(57)【要約】本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ＰＡＬ酵素を産生させるための方法も提供する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、医薬化合物の生成のための工業プロセス条件下で有用な増強された触媒活性を提供するように最適化される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４および／もしくは９８８またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼであって、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、前記ポリペプチド配列中の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、それぞれ、配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０を参照して番号付けされる、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項２】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、８０／９９／１０４／１７５／２２０／３５９、８０／１０４、８０／１０４／１０５／１７２、８０／１０４／１０５／１７２／１７５／２２２／３５９、８０／１０４／１０５／１７２／２２０／２２２、８０／１０４／１０５／２２０、８０／１０４／１０５／２２０／２２２／４１６、８０／１０４／１０５／２２２、８０／１０４／１７２／１７５、８０／１０４／１７２／１７５／２２０／３１０／３５９、８０／１０４／１７２／２２２、８０／１０４／３５９／４１６、８４、９０、９９／１０４／１０５／１７２／１７５／２２０／２２２、１００、１０１、１０４、１０４／１０５／１７５、１０４／１７２／３１０／３５９、１０４／１７５／２１３／２２２／３５９、１０４／１７５／２２０／２２２、１０４／２２０／２２２／３５９、１０４／３５９、１０７、１０８、１１０／４１９、１７５／３１５、２１９、２１９／５４０、２２０、３４７、３６０、３６３、４０５、４１６、４１８、４２３、４５０、４５１、および４５２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号４を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項３】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、２０／３０６／５６４、７４／８０／１０５／１０７／３９４／４２０、７４／８３／１０２／１０５／１０７／１１１／２２２／３９４／４１６、７４／９７／１０５／１０６／１０７、７４／１０２／１０５／１０６／１０７／１７５／３９４、７４／１０２／１０５／１０６／１０７／１７５／３９４／４２１、８０／８４／９９／１０４／１０５／１０７／２１９、８０／１０２／１０５／１０７／３０４、８３／１０２／１０５／１０６／１０７／４１６／４２０／４２１、８３／１０２／１０５／３９４／４１６／４２０、８４、８４／９９、８４／９９／１０４／１０５／２１９、８４／１０７、９７／１０２／１０５／１０６／１０７／１１１／３９４／４２０／４２１、９７／１０２／１０５／１０７／１１１／１７５／３０４／４２１／４２４、９７／１０２／１１１／１７５／２２２／４２０／４２１、９７／１０５／１０７／１１１／２２２／４２１／４２４、９７／１０５／１０７／１１１／３９４／４１６／４２１、９９／１０５／１０７、１０２、１０２／１０５／１０７／２２２／３０４／３０７／３９４／４２１／４２４、１０２／１０５／１０７／２２２／３０４／３９４／４２１／４２４、１０２／１０５／１０７／３０４／４２４、１０２／１０５／１０７／３９４／４１６／４２４、１０２／１０７／１１１／２２２／３９４、１０２／１０７／４２０／４２４、１０３、１０４、１０５、１０５／１０６／１０７／４２０／４２１、１０５／１０７、１０５／１０７／１１１、１０５／１０７／１１１／３０４、１０５／１０７／１１１／３９４／４２０／４２４、１０５／１０７／２２２／３０４／４１６、１０５／１１１／２１９、１０５／１７５／２１９、１０５／２１９、１０６、１０７、１０７／１１１／２０９／２２２／３０４、１０７／２２２／３０４、１０７／２９１、１０７／４２１、１７５、２１６、２１９、２２０、２２２／４２１／４２４、３０４／３９４／４１６／４２０、３０６、３５９、３９４、３９５、４１３、４１６、４１８、および４２０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号８を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項４】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号１０６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、３、３／５５０、４、５、６、７、１０、１４、２２、２２／７６、２４、２５、４０、７５、７６、７６／５６１、８４／１０７／１７５／２１９、８４／１０７／２１９、１０２／１０７／２１９／４１０、１０７、１０７／２１６／４１０、１０７／２１９、１０７／２２０、２１２、２１９／２２０、２１９／２２０／４１０、２２０／３５９、２２０／４１０、２８６、３０１、３０３、４１０、５０２、５４４、５６６、および５６７から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１０６を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項５】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号２５２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、３／４／５／７／７６／８４／１０７／３０７、３／５／１０７／３０７／５６６、３／７／７６／１０７／３０７／５６６、３／７／８４／３０７、２４／７６／１０７／３０７、２４／８４／１０７／３０７、７６、７６／８４／１０７、７６／８４／１０７／３０７、７６／８４／１０７／３０７／５０２、７６／８４／１０７／５０２、７６／１０７、７６／１０７／３０７、７６／３０７、７６／３０７／５０２、８４／１０７／３０７、８４／１０７／３０７／５０２、８４／３０１／３０７／５６６、８４／３０７、１０７／３０１／５０２、１０７／３０７、１０７／３０７／５６６、１０７／５０２、１０７／５０２／５６６、３０７、３０７／５０２、および３０７／５６６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号２５２を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項６】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号４４６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、３／４／６／７／７６、３／４／６／７／３０３、３／４／７、３／４／７／７６、３／６／５０２、３／７／７６、７／３０３、４０／３０３、７６、７６／５０２、８２、１００、１０２、１７１、１７４、２１６、２１８、２１９、２２２、２２２／５０９、３０３、３０３／５０２、３０４および３４５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号４４６を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項７】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号４８２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、３／４／７、３／７、４／７、４／７／２１６／２１８、７、７／４０、７／７６／８２／１７４／２２２／３０３、７／７６／１７４／２２２、７／７６／２１９／３０３、７／８２、７／２１６／２１８、４０／８２、４７、６６、７６／８２／２１６／２１８、７６／２１６、７６／２１６／２１９、８２、１１２、１７１、１７４／２２２、２０９、２１６、２１９、２１９／３４５、２２２、２６８、２７１、３３１、３６６、４２８、４３７、４４３、４６０、４７４、５０３、５２４、５３８、および５４３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号４８２を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項８】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号５１６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、４、４／３０４、６、７、９、１６、２０、２５、４０、４０／４３７、４４／４７、４４／４７／９４／５０９、４４／９４／２７０／５５４、４４／９４／５５４、４７、４７／７６、４７／７６／３４５、４７／９４／５０９、４７／１９５／５５４、４７／４２８、５１／１０６、７６、７６／２７１、７６／３４５、８２、８４、９４／１４９、９４／１９５、９４／５５４、９８、９８／４６０、１０９、１１２／５２４、２７１／３４５、２７１／４２８、３０２、３０３、３０４、３０６、３４９、３５８、４１０、４１３、４１６、および５２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号５１６を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項９】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号６１８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、４／４７／７６／８２／９４、７／４４／９４／９８、７／４７／７６／８２、７／７６／５５４、７／９４／９８、１６／４０／７６、１６／４４／７６／９８、１６／４４／９４／９８／５２４、２５／５４／６８／７２、２５／５４／６８／７２／１５８／３３９、２５／５４／６８／７２／２０９／２１２／３３９／５１７、２５／５４／６８／１５８／３３９／５１７、２５／５４／７２／３３９／５１７、２５／５４／１５８／２０９／２１２／３３９／５５１、３０／６８／７２／２０７／２０９／２１２／３３９／４９５／５１７、４０／４４／７６／３０４／５０９、４０／４４／９８／３０４、４０／７６／３０４／４３７、４０／７６／５５４、４４／７６／９４／１１２／３０４、４４／７６／１１２、４４／９４／２７１／３０４／４３７／５５４、４７／７６／８２／９４／２７１、４７／７６／８２／２７１／３０４、４７／７６／９４／２７１、４７／７６／９４／２７１／３０６／３７５／５２４／５５４、４７／７６／３０４／３０６／５５４、４７／７６／３０４／５２４／５５４、４７／９４、４７／９４／２７１、４７／９４／２７１／３０４／５５４、４９／１１４／２４０／５２１、５４／６８／１５８／２０９／２１２／４９５／５１７、６８／７２／１５８／２０９／２１２／３３９／４９５／５５１、６８／７２／１５８／５１７、６８／１５８／２０９／４９５／５１７／５５１、７６、７６／２７１／３０４／５５４、７６／３０４／４３７、８２、８２／５５４、９４／９８、９４／９８／３０６、９４／９８／５０９、９４／９８／５２４、９４／５５４、９８／２７０／３０４／５５４、１１９、２９４、３５７、４００、５１６、５２７、および５６５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号６１８を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項１０】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号７１４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、２５、２５／４０／１５８／２０９／３０４／４１０／５１７、２５／５４／２７１／５１７、２５／１５８／２０９／４１０、２５／３０６／３３９、２５／４１０、４０／４７／６８／９４／９８／４１０／５１７、４０／６８／４６０／５１７、４７／９８／３３９／４１０、５４／６８／７２／９８／２０９／５１７、６８、６８／３３９／５１７、７２／９４／１５８／３３９／４１０／４６０／５１７、７２／１５８／２０９／４１０／５１７、８３、９４／１５８／２０９／３３９／４１０、１００、１２９、１５８、１５８／２０７／３３９／４１０、１５８／２０９／４１０／５１７、２０７／４１０、２０７／４１０／４６０／５１７、２２０、３１７、３３９、３９４、４１０、４１０／５１７、４１６、４６０、４６０／５１７、および５１７から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号７１４を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項１１】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号８３０またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、２５／８３／１５８／２２０／５１７、２５／８３／２２０／４１６、２５／１５８／２０９／２２０／５１７、２５／１５８／２２０、２５／１５８／２２０／５１７、２５／２２０／３３９、２５／２２０／５１７、２５／４１０／４１６／５１７、４０、４５、５４／５９、５４／２８５、８３、８３／２０９／２２０／４１０／５１７、８３／３３９／４１０、１１９、１５８／２２０／２７１／５１７、２０９、２２０、２２０／４１０／４１６／５１７、２２０／５１７、２４４、２４６、２７１、２７１／４１０／４１６／５１７、２９３、３０４、３３９、３６８、４００、４１０、４１０／４１６／５１７、４２４、４５９、４７９、５２０、５２５、５３７、５６２、および５６５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号８３０を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項１２】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号８９４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、２５／４０／４５／２０９／４２４、２５／４０／４２４、２５／４５／５４／７３／２４６／４２４、２５／５４／７３／２０９／４２４／５２０、４０／４７／５４／２１４／５０３、４０／５４／２０９／２１４／２４４／３３９／５２０、４０／５４／２１４／２４４／３３９／５０３、４０／２０９／２４６／４２４、５４、５４／２０９／２１４／２４４、５４／２０９／２１４／２４４／３３９／５０３、５４／４２４、５４／４２４／５２０、２０９／５０３、２２７、２４６、２４６／４２４、２７４／３１１、４１０、４１１、４１３、および４２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号８９４を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項１３】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号９８８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、４０、４０／５４／２１４／４２１／４２４、４０／９０／４２１／４２４、４０／２１４、４０／２１４／４２４、４０／４２１／４２４、４０／４２４、５４／２１４、６６、９０／２１４／４２４、１０６／２２７、１０６／２２７／２４４、１０６／２２７／２４４／５５４、１０６／２２７／５５４、２１４、２１４／４２１、３３９、４２１／４２４、４２４、４５４、４６３、４６４、４７４、および５４３４０、４０／５４／２１４／４２１／４２４、４０／９０／４２１／４２４、４０／２１４、４０／２１４／４２４、４０／４２１／４２４、４０／４２４、５４／２１４、６６、９０／２１４／４２４、１０６／２２７、１０６／２２７／２４４、１０６／２２７／２４４／５５４、１０６／２２７／５５４、２１４、２１４／４２１、３３９、４２１／４２４、４２４、４５４、４６３、４６４、４７４、および５４３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号９８８を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項１４】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号９８８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、３６、４０／６６／２２７、４０／６６／２２７／２４４／４１０／４２４、４０／６６／４１０／４７４、４０／４１０／４１１／４２４、４７、６６、６６／２１４／３７４／４１０／４７４、６６／２１４／４２４、６６／２１４／４３７／４７４、６６／２２７、６６／２２７／２４４／４２４／５４３、６６／２２７／４２４、６６／３３９、６６／３３９／４１０／５４３、６６／３３９／４７４、６６／３７０、６６／４１０／４２４／４５４／５２７、６６／４２４、６６／４６３／４６４、６６／５４３、１０２、１０４、１０５、１５４、２１４／２４４／５４３、２１４／３７４／４２４、２２７、２２７／２４４／４１１／４２４、２２７／３３９／４１３／４３７、２４４／４１１、３３９、３９４、４１０、４１０／４１１／４２４、４１３、４２１、４２４、５１７、５２４、および５５４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号９８８を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項１５】
前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、配列番号１１４０またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、３６／４７／４２４／５１７／５５４、４７／２１４／４１３／５２４／５６３、４７／４１０／５２４、４７／５２４、４７／５５４、２１４、２１４／４２４、４１０、４１０／５１７／５５４、４１０／５５４、４２４／５１７／５５４、５１７／５２４／５５４および５５４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、前記ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、配列番号１１４０を参照して番号付けされる、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項１６】
配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／もしくは１１４０またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項１７】
配列番号４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８、１１４０またはそれらの機能的断片を含む、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項１８】
表５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、１０．１、１１．１、１２．１、１３．１、１４．１、１５．１、１８．１および／または１９．１に示される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項１９】
配列番号４〜１２２２の偶数配列に示される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項２０】
配列番号４〜１２２２の偶数配列に示される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントの配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項２１】
配列番号４〜１２２２の偶数配列に示されるポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項２２】
野生型Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのフェニルアラニンアンモニアリアーゼと比較して少なくとも１つの改善された性質を示すポリペプチド配列を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項２３】
前記改善された性質が、化合物２の改善された生成を含む、請求項２２に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項２４】
前記改善された性質が、
【化７】
2021531749.tif 000035
の改善された生成を含む、請求項２２に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項２５】
前記改善された性質が、
【化８】
2021531749.tif 000036
の改善された利用を含む、請求項２２に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項２６】
前記改善された性質が、
【化９】
2021531749.tif 000037
から
【化１０】
2021531749.tif 000038
の改善された生成を含む、請求項２２に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項２７】
前記改善された性質が、改善されたエナンチオ選択性を含む、請求項２２に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項２８】
前記改善された性質が、改善された安定性を含む、請求項２２に記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項２９】
精製されている、請求項１〜２８のいずれかに記載の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれかに提供される少なくとも１つのフェニルアラニンアンモニアリアーゼを含む組成物。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３２】
少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする操作されたポリヌクレオチド配列であって、前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含み、前記操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼの前記ポリヌクレオチド配列が、１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換を含む、操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３３】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含む、請求項３１または３２に記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３４】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９を含む、請求項２９〜３１のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３５】
前記ポリヌクレオチド配列が、配列番号３〜１２２１に示される奇数配列に示される配列を含む、請求項２９〜３２のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３６】
前記ポリヌクレオチド配列が、制御配列に作動可能に連結されている、請求項３１〜３５のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３７】
前記操作されたポリヌクレオチド配列が、コドン最適化されている、請求項２１〜３６のいずれかに記載の操作されたポリヌクレオチド配列。
【請求項３８】
請求項３１〜３７のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
【請求項３９】
請求項３８に記載の少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞。
【請求項４０】
請求項３１〜３７のいずれかに記載の少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞。
【請求項４１】
宿主細胞において操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼを産生させる方法であって、少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが産生するように、適切な条件下で、培養培地中で請求項３９および／または４０に記載の宿主細胞を培養することを含む、方法。
【請求項４２】
前記培養培地および／または前記宿主細胞から少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼを回収するステップをさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記少なくとも１つのフェニルアラニンアンモニアリアーゼを精製するステップをさらに含む、請求項４１および／または４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年７月１２日および２０１９年３月６日にそれぞれ出願された米国仮特許出願第６２／６９６，９７８号および同第６２／８１４，３６２号に対する優先権を主張し、この両方とも、すべての目的のために、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ＰＡＬ酵素を産生させるための方法も提供する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、医薬化合物の生成のための工業プロセス条件下で有用な増強された触媒活性を提供するように最適化される。
【０００３】
配列表、表またはコンピュータープログラムに対する参照
配列表の公式の写しを、作成日２０１９年６月１２日およびサイズ４．１６メガバイトのファイル名「ＣＸ２−１７９ＷＯ１＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」のＡＳＣＩＩフォーマットのテキストファイルとして本明細書と共に、ここに、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出する。ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して提出された配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）（例えば、Cui  et  al.,  Crit.  Rev.  Biotechnol.,  34:  258-268  [2014]；Hyun  et  al.,  Mycobiol.,  39:257-265  [2011]；MacDonald  et  al.,  Biochem.  Cell  Biol.,  85:273-282  [2007]を参照のこと）は、ヒスチジンアンモニアリアーゼ（ＨＡＬ）およびチロシンアンモニアリアーゼ（ＴＡＬ）と共に（例えば、Kyndt  et  al.,  FEBS  Lett.,  512:240-244  [2002]；Watt  et  al.,  Chem.  Biol.,  13:  1317-132  [2006]；およびXue  et  al.,  J.  Ind.  Microbiol.  Biotechnol.,  34:599-604  [2007]を参照のこと）、芳香族アミノ酸リアーゼファミリー（ＥＣ  ４．３．１．２３〜１．２５および４．３．１．３）のメンバーである。より詳細には、ＰＡＬ活性を有する酵素（ＥＣ  ４．３．１．２３〜１．２５、および以前はＥＣ  ４．３．１．５として分類）は、Ｌ−フェニルアラニンの（Ｅ）−ケイ皮酸への非酸化的脱アミノ化を触媒する（スキーム１）。
【０００５】
反応は、可逆的であり、したがって、ＰＡＬは、高濃度のアンモニアまたは溶液中でアンモニアを遊離させる材料の存在下、（Ｅ）−ケイ皮酸のアミノ化を触媒して、Ｌ−フェニルアラニンを与える（スキーム１）。
【化１】
2021531749.tif 000002
【０００６】
ＰＡＬは、植物中に広く分布している非哺乳動物酵素であり、真菌および限られた数の細菌においても同定されている。これは、通常、３００〜３４０ｋＤａの典型的な質量を有する四量体である（例えば、Cui  et  al.,  Crit.  Rev.  Biotechnol.,  34:258-268  [2014]を参照のこと）。補因子を外部から添加する必要はなく、代わりに、３つの残基、すなわち、アラニン、セリンおよびグリシンの自己環化ならびに脱水で３，５−ジヒドロ−５−メチリデン−４Ｈ−イミダゾール−４−オン（ＭＩＯ）（反応を触媒する求電子剤としての機能を果たす）を形成することにより補因子が触媒の活性部位に形成される（例えば、MacDonald  and  D'Cunha,  Biochem.  Cell  Biol.,  85:273-82  [2007]を参照のこと）。
【０００７】
キラルアミン化合物は、多くの場合、医薬工業、農薬工業および化学工業において、広範囲の商業的に望まれる化合物の調製のための中間体またはシントンとして使用される。現在の医薬の４０％がアミン官能性を含有すると推定される（例えば、Ghislieri  and  Turner,  Top.  Catal.,  57:284-300  [2014]を参照のこと）。典型的には、キラルアミン化合物のこれらの工業的適用は、分子の唯一の特定の立体異性体の形態の使用を含む（例えば、（Ｒ）または（Ｓ）エナンチオマーのみが生理学的に活性である）。
【０００８】
ＰＡＬ酵素は、高度にエナンチオ選択的であり、フェニルアラニンの商業的合成のためのアミノ化の方向で使用されている（例えば、Yamada  et  al.,  Appl.  Environ.  Microbiol.,  19:421-427  [1981]；およびEI-Batal  et  al.,  Acta  Microbiol.  Pol.,  51:153-169  [2002]を参照のこと）。芳香環上に小さな置換基を有するケイ皮酸に対する活性を有する操作されたＰＡＬバリアントが報告されている（例えば、Gloge  et  al.  Chem.  Eur.  J.,  6:3386-3390  [2000]；  de  Lange  et  al.,  ChemCatChem.,  3:289-292  [2011]；Lovelock  et  al.,  Bioorg.  Med.  Chem.,  22:5555-5557  [2014]；Parmeggiani  et  al.,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.,  54:4608-4611  [2015]；Rowles  et  al.,  Tetrahed.,  72:7343-7347  [2016]；およびWeise  et  al.,  Catal.  Sci.  Technol.,  6:4086-408  [2016]を参照のこと）。
【０００９】
所望のｐＨに酸で調整されたアンモニア水溶液は、キラルアミノ酸の生成のためのアミノ化反応の方向で使用される場合、アンモニア源として通常使用される。加えて、炭酸アンモニウムおよびカルバミン酸アンモニウムなどのアンモニアを含有する塩（Weise  et  al.,  Catal.  Sci.  Technol.,  6:4086-408  [2016]）も使用されている。塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、酢酸アンモニウム、リン酸アンモニウム、ギ酸アンモニウムなどのような他のアンモニウム塩を使用することもできる。
ＰＡＬを商業的に用いることの主な欠点は、それらが一般に、工業的に重要なキラルアミン化合物の調製のために望ましくない性質を有することである。これらの欠点は、天然の基質であるケイ皮酸およびフェニルアラニンと比較して、芳香環上に嵩高いか、もしくは電子リッチな置換基（複数可）を含有する基質に対する活性が低いか、またはないこと、および多くの場合、工業的に有用なプロセス条件下（例えば、有機溶媒の存在下、または上昇した温度）での安定性が低いことが挙げられる。したがって、多様な範囲の基質からキラルアミン化合物を調製するための工業的プロセスにおいて使用することができる操作されたＰＡＬについての必要性がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Cui  et  al.,  Crit.  Rev.  Biotechnol.,  34:  258-268  [2014]
【非特許文献２】Hyun  et  al.,  Mycobiol.,  39:257-265  [2011]
【非特許文献３】MacDonald  et  al.,  Biochem.  Cell  Biol.,  85:273-82  [2007]
【非特許文献４】Kyndt  et  al.,  FEBS  Lett.,  512:240-244  [2002]
【非特許文献５】Watt  et  al.,  Chem.  Biol.,  13:  1317-132  [2006]
【非特許文献６】Xue  et  al.,  J.  Ind.  Microbiol.  Biotechnol.,  34:599-604  [2007]
【非特許文献７】Ghislieri  and  Turner,  Top.  Catal.,  57:284-300  [2014]
【非特許文献８】Yamada  et  al.,  Appl.  Environ.  Microbiol.,  19:421-427  [1981]
【非特許文献９】EI-Batal  et  al.,  Acta  Microbiol.  Pol.,  51:153-169  [2002]
【非特許文献１０】Gloge  et  al.  Chem.  Eur.  J.,  6:3386-3390  [2000]
【非特許文献１１】de  Lange  et  al.,  ChemCatChem.,  3:289-292  [2011]
【非特許文献１２】Lovelock  et  al.,  Bioorg.  Med.  Chem.,  22:5555-5557  [2014]
【非特許文献１３】Parmeggiani  et  al.,  Angew.  Chem.  Int.  Ed.,  54:4608-4611  [2015]
【非特許文献１４】Rowles  et  al.,  Tetrahed.,  72:7343-7347  [2016]
【非特許文献１５】Weise  et  al.,  Catal.  Sci.  Technol.,  6:4086-408  [2016]
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）酵素、ＰＡＬ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。ＰＡＬ酵素を産生させるための方法も提供する。本発明は、ＰＡＬ酵素を含む組成物、および操作されたＰＡＬ酵素を使用する方法をさらに提供する。
【００１２】
本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、医薬化合物の生成のための工業プロセス条件下で有用な増強された触媒活性を提供するように最適化される。
【００１３】
本発明は、配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４および／もしくは９８８またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼを提供する。本発明は、配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４および／もしくは９８８またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼであって、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが、ポリペプチド配列中の少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置が、それぞれ、配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４および／または９８８を参照して番号付けされる、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼも提供する。
【００１４】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、８０／９９／１０４／１７５／２２０／３５９、８０／１０４、８０／１０４／１０５／１７２、８０／１０４／１０５／１７２／１７５／２２２／３５９、８０／１０４／１０５／１７２／２２０／２２２、８０／１０４／１０５／２２０、８０／１０４／１０５／２２０／２２２／４１６、８０／１０４／１０５／２２２、８０／１０４／１７２／１７５、８０／１０４／１７２／１７５／２２０／３１０／３５９、８０／１０４／１７２／２２２、８０／１０４／３５９／４１６、８４、９０、９９／１０４／１０５／１７２／１７５／２２０／２２２、１００、１０１、１０４、１０４／１０５／１７５、１０４／１７２／３１０／３５９、１０４／１７５／２１３／２２２／３５９、１０４／１７５／２２０／２２２、１０４／２２０／２２２／３５９、１０４／３５９、１０７、１０８、１１０／４１９、１７５／３１５、２１９、２１９／５４０、２２０、３４７、３６０、３６３、４０５、４１６、４１８、４２３、４５０、４５１、および４５２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、８０Ａ／９９Ｄ／１０４Ａ／１７５Ａ／２２０Ｇ／３５９Ｙ、８０Ａ／１０４Ａ、８０Ａ／１０４Ａ／１０５Ｉ／１７２Ａ、８０Ａ／１０４Ａ／１０５Ｉ／１７２Ａ／２２０Ｇ／２２２Ｖ、８０Ａ／１０４Ａ／１０５Ｉ／１７２Ｔ／１７５Ａ／２２２Ｖ／３５９Ｙ、８０Ａ／１０４Ａ／１０５Ｉ／２２０Ｇ、８０Ａ／１０４Ａ／１０５Ｉ／２２０Ｇ／２２２Ｖ／４１６Ｖ、８０Ａ／１０４Ａ／１０５Ｉ／２２２Ｖ、８０Ａ／１０４Ａ／１７２Ａ／１７５Ａ、８０Ａ／１０４Ａ／１７２Ａ／１７５Ａ／２２０Ｇ／３１０Ａ／３５９Ｙ、８０Ａ／１０４Ａ／１７２Ｔ／２２２Ｖ、８０Ａ／１０４Ａ／３５９Ｙ／４１６Ｖ、８４Ｐ、８４Ｖ、９０Ｔ、９９Ｄ／１０４Ａ／１０５Ｉ／１７２Ｔ／１７５Ａ／２２０Ｇ／２２２Ｖ、１００Ｒ、１００Ｓ、１０１Ｋ、１０４Ａ、１０４Ａ／１０５Ｉ／１７５Ａ、１０４Ａ／１７２Ａ／３１０Ａ／３５９Ｙ、１０４Ａ／１７５Ａ／２１３Ｑ／２２２Ｖ／３５９Ｙ、１０４Ａ／１７５Ａ／２２０Ｇ／２２２Ｖ、１０４Ａ／２２０Ｇ／２２２Ｖ／３５９Ｙ、１０４Ａ／３５９Ｙ、１０４Ｉ、１０４Ｐ、１０４Ｓ、１０７Ｔ、１０８Ｅ、１１０Ｐ／４１９Ｄ、１７５Ｇ／３１５Ｒ、２１９Ｇ、２１９Ｍ／５４０Ｇ、２１９Ｐ、２２０Ｐ、３４７Ｖ、３６０Ｖ、３６３Ｒ、４０５Ｒ、４１６Ｅ、４１６Ｌ、４１８Ｇ、４２３Ｅ、４５０Ｅ、４５１Ｐ、および４５２Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｖ８０Ａ／Ｅ９９Ｄ／Ｌ１０４Ａ／Ｓ１７５Ａ／Ａ２２０Ｇ／Ｈ３５９Ｙ、Ｖ８０Ａ／Ｌ１０４Ａ、Ｖ８０Ａ／Ｌ１０４Ａ／Ｖ１０５Ｉ／Ｖ１７２Ａ、Ｖ８０Ａ／Ｌ１０４Ａ／Ｖ１０５Ｉ／Ｖ１７２Ａ／Ａ２２０Ｇ／Ｍ２２２Ｖ、Ｖ８０Ａ／Ｌ１０４Ａ／Ｖ１０５Ｉ／Ｖ１７２Ｔ／Ｓ１７５Ａ／Ｍ２２２Ｖ／Ｈ３５９Ｙ、Ｖ８０Ａ／Ｌ１０４Ａ／Ｖ１０５Ｉ／Ａ２２０Ｇ、Ｖ８０Ａ／Ｌ１０４Ａ／Ｖ１０５Ｉ／Ａ２２０Ｇ／Ｍ２２２Ｖ／Ｍ４１６Ｖ、Ｖ８０Ａ／Ｌ１０４Ａ／Ｖ１０５Ｉ／Ｍ２２２Ｖ、Ｖ８０Ａ／Ｌ１０４Ａ／Ｖ１７２Ａ／Ｓ１７５Ａ、Ｖ８０Ａ／Ｌ１０４Ａ／Ｖ１７２Ａ／Ｓ１７５Ａ／Ａ２２０Ｇ／Ｉ３１０Ａ／Ｈ３５９Ｙ、Ｖ８０Ａ／Ｌ１０４Ａ／Ｖ１７２Ｔ／Ｍ２２２Ｖ、Ｖ８０Ａ／Ｌ１０４Ａ／Ｈ３５９Ｙ／Ｍ４１６Ｖ、Ｆ８４Ｐ、Ｆ８４Ｖ、Ｖ９０Ｔ、Ｅ９９Ｄ／Ｌ１０４Ａ／Ｖ１０５Ｉ／Ｖ１７２Ｔ／Ｓ１７５Ａ／Ａ２２０Ｇ／Ｍ２２２Ｖ、Ｌ１００Ｒ、Ｌ１００Ｓ、Ｑ１０１Ｋ、Ｌ１０４Ａ、Ｌ１０４Ａ／Ｖ１０５Ｉ／Ｓ１７５Ａ、Ｌ１０４Ａ／Ｖ１７２Ａ／Ｉ３１０Ａ／Ｈ３５９Ｙ、Ｌ１０４Ａ／Ｓ１７５Ａ／Ｌ２１３Ｑ／Ｍ２２２Ｖ／Ｈ３５９Ｙ、Ｌ１０４Ａ／Ｓ１７５Ａ／Ａ２２０Ｇ／Ｍ２２２Ｖ、Ｌ１０４Ａ／Ａ２２０Ｇ／Ｍ２２２Ｖ／Ｈ３５９Ｙ、Ｌ１０４Ａ／Ｈ３５９Ｙ、Ｌ１０４Ｉ、Ｌ１０４Ｐ、Ｌ１０４Ｓ、Ｈ１０７Ｔ、Ｌ１０８Ｅ、Ｔ１１０Ｐ／Ｋ４１９Ｄ、Ｓ１７５Ｇ／Ｓ３１５Ｒ、Ｌ２１９Ｇ、Ｌ２１９Ｍ／Ｅ５４０Ｇ、Ｌ２１９Ｐ、Ａ２２０Ｐ、Ｎ３４７Ｖ、Ｇ３６０Ｖ、Ｆ３６３Ｒ、Ｓ４０５Ｒ、Ｍ４１６Ｅ、Ｍ４１６Ｌ、Ｌ４１８Ｇ、Ｉ４２３Ｅ、Ｆ４５０Ｅ、Ｎ４５１Ｐ、およびＱ４５２Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４を参照して番号付けされる。
【００１５】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、２０／３０６／５６４、７４／８０／１０５／１０７／３９４／４２０、７４／８３／１０２／１０５／１０７／１１１／２２２／３９４／４１６、７４／９７／１０５／１０６／１０７、７４／１０２／１０５／１０６／１０７／１７５／３９４、７４／１０２／１０５／１０６／１０７／１７５／３９４／４２１、８０／８４／９９／１０４／１０５／１０７／２１９、８０／１０２／１０５／１０７／３０４、８３／１０２／１０５／１０６／１０７／４１６／４２０／４２１、８３／１０２／１０５／３９４／４１６／４２０、８４、８４／９９、８４／９９／１０４／１０５／２１９、８４／１０７、９７／１０２／１０５／１０６／１０７／１１１／３９４／４２０／４２１、９７／１０２／１０５／１０７／１１１／１７５／３０４／４２１／４２４、９７／１０２／１１１／１７５／２２２／４２０／４２１、９７／１０５／１０７／１１１／２２２／４２１／４２４、９７／１０５／１０７／１１１／３９４／４１６／４２１、９９／１０５／１０７、１０２、１０２／１０５／１０７／２２２／３０４／３０７／３９４／４２１／４２４、１０２／１０５／１０７／２２２／３０４／３９４／４２１／４２４、１０２／１０５／１０７／３０４／４２４、１０２／１０５／１０７／３９４／４１６／４２４、１０２／１０７／１１１／２２２／３９４、１０２／１０７／４２０／４２４、１０３、１０４、１０５、１０５／１０６／１０７／４２０／４２１、１０５／１０７、１０５／１０７／１１１、１０５／１０７／１１１／３０４、１０５／１０７／１１１／３９４／４２０／４２４、１０５／１０７／２２２／３０４／４１６、１０５／１１１／２１９、１０５／１７５／２１９、１０５／２１９、１０６、１０７、１０７／１１１／２０９／２２２／３０４、１０７／２２２／３０４、１０７／２９１、１０７／４２１、１７５、２１６、２１９、２２０、２２２／４２１／４２４、３０４／３９４／４１６／４２０、３０６、３５９、３９４、３９５、４１３、４１６、４１８、および４２０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号８を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、２０Ｄ／３０６Ｌ／５６４Ｑ、７４Ｄ／８０Ａ／１０５Ｉ／１０７Ｇ／３９４Ｎ／４２０Ｓ、７４Ｄ／８３Ｓ／１０２Ｅ／１０５Ｉ／１０７Ｓ／１１１Ａ／２２２Ａ／３９４Ｎ／４１６Ｖ、７４Ｄ／９７Ｔ／１０５Ｉ／１０６Ｒ／１０７Ｇ、７４Ｄ／１０２Ｅ／１０５Ｉ／１０６Ｒ／１０７Ｇ／１７５Ａ／３９４Ｎ／４２１Ｔ、７４Ｄ／１０２Ｅ／１０５Ｉ／１０６Ｒ／１０７Ｌ／１７５Ａ／３９４Ｎ、８０Ａ／８４Ｖ／９９Ｄ／１０４Ｉ／１０５Ｉ／１０７Ｔ／２１９Ｇ、８０Ａ／１０２Ｅ／１０５Ｉ／１０７Ｌ／３０４Ｗ、８３Ｓ／１０２Ｅ／１０５Ｉ／１０６Ｒ／１０７Ｇ／４１６Ｖ／４２０Ｓ／４２１Ｔ、８３Ｓ／１０２Ｅ／１０５Ｉ／３９４Ｎ／４１６Ｖ／４２０Ｓ、８４Ｇ、８４Ｌ、８４Ｐ、８４Ｒ、８４Ｓ、８４Ｖ、８４Ｖ／９９Ｄ、８４Ｖ／９９Ｄ／１０４Ｉ／１０５Ｉ／２１９Ｇ、８４Ｖ／１０７Ｔ、９７Ｔ／１０２Ｅ／１０５Ｉ／１０６Ｒ／１０７Ｇ／１１１Ａ／３９４Ｎ／４２０Ｓ／４２１Ｔ、９７Ｔ／１０２Ｅ／１０５Ｉ／１０７Ｇ／１１１Ａ／１７５Ａ／３０４Ｗ／４２１Ｔ／４２４Ｖ、９７Ｔ／１０２Ｅ／１１１Ａ／１７５Ａ／２２２Ｇ／４２０Ｓ／４２１Ｔ、９７Ｔ／１０５Ｉ／１０７Ｇ／１１１Ａ／２２２Ｇ／４２１Ｔ／４２４Ｖ、９７Ｔ／１０５Ｉ／１０７Ｓ／１１１Ａ／３９４Ｎ／４１６Ｖ／４２１Ｔ、９９Ｄ／１０５Ｉ／１０７Ｔ、１０２Ｅ／１０５Ｉ／１０７Ｇ／３９４Ｎ／４１６Ｖ／４２４Ｖ、１０２Ｅ／１０５Ｉ／１０７Ｉ／３０４Ｗ／４２４Ｖ、１０２Ｅ／１０５Ｉ／１０７Ｓ／２２２Ｇ／３０４Ｗ／３０７Ｈ／３９４Ｎ／４２１Ｔ／４２４Ｖ、１０２Ｅ／１０５Ｉ／１０７Ｓ／２２２Ｇ／３０４Ｗ／３９４Ｎ／４２１Ｔ／４２４Ｖ、１０２Ｅ／１０７Ａ／１１１Ａ／２２２Ｇ／３９４Ｎ、１０２Ｅ／１０７Ｇ／４２０Ｓ／４２４Ｖ、１０２Ｎ、１０３Ｓ、１０４Ｇ、１０５Ｉ、１０５Ｉ／１０６Ｒ／１０７Ｇ／４２０Ｓ／４２１Ｔ、１０５Ｉ／１０７Ａ／２２２Ｇ／３０４Ｗ／４１６Ｖ、１０５Ｉ／１０７Ｅ／１１１Ａ、１０５Ｉ／１０７Ｇ／１１１Ａ／３９４Ｎ／４２０Ｓ／４２４Ｖ、１０５Ｉ／１０７Ｉ／１１１Ａ／３０４Ｗ、１０５Ｉ／１０７Ｔ、１０５Ｉ／１１１Ａ／２１９Ｇ、１０５Ｉ／１７５Ａ／２１９Ｇ、１０５Ｉ／２１９Ｇ、１０６Ｍ、１０７Ｇ、１０７Ｇ／２９１Ｎ、１０７Ｇ／４２１Ｔ、１０７Ｌ、１０７Ｌ／２２２Ｇ／３０４Ｗ、１０７Ｐ、１０７Ｑ、１０７Ｔ、１０７Ｔ／１１１Ａ／２０９Ｉ／２２２Ｇ／３０４Ｗ、１７５Ｎ、２１６Ｇ、２１９Ｃ、２２０Ｓ、２２２Ａ／４２１Ｔ／４２４Ｖ、３０４Ｗ／３９４Ｎ／４１６Ｖ／４２０Ｓ、３０６Ｌ、３５９Ｒ、３９４Ｖ、３９５Ｍ、４１３Ｅ、４１３Ｔ、４１６Ａ、４１６Ｃ、４１６Ｇ、４１６Ｈ、４１６Ｌ、４１６Ｖ、４１８Ｉ、４２０Ａ、および４２０Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号８を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｇ２０Ｄ／Ｄ３０６Ｌ／Ｐ５６４Ｑ、Ｇ７４Ｄ／Ｖ８０Ａ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｇ／Ａ３９４Ｎ／Ｇ４２０Ｓ、Ｇ７４Ｄ／Ｇ８３Ｓ／Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｓ／Ｇ１１１Ａ／Ｖ２２２Ａ／Ａ３９４Ｎ／Ｍ４１６Ｖ、Ｇ７４Ｄ／Ａ９７Ｔ／Ｖ１０５Ｉ／Ｗ１０６Ｒ／Ｈ１０７Ｇ、Ｇ７４Ｄ／Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ｗ１０６Ｒ／Ｈ１０７Ｇ／Ｓ１７５Ａ／Ａ３９４Ｎ／Ｌ４２１Ｔ、Ｇ７４Ｄ／Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ｗ１０６Ｒ／Ｈ１０７Ｌ／Ｓ１７５Ａ／Ａ３９４Ｎ、Ｖ８０Ａ／Ｆ８４Ｖ／Ｅ９９Ｄ／Ａ１０４Ｉ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｔ／Ｌ２１９Ｇ、Ｖ８０Ａ／Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｌ／Ｙ３０４Ｗ、Ｇ８３Ｓ／Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ｗ１０６Ｒ／Ｈ１０７Ｇ／Ｍ４１６Ｖ／Ｇ４２０Ｓ／Ｌ４２１Ｔ、Ｇ８３Ｓ／Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ａ３９４Ｎ／Ｍ４１６Ｖ／Ｇ４２０Ｓ、Ｆ８４Ｇ、Ｆ８４Ｌ、Ｆ８４Ｐ、Ｆ８４Ｒ、Ｆ８４Ｓ、Ｆ８４Ｖ、Ｆ８４Ｖ／Ｅ９９Ｄ、Ｆ８４Ｖ／Ｅ９９Ｄ／Ａ１０４Ｉ／Ｖ１０５Ｉ／Ｌ２１９Ｇ、Ｆ８４Ｖ／Ｈ１０７Ｔ、Ａ９７Ｔ／Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ｗ１０６Ｒ／Ｈ１０７Ｇ／Ｇ１１１Ａ／Ａ３９４Ｎ／Ｇ４２０Ｓ／Ｌ４２１Ｔ、Ａ９７Ｔ／Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｇ／Ｇ１１１Ａ／Ｓ１７５Ａ／Ｙ３０４Ｗ／Ｌ４２１Ｔ／Ｃ４２４Ｖ、Ａ９７Ｔ／Ｔ１０２Ｅ／Ｇ１１１Ａ／Ｓ１７５Ａ／Ｖ２２２Ｇ／Ｇ４２０Ｓ／Ｌ４２１Ｔ、Ａ９７Ｔ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｇ／Ｇ１１１Ａ／Ｖ２２２Ｇ／Ｌ４２１Ｔ／Ｃ４２４Ｖ、Ａ９７Ｔ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｓ／Ｇ１１１Ａ／Ａ３９４Ｎ／Ｍ４１６Ｖ／Ｌ４２１Ｔ、Ｅ９９Ｄ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｔ、Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｇ／Ａ３９４Ｎ／Ｍ４１６Ｖ／Ｃ４２４Ｖ、Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｉ／Ｙ３０４Ｗ／Ｃ４２４Ｖ、Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｓ／Ｖ２２２Ｇ／Ｙ３０４Ｗ／Ｇ３０７Ｈ／Ａ３９４Ｎ／Ｌ４２１Ｔ／Ｃ４２４Ｖ、Ｔ１０２Ｅ／Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｓ／Ｖ２２２Ｇ／Ｙ３０４Ｗ／Ａ３９４Ｎ／Ｌ４２１Ｔ／Ｃ４２４Ｖ、Ｔ１０２Ｅ／Ｈ１０７Ａ／Ｇ１１１Ａ／Ｖ２２２Ｇ／Ａ３９４Ｎ、Ｔ１０２Ｅ／Ｈ１０７Ｇ／Ｇ４２０Ｓ／Ｃ４２４Ｖ、Ｔ１０２Ｎ、Ｎ１０３Ｓ、Ａ１０４Ｇ、Ｖ１０５Ｉ、Ｖ１０５Ｉ／Ｗ１０６Ｒ／Ｈ１０７Ｇ／Ｇ４２０Ｓ／Ｌ４２１Ｔ、Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ａ／Ｖ２２２Ｇ／Ｙ３０４Ｗ／Ｍ４１６Ｖ、Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｅ／Ｇ１１１Ａ、Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｇ／Ｇ１１１Ａ／Ａ３９４Ｎ／Ｇ４２０Ｓ／Ｃ４２４Ｖ、Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｉ／Ｇ１１１Ａ／Ｙ３０４Ｗ、Ｖ１０５Ｉ／Ｈ１０７Ｔ、Ｖ１０５Ｉ／Ｇ１１１Ａ／Ｌ２１９Ｇ、Ｖ１０５Ｉ／Ｓ１７５Ａ／Ｌ２１９Ｇ、Ｖ１０５Ｉ／Ｌ２１９Ｇ、Ｗ１０６Ｍ、Ｈ１０７Ｇ、Ｈ１０７Ｇ／Ｓ２９１Ｎ、Ｈ１０７Ｇ／Ｌ４２１Ｔ、Ｈ１０７Ｌ、Ｈ１０７Ｌ／Ｖ２２２Ｇ／Ｙ３０４Ｗ、Ｈ１０７Ｐ、Ｈ１０７Ｑ、Ｈ１０７Ｔ、Ｈ１０７Ｔ／Ｇ１１１Ａ／Ｓ２０９Ｉ／Ｖ２２２Ｇ／Ｙ３０４Ｗ、Ｓ１７５Ｎ、Ｋ２１６Ｇ、Ｌ２１９Ｃ、Ｇ２２０Ｓ、Ｖ２２２Ａ／Ｌ４２１Ｔ／Ｃ４２４Ｖ、Ｙ３０４Ｗ／Ａ３９４Ｎ／Ｍ４１６Ｖ／Ｇ４２０Ｓ、Ｄ３０６Ｌ、Ｙ３５９Ｒ、Ａ３９４Ｖ、Ｓ３９５Ｍ、Ｋ４１３Ｅ、Ｋ４１３Ｔ、Ｍ４１６Ａ、Ｍ４１６Ｃ、Ｍ４１６Ｇ、Ｍ４１６Ｈ、Ｍ４１６Ｌ、Ｍ４１６Ｖ、Ｌ４１８Ｉ、Ｇ４２０Ａ、およびＧ４２０Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号８を参照して番号付けされる。
【００１６】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号１０６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号１０６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３、３／５５０、４、５、６、７、１０、１４、２２、２２／７６、２４、２５、４０、７５、７６、７６／５６１、８４／１０７／１７５／２１９、８４／１０７／２１９、１０２／１０７／２１９／４１０、１０７、１０７／２１６／４１０、１０７／２１９、１０７／２２０、２１２、２１９／２２０、２１９／２２０／４１０、２２０／３５９、２２０／４１０、２８６、３０１、３０３、４１０、５０２、５４４、５６６、および５６７から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１０６を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号１０６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３Ｅ、３Ｅ／５５０Ｔ、３Ｈ、３Ｋ、３Ｎ、３Ｐ、３Ｒ、４Ｐ、４Ｓ、５Ｄ、５Ｌ、５Ｐ、６Ｄ、６Ｓ、７Ｄ、７Ｇ、７Ｔ、１０Ａ、１０Ｐ、１０Ｓ、１４Ａ、２２Ａ、２２Ｖ／７６Ｓ、２４Ｖ、２５Ｒ、４０Ｄ、７５Ｌ、７６Ａ、７６Ｅ、７６Ｈ、７６Ｌ、７６Ｌ／５６１Ｌ、７６Ｍ、７６Ｒ、７６Ｔ、８４Ｐ／１０７Ａ／１７５Ａ／２１９Ｃ、８４Ｐ／１０７Ａ／２１９Ｃ、８４Ｐ／１０７Ｇ／２１９Ｃ、１０２Ｎ／１０７Ｇ／２１９Ｃ／４１０Ｋ、１０７Ａ、１０７Ａ／２１９Ｃ、１０７Ｇ、１０７Ｇ／２１６Ｇ／４１０Ｋ、１０７Ｇ／２１９Ｃ、１０７Ｇ／２２０Ｓ、２１２Ｎ、２１２Ｐ、２１９Ｃ／２２０Ｓ、２１９Ｃ／２２０Ｓ／４１０Ｋ、２２０Ｓ／３５９Ｒ、２２０Ｓ／４１０Ｋ、２８６Ｒ、３０１Ｓ、３０３Ｉ、３０３Ｋ、３０３Ｒ、３０３Ｔ、３０３Ｖ、４１０Ｋ、５０２Ｑ、５０２Ｔ、５４４Ｗ、５６６Ｇ、および５６７Ｄから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１０６を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号１０６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｔ３Ｅ、Ｔ３Ｅ／Ａ５５０Ｔ、Ｔ３Ｈ、Ｔ３Ｋ、Ｔ３Ｎ、Ｔ３Ｐ、Ｔ３Ｒ、Ｌ４Ｐ、Ｌ４Ｓ、Ｓ５Ｄ、Ｓ５Ｌ、Ｓ５Ｐ、Ｑ６Ｄ、Ｑ６Ｓ、Ａ７Ｄ、Ａ７Ｇ、Ａ７Ｔ、Ｋ１０Ａ、Ｋ１０Ｐ、Ｋ１０Ｓ、Ｑ１４Ａ、Ｓ２２Ａ、Ｓ２２Ｖ／Ｐ７６Ｓ、Ａ２４Ｖ、Ｎ２５Ｒ、Ｒ４０Ｄ、Ｅ７５Ｌ、Ｐ７６Ａ、Ｐ７６Ｅ、Ｐ７６Ｈ、Ｐ７６Ｌ、Ｐ７６Ｌ／Ｄ５６１Ｌ、Ｐ７６Ｍ、Ｐ７６Ｒ、Ｐ７６Ｔ、Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ａ／Ｓ１７５Ａ／Ｌ２１９Ｃ、Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ａ／Ｌ２１９Ｃ、Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ｇ／Ｌ２１９Ｃ、Ｅ１０２Ｎ／Ｓ１０７Ｇ／Ｌ２１９Ｃ／Ｒ４１０Ｋ、Ｓ１０７Ａ、Ｓ１０７Ａ／Ｌ２１９Ｃ、Ｓ１０７Ｇ、Ｓ１０７Ｇ／Ｋ２１６Ｇ／Ｒ４１０Ｋ、Ｓ１０７Ｇ／Ｌ２１９Ｃ、Ｓ１０７Ｇ／Ｇ２２０Ｓ、Ｔ２１２Ｎ、Ｔ２１２Ｐ、Ｌ２１９Ｃ／Ｇ２２０Ｓ、Ｌ２１９Ｃ／Ｇ２２０Ｓ／Ｒ４１０Ｋ、Ｇ２２０Ｓ／Ｙ３５９Ｒ、Ｇ２２０Ｓ／Ｒ４１０Ｋ、Ｓ２８６Ｒ、Ｋ３０１Ｓ、Ｄ３０３Ｉ、Ｄ３０３Ｋ、Ｄ３０３Ｒ、Ｄ３０３Ｔ、Ｄ３０３Ｖ、Ｒ４１０Ｋ、Ａ５０２Ｑ、Ａ５０２Ｔ、Ｒ５４４Ｗ、Ｌ５６６Ｇ、およびＨ５６７Ｄから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１０６を参照して番号付けされる。
【００１７】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号２５２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号２５２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３／４／５／７／７６／８４／１０７／３０７、３／５／１０７／３０７／５６６、３／７／７６／１０７／３０７／５６６、３／７／８４／３０７、２４／７６／１０７／３０７、２４／８４／１０７／３０７、７６、７６／８４／１０７、７６／８４／１０７／３０７、７６／８４／１０７／３０７／５０２、７６／８４／１０７／５０２、７６／１０７、７６／１０７／３０７、７６／３０７、７６／３０７／５０２、８４／１０７／３０７、８４／１０７／３０７／５０２、８４／３０１／３０７／５６６、８４／３０７、１０７／３０１／５０２、１０７／３０７、１０７／３０７／５６６、１０７／５０２、１０７／５０２／５６６、３０７、３０７／５０２、および３０７／５６６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２５２を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号２５２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３Ｅ／４Ｓ／５Ｐ／７Ｇ／７６Ｔ／８４Ｐ／１０７Ａ／３０７Ｇ、３Ｅ／７Ｇ／８４Ｐ／３０７Ｇ、３Ｋ／７Ｄ／７６Ｌ／１０７Ａ／３０７Ｇ／５６６Ｇ、３Ｐ／５Ｐ／１０７Ａ／３０７Ｇ／５６６Ｇ、２４Ｖ／７６Ａ／１０７Ａ／３０７Ｇ、２４Ｖ／８４Ｐ／１０７Ｇ／３０７Ｇ、７６Ａ／８４Ｐ／１０７Ａ／５０２Ｑ、７６Ｈ／８４Ｐ／１０７Ａ、７６Ｈ／３０７Ｇ／５０２Ｑ、７６Ｌ／１０７Ａ／３０７Ｇ、７６Ｌ／１０７Ｇ／３０７Ｇ、７６Ｌ／３０７Ｇ、７６Ｍ／８４Ｐ／１０７Ａ、７６Ｍ／８４Ｐ／１０７Ａ／３０７Ｇ、７６Ｍ／８４Ｐ／１０７Ｇ、７６Ｍ／８４Ｐ／１０７Ｇ／３０７Ｇ、７６Ｍ／１０７Ａ、７６Ｍ／１０７Ｇ、７６Ｔ、７６Ｔ／８４Ｐ／１０７Ａ／３０７Ｇ／５０２Ｑ、７６Ｔ／８４Ｐ／１０７Ｇ、７６Ｔ／１０７Ｇ、８４Ｐ／１０７Ａ／３０７Ｇ、８４Ｐ／１０７Ａ／３０７Ｇ／５０２Ｑ、８４Ｐ／３０１Ｓ／３０７Ｇ／５６６Ｇ、８４Ｐ／３０７Ｇ、１０７Ａ／３０１Ｓ／５０２Ｑ、１０７Ａ／３０７Ｇ、１０７Ａ／３０７Ｇ／５６６Ｇ、１０７Ａ／５０２Ｑ、１０７Ａ／５０２Ｑ／５６６Ｇ、３０７Ｇ、３０７Ｇ／５０２Ｑ、および３０７Ｇ／５６６Ｇから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２５２を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号２５２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｔ３Ｅ／Ｌ４Ｓ／Ｓ５Ｐ／Ａ７Ｇ／Ｐ７６Ｔ／Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ａ／Ｈ３０７Ｇ、Ｔ３Ｅ／Ａ７Ｇ／Ｆ８４Ｐ／Ｈ３０７Ｇ、Ｔ３Ｋ／Ａ７Ｄ／Ｐ７６Ｌ／Ｓ１０７Ａ／Ｈ３０７Ｇ／Ｌ５６６Ｇ、Ｔ３Ｐ／Ｓ５Ｐ／Ｓ１０７Ａ／Ｈ３０７Ｇ／Ｌ５６６Ｇ、Ａ２４Ｖ／Ｐ７６Ａ／Ｓ１０７Ａ／Ｈ３０７Ｇ、Ａ２４Ｖ／Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ｇ／Ｈ３０７Ｇ、Ｐ７６Ａ／Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ａ／Ａ５０２Ｑ、Ｐ７６Ｈ／Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ａ、Ｐ７６Ｈ／Ｈ３０７Ｇ／Ａ５０２Ｑ、Ｐ７６Ｌ／Ｓ１０７Ａ／Ｈ３０７Ｇ、Ｐ７６Ｌ／Ｓ１０７Ｇ／Ｈ３０７Ｇ、Ｐ７６Ｌ／Ｈ３０７Ｇ、Ｐ７６Ｍ／Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ａ、Ｐ７６Ｍ／Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ａ／Ｈ３０７Ｇ、Ｐ７６Ｍ／Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ｇ、Ｐ７６Ｍ／Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ｇ／Ｈ３０７Ｇ、Ｐ７６Ｍ／Ｓ１０７Ａ、Ｐ７６Ｍ／Ｓ１０７Ｇ、Ｐ７６Ｔ、Ｐ７６Ｔ／Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ａ／Ｈ３０７Ｇ／Ａ５０２Ｑ、Ｐ７６Ｔ／Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ｇ、Ｐ７６Ｔ／Ｓ１０７Ｇ、Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ａ／Ｈ３０７Ｇ、Ｆ８４Ｐ／Ｓ１０７Ａ／Ｈ３０７Ｇ／Ａ５０２Ｑ、Ｆ８４Ｐ／Ｋ３０１Ｓ／Ｈ３０７Ｇ／Ｌ５６６Ｇ、Ｆ８４Ｐ／Ｈ３０７Ｇ、Ｓ１０７Ａ／Ｋ３０１Ｓ／Ａ５０２Ｑ、Ｓ１０７Ａ／Ｈ３０７Ｇ、Ｓ１０７Ａ／Ｈ３０７Ｇ／Ｌ５６６Ｇ、Ｓ１０７Ａ／Ａ５０２Ｑ、Ｓ１０７Ａ／Ａ５０２Ｑ／Ｌ５６６Ｇ、Ｈ３０７Ｇ、Ｈ３０７Ｇ／Ａ５０２Ｑ、およびＨ３０７Ｇ／Ｌ５６６Ｇから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号２５２を参照して番号付けされる。
【００１８】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４４６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４４６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３／４／６／７／７６、３／４／６／７／３０３、３／４／７、３／４／７／７６、３／６／５０２、３／７／７６、７／３０３、４０／３０３、７６、７６／５０２、８２、１００、１０２、１７１、１７４、２１６、２１８、２１９、２２２、２２２／５０９、３０３、３０３／５０２、３０４および３４５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４４６を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４４６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３Ｅ／４Ｓ／７Ｖ／７６Ｈ、３Ｅ／６Ｓ／５０２Ｑ、３Ｈ／４Ｓ／７Ｇ、３Ｈ／７Ｄ／７６Ｈ、３Ｈ／７Ｄ／７６Ｒ、３Ｋ／４Ｓ／６Ｓ／７Ｖ／３０３Ｉ、３Ｔ／４Ｓ／６Ｄ／７Ｄ／７６Ｒ、７Ｇ／３０３Ｉ、４０Ｄ／３０３Ｉ、７６Ａ、７６Ｈ、７６Ｌ、７６Ｒ、７６Ｒ／５０２Ｑ、８２Ｔ、１００Ｈ、１０２Ｍ、１７１Ｐ、１７１Ｖ、１７４Ｇ、２１６Ｇ、２１８Ａ、２１９Ｍ、２１９Ｔ、２２２Ｔ、２２２Ｔ／５０９Ｋ、２２２Ｖ、３０３Ｉ、３０３Ｉ／５０２Ｑ、３０４Ｆ、３０４Ｈ、３０４Ｖ、および３４５Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４４６を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４４６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｐ３Ｅ／Ｌ４Ｓ／Ａ７Ｖ／Ｐ７６Ｈ、Ｐ３Ｅ／Ｑ６Ｓ／Ａ５０２Ｑ、Ｐ３Ｈ／Ｌ４Ｓ／Ａ７Ｇ、Ｐ３Ｈ／Ａ７Ｄ／Ｐ７６Ｈ、Ｐ３Ｈ／Ａ７Ｄ／Ｐ７６Ｒ、Ｐ３Ｋ／Ｌ４Ｓ／Ｑ６Ｓ／Ａ７Ｖ／Ｄ３０３Ｉ、Ｐ３Ｔ／Ｌ４Ｓ／Ｑ６Ｄ／Ａ７Ｄ／Ｐ７６Ｒ、Ａ７Ｇ／Ｄ３０３Ｉ、Ｒ４０Ｄ／Ｄ３０３Ｉ、Ｐ７６Ａ、Ｐ７６Ｈ、Ｐ７６Ｌ、Ｐ７６Ｒ、Ｐ７６Ｒ／Ａ５０２Ｑ、Ｓ８２Ｔ、Ｌ１００Ｈ、Ｅ１０２Ｍ、Ｌ１７１Ｐ、Ｌ１７１Ｖ、Ｌ１７４Ｇ、Ｋ２１６Ｇ、Ｇ２１８Ａ、Ｃ２１９Ｍ、Ｃ２１９Ｔ、Ｇ２２２Ｔ、Ｇ２２２Ｔ／Ｅ５０９Ｋ、Ｇ２２２Ｖ、Ｄ３０３Ｉ、Ｄ３０３Ｉ／Ａ５０２Ｑ、Ｗ３０４Ｆ、Ｗ３０４Ｈ、Ｗ３０４Ｖ、およびＴ３４５Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４４６を参照して番号付けされる。
【００１９】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４８２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４８２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３／４／７、３／７、４／７、４／７／２１６／２１８、７、７／４０、７／７６／８２／１７４／２２２／３０３、７／７６／１７４／２２２、７／７６／２１９／３０３、７／８２、７／２１６／２１８、４０／８２、４７、６６、７６／８２／２１６／２１８、７６／２１６、７６／２１６／２１９、８２、１１２、１７１、１７４／２２２、２０９、２１６、２１９、２１９／３４５、２２２、２６８、２７１、３３１、３６６、４２８、４３７、４４３、４６０、４７４、５０３、５２４、５３８、および５４３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４８２を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４８２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３Ｅ／４Ｓ／７Ｄ、３Ｅ／７Ｄ、４Ｓ／７Ｄ、４Ｓ／７Ｄ／２１６Ｇ／２１８Ａ、７Ｄ、７Ｄ／４０Ｄ、７Ｄ／７６Ｌ／８２Ｔ／１７４Ｇ／２２２Ｔ／３０３Ｉ、７Ｄ／７６Ｍ／１７４Ｇ／２２２Ｖ、７Ｄ／７６Ｍ／２１９Ｔ／３０３Ｉ、７Ｄ／８２Ｔ、７Ｄ／２１６Ｇ／２１８Ａ、４０Ｄ／８２Ｔ、４７Ｐ、４７Ｑ、６６Ｗ、７６Ｌ／８２Ｔ／２１６Ｇ／２１８Ａ、７６Ｍ／２１６Ｇ、７６Ｍ／２１６Ｇ／２１９Ｔ、８２Ｔ、１１２Ｌ、１１２Ｓ、１１２Ｔ、１７１Ｐ、１７４Ｇ／２２２Ｖ、２０９Ａ、２１６Ｇ、２１９Ｔ、２１９Ｔ／３４５Ｓ、２２２Ｖ、２６８Ｔ、２７１Ａ、３３１Ｔ、３６６Ｓ、４２８Ｌ、４２８Ｍ、４３７Ｈ、４４３Ｑ、４６０Ｆ、４７４Ｙ、５０３Ｔ、５２４Ａ、５２４Ｄ、５２４Ｒ、５３８Ｉ、５３８Ｖ、および５４３Ｑから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４８２を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４８２またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｐ３Ｅ／Ｌ４Ｓ／Ａ７Ｄ、Ｐ３Ｅ／Ａ７Ｄ、Ｌ４Ｓ／Ａ７Ｄ、Ｌ４Ｓ／Ａ７Ｄ／Ｋ２１６Ｇ／Ｇ２１８Ａ、Ａ７Ｄ、Ａ７Ｄ／Ｒ４０Ｄ、Ａ７Ｄ／Ｐ７６Ｌ／Ｓ８２Ｔ／Ｌ１７４Ｇ／Ｇ２２２Ｔ／Ｄ３０３Ｉ、Ａ７Ｄ／Ｐ７６Ｍ／Ｌ１７４Ｇ／Ｇ２２２Ｖ、Ａ７Ｄ／Ｐ７６Ｍ／Ｃ２１９Ｔ／Ｄ３０３Ｉ、Ａ７Ｄ／Ｓ８２Ｔ、Ａ７Ｄ／Ｋ２１６Ｇ／Ｇ２１８Ａ、Ｒ４０Ｄ／Ｓ８２Ｔ、Ｌ４７Ｐ、Ｌ４７Ｑ、Ｙ６６Ｗ、Ｐ７６Ｌ／Ｓ８２Ｔ／Ｋ２１６Ｇ／Ｇ２１８Ａ、Ｐ７６Ｍ／Ｋ２１６Ｇ、Ｐ７６Ｍ／Ｋ２１６Ｇ／Ｃ２１９Ｔ、Ｓ８２Ｔ、Ａ１１２Ｌ、Ａ１１２Ｓ、Ａ１１２Ｔ、Ｌ１７１Ｐ、Ｌ１７４Ｇ／Ｇ２２２Ｖ、Ｓ２０９Ａ、Ｋ２１６Ｇ、Ｃ２１９Ｔ、Ｃ２１９Ｔ／Ｔ３４５Ｓ、Ｇ２２２Ｖ、Ｉ２６８Ｔ、Ｓ２７１Ａ、Ｓ３３１Ｔ、Ｑ３６６Ｓ、Ｉ４２８Ｌ、Ｉ４２８Ｍ、Ｎ４３７Ｈ、Ｆ４４３Ｑ、Ｔ４６０Ｆ、Ｎ４７４Ｙ、Ｃ５０３Ｔ、Ｓ５２４Ａ、Ｓ５２４Ｄ、Ｓ５２４Ｒ、Ｌ５３８Ｉ、Ｌ５３８Ｖ、およびＡ５４３Ｑから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号４８２を参照して番号付けされる。
【００２０】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号５１６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号５１６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、４、４／３０４、６、７、９、１６、２０、２５、４０、４０／４３７、４４／４７、４４／４７／９４／５０９、４４／９４／２７０／５５４、４４／９４／５５４、４７、４７／７６、４７／７６／３４５、４７／９４／５０９、４７／１９５／５５４、４７／４２８、５１／１０６、７６、７６／２７１、７６／３４５、８２、８４、９４／１４９、９４／１９５、９４／５５４、９８、９８／４６０、１０９、１１２／５２４、２７１／３４５、２７１／４２８、３０２、３０３、３０４、３０６、３４９、３５８、４１０、４１３、４１６、および５２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５１６を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号５１６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、４Ｇ、４Ｉ／３０４Ｃ、６Ｒ、７Ｓ、９Ｃ、１６Ｓ、１６Ｙ、２０Ｔ、２５Ａ、２５Ｇ、４０Ｄ、４０Ｄ／４３７Ｈ、４４Ｈ／４７Ｋ、４４Ｈ／４７Ｋ／９４Ｐ／５０９Ｌ、４４Ｈ／９４Ｐ／２７０Ｑ／５５４Ｒ、４４Ｈ／９４Ｐ／５５４Ｒ、４７Ｋ、４７Ｋ／９４Ｐ／５０９Ｌ、４７Ｋ／１９５Ｅ／５５４Ｒ、４７Ｐ、４７Ｐ／７６Ｈ、４７Ｐ／７６Ｈ／３４５Ｓ、４７Ｐ／４２８Ｌ、５１Ａ／１０６Ｇ、７６Ｈ、７６Ｈ／２７１Ａ、７６Ｈ／３４５Ｓ、８２Ｔ、８４Ｐ、９４Ｐ／１４９Ｔ、９４Ｐ／１９５Ｅ、９４Ｐ／５５４Ｒ、９８Ａ、９８Ｅ、９８Ｎ／４６０Ａ、１０９Ｇ、１１２Ｌ／５２４Ａ、２７１Ａ／３４５Ｓ、２７１Ａ／４２８Ｌ、３０２Ｒ、３０３Ｉ、３０４Ｈ、３０４Ｌ、３０４Ｓ、３０６Ｋ、３４９Ｉ、３５８Ｌ、４１０Ｍ、４１３Ｓ、４１３Ｔ、４１６Ｔ、および５２４Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５１６を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号５１６またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｌ４Ｇ、Ｌ４Ｉ／Ｗ３０４Ｃ、Ｑ６Ｒ、Ｄ７Ｓ、Ｓ９Ｃ、Ｆ１６Ｓ、Ｆ１６Ｙ、Ｇ２０Ｔ、Ｎ２５Ａ、Ｎ２５Ｇ、Ｒ４０Ｄ、Ｒ４０Ｄ／Ｎ４３７Ｈ、Ｎ４４Ｈ／Ｌ４７Ｋ、Ｎ４４Ｈ／Ｌ４７Ｋ／Ｒ９４Ｐ／Ｅ５０９Ｌ、Ｎ４４Ｈ／Ｒ９４Ｐ／Ｎ２７０Ｑ／Ｖ５５４Ｒ、Ｎ４４Ｈ／Ｒ９４Ｐ／Ｖ５５４Ｒ、Ｌ４７Ｋ、Ｌ４７Ｋ／Ｒ９４Ｐ／Ｅ５０９Ｌ、Ｌ４７Ｋ／Ｋ１９５Ｅ／Ｖ５５４Ｒ、Ｌ４７Ｐ、Ｌ４７Ｐ／Ｍ７６Ｈ、Ｌ４７Ｐ／Ｍ７６Ｈ／Ｔ３４５Ｓ、Ｌ４７Ｐ／Ｉ４２８Ｌ、Ｔ５１Ａ／Ｗ１０６Ｇ、Ｍ７６Ｈ、Ｍ７６Ｈ／Ｓ２７１Ａ、Ｍ７６Ｈ／Ｔ３４５Ｓ、Ｓ８２Ｔ、Ｆ８４Ｐ、Ｒ９４Ｐ／Ｉ１４９Ｔ、Ｒ９４Ｐ／Ｋ１９５Ｅ、Ｒ９４Ｐ／Ｖ５５４Ｒ、Ｓ９８Ａ、Ｓ９８Ｅ、Ｓ９８Ｎ／Ｔ４６０Ａ、Ｋ１０９Ｇ、Ａ１１２Ｌ／Ｓ５２４Ａ、Ｓ２７１Ａ／Ｔ３４５Ｓ、Ｓ２７１Ａ／Ｉ４２８Ｌ、Ｈ３０２Ｒ、Ｄ３０３Ｉ、Ｗ３０４Ｈ、Ｗ３０４Ｌ、Ｗ３０４Ｓ、Ｄ３０６Ｋ、Ｌ３４９Ｉ、Ｙ３５８Ｌ、Ｒ４１０Ｍ、Ｋ４１３Ｓ、Ｋ４１３Ｔ、Ｍ４１６Ｔ、およびＳ５２４Ａから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号５１６を参照して番号付けされる。
【００２１】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号６１８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号６１８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、４／４７／７６／８２／９４、７／４４／９４／９８、７／４７／７６／８２、７／７６／５５４、７／９４／９８、１６／４０／７６、１６／４４／７６／９８、１６／４４／９４／９８／５２４、２５／５４／６８／７２、２５／５４／６８／７２／１５８／３３９、２５／５４／６８／７２／２０９／２１２／３３９／５１７、２５／５４／６８／１５８／３３９／５１７、２５／５４／７２／３３９／５１７、２５／５４／１５８／２０９／２１２／３３９／５５１、３０／６８／７２／２０７／２０９／２１２／３３９／４９５／５１７、４０／４４／７６／３０４／５０９、４０／４４／９８／３０４、４０／７６／３０４／４３７、４０／７６／５５４、４４／７６／９４／１１２／３０４、４４／７６／１１２、４４／９４／２７１／３０４／４３７／５５４、４７／７６／８２／９４／２７１、４７／７６／８２／２７１／３０４、４７／７６／９４／２７１、４７／７６／９４／２７１／３０６／３７５／５２４／５５４、４７／７６／３０４／３０６／５５４、４７／７６／３０４／５２４／５５４、４７／９４、４７／９４／２７１、４７／９４／２７１／３０４／５５４、４９／１１４／２４０／５２１、５４／６８／１５８／２０９／２１２／４９５／５１７、６８／７２／１５８／２０９／２１２／３３９／４９５／５５１、６８／７２／１５８／５１７、６８／１５８／２０９／４９５／５１７／５５１、７６、７６／２７１／３０４／５５４、７６／３０４／４３７、８２、８２／５５４、９４／９８、９４／９８／３０６、９４／９８／５０９、９４／９８／５２４、９４／５５４、９８／２７０／３０４／５５４、１１９、２９４、３５７、４００、５１６、５２７、および５６５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６１８を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号６１８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、４Ｉ／４７Ｋ／７６Ｈ／８２Ｔ／９４Ｐ、７Ｓ／４４Ｈ／９４Ｐ／９８Ｎ、７Ｓ／４７Ｐ／７６Ｈ／８２Ｔ、７Ｓ／７６Ｈ／５５４Ｒ、７Ｓ／９４Ｐ／９８Ｅ、１６Ｙ／４０Ｄ／７６Ｈ、１６Ｙ／４４Ｈ／７６Ｈ／９８Ｅ、１６Ｙ／４４Ｈ／９４Ｐ／９８Ｅ／５２４Ａ、２５Ｔ／５４Ｅ／６８Ａ／７２Ａ／１５８Ｈ／３３９Ｖ、２５Ｔ／５４Ｅ／６８Ａ／７２Ａ／２０９Ｅ／２１２Ｑ／３３９Ｖ／５１７Ｅ、２５Ｔ／５４Ｅ／７２Ａ／３３９Ｖ／５１７Ｅ、２５Ｔ／５４Ｅ／１５８Ｈ／２０９Ｅ／２１２Ｑ／３３９Ｖ／５５１Ｓ、２５Ｔ／５４Ｋ／６８Ａ／７２Ａ、２５Ｔ／５４Ｋ／６８Ａ／１５８Ｈ／３３９Ｖ／５１７Ｅ、３０Ｇ／６８Ａ／７２Ａ／２０７Ｇ／２０９Ｅ／２１２Ｑ／３３９Ｖ／４９５Ａ／５１７Ｅ、４０Ｄ／４４Ｈ／７６Ｈ／３０４Ｈ／５０９Ｌ、４０Ｄ／４４Ｈ／９８Ａ／３０４Ｓ、４０Ｄ／７６Ｈ／３０４Ｓ／４３７Ｈ、４０Ｄ／７６Ｈ／５５４Ｒ、４４Ｈ／７６Ｈ／９４Ｐ／１１２Ｌ／３０４Ｓ、４４Ｈ／７６Ｈ／１１２Ｌ、４４Ｈ／９４Ｐ／２７１Ａ／３０４Ｓ／４３７Ｈ／５５４Ｒ、４７Ｋ／７６Ｈ／８２Ｔ／９４Ｐ／２７１Ａ、４７Ｋ／７６Ｈ／８２Ｔ／２７１Ａ／３０４Ｓ、４７Ｋ／７６Ｈ／９４Ｐ／２７１Ａ、４７Ｋ／７６Ｈ／３０４Ｓ／３０６Ｋ／５５４Ｒ、４７Ｋ／９４Ｐ、４７Ｋ／９４Ｐ／２７１Ａ、４７Ｋ／９４Ｐ／２７１Ａ／３０４Ｓ／５５４Ｒ、４７Ｐ／７６Ｈ／９４Ｐ／２７１Ａ／３０６Ｋ／３７５Ｍ／５２４Ａ／５５４Ｒ、４７Ｐ／７６Ｈ／３０４Ｓ／５２４Ａ／５５４Ｒ、４９Ｒ／１１４Ｋ／２４０Ｋ／５２１Ｋ、５４Ｋ／６８Ａ／１５８Ｈ／２０９Ｅ／２１２Ｑ／４９５Ａ／５１７Ｅ、６８Ａ／７２Ａ／１５８Ｈ／２０９Ｅ／２１２Ｑ／３３９Ｖ／４９５Ａ／５５１Ｓ、６８Ａ／７２Ａ／１５８Ｈ／５１７Ｅ、６８Ａ／１５８Ｈ／２０９Ｅ／４９５Ａ／５１７Ｅ／５５１Ｓ、７６Ｈ、７６Ｈ／２７１Ａ／３０４Ｓ／５５４Ｒ、７６Ｈ／３０４Ｓ／４３７Ｈ、８２Ｔ、８２Ｔ／５５４Ｒ、９４Ｐ／９８Ｅ／３０６Ｋ、９４Ｐ／９８Ｅ／５０９Ｌ、９４Ｐ／９８Ｅ／５２４Ａ、９４Ｐ／９８Ｎ、９４Ｐ／５５４Ｒ、９８Ｅ／２７０Ｑ／３０４Ｓ／５５４Ｒ、１１９Ｅ、１１９Ｖ、２９４Ａ、２９４Ｃ、３５７Ｉ、４００Ａ、５１６Ｍ、５２７Ｖ、および５６５Ｅから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６１８を参照して番号付けされる。
一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号６１８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｌ４Ｉ／Ｌ４７Ｋ／Ｍ７６Ｈ／Ｓ８２Ｔ／Ｒ９４Ｐ、Ｄ７Ｓ／Ｎ４４Ｈ／Ｒ９４Ｐ／Ｓ９８Ｎ、Ｄ７Ｓ／Ｌ４７Ｐ／Ｍ７６Ｈ／Ｓ８２Ｔ、Ｄ７Ｓ／Ｍ７６Ｈ／Ｖ５５４Ｒ、Ｄ７Ｓ／Ｒ９４Ｐ／Ｓ９８Ｅ、Ｆ１６Ｙ／Ｒ４０Ｄ／Ｍ７６Ｈ、Ｆ１６Ｙ／Ｎ４４Ｈ／Ｍ７６Ｈ／Ｓ９８Ｅ、Ｆ１６Ｙ／Ｎ４４Ｈ／Ｒ９４Ｐ／Ｓ９８Ｅ／Ｓ５２４Ａ、Ｎ２５Ｔ／Ｔ５４Ｅ／Ｎ６８Ａ／Ｅ７２Ａ／Ｙ１５８Ｈ／Ｉ３３９Ｖ、Ｎ２５Ｔ／Ｔ５４Ｅ／Ｎ６８Ａ／Ｅ７２Ａ／Ｓ２０９Ｅ／Ｔ２１２Ｑ／Ｉ３３９Ｖ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２５Ｔ／Ｔ５４Ｅ／Ｅ７２Ａ／Ｉ３３９Ｖ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２５Ｔ／Ｔ５４Ｅ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｔ２１２Ｑ／Ｉ３３９Ｖ／Ａ５５１Ｓ、Ｎ２５Ｔ／Ｔ５４Ｋ／Ｎ６８Ａ／Ｅ７２Ａ、Ｎ２５Ｔ／Ｔ５４Ｋ／Ｎ６８Ａ／Ｙ１５８Ｈ／Ｉ３３９Ｖ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ３０Ｇ／Ｎ６８Ａ／Ｅ７２Ａ／Ｎ２０７Ｇ／Ｓ２０９Ｅ／Ｔ２１２Ｑ／Ｉ３３９Ｖ／Ｔ４９５Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｒ４０Ｄ／Ｎ４４Ｈ／Ｍ７６Ｈ／Ｗ３０４Ｈ／Ｅ５０９Ｌ、Ｒ４０Ｄ／Ｎ４４Ｈ／Ｓ９８Ａ／Ｗ３０４Ｓ、Ｒ４０Ｄ／Ｍ７６Ｈ／Ｗ３０４Ｓ／Ｎ４３７Ｈ、Ｒ４０Ｄ／Ｍ７６Ｈ／Ｖ５５４Ｒ、Ｎ４４Ｈ／Ｍ７６Ｈ／Ｒ９４Ｐ／Ａ１１２Ｌ／Ｗ３０４Ｓ、Ｎ４４Ｈ／Ｍ７６Ｈ／Ａ１１２Ｌ、Ｎ４４Ｈ／Ｒ９４Ｐ／Ｓ２７１Ａ／Ｗ３０４Ｓ／Ｎ４３７Ｈ／Ｖ５５４Ｒ、Ｌ４７Ｋ／Ｍ７６Ｈ／Ｓ８２Ｔ／Ｒ９４Ｐ／Ｓ２７１Ａ、Ｌ４７Ｋ／Ｍ７６Ｈ／Ｓ８２Ｔ／Ｓ２７１Ａ／Ｗ３０４Ｓ、Ｌ４７Ｋ／Ｍ７６Ｈ／Ｒ９４Ｐ／Ｓ２７１Ａ、Ｌ４７Ｋ／Ｍ７６Ｈ／Ｗ３０４Ｓ／Ｄ３０６Ｋ／Ｖ５５４Ｒ、Ｌ４７Ｋ／Ｒ９４Ｐ、Ｌ４７Ｋ／Ｒ９４Ｐ／Ｓ２７１Ａ、Ｌ４７Ｋ／Ｒ９４Ｐ／Ｓ２７１Ａ／Ｗ３０４Ｓ／Ｖ５５４Ｒ、Ｌ４７Ｐ／Ｍ７６Ｈ／Ｒ９４Ｐ／Ｓ２７１Ａ／Ｄ３０６Ｋ／Ｌ３７５Ｍ／Ｓ５２４Ａ／Ｖ５５４Ｒ、Ｌ４７Ｐ／Ｍ７６Ｈ／Ｗ３０４Ｓ／Ｓ５２４Ａ／Ｖ５５４Ｒ、Ｓ４９Ｒ／Ｎ１１４Ｋ／Ｑ２４０Ｋ／Ｑ５２１Ｋ、Ｔ５４Ｋ／Ｎ６８Ａ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｔ２１２Ｑ／Ｔ４９５Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ６８Ａ／Ｅ７２Ａ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｔ２１２Ｑ／Ｉ３３９Ｖ／Ｔ４９５Ａ／Ａ５５１Ｓ、Ｎ６８Ａ／Ｅ７２Ａ／Ｙ１５８Ｈ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ６８Ａ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｔ４９５Ａ／Ｈ５１７Ｅ／Ａ５５１Ｓ、Ｍ７６Ｈ、Ｍ７６Ｈ／Ｓ２７１Ａ／Ｗ３０４Ｓ／Ｖ５５４Ｒ、Ｍ７６Ｈ／Ｗ３０４Ｓ／Ｎ４３７Ｈ、Ｓ８２Ｔ、Ｓ８２Ｔ／Ｖ５５４Ｒ、Ｒ９４Ｐ／Ｓ９８Ｅ／Ｄ３０６Ｋ、Ｒ９４Ｐ／Ｓ９８Ｅ／Ｅ５０９Ｌ、Ｒ９４Ｐ／Ｓ９８Ｅ／Ｓ５２４Ａ、Ｒ９４Ｐ／Ｓ９８Ｎ、Ｒ９４Ｐ／Ｖ５５４Ｒ、Ｓ９８Ｅ／Ｎ２７０Ｑ／Ｗ３０４Ｓ／Ｖ５５４Ｒ、Ａ１１９Ｅ、Ａ１１９Ｖ、Ｖ２９４Ａ、Ｖ２９４Ｃ、Ｓ３５７Ｉ、Ｎ４００Ａ、Ｒ５１６Ｍ、Ｒ５２７Ｖ、およびＣ５６５Ｅから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号６１８を参照して番号付けされる。
【００２２】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号７１４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号７１４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、２５、２５／４０／１５８／２０９／３０４／４１０／５１７、２５／５４／２７１／５１７、２５／１５８／２０９／４１０、２５／３０６／３３９、２５／４１０、４０／４７／６８／９４／９８／４１０／５１７、４０／６８／４６０／５１７、４７／９８／３３９／４１０、５４／６８／７２／９８／２０９／５１７、６８、６８／３３９／５１７、７２／９４／１５８／３３９／４１０／４６０／５１７、７２／１５８／２０９／４１０／５１７、８３、９４／１５８／２０９／３３９／４１０、１００、１２９、１５８、１５８／２０７／３３９／４１０、１５８／２０９／４１０／５１７、２０７／４１０、２０７／４１０／４６０／５１７、２２０、３１７、３３９、３９４、４１０、４１０／５１７、４１６、４６０、４６０／５１７、および５１７から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号７１４を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号７１４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、２５Ｔ、２５Ｔ／４０Ｄ／１５８Ｈ／２０９Ｅ／３０４Ｈ／４１０Ｍ／５１７Ｅ、２５Ｔ／５４Ｅ／２７１Ａ／５１７Ｅ、２５Ｔ／１５８Ｈ／２０９Ｅ／４１０Ｍ、２５Ｔ／３０６Ｅ／３３９Ｖ、２５Ｔ／４１０Ｍ、４０Ｄ／４７Ｋ／６８Ａ／９４Ｐ／９８Ａ／４１０Ｍ／５１７Ｅ、４０Ｄ／６８Ａ／４６０Ａ／５１７Ｅ、４７Ｋ／９８Ｅ／３３９Ｖ／４１０Ｍ、５４Ｅ／６８Ａ／７２Ａ／９８Ｅ／２０９Ｅ／５１７Ｅ、６８Ａ、６８Ａ／３３９Ｖ／５１７Ｅ、７２Ａ／９４Ｐ／１５８Ｈ／３３９Ｖ／４１０Ｍ／４６０Ａ／５１７Ｅ、７２Ａ／１５８Ｈ／２０９Ｅ／４１０Ｍ／５１７Ｅ、８３Ｌ、８３Ｐ、９４Ｐ／１５８Ｈ／２０９Ｅ／３３９Ｖ／４１０Ｍ、１００Ｇ、１２９Ｉ、１５８Ｈ、１５８Ｈ／２０７Ｇ／３３９Ｖ／４１０Ｍ、１５８Ｈ／２０９Ｅ／４１０Ｍ／５１７Ｅ、２０７Ｇ／４１０Ｍ、２０７Ｇ／４１０Ｍ／４６０Ａ／５１７Ｅ、２２０Ａ、３１７Ｅ、３３９Ｖ、３９４Ｓ、４１０Ｍ、４１０Ｍ／５１７Ｅ、４１６Ｉ、４６０Ａ、４６０Ａ／５１７Ｅ、および５１７Ｅから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号７１４を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号７１４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｎ２５Ｔ、Ｎ２５Ｔ／Ｒ４０Ｄ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｓ３０４Ｈ／Ｒ４１０Ｍ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２５Ｔ／Ｔ５４Ｅ／Ｓ２７１Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２５Ｔ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｒ４１０Ｍ、Ｎ２５Ｔ／Ｄ３０６Ｅ／Ｉ３３９Ｖ、Ｎ２５Ｔ／Ｒ４１０Ｍ、Ｒ４０Ｄ／Ｐ４７Ｋ／Ｎ６８Ａ／Ｒ９４Ｐ／Ｓ９８Ａ／Ｒ４１０Ｍ／Ｈ５１７Ｅ、Ｒ４０Ｄ／Ｎ６８Ａ／Ｔ４６０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｐ４７Ｋ／Ｓ９８Ｅ／Ｉ３３９Ｖ／Ｒ４１０Ｍ、Ｔ５４Ｅ／Ｎ６８Ａ／Ｅ７２Ａ／Ｓ９８Ｅ／Ｓ２０９Ｅ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ６８Ａ、Ｎ６８Ａ／Ｉ３３９Ｖ／Ｈ５１７Ｅ、Ｅ７２Ａ／Ｒ９４Ｐ／Ｙ１５８Ｈ／Ｉ３３９Ｖ／Ｒ４１０Ｍ／Ｔ４６０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｅ７２Ａ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｒ４１０Ｍ／Ｈ５１７Ｅ、Ｇ８３Ｌ、Ｇ８３Ｐ、Ｒ９４Ｐ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｉ３３９Ｖ／Ｒ４１０Ｍ、Ｌ１００Ｇ、Ａ１２９Ｉ、Ｙ１５８Ｈ、Ｙ１５８Ｈ／Ｎ２０７Ｇ／Ｉ３３９Ｖ／Ｒ４１０Ｍ、Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｒ４１０Ｍ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２０７Ｇ／Ｒ４１０Ｍ、Ｎ２０７Ｇ／Ｒ４１０Ｍ／Ｔ４６０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｓ２２０Ａ、Ｒ３１７Ｅ、Ｉ３３９Ｖ、Ｎ３９４Ｓ、Ｒ４１０Ｍ、Ｒ４１０Ｍ／Ｈ５１７Ｅ、Ｍ４１６Ｉ、Ｔ４６０Ａ、Ｔ４６０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、およびＨ５１７Ｅから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号７１４を参照して番号付けされる。
【００２３】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８３０またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８３０またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｎ２５Ｔ、Ｎ２５Ｔ／Ｒ４０Ｄ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｓ３０４Ｈ／Ｒ４１０Ｍ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２５Ｔ／Ｔ５４Ｅ／Ｓ２７１Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２５Ｔ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｒ４１０Ｍ、Ｎ２５Ｔ／Ｄ３０６Ｅ／Ｉ３３９Ｖ、Ｎ２５Ｔ／Ｒ４１０Ｍ、Ｒ４０Ｄ／Ｐ４７Ｋ／Ｎ６８Ａ／Ｒ９４Ｐ／Ｓ９８Ａ／Ｒ４１０Ｍ／Ｈ５１７Ｅ、Ｒ４０Ｄ／Ｎ６８Ａ／Ｔ４６０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｐ４７Ｋ／Ｓ９８Ｅ／Ｉ３３９Ｖ／Ｒ４１０Ｍ、Ｔ５４Ｅ／Ｎ６８Ａ／Ｅ７２Ａ／Ｓ９８Ｅ／Ｓ２０９Ｅ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ６８Ａ、Ｎ６８Ａ／Ｉ３３９Ｖ／Ｈ５１７Ｅ、Ｅ７２Ａ／Ｒ９４Ｐ／Ｙ１５８Ｈ／Ｉ３３９Ｖ／Ｒ４１０Ｍ／Ｔ４６０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｅ７２Ａ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｒ４１０Ｍ／Ｈ５１７Ｅ、Ｇ８３Ｌ、Ｇ８３Ｐ、Ｒ９４Ｐ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｉ３３９Ｖ／Ｒ４１０Ｍ、Ｌ１００Ｇ、Ａ１２９Ｉ、Ｙ１５８Ｈ、Ｙ１５８Ｈ／Ｎ２０７Ｇ／Ｉ３３９Ｖ／Ｒ４１０Ｍ、Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｒ４１０Ｍ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２０７Ｇ／Ｒ４１０Ｍ、Ｎ２０７Ｇ／Ｒ４１０Ｍ／Ｔ４６０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｓ２２０Ａ、Ｒ３１７Ｅ、Ｉ３３９Ｖ、Ｎ３９４Ｓ、Ｒ４１０Ｍ、Ｒ４１０Ｍ／Ｈ５１７Ｅ、Ｍ４１６Ｉ、Ｔ４６０Ａ、Ｔ４６０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、およびＨ５１７Ｅから選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号８３０を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８３０またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、２５Ｔ／８３Ｌ／１５８Ｈ／２２０Ａ／５１７Ｅ、２５Ｔ／８３Ｐ／２２０Ａ／４１６Ｉ、２５Ｔ／１５８Ｈ／２０９Ｅ／２２０Ａ／５１７Ｅ、２５Ｔ／１５８Ｈ／２２０Ａ、２５Ｔ／１５８Ｈ／２２０Ａ／５１７Ｅ、２５Ｔ／２２０Ａ／３３９Ｖ、２５Ｔ／２２０Ａ／５１７Ｅ、２５Ｔ／４１０Ｍ／４１６Ｉ／５１７Ｅ、４０Ｇ、４５Ｈ、５４Ｋ／５９Ｒ、５４Ｋ／２８５Ｌ、８３Ｐ、８３Ｐ／２０９Ｅ／２２０Ａ／４１０Ｍ／５１７Ｅ、８３Ｐ／３３９Ｖ／４１０Ｍ、１１９Ｑ、１５８Ｈ／２２０Ａ／２７１Ａ／５１７Ｅ、２０９Ｐ、２０９Ｔ、２２０Ａ、２２０Ａ／４１０Ｍ／４１６Ｉ／５１７Ｅ、２２０Ａ／５１７Ｅ、２４４Ｓ、２４６Ｖ、２７１Ａ、２７１Ａ／４１０Ｍ／４１６Ｉ／５１７Ｅ、２９３Ｍ、３０４Ａ、３３９Ｖ、３６８Ｆ、４００Ａ、４００Ｑ、４１０Ａ、４１０Ｅ、４１０Ｍ／４１６Ｉ／５１７Ｅ、４２４Ａ、４５９Ｆ、４７９Ｓ、５２０Ａ、５２５Ｐ、５３７Ａ、５３７Ｐ、５６２Ｖ、および５６５Ｋから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号８３０を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８３０またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｎ２５Ｔ／Ｇ８３Ｌ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２２０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２５Ｔ／Ｇ８３Ｐ／Ｓ２２０Ａ／Ｍ４１６Ｉ、Ｎ２５Ｔ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２０９Ｅ／Ｓ２２０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２５Ｔ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２２０Ａ、Ｎ２５Ｔ／Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２２０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２５Ｔ／Ｓ２２０Ａ／Ｉ３３９Ｖ、Ｎ２５Ｔ／Ｓ２２０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｎ２５Ｔ／Ｒ４１０Ｍ／Ｍ４１６Ｉ／Ｈ５１７Ｅ、Ｒ４０Ｇ、Ｇ４５Ｈ、Ｔ５４Ｋ／Ｇ５９Ｒ、Ｔ５４Ｋ／Ｉ２８５Ｌ、Ｇ８３Ｐ、Ｇ８３Ｐ／Ｓ２０９Ｅ／Ｓ２２０Ａ／Ｒ４１０Ｍ／Ｈ５１７Ｅ、Ｇ８３Ｐ／Ｉ３３９Ｖ／Ｒ４１０Ｍ、Ａ１１９Ｑ、Ｙ１５８Ｈ／Ｓ２２０Ａ／Ｓ２７１Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ｓ２０９Ｐ、Ｓ２０９Ｔ、Ｓ２２０Ａ、Ｓ２２０Ａ／Ｒ４１０Ｍ／Ｍ４１６Ｉ／Ｈ５１７Ｅ、Ｓ２２０Ａ／Ｈ５１７Ｅ、Ａ２４４Ｓ、Ａ２４６Ｖ、Ｓ２７１Ａ、Ｓ２７１Ａ／Ｒ４１０Ｍ／Ｍ４１６Ｉ／Ｈ５１７Ｅ、Ｌ２９３Ｍ、Ｓ３０４Ａ、Ｉ３３９Ｖ、Ｖ３６８Ｆ、Ｎ４００Ａ、Ｎ４００Ｑ、Ｒ４１０Ａ、Ｒ４１０Ｅ、Ｒ４１０Ｍ／Ｍ４１６Ｉ／Ｈ５１７Ｅ、Ｖ４２４Ａ、Ｙ４５９Ｆ、Ａ４７９Ｓ、Ｇ５２０Ａ、Ｓ５２５Ｐ、Ｇ５３７Ａ、Ｇ５３７Ｐ、Ｉ５６２Ｖ、およびＣ５６５Ｋから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号８３０を参照して番号付けされる。
【００２４】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８９４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８９４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、２５／４０／４５／２０９／４２４、２５／４０／４２４、２５／４５／５４／７３／２４６／４２４、２５／５４／７３／２０９／４２４／５２０、４０／４７／５４／２１４／５０３、４０／５４／２０９／２１４／２４４／３３９／５２０、４０／５４／２１４／２４４／３３９／５０３、４０／２０９／２４６／４２４、５４、５４／２０９／２１４／２４４、５４／２０９／２１４／２４４／３３９／５０３、５４／４２４、５４／４２４／５２０、２０９／５０３、２２７、２４６、２４６／４２４、２７４／３１１、４１０、４１１、４１３、および４２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号８９４を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８９４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、２５Ｔ／４０Ｃ／４２４Ａ、２５Ｔ／４０Ｇ／４５Ｈ／２０９Ｐ／４２４Ａ、２５Ｔ／４５Ｈ／５４Ｌ／７３Ｋ／２４６Ｖ／４２４Ａ、２５Ｔ／５４Ｐ／７３Ｋ／２０９Ｔ／４２４Ａ／５２０Ａ、４０Ｇ／２０９Ｐ／２４６Ｖ／４２４Ａ、４０Ｑ／４７Ｒ／５４Ｐ／２１４Ｎ／５０３Ｔ、４０Ｑ／５４Ｐ／２０９Ｐ／２１４Ｎ／２４４Ｓ／３３９Ｖ／５２０Ａ、４０Ｔ／５４Ｐ／２１４Ｎ／２４４Ｓ／３３９Ｖ／５０３Ｔ、５４Ｋ／２０９Ｐ／２１４Ｎ／２４４Ｓ／３３９Ｖ／５０３Ｔ、５４Ｐ、５４Ｐ／２０９Ｐ／２１４Ｎ／２４４Ｓ、５４Ｐ／４２４Ａ、５４Ｐ／４２４Ａ／５２０Ａ、２０９Ｐ／５０３Ｔ、２２７Ｆ、２４６Ｖ、２４６Ｖ／４２４Ａ、２７４Ｐ／３１１Ｓ、４１０Ｑ、４１１Ａ、４１３Ｓ、４２４Ａ、４２４Ｃ、４２４Ｇ、および４２４Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号８９４を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号８９４またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｎ２５Ｔ／Ｒ４０Ｃ／Ｖ４２４Ａ、Ｎ２５Ｔ／Ｒ４０Ｇ／Ｇ４５Ｈ／Ｅ２０９Ｐ／Ｖ４２４Ａ、Ｎ２５Ｔ／Ｇ４５Ｈ／Ｔ５４Ｌ／Ｓ７３Ｋ／Ａ２４６Ｖ／Ｖ４２４Ａ、Ｎ２５Ｔ／Ｔ５４Ｐ／Ｓ７３Ｋ／Ｅ２０９Ｔ／Ｖ４２４Ａ／Ｇ５２０Ａ、Ｒ４０Ｇ／Ｅ２０９Ｐ／Ａ２４６Ｖ／Ｖ４２４Ａ、Ｒ４０Ｑ／Ｐ４７Ｒ／Ｔ５４Ｐ／Ｌ２１４Ｎ／Ｃ５０３Ｔ、Ｒ４０Ｑ／Ｔ５４Ｐ／Ｅ２０９Ｐ／Ｌ２１４Ｎ／Ａ２４４Ｓ／Ｉ３３９Ｖ／Ｇ５２０Ａ、Ｒ４０Ｔ／Ｔ５４Ｐ／Ｌ２１４Ｎ／Ａ２４４Ｓ／Ｉ３３９Ｖ／Ｃ５０３Ｔ、Ｔ５４Ｋ／Ｅ２０９Ｐ／Ｌ２１４Ｎ／Ａ２４４Ｓ／Ｉ３３９Ｖ／Ｃ５０３Ｔ、Ｔ５４Ｐ、Ｔ５４Ｐ／Ｅ２０９Ｐ／Ｌ２１４Ｎ／Ａ２４４Ｓ、Ｔ５４Ｐ／Ｖ４２４Ａ、Ｔ５４Ｐ／Ｖ４２４Ａ／Ｇ５２０Ａ、Ｅ２０９Ｐ／Ｃ５０３Ｔ、Ｖ２２７Ｆ、Ａ２４６Ｖ、Ａ２４６Ｖ／Ｖ４２４Ａ、Ｈ２７４Ｐ／Ｑ３１１Ｓ、Ｍ４１０Ｑ、Ｅ４１１Ａ、Ｋ４１３Ｓ、Ｖ４２４Ａ、Ｖ４２４Ｃ、Ｖ４２４Ｇ、およびＶ４２４Ｓから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号８９４を参照して番号付けされる。
【００２５】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号９８８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号９８８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、４０、４０／５４／２１４／４２１／４２４、４０／９０／４２１／４２４、４０／２１４、４０／２１４／４２４、４０／４２１／４２４、４０／４２４、５４／２１４、６６、９０／２１４／４２４、１０６／２２７、１０６／２２７／２４４、１０６／２２７／２４４／５５４、１０６／２２７／５５４、２１４、２１４／４２１、３３９、４２１／４２４、４２４、４５４、４６３、４６４、４７４、および５４３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９８８を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号９８８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、４０Ｃ、４０Ｃ／５４Ｌ／２１４Ｑ／４２１Ｓ／４２４Ｃ、４０Ｃ／９０Ｑ／４２１Ｓ／４２４Ｃ、４０Ｃ／２１４Ｎ／４２４Ｃ、４０Ｃ／２１４Ｑ、４０Ｃ／４２１Ｓ／４２４Ｇ、４０Ｃ／４２４Ｃ、５４Ｌ／２１４Ｑ、６６Ｆ、９０Ｑ／２１４Ｑ／４２４Ｇ、１０６Ｒ／２２７Ｆ、１０６Ｓ／２２７Ｆ／２４４Ｓ、１０６Ｓ／２２７Ｆ／２４４Ｓ／５５４Ｃ、１０６Ｓ／２２７Ｆ／５５４Ｃ、２１４Ｑ、２１４Ｑ／４２１Ｓ、３３９Ｍ、４２１Ｓ／４２４Ｃ、４２４Ｃ、４５４Ｌ、４５４Ｖ、４６３Ａ、４６３Ｇ、４６３Ｌ、４６３Ｎ、４６３Ｓ、４６３Ｖ、４６３Ｗ、４６４Ｃ、４６４Ｑ、４７４Ｅ、および５４３Ｑから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９８８を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号９８８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｒ４０Ｃ、Ｒ４０Ｃ／Ｐ５４Ｌ／Ｌ２１４Ｑ／Ｔ４２１Ｓ／Ａ４２４Ｃ、Ｒ４０Ｃ／Ｖ９０Ｑ／Ｔ４２１Ｓ／Ａ４２４Ｃ、Ｒ４０Ｃ／Ｌ２１４Ｎ／Ａ４２４Ｃ、Ｒ４０Ｃ／Ｌ２１４Ｑ、Ｒ４０Ｃ／Ｔ４２１Ｓ／Ａ４２４Ｇ、Ｒ４０Ｃ／Ａ４２４Ｃ、Ｐ５４Ｌ／Ｌ２１４Ｑ、Ｙ６６Ｆ、Ｖ９０Ｑ／Ｌ２１４Ｑ／Ａ４２４Ｇ、Ｗ１０６Ｒ／Ｖ２２７Ｆ、Ｗ１０６Ｓ／Ｖ２２７Ｆ／Ａ２４４Ｓ、Ｗ１０６Ｓ／Ｖ２２７Ｆ／Ａ２４４Ｓ／Ｒ５５４Ｃ、Ｗ１０６Ｓ／Ｖ２２７Ｆ／Ｒ５５４Ｃ、Ｌ２１４Ｑ、Ｌ２１４Ｑ／Ｔ４２１Ｓ、Ｉ３３９Ｍ、Ｔ４２１Ｓ／Ａ４２４Ｃ、Ａ４２４Ｃ、Ｉ４５４Ｌ、Ｉ４５４Ｖ、Ｔ４６３Ａ、Ｔ４６３Ｇ、Ｔ４６３Ｌ、Ｔ４６３Ｎ、Ｔ４６３Ｓ、Ｔ４６３Ｖ、Ｔ４６３Ｗ、Ｌ４６４Ｃ、Ｌ４６４Ｑ、Ｎ４７４Ｅ、およびＡ５４３Ｑから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９８８を参照して番号付けされる。
【００２６】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号９８８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号９８８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３６、４０／６６／２２７、４０／６６／２２７／２４４／４１０／４２４、４０／６６／４１０／４７４、４０／４１０／４１１／４２４、４７、６６、６６／２１４／３７４／４１０／４７４、６６／２１４／４２４、６６／２１４／４３７／４７４、６６／２２７、６６／２２７／２４４／４２４／５４３、６６／２２７／４２４、６６／３３９、６６／３３９／４１０／５４３、６６／３３９／４７４、６６／３７０、６６／４１０／４２４／４５４／５２７、６６／４２４、６６／４６３／４６４、６６／５４３、１０２、１０４、１０５、１５４、２１４／２４４／５４３、２１４／３７４／４２４、２２７、２２７／２４４／４１１／４２４、２２７／３３９／４１３／４３７、２４４／４１１、３３９、３９４、４１０、４１０／４１１／４２４、４１３、４２１、４２４、５１７、５２４、および５５４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９８８を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号９８８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３６Ｃ、３６Ｑ、４０Ｃ／６６Ｆ／２２７Ｆ、４０Ｃ／６６Ｆ／２２７Ｆ／２４４Ｓ／４１０Ｋ／４２４Ｃ、４０Ｃ／６６Ｆ／４１０Ｋ／４７４Ｅ、４０Ｃ／４１０Ｋ／４１１Ａ／４２４Ｃ、４７Ａ、４７Ｅ、４７Ｒ、４７Ｔ、６６Ｆ、６６Ｆ／２１４Ｑ／３７４Ｄ／４１０Ｋ／４７４Ｅ、６６Ｆ／２１４Ｑ／４２４Ｃ、６６Ｆ／２１４Ｑ／４３７Ｇ／４７４Ｅ、６６Ｆ／２２７Ｆ、６６Ｆ／２２７Ｆ／２４４Ｓ／４２４Ｃ／５４３Ｑ、６６Ｆ／２２７Ｆ／４２４Ｇ、６６Ｆ／３３９Ｌ、６６Ｆ／３３９Ｌ／４１０Ｋ／５４３Ｑ、６６Ｆ／３３９Ｌ／４７４Ｅ、６６Ｆ／３７０Ｅ、６６Ｆ／４１０Ｋ／４２４Ｃ／４５４Ｖ／５２７Ｈ、６６Ｆ／４２４Ｃ、６６Ｆ／４６３Ａ／４６４Ｃ、６６Ｆ／４６３Ｌ／４６４Ｑ、６６Ｆ／５４３Ｑ、１０２Ｓ、１０４Ｇ、１０５Ｇ、１５４Ｔ、２１４Ｑ／２４４Ｓ／５４３Ｑ、２１４Ｑ／３７４Ｄ／４２４Ｃ、２２７Ｆ、２２７Ｆ／２４４Ｓ／４１１Ａ／４２４Ｃ、２２７Ｆ／３３９Ｌ／４１３Ａ／４３７Ｇ、２４４Ｓ／４１１Ａ、３３９Ｌ、３９４Ｌ、４１０Ｋ／４１１Ａ／４２４Ｇ、４１０Ｌ、４１０Ｔ、４１０Ｖ、４１０Ｙ、４１３Ｔ、４２１Ｑ、４２４Ｇ、４２４Ｌ、５１７Ｄ、５２４Ｉ、５５４Ｌ、および５５４Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９８８を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号９８８またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｎ３６Ｃ、Ｎ３６Ｑ、Ｒ４０Ｃ／Ｙ６６Ｆ／Ｖ２２７Ｆ、Ｒ４０Ｃ／Ｙ６６Ｆ／Ｖ２２７Ｆ／Ａ２４４Ｓ／Ｍ４１０Ｋ／Ａ４２４Ｃ、Ｒ４０Ｃ／Ｙ６６Ｆ／Ｍ４１０Ｋ／Ｎ４７４Ｅ、Ｒ４０Ｃ／Ｍ４１０Ｋ／Ｅ４１１Ａ／Ａ４２４Ｃ、Ｐ４７Ａ、Ｐ４７Ｅ、Ｐ４７Ｒ、Ｐ４７Ｔ、Ｙ６６Ｆ、Ｙ６６Ｆ／Ｌ２１４Ｑ／Ｈ３７４Ｄ／Ｍ４１０Ｋ／Ｎ４７４Ｅ、Ｙ６６Ｆ／Ｌ２１４Ｑ／Ａ４２４Ｃ、Ｙ６６Ｆ／Ｌ２１４Ｑ／Ｎ４３７Ｇ／Ｎ４７４Ｅ、Ｙ６６Ｆ／Ｖ２２７Ｆ、Ｙ６６Ｆ／Ｖ２２７Ｆ／Ａ２４４Ｓ／Ａ４２４Ｃ／Ａ５４３Ｑ、Ｙ６６Ｆ／Ｖ２２７Ｆ／Ａ４２４Ｇ、Ｙ６６Ｆ／Ｉ３３９Ｌ、Ｙ６６Ｆ／Ｉ３３９Ｌ／Ｍ４１０Ｋ／Ａ５４３Ｑ、Ｙ６６Ｆ／Ｉ３３９Ｌ／Ｎ４７４Ｅ、Ｙ６６Ｆ／Ｍ３７０Ｅ、Ｙ６６Ｆ／Ｍ４１０Ｋ／Ａ４２４Ｃ／Ｉ４５４Ｖ／Ｒ５２７Ｈ、Ｙ６６Ｆ／Ａ４２４Ｃ、Ｙ６６Ｆ／Ｔ４６３Ａ／Ｌ４６４Ｃ、Ｙ６６Ｆ／Ｔ４６３Ｌ／Ｌ４６４Ｑ、Ｙ６６Ｆ／Ａ５４３Ｑ、Ｍ１０２Ｓ、Ａ１０４Ｇ、Ｉ１０５Ｇ、Ｇ１５４Ｔ、Ｌ２１４Ｑ／Ａ２４４Ｓ／Ａ５４３Ｑ、Ｌ２１４Ｑ／Ｈ３７４Ｄ／Ａ４２４Ｃ、Ｖ２２７Ｆ、Ｖ２２７Ｆ／Ａ２４４Ｓ／Ｅ４１１Ａ／Ａ４２４Ｃ、Ｖ２２７Ｆ／Ｉ３３９Ｌ／Ｋ４１３Ａ／Ｎ４３７Ｇ、Ａ２４４Ｓ／Ｅ４１１Ａ、Ｉ３３９Ｌ、Ｎ３９４Ｌ、Ｍ４１０Ｋ／Ｅ４１１Ａ／Ａ４２４Ｇ、Ｍ４１０Ｌ、Ｍ４１０Ｔ、Ｍ４１０Ｖ、Ｍ４１０Ｙ、Ｋ４１３Ｔ、Ｔ４２１Ｑ、Ａ４２４Ｇ、Ａ４２４Ｌ、Ｅ５１７Ｄ、Ａ５２４Ｉ、Ｒ５５４Ｌ、およびＲ５５４Ｖから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号９８８を参照して番号付けされる。
【００２７】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号１１４０またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号１１４０またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３６／４７／４２４／５１７／５５４、４７／２１４／４１３／５２４／５６３、４７／４１０／５２４、４７／５２４、４７／５５４、２１４、２１４／４２４、４１０、４１０／５１７／５５４、４１０／５５４、４２４／５１７／５５４、５１７／５２４／５５４および５５４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１１４０を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号１１４０またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、３６Ｑ／４７Ｒ／４２４Ｌ／５１７Ｄ／５５４Ｖ、４７Ｅ／２１４Ｑ／４１３Ａ／５２４Ｉ／５６３Ｖ、４７Ｅ／５２４Ｉ、４７Ｔ／４１０Ｙ／５２４Ｉ、４７Ｔ／５５４Ｌ、２１４Ｑ、２１４Ｑ／４２４Ｌ、４１０Ｌ／５５４Ｖ、４１０Ｔ／５１７Ｄ／５５４Ｖ、４１０Ｙ、４２４Ｌ／５１７Ｄ／５５４Ｖ、５１７Ｄ／５２４Ｉ／５５４Ｌ、および５５４Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１１４０を参照して番号付けされる。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号１１４０またはその機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、Ｎ３６Ｑ／Ｐ４７Ｒ／Ａ４２４Ｌ／Ｅ５１７Ｄ／Ｒ５５４Ｖ、Ｐ４７Ｅ／Ｌ２１４Ｑ／Ｋ４１３Ａ／Ａ５２４Ｉ／Ｌ５６３Ｖ、Ｐ４７Ｅ／Ａ５２４Ｉ、Ｐ４７Ｔ／Ｋ４１０Ｙ／Ａ５２４Ｉ、Ｐ４７Ｔ／Ｒ５５４Ｌ、Ｌ２１４Ｑ、Ｌ２１４Ｑ／Ａ４２４Ｌ、Ｋ４１０Ｌ／Ｒ５５４Ｖ、Ｋ４１０Ｔ／Ｅ５１７Ｄ／Ｒ５５４Ｖ、Ｋ４１０Ｙ、Ａ４２４Ｌ／Ｅ５１７Ｄ／Ｒ５５４Ｖ、Ｅ５１７Ｄ／Ａ５２４Ｉ／Ｒ５５４Ｌ、およびＲ５５４Ｌから選択される少なくとも１つの置換または置換セットを含み、ポリペプチド配列のアミノ酸位置は、配列番号１１４０を参照して番号付けされる。
【００２８】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／もしくは１１４０またはそれらの機能的断片と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８もしくは１１４０またはそれらの機能的断片を含む。なお一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、表５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、１０．１、１１．１、１２．１、１３．１、１４．１、１５．１、１８．１および／または１９．１に示される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４〜１２２２の偶数配列に示される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントの配列と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４〜１２２２の偶数配列に示される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントの配列と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高く同一であるポリペプチド配列を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号４〜１２２２の偶数配列に示されるポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、野生型Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのフェニルアラニンアンモニアリアーゼと比較して少なくとも１つの改善された性質を示すポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、改善された性質は、化合物２の改善された生成を含む。一部の実施形態では、改善された性質は、
【化２】
2021531749.tif 000003
の改善された生成を含む。
【００２９】
一部の追加の実施形態では、改善された性質は、
【化３】
2021531749.tif 000004
の改善された利用を含む。さらに一部の追加の実施形態では、改善された性質は、
【化４】
2021531749.tif 000005
から
【化５】
2021531749.tif 000006
の改善された生成を含む。
【００３０】
さらに一部の追加の実施形態では、改善された性質は、改善されたエナンチオ選択性を含む。一部のさらなる実施形態では、改善された性質は、改善された安定性を含む。一部の追加の実施形態では、改善された性質は、改善された熱安定性、改善された酸安定性および／または改善されたアルカリ安定性を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、精製されている。本発明では、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼを含む組成物も提供する。本発明では、本明細書に提供される操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼを含む組成物も提供する。
【００３１】
本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする操作されたポリヌクレオチド配列も提供する。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含み、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼのポリヌクレオチド配列は、１つまたは複数の位置に少なくとも１つの置換を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９と少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号３〜１２２１の奇数配列の１つと少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い配列同一性を含む。一部のさらなる実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、配列番号３〜１２２１に示される奇数配列に示される配列を含む。一部の追加の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、制御配列に作動可能に連結されている。一部の実施形態では、制御配列は、プロモーターを含む。一部の追加の実施形態では、プロモーターは、異種プロモーターである。一部のさらなる実施形態では、制御配列は、２つ以上の制御配列を含む。一部の実施形態では、制御配列の１つは、プロモーターを含み、他の制御配列は、異なる制御配列を含む。一部の実施形態では、操作されたポリヌクレオチド配列は、コドン最適化されている。本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供する。本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つの発現ベクターを含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、本発明は、本明細書に提供される少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞であるが、一部の他の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。一部の追加の実施形態では、宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【００３２】
本発明は、宿主細胞において操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼを産生させる方法であって、本明細書に提供される少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼが産生するように、適切な条件下で、培養培地中で本明細書に提供される宿主細胞を培養することを含む、方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、培養培地および／または宿主細胞から少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼを回収するステップをさらに含む。一部の追加の実施形態では、方法は、本発明の方法を使用して得られる少なくとも１つのフェニルアラニンアンモニアリアーゼを精製するステップをさらに含む。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ＰＡＬ酵素を産生させるための方法も提供する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、医薬化合物の生成のための工業プロセス条件下で有用な増強された触媒活性を提供するように最適化される。
【００３４】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、一般に、本発明が関係する分野の当業者によって通常理解されるものと同じ意味を有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに下記に記載する細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験手順は、当技術分野において周知かつ通常用いられるものである。このような技法は周知であり、多数のテキストおよび当業者に周知の参照文献に記載されている。標準的な技法、またはその改変は、化学合成および化学分析のために使用される。したがって、以下の用語は、本明細書に提供される意味を有することが意図される。
【００３５】
本明細書に記載されるものに類似または同等の任意の適切な方法および材料は、本発明の実施において使用されるが、いくつかの方法および材料を、本明細書に記載する。それらが当業者によって使用される状況に応じて変わり得るので、本発明が、記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことが理解されるべきである。したがって、直下で定義される用語は、全体として本発明に対する参照によって、より完全に記載される。
【００３６】
前述の一般的な記載および以下の詳細な記載の両方が、例示的かつ説明的なものにすぎず、本発明を制限するものではないことが理解されるべきである。本明細書において使用される節の見出しは、構成の目的のためにすぎず、記載される主題を限定するものとして解釈されるべきではない。数値範囲は、その範囲を定義する数字を包含する。したがって、本明細書に開示されるすべての数値範囲は、より狭い数値範囲が本明細書においてすべて明示的に記載されているかのように、より広い数値範囲内に入るそのようなすべてのより狭い数値範囲を包含することが意図される。本明細書に開示されるすべての最大の（または最小の）数値限定は、より低い（またはより高い）数値限定が本明細書において明示的に記載されているかのように、そのようなすべてのより低い（またはより高い）数値限定を含むことも意図される。
【００３７】
本明細書で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかに他のことを示さない限り、複数の指示対象を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」への言及は、２つ以上のポリペプチドを含む。
【００３８】
同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、互換可能であり、限定することを意図しない。したがって、本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語およびその同語源語は、それらの包括的な意味で使用される（すなわち、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」という用語およびその対応する同語源語と同等である）。
【００３９】
さまざまな実施形態の記載が「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語を使用する場合、当業者が、一部の特定の例では、実施形態が、「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」または「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」という語を使用して代わりに記載することができることを理解するはずであることがさらに理解されるべきである。
【００４０】
本明細書において言及されるすべての特許、特許出願、文献および刊行物は、上記および下記の両方とも、ここに、参照によって本明細書に明示的に組み込まれる。
【００４１】
定義および略語
遺伝子によってコードされるアミノ酸について使用される略語は、従来のものであり、以下の通りである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｇまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。
【００４２】
三文字略語が使用される場合、「Ｌ」もしくは「Ｄ」が具体的に先行しない限り、または略語が使用される文脈から明らかでない限り、アミノ酸は、α炭素（Ｃα）についてＬ配置またはＤ配置のいずれかであり得る。例えば、「Ａｌａ」は、α炭素についての立体配置を特定することなくアラニンを指すが、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、それぞれ、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニンを指す。一文字略語が使用される場合、大文字は、α炭素についてＬ配置にあるアミノ酸を指し、小文字は、α炭素についてＤ配置にあるアミノ酸を指す。例えば、「Ａ」は、Ｌ−アラニンを指し、「ａ」は、Ｄ−アラニンを指す。ポリペプチド配列が、一連の一文字または三文字の略語（またはこれらの混合）として表される場合、配列は、一般的な慣例に従って、アミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）の方向で表される。
【００４３】
遺伝的にコードするヌクレオシドのために使用される略語は、従来のものであり、以下の通りである：アデノシン（Ａ）；グアノシン（Ｇ）；シチジン（Ｃ）；チミジン（Ｔ）；およびウリジン（Ｕ）。具体的に詳述されない限り、略されたヌクレオシドは、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであり得る。ヌクレオシドは、個別基準または集合基準で、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのいずれかであると特定され得る。核酸配列が、一連の一文字略語として表される場合、配列は、一般的な慣例に従って、５’から３’の方向で表され、そのリン酸は示さない。
【００４４】
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、特定の値についての許容可能な誤差を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の範囲の０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％以内を意味する。一部の例では、「約」は、所与の値の１、２、３または４標準偏差以内を意味する。
【００４５】
本明細書で使用される場合、「ＥＣ」番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名委員会（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法を指す。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素が触媒する化学反応に基づく、酵素についての数字分類システムである。
【００４６】
本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関を指し、その保存機関は遺伝子および株を含む。
【００４７】
本明細書で使用される場合、「ＮＣＢＩ」は、アメリカ国立生物学情報センター（National  Center  for  Biological  Information）およびそこで提供される配列データベースを指す。
【００４８】
本明細書で使用される場合、「フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（lysate）」（「ＰＡＬ」）酵素は、Ｌ−フェニルアラニン、およびＬ−２−アミノ−３−（２−（ベンジルオキシ）−３−メトキシフェニル）プロパン酸などの関連化合物の可逆的非酸化的脱アミノ化を触媒する酵素である。
【００４９】
「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）に関わらず、アミド結合によって共有結合的に連結された少なくとも２つのアミノ酸のポリマーを示すために、本明細書で互換可能に使用される。この定義内には、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の混合物だけでなく、Ｄ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−アミノ酸およびＬ−アミノ酸の混合物を含むポリマーも含む。
【００５０】
「アミノ酸」は、本明細書において、それらの通常公知の三文字記号によって、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名委員会によって推奨される一文字記号によってのいずれかで言及される。同様に、ヌクレオチドは、それらの通常許容される一文字表記によって言及され得る。
【００５１】
本明細書で使用される場合、「親水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Eisenberg  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,  179:125-142  [1984]）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従って、ゼロ未満の疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる親水性アミノとしては、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ａｓｐ（Ｄ）、Ｌ−Ｌｙｓ（Ｋ）およびＬ−Ａｒｇ（Ｒ）が挙げられる。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「酸性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合、約６未満のｐＫａ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。酸性アミノ酸は、典型的には、水素イオンの喪失に起因して、生理学的なｐＨで負に荷電した側鎖を有する。遺伝子によってコードされる酸性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｕ（Ｅ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００５３】
本明細書で使用される場合、「塩基性アミノ酸または残基」は、アミノ酸がペプチドまたはポリペプチドに含まれる場合、約６よりも大きいｐＫａ値を示す側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。塩基性アミノ酸は、典型的には、ヒドロニウムイオンとの会合に起因して、生理学的なｐＨで正に荷電した側鎖を有する。遺伝子によってコードされる塩基性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｒｇ（Ｒ）およびＬ−Ｌｙｓ（Ｋ）が挙げられる。
【００５４】
本明細書で使用される場合、「極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで非荷電であるが、２つの原子によって共有される電子対が、原子の１つによってより密接に保持される少なくとも１つの結合を有する側鎖を有する親水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる極性アミノ酸としては、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）およびＬ−Ｔｈｒ（Ｔ）が挙げられる。
【００５５】
本明細書で使用される場合、「疎水性アミノ酸または残基」は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇら（Eisenberg  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,  179:125-142  [1984]）の正規化コンセンサス疎水性尺度に従って、ゼロを超える疎水性を示す側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる疎水性アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００５６】
本明細書で使用される場合、「芳香族アミノ酸または残基」は、少なくとも１つの芳香族環もしくは芳香族複素環を含む側鎖を有する親水性または疎水性のアミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる芳香族アミノ酸としては、Ｌ−Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｌ−Ｔｙｒ（Ｙ）およびＬ−Ｔｒｐ（Ｗ）が挙げられる。Ｌ−Ｈｉｓ（Ｈ）は、その芳香族複素環の窒素原子のｐＫａに基づいて塩基性残基として分類される場合があり、または、その側鎖として芳香族複素環を含むので芳香族残基として分類される場合があるが、本明細書において、ヒスチジンは、親水性残基として、または「拘束残基」（以下を参照のこと）として分類される。
【００５７】
本明細書で使用される場合、「拘束アミノ酸または残基」は、拘束配置を有するアミノ酸または残基を指す。本明細書において、拘束残基としては、Ｌ−Ｐｒｏ（Ｐ）およびＬ−Ｈｉｓ（Ｈ）が挙げられる。ヒスチジンは、比較的小さなイミダゾール環を有するので、拘束配置を有する。プロリンは、これも５員環を有するので、拘束配置を有する。
【００５８】
本明細書で使用される場合、「非極性アミノ酸または残基」は、生理学的ｐＨで非荷電であり、２つの原子によって共有される電子対が、一般に、２つの原子のそれぞれによって同等に保持される結合を有する側鎖を有する（すなわち、側鎖は極性でない）疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる非極性アミノ酸としては、Ｌ−Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌ−Ｍｅｔ（Ｍ）およびＬ−Ａｌａ（Ａ）が挙げられる。
【００５９】
本明細書で使用される場合、「脂肪族アミノ酸または残基」は、脂肪族炭化水素側鎖を有する疎水性アミノ酸または残基を指す。遺伝子によってコードされる脂肪族アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｌｅｕ（Ｌ）およびＬ−Ｉｌｅ（Ｉ）が挙げられる。システイン（または「Ｌ−Ｃｙｓ」もしくは「［Ｃ］」）は、他のＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）アミノ酸、または他のスルファニルもしくはスルフヒドリル含有アミノ酸とジスルフィド架橋を形成することができるという点で、普通ではないことに留意する。「システイン様残基」としては、システイン、およびジスルフィド架橋の形成のために利用可能なスルフヒドリル部分を含有する他のアミノ酸が挙げられる。還元型遊離−ＳＨまたは酸化型ジスルフィド架橋形態のいずれかでペプチド中に存在するＬ−Ｃｙｓ（Ｃ）（および−ＳＨを含有する側鎖を有する他のアミノ酸）の能力は、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）がペプチドへの正味の疎水性または親水性の特性に寄与するかどうかに影響を及ぼす。Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（Eisenberg  et  al.,  1984、上記）の正規化コンセンサス尺度に従って、０．２９の疎水性を示すが、本開示の目的のためには、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）は、その独自の類のない群に分類されることが理解されるべきである。
【００６０】
本明細書で使用される場合、「小型アミノ酸または残基」は、全部で３つまたはそれよりも少ない炭素および／またはヘテロ原子（α−炭素および水素を除く）で構成される側鎖を有するアミノ酸または残基を指す。小型アミノ酸または残基は、上記の定義に従って、脂肪族、非極性、極性もしくは酸性の小型アミノ酸または残基として、さらに分類されてもよい。遺伝子によってコードされる小型アミノ酸としては、Ｌ−Ａｌａ（Ａ）、Ｌ−Ｖａｌ（Ｖ）、Ｌ−Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｌ−Ａｓｎ（Ｎ）、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ａｓｐ（Ｄ）が挙げられる。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシル含有アミノ酸または残基」は、ヒドロキシル（−ＯＨ）部分を含有するアミノ酸を指す。遺伝子によってコードされるヒドロキシルを含有するアミノ酸としては、Ｌ−Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｌ−Ｔｈｒ（Ｔ）およびＬ−Ｔｙｒ（Ｙ）が挙げられる。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合的に一緒に連結された２つまたはそれよりも多くのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドから全体的に構成されてもよく（すなわち、ＲＮＡ）、２’−デオキシリボヌクレオチドから全体的に構成されてもよく（すなわち、ＤＮＡ）、またはリボヌクレオチドおよび２’−デオキシリボヌクレオチドの混合物で構成されてもよい。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル連結を介して一緒に連結されるが、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準的な連結を含んでいてもよい。ポリヌクレオチドは、一本鎖もしくは二本鎖であってもよく、または一本鎖領域および二本鎖領域の両方を含んでいてもよい。また、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）から構成されるが、例えば、イノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどのような１つまたは複数の修飾核酸塩基および／または合成核酸塩基を含んでいてもよい。一部の実施形態では、このような修飾核酸塩基または合成核酸塩基は、アミノ酸配列をコードする核酸塩基である。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基（すなわち、窒素塩基）および５炭糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）を含むグリコシルアミンを指す。ヌクレオシドの非制限的な例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシンが挙げられる。対照的に、「ヌクレオチド」という用語は、核酸塩基、５炭糖、および１つまたは複数のリン酸基を含むグリコシルアミンを指す。一部の実施形態では、ヌクレオシドは、キナーゼによってリン酸化されて、ヌクレオチドを生成することができる。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド二リン酸」は、核酸塩基（すなわち、窒素塩基）、５炭糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）および二リン酸（すなわち、ピロリン酸）部分を含むグリコシルアミンを指す。本明細書における一部の実施形態では、「ヌクレオシド二リン酸」は、「ＮＤＰ」と略される。ヌクレオシド二リン酸の非限定的な例としては、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）およびイノシン二リン酸が挙げられる。「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」という用語は、一部の文脈において互換可能に使用され得る。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）の部分を指す。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「生体触媒」、「生体触媒の」、「生体内変換」および「生合成」という用語は、有機化合物に対して化学反応を行う酵素の使用を指す。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、天然に見出される形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、天然の供給源から単離することができ、ヒトの操作（human  manipulation）によって意図的に改変されていない、生物中に存在する配列である。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「組換え」、「操作された」、「天然に存在しない」および「バリアント」は、細胞、核酸またはポリペプチドに関連して使用される場合、そうでなければ天然に存在しないはずである様式で改変されている材料、または材料の天然もしくはネイティブ形態に対応する材料を指す。一部の実施形態では、細胞、核酸またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸またはポリペプチドと同一であるが、合成材料からおよび／もしくは組換え技法を使用する操作によって、生成または誘導される。非限定的な例としては、中でも、細胞のネイティブ（非組換え）形態内では見出されない遺伝子を発現するか、またはそうでなければ異なるレベルで発現されるネイティブ遺伝子を発現する、組換え細胞が挙げられる。
【００６９】
「配列同一性のパーセント（％）」という用語は、本明細書において、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドの間の比較を指すために使用され、２つの最適に整列させた配列を比較ウインドウに対して比較することによって決定され、ここで、比較ウインドウにおけるポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に存在する位置の数を決定して、マッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算されてもよい。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列に存在する位置の数を決定するか、または核酸塩基もしくはアミノ酸残基をギャップと共に整列させてマッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を比較ウインドウにおける位置の総数で除算し、その結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算されてもよい。当業者は、２つの配列を整列させるために利用可能な多くの確立されたアルゴリズムが存在することを十分に理解している。比較のための配列の最適なアライメントは、当技術分野において公知であるように、限定されるものではないが、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎのローカル相同性アルゴリズム（Smith  and  Waterman,    Adv.  Appl.  Math.,  2:482  [1981]）、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アライメントアルゴリズム（Needleman  and  Wunsch,  J.  Mol.  Biol.,  48:443  [1970]）、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性についての検索方法（Pearson  and  Lipman,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  85:2444  [1988]）、これらのアルゴリズムのコンピューターによる実行（例えば、ＧＣＧ  ＷｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージにおけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）、または目視検査を含む、任意の適切な方法によって実施することができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するために適切なアルゴリズムの例としては、限定されるものではないが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら（それぞれ、Altschul  et  al.,  J.  Mol.  Biol.,  215:  403-410  [1990]；およびAltschul  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  3389-3402  [1977]を参照のこと）によって記載される、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムが挙げられる。ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、アメリカ国立生物工学情報センターのウェブサイトを通して公開されている。このアルゴリズムは、最初に、データベース配列における同じ長さのワードと整列させた場合に、いくつかの正の値の閾値スコアＴとマッチするか、または満たす、クエリ配列における短いワード長Ｗを特定することによって、高スコアリングの配列ペア（ＨＳＰ）を特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と称される（Altschul  et  al.、上記を参照のこと）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出す検索を開始するためのシードとしての役割を果たす。次いで、ワードヒットを、累積アライメントスコ��を増加させることができる範囲まで、それぞれの配列に沿って両方の方向に伸長させる。累積スコアは、ヌクレオチド配列のために、パラメータＭ（マッチする残基の対についてのリワードスコア：常に＞０）およびＮ（ミスマッチ残基についてのペナルティスコア；常に＜０）を使用して計算する。アミノ酸配列のためには、スコアリング行列を使用して累積スコアを計算する。それぞれの方向におけるワードヒットの伸長は、以下の場合に停止する：累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下する；累積スコアが、１つもしくは複数の負のスコアリング残基アライメントの蓄積に起因して、ゼロもしくはそれよりも低くなる；またはいずれかの配列の末端に達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータのＷ、Ｔ、およびＸは、アライメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のため）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のためには、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリング行列を使用する（Henikoff  and  Henikoff,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  89:10915  [1989]を参照のこと）。配列アライメントおよび配列同一性％の例示的な決定は、提供されたデフォルトパラメータを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎソフトウェアパッケージ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）におけるＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを用いることができる。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、配列および／または活性の比較のための基礎として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば、全長の遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであってもよい。一般に、参照配列は、少なくとも２０ヌクレオチド長またはアミノ酸残基長、少なくとも２５残基長、少なくとも５０残基長、少なくとも１００残基長、または全長の核酸もしくはポリペプチドである。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、それぞれ、（１）２つの配列間で類似である配列（すなわち、完全な配列の一部）を含んでいてもよく、（２）２つの配列間で相違する配列をさらに含んでいてもよいので、２つの（またはそれより多くの）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、典型的には、「比較ウインドウ」に対して２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較して、ローカル領域の配列類似性を同定および比較することによって行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、参照配列が一次配列中に１つまたは複数の変化を有することができる配列である場合、一次アミノ酸配列に基づくことができる。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「比較ウインドウ」は、少なくとも約２０の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念的セグメントを指し、ここで、配列は、少なくとも２０の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と比較されてもよく、比較ウインドウにおける配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために参照配列（付加または欠失を含まない）と比較して２０パーセントまたはそれよりも低い付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでいてもよい。比較ウインドウは、２０の連続する残基よりも長い場合があり、必要に応じて、３０、４０、５０、１００、またはそれよりも長いウインドウを含む。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「対応する」、「参照して」および「比べて」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈において使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列を参照配列と比較した場合の特定された参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えれば、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の数的な位置によってよりもむしろ参照配列に関連して指定される。例えば、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼのアミノ酸配列などの所与のアミノ酸配列は、２つの配列間の残基のマッチを最適化するためにギャップを導入することによって、参照配列と整列させることができる。これらの場合では、ギャップは存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の番号付けは、それを整列させた参照配列に関して行われる。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「実質的な同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウインドウに対して、しばしば少なくとも３０〜５０残基のウインドウに対して、参照配列と比較して、少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、少なくとも８９〜９５パーセントの配列同一性、もしくはより通常は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有するポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、ここで、配列同一性のパーセンテージは、比較ウインドウに対して、参照配列の合計で２０パーセントまたはそれよりも少ない欠失または付加を含む配列に対して参照配列を比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される一部の特定の実施形態では、「実質的な同一性」という用語は、デフォルトギャップ重みを使用して、プログラムのＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴによってなど最適に整列させた場合に、２つのポリペプチド配列が、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントまたはそれより高い配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。一部の実施形態では、比較される配列中の同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なる。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸の相違」および「残基の相違」は、参照配列における対応する位置でのアミノ酸残基と比べて、ポリペプチド配列の位置でのアミノ酸残基の相違を指す。一部の場合では、参照配列は、ヒスチジンタグを有するが、番号付けは、ヒスチジンタグなしの同等の参照配列と比べて維持される。アミノ酸の相違の位置は、一般に、本明細書において、「Ｘｎ」と称し、ここで、ｎは、残基の相違がそれに基づく参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号４と比較したＸ９３位での残基の相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチド位置でのアミノ酸残基の相違を指す。したがって、配列番号４の参照ポリペプチドが９３位にセリンを有する場合、「配列番号４と比較したＸ９３位での残基の相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチドの位置でのセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換である。本明細書におけるほとんどの例では、ある位置での特定のアミノ酸残基の相違は、「ＸｎＹ」として示され、ここで、「Ｘｎ」は、上記に記載の対応する位置を特定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドにおいて見出されるアミノ酸の一文字識別子（すなわち、参照ポリペプチドとは異なる残基）である。一部の例では（例えば、実施例に示す表では）、本発明は、従来の表記「ＡｎＢ」によって表される特定のアミノ酸の相違も提供し、ここで、Ａは、参照配列における残基の一文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列における残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列における残基置換の一文字識別子である。一部の例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比べて残基の相違が存在する特定された位置のリストによって表される、参照配列と比べて１つまたは複数のアミノ酸残基の相違を含むことができる。一部の実施形態では、２つ以上のアミノ酸をポリペプチドの特定の残基位置で使用することができる場合、使用することができるさまざまなアミノ酸残基は、「／」によって区切られる（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。スラッシュはまた、所与のバリアント内の複数の置換を示すために使用されてもよい（すなわち、コンビナトリアルバリアントにおけるなどの所与の配列において、２つ以上の置換が存在する）。一部の実施形態では、本発明は、保存的または非保存的アミノ酸置換を含む１つまたは複数のアミノ酸の相違を含む操作されたポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、本発明は、保存的および非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する異なる残基による残基の置換を指し、したがって、典型的には、同じまたは類似の定義されたアミノ酸のクラス内のアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を含む。限定ではなく例として、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）で置換され；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）で置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）で置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）で置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され；および／または疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ、別の疎水性もしくは親水性アミノ酸で置き換えられる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖の性質を有するアミノ酸によるポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、定義された群内よりもむしろ、群の間のアミノ酸を使用してもよく、（ａ）置換（例えば、グリシンについてプロリン）の領域におけるペプチド主鎖の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響を及ぼす。限定ではなく例として、例示的な非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸、小型アミノ酸で置換された芳香族アミノ酸、および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１つまたは複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドへの改変を指す。欠失は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素の酵素活性を保持し、および／または該酵素の改善された性質を保持しながら、１もしくはそれより多くのアミノ酸、２もしくはそれより多くのアミノ酸、５もしくはそれより多くのアミノ酸、１０もしくはそれより多くのアミノ酸、１５もしくはそれより多くのアミノ酸、または２０もしくはそれより多くのアミノ酸、参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大で１０％、または参照酵素を構成するアミノ酸の総数の最大で２０％の除去を含み得る。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分を対象とすることができる。さまざまな実施形態では、欠失は、連続するセグメントを含み得るか、または不連続であり得る。欠失は、典型的に、アミノ酸配列において「−」によって示される。
【００７８】
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドからの１つまたは複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドへの改変を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分に存在し得るか、またはカルボキシ末端もしくはアミノ末端に対するものでよい。本明細書で使用される挿入は、当技術分野において公知の融合タンパク質を含む。挿入は、アミノ酸の連続するセグメントであり得るか、または天然に存在するポリペプチドにおいて１つまたは複数のアミノ酸によって分離され得る。
【００７９】
「アミノ酸置換セット」または「置換セット」という用語は、参照配列と比較して、ポリペプチド配列中のアミノ酸置換の群を指す。置換セットは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５またはそれよりも多くのアミノ酸置換を有することができる。一部の実施形態では、置換セットは、実施例において提供される表に列挙されたバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼのいずれかに存在するアミノ酸置換のセットを指す。
【００８０】
「機能的断片」および「生物活性断片」は、本明細書において互換可能に使用され、アミノ末端および／またはカルボキシ末端の欠失（複数可）および／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列が、それが比較される配列（例えば、本発明の全長の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ）における対応する位置と同一であり、全長ポリペプチドの活性の実質的にすべてを保持する、ポリペプチドを指す。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、天然でそれに付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系（例えば、宿主細胞内またはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成を介して）から除去されているか、または精製されているポリペプチドを包含する。組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、細胞内に存在していてもよく、細胞培地に存在していてもよく、または溶解物もしくは単離された調製物などのさまざまな形態で調製されてもよい。このように、一部の実施形態では、組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであり得る。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」または「精製されたタンパク質」は、ポリペプチド種が存在する主たる種である組成物を指し（すなわち、モルまたは重量に基づいて、それが組成物において任意の他の個々の高分子種より豊富である）、一般に、目的の種がモル％または重量％によって、存在する高分子種の少なくとも約５０パーセントを占める場合、実質的に精製された組成物である。しかしながら、一部の実施形態では、フェニルアラニンアンモニアリアーゼを含む組成物は、５０％未満（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％）純粋であるフェニルアラニンアンモニアリアーゼを含む。一般に、実質的に純粋なフェニルアラニンアンモニアリアーゼ組成物は、組成物中に存在するモル％または重量％ですべての高分子種のうちの約６０％またはそれより多く、約７０％またはそれより多く、約８０％またはそれより多く、約９０％またはそれより多く、約９５％またはそれより多く、および約９８％またはそれより多くを占める。一部の実施形態では、目的の種は、本質的に均一まで精製され（すなわち、夾雑種が従来の検出法によって組成物中で検出することができない）、ここで、組成物は、単一の高分子種から本質的になる。溶媒種、小型分子（＜５００ダルトン）および元素イオン種は、高分子種とは見なさない。一部の実施形態では、単離された組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「改善された酵素の性質」は、酵素の少なくとも１つの改善された性質を指す。一部の実施形態では、本発明は、参照フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド、および／または野生型フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド、および／または別の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドと比較して、任意の酵素の性質の改善を示す操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを提供する。したがって、「改善」のレベルは、野生型だけでなく操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼを含む、さまざまフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドの間で決定および比較することができる。改善された性質としては、限定されるものではないが、増加したタンパク質発現、増加した熱活性、増加した熱安定性、増加したｐＨ活性、増加した安定性、増加した酵素活性、増加した基質特異性もしくは親和性、増加した比活性、基質または最終生成物の阻害に対する増加した耐性（resistance）、増加した化学安定性、改善された化学選択性、改善された溶媒安定性、酸性ｐＨに対する増加した耐性（tolerance）、タンパク質分解活性に対する増加した耐性（すなわち、タンパク質分解に対する低減された感受性）、低減された凝集、増加した溶解度、および変更された温度プロファイルなどの性質が挙げられる。追加の実施形態では、この用語は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素の少なくとも１つの改善された性質に関連して使用される。一部の実施形態では、本発明は、参照フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド、および／または野生型フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド、および／または別の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドと比較して、任意の酵素の性質の改善を示す操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを提供する。したがって、「改善」のレベルは、野生型だけでなく操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼを含む、さまざまフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドの間で決定および比較することができる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「増加した酵素活性」および「増強された触媒活性」は、操作されたポリペプチドの改善された性質を指し、これは、参照酵素と比較して、比活性（例えば、生成した生成物／時間／重量タンパク質）の増加、または基質の生成物への変換パーセント（例えば、特定の量の酵素を使用して特定の期間での開始量の基質の生成物への変換パーセント）の増加によって表すことができる。一部の実施形態では、この用語は、本明細書に提供される操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドの改善された性質を指し、これは、参照フェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素と比較して、比活性（例えば、生成した生成物／時間／重量タンパク質）の増加、または基質の生成物への変換パーセント（例えば、特定の量のフェニルアラニンアンモニアリアーゼを使用して特定の期間での開始量の基質の生成物への変換パーセント）の増加によって表すことができる。一部の実施形態では、この用語は、本明細書に提供される改善されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素に関連して使用される。本発明の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼの酵素活性を決定する例示的な方法を実施例に提供する。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔの古典的な酵素の性質を含む、酵素活性に関する任意の性質は影響を受け得、その変化が増加した酵素活性をもたらし得る。例えば、酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、天然に存在するフェニルアラニンアンモニアリアーゼまたはフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドが由来する別の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼよりも２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍、またはそれより高い酵素活性であり得る。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「変換」は、基質（複数可）の対応する生成物（複数可）への酵素的変換（または生体内変換）を指す。「変換パーセント」は、特定の条件下で一定の期間内に生成物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特定の期間での基質の生成物への「変換パーセント」として表すことができる。
【００８６】
「万能の性質」を有する酵素（または「万能酵素（generalist  enzyme）」）は、親配列と比較して、広範囲の基質について改善された活性を示す酵素を指す。万能酵素は、すべての可能性がある基質について改善された活性を必ずしも実証する必要はない。一部の実施形態では、本発明は、それらが広範囲の立体的および電子的に多様な基質について親遺伝子と比べて、類似または改善された活性を実証するという点で、万能の性質を有するフェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントを提供する。加えて、本明細書に提供される万能酵素は、代謝物／生成物の生成を増加させるために広範囲の多様な分子にわたって改善されるように操作された。
【００８７】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」という用語は、本明細書において、その条件下で核酸ハイブリッドが安定である条件を指す。当業者に公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドについてのＴｍ値は、融解温度を予測するための公知の方法を使用して計算することができる（例えば、Baldino  et  al.,  Meth.  Enzymol.,  168:761-777  [1989]；Bolton  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  48:1390  [1962]；Bresslauer  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  83:8893-8897  [1986]；Freier  et  al.,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  83:9373-9377  [1986]；Kierzek  et  al.,  Biochem.,  25:7840-7846  [1986]；Rychlik  et  al.,    Nucl.  Acids  Res.,  18:6409-6412  [1990]  (erratum,  Nucl.  Acids  Res.,  19:698  [1991])；Sambrook  et  al.、上記）；Suggs  et  al.,  1981,  in  Developmental  Biology  Using  Purified  Genes,  Brown  et  al.  [eds.],  pp.  683-693,  Academic  Press,  Cambridge,  MA  [1981]；およびWetmur,  Crit.  Rev.  Biochem.  Mol.  Biol.  26:227-259  [1991]を参照のこと）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードし、中ストリンジェントまたは高ストリンジェントな条件などの定義された条件下で、本発明の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素をコードする配列の相補体とハイブリダイズする。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションのストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションにおける洗浄条件などのハイブリダイゼーション条件に関する。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低いストリンジェンシーの条件下で行われ、続いて、多様であるが、より高いストリンジェンシーの洗浄を行う。「中ストリンジェントなハイブリダイゼーション」という用語は、標的ＤＮＡを、標的ポリヌクレオチドに対して約９０％よりも高い同一性で、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中ストリンジェントな条件は、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて、０．２×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ中、４２℃での洗浄と同等の条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、一般に、定義されたポリヌクレオチド配列のための溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれより低い条件を指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８ＭのＮａＣｌ中、６５℃で安定なハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、０．０１８ＭのＮａＣｌ中、６５℃で安定ではない場合、これは、本明細書において企図されるように、高ストリンジェンシー条件下で安定ではない）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、５０％のホルムアミド、５×デンハルト溶液、５×ＳＳＰＥ、０．２％のＳＤＳ、４２℃と同等の条件でのハイブリダイゼーション、続いて、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％のＳＤＳ中、６５℃での洗浄によって提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ／ｖ）のＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイズと同等の条件でハイブリダイズすること、および０．１％のＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃で洗浄することである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件および中ストリンジェントな条件は、上記で引用した参考文献に記載されている。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「コドン最適化」は、コードされるタンパク質が目的の生物において効率的に発現されるように、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、特定の生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。遺伝コードは、ほとんどのアミノ酸が、「同義」または「同義の」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されるという点において縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度は、ランダムではなく、特定のコドントリプレットの方に偏っていることは周知である。このコドン使用頻度バイアスは、所与の遺伝子、共通の機能または先祖起源の遺伝子、低コピー数タンパク質に対する高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域（aggregate  protein  coding  region）に関連してより高くてもよい。一部の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現のために選択される宿主生物における最適な産生のためにコドン最適化されてもよい。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「好ましい」、「最適な」および「高いコドン使用頻度バイアス」コドンは、単独または組み合わせて使用される場合、同じアミノ酸をコードする他のコドンより高い頻度でタンパク質コード領域において使用されるコドンを互換可能に指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子、共通の機能もしくは起源の遺伝子のセット、高度に発現された遺伝子におけるコドン使用頻度、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、関連する生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度、またはそれらの組合せに関して決定され得る。その頻度が遺伝子発現のレベルと共に増加するコドンは、典型的には、発現のために最適なコドンである。例えば、クラスター分析または対応分析、および遺伝子において使用されるコドンの有効数を使用する多変量解析を含む種々の方法が、コドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対的に同義のコドン使用頻度）および特定の生物におけるコドン優先選択を決定するために、公知である（例えば、GCG  CodonPreference,  Genetics  Computer  Group  Wisconsin  Package；CodonW,  Peden,  University  of  Nottingham；McInerney,  Bioinform.,  14:372-73  [1998]；Stenico  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  222437-46  [1994]；およびWright,  Gene  87:23-29  [1990]を参照のこと）。コドン使用頻度の表は、多くの異なる生物について利用可能である（例えば、Wada  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  20:2111-2118  [1992]；Nakamura  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  28:292  [2000]；Duret,  et  al.、上記；Henaut  and  Danchin,  in  Escherichia  coli  and  Salmonella,  Neidhardt,  et  al.  (eds.),  ASM  Press,  Washington  D.C.,  p.  2047-2066  [1996]を参照のこと）。コドン使用頻度を得るためのデータソースは、タンパク質についてコードする能力を有する任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠し得る。これらのデータセットは、発現されるタンパク質をコードすることが実際に公知である核酸配列（例えば、完全なタンパク質コード配列−ＣＤＳ）、発現される配列タグ（ＥＳＴＳ）、またはゲノム配列の予想されるコード領域を含む（例えば、Mount,  Bioinformatics:  Sequence  and  Genome  Analysis,  Chapter  8,  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press,  Cold  Spring  Harbor,  N.Y.  [  2001]；Uberbacher,  Meth.  Enzymol.,  266:259-281  [1996]；およびTiwari  et  al.,  Comput.  Appl.  Biosci.,  13:263-270  [1997]を参照のこと）。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現のために必要であるか、または有利であるすべての構成要素を含む。それぞれの制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列に対して、ネイティブまたは外来性であり得る。そのような制御配列としては、限定されるものではないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターが挙げられる。最低でも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを容易にする特異的制限部位を導入する目的で、リンカーを備えていてもよい。
【００９２】
「作動可能に連結された」は、本明細書において、制御配列が、目的のポリヌクレオチドおよび／もしくはポリペプチドの発現を指示または調節するように、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対する位置で適切に（すなわち、機能的な関係で）配置される配置として定義される。
【００９３】
「プロモーター配列」は、コード配列などの目的のポリヌクレオチドの発現のために宿主細胞によって認識される核酸配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、短縮型（truncated）およびハイブリッドプロモーターを含む、選り抜きの宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であってもよく、宿主細胞に対して同種もしくは異種のいずれかである細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得られ得る。
【００９４】
「適切な反応条件」という語句は、本発明のフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドが、基質を所望の生成物化合物に変換する能力を有する酵素的変換反応溶液中の条件（例えば、酵素添加量、基質添加量、温度、ｐＨ、緩衝液、共溶媒などの範囲）を指す。一部の例示的な「適切な反応条件」を本明細書に提供する。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「化合物添加量」または「酵素添加量」などにおける「添加量」は、反応の開始時の反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
【００９６】
本明細書で使用される場合、酵素変換反応プロセスの文脈における「基質」は、本明細書に提供される操作された酵素（例えば、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド）が作用する化合物または分子を指す。
【００９７】
本明細書で使用される場合、反応からの生成物（例えば、Ｌ−フェニルアラニンアナログ）の収量を「増加させること」は、反応の間に存在する特定の成分（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素）が、同じ基質および他の置換基を用いるが、目的の成分が非存在の同じ条件下で実施される反応と比較して、より多くの生成物を生成させる。
【００９８】
反応は、反応の触媒に関与する他の酵素と比較して、その酵素の量が、約２％未満、約１％未満、または約０．１％（ｗｔ／ｗｔ）未満である場合に、特定の酵素を「実質的に含まない」と言う。
【００９９】
本明細書で使用される場合、液体（例えば、培養ブロス）を「分画すること」は、分離プロセス（例えば、塩析、カラムクロマトグラフィー、サイズ排除、および濾過）またはそのようなプロセスの組合せを適用して、所望のタンパク質が、最初の液体生成物よりも溶液中で総タンパク質のより大きいパーセンテージを占める溶液を提供することを意味する。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「出発組成物」は、少なくとも１つの基質を含む任意の組成物を指す。一部の実施形態では、出発組成物は、任意の適切な基質を含む。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、酵素変換プロセスの文脈における「生成物」は、基質に対する酵素的ポリペプチドの作用から生じる化合物または分子を指す。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、本明細書で使用される「平衡」は、化学反応または酵素反応の順方向速度定数および逆方向速度定数によって決定される、立体異性体の相互変換を含む、化学反応または酵素反応（例えば、ＡおよびＢの２つの種の相互変換）において化学種の定常状態の濃度をもたらすプロセスを指す。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「アルキル」は、直鎖状または分枝状のいずれかの、全てを含めて１〜１８個の炭素原子、より好ましくは、全てを含めて１〜８個の炭素原子、最も好ましくは、全てを含めて１〜６個の炭素原子の飽和炭化水素基を指す。特定の数の炭素原子を有するアルキルは、丸括弧内に示す（例えば、（Ｃ１〜Ｃ４）アルキルは１〜４個の炭素原子のアルキルを指す）。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「アルケニル」は、少なくとも１つの二重結合を含有するが、必要に応じて２つ以上の二重結合を含有する、直鎖状または分枝状のいずれかの、全てを含めて２〜１２個の炭素原子の基を指す。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、少なくとも１つの三重結合を含有するが、必要に応じて２つ以上の三重結合を含有し、追加で必要に応じて１つまたは複数の二重結合部分を含有する、直鎖状または分枝状のいずれかの、全てを含めて２〜１２個の炭素原子の基を指す。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアルキル」、「ヘテロアルケニル」および「ヘテロアルキニル」は、１つまたは複数の炭素原子がそれぞれ独立して、同じもしくは異なるヘテロ原子またはヘテロ原子基で置き換えられる、本明細書で定義されるアルキル、アルケニルおよびアルキニルを指す。炭素原子を置き換え得るヘテロ原子および／またはヘテロ原子基としては、限定されるものではないが、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ−Ｏ−、−ＮＲα−、−ＰＨ−、−Ｓ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）２−、−Ｓ（Ｏ）ＮＲα−、−Ｓ（Ｏ）２ＮＲα−などが挙げられ（それらの組合せを含む）、式中、それぞれのＲαは、水素、アルキル、ヘテロアルキル、シクロアルキル、ヘテロシクロアルキル、アリールおよびヘテロアリールから独立して選択される。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「アルコキシ」は、基−ＯＲβを指し、式中、Ｒβは、本明細書でも定義される必要に応じて置換されたアルキル基を含む、上記で定義される通りのアルキル基である。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「アリール」は、単環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する全てを含めて６〜１２個の炭素原子の不飽和芳香族炭素環式基を指す。例示的なアリールとしては、フェニル、ピリジル、ナフチルなどが挙げられる。
【０１０９】
本明細書で使用される場合、「アミノ」は、基−ＮＨ２を指す。置換アミノは、基−ＮＨＲδ、ＮＲδＲδ、およびＮＲδＲδＲδを指し、式中、それぞれのＲδは、置換または非置換の、アルキル、シクロアルキル、シクロヘテロアルキル、アルコキシ、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、アシル、アルコキシカルボニル、スルファニル、スルフィニル、スルホニルなどから独立して選択される。典型的なアミノ基としては、限定されるものではないが（but  are  limited  to、ジメチルアミノ、ジエチルアミノ、トリメチルアンモニウム、トリエチルアンモニウム、メチルスルホニルアミノ、フラニル−オキシ−スルファミノなどが挙げられる。
【０１１０】
本明細書で使用される場合、「オキソ」は、＝Ｏを指す。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「オキシ」は、エーテルおよびエステルを含む異なるオキシ基を形成するためにさまざまな置換基を有していてもよい、二価の基の−Ｏ−を指す。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「カルボキシ」は、−ＣＯＯＨを指す。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、「カルボニル」は、酸、酸ハロゲン化物、アルデヒド、アミド、エステルおよびケトンを含む異なるカルボニル基を形成するために種々の置換基を有していてもよい、−Ｃ（Ｏ）−を指す。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「アルコキシカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）ＯＲεを指し、式中、Ｒεは、必要に応じて置換され得る本明細書に定義されるアルキル基である。
【０１１５】
本明細書で使用される場合、「アミノカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２を指す。置換アミノカルボニルは、−Ｃ（Ｏ）ＮＲδＲδを指し、式中、アミノ基ＮＲδＲδは、本明細書に定義される通りである。
【０１１６】
本明細書で使用される場合、「ハロゲン」および「ハロ」は、フルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「ヒドロキシ」は、−ＯＨを指す。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「シアノ」は、−ＣＮを指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリール」は、環内に全てを含めて１〜１０個の炭素原子、ならびに酸素、窒素、および硫黄から選択される全てを含めて１〜４個のヘテロ原子の芳香族複素環式基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単環（例えば、ピリジルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有することができる。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキル」は、好ましくは、アルキル部分に全てを含めて１〜６個の炭素原子、およびヘテロアリール部分に全てを含めて５〜１２個の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されたアルキル（すなわち、ヘテロアリール−アルキル基）を指す。そのようなヘテロアリールアルキル基は、ピリジルメチルなどによって例示される。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルケニル」は、好ましくは、アルケニル部分に全てを含めて２〜６個の炭素原子、およびヘテロアリール部分に全てを含めて５〜１２個の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されたアルケニル（すなわち、ヘテロアリール−アルケニル基）を指す。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、「ヘテロアリールアルキニル」は、好ましくは、アルキニル部分に全てを含めて２〜６個の炭素原子、およびヘテロアリール部分に全てを含めて５〜１２個の環原子を有する、ヘテロアリールで置換されたアルキニル（すなわち、ヘテロアリール−アルキニル基）を指す。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、「ヘテロ環」、「複素環」、および互換可能に「ヘテロシクロアルキル」は、環内に全てを含めて２〜１０個の炭素環原子、および窒素、硫黄または酸素から選択される全てを含めて１〜４個のヘテロ環原子の単環または複数の縮合環を有する飽和または不飽和の基を指す。そのような複素環式基は、単環（例えば、ピペリジニルまたはテトラヒドロフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリニル、ジヒドロベンゾフランまたはキヌクリジニル）を有することができる。ヘテロ環の例としては、限定されるものではないが、フラン、チオフェン、チアゾール、オキサゾール、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソオキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、ピロリジン、インドリンなどが挙げられる。
【０１２４】
本明細書で使用される場合、「員環」は、任意の環状構造を包含することを意味する。「員」という用語に先行する数字は、環を構成する骨格原子の数を表す。したがって、例えば、シクロヘキシル、ピリジン、ピランおよびチオピランは、６員環であり、シクロペンチル、ピロール、フランおよびチオフェンは、５員環である。
【０１２５】
他に規定のない限り、前述の基において水素によって占められる位置は、限定されるものではないが、ヒドロキシ、オキソ、ニトロ、メトキシ、エトキシ、アルコキシ、置換アルコキシ、トリフルオロメトキシ、ハロアルコキシ、フルオロ、クロロ、ブロモ、ヨード、ハロ、メチル、エチル、プロピル、ブチル、アルキル、アルケニル、アルキニル、置換アルキル、トリフルオロメチル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アルコキシアルキル、チオ、アルキルチオ、アシル、カルボキシ、アルコキシカルボニル、カルボキサミド、置換カルボキサミド、アルキルスルホニル、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニルアミノ、スルホンアミド、置換スルホンアミド、シアノ、アミノ、置換アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アミノアルキル、アシルアミノ、アミジノ、アミドキシモ（amidoximo）、ヒドロキサモイル、フェニル、アリール、置換アリール、アリールオキシ、アリールアルキル、アリールアルケニル、アリールアルキニル、ピリジル、イミダゾリル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールアルキル、ヘテロアリールアルケニル、ヘテロアリールアルキニル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキルアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、ピロリジニル、ピペリジニル、モルホリノ、ヘテロ環、（ヘテロ環）オキシおよび（ヘテロ環）アルキルによって例示される置換基でさらに置換され得、好ましいヘテロ原子は、酸素、窒素および硫黄である。開放原子価がこれらの置換基上に存在する場合、開放原子価がアルキル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基および／またはヘテロ環基でさらに置換され得ること、これらの開放原子価が炭素上に存在する場合、開放原子価がハロゲンならびに酸素、窒素、または硫黄に結合した置換基によってさらに置換され得ること、ならびに複数のそのような開放原子価が存在する場合、結合の直接形成または新たなヘテロ原子、好ましくは、酸素、窒素または硫黄への結合の形成のいずれかによって、これらの基が、結合して環を形成することができることが理解される。置換基による水素の置き換えが、本発明の分子に許容されない不安定性を導入せず、そうでなければ化学的に合理的であるという条件で、上記置換を行うことができることがさらに理解される。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「培養する」という用語は、任意の適切な条件下で（例えば、液体、ゲルまたは固体培地を使用する）、微生物細胞の集団を成長させることを指す。
【０１２７】
組換えポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して産生させることができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子は、プラスミドなどのベクターにおいてクローニングすることができ、Ｅ．ｃｏｌｉなどのような所望の宿主において発現させることができる。組換えポリペプチドのバリアントは、当技術分野において公知のさまざまな方法によって作成することができる。実際に、当業者に周知である広範な異なる変異誘発技法がある。加えて、変異誘発キットは、多くの市販の分子生物学供給業者から入手可能でもある。定義されたアミノ酸での特定の置換（部位特異的）、遺伝子の局所領域における特異的もしくはランダム変異（領域特異的）、または全遺伝子にわたるランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行う方法が利用可能である。限定されるものではないが、ＰＣＲを使用する一本鎖ＤＮＡまたは二本鎖ＤＮＡの部位特異的変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャッフリング、および化学的飽和変異誘発、または当技術分野において公知の任意の他の適切な方法を含む、酵素バリアントを作成するための多数の適切な方法が当業者に公知である。変異誘発および定向進化法を、酵素をコードするポリヌクレオチドに容易に適用して、発現させ、スクリーニングし、アッセイすることができるバリアントライブラリーを作成することができる。任意の適切な変異誘発および定向進化法は、本発明において使用され、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３号、同第５，８１１，２３８号、同第５，８３０，７２１号、同第５，８３４，２５２号、同第５，８３７，４５８号、同第５，９２８，９０５号、同第６，０９６，５４８号、同第６，１１７，６７９号、同第６，１３２，９７０号、同第６，１６５，７９３号、同第６，１８０，４０６号、同第６，２５１，６７４号、同第６，２６５，２０１号、同第６，２７７，６３８号、同第６，２８７，８６１号、同第６，２８７，８６２号、同第６，２９１，２４２号、同第６，２９７，０５３号、同第６，３０３，３４４号、同第６，３０９，８８３号、同第６，３１９，７１３号、同第６，３１９，７１４号、同第６，３２３，０３０号、同第６，３２６，２０４号、同第６，３３５，１６０号、同第６，３３５，１９８号、同第６，３４４，３５６号、同第６，３５２，８５９号、同第６，３５５，４８４号、同第６，３５８，７４０号、同第６，３５８，７４２号、同第６，３６５，３７７号、同第６，３６５，４０８号、同第６，３６８，８６１号、同第６，３７２，４９７号、同第６，３３７，１８６号、同第６，３７６，２４６号、同第６，３７９，９６４号、同第６，３８７，７０２号、同第６，３９１，５５２号、同第６，３９１，６４０号、同第６，３９５，５４７号、同第６，４０６，８５５号、同第６，４０６，９１０号、同第６，４１３，７４５号、同第６，４１３，７７４号、同第６，４２０，１７５号、同第６，４２３，５４２号、同第６，４２６，２２４号、同第６，４３６，６７５号、同第６，４４４，４６８号、同第６，４５５，２５３号、同第６，４７９，６５２号、同第６，４８２，６４７号、同第６，４８３，０１１号、同第６，４８４，１０５号、同第６，４８９，１４６号、同第６，５００，６１７号、同第６，５００，６３９号、同第６，５０６，６０２号、同第６，５０６，６０３号、同第６，５１８，０６５号、同第６，５１９，０６５号、同第６，５２１，４５３号、同第６，５２８，３１１号、同第６，５３７，７４６号、同第６，５７３，０９８号、同第６，５７６，４６７号、同第６，５７９，６７８号、同第６，５８６，１８２号、同第６，６０２，９８６号、同第６，６０５，４３０号、同第６，６１３，５１４号、同第６，６５３，０７２号、同第６，６８６，５１５号、同第６，７０３，２４０号、同第６，７１６，６３１号、同第６，８２５，００１号、同第６，９０２，９２２号、同第６，９１７，８８２号、同第６，９４６，２９６号、同第６，９６１，６６４号、同第６，９９５，０１７号、同第７，０２４，３１２号、同第７，０５８，５１５号、同第７，１０５，２９７号、同第７，１４８，０５４号、同第７，２２０，５６６号、同第７，２８８，３７５号、同第７，３８４，３８７号、同第７，４２１，３４７号、同第７，４３０，４７７号、同第７，４６２，４６９号、同第７，５３４，５６４号、同第７，６２０，５００号、同第７，６２０，５０２号、同第７，６２９，１７０号、同第７，７０２，４６４号、同第７，７４７，３９１号、同第７，７４７，３９３号、同第７，７５１，９８６号、同第７，７７６，５９８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，７９５，０３０号、同第７，８５３，４１０号、同第７，８６８，１３８号、同第７，７８３，４２８号、同第７，８７３，４７７号、同第７，８７３，４９９号、同第７，９０４，２４９号、同第７，９５７，９１２号、同第７，９８１，６１４号、同第８，０１４，９６１号、同第８，０２９，９８８号、同第８，０４８，６７４号、同第８，０５８，００１号、同第８，０７６，１３８号、同第８，１０８，１５０号、同第８，１７０，８０６号、同第８，２２４，５８０号、同第８，３７７，６８１号、同第８，３８３，３４６号、同第８，４５７，９０３号、同第８，５０４，４９８号、同第８，５８９，０８５号、同第８，７６２，０６６号、同第８，７６８，８７１号、同第９，５９３，３２６号、およびすべての関連する米国特許、ならびにＰＣＴおよび米国以外の対応特許；Ling  et  al.,  Anal.  Biochem.,  254(2):157-78  [1997]；Dale  et  al.,  Meth.  Mol.  Biol.,  57:369-74  [1996]；Smith,  Ann.  Rev.  Genet.,  19:423-462  [1985]；Botstein  et  al.,  Science,  229:1193-1201  [1985]；Carter,  Biochem.  J.,  237:1-7  [1986]；Kramer  et  al.,  Cell,  38:879-887  [1984]；Wells  et  al.,  Gene,  34:315-323  [1985]；Minshull  et  al.,  Curr.  Op.  Chem.  Biol.,  3:284-290  [1999]；Christians  et  al.,  Nat.  Biotechnol.,  17:259-264  [1999]；Crameri  et  al.,  Nature,  391:288-291  [1998]；Crameri,  et  al.,  Nat.  Biotechnol.,  15:436-438  [1997]；Zhang  et  al.,  Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  U.S.A.,  94:4504-4509  [1997]；Crameri  et  al.,  Nat.  Biotechnol.,  14:315-319  [1996]；Stemmer,  Nature,  370:389-391  [1994]；Stemmer,  Proc.  Nat.  Acad.  Sci.  USA,  91:10747-10751  [1994]；国際公開第９５／２２６２５号；国際公開第９７／００７８号；国際公開第９７／３５９６６号；国際公開第９８／２７２３０号；国際公開第００／４２６５１号；国際公開第０１／７５７６７号；および国際公開第���００９／１５２３３６号を参照のこと、これらのすべては参照によって本明細書に組み込まれる）。
【０１２８】
一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られた酵素クローンは、酵素調製物を規定の温度（または他のアッセイ条件）に付すこと、および熱処理または他の適切なアッセイ条件後に残った酵素活性の量を測定することによってスクリーニングされる。次いで、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンを、遺伝子から単離し、配列決定して、ヌクレオチド配列の変化（もしあれば）を同定し、宿主細胞において酵素を発現させるために使用する。発現ライブラリーから酵素活性を測定することは、当技術分野において公知の任意の適切な方法（例えば、ＨＰＬＣ分析などの標準的な生化学技法）を使用して行うことができる。
【０１２９】
バリアントが産生した後、それらは、任意の所望の性質（例えば、高いもしくは増加した活性、または低いもしくは低減された活性、増加した熱活性、増加した熱安定性、および／または酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド」（本明細書において「操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド」、「バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素」、「フェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアント」および「フェニルアラニンアンモニアリアーゼコンビナトリアルバリアント」とも称する）が使用される。一部の実施形態では、「組換えフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド」（「操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド」、「バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素」、「フェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアント」および「フェニルアラニンアンモニアリアーゼコンビナトリアルバリアント」とも称する）が使用される。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、適切な宿主において、ＤＮＡ配列におけるコードされるポリペプチドの発現をもたらす能力を有する適切な制御配列に作動可能に連結された発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞において発現を駆動するためにＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結されたプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
【０１３１】
本明細書で使用される場合、「発現」という用語は、限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
【０１３２】
本明細書で使用される場合、「産生する」という用語は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を指す。この用語は、限定されるものではないが、転写、転写後修飾、翻訳および翻訳後修飾を含む、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを包含することが意図される。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
【０１３３】
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、２つの配列が天然で会合していない場合、それが作動可能に連結している別の配列に対して「異種」である。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、実験技法によって宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドであり、宿主細胞から取り出され、実験操作に付され、次いで、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「宿主細胞」および「宿主株」という用語は、本明細書に提供されるＤＮＡ（例えば、フェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターのための適切な宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野において公知である組換えＤＮＡ技法を使用して構築されたベクターで形質転換されたか、もしくはトランスフェクトされた、原核細胞または真核細胞である。
【０１３５】
「アナログ」という用語は、参照ポリペプチドに対して７０％より高い配列同一性であるが、１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％より高い配列同一性）を有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、限定されるものではないが、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含む、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸残基、ならびに天然に存在するアミノ酸を含有するポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、アナログは、１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基、および２つまたはそれより多くのアミノ酸残基の間に非ペプチド結合も含む。
【０１３６】
「有効量」という用語は、所望の結果をもたらすために十分な量を意味する。当業者は、慣例の実験を使用することによって、有効量を決定し得る。
【０１３７】
「単離された」および「精製された」という用語は、それが天然に会合する少なくとも１つの他の成分から除去された分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど）または他の成分を指すために使用される。「精製された」という用語は、絶対純度は必要とせず、むしろこれは相対的な定義として意図される。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「立体選択性」は、別の立体異性体に対して１つの立体異性体の化学反応または酵素反応における優先的な形成を指す。立体選択性は、１つの立体異性体の形成が他の立体異性体より好ましい場合、部分的であり得るか、または唯一の立体異性体が形成される場合、完全であり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性は、エナンチオ選択性と称され、両方の和における一方のエナンチオマーの画分（典型的には、パーセンテージとして報告される）である。あるいは、これは、通常、式［主たるエナンチオマー−少量のエナンチオマー］／［主たるエナンチオマー＋少量のエナンチオマー］に従って、それらから計算されたエナンチオマー過剰率（［ｅ．ｅ．］）として（典型的にパーセンテージとして）、当技術分野において報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、ジアステレオ選択性と称され、２つのジアステレオマーの混合物における一方のジアステレオマーの画分（典型的には、パーセンテージとして報告される）であり、あるいは、通常、ジアステレオマー過剰率（「ｄ．ｅ．」）として報告される。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率（stereomeric  excess）の種類である。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「位置選択性」および「位置選択的反応」は、結合の形成または切断の１つの方向が、すべての他の可能な方向に対して優先的に起こる反応を指す。反応は、判別が完全である場合、完全に（１００％）位置選択的であり得、１つの部位の反応の生成物が他の部位での反応の生成物に対して優勢である場合、実質的に位置選択的（少なくとも７５％）、または部分的に位置選択的（ｘ％、ここで、パーセンテージは、目的の反応に依存して設定される）であり得る。
【０１４０】
本明細書で使用される場合、「化学選択性」は、別の生成物に対して１つの生成物の化学反応または酵素反応における優先的な形成を指す。
【０１４１】
本明細書で使用される場合、「ｐＨ安定な」とは、高いまたは低いｐＨ（例えば、４．５〜６、または８〜１２）に一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露後に、未処理の酵素と比較して、類似の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持するフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを指す。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「熱安定な」とは、上昇した温度（例えば、４０〜８０℃）に一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露後に、同じ上昇した温度に曝露された野生型酵素と比較して、類似の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持するフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを指す。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「溶媒安定な」とは、様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）に一定期間（例えば、０．５〜２４時間）曝露後に、同じ濃度の同じ溶媒に曝露した野生型酵素と比較して、類似の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持するフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを指す。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「熱および溶媒安定な」とは、熱安定および溶媒安定の両方であるフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを指す。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「必要に応じた」および「必要に応じて」は、続いて記載される事象もしくは状況が起こってもよく、または起こらなくてもよいこと、ならびに記載が、事象または状況が起こる例、および起こらない例を含むことを意味する。当業者は、１つまたは複数の必要に応じた置換基を含有すると記載された任意の分子に関して、立体的に実用的および／または合成的に実現可能な化合物のみが含まれることを意味すると理解するはずである。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「必要に応じて置換された」とは、１つの用語または一連の化学基におけるすべての後続の修飾物質を指す。例えば、「必要に応じて置換されたアリールアルキル」という用語において、分子の「アルキル」部分および「アリール」部分が、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよく、一連の「必要に応じて置換されたアルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール」について、アルキル、シクロアルキル、アリールおよびヘテロアリール基は、他とは独立して、置換されていてもよく、または置換されていなくてもよい。
【０１４７】
本発明の詳細な説明
本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドおよびその組成物、ならびに操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＰＡＬ）ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。ＰＡＬ酵素を産生させるための方法も提供する。一部の実施形態では、操作されたＰＡＬポリペプチドは、医薬化合物の生成のための工業プロセス条件下で有用な増強された触媒活性を提供するように最適化される。
【０１４８】
一部の実施形態では、本発明は、ＥＭＡ４０１−Ａ１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）などのＬ−フェニルアラニンアナログの生成のために適切な酵素を提供する。本発明は、これらのＬ−フェニルアラニンアナログを生成する酵素の潜在的な使用に対処するために開発された。しかしながら、このアプローチによる１つの課題は、野生型酵素が、Ｌ−フェニルアラニンアナログの生成のために必要な、必要な基質アナログに最適ではない可能性があることを確認した。
【０１４９】
具体的な目的は、スキーム２に示される反応を触媒する能力を有するＰＡＬ酵素の開発である。ＥＭＡ４０１−Ａ１としても公知の化合物（２）は、スキーム３に示されるように、ＥＭＡ４０１としても公知の化合物（３）への前駆体である。ＥＭＡ４０１は、アンジオテンシンＩＩ２型（ＡＴ２Ｒ）受容体のための高親和性リガンドとしてのファーストインクラスであり、神経障害性疼痛の処置のために研究されている（Hesselink  and  Schatman,  J.  Pain  Res.,  10:439-443  [2017]を参照のこと）。本発明の開発の前に、商業的適用のために化合物（１）に対する十分な活性を有する天然に存在するＰＡＬ酵素を同定することは、ベンジル環（benzyl  ring）上の置換基（すなわち、ベンジルオキシおよびメトキシ基）の嵩高い性質およびこれらの基の電子供与性に起因して、これがＰＡＬ活性に負の影響を及ぼすと記載されているので（Ahmed  et  al.,  ACS  Catal.,  8:3129-3132  [2018]を参照のこと）、非常に困難であると予想された。したがって、本発明は、下記のスキーム２に示されるように、化合物（１）に対する新たな活性または改善された活性について、これらの酵素を操作する必要性に対処するために開発された。
【化６】
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【０１５０】
本発明は、操作されたＰＡＬポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用するための方法を提供する。記載がポリペプチドに関する場合、これがポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも記載することが理解されるべきである。
【０１５１】
一部の実施形態では、本発明は、野生型ＰＡＬ酵素と比較して、改善された性質を有する、操作された天然に存在しないＰＡＬ酵素を提供する。任意の適切な反応条件が本発明において使用される。一部の実施形態では、方法を使用して、異性化反応を行うための操作されたポリペプチドの改善された性質を分析する。一部の実施形態では、反応条件は、下記および実施例においてさらに記載するように、操作されたＰＡＬの濃度もしくは量、基質（複数可）、緩衝液（複数可）、溶媒（複数可）、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、ならびに／または操作されたＰＡＬポリペプチドが固相支持体に固定される条件に関連して、修正される。一部の実施形態では、追加の反応成分または追加の技法を利用して、反応条件を補完する。一部の実施形態では、これらは、酵素を安定化するか、または酵素の不活化を防止する、生成物の阻害を低減する、反応の平衡を所望の生成物の形成にシフトさせるための手段を取ることを含む。
【０１５２】
一部のさらなる実施形態では、基質化合物の生成物化合物への変換のための上記に記載のプロセスのいずれかは、生成化合物（複数可）の抽出、単離、精製、結晶化、濾過および／もしくは凍結乾燥から選択される１つまたは複数のステップをさらに含むことができる。本明細書に提供されるプロセスによって生成した生体触媒反応混合物から生成物（複数可）を抽出、単離、精製および／または結晶化するための方法、技法、ならびにプロトコールは、当業者に公知であるか、および／または慣例の実験を通して利用可能である。加えて、例示的な方法を下記の実施例において提供する。
【０１５３】
操作されたＰＡＬポリペプチド  
一部の追加の実施形態では、本発明の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０と少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を含むポリペプチドを含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを産生させるために実施される条件下で、少なくとも１つの操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチド配列を含む微生物を培養することによって、産生される。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、続いて、得られる培養培地および／または細胞から回収される。
【０１５５】
本発明は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有する例示的な操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを提供する。実施例は、特定のアミノ酸配列の特徴を操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドの機能活性と関連付ける配列構造情報を示す表を提供する。この構造−機能の相関情報は、配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０の参照の操作されたポリペプチドと比較して特定のアミノ酸残基の相違の形態で提供されるだけでなく、例示的な操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドのための例示的に決定された活性データと関連する。
【０１５６】
一部の実施形態では、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有する本発明の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、参照配列の配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０と少なくとも８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、参照配列（例えば、野生型Ａ．ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ）と比較して、少なくとも１つの改善された性質を示す。
【０１５７】
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された性質を示す操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも高いアミノ酸配列同一性、ならびに配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０と比較して、１つまたは複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５、２０またはそれよりも多くのアミノ酸位置など）でのアミノ酸残基の相違を有する。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、実施例に提供される表中に列挙されるポリペプチドである。
【０１５８】
一部の実施形態では、本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドの機能的断片を提供する。一部の実施形態では、機能的断片は、それが由来する操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド（すなわち、親の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ）の活性の少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼの親配列の少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、５アミノ酸未満、１０アミノ酸未満、１５アミノ酸未満、１０アミノ酸未満、２５アミノ酸未満、３０アミノ酸未満、３５アミノ酸未満、４０アミノ酸未満、４５アミノ酸未満、および５０アミノ酸未満まで短縮される。
【０１５９】
一部の実施形態では、本発明は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドの機能的断片を提供する。一部の実施形態では、機能的断片は、それが由来する操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチド（すなわち、親の操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ）の活性の少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または約９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼの親配列の少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％を含む。一部の実施形態では、機能的断片は、５アミノ酸未満、１０アミノ酸未満、１５アミノ酸未満、１０アミノ酸未満、２５アミノ酸未満、３０アミノ酸未満、３５アミノ酸未満、４０アミノ酸未満、４５アミノ酸未満、５０アミノ酸未満、５５アミノ酸未満、６０アミノ酸未満、６５アミノ酸未満、または７０アミノ酸未満まで短縮される。
【０１６０】
一部の実施形態では、少なくとも１つの改善された性質を示す操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０と少なくとも８５％、少なくとも８８％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％またはそれよりも高いアミノ酸配列同一性、ならびに配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０と比較して、１つまたは複数のアミノ酸位置（１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１４、１５またはそれよりも多くのアミノ酸位置など）でのアミノ酸残基の相違を有する。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０と少なくとも９０％の配列同一性を含み、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのアミノ酸位置のアミノ酸の相違を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、配列番号４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０の配列からなる。
【０１６１】
操作されたポリペプチドをコードする操作されたＰＡＬポリヌクレオチド
発現ベクターおよび宿主細胞  
本発明は、本明細書に記載の操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを、遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に作動可能に連結させて、ポリペプチドを発現する能力を有する組換えポリヌクレオチドを作出する。一部の実施形態では、操作された酵素ポリペプチド（複数可）をコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物を、適切な宿主細胞に導入して、対応する酵素ポリペプチド（複数可）を発現させる。
【０１６２】
当業者に明らかであるように、タンパク質配列の利用可能性、およびさまざまなアミノ酸に対応するコドンの知識は、対象のポリペプチドをコードする能力を有するすべてのポリヌクレオチドの説明を提供する。同じアミノ酸が代替または同義のコドンによってコードされる遺伝コードの縮重は、そのすべてが操作された酵素（例えば、ＰＡＬ）ポリペプチドをコードする極めて多数の核酸を作製することを可能にする。したがって、本発明は、可能性があるコドンの選択に基づいて組合せを選択することによって、本明細書に記載の酵素ポリペプチドをコードする、作製され得る酵素ポリヌクレオチドのそれぞれおよびすべての可能性のあるバリエーションの生成のための方法ならびに組成物を提供し、そのようなすべてのバリエーションは、実施例（例えば、さまざまな表中）に示されるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載の任意のポリペプチドについて具体的に開示されると見なされるべきである。
【０１６３】
一部の実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質産生のための選択された宿主細胞による利用のために最適化される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、典型的には、細菌中での発現のために使用される。その結果、操作された酵素ポリペプチドをコードするコドン最適化されたポリヌクレオチドは、全長コード領域において約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％よりも多くのコドン位置に好ましいコドンを含有する。
【０１６４】
一部の実施形態では、酵素ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される性質を有する酵素活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここで、ポリペプチドは、配列番号２、４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０から選択される参照配列と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、または任意のバリアント（例えば、実施例に提供されるバリアント）のアミノ酸配列、および参照ポリヌクレオチド（複数可）もしくは実施例に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数の残基の相違（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのアミノ酸残基の位置）を含む。一部の実施形態では、参照ポリペプチド配列は、配列番号２、４、８、１０６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０から選択される。
【０１６５】
一部の実施形態では、フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリヌクレオチドは、本明細書に開示される性質を有するフェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性を有する操作されたポリペプチドをコードし、ここで、ポリペプチドは、配列番号４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０から選択される参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するアミノ酸配列、または任意のバリアント（例えば、実施例に提供されるバリアント）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１４０の参照ポリヌクレオチドもしくは実施例に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数の相違（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのアミノ酸残基の位置）を含む。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１４０から選択される。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントは、配列番号４、８、１０６、２５２、４４６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントは、実施例（例えば、表４．１、５．１、６．１、７．１、８．１、９．１、１０．１、１１．１、１２．１、１３．１、１４．１、１５．１、１８．１および／または１９．１）に提供される置換（複数可）または置換セット（複数可）を含む。
【０１６６】
本発明は、本明細書に提供される操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９から選択される参照配列と少なくとも８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれよりも高い同一性を有するヌクレオチド配列、または任意のバリアント（例えば、実施例に提供されるバリアント）のアミノ酸配列、ならびに配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９の参照ポリヌクレオチドもしくは実施例に開示される任意のバリアントのアミノ酸配列と比較して、１つまたは複数の残基の相違（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０またはそれよりも多くのアミノ酸残基の位置）を含む。一部の実施形態では、参照配列は、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９から選択される。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９から選択される参照ポリヌクレオチド配列、もしくはその相補体、または本明細書に提供されるバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする能力を有する。一部の実施形態では、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする能力を有するポリヌクレオチドは、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９と比較して、１つまたは複数の残基の相違を有するアミノ酸配列を含むフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードする。一部の実施形態では、操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントは、配列番号１、３、７、１０５、２５１、４４５、４８１、５１５、６１７、７１３、８２９、８９３、９８７および／または１１３９に示されるポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【０１６７】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書に提供される任意のポリヌクレオチド配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列、もしくはその相補体、または本明細書に提供されるバリアント酵素ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列と、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする能力を有する。一部の実施形態では、高ストリンジェント条件下でハイブリダイズする能力を有するポリヌクレオチドは、参照配列と比較して、１つまたは複数の残基の相違を有するアミノ酸配列を含む酵素ポリペプチドをコードする。
【０１６８】
一部の実施形態では、本明細書における操作された酵素ポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、酵素ポリペプチドの発現を容易にするために種々の方法で処置される。一部の実施形態では、酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の制御配列が酵素ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために存在する発現ベクターを含む。単離されたポリヌクレオチドのベクターへの挿入前の処置は、利用される発現ベクターに応じて、望ましい場合もあり、必要な場合もある。組換えＤＮＡ法を利用するポリヌクレオチドおよび核酸配列を改変するための技法は、当技術分野において周知である。一部の実施形態では、制御配列としては、中でも、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターが挙げられる。一部の実施形態では、適切なプロモーターは、宿主細胞の選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞のためには、本開示の核酸構築物の転写を指示するために適切なプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、および原核生物のベータ−ラクタマーゼ遺伝子（例えば、Villa-Kamaroff  et  al.,  Proc.  Natl  Acad.  Sci.  USA  75:  3727-3731  [1978]を参照のこと）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、DeBoer  et  al.,  Proc.  Natl  Acad.  Sci.  USA  80:  21-25  [1983]を参照のこと）から得られるプロモーターが挙げられる。糸状菌宿主細胞のための例示的なプロモーターとしては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  タカアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ（例えば、国際公開第９６／００７８７号を参照のこと）の遺伝子から得られるプロモーター、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子由来のプロモーターのハイブリッド）、ならびにそれらの変異体、短縮型、およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る（can  be  from  the  genes  can  be  from  the  genes）。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、当技術分野において公知である（例えば、Romanos  et  al.,  Yeast  8:423-488  [1992]を参照のこと）。
【０１６９】
一部の実施形態では、制御配列は、適切な転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終結するために宿主細胞によって認識される配列）でもある。一部の実施形態では、ターミネーター配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞において機能する任意の適切なターミネーターが、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  タカアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼおよびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅチトクロムＣ（ＣＹＣ１）およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、当技術分野において公知である（例えば、Romanos  et  al.、上記を参照のこと）。
【０１７０】
一部の実施形態では、制御配列は、適切なリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳のために重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域）でもある。一部の実施形態では、リーダー配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結される。選択される宿主細胞において機能する任意の適切なリーダー配列が、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なリーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  タカアミラーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための適切なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ  ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１７１】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結され、転写されると、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列）でもある。選択される宿主細胞において機能する任意の適切なポリアデニル化配列が、本発明において使用される。糸状菌宿主細胞のための例示的なポリアデニル化配列としては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  タカアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼの遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞のために有用なポリアデニル化配列は公知である（例えば、Guo  and  Sherman,  Mol.  Cell.  Bio.,  15:5983-5990  [1995]を参照のこと）。
【０１７２】
一部の実施形態では、制御配列は、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向付けるコード領域）を含む。一部の実施形態では、核酸配列のコード配列の５’末端は、本質的に、翻訳リーディングフレームにおいて、分泌されたポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと天然に連結されたシグナルペプチドコード領域を含有する。あるいは、一部の実施形態では、コード配列の５’末端は、コード配列に対して外来であるシグナルペプチドコード領域を含有する。発現されたポリペプチドを選択される宿主細胞の分泌経路に方向付ける任意の適切なシグナルペプチドコード領域が、操作されたポリペプチド（複数可）の発現のために使用される。細菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域は、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣｌＢ  １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子から得られる領域を含む、シグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野において公知である（例えば、Simonen  and  Palva,  Microbiol.  Rev.,  57:109-137  [1993]を参照のこと）。一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞のための有効なシグナルペプチドコード領域としては、限定されるものではないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  タカアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼおよびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドとしては、限定されるものではないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子由来のシグナルペプチドが挙げられる。
【０１７３】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもある。得られたポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「酵素原」と称される。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって、成熟活性ポリペプチドに変換することができる。プロペプチドコード領域としては、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ−因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテアーゼおよびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼ（例えば、国際公開第９５／３３８３６号を参照のこと）の遺伝子を含む、任意の適切な供給源から得られ得る。シグナルペプチドおよびプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【０１７４】
一部の実施形態では、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の成長に関連して、ポリペプチドの発現の調節を容易にする。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学的もしくは物理的刺激に応答してオンまたはオフされる遺伝子の発現を引き起こす系である。原核宿主細胞では、適切な調節配列としては、限定されるものではないが、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレーター系が挙げられる。酵母宿主細胞では、適切な調節系としては、限定されるものではないが、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状菌では、適切な調節配列としては、限定されるものではないが、タカアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーターおよびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０１７５】
別の態様では、本発明は、操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにそれらが導入される宿主の種類に応じて、プロモーターおよびターミネーター、複製開始点などのような１つまたは複数の発現調節領域を含む、組換え発現ベクターを対象とする。一部の実施形態では、本明細書に記載のさまざまな核酸および制御配列を一緒に結合して、そのような部位で酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするために１つまたは複数の好都合な制限部位を含む組換え発現ベクターを生成する。あるいは、一部の実施形態では、本発明の核酸配列は、核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を、発現のための適切なベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターの作出を含む一部の実施形態では、コード配列は、コード配列が発現のための適切な制御配列に作動可能に連結されるように、ベクターに配置される。
【０１７６】
組換え発現ベクターは、組換えＤＮＡ手順に好都合に付され、酵素ポリヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる、任意の適切なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターが導入される宿主細胞との適合性に依存する。ベクターは、線形または閉環状のプラスミドであってもよい。
【０１７７】
一部の実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体または人工染色体などの、その複製が染色体の複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター）である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有していてもよい。一部の代替の実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されると、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体（複数可）と一緒に複製されるベクターである。さらにまた、一部の実施形態では、宿主細胞のゲノムに導入される総ＤＮＡを一緒に含有する、単一のベクターもしくはプラスミド、または２つもしくはそれよりも多くのベクターもしくはプラスミド、および／あるいはトランスポゾンが利用される。
【０１７８】
一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする１つまたは複数の選択マーカーを含有する。「選択マーカー」は、その生成物が、殺生物剤もしくはウイルスに対する耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である。細菌の選択マーカーの例としては、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞のための適切なマーカーとしては、限定されるものではないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。糸状菌宿主細胞における使用のための選択マーカーとしては、限定されるものではないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓ由来）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅ由来）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにそれらの同等物が挙げられる。
【０１７９】
別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの操作された酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチド（複数可）が宿主細胞において操作された酵素（複数可）（engineered  enzyme  enzyme(s)）の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるポリペプチドの発現における使用のために適切な宿主細胞は、当技術分野において周知であり、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞などの細菌細胞；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））などの真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。例示的な宿主細胞としては、さまざまなＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）も挙げられる。細菌の選択マーカーの例としては、限定されるものではないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ由来のｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールおよびもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。
【０１８０】
一部の実施形態では、本発明の発現ベクターは、ベクターの宿主細胞のゲノムへの組込み、またはゲノムとは無関係の細胞におけるベクターの自己複製を可能にするエレメント（複数可）を含有する。宿主細胞ゲノムへの統合を含む一部の実施形態では、ベクターは、ポリペプチドをコードする核酸配列、または相同もしくは非相同組換えによるベクターのゲノムへの組込みのためのベクターの任意の他のエレメントに依拠する。
【０１８１】
一部の代替の実施形態では、発現ベクターは、宿主細胞のゲノムへの相同組換えによる組込みを指示するための追加の核酸配列を含有する。追加の核酸配列は、ベクターが、染色体（複数可）の正確な場所（複数可）で宿主細胞のゲノムに組み込まれることを可能にする。正確な場所での組込みの可能性を増加させるために、組込みエレメントは、好ましくは、相同組換えの確率を増強するために対応する標的配列と高度に相同である、１００〜１０，０００塩基対、好ましくは、４００〜１０，０００塩基対、最も好ましくは、８００〜１０，０００塩基対などの十分な数のヌクレオチドを含有する。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列であり得る。さらにまた、組込みエレメントは、非コード核酸配列またはコード核酸配列であり得る。他方では、ベクターは、非相同組換えによって宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【０１８２】
自己複製のために、ベクターは、ベクターが問題の宿主細胞において自己複製することを可能にする複製開始点をさらに含んでいてもよい。細菌の複製開始点の例は、Ｐ１５Ａ  ｏｒｉもしくはプラスミドｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１９、ｐＡＣＹＣｌ７７（このプラスミドはＰ１５Ａ  ｏｒｉを有する）の複製開始点、またはＥ．ｃｏｌｉにおける複製を可能にするｐＡＣＹＣ１８４、およびＢａｃｉｌｌｕｓにおける複製を可能にするｐＵＢ１１０、ｐＥ１９４もしくはｐＴＡ１０６０である。酵母宿主細胞における使用のための複製開始点の例は、２ミクロンの複製開始点、ＡＲＳ１、ＡＲＳ４、ＡＲＳ１およびＣＥＮ３の組合せ、ならびにＡＲＳ４およびＣＥＮ６の組合せである。複製開始点は、宿主細胞において温度感受性で機能するようになる変異を有するものであってもよい（例えば、Ehrlich,  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  USA  75:1433  [1978]を参照のこと）。
【０１８３】
一部の実施形態では、本発明の核酸配列の２つ以上のコピーは、遺伝子産物の産生を増加させるために、宿主細胞に挿入される。選択マーカー遺伝子の増幅されたコピー、およびそれにより、核酸配列の追加のコピーを含有する細胞を、細胞を適切な選択剤の存在下で培養することによって選択することができる場合、核酸配列のコピー数の増加は、配列の少なくとも１つの追加のコピーを宿主細胞のゲノム中に組み込むことによって、または、増幅可能な選択マーカー遺伝子を核酸配列と共に含めることによって得ることができる。
【０１８４】
本発明における使用のための多くの発現ベクターが市販されている。適切な市販の発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ｐ３ｘＦＬＡＧＴＭ（商標）発現ベクター（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）が挙げられ、これは、ＣＭＶプロモーター、および哺乳動物宿主細胞における発現のためのｈＧＨポリアデニル化部位、およびｐＢＲ３２２複製開始点、およびＥ．ｃｏｌｉにおける増幅のためのアンピシリン耐性マーカーを含む。他の適切な発現ベクターとしては、限定されるものではないが、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ  ＳＫ（−）およびｐＢＫ−ＣＭＶ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、ならびにｐＢＲ３２２（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＵＣ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）またはｐＰｏｌｙ（例えば、Lathe  et  al.,  Gene  57:193-201  [1987]を参照のこと）に由来するプラスミドが挙げられる。
【０１８５】
したがって、一部の実施形態では、少なくとも１つのバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼをコードする配列を含むベクターは、ベクターの増殖およびバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（複数可）の発現を可能にするために、宿主細胞に形質転換される。一部の実施形態では、バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼを翻訳後修飾して、シグナルペプチドを除去し、一部の場合では、分泌後に切断してもよい。一部の実施形態では、上記に記載の形質転換された宿主細胞は、バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（複数可）の発現を可能にする条件下で、適切な栄養培地中で培養される。限定されるものではないが、適切な補充物を含有する最小培地または複合培地を含む、宿主細胞を培養するために有用な任意の適切な培地が本発明において使用される。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＨＴＰ培地中で成長させる。適切な培地は、さまざまな商業的供給業者から入手可能であるか、または公開されたレシピ（例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関のカタログ中）に従って調製されてもよい。
【０１８６】
別の態様では、本発明は、本明細書に提供される改善されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む宿主細胞を提供し、ポリヌクレオチドは、宿主細胞においてフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素の発現のための１つまたは複数の制御配列に作動可能に連結されている。本発明の発現ベクターによってコードされるフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドの発現における使用のための宿主細胞は、当技術分野において周知であり、限定されるものではないが、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｋｅｆｉｒ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞などの細菌細胞；酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣアクセッション番号２０１１７８））などの真菌細胞；Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞などの動物細胞；ならびに植物細胞が挙げられる。上記に記載の宿主細胞のための適切な培養培地および成長条件は、当技術分野において周知である。
【０１８７】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼの発現のためのポリヌクレオチドは、当技術分野において公知のさまざまな方法によって細胞に導入され得る。技法としては、中でも、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。ポリヌクレオチドを細胞に導入するためのさまざまな方法は、当業者に公知である。
【０１８８】
一部の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞である。適切な真核生物宿主細胞としては、限定されるものではないが、真菌細胞、藻類細胞、昆虫細胞および植物細胞が挙げられる。適切な真菌宿主細胞としては、限定されるものではないが、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、Ｆｕｎｇｉ  ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉが挙げられる。一部の実施形態では、真菌宿主細胞は、酵母細胞および糸状菌細胞である。本発明の糸状菌宿主細胞は、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門およびＯｏｍｙｃｏｔａ亜門のすべての糸状形態を含む。糸状菌は、キチン、セルロースおよび他の複合多糖で構成される細胞壁を有する栄養菌糸によって特徴付けられる。本発明の糸状菌宿主細胞は、酵母とは形態学的に区別される。
【０１８９】
本発明の一部の実施形態では、糸状菌宿主細胞は、限定されるものではないが、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍｅｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍおよび／もしくはＶｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、ならびに／またはそれらの完全世代もしくは無性世代、ならびに異名、バシオニムもしくは分類学的等価物を含む、任意の適切な属および種のものである。
【０１９０】
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、限定されるものではないが、Ｃａｎｄｉｄａ、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｉｃｈｉａ、ＫｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ種の細胞を含む、酵母細胞である。本発明の一部の実施形態では、酵母細胞は、Ｈａｎｓｅｎｕｌａ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃａｒｌｓｂｅｒｇｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｄｉａｓｔａｔｉｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｒｂｅｎｓｉｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｌｕｙｖｅｒｉ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｆｉｎｌａｎｄｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｒｅｈａｌｏｐｈｉｌａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｋｏｄａｍａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｍｂｒａｎａｅｆａｃｉｅｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｏｐｕｎｔｉａｅ、Ｐｉｃｈｉａ  ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓａｌｉｃｔａｒｉａ、Ｐｉｃｈｉａ  ｑｕｅｒｃｕｕｍ、Ｐｉｃｈｉａ  ｐｉｊｐｅｒｉ、Ｐｉｃｈｉａ  ｓｔｉｐｉｔｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ  ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａ、Ｐｉｃｈｉａ  ａｎｇｕｓｔａ、Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ  ｌａｃｔｉｓ、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓまたはＹａｒｒｏｗｉａ  ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａである。
【０１９１】
本発明の一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ（例えば、Ｃ．ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）およびＰｈｏｒｍｉｄｉｕｍ（Ｐ．ｓｐ．ＡＴＣＣ２９４０９）などの藻類細胞である。
【０１９２】
一部の他の実施形態では、宿主細胞は、原核細胞である。適切な原核細胞としては、限定されるものではないが、グラム陽性、グラム陰性およびグラム不定性の細菌細胞が挙げられる。限定されるものではないが、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ａｎａｂａｅｎａ、Ａｎａｃｙｓｔｉｓ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｃｉｄｏｔｈｅｒｍｕｓ、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｃａｍｐｅｓｔｒｉｓ、Ｃａｍｐｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｃｈｒｏｍａｔｉｕｍ、Ｃｏｐｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆａｅｃａｌｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｉｌｙｏｂａｃｔｅｒ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｍｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｅｔｈｙｌｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｐｒｏｃｈｌｏｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｈｏｄｏｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ、Ｒｈｏｄｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｃｅｎｅｄｅｓｍｕｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｙｎｅｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓｅｒｒａｔｉａ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｈｉｇｅｌｌａ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｔｒｏｐｈｅｒｙｍａ、Ｔｕｌａｒｅｎｓｉｓ、Ｔｅｍｅｃｕｌａ、Ｔｈｅｒｍｏｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ、Ｔｈｅｒｍｏｃｏｃｃｕｓ、Ｕｒｅａｐｌａｓｍａ、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ、Ｘｙｌｅｌｌａ、ＹｅｒｓｉｎｉａおよびＺｙｍｏｍｏｎａｓを含む、任意の適切な細菌生物が本発明において使用される。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ、Ａｚｏｂａｃｔｅｒ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｂｕｃｈｎｅｒａ、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ、Ｅｒｗｉｎｉａ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｐａｎｔｏｅａ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓまたはＺｙｍｏｍｏｎａｓの種である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、ヒトに対して非病原性である。一部の実施形態では、細菌宿主株は、工業用株である。多数の細菌工業用株が公知であり、本発明において適切である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ａ．ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ、Ａ．ｒｈｉｚｏｇｅｎｅｓおよびＡ．ｒｕｂｉ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ種（例えば、Ａ．ａｕｒｅｓｃｅｎｓ、Ａ．ｃｉｔｒｅｕｓ、Ａ．ｇｌｏｂｉｆｏｒｍｉｓ、Ａ．ｈｙｄｒｏｃａｒｂｏｇｌｕｔａｍｉｃｕｓ、Ａ．ｍｙｓｏｒｅｎｓ、Ａ．ｎｉｃｏｔｉａｎａｅ、Ａ．ｐａｒａｆｆｉｎｅｕｓ、Ａ．ｐｒｏｔｏｐｈｏｎｎｉａｅ、Ａ．ｒｏｓｅｏｐａｒｑｆｆｉｎｕｓ、Ａ．ｓｕｌｆｕｒｅｕｓおよびＡ．ｕｒｅａｆａｃｉｅｎｓ）である。本発明の一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ種（例えば、Ｂ．ｔｈｕｒｉｎｇｅｎｓｉｓ、Ｂ．ａｎｔｈｒａｃｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｅｎｔｕｓ、Ｂ．ｃｉｒｃｕｌａｎｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌａｕｔｕｓ、Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ、Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ、Ｂ．ｆｉｒｍｕｓ、Ｂ．ａｌｋａｏｐｈｉｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｂ．ｈａｌｏｄｕｒａｎｓおよびＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、限定されるものではないが、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｐｕｍｉｌｕｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｃｌａｕｓｉｉ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓまたはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓを含む、工業用Ｂａｃｉｌｌｕｓ株である。一部の実施形態では、Ｂａｃｉｌｌｕｓ宿主細胞は、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ、Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ、Ｂ．ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ、Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓおよび／またはＢ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓである。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｔｅｔａｎｉ  Ｅ８８、Ｃ．ｌｉｔｕｓｅｂｕｒｅｎｓｅ、Ｃ．ｓａｃｃｈａｒｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ、Ｃ．ｐｅｒｆｒｉｎｇｅｎｓおよびＣ．ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉｉ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ種（例えば、Ｃ．ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍおよびＣ．ａｃｅｔｏａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ種（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）である。一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｅｒｗｉｎｉａ種（例えば、Ｅ．ｕｒｅｄｏｖｏｒａ、Ｅ．ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ、Ｅ．ａｎａｎａｓ、Ｅ．ｈｅｒｂｉｃｏｌａ、Ｅ．ｐｕｎｃｔａｔａおよびＥ．ｔｅｒｒｅｕｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐａｎｔｏｅａ種（例えば、Ｐ．ｃｉｔｒｅａおよびＰ．ａｇｇｌｏｍｅｒａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｐ．ｐｕｔｉｄａ、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｐ．ｍｅｖａｌｏｎｉｉおよびＰ．ｓｐ．Ｄ−０ｌ  １０）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ種（例えば、Ｓ．ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｅｓ、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓおよびＳ．ｕｂｅｒｉｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ種（例えば、Ｓ．ａｍｂｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｃｈｒｏｍｏｇｅｎｅｓ、Ｓ．ａｖｅｒｍｉｔｉｌｉｓ、Ｓ．ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ、Ｓ．ａｕｒｅｏｆａｃｉｅｎｓ、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ、Ｓ．ｆｕｎｇｉｃｉｄｉｃｕｓ、Ｓ．ｇｒｉｓｅｕｓおよびＳ．ｌｉｖｉｄａｎｓ）である。一部の実施形態では、細菌宿主細胞は、Ｚｙｍｏｍｏｎａｓ種（例えば、Ｚ．ｍｏｂｉｌｉｓおよびＺ．ｌｉｐｏｌｙｔｉｃａ）である。
【０１９３】
本発明において使用される多くの原核生物株および真核生物株は、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）、ドイツ微生物培養細胞系統保存機関（ＤＳＭ）、オランダ微生物株保存センター（ＣＢＳ）、および農業研究局特許培養株保存機関、北部地域研究センター（ＮＲＲＬ）などの多くの菌株保存機関から、公的に容易に入手可能である。
【０１９４】
一部の実施形態では、宿主細胞は、タンパク質分泌、タンパク質安定性ならびに／またはタンパク質の発現および／もしくは分泌のために望ましい他の性質を改善する特性を有するように遺伝子改変される。遺伝子改変は、遺伝子操作技法および／または古典的な微生物学的技法（例えば、化学的またはＵＶ変異誘発、およびその後の選択）によって達成することができる。実際に、一部の実施形態では、組換え改変技法および古典的な選択技法の組合せを使用して、宿主細胞を生成させる。組換え技術を使用して、核酸分子を、宿主細胞内および／または培養培地中、フェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアント（複数可）の収量の増加をもたらす様式で、導入、欠失、阻害または改変することができる。例えば、Ａｌｐ１機能のノックアウトは、プロテアーゼが欠損した細胞をもたらし、ｐｙｒ５機能のノックアウトは、ピリミジン欠損表現型を有する細胞をもたらす。１つの遺伝子工学アプローチでは、相同組換えを使用して、コードされるタンパク質の発現を抑制するためにｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子を特異的に標的化することによって、標的化遺伝子改変を誘導する。代替のアプローチでは、ｓｉＲＮＡ、アンチセンスおよび／またはリボザイム技術は、遺伝子発現の阻害において使用される。限定されるものではないが、タンパク質をコードする遺伝子の全部または一部の欠失、および遺伝子産物の発現または活性を破壊する部位特異的変異誘発を含む、細胞におけるタンパク質の発現を低減するための種々の方法が当技術分野において公知である  （例えば、Chaveroche  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.,  28:22  e97  [2000]；Cho  et  al.,  Molec.  Plant  Microbe  Interact.,  19:7-15  [2006]；Maruyama  and  Kitamoto,  Biotechnol  Lett.,  30:1811-1817  [2008]；Takahashi  et  al.,  Mol.  Gen.  Genom.,  272:  344-352  [2004]；およびYou  et  al.,  Arch.  Micriobiol.,191:615-622  [2009]を参照のこと、これらのすべては参照によって本明細書に組み込まれる）。ランダム変異誘発、続く所望の変異についてのスクリーニングも使用される（例えば、Combier  et  al.,  FEMS  Microbiol.  Lett.,  220:141-8  [2003]；およびFiron  et  al.,  Eukary.  Cell  2:247-55  [2003]を参照のこと、これらは両方とも参照によって組み込まれる）。
【０１９５】
宿主細胞へのベクターまたはＤＮＡ構築物の導入は、限定されるものではないが、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、ＰＥＧ媒介形質転換、電気穿孔、または当技術分野において公知の他の一般的な技法を含む、当技術分野において公知の任意の適切な方法を使用して達成することができる。一部の実施形態では、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ発現ベクターｐＣＫ１００９００ｉ（米国特許第９，７１４，４３７号を参照のこと、これはここで、参照によって本明細書に組み込まれる）が使用される。
【０１９６】
一部の実施形態では、本発明の操作された宿主細胞（すなわち、「組換え宿主細胞」）は、プロモーターを活性化するため、形質転換体を選択するため、またはフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリヌクレオチドを増幅するために、必要により、改変された従来の栄養培地中で培養される。温度、ｐＨなどのような培養条件は、発現のために選択された宿主細胞で以前使用したものであり、当業者に周知である。述べたように、多くの標準的な参照文献およびテキストは、細菌、植物、動物（特に、哺乳動物）および古細菌が起源の細胞を含む、多くの細胞の培養および生成のために利用可能である。
【０１９７】
一部の実施形態では、本発明のバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを発現する細胞は、バッチまたは連続発酵条件下で成長させる。古典的な「バッチ発酵」は、閉鎖系であり、ここで、培地の組成は、発酵の開始時に設定され、発酵の間に人為的な変更に付されない。バッチ系のバリエーションは、「フェドバッチ発酵」であり、これも本発明において使用される。このバリエーションでは、基質を、発酵が進行するにつれて段階的に増量しながら添加する。フェドバッチ系は、異化代謝産物抑制が細胞の代謝を阻害する可能性がある場合、および培地中の基質の量を制限することが望ましい場合、有用である。バッチおよびフェドバッチ発酵は、一般的であり、当技術分野において周知である。「連続発酵」は、開放系であり、ここで、規定の発酵培地を、バイオリアクターに連続的に添加し、等量の条件培地を処理のために同時に除去する。連続発酵は、一般に、細胞が主に対数増殖期にある一定の高密度で培養を維持する。連続発酵系は、定常状態の成長条件を維持することを目指す。連続発酵プロセスのために栄養分および成長因子を調整するための方法、ならびに生成物形成の速度を最大化するための技法は、工業微生物学の技術分野において周知である。
【０１９８】
本発明の一部の実施形態では、無細胞転写／翻訳系は、バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（複数可）の産生において使用される。いくつかの系が市販されており、方法は、当業者に周知である。
【０１９９】
本発明は、バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドまたは生物学的に活性なその断片を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、配列番号２、４、８、１０６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および／または１１４０と少なくとも約７０％（または少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％）の配列同一性を含むアミノ酸配列をコードし、本明細書に提供される少なくとも１つの変異を含む、ポリヌクレオチドで形質転換された宿主細胞を提供すること；培養培地中で形質転換された宿主細胞を、該宿主細胞がそのコードされたバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを発現する条件下で培養すること；ならびに必要に応じて、発現したバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを回収もしくは単離すること、および／または、発現したバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを含有する培養培地を回収もしくは単離することを含む。一部の実施形態では、方法は、必要に応じて、コードされるフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドが発現した後に形質転換された宿主細胞を溶解すること、ならびに必要に応じて、発現したバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを細胞溶解物から回収および／または単離することをさらに提供する。本発明は、バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドで形質転換された宿主細胞を、バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドの産生のために適切な条件下で培養すること、およびバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを回収することを含む、バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを作製する方法をさらに提供する。典型的には、フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドの回収または単離は、宿主細胞の培養培地、宿主細胞、またはその両方からであり、本明細書に記載されるものを含む当技術分野において周知のタンパク質回収技法を使用する。一部の実施形態では、宿主細胞を、遠心分離によって採取し、物理的または化学的手段によって破壊し、得られた粗抽出物をさらなる精製のために保持する。タンパク質の発現において用いられる微生物細胞は、限定されるものではないが、凍結解凍サイクル、超音波処理、機械的破壊および／または細胞溶解剤の使用、ならびに当業者に周知の多くの他の適切な方法を含む任意の好都合な方法によって、破壊することができる。
【０２００】
宿主細胞において発現した操作されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素は、中でも、リゾチーム処理、超音波処理、濾過、塩析、超遠心分離およびクロマトグラフィーを含むタンパク質精製のための当術分野において公知の任意の１つまたは複数の技法を使用して、細胞および／または培養培地から回収することができる。Ｅ．ｃｏｌｉなどの細菌由来のタンパク質の溶解および高効率の抽出のために適切な溶液は、商品名ＣｅｌＬｙｔｉｃ  Ｂ（商標）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）で市販されている。したがって、一部の実施形態では、得られたポリペプチドを、回収／単離し、必要に応じて当技術分野において公知の多くの方法のいずれかによって精製する。例えば、一部の実施形態では、ポリペプチドを、限定されるものではないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、クロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティー、疎水性相互作用、クロマト分画およびサイズ排除）、または沈殿を含む従来の手順によって、栄養培地から単離する。一部の実施形態では、タンパク質の再フォールディングステップを、所望により、成熟タンパク質の立体配置の完成において使用する。加えて、一部の実施形態では、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を最終精製ステップにおいて用いる。例えば、一部の実施形態では、当技術分野において公知の方法を、本発明において使用する（例えば、Parry  et  al.,  Biochem.  J.,  353:117  [2001]；およびHong  et  al.,  Appl.  Microbiol.  Biotechnol.,  73:1331  [2007]を参照のこと、これらは両方とも参照によって本明細書に組み込まれる）。実際に、当技術分野において公知の任意の適切な精製方法を、本発明において使用する。
【０２０１】
フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドの単離のためのクロマトグラフィー技法としては、限定されるものではないが、逆相クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーが挙げられる。特定の酵素を精製するための条件は、正味電荷、疎水性、親水性、分子量、分子形状などのような要因に部分的に依存し、当業者に公知である。
【０２０２】
一部の実施形態では、アフィニティー技法が、改善されたフェニルアラニンアンモニアリアーゼ酵素の単離において使用される。アフィニティークロマトグラフィー精製のために、フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドに特異的に結合する任意の抗体を使用してもよい。抗体の産生のために、限定されるものではないが、ウサギ、マウス、ラットなどを含むさまざまな宿主動物を、フェニルアラニンアンモニアリアーゼによる注射によって免疫してもよい。フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、側鎖官能基、または側鎖官能基に結合させたリンカーによって、ＢＳＡなどの適切な担体に結合させてもよい。限定されるものではないが、フロイント（完全および不完全）、水酸化アルミニウムなどの無機ゲル、リゾレシチンなどの表面活性物質、プルロニック（登録商標）ポリオール、ポリアニオン、ペプチド、油エマルジョン、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、ならびにＢＣＧ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  Ｃａｌｍｅｔｔｅ  Ｇｕｅｒｉｎ）およびＣｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｐａｒｖｕｍなどの潜在的に有用なヒトアジュバントを含むさまざまなアジュバントを、宿主種に応じて、免疫学的応答を増加させるために使用してもよい。
【０２０３】
一部の実施形態では、フェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントを調製し、酵素を発現する細胞の形態で、粗抽出物として、または単離もしくは精製された調製物として使用する。一部の実施形態では、フェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントは、凍結乾燥物として、粉末形態（例えば、アセトン粉末）で調製され、または酵素溶液として調製される。一部の実施形態では、フェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントは、実質的に純粋な調製物の形態である。
【０２０４】
一部の実施形態では、フェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドは、任意の適切な固体基材に付着させる。固体基材としては、限定されるものではないが、固相、表面および／または膜が挙げられる。固体支持体としては、限定されるものではないが、ポリスチレン、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリフルオロエチレン、ポリエチレンオキシおよびポリアクリルアミド、ならびにそれらのコポリマーおよびグラフトなどの有機ポリマーが挙げられる。固体支持体はまた、ガラス、シリカ、制御細孔ガラス（ＣＰＧ）、逆相シリカ、または金もしくは白金などの金属などの無機物であり得る。基材の形状は、ビーズ、球、粒子、顆粒、ゲル、膜または面の形態であり得る。面は、平面、実質的に平面、または非平面であり得る。固体支持体は、多孔性または非多孔性であり得、膨潤特性または非膨潤特性を有し得る。固体支持体は、ウェル、窪みまたは他の容器（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）、容器（ｖｅｓｓｅｌ）、フィーチャまたは場所の形態で形作ることができる。複数の支持体は、試薬のロボット送達のため、または検出方法および／もしくは装置によって対処可能なさまざまな場所で、アレイ上に配置され得る。
【０２０５】
一部の実施形態では、免疫学的方法を使用して、フェニルアラニンアンモニアリアーゼバリアントを精製する。１つのアプローチでは、従来の方法を使用してバリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドに対して（例えば、配列番号２、４、８、１０６、４８２、５１６、６１８、７１４、８３０、８９４、９８８および１１４０のいずれかを含むポリペプチド、ならびに／またはそれらの免疫原性断片に対して）生じさせた抗体を、ビーズ上に固定し、バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼが結合する条件下で、細胞培養培地と混合し、沈殿させる。関連するアプローチでは、免疫クロマトグラフィーが使用される。
【０２０６】
一部の実施形態では、バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼは、非酵素部分を含む融合タンパク質として発現される。一部の実施形態では、バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼ配列は、精製を容易にするドメインと融合されている。本明細書で使用される場合、「精製を容易にするドメイン」という用語は、それが融合しているポリペプチドの精製を媒介するドメインを指す。適切な精製ドメインとしては、限定されるものではないが、金属キレート化ペプチド、固定された金属上での精製を可能にするヒスチジン−トリプトファンモジュール、グルタチオンに結合する配列（例えば、ＧＳＴ）、赤血球凝集素（ＨＡ）タグ（インフルエンザ赤血球凝集素タンパク質に由来するエピトープに対応する；例えば、Wilson  et  al.,  Cell  37:767  [1984]を参照のこと）、マルトース結合性タンパク質配列、ＦＬＡＧＳ伸長／アフィニティー精製システムにおいて利用されるＦＬＡＧエピトープ（例えば、Ｉｍｍｕｎｅｘ  Ｃｏｒｐから入手可能なシステム）などが挙げられる。本明細書に記載の組成物および方法における使用について意図される１つの発現ベクターを、エンテロキナーゼ切断部位によって分離されるポリヒスチジン領域と融合した本発明のポリペプチドを含む融合タンパク質の発現のために提供する。ヒスチジン残基は、ＩＭＩＡＣ（固定された金属イオンアフィニティークロマトグラフィー；例えば、Porath  et  al.,  Prot.  Exp.  Purif.,  3:263-281  [1992]を参照のこと）における精製を容易にするが、エンテロキナーゼ切断部位は、バリアントフェニルアラニンアンモニアリアーゼポリペプチドを融合タンパク質から分離するための手段を提供する。ｐＧＥＸベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）はまた、外来ポリペプチドをグルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）との融合タンパク質として発現させるために使用され得る。一般に、そのような融合タンパク質は、可溶性であり、溶解細胞から、リガンド−アガロースビーズ（例えば、ＧＳＴ融合物の場合では、グルタチオン−アガロース）への吸着、続く遊離リガンドの存在下での溶出によって、容易に精製することができる。
【０２０７】
したがって、別の態様では、本発明は、操作された酵素ポリペプチドを産生させる方法であって、方法が、ポリペプチドの発現のために適切な条件下で、操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現する能力を有する宿主細胞を培養することを含む、方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載の酵素ポリペプチドを単離および／または精製するステップをさらに含む。
【０２０８】
宿主細胞のための適切な培養培地および成長条件は、当技術分野において周知である。酵素ポリペプチドの発現のためにポリヌクレオチドを細胞に導入するための任意の適切な方法を本発明において使用することが企図される。適切な技法としては、限定されるものではないが、電気穿孔、微粒子銃、リポソーム媒介トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクションおよびプロトプラスト融合が挙げられる。
【０２０９】
本発明のさまざまな特徴および実施形態を以下の代表的な実施例において説明し、これらは例示的なものであって、限定するものではないことを意図する。
【実施例】
【０２１０】
実験
実験および達成された結果を含む以下の実施例は、例示の目的のためにのみ提供され、本発明を限定するものとして解釈されるべきではない。実際に、下記に記載の多くの試薬および機器についてさまざまな適切な供給源がある。本発明が、任意の試薬または機器の品目について任意の特定の供給源に限定されることを意図しない。
【０２１１】
下記の実験の開示では、以下の略記が適用される：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμΜ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時間）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ＡＵＣ（曲線下面積）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（平方インチあたりポンド）；℃（摂氏温度）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＶ（変動係数）；ＣＡＭおよびｃａｍ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（硫酸ポリミキシンＢ）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−ｌ−チオガラクトピラノシド）；ＬＢ（溶原ブロス）；ＴＢ（テリフィックブロス）；ＳＦＰ（振とうフラスコ粉末）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ｎｔ（ヌクレオチド；ポリヌクレオチド）；ａａ（アミノ酸；ポリペプチド）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（一般に使用される実験室Ｅ．ｃｏｌｉ株、ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能）；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＨＰＬＣ（高速液体クロマトグラフィー）；ＨＰＬＣ−ＵＶ（ＨＰＬＣ−紫外可視検出器）；１Ｈ  ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴分光法）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する倍数改善）；ＳｉｇｍａおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一員、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ａｍｒｅｓｃｏ（Ａｍｒｅｓｃｏ，ＬＬＣ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）；Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ，Ｌｔｄ．、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）；Ｖａｒｉａｎ（Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；Ｉｎｆｏｒｓ（Ｉｎｆｏｒｓ  ＵＳＡ  Ｉｎｃ．、Ａｎｎａｐｏｌｉｓ  Ｊｕｎｃｔｉｏｎ、ＭＤ）；ならびにＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌａｎｄ、ＭＩ）。
【０２１２】
（実施例１）
ＨＴＰ  ＰＡＬを含有する湿細胞ペレットの調製
Ｅ．ｃｏｌｉにおける発現のために最適化されたＡｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓのフェニルアラニンアンモニアリアーゼ（ＡｖＰＡＬ）（配列番号２）をコードする合成遺伝子（配列番号１）を、ｐＣＫ１１０９００ベクターにクローニングした。より安定で、チロシンアンモニアリアーゼ活性を有する野生型ＡｖＰＡＬ（配列番号２）の進化バリアントを、親遺伝子（配列番号４）として選択した。Ｗ３１１０  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を、親ＰＡＬをコードする遺伝子（配列番号３）を含有するそれぞれのプラスミドで形質転換し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコール（ＣＡＭ）を含有するＬＢ寒天プレートに蒔き、３７℃で終夜成長させた。モノクローナルコロニーを採集し、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールを含有する１８０μｌのＬＢに接種し、９６ウェルのシャローウェルマイクロタイタープレートに入れた。プレートをＯ２透過性シールでシールし、培養物を、３０℃、２００ｒｐｍおよび８５％湿度で終夜成長させた。次いで、１０μｌのそれぞれの細胞培養物を、３９０μｌのＴＢおよび３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含有する９６ウェルのディープウェルプレートのウェルに移した。ディープウェルプレートを、Ｏ２透過性シールでシールし、０．６〜０．８のＯＤ６００に達するまで、３０℃、２５０ｒｐｍおよび８５％湿度でインキュベートした。次いで、細胞培養物を、イソプロピルチオグリコシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって１ｍＭの最終濃度に誘導し、３０℃、２５０ｒｐｍでの振とうで終夜インキュベートした。次いで、細胞を、４，０００ｒｐｍで１０分間の遠心分離を使用してペレット化した。上清を廃棄し、ペレットを溶解前に−８０℃で凍結させた。
【０２１３】
（実施例２）
ＨＴＰ  ＰＡＬ含有細胞溶解物の調製
実施例１に記載のようにして調製された凍結ペレットを、１００ｍＭのトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５、１ｇ／Ｌのリゾチームおよび０．５ｇ／Ｌを含有する４００μｌの溶解緩衝液を用いて溶解した。溶解混合物を、室温で２時間、振とうした。次いで、プレートを４０００ｒｐｍおよび４℃で１５分間遠心分離した。次いで、上清を、酵素活性を決定するために、澄明な溶解物として生体触媒反応において使用した。
【０２１４】
（実施例３）
振とうフラスコ（ＳＦ）培養物由来の凍結乾燥溶解物の調製
１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含むＬＢ寒天プレートから採集し、３７℃で終夜インキュベートした所望の遺伝子を含有する単一コロニーを、１％のグルコースおよび３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含む６ｍｌのＬＢに移した。培養物を、３０℃、２５０ｒｐｍで１８時間成長させ、約０．０５の最終ＯＤ６００まで、３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含有する２５０ｍｌのＴＢにおよそ１：５０で継代培養した。継代培養物を、０．６〜０．８の間のＯＤ６００まで、３０℃、２５０ｒｐｍでおよそ１９５分間成長させ、１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した。次いで、継代培養物を３０℃、２５０ｒｐｍで２０時間成長させた。継代培養物を４０００ｒｐｍで２０分間遠心分離した。上清を廃棄し、ペレットを、３５ｍｌの２５ｍＭのトリエタノールアミン緩衝液、ｐＨ７．５に再懸濁させた。細胞を、Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｚｅｒ（登録商標）プロセッサーシステム（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）を１８，０００ｐｓｉで使用して溶解させた。溶解物をペレット化し（１０，０００ｒｐｍ×６０分）、上清を凍結し、凍結乾燥して、振とうフラスコ（ＳＦ）酵素粉末を作成した。
【０２１５】
（実施例４）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント
Ａｎａｂａｅｎａ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ由来の野生型ＰＡＬ（配列番号２）のバリアントを、最初の親酵素（配列番号４）として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。
【０２１６】
それぞれ１００μＬの反応を、５０％（ｖ／ｖ）の澄明な細胞溶解物、１０ｍＭの化合物（１）、１Ｍの炭酸アンモニウム、ｐＨおよそ９を含む９６ウェルのシャローウェルマイクロタイタープレートにおいて行った。プレートを、ヒートシールし、３０℃でインキュベートし、Ｉｎｆｏｒｓ  Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）シェーカー中、５００ＲＰＭで終夜撹拌した。プレートを取り出し、１体積（１００μＬ）のメタノールをそれぞれのウェルに添加することによってクエンチし、続いて、混合および遠心分離した。次いで、上清を、検出限界を上回り、分析の線形範囲内になるように、必要により、追加量のメタノールで希釈した。分析を、製造者のプロトコールを使用して、Ａｇｉｌｅｎｔ  ＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ３６５ハイスループット質量分析計において行った。
【０２１７】
配列番号４に対する活性を、以前に記載のＲａｐｉｄＦｉｒｅによって決定されるように、配列番号４のものと比較して、バリアントによって形成された生成物の曲線下面積として計算した。
【表４−１】
2021531749.tif 000008
【表４−２】
2021531749.tif 000009
【０２１８】
（実施例５）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント  
配列番号８を、次のラウンドの進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、実施例４に記載されるようにして行った。配列番号８に対する活性を、実施例４に記載されるようにして計算した。
【表５−１】
2021531749.tif 000010
【表５−２】
2021531749.tif 000011
【表５−３】
2021531749.tif 000012
【０２１９】
（実施例６）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント  
配列番号１０６を、次のラウンドの進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、溶解物を反応プレートに添加する前に２倍希釈し、反応温度を４０℃に上昇させた以外は、実施例４に記載されるようにして行った。配列番号１０６に対する活性を、実施例４に記載されるようにして計算した。
【表６−１】
2021531749.tif 000013
【表６−２】
2021531749.tif 000014
【０２２０】
（実施例７）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント  
配列番号２５２を、次のラウンドの進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、溶解物を反応プレートに添加する前に８倍希釈した以外は、実施例６に記載されるようにして行った。配列番号２５２に対する活性を、実施例４に記載されるようにして計算した。
【表７】
2021531749.tif 000015
【０２２１】
（実施例８）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント
配列番号４４６を、次のラウンドの進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、実施例７に記載されるようにして行った。配列番号４４６に対する活性を、実施例４に記載されるようにして計算した。
【表８−１】
2021531749.tif 000016
【表８−２】
2021531749.tif 000017
【０２２２】
（実施例９）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント
配列番号４８２を、次のラウンドの進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、溶解物を反応に添加する前に４倍希釈し、化合物（１）の濃度を４０ｍＭに高め、２Ｍのカルバミン酸アンモニウムを１Ｍの炭酸アンモニウムに代えて使用した以外は、実施例７に記載されるようにして行った。配列番号４８２に対する活性を、実施例４に記載されるようにして計算した。
【表９−１】
2021531749.tif 000018
【表９−２】
2021531749.tif 000019
【０２２３】
（実施例１０）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント
配列番号５１６を、次のラウンドの進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、溶解物の濃度を５％ｖ：ｖに変更し、反応に添加する前に希釈せず、カルバミン酸アンモニウムの濃度を４Ｍに高めた以外は、実施例９に記載されるようにして行った。配列番号５１６に対する活性を、実施例４に記載されるようにして計算した。
【表１０−１】
2021531749.tif 000020
【表１０−２】
2021531749.tif 000021
【０２２４】
（実施例１１）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント
配列番号６１８を、次のラウンドの進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、溶解物の濃度を１０％ｖ：ｖに変更し、反応に添加する前に４倍希釈し、カルバミン酸アンモニウムの濃度を４．５Ｍに高めた以外は、実施例１０に記載されるようにして行った。配列番号６１８に対する活性を、実施例４に記載されるようにして計算した。
【表１１−１】
2021531749.tif 000022
【表１１−２】
2021531749.tif 000023
【０２２５】
（実施例１２）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント
配列番号７１４を、次のラウンドの進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、溶解物を反応に添加する前に希釈せず、化合物（１）の濃度を８０ｍＭに高め、カルバミン酸アンモニウムの濃度を５Ｍに高めた以外は、実施例１１に記載されるようにして行った。配列番号７１４に対する活性を、実施例４に記載されるようにして計算した。
【表１２−１】
2021531749.tif 000024
【表１２−２】
2021531749.tif 000025
【０２２６】
（実施例１３）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント
配列番号８３０を、親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、カルバミン酸アンモニウムの濃度を４．５Ｍに変更した以外は、実施例１２に記載されるようにして行った。配列番号８３０に対する活性を、実施例４に記載されるようにして計算した。
【表１３−１】
2021531749.tif 000026
【表１３−２】
2021531749.tif 000027
【０２２７】
（実施例１４）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント
配列番号８９４を、親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、溶解物を反応に添加する前に８倍希釈した以外は、実施例１３に記載されるようにして行い、反応物を、実施例１６に記載されるようにしてＨＰＬＣによって分析した。配列番号８９４に対する活性を、配列番号８９４の変換パーセントと比較して、バリアントの変換パーセントとして計算した。
【表１４】
2021531749.tif 000028
【０２２８】
（実施例１５）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント
配列番号９８８を、親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、実施例１４に記載されるようにして行った。配列番号９８８に対する活性を、実施例１４に記載されるようにして計算した。
【表１５】
2021531749.tif 000029
【０２２９】
（実施例１６）
スキーム２における反応を監視するためのＨＰＬＣ分析方法
この実施例は、実施例１４、１５、１８および１９で提供されたデータを収集するために使用した方法を提供する。この実施例において提供される方法は、本発明を使用して産生するバリアントの分析において使用される。しかしながら、他の適切な方法が当業者に公知であるので、本発明が本明細書に記載の方法に限定されることは意図しない。
【表１６】
2021531749.tif 000030
【０２３０】
（実施例１７）
ＰＡＬバリアントのエナンチオ選択性
この実施例は、スキーム２に示される反応のエナンチオ選択性を決定するために使用した方法を提供する。実施例４〜１５に記載のバリアントの一部のみをエナンチオ選択性について評価し、それぞれの場合で、望ましくない（Ｒ）−アミノ酸は、これらの条件下で観察されなかった。この実施例において提供される方法は、本発明を使用して産生するバリアントの分析において使用される。しかしながら、他の適切な方法が当業者に公知であるので、本発明が本明細書に記載の方法に限定されることは意図しない。
【表１７】
2021531749.tif 000031
【０２３１】
（実施例１８）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント
配列番号９８８を、別の次のラウンドの進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、実施例１４に記載されるようにして行った。配列番号９８８に対する活性を、実施例１４に記載されるようにして計算した。
【表１８−１】
2021531749.tif 000032
【表１８−２】
2021531749.tif 000033
【０２３２】
（実施例１９）
化合物２の生成のための改善されたＰＡＬバリアント
配列番号１１４０を、別のラウンドの進化のための親酵素として選択した。操作された遺伝子のライブラリーを、十分に確立された技法（例えば、飽和変異誘発、および以前に特定された有益な変異の組換え）を使用して、生成した。それぞれの遺伝子によってコードされるポリペプチドを、実施例１に記載されるようにして、ＨＴＰ中で産生させ、澄明な溶解物を、実施例２に記載されるようにして、作成した。ＨＴＰスクリーニング反応を、溶解物を反応プレートに添加する前に１６倍希釈した以外は、実施例１４に記載されるようにして行った。配列番号１１４０に対する活性を、実施例１４に記載されるようにして計算した。
【表１９】
2021531749.tif 000034
【０２３３】
本出願において引用されたすべての刊行物、特許、特許出願および他の文書は、個々の刊行物、特許、特許出願または他の文書のそれぞれがすべての目的のために参照によって組み込まれることが個々に示されたものと同じ程度に、すべての目的のために、それらの全体がこれにより参照によって本明細書に組み込まれる。
【０２３４】
さまざまな特定の実施形態を説明し、記載してきたが、本発明（複数可）の趣旨および範囲から逸脱することなく、さまざまな変更を行うことができることが理解される。
【配列表】
2021531749000001.app
【国際調査報告】
2021531749.tif 000039
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2021531749.tif 000041
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