(57)【要約】  本発明は、筋肉疾患の分野に関する。具体的には、本発明は、対象がサルコペニアを有するか、又はサルコペニア発症リスクが高いかを判定する方法に関する。対象の栄養療法に対する応答性を予測する方法も提供される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象がサルコペニアを有するか、又はサルコペニア発症リスクが高いかを判定する方法であって、
（ａ）前記対象から得たサンプル中のアントラニル酸のレベルを測定する工程と、
（ｂ）前記サンプル中のアントラニル酸のレベルを基準値と比較する工程と、
を含み、前記サンプル中のアントラニル酸のレベルが前記基準値と比較して増加していることが、サルコペニア又はサルコペニア発症リスクの指標である、方法。
【請求項２】
対象がサルコペニアを有するか、又はサルコペニア発症リスクが高いかを判定する方法であって、
（ａ）前記対象から得たサンプル中のトリゴネリンのレベルを測定する工程と、
（ｂ）前記サンプル中のトリゴネリンのレベルを基準値と比較する工程と、
を含み、前記サンプル中のトリゴネリンのレベルが前記基準値と比較して減少していることが、前記対象におけるサルコペニア又はサルコペニア発症リスクの指標である、方法。
【請求項３】
対象がサルコペニアを有するか、又はサルコペニア発症リスクが高いかを判定する方法であって、
（ａ）前記対象から得たサンプル中のトリゴネリン及びアントラニル酸のレベルを測定する工程と、
（ｂ）前記サンプル中のトリゴネリン及びアントラニル酸の比を決定する工程と、
（ｃ）前記サンプル中のトリゴネリン及びアントラニル酸の比を基準値と比較する工程と、
を含み、前記サンプル中のトリゴネリン：アントラニル酸の比と前記基準値との比較が、前記対象におけるサルコペニア又はサルコペニア発症リスクの指標である、方法。
【請求項４】
前記対象から得た前記サンプル中のトリゴネリン及びアントラニル酸の比が前記基準値と比較して減少していることが、前記対象におけるサルコペニア又はサルコペニア発症リスク増加の指標である、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
サルコペニアが、筋肉量低下、筋力低下、及び身体パフォーマンス低下のうちの１つ以上によって評価される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
（ｉ）筋肉量がＤＸＡ、ＭＲＩ又はＤ３クレアチン希釈法によって測定され、（ｉｉ）筋力が握力又は膝伸展筋力によって測定され、（ｉｉｉ）身体パフォーマンスが歩行速度、ＳＰＰＢ、４００ｍ歩行テスト、ＴＵＧテスト、又は階段昇段テストによって測定される、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
トリゴネリン及び／又はアントラニル酸の前記レベルが質量分析によって測定される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記対象がヒト対象である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
ヒト対象が筋消耗状態若しくは筋疾患を有するか、又は筋消耗状態又は筋疾患の発症リスクが高いかを判定する方法であって、
（ａ）前記対象から得たサンプル中のアントラニル酸及び／又はトリゴネリンのレベルを測定する工程と、
（ｂ）前記サンプル中のアントラニル酸及びトリゴネリンのレベルをアントラニル酸及びトリゴネリンの基準値と比較する工程と、
を含み、前記サンプル中のアントラニル酸のレベルが前記基準値と比較して増加していること及び前記サンプル中のトリゴネリンのレベルが前記基準値と比較して減少していることが、筋消耗若しくは筋疾患、又は筋消耗若しくは筋疾患の発症リスクの指標である、方法。
【請求項１０】
前記ヒト対象が高齢者又は老齢者である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記基準値が、同じ対象から得たサンプル又は対象の群から得たサンプルから決定される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記対象から得た前記サンプルが血液由来のサンプルである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象から得た前記サンプルが尿サンプルである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
対象におけるサルコペニアの治療又は予防に使用するための栄養組成物であって、前記対象がサルコペニアを有するものとして識別されている、又はサルコペニア発症リスクが高い、栄養組成物。
【請求項１５】
前記対象が老齢であり、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法に従ってサルコペニアを有するものとして識別されている、請求項１４による使用のためのＮＡＤ前駆体を含む栄養組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法によってサルコペニアを有するものとして識別された対象又はサルコペニアの発症リスクが高い対象におけるサルコペニアの治療又は予防の方法であって、前記対象の生活習慣を改善することを含む、方法。
【請求項１７】
前記対象の生活習慣を改善することが、食生活の変更を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記食生活の変更が、サルコペニアを治療又は予防する食生活の一部として、少なくとも１種の栄養組成物を前記対象に投与することを含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
サルコペニアを有する対象、又はサルコペニアの発症リスクが高い対象の、栄養組成物に対する応答性を予測するための方法であって、
（ａ）前記対象から得たサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを検出する工程と、
（ｂ）前記サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを基準値と比較する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の結果に基づいて、前記対象の前記栄養組成物に対する応答性を予測する工程と、
を含み、前記１種以上のバイオマーカーはトリゴネリン及び／又はアントラニル酸である、方法。
【請求項２０】
前記バイオマーカーがアントラニル酸及びトリゴネリンであり、前記サンプル中のアントラニル酸のレベルが前記基準値と比較して増加していた場合、前記対象は前記栄養組成物に対して応答性であると予測されることとなり、前記サンプル中のトリゴネリンのレベルが前記基準値と比較して減少していた場合、前記対象は前記栄養組成物に対して応答性であると予測されることとなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
トリゴネリンレベル及びアントラニル酸レベルの比が対象の前記サンプルにおいて測定され、トリゴネリン及びアントラニル酸の基準値比と比較され、前記トリゴネリン及びアントラニル酸の比が前記サンプルにおいて前記基準値比と比較して減少していた場合に、前記対象は栄養組成物に対して応答性であると予測されることとなる、請求項１９に記載の方法。
【請求項２２】
前記栄養組成物がビタミンＢ３を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記栄養組成物がＮＡＤ前駆体を含む、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＮＡＤ前駆体がニコチンアミドリボシドである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記バイオマーカーがトリゴネリンである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２６】
前記栄養組成物がトリゴネリンを含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記栄養組成物がコーヒー抽出物を含む、請求項２５に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
加齢に伴う筋肉量及び筋機能の低下は、全ての個体において避けられないものであるが、その進行は、遺伝的要因並びに身体活動及び栄養摂取などの環境要因によって大きく異なる。
【０００２】
サルコペニアは、加齢に伴う筋肉量及び筋機能の低下が悪化して、生活の質に影響を及ぼすようになっている状態であるとして定義されている。対照的に、フレイルは、加齢に伴う身体機能の衰えという別の分類であり、筋肉量ではなく、筋力及び筋機能の低下を特徴とする。サルコペニアは、可動性が病的状態にある個体について老齢集団を階層化する区切りを使用して、筋肉量及び筋機能の低下により臨床的に定義される。サルコペニアからは将来的な身体障害及び死亡が予測され、サルコペニアには、２０１６年に公式のＩＣＤ−１０疾病コードが割り当てられている（Ａｎｋｅｒら、２０１６）。
【０００３】
サルコペニアは、６５歳を超える男女のいずれもで一般的であり、実施された操作的定義によると、世界での有病率は３〜３０％と推定される。サルコペニアは、フレイル、障害、肥満、糖尿病、及び骨粗鬆症を含む数多くの有害な身体的及び代謝的転帰に関連する。結果として、サルコペニアに起因するかなりの医療コストが存在する。年齢、性別、体格、遺伝率及び身体活動は、確認されている成人影響（adult influences）であるが、高齢個体の間には、筋肉量及び筋力について説明のつかないばらつきがなおも存在する。
【０００４】
サルコペニアは、神経筋伝達障害、興奮収縮連関の変化、幹細胞枯渇に関連した再生能の低下、筋線維におけるミトコンドリア代謝及びエネルギー代謝の不全並びに最終的な骨格筋の大理石様脂肪化及び線維化などの病態生理学的変化に関連する多因性症候群である。したがって、この症候群の病因は、複雑であり、また十分に解明されていないが、身体活動の低下、タンパク同化ホルモン（アンドロゲン、ＩＧＦ−１）のホルモン減少及び栄養不良／栄養失調が強く関与している。
【０００５】
ＭＥＭＯＳＡ（Ｍｕｌｔｉ−Ｅｔｈｎｉｃ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔｓ  ｏｆ  Ｈｕｍａｎ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ）研究は、ヒトにおいてサルコペニアと関連付けられている分子上の変化及び栄養上の変化を決定するために設計された。
【０００６】
本出願の発明者らは、体内のアントラニル酸及びトリゴネリンのレベル、並びにトリゴネリンレベル：アントラニル酸レベルの比は、対象におけるサルコペニア、又はサルコペニア発症リスク増加の指標であることを発見した。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１】血清中のトリゴネリンレベルは、サルコペニア患者において異なっており、除脂肪筋肉量、握力、及び歩行と正の相関があることを示す図である。
【図２】血清中のアントラニル酸レベルは、サルコペニア患者において異なっており、除脂肪筋肉量、握力、及び歩行と負の相関があることを示す図である。
【図３】血清中のトリゴネリンレベル：アントラニル酸レベルの比は、サルコペニア患者において異なっており、除脂肪筋肉量、握力、及び歩行と正の相関があることを示す図である。
【図４Ａ】サルコペニアの筋肉の対照の筋肉に対する遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）である。
【図４Ｂ】図４Ａから選択された酸化的リン酸化遺伝子セットのＧＳＥＡエンリッチメントプロットである。ヒトサルコペニアの骨格筋のＲＮＡ配列は、ミトコンドリア機能不全がサルコペニア下の転写における主な変化であることを明らかにしている。
【図５Ａ】サルコペニアの筋肉の対照の筋肉に対する遺伝子セットエンリッチメント解析である。
【図５Ｂ】図５Ａから選択された酸化的リン酸化遺伝子セットのＧＳＥＡエンリッチメントプロットである。骨格筋ミトコンドリアの機能遺伝子の発現と血清中トリゴネリンレベルとの正の相関を示す。
【図６Ａ】サルコペニアの筋肉の対照の筋肉に対する遺伝子セットエンリッチメント解析である。
【図６Ｂ】図６Ａから選択された酸化的リン酸化遺伝子セットのＧＳＥＡエンリッチメントプロットの図である。骨格筋ミトコンドリアの機能遺伝子の発現と血清中アントラニル酸レベルとの負の相関を示す。
【図７Ａ】サルコペニアの筋肉の対照筋肉に対する遺伝子セットエンリッチメント解析の図である。
【図７Ｂ】図７Ａから選択された酸化的リン酸化遺伝子セットのＧＳＥＡエンリッチメントプロットの図である。骨格筋ミトコンドリアの機能遺伝子の発現と血清中トリゴネリンレベル：アントラニル酸レベルの比との正の相関を示す。
【図８】ヒトサルコペニア筋肉では、ＮＭＡＴ１、ＮＡＭＰＴ、及びＰＮＰなどの遺伝子の発現が低下していることを示す図である。
【図９】対照及びサルコペニアの参加者の筋生検におけるＮＡＤ＋レベルである。
【図１０】血清中のトリゴネリンレベル：アントラニル酸レベルの比は、除脂肪筋肉量指数と正の相関を有することを示す図である。
【発明の詳細な説明】
【０００８】
本発明は、対象がサルコペニアを有するか、又はサルコペニア発症リスクが高いかを判定する方法であって、
（ａ）対象から得たサンプル中のアントラニル酸のレベルを測定する工程と、
（ｂ）サンプル中のアントラニル酸のレベルを基準値と比較する工程と、
を含み、サンプル中のアントラニル酸のレベルが基準値と比較して増加していることが、サルコペニア又はサルコペニア発症リスクの指標である、方法に関する。
【０００９】
一実施形態では、方法は、
（ａ）対象から得たサンプル中のトリゴネリンのレベルを測定する工程と、
（ｂ）サンプル中のトリゴネリンのレベルを基準値と比較する工程と、
を更に含み、サンプル中のトリゴネリンのレベルが基準値と比較して減少していることが、対象におけるサルコペニア又はサルコペニア発症リスクの指標である。
【００１０】
本発明はまた、対象がサルコペニアを有するか、又はサルコペニア発症リスクが高いかを判定する方法であって、
（ａ）対象から得たサンプル中のトリゴネリン及びアントラニル酸のレベルを測定する工程と、
（ｂ）サンプル中のトリゴネリン：アントラニル酸の比を決定する工程と、
（ｃ）サンプル中のトリゴネリン：アントラニル酸の比を基準値と比較する工程と、
を含み、サンプル中のトリゴネリン：アントラニル酸の比と基準値との比較が、対象におけるサルコペニア又はサルコペニア発症リスクの指標である、方法に関する。
【００１１】
一実施形態では、対象から得たサンプル中のトリゴネリン：アントラニル酸の比が基準値と比較して減少していることは、対象におけるサルコペニア又はサルコペニア発症リスク増加の指標である。
【００１２】
本発明はまた、対象がサルコペニアを有するか、又はサルコペニア発症リスクが高いかを判定する方法であって、
（ａ）対象から得たサンプル中のトリゴネリン及びアントラニル酸のレベルを測定する工程と、
（ｂ）サンプル中のアントラニル酸：トリゴネリンの比を決定する工程と、
（ｃ）サンプル中のアントラニル酸：トリゴネリンの比を
基準値と比較する工程と、
を含み、サンプル中のアントラニル酸：トリゴネリンの比と基準値との比較が、対象におけるサルコペニア又はサルコペニア発症リスクの指標である、方法に関する。
【００１３】
一実施形態では、対象から得たサンプル中のアントラニル酸：トリゴネリンの比が基準値と比較して増加していることが、対象におけるサルコペニア又はサルコペニア発症リスク増加の指標である。
【００１４】
本発明はまた、対象がサルコペニアを有するか、又はサルコペニア発症リスクが高いかを判定する方法であって、
（ａ）対象から得たサンプル中のトリゴネリン及びアントラニル酸のレベルを測定する工程と、
（ｂ）サンプル中のアントラニル酸及びトリゴネリンの相対量又は組み合わせを決定する工程と、
（ｃ）サンプル中のアントラニル酸及びトリゴネリンの相対量又は組み合わせを基準値と比較する工程と、
を含み、サンプル中のアントラニル酸及びトリゴネリンの相対量又は組み合わせの基準値との比較が、対象におけるサルコペニア又はサルコペニア発症リスクを示し、
上記組み合わせが、ｎ＊ｆ（Ａ）＋ｍ＊ｇ（Ｂ）［式中、Ａ及びＢは、トリゴネリン及びアントラニル酸の濃度であり、ｆ（）及びｇ（）は数学的変換を表し、ｎ及びｍは正又は負であり得る数値係数である］として定義される、方法に関する。
【００１５】
例えば、組み合わせは、１＊ｌｏｇ２（Ａ）＋（−１）＊ｌｏｇ２（Ｂ）＝ｌｏｇ２（Ａ／Ｂ）又は１＊ｌｏｇ２（Ａ）−２ｌｏｇ２（Ｂ）＝ｌｏｇ２（Ａ／（Ｂ）＾２）として定義され得る。
【００１６】
一実施形態では、数学的変換は、対数変換を含む。
【００１７】
一実施形態では、対象から得たサンプル中のアントラニル酸のトリゴネリンに対する相対量が基準値と比較して増加していることが、対象におけるサルコペニア又はサルコペニア発症リスク増加の指標である。
【００１８】
一実施形態では、本発明は、対象がサルコペニアを有するかを判定する方法に関する。
【００１９】
一実施形態では、本発明は、対象のサルコペニア発症リスクが高いかを判定する方法に関する。
【００２０】
サルコペニアは、筋肉量低下、筋力低下、及び身体パフォーマンス低下のうちの１つ以上によって評価される。より好ましくは、サルコペニアは、筋肉量低下、筋力低下、及び身体パフォーマンス低下のうちの２つ以上によって評価される。最も好ましくは、サルコペニアは、筋肉量低下、筋力低下、及び身体パフォーマンス低下によって評価される。これらは全て、当業者に周知の方法によって測定できる。
【００２１】
筋肉量は、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）、ＤＸＡ（二重エネルギーＸ線吸収測定）、ＭＲＩ（磁気共鳴映像法）又はＤ３クレアチン希釈法によって測定できる。
【００２２】
筋力は、握力（例えば、ハンドヘルドダイナモメトリーを使用）又は膝伸展筋力（例えば、四頭筋トルク測定を使用）によって測定できる。
【００２３】
身体パフォーマンスは、歩行速度、ＳＰＰＢ、４００ｍ歩行試験、ＴＵＧ（ｔｉｍｅ  ｕｐ  ａｎｄ  ｇｏ）テスト、又は階段昇段テストによって測定できる。
【００２４】
一実施形態では、トリゴネリン及びアントラニル酸のレベルは質量分析によって測定される。好ましくは、トリゴネリン及びアントラニル酸のレベルは、液体クロマトグラフィーに続く質量分析によって測定される。
【００２５】
一実施形態では、対象はヒト対象である。
【００２６】
一実施形態では、ヒト対象は高齢者である。一実施形態では、ヒト対象は老齢である。
【００２７】
一実施形態では、対象は、コンパニオンアニマル、好ましくはイヌである。
【００２８】
本発明は、対象が筋消耗状態若しくは筋疾患を有するか、又は筋消耗状態又は筋疾患の発症リスクが高いかを判定する方法であって、
（ａ）対象から得たサンプル中のアントラニル酸及び／又はトリゴネリンのレベルを測定する工程と、
（ｂ）サンプル中のアントラニル酸及び／又はトリゴネリンのレベルを基準値と比較する工程と、
を含み、サンプル中のアントラニル酸のレベルが基準値と比較して増加していること、又はサンプル中のトリゴネリンのレベルが基準値と比較して減少していることが、筋消耗状態若しくは筋疾患、又は筋消耗状態若しくは筋疾患の発症リスクの指標である、方法に関する。
【００２９】
本発明はまた、対象が筋消耗状態若しくは筋疾患を有するか、又は筋消耗状態若しくは筋疾患の発症リスクが高いかを判定する方法であって、
（ａ）対象から得たサンプル中のトリゴネリン及びアントラニル酸のレベルを測定する工程と、
（ｂ）サンプル中のトリゴネリン：アントラニル酸の比を決定する工程と、
（ｃ）サンプル中のトリゴネリン：アントラニル酸の比を基準値と比較する工程と、
を含み、サンプル中のトリゴネリン：アントラニル酸の比の基準値との比較が、対象における筋消耗状態若しくは筋疾患、又は筋消耗状態若しくは筋疾患の発症リスク増加の指標である、方法にも関する。
一実施形態では、対象から得たサンプル中のトリゴネリン：アントラニル酸の比が基準値と比較して減少していることが、対象における筋消耗状態若しくは筋疾患、又は筋消耗状態若しくは筋疾患の発症リスク増加の指標である。
【００３０】
筋消耗状態は、不使用、不動、長期臥床、ＩＣＵ（集中治療室）滞在によって引き起こされ得る。
【００３１】
筋疾患は、サルコペニア、悪液質（癌、ＣＯＰＤ、心不全、腎疾患などの慢性疾患によって引き起こされる）、遺伝的筋障害、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィーなどのジストロフィー、コルチコステロイド若しくはスタチンのような薬物によって誘発される筋毒性又は横紋筋融解であり得る。
【００３２】
好ましくは、筋疾患はサルコペニアである。
【００３３】
以下の実施形態は、本発明の上記の方法のうちの１つ以上に関する。
【００３４】
一実施形態では、基準値は、同じ対象から得たサンプル又は対象の群から得たサンプルから決定される。
【００３５】
一実施形態では、基準値は、同じ対象からのサンプルで測定される。
【００３６】
一実施形態では、基準値は、同じ対象において、例えば栄養組成物を用いた栄養療法の前に測定され、栄養療法後の測定値と比較される。
【００３７】
一実施形態では、基準値は、対象の群、例えば、年齢の近い対象の群から得たサンプルで測定される。
【００３８】
一実施形態では、対象は高齢者である。
【００３９】
一実施形態では、対象は老齢である。
【００４０】
一実施形態では、対象から得たサンプルは、血漿サンプルである。
【００４１】
一実施形態では、対象から得たサンプルは、血清サンプルである。
【００４２】
一実施形態では、対象から得たサンプルは尿サンプルである。
【００４３】
本発明はまた、対象におけるサルコペニアの治療又は予防に使用するための栄養組成物にも関する。
【００４４】
一実施形態では、対象はサルコペニアを有するものとして識別されている、又はサルコペニア発症リスクが高い。
【００４５】
一実施形態では、対象は、本発明による方法によって、サルコペニアを有するものとして識別されている、又はサルコペニア発症リスクが高い。
【００４６】
一実施形態では、栄養組成物はＮＡＤ前駆体を含む。一実施形態では、栄養組成物はトリゴネリンを含む。一実施形態では、栄養組成物はトリゴネリンの前駆体を含む。一実施形態では、栄養組成物は、トリゴネリンの誘導体を含む。トリゴネリンは、化学式Ｃ７Ｈ７ＮＯ２及びＣＡＳ番号５３５−８３−１を有するアルカロイドである。
【００４７】
一実施形態では、対象は高齢者である。
【００４８】
一実施形態では、対象は老齢である。
【００４９】
一実施形態では、対象は、本発明による方法によってサルコペニアを有するものとして識別され、栄養組成物はＮＡＤ前駆体を含み、対象は老齢である。
【００５０】
一実施形態では、対象は、本発明による方法によってサルコペニアを有するものとして識別され、栄養組成物はトリゴネリンを含み、対象は老齢である。
【００５１】
本発明はまた、対象におけるサルコペニアの治療又は予防の方法にも関する。
【００５２】
一実施形態では、対象はサルコペニアを有するものとして識別されている、又はサルコペニア発症リスクが高い。
【００５３】
一実施形態では、対象は、本発明による方法によって、サルコペニアを有するものとして識別されている、又はサルコペニアの発症リスクが高いものとして識別される。
【００５４】
一実施形態では、本方法は、対象の生活習慣を改善することを含む。
【００５５】
一実施形態では、生活習慣を改善することは、身体活動、例えば、体重負荷運動、レジスタンス運動又は持久運動を含む。
【００５６】
一実施形態では、対象の生活習慣を改善することは、食生活の変更を含む。
【００５７】
一実施形態では、食生活の変更は、サルコペニアを治療又は予防する食生活の一部として、少なくとも１種の栄養組成物を対象に投与することを含む。
【００５８】
一実施形態では、栄養組成物はＮＡＤ前駆体を含む。
【００５９】
一実施形態では、対象は高齢者である。
【００６０】
一実施形態では、対象は老齢である。
【００６１】
本発明はまた、筋消耗若しくは筋疾患を有する対象、又は筋消耗若しくは筋疾患の発症リスクが高い対象の、栄養組成物に対する応答性を予測するための方法にも関する。
【００６２】
一実施形態では、栄養組成物はＮＡＤ前駆体を含み、対象は老齢であり、筋疾患はサルコペニアである。
【００６３】
本発明はまた、サルコペニアを有する対象、又はサルコペニアの発症リスクが高い対象の、栄養組成物に対する応答性を予測するための方法にも関する。
【００６４】
一実施形態では、栄養組成物はＮＡＤ前駆体を含み、対象は老齢である。
【００６５】
一実施形態では、本発明の方法は、
（ａ）対象から得たサンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを検出する工程と、
（ｂ）サンプル中の１種以上のバイオマーカーのレベルを基準値と比較する工程と、
（ｃ）工程（ｂ）の結果に基づいて、対象の栄養組成物に対する応答性を予測する工程と、を含み、
１種以上のバイオマーカーは、アントラニル酸及び／又はトリゴネリンである。
【００６６】
対象は、サンプル中のアントラニル酸のレベルが基準値と比較して増加していた場合、栄養組成物又は栄養療法に対して応答性であると予測されることとなる。対象は、サンプル中のトリゴネリンのレベルが基準値と比較して減少していた場合、栄養組成物又は栄養療法に対して応答性であると予測されることとなる。
【００６７】
一実施形態では、バイオマーカーはアントラニル酸である。
【００６８】
一実施形態では、バイオマーカーはトリゴネリンである。
【００６９】
一実施形態では、バイオマーカーは、アントラニル酸とトリゴネリンとの組み合わせである。
【００７０】
一実施形態では、バイオマーカーは、アントラニル酸、トリゴネリン、３−ヒドロキシ−アントラニル酸、トリプトファン、キヌレニン、又はこれらの代謝産物の組み合わせである。
【００７１】
一実施形態では、栄養組成物はビタミンＢ３である。
【００７２】
一実施形態では、栄養組成物はＮＡＤ前駆体、例えばニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド、及びニコチンアミドである。
【００７３】
一実施形態では、栄養組成物はトリプトファン、キヌレニン、及びこれらの代謝産物である。
【００７４】
一実施形態では、栄養組成物はトリゴネリンである。
【００７５】
一実施形態では、栄養組成物は、コーヒー、例えば、コーヒー豆抽出物又はコーヒー飲料から誘導される。一実施形態では、上記コーヒー抽出物は、カフェイン酸、トリゴネリン、キノリン酸、及びキノリン酸の前駆体のうちの１つ以上を含む。
【００７６】
対象
用語「対象」は、ヒト及びコンパニオンアニマルを含む任意の動物を意味する。概して、対象は、ヒト、又は鳥類、ウシ、イヌ、ウマ、ネコ、ヤギ、ネズミ、ヒツジ若しくはブタの動物である。対象は、ウマ又はコンパニオンアニマル、例えば、ネコ又はイヌであり得る。好ましくは、対象は、ヒトである。用語「老齢」は、ヒトに関連して、少なくとも６０歳、より好ましくは６４歳超、最も好ましくは６８歳超の年齢を意味する。用語「高齢者」は、ヒトに関連して、少なくとも４５歳、好ましくは５０歳超、より好ましくは５５歳超の年齢を意味し、老齢の対照を含む。
【００７７】
サルコペニア
サルコペニアは、筋肉量低下、筋力低下、及び身体パフォーマンス低下のうちの１つ以上によって評価することができる。
【００７８】
対象において、サルコペニアは、例えばＣｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４に記載のように、ＡＷＧＳＯＰ（Ａｓｉａｎ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  Ｏｌｄｅｒ  Ｐｅｏｐｌｅ）の定義に基づいて診断できる。筋肉量低下は、概ね、体肢除脂肪量を身長の２乗に対して正規化した値（ＡＬＭ指数）が低いこと、具体的には、男性は７．００ｋｇ／ｍ２未満、女性は５．４０ｋｇ／ｍ２未満のＡＬＭ指数を基準とすることができる。身体パフォーマンス低下は、概ね、歩行速度、具体的には＜０．８ｍ／秒の歩行速度を基準とすることができる。筋力低下は、概ね、握力低下、具体的には男性２６ｋｇ未満及び女性１８ｋｇ未満の握力を基準とすることができる。
【００７９】
対象において、サルコペニアは、例えばＣｒｕｚ−Ｊｅｎｔｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０に記載のように、ＥＷＧＳＯＰ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  Ｏｌｄｅｒ  Ｐｅｏｐｌｅ）の定義に基づいて診断することができる。筋肉量低下は、概ね、体肢除脂肪量を身長の２乗に対して正規化した値（ＡＬＭ指数）が低いこと、具体的には、男性は７．２３ｋｇ／ｍ２未満、女性は５．６７ｋｇ／ｍ２未満のＡＬＭ指数を基準とすることができる。身体パフォーマンス低下は、概ね、歩行速度、具体的には＜０．８ｍ／秒の歩行速度を基準とすることができる。筋力低下は、概ね、握力低下、具体的には男性３０ｋｇ未満及び女性２０ｋｇ未満の握力を基準とすることができる。
【００８０】
対象において、サルコペニアは、例えば  Ｓｔｕｄｅｎｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４に記載のように、ＦＮＩＨ（Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ）の定義に基づいて診断することができる。筋肉量低下は、概ね、体肢除脂肪量（ＡＬＭ）を体格指数（ＢＭＩ；ｋｇ／ｍ２）に対して正規化した値が低いこと、具体的には男性は０．７８９未満、女性は０．５１２未満のＡＬＭ対ＢＭＩを基準とすることができる。身体パフォーマンス低下は、概ね、歩行速度、具体的には＜０．８ｍ／秒の歩行速度を基準とすることができる。筋力低下は、概ね、握力低下、具体的には男性２６ｋｇ未満及び女性１８ｋｇ未満の握力を基準とすることができる。筋力低下はまた、概ね、握力対体格指数の低下、具体的には男性１．００未満及び女性０．５６未満の握力対体格指数を基準とすることができる。
【００８１】
Ｄ３クレアチン希釈法は、筋肉量を測定する別のアプローチである。この方法は、ロバストな標準であり、将来のＤＸＡ代替法となり得る方法として、より広く受け入れられている。Ｄ３クレアチン希釈法は、Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）及びＳｔｉｍｐｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）によって既に記載されている。
【００８２】
本方法は、対象から得たサンプル中のトリゴネリンのレベル、アントラニル酸のレベル、及び／又はこれらのレベルの比を測定することを含む。これは、「試験サンプル」と呼ばれることもある。したがって、本方法は、典型的には、ヒト又は動物の身体の外側で、例えば、試験を行う対象から事前に得た体液サンプルに対して行われる。
【００８３】
サンプルは、例えば、血清、血漿又は尿サンプルであってよい。サンプルは、血液から得てもよく、すなわち、サンプルは、全血又は血液画分を含んでもよい。サンプルは、血漿又は血清を含むことができる。好ましくは、サンプルは血清サンプルである。
【００８４】
血液サンプルを採取し、血液画分を分離する手法は、当該技術分野において周知である。例えば、静脈血サンプルは、針を用いて患者から採取し、プラスチック管中に保管することができる。採取管は、例えば、スプレーコーティングしたシリカ、及び血清分離のためのポリマーゲルを含んでいてもよい。血清は、１３００ＲＣＦにおいて室温で１０分間の遠心分離によって分離し、小型プラスチック管中、−８０℃で保管することができる。
【００８５】
基準値との比較
本方法は、アントラニル酸及びトリゴネリンのレベルと、アントラニル酸及びトリゴネリンの基準値レベルとの比較を含む。用語「基準値」は、「対照値」と同義であり、技術的データの正確な解釈を促すために当業者が使用するデータを広く含む。
【００８６】
対象から得たサンプル中のアントラニル酸のレベル、トリゴネリンのレベル、及び／又はトリゴネリンレベル：アントラニル酸レベルの比を、同じ対象のレベル及び／若しくは比、又は対照対象者の１つ以上のコホート（集団／群）のレベル及び／若しくは比と比較することができる。
【００８７】
基準値は、同じ対象からのサンプルを、例えば反復サンプルのアッセイによって分析することによって確立され得る。基準値は、一般集団又は選択集団中の個体のサンプルを分析し、陽性判定基準を選択するための予測的中率法又は最適な特異度（最も高い真陰性率）及び感度（最も高い真陽性率）を定義する受信者操作特性曲線などの統計モデルを使用することによって確立することができ、これは、Ｋｎａｐｐ，Ｒ．Ｇ．，ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｃ．（１９９２）．Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｅｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ．Ｗｉｌｌｉａｍ  ａｎｄ  Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｈａｒｕａｌ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｐａ．に記載されているとおりである（この文献を参考として本明細書に援用する）。
【００８８】
基準値は、少なくとも１つの個体、より好ましくは少なくとも５つの個体、より好ましくは少なくとも１０の個体、より好ましくは少なくとも１５の個体、最も好ましくは少なくとも２０の個体を分析することによって確立され得る。上記個体の全て又はかなりの数が、好ましくはサルコペニアを有さない。
【００８９】
正しい基準値をどのように割り当てるについては、当業者に知られているが、これらは、例えば、性別、人種、遺伝的遺産、健康状態又は年齢に応じて変わる。
【００９０】
栄養組成物
本発明による栄養組成物は、栄養補助組成物、機能性食品、機能性栄養製品、薬物として規制される医療用食品、医療栄養製品、又は栄養補助食品であってもよい。
【００９１】
用語「栄養補助食品」（nutraceutical）は、単語「栄養」（nutrition）と「医薬」（pharmaceutical）を組み合わせたものである。栄養補助食品は、疾患の予防及び処置を含む、健康及び医学的利益をもたらす食品又は食品製品である。栄養補助食品は、通常は食品と関連しない医薬品の形態で一般に販売されており、食品から分離された又は精製された製品である。栄養補助食品は、生理学的効果を有すること、又は慢性疾患に対する保護をもたらすことが実証されている。このような製品は、分離された栄養素、健康補助食品、及び特別食から、遺伝子操作された食品、ハーブ製品、並びにシリアル、スープ、及び飲料などの加工食品にまで及び得る。
【００９２】
本明細書で使用するとき、用語「栄養補助食品」は、栄養分野及び医薬品分野の両方において有用であることを意味する。したがって、栄養補助組成物は、食品及び飲料への栄養補助剤として、並びにカプセル若しくは錠剤などの固体製剤、又は溶液若しくは懸濁液などの液体製剤であり得る経腸若しくは非経口適用の医薬製剤として使用できる。
【００９３】
本発明による栄養組成物は、トリゴネリン、トリゴネリンの前駆体、及び／又はトリゴネリンの誘導体を含み得る。トリゴネリンの前駆体は、例えば、キノリン酸、ニコチン酸、及び／又はニコチンアミドであってもよい。
【００９４】
好ましくは、本発明による栄養組成物は、ＮＡＤ前駆体、例えばニコチンアミドリボシド、ニコチンアミドモノヌクレオチド、及びニコチンアミド及び／又はニコチン酸を含む。
【００９５】
本発明による栄養組成物は、保護親水コロイド（ガム、タンパク質、改質デンプンなど）、結合剤、被膜形成剤、封入剤／封入材、壁／シェル材料、マトリックス化合物、コーティング、乳化剤、表面活性剤、可溶化剤（油、脂肪、ワックス、レシチンなど）、吸着剤、担体、充填剤、共化合物、分散剤、湿潤剤、加工助剤（溶媒）、流動剤、矯味剤、増量剤、ゼリー化剤、ゲル形成剤、酸化防止剤及び抗菌剤を更に含んでもよい。
【００９６】
更に、マルチビタミン及びミネラルサプリメントを本発明の栄養組成物に添加して、一部の食生活で欠けている必須栄養素を適量得ることができる。マルチビタミン及びミネラルサプリメントはまた、疾患予防並びに生活習慣のパターンによる栄養の減少及び栄養失調に対する補償に有用であり得る。
【００９７】
本発明の栄養組成物は、身体への投与に適した任意のガレヌス製剤の形態（galenicform）であってもよく、特に従来経口投与に用いられる任意の形態、例えば、食品又は飼料（そのための添加剤／栄養補助剤）、食品又は飼料プレミックス、強化食品又は飼料、錠剤、丸剤、顆粒剤、糖衣錠、カプセル剤、並びに粉末及び錠剤などの発泡性製剤などの固体形態、又は溶液、エマルション若しくは懸濁液（例えば、飲料、ペースト、及び油性懸濁液として）などの液体形態であってもよい。ペーストは、ハード又はソフトシェルカプセルに組み込まれてもよく、それにより、カプセルは、例えば、（魚、ブタ、家禽、ウシ）ゼラチン、植物タンパク質、又はリグニンスルホネートのマトリックスを特徴とする。他の適用形態の例は、経皮、非経口、又は注射可能な投与のための形態である。栄養組成物は、制御（遅延）放出製剤の形態であってよい。
【００９８】
栄養組成物は飲料を含んでもよい。用語「飲料」は、非アルコール飲料及びアルコール飲料並びに飲用水及び液体食品に添加される液体製剤を包含する。非アルコール飲料は、例えば、ソフトドリンク、スポーツドリンク、果汁、茶、及び乳ベースのドリンクである。液体食品は、スープ及び乳製品を含んでもよい。本発明の化合物を含む栄養補助組成物は、ソフトドリンク、エネルギーバー、又はキャンディに添加されてもよい。
【００９９】
栄養組成物が栄養補助製剤であり、組成物が、薬学的に許容される賦形剤、希釈剤又は補助剤を更に含有する場合、その配合には標準的な技術、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，２０ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，ＰＡ，ＵＳＡに開示されている技術を使用してもよい。経口投与の場合、好適な結合剤（例えばゼラチン又はポリビニルピロリドン）、好適な充填剤（例えばラクトース又はデンプン）、好適な潤滑剤（例えばステアリン酸マグネシウム）、及び任意に追加の添加剤を含有する、錠剤及びカプセルが好ましくは使用される。
【０１００】
「機能性食品」、「機能性栄養製品」、「医療用食品」、及び「医療用栄養製品」は、栄養素を供給するという基本機能を超える健康増進又は疾患予防特性を有すると主張する任意の健康食品に関連する。機能性食品の一般的なカテゴリーには、「ビタミン強化」製品のような、健康増進添加剤で強化された加工食品又は食品類が含まれる。
【０１０１】
栄養補助食品は、食品補助剤又は栄養補助剤としても知られ、食生活を補うこと、及びビタミン、ミネラル、繊維、脂肪酸、又はアミノ酸など、個人の食生活で欠けている場合がある又は十分な量で消費されていない場合がある栄養素を補給することを目的とした配合物である。栄養補助食品を食品として定義している国もあれば、薬物又は天然健康製品として定義している国もある。ビタミン又は食事性ミネラルを含有する栄養補助食品は、食品、食品生産、及び食品安全性に関する国際的に認識された規格、実施規準、ガイドライン、及びその他の勧告を集めたものであるコーデックス規格（Codex Alimentarius）に、食品の１カテゴリーとして含まれている。コーデックス規格は、国際連合食糧農業機関（ＦＡＯ）と世界保健機関（ＷＨＯ）が後援する組織であるコーデックス委員会（Codex Alimentarius Commission）によって作成されている。
【０１０２】
疾患の予防又は治療
「予防」は、状態又は疾患のリスク及び／又は重症度を低減させることを含む。用語「治療」、「治療する」、「軽減する」及び「緩和する」には、予防若しくは予防的治療（標的とする病態若しくは障害の発現を予防する及び／又は遅らせる）と、治癒的、治療的若しくは疾患改善的な治療の両方が含まれ、例えば、診断された病態又は障害の治癒、遅延、症状の緩和、及び／又は進行の停止のための治療的手段、並びに、疾患のリスクがある患者又は疾患に罹患する疑いのある患者、及び体調不良の患者又は疾患若しくは医学的症状に罹患していると診断された患者の治療が含まれる。この用語は、完治するまで対象が治療されることを必ずしも意味するものではない。これらの用語の全てはまた、疾患を患ってはいないが、不健康な状態を起こしやすい対象の健康維持及び／又は促進も意味する。これらの用語はまた、１つ以上の主たる予防的又は治療的手段の相乗作用あるいは増進を含むことを意図するものである。用語「治療」、「治療する」、「軽減する」及び「緩和する」は更に、疾患若しくは症状に対する食事療法、又は疾患若しくは症状の予防（prophylaxis）若しくは予防（prevention）のための食事療法を含むことを意図するものである。治療は患者に関連するものであってもよく、又は医師に関連するものであってもよい。
【０１０３】
実施例により本発明を更に説明するが、これらの実施例は、当業者が本発明を実施するのに役立てるために提供することを意味するものであり、本発明の範囲を限定することを決して意図するものではない。
【実施例】
【０１０４】
実施例１
血清中の代謝産物の測定
６５〜７９歳の主に中国系の男性の参加者２０人と、サルコペニアと診断されていない同年齢群の２０人の対照対象者を、シンガポールの健康なコミュニティに居住する高齢者に関する２つの研究（Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  Ｇｒｏｕｐ及びＡｇｅｉｎｇ  ｉｎ  ａ  Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ  Ｓｔｕｄｙ［ＡＣＥＳ］）から募集した。サルコペニアは、Ａｓｉａｎ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｆｏｒ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  ｉｎ  Ｏｌｄｅｒ  Ｐｅｏｐｌｅ（Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４）の定義を用いて、サルコペニアの標準化された操作的定義（Ｃｒｕｚ−Ｊｅｎｔｏｆｔ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）に従って診断された。
【０１０５】
ＮＨＧ  ＤＳＲＢ（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ  Ｇｒｏｕｐ  Ｄｏｍａｉｎ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｂｏａｒｄ）は、この研究（参照番号２０１４／０１３０４）を承認し、各参加者は書面によるインフォームド・コンセントを提出した。体重及び身長は、０．１ｋｇ又は１ｃｍ単位で測定した。総除脂肪量は、二重エネルギーＸ線吸収測定（ＤＸＡ）走査（ＡＰＥＸ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ４．０．１，Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  Ｗｉ  ＤＸＡ  ｓｙｓｔｅｍ）により測定した。標準化されたプロトコルを使用して、等尺性ハンドグリップをＪａｍａｒハンドヘルドダイナモメーターで測定し、利き手の３回の試行の平均を最終測定値として使用した。身体パフォーマンスは、通常ペースの６ｍ歩行テストにおける歩行速度を測定することによって評価した。サルコペニアの診断は、総体肢除脂肪量を身長に対して正規化した値が７．００ｋｇ／ｍ２未満として定義されたＡＷＧＳＯＰの定義、歩行速度＜０．８ｍ／秒を基準とした身体パフォーマンスの低下又は握力＜２６ｋｇを基準とした筋力低下のいずれかのエビデンスに基づいて行った。人体計測パラメータは、対照群及びサルコペニア群において、次のとおりであった。
【表１】
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【０１０６】
空腹時血液サンプルを、真空容器管及び留置した２０ゲージ翼状針を使用して、肘前窩から採取した。血液を４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次いで血清を分割し、更に分析するまで−８０℃で凍結した。血清中のアントラニル酸及びトリゴネリンのレベルを、ＢＥＶＩＴＡＬ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｒｇｅｎ，Ｎｏｒｗａｙ）において、液体クロマトグラフィーに続く質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。ストローク長を３段階で調節できる（１３ｍｍ、２３ｍｍ、３３ｍｍ）ＢｉｏＰｉｎｃｅ（商標）（Ａｎｇｉｏｔｅｃｈ）１６Ｇフルコア生検針を使用して、２０人の男性参加者及び２０人の同年齢対照から外側広筋の半開放筋生検を採取し、液体窒素中で急速冷凍し、更に分析するまで−８０℃で保管した。
【０１０７】
血清中トリゴネリンレベル、アントラニル酸レベル及びこれらの比（トリゴネリン：アントラニル酸）について、サルコペニア症例と対照との間の差を、ウィルコクソン検定及びｌｏｇ２変換後のスチューデントｔ検定を用いて試験した。本発明者らは、これらの検体と、サルコペニアの評価に使用した連続する臨床的変数（体肢除脂肪筋肉量指数（ＡＬＭｉ；ｋｇ／ｍ２）、握力及び歩行速度）との間の相関を、血清中の検体濃度のｌｏｇ２変換後にスピアマンの順位相関及びピアソン相関の両方を適用して調べた。
【０１０８】
図１〜３は、血清中のトリゴネリンレベル、アントラニル酸レベル及びトリゴネリン：アントラニル酸の比がサルコペニア患者において異なっており、除脂肪筋肉量、握力、及び歩行との正の相関があることを示す。トリゴネリン（図１）、アントラニル酸（図２）及びトリゴネリン／アントラニル酸比（図３）を、２０人のサルコペニア患者のヒトコホート及び２０人の同年齢対照（全員が６５歳超）の血清において測定した。左側のパネルは、サルコペニア患者及び対照患者の血清中の検体のｌｏｇ２値を表す。右側のパネルは、血清中の検体と、筋肉量、握力、及び歩行速度の代用としてＤＸＡによって測定した体肢除脂肪体格指数（ＡＬＭｉ）との相関性を表す。オレンジ色の線は、検体に対する臨床的変数の当てはめ回帰直線を示し、灰色の部分は、当てはめたモデルの９５％信頼区間を示す。報告されたｐ値は、Ｌｏｇ２変換値に対するスチューデントＴ統計（症例対照）又はピアソン相関（相関分析）を用いて計算した。
【０１０９】
実施例２
筋肉の遺伝子発現の解析
筋肉の遺伝子発現を解析するために、製造元による使用説明に従ってＱｉａｇｅｎのキットを使用して、筋肉生検から全ＲＮＡを抽出した。ＲＮＡ量はＲｉｂｏｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で測定し、ＲＮＡの質は標準感度のＲＮＡ分析キットを用いてフラグメントアナライザー（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で確認した。全てのＲＮＡサンプルは均質であり、２６０／２８０ｎｍ比＞１．８及びＲＩＮスコア＞７で品質管理に合格した。ＲＮＡの配列決定のために、各サンプルから２５０ｎｇの全ＲＮＡをライブラリー調製の出発材料として用い、Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用してリボソームＲＮＡを除去した。ＴｒｕＳｅｑ  Ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ＨＴ及びＲｉｂｏ−Ｚｅｒｏ  Ｇｏｌｄキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を使用して配列決定ライブラリーを調製した後、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉ  ＨｏｔＳｔａｒｔ  ＲｅａｄｙＭｉｘ（Ｋａｐａ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を用いＰＣＲ増幅工程を１３サイクル実施した。ライブラリーは、Ｐｉｃｏｇｒｅｅｎ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で定量し、サイズパターンはＤＮＡ高感度試薬キットを用いてＬａｂＣｈｉｐ  ＧＸ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）で管理した。次いで、ライブラリーを等モル比でプールし、ペアエンド法で配列決定フローセル（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にて７ｐｍｏｌの濃度でクラスター形成させた。配列決定は、Ｖ３ケミストリーを用いＨｉＳｅｑ  ２５００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）で２×１０１サイクル実施した。生成されたデータに、Ｃａｓａｖａを使用してデマルチプレックスを行った。ＳＴＡＲ（Ｄｏｂｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）を使用してリードをヒトゲノム（ｈｓ＿ＧＲＣｈ３８．ｐ２）にアラインし、遺伝子内にマッピングされたリードの数をＨＴＳｅｑによって定量した（Ａｎｄｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）（ｖｅｒｓｉｏｎ  ＨＴＳｅｑ−０．６．１ｐ１、モードｕｎｉｏｎ、ｓｔｒａｎｄ  ｒｅｖｅｒｓｅ、ｑｕａｌｉｔｙ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔ＞１０）。サンプルは、１サンプル当たり７５００万〜１億４００万リードのシーケンス深度を有しており、このうち３４００万〜７７００万リードは１か所にのみマップされた。
【０１１０】
対照及びサルコペニアのサンプル間の差次的発現遺伝子は、ｌｉｍｍａパッケージ（Ｓｍｙｔｈ，２００４）を使用することによって定義した。簡潔に述べると、平均発現が２０リード未満である遺伝子を除外した後、ｅｄｇｅＲ関数のｃａｌｃＮｏｒｍＦａｃｔｏｒｓ（Ｒｏｂｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）に実装されているｔｒｉｍｍｅｄ  ｍｅａｎ  ｏｆ  Ｍ  ｖａｌｕｅ（ＴＭＭ）法によってデータを正規化し、ｖｏｏｍＷｉｔｈＱｕａｌｉｔｙＷｅｉｇｈｔｓ関数を適用して、平均分散関係をモデル化し、サンプル固有のｑｕａｌｉｔｙ  ｗｅｉｇｈｔｓを推定した（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５）。Ｂｅｎｊａｍｉｎｉ  Ｈｏｅｃｈｂｅｒｇ法を使用して、複数の試験についてｐ値を補正した。遺伝子発現と連続パラメータ又はカテゴリ型パラメータ（ＡＬＭｉ、握力及び歩行速度）との間の相関を評価する際には、サルコペニアを定義するために使用したものと同じ手順を適用した。遺伝子セットエンリッチメント解析は、ＣＡＭＥＲＡ（Ｗｕ  ａｎｄ  Ｓｍｙｔｈ，２０１２）を使用して実施した。この解析は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ（ＭＳｉｇＤＢ）（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）においてアノテーションされている遺伝子のセットが差次的発現遺伝子において増加しているかを照会する競合的遺伝子セットのテストである。ＭＳｉｇＤＢ  ｖ５．２コレクションのＨ（ホールマーク遺伝子セット）、Ｃ２（キュレーションされた遺伝子セット）及びＣ５（ＧＯ遺伝子セット）を使用してパスウェイ解析を行った。
【０１１１】
図４Ａ〜４Ｂでは、ヒトサルコぺニア骨格筋のＲＮＡ配列決定から、ミトコンドリアの機能不全がサルコペニア時の主な転写変化であることがわかる。（４Ａ）ＣＡＭＥＲＡ及びＭＳｉｇＤＢからのホールマーク遺伝子のセットコレクションを使用した、サルコペニアの筋肉と対照の筋肉の遺伝子セットエンリッチメント解析。赤色のバーは、サルコペニアの筋肉で増加していた遺伝子セットを表し、青色のバーは、サルコペニアの筋肉で減少していた遺伝子セットを表す。遺伝子セットは、エンリッチメントの有意性（significance）の順に並んでいる。（４Ｂ）Ａから選択された酸化的リン酸化遺伝子セットのＧＳＥＡエンリッチメントプロット。
【０１１２】
ＴＭＭ正規化した筋遺伝子発現と、対象となる各血清検体（トリゴネリン、アントラニル酸及びトリゴネリン：アントラニル酸比）との間のスピアマンの順位相関を計算し、このスピアマンの順位相関を使用して、生物学的ホールマークとなる遺伝子セットコレクションを用いた遺伝子セットエンリッチメント解析を実施した。
【０１１３】
図４Ａの説明：１．酸化的リン酸化、２．脂肪酸代謝、３．ＭＹＣターゲットＶ１、４．同種移植片拒絶、５．ＭＴＯＲＣ１シグナル伝達、６．ペルオキシソーム、７．脂肪生成、８．上皮間葉転換、９．頂端結合、１０．Ｇ２Ｍチェックポイント、１１．胆汁酸代謝、１２．小胞体ストレス応答、１３．反応性酸素種パスウェイ、１４．紡錘体、１５．ＵＶ応答増加、１６．ＵＶ応答低下、１７．ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達、１８．ＭＹＣターゲットＶ２、１９．ＫＲＡＳシグナル伝達低下、２０．ヘッジホッグシグナル伝達、２１．Ｅ２Ｆターゲット、２２．インターフェロンγ応答、２３．頂端表面、２４．ＴＧＦ−βシグナル伝達、２５．タンパク質分泌、２６．ＩＬ２−ＳＴＡＴ５シグナル伝達。
【０１１４】
図５Ａ〜５Ｂ、６Ａ〜６Ｂ、７Ａ〜７Ｂは、骨格筋遺伝子発現と、血清中のトリゴネリンレベル、アントラニル酸レベル、及びトリゴネリン：アントラニル酸比の相関を示す。筋肉遺伝子発現の遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）と、血清中のトリゴネリンレベル（図５Ａ〜５Ｂ）、アントラニル酸レベル（図６Ａ〜６Ｂ）、及びトリゴネリン／アントラニル酸比（図７Ａ〜７Ｂ）との相関。ＧＳＥＡは、平均順位（mean-rank）遺伝子セットテスト、及びＭＳｉｇＤＢからの生物学的ホールマークとなる遺伝子セットコレクションを使用して実施された。赤色のバーは、骨格筋における発現が検体の血清中レベルと正に相関する遺伝子セットを表し、青色のバーは、骨格筋における発現が検体の血清中レベルと負に相関する遺伝子セットを表す。遺伝子セットは、エンリッチメントの有意性の順に並んでおり、ＦＤＲ＜１％の遺伝子セットのみが示されている。左側の図は、酸化的リン酸化遺伝子セットのＧＳＥＡエンリッチメントプロットを表す。
【０１１５】
図５Ａの説明：１．酸化的リン酸化、２．ＭＴＯＲＣ１シグナル伝達、３．タンパク質分泌、４．脂肪生成、５．脂肪酸代謝、６．ＭＹＣターゲットＶ１、７．ペルオキシソーム、８．ＤＮＡ修復、９．解糖、１０．紡錘体、１１．筋形成、１２．インターフェロンγ応答、１３．ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ／ｍＴＯＲシグナル伝達、１４．Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達、１５．インターフェロンα応答１６．同種移植片拒絶、１７．胆汁酸代謝、１８．アンドロゲン応答、１９．コレステロールホメオスタシス。
【０１１６】
図６Ａの説明：１．酸化的リン酸化、２．脂肪酸代謝、３．脂肪生成、４．Ｇ２Ｍチェックポイント、５．胆汁酸代謝、６．ペルオキシソーム、７．筋形成。
【０１１７】
図７Ａの説明：１．酸化的リン酸化、２．脂肪酸代謝、３．脂肪生成、４．ＭＴＯＲＣ１シグナル伝達、５．ペルオキシソーム、６．タンパク質分泌、７．筋形成、８．Ｇ２Ｍチェックポイント、９．ＭＹＣターゲットＶ１、１０．胆汁酸代謝、１１．ＤＮＡ修復、１２．コレステロールホメオスタシス、１３．ＫＲＡＳシグナル伝達低下、１４．解糖。
【０１１８】
図８は、ヒトサルコペニア筋肉では、ＮＡＤ前駆体又は食生活からのＮＡＤの生合成及びＮＡＤサルベージを制御するＮＭＡＴ１、ＮＡＭＰＴ、及びＰＮＰなどの遺伝子の発現が低いことを示す。高カバレッジでのＲＮＡ配列決定によって、筋肉における遺伝子発現を測定した。ＮＭＮＡＴ：ニコチンアミドヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ１；ＮＡＭＰＴ：ニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼ；ＰＮＰ：プリンヌクレオシドホスホリラーゼ。
【０１１９】
実施例３
筋肉生検におけるＮＡＤ＋レベルの測定
ＮＡＤレベルがサルコペニアの筋肉におけるミトコンドリアのシグネチャーの上流トリガであり得るかを判定するために、高齢ヒト筋肉生検材料のＮＡＤを測定した。ＮＡＤ＋レベルは、Ｄａｌｌ  ｅｔ  ａｌ，２０１８に記載のヒト筋生検で測定した。簡潔に述べると、残りの生検から５ｍｇの筋組織を２００μＬの０．６Ｍ過塩素酸中に溶解し、上清を１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８．０）で２５０倍に希釈した。１００μＬの希釈サンプルを１００μＬの反応混合物（１００ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４（ｐＨ８）、２％エタノール、９０Ｕ／ｍＬのアルコールデヒドロゲナーゼ、１３０ｍＵ／ｍＬのジアホラーゼ、１０μＭのレサズリン、１０μＭのフラビンモノヌクレオチド、１０ｍＭのニコチンアミド）と組み合わせ、蛍光増加（Ｅｘ５４０ｎｍ／Ｅｍ５８０）を１０分かけて測定した。標準曲線からＮＡＤ＋含量を計算し、組織重量に対して正規化した。
【０１２０】
図９は、高齢サルコペニア患者のヒト骨格筋においてＮＡＤレベルの有意な（３２％）減少があったことを示す。サルコペニア患者の骨格筋におけるこのＮＡＤ＋レベルの大きな減少は、ヒトにおける低ＮＡＤ＋レベルと加齢性病理とを初めて関連付け、ヒト骨格筋におけるＮＡＤ欠乏を初めて実証している。この結果は、マウスの老化した筋肉に対するＮＲ及びＮＭＮのようなＮＡＤ前駆体の前臨床的有効性と合わせて、老化におけるＮＡＤ生物学の臨床的関連性を拡張すると共に、サルコペニア及び加齢による可動性低下についての臨床解釈のガイドとなる。
【０１２１】
実施例４
女性を含む異なる民族の血清中の代謝産物の測定
この実施例では、７０人の主に白人由来の参加者（女性５２人と男性１８人、中央値７８歳（四分位範囲７６、８１））を検討した。
【０１２２】
これらの７０人の参加者は、一般社会で生活する高齢者の筋肉形態、筋肉量及び筋肉強度に対する生涯の影響を調査するために計画された英国Ｈｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ  Ｃｏｈｏｒｔ  Ｓｔｕｄｙ（ＨＣＳ）のサブ研究であるＨｅｒｔｆｏｒｄｓｈｉｒｅ  Ｓａｒｃｏｐｅｎｉａ  Ｓｔｕｄｙ（ＨＳＳ）の一部、又は当該研究の延長期（ＨＳＳｅ）の一部であった。本研究で実施した骨格筋の特性評価には、二重エネルギーＸ線吸収測定法（ＤＸＡ）走査によって確認された身体組成及び除脂肪量が含まれた。
【０１２３】
バキュテイナーチューブ及び留置型２０ゲージ翼状針カニューレを使用して、空腹時血液サンプルを肘前窩から採取した。血液を４℃、３０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、次いで血清を分割し、更に分析するまで−８０℃で凍結した。血清中のアントラニル酸及びトリゴネリンのレベルを、ＢＥＶＩＴＡＬ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂｅｒｇｅｎ，Ｎｏｒｗａｙ）において、液体クロマトグラフィーとそれに続く質量分析（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ）により測定した。
【０１２４】
トリゴネリン：アントラニル酸の比と四肢除脂肪筋肉量指数（ＡＬＭｉ；ｋｇ／ｍ２）との間の相関を、検体の血清濃度のｌｏｇ２変換後に年齢について補正した回帰を適用することによって推定した。
【０１２５】
図１０は、トリゴネリン：アントラニル酸の血清レベルの比が、体肢除脂肪量指数で評価した除脂肪筋肉量と相関することを示す。７０人の対象（女性５２人と男性１８人、全員が６５歳以上）からなるヒトコホートの血清において、トリゴネリン及びアントラニル酸のレベルを測定した。グラフは、血清中の検体の比（トリゴネリン：アントラニル酸）のｌｏｇ２値（ｘ軸）と、筋肉量の代用としてＤＸＡで測定した体肢除脂肪体格指数（ＡＬＭｉ）（ｙ軸）との相関を表す。直線は、ＡＬＭｉをｌｏｇ２（トリゴネリン：アントラニル酸）に対して当てはめた回帰直線を示す。この単純な線形回帰により、ピアソン相関係数０．２３、ｐ値＝０．０３１が得られ、年齢について補正した回帰に基づいて、検体の比に対する係数について５１％の自由度調整済みＲ２及びｐ値＝０．０２４を得た。
【０１２６】
参照文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【国際調査報告】
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