム上に存在する。
【００９５】
一部の実施形態では、産生細胞はさらに、追加の外因性配列を含むように改変される。例えば、追加の外因性配列は、内因性遺伝子発現を調節するか、または特定のポリペプチドをペイロードとして含むエクソソームを産生するように含められ得る。一部の実施形態では、産生細胞は、２つの外因性配列を含むように改変され、一方は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の改変体もしくは断片をコードし、他方は、ペイロードをコードする。
【００９６】
より具体的には、内腔操作エクソソームは、限定されないが、（１）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、（２）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、及び、（３）脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）を含む１つ以上のエクソソーム内腔タンパク質をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。本明細書に記載の１つ以上のエクソソーム内腔タンパク質のいずれもが、プラスミド、ゲノムに挿入された外因性配列、または合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）等の他の外因性核酸から発現させることができる。
【００９７】
一部の実施形態では、１つ以上のエクソソーム内腔タンパク質は、全長、内因性形態をコードする外因性配列で形質転換された細胞において発現される。一部の実施形態では、このような外因性配列は、配列番号１のＭＡＲＣＫＳタンパク質をコードする。一部の実施形態では、このような外因性配列は、配列番号２のＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質をコードする。一部の実施形態では、このような外因性配列は、配列番号３のＢＡＳＰ１タンパク質をコードする。
【００９８】
内腔操作エクソソームは、限定されないが、（１）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、（２）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、及び、（３）脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）を含む１つ以上のエクソソーム内腔タンパク質の断片をコードする配列で形質転換された細胞から産生することができる。一部の実施形態では、配列は、天然タンパク質のＮ末端から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、または３００アミノ酸を欠くエクソソーム内腔タンパク質の断片をコードする。一部の実施形態では、配列は、天然タンパク質のＣ末端から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、または３００アミノ酸を欠くエクソソーム内腔タンパク質の断片をコードする。一部の実施形態では、配列は、天然タンパク質のＮ末端及びＣ末端の両方から少なくとも５、１０、５０、１００、２００、または３００アミノ酸を欠くエクソソーム内腔タンパク質の断片をコードする。一部の実施形態では、配列は、天然タンパク質の１つ以上の機能性または構造ドメインを欠くエクソソーム内腔タンパク質の断片をコードする。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４〜１０９のペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３のペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（式中、Ｘは、アラニンまたは任意のアミノ酸である）（配列番号１１７）を有するペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない）の配列を有するペプチドを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり；５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない）の配列を有するペプチドを含む。
【００９９】
一部の実施形態では、内腔操作エクソソームは、１つ以上の異種タンパク質に融合しているエクソソームタンパク質またはその断片もしくは改変体をコードする配列で形質転換された細胞から産生することできる。一部の実施形態では、１つ以上の異種タンパク質は、エクソソームタンパク質またはその改変体、特に、その断片または多様体、のＮ末端に融合している。一部の実施形態では、１つ以上の異種タンパク質は、エクソソームタンパク質またはその改変体、特に、その断片または多様体、のＣ末端に融合している。一部の実施形態では、１つ以上の異種タンパク質は、エクソソームタンパク質またはその改変体、特に、その断片または多様体、のＮ末端及びＣ末端に融合している。一部の実施形態では、１つ以上の異種タンパク質は、哺乳動物タンパク質である。一部の実施形態では、１つ以上の異種タンパク質は、ヒトタンパク質である。
【０１００】
一部の実施形態では、内腔操作エクソソームは、限定されないが、（１）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、（２）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、及び、（３）脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）を含む天然エクソソーム内腔タンパク質の全長または断片と同一かまたは類似の配列のポリペプチドをコードする配列で形質転換された細胞から産生される。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、天然エクソソーム内腔タンパク質の全長または断片と５０％同一である、例えば、配列番号１〜３と５０％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、天然エクソソーム内腔タンパク質の全長または断片と６０％同一である、例えば、配列番号１〜３と６０％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、天然エクソソーム内腔タンパク質の全長または断片と７０％同一である、例えば、配列番号１〜３と７０％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、天然エクソソーム内腔タンパク質の全長または断片と８０％同一である、例えば、配列番号１〜３と８０％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、天然エクソソーム内腔タンパク質の全長または断片と９０％同一である、例えば、配列番号１〜３と９０％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、天然エクソソーム内腔タンパク質の全長または断片と９５％同一である、例えば、配列番号１〜３と９５％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、天然エクソソーム内腔タンパク質の全長または断片と９９％同一である、例えば、配列番号１〜３と９９％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、天然エクソソーム内腔タンパク質の全長または断片と９９．９％同一である、例えば、配列番号１〜３と９９．９％同一である。
【０１０１】
一部の実施形態では、細胞から産生された内腔操作エクソソームは、脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）の断片と同一かまたは類似の配列のポリペプチドを含む。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片と５０％同一であり、例えば、配列番号４〜１０９と５０％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片と６０％同一であり、例えば、配列番号４〜１０９と６０％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片と７０％同一であり、例えば、配列番号４〜１０９と７０％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片と８０％同一であり、例えば、配列番号４〜１０９と８０％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片と９０％同一であり、例えば、配列番号４〜１０９と９０％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片と９５％同一であり、例えば、配列番号４〜１０９と９５％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片と９９％同一であり、例えば、配列番号４〜１０９と９９％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の全長または断片と９９．９％同一であり、例えば、配列番号４〜１０９と９９．９％同一である。一部の実施形態では、該ポリペプチドは、ＢＡＳＰ１の断片と１００％同一であり、例えば、配列番号４〜１０９と１００％同一である。
【０１０２】
エクソソームの特性決定
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法はさらに、各収集画分に含有されるエクソソームを特性決定するステップを含む。一部の実施形態では、エクソソームの内容物を、研究及び特性決定のために抽出することができる。一部の実施形態では、限定されないが、エクソソームは、サイズ、形状、形態、または分子組成、例えば、核酸、タンパク質、代謝産物、及び脂質を含むメトリックにより単離及び特性決定される。
【０１０３】
エクソソームの内容物の測定
エクソソームは、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び脂質を含み得る。全ＲＮＡは、酸性フェノール：クロロホルム抽出を使用して抽出することができる。次に、ＲＮＡは、全ＲＮＡを含有するｓｍａｌｌ−ＲＮＡを回収するという条件下で、またはｍＲＮＡ等のより長いＲＮＡ種から２００ヌクレオチド長未満のｓｍａｌｌ  ＲＮＡ種を分離するという条件下で、ガラス繊維フィルターを使用して精製することができる。ＲＮＡが少量で溶出されるため、アルコール沈殿ステップは、ＲＮＡの単離に必要とされないことがある。
【０１０４】
エクソソーム組成物は、限定されないが、トランスクリプトミックス、配列決定、プロテオミックス、質量分析、またはＨＰ−ＬＣを含む当該技術分野で既知の方法により評価されてもよい。
【０１０５】
（ＲＮＡ及びＤＮＡを含む）単離されたエクソソームに関連するヌクレオチドの組成は、当業者らに周知の様々な技術（例えば、定量的または半定量的ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット分析、溶液ハイブリダイゼーション検出）を使用して測定することができる。特定の実施形態では、少なくとも１つのＲＮＡのレベルは、一連の標的オリゴデオキシヌクレオチドを提供するために、エクソソーム組成物からＲＮＡを逆転写すること、エクソソーム組成物のハイブリダイゼーションプロファイルを提供するために、標的オリゴデオキシヌクレオチドを１つ以上のＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチド（例えば、ＲＮＡ特異的プローブオリゴヌクレオチドを含むマイクロアレイ）にハイブリダイズすること、エクソソーム組成物ハイブリダイゼーションプロファイルを、対照試料から生成されたハイブリダイゼーションプロファイルと比較することにより測定される。対照試料と対比した試験試料中の少なくとも１つのＲＮＡのシグナルの変化は、ＲＮＡ組成物を示す。
【０１０６】
さらに、マイクロアレイは、既知のＲＮＡ配列から生成された遺伝子特異的オリゴヌクレオチドプローブから調製することができる。このアレイは、各ＲＮＡに対する２つの異なるオリゴヌクレオチドプローブを含有し得、一方は、活性な成熟配列を含有し、他方は、ＲＮＡの前駆体（例えば、ｍｉＲＮＡ及び初期ｍｉＲＮＡ）に特異的である。アレイは、ヒトオルソログとわずか数塩基異なる１つ以上のマウス配列等の対照も含有し得、これは、ハイブリダイゼーションストリンジェントな条件の対照として機能し得る。両方の種に由来のｔＲＮＡ及び他のＲＮＡ（例えば、ｒＲＮＡ、ｍＲＮＡ）は、マイクロチップ上にプリントすることもでき、これは、特定のハイブリダイゼーションの比較的安定した内部の陽性対照を提供する。非特異的ハイブリダイゼーションの１つ以上の適切な対照も、マイクロチップ上に含まれ得る。この目的のために、配列は、既知のＲＮＡと相同性がないことに基づいて選択される。
【０１０７】
マイクロアレイは、当該技術分野で既知の技術を使用して作製することができる。例えば、適当な長さ、例えば、４０ヌクレオチド、のプローブオリゴヌクレオチドは、Ｃ６位で５’−アミン改変し、市販のマイクロアレイシステム、例えば、ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅ  ＯｍｎｉＧｒｉｄ（商標）１００  Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｅｒ及びＡｍｅｒｓｈａｍ  ＣｏｄｅＬｉｎｋ（商標）を使用して活性化スライド上にプリントする。標的ＲＮＡに対応する標識ｃＤＮＡオリゴマーを、標識プライマーを用いて標的ＲＮＡを逆転写することにより調製する。第１の鎖合成の後、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッドは、ＲＮＡ鋳型を分解するように変性させる。次に、ハイブリダイゼーション条件下、例えば、６倍のＳＳＰＥ／３０％のホルムアミド、２５℃、１８時間で、このように調製された標識された標的ｃＤＮＡをマイクロアレイチップにハイブリダイズし、続いて、０．７５倍のＴＮＴ中３７℃で４０分間洗浄する。固定されたプローブＤＮＡが試料中の相補的な標的ｃＤＮＡを認識するアレイ上の位置で、ハイブリダイゼーションが生じる。標識された標的ｃＤＮＡは、結合が生じたアレイ上の正確な位置を示し、自動検出及び定量が可能となる。アウトプットは、ハイブリダイゼーション事象のリストからなり、これは、エクソソーム調製物中の特定のｃＤＮＡ配列の相対存在量、従って、対応する相補的ＲＮＡの相対存在量を示す。一実施形態に従い、標識ｃＤＮＡオリゴマーは、ビオチン標識ｃＤＮＡであり、ビオチン標識プライマーから調製される。次に、マイクロアレイは、例えば、ストレプトアビジン−Ａｌｅｘａ６４７コンジュゲートを使用したビオチン含有転写産物の直接的検出により処理され、従来のスキャニング法を利用してスキャンされる。アレイ上の各スポットの画像強度は、エクソソーム中の対応するＲＮＡの存在量に比例する。
【０１０８】
データマイニング作業は、チップの走査、信号収集、画像処理、正規化、統計学的処理、及びデータ比較、ならびに経路分析を含む生物情報学により達成される。このように、マイクロアレイは、高いスループット能で、数百、数千のポリヌクレオチドを同時にプロファイリングすることができる。ｍＲＮＡ発現のマイクロアレイプロファイリング分析は、基礎研究において遺伝子発現研究に有益なデータをうまく提供している。そして、技術はさらに、製薬産業及び臨床診断において実践されている。利用可能になるｍｉＲＮＡデータの量の増加及び遺伝子制御におけるｍｉＲＮＡの重要性についての証拠の蓄積に伴い、マイクロアレイは高スループットｍｉＲＮＡ研究に有用な技術となっている。ポリヌクレオチドプローブを利用するｍｉＲＮＡレベルの分析は同様に、様々な物理的フォーマットにおいて実施することができる。例えば、マイクロタイタープレートの使用または自動操作は、多数の試験試料の処理を容易にするために使用することができる。
【０１０９】
エクソソームのサイズの測定
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、精製された画分に含まれるエクソソーム及び／またはエクソソームの集団のサイズを測定することを含む。一部の実施形態では、エクソソームサイズは、最長の測定可能な寸法として測定される。一般に、エクソソームの最長の全体寸法は、直径とも称される。
【０１１０】
エクソソームサイズは、当該技術分野で既知の種々の方法、例えば、ナノ粒子トラッキング解析、多角度光散乱、単一角度光散乱、サイズ排除クロマトグラフィー、超遠心分析、流動場分離法、レーザー回析、可変抵抗パルスセンシング、または動的光散乱法を使用して測定することができる。
【０１１１】
エクソソームサイズは、動的光散乱法（ＤＬＳ）及び／または多角度光散乱検出器（ＭＡＬＳ）を使用して測定することができる。エクソソームのサイズを測定するＤＬＳ及び／またはＭＡＬＳを使用する方法は、当業者らに既知であり、ナノ粒子トラッキングアッセイ（ＮＴＡ、例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００ナノ粒子トラッキングデバイスを使用する）を含む。特定の実施形態では、エクソソームサイズは、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏＳｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用して決定される。一部の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏｓｉｇｈｔＮＳ３００を使用する）で測定した約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  ＮａｎｏｓｉｇｈｔＮＳ３００を使用する）で測定した約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９０％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）で測定した約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９５％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）で測定した約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９９％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）で測定した約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９０％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）で測定した約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９５％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）で測定した約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９９％が、ＮＴＡ（例えば、Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｎａｎｏｓｉｇｈｔ  ＮＳ３００を使用する）で測定した約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。
【０１１２】
エクソソームサイズは、可変抵抗パルスセンシング（ＴＲＰＳ）を使用して測定することができる。特定の実施形態では、ＴＲＰＳで測定されたエクソソームサイズは、ｉＺＯＮ  ｑＮＡＮＯ  Ｇｏｌｄを使用して決定される。一部の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）で測定された約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄ）で測定された約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９０％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）で測定された約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９５％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）で測定された約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９９％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）で測定された約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９０％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）で測定された約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９５％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）で測定された約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９９％が、ＴＲＰＳ（例えば、ｉＺＯＮ  ｑＮａｎｏ  Ｇｏｌｄを使用する）で測定された約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。
【０１１３】
エクソソームサイズは、電子顕微鏡を使用して測定することができる。一部の実施形態では、エクソソームサイズを測定するために使用される電子顕微鏡法は、透過型電子顕微鏡法である。特定の実施形態では、エクソソームサイズを測定するために使用される透過型電子顕微鏡は、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮである。電子顕微鏡を使用してエクソソームサイズを測定する方法は、当業者らに周知であり、任意のこのような方法は、エクソソームサイズを測定するのに適切であり得る。一部の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）で測定された約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）で測定された約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９０％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）で測定された約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９５％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）で測定された約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９９％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）で測定された約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９０％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）で測定された約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９５％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）で測定された約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。他の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９９％が、走査電子顕微鏡（例えば、Ｔｅｃｎａｉ（商標）Ｇ２  Ｓｐｉｒｉｔ  ＢｉｏＴＷＩＮ走査電子顕微鏡）で測定された約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。
【０１１４】
個々のエクソソームのサイズは、ナノフローサイトメトリーで粒子ごとに決定することができる。一部の実施形態では、ナノフローサイトメーターは、Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒ（ＮａｎｏＦＣＭ，Ｉｎｃ．；Ｘｉａｍｅｎ、中国）である。一部の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、ナノフローサイトメトリー（例えば、Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用する）で測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のエクソソームは、ナノフローサイトメトリー（例えば、Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用する）で測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する。一部の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９０％が、ナノフローサイトメトリー（例えば、Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用する）で測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９５％が、ナノフローサイトメトリー（例えば、Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用する）で測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９９％が、ナノフローサイトメトリー（例えば、Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用する）で測定して約２０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９０％が、ナノフローサイトメトリー（例えば、Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用する）で測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９５％が、ナノフローサイトメトリー（例えば、Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用する）で測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。一部の実施形態では、本明細書に記載のエクソソーム集団は、該エクソソームの９９％が、ナノフローサイトメトリー（例えば、Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎａｌｙｚｅｒを使用する）で測定して約４０〜１０００ｎｍの最長寸法を有する集団を含む。
【０１１５】
エクソソームの電荷密度の測定
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、精製された画分に含まれるエクソソーム及び／またはエクソソームの集団の電荷密度を測定することを含む。一部の実施形態では、電荷密度は、電位差滴定、陰イオン交換、陽イオン交換、等電点電気泳動、ゼータ電位、キャピラリー電気泳動、キャピラリーゾーン電気泳動、またはゲル電気泳動で測定される。
【０１１６】
エクソソームタンパク質の密度の測定
一部の実施形態では、本明細書に記載の方法は、エクソソーム表面上のエクソソームタンパク質の密度を測定することを含む。表面密度は、単位面積質量、面積当たりのタンパク質の数、エクソソーム当たりの分子の数または分子の強度、タンパク質のモル量、等として計算または提示することができる。表面密度は、当該技術分野で既知の方法により、例えば、バイオレイヤー干渉法（ＢＬＩ）、ＦＡＣＳ、ウェスタンブロッティング、蛍光（例えば、ＧＦＰ融合タンパク質）検出、ナノ−フローサイトメトリー、ＥＬＩＳＡ、ａｌｐｈａＬＩＳＡ、及び／またはタンパク質ゲル上のバンドを測定することによるデンシトメトリーを使用することにより、実験的に測定することができる。
【実施例】
【０１１７】
以下の実施例は、本発明を作成及び使用方法の完全な開示及び説明を当業者らに提供するために記載され、本発明者らが自己の発明とみなすものの範囲を限定することを意図するものではなく、それらは、以下の実験が実施された全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものではない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関し、正確性を確保する取り組みがなされているが、実験的誤差及び偏差を考慮に入れるべきである。別途指示のない限り、部は、重量部であり、分子量は、重量平均分子重量であり、温度は、摂氏温度であり、圧力は、大気圧または大気圧付近である。標準的な略語、例えば、ｂｐ：塩基対（複数可）、ｋｂ：キロ塩基（複数可）、ｐｌ：ピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃ：秒（複数可）、ｍｉｎ：分（複数可）、ｈまたはｈｒ：時間（複数可）、ａａ：アミノ酸（複数可）、ｎｔ：ヌクレオチド（複数可）等を使用することができる。
【０１１８】
本発明の実践は、別途指示のない限り、当該分野の技術範囲内で、タンパク質化学、生化学、組み換えＤＮＡ技術、及び薬理学の従来の方法を用いるであろう。このような技術は、文献において十分に説明される。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）；ＡＬ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２１ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，２００５）；Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（ｌ９９２）を参照のこと。
【０１１９】
実施例１：新規エクソソームタンパク質の同定
エクソソームの収集
９日後に、エクソソームをＨＥＫ２９３  ＳＦ細胞の高密度懸濁培養物の上清から収集した。上清を濾過し、陰イオン交換クロマトグラフィーにより分画し、塩化ナトリウムの段階勾配で溶出させた。タンパク質濃度が最も高いピーク画分は、エクソソーム及び夾雑細胞構成成分を含有した。ピーク画分を分離し、さらに超遠心分離によりＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配で分画した。
【０１２０】
Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配では、ＳＷ  ４１  Ｔｉローター用の１２ｍＬのＵｌｔｒａ−Ｃｌｅａｒ（３４４０５９）チューブ中の４５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）４ｍＬ、３０％のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）３ｍＬ、２２．５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）２ｍＬ、１７．５％のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）２ｍＬ、及び１ｍＬのＰＢＳを用いて、４段滅菌勾配を調製した。エクソソーム画分を分離するために、エクソソーム画分を、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配に添加し、４℃で１６時間２００，０００×ｇで超遠心分離した。超遠心分離により、エクソソームを含有すると知られている上部画分、中密度の細胞デブリを含有する中間画分、ならびに高密度凝集体及び細胞デブリを含有する下部画分がもたらされた（図１）。次に、エクソソーム層をチューブの上部約３ｍＬから穏やかに収集した。
【０１２１】
エクソソーム画分を、３８．５ｍＬのウルトラクリア（３４４０５８）チューブ中で約３２ｍＬのＰＢＳに希釈し、１３３，９００×ｇ、４℃で３時間超遠心分離して、精製エクソソームをペレット化した。次に、ペレット化エクソソームを、最小容量のＰＢＳ（約２００μＬ）に再懸濁し、４℃で保管した。
【０１２２】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析のための試料調製
エクソソームに特異的なタンパク質を決定するために、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配の上部画分及び下部画分を、液体クロマトグラフィー−タンデム質量分析により分析した。分析前に、２つの試料の総タンパク質濃度を、ビシンコニン酸（ＢＣＡ）アッセイで決定し、この後、各試料をＰＢＳ緩衝液で１２５μｇ／ｍＬに適切に希釈した。次に、等量のエクソソーム溶解緩衝液（６０ｍＭのトリス、４００ｍＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、２０ｍＭのＴＣＥＰ、１．０％のトリトンＸ−１００）を含有する別の１．５ｍＬの微量遠心チューブに、５０．０μＬの各試料を添加し、その後、１．０％のトリトンＸ−１００溶液２．０μＬを移した。次に、全ての試料を５５℃で６０分間インキュベートした。
【０１２３】
１２５０μＬのエタノールを−２０℃で添加することにより、タンパク質の沈殿を実施した。効率を改善するために、試料を激しくボルテックスし、次に、水浴で５分間超音波処理した。室温にて１５，０００ｇで５分間遠心分離することにより、沈殿した材料をペレット化した。上清をデカントし、窒素ガスを使用して、ペレット化物質を完全に乾燥させた。ペレットを、３０．０μＬの消化緩衝液（３０ｍＭのトリス、１．０ＭのＧｄｍＣｌ、１００ｍＭのＥＤＴＡ、５０ｍＭのＴＣＥＰ、ｐＨ８．５）に再懸濁し、これはさらに、ジスルフィド結合を還元した。５．０μＬのアルキル化溶液（３７５ｍＭのヨードアセトアミド、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５）を添加し、得られた溶液を室温、暗所で少なくとも３０分間インキュベートすることにより、遊離システイン残基をアルキル化した。
【０１２４】
インキュベーション後に、５０ｍＭのトリス、ｐＨ８．５、３０．０μＬを使用して、各試料を希釈し、２．０μｇのトリプシンを添加することにより、タンパク質分解消化を開始した。全ての試料を混合し、次に、３７℃で一晩インキュベートした。インキュベーション後、１０％のギ酸５．０μＬを添加することにより、トリプシン活性を停止させた。ＬＣ−ＭＳ／ＭＳによる分析の前に、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃ１８スピンカラムを使用して、各試料を脱塩した。このプロセスの最後に、各試料を乾燥させ、０．１％のギ酸を含む９５：５の水：アセトニトリル７５．０μＬで再構成し、分析のためにＨＰＬＣバイアルに移した。
【０１２５】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析
試料を、ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＲＳＣＬｎａｎｏ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）低流量クロマトグラフィーシステムに注入し、２．５００μＬ／分の流量のローディング移動相（ＭＰＬ：９５％の水、５％のアセトニトリル、０．１％のギ酸）を使用したＡｃｃｌａｉｍ  ＰｅｐＭａｐ  １００  Ｃ１８トラッピングカラム（７５μｍｘ２ｃｍ、３μｍ粒径、１００Å孔径、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、トリプシンペプチドをロードした。ＥＡＳＹ−Ｓｐｒａｙ  ＬＣ  Ｃ１８分析用カラム（７５μｍｘ２５ｃｍ、２μｍの粒径、１００Å孔径、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に、３００ｎＬ／分の流量の移動相Ａ（ＭＰＡ：水、０．１％のギ酸）及び移動相Ｂ（ＭＰＢ：アセトニトリル、０．１％のギ酸）の勾配で、ペプチドを溶出させて、分離した。溶出に使用される段階的な勾配は、５％のＭＰＢで開始し、それをローディング中に１５分間保持した。次に、パーセンテージＭＰＢを、３０分間かけて５〜１７％に、再度４５分間かけて１７〜２５％に、最後に５分間かけて２５〜４０％に増加させた。９０％のＭＰＢに５分間かけて増加させ、次に、そこに９分間保持することにより、最も疎水性の高い種を取り出した。方法の合計実行時間は、１３０分であり、カラムの再平衡化に十分な時間を確保した。キャリーオーバーを最小限にするために、洗浄サイクルを分析サイクルの間に実施した。
【０１２６】
Ｑ  Ｅｘａｃｔｉｖｅ  Ｂａｓｉｃ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）質量分析計を用いて、質量分析を実施した。前駆体イオン質量スペクトルを、７０，０００の分解能で４００〜１６００Ｄａのｍ／ｚ範囲にわたって測定した。１０の最も強力な前駆体イオンを選択し、２７の衝突エネルギーを使用して、ＨＣＤ細胞中で断片化し、ＭＳ／ＭＳスペクトルを、３５，０００の分解能で２００〜２０００Ｄａのｍ／ｚ範囲にわたって測定した。２〜４の電荷状態を有するイオンを、断片化のために選択し、動的排除時間を３０秒に設定した。１４の一般的なポリシロキサンを含有する排除リストを利用して、既知の夾雑物質の誤同定を最小限に抑えた。
【０１２７】
データ処理
最初に、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒソフトウェア（バージョン２．１．１．２１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）及び標的デコイＰＳＭバリデーターと組み合わせたＳｅｑｕｅｓｔ  ＨＴアルゴリズムを使用して、タンパク質を同定及び定量（標識不含）した。完全Ｕｎｉｐｒｏｔホモサピエンス（分類９６０６：１２７，７８３エントリー）またはＳｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔホモサピエンス（分類９６０６バージョン２０１７−０５−１０：４２，１５３エントリー）参照データベースのいずれか、ならびにＥ１ａタンパク質（７エントリー）を含有するカスタムＵｎｉｐｒｏｔデータベースに対して、検索を実施した。以下の検索パラメータ：酵素、トリプシン；最大２の未消化サイト数；６残基の最小ペプチド長；１０ｐｐｍの前駆体質量許容値；及び０．０２Ｄａの断片質量許容値を使用した。検索は、特異的な動的改変（Ｍの酸化；ＮまたはＱの脱アミド化；Ｓ、Ｔ、またはＹのリン酸化；ペプチド末端Ｅのピログルタミル化；及びタンパク質Ｎ末端のアセチル化）ならびに静的改変（Ｃのカルバミドメチル化）も含んだ。
【０１２８】
標的デコイＰＳＭバリデーターでは、Ｓｃａｆｆｏｌｄソフトウェア（バージョン４．８．２、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）を使用してデータを再度検索したので、最大デルタＣｎならびに厳密及び緩和の両方の標的偽発見率（ＦＤＲ）を１に設定した。Ｓｃａｆｆｏｌｄでは、Ｘ！タンデムオープンソースアルゴリズムを使用して、データをさらに検索して９９．０％のタンパク質閾値、最小２つのペプチド、及び９５％のペプチド閾値を使用してタンパク質を同定した。
【０１２９】
新規エクソソーム特異的タンパク質の同一性を決定するために、Ｏｐｔｉｐｒｅｐ（商標）勾配の上部エクソソーム画分に見出されたタンパク質対下部画分中のものについて、全ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）を比較した。図２に示されるように、上部画分タンパク質（Ｙ軸）及び下部画分タンパク質（Ｘ軸）の間に弱い相関があった。点線より上にプロットされたタンパク質は、エクソソームで富化されたタンパク質を表すが、点線より下のものは、夾雑物が富化されたタンパク質を表す。重要なことに、膜貫通ドメインを欠いた同定された多数のタンパク質があり、これは、（１）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質（ＭＡＲＣＫＳ）、（２）ミリストイル化アラニンリッチプロテインキナーゼＣ基質様１（ＭＡＲＣＫＳＬ１）、及び、（３）脳酸可溶性タンパク質１（ＢＡＳＰ１）を含むエクソソーム画分中で非常に富化されていた。図３〜５のトリプシンペプチドカバレッジマップに示されるように、質量分析試験は、ＭＡＲＣＫＳ（図３）、ＭＡＲＣＫＳＬ１（図４）、及びＢＡＳＰ１（図５）の広範なカバレッジをもたらした。これらのタンパク質はいずれもが膜貫通ドメインを有すると予測されないので、エクソソームの内腔で可溶性タンパク質として富化されることが示唆される。共に、これらの結果は、操作エクソソームを生成する際のペイロード足場として有用であり得る精製されたエクソソーム集団に富化されている多数の内腔タンパク質があることを示す。
【０１３０】
実施例２：内腔タンパク質発現の検証
質量分析研究で同定されたエクソソーム特異的タンパク質がエクソソームの内腔で高度に発現されたことを確認するために、全細胞溶解物及びＨＥＫ２９３細胞由来の精製エクソソーム集団で、ウェスタンブロットを実施した。図６Ａに示されるように、細胞溶解物（左）及び精製エクソソーム（右）由来の等量の全タンパク質を、変性ポリアクリルアミドゲルにロードした。ＭＡＲＣＫＳ（図６Ｂ）、ＭＡＲＣＫＳＬ１（図６Ｃ）、及びＢＡＳＰ１（図６Ｄ）のウェスタンブロッティングは、細胞溶解物ではなくエクソソーム中で、新規の内腔タンパク質を表すバンドが容易に検出されることを示した。これは、これらのタンパク質がエクソソーム中で高度に富化されており、全エクソソーム溶解物中に視覚的に検出され得ることを示す。これらの内腔タンパク質がエクソソームで高度に発現及び富化されるという実証は、高レベルのこれらの新規タンパク質のいずれかに融合している異種タンパク質を含有する内腔改変エクソソームを生成する機会を提供する。
【０１３１】
実施例３：新規タンパク質を足場として使用した内腔搭載の検証
内腔の搭載足場としてのＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及び／またはＢＡＳＰ１の有用性を確認するために、タンパク質のそれぞれをＧＦＰのＮ末端に融合させた。さらに、これらのタンパク質のそれぞれの最初の３０アミノ酸をもＧＦＰに融合させて、より短いタンパク質断片が、操作エクソソームへの搭載を引き起こし得るかどうかを決定した。ＧＦＰと融合しているＣＤ８１（十分に確立されたエクソソームマーカー）またはＰＤＧＦＲ（中程度のエクソソーム搭載効率を有する膜貫通タンパク質）を含有するように操作されたエクソソームを参照標準として使用した。
【０１３２】
発現構築物のそれぞれを含有する操作ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を安定的に選択し、２００ｍｌの培養液中で高密度に成長させた。上清を収集し、実施例１に記載されるようなＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配超遠心分離で精製した。得られたＧＦＰ含有エクソソームを、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１プレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ（登録商標））上の９６ウェルフォーマットで測定した。図７に示されるように、ＧＦＰと融合しているＭＡＲＣＫＳの最初の３０アミノ酸（「ＭＡＲＣＫＳ（ａａ１〜３０）」）は、ＣＤ８１−ＧＦＰ（「ＣＤ８１」）またはＰＤＧＦＲ−ＧＦＰ（「ｐＤｉｓｐｌａｙ」）のいずれかのレベルを超えてエクソソームに搭載するには不十分であった。同様に、ＧＦＰに融合しているＭＡＲＣＫＳＬ１の最初の３０アミノ酸（「ＭＡＲＣＫＳＬ１（ａａ１〜３０）」）は、ＣＤ８１−ＧＦＰ（「ＣＤ８１」）と比較して、エクソソームへの搭載を増加させるには不十分であったが、全長ＭＡＲＣＫＳＬ１−ＧＦＰ融合体（「ＭＡＲＣＫＳＬ１」）はＣＤ８１−ＧＦＰよりも劇的に高いシグナルをもたらしたが、（図８）。際立って対照的に、全長ＢＡＳＰ１−ＧＦＰ融合体（「ＢＡＳＰ１」）及びＧＦＰに融合しているＢＡＳＰ１の最初の３０アミノ酸（「ＢＡＳＰ１（ａａ１〜３０）」）の両方が、ＣＤ８１−ＧＦＰ（「ＣＤ８１」）またはＰＤＧＦＲ−ＧＦＰ（「ｐＤｉｓｐｌａｙ」））と比較して、非常に多いＧＦＰ搭載をもたらした（図９）。これらの結果は、ＢＡＳＰ１（全長またはＮ末端）及び全長ＭＡＲＣＫＳＬ１は、エクソソームカーゴタンパク質の内腔発現に適する足場であり得ることを示唆する。
【０１３３】
実施例４：内腔エクソソームペイロードを積載するのに十分な最小タンパク質配列の同定
実施例３の結果は、ＢＡＳＰ１のＮ末端配列がエクソソームの内腔にタンパク質カーゴを搭載するのに十分であることを示唆する。この活性を有する最小のペプチド配列を決定するために、ＧＦＰのＮ末端に融合している様々なＢＡＳＰ１切断部分を生成すること及びエクソソーム中への搭載の程度を測定することにより、操作されたＧＦＰ搭載実験を行った。図１０は、この実験で使用された一連の融合タンパク質を示し、これは、ＢＡＳＰ１配列の断片及び改変体、ウェスタンブロッティング検出用ＦＬＡＧタグ、ＧＦＰの最初のいくつかのアミノ酸、ならびに領域のそれぞれの間のグリシン／セリンリンカーを示す。
【０１３４】
ＢＡＳＰ１は、ミリストイル化されることが報告されており、エクソソーム内腔への局在化に関与し得る。ＢＡＳＰ１搭載におけるミリストイル化の役割を試験するために、予測されたミリストリル化部分におけるグリシンからアラニンへの点変異をさらに、ＧＦＰ搭載実験で試験した。２位の単一変異（配列ｐＣＢ６９２）、３位（ｐＣＢ６９３）、または二重変異（ｐＣＢ６９４）が、ＢＡＳＰ１  １〜３０（ｐＣＢ５４０）と共に含まれ、ＢＡＳＰ１の種々のトランケーションを含有する融合タンパク質（ｐＣＢ６８３〜６９１）と共に試験された。
【０１３５】
ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞をトランスフェクトし、ピューロマイシンの存在下で選択して、図１０の配列のそれぞれをコードするプラスミドを安定的に発現させ、エクソソームを実施例１に記載されるように精製した。精製されたエクソソームをナノフローサイトメトリー（Ｆｌｏｗ  ＮａｎｏＡｎｌｙｚｅｒ、ＮａｎｏＦＣＭ，Ｉｎｃ．）でＧＦＰ蛍光について分析し、ＧＦＰ搭載の程度を決定した。図１１に示されるように、非トランスフェクト細胞（すなわち、ＧＦＰを欠く）由来のエクソソームは、非常に低いシグナル（ＷＴ  ＥＸＯ）を示した。同様に、ＢＡＳＰ１  Ｇ２Ａ−ＧＦＰ（ｐＣＢ６９２）またはＢＡＳＰ１  Ｇ２Ａ／Ｇ３Ａ−ＧＦＰ（ｐＣＢ６９４）を含有するエクソソームは、低いレベルのＧＦＰシグナルを示したが、ＢＡＳＰ１  Ｇ３Ａ−ＧＦＰ（ｐＣＢ６９３）は、はるかに高いレベルを示し、これは、ＢＡＳＰ１の２位のグリシンが、おそらく、ミリストイル化に起因して、エクソソームにＢＡＳＰ１断片を搭載するのに不可欠であることを示す。ＢＡＳＰ１切断部分ｐＣＢ６８３−６８９もまた、高レベルのＧＦＰシグナルを示したが、より短い断片ｐＣＢ６９０−６９１は、ＷＴ  ＥＸＯに類似していた。これらの結果は、９アミノ酸断片であるｐＣＢ６８９が、非常に高いレベルでエクソソームの内腔にタンパク質カーゴを入れるのに十分であることを示す。
【０１３６】
図１１に示される結果を確認するために、ＢＡＳＰ１断片−ＧＦＰエクソソームをタンパク質ブロッティングで分析した。等量のタンパク質を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ  ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ  Ｓｔａｉｎ−Ｆｒｅｅ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、Ｉｎｃ．）に搭載して、全エクソソームタンパク質を測定した（図１２）。ＢＡＳＰ１−ＧＦＰ断片は、約３０ｋＤａのタンパク質ゲルのいくつかのレーンで検出可能であった（点線矢印）。この可視化方法は、タンパク質のトリプトファン残基への、ゲル中の蛍光分子の結合に依存するが、ＢＡＳＰ１−ＧＦＰ融合タンパク質のそれぞれには単一のトリプトファン残基しかなく、おそらく、各レーンのＢＡＳＰ１断片の存在量を過小評価している。エクソソームへのＢＡＳＰ１−ＧＦＰの搭載の公正な測定を達成するために、エクソソーム試料を含有するタンパク質ゲルをクーマシーブルー（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｉｍｐｌｙＢｌｕｅ  ＳａｆｅＳｔａｉｎ）で染色した（図１３）。染色ゲルのバンドパターンは、ＢＡＳＰ１−ＧＦＰ融合タンパク質（点線矢印）の明確な同定を可能にし、各試料において等量の入力タンパク質を確認した。これは、図１２に示された結果と相関する。
【０１３７】
抗ＦＬＡＧ抗体（Ｍ２モノクローナル抗体、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ−Ｓｉｇｍａ）を用いるウェスタンブロッティングは、ｐＣＢ５４０（アミノ酸１〜３０）及びｐＣＢ６８３〜６８９中のＢＡＳＰ１−ＧＦＰの量が等しいことを示した（図１４）。これはさらに、ＢＡＳＰ１が内腔エクソソームカーゴを搭載する能力を示す。より短い断片ｐＣＢ６９０−６９１の抗ＦＬＡＧシグナルは、著しく低減したか、または存在しなかった。ＢＡＳＰ１  Ｇ２Ａ−ＧＦＰ（ｐＣＢ６９２）またはＢＡＳＰ１  Ｇ２Ａ／Ｇ３Ａ−ＧＦＰ（ｐＣＢ６９４）も、シグナルを欠いていたが、ＢＡＳＰ１  Ｇ３Ａ−ＧＦＰ（ｐＣＢ６９３）は、ｐＣＢ５４０と同様のレベルで発現された。これらの結果は、図１１のナノフローサイトメトリーのデータと一致し、ｐＣＢ６８９がエクソソームにタンパク質カーゴを搭載するのに十分であることを確認する。確立されたエクソソームタンパク質であるＡｌｉｘに対する抗体を用いるウェスタンブロッティングは、全ての試料で同等のシグナルを示した。これは、ＢＡＳＰ１−ＧＦＰの過剰発現が内因性エクソソームタンパク質の発現パターンを攪乱しなかったか、または、別様にエクソソームの生合成または組成を攪乱しなかったことを示す（図１５）。共に、これらの結果は、異種タンパク質との融合体として、９アミノ酸タグ（ＭＧＧＫＬＳＫＫＫ−配列番号１３）を発現させ、エクソソームの内腔へのタンパク質の局在化を駆動することができることを示す。さらに、配列の２位がエクソソーム搭載に必要とされるが、配列の３位は省くことができる。従って、配列ＭＧＡＫＬＳＫＫＫ（配列番号１１０）、または、より一般には、ＭＧＸＫＬＳＫＫＫ（配列番号１１６）は、エクソソーム内腔に目的のタンパク質を搭載するために使用することもできる。
【０１３８】
上に示されるような、搭載を容易にする１２アミノ酸トランケーション及び搭載を容易にすることができない６アミノ酸トランケーションの間の最小のＢＡＳＰ１アミノ酸配列を同定するために、ＦＬＡＧタグ及びＧＦＰに融合しているＢＡＳＰ１のＮ末端の個々のトランケーション変異体を生成し、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞で安定的に発現させた（図１６Ａ）。エクソソームを、上記のように安定した細胞培養物から精製した。７〜１２アミノ酸のＢＡＳＰ１配列は、エクソソームにＧＦＰを搭載することが可能であるが、最初の６アミノ酸は、そうではなかった（図１６Ｂ）。これらのデータは、６位以降に少なくとも１つのリジン残基が、ＢＡＳＰ１のＮ末端がエクソソームの内腔搭載に必要とされることを示す。
【０１３９】
ＢＡＳＰ１の６位のセリンは、種間で且つＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１で、高度に保存される。このアミノ酸がエクソソームへのカーゴの搭載に必要かどうかを判定するために、セリン６をアスパラギン酸（Ｓ６Ｄ、極性荷電置換）またはアラニン（Ｓ６Ａ、小さな非極性置換）で置換する点変異体を含むＢＡＳＰ１  １〜３０−ＦＬＡＧ−ＧＦＰまたはＢＡＳＰ１  １〜３０−ＦＬＡＧ−ＧＦＰをコードする発現プラスミドで、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を安定的にトランスフェクトした。さらに、５位のリジンをグルタミン酸（Ｌ５Ｑ）に変異させて、いくつかの膜関連タンパク質のミリストイル化、パルミトイル化、及び他の膜機能の調節におけるこの位置の潜在的な役割を試験した（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ−Ａｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ．２０１６  Ｄｅｃ  １；２７（２４）：３９２６−３９３６）（図１７Ａ）。ＢＡＳＰ１  Ｓ６Ｄは、エクソソームへのＧＦＰの搭載を完全に抑制したが、Ｓ６Ａは、搭載を変更しなかった。ＢＡＳＰ１  Ｌ５Ｑは、内腔搭載にも影響せず、これは、６位の負電荷が搭載を阻害するが、５位の極性アミノ酸置換が十分に許容されることを示す（図１７Ｂ）。
【０１４０】
ＢＡＳＰ１の最初の３０アミノ酸は、上記で同定されたＮ末端リーダー配列、続いて、リジンリッチアミノ酸を含有する。ＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１のＮ末端がＢＡＳＰ１と同様にエクソソームに搭載し得るかどうかを理解するために、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を、ＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１の全長タンパク質またはＦＬＡＧ−ＧＦＰに融合しているアミノ酸１〜３０で安定的にトランスフェクトした。精製されたエクソソームをＳＤＳ  ＰＡＧＥ及びクーマシー染色で分析して、搭載の程度を決定した。全長ＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１は、エクソソームにＧＦＰを搭載することができたが、アミノ酸１〜３０は、全長タンパク質よりも劣っていた。これは、搭載に必要なＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１タンパク質の遠位領域に追加の構造または配列の特徴があることを示唆する（図１８）。ＭＡＲＣＫＳ及びＭＡＲＣＫＳＬ１の配列解析により、ＢＡＳＰ１のＮ末端と潜在的な配列相同性を有する領域が明らかになった。ＭＡＲＣＫＳのアミノ酸１５２〜１７３及びＭＡＲＣＫＳＬ１の８７〜１１０は、フェニルアラニン及びセリン残基が散在したリジンリッチであり、リン酸化部位ドメイン（ＰＳＤ）またはエフェクタードメイン（ＥＤ）であると予測される（図１９）。ＰＳＤドメインにＭＡＲＣＫＳのアミノ酸１〜３を融合するプラスミド構築物（ＭＧ−ＰＳＤ）で、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を安定的にトランスフェクトした。エクソソームの搭載においてこれらの残基の役割を決定するために、予測されたミリストイル化部位（ＭＡ−ＰＳＤ）ならびに６位（Ｋ６Ｓ及びＫ６Ａ）で、個々の点変異を生成した（図２０Ａ）。精製されたエクソソームのウェスタンブロット法は、ＢＡＳＰ１  １〜３０の陽性対照と比較して、ＭＧ−ＰＳＤもＭＡ−ＰＳＤもエクソソームに効率的に搭載することができないことを示した。興味深いことに、Ｋ６Ａ及びＫ６Ｓ変異は、搭載の改善をもたらした。これは、６位の正電荷がエクソソームカーゴの搭載を妨げること、及び、ＭＡＲＣＫＳのＰＳＤが内因性Ｎ末端配列を機能的に補完し得ることを示唆する（図２０Ｂ）。共に、これらの試験は、エクソソームにカーゴを搭載するのに十分ないくつかのモチーフの同定を可能にした（図２１）。
【０１４１】
最も狭いモチーフであるモチーフ１は、（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）（配列番号１１８）のタンパク質配列を可能にし、各括弧文字または文字のグループは、アミノ酸位置であり、さらに、５位は、正荷電アミノ酸（Ｋ／Ｒ／Ｈ）とすることができず、６位は、負荷電アミノ酸（Ｄ／Ｅ）とすることができない。モチーフ１のサブモチーフは、タンパク質配列：（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）、（Ｍ）（Ｇ）（Ａ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）、（Ｍ）（Ｇ）（Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）、（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）、（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）、（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）、（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｆ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）、（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｓ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）、（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｑ）（Ｓ／Ａ）（Ｋ）（Ｋ）、（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ｓ）（Ｋ）（Ｋ）、及び（Ｍ）（Ｇ）（Ｇ／Ａ／Ｓ）（Ｋ／Ｑ）（Ｌ／Ｆ／Ｓ／Ｑ）（Ａ）（Ｋ）（Ｋ）を含むが、これらに限定されず、５位は、正荷電アミノ酸（Ｋ／Ｒ／Ｈ）とすることができず、６位は、負荷電アミノ酸（Ｄ／Ｅ）とすることができない。
【０１４２】
より広いモチーフであるモチーフ２は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（ξ）（Φ／π）（Ｓ／Ａ／Ｇ／Ｎ）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、ξは、（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｐ、Ｇｌｕ、Ｌｙｓ、Ｈｉｓ、Ａｒｇ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐまたはＧｌｕ）でもない）として表すことができる。
【０１４３】
最も広いモチーフであるモチーフ３は、（Ｍ）（Ｇ）（π）（Ｘ）（Φ／π）（π）（＋）（＋）（式中、各括弧位置は、アミノ酸を表し、πは、（Ｐｒｏ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ｓｅｒ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、Ｘは、任意のアミノ酸であり、Φは、（Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｍｅｔ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であり、（＋）は、（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ）からなる群より選択される任意のアミノ酸であって、５位は（＋）ではなく、６位は（＋）でも（ＡｓｐもしくはＧｌｕ）でもない）として表すことができる。モチーフ１〜３の全ての場合、配列は、合計アミノ酸長が７になるように、１つのアミノ酸だけ切断されてもよい（すなわち、モチーフ１〜３で提示された順序のアミノ酸１〜７からなる）。モチーフ１、２、または３（またはアミノ酸７を欠くこれらのモチーフ）のいずれに由来する配列のいずれも、全長ＢＡＳＰ１またはＢＡＳＰ１の天然トランケーション配列と同程度または同等に、エクソソームにカーゴを搭載するために使用することができる。アミノ酸配列−構造−機能のこの深い分析は、産生細胞により生物学的に発現されたカーゴをエクソソームに向けるための要件に新たな洞察を提供する。
【０１４４】
実施例５：ＢＡＳＰ１のＮ末端は、多様なクラスのタンパク質を搭載するのに十分である
実施例４の結果は、ＢＡＳＰ１のＮ末端が、産生細胞から内腔に直接搭載されたエクソソームを生成するのに有用な操作足場であり得ることを示唆する。この仮説を試験するために、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜３０または１〜１０に融合しているコドン最適化された全長Ｃａｓ９タンパク質を発現する安定したＨＥＫ２９３ＳＦ細胞を生成した（Ｚｅｔｓｃｈｅ  Ｂ，Ｖｏｌｚ  ＳＥ，Ｚｈａｎｇ  Ｆ．Ａ  ｓｐｌｉｔ−Ｃａｓ９  ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ  ｆｏｒ  ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｅｄｉｔｉｎｇ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１５  Ｆｅｂ；３３（２）：１３９−４２に記載されるように）。エクソソームを上記のように細胞培養物から精製し、抗Ｃａｓ９抗体を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングで分析した（Ａｂｃａｍ；カタログ番号ａｂ１９１４６８、クローン７Ａ９−３Ａ３）。図２２Ａに示されるように、ＢＡＳＰ１  １〜３０及び１〜１０の両方は、エクソソームにＣａｓ９を搭載するのに十分であった。組み換えＣａｓ９タンパク質をウェスタンブロットの陽性対照として使用した。ウェスタンブロッティング実験からの種々の量の組み換えＣａｓ９及びＢＡＳＰ１−Ｃａｓ９エクソソームレーンのデンシトメトリー定量及び比較により、エクソソームに、１エクソソーム当たり４〜５つのＣａｓ９分子が搭載されたことが明らかになった（図２２Ｂ）。質量が約１６０ｋＤａであるこのＣａｓ９酵素は、上記のＧＦＰ実験と比較してカーゴサイズの大幅な増加を示す。
【０１４５】
ＢＡＳＰ１のＮ末端への融合として搭載し得るカーゴタンパク質の多様性の追加検証として、オボアルブミンを、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜１０への融合体として、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞中で安定的に発現させた（「ＢＡＳＰ１（１〜１０）−ＯＶＡ」）。第２の選択マーカーを使用して、同じプラスミド及びエクソソーム特異的表面糖タンパク質ＰＴＧＦＲＮ（「３ｘＣＤ４０Ｌ−ＰＴＧＦＲＮ」）に融合している三量体ＣＤ４０Ｌをコードする第２のプラスミドで、別の細胞株を同時トランスフェクトした。エクソソームを２つのトランスフェクトされた細胞培養物から精製し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２３Ａ）及び抗オボアルブミンウェスタンブロッティング（Ａｂｃａｍ；カタログ番号ａｂ１７２９３、クローン６Ｃ８）で分析した（図２３Ｂ）。対照として、組み換えオボアルブミン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；Ｃａｔａｌｏｇ番号ｖａｃ−ｐｏｖａ）を別のゲル中で滴定した。オボアルブミンは、単一の構築物としてＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜１０に融合している時、または追加の過剰発現プラスミド（３ｘＣＤ４０Ｌ−ＰＴＧＦＲＮ）と組み合わせた時、エクソソームに堅固に搭載された。この結果は、エクソソームが、内腔カーゴ及び別の転写物からの同時表面カーゴ（例えば、ＰＴＧＦＲＮ）の両方を用いて、組み合わせて操作することができることを示す。
【０１４６】
治療エクソソームとの関連で有用であり得る別のクラスのタンパク質は、抗体及び抗体断片である。ＧＦＰを標的とする一本鎖ラクダ科動物ナノボディ（Ｃａｕｓｓｉｎｕｓ  Ｅ，Ｋａｎｃａ  Ｏ，Ａｆｆｏｌｔｅｒ  Ｍ．Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ  ｆｕｓｉｏｎ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｋｎｏｃｋｏｕｔ  ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｂｙ  ａｎｔｉ−ＧＦＰ  ｎａｎｏｂｏｄｙ．Ｎａｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ．２０１１  Ｄｅｃ  １１；１９（１）：１１７−２１に記載される）を、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜１０及びＦＬＡＧタグへの融合タンパク質（「ＢＡＳＰ１（１〜１０）−ナノボディ」）またはＦＬＡＧタグのみへの融合タンパク質（「ナノボディ」）として、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞で安定的に発現させた（図２４Ａ）。精製されたエクソソームをＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び抗ＦＬＡＧウェスタンブロッティングで分析した。これは、ナノボディをＢＡＳＰ１のＮ末端に融合させた時、全搭載タンパク質の量が等しいナノボディの実質的な富化があったことを示す（図２４Ｂ）。これらの結果は、ＢＡＳＰ１のＮ末端に由来する非常に短いタンパク質配列を使用する産生細胞で、多様なクラスのタンパク質カーゴをエクソソーム中に発現させ、パッケージ化することができることを示す。
【０１４７】
実施例６：ＢＡＳＰ１のＮ末端を、エクソソームの内腔に核酸を搭載するために使用することができる
核酸、特に、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）は、治療エクソソームの内腔に搭載されるべき治療カーゴの魅力的なクラスである。ＲＮＡのエクソソーム搭載は、細胞外環境中での分解からＲＮＡを保護し得、搭載されたエクソソームは、さらなるレベルのエクソソーム操作、例えば、標的化構築物の表面発現、を介して特定の細胞及び／または組織に向けることができる。上で同定されたエクソソームタンパク質（またはタンパク質断片）が、ｍＲＮＡが搭載されたエクソソームを生成するために使用することができるかどうかを理解するために、組み合わせの操作エクソソームを生成した。図２５で示されるように、ＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜３０を、ＦＬＡＧ及びファージタンパク質ＭＣＰの多様体の融合体として発現させた。ＭＣＰは、ＭＳ２と呼ばれるｍＲＮＡステムループを認識して、それに結合し、これは、ｍＲＮＡ及び他のＲＮＡとの転写融合体として発現させ、それにより、ＭＣＰ融合タンパク質及び目的のＭＳ２融合ＲＮＡ間の物理的会合を駆動することができる。変異解析により、ＭＳ２への親和性を増加させるＭＣＰの２つの位置、すなわち２９位でのバリンからイソロイシンへの置換（Ｖ２９Ｉ；Ｌｉｍ  ＆  Ｐｅａｂｏｄｙ，ＲＮＡ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９４  Ｓｅｐ  １１；２２（１８）：３７４８−５２）及び５５位でのアスパラギンからリジンへの置換（Ｎ５５Ｋ；Ｌｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．１９９４  Ｍａｒ  ２５；２６９（１２）：９００６−１０）を既に同定した。ＢＡＳＰ１  １〜３０を、単量体または二量体ＭＣＰ多様体に融合させ、各ＭＣＰは、Ｖ２９Ｉまたは二重変異Ｖ２９Ｉ／Ｎ５５Ｋのいずれかであった。ルシフェラーゼレポーター構築物を、別のプラスミド由来の３つのＭＳ２ステムループへの融合として発現された。ルシフェラーゼ−ＭＳ２（番号８１１）単独か、またはＢＡＳＰ１−ＭＣＰ多様体（番号８１５、８１７、８１９、もしくは８２１）のそれぞれと組み合わせた５つの安定したＨＥＫ２９３ＳＦ細胞株が生成された（図２５）。追加の対照として、ＨＥＫ２９３ＳＦ細胞をＦＬＡＧタグ付きＢＡＳＰ１  １〜２７で安定的にトランスフェクトした。エクソソームを単離し、あらゆる外部関連ｍＲＮＡを除去するためにＢｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）で処理し、上記の方法に従って精製した。精製されたエクソソームをＳＤＳ−ＰＡＧＥ（図２６Ａ）及び抗ＦＬＡＧウェスタンブロッティング（図２６Ｂ）で分析した。これは、各エクソソーム調製物における等量の全タンパク質及び同等レベルのＢＡＳＰ１−ＦＬＡＧ融合体を示す。重要なことに、ＢＡＳＰ１−ＭＣＰ融合体は、ＭＣＰタンパク質を欠くＢＡＳＰ１  １〜２７  ＦＬＡＧ融合体と同等のレベルで発現した。これは、ＭＣＰ単量体または二量体の添加が、エクソソームへのタンパク質のＢＡＳＰ１媒介性搭載を妨げないことを示す。
【０１４８】
ＢＡＳＰ１−ＭＣＰ及びルシフェラーゼ−ＭＳ２  ｍＲＮＡを安定的に発現する細胞を単離し、全ルシフェラーゼｍＲＮＡをＲＴ−ｑＰＣＲで定量した（ＦＷＤプライマー：５’−ＴＧＧＡＧＧＴＧＣＴＣＡＡＡＧＡＧＴＴＧ−３’（配列番号１１９）；ＲＥＶプライマー：５’−ＴＴＧＧＧＣＧＴＧＣＡＣＴＴＧＡＴ−３’（配列番号１２０）；プローブ：５’−／５６−ＦＡＭ／ＣＡＧＣＴＴＴＣＣ／ＺＥＮ／ＧＧＧＣＡＴＴＧＧＣＴＴＣ／３ＩＡＢｋＦＱ／−３’（配列番号１２１））。非トランスフェクト細胞は、同等のレベルのルシフェラーゼを発現した８１１発現細胞の全てよりも低いレベルのルシフェラーゼを発現した（図２７Ａ、上）。安定した細胞株のそれぞれから精製されたエクソソームをさらに、ＲＴ−ｑＰＣＲで分析した。天然エクソソームは検出可能なレベルのルシフェラーゼＭＳ２を有しないが、８１１のみを発現する細胞は検出可能であるが非常に低いレベルのルシフェラーゼＭＳ２を有していた。重要なことに、ＢＡＳＰ１−ＭＣＰ融合タンパク質のそれぞれは、より大量のルシフェラーゼ−ＭＳ２  ｍＲＮＡを含有した。これは、エクソソームへのｍＲＮＡの搭載を促進するＭＣＰ及びＭＳ２間の結合の重要性を実証する（図２７Ａ、下）。グループ間の相対ｍＲＮＡの定量は、８１１単独でのＢＡＳＰ１−ＭＣＰ融合物の全てについて３０〜６０倍の富化を示した（図２７Ｂ）。二量体ＭＣＰ  Ｖ２９Ｉ／Ｎ５５Ｋを含有したＢＡＳＰ１−ＭＣＰ構築物８２１は、ＭＳ２  ｍＲＮＡに対して最大の親和性を有すると予測され、実に、この実験では最大量のルシフェラーゼ−ＭＳ２を含有していた。これらの結果は、ＢＡＳＰ１断片が、核酸を含む多様なカーゴをエクソソームの内腔に搭載するための堅牢で用途の広い足場タンパク質であることを示す。
【０１４９】
実施例７：ＢＡＳＰ１、ＭＡＲＣＫＳ、及びＭＡＲＣＫＳＬ１は、表面装飾エクソソームを生成するために使用することができる
以前の実験の結果は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１の全長及びＮ末端領域が、内腔に搭載されたエクソソームを生成するために使用することができることを示す。さらにエクソソーム操作のためのこれらのタンパク質の可能性を調査するために、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜３０、またはＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜１０を、ホモ三量体として発現するＣＤ４０Ｌの内因性膜貫通領域に融合させた。リガンドは他の種の同族受容体と交差反応しないので、ＣＤ４０Ｌのヒト及びマウス配列の両方に対する構築物を調製した（図２８）。ＣＤ４０Ｌ発現構築物の１つで安定にトランスフェクトされたＨＥＫ２９３ＳＦ細胞から、エクソソームを精製し、マウス細胞内またはヒトＢ細胞内のいずれかでインキュベートした。エクソソーム上の投入ＣＤ４０Ｌの量をＣＤ４０Ｌ  ＥＬＩＳＡで定量し（ヒトＣＤ４０Ｌの測定の場合、Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、カタログ番号ＤＣＤＬ４０、ロット番号Ｐ１６８２４８、及びマウスＣＤ４０Ｌの測定の場合、Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ１１９５１７、ロット番号ＧＲ３２１８８５０−２を使用した）、Ｂ細胞マーカーＣＤ１９を使用して、Ｂ細胞を定量し、ＣＤ６９に対して陽性のゲーティングされた細胞のパーセンテージにより、Ｂ細胞活性化を測定した。種適合培養物中のマウス（図２９Ａ）またはヒト（図２９Ｂ）エクソソームＣＤ４０Ｌの用量滴定曲線は、構築物間で、粒子間基準で（以下の左のグラフ及び表）、またはＣＤ４０Ｌモル基準の相互に及び等量の組み換えタンパク質と比較した場合に（以下の右のグラフ及び表）、同等の活性を示した。同等の活性は、同様にＣＤ４０Ｌ構築物が単量体として発現された時にも観察され、高密度エクソソーム提示足場であるＰＴＧＦＲＮのＮ末端上に発現された三量体ＣＤ４０Ｌよりもほんのわずかに効能が弱かった（例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４８０２６号を参照のこと）（図２９Ｃ）。これらの結果は、ＭＡＲＣＫＳ、ＭＡＲＣＫＳＬ１、及びＢＡＳＰ１が、ヒト及び動物の用途で使用される種々のクラスの操作エクソソームの生成に有用な多様で堅牢な足場であることを示す。
【０１５０】
実施例８：多様な細胞型が、ＢＡＳＰ１、ＭＡＲＣＫＳ、及び／またはＭＡＲＣＫＳＬ１を発現する
起源の異なる組織（ＨＥＫ２９３：腎臓、ＨＴ１０８０：結合組織、Ｋ５６２：骨髄、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１：乳房、Ｒａｊｉ：リンパ芽球）由来の細胞株を対数増殖期まで成長させ、ＨＥＫ２９３細胞（化学的に定義された培地で成長させた）を除いて、エクソソーム枯渇血清が約６日間補充された培地に移し、これを。骨髄由来間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を３Ｄマイクロキャリア上で５日間成長させ、無血清培地に３日間補充した。各細胞株の培養物の上清を単離し、上記のＯｐｔｉｐｒｅｐ（商標）密度勾配超遠心分離法を使用して、エクソソームを精製した。精製されたエクソソーム調製物のそれぞれを、上記のようにＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析し、ペプチドスペクトルマッチ（ＰＳＭ）の数をＢＡＳＰ１、ＭＡＲＣＫＳ、及びＭＡＲＣＫＳＬ１、ならびに２つの広く研究されたエクソソームのタンパク質（ＣＤ８１及びＣＤ９）について定量した。テトラスパニンＣＤ８１及びＣＤ９は、最も精製されたエクソソーム集団において検出可能であったが、一部の場合では、内腔エクソソームタンパク質以下であった（例えば、ＣＤ９をＢＡＳＰ１またはＭＡＲＣＫＳＬ１と比較）（図３０）。新たに同定された内腔エクソソームマーカーが、異なる組織に由来するいくつかの無関係な細胞株から操作エクソソームを生成するための好適な融合タンパク質であり得ることを、この知見は示している。
【０１５１】
実施例９：ＢＡＳＰ１を過剰発現する非ヒト細胞は、内腔操作エクソソームを産生する
実施例８の結果は、多数のヒト由来細胞が、ＢＡＳＰ１及び実施例１で同定された他の新規エクソソームタンパク質を自然に発現することを示す。ＢＡＳＰ１を汎用エクソソーム足場タンパク質として使用することができるかどうかを判断するために、ＦＬＡＧタグ及びＧＦＰに融合している全長ＢＡＳＰ１（「ＢＡＳＰ１−ＧＦＰ−ＦＬＡＧ」）を発現するプラスミド、ＦＬＡＧタグ及びＧＦＰに融合しているＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜３０（「ＢＡＳＰ１（１〜３０）−ＧＦＰ−ＦＬＡＧ」）を発現するプラスミド、またはＦＬＡＧタグ及びＧＦＰに融合しているＢＡＳＰ１のアミノ酸１〜８（「ＢＡＳＰ１（１〜８）−ＧＦＰ−ＦＬＡＧ」）を発現するプラスミドで、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞を安定的にトランスフェクトした。実施例１に記載の方法を使用して、野生型ＣＨＯ細胞及び３つのＢＡＳＰ１プラスミドのうちの１つでトランスフェクトされたＣＨＯ細胞からエクソソームを精製した。図３１Ａ〜Ｂに示されるように、ＢＡＳＰ１及びＢＡＳＰ１断片融合タンパク質は、ＣＨＯ細胞中で効率よく過剰発現され、無染色ＰＡＧＥ（図３１Ａ）及びＦＬＡＧに対する抗体を用いるウェスタンブロッティング（図３１Ｂ）で検出されるようにエクソソーム中に搭載された。この結果は、ＣＨＯ細胞等の非ヒト細胞がヒトＢＡＳＰ１断片を過剰発現するエクソソームを産生し得ること、ならびに、この過剰発現が高密度でエクソソームの内腔にカーゴタンパク質を駆動し得ることを示す。この結果は、ＢＡＳＰ１が、多くの異なる細胞型及び種から操作エクソソームを生成するための汎用足場タンパク質であることを示す。
【０１５２】
実施例１０：内腔操作エクソソームの生成
内腔操作エクソソームを生成する産生細胞は、エクソソームタンパク質またはエクソソームタンパク質の改変体もしくは断片をコードする外因性配列を導入することにより作成される。エクソソームタンパク質は、上記の実施例４に開示のＢＡＳＰ１断片及びカーゴタンパク質を含む融合タンパク質である。エクソソームタンパク質をコードするプラスミドを、一過的にトランスフェクトして、エクソソーム内腔でエクソソームタンパク質の高レベル発現を誘導する。
【０１５３】
エクソソームタンパク質、エクソソームタンパク質の改変体もしくは断片をコードするポリヌクレオチド、または治療ペプチド、カーゴペプチド、もしくは標的化部分をコードする外因性配列を、産生細胞に安定的に形質転換して、内腔操作エクソソームをする。治療ペプチド、カーゴペプチド、または標的化部分をコードする外因性配列を、エクソソームタンパク質をコードするゲノム部位に挿入して、エクソソームタンパク質に結合している治療ペプチドまたはカーゴペプチドを含む融合タンパク質を生成する。改変されたエクソソームタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、エクソソームタンパク質をコードするゲノム部位にノックインする。
【０１５４】
産生細胞株は、少なくとも２つのポリヌクレオチドを安定的にトランスフェクトすることにより生成され、それぞれは、エクソソームタンパク質、エクソソームタンパク質の改変体もしくは断片、または外因性ペプチド（例えば、標的化部分、治療ペプチド）をコードする。エクソソームタンパク質をコードするゲノム配列内のまたはその近くの複数のゲノム部位に、２つ以上の外因性配列を挿入して、複数の改変エクソソームタンパク質を含む内腔操作エクソソームを生成する。複数の改変されたエクソソームタンパク質のそれぞれは、エクソソームの内腔を標的とする。
【０１５５】
参照による組み込み
本出願で引用される、全ての出版物、特許、特許出願、及び他の文書は、それぞれ個々の出版物、特許、特許出願、または他の文書が個別に、あらゆる目的のために参照により組み込まれると示されるように、あらゆる目的で全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５６】
等価物
本開示は、とりわけ、エクソソームにおける外因性タンパク質の富化に使用される改変外因性タンパク質及びペプチドを含有するエクソソームの組成物を提供する。本開示はまた、富化エクソソームを産生する方法（複数可）を提供する。種々の特定の実施形態が例示及び説明されているが、上の明細書は、制限的ではない。本発明（複数可）の趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができることが理解されるであろう。本明細書の概説の際に、多くの変形形態が当業者らに明らかになるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７Ａ】
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【図１７Ｂ】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２５】
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【図２６Ａ】
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【図２６Ｂ】
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【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図２９Ｃ】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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