(57)【要約】  本開示は、3-ヒドロキシプロピオン酸又はその塩を産生するための、水溶液(例えば、水性ブロス)から3-ヒドロキシプロピオン酸を除去するための、及びそれを用いて、様々な化学物質を作製するための方法及び装置を提供する。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
小分子によって誘導可能である第一のプロモーター、第二のプロモーター、3-HP、3-HPの塩、又はB12の合成に関与するタンパク質をコードする第一の遺伝子、修飾されたUTR、及び天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質のN-末端由来の最大20個のアミノ酸をコードする天然の配列を含む発現システムであって、該天然の配列が、該修飾されたUTRの3'-末端に機能的に連結され、かつ該第一の遺伝子の5'-末端に機能的に連結されており、かつ該第一のプロモーターと第二のプロモーターが該修飾されたUTRの上流でタンデムに機能的に連結されている、前記発現システム。
【請求項２】
第三のプロモーター;及び前記第一の遺伝子の発現を調節するように設定された転写調節因子をコードする第二の遺伝子をさらに含み、ここで、該第三のプロモーターが該第二の遺伝子に機能的に連結されている、請求項1記載の発現システム。
【請求項３】
前記第二のプロモーターが前記小分子によって誘導可能である、請求項1又は2記載の発現システム。
【請求項４】
前記天然の配列が前記第一の遺伝子の5'-末端に機能的に連結されて、融合遺伝子を規定し、前記第二のプロモーターが前記天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質の天然のプロモーターであり、かつ該第二のプロモーターが該融合遺伝子の5'-末端に機能的に連結されている、請求項1〜3のいずれか一項記載の発現システム。
【請求項５】
前記第一のプロモーターが前記第二のプロモーターの5'-末端に機能的に連結されており、該第二のプロモーターが前記修飾されたUTRの5'-末端に機能的に連結されており、かつ該修飾されたUTRが前記融合遺伝子の5'-末端に機能的に連結されている、請求項1〜4のいずれか一項記載の発現システム。
【請求項６】
第一及び第二のプロモーターを含み、ここで、該第一のプロモーターが誘導性プロモーターであり、かつ小分子によって誘導可能であり;該第一及び第二のプロモーターが第一の遺伝子に機能的に連結されており;かつ該第一の遺伝子が、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、3-HPの塩、又は補酵素B12の合成に関与するタンパク質をコードする、核酸。
【請求項７】
前記第一の遺伝子が3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)の合成に関与するタンパク質をコードし、かつグリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼリアクティバーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、請求項6記載の核酸。
【請求項８】
前記第一の遺伝子が、dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、gdrB、及びkgsAからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子を含む、請求項6又は7記載の核酸。
【請求項９】
前記第一の遺伝子が、dhaB1遺伝子、dhaB2遺伝子、dhaB3遺伝子、gdrA遺伝子、及びgdrB遺伝子を含む、請求項6〜8のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１０】
前記第一の遺伝子がdhaB1であり、かつ該配列が配列番号1と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜8のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１１】
前記第一の遺伝子がdhaB2であり、かつ該配列が配列番号2と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜8のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１２】
前記第一の遺伝子がdhaB3であり、かつ該配列が配列番号3と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜8のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１３】
前記第一の遺伝子がgdrAであり、かつ該配列が配列番号4と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜8のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１４】
前記第一の遺伝子がgrdBであり、かつ該配列が配列番号5と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜8のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１５】
前記第一の遺伝子がアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、請求項7記載の核酸。
【請求項１６】
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼがkgsAである、請求項15記載の核酸。
【請求項１７】
kgsAが配列番号6と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項16記載の核酸。
【請求項１８】
前記小分子が酸又はアルコールである、請求項6〜17のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１９】
前記小分子酸又はアルコールが、L-乳酸(LAC)、酢酸(AcOH)、プロピオン酸(PA)、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、3-ヒドロキシブチレート(3-HB)、1,3-プロパンジオール(1,3-PDO)、2,3-ブタンジオール(2,3-BDO)、L-バリン(L-val)、及び3-ヒドロキシイソブチレート(3-HIB)からなる群から選択される、請求項18記載の核酸。
【請求項２０】
前記小分子酸又はアルコールが、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、3-ヒドロキシブチレート(3-HB)、L-バリン(L-val)、及び3-ヒドロキシイソブチレート(3-HIB)からなる群から選択される、請求項19記載の核酸。
【請求項２１】
前記小分子が3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)である、請求項20記載の核酸。
【請求項２２】
前記第二のプロモーターが前記第一のプロモーターの3'-末端に機能的に連結されており、かつ前記第一の遺伝子が該第二のプロモーターの機能的に下流にある、請求項6〜21のいずれか一項記載の核酸。
【請求項２３】
前記核酸が配列番号65と少なくとも85％同一である配列を含む、請求項6〜22のいずれか一項記載の核酸。
【請求項２４】
前記核酸が配列番号65を含む、請求項6〜22のいずれか一項記載の核酸。
【請求項２５】
前記第一のプロモーターが前記第二のプロモーターの3'-末端に機能的に連結されており、かつ前記第一の遺伝子が該第二のプロモーターの機能的に下流にある、請求項6〜21のいずれか一項記載の核酸。
【請求項２６】
前記第二のプロモーターが構成的プロモーターである、請求項6〜25のいずれか一項記載の核酸。
【請求項２７】
前記第二のプロモーターが第二の誘導性プロモーターである、請求項6〜25のいずれか一項記載の核酸。
【請求項２８】
前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターの間の遺伝子間スペースがターミネーター配列を含まない、請求項6〜27のいずれか一項記載の核酸。
【請求項２９】
前記第一のプロモーター及び前記第二のプロモーターが前記第一の遺伝子の発現を調節する、請求項6〜28のいずれか一項記載の核酸。
【請求項３０】
前記第一のプロモーターが、PmmsAプロモーター、PhbdH-1プロモーター、PhbdH-4プロモーター、又はPhpdHプロモーターに由来する、請求項6〜28のいずれか一項記載の核酸。
【請求項３１】
前記第一のプロモーターが配列番号14(PmmsAプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜28のいずれか一項記載の核酸。
【請求項３２】
前記第一のプロモーターが配列番号13(PhbdH-1プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜28のいずれか一項記載の核酸。
【請求項３３】
前記第一のプロモーターが配列番号11(PhbdH-4プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜28のいずれか一項記載の核酸。
【請求項３４】
前記第一のプロモーターが配列番号12(PhpdHプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜28のいずれか一項記載の核酸。
【請求項３５】
前記第一のプロモーターが、配列番号11;配列番号12;配列番号13;及び配列番号14からなる群から選択される配列を含む、請求項30記載の核酸。
【請求項３６】
前記第一のプロモーターがPmmsAプロモーターを含み、かつ前記核酸が該PmmsAプロモーターの5'-末端に機能的に連結されたオペレーター部位をさらに含む、請求項6〜35のいずれか一項記載の核酸。
【請求項３７】
配列番号15(PmmsA配列Δ2、図4)と95％同一である配列を含む、請求項36記載の核酸。
【請求項３８】
配列番号16(MmsAオペレーターのO1)と95％同一である配列及び配列番号17(MmsAオペレーターのO2)と95％同一である配列を含む、請求項36記載の核酸。
【請求項３９】
配列番号18(PmmsA及びオペレーター、図3)と95％同一である配列を含む、請求項36記載の核酸。
【請求項４０】
配列番号15、18、19(PmmsA2a)、20(PmmsA2b)、及び21(PmmsA2ab)からなる群から選択される配列を含む、請求項36記載の核酸。
【請求項４１】
前記第二のプロモーターが、PmmsAプロモーター、PhbdH-1プロモーター、PhbdH-4プロモーター、PhpdHプロモーター、又はPzwfプロモーターに由来する、請求項6〜40のいずれか一項記載の核酸。
【請求項４２】
前記第二のプロモーターが配列番号11(PhbdH-4プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜40のいずれか一項記載の核酸。
【請求項４３】
前記第二のプロモーターが配列番号12(PhpdHプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜40のいずれか一項記載の核酸。
【請求項４４】
前記第二のプロモーターが配列番号14(PmmsAプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜40のいずれか一項記載の核酸。
【請求項４５】
前記第二のプロモーターが配列番号13(PhbdH-1プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜40のいずれか一項記載の核酸。
【請求項４６】
前記第二のプロモーターが配列番号7(Pzwf)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜40のいずれか一項記載の核酸。
【請求項４７】
前記第二のプロモーターが配列番号8(Pzwf-1)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜40のいずれか一項記載の核酸。
【請求項４８】
前記第二のプロモーターが配列番号9(Pzwf-7)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜40のいずれか一項記載の核酸。
【請求項４９】
前記第二のプロモーターが配列番号62(より短いPzwf-7)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜40のいずれか一項記載の核酸。
【請求項５０】
前記第二のプロモーターが配列番号10(Pzwf-12)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜40のいずれか一項記載の核酸。
【請求項５１】
前記第二のプロモーターが、配列番号7、8、9、10、11、12、13、14、52〜60、61、62、及び63(Pzwfプロモーター及び他のプロモーター)からなる群から選択される配列を含む、請求項6〜40のいずれか一項記載の核酸。
【請求項５２】
前記第一のプロモーターがPmmsAプロモーターを含み、かつ前記第二のプロモーターがPhbdH-4プロモーターを含む、請求項6〜29のいずれか一項記載の核酸。
【請求項５３】
前記第一のプロモーターが配列番号14(PmmsAプロモーター配列)と少なくとも95％同一である配列を含み、かつ前記第二のプロモーターが配列番号11(PhbdH-4プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜29のいずれか一項記載の核酸。
【請求項５４】
前記第一のプロモーターがPhbdH-1プロモーターを含み、かつ前記第二のプロモーターがPhpdHプロモーターを含む、請求項6〜29のいずれか一項記載の核酸。
【請求項５５】
前記第一のプロモーターが配列番号13(PhbdH-1プロモーター配列)と少なくとも95％同一である配列を含み、かつ前記第二のプロモーターが配列番号12(PhpdHプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項6〜29のいずれか一項記載の核酸。
【請求項５６】
前記第二のプロモーターがPhbdHプロモーターを含み、かつ前記核酸が該PhbdHプロモーターのN-末端に機能的に連結されたオペレーター部位をさらに含む、請求項6〜29のいずれか一項記載の核酸。
【請求項５７】
前記オペレーター部位が、配列番号:RBS-1、RBS-2、ABS-1、ABS-2、及びABS-3と少なくとも95％同一である1以上の配列を含む、請求項56記載の核酸。
【請求項５８】
前記オペレーター部位が配列番号:RBS-1部位及びABS-2と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項57記載の核酸。
【請求項５９】
前記オペレーター部位が配列番号:RBS-1部位及びABS-2を含む、請求項58記載の核酸。
【請求項６０】
前記核酸が前記第一の遺伝子の発現を調節する転写調節因子をコードする遺伝子をさらに含む、請求項6〜59のいずれか一項記載の核酸。
【請求項６１】
前記転写調節因子が前記第一又は第二のプロモーターに結合する、請求項60記載の核酸。
【請求項６２】
前記転写調節因子がLysR型転写調節因子(LTTR)である、請求項60又は61記載の核酸。
【請求項６３】
前記転写調節因子がMmsR又はHpdRである、請求項62記載の核酸。
【請求項６４】
前記転写調節因子がMmsRである、請求項63記載の核酸。
【請求項６５】
前記転写調節因子が前記第一のプロモーターに結合する、請求項61記載の核酸。
【請求項６６】
前記転写調節因子がmmsRタンパク質に由来し、かつ前記第一のプロモーターがPmmsAプロモーターに由来する、請求項65記載の核酸。
【請求項６７】
前記転写調節因子がmmsRタンパク質を含み、かつ前記第一のプロモーターがPmmsAプロモーターを含む、請求項65記載の核酸。
【請求項６８】
オペレーター部位をさらに含み、ここで、前記MmsRタンパク質が該オペレーター部位に結合する、請求項66記載の核酸。
【請求項６９】
配列番号19(PmmsA2a)と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項68記載の核酸。
【請求項７０】
配列番号19〜21(PmmsA2a、A2b、A2ab)からなる群から選択される配列を含む、請求項68記載の核酸。
【請求項７１】
前記転写調節因子が前記第二のプロモーターに結合する、請求項60記載の核酸。
【請求項７２】
前記第二のプロモーターが構成的プロモーターである、請求項71記載の核酸。
【請求項７３】
前記転写調節因子がHpdRタンパク質であり、かつ前記第二のプロモーターがhpdHプロモーターに由来する、請求項71記載の核酸。
【請求項７４】
前記第二のプロモーターが配列番号12のPhpdHの配列と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項73記載の核酸。
【請求項７５】
前記転写調節因子が前記第一のプロモーターに結合し、かつ前記小分子の存在下で該第一のプロモーターに対する増強された結合を有する、請求項60記載の核酸。
【請求項７６】
前記転写調節因子が前記第二のプロモーターに結合し、かつ前記小分子の存在下で該第二のプロモーターに対する増強された結合を有する、請求項60記載の核酸。
【請求項７７】
前記転写調節因子が自己調節性である、請求項60記載の核酸。
【請求項７８】
前記第一の転写調節因子をコードする遺伝子に機能的に連結されている第三のプロモーターをさらに含む、請求項60記載の核酸。
【請求項７９】
前記第三のプロモーターが配列番号7〜10及び52〜63からなる群から選択される配列と95％同一である配列を含む、請求項78記載の核酸。
【請求項８０】
前記第二の構成的プロモーターが、配列番号9、10、57〜60、62、及び63からなる群から選択され;
前記転写調節因子がMmsRタンパク質を含み;かつ
前記第一のプロモーターがPmmsAを含む:
請求項78記載の核酸。
【請求項８１】
前記第二の構成的プロモーターが、配列番号9、10、57〜60、62、及び63からなる群から選択され;
前記転写調節因子がHpdRタンパク質を含み;かつ
前記第一のプロモーターがPhbdHを含む、
請求項78記載の核酸。
【請求項８２】
前記第三のプロモーターが配列番号10を含む、請求項80又は81記載の核酸。
【請求項８３】
前記第三のプロモーターが配列番号62を含む、請求項80又は81記載の核酸。
【請求項８４】
前記第一の遺伝子が該遺伝子の修飾された5'UTRを含む、請求項6〜83のいずれか一項記載の核酸。
【請求項８５】
前記第一の遺伝子が配列番号22〜28及び64(UTR 0〜6)からなる群から選択される配列を含む、請求項84記載の核酸。
【請求項８６】
前記5'UTRが配列番号28(UTR-6)を含む、請求項85記載の核酸。
【請求項８７】
前記第一の遺伝子がkgsAをコードする遺伝子を含み、かつ前記5'UTRが配列番号28(UTR-6)を含む、請求項84記載の核酸。
【請求項８８】
前記第一の遺伝子の5'末端の少なくとも10個のコドンがシュードモナス・デニトリフィカンスにおける翻訳のために最適化されている、請求項6〜87のいずれか一項記載の核酸。
【請求項８９】
前記第一の遺伝子の5'末端の最大10個のコドンがシュードモナス・デニトリフィカンスにおける翻訳のために最適化されている、請求項6〜88のいずれか一項記載の核酸。
【請求項９０】
コドン最適化が:
天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする遺伝子における各々のアミノ酸のコドン頻度を測定すること;
該天然のタンパク質のコドン頻度を用いて、前記第一の遺伝子の5'-末端の10個のコドンを最適化された10個のコドンと交換すること(ここで、該最適化された10個のコドンの各々のアミノ酸に対するコドンは、該天然のタンパク質のコドン頻度と同じ頻度で存在する)
を含む、請求項88又は89記載の核酸。
【請求項９１】
前記最適化された第二の10個のコドン中の各々のアミノ酸のコドン頻度が0よりも大きい、請求項90記載の核酸。
【請求項９２】
前記コドン頻度が前記天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする遺伝子の5'末端の10個のコドン中の各々のアミノ酸について測定される、請求項90記載の核酸。
【請求項９３】
前記核酸が、配列番号29、30、及び31(Opt1〜3)からなる群から選択される配列と95％同一である配列を含む、請求項88記載の核酸。
【請求項９４】
前記第一の遺伝子がkgsAをコードする遺伝子を含み、かつ配列番号29〜31からなる群から選択される配列を含む、請求項6〜93のいずれか一項記載の核酸。
【請求項９５】
前記第一の遺伝子が、その5'-末端で、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする第二の遺伝子の5'末端に由来する最大20個のアミノ酸をコードする配列に融合されており、それにより、融合遺伝子を生み出す、請求項6〜93のいずれか一項記載の核酸。
【請求項９６】
前記融合遺伝子のmRNAが前記第一の遺伝子のみのmRNAよりも高い安定性を有する、請求項95記載の核酸。
【請求項９７】
前記融合遺伝子が、前記第一の遺伝子のみと比較したとき、遺伝子翻訳を増大させる、請求項95記載の核酸。
【請求項９８】
前記融合遺伝子のmRNAが前記第一の遺伝子のみのmRNAよりもリボヌクレアーゼ分解に対して抵抗性が大きい、請求項95記載の核酸。
【請求項９９】
前記融合遺伝子が前記第一の遺伝子のみと比較して遺伝子翻訳を増大させる、請求項95記載の核酸。
【請求項１００】
前記第一の遺伝子が、その5'-末端で、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする第二の遺伝子の5'末端に由来する最大20個(5個、10個、15個、又は20個)のアミノ酸をコードする配列に融合されており、それにより、融合遺伝子を生み出し、かつ前記第二のプロモーターが該第二の遺伝子の天然のプロモーターに由来する、請求項6〜29のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１０１】
前記第二のプロモーターが前記PmmsAプロモーターに由来し、かつ前記融合遺伝子が、天然のMmsAタンパク質のN-末端の少なくとも5個、10個、15個、又は20個のアミノ酸をコードする配列を含む、請求項100記載の核酸。
【請求項１０２】
前記第二のプロモーターが前記PmmsAプロモーターを含み、かつ前記融合遺伝子が天然のMmsA遺伝子のN-末端由来の5以上のアミノ酸をコードする配列を含み、かつ該融合遺伝子が該PmmsAプロモーターの3'末端に機能的に連結されている、請求項6〜29のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１０３】
前記核酸が配列番号32〜35からなる群から選択される配列を含む、請求項102記載の核酸。
【請求項１０４】
前記第一の遺伝子が、その5'-末端で、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスMmsAタンパク質のN-末端をコードする配列に由来する最大20個(5個、10個、15個、又は20個)のアミノ酸をコードする配列に融合されている、請求項6〜29のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１０５】
配列番号32〜35(Pcm-mmsA(5)(10)(15)(20))からなる群から配列を含む、請求項104記載の核酸。
【請求項１０６】
前記第一の遺伝子がビタミンB12の合成に関与するタンパク質をコードする、請求項6〜29のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１０７】
前記第一の遺伝子が、cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM、及びcobVからなる群から選択される遺伝子を含む、請求項106記載の核酸。
【請求項１０８】
前記第一の遺伝子がbgpMを含む、請求項107記載の核酸。
【請求項１０９】
前記第一の遺伝子が、P.デニトリフカンス;緑膿菌; P.エントモフィラ; P.プチダ; P.シリンガエ; P.フルオレセンス; P.メンドシナ;及びP.スタッツェリからなる群から選択されるシュードモナス属種に由来する、請求項106記載の核酸。
【請求項１１０】
補酵素B12の合成に関与するタンパク質をコードする第一の遺伝子に機能的に連結された第一のプロモーターを含む核酸。
【請求項１１１】
前記第一のプロモーターが構成的プロモーターである、請求項110記載の核酸。
【請求項１１２】
前記核酸が配列番号7〜10及び52〜63から選択される配列を含む、請求項110又は111記載の核酸。
【請求項１１３】
前記第一の遺伝子が、cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM、及びcobVからなる群から選択される1以上の遺伝子を含む、請求項110又は111記載の核酸。
【請求項１１４】
前記第一の遺伝子が、P.デニトリフカンス;緑膿菌; P.エントモフィラ; P.プチダ; P.シリンガエ; P.フルオレセンス; P.メンドシナ;及びP.スタッツェリからなる群から選択されるシュードモナス属種由来のものである、請求項110又は111記載の核酸。
【請求項１１５】
前記第一のプロモーターに機能的に連結された第二のプロモーターをさらに含む、請求項110〜114のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１１６】
前記第一及び前記第二のプロモーターが前記第一の遺伝子の発現を調節する、請求項115記載の核酸。
【請求項１１７】
前記第一のプロモーターが前記第一の遺伝子の天然のプロモーターではない、請求項110〜116のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１１８】
cobG遺伝子、Peddプロモーター、PsucAプロモーター、及びcobL遺伝子を含み;ここで、該Peddプロモーターが該cobG遺伝子及び該PsucAプロモーターに機能的に連結されており、かつ該PsucAプロモーターが該cobL遺伝子に機能的に連結されている、核酸。
【請求項１１９】
前記Peddプロモーターが配列番号36の配列を含み;かつ前記PsucAプロモーターが配列番号37の配列を含む、請求項118記載の核酸。
【請求項１２０】
配列番号38の配列を含む、請求項118記載の核酸。
【請求項１２１】
cobG遺伝子、Psp9プロモーター、Pzwfプロモーター、及びcobL遺伝子を含み;ここで、該Psp9プロモーターが該cobG遺伝子及び該Pzwfプロモーターに機能的に連結されており、かつ該Pzwfプロモーターが該cobL遺伝子に機能的に連結されている、核酸。
【請求項１２２】
前記Psp9プロモーターが配列番号39を含み;かつ前記Pzwfプロモーターが配列番号40を含む、請求項121記載の核酸。
【請求項１２３】
配列番号41を含む、請求項121記載の核酸。
【請求項１２４】
cobW遺伝子、Pzwfプロモーター、Psp9プロモーター、及びcbtB遺伝子を含み、ここで、該Pzwfプロモーターが該cobW遺伝子及び該Psp9プロモーターに機能的に連結されており、かつ該Psp9プロモーターが該cbtB遺伝子に機能的に連結されている、核酸。
【請求項１２５】
前記Pzwfプロモーターが配列番号42を含み;かつ前記Psp9プロモーターが配列番号43を含む、請求項124記載の核酸。
【請求項１２６】
配列番号44を含む、請求項124記載の核酸。
【請求項１２７】
cobW遺伝子、Ptktプロモーター、Psp2プロモーター、及びcbtB遺伝子を含み、ここで、該Ptktプロモーターが該cobW遺伝子及び該Psp2プロモーターに機能的に連結されており、かつ該Psp2プロモーターが該cbtB遺伝子に機能的に連結されている、核酸。
【請求項１２８】
前記Ptktプロモーターが配列番号45を含み;かつ前記Psp2プロモーターが配列番号46を含む、請求項127記載の核酸。
【請求項１２９】
配列番号47を含む、請求項127記載の核酸。
【請求項１３０】
tonB遺伝子(例えば、butB遺伝子)に機能的に連結されたPzwfプロモーターを含む核酸。
【請求項１３１】
前記Pzwfプロモーターが配列番号48を含む、請求項130記載の核酸。
【請求項１３２】
配列番号49を含む、請求項130記載の核酸。
【請求項１３３】
tonB遺伝子(例えば、butB遺伝子)に機能的に連結されたPsp9プロモーターを含む核酸。
【請求項１３４】
前記Psp9プロモーターが配列番号50を含む、請求項133記載の核酸。
【請求項１３５】
配列番号51を含む、請求項133記載の核酸。
【請求項１３６】
前記核酸がシュードモナス・デニトリフィカンスに由来する1以上の配列を含む、請求項1〜135のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１３７】
前記第一又は前記第二のプロモーターがシュードモナス・デニトリフィカンスに由来する、請求項136記載の核酸。
【請求項１３８】
前記核酸が、エンテロバクター属、ラクトバチルス属、シュードモナス属、又はアゾスピリルム属細菌に由来する1以上の配列を含む、請求項1〜137のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１３９】
前記第一の遺伝子が、エンテロバクター属、ラクトバチルス属、シュードモナス属、又はアゾスピリルム属細菌に由来する、請求項138記載の核酸。
【請求項１４０】
配列番号66(DhaB発現モジュール)と少なくとも85％同一である配列を含むDhaB発現モジュールを含む核酸。
【請求項１４１】
前記配列が配列番号66と少なくとも90％同一である、請求項140記載の核酸。
【請求項１４２】
前記配列が配列番号66を含む、請求項140記載の核酸。
【請求項１４３】
配列番号67(kgsA発現モジュール)と少なくとも85％同一である配列を含むDhaB発現モジュールを含む核酸。
【請求項１４４】
前記配列が配列番号67と少なくとも90％同一である、請求項143記載の核酸。
【請求項１４５】
前記配列が配列番号67を含む、請求項143記載の核酸。
【請求項１４６】
配列番号68を含むgdrA遺伝子のUTR及び配列番号69を含むgdrB遺伝子のUTRを含むDhaB発現モジュールを含む核酸。
【請求項１４７】
前記核酸が配列番号70〜72からなる群から選択される配列と少なくとも85％同一である配列を含む、請求項6〜29のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１４８】
前記核酸が配列番号70〜72からなる群から選択される配列を含む、請求項6〜29のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１４９】
配列番号73及び74からなる群から選択される配列と少なくとも85％同一である配列を含む補酵素B12センサーを含む核酸。
【請求項１５０】
配列番号73及び74からなる群から選択される配列を含む、請求項149記載の核酸。
【請求項１５１】
補酵素B12の合成に関与する第一の遺伝子、小分子によって誘導される第一のプロモーター、及び第二のプロモーターを含む補酵素B12発現モジュールを含み、ここで、該第一及び第二のプロモーターが、該第一の遺伝子の発現を調節するように、該第一の遺伝子の上流にタンデムに機能的に連結されている、核酸。
【請求項１５２】
補酵素B12の合成に関与する第二の遺伝子、小分子によって誘導される第三のプロモーター、及び第四のプロモーターをさらに含み、ここで、該第三及び第四のプロモーターが、該第二の遺伝子の発現を調節するように、該第二の遺伝子の上流にタンデムに機能的に連結されている、請求項151記載の核酸。
【請求項１５３】
補酵素B12の合成に関与する第三の遺伝子、小分子によって誘導される第五のプロモーター、及び第六のプロモーターをさらに含み、ここで、該第五及び第六のプロモーターが、該第三の遺伝子の発現を調節するように、該第三の遺伝子の上流にタンデムに機能的に連結されている、請求項152記載の核酸。
【請求項１５４】
補酵素B12の合成に関与する第四の遺伝子、小分子によって誘導される第七のプロモーター、及び第八のプロモーターをさらに含み、ここで、該第七及び第八のプロモーターが、該第四の遺伝子の発現を調節するように、該第四の遺伝子の上流にタンデムに機能的に連結されている、請求項153記載の核酸。
【請求項１５５】
前記第一、第二、第三、及び第四の遺伝子が、各々、cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM、及びcobVからなる群から選択される1以上の遺伝子を含む、請求項151〜154のいずれか一項記載の核酸。
【請求項１５６】
前記第一の遺伝子がbgpMを含む、請求項155記載の核酸。
【請求項１５７】
前記核酸が補酵素B12の産生に関与する遺伝子を調節する任意の天然のリボスイッチを含まない、請求項151記載の核酸。
【請求項１５８】
前記核酸が配列番号75又は76を含まない、請求項151記載の核酸。
【請求項１５９】
請求項1〜158のいずれか一項記載の核酸を含む組換え細菌。
【請求項１６０】
前記細菌がシュードモナス属種である、請求項159記載の組換え細菌。
【請求項１６１】
前記細菌がシュードモナス・デニトリフィカンスである、請求項160記載の組換え細菌。
【請求項１６２】
前記核酸が発現プラスミド上にある、請求項159記載の組換え細菌。
【請求項１６３】
前記核酸が前記細菌の染色体に組み込まれている、請求項159記載の組換え細菌。
【請求項１６４】
前記核酸がエピソーム上にある、請求項159記載の組換え細菌。
【請求項１６５】
DhaB発現モジュールを含む第一の核酸及びALDH発現モジュールを含む第二の核酸を含む組換え細菌。
【請求項１６６】
前記DhaB発現モジュールが請求項1〜14及び18〜142のいずれか一項記載の核酸を含む、請求項165記載の組換え細菌。
【請求項１６７】
前記ALDH発現モジュールが請求項1〜8及び15〜142のいずれか一項記載の核酸を含む、請求項165記載の組換え細菌。
【請求項１６８】
前記第一及び前記第二の核酸が発現プラスミド上にある、請求項165記載の組換え細菌。
【請求項１６９】
前記第一及び前記第二の核酸がエピソーム上にある、請求項165記載の組換え細菌。
【請求項１７０】
前記第一及び前記第二の核酸が前記細菌の染色体に組み込まれている、請求項165記載の組換え細菌。
【請求項１７１】
前記第一の核酸が前記細菌の染色体に組み込まれており、かつ該第二の核酸が発現プラスミド上にある、請求項165記載の組換え細菌。
【請求項１７２】
前記第一の核酸が発現プラスミド上にあり、かつ前記第二の核酸が前記細菌の染色体に組み込まれている、請求項165記載の組換え細菌。
【請求項１７３】
前記第一の核酸が前記細菌の染色体に組み込まれており、かつ前記第二の核酸がエピソーム上にある、請求項165記載の組換え細菌。
【請求項１７４】
前記第一の核酸がエピソーム上にあり、かつ前記第二の核酸が前記細菌の染色体に組み込まれている、請求項165記載の組換え細菌。
【請求項１７５】
前記第一の核酸が第一の位置で前記細菌の染色体に組み込まれており、かつ前記第二の核酸が第二の位置で該細菌の染色体に組み込まれており;かつ該第一及び該第二の位置が互いの2500キロ塩基対以内にある、請求項170記載の組換え細菌。
【請求項１７６】
前記第一及び第二の位置が互いの100キロ塩基対以内にある、請求項175記載の組換え細菌。
【請求項１７７】
前記第一及び第二の位置が互いの50キロ塩基対以内にある、請求項175記載の組換え細菌。
【請求項１７８】
前記第一及び第二の位置が互いの1000塩基対以内にある、請求項175記載の組換え細菌。
【請求項１７９】
前記第一の核酸が、複製起点の4000塩基対以内にある第一の位置で、前記細菌の染色体に組み込まれている、請求項170記載の組換え細菌。
【請求項１８０】
前記第一の位置が前記複製起点の1000塩基対以内にある、請求項179記載の組換え細菌。
【請求項１８１】
補酵素B12の合成に関与する第一の遺伝子、小分子によって誘導される第一のプロモーター、及び第二のプロモーターを含む補酵素B12発現モジュールを含み、ここで、前記第一及び第二のプロモーターが該第一の遺伝子の上流にタンデムに機能的に連結されている、組換え細菌。
【請求項１８２】
前記細菌がシュードモナス・デニトリフィカンス細菌である、請求項181記載の組換え細菌。
【請求項１８３】
前記細菌が前記第一の遺伝子の発現を調節する第一のリボスイッチの第一の位置における欠失を含み、かつ前記第一及び第二のプロモーターが、該第一の遺伝子の発現を調節するように、該第一の位置で該細菌の染色体に組み込まれている、請求項182記載の組換え細菌。
【請求項１８４】
前記細菌が、補酵素B12の合成に関与する第二の遺伝子の発現を調節する第二のリボスイッチの第二の位置における第二の欠失、補酵素B12の合成に関与する第三の遺伝子の発現を調節する第三のリボスイッチの第三の位置における第三の欠失、及び補酵素B12の合成に関与する第四の遺伝子の発現を調節する第四のリボスイッチの第四の位置における第四の欠失をさらに含む、請求項183記載の組換え細菌。
【請求項１８５】
前記第二の遺伝子の発現を調節するように、タンデムに機能的に連結され、かつ前記第二の位置で前記染色体に組み込まれている、第三のプロモーター及び第四のプロモーター;前記第三の遺伝子の発現を調節するように、タンデムに機能的に連結され、かつ前記第三の位置で該染色体に組み込まれている、第五のプロモーター及び第六のプロモーター;並び前記第四の遺伝子の発現を調節するにように、タンデムに機能的に連結され、かつ前記第四の位置で該染色体に組み込まれている、第七及び第八のプロモーターをさらに含む、請求項184記載の組換え細菌。
【請求項１８６】
前記細菌が天然のシュードモナス・デニトリフィカンスよりも多くの補酵素B12を産生する、請求項181記載の組換え細菌。
【請求項１８７】
補酵素B12発現モジュールをさらに含む、請求項165記載の組換え細菌。
【請求項１８８】
3-HP又はその塩を産生する方法であって、請求項159〜187のいずれか一項記載の組換え細菌を3-HP又はその塩を産生するのに十分な条件下で培養することを含む、前記方法。
【請求項１８９】
前記条件が少なくとも85g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である、請求項188記載の方法。
【請求項１９０】
前記条件が少なくとも90g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である、請求項189記載の方法。
【請求項１９１】
前記条件が少なくとも95g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である、請求項189記載の方法。
【請求項１９２】
前記条件が少なくとも100g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である、請求項189記載の方法。
【請求項１９３】
前記細菌を培養することが外部補酵素B12の添加を含まない、請求項188記載の方法。
【請求項１９４】
前記細菌を培養することが前記培養物への外部補酵素B12の添加を含む、請求項188記載の方法。
【請求項１９５】
培養することが、前記細菌を、グリセロール、グルコース、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、及びクエン酸からなる群から選択される炭素源を含む培地中で増殖させることを含む、請求項188記載の方法。
【請求項１９６】
培養することが、グリセロールを添加することにより、前記細菌を誘導して、3-HPを産生することを含む、請求項188記載の方法。
【請求項１９７】
前記グリセロールが対数期中期に添加される、請求項196記載の方法。
【請求項１９８】
培養することが、前記細菌を、酵母抽出物、コーンスティープリカー粉末、及びコーンスティープリカーペーストからなる群から選択される窒素源を含む培地中で増殖させることを含む、請求項188記載の方法。
【請求項１９９】
培養することが、前記細菌を6.8〜7.8のpHで増殖させることを含む、請求項188記載の方法。
【請求項２００】
培養することが、NaOH、KOH、NaHCO3、NH4HCO3、NH4OH、(NH4)2CO3、及びNa2CO3からなる群から選択される1以上の塩基を添加することを含む、請求項199記載の方法。
【請求項２０１】
培養することが、NaOH、KOH、NaHCO3、NH4HCO3、NH4OH、(NH4)2CO3、及びNa2CO3からなる群から選択される少なくとも1つの塩基を添加することを含む、請求項199記載の方法。
【請求項２０２】
培養することが、塩基濃度を希釈すること及び酸濃度を増加させることを含む、請求項188記載の方法。
【請求項２０３】
培養することが、前記細菌を摂氏28〜40度の温度で増殖させることを含む、請求項188記載の方法。
【請求項２０４】
培養することが、前記細菌を摂氏33度の温度で増殖させることを含む、請求項203記載の方法。
【請求項２０５】
3-HP又はその塩を産生する方法であって:
請求項159〜187のいずれか一項記載の組換え細菌を該細菌の増殖及び3-HP又はその塩の産生に好適な培養培地中で提供することを含む、前記方法。
【請求項２０６】
3-HPを前記細菌又は培養培地から分離することをさらに含む、請求項205記載の方法。
【請求項２０７】
前記培養培地が約2〜20％溶存酸素である溶存酸素濃度を含む、請求項205記載の方法。
【請求項２０８】
前記溶存酸素濃度が約5〜10％である、請求項207記載の方法。
【請求項２０９】
前記溶存酸素濃度が20％以下である、請求項207記載の方法。
【請求項２１０】
前記溶存酸素濃度が少なくとも2％である、請求項207記載の方法。
【請求項２１１】
向流液体フローを使用しないで、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から除去することを含む:方法。
【請求項２１２】
溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去することを含む、請求項211記載の方法。
【請求項２１３】
前記溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去する前に:
該溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した溶媒を凝縮させること
を含む、請求項212記載の方法。
【請求項２１４】
前記溶媒が水不混和性溶媒を含む、請求項212又は213記載の方法。
【請求項２１５】
前記溶媒が水混和性溶媒を含む、請求項212又は213記載の方法。
【請求項２１６】
前記溶媒が約1g/mL未満の密度を有する、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１７】
前記溶媒が約1g/mL超の密度を有する、請求項211〜215のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１８】
前記溶媒が、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項212又は213記載の方法。
【請求項２１９】
前記溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項212又は213記載の方法。
【請求項２２０】
前記溶媒が酢酸エチルを含む、請求項212又は213記載の方法。
【請求項２２１】
前記溶媒が、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項212又は213記載の方法。
【請求項２２２】
前記溶媒がイソブチルアルコールを含む、請求項212又は213記載の方法。
【請求項２２３】
前記溶媒が、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、及びメチルヘキシルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項212又は213記載の方法。
【請求項２２４】
前記溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、及び四塩化炭素からなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項212又は213記載の方法。
【請求項２２５】
前記溶媒を前記水溶液に添加することを含む、請求項212、213、又は215のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２６】
前記溶媒がC1-3アルコールを含む、請求項212、213、215、又は225のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２７】
前記溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項212、213、215、又は225のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２８】
前記溶媒がメタノールを含む、請求項212、213、215、又は225のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２９】
前記溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、請求項212、213、又は225〜228のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３０】
前記溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、請求項212、213、又は225〜228のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３１】
水混和性溶媒及び水不混和性溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去することを含み、ここで、1)該水混和性溶媒及び該水不混和性溶媒の組合せ容量と2)該水溶液の容量との比が約1:1〜約2:1である、請求項212、213、又は225〜228のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３２】
3-HPが少なくとも50％の収率で前記水溶液から除去される、請求項211〜231のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３３】
3-HPが少なくとも60％の収率で前記水溶液から除去される、請求項211〜231のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３４】
3-HPが少なくとも70％の収率で前記水溶液から除去される、請求項211〜231のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３５】
3-HPが少なくとも80％の収率で前記水溶液から除去される、請求項211〜231のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３６】
3-HPが少なくとも90％の収率で前記水溶液から除去される、請求項211〜231のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３７】
3-HPが少なくとも95％の収率で前記水溶液から除去される、請求項211〜231のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３８】
3-HPが少なくとも99％の収率で前記水溶液から除去される、請求項211〜231のいずれか一項記載の方法。
【請求項２３９】
第一の溶媒を蒸発させること;
該蒸発した第一の溶媒を凝縮させること;及び
該第一の溶媒のフローの向きを変えて、3-HPを前記水溶液から除去すること
:を含む、方法。
【請求項２４０】
前記第一の溶媒が約1g/mL未満の密度を有する、請求項233記載の方法。
【請求項２４１】
前記第一の溶媒が約1g/mL超の密度を有する、請求項233記載の方法。
【請求項２４２】
前記第一の溶媒が水不混和性溶媒を含む、請求項239記載の方法。
【請求項２４３】
前記第一の溶媒が、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項239記載の方法。
【請求項２４４】
前記第一の溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項239記載の方法。
【請求項２４５】
前記第一の溶媒が酢酸エチルを含む、請求項239記載の方法。
【請求項２４６】
前記第一の溶媒が、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項239記載の方法。
【請求項２４７】
前記第一の溶媒がイソブチルアルコールを含む、請求項239記載の方法。
【請求項２４８】
前記第一の溶媒が、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、及びメチルヘキシルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項239記載の方法。
【請求項２４９】
前記第一の溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、及び四塩化炭素からなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項239記載の方法。
【請求項２５０】
第二の溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去することを含む、請求項239〜249のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５１】
前記第二の溶媒が水混和性溶媒を含む、請求項250記載の方法。
【請求項２５２】
前記第一の溶媒が水不混和性溶媒を含み、かつ前記第二の溶媒が水混和性溶媒を含む、請求項250記載の方法。
【請求項２５３】
前記第二の溶媒を前記水溶液に添加することを含む、請求項250〜252のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５４】
前記第二の溶媒がC1-3アルコールを含む、請求項250〜253のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５５】
前記第二の溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項250〜253のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５６】
前記第二の溶媒がメタノールを含む、請求項250〜253のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５７】
前記第二の溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、請求項250〜256のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５８】
前記第二の溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、請求項250〜256のいずれか一項記載の方法。
【請求項２５９】
1)前記第一及び第二の溶媒の組合せ容量と2)前記水溶液の容量との比が1:1〜約2:1である、請求項250〜258のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６０】
3-HPが少なくとも50％の収率で前記水溶液から除去される、請求項239〜259のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６１】
3-HPが少なくとも60％の収率で前記水溶液から除去される、請求項239〜259のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６２】
3-HPが少なくとも70％の収率で前記水溶液から除去される、請求項239〜259のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６３】
3-HPが少なくとも80％の収率で前記水溶液から除去される、請求項239〜259のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６４】
3-HPが少なくとも90％の収率で前記水溶液から除去される、請求項239〜259のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６５】
3-HPが少なくとも95％の収率で前記水溶液から除去される、請求項239〜259のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６６】
3-HPが少なくとも99％の収率で前記水溶液から除去される、請求項239〜259のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６７】
水不混和性溶媒を用いて、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から少なくとも50％の収率で除去すること
:を含む、方法。
【請求項２６８】
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも60％である、請求項267記載の方法。
【請求項２６９】
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも70％である、請求項267記載の方法。
【請求項２７０】
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも80％である、請求項267記載の方法。
【請求項２７１】
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも90％である、請求項267記載の方法。
【請求項２７２】
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも95％である、請求項267記載の方法。
【請求項２７３】
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも99％である、請求項265記載の方法。
【請求項２７４】
前記水不混和性溶媒が少なくとも1つのC1-6アルキルアセテートを含む、請求項267〜273のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７５】
前記水不混和性溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項267〜273のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７６】
前記水不混和性溶媒が酢酸エチルを含む、請求項267〜273のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７７】
向流液体フローを使用することを含む、請求項267〜276のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７８】
前記水不混和性溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去する前に:
該水不混和性溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した水不混和性溶媒を凝縮させること
を含む、請求項267〜276のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７９】
水混和性溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去することを含む、請求項267〜278のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８０】
前記水混和性溶媒を前記水溶液に添加することを含む、請求項279記載の方法。
【請求項２８１】
前記水混和性溶媒がC1-3アルコールを含む、請求項279又は280記載の方法。
【請求項２８２】
前記水混和性溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項279又は280記載の方法。
【請求項２８３】
前記水混和性溶媒がメタノールを含む、請求項279又は280記載の方法。
【請求項２８４】
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、請求項279〜283のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８５】
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、請求項279〜283のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８６】
1)前記水混和性溶媒及び前記水不混和性溶媒の組合せ容量と2)前記水溶液の容量との比が約1:1〜約2:1である、請求項279〜283のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８７】
液体を用いて、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から除去すること
:を含み、
ここで、該液体が第一及び第二の溶媒を含む、方法。
【請求項２８８】
前記第一の溶媒が有機溶媒を含む、請求項287記載の方法。
【請求項２８９】
前記第二の溶媒が有機溶媒を含む、請求項287又は288記載の方法。
【請求項２９０】
前記第一の溶媒が水混和性である、請求項287〜289のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９１】
前記第一の溶媒が水混和性であり、かつ前記第二の溶媒が水不混和性である、請求項287〜289のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９２】
前記方法が向流液体フローを使用しないで実施される、請求項287〜291のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９３】
前記液体を用いて、3-HPを除去する前に:
前記第二の溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した第二の溶媒を凝縮させること
をさらに含む、請求項287〜292のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９４】
前記第二の溶媒が約1g/mL未満の密度を有する、請求項287〜293のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９５】
前記第二の溶媒が、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項287〜294のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９６】
前記第二の溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項287〜294のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９７】
前記第二の溶媒が酢酸エチルを含む、請求項287〜294のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９８】
前記第二の溶媒が、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項287〜294のいずれか一項記載の方法。
【請求項２９９】
前記第二の溶媒がイソブチルアルコールである、請求項287〜294のいずれか一項記載の方法。
【請求項３００】
前記第二の溶媒が、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、及びメチルヘキシルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項287〜294のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０１】
前記第二の溶媒が約1g/mL超の密度を有する、請求項287〜300のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０２】
前記第一の溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、及び四塩化炭素からなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項287〜300のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０３】
前記第一の溶媒がC1-3アルコールを含む、請求項287〜300のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０４】
前記第一の溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項287〜300のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０５】
前記第一の溶媒がメタノールを含む、請求項287〜300のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０６】
前記第一の溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、請求項287〜305のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０７】
前記第一の溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、請求項287〜305のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０８】
1)前記第一及び第二の溶媒の組合せ容量と2)前記水溶液の容量との比が1:1〜約2:1である、請求項287〜307のいずれか一項記載の方法。
【請求項３０９】
3-HPが少なくとも50％の収率で前記水溶液から除去される請求項287〜308のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１０】
3-HPが少なくとも60％の収率で前記水溶液から除去される請求項287〜308のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１１】
3-HPが少なくとも70％の収率で前記水溶液から除去される請求項287〜308のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１２】
3-HPが少なくとも80％の収率で前記水溶液から除去される請求項287〜308のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１３】
3-HPが少なくとも90％の収率で前記水溶液から除去される請求項287〜308のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１４】
3-HPが少なくとも95％の収率で前記水溶液から除去される請求項287〜308のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１５】
3-HPが少なくとも99％の収率で前記水溶液から除去される請求項287〜308のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１６】
水混和性溶媒及び水不混和性溶媒を用いて、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から除去すること
:を含む、方法。
【請求項３１７】
前記方法が向流液体フローを使用しないで実施される、請求項316記載の方法。
【請求項３１８】
前記水不混和性溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去する前に:
該水不混和性溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した水不混和性溶媒を凝縮させること
を含む、請求項316又は317記載の方法。
【請求項３１９】
3-HPを前記水溶液から除去するための前記水混和性溶媒の前に:
該水混和性溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した水混和性溶媒を凝縮させること
を含む、請求項316〜318のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２０】
前記水不混和性溶媒が約1g/mL未満の密度を有する、請求項316〜319のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２１】
前記水不混和性溶媒が、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項316〜320のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２２】
水不混和性溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項316〜320のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２３】
前記水不混和性溶媒が酢酸エチルを含む、請求項316〜320のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２４】
水不混和性溶媒が、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項316〜320のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２５】
前記水不混和性溶媒がイソブチルアルコールを含む、請求項316〜320のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２６】
水不混和性溶媒が、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、及びメチルヘキシルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項316〜320のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２７】
前記水不混和性溶媒が約1g/mL超の密度を有する、請求項316〜326のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２８】
前記水不混和性溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、及び四塩化炭素からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含む、請求項316〜327のいずれか一項記載の方法。
【請求項３２９】
前記水混和性溶媒がC1-3アルコールを含む、請求項316〜327のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３０】
前記水混和性溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項316〜327のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３１】
前記水混和性溶媒がメタノールを含む、請求項316〜327のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３２】
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、請求項316〜331のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３３】
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、請求項316〜331のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３４】
1)前記水混和性溶媒及び前記水不混和性溶媒の組合せ容量と2)前記水溶液の容量との比が約1:1〜約2:1である、請求項316〜333のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３５】
3-HPが少なくとも50％の収率で前記水溶液から除去される、請求項316〜334のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３６】
3-HPが少なくとも60％の収率で前記水溶液から除去される、請求項316〜334のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３７】
3-HPが少なくとも70％の収率で前記水溶液から除去される、請求項316〜334のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３８】
3-HPが少なくとも80％の収率で前記水溶液から除去される、請求項316〜334のいずれか一項記載の方法。
【請求項３３９】
3-HPが少なくとも90％の収率で前記水溶液から除去される、請求項316〜334のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４０】
3-HPが少なくとも95％の収率で前記水溶液から除去される、請求項316〜334のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４１】
3-HPが少なくとも99％の収率で前記水溶液から除去される、請求項316〜334のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４２】
前記水溶液のpHが少なくとも約3である、請求項211〜341のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４３】
前記水溶液のpHが少なくとも約4である、請求項211〜341のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４４】
前記水溶液のpHが約3〜約7である、請求項211〜341のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４５】
前記水溶液のpHが約4〜約6である、請求項211〜341のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４６】
前記水溶液のpHが約4.2〜約4.7である、請求項211〜341のいずれか一項記載の方法。
【請求項３４７】
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から除去すること
:を含み、
ここで、該水溶液のpHが少なくとも約3である、方法。
【請求項３４８】
前記水溶液のpHが少なくとも約4である、請求項347記載の方法。
【請求項３４９】
前記水溶液のpHが最大でも約7である、請求項347又は348記載の方法。
【請求項３５０】
前記水溶液のpHが約4〜約6である、請求項347記載の方法。
【請求項３５１】
前記水溶液のpHが約4〜約5である、請求項347記載の方法。
【請求項３５２】
前記水溶液のpHが約4.2〜約4.8である、請求項347記載の方法。
【請求項３５３】
前記水溶液のpHが約4.3〜約4.6である、請求項347記載の方法。
【請求項３５４】
前記水溶液のpHが約4.4である、請求項347記載の方法。
【請求項３５５】
前記方法が向流液体フローを使用しないで実施される、請求項347〜354のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５６】
水不混和性溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去することを含む、請求項347〜355のいずれか一項記載の方法。
【請求項３５７】
前記水不混和性溶媒を用いて、前記3-HPを除去する前に:
該水不混和性溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した水不混和性溶媒を凝縮させること
を含む、請求項356記載の方法。
【請求項３５８】
前記水不混和性溶媒が約1g/mL未満の密度を有する、請求項356又は357記載の方法。
【請求項３５９】
前記水不混和性溶媒が、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項356〜358のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６０】
前記水不混和性溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項356〜358のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６１】
前記水不混和性溶媒が酢酸エチルを含む、請求項356〜358のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６２】
前記水不混和性溶媒が、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項356〜358のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６３】
前記水不混和性溶媒がイソブチルアルコールを含む、請求項356〜358のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６４】
前記水不混和性溶媒が、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、及びメチルヘキシルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項356〜358のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６５】
前記水不混和性溶媒が約1g/mL超の密度を有する、請求項355〜364のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６６】
前記水不混和性溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、及び四塩化炭素からなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項356〜365のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６７】
3-HPを前記水溶液から除去するための水混和性溶媒を使用することを含む、請求項347〜365のいずれか一項記載の方法。
【請求項３６８】
前記水混和性溶媒の使用が該水混和性溶媒を前記水溶液に添加することを含む、請求項367記載の方法。
【請求項３６９】
前記水混和性溶媒がC1-3アルコールである、請求項367又は368記載の方法。
【請求項３７０】
水混和性溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項367又は368記載の方法。
【請求項３７１】
前記水混和性溶媒がメタノールを含む、請求項367又は366記載の方法。
【請求項３７２】
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、請求項367〜371のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７３】
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、請求項367〜371のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７４】
1)前記水混和性溶媒及び前記水不混和性溶媒の組合せ容量と2)前記水溶液の容量との比が約1:1〜約2:1である、請求項357〜373のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７５】
3-HPが少なくとも50％の収率で前記水溶液から除去される、請求項347〜374のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７６】
3-HPが少なくとも60％の収率で前記水溶液から除去される、請求項347〜374のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７７】
3-HPが少なくとも70％の収率で前記水溶液から除去される、請求項347〜374のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７８】
3-HPが少なくとも80％の収率で前記水溶液から除去される、請求項347〜374のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７９】
3-HPが少なくとも90％の収率で前記水溶液から除去される、請求項347〜374のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８０】
3-HPが少なくとも95％の収率で前記水溶液から除去される、請求項347〜374のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８１】
3-HPが少なくとも99％の収率で前記水溶液から除去される、請求項347〜369のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８２】
前記3-HPの水溶液が脱細胞化発酵ブロスを含む、請求項211〜381のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８３】
前記水溶液中の3-HPの濃度が約50g/L〜約100g/Lである、請求項211〜382のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８４】
前記水溶液中の3-HPの濃度が約60g/L〜約80g/Lである、請求項211〜382のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８５】
前記水溶液が酸を含む、請求項211〜384のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８６】
前記酸が、硫酸、塩酸、酢酸、及びシュウ酸からなる群から選択される少なくとも1つの酸を含む、請求項211〜384のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８７】
前記水溶液の温度が約15℃〜約50℃である、請求項211〜386のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８８】
前記水溶液の温度が約15℃〜約40℃である、請求項211〜386のいずれか一項記載の方法。
【請求項３８９】
前記水溶液の温度が約20℃〜約30℃である、請求項211〜386のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９０】
前記水溶液が約室温である、請求項211〜386のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９１】
3-HPを前記水溶液から除去した後、該3-HPを反応させて、アクリル酸を製造することをさらに含む、請求項211〜390のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９２】
前記3-HPを約700mbar未満の圧力で反応させることを含む、391記載の方法。
【請求項３９３】
3-HPを反応させることが水溶液中で行われることを含む、請求項391又は392記載の方法。
【請求項３９４】
前記水溶液をゼオライトと接触させることを含む、請求項393記載の方法。
【請求項３９５】
前記水溶液が酸を含む、請求項393又は394記載の方法。
【請求項３９６】
前記3-HPを反応させることが該3-HPを少なくとも約50℃の温度に加熱することを含む、請求項391〜395のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９７】
前記反応させることが重合阻害剤の存在下で行われる、請求項391〜396のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９８】
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を反応させて、約1大気圧未満の圧力でアクリル酸を形成させて、アクリル酸を提供すること
:を含む、方法。
【請求項３９９】
前記圧力が約700mbar未満である、請求項398記載の方法。
【請求項４００】
前記圧力が約500mbar未満である、請求項398記載の方法。
【請求項４０１】
前記圧力が約200mbar未満である、請求項398記載の方法。
【請求項４０２】
前記圧力が約100mbar未満である、請求項398記載の方法。
【請求項４０３】
前記圧力が約70〜約100mbarの範囲内にある、請求項398記載の方法。
【請求項４０４】
3-HPが水溶液中で行われる、請求項398〜403のいずれか一項記載の方法。
【請求項４０５】
前記水溶液をゼオライトと接触させることを含む、請求項404記載の方法。
【請求項４０６】
前記ゼオライトが4A分子篩を含む、請求項405記載の方法。
【請求項４０７】
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約1wt.％〜約5wt.％である、請求項405又は406記載の方法。
【請求項４０８】
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約2wt.％〜約4wt.％である、請求項405又は406記載の方法。
【請求項４０９】
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約50℃の温度に加熱することを含む、請求項398〜408のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１０】
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約80℃の温度に加熱することを含む、請求項398〜408のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１１】
3-HPを反応させることが、3-HPを最大で約180℃の温度に加熱することを含む、請求項398〜408のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１２】
前記水溶液が酸を含む、請求項404〜411のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１３】
前記酸がシュウ酸及びポリリン酸からなる群から選択される少なくとも1つの酸を含む、請求項412記載の方法。
【請求項４１４】
前記酸の量が3-HPの量をベースにして約2wt.％〜約20wt.％である、請求項412又は413記載の方法。
【請求項４１５】
前記3-HPを重合阻害剤の存在下で反応させることを含む、請求項398〜414のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１６】
前記重合阻害剤がフェノチアジン及びヒドロキノンからなる群から選択される少なくとも1つの重合阻害剤を含む、請求項415記載の方法。
【請求項４１７】
前記重合阻害剤の量が3-HPの量をベースにして約5wt.％〜約10wt.％である、請求項415又は416記載の方法。
【請求項４１８】
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を反応させて、反応混合物中でアクリル酸を形成させること;及び
ガス状アクリル酸を該反応混合物から除去すること
:を含む、方法。
【請求項４１９】
前記反応混合物が液体を含む、請求項418記載の方法。
【請求項４２０】
前記液体が水性である、請求項419記載の方法。
【請求項４２１】
前記反応混合物をゼオライトと接触させることを含む、請求項418〜420のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２２】
前記ゼオライトが4A分子篩を含む、請求項421記載の方法。
【請求項４２３】
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約1wt.％〜約5wt.％である、請求項421又は422記載の方法。
【請求項４２４】
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約2wt.％〜約4wt.％である、請求項421又は422記載の方法。
【請求項４２５】
前記ガス状アクリル酸を除去することが約1大気圧未満の圧力で行われる、請求項418〜424のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２６】
前記圧力が約700mbar未満である、請求項425記載の方法。
【請求項４２７】
前記圧力が約500mbar未満である、請求項425記載の方法。
【請求項４２８】
前記圧力が約200mbar未満である、請求項425記載の方法。
【請求項４２９】
前記圧力が約100mbar未満である、請求項425記載の方法。
【請求項４３０】
前記圧力が約70〜約100mbarの範囲内にある、請求項425記載の方法。
【請求項４３１】
3-HPを反応させることが3-HPを少なくとも約50℃の温度に加熱することを含む、請求項418〜430のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３２】
3-HPを反応させることが3-HPを少なくとも約80℃の温度に加熱することを含む、請求項418〜430のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３３】
3-HPを反応させることが3-HPを最大で約180℃の温度に加熱することを含む、請求項418〜430のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３４】
前記反応混合物が酸を含む、請求項418〜423のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３５】
前記酸がシュウ酸及びポリリン酸からなる群から選択される少なくとも1つの酸を含む、請求項434記載の方法。
【請求項４３６】
前記酸の量が3-HPの量をベースにして約2wt.％〜約20wt.％である、請求項434又は435記載の方法。
【請求項４３７】
前記反応混合物が重合阻害剤を含む、請求項418〜436のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３８】
前記重合阻害剤がフェノチアジン及びヒドロキノンからなる群から選択される重合阻害剤を含む、請求項437記載の方法。
【請求項４３９】
前記重合阻害剤の量が3-HPの量をベースにして約5wt.％〜約10wt.％である、請求項437又は438記載の方法。
【請求項４４０】
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を含む液体を反応させて、アクリル酸を形成させること
:を含む、方法。
【請求項４４１】
前記液体が水溶液を含む、請求項440記載の方法。
【請求項４４２】
ガス状アクリル酸を形成させることを含む、請求項440又は441記載の方法。
【請求項４４３】
前記アクリル酸を前記液体から除去することを含む、請求項440〜442のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４４】
除去することが約1大気圧未満の圧力で行われる、請求項443記載の方法。
【請求項４４５】
前記圧力が約700mbar未満である、請求項444記載の方法。
【請求項４４６】
前記圧力が約500mbar未満である、請求項444記載の方法。
【請求項４４７】
前記圧力が約200mbar未満である、請求項444記載の方法。
【請求項４４８】
前記圧力が約100mbar未満である、請求項444記載の方法。
【請求項４４９】
前記圧力が約70〜約100mbarの範囲内にある、請求項444記載の方法。
【請求項４５０】
前記液体をゼオライトと接触させることを含む、請求項440〜449のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５１】
前記ゼオライトが4A分子篩を含む、請求項450記載の方法。
【請求項４５２】
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約1wt.％〜約5wt.％である、請求項440又は441記載の方法。
【請求項４５３】
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約2wt.％〜約4wt.％である、請求項440又は441記載の方法。
【請求項４５４】
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約50℃の温度に加熱することを含む、請求項440〜453のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５５】
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約80℃の温度に加熱することを含む、請求項440〜453のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５６】
3-HPを反応させることが、3-HPを最大で約180℃の温度に加熱することを含む、請求項440〜453のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５７】
前記液体が酸を含む、請求項440〜456のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５８】
前記酸がシュウ酸及びポリリン酸からなる群から選択される少なくとも1つの酸を含む、請求項457記載の方法。
【請求項４５９】
前記酸の量が3-HPの量をベースにして約2wt.％〜約20wt.％である、請求項247又は248記載の方法。
【請求項４６０】
反応させることが重合阻害剤の存在下で行われる、請求項440〜459のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６１】
前記重合阻害剤がフェノチアジン及びヒドロキノンからなる群から選択される少なくとも1つの重合阻害剤を含む、請求項460記載の方法。
【請求項４６２】
前記重合阻害剤の量が3-HPの量をベースにして約5wt.％〜約10wt.％である、請求項460又は461記載の方法。
【請求項４６３】
前記アクリル酸が少なくとも約70％の収率で形成される、請求項391〜462のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６４】
前記アクリル酸が少なくとも約80％の収率で形成される、請求項391〜462のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６５】
前記アクリル酸が少なくとも約90％の収率で形成される、請求項391〜462のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６６】
前記アクリル酸が少なくとも約95％の収率で形成される、請求項391〜462のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６７】
前記アクリル酸が少なくとも約99％の収率で形成される、請求項391〜462のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６８】
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を反応させて、アクリル酸を少なくとも約70％の収率で形成させること
:を含む、方法。
【請求項４６９】
前記アクリル酸が少なくとも約80％の収率で形成される、請求項468記載の方法。
【請求項４７０】
前記アクリル酸が少なくとも約90％の収率で形成される、請求項468記載の方法。
【請求項４７１】
前記アクリル酸が少なくとも約95％の収率で形成される、請求項468記載の方法。
【請求項４７２】
前記アクリル酸が少なくとも約99％の収率で形成される、請求項468記載の方法。
【請求項４７３】
前記3-HPが水溶液中で行われる、請求項468〜472のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７４】
ガス状アクリル酸を形成させることを含む、請求項468〜473のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７５】
前記アクリル酸を前記液体から除去することを含む、請求項468〜474のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７６】
前記除去することが約1大気圧未満の圧力で行われる、請求項475記載の方法。
【請求項４７７】
前記圧力が約700mbar未満である、請求項476記載の方法。
【請求項４７８】
前記圧力が約500mbar未満である、請求項476記載の方法。
【請求項４７９】
前記圧力が約200mbar未満である、請求項476記載の方法。
【請求項４８０】
前記圧力が約100mbar未満である、請求項476記載の方法。
【請求項４８１】
前記圧力が約70〜約100mbarの範囲内にある、請求項476記載の方法。
【請求項４８２】
前記水溶液をゼオライトと接触させることを含む、請求項468〜481のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８３】
前記ゼオライトが4A分子篩である、請求項482記載の方法。
【請求項４８４】
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約1wt.％〜約5wt.％である、請求項482又は483記載の方法。
【請求項４８５】
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約2wt.％〜約4wt.％である、請求項482又は483記載の方法。
【請求項４８６】
前記水溶液が酸を含む、請求項468〜485のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８７】
前記酸がシュウ酸及びポリリン酸からなる群から選択される酸を含む、請求項486記載の方法。
【請求項４８８】
前記酸の量が3-HPの量をベースにして約2wt.％〜約20wt.％である、請求項486又は487記載の方法。
【請求項４８９】
前記反応させることが重合阻害剤の存在下で行われる請求項468〜488のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９０】
前記重合阻害剤がフェノチアジン及びヒドロキノンからなる群から選択される重合阻害剤を含む、請求項489記載の方法。
【請求項４９１】
前記重合阻害剤の量が3-HPの量をベースにして約5wt.％〜約10wt.％である、請求項489又は490記載の方法。
【請求項４９２】
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約50℃の温度に加熱することを含む、請求項468〜491のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９３】
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約80℃の温度に加熱することを含む、請求項468〜491のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９４】
3-HPを反応させることが、3-HPを最大で約180℃の温度に加熱することを含む、請求項468〜491のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(関連出願の相互参照)
本出願は、米国特許法第119条(e)の下で、その各々の内容全体が引用により本明細書中に組み込まれる、2017年10月26日に出願された米国仮出願第62/577,361号及び2017年12月4日に出願された仮出願第62/594,318号の優先権の恩典を主張する。
【０００２】
(技術分野)
本開示は、組換え株によるグリセロールからのその産生、及び水溶液(例えば、水性ブロス)からのその除去を含む、3-ヒドロキシプロピオン酸の産生、並びに様々な化学物質を産生するためのその使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
(背景)
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)及び3-ヒドロキシプロパノエート(3-HPの塩)は、ポリマーコーティング用架橋剤、金属潤滑剤、及び織物用帯電防止剤として使用することができる、アクリル酸などの、様々な化学物質の工業的生産で使用される。
【発明の概要】
【０００４】
(概要)
本開示は、3-HP又はその塩を産生するための、水溶液(例えば、水性ブロス)から3-HPを除去するための、及びそれを用いて、様々な化学物質を作製するための方法及び装置を提供する。
【０００５】
いくつかの実施態様において、本開示は、シュードモナス・デニトリフィカンス(Pseudomonas denitrificans)の遺伝子改変株を用いて、グリセロールから3-HP又はその塩を産生する方法を提供する。
【０００６】
ある実施態様において、本開示は、補酵素B12の外的補充なしで、高力価の3-HP又はその塩を産生することができるシュードモナス属株を作出するための方法を提供する。
【０００７】
いくつかの実施態様において、本開示は、シュードモナス属株で使用するための発現システム(例えば、発現モジュール又は発現コンストラクト)を提供する。そのような発現システムは、とりわけ、下流遺伝子の発現を制御するために機能的に連結された2以上のプロモーターを含むタンデムプロモーターシステムを含むことができる。そのようなプロモーターは、誘導性プロモーター又は構成的プロモーターであることができる。任意に、発現システムは、少なくとも1つの誘導性プロモーターを含む。発現システムを用いて、標的タンパク質/酵素を産生し、又は毒性中間体を最小限に抑えることにより、代謝経路を増強して、高力価の標的産物、例えば、3-HPもしくはその塩を産生し、かつ/又は3-HP合成経路の最初の反応における補因子であるビタミンB12の産生を増大させることができる。
【０００８】
いくつかの実施態様において、本開示は、これらのシステムをコードする核酸、これらのシステムを発現する組換え細菌、及び/又は該細菌を培養して、3-HPもしくはその塩を産生する方法を提供する。これらの細菌は、標的産物レベル、この場合は、培地中の3-HP又はその塩に応答し、かつ該標的産物、例えば、3-HP又はその塩の産生に使用される遺伝子を発現する1以上の発現システムを含むように修飾されている。いくつかの場合において、これらの細菌は、B12の産生に使用される遺伝子の発現を増大させるための1以上の発現システムを含むようにも修飾されている。該細菌を培養して、3-HP産生(又はその塩)を増大させるための条件も本明細書に提供される。
【０００９】
一態様において、本開示は、小分子によって誘導可能である第一のプロモーター、第二のプロモーター、3-HP(もしくはその塩)又はB12の合成に関与するタンパク質をコードする第一の遺伝子、修飾されたUTR、及び天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質のN-末端由来の最大20個のアミノ酸をコードする天然の配列を含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になる発現システムであって、該天然の配列が、該修飾されたUTRの3'-末端に機能的に連結され、かつ該第一の遺伝子の5'-末端に機能的に連結されており、かつ該第一及び第二のプロモーターが該修飾されたUTRの上流にタンデムに機能的に連結されている、発現システムを提供する。
【００１０】
全ての態様のいくつかの実施態様において、該発現システムはさらに、第三のプロモーター;及び第一の遺伝子の発現を調節するように設定された転写調節因子をコードする第二の遺伝子を含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になり、ここで、該第三のプロモーターは、該第二の遺伝子に機能的に接続されている。いくつかの例において、該第二のプロモーターは、小分子によって誘導可能である。いくつかの場合において、該天然の配列は、該第一の遺伝子の5'-末端に機能的に連結されて、融合遺伝子を規定し、かつ該第二のプロモーターは、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質の天然のプロモーターであり、かつ該第二のプロモーターは、該融合遺伝子の5'-末端に機能的に連結されている。いくつかの実施態様において、該第一のプロモーターは、第二のプロモーターの5'-末端に機能的に連結されており、該第二のプロモーターは、修飾されたUTRの5'-末端に機能的に連結されており、かつ該修飾されたUTRは、融合遺伝子の5'末端に機能的に連結されている。
【００１１】
一態様において、本開示は、第一及び第二のプロモーターを含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になり、ここで、該第一のプロモーターが誘導性プロモーターであり、かつ小分子によって誘導可能であり;該第一及び第二のプロモーターが第一の遺伝子に機能的に連結されており;かつ該第一の遺伝子が3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)(もしくはその塩)又は補酵素B12の合成に関与するタンパク質をコードする、核酸を提供する。
【００１２】
全ての態様のいくつかの実施態様において、該第一の遺伝子は、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)(又はその塩)の合成に関与するタンパク質をコードし、かつグリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼリアクティバーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される。いくつかの場合において、該第一の遺伝子は、dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、gdrB、及びkgsAからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子を含む。いくつかの例において、該第一の遺伝子は、dhaB1遺伝子、dhaB2遺伝子、dhaB3遺伝子、gdrA遺伝子、及びgdrB遺伝子を含む。
【００１３】
いくつかの実施態様において、該第一の遺伝子はdhaB1であり、かつその配列は、配列番号1と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、該第一の遺伝子はdhaB2であり、かつその配列は、配列番号2と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、該第一の遺伝子はdhaB3であり、かつその配列は、配列番号3と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００１４】
全ての態様のいくつかの実施態様において、該第一の遺伝子はgdrAであり、かつその配列は、配列番号4と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、該第一の遺伝子はgrdBであり、かつその配列は、配列番号5と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００１５】
全ての態様のいくつかの実施態様において、該第一の遺伝子は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含むか、アルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子からなるか、又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子から本質的になる。いくつかの例において、該アルデヒドデヒドロゲナーゼは、kgsAである。いくつかの場合において、kgsAは、配列番号6と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００１６】
全ての態様のいくつかの実施態様において、小分子は、酸又はアルコールである。いくつかの場合において、小分子酸又はアルコールは、L-乳酸(LAC)、酢酸(AcOH)、プロピオン酸(PA)、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、3-ヒドロキシブチレート(3-HB)、1,3-プロパンジオール(1,3-PDO)、2,3-ブタンジオール(2,3-BDO)、L-バリン(L-val)、及び3-ヒドロキシイソブチレート(3-HIB)、又はこれらの塩からなる群から選択される。いくつかの例において、小分子酸又はアルコールは、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、3-ヒドロキシブチレート(3-HB)、L-バリン(L-val)、及び3-ヒドロキシイソブチレート(3-HIB)からなる群から選択される。いくつかの場合において、小分子は、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)(又はその塩)である。
【００１７】
全ての態様のいくつかの実施態様において、核酸は、配列番号65と少なくとも85％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、核酸は、配列番号65を含むか、配列番号65からなるか、又は配列番号65から本質的になる。
【００１８】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第二のプロモーターは、第一のプロモーターの3'-末端に機能的に連結されており、かつ第一の遺伝子は、該第二のプロモーターの機能的に下流にある。全ての態様のいくつかの実施態様において、第一のプロモーターは、第二のプロモーターの3'-末端に機能的に連結されており、かつ第一の遺伝子は、該第二のプロモーターの機能的に下流にある。
【００１９】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第二のプロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの例において、第二のプロモーターは、第二の誘導性プロモーターである。いくつかの場合において、第一のプロモーターと第二のプロモーターの間の遺伝子間スペースは、ターミネーター配列を含まない。いくつかの例において、第一のプロモーター及び第二のプロモーターは、第一の遺伝子の発現を調節する。
【００２０】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第一のプロモーターは、PmmsAプロモーター、PhbdH-1プロモーター、PhbdH-4プロモーター、又はPhpdHプロモーターに由来する。いくつかの例において、第一のプロモーターは、配列番号14(PmmsAプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、第一のプロモーターは、配列番号13(PhbdH-1プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、第一のプロモーターは、配列番号11(PhbdH-4プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、第一のプロモーターは、配列番号12(PhpdHプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、第一のプロモーターは、配列番号11;配列番号12;配列番号13;及び配列番号14からなる群から選択される配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００２１】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第一のプロモーターは、PmmsAプロモーターを含むか、PmmsAプロモーターからなるか、又はPmmsAプロモーターから本質的になり、かつ核酸は、PmmsAプロモーターの5'-末端に機能的に連結されたオペレーター部位をさらに含む。いくつかの場合において、本明細書に記載される核酸は、配列番号15と95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、本明細書に記載される核酸は、配列番号16(MmsAオペレーターのO1)と95％同一である配列及び配列番号17(MmsAオペレーターのO2)と95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。全ての態様のいくつかの実施態様において、本明細書に記載される核酸は、配列番号18(PmmsA及びオペレーター、図3)と95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、本明細書に記載される核酸は、配列番号15、18、19(PmmsA2a)、20(PmmsA2b)、及び21(PmmsA2ab)からなる群から選択される配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００２２】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第二のプロモーターは、PmmsAプロモーター、PhbdH-1プロモーター、PhbdH-4プロモーター、PhpdHプロモーター、又はPzwfプロモーターに由来する。いくつかの場合において、第二のプロモーターは、配列番号11(PhbdH-4プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、第二のプロモーターは、配列番号12(PhpdHプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。全ての態様のいくつかの実施態様において、第二のプロモーターは、配列番号14(PmmsAプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、第二のプロモーターは、配列番号13(PhbdH-1プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。全ての態様のいくつかの実施態様において、第二のプロモーターは、配列番号7(Pzwf)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、第二のプロモーターは、配列番号8(Pzwf-1)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、第二のプロモーターは、配列番号9と少なくとも95％同一である配列(Pzwf-7)を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。全ての態様のいくつかの実施態様において、第二のプロモーターは、配列番号62(より短いPzwf-7)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、第二のプロモーターは、配列番号10(Pzwf-12)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、第二のプロモーターは、配列番号7、8、9、10、11、12、13、14、52〜60、61、62、及び63(例えば、Pzwfプロモーター)からなる群から選択される配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００２３】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第一のプロモーターは、PmmsAプロモーターを含むか、PmmsAプロモーターからなるか、又はPmmsAプロモーターから本質的になり、かつ第二のプロモーターは、PhbdH-4プロモーターを含むか、PhbdH-4プロモーターからなるか、又はPhbdH-4プロモーターから本質的になる。いくつかの場合において、第一のプロモーターは、配列番号14(PmmsAプロモーター配列)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になり、かつ第二のプロモーターは、配列番号11(PhbdH-4プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、第一のプロモーターは、PhbdH-1プロモーターを含むか、PhbdH-1プロモーターからなるか、又はPhbdH-1プロモーターから本質的になり、かつ第二のプロモーターは、PhpdHプロモーターを含むか、PhpdHプロモーターからなるか、又はPhpdHプロモーターから本質的になる。いくつかの場合において、第一のプロモーターは、配列番号13(PhbdH-1プロモーター配列)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になり、かつ第二のプロモーターは、配列番号12(PhpdHプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００２４】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第二のプロモーターは、PhbdHプロモーターを含むか、PhbdHプロモーターからなるか、又はPhbdHプロモーターから本質的になり、かつ核酸はさらに、該PhbdHプロモーターのN-末端に機能的に連結されたオペレーター部位を含むか、該オペレーター部位からなるか、又は該オペレーター部位から本質的になる。いくつかの場合において、該オペレーター部位は、配列番号RBS-1、RBS-2、ABS-1、ABS-2、及びABS-3と少なくとも95％同一である1以上の配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、該オペレーター部位は、配列番号RBS-1部位及びABS-2と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、該オペレーター部位は、配列番号RBS-1部位及びABS-2を含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になる。
【００２５】
全ての態様のいくつかの実施態様において、核酸はさらに、第一の遺伝子の発現を調節する転写調節因子をコードする遺伝子を含むか、該遺伝子からなるか、又は該遺伝子から本質的になる。いくつかの例において、該転写調節因子は、第一又は第二のプロモーターに結合する。いくつかの場合において、該転写調節因子は、LysR型転写調節因子(LTTR)である。いくつかの実施態様において、該転写調節因子は、MmsR又はHpdRである。いくつかの場合において、該転写調節因子は、MmsRである。
【００２６】
全ての態様のいくつかの実施態様において、転写調節因子は、第一のプロモーターに結合する。いくつかの場合において、転写調節因子は、mmsRタンパク質に由来し、かつ第一のプロモーターは、PmmsAプロモーターに由来する。いくつかの場合例において、転写調節因子は、mmsRタンパク質を含むか、mmsRタンパク質からなるか、又はmmsRタンパク質から本質的になり、かつ第一のプロモーターは、PmmsAプロモーターを含むか、PmmsAプロモーターからなるか、又はPmmsAプロモーターから本質的になる。
【００２７】
全ての態様のいくつかの実施態様において、本明細書に記載される核酸はさらに、オペレーター部位を含むか、オペレーター部位からなるか、又はオペレーター部位から本質的になり、ここで、MmsRタンパク質は、該オペレーター部位に結合する。いくつかの例において、本明細書に記載される核酸は、配列番号19(PmmsA2a)と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、本明細書に記載される核酸は、配列番号19〜21(PmmsA2a、A2b、A2ab)からなる群から選択される配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、転写調節因子は、第二のプロモーターに結合する。全ての態様のいくつかの実施態様において、第二のプロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの場合において、転写調節因子は、HpdRタンパク質であり、かつ第二のプロモーターは、hpdHプロモーターに由来する。いくつかの例において、第二のプロモーターは、配列番号12のPhpdHの配列と少なくとも95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００２８】
全ての態様のいくつかの実施態様において、転写調節因子は、第一のプロモーターに結合し、かつ小分子の存在下で該第一のプロモーターに対する増強された結合を有する。いくつかの場合において、転写調節因子は、第二のプロモーターに結合し、かつ小分子の存在下で該第二のプロモーターに対する増強された結合を有する。いくつかの例において、転写調節因子は、自己調節性である。いくつかの場合において、本明細書に記載される核酸はさらに、第一の転写調節因子をコードする遺伝子に機能的に連結されている第三のプロモーターを含むか、該第三のプロモーターからなるか、又は該第三のプロモーターから本質的になる。
【００２９】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第三のプロモーターは、配列番号7〜10及び52〜63からなる群から選択される配列と95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、第二の構成的プロモーターは、配列番号9、10、57〜60、62、及び63からなる群から選択され;転写調節因子は、MmsRタンパク質を含むか、MmsRタンパク質からなるか、又はMmsRタンパク質から本質的になり;かつ第一のプロモーターは、PmmsAを含むか、PmmsAからなるか、又はPmmsAから本質的になる。いくつかの例において、第二の構成的プロモーターは、配列番号9、10、57〜60、62、及び63からなる群から選択され;転写調節因子は、HpdRタンパク質を含むか、HpdRタンパク質からなるか、又はHpdRタンパク質から本質的になり;かつ第一のプロモーターは、PhbdHを含むか、PhbdHからなるか、又はPhbdHから本質的になる。いくつかの場合において、第三のプロモーターは、配列番号10を含むか、配列番号10からなるか、又は配列番号10から本質的になる。いくつかの場合において、第三のプロモーターは、配列番号62を含むか、配列番号62からなるか、又は配列番号62から本質的になる。
【００３０】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第一の遺伝子は、該遺伝子の修飾された5'UTRを含むか、該遺伝子の修飾された5'UTRからなるか、又は該遺伝子の修飾された5'UTRから本質的になる。いくつかの例において、第一の遺伝子は、配列番号22〜28及び64(UTR 0〜6)からなる群から選択される配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、5'UTRは、配列番号28(UTR-6)を含むか、配列番号28(UTR-6)からなるか、又は配列番号28(UTR-6)から本質的になる。いくつかの例において、第一の遺伝子は、kgsAをコードする遺伝子を含むか、kgsAをコードする遺伝子からなるか、又はkgsAをコードする遺伝子から本質的になり、かつ5'UTRは、配列番号28(UTR-6)を含むか、配列番号28(UTR-6)からなるか、又は配列番号28(UTR-6)から本質的になる。
【００３１】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第一の遺伝子の5'末端の少なくとも10個のコドンは、シュードモナス・デニトリフィカンスにおける翻訳のために最適化されている。いくつかの場合において、第一の遺伝子の5'末端の最大10個のコドンは、シュードモナス・デニトリフィカンスにおける翻訳のために最適化されている。いくつかの例において、コドン最適化は:天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする遺伝子における各々のアミノ酸のコドン頻度を測定すること;該天然のタンパク質のコドン頻度を用いて、該第一の遺伝子の5'-末端の10個のコドンを最適化された10個のコドンと交換することを含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になり、ここで、最適化された10個のコドンの各々のアミノ酸に対するコドンは、該天然のタンパク質のコドン頻度と同じ頻度で存在する。いくつかの場合において、最適化された第二の10個のコドン中の各々のアミノ酸のコドン頻度は、0よりも大きい。いくつかの例において、該コドン頻度は、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする遺伝子の5'末端の10個のコドン中の各々のアミノ酸について測定される。
【００３２】
全ての態様のいくつかの実施態様において、核酸は、配列番号29、30、及び31(Opt1〜3)からなる群から選択される配列と95％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、第一の遺伝子は、kgsAをコードする遺伝子を含むか、kgsAをコードする遺伝子からなるか、又はkgsAをコードする遺伝子から本質的になり、かつ配列番号29〜31からなる群から選択される配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、第一の遺伝子は、その5'-末端で、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする第二の遺伝子の5'末端に由来する最大20個のアミノ酸をコードする配列に融合されており、それにより、融合遺伝子を生み出す。いくつかの場合において、融合遺伝子のmRNAは、第一の遺伝子のみのmRNAよりも高い安定性を有する。いくつかの例において、融合遺伝子は、第一の遺伝子のみと比較したとき、遺伝子翻訳を増大させる。全ての態様のいくつかの実施態様において、融合遺伝子のmRNAは、第一の遺伝子のみのmRNAよりもリボヌクレアーゼ分解に対して抵抗性が大きい。いくつかの場合において、融合遺伝子は、第一の遺伝子のみと比較して、遺伝子翻訳を増大させる。
【００３３】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第一の遺伝子は、その5'-末端で、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする第二の遺伝子の5'末端に由来する最大20個(5個、10個、15個、又は20個)のアミノ酸をコードする配列に融合されており、それにより、融合遺伝子を生み出し、かつ第二のプロモーターは、該第二の遺伝子の天然のプロモーターに由来する。いくつかの場合において、第二のプロモーターは、PmmsAプロモーターに由来し、かつ融合遺伝子は、天然のMmsAタンパク質のN-末端の少なくとも5、10、15、又は20個のアミノ酸をコードする配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、第二のプロモーターは、PmmsAプロモーターを含むか、PmmsAプロモーターからなるか、又はPmmsAプロモーターから本質的になり、かつ融合遺伝子は、天然のMmsA遺伝子のN-末端由来の5以上のアミノ酸をコードする配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になり、かつ融合遺伝子は、該PmmsAプロモーターの3'末端に機能的に連結されている。いくつかの場合において、核酸は、配列番号32〜35からなる群から選択される配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００３４】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第一の遺伝子は、その5'-末端で、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスMmsAタンパク質のN-末端をコードする配列に由来する最大20個(5個、10個、15個、又は20個)のアミノ酸をコードする配列に融合されている。いくつかの場合において、本明細書に記載される核酸は、配列番号32〜35(Pcm-mmsA(5)(10)(15)(20))からなる群から選択される配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００３５】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第一の遺伝子は、ビタミンB12の合成に関与するタンパク質をコードする。いくつかの場合において、第一の遺伝子は、cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM、及びcobVからなる群から選択される遺伝子を含むか、該遺伝子からなるか、又は該遺伝子から本質的になる。いくつかの例において、第一の遺伝子は、bgpMを含むか、bgpMからなるか、又はbgpMから本質的になる。いくつかの場合において、第一の遺伝子は、P.デニトリフカンス;緑膿菌(P.aeruginosa); P.エントモフィラ(P.entomophila); P.プチダ(P.putida); P.シリンガエ(P.syringae); P.フルオレセンス(P.fluorescens); P.メンドシナ(P mendocina);及びP.スタッツェリ(P.stutzeri)からなる群から選択されるシュードモナス属種に由来する。
【００３６】
別の態様において、本開示は、補酵素B12の合成に関与するタンパク質をコードする第一の遺伝子に機能的に連結された第一のプロモーターを含むか、該第一のプロモーターからなるか、又は該第一のプロモーターから本質的になる核酸を提供する。いくつかの場合において、該第一のプロモーターは、構成的プロモーターである。いくつかの例において、該核酸は、配列番号7〜10及び52〜63から選択される配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。全ての態様のいくつかの実施態様において、該第一の遺伝子は、cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM、及びcobVからなる群から選択される1以上の遺伝子を含むか、該遺伝子からなるか、又は該遺伝子から本質的になる。いくつかの場合において、該第一の遺伝子は、P.デニトリフカンス;緑膿菌; P.エントモフィラ; P.プチダ; P.シリンガエ; P.フルオレセンス; P.メンドシナ;及びP.スタッツェリからなる群から選択されるシュードモナス属種由来のものである。
【００３７】
全ての態様のいくつかの実施態様において、本明細書に記載される核酸はさらに、第一のプロモーターに機能的に連結された第二のプロモーターを含むか、該第二のプロモーターからなるか、又は該第二のプロモーターから本質的になる。いくつかの場合において、第一及び第二のプロモーターは、第一の遺伝子の発現を調節する。いくつかの例において、第一のプロモーターは、第一の遺伝子の天然のプロモーターではない。
【００３８】
別の態様において、本開示は、cobG遺伝子、Peddプロモーター、PsucAプロモーター、及びcobL遺伝子を含み;ここで、PeddプロモーターがcobG遺伝子及びPsucAプロモーターに機能的に連結されており、かつ該PsucAプロモーターがcobL遺伝子に機能的に連結されている、核酸を提供する。いくつかの場合において、Peddプロモーターは、配列番号36の配列を含むか、配列番号36の配列からなるか、又は配列番号36の配列から本質的になり;かつPsucAプロモーターは、配列番号37の配列を含むか、配列番号37の配列からなるか、又は配列番号37の配列から本質的になる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される核酸は、配列番号38の配列を含むか、配列番号38の配列からなるか、又は配列番号38の配列から本質的になる。
【００３９】
一態様において、本開示は、cobG遺伝子、Psp9プロモーター、Pzwfプロモーター、及びcobL遺伝子を含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になり;ここで、該Psp9プロモーターがcobG遺伝子及びPzwfプロモーターに機能的に連結されており、かつ該PzwfプロモーターがcobL遺伝子に機能的に連結されている、核酸を提供する。いくつかの場合において、Psp9プロモーターは、配列番号39を含むか、配列番号39からなるか、又は配列番号39から本質的になり;かつPzwfプロモーターは、配列番号40を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される核酸は、配列番号41を含むか、配列番号41からなるか、又は配列番号41から本質的になる。
【００４０】
一態様において、本開示は、cobW遺伝子、Pzwfプロモーター、Psp9プロモーター、及びcbtB遺伝子を含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になり、ここで、PzwfプロモーターがcobW遺伝子及びPsp9プロモーターに機能的に連結されており、かつ該Psp9プロモーターがcbtB遺伝子に機能的に連結されている、核酸を提供する。いくつかの場合において、Pzwfプロモーターは、配列番号42を含み;かつPsp9プロモーターは、配列番号43を含む。いくつかの例において、本明細書に記載される核酸は、配列番号44を含むか、配列番号44からなるか、又は配列番号44から本質的になる。
【００４１】
一態様において、本開示は、cobW遺伝子、Ptktプロモーター、Psp2プロモーター、及びcbtB遺伝子を含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になり、ここで、PtktプロモーターがcobW遺伝子及びPsp2プロモーターに機能的に連結されており、かつ該Psp2プロモーターがcbtB遺伝子に機能的に連結されている、核酸を提供する。いくつかの例において、Ptktプロモーターは、配列番号45を含むか、配列番号45からなるか、又は配列番号45から本質的になり;かつPsp2プロモーターは、配列番号46を含むか、配列番号46からなるか、又は配列番号46から本質的になる。いくつかの場合において、本明細書に記載される核酸は、配列番号47を含むか、配列番号47からなるか、又は配列番号47から本質的になる。
【００４２】
一態様において、本開示は、tonB遺伝子(例えば、butB遺伝子)に機能的に連結されたPzwfプロモーターを含むか、該Pzwfプロモーターからなるか、又は該Pzwfプロモーターから本質的になる核酸を提供する。いくつかの場合において、Pzwfプロモーターは、配列番号48を含むか、配列番号48からなるか、又は配列番号48から本質的になる。いくつかの例において、本明細書に記載される核酸は、配列番号49を含むか、配列番号49からなるか、又は配列番号49から本質的になる。
【００４３】
一態様において、本開示は、tonB遺伝子(例えば、butB遺伝子)に機能的に連結されたPsp9プロモーターを含むか、該Psp9プロモーターからなるか、又は該Psp9プロモーターから本質的になる核酸を提供する。いくつかの場合において、Psp9プロモーターは、配列番号50を含むか、配列番号50からなるか、又は配列番号50から本質的になる。いくつかの例において、本明細書に記載される核酸は、配列番号51を含むか、配列番号51からなるか、又は配列番号51から本質的になる。
【００４４】
全ての態様のいくつかの実施態様において、核酸は、シュードモナス・デニトリフィカンスに由来する1以上の配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、第一又は第二のプロモーターは、シュードモナス・デニトリフィカンスに由来する。いくつかの例において、核酸は、エンテロバクター属(Enterobacter)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、シュードモナス属(Pseudomonas)、又はアゾスピリルム属(Azospirillum)の細菌に由来する1以上の配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの場合において、第一の遺伝子は、エンテロバクター属、ラクトバチルス属、シュードモナス属、又はアゾスピリルム属細菌に由来する。
【００４５】
一態様において、本開示は、配列番号66(DhaB発現モジュール)と少なくとも85％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になるDhaB発現モジュールを含む核酸を提供する。いくつかの場合において、該配列は、配列番号66と少なくとも90％同一である。いくつかの例において、本明細書に記載される核酸は、配列番号66を含むか、配列番号66からなるか、又は配列番号66から本質的になる。
【００４６】
一態様において、本開示は、配列番号67(kgsA発現モジュール)と少なくとも85％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になるDhaB発現モジュールを含む核酸を提供する。いくつかの場合において、該配列は、配列番号67と少なくとも90％同一である。いくつかの例において、該配列は、配列番号67を含むか、配列番号67からなるか、又は配列番号67から本質的になる。
【００４７】
一態様において、本開示は、配列番号68を含むか、配列番号68からなるか、又は配列番号68から本質的になるgdrA遺伝子のUTR及び配列番号69を含むか、配列番号69からなるか、又は配列番号69から本質的になるgdrB遺伝子のUTRを含むか、これらのUTRからなるか、又はこれらのUTRから本質的になるDhaB発現モジュールを含む核酸を提供する。いくつかの場合において、該核酸は、配列番号70〜72からなる群から選択される配列と少なくとも85％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。いくつかの例において、該核酸は、配列番号70〜72からなる群から選択される配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００４８】
一態様において、本開示は、配列番号73及び74からなる群から選択される配列と少なくとも85％同一である配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる補酵素B12センサーを含む核酸を提供する。いくつかの場合において、本明細書に記載される核酸は、配列番号73及び74からなる群から選択される配列を含むか、該配列からなるか、又は該配列から本質的になる。
【００４９】
一態様において、本開示は、補酵素B12の合成に関与する第一の遺伝子、小分子によって誘導される第一のプロモーター、及び第二のプロモーターを含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になる補酵素B12発現モジュールを含むか、該補酵素B12発現モジュールからなるか、又は該補酵素B12発現モジュールから本質的になり、ここで、該第一及び第二のプロモーターが、該第一の遺伝子の発現を調節するように、該第一の遺伝子の上流でタンデムに機能的に連結されている、核酸を提供する。いくつかの場合において、該核酸はさらに、補酵素B12の合成に関与する第二の遺伝子、小分子によって誘導される第三のプロモーター、及び第四のプロモーターを含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になり、ここで、該第三及び第四のプロモーターは、該第二の遺伝子の発現を調節するように、該第二の遺伝子の上流でタンデムに機能的に連結されている。全ての態様のいくつかの実施態様において、核酸はさらに、補酵素B12の合成に関与する第三の遺伝子、小分子によって誘導される第五のプロモーター、及び第六のプロモーターを含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になり、ここで、該第五及び第六のプロモーターは、該第三の遺伝子の発現を調節するように、該第三の遺伝子の上流でタンデムに機能的に連結されている。いくつかの場合において、核酸はさらに、補酵素B12の合成に関与する第四の遺伝子、小分子によって誘導される第七のプロモーター、及び第八のプロモーターを含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になり、ここで、該第七及び第八のプロモーターは、該第四の遺伝子の発現を調節するように、該第四の遺伝子の上流でタンデムに機能的に連結されている。いくつかの例において、該第一、第二、第三、及び第四の遺伝子は、各々、cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM、及びcobVからなる群から選択される1以上の遺伝子を含むか、該遺伝子からなるか、又は該遺伝子から本質的になる。いくつかの場合において、該第一の遺伝子は、bgpMを含むか、bgpMからなるか、又はbgpMから本質的になる。
【００５０】
全ての態様のいくつかの実施態様において、核酸は、補酵素B12の産生に関与する遺伝子を調節する任意の天然のリボスイッチを含まない。いくつかの場合において、核酸は、配列番号75又は76を含まない。
【００５１】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される核酸を含むか、本明細書に記載される核酸からなるか、又は本明細書に記載される核酸から本質的になる組換え細菌を提供する。いくつかの場合において、細菌は、シュードモナス属種である。いくつかの例において、細菌は、シュードモナス・デニトリフィカンスである。
【００５２】
全ての態様のいくつかの実施態様において、核酸は、発現プラスミド上にある。いくつかの場合において、核酸は、細菌の染色体に組み込まれている。いくつかの例において、核酸は、エピソーム上にある。
【００５３】
別の態様において、本開示は、DhaB発現モジュールを含むか、DhaB発現モジュールからなるか、又はDhaB発現モジュールから本質的になる第一の核酸及びALDH発現モジュールを含むか、ALDH発現モジュールからなるか、又はALDH発現モジュールから本質的になる第二の核酸を含むか、該核酸からなるか、又は該核酸から本質的になる組換え細菌を提供する。いくつかの場合において、DhaB発現モジュールは、本明細書に記載される核酸のいずれか1つを含むか、本明細書に記載される核酸のいずれか1つからなるか、又は本明細書に記載される核酸のいずれか1つから本質的になる。いくつかの例において、ALDH発現モジュールは、本明細書に記載される核酸のいずれか1つを含むか、本明細書に記載される核酸のいずれか1つからなるか、又は本明細書に記載される核酸のいずれか1つから本質的になる。
【００５４】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第一及び第二の核酸は、発現プラスミド上にある。いくつかの場合において、第一及び第二の核酸は、エピソーム上にある。いくつかの例において、第一及び第二の核酸は、細菌の染色体に組み込まれている。いくつかの場合において、第一の核酸は、細菌の染色体に組み込まれており、かつ第二の核酸は、発現プラスミド上にある。いくつかの例において、第一の核酸は、発現プラスミド上にあり、かつ第二の核酸は、細菌の染色体に組み込まれている。全ての態様のいくつかの実施態様において、第一の核酸は、細菌の染色体に組み込まれており、かつ第二の核酸は、エピソーム上にある。いくつかの例において、第一の核酸は、エピソーム上にあり、かつ第二の核酸は、細菌の染色体に組み込まれている。
【００５５】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第一の核酸は、第一の位置で細菌の染色体に組み込まれており、かつ第二の核酸は、第二の位置で細菌の染色体に組み込まれており;かつ該第一及び該第二の位置は、互いの2500キロ塩基対以内にある。いくつかの場合において、該第一及び第二の位置は、互いの100キロ塩基対以内にある。いくつかの例において、該第一及び第二の位置は、互いの50キロ塩基対以内にある。いくつかの場合において、該第一及び第二の位置は、互いの1000塩基対以内にある。
【００５６】
全ての態様のいくつかの実施態様において、第一の核酸は、複製起点の4000塩基対以内にある第一の位置で細菌の染色体に組み込まれている。いくつかの場合において、該第一の位置は、複製起点の1000塩基対以内にある。
【００５７】
別の態様において、本開示は、補酵素B12の合成に関与する第一の遺伝子、小分子によって誘導される第一のプロモーター、及び第二のプロモーターを含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になり、ここで、該第一及び第二のプロモーターが該第一の遺伝子の上流でタンデムに機能的に連結されている、補酵素B12発現モジュールを含むか、該補酵素B12発現モジュールからなるか、又は該補酵素B12発現モジュールから本質的になる組換え細菌を提供する。
【００５８】
全ての態様のいくつかの実施態様において、細菌は、シュードモナス・デニトリフィカンス細菌である。いくつかの場合において、細菌は、第一の遺伝子の発現を調節する第一のリボスイッチの第一の位置における欠失を含むか、該欠失からなるか、又は該欠失から本質的になり、かつ第一及び第二のプロモーターは、該第一の遺伝子の発現を調節するように、該第一の位置で細菌の染色体に組み込まれている。いくつかの例において、細菌はさらに、補酵素B12の合成に関与する第二の遺伝子の発現を調節する第二のリボスイッチの第二の位置における第二の欠失、補酵素B12の合成に関与する第三の遺伝子の発現を調節する第三のリボスイッチの第三の位置における第三の欠失、及び補酵素B12の合成に関与する第四の遺伝子の発現を調節する第四のリボスイッチの第四の位置における第四の欠失を含むか、これらからなるか、又はこれらから本質的になる。いくつかの場合において、組換え細菌はさらに、第二の遺伝子の発現を調節するように、タンデムに機能的に連結され、かつ第二の位置で染色体に組み込まれている、第三のプロモーター及び第四のプロモーター;第三の遺伝子の発現を調節するように、タンデムに機能的に連結され、かつ第三の位置で該染色体に組み込まれている、第五のプロモーター及び第六のプロモーター;並び第四の遺伝子の発現を調節するにように、タンデムに機能的に連結され、かつ第四の位置で該染色体に組み込まれている、第七及び第八のプロモーターを含むか、これらのプロモーターからなるか、又はこれらのプロモーターから本質的になる。全ての態様のいくつかの実施態様において、細菌は、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスよりも多くの補酵素B12を産生する。全ての態様のいくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換え細菌はさらに、補酵素B12発現モジュールを含むか、補酵素B12発現モジュールからなるか、又は補酵素B12発現モジュールから本質的になる。
【００５９】
別の態様において、本開示は、本明細書に記載される組換え細菌を、3-HP又はその塩を産生するのに十分な条件下で培養することを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる、3-HP又はその塩を産生する方法を提供する。いくつかの場合において、該条件は、少なくとも85g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である。いくつかの例において、該条件は、少なくとも90g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である。全ての態様のいくつかの実施態様において、該条件は、少なくとも95g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である。いくつかの場合において、該条件は、少なくとも100g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である。
【００６０】
全ての態様のいくつかの実施態様において、細菌を培養することは、外部補酵素B12の添加を含まない。いくつかの場合において、細菌を培養することは、培養物への外部補酵素B12の添加を含む。
【００６１】
いくつかの場合において、培養することは、細菌を、グリセロール、グルコース、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、及びクエン酸からなる群から選択される炭素源を含む培地中で増殖させることを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる。いくつかの例において、培養することは、グリセロールを添加することにより、細菌を誘導して、3-HP又はその塩を産生することを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる。いくつかの場合において、グリセロールは、対数期中期に添加される。
【００６２】
全ての態様のいくつかの実施態様において、培養することは、細菌を、酵母抽出物、コーンスティープリカー粉末、及びコーンスティープリカーペーストからなる群から選択される窒素源を含む培地中で増殖させることを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる。
【００６３】
全ての態様のいくつかの実施態様において、培養することは、細菌を、6.8〜7.8のpHで増殖させることを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる。いくつかの場合において、培養することは、NaOH、KOH、NaHCO3、NH4HCO3、NH4OH、(NH4)2CO3、及びNa2CO3からなる群から選択される1以上の塩基を添加することを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる。いくつかの例において、培養することは、NaOH、KOH、NaHCO3、NH4HCO3、NH4OH、(NH4)2CO3、及びNa2CO3からなる群から選択される少なくとも1つの塩基を添加することを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる。いくつかの場合において、培養することは、塩基濃度を希釈すること及び酸濃度を増大させることを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる(図46及び図49を参照)。
【００６４】
全ての態様のいくつかの実施態様において、培養することは、細菌を摂氏28〜40度の温度で増殖させることを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる。いくつかの場合において、培養することは、細菌を摂氏33度で増殖させることを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる。
【００６５】
別の態様において、本開示は、3-HP又はその塩を産生する方法であって:本明細書に記載される組換え細菌を、該細菌の増殖及び3-HP又はその塩の産生に好適な培養培地中で提供することを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる、方法を提供する。いくつかの場合において、本明細書に記載される方法は、3-HP又はその塩を該細菌又は該培養培地から分離することを含むか、そのことからなるか、又はそのことから本質的になる。
【００６６】
いくつかの例において、培養培地は、約2〜20％溶存酸素である溶存酸素濃度を含むか、該溶存酸素濃度からなるか、又は該溶存酸素濃度から本質的になる。全ての態様のいくつかの実施態様において、溶存酸素濃度は、20％以下である。いくつかの場合において、溶存酸素濃度は、少なくとも2％である。
【００６７】
さらに、本開示は、3-ヒドロキシプロピオン酸を提供し、それを反応させる方法に関する。
【００６８】
本開示は、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から除去する方法を提供する。本方法は、実施するのが比較的簡単でかつ安価であり得る。本方法は、比較的高収率の3-HPを提供することができる。
【００６９】
本開示は、アクリル酸を製造する方法も提供する。本方法は、実施するのが比較的簡単でかつ安価であり得る。本方法は、アクリル酸重合をほとんど又は全く起こさないで実施することができる。本方法は、比較的高収率のアクリル酸を提供することができる。
【００７０】
一態様において、本開示は、向流液体フローを使用しないで、3-HPを水溶液から除去する方法を提供する。
【００７１】
別の態様において、本開示は、第一の溶媒を蒸発させること、該蒸発した第一の溶媒を凝縮させること、及び該第一の溶媒のフローの向きを変えて、3-HPを水溶液から除去することを含む方法を提供する。
【００７２】
別の態様において、本開示は、水不混和性溶媒を用いて、3-HPを水溶液から少なくとも50％の収率で除去することを含む方法を提供する。
【００７３】
別の態様において、本開示は、少なくとも2つの溶媒を含む有機液を用いて、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から除去することを含む方法を提供する。
【００７４】
別の態様において、本開示は、液体を用いて、3-HPを水溶液から除去することを含み、ここで、該液体が、2つの異なる溶媒(例えば、水混和性溶媒及び水不混和性溶媒)を含む、方法を提供する。
【００７５】
別の態様において、本開示は、3-HPを水溶液から除去することを含み、ここで、該水溶液のpHが少なくとも約3である、方法を提供する。
【００７６】
別の態様において、本開示は、3-HPを反応させて、約1大気圧未満の圧力でアクリル酸を形成させることを含む方法を提供する。
【００７７】
別の態様において、本開示は、3-HPを反応させて、反応混合物中でアクリル酸を形成させること、及びガス状アクリル酸を該反応混合物から除去することを含む方法を提供する。
【００７８】
別の態様において、本開示は、3-HPを含む液体を反応させて、アクリル酸を形成させることを含む方法を提供する。
【００７９】
別の態様において、本開示は、3-HPを反応させて、少なくとも約70％の収率でアクリル酸を形成させることを含む方法を提供する。
【００８０】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的及び科学的用語は、本開示が属する分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。方法及び材料は、本開示での使用について本明細書に記載されており;当技術分野で公知の他の好適な方法及び材料も使用することができる。材料、方法、及び実施例は、例示的であるに過ぎず、限定することを意図するものではない。本明細書で言及される刊行物、特許出願、特許、配列、データベースエントリー、及び他の参考文献は全て、引用により完全に組み込まれる。矛盾がある場合、定義を含む本開示が優先されることになる。
【００８１】
本開示の他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明及び図面から、及び特許請求の範囲から明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００８２】
(図面の説明)
【図１】図1A〜Bは、シュードモナス・デニトリフィカンスの3-ヒドロキシプロピオネート分解経路におけるLysR型転写アクチベータータンパク質MmsRによる遺伝子発現調節を示す模式図及びグラフである。(図1A)MmsRに基づく調節の仮想上の模式的表示。hpdH、3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ; mmsA、メチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ; hbdH-4、3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼIV。(図1B)様々なインデューサー分子の存在下におけるmmsA(灰色のバー)及びhbdH-4(黒色のバー)の相対的mRNA存在量。
【図２】図2A〜Bは、野生型(WT)及び突然変異体P.デニトリフィカンス株におけるリアルタイムPCRによるmmsA遺伝子(白色のバー)及びhbdH-4遺伝子(黒色のバー)の転写解析を示すグラフである。(図2A)3-HP分解酵素を欠く欠失突然変異体P.デニトリフィカンスΔhpdHΔhbdH4ΔhbdH1(ΔΔΔと表記)におけるmRNAレベル。(図2B)転写アクチベーターMmsRの欠失及び相補時のmRNAレベル。ΔmmsR、P.デニトリフィカンスmmsR欠失突然変異体;及びmmsR-C、プラスミド由来のmmsR-相補を有するP.デニトリフィカンスΔmmsR。
【図３】図3A〜Bは、プロモーター領域を有するmmsR-mmsA遺伝子間領域の模式的解析及び調節タンパク質MmsA結合部位の同定である。(図3A)インビボ及びインビトロでのその特徴解析のためのmmsR-mmsA遺伝子間領域のDNA配列及びプロモーター領域の突然変異。(図3A)PmmsA、(図3B)MmsA結合部位(O1及びO2)の5'-末端マッピング。
【図４】図4A〜Bは、mmsRプロモーター(PmmsR)(図4A)及びmmsAプロモーター(PmmsA)(図4B)における転写活性化にとってのO1及びO2部位の重要性を明らかにするためのインビボ試験を示す模式図及びグラフである。O1又は/及びO2部位をランダム化し、GFPをレポータータンパク質として用いて、O1又は/及びO2部位に突然変異を有するプロモーターの強度を調べた。これらの突然変異をP.デニトリフィカンスΔhpdHΔhbdH1ΔhbdH4ΔmmsRに導入し、発現宿主として使用した。
【図５】図5A〜Eは、組換え大腸菌(E.coli) BL21で、pG-KJE8(図5A)、pGro7(図5B)、pKJE7(図5C)、pG-Tf2(図5D)、及びpTf16(図5E)などの様々なシャペロンプラスミドを援用して、組換えC-Hisタグ化MmsRタンパク質の溶解度を調べるためのSDS-PAGE解析の写真である。MmsR及びシャペロンを有する組換え株の細胞溶解物(T)及び無細胞抽出物(S)を解析した。
【図６】図6A〜Cは、組換えMmsRタンパク質の発現、精製、及びオリゴマー形態を示すゲルの写真である。(図6A)SDS-PAGE、(図6B)Blue Native-PAGE、及び(図6C)N-末端又はC-末端のいずれかにhis-タグを有する組換えMmsRによる相対的mRNAレベル。レーン1、宿主大腸菌BL21(無細胞抽出物);レーン2、IPTG誘導なしで培養された組換え大腸菌BL21(無細胞抽出物);レーン3、4、5、及び7は、それぞれ、組換え大腸菌BL21由来の無細胞抽出物、可溶性画分、不溶性画分、及び精製タンパク質に対応し;レーン9、11、及び13は、それぞれ、65、220、550nMの精製MmsRタンパク質に対応する。
【図７】図7A〜Bは、オペレーター部位へのMmsRタンパク質の結合を調べるためのインビトロ電気移動度シフトアッセイ(EMSA)の写真である。mmsAプロモーター(PmmsA)を含むDNA断片は、インタクトであったか(F12)、又はO2部位(F12M)もしくはO1部位(F1M2)のいずれかで突然変異していた。実験は、3-HP(25mM)の非存在下(上のパネル)及び存在下(下のパネル)で行った。レーン1〜10、0、0.36、0.73、1.45、2.9、5.8、11.6、14.5、及び24.2nMの増加する量のMmsRタンパク質;及びDNA断片を0.4nMで固定した(図7A)。増加する量のMmsRとの反応から得られた電気泳動図(図7B)。MmsRによるDNアーゼI消化から保護されたオペレーター領域。下に、MmsR転写開始部位に対するヌクレオチド位置を与えるスケールがある。
【図８】図8は、MmsRとPmmsAプロモーターの解離定数を推定するための低DNA濃度での電気泳動移動度シフトアッセイの写真である。(F12)オペレーターO1とO2の両方がインタクトであるDNA断片、(F12M)O2オペレーターが突然変異しているDNA断片、及び(F1M2)O1が突然変異しているDNA断片。
【図９】図9は、MmsRタンパク質-DNA結合等温曲線及び結合の解離定数を示すグラフ及び表である。インタクトのプロモーター配列(F12)又は突然変異した配列のいずれかを含むDNA断片を使用した。
【図１０】図10A〜Bは、hpdR-hpdH遺伝子間領域の解析の模式図である。(図10A)推定プロモーター及びオペレーター領域を示すhpdR-hpdH遺伝子間領域のDNA配列。(図10B)オペレーターパリンドロム部位のコンセンサス。
【図１１】図11A〜Bは、hpdR及びhpdHの相対的転写を示すグラフである。(図11A)HpdRは、hpdHの発現を制御する転写因子である。(図11B)2つの3-HP誘導システムHpdRとMmsRの間のクロストークの不在。
【図１２】図12A〜Dは、様々な酸の存在下におけるhpdH転写の相対的誘導性及びGFP蛍光を示すグラフである。(図12A)染色体レベルでの転写、(図12B)プラスミドレベルでのGFP蛍光、(図12C)様々な時間間隔でのGFP蛍光、及び(図12D)様々な3-HP濃度での感度。
【図１３】図13A〜Bは、PC3 3-HP誘導性プロモーターの突然変異ランダム化の位置を示す模式図及び様々なプロモーターの正規化したGFPレベルを示すグラフである。
【図１４】図14A〜Bは、プラスミド及びゲノムレベルでのmmsAとkgsAの転写及び酵素活性の比較を示す一連のグラフである。(図14A)mRNA(転写)と(図14B)KgsA活性の比較。
【図１５】図15A〜Cは、MmsRオペレーター部位ランダム化をKgsA過剰発現に適用した方法を示す一連の模式図である。(図15A)オペレーター突然変異誘発の模式図、(図15B)kgsA mRNA発現レベル、(図15C)選択されたオペレーター突然変異PmmsA2aを用いたGFP蛍光。
【図１６】図16A〜Bは、様々な構成的合成プロモーターを用いるKgsA転写に対するMmsR過剰発現の影響を示す一連のグラフである。(図16A)Pzwfプロモーターライブラリー、(図16B)KgsA転写。
【図１７】図17A〜Dは、KgsAの発現及び酵素活性に対する天然のMmsAタンパク質の融合の効果を示す一連のグラフである。5、10、15、及び20アミノ酸長に相当する様々な長さのmmsA N-末端配列(それぞれ、Hyb-5、Hyb-10、Hyb-15、及びHyb-20と表記)をkgsAの5'-末端DNA配列に連結させた。(図17A)KgsAの酵素活性。(図17B)融合タンパク質を発現する粗細胞抽出物のSDS-PAGE解析。転写物の安定性も測定した(図17C及び17D)。
【図１８】図18A〜Cは、mRNAでのkgsAの発現及び酵素活性に対するタンデムプロモーターの効果を示す一連の模式図及びグラフである。(図18A)タンデムプロモーター及びその転写物の配置; TSS、転写開始部位; RBS、リボソーム結合部位; UTR、5'-非翻訳部位、(図18B)mRNA発現、及び(図18C)KgsA活性。
【図１９】図19A〜Cは、kgsAの発現に対する5'UTRの効果を示す表及びグラフである。(図19A)kgsA発現システムの5'UTR強度の予測。(図19B)0、0.25、及び25mM 3-HPでの様々な誘導によるUTRコンストラクトの比KgsA活性。(図19C)様々な3-HP濃度での理論上の予測と実験的測定の間の5'UTR強度の比較。
【図２０】図20A〜Bは、hbdH-4による3-HPからマロン酸セミアルデヒドへの及びさらにmmsAによるアセチル-CoAへの分解の模式図(図20A)、並びにmmsR-mmsA遺伝子間領域の遺伝子構造及びその調節の模式図(図20B)である。
【図２１】図21A〜Bは、KgsAの最初の10個のコドンが最適化された株のKgsA発現レベルの酵素活性解析(図21A)及びSDS-PAGE解析(図21B)を示すグラフ及び画像である。コドン頻度レベル(高い、中等度、及び低い)に関して異なる3つのコンストラクトを開発し、それぞれ、Opt-1、Opt-2、及びOpt-3と表記した。
【図２２】図22は、KgsAの発現に対するUTR設計の効果を示す一連のSDS-PAGEの画像である。UTRデザイナーによってコンピュータ上で予測された様々な強度を有するUTRを試験した。
【図２３】図23は、P.デニトリフィカンスにおけるビタミンB12(補酵素B12)遺伝子クラスター及びリボスイッチの模式図である。
【図２４】図24は、様々なシュードモナス属種由来の補酵素B12遺伝子の構成の比較解析を示す模式図である。
【図２５】図25A〜Dは、ビタミンB12リボスイッチの構造を示す模式図である。図25Aは、cobGの前にあるRS1の構造を示している。図25Bは、cobWの前にあるRS2の構造を示している。図25Cは、cbtBの前にあるRS3の構造を示している。図25Dは、btuBの前にあるRS4の構造を示している。
【図２６】図26は、シュードモナス・デニトリフィカンスにおける染色体レベルでのcob遺伝子の転写を示すグラフである。
【図２７】図27は、P.デニトリフィカンスにおけるビタミンB12遺伝子間領域のインビボ特徴解析を特徴付ける一連のグラフである。
【図２８】図28は、B12濃度とP.デニトリフィカンス由来の遺伝子cobG及びcbtBの遺伝子間領域に由来するビタミンB12リボセンサーのGFP蛍光の相関関係を示すグラフである。
【図２９】図29A〜Bは、以下のことを示す一連のグラフである。(図29A)遺伝子不可欠性プロファイリングはbgpMをコードする遺伝子のみが補酵素B12生合成に不可欠であることを明らかにした。cob遺伝子クラスター内のいくつかの特徴付けされていない又はあまり理解されていない遺伝子の不可欠性を理解するために、様々な濃度の塩化コバルトを使用した。(図29B)ネズミチフス菌(Salmonella typhimurium) metE- cbiB-とB12リボスイッチに基づくセンサーの両方を用いて、補酵素B12の濃度を定量した。
【図３０】図30A〜Bは、dhaB-gdrAB発現カセットの開発を示す一連の模式図である。(図30A)発現カセット構築の模式図、(図30B)ΔmmsA突然変異体株におけるhbdH-4遺伝子の部位へのkgsA遺伝子の組込み。
【図３１】図31A〜Bは、DhaB-GdrAB発現システムの開発のために使用された転写修飾と翻訳修飾の組合せを示す模式図(図31A)及び染色体への組込みのためのDhaB-GdrAB(DhaB)発現システムの模式図(図31B)である。
【図３２】図32は、KgsAの発現に対するゲノム位置の効果(例えば、染色体組込み後のkgsA遺伝子の位置及びKgsAの活性)を示す一連のポンチ絵(P2-0、P2-10、P2-20、P2-30; DhaBのプラスミドを有さない株)である。数字は、25mM 3-HPによる誘導から4時間後のKgsA活性を示している。
【図３３】図33は、P4-1を作出するためのP2-20株の染色体への又はP4-2を作出するためのP2-10へのDhaB発現カセットのゲノム組込みを示す一連のポンチ絵である。後に、P4-1及びP4-2におけるDhaB-GdrAB発現カセットのプロモーターを減弱させて(DhaB低下)、P4-3及びP4-4株を作出した。
【図３４】図34は、3-HPAチャネリングのための株開発(P4-5)を示すポンチ絵である。P4-5は、DhaBの近くに位置する1コピーのKgsAを有する。
【図３５】図35は、3-HPの産生に対する様々な中和塩基の効果を示すグラフである。
【図３６】図36は、様々な3-HP濃度が補充された培地中の組換え株の修飾を示すグラフである。
【図３７】図37は、50g/Lの濃度の様々な有機酸が補充された培地中の3-HP修飾組換え株(80g/L)の増殖を示すグラフである。
【図３８】図38は、様々なpHの培地中の3-HP修飾組換え株(80g/L)の培養を示すグラフである。
【図３９】図39は、より高いpHでの比増殖速度を改善するための3-HP(80g/L)耐性組換え株の修飾を示すグラフである。
【図４０】図40は、様々なpHでのpH 7.6に適応した3-HP(80g/L)耐性組換え株の培養を示すグラフである。
【図４１】図41は、組換え株で適応したグリセロールからの3-HP合成経路の模式図である。第一の酵素は、酸素に感受性があり、一方、第二の反応は、酸素の存在下で増強される。
【図４２】図42は、3-HP産生に対する様々な溶存酸素濃度の効果を示すグラフである。
【図４３】図43は、3-HP産生に対する様々な温度の効果を示すグラフである。
【図４４】図44は、3-HP産生に対する様々な誘導OD600の効果を示すグラフである。
【図４５】図45は、3-HP産生及び比増殖速度に対するNH4OHの様々な濃度の効果を示すグラフである。
【図４６】図46は、比3-HP力価(％)及び量(％)に対するNH4OH(％)の効果を示すグラフである。
【図４７】図47は、中心炭素代謝におけるアナプレロティック反応を示す模式図である。PPC、PEPカルボキシラーゼ; PEPK、PEPカルボキシキナーゼ、ME、リンゴ酸酵素;及びPC、ピルビン酸カルボキシラーゼ。
【図４８】図48は、3-HPの産生(％)に対する様々な中和剤の効果を示すグラフである。
【図４９】図49は、3-HP力価及び量(％)に対するNH4HCO3の様々な濃度の効果を示すグラフである。
【図５０】図50は、B12リボスイッチの逐次的破壊、プロモーター交換による、及び最後に、タンデムプロモーターの使用による補酵素B12産生の改善の効果とそれによる、市販レベルへの3-HP産生を示すグラフである。
【図５１】図51は、3-HP産生に対する基質チャネリングの効果を示すグラフである。
【図５２】図52は、3-HPの産生(％)に対するNH4OH及びNaOHなどの様々な中和剤の効果を示すグラフである。条件の1つにおいて、発酵から24時間までNH4OHを、その後、最大48時間、NaOHを中和剤として使用した。
【図５３】図53は、バイオリアクターの様々な段階におけるグリセロールデヒドラターゼ(DhaB)及びKgsAのインビトロ酵素活性である。
【図５４】図54は、グリセロールデヒドラターゼ(DhaB)のインビトロ酵素活性に対する様々な毒性中間体の効果を示すグラフである。
【図５５】図55A〜Bは、様々な発現レベルでのDhaBの制御発現のための3-HP誘導性タンデムプロモーターライブラリーの開発を示している。(図55A)タンデムプロモーター構築の模式図、(図55B)様々なタンデムプロモーターライブラリーコンストラクトの比DhaB活性。
【図５６】図56は、PC3プロモーター領域の配列を示す模式図である。
【図５７】図57は、P.デニトリフィカンスにおける天然及び合成の構成的プロモーターの効果を示すグラフである。
【図５８】図58は、水よりも密度が小さい水不混和性溶媒を用いて、水溶液から3-HPを抽出するための例示的なシステムを示している。
【図５９】図59は、水よりも密度が大きい水不混和性溶媒を用いて、水溶液から3-HPを抽出するための例示的なシステムを示している。
【図６０】図60は、反応蒸留によって3-HPからアクリル酸産生するための例示的なシステムを示している。
【図６１】図61は、酢酸エチルを用いて脱細胞化発酵から3-HPを抽出した時の溶媒容器中の3-HPの濃度の増加を示す例示的な線プロットである。
【発明を実施するための形態】
【００８３】
(詳細な説明)
本開示は、3-HP又はその塩をグリセロールから産生するための発現システムが増強された工業用微生物株(例えば、シュードモナス属株を含む)を提供する。3-HP又はその塩の産生に関与する酵素及びその調節領域を工業用株の染色体に組み込んだ。3-HP誘導性プロモーターを同定し、特徴付け、3-HP又はその塩の産生に関与する酵素に機能的に連結させた。3-HP酵素の発現は、3-HP誘導性プロモーターを構成的、誘導性、及び/又は合成的プロモーターと組み合わせ、それにより、タンデムプロモーターシステムを作り出すことにより増大させることができる。タンデムプロモーターシステムをUTR(天然又は合成のいずれか)及び発現を制御又は増強する他の調節ドメインと融合させて、該システムの発現を改善することができる。タンデムプロモーターシステム(例えば、UTRと合体したタンデムプロモーターシステム)を高度に発現される天然遺伝子の最初のアミノ酸をコードする配列(例えば、最大20個のアミノ酸をコードする配列)と融合させることもできる。これらの修飾は、酵素、下流遺伝子、今回のケースでは、3-HP産生(又はその塩の産生)に関与する遺伝子の発現を増大させることができる。さらに、工業用株の染色体におけるこれらの発現システムのポジショニングを検討し、3-HP(又はその塩)産生に対する効果を評価した。発現システムのポジショニングの設計は、毒性3-HPAの蓄積を回避することができ、かつチャネリングを通して3-HP産生を増大させることができる。
【００８４】
さらに、本開示は、補酵素B12(B12)の外部補充なしで高力価の3-HPを産生することができる工業用株を提供する。B12産生経路内の酵素の発現を制御する調節領域を同定し、特徴付けた。これらの調節領域の多く(例えば、二次構造を含む)の除去は、B12酵素の発現を改善した。本明細書に記載される構成的又は3-HP誘導性発現システムの組込みは、天然のB12酵素の発現を増大させ、かつB12産生を増大させることができる。これは、B12の外部添加なしでの3-HP(又はその塩)の産生を可能にする。
【００８５】
本開示は、3-HPを水溶液から除去する方法も提供する。例えば、3-HPは、溶媒抽出によって水溶液から除去することができる。本開示は、3-HPを(例えば、水溶液からのその除去の後に)精製する方法も提供する。さらに、本開示は、3-HPから(例えば、水溶液からのその除去の後、及び任意にその精製の後に)アクリル酸を製造する方法も提供する。さらに、本開示は、アクリル酸を精製する方法を提供する。
【００８６】
(組換え細菌による3-ヒドロキシプロピオン酸の産生)
本明細書に記載される組成物及び方法は、組換え微生物を用いる炭素源からの3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)(又はその塩)の産生において有用である。いくつかの場合において、炭素源は、グリセロールである。グリセロールは、補酵素B12を伴う反応により、グリセロール/ジオールデヒドラターゼ(例えば、DhaB)によって、3-ヒドロキシプロピオンアルデヒド(3-HPA)に変換される。次に、3-HPAは、NAD(P)(+)を必要とする反応において、アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)(例えば、KgsA、EaldH、KaldH)によって、3-HPに変換される。グリセロールから3-HPへの変換は、高力価の3-HP(又はその塩)の産生を妨害し得るいくつかの律速因子を含む。そのような因子としては、例えば、補酵素B12、経路内の酵素の複雑な性質、NAD+再生、並びに細胞に対する3-ヒドロキシプロパンアルデヒド(3-HPA)及び3-HPの毒性が挙げられる。本試験では、3-HP(又はその塩)を、高力価、例えば、3-HPの商業化に十分な力価で産生した。
【００８７】
毒性中間体の蓄積による3-HP産生(又はその塩の産生)時の酵素活性の喪失は、高力価の3-HP(又はその塩)の産生にとって困難な課題である。3-HPAは、3-HP産生時に蓄積する毒性中間体である。研究により、3-HP経路酵素を3-HPAとともにインキュベートしたとき、酵素活性が用量依存的に低下することが示されている。アルデヒドは、それぞれ、ε-アミノ基(NH3+)、スルフヒドリル基(-SH)、及びイミダゾール基を標的とすることにより、リジン、システイン、及びヒスチジンなどのアミノ酸残基と反応することが知られている。3-HPAの蓄積は、例えば、グリセロールから3-HPへの合成経路における3-HPA合成に関与する酵素であるグリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼを含む、タンパク質に損傷を与える。3-HPAによるグリセロール又はジオールデヒドラターゼの不活化は、3-HP(又はその塩)産生の低下、及び低力価をもたらす。毒性中間体による酵素不活化を克服するための可能性のある手法には、とりわけ、3-HPA毒性に対する耐性が極めて高い酵素を開発すること、又は新しい酵素を絶えず合成することが含まれる。本明細書に記載される組成物及び方法は、グリセロールから3-HPを産生する間の毒性中間体(例えば、3-HPA)の蓄積を低下させ、それにより、組換え細菌によって産生されることができる3-HP又はその塩の量を増加させることができる。
【００８８】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換え微生物は、炭素源からの3-HP又はその塩の産生を触媒する酵素をコードする1以上の遺伝子、例えば、グリセロールデヒドラターゼ、ジオールデヒドラターゼ、及び/又はアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする1以上の遺伝子を発現することができる。いくつかの実施態様において、化合物の合成に関与するタンパク質は、炭素源からの化合物の産生を触媒する1以上の酵素であることができる。3-HP又はその塩の合成に関与するタンパク質は、例えば、グリセロールデヒドラターゼ、ジオールデヒドラターゼ、及び/又はアルデヒドデヒドロゲナーゼを構成する1以上のタンパク質であることができる。いくつかの実施態様において、炭素源は、グリセロールであるが、他の炭素源、例えば、グルコース、グルタミン酸塩、グルコン酸塩、及びクエン酸を使用することができる。該組換え生物は、グリセロールから3-ヒドロキシプロパンアルデヒド(3-HPA)への触媒作用を及ぼすグリセロールデヒドラターゼ酵素(例えば、DhaB)又はジオールデヒドラターゼ酵素を発現することができる。DhaBは、複合グリセロール/ジオールデヒドラターゼ(dhaBCD)をコードする、3つのサブユニットを有する複合酵素である。DhaBは、補酵素B12と複合体を形成する。その触媒活性(グリセロールから3-HPAへの変換)の間、補酵素B12が損傷を受け、この損傷を受けた補酵素B12は、別の酵素グリセロールデヒドラターゼ再活性化因子(GdrAB)又はジオールデヒドラターゼ再活性化因子によって、新しい活性補酵素B12と交換されることになる。GdrABは、2つのサブユニットGdrA及びGdrBを有する複合酵素である。組換え生物は、後に、3-HPAから3-HPへの触媒作用を及ぼすアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)をコードする遺伝子を発現することもできる。この触媒作用は、NAD(P)(+)を必要とする。アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH酵素)の発現は、kgsA遺伝子の発現を含むことができる。したがって、いくつかの実施態様において、該組換え微生物は、グリセロールから3-HPAへの触媒作用を及ぼすDhaB酵素、及び後に、3-HPAを3-HPに変換するALDH酵素を発現する。
【００８９】
本明細書に記載される組換え微生物は、細菌又は真菌であることができる。いくつかの実施態様において、該組換え微生物は、細菌である。該組換え細菌は、バイオプロセッサー又はバイオリアクター中などの培養条件で炭素源から3-HPを産生することができる任意の遺伝子改変細菌であることができる。いくつかの実施態様において、細菌は、好気的条件下で増殖する。いくつかの実施態様において、細菌は、嫌気的条件下で増殖する。いくつかの実施態様において、細菌のゲノムは、グリセロールなどの炭素源から3-HPを産生するのに有用である遺伝子、例えば、グリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼ(例えば、DhaB)及び/又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ(例えば、ksgA)をコードする遺伝子を天然に含有する。いくつかの実施態様において、細菌のゲノムは、グリセロールなどの炭素源から3-HPを産生するのに有用である遺伝子を天然には含有しない。いくつかの実施態様において、グリセロールからの3-HPの産生に使用される遺伝子を天然には含有も発現もしない細菌を、3-HP産生に使用される少なくとも1つの遺伝子を発現するように遺伝子修飾することができる。例えば、グリセロールデヒドラターゼ(DhaB)、ジオールデヒドラターゼ、及び/又はアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)を発現しない細菌を、DhaB及び/又はALDHを発現するように遺伝子改変することができる。
【００９０】
いくつかの実施態様において、組換え細菌は、シュードモナス属株、クレブシエラ属(Klebsiella)株、又はエシェリキア属(Escherichia)株である。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、シュードモナス・デニトリフィカンス、肺炎桿菌(Klebsiella pneumonia)、又は大腸菌の株である。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、シュードモナス・デニトリフィカンスの株である。シュードモナス・デニトリフィカンスは、補因子の補酵素B12を天然に合成することができる好気性微生物である。補酵素B12は、グリセロールからの3-HP産生にとって重要な補因子である。さらに、P.デニトリフィカンスは、NAD+を効率的に再生することができる。NAD+再生は、3-HPの連続産生にとって非常に重要である。それゆえ、シュードモナス・デニトリフィカンスは、3-HP産生(又はその塩の産生)のための好適な微生物であると考えられる。
【００９１】
いくつかの実施態様において、組換え細菌は、エンテロバクター属細菌(例えば、クレブシエラ属もしくはサルモネラ属(Salmonella)もしくはシトロバクター属(Citrobacter))又はラクトバチルス属細菌又はプロピオニバクテリウム属(Propionibacterium)もしくはプロテウス属(Proteus)もしくはセラチア属(Serratia)種又はクロストリジウム属(Clostridium)由来の少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ及び/又はジオールデヒドラターゼ酵素、例えば、エンテロバクター属(例えば、クレブシエラ属もしくはサルモネラ属もしくはシトロバクター属)又はラクトバチルス属又はプロピオニバクテリウム属又はプロテウス属又はセラチア属又はクロストリジウム属種由来の少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ酵素(例えば、DhaB)を発現する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、2以上のグリセロールデヒドラターゼ酵素(例えば、DhaB)及び/又はジオールデヒドラターゼ酵素を発現し、ここで、該デヒドラターゼ酵素(例えば、DhaB)の各々は、異なるエンテロバクター属(例えば、クレブシエラ属もしくはサルモネラ属シトロバクター属)又はラクトバチルス属又はプロピオニバクテリウム属又はプロテウス属又はセラチア属又はクロストリジウム属種由来のものであることができる。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、エンテロバクター属細菌(例えば、クレブシエラ属もしくはサルモネラ属シトロバクター属)又はラクトバチルス属又はプロピオニバクテリウム属又はプロテウス属又はセラチア属又はクロストリジウム属種由来の少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素(ALDH)、例えば、少なくとも1つのALDH酵素を発現する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、2以上のALDH酵素を発現し、ここで、該ALDH酵素の各々は、異なるエンテロバクター属又はラクトバチルス属株由来のものであることができる。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、エンテロバクター属細菌(例えば、クレブシエラ属もしくはサルモネラ属)又はラクトバチルス属細菌由来の少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ(例えば、DhaB)及び/又はジオールデヒドラターゼ、並びにエンテロバクター属細菌(例えば、クレブシエラ属もしくはサルモネラ属)又はラクトバチルス属細菌由来の少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)酵素を発現する。
【００９２】
いくつかの実施態様において、組換え細菌は、細菌、今回のケースでは、肺炎桿菌由来の少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ及び/又はジオールデヒドラターゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、例えば、肺炎桿菌由来のdhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、及び/又はgdrBを発現する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、アゾスピリルム・ブラシレンセ(Azospirullum brasilense)由来の少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、例えば、アゾスピリルム・ブラシレンセ由来のkgsAを発現する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、肺炎桿菌由来の少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、例えば、肺炎桿菌由来のdhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、及び/もしくはgdrB、又は少なくとも1つのジオールデヒドラターゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、並びにアゾスピリルム・ブラシレンセ由来の少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、例えば、アゾスピリルム・ブラシレンセ由来のkgsAを発現する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、肺炎桿菌由来の少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ及び/又はジオールデヒドラターゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、例えば、dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、及び/又はgdrB、並びにアゾスピリルム・ブラシレンセ由来の少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする少なくとも1つの遺伝子、例えば、アゾスピリルム・ブラシレンセ由来のkgsAを発現するシュードモナス・デニトリフィカンス株である。
【００９３】
いくつかの実施態様において、組換え細菌は、エンテロバクター属細菌(例えば、クレブシエラ属もしくはサルモネラ属)又はラクトバチルス属細菌由来の少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ遺伝子及び/又はジオールデヒドラターゼ遺伝子(例えば、dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、及び/又はgdrB遺伝子)、例えば、肺炎桿菌由来の少なくとも1つのグリセロール/ジオールデヒドラターゼ遺伝子(例えば、dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、及び/又はgdrB遺伝子)を有する少なくとも1つの核酸を有する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、エンテロバクター属細菌(例えば、クレブシエラ属もしくはサルモネラ属)又はラクトバチルス属細菌由来の少なくとも2つのグリセロールデヒドラターゼ遺伝子及び/又はジオールデヒドラターゼ遺伝子(例えば、dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、及び/又はgdrB遺伝子のうちの2つ以上)、例えば、肺炎桿菌由来の少なくとも2つのグリセロールデヒドラターゼ遺伝子(例えば、dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、及び/もしくはgdrB遺伝子のうちの2つ以上)又はジオールデヒドラターゼ遺伝子を有する少なくとも1つの核酸を有する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、アゾスピリルム属細菌由来の少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(kgsA遺伝子)、例えば、アゾスピリルム・ブラシレンセ株由来の少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(kgsA遺伝子)を有する少なくとも1つの核酸を有する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、アゾスピリルム属細菌由来の少なくとも2つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(例えば、kgsA遺伝子)、例えば、アゾスピリルム・ブラシレンセ株由来の少なくとも2つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(例えば、kgsA遺伝子)を有する少なくとも1つの核酸を有する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、エンテロバクター属細菌(例えば、クレブシエラ属もしくはサルモネラ属)又はラクトバチルス属細菌由来の少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ遺伝子及び/又はジオールデヒドラターゼ遺伝子(例えば、dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、及び/又はgdrB遺伝子)、例えば、肺炎桿菌由来の少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ遺伝子(例えば、dhaB、dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、及び/又はgdrB遺伝子)を有する少なくとも1つの核酸、並びにアゾスピリルム属細菌由来の少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(kgsA遺伝子)、例えば、アゾスピリルム・ブラシレンセ株由来の少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子(kgsA遺伝子)を有する少なくとも1つの核酸を有する。
【化１】
2021502112.tif 000003
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【００９４】
いくつかの実施態様において、ジオールデヒドラターゼ遺伝子は、クレブシエラ属細菌、例えば、肺炎桿菌由来のものである。いくつかの実施態様において、ジオールデヒドラターゼは、肺炎桿菌亜種ニューモニエMGH78478由来のものである。いくつかの実施態様において、ジオールデヒドラターゼ遺伝子は、pduC、pduD、pduE、pduG、及び/又はpduHのうちの1つ又は複数であることができる。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、例えば、PduC、PduD、PduE、PduG、及び/又はPduHを含む、少なくとも1つのジオールデヒドロゲナーゼ酵素を発現する。
【００９５】
いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号1〜6又は配列番号83〜87から選択される少なくとも1つの配列を有する少なくとも1つの核酸を有する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号1〜5から選択される1つの配列を有する少なくとも1つの核酸を有する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号83〜87から選択される少なくとも1つの配列を有する少なくとも1つの核酸を有する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号6を有する少なくとも1つの核酸を有する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号1〜5及び/又は配列番号83〜87から選択される少なくとも1つの配列を有する少なくとも1つの核酸、並びに配列番号6を有する別の核酸を有する。
【００９６】
いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号1〜6及び配列番号83〜87のいずれかと少なくとも80％同一である少なくとも1つの配列を有する少なくとも1つの核酸を有する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号1〜6及び配列番号83〜87のいずれかと少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一である少なくとも1つの配列を有する少なくとも1つの核酸を有する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号1〜6及び配列番号83〜87のいずれかの核酸配列と1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個、又はそれより多くのヌクレオチドだけ異なる少なくとも1つの配列を有する少なくとも1つの核酸を有する。
【００９７】
いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号77〜82及び88〜92から選択されるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのタンパク質を発現する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号77〜82及び88〜92のいずれかと少なくとも80％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのタンパク質を発現する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号77〜82及び88〜92のいずれかと少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのタンパク質を発現する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号77〜82及び88〜92のいずれかのアミノ酸と1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個、又はそれより多くのアミノ酸だけ異なるアミノ酸配列を有する少なくとも1つのタンパク質を発現する。
【００９８】
(プロモーター)
本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、機能的に連結された遺伝子の発現に使用される調節核酸配列を含有するDNA配列を指す。コアプロモーターは、TATAボックス及び転写開始部位を含む、プロモーター機能のための不可欠なヌクレオチド配列を含有する。この定義によると、コアプロモーターは、例えば、活性を増強し又は組織特異的活性を付与し得る特異的配列の非存在下で検出可能な活性を有していても有していなくてもよい。プロモーターは、構成的又は誘導性のいずれかであることができる。構成的プロモーターは、細胞の寿命の間、一定の速度で遺伝子の転写を制御する。誘導性プロモーターの活性は、特異的インデューサーの存在(又は非存在)、例えば、細胞外又は環境因子の存在(又は非存在)によって決定されるように変動する。「3-HP誘導性プロモーター」は、そのようなプロモーターを保有する細胞を3-HPに曝露させたときに、例えば、3-HPプロモーターを保有する細胞を細胞培養培地中又はバイオリアクター中に存在する3-HPに曝露させたときに、機能的に連結された遺伝子(単数又は複数)の発現を増大させるプロモーターである。いくつかの場合において、プロモーターは、1以上のオペレーター部位を含む。
【００９９】
本明細書に記載される組換え微生物は、少なくとも1つのプロモーターの制御下でグリセロールから3-HP(又はその塩)を産生するために使用される少なくとも1つの遺伝子を発現する。いくつかの実施態様において、発現システムは、刺激(すなわち、インデューサー、例えば、3-HP)に応答して遺伝子の発現を増大させる少なくとも1つの誘導性プロモーターを含む。ひとたび刺激が誘導性プロモーターと接触すると、該プロモーターは、遺伝子の発現をオンにするか又は上方調節する。いくつかの実施態様において、誘導性プロモーターは、3-HPによって誘導される。発現システムの少なくとも1つの誘導性プロモーターによって遺伝子発現の上方調節を引き起こす刺激又はインデューサーは、3-HPである。いくつかの実施態様において、発現システムの少なくとも1つの誘導性プロモーターによって遺伝子発現の上方調節を引き起こす刺激又はインデューサーは、3-HPと化学的及び/又は構造的に類似している。いくつかの実施態様において、発現システムの少なくとも1つの誘導性プロモーターによって遺伝子発現の上方調節を引き起こす刺激又はインデューサーは、小分子、例えば、酸又はアルコールなどの小有機分子である。いくつかの実施態様において、小分子は、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)又は3-ヒドロキシプロパンアルデヒド(3-HPA)と構造的に類似している。3-HPは、化学構造C3H6O3を有する、分子量90.08のカルボン酸である。いくつかの実施態様において、L-バリン分解経路及び中心炭素代謝において見られる3-HP又はその中間体と構造的に類似した小さい様々な酸。いくつかの実施態様において、小分子酸又はアルコールは、L-乳酸(LAC)、酢酸(AcOH)、プロピオン酸(PA)、3-ヒドロキシブチレート(3-HB)、1,3-プロパンジオール(1,3-PDO)、2,3-ブタンジオール(2,3-BDO)、L-バリン(L-val)、及び3-ヒドロキシイソブチレート(3-HIB)のいずれかであることができるが、これらに限定されない。いくつかの実施態様において、誘導性プロモーターは、2以上のインデューサーによって誘導されることができる。
【０１００】
本明細書に提示されるのは、C3プラットフォーム化学物質の3-HPによって誘導されることができる新規のプロモーターである。本開示は、これらの新規のプロモーターによって遺伝子発現を活性化/開始する3-HPの機構を報告している。本発明者らの実験において、本発明者らは、シュードモナス属株に、唯一の炭素源として3-HPを提供したとき、この株が3-HPを活発に消費し、増殖を示すことを観察した。本発明者らは、いくつかの酵素、すなわち、推定上の3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼIV(HbdH-4)、3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ(HpdH)、及び/又はメチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(MmsA)が3-HP分解に関与していることを特定した。興味深いことに、本発明者らは、これらの酵素をコードする遺伝子の転写が、高いレベルで、しかし、3-HP又は類似の小型酸の存在下でのみ大幅に上方調節されることを見出した。これらの3-HP分解遺伝子付近の遺伝子配置の解析により、mmsA、hbdH-4、又はhpdHに対応する、推定転写調節因子タンパク質の存在が明らかになった。これらの転写調節因子タンパク質は、3-HPによって複合体が形成されたとき、mmsA、hpdH、及びその他の転写を活性化する。
【０１０１】
本明細書に記載されるプロモーターの誘導性の性質及びその高い誘導効率により、該プロモーターは、3-HP合成の経路酵素の発現、3-HP応答性バイオセンサーの開発、及び/又は補酵素B12産生の経路酵素の発現に有用となっている。ここで、本発明者らは、様々な3-HP誘導性遺伝子調節システムを解明している。細胞レベルで、L-バリン分解経路及び中心炭素代謝において見られる3-HP又はその中間体と構造的に類似している様々な酸を用いて、小分子インデューサーの特異性及び/又は薬効範囲を検討した。
【０１０２】
これらのプロモーターを用いて、プロモーターが小型酸によって誘導可能であり、かつ様々な発現レベルを示すプロモーターのライブラリーを作製した。このライブラリーを他の天然又は合成プロモーターと組み合わせて用いて、タンデムプロモーターシステムを開発した。ここで、本発明者らは、小型酸で誘導可能なシステムと天然/合成プロモーターライブラリーを組み合わせることにより、タンデムプロモーターシステムを刺激して、標的遺伝子、例えば、3-HP合成経路遺伝子を発現させることを試みた。
【０１０３】
いくつかの実施態様において、誘導性プロモーターは、3-HPによって誘導される。いくつかの実施態様において、誘導性プロモーターは、天然のプロモーター、例えば、細菌、例えば、シュードモナス属細菌で遺伝子の発現を駆動するプロモーターである。いくつかの実施態様において、誘導性プロモーターは、細菌、例えば、シュードモナス属細菌、例えば、シュードモナス・デニトリフィカンスに存在する天然の3-HP誘導性プロモーターである。シュードモナス属細菌、例えば、P.デニトリフィカンスにおいて、3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼI(HbdH-1)、3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼIV(HbdH-4)、3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ(HpdH)、及びメチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(MmsA)の発現を駆動するプロモーターを含む、3-HP分解に関与するタンパク質の発現を駆動するいくつかの天然のプロモーターは、3-HPによって次々に上方調節される。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換え細菌は、P.デニトリフィカンスのmmsA遺伝子(PmmsAプロモーター)、hpdH遺伝子(PhpdHプロモーター)、又はhbdH-4遺伝子(PhbdH-1プロモーター)の少なくとも1つの天然のプロモーターの制御下でグリセロールから3-HPを産生するために使用される少なくとも1つの遺伝子を発現する。いくつかの実施態様において、誘導性プロモーターは、合成プロモーターである。
【化２】
2021502112.tif 000008
【０１０４】
いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号11〜14のいずれかによって表される少なくとも1つのプロモーターの制御下でグリセロールから3-HP(又はその塩)を産生するために使用される少なくとも1つの遺伝子を発現する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号11〜14によって表される少なくとも1つのプロモーターの制御下でdhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、gdrB、及び/又はkgsAのいずれか由来の少なくとも1つの遺伝子を発現する。
【０１０５】
いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号11〜14のいずれかと少なくとも80％同一である配列を有する少なくとも1つのプロモーターの制御下でグリセロールから3-HP(又はその塩)を産生するために使用される少なくとも1つの遺伝子を発現する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号11〜14のいずれかと少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一である配列を有する少なくとも1つのプロモーターの制御下でグリセロールから3-HP又はその塩を産生するために使用される少なくとも1つの遺伝子を発現する。いくつかの実施態様において、組換え細菌は、配列番号11〜14のいずれかと1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個、又はそれより多くのヌクレオチドだけ異なる配列を有する少なくとも1つのプロモーターの制御下でグリセロールから3-HP又はその塩を産生するために使用される少なくとも1つの遺伝子を発現する。
【０１０６】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される発現システムは、グリセロールなどの炭素源からの3-HP又はその塩の産生に関与する少なくとも1つの遺伝子を制御する少なくとも2つのプロモーターをタンデムに含む。タンデムプロモーターシステムは、様々な生理的又は環境条件下で下流遺伝子の発現を制御する微生物で観察される。そのようなシステムは、細胞増殖の様々な段階における標的遺伝子発現の制御調節を助ける。タンデムプロモーターは、細菌株で天然に見出されるプロモーターなどの、微生物にとって天然もしくは内在性のものであることができるし、又は合成されたものであることができる。いくつかの実施態様において、該プロモーターの1つ又は複数は、天然のプロモーターであることができる。いくつかの実施態様において、該プロモーターの1つ又は複数は、合成プロモーターであることができる。
【０１０７】
本明細書に記載される発現システムのタンデムプロモーターは、1以上の誘導性プロモーター及び/又は1以上の構成的プロモーターを含むことができる。いくつかの場合において、該タンデムプロモーターは、2以上の誘導性プロモーターを含む。2以上の誘導性プロモーターを含むタンデムプロモーターは、2つの同じ誘導性プロモーターを有することができる、すなわち、誘導性プロモーターは、同じインデューサーもしくは刺激によって誘導されるか、又は2つの異なる誘導性プロモーターを有することができる、すなわち、誘導性プロモーターが異なるインデューサーもしくは刺激によって誘導されるかのいずれかである。いくつかの実施態様において、該タンデムプロモーターは、少なくとも1つの誘導性プロモーター及び少なくとも1つの構成的プロモーターを含む。例えば、該タンデムプロモーターは、3-HP誘導性プロモーターと構成的プロモーターを組み合わせて、3-HP合成に関与する遺伝子の発現を調節することができる。
【０１０８】
いくつかの実施態様において、プロモーターの各々がタンデムプロモーターの下流に位置する遺伝子の発現を調節することができるように、ターミネーター配列は、発現システムのタンデムプロモーターの間に、例えば、どの2以上のプロモーターの間にも存在しない。
【０１０９】
いくつかの実施態様において、タンデムプロモーターは、少なくとも2つの3-HP誘導性プロモーターを含む。いくつかの実施態様において、タンデムプロモーターは、3-HP誘導性プロモーターである第一のプロモーター及び3-HP誘導性プロモーターである第二のプロモーターを含む。いくつかの実施態様において、該第一の3-HP誘導性プロモーター及び第二の3-HP誘導性プロモーターは、各々、PmmsAプロモーター(配列番号14)、PhbdH-1プロモーター(配列番号13)、PhbdH-4プロモーター(配列番号11)、又はPhpdHプロモーター(配列番号12)であることができる。
【０１１０】
いくつかの実施態様において、タンデムプロモーターは、3-HP誘導性プロモーターである第一のプロモーター及び構成的プロモーターである第二のプロモーターを含み、ここで、該第一の3-HP誘導性プロモーターは、該第二の構成的プロモーターの5'又は上流に位置する。いくつかの実施態様において、該第一の3-HP誘導性のものは、PmmsAプロモーター(配列番号14)、PhbdH-1プロモーター(配列番号13)、PhbdH-4プロモーター(配列番号11)、又はPhpdHプロモーター(配列番号12)である。いくつかの実施態様において、該第二の構成的プロモーターは、Pzwf(配列番号7)プロモーターである。いくつかの実施態様において、該第二の構成的プロモーターの配列は、配列番号7と少なくとも80％同一である。いくつかの実施態様において、該第二の構成的プロモーターの配列は、配列番号7と少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一である。いくつかの実施態様において、該第二の構成的プロモーターの配列は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個、又はそれより多くのヌクレオチドだけ配列番号7と異なる。いくつかの実施態様において、該第二の構成的プロモーターの配列は、配列番号8(Pzwf-1)、配列番号9(Pzwf-7)、配列番号10(Pzwf-12)、配列番号52(Pzwf-2)、配列番号53(Pzwf-3)、配列番号54(Pzwf-4)、配列番号55(Pzwf-5)、配列番号56(Pzwf-6)、配列番号57(Pzwf-7)、配列番号58(Pzwf-8)、配列番号59(Pzwf-10)、配列番号60(Pzwf-11)、配列番号61、配列番号62、又は配列番号63である。
【化３】
2021502112.tif 000009
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【０１１１】
いくつかの実施態様において、発現カセット中のタンデムプロモーターの配列は、配列番号65、配列番号70、配列番号71、又は配列番号72であることができる。いくつかの実施態様において、発現カセット中のタンデムプロモーターの配列は、配列番号65、配列番号70、配列番号71、又は配列番号72と少なくとも80％同一であることができる。いくつかの実施態様において、発現カセット中のタンデムプロモーターの配列は、配列番号65、配列番号70、配列番号71、又は配列番号72と少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一であることができる。いくつかの実施態様において、発現カセット中のタンデムプロモーターの配列は、配列番号70〜72のいずれかの配列と1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個、又はそれより多くのヌクレオチドだけ異なることができる。
【化４】
2021502112.tif 000011
【０１１２】
(転写調節因子)
3-HP分解遺伝子の調節領域は、天然のLysRファミリー転写調節因子(LTTR)タンパク質をコードする配列の近くに位置する。3-HPによって複合体が形成されたとき、LysRファミリー転写調節因子タンパク質は、転写を活性化する。細菌において、LTTRタンパク質は、RNAポリメラーゼと相互作用することにより、下流遺伝子を上方調節する。結果として、LTTRタンパク質の量は、下流の標的遺伝子の転写レベルに影響を及ぼす。
【０１１３】
いくつかの実施態様において、少なくとも1つの転写調節因子タンパク質は、本明細書に記載される少なくとも1つの3-HP産生遺伝子と組み合わせて、細菌などの組換え微生物で発現される。いくつかの場合において、少なくとも1つの転写調節因子タンパク質は、少なくとも1つの構成的又は誘導性プロモーターの制御下のLTTRタンパク質である。いくつかの場合において、転写調節因子タンパク質は、少なくとも1つの3-HP産生遺伝子の上流の部位に結合し、3-HP合成に関与する少なくとも1つの遺伝子の発現を調節する。
【０１１４】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される組換え細菌は、少なくとも1つのLTTRタンパク質並びに3-HP又はその塩の産生に使用される少なくとも1つの遺伝子、例えば、少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ、ジオールデヒドラターゼ、及び/又はアルデヒドデヒドロゲナーゼを発現する。いくつかの実施態様において、LTTRタンパク質は、MmsRである。いくつかの実施態様において、MmsRプロモーターは、構成的プロモーターの制御下、組換え細菌で発現される。いくつかの実施態様において、構成的プロモーターは、Pzwfプロモーター(配列番号7)である。いくつかの実施態様において、構成的プロモーターは、Pzwfプロモーターと比べてMmsRの発現を増大又は低下させるように突然変異させられている。いくつかの実施態様において、構成的プロモーターは、Pzwf(配列番号7)プロモーターである。いくつかの実施態様において、構成的プロモーターの配列は、配列番号7と少なくとも80％同一である。いくつかの実施態様において、構成的プロモーターの配列は、配列番号7と少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一である。いくつかの実施態様において、構成的プロモーターの配列は、配列番号7と1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは30個、又はそれより多くのヌクレオチドだけ異なる。いくつかの実施態様において、構成的プロモーターは、配列番号8(Pzwf-1)、配列番号9(Pzwf-7)、配列番号10(Pzwf-12)、配列番号52(Pzwf-2)、配列番号53(Pzwf-3)、配列番号54(Pzwf-4)、配列番号55(Pzwf-5)、配列番号56(Pzwf-6)、配列番号57(Pzwf-7)、配列番号58(Pzwf-8)、配列番号59(Pzwf-10)、配列番号60(Pzwf-11)、配列番号61、配列番号62、又は配列番号63である。いくつかの実施態様において、mmsR遺伝子は、染色体上に位置し、例えば、構成的プロモーターの制御下のmmsR遺伝子は、組換え細菌内の染色体から発現される。
【０１１５】
(5'UTR)
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される発現システムは、対象の遺伝子(例えば、3-HP合成に関与する遺伝子)に機能的に連結された5'UTRを有することができ、ここで、該5'UTRは、3-HPを天然に産生した細菌、例えば、P.デニトリフィカンス内の3-HP誘導性プロモーターによって調節される天然の遺伝子由来のものである。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される発現は、P.デニトリフィカンスのmmsA遺伝子(配列番号64)の5'UTRを有する。
【０１１６】
いくつかの場合において、5'UTRの突然変異は、mRNA転写物の翻訳開始の速度を改善し、かつ/又は発現システムによって産生されるmRNA転写物の安定性を改善することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される発現システムは、配列番号64と少なくとも80％同一である配列を有する5'UTRを有することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される発現システムは、配列番号64と少なくとも80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、又は99％同一である配列を有する5'UTRを有することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される発現システムは、配列番号64と1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、もしくは3個、又はそれより多くのヌクレオチドだけ異なる配列を有する5'UTRを有することができる。いくつかの実施態様において、本明細書に記載される発現システムは、配列番号22〜28から選択される任意の配列を有する5'UTRを有することができる。
【０１１７】
非限定的な例において、PmAdH-4タンデムプロモーター、Opt-3、Hyb-20、及び染色体MmsRを有する発現システムは、mmsA遺伝子の5'UTRを有する。いくつかの実施態様において、mmsA 5'UTRを突然変異させることができる。
【化５】
2021502112.tif 000012
【０１１８】
(天然タンパク質の最初の数個のアミノ酸の融合によるP.デニトリフィカンスにおける遺伝子発現の最適化)
P.デニトリフィカンスにおける異種タンパク質の発現を最適化するために、新規の手法を採用した。異種タンパク質を、高発現する天然酵素の最初の数個のアミノ酸(5〜20AA)と標的タンパク質のN-末端で融合させた(例えば、天然のタンパク質のN-末端の5〜20個のアミノ酸を異種タンパク質のN-末端に融合させた)。例えば、mmsAの様々な長さ(例えば、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、又は20アミノ酸長;それぞれ、Hyb-5、Hyb-6、Hyb-7、Hyb-8、Hyb-9、Hyb-10、Hyb-11、Hyb-12、Hyb-13、Hyb-14、Hyb-15、Hyb-16、Hyb-17、Hyb-18、Hyb-19、及びHyb-20と表記)のN-末端を全長異種kgsA遺伝子に接続し、多コピープラスミドから発現させた(図17)。最大活性は、Hyb-20(+3-HP、9.3U/mgタンパク質; -3-HP、3.0U/mgタンパク質)の場合に得られた。他方、Hyb-5は、その発現の変化もその酵素活性の変化も示さなかった(図17A)。SDS-PAGE解析は、kgsAをN-末端mmsA断片と融合させた(5個よりも多くのアミノ酸を付加した)ときに、タンパク質産生が増大することを示した(図17B)。野生型及びHyb-20 kgsA組換え株における改善された発現及びmRNA安定性の機構を理解するために、転写物を測定し、比較した。mmsA及びmmsR転写物の安定性も決定した(図17C及び17D)。野生型kgsA転写物の半減期(2.7分)は、mmsAの半減期(6.1分)よりも2.3倍短かった;しかしながら、mmsAの最初の20aa(20)を融合することにより、融合タンパク質のmRNAの半減期は、天然のmmsAのmRNAの半減期と同等である5.7分にまで大幅に改善された。これは、融合タンパク質(mRNA転写物)が内在性のヌクレアーゼ攻撃の影響を受けにくくなっていることを示唆している。RT-PCRによって決定されるハイブリッドmmsA(20)kgsA遺伝子の転写レベルも、野生型kgsA遺伝子の転写レベルより2倍高かった(データは示さない)。本発明者らは、より高いmRNA安定性が、転写の改善と併せて、ハイブリッド酵素のKgsA活性の改善に寄与したはずであると考えている。検討されたいくつかの遺伝子の中で、mmsAは、最も高いmRNA安定性を示し、半減期は9.5分であった(データは示さない)。
【０１１９】
(組換え細菌による補酵素B12の産生)
3-HP又はその塩を産生する微生物によるグリセロールからの3-HPの産生は、補酵素B12の外部添加なしでは限定される。補酵素B12は、3-HP合成経路の最初の反応に使用される、グリセロール/ジオールデヒドラターゼ酵素活性のための不可欠な補因子であり、ここで、グリセロールは、触媒作用によって3-ヒドロキシプロパンアルデヒド(propanealdehyde)に変換される。それゆえ、補酵素B12の連続供給は、細菌などの微生物によるグリセロールからの3-HP又はその塩の連続産生に不可欠である。補酵素B12は、限られた数の微生物によって好気的又は嫌気的条件下で天然に合成されることができる(補酵素B12の嫌気的産生者としては、例えば、クレブシエラ属、連鎖球菌属(Streptococcus)、サルモネラ属種が挙げられる。補酵素B12の好気的産生者としては、例えば、シュードモナス属、リゾビウム属(Rhizobium)、ロドバクター属(Rhodobacter)種が挙げられる)。しかしながら、グリセロールから3-HP又はその塩を産生するための潜在的宿主として評価されている微生物は、高力価の3-HPを産生するのに十分な量の補酵素B12を産生しないように思われる。さらなる解析により、補酵素B12産生は転写及び翻訳調節されることが示されている。これらのプロセスを、組換え微生物、例えば、細菌で遺伝子修飾して、補酵素B12産生を増大させ、それにより、細菌に外部補酵素B12を補充しないで、3-HP(又はその塩)の力価を増大させることができる。
【０１２０】
図23に示されているように、2つの遺伝子クラスター(クラスターI及びクラスターII)は、P.デニトリフィカンスにおける補酵素B12の産生に使用されるタンパク質を産生するのに関与している。リボスイッチ及び他の二次構造は、クラスターI及びII中に存在するオペロンのプロモーター領域で同定されている(図23を参照)。これらのリボスイッチは、B12生合成オペロンの発現を調節するように思われ、遺伝子発現を抑制し得る。本明細書に記載されるいくつかの実施態様において、1以上のリボスイッチ又は他の二次構造は、P.デニトリフィカンスのゲノム中のクラスターI及び/又はクラスターIIの1以上のオペロンプロモーター領域から除去されてもよい。いくつかの実施態様において、図23及び図25A〜Dに示されているリボスイッチ1、2、3、及び/もしくは4、又はその一部のうちの1つ又は複数は、P.デニトリフィカンスのゲノム中で欠失している。いくつかの実施態様において、リボスイッチ1(配列番号75)又はリボスイッチ2(配列番号76)のDNA配列の全て又は一部は、P.デニトリフィカンスのゲノムから除去されている。いくつかの実施態様において、リボスイッチ1(配列番号75)及びリボスイッチ2(配列番号76)のDNA配列の全て又は一部は、P.デニトリフィカンスのゲノムから除去されている。
【０１２１】
本明細書に記載される発現システムのいずれかを用いて、補酵素B12の産生に関与する遺伝子の発現を増大させること及び/又は補酵素B12の産生を増大させることができる。本明細書に記載される3-HP誘導性プロモーターシステムを用いて、B12産生遺伝子(例えば、翻訳及び/又は転写調節因子)の調節領域を交換することができる。本開示は、補酵素B12の補充が生物による3-HPの産生に使用されないように、補酵素B12の産生を増大させる方法を提供する。本明細書に提供されるのは、3-HPの産生用の遺伝子の制御及び/又は上方調節のための発現システム並びに補酵素B12の産生用の遺伝子の制御及び/又は上方調節のための発現システムを含むことができる組換え生物である。
【化６】
2021502112.tif 000013
【０１２２】
(チャネリングのための発現システム配置)
本明細書に記載される発現システムを、当技術分野で周知の任意の方法を用いて、宿主微生物、例えば、細菌に遺伝子導入することができる。いくつかの場合において、該発現システムを、プラスミド、人工染色体、又は他のベクターを用いて、微生物に導入することができる。いくつかの実施態様において、該発現システムを、微生物のゲノムに組み込む、例えば、染色体に組み込むことができる。
【０１２３】
多コピーの発現システムを、微生物、例えば、細菌に導入することができる。多コピーの発現システムを、少なくとも1つのプラスミド、人工染色体、又は他のベクター上で、微生物、例えば、細菌に導入することができる。例えば、多コピーの発現システムを、単一のプラスミド上で、又は2以上の異なるプラスミド(すなわち、異なる配列、選択マーカーなどを有するプラスミド)上で、細菌に導入することができる。多コピーの発現システムを微生物のゲノムに組み込むことができる。いくつかの実施態様において、多コピーの発現システムを、ゲノム中の同じ位置で、例えば、同じ染色体位置で組み込むことができる。いくつかの実施態様において、多コピーの発現システムを、異なる位置で、例えば、異なる染色体位置で組み込むことができる。いくつかの実施態様において、多コピーの発現システムを、シュードモナス属細菌、例えば、P.デニトリフィカンスの異なる染色体位置で組み込むことができる。いくつかの実施態様において、炭素源からの3-HP産生に関与する異なる遺伝子、例えば、1以上のグリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼ遺伝子及びアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を調節する2以上の発現システムは、シュードモナス属細菌のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施態様において、該2以上の発現システムは、ゲノムの同じ位置で組み込まれる。いくつかの実施態様において、該2以上の発現システムは、異なる染色体位置で組み込まれる。
【０１２４】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される1以上の発現システムは、シュードモナス・デニトリフィカンス細菌などの細菌に導入される。いくつかの実施態様において、グリセロールデヒドラターゼ遺伝子及び/又はジオールデヒドラターゼ遺伝子(例えば、dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、及び/又はgdrB遺伝子のうちの少なくとも1つ)をコードする1以上の遺伝子を調節する発現システム並びにアルデヒドデヒドロゲナーゼ(例えば、少なくとも1つのksgA遺伝子)をコードする1以上の遺伝子を調節する発現システムは、P.デニトリフィカンス細菌に導入され、かつ任意に、細菌のゲノムに組み込まれる。いくつかの実施態様において、グリセロールデヒドラターゼ(及び/又はジオールデヒドラターゼ)並びにアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を調節する発現システムは、異なる染色体位置で組み込まれる。
【０１２５】
いくつかの実施態様において、グリセロールデヒドラターゼ(及び/又はジオールデヒドラターゼ)並びにアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を調節する発現システムは、異なる染色体位置で組み込まれる。特定の染色体組込み部位は、発現システム又はモジュールの発現のレベルに顕著に影響を及ぼすことができ、その結果、ある組込み部位での遺伝子発現のレベルが異なる組込み部位での遺伝子発現のレベルと異なることになる。さらに、経路内の特定の遺伝子の染色体への挿入のポジショニングは、合成経路酵素の活性の均衡を取り、3-ヒドロキシプロパンアルデヒドなどの毒性中間体の蓄積を回避することができる。例えば、多くの原核生物において、1つの経路の酵素をコードする遺伝子は、集まってクラスター化している。このクラスター化した配置は、細胞内の経路によって産生される中間体の蓄積を回避すると考えられる細菌で観察される。原核生物では、転写と翻訳は同時に起こり、多くの場合、第一の遺伝子によってコードされる第一の酵素の産物は、経路内の第二の遺伝子によってコードされる第二の酵素の基質となる。遺伝子が互いに近くに位置している場合、第一の遺伝子によってコードされる酵素によって産生される、経路内の第二の遺伝子によってコードされる第二の酵素の基質は、第二の酵素の近くに局在している。この種の機構は、経路の効率を高め、中間体が経路内の次の酵素によってすぐに消費されるのを可能にすることにより、潜在的に毒性のある中間体の蓄積を回避する。互いにごく近接するこの種の遺伝子のクラスター化は、チャネリングとして知られている。
【０１２６】
したがって、染色体におけるグリセロールデヒドラターゼ及びアルデヒドデヒドロゲナーゼのポジショニングが、例えば、3-HPAから3-HPへの速やかな変換をもたらすことによって、チャネリング効果を生じるように、グリセロールデヒドラターゼ(及び/又はジオールデヒドラターゼ)並びにアルデヒドデヒドロゲナーゼを調節する発現システムを異なる染色体位置で組み込むことによって、これらの酵素のレベルを調節することにより、組換え細菌内の3-HPA及び3-HPのレベルを調節することが可能である。グリセロールデヒドラターゼ(及び/又はジオールデヒドラターゼ)並びにアルデヒドデヒドロゲナーゼを調節する別々の発現システムのポジショニングによるチャネリング効果の生成は、細胞にとって毒性のある細菌細胞内での3-HPAの蓄積を妨げることができ、それにより、細胞がより長く生存及び増殖し、より高い力価の3-HP又はその塩を産生することを可能にする。
【０１２７】
いくつかの場合において、第二の発現システムの第二の組込み位置との関連における第一の発現システムの第一の組込み位置は、3-HP又はその塩の産生レベルに影響を及ぼす。いくつかの場合において、第一の発現システムは、グリセロールデヒドラターゼ又はジオールデヒドラターゼ酵素(例えば、1以上のdhaB及び/又はgdrAB遺伝子)を発現する発現システムであることができる。いくつかの場合において、第二の発現システムは、アルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素(例えば、1以上のALDH遺伝子、例えば、kgsA、ealdH、及び/又はkaldH遺伝子)を発現する発現システムであることができる。いくつかの場合において、2つの発現システムを互いに関して近くに組み込むこのシステムは、毒性中間体(例えば、3-HPA)の蓄積を低下させ、かつこれらの毒性中間体への他の酵素の曝露を低下させ、それにより、3-HP又はその塩の産生を増大させることができる。
【０１２８】
いくつかの実施態様において、本明細書に記載される少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ(及び/又は1以上のジオールデヒドラターゼ遺伝子)をコードする発現システム又はモジュールは、組換え細菌、例えば、P.デニトリフィカンスの染色体において、本明細書に記載される、少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼをコードする発現システムもしくはモジュールの約500〜2,500,000ヌクレオチド塩基対(例えば、約500塩基対〜2,500キロ塩基対)(例えば、ヌクレオチドもしくは塩基対)又はそれ未満以内(例えば、互いの約500〜2,500,000塩基対以内)に位置付けられている。いくつかの実施態様において、少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ(又はジオールデヒドラターゼ)酵素及び少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする、本明細書に記載される発現システムは、互いの約2,500キロヌクレオチド、1,500キロヌクレオチド、500キロヌクレオチド、250キロヌクレオチド、150キロヌクレオチド、50,000ヌクレオチド、25,000ヌクレオチド、15,000ヌクレオチド、10,000ヌクレオチド、8,000ヌクレオチド、6,000ヌクレオチド、4,000ヌクレオチド、3,800ヌクレオチド、3,600ヌクレオチド、3,400ヌクレオチド、3,200ヌクレオチド、3,000ヌクレオチド、2,800ヌクレオチド、2,600ヌクレオチド、2,400ヌクレオチド、2,200ヌクレオチド、2,000ヌクレオチド、1,800ヌクレオチド、1,600ヌクレオチド、1,400ヌクレオチド、1,200ヌクレオチド、1,000ヌクレオチド、900ヌクレオチド、800ヌクレオチド、700ヌクレオチド、600ヌクレオチド、500ヌクレオチド、400ヌクレオチド、300ヌクレオチド、200ヌクレオチド、100ヌクレオチド、50ヌクレオチド、又は数ヌクレオチド以内に位置している。いくつかの実施態様において、遺伝子又は発現システムの組込み部位間の距離は、約4000塩基対である。いくつかの実施態様において、該組込み部位は、少なくとも約1500塩基対(例えば、約1500塩基対; 2000塩基対; 2500塩基対; 3000塩基対; 3500塩基対; 4000塩基対; 4500塩基対; 5000塩基対; 5500塩基対; 6000塩基対; 6500塩基対; 7000塩基対; 7500塩基対; 8000塩基対; 8500塩基対; 9000塩基対; 9500塩基対; 10,000塩基対; 20,000塩基対; 50,000塩基対; 100,000塩基対; 200,000塩基対;又は500,000塩基対)離れていた。いくつかの実施態様において、少なくとも1つのグリセロールデヒドラターゼ酵素もしくはジオールデヒドラターゼをコードする、本明細書に記載される発現システム、及び少なくとも1つのアルデヒドデヒドロゲナーゼ酵素をコードする、本明細書に記載される発現システムは、細菌染色体において、互いの約500ヌクレオチド以内に位置付けされている(例えば、遺伝子又は発現システムの組込み部位間の距離は、約500塩基対である)。
【０１２９】
いくつかの実施態様において、発現システムの細菌染色体への組込み位置は、発現システムの発現レベルに影響を及ぼす。いくつかの場合において、複製起点に近ければ近いほど、発現システムの発現レベルはより高くなる。いくつかの実施態様において、発現システムは、複製起点から約500〜4000ヌクレオチド(例えば、ヌクレオチド又は塩基対)離れて組み込まれた。いくつかの実施態様において、発現システムは、複製起点から〜4000ヌクレオチド離れて、〜3000ヌクレオチド離れて、〜2000ヌクレオチド離れて、〜1000ヌクレオチド離れて、〜750ヌクレオチド離れて、又は〜500ヌクレオチド離れて組み込まれた。いくつかの実施態様において、複製起点に最も近い組込み部位は、複製起点から約500ヌクレオチド離れている。いくつかの実施態様において、複製起点に最も近い組込み部位は、複製起点から少なくとも500ヌクレオチド(例えば、約500ヌクレオチド; 600ヌクレオチド; 700塩基ヌクレオチド対; 800ヌクレオチド; 900ヌクレオチド; 1000ヌクレオチド; 1100ヌクレオチド; 1200ヌクレオチド; 1300ヌクレオチド; 1400ヌクレオチド; 1500ヌクレオチド; 2000ヌクレオチド; 2500ヌクレオチド; 4000ヌクレオチド;又は5000ヌクレオチド)離れている。いくつかの実施態様において、発現システムは、複製起点から約500ヌクレオチド離れて組み込まれた。
【０１３０】
上記のように、3-HPAをDhaB及びALDH酵素経由でチャネリングして、3-HP産生及び細胞生存を改善するためのシステムを作り出した。このシステムは、他の酵素及び細胞成分の毒性3-HPAへの曝露を低下させ、3-HP又はその塩の産生を増大させる。一実施態様において、dhaB、gdrAB遺伝子、及びkgsAを互いに隣接して配置した。別の場合において、kgsAの位置は、DhaB及びGdrABコード遺伝子から2000bpを超えて離れていた。相互の関連における及び複製起点との関連における遺伝子の組込み位置は、発現及び活性に影響を及ぼす。
【０１３１】
kgsAを様々な位置(DhaB、GdrABの近く(P4-20株)、及びDhaB、GdrABから2000bp離れている(P4-10株))に配置したとき、本発明者らは、酵素活性の違いに気付く。P4-10及びP4-20株において、チャネリング効果を調べるために、酵素活性を(プロモーター、UTRなどの遺伝子調節モジュールを変化させることにより)同期させた。これらの修飾により、両方の株(チャネリング効果あり(P4-20)及びチャネリング効果なし(P4-10))は、同様のKgsA及びDhaB活性を示した。これら2つの株(チャネリングありの株及びチャネリングなしの株)間の唯一の違いは、dhaB及びgdrAB遺伝子との関連におけるkgsA遺伝子の位置であった(図51)。
【０１３２】
これらの同じ株(P4-10及びP4-20)において、3-HPの産生を比較した。遺伝子(kgsA遺伝子とdhaB及びgdrAB遺伝子)がチャネリングされている(例えば、互いに近くに位置している)P4-20株は、遺伝子(kgsA遺伝子とdhaB及びgdrAB遺伝子)がチャネリングされていない(例えば、染色体上で2000bp離れて位置している)P4-10株と比較したとき、より高い3-HP産生率及び改善された3-HP力価を示した。P4-20株において、3-HPA蓄積のレベルは、P4-10よりも低かった。いくつかの場合において、これは、近くに位置するKgsA酵素による3-HPAの消費によるものである。P4-20株において、DhaB酵素(これにより、3-HPAが産生される)は、KgsA酵素の近くに位置しており、したがって、3-HPAは、それが蓄積し、かつ/又はKgsA酵素に影響を及ぼす前に、この酵素によって速やかに消費される。
【０１３３】
(バイオ産生)
培地、通気、温度、pH、及び標的産物の誘導時間などの、最適な生理的パラメータは、個々に又は組合せで、細胞増殖及び標的分子産生に対するかなりの効果を有する。
【０１３４】
培地は、細胞生存を維持する上で及び標的産物の力価を改善するために極めて重要な役割を果たすバイオプロセスの重要なパラメータであり、それゆえ、それは、効率的な3-HP産生のために適切に配合されなければならない。分析等級の化学物質を用いて3-HP又はその塩を産生するバイオプロセスは市販されていない。それゆえ、培地成分の慎重な選択及び配合が非常に重要であった。成分の中で、DhaB酵素活性のための補酵素B12、炭素源及び窒素源は、3-HP産生用の培地中に補充される高価な成分であり、したがって、より安価な培地成分を特定及び調査し、かつ3-HP産生及び商業化のための好適な培地を配合することも極めて重要である。
【０１３５】
工業用培地の配合は別として、例えば、温度、pH、通気などのバイオプロセス条件をバイオリアクター条件で検討し、最適化した。生理的パラメータを制御された条件下で様々に変えることにより、3-HP産生にとって極めて重要である細胞代謝及びNAD+再生を分析的に検討した。組換え株の酸耐性及び3-HP産生経路の酵素効率を改善するのに重要な役割を果たすpHの効果を調べた。各々の生理的パラメータが3-HP産生に顕著に影響を及ぼすので、通気及び温度及び誘導時間の最適化を検討した。バイオプロセス最適化によるグリセロールから3-HPを産生する組換え株の性能の改善を達成した。
【０１３６】
実施例に記載されているように、例えば、グルコース、グルタミン酸塩、グルコン酸塩、及びクエン酸を含む、組換え株がより高い細胞密度まで増殖し、また、高力価の3-HPを産生するのを支援し得る様々な炭素源を調べた。増殖条件のpHも調べ、いくつかの場合においては、中和塩基をバイオリアクター中で用いて、pHを維持した。より高い酸濃度及び/又はより高い3-HP濃度で増殖することができる細菌株も本明細書で提供される。いくつかの場合において、増殖培養物中の重炭酸塩のレベルを制御する。
【０１３７】
窒素は、培地中の別の重要な成分である。以下の実施例に示されているように、例えば、コーンスティープリカー、酵母抽出物などを含む、様々な窒素源を用いる3-HPの産生も調べた。
【０１３８】
通気は、細胞増殖のための重要な特性である。培養条件の通気は、細胞増殖に使用されるが、過剰な通気は、3-HP産生のレベルを低下させることがある。以下の実施例は、3-HPのバイオ産生のための適切な通気を示している。
【０１３９】
本開示は、細胞増殖及び組換え微生物による標的分子産生のための最適温度の特定も提供する。これは、細胞増殖のための最適温度と標的分子産生のための最適温度のバランスを含む。
【０１４０】
3-HPの産生のための誘導のタイミングを培養条件及び組換え細菌に基づいて調整することもできる。例えば、対数期中期でのグリセロール(3-HPの供給源として)の添加による誘導は、組換え株による高レベルの3-HPを産生した。他の培養条件及び/又は組換え株は、対数期初期又は対数期後期で誘導することにより、高レベルの3-HPを産生することができる。
【０１４１】
(水溶液からの3-HPの除去)
いくつかの実施態様において、水溶液から3-HPを抽出する方法は:水不混和性溶媒を蒸発させること;蒸発した水不混和性溶媒を液体状態にまで凝縮させること;液体の水不混和性溶媒を用いて、3-HPを含有する水性相から3-HPを抽出し、水不混和性溶媒中の3-HPの溶液を提供すること;該水不混和性溶媒中の3-HPの溶液を水性相から分離することを含む。通常、液体の水不混和性溶媒と接触させる前に、3-HPを含有する水性相はさらに、水混和性溶媒を含有する。
【０１４２】
通常、任意の適当な水混和性もしくは水不混和性溶媒、又はその任意の組合せを、水溶液から3-HPを除去するために使用することができる。これらの溶媒及びその組合せの例示的な実施態様は、本開示の対応する「水不混和性溶媒」、「水混和性溶媒」、「溶媒の組合せ」の節に記載されている。
【０１４３】
一般に、任意の適当なプロセス条件を、水溶液から3-HPを除去する方法で使用することができる。実例となる例示的なプロセスパラメータは、以下の「プロセスパラメータ」と題する節に記載されている。
【０１４４】
一般に、3-HPは、水への溶解性が比較的高く、かつ有機溶媒への溶解性が比較的低い極性有機酸である。3-HPは市販製品である。例えば、3-HPは、30wt.％水溶液(カタログ番号792659)としてSigma-Aldrichから購入することができ、一方、3-HPの5〜6wt.％酢酸エチル溶液は、入手困難である。理論に束縛されることを望むものではないが、水混和性溶媒(例えば、メタノール)を3-HPの水溶液に添加すると、得られる水溶液への3-HPの溶解度が低下し、それにより、水不混和性溶媒(例えば、酢酸エチル)による水溶液からの3-HPの除去が容易になると考えられている。
【０１４５】
(水溶液)
本明細書で使用される場合、「水溶液」という用語は、1以上の溶媒(例えば、溶媒の混合物)を含む液体中の少なくとも1つの溶質の溶液を指し、ここで、少なくとも1つの溶媒は、水であり、溶媒又は溶媒の混合物中の水の重量パーセンテージは、少なくとも約50％(例えば、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも90％)である。いくつかの実施態様において、水溶液は、水が唯一の溶媒である溶液である。
【０１４６】
いくつかの実施態様において、水溶液中の3-HPの量は、約10g/L〜約150g/L(例えば、約20g/L〜約140g/L、約30g/L〜約130g/L、約40g/L〜約120g/L、約50g/L〜約110g/L、約50g/L〜約100g/L、約60g/L〜約100g/L、約60g/L〜約80g/L、又は約80g/L〜約120g/L)である。溶液中の3-HPの濃度は、規定の容量の3-HPを含有する溶液中の3-HPの質量(力価)、規定の質量の溶媒中の3-HPの量(モル濃度)、又は規定の容量の該溶液中の3-HPの量(モル濃度)として表すことができる。それに加えて又はその代わりに、溶液中の溶質の濃度を表す任意の他の方法を用いて、水溶液中の3-HPの濃度を記述してもよい。一例として、いくつかの実施態様において、水溶液中の3-HPの力価は、少なくとも約40g/L(例えば、約50g/L、約60g/L、約70g/L、約80g/L、約90g/L、約100g/L、又は約120g/L)である。
【０１４７】
いくつかの実施態様において、水溶液は、脱細胞化後に得られる発酵ブロスである。ブロスから全細胞を除去するための任意の方法を脱細胞化に利用することができる。一例として、発酵ブロスを、遠心分離を用いて脱細胞化することができる。いくつかの実施態様において、水溶液は、微生物を培養し又は増殖させた後に得られる発酵ブロス(例えば、培養培地)である。いくつかの場合において、水溶液は、脱細胞化される。いくつかの実施態様において、3-HPを含有するブロスは、3-HPを産生する微生物を培養することにより得ることができる。そのような微生物の例示的な例としては、グラム陰性細菌、例えば、大腸菌、オリゴトロファ・カルボキシドボランス(Oligotropha carboxidovorans)、肺炎桿菌もしくはシュードモナス属種;及びグラム陽性細菌、例えば、枯草菌(Bacillus subtilis)、ラクトバシルス属種(Lactobaccilus sp)、又はラクトコッカス属種(Lactococcus sp)が挙げられる。発酵によって3-HPを産生し得る微生物としては、クロストリジウム属、ザイモモナス属(Zymomonas)、エシェリキア属、サルモネラ属、ロドコッカス属、シュードモナス属、バチルス属、ラクトバチルス属、エンテロコッカス属(Enterococcus)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、クレブシエラ属、パエニバチルス属(Paenibacillus)、アルスロバクター属(Arthrobacter)、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)、ブレビバクテリウム属(Brevibacterium)、ピキア属(Pichia)、カンジダ属(Candida)、ハンセヌラ属(Hansenula)、又はサッカロミセス属(Saccharomyces)という属の任意のメンバーが挙げられる。いくつかの実施態様において、3-HPを産生する微生物は、本明細書に記載される組換え細菌である。3-HPを産生する組換え細菌いくつかの例は、シュードモナス属株、クレブシエラ属株、又はエシェリキア属株である。発酵によって3-HPを産生し得る微生物のいくつかの例としては、アルカリゲネス・ユートロフス(Alcaligenes eutrophus)(カプリアビダス・ネカトー(Cupriavidus necator))、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、パエニバチルス・マセランス(Paenibacillus macerans)、ロドコッカス・エリスロポリス(Rhodococcus erythropolis)、シュードモナス・プチダ(Pseudomonas putida)、ラクトバチルス・プランタルム(Lactobacillus plantarum)、エンテロコッカス・フェシウム(Enterococcus faecium)、エンテロコッカス・ガリナリウム(Enterococcus gallinarium)、エンテロコッカス・ファエカリス(Enterococcus faecalis)、枯草菌、及び出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)が挙げられる。
【０１４８】
ブロス中の発酵培地は、細菌又は真菌増殖培地中で通常有用である種々の栄養素及び成分(例えば、炭素及び/又は窒素源)を含むことができる。そのような栄養素及び成分の例示的かつ非限定的な例は、本明細書に記載されている。炭素源の例は、例えば、グルコース、グルタミン酸塩、グルコン酸塩、フルクトース、アラビノース、もしくはガラクトースなどの糖、クエン酸、又はクエン酸サイクル中間体、例えば、ピルビン酸塩もしくはコハク酸塩、又はこれらの組合せである。炭素源の別の例は、グリセロールである。例示的な窒素源としては、アンモニウム塩、コーンスティープリカー、酵母抽出物、及び硝酸塩が挙げられる。発酵培地中で有用なさらなる成分の例示的な例としては、血清タンパク質、ビタミン、核酸、及びアミノ酸も挙げられる。
【０１４９】
いくつかの実施態様において、発酵後に3-HPを含有する脱細胞化ブロスは、約0.5wt.％〜約5wt.％(例えば、約1wt.％〜約3wt.％)の炭素源、例えば、グリセロールなどを含有する。
【０１５０】
いくつかの実施態様において、脱細胞化発酵ブロスは、3-HPを産生するために微生物によって使用される約0.5wt.％〜約20wt.％(例えば、約1wt.％〜約10wt.％)の組合せ量のさらなる成分(例えば、本明細書に記載されているものなど)を含有する。
【０１５１】
いくつかの実施態様において、発酵及び脱細胞化後のブロスは、約7〜約8(例えば、約7〜約7.5)のpHを有する。そのようなブロスは、例えば、ナトリウム塩又はカリウム塩などの、3-HPの塩を含有し得る。いくつかの実施態様において、酸を脱細胞化発酵ブロスに添加して、pHを増大させ、遊離酸形態の3-HPをブロス中で得ることができる。任意の適当な無機酸又は有機酸を用いて、発酵ブロスのpHを調整することができる。例示的な無機酸としては、HCl、H2SO4、HNO3、及びH3PO4が挙げられる。例示的な有機酸としては、ギ酸、シュウ酸、酢酸、酒石酸、マロン酸、グルタル酸、コハク酸、及びトリフルオロ酢酸が挙げられる。いくつかの実施態様において、シュウ酸の飽和水溶液を用いて、水溶液のpHを調整する。約室温でのシュウ酸の飽和溶液の濃度は、例えば、約40g/L〜約50g/L(例えば、約45g/L)である。
【０１５２】
いくつかの実施態様において、3-HPを含有する水溶液のpHは、約3〜約7(例えば、約4〜約7、約4〜約5、約4〜約6、約4.1〜約4.9、約4.2〜約4.7、約4.2〜約4.8、約4.3〜約4.6、又は約4.3〜約4.5)である。いくつかの実施態様において、水溶液のpHは、少なくとも約3(例えば、少なくとも約3.5、少なくとも約4、もしくは少なくとも約4.1)、及び/又は最大で約7(例えば、最大で約6.5、最大で約6、最大で約5.5、もしくは最大で約5.0)である。いくつかの実施態様において、水溶液のpHは、約4、約4.1、約4.2、約4.3、約4.4、約4.5、約4.6、又は約4.7である。
【０１５３】
いくつかの実施態様において、水溶液のpHは、通常、3-HPを水溶液から除去すると上昇する。そのような実施態様において、水溶液のpHを、1以上の酸を水溶液に連続的に又は不連続的に添加することにより、除去プロセスの間に(連続的に又は不連続的に)調整して、3-HP除去による任意の段階的なpHの上昇に所望の通りに対処することができる。
【０１５４】
いくつかの実施態様において、3-HPは、少なくとも約20％(例えば、少なくとも約30％、少なくとも約40％、少なくとも約50％、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％)の収率で水溶液から除去することができる。いくつかの実施態様において、3-HPは、(例えば、HPLC又はLCMSによって)ごく微量の3-HPしか水溶液中で検出されることができないように、水溶液から除去することができる。いくつかの実施態様において、3-HPは、水溶液から完全に除去することができる。(すなわち、除去プロセスの収率は100％である)。
【０１５５】
本明細書で使用される場合、「収率」という用語は、産物を得るために使用されるプロセスで使用される出発材料の量に基づく、得られる産物の総量と該プロセスによって得ることができる産物の理論上の量との比(パーセンテージとして表される)を指す。
【０１５６】
いくつかの実施態様において、3-HPは、向流液体フローを使用しないで、水溶液から除去することができる。本明細書で使用される場合、「向流液体フロー」という用語は、接触及び相分離後の2つの不混和性液体の双方向性フローを指す。いくつかの実施態様において、液体の流速は等しい。他の実施態様において、一方の液体の流速は、もう一方の液体の流速を上回る。水不混和性溶媒による水性溶媒からの溶質の向流抽出は、向流液体フローの1つの例に過ぎない。3-HPが向流フローを使用しないで水溶液から除去される実施態様において、3-HPは、例えば、水溶液及び有機溶媒の向流フローのための技法及び装置のいずれも使用しないで、水溶液から有機溶媒で抽出することができる。向流フローの技法及び装置は、例えば、PCT刊行物WO 2005/003074号、WO 2013/192450号、及びWO 2013/192451号に記載されている。
【０１５７】
いくつかの実施態様において、3-HPは、有機溶媒、又は2以上の有機溶媒の組合せを使用することにより、水溶液から除去することができる。いくつかの実施態様において、水溶液からの3-HPの除去のための有機溶媒は、(1)溶媒を蒸発させ;かつ(2)蒸発した溶媒を凝縮させた後に使用することができる。いくつかの実施態様において、凝縮した溶媒のフローの向きを変えて、例えば、3-HPが溶媒によって水性相から除去されるように、溶媒のフローを水溶液に向けて、溶媒と水性相の効果的な混合を達成することにより、水溶液から3-HPを除去することができる。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「蒸発」という用語は、液体からガス相(蒸気)への変換を指す。蒸気圧が周囲大気によって液体に与えられる圧力と等しいとき、液体の蒸発は、「沸騰」と呼ばれる。いくつかの実施態様において、蒸発は、液体が加熱されたときに起こる。典型的には、液体の沸騰は、液体がその沸点以上で加熱されたときに起こる。複数の溶媒を含有する液体が加熱されたとき、2つの溶媒が共沸混合物を形成して、同時に蒸発しない限り、より低い沸点を有する溶媒がまず蒸発し、次に、より高い沸点を有する溶媒が蒸発することが理解される。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「凝縮」という用語は、蒸気から液体への変換のプロセスを指す。典型的には、蒸気の凝縮は、蒸気が液体の沸点未満に冷却されたときに起こる。
【０１６０】
(水不混和性溶媒)
いくつかの実施態様において、水不混和性溶媒(例えば、水不混和性有機溶媒)を、水溶液から3-HPを除去するプロセスで使用することができる。すなわち、3-HPの溶液が水不混和性溶媒中で形成されるように、水不混和性溶媒と水溶液を組み合わせることができる。その後、水不混和性溶媒中の3-HPの溶液を水性相から分離することができる。
【０１６１】
本明細書で使用される場合、「水不混和性溶媒」という用語は、水と混合して、均一な液体を形成することができない溶媒を指す。例えば、水への水不混和性溶媒の溶解度は、約3wt.％未満(例えば、約2wt.％未満、又は約1wt.％未満)である。例えば、約3g未満(例えば、約2g未満、又は約1g未満)の水不混和性溶媒が100mLの水に溶ける。
【０１６２】
いくつかの実施態様において、水不混和性溶媒は、約1g/mL未満の密度を有する。そのような実施態様において、水不混和性溶媒は、水よりも密度が低く、水と組み合わせたとき、溶媒は、水性相の上に有機相を形成する。いくつかの実施態様において、水不混和性溶媒は、約0.5g/mL〜約1g/mL(例えば、約0.5g/mL、約0.6g/mL、約0.75g/mL、約0.85g/mL、約0.9g/mL、又は約0.95g/mL)の密度を有する。
【０１６３】
水よりも密度が低い水不混和性溶媒の例示的な例としては、C5-10アルカン、C5-8シクロアルカン、芳香族炭化水素溶媒、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルが挙げられる。そのような水不混和性溶媒の組合せを使用することができる。
【０１６４】
例示的なC5-10アルカンとしては、n-ペンタン、n-ヘキサン、n-ヘプタン、n-オクタン、及びイソオクタンが挙げられる。
【０１６５】
例示的なC5-8シクロアルカンとしては、シルコペンタン及びシクロヘキサンが挙げられる。
【０１６６】
例示的な芳香族炭化水素溶媒としては、ベンゼン、トルエン、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、及びクメンが挙げられる。
【０１６７】
例示的なC1-6アルキルアセテートとしては、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルが挙げられる。
【０１６８】
例示的なC4-6アルコールとしては、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコールが挙げられる。
【０１６９】
例示的なC1-6アルキルエーテルとしては、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル(MTBE)、及びメチルヘキシルエーテルが挙げられる。
【０１７０】
いくつかの実施態様において、水不混和性溶媒は、約1g/mL超の密度を有する。そのような実施態様において、水不混和性溶媒は、水よりも密度が高く、水と組み合わせたとき、溶媒は、水性相の下に有機相を形成する。いくつかの実施態様において、水不混和性溶媒は、約1g/mL〜約1.5g/mL(例えば、約1.1g/mL、約1.15g/mL、約1.2g/mL、約1.25g/mL、約1.3g/mL、又は約1.4g/mL)の密度を有する。
【０１７１】
いくつかの実施態様において、水よりも密度が高い水不混和性溶媒は、C1-4アルカン、C1-4アルケン、C4-6シクロアルカン、C4-6シクロアルケン、芳香族炭化水素溶媒、C1-6アルキルアセテート、C2-6アルコール、又はC1-6アルキルエーテルである。任意に、そのような溶媒は、1以上(例えば、1、2、3、4、又は5個)の独立に選択されるハロゲン原子、例えば、1以上のCl原子、1以上のBr原子、1以上のF原子、又はこれらの組合せなどで置換される。そのような水不混和性溶媒の例示的な実施態様としては、C1-4ハロアルカン、C1-4ハロアルケン、C2-6ハロアルコール、及びハロゲン化芳香族炭化水素溶媒が挙げられる。この段落に記載されている水不混和性溶媒の組合せを使用することができる。
【０１７２】
C1-6ハロアルカンの例示的な例としては、クロロホルム、ブロモホルム、クロロフルオロカーボン、塩化メチレン、四塩化炭素、1,1-ジクロロ-1-フルオロエタン、1,1,1-トリクロロエタン、及びパーフルオロデカリンが挙げられる。
【０１７３】
C1-4ハロアルケンの例示的な例としては、1,2-ジクロロエテン、1,1-ジクロロエテン、及びトリクロロエチレンが挙げられる。
【０１７４】
ハロゲン化芳香族炭化水素溶媒の例示的な例としては、クロロベンゼン、1,2-ジフルオロベンゼン、1,2,4-トリクロロベンゼン、及びトリフルオロトルエンが挙げられる。
【０１７５】
C2-6ハロアルコールの例示的な例としては、ヘキサフルオロ-2-プロパノール、2,2,2-トリフルオロエタノール、及びトリクロロ-2-メチル-2-プロパノールが挙げられる。
【０１７６】
水溶液から3-HPを除去するために水不混和性溶媒を使用する場合、条件は、水不混和性溶媒中の3-HPの濃度が、約1g/L〜約300g/L(例えば、約5g/L〜約250g/L、約10g/L〜約200g/L、約20g/L〜約150g/L、約30g/L〜約100g/L、約40g/L〜約90g/L、又は約50g/L〜約80g/L)となり得るように選択することができる。
【０１７７】
一般に、水溶液の量に対する水不混和性溶媒の量は、必要に応じて選択することができる。いくつかの実施態様において、水不混和性溶媒の量は、水溶液の量をベースにして、約50v/v％〜約150v/v％(例えば、約80v/v％〜約120v/v％、又は約90v/v％〜約110v/v％)である。例えば、水不混和性溶媒の量は、水溶液の量をベースにして、約50v/v％、約60v/v％、約70v/v％、約80v/v％、約90v/v％、約100v/v％、約105v/v％、約110v/v％、約120v/v％、約125v/v％、約130v/v％、又は約140v/v％であり得る。
【０１７８】
(水混和性溶媒)
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒(例えば、水混和性有機溶媒)を、水溶液から3-HPを除去するプロセスで使用することができる。本明細書で使用される場合、「水混和性」という用語は、任意の比率で水と混合して、均一な液体を形成する得る溶媒を指す。
【０１７９】
一般に、水混和性溶媒を、水溶液から3-HPを除去するプロセスで使用する実施態様において、水混和性溶媒を水溶液と組み合わせて、均一な水溶液を形成させる。一例として、水混和性溶媒を水溶液に注ぎ入れて、均一な液体を形成させることができる。別の例として、水混和性溶媒を水溶液に添加して:(1)水混和性溶媒を蒸発させ;(2)蒸発した水混和性溶媒を凝縮させ;かつ(3)凝縮した水混和性溶媒のフローを水溶液に向けた後に、均一な液体を形成させることができる。
【０１８０】
水混和性溶媒を、水溶液から3-HPを除去するプロセスで使用する実施態様において、単一の水混和性溶媒を使用することができ、又は水混和性溶媒の組合せを使用することができる。
【０１８１】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、C1-3アルコールである。C1-3アルコールの例示的な例としては、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールが挙げられる。
【０１８２】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、極性非プロトン性溶媒である。極性非プロトン性溶媒の例示的な例としては、テトラヒドロフラン(THF)、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヘキサメチルリン酸トリアミド(HMPT)、ジメチルホルムアミド(DMF)、アセトニトリル、ジオキサン、及びアセトンが挙げられる。
【０１８３】
通常、水溶液の量に対する水混和性溶媒の量は、必要に応じて選択することができる。いくつかの実施態様において、水混和性溶媒の量は、水溶液の量をベースにして、約1v/v％〜約50v/v％(例えば、約1v/v％〜約40v/v％、約1v/v％〜約30v/v％、約5v/v％〜約50v/v％、約10v/v％〜約40v/v％、約15v/v％〜約35v/v％、又は約20v/v％〜約30v/v％)である。例えば、水混和性溶媒の量は、水溶液の量をベースにして、約5v/v％、約10v/v％、約15v/v％、約20v/v％、約25v/v％、約30v/v％、又は約40v/v％であり得る。
【０１８４】
(水不混和性溶媒と水混和性溶媒の組合せ)
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒と水不混和性溶媒の両方を、水溶液から3-HPを除去するプロセスで使用する。そのような実施態様において、一般に、水不混和性溶媒と水混和性溶媒の容量比は、必要に応じて選択することができる。いくつかの実施態様において、水不混和性溶媒と水混和性溶媒の容量比は、約10:1〜約1:1(例えば、約9:1〜約2:1、約8:1〜約2:1、約7:1〜約2:1、約6:1〜約2:1、又は約5:1〜約3:1)である。例えば、水不混和性溶媒と水混和性溶媒の容量比は、約2:1、約3:1、約4:1、約4.5:1、約5:1、約8:1、又は約10:1である。
【０１８５】
一般に、1)水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、必要に応じて選択することができる。いくつかの実施態様において、1)水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1(例えば、約1:1〜約1.5:1)、例えば、約1:1、約1.2:1、約1.3:1、約1.4:1、又は約1.5:1などであることができる。
【０１８６】
通常、水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の相対的沸点は、必要に応じて選択することができる。いくつかの実施態様において、水混和性溶媒の沸点は、水不混和性溶媒の沸点よりも低い。いくつかの実施態様において、水混和性溶媒の沸点は、水不混和性溶媒の沸点よりも高い。
【０１８７】
一般に、水不混和性溶媒及び水混和性溶媒、並びにそのそれぞれの量は、必要に応じて選択することができる。
【０１８８】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、メタノール、エタノール、アセトン、アセトニトリル、THF、ジメチルスルホキシド(DMSO)、ヘキサメチルリン酸トリアミド(HMPT)、及びジメチルホルムアミド(DMF)から選択され、水不混和性溶媒は、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、ベンゼン、クロロベンゼン、トルエン、o-キシレン、m-キシレン、及びp-キシレン、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、ジエチルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル(MTBE)、メチルヘキシルエーテル、クロロホルム、塩化メチレン、並びに四塩化炭素から選択される。そのような実施態様において、水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、水混和性溶媒の量は、水溶液の量をベースにして、約5v/v％〜約50v/v％であることができ、水混和性溶媒と水不混和性溶媒の容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ/又は1)水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０１８９】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、C1-3アルコール(例えば、メタノール、エタノール、又はイソプロパノール)であり、水不混和性溶媒は、芳香族炭化水素溶媒(例えば、ベンゼン、トルエン、o-キシレン、m-キシレン、p-キシレン、又はクロロベンゼン)である。そのような実施態様において、水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、水混和性溶媒の量は、水溶液の量をベースにして、約5v/v％〜約50v/v％であることができ、水混和性溶媒と水不混和性溶媒の容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ/又は1)水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０１９０】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、C1-3アルコール(例えば、メタノール、エタノール、又はイソプロパノール)であり、水不混和性溶媒は、C1-6アルキルアセテート(例えば、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、又は酢酸tert-ブチル)である。そのような実施態様において、水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、水混和性溶媒の量は、水溶液の量をベースにして、約5v/v％〜約50v/v％であることができ、水混和性溶媒と水不混和性溶媒の容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ/又は1)水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０１９１】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、C1-3アルコール(例えば、メタノール、エタノール、又はイソプロパノール)であり、水不混和性溶媒は、C1-6アルキルエーテル(例えば、ジエチルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル(MTBE)、又はメチルヘキシルエーテル)である。そのような実施態様において、水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、水混和性溶媒の量は、水溶液の量をベースにして、約5v/v％〜約50v/v％であることができ、水混和性溶媒と水不混和性溶媒の容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ/又は1)水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０１９２】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、C1-3アルコール(例えば、メタノール、エタノール、又はイソプロパノール)であり、水不混和性溶媒は、C1-6ハロアルカン(例えば、クロロホルム、塩化メチレン、又は四塩化炭素)である。そのような実施態様において、水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、水混和性溶媒の量は、水溶液の量をベースにして、約5v/v％〜約50v/v％であることができ、水混和性溶媒と水不混和性溶媒の容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ/又は1)水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０１９３】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、メタノールであり、水不混和性溶媒は、酢酸ブチルである。そのような実施態様において、メタノール及び酢酸ブチルの量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、メタノールの量は、水溶液の約5v/v％〜約50v/v％であり、メタノールと酢酸ブチルの容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ/又は1)メタノール及び酢酸ブチルの組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０１９４】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、メタノールであり、水不混和性溶媒は、MTBEである。そのような実施態様において、メタノール及びMTBEの量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、メタノールの量は、水溶液の約5v/v％〜約50v/v％であることができ、メタノールとMTBEの容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ/又は1)メタノール及びMTBEの組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０１９５】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、メタノールであり、水不混和性溶媒は、イソブチルアルコールであることができる。そのような実施態様において、メタノール及びイソブチルアルコールの量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、メタノールの量は、水溶液の約5v/v％〜約50v/v％であることができ、メタノールとイソブチルアルコールの容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ/又は1)メタノール及びイソブチルアルコールの組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０１９６】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、メタノールであり、水不混和性溶媒は、tert-ブチルアルコールである。そのような実施態様において、メタノール及びtert-ブチルアルコールの量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、メタノールの量は、水溶液の約5v/v％〜約50v/v％であることができ、メタノールとtert-ブチルアルコールの容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ及び/又は1)メタノール及びtert-ブチルアルコールの組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０１９７】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、メタノールであり、水不混和性溶媒は、ベンゼンである。そのような実施態様において、メタノール及びベンゼンの量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、メタノールの量は、水溶液の約5v/v％〜約50v/v％であることができ、メタノールとベンゼンの容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ/又はメタノール及びベンゼンの組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０１９８】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、メタノールであり、水不混和性溶媒は、トルエンである。そのような実施態様において、メタノール及びトルエンの量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、メタノールの量は、水溶液の約5v/v％〜約50v/v％であることができ、メタノールとトルエンの容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ/又は1)メタノール及びトルエンの組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０１９９】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒は、メタノールであり、水不混和性溶媒は、クロロホルムである。そのような実施態様において、メタノール及びクロロホルムの量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、メタノールの量は、水溶液の約5v/v％〜約50v/v％であることができ、メタノールとクロロホルムの容量比は、約1:10〜約1:2であることができ、かつ及び/又は1)メタノール及びクロロホルムの組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。
【０２００】
特定の例示的な実施態様において、水混和性溶媒は、メタノールであり、水不混和性溶媒は、酢酸エチルである。そのような実施態様において、メタノール及び酢酸エチルの量は、必要に応じて選択することができる。一例として、そのような実施態様において、メタノールの量は、水溶液の約15v/v％〜約35v/v％であることができ、メタノールと酢酸エチルの容量比は、約1:9〜約3:7であり、かつ/又は1)メタノール及び酢酸エチルの組合せ容量と2)水溶液の容量の比は、約1:1〜約2:1であることができる。また、そのような実施態様において、水溶液中の3-HPの濃度は、約50g/L〜約80g/Lであることができ、水溶液の3 pHは、約4〜約5であることができ、かつ水溶液から3-HPを除去するプロセスにおける水溶液の温度は、約15℃〜約40℃である。
【０２０１】
いくつかの実施態様において、水溶液から3-HPを抽出する方法は:(1)3-HPを含有する脱細胞化発酵ブロスを含有する抽出容器、該抽出容器中のブロスの量をベースにして約90v/v％〜約110v/v％の量の酢酸エチルを含有する溶媒容器、及びコンデンサを提供すること;(2)該溶媒容器から酢酸エチルを蒸発させること;(3)該蒸発した酢酸エチルを該コンデンサ中で液体状態にまで凝縮させること;(4)3-HPの酢酸エチル溶液が該抽出容器中で形成されるように、酢酸エチルのフローを該コンデンサから該抽出容器に向けること;(5)該ブロスと該3-HPの酢酸エチル溶液を該抽出容器中で分離すること;並びに(6)該3-HPの酢酸エチル溶液のフローを該抽出容器から該溶媒容器に向けることを含む。いくつかの実施態様において、抽出容器は、ブロスの量をベースにして、約20v/v％〜約30v/v％の量のメタノールも含有する。そのような実施態様において、メタノールは、ブロスと完全に混和し、抽出プロセスの間、溶媒容器中に留まる。そのようなシステムにおける酢酸エチルの量とメタノールの量の比は、約5:1〜約3:1である。
【０２０２】
(プロセスパラメータ)
一般に、水溶液から3-HPを除去するプロセスにおいて、任意の適当な流速を溶媒(例えば、有機溶媒)に使用することができる。例えば、いくつかの実施態様において、水溶液から3-HPを除去するプロセスにおける溶媒のフローは、約0.1L/h〜約10L/h(例えば、約0.5L/h〜約8L/h、約1L/h〜約5L/h、又は約1L/h〜約3L/h)である。
【０２０３】
通常、水溶液から3-HPを除去するプロセスにおいて、任意の適当な温度を使用することができる。例えば、いくつかの実施態様において、水溶液から3-HPを除去することは、約15℃〜約50℃(例えば、約15℃〜約40℃、又は約20℃〜約30℃)の水溶液の温度で行われる。いくつかの実施態様において、水溶液から3-HPを除去することは、最大で約50℃(例えば、約40℃、又は約30℃)の水溶液の温度で行われる。任意に、水溶液から3-HPを除去することは、室温で行われる。
【０２０４】
いくつかの実施態様において、水又は低級アルコールなどの極性プロトン性溶媒中で3-HPを加熱することにより、スキーム1に示されているような3-HPの分解が生じる:
(スキーム1)
【化７】
2021502112.tif 000014
【０２０５】
スキーム1に関して、3位のヒドロキシル基の水素原子は、3-HPのカルボニル基との水素結合を形成し、それにより、6員環を形成することができる。極性プロトン性溶媒は、6員環の形成及び3-HPの分解を促進して、エチレン、二酸化炭素、及び水を形成させることができる。1つの例として、分解は、極性プロトン性溶媒(例えば、水)中の3-HPの溶液が50℃超の温度で加熱されたときに起こり得る。したがって、理論に束縛されることを望むものではないが、いくつかの実施態様において、水溶液から3-HPを除去するときに、温度を50℃以下に維持することにより、望ましくないエチレン及び/又は二酸化炭素の形成を低下させることができる。
【０２０６】
ある実施態様において、水不混和性溶媒中の3-HPの溶液の温度は、水不混和性溶媒の沸点又はその付近である。一例として、酢酸エチルがプロセスで使用されるとき、3-HPの酢酸エチル溶液の温度は、約78℃〜約80℃であり得る。別の例として、イソブタノールがプロセスで使用されるとき、3-HPのイソブタノール溶液の温度は、約105℃〜約110℃であり得る。有利なことに、温度は、水溶液から化合物を除去する間、水不混和性溶媒中のその溶液を加熱するときに、望ましくない産物への3-HP分解がほとんど又は全くないように選択される。
【０２０７】
いくつかの実施態様において、水溶液から3-HPを除去するプロセスは、例えば、少なくとも約70％(例えば、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％)などの比較的高い、回収される3-HPの収率をもたらす。
【０２０８】
(水溶液から3-HPを除去するための例示的なシステム及び方法)
図58は、水よりも密度が低い水不混和性溶媒を用いて、水溶液から3-HPを除去するための例示的なシステムを示している。図58に関して、このシステムは、溶媒容器100と側管108を介して溶媒容器100に温水循環式に接続されたコンデンサ110とを含む。コンデンサ110は、サイフォン管112を介して抽出容器116にも温水循環式に接続されている。溶媒容器100は、撹拌子102、温度計124、及び加熱素子104を含む。抽出容器116は、撹拌子120、pHメータ122、及び注入管114を含む。注入管114は、蠕動ポンプ126に接続されており、該蠕動ポンプ126は、酸貯蔵容器130から注入管114を経由して抽出容器116に酸を添加するように構成されている。
【０２０９】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒と水不混和性溶媒はどちらも、溶媒容器100中に配置される。通常、3-HPの水溶液(例えば、3-HPを含有する脱細胞化発酵ブロス)は、水混和性溶媒及び水不混和性溶媒が溶媒容器100中に配置された後に、抽出容器116中に配置されるが、任意に、3-HPの水溶液は、水混和性溶媒が溶媒容器100中に配置される前もしくはそれと同時に、及び/又は水不混和性溶媒が溶媒容器100中に配置される前もしくはそれと同時に、抽出容器116中に配置されることができる。抽出容器116中に最初に配置される3-HPの水溶液の量は、3-HPの水溶液が溶媒容器100中に持ち越されないために、該水溶液がサイドアーム108まで及ばないように選択される。溶媒容器100は、例えば、温度計124によって決定したとき、溶媒容器100中に含まれる液体の温度が溶媒容器100中に含まれるより低い沸点を有する溶媒(水不混和性溶媒又は水混和性溶媒のいずれか)の沸点に達するまで、加熱素子104を用いて加熱される。一般に、水混和性溶媒は、水不混和性溶媒よりも低い沸騰を有する。溶媒容器100中の水混和性溶媒は(溶媒容器100中の水不混和性溶媒の蒸発を伴わずに)蒸発し、水混和性溶媒の蒸気は、溶媒容器100から側管108を通ってコンデンサ110に流れる。コンデンサ110は、水混和性溶媒の沸点を下回る温度(例えば、約5℃〜約25℃、約5℃、約10℃、又は約15℃)でクーラントを使用する。したがって、蒸発した水混和性溶媒は、コンデンサ110中で液体状態にまで凝縮し、液体の水混和性溶媒(例えば、約室温のもの)は、サイフォン管112を経由して抽出容器116の底に流れる。凝縮した水混和性溶媒は、3-HPの水溶液と組み合わさって、抽出容器116中で水性相を形成する。溶媒容器100中に最初に配置され、その後、抽出容器116に移される水混和性溶媒の量は、水性相が溶媒容器100中に持ち越されないために、容器116中の水性相がサイドアーム108まで及ばないように選択される。その後、溶媒容器100は、溶媒容器100中に含まれる液体の温度が水不混和性溶媒の沸点に達し、溶媒容器100中の水不混和性溶媒を蒸発させるまで、加熱素子104を用いて、より高い温度にまで加熱される。水不混和性溶媒の蒸気は、溶媒容器100から側管108を通ってコンデンサ110に流れる。コンデンサ110は、水不混和性溶媒の沸点を下回る温度(例えば、約5℃〜約25℃、約5℃、約10℃、又は約15℃)でクーラントを使用する。したがって、蒸発した水不混和性溶媒は、コンデンサ110中で液体状態にまで凝縮し、液体の水不混和性溶媒(例えば、約室温のもの)は、サイフォン管112を経由して抽出容器116の底に流れる。凝縮した水不混和性溶媒は、水不混和性溶媒が水性相から3-HPを抽出し、それにより、水不混和性溶媒(有機相)中の3-HPの溶液を形成するように、抽出容器116中の水性相と混合する。そのため、抽出容器116が水性相及び有機相を含有することになる。水不混和性溶媒は水よりも密度が低いので、有機相が水性相の上にある。システム中に最初に配置される3-HPの水溶液、水混和性溶媒、及び水不混和性溶媒の組合せ量は、抽出容器116中の有機相がサイドアーム108に達するように選択される。したがって、有機相は、抽出容器116からサイドアーム108を通って溶媒容器100に流れる。このように、3-HPが抽出容器116から溶媒容器100に移される。抽出容器116中の3-HPの量が減少すると、例えば���pHメータ122によって検出したとき、抽出容器116中の水性相のpHが増加する傾向にある。このpHの増加に応答して、蠕動ポンプ126は、酸を酸貯蔵容器130から注入管114を経由して抽出容器116に送り込み、それにより、抽出容器116中の水性相のpHを調整する。抽出容器116中の水性相を撹拌子120で撹拌して(例えば、連続的に撹拌して)、水性相のpH均一性を高めてもよい。抽出容器116中の水性相と抽出容器116中の有機相の温度は、ほぼ同じであることができ、典型的には、約15℃〜約40℃(例えば、約室温)である。典型的には、抽出容器116中の水性相のpHは、上で論じた範囲内に調整される。例えば、いくつかの実施態様において、水性相のpHは、約4〜約7(例えば、約4〜約5、約4.2〜約4.7、約4.3〜約4.4、約4.3、又は約4.4)である。
【０２１０】
ある実施態様において、水混和性溶媒は、抽出容器116中に最初に配置され、水不混和性溶媒は、溶媒容器100中に最初に配置される。通常、3-HPの水溶液(例えば、3-HPを含有する脱細胞化発酵ブロス)は、水混和性溶媒が抽出容器116中に配置され、水不混和性溶媒が溶媒容器100中に配置された後に、抽出容器116中に配置されるが、任意に、3-HPの水溶液は、水混和性溶媒が抽出容器116中に配置される前もしくはそれと同時に、及び/又は水不混和性溶媒が溶媒容器100中に配置される前もしくはそれと同時に、抽出容器116中に配置されることができる。抽出容器116中の3-HPと水混和性溶媒の水溶液は、組み合わさって、抽出容器116中で水性相を形成する。3-HP及び水混和性溶媒の水溶液の組合せ量は、水性相が溶媒容器100中に持ち越されないために、該水性相がサイドアーム108まで及ばないように選択される。溶媒容器100は、例えば、温度計124によって決定したとき、溶媒容器100中に含まれる水不混和性溶媒の温度がその沸点に達するまで、加熱素子104を用いて加熱される。溶媒容器100中の水不混和性溶媒は蒸発し、水不混和性溶媒の蒸気は、溶媒容器100から側管108を通ってコンデンサ110に流れる。コンデンサ110は、水不混和性溶媒の沸点を下回る温度(例えば、約5℃〜約25℃、約5℃、約10℃、又は約15℃)でクーラントを使用する。それゆえ、蒸発した水不混和性溶媒は、コンデンサ110中で液体状態にまで凝縮し、液体の水不混和性溶媒(例えば、約室温のもの)は、サイフォン管112を経由して抽出容器116の底に流れる。凝縮した水不混和性溶媒は、水不混和性溶媒が水性相から3-HPを抽出し、それにより、水不混和性溶媒(有機相)中の3-HPの溶液を形成するように、抽出容器116中の水性相と混合する。そのため、抽出容器116が水性相及び有機相を含有することになる。水不混和性溶媒は水よりも密度が低いので、有機相が水性相の上にある。システム中に最初に配置される3-HPの水溶液、水混和性溶媒、及び水不混和性溶媒の組合せ量は、抽出容器116中の有機相がサイドアーム108に達するように選択される。したがって、有機相は、抽出容器116からサイドアーム108を通って溶媒容器100に流れる。このように、3-HPが抽出容器116から溶媒容器100に移される。抽出容器116中の3-HPの量が減少すると、例えば、pHメータ122によって検出したとき、抽出容器116中の水性相のpHが増加する傾向にある。このpHの増加に応答して、蠕動ポンプ126は、酸を酸貯蔵容器130から注入管114を経由して抽出容器116に送り込み、それにより、抽出容器116中の水性相のpHを調整する。抽出容器116中の水性相を撹拌子120で撹拌して(例えば、連続的に撹拌して)、水性相のpH均一性を高めてもよい。抽出容器116中の水性相と抽出容器116中の有機相の温度は、ほぼ同じであることができ、典型的には、約15℃〜約40℃(例えば、約室温)である。典型的には、抽出容器116中の水性相のpHは、上で論じた範囲内に調整される。例えば、いくつかの実施態様において、水性相のpHは、約4〜約7(例えば、約4〜約5、約4.2〜約4.7、約4.3〜約4.4、約4.3、又は約4.4)である。
【０２１１】
図59は、水よりも密度が高い水不混和性溶媒を用いて、水溶液から3-HPを除去するための例示的なシステムを示している。このシステムは、溶媒容器300、コンデンサ310、及び抽出容器316を含む。溶媒容器300は、側管308を通してコンデンサ310に温水循環式に接続されている。溶媒容器300は、側管312を通して抽出容器316にも温水循環式に接続されている。コンデンサ310は、接続管334を通して抽出容器316に温水循環式に接続されている。溶媒容器300は、撹拌子302、加熱素子304、及び温度計332を含む。抽出容器316は、pHメータ320及び注入管324を含む。注入管324は、蠕動ポンプ326に接続されており、該蠕動ポンプ326は、酸貯蔵容器330から注入管324経由して抽出容器316に酸を添加するように構成されている。
【０２１２】
いくつかの実施態様において、水混和性溶媒と水不混和性溶媒はどちらも抽出容器300中に配置される。通常、水混和性溶媒及び水不混和性溶媒が溶媒容器300中に配置される前に、3-HPの水溶液(例えば、3-HPを含有する脱細胞化発酵ブロス)は、抽出容器316中に配置される。しかしながら、任意に、3-HPの水溶液は、水混和性溶媒が溶媒容器300中に配置された後もしくはそれと同時に、及び/又は水不混和性溶媒が溶媒容器300中に配置されるた後もしくはそれと同時に、抽出容器316中に配置されることができる。抽出容器316中に配置される3-HPの水溶液の容量は、該溶液が側管312を経由して溶液容器300に流入するほど十分大きく及ばないように選択される。溶媒容器300は、例えば、温度計332によって決定したとき、溶媒容器300中に含まれる液体の温度が、溶媒容器300中に含まれるより低い沸点を有する溶媒(水不混和性溶媒又は水混和性溶媒のいずれか)の沸点に達するまで、加熱素子304を用いて加熱される。一般に、水混和性溶媒は、水不混和性溶媒よりも低い沸騰を有する。溶媒容器300中の水混和性溶媒は(溶媒容器300中の水不混和性溶媒の蒸発を伴わずに)蒸発し、水混和性溶媒の蒸気は、溶媒容器300から側管308を通ってコンデンサ310に流れる。コンデンサ310は、水混和性溶媒の沸点を下回る温度(例えば、約5℃〜約25℃、約5℃、約10℃、又は約15℃)でクーラントを使用する。したがって、蒸発した水混和性溶媒は、コンデンサ310中で液体状態にまで凝縮し、液体の水混和性溶媒(例えば、約室温のもの)は、接続管334を経由して抽出容器316に流れる。凝縮した水混和性溶媒は、3-HPの水溶液と組み合わさって、抽出容器316中で水性相を形成する。溶媒容器300中に最初に配置され、その後、抽出容器316に移される水混和性溶媒の量は、容器316中の水性相が側管312を経由して溶液容器300に流入するほど十分大きく及ばないように選択される。その後、溶媒容器300は、溶媒容器300中に含まれる液体の温度が水不混和性溶媒の沸点に達し、溶媒容器300中の水不混和性溶媒を蒸発させるまで、加熱素子304を用いて、より高い温度にまで加熱される。水不混和性溶媒の蒸気は、溶媒容器300から側管308を通ってコンデンサ310に流れる。コンデンサ310は、水不混和性溶媒の沸点を下回る温度(例えば、約5℃〜約25℃、約5℃、約10℃、又は約15℃)でクーラントを使用する。したがって、蒸発した水不混和性溶媒は、コンデンサ310中で液体状態にまで凝縮し、液体の水不混和性溶媒(例えば、約室温のもの)は、接続管334を経由して抽出容器316に流れる。凝縮した水不混和性溶媒は、水不混和性溶媒が水性相から3-HPを抽出し、それにより、水不混和性溶媒(有機相)中の3-HPの溶液を形成するように、抽出容器316中の水性相と混合する。そのため、抽出容器316が水性相及び有機相を含有することになる。水不混和性溶媒は水よりも密度が高いので、有機相が水性相の下にある。システム中に最初に配置される3-HPの水溶液、水混和性溶媒、及び水不混和性溶媒の組合せ量は、抽出容器316中の有機相が、有機相が抽出容器316から側管312を経由して溶媒容器300に移ることができるほど十分に多くなるように選択される。このように、3-HPが抽出容器316から溶媒容器300に移される。抽出容器316中の3-HPの量が減少すると、例えば、pHメータ320によって検出したとき、抽出容器316中の水性相のpHが増加する傾向にある。このpHの増加に応答して、蠕動ポンプ326は、酸を酸貯蔵容器330から注入管324を経由して抽出容器316に送り込み、それにより、抽出容器316中の水性相のpHを調整する。抽出容器316中の水性相と抽出容器316中の有機相の温度は、ほぼ同じであることができ、典型的には、約15℃〜約40℃(例えば、約室温)である。典型的には、抽出容器316中の水性相のpHは、上で論じた範囲内に調整される。例えば、いくつかの実施態様において、水性相のpHは、約4〜約7(例えば、約4〜約5、約4.2〜約4.7、約4.3〜約4.4、約4.3、又は約4.4)である。
【０２１３】
ある実施態様において、水混和性溶媒は、抽出容器316中に配置され、水不混和性溶媒は、抽出容器300中に配置される。通常、この前に、3-HPの水溶液(例えば、3-HPを含有する脱細胞化発酵ブロス)は、抽出容器316中に配置される。しかしながら、任意に、3-HPの水溶液は、水混和性溶媒が抽出容器316中に配置された後もしくはそれと同時に、及び/又は水不混和性溶媒が溶媒容器300中に配置された後もしくはそれと同時に、抽出容器316中に配置されることができる。抽出容器316中の3-HPの水溶液と水混和性溶媒は、組み合わさって、抽出容器316中で水性相を形成する。抽出容器316中の3-HPの水溶液及び水混和性溶媒の組み合わせ量は、抽出容器316中の水性相が側管312を経由して溶液容器300に流入するほど十分大きく及ばないように選択される。溶媒容器300は、溶媒容器300中に含まれる液体の温度が水不混和性溶媒の沸点に達し、溶媒容器300中の水不混和性溶媒を蒸発させるまで、加熱素子304を用いて、ある温度にまで加熱される。水不混和性溶媒の蒸気は、溶媒容器300から側管308を通ってコンデンサ310に流れる。コンデンサ310は、水不混和性溶媒の沸点を下回る温度(例えば、約5℃〜約25℃、約5℃、約10℃、又は約15℃)でクーラントを使用する。したがって、蒸発した水不混和性溶媒は、コンデンサ310中で液体状態にまで凝縮し、液体の水不混和性溶媒(例えば、約室温のもの)は、接続管334を経由して抽出容器316に流れる。凝縮した水不混和性溶媒は、水不混和性溶媒が水性相から3-HPを抽出し、それにより、水不混和性溶媒(有機相)中の3-HPの溶液を形成するように、抽出容器316中の水性相と混合する。そのため、抽出容器316が水性相及び有機相を含有することになる。水不混和性溶媒は水よりも密度が高いので、有機相が水性相の下にある。システム中に最初に配置される3-HPの水溶液、水混和性溶媒、及び水不混和性溶媒の組合せ量は、抽出容器316中の有機相が、有機相が抽出容器316から側管312を経由して溶媒容器300に移ることができるほど十分に多くなるように選択される。このように、3-HPが抽出容器316から溶媒容器300に移される。抽出容器316中の3-HPの量が減少すると、例えば、pHメータ320によって検出したとき、抽出容器316中の水性相のpHが増加する傾向にある。このpHの増加に応答して、蠕動ポンプ326は、酸を酸貯蔵容器330から注入管324を経由して抽出容器316に送り込み、それにより、抽出容器316中の水性相のpHを調整する。抽出容器316中の水性相と抽出容器316中の有機相の温度は、ほぼ同じであることができ、典型的には、約15℃〜約40℃(例えば、約室温)である。典型的には、抽出容器316中の水性相のpHは、上で論じた範囲内に調整される。例えば、いくつかの実施態様において、水性相のpHは、約4〜約7(例えば、約4〜約5、約4.2〜約4.7、約4.3〜約4.4、約4.3、又は約4.4)である。
【０２１４】
(3-HPの精製)
いくつかの実施態様において、3-HPを、水溶液から除去した後に精製することができる。一例として、粗3-HP(水溶液から除去した後の、しかし、精製する前の3-HP)をアルカリ金属塩などの塩に変換し、その後、該塩を有機溶媒で洗浄して、3-HPの純粋なアルカリ金属塩を提供することができる。3-HPの純粋なアルカリ金属塩を純粋な3-HP遊離酸に変換することができる。そのような実施態様において、3-HPのアルカリ金属塩を、粗3-HPを水酸化ナトリウム又は水酸化カリウムなどの水酸化アルカリで処理することにより形成させることができる。反応を行うために、有機溶媒中の粗3-HPの溶液を形成させることができ、得られた溶液を水酸化アルカリ金属で処理することができる。いくつかの実施態様において、有機溶媒は、アセトン、メタノール、又はイソプロパノールのうちの少なくとも1つである。いくつかの実施態様において、有機溶媒中の粗3-HPの溶液pHは、約4〜約5(例えば、約4.3又は約4.4)である。いくつかの実施態様において、水酸化アルカリ金属は、反応混合物のpHが約7となるまで、反応混合物に添加される。反応混合物から沈殿した3-HPのアルカリ金属塩を濾過によって回収し、上記のような有機溶媒でさらに洗浄することができる。
【０２１５】
純粋な3-HP遊離酸を得るために、3-HPの塩、例えば、ナトリウム塩を水に溶解させることができ、得られた水溶液を本明細書に記載される酸のうちのいずれか1つで処理することができる。例えば、3-HP塩の水溶液を、約4〜約5のpHまで、塩酸又はシュウ酸で処理することができ、純粋な3-HP遊離酸を、本明細書に記載される方法のいずれかによって、得られた水溶液から除去することができる。
【０２１６】
(アクリル酸の製造)
いくつかの実施態様において、3-HPからアクリル酸を製造する方法は、3-HPを反応させて、アクリル酸を形成させることを含む。本方法は、少なくとも約50％(例えば、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％)の収率のアクリル酸を提供することができる。ある実施態様において、本方法は、定量的収率のアクリル酸(すなわち、100％収率)を提供する。
【０２１７】
いくつかの実施態様において、本方法は、液体状態の3-HPを反応させることを含む。そのような実施態様において、3-HPは、未希釈であってもよく、又は水溶液中もしくは1以上の有機溶媒の溶液中のものであってもよい。例示的な有機溶媒としては、DMSO、DMF、及び水が挙げられる。
【０２１８】
通常、アクリル酸を製造する方法は、任意の適当な温度で実施することができる。いくつかの実施態様において、アクリル酸を製造する方法は、3-HPを少なくとも約50℃(例えば、約60℃、約70℃、又は約80℃)の温度で加熱することを含む。いくつかの実施態様において、3-HPを反応させることは、最大で約200℃(例えば、約190℃、又は約180℃)の温度で行われる。いくつかの実施態様において、3-HPを反応させて、アクリル酸を産生することは、約50℃〜約200℃(例えば、約60℃〜約190℃、又は約80℃〜約180℃)の温度で行われる。
【０２１９】
一般に、3-HPを反応させて、アクリル酸を産生することは、任意の適当な圧力で行われる。いくつかの実施態様において、3-HPを含有する反応混合物に隣接する圧力が大気圧よりも低いとき、アクリル酸は、反応温度で反応混合物から蒸発する。すなわち、アクリル酸を反応混合物からガス形態で除去することができる。いくつかの実施態様において、3-HPを反応させて、アクリル酸を形成させることは、例えば、3-HPを含有する反応混合物に隣接する1大気圧未満の圧力などの低い圧力で行われる。ある実施態様において、3-HPを含有する反応混合物に隣接する圧力は、約700mbar未満(例えば、約500mbar未満、約400mbar未満、約300mbar未満、約200mbar未満、約150mbar未満、約120mbar未満、又は約100mbar未満)である。いくつかの実施態様において、3-HPを含有する反応混合物に隣接する圧力は、約50mbar〜約200mbar(例えば、約60mbar〜約150mbar、約70mbar〜約130mbar、又は約70mbar〜約100mbar)である。いくつかの実施態様において、3-HPを含有する反応混合物に隣接する圧力は、約70mbar、約74mbar、約75mbar、約80mbar、約90mbar、約100mbar、又は約120mbarである。
【０２２０】
いくつかの実施態様において、反応混合物は、3-HPからアクリル酸への変換を触媒するための触媒を含有する。典型的には、酸触媒を用いて、3-HPからアクリル酸への変換を触媒することができる。
(スキーム2)
【化８】
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【０２２１】
スキーム2に関して、3-HPが酸と接触すると、3位のヒドロキシル基がプロトン化され、その後、脱離反応が起こって、アクリル酸及び水が生じる。反応触媒の好適な例としては、本明細書に記載される有機酸及び無機酸のうちのいずれか1つが挙げられる。例えば、塩酸、硫酸、ポリリン酸、シュウ酸、又は酢酸を用いて、3-HPの反応を触媒し、アクリル酸を形成させることができる。いくつかの実施態様において、ゼオライト、シリカ、又は海砂を反応用の触媒として使用してもよい。ゼオライトの好適な例としては、3A分子篩、4A分子、又は5A分子篩などの分子篩が挙げられる。
【０２２２】
一般に、使用される触媒の量は、必要に応じて選択することができる。いくつかの実施態様において、反応混合物は、反応混合物中の3-HPの量をベースにして、約1wt.％〜約25wt.％(例えば、約1wt.％〜約20wt.％、約2wt.％〜約20wt.％、約1wt.％〜約10wt.％、約1wt.％〜約5wt.％、又は約2wt.％〜約4wt.％)の触媒を含有することができる。いくつかの実施態様において、反応混合物中の触媒の量は、反応混合物中の3-HPの量をベースにして、約1wt.％、約2wt.％、約3wt.％、約4wt.％、約5wt.％、約10wt.％、約20wt.％、又は約25wt.％である。
【０２２３】
反応混合物中で3-HPから形成されているアクリル酸は、重合して、ポリアクリル酸を形成しやすい。本明細書に記載されるアクリル酸の製造方法は、ポリアクリル酸の形成を有利に回避し、所望の産物を、例えば、少なくとも50％(例えば、少なくとも約60％、少なくとも約70％、少なくとも約80％、少なくとも約90％、少なくとも約95％、又は少なくとも約99％)の収率などの高い収率で提供する。
【０２２４】
望ましくない重合を低下させるために、いくつかの実施態様において、3-HPを重合阻害剤の存在下で反応させて、アクリル酸を形成させる。重合阻害剤の例示的な例としては、フェノチアジン、ヒドロキノン、4-tert-ブチルピロカテコール、tert-ブチルヒドロキノン、1,4-ベンゾキノン、6-tert-ブチル-2,4-キシレノール、2,6-ジ-tert-ブチル-p-クレゾール、2,6-ジ-tert-ブチルフェノール、又は4-メトキシフェノールが挙げられる。
【０２２５】
一般に、使用される重合阻害剤の量は、必要に応じて選択することができる。いくつかの実施態様において、重合阻害剤は、反応混合物中の3-HPの量をベースにして、約1wt.％〜約20wt.％(例えば、約1wt.％〜約10wt.％、約1wt.％〜約5wt.％、約5wt.％〜約15wt.％)の量で反応混合物中に存在する。いくつかの実施態様において、重合阻害剤の量は、反応混合物中の3-HPの量をベースにして、約1wt.％、約2wt.％、約3wt.％、約5wt.％、約10wt.％、又は約15wt.％である。
【０２２６】
いくつかの実施態様において、3-HPから形成されているアクリル酸を反応混合物から除去する。アクリル酸の除去は、反応の経過全体を通じて連続的に、任意に、全ての3-HPが反応して、アクリル酸を形成するまで行うことができ、又はアクリル酸の除去は、反応期間中、不連続的に、任意に、全ての3-HPが反応して、アクリル酸を形成するまで行うことができる。
【０２２７】
上述のように、アクリル酸を反応混合物からガス状アクリル酸として除去することができる。そのような実施態様において、反応混合物から除去されたガス状アクリル酸を液体状態まで凝縮させ、回収し、意図した目的のために使用することができる。いくつかの実施態様において、クーラントを用いて、ガス状アクリル酸を凝縮させる。例えば、大気圧よりも低い圧力でアクリル酸を凝縮させるために使用されるクーラントの温度は、約-5℃〜約10℃(例えば、約0℃〜約5℃)である。
【０２２８】
(アクリル酸を製造する例示的なシステム及び方法)
3-HPを反応させて、アクリル酸を形成させ、アクリル酸を反応混合物から蒸留するための例示的なシステムは、図60に示されている。このシステムは、反応容器200、溶媒ライン212を介して反応容器200に接続されたスチルヘッド214、溶媒トラップ224、スチルヘッド214上のコンデンサ226、及びバルブ236を介してスチルヘッド214に接続された蒸留されたアクリル酸の回収用の回収容器238を含む。反応容器200は、撹拌子206、加熱素子202、反応容器200の内部の温度を制御するための温度計208、並びに3-HP(並びに任意に、溶媒及び触媒)を含有する反応混合物を反応容器200に添加することができる注入管210を含む。スチルヘッド214は、クーラント注入管220及びクーラント排出管222を有する冷却ジャケット218を含む。回収容器238は、追加成分、例えば、重合阻害剤を回収容器238に添加することができる注入管242を含む。回収容器238は、システムからアクリル酸を除去するための排出管244も含む。注入管242は、回収容器238をさらなる真空ラインに接続するために使用することもできる。コンデンサ226は、クーラント注入管230及びクーラント排出管232を有する冷却ジャケット228を含む。コンデンサ226は、システムを主要な真空ラインに接続することができる接合部234も含む。
【０２２９】
除去プロセスの前に、反応容器200に、3-HP、任意に、例えば、4A分子篩などの触媒を投入する。その後、システムに真空をかけて、システム内に約70〜100mbarの圧力を作り出す。その後、反応混合物を、加熱マントル202を用いて、温度計208を用いて決定される約80℃の温度に加熱する。この温度で、3-HPが反応し始めて、反応産物、アクリル酸、及び水を形成する。約70〜100mbarの圧力で、反応の過程で形成されたアクリル酸及び水は蒸発し、蒸気は、溶媒ライン212を通ってスチルヘッド214に流れる。アクリル酸及び水を含有する蒸気の一部は、スチルヘッド214中で凝縮し、スチルヘッド214中に含まれる液体産物を形成する。残りの蒸気は、トラップ224を通ってコンデンサ226に移動し、そこで、残りのガス状アクリル酸及び水が凝縮して、トラップ224を通って、スチルヘッド214に流れる。十分な量の液体産物混合物がスチルヘッド214中に回収されると、液体は、オープンバルブ236を経由して回収容器238に流れる。バルブ236を閉じて、スチルヘッド214中に含まれる液体の回収容器238への望ましくないフローを防いでもよい。
【０２３０】
いくつかの実施態様において、本開示は、3-HPを反応させて、アクリル酸を形成させる方法であって、(1)3-HPを含有する反応容器、回収容器、及びコンデンサを提供すること;(2)3-HPを反応させて、反応容器中でアクリル酸を形成させること;(3)該アクリル酸を該反応容器から蒸発させること、(3)該蒸発したアクリル酸を該コンデンサ中で液体状態まで凝縮させること;並びに(4)アクリル酸のフローの向きを該コンデンサから該回収容器に変えることを含む、方法を提供する。いくつかの実施態様において、反応容器は、触媒も含有する。いくつかの実施態様において、反応容器は、重合阻害剤も含有する。触媒、重合阻害剤、触媒及び重合阻害剤の量、並びに反応条件の例示的な実施態様は、本出願の「アクリル酸の製造」の節に記載されている。
【０２３１】
(アクリル酸の精製)
いくつかの実施態様において、本開示の「アクリル酸の製造」の節に記載されている方法のいずれかによって調製されるアクリル酸をさらに精製して、任意の重合産物及び未反応の3-HPを含まないアクリル酸を得ることができる。アクリル酸を精製するための従来の方法は、4-メトキシフェノール(MEHQ)などの重合阻害剤の存在下、大気圧(アクリル酸の沸点は、約760mmHgで約141℃である)でのアクリル酸の蒸留を含む。その沸点又はその付近で加熱されると、アクリル酸は、重合阻害剤の存在下でさえも、速やかに重合する。したがって、従来のプロセスの収率は、悪くない程度(例えば、40〜60％)に過ぎない。本開示の方法は、有利なことに、重合を回避し、精製前の粗アクリル酸の量をベースにして、少なくとも約50％(例えば、約75％〜約95％)の収率でアクリル酸を精製することを可能にする。いくつかの実施態様において、純粋なアクリル酸は、水性混合物の形態で得られる。そのような混合物中のアクリル酸の濃度は、約70wt.％〜約90wt.％(例えば、約70wt.％、約75wt.％、約80wt.％、約85wt.％、又は約90wt.％)である。
【０２３２】
いくつかの実施態様において、本開示は、アクリル酸を低い圧力で蒸留することにより、アクリル酸を精製する方法を提供する。そのような実施態様において、蒸留中にアクリル酸の周囲の大気によってかけられる圧力は、典型的には、約70mbar〜約100mbar(例えば、約75mbar〜約105mbar、又は約80mbar〜約100mbar)であり、温度は、典型的には、約80℃〜約120℃(例えば、約90℃〜約110℃、又は約80℃〜約100℃)である。例えば、いくつかの実施態様において、蒸留中にアクリル酸の周囲の大気によってかけられる圧力は、約70mbar、約75mbar、約80mbar、約85mbar、約90mbar、約95mbar、又は約100mbarであり、かつ/又は温度は、約80℃、約85℃、約90℃、約95℃、又は約100℃)である。いくつかの実施態様において、蒸留は、重合阻害剤の存在下で実施され、重合阻害剤の量は、必要に応じて選択することができる(例えば、約1wt.％〜約20wt.％)。重合阻害剤は、本明細書に記載される重合阻害剤のいずれか1つ、又はその組合せであることができる。
【０２３３】
いくつかの実施態様において、本開示は、粗アクリル酸を含有する容器をガスでパージすることにより、アクリル酸を精製する方法を提供する。いくつかの実施態様において、ガスは、大気、窒素、又はアルゴンである。いくつかの実施態様において、ガスの温度は、アクリル酸の沸点未満である。そのような実施態様において、温度は、約40℃〜約80℃(例えば、約50℃、約60℃、又は約70℃)である。いくつかの実施態様において、パージは、約大気圧で実施される。このプロセスにおいて、アクリル酸は、暖かいガスの温度で(沸騰することなく)ゆっくりと蒸発し、暖かいガスのフローによって、該容器から純粋なアクリル酸の蒸気が運ばれる。いくつかの実施態様において、ガスでアクリル酸をパージするためのシステムは、コンデンサを含有し、該コンデンサ中のクーラントの温度は、約5℃〜約25℃である。アクリル酸の蒸気を含有する暖かいガスがコンデンサを通過すると、アクリル酸が液体状態まで凝縮する一方、キャリアガスはコンデンサ中に保持されず、システムから離れる。純粋なアクリル酸をコンデンサから回収し、意図した目的のために使用することができる。
【実施例】
【０２３４】
(実施例)
本開示を、以下の実施例でさらに説明することにするが、これらの実施例は、特許請求の範囲に記載される本開示の範囲を限定するものではない。
【０２３５】
(実施例1. MmsR転写アクチベータータンパク質に対する小分子インデューサーの特異性)
3-HP又は類似の小型酸によって誘導される遺伝子発現システムは、P.デニトリフィカンスで同定された新規の発現システムである。この発現システムは、3-HP分解酵素の発現を調節する。P.デニトリフィカンスゲノム中の3-HP分解遺伝子付近の遺伝子配置の解析により、推定LysRファミリー転写調節因子MmsRの存在が明らかになった。転写調節因子タンパク質は、3-HPによって複合体が形成されると、mmsA、hpdH、及びその他の転写を活性化すると推測された。推定転写アクチベータータンパク質MmsRは、DNA結合のためのN-末端ヘリックス-ターン-ヘリックスドメイン、3-HPに応答するインデューサー結合のためのC-末端ドメイン、及びこれら2つのドメインを接続するリンカーから構成される。MmsRを誘導することができる分子の薬効範囲を決定するための試験を実施した。L-乳酸(LAC)、酢酸(AcOH)、プロピオン酸(PA)、3-ヒドロキシブチレート(3-HB)、1,3-プロパンジオール(1,3-PDO)、及び2,3-ブタンジオール(2,3-BDO)、並びにL-バリン(L-val)及びその分解中間体の3-ヒドロキシイソブチレート(3-HIB)を含む、様々な酸及びアルコールを、MmsRを誘導するその能力について試験した。試験された酸及びアルコールのほとんどは、主に3-HPとのそのサイズ及び/又は構造の類似性によって選択した。しかしながら、その転写がMmsRによって調製されるmmsA及びhbdH-4は、それぞれ、L-val分解に関与する酵素であるメチルマロニルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ及び3-ヒドロキシイソブチルデヒドロゲナーゼをコードするので、L-val及び3-HIBは、メチルマロニルセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ及び3-ヒドロキシイソブチルデヒドロゲナーゼとのその類似性に基づいて選択した。
【０２３６】
P.デニトリフィカンスを、試験されることになる各々の化合物を含む及び含まない最小培地中で培養し、mmsA及びhbdH-4の転写を定量的RT-PCRによって測定した(図2A)。σ因子70をコードするハウスキーピング遺伝子rpoDを参照として使用した。2つの遺伝子(mmsA及びhbdH-4)の転写は、P.デニトリフィカンスを3-HIB(mmsA、154倍; hbdH-4、146倍)、3-HB(mmsA、38倍; hbdH-4、32倍)、及びL-val(mmsA、72倍; hbdH-4、68倍)、並びに3-HP(mmsA、134倍; hbdH-4、128倍)を曝露させたときに著しく増強された。対照的に、LAC、AcOH、PA、1,3-PDO、及び2,3-BDOに曝露させたとき、限定された誘導が観察されたか、又は誘導が観察されなかった。3-HP、3-HB、及び3-HIBは、全てβ-ヒドロキシ酸であるので、構造的に類似している。カルボキシル基とβ-ヒドロキシはどちらも、3-HP、3-HB、及び3-HIBがMmsRに結合する能力に不可欠であるように思われる。L-valは、これら3つの化合物と構造的に大きく異なり、3-HIBに変換される。L-valによる誘導は、L-valそれ自体ではなく、L-valから誘導される3-HIBに起因する。
【０２３７】
3-HP及び/又は3-HIBではなく、3-HPから誘導されるマロン酸セミアルデヒド(MSA)並びにL-val及び3-HIBから誘導されるメチルマロン酸セミアルデヒド(MMSA)が生理的インデューサーである可能性も調べた(図2A及び2Bを参照)。一般に、アルデヒドは毒性があり、アルデヒド分解遺伝子は、多くの場合、アルデヒドが細胞内に蓄積したときに上方調節される。3-HPは、hpdH、hbdH-4、及びhbdH-1によってコードされる酵素によって分解され、欠失突然変異体P.デニトリフィカンスΔhpdHΔhbdH-4ΔhbdH-1は、感知できるほどの速度では3-HPを分解しない。3-HPからMSAを産生しないこの三重突然変異体において、mmsAの転写は、依然として、3-HPによって上方調節された(図3)。これにより、3-HPは、MSAに変換されなくても、MmsRタンパク質を活性化することができることが示された。同様に、mmsAの転写は、該三重突然変異体において、3-HIBによって上方調節され、3-HIBもまた、MmsRの実際のインデューサーであることが示唆された。興味深いことに、三重欠失突然変異体P.デニトリフィカンスにおけるmmsAの転写は、3-HPの非存在下又は存在下のいずれにおいても、野生型株よりも高かった。
【０２３８】
MmsRが転写アクチベーターであることを確認するために、欠失実験及びその後の相補実験を行った(図2B)。欠失突然変異体(ΔmmsR)において、mmsAとhbdH-4の両方の転写は低く、そのレベルは、3-HPによって影響されなかった。しかしながら、mmsRをプラスミドによってΔmmsR突然変異体に再導入すると、3-HPによるmmsAとhbdH-4の両方の上方調節が完全に回復した。これらの結果から、MmsRがmmsA及びhbdH-4の発現のための転写アクチベータータンパク質であることが確認される。興味深いことに、ΔmmsR突然変異体におけるmmsA及びhbdH-4の転写の基礎レベルは、野生型又はmmsR相補組換体(mmR-C)よりも〜2倍高かった。これは、インデューサーを伴わないMmsRタンパク質が、mmsA及びhbdH-4の転写をある程度まで抑制し得ることを示唆している。
【０２３９】
hbdH-4の発現は3-HPによって調節されたが、プロモーター配列は、プロモーターが転写アクチベータータンパク質の結合のためのオペレーター部位を欠くので、mmsAのプロモーター配列と大きく異なっていた。hbdH-4プロモーターが誘導性であることを確認するために、mmsA-hbdH-4遺伝子間領域を、緑色蛍光タンパク質(GFP)をレポーターとして有するプラスミド上にクローニングした。さらに、電気泳動移動度シフトアッセイ(EMSA)を、精製されたMmsRタンパク質及びhbdH-4プロモーター領域のDNA断片を用いて実施した。どちらの実験も、hbdH-4プロモーターが構成的であり、3-HPによって誘導されないことを示した。PhbdH-4の制御下のGFPは、構成的に発現され、MmsRタンパク質とhbdH-4プロモーター領域の結合は存在しなかった(データは示さない)。さらに、3-HPの存在下で増殖した細胞についてのqRT-PCR実験において、mmsA及びhbdH-4の大量のポリシストロン性mRNA転写物が検出された。これらの結果は、hbdH-4の転写が、3-HP誘導性PmmsA及び構成的PhbdH-4という2つの独立したプロモーターによって制御され、3-HP添加によるhbdH-4の顕著な上方調節(図1B及び2Bを参照)がPmmsAからの転写読み飛ばしに起因することを示唆している。本発明者らは、ターミネーター配列がmmsAとhbdH-4の遺伝子間領域に存在しないことにも気付いた。PhbdH-4は誘導性ではないので、PmmsAを詳細に検討した。
【０２４０】
(実施例2. mmsR-mmsA遺伝子間オペレーター-プロモーター領域のインシリコ解析)
mmsR及びmmsAという2つの分岐転写される遺伝子間の遺伝子間領域のインシリコ解析を行った。この試験により:(i)mmsA転写開始部位(TSS)の推定上流プロモーター、(ii)2つの推定タンデムオペレーター部位O1及びO2、並びに(iii)2つがO1の2つの半部位を包含し、最後の1つがO2の半部位を包含する3つのT-N11-Aモチーフ含む、シス作用エレメントが特徴付けられた(図3A)。各々のオペレーターは、mmsA遺伝子の推定TSSの上流にある、それぞれ、-81位と-33位に中心があるダイアド対称性のDNA配列を含有していた。逆向き反復は、調節タンパク質によって認識される多くの原核生物オペレーターに共通である。2つのパリンドロム領域の中心間の距離は、〜50bpであり、5ターンのらせんDNAに相当する。15bp離れた2つの9bp断片から構成されるO1部位のダイアド中のヌクレオチド配列は対称性が高く、ミスマッチが1つしかない。11bp隔てられたO2部位の逆向き反復は対称性が低く、9塩基中6塩基にミスマッチがある。O1及びO2オペレーターの4つのパリンドロム断片のアラインメントにより、コンセンサス配列
【化９】
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の存在が示された(図3B)。2、4、及び5位の3つの塩基A、G、及びT(図3B、太字)は、それぞれ、これらの断片の全てで完全に保存されており、3、7、及び8位の3つの塩基C、T、A(下線)は、それぞれ、3つの断片で高度に保存されていた。推定O2領域の同一性は幾分疑わしいことに留意すべきであり;その半部位のうちの1つは、非常に低い保存性(3/9)を示し、スペーサーのサイズは、O1中のスペーサーのサイズよりも4bp短かった。O2部位の同一性を確認するためのさらなる証拠がインビボ及びインビトロ実験で得られるべきである(下記の実施例を参照)。
【０２４１】
LysR型転写調節因子(LTTR)は、原核生物における最も大きいファミリーの転写因子である。LTTR結合DNA配列は、RBS(調節性結合部位)及びABS(アクチベーター結合部位)と呼ばれる2つの対称的なオペレーター領域を有し、ここで、RBSは、ABSと比べてより大きい対称度を示す。さらに、RBS及びABSの対称的半部位は、多くの場合、T-(N11)-Aモチーフに包含されることが知られている。これらの配列特徴は、MmsRの構造的特徴とともに、MmsRがLTTRファミリーの転写調節因子に属することを示している。遺伝子間領域の配列に関する本発明者らの解析(図3Aを参照)により、mmsRの転写がそれ自身の産物であるMmsRによって抑制されることも示唆された。それぞれ、O1部位は、mmsRの上流の推定-10領域に位置し、O2部位は、mmsRの上流の推定-35プロモーター領域と完全にオーバーラップした。O1及びO2部位でのMmsRタンパク質の結合は、mmsRプロモーターにおけるRNAポリメラーゼの結合及び/又は転写時のDNA鎖に沿ったその移動を妨害し得る。mmsAの-35領域がO2部位の2つの半部位の11bp長のスペーサー領域に位置するので、本発明者らは、mmsAの転写がMmsRタンパク質の結合によって妨害される可能性があり得ることにも気付いた。これは、ΔmmsR突然変異体におけるmmsA及びhbdH-4の転写の基礎レベルが野生型対応物における該基礎レベルよりも2倍高い理由を説明することができる(図2A及び図2Bを参照)。インシリコ予測の妥当性を検証するために、遺伝子間領域に関するインビボとインビトロの両方における広範な研究を実施した(以下の実施例を参照)。
【０２４２】
(実施例3. mmsR-mmsA遺伝子間オペレーター-プロモーター領域のインビボ特徴解析)
mmsA遺伝子の発現を制御するプロモーター領域の特徴を5'末端マッピング及びインビボでのランダム突然変異誘発によって調べた。-10及び-35領域を同定するために、上流領域中の連続欠失、又は推定-10及び-35領域のランダム化を含む、様々な突然変異をPmmsAプロモーター領域中で作製し、突然変異体プロモーターをgfpレポーター遺伝子と融合させた(図4)。MmsRはプロモーターに結合することができ、gfpレポーター遺伝子の発現に影響を及ぼすので、mmsR遺伝子を欠くP.デニトリフィカンスを、突然変異体プロモーターを試験するための宿主として使用した。-117〜-60(PmmsA_Δ1)又は-117〜-37(PmmsA_Δ2)のプロモーター領域を欠失させたとき、gfp発現は、全長プロモーターを含有する対照(PmmsA_wt)と比較して、約16％減少した(表1)。比較すると、-27(PmmsA_Δ3)又は-14(PmmsA_Δ4)の前のより長い上流配列を欠失させたとき、プロモーター強度が39％又は58％顕著に減少した。これらの結果から、PmmsA_Δ3及びPmmsA_Δ4で欠失している配列が、転写のための重要なエレメント、おそらくは、インシリコ解析によって予測された、-10及び-35領域を含有することが示唆される。さらに、推定-10(PmmsA_Δ-10)及び-35(PmmsA_Δ-35)領域におけるランダム化により、PmmsA_wtのプロモーター強度と比較して、プロモーター強度が52％低下した。5'末端マッピング及びランダム化突然変異誘発により、PmmsAの-10及び-35領域のインシリコ予測が裏付けられている。
表1:プロモーター及びオペレーター領域の制御された連続突然変異誘発の後のGFP(AU/OD; AU、任意単位)の発現に基づくインビボmmsR-mmsA遺伝子間領域解析
【表１】
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a.プラスミド上でのMmsRの相補的発現を示している
b.蛍光を誘導から4時間後に3回(n＝3)測定し、平均化した
c.誘導のために、25mMの3-HPを増殖培地に添加した
【０２４３】
オペレーター領域(O1及びO2)の位置及び内容をインビボで調べるために、5'末端マッピング及びランダム突然変異誘発も実施した。mmsRは自己調節される可能性が高いので(下記の実施例を参照)、mmsRを弱いPc1プロモーター(hbdH-Iプロモーター)の制御下でプラスミドから構成的に発現させた。表1に示されているように、両方のオペレーター(O1及びO2)を含有するBS_wt及びBS_Δ1は、高い3-HP誘導を示した(最大〜34.6倍)。比較すると、推定O1部位の第一の半部位(BS_Δ2)を単独で又はO1もしくはO2の他の半部位(BS_Δ3もしくはBS_Δ4)とともに欠失させたとき、誘導性が完全に失われた。
【０２４４】
O1及び/又はO2領域に突然変異を有するプロモーターも調べた。ここでは、オペレーター配列をランダム化して、ダイアド対称性を破壊したが、-35領域は変化させなかった。予想通り、O1、又はO1とO2の両方のランダム化は、3-HPによる誘導性を完全に消失させた。これらの結果から、-98の下流に存在すると考えられたO1オペレーター領域の位置及び内容が確認される。しかしながら、これらの結果から、O2領域の役割が明確に規定されることも特定されることもなかった。推定O2領域のみをランダム化したとき(BS_ΔO2)、3-HPの非存在下のプロモーター強度は、野生型BS_wtのプロモーター強度と比較して、大いに増大した(〜10倍)。3-HPが存在するとき、強度は、(野生型BS_wtの強度と比較して)37％低下したが、それでも高いレベルで維持された。さらに、O1とO2の両方を同時に突然変異させたとき(BS_ΔO1O2)、プロモーター強度は顕著に低下し、プロモーターは誘導されなかった。これにより、O2部位がO1部位と緊密に連携して機能し、かつPmmsAの機能及び強度を調節するのに重要な役割を果たすことが示唆される。
【０２４５】
総合すると、オペレーター領域に関するインビボ試験は、次のようにまとめることができる:(i)O1のみで転写を活性化することができるが(3-HP-MmsR複合体の場合)、O1とO2の両方が存在するときよりも効率が悪い、(ii)O2オペレーターに対する3-HPを伴わないMmsRの結合はPmmsAプロモーターからの転写を抑制することができる、及び(iii)ΔO2突然変異体の高強度のプロモーターは、それでもやはり、O1部位の存在と必要とする。PmmsAプロモーターが正の調節(3-HPの存在下)及び負の調節(3-HPの非存在下)を受ける可能性が最も高い。
【０２４６】
GFPレポーターを用いて、mmsR発現に対するオペレーター領域中でのMmsR結合による効果も調べた。PmmsRプロモーターは、それ自身のタンパク質産物であるMmsRタンパク質によって負に調節され(図4B); mmsRを欠失させたとき(PmmsR_wtΔmmsR)、GFP発現は、〜2倍増大した。O2における突然変異(PmmsR_ΔO2)がGFPの発現に影響を及ぼさなかったのに対し、O1突然変異(PmmsR_ΔO1)は、それを〜20％だけわずかに増大させた。これらの結果は、MmsRによるO1領域のみの占有がPmmsRプロモーターからの転写を抑制することができることを示唆している。さらに、3-HPの存在は、MmsRタンパク質による抑制に影響を及ぼさず、この抑制が3-HP依存性ではないことを示した。推定プロモーター領域の5'末端マッピングによって、PmmsRの-10及び-35領域の同定も試みたが(図5A)、失敗した。PmmsRプロモーターの強度は非常に弱く、突然変異体プロモーターにおける違いは達成不可能であった(p＞0.05)。
【０２４７】
LTTRタンパク質及びそのシス作用エレメントは、いくつかの微生物で研究されている。大腸菌及びネズミチフス菌LT2において、ilvC遺伝子(アセトヒドロキシ酸イソメラーゼ; EC 1.1.1.86をコードする)の発現を制御するIlvYタンパク質(LysR型転写調節タンパク質)が検討されている。これらの研究では、ilvC遺伝子の転写をアセトヒドロキシ酸イソメラーゼの基質であるアセトヒドロキシブチレート又はアセトラクテートによって誘導し、誘導は、IlvYタンパク質によって媒介された。PmmsAプロモーターと同様、ilvY及びilvC遺伝子のプロモーター領域は、2つのオペレーターO1及びO2を有し、各々のオペレーターは、9bp長の逆向き反復から構成されていた。反復は、相同配列、それぞれ、大腸菌の
【化１０】
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及びネズミチフス菌LT2の
【化１１】
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を共有していた。さらに、P.デニトリフィカンスのPmmsAプロモーターと同様、これらの株における2つのダイアド間の対称性は、O2(6つのミスマッチ)よりもO1(単一のミスマッチ)で厳格であった。シュードモナス属種に存在する別のLysR型アクチベーターAtzRは、ABSオペレーター領域で相違を示すことが報告されている。AtzRは、分岐転写されるシアヌル酸分解オペロンatzDEFの発現を活性化する。しかしながら、ABSは、個々のサブ部位が活性化プロセスにおいて異なる役割を有するABS-1、ABS-2、及びABS-3と表記される3つのモチーフを含有する。インビボ突然変異解析により、ABS-1及びABS-2サブ部位がPaztDEFプロモーターの完全な活性化に関与することが示された。対照的に、ABS-3は、「サブユニットトラップ」として機能し、AtzRがABS-2及びABS-3サブ部位に位置するとき、PaztDEFの不活化をもたらす。PmmsAプロモーターについては、O2領域は、他の多くのLTTR媒介性システムと同様に-35領域と完全にオーバーラップすると考えられた。それぞれ、大腸菌、P.プチダ、及び緑膿菌由来の転写アクチベーターIlvY、ClcR、及びAtuRも、-35プロモーターエレメントがO2サブ部位内に位置している同じ配置を保有する。このオーバーラップの領域は、LTTRの二量体に結合することにより、下流遺伝子の上方調節を制御する。しかしながら、インデューサー分子の非存在下で下流遺伝子を抑制する機能は、報告されていない。
【０２４８】
(実施例4.インビトロでのMmsRタンパク質の産生及びその結合オペレーター部位)
インビトロでの生化学的な特徴解析のために、タンパク質のC末端において6つのヒスチジン残基でタグ化された組換えMmsRタンパク質を産生し、組換え大腸菌から精製した。天然のMmsRタンパク質だけでなく、Hisタグ化MmsRタンパク質も、HisがMmsRのC-末端に存在するか又はN-末端に存在するかにかかわらず、実施例1に記載されているように実施された相補実験で機能するように思われた(図6Cを参照)。結果として、組換えC-末端His-タグMmsRのみをインビトロでさらに調べた。培養条件(例えば、温度、培養培地、IPTG濃度、回収時期、及び3-HP濃度、並びにGroEL-ES、DnaKJ-GrpE、及びトリガー因子などの様々なシャペロンとの共発現)の最適化後、組換えMmsRを大腸菌で高いレベルで可溶形態で発現させ、親和性クロマトグラフィーにより精製した(図5A〜E)。His-タグ融合MmsRタンパク質のサイズは、34.4kDaであると推定された。これは、6×his-mmsR遺伝子配列に基づくサイズ推定値とよく一致している。ネイティブPAGE及び/又はゲル濾過解析によると、MmsRタンパク質は、低濃度の65nMでは単量体であるが、高濃度の550nMでは二量体であった(図6B)。
【０２４９】
mmsR-mmsA遺伝子間領域へのMmsRの結合をインビトロでEMSAにより調べた(図7A)。40nMの完全な130bpのDNA断片をプローブとして使用し(F12断片と表記;図3Bを参照)、0〜72.7nMの精製MmsRタンパク質を該DNAプローブとともにインデューサーとしての3-HPの存在下と非存在下の両方でインキュベートした。O1とO2の両方でランダム化したDNA断片(F1M2M)を対照として使用した(図3B及び表2を参照)。電気泳動において、バンドシフトは、MmsRを添加したとき、インタクトの130bpのDNA断片について現れ、シフトしたDNAとシフトしていないDNAの比は、インキュベーション期間中にタンパク質の濃度を増大させると増大した。対照的に、そのような移動遅延は、対照DNA断片では、最大72.7nMのMmsRタンパク質まで観察されなかった(データは示さない)。これにより、MmsRが天然のPmmsAに対する強い結合親和性を有し、インビトロで結合複合体を形成することが示された。高濃度のMmsRタンパク質では、より短い距離を移動する複数のバンドが現れた。これは、DNA断片とタンパク質分子の間での多様なオリゴマー複合体の形成に起因するものであった。DNAプローブは、MmsRに対する2つの結合部位(O1及びO2)を有し、MmsRは、二量体としてDNAに結合するため、DNAとタンパク質は、その濃度が高いとき、多様なオリゴマー複合体を形成する可能性が極めて高い。図7Aは、MmsRとPmmsAプロモーターの間の結合親和性に対する3-HPの効果も示している。バンドシフトは、3-HPを添加したとき、より低いMmsR濃度で現れた。また、より短い距離を移動するオリゴマー複合体は、3-HPが存在するとき、より低いMmsR濃度で早く現れた。これにより、3-HPがMmsRとPmmsAプロモーターの間の結合親和性を促進することが示唆された。
表2:本試験で使用されたEMSAの断片
【表２】
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a太字は、O1オペレーターの半部位を示し;イタリック体の文字は、O2オペレーターの半部位を示し;下線の文字は、部位特異的突然変異誘発領域を示した。
【０２５０】
インビトロでMmsR結合領域を解析するために、DNアーゼIフットプリンティング解析をキャピラリー電気泳動により実施した(図7B)。完全な130bpの遺伝子間領域を含むより長い169bpのDNA断片(上記のEMSA実験で使用)をプローブとして使用した(表2)。DNAの濃度を特定の濃度で固定し、その一方、MmsR濃度は、0〜1.2μMで様々に変化した。フットプリンティングの結果は、MmsRによる2つの保護された領域の存在をはっきりと示し、これは、それぞれ、オペレーターO1(位置-81に中心がある)及びO2(位置-33に中心がある)に対応するはずである。保護は、MmsR濃度を増大させると、より明白になった。しかしながら、保護の正確な領域をDNA配列の塩基対レベルで正確に示すのは困難であった。
【０２５１】
EMSA実験を低いDNA濃度(0.4nM)で繰り返して、MmsRとPmmsAプロモーターの間の解離定数KDを推定した(図8)。1つはO1オペレーター部位とO2オペレーター部位の両方(F12)を含有し、他の2つは、F12と同じ長さを有するが、O1オペレーター部位(F1M2)又はO2オペレーター部位(F12M)のパリンドローム領域中で突然変異している(ランダム化されている)、3つのDNA断片を利用した。これら3つのDNA断片の中で、F12がMmsRに対する最も強い親和性を示し、続いて、F12M、次に、F1M2であった。これら3つのDNA断片に対するMmsR結合(KD)についての解離定数を、MmsR結合DNA画分が反応バッファー中の遊離MmsR濃度に対してプロットされているMmsRタンパク質-DNA等温曲線から決定した(図9)。単量体MmsRタンパク質について3-HPの非存在下で推定したとき、KDは、F12については10.7nM、F12Mについては18.6nM、F1M2については79.8nMであった(図9)。3-HPは、DNA断片に対する結合親和性を異なるように変化させた。3-HPの存在下において、(単量体MmsR濃度の)KD値は、F12については5.4nM、F12Mについては19.8nM、F1M2については316nMであると推定された(図9)。F12M又はF1M2よりも高いF12の親和性により、1つのオペレーター(おそらく、O1)へのMmsR結合が他のオペレーター(おそらく、O2)への結合を刺激するように、オペレーター結合にある程度の協調性が存在することが示唆された。3-HPの非存在下におけるF12についてのただ1つのDNA-MmsR複合体バンドの存在によっても、2つのオペレーター間の結合に協調性が存在するという概念が支持された: O1へのMmsRの結合がO2への結合を刺激しないならば、2つのDNA-MmsR複合体バンド(O1結合について1つ、O1とO2の結合についてもう1つ)が出現するはずであった。
【０２５２】
Rheeらは、タンデムオペレーター(O1O2)又はO1もしくはO2オペレーターのみのいずれかを含有するDNA断片に対する大腸菌IlvYタンパク質の結合親和性も試験した。結合親和性は、タンデムO1O2オペレーターを含有する断片で最も高く、O2オペレーターのみを有する断片で最も低く、単量体IlvYのKappは、タンデムオペレーターについては4.4nM、O1については35.2nM、O2については〜900nMであると決定された。しかしながら、Rheeらは、インデューサーがオペレーターに対するIlvYタンパク質の結合に影響を及ぼさないことも報告した。ここでは、3-HPの存在下において、2つの遅延バンドが最も高いタンパク質濃度で区別された。インデューサーの存在下におけるDNA結合タンパク質の性質の変化は、複合体の形成に対して影響を及ぼすことができた。おそらくは、上記の実施例で説明されているように、DNA及びMmsRの濃度があるレベルを超えて増大したとき、それらは、異なる移動度を有する複数の複合オリゴマー構造を形成することができる。
【０２５３】
(実施例5. HpdR転写アクチベータータンパク質に対する小分子インデューサーの特異性)
HpdRは、MmsRと同様、3-HP又は類似の小型酸を認識し、かつP.デニトリフィカンスにおける特異的遺伝子の発現を刺激することができる、転写アクチベータータンパク質である。図10Aは、P.デニトリフィカンスにおけるHpdR調節型オペロン中の遺伝子及び遺伝子間領域の配置を示している。hpdR及びhpdH遺伝子は、シュードモナスゲノムデータベースで入手可能な全てのシークエンシングされたシュードモナスゲノムで保存されており、このゲノム領域の構成は同じである。hpdH遺伝子は、3-HP異化に関与する酵素である3-ヒドロキシプロピオン酸デヒドロゲナーゼ(EC番号1.1.1.59)をコードする。hpdR遺伝子は、その構造遺伝子hpdHと比較すると、304個のアミノ酸残基から構成され、かつ分岐転写されるLTTRタンパク質をコードする。配列解析により、hpdRとhpdHの間の遺伝子間領域は、124ヌクレオチドbpの長さであり、hpdR及びhpdHの発現のための2つのプロモーター、HpdR二量体結合部位(それぞれ、調節結合部位及び活性化結合部位であるRBS及びABS)、並びにリボソーム結合部位を含有することが明らかになった。HpdRのDNA結合部位は、おそらく、3つの推定タンデムオペレーター部位ABS-1、-2、及び-3とRBS-1及び-2とを有し、2つのT-N11-Aモチーフのみがこの遺伝子間領域内に位置し、一方は、RBS-1に位置し、他方は、RBS-2及びABS-1とオーバーラップする。T-N11-Aモチーフの存在は、LTTR媒介姓発現システムの典型的な特徴の1つである(図10Aを参照)。3つのオペレーターは、hpdH転写開始部位(TSS; NNPPツールを用いて予測される)に対して上流に、それぞれ、位置-52、-36、及び-21に中心があるダイアド対称性の領域を含有していた。hpdR遺伝子の発現については、RBS-2及びABS-2などの偽パリンドロム反復が転写開始部位と-35領域の間の領域を遮蔽し、これらのオペレーター領域におけるHpdR結合がRNAポリメラーゼの結合を完全に消失させ、したがって、それ自体の遺伝子hpdRの転写を自己抑制することができることを示している。他方、RBS及びABS部位の2つの9-bp断片は、それぞれ、5、7、及び6ヌクレオチド離れている。これら3つの逆向きダイアドのヌクレオチド配列は、各々のサブ部位に3つのミスマッチがあるので、完全に対称的というわけではなかった。
【０２５４】
(実施例6. HpdRによるhpdHの転写活性化)
HpdRは、シュードモナス・デニトリフィカンスにおけるhpdH遺伝子の転写アクチベータータンパク質であることが示唆されている。これをインビボで試験するために、欠失突然変異体株、すなわち、PdΔhpdR及びPdΔmmsR、並びにpUCPK'/Pc1-hpdRを有する組換え株PdΔhpdR(相補試験用)を含む、いくつかのP.デニチリフィカンス株を作出し、WT株(ATCC13867)とともに、hpdH転写について解析した。C3及びC4転写アクチベータータンパク質であるHpdRとMmsRの間のクロストークが存在するかどうかを確かめるために、推定C4転写アクチベータータンパク質の欠失を有するPdΔmmsR株を試験した。mRNA発現レベルを決定し、インデューサーとしての3-HPの存在下と非存在下で比較した。3-HPによるP.デニトリフィカンス染色体(WT)からのhpdH発現の増加は43.0±10.9倍であったが、その転写アクチベーターHpdRは、3-HPによる変化を示さなかった(図11A)。C4オペロンでは、mmsA及びhpdH-IVの発現も、3-HPによって、それぞれ、151.3±18.2倍及び149.3±9.6倍活性化されたが、mmsRの発現は、全く活性化されなかった(図11B)。P.デニトリフィカンスWTにおいて、調節タンパク質の遺伝子(すなわち、hpdR及びmmsR)は低レベルで発現されたが、これらのタンパク質によって調節される遺伝子(hpdH、mmsA、及びhpdH-IV)は、3-HPの存在下で高度に発現された。特に、C4オペロンのmmsA及びhpdH-IVは高発現を示し、高強度のプロモーターの存在を示した。ひとたびhpdRを欠失させたら(ΔhpdR)、hpdHの転写は不活化され(1.20±0.58); hpdRがHpdRを発現させる組換えプラスミド(hpdR-C)によって相補されたとき、その転写活性化は、野生型レベル(60.5±6.1)にまで回復した。したがって、3-HPがインデューサーとして存在するとき、3-HPのC3オペロン中の異化遺伝子の1つであるhpdHは、その転写調節因子HpdRによって正に調節されると結論付けることができた。C3オペロンとC4オペロンの間のクロストークを調べるために、PdΔhpdR、及びhdpR相補組換えP.デニトリフィカンス株におけるC4オペロン遺伝子(mmsA及びhbdH-IV)の発現を観察した。mmsA及びhbdH-IVの発現は、hpdRの存在及び/又は欠失による影響を受けず、C3転写アクチベーターがC3オペロンに特異的であり、かつC4オペロンを実際に調節することを示した(図11B)。同様に、C4転写アクチベーター(MmsR)は、C3オペロン遺伝子の発現に影響を及ぼさなかった(データは示さない)。総合すると、これらの結果から、HpdRとMmsRは、同じインデューサー分子(3-HP)によって活性化され、かつ同じLTTRファミリーに属するが、それらは、オペレーター部位に対するその結合及びその後の制御下でのその遺伝子の転写活性化に関して極めて特異的であることが示される。
【０２５５】
(実施例7. HpdRの自己調節)
LTTR調節タンパク質は、インデューサー非依存的な様式で転写開始を抑制することにより、それ自体のプロモーターを自己調節することが知られている。hpdHの上流にあるHpdRの調節結合部位(オペレーター)は、可能性のある自己調節部位として関係している。C3オペロンにおけるHpdRの自己調節を理解するために、本発明者らは、それぞれ、(i)PC1又はPzwfプロモーターを用いて構成的に発現されるHpdRにより、PhpdRの制御下で発現されるGFP、並びに(ii)Peda及びPfbpプロモーターを用いて構成的に発現されるGFPを含む、いくつかのプラスミドを構築した。GFP蛍光は、PhpdRプロモーターを用いて発現され、この場合、HpdRがPzwfプロモーター又はPC1(Pzwfよりも弱い)プロモーターのいずれかによって2つの異なるレベルで発現される。GFPの自己調節を24時間の培養期間にわたってモニタリングした。HpdRがPzwf又はPC1を用いて発現されたとき、GFPは、10時間で飽和レベルに達し、HpdRの構成的発現にもかかわらず、それ以上の発現はなかった。しかしながら、GFP蛍光は、Peda及びPfbpなどの構成的プロモーターによって調節されたとき、少しずつ発現され続けた。GFP蛍光の発現レベルは、そのプロモーター強度、すなわち、PhpdR、Peda、及びPfbpによる影響を受けることが示された。この結果は、LTTRタンパク質がそれ自体のプロモーターを自己調節するという事実と一致していた(図12)。
【０２５６】
(実施例8. C3オペロンにおけるHpdRのインデューサーの特異性)
3-HP、L-val、BA、IBA、LAC、AA、IVA、及びPAを含む、炭素数(C3又は4)、分子質量、及び化学構造に関する3-HPとのその類似性に従って選択されたいくつかの酸及びアルデヒドを用いて、HpdRのインデューサー特異性を調べた。hpdH及びgfp遺伝子の転写、並びにGFPからの蛍光に基づいて、相対的誘導性を調べた。HpdH及びgfpの転写レベル、並びにGFP蛍光に基づいて、3-HPがHpdRの最も良好なインデューサーであると決定された。3-HPは、インデューサーなしの対照(Ctrl)と比較して、hpdHの転写を75±8.3倍増大させた。これは、他の化学物質から得られた結果と比較して、統計的に有意な差であった(図12A)。hpdHの転写はまた、L-バリンに曝露させたときに52.8±27.4倍増大し、L-バリンがこれらの実験における2番目に強力なインデューサーとなった。しかしながら、他の酸及びプロピオンアルデヒドは、あまり効果がないか、又はHpdR媒介性の調節C3遺伝子発現システムを誘導しないことが分かった。C3(hpdH及びhpdR)レギュロンを用いた3-HP及びL-バリン誘導性に関するこれらの知見は、C4レギュロン(mmsA及びMmsR)についての上記の実施例に記載されている結果と同様であった。
【０２５７】
構造的に、3-HPは、HpdRに対するリガンドの結合能力において重要な役割を果たすカルボキシル基とβ-ヒドロキシ基の両方を有する。3-HPデヒドロゲナーゼをコードするhpdHはL-バリン分解にも関与し、かつその代謝産物は誘導能を示すことができるので、L-バリンも試験した。L-バリンは、3-HPと構造的に異なるが、Cmオペロン(原稿準備中)を誘導することができる3-ヒドロキシイソ酪酸(3-HIB)に容易に変換されることができ、L-valによる誘導は、3-HIBへのその変換によるものである。同時に、レポーター遺伝子としてのgfpの転写を調べた。hpdH遺伝子をプラスミドpUCPK'/Pzwf-hpdR-PC3-gfp中でgfpと交換し、gfpを不均一に発現させた。gfpを保有するレポーター株PdΔhpdRΔhpdHを、上記のように、3-HP、L-val、BA、IBA、LAC、AA、IVA、及びPAを含む、25mMのいくつかの化学物質で処理した(pH 7.0〜7.4)。gfp mRNA発現は、3-HPで最大限に誘導され、これは、対照と比べて3.4倍の発現の増大をもたらした。これは、対照に関して統計的に有意であった。試験された他の化学物質は、mRNA発現を誘導しなかった(図12B)。同様に、GFP蛍光は、それぞれ、誘導から6及び11時間後に、3-HPによって最も大きく誘導され(3倍及び3.3倍)(図12C)、これは、3倍の誘導比を示すgfp遺伝子発現の結果と一致していた。したがって、3-HPは、C3オペロン中でHpdRと複合体を形成したときに、標的遺伝子の転写を活性化する最も優れたインデューサーである。
【０２５８】
3-HPの濃度を0.1mM〜25mMの範囲で変化させることにより、hpdHの誘導性プロモーターシステムに対する3-HPの用量効果も調べた。誘導比で表すGFP蛍光の増加倍率は直線的であり、誘導から6及び11時間後に、0〜0.5mMであることが示された。しかしながら、0.5mM〜25mMよりも高い濃度は、よく似た誘導性の増大を示した(図12D)。hdpHの転写が3-HP媒介性誘導プロセスを介してインビボ及びインビトロでHpdRによって調節されるC3オペロンを、転写及び翻訳レベルでのインデューサー特異性の検討を通じて特徴付けた。インデューサー特異性及びhpdHプロモーターシステムの強度を調べた。得られた知見から、3-HPが、この遺伝子発現システムの誘導のためにHpdRと複合体を形成したときに、最も高い特異性を示し、かつhpdHプロモーターの全体で3倍の誘導比がGFP発現についてインビボで観察されることが示された。
【０２５９】
(実施例9. HpdR結合部位のインビボ解析)
PhpdHの5'領域のインシリコ配列解析により、5つの推定オペレーター(RBS-1、RBS-2、ABS-1、ABS-2、及びABS-3)の存在が明らかになった。hpdHの転写活性化におけるこれらのオペレーターの重要性を解明するために、推定オペレーターの各々の反復配列を突然変異させる試験を実施した。5つのオペレーター反復のうちの1つが9bpのランダムDNA配列(保存されたT-N11-Aモチーフも実際のサブ部位との配列保存性も示さない、ランダムDNA配列ジェネレーターツールによって作製された、
【化１２】
2021502112.tif 000021
)と交換されるように、pUCPK'/Pzwf-hpdR-PC3-gfpプラスミドをベースにした、いくつかの組換えプラスミドを構築し、その後、GFPレベル(レポーター)を測定することにより、遺伝子発現の誘導性を評価した(データは示さない)。RBS-1部位又はABS-2部位のいずれかの突然変異は、3-HP誘導性を著しく減少させた(データは示さない)。比較すると、ABS-1又はABS-3部位に対する突然変異の効果は、あまり重大ではなく、RBS-2部位の突然変異は、PC3プロモーターの誘導性にごくわずかしか影響を及ぼさなかった。これらの結果から、RBS-1及びABS-2部位がhpdH(又はgfp)の転写を活性化するためのHpdRの重要な結合部位であり、一方、他のオペレーター部位はHpdR結合にあまり重要でないことが示唆される。
【０２６０】
LTTR試験によれば、LysRタンパク質二量体は、2つのオペレーター部位に協調的に結合する。一般に、RBSが最初に占有されると、それは、ABSが第二のLTTR二量体の動員を助ける。この場合、標的遺伝子の転写活性化のためのLTTR二量体の効率的な動員におけるRBSの機能的な役割のため、RBS部位はABSよりも重要である。1つのオペレーター中の2つの反復(すなわち、RBS-1及びRBS-2)のうち、どちらの反復がLTTRタンパク質の結合により不可欠であるかは不明である。両反復とも、LysRタンパク質のヘリックス-ターン-ヘリックスモチーフを受容し、したがって、どちらも等しく重要である。しかしながら、PC3の低いプロモーター強度を考慮すると、オペレーターに対するHpdRの親和性は、弱い可能性があり、それは、HpdRタンパク質の動員におけるRBS-2の寄与がより低いためであり得る。この試験は、RBS-2の突然変異を調べたにもかかわらず、誘導性の変化を示さず、この反復の寄与が十分に高いものではないことを示唆した。LysRに対するより高い親和性のためのよりコンセンサスのある配列を有するようにRBS-2を変化させることにより、LTTR結合の局面におけるRBS-2の役割に関するより詳細な試験を実施することができる。ABS部位(ABSの両方の反復)の突然変異後のあまり大きくない発現の減少は、このABSがhpdHの推定プロモーター部位にぴったりと適合し、かつこれらの突然変異が誘導性の変動をもたらすhpdHプロモーターの変化を引き起こしたという事実によるものであり得る。ABS-2上の突然変異は、PC3を構成的にし、3-HPの存在下におけるHpdR媒介姓の転写活性化の誘導性を生じないように思われた。まとめると、RBS-2を除くオペレーターの各々の突然変異は、3-HPとの複合体を形成したHpdRの場合、誘導性の喪失を引き起こし、この変化は、誘導性であることから構成的特徴を有することへのプロモーターの機能的修飾をもたらした。オペレーター突然変異に起因する遺伝子発現のこの変化は、(i)hpdH(又はgfp)転写の活性化のためのDNA結合部位に対するHpdRの親和性の減弱;(ii)標的遺伝子の低転写をもたらすDNA湾曲に関するHpdRタンパク質-オペレーターDNA複合体の立体構造変化の不適切性;(iii)発現の減少をもたらすhpdHプロモーター強度の顕著な変化といったいくつかの仮定の理由によるものであり得る。それゆえ、オペレーター突然変異は、固有のプロモーター特徴の改変をもたらすことができる。
【０２６１】
(実施例10.結合部位ランダム化及びアクチベーター発現レベルの修飾)
遺伝子発現は、転写及び/又は翻訳レベルで修飾することができる。最初に、本発明者らは、オペレーター部位(O1及びO2)を修飾して、PmmsAプロモーターからの転写を改善することを試みた。アクチベータータンパク質MmsRが結合する、mmsR-mmsAの遺伝子間領域中に存在するオペレーター部位は、RNAポリメラーゼに対するプロモーター領域の親和性を決定するのに重要な役割を果たす。kgsA遺伝子を多コピーpUCPKプラスミド中のmmsR-mmsAの遺伝子間領域の下流にクローニングし、各々オペレーターの半部位から構成されたO2オペレーター配列の2つの異なる部分を独立に(PmmsA2a及びPmmsA2b)又は組み合わせて(PmmsA2ab)ランダム化した(図15A)。転写アクチベーターMmsRを、天然のプロモーター(PmmsR)の下で、細菌染色体から発現させた。突然変異のないインタクトの遺伝子間配列を対照として使用した。O2a又はO2bにおける突然変異は、転写レベルを、3-HPなしで7.3〜10.6倍及び3-HPありで1.3〜1.7倍顕著に増大させた。O2領域の第一の半分(O2a)における突然変異は、第二の半分(O2b)における突然変異よりも顕著に転写効率を改善した。O2オペレーターの両方の半部位をランダム化したとき、転写(3-HPなし)の基礎レベルは、O2a又はO2bのいずれかの突然変異から得られる基礎転写レベルと同等であった(図15B)。しかしながら、3-HPの存在下における最大転写レベルは減少し、そのレベルは、野生型プロモーターの最大転写レベルよりもさらに低かった。O2領域は、RNAポリメラーゼのσ-因子が結合する-35領域と完全にオーバーラップする。-35領域の周囲の配列の変化は、3-HPに応答しているときの上方調節に関して、PmmsAプロモーターに対するMmsRの親和性/機能に直接影響を及ぼし得る可能性がある。この場合、O2領域の半分をランダム化することによる結合相互作用の減少は、転写レベルを誘導可能な様式で大いに増大させた。
【０２６２】
GFPをレポーターとして使用することにより、野生型及び突然変異体プロモーターの強度を明確に比較した(図15C)。結果は、O2領域の第一の半分に突然変異を有するプロモーター(PmmsA2a)が、25mMの3-HPによる誘導期間中に、GFPの発現に関して〜2倍高い性能を発揮することを示した。この結果は、図15Bに示されている転写レベルの結果と一致した。この試験は、オペレーター結合部位領域を改変することにより、転写レベルを修飾することができることを示した。本発明者らは、プロモーターの基礎レベルの発現(大きく)とプロモーターの誘導レベルの発現(〜2倍)の両方を増大させることができた。
【０２６３】
細菌において、LysR型転写調節因子(LTTR)タンパク質は、RNAポリメラーゼと相互作用することにより、下流遺伝子を効果的に上方調節する。結果として、LTTRタンパク質の量は、標的遺伝子の転写レベルに影響を及ぼす。PmmsAプロモーター強度に対するMmsR発現の効果を調べるために、本発明者らは、構成的Pzwfプロモーターのライブラリーを開発し(図16A)、選択されたプロモーターの下でPzwfライブラリーからMmsRを発現させた(図16B)。この合成プロモーターライブラリーを構築する際に、Pzwfプロモーターの-35及び-10コンセンサス配列を一定に保ち、これらの配列の周囲の間隔をランダム化し、長さを様々に変化させた。
【０２６４】
ライブラリー中のいくつかの合成プロモーターを評価し、これらは、図16Aに示されるようなプロモーター強度の分布を示した。陽性対照として、構成的プロモーターPzwf(Pzwf-7)を使用した。バックグラウンドシグナルを正規化した後、ライブラリープロモーターは、11,500(Pzwf-1)〜51,000(Pzwf-12)相対蛍光単位(AU/OD600)の範囲に及ぶGFP蛍光レベルを生じた。したがって、プロモーター発現のレベルは、野生型Pzwf-7(32,200)を基準にして、約5桁に及んだ。このライブラリー由来の3つのプロモーターを選択し: Pzwf-1及びPzwf-11は、野生型Pzwfと比較して、それぞれ、0.4、1、及び1.7倍の差に相当する。これらの派生的Pzwfプロモーターの各々の制御下に置かれた転写アクチベーターMmsRを様々なレベルで産生し、PmmsAプロモーターの下流の遺伝子(kgsA)の転写に影響を及ぼした。天然のプロモーターPmmsRの下でMmsRを染色体から発現する株(PmmsA)を対照として使用した。低いMmsRレベル(MmsR-1株)で、MmsRがPzwf-1プロモーターの制御下にあるとき、kgsAのmRNA発現は、3-HPが存在しないか存在するにかかわらず、対照のmRNA発現と同等であった。MmsRを2つのより強いPzwf-1及びPzwf-11プロモーターの各々のいずれかの制御下に置くことによって、MmsRの量を増大させたとき(それぞれ、MmsR-1及びMmsR-11株)、kgsAの転写は、3-HPの存在下で改善した。しかしながら、kgsAの基礎発現レベルは、3-HPが存在しないとき、顕著に低下した。この結果は、以前に記載されているようなapo-MmsRの抑制調節のために、理解することができた。誘導性について、より高いMmsR発現レベルは、基礎レベルを最小限に抑えることにより、誘導されていない状況と誘導された状況の差を大きく増大させることができた。これにより、アクチベーターの増強が、強い誘導性プロモーターの場合によく起こる誘導前の標的遺伝子の漏出を妨げるための優れた戦略であることが示された。
【０２６５】
(実施例11. PmmsAプロモーター下の天然mmsA遺伝子と異種kgsA遺伝子の発現の比較)
P.デニトリフィカンスは、グリセロールから産生される3-HPを活発に分解することができる。それぞれ、hbdH-4及びmmsAによってコードされる酵素3-ヒドロキシイソ酪酸デヒドロゲナーゼIV(HbdH-4)及びメチルマロン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ(MmsA)は、3-HPの分解に部分的に関与していた。mmsAプロモーター(PmmsA)は、アクチベータータンパク質MmsRの助けを借りて、3-HPにより高度に誘導された(＞140倍)。このプロモーターを利用して、外から添加したとき、約25mMで3-HPを敏感に検出することができる3-HPセンサーを開発した。
【０２６６】
PmmsAは3-HPによって高度に誘導されるが、PmmsAの制御下に置かれたgfp又はkgsAなどの異種遺伝子の発現レベルは、P.デニトリフィカンスのPmmsAによって本来制御されるmmsAの発現レベルよりもずっと低かった。PmmsAの改変の前に、PmmsA下にクローニングされた相同遺伝子(mmsA)及び異種遺伝子(kgsA)の発現をRT-PCRによって定量的に比較した。異種遺伝子kgsAの転写は、染色体から発現させたときは〜100倍、多コピー(〜20コピー)のpUCPK'プラスミドを用いてエピソームから発現させたときは〜40倍、天然の遺伝子(mmsA)の転写よりも顕著に低かった。粗細胞KgsA活性は、3-HP誘導及び遺伝子量の効果を明瞭に示した。染色体(Int-1)から発現させたとき、活性は、それぞれ、3-HPなしで0.08U/mgタンパク質、3-HPありで0.15U/mgタンパク質であった。多コピープラスミドから発現させたとき、活性は、それぞれ、3-HPなしで1.02U/mgタンパク質、3-HPありで3.15U/mgタンパク質であった。本発明者らは、3-HPあり又はなしのいずれかで決定されたKgsA活性が遺伝子量効果を正確に反映しており、かつ遺伝子コピー数にほぼ比例していたことに気付いている。KgsAをグリセロールデヒドラテアーゼ(DhaB)とともに多コピープラスミドから発現させ、その粗細胞活性が2.5U/mgタンパク質であったとき、良好な3-HP産生が結果として生じた。これは、kgsAが染色体に組み込まれる場合、PmmsAプロモーターが遺伝子を〜20倍高く発現するように改変されるべきであることを示唆している。運良く、PmmsAプロモーターの制御下では、相同なmmsA遺伝子は、kgsAの遺伝子よりも〜100倍高く転写されることができた。kgsAの発現は、kgsA遺伝子コピー数が、1又は2コピーなどの、非常に低い場合でも、mmsA調節構造の性質を改変することによって、その転写及び/又は翻訳の効率を増大させることにより改善することができる。
【０２６７】
(実施例12.タンデムプロモーターシステムの開発)
細菌宿主で遺伝子発現レベルを最適化する試みは、転写及び翻訳レベルを改変するのに合理的でかつ組合せに関するアプローチを使用している。強力なプロモーター及び/又はリボソーム結合部位(RBS)を使用すると、遺伝子発現は増大する。様々な発現レベルを提供する合成プロモーターライブラリーが開発されている。大腸菌及び枯草菌などの細菌では、RNAポリメラーゼのσ因子の一方が他方よりも良好な応答を有する栄養期及び静止期プロモーターも同定されている。前述の調節モジュールは、広範なレベルでのより優れた制御により遺伝子の発現を助けることができるが、これは、動的増殖条件下のレベルで遺伝子を発現することができない。この問題に対処するために、本発明者らは、先に上記の実施例で記載された3-HP誘導性プロモーター発現モジュールを組み込んでいるタンデムプロモーターを作出することにより、新しい遺伝子発現調節モジュールを開発した。本来、微生物は、特定の分子の濃度を維持するために、及び動的細胞増殖中に様々な生理的条件下でタンパク質を調節するためにタンデムプロモーターを使用している。本発明者らは、3-HP又は小型酸誘導性プロモーターを様々な構成的又は誘導性プロモーターと組み合わせた。これらのプロモーターは、天然又は合成のいずれかであった。ここでは、本発明者らは、天然/合成のいずれかであり、かつ/又は指数/静止増殖期に遺伝子を活性化することができる別のプロモーターと融合した3-HP誘導性プロモーターのライブラリーを開発した。いくつかの例において、タンデムプロモーターシステムは、少なくとも1つの誘導性プロモーター及び少なくとも1つの構成的プロモーターを有していた。
【０２６８】
小型酸誘導性プロモーターは、ひとたび(LysRと類似した)アクチベータータンパク質に結合すると、3-HPによって活性化される。3-HP(又は類似の小型酸)誘導性プロモーターシステムを調節するアクチベータータンパク質を特徴付けた後、これらのプロモーターは、標的タンパク質を低い強度で発現するので、組換えタンパク質発現に単独で使用するには実用的でないことが明らかになった。それゆえ、ランダムプロモーター突然変異を生成させることにより、様々な発現強度を示す小型酸誘導性プロモーターのライブラリーを開発した。突然変異体プロモーターをレポーター遺伝子(緑色蛍光タンパク質(GFP))の上流にクローニングすることにより、各々の突然変異したプロモーターの強度を解析した。3-HP誘導性の派生的突然変異体プラスミドを保有する株の蛍光測定を行うことにより、インビボ解析を実施した。簡潔に述べると、長さ10bpの4ブロックの配列を、-51の位置(第一の反復の出発点)から始めて、予測されるTSSから-9領域までランダム化した。第一の30bp、すなわち、-51〜-21の突然変異は蛍光の差をもたらさなかったが、-21〜-12の突然変異は、蛍光レベルを顕著に(最大〜6倍)増強した。それゆえ、-10領域付近の突然変異ランダム化は、プロモーター強度を顕著に増強した(図13)。この結果は、インシリコ予測とともに、本発明者らの予測した3-HP誘導性プロモーターのプロモーターエレメントの位置を強く支持する。
【０２６９】
代謝経路が該経路の中間体又は最終産物によって増強されることができ、任意の追加のインデューサーを添加する必要がないので、本明細書に記載される自己誘導性プロモーターシステムは、生化学燃料及びバイオ燃料を産生する株における酵素発現及び調節に有益である。しかしながら、自己誘導性プロモーターのタイプは、細胞内でかなり限られており、これらのプロモーターは、通常、弱い発現レベルを生じる。誘導性システムの修飾(例えば、プロモーターエレメント又はオペレーター領域の修飾による)は、より優れた性能を達成するために行われることができるが、プロモーターの誘導性の性質を維持するように慎重に行われなければならない。本発明者らは、タンデムプロモーターを含む発現カセットを利用することにより、誘導性プロモーターによる転写の強度を増大させると同時に、プロモーターの誘導性の性質を維持しようした。
【０２７０】
本発明者らは、誘導性プロモーターと構成的プロモーターを組み合わせたタンデムプロモーター発現カセットを設計した。kgsA遺伝子を制御するPmmsA及びPhbdH-4プロモーターを含有するタンデムプロモーター発現カセットをpUCPK'プラスミドにクローニングし、一方、MmsRアクチベーターを染色体中のその天然のプロモーターから産生した。図17Aは、タンデムプロモーター発現カセット、及び該プロモーターによって産生される2つのmRNA転写物を模式的に示している。2つのプロモーターをタンデムに組み合わせることにより、図17Aに示されているように、2種類のmRNA転写物が、一方はPmmsAプロモーターから、もう一方はPhbdH-4プロモーターから転写され、それにより、kgsA mRNA転写物の数が増加した。図17Bは、タンデムプロモーターシステムが、天然のPmmsAプロモーターのみと比較して、kgsAのmRNA発現レベルを1.75倍増大させたことを示している。図17Cは、タンデムプロモーターシステムの使用が、天然のPmmsAプロモーターのみの使用によって得られる酵素活性と比べて、3倍のKgsA酵素活性の増大をもたらしたことを示している。
【０２７１】
タンデムコンストラクト中のプロモーターの各々の翻訳効率を検討したとき、本発明者らは、PhbdH-4プロモーターからの1単位の転写物が2単位のタンパク質/活性を生じさせる(比は1:2である)のに対し; PmmsAプロモーターからの1単位の転写物は1単位のタンパク質/活性を生じさせる(比は1:1である)ことを見出した(図17を参照)。この結果は、PhbdH-4プロモーターの5'非翻訳領域(5'UTR)が、PmmsAプロモーターの5'UTR領域と比較して、より高い翻訳レベルをもたらし得ることを示した。タンデムプロモーター発現カセットによって産生される各々の転写物は、PhbdH-4のUTR領域を受け継ぎ、これにより、翻訳が顕著に増大し、各々のプロモーター(PmmsA又はPhbdH-4)のみのものと比較して、より高いKgsAの活性が生じることができる。したがって、どちらかの単一のプロモーターのみと比べて、PhbdH-4プロモーターの誘導性は、(わずかに低下したとしても)PmmsAプロモーターの寄与によって維持され、インデューサーなしの基礎発現レベルは、早い時点での経路酵素の発現に有用である構成的プロモーターによって増大した。
【０２７２】
図55Aは、少なくとも1つの3-HP誘導性プロモーター含むタンデムプロモーターを用いて構築された4つの異なる発現コンストラクトを示している。これらは、phpdHとPc1プロモーター又はPzwfプロモーターのいずれかとを組み合わせたものであった。図55Bは、タンデムプロモーターがDhaB活性に基づく様々な強度を有していたことを示している。
【０２７３】
(実施例13. UTRの改変)
5'-非翻訳領域(5'-UTR)及び5'-近位コード配列は、これらのエレメントへのリボソームの接近可能性に基づく、翻訳開始速度及びmRNA安定化の制御において重要な役割を果たしている。本発明者らは、このシステムの制御下に置かれた遺伝子によって産生される転写物の翻訳を増大させるために、PmAdH-4タンデムプロモーター発現カセットの5'UTR及び5'近位コード配列における突然変異のライブラリーを作出した。これらの領域の全体の長さと翻訳効率が容易に失われ得ることとを含む、いくつかの要因がこれらの領域の突然変異誘発を困難にした。RBS改変は、RBSをランダム化して、その結合部位に対するリボソームの親和性を調節するための操作しやすい方法である。しかしながら、RBS中の6〜9ヌクレオチドしかこの方法によって修飾されず、翻訳のための他の重要な構成要素(5'-UTR又は5'-コード配列)が考慮されるべきであった。
【０２７４】
翻訳開始レベルの正確な予測のためのUTRデザイナーというインシリコツールが開発されている。このツールは、標的遺伝子の翻訳制御を理解するために、mRNAの5'非翻訳領域(5'UTR)(35bp)の折り畳み構造、構造遺伝子の5'-近位コード配列(25bp)、及びリボソームとシャイン-ダルガーノ領域の親和性を検討し、そのため、翻訳レベルを変化させるように修飾を設計することができる。本発明者らは、このツールを用いて、本発明者らが作製した、MmsRの染色体発現とともにOpt-3及びHyb-20を有するコンストラクト(本発明者らはUTR-0と称している)を含む、PhbdH-4タンデムプロモーター発現カセットの転写及び翻訳を改善する特徴の組合せを評価した。図19Cに示されているように、UTRデザイナーツールは、このシステムが通常の条件(200rpm、37℃、25mM 3-HP)下で完全に発現されたときに本発明者らが観察した1.5〜2倍の改善よりも大きい12倍の増加を予測した(データは示さない)。翻訳開始に対するUTR修飾の効果を明らかにするために、関連遺伝子(このケースでは、KgsA)の発現レベルを測定した。タンパク質の発現レベルをSDS-PAGEゲル上で測定し、本発明者らは、様々なUTRの違いを容易に区別することができるように、インデューサーの添加を意図的に回避して、発現を低レベルで維持した。この実験は、翻訳開始効果のみを検討している。それゆえ、インデューサーなしの基礎発現は、本発明者らに、評価のためのより良好でかつ十分な証拠を与えるはずであり;また、増殖条件は、低速のシェーカー(150rpm)を用いて、タンパク質発現限度を最小限に抑えることにより制限された。
【０２７５】
図19A〜Cに示されているように、UTRの改変は、標的タンパク質のレベルを増大させることに成功した。図19Aは、広範な翻訳レベルが、PhbdH-4タンデムプロモーター発現カセットの5'UTR及び5'近位コード配列に対してなされた突然変異のライブラリーで達成され、細菌を通常の誘導条件(200rpm、37℃、25mM 3-HP)下で増殖させたときに観察されたことを示している。本発明者らは、効力が天然のPmmsAプロモーターと比較して顕著に(〜30倍)増強され得ることを見出した。
【０２７６】
UTR-6コンストラクトは、最大の変化倍率を示し、SDS-PAGE解析によって決定した(BioRad Image Lab 2.2ソフトウェアを用いて解析した)とき、それぞれ、UTR-0及びPmmsAと比較して、レベルを12.5倍及び30.8倍増大させた。UTR-6は、組換えP.デニトリフィカンス株のmmsA染色体位置での組込みのために選択した(mmsRアクチベーター遺伝子システムは無傷で保持された)。最後に、染色体からの標的タンパク質の発現は、図18B及び図18Cに示されているように、転写(mRNA)及び翻訳(酵素活性)レベルで、予想されたレベルを超えて、それぞれ、2及び1.7倍で首尾よく観察された。この結果から、UTRデザイナーが、広い範囲で発現を促進し、さらには、少数の変異体で標的遺伝子の所望のレベルを達成するための有望なツールであることが示された。
【０２７７】
(実施例14.コドン最適化及びタンパク質ハイブリダイゼーション)
効果的な転写システムを用いても、翻訳システムがうまく作動しなければ、タンパク質が効率的に産生されない可能性がある。それゆえ、十分なタンパク質レベルを生じさせるために、転写及び翻訳制御の最適化が使用されることが多い。
【０２７８】
コドン選好はtRNA組成に関連しており、翻訳伝播速度を制御する。コドン選好は、多くの場合、タンパク質のフォールディングに影響を及ぼす。異種遺伝子をクローニングする場合、通常、好ましいコドンを使用することが推奨されるが、これは、ミスフォールディングした不活性なタンパク質又は封入体の産生すらもたらすこともある。このような場合、融合システム(ハイブリッドタンパク質)は、タンパク質発現を増大させ、タンパク質分解を防止し、溶解度を改善し、精製を支援するように検討されるべきである。
【０２７９】
上記の実施例に記載されているように、遺伝子発現を駆動するためのPmmsA発現システムの使用は、相同mmsA遺伝子と異種kgsA遺伝子の間で異なる発現レベルを生じさせた。kgsAの制御におけるPmmsA発現システムの成績の悪さは、kgsA及びmmsA遺伝子の性質(二次構造、翻訳開始能力、コドンバイアス、溶解度)の違いに由来し得る。これらの違いを減らすために、本発明者らは、kgsA遺伝子を修飾した。
【０２８０】
全遺伝子のコドン最適化は、翻訳を増大させるための一般的な方法である。しかしながら、これは、費用がかかりかつ多くの時間を必要とするプロセスである。結果として、本試験は、翻訳開始を増強するために、異種遺伝子の最初の10個のコドンのみの最適化に焦点を当てた。本発明者らは、GenScriptバイオインフォマティクスツールを用いて、高度に発現される天然のmmsA遺伝子に関するコドン使用表を作成した。このコドン使用表は、MmsA中の各々のアミノ酸のコドン頻度レベルを示している。本発明者らは、この情報を用いて、(i)mmsA中で高頻度レベルを示すコドンを使用する、(ii)中頻度レベルを示すコドンを使用する、及び(iii)MmsAの最初の10個のコドンと同じ頻度レベルを示すコドンを使用し、かつKgsAのレアコドン(0％の頻度)を除外する:という3つのオプションに従って、KgsA(異種タンパク質)の最初の10個のコドンを修飾した(表3)。
【０２８１】
本発明者らは、オプション3(Opt-3)によるコドン最適化が、3-HPの非存在下又は存在下のいずれにおいても、KgsA活性を30％増大させることができることを見出した。本発明者らは、最初の10個のコドンの全ての頻度をmmsA遺伝子の頻度と同じに維持すること(Opt-3)により、kgsAの翻訳が改善されることを見出した。対照的に、いくつかのコドン、例えば、Opt-1及びOpt-2の1番目、4番目、7番目、及び9番目(表3)の頻度を高めると、発現が増大するのではなく、わずかに低下しさえした。
表3: P.デニトリフィカンスにおけるmmsAコドン使用に基づく野生型及び最適化されたkgsAの最初の10個のコドンの頻度
【表３】
2021502112.tif 000022
a高頻度レベルを示すコドンを使用する
b中頻度レベルを示すコドンを使用する
cmmsAの最初の10個のコドンと同じ頻度レベルを示すコドンを使用し、かつレアコドンを除外する
【０２８２】
結果をSDS-PAGEでのタンパク質産生により確認した(図21B)。
【０２８３】
融合タンパク質は、タンパク質産生を増強し、タンパク質分解を低下させ、かつフォールディング及び溶解度を改善するために異種遺伝子発現で使用されることが多い。本発明者らは、P.デニトリフィカンスの高発現mmsA遺伝子によって産生されるMmsAのN-末端をKgsA酵素に融合させた。本発明者らは、mmsAの5'コード領域の一部をPmmsAプロモーターの下流に付加することにより、異種遺伝子(kgsA)転写物の翻訳開始をより効率的にすることができると推論した。本発明者らは、MmsAタンパク質の一部をKgsAに融合することがKgsA活性に対してどのような効果を有するのかということに関心があったので、MmsAの長さを、それぞれ、Hyb-5、Hyb-10、Hyb-15、及びHyb-20株に対応する、5、10、15、及び20アミノ酸だけ変化させた。結果は、KgsAに融合したMmsAの長さが増大するにつれて、KgsA活性は増大するが、ひとたび15アミノ酸のMmsAを使用すると(Hyb-15)、この効果が頭打ちになることを示した(図17A)。Hyb-15融合タンパク質は、対照KgsA(MmsA融合なし)と比較して、3-HPの存在下で、産生が〜3倍増大した。システムが完全に誘導された場合、長さを20アミノ酸のMmsA(Hyb-20)までさらに延長しても、発現は改善しなかったが; Hyb-20株におけるタンパク質産生の基礎レベルは増強された。この結果は、SDS-PAGEでのKgsAのバンド強度によって確認された(図17B)。
【０２８４】
翻訳開始への関与の他に、標的遺伝子の5'末端は、mRNA濃度の調節を介する転写物のレベルの制御において重要な役割を果たす。MmsAの最初の20aaのN-末端融合を有さない及び該N-末端融合を有するkgsA転写物(mmsA(20)kgsA)の安定性を測定した(図17C)。発現を対照とともに調べた。kgsA及びmmsA(20)kgsAの半減期は、それぞれ、2.7分及び5.4分であり、mmsAハイブリッド融合kgsA mRNAが、野生型kgsA mRNAと比較して、より安定であることが示された。mmsA転写物の半減期は、約6分であることが分かり、そのため、mmsA(20)kgsA安定性の改善は、kgsA遺伝子に融合したmmsAの5'末端コード部分(20アミノ酸)の保護の結果として生じる可能性がある。興味深いことに、本発明者らが試験した遺伝子の中で、最も安定な転写物は、mmsRに属するように思われ、半減期は、9.5分であった(図17D)。
【０２８５】
(実施例15.補酵素B12産生)
補酵素B12は、グリセロールデヒドラターゼ、メチオニンシンターゼ、又はメチルマロニルCoAムターゼを含む、多くの酵素にとっての不可欠な補因子である。グリセロールデヒドラターゼ(又はその代わりに、ジオールデヒドラターゼ)は、グリセロールから3-ヒドロキシプロパンアルデヒド(propanealdehyde)(3-HPA)への変換に関与しており、グリセロールからの3-HP(もしくはその塩)又は1,3-PDOの産生のための不可欠な酵素である。3-HPAは、1,3-PDO又は3-HP(もしくはその塩)などの、他の工業的に重要な化学物質へとさらに変換することができる。これらの生化学物質をグリセロールから商業規模で連続的に産生するために、補酵素B12の連続供給が不可欠である。補酵素B12は非常に高価であるので、本発明者らは、天然の補酵素B12産生物質を使用した、グリセロールからの3-HP産生を調べた。補酵素B12を天然に産生することが報告されている数種の微生物が存在する(例えば、クレブシエラ種を含むエンテロバクター属、肺炎連鎖球菌を含む連鎖球菌属種、P.デニトリフィカンスを含むシュードモナス属種、リゾビウム属種、アルファルファ根粒菌(S.meliloti)を含むシノリゾビウム属(Sinorhizobium)種、並びにR.カプスラーツス(R.capusulatus)及びR.スフェロイデス(R.sphaeroides)を含むロドバクター属種などを含む)。本発明者らが、これらの微生物のうちのいくつかをグリセロールから3-HPを産生するための宿主として試験したとき、産生された補酵素B12の量は、高力価の3-HPを合成するのに十分ではなかった(各々＜30g/Lを産生した)。
【０２８６】
P.デニトリフィカンスは、この補因子の外部添加なしで、〜20.8g/Lの3-HP(又はその塩)を産生することができることが分かった。しかしながら、この株に飽和量の補酵素B12を補給したとき、それは、〜100g/Lの3-HPを産生することができた。これらの結果から、この微生物によって天然に産生される補酵素B12は、高力価での3-HP産生を支援するのに十分ではないことが示された。綿密な解析の後、補酵素B12合成に関与する規制(mRNA中の二次構造)を外すことにより、その産生のわずかな改善が認められた。補酵素B12の改善は、先の節で言及されている様々なアッセイによって確認された。この組換え株は、グリセロールから3-HPを産生するための宿主として使用したとき、グリセロールからの2倍を超える38.6g/Lの3-HP産生の改善を示した。
【０２８７】
次の実験において、本発明者らは、培養培地中に少量の補酵素B12を補給することにより、この株を調べた。結果は、図50に示されている。本発明者らは、培養物に少量の補酵素B12(10mg/L)を補給したとき、3-HP産生が38.6g/Lから100g/Lに大幅に改善したことに気付いている。この結果から、修飾された株(IR1-RS1)によって産生される補酵素B12の量は改善されたが、高力価での3-HP産生を支援するのに十分ではなかったことが示される。
【０２８８】
さらに、補酵素B12産生を改善するために、本発明者らは、補酵素B12合成経路に関与する酵素の活性を増強する必要がある。これは、その酵素活性を改善することによって、補酵素B12合成経路を増強することにより行うことができる。酵素活性は、その物理的特性及び反応速度特性を増強することによるか、又はその発現を改善し、その量を増大させることによるかのいずれかで改善することができる。この経路は多くの酵素と関連しているので、最初、本発明者らは、酵素量を増大させ、補酵素B12合成を増強しようと試みた。細胞内の酵素の量を増強するために、天然のプロモーターを上記の合成によって改変されたプロモーターと交換した。
【０２８９】
本試験において、本発明者らは、微生物による補酵素B12産生を改善して、商業化に好適な規模でのグリセロールからの生化学物質の産生を支援しようと試みた。これを達成するために、本発明者らは、様々な補酵素B12-リボスイッチ(B12-リボスイッチ)による転写及び翻訳の調節を理解しようと、補酵素B12の天然の微生物プロデューサー、例えば、P.デニトリフィカンスにおけるコバラミン遺伝子クラスターを調べた。最初、本発明者らは、ソフトウェアを用いて、補酵素B12によって調節されることができる5つの二次構造を同定した(図23を参照)。本発明者らは、これらの構造のうちの4つがリボスイッチであることを明らかにした。インビトロ特徴解析により、これらの中で、cobG及びcbtB遺伝子の上流にあるリボスイッチのうちの3つしか転写調節されないことが示された(図23)。これらのリボスイッチは、コバラミンB12(〜5nM程度の低い濃度のもの)の添加によって、転写/翻訳の大幅な低下がもたらされるように、補酵素B12によって調節された(図28を参照)。
【０２９０】
さらに、本発明者らは、cob遺伝子クラスターI及びIIに位置する6つの特徴付けられていない遺伝子(gst、xre、dahp、gntR、bgpM、cobA)が補酵素B12合成に関与するかどうかを調べた(図23を参照)。本発明者らは、bgpM遺伝子産物が補酵素B12生合成に不可欠であることを見出した。ウロポルフィリノーゲンメチルトランスフェラーゼをコードするcobA遺伝子は、補酵素B12生合成経路における重要な分岐点に関与しており、したがって、本発明者らは、cobAの欠失が補酵素B12産生を妨げることを予想した。しかしながら、本発明者らは、cobA欠失突然変異体が相当な量の補酵素B12を合成することができることを見出した。本発明者らがP.デニトリフィカンスのゲノムを解析したとき、本発明者らは、潜在的にCobA活性の代わりになり得るいくつかのCobAイソ酵素の存在に気付いた。
【０２９１】
本試験の第一のパートにおいて、本発明者らは、B12-リボスイッチを同定するために採用された方法及び補酵素B12合成に関与する転写/翻訳におけるその調節的役割を記載している。本発明者らは、リボスイッチによる調節を調節することにより、補酵素B12産生を増強する方法も調べた。本発明者らはまた、天然のプロモーターを、上記の実施例に記載されている合成発現モジュール(高発現する遺伝子のタンデムプロモーター、UTR、調節タンパク質、N-末端領域)と交換することにより、補酵素B12産生をさらに改善している。これらの修飾株では補酵素B12産生が増強されており、それにより、補酵素B12の外部添加を伴わないグリセロールからの3-HP(又はその塩)産生の増大が助長された。
【０２９２】
修飾されたプロモーターを有する株は良好な補酵素B12産生を示し、解析により、この株は、野生型株よりも4倍多くの補酵素B12及びリボスイッチ修飾株よりも2倍多くの補酵素B12を産生し得ることが示された。この株に、3-HP合成経路酵素を含有するプラスミドを移入したとき、これは、補酵素B12の添加なしで、3-HP産生の大幅な改善を示した。この株は、グリセロールから90g/Lを上回る3-HPを産生したが、その増殖は、野生型株と比較して少し遅く、これは、補酵素B12合成経路の修飾によるものである可能性があった。本試験において、本発明者らは、より大量に補酵素B12を産生することができ、かつ高力価での3-HP産生を支援することができる突然変異体株を開発することに成功した。
【０２９３】
(実施例16.様々なシュードモナス属種間でのB12遺伝子のインシリコ解析及び比較)
遺伝子の配置及びその調節を理解するために、本発明者らは、様々なシュードモナス属の株に存在する補酵素B12遺伝子クラスターを比較した。これまで、31個もの遺伝子が、好気的補酵素B12生合成経路に関与する補酵素B12生合成遺伝子クラスター中で同定されている。その中で、P.デニトリフィカンス由来の補酵素B12生合成経路が酵素レベルで検討されている。様々なシュードモナス属種由来の補酵素B12遺伝子の構成の比較解析に基づいて(図24)、P.デニトリフィカンスATCC 13867株と緑膿菌PAO1株の遺伝子は、非常によく似ており、73％の平均配列同一性を有することが分かった。興味深いことに、これらの株は、補酵素B12遺伝子クラスター内の特徴付けられていないさらに4つの遺伝子: gst、xre、dahp、及びbgpMを保有している。他のシュードモナス属の株とは異なり、マグネシウムキラターゼ(chlID)をコードする遺伝子は、これら2つの株において、xre遺伝子とともに、離れて位置している。さらに、P.エントモフィラ、P.プチダ、及びP.フルオレセンスにおける遺伝子及び遺伝子の構成は、P.デニトリフィカンスと類似している。さらに、これらの株は、補酵素B12輸送システムをコードすることが知られているton依存性B12輸送体(btuB)を欠いている。また、これらの微生物中のオペロンcobGHIJは、B12依存性リボスイッチ構造によって制御されない(図24)。
【０２９４】
エンシファー属(Ensifer)/リゾビウム属種などの窒素固定細菌も、高いB12産生能力を有することが報告されている。興味深いことに、P.デニトリフィカンスSC510(及び工業用B12プロデューサー)とP.デニトリフィカンスATCC 13867とエンシファー・メリロティ(Ensifer meliloti)の間の遺伝子構成の比較により、P.デニトリフィカンスSC510とエンシファー・メリロティは、より緊密に関連しており、かつP.デニトリフィカンスATCC 13867株とは異なることが明らかになった。これらの違いは、P.デニトリフィカンスSC510の全ゲノム配列が利用できないことが原因でそれ以上調べることができなかった。
【０２９５】
P.デニトリフィカンスにおける遺伝子構成を理解することの他に、本発明者らは、Rfamデータベース/ツールを用いて、4つの潜在的B12-リボスイッチの存在を同定した。これらのリボスイッチ構造の1つの代表例が図25Aに示されており、これは、コバラミン生合成の発現を制御していると考えられる。これらのB12-リボスイッチは、各々、大腸菌に存在するものと同様の、及びサルモネラ・エンテリカ(Salmonella enterica)のbtuB B12-リボスイッチと同様のコバラミン結合コンセンサスドメイン(調節ドメイン及び受容体ドメイン)を有する。1つのリボスイッチ(RS1)は、プレコリン-2中間体からのヒドロゲノビリン酸の形成に関与する酵素をコードする2つの分岐して位置するcobGHIJオペロンとcobLFKオペロン(cobM遺伝子を除く)の間に位置している(図25A;図23を参照)。図23に示されているように、この遺伝子座の遺伝子の重要性に基づいて、本発明者らは、補酵素B12ノードとシロヘム生合成ノードの間のフラックスの転換におけるRS1による遺伝子間領域1(IR1)での厳格な制御を想定している。cobWNオペロンとcbtBA-cobEMオペロンの間に位置する2つのB12特異的リボスイッチ構造(RS2及びRS3)は、両方のオペロンの発現を独立に調節するように思われる。最後に、RS4は、ヒドロゲノビリン酸からのAdo-Cblの形成に関与する酵素をコードする11個の遺伝子を含有するcobオペロン(btuB-cobOBRDCQUP-bgpM-cobV)の上流に位置している。
【０２９６】
本発明者らは、これらのリボスイッチ構造がcobオペロン遺伝子の発現を制御する機構を調べた。簡潔に述べると、リボスイッチの保存された領域J6/3とJ11/10の相互作用が、各々のリボスイッチを特異的なものにし、かつアデノシル部分で補酵素B12に結合することができるようにする一方で、リボスイッチのループL5とL13の間の相互作用は、このスイッチの調節状況を変化させる(図25A〜25Dを参照)。
【０２９７】
(実施例17.補酵素B12を感知するリボスイッチ構造及びそのプロモーターシステムの特徴解析)
リボスイッチ構造は、転写伸長又は翻訳開始のいずれかのレベルで遺伝子発現を調節する。遺伝子間領域内のリボスイッチの位置は、これらのリボスイッチ構造による調節の様式を決定する。本発明者らは、P.デニトリフィカンスにおけるB12リボスイッチ構造のほとんどが、非翻訳領域(UTR)ではなく、プロモーターエレメントとオーバーラップすることに気付き、これらのリボスイッチが転写レベルで制御され得ることが示唆された。それゆえ、本発明者らは、補酵素B12の存在下又は非存在下で増殖した対数期後期に採取されたP.デニトリフィカンス培養物に対するリアルタイムPCRを用いて、cobオペロン中の選択された遺伝子(各々のオペロン中の第一の遺伝子)のmRNAレベルを解析した。予想された通り、cobオペロン中の4つの遺伝子(cobG、cobW、cbtB、及びbtuB)のmRNAレベルは、補酵素B12の存在下で顕著に抑制された(図26)。RS3の制御下のオペロンcbtBA-cobEMの転写は、43.3倍大いに抑制された。本発明者らは、このオペロン中の遺伝子のほとんどがB12生合成経路の構造遺伝子をコードしないことに気付いた(cobE、cbtBAは、それぞれ、推定上のシャペロン及びコバルト輸送体タンパク質として機能する)。オペロン(cobGHIJ、cobWN、及びbtuB-cobOBRDCQUP-bgpM-cobV)をコードする構造遺伝子の転写が、B12(非抑制形態)の非存在下で、オペロンcbtBA-cobEM中の構造遺伝子よりも少なくとも3.3倍低い転写レベルを有することは注目すべきである。遺伝子間領域のインシリコ解析から、RS1がcobGHIJ/cobLFKオペロンのどちらか又は両方の発現を制御するかどうかは不明である。しかしながら、mRNAレベルに基づくと、RS1は、cobGHIJオペロンの発現を制御するが、cobLFKオペロンの発現を制御しないようである。本発明者らは、高いものから順に、cob遺伝子クラスター中の様々なB12-RSによる転写抑制を観察した: cbtB-RS3＞cobG-RS1＞cobW-RS2＞btuB-RS4。cobLFK、chlID-xre、及びdahpオペロンでは、抑制が認められなかった。これらの結果は、それらが、これらのオペロンの上流にあるリボスイッチ構造を欠いているという事実と相関している。
【０２９８】
本発明者らは、これらのリボスイッチが、転写レベルでの調節に加えて、翻訳の開始時にも制御され得ると推測している。さらに、本発明者らは、cobオペロンのプロモーターと酵素コード領域(上流)の間の遺伝子間領域をプラスミドにクローニングすることにより、これらのリボスイッチの調節強度を予測しようとした。これらのプラスミドに、本発明者らは、cobオペロンから選択される二次構造位置の下流に、レポータータンパク質(蛍光マーカー)としての緑色蛍光タンパク質を付加した。これらのプラスミドシステムの2つのバージョンを構築した。天然のタンパク質をコードするそれぞれの配列の最初の35bpがプラスミド中でGFPをコードする遺伝子に融合された1つのバージョン及びこの融合を有さなかった1つのバージョン。cobGの融合形態(cobGの最初の35bpがgfpに融合されたもの)は、その融合していないgfpコンストラクトと比較して、4.2倍高い蛍光を示した(図27、表6)。しかしながら、本発明者らは、cobGの最初の35個がgfpに融合されたとき、他のプロモーターシステム(他のB12オペロン由来の遺伝子間セグメント)によってもたらされる蛍光レベルに顕著な差がないことを観察し、それらが翻訳開始レベルで制御されないことが示唆された。これらの結果は、PcobG-RS1が転写開始レベルと翻訳開始レベルの両方で遺伝子の発現を厳密に制御することをさらに示唆している。転写及び翻訳における厳しい調節は、cobGHIJオペロン中の遺伝子の制御された発現の重要性の表れである。
【０２９９】
天然のプロモーターの強度の推定は、いくつかの遺伝子が関係する任意の経路、例えば、ビタミンB12経路、又はいくつかの膜タンパク質が関係する経路を過剰発現するときに極めて重要である。多くの遺伝子を有する経路の過剰発現は、細胞増殖にとって有害である可能性があり、経路遺伝子/オペロンの不均衡な発現は、毒性のある経路中間体の蓄積をもたらし得る。天然のプロモーターの強度の解析及び定量は、改変中、経路酵素を過剰発現させることなく、本発明者らが合成プロモーターを有するオペロンを再設計するのを助けることができる。表5は、本発明者らがオペロン中の様々な天然のcobプロモーターについて観察した推定プロモーター強度(相対蛍光(florescence)単位で示す)を示している。コバルト輸送体遺伝子の発現を制御するプロモーターPcbtBは、最も高い強度を有し、PcobLプロモーターは、このグループの最も低い強度を有する。メチルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子は、通常、弱いプロモーターシステムによるものであるように思われた。
表6. P.デニトリフィカンスにおけるcobレギュロン遺伝子間領域の特徴解析
【表４】
2021502112.tif 000023
【０３００】
(補酵素B12産生経路の改変)
B12プロモーターの合理的改変は、そのUTR構造(融合及び非融合バージョン)とともに、プロモーター強度の定量を必要とする。それゆえ、補酵素B12合成経路酵素をコードするcobオペロンの天然のプロモーターの強度を慎重に定量した(図27、表6及び10)。さらに、これらの(cob)遺伝子の発現レベルを(その天然の発現と比べて3〜5倍)増大させるために。cobオペロンの発現を、好適な構成的プロモーターと交換することにより修飾した(図57)。構成的プロモーターは、いくつかの天然のシュードモナス属プロモーターのその強度をスクリーニングし、同定することにより選択した(表10)。例えば、3倍改善されたプロモーター強度を有するPedd-IR13-PsucA組換え株を開発するために、PcobG及びPcobLを、それぞれ、構成的プロモーターのPedd及びPsucAと交換した(さらなる詳細については、表8を参照)。
表10. B12プロモーター交換のための戦略
【表５】
2021502112.tif 000024
【０３０１】
(実施例18.リボスイッチベースのB12感知システムの開発)
ビタミンB12定量法には、典型的には、微生物学的アッセイ及びUV検出を伴う高速液体クロマトグラフィー(HPLC)が含まれていた。HPLC法は、高濃度(μMを超えるレベル)のB12を検出することができるが、微生物アッセイは、非常に低い濃度(nM程度の低さのレベル)のB12を検出することができる。微生物学的アッセイは、ネズミチフス菌の特定の突然変異体株metE- cbiB-における増殖因子としてのB12に基づいていた。簡潔に述べると、これらの微生物の増殖は、B12の濃度に比例していた。しかしながら、細胞増殖に基づくB12の定量は、培養培地及びインキュベーション時間などのいくつかの生理学的因子によって達成される。それゆえ、細胞増殖に基づく補酵素B12の定量は面倒であり、かつ再現するのが困難である。
【０３０２】
本試験において、本発明者らは、5つの推定B12リボスイッチ構造の中で、プロモーターPcobG'及びPcbtBの後ろに見られる、そのうちの2つが、補酵素B12の存在下及び非存在下で下流遺伝子の示差発現を示すことができることを見出した。さらに、これらのリボスイッチのダイナミックレンジを、様々な濃度の補酵素B12(最大100nM)を用いて、新規のB12センサーとしてのその潜在能力を検証することにより評価した。B12濃度とGFP蛍光との線形相関が約5nMのコバラミンB12のスイッチオフ点で認められた(図28)。B12リボスイッチPcobG'及びPcbtBは、B12の存在下及び非存在下で〜2.1-及び1.7倍の示差発現を示した。増殖に基づくB12検出とは対照的に、蛍光に基づくB12検出法は、再現性があり、使いやすく、かつ手間がかからない。
【０３０３】
(実施例19.補酵素B12の定量的バイオアッセイ:)
P.デニトリフィカンスを、0.1mMの5,6-ジメチルベンズイミダゾール(DMB)、1g/Lのベタイン、及び微量元素である0.232g/LのH3BO3、0.174g/LのZnSO4・7H2O、0.116g/LのFe(NH4)2SO4・6H2O、0.025g/LのCoCl2・6H2O、0.022g/Lの(NH4)6Mo7O24・4H2O、及び0.008g/LのCuSO4・5H2O、0.008g/LのMnSO4・4H2Oが補充された、1g/LのNaCl、1g/LのNH4Cl、2mMのMgSO4、10g/Lのグルコン酸ナトリウムを含有するM9最小培地中、0.1の初期OD600で増殖させた。細胞を対数期で採取し、FastPrep-24(商標) 5Gホモジナイザーシステム(MP Biomedicals, Korea)により破壊した。細胞溶解物を13,000rpmで30分で遠心分離し、上清を回収し、0.2μmのメンブレンフィルターに通して滅菌した。得られた溶解物溶液をバイオアッセイに使用した。補酵素B12を、突然変異体株ネズミチフス菌metE- cbiB-を使用することにより定量した。簡潔に述べると、ネズミチフス菌において、metEは、B12非依存性メチオニンシンターゼをコードし、cbiBは、B12合成経路に不可欠な酵素であるアデノシルコビンアミドリン酸シンターゼをコードする。これらの遺伝子の突然変異により、ネズミチフス菌がB12又はメチオニンに対する栄養要求株になる。指標株のネズミチフス菌metE- cbiB-を、50mg/Lのメチオニンが補充された0.5g/LのNaCl; 6g/LのNa2HPO4; 3g/LのKH2PO4; 1g/LのNH4Cl; 4g/Lのグルコース; 2mMのMgSO4、0.1mMのCaCl2を含有する最小培地中で前培養した。終夜ブロスを遠心分離し、水で洗浄した。洗浄した細胞に、最小培地中、0.01の初期OD600を植菌した。B12を測定する必要がある細胞溶解物を培養ブロスに添加した。指標株の増殖は、試料中の補酵素B12の濃度を反映する。補酵素B12の濃度を変化させて、標準曲線を作成した。B12濃度のダイナミックレンジは、0〜100pM B12であった。B12の濃度を1 OD600当たりのnMとして表した。
【０３０４】
(実施例20. B12合成に不可欠な遺伝子としてのbgpMの同定)
cob生合成オペロン内の遺伝子の不可欠性に関する完全な見識を得るために、B12生合成のためのcob遺伝子クラスター内のいくつかの特徴付けられていない遺伝子、例えば、gnt、gst、xre、dahp、及びbgpMの不可欠性を調べた。これらの遺伝子がB12生合成に必要であるかどうかを解明するために、これらの遺伝子の各々の単一ノックアウト突然変異体を作出した。これらの突然変異体株のB12生合成能を、上記の実施例に記載されているB12特異的リボスイッチ感知システムと従来のネズミチフス菌metE- cbiB-ベースのB12アッセイシステム(材料を参照)の両方を用いて調べた。補酵素B12生合成は、その金属中心にコバルトを必要とするので、その生合成は、CoCl2の濃度に依存する。これらの突然変異体株を増加濃度のCoCl2(最大50μg L-1)とともに培養したとき、GFP蛍光は、ΔbgpM突然変異体を除いて、比例減少した(図29A)。これらの結果は、これらの突然変異体株の各々が、ΔbgpMを除いて、野生型株の補酵素B12と同様の補酵素B12を合成することができることを示している。bgpMの遺伝子産物は、P.デニトリフィカンスにおける補酵素B12の生合成にとって不可欠な役割を果たしている。しかしながら、B12生合成におけるその正確な役割は、未だ解明されていない。不可欠性解析は、ネズミチフス菌を指標株として用いて行った。これらの突然変異体株によって合成される補酵素B12の細胞内濃度を定量した(図29B)。P.デニトリフィカンスにおける結果と同様に、ΔbgpM突然変異体だけが補酵素B12を合成することができなかった(又は微量の補酵素B12しか合成することができなかった)(野生型株よりも〜7倍少ないB12)。これらの結果に基づくと、IR2に位置する遺伝子(図23を参照)は、B12生合成にとって不可欠ではない。それゆえ、これらの遺伝子の過剰発現は、補酵素B12産生を増強するのに有効ではない可能性がある。驚くことに、B12生合成経路の重要な分岐点である、cobA欠失突然変異体(ウロポルフィリノーゲンメチルトランスフェラーゼをコードする)は、依然として、補酵素B12を合成することができた(図29B)。さらなる解析に基づいて、本発明者らは、P.デニトリフィカンスにおいてCobAの役割の代わりになり得るいくつかのCobAイソ酵素の存在をP.デニトリフィカンスのゲノム中に同定した。
【０３０５】
(実施例21.補酵素B12産生はリボスイッチ構造の欠失によって改善する)
B12産生を改善するために、全てのリボスイッチ構造の同定された負の調節ドメイン(P5〜L5領域)を個々に欠失させた。これらのリボスイッチ欠失突然変異体によって産生されたmRNAレベルを補酵素B12の存在下及び非存在下で定量した(表7)。＞5nMの補酵素B12の存在下で、cobオペロン転写は、P.デニトリフィカンス株のリボスイッチにより抑制されることができるが、リボスイッチ突然変異体株では、補酵素B12の存在により、より多くの量の補酵素B12産生をもたらすことができる。それゆえ、これらの突然変異体株によって合成されるB12の量を測定することにより、リボスイッチの突然変異による補酵素B12生合成遺伝子の増強を評価する方がより簡単であろう。興味深いことに、野生型株と比較して、ΔRS1(リボスイッチ1欠失)突然変異体とΔRS2/RS3(リボスイッチ2及び3欠失)突然変異体における補酵素B12産生に顕著な差はなかった。しかしながら、野生型と比較したとき、ΔRS4(リボスイッチ4欠失)突然変異体における補酵素B12に顕著な差があった。補酵素B12の産生は、ΔRS4株で大幅に抑制された。上記の結果は、ΔRS1及びΔRS2/RS3における欠失が補酵素B12産生に影響を及ぼさなかった一方で、ΔRS4欠失が補酵素B12産生を大幅に減少させたことを示している。1つの可能性は、突然変異についてランダムに選択されたリボスイッチ1、2、及び3中の領域が機能を消失させるのに十分ではなかったということであり、それゆえ、本発明者らは、ΔRS1及びΔRS2/RS3突然変異体株で補酵素B12産生の変化を見なかった。他方、ΔRS4の突然変異は、リボスイッチがコード領域とオーバーラップしていたので、タンパク質発現に影響を及ぼす可能性が高い。欠失突然変異体を開発せずに、この限界を克服するために、本発明者らは、mRNA中の二次構造が突然変異により中和され、同時に、タンパク質配列がコドン最適化によって維持されているリボスイッチ領域を修飾した。
表7. 25mg/L CoCl2の存在下及び非存在下におけるB12合成遺伝子の転写レベル
【表６】
2021502112.tif 000025
【０３０６】
本発明者らは、ソフトウェアを用いて配列を設計し、核酸を化学合成し、補酵素B12合成経路の酵素をコードするcob mRNA中での二次構造形成を回避するようにゲノム中で交換した。本発明者らは、各々のリボスイッチ、又はリボスイッチの組合せを変化させることにより、7つの組換え株を開発した。興味深いことに、本発明者らは、リボスイッチ1を欠失させたとき(ΔRS1株)、細胞増殖及び補酵素B12産生のわずかな減少が認められることに気付いた。これは、おそらくは、一部の毒性中間体の蓄積によるものであり得る。しかしながら、リボスイッチ2及び3の欠失(ΔRS2/RS3)又はリボスイッチ4の欠失(ΔRS4)は、補酵素B12産生を改善しなかった。これは、上方の経路の炭素フラックスの制限によるものであり得る。しかしながら、リボスイッチ1をリボスイッチ2及び3(ΔRS1 ΔRS2/RS3)又はリボスイッチ4(ΔRS1 ΔRS4)のいずれかとともに欠失させたとき、補酵素B12産生のわずかな改善が見られた。さらに、全てのリボスイッチを欠く突然変異体株は、同等に高い補酵素B12産生を示した(表8)。
【０３０７】
本試験は、P.デニトリフィカンスによる補酵素B12産生がcob mRNAから二次構造を取り除くことにより改善され得ることを示した。補酵素B12産生が改善された突然変異体株を宿主として用いて、グリセロールから3-HP(又はその塩)を産生させたとき、それは、＜38.6g/Lの3-HPを産生した(表8)。この突然変異体株は、＜30g/L産生する野生型株よりもわずかに高い3-HP力価を生じた。野生型株と比較した突然変異体株によるグリセロールからの3-HP産生の改善は、補酵素B12経路の改善に起因し得る。この突然変異体株に、10mg/Lの補酵素B12を培地中に外部補給したとき、この株は、グリセロールから〜100g/Lの3-HP産生をもたらすことができた(図50)。これらの実験から、突然変異体株は、補酵素B12産生を増大させているが、この株を、より高い力価の3-HP産生をより顕著に増大させるようにさらに修飾し得ることが明確に示された。
【０３０８】
補酵素B12産生をさらに改善するために、リボスイッチ突然変異体株のcobオペロンの天然のプロモーターを、上記の実施例に記載されている合成発現モジュール(高発現する遺伝子のタンデムプロモーター、UTR、調節タンパク質、N-末端領域)と交換した。cob遺伝子クラスターの解析により、B12生合成経路内の遺伝子の発現を制御する5つのプロモーターの存在が示され、天然のプロモーターを表8に示されているように個々に又は組み合わせて交換することにより、いくつかの組換え株を開発した。プロモーター交換用に選択されるプロモーターの選択を表10に示した。各々のプロモーターの交換は、補酵素B12産生のわずかな改善を示したが、全てのプロモーターを合成遺伝子発現モジュールと交換したとき、補酵素B12の大幅な改善が認められた。この株(PhpdH-Pedd-IR15-PsucA-PhpdH: PhpdH-Ptkt-IR45-Psp2-PhpdH)を宿主として用いて、バイオリアクター中でグリセロールから3-HPを産生し、この株は、〜100g/Lの3-HPを産生することができた。これは、工業的量の3-HPを産生するために、野生型P.デニトリフィカンスに、補酵素B12(最大50mg/L)をバイオリアクター中に外部補給したときに産生することができる3-HPの量と同様である(図50を参照)。したがって、本発明者らは、より多くの量の補酵素B12を合成することができ、それにより、補酵素B12の外部補給を必要とせずに、廃グリセロールからの商業的規模の3-HP産生を支援する組換えP.デニトリフィカンス株を開発することに成功した。3-HP産生コストの約38％は、補酵素B12を培養培地に外部補給するコストによるものであるので、グリセロールからの3-HPの産生コストは、大幅に減少した。
表8.様々な補酵素B12を過剰産生するP.デニトリフィカンス株の開発及び評価のまとめ
【表７】
2021502112.tif 000026
【０３０９】
(実施例22.アルデヒド-デヒドロゲナーゼ発現カセットの開発)
アルデヒドデヒドロゲナーゼ(ALDH)は、3-HPAから3-HPへの変換(3-HP合成経路における第二の反応)を触媒する。毒性のある、細胞内3-HPAの蓄積を最小限に抑えるために、(例えば、kgsA遺伝子による)ALDHの発現は、そのグリセロールデヒドラターゼ(DhaB)よりも高いレベルで維持されるべきである。さらに、ALDHを染色体に組み込むために、その発現を(プラスミドからの観察される遺伝子発現を追跡するために)さらにより高いレベルまで増大させる。これを達成するために、上記の実施例に記載されている誘導性タンデムプロモーターシステムを含有する発現モジュール/カセットを基本プロモーターとして利用して、ALDH(例えば、kgsA)を発現する遺伝子を駆動し、さらに開発した。ALDH発現カセットの強度を、上記の実施例に記載されている様々な遺伝子改変によって変化させ/改善した。要約すると、発現モジュール/カセットは、以下の特徴:(i)一方のプロモーターが誘導性であり、もう一方のプロモーターが構成的又は誘導性であるタンデムプロモーター(このプロモーターは、宿主微生物にとって天然のものであっても、合成されたものであってもよい);(ii)プロモーター領域中のアクチベータータンパク質の結合(オペレーター)部位の突然変異(ランダム化)、(iii)アクチベータータンパク質の発現レベルの変化;(iv)様々な長さの融合体(ここで、高発現する天然のタンパク質、例えば、MmsAのN-末端の一部は、ALDHに融合されている)、及びALDHの最初の10個のコドンのコドン最適化(宿主微生物、例えば、P.デニトリフィカンスのコドン使用に準拠する);並びに(v)5'-非翻訳領域(UTR)の改変(発現システムに対する遺伝子修飾の模式図については、図30Aを参照; ALDH発現遺伝子を染色体に組み込むために使用される発現システムについては、図30Bを参照)を有していた。
【０３１０】
(実施例23. DhaB-GdrAB発現カセットの開発)
dhaB及びgdrAB遺伝子をP.デニトリフィカンスの染色体に組み込み、転写効率と翻訳効率の両方を増強することにより、その発現レベルを改善した。3-HPA蓄積を回避するために、dhaB及びgdrABは、ALDHよりも低いレベルで発現させるべきである。これを達成するために、ALDHを産生するために使用されるプロモーターと比べて中程度の強度である3-HP誘導性プロモーターを用いて、dhaB及びgdrAB遺伝子の発現を駆動した。発現カセットは、次のように設計した:(i)UTR改変;(ii)一方のプロモーターが構成的であり、もう一方のプロモーターが誘導性であるタンデムプロモーターの使用;(iii)構成的プロモーターの修飾;(iv)アクチベータータンパク質HpdRの誘導性プロモーター(-10〜-35ボックス)及び結合(オペレーター)部位の修飾;並びに(v)アクチベータータンパク質の発現レベルの変動(発現システムに対する遺伝子修飾の模式図については、図31Aを参照; DhaBを染色体に組み込むために使用される発現システムについては図31Bを参照)。
【０３１１】
このように、実施例22に記載されているアルデヒド-デヒドロゲナーゼ発現カセット、及びここに記載されているDhaB-gdrAB発現カセットを用いて、組換え株によりグリセロールから3-HPを産生した。
【０３１２】
(実施例24.シュードモナス・デニトリフィカンスを用いるプラスミドからのALDH及びDhaBの発現)
P.デニトリフィカンスΔ3hpdhΔ3hibdhIVΔ3hibdhIpUCPK'を、様々な組合せのDhaB及びKgsAの発現用のプラスミドで形質転換した。プラスミドは、異なる強度の異なる発現モジュールを保有していた。したがって、一緒に大量の3-HPを産生するDhaB及びKgsAの発現モジュールを発見するために、DhaB及びKgsAの発現を駆動する異なる強度の様々なプロモーターを試験した。3-HPA蓄積を回避しながら、それでも顕著な3-HP産生及び細胞増殖を可能にしようとするために、より低い強度の発現モジュールをDhaB、GdrAB発現に使用し、その一方で、より高い強度の発現モジュールをKgsA発現に使用した。
【０３１３】
産生された全ての株の中で、P1-1と表記される1つの株は、バイオリアクター実験でかなりの3-HP産生を示した(表9を参照)。しかしながら、この株において、本発明者らは、ALDH活性が比較的低く、毒性中間体3-HPAが発酵の初期の段階で現れることを明らかにした。P1-1を(DhaB、GdrAB、及びKgsAの参照発現レベルを有する)参照株として用いて、本発明者らは、次に、ALDHのプラスミド発現レベルを増大させることにより、3-HPA蓄積を低下させようとした。本発明者らは、上記の実施例に記載されている様々な遺伝子発現カセットを利用することにより、より高いALDHレベルを発現する一連のプラスミドを開発した。これらのプラスミドをP.デニトリフィカンスに導入して、P1-1x株(x＝a、b、c、d、…)を作製した。新たに開発された組換え株の粗細胞抽出物におけるALDH活性は、P1-1株におけるタンパク質1mg当たり2.5UのALDH活性と比べて、タンパク質1mg当たり10〜19U増大した。組換え株をバイオリアクター規模での3-HP産生について評価した。
表9.プラスミドからKgsA及びDhaBを発現するP.デニトリフィカンス株の評価
【表８】
2021502112.tif 000027
a25mMの3-HPで誘導してから4時間後のフラスコ実験から測定された
bバイオリアクター実験から
【０３１４】
(実施例25.染色体組込み型のALDH発現モジュール及びエピソーム性DhaB発現モジュールを有するP.デニトリフィカンスの開発)
(ALDH組込み体株の開発:)
組込みの染色体位置は、組み込まれた遺伝子の発現レベルに影響を及ぼすことが知られており、注意深く選択されるべきである。通常、遺伝子は、遺伝子量効果のために、複製起点により近い位置にあるときに、より高発現される。まず、kgsA遺伝子を、複製起点から〜3,000Kb離れて位置する内在性mmsA遺伝子の代わりに組み込んだ。染色体上のmmsA遺伝子発現単位(すなわち、遺伝子間領域及びmmsA)を、kgsA発現カセット(図30を参照;発現カセットは、タンデムプロモーター(mmsAの20個のアミノ酸がkgsAのN-末端に融合されているもの(ハイブリッドタンパク質); kgsAの最初の10個のコドンのコドン最適化;及び修飾されたUTR(UTR-6)を有する)により置き換えて、第一のKgsA組込み体株(P2-0と表記される)を作出した。P2-0については、野生型kgsAを使用した。
【０３１５】
組込みの位置を変化させることにより、より多くの組込み体株(例えば、P2-0、P2-10、P2-20、及びP2-30)を開発した(図32を参照)。これらの株について、融合kgsA遺伝子(例えば、mmsAの20個のアミノ酸がkgsA遺伝子のN-末端に融合されているもの)を利用した。染色体の様々な位置、例えば、複製起点から〜500Kb(P2-10)、〜1500Kb(P2-20)、〜3000Kb(P2-30)離れた位置にkgsAを有する多くの株を調べた。これらの株は、DhaBを発現するプラスミドを有していなかった。これらの株を25mMの3-HPで4時間誘導し、KgsA活性をアッセイした。図32は、突然変異体kgsAが複製起点の最も近くに位置するP2-10が最も大きいKgsA1活性(24U/mg)を生じさせたことを示している。P2-0株(野生型kgsA)と同じ染色体位置に挿入された突然変異体kgsAを有するP2-30株は、P2-0株よりも多くのタンパク質を産生した(それぞれ、15U/mgと10.8U/mg)。この結果は;(i)同じ染色体位置での組込みの後に試験したとき、突然変異体KgsA1活性がKgsAの活性よりも高かったこと、及び(ii)ALDH活性が、その染色体組込みの位置によって、顕著に変化したことを示している(図32)。
【０３１６】
(プラスミド由来のDhaB及び染色体に組み込まれたKgsAの様々な発現:)
プラスミドからのエピソーム性DhaBの発現及び/又は染色体に組み込まれたALDHの発現を調節することにより、DhaBとALDHの比を変化させることができた。組換えP2-0及びP2-10株のみを、DhaB発現カセットを含有するプラスミド(pUCPK骨格中のdhaB gdrAB)で修飾した(表11)。表11に示されているP2株は、DhaB発現カセットを発現させるために使用されるプロモーターシステムが異なる。P2-1〜P2-5に使用されるプロモーターは、それぞれ、次の通りである: Pc3、UTR設計(すなわち、本明細書に記載される修飾されたUTR)を有するPc3、UTR設計を有するPc3-Pc1、UTR設計を有するPc1-Pc3、及びUTR設計を有するPc3-Pzwf。これらのプロモーターシステムは、そのプロモーター強度が昇順に異なる。
表11.染色体ALDH及びエピソーム性DhaBを有するP.デニトリフィカンス株の評価
【表９】
2021502112.tif 000028
a25mMの3-HPで誘導してから4時間後のフラスコ実験から測定された
bバイオリアクター実験から
【０３１７】
(実施例26. ALDH及びDhaBの染色体組込みを有する組換えP.デニトリフィカンスの開発)
(DhaB/ALDH比の最適化:)
DhaB-GdrAB発現カセットとKgsA発現カセットの両方が染色体に組み込まれている組換えシュードモナス・デニトリフィカンス株を開発した。上記の実施例に記載されているように、ALDH活性は、kgsA遺伝子挿入の染色体位置によって異なり(図32)、本発明者らは、異なる活性を示すALDHについてのいくつかの組込み体(P2-10、P2-20、P2-30)を開発した。本発明者らは、DhaB-GdrAB発現カセットを実施例25に記載されているP2-10及びP2-20組換え株に組み込んだ。DhaB-GdrAB発現カセットの染色体組込み部位の位置は、組換え株におけるKgsA発現カセットとの関連で様々であった。例えば、P4-1組込み体株は、DhaB-GdrAB発現カセット(図31Bを参照)を宿主P2-20の染色体に組み込むことにより開発した(図32及び37を参照)。P4-1株において、DhaB-GdrABカセットは、複製起点から〜4,150kb離れて組み込まれた。P4-1株は、染色体からDhaB及びKgsAを高発現した(表12)。DhaB活性とKgsA活性の比を最適化するために、KgsA、DhaB、又はKgsAとDhaBの両方の発現を変化させることによって、さらなる株を開発した。本発明者らは、P2-10株を利用して、DhaB-GdrABカセット(P4-1に対して使用されたのと同じカセット)を組み込み、それにより、P4-2株も作出した(図33)。
【０３１８】
さらに、KgsA発現と比べてDhaB発現を低下させるために、P4-1及びP4-2におけるDhaBカセットのプロモーター領域を修飾した。本発明者らは、DhaBカセットを発現させるためのより弱いプロモーターを選択した(実施例10を参照)。これにより、それぞれ、2つの新しい組込み体株P4-3及びP4-4が結果として得られた(図33)。表12は、これらの株の各々におけるDhaB及びKgsA活性をまとめたものである。P4-3及びP4-4株では、P4-1及びP4-1株で使用されたPc1-Pc3タンデムプロモーターよりも低いプロモーター強度を有するタンデムプロモーターPc3-Pzwfを使用した。プロモーター強度は、KgsA発現について、P4-5及びP4-6株で減弱していた。
表12. KgsAとDhaBの両方の染色体組込みを有する組換えP.デニトリフィカンス株の評価
【表１０】
2021502112.tif 000029
a3-HPで誘導してから4時間後のフラスコ培養から測定された
bバイオリアクター実験から測定された
【０３１９】
(実施例27: DhaB及びKgsAのチャネリング)
細胞内の特定の経路の中間体の蓄積を回避するために、1つの経路の酵素をコードする遺伝子のクラスター配置が細菌で観察される。原核生物、例えば、細菌において、転写及び翻訳が同時に起こることに留意するのは重要なことである。ほとんどの場合、第一の酵素の産物が第二の酵素の基質となる。これらの遺伝子が互いに近くに位置する場合、第二の遺伝子/酵素の基質は、その近くに位置する。この種の機構は、経路の効率を増大させ、第二の酵素によって中間体をすぐに消費することにより、もしあるとしても、その毒性を回避することができる。互いの近くへの遺伝子のこの種のクラスタリングは、チャネリング効果として知られる。3-HP産生及び細胞生存を改善するために、本発明者らは、毒性3-HPAに対する他の酵素及び細胞構成要素の曝露を低下させるために、DhaB及びALDH酵素を介して3-HPAをチャネリングした。本発明者らは、3-HPAが触媒作用によって素早く3-HPになるシステムを確立しようとした。これを行うために、本発明者らは、3-HPAのチャネリングを促進するために、染色体中の互いに対するDhaB及びkgsA(ALDH)の位置を変化させる効果を調べた。ある株では、dhaB、gdrAB遺伝子、及びkgsAが互いに接して位置していた。一方、別の株では、kgsAの位置がDhaB及びGdrABコード遺伝子から2000bpを超えて離れていた。上で言及したように、染色体上の様々な位置における遺伝子のポジショニングは、発現及び活性にかなりの影響を及ぼす。kgsAを異なる位置に(DhaB、GdrABの近くに(P4-20株)、及びDhaB、GdrABから2000bp離れて(P4-10株))配置したとき、本発明者らは、非常に大きな酵素活性の違いに気付いている。両方の株(チャネリング効果あり(P4-20)及びチャネリング効果なし(P4-10))は、同様のKgsA及びDhaB活性を示した。これら2つの株の唯一の違いは、チャネリング効果を調べるべき遺伝子の位置であった(図51)。
【０３２０】
(細胞内代謝及び3-HP産生に対する3-HPAのチャネリング効果)
本発明者らは、2つの株(チャネリング効果あり(P4-20)及びチャネリング効果なし(P4-10))を調べ、3-HP産生の顕著な違いを示した。遺伝子が互いの近くに位置し、チャネリング効果を促進したP4-20株は、遺伝子が染色体上で2000bp離れて位置するP4-10株と比較したとき、より高い3-HP産生率を示し、3-HP力価を改善した。興味深いことに(Interesting)、1,3-PDOのわずかな違いもこれらの株で認められた。P4-10は、P4-20と比較したとき、わずかに大きい1,3-PDO産生を示した。これは、より大きい3-HPA蓄積によるオキシドレダクターゼの誘導によるものである可能性があった。一方、遺伝子が互いに接して位置するP4-20株では、1,3-PDOの少なさ及び多くの3-HPの多さから、DhaB酵素によって産生される3-HPAが近くに位置するKgsA酵素によってすぐに消費され、3-HPAを蓄積させなかったことが示される。
【０３２１】
(実施例28.組換え生物における3-HPのバイオ産生条件)
3-ヒドロキシプロピオン酸は、工業的に重要な汎用化学物質を得るためのプラットフォーム化学物質として使用することができる潜在的な工業用化学物質として認識されている。汎用(バルク)化学物質の前駆体であるので、その産生は、安価でかつ経済的でなければならない。3-HP又はその塩の生物学的産生のために、いくつかの優れた組換え株が開発されたが、これらの株の大部分は、分析等級培地で培養したときに優れた性能を示した。分析等級培地は高価であり、バルク化学物質の商業化に適用されない。それゆえ、組換え株が商業化規模でグリセロールから3-HPを産生するのを助ける安価な培地成分を使用している工業用培地が調合されるべきである。さらに、組換え株の性能は、生理学的/バイオプロセス条件に大きく依存する。それゆえ、工業用培地の開発とともに、生理学的/バイオプロセス条件は、高力価の標的産物を達成するように注意深く最適化されるべきである。
【０３２２】
微生物を培養するために使用される培地は、多くの無機化学物質と有機化学物質の組合せである。良好な培地を調合するために、組換え株の代謝及び標的産物の特性を理解することが重要である。安価な培地を開発するために、かなりの量の望ましくない毒性材料を含有するいくつかの低等級の原材料を使用した。これらの毒性材料は、その増殖及び生存を低下させることにより株の性能に影響を及ぼすか、又は標的産物の精製を妨げるかのいずれかである。それゆえ、このプロセスに好適な培地成分の正しい組合せの選択は苦心するが、相当に重要である。本試験において、本発明者らは、いくつかの成分を注意深く選択及びスクリーニングし、各々の成分を綿密に分析して、工業用培地を調合した。
【０３２３】
工業用培地の調合の他に、例えば、温度、pH、通気などのバイオプロセスの条件がバイオリアクター条件で検討及び最適化されるべきである。細胞代謝及びNAD+再生は、3-HP産生に極めて重要であるが、これを、制御された条件下で生理学的パラメータを変化させることにより分析的に検討した。組換え株の酸耐性及び3-HP産生経路の酵素効率を改善するのに重要な役割を果たすpHの効果を調べた。各々の生理学的パラメータは3-HP産生に顕著な影響を及ぼすので、通気及び温度及び誘導時間の最適化を綿密に検討した。バイオプロセス最適化によってグリセロールから3-HPを産生する組換え株の性能の良好な改善を達成した。
【０３２４】
(pH)
効率的な組換え株の開発の他に、商業的に意味のある力価の有機酸の生物学的産生にとっての他の重大な課題は、これらの酸を産生する微生物の細胞増殖及び細胞代謝に対するこれらの酸の毒性効果に対処することである。ほとんどの弱酸は抗微生物特性を有することが知られているため。有機酸の抗微生物活性に関するいくつかの機構が示唆されている。1つのそのような機構には、酸毒性を引き起こすプロトンによる細胞内pHの変動又は細胞内pHの減少が含まれる。
【０３２５】
その連続産生の間、有機酸は、培養ブロス中に蓄積し、そのため、その非解離形態の濃度がヘンダーソン・ハッセルバルヒの式に従って増大する。この非解離形態の酸は、形質膜を容易に通過し、細胞質に進入したときに、プロトン及びそれぞれのアニオンに解離することができる。遊離したプロトンは、細胞質pHを低下させるが、他方、アニオンは、特定の代謝に影響を及ぼすことが報告されており、増殖の障害をもたらす。酸毒性に関するいくつかの研究は、有機酸産生をもたらす微生物の細胞質pHを減少させることが示されている。
【０３２６】
商業化のために、微生物による高力価の3-HP合成に影響を及ぼす重要な因子は、その毒性(有機酸毒性)である。乳酸の異性体である3-HPは、より低い酸性度又は0.64高いpKa値のために、乳酸よりも約4.4倍毒性が高いことが報告されている。これら2つの酸は、増殖阻害がヘンダーソン・ハッセルバルヒの式によって算出される非解離又はプロトン化遊離酸濃度と相関性があるとき、明らかな違いを示さなかった。Chunらは、小さい弱酸による増殖阻害が、主に、(アニオン効果ではなく)プロトン効果、すなわち、細胞内プロトン濃度の増大によって生じることを示唆した。本試験では、培養培地中の遊離酸濃度を低下させることにより、培地pHの適切な増加が酸毒性を緩和することが示唆された。
【０３２７】
本試験で使用される組換え株は、6.8〜7のpHで最適増殖する好中球であるが、この株を7.5のpHで増殖するように進化的に適応させた。本発明者らの目的とする標的産物は、酸(3-HP)又はその塩であり、これらの組換え微生物は、細胞質中で標的産物を産生し、それを培養培地中に分泌する。微生物による酸の連続産生及び分泌は、前の節で詳細に説明した培養培地のpHのかなりの減少をもたらす。3-HP又はその塩の連続産生のために、及び細胞生存を持続するために、培地は、中性pHで維持されなければならない。それゆえ、pHを維持するために、中和塩基が細菌バイオリアクター試験で使用されている。通常、強塩基、例えば、NaOH、KOH、又はNH4OHさえも、細菌バイオリアクター試験でpHを維持するために使用される。そのような強塩基の使用は、それぞれ、NaOH又はKOHを使用したとき、Na+又はK+などの塩の蓄積をもたらす。この高濃度の塩の蓄積は、細胞増殖及びその代謝にとって毒性があると報告されている。他方、酸産生を中和するために、水酸化アンモニウム又は重炭酸アンモニウムを使用した。アンモニアを含有する中和塩基を用いる利点は、NH3+が微生物によって窒素源として消費され得るということである。一方、重炭酸塩は、中心代謝に影響を及ぼすことが報告されており、これにより、TCAサイクルへのフラックスが増強し、それにより、細胞増殖及び生存が改善される。したがって、重炭酸塩ベースの中和剤を用いて、3-HP産生のための商業的に実現可能なバイオプロセスを開発した。
【０３２８】
組換え株によってグリセロールから3-HP又はその塩を産生するためのバイオリアクター実験を、様々な塩基NaOH、KOH、及びNH4OHを用いて実施し、細胞増殖及び3-HP産生に対するその効果を調べた(図35)。NaOH及びKOHを中和塩基として含む培養物は、ほぼ同一の結果を示した。NH4OHを用いたバイオリアクター試験は、これらの試験で使用した他の中和塩基の最終力価と同様の最終力価を示した。しかしながら、NH4OHから得られた結果の綿密な解析により、最初の22時間のバイオリアクター試験における増殖及び生産性の改善が示された。興味深いことに、生産性は、NH4OHを用いると22時間後に減少し、これは、NH3+蓄積の毒性によるものである可能性があった。NH4OHがより高い細胞増殖を示す理由は、NH4OH利用の結果として生じるNH3+の同化によるものである可能性があった。他方、3-HP生産性は、22時間後に同等に高く、かつ中和塩基としてのNaOH/KOHと一致していた。この結果は、初期段階での良好な増殖及びより高い生産性のために培養物をまずNH4OHで培養し、22時間後の持続的かつ一貫性のある生産性のために塩基をNaOHに変更する動機付けになった。実験をこの戦略で実施した。結果は、図52に示されている。2つの中和塩基を組み合わせることにより、より高い増殖及びより高い3-HP力価がもたらされた。この実験は、48時間で＞90g/Lの産生をもたらした。
【０３２９】
前述の通り、酸毒性を回避するための重要な因子は、非解離形態の酸の蓄積を回避することによるものであった。これは、1)pHを有機酸のpKa値から離れて増大させることによる(これは、先に言及した通りに調べられた)、2)酸蓄積の濃度を減少させることによる、2つの方法によって行うことができる。培養ブロス中の酸の蓄積を回避するために、最も好適なオプションは、産生中に酸をブロスから抽出することである。この方法は、経済的な快適さがないために、実際には実現不可能である。他のアプローチは、濃度を低下させることができるように培養ブロスを希釈することであり、この結果、非解離形態の有機酸が減少することになる。ヘンダーソン・ハッセルバルヒの式によれば、非解離形態の酸を、高いpHによるか、又は培養培地中の酸の濃度を減少させることによるかのいずれかで大幅に減少させることができる。非常に高いpHは細胞増殖に好適でないので、先の実験において、本発明者らは、pH条件を最適化した。ここでは、本試験において、本発明者らは、第二のアプローチを調べた。これらの実験を検討するために、本発明者らは、中和塩基の希釈に焦点を当てた。本発明者らの実験で調べた様々な中和塩基の中で、本発明者らは、水酸化アンモニウムが最高の結果をもたらしたことに注目している。それゆえ、3-HP濃度を低下させ、3-HP量を増大させる実験のために、水酸化アンモニウムを中和塩基として使用した。戦略は、希釈した中和塩基を使用することにより、培地中の3-HP濃度希釈することであった。先の実験では、＞100g/Lの濃度及び全体で280g(量)の3-HPを生じさせる15％水酸化アンモニウムを産生した。次の一連の実験では、10、7、及び3.5％のさらに希釈した濃度の水酸化アンモニウムを使用し、これにより、それぞれ、72、61、及び54g/Lの3-HP力価が得られた。しかしながら、産生された総量は、それぞれ、295、304、326gで同等であった。これらの結果は、培養ブロス中の酸濃度を減少させると、組換え細胞によって産生される酸の総量を増大させることにより、酸産生を増強することができることを示している。他方(On the hand)、水酸化アンモニウムを用いて、酸産生を中和したとき、アンモニアを含有する中和塩基を用いる利点は、NH3+が微生物によって窒素源として消費され得るということである。
【０３３０】
本発明者らの試験において、本発明者らは、より高い酸濃度で増殖する適応突然変異によって組換え株を開発している。特定の濃度の有機酸(今回のケースでは、3-HP)を補充することにより、3-HPを産生する組換え株を有機酸産生培地中で増殖させた。組換え株を30g/Lの3-HPが補充された培養培地中で増殖させたとき、この培養物は、有機酸を補充していない培養物と比較すると、より遅い増殖を示すことが認められた。しかしながら、組換え株は、30g/L未満が補充された培地中で細胞増殖又は比増殖速度の顕著な違いを示さなかった。それゆえ、30g/Lの3-HPは、組換え株の毒性濃度と考えられた。適応進化のために、組換え株を、比増殖速度が増大し、3-HPを補充していない培地中での培養物と一致するまで、30g/Lが補充された培地中で繰り返し培養した。ひとたび比増殖速度が培養物間で同等になったら、適応株を、より高濃度の3-HP(＞30g/L)が補充された新鮮な培地に移した。適切な比増殖速度が達成されるまで、この適応進化手順を数回繰り返した。興味深いことに、これらの組換え株は、3-HPの濃度(＞50g/L)が培養培地中で増加していくにつれて、適応し、より高い比増殖速度に達するのにより長い時間(繰り返し培養の回数)がかかることが注目された。これらの組換え細胞を最大80g/Lの3-HPまで適応させた(図36)。
【０３３１】
3-HP又はその塩産生のために開発された組換え株を、80g/Lの3-HPが補充された工業用培地中で増殖するように適応させた。しかしながら、これらの適応株で活性化された耐性機構を本発明者らが理解することが重要であった。この機構は、3-HP耐性体に極めて特異的であるのか、又はそれは、いくつかの有機酸耐性体に対するものであるのか。これを確認するために、50g/Lの濃度の他の有機酸、例えば、乳酸、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、2-ヒドロキシ酪酸、及び3-ヒドロキシ酪酸を補充することにより、適応株を工業用培地中で増殖させた。結果は、(図37)に示されている。興味深いことに、適応株は、本試験で検討された他の有機酸に対する特定のレベルの耐性を示すことが注目された。これらの結果から、酸毒性が、カチオンと比較したとき、どちらかと言えば、発生したプロトンによるものであることが確認される。適応微生物におけるこれらの有機酸耐性のオミックスを調べることによる特異的機構の同定が進行中である。
【０３３２】
前述の通り、いくつかの試験において、酸毒性は、非解離形態の酸の濃度の増加によるものであることが報告されている。ヘンダーソン・ハッセルバルヒの式(HH式)によれば、非解離形態の濃度は、より高濃度の酸の蓄積とともに増加する。しかしながら、ヘンダーソン・ハッセルバルヒの式によれば、非解離形態の酸は、pHがpKa値から離れて増加すると、大幅に減少する。酸耐性及び組換え株によるその産生に対するより高いpHの効果を調べた。適応進化実験から単離された組換え株を、図38に示されているような0.2 pHの間隔で6.8〜8.0 pHの範囲の様々なpHを有する培養培地中で増殖させた。結果は、pHの増加に伴う3-HP力価及び比産生速度の連続的な改善を示している。しかしながら、細胞増殖がpHの増加によって大幅に影響を受けることが認められた。組換え株は、pH 7.4よりも上で細胞増殖の低下を示した。それゆえ、酸適応実験から単離された(80g/Lの3-HPに適応した)組換え株をより高いpH値で維持された培養物中でさらに適応させた。これらの組換え株にとっての最適pHは7であり、それゆえ、これらの株を、比増殖がpH 7で増殖させた培養物と同等となるまで、より高いpHを有する培地中で繰り返し増殖させた。この手順を用いて、酸耐性株を、pH 7で増殖させた培養物と同じ比増殖速度で、pH 7.6で増殖するように適応させた。興味深いことに、組換え細胞の比増殖速度は、本発明者らが、細胞をpH 7.6を超えて適応させようとしたとき、いくつかの適応進化試験の試みの後でさえも改善しなかった(図38及び図39)。
【０３３３】
次の試験において、pH 7.6適応組換え株を、より高い3-HP力価及び量をもたらす目的で、バイオリアクター試験に供した。この適応株を増殖及び3-HP産生についてpH 7〜8で調べた。この適応株が、非適応株と比較したとき、より優れた性能を示すことが認められた。興味深いことに、7.4〜7.5で、適応組換え体は、非適応細胞と同等の増殖を示し、かつ大幅に改善された増殖、3-HP力価、グリセロールでの収率、及び廃グリセロールからの生産性を示した。結果は、図40に示されている。より高い標的産物産生のための最適pHの同定は、バイオプロセス最適化に関して重要である。最適pHは、酵素の最大活性を達成するために重要である。この場合、様々な異なる微生物由来の酵素を取り込むことにより、3-HP合成経路を有する組換え株を構築し、その酵素特徴解析により、各々の酵素が異なる最適生理特性を有することが示されている。それゆえ、廃グリセロールから最大の3-HP力価を生じさせるために、この株の最適pHを同定することが重要である。いくつかの実験を設計して、高力価の3-HPを産生する異種3-HP合成経路を有する組換え微生物の最適pHを同定した。
【０３３４】
3-HP産生用の組換え株を6.8〜7.8の範囲の様々なpHで増殖させることにより得られた結果は、図38に示されている。6.8のバイオリアクターは、良好な増殖を示したが、低い3-HP産生を示した;しかしながら、pHを増大させると、3-HP産生の改善が認められた。これらの組換え細胞は、pHが7.4〜7.5で維持されたとき、最大の産生を示した。pHのさらなる増大は、3-HP産生のかなりの減少を示した。他方、pHの増大は、細胞増殖を低下させた。細胞増殖は、pH 7.8でかなりの影響を受け、より低い3-HP産生をもたらした。細胞増殖及び3-HP産生を大きく損なわないさらなる試験のために、最適pH(pH 7.4)を選択した。最大の3-HP産生は、pH 7.4で認められた。
【０３３５】
(グリセロールからの3-HP産生に対する重炭酸塩の効果)
水酸化アンモニウムを中和塩基として用いる本発明者らの実験のうちの1つにおいて、本発明者らは、ピルビン酸からアセチル-CoA及びTCAへの炭素フローが3-HP産生組換え株で遮断されていることを示す相当な量のピルビン酸の蓄積に気付いている。ピルビン酸の蓄積は、顕著な量の酢酸産生をもたらした。ピルビン酸からアセチル-CoAへの触媒作用に関与する酵素が細胞質内のNADH濃度の増加によってアロステリックに抑制されることが十分に報告されている。本発明者らは、グリセロールから3-HPを産生するように開発されている組換え株の細胞質をNAD/NADHについて調べた。本発明者らは、3-HP産生株がその産生時にNADHの顕著な蓄積を示したことに気付いている。本発明者らは、3-HP産生時の組換え株の細胞質内の高いNADH濃度がピルビン酸からアセチル-CoAへの変換に関与する酵素(PDHc)をアロステリックに抑制し、ピルビン酸及び酢酸産生(Pox B酵素を介する)をもたらすという仮説を立てている。低いNAD/NADH比により、3-HPAから3-HPへの変換に関与するアルデヒドデヒドロゲナーゼの低い活性がもたらされ、これにより、宿主DNA及びタンパク質を損傷することが報告されている毒性アルデヒドである3-HPAの蓄積がもたらされるはずである。興味深いことに、本発明者らの実験結果は、3-HPAの蓄積を示さなかった。しかしながら、3-HP産生は、低いNAD+/NADH比の間、完全に妨げられた。これらの結果は、3-HP産生経路の第二の反応とともに、第一の酵素活性も低いNAD/NADH比のために大幅に減少したことを示している。
【０３３６】
本発明者らは、バイオリアクター試験の様々な段階における第一の酵素であるグリセロールデヒドラターゼの発現レベル及びインビトロ活性を解析した(図53)。本発明者らは、グリセロールデヒドラターゼ酵素の発現レベルをSDS PAGEで調べ、バイオリアクター全体にわたる酵素発現及びそのインビトロ活性に顕著な変化がないことを確認した。これらの解析は、酵素発現が影響を受けないことを示したが、本発明者らは、おそらく、細胞質内の生理的条件/環境がグリセロールデヒドラターゼ活性にとって好ましくないという仮説を立てた。綿密な解析により、いくつかの解糖経路中間体によるグリセロールデヒドラターゼ酵素のアロステリック抑制が存在することが明らかになった。インビトロのグリセロールデヒドラターゼ酵素活性を、反応混合物中の様々な濃度のいくつかの解糖経路中間体の存在下で測定した(図54)。これらの結果において、酵素活性反応混合物中のいくつかの解糖経路中間体の存在が顕著に低い濃度でも酵素活性を大幅に減少させることが認められた。図54に示されているように、ジヒドロキシアセトンリン酸及びグリセロールデハイド 3-リン酸などの中間体は、グリセロールデヒドラターゼ酵素活性に対する顕著なアロステリック抑制を及ぼした。これらの結果は、解糖経路中間体蓄積がグリセロールデヒドラターゼをアロステリックに抑制し得るので、グリセロールからの3-HPの連続産生のために、それが回避されるべきであることを示している。これを行う最良の方法は、TCAサイクルに向かう炭素フラックスを増強することである。
【０３３７】
以前、低いNAD/NADH比でもより高い活性を維持することができる突然変異体PDHc酵素の開発がTCAサイクルに向かう炭素フラックスを改善することができることを示すことに成功した。しかしながら、本試験において、本発明者らは、これらの突然変異体酵素の開発は骨が折れるので、異なるアプローチを取った。ここで、本発明者らは、炭酸塩を培地中で使用し、図47に示されているようなアナプレロティック経路酵素を活性化することにより、オキサロ酢酸への炭素フラックスを増強する。ここで、本発明者らは、アンモニウム形態又はナトリウム形態の炭酸塩を使用する計画を立てている。炭酸アンモニウム、炭酸ナトリウム、重炭酸アンモニウム、及び炭酸水素ナトリウムなどの、4つの異なる炭酸塩を使用した。これらの試験の目的は、高力価の有機酸、今回のケースでは、3-HPを産生することであり、それゆえ、本発明者らは、これらの塩基を、酸産生時の中和塩基として、また、中心代謝のアナプレロティック経路を増強するためにという、2つの重要な目的のために使用した。
【０３３８】
この実験で得られた結果は、図48及び図49に示されている。最初に、全ての重炭酸塩のただ1つの濃度を、これらの炭酸塩の溶解度に基づいて検討した。興味深いことに、本発明者らが仮定したように、本発明者らは、3-HP産生組換え株によるピルビン酸蓄積も酢酸産生も見なかった。本発明者らは、組換え株によって産生される3-HP量の大幅な改善にも気付いた。炭酸塩での結果と水酸化アンモニウムで以前に最適化された条件とを比較すると、3-HP量の大幅な改善が明らかであった。炭酸塩の使用は、100gを上回る5Lバイオリアクター中の3-HP量の増加をもたらした。しかしながら、3-HP量の増加により、より多くの塩基が消費され、過剰量のアンモニウム及び炭酸塩の添加により、より高濃度のこれらの元素がブロス中に生じた。より高濃度のアンモニウム及び/又は重炭酸塩/炭酸塩は、バイオリアクター試験の後期に、細胞溶解及び細胞死をもたらした。この限界を克服するために、本発明者らは、これらの中和塩基のいくつかの希釈を調べた。中和塩基の希釈は、培養ブロスの総容量を増大させることにより、結果的に濃度を減少させた。この希釈因子は、2つの重大な利点を有していた。1つは、これが、アンモニウム及び炭酸塩/重炭酸塩の濃度を減少させることにより、細胞溶解を回避することができたことであり、他方、容量増加は、培養ブロス中の有機酸蓄積の濃度も減少させ、それにより、その非解離形態の低下が生じ、先の節で記載されているような酸毒性を回避した。
【０３３９】
バイオプロセスをさらに最適化するために、適当な比で混合した2つの異なる塩基、例えば、重炭酸アンモニウム及び水酸化アンモニウム又は重炭酸アンモニウム及び炭酸水素ナトリウムのいずれか、並びに3-HP産生及び細胞生存に対するその効果をバイオリアクター条件で調べた。これは、高濃度でのアンモニウムイオン及び重炭酸塩の蓄積を回避するために、また、細胞溶解の一因となるイオンを同定するために行った。アンモニウムイオンが毒性を有し、細胞溶解をもたらした場合、アンモニウム蓄積は、ナトリウム形態の重炭酸塩と組み合わせることにより回避することができる。重炭酸塩が毒性を有する場合、それは、水酸化物形態との組合せで回避することができる。同様の試験を、炭酸水素ナトリウムと水酸化ナトリウムを適切な比で混合することによっても実施した。同様に、好適な濃度の炭酸水素ナトリウム及び重炭酸アンモニウム。最初に、様々な濃度を有するいくつかの組合せを解析し、標的有機酸産物の力価を改善し、かつバイオプロセス時の細胞溶解も回避する中和塩基の濃度の適切な混合物を同定した。検討後、中和塩基及びその希釈液のいくつかの異なる組合せにより、300g〜450gへの3-HP量の改善がもたらされ、5Lバイオリアクターでほぼ＞150gであった。これらの組合せにより、3-HP量が増大し、アンモニウム/炭酸水素ナトリウム/炭酸塩形態の中和塩基と関連する細胞溶解の問題が回避された(図52)。5Lの実験規模で得られた結果を50Lの規模にスケールアップすると、結果に再現性があった。このプロセス最適化により、グリセロールからの3-HPの産生費用が大幅に減少した。
【０３４０】
(通気)
通気は、細胞増殖及びその代謝のための重要な生理的パラメータの1つである。酸素は最も優れた電子受容体であるので、微生物は、酸素を用いて細胞の酸化還元状態を維持するように進化し、また、酸素は、電子伝達鎖を介してATPを産生するために使用される。グリセロールからの3-HP(又はその塩)産生は、酸素感受性グリセロールデヒドラターゼ酵素(DhaB)を用いて広く研究されている。この酵素は、嫌気的/微好気的条件下でのグリセロール代謝及び1,3-プロパンジオール(1,3-PDO)産生時に、グリセロールから3-ヒドロキシプロパンアルデヒド(propanealdehyde)(3-HPA)への触媒作用を及ぼし、これは、いくつかのエンテロバクター属で天然に見出される。本発明者らの試験において、本発明者らは、肺炎桿菌由来の同様の酸素感受性酵素を使用した。DhaBの活性はより大量の酸素の存在下で大幅に減少することが十分に報告されている。他方、前述の通り、酸素は細胞増殖にとって最も重要であるので、いくつかの微生物は、酸素を最終的な電子受容体として使用し、細胞の酸化還元バランスを助けるように進化してきた。3-HP産生用に開発された組換え株は、酸素を効率的に用いて、NAD+を再生し、酸化還元バランスを維持することも知られている。組換え細胞におけるグリセロールからの3-HP産生経路は、電子をNAD+に伝達することにより3-HPAを3-HPに酸化し、NADHを産生するアルデヒドデヒドロゲナーゼを含む。これらのNADHは、グリセロールからの3-HPの連続産生のために、NAD+に再生されるべきである。周知の通り、グリセロールからの3-HP合成経路に関与する2つの酵素は、1つが酸素感受性であるが、第二の酵素は、その連続的な活性に酸素を必要とする(図41)。それゆえ、通気の最適化は、グリセロールからの3-HP産生にとって極めて重要であり、慎重に検討されるべきである。電子伝達系を介してNAD+を再生するのに十分であるが、グリセロール/ジオールデヒドラターゼの活性に影響を及ぼすほどではない酸素が培地中に溶解していなければならない。バイオリアクター中の通気は、物質移動を決定する撹拌及び気流によって制御されることができ;それゆえ、本試験において、本発明者らは、気流及び撹拌rpmを綿密に制御することにより、通気を検討した。
【０３４１】
組換え株を様々な撹拌速度及び気流下で培養した(結果は示さない)。最初に、気流を0.5又は1vvmのいずれかで固定し、撹拌速度を50rpm毎に増大させて400から800まで変化させた。結果は、より低い通気条件が低い3-HP産生を示し、これが、ALDH触媒活性の減少をもたらし、かつ細胞増殖に対する毒性アルデヒドである3-HPAを蓄積させる、NAD+の不適切な再生によるものであり得ることを示した。しかしながら、3-HPA(3-HP経路中間体)の蓄積は、不適切なピークのために、HPLCで正確に測定することができなかった。それゆえ、撹拌及び気流変動ではなく、溶存酸素(DO)を維持するように戦略を変更した。最初に、DOを40％で維持したが、3-HP産生は、このパーセンテージではあまり有望なものではなかった。それゆえ、1％〜40％の様々なDOレベルを調べた。結果は、図42に示されている。DOを1％で維持したとき、組換え株は、48時間で、40g/Lに近い3-HPを産生した。細胞増殖は、満足の行くものではなかった。顕著な量の3-HPA蓄積が認められた。撹拌速度を450rpmに上昇させることによる通気(溶存酸素％)のわずかな改善は、グリセロールからの3-HP産生の改善を示した。さらなるrpmの追加増分は、より高い3-HP産生を示した。最大産生は、DOを5〜6％で維持したときに認められたが、3-HP産生は、力価の顕著な変化を伴うことなく、10％DOまで維持された。他方、10％を超えるさらなるDOの増加は、3-HP産生の減少を示し、〜5〜10％DOがこれらのバイオリアクター条件下でのより高い3-HP産生に至適であることを示した。＞10％のより高いDOは、10％のDOと比較して、わずかに低い3-HP産生を示し、これは、より高濃度で酸素感受性となるDhaB活性の減少によるものである可能性があった。最大産生は、600rpmで認められたが、600rpmを超えるさらなるrpmの改善は、3-HP産生の減少を示し、700rpmがこれらのバイオリアクター条件下でのより高い3-HP産生のための最適rpmであることを示した。より高い800のrpmは、700rpm及び1vvmと比較して、わずかに低い3-HP産生を示し、これは、より高濃度で酸素感受性となるDhaB活性の減少によるものである可能性があった
【０３４２】
(温度)
温度は、最適な細胞増殖及び細胞代謝のための他の重要な生理的パラメータの1つであり、これは、組換え微生物による標的産物の産生に大きな影響を及ぼす。より高い標的産物産生のための最適温度を同定することは、バイオプロセス最適化において極めて重要である。他方、温度は、酵素の最適な触媒活性を決定する重要な生理的パラメータである。今回のケースで、3-HP合成経路を有する組換え株は、様々な異なる微生物由来の酵素を持ち込むことにより構築されたが、その酵素特徴解析により、各々の酵素が異なる最適な生理的特性を有することが示されている。それゆえ、この株が最高の3-HP力価を生じるための最適温度を同定することが重要である。これに関して、異種3-HP合成経路を有する組換え微生物が高力価の3-HPを生じるための最適温度を同定するために、いくつかの実験を設計した。
【０３４３】
28〜40℃の範囲の様々な温度で3-HP産生用の組換え株を増殖させることにより得られた結果は、図43に示されている。28℃のバイオリアクターは、緩慢な増殖、緩慢な細胞代謝、及び低い3-HP産生を示した;しかしながら、温度を上昇させたとき、細胞増殖及び3-HP産生の改善が認められた。これらの組換え細胞は、温度を33℃で維持したとき、最大の産生を示した。さらなる温度の上昇は、緩慢な細胞増殖及び3-HP産生の大幅な減少を示した。細胞増殖及び3-HP産生の大幅な減少は、40℃の培養物で認められた。しかしながら、3-HP合成経路に関与する酵素の特徴解析により、その活性の最適温度は、約37〜45℃であり、かつ親株の最適な細胞増殖は、30℃であることが示された。しかしながら、33℃は、最大の3-HP産生と同様、細胞増殖により好適であることが分かった。それゆえ、33℃の温度をさらなる実験のために検討した。
【０３４４】
(インキュベーション時間)
他方、文献研究により、組換え株が標的産物及びタンパク質を産生する能力は、特定の酵素の誘導の段階/時間に依存することが示されている。例えば、いくつかの産物は、経路の酵素が対数期初期に誘導されたときに高力価に達するが、いくつかは、増殖の後期(対数後期又は静止期)に誘導されたときにより高い産生を示す。これに関して、本発明者らは、3-HP産生のための合成経路を細胞増殖の様々な段階で誘導することにより、高力価への組換え株の3-HP産生能力を解析した。3-HP産生に対する様々な誘導時間の効果を、様々な細胞OD点、例えば、3、5、6、7、9、11、及び15 OD)でグリセロール(3-HPの供給源)を補充することにより調べた。これらの結果は、対数期中期での誘導が組換え株による最大の3-HP産生をもたらすことを示した。
【０３４５】
細胞増殖の様々な段階での標的産物の誘導は、その産生の大きな違いを示すことができる。それゆえ、本試験では、3-HP産生のための誘導時間を3〜15 ODと変化させた。これらの実験から得られた結果は、図44に示されている。これらの結果は、3〜9 ODで誘導された培養物がバイオリアクター試験の初期段階から良好な産生を示すことを示した。しかしながら、9 OD以降に誘導された培養物は、低い3-HP産生を示した。これら全ての条件の中で、〜6 ODで誘導された培養物が48時間で102g/Lの最大の3-HP産生を示した。興味深いことに、3〜9 ODで誘導された培養物は全て、2.5g/L/hの生産性を伴って、36時間で〜100g/Lを産生し、その後、その産生は大幅に減少した。代謝産物解析により、細胞がグルコン酸塩消費を減少させたことを示す36時間後の炭素源の蓄積も示され、これは、36時間後のNAD+の不適切な再生、したがって、低い3-HPをもたらすことにもなった。
【０３４６】
(組換え株による3-HP産生のための工業用培地の開発)
5Lの作業容量を有するNBSバイオリアクターを用いて、組換え株による細胞増殖及び3-HP産生に対する炭素源の効果を調べた。振盪フラスコ実験に基づいて、良好な細胞増殖及び3-HP産生を示すグルコン酸塩、グルタミン酸塩(グルタミン酸一ナトリウム、MSG)、及びクエン酸をバイオリアクター試験に供した。最初に、3つの異なる工業等級MSGをバイオリアクターで調べた。結果は、図2に示されている。工業等級MSGの違いにかかわらず、細胞増殖、グリセロール消費、及び3-HP産生に顕著な差はなかった。初めに、細胞を特定の光学密度(OD)まで増殖させておき、その後、培地に廃グリセロールを補充することにより、それを誘導して、3-HPを産生する。グリセロールの添加又は3-HP産生は、細胞増殖を停止させなかったが、ODが15時間で約5g cdw/Lに達した後、炭素源としてのMSGの違いにかかわらず、細胞増殖は、大幅に減少した。いくつかのMSGの中で、メッシュサイズが小さいMSGは、3-HP産生の改善を示したが、メッシュサイズがより大きい他のMSGは、廃グリセロールから同等に低い3-HPを産生した。
【０３４７】
(実施例29.高力価3-ヒドロキシプロピオン酸産生のための好適な炭素源の同定)
本試験は、組換え株が増殖し、かつ高力価まで標的酸産物を産生することを支援することができる好適な炭素源を同定することを意図した。炭素源は、細胞代謝、細胞増殖、及び同じく3-HP産生において重要な役割を果たす主な培地成分の1つである。この試験において、本発明者らは、組換え株がより高い細胞密度まで増殖し、また、高力価の3-HPを産生することを支援することができる炭素源を調べた。これに関して、本発明者らは、次のような4つの異なる炭素源;グルコース、グルタミン酸塩、グルコン酸塩、及びクエン酸を解析した。これらの炭素源は全て、組換え株の代謝経路に基づいて、及び入手可能性及び費用にも基づいて、注意深く選択した。
【０３４８】
組換え株を、前述のような様々な炭素源が補充された工業用培地を含有する振盪フラスコ中で培養した。実験を2回反復して実施して、再現性をチェックした。得られた結果は、図1に示されている。使用されたいくつかの炭素源中で、グルコン酸塩及びグルコースは、本試験で使用された他の炭素源と比較して、それぞれ、最大の増殖速度及び最低の増殖速度を示した。他方、直接TCAサイクルに入ることができる他の2つの炭素源であるグルタミン酸塩及びクエン酸は、同等の増殖パターンを示した。しかしながら、増殖速度は、グルコン酸塩と比較したとき、わずかに小さかった。同様に、グリセロールからの3-HP産生は、種々の炭素源で異なる産生速度を示した。産生は、グルコン酸塩で最も高く、グルコースで最も低かった。調べた全4つの炭素源の中で、グルコン酸塩は、より良好な増殖及び3-HP産生を示したが、増殖及び3-HP産生は、フラスコ実験で、12時間後に大幅に減少し、これは、pHの大幅な低下によるか又は炭素源の枯渇による可能性があったが、これは、本試験では測定されなかった。それゆえ、組換え株による廃グリセロールからの3-HP産生に対するグルコン酸塩の潜在能力を検討するために、この条件を、制御された条件下のバイオリアクターで調べた。他方、グルタミン酸塩及びクエン酸も、グルコン酸塩と同等の量の3-HPを産生する潜在能力を示し、それゆえ、別々の試験において、グルタミン酸塩及びクエン酸も、バイオリアクター条件下で、3-HP産生用の炭素源として調べた。
【０３４９】
(実施例29.高力価3-ヒドロキシプロピオン酸産生のための好適な炭素源としてのグルコン酸塩の同定)
次の一連の実験において、グルコン酸塩を炭素源として調べた。1つのバイオリアクターを用いて、細胞増殖及び3-HP産生に対するグルコン酸塩の効果を検討し、一方、他のバイオリアクターにおいて、12時間のバイオリアクター試験で炭素源を変化させることにより、グルコン酸塩を細胞増殖用に、MSGを3-HP産生用に使用した。MSGは、細菌における酸耐性機構の1つのためのよく知られている基質であるので、これを産生条件に使用した。他方、グルタミン酸塩代謝は、グリセロールからの3-HP産生を間接的に支援するNADH生成の低下をもたらした(図3)。同様に、さらなるバイオリアクター実験を、クエン酸を炭素源として実施し、1つのバイオリアクターでは細胞増殖及び3-HP産生用のクエン酸、一方、もう1つのバイオリアクターでは細胞増殖用のクエン酸及び3-HP産生用のMSGを組み合わせて使用した。クエン酸を初期細胞増殖期の炭素源として使用したとき、大きいpHの変動は認められず、バイオリアクター試験中にpHを制御するのは困難であった。しかしながら、バイオリアクター試験から6時間でのグリセロールの添加により、毒性3-ヒドロキシプロパンアルデヒド(propanealdehyde)(3-HPA)のかなりの蓄積が生じ、これにより、細胞死がもたらされ、3-HP産生は認められなかった。
【０３５０】
グルコン酸塩の使用は、良好な細胞増殖をもたらし、バイオマスは、6cdw l-1に達した。細胞を、3-HP産生のために、グリセロールを添加することにより誘導したとき、細胞増殖は、突然、大幅に減少し(図2a)、バイオリアクターの後期に、〜4.5cdw l-1にまで低下した。細胞増殖の減少は、低い3-HP産生をもたらした。グルコン酸塩を細胞増殖及び3-HP産生用の炭素源として用いて36時間で、商業化に有望であるまあまあ良好な3-HP産生が示された。36時間以後、産生は、次の12時間で減少した。48時間で、バイオリアクターを停止させ、本試験は、それぞれ、83g l-1、＞0.95molmol-1、及び1.72g l-1h-1の力価、収率、及び生産性を示した。他方、12バイオリアクター時間後に、炭素源をグルコン酸塩からグルタミン酸塩に変更したバイオリアクター試験は、3-HP産生の大幅な減少を示し、炭素源の変更がこれらの条件下では好適でないことを示した。本試験により、48時間で廃グリセロールから65g/Lの3-HPしか得られなかった(図2b)。
【０３５１】
これらの試験は、グルコン酸塩が細胞増殖用及び3-HP産生用の良好な炭素源の1つであることを示した。それゆえ、様々な源由来のいくつかの広範な工業等級グルコン酸塩を最適化された条件下で調べ、細胞増殖に大きく影響を及ぼさずに良好な3-HP産生を示すものをさらなる試験に使用した。
【０３５２】
(実施例30.好適な窒素源の同定)
窒素源は、炭素源とともに微生物を培養するために使用される培地中の他の重要な成分である。窒素含有培地成分は、細胞代謝及び3-HP産生において重要な役割を果たすので、炭素源とともに、極めて慎重に選択されるべきである。本試験において、本発明者らは、組換え株がより高い細胞密度まで増殖し、また、高力価の3-HPを産生するのを支援することができる好適な窒素源を同定し、検討した。これに関して、本発明者らは、窒素源としてのいくつかの異なるタイプのコーンスティープリカー及び酵母抽出物を解析した。この解析により、いくつかの窒素源の中で、中国製の酵母抽出物(SJB)は、廃グリセロールからより高い3-HP力価及び生産性をもたらすことにより、組換え株のより良好な性能を示すことが明らかになった。3Lの初期作業容量を有するNBSバイオリアクターを用いて、組換え株による細胞増殖及び3-HP産生に対する窒素源の効果を調べた。異なる源由来の様々な酵母抽出物(工業等級)を異なるバイオリアクター試験で使用した。先に、グルコン酸塩は、良好な3-HP力価及び細胞増殖を達成するためのまあまあ良い炭素源であることが確認されたので、グルコン酸塩を炭素源として用いて、グリセロールからの3-HP産生に対する様々なタイプの窒素源の効果を調べた。
【０３５３】
バイオリアクター試験は、様々な窒素源を用いた組換え株による細胞増殖及び3-HP産生に顕著な違いがあったことを示している。粉末とペーストの両方の形態のコーンスティープリカー(CSL)は、非常に低い3-HP産生を示した。CSLを窒素源として使用したとき、CSL中の非溶解粒子がOD測定に干渉するので、細胞増殖の測定は困難であった。結果は、図4aに示されている。他方、酵母抽出物を窒素源として用いた3-HP産生のタイムコースプロファイルに顕著な違いはなかった。しかしながら、バイオリアクターのパン酵母抽出物は、バイオリアクター試験の初期段階でわずかに良好な3-HP産生を示し、また、これは、細胞増殖をわずかに改善するのを助けた。
【０３５４】
好適な窒素源を同定した後、その濃度を変化させて、細胞増殖及びグリセロールからの3-HP産生に対する酵母抽出物濃度の効果を同定した。酵母抽出物を培養培地中＞1g/Lで使用したとき、組換え細胞は、廃グリセロールからかなりの量の3-HPを産生することが分かった。同様に、コーンスティープリカーを炭素源としてのグルコン酸塩又はグルタミン酸塩と組み合わせて＞1g/Lの濃度で使用したとき、これも、酵母抽出物条件と同様の3-HP産生をもたらした。
【０３５５】
(実施例31.脱細胞化ブロスから3-HPを抽出するための水不混和性溶媒の使用)
(一般的プロトコルA)
先の実施例に記載されているように調製された規定の力価の3-HPのナトリウム塩を含有する規定量のブロスに、規定の酸を、室温で、規定のpHに達するまで添加した。得られた反応混合物を、規定量の時間、規定の温度で、規定量の規定の水不混和性溶媒で連続抽出した。ある例において、抽出を、少なくとも1つの追加分の同じ溶媒を同じ条件で用いて繰り返した。そのような例において、抽出時間は、表13の「温度、抽出時間」の欄に以下のように示されている:初回抽出の時間/追加分の溶媒による抽出時間。得られた3-HPの純度を1H NMRにより決定した。
【０３５６】
3-HPの1H NMR:三重線は、OHに隣接するCH2基については、約3.75ppmで観測され、かつ約2.39ppmの三重線は、COOHに隣接するCH2基については、その辺りで観測される。長距離カップリングは、1H NMRでは観測されない。
【化１３】
2021502112.tif 000030
【０３５７】
表13には、酸、水性相のpH、水不混和性溶媒及びその量、温度、抽出時間、並びに一般的な抽出プロトコルAに従うことにより得られた3-HPの収率及び純度が記載されている。
表13
【表１１】
2021502112.tif 000031
【０３５８】
(一般的プロトコルB)
先の実施例に記載されているように調製された65g/Lの3-HPのナトリウム塩を含有する4.8Lのブロスに、規定の酸を、室温で、規定のpHに達するまで添加した。得られた反応混合物を、規定量の時間、規定の温度で、6.2Lのイソブタノーで連続抽出した。得られた3-HPの純度を1H NMRにより決定した。
【０３５９】
表14には、酸、水性相のpH、水不混和性溶媒、温度、抽出時間、及び一般的な抽出プロトコルBに従うことにより得られた3-HPの収率が記載されている。
表14
【表１２】
2021502112.tif 000032
【０３６０】
(実施例32.脱細胞化ブロスから3-HPを抽出するための水混和性溶媒及び水不混和性溶媒の使用)
(一般的プロトコルC)
水混和性溶媒と水不混和性溶媒の混合物を用いて、発酵ブロスから3-HPを抽出するための典型的なシステムは、図58及び図59に示されている。先の実施例に記載されているように調製された3-HPのナトリウム塩を含有する規定量のブロスに、pH 4.4のブロスが室温で達成されるまで、シュウ酸を添加した。該ブロス中のpHの減少を、pHメータを用いてモニタリングした。規定量の酢酸エチル(水不混和性溶媒)を溶媒フラスコに添加し、その後、規定量(システム中のブロスの量のv/v％として)の規定の水混和性溶媒を該溶媒フラスコに添加した。該溶媒フラスコを、水混和性溶媒の全てが蒸発するまで、加熱マントルを用いて、水混和性溶媒の沸点まで加熱し、該ブロスを含有するフラスコに移した。その後、該溶媒フラスコを、約48時間、酢酸エチルの沸点まで加熱し、その間に、3-HPを、酢酸エチルにより、該ブロスから連続抽出した。得られた3-HPの酢酸エチル溶液を真空中で濃縮すると、所望の粗3-HPが黄色の油状物として得られた。得られた3-HPの純度を1H NMRにより決定した。
【０３６１】
発酵ブロスから3-HPを抽出するための様々な条件、例えば、ブロスの量及び力価、水混和性(w-m)溶媒及びその量、一般的な抽出プロトコルCに従うことにより得られた3-HPの収率及び純度は、表15に示されている。
表15
【表１３】
2021502112.tif 000033
【０３６２】
図61は、酢酸エチル及びメタノールを水混和性溶媒として使用する(メタノールの量は、抽出に使用されたブロスの量の25v/v％である)、78℃で48時間の脱細胞化ブロスの抽出の全体を通じた、溶媒フラスコ中の酢酸エチル中の3-HPの濃度の増加を示している。図61に示されているデータは、表16にまとめられている。
表16
【表１４】
2021502112.tif 000034
【０３６３】
(実施例33.粗3-HPの精製)
【化１４】
2021502112.tif 000035
(工程1−3-HPナトリウム塩の形成)
粗3-HP(先の実施例に記載されているように調製されたもの)のIPA溶液に、NaOH(2NのMeOH溶液)を室温でpH＝7.0まで添加した。反応混合物を室温で2時間撹拌した後、該反応混合物を濾過し、IPAで洗浄した。粗3-HPナトリウム塩をEtOHに溶解させ(比:3-HPナトリウム塩:EtOH＝1:4又は1:6又は1:8)、濾過すると、純粋な所望の生成物3-HPナトリウム塩が、1H NMRにより決定したとき、99％純度の63％収率の白色の固体として得られた。
【０３６４】
(工程2−3-HPナトリウム塩からの純粋な3-HPの形成)
【化１５】
2021502112.tif 000036
3-HPナトリウム塩の溶液に、MeOH中の酸(酢酸、濃HCl、H2SO4、又はシュウ酸)を室温で添加した。室温で2時間撹拌した後、反応混合物を濾過し、MeOHで洗浄した。濾液を真空中で濃縮すると、所望の純粋な3-HPが定量的収率の黄色の油状物として得られた。
【０３６５】
(実施例34.触媒の存在下における粗3-HPの反応性蒸留)
【化１６】
2021502112.tif 000037
(一般的プロトコルD)
アクリル酸の反応性蒸留のための典型的なシステムは、図60に示されている。先の実施例で調製されたような規定量の粗3-HPを反応フラスコ中に入れ、その後、規定量の触媒(反応混合物中の粗3-HPの量に基づくwt.％)を入れた。ひとたびシステムが構築されると、真空をオンにし、74mbarに設定した(反応性蒸留プロセスの全体を通じて、圧力を70〜100mbarで維持した)。圧力を設定した場合、加熱マントルを用いて、反応混合物を80℃に加熱した。反応混合物の温度が50℃に達したとき、脱水反応が始まった。アクリル酸と水の混合物(反応生成物)が蒸発し、スチルヘッド及び回収フラスコに回収された。反応混合物の温度を、規定の温度に達するまで、20℃ずつ徐々に増加させ、それ以上の液体回収が観察されなくなるまで、プロセスを規定量の時間継続した。得られたアクリル酸の純度を1H NMRにより決定した。
【化１７】
2021502112.tif 000038
【０３６６】
粗3-HPからアクリル酸を製造するための様々な条件、例えば、粗3-HPの量、触媒及びその量、反応温度、反応時間、一般的な反応プロトコルDに従うことにより得られた3-HPの収率及び純度は、表17に示されている。
表17
【表１５】
2021502112.tif 000039
【０３６７】
(実施例35.ポリリン酸(PPA)によって触媒される3-HPの反応性蒸留)
【化１８】
2021502112.tif 000040
精製された化合物3-HP(10.00g、0.11mmol)に、PPA(1.00g、10wt.％)を室温で添加した。反応混合物を180℃で5時間加熱し、その間に、アクリル酸が形成され、反応混合物から蒸留すると、所望の生成物(4.90g、62％)が、1H NMRにより決定したとき、76％純度の62％収率の無色の油状物として得られた。
【０３６８】
(実施例36.フェノチアジンの存在下における3-HPの反応性蒸留)
【化１９】
2021502112.tif 000041
(一般的プロトコルE)
3-HPに、規定量のフェノチアジン(3-HPの量のwt.％)及び規定量のシュウ酸(3-HPの量のwt.％)を室温で添加した。反応混合物を180℃で5時間加熱し、その間に、アクリル酸が形成され、反応混合物から蒸留すると、所望の生成物が無色の油状物として得られた。
【０３６９】
粗3-HPからアクリル酸を製造するための様々な条件、例えば、フェノチアジン及びシュウ酸の量、並びに一般的な反応プロトコルEに従うことにより得られた3-HPの収率は、表18に示されている。
表18
【表１６】
2021502112.tif 000042
【０３７０】
(実施例37.ヒドロキノンの存在下における3-HPの反応性蒸留)
【化２０】
2021502112.tif 000043
精製された化合物3-HP(50g)に、ヒドロキノン(2wt.％)、クエン酸(10wt.％)、及びシュウ酸(20wt.％)を室温で添加した。反応混合物を180℃で5時間加熱し、その間に、アクリル酸が形成され、反応混合物から蒸留すると、所望の生成物が、1H NMRにより決定したとき、67％純度の75％収率の無色の油状物として得られた。
【０３７１】
(実施例38.精製された3-HPの反応性蒸留)
【化２１】
2021502112.tif 000044
精製された化合物3-HP(1.36kg)を180℃で8時間加熱し、その間に、アクリル酸が形成され、蒸留すると、所望の生成物が、1H NMRにより決定したとき、75％純度の56％収率の無色の油状物として得られた。
【０３７２】
(実施例39.活性炭及びシュウ酸で処理された3-HPの反応性蒸留)
【化２２】
2021502112.tif 000045
(一般的プロトコルF)
規定量の粗化合物3-HPをMeOHに溶解させ、その後、得られた溶液に、活性炭(3-HPの量の1wt.％)を添加した。該溶液をセライトのパッドに通して濾過し、濾液を真空中で濃縮した。得られた残渣に、規定量のシュウ酸を室温で添加し、反応混合物を、12時間かけて、135℃から180℃へと段階的に上昇する温度で加熱し、その間に、アクリル酸が形成され、蒸留すると、所望の生成物が無色の油状物として得られた。純度を1H NMRにより決定した。
【０３７３】
粗3-HPからアクリル酸を製造するための様々な条件、例えば、活性炭及びシュウ酸の量、並びに一般的な反応プロトコルFに従うことにより得られた3-HPの収率は、表19に示されている。
表19
【表１７】
2021502112.tif 000046
【０３７４】
(実施例40.蒸留による粗アクリル酸の精製)
粗アクリル酸(650.8g)を70〜80mbarの低圧及び80℃〜110℃の温度で蒸留すると、所望の生成物が無色の油状物(360.7g、55.4％)として得られた。
【０３７５】
(実施例41.ガスでパージすることによる粗アクリル酸の精製)
温かい空気を反応混合物に通して大気圧でバブリングするために、粗アクリル酸(2457g)を、注入管を備えた反応フラスコ中に入れた。空気を〜約60℃に加熱し、粗アクリル酸に通して、約12時間激しくバブリングさせた。この温かい空気により、アクリル酸がスチルヘッドに運ばれた。蒸発したアクリル酸をコンデンサ中で液体状態にまで凝縮させた。反応フラスコも加熱マントルを用いて60℃に加熱した。精製プロセスの後、回収したアクリル酸生成物(1969g、80.1％)は、NMRによると純粋であり、回収された生成物中のアクリル酸と水の比は、約80:20である(純粋なアクリル酸生成物が20wt.％の水を含有する)ことが示された。
【化２３】
2021502112.tif 000047
【０３７６】
(他の実施態様)
本開示は、その詳細な説明とともに記載されているが、前述の説明は、例示することを意図するものであって、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって規定されることが理解されるべきである。他の態様、利点、及び修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
【図１】
2021502112.tif 000048
【図２】
2021502112.tif 000049
【図３Ａ】
2021502112.tif 000050
【図３Ｂ】
2021502112.tif 000051
【図４】
2021502112.tif 000052
【図５Ａ−５Ｅ】
2021502112.tif 000053
【図６Ａ】
2021502112.tif 000054
【図６Ｂ】
2021502112.tif 000055
【図６Ｃ】
2021502112.tif 000056
【図７】
2021502112.tif 000057
【図８】
2021502112.tif 000058
【図９】
2021502112.tif 000059
【図１０】
2021502112.tif 000060
【図１１Ａ】
2021502112.tif 000061
【図１１Ｂ】
2021502112.tif 000062
【図１２Ａ−Ｂ】
2021502112.tif 000063
【図１２Ｃ−Ｄ】
2021502112.tif 000064
【図１３】
2021502112.tif 000065
【図１４】
2021502112.tif 000066
【図１５Ａ】
2021502112.tif 000067
【図１５Ｂ−Ｃ】
2021502112.tif 000068
【図１６】
2021502112.tif 000069
【図１７】
2021502112.tif 000070
【図１８】
2021502112.tif 000071
【図１９】
2021502112.tif 000072
【図２０】
2021502112.tif 000073
【図２１】
2021502112.tif 000074
【図２２】
2021502112.tif 000075
【図２３】
2021502112.tif 000076
【図２４】
2021502112.tif 000077
【図２５Ａ】
2021502112.tif 000078
【図２５Ｂ】
2021502112.tif 000079
【図２５Ｃ】
2021502112.tif 000080
【図２５Ｄ】
2021502112.tif 000081
【図２６】
2021502112.tif 000082
【図２７】
2021502112.tif 000083
【図２８】
2021502112.tif 000084
【図２９Ａ】
2021502112.tif 000085
【図２９Ｂ】
2021502112.tif 000086
【図３０】
2021502112.tif 000087
【図３１】
2021502112.tif 000088
【図３２】
2021502112.tif 000089
【図３３】
2021502112.tif 000090
【図３４】
2021502112.tif 000091
【図３５】
2021502112.tif 000092
【図３６】
2021502112.tif 000093
【図３７】
2021502112.tif 000094
【図３８】
2021502112.tif 000095
【図３９】
2021502112.tif 000096
【図４０】
2021502112.tif 000097
【図４１】
2021502112.tif 000098
【図４２】
2021502112.tif 000099
【図４３】
2021502112.tif 000100
【図４４】
2021502112.tif 000101
【図４５】
2021502112.tif 000102
【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
2021502112.tif 000111
【図５５】
2021502112.tif 000112
【図５６】
2021502112.tif 000113
【図５７】
2021502112.tif 000114
【図５８】
2021502112.tif 000115
【図５９】
2021502112.tif 000116
【図６０】
2021502112.tif 000117
【図６１】
2021502112.tif 000118
【手続補正書】
【提出日】令和2年7月27日(2020.7.27)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021502112000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月4日(2020.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
構成的又は小分子によって誘導可能である第一のプロモーター、構成的又は小分子によって又は誘導される第二のプロモーター、3-HP、3-HPの塩、又は補酵素B12の合成に関与するタンパク質をコードする第一の遺伝子、修飾されたUTR、及び天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質のN-末端由来の最大20個のアミノ酸をコードする天然の配列を含む発現システムであって、該天然の配列が、該修飾されたUTRの3'-末端に機能的に連結され、かつ該第一の遺伝子の5'-末端に機能的に連結されており、該第一のプロモーターと第二のプロモーターが該修飾されたUTRの上流でタンデムに機能的に連結され、かつ該修飾されたUTRが配列番号22〜28及び64(UTR 0〜6)からなる群から選択される配列を含む、前記発現システム。
【請求項２】
第三のプロモーター;及び前記第一の遺伝子の発現を調節するように設定された転写調節因子をコードする第二の遺伝子をさらに含み、ここで、該第三のプロモーターが該第二の遺伝子に機能的に連結され、該第三のプロモーターが配列番号7〜10及び52〜63からなる群から選択される配列と95％同一である配列を含む、請求項1記載の発現システム。
【請求項３】
前記第一のプロモーターが前記第二のプロモーターの5'-末端に機能的に連結されており、該第二のプロモーターが前記修飾されたUTRの5'-末端に機能的に連結されており、かつ該修飾されたUTRが前記融合遺伝子の5'-末端に機能的に連結されている、請求項1記載の発現システム。
【請求項４】
核酸であって、
第一及び第二のプロモーターを含み、ここで、該第一のプロモーターが誘導性プロモーターであり、かつ小分子によって誘導可能であり;該第一及び第二のプロモーターが第一の遺伝子に機能的に連結されており;かつ該第一の遺伝子が、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、3-HPの塩、又は補酵素B12の合成に関与するタンパク質をコードし;
配列番号22〜28及び64(UTR 0〜6)からなる群から選択される配列を含む、前記核酸。
【請求項５】
前記第一の遺伝子が3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)の合成に関与するタンパク質をコードし、かつグリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼリアクティバーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択され、
該グリセロールデヒドラターゼがdhaB1、dhaB2、dhaB3からなる群から選択され;
該グリセロールデヒドラターゼリアクティバーゼがgdrA及びgdrBからなる群から選択され;かつ
該アルデヒドデヒドロゲナーゼがkgsAからなる群から選択される請求項4記載の核酸。
【請求項６】
前記第一の遺伝子が、dhaB1遺伝子、dhaB2遺伝子、dhaB3遺伝子、gdrA遺伝子、及びgdrB遺伝子を含み、かつ前記配列が配列番号1、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、及び配列番号6からなる群から選択される配列と少なくとも95％同一である配列を含み、並びに/又は
前記小分子の酸又はアルコールが、L-乳酸(LAC)、酢酸(AcOH)、プロピオン酸(PA)、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、3-ヒドロキシブチレート(3-HB)、1,3-プロパンジオール(1,3-PDO)、2,3-ブタンジオール(2,3-BDO)、L-バリン(L-val)、及び3-ヒドロキシイソブチレート(3-HIB)からなる群から選択され、並びに/又は
前記第二のプロモーターが、PmmsAプロモーター、PhbdH-1プロモーター、PhbdH-4プロモーター、PhpdHプロモーター、又はPzwfプロモーターに由来し、かつ該プロモーターが配列番号7;配列番号8;配列番号9;配列番号10;配列番号11;配列番号12;配列番号13;配列番号14;配列番号15;配列番号16;配列番号17;配列番号18;配列番号19;配列番号52〜63;及び配列番号65〜72、からなる群から選択される配列と少なくとも95％同一である配列を含む、請求項4記載の核酸。
【請求項７】
前記核酸が前記第一の遺伝子の発現を調節する転写調節因子をコードする遺伝子をさらに含み、前記転写調節因子が前記第一又は第二のプロモーターに結合し、
任意に、前記転写調節因子がLysR型転写調節因子(LTTR)、MmsR調節因子又はHpdR調節因子である、請求項4記載の核酸。
【請求項８】
前記第一の遺伝子が、その5'-末端で、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする第二の遺伝子の5'末端に由来する最大20個(5個、10個、15個、又は20個)のアミノ酸をコードする配列に融合されており、それにより、融合遺伝子を生み出し、かつ前記第二のプロモーターが該第二の遺伝子の天然のプロモーターに由来し、かつ該融合遺伝子が、天然のタンパク質のN-末端の少なくとも5個、10個、15個、又は20個のアミノ酸をコードする配列を含み、並びに/又は
該第二のプロモーターが前記PmmsAプロモーターを含み、かつ前記融合遺伝子が天然のMmsA遺伝子のN-末端由来の5以上のアミノ酸をコードする配列を含み、かつ該融合遺伝子が該PmmsAプロモーターの3'末端に機能的に連結され、かつ前記核酸が配列番号32〜35からなる群から選択される配列を含み、
任意に、該融合遺伝子のmRNAが、該第一の遺伝子のみと比較したとき、高い安定性を有し、かつ遺伝子翻訳を増大させる、請求項4記載の核酸。
【請求項９】
第一及び第二のプロモーターを含む核酸であって、ここで、該第一のプロモーターが誘導性プロモーターであり、かつ小分子によって誘導可能であり;該第一及び第二のプロモーターが第一の遺伝子に機能的に連結されており;かつ該第一の遺伝子が、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、3-HPの塩、又は補酵素B12の合成に関与するタンパク質をコードし、
該第一の遺伝子の5'末端の第二の10個のコドンがシュードモナス・デニトリフィカンスにおける翻訳のために最適化され、
該最適化された第二の10個のコドン中の各々のアミノ酸のコドン頻度が0よりも大きい、前記核酸。
【請求項１０】
コドン最適化が:
天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする遺伝子における各々のアミノ酸のコドン頻度を測定すること;及び
該天然のタンパク質のコドン頻度を用いて、前記第一の遺伝子の5'-末端の前記第二の10個のコドンを最適化された10個のコドンと交換すること(ここで、該最適化された10個のコドンの各々のアミノ酸に対するコドンは、該天然のタンパク質のコドン頻度と同じ頻度で存在する)
を含み、
任意に前記核酸が、配列番号29、30、及び31(Opt1〜3)からなる群から選択される配列と95％同一である配列を含む、請求項9記載の核酸。
【請求項１１】
第一の溶媒を蒸発させること;
該蒸発した第一の溶媒を凝縮させること;及び
該第一の溶媒のフローの向きを変えて、3-HPを水溶液から除去すること;
を含み、
3-HPが向流液体フローを使用しないで、前記水溶液から除去される、方法。
【請求項１２】
前記第一の溶媒が約1g/mL未満の密度を有し、又は
該第一の溶媒が約1g/mL超の密度を有する、請求項11記載の方法。
【請求項１３】
前記第一の溶媒が水不混和性溶媒を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１４】
前記水溶液のpHが約3〜約7である、請求項11記載の方法。
【請求項１５】
前記第一の溶媒が、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルからなる群から選択される、少なくとも1つの溶媒を含み、かつ前記第一の溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含み、又は
該第一の溶媒が、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコール、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、メチルヘキシルエーテル、クロロホルム、塩化メチレン、及び四塩化炭素からなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１６】
第二の溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去することを含み、
任意に該第二の溶媒が水混和性溶媒を含む、請求項11記載の方法。
【請求項１７】
前記第一の溶媒が水不混和性溶媒を含み、
前記第二の溶媒が水混和性溶媒を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
前記第二の溶媒がC1-3アルコールを含み、
任意に該第二の溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、請求項16記載の方法。
【請求項１９】
前記第二の溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％であり、
任意に前記第二の溶媒の量が該水溶液の量の約20v/v％である、請求項16記載の方法。
【請求項２０】
1)前記第一及び第二の溶媒の組合せ容量と2)前記水溶液の容量との比が1:1〜約2:1である、請求項16記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２７０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２７０】
本発明者らは、誘導性プロモーターと構成的プロモーターを組み合わせたタンデムプロモーター発現カセットを設計した。kgsA遺伝子を制御するPmmsA及びPhbdH-4プロモーターを含有するタンデムプロモーター発現カセットをpUCPK'プラスミドにクローニングし、一方、MmsRアクチベーターを染色体中のその天然のプロモーターから産生した。図18Aは、タンデムプロモーター発現カセット、及び該プロモーターによって産生される2つのmRNA転写物を模式的に示している。2つのプロモーターをタンデムに組み合わせることにより、図18Aに示されているように、2種類のmRNA転写物が、一方はPmmsAプロモーターから、もう一方はPhbdH-4プロモーターから転写され、それにより、kgsA mRNA転写物の数が増加した。図18Bは、タンデムプロモーターシステムが、天然のPmmsAプロモーターのみと比較して、kgsAのmRNA発現レベルを1.75倍増大させたことを示している。図18Cは、タンデムプロモーターシステムの使用が、天然のPmmsAプロモーターのみの使用によって得られる酵素活性と比べて、3倍のKgsA酵素活性の増大をもたらしたことを示している。
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図２４】
2021502112.tif 000119
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月4日(2020.9.4)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３７６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３７６】
(他の実施態様)
本開示は、その詳細な説明とともに記載されているが、前述の説明は、例示することを意図するものであって、本開示の範囲を限定することを意図するものではなく、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲の範囲によって規定されることが理解されるべきである。他の態様、利点、及び修飾は、以下の特許請求の範囲の範囲内にある。
本件出願は、以下の態様の発明を提供する。
（態様１）
小分子によって誘導可能である第一のプロモーター、第二のプロモーター、3-HP、3-HPの塩、又はB12の合成に関与するタンパク質をコードする第一の遺伝子、修飾されたUTR、及び天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質のN-末端由来の最大20個のアミノ酸をコードする天然の配列を含む発現システムであって、該天然の配列が、該修飾されたUTRの3'-末端に機能的に連結され、かつ該第一の遺伝子の5'-末端に機能的に連結されており、かつ該第一のプロモーターと第二のプロモーターが該修飾されたUTRの上流でタンデムに機能的に連結されている、前記発現システム。
（態様２）
第三のプロモーター;及び前記第一の遺伝子の発現を調節するように設定された転写調節因子をコードする第二の遺伝子をさらに含み、ここで、該第三のプロモーターが該第二の遺伝子に機能的に連結されている、態様1記載の発現システム。
（態様３）
前記第二のプロモーターが前記小分子によって誘導可能である、態様1又は2記載の発現システム。
（態様４）
前記天然の配列が前記第一の遺伝子の5'-末端に機能的に連結されて、融合遺伝子を規定し、前記第二のプロモーターが前記天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質の天然のプロモーターであり、かつ該第二のプロモーターが該融合遺伝子の5'-末端に機能的に連結されている、態様1〜3のいずれか一項記載の発現システム。
（態様５）
前記第一のプロモーターが前記第二のプロモーターの5'-末端に機能的に連結されており、該第二のプロモーターが前記修飾されたUTRの5'-末端に機能的に連結されており、かつ該修飾されたUTRが前記融合遺伝子の5'-末端に機能的に連結されている、態様1〜4のいずれか一項記載の発現システム。
（態様６）
第一及び第二のプロモーターを含み、ここで、該第一のプロモーターが誘導性プロモーターであり、かつ小分子によって誘導可能であり;該第一及び第二のプロモーターが第一の遺伝子に機能的に連結されており;かつ該第一の遺伝子が、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、3-HPの塩、又は補酵素B12の合成に関与するタンパク質をコードする、核酸。
（態様７）
前記第一の遺伝子が3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)の合成に関与するタンパク質をコードし、かつグリセロールデヒドラターゼ、グリセロールデヒドラターゼリアクティバーゼ、及びアルデヒドデヒドロゲナーゼからなる群から選択される、態様6記載の核酸。
（態様８）
前記第一の遺伝子が、dhaB1、dhaB2、dhaB3、gdrA、gdrB、及びkgsAからなる群から選択される少なくとも1つの遺伝子を含む、態様6又は7記載の核酸。
（態様９）
前記第一の遺伝子が、dhaB1遺伝子、dhaB2遺伝子、dhaB3遺伝子、gdrA遺伝子、及びgdrB遺伝子を含む、態様6〜8のいずれか一項記載の核酸。
（態様１０）
前記第一の遺伝子がdhaB1であり、かつ該配列が配列番号1と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜8のいずれか一項記載の核酸。
（態様１１）
前記第一の遺伝子がdhaB2であり、かつ該配列が配列番号2と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜8のいずれか一項記載の核酸。
（態様１２）
前記第一の遺伝子がdhaB3であり、かつ該配列が配列番号3と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜8のいずれか一項記載の核酸。
（態様１３）
前記第一の遺伝子がgdrAであり、かつ該配列が配列番号4と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜8のいずれか一項記載の核酸。
（態様１４）
前記第一の遺伝子がgrdBであり、かつ該配列が配列番号5と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜8のいずれか一項記載の核酸。
（態様１５）
前記第一の遺伝子がアルデヒドデヒドロゲナーゼ遺伝子を含む、態様7記載の核酸。
（態様１６）
前記アルデヒドデヒドロゲナーゼがkgsAである、態様15記載の核酸。
（態様１７）
kgsAが配列番号6と少なくとも95％同一である配列を含む、態様16記載の核酸。
（態様１８）
前記小分子が酸又はアルコールである、態様6〜17のいずれか一項記載の核酸。
（態様１９）
前記小分子酸又はアルコールが、L-乳酸(LAC)、酢酸(AcOH)、プロピオン酸(PA)、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、3-ヒドロキシブチレート(3-HB)、1,3-プロパンジオール(1,3-PDO)、2,3-ブタンジオール(2,3-BDO)、L-バリン(L-val)、及び3-ヒドロキシイソブチレート(3-HIB)からなる群から選択される、態様18記載の核酸。
（態様２０）
前記小分子酸又はアルコールが、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)、3-ヒドロキシブチレート(3-HB)、L-バリン(L-val)、及び3-ヒドロキシイソブチレート(3-HIB)からなる群から選択される、態様19記載の核酸。
（態様２１）
前記小分子が3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)である、態様20記載の核酸。
（態様２２）
前記第二のプロモーターが前記第一のプロモーターの3'-末端に機能的に連結されており、かつ前記第一の遺伝子が該第二のプロモーターの機能的に下流にある、態様6〜21のいずれか一項記載の核酸。
（態様２３）
前記核酸が配列番号65と少なくとも85％同一である配列を含む、態様6〜22のいずれか一項記載の核酸。
（態様２４）
前記核酸が配列番号65を含む、態様6〜22のいずれか一項記載の核酸。
（態様２５）
前記第一のプロモーターが前記第二のプロモーターの3'-末端に機能的に連結されており、かつ前記第一の遺伝子が該第二のプロモーターの機能的に下流にある、態様6〜21のいずれか一項記載の核酸。
（態様２６）
前記第二のプロモーターが構成的プロモーターである、態様6〜25のいずれか一項記載の核酸。
（態様２７）
前記第二のプロモーターが第二の誘導性プロモーターである、態様6〜25のいずれか一項記載の核酸。
（態様２８）
前記第一のプロモーターと前記第二のプロモーターの間の遺伝子間スペースがターミネーター配列を含まない、態様6〜27のいずれか一項記載の核酸。
（態様２９）
前記第一のプロモーター及び前記第二のプロモーターが前記第一の遺伝子の発現を調節する、態様6〜28のいずれか一項記載の核酸。
（態様３０）
前記第一のプロモーターが、PmmsAプロモーター、PhbdH-1プロモーター、PhbdH-4プロモーター、又はPhpdHプロモーターに由来する、態様6〜28のいずれか一項記載の核酸。
（態様３１）
前記第一のプロモーターが配列番号14(PmmsAプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜28のいずれか一項記載の核酸。
（態様３２）
前記第一のプロモーターが配列番号13(PhbdH-1プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜28のいずれか一項記載の核酸。
（態様３３）
前記第一のプロモーターが配列番号11(PhbdH-4プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜28のいずれか一項記載の核酸。
（態様３４）
前記第一のプロモーターが配列番号12(PhpdHプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜28のいずれか一項記載の核酸。
（態様３５）
前記第一のプロモーターが、配列番号11;配列番号12;配列番号13;及び配列番号14からなる群から選択される配列を含む、態様30記載の核酸。
（態様３６）
前記第一のプロモーターがPmmsAプロモーターを含み、かつ前記核酸が該PmmsAプロモーターの5'-末端に機能的に連結されたオペレーター部位をさらに含む、態様6〜35のいずれか一項記載の核酸。
（態様３７）
配列番号15(PmmsA配列Δ2、図4)と95％同一である配列を含む、態様36記載の核酸。
（態様３８）
配列番号16(MmsAオペレーターのO1)と95％同一である配列及び配列番号17(MmsAオペレーターのO2)と95％同一である配列を含む、態様36記載の核酸。
（態様３９）
配列番号18(PmmsA及びオペレーター、図3)と95％同一である配列を含む、態様36記載の核酸。
（態様４０）
配列番号15、18、19(PmmsA2a)、20(PmmsA2b)、及び21(PmmsA2ab)からなる群から選択される配列を含む、態様36記載の核酸。
（態様４１）
前記第二のプロモーターが、PmmsAプロモーター、PhbdH-1プロモーター、PhbdH-4プロモーター、PhpdHプロモーター、又はPzwfプロモーターに由来する、態様6〜40のいずれか一項記載の核酸。
（態様４２）
前記第二のプロモーターが配列番号11(PhbdH-4プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜40のいずれか一項記載の核酸。
（態様４３）
前記第二のプロモーターが配列番号12(PhpdHプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜40のいずれか一項記載の核酸。
（態様４４）
前記第二のプロモーターが配列番号14(PmmsAプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜40のいずれか一項記載の核酸。
（態様４５）
前記第二のプロモーターが配列番号13(PhbdH-1プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜40のいずれか一項記載の核酸。
（態様４６）
前記第二のプロモーターが配列番号7(Pzwf)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜40のいずれか一項記載の核酸。
（態様４７）
前記第二のプロモーターが配列番号8(Pzwf-1)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜40のいずれか一項記載の核酸。
（態様４８）
前記第二のプロモーターが配列番号9(Pzwf-7)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜40のいずれか一項記載の核酸。
（態様４９）
前記第二のプロモーターが配列番号62(より短いPzwf-7)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜40のいずれか一項記載の核酸。
（態様５０）
前記第二のプロモーターが配列番号10(Pzwf-12)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜40のいずれか一項記載の核酸。
（態様５１）
前記第二のプロモーターが、配列番号7、8、9、10、11、12、13、14、52〜60、61、62、及び63(Pzwfプロモーター及び他のプロモーター)からなる群から選択される配列を含む、態様6〜40のいずれか一項記載の核酸。
（態様５２）
前記第一のプロモーターがPmmsAプロモーターを含み、かつ前記第二のプロモーターがPhbdH-4プロモーターを含む、態様6〜29のいずれか一項記載の核酸。
（態様５３）
前記第一のプロモーターが配列番号14(PmmsAプロモーター配列)と少なくとも95％同一である配列を含み、かつ前記第二のプロモーターが配列番号11(PhbdH-4プロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜29のいずれか一項記載の核酸。
（態様５４）
前記第一のプロモーターがPhbdH-1プロモーターを含み、かつ前記第二のプロモーターがPhpdHプロモーターを含む、態様6〜29のいずれか一項記載の核酸。
（態様５５）
前記第一のプロモーターが配列番号13(PhbdH-1プロモーター配列)と少なくとも95％同一である配列を含み、かつ前記第二のプロモーターが配列番号12(PhpdHプロモーター)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様6〜29のいずれか一項記載の核酸。
（態様５６）
前記第二のプロモーターがPhbdHプロモーターを含み、かつ前記核酸が該PhbdHプロモーターのN-末端に機能的に連結されたオペレーター部位をさらに含む、態様6〜29のいずれか一項記載の核酸。
（態様５７）
前記オペレーター部位が、配列番号:RBS-1、RBS-2、ABS-1、ABS-2、及びABS-3と少なくとも95％同一である1以上の配列を含む、態様56記載の核酸。
（態様５８）
前記オペレーター部位が配列番号:RBS-1部位及びABS-2と少なくとも95％同一である配列を含む、態様57記載の核酸。
（態様５９）
前記オペレーター部位が配列番号:RBS-1部位及びABS-2を含む、態様58記載の核酸。
（態様６０）
前記核酸が前記第一の遺伝子の発現を調節する転写調節因子をコードする遺伝子をさらに含む、態様6〜59のいずれか一項記載の核酸。
（態様６１）
前記転写調節因子が前記第一又は第二のプロモーターに結合する、態様60記載の核酸。
（態様６２）
前記転写調節因子がLysR型転写調節因子(LTTR)である、態様60又は61記載の核酸。
（態様６３）
前記転写調節因子がMmsR又はHpdRである、態様62記載の核酸。
（態様６４）
前記転写調節因子がMmsRである、態様63記載の核酸。
（態様６５）
前記転写調節因子が前記第一のプロモーターに結合する、態様61記載の核酸。
（態様６６）
前記転写調節因子がmmsRタンパク質に由来し、かつ前記第一のプロモーターがPmmsAプロモーターに由来する、態様65記載の核酸。
（態様６７）
前記転写調節因子がmmsRタンパク質を含み、かつ前記第一のプロモーターがPmmsAプロモーターを含む、態様65記載の核酸。
（態様６８）
オペレーター部位をさらに含み、ここで、前記MmsRタンパク質が該オペレーター部位に結合する、態様66記載の核酸。
（態様６９）
配列番号19(PmmsA2a)と少なくとも95％同一である配列を含む、態様68記載の核酸。
（態様７０）
配列番号19〜21(PmmsA2a、A2b、A2ab)からなる群から選択される配列を含む、態様68記載の核酸。
（態様７１）
前記転写調節因子が前記第二のプロモーターに結合する、態様60記載の核酸。
（態様７２）
前記第二のプロモーターが構成的プロモーターである、態様71記載の核酸。
（態様７３）
前記転写調節因子がHpdRタンパク質であり、かつ前記第二のプロモーターがhpdHプロモーターに由来する、態様71記載の核酸。
（態様７４）
前記第二のプロモーターが配列番号12のPhpdHの配列と少なくとも95％同一である配列を含む、態様73記載の核酸。
（態様７５）
前記転写調節因子が前記第一のプロモーターに結合し、かつ前記小分子の存在下で該第一のプロモーターに対する増強された結合を有する、態様60記載の核酸。
（態様７６）
前記転写調節因子が前記第二のプロモーターに結合し、かつ前記小分子の存在下で該第二のプロモーターに対する増強された結合を有する、態様60記載の核酸。
（態様７７）
前記転写調節因子が自己調節性である、態様60記載の核酸。
（態様７８）
前記第一の転写調節因子をコードする遺伝子に機能的に連結されている第三のプロモーターをさらに含む、態様60記載の核酸。
（態様７９）
前記第三のプロモーターが配列番号7〜10及び52〜63からなる群から選択される配列と95％同一である配列を含む、態様78記載の核酸。
（態様８０）
前記第二の構成的プロモーターが、配列番号9、10、57〜60、62、及び63からなる群から選択され;
前記転写調節因子がMmsRタンパク質を含み;かつ
前記第一のプロモーターがPmmsAを含む:
態様78記載の核酸。
（態様８１）
前記第二の構成的プロモーターが、配列番号9、10、57〜60、62、及び63からなる群から選択され;
前記転写調節因子がHpdRタンパク質を含み;かつ
前記第一のプロモーターがPhbdHを含む、
態様78記載の核酸。
（態様８２）
前記第三のプロモーターが配列番号10を含む、態様80又は81記載の核酸。
（態様８３）
前記第三のプロモーターが配列番号62を含む、態様80又は81記載の核酸。
（態様８４）
前記第一の遺伝子が該遺伝子の修飾された5'UTRを含む、態様6〜83のいずれか一項記載の核酸。
（態様８５）
前記第一の遺伝子が配列番号22〜28及び64(UTR 0〜6)からなる群から選択される配列を含む、態様84記載の核酸。
（態様８６）
前記5'UTRが配列番号28(UTR-6)を含む、態様85記載の核酸。
（態様８７）
前記第一の遺伝子がkgsAをコードする遺伝子を含み、かつ前記5'UTRが配列番号28(UTR-6)を含む、態様84記載の核酸。
（態様８８）
前記第一の遺伝子の5'末端の少なくとも10個のコドンがシュードモナス・デニトリフィカンスにおける翻訳のために最適化されている、態様6〜87のいずれか一項記載の核酸。
（態様８９）
前記第一の遺伝子の5'末端の最大10個のコドンがシュードモナス・デニトリフィカンスにおける翻訳のために最適化されている、態様6〜88のいずれか一項記載の核酸。
（態様９０）
コドン最適化が:
天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする遺伝子における各々のアミノ酸のコドン頻度を測定すること;
該天然のタンパク質のコドン頻度を用いて、前記第一の遺伝子の5'-末端の10個のコドンを最適化された10個のコドンと交換すること(ここで、該最適化された10個のコドンの各々のアミノ酸に対するコドンは、該天然のタンパク質のコドン頻度と同じ頻度で存在する)
を含む、態様88又は89記載の核酸。
（態様９１）
前記最適化された第二の10個のコドン中の各々のアミノ酸のコドン頻度が0よりも大きい、態様90記載の核酸。
（態様９２）
前記コドン頻度が前記天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする遺伝子の5'末端の10個のコドン中の各々のアミノ酸について測定される、態様90記載の核酸。
（態様９３）
前記核酸が、配列番号29、30、及び31(Opt1〜3)からなる群から選択される配列と95％同一である配列を含む、態様88記載の核酸。
（態様９４）
前記第一の遺伝子がkgsAをコードする遺伝子を含み、かつ配列番号29〜31からなる群から選択される配列を含む、態様6〜93のいずれか一項記載の核酸。
（態様９５）
前記第一の遺伝子が、その5'-末端で、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする第二の遺伝子の5'末端に由来する最大20個のアミノ酸をコードする配列に融合されており、それにより、融合遺伝子を生み出す、態様6〜93のいずれか一項記載の核酸。
（態様９６）
前記融合遺伝子のmRNAが前記第一の遺伝子のみのmRNAよりも高い安定性を有する、態様95記載の核酸。
（態様９７）
前記融合遺伝子が、前記第一の遺伝子のみと比較したとき、遺伝子翻訳を増大させる、態様95記載の核酸。
（態様９８）
前記融合遺伝子のmRNAが前記第一の遺伝子のみのmRNAよりもリボヌクレアーゼ分解に対して抵抗性が大きい、態様95記載の核酸。
（態様９９）
前記融合遺伝子が前記第一の遺伝子のみと比較して遺伝子翻訳を増大させる、態様95記載の核酸。
（態様１００）
前記第一の遺伝子が、その5'-末端で、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスタンパク質をコードする第二の遺伝子の5'末端に由来する最大20個(5個、10個、15個、又は20個)のアミノ酸をコードする配列に融合されており、それにより、融合遺伝子を生み出し、かつ前記第二のプロモーターが該第二の遺伝子の天然のプロモーターに由来する、態様6〜29のいずれか一項記載の核酸。
（態様１０１）
前記第二のプロモーターが前記PmmsAプロモーターに由来し、かつ前記融合遺伝子が、天然のMmsAタンパク質のN-末端の少なくとも5個、10個、15個、又は20個のアミノ酸をコードする配列を含む、態様100記載の核酸。
（態様１０２）
前記第二のプロモーターが前記PmmsAプロモーターを含み、かつ前記融合遺伝子が天然のMmsA遺伝子のN-末端由来の5以上のアミノ酸をコードする配列を含み、かつ該融合遺伝子が該PmmsAプロモーターの3'末端に機能的に連結されている、態様6〜29のいずれか一項記載の核酸。
（態様１０３）
前記核酸が配列番号32〜35からなる群から選択される配列を含む、態様102記載の核酸。
（態様１０４）
前記第一の遺伝子が、その5'-末端で、天然のシュードモナス・デニトリフィカンスMmsAタンパク質のN-末端をコードする配列に由来する最大20個(5個、10個、15個、又は20個)のアミノ酸をコードする配列に融合されている、態様6〜29のいずれか一項記載の核酸。
（態様１０５）
配列番号32〜35(Pcm-mmsA(5)(10)(15)(20))からなる群から配列を含む、態様104記載の核酸。
（態様１０６）
前記第一の遺伝子がビタミンB12の合成に関与するタンパク質をコードする、態様6〜29のいずれか一項記載の核酸。
（態様１０７）
前記第一の遺伝子が、cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM、及びcobVからなる群から選択される遺伝子を含む、態様106記載の核酸。
（態様１０８）
前記第一の遺伝子がbgpMを含む、態様107記載の核酸。
（態様１０９）
前記第一の遺伝子が、P.デニトリフカンス;緑膿菌; P.エントモフィラ; P.プチダ; P.シリンガエ; P.フルオレセンス; P.メンドシナ;及びP.スタッツェリからなる群から選択されるシュードモナス属種に由来する、態様106記載の核酸。
（態様１１０）
補酵素B12の合成に関与するタンパク質をコードする第一の遺伝子に機能的に連結された第一のプロモーターを含む核酸。
（態様１１１）
前記第一のプロモーターが構成的プロモーターである、態様110記載の核酸。
（態様１１２）
前記核酸が配列番号7〜10及び52〜63から選択される配列を含む、態様110又は111記載の核酸。
（態様１１３）
前記第一の遺伝子が、cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM、及びcobVからなる群から選択される1以上の遺伝子を含む、態様110又は111記載の核酸。
（態様１１４）
前記第一の遺伝子が、P.デニトリフカンス;緑膿菌; P.エントモフィラ; P.プチダ; P.シリンガエ; P.フルオレセンス; P.メンドシナ;及びP.スタッツェリからなる群から選択されるシュードモナス属種由来のものである、態様110又は111記載の核酸。
（態様１１５）
前記第一のプロモーターに機能的に連結された第二のプロモーターをさらに含む、態様110〜114のいずれか一項記載の核酸。
（態様１１６）
前記第一及び前記第二のプロモーターが前記第一の遺伝子の発現を調節する、態様115記載の核酸。
（態様１１７）
前記第一のプロモーターが前記第一の遺伝子の天然のプロモーターではない、態様110〜116のいずれか一項記載の核酸。
（態様１１８）
cobG遺伝子、Peddプロモーター、PsucAプロモーター、及びcobL遺伝子を含み;ここで、該Peddプロモーターが該cobG遺伝子及び該PsucAプロモーターに機能的に連結されており、かつ該PsucAプロモーターが該cobL遺伝子に機能的に連結されている、核酸。
（態様１１９）
前記Peddプロモーターが配列番号36の配列を含み;かつ前記PsucAプロモーターが配列番号37の配列を含む、態様118記載の核酸。
（態様１２０）
配列番号38の配列を含む、態様118記載の核酸。
（態様１２１）
cobG遺伝子、Psp9プロモーター、Pzwfプロモーター、及びcobL遺伝子を含み;ここで、該Psp9プロモーターが該cobG遺伝子及び該Pzwfプロモーターに機能的に連結されており、かつ該Pzwfプロモーターが該cobL遺伝子に機能的に連結されている、核酸。
（態様１２２）
前記Psp9プロモーターが配列番号39を含み;かつ前記Pzwfプロモーターが配列番号40を含む、態様121記載の核酸。
（態様１２３）
配列番号41を含む、態様121記載の核酸。
（態様１２４）
cobW遺伝子、Pzwfプロモーター、Psp9プロモーター、及びcbtB遺伝子を含み、ここで、該Pzwfプロモーターが該cobW遺伝子及び該Psp9プロモーターに機能的に連結されており、かつ該Psp9プロモーターが該cbtB遺伝子に機能的に連結されている、核酸。
（態様１２５）
前記Pzwfプロモーターが配列番号42を含み;かつ前記Psp9プロモーターが配列番号43を含む、態様124記載の核酸。
（態様１２６）
配列番号44を含む、態様124記載の核酸。
（態様１２７）
cobW遺伝子、Ptktプロモーター、Psp2プロモーター、及びcbtB遺伝子を含み、ここで、該Ptktプロモーターが該cobW遺伝子及び該Psp2プロモーターに機能的に連結されており、かつ該Psp2プロモーターが該cbtB遺伝子に機能的に連結されている、核酸。
（態様１２８）
前記Ptktプロモーターが配列番号45を含み;かつ前記Psp2プロモーターが配列番号46を含む、態様127記載の核酸。
（態様１２９）
配列番号47を含む、態様127記載の核酸。
（態様１３０）
tonB遺伝子(例えば、butB遺伝子)に機能的に連結されたPzwfプロモーターを含む核酸。
（態様１３１）
前記Pzwfプロモーターが配列番号48を含む、態様130記載の核酸。
（態様１３２）
配列番号49を含む、態様130記載の核酸。
（態様１３３）
tonB遺伝子(例えば、butB遺伝子)に機能的に連結されたPsp9プロモーターを含む核酸。
（態様１３４）
前記Psp9プロモーターが配列番号50を含む、態様133記載の核酸。
（態様１３５）
配列番号51を含む、態様133記載の核酸。
（態様１３６）
前記核酸がシュードモナス・デニトリフィカンスに由来する1以上の配列を含む、態様1〜135のいずれか一項記載の核酸。
（態様１３７）
前記第一又は前記第二のプロモーターがシュードモナス・デニトリフィカンスに由来する、態様136記載の核酸。
（態様１３８）
前記核酸が、エンテロバクター属、ラクトバチルス属、シュードモナス属、又はアゾスピリルム属細菌に由来する1以上の配列を含む、態様1〜137のいずれか一項記載の核酸。
（態様１３９）
前記第一の遺伝子が、エンテロバクター属、ラクトバチルス属、シュードモナス属、又はアゾスピリルム属細菌に由来する、態様138記載の核酸。
（態様１４０）
配列番号66(DhaB発現モジュール)と少なくとも85％同一である配列を含むDhaB発現モジュールを含む核酸。
（態様１４１）
前記配列が配列番号66と少なくとも90％同一である、態様140記載の核酸。
（態様１４２）
前記配列が配列番号66を含む、態様140記載の核酸。
（態様１４３）
配列番号67(kgsA発現モジュール)と少なくとも85％同一である配列を含むDhaB発現モジュールを含む核酸。
（態様１４４）
前記配列が配列番号67と少なくとも90％同一である、態様143記載の核酸。
（態様１４５）
前記配列が配列番号67を含む、態様143記載の核酸。
（態様１４６）
配列番号68を含むgdrA遺伝子のUTR及び配列番号69を含むgdrB遺伝子のUTRを含むDhaB発現モジュールを含む核酸。
（態様１４７）
前記核酸が配列番号70〜72からなる群から選択される配列と少なくとも85％同一である配列を含む、態様6〜29のいずれか一項記載の核酸。
（態様１４８）
前記核酸が配列番号70〜72からなる群から選択される配列を含む、態様6〜29のいずれか一項記載の核酸。
（態様１４９）
配列番号73及び74からなる群から選択される配列と少なくとも85％同一である配列を含む補酵素B12センサーを含む核酸。
（態様１５０）
配列番号73及び74からなる群から選択される配列を含む、態様149記載の核酸。
（態様１５１）
補酵素B12の合成に関与する第一の遺伝子、小分子によって誘導される第一のプロモーター、及び第二のプロモーターを含む補酵素B12発現モジュールを含み、ここで、該第一及び第二のプロモーターが、該第一の遺伝子の発現を調節するように、該第一の遺伝子の上流にタンデムに機能的に連結されている、核酸。
（態様１５２）
補酵素B12の合成に関与する第二の遺伝子、小分子によって誘導される第三のプロモーター、及び第四のプロモーターをさらに含み、ここで、該第三及び第四のプロモーターが、該第二の遺伝子の発現を調節するように、該第二の遺伝子の上流にタンデムに機能的に連結されている、態様151記載の核酸。
（態様１５３）
補酵素B12の合成に関与する第三の遺伝子、小分子によって誘導される第五のプロモーター、及び第六のプロモーターをさらに含み、ここで、該第五及び第六のプロモーターが、該第三の遺伝子の発現を調節するように、該第三の遺伝子の上流にタンデムに機能的に連結されている、態様152記載の核酸。
（態様１５４）
補酵素B12の合成に関与する第四の遺伝子、小分子によって誘導される第七のプロモーター、及び第八のプロモーターをさらに含み、ここで、該第七及び第八のプロモーターが、該第四の遺伝子の発現を調節するように、該第四の遺伝子の上流にタンデムに機能的に連結されている、態様153記載の核酸。
（態様１５５）
前記第一、第二、第三、及び第四の遺伝子が、各々、cobJ、cobI、cobH、cobG、cobL、cobF、cobK、gst、xre、chlD、chlI、dahp、cobN、cobW、cbtBA、cobE、cobM、btuB、cobO、cob、cobR、cobD、cobC、cobQ、cobU、cobP、bgpM、及びcobVからなる群から選択される1以上の遺伝子を含む、態様151〜154のいずれか一項記載の核酸。
（態様１５６）
前記第一の遺伝子がbgpMを含む、態様155記載の核酸。
（態様１５７）
前記核酸が補酵素B12の産生に関与する遺伝子を調節する任意の天然のリボスイッチを含まない、態様151記載の核酸。
（態様１５８）
前記核酸が配列番号75又は76を含まない、態様151記載の核酸。
（態様１５９）
態様1〜158のいずれか一項記載の核酸を含む組換え細菌。
（態様１６０）
前記細菌がシュードモナス属種である、態様159記載の組換え細菌。
（態様１６１）
前記細菌がシュードモナス・デニトリフィカンスである、態様160記載の組換え細菌。
（態様１６２）
前記核酸が発現プラスミド上にある、態様159記載の組換え細菌。
（態様１６３）
前記核酸が前記細菌の染色体に組み込まれている、態様159記載の組換え細菌。
（態様１６４）
前記核酸がエピソーム上にある、態様159記載の組換え細菌。
（態様１６５）
DhaB発現モジュールを含む第一の核酸及びALDH発現モジュールを含む第二の核酸を含む組換え細菌。
（態様１６６）
前記DhaB発現モジュールが態様1〜14及び18〜142のいずれか一項記載の核酸を含む、態様165記載の組換え細菌。
（態様１６７）
前記ALDH発現モジュールが態様1〜8及び15〜142のいずれか一項記載の核酸を含む、態様165記載の組換え細菌。
（態様１６８）
前記第一及び前記第二の核酸が発現プラスミド上にある、態様165記載の組換え細菌。
（態様１６９）
前記第一及び前記第二の核酸がエピソーム上にある、態様165記載の組換え細菌。
（態様１７０）
前記第一及び前記第二の核酸が前記細菌の染色体に組み込まれている、態様165記載の組換え細菌。
（態様１７１）
前記第一の核酸が前記細菌の染色体に組み込まれており、かつ該第二の核酸が発現プラスミド上にある、態様165記載の組換え細菌。
（態様１７２）
前記第一の核酸が発現プラスミド上にあり、かつ前記第二の核酸が前記細菌の染色体に組み込まれている、態様165記載の組換え細菌。
（態様１７３）
前記第一の核酸が前記細菌の染色体に組み込まれており、かつ前記第二の核酸がエピソーム上にある、態様165記載の組換え細菌。
（態様１７４）
前記第一の核酸がエピソーム上にあり、かつ前記第二の核酸が前記細菌の染色体に組み込まれている、態様165記載の組換え細菌。
（態様１７５）
前記第一の核酸が第一の位置で前記細菌の染色体に組み込まれており、かつ前記第二の核酸が第二の位置で該細菌の染色体に組み込まれており;かつ該第一及び該第二の位置が互いの2500キロ塩基対以内にある、態様170記載の組換え細菌。
（態様１７６）
前記第一及び第二の位置が互いの100キロ塩基対以内にある、態様175記載の組換え細菌。
（態様１７７）
前記第一及び第二の位置が互いの50キロ塩基対以内にある、態様175記載の組換え細菌。
（態様１７８）
前記第一及び第二の位置が互いの1000塩基対以内にある、態様175記載の組換え細菌。
（態様１７９）
前記第一の核酸が、複製起点の4000塩基対以内にある第一の位置で、前記細菌の染色体に組み込まれている、態様170記載の組換え細菌。
（態様１８０）
前記第一の位置が前記複製起点の1000塩基対以内にある、態様179記載の組換え細菌。
（態様１８１）
補酵素B12の合成に関与する第一の遺伝子、小分子によって誘導される第一のプロモーター、及び第二のプロモーターを含む補酵素B12発現モジュールを含み、ここで、前記第一及び第二のプロモーターが該第一の遺伝子の上流にタンデムに機能的に連結されている、組換え細菌。
（態様１８２）
前記細菌がシュードモナス・デニトリフィカンス細菌である、態様181記載の組換え細菌。
（態様１８３）
前記細菌が前記第一の遺伝子の発現を調節する第一のリボスイッチの第一の位置における欠失を含み、かつ前記第一及び第二のプロモーターが、該第一の遺伝子の発現を調節するように、該第一の位置で該細菌の染色体に組み込まれている、態様182記載の組換え細菌。
（態様１８４）
前記細菌が、補酵素B12の合成に関与する第二の遺伝子の発現を調節する第二のリボスイッチの第二の位置における第二の欠失、補酵素B12の合成に関与する第三の遺伝子の発現を調節する第三のリボスイッチの第三の位置における第三の欠失、及び補酵素B12の合成に関与する第四の遺伝子の発現を調節する第四のリボスイッチの第四の位置における第四の欠失をさらに含む、態様183記載の組換え細菌。
（態様１８５）
前記第二の遺伝子の発現を調節するように、タンデムに機能的に連結され、かつ前記第二の位置で前記染色体に組み込まれている、第三のプロモーター及び第四のプロモーター;前記第三の遺伝子の発現を調節するように、タンデムに機能的に連結され、かつ前記第三の位置で該染色体に組み込まれている、第五のプロモーター及び第六のプロモーター;並び前記第四の遺伝子の発現を調節するにように、タンデムに機能的に連結され、かつ前記第四の位置で該染色体に組み込まれている、第七及び第八のプロモーターをさらに含む、態様184記載の組換え細菌。
（態様１８６）
前記細菌が天然のシュードモナス・デニトリフィカンスよりも多くの補酵素B12を産生する、態様181記載の組換え細菌。
（態様１８７）
補酵素B12発現モジュールをさらに含む、態様165記載の組換え細菌。
（態様１８８）
3-HP又はその塩を産生する方法であって、態様159〜187のいずれか一項記載の組換え細菌を3-HP又はその塩を産生するのに十分な条件下で培養することを含む、前記方法。
（態様１８９）
前記条件が少なくとも85g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である、態様188記載の方法。
（態様１９０）
前記条件が少なくとも90g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である、態様189記載の方法。
（態様１９１）
前記条件が少なくとも95g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である、態様189記載の方法。
（態様１９２）
前記条件が少なくとも100g/Lの3-HP又はその塩を産生するのに十分である、態様189記載の方法。
（態様１９３）
前記細菌を培養することが外部補酵素B12の添加を含まない、態様188記載の方法。
（態様１９４）
前記細菌を培養することが前記培養物への外部補酵素B12の添加を含む、態様188記載の方法。
（態様１９５）
培養することが、前記細菌を、グリセロール、グルコース、グルコン酸塩、グルタミン酸塩、及びクエン酸からなる群から選択される炭素源を含む培地中で増殖させることを含む、態様188記載の方法。
（態様１９６）
培養することが、グリセロールを添加することにより、前記細菌を誘導して、3-HPを産生することを含む、態様188記載の方法。
（態様１９７）
前記グリセロールが対数期中期に添加される、態様196記載の方法。
（態様１９８）
培養することが、前記細菌を、酵母抽出物、コーンスティープリカー粉末、及びコーンスティープリカーペーストからなる群から選択される窒素源を含む培地中で増殖させることを含む、態様188記載の方法。
（態様１９９）
培養することが、前記細菌を6.8〜7.8のpHで増殖させることを含む、態様188記載の方法。
（態様２００）
培養することが、NaOH、KOH、NaHCO3、NH4HCO3、NH4OH、(NH4)2CO3、及びNa2CO3からなる群から選択される1以上の塩基を添加することを含む、態様199記載の方法。
（態様２０１）
培養することが、NaOH、KOH、NaHCO3、NH4HCO3、NH4OH、(NH4)2CO3、及びNa2CO3からなる群から選択される少なくとも1つの塩基を添加することを含む、態様199記載の方法。
（態様２０２）
培養することが、塩基濃度を希釈すること及び酸濃度を増加させることを含む、態様188記載の方法。
（態様２０３）
培養することが、前記細菌を摂氏28〜40度の温度で増殖させることを含む、態様188記載の方法。
（態様２０４）
培養することが、前記細菌を摂氏33度の温度で増殖させることを含む、態様203記載の方法。
（態様２０５）
3-HP又はその塩を産生する方法であって:
態様159〜187のいずれか一項記載の組換え細菌を該細菌の増殖及び3-HP又はその塩の産生に好適な培養培地中で提供することを含む、前記方法。
（態様２０６）
3-HPを前記細菌又は培養培地から分離することをさらに含む、態様205記載の方法。
（態様２０７）
前記培養培地が約2〜20％溶存酸素である溶存酸素濃度を含む、態様205記載の方法。
（態様２０８）
前記溶存酸素濃度が約5〜10％である、態様207記載の方法。
（態様２０９）
前記溶存酸素濃度が20％以下である、態様207記載の方法。
（態様２１０）
前記溶存酸素濃度が少なくとも2％である、態様207記載の方法。
（態様２１１）
向流液体フローを使用しないで、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から除去することを含む:方法。
（態様２１２）
溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去することを含む、態様211記載の方法。
（態様２１３）
前記溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去する前に:
該溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した溶媒を凝縮させること
を含む、態様212記載の方法。
（態様２１４）
前記溶媒が水不混和性溶媒を含む、態様212又は213記載の方法。
（態様２１５）
前記溶媒が水混和性溶媒を含む、態様212又は213記載の方法。
（態様２１６）
前記溶媒が約1g/mL未満の密度を有する、態様1〜5のいずれか一項記載の方法。
（態様２１７）
前記溶媒が約1g/mL超の密度を有する、態様211〜215のいずれか一項記載の方法。
（態様２１８）
前記溶媒が、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様212又は213記載の方法。
（態様２１９）
前記溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様212又は213記載の方法。
（態様２２０）
前記溶媒が酢酸エチルを含む、態様212又は213記載の方法。
（態様２２１）
前記溶媒が、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様212又は213記載の方法。
（態様２２２）
前記溶媒がイソブチルアルコールを含む、態様212又は213記載の方法。
（態様２２３）
前記溶媒が、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、及びメチルヘキシルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様212又は213記載の方法。
（態様２２４）
前記溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、及び四塩化炭素からなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様212又は213記載の方法。
（態様２２５）
前記溶媒を前記水溶液に添加することを含む、態様212、213、又は215のいずれか一項記載の方法。
（態様２２６）
前記溶媒がC1-3アルコールを含む、態様212、213、215、又は225のいずれか一項記載の方法。
（態様２２７）
前記溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様212、213、215、又は225のいずれか一項記載の方法。
（態様２２８）
前記溶媒がメタノールを含む、態様212、213、215、又は225のいずれか一項記載の方法。
（態様２２９）
前記溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、態様212、213、又は225〜228のいずれか一項記載の方法。
（態様２３０）
前記溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、態様212、213、又は225〜228のいずれか一項記載の方法。
（態様２３１）
水混和性溶媒及び水不混和性溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去することを含み、ここで、1)該水混和性溶媒及び該水不混和性溶媒の組合せ容量と2)該水溶液の容量との比が約1:1〜約2:1である、態様212、213、又は225〜228のいずれか一項記載の方法。
（態様２３２）
3-HPが少なくとも50％の収率で前記水溶液から除去される、態様211〜231のいずれか一項記載の方法。
（態様２３３）
3-HPが少なくとも60％の収率で前記水溶液から除去される、態様211〜231のいずれか一項記載の方法。
（態様２３４）
3-HPが少なくとも70％の収率で前記水溶液から除去される、態様211〜231のいずれか一項記載の方法。
（態様２３５）
3-HPが少なくとも80％の収率で前記水溶液から除去される、態様211〜231のいずれか一項記載の方法。
（態様２３６）
3-HPが少なくとも90％の収率で前記水溶液から除去される、態様211〜231のいずれか一項記載の方法。
（態様２３７）
3-HPが少なくとも95％の収率で前記水溶液から除去される、態様211〜231のいずれか一項記載の方法。
（態様２３８）
3-HPが少なくとも99％の収率で前記水溶液から除去される、態様211〜231のいずれか一項記載の方法。
（態様２３９）
第一の溶媒を蒸発させること;
該蒸発した第一の溶媒を凝縮させること;及び
該第一の溶媒のフローの向きを変えて、3-HPを前記水溶液から除去すること
:を含む、方法。
（態様２４０）
前記第一の溶媒が約1g/mL未満の密度を有する、態様233記載の方法。
（態様２４１）
前記第一の溶媒が約1g/mL超の密度を有する、態様233記載の方法。
（態様２４２）
前記第一の溶媒が水不混和性溶媒を含む、態様239記載の方法。
（態様２４３）
前記第一の溶媒が、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様239記載の方法。
（態様２４４）
前記第一の溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様239記載の方法。
（態様２４５）
前記第一の溶媒が酢酸エチルを含む、態様239記載の方法。
（態様２４６）
前記第一の溶媒が、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様239記載の方法。
（態様２４７）
前記第一の溶媒がイソブチルアルコールを含む、態様239記載の方法。
（態様２４８）
前記第一の溶媒が、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、及びメチルヘキシルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様239記載の方法。
（態様２４９）
前記第一の溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、及び四塩化炭素からなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様239記載の方法。
（態様２５０）
第二の溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去することを含む、態様239〜249のいずれか一項記載の方法。
（態様２５１）
前記第二の溶媒が水混和性溶媒を含む、態様250記載の方法。
（態様２５２）
前記第一の溶媒が水不混和性溶媒を含み、かつ前記第二の溶媒が水混和性溶媒を含む、態様250記載の方法。
（態様２５３）
前記第二の溶媒を前記水溶液に添加することを含む、態様250〜252のいずれか一項記載の方法。
（態様２５４）
前記第二の溶媒がC1-3アルコールを含む、態様250〜253のいずれか一項記載の方法。
（態様２５５）
前記第二の溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様250〜253のいずれか一項記載の方法。
（態様２５６）
前記第二の溶媒がメタノールを含む、態様250〜253のいずれか一項記載の方法。
（態様２５７）
前記第二の溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、態様250〜256のいずれか一項記載の方法。
（態様２５８）
前記第二の溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、態様250〜256のいずれか一項記載の方法。
（態様２５９）
1)前記第一及び第二の溶媒の組合せ容量と2)前記水溶液の容量との比が1:1〜約2:1である、態様250〜258のいずれか一項記載の方法。
（態様２６０）
3-HPが少なくとも50％の収率で前記水溶液から除去される、態様239〜259のいずれか一項記載の方法。
（態様２６１）
3-HPが少なくとも60％の収率で前記水溶液から除去される、態様239〜259のいずれか一項記載の方法。
（態様２６２）
3-HPが少なくとも70％の収率で前記水溶液から除去される、態様239〜259のいずれか一項記載の方法。
（態様２６３）
3-HPが少なくとも80％の収率で前記水溶液から除去される、態様239〜259のいずれか一項記載の方法。
（態様２６４）
3-HPが少なくとも90％の収率で前記水溶液から除去される、態様239〜259のいずれか一項記載の方法。
（態様２６５）
3-HPが少なくとも95％の収率で前記水溶液から除去される、態様239〜259のいずれか一項記載の方法。
（態様２６６）
3-HPが少なくとも99％の収率で前記水溶液から除去される、態様239〜259のいずれか一項記載の方法。
（態様２６７）
水不混和性溶媒を用いて、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から少なくとも50％の収率で除去すること
:を含む、方法。
（態様２６８）
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも60％である、態様267記載の方法。
（態様２６９）
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも70％である、態様267記載の方法。
（態様２７０）
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも80％である、態様267記載の方法。
（態様２７１）
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも90％である、態様267記載の方法。
（態様２７２）
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも95％である、態様267記載の方法。
（態様２７３）
前記水溶液からの3-HPの除去の収率が少なくとも99％である、態様265記載の方法。
（態様２７４）
前記水不混和性溶媒が少なくとも1つのC1-6アルキルアセテートを含む、態様267〜273のいずれか一項記載の方法。
（態様２７５）
前記水不混和性溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様267〜273のいずれか一項記載の方法。
（態様２７６）
前記水不混和性溶媒が酢酸エチルを含む、態様267〜273のいずれか一項記載の方法。
（態様２７７）
向流液体フローを使用することを含む、態様267〜276のいずれか一項記載の方法。
（態様２７８）
前記水不混和性溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去する前に:
該水不混和性溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した水不混和性溶媒を凝縮させること
を含む、態様267〜276のいずれか一項記載の方法。
（態様２７９）
水混和性溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去することを含む、態様267〜278のいずれか一項記載の方法。
（態様２８０）
前記水混和性溶媒を前記水溶液に添加することを含む、態様279記載の方法。
（態様２８１）
前記水混和性溶媒がC1-3アルコールを含む、態様279又は280記載の方法。
（態様２８２）
前記水混和性溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様279又は280記載の方法。
（態様２８３）
前記水混和性溶媒がメタノールを含む、態様279又は280記載の方法。
（態様２８４）
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、態様279〜283のいずれか一項記載の方法。
（態様２８５）
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、態様279〜283のいずれか一項記載の方法。
（態様２８６）
1)前記水混和性溶媒及び前記水不混和性溶媒の組合せ容量と2)前記水溶液の容量との比が約1:1〜約2:1である、態様279〜283のいずれか一項記載の方法。
（態様２８７）
液体を用いて、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から除去すること
:を含み、
ここで、該液体が第一及び第二の溶媒を含む、方法。
（態様２８８）
前記第一の溶媒が有機溶媒を含む、態様287記載の方法。
（態様２８９）
前記第二の溶媒が有機溶媒を含む、態様287又は288記載の方法。
（態様２９０）
前記第一の溶媒が水混和性である、態様287〜289のいずれか一項記載の方法。
（態様２９１）
前記第一の溶媒が水混和性であり、かつ前記第二の溶媒が水不混和性である、態様287〜289のいずれか一項記載の方法。
（態様２９２）
前記方法が向流液体フローを使用しないで実施される、態様287〜291のいずれか一項記載の方法。
（態様２９３）
前記液体を用いて、3-HPを除去する前に:
前記第二の溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した第二の溶媒を凝縮させること
をさらに含む、態様287〜292のいずれか一項記載の方法。
（態様２９４）
前記第二の溶媒が約1g/mL未満の密度を有する、態様287〜293のいずれか一項記載の方法。
（態様２９５）
前記第二の溶媒が、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様287〜294のいずれか一項記載の方法。
（態様２９６）
前記第二の溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様287〜294のいずれか一項記載の方法。
（態様２９７）
前記第二の溶媒が酢酸エチルを含む、態様287〜294のいずれか一項記載の方法。
（態様２９８）
前記第二の溶媒が、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様287〜294のいずれか一項記載の方法。
（態様２９９）
前記第二の溶媒がイソブチルアルコールである、態様287〜294のいずれか一項記載の方法。
（態様３００）
前記第二の溶媒が、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、及びメチルヘキシルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様287〜294のいずれか一項記載の方法。
（態様３０１）
前記第二の溶媒が約1g/mL超の密度を有する、態様287〜300のいずれか一項記載の方法。
（態様３０２）
前記第一の溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、及び四塩化炭素からなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様287〜300のいずれか一項記載の方法。
（態様３０３）
前記第一の溶媒がC1-3アルコールを含む、態様287〜300のいずれか一項記載の方法。
（態様３０４）
前記第一の溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様287〜300のいずれか一項記載の方法。
（態様３０５）
前記第一の溶媒がメタノールを含む、態様287〜300のいずれか一項記載の方法。
（態様３０６）
前記第一の溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、態様287〜305のいずれか一項記載の方法。
（態様３０７）
前記第一の溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、態様287〜305のいずれか一項記載の方法。
（態様３０８）
1)前記第一及び第二の溶媒の組合せ容量と2)前記水溶液の容量との比が1:1〜約2:1である、態様287〜307のいずれか一項記載の方法。
（態様３０９）
3-HPが少なくとも50％の収率で前記水溶液から除去される態様287〜308のいずれか一項記載の方法。
（態様３１０）
3-HPが少なくとも60％の収率で前記水溶液から除去される態様287〜308のいずれか一項記載の方法。
（態様３１１）
3-HPが少なくとも70％の収率で前記水溶液から除去される態様287〜308のいずれか一項記載の方法。
（態様３１２）
3-HPが少なくとも80％の収率で前記水溶液から除去される態様287〜308のいずれか一項記載の方法。
（態様３１３）
3-HPが少なくとも90％の収率で前記水溶液から除去される態様287〜308のいずれか一項記載の方法。
（態様３１４）
3-HPが少なくとも95％の収率で前記水溶液から除去される態様287〜308のいずれか一項記載の方法。
（態様３１５）
3-HPが少なくとも99％の収率で前記水溶液から除去される態様287〜308のいずれか一項記載の方法。
（態様３１６）
水混和性溶媒及び水不混和性溶媒を用いて、3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から除去すること
:を含む、方法。
（態様３１７）
前記方法が向流液体フローを使用しないで実施される、態様316記載の方法。
（態様３１８）
前記水不混和性溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去する前に:
該水不混和性溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した水不混和性溶媒を凝縮させること
を含む、態様316又は317記載の方法。
（態様３１９）
3-HPを前記水溶液から除去するための前記水混和性溶媒の前に:
該水混和性溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した水混和性溶媒を凝縮させること
を含む、態様316〜318のいずれか一項記載の方法。
（態様３２０）
前記水不混和性溶媒が約1g/mL未満の密度を有する、態様316〜319のいずれか一項記載の方法。
（態様３２１）
前記水不混和性溶媒が、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様316〜320のいずれか一項記載の方法。
（態様３２２）
水不混和性溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様316〜320のいずれか一項記載の方法。
（態様３２３）
前記水不混和性溶媒が酢酸エチルを含む、態様316〜320のいずれか一項記載の方法。
（態様３２４）
水不混和性溶媒が、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様316〜320のいずれか一項記載の方法。
（態様３２５）
前記水不混和性溶媒がイソブチルアルコールを含む、態様316〜320のいずれか一項記載の方法。
（態様３２６）
水不混和性溶媒が、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、及びメチルヘキシルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様316〜320のいずれか一項記載の方法。
（態様３２７）
前記水不混和性溶媒が約1g/mL超の密度を有する、態様316〜326のいずれか一項記載の方法。
（態様３２８）
前記水不混和性溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、及び四塩化炭素からなる群から選択される少なくとも1つのメンバーを含む、態様316〜327のいずれか一項記載の方法。
（態様３２９）
前記水混和性溶媒がC1-3アルコールを含む、態様316〜327のいずれか一項記載の方法。
（態様３３０）
前記水混和性溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様316〜327のいずれか一項記載の方法。
（態様３３１）
前記水混和性溶媒がメタノールを含む、態様316〜327のいずれか一項記載の方法。
（態様３３２）
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、態様316〜331のいずれか一項記載の方法。
（態様３３３）
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、態様316〜331のいずれか一項記載の方法。
（態様３３４）
1)前記水混和性溶媒及び前記水不混和性溶媒の組合せ容量と2)前記水溶液の容量との比が約1:1〜約2:1である、態様316〜333のいずれか一項記載の方法。
（態様３３５）
3-HPが少なくとも50％の収率で前記水溶液から除去される、態様316〜334のいずれか一項記載の方法。
（態様３３６）
3-HPが少なくとも60％の収率で前記水溶液から除去される、態様316〜334のいずれか一項記載の方法。
（態様３３７）
3-HPが少なくとも70％の収率で前記水溶液から除去される、態様316〜334のいずれか一項記載の方法。
（態様３３８）
3-HPが少なくとも80％の収率で前記水溶液から除去される、態様316〜334のいずれか一項記載の方法。
（態様３３９）
3-HPが少なくとも90％の収率で前記水溶液から除去される、態様316〜334のいずれか一項記載の方法。
（態様３４０）
3-HPが少なくとも95％の収率で前記水溶液から除去される、態様316〜334のいずれか一項記載の方法。
（態様３４１）
3-HPが少なくとも99％の収率で前記水溶液から除去される、態様316〜334のいずれか一項記載の方法。
（態様３４２）
前記水溶液のpHが少なくとも約3である、態様211〜341のいずれか一項記載の方法。
（態様３４３）
前記水溶液のpHが少なくとも約4である、態様211〜341のいずれか一項記載の方法。
（態様３４４）
前記水溶液のpHが約3〜約7である、態様211〜341のいずれか一項記載の方法。
（態様３４５）
前記水溶液のpHが約4〜約6である、態様211〜341のいずれか一項記載の方法。
（態様３４６）
前記水溶液のpHが約4.2〜約4.7である、態様211〜341のいずれか一項記載の方法。
（態様３４７）
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を水溶液から除去すること
:を含み、
ここで、該水溶液のpHが少なくとも約3である、方法。
（態様３４８）
前記水溶液のpHが少なくとも約4である、態様347記載の方法。
（態様３４９）
前記水溶液のpHが最大でも約7である、態様347又は348記載の方法。
（態様３５０）
前記水溶液のpHが約4〜約6である、態様347記載の方法。
（態様３５１）
前記水溶液のpHが約4〜約5である、態様347記載の方法。
（態様３５２）
前記水溶液のpHが約4.2〜約4.8である、態様347記載の方法。
（態様３５３）
前記水溶液のpHが約4.3〜約4.6である、態様347記載の方法。
（態様３５４）
前記水溶液のpHが約4.4である、態様347記載の方法。
（態様３５５）
前記方法が向流液体フローを使用しないで実施される、態様347〜354のいずれか一項記載の方法。
（態様３５６）
水不混和性溶媒を用いて、3-HPを前記水溶液から除去することを含む、態様347〜355のいずれか一項記載の方法。
（態様３５７）
前記水不混和性溶媒を用いて、前記3-HPを除去する前に:
該水不混和性溶媒を蒸発させること;及び
該蒸発した水不混和性溶媒を凝縮させること
を含む、態様356記載の方法。
（態様３５８）
前記水不混和性溶媒が約1g/mL未満の密度を有する、態様356又は357記載の方法。
（態様３５９）
前記水不混和性溶媒が、C1-6アルキルアセテート、C4-6アルコール、及びC1-6アルキルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様356〜358のいずれか一項記載の方法。
（態様３６０）
前記水不混和性溶媒が、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸n-プロピル、酢酸イソプロピル、酢酸n-ブチル、酢酸イソブチル、酢酸sec-ブチル、酢酸tert-ブチル、酢酸n-ペンチル、及び酢酸n-ヘキシルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様356〜358のいずれか一項記載の方法。
（態様３６１）
前記水不混和性溶媒が酢酸エチルを含む、態様356〜358のいずれか一項記載の方法。
（態様３６２）
前記水不混和性溶媒が、n-ブチルアルコール、イソブチルアルコール、tert-ブチルアルコール、n-ペンチルアルコール、及びn-ヘキシルアルコールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様356〜358のいずれか一項記載の方法。
（態様３６３）
前記水不混和性溶媒がイソブチルアルコールを含む、態様356〜358のいずれか一項記載の方法。
（態様３６４）
前記水不混和性溶媒が、ジエチルエーテル、ジプロピルエーテル、エチルプロピルエーテル、メチルtert-ブチルエーテル、及びメチルヘキシルエーテルからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様356〜358のいずれか一項記載の方法。
（態様３６５）
前記水不混和性溶媒が約1g/mL超の密度を有する、態様355〜364のいずれか一項記載の方法。
（態様３６６）
前記水不混和性溶媒が、クロロホルム、塩化メチレン、及び四塩化炭素からなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様356〜365のいずれか一項記載の方法。
（態様３６７）
3-HPを前記水溶液から除去するための水混和性溶媒を使用することを含む、態様347〜365のいずれか一項記載の方法。
（態様３６８）
前記水混和性溶媒の使用が該水混和性溶媒を前記水溶液に添加することを含む、態様367記載の方法。
（態様３６９）
前記水混和性溶媒がC1-3アルコールである、態様367又は368記載の方法。
（態様３７０）
水混和性溶媒が、メタノール、エタノール、n-プロパノール、及びイソプロパノールからなる群から選択される少なくとも1つの溶媒を含む、態様367又は368記載の方法。
（態様３７１）
前記水混和性溶媒がメタノールを含む、態様367又は366記載の方法。
（態様３７２）
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約5v/v％〜約50v/v％である、態様367〜371のいずれか一項記載の方法。
（態様３７３）
前記水混和性溶媒の量が前記水溶液の量の約25v/v％である、態様367〜371のいずれか一項記載の方法。
（態様３７４）
1)前記水混和性溶媒及び前記水不混和性溶媒の組合せ容量と2)前記水溶液の容量との比が約1:1〜約2:1である、態様357〜373のいずれか一項記載の方法。
（態様３７５）
3-HPが少なくとも50％の収率で前記水溶液から除去される、態様347〜374のいずれか一項記載の方法。
（態様３７６）
3-HPが少なくとも60％の収率で前記水溶液から除去される、態様347〜374のいずれか一項記載の方法。
（態様３７７）
3-HPが少なくとも70％の収率で前記水溶液から除去される、態様347〜374のいずれか一項記載の方法。
（態様３７８）
3-HPが少なくとも80％の収率で前記水溶液から除去される、態様347〜374のいずれか一項記載の方法。
（態様３７９）
3-HPが少なくとも90％の収率で前記水溶液から除去される、態様347〜374のいずれか一項記載の方法。
（態様３８０）
3-HPが少なくとも95％の収率で前記水溶液から除去される、態様347〜374のいずれか一項記載の方法。
（態様３８１）
3-HPが少なくとも99％の収率で前記水溶液から除去される、態様347〜369のいずれか一項記載の方法。
（態様３８２）
前記3-HPの水溶液が脱細胞化発酵ブロスを含む、態様211〜381のいずれか一項記載の方法。
（態様３８３）
前記水溶液中の3-HPの濃度が約50g/L〜約100g/Lである、態様211〜382のいずれか一項記載の方法。
（態様３８４）
前記水溶液中の3-HPの濃度が約60g/L〜約80g/Lである、態様211〜382のいずれか一項記載の方法。
（態様３８５）
前記水溶液が酸を含む、態様211〜384のいずれか一項記載の方法。
（態様３８６）
前記酸が、硫酸、塩酸、酢酸、及びシュウ酸からなる群から選択される少なくとも1つの酸を含む、態様211〜384のいずれか一項記載の方法。
（態様３８７）
前記水溶液の温度が約15℃〜約50℃である、態様211〜386のいずれか一項記載の方法。
（態様３８８）
前記水溶液の温度が約15℃〜約40℃である、態様211〜386のいずれか一項記載の方法。
（態様３８９）
前記水溶液の温度が約20℃〜約30℃である、態様211〜386のいずれか一項記載の方法。
（態様３９０）
前記水溶液が約室温である、態様211〜386のいずれか一項記載の方法。
（態様３９１）
3-HPを前記水溶液から除去した後、該3-HPを反応させて、アクリル酸を製造することをさらに含む、態様211〜390のいずれか一項記載の方法。
（態様３９２）
前記3-HPを約700mbar未満の圧力で反応させることを含む、391記載の方法。
（態様３９３）
3-HPを反応させることが水溶液中で行われることを含む、態様391又は392記載の方法。
（態様３９４）
前記水溶液をゼオライトと接触させることを含む、態様393記載の方法。
（態様３９５）
前記水溶液が酸を含む、態様393又は394記載の方法。
（態様３９６）
前記3-HPを反応させることが該3-HPを少なくとも約50℃の温度に加熱することを含む、態様391〜395のいずれか一項記載の方法。
（態様３９７）
前記反応させることが重合阻害剤の存在下で行われる、態様391〜396のいずれか一項記載の方法。
（態様３９８）
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を反応させて、約1大気圧未満の圧力でアクリル酸を形成させて、アクリル酸を提供すること
:を含む、方法。
（態様３９９）
前記圧力が約700mbar未満である、態様398記載の方法。
（態様４００）
前記圧力が約500mbar未満である、態様398記載の方法。
（態様４０１）
前記圧力が約200mbar未満である、態様398記載の方法。
（態様４０２）
前記圧力が約100mbar未満である、態様398記載の方法。
（態様４０３）
前記圧力が約70〜約100mbarの範囲内にある、態様398記載の方法。
（態様４０４）
3-HPが水溶液中で行われる、態様398〜403のいずれか一項記載の方法。
（態様４０５）
前記水溶液をゼオライトと接触させることを含む、態様404記載の方法。
（態様４０６）
前記ゼオライトが4A分子篩を含む、態様405記載の方法。
（態様４０７）
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約1wt.％〜約5wt.％である、態様405又は406記載の方法。
（態様４０８）
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約2wt.％〜約4wt.％である、態様405又は406記載の方法。
（態様４０９）
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約50℃の温度に加熱することを含む、態様398〜408のいずれか一項記載の方法。
（態様４１０）
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約80℃の温度に加熱することを含む、態様398〜408のいずれか一項記載の方法。
（態様４１１）
3-HPを反応させることが、3-HPを最大で約180℃の温度に加熱することを含む、態様398〜408のいずれか一項記載の方法。
（態様４１２）
前記水溶液が酸を含む、態様404〜411のいずれか一項記載の方法。
（態様４１３）
前記酸がシュウ酸及びポリリン酸からなる群から選択される少なくとも1つの酸を含む、態様412記載の方法。
（態様４１４）
前記酸の量が3-HPの量をベースにして約2wt.％〜約20wt.％である、態様412又は413記載の方法。
（態様４１５）
前記3-HPを重合阻害剤の存在下で反応させることを含む、態様398〜414のいずれか一項記載の方法。
（態様４１６）
前記重合阻害剤がフェノチアジン及びヒドロキノンからなる群から選択される少なくとも1つの重合阻害剤を含む、態様415記載の方法。
（態様４１７）
前記重合阻害剤の量が3-HPの量をベースにして約5wt.％〜約10wt.％である、態様415又は416記載の方法。
（態様４１８）
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を反応させて、反応混合物中でアクリル酸を形成させること;及び
ガス状アクリル酸を該反応混合物から除去すること
:を含む、方法。
（態様４１９）
前記反応混合物が液体を含む、態様418記載の方法。
（態様４２０）
前記液体が水性である、態様419記載の方法。
（態様４２１）
前記反応混合物をゼオライトと接触させることを含む、態様418〜420のいずれか一項記載の方法。
（態様４２２）
前記ゼオライトが4A分子篩を含む、態様421記載の方法。
（態様４２３）
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約1wt.％〜約5wt.％である、態様421又は422記載の方法。
（態様４２４）
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約2wt.％〜約4wt.％である、態様421又は422記載の方法。
（態様４２５）
前記ガス状アクリル酸を除去することが約1大気圧未満の圧力で行われる、態様418〜424のいずれか一項記載の方法。
（態様４２６）
前記圧力が約700mbar未満である、態様425記載の方法。
（態様４２７）
前記圧力が約500mbar未満である、態様425記載の方法。
（態様４２８）
前記圧力が約200mbar未満である、態様425記載の方法。
（態様４２９）
前記圧力が約100mbar未満である、態様425記載の方法。
（態様４３０）
前記圧力が約70〜約100mbarの範囲内にある、態様425記載の方法。
（態様４３１）
3-HPを反応させることが3-HPを少なくとも約50℃の温度に加熱することを含む、態様418〜430のいずれか一項記載の方法。
（態様４３２）
3-HPを反応させることが3-HPを少なくとも約80℃の温度に加熱することを含む、態様418〜430のいずれか一項記載の方法。
（態様４３３）
3-HPを反応させることが3-HPを最大で約180℃の温度に加熱することを含む、態様418〜430のいずれか一項記載の方法。
（態様４３４）
前記反応混合物が酸を含む、態様418〜423のいずれか一項記載の方法。
（態様４３５）
前記酸がシュウ酸及びポリリン酸からなる群から選択される少なくとも1つの酸を含む、態様434記載の方法。
（態様４３６）
前記酸の量が3-HPの量をベースにして約2wt.％〜約20wt.％である、態様434又は435記載の方法。
（態様４３７）
前記反応混合物が重合阻害剤を含む、態様418〜436のいずれか一項記載の方法。
（態様４３８）
前記重合阻害剤がフェノチアジン及びヒドロキノンからなる群から選択される重合阻害剤を含む、態様437記載の方法。
（態様４３９）
前記重合阻害剤の量が3-HPの量をベースにして約5wt.％〜約10wt.％である、態様437又は438記載の方法。
（態様４４０）
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を含む液体を反応させて、アクリル酸を形成させること
:を含む、方法。
（態様４４１）
前記液体が水溶液を含む、態様440記載の方法。
（態様４４２）
ガス状アクリル酸を形成させることを含む、態様440又は441記載の方法。
（態様４４３）
前記アクリル酸を前記液体から除去することを含む、態様440〜442のいずれか一項記載の方法。
（態様４４４）
除去することが約1大気圧未満の圧力で行われる、態様443記載の方法。
（態様４４５）
前記圧力が約700mbar未満である、態様444記載の方法。
（態様４４６）
前記圧力が約500mbar未満である、態様444記載の方法。
（態様４４７）
前記圧力が約200mbar未満である、態様444記載の方法。
（態様４４８）
前記圧力が約100mbar未満である、態様444記載の方法。
（態様４４９）
前記圧力が約70〜約100mbarの範囲内にある、態様444記載の方法。
（態様４５０）
前記液体をゼオライトと接触させることを含む、態様440〜449のいずれか一項記載の方法。
（態様４５１）
前記ゼオライトが4A分子篩を含む、態様450記載の方法。
（態様４５２）
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約1wt.％〜約5wt.％である、態様440又は441記載の方法。
（態様４５３）
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約2wt.％〜約4wt.％である、態様440又は441記載の方法。
（態様４５４）
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約50℃の温度に加熱することを含む、態様440〜453のいずれか一項記載の方法。
（態様４５５）
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約80℃の温度に加熱することを含む、態様440〜453のいずれか一項記載の方法。
（態様４５６）
3-HPを反応させることが、3-HPを最大で約180℃の温度に加熱することを含む、態様440〜453のいずれか一項記載の方法。
（態様４５７）
前記液体が酸を含む、態様440〜456のいずれか一項記載の方法。
（態様４５８）
前記酸がシュウ酸及びポリリン酸からなる群から選択される少なくとも1つの酸を含む、態様457記載の方法。
（態様４５９）
前記酸の量が3-HPの量をベースにして約2wt.％〜約20wt.％である、態様247又は248記載の方法。
（態様４６０）
反応させることが重合阻害剤の存在下で行われる、態様440〜459のいずれか一項記載の方法。
（態様４６１）
前記重合阻害剤がフェノチアジン及びヒドロキノンからなる群から選択される少なくとも1つの重合阻害剤を含む、態様460記載の方法。
（態様４６２）
前記重合阻害剤の量が3-HPの量をベースにして約5wt.％〜約10wt.％である、態様460又は461記載の方法。
（態様４６３）
前記アクリル酸が少なくとも約70％の収率で形成される、態様391〜462のいずれか一項記載の方法。
（態様４６４）
前記アクリル酸が少なくとも約80％の収率で形成される、態様391〜462のいずれか一項記載の方法。
（態様４６５）
前記アクリル酸が少なくとも約90％の収率で形成される、態様391〜462のいずれか一項記載の方法。
（態様４６６）
前記アクリル酸が少なくとも約95％の収率で形成される、態様391〜462のいずれか一項記載の方法。
（態様４６７）
前記アクリル酸が少なくとも約99％の収率で形成される、態様391〜462のいずれか一項記載の方法。
（態様４６８）
3-ヒドロキシプロピオン酸(3-HP)を反応させて、アクリル酸を少なくとも約70％の収率で形成させること
:を含む、方法。
（態様４６９）
前記アクリル酸が少なくとも約80％の収率で形成される、態様468記載の方法。
（態様４７０）
前記アクリル酸が少なくとも約90％の収率で形成される、態様468記載の方法。
（態様４７１）
前記アクリル酸が少なくとも約95％の収率で形成される、態様468記載の方法。
（態様４７２）
前記アクリル酸が少なくとも約99％の収率で形成される、態様468記載の方法。
（態様４７３）
前記3-HPが水溶液中で行われる、態様468〜472のいずれか一項記載の方法。
（態様４７４）
ガス状アクリル酸を形成させることを含む、態様468〜473のいずれか一項記載の方法。
（態様４７５）
前記アクリル酸を前記液体から除去することを含む、態様468〜474のいずれか一項記載の方法。
（態様４７６）
前記除去することが約1大気圧未満の圧力で行われる、態様475記載の方法。
（態様４７７）
前記圧力が約700mbar未満である、態様476記載の方法。
（態様４７８）
前記圧力が約500mbar未満である、態様476記載の方法。
（態様４７９）
前記圧力が約200mbar未満である、態様476記載の方法。
（態様４８０）
前記圧力が約100mbar未満である、態様476記載の方法。
（態様４８１）
前記圧力が約70〜約100mbarの範囲内にある、態様476記載の方法。
（態様４８２）
前記水溶液をゼオライトと接触させることを含む、態様468〜481のいずれか一項記載の方法。
（態様４８３）
前記ゼオライトが4A分子篩である、態様482記載の方法。
（態様４８４）
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約1wt.％〜約5wt.％である、態様482又は483記載の方法。
（態様４８５）
ゼオライトの量が前記水溶液の量をベースにして約2wt.％〜約4wt.％である、態様482又は483記載の方法。
（態様４８６）
前記水溶液が酸を含む、態様468〜485のいずれか一項記載の方法。
（態様４８７）
前記酸がシュウ酸及びポリリン酸からなる群から選択される酸を含む、態様486記載の方法。
（態様４８８）
前記酸の量が3-HPの量をベースにして約2wt.％〜約20wt.％である、態様486又は487記載の方法。
（態様４８９）
前記反応させることが重合阻害剤の存在下で行われる態様468〜488のいずれか一項記載の方法。
（態様４９０）
前記重合阻害剤がフェノチアジン及びヒドロキノンからなる群から選択される重合阻害剤を含む、態様489記載の方法。
（態様４９１）
前記重合阻害剤の量が3-HPの量をベースにして約5wt.％〜約10wt.％である、態様489又は490記載の方法。
（態様４９２）
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約50℃の温度に加熱することを含む、態様468〜491のいずれか一項記載の方法。
（態様４９３）
3-HPを反応させることが、3-HPを少なくとも約80℃の温度に加熱することを含む、態様468〜491のいずれか一項記載の方法。
（態様４９４）
3-HPを反応させることが、3-HPを最大で約180℃の温度に加熱することを含む、態様468〜491のいずれか一項記載の方法。
【国際調査報告】
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