(57)【要約】  本技術は、概して、ゲムシタビンおよびゲムシタビン誘導体のオリゴ乳酸コンジュゲートおよびコンジュゲートのステレオコンプレックス、そのようなコンジュゲートまたはコンジュゲートのステレオコンプレックスを含有するミセル組成物、ならびに様々ながんを治療するためのそのような組成物の調製および使用方法に関する。オリゴ乳酸コンジュゲートおよびコンジュゲートのステレオコンプレックスは、２〜２０個の乳酸サブユニットを含むオリゴ乳酸を含み得、アミド結合によってゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）の窒素に結合していてもよい。水、ならびにポリ乳酸含有ポリマーおよびオリゴ乳酸コンジュゲートまたはコンジュゲートのステレオコンプレックスを含むミセルを含む組成物は、容易に調製され得る。がん細胞を阻害するまたは死滅させる方法、ならびにゲムシタビン感受性がんを治療する方法もまた提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲートであって、前記コンジュゲート中の前記オリゴ−Ｌ−乳酸が、２〜２０個の乳酸サブユニットを含み、かつ、アミド結合によって前記ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４−アミノの窒素に結合している、前記４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲート。
【請求項２】
前記オリゴ−Ｌ−乳酸が、７〜２０個の乳酸サブユニットを含む、請求項１に記載の４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲート。
【請求項３】
ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲートであって、前記コンジュゲート中の前記オリゴ−Ｄ−乳酸が、２〜２０個の乳酸サブユニットを含み、かつ、アミド結合によって前記ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４−アミノの窒素に結合している、前記４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲート。
【請求項４】
前記オリゴ−Ｄ−乳酸が、７〜２０個の乳酸サブユニットを含む、請求項３に記載の４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲート。
【請求項５】
ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲートと、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲートとのステレオコンプレックスを含む組成物であって、
各コンジュゲート中の前記オリゴ−Ｌ−乳酸および前記オリゴ−Ｄ−乳酸が、７〜２０個の乳酸サブユニットを含み、
前記オリゴ−Ｌ−乳酸または前記オリゴ−Ｄ−乳酸が、アミド結合によって前記ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４−アミノの窒素に結合している、
前記組成物。
【請求項６】
ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲートの、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲートに対するモル比が、約２：１〜約１：２の範囲である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
水およびミセルを含む組成物であって、
前記ミセルが、
請求項５もしくは請求項６のいずれか一項に記載の組成物、
請求項１もしくは請求項２に記載のゲムシタビンもしくはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲート、または
請求項３もしくは請求項４に記載のゲムシタビンもしくはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲート
を含む、前記組成物。
【請求項８】
前記ステレオコンプレックスの負荷が、前記ミセルの質量に対して約１重量％〜約５０重量％である、請求項７に記載の組成物。
【請求項９】
前記ステレオコンプレックスの濃度が、前記組成物中の前記水の体積に対して約０．６ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬである、請求項７に記載の組成物。
【請求項１０】
ポリ（エチレングリコール）−ブロック−ポリ乳酸（ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ）コポリマーをさらに含む、請求項５〜９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
前記ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡコポリマーのポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量が、約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜約３５，０００ｇ／ｍｏｌであるか、前記ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡコポリマーのポリ（乳酸）ブロックの分子量が、約１，０００ｇ／ｍｏｌ〜約１５，０００ｇ／ｍｏｌであるか、またはそれらの組み合わせである、請求項１０に記載の組成物。
【請求項１２】
前記ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡコポリマーのポリ（エチレングリコール）ブロックの分子量が、約１，５００ｇ／ｍｏｌ〜約１４，０００ｇ／ｍｏｌであるか、前記ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡコポリマーのポリ（乳酸）ブロックの分子量が、約１，５００ｇ／ｍｏｌ〜約７，０００ｇ／ｍｏｌであるか、またはそれらの組み合わせである、請求項１０または請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の、ゲムシタビンもしくはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲート、またはゲムシタビンもしくはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲートを作製する方法であって、
遊離４−アミノ基を有するゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体を、カップリング剤、およびヒドロキシル基を有するオリゴ−Ｌ−乳酸またはヒドロキシル基を有するオリゴ−Ｄ−乳酸と接触させることを含み、
前記オリゴ−Ｌ−乳酸および前記オリゴ−Ｄ−乳酸が、２〜２０個の乳酸サブユニットを含む、
前記方法。
【請求項１４】
前記ヒドロキシル基が、以前は保護されているヒドロキシル基であった、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記オリゴ−Ｌ−乳酸または前記オリゴ−Ｄ−乳酸が、７〜２０個の乳酸サブユニットを含む、請求項１３に記載の方法。
【請求項１６】
ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲートと、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲートとのステレオコンプレックスを含む第１の組成物のｔブタノール／水溶液を凍結乾燥させること
を含み、
各コンジュゲート中の前記オリゴ−Ｌ−乳酸または前記オリゴ−Ｄ−乳酸が、２〜２０個の乳酸サブユニットを含み、
前記オリゴ−Ｌ−乳酸または前記オリゴ−Ｄ−乳酸が、アミド結合によって前記ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４−アミノの窒素に結合している、
請求項５〜１２のいずれか一項に記載の組成物を作製する方法。
【請求項１７】
ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体に感受性のがん細胞を阻害するまたは死滅させる方法であって、前記がん細胞を、有効阻害量または致死量の請求項５〜１２のいずれか一項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項１８】
前記接触が、インビトロで行われる、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
がんの治療を必要とする対象においてがんを治療する方法であって、有効量の請求項５〜１２のいずれか一項に記載の組成物を前記対象に投与することを含み、前記がんが、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体に感受性である、前記方法。
【請求項２０】
前記がんが、卵巣がん、白血病、血管肉腫、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、肺がん、膵がん、胆管癌、脳がん（神経膠腫など）、腺癌、肝細胞腫、および胆道がんからなる群から選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記がんが、卵巣がん、乳がん、肺がん、膵がん、胆管癌、および胆道がんからなる群から選択される、請求項１９または請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記がんが、肺がんまたは膵がんである、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物が、局所的に、鼻腔内に、全身的に、静脈内に、皮下に、腹腔内に、皮内に、眼内に、イオン泳動的に、経粘膜的に、または筋肉内に投与される、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月２日に出願された米国仮特許出願第６２／６５１，３６５号の利益および優先権を主張するものであり、その全開示は、あらゆる全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
政府の支援に関する声明
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＡＩ１０１１５７の下で政府の支援を受けて行われた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
技術分野
本技術は、概して、ゲムシタビンおよびそのゲムシタビン誘導体のオリゴ乳酸コンジュゲートおよびコンジュゲートのステレオコンプレックスに関する。コンジュゲートおよびコンジュゲートのステレオコンプレックスは、ゲムシタビンの標準製剤と比較して、がんの治療において優れた血漿安定性および／または増強された効果を提供するために、合成ミセルに製剤化され得る。
【背景技術】
【０００４】
背景
ゲムシタビンは、様々ながんの治療において有用な強力な化学療法剤であり、以下に示す構造を有する。
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【０００５】
ゲムシタビンは、天然に存在するピリミジン、シチジンを模倣するように設計された高度に水溶性のヌクレオシド類似体である。細胞内に入ると、ゲムシタビンは、一連の翻訳後修飾が活性であることを必要とする。しかしながら、ゲムシタビンは、血漿中で不活性代謝産物２’，２’−ジフルオロデオキシウリジンに急速に脱アミノ化され、尿を介して急速に排泄される。血液中の治療レベルを増加させるために、ゲムシタビンは、短い半減期を克服するために高用量（約１０００ｍｇ／ｍ２）での投与を必要とする。
【発明の概要】
【０００６】
概要
本技術は、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲート、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲート、ならびに４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲートと４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲートとのステレオコンプレックスを提供する。コンジュゲートまたはステレオコンプレックスは、典型的には、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４−アミノ基のアミド結合により結合し得る、２〜２０個の乳酸サブユニットを含む。任意の実施形態では、ステレオコンプレックス中のコンジュゲートは、７〜２０個の乳酸サブユニットを含み得る。
【０００７】
いくつかの実施形態では、本技術は、オリゴ乳酸ならびに血漿安定性および抗がん効果の増強を有するゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体のコンジュゲートおよびステレオコンプレックスを提供する。本明細書に提供されるコンジュゲートは、がんの治療に有用である薬学的組成物および薬剤として、ミセルに製剤化することができる。また、薬学的製剤および薬剤の調製におけるコンジュゲートの使用も提供される。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
【図１】一実施形態による、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのｏ（ＬＬＡ）ｎ−ＧＥＭおよびｏ（ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭのステレオコンプレックスプロドラッグ：負荷、安定性、ならびに放出後のバックバイティングおよびエステラーゼによるプロドラッグ変換を示す。
【図２】実施例による、ｏ（ＬＬＡ）ｎ−ＧＥＭおよびｏ（ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭの合成スキームを示す。
【図３Ａ】実施例による、ＣＨ３ＣＮからの蒸発後の、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ、ｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ、および両方のプロドラッグのステレオコンプレックス混合物の粉末ＸＲＤプロファイルを示す。
【図３Ｂ】実施例による、ＣＨ３ＣＮからの蒸発後の、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ、ｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ、および両方のプロドラッグのステレオコンプレックス混合物のＤＳＣサーモグラムを示す。
【図３Ｃ】実施例による、ＣＨ３ＣＮからの蒸発後の、ｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭ、ｏ（ＤＬＡ）６−ＧＥＭ、および両方のプロドラッグのステレオコンプレックス混合物の粉末ＸＲＤプロファイルを示す。
【図３Ｄ】実施例による、ＣＨ３ＣＮからの蒸発後の、ｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭ、ｏ（ＤＬＡ）６−ＧＥＭ、および両方のプロドラッグのステレオコンプレックス混合物のＤＳＣサーモグラムを示す。
【図４】図４Ａおよび４Ｂは、実施例による、ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのＡＦＭ画像を示す。
【図５】実施例による、５％および１５％の負荷でのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルからのｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭ、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ、またはステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭのインビトロ放出を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３〜４）。
【図６】図６Ａは、実施例による、１：１のＣＨ３ＣＮ／１０ｍＭのＰＢＳ中、３７℃、ｐＨ７．４で０〜７２時間インキュベートした後の、ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭおよびそのバックバイティング変換生成物の物理的混合物の相対量を示す（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。図６Ｂは、実施例による、ＭｉｌｌｉＱ水中、２５℃、０〜８週間インキュベートした後の、１５％の負荷でのｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルおよびその変換生成物の相対量を示す（平均±ＳＤ、ｎ＝３）。
【図７Ａ】実施例による、３７℃で０〜２４時間インキュベーションした後の、ラット血漿中のＧＥＭの相対量を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【図７Ｂ】実施例による、３７℃で０〜２４時間インキュベーションした後の、ラット血漿中のｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの相対量を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【図７Ｃ】実施例による、３７℃で０〜２４時間インキュベーションした後の、ラット血漿中の１５％の負荷でのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル中のｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭプロドラッグおよびその変換生成物ＧＥＭの相対量を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３）。
【図８】図８Ａは、実施例による、ヒトＡ５４９非小肺がん細胞に対する１５％の負荷でのＧＥＭおよびｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルのインビトロ細胞毒性を示す。図８Ｂは、実施例による、ＰＡＮＣ−１膵がん細胞に対する１５％の負荷でのＧＥＭおよびｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルのインビトロ細胞毒性を示す。５重複判定の平均±ＳＥＭ。
【図９】図９Ａおよび９Ｂは、実施例による、Ａ５４９非小細胞肺がん異種移植片モデルにおけるＧＥＭおよびｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルのインビボ抗腫瘍効果を示す。マウスは、実施例により、ＧＥＭ（１０ｍｇ／ｋｇ）またはｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセル（５％の負荷、１０ｍｇ／ｋｇのＧＥＭ当量）を、３週間、毎週、静脈内投与された（矢印によって示されるように）。図９Ａは、相対腫瘍体積を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３〜４、＊：ｐ＜０．０５）。図９Ｂは、相対体重を示す（平均±ＳＥＭ、ｎ＝３〜４、＊：ｐ＜０．０５）。
【発明を実施するための形態】
【０００９】
詳細な説明
以下で定義されるように、以下の用語が全体を通して使用される。
【００１０】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、要素を記載する文脈において、（特に、添付の特許請求の範囲の文脈において）「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および同様の指示語などの単数形冠詞は、本明細書において別段の記載がないか、または文脈によって明確に矛盾することがない限り、単数形および複数形の両方を網羅するよう解釈されることになっている。本明細書の値の範囲の記載は、本明細書において別段の記載がない限り、この範囲内に入る各別個の値に対して、個々に言及する簡便法として働くと意図されるに過ぎず、各別個の値は、本明細書で個々に記載されているかのように本明細書に組み込まれる。本明細書に記載の方法は全て、本明細書において別段の記載がない限り、または文脈によって明確に矛盾することがない限り、任意の好適な順序で実行することができる。本明細書で提供されるいずれかのおよび全ての例、または例示的な言語的表現（例えば、「など」）の使用は単に、実施形態をより良好に明らかにするよう意図されており、別段の記載がない限り、特許請求の範囲に制限を与えるものではない。本明細書におけるいかなる用語も、主張されていないいかなる要素も不可欠なものとして示すものと解釈されるべきではない。
【００１１】
本明細書で使用される場合、数に関する「約」という用語は、通常、特に記載がない限り、または文脈から明らかでない限り、数のいずれかの方向（より大きい、またはより小さい方向）に１％、５％、または１０％の範囲内に含まれる数を含むと見なされる（そのような数が０％未満であるか、または可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【００１２】
本技術は、本明細書に開示される化合物（薬物および／または薬物コンジュゲート）およびミセルの実施形態のうちのいずれか１つを含む薬学的組成物および薬剤、ならびに薬学的に許容される担体または１つ以上の賦形剤を提供する。組成物は、本明細書に記載の方法および治療において使用され得る。薬学的組成物は、有効量の本明細書に開示される本技術の化合物の実施形態のうちのいずれか１つを含み得る。任意の実施形態では、有効量は、対象に関連して決定され得る。「有効量」とは、所望の効果をもたらすために必要とされる化合物、コンジュゲート、ミセル、または組成物の量を指す。有効量の一例としては、がんまたは再狭窄などの心血管疾患の治療を含むがこれらに限定されない、治療的（薬学的）使用のための許容される毒性および生物学的利用能のレベルをもたらす量または投薬量が挙げられる。
【００１３】
本明細書で使用される「対象」または「患者」は、ネコ、イヌ、げっ歯類、または霊長類などの哺乳動物である。典型的には、対象は、ヒトであり、好ましくは、ゲムシタビンまたはその誘導体に感受性のがん、すなわち、有効量のゲムシタビンまたはその誘導体を用いて治療することができるがんに罹患しているヒトである。「対象」および「患者」という用語は互換的に使用され得る。
【００１４】
本明細書で使用される場合、「ゲムシタビン誘導体」は、ゲムシタビンのピリミジン／ヌクレオシド骨格を保持するが、少なくとも１つの修飾側鎖を含有する化合物である。他のゲムシタビン誘導体は、当業者に既知であり、シタラビン（ＡｒａＣ）、エムトリシタビン、ラミブジン、ザルシタビン、アザシチジン、およびトロキサシタビンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００１５】
「ステレオコンプレックス」という用語は、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲートと、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲートとを含む、立体選択的に会合した予め形成されたオリゴ乳酸コンジュゲートの組成物を指す。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル保護基」は、−Ｏ−Ｇ基を指す。Ｇは、ヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、当業者に周知である。いくつかの実施形態では、ヒドロキシル保護基は、メトキシメチルエーテル（ＭＯＭ）、メトキシエトキシメチルエーテル（ＭＥＭ）、ベンジルオキシメチルエーテル（ＢＯＭ）、テトラヒドロピラニルエーテル（ＴＨＰ）、ベンジルエーテル（Ｂｎ）、ｐ−メトキシベンジルエーテル、トリメチルシリルエーテル（ＴＭＳ）、トリエチルシリルエーテル（ＴＥＳ）、トリイソプロピルシリルエーテル（ＴＩＰＳ）、ｔ−ブチルジメチルシリルエーテル（ＴＢＤＭＳ）、ｔ−ブチルジフェニルシリルエーテル（ＴＢＤＰＳ）、ｏ−ニトロベンジルエーテル、ｐ−ニトロベンジルエーテル、トリチルエーテル、酢酸、クロロ酢酸、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、トリフルオロ酢酸、安息香酸（Ｂｚ）、メチルカーボネート、アリルカーボネート（ａｌｌｏｃ）、ジメチルチオカルバメート（ＤＭＴＣ）、ベンジルカーボネート（Ｃｂｚ）、ｔ−ブチルカーボネート（Ｂｏｃ）、および９−（フルオロエニルメチル）カーボネート（Ｆｍｏｃ）からなる群から選択され得る。ヒドロキシル基官能性についての保護基の広範なリストは、Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｇｒｅｅｎｅ，Ｔ．Ｗ．、Ｗｕｔｓ，Ｐ．Ｇ．Ｍ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ（第３版、１９９９）に見出され得、その中に記載されている手順を使用して追加または除去することができ、本明細書に完全に記載されているかのように、あらゆる全ての目的のために、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【００１７】
一態様では、本技術は、オリゴ−Ｌ−乳酸のゲムシタビンおよびゲムシタビン誘導体とのコンジュゲートを提供する。別の態様では、本技術は、オリゴ−Ｄ−乳酸のゲムシタビンおよびゲムシタビン誘導体とのコンジュゲートを提供する。別の態様では、本技術は、ステレオコンプレックスのゲムシタビンおよびゲムシタビン誘導体とのコンジュゲートを提供する。
【００１８】
本技術のコンジュゲートおよびステレオコンプレックスでは、オリゴ乳酸は、乳酸の直鎖状ポリエステルであり得る。本技術のコンジュゲートおよびステレオコンプレックスでは、オリゴ乳酸は、アミド結合によってゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４−アミノの窒素に結合していてもよい。そのようなコンジュゲートおよびステレオコンプレックスでは、オリゴ乳酸は、典型的には、２〜２０個の乳酸サブユニットを含む。本コンジュゲートおよびステレオコンプレックスが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個の乳酸サブユニット、または前述の値のうちのいずれか２つの間のサブユニットの範囲を有し得ることが、当業者に理解されるであろう。例えば、コンジュゲートおよびステレオコンプレックスは、７〜２０個の乳酸サブユニットを含み得る。任意の実施形態では、オリゴ−Ｌ−乳酸およびオリゴ−Ｄ−乳酸は、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、または少なくとも７個の乳酸サブユニットをそれぞれ含み得る。
【００１９】
任意の実施形態では、コンジュゲートおよびステレオコンプレックスは、式Ｉに示される構造を有し得、
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式中、ｎは、各出現時に、個々に、２〜２０の整数、または終点を含む間の範囲（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０）である。任意の実施形態では、ｎは、各出現時に、７〜２０の整数、または終点を含む間の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴ乳酸はＬ−オリゴ乳酸であり得る。いくつかの実施形態では、オリゴ乳酸はＤ−オリゴ乳酸であり得る。
【００２０】
本技術は、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲートと、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲートとのステレオコンプレックスを含む、組成物を提供する。上記に示されるように、各コンジュゲート中のオリゴ−Ｌ−乳酸またはオリゴ−Ｄ−乳酸は、２〜２０個の乳酸サブユニットを含み得、および／または、アミド結合によってゲムシタビンもしくはゲムシタビン誘導体の４−アミノの窒素に結合し得る。オリゴ乳酸の長さは、上記に示されるように変化し得、例えば、オリゴ乳酸は、７〜２０個の乳酸残基を有し得る。ステレオコンプレックスでは、２つのコンジュゲートのモル比は、約１：１であり得る。しかしながら、ステレオコンプレックスを含む組成物は、２：１〜１：２、例えば３：２、または２：３、または１：１の範囲の、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲートの、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体の４（Ｎ）−オリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲートに対するモル比を含み得る。図１は、本技術の一実施形態について、ステレオコンプレックス、ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭ、およびそれらのミセルへの負荷を概略的に示す。
【００２１】
任意の実施形態では、本技術のコンジュゲートは、遊離４アミノ基を有するゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体を、カップリング剤、ならびに２〜２０個の乳酸サブユニットおよびヒドロキシルを有するオリゴ乳酸と接触させることによって調製され得る。任意の実施形態では、ヒドロキシルは、保護されているヒドロキシル基であり得るか、または以前は保護されているヒドロキシル基であり得る。任意の実施形態では、ヒドロキシル基は、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体と接触する前に脱保護され得る。任意の実施形態では、保護されているヒドロキシル基は、ベンジル保護基を含み得る。任意の実施形態では、ヒドロキシル基が脱保護される前に、オリゴ乳酸は、２〜２０個の乳酸サブユニットを有するベンジルオリゴ乳酸であり得る。ほんの一例として、図２は、本コンジュゲートを作製する方法の例示的な実施形態を提供する。図２では、ゲムシタビンは、好適な有機溶媒中のカップリング試薬を使用して、Ｌ−またはＤ−オリゴ乳酸中間体においてカルボキシルに結合している。好適なカップリング剤としては、ＤＣＣおよびＥＤＣＩなどのカルボジイミドが挙げられる。好適な有機溶媒としては、ハロゲン化溶媒（例えば、ジクロロメタン、クロロホルム）、酢酸アルキル（例えば、酢酸エチル）、または他の極性非プロトン性溶媒（例えば、ＤＭＦ、ＴＨＦ）が挙げられる。
【００２２】
別の態様では、本技術は、水、ポリ乳酸含有ポリマー、および本明細書に記載の本技術の任意のゲムシタビン／ゲムシタビン誘導体オリゴ乳酸コンジュゲートから形成されるミセルの水性組成物を提供する。別の態様では、本技術は、水、ポリ乳酸含有ポリマー、および本明細書に記載の本技術のゲムシタビン／ゲムシタビン誘導体オリゴ乳酸コンジュゲートの任意のステレオコンプレックスから形成されるミセルの水性組成物を提供する。
【００２３】
任意の実施形態では、ミセルは、ブロックコポリマー、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡ（ＰＥＧ−ＰＬＡとしても知られている）を含み得る。ポリ（乳酸）ブロックは、（Ｄ−乳酸）、（Ｌ−乳酸）、（Ｄ、Ｌ−乳酸）、またはこれらの組み合わせを含み得る。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡの様々な形態は、例えば、Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｏｕｒｃｅ、Ｉｎｃ．、Ｍｏｎｔｒｅａｌ、Ｑｕｅｂｅｃから市販されているか、または当業者に周知の方法に従って調製することができる。任意の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）ブロック（ＰＥＧブロック）の分子量は、約１，０００〜約３５，０００ｇ／ｍｏｌ、または該範囲内の約５００ｇ／ｍｏｌの任意の増分であり得る。（特に明記しない限り、本明細書で言及される全てのポリマー分子量は、重量平均分子量であると理解される。）例えば、ＰＥＧブロックの分子量は、約１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、６，０００、７，０００、８，０００、９，０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２１，０００、２２，０００、２３，０００、２４，０００、２５，０００、２６，０００、２７，０００、２８，０００、２９，０００、３０，０００、３１，０００、３２，０００、３３，０００、３４，０００、３５，０００、または前述の値のいずれか２つの間およびそれらを含む範囲であり得る。任意の実施形態では、ポリ（乳酸）ブロック（ＰＬＡブロック）の好適なブロックは、約１，０００〜約１５，０００ｇ／ｍｏｌ、または該範囲内の約５００ｇ／ｍｏｌの任意の増分を有し得る。例えば、ＰＬＡブロックの分子量は、約１，０００、１，５００、２，０００、２，５００、３，０００、３，５００、４，０００、４，５００、５，０００、６，０００、６，５００、７，０００、７，５０００、８，０００、８，５００、９，０００、９，５００、１０，０００、１０，５００、１１，０００、１１，５００、１２，０００、１２，５００、１３，０００、１３，５００、１４，０００、１４，５００、１５，０００、または前述の値のいずれか２つの間およびそれらを含む範囲であり得る。任意の実施形態では、ＰＥＧブロックは、メチル基（例えば、メトキシエーテル）などのアルキル基、または任意の好適な保護、キャッピング、またはブロッキング基で終結してもよい。任意の実施形態では、ＰＥＧブロックの分子量は、約１，０００〜約３５，０００ｇ／ｍｏｌであってもよく、ＰＬＡブロックの分子量は、約１，０００〜約１５，０００ｇ／ｍｏｌ、またはこれらの組み合わせであってもよい。任意の実施形態では、ＰＥＧブロックの分子量は、約１，５００〜約１４，０００ｇ／ｍｏｌであってもよく、ＰＬＡブロックの分子量は、約１，５００〜約７，０００ｇ／ｍｏｌ、またはこれらの組み合わせであってもよい。
【００２４】
任意の実施形態では、本技術のミセルは、様々なブロックサイズ（例えば、上記の範囲内のブロックサイズ）および様々な比のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡポリマーを使用して調製され得る。例えば、ＰＥＧ：ＰＬＡ比は、約１：１０〜約１０：１、または限定されないが１：５、１：３、１：２、１：１、２：１、３：１、および５：１を含む該範囲内の任意の整数比であり得る。例えば、ＰＥＧ−ＰＬＡポリマーの数平均分子量（Ｍａ）としては、約２Ｋ−２Ｋ、３Ｋ−５Ｋ、５Ｋ−３Ｋ、５Ｋ−６Ｋ、６Ｋ−５Ｋ、６Ｋ−６Ｋ、８Ｋ−４Ｋ、４Ｋ−８Ｋ、１２Ｋ−３Ｋ、３Ｋ−１２Ｋ、１２Ｋ−６Ｋ、６Ｋ−１２Ｋ（それぞれＰＥＧ−ＰＬＡ）、または前述の値のいずれか２つの間およびそれらを含む範囲を挙げることができるが、これらに限定されない。
【００２５】
１つの好適なＰＥＧ−ＰＬＡポリマーは、約１：１の比で約１〜３ｋＤａ（例えば、約２Ｋダルトン）のブロックを含む。このブロックポリマーを使用すると、ミセル中の高レベルの薬物コンジュゲートの負荷をもたらした。ＰＥＧ−ＰＬＡ分子量のさらなる特定の例には、４．２Ｋ−ｂ−１．９Ｋ、５Ｋ−ｂ−１０Ｋ、１２Ｋ−ｂ−６Ｋ、２Ｋ−ｂ−１．８Ｋ、および以下の実施例に記載されているものが挙げられる。使用することができる他の好適な両親媒性ブロックコポリマーは、米国特許第４，７４５，１６０号（Ｃｈｕｒｃｈｉｌｌら）および同第６，３２２，８０５号（Ｋｉｍら）に記載されており、これらはそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。薬物対ポリマー比は、約１：２０〜約２：１、または該範囲内の任意の整数比であってよい。好適な薬物−ポリマー比の具体例としては、約２：１、約３：２、約１．２：１、約１：１、約３：５、約２：５、約１：２、約１：５、約１：７．５、約１：１０、約１：２０、または前述の値のいずれかの間およびそれらを含む範囲が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２６】
本技術のミセルは、大量の、本明細書に記載されているコンジュゲートおよびステレオコンプレックスを含む、広範囲の量を負荷することができる。例えば、コンジュゲートおよびステレオコンプレックスの負荷は、ミセルの質量に対して約１重量％〜約５０重量％であってよい。ミセル中のコンジュゲートおよびステレオコンプレックスの負荷の例としては、ミセルの質量に対して、約１重量％、約２重量％、約３重量％、約４重量％、約５重量％、約１０重量％、約１５重量％、約２０重量％、約２５重量％、約３０重量％、約３５重量％、約４０重量％、約４５重量％、もしくは約５０重量％、または前述の値のいずれか２つの間およびそれらを含む範囲が挙げられる。任意の実施形態では、コンジュゲートおよびステレオコンプレックスの負荷は、約５重量％〜約１５重量％であってよい。
【００２７】
ミセル中の各コンジュゲートおよびコンジュゲートのステレオコンプレックスの負荷は、濃度の観点から表すこともできる。例えば、各コンジュゲートおよびコンジュゲートのステレオコンプレックスの濃度は、組成物中の水の体積に対して、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４０ｍｇ／ｍＬであってもよい。本技術で得ることができる各コンジュゲート濃度の例としては、組成物中の水の体積に対して、約０．６ｍｇ／ｍＬ、約１ｍｇ／ｍＬ、約２ｍｇ／ｍＬ、約３ｍｇ／ｍＬ、約４ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ、約６ｍｇ／ｍＬ、約８ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ、約１２ｍｇ／ｍＬ、約１５ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ、約２５ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ、約３５ｍｇ／ｍＬ、もしくは約４０ｍｇ／ｍＬ、または前述の値のいずれか２つの間およびそれらを含む範囲が挙げられる。任意の実施形態では、Ｌ−オリゴ乳酸コンジュゲートの濃度は、約１〜約１５ｍｇ／ｍＬ、もしくはさらに約２〜約１２ｍｇ／ｍＬであってもよく、Ｄ−オリゴ乳酸コンジュゲートの濃度は、約１〜約２０ｍｇ／ｍＬ、もしくはさらに約１．５〜約１０ｍｇ／ｍＬであってもよく、および／またはコンジュゲートのステレオコンプレックスの濃度は、約０．５〜約１５ｍｇ／ｍＬ、もしくはさらに約１〜約１０ｍｇ／ｍＬであってもよい。
【００２８】
ミセル中の各コンジュゲートおよびステレオコンプレックスの負荷は、負荷効率の観点から表すこともできる。例えば、各コンジュゲートおよびステレオコンプレックスの負荷効率は、ミセルの質量に対して約２５重量％〜約１００重量％であってよい。ミセル中のコンジュゲートおよびコンジュゲートのステレオコンプレックスの負荷効率の例としては、ミセルの質量に対して、約３０重量％、約３５重量％、約４０重量％、約４５重量％、約５０重量％、約５５重量％、約６０重量％、約６５重量％、約７０重量％、約７５重量％、約８０重量％、約８５重量％、約９０重量％、約９５重量％、約９９重量％、もしくは約１００重量％、または前述の値のいずれか２つの間およびそれらを含む範囲が挙げられる。任意の実施形態では、Ｌ−オリゴ乳酸コンジュゲートの負荷効率は、約８０重量％〜約９０重量％を含む少なくとも約５０重量％であってもよく、ステレオコンプレックスの負荷効率は、約９０重量％〜約１００重量％を含む少なくとも約５０重量％であってもよい。
【００２９】
任意の実施形態では、本技術は、水と、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡならびにＬ−オリゴ乳酸コンジュゲート、Ｄ−オリゴ乳酸コンジュゲート、および本明細書に記載のステレオコンプレックスのうちの少なくとも１つを含むミセルと、を含む組成物を提供する。任意の実施形態では、ミセルの質量に対して、Ｌ−オリゴ乳酸コンジュゲートの負荷の負荷は、約１重量％〜約５０重量％であってもよく、Ｄ−オリゴ乳酸コンジュゲートの負荷は、約１重量％〜約５０重量％であってよく、および／またはステレオコンプレックスの負荷は、約１重量％〜約５０重量％であってよい。任意の実施形態では、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡのＰＥＧブロックの分子量は、約１，５００〜約１４，０００ｇ／ｍｏｌであってもよく、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡのＰＬＡブロックの分子量は、約１，５００〜約７，０００ｇ／ｍｏｌ、またはこれらの組み合わせであってもよい。このような組成物は、例えば、約１重量％〜約５０重量％、約１〜約１５ｍｇ／ｍＬ、または約２〜約１２ｍｇ／ｍＬのＬ−オリゴ乳酸コンジュゲートのいずれか、約５重量％〜約５０重量％、約１〜約２０ｍｇ／ｍＬ、または約２〜約１０ｍｇ／ｍＬのＤ−オリゴ乳酸コンジュゲートのいずれか、および／または約２重量％〜約３０重量％、約１〜約１５ｍｇ／ｍＬ、または約２〜約１５ｍｇ／ｍＬのステレオコンプレックスのいずれかを含む、本明細書に記載のゲムシタビン負荷のいずれかを含み得る。任意の実施形態では、組成物は、Ｌ−オリゴ乳酸コンジュゲートのいずれか、Ｄ−オリゴ乳酸コンジュゲートのいずれか、本明細書に記載のステレオコンプレックスのいずれか、またはそれらの２つ以上の組み合わせを含み得る。
【００３０】
溶媒中に臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を超える量で存在する両親媒性ポリマーの両親媒性一本鎖は、ミセル、疎水性内部のコア−コロナ構造、および親水性外部またはシェルに凝集する。薬物またはコンジュゲートが負荷されたＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのプロトンＮＭＲ分光法の研究は、ミセルが水性環境で容易に形成される一方で、ＤＭＳＯなどの有機溶媒中で分解することを示している。本ミセル組成物は、典型的には、有機溶媒を実質的に含まず、例えば、組成物の重量に基づいて、約２重量％未満のエタノール、ジメチルスルホキシド、ヒマシ油、およびヒマシ油誘導体（すなわち、クレモフォア（Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ）ＥＬなどのポリエトキシル化カンファー化合物）である。任意の実施形態では、有機溶媒の量は、約１重量％未満、約０．５重量％未満、約０．１重量％未満であってもよく、または本質的に検出可能な量の有機溶媒を含まなくてもよい。
【００３１】
ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、このセクションで以下に記載されるように、ならびに以下の実施例で記載されるように調製され得る。本明細書に記載のミセルの組成物は、水と、ポリ乳酸含有ポリマーおよびゲムシタビンの薬物／薬物誘導体の組み合わせの混合物とを組み合わせることによって調製され得る。別の実施形態では、本明細書に記載のミセルの組成物は、水と、ポリ乳酸含有ポリマーおよび薬物／薬物誘導体コンジュゲート／本明細書に記載のコンジュゲートのステレオコンプレックスのうちの少なくとも１つの混合物とを組み合わせることによって調製され得る。任意の実施形態では、ポリ乳酸含有ポリマーは、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡを含み得る。
【００３２】
以下に示される手順は、例示に過ぎない。当業者によって容易に認識されるように、手順は、所望の調製規模に応じて変えることができる。この手順の利点の１つは、ミセル溶液の透析を必要としないことである。
【００３３】
調製手順：凍結乾燥。一実施形態では、ミセル調製は、以下のように実施することができる。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに負荷された、本明細書に記載の少なくとも１つのコンジュゲートまたはステレオコンプレックスは、ｔｅｒｔ−ブタノール−水混合物から凍結乾燥することによって調製することができる。例えば、２〜２０ｍｇのＰＥＧ４０００−ｂ−ＰＬＡ２２００（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．，Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）と、１．０ｍｇの本明細書に記載のコンジュゲート（複数可）とを、１．０ｍＬのｔｅｒｔ−ブタノールに６０℃で溶解し、続いて、激しく混合しながら、６０℃で予熱した再蒸留水１．０ｍＬを添加することができる。混合物を、ドライアイス／エタノール冷却浴で−７０℃で凍結させる。次いで、凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚａｔｉｏｎ）を、実験全体を通して、１００μＢａｒで、−２０℃の棚入口温度にて７２時間、凍結乾燥機（ｆｒｅｅｚｅ−ｄｒｙｅｒ）棚上で行うことができる。次いで、凍結乾燥したケークを、０．９％の生理食塩水溶液１．０ｍＬで６０℃にて再水和し、遠心分離し、０．２２μｍの再生セルロースフィルターを通して濾過し、ＨＰＬＣで分析することができる。いくつかの実施形態では、この手順は、オリゴ−Ｌ−乳酸コンジュゲートまたはオリゴ−Ｄ−乳酸コンジュゲートのミセルを調製するために使用される。いくつかの実施形態では、この手順は、ステレオコンプレックスのミセルを調製するために使用される。
【００３４】
一旦調製されると、ミセル−コンジュゲートまたはミセル−ステレオコンプレックス組成物は、冷蔵下で、好ましくは約５℃未満の温度で長期間保存することができる。約−２０℃〜約４℃の温度は、ほとんどのミセル−コンジュゲートおよびミセル−ステレオコンプレックス組成物の保存に好適な条件であることが見出されている。例えば、本発明のコンジュゲート負荷ミセルの水溶液は、約４℃で保存され得る。本明細書に記載の凍結乾燥ミセル組成物は、−２０℃で長期間保存し、その後再水和することができる。褐色ガラスバイアルまたは他の不透明な容器を使用してミセル組成物を光から保護すると、組成物の有効寿命をさらに延ばすことができる。
【００３５】
任意の実施形態では、本技術は、ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体に感受性のがん細胞を阻害する、または死滅させる方法を提供する。任意の実施形態では、方法は、細胞を、有効阻害量または致死量の本明細書に記載の組成物のいずれかと接触させることを含み得る。任意の実施形態では、接触させることは、インビトロまたはインビボで行われ得る。ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体に感受性のがんに罹患している哺乳動物に、有効量の本明細書に記載のミセル組成物を投与することを含む治療方法も提供される。ゲムシタビン感受性のがんの例としては、卵巣がん、白血病、血管肉腫、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、肺がん、膵がん、胆管癌、脳がん（神経膠腫など）、腺癌、肝細胞腫、および胆道がんが挙げられる。任意の実施形態では、がんは、肺がんまたは膵がんであり得る。
【００３６】
本明細書に記載の本技術の実施形態のいずれかでは、薬学的組成物は、単位剤形に包装されてもよい。単位剤形は、がんの治療に有効である。一般に、本技術の組成物を含む単位投薬量は、患者の考慮事項に応じて変化する。そのような考慮事項には、例えば、年齢、プロトコル、病態、性別、疾患の程度、禁忌、併用療法などが含まれる。これらの考慮事項に基づく例示的な単位投与量はまた、当業者によって調整または修正され得る。例えば、本技術の化合物を含む患者の単位投与量は、１×１０−４ｇ／ｋｇ〜１ｇ／ｋｇ、好ましくは１×１０−３ｇ／ｋｇ〜１．０ｇ／ｋｇで変化し得る。本技術の化合物の投与量はまた、０．０１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇ、または好ましくは０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇで変化し得る。
【００３７】
ゲムシタビンまたはゲムシタビン誘導体のコンジュゲート／ステレオコンプレックスを含有するミセル組成物は、本明細書に記載されるように調製され、がんおよび心血管疾患を治療するために使用され得る。本明細書に記載のコンジュゲート、ステレオコンプレックス、および組成物は、再狭窄またはがん、例えば、卵巣がん、白血病、血管肉腫、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、肺がん、膵がん、胆管癌、脳がん（神経膠腫など）、腺癌、肝細胞腫、もしくは胆道がんを治療する製剤および薬剤を調製するために使用され得る。そのような組成物は、例えば、顆粒、粉末、錠剤、カプセル、シロップ、坐剤、注射剤、乳剤、エリキシル剤、懸濁液、または溶液の形態でもよい。本発明の組成物は、例えば、非経口、直腸、経鼻、経膣投与による、または移植されたマトリックスまたはリザーバを介する、または再狭窄のための薬物被覆ステントまたはバルーンベースの送達による、様々な投与経路用に製剤化できる。非経口または全身投与には、限定されないが、皮下、静脈内、腹腔内、および筋肉内注射が含まれる。以下の剤形は、例として与えられ、本技術を限定するものとして解釈されるべきではない。
【００３８】
注射可能な剤形は、一般に、好適な分散剤または湿潤剤および懸濁剤を使用して調製され得る溶液または水性懸濁液もしくは水中油型懸濁液を含む。注射可能な形態は、溶媒または希釈剤で調製される溶液相または懸濁液の形態であり得る。許容される溶媒またはビヒクルとしては、滅菌水、リンゲル液、または等張生理食塩水溶液が含まれる。
【００３９】
注射の場合、薬学的製剤および／または薬剤は、上述の適切な溶液で再構成するのに好適なフィルムまたは粉末であってもよい。これらの例には、限定されないが、凍結乾燥、回転乾燥、もしくは噴霧乾燥粉末、アモルファス粉末、顆粒、沈殿物、または微粒子が含まれる。注射の場合、製剤は、安定剤、ｐＨ調整剤、界面活性剤、生物学的利用能調整剤、およびこれらの組み合わせを任意選択で含んでもよい。任意の実施形態では、注射可能な製剤は、等張剤（例えば、ＮａＣｌおよび／またはデキストロース）、緩衝液（例えば、リン酸塩）および／または保存剤を含む。
【００４０】
上述の代表的な剤形に加えて、薬学的に許容される賦形剤および担体は一般に当業者に既知であり、したがって本技術に含まれる。そのような賦形剤および担体は、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ（１９９１）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４１】
本技術の製剤は、以下に記載されるように、短時間作用性、速放性、長時間作用性、および持続放出性であるように設計され得る。したがって、薬学的製剤は、制御放出用または徐放用に製剤化することもできる。
【００４２】
特定の投薬量は、対象の疾患の病態、年齢、体重、一般的な健康状態、性別、および食事、投与間隔、投与経路、排泄率、および遊離薬物／コンジュゲートの組み合わせに応じて調節することができる。有効量を含む上記の剤形のいずれも、十分に日常的な実験の範囲内であり、したがって、十分に本技術の範囲内である。ほんの一例として、このような投薬量は、有効量の遊離薬物／コンジュゲートを患者に投与するために使用することができ、約１０ｍｇ／ｍ２、約２０ｍｇ／ｍ２、約３０ｍｇ／ｍ２、約４０ｍｇ／ｍ２、約５０ｍｇ／ｍ２、約７５ｍｇ／ｍ２、約１００ｍｇ／ｍ２、約１２５ｍｇ／ｍ２、約１５０ｍｇ／ｍ２、約２００ｍｇ／ｍ２、約２５０ｍｇ／ｍ２、約３００ｍｇ／ｍ２、または前述の値のいずれか２つの間およびそれらを含む範囲を挙げることができる。このような量は、本明細書に記載されるように非経口的に投与することができ、５分、１０分、２０分、３０分、４５分、１時間、２時間、３時間、５時間、１０時間、１２時間、１５時間、２０時間、２４時間、または前述の値のいずれかの間およびそれらを含む範囲を挙げることができるが、これらに限定されない時間にわたって行うことができる。投与の頻度は、例えば、１日ごと、２日ごと、３日ごと、１週間ごと、１０日ごと、２週間ごとに１回、または前述の頻度のいずれかの間およびそれらを含む範囲で変動し得る。
【００４３】
本明細書に記載の示される病態の各々について、試験対象は、プラセボ治療を受けた対象または他の好適な対照対象と比較して、対象の障害によって引き起こされた、またはそれに関連する１つ以上の症状（複数可）において、１０％、２０％、３０％、５０％以上の減少、最大７５〜９０％、または９５％以上の減少を示す。
【００４４】
関連する実施形態では、対象を治療する方法が提供され、この方法は、がんまたは心血管疾患に罹患している対象への、本技術の組成物の実施形態のいずれか１つの投与を伴う。この方法では、がんは、卵巣がん、白血病、血管肉腫、乳がん、結腸直腸がん、前立腺がん、肺がん、膵がん、胆管癌、脳がん（神経膠腫など）、腺癌、肝細胞腫、または胆道がんであり得る。
【００４５】
方法の実施形態のいずれかにおいて、方法は、薬学的組成物の投与を含むことができ、薬学的組成物は、本技術の遊離薬物もしくはコンジュゲートを含有するコンジュゲートまたはミセルの実施形態のいずれか１つならびに薬学的に許容される担体を含む。
【００４６】
本技術のコンジュゲートおよびミセル組成物、その薬学的組成物、誘導体、代謝産物、プロドラッグ、ラセミ混合物、または互変異性体の調製または使用により、本技術の利点を示し、当業者をさらに補助するために、本明細書において実施例が提供される。遊離薬物／コンジュゲート／ステレオコンプレックスがイオン化可能なゲムシタビンまたはその誘導体の遊離薬物／コンジュゲート／ステレオコンプレックスを含む限り、薬学的に許容される塩などの塩も使用することができる。本技術の好ましい態様をより完全に示すために、本明細書において実施例も提示される。実施例は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本技術の範囲を限定するものとして決して解釈されるべきではない。実施例は、上記の本技術の変形形態、態様または態様（複数可）のいずれかを含むか組み込むことができる。上記の変形、態様または態様（複数可）は、各々、本技術のいずれかまたは全ての他の変形、態様または態様（複数可）をさらに含むか、または組み込むこともできる。
【実施例】
【００４７】
本技術は、以下の実施例によってさらに例示されるが、決して限定するものとして解釈されるべきではない。
【００４８】
実施例１：実験材料および方法
材料。全ての化学物質はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入し、受け取ったままの状態で使用した。分析グレードの有機溶媒および他の全ての試薬は、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｐｉｔｔｓｂｕｒｇｈ，ＰＡ）から購入した。ゲムシタビン（ＧＥＭ）は、ＬＣ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｏｂｕｒｎ，ＭＡ）から購入した。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡは、Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｔｒｅａｌ，Ｃａｎａｄａ）から購入し、ＰＥＧおよびＰＬＡのＭｎは、それぞれ４，０００および２，２００ｇ／ｍｏｌであり、ＰＤＩは、１．０５であった。Ａ５４９ヒト肺腺癌細胞およびＰＡＮＣ−１膵臓腺癌細胞は、ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入し、１０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００ＩＵ／ｍＬのペニシリン、１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン、および２ｍＭのＬ−グルタミンを補充した、それぞれＲＰＭＩ  １６４０培地およびＤＭＥＭ中で、５％のＣＯ２のインキュベータにおいて、３７℃で培養した。ヘパリン化スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラット血漿およびヒトプール血漿は、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．（Ｎｏｖｉ，ＭＩ）から購入した。
【００４９】
計装。プロトン核磁気共鳴（１Ｈ  ＮＭＲ）データは、２５℃の温度に制御されたＶａｒｉａｎ  Ｕｎｉｔｙ−Ｉｎｏｖａ  ２チャネル５００ＭＨｚ  ＮＭＲ分光計（Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ）で記録した。化学シフト（δ）は、ＣＤＣｌ３の７．２６ｐｐｍでの残留プロトン化溶媒共鳴と比較して、百万分率（ｐｐｍ）で報告した。質量分析データは、ウィスコンシン大学マディソン校の化学学部の化学計装センターにあるＷａｔｅｒｓ  ＬＣＴ（ＥＳＩ−ＴＯＦ）（Ｗａｔｅｒｓ  Ｃｏｒｐ．，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）を使用して得た。サンプルは、１０ｍＭのＮＨ４ＯＡｃ／ＣＨ３ＣＮ溶液から噴霧した。逆相ＨＰＬＣ（ＲＰ−ＨＰＬＣ）分析は、ＬＣ−２０ＡＴポンプ、ＳＩＬ−２０ＡＣ  ＨＴオートサンプラー、ＣＴＯ−２０ＡＣカラムオーブン、およびＳＰＤ−Ｍ２０Ａダイオードアレイ検出器を装備したＳｈｉｍａｄｚｕ  Ｐｒｏｍｉｎｅｎｃｅ  ＨＰＬＣ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を使用して実施した。サンプルを、Ｗａｔｅｒｓ  Ｓｙｍｍｅｔｒｙ  Ｓｈｉｅｌｄ（商標）ＲＰ１８カラム（４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ、１００Å）で分離した。典型的な実験では、１０μＬのサンプルを、０．８ｍＬ／分の流速、２５℃のカラム温度、およびＧＥＭの場合は２７０ｎｍで、およびｏ（ＬＡ）ｎ−ＧＥＭの場合は３００ｎｍでのＵＶ検出波長で注入した。ｏ（ＬＡ）ｎ−ＧＥＭ変換生成物の分離は、溶媒Ａとして１００％のＣＨ３ＣＮを含む有機相と、溶媒Ｂとして０．１％のギ酸を含有する１００％のｍｉｌｌｉＱ水を含む水相を用いた勾配モードで行った。勾配溶離を以下のように使用した：０分、２０％の溶媒Ａおよび８０％の溶媒Ｂ；３０分、６８％の溶媒Ａおよび３２％の溶媒Ｂ；および平衡のための３５分。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの流体力学的直径は、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ−ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ  Ｉｎｃ．，Ｍａｌｖｅｒｎ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を使用して動的光散乱（ＤＬＳ）により、２５℃で、検出角度１７３°および光源としてのＨｅ−Ｎｅイオンレーザー（４ｍＷ、６３３ｎｍ）を用いて測定した。測定前に、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル溶液をｍｉｌｌｉＱ水またはＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈して、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡのレベルを約０．１ｍｇ／ｍＬにし、各サンプル１ｍＬを使い捨ての定寸キュベット（ＢｒａｎｄＴｅｃｈ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｉｎｃ．，Ｅｓｓｅｘ，ＣＴ）に置いた。キュムラント法を使用して相関関数を曲線当てはめし、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのｚ平均直径および多分散指数（ＰＤＩ）を、ストークスアインシュタイン方程式および相関関数の勾配からそれぞれ計算した。全ての測定は、三通りで行った。ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの形態（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）を、雲母に５０．０ｍｇ／ｍＬでポリマーを吸着させた後、ＡＣモードで原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用して観察した。ミセルは、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  Ｂｉｏｓｃｏｐｅ（Ａｓｙｌｕｍ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）のＡＣ４０バイオレバーを使用して、ｍｉｌｌｉＱ水中で画像化した。
【００５０】
単分散ベンジルオリゴ（Ｌ−乳酸）ｎ（Ｂｎ−ｏ（ＬＬＡ）ｎ）またはベンジルオリゴ（Ｄ−乳酸）ｎ（Ｂｎ−ｏ（ＤＬＡ）ｎ）の合成。多分散系の合成は、以前に報告された手順に変更を加えたものに従って、スズ（ＩＩ）−エチルヘキサノエート（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）で開始した（Ｄｅ  Ｊｏｎｇ，Ｓ．Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９９８，３１（１９）：６３９７−６４０２を参照）。例えば、平均重合度が８の場合、環状Ｌ−ラクチドまたは環状Ｄ−ラクチドを、４：１のモル比でベンジルアルコールと混合した。混合物を、溶融するまで１３０℃で撹拌した。その後、トルエン中の０．０１当量のＳｎ（Ｏｃｔ）２（１００ｍｇ／ｍＬ）を添加した。混合物を１３０℃で４時間撹拌し、室温まで放冷して、多分散系Ｂｎ−ｏ（ＬＬＡ）ｎまたはＢｎ−ｏ（ＤＬＡ）ｎを得た。単分散系Ｂｎ−ｏ（ＬＬＡ）６、Ｂｎ−ｏ（ＬＬＡ）１０、Ｂｎ−ｏ（ＤＬＡ）６、またはＢｎ−ｏ（ＤＬＡ）１０を、Ｃ１８逆相カラムクロマトグラフィーを使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｒｆ  ４ｘシステムで分画した。０．１％のギ酸中のアセトニトリルおよび０．１％のギ酸中の水の勾配溶離を適用した。精製した生成物を減圧下で濃縮して、無色の液体を得た。（収率：Ｂｎ−ｏ（ＬＬＡ）６の場合８．３％、Ｂｎ−ｏ（ＤＬＡ）６の場合８．０％、Ｂｎ−ｏ（ＬＬＡ）１０の場合６．７％、およびＢｎ−ｏ（ＤＬＡ）１０の場合７．９％）。Ｂｎ−ｏ（ＬＬＡ）６のＥＳＩ−ＴＯＦ：Ｃ２５Ｈ３２Ｏ１３［Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ計算値：５５８．２１８１、実測値５５８．２１７９；Ｂｎ−ｏ（ＤＬＡ）６のＥＳＩ−ＴＯＦ：Ｃ２５Ｈ３２Ｏ１３［Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ計算値：５５８．２１８１、実測値５５８．２１７８；Ｂｎ−ｏ（ＬＬＡ）１０のＥＳＩ−ＴＯＦ：Ｃ３７Ｈ４８Ｏ２１［Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ計算値：８４６．３０２６、実測値８４６．３０２７；Ｂｎ−ｏ（ＤＬＡ）１０のＥＳＩ−ＴＯＦ：Ｃ３７Ｈ４８Ｏ２１［Ｍ＋Ｎａ］＋のｍ／ｚ計算値：８４６．３０２６、実測値８４６．３０２３。
【００５１】
オリゴ（Ｌ−乳酸）ｎ−ゲムシタビン（ｏ（ＬＬＡ）ｎ−ＧＥＭ）またはオリゴ（Ｄ−乳酸）ｎ−ゲムシタビン（ｏ（ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭ）の合成。ｏ（ＬＬＡ）ｎ−ＧＥＭまたはｏ（ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭは、ｏ（ＬＬＡ）ｎまたはｏ（ＤＬＡ）ｎ上のカルボン酸基とゲムシタビン分子上のアミン基とをアミド化することにより調製した。一般に、Ｂｎ−ｏ（ＬＬＡ）ｎまたはＢｎ−ｏ（ＤＬＡ）ｎの直接水素化は、活性炭上のパラジウム（１０重量％）で達成され、以前公開された報告に従ってｏ（ＬＬＡ）ｎまたｏ（ＤＬＡ）ｎを得た（収率：約９０〜９９％、Ｔａｋｉｚａｗａ，Ｋ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｐｏｌｙｍ．Ｓｃｉ．Ａ  Ｐｏｌｙｍ．Ｃｈｅｍ．，２００８，４６：５９７７−５９９０を参照）。続いて、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）（１．５当量）とＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）（１．５当量）を、乾燥ＤＭＦ中のｏ（ＬＬＡ）ｎまたはｏ（ＤＬＡ）ｎの溶液（１当量）に添加し、アルゴン下で、室温で２時間撹拌した。ＧＥＭ（１当量）を乾燥ＤＭＦに溶解し、上記の混合物に滴加した。反応混合物を、アルゴン下で、室温で２４時間撹拌した。粗生成物を酢酸エチルで希釈し（２０倍）、０．５％（ｗ／ｖ）の塩酸、飽和ＮａＨＣＯ３、およびブライン溶液で洗浄した。次いで、有機層を採取し、ＭｇＳＯ４上で乾燥させ、濾過した。溶媒を減圧下で除去し、得られた濃縮物を、ヘキサンおよび酢酸エチルの勾配溶離を使用するＣｏｍｂｉＦｌａｓｈ  Ｒｆ  ４ｘシステムを介して精製した。精製した生成物を減圧下で濃縮して、白色固体を得た（収率：ｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭの場合８０％、ｏ（ＤＬＡ）６−ＧＥＭの場合６３％、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭの場合８７％、およびｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの場合７４％）。
2021520344.tif 000005
【００５２】
ステレオコンプレックスｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭおよびｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの形成および特性評価。示差走査熱量測定（ＤＳＣ）測定を、ＴＡ  Ｑ２０００示差走査熱量計を使用して、約５〜１０ｍｇの材料を含む圧着アルミニウムパンで実行した。サンプルを冷却し、５０ｍｌ／分のＮ２パージ下で１０Ｋ／分で加熱した。粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）パターンを、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄ８  Ａｄｖａｎｃｅ回折計（Ｂｒｕｋｅｒ，Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）を使用して、０．０２°のステップサイズおよび１秒の積分時間で、２から４０°２θまで室温で収集した。ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭおよびｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭのステレオコンプレックスを調製するために、等量のｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ（４ｍｇ）およびｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ（４ｍｇ）を最初に、ガラスバイアル中の１００μＬのアセトニトリルに溶解し、３０秒間撹拌した。次いで、この溶液をＤＳＣ基板またはシリコンウェーハ上に配置し、７０℃で１２時間真空乾燥して、固体を得た。
【００５３】
ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ、またはｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの調製および特性評価。ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ、またはｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭ負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルを、ｔｅｒｔ−ブタノール−水混合物から凍結乾燥して調製した（Ｆｏｕｒｎｉｅｒ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．Ｒｅｓ．，２００４，２１（６）：９６２−９６８を参照）。典型的な実験では、１．０ｍｇのｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭと、１．０ｍｇのｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭと、１０．０ｍｇまたは２０．０ｍｇのＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡとを、１．０ｍＬのｔｅｒｔ−ブタノールに６０℃で溶解し、続いて、激しく混合しながら、６０℃で予熱した再蒸留水１．０ｍＬを添加した。混合物をドライアイス／エタノール冷却浴で−７０℃で２時間凍結させた。次いで、凍結乾燥を、ＶｉｒＴｉｓ  ＡｄＶａｎｔａｇｅ  Ｐｒｏ凍結乾燥機（ＳＰ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇａｒｄｉｎｅｒ，ＮＹ）を使用して、実験全体を通して−２０℃の棚入口温度で１００μＢａｒで７２時間実行した。その後、凍結乾燥したケークを、１．０ｍＬのＭｉｌｌｉＱ水または０．９％の生理食塩水溶液で６０℃で再水和し、遠心分離し、０．２μｍのフィルターを使用して濾過した。上清中の薬物含有量を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって特性評価した。同様の方法を用いて、ｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭまたはｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭを負荷したＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルを調製した。
【００５４】
ｐＨ７．４のＣＨ３ＣＮ／ＰＢＳ混合物におけるステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭプロドラッグの変換。ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ（１．０ｍｇ／ｍＬ）とｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ（１．０ｍｇ／ｍＬ）との混合物を最初に、ＣＨ３ＣＮとＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）との１：１（ｖ／ｖ）混合物に溶解し、１．５ｍＬのエッペンドルフチューブに入れ、温度調整された水浴（ＧＣＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＩＬ）で３７℃でインキュベートした（Ｔａｍ，Ｙ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１６，１３８：８６７４−８６７７を参照）。１０μＬの溶液を所定の時点で取り出し、９０μＬのＣＨ３ＣＮで希釈後、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。同様に、ＣＨ３ＣＮとＰＢＳ（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）との１：１（ｖ／ｖ）混合物中のｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭまたはｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭの変換を、ＲＰ−ＨＰＬＣによって測定した。一次定数を、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭとｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭまたはｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭの混合物の分解速度について計算した。各実験を３回評価し、平均値と標準偏差で報告した。
【００５５】
ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの水中での安定性。ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルを凍結乾燥により調製し（２．０ｍｇ／ｍＬ）、ＭｉｌｌｉＱ水で再水和した。水中でのステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルの安定性を、室温で監視した。１０μＬの溶液を所定の時点で取り出し、９０μＬのＣＨ３ＣＮで希釈後、ＲＰ−ＨＰＬＣ分析を行った。
【００５６】
ラット血漿中のステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭとｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭとの混合物、およびＧＥＭの安定性。ラット血漿中のステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭとｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭとの混合物、およびＧＥＭの安定性を、ヘパリン化スプラーグドーリーラット血漿（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．，Ｎｏｖｉ，ＭＩ）を使用して決定した。凍結血漿サンプルを、使用前に３７℃で５分間インキュベートした。ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルまたはＧＥＭの原液を、水中で２．０ｍｇ／ｍＬに調製した。１００μＬのステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルまたはＧＥＭ水溶液を、９００μＬの血漿サンプルに添加し、最終濃度を０．２ｍｇ／ｍＬにした。ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭとｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの混合物については、ＤＭＳＯ中で４．０ｍｇ／ｍＬの原液を調製した。１０μＬのＤＭＳＯ中の混合物を、９９０μＬの血漿サンプルに添加し、最終濃度を０．０４ｍｇ／ｍＬにした。サンプルを、温度を調整した水浴（ＧＣＡ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，ＩＬ）内で３７℃でインキュベートした。所定の時間間隔（０、０．５、１、２、４、および２４時間）で、５０μＬの血漿サンプルを回収し、０．１％のギ酸を含有する１００μＬのアセトニトリルで希釈した。沈殿したサンプルを１３，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、得られた上清をＲＰ−ＨＰＬＣで分析した。
【００５７】
インビトロ放出試験。ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ、またはｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭ負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルを、ｐＨ７．４の１０ｍＭのＰＢＳ溶液で、０．５ｍｇ／ｍＬに希釈した。Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（商標）透析カセットとＭＷＣＯ  ２０Ｋ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、２．５ｍＬの希釈ミセル溶液を負荷した。３つの透析カセットを、３７℃のＣｏｒｎｉｎｇ  Ｈｏｔｐｌａｔｅ  Ｓｔｉｒｒｅｒ（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃ．，Ｃｏｒｎｉｎｇ，ＮＹ）上の４ＬのＰＢＳ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中に置いた。０、１、２、３、６、９、２４、４８、７２、１２０、１６８、２１６、３１２、および５０４時間の時点で、１００μＬのサンプルを透析カセットから回収し、カセットに１００μＬの新しいＰＢＳ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）を補充した。シンク条件を概算するために、２、６、２４、７２、および１６８時間で外部培地を４Ｌの新しい緩衝液に交換した。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセル中のステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ、またはｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭの薬物定量化を、ＲＰ−ＨＰＬＣで決定した。薬物放出の累積パーセントを計算し、半薬物放出を一次速度式に従って計算した。
【００５８】
インビトロ細胞傷害性試験。ＧＥＭ、または１５％の負荷でのステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルの、ヒトＡ５４９非小肺がん細胞およびＰＡＮＣ−１膵がん細胞に対する細胞傷害性を、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ（登録商標）細胞生存率アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）によって検討した。Ａ５４９細胞を、１，５００細胞／１００μＬ／ウェルの播種密度で９６ウェルプレートに播種し、ＲＰＭＩ  １６４０培地で培養し、またはＰＡＮＣ−１細胞を、５，０００細胞／１００μＬ／ウェルの播種密度で９６ウェルプレートに播種し、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で、３７℃で５％のＣＯ２インキュベータ内で２４時間培養した。ＰＢＳ溶液（１０ｍＭ、ｐＨ７．４）中の、ＧＥＭ、または１５％の負荷でのステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルを、ウェルに添加し、１〜１０，０００ｎＭの最終濃度を達成した。培地中の希釈ＰＢＳで培養した細胞を対照として使用した。薬物処理した細胞を、３７℃の５％のＣＯ２インキュベータ内に７２時間置いた。各ウェルの培地を吸引し、無血清ＲＰＭＩ  １６４０またはＤＭＥＭ中の２０％（ｖ／ｖ）のＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅ試薬１００μＬを添加し、５％のＣＯ２雰囲気中で、３７℃にて１．５時間インキュベートした。蛍光強度を、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｍ２プレートリーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ，ＣＡ）によって、それぞれ５６０ｎｍおよび５９０ｎｍで、励起および発光させて測定した。半最大阻害薬濃度（ＩＣ５０）を、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して決定した。
【００５９】
インビボ抗腫瘍効果試験。全ての動物実験は、実験動物の管理および使用に関する施設内およびＮＩＨガイダンス（ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ＮＩＨ  ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ）に従って、ウィスコンシン大学マディソン校の施設内動物の管理および使用委員会（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｉｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ−Ｍａｄｉｓｏｎ）によって承認されたプロトコルの下で行われた。ウィスコンシン大学マディソン校の医学部および公衆衛生部の実験動物資源から、６〜８週齢の雌の胸腺欠損ヌードマウス（各２０〜２５ｇ）を入手した。マウスは、水および食物に自由にアクセスできる換気されたケージに収容され、腫瘍細胞注射の前に１週間順応させた。Ａ５４９細胞（１００μＬの無血清ＲＰＭＩ  １６４０培地中、２×１０６細胞）を、トリプシン処理後にサブコンフルエントな培養物から採取し、各マウスの右側腹部に皮下注射した。腫瘍の体積が約２００〜４００ｍｍ３に達したとき、マウスを、ランダムに３つの処置群（ｎ＝３〜４／群）に分けた：１０ｍｇ／ｋｇでのＧＥＭ、１０ｍｇ／ｋｇのＧＥＭ相当量での５％負荷のステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセル、および生理食塩水対照。薬物を、尾静脈を介して、週３回投与した。体重および腫瘍体積を、試験の過程全体にわたって監視した。腫瘍の体積は、式：Ｖ＝（ａ×ｂ２）／２を使用して計算し、式中、Ｖは腫瘍の体積であり、ａは腫瘍の長さであり、ｂは腫瘍の幅である。
【００６０】
統計分析。５％の有意水準でのスチューデントｔ検定を、統計分析に使用した。全てのデータ分析は、Ｗｉｎｄｏｗｓ用のＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍバージョン５．００（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）を使用して実行した。
【００６１】
実施例２：ｏ（ＬＬＡ）ｎ−ＧＥＭ、ｏ（ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭ、またはステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭの合成
単分散系ｏ（ＬＬＡ）ｎまたはｏ（ＤＬＡ）ｎを、開始剤としてベンジルアルコールおよび触媒としてスズ（ＩＩ）−エチルヘキサノエート（Ｓｎ（Ｏｃｔ）２）を使用して、環状Ｌ−ラクチドまたは環状Ｄ−ラクチドのいずれかの開環重合（ＲＯＰ）、それに続く分別および直接水素化によって合成した。４−（Ｎ）位置でのｏ（ＬＬＡ）ｎまたはｏ（ＤＬＡ）ｎと、ＧＥＭとのアミド結合によるカップリングは、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣＩ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）によって媒介され、ｏ（ＬＬＡ）ｎ−ＧＥＭ、およびｏ（ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭプロドラッグ（ｎ＝６または１０）をもたらした（図２）。化学構造は、１Ｈ  ＮＭＲ分光法および電子噴霧質量分析によって裏付けられた。
【００６２】
ｏ（ＬＬＡ）ｎ−ＧＥＭおよびｏ（ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭのステレオコンプレックス形成を調査するために、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）に溶解する前に、両方のプロドラッグをガラスバイアル中で同じ質量比で混合した。次に、得られた溶液を真空オーブン内い７０℃で１２時間入れて、溶媒を完全に除去した。粉末Ｘ線回折（ＰＸＲＤ）（図３Ａならびに３Ｃ）および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）（図３Ｂならびに３Ｄ）を使用して、プロドラッグの各鏡像異性体型と比較した場合の、異なる回折パターンおよび融解転移（Ｔｍ）の特定により、結晶性ステレオコンプレックスの形成を確認した。ｎ＝１０のとき、広い回折パターンおよびＤＳＣ融解吸熱がないことから明らかなように、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭおよびｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭは、両方とも非晶質である。対照的に、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭとｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの１：１混合物は、１２．０°、２０．８°、および２３．９°に３つの明確な結晶性ピークを示し、これは、結晶性ＰＬＡステレオコンプレックスの形成に特有の回折シグネチャである（Ｉｋａｄａ，Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，１９８７，２０：９０４−９０６を参照）。結晶性ステレオコンプレックスの存在は、１１７．８℃の融解吸熱によってさらに証明された。興味深いことに、広い回折ピークおよび融解吸熱がないことから明らかなように、ｎ＝６の場合、ｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭとｏ（ＤＬＡ）６−ＧＥＭとの等しい質量比をブレンドした後、結晶性ステレオコンプレックスを形成することはできない（図３Ｃおよび３Ｄ）。
【００６３】
実施例３：ｏ（ＬＬＡ）ｎ−ＧＥＭ、ｏ（ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭ、またはステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの特性評価
ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルへのｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭ、ｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ、またはステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの組み込みは、ｔｅｒｔ−ブタノール−水混合物からの凍結乾燥によって達成された。表１に示すように、ｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭとｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭとの両方がＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡに成功裏に組み込まれ、平均流体力学的直径が約３０ｎｍで約７％の薬物負荷を含むミセルを形成した。
【００６４】
（表１）ｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭとｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ、およびステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ負荷ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの物理化学的特性評価（平均±ＳＤ、ｎ＝３）
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ａ）１．０ｍｇのｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭまたはｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭおよび１０．０ｍｇのＰＥＧ４０００−ｂ−ＰＬＡ２２００を使用した。
ｂ）１．０ｍｇのｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ、１．０ｍｇのｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭおよび２０．０ｍｇのＰＥＧ４０００−ｂ−ＰＬＡ２２００を使用した。
ｃ）１．０ｍｇのｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭ、１．０ｍｇのｏ（ＤＬＡ）１０−ＧＥＭおよび１０．０ｍｇのＰＥＧ４０００−ｂ−ＰＬＡ２２００を使用した。
ｄ）配合物を、２５℃でＭｉｌｌｉＱ水中に分散させた。
【００６５】
理論に束縛されることを望むものではないが、プロ部分としてｏ（ＬＬＡ）ｎをＧＥＭに導入すると、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのＰＬＡコアにおけるＧＥＭの互換性を高めることができると考えられている。しかしながら、ミセル内のｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭまたはｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭの負荷は、物理的安定性の向上を示さず、それぞれ２４時間未満または１時間未満で沈殿した。対照的に、ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭを含有するＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルは、優れた物理的安定性を示し、粒径に実質的な変化はなく、薬物沈殿は１６８時間を超えて生じなかった。興味深いことに、５．４％および１５．３％のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルにステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭを組み込むと、流体力学的直径が、それらの非複合対化対応物と比べて、それぞれ３０ｎｍから約１４０ｎｍおよび約２００ｎｍに増加した。
【００６６】
ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルの形態を、原子間力顕微鏡（ＡＦＭ）を使用してさらに検討した。図４Ａおよび４Ｂは、ステレオコンプレックス化ミセルの予想外の細長い構造を示している。ジブロックコポリマーを含有する他のミセルと比べて、この径の明確な違いは、ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭプロドラッグが、コポリマーのコアブロック間の直接ステレオコンプレックス化の代わりに、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのコア内に負荷されることである。
【００６７】
図５は、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルからのｏ（ＬＬＡ）６−ＧＥＭおよびｏ（ＬＬＡ）１０−ＧＥＭの放出が、インビトロで比較的速く、ｔ１／２が、それぞれ約０．８時間および約４時間であることを示している。これは、ＧＥＭの親水性に起因し、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルの疎水性ミセルコアに対する薬物の分配の減少をもたらし、したがって薬物放出が速くなる。対照的に、ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭは、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルから５．４％および１５．３％で徐々に放出され、どちらも最初の３日間の約６０時間でｔ１／２となり、その後３週間を通してより遅い放出速度となる（図５）。これらのデータは、ステレオコンプレックスｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭが、優れた物理的安定性および持続的な薬物放出を示す、予期しない円筒形態のＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに安定して負荷されたことを示している。
【００６８】
オリゴ乳酸コンジュゲートの分解は、乳酸ラクトイルを段階的な鎖末端切断で切断する、アセトニトリルとリン酸緩衝生理食塩水との混合液（１：１ｖ／ｖのＣＨ３ＣＮ／ＰＢＳ）におけるｏ（ＬＡ）ｎの最後から２番目のエステル結合の末端ヒドロキシル基の分子内バックバイティング反応によって引き起こされる。ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭのバックバイティング反応速度は、ＰＬＡステレオコンプレックスの相互作用が強いために遅くなると予想されていたが、ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭ（λｍａｘ＝３００ｎｍ）の変換は、１：１ｖ／ｖのＣＨ３ＣＮ／ＰＢＳでの同様なバックバイティング反応速度を有することが見出され、ｏ（ＬＡ）８−ＰＴＸの約７．３時間に対して約６．６時間のｔ１／２であった（図６Ａ）（Ｔａｍ，Ｙ．Ｔ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１６，１３８：８６７４−８６７７を参照）。対照的に、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルにおけるｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの分解は著しく遅く、約６３０時間でのｔ１／２であった（図６Ｂ）。ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルにおけるｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの優れた安定性は、バックバイティングを阻害する可能性がある、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルのＰＬＡコアにおけるｏ（ＬＬＡ）１０とｏ（ＤＬＡ）１０プロ部分との間の安定したステレオコンプレックス化に原因し得る。しかしながら、ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭをＣＨ３ＣＮ／ＰＢＳ混合物に溶解した場合、ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの完全な溶解化、したがってバックバイティング変換が続くために、ステレオコンプレックス化は形成されなかった。
【００６９】
ＧＥＭはシチジンデアミナーゼのような代謝酵素による血漿中の脱アミノ化の影響を受けやすく、薬理学的に不活性になる。理論に束縛されることを望むものではないが、ＧＥＭの４−（Ｎ）の位置にプロ部分の結合を導入すると、脱アミノ化部位が不明瞭になり、したがってＧＥＭの代謝安定性が向上すると考えられている。その結果、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルにおける、ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの代謝安定性、およびｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭのＧＥＭとの比較を、ラットの血漿において検討した。図７Ａは、ＧＥＭが血漿中で安定ではなく、３７℃での血漿中で２４時間のインキュベーション後に、５０％未満の無傷のＧＥＭが検出された。驚くべきことに、ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの分解は血漿中で非常に急速であり、最初のサンプリング時点で分解種と約２０％ＧＥＭのランダムな分布を生成し、バックバイティングに加えて、壊れやすいアミド結合およびエステラーゼの寄与を示唆した（図７Ｂ）。ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭがＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルに負荷された場合、ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭはステレオコンプレックス化により追加の安定性を獲得し、ＧＥＭを２４時間にわたって血漿中の唯一の主要な分解種としてゆっくり生成した（図７Ｃ）。特に、分解中間体は試験全体を通して生成されなかったことから、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルにおけるｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭの安定したステレオコンプレックス化は、ｏ（ＬＬＡ）ｎおよびｏ（ＤＬＡ）ｎのエステラーゼ分解を潜在的に防止することができることを示している。
【００７０】
実施例４：ステレオコンプレックス化ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）ｎ−ＧＥＭミセルのインビトロおよびインビボ抗がん活性
ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルの生物活性をインビトロ細胞生存率アッセイで評価し、ＧＥＭと比較して半最大阻害濃度（ＩＣ５０）をテストした。ＧＥＭが非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）および膵がんのための第一選択治療として使用されたため、ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｂｌｕｅアッセイを使用して、ヒトＡ５４９  ＮＳＣＬＣ細胞株およびＰＡＮＣ−１膵がん細胞株を検討した。ＧＥＭは、それぞれ約１．１μＭおよび約９．２μＭで、Ａ５４９（図８Ａ）およびＰＡＮＣ−１（図８Ｂ）細胞に対して比較的低いＩＣ５０値を有した。対照的に、ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルは、７２時間のインキュベーション後、Ａ５４９（図８Ａ）およびＰＡＮＣ−１（図８Ｂ）細胞でＧＥＭよりも細胞傷害性が低く、ＩＣ５０値は、それぞれ、約１２．７μＭおよび約９７．９μＭであった。インビトロ細胞傷害性データは、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルにおけるｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭステレオコンプレックスの高い安定性および細胞傷害性の低下につながるミセルからの著しく遅いプロドラッグ放出のさらなる裏付けとなる証拠を提供した。
【００７１】
インビボでのｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルの抗腫瘍効果を検証するために、皮下Ａ５４９異種移植片を担持するマウスを通常の生理食塩水、ＧＥＭ、またはＧＥＭの１０ｍｇ／ｋｇに相当するｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルで、週３回のＩＶ注射により処置した。特に、ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルの投与は、ＧＥＭまたは生理食塩水対照と比較して、有意な腫瘍増殖阻害を示した（図９Ａ）。興味深いことに、ＧＥＭで処置されたマウスの腫瘍は、生理食塩水対照よりも速い速度で増殖し、ＧＥＭが有効ではなかったことを示した（図９Ａ）。ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルの最初の投与後に体重のわずかな減少が記録されたが、全ての処置群間で有意差は観察されなかった（図９Ｂ）。１０ｍｇ／ｋｇでのＧＥＭの送達は、マウスの皮下腫瘍に対しては一般的に無効である。一般に、ＧＥＭの代謝不安定性に起因して、皮下腫瘍を有するマウスの腫瘍増殖を阻害するには、１００ｍｇ／ｋｇのＧＥＭが必要である。マウスのスクアレノイルＧＥＭナノアセンブリの報告された最大耐量（ＭＴＤ）（２０ｍｇ／ｋｇ）は、ＧＥＭ（１００ｍｇ／ｋｇ）の５分の１であった。この試験のインビボでの有効性の結果は、これらの所見によって裏付けられる。比較的低用量のＧＥＭ（１０ｍｇ／ｋｇ）が使用されたが、ｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭミセルは、インビボで強力な抗腫瘍効果を示し、ＰＥＧ−ｂ−ＰＬＡミセルにおける安定したｏ（Ｌ＋ＤＬＡ）１０−ＧＥＭステレオコンプレックス化が、薬物作用のためにＧＥＭを腫瘍部位に効果的に送達することができることを示唆している。
【００７２】
等価物
ある特定の実施形態を例示かつ説明したが、当業者は、前述の明細書を読んだ後、本明細書に記載の本技術のコンジュゲートおよびミセルもしくはその誘導体、プロドラッグ、または薬学的組成物に変更、等価物の置換、および他の種類の変更をもたらすことができる。上記の各態様および実施形態は、他の態様および実施形態のいずれかまたは全てに関して開示されたそのような変形形態または態様もそこに含むかまたは組み込むことができる。
【００７３】
本技術はまた、本技術の個別の態様の単一の例示として意図される、本明細書に記載の特定の態様に関して限定されるべきではない。当業者には明らかであるように、その意図および範囲から逸脱することなく、本技術の多くの変更および変形形態が行われ得る。本技術の範囲内の機能的に同等の方法は、本明細書に列挙されたものに加えて、前述の説明から当業者に明らかとなる。このような修正および変形は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。本技術が、特定の方法、コンジュゲート、試薬、化合物、組成物、標識化合物、または生物系に限定されず、これらは当然のことながら変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用する用語は、単に特定の態様を説明するためのものであり、限定することを意図するものではないことも理解されたい。したがって、本明細書は、添付の特許請求の範囲、その中の定義、およびそれらのいずれの等価物によってのみ示される本技術の広さ、範囲、および意図によってのみ例示とみなされることが意図される。
【００７４】
本明細書で実例として説明される実施形態は、本明細書に具体的には開示されていないいかなる要素以上の要素、制限以上の制限の不在下でも好適に実施され得る。したがって、例えば、「を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「を含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「を含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」などの用語は、広範にかつ制限なしで読まれることになっている。さらに、本明細書で採用される用語および表現は、説明の用語として使用されており、制限の用語として使用されてはおらず、このような用語および表現の使用において、示されおよび説明される特徴またはその部分のいかなる等価物も除外することを意図するものではなく、特許請求された技術の範囲内で種々の変更が可能であることが認識される。さらに、「から本質的になる」という語句は、具体的に引用される複数の要素、および特許請求される技術の基本的かつ新規の特徴に実質的に影響しない追加の要素を含むよう理解されることになっている。「からなる」という語句は、指定されていないいかなる要素も除外する。
【００７５】
さらに、本開示の特徴または態様がマーカッシュグループに関して記載されている場合、当業者は、本開示がまた、マーカッシュグループのメンバーの任意の個別のメンバーまたはサブグループの観点から記載されることを認識するであろう。一般的な開示に含まれるより狭い種および亜属のグループ分けの各々も、本発明の一部を形成する。これには、削除された材料が本明細書に具体的に列挙されているかどうかに関係なく、属から任意の主題を除去する条件または否定的な制限を伴う本発明の一般的な説明が含まれる。
【００７６】
当業者には理解されるように、いずれかのおよび全ての目的のために、特に書面による説明を提供する観点から、本明細書に開示される全ての範囲は、いずれかのおよび全ての可能な部分範囲およびその部分範囲の組み合わせをも包含する。いかなる列挙された範囲も、少なくとも等しい半分、１／３、１／４、１／５、１／１０などへと分解される同じ範囲を十分に説明および可能にするものとして容易に認識することができる。非限定例として、本明細書で考察される各範囲は、下位の１／３、中間の１／３、および上位の１／３などへと容易に分解されることができる。また、当業者によって理解されることになっているように、「最高」、「少なくとも」、「より大きな」、「より小さな」、およびこれらに類するものなどの言葉は全て、列挙された数を含み、先に考察した下位範囲へと後に分解することができる範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は各々の個別の部材を含む。
【００７７】
全ての刊行物、特許出願、発行された特許、および本明細書で参照される他の文書（例えば、ジャーナル、記事、および／または教科書）は、各々の個別の刊行物、特許出願、発行された特許、または他の文書が、その全体が参照によって組み込まれるように具体的かつ個別的に示されるように、参照によって本明細書に組み込まれる。参照によって組み込まれる本文に含まれる定義は、本開示における定義と矛盾する範囲で除外される。
【００７８】
他の実施形態は、そのような特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲と共に、以下の特許請求の範囲に記載される。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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