(57)【要約】  対象における加齢依存性リソソーム障害を低減し、および／または加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、対象に治療剤を投与するステップを含み、治療剤が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）−オキシダーゼ（ＮＯＸ）または下流のＮＯＸエフェクターを阻害する、方法が開示される。【選択図】図９
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、前記対象に治療剤を投与するステップを含み、前記治療剤が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）−オキシダーゼ（ＮＯＸ）または下流のＮＯＸエフェクターを阻害する、方法。
【請求項２】
前記神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、１型脊髄小脳性運動失調、加齢関連認知症、レヴィー小体認知症、おそらく血管性認知症、前頭側頭認知症、および筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＮＯＸが、ＮＯＸ１、ＮＯＸ２、ＮＯＸ３、ＮＯＸ４、またはＮＯＸ５から選択されるＮＯＸアイソフォームである、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記治療剤が、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の阻害剤であり、前記治療剤が、ＳＴＡＴ３媒介ＮＯＸ活性化を低減し、それによりＮＯＸの阻害を惹起する、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記治療剤が、抗ＩＬ−６抗体または抗炎症剤であり、前記治療剤が、ＩＬ−６媒介ＮＯＸ活性化を低減し、それによりＮＯＸの阻害を惹起する、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記下流のＮＯＸエフェクターが、反応性酸素種、過酸化水素、またはスーパーオキシドを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記治療剤が、小分子、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはタンパク質である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記治療剤が、ジフェニレンヨードニウム、アポシニン、２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６−ジオン（ＧＫＴ−８３１）、ラパマイシン、ジスムタザイム、Ｃ６０のマロン酸誘導体、Ｃ６０の酢酸誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む小分子である、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記治療剤が、神経変性疾患に特徴的な病理学的変化の発症の前に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
対象における加齢依存性リソソーム障害を低減し、および／またはオートファジーの開始を増大させる方法であって、前記対象に治療剤を投与するステップを含み、前記治療剤が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）−オキシダーゼ（ＮＯＸ）または下流のＮＯＸエフェクターを阻害する、方法。
【請求項１１】
前記リソソーム障害が、海馬のピラミッド状ニューロンおよびパルバルブミンインターニューロンに存在する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＮＯＸが、ＮＯＸ１、ＮＯＸ２、ＮＯＸ３、ＮＯＸ４、またはＮＯＸ５から選択されるＮＯＸアイソフォームである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１３】
前記下流のＮＯＸエフェクターが、反応性酸素種、過酸化水素、またはスーパーオキシドを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
前記治療剤が、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の阻害剤であり、前記治療剤がＳＴＡＴ３媒介ＮＯＸ活性化、それによりＮＯＸの阻害を惹起する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１５】
前記治療剤が、抗ＩＬ−６抗体または抗炎症剤であり、前記治療剤が、ＩＬ−６媒介ＮＯＸ活性化を低減し、それによりＮＯＸの阻害を惹起する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１６】
前記治療剤が、小分子、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはタンパク質である、請求項１０〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記治療剤が、ジフェニレンヨードニウム、アポシニン、２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６−ジオン（ＧＫＴ−８３１）、ラパマイシン、ジスムタザイム、Ｃ６０のマロン酸誘導体、Ｃ６０の酢酸誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む小分子である、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
対象におけるリソソーム機能を改善する方法であって、前記対象に治療剤を投与するステップを含み、前記治療剤が、反応性酸素種（ＲＯＳ）、過酸化水素、またはスーパーオキシドを低減させる、方法。
【請求項１９】
前記治療剤が、ＲＯＳ、過酸化水素、またはスーパーオキシドを阻害することによってリソソーム機能を改善し、小分子、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはタンパク質である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記治療剤が、ジスムタザイム、Ｃ６０のマロン酸誘導体、Ｃ６０の酢酸誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む小分子である、請求項１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は２０１７年１１月１５日に出願した米国仮特許出願第６２／５８６５２７号の利益を主張し、該出願は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本研究はＮａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって与えられた認可番号ＲＯ１  ＡＧ０３３６７９による政府の支援を受けた。政府は本発明に一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００２】
加齢関連疾患は疑いもなく２１世紀における生医学の単一で最大の課題である。６５歳を超える米国人の数は２０３０年までに７千万人、すなわち人口のほぼ２５％に達する1。その数が常に増加し続けるこれらの高齢者は、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびその他の認知障害等の慢性進行性神経変性病態に直面することになる。これらの晩期発症型神経変性疾患の全てにおいて、加齢それ自体が群を抜いて単一で最大の共通危険因子である。神経変性疾患の患者数の増加を示すこれらの人口動態は、治療のための極めて大きくかつ拡大する市場があることを示唆している。しかし、この加齢に伴うリスクを生じる機序は十分に理解されていないままであり、現在のところ、これらの疾患のいずれにおいても疾患を改変する療法は存在しない。
【０００３】
パーキンソン病には対症療法があるが、持続治療の後、疾患が連続的に進展するので、対症療法は失敗する。アルツハイマー病のために用いられる治療は高価であるが、本質的には効果がなく、一次的には家族にとって偽薬としての役目を果たしている。機能的に意味のある様式でこれらの疾患のいずれかの進行を遅くすることさえできるいずれの治療も大きな前進であろう。求められているのは神経変性疾患の新規で効果的な治療である。
【発明の概要】
【０００４】
対象における加齢依存性リソソーム障害を低減し、リソソーム機能を改善し、オートファジーの開始を増大させ、および／または加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、対象に治療剤を投与するステップを含み、治療剤が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）−オキシダーゼ（ＮＯＸ）または下流のＮＯＸエフェクターを阻害する、方法が本明細書で開示される。
【０００５】
一態様では、加齢依存性リソソーム障害を低減し、リソソーム機能を改善し、オートファジーの開始を増大させ、および／または先行する態様のいずれかの加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、神経変性疾患が、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、１型脊髄小脳性運動失調（spinocervellar ataxia type 1）、加齢関連認知症、レヴィー小体認知症、おそらく血管性認知症、前頭側頭認知症、および筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を含む、方法が本明細書で開示される。
【０００６】
加齢依存性リソソーム障害を低減し、リソソーム機能を改善し、オートファジーの開始を増大させ、および／または先行する態様のいずれかの加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、ＮＯＸが、ＮＯＸ１、ＮＯＸ２、ＮＯＸ３、ＮＯＸ４、またはＮＯＸ５から選択されるＮＯＸアイソフォームであり、および／または下流のＮＯＸエフェクターが反応性酸素種、過酸化水素、またはスーパーオキシドを含む、方法も本明細書で開示される。したがって一態様では、治療剤は、たとえばＲＯＳ、過酸化水素、および／またはスーパーオキシド等の下流のＮＯＸエフェクターを阻害し、低減し、および／または排除することによって、加齢依存性リソソーム障害を低減し、リソソーム機能を改善し、オートファジーの開始を増大させ、および／または加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療することができる。
【０００７】
一態様では、加齢依存性リソソーム障害を低減し、リソソーム機能を改善し、オートファジーの開始を増大させ、および／または先行する態様のいずれかの加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、治療剤が、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の阻害剤であり、治療剤が、ＳＴＡＴ３媒介ＮＯＸ活性化を低減し、それによりＮＯＸの阻害を惹起する、方法が本明細書で開示される。
【０００８】
加齢依存性リソソーム障害を低減し、リソソーム機能を改善し、オートファジーの開始を増大させ、および／または先行する態様のいずれかの加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、治療剤が、抗ＩＬ−６抗体または抗炎症剤であり、治療剤が、ＩＬ−６媒介ＮＯＸ活性化を低減し、それによりＮＯＸの阻害を惹起する、方法も本明細書で開示される。
【０００９】
加齢依存性リソソーム障害を低減し、リソソーム機能を改善し、オートファジーの開始を増大させ、および／または先行する態様のいずれかの加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、ＮＯＸまたはＮＯＸの下流のエフェクターを阻害する薬剤が、それだけに限らないが、ジフェニレンヨードニウム、アポシニン、２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６−ジオン（ＧＫＴ−８３１）、ラパマイシン、ジスムタザイム（ｄｉｓｍｕｔａｚｙｍｅ）、Ｃ６０のマロン酸誘導体、Ｃ６０の酢酸誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む小分子を含む小分子、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、ペプチド、またはタンパク質である、方法も本明細書で開示される。
【００１０】
本明細書に組み込まれ、本明細書の一部を構成する添付の図面は、いくつかの実施形態を説明し、本明細書の記載とともに開示した組成物および方法を説明する。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】ＷＴマウスの海馬におけるｐ６２凝集物の加齢依存性の蓄積を示す図である。前期高齢（図１Ａ、２４月齢）または若齢（図１Ｂ、４月齢）マウスの切片をｐ６２について免疫染色した（赤）。図１Ｃはクラスターで占められた海馬の面積％を示す。平均±ＳＤ、ｎ＝８、ｔ検定で＊ｐ＜０．０５。図１ＤはＩｍａｒｉｓソフトウェアを用いた凝集物の３Ｄ再構成を示し、数百個の離散した３〜８μｍの堆積物が凝集物の中に示されている。凝集物の中央部を通る９０°の光学切片を下に示す。細胞核を示すＤａｐｉ（青）が含まれていた。
【図２】ｐ６２陽性凝集物と他のタンパク質との共局在化を示す図である。図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、および図２Ｅは老化した海馬のｐ６２（赤）およびパーキン（緑）の免疫染色を示す。図２Ａは併合したチャネル、図２Ｂは個別のチャネル、図２Ｃは凝集物の強拡大、図２Ｄは３００直交視、図２ＥはＳｉｇｍａｐｌｏｔ１１およびＳｉｇｍａｓｔａｔ４．０を用いたシグナル間の統計的相関（ｒ２＝０．８１、ｐ＝０．０１３）である。図２Ｆおよび図２Ｇはｐ６２とＳｕｍｏ３（図２Ｆ）またはｐ６２とｌａｍｐ２（リソソームを介するタンパク質のプロセシングにも関与するタンパク質）（図２Ｇ）の併合画像を示す。図２Ｈはｐ６２およびリーリン（ニューロンタンパク質）を示す。ｐ６２とＳｕｍｏ３およびリーリンとの間には実質的な重なりがあるが、ｌａｍｐ２との重なりは部分的である。
【図３】ｐ６２陽性タンパク質凝集物とＧＡＢＡ作動性ニューロン線維との間の部分的な重なりを示す図である。大部分のｐ６２タンパク質凝集物はカルレチニン（ＣＲ）（図３Ａ）およびＰＶニューロン（図３Ｄ）を伴っていなかった。いくつかのｐ６２凝集物をＣＲ（図３Ｂおよび図３Ｃ）またはＰＶ（図３Ｅおよび図３Ｆ）で標識した。図３Ｂ、図３Ｃ、図３Ｅ、および図３Ｆは厚み１ｍｍの光学切片の共焦点写真であった。矢じりおよび矢印はそれぞれ、ＣＲまたはＰＶで標識され、および標識されていない、ｐ６２の点を示す。
【図４】星状膠細胞とｐ６２タンパク質凝集物との会合を示す図である。小膠細胞の中ではｐ６２の免疫反応性はほとんど観察されなかった（Ｉｂａで標識、図４Ａおよび図４Ｅ）。ＧＦＡＰで標識したいくつかの星状膠細胞は細胞体の中にｐ６２陽性ドットを含んでいた。時には星状膠細胞はｐ６２陽性凝集物に取り巻かれていた（図４Ｂおよび図４Ｆ）。ｐ６２含有凝集物と星状膠細胞との会合は、ＧＦＰ蛍光によって星状膠細胞の微細な突起の可視化を可能にするＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスにおいてさらに確かめられた（図４Ｃおよび図４Ｇ）。同様に、リーリン陽性凝集物は星状膠細胞と会合するか、その内部にあった（図４Ｄおよび図４Ｈ）。図４Ａ、図４Ｂ、図４Ｃ、および図４Ｄは厚み１ｍｍの５〜２０個の切片の突起であり、図４Ｅ、図４Ｆ、図４Ｇ、および図４Ｈは、共局在化が存在するかを確認するための厚み１μｍの切片の対応する代表例である。
【図５】ジスムターゼ模倣体Ｃ３によるＮｏｘの阻害、すなわちスーパーオキシドの低減がｐ６２凝集物の蓄積を低下させることを示す図である。雌Ｃ５７ＢＬ６マウスに水中のアポシニン（５０ｍｇ／ｋｇ）またはＣ３（１ｍｇ／ｋｇ／日）を１２〜１７月齢で投与し、その後灌流した。脳を固定して切片とし、ｐ６２について免疫染色した。１群あたり４匹のマウスで、１匹あたり３つの切片について６個の海馬の共焦点画像を解析した。ｐ６２含有凝集物を定量するため、描写された領域において凝集物を予備知識のない研究者が個別に円で囲み、ＩｍａｇｅＪを用いて凝集面積を測定した。凝集物で覆われた面積およびクラスターの数を示す。平均±ＳＤ、＊ｐ＜０．０５、＊＊＊ｐ＜０．００１、マン−ホイットニーの順位和検定。
【図６】高齢マウスの海馬ニューロンのリソソームが若齢マウスよりも有意に大きいことを示す図である。５月齢および２０月齢の雌マウスの脳の切片を、個別のニューロン中のリソソームが解析できるように選択したｌａｍｐ１およびパルバルブミン（ＰＶ）に対する抗体で免疫染色した。高齢動物と若齢動物の比較において、ｌａｍｐ１で標識したリソソームはＰＶニューロンと周囲のピラミッド状ニューロンの両方で大きかった。Ａｎａｌｙｚｅ  Ｐａｒｔｉｃｌｅｓ機能を用いるＩｍａｇｅＪで、厚み１μｍの光学切片でＰＶニューロン中のリソソームを定量した。ｎ＝８（若齢）、ｎ＝７（高齢）、＊ｐ＜０．００１、マン−ホイットニーの順位和検定。
【図７】カテプシンＤ（ＣａｔＤ）のウェスタンブロットを示す図であり、高齢と若齢のマウスの海馬の抽出物中のプレプロＣａｔＤの蓄積を示す。プレプロＣａｔＤ（ｐｐＣａｔＤ）は酸性環境下のＣａｔＤによる自己溶解プロセシングを必要とし、したがってこれらのデータは老化した脳におけるリソソームの酸性化の障害と一致する。
【図８】ｐ６２陽性凝集物に近接したニューロン線維に対する傷害の最初の証拠を示す図である。図８Ａはｐ６２凝集物に近い露出された区域を示すＹＦＰ発現ピラミッド状ニューロン（緑色）を有する海馬を示す（１４月齢のマウス）。ｐ６２（赤）およびＰＶ（緑）について免疫染色した若齢（図８Ｂ、４月齢）および高齢（図８Ｃ、２４月齢）の脳のスライスの強拡大画像。個別の線維がよりよく可視化されている。図８Ｄおよび図８Ｅは、ｐ６２陽性凝集物に直接隣接している線維の喪失を示す高倍率画像を示す。
【図９】炎症誘発性ＬＰＳによる処置によって惹起されたＪ７７４Ａ．１細胞のリソソーム障害およびＣ３共処置による機能の回復を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本発明の化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法を開示し説明する前に、これらは他に特定しない限り特定の合成方法または特定の組み換えバイオテクノロジー方法に限定されず、また他に特定しない限り特定の試薬に限定されず、したがってもちろん変動し得ることを理解されたい。本明細書で用いる用語は特定の実施形態を説明する目的のためのみであって限定することを意図していないことも理解されたい。
【００１３】
定義
本明細書および添付の特許請求の範囲で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈から明白に他が指示されない限り、複数の対象を含む。したがって、たとえば「薬学的担体」への言及は２つ以上のそのような担体の混合物等を含む。
【００１４】
本明細書において範囲は「約」１つの特定の値からおよび／または「約」別の特定の値までとして表すことができる。そのような範囲を表す場合、別の実施形態には１つの特定の値からおよび／または他の特定の値までが含まれる。同様に、先行詞「約」を用いて値を近似として表す場合、その特定の値が別の実施形態を形成することが理解される。範囲のそれぞれの終点は両方とも他の終点に関して有意であり、他の終点から独立していることもさらに理解される。本明細書に開示された、いくつかの値が存在し、それぞれの値はその値それ自体に加えて「約」その特定の値としても本明細書に開示されていることも理解される。たとえば、値「１０」が開示されれば、「約１０」も開示されている。ある値が開示された場合、当業者によって適切に理解されるように、その値「未満またはこれに等しい」、「その値より大きくまたはこれに等しい」、およびその値の間の可能な範囲も開示されていることも理解される。たとえば、値「１０」が開示されれば、「１０未満またはこれに等しい」ならびに「１０より大きくまたはこれに等しい」も開示されている。本出願を通して、データはいくつかの様々なフォーマットで提供され、このデータは終点および開始点、ならびにデータ点の任意の組み合わせの範囲を表すことも理解される。たとえば、特定のデータ点「１０」および特定のデータ点１５が開示されれば、１０および１５より大きく、これより大きいかこれに等しく、これ未満、これ未満かこれに等しく、およびこれに等しい値、ならびに１０と１５の間の値も開示されていると考えられることが理解される。２つの特定の単位の間のそれぞれの単位も開示されているとも理解される。たとえば、１０および１５が開示されれば、１１、１２、１３、および１４も開示されている。
【００１５】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲において、以下の意味を有すると定義されるいくつかの用語に言及する。
【００１６】
「任意選択の」または「任意選択で」は、その後に記載された事象または状況が生じても生じなくてもよいこと、およびその記載が前記事象または状況が生じる場合ならびに生じない場合を含むことを意味する。
【００１７】
「増大」は、より大きな遺伝子発現、タンパク質発現、症状、疾患、組成、状態、または活性の量をもたらす任意の変化を指すこともある。増大は統計的に有意な量の状態、症状、活性、組成における任意の個別の、中央の、または平均の増大であってよい。したがって、増大が統計的に有意である限り、増大は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％の増大であってよい。
【００１８】
「低下」は、より小さな遺伝子発現、タンパク質発現、症状、疾患、組成、状態、または活性の量をもたらす任意の変化を指すこともある。ある物質は、その物質を用いた場合の遺伝子産物の遺伝的アウトプットがその物質を用いない場合の遺伝子産物のアウトプットと比較して小さい場合に、遺伝子の遺伝的アウトプットを低下させるとも理解される。また、たとえば低下は、症状が以前に観察されたもの未満になるような障害の症状における変化であってもよい。低下は統計的に有意な量の状態、症状、活性、組成における任意の個別の、中央の、または平均の低下であってよい。したがって、低下が統計的に有意である限り、低下は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００％の低下であってよい。
【００１９】
用語「阻害する」は、活性、応答、状態、疾患、またはその他の生物学的パラメーターの低下を指す。これには、それだけに限らないが、活性、応答、状態、または疾患の完全な除去が含まれ得る。これには、天然のまたは対照のレベルと比較した、活性、応答、状態、または疾患のたとえば１０％の低減も含まれ得る。したがって、低減は、天然のまたは対照のレベルと比較した、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％、またはその間の任意の量の低減であってよい。
【００２０】
本明細書で用いる場合、「対象」は個体を意味する。したがって、「対象」には飼いならされた動物（たとえばネコ、イヌ等）、家畜（たとえばウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ等）、実験動物（たとえばマウス、ウサギ、ラット、モルモット等）、および鳥類が含まれ得る。「対象」には霊長類またはヒト等の哺乳類も含まれ得る。
【００２１】
「低減する」または「低減すること」もしくは「低減」等の他の形態の単語は、事象または特徴（たとえば腫瘍成長）を低下させることを意味する。これは典型的にはある標準的なまたは予想される値に関連し、言い換えればこれは相対的であるが、標準的なまたは相対的な値に言及することが必ずしも必要でないことが理解される。たとえば、「腫瘍成長を低減する」は、標準または対照と比較して腫瘍の成長の速度を低減させることを意味する。
【００２２】
「防止する」または「防止すること」もしくは「防止」等の他の形態の単語は、特定の事象もしくは特徴を停止させること、特定の事象もしくは特徴の進行もしくは進展を安定化させもしくは遅延させること、または特定の事象もしくは特徴が生じる機会を最小化することを意味する。防止は典型的にはたとえば低減よりも絶対的であるので、対照と比較する必要はない。本明細書で用いる場合、あるものは低減できるが防止できない。しかし低減されるものは防止される場合もある。同様に、あるものは防止できるが低減できない。しかし防止されるものは低減される場合もある。他に具体的に指示されない限り、低減または防止を用いる場合には他の単語の使用も明示的に開示されていると理解される。
【００２３】
本明細書で用いる用語「治療する」、「治療すること」、「治療」およびそれらの文法的変形には、疾患に付随する１つまたは複数の症状の強度を部分的にまたは完全に遅延し、軽減し、緩和し、または低減すること、および／または疾患の１つまたは複数の原因を軽減し、緩和し、または遅延することが含まれる。本発明による治療は防止的に、予防的に、緩和目的で、または救済的に適用することができる。予防的治療は発症に先立って（たとえば疾患の明らかな兆候の前に）、初期の発症の間に（たとえば疾患の最初の兆候および症状に際して）、または疾患の進行が成立した後に、対象に施行される。予防的投与は、感染の症状の顕在化に先立って数日〜数年の間、実施することができる。いくつかの例では、用語「治療する」、「治療すること」、「治療」およびそれらの文法的変形には、対象を治療する前と比較して、または一般的なもしくは研究対象の集団におけるそのような症状の発生率と比較して、リソソームの分解を部分的にまたは完全に救済すること、および／またはオートファジーの開始を増大させることが含まれる。低減は５％、１０％、２０％、３０％、４０％またはそれ超であってよい。
【００２４】
対象への「投与」には、治療剤を対象に導入しまたは送達する任意の経路が含まれる。投与は経口、局所的、静脈内、皮下、経皮（transcutaneous）、経皮（transdermal）、筋肉内、関節内、非経口、細動脈内、皮内、心室内、頭蓋内、腹腔内、病巣内、鼻腔内、直腸、膣、吸入により、埋め込んだリザーバを介して、非経口（たとえば皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、滑膜内、胸骨内、髄腔内、腹腔内、肝内、病巣内、および頭蓋内注射または注入手法）、その他を含む任意の好適な経路によって実施することができる。本明細書で用いる「並行投与」、「組み合わせ投与」、「同時投与」、または「同時に投与した」は、同じ時点で、または互いに本質的に直後に化合物を投与することを意味する。後者の場合、２つの化合物は、観察された結果が、これらが同時に投与された場合に得られる結果と区別できないほど十分に近い時間で投与される。「全身投与」は、たとえば循環系またはリンパ系の入り口を通して対象の身体の広範囲な面積（たとえば身体の５０％より広い）に薬剤を導入しまたは送達する経路を介して対象に薬剤を導入しまたは送達することを指す。対照的に、「局所投与」は、投与区域もしくは投与点の直近の区域に薬剤を導入しまたは送達する経路を介して対象に薬剤を導入しまたは送達し、全身的には治療的に有意な量で薬剤を導入しないことを指す。投与には自己投与および他者による投与が含まれる。
【００２５】
本明細書を通して識別語「第１の」および「第２の」は、開示した主題の種々の成分およびステップの区別を助けるためだけに用いられることが理解される。識別語「第１の」および「第２の」は、これらの用語が修飾する成分またはステップの任意の特定の順序、量、優先度、または重要性を意味することを意図していない。
【００２６】
本出願を通して、種々の出版物を参照している。これらの出版物の開示はそれらの全体が、本出願が関連する技術の状況をより完全に説明するために、参照により本出願に組み込まれる。開示した参考文献はまた、その参考文献が依拠する文章において議論された、参考文献の中に含まれる要素について、個別的かつ具体的に参照により本明細書に組み込まれる。
神経変性疾患を治療する方法
【００２７】
加齢関連疾患は疑いもなく２１世紀における生医学の単一で最大の課題である。６５歳を超える米国人の数は２０３０年までに７千万人、すなわち人口のほぼ２５％に達する１。現在のＣＤＣのデータは、６５歳を超える高齢者の３０％まで、および８５歳を超える高齢者の５０％で認知症が進行することを示唆している。その数が常に増加し続けるこれらの高齢者は、パーキンソン病、アルツハイマー病、およびその他の認知障害等の慢性進行性神経変性病態に直面することになる。これらの晩期発症型神経変性疾患の全てにおいて、加齢それ自体が群を抜いて単一で最大の共通危険因子である。
【００２８】
アルツハイマー病（ＡＤ）は認知症の主な原因であり、高齢米国人の８人に１人が罹患している。患者の僅か２％を占める遺伝型のＡＤには、ＡＤにおけるβ−アミロイド（Ａβ）の蓄積（プラーク）および異常にリン酸化されたタウ（タングル）の堆積を含む事象のカスケードが強く関わっていると見なされてきたが、散発的なＡＤ患者におけるＡβを標的とした最近の臨床試験は落胆させるものであった。しかし、加齢それ自体がＡＤの進行において単一で最大の危険因子であることは明らかである。
【００２９】
全ての主な加齢関連神経変性疾患はタンパク質症、すなわち脳における１つまたは複数のタンパク質（たとえばアルツハイマー病（ＡＤ）におけるアミロイド−βおよびタウ、レヴィー小体認知症におけるα−シヌクレイン、および前頭側頭認知症／筋委縮性軸索硬化症バリアント認知症（ＦＴＤ）におけるＴＢＰ４３）の異常な堆積によって特徴付けられる。これらの疾患の遺伝型では早期発症ファミリーは稀であるが、大部分の患者では散発性の晩期発症型疾患が進行する。現在のＣＤＣのデータは、６５歳を超える高齢者の３０％まで、および８５歳を超える高齢者の５０％で認知症が進行することを示しており、加齢それ自体がこれらの晩期発症型神経変性疾患（ＬＯ−ＮＤ）の単一で最大の危険因子であるという観察を支持する統計である。
【００３０】
脳は過剰なまたは損傷を受けたタンパク質を分解して除去する精巧なシステムを発達させてきた。タンパク質はユビキチン−プロテアソーム系またはオートファジー−リソソーム経路を介して細胞内で分解され得る（「自食作用」）。興味あることに、加齢とともに減退すると思われる１つの基礎的な生物学的プロセスがオートファジー、すなわち高度に協調され、進化的に保存されたプロセスであり、それにより真核細胞が細胞質成分を分解および再利用するためにリソソームに送達する。オートファジー（ここでは具体的にマクロオートファジー）は、栄養の欠乏およびその他の種類の細胞ストレスに応答して活性化され、高分子が再利用されること、および損傷を受けたオルガネラが分解されて除去されることを可能にする。
【００３１】
オートファゴソーム／リソソーム系はその未消化の内容物を細胞外スペースに放出することもでき、そこで未消化の内容物は星状膠細胞が発現し分泌したプロテアーゼによって分解され、またはグリア細胞によって細胞内で分解されるように取り込まれ、または血液またはリンパに輸出され得る。これらのプロセスのいずれかの障害により、細胞内封入体、細胞外凝集物、および潜在的な神経変性の形成がもたらされ得る。
【００３２】
加齢に関する別の基礎的特徴としては低グレードの炎症がある。高齢者の健康に関する有害な転帰がこの炎症誘発性状態の進行に強く随伴していることを示す証拠が増加している。老化した脳における炎症性サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の高いレベルは、認知機能の低下および認知の急速な減退に持続的に随伴している。さらに、ＩＬ−６遺伝子およびＩＬ−６受容体遺伝子はＡＤの危険遺伝子として同定されてきた。ＩＬ−６等の炎症経路活性化の循環マーカーは、多くの研究において虚弱、筋肉減少、能力低下、および早期死亡のリスクの増大にも随伴している。これに関して、老化した脳でＮＡＤＰＨオキシダーゼ（Ｎｏｘ）も増加していること、およびこの上方調節がＩＬ−６に依存していることが本明細書で示されている。反応性酸素種（ＲＯＳ）がプロテアソーム、オートファゴソーム／リソソーム系およびリソソームエキソサイトーシスによるタンパク質のクリアランスに影響を与えることが示されているので、老化した脳の海馬のタンパク質凝集物がｐ６２およびオートファゴソーム／リソソーム系からのさらなるタンパク質を含んでいるか、およびそれらの蓄積がＮｏｘ誘導ＲＯＳの結果としてのタンパク質のクリアランスの欠陥によるものかという疑問が生じた。本明細書では加齢関連リソソームの不全がＮＡＤＰＨオキシダーゼのＩＬ−６媒介活性化によることを示す。
【００３３】
老化した脳における炎症はリソソームの不全の進展を惹起し、これが未消化の内容物の細胞外における蓄積をもたらす。リソソームまたはその機能の何らかの障害を阻害することによって、細胞内封入体、細胞外凝集物、および潜在的な神経変性の量および大きさを顕著に低減させることができることが理解され、本明細書で企図されている。老化した脳においてＮｏｘによるＲＯＳの産生が増大したこと、およびＲＯＳはプロテオソームおよびオートファゴソーム／リソソーム系、ならびにリソソームエキソサイトーシスによってタンパク質のクリアランスに影響していることが知られていたことから、一態様では、このリソソーム障害の阻害および最終的には加齢関連神経変性疾患の治療は、少なくとも１つのＮＯＸアイソフォーム（たとえばＮｏｘ１、Ｎｏｘ２、Ｎｏｘ３、Ｎｏｘ４、および／またはＮｏｘ５）または下流のＮｏｘアイソフォームエフェクター（たとえばスーパーオキシドまたは過酸化水素等の反応性酸素種（ＲＯＳ）を阻害するステップを含んでよいことが理解され、本明細書で企図されている。したがって、対象における加齢依存性リソソーム障害を低減し、および／または加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、対象に治療剤を投与するステップを含み、治療剤がニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）−オキシダーゼ（ＮＯＸ）または下流のＮＯＸエフェクターを阻害する、方法が本明細書で開示される。
【００３４】
本明細書で用いる場合、開示した方法は任意の加齢依存性リソソーム障害（たとえば海馬のピラミッド状ニューロンおよびパルバルブミンインターニューロンに存在するリソソーム障害）および／または、それだけに限らないが、たとえばアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、１型脊髄小脳性運動失調、加齢関連認知症、レヴィー小体認知症、おそらく血管性認知症、前頭側頭認知症、および筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）等の神経変性疾患を含む先行する態様のいずれかの加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患の治療または阻害のために用いることができる。
【００３５】
リソソームまたはリソソームエフェクターの活性の障害は疾患の病理学的兆候が現れた後のみでなく、疾患が病理学的に発現する数日前、数週前、数か月前、または数年前にさえも起こり得るので、上記の方法は存在する神経変性疾患を治療として低減しまたは治療するためのみでなく、予防的に疾患の規模を阻害し、遅延させ、または低減し、および／または疾患の臨床的発現の発症を阻害しまたは遅延させるために用いることができることが企図される。したがって、一態様では、対象における加齢依存性リソソーム障害を低減し、および／または加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、対象に治療剤を投与するステップを含み、治療剤が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）−オキシダーゼ（ＮＯＸ）または下流のＮＯＸエフェクターを阻害し、治療剤が疾患の何らかの臨床的発現の少なくとも１、２、３、４、５、６、７日前、２、３、４週前、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月前、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０年またはそれ以上前に少なくとも１回投与される、方法が本明細書で開示される。対象における加齢依存性リソソーム障害を低減し、および／または加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、対象に治療剤を投与するステップを含み、治療剤が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）−オキシダーゼ（ＮＯＸ）または下流のＮＯＸエフェクターを阻害し、治療剤が疾患の何らかの臨床的発現の１、２、３、４、５、６、７日後、２、３、４週後、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２か月後、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０年またはそれ以上後に少なくとも１回投与される、方法も本明細書で開示される。
【００３６】
治療剤の効率は多数回の投与が効果的であり得ることが理解され、本明細書で企図されている。したがって、対象における加齢依存性リソソーム障害を低減し、および／または加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、対象に治療剤を投与するステップを含み、治療剤が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）−オキシダーゼ（ＮＯＸ）または下流のＮＯＸエフェクターを阻害し、治療剤が少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００回またはそれ以上投与される、方法が本明細書で開示される。投与は毎年、半年ごと、四半期ごと、毎月、週２回、毎週、毎日、１２時間ごと、８時間ごと、６時間ごと、５時間ごと、４時間ごと、３時間ごと、２時間ごと、１時間ごと、または自動化送達デバイスの一部として連続的に、行なってよい。
【００３７】
開示した方法は、Ｎｏｘの下流のエフェクターもしくは酵素活性を阻害すること、またはＮｏｘアイソフォームが集合しもしくはその酵素活性を実行することを阻害することができる任意の小分子、抗体、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、もしくはペプチド、またはそれらの任意の組み合わせを用いることができる。たとえば一態様では、薬剤はジフェニレンヨードニウム、アポシニン、２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６−ジオン（ＧＫＴ−８３１）、ラパマイシン、ジスムタザイム、カルボキシフラーレン（たとえばＣ６０等）のマロン酸誘導体、カルボキシフラーレン（たとえばＣ６０等）の酢酸誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む小分子であってよい。したがって一態様では、対象における加齢依存性リソソーム障害を低減し、および／または加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、対象に治療剤を投与するステップを含み、治療剤が、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドホスフェート（ＮＡＤＰＨ）−オキシダーゼ（ＮＯＸ）または下流のＮＯＸエフェクターを阻害し、治療剤が、ジフェニレンヨードニウム、アポシニン、２−（２−クロロフェニル）−４−［３−（ジメチルアミノ）フェニル］−５−メチル−１Ｈ−ピラゾロ［４，３−ｃ］ピリジン−３，６−ジオン（ＧＫＴ−８３１）、ラパマイシン、ジスムタザイム、カルボキシフラーレン（たとえばＣ６０等）のマロン酸誘導体、カルボキシフラーレン（たとえばＣ６０等）の酢酸誘導体、またはそれらの任意の組み合わせを含む、方法が本明細書で開示される。
【００３８】
リソソームに対して有害な影響を有するＮｏｘの一次エフェクターの１つは反応性酸素種（ＲＯＳ）であり、Ｎｏｘ阻害剤のいくつか（たとえばジスムタザイム、カルボキシフラーレン（たとえばＣ６０等）のマロン酸誘導体、カルボキシフラーレン（たとえばＣ６０等）の酢酸誘導体、および／またはそれらの任意の組み合わせ）が下流のＮｏｘエフェクターとしてＲＯＳを阻害するので、これらが有効であることがさらに理解され、本明細書で企図されている。しかしそのような阻害はＮｏｘが開始するＲＯＳに限られておらず、供給源に関わらず任意のＲＯＳであってよい。このＲＯＳの阻害、低減、および／または除去によってリソソーム機能を改善することができる。したがって、対象に治療剤（たとえばジスムタザイム、カルボキシフラーレン（たとえばＣ６０等）のマロン酸誘導体、カルボキシフラーレン（たとえばＣ６０等）の酢酸誘導体、および／またはそれらの任意の組み合わせ）を投与するステップを含む、対象におけるリソソーム機能を改善する方法であって、治療剤が、反応性酸素種を低減し、阻害し、および／または除去する、方法が本明細書で企図されている。
【００３９】
一態様では、加齢したヒト、マウス、ラット、およびサルの脳においてＩＬ−６が増加していることが理解され、本明細書で企図されている。さらに、ＩＬ−６の増加はＮｏｘの誘導に必要かつ十分である。したがって、Ｎｏｘの酵素活性または集合を阻害することができる１つの様式は、その誘導を防止することである。したがって一態様では、対象における加齢依存性リソソーム障害を低減し、リソソーム機能を改善し、オートファジーの開始を増大させ、および／または加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、対象に治療剤を投与するステップを含み、治療剤が、Ｎｏｘの集合および／または酵素活性を阻害し、治療剤が海馬のピラミッド状ニューロン中およびパルバルブミンインターニューロン中に存在するＩＬ−６の量を低下させ、海馬のピラミッド状ニューロン中およびパルバルブミンインターニューロン中のＩＬ−６の増加を阻害し、またはＩＬ−６によるＮｏｘの誘導を阻害する（すなわちＩＬ−６媒介Ｎｏｘ活性化を低減させ、それによりＮＯＸの阻害を惹起する）、方法が本明細書で開示される。たとえば、治療剤は抗ＩＬ−６抗体または小分子であってよい。たとえばＩＬ−６抗体はトシリズマブ、サリルマブ、オロキズマブ、エルシリモマブ、ＣＰＳＩ−２３６４、ガリエラクラクトン、および／またはシルクマブであってよい。
【００４０】
一態様では、ＩＬ−６はＳＴＡＴ３の活性化を介してＮＯＸを活性化することが理解され、本明細書で企図されている。したがって一態様では、加齢依存性リソソーム障害を低減し、リソソーム機能を改善し、オートファジーの開始を増大させ、および／または先行する態様のいずれかの加齢関連神経変性疾患、線維症、またはリウマチ性疾患を治療する方法であって、治療剤が、シグナル伝達兼転写活性化因子３（ＳＴＡＴ３）の阻害剤であり、治療剤が、ＳＴＡＴ３媒介ＮＯＸ活性化を低減し、それによりＮＯＸの阻害を惹起する、方法が本明細書で開示される。たとえば、治療剤は抗ＳＴＡＴ３抗体または小分子ＳＴＡＴ３阻害剤、たとえばニクロサミド、ＳＴＡＴ３阻害剤ＶＩ（Ｓ３１−２０１）、ＳＴＡ−２１、ＷＰ１０６６、ククルビタシンＩ、クルクミン、アウラノフィン、および／またはニフロキサジドであってよい。
【００４１】
１．抗体
（１）抗体一般
用語「抗体」は本明細書において広い意味に用いられ、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方を含む。インタクトな免疫グロブリン分子に加えて、免疫グロブリン分子の断片またはポリマー、および免疫グロブリン分子またはその断片のヒトバージョンまたはヒト化バージョンも、それらが下流のＮＯＸエフェクター（たとえばスーパーオキシド、過酸化水素、またはその他の反応性酸素種等）またはＮＯＸアイソフォーム（たとえばＮＯＸ１、ＮＯＸ２、ＮＯＸ３、ＮＯＸ４、またはＮＯＸ５等）と相互作用する能力によって選択され、それによりＮＯＸが集合しまたはその酵素活性を実行することが阻害されるならば、用語「抗体」に含まれる。抗体は、本明細書に記載したインビトロアッセイによって、または類似の方法によって、その所望の活性について試験することができ、その後で公知の臨床的試験方法によってインビボの治療および／または予防的な活性を試験することができる。ヒトの免疫グロブリンには５つの主要なクラス、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭがあり、そのいくつかはサブクラス（アイソタイプ）、たとえばＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、およびＩｇＧ−４、ＩｇＡ−１およびＩｇＡ−２等にさらに分割することができる。当業者であればマウスについても同様のクラスがあることを認識できる。異なったクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと称される。
【００４２】
本明細書で用いる用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち集団の中の個別の抗体は抗体分子の中の小さなサブセットに存在する可能性のある天然発生の変異を除いて同一である。本明細書におけるモノクローナル抗体は特に、これらが所望のアンタゴニスト活性を示す限り、重鎖および／または軽鎖の一部が特定の種に由来するか特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同であり、鎖の残りの部分が別の種に由来するか別の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一または相同である、「キメラ」抗体、ならびにそのような抗体の断片を含む。
【００４３】
開示したモノクローナル抗体は、モノクローナル抗体を産生する任意の手順を用いて作製することができる。たとえば、開示したモノクローナル抗体は、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されたようなハイブリドーマ法を用いて調製することができる。ハイブリドーマ法では、典型的にはマウスまたはその他の適切な宿主動物を免疫化剤で免疫化して、免疫化剤と特異的に結合する抗体を産生しまたは産生することができるリンパ球を誘起する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。
【００４４】
モノクローナル抗体は組み換えＤＮＡ法で作製してもよい。開示したモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離しシーケンシングすることができる（たとえばマウス抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）。抗体または活性な抗体断片のライブラリーは、たとえばBurtonらの米国特許第５８０４４４０号明細書およびBarbasらの米国特許第６０９６４４１号明細書に記載されているように、ファージディスプレイ手法を用いて生成し、スクリーニングすることもできる。
【００４５】
インビトロ法は一価の抗体を調製するためにも好適である。抗体の断片、特にＦａｂ断片を産生するための抗体の消化は、当技術で公知の通常の手法を用いて達成することができる。たとえば、消化はパパインを用いて実施することができる。パパイン消化の例は１９９４年１２月２２日に公開された国際公開第９４／２９３４８号パンフレットおよび米国特許第４３４２５６６号明細書に記載されている。抗体のパパイン消化により、典型的にはそれぞれが単一の抗原結合部位を有するＦａｂ断片と称される２つの同一の抗原結合断片および残りのＦｃ断片が産生される。ペプシン処理では２つの抗原結合部位を有しなお抗原を架橋することができる断片が得られる。
【００４６】
本明細書で用いる場合、用語「抗体またはその断片」は、二重もしくは多重の抗原またはエピトープ特異性を有するキメラ抗体およびハイブリッド抗体、ならびにハイブリッド断片を含むＦ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ等の断片を包含する。したがって、それらの特定の抗原と結合する能力を保持した抗体の断片が提供される。たとえば、下流のＮＯＸエフェクター活性（たとえばスーパーオキシド、過酸化水素、またはその他の反応性酸素種等）またはＮＯＸアイソフォーム（たとえばＮＯＸ１、ＮＯＸ２、ＮＯＸ３、ＮＯＸ４、またはＮＯＸ５等）阻害を維持し、それによりＮＯＸが集合しまたはその酵素活性を実行することが阻害される、抗体の断片は、用語「抗体またはその断片」の意味に含まれる。そのような抗体および断片は当技術で公知の手法によって作製することができ、実施例で説明する方法および抗体を産生し特異性および活性について抗体をスクリーニングする一般的な方法に従って特異性および活性についてスクリーニングすることができる（Harlow and Lane. Antibodies, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Publications, New York, (1988)を参照されたい）。
【００４７】
抗体断片と抗原結合タンパク質とのコンジュゲート（一本鎖抗体）も「抗体またはその断片」の意味に含まれる。
【００４８】
断片は、他の配列に結合していてもいなくても、抗体または抗体断片の活性が改変されていない抗体または抗体断片と比較して顕著に変化しまたは障害されない限り、特定の領域または特定のアミノ酸残基の挿入、欠失、置換、またはその他の選択された改変を含んでもよい。これらの改変によって、たとえばジスルフィド結合が可能なアミノ酸を除去／追加し、その生体内持続性を増大し、その分泌特性を変化させる等のために、いくつかの追加的特質を提供することができる。いずれの場合でも、抗体または抗体断片はその同族抗原に対する特異的結合等の生体活性特質を保有していなければならない。抗体または抗体断片の機能性または活性領域は、そのタンパク質の特定の領域の変異ならびにそれに続く発現および発現したポリペプチドの試験によって同定することができる。そのような方法は当業者には容易に明白であり、抗体または抗体断片をコードする核酸の部位特異的変異が含まれ得る（Zoller, M.J. Curr. Opin. Biotechnol. 3:348-354, 1992）。
【００４９】
本明細書で用いる場合、用語「抗体」（単数および複数）は、ヒト抗体および／またはヒト化抗体を指すこともある。多くの非ヒト抗体（たとえばマウス、ラット、またはウサギ由来の抗体）は当然ながらヒトに対して抗原性があり、したがってヒトに投与した場合には望ましくない免疫応答を生じることがある。したがって、本方法においてヒト抗体またはヒト化抗体を用いることは、ヒトに投与された抗体が望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を低減させるという目的を果たす。
【００５０】
（２）ヒト抗体
開示したヒト抗体は任意の手法を用いて調製することができる。開示したヒト抗体はトランスジェニック動物から得ることもできる。たとえば、免疫化に応答してヒト抗体の完全なレパートリーを産生することができるトランスジェニックな変異マウスが記載されている（たとえばJakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551-255 (1993)、Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993)、Bruggermann et al., Year in Immunol., 7:33 (1993)を参照されたい）。具体的には、これらのキメラおよび生殖細胞系変異マウスにおける抗体重鎖連結領域（Ｊ（Ｈ））遺伝子のホモ接合性欠失によって内因性抗体産生が完全に阻害され、そのような生殖細胞系変異マウスへのヒト生殖細胞系抗体遺伝子アレイの移送が成功したことによって、抗原攻撃の際にヒト抗体が産生されるという結果がもたらされる。所望の活性を有する抗体は、本明細書に記載するようにＥｎｖ−ＣＤ４−ｃｏ−受容体複合体を用いて選択される。
【００５１】
（３）ヒト化抗体
抗体のヒト化手法には、一般に抗体分子の１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードするＤＮＡ配列を操作する組み換えＤＮＡ技術の使用が含まれる。したがって、非ヒト抗体（またはその断片）のヒト化形態は、ヒト（レシピエント）抗体のフレームワークに一体化された非ヒト（ドナー）抗体の抗原結合部位の一部を含む、キメラ抗体または抗体鎖（またはその断片、たとえばｓＦｖ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、または抗体のその他の抗原結合部分）である。
【００５２】
ヒト化抗体を生成するためには、レシピエント（ヒト）抗体分子の１つまたは複数の相補性決定領域（ＣＤＲ）由来の残基を、所望の抗原結合特性（たとえば標的抗原に対する一定レベルの特異性および親和性）を有していることが知られているドナー（非ヒト）抗体分子の１つまたは複数のＣＤＲの残基で置き換える。いくつかの例では、ヒト抗体のＦｖフレームワーク（ＦＲ）残基を、対応する非ヒト残基で置き換える。ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも導入されたＣＤＲもしくはフレームワーク配列にも見られない残基を含んでもよい。一般に、ヒト化抗体は非ヒトの供給源からその中に導入された１つまたは複数のアミノ酸残基を有する。実際、ヒト化抗体は典型的には、いくつかのＣＤＲ残基およびおそらくいくつかのＦＲ残基がげっ歯類の抗体の類似の部位の残基によって置換されたヒト抗体である。ヒト化抗体は一般に、典型的にはヒト抗体の定常領域（Ｆｃ）である抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいる（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)、Reichmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)、およびPresta, Curr. Opin. Struct. Biol., 2:593-596 (1992)）。
【００５３】
非ヒト抗体をヒト化する方法は当技術で周知である。たとえば、ヒト化抗体はWinterおよび共同研究者らの方法（Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986)、Riechmann et al., Nature, 332:323-327 (1988)、Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (1988)）に従ってげっ歯類のＣＤＲまたはＣＤＲ配列を対応するヒト抗体の配列で置換することによって、生成することができる。ヒト化抗体を産生するために用いることができる方法は、米国特許第４８１６５６７号明細書（Cabillyら）、米国特許第５５６５３３２号明細書（Hoogenboomら）、米国特許第５７２１３６７号明細書（Kayら）、米国特許第５８３７２４３号明細書（Deoら）、米国特許第５９３９５９８号明細書（Kucherlapatiら）、米国特許第６１３０３６４号明細書（Jakobovitsら）、および米国特許第６１８０３７７号明細書（Morganら）にも記載されている。
【００５４】
２．薬学的担体／薬学的産物の送達
上記のように、組成物は薬学的に許容される担体の中でインビボで投与することもできる。「薬学的に許容される」は、生物学的またはその他に望ましくない材料でないことを意味し、すなわち材料は望ましくない生物学的影響を惹起せず、またはそれが含まれる薬学的組成物の中の他の成分のいずれとも有害な様式で相互作用せずに、核酸またはベクターとともに対象に投与することができる。担体は、当業者には周知のように、活性成分のいかなる劣化も最小化され、対象におけるいかなる有害な副作用も最小化されるように、当然ながら選択される。
【００５５】
組成物は経口、非経口（たとえば静脈内）、筋肉内注射、腹腔内注射、経皮、体外、局所的等、例えば局所的鼻腔内投与または吸入による投与で投与することができる。本明細書で用いる場合、「局所的鼻腔内投与」は、鼻孔の一方または両方を通して鼻および鼻道に組成物を送達することを意味し、噴霧機構もしくは液滴機構、または核酸もしくはベクターのエアロゾル化による送達を含み得る。吸入による組成物の投与は、噴霧または液滴機構による送達を介して鼻または口から行なうことができる。送達は挿管を介して呼吸器系（たとえば肺）の任意の区域に直接行なうこともできる。必要な組成物の正確な量は、対象の種、年齢、体重、および一般的病態、治療すべきアレルギー障害の重症度、用いる特定の核酸またはベクター、その投与の方式、その他に応じて、対象ごとに異なることになる。したがって、それぞれの組成物について正確な量を特定することはできない。しかし適切な量は本明細書の教示を前提として通常の実験のみを用いて当業者によって決定することができる。
【００５６】
組成物の非経口投与は、用いる場合には一般に注射によって特徴付けられる。注射剤は従来の形態で、液体溶液もしくは懸濁液、注射前の液体中の懸濁液の溶液に好適な固体形態、またはエマルジョンとして、調製することができる。非経口投与のための最近改訂されたアプローチには、一定用量を維持するための徐放システムまたは持続放出システムの使用が含まれる。たとえば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第３６１０７９５号明細書を参照されたい。
【００５７】
材料は溶液、懸濁液（たとえばミクロ粒子、リポソーム、または細胞に組み込まれた）であってよい。これらは抗体、受容体、または受容体リガンドを介して特定の細胞型に標的化される。以下の参考文献は、特定のタンパク質を腫瘍組織に標的化するためのこの技術の使用の例である（Senter, et al., Bioconjugate Chem., 2:447-451, (1991)、Bagshawe, K.D., Br. J. Cancer, 60:275-281, (1989)、Bagshawe, et al., Br. J. Cancer, 58:700-703, (1988)、Senter, et al., Bioconjugate Chem., 4:3-9, (1993)、Battelli, et al., Cancer Immunol. Immunother., 35:421-425, (1992)、Pietersz and McKenzie, Immunolog. Reviews, 129:57-80, (1992)およびRoffler, et al., Biochem. Pharmacol, 42:2062-2065, (1991)）。「ステルス」およびその他の抗体コンジュゲートリポソーム（結腸癌への脂質媒介薬物標的化を含む）等のビヒクル、細胞特異的リガンドによるＤＮＡの受容体媒介標的化、リンパ球によって導かれる腫瘍標的化、およびインビボにおけるマウスグリオーマ細胞の高度に特異的な治療用レトロウイルスの標的化。以下の参考文献は、特異的タンパク質を腫瘍組織に標的化するためのこの技術の使用の例である（Hughes et al., Cancer Research, 49:6214-6220, (1989)およびLitzinger and Huang, Biochimica et Biophysica Acta, 1104:179-187, (1992)）。一般に、エンドサイトーシスの経路には、構成的またはリガンド誘導的に、受容体が関与している。これらの受容体はクラスリンで被覆されたピットに集積し、クラスリンで被覆されたベシクルを介して細胞に進入し、その中で受容体が分類される酸性化されたエンドソームを通過して、細胞表面にリサイクルされるか、細胞内に保存されるか、またはリソソームの中で分解される。内在化経路は、栄養の取り込み、活性化されたタンパク質の除去、高分子のクリアランス、ウイルスおよび毒素の日和見的進入、リガンドの解離および分解、ならびに受容体レベル調節等の様々な機能を提供する。多くの受容体は細胞型、受容体の濃度、リガンドの型、リガンド価数、およびリガンドの濃度に応じて２つ以上の細胞内経路をたどる。受容体媒介エンドサイトーシスの分子的および細胞的な機序がレビューされている（Brown and Greene, DNA and Cell Biology 10:6, 399-409 (1991)）。
【００５８】
ａ）薬学的に許容される担体
抗体を含む組成物は薬学的に許容される担体と組み合わせて治療的に用いることができる。
【００５９】
好適な担体およびその製剤は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy (19th ed.) ed. A.R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA 1995に記載されている。典型的には、製剤を等張にするために、適切な量の薬学的に許容される塩が製剤に用いられる。薬学的に許容される担体の例としては、それだけに限らないが、食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液が挙げられる。溶液のｐＨは好ましくは約５〜約８、より好ましくは約７〜約７．５である。さらなる担体には、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックス等の持続放出調製物が含まれ、このマトリックスは成形した物品、たとえばフィルム、リポソーム、またはミクロ粒子の形態である。たとえば投与経路および投与される組成物の濃度に応じてある特定の担体がより好ましい場合があることは、当業者には明白であろう。
【００６０】
薬学的担体は当業者には公知である。これらは最も典型的には無菌水、食塩水、および生理的ｐＨの緩衝溶液等の溶液を含む、薬物をヒトに投与するための標準的な担体である。組成物は筋肉内または皮下に投与することができる。その他の化合物は当業者によって用いられる標準的な手順に従って投与されることになる。
【００６１】
薬学的組成物は選択した分子に加えて担体、増粘剤、希釈剤、緩衝剤、保存剤、表面活性剤、その他を含んでもよい。薬学的組成物はまた、抗微生物剤、抗炎症剤、麻酔剤、その他等の１つまたは複数の活性成分を含んでもよい。
【００６２】
薬学的組成物は局所または全身のいずれの治療が望ましいか、および治療すべき区域に応じていくつかの経路で投与してよい。投与は局所的（眼内、膣内、直腸内、鼻腔内を含む）、経口、吸入または非経口、たとえば静脈内点滴、皮下、腹腔内、または筋肉内注射であってよい。開示した抗体は静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、空腔内、または経皮投与することができる。
【００６３】
非経口投与のための調製物には、無菌の水性または非水性の溶液、懸濁液、およびエマルジョンが含まれる。非水性溶媒の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、オリーブ油等の植物油、およびエチルオレエート等の注射可能な有機エステルが挙げられる。水性担体には食塩水および緩衝媒体を含む水、アルコール性／水性溶液、エマルジョン、または懸濁液が含まれる。非経口ビヒクルには塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、ラクテート化リンゲル、または固定油が含まれる。静脈内ビヒクルには流体および栄養補給剤、電解質補給剤（リンゲルデキストロース系のもの等）、その他が含まれる。保存剤およびその他の添加剤、たとえば抗微生物剤、抗酸化剤、キレート化剤、不活性ガス、その他が存在してもよい。
【００６４】
局所的投与のための製剤は、軟膏、ローション、クリーム、ゲル、滴剤、坐剤、スプレー、液体、および粉末を含んでよい。従来の薬学的担体、水性、粉末状もしくは油状の基剤、増粘剤、その他が必要または望ましい。
【００６５】
経口投与のための組成物には粉末または顆粒、水もしくは非水性媒体中の懸濁液または溶液、カプセル、サシェ、または錠剤が含まれる。増粘剤、香味剤、希釈剤、乳化剤、分散助剤、または結合剤が望ましい。
【００６６】
組成物のいくつかは、塩酸、臭化水素酸、過塩素酸、硝酸、チオシアン酸、硫酸、およびリン酸等の無機酸、ならびにギ酸、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、乳酸、ピルビン酸、シュウ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、およびフマル酸等の有機酸との反応によって、または水酸化ナトリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カリウム等の無機塩基およびモノ−、ジ−、トリ−アルキルおよびアリールアミンならびに置換エタノールアミン等の有機塩基との反応によって形成された、薬学的に許容される酸または塩基付加塩として投与してよい場合がある。
【００６７】
ｂ）治療用途
組成物を投与するための効果的な用量およびスケジュールは実験的に決定することができ、そのような決定を行なうことは当技術の範囲内である。組成物の投与のための用量範囲は障害の症状が影響を受ける望ましい効果を産生するために十分大きな用量である。用量は望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応等の有害な副作用を惹起するほど大きくてはならない。一般に、用量は患者の年齢、病態、性別、および疾患の程度、投与経路、または他の薬物がレジメンに含まれているかによって異なり、当業者によって決定することができる。禁忌事象があれば個別の医師によって用量を調整してよい。用量は変動してもよく、１日または数日にわたって毎日、１回または複数の用量投与で投与してよい。ガイダンスは所与の医薬製品のクラスについての適切な用量に関する文献の中で見ることができる。たとえば、抗体の適切な用量を選択するためのガイダンスは、抗体の治療用途に関する文献、たとえばHandbook of Monoclonal Antibodies, Ferrone et al., eds., Noges Publications, Park Ridge, N.J., (1985) ch. 22 and pp. 303-357、Smith et al., Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al., eds., Raven Press, New York (1977) pp. 365-389で見ることができる。単独で用いる抗体の典型的な日用量は、上記の要因によるが１日あたり約１μｇ／ｋｇ体重〜１００ｍｇ／ｋｇ体重またはそれ以上の範囲である。
【実施例】
【００６８】
以下の実施例は、本明細書で特許を請求する化合物、組成物、物品、デバイス、および／または方法がどのように作製され評価されるかについての完全な開示および説明を当業者に提供するために提示するもので、純粋に例示的であることを意図しており、本開示を限定することを意図するものではない。数値（たとえば量、温度等）については正確であることを保証するための努力を払っているが、いくらかの誤差および偏差を考慮する必要がある。他に指示しない限り、部は重量部であり、温度は℃または周囲温度であり、圧は大気圧またはその付近である。
【００６９】
[実施例１]マウスの海馬におけるタンパク質凝集物の加齢依存性の蓄積はＮＡＤＰＨオキシダーゼの阻害によって低減される。
脳は過剰なまたは損傷を受けたタンパク質を分解して除去する精巧なシステムを発達させてきた。タンパク質はユビキチン−プロテアソーム系またはオートファジー−リソソーム経路を介して細胞内で分解され得る。オートファゴソーム／リソソーム系はその未消化の内容物を細胞外スペースに放出することもでき、そこで未消化の内容物は星状膠細胞が発現し分泌したプロテアーゼによって分解され、またはグリア細胞によって細胞内で分解されるように取り込まれ、または血液またはリンパに輸出される。これらのプロセスのいずれかが障害されると、細胞内封入体、細胞外プラーク、および潜在的な神経変性プロセスの形成がもたらされ得る。
【００７０】
一致した証拠によれば、タンパク質のクリアランス、特にリソソームによる分解の効率は、加齢および神経変性疾患の両方において次第に低くなることが示唆されている。ゲノムワイド関連解析（ＧＷＡＳ）によって、アルツハイマー病（ＡＤ）の危険遺伝子としてのリソソーム遺伝子（ＣＬＵ、ＢＩＮ１、およびＰＩＣＡＬＭを含む）が同定され、パーキンソン病（ＰＤ）の危険遺伝子としてその他のいくつかのリソソーム関連遺伝子が同定された。脳由来のエキソソームである分泌された膜局在ベシクルに関する研究により、ＡＤの発症前１０年までの患者でリソソームタンパク質（Ｌａｍｐ２およびユビキチン）のレベルが上昇していることが見出された。これらの結果は、老化した脳ではこれらの神経変性疾患の特徴である病理学的変化の発症の数年前にリソソーム機能不全が起こり得ることを示唆している。正常な高齢動物の脳において種を超えて細胞内リポフスチンおよび細胞外タンパク質凝集物が観察されることから推察されるように、タンパク質のクリアランスの減退は正常な加齢でも起こるようである。細胞外タンパク質凝集は周期的な酸−シッフ陽性顆粒として最初に同定され、続いてニューロンおよびグリア細胞の両方に起因していることが示された。これらの凝集物中で検出されたタンパク質の中には、ｐ６２／セケストソーム−１、すなわちタンパク質のトラフィッキングおよびオートファジーに関与する多機能タンパク質が存在する。ｐ６２はユビキチン化されたタンパク質に結合して隔離することができ、これが後に放出されてプロテオソームによって分解され、またはその代わりにオートファジー経路によって分解される。タンパク質凝集物の中にｐ６２が存在することは、高齢マウスの海馬がオートファゴソームのカーゴを効率よく除去することができないことを暗示しており、それはおそらくリソソームタンパク質の分解が減退しているためと考えられる。タンパク質のクリアランスのそのような加齢依存性の減退は、正常な加齢および神経変性疾患に関する共通のテーマであり得る。
【００７１】
加齢に関する別の基礎的特徴としては低グレードの炎症がある。高齢者の健康に関する有害な転帰がこの炎症誘発性状態の進行に強く随伴していることを示す証拠が増加している。炎症性サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の高いレベルは、認知機能の低下および認知の急速な減退と一貫して随伴している。さらに、ＩＬ−６遺伝子およびＩＬ−６受容体遺伝子はＡＤの危険遺伝子として同定されてきた。ＩＬ−６等の炎症経路活性化の循環マーカーは、多くの研究において虚弱、筋肉減少、能力低下、および早期死亡のリスクの増大にも随伴している。これに関して、老化した脳でＮＡＤＰＨオキシダーゼ（Ｎｏｘ）も増加していること、およびこの上方調節がＩＬ−６に依存していることが本明細書で示されている。反応性酸素種（ＲＯＳ）がプロテアソーム、オートファゴソーム／リソソーム系およびリソソームエキソサイトーシスによるタンパク質のクリアランスに影響を与えることが示されているので、老化した脳の海馬のタンパク質凝集物がｐ６２およびオートファゴソーム／リソソーム系からのさらなるタンパク質を含んでいるか、およびそれらの蓄積がＮｏｘ誘導ＲＯＳの結果としてのタンパク質のクリアランスの欠陥によるものかという疑問が生じた。
【００７２】
ａ）方法
（１）材料
以下の抗体を用いた。ウサギ抗パルバルブミン（Ｓｗａｎｔ社、ＰＶ−２５）、マウスモノクローナル抗パルバルブミン（Ｓｗａｎｔ社、ＰＶ−２３５）、ウサギ抗カルレチニン（Ｓｗａｎｔ社、７６９９／４）、ウサギ抗ｐ６２（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ００６７）、ウサギ抗ＬＣ３Ｂ（Ｓｉｇｍａ社、Ｌ７５４３）、マウスｍａｂ抗パーキン（Parkin）（Ａｂｃａｍ社、ａｂ７７９２４）、ウサギ抗ピンク１（Ａｂｃａｍ社、ａｂ２３７０７）、ウサギｍａｂ抗ｌａｍｐ２ｂ（Ａｂｃａｍ社、ａｂ１２５０６８）、マウスｍａｂ抗チトクロームＰ４５０（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ｍａｂ１００３７）、マウスｍａｂ抗リーリン（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ｍａｂ５３６４）、マウスｍａｂ抗ＧＡＤ６７（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ｍａｂ５４０６）、ウサギ抗α−シヌクレイン（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社、ａｂ５０３８）、ウサギ抗Ｉｂａ（Ｗａｋｏ社、０１９−１９７４１）、およびラットｍａｂ抗ＧＦＡＰ（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ社、３４５８６０）。ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤおよびＤＡＰＩ封入剤を含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤはＶｅｃｔｏｒ  Ｌａｂ社（Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）から入手した。Ｔｙｒａｍｉｄｅ  Ｓｉｇｎａｌ  Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ（ＴＳＡ）プラスフルオレセインおよびシアニン−３のキットはＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）から入手した。
【００７３】
（２）マウス
動物実験はカリフォルニア大学サンディエゴおよびバンダービルト大学メディカルセンターのＡｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  Ｐｒｏｇｒａｍの承認を得て、ＰＨＳ  Ｇｕｉｄｅ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ａｎｉｍａｌｓ、ＵＳＤＡ  ＲｅｇｕｌａｔｉｏｎｓおよびＡＶＭＡ  Ｐａｎｅｌ  ｏｎ  Ｅｕｔｈａｎａｓｉａに従って行なった。若齢（３〜５月齢）および高齢（１７〜２７月齢）のＣ５７ＢＬ／６マウス、Ｔａｍ−Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｃｒｅ、ｔｄＴｏｍａｔｏまたは２４月齢のＧＦＡＰ／ＧＦＰトランスジェニックマウス（ＪＡＸ、０１０８３５）を実験に用いた。Ｔａｍ−Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｃｒｅを有する系統はＴｈｙ１プロモーターの制御下でＣｒｅリコンビナーゼおよびＹＦＰの両方を発現し、これが大部分の海馬および皮質の興奮性ニューロンにおける発現を駆動するが、抑制性ニューロンの発現は駆動しない。Ｔａｍ−Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｃｒｅ：Ｓｔａｔ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ（ＴＦ）マウスが生成され、Ｒｏｓａ２６−ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウス系統とも交差して、Ｔａｍ−Ｔｈｙ１−ＹＦＰ−Ｃｒｅ：Ｓｔａｔ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ：ｔｄＴｏｍ（ＴＦＴＤ）マウスが産生された。これらのレポーターマウスはタモキシフェンに応答してｔｄＴｏｍ蛍光を発現することになる。マウスをイソフラレンで深く麻酔し、その後氷冷したリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で心臓を経由して灌流した。ＰＢＳでフラッシュした後、マウスを０．０１Ｍ  ＰＢＳ中４％のＰＦＡ溶液で１０分間、さらに灌流した。脳を全体として取り出し、４％のＰＦＡで、４℃で終夜、後固定し、その後ビブラトームを用いて５０μｍの切片にスライスした。免疫染色のための処理の準備ができるまで、切片を３０％のスクロース、３０％のエチレングリコール、および１％のＰＶＰ−４０の中に−２０℃で保持した。
【００７４】
（３）アポシニンによる処理
マウスを１２月齢から始めて５か月間、飲水中のアポシニン（初期用量５ｍｇ／ｋｇ、次いで１００ｍｇ／ｋｇまで増加）で処置した。次いでマウスをＰＢＳ、次にＰＦＡで灌流し、１７月齢で脳を摘出した。
【００７５】
（４）免疫蛍光
切片を１０ｍＭクエン酸緩衝液（ｐＨ６．０）中、９０℃で１０分加熱することにより、大部分の抗原について抗原回復法を実施した。次いで内因性ペルオキシダーゼの活性を不活化するためにＰＢＳ中３％のＨ２Ｏ２および１０％のエタノールで１５分、切片を処理し、ＰＢＳ中２％のウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で室温で１時間ブロッキングし、続いてブロッキング緩衝液中で一次抗体（蛍光二次抗体による検出では１：５００〜１：６０００に希釈、ＴＳＡ検出では５０００〜１０００００倍に希釈）と４℃で終夜ないし７２時間の期間、インキュベートした。次いで切片を洗浄し、ＰＢＳ中２％のＢＳＡおよび０．３％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００と、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８もしくは５６８コンジュゲート二次抗体（１μｇ／ｍｌ）またはＨＲＰコンジュゲート二次抗体（１：３０００）で、室温で２時間、染色した。ＨＲＰコンジュゲート二次抗体については、フルオレセインまたはシアニン３ＴＳＡ増幅システムで蛍光を発色させた。同種の一次抗体を用いるマウス脳の切片の二重蛍光染色のため、高度希釈抗体を用いてＴＳＡによって１つの抗原を検出し、続いて通常の蛍光免疫染色によって第２の抗原、通常ｐ６２を検出した。切片を洗浄してＤＡＰＩを含むＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ封入剤とともに清潔な顕微鏡スライドにマウントした。
【００７６】
（５）顕微鏡および画像解析
画像はＺｅｉｓｓ社のＬＳＭ５１０またはＬＳＭ８１０マルチフォトンレーザー共焦点顕微鏡を用いて捕捉した。チオフラビンＳについては、４５８ｎｍのレーザー線で励起し、４８０〜５２０ｎｍで蛍光を検出した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ４８８およびフルオレセインＴＳＡについては、４８８ｎｍのレーザー線で励起し、５００〜５５０ｎｍの蛍光を検出した。Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ５６８またはシアニン３ＴＳＡについては、５４３ｎｍのレーザー線で励起し、５６０ｎｍより長い波長の蛍光を検出した。リポフスチンについては、４５８ｎｍのレーザー線で励起し、５７１〜６０６ｎｍの蛍光を検出した。それぞれの実験について共焦点顕微鏡の設定は一定に保った。次いで画像を解析し、ＭｅｔａｍｏｒｐｈまたはＦｉｊｉソフトウェアを用いて処理した。ｐ６２含有凝集物のクラスターを定量するため、各群に４匹のマウスを用いてマウス１匹あたり３個の切片から６個の海馬領域について画像を取得した。海馬領域を異なったサブ領域に分割し、ｐ６２クラスターを計数した。写真を閾値化した後、クラスターを個別に囲い、Ｆｉｊｉを用いて有効面積を測定した。次に各サブ領域における凝集クラスターの面積を合計した。比較的加齢していないマウスにおいて、凝集の大部分はサブ領域で形成されていたので、強調したサブ領域（図５Ａ）の凝集の面積およびクラスターの数を提示した。解析者は試料について知らされていなかった。
【００７７】
（６）イムノブロット
急速凍結した海馬組織から組織溶解物を調製した。組織を解凍し、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ社、０４  ４９３１２４００１）を含む冷却したＳｕｐｅｒＲＩＰＡ緩衝液（１０ｍＭのリン酸塩緩衝液、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＥＧＴＡ、１％のＩｐｅｇａｌ−６３０、１％のデオキシコール酸、０．５％のＳＤＳ、１ｍＭのモリブデン酸、および１ｍＭのＤＴＴ）の中でホモジナイズした。１２０００ＲＰＭで１０分遠心分離することによって、組織溶解物を清澄にした。タンパク質の濃度はＢＣＡプロテインアッセイキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、２３２２５）によって決定した。２０〜４０μｇのタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥに供し、ＰＶＤＦ膜に移送し、０．１％のＴＢＳ−Ｔｗｅｅｎ中の５％の脱脂肪ミルクで室温、１時間ブロックし、一次抗体で４℃、終夜、プロービングした。一次抗体とインキュベートした後、西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体で、室温で１時間、ブロットをプロービングし、Ｐｉｅｒｃｅ社のＥＣＬウェスタンブロット基質（３２１０６）で可視化した。
【００７８】
（７）統計解析
全ての統計はＳｉｇｍａＰｌｏｔ１１．０を用いて実施した。
ｂ）結果
（１）加齢マウスの海馬におけるクラスター化したタンパク質凝集物
【００７９】
以下に示すように、加齢マウスはｐ６２を含む堆積したリソソームタンパク質の大きな（１００〜３００μｍ）クラスター／凝集物を示す（図１）。これらの凝集物は海馬全体で観察され、高齢動物ではその構造のかなりの割合を覆っていた。ｐ６２凝集物の脳への蓄積は高齢ラット、ヒト、および無脊椎動物（すなわち、ショウジョウバエではｐ６２のオルソログであるＲｅｆ（２）Ｐ）で以前に報告されていた。マウスの脳におけるオートファジーを可視化するため、オートファジーに関与し、オートファゴソームで富化されるタンパク質であるｐ６２に対する抗体で脳の切片を染色した。ｐ６２の蛍光は海馬のピラミッド状ニューロンと局所のインターニューロンで観察され、後者の強度が大きかった。高拡大では、若齢と高齢の両方のマウスにおいて、ピラミッド状ニューロンとインターニューロンの体細胞で点状の蛍光が観察された。これらの点は加齢マウスで顕著なリポフスチン体とは区別された。高齢マウスの海馬では、ｐ６２ならびに脂質化されたＬＣ３Ｂ形態であるＬＣ３ＢＩＩの全体のレベルが僅かに増加していた。さらに、若齢と高齢の両方のマウスの海馬の抽出物で、ＬＣ３ＢＩＩのレベルはインタクトなＬＣ３ＢＩのレベルと比較して低かった。これらをまとめると、老化した脳のオートファゴソームの全体のレベルは顕著に増加しなかったが、加齢の間のパルバルブミンニューロンのオートファゴソームが優先的に増加する可能性がある。
【００８０】
高齢マウスと若齢マウスとの間のｐ６２の染色の顕著な相違は、高齢マウスではクラスター化した顆粒状凝集物が観察されたが、若齢マウスではそれがないことである（図１Ａ、図１Ｂ、および図１Ｃ）。これは１年齢のマウスでも見られた。この特定のパターンは海馬および梨状皮質で観察された。高分解能のイメージング（図１Ｄ）により、これらの凝集物は小さな３〜８μｍの堆積物からできていることが示された。ｐ６２はリソソームによって優先的に分解され、リソソームのタンパク質分解活性が障害されると急速に蓄積するので、このことはリソソームが内容物を効率的に分解していなかったこと、および他のタンパク質「カーゴ」も分解を逃れることができたことを示した。
【００８１】
（２）ｐ６２陽性凝集物中のさらなるオートファジー関連タンパク質
これらの凝集物の考えられる起源を、ｐ６２ならびにマイトファジーおよびＰＤに関与しているタンパク質であるパーキンの免疫染色によってさらに検討した。パーキンは本質的に全てのｐ６２陽性凝集物中に存在していた（図２Ａ、図２Ｂ、図２Ｃ、図２Ｄ、および図２Ｂ）。リーリン、パルバルブミン（ＰＶ）、ピンク１、ｐ４５０、カルレチニン、およびα−シヌクレイン等のいくつかの他のタンパク質も凝集物中に見出された。このことはカーゴタンパク質のリソソームによる分解の全体的な欠陥と一致している。凝集物中のタンパク質の共局在化の程度を定量するため、利用可能なＩｍａｒｉｓ  ＣｏＬｏｃ画像解析ソフトウェアをＰｅａｒｓｏｎの相関係数（ＰＣＣ）とともに用いた。ｐ６２およびパーキンについての計算を図２Ｆおよび図２Ｇに示す。
【００８２】
（３）マウスの海馬中のタンパク質凝集物の細胞起源
同様のタンパク質凝集物の中にリーリンが含まれていることが研究によって示された。リーリンはカルレチニンニューロンから合成され、分泌されるので、ｐ６２含有凝集物もカルレチニンニューロンに随伴しているかという疑問が生じた。ｐ６２陽性凝集物の大部分はカルレチニンを含んでいなかったが、いくつかのｐ６２陽性凝集物はカルレチニンにも陽性であった（図３Ａ〜図３Ｃ）。したがって、カルレチニンニューロンもｐ６２陽性タンパク質凝集物に寄与していた。パルバルブミンニューロンにおいてｐ６２ベシクルが最も顕著であり、オートファゴソームの内容物のクリアランスにおける障害の可能性を示しているので、これらがタンパク質凝集物の形成に寄与したかという疑問が生じた。ｐ６２陽性凝集物の大部分はパルバルブミンを含んでいなかった。しかし、パルバルブミン陽性線維の中にいくつかのｐ６２陽性凝集物が観察された（図３Ｄ〜図３Ｆ）。さらに、ｐ６２陽性パルバルブミン線維は、若齢マウスのパルバルブミン陽性線維（円形度＝０．５３０６±０．２０２３（平均±標準偏差）、ｎ＝２５）と差がないｐ６２陰性パルバルブミン線維（円形度＝０．４４５３６±０．１８０２、ｎ＝１８）と比較してより円形度が高く、より膨潤している（円形度＝０．７０６９±０．１２１、ｎ＝２３）ように見えた（ｐ＜０．００１）。したがって、カルレチニンニューロンとパルバルブミンニューロンの両方がタンパク質凝集物の形成に寄与している可能性がある。
【００８３】
これらのタンパク質凝集物が細胞外および細胞内の両方であり、約６０％が星状膠細胞に随伴していることが、いくつかのグループによって示された（Jucker et al., 1994、Kuo et al., 1996）。Ｉｂａ陽性ミクログリアでは顕著なｐ６２陽性凝集物は観察されなかったが、ＧＦＡＰで標識したいくつかの星状膠細胞の内部では小さなｐ６２の点を観察することができる（図４Ａ〜図４Ｂおよび図４Ｅ〜図４Ｆ）。さらに、いくつかのｐ６２陽性凝集物は星状膠細胞の周囲に集積しているように見えた。ＧＦＡＰは星状膠細胞の細かい突起の全てを標識していないので、マウスの脳の中のｐ６２染色を、ＧＦＡＰプロモーターで駆動されたＧＦＰの発現によって検討した（ＧＦＡＰ−ＧＦＰマウス）。ＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスでは、ＧＦＰ標識星状膠細胞に随伴してｐ６２が頻繁に観察された（図４Ｃおよび図４Ｇ）。ｐ６２陽性クラスターの大部分はＧＦＰ標識星状膠細胞に随伴していなかったが、これらのマウスでは全ての星状膠細胞がＧＦＰを発現した訳ではないので、タンパク質凝集物と星状膠細胞との会合はここで見られたよりは大きいと考えられる。以前の観察と一致して、リーリン陽性凝集物も星状膠細胞に随伴してその中にあることが観察された（図４Ｄおよび図４Ｈ）。これらの観察は、ニューロンに由来するタンパク質凝集物は星状膠細胞によって取り込まれ得るという主張と一致した。
【００８４】
（４）Ｎｏｘの活性化がリソソームカーゴのプロセッシングの障害に関与しているという証拠
上で論じたように、加齢したＷＴマウスの脳におけるＮｏｘ２の発現および活性は増大していた。Ｎｏｘは好中球における呼吸バーストオキシダーゼとして最初に記載されたマルチマー酵素複合体である。オキシダーゼのＮｏｘファミリーは、病原体の殺滅、および種々の酸化還元機序による細胞内シグナル伝達の両方のために、分子状酸素の一電極還元産物であるスーパーオキシドを主として大量に産生することができる。タンパク質のＮｏｘファミリーは広く発現され、Ｎｏｘ１、Ｎｏｘ２、およびＮｏｘ４はげっ歯類の脳で、またこれらの全てとＮｏｘ５はヒトの脳で発現される。しかしカルシウム依存性であるＮｏｘ５はげっ歯類には存在しない。Ｎｏｘの発現は種々のストレッサーおよび傷害の状態によって増大され得る。ＩＬ−６およびシグナル伝達兼転写活性化因子３（Ｓｔａｔ３）はＮｏｘ２の活性化に関与している。Ｎｏｘ２、Ｎｏｘ４、及び調節サブユニットであるｐ２２ｐｈｏｘは老化した脳で誘導され、Ｎｏｘ２の活性は正常に加齢した野生型マウスで高度に上方調節されていることが示された。
【００８５】
ここでＮｏｘ阻害剤であるアポシニン（５０ｍｇ／ｋｇ／日）またはスーパーオキシドジスムターゼ模倣体（Ｃ３、１ｍｇ／ｋｇ／日）でマウスを長期間処置することによって、Ｎｏｘの活性がリソソーム機能不全に寄与しているか否かを解明し、ｐ６２陽性凝集物（図５）（およびパーキン陽性凝集物）の数および大きさの両方が低減することによって実証されるように、リソソーム機能の顕著な改善を見出した。図５には雌のデータを示すが、加齢した雄マウスの第２のコホートも同様の効果を示し、Ｎｏｘが両方の性でタンパク質のクリアランスを障害していることが示された。これらのデータはＮｏｘの活性と物質のリソソームによるクリアランスの欠陥とを直接結びつけているので重要である。非遺伝子的な様式でリソソーム機能とカーゴのクリアランスを改変する能力によって、生涯にわたる加齢関連リソソーム機能不全の機序の研究を可能にすることができる。
【００８６】
（５）障害を受けたリソソームによる分解のための細胞物質の送達の促進はリソソーム機能を悪化させる可能性がある。
欠陥のあるリソソームに過負荷を与えることは組織傷害を生じることがある。オートファゴソームの形成が増大し、リソソームの生物発生が促進されたにも関わらず、脳においてＬＣ３ｂ−ＩＩ、ＳＷＱＴＭ１／ｐ６２、および大きな飽食したリソソームの蓄積が進行していたことが見出された。筆者は、リソソームによる基質のクリアランスが低下したにも関わらずオートファジーが継続して上方調節された結果、欠陥のあるリソソームが増加しただけでなく、実際、ニューロンの傷害を助長したと結論付けた。オートファジーの初期のステップを活性化して損傷を受けた高分子／オルガネラのリソソームへの送達を促進するラパマイシン等の薬物はいくつかの疾患モデルでは有益であったが、機能不全のリソソームへの物質の負荷を増大させると、オートファジーを促進させるよりむしろ、それを悪化させる可能性があるという事実が最近認識されるようになった。事実、ＡＤのマウスモデルにラパマイシンを用いた最近の論文では、処置によるいくらかの行動の改善が示されたが、プラークまたは絡まりのクリアランスには差がなく、ラパマイシンはリソソームのタンパク質分解の障害を克服できないことが示された。これらの結果は、ラパマイシンまたはラパマイシン類似体によってオートファジーを促進する完全な利点を得るためには、最初にリソソーム機能を正常化することが重要であることを示している。
【００８７】
これに関連して、リソソームにおける内容物の分解が効果的でないことが高齢マウスの肥大化した（おそらく飽食した）リソソーム（図６）で見られるかという疑問が生じた。リソソームのｖ−ＡＴＰアーゼの阻害剤であるバフィロマイシンによるリソソームの酸性化の直接的な阻害によってリソソームの大きさが数時間の間に急速に増大することが知られているので、そのような知見は提案されたリソソームの酸性化の障害と一致し、リソソームの大きさがリソソームの効果的な機能の動的な指標であることを示している。示されるように（図６）、ｌａｍｐ１陽性リソソームの平均および累積した大きさは、高齢動物のニューロンで有意に大きかった。Ｎｏｘの阻害によって、アポシニンで処置した加齢マウスでは水の場合と比較して、ｌａｍｐ１（図６）およびＣａｔＤによる免疫染色で、ニューロン中の細胞内リソソームの大きさの顕著な正常化（低減）が生じた。これらの結果に基づき、ｐ６２凝集物の大きさ、数、および占拠された海馬面積％を静的な長期のリソソーム機能不全の尺度として用い、ニューロンのリソソームの大きさおよび数（マーカーとしてｌａｍｐ１およびＣａｔＤを用いる）をリソソーム活性の動的変化の尺度として用いた。
【００８８】
ｃ）考察
老化した海馬におけるタンパク質凝集物が種々の抗原に対する抗体を用いて検出されてきたが、これらの凝集物の意義は明確ではない。ｐ６２、パーキン、ピンク１、およびＬａｍｐ２Ｂ等のオートファゴソーム／リソソームカーゴタンパク質もこれらの凝集物に含まれていることが研究によって示されている。これらの観察は、タンパク質凝集物の加齢依存性の蓄積が、海馬組織がオートファジー−リソソーム経路からタンパク質を効率よく除去または分解することができないことに起因していることを示している。さらに、パルバルブミンまたはカルレチニンＧＡＢＡ作動性ニューロン、ならびに星状膠細胞が、これらの凝集物の形成に寄与している可能性がある。加齢の間のタンパク質凝集物の蓄積はＮｏｘの阻害によって弱められ、このことはＮｏｘ由来のＲＯＳがマウスの海馬からのタンパク質のクリアランスに影響している可能性があることを示している。
【００８９】
（１）加齢マウスの海馬におけるオートファジー−リソソーム経路の欠陥の可能性
オートファジーは主として細胞保護的であり、高分子が再利用されること、および損傷を受けたオルガネラが分解され除去されることを可能にする。オートファジーの障害によって炎症が誘導され、寿命が短くなる一方、オートファジーの活性化によって多くの疾患モデルで疾患の病状が低減され、寿命が長くなる。オートファジーは加齢の間に障害を受けると考えられているが、加齢動物におけるオートファジーの流れの増加も減少も報告されている。より一致しているように見えるものは、老化した細胞におけるリソソーム機能の減退である。ＬＣ３Ｂおよびｐ６２に対する抗体で免疫染色することによってオートファゴソームと類似したいくつかの点が観察されたが、老化した海馬では広範囲の顕著な増加はなかった。これは、ＬＣ３ＢＩＩの量がインタクトなＬＣ３ＢＩの量と比較して有意でないことを示すウェスタンブロットの実験結果と一致している。しかしウェスタンブロットによって示された高齢マウスにおけるｐ６２とＬＣ３ＢＩＩの僅かな増加は、オートファジー−リソソーム経路の能力が減退した結果として解釈することができる。最後に、ベシクル様のｐ６２の免疫反応性は、パルバルブミンインターニューロン中でピラミッド状ニューロン中よりも大きくかつ多く、オートファジーまたはリソソームがこれらの細胞中で優先的に障害され得ることを示している。
【００９０】
（２）加齢マウスのタンパク質凝集物はオートファジー−リソソーム経路のタンパク質を含んでおり、ニューロンおよびグリア細胞起源である。
ｐ６２免疫染色によって検出されるタンパク質凝集物は周期的な酸−シッフ陽性顆粒と類似している。これらの顆粒はヘパリン硫酸プロテオグリカンおよびラミニン、ならびにリーリンを含んでおり、ニューロンとグリア細胞の両方が起源であることが提案されている。これらの凝集物がパーキン、ピンク１、およびＬａｍｐ２Ｂ、ならびにチトクロームＰ４５０を含んでおり、加齢マウスにおいてオートファジーまたはマイトファジーの後のタンパク質の凝集が損なわれ得ることを示していることが本明細書で実証された。これらの凝集物はニューロンとグリア細胞の両方の起源もあると思われる。ＧＦＡＰ−ＧＦＰマウスを用いた実験で明らかになったように、いくつかのｐ６２陽性凝集物は星状膠細胞に随伴している。いくつかのｐ６２陽性凝集物は、パルバルブミンまたはカルレチニンを含む線維でも観察される。これらのマーカーが類似のタンパク質凝集物を標識していれば、星状膠細胞に随伴する顆粒もニューロンから分泌されたリーリンを含み、これはＧＦＡＰとリーリンの二重免疫染色によって確認される。これらの観察も、星状膠細胞がニューロン起源のタンパク質を取り込むことができることを暗示している。ニューロン成分の星状膠細胞へのこの移動は珍しいものではない。たとえば、星状膠細胞はＡβ堆積物およびシナプス成分の除去を媒介していることが示されている。星状膠細胞はそれ自体のテリトリーを有する傾向があるので、特定の星状膠細胞の周囲に集積したこれらの凝集物の蓄積は、細胞外タンパク質凝集物を取り込みまたは分解する能力が低下していることを反映している可能性がある。これらのタンパク質凝集物を長期にわたって細胞外スペースに曝露することは、ＲＯＳまたは細胞外酵素によるさらなる改変をもたらし、引き続く分解および除去に対するタンパク質凝集物の抵抗性をさらに増す可能性がある。
【００９１】
（３）Ｎｏｘ由来のＲＯＳおよびタンパク質のクリアランス
中年マウスをＮｏｘ阻害剤であるアポシニンで５か月処置することによって海馬凝集物が低減し、これはＮｏｘ由来のＲＯＳが海馬からのタンパク質のクリアランスを障害するという理解と一致している。ＲＯＳはプロテアソーム系に複合的な効果を有していることが知られている。酸化されたタンパク質はこの系のよりよい基質であり、ＲＯＳへの短期的な曝露はこの系によるタンパク質の分解を低減させまたは増大させ得るが、加齢の間に起こるタンパク質の分解に対する長期的なＲＯＳへの曝露の影響は知る限りでは報告されていない。同様に、ＲＯＳもリソソームにおけるオートファジーの開始およびそれに続くオートファジーカーゴの分解に影響する。具体的には、カテプシンＢおよびＬ等のリソソームタンパク質の分解に関与する酵素は、ＲＯＳによって不活性化され得る活性システイン残基を有している。さらに、オートファゴソームおよびリソソームに対するＶ−ＡＴＰアーゼの集合および活性もＲＯＳによって調節されており、これらのオルガネラのアルカリ化がもたらされる。そのため、リソソームカーゴの消化が非効率となる。最後に、ＲＯＳはリソソームエキソサイトーシスを促進することもでき、リソソームから未消化のタンパク質を放出する。これら全てが、老化した脳の海馬におけるタンパク質凝集物の形成に寄与し得る。まとめると、本明細書に提示した結果は、Ｎｏｘ由来のＲＯＳのレベルが上昇したことに起因するオートファゴソーム／リソソーム系によるタンパク質の分解の障害に応答する老化したパルバルブミンおよびカルレチニンインターニューロンからの未消化のタンパク質の排出によってタンパク質凝集物が形成されることを示している。
【００９２】
[実施例２]現在の抗炎症薬は適切な経路を標的としていない。
加齢関連リソソームのカーゴのクリアランスに関与する機序を同定することが新たな治療アプローチを開発するために極めて重要である理由に対処するため、以下に注目することが重要である。リソソームを直接活性化する薬物は存在しない。一般に用いられる非ステロイド抗炎症薬はＩＬ−６の発現を低減させず、ある状況ではＩＬ−６／Ｓｔａｔ３カスケードの活性化を実際に増大させる。したがって、この経路ならびに下流のメディエーター、たとえばＮＡＤＰＨオキシダーゼに関与する、炎症を治療する新規な薬物が必要である。
【００９３】
他の治療では難治性のリウマチ性関節炎に特に承認された３種類の臨床承認された抗ＩＬ−６免疫療法が現在存在している。これらは介入治療に魅力的である。しかし、これらの免疫療法はＩＬ−６の膜受容体（ＩＬ−６Ｒ）に向けられており、ＩＬ−６のシグナル伝達の多くはＩＬ−６Ｒではなくｇｐ１３０に結合する可溶性の受容体を経由しているので、ＩＬ−６のシグナル伝達の多くはこれらの免疫療法の標的ではない。さらに、両方の製剤は特に持続治療においいて有害反応を有していることが証明されており、血液脳関門を通過せず、これらは難治性のリウマチ性関節炎を有する個人にのみ用いられ、健常な老齢の患者には長期に用いられていない。小分子のＮｏｘ阻害剤の開発はいくつかの医薬会社の活発な研究領域であり、ある範囲の応用のために１つまたは複数が臨床試験中である。しかし、それぞれの阻害剤は特定のＮｏｘアイソフォームを標的としており、炎症性サイトカインによって２つ以上のアイソフォームが誘導され得る。最後に、そのカルシウム依存性によってＣＮＳにおいて重要な役割を果たし得るＮｏｘ５については今日までほとんど強調されなかった。
【００９４】
[実施例３]正常な加齢の間のリソソーム機能不全はＩＬ−６および／またはＳｔａｔ３の経路活性化の増大を介するＮＡＤＰＨオキシダーゼの炎症活性化による。
ＮＡＤＰＨオキシダーゼ（Ｎｏｘ）阻害剤であるアポシニンで処置されたマウスが脳全体において分解されていないリソソーム物質の強固で高度に顕著な低減を有することを実証することによって、このリンクにおける最初のステップを支持する刺激的で新たなデータが本明細書で提供される（図５）。これらは、Ｎｏｘの活性を阻害することによってインビボで脳のリソソーム機能を改善することができることを示す最初のデータである。加齢動物で肥大化していた（図６）リソソームの大きさがアポシニンによって顕著に低減され、若齢動物で見られるリソソームの大きさに戻ることも解析によって示された。ＩＬ−６が老化した脳におけるＮｏｘ２の誘導に関与しているという本明細書での観察に基づいて、ＩＬ−６がリソソーム機能不全を媒介しているか否かを本明細書で判定する。また、ＩＬ−６はＳｔａｔ３を調節し、Ｎｏｘサブユニットのプロモーター領域はＧＡＳ（Ｓｔａｔ３の標的）配列を有しているので、Ｓｔａｔ３はＮｏｘに媒介されるリソソームの欠陥に関与している可能性がある。これらの可能性のそれぞれを試験するために、ニューロン中のＳｔａｔ３の標的された欠失およびＮｏｘ由来のスーパーオキシド産生の薬学的阻害を有するＩＬ−６ノックアウトマウスを用いることができる。このことの支持として、２日間連続でＩＬ−６（５μｇ／ｋｇ）を注射した４月齢および２４月齢のＣ５７Ｂｌ／６マウスに、脳のスライスのｑＲＴ−ＰＣＲ、ウェスタンブロット、および免疫染色によって測定されるＮｏｘ２、Ｎｏｘ４、およびｐ２２ｐｈｏｘの誘導を行なった。この増加はミクログリアだけでなく、皮質および海馬ニューロン、ならびにシナプトソームでも起こっていた。抗Ｎｏｘ２Ａｂの特異性を確認するため、ｇｐ９１ｐｈｏｘ−／−（Ｎｏｘ２−／−）マウスのスライスおよび組織も対照として常に含めた。
【００９５】
ａ）マウスのインビボ研究
Ｎｏｘ由来のスーパーオキシドが老化した脳におけるリソソーム機能不全をもたらすという理解を検討するため、リソソーム機能に対するＮｏｘの影響の態様を試験する薬剤でマウスのコホートを処置した。ここでこれらの薬剤およびその論拠としては、１）Ｎｏｘ阻害剤であるアポシニン（１００ｍｇ／ｋｇ／日、図５、カーゴのクリアランスの改善）、２）スーパーオキシドジスムターゼ模倣体（Ｃ３、１ｍｇ／ｋｇ／日、スーパーオキシドの組織レベルを低減するため）、および３）Ｎ−アセチルシステイン（１０ｍｇ／ｋｇ／日、グルタチオンの細胞レベルおよびカテプシンの逆チオール酸化を増大させるため）が挙げられる。全ての薬剤は飲水中で与え、対照群（２匹）には対照として通常の飲水を与えた。マウスは３つの月齢群、すなわち５か月（若年成体）、１２か月（早期の凝集堆積が観察される）、および１８か月（高齢）で、各月齢について雄５匹、雌５匹として処置または対照を開始し、全てを２２か月で屠殺させてよい（加齢関連認知障害とともに顕著な堆積が見られたとき）。したがって各処置群について３０匹のマウスを画像研究に登録する。結果の測定には、ｐ６２のクラスターの大きさ、数、および海馬面積の百分率（図５）、ｌａｍｐ１を用いたニューロン内のリソソームの大きさ（図６）、ならびに凝集物と共局在化した他のタンパク質の証拠（たとえば図２）が含まれている。３つの月齢群の全てが屠殺の際に２２月齢になるように処置の開始をずらすことができるので、これらを並行して処置することができる。タンパク質の発現とカテプシンの活性の解析を可能にするため、同様な処置群の第２の組が必要であり、処置の開始を上記のようにずらすことができる。したがって、タンパク質およびカテプシンの活性の解析のために追加のマウスが必要である。
【００９６】
ｂ）マウス脳のスライスを用いる免疫染色の手順
マウスはイソフルランで麻酔することができ、氷冷したリン酸塩緩衝食塩水（ＰＢＳ）で１分、心臓を経由して灌流し、続いて冷却した１０μＭのＰＢＳ中、４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で５分、灌流する。全脳を取り出し、４％のＰＦＡ中、４℃で終夜、前固定し、さらに２４時間、２％のＰＦＡに交換し、ビブラトームでスライスして５０μｍの切片を生成し、免疫染色のための処理の準備ができるまで、これを３０％のスクロース、３０％のエチレングリコール、１％のＰＶＰ−４０の中に−２０℃で維持する。次いで浮遊切片をブロックし、一次抗体で免疫染色し、洗浄し、蛍光二次抗体で標識し、画像処理のためにＶｅｃｔａｓｈｉｅｌｄ封入剤中でガラススライド上にマウントする。全ての解析は処置情報を知らされていない個人が行なう。用いる抗体（販売者、カタログ番号、希釈倍率）にはウサギ抗ｐ６２（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ００６７、１：４０００）、マウスｍａｂ抗パーキン（Ａｂｃａｍ社、ａｂ７７９２４、１：１０００）、ウサギ抗ピンク−１（Ａｂｃａｍ社、ａｂ２３７０７、ＴＳＡで１：５０００）、ウサギｍａｂ抗ｌａｍｐ２ｂ（Ａｂｃａｍ社、ａｂ１２５０６８、ＴＳＡで１：５０００）、およびウサギ抗ＬＣ３Ｂ（Ｓｉｇｍａ社、Ｌ７５４３、１：１０００〜１：２０００）が含まれている。免疫染色した切片をＺｅｉｓｓ社のＬＳＭ８８０  ２−フォトン共焦点顕微鏡で画像解析する。画像解析しない場合にはスライドを暗所で保存する。所与のオートファジーマーカーについての免疫蛍光はＺｅｉｓｓ社のＺｅｎ  Ｂｌｕｅ解析ソフトウェアまたはＩｍａｇｅ  Ｊで定量することができる。リソソームの不全は、全て免疫染色によるｐ６２の増加およびＬＣ３ｂ−ＩＩのレベルの増大の存在下でのｌａｍｐ２の堆積として定義することができる。
【００９７】
ｃ）老化および炎症を起こした脳におけるＮｏｘアイソフォームの変化
ミクログリアで観察された老化した脳におけるＮｏｘ２およびＮｏｘ４の発現の増加は、ニューロンでも広範囲に観察された。これらの実験で、加齢マウスの脳におけるＮｏｘ２およびＮｏｘ４の変化の役割を決定することができる。Ｎｏｘの発現レベルは最初にｑＰＣＲおよび通常のウェスタンブロットによって定量することができ、それらの分布は特定のニューロン、グリア、エンドソームおよびリソソームマーカーと共免疫染色することによって検討することができる。ＣＮＳの炎症はＴＮＦα、ＩＬ１β、ＩＬ６、Ｎｏｘ２、およびＮｏｘ４等の炎症マーカーをｑＰＣＲ、ＥＬＩＳＡ、およびウェスタンブロットで定量することによって検討することができる。
【００９８】
低グレードのＩＬ−６媒介炎症の誘導可能なモデルには、老化の研究に表面的妥当性を有するＡＡＶの腹部脂肪への注射を採用した。マウスのＩＬ−６はアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにサブクローニングすることができ、これは免疫原性が低く、安全性プロファイルが良好であり、分裂している細胞および分裂していない細胞を形質転換して組織中の長期的な遺伝子発現（数年まで）を低い増殖速度で駆動する。ＡＡＶ８またはＡＡＶ９は成体マウスに投与した後で脂肪組織への効率的かつ長期の遺伝子移送を媒介するので、用いることができる。マウスを３％のイソフルランで麻酔し、マウス１匹あたり２×１０１０〜１×１０１２のウイルスゲノムを精巣上体内の脂肪に投与することができる。それぞれの鼠径部の脂肪組織に１０μＬのＡＡＶ溶液を、ハミルトンシリンジを用いて４回注射する。次いでＥＬＩＳＡによって血清ＩＬ−６レベルを測定し、トランスジーン発現およびウイルスの滴定の時間経過を決定する。
【００９９】
ｄ）ｖ−ＡＴＰアーゼの活性の変化
同様に、ｖ−ＡＴＰアーゼによるリソソームの酸性化もその集合およびトラフィッキングによって調節されている。リソソームのｐＨをインビボで測定することは実際的でないが、集合の可能な変化およびリソソームのアルカリ化をもたらすｖ−ＡＴＰアーゼの標的化は、細胞分画、ウェスタンブロット、および免疫蛍光によって検討することができる。そのような変化が観察された場合には、システインの酸化等の基礎的な機序をさらに検討することができる。
【０１００】
ｅ）組織溶解物中のリソソーム活性の変化
リソソーム酵素の酸化による改変およびそれに続く不活性化を、組織溶解物中で検出することができる。海馬、皮質、および脳のその他の領域を切除し、ドライアイス上で凍結し、適切な緩衝液中で超音波によってホモジナイズするまで−８０℃に保つことができる。老化して炎症を有する脳のホモジネートから得たカテプシンの活性を、還元試薬の存在または非存在下に、ＣａｔＤ、ＣａｔＢ、およびＣａｔＬの活性に特異的ないくつかの蛍光系の市販のキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ社）を用いて緩衝液中でアッセイすることができる。１９月齢と５月齢のマウスの皮質組織を用いた結果より、カテプシンの活性の測定は信頼できることが示された。
ｆ）ＣａｔＤの自己分解性タンパク質分解性開裂のウェスタンブロット解析
【０１０１】
ＣａｔＤの高分子量（ＨＭＷ）のプレプロ形態からより小さな活性形態へのプロセッシングにはリソソームの酸性化が必要であるので、図７に示すように種々の実験群について組織抽出物のウェスタンブロット解析を行なった。未開裂のＨＭＷ形態の蓄積はリソソーム機能不全の追加的な指標になり得る。
【０１０２】
[実施例４]ＩＬ−６の欠失はリソソーム機能を改善する。
動物モデルおよびヒトにおける多くの研究によって、加齢には慢性の低グレードの炎症が随伴していることが示されてきた。ヒトにおいては、多くの研究で、炎症誘発性サイトカインであるインターロイキン−６（ＩＬ−６）の循環レベルの増大が特に加齢関連病態および健康に関する転帰の悪化に随伴している。高齢者の全身および脳において炎症経路を活性化させる可能性のある多くの因子として、慢性疾患、例えば糖尿病、心臓血管系疾患、高血圧、ホルモン状態の変化、およびさらには食事がある。より重要なことに、ＩＬ−６およびＩＬ−６によって転写段階で調節されるＣ反応性タンパク質の上昇によって、高齢者における急性および慢性の認知の減退、軽度認知障害（ＭＣＩ）、アルツハイマー病、ならびに錯乱状態が予測される。現在の提案を支持するものとして、健常な高齢者においてさえも、ＩＬ−６の上昇と神経心理学的検査における認知性能の悪化との間の有意な統計的相関が臨床研究で示されている。これらの研究の多くにおいて、ＩＬ−６のみが上昇し、ＩＬ−１βおよびＴＮＦα等の他の炎症誘発性メディエーターは上昇しなかった。
【０１０３】
老化によって障害を受けたオートファジーにおけるＩＬ−６の役割を直接検討するため、ＷＴマウスおよびＩＬ−６−／−マウスの脳を用いることができる。高齢ＩＬ−６−／−マウスの脳は、ＷＴマウスと比較してＮｏｘ２の発現および活性が低いことが本明細書で示される。この研究における若齢（４月齢、ｎ＝８）および高齢（２２月齢、ｎ＝１２）のＷＴマウス、ならびに若齢（ｎ＝１０）および高齢（ｎ＝１２）のＩＬ−６−／−マウスの予め凍結保存した脳を検討することができる。脳をＰＦＡで固定し、摘出し、凍結保護剤中、−２０℃で保存した。新たなマウスはこれらの研究には提案していない。脳のスライスはｐ６２、ｌａｍｐ２、パーキン、ピンク１、ＬＣ３Ｂ、ｌａｍｐ１、ならびにカテプシンＤおよびＬについて免疫染色することができる。これらの保存した脳ではＰＶ、ｐ６２、およびＭＡＰ２染色はインタクトなままであった。ＩＬ−６がリソソームの阻害に関与しているならば、ｐ６２凝集物はＷＴの脳よりも少なく、および／または小さい可能性がある（たとえば図５）。
【０１０４】
[実施例５]Ｓｔａｔ３のニューロンにおける欠失はリソソーム機能を改善するか？
これらの研究は、全て１０世代を超えるＣ５７ＢＬ６のバックグラウンドを有する、本提案のために特別に生成された２つのマウス系統ならびに月齢および性を一致させたＷＴマウスで実施することができる。第１の系統はＴｈｙ１−ＹＦＰ−Ｃｒｅ：ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスである。これらのマウスはＴｈｙ１プロモーターの制御下で海馬のピラミッド状ニューロンの９５％および皮質ニューロンの９０％に黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）の構成的発現を有する。Ｃｒｅ−リコンビナーゼを活性化するためのこれらのマウスの１週間のタモキフェン処置によって、海馬ニューロンの９５％で赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏの高レベルの発現が産生され、ｔｄＴｏｍａｔｏとＹＦＰ陽性ニューロンとのほぼ１００％の共局在化が存在する。したがって、タモキシフェン（Ｔａｍ）処置の１週間後にマウスを研究することができる。これらのマウスは最終的なトランスジェニック系統であるＴｈｙ１−ＹＦＰ−Ｃｒｅ：Ｓｔａｔ３ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ：ｔｄＴｏｍａｔｏマウスのためのＴａｍ誘導対照として働き、これらも海馬および皮質の全体でニューロン中にＳｔａｔ３のＴａｍ誘導除去を有し、ここでも任意の月齢でピラミッド状および皮質ニューロンにおいてＳｔａｔ３を誘導的に除去することができる。
【０１０５】
特にこの助成金のために得られたデータに基づいて、月齢５か月、１２か月、２２か月のマウス（雌雄同数）を研究することができる。同数の雄と雌を用いることができる。ＷＴマウスの正常な加齢の間に、老化した脳のニューロンおよび限られた数のミクログリアでＮｏｘ２が誘導され、ＩＬ−６がこの誘導を媒介することがさらに示された。ＷＴマウス、および海馬の主要なニューロンにおいてＳｔａｔ３を除去するために予め４〜５月齢でタモキシフェンで処置したＴａｍ−Ｔｈｙ１−ＹＦＰＣｒｅ：Ｓｔａｔ３ｆｌｏｘｅｄ：ｔｄＴｏｍａｔｏ（ＴＦｔｄＴｏｍ）マウスのＮｏｘ２について脳のスライスを免疫染色することができる。Ｎｏｘの発現の誘導にＳｔａｔ３が必要であれば、老化した海馬および皮質におけるニューロンの大部分はＷＴ動物でＮｏｘ（１種または複数）を発現するが、ＴＦｔｄＴｏｍマウスでは発現しない。さらに、ｔｄＴｏｍの発現が結果に影響しないことを確認するために、ｔｄＴｏｍのないＴｈｙ１−ＹＦＰ−Ｃｒｅ：Ｓｔａｔ３ｆｌｏｘｅｄマウスを同時に研究することができる。Ｎｏｘの誘導におけるＳｔａｔ３の役割をさらに試験するため、研究に基づき、Ｎｏｘ（１種または複数）の発現がＳｔａｔ３ノックアウトマウスのニューロンでは誘導されないという予想のもとに、ＩＬ−６のＩＶＣ注射（４μｌの食塩水中１μｇ）を行ない、続いて４８時間後にＮｏｘ２について免疫染色を行なうことができる。Ｓｔａｔ３の非存在下でも炎症によってＮｏｘ２の発現が誘導されるのであれば、このことは代替の因子によるＮｏｘの転写調節が関係していることを示している。
【０１０６】
（１）データ解析
ｐ６２凝集物で占められた海馬の面積％および凝集クラスターの絶対数を、ＡＮＯＶＡおよびテューキーの事後検定法を用いて、または５群以上を比較する場合にはボンフェローニの補正を用いて、ｐ＜０．０５を有意と設定して群の間で比較する。しかし、凝集物の大きさは分布しており、群の間の凝集物の大きさの分布を比較するために、クラスカル−ウォリスまたはマン−ホイットニーの順位和検定等の非パラメーター解析を用いることができる。Ｎｏｘ２（およびこれも関与する場合にはＮｏｘ１）を阻害することによるアポシニン、ならびに合成のスーパーオキシドジスムターゼ（ＳＯＤ）模倣体（Ｃ３、これはＮｏｘ（１種または複数）によって生成するスーパーオキシドのレベルを低減させる）は両方とも、凝集物の数および大きさを低減させることができる。Ｎｏｘ４も関与する場合には、ＳＯＤ模倣体はＮｏｘ４によるスーパーオキシドから過酸化水素の生成を低減させることもできるので、より効果的であり得る。Ｎｏｘ（１種または複数）の活性化がリソソームの不全の主な原因でない場合でも、他の炎症経路の調節によって作用するＩＬ−６は、脳の老化におけるリソソーム機能への障害に関与している可能性がある。
【０１０７】
[実施例６]炎症はリソソーム機能不全およびリソソームの内容物の分解の障害を惹起する。
ゲノムワイド関連研究（ＧＷＡＳ）によって、ＬＯ−ＮＤの進行のリスクの増大をもたらし、ある場合には疾患の早期発症をもたらす２つの遺伝子のネットワークが繰り返して示されてきた。これら２つのネットワークの第１には脳における炎症および先天性免疫の調節に関連する遺伝子が含まれ、多くの遺伝子はミクログリア、すなわち脳に常在している単球に特異的である。ＬＯ−アルツハイマー病（ＬＯ−ＡＤ）において同定される危険遺伝子には特に、ＰＵ．１（単球−リニエージ転写因子）、ＣＤ３３、ＣＲ１、ＡＢＣＡ７、ＭＳ４Ａ、およびＴＲＥＭ２（活性化されたミクログリア上の細胞表面タンパク質）、ならびにとりわけインターロイキン−６受容体（ＩＬ−６Ｒ）が含まれる。ＰＤおよびＦＴＤにおけるさらなるＧＷＡＳによって、同じ危険遺伝子の多くが同定された。正常で健常な高齢者の脳の遺伝子アレイプロファイルもＣＤ３３、ＩＬ−６Ｒ、およびＣＲ１等の炎症性遺伝子の発現の増大を示し、全身的な炎症への曝露の後に数か月にわたって脳における先天的免疫の活性化が持続することを示している。したがって、多くの証拠が老化した脳における先天的免疫の炎症活性化に対する役割を支持している。
【０１０８】
ａ）ｖ−ＡＴＰアーゼの酸化還元部位の炎症調節によるｖ−ＡＴＰアーゼの阻害
マウスの皮質の培養をＩＬ−６に曝露することによって、ｐ６２を含むタンパク質のリソソームにおける分解が障害される。また、ＩＬ−６は標準的なｐＴｙｒ−Ｓｔａｔ３転写と非標準的なＳｔａｔ３  ＮＦκＢ転写の両方によって、ＴＮＦα、ＩＬ−６、ＩＬ−１β、Ｎｏｘ２、およびＮｏｘ４等の炎症性メディエーターの発現を誘導することができる。ここで、記載したようにマウスの初代培養物をカバースリップ皿の上で調製し、ＩＬ−６（１０ｎｇ／ｍｌおよび１００ｎｇ／ｍｌ）またはビヒクル対照（媒体）と、４日間、毎日、処置することができる。直接的なｖ−ＡＴＰアーゼの阻害の陽性対照として、いくつかの皿にバフィロマイシン（１００ｎＭ）を含ませてもよい。培養物を４％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定し、免疫染色してよい。データに基づいて、ＩＬ−６およびＢＡＦで処理した細胞の中の大きなｌａｍｐ１およびｐ６２陽性のリソソームの蓄積を観察することができる。次いでｖ−ＡＴＰアーゼに対する酸化還元の影響の役割を評価するため、培養物を３つの抗酸化剤、ＴＥＭＰＯＬ（一般的なラジカル捕捉）、Ｃ３化合物（寄与しているアイソフォームに関わらずＮｏｘ由来スーパーオキシドを還元するための触媒的スーパーオキシドジスムターゼ）、およびＮ−アセチルシステイン（グルタチオンレベルを上昇させるため）のうちの１つで共処理することができる。ｖ−ＡＴＰアーゼがその酸化還元部位を通して阻害される場合には、抗酸化剤処理によって未消化の内容物（ｐ６２、ｌａｍｐ１）の蓄積を防止することができ、リソソームの肥大化を防止することができる。さらに、リソソームの酸性化およびしたがってカテプシンの活性がｖ−ＡＴＰアーゼの酸化還元不活化によってＩＬ−６で処理した培養物中で既に障害されているならば、ｖ−ＡＴＰアーゼが既に阻害されているので、ＢＡＦはリソソーム機能をさらに悪化させることができない。逆に、抗酸化剤による処理はｖ−ＡＴＰアーゼの活性を保持し、ＢＡＦがｖ−ＡＴＰアーゼおよびリソソームのカーゴの分解に対する阻害効果を生じることを可能にすることができる。
【０１０９】
上記の実験によってｖ−ＡＴＰアーゼがニューロンの培養におけるリソソーム機能不全の誘導においてＮｏｘ由来反応性酸素種（ＲＯＸ）の標的として関係付けられれば、ｖ−ＡＴＰアーゼの不活化をもたらす機序をさらに検討することができる。ｖ−ＡＴＰアーゼは、ＡＴＰを加水分解する末梢のＶ１ドメインと、タンパク質を転位させる一体のＶ０ドメインとからなるマルチサブユニットの複合体である。哺乳類細胞では、ＰＩ−３キナーゼ、ＥＲＫ、およびｍＴＯＲがその集合を促進し、ＰＫＡの活性化がその原形質膜への転位を促進する。これはまた、酸化的阻害に対して極めて感受性が高く、哺乳類においては、これはＡＴＰ６ＶＡ１サブユニットのＣｙｓ２５４またはＣｙｓ２７７の酸化によるものと思われるが、正確な機序にはまだ論争の余地がある。非哺乳類細胞中では高レベルのＲＯＳも末梢Ｖ１ドメインのベシクルからの脱集合をもたらす。Ｎｏｘの活性化および上で提案した処置によって誘導される培養中のｖ−ＡＴＰアーゼの変化を判定するため、キット（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いてリソソームを単離することができる。ＡＴＰアーゼの活性は、マラカイトグリーン（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）を用いる発色反応によって定量されるリン酸塩の放出によって測定することができる。ｖ−ＡＴＰアーゼの活性は、バフィロマイシンの非存在時と存在時との差によって定義することができる。不活性化が検出され、ＤＴＴによる前処理で逆転するならば、不活性化はシステインの酸化またはジスルフィド結合の形成による可能性がある。
【０１１０】
ｂ）リソソームの直接化学アルカリ化は、カテプシン酸プロテアーゼの活性の阻害をもたらす。
同様に、培養物を上記のようにＩＬ−６に曝露し、リソソームのｐＨに対する影響をモニターすることができる。初代ニューロンの培養をガラス底の９６ウェルプレートで増殖させ、ＩＬ−６で処理してＮｏｘの活性化を誘導し、ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒグリーン（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ社、Ｌ７５２６）を負荷することができ、リソソーム中におけるその蓄積はリソソームのｐＨによる。蛍光プレートリーダー、あるいは共焦点顕微鏡によるイメージングによって、蛍光強度を定量することができる。Ｎｏｘ（１種または複数）の活性化によってリソソームのアルカリ化がもたらされ、蛍光が低減されるが、これはＮｏｘの阻害およびＲＯＳ捕捉剤によって逆転され得る。ＬｙｓｏＴｒａｃｋｅｒ色素の蓄積も細胞質のｐＨ等の条件によって影響され、そのような可能性を除外するためにＬｙｓｏＳｅｎｓｏｒ（商標）Ｙｅｌｌｏｗ／Ｂｌｕｅ  ＤＮＤ−１６０等の電圧比例プローブを用いて、可能な場合にはいつでも上記の実験を繰り返すことができる。ニューロンは長期のインキュベーションの後で、デキストランにコンジュゲートしたオレゴングリーンおよびローダミンをリソソームの中に取り込むことができ、オレゴングリーンとローダミンの比はリソソームのｐＨの変化を反映し得る。これらの色素は異なった経路でリソソームを標識するので、これらの色素を用いて上記の実験を繰り返すことができる。いくつかの皿については、イメージングの後で細胞を固定し、ｌａｍｐ１等のリソソームマーカーについて免疫染色し、ｐＨの変化のために既にイメージングしたリソソームの同定をさらに確認するためにフィールドを転位する。
【０１１１】
リソソームのｐＨおよびプロテアーゼの活性の両方に依存する培養細胞中のリソソームタンパク質の分解を評価するため、細胞をＤＱグリーンＢＳＡ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）とインキュベートし、次いで洗浄し、種々の時点で蛍光をモニターすることができる。蛍光の増大はＤＱグリーンＢＳＡの分解と相関する。このアッセイはエンドサイトーシスに依存するので、エンドサイトーシスに対する処置の効果も、デキストランコンジュゲートしたローダミンを用いて同時に評価することができる。あるいは、ローダミン１１０系のビスペプチド基質（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、たとえばセリンプロテアーゼ用のＢｉｓ−（ＣＢＺ−Ａｒｇ）−Ｒ１１０、カテプシンＢおよびＬ用のＢｉｓ−（ＣＢＺ−Ｐｈｅ−Ａｒｇ）−Ｒ１１０）等の種々のリソソームプロテアーゼのための細胞透過性基質を用いて、細胞におけるそれらの分解をモニターすることができる。これらのアッセイはリソソームのｐＨとプロテアーゼの活性の両方に依存することが予想され、後者はＢＭＶ１０９（Ｖｅｒｇｅｎｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社）、すなわち細胞溶解物、インタクトな細胞、およびインビボにおいてカテプシンの活性を検出するために用いられてきたパンカテプシンプローブ等の活性依存プローブでさらに評価することができる３。蛍光は顕微鏡または蛍光プレートリーダーで検出することができる。以上まとめると、これらのアッセイにより、本明細書に記載した実験と組み合わせて、プロテアーゼ分解における変化がｐＨの変化によるものか、またはプロテアーゼの活性によるものかに関する洞察が提供される。
【０１１２】
（１）解析および解釈
Ｎｏｘがリソソームのアルカリ化に関与している場合には、Ｎｏｘの誘導の後にリソソーム内の高いｐＨが観察され、これはＮｏｘの阻害によって防止または正常化することができる。それぞれのＮｏｘの誘導処理と対照との、およびＮｏｘの阻害との比較のために、多重比較のためのＢｏｎｆｅｒｏｎｉ事後検定を伴うＡＮＯＶＡを用いることができる。Ｎｏｘの誘導に伴ってリソソームのｐＨの変化がないことは、誘導のレベルもしくは期間が不適切であったか、または以下に検討するようにリソソームの不全に別の機序があることを関係付けている。本明細書における研究はＮｏｘの誘導に伴う高いｐＨを示しており、したがってこれらのデータに基づいて、Ｎｏｘ依存性のｐＨの変化を確認することができる。同様に、ｐＨの変化によってプロテアーゼの効率に対する影響が予測できなければ、別の機序の可能性があり、以下にこれを検討する。
【０１１３】
ｃ）カテプシンを含むリソソームタンパク質の酸化的改変はタンパク質分解の障害を惹起する。
カテプシン、特にカテプシンＢ、Ｌ、およびＳ等のシステインプロテアーゼは酸化されやすいシステイン残基を有し、その結果、これらは不活性化される。カテプシンの活性に対するＲＯＳの影響を評価するため、曝露した培養物を還元試薬とともに、または還元試薬なしで、緩衝液中に採取し、適切な基質［カテプシンＢ（ＣＡ−０７４に感受性のある部分）およびＬ（ＣＡ−０７４に非感受性）にはＡｎｅｓｐｅｃ社のＺ−ＦＲ−ＡＭＣ、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社のカテプシンＳ基質、Ｅｎｚｏ社のカテプシンＤおよびＥ基質］を用いてカテプシンの活性を測定することができる。アスパルチルカテプシン（ＣａｔＤまたはＣａｔＥ）は酸化の可能性に対してあまり影響を受けないが、システイニルカテプシンＢ、Ｌ、およびＳの活性は優先的に障害を受け得る。
【０１１４】
（１）ｉＰＳＣ細胞からのヒトニューロンの培養
よく特徴解析されたヒトの誘導可能な多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）株であるＣＣ−３に由来するニューロンの培養を確立し、マウスの培養実験からの重要な知見を確認するために用いることができる。ＣＣ−３株から分化したヒトニューロンは６０％刺激性、４０％抑制性である（５％ＰＶ陽性）。培養したヒトニューロンにおいて炎症をモジュレートするために必要な薬剤の濃度についてはほとんど知られていないので、用量発見のための実験を最初に行なうことができる。ｉＰＳＣのニューロンへの分化には５週間を要し、したがってこれらの培養がマウスの培養からの重要な観察を確認するために最もよく用いられる。ヒトニューロンを用いることへの１つの追加的な説得力のある論拠は、Ｎｏｘ５遺伝子がヒトに存在し、げっ歯類には存在しないことである。Ｃａ２＋依存性であるＮｏｘ５がヒトにおけるＲＯＳの重要な供給源であり得ることが証拠で示されており、Ｎｏｘ５はヒトニューロンで発現していることが知られている。Ｎｏｘ５がリソソームに影響し得るか否かを判定するため、細胞透過性Ｃａ２＋キレーターであるＢＡＰＴＡＡＭ（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ社）を用いてＮｏｘ５を阻害することができる。これらの研究は、リソソーム機能がヒトニューロンの炎症によってどのように影響を受けるかに関する刺激的で新規なアプローチを提供する。
【０１１５】
[実施例７]ニューロンの培養におけるリソソーム機能不全におけるＮｏｘの活性化、ＩＬ−６、およびＳｔａｔ３の活性化の役割
リソソーム障害にＮｏｘを関連付けるため、ＩＬ−６（１０および１００ｎｇ／ｍｌ）で処理した細胞を、１）プロドラッグＮｏｘ阻害剤であるアポシニン（１００μＭ）、２）Ｎｏｘを選択的に阻害する、ｐ２２ｐｈｏｘに対するブロッキング抗体、または３）記載したｐ２２ｐｈｏｘ  ｓｈＲＮＡと共処理することができる。ヒトニューロンにおいて、Ｎｏｘ５  ｓｈＲＮＡの効果を試験することができる。Ｎｏｘ（１種または複数）の誘導はＮｏｘ（１種または複数）についての免疫染色によって、およびマウスおよび／またはヒト試料について検証した抗体を用いるＮｏｘ（１種または複数）サブユニット発現のためのウェスタンブロットによって、モニターすることができる。Ｎｏｘの活性はスーパーオキシドの生成のＥＰＲ検出によってモニターされる。ＩＬ−６の役割を決定するため、ＩＬ−６に対するブロッキング抗体を記載したように薬剤とともに投与することができる。
【０１１６】
リソソーム機能不全におけるＳｔａｔ３の役割を決定するため、タモキシフェン（ＴＡＭ）によって誘導されるＳｔａｔ３欠失マウス（「ＴＦ」マウス）からニューロンを調製することができる。Ｓｔａｔ３は海馬のピラミッド状ニューロンの９５％から欠失する。これらのマウスはＰＩのコロニーの中に維持される。これらのマウスおよびＷＴ  Ｃ５７ＢＬ６マウスからの海馬の培養物を調製することができる。ＷＴおよびＴＦの培養物をプレートに播種した３日後にＴＡＭまたはコーン油ビヒクルで処理して、ＴＦではＳｔａｔ３を除去し、ＷＴ培養では除去しない。培養の１４日目に培養物をＮＭＤＡ（１０μＭ）に２２時間曝露して研究し、記載したようにＮｏｘの活性化を誘導する。Ｓｔａｔ３がリソソームの阻害に必要であれば、ＷＴ培養でなくＴＡＭで処理したＴＦ培養物、またはビヒクルで処理した培養物はリソソーム機能が改善され、Ｎｏｘの活性化が低減する。これに基づいて、Ｓｔａｔ３欠失はやはり炎症性シグナル伝達およびＮｏｘの誘導を低減することができる。注意すべきことに、Ｊａｋ２阻害剤はチロシンのリン酸化のみを防止するので、Ｕ−Ｓｔａｔ３またはｐ−ＳｅｒＳｔａｔ３の作用はブロックされない。ＡＧ４９０はＳｔａｔ３の活性化を防止するＪａｋ阻害剤であり、これはＳｔａｔ３を阻害するための第２の手段として用いることができるが、Ｓｔａｔ３はセリンならびにチロシン残基でリン酸化され得るので、ＡＧ４９０は全てのＳｔａｔ３活性を阻害する訳ではない。したがって、遺伝子欠失実験はＡＧ０４９０による処理とは異なった結果を提供する可能性がある。
【０１１７】
ａ）データの解析および解釈
酸化がジスルフィド結合の形成またはスルフェニル化によってカテプシンを不活性化すれば、カテプシンの活性は還元試薬の封入によって復元できる。細胞を抗酸化剤で処理することによって、カテプシンの炎症誘導不活性化を少なくとも部分的に逆転させることができる。ボンフェローニの事後検定を含むＡＮＯＶＡによって、直接酸化還元効果がカテプシンの活性を阻害するかを決定することができる。
【０１１８】
[実施例８]活性プロテアーゼを含む未分解のリソソームカーゴが近傍のニューロンを傷害する。未消化のリソソーム物質は炎症誘発性か。
心臓および骨等の神経系以外で、無効なリソソームが細胞外スペースに活性プロテアーゼを放出し、それが近傍の組織を破壊することが研究から明らかである。リソソーム物質の凝集物の付近のニューロン線維に傷害があることもデータが示している（図８）。ニューロンのサブセットにおいてｔｄＴｏｍ赤色蛍光レポータータンパク質を発現しているマウスを用いて、共焦点蛍光顕微鏡によってニューロンのプロセスおよびシナプスを可視化することができる。若齢および高齢マウス、ならびにアポシニンで処置したマウスについて回帰分析を実施し、ＳｉｇｍａｓｔａｔおよびＥｘｃｅｌ統計パッケージで利用可能な非パラメーター分布のための検定を用いて、凝集物への接近によって線維の喪失が予測できるかを判定することができる。局所の凝集物と線維の喪失との関係をグラフ化し、線形回帰分析を行なって相関係数（ｒ）を決定し、これを群の間で統計的に比較することができる。排出されたリソソーム物質が局所のニューロン線維に損傷を与えるならばｒは１．０に近付くが、そうでなければｒは０．５に近付く。同様に、本明細書において、凝集物への接近がミクログリアおよび星状膠細胞の活性化として評価される局所の炎症を増大させるかが示される。
【０１１９】
ａ）ニューロンの完全性に対するリソソーム機能不全の影響
全てが傷害の潜在的な標的である単一のニューロン軸索、樹状突起、およびシナプスを容易に可視化できるように、パルバルブミンを発現している阻害性（ＰＶ）ニューロンの中で赤色蛍光タンパク質ｔｄＴｏｍａｔｏ（ｔｄＴｏｍ）を発現するＰＶ−Ｃｒｅ：ｔｄＴｏｍａｔｏレポーターマウスを用いることができる。これらのニューロンは十分に少なく、個別のニューロン、それらの細胞体、およびそれらのプロセスを詳細に観察することが可能であるので、これらのマウスを選択した。ＭＡＰ−２、β−Ｔａｂ、ＳＭＩ３２（線維）、およびＰＳＤ９５、シナプトフィシン（シナプス）の免疫染色を用いてニューロン線維の密度およびシナプスの数を解析するために、公開されたプロトコルを用いることができる。
【０１２０】
リソソーム機能の障害および排出されてもまだ活性のあるカテプシンがニューロン線維／シナプスへのバイスタンダー傷害に関与している場合には、凝集物を低減させる処置は凝集物の付近のニューロンのみの損傷を低減させることができる。処置によって線維の喪失が全体として低減される場合には、これは凝集物が線維の損傷に関与しているという考えに異論を唱えるものである。
【０１２１】
ｂ）リソソーム凝集物は局所の炎症反応を誘導する
星状膠細胞およびミクログリアの活性化は、炎症の２つの尺度として解析することができる。排出されたリソソームの付近の星状膠細胞およびミクログリアの炎症活性化を評価するため、ＧＦＡＰについておよびＩｂａ１についてＩＦを実施して凝集物の付近の増加したＧＦＡＰ陽性星状膠細胞を探し、それにより星状膠細胞の局所活性化を示すことができる。同様に、局所のミクログリアの炎症応答を探すためにＩｂａ１についてスライスを免疫染色することができる。炎症の局所誘導は、ミクログリアおよび星状膠細胞の活性化ならびにＨＬＡ−ＤＲ４α、ＭＨＣ  ＩＩ、およびＩｂａ−１等の炎症誘発性マーカーの誘導を調べることによって、同様にモニターすることができる。星状膠細胞の活性化はＧＦＡＰの発現で追跡することができる。ＧＦＡＰ−ｔｄＴｏｍマウスおよびＣｘ３ｃｒ１−ｅＧＦＰレポーターマウスを用いることができ、必要があれば若齢および高齢マウスの脳のスライスを画像処理することができる。ヒトを含めた老化した脳でミクログリアおよび星状膠細胞の活性の増大が起こることが知られている。しかし、現在までのところ、脳の老化において、排出されたリソソームの内容物および未消化のリソソームの内容物が局所の炎症をどの程度活性化するかは知られていない。ＧＦＡＰおよびＩＬ−６の発現として定義される星状膠細胞の活性化と２０μｍ（およそ細胞２個分の直径）以内のｐ６２陽性凝集物の存在との統計的相関も、本明細書で決定される。同様に、ｐ６２凝集物クラスターとミクログリア上のＩＬ−６受容体、ＭＨＣ  ＩＩ、およびＩｂａ−１等の炎症誘発性マーカーの誘導との有意な相関は、凝集物に対する局所の炎症応答を示している。
【０１２２】
[実施例９]リソソーム機能の回復
リソソーム機能を回復するＮＯＸの阻害の効率を示すため、Ｊ７７４Ａ．１細胞を炎症誘発性分子ＬＰＳで処理してリソソーム機能を障害した。図９に示すように、１μｇ／ｍＬのＬＰＳによる刺激でｐ６２およびＮＯＸ２は対照と比較して上方調節され、リソソーム障害を示した。しかし、５０μＭのＣ３の存在下に１μｇ／ｍＬのＬＰＳで処理した細胞はｐ６２またはＮＯＸ２の増加を示さず、すなわちリソソーム機能が回復された。
【０１２３】
参考文献
【表１−１】
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【０１２４】
【表１−２】
2021502971.tif 000004
【０１２５】
【表１−３】
2021502971.tif 000005
【０１２６】
【表１−４】
2021502971.tif 000006
【０１２７】
【表１−５】
2021502971.tif 000007
【０１２８】
【表１−６】
2021502971.tif 000008
【０１２９】
【表１−７】
2021502971.tif 000009
【０１３０】
【表１−８】
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【０１３１】
【表１−９】
2021502971.tif 000011
【０１３２】
【表１−１０】
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【０１３３】
【表１−１１】
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【０１３４】
【表１−１２】
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【０１３５】
【表１−１３】
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【０１３６】
【表１−１４】
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【０１３７】
【表１−１５】
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【０１３８】
【表１−１６】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【国際調査報告】
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