(57)【要約】  チモヒドロキノンを含有する組成物を使用して、哺乳動物における高血糖症を治療管理するための方法を開示する。より詳細には、本発明は、酵素α−グルコシダーゼの活性を阻害し、かつ哺乳動物細胞によるグルコースの細胞取込みを高めるためのチモヒドロキノンを含有する組成物を開示する。チモヒドロキノンの抗酸化、抗炎症および抗糖化の効果も本明細書において開示する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコシダーゼ酵素を阻害する方法であって：
ｉ）グルコシダーゼ酵素をパラニトロフェニル−α−ｄ−グルコピラノシド基質と接触させる工程；
ｉｉ）最適条件下で、有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物とインキュベートする工程；
ｉｉｉ）分光光度法および蛍光法を使用して吸光度の変化を読み取る工程；
ｉｖ）前記吸光度を対照ブランクと比較し、式：
阻害パーセント＝［（対照の吸光度−阻害剤の吸光度）／対照の吸光度］×１００
を使用して、チモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物による酵素阻害百分率（ＩＣ50）を決定する工程
を含む方法。
【請求項２】
前記チモヒドロキノンを含む組成物が、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記安定剤が、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記バイオアベイラビリティ増強剤が、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンを含む群から選択される、請求項２に記載の組成物。
【請求項５】
哺乳動物細胞によるグルコース取込みを高める方法であって、
哺乳動物細胞を有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物と接触させて、細胞によるグルコース取込みを高める工程を含む、方法。
【請求項６】
前記組成物が、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗを含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記安定剤が、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記バイオアベイラビリティ増強剤が、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンを含む群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項６に記載の組成物。
【請求項１０】
哺乳動物における高血糖症および関連状態を治療管理するための方法であって、
有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物を投与して、血中グルコースレベルの低減をもたらす工程を含む、方法。
【請求項１１】
前記高血糖症および関連状態の管理が、グルコシダーゼ酵素の阻害によってグルコースの吸収を低下させること、グルコースの細胞取込みを高めること、フリーラジカルを低減させること、炎症を軽減させること、および糖化を低下させることによってもたらされる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記高血糖症関連状態が、糖尿病、肥満、高リポタンパク血症、高脂血症、心血管系合併症、がん、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、アレルギー、炎症、および骨粗鬆症を含む群から選択される病態に存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記組成物が、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記安定剤が、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記バイオアベイラビリティ増強剤が、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンを含む群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
薬学的に／栄養補助に許容される賦形剤、補助剤、希釈剤または担体と共に製剤化され、錠剤、カプセル、ソフトジェル、シロップ、グミ、散剤、懸濁液、乳濁液、チュアブル、キャンディーまたは食料品の形態で経口投与される、請求項１３に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その詳細が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１２月２７日に出願された米国仮特許出願第６２６１０５６５号の優先権を主張するＰＣＴ出願である。
本発明は、哺乳動物における高血糖症の治療管理に関する。より詳細には、本発明は、チモヒドロキノンを含む組成物と、高血糖症およびこれの関連状態の管理におけるそれらの治療能とに関する。
【背景技術】
【０００２】
高血糖症とは、血中グルコースレベルが高いままの状態である。慢性高血糖症は、治療しないまま放置すると、糖尿病、肥満、高リポ  タンパク血症、高脂血症、心血管系合併症、がん、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、アレルギー、炎症、および骨粗鬆症などの多くの疾患の発病にいたる二次的合併症を引き起こす恐れがある。血中グルコースレベルの上昇によって、活性酸素種／活性窒素種および炎症誘発性サイトカインの産生が高まり、それにより、酸化ストレスおよび炎症が引き起こされる。グルコースレベルの上昇によってさらに、タンパク質およびその他の生体分子の非酵素的グリコシル化（糖化反応）が高まり、その結果、細胞老化の主たる原因であると報告されている終末糖化産物（ＡＧＥ）の産生にいたる。ＡＧＥはまた、進行性悪化およびアポトーシスにいたる細胞性の炎症カスケードを例示するものでもある。
投与されている現在の薬物（たとえばメトホルミン）は、血液グルコースレベルを制御するのに効果的である。これらの合成薬物を継続的に摂取すると、肝毒性および腎毒性を含む多くの副作用がもたらされる。したがって、血液グルコースレベルを管理するために、より安全かつ効果的な植物性の天然分子が正当化される。
高血糖症の管理に現在用いられている処置方法には、炭水化物の分解を調節するキー酵素に対する阻害剤を投与すること、およびグルコースの取込みを高めることが含まれる。この態様では、グルコシダーゼ阻害剤が特に重要である（Kim et al., Isolation and characterization of α-glucosidase inhibitor from the fungus Ganoderma lucidum. Journal of Microbiology, 2013;42:223-227）。α−グルコシダーゼは、グリコーゲンのグルコースへの分解に必須である。それは複雑な炭水化物分子に作用して、血流に容易に吸収される単糖単位を生じる。α−グルコシダーゼを阻害すると、血流へのグルコース放出の低減がもたらされ、それによって高血糖症状態が低下する。
【０００３】
以下の先行技術で論議されている、α−グルコシダーゼに対する多くの植物性阻害分子が存在する：
１．Thilagam et al., α-Glucosidase and α-Amylase Inhibitory Activity of Senna surattensis, Journal of Acupuncture and Meridian Studies, 2013; 6(1):24-30
２．Poongunran et al., α-Glucosidase and α-Amylase Inhibitory Activities of Nine Sri Lankan Antidiabetic Plants, British Journal of Pharmaceutical Research, 2015;7(5): 365-374.
３．Kim et al., Isolation and characterization of α-glucosidase inhibitor from the fungus Ganoderma lucidum. Journal of Microbiology, 2013;42:223-227.
しかし、α−グルコシダーゼを効果的に阻害し、グルコース取込みを高める植物性分子が、高血糖症および関連状態の効果的な管理に必要である。
ニゲラ・サティバ（Ｎｉｇｅｌｌａ  ｓａｔｉｖａ）は、医薬に関するアーユルヴェーダ、シッダおよびウナニの各システムではその多くの治療特性で良く知られている。この植物は、チモキノン、チモヒドロキノン、ジチモキノン、ｐ−シメン、カルバクロール、４−テルピネオール、ｔ−アネトール、セスキテルペンロンギフォレン、α−ピネン、チモール、αヘデリンおよびヘデラゲニンなどの多数の活性分子を含有すると報告されており（Ahmad et al., A review on therapeutic potential of Nigella sativa: A miracle herb, Asian Pac J Trop Biomed. 2013; 3(5): 337-352）、これらの分子が、この植物の有益な効果を担っている。ニゲラ・サティバの治療効果の一部については、以下の先行技術文献に列記されている：
１．Alimohammadi et al., Protective and antidiabetic effects of extract from Nigella sativa on blood glucose concentrations against streptozotocin (STZ)-induced diabetic in rats: an experimental study with histopathological evaluation, Diagn Pathol. 2013; 8: 137.
２．Sultana et al., Nigella sativa: Monograph, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry 2015; 4(4): 103-106.
３．Randhwa and Alghamdi, Anticancer activity of Nigella sativa (black seed) - a review, Am J Chin Med. 2011;39(6):1075-91.
４．Mahmood et al., Nigella Sativa as an Antiglycating Agent for Human Serum Albumin, International Journal of Scientific research, 2013;2(4):25-27
５．Sobhi et al., Effect of lipid extracts of Nigella sativa L. seeds on the liver ATP reduction and alpha-glucosidase inhibition, Pak J Pharm Sci., 2016;29(1):111-117.
６．Awasthi S, Understanding the mechanism of antidiabetic activity and efficacy of functional foods against advanced glycation end products: Nigella sativa and Moringa oleifera, Planta Med, 2013; 79 - PN8
【０００４】
ニゲラ・サティバの報告されている生物学的効果のほとんどは、全抽出物に関するか、具体的にはチモキノンに関するかのいずれかである。特に高血糖症の管理に関連してチモヒドロキノンの生物学的効果に関する報告は入手できない。チモヒドロキノンはチモキオンの還元型であるが、構造的にも機能的にも異なる。したがって、本発明は、高血糖症および関連障害の管理向けにチモヒドロキノンで強化された新規で非自明な組成物を開示する。
【０００５】
本発明の主要な目的は、チモヒドロキノンを含む組成物を使用してα−グルコシダーゼの活性を阻害するための方法を開示することである。
本発明の別の目的は、チモヒドロキノンを含む組成物を投与することにより、哺乳動物細胞によるグルコースの取込みを高める方法を開示することである。
本発明のさらに別の目的は、チモヒドロキノンを含む組成物を使用して、哺乳動物における高血糖症および関連障害を治療管理するための方法を開示することである。
本発明は上記の目的を解決し、関連する利点をさらに提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、チモヒドロキノンを含む新規な組成物を開示する。具体的には、本発明は、酵素α−グルコシダーゼの活性を阻害するためのチモヒドロキノンを含有する組成物を開示する。本発明はまた、哺乳動物細胞によるグルコースの細胞取込みを高めるためのチモヒドロキノンを含有する組成物の使用も開示する。より詳細には、本発明は、チモヒドロキノンを含有する組成物を使用して、哺乳動物における高血糖症を治療管理するための方法を開示する。チモヒドロキノンの抗酸化、抗炎症および抗糖化の効果も本明細書において開示する。
本発明の他の特徴および利点は、例として本発明の原理を例示する添付の図面と併せて、以下のより詳細な説明から明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【０００７】
【図１ａ】チモキノン（ＴＱ）、チモヒドロキノン（ＴＨＱ）およびチモヒドロキノン組成物のα−グルコシダーゼ阻害活性のグラフ表示を示す図である。
【図１ｂ】チモキノン（ＴＱ）、チモヒドロキノン（ＴＨＱ）およびチモヒドロキノン組成物のα−グルコシダーゼ阻害活性のグラフ表示を示す図である。
【図２】チモキノン（ＴＱ）、チモヒドロキノン（ＴＨＱ）およびチモヒドロキノン組成物で処理された脂肪細胞および筋細胞によるグルコース取込みの百分率を示すグラフ表示の図である。
【図３】インスリン（３ａ）、チモキノン（ＴＱ）（３ｂ）、チモヒドロキノン（ＴＨＱ）（３ｃ）、およびチモヒドロキノン組成物（３ｄ）で処理された哺乳動物細胞によるグルコース取込みの代表的ヒストグラムを示す図である。未処理の細胞は対照群としての役割を担う（３ｅ）。
【図４】チモキノン（ＴＱ）（４ａ）、チモヒドロキノン（ＴＨＱ）（４ｂ）、およびチモヒドロキノン組成物（４ｃ）のＤＰＰＨ消去活性のグラフ表示を示す図である。
【図５】チモヒドロキノンの百分率が増加する組成物のＤＰＰＨ消去活性およびグルコシダーゼ阻害活性のグラフ表示を示す図である。チモヒドロキノン含有率の上昇は、生物活性の上昇と直接相関していた。
【図６】チモキノンの百分率が増加する組成物のＤＰＰＨ消去活性およびグルコシダーゼ阻害活性のグラフ表示を示す図である。チモキノン含有率の増加は、生物活性の増加と逆相関していた。
【発明を実施するための形態】
【０００８】
最も好ましい実施形態では、本発明は、グルコシダーゼ酵素を阻害する方法であって：
ｉ）グルコシダーゼ酵素をパラニトロフェニル−α−ｄ−グルコピラノシド基質と接触させる工程；
ｉｉ）最適条件下で、有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物とインキュベートする工程；
ｉｉｉ）分光光度法および蛍光法を使用して吸光度の変化を読み取る工程；
ｉｖ）吸光度を対照ブランクと比較し、式：
阻害パーセント＝［（対照の吸光度−阻害剤の吸光度）／対照の吸光度］×１００
を使用して、チモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物による酵素阻害百分率（ＩＣ50）を決定する工程
を含む方法を開示する。
【０００９】
関連する実施形態では、組成物は、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗ、を含む。別の関連する実施形態では、安定剤は、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される。さらに別の関連する実施形態では、バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンを含む群から選択される。
別の最も好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物細胞によるグルコース取込みを高める方法であって、哺乳動物細胞を有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物と接触させて、細胞によるグルコース取込みを高める工程を含む方法を開示する。関連する実施形態では、組成物は、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗ、を含む。別の関連する実施形態では、安定剤は、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される。さらに別の関連する実施形態では、バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンを含む群から選択される。別の関連する実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【００１０】
別の好ましい実施形態では、本発明は、哺乳動物における高血糖症および関連状態を治療管理するための方法であって、有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物を投与して、血中グルコースレベルの低減をもたらす工程を含む方法を開示する。関連する実施形態では、高血糖症および関連状態の管理は、グルコシダーゼ酵素の阻害によるグルコースの吸収を低下させること、グルコースの細胞取込みを高めること、フリーラジカルを低減させること、炎症を軽減させることおよび糖化を低下させることによってもたらされる。別の関連する実施形態では、高血糖症関連状態は、糖尿病、肥満、高リポタンパク血症、高脂血症、心血管系合併症、がん、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、アレルギー、炎症、および骨粗鬆症を含む群から選択される病態に存在する。関連する実施形態では、組成物は、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗ、を含む。別の関連する実施形態では、安定剤は、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される。さらに別の関連する実施形態では、バイオアベイラビリティ増強剤は、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンの群から選択される。別の関連する実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。別の関連する実施形態では、組成物は、薬学的に／栄養補助に許容される賦形剤、補助剤、希釈剤または担体と共に製剤化され、錠剤、カプセル、ソフトジェル、シロップ、グミ、散剤、懸濁液、乳濁液、チュアブル、キャンディーまたは食料品の形態で経口投与される。
【００１１】
本発明の技術的特徴および技術的効果を具体化する前述の最も好ましい実施形態を、下記の例示的な実施例を通して説明する。
【実施例】
【００１２】
（実施例１）：グルコシダーゼの阻害
グルコシダーゼ阻害については、α−グルコシダーゼ（Ｃｏｄｅ  Ｇ５００３；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、米国）を、０．２％ウシ血清アルブミン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）および０．０２％アジ化ナトリウム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を含有する、６７ｍＭリン酸カリウム緩衝液、ｐＨ６．８に溶かし、これを酵素源として使用した。パラニトロフェニル−α−ｄ−グルコピラノシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を基質として使用した。チモキノン、チモヒドロキノン、およびチモヒドロキノンを含有する組成物を秤量し、６３、１２５、２５０、および５００μｇ／ｍｌの濃度で調製し、等容量の蒸留水で補充した。上記組成物５０μｌを酵素源（０．１５Ｕ／ｍｌ）５０μｌと共に５分間インキュベートした。インキュベーション後、基質（１．２５ｍＭ）５０μｌを添加し、さらに室温で２０分間インキュベートした。基質の添加前後、マイクロプレートリーダー（ＢＭＧ  ＦＬＵＯｓｔａｒ  ＯＰＴＩＭＡ  Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ  Ｒｅａｄｅｒ）上、吸光度を４０５ｎｍで測定した。基質の添加と同時に吸光度の上昇が得られた。各試験を３回実行し、平均吸収を使用して、α−グルコシダーゼ阻害の百分率を計算した。アカルボースを種々の濃度で陽性対照として使用した。上記組成物の異なる濃度の阻害活性については、１００から、陰性対照（すなわち、試験液として使用される水）の吸光度変化に対する上記組成物の吸光度の差（％）を引いたものとして表した。測定は３回繰返しで行い、ＩＣ50値（すなわち、最大活性の５０％阻害という結果がもたらされる上記組成物の濃度）を決定した。
チモヒドロキノン（ＩＣ50  ７１．９μｇ／ｍｌ）およびチモヒドロキノンを含む組成物（ＩＣ50  １５０．９μｇ／ｍｌ）は、チモキノン（ＩＣ50  ４０７．６μｇ／ｍｌ）と比較した場合、αグルコシダーゼの効果的な阻害を呈した（図１ａおよび図１ｂ）。
【００１３】
（実施例２）：グルコース取込みの上昇
骨格筋細胞株Ｃ２Ｃ１２筋芽細胞（ＡＴＣＣから調達した）を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭ中、３７℃、５％ＣＯ2で維持した。１ウェルあたり２万個の細胞を２４ウェルプレートに播種した。細胞がコンフルエンス８０〜９０％に達したとき、その増殖培地を、１％ウマ血清を含有するＤＭＥＭに交換することにより分化を誘導した。実験は、分化培地中で４〜５日後に完全に分化したＣ２Ｃ１２筋管で行った。次いで、細胞を低グルコース培地中０．５％ＢＳＡで１６時間処理し、グルコースを含まない低温のクレブスリンガーリン酸緩衝液で洗浄した。次いで、細胞を、０．１μＭ濃度のインスリンと共に、またはそれ無しで低グルコースＤＭＥＭ培地中、様々な非細胞毒濃度の試料で、３７℃で３０分間処理した。次いで、細胞を、低温ＰＢＳで洗浄し、蛍光性のＤ−グルコースアナログ２−［Ｎ−（７−ニトロベンザ−２−オキサ−１、３−ジアゾール−４−イル）アミノ］−２−デオキシ−Ｄ−グルコース（２−ＮＢＤＧ）５μＭにて暗所で１５分間染色し、これに続いて、細胞により生じた蛍光のフローサイトメトリー検出を行った。
チモヒドロキノンおよびチモヒドロキノンを含む組成物は、チモキノンと比較した場合、脂肪細胞および筋細胞におけるグルコース取込みの増強を示した（図２ａおよび図２ｂ）。
【００１４】
（実施例３）：チモヒドロキノンの抗酸化活性
チモヒドロキノンの抗酸化能を、ＤＰＰＨ消去活性によって評価した。
血糖レベルが慢性的に上昇すると、活性酸素種の形成にいたる。スーパーオキシド、ヒドロキシル、ペルオキシル、およびアルコキシの各ラジカルといった活性酸素種（ＲＯＳ）は、細胞の抗酸化物質によって消去され、平衡が保たれる。こういったＲＯＳが引き起こした損傷は、皮膚の刺激、炎症、老化、がん、およびその他の多くの疾患の原因となる。α，α−ジフェニル−β−ピクリルヒドラジル（ＤＰＰＨ）フリーラジカル消去法は、化合物の抗酸化能を評価する第１のアプローチの１つである。
【００１５】
手順
ＤＰＰＨは、５２０ｎｍに吸収をもつ、メタノール溶液中で安定なフリーラジカルである。フリーラジカルが抗酸化分子によって消去されると、生成する溶液は黄色に見える。細胞外代謝産物の水素原子または電子の供与能を、紫色のＤＰＰＨメタノール溶液の漂白法によって測定した。
チモキノン、チモヒドロキノン、およびチモヒドロキノンを含む組成物を、種々の濃度で調製した。ＤＰＰＨラジカル消去アッセイの場合、先に記載の方法（Clarke et al., 2013）にしたがって、試験材料２０μＬを、９６ウェルプレート中、メタノール中ＤＰＰＨ１８０μＬと混合した。プレートを暗所に１５分間維持し、その後、マイクロプレートリーダー（ＴＥＣＡＮ  Ｌｔｄ、Ｍａｎｎｅｄｏｒｆ、スイス）を使用して、溶液の吸光度を５４０ｎｍで測定した。ブランク（ＤＭＳＯ、メタノール）および標準液（ＤＭＳＯのＴｒｏｌｏｘ溶液）を同時に記録した。抽出物を様々な濃度でスクリーニングして、阻害濃度を確立した（ＩＣ50、ＤＰＰＨ吸光度を５０％低減させる濃度）。
【００１６】
フリーラジカル消去活性は、以下のように計算した。
（Ｂ−Ｃ）−（Ｓ−Ｃ）
消去活性パーセント＝−−−−−−−−−−−  ×１００
（Ｂ−Ｃ）
（式中、
Ｂ＝基準溶液の吸光度（ＤＰＰＨのＯＤ）
Ｃ＝基準溶液ブランクの吸光度（メタノールのみのＯＤ）
Ｓ＝試験溶液の吸光度
Ｃ＝試験溶液ブランクの吸光度）
チモヒドロキノンは、ＩＣ50が１．７８μｇ／ｍｌであり、強力な抗酸化剤である（図４ｂ）。チモヒドロキノンを含む組成物も、ＩＣ50が５４０．１μｇ／ｍｌ（図４ｃ）であり、優れた抗酸化能を呈し、この抗酸化能はチモキノン（図４ａ）よりもはるかに効果的である。
【００１７】
（実施例４）：チモヒドロキノンの抗炎症活性
慢性高血糖症は、ＴＮＦ−αなどの炎症性サイトカインの産生を高めることにより、細胞性炎症を増大する。チモキノン、チモヒドロキノン、およびチモヒドロキノンを含む組成物を、これらのＴＮＦ−α阻害活性を評価することにより、これらの抗炎症活性について試験した。
細胞：Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から購入したＴＨＰ１−ヒト単球であり、１０％（ｖ／ｖ）熱不活化ウシ胎児血清（ＦＢＳ；ＧＩＢＣＯ／Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、１００単位／ｍＬペニシリンおよび１００μｇ／ｍＬストレプトマイシン（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を補充した、Ｒｏｓｅｗｅｌｌ  ｐａｒｋ  ｍｅｍｏｒｉａｌ  ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ培地（ＲＰＭ１  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ＣＡ、米国）中、単層培養として、加湿した５％Ｃ０２インキュベーター内で、３７°Ｃで維持した。
試薬および緩衝液：リポ多糖（ＬＰＳ、Ｓｉｇｍａ  ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、米国）、リン酸緩衝生理食塩水、ＲＰＭＩ、ＦＢＳ
ＥＬＩＳＡキット：Ｈｕｍａｎ  ＴＮＦ  ＥＬＩＳＡ  ｋｉｔ、Ｋｒｉｓｈｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、米国
【００１８】
手順
抗炎症活性を、炎症性サイトカインを分泌することによりリポ多糖（ＬＰＳ）に応答するヒト単球／マクロファージ細胞株ＴＨＰ−単球を使用して試験した。腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−α）は、炎症反応のカスケードを誘発する主要なサイトカインの１つである。ＴＮＦ−αの濃度は、酵素結合免疫吸着法（ＥＬＩＳＡ）を使用して測定した。ＴＮＦ−α濃度の低減が指し示すことは、化合物の抗炎症活性である。
１Ｘ１０5  ＴＨＰ−１細胞をリポ多糖（ＬＰＳ、Ｏ．１μｇ／ｍＬ）による１００ｎｇで刺激して、ＴＮＦ−α分泌を誘導した。細胞を様々な濃度の試験物質（チモキノン、チモヒドロキノン、およびチモヒドロキノンを含む組成物）で前処理し、その後、ＬＰＳ処理を行った。細胞上清を処理の２４時間後に収集し、製造業者が記載するサイトカインＥＬＩＳＡによって分泌ＴＮＦ−αを見積もった。非刺激細胞を陰性対照として使用した。検出限界は＜１ｐｇ／ｍＬであった。
【００１９】
結果
結果から、チモヒドロキノンがＴＮＦ−αを阻害し（表１）、細胞生存率に影響を与えずに有意な抗炎症活性を示すことが分かった。
【表１】
2021508480.tif 000002
【００２０】
（実施例５）：チモヒドロキノンの抗糖化活性
終末糖化産物（ＡＧＥ）は、メイラード反応としても知られる、タンパク質のアミノ基（主にリジンおよびアルギニン）と還元糖のカルボニル基との間の非酵素的付加物形成によって、生成される。初期段階では、還元糖が遊離アミノ基と反応して不安定なアルジミン化合物を形成し、この化合物は、分子転位を経て、アマドリ産物として知られる安定した初期糖化産物を形成する。後期段階では、酸化、脱水、および環化の各反応を通した糖化プロセスにより、ＡＧＥとも知られる終末糖化産物が形成される。Ｎε−（カルボキシメチル）−リジン（ＣＭＬ）、ピラリン、ペントシジンなどのＡＧＥの種々の構造が、老化、糖尿病、アテローム性動脈硬化症、アルツハイマー病、および腎不全を含めて、変性疾患に関連付けられることが知られている。
【００２１】
ペントシジンは糖尿病患者において蓄積することが知られており、ベスペルリシンは白内障および糖尿病性網膜症に見いだされる。糖化を予防できる薬剤を効果的に使用して、高血糖症に伴う二次的合併症に対処することができる。チモキノンおよびチモヒドロキノンを、これらの抗糖化効果について試験した。
ＡＧＥは、本質的に、蛍光性の場合もあり、非蛍光性の場合もある。通常、ベスペルリシンタイプのＡＧＥは３７０ｎｍで励起し、４４０ｎｍで発光するが、ペントシジン様ＡＧＥは３３５ｎｍで励起し、３８５ｎｍで発光する。この原理は、リボース糖およびウシ血清アルブミンを特定の比で混合し、２４時間インキュベートするという事実に基づいている。反応によって形成されたベスペルリシン様ＡＧＥは、３９０／４６０ｎｍでのＥｘ／Ｅｍで検出される蛍光の上昇によって見積り、ペントシジンは３２０／４０５ｎｍでのＥｘ／Ｅｍで検出した。
【００２２】
材料
リボース、ウシ血清アルブミン、９６ウェルブラックマイクロプレート
リボース−ＢＳＡ法：９６ウェルブラックマイクロプレートの１ウェル当たりで、種々の濃度の試料１０μｌを、ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン、２５ｍｇ／ｍｌストック）４０μｌおよびＤ−リボース（１５０ｍｇ／ｍｌストック）５０μｌに添加し、３７℃で２４時間インキュベートした。ＢＳＡを対照とした。形成されたＡＧＥ（終末糖化産物）を、ベスペルリジンについては３９０／４６０ｎｍでのＥｘ／Ｅｍで、ペントシジンＡＧＥについては３２０／４０５ｎｍでのＥｘ／Ｅｍで蛍光によって検出した。
【００２３】
結果
チモキノンおよびチモヒドロキノンによるＡＧＥベスペルリシンおよびペントシジンの阻害を表２に表示した。
【００２４】
【表２】
2021508480.tif 000003
【００２５】
結果から、チモヒドロキノンは生物学的により強力な分子であり、チモキノンと比較した場合、増強された生物学的活性を呈することが分かった。
チモヒドロキノンの百分率が増加する組成物の生物学的効果も評価した。表３に、チモヒドロキノン含有率が増加する組成物のリストを提供する。
【表３】
2021508480.tif 000004
【００２６】
組成物中のチモヒドロキノン含有率の上昇は、生物活性との相関を示さなかったチモキノン（図６）と比較した場合、ＤＰＰＨ消去およびグルコシダーゼ阻害がより高いことと相関していた（図５）。したがって、チモヒドロキノンは、それらに限定されないが、高血糖症、糖尿病、肥満、高リポタンパク血症、高脂血症、心血管系合併症、がん、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、アレルギー、炎症、および骨粗鬆症を含めて、種々の疾患および障害を効果的に管理するための製剤に効果的に組み入れることができる。
本発明の他の修正および変更は、前述の開示および教示から当業者にとって明らかであろう。したがって、本明細書で本発明のある特定の実施形態のみについて具体的に説明したが、多数の修正は、本発明の精神と範囲から逸脱することなくそれらに加えることができ、添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈すべきであることが明らかであろう。
【図１ａ】
2021508480.tif 000005
【図１ｂ】
2021508480.tif 000006
【図２ａ】
2021508480.tif 000007
【図２ｂ】
2021508480.tif 000008
【図３−１】
2021508480.tif 000009
【図３−２】
2021508480.tif 000010
【図３−３】
2021508480.tif 000011
【図４ａ】
2021508480.tif 000012
【図４ｂ】
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【図４ｃ】
2021508480.tif 000014
【図５】
2021508480.tif 000015
【図６】
2021508480.tif 000016
【手続補正書】
【提出日】令和2年6月26日(2020.6.26)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
グルコシダーゼ酵素を阻害する方法であって：
ｉ）グルコシダーゼ酵素をパラニトロフェニル−α−ｄ−グルコピラノシド基質と接触させる工程；
ｉｉ）最適条件下で、有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物とインキュベートする工程；
ｉｉｉ）分光光度法および蛍光法を使用して吸光度の変化を読み取る工程；
ｉｖ）前記吸光度を対照ブランクと比較し、式：
阻害パーセント＝［（対照の吸光度−阻害剤の吸光度）／対照の吸光度］×１００
を使用して、チモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物による酵素阻害百分率（ＩＣ50）を決定する工程
を含む、人に対する医療行為を除く方法。
【請求項２】
前記チモヒドロキノンを含む組成物が、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記安定剤が、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記バイオアベイラビリティ増強剤が、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンを含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
【請求項５】
有効用量のチモヒドロキノンを含む、哺乳動物細胞によるグルコース取込みを高めるための組成物。
【請求項６】
前記組成物が、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗを含む、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
前記安定剤が、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項８】
前記バイオアベイラビリティ増強剤が、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンを含む群から選択される、請求項６に記載の組成物。
【請求項９】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項５〜８のいずれかに記載の組成物。
【請求項１０】
有効用量のチモヒドロキノンを含む、血中グルコースレベルの低減をもたらして、哺乳動物における高血糖症および関連状態を治療管理するための組成物。
【請求項１１】
前記高血糖症および関連状態の管理が、グルコシダーゼ酵素の阻害によってグルコースの吸収を低下させること、グルコースの細胞取込みを高めること、フリーラジカルを低減させること、炎症を軽減させること、および糖化を低下させることによってもたらされる、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記高血糖症関連状態が、糖尿病、肥満、高リポタンパク血症、高脂血症、心血管系合併症、がん、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、アレルギー、炎症、および骨粗鬆症を含む群から選択される病態に存在する、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１３】
前記組成物が、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗを含む、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１４】
前記安定剤が、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記バイオアベイラビリティ増強剤が、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンを含む群から選択される、請求項１３に記載の組成物。
【請求項１６】
前記哺乳動物細胞がヒト細胞である、請求項１０〜１５のいずれかに記載の組成物。
【請求項１７】
薬学的に／栄養補助に許容される賦形剤、補助剤、希釈剤または担体と共に製剤化され、錠剤、カプセル、ソフトジェル、シロップ、グミ、散剤、懸濁液、乳濁液、チュアブル、キャンディーまたは食料品の形態で経口投与される、請求項１０〜１６のいずれかに記載の組成物。
【請求項１８】
有効用量のチモヒドロキノンを含む、グルコシダーゼ酵素を阻害するための組成物。
【請求項１９】
非ヒト哺乳動物細胞によるグルコース取込みを高める方法であって、
前記非ヒト哺乳動物細胞を有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物と接触させて、細胞によるグルコース取込みを高める工程を含む、方法。
【請求項２０】
非ヒト哺乳動物における高血糖症および関連状態を治療管理するための方法であって、
有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物を投与して、血中グルコースレベルの低減をもたらす工程を含む、方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２６】
組成物中のチモヒドロキノン含有率の上昇は、生物活性との相関を示さなかったチモキノン（図６）と比較した場合、ＤＰＰＨ消去およびグルコシダーゼ阻害がより高いことと相関していた（図５）。したがって、チモヒドロキノンは、それらに限定されないが、高血糖症、糖尿病、肥満、高リポタンパク血症、高脂血症、心血管系合併症、がん、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、アレルギー、炎症、および骨粗鬆症を含めて、種々の疾患および障害を効果的に管理するための製剤に効果的に組み入れることができる。
本発明の他の修正および変更は、前述の開示および教示から当業者にとって明らかであろう。したがって、本明細書で本発明のある特定の実施形態のみについて具体的に説明したが、多数の修正は、本発明の精神と範囲から逸脱することなくそれらに加えることができ、添付の特許請求の範囲と併せてのみ解釈すべきであることが明らかであろう。
本発明のまた別の態様は、以下のとおりであってもよい。
〔１〕グルコシダーゼ酵素を阻害する方法であって：
ｉ）グルコシダーゼ酵素をパラニトロフェニル−α−ｄ−グルコピラノシド基質と接触させる工程；
ｉｉ）最適条件下で、有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物とインキュベートする工程；
ｉｉｉ）分光光度法および蛍光法を使用して吸光度の変化を読み取る工程；
ｉｖ）吸光度を対照ブランクと比較し、式：
阻害パーセント＝［（対照の吸光度−阻害剤の吸光度）／対照の吸光度］×１００
を使用して、チモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物による酵素阻害百分率（ＩＣ50）を決定する工程
を含む方法。
〔２〕チモヒドロキノンを含む組成物が、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗを含む、前記〔１〕に記載の方法。
〔３〕安定剤が、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される、前記〔２〕に記載の組成物。
〔４〕バイオアベイラビリティ増強剤が、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンを含む群から選択される、前記〔２〕に記載の組成物。
〔５〕哺乳動物細胞によるグルコース取込みを高める方法であって、
哺乳動物細胞を有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物と接触させて、細胞によるグルコース取込みを高める工程を含む、方法。
〔６〕組成物が、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗを含む、前記〔５〕に記載の方法。
〔７〕安定剤が、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される、前記〔６〕に記載の組成物。
〔８〕バイオアベイラビリティ増強剤が、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンを含む群から選択される、前記〔６〕に記載の組成物。
〔９〕哺乳動物細胞がヒト細胞である、前記〔６〕に記載の組成物。
〔１０〕哺乳動物における高血糖症および関連状態を治療管理するための方法であって、
有効用量のチモヒドロキノンまたはチモヒドロキノンを含む組成物を投与して、血中グルコースレベルの低減をもたらす工程を含む、方法。
〔１１〕高血糖症および関連状態の管理が、グルコシダーゼ酵素の阻害によるグルコースの吸収を低下させること、グルコースの細胞取込みを高めること、フリーラジカルを低減させること、炎症を軽減させること、および糖化を低下させることによってもたらされる、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１２〕高血糖症関連状態が、糖尿病、肥満、高リポタンパク血症、高脂血症、心血管系合併症、がん、アテローム性動脈硬化症、神経変性疾患、アレルギー、炎症、および骨粗鬆症を含む群から選択される病態に存在する、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１３〕組成物が、チモキノン約０．１％〜５％ｗ／ｗ、チモヒドロキノン約０．０１％〜１０％ｗ／ｗ、脂肪酸約２０％〜９５％ｗ／ｗ、α−ヘデリンまたはヘデラゲニン約０．００１％〜３％ｗ／ｗ、安定剤０．１％〜４．０％ｗ／ｗおよびバイオアベイラビリティ増強剤０．２％〜２％ｗ／ｗを含む、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１４〕安定剤が、ロスマリン酸、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸ナトリウム、没食子酸プロピル、システイン、アスコルビン酸およびトコフェロールを含む群から選択される、前記〔１３〕に記載の組成物。
〔１５〕バイオアベイラビリティ増強剤が、ピペリン、ケルセチン、ニンニク抽出物、ショウガ抽出物、およびナリンギンを含む群から選択される、前記〔１３〕に記載の組成物。
〔１６〕哺乳動物細胞がヒト細胞である、前記〔１０〕に記載の方法。
〔１７〕薬学的に／栄養補助に許容される賦形剤、補助剤、希釈剤または担体と共に製剤化され、錠剤、カプセル、ソフトジェル、シロップ、グミ、散剤、懸濁液、乳濁液、チュアブル、キャンディーまたは食料品の形態で経口投与される、前記〔１３〕に記載の組成物。
【国際調査報告】
2021508480.tif 000017