(57)【要約】本発明は、遺伝子治療のための組成物および方法に関する。本明細書に記載のいくつかの手法では、超高正確度ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集プラットフォームをもたらすＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９系を利用する。さらに、本発明は、完全なｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９ベクターをｉｎ  ｖｉｖｏ投与に対して適合性のアデノ随伴ウイルスプラスミドに挿入することを可能にする全長および短縮された単一ガイドＲＮＡ配列を組み入れる。さらに、１〜４個の間の必要なヌクレオチドに限定されたプロトスペーサー隣接モチーフ配列を標的とするＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログが同定されている。
2021502097.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
短縮されたリピート：アンチリピート領域を含む単一ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）配列。
【請求項２】
短縮されたＳｔｅｍ  ２領域をさらに含む、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ配列。
【請求項３】
短縮されたスペーサー領域をさらに含む、請求項２に記載のｓｇＲＮＡ配列。
【請求項４】
長さが１２１ヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ配列。
【請求項５】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項２に記載のｓｇＲＮＡ配列。
【請求項６】
長さが１００ヌクレオチドである、請求項３に記載のｓｇＲＮＡ配列。
【請求項７】
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９単一ガイドリボ核酸配列またはＮｍｅ２Ｃａｓ９単一ガイドリボ核酸配列である、請求項１に記載のｓｇＲＮＡ配列。
【請求項８】
短縮されたＳｔｅｍ  ２領域を含む単一ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）配列。
【請求項９】
短縮されたリピート：アンチリピート領域をさらに含む、請求項８に記載のｓｇＲＮＡ配列。
【請求項１０】
短縮されたスペーサー領域をさらに含む、請求項９に記載のｓｇＲＮＡ配列。
【請求項１１】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項９に記載のｓｇＲＮＡ配列。
【請求項１２】
長さが１００ヌクレオチドである、請求項１０に記載のｓｇＲＮＡ配列。
【請求項１３】
単一ガイドリボ核酸−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９核酸ベクターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド。
【請求項１４】
前記単一ガイドリボ核酸−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９核酸ベクターが、少なくとも１つのプロモーターを含む、請求項１３に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項１５】
前記少なくとも１つのプロモーターが、Ｕ６プロモーターおよびＵ１ａプロモーターからなる群より選択される、請求項１４に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項１６】
前記単一ガイドリボ核酸−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９核酸ベクターが、コザック配列を含む、請求項１３に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項１７】
前記ｓｇＲＮＡが、目的の遺伝子の配列と相補的な核酸配列を含む、請求項１３に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項１８】
前記目的の遺伝子の配列が、ＰＣＳＫ９配列およびＲＯＳＡ２６配列からなる群より選択される、請求項１７に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項１９】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたリピート−アンチリピート配列を含む、請求項１３に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項２０】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたＳｔｅｍ  ２領域をさらに含む、請求項１９に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項２１】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたスペーサー領域をさらに含む、請求項２０に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項２２】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１２１ヌクレオチドである、請求項１９に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項２３】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項２０に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項２４】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１００ヌクレオチドである、請求項２１に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項２５】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたＳｔｅｍ  ２領域を含む、請求項１３に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項２６】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたリピート：アンチリピート領域をさらに含む、請求項２５に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項２７】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたスペーサー領域をさらに含む、請求項２６に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項２８】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項２６に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項２９】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１００ヌクレオチドである、請求項２７に記載のＡＡＶプラスミド。
【請求項３０】
ａ）
ｉ）医学的状態の少なくとも１つの症状を示している患者であって、前記医学的状態に関連する複数の遺伝子を含む患者と、
ｉｉ）単一ガイドリボ核酸−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９核酸ベクターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドであって、前記ｓｇＲＮＡが、前記複数の遺伝子のうちの少なくとも１つの一部と相補的な核酸配列を含む、ＡＡＶプラスミドと
を提供するステップと、
ｂ）前記ＡＡＶプラスミドを前記患者に前記医学的状態の前記少なくとも１つの症状が軽減する条件下で投与するステップと
を含む方法。
【請求項３１】
前記医学的状態が、高コレステロール血症を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記複数の遺伝子のうちの前記少なくとも１つが、ＰＣＳＫ９遺伝子である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
前記ｓｇＲＮＡ核酸が、前記ＰＣＳＫ９遺伝子の一部と相補的である、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたリピート−アンチリピート配列を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３５】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたＳｔｅｍ  ２領域をさらに含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたスペーサー領域をさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１２１ヌクレオチドである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１００ヌクレオチドである、請求項２１に記載の方法。
【請求項４０】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたＳｔｅｍ  ２領域を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項４１】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたリピート：アンチリピート領域をさらに含む、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記ｓｇＲＮＡが、短縮されたスペーサー領域をさらに含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
前記ｓｇＲＮＡ配列の長さが、１００ヌクレオチドである、請求項４２に記載の方法。
【請求項４５】
ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドであって、前記タンパク質が、１〜４個の間の必要なヌクレオチドを含むプロトスペーサー隣接モチーフ配列に対する結合部位とともに構成されるプロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメインを含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド。
【請求項４６】
前記ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株Ｄｅ１０４４４  Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＨｐａＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質およびＳｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ  ＳｍｕＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる群より選択される、請求項４５に記載のアデノ随伴ウイルスプラスミド。
【請求項４７】
１〜４個の間の必要なヌクレオチドを含む前記プロトスペーサー隣接モチーフ配列が、Ｎ４ＣＮ３、Ｎ４ＣＴ、Ｎ４ＣＣＮ、Ｎ４ＣＣＡ、およびＮ４ＧＮＴ３からなる群より選択される、請求項４６に記載のアデノ随伴ウイルスプラスミド。
【請求項４８】
前記１〜４個の必要なヌクレオチドが、Ｃ、ＣＣ、ＣＴ、ＣＣＮ、ＣＣＡ、ＣＮ３およびＧＮＴ２からなる群より選択される、請求項４５に記載のアデノ随伴ウイルスプラスミド。
【請求項４９】
前記ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質が、短縮されたｓｇＲＮＡと結合している、請求項４５に記載のアデノ随伴ウイルスプラスミド。
【請求項５０】
ａ）
ｉ）医学的状態の少なくとも１つの症状を示している患者であって、前記医学的状態に関連する複数の遺伝子を含み、前記複数の遺伝子が、２〜４個の間の必要なヌクレオチドを含むプロトスペーサー隣接モチーフを含む、患者と、
ｉｉ）ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む送達プラットフォームであって、前記タンパク質が、２〜４個の間の必要なヌクレオチドを含む前記プロトスペーサー隣接モチーフ配列に対する結合部位とともに構成されるプロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメインを含む、送達プラットフォームと
を提供するステップと、
ｂ）前記送達プラットフォームを前記患者に前記医学的状態の前記少なくとも１つの症状が軽減する条件下で投与するステップと
を含む方法。
【請求項５１】
前記送達プラットフォームが、アデノ随伴ウイルスプラスミドを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記送達プラットフォームが、微小粒子を含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５３】
前記ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質が、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株Ｄｅ１０４４４  Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＨｐａＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質およびＳｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ  ＳｍｕＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５４】
１〜４個の必要なヌクレオチドを含む前記プロトスペーサー隣接モチーフ配列が、Ｎ４Ｃ３、Ｎ４ＣＴ、Ｎ４ＣＣＮ、Ｎ４ＣＣＡ、およびＮ４ＧＮＴ３からなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【請求項５５】
前記１〜４個の必要なヌクレオチドが、Ｃ、ＣＣ、ＣＴ、ＣＣＮ、ＣＣＡ、ＣＮ３およびＧＮＴ２からなる群より選択される、請求項５０に記載のアデノ随伴ウイルスプラスミド。
【請求項５６】
前記ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質が、短縮されたｓｇＲＮＡと結合している、請求項５０に記載の方法。
【請求項５７】
前記医学的状態が、高脂血症およびチロシン血症からなる群より選択される、請求項５０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、遺伝子治療のための組成物および方法に関する。本明細書に記載のいくつかの手法では、超高正確度（hyperaccurate）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集プラットフォームをもたらすＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９系を利用する。さらに、本発明は、このＣａｓ９系の改善：例えば、単一ガイドＲＮＡ配列を短縮すること、およびＮｍｅ１Ｃａｓ９またはＮｍｅ２Ｃａ９をそのガイドＲＮＡと共にｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適合性のアデノ随伴ウイルスベクターに詰め込むことを組み入れる。さらに、１〜４個の間の必要なヌクレオチドに限定されたプロトスペーサー隣接モチーフ配列を標的とするＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログが同定されている。
【背景技術】
【０００２】
クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート（ＣＲＩＳＰＲ）−ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）は、古細菌および細菌に見いだされる、独特の、ＲＮＡをガイドとする適応免疫系である。これらの系は、外来遺伝子エレメントを起源とする核酸を標的とし、それを不活化することによって免疫をもたらすものである。現在まで多くの異なる型のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が同定されており、２つのクラスにカテゴリー化されている。
【０００３】
クラスＩＩ  ＣＲＩＳＰＲ系の中で、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）およびトランス活性化型ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）とリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成して、ＤＮＡを標的とし、それを切断する、Ｃａｓ９と称される単一のエフェクタータンパク質によって特徴付けられる。ｃｒＲＮＡは、生きている生物体内のほぼ全てのＤＮＡ配列にＣａｓ９を方向付けることができるプログラム可能なガイド配列を含有する。
【０００４】
このＣａｓ９  ＲＮＰ複合体のプログラム可能性は、真核生物系におけるゲノム編集のために多くの研究者によって利用されてきた。これは、哺乳動物細胞、ヒト胚、植物、齧歯類、および他の生きている生物体のゲノムを編集するために使用されてきた。Ｃａｓ９  ＲＮＰは、どちらも遺伝子治療、農業、および他の場合に適用される、精密な（ドナー鋳型を用いる）ゲノム編集および厳密でないゲノム編集のために使用されてきた。さらに、ヌクレアーゼ失活バージョンのＣａｓ９オルソログが、転写モジュレーション、部位特異的ＤＮＡ標識付け、および特定のゲノム遺伝子座におけるプロテオームプロファイリングのために使用されている。いくつかの異なるＣａｓ９がこれらの適用のために使用されてきた。Ｃａｓ９のプログラム可能性、したがってその適用の中心となるのは、任意のガイド配列をｃｒＲＮＡに導入する能力である。ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡを一緒に融合して、より安定であり、かつゲノム編集の増強をもたらす単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）を形成することができる。
【０００５】
特に、信頼できる核酸送達プラットフォームと組み合わせた場合に、より広い範囲の標的部位の特異的かつ正確な編集をもたらすことができる改善されたＣａｓ９およびｓｇＲＮＡ配列が当技術分野において必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、遺伝子治療のための組成物および方法に関する。本明細書に記載のいくつかの手法では、超高正確度ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集プラットフォームをもたらすＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９系を利用する。さらに、本発明は、このＣａｓ９系の改善：例えば、単一ガイドＲＮＡ配列を短縮すること、およびＮｍｅ１Ｃａｓ９またはＮｍｅ２Ｃａｓ９をそのガイドＲＮＡと共にｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適合性のアデノ随伴ウイルスベクターに詰め込むことを組み入れる。さらに、１〜４個の間の必要なヌクレオチドに限定されたプロトスペーサー隣接モチーフ配列を標的とするＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログが同定されている。
【０００７】
一実施形態では、本発明は、短縮されたリピート：アンチリピート領域を含む単一ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）配列を意図している。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、短縮されたＳｔｅｍ  ２領域をさらに含む。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１２１ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９単一ガイドリボ核酸配列である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９単一ガイドリボ核酸配列である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９単一ガイドリボ核酸配列またはＮｍｅ２Ｃａｓ９単一ガイドリボ核酸配列である。
【０００８】
一実施形態では、本発明は、短縮されたＳｔｅｍ  ２領域を含む単一ガイドリボ核酸（ｓｇＲＮＡ）配列を意図している。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、短縮されたリピート：アンチリピート領域をさらに含む。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。
【０００９】
一実施形態では、本発明は、単一ガイドリボ核酸−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９（ｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９またはｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）核酸ベクターを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを意図している。一実施形態では、前記単一ガイドリボ核酸−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９核酸ベクターは、少なくとも１つのプロモーターを含む。一実施形態では、前記少なくとも１つのプロモーターは、Ｕ６プロモーターおよびＵ１ａプロモーターからなる群より選択される。一実施形態では、前記単一ガイドリボ核酸−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９核酸ベクターは、コザック配列を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、目的の遺伝子の配列と相補的な核酸配列を含む。一実施形態では、前記目的の遺伝子の配列は、ＰＣＳＫ９配列およびＲＯＳＡ２６配列からなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、長さが１４５ヌクレオチドである短縮されていない配列を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたリピート−アンチリピート配列を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたＳｔｅｍ  ２領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１２１ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたＳｔｅｍ  ２領域を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたリピート：アンチリピート領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、長さが１４５ヌクレオチドである短縮されていない配列を含む。
【００１０】
一実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）医学的状態の少なくとも１つの症状を示している患者であって、前記医学的状態に関連する複数の遺伝子を含む患者と、ｉｉ）単一ガイドリボ核酸−Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９（ｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９またはｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）核酸ベクターを含む送達プラットフォームであって、前記ｓｇＲＮＡが、前記複数の遺伝子のうちの少なくとも１つの一部と相補的な核酸配列を含む、送達プラットフォームとを提供するステップと、ｂ）前記ＡＡＶプラスミドを前記患者に前記医学的状態の前記少なくとも１つの症状が軽減する条件下で投与するステップとを含む方法を意図している。一実施形態では、送達プラットフォームは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む。一実施形態では、送達プラットフォームは、微小粒子を含む。一実施形態では、前記医学的状態は、高コレステロール血症を含む。一実施形態では、前記医学的状態は、チロシン血症を含む。一実施形態では、前記複数の遺伝子のうちの前記少なくとも１つは、ＰＣＳＫ９遺伝子である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ核酸は、前記ＰＣＳＫ９遺伝子の一部と相補的である。一実施形態では、前記複数の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＦＡＨ遺伝子である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ核酸は、前記ＦＡＨ遺伝子の一部と相補的である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたリピート−アンチリピート配列を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたＳｔｅｍ  ２領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１２１ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたＳｔｅｍ  ２領域を含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたリピート：アンチリピート領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、短縮されたスペーサー領域をさらに含む。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１１１ヌクレオチド、１０７ヌクレオチド、１０５ヌクレオチド、１０３ヌクレオチド、１０２ヌクレオチド、１０１ヌクレオチド、および９９ヌクレオチドからなる群より選択される。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ配列の長さは、１００ヌクレオチドである。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡは、長さが１４５ヌクレオチドである短縮されていない配列を含む。
【００１１】
一実施形態では、本発明は、ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドであって、前記タンパク質が、１〜４個の間の必要なヌクレオチドを含むプロトスペーサー隣接モチーフ配列に対する結合性部位とともに構成されるプロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメインを含む、ＡＡＶプラスミドを意図している。一実施形態では、前記ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株Ｄｅ１０４４４  Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＨｐａＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質およびＳｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ  ＳｍｕＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる群より選択される。一実施形態では、１〜４個の必要なヌクレオチドを含む前記プロトスペーサー隣接モチーフ配列は、Ｎ４ＣＮ３、Ｎ４ＣＴ、Ｎ４ＣＣＮ、Ｎ４ＣＣＡ、およびＮ４ＧＮＴ３からなる群より選択される。一実施形態では、１〜４個の必要なヌクレオチドは、Ｃ、ＣＴ、ＣＣＮ、ＣＣＡ、ＣＮ３およびＧＮＴ２からなる群より選択される。一実施形態では、前記ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、短縮されたｓｇＲＮＡと結合している。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、２つのｓｇＲＮＡ配列をコードする。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、ポリ−アデノシン配列をコードする。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、相同組換え修復ドナーヌクレオチド鋳型をコードする。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、一体型アデノ随伴ウイルスプラスミドである。
【００１２】
一実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）医学的状態の少なくとも１つの症状を示している患者であって、前記医学的状態に関連する複数の遺伝子を含み、前記複数の遺伝子が、１〜４個の間の必要なヌクレオチドを含むプロトスペーサー隣接モチーフを含む、患者と、ｉｉ）ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む送達プラットフォームであって、前記タンパク質が、２〜４個の間の必要なヌクレオチドを含む前記プロトスペーサー隣接モチーフ配列に対する結合性部位とともに構成されるプロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメインを含む、送達プラットフォームとを提供するステップと、ｂ）前記送達プラットフォームを前記患者に前記医学的状態の前記少なくとも１つの症状が軽減する条件下で投与するステップとを含む方法を意図している。一実施形態では、前記医学的状態は、高コレステロール血症を含む。一実施形態では、前記医学的状態は、チロシン血症を含む。一実施形態では、前記複数の遺伝子のうちの前記少なくとも１つは、ＰＣＳＫ９遺伝子である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ核酸は、前記ＰＣＳＫ９遺伝子の一部と相補的である。一実施形態では、前記複数の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＦＡＨ遺伝子である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ核酸は、前記ＦＡＨ遺伝子の一部と相補的である。一実施形態では、前記送達プラットフォームは、アデノ随伴ウイルスプラスミドを含む。一実施形態では、前記送達プラットフォームは、微小粒子を含む。一実施形態では、前記ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株Ｄｅ１０４４４  Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ  ＨｐａＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質およびＳｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ  ＳｍｕＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質からなる群より選択される。一実施形態では、１〜４個の必要なヌクレオチドを含む前記プロトスペーサー隣接モチーフ配列は、Ｎ４ＣＮ３、Ｎ４ＣＴ、Ｎ４ＣＣＮ、Ｎ４ＣＣＡ、およびＮ４ＧＮＴ３からなる群より選択される。一実施形態では、１〜４個の必要なヌクレオチドは、Ｃ、ＣＴ、ＣＣＮ、ＣＣＡ、ＣＮ３およびＧＮＴ２からなる群より選択される。一実施形態では、前記ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、短縮されたｓｇＲＮＡと結合している。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、２つのｓｇＲＮＡ配列をコードする。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、ポリ−アデノシン配列をコードする。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、相同組換え修復ドナーヌクレオチド鋳型をコードする。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、一体型アデノ随伴ウイルスプラスミドである。
【００１３】
一実施形態では、本発明は、ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）プラスミドであって、前記タンパク質が、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列と結合するように構成されるプロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメイン（例えば、ＰＡＭ相互作用ドメイン；ＰＩＤ）を含み、前記ＰＡＭ配列が、隣接するシトシンジヌクレオチド対を含む、ＡＡＶプラスミドを意図している。一実施形態では、隣接するシトシンジヌクレオチド対は、ＰＡＭの５位および６位にある。一実施形態では、前記ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に由来する。一実施形態では、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株は、Ｄｅ１０４４４である。一実施形態では、ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質である。一実施形態では、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株は、９８００２である。一実施形態では、ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、Ｎｍｅ３Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質である。一実施形態では、前記ＰＡＭ配列は、Ｎ４ＣＣ、Ｎ４ＣＣＮ３、Ｎ４ＣＣＡ、Ｎ４ＣＣ（Ｘ）、Ｎ４ＣＡ３およびＮ１０からなる群より選択される。一実施形態では、ＰＡＭ配列は、Ｎ３ＣＣである。一実施形態では、ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、ｓｇＲＮＡ配列をさらに含む。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、およそ１７〜２４ヌクレオチドの間の長さにわたるスペーサーを含む。
【００１４】
一実施形態では、本発明は、ａ）ｉ）医学的状態の少なくとも１つの症状を示している患者であって、前記医学的状態に関連する複数の遺伝子を含み、前記複数の遺伝子が、隣接するシトシンジヌクレオチド対を含むプロトスペーサー隣接モチーフを含む、患者と、ｉｉ）ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質をコードする少なくとも１つの核酸を含む送達プラットフォームであって、前記タンパク質が、隣接するシトシンジヌクレオチド対を含む前記プロトスペーサー隣接モチーフ配列と結合するように構成されるプロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメイン（例えば、ＰＡＭ相互作用ドメイン；ＰＩＤ）を含む、送達プラットフォームとを提供するステップと、ｂ）前記送達プラットフォームを前記患者に前記医学的状態の前記少なくとも１つの症状が軽減する条件下で投与するステップとを含む方法を意図している。一実施形態では、前記送達プラットフォームは、アデノ随伴ウイルスベクターを含む。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスベクターは、アデノ随伴ウイルスベクター８（ＡＡＶ８）である。一実施形態では、前記医学的状態は、高コレステロール血症を含む。一実施形態では、前記医学的状態は、チロシン血症を含む。一実施形態では、医学的状態は、Ｘ連鎖慢性肉芽腫症である。一実施形態では、医学的状態は、アスパルチルグリコサミン尿症である。一実施形態では、前記複数の遺伝子のうちの前記少なくとも１つは、ＰＣＳＫ９遺伝子である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ核酸は、前記ＰＣＳＫ９遺伝子の一部と相補的である。一実施形態では、前記複数の遺伝子のうちの少なくとも１つは、ＦＡＨ遺伝子である。一実施形態では、前記ｓｇＲＮＡ核酸は、前記ＦＡＨ遺伝子の一部と相補的である。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、少なくとも１つのｓｇＲＮＡ配列をコードする。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、２つのｓｇＲＮＡ配列をコードする。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、ポリ−アデノシン配列をコードする。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、相同組換え修復ドナーヌクレオチド鋳型をコードする。一実施形態では、アデノ随伴ウイルスプラスミドは、一体型アデノ随伴ウイルスプラスミドである。一実施形態では、前記送達プラットフォームは、微小粒子を含む。一実施形態では、隣接するシトシンジヌクレオチド対は、ＰＡＭの５位および６位にある。一実施形態では、前記ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株に由来する。一実施形態では、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株は、Ｄｅ１０４４４である。一実施形態では、ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質である。一実施形態では、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株は、９８００２である。一実施形態では、ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、Ｎｍｅ３Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質である。一実施形態では、前記ＰＡＭ配列は、Ｎ４ＣＣ、Ｎ４ＣＣＮ３、Ｎ４ＣＣＡ、Ｎ４ＣＣ（Ｘ）、Ｎ４ＣＡ３およびＮ１０からなる群より選択される。一実施形態では、ＰＡＭ配列は、Ｎ３ＣＣである。一実施形態では、ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、ｓｇＲＮＡ配列をさらに含む。一実施形態では、ｓｇＲＮＡ配列は、およそ１７〜２４ヌクレオチドの間の長さにわたるスペーサーを含む。
【００１５】
定義
本発明の理解を容易にするために、いくつかの用語を下に定義する。本明細書において定義されている用語は、本発明が関する分野の当業者に一般に理解される意味を有する。「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」などの用語は、単数の実体のみならず、複数の実体も指すものであり、また、例示のために具体例を使用することができる一般的なクラスも含む。本明細書における用語法は、本発明の特定の実施形態を説明するために使用されるが、それらの使用は、特許請求の範囲に概説されている以外は本発明の限界を定めるものではない。
【００１６】
「約」または「およそ」という用語は、本明細書で使用される場合、あらゆるアッセイ測定値のいずれに関しても、所与の測定値の＋／−５％を指す。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「ＲＯＳＡ２６遺伝子」または「Ｒｏｓａ２６遺伝子」は、マウスにおける全身発現を達成するために広く使用されている（それぞれ）ヒトまたはマウス遺伝子座を指す。ＲＯＳＡ２６遺伝子座の標的化は、当該遺伝子座の第１のイントロンの、元のジーントラップラインのおよそ２４８ｂｐ上流の独特のＸｂａＩ部位に所望の遺伝子を導入することによって達成することができる。構築物は、アデノウイルススプライスアクセプター、続いて独特のＸｂａＩ部位に挿入される目的の遺伝子およびポリアデニル化部位を使用して構築することができる。ネオマイシン耐性カセットも標的化ベクターに含めることができる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「ＰＣＳＫ９遺伝子」または「Ｐｃｓｋ９遺伝子」は、ＰＣＳＫ９タンパク質をコードする（それぞれ）ヒトまたはマウス遺伝子座を指す。ＰＣＳＫ９遺伝子は、バンド１ｐ３２．３における第１染色体に存在し、１３のエクソンを含む。この遺伝子からは、代替スプライシングによって少なくとも２つのアイソフォームが産生し得る。
【００１９】
「プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型」および「ＰＣＳＫ９」という用語は、低密度リポタンパク質レベルをモジュレートする遺伝子によってコードされるタンパク質を指す。プロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型は、ＰＣＳＫ９としても公知であり、ヒトにおいてＰＣＳＫ９遺伝子によってコードされる酵素である。Seidah  et  al.,  "The  secretory  proprotein  convertase  neural  apoptosis-regulated  convertase  1  (NARC-1):  liver  regeneration  and  neuronal  differentiation"  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A.  100  (3):  928-933  (2003)。同様の遺伝子（オルソログ）が多くの種にわたって見いだされる。ＰＳＣＫ９を含めた多くの酵素は、最初に合成された時には不活性である、なぜなら、これらは、それらの活性を遮断するペプチド鎖の部分を有するからである。プロタンパク質転換酵素によりその部分が除去されて酵素が活性化する。ＰＳＣＫ９は、コレステロール恒常性を調節する役割を果たすと考えられている。例えば、ＰＣＳＫ９は、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬ−Ｒ）の上皮増殖因子様リピートＡ（ＥＧＦ−Ａ）ドメインに結合し、その結果、ＬＤＬ−Ｒの内部移行および分解をもたらし得る。明白に、ＬＤＬ−Ｒレベルの低減により、ＬＤＬ−Ｃの代謝が減少し、それにより、高コレステロール血症が導かれ得ることが予測される。
【００２０】
「高コレステロール血症」という用語は、本明細書で使用される場合、血中コレステロールレベルが臨床的に推奨されるレベルを超えて上昇しているあらゆる医学的状態を指す。例えば、コレステロールが低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を使用して測定される場合、高コレステロール血症は、測定されたＬＤＬレベルが、例えば、およそ７０ｍｇ／ｄｌを超えていれば存在し得る。あるいは、コレステロールが遊離の血漿コレステロールを使用して測定される場合、高コレステロール血症は、測定された遊離のコレステロールレベルが、例えば、およそ２００〜２２０ｍｇ／ｄｌを超えていれば存在し得る。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ」または「クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート」という用語は、複数の、短い、塩基配列の直接反復を含有するＤＮＡ遺伝子座の頭字語を指す。各反復は、一連の塩基、続いて、「スペーサー」配列として公知の３０ほどの塩基対を含有する。スペーサーは、ウイルス由来のＤＮＡの短いセグメントであり、将来の侵襲に対する適応防御を容易にするための、過去の曝露に関する「メモリー」としての機能を果たし得る。Doudna  et  al.  Genome  editing.  The  new  frontier  of  genome  engineering  with  CRISPR-Cas9"  Science  346(6213):  1258096  (2014)。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ」または「ＣＲＩＳＰＲ関連（ｃａｓ）」という用語は、多くの場合にＣＲＩＳＰＲリピート−スペーサーアレイに関連する遺伝子を指す。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「Ｃａｓ９」という用語は、二重らせんの各鎖に対するものである２つの活性なカッティング部位（ＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメイン）を有する、ＤＮＡにおける二本鎖切断の生成に特殊化された酵素であるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系由来のヌクレアーゼを指す。ｔｒａｃｒＲＮＡとスペーサーＲＮＡを組み合わせて「単一ガイドＲＮＡ」（ｓｇＲＮＡ）分子にすることができ、これは、Ｃａｓ９と混合して、ｓｇＲＮＡ内のガイド配列と標的ＤＮＡ配列の間のワトソン・クリック対合を通じてＤＮＡ標的を見つけ、それを切断することができる。Jinek  et  al.  A  programmable  dual-RNA-guided  DNA  endonuclease  in  adaptive  bacterial  immunity"  Science  337(6096):816-821  (2012)。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「触媒として活性なＣａｓ９」という用語は、完全なヌクレアーゼ活性を含む、修飾されていないＣａｓ９ヌクレアーゼを指す。
【００２５】
「ニッカーゼ」という用語は、本明細書で使用される場合、天然の機能に起因して、または単一のＤＮＡ鎖のみを切断するように操作されていることが原因で、単一のＤＮＡ鎖のみを切断するヌクレアーゼを指す。ＲｕｖＣドメインまたはＨＮＨドメインのいずれかが変異したＣａｓ９ニッカーゼバリアントにより、いずれのＤＮＡ鎖が切断され、いずれの鎖がインタクトなままになるかの制御がもらされる。Jinek  et  al.,  "A  programmable  dual-RNA-guided  DNA  endonuclease  in  adaptive  bacterial  immunity"  Science  337(6096):816-821  (2012)およびCong  et  al.  Multiplex  genome  engineering  using  CRISPR/Cas  systems"  Science  339(6121):819-823  (2013)。
【００２６】
「トランス活性化型ｃｒＲＮＡ」、「ｔｒａｃｒＲＮＡ」という用語は、本明細書で使用される場合、トランスにコードされた小型ＲＮＡを指す。例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ（クラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピート／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質）は、ウイルスおよびプラスミドからの保護をなすＲＮＡ媒介性防御系を構成する。この防御経路には３つのステップがある。まず、侵入核酸のコピーがＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に組み込まれる。次に、ＣＲＩＳＰＲ  ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）がこのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。次いで、ｃｒＲＮＡがエフェクター複合体に組み入れられ、そこで、ｃｒＲＮＡがガイドとして複合体を侵入核酸に導き、Ｃａｓタンパク質がこの核酸を分解する。ＣＲＩＳＰＲ活性化にはいくつかの経路があり、そのうちの１つは、ｃｒＲＮＡの成熟化において役割を果たすｔｒａｃｒＲＮＡを必要とするものである。ｔｒａｃｒＲＮＡは、プレｃｒＲＮＡのリピート配列と相補的であり、ＲＮＡ二重鎖を形成する。このＲＮＡ二重鎖がＲＮＡ特異的リボヌクレアーゼであるＲＮａｓｅ  ＩＩＩによって切断されて、ｃｒＲＮＡ／ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッドが形成される。このハイブリッドは、侵入核酸を切断するエンドヌクレアーゼＣａｓ９に対するガイドとして作用する。
【００２７】
「プロトスペーサー隣接モチーフ」（またはＰＡＭ）という用語は、本明細書で使用される場合、Ｃａｓ９／ｓｇＲＮＡに、そのガイドＲＮＡのゲノムとのワトソン・クリック対合を通じて特異的なＤＮＡ配列を調べるためのＲループを形成するために必要とされ得るＤＮＡ配列を指す。ＰＡＭ特異性は、Ｃａｓ９タンパク質のＤＮＡ結合特異性の関数であり得る（例えば、Ｃａｓ９のＣ末端の「プロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメイン」）。
【００２８】
「プロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメイン」、「ＰＡＭ相互作用ドメイン」または「ＰＩＤ」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ標的ＰＡＭ配列に対する結合性部位を含むＣａｓ９アミノ酸配列を指す。
【００２９】
「結合性部位」という用語は、本明細書で使用される場合、結合性構成成分との物理的付着または密接な関連を受ける特定の三次構造および／または四次構造を有する任意の分子配置を指す。例えば、分子配置は、アミノ酸の配列を含み得る。あるいは、分子配置は、核酸の配列を含み得る。さらに、分子配置は、脂質二重層または他の生物材料を含み得る。
【００３０】
本明細書で使用される場合、「ｓｇＲＮＡ」という用語は、ＣＲＩＳＰＲ関連系（Ｃａｓ）と併せて使用される単一ガイドＲＮＡを指す。ｓｇＲＮＡは、ｃｒＲＮＡとｔｒａｃｒＲＮＡの融合物であり、所望の標的部位に対して相補的な配列のヌクレオチドを含有する。Jinek  et  al.,  "A  programmable  dual-RNA-guided  DNA  endonuclease  in  adaptive  bacterial  immunity"  Science  337(6096):816-821  (2012)。ｓｇＲＮＡと標的部位のワトソン・クリック対合によりＲループ形成が可能になり、これにより、機能的ＰＡＭと併せて、ＤＮＡ切断が可能になる、または、ヌクレアーゼ欠損Ｃａｓ９の場合では、その遺伝子座にあるＤＮＡへの結合が可能になる。
【００３１】
本明細書で使用される場合、「直交性」という用語は、重複していない、相関しない、または独立した標的を指す。例えば、２つの直交性Ｃａｓ９アイソフォームを利用する場合、それらは、ＤＮＡ認識および切断のためにＣａｓ９アイソフォームのうちの１つのみをプログラムする直交性ｓｇＲＮＡを使用することになる。Esvelt  et  al.,  "Orthogonal  Cas9  proteins  for  RNA-guided  gene  regulation  and  editing"  Nat  Methods  10(11):1116-1121  (2013)。例えば、これにより、１つのＣａｓ９アイソフォーム（例えば、Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９またはＳｐｙＣａｓ９）が、それに特異的であり得るｓｇＲＮＡによってプログラムされたヌクレアーゼとして機能することが可能になり、別のＣａｓ９アイソフォーム（例えば、Ｎ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９またはＮｍｅＣａｓ９）は、そのＰＡＭ特異性および直交性ｓｇＲＮＡを通じた結合性部位へのＤＮＡ標的化をもたらすヌクレアーゼ失活Ｃａｓ９として作動することが可能になる。他のＣａｓ９としては、Ｓ．ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９またはＳａｕＣａｓ９およびＡ．ｎａｅｓｌｕｎｄｉｉ  Ｃａｓ９またはＡｎａＣａｓ９が挙げられる。
【００３２】
「短縮された」という用語は、本明細書で使用される場合、ポリヌクレオチド配列またはアミノ酸配列に関して使用される場合、野生型配列の少なくとも一部が存在しない可能性があることを意味する。一部の場合では、ｓｇＲＮＡまたはｃｒＲＮＡ内の短縮されたガイド配列により、Ｃａｓ９の編集精度が改善し得る。Fu,  et  al.  "Improving  CRISPR-Cas  nuclease  specificity  using  truncated  guide  RNAs"  Nat  Biotechnol.  2014  Mar;32(3):279-284  (2014)。
【００３３】
「塩基対」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡおよびＲＮＡのどちらの一次構造も形成するヌクレオチド配列の構成要素である特定の核酸塩基（窒素塩基とも称される）を指す。二本鎖ＤＮＡは、特定の水素結合のパターンによって特徴付けられ得る。塩基対は、これだけに限定されないが、グアニン−シトシン塩基対およびアデニン−チミン塩基対を含み得る。
【００３４】
「特定のゲノム標的」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書において意図されているＣａｓ９タンパク質に結合することができる任意の所定のヌクレオチド配列を指す。標的は、これだけに限定しなくてよいが、プログラム可能なＤＮＡ結合性ドメインまたは独自のガイドＲＮＡでプログラムされた直交性Ｃａｓ９タンパク質に相補的なヌクレオチド配列、単一ガイドＲＮＡに相補的なヌクレオチド配列、プロトスペーサー隣接モチーフ認識配列、オンターゲット結合性配列およびオフターゲット結合性配列を含み得る。
【００３５】
「オンターゲット結合性配列」という用語は、本明細書で使用される場合、プログラム可能なＤＮＡ結合性ドメインおよび／または単一ガイドＲＮＡ配列と完全に相補的であり得る特定のゲノム標的の部分配列を指す。
【００３６】
「オフターゲット結合性配列」という用語は、本明細書で使用される場合、プログラム可能なＤＮＡ結合性ドメインおよび／または単一ガイドＲＮＡ配列と部分的に相補的であり得る特定のゲノム標的の部分配列を指す。
【００３７】
「結合できない」という用語は、本明細書で使用される場合、部分的な相補性を示すが、Ｃａｓ９ヌクレアーゼによる標的部位の切断を誘発するための認識には不十分な相補性を有する任意のヌクレオチド−ヌクレオチド相互作用またはヌクレオチド−アミノ酸相互作用を指す。そのような結合できないことにより、２つの分子の弱いまたは部分的な結合がもたらされる場合があり、したがって、予測される生物学的機能（例えば、ヌクレアーゼ活性）がなくなる。
【００３８】
「切断（ｃｌｅａｖａｇｅ）」という用語は、本明細書で使用される場合、ＤＮＡ内の切断（ｂｒｅａｋ）の生成と定義することができる。これは、使用することができるヌクレアーゼの型に応じて一本鎖切断（ｓｉｎｇｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋ）または二本鎖切断（ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋ）であり得る。
【００３９】
本明細書で使用される場合、「編集する（ｅｄｉｔ）」「編集すること（ｅｄｉｔｉｎｇ）」または「編集した（ｅｄｉｔｅｄ）」という用語は、ポリヌクレオチド（例えば、例えば野生型の天然に存在する核酸配列または変異した天然に存在する配列）の核酸配列を、外因的に供給されたＤＮＡ鋳型を使用することによって特定のゲノム標的を選択的に欠失させることまたは新しい配列を特異的に含めることによって変更する方法を指す。そのような特定のゲノム標的としては、これだけに限定しなくてよいが、染色体領域、ミトコンドリアＤＮＡ、遺伝子、プロモーター、オープンリーディングフレームまたは任意の核酸配列が挙げられる。
【００４０】
「欠失させる（ｄｅｌｅｔｅ）」、「欠失させた（ｄｅｌｅｔｅｄ）」、「欠失させること（ｄｅｌｅｔｉｎｇ）」または「欠失（ｄｅｌｅｔｉｏｎ）」という用語は、本明細書で使用される場合、それぞれ１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸残基が存在しないまたは存在しなくなるような、ヌクレオチド配列またはアミノ酸配列のいずれかの変化と定義することができる。
【００４１】
「目的の遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、欠失させることが望ましい場合がある任意の所定の遺伝子を指す。
【００４２】
「対立遺伝子」という用語は、本明細書で使用される場合、同じ遺伝子または同じ遺伝子座のいくつかの代替形態のいずれか１つを指す。
【００４３】
「有効量」という用語は、本明細書で使用される場合、臨床的に有益な結果（すなわち、例えば、症状の低減）が達成される、治療剤を含む医薬組成物の特定の量を指す。そのような組成物の毒性および治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の５０％に対して致死的な用量）およびＥＤ５０（集団の５０％において治療的に有効な用量）を決定するための、細胞培養物または実験動物における標準の薬学的手順によって決定することができる。毒性効果と治療効果との間の用量比は治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。大きな治療指数を示す化合物が好ましい。これらの細胞培養アッセイおよび追加的な動物試験から得られたデータを、ヒトへの使用のための投与量の範囲の製剤化において使用することができる。そのような化合物の投与量は、毒性をほとんどまたは全く伴わずに、ＥＤ５０を含む循環濃度の範囲内に入ることが好ましい。投与量は、この範囲内で、使用される剤形、患者の感受性、および投与経路に応じて変動する。
【００４４】
「症状」という用語は、本明細書で使用される場合、患者に認められる疾患または身体的障害の任意の主観的または客観的証拠を指す。例えば、主観的証拠は、通常、患者の自己申告に基づき、これらとして、これだけに限定されないが、疼痛、頭痛、視覚障害、悪心および／または嘔吐を挙げることができる。あるいは、客観的証拠は、通常、これだけに限定されないが、体温、全血球計算、脂質パネル、甲状腺パネル、血圧、心拍数、心電図、組織および／または身体イメージングスキャンを含めた医学的検査の結果である。
【００４５】
「疾患」または「医学的状態」という用語は、本明細書で使用される場合、生きている動物もしくは植物体またはその一部の正常な状態の、生命機能の遂行を妨害するまたは変更するあらゆる欠陥を指す。一般には、これは、目立った徴候および症状によってあらわれ、通常、ｉ）環境因子（栄養不良、工業災害、または気候として）；ｉｉ）特定の感染因子（虫、細菌、またはウイルスとして）；ｉｉｉ）生物体の固有の欠損（遺伝子異常として）；および／またはｉｖ）これらの因子の組合せに対する応答である。
【００４６】
「低減する（ｒｅｄｕｃｅ）」、「阻害する（ｉｎｈｉｂｉｔ）」、「減弱させる（ｄｉｍｉｎｉｓｈ）」、「抑制する（ｓｕｐｐｒｅｓｓ）」、「減少させる（ｄｅｃｒｅａｓｅ）」、「防止する（ｐｒｅｖｅｎｔ）」という用語および文法上の等価物（「より低い（ｌｏｗｅｒ）」「より小さい（ｓｍａｌｌｅｒ）」などを含む）は、無処置の被験体と処置された被験体の相対的な任意の症状に関する表現に関しては、処置された被験体における症状の数量および／または大きさが、無処置の被験体における症状の数量および／または大きさよりも、任意の医学的に訓練された人員によって臨床的に意義のあると認識される任意の量だけ少ないことを意味する。一実施形態では、処置された被験体における症状の数量および／または大きさは、無処置の被験体における症状の数量および／または大きさよりも少なくとも１０％低い、少なくとも２５％低い、少なくとも５０％低い、少なくとも７５％低い、および／または少なくとも９０％低い。
【００４７】
「付着した（ａｔｔａｃｈｅｄ）」という用語は、本明細書で使用される場合、媒体（または担体）と薬物の間のあらゆる相互作用を指す。付着は、可逆的または不可逆的であり得る。そのような付着としては、これだけに限定されないが、共有結合、イオン結合、ファンデルワールス力または摩擦などが挙げられる。薬物は、媒体（または担体）に浸透している、組み入れられている、コーティングされている、それと共に懸濁物になっている、それと共に溶液になっている、それと混合されているなどであれば、媒体（または担体）に付着している。
【００４８】
「薬物」または「化合物」という用語は、本明細書で使用される場合、所望の効果を達成する、投与可能な任意の薬理活性のある物質を指す。薬物または化合物は、合成または天然に存在する、非ペプチド、タンパク質またはペプチド、オリゴヌクレオチドまたはヌクレオチド、多糖または糖であり得る。
【００４９】
「投与した（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｅｄ）」または「投与すること（ａｄｍｉｎｉｓｔｅｒｉｎｇ）」という用語は、本明細書で使用される場合、組成物を患者に組成物が患者に対してその意図された効果を有するように提供する任意の方法を指す。投与の例示的な方法は、局所組織投与（すなわち、例えば、血管外配置）、経口摂取、経皮パッチ、局部、吸入、坐薬などの直接的な機構によるものである。
【００５０】
「患者」または「被験体」という用語は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは動物であり、入院している必要はない。例えば、外来患者、看護施設に入所している人が「患者」である。患者は、任意の年齢のヒトまたは非ヒト動物を含んでよく、したがって、成体および若齢者（すなわち、小児）のどちらも含む。「患者」という用語は、医学的処置の必要性を意味するものではなく、したがって、患者は、臨床的なものであるか基礎的科学研究の裏付けとしてのものであるかにかかわらず実験に自発的または非自発的に参加し得る。
【００５１】
「親和性」という用語は、本明細書で使用される場合、物質または粒子を化学的に組み合わせ、その状態に留める、物質または粒子間のあらゆる引力を指す。例えば、受容体に対して高い親和性を有する阻害化合物は、受容体とその天然のリガンドとの相互作用の防止における有効性が、親和性が低い阻害剤よりも大きくなる。
【００５２】
「に由来する（ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ）」という用語は、本明細書で使用される場合、化合物または配列の供給源を指す。ある点では、化合物または配列は、生物体または特定の種に由来し得る。別の点では、化合物または配列は、より大きな複合体または配列に由来し得る。
【００５３】
「タンパク質」という用語は、本明細書で使用される場合、炭素、水素、窒素、酸素、通常、硫黄の元素を含有する、ペプチド結合によって接合したアミノ酸残基からなる多数の天然に存在する非常に複雑な物質（酵素または抗体として）のいずれかを指す。一般に、タンパク質は、数百個程度のアミノ酸を含む。
【００５４】
「ペプチド」という用語は、本明細書で使用される場合、１つのアミノ酸のアミノ基と別のアミノ酸のカルボキシル基の組合せによる、２つまたはそれよりも多くのアミノ酸に由来する種々のアミドのいずれかを指し、通常、タンパク質の部分的な加水分解によって得られる。一般に、ペプチドは、数十個程度のアミノ酸を含む。
【００５５】
「ポリペプチド」という用語は、１つのアミノ酸のアミノ基と別のアミノ酸のカルボキシル基との組合せによる、２つまたはそれよりも多くのアミノ酸に由来する種々のアミドのいずれかを指し、通常、タンパク質の部分的な加水分解によって得られる。一般に、ペプチドは、おおよそ数十個またはそれよりも多くのアミノ酸を含む。
【００５６】
「薬学的に」または「薬理学的に許容される」という用語は、本明細書で使用される場合、動物またはヒトに投与された際に有害な反応、アレルギー性反応、または他の不都合な反応を生じさせない分子実体および組成物を指す。
【００５７】
「薬学的に許容される担体」という用語は、本明細書で使用される場合、これだけに限定されないが、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの適切な混合物、ならびに植物油、コーティング、等張化剤（isotonic  agent）および吸収遅延剤、リポソーム、市販の洗浄剤などを含めた任意のかつ全ての溶媒、または分散媒を含む。補足的な生物活性成分もそのような担体に組み入れることができる。
【００５８】
「核酸配列」および「ヌクレオチド配列」は、本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチド、およびその断片または一部、ならびに、一本鎖または二本鎖であり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す、ゲノムまたは合成起源のＤＮＡまたはＲＮＡを指す。
【００５９】
「単離された核酸」という用語は、本明細書で使用される場合、その天然の状態から取り出された（例えば、細胞から取り出され、好ましい実施形態では、他のゲノム核酸を含まない）任意の核酸分子を指す。
【００６０】
「アミノ酸配列」および「ポリペプチド配列」という用語は、本明細書で使用される場合、互換的であり、アミノ酸の配列を指す。
【００６１】
本明細書で使用される場合、「一部」という用語は、タンパク質に関する場合（「所与のタンパク質の一部」などで）、そのタンパク質の断片を指す。断片は、４アミノ酸残基から、アミノ酸配列全体から１アミノ酸を引いたものまでのサイズにわたり得る。
【００６２】
「一部」という用語は、ヌクレオチド配列に関して使用される場合、そのヌクレオチド配列の断片を指す。断片は、５ヌクレオチド残基から、ヌクレオチド配列全体から１つの核酸残基を引いたものまでのサイズにわたり得る。
【００６３】
「生物学的に活性な」という用語は、構造的機能、調節機能または生化学的機能を有する任意の分子を指す。例えば生物学的活性は、例えば、タンパク質の活性を欠く細胞における野生型成長の修復によって決定することができる。タンパク質の活性を欠く細胞は、多くの方法（すなわち、例えば、点変異およびフレームシフト変異）によって作製することができる。タンパク質の活性を欠く細胞に、タンパク質、その誘導体、またはその一部を発現する発現ベクターをトランスフェクトすることによって補完が達成される。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「相補的な」または「相補性」という用語は、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」（ヌクレオチドの配列を指す用語と互換的である）に関して塩基対合規則に関連して使用される。例えば、「Ｃ−Ａ−Ｇ−Ｔ」という配列は、「Ｇ−Ｔ−Ｃ−Ａ」という配列と相補的である。相補性は「部分的」または「全面的」であり得る。「部分的な」相補性は、塩基対合規則に従って１つまたは複数の核酸塩基がマッチしない場合である。核酸間の「全面的な」または「完全な」相補性は、塩基対合規則の下で各々全ての核酸塩基が別の塩基とマッチする場合である。核酸鎖間の相補性の度合いは、核酸鎖間のハイブリダイゼーションの効率および強度に有意に影響を及ぼす。これは、増幅反応、ならびに核酸間の結合に依存する検出方法において特に重要である。
【００６５】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、核酸の鎖を相補鎖と塩基対合によって接合して、ハイブリダイゼーション複合体を形成する任意のプロセスを使用した相補的な核酸の対合に関して使用される。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度（すなわち、核酸間の会合の強度）は、核酸間の相補性の度合い、必要とされる条件のストリンジェンシー、形成されるハイブリッドのＴｍ、および核酸内のＧ：Ｃ比などの因子の影響を受ける。
【００６６】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション複合体」という用語は、相補的なＧ塩基とＣ塩基の間および相補的なＡ塩基とＴ塩基の間の水素結合の形成によって２つの核酸配列の間で形成される複合体を指し、これらの水素結合は、塩基スタッキング相互作用によってさらに安定化され得る。２つの相補的な核酸配列は、逆平行立体配置で水素結合する。ハイブリダイゼーション複合体は、溶液中で形成させることもでき（例えば、Ｃ０  ｔまたはＲ０  ｔ分析）、または溶液中に存在する１つの核酸配列と固体支持体（例えば、サザンブロット法およびノーザンブロット法において使用されるナイロンメンブレンまたはニトロセルロースフィルター、ＦＩＳＨ（蛍光ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーション）を含めたｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにおいて使用されるドットブロッティングまたはガラススライド）に固定化された別の核酸配列との間で形成させることもできる。
【００６７】
真核生物における転写制御シグナルは、「プロモーター」および「エンハンサー」エレメントを含む。プロモーターおよびエンハンサーは、転写に関与する細胞タンパク質と特異的に相互作用するＤＮＡ配列の短いアレイからなる。Maniatis,  T.  et  al.,  Science  236:1237  (1987)。プロモーターおよびエンハンサーエレメントは、植物、酵母、昆虫および哺乳動物細胞およびウイルスの遺伝子を含めた種々の真核生物供給源から単離されている（類似の制御エレメント、すなわち、プロモーターが原核生物においても見いだされる）。特定のプロモーターおよびエンハンサーの選択は、目的のタンパク質を発現させるためにいずれの細胞型を使用するかに依存する。
【００６８】
「ポリＡ部位」または「ポリＡ配列」という用語は、本明細書で使用される場合、新生ＲＮＡ転写物の終結およびポリアデニル化の両方を方向付けるＤＮＡ配列を指す。ポリＡ尾部を欠く転写物は不安定であり、急速に分解されるので、組換え転写物の効率的なポリアデニル化が望ましい。発現ベクターに利用されるポリＡシグナルは、「異種」であっても「内在性」であってもよい。内在性ポリＡシグナルは、ゲノム内の所与の遺伝子のコード領域の３’末端に天然に見いだされるものである。異種ポリＡシグナルは、１つの遺伝子から単離され、別の遺伝子の３’に配置されたものである。真核細胞における組換えＤＮＡ配列の効率的な発現には、得られる転写物の効率的な終結およびポリアデニル化を方向付けるシグナルの発現が伴う。転写終結シグナルは、一般に、ポリアデニル化シグナルの下流に見いだされ、数百ヌクレオチドの長さである。
【００６９】
「トランスフェクション（ｔｒａｓｎｆｅｃｔｉｏｎ）」または「トランスフェクトされた（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ）」という用語は、細胞への外来ＤＮＡの導入を指す。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「をコードする核酸分子」、「をコードするＤＮＡ配列」および「をコードするＤＮＡ」という用語は、デオキシリボ核酸の鎖に沿ったデオキシリボヌクレオチドの順序または配列を指す。これらのデオキシリボヌクレオチドの順序により、ポリペプチド（タンパク質）鎖に沿ったアミノ酸の順序が決定される。したがって、ＤＮＡ配列はアミノ酸配列をコードする。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「コード領域」という用語は、構造遺伝子に関して使用される場合、ｍＲＮＡ分子の翻訳の結果として新生ポリペプチドに見いだされるアミノ酸をコードするヌクレオチド配列を指す。真核生物では、コード領域は、５’側で開始メチオニンをコードするヌクレオチドトリプレット「ＡＴＧ」が境界となっており、３’側で終止コドンを指定する３つのトリプレット（すなわち、ＴＡＡ、ＴＡＧ、ＴＧＡ）のうちの１つが境界となっている。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「構造遺伝子」という用語は、ＲＮＡまたはタンパク質をコードするＤＮＡ配列を指す。対照的に、「調節遺伝子」は、他の遺伝子の発現を制御する産物（例えば、転写因子）をコードする構造遺伝子である。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、構造遺伝子のコード領域を含むデオキシリボヌクレオチド配列を意味し、５’末端および３’末端において、いずれの末端においても約１ｋｂの距離にわたってコード領域に隣接して位置する配列を含み、したがって、遺伝子は、全長ｍＲＮＡの長さに対応する。コード領域の５’に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、５’非翻訳配列と称される。コード領域の３’または下流に位置し、ｍＲＮＡ上に存在する配列は、３’非翻訳配列と称される。「遺伝子」という用語は、ｃＤＮＡおよびゲノム形態の遺伝子の両方を包含する。遺伝子のゲノム形態またはクローンは、「イントロン」または「介在領域」または「介在配列」と称される非コード配列で中断されたコード領域を含有する。イントロンは、異種核内ＲＮＡ（ｈｎＲＮＡ）に転写される遺伝子のセグメントである；イントロンは、エンハンサーなどの調節エレメントを含有し得る。イントロンは、核または一次転写物から除去されるまたは「スプライシングで切り出される」；したがって、イントロンはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）転写物には存在しない。ｍＲＮＡは、翻訳の間、新生ポリペプチドのアミノ酸の配列または順序が指定されるように機能する。
【００７４】
イントロンを含有することに加えて、ゲノム形態の遺伝子は、ＲＮＡ転写物上に存在する配列の５’末端および３’末端の両方に位置する配列も含み得る。これらの配列は、「フランキング」配列または領域と称される（これらのフランキング配列は、ｍＲＮＡ転写物上に存在する非翻訳配列に対して５’側または３’側に位置する）。５’フランキング領域は、遺伝子の転写を制御するまたはそれに影響を及ぼすプロモーターおよびエンハンサーなどの調節配列を含有し得る。３’フランキング領域は、転写の終結、転写後の切断およびポリアデニル化を方向付ける配列を含有し得る。
【００７５】
「ウイルスベクター」という用語は、宿主生物体において発現させるための異種核酸配列を組み入れることが可能な、ウイルスゲノムに由来する任意の核酸構築物を包含する。例えば、そのようなウイルスベクターとしては、これだけに限定されないが、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクターを挙げることができる。ウイルスベクターは、時々、病原性ウイルスから創出されるが、これらを、それらの全体的な健康リスクを最小限になるように改変することができる。これには、通常、ウイルス複製に関与するウイルスゲノムの一部を欠失させることを伴う。そのようなウイルスは、細胞に効率的に感染することができるが、感染が起こったら、ウイルスは、新しいビリオンを産生するために、失われたタンパク質をもたらすためにヘルパーウイルスを必要とし得る。好ましくは、ウイルスベクターは、それが感染する細胞の生理に対して最小限の影響を有し、また、遺伝学的に安定な性質（例えば、自発性ゲノム再構成を受けない）を示すべきである。大多数のウイルスベクターは、できるだけ広い範囲の細胞型に感染するように操作される。たとえそうであっても、ウイルス受容体を、ウイルスが特定の種類の細胞を標的とするように改変することができる。このように改変されたウイルスは、シュードタイピングされたと言える。ウイルスベクターは、多くの場合、いずれの細胞にウイルス遺伝子が取り入れられたかの同定に役立つ特定の遺伝子が組み入れられるように操作される。これらの遺伝子は、マーカー遺伝子と称される。例えば、一般的なマーカー遺伝子は、ある特定の抗生物質に対する抗生物質耐性を付与するものである。
【００７６】
この特許のファイルは、カラーで製作された図面を少なくとも１つ含有する。カラーの図面を伴うこの特許のコピーは、要求し必要な料金の支払いを行えばＰａｔｅｎｔ  ａｎｄ  Ｔｒａｄｅｍａｒｋ  Ｏｆｆｉｃｅにより提供される。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１】図１は、従来の、全長の、１４５ｎｔのＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡおよびＮｍｅ２Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡの代表的な配列を提示する図である。
【図２】図２は、短縮されたリピート：アンチリピート領域または短縮されたＳｔｅｍ  ２領域を有する例示的なＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ配列および関連する遺伝子編集活性を提示する図である。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡの欠失／短縮系列。上：アラインメントされた配列、図１と同様に色分けされている。下：示されているｓｇＲＮＡをガイドとして使用した、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９標的部位７（ＮＴＳ７）における編集に関するＴ７Ｅ１アッセイ。
【図３】図３は、短縮されたリピート：アンチリピート領域または短縮されたＳｔｅｍ  ２領域を有する例示的なＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ配列および関連する遺伝子編集活性を提示する図である。最も短いＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ（＃１０−１０１ｎｔ；２４ｎｔのガイド配列；および＃１１−１００ｎｔ；２３ｎｔのガイド配列）により、ヒトゲノム内の３つの別個の標的部位（ＮＴＳ７、ＮＴＳ２７、およびＮＴＳ５５）が効率的に編集される。上：野生型ｓｇＲＮＡおよび最小化ｓｇＲＮＡの配列、前の図と同じカラースキームを使用。下：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞の３つの標的部位における編集効率に関するＴ７Ｅ１アッセイ。
【図４−１】図４は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ｗｔ  ｓｇＲＮＡ、ならびに短縮されたｓｇＲＮＡ  １１および１２の例示的な配列（二次構造として）、ならびにＮｍｅ１Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡのＲＮＰ送達による関連する遺伝子編集を提示する図である。３つのゲノム部位（Ｎ−ＴＳ７２、Ｎ−ＴＳ５５およびＮ−ＴＳ４０）、および１つのトラフィックライトレポーター部位（ｔｒａｆｆｉｃ  ｌｉｇｈｔ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｓｉｔｅ）をヒトゲノムにおいてＨＥＫ２９３Ｔ細胞を使用して標的とした。上：配列が野生型ｓｇＲＮＡおよび最小化ｓｇＲＮＡの二次構造として示されている。下：Ｔ７Ｅ１アッセイまたはフローサイトメトリーによって測定された編集効率が棒グラフとして示されている。
【図４−２】同上。
【図４−３】同上。
【図５】図５は、ＰＬＢ９８５細胞における最小化ｓｇＲＮＡ  １１、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｗｔ  ｓｇＲＮＡを使用した遺伝子編集を提示するグラフである。細胞にＮｍｅ１Ｃａｓ９とｓｇＲＮＡのＲＮＰ複合体をトランスフェクトし、ゲノム部位Ｎ−ＴＳ７２における遺伝子編集をＴＩＤＥによって測定した。
【図６】図６は、完全なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集複合体を含むＡＡＶベクターの一実施形態の概略図である。種々のＡＡＶベクター領域の代表的な配列が付録１において色分けされている。
【図７】図７は、図４に示されているＮｍｅ単一ガイドＲＮＡおよびプロモーターの色分けされた配列の一実施形態を提示する図である。２４ｎｔの標的スペーサーを挿入するために骨格がＳａｐＩを使用して直線化されている。  Ｕ６プロモーター：青緑色  Ｎｍｅ単一ガイドＲＮＡ：紫色  ＳａｐＩ制限部位：太字
【図８】図８は、図４に示されているＮｍｅ１Ｃａｓ９およびプロモーターの色分けされた配列の一実施形態を提示する図である。開始および終止コドンは太字に下線が引かれている。  Ｕ１ａプロモーター：青色  コザック配列：灰色  ヒト化Ｎｍｅ１Ｃａｓ９：赤色  ＳＶ４０  ＮＬＳ：緑色  ヌクレオプラスミン（ＮＰ）ＮＬＳ：黄色  ＨＡタグ（３×）：太字のオレンジ色  合成ＮＬＳ：青緑色  ベータグロビンポリアデニル化シグナル：暗青緑色
【図９】図９は、Ｐｃｓｋ９遺伝子またはＲｏｓａ２６遺伝子（対照）のいずれかにガイドにより導かれるｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９構築物を有するＡＡＶプラスミドを使用した種々の標的部位の編集効率を示す例示的なデータを提示する図である。
【図１０】図１０は、Ｐｃｓｋ９遺伝子またはＲｏｓａ２６遺伝子（対照）のいずれかにガイドにより導かれるｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９構築物の色分けされた標的部位配列の一実施形態を提示する図である。  ２４ｎｔのＮｍｅ１Ｃａｓ９標的スペーサー、青色の太字  Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ＰＡＭ、下線が引かれている［ＮＮＮＮＧＡＴＴ）  Ｔ７Ｅ１プライマー結合性部位：緑色のイタリック体  ＴＩＤＥプライマー結合性部位：紫色のイタリック体
【図１１】図１１は、Ｐｃｓｋ９を標的とする内毒素を含まないｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶプラスミド３０μｇのマウス尾静脈でのｉｎ  ｖｉｖｏ流体力学的注射（ｈｙｄｒｏｄｙｎａｍｉｃ  ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ）後の遺伝子編集効率を示す例示的なデータを提示する図である。
【図１２】図１２Ａは、マウス１匹当たり４×１０１１ゲノムコピー（ｇｃ）の用量の、肝細胞特異的ＡＡＶ８血清型にパッケージングされたＮｍｅ１−Ｃａｓ９ベクターによる、ベクター投与の１４日後の肝臓のＰｃｓｋ９遺伝子およびＲｏｓａ２６遺伝子における遺伝子編集効率を示す例示的なデータを提示するグラフである。図１２Ｂは、マウス１匹当たり４×１０１１ゲノムコピー（ｇｃ）の用量の、肝細胞特異的ＡＡＶ８血清型にパッケージングされたＮｍｅ１−Ｃａｓ９ベクターによる、ベクター投与の５０日後の肝臓のＰｃｓｋ９遺伝子およびＲｏｓａ２６遺伝子における遺伝子編集効率を示す例示的なデータを提示するグラフである。
【図１３】図１３は、Ｐｃｓｋ９遺伝子、Ｒｏｓａ２６遺伝子を標的とするｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−ＡＡＶベクターおよびＰＢＳ対照群の注射後０日目、２５日目および５０日目のマウスコレステロールレベルの低減を示す例示的なデータを提示するグラフである。
【図１４】図１４Ａおよび１４Ｂは、Ｐｃｓｋ９−ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−ＡＡＶ（Ａ）およびＲｏｓａ２６−ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−ＡＡＶ（Ｂ）の両方についてオフターゲット編集部位を検索した、配列決定によって可能になる二本鎖切断（ＤＳＢ）のゲノムワイド不偏同定（例えば、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ）アッセイを示す例示的なデータを提示するグラフである。
【図１５】図１５は、最小の切断が明らかになった、Ｐｃｓｋ９−ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−ＡＡＶおよびＲｏｓａ２６−ｓｇＲＮＡ−Ｃａｓ９−ＡＡＶの両方を注射した１４日後のマウスにおける標的化ＴＩＤＥ解析を示す例示的なデータを提示するグラフである。ＯｎＴ、オンターゲット部位；ＯＴ１、ＯＴ２など：オフターゲット部位。
【図１６】図１６は、Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とするベクターおよびＲｏｓａ２６遺伝子を標的とするベクターの注射後１４日目に屠殺したマウスの肝臓切片におけるヘマトキシリン・エオシン染色アッセイを示す例示的なデータを提示する図である。宿主免疫応答の証拠は認められない。
【図１７】図１７は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＡＭライブラリー同定ワークフローの一実施形態を例示する図である。ＮＧＳ、次世代シーケンシング。
【図１８】図１８は、図１７に示されているｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＡＭ発見アッセイからの推定配列を提示する図である。各細菌から組換えによって精製されたＣａｓ９をｓｇＲＮＡおよびランダム化ＰＡＭを有する標的と共にインキュベートした。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９を対照として使用した。
【図１９】図１９は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒトゲノム内の単一の部位におけるパーセントゲノム編集を示す例示的なデータを提示するグラフである（上のパネル）。パーセンテージは、Ｔ７Ｅ１エンドヌクレアーゼアッセイ（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、ＨｐａＣａｓ９）またはＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノムに組み込まれた「トラフィックライト」レポーターに基づく蛍光アッセイ（ＳｍｕＣａｓ９に関して）を使用して推定されたインデル形成を示す。
【図２０】図２０は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞における種々のＰＡＭを有する種々のプロトスペーサーを標的とするＮｍｅ２Ｃａｓ９（Ｘ軸）を用いた組み込まれたトラフィックライトレポーターのゲノム編集を示す例示的なデータを提示するグラフである。結果から、ヒト細胞においてＮｍｅ２Ｃａｓ９にはＮＮＮＮＣＣ  ＰＡＭが好ましいことが示唆される。
【図２１】図２１は、種々の抗ＣＲＩＳＰＲ（Ａｃｒ）タンパク質の存在下でのＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるゲノム編集を示す例示的なデータを提示する図である。Ｔ７Ｅ１消化によりプラスミドトランスフェクション（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡを発現させるため）またはＲＮＡ／タンパク質送達（ＨｐａＣａｓ９およびそのｓｇＲＮＡ）後のゲノム編集が示される。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は２種のＡｃｒタンパク質（ＡｃｒＩＩＣ３ＮｍｅおよびＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａ）によって頑強に阻害され、一方、ＨｐａＣａｓ９は以前報告されたＩＩ−Ｃ型Ａｃｒのうちの４種によって阻害される。これらの結果から、これらの２種のＣａｓ９タンパク質が抗ＣＲＩＳＰＲによるオフスイッチ制御を受けることが示される。
【図２２】図２２は、「ＣＣ」ジヌクレオチドＰＡＭでＮｍｅ２Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を使用したトラフィックライトレポーター（ＴＬＲ）遺伝子編集の例示的なデータを提示するグラフである。図２２Ａ。青色の棒は、蛍光を示す細胞の％であり、赤色の棒は、配列決定により正確に基づいた％編集を示す（「ＴＩＤＥ解析」）。
【図２３】図２３は、ＡＡＶＳ１、第１４染色体ＮＴＳ４、ＶＥＧＦおよびＣＦＴＲ遺伝子座におけるＴ７Ｅ１アッセイを使用したＮｍｅ２Ｃａｓ９による遺伝子編集の例示的なデータを提示する図である。
【図２４】図２４は、野生型Ｎｍｅ２Ｃａｓ９細菌オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の一実施形態を提示する図である。
【図２５】図２５は、野生型Ｎｍｅ２Ｃａｓ９細菌タンパク質配列の一実施形態を提示する図である。
【図２６】図２６は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ヒトコドン最適化オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の一実施形態を提示する図である。黄色−ＳＶ４０  ＮＬＳ；緑色−３×−ＨＡタグ；青色：ｃＭｙｃ様ＮＬＳ。
【図２７】図２７は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ヒト化タンパク質配列の一実施形態を提示する図である。黄色−ＳＶ４０  ＮＬＳ；緑色−３×−ＨＡタグ；青色：ｃＭｙｃ様ＮＬＳ。
【図２８】図２８は、ＨｐａＣａｓ９細菌タンパク質配列の一実施形態を提示する図である。
【図２９】図２９は、ＳｍｕＣａｓ９ネイティブ細菌オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の一実施形態を提示する図である。
【図３０】図３０は、ＳｍｕＣａｓ９細菌タンパク質配列の一実施形態を提示する図である。
【図３１】図３１は、ＳｍｕＣａｓ９ヒトコドン最適化オープンリーディングフレームＤＮＡ配列の一実施形態を提示する図である。黄色−ＳＶ４０  ＮＬＳ；緑色−３×−ＨＡタグ；青色：ｃＭｙｃ様ＮＬＳ。
【図３２】図３２は、ＳｍｕＣａｓ９ヒト化タンパク質配列の一実施形態を提示する図である。黄色−ＳＶ４０  ＮＬＳ；緑色−３×−ＨＡタグ；青色：ｃＭｙｃ様ＮＬＳ。
【図３３】図３３は、短いＣリッチＰＡＭに適合性の例示的なＩＩ  Ｃ型Ｃａｓ９オルソログ単一ガイドＲＮＡ配列を提示する図である。黄色−ｃｒＲＮＡ；灰色−リンカー；紫色−ｔｒａｃｒＲＮＡ。
【図３４−１】図３４は、別個のＰＡＭを有する３つの密接に関連するＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９オルソログを例示する図である。図３４Ａ：Ｎｍｅ１Ｃａｓ９の予測される構造にマッピングしたＮｍｅ２Ｃａｓ９（左）とＮｍｅ３Ｃａｓ９（右）の変異した残基（オレンジ色の球体）を示す概略図。ＰＩＤ（黒色）における変異のクラスターが明らかである。図３４Ｂ：プロトスペーサーの下流にある１０ｎｔのランダム化ＰＡＭ配列を用いたｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＡＭ発見アッセイの実験ワークフロー。アダプターを切断生成物にライゲーションし、配列決定した。
【図３４−２】図３４Ｃ：細胞において前に示されている通り、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９に対するＮ４ＧＡＴＴ  ＰＡＭを実証するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＡＭ発見アッセイの配列ロゴ。図３４Ｄ：ＰＩＤがＮｍｅ２Ｃａｓ９（左）およびＮｍｅ３Ｃａｓ９（右）のＰＩＤと取り換えられたＮｍｅ１Ｃａｓ９が、５位のＣを認識することを示す配列ロゴ。残りのヌクレオチドは、タンパク質キメラの穏当な切断効率に起因して低い信頼度で決定された（図３５Ｃ）。
【図３４−３】図３４Ｅ：５位に固定化されたＣ、ならびにランダム化された１〜４ｎｔおよび６〜８ｎｔのＰＡＭを用いたＰＡＭ発見アッセイに基づいて、全長Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がＮ４ＣＣ  ＰＡＭを認識することを例示する配列ロゴ。
【図３５−１】図３５は、図３４に従った急速に進化しているＰＩＤを用いたＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９オルソログの特徴付けを示す図である。図３５Ａ：Ｎｍｅ１Ｃａｓ９に対して＞８０％同一であるＮｍｅＣａｓ９オルソログの無根の系統樹。３つの別個の枝が現れ、大多数の変異がＰＩＤにクラスター化した。群１（青色）Ｎｍｅ１Ｃａｓ９に対して＞９８％同一性を有するＰＩＤ、群２（オレンジ色）Ｎｍｅ１Ｃａｓ９に対して約５２％同一のＰＩＤを有する、および群３（緑色）Ｎｍｅ１Ｃａｓ９に対して約８６％同一のＰＩＤを有する。各群からの３つの代表的なＣａｓ９オルソログ（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＮｍｅ３Ｃａｓ９）に印が付されている。図３５Ｂ：（Ａ）からの３つのＣａｓ９オルソログ（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、およびＮｍｅ３Ｃａｓ９）をコードする株のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座を示す概略図。各ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分のＮ．ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ８０１３（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９をコードする）に対するパーセント同一性が示されている。
【図３５−２】図３５Ｃ：インタクトなＮｍｅ１Ｃａｓ９について、ならびにＮｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤがＮｍｅ２Ｃａｓ９およびＮｍｅ３Ｃａｓ９のＰＩＤに取り換えられたキメラについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイからの切断されたＤＮＡ由来のリードの数。リード計数の低減により、キメラにおける切断効率がより低いことが示される。
【図３５−３】図３５Ｄ：ＰＩＤがＮｍｅ２Ｃａｓ９（左）またはＮｍｅ３Ｃａｓ９（右）のＰＩＤに取り換えられたＮｍｅ１Ｃａｓ９によるＮＮＮＮＣＮＮＮランダム化ＰＡＭに対するｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＡＭ発見アッセイからの配列ロゴ。
【図３６−１】図３６は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が、２２〜２４ヌクレオチドのスペーサーを使用してＮ４ＣＣ  ＰＡＭに隣接する部位を認識し、編集することを示す図である。全ての実験を３連で行った。エラーバーは、平均値の標準誤差（ｓ．ｅ．ｍ．）を表す。図３６Ａ：ＨＥＫ２９３Ｔ  ＴＬＲ２．０細胞に対する一過性トランスフェクションワークフローを示す概略図。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡプラスミドをトランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後にｍＣｈｅｒｒｙ＋細胞を検出した。図３６Ｂ：ＴＬＲ２．０においてＮｍｅ２Ｃａｓ９を使用してＰＡＭのアレイを標的とする。Ｎ４ＣＣ  ＰＡＭを有する全ての部位が種々の程度の効率で標的とされたが、Ｎ４ＧＡＴＴ  ＰＡＭで、またはｓｇＲＮＡの不在下ではＮｍｅ２Ｃａｓ９による標的化は観察されなかった。ＳｐｙＣａｓ９（ＮＧＧを標的とする）およびＮｍｅ１Ｃａｓ９（Ｎ４ＧＡＴＴを標的とする）を陽性対照として使用した。
【図３６−２】図３６Ｃ：スペーサーの長さのＮｍｅ２Ｃａｓ９による編集の効率に対する影響。スペーサーの長さが２４ｎｔから２０ｎｔまで変動する（５’末端のＧを含む）、ＴＬＲ２．０部位（Ｎ４ＣＣＡ  ＰＡＭを有する）を標的とするｓｇＲＮＡ、２２〜２４ヌクレオチドのスペーサーを用いると編集効率が最も高いことが示されている。図３６Ｄ：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ニッカーゼ（ＨＮＨニッカーゼ＝Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｄ１６Ａ；ＲｕｖＣニッカーゼ＝Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｈ５８８Ａ）をタンデムに使用して、ＴＬＲ２．０内にインデルを生成することができる。３２塩基対および６４塩基対離れた切断部位を有する標的を、いずれかのニッカーゼを使用して標的として、インデルを生成した。ＨＮＨニッカーゼは、特に切断部位が近い場合に（３２ｂｐ）、効率的な編集を示す。野生型Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を対照として使用した。緑色はＧＦＰ（ＨＤＲ）であり、赤色はｍＣｈｅｒｒｙ（ＮＨＥＪ）である。
【図３７−１】図３７は、図３６に従った哺乳動物細胞におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９による標的化のためのＰＡＭ、スペーサー、およびシードエレメントに関する例示的なデータを提示するグラフである。全ての実験を３連で行った。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍを表す。図３７Ａ：ＴＬＲ２．０におけるＮ４ＣＤ部位へのＮｍｅ２Ｃａｓ９による標的化。試験した位置（Ｎ４ＣＡ、Ｎ４ＣＴおよびＮ４ＣＧ）における各非Ｃヌクレオチドについて４つの部位を調査し、Ｎ４ＣＣ部位を陽性対照として使用した。
【図３７−２】図３７Ｂ：ＴＬＲ２．０におけるＮ４ＤＣ部位へのＮｍｅ２Ｃａｓ９による標的化［（Ａ）と同様］。
【図３７−３】図３７Ｃ：別のＴＬＲ２．０部位に対するガイド短縮。図３６Ｃにおいて観察されたものと同様の長さが必要であることが明らかになった。図３７Ｄ：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９による標的化効率は、シード配列内の単一ヌクレオチドミスマッチに対して示差的な感受性を有する。データから、ＴＬＲ標的部位においてｓｇＲＮＡ内の単一ヌクレオチドミスマッチを２３ｎｔのスペーサーに沿って動かすことの影響が示される。
【図３８】図３８は、多数の送達方法による哺乳動物細胞におけるゲノム遺伝子座でのＮｍｅ２Ｃａｓ９によるゲノム編集効率を示す例示的なデータを提示するグラフである。結果は全て、３回の独立した生物学的反復を表し、エラーバーはｓ．ｅ．ｍを表す。図３８Ａ：ＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒトゲノム全体を通した遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡを用いた一過性トランスフェクションを使用したＮｍｅ２Ｃａｓ９によるゲノム編集。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９によって誘導される、異なる遺伝子座におけるインデルの範囲（ＴＩＤＥによって検出される）を実証するために、３８の部位の最初のスクリーニングに基づいて１４の部位を選択した。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９標的部位（Ｎ４ＧＡＴＴ  ＰＡＭを有する）を陰性対照として使用した。図３８Ｂ：左のパネル：ＴＩＤＥによって検出される、Ｈｅｐａ１−６マウス細胞におけるＰｃｓｋ９遺伝子座およびＲｏｓａ２６遺伝子座を標的とする一体型プラスミド（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ）の一過性トランスフェクション。右のパネル：レンチベクター由来のＮｍｅ２Ｃａｓ９を安定に発現するＫ５６２細胞へのｓｇＲＮＡプラスミドの電気穿孔の結果、意図された遺伝子座において効率的なインデル形成がもたらされる。図３８Ｃ：効率的なゲノム編集のためにＮｍｅ２Ｃａｓ９をＲＮＰ複合体として電気穿孔することができる。Ｃａｓ９  ４０ピコモルを３つの異なる遺伝子座を標的とするｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｓｇＲＮＡ  ５０ピコモルと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞に電気穿孔した。７２時間後にＴＩＤＥを使用してインデルを測定した。
【図３９−１】図３９は、図３８に従ったＮｍｅ２Ｃａｓ９による用量依存性およびブロック欠失を示す例示的なデータを提示する図である。図３９Ａ：電気穿孔するＮｍｅ２Ｃａｓ９プラスミドの用量を増加させること（５００ｎｇ、図３Ａの２００ｎｇに対して）により、２つの部位（ＴＳ１６およびＴＳ６）における編集効率が改善される。
【図３９−２】図３９Ｂ：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を使用してブロック欠失を創出することができる。３２ｂｐ離れた切断部位を有する２つのＴＬＲ２．０標的をＮｍｅ２Ｃａｓ９を用いて同時に標的とした。創出された大多数の傷害が正確に３２ｂｐの欠失（緑色）であった。
【図４０−１】図４０は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９遺伝子編集活性を阻害するためにＩＩ−Ｃ型抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質を使用することができること（例えば、オフスイッチとして）を示す例示的なデータを提示する図である。全ての実験を３連で行った。エラーバーは、ｓ．ｅ．ｍを表す。図４０Ａ：５種の以前に特徴付けられた抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の存在下（１０：１の比のＡｃｒ：Ｃａｓ９）でのＮｍｅ１Ｃａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９のｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイ。上：Ａｃｒの不在下または対照Ａｃｒ（ＡｃｒＥ２）の存在下では、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９によりＮ４ＧＡＴＴ  ＰＡＭを有するプロトスペーサーを含有する断片が効率的に切断される。予測通り、他の全ての以前に特徴付けられたＡｃｒによりＮｍｅ１Ｃａｓ９が阻害された。下：ＡｃｒＥ２およびＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕの存在下でＮｍｅ２Ｃａｓ９によりＮ４ＣＣ  ＰＡＭを有するプロトスペーサーを含有する標的が効率的に切断され、これにより、ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕが１０：１モル比ではＮｍｅ２Ｃａｓ９を阻害することができないことが示唆される。
【図４０−２】図４０Ｂ：５種の以前に記載された抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質の存在下でのゲノム編集。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９、ｓｇＲＮＡおよびそれぞれのＡｃｒを発現するプラスミド（Ｃａｓ９  ２００ｎｇ、ｓｇＲＮＡ  １００ｎｇ、Ａｃｒ  ２００ｎｇ）をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に同時トランスフェクトし、トランスフェクションの７２時間後にＴＩＤＥを使用してゲノム編集を測定した。ＡｃｒＥ２およびＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕ以外は、効率は異なったが、他の全てのＡｃｒによりゲノム編集が阻害された。
【図４０−３】図４０Ｃ：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９のＡｃｒによる阻害は用量依存的であり、別個の明らかな効力が伴う。ＡｃｒＩＩＣ１ＮｍｅおよびＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａでは、それぞれ２：１および１：１の同時トランスフェクトされたプラスミドの比で、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が完全に阻害された。
【図４１】図４１は、図４０に従った、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９  ＰＩＤ取換えによりＮｍｅ１Ｃａｓ９がＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕによる阻害に対して非感受性になることを示す例示的なデータを提示する図である。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ＰＩＤキメラによるｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断を以前に特徴付けられたＡｃｒタンパク質の存在下で実施した（Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ  １０μＭ＋Ａｃｒ  １００μＭ）。
【図４２−１】図４２は、哺乳動物細胞においてＮｍｅ２Ｃａｓ９が検出可能なオフターゲットを有さないことを示す例示的なデータを提示する図である。図４２Ａ：ＰＡＭが重複していないことにより、ＳｐｙＣａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９の両方によって標的とすることができる二重部位（ＤＳ）を示す概略図。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９  ＰＡＭ（オレンジ色）およびＳｐｙＣａｓ９  ＰＡＭ（青色）が強調表示されている。図４２Ｂ：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９により二重部位におけるインデルが誘導される。ＧＮ３ＧＮ１９ＮＧＧＮＣＣ配列を有するＶＥＧＦＡにおける６つの二重部位を２つのオルソログ間の直接比較のために選択した。各Ｃａｓ９（同じプロモーターおよびＮＬＳを有する）を発現するプラスミドを各オルソログの同類ガイドと共にＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後にインデル率をＴＩＤＥによって決定した。６つの部位全てにおいてＮｍｅ２Ｃａｓ９による編集が検出可能であり、２つの部位（ＤＳ２および６）でＳｐｙＣａｓ９よりも効率的であった。ＳｐｙＣａｓ９では６つの部位のうち４つ（ＤＳ１、２、４および６）が編集され、２つの部位でＮｍｅ２Ｃａｓ９よりも有意に高い編集率が示された（ＤＳ１および４）。ＤＳ２、４および６では、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が、それぞれＳｐｙＣａｓ９と同等に効率的であった、ＳｐｙＣａｓ９よりも効率が低かった、およびＳｐｙＣａｓ９よりも効率的であったので、これらの部位をＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ解析のために選択した。
【図４２−２】図４２Ｃ：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は、ヒト細胞においてきれいなオフターゲットプロファイルを有する。個々の標的部位において各ヌクレアーゼについてＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑによって検出されたオフターゲット部位の数が示されている。ＳｐｙＣａｓ９オフターゲット数が黒色で示されている。二重部位に加えて、ＴＳ６（高い効率およびオフターゲットについての潜在性が理由で）および２つのマウス部位（別の細胞型における正確度を試験するために）でもガイド１つ当たりゼロまたは１つのオフターゲット部位が示された。
【図４２−３】図４２Ｄ：標的化ディープシーケンシングにより、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって示されたＮｍｅ２Ｃａｓ９の高い正確度が確認される。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって検出された上位のオフターゲット遺伝子座を増幅し、ディープシーケンシングを行った。ＳｐｙＣａｓ９では大多数の遺伝子座においてオフターゲティングが示されたが、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９では、ただ１つ（Ｒｏｓａ２６部位）でオフターゲット遺伝子座における編集が比較的低レベル（約４０％のオンターゲット対約１％のオフターゲット）で示された。ｙ軸の対数目盛に留意されたい。
【図４２−４】図４２Ｅ：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の効率は、遺伝子座および標的部位に基づいて変動する。ゲノム全体を通した部位（ＧＮ３ＧＮ１９ＮＧＧＮＣＣ配列を有する）を２つのオルソログによる編集の直接比較のために選択した。各Ｃａｓ９（同じプロモーター、リンカー、タグおよびＮＬＳを有する）およびその同類ガイドを発現するプラスミドをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後にインデル効率をＴＩＤＥによって決定した。箱ひげ図は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９による２８の二重部位における編集効率を示す（左）。編集が示されなかった部位は解析から除外した。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９とＳｐｙＣａｓ９の相対的な効率により、平均して、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がＳｐｙＣａｓ９よりも効率が低いことが示される（右）。２８の部位全てにおける両方のＣａｓ９オルソログによる編集効率を右のパネルの相対的な効率の解析に含めた。図４２Ｆは、Ｒｏｓａ２６ガイドの確証されたオフターゲット部位の核酸配列を提示し、ＰＡＭ領域（下線が引かれている）、コンセンサスＣＣ  ＰＡＭジヌクレオチド（太字）、およびスペーサーのＰＡＭ遠位部分における３つのミスマッチ（赤色）が示されている。
【図４３−１】図４３は、図４２に従った、二重標的部位におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の直交性および相対的な正確度を示す例示的なデータを提示する図である。図４３Ａ：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９ガイドとＳｐｙＣａｓ９ガイドは直交性である。ＴＩＤＥの結果から、ＤＳ１２を標的とする両方のヌクレアーゼにより、それらの同類ｓｇＲＮＡ、または他のオルソログのｓｇＲＮＡのいずれかと共に創出されたインデルの頻度が示される。
【図４３−２】図４３Ｂ：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９とＳｐｙＣａｓ９は、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑの間、同等のオンターゲット編集効率を示す。棒は、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑからの、各オルソログによって標的とされた３つの二重部位におけるオンターゲットリード計数を示す。オレンジ色の棒はＮｍｅ２Ｃａｓ９を表し、黒色の棒はＳｐｙＣａｓ９を表す。
【図４３−３】図４３Ｃ：各部位についてのＳｐｙＣａｓ９のオンターゲットリード対オフターゲットリード。オレンジ色の棒はオンターゲットリードを表し、黒色の棒はオフターゲットを表す。
【図４３−４】図４３Ｄ：各部位についてのＮｍｅ２Ｃａｓ９のオンターゲットリード対オフターゲットリード。
【図４３−５】図４３Ｅ：ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋに基づいて予測されたオフターゲット部位におけるＴＩＤＥを示す棒グラフ。オフターゲット遺伝子座におけるインデルは検出されなかった。
【図４４−１】図４４は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける一体型ＡＡＶ送達を介したＮｍｅ２Ｃａｓ９によるゲノム編集を示す例示的なデータを提示する図である。図４４Ａ：Ｐｃｓｋ９を標的とすることによってマウスにおけるコレステロールレベルを低下させるためのＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡの送達のワークフロー。上：Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを発現する一体型ＡＡＶベクターの概略図。下：ＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ尾静脈注射、その後の、１４日目のコレステロール測定、ならびに２８日目のインデル、組織学およびコレステロール分析の時系列。図４４Ｂ：Ｐｃｓｋ９遺伝子座およびＲｏｓａ２６遺伝子座（対照）を標的とするＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡを注射したマウスの肝臓から抽出したＤＮＡにおけるインデルを測定するためのディープシーケンシング解析。
【図４４−２】図４４Ｃ：Ｐｃｓｋ９を標的とするガイドを注射したマウスにおける、Ｒｏｓａ２６を標的とする対照と比較して低減した血清コレステロールレベル。Ｐ値は対応のないＴ検定によって算出される。図４４Ｄ：ＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲｏｓａ２６ベクター（左）またはＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＰｃｓｋ９ベクター（右）を注射したマウスの肝臓からのＨ＆Ｅ染色。スケールバー、２５μｍ。
【図４５】図４５は、最小化ＡＡＶ骨格および従来のサイズのＡＡＶ骨格に対する例示的な比較ＴＬＲ２．０データの一実施形態を提示する図である。
【図４６】図４６は、短縮されたｓｇＲＮＡ  １１のＮｍｅ２Ｃａｓ９構造と短縮されたｓｇＲＮＡ  １２のＮｍｅ２Ｃａｓ９構造の比較を提示する図である。
【図４７】図４７は、短いポリＡシグナルを有する最小化一体型ＡＡＶの一実施形態を例示する図である。
【図４８−１】図４８は、最小化一体型ＡＡＶ骨格の２つの実施形態を例示する図である。タンデムな二重ｓｇＲＮＡ（上）。相同組換え修復のためのドナー鋳型（下）。
【図４８−２】同上。
【図４９】図４９は、一体型ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９構築物の確証を提示する図である。図４９Ａ：ヒトコドン最適化Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡを発現する単一のｒＡＡＶベクターの略図。骨格はＡＡＶ末端逆位配列（ＩＴＲ）に挟まれている。ポリ（ａ）シグナルはウサギベータグロビン（ＢＧＨ）由来のものである。図４９Ｂ：Ｐｃｓｋ９（上）およびＲｏｓａ２６（下）マウス遺伝子の概略図。赤色の棒はエクソンを表す。拡大図はプロトスペーサー配列（赤色）を示し、同時にＮｍｅ１Ｃａｓ９  ＰＡＭ配列が緑色で強調表示されている。二本鎖切断が位置する部位が示されている（黒色の矢じり）。図４９Ｃ：Ｐｃｓｋ９（ｓｇＰｃｓｋ９）およびＲｏｓａ２６（ｓｇＲｏｓａ２６）遺伝子を標的とする、Ｈｅｐａ１−６細胞へのＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９プラスミドトランスフェクション後に、ＴＩＤＥによって得られた挿入−欠失（インデル）の代表的なパーセンテージ分布を示す積み上げヒストグラム。データは、３回の生物学的反復からの平均値±ＳＤとして提示されている。図４９Ｄ：ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９プラスミドの流体力学的注射後にＴＩＤＥによって得られた、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスの肝臓におけるＰｃｓｋ９におけるインデルの代表的なパーセンテージ分布を示す積み上げヒストグラム。
【図５０】図５０は、マウスゲノムにおいて、多くのＮ４ＧＮ３  ＰＡＭが不活性であり、４つ未満のミスマッチではオフターゲット部位は明らかにならなかったことを示す例示的なデータを提示するグラフである。
【図５１】図５１は、遺伝性チロシン血症Ｉ型マウスにおいて、ＨｐｄのＮｍｅ１Ｃａｓ９媒介性ノックアウトにより、致死的な表現型がレスキューされることを示す例示的なデータを提示する図である。図５１Ａ：Ｈｐｄマウス遺伝子の概略図。赤色の棒はエクソンを表す。拡大図は、エクソン８（ｓｇＨｐｄ１）およびエクソン１１（ｓｇＨｐｄ２）を標的とするためのプロトスペーサー配列（赤色）を示す。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ＰＡＭ配列が緑色になっており、二本鎖切断位置が示されている（黒色の矢じり）。図５１Ｂ：実験設計。遺伝性チロシン血症Ｉ型Ｆａｈ−／−マウスの３つの群に、ＰＢＳまたは一体型ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９プラスミドｓｇＨｐｄ１もしくはｓｇＨｐｄ２を注射する。図５１Ｃ：ＰＢＳ（緑色）、ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９プラスミドである、Ｈｐｄエクソン８を標的とするｓｇＨｐｄ１（赤色）またはＨｐｄエクソン１１を標的とするｓｇＨｐｄ２（青色）を流体力学的に注射したマウスの体重を、ＮＴＢＣ離脱後にモニターした。エラーバーは、ＰＢＳ群およびｓｇＨｐｄ１群のマウス３匹ならびにｓｇＨｐｄ２群のマウス２匹を表す。データは平均±ＳＤとして提示されている。図５１Ｄ：ＰＢＳまたはｓｇＨｐｄ１およびｓｇＨｐｄ２プラスミドの流体力学的注射後にＴＩＤＥによって得られた、Ｆａｈ−／−マウスの肝臓におけるＨｐｄにおけるインデルの代表的なパーセンテージ分布を示す積み上げヒストグラム。ＮＴＢＣ離脱の最後に（４３日目）肝臓を収集した。
【図５２】図５２は、図５１に提示されているガイドの平均インデル効率を示す例示的なデータを提示するグラフである。
【図５３】図５３は、ｓｇＨｐｄ１で処置したマウスおよびｓｇＨｐｄ２で処置したマウスでは、ＰＢＳを注射したマウスと比較して多核肝細胞の数が少ないことによって示される通り、ＰＢＳを注射したＦａｈｍｕｔ／ｍｕｔマウスと比較して肝損傷の重症度が実質的に低いことを示す例示的な組織学的顕微鏡写真である。
【図５４】図５４は、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるゲノム編集のためのＮｍｅ１Ｃａｓ９のＡＡＶによる送達を提示する図である。図５４Ａ：Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにおいてＰｃｓｋ９（ｓｇＰｃｓｋ９）およびＲｏｓａ２６（ｓｇＲｏｓａ２６）を標的とするためのＡＡＶ８−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９ベクター尾静脈注射の実験の概略。マウスを注射の４日後（ｎ＝１）または５０日後（ｎ＝５）に屠殺し、肝組織を収集した。注射後０日目、２５日目、および５０日目にコレステロールレベル測定のために血清を採取した。図５４Ｂ：血清コレステロールレベル。ｐ値は対応のないｔ検定によって算出される。図５４Ｃ：標的化ディープシーケンシング解析によって測定された、マウスの肝臓におけるＰｃｓｋ９またはＲｏｓａ２６におけるインデルの代表的なパーセンテージ分布を示す積み上げヒストグラム。データはコホート１つ当たり５匹のマウスからの平均±ＳＤとして提示されている。図５４Ｄ：５０日目のマウス肝臓ホモジネートから採取された総タンパク質を使用した代表的な抗ＰＣＳＫ９ウエスタンブロット。組換えマウスＰＣＳＫ９（ｒ−ＰＣＳＫ９）合計２ｎｇを移動度標準として含めた。アスタリスクは、対照組換えタンパク質よりも大きな交差反応性タンパク質を示す。
【図５５】図５５は、ＡＡＶ８−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９を注射したマウスが抗Ｎｍｅ１Ｃａｓ９抗体を産生することを示す例示的なデータを提示するグラフである。
【図５６】図５６は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のＧＵＩＤＥ−ｓｅｑゲノムワイド特異性を示す例示的なデータを提示する図である。データは平均±ＳＤとして提示されている。図５６Ａ：オンターゲット（ＯｎＴ）部位およびオフターゲット（ＯＴ）部位についてのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑリードの数。図５６Ｂ：Ｈｅｐａ１−６細胞におけるＯＴ部位のそれぞれにおける傷害率を測定するための標的化ディープシーケンシング。各ＯＴ部位のＯｎＴプロトスペーサーとのミスマッチが強調表示されている（青色）。データは３回の生物学的反復からの平均±ＳＤとして提示されている。図５６Ｃ：一体型ＡＡＶ８−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＰｃｓｋ９およびｓｇＲｏｓａ２６を注射し、注射後１４日目（Ｄ１４）または５０日目（Ｄ５０）に屠殺したマウスから得たゲノムＤＮＡを使用した、ＯＴ部位のそれぞれにおける傷害率を測定するための標的化ディープシーケンシング。
【図５７】図５７は、図５８に関連する、マウス接合体におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９によるｅｘ  ｖｉｖｏにおけるチロシナーゼ（Ｔｙｒ）遺伝子編集についての例示的なデータを提示する図である。図５７Ａ：Ｈｅｐａ１−６細胞において、それぞれＮ４ＣＣ  ＰＡＭを有するＴｙｒ遺伝子内の２つの部位を編集について試験した。ｓｇＴｙｒ２ガイドがより高い編集効率を示し、これをさらなる試験のために選択した。図５７Ｂ：７匹のマウスが生後発育を生き延び、それぞれが、毛色表現型ならびにＴＩＤＥによってアッセイされるオンターゲット編集を示した。図５７Ｃ：ＴＩＤＥ解析によって示された、図５７Ｂの各マウスの尾部ＤＮＡからのインデルスペクトル、ならびに編集されていないＣ５７ＢＬ／６ＮＪマウス。種々のサイズの挿入（正）および欠失（負）の効率が示されている。
【図５８】図５８は、一体型ＡＡＶ送達を使用したｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＮｍｅ２Ｃａｓ９によるゲノム編集の例示的なデータを提示する図である。図５８Ａ：Ｔｙｒ遺伝子を標的とすることによってアルビノＣ５７ＢＬ／６ＮＪマウスを生成するためのｅｘ  ｖｉｖｏにおける単一ＡＡＶ  Ｎｍｅ２Ｃａｓ９による編集のワークフロー。接合体を、ＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９：ｓｇＴｙｒを含有するＫＳＯＭ中で５〜６時間培養し、Ｍ２中ですすぎ、１日培養した後、偽妊娠レシピエントの卵管に移入する。図５８Ｂ：３×１０９ＧＣのＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９：ｓｇＴｙｒを有する接合体によって生じた、アルビノ（左）およびチンチラまたは斑（中央）マウス、ならびに３×１０８ＧＣのＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９：ｓｇＴｙｒを有する接合体によって生じた、チンチラまたは斑マウス（右）。図５８Ｃ：２つのＡＡＶ用量でのＮｍｅ２Ｃａｓ９．ｓｇＴｙｒ単一ＡＡＶのｅｘ  ｖｉｖｏにおけるＴｙｒ編集実験の要約。
【図５９】図５９は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９ヌクレオチド配列とＮｍｅ２Ｃａｓ９ヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。説明文：非ＰＩＤ  ａａの差異（青緑色の影付き）；ＰＩＤ  ａａの差異（黄色の影付き）；活性部位残基（赤色の文字）。
【図６０】図６０は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９ヌクレオチド配列とＮｍｅ３Ｃａｓ９ヌクレオチド配列のアラインメントを示す図である。説明文：非ＰＩＤ  ａａの差異（青緑色の影付き）；ＰＩＤ  ａａの差異（黄色の影付き）；活性部位残基（赤色の文字）。
【図６１】図６１は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９アミノ酸配列の一実施形態を示す図である。説明文：ＳＶ４０  ＮＬＳ（黄色の影付き）；３×−ＨＡタグ（緑色の影付き）；ｃＭｙｃ様ＮＬＳ（青緑色の影付き）；リンカー（紫色の影付き）。
【図６２】図６２は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９アミノ酸配列の一実施形態を示す図である。説明文：ＳＶ４０  ＮＬＳ（黄色の影付き）；３×−ＨＡタグ（緑色の影付き）；ヌクレオプラスミン様ＮＬＳ（赤色の影付き）；ｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ（青緑色の影付き）；リンカー（紫色の影付き）。
【図６３】図６３は、組換えＮｍｅ２Ｃａｓ９（ｒＮｍｅ２Ｃａｓ９）アミノ酸配列の一実施形態を示す図である。説明文：ＳＶ４０  ＮＬＳ（黄色の影付き）；ヌクレオプラスミン様ＮＬＳ（赤色の影付き）；リンカー（紫色の影付き）。
【図６４】図６４は、一体型ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅＣａｓ９プラスミドヌクレオチド配列の一実施形態を示す図である。説明文：ｓｇＲＮＡ足場（褐色の文字）；ガイド配列（黒色の文字）；Ｕ６プロモーター（青色の文字）；Ｕ１ａプロモーター（紫色の文字）：ＮＬＳ  ＮＬＳ（緑色の文字）；ｈＮｍｅＣａｓ９（赤色の文字）；ＮＬＳ  ３×−ＨＡおよびＮＬＳ  ＢＧＨ−ｐＡ（緑色／黒色交互の文字）。
【発明を実施するための形態】
【００７８】
本発明は、遺伝子治療のための組成物および方法に関する。本明細書に記載のいくつかの手法では、超高正確度ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集プラットフォームをもたらすＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９系を利用する。さらに、本発明は、このＣａｓ９系の改善：例えば、単一ガイドＲＮＡ配列を短縮すること、および−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９またはＮｍｅ２Ｃａｓ９をそのガイドＲＮＡと共にｉｎ  ｖｉｖｏ投与に適合性のアデノ随伴ウイルスベクターに詰め込むことを組み入れる。さらに、１〜４個の間の必要なヌクレオチドに限定されたプロトスペーサー隣接モチーフ配列を標的とするＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログが同定されている。
【００７９】
Ｉ．Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９）／ＣＲＩＳＰＲ遺伝子編集の正確度
以前に、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  Ｃａｓ９（Ｎｍｅ１Ｃａｓ９）と称されるＩＩ−Ｃ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の超高正確度バージョンが報告された。超高正確度であることに加えて、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９はまた、広く使用されているＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ  Ｃａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）よりも小さく、それにより、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９をウイルスおよびメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に基づく方法によってより容易に送達することが可能になる。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９を用いたゲノム編集は、一般には、プラスミドトランスフェクションを使用して達成されている。Zhang  et  al.,  "Processing-independent  CRISPR  RNAs  limit  natural  transformation  in  Neisseria  meningitidis"  Mol  Cell  50:488-503  (2013)；Hou  et  al.,  "Efficient  genome  engineering  in  human  pluripotent  stem  cells  using  Cas9  from  Neisseria  meningitidis"  Procd  Natl  Acad  Sci  U.S.A.  110:15644-15649  (2013)；Esvelt  et  al.,  "Orthogonal  Cas9  proteins  for  RNA-guided  gene  regulation  and  editing"  Nature  Methods  10:1116-1121  (2013)；Zhang  et  al.,  "DNase  H  activity  of  Neisseria  meningitidis  Cas9"  Mol  Cell  60:242-255  (2015)；Lee  et  al.,  "The  Neisseria  meningitidis  CRISPR-Cas9  system  enables  specific  genome  editing  in  mammalian  cells"  Molecular  Therapy  24:645-654  (2016)；Pawluk  et  al.,  "Naturally  occurring  off-switches  for  CRISPR-Cas9"  Cell  167:1829-1838  (2016)；およびAmrani  et  al.,  "Nme1Cas9  is  an  intrinsically  high-fidelity  genome  editing  platform"  biorxiv.org/content/early/2017/08/04/172650  (2017)。
【００８０】
しかし、ウイルスに基づくＮｍｅ１Ｃａｓ９送達、ＲＮＡに基づくＮｍｅ１Ｃａｓ９送達およびリボ核タンパク質（ＲＮＰ）に基づくＮｍｅ１Ｃａｓ９送達は広範囲には探究されていない。ゲノムを操作するためのＣａｓ９オルソログのＲＮＡに基づく送達およびＲＮＰに基づく送達には、他の送達方法よりも有利な点がいくつかある。ＲＮＡに基づく送達およびＲＮＰに基づく送達は、Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡのＤＮＡに基づく送達に関連する発現問題を迂回するのでより速い編集がもたらされるだけでなく、Ｃａｓ９に基づく編集に付随するオフターゲット効果も低減する。オフターゲット活性の低減は、Ｃａｓ９  ＲＮＡおよびＲＮＰ濃度のより細かな制御、ならびに細胞におけるＣａｓ９  ＲＮＡおよびＲＮＰ分解が比較的急速であることに起因する。細胞内に活性なＣａｓ９が長期にわたって存在することは、オフターゲット効果がより高いことに関連付けられることが示されている。Ｃａｓ９  ＲＮＡおよびＲＮＰは細胞内でより急速に分解されるので、ＲＮＡまたはＲＮＰとして送達されるＣａｓ９は長期間持続せず、したがって、オフターゲット効果が低減する。
【００８１】
慣習的に使用される全長１４５ｎｔのＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡは、４８ヌクレオチド（ｎｔ）のｃｒＲＮＡ、４ｎｔのリンカー、および９３ｎｔのｔｒａｃｒＲＮＡを含む。ｓｇＲＮＡのｃｒＲＮＡ領域は、第１の２４ｎｔのスペーサー配列、および、２４ｎｔのｔｒａｃｒＲＮＡアンチリピート５’領域と対合し、それにより、リピート：アンチリピート領域を形成する第２の２４ｎｔのリピート配列で構成される。残りの６９ｎｔのｔｒａｃｒＲＮＡ領域は、Ｓｔｅｍ  １領域およびＳｔｅｍ  ２領域を含む。図１。
【００８２】
この全長Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡは、プラスミドに基づく方法を使用したゲノム編集のために首尾よく使用されている。さらに、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡを、精製されたＮｍｅ１Ｃａｓ９と複合体を形成させ、ヒト細胞におけるゲノム編集のために使用することができる。ヒト細胞のゲノム編集はｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｓｇＲＮＡを用いて成功しているが、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ＲＮＰの編集効率は、ＰＬＢ９８５などのトランスフェクトが難しいヒト細胞株では低減する。
【００８３】
Ｃａｓ９  ＲＮＰの編集効率がそれらのｓｇＲＮＡの化学的安定性に比例することが以前示されている。発明の機構を理解する必要はないが、いくつかの細胞機構がＲＮＡを急速に分解するために使用されると考えられる。このような理由で、Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡは常套的に化学的手段によって修飾される。ｓｇＲＮＡに増大した安定性を付与する化学修飾の一部として、これだけに限定されないが、リボース２’−Ｏ−メチル化および／またはホスホロチオエート連結が挙げられる。化学修飾されたＲＮＡは、Ｃａｓ９  ＲＮＰによるゲノム編集の改善のための選択肢であるが、それらの効果は、ＲＮＡの化学合成がＲＮＡの長さが増大するにつれてますます難しく、費用がかかるようになるという事実によって限定される。１４５ｎｔでは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ合成は、化学的に合成されたｓｇＲＮＡを使用する常套的なゲノム編集適用に到達できるものではない。
【００８４】
ＩＩ．短縮されたＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡ配列
全長１４５ｎｔのＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡがゲノム編集のためのｓｇＲＮＡの常套的な化学合成には大きすぎるという上記の同定された限定に起因して、本発明の一実施形態では、短縮されたＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡが意図されている。発明の機構を理解する必要はないが、短縮されたＮｍｅ１Ｃａｓ−ｓｇＲＮＡはＮｍｅ１Ｃａｓ９  ＲＮＰの機能を損なうものではないと考えられる。さらに、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９に対するｓｇＲＮＡとＮｍｅ２Ｃａｓ９に対するｓｇＲＮＡは、同一であり、交換することができ（図３５Ｂ）、したがって、ｓｇＲＮＡ短縮は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９のどちらにも同等に適用可能である。短縮されたｓｇＲＮＡおよび関連する標的部位の例示的な配列を以下に開示し、そこではガイド領域内の変動するｓｇＲＮＡのｎｔ数は「Ｎ」残基として示されている。標的配列内では、ｓｇＲＮＡガイド領域によって認識される２４ｎｔに下線が引かれており、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）領域が太字で示されている。表１。
【表１】
2021502097.tif 000003
【００８５】
本明細書において意図されている通り、短縮されたＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡは、妥当な費用での合成を可能にするだけでなく、ＤＮＡの許容される長さが限られるウイルスに基づく送達方法（例えば、例えば、アデノ随伴ウイルス送達プラットフォーム）における使用も容易にするものである。一実施形態では、短縮されたｓｇＲＮＡにより、オフターゲットＮｍｅ１Ｃａｓ９編集効果が低減する。一実施形態では、短縮されたＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９編集効率を上昇させる化学修飾を少なくとも１つ含む。
【００８６】
上で考察している通り、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９の全長１４５ｎｔのｓｇＲＮＡは、ガイド領域、リピート：アンチリピート二重鎖領域、Ｓｔｅｍ  １領域およびＳｔｅｍ  ２領域を含む。図１。しかし、ｓｇＲＮＡの長さが常套的なゲノム編集（ｇｅｎｏｍｉｃ  ｅｄｉｔｉｎｇ）のためには問題があるので、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のための短縮されたｓｇＲＮＡを開発することが高度に望ましかった。現在、市販のＲＮＡ合成方法では、ＲＮＡ最終生成物が約１００ｎｔを超えないことが必要である。
【００８７】
一実施形態では、本発明は、短縮されたリピート：アンチリピート二重鎖を含むＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡを意図している。一実施形態では、本発明は、短縮されたｓｔｅｍ  ２を含むＮｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡを意図している。図２。さらに、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９の５’可変性ガイドｃｒＲＮＡ領域（例えば、スペーサー領域）も機能喪失を伴わずに数ヌクレオチド短縮することができることが以前示されている。Amrani  et  al.,  "Nme1Cas9  is  an  intrinsically  high-fidelity  genome  editing  platform"  biorxiv.org/content/early/2017/08/04/172650  (2017)；およびLee  et  al.,  "The  Neisseria  meningitidis  CRISPR-Cas9  system  enables  specific  genome  editing  in  mammalian  cells"  Molecular  Therapy  24:645-654  (2016)。
【００８８】
一実施形態では、本発明は、１００ｎｔのＮｍｅ１Ｃａｓ９短縮ｓｇＲＮＡを意図している。図３、構築物＃１１。この１００ｎｔのＮｍｅ１Ｃａｓ９短縮ｓｇＲＮＡ構築物＃１１を、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において一過性トランスフェクションによって３つの異なるヒトゲノム部位に対して試験し、３つの部位全てにおいて、全長Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡよりも良好とはいかないまでも同じレベルでＮｍｅ１Ｃａｓ９機能が支持される。図３、下のパネル。さらに、ｓｇＲＮＡ  １１およびｓｇＲＮＡ  １３を同様にいくつかのゲノム標的部位においてＲＮＰによる送達を使用して試験し、編集効率はｗｔ  ｓｇＲＮＡと同様であるかそれよりも高かった。図４。構築物＃１１の合成バージョンもＰＬＢ９８５細胞において試験し、その結果、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｗｔ  ｓｇＲＮＡと比べて高い編集効率がもたらされた。図５。
【００８９】
ＩＩＩ．関連するアデノウイルスＣＲＩＳＰＲ送達プラットフォーム
転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）およびジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）と比較して、Ｃａｓ９は、それらの柔軟性および多用性によって区別される。Komor  et  al.,  "CRISPR-based  technologies  for  the  manipulation  of  eukaryotic  genomes"  Cell  2017;168:20-36。そのような特性により、Ｃａｓ９はゲノム工学の分野を前進させるために理想的なものになる。過去数年にわたって、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９は、遺伝子治療および個別化医療における有望な適用に加えて、農業、食物、および産業において生産物を増強するために使用されてきた。Barrangou  et  al.,  "Applications  of  CRISPR  technologies  in  research  and  beyond"  Nat  Biotechnol.  2016;34:933-41。記載されているクラス２  ＣＲＩＳＰＲ系の多様性にもかかわらず、それらのうちのほんの少数だけがｉｎ  ｖｉｖｏにおけるゲノム編集のために開発され、確証されている。本明細書で示されているように、ＮｍｅＣａｓ９は、今後の一体型ｒＡＡＶを使用したｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集適用について検討することができる、小型の高忠実度のＣａｓ９である。ＮｍｅＣａｓ９の独特のＰＡＭにより、他の２つの小型の一体型ｒＡＡＶ有効オルソログ（ＳａｕＣａｓ９およびＣｊｅＣａｓ９）では到達し難い追加的な標的における編集が可能になる。
【００９０】
細菌ＣＲＩＳＰＲ系を使用したゲノム編集により、ヒト遺伝子治療のための新しい道が開かれた。細菌における侵入性核酸の切れ端を捕捉するクラスター化された規則的な配置の短い回文配列リピートに由来し、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、相補的な二本鎖ＤＮＡを切断するようにヌクレアーゼＣａｓ９（ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９）を方向付けるガイドＲＮＡ（例えば、ｓｇＲＮＡ）を含む。Ｃａｓ９により誘導されたＤＮＡ切断の非相同修復により、標的遺伝子を不活化する小さな挿入または欠失（インデル）が導かれるが、切断を相同ＤＮＡ鋳型によって修復し、それにより遺伝子置換をもたらすこともできる。Nelson  et  al.,  "In  vivo  genome  editing  improves  muscle  function  in  a  mouse  model  of  Duchenne  muscular  dystrophy"  Science  351:403-407  (2016)；およびRan  et  al.,  "In  vivo  genome  editing  using  Staphylococcus  aureus  Cas9"  Nature  520:186-191  (2015)；およびYin  et  al.,  "Genome  editing  with  Cas9  in  adult  mice  corrects  a  disease  mutation  and  phenotype"  Nature  Biotechnology  32:551-553  (2014)。
【００９１】
柔軟なゲノム編集ツールとして、現在、広範に使用されているＩＩ−Ａ型Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（Ｓｐｙ）Ｃａｓ９は、いくつかの不都合を示す：ｉ）非効率的な送達；ｉｉ）オフターゲット切断；およびｉｉｉ）調節されない活性。これらの不都合は、潜在的な遺伝子治療ツールとしてのＳｐｙＣａｓ９を厳しく限定するものである。本明細書で考察している通り、高度に正確かつ精密なＮｍｅ１Ｃａｓ９またはＮｍｅ２Ｃａｓ９複合体により、これらのＳｐｙＣａｓ９の限界を克服することができる。
【００９２】
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９は、哺乳動物細胞における効率的なゲノム編集プラットフォームであることが本明細書において示され、ＳｐｙＣａｓ９よりも小さなタンパク質であるので、ウイルスベクターをｉｎ  ｖｉｖｏ送達のために操作することが容易である。さらに、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９のオフターゲット編集はＳｐｙＣａｓ９よりも有意に低く、また、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９活性の制御を可能にする抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質が同定されている。Esvelt  et  al.,  "Orthogonal  Cas9  proteins  for  RNA-guided  gene  regulation  and  editing"  Nature  Methods  10:1116-1121  (2013)；Amrani  et  al.,  "Nme1Cas9  is  an  intrinsically  high-fidelity  genome  editing  platform"  biorxiv.org/content/early/2017/08/04/172650  (2017)；Lee  et  al.,  'The  Neisseria  meningitidis  CRISPR-Cas9  System  Enables  Specific  Genome  Editing  in  Mammalian  Cells"  Molecular  Therapy  24:645-654  (2016)；Hou  et  al.,  "'Efficient  genome  engineering  in  human  pluripotent  stem  cells  using  Cas9  from  Neisseria  meningitidis"  Procd  Natl  Acad  Sci  USA  110:15644-15649  (2013)；およびPawluk  et  al.,  "Naturally  Occurring  Off-Switches  for  CRISPR-Cas9"  Cell  167:1829-38  e9  (2016)；ならびに図２１。
【００９３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、病原性が最小の送達シャトルであることが前臨床の状況および臨床の状況で実証されているが、パッケージング容量が限られている。約３．３ｋｂのオープンリーディングフレームによってコードされるＮｍｅ１Ｃａｓ９およびそのガイドＲＮＡはＡＡＶのパッケージング限界の範囲内である。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９も同様の利点を有する。ｓｇＲＮＡとＣａｓ９を別々のベクターによって送達する必要があるＳｐｙＣａｓ９とは異なり、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびそれらのｓｇＲＮＡは単一のＡＡＶベクターで送達するために十分に小さい。
【００９４】
Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ  ｊｅｊｕｎｉ  Ｃａｓ９（ＣｊｅＣａｓ９）およびＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ（ＳａｕＣａｓ９）などの他のＣａｓ９オルソログもｉｎ  ｖｉｖｏにおいてＡＡＶによって首尾よく送達されている。Kim  et  al.,  "In  vivo  genome  editing  with  a  small  Cas9  orthologue  derived  from  Campylobacter  jejuni"  Nat  Commun  8:14500  (2017)；およびRan  et  al.,  "In  vivo  genome  editing  using  Staphylococcus  aureus  Cas9"  Nature  520:186-191  (2015)。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、通常、Ｎ４ＧＡＴＴ  ＰＡＭを伴い、これは、ＣｊｅＣａｓ９  ＰＡＭ（例えば、Ｎ４ＲＹＡＣ）、またはＳａｕＣａｓ９  ＰＡＭ（例えば、ＮＮＧＲＲＴ）（Ｒ＝プリン（ＡまたはＧ）、Ｙ＝ピリミジン（ＣまたはＴ））とは異なる。
【００９５】
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、ヒト細胞においてリボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体として首尾よく送達されている。図２および図３。さらに、本明細書で提示されているデータから、尾静脈注射後、一体型ｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶベクターを使用して、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９核酸配列をマウスにおいてｉｎ  ｖｉｖｏで発現させ、遺伝子を標的とすることができることが示される。
【００９６】
本明細書で提示されているデータにより、マウスプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（Ｐｃｓｋ９）遺伝子の標的化が実証される。ＰＣＳＫ９は、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）受容体に対するアンタゴニストとして機能し、ＬＤＬコレステロールの取り込みを限定する。血清中のコレステロールレベルの低減の検出により、ＰＣＳＫ９指向性Ｃａｓ９プラットフォームを使用した効率的なＮｍｅ１Ｃａｓ９編集の直接の機能的読み取りがもたらされ得る。
【００９７】
一実施形態では、本発明は、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体またはＮｍｅ２Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を含むアデノ随伴ウイルスベクターを意図している。発明の機構を理解する必要はないが、ＡＡＶ／Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体またはＡＡＶ／Ｎｍｅ２Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体は、遺伝子編集をもたらすために、ｉｎ  ｖｉｖｏ送達経路に適合性であると考えられる。
【００９８】
一実施形態では、本発明は、ｓｇＲＮＡ配列、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ  Ｕ６プロモーター配列、ヒトコドン最適化Ｎｍｅ１Ｃａｓ９配列、およびＲＮＡポリメラーゼＩＩ  Ｕ１ａプロモーター配列を含むｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶベクターを意図している。図６。Ｕ１ａは、様々な目的の組織におけるＣａｓ９の多用途発現を可能にする遍在プロモーターである。編集される特定の遺伝子を、標的遺伝子とマッチするスペーサー配列をｓｇＲＮＡカセットに従来の制限部位（例えば、Ｓａｐ１）を使用して挿入することによって標的とすることができる。ｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶの種々のエレメントの代表的な配列が色付けされたアノテーションによって示されている。図７および８。
【００９９】
Ｐｃｓｋ９−ｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶプラスミドおよびＲｏｓａ２６−ｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶプラスミドを使用したいくつかの標的部位の編集効率を、マウスＨｅｐａ１−６ヘパトーマ細胞への一過性トランスフェクション後のＴ７Ｅ１アッセイによって推定した。図９。Ｐｃｓｋ９−ｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶプラスミドおよびＲｏｓａ２６−ｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶプラスミドと相補的なＰｃｓｋ９遺伝子およびＲｏｓａ２６遺伝子内の代表的な標的部位配列が色付けされたアノテーションによって示されている。図１０。
【０１００】
プラスミド設計を、マウスを用い、Ｐｃｓｋ９を標的とする内毒素を含まないｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶプラスミド３０μｇの尾静脈を介した流体力学的注射により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて確証した。インデル効率を評価する配列決定に基づく方法であるＴｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｄｅｌｓ  ｂｙ  ＤＥｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ）によって測定された通り、注射の１０日後にマウス肝臓において有意な遺伝子編集が検出された。図１１。
【０１０１】
Ｐｃｓｋ９遺伝子およびＲｏｓａ２６遺伝子を標的とするプラスミド骨格を肝細胞特異的ＡＡＶ８血清型にパッケージングし、マウス１匹当たり４×１０１０ゲノムコピー（ｇｃ）の用量を尾静脈を介して注射した。予備データは、注射の１４日後に屠殺したマウスから、肝臓Ｐｃｓｋ９遺伝子およびＲｏｓａ２６遺伝子における有意なインデルレベルでのインデル値を示す。図１２Ａ。注射後５０日目にディープシーケンシングデータも収集した。
【０１０２】
注射後５０日目に３つのマウス群を屠殺し、ＴＩＤＥを使用してＰｃｓｋ９およびＲｏｓａ２６におけるインデル値を測定するために肝臓ｇＤＮＡを使用した。図１２Ｂ。インデル値の正確な測定値を記録するためにディープシーケンシング解析も実施した。
【０１０３】
ＰＣＳＫ９タンパク質「ノックダウン」により、マウスにおけるコレステロールレベルの有意な低下を導くことができる。Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とするベクター、Ｒｏｓａ２６遺伝子を標的とするベクターおよびＰＢＳ対照群を注射した３つのマウス群において、血清コレステロールレベルをＩｎｆｉｎｉｔｙ（商標）比色定量エンドポイントアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって測定した。結果から、注射の２５日後および５０日後に血清コレステロール値が有意に低減したことによって示される通り、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９により誘導されるインデル形成により、Ｐｃｓｋ９遺伝子の正常なリーディングフレームの妨害が導かれたことが示唆される。図１３。５０日目のマウス肝臓におけるＰＣＳＫ９タンパク質のレベルを測定するためにウエスタンブロットアッセイも実施した。
【０１０４】
配列決定によって可能になる二本鎖切断（ＤＳＢ）のゲノムワイド不偏同定アッセイ（例えば、ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ（登録商標）、Ｉｌｌｕｍｉｎａ）により、Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とするベクターおよびＲｏｓａ２６遺伝子を標的とするベクターを注射した後のオフターゲット編集部位を検索した。データから、Ｐｃｓｋ９に関しては４つの潜在的なオフターゲット部位、およびＲｏｓａ２６に関しては６つの潜在的なオフターゲット部位が明らかになった。図１４Ａおよび１４Ｂ。
【０１０５】
標的化ＴＩＤＥ解析により、Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とするＡＡＶベクターおよびＲｏｓａ２６遺伝子を標的とするＡＡＶベクターの注射後１４日目の細胞およびマウスにおけるオンターゲットゲノム編集が明らかになった。図１５。注射の５０日後にこれらの部位におけるオフターゲット切断についてのディープシーケンシング解析も実施した。
【０１０６】
ヘマトキシリン・エオシン染色アッセイにより、Ｐｃｓｋ９遺伝子を標的とするベクターおよびＲｏｓａ２６遺伝子を標的とするベクターの注射後１４日目に屠殺したマウスの肝臓切片において大量の免疫細胞浸潤の徴候は示されなかった。図１６。注射の５０日後に特異的免疫応答アッセイを実施する。
【０１０７】
一実施形態では、本発明は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の一体型ＡＡＶ送達による治療的ｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集のための方法を意図している。発明の機構を理解する必要はないが、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は、小型であること、小さなＰＡＭおよび高忠実度により、ＡＡＶを使用したｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集のための理想的なツールになると考えられる。この目的のために、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９をその同類ｓｇＲＮＡおよびそれらのそれぞれのプロモーターと共に単一のＡＡＶベクター骨格にクローニングした。図４４Ａ；上。この一体型ＡＡＶ．ｓｇＲＮＡ．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を肝細胞選択的ＡＡＶ８カプシドにパッケージングした。２つの遺伝子を標的とした：ｉ）陰性対照として一般に使用される遺伝子座であるＲｏｓａ２６；およびｉｉ）循環コレステロール恒常性の主要な調節因子であるプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（Ｐｃｓｋ９）。研究により、Ｃａｓ９を使用してＰｃｓｋ９をノックアウトすることにより、コレステロールレベルの低減がもたらされることが示されている（Ran  et  al）。
【０１０８】
マウス（ｎ＝５）の２つの群に、Ｐｃｓｋ９またはＲｏｓａ２６のいずれかを標的とするパッケージングされたＡＡＶ８．ｓｇＮＡ．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を注射した。ベクターの注射の０日後、１４日後および２８日後に、コレステロールレベル測定のために血清を採取した。注射の２８日後にマウスを屠殺し、肝組織を収集した（図４４Ａ、下）。ディープシーケンシング解析により、Ｐｃｓｋ９およびＲｏｓａ２６において有意に高レベルのインデルが示された。図４４Ｂ。これらのインデル値には、ｓｇＰｃｓｋ９を注射したマウスにおける１４日後および２８日後の血中コレステロールレベルの有意な低減が伴った；ｓｇＲｏｓａ２６を注射したマウスでは試験全体を通してコレステロールの正常なレベルが維持された。図４４Ｃ。Ｈ＆Ｅ分析により、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９発現後に両群で毒性または組織損傷の徴候は示されなかった。図４４Ｄ。これらのデータにより、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて高度に機能的であること、および好都合な一体型ＡＡＶプラットフォームによって容易に送達することができることが確証される。
【０１０９】
一実施形態では、本発明は、最小化されたＡＡＶ．ｈＮｍｅＣａｓ９構築物を意図している。図４４Ａを参照されたい。上で考察している通り、本発明は、マウス肝臓におけるＰｃｓｋ９遺伝子およびＲｏｓａ２６遺伝子を首尾よく編集した、ＡＡＶ８ビリオンにパッケージングされる操作された一体型ＡＡＶ．ｓｇＲＮＡ．ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９構築物を意図している。
【０１１０】
一実施形態では、本発明は、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９カセットを含むＡＡＶ８骨格を意図している。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９と同様に、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９でもマウスにおけるＰｃｓｋ９およびＲｏｓａ２６において頑強な編集が示された（下記）。本明細書で提示されているデータは、ＡＡＶ８−ＮｍｅＣａｓ９のマウスへのｉｎ  ｖｉｖｏ投与には、ベクター注射の２８日後の循環コレステロールのレベルの有意な低減が伴うことを示すものである。
【０１１１】
この一体型ＡＡＶプラットフォームの有用性を増大させるために、カーゴのサイズを最小限にして二重ｓｇＲＮＡまたはドナーＤＮＡセグメントなどのＡＡＶカプシド内に追加的な特徴のためのスペースを作るために種々の短縮を導入した。
【０１１２】
一体型ＡＡＶ骨格のカーゴを最小限にするために、Ｃａｓ９のヌクレアーゼ活性を損なわずに余分の特徴（３×ＨＡタグおよび２×ＮＬＳ配列）を系統的に除去した。トラフィックライトレポーター（ＴＬＲ）系を使用したＮｍｅ１Ｃａｓ９により、この最小化一体型ＡＡＶ．ｓｇＲＮＡ．ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９（４．４６８ｋｂ）が以前の４つのＮＬＳ配列を有するより長いバージョンと同様に強力であることが示される。図４５を参照されたい。ｓｇＲＮＡ１１バージョンと同様であるが３’末端にＵＡが付加された新しいｓｇＲＮＡ１２を使用し、より多くのスペースが空くように短縮されたｓｇＲＮＡを構築した。図４６を参照されたい。
【０１１３】
以前に、短いポリＡ配列がＣａｓ９構築物に有用であり得ることが報告されている。Platt  et.  al.  (2015)。一実施形態では、本発明は、ＢＧＨポリＡを含むＡＡＶ−Ｎｍｅ２Ｃａｓ９構築物を意図している。図４７を参照されたい。発明の機構を理解する必要はないが、このポリＡ配列により、一体型ＡＡＶ骨格のサイズがさらに低減すると考えられる。
【０１１４】
この最小化された（４．４ｋｂ）一体型ＡＡＶ骨格では、二重遺伝子ノックアウトまたはＤＮＡ断片削除のために別のｓｇＲＮＡを含めることにより、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９の有用性が増大することがさらに考えられる。図４８、上を参照されたい。この構成では、ＡＡＶカプシド内に相同組換え修復適用のためのドナー鋳型（約６００塩基対）を含めるための空きスペースももたらされる。図４８、下を参照されたい。一部の実施形態では、二重ｓｇＲＮＡ  ＡＡＶ構築物を単一のＡＡＶベクターにパッケージングする。
【０１１５】
比較的小型のＮｍｅ１Ｃａｓ９は、様々な細胞型におけるゲノム編集において活性である。このＣａｓ９オルソログの小さなサイズを活用するために、マウスＵ１ａプロモーターの発現下のヒトコドン最適化Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびＵ６プロモーターによって駆動されるそのｓｇＲＮＡを用いて一体型ＡＡＶ構築物を生成した。図４９Ａを参照されたい。マウスゲノム内の２つの部位を最初に選択して、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のｉｎ  ｖｉｖｏでのヌクレアーゼ活性を試験した：Ｒｏｓａ２６「セーフハーバー」遺伝子（ｓｇＲｏｓａ２６によって標的とされる）；および、循環コレステロールを低下させ、心血管疾患のリスクを低減するための一般的な治療標的であるプロタンパク質転換酵素サブチリシン／ケキシン９型（Ｐｃｓｋ９）遺伝子（ｓｇＰｃｓｋ９によって標的とされる）。図４９Ｂ。これらのガイドについてのゲノムワイドオフターゲット予測を、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋ  １．９．１を使用し、Ｎ４ＧＮ３  ＰＡＭおよび最大６つのミスマッチを用いてコンピューターにより決定した。Zhu  et  al.,  "CRISPRseek:  a  bioconductor  package  to  identify  target-specific  guide  RNAs  for  CRISPR-Cas9  genomeediting  systems"  PLoS  One  2014;9:e108424。多くのＮ４ＧＮ３  ＰＡＭは不活性であり、したがって、これらの検索パラメーターは、真のオフターゲットプロファイルよりも広い網を打つものであることがほほ確実である。検索が広範囲なものであるにもかかわらず、解析により、マウスゲノムにおいて４つ未満のミスマッチではオフターゲット部位は明らかにならなかった。図５０を参照されたい。これらの標的部位におけるオンターゲット編集効率をマウスＨｅｐａ１−６ヘパトーマ細胞においてプラスミドトランスフェクションによって評価し、Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｄｅｌｓ  ｂｙ  Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ）ウェブツールを使用した配列トレース分解によってインデル定量化を実施した。Brinkman  et  al.,  "Easy  quantitative  assessment  of  genome  editing  by  sequence  trace  decomposition"  Nucleic  Acids  Res.  2014;42:e168。データは、選択されたガイドについて＞２５％のインデル値を示し、その大多数が欠失であった。図４９Ｃを参照されたい。
【０１１６】
構築された一体型ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９ベクターの予備的な有効性を評価するために、内毒素を含まないｓｇＰｃｓｋ９プラスミドをＣ５７Ｂｌ／６マウスに尾静脈注射によって流体力学的に投与した。この方法では、プラスミドＤＮＡを肝細胞の約４０％に一過性発現のために送達することができる。Liu  et  al.,  "Hydrodynamics-based  transfection  in  animals  by  systemic  administration  of  plasmid  DNA"  Gene  Ther.  1999;6:1258-66。肝組織から抽出したＤＮＡを使用したＴＩＤＥによるインデル解析により、ベクター投与の１０日後に５〜９％のインデルが明らかになり、これは、ＳｐｙＣａｓ９の類似試験で得られた編集効率と同等であった。図４９Ｄ；およびXue  et  al.,  "CRISPR-mediated  direct  mutation  of  cancer  genes  in  the  mouse  liver"  Nature  2014;514:380-4を参照されたい。これらの結果から、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９によりｉｎ  ｖｉｖｏにおいて肝臓細胞を編集することが可能であることが示唆される。
【０１１７】
遺伝性チロシン血症Ｉ型（ＨＴ−Ｉ）は、フマリルアセト酢酸ヒドロキシラーゼ（ＦＡＨ）酵素をコードするＦａｈ遺伝子の常染色体性劣性変異によって引き起こされる致死的な遺伝子疾患である。ＦＡＨが減弱している患者では、チロシン異化経路が乱れており、それにより、毒性のフマリルアセト酢酸およびサクシニルアセト酢酸の蓄積が導かれ、肝損傷および腎損傷が引き起こされる。Grompe  M.,  "The  pathophysiology  and  treatment  of  hereditary  tyrosinemia  type  1"  Semin  Liver  Dis.  2001;21:563-71。過去二十年の間、この疾患は、チロシン分解経路の上流の４−ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼを阻害し、したがって、毒性代謝産物の蓄積を防止する２−（２−ニトロ−４−トリフルオロメチルベンゾイル）−１，３−シクロヘキサンジオン（ＮＴＢＣ）によって制御されてきた。Lindstedt  et  al.,  "Treatment  of  hereditary  tyrosinaemia  type  I  by  inhibition  of  4-hydroxyphenylpyruvate  Dioxygenase"  Lancet  1992;340:813-7。しかし、この処置には、食事および薬物の生涯の管理が必要であり、最終的には肝移植が必要になる場合がある。Das,  AM.,  "Clinical  utility  of  nitisinone  for  the  treatment  of  hereditary  tyrosinemia  type-1  (HT-1)"  Appl  Clin  Genet.  2017;10:43-8。
【０１１８】
欠損したＦａｈ遺伝子を部位特異的変異誘発またはＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９による相同組換え修復を使用して補正するために、いくつかの遺伝子治療戦略が試験されてきた。Paulk  et  al.,  "Adenoassociated  virus  gene  repair  corrects  a  mouse  model  of  hereditary  tyrosinemia  in  vivo"  Hepatology  2010;51:1200-8；Yin  et  al.,  "Therapeutic  genome  editing  by  combined  viral  and  non-viral  delivery  of  CRISPR  system  components  in  vivo"  Nat  Biotechnol.  2016;34:328-33；およびYin  et  al.,  "Genome  editing  with  Cas9  in  adult  mice  corrects  a  disease  mutation  and  phenotype"  Nat  Biotechnol.  2014;32:551-3。Ｆａｈｍｕｔ／ｍｕｔマウスの表現型をレスキューするためには肝臓中の肝細胞のたった１／１０，０００の上首尾の改変で十分であることが報告されている。最近、肝臓におけるＨｐｄ遺伝子のエクソン３および４の欠失によってヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（ＨＰＤ）酵素の機能を乱す代謝経路再プログラミング手法が示唆された。Pankowicz  et  al.,  "Reprogramming  metabolic  pathways  in  vivo  with  CRISPR/Cas9  genome  editing  to  treat  hereditary  tyrosinaemia"  Nat  Commun.  2016;7:12642。これにより、例えば、Ｈｐｄを標的とし、Ｆａｈ変異体マウスにおける疾患表現型のレスキューを評価することによってＮｍｅ１Ｃａｓ９による編集の有効性を試験する状況がもたらされる。Grompe  et  al.,  "Loss  of  fumarylacetoacetate  hydrolase  is  responsible  for  the  neonatal  hepatic  dysfunction  phenotype  of  lethal  albino  mice"  Genes  Dev.  1993;7:2298-307。この目的のために、２つの標的部位（それぞれエクソン８内のもの［ｓｇＨｐｄ１］およびエクソン１１内のもの［ｓｇＨｐｄ２］）をＨｐｄのオープンリーディングフレーム内でスクリーニングし、同定した。図５１Ａを参照されたい。これらのガイド（例えば、ｓｇＲＮＡ）では、Ｈｅｐａ１−６細胞におけるプラスミドトランスフェクションにより、それぞれ１０．８％および９．１％のＮｍｅ１Ｃａｓ９により誘導される平均インデル効率が促進された。図５２。
【０１１９】
マウスの３つの群を、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）またはｓｇＨｐｄ１およびｓｇＨｐｄ２一体型ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９プラスミドの２つのうちの１つを用いて流体力学的注射によって処置した。ｓｇＨｐｄ１群のマウス１匹およびｓｇＨｐｄ２群の２匹は尾静脈注射に失敗したので追跡試験から除外した。注射の７日後にマウスにＮＴＢＣを含有する水をやめさせ、体重を注射後４３日間モニターした。図５１Ｂを参照されたい。ＰＢＳを注射したマウスは重度の体重減少（ＨＴ−Ｉの特質）を被り、体重の２０％が喪失した後に屠殺した。全体的に、全てのｓｇＨｐｄ１マウスおよびｓｇＨｐｄ２マウスは全体で４３日間、およびＮＴＢＣなしで少なくとも２１日間にわたって体重を首尾よく維持した。図５１Ｃを参照されたい。
【０１２０】
ｓｇＨｐｄ１を受けたマウス２匹およびｓｇＨｐｄ２を受けた１匹に関しては、プラスミド注射後第３週中に、おそらく最初の編集効率が低かったこと、流体力学的注射に起因する肝傷害、またはその両方に起因して、体重を元に戻すためにＮＴＢＣ処置を２〜３日間再開しなければならなかった。逆に、他の全てのｓｇＨｐｄ１で処置したマウスおよびｓｇＨｐｄ２で処置したマウスでは３５〜６０％の範囲の頻度でインデルが達成された。図５１Ｄを参照されたい。この遺伝子不活化のレベルは、最初の編集事象だけでなく、編集された細胞系列の、それらの編集されていない対応物を犠牲にした競合的な増大（ＮＴＢＣ離脱後に）も反映する可能性がある。肝臓の組織学により、ｓｇＨｐｄ１で処置したマウスおよびｓｇＨｐｄ２で処置したマウスでは、ＰＢＳを注射したマウスと比較して多核肝細胞の数が少ないことによって示される通り、ＰＢＳを注射したＦａｈｍｕｔ／ｍｕｔマウスと比較して肝損傷の重症度が実質的に低いことが明らかになった。図５３を参照されたい。
【０１２１】
微量注射または電気穿孔を必要とせずに、単に、接合体を、ＡＡＶベクターを含有する培養培地に浸漬し、その後、偽妊娠雌に再移植することによってゲノム編集されたマウスを生成するために、ＡＡＶベクターが最近使用されている。編集は、以前は、ＳｐｙＣａｓ９およびそのｓｇＲＮＡを別々のベクターで送達する二重ＡＡＶ系を用いて得た。Yoon  et  al.,  "Streamlined  ex  vivo  and  in  vivo  genome  editing  in  mouse  embryos  using  recombinant  adeno-associated  viruses"  Nat.  Commun.  9:412  (2018)。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９により、一体型ＡＡＶ送達系を用いてマウス接合体における正確かつ効率的な編集を可能にすることができるかどうかを試験するために、その二対立遺伝子不活化によりメラニン産生が乱され、その結果、アルビノの仔が生じる、チロシナーゼ遺伝子（Ｔｙｒ）を標的とした。Yokoyama  et  al.,  "Conserved  cysteine  to  serine  mutation  in  tyrosinase  is  responsible  for  the  classical  albino  mutation  in  laboratory  mice"  Nucleic  Acids  Res.  18:7293-7298  (1990)。
【０１２２】
効率的なＴｙｒ  ｓｇＲＮＡ（古典的なアルビノ変異の部位からたった１７ｂｐのＴｙｒ遺伝子座を切断する）を、Ｈｅｐａ１−６細胞において一過性トランスフェクションによって確証した。図５７を参照されたい。次に、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ接合体を、３×１０９または３×１０８ＧＣの、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９をＴｙｒ  ｓｇＲＮＡと共に発現する一体型ＡＡＶ６ベクターを含有する培養培地で５〜６時間インキュベートした。新鮮な培地で終夜培養した後、二細胞期に進行した接合体を偽妊娠レシピエントの卵管に移入し、出産まで発育させた。図５８Ａを参照されたい。仔の毛色解析により、アルビノ、薄い灰色（Ｔｙｒの低形質対立遺伝子を示唆する）であるマウス、またはアルビノと薄い灰色の斑点で構成されるが黒色の色素沈着を欠く斑の毛色を有するマウスが明らかになった。図５８Ｂおよび５８Ｃを参照されたい。これらの結果から、単一の野生型Ｔｙｒ対立遺伝子の存在により黒色の色素沈着がもたらされるはずなので、二対立遺伝子変異が高頻度であったことが示唆される。３×１０９ＧＣ実験からは合計５匹の仔（１０％）が生まれた。それら全てがインデルを有した；表現型的に、２匹がアルビノであり、１匹が薄い灰色であり、および２匹がモザイク現象を示す斑の色素沈着を有した。３×１０８ＧＣ実験からは、４匹の仔（１４％）が得られ、そのうち２匹は出生時に死亡し、毛色解析またはゲノム解析は妨げられた。残りの２匹の仔の毛色解析から、１匹が薄い灰色であり、１匹がモザイクの仔であることが明らかになった。これらの結果から、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡの単一ＡＡＶ送達を使用して、微量注射または電気穿孔を伴わずにマウス接合体における変異を生じさせることができることが示される。
【０１２３】
Ｔｙｒ遺伝子におけるオンターゲットインデル形成を測定するために、ＤＮＡを各マウスの尾部から単離し、遺伝子座を増幅し、ＴＩＤＥ解析を実施した。データから、全てのマウスがＮｍｅ２Ｃａｓ９によるオンターゲット編集を８４％から１００％まで変動する高レベルで有したことが示された。図５７Ｂおよび５Ｃを参照されたい。アルビノマウス９−１における大多数の傷害は１ｂｐまたは４ｂｐの欠失であり、これにより、モザイク現象またはトランス−ヘテロ接合性のいずれかが示唆される。アルビノマウス９−２は、均一な２ｂｐの欠失を示した。図５８Ｃを参照されたい。薄い灰色のマウス由来の尾部ＤＮＡの解析により、薄い灰色の毛色の潜在的な原因であるインフレーム変異の存在が明らかになった。変異の複雑さが限られていることにより、これらのマウスでは胚発生の初期に編集が起こったことが示唆される。１匹の雌（マウス９−２）を古典的なアルビノ雄と交配し、得られた仔６匹全てがアルビノであり、これにより、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡの接合体一体型ＡＡＶ送達によって生じた変異を、生殖細胞系列を通じて伝達することができることが実証される。これらの結果から、この場合はＮｍｅ２Ｃａｓ９およびそのｓｇＲＮＡの両方を送達する単一のＡＡＶベクターの適用による、哺乳動物変異誘発の合理化された経路がもたらされる。
【０１２４】
Ｈｐｄ遺伝子に変異を有する患者は、ＩＩＩ型チロシン血症を有すると考えられ、高レベルの血液中チロシンを示すが、他の点では大部分が無症候性であると思われる。Szymanska  et  al.,  "Tyrosinemia  type  III  in  an  asymptomatic  girl.  Mol  Genet  Metab  Rep.  2015;5:48-50；およびNakamura  et  al.,  "Animal  models  of  tyrosinemia"  J  Nutr.  2007;137:1556S-60S。ＨＰＤは、チロシン異化経路においてＦＡＨの上流で作用し、Ｈｐｄを乱すことにより、ＦＡＨの喪失に起因する毒性代謝産物の集積が防止されることによってＨＴ−Ｉ症状が好転する。ＨＰＤの構造解析により、ＨＰＤ酵素の触媒ドメインが当該酵素のＣ末端に位置し、エクソン１３および１４によってコードされることが明らかになる。Huang  et  al.,  "The  different  catalytic  roles  of  the  metal-binding  ligands  in  human  4-hydroxyphenylpyruvate  dioxygenase"  Biochem  J.  2016;473:1179-89。したがって、エクソン１３の上流のフレームシフト誘導性インデルにより、酵素が不活性にされるはずである。この状況を使用して、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９プラスミドの流体力学的注射によるＨｐｄ不活化が、ＨＴ−Ｉマウスをレスキューするための実行可能な手法であることを実証した。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９により、いくつかの異なるＰＡＭ（Ｎ４ＧＡＴＴ［コンセンサス］、Ｎ４ＧＣＴＴ、Ｎ４ＧＴＴＴ、Ｎ４ＧＡＣＴ、Ｎ４ＧＡＴＡ、Ｎ４ＧＴＣＴ、およびＮ４ＧＡＣＡ）を有する部位を編集することができる。Ｈｐｄ編集実験により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるバリアントＰＡＭの１つが、Ｎ４ＧＡＣＴ  ＰＡＭを有する部位を標的とするｓｇＨｐｄ２ガイドと共に確認された。
【０１２５】
プラスミド流体力学的注射によりインデルを生成することができるが、治療開発には、ｒＡＡＶの使用によるものなどの侵襲性の低い送達戦略が必要になり得る。この目的のために、一体型ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９プラスミドを肝細胞向性ＡＡＶ８カプシドにパッケージングして、Ｐｃｓｋ９（ｓｇＰｃｓｋ９）およびＲｏｓａ２６（ｓｇＲｏｓａ２６）を標的とした。図４９Ｂ；Gao  et  al.,  "Novel  adenoassociated  viruses  from  rhesus  monkeys  as  vectors  for  human  gene  therapy"  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  2002;99:11854-9；およびNakai  et  al.,  "Unrestricted  hepatocyte  transduction  with  adeno-associated  virus  serotype  8  vectors  in  mice"  J  Virol.  2005;79:214-24を参照されたい。Ｐｃｓｋ９およびＲｏｓａ２６は、一部において、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のＡＡＶによる送達が、同様に送達され、同じ遺伝子座を標的とする他のＣａｓ９オルソログのＡＡＶによる送達の基準になることを可能にするために使用した。Ran  et  al.,  "In  vivo  genome  editing  using  Staphylococcus  aureus  Cas9"  Nature  2015;520:186-91。ベクターをＣ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈を介して投与した。図５４Ａを参照されたい。血清中のコレステロールレベルをモニターし、注射の２５日後および５０日後に肝組織におけるＰＣＳＫ９タンパク質およびインデル頻度を測定した。
【０１２６】
比色定量エンドポイントアッセイを使用して、注射の２５日後および５０日後に、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９／ｓｇＰｃｓｋ９を投与したマウスにおける循環血清コレステロールレベルがＰＢＳマウスおよびＮｍｅ１Ｃａｓ９／ｓｇＲｏｓａ２６マウスと比較して有意に（ｐ＜０．００１）減少したことが決定された。図５４Ｂを参照されたい。Ｐｃｓｋ９標的部位およびＲｏｓａ２６標的部位における標的化ディープシーケンシング解析により、ベクター投与の５０日後にそれぞれ３５％および５５％の非常に効率的なインデルが明らかになった。図５４Ｃ。さらに、各群から１匹のマウスを注射の１４日後に安楽死させ、Ｐｃｓｋ９およびＲｏｓａ２６においてそれぞれ３７％および４６％のオンターゲットインデル効率が明らかになった。予測通り、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９／ｓｇＰｃｓｋ９で処置したマウスの肝臓におけるＰＣＳＫ９タンパク質レベルがＰＢＳを注射したマウスおよびＮｍｅ１Ｃａｓ９／ｓｇＲｏｓａ２６を注射したマウスと比較して実質的に低減した。図５４Ｄを参照されたい。効率的な編集、ＰＣＳＫ９低減、および血清コレステロールの減弱により、Ｐｃｓｋ９遺伝子座におけるＮｍｅ１Ｃａｓ９の上首尾の送達および活性が示される。
【０１２７】
ウイルスベクターによって送達されたＳｐｙＣａｓ９は宿主の免疫応答を引き出すことが公知である。Chew  et  al.,  "A  multifunctional  AAV-CRISPR-Cas9  and  its  host  response"  Nat  Methods  2016;13:868-74；およびWang  et  al.,  "Adenovirus-mediated  somatic  genome  editing  of  Pten  by  CRISPR/Cas9  in  mouse  liver  in  spite  of  Cas9-specific  immune  responses"  Hum  Gene  Ther.  2015;26:432-42。ＡＡＶ８−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９を注射したマウスで抗Ｎｍｅ１Ｃａｓ９抗体が産生されるかどうかを調査するために、処置した動物由来の血清を使用して、ＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡを実施した。これらの結果から、これらの動物においてＮｍｅ１Ｃａｓ９により体液性応答が引き出されることが示される。図５５を参照されたい。免疫応答が存在するにもかかわらず、ｒＡＡＶによって送達されたＮｍｅ１Ｃａｓ９はｉｎ  ｖｉｖｏにおいて高度に機能的であり、異常または肝損傷の明らかな徴候はない。図１６を参照されたい。
【０１２８】
治療用ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によるゲノム編集に関する重要な懸念事項は、オフターゲット編集の活性の可能性である。例えば、野生型Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、培養された哺乳動物細胞における天然に正確度が高いゲノム編集プラットフォームであることが見いだされている。Lee  et  al.,  "The  Neisseria  meningitidis  CRISPR-Cas9  system  enables  specific  genome  editing  in  mammalian  cells"  Mol  Ther.  2016;24:645-54。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９がマウス細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいてその最小のオフターゲティングプロファイルを維持するかどうかを決定するために、配列決定によって可能になるＤＳＢのゲノムワイド不偏同定（ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ）を使用してマウスゲノムにおけるオフターゲット部位をスクリーニングした。Tsai  et  al.,  "Defining  and  improving  the  genome-wide  specificities  of  CRISPR-Cas9  nucleases"  Nat  Rev  Genet.  2016;17:300-12。Ｈｅｐａ１−６細胞に、ｓｇＰｃｓｋ９、ｓｇＲｏｓａ２６、ｓｇＨｐｄ１、およびｓｇＨｐｄ２一体型ＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９プラスミドをトランスフェクトし、得られたゲノムＤＮＡをＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ解析に供した。ヒト細胞における観察（データは示していない）と一致して、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑにより、マウスゲノムにおける非常に少ないオフターゲット（ＯＴ）部位が明らかになった。ｓｇＰｃｓｋ９について４つの潜在的なＯＴ部位が同定され、ｓｇＲｏｓａ２６について別の６つが同定された。ｓｇＨｐｄ１およびｓｇＨｐｄ２を用いたオフターゲット編集は検出されなかった。図５６Ａを参照されたい。これらのデータから、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９が内因的に超高正確度であることがさらに確証される。
【０１２９】
ｓｇＰｃｓｋ９およびｓｇＲｏｓａ２６についての推定ＯＴ部位のいくつかは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ＰＡＭ優先性（すなわち、Ｎ４ＧＡＴＴ、Ｎ４ＧＣＴＴ、Ｎ４ＧＴＴＴ、Ｎ４ＧＡＣＴ、Ｎ４ＧＡＴＡ、Ｎ４ＧＴＣＴ、およびＮ４ＧＡＣＡ）を欠く。図５６Ｂを参照されたい。これらのＯＴ部位を確証するために、Ｈｅｐａ１−６細胞由来のゲノムＤＮＡを使用して標的化ディープシーケンシングを実施した。このより高い感度の読み取りにより、インデル頻度が＜２％であったＰｃｓｋ９のＯＴ１以外のこれらのＯＴ部位の全てで、インデルはバックグラウンドを超えて検出不可能であった。図５６Ｂを参照されたい。ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮｍｅ１Ｃａｓ９の高忠実度を確証するために、ＡＡＶ８−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９で処置した、ｓｇＰｃｓｋ９標的化、およびｓｇＲｏｓａ２６標的化マウス由来の肝臓ゲノムＤＮＡのこれらのＯＴ部位におけるインデル形成を測定した。１４日目に屠殺したマウス肝臓において、＜２％の傷害効率が示されたｓｇＰｃｓｋ９  ＯＴ１以外の全ての部位で、検出可能なオフターゲット編集はほとんどまたは全く見いだされなかった。より重要なことに、このＯＴ編集のレベルは５０日後であっても＜２％を下回ったままであり、また、他の全ての候補ＯＴ部位において検出不可能であるかまたは非常に低いままであった。これらの結果により、ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮｍｅ１Ｃａｓ９の長期（５０日間）発現によりその標的化忠実度は損なわれないことが示唆された。図５６Ｃを参照されたい。
【０１３０】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＮｍｅ１Ｃａｓ９の様々な組織への標的化送達を達成するためにはｒＡＡＶベクターが有望な送達プラットフォームであり、これは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９導入遺伝子のサイズが小型であり、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９とそのガイドを一体型フォーマットで送達することが可能になるからである。本明細書で提示されているデータから、注射の１４日後であっても効率的な編集が観察され、成体マウスにおいてＰｃｓｋ９遺伝子およびＲｏｓａ２６遺伝子を標的とするための、この手法が確証される。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、ＳｐｙＣａｓ９によるオフターゲティングを低減するために必要な広範囲にわたる操作を伴わなくても、内因的に正確である。Lee  et  al.,  "The  Neisseria  meningitidis  CRISPR-Cas9  system  enables  specific  genome  editing  in  mammalian  cells"  Mol  Ther.  2016;24:645-54；Bolukbasi  et  al.,  "Creating  and  evaluating  accurate  CRISPRCas9  scalpels  for  genomic  surgery"  Nat  Methods  2016;13:41-50；Tsai  et  al.,  "Defining  and  improving  the  genome-wide  specificities  of  CRISPR-Cas9  nucleases"  Nat  Rev  Genet.  2016;17:300-12；およびTycko  et  al.,  "Methods  for  optimizing  CRISPR-Cas9  genome  editing  specificity"  Mol  Cell.  2016;63:355-70。
【０１３１】
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ＯＴ編集の対照比較を培養細胞およびｉｎ  ｖｉｖｏにおいて標的化ディープシーケンシングによって実施し、どちらの状況においてもオフターゲティングが最小であることが見いだされた。ｓｇＰｃｓｋ９  ＯＴ１部位（アノテートされていない遺伝子座内）における編集が約２％で最も高く検出可能であった。
【０１３２】
ＩＶ．シトシンリッチＰＡＭを用いた小さなＣａｓ９オルソログ
上述の通り、ＣＲＩＳＰＲ系は、少なくとも６つの異なる型に分類することができる。一般に、ＩＩ型系は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質の存在によってカテゴリー化される。例えば、Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は、ヒトを含めたほとんど全ての生物体においてゲノム編集プラットフォームとして別の目的のために利用することができるＲＮＡをガイドとするヌクレアーゼであると考えられる。報告により、Ｃａｓ９によるゲノム編集が医薬、農業、ヒト遺伝子治療および多くの他の適用に使用されてきたことが示されている。
【０１３３】
一般に、ヒトゲノム内の特定の遺伝子遺伝子座の標的化は、特異的な核酸配列（例えば、例えば、プロトスペーサー隣接モチーフ；ＰＡＭ）との相互作用によって遺伝子座を標的とする単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）と結合したＣａｓ９ヌクレアーゼタンパク質によって達成することができる。ｓｇＲＮＡは、通常、標的核酸配列と相補的な２０〜２４ヌクレオチドのセグメント、その後に、Ｃａｓ９タンパク質と相互作用する（例えば、例えば、結合する）定常領域を含む。Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質によりゲノム編集を行うためには、まず、Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体が、通常は標的部位配列の下流に見いだされるプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列を認識する。発明の機構を理解する必要はないが、各Ｃａｓ９ヌクレアーゼタンパク質は特定のＰＡＭに対する親和性を有する（すなわち、プロトスペーサー隣接モチーフ認識ドメインによって媒介される）と考えられる。下流のＰＡＭ標的核酸配列に結合するＰＡＭ認識ドメインの不在下では、Ｃａｓ９ヌクレアーゼにより二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）を切断することはできない。
【０１３４】
報告により、ヒトゲノム編集に関してはほんの少数のＣａｓ９オルソログが確証されていることが示唆される。報告されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９型のうちの３つとして、ＩＩ−Ａ、ＩＩ−ＢおよびＩＩ−Ｃが挙げられる。ＩＩ−Ａ型Ｃａｓ９（例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ（ＳｐｙＣａｓ９））が現在まで最も一般的に使用されているＣａｓ９である。しかし、ＳｐｙＣａｓ９（および他の大多数のＩＩ−Ａ型オルソログ）は、ある特定の適用に不適当なものになり得る特性をいくつか有する。第１に、ＳｐｙＣａｓ９は比較的大きく、それにより、このＣａｓ９はウイルスベクターへの効率的なパッケージングには不適当なものになる。第２に、ＳｐｙＣａｓ９は、オフターゲット活性の率が高い（すなわち、ヒトゲノム内の意図されたものではない遺伝子座においてＤＮＡを切断する）が、より特異性の高いバリアントが作出されている。最後に、ＳｐｙＣａｓ９のＰＡＭ（例えば、ＮＧＧ）はヒトゲノム内の一部の部位、または編集中に特定のヌクレオチドが認識されるべき適用に関しては使用が限られている。これらの欠点を克服するために、いくつかのグループにより、他のＣａｓ９オルソログが、ヒトおよび他の生物体において機能するように別の目的のために利用されている。上で考察している通り、ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログ（例えば、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９）は、哺乳動物細胞においてより高忠実度の活性をもたらす一体型ウイルスパッケージング（例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター］のために十分に小さい。しかし、通常２ヌクレオチドの長さのＳｐｙＣａｓ９  ＰＡＭとは対照的に、野生型Ｃａｓ９  ＩＩ−Ｃ  ＰＡＭは通常およそ４ヌクレオチドの長さである。この追加的なＰＡＭの長さにより、野生型Ｃａｓ９  ＩＩ−Ｃ  ＰＡＭによって標的とすることができる遺伝子座の数が限られる可能性がある。これにより、ゲノム編集のためのより多くのＣａｓ９オルソログを同定することへの当技術分野における必要性が生じる。
【０１３５】
ＮＣＢＩデータベース内には選択できる何千ものＣａｓ９オルソログが存在するが、哺乳動物細胞における機能性の改善をもたらす拘束性の少ないＰＡＭを用いる小さなＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログを開発するためには経験的プロセスが必要である。一実施形態では、本発明は、より広範な範囲の標的部位を用いた精密なゲノム編集を可能にする改善されたＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログを意図している。一実施形態では、改善されたＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログは、効率的なウイルスによる送達が可能な小型のサイズを有する。一実施形態では、改善されたＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログとして、これだけに限定されないが、Ｈａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ（ＨｐａＣａｓ９）、Ｓｉｍｏｎｓｉｅｌｌａ  ｍｕｅｌｌｅｒｉ（ＳｍｕＣａｓ９）およびＮｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株Ｄｅ１０４４４（Ｎｍｅ２Ｃａｓ９）が挙げられる。
【０１３６】
Ａ．ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログと関連する短いＰＡＭ
本明細書で提示されているデータは、いくつかのＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログについての短いＰＡＭ標的の特徴付けを示すものである。図１７。例えば、ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログは、１〜４個の間の必要なヌクレオチドを含む短いＰＡＭと相互作用し得る。発明の機構を理解する必要はないが、これらの短いＣリッチＰＡＭにより、以前はより小型のＣａｓ９オルソログ（例えば、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９）であっても接近できなかった標的部位のＣａｓ９によるゲノム編集の改善がもたらされると考えられる。一実施形態では、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９  ＰＡＭはＮＮＮＮＣｃの配列を有し、ここで、「ｃ」は、唯一の部分的優先性である。一実施形態では、ＳｍｕＣａｓ９  ＰＡＭはＮＮＮＮＣＴの配列を有する。図１８。
【０１３７】
ゲノム編集に関して確証された短いＣリッチＰＡＭを有するＣａｓ９オルソログは存在しないこと、およびＮｍｅ２Ｃａｓ９が、ヒト細胞における高度に効率的な遺伝子編集活性の潜在的な候補として、特に説得力のあるものであることが現在考えられている。一実施形態では、本発明は、野生型Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ｓｇＲＮＡと結合したＮｍｅ２Ｃａｓ９ヌクレアーゼ（例えば、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ  ８０１３  Ｃａｓ９；以前はＮｍｅＣａｓ９と称されていた）を意図している。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、以前記載されている。Sontheimer  et  al.,  "RNA-Directed  DNA  Cleavage  and  Gene  Editing  by  Cas9  Enzyme  From  Neisseria  Meningitidis"、米国特許出願公開第２０１４／０３４９，４０５号（参照により本明細書に組み込まれる）。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９はゲノム編集のために有用であり得るが、その主要な限界は、ＰＡＭが比較的長く、それにより任意の所与のゲノム遺伝子座における編集可能な部位の数が制限されることである。
【０１３８】
一部の実施形態では、本発明は、これだけに限定されないが、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を含めたＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログのためのより短くより低ストリンジェントであるＰＡＭを意図している。発明の機構を理解する必要はないが、短く、低ストリンジェントであるＰＡＭにより、標的が制限されるという限界が部分的に緩和されると同時に、これだけに限定されないが、効率的な一体型ＡＡＶ送達のための小さなサイズ（例えば、小型であること）および改善された標的正確度（例えば、オフターゲット切断の低減）を含めたＮｍｅ１Ｃａｓ９の利点のほとんどではないにしても多くがなお残ると考えられる。さらに、上で考察したＮｍｅ１Ｃａｓ９のための最小化ｓｇＲＮＡはまた、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９構築物とも適合する。したがって、そのような短縮されたガイドＲＮＡは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を用いたゲノム編集にも同様に使用することができる可能性がある。
【０１３９】
一実施形態では、本発明は、ＮＮＮＮＧＮＴＴＴの配列を有するＨｐａＣａｓ９  ＰＡＭを意図している。長いＰＡＭではヒトゲノム内の標的化可能な部位の数が限定されるという事実にもかかわらず、ＨｐａＣａｓ９  ＰＡＭにより、極めて正確度が高いＮｍｅ１Ｃａｓ９（上記）と同様の非常に高い正確度で部位を標的とすることができると考えられる。
【０１４０】
本明細書で提示されているデータから、短いＣリッチＰＡＭを標的とするＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９ヌクレアーゼの、ヒト（ＨＥＫ２９３Ｔ）細胞においてゲノム編集を実施する能力が実証される。Certo  et  al.,  "Tracking  genome  engineering  outcome  at  individual  DNA  breakpoints"  Nature  Methods  8:671-676  (2011)。例えば、ＨｐａＣａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９により特定の遺伝子座における効率的なゲノム編集がもたらされることが示され、これにより、ＨｐａＣａｓ９およびＮｍｅ２Ｃａｓ９が哺乳動物細胞において活性であることが実証される。図１９および表２。
【表２】
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【０１４１】
これらのデータから、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＨｐａＣａｓ９のどちらによっても、以前に確証されたＮｍｅ１Ｃａｓ９と同じゲノム遺伝子座において同等のレベルでゲノム編集が実施されることが示される。ＳｍｕＣａｓ９に関しては、編集の効率は比較的低いが、活性がゼロではないことが重要であり、効率の改善が予測される。次いで、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を使用して、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞のゲノムに組み込まれたトラフィックライトレポーター（ＴＬＲ）における１４の追加的な部位を試験した。これらのアッセイでは、各部位は、「Ｃ」がＰＡＭ領域の第５のヌクレオチドであるＰＡＭ鋳型（すなわち、ＮＮＮＮＣＮＮＮ）と一致する。驚くべきことに、１４の部位全てが、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９により編集され、これにより、この酵素が、哺乳動物細胞において、種々のガイドを用いて一貫して活性であることが示される。最も上首尾のガイドＲＮＡは、ＮＮＮＮＣＣＮ  ＰＡＭコンセンサスと一致する。図２０。
【０１４２】
ＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログ切断を抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質に対する感受性について試験した。抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質は、Ｃａｓ９活性がもはや望まれない場合にＣａｓ９をオフにすることができる、天然に存在するタンパク質である。データから、３つのＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９オルソログの全てが、ある特定の抗ＣＲＩＳＰＲによって阻害されることが示される。図２１。これらのＣａｓ９オルソログの抗ＣＲＩＳＰＲによる制御可能性は、ゲノム編集におけるそれらの潜在的有用性を増大し得るものである。
【０１４３】
Ｂ．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９遺伝子編集
本明細書で提示されているデータは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体を使用した遺伝子編集を示すものである。データには、ＮＮＮＮＣＣ配列（上記）の状況で遺伝子標的配列内の任意のＣＣジヌクレオチドがＰＡＭとして機能し得ることを実証するためにトラフィックライトレポーター（ＴＬＲ）系を使用している。図２２。青色の棒は、蛍光を示す細胞の％であり、赤色の棒は、より正確に配列決定に基づいた％編集を示す（「ＴＩＤＥ解析」）。これらのデータから、トリヌクレオチド配列（例えば、配列ＮＮＮＮＣＣＸ内の「Ｘ」）の必要性とは対照的に、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９  ＰＡＭ結合のためにはジヌクレオチドで十分であることが確認される。発明の機構を理解する必要はないが、これは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９により編集可能なゲノム標的部位の頻度が少なくともＳｐｙＣａｓ９により編集可能な部位と同様であり、ＳａｕＣａｓ９、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９またはＣｊｅＣａｓ９および他の現行の代替物よりも頻度が大きいことを意味すると考えられる。
【０１４４】
さらに、Ｔ７Ｅ１アッセイを使用して、ネイティブなゲノム部位（例えば、組み込まれた人工蛍光レポーターではない）の編集を分析した。これらのデータにより、一部の状況では、第２の「Ｃ」さえ必要ない可能性があることが示唆される。図２３を参照されたい。どちらもＡＡＶＳ１遺伝子座内の標的部位であるＤｅＴＳ１およびＤｅＴＳ４により、それぞれＮＮＮＮＣＡ候補ＰＡＭおよびＮＮＮＮＣＧ候補ＰＡＭを有する標的部位における編集が可能になることに留意されたい。これらのＮｍｅ２Ｃａｓ９標的部位のいくつかが本明細書に開示される。表３を参照されたい。
【表３】
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【０１４５】
発明の機構を理解する必要はないが、これらのデータにより、ゲノム内に平均して４〜８塩基対ごとに候補編集部位があり得ることが示唆されると考えられる。これらのデータから、大多数のＣａｓ９  ｓｇＲＮＡがいくつかの機能性を有し、したがって、ｓｇＲＮＡスクリーニングの必要性が当技術分野において強調され過ぎている可能性があることも示唆される。
【０１４６】
Ｃ．急速に進化しているＰＡＭ相互作用ドメイン
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のｉｎ  ｖｉｖｏにおける適用には、バイオテクノロジーおよび治療学の多くの分野を変換する潜在性がある。何千ものＣａｓ９オルソログが天然に存在し、そのうちのほんの少数のみが、ｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集に関して確証されている。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ由来のＣａｓ９（ＳｐｙＣａｓ９）は、効率が高いこと、および非拘束性ＮＧＧプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）に起因して、広く使用されている。しかし、ＳｐｙＣａｓ９はサイズが比較的大きいことにより、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）などのパッケージング容量が限られた送達シャトルを使用するｉｎ  ｖｉｖｏ治療適用におけるその使用が制限される。いくつかのより小さなＣａｓ９オルソログが哺乳動物細胞において活性であることが公知であるが、これらは、標的部位の密度を限定する拘束性の大きなＰＡＭを有する。密接に関連するＣａｓ９オルソログのＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩＤ）の天然の変形形態では、これらの限界を克服するゲノム編集酵素の同定を活用することができる。一部の実施形態では、本発明は、Ｎ４ＣＣ  ＰＡＭを用いる小型の天然に超高正確度のＣａｓ９であるＮｍｅ２Ｃａｓ９複合体を使用すること意図している。本明細書で提示されているデータから、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が、ＳｐｙＣａｓ９と同じ標的部位密度をもたらす高忠実度の哺乳動物ゲノム編集プラットフォームであることが示される。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９をそのガイドＲＮＡと共に一体型ＡＡＶベクターによって送達することにより、成体マウスにおける効率的なゲノム編集が導かれ、肝臓におけるＰｃｓｋ９遺伝子の標的化により、有意なオフターゲティングを伴わずに血清コレステロール低減が誘導される（下記）。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９により、哺乳動物におけるｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集のための一体型ＡＡＶ適合性、天然の超高正確度、および高い標的部位密度の独特の組合せももたらされる。
【０１４７】
標的密度に加えて、Ｃａｓ９のオフターゲット活性（例えば、望ましくない遺伝子座における切断）を最小化することが、Ｃａｓ９を安全な治療剤として使用するために高度に望ましい。野生型（ｗｔ）ＳｐｙＣａｓ９は、独特のハイブリダイゼーション動態に起因して高度のオフターゲット活性を有する（Klein  et  al,  2018）。特に、それらのオンターゲット編集効率に関する疑問が残っており、これらのバリアントは、上で考察した全体的なサイズに関する限界を克服していない。対照的に、本明細書では、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびＣｊｅＣａｓ９の実施形態が天然に正確な遺伝子編集活性を含むことが示されている。発明の機構を理解する必要はないが、ｉ）ヒト細胞において活性である；ｉｉ）ＳｐｙＣａｓ９の例外的に高い標的部位密度を示す；ｉｉｉ）一体型ＡＡＶによる送達可能性のために十分に小型である；かつｉｖ）天然に超高正確度であることが以前に報告されたＣａｓ９オルソログは存在しないと考えられる。一実施形態では、本発明は、上記の特性の全てを含むゲノム編集プラットフォームとしてのＮｍｅ２Ｃａｓ９を意図している。例えば、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は、Ｎ４ＣＣ  ＰＡＭに対する高い親和性を含み、超高正確度であり、かつ哺乳動物細胞において効率的に機能する結合性部位を含む。一実施形態では、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を治療的ゲノム編集のために一体型ＡＡＶ送達プラットフォームにパッケージングする。
【０１４８】
１．急速に進化しているＰＩＤを有する密接に関連するＮｍｅ１Ｃａｓ９オルソログ
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株８０１３由来）がｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集のための小さな超高正確度Ｃａｓ９であることが以前報告されている（Amrani  et  al,  2018）。しかし、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、長いＰＡＭ（Ｎ４ＧＭＴＴ）に結合し、これにより、小さなウインドウを標的とし得るある特定の状況におけるＮｍｅ１Ｃａｓ９の使用が限定される。Ｃａｓ９によるＰＡＭ認識は、主にＣａｓ９のＰＡＭ相互作用ドメイン（ＰＩＤ）とＰＡＭに隣接するヌクレオチドの間のタンパク質−ＤＮＡ相互作用を通じて起こる。ＰＩＤはファージおよび他の移動性遺伝子エレメント（ＭＧＥ）による高い選択圧に供される。例えば、抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質はＰＩＤと相互作用してＣａｓ９を阻害することが示されている（下記）。これにより、大幅に異なるＰＡＭを認識するＰＩＤを有する密接に関連するＣａｓ９オルソログがもたらされ得る。
【０１４９】
最近、この原理は、Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓの２つの種を使用して強調された。Ｇ．ｓｔｅｒｏｔｈｅｒｍｐｏｐｈｉｌｕｓは、Ｎ４ＣＲＡＡ  ＰＡＭに特異的なＰＩＤを含むが、ＬＣ３００株ＰＩＤと交換すると、その親和性がＮ４ＧＭＡＡ  ＰＡＭに変化することが決定された（Harrington  et  al,  2017）。Ｎ．ｍｅｎｉｎｉｇｉｔｉｄｉｓ株が高度に配列決定されていることを考慮して、異なるＰＡＭを認識する急速に進化したＰＩＤを用いて密接に関連するＣａｓ９オルソログを見いだすことができることが仮定された。ＮｍｅＣａｓ９  ８０１３株は、ゲノム編集に関して十分に特徴付けられており、小さく、かつ超高正確度であるので、このＣａｓ９に対して高い配列同一性（＞８０％）を有するＣａｓ９オルソログを調査した。８０１３株と比較してＰＩＤアミノ酸配列が異なるいくつかのＣａｓ９オルソログが同定された。図３４Ａ。
【０１５０】
大幅に異なるＰＩＤを有するＣａｓ９オルソログの３つの別個の群が見いだされた。図３５Ａ。各ＰＩＤ群から１つの株、例えば、群２からＤｅ１１４４４および群３から９８００２を選択した。これらの２つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、インタクトなＣａｓ９オープンリーディングフレームおよびいくつかのスペーサーを伴うＣＲＩＳＰＲアレイを有し、これにより、これらの２つのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が活性な遺伝子座であることが示唆される。興味深いことに、これらのＣＲＩＳＰＲ遺伝子座のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡは、８０１３のｃｒＲＮＡおよびｔｒａｃｒＲＮＡと同一であり、同じｓｇＲＮＡを利用することができる。図３５Ｂ。
【０１５１】
これらのＣａｓ９オルソログが実際に異なるＰＡＭに対する親和性を有するＰＩＤを有するかどうかを試験するために、これらのオルソログに由来するタンパク質の残りでは配列同一性が高いので、８０１３  ＰＩＤを９８００２  ＰＩＤおよびＤｅ１１４４４  ＰＩＤと交換した。ＰＡＭを同定するために、これらのタンパク質「キメラ」を、以前に記載されている通り、組換えによって発現させ、精製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＰＡＭ同定に使用した。簡単に述べると、プロトスペーサーおよび下流の１０ヌクレオチドランダム化配列を含むＤＮＡ断片をｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて組換えＣａｓ９およびプロトスペーサーを標的とするｓｇＲＮＡを使用して切断した。図３４Ｂ。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９  ８０１３および試験されている他のＩＩ−Ｃ型系と一致して、Ｇ２３ヌクレオチドスペーサー長をｓｇＲＮＡに対して使用した。ＰＡＭ同定アッセイにより、これらの異なるＣａｓ９キメラが異なるＰＡＭを認識するＰＩＤを有することが明らかになった。例えば、そのＮ４ＧＡＴＴ  ＰＡＭを用いるＮｍｅ１Ｃａｓ９  ８０１３によって認識されるＧの代わりに５位のＣ残基を認識することにより。図３４Ｃ。
【０１５２】
しかし、キメラタンパク質の切断効率が低いことに起因して、残りのヌクレオチドを確信的に特徴付けることはできず、これにより、ＰＩＤの外側のわずかな残基が効率的な活性に関与する可能性があることが示唆される。図３５Ｃ。ＰＡＭをさらに解明するために、５位のＣを有する７ヌクレオチドランダム化ＰＡＭ（例えば、ＮＮＮＮＣＮＮＮ）を有するライブラリーに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイを実施した。結果から、ＮｍｅＣａｓ９−Ｄｅ１１４４４およびＮｍｅＣａｓ９−９８００２がそれぞれＮＮＮＮＣＣ（Ａ）  ＰＡＭおよびＮＮＮＮＣＡＡＡ  ＰＡＭを認識することが示唆された。図３５Ｄ。ＮｍｅＣａｓ９−Ｄｅ１１４４４は、５位のＣに対する強力な優先性を有したが、ヌクレオチド６および７はそれほどでもなかった。本明細書で使用される場合、Ｃａｓ９  Ｄｅ１１４４４オルソログは、「Ｎｍｅ２Ｃａｓ９」と称され、Ｃａｓ９  ９８００２オルソログは「Ｎｍｅ３Ｃａｓ９」と称される。
【０１５３】
このアッセイをまた、全長（例えば、ＰＩＤが取り換えられていない）Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を使用しても実施し、同様の結果が観察された。図３４Ｅ。これらの結果により、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＮｍｅ３Ｃａｓ９がＮｍｅ１Ｃａｓ９のものとは大幅に異なるＰＡＭを認識するＰＩＤを有することが示唆される。
【０１５４】
２．ヒト細胞におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９
Ｎｍｅ２Ｃａｓ９  ＰＩＤは小さなＰＡＭ配列に結合するので、このオルソログは、ヒトゲノム編集のために、特に高標的化密度が伴う場合に、有用である。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を特徴付けるために、全長（ＰＩＤが取り換えられていない）ヒト化Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を、哺乳動物での発現のために、ＣＭＶにより駆動されるプラスミドにＮＬＳと共にクローニングした。ヒト細胞における特徴付けのために、以前に記載されたものと同様のトラフィックライトレポーター系を使用した（Certo  et  al.,  2011）。
【０１５５】
＋１フレームシフトインデルの誘導を、ＴＬＲ２．０遺伝子座における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）による不完全な修復によって創出した。ドナーＤＮＡの不在下ではインフレームｍＣｈｅｒｒｙタンパク質がもたらされ、これは、フローサイトメトリーによって定量化することができる。図３６Ａ。最初の試験として、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９プラスミドを、Ｎ４ＣＣＸ  ＰＡＭを有するプロトスペーサーを標的とするスペーサーを有する１５種のｓｇＲＮＡプラスミドと共にトランスフェクトした。対照として、ＳｐｙＣａｓ９およびＮｍｅ１Ｃａｓ９を、それぞれＮＧＧおよびＮ４ＧＡＴＴプロトスペーサーを標的とするそれらの同類ｓｇＲＮＡと共に使用した。７２時間後に細胞を収集し、各標的部位についてｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の数を定量化した。ＳｐｙＣａｓ９およびＮｍｅ１Ｃａｓ９では、それらのそれぞれの標的において効率的な編集が示された（それぞれ約２８％および１０％ｍＣｈｅｒｒｙ）図３６Ｂ。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９に関しては、Ｎ４ＣＣＸ  ＰＡＭを有する標的１５種全てが種々の程度に機能的であったが（４％ｍＣｈｅｒｒｙから２０％ｍＣｈｅｒｒｙまでにわたる）、付随的なｓｇＲＮＡを伴わないＮｍｅＣａｓ９による処理および／またはＮ４ＧＡＴＴ対照では、ｍＣｈｅｒｒｙ細胞はもたらされなかった。図３６Ｂ。これらのデータから、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がヒト細胞においてＮ４ＣＣ  ＰＡＭを認識することが示唆された。
【０１５６】
Ｎｍｅ２Ｃａｓ９  ＰＡＭをさらに解明するために、ＴＬＲレポーター細胞においてＮ５ＣＸおよびＮ４ＣＤ（Ｄ＝Ａ、Ｔ、Ｇ）を用いても標的部位を試験した。Ｎ５ＣＸ  ＰＡＭおよびＮ４ＣＤ  ＰＡＭでは標的部位における検出可能な編集は観察されず、これにより、ＴＬＲ２．０レポーターに基づいて５位のＣヌクレオチドおよび６位のＣヌクレオチドがどちらもＮｍｅ２Ｃａｓ９の活性に必要であることが示唆される。図３７Ａおよび３７Ｂ。これらの結果により、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が、Ｎ４ＣＣ  ＰＡＭに結合するＰＩＤを含み、哺乳動物細胞においてＴＬＲ２．０遺伝子座で一貫して機能的であることが実証される。
【０１５７】
ｃｒＲＮＡのスペーサー部分の長さは、異なるＣａｓ９オルソログ間で異なる。ＳｐｙＣａｓ９の最適なスペーサーの長さは２０クレオチドであるが、１７ヌクレオチドまでの短縮が許容される。Fu  et  al.,  Nature  Biotechnology  32,  279  (2014)。対照的に、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、２４ヌクレオチドのスペーサーを有するｓｇＲＮＡを含み、１８ヌクレオチドまでの短縮が許容される（Amrani  et  al.,  2018）。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９についてのスペーサーの長さを試験するために、同じ遺伝子座を標的とするが、スペーサーの長さが変動するｓｇＲＮＡプラスミドを創出した。図３６Ｃおよび図３７Ｂ。Ｇ２３スペーサー、Ｇ２２スペーサーおよびＧ２１スペーサーを使用した場合に同等の活性が観察され、ガイドをＧ２０およびＧ１９に短縮した場合には活性が有意に減少した。図３６Ｃ。これらの結果により、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の最適なスペーサーの長さは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９、ＧｅｏＣａｓ９およびＣｊｅＣａｓ９と同様に２２〜２４ヌクレオチドの間であることが示唆される。したがって、下記の全ての実験は２３〜２４ヌクレオチドのスペーサーを用いて実施した。
【０１５８】
Ｃａｓ９オルソログは、標的ＤＮＡの相補鎖および非相補鎖における二本鎖切断を誘導するために、それぞれＨＮＨドメインおよびＲｕｖＣドメインを使用すると考えられている。あるいは、突出部を創出することによってゲノム編集の特異性および相同組換え修復（ＨＤＲ）を改善するためにＣａｓ９ニッカーゼが使用されてきた（Ran  et  al,  2013）。しかし、この手法は、高い標的密度に起因してＳｐｙＣａｓ９を使用することによってのみ成功している。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９をニッカーゼとして使用するために、それぞれＲｕｖＣドメインおよびＨＮＨドメインの触媒残基における変異をもたらすＮｍｅ２Ｃａｓ９Ｄ１６ＡおよびＮｍｅ２Ｃａｓ９Ｈ５８８Ａを創出した。ＴＬＲ２．０もＨＤＲの効率を試験するために使用することができ、その場合、ドナーがもたらされると修復された遺伝子座がＧＦＰを発現するので、これらのＮｍｅ２Ｃａｓ９ニッカーゼを用いたＨＤＲを試験するためにドナーＤＮＡ配列を含めた。３２ｂｐおよび６４ｂｐの間隔があいた切断部位を標的とするガイドＲＮＡを使用して各ニッカーゼの機能性を試験するために、ＴＬＲ２．０遺伝子内の標的部位を選択した。対照として、単一の部位を標的とする野生型Ｎｍｅ２Ｃａｓ９では効率的な編集が示され、ＮＨＥＪ修復経路およびＨＤＲ修復経路の両方の誘導が伴った。ニッカーゼに関しては、３２ｂｐおよび６４ｂｐの間隔があいた切断部位ではＮｍｅ２Ｃａｓ９Ｄ１６Ａ（ＨＮＨニッカーゼ）を使用した編集が示されたが、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９Ｈ５８８Ａを使用するといずれの標的もニック導入されなかった。図３６Ｄ。
【０１５９】
Ｃａｓ９オルソログは、通常ＰＡＭの近位の８〜１２ヌクレオチドの間の標的配列とハイブリダイズするシード配列を含む。シード配列とＰＡＭの間のミスマッチ（例えば、非相補性）により、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ活性が低減する可能性がある。２３ヌクレオチドのスペーサーに沿って単一ヌクレオチドミスマッチを動かすことにより、ＴＬＲ２．０遺伝子における同じ遺伝子座を標的とする一連の一過性トランスフェクションを実施した。図３７Ｃ。他のＣａｓ９オルソログと同様に、データから、ｍＣｈｅｒｒｙ陽性細胞の数の減少から推定される通り、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がＰＡＭの近位の標的配列とハイブリダイズする最初の８〜９ヌクレオチド内に「シード配列」を有することが示唆される。ミスマッチに対する許容性はｓｇＲＮＡの配列および標的遺伝子座に高度に依存するにもかかわらず、これらの結果により、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が特にそのシード配列においてミスマッチに関して非常に低い許容性を有することが示唆される。
【０１６０】
３．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９によるゲノム編集効率
一過性トランスフェクションを使用してＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるヒトゲノム全体を通して４０の異なる標的部位を標的とするためにＮｍｅ２Ｃａｓ９を使用した。表４。
【表４】
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【０１６１】
トランスフェクションの７２時間後、細胞を収集し、その後、ｇＤＮＡ抽出および標的とされた遺伝子座の選択的増幅を行った。Ｔｒａｃｋｉｎｇ  ｏｆ  Ｉｎｄｅｌｓ  ｂｙ  Ｄｅｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎ（ＴＩＤＥ）解析を使用して、各遺伝子座におけるインデル率を測定した。標的配列および遺伝子座に応じてインデル率が有意に変動したにもかかわらず、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９による効率的な編集が観察された。図３８Ａ。さらに、ＣＹＢＢ（ｘ連鎖慢性肉芽腫症を引き起こす変異）およびＡＧＡ（アスパルチルグリコサミン尿症を引き起こす変異）などの治療的に関連性のある遺伝子座またはその付近の標的部位に対するＮｍｅ２Ｃａｓ９の親和性により、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９には治療的潜在性があることが示唆される。さらに、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９プラスミドの数量を増加させることにより、編集効率を上昇させることができた。図３９Ａ。総合すると、これらの結果により、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞において特異的な標的ゲノム部位を選択的に編集するためにＮｍｅ２Ｃａｓ９を構築することができることが実証される。
【０１６２】
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に加えて、ヒト白血病Ｋ５６２細胞、ヒト骨肉腫Ｕ２ＯＳ細胞およびマウス肝臓ヘパトーマＨｅｐａ１−６細胞を含めたいくつかの他の哺乳動物細胞におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９の遺伝子編集効率を決定した。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を発現するレンチウイルス構築物を創出し、ＳＦＦＶプロモーターの制御下でＮｍｅ２Ｃａｓ９を安定に発現するようにＫ５６２細胞に形質導入した。この安定な細胞株では、無処理の細胞と比較して成長および形態に関していかなる有意差も示されず、これにより、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が、安定に発現された場合に毒性でないことが示唆される。これらの細胞にいくつかの標的部位を標的とするｓｇＲＮＡを発現するプラスミドを一過性に電気穿孔し、７２時間後にＴＩＤＥによってインデル率について解析した。試験した３つの部位において効率的な編集が観察され、これにより、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９のＫ５６２細胞において機能する能力が実証される。Ｈｅｐａ１−６細胞に関しては、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９をコードするプラスミドとｓｇＲＮＡをコードするプラスミドを、上記のＨＥＫ２９３Ｔへの形質導入と同様の技法を使用して同時トランスフェクトした。これらのデータから、このマウス細胞株においてＮｍｅ２Ｃａｓ９によりＰｃｓｋ９部位およびＲｏｓａ２６部位が効率的に編集されたことも示される。図３８Ｂ。
【０１６３】
以前の研究により、Ｃａｓ９をプラスミドトランスフェクションの代わりにリボ核タンパク質（ＲＮＰ）により送達することが、一部のゲノム編集適用に関して代替選択になり得ることが示唆される。例えば、ＲＮＰ電気穿孔を用いると、プラスミドによる送達と比較してＳｐｙＣａｓ９のオフターゲット効果が有意に低減し得る。Kim  et  al.,  Genome  Research  24:1012-1019  (2014)。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がＲＮＰによる送達によって機能的になるかどうかを試験するために、Ｈｉｓタグを付したＮｍｅ２Ｃａｓ９を３つの核局在化シグナル（ＮＬＳ）および精製された組換えタンパク質と共に細菌発現構築物にクローニングした。いくつかの確証された標的部位を標的とするｓｇＲＮＡをＴ７  ｉｎ  ｖｉｔｒｏ転写によって生成した。ＴＩＤＥによって検出された通り、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体の電気穿孔により標的部位における上首尾の編集が誘導された。図３８Ｃ。これらの結果から、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９をプラスミドとして、またはＲＮＰ複合体として送達することができることが示唆される。全体的に、これらの結果から、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が、異なる送達方式で種々の細胞型において機能的であることが実証される。
【０１６４】
４．抗ＣＲＩＳＰＲタンパク質阻害
多様な細菌種由来のＮｍｅ１Ｃａｓ９に対する５つの抗ＣＲＩＳＰＲ（Ａｃｒ）タンパク質ファミリーにより、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいておよびヒト細胞においてＮｍｅ１Ｃａｓ９が阻害されることが報告されている（Pawluk  et  al.  2016、Lee  et  al.,  mBio,  in  press）。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９とＮｍｅ２Ｃａｓ９の間の高い配列同一性を考慮すると、これらのＡｃｒファミリー内の少なくとも一部の種によりＮｍｅ２Ｃａｓ９も阻害され得る可能性があると思われる。５つのＡｃｒファミリー全てを組換えによって発現させ、精製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて標的配列を切断するＮｍｅ２Ｃａｓ９の能力を試験した（Ａｃｒ：Ｃａｓ９モル比１０：１）。陰性対照として、Ｅ．ｃｏｌｉにおけるＩ−Ｅ型ＣＲＩＳＰＲ系の阻害剤（ＡｃｒＥ２）を使用した。予測通り、全てのＡｒｃファミリーによりＮｍｅ１Ｃａｓ９が阻害されたが、ＡｃｒＥ２ではＮｍｅ１Ｃａｓ９を阻害することができなかった。特に、Ａｃｒ  ＩＩＣ１Ｎｍｅ、Ａｃｒ  ＩＩＣ２Ｎｍｅ、Ａｃｒ  ＩＩＣ３ＮｍｅおよびＡｃｒ  ＩＩＣ４Ｈｐａにより、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９遺伝子編集活性が阻害された。図４０Ａ、上。
【０１６５】
著しいことに、ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕではｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて１０倍過剰であってもＮｍｅ２Ｃａｓ９が阻害されず、これにより、ＡｃｒＩＩＣ５ＳｍｕがＰＩＤと相互作用することによってＮｍｅ１Ｃａｓ９を阻害する可能性があることが示唆される。これをさらに確認するために、ＮｍｅＣａｓ９のハイブリッドバージョン（例えば、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９のＰＩＤを有するＮｍｅ１Ｃａｓ９）を使用して同じｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断アッセイを実施した。このハイブリッドは活性が低減するので、Ｃａｓ９：Ａｃｒモル比１０：１を維持しながら同様の切断プロファイルを達成するために、より高濃度（約３０×）のＣａｓ９を使用した。最初の結果と一致して、このタンパク質キメラに対するＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕによる阻害は観察されなかった。図４１。ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕがハイブリッドタンパク質を阻害することができないことにより、ＡｃｒＩＩＣ５ＳｍｕがＮｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤと相互作用する可能性があることがさらに示唆される。
【０１６６】
上記のｉｎ  ｖｉｔｒｏデータから、Ａｃｒ−ＩＩＣ１Ｎｍｅ、Ａｃｒ−ＩＩＣ２Ｎｍｅ、Ａｃｒ−ＩＩＣ３ＮｍｅおよびＡｃｒ−ＩＩＣ４ＨｐａをＮｍｅ２Ｃａｓ９によるゲノム編集のオフスイッチとして使用することができることが示唆された。これを試験するために、哺乳動物プロモーターによって駆動されるＡｃｒをコードするプラスミドの存在下または不在下でトランスフェクションを上記の通り実施した。大多数のＡＣＲによりＮｍｅ１Ｃａｓ９が１：１：１の比で阻害されることが報告されているので（Pawluk  et  al.,  2016）、各プラスミドおよそ１５０ｎｇ（例えば、ｓｇＲＮＡ：Ｃａｓ９：Ａｃｒ比１：１：１）をトランスフェクトした。ｉｎ  ｖｉｔｒｏ実験から予測される通り、ＡｃｒＩＩＣ１Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ２Ｎｍｅ、ＡｃｒＩＩＣ３ＮｍｅおよびＡｃｒＩＩＣ４ＨｐａによりＮｍｅ２Ｃａｓ９によるゲノム編集が阻害されたが、ＡｃｒＩＩＣ５ＳｍｕではＮｍｅ２Ｃａｓ９によるゲノム編集を阻害することができなかった（図４０Ｂ。さらに、Ａｃｒ３ＮｍｅおよびＡｃｒ４Ｈｐａによって検出レベルを下回る完全な阻害が観察され、これにより、これらの効力がＡｃｒＩＩＣ１ＮｍｅおよびＡｃｒＩＩＣ２Ｎｍｅと比較して高いことが示唆される。ＡｃｒＩＩＣ１ＮｍｅおよびＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａの効力をさらに比較するために、種々のＡｃｒとＣａｓ９の比で実験を実施した。図４０Ｃ。結果的に、ＡｃｒＩＩＣ４Ｈｐａは、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９に対する非常に強力な阻害剤であり、Ａｃｒ：Ｃａｓ９が２５ｎｇ：１００ｎｇという低さの濃度でＮｍｅ２Ｃａｓ９を４倍阻害した。まとめると、これらのデータから、Ａｃｒタンパク質をＮｍｅ２Ｃａｓ９に基づく適用のオフスイッチとして使用することができることが示唆される。
【０１６７】
５．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の超高正確度
オフターゲット効果により、意図されたものではない変異が創出されることによってｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏにおけるヒト遺伝子治療の間に治療適用に潜在的に交絡が生じる可能性がある。野生型ＳｐｙＣａｓ９はヒト細胞において比較的大きいオフターゲット部位の数を有するので、高忠実度のＳｐｙＣａｓ９バリアントを作出するためにいくつかの試みがなされており、成功は変動している。対照的に、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９は、天然に超高正確度であり、細胞およびマウスモデルにおいて注目すべき忠実度が実証されている。以前の研究により、Ｃａｓ９の忠実度がＰＩＤによって決定されないハイブリダイゼーション動態から決定され得ることが示され、したがって、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９も超高正確度である可能性があることが示唆される。
【０１６８】
ＮｍｅＣａｓ９オフターゲットプロファイルを経験的に評価するために、配列決定によって可能になる二本鎖切断のゲノムワイド不偏同定（Ｇｅｎｏｍｅ−Ｗｉｄｅ，Ｕｎｂｉａｓｅｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ｂｒｅａｋａｓ  Ｅｎａｂｌｅｄ  ｂｙ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ；ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ）技法を使用して、潜在的なオフターゲット部位を不偏的に決定した。ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑは、二本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｄｓＯＤＮ）のゲノム全体を通したＤＮＡ二本鎖切断部位への組み入れに依拠する。これらの切断部位を増幅およびハイスループットの配列決定によって検出する。
【０１６９】
ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑの基準として野生型ＳｐｙＣａｓ９を使用した。特に、ＳｐｙＣａｓ９とＮｍｅ２Ｃａｓ９は同じプロモーターによって駆動される同一の骨格にクローニングすることができ、また、これらのＰＡＭは重複していないので、同じ部位を標的とするために使用した。この技法により、２つのヌクレアーゼの対照比較が可能になる。ＶＥＧＦＡにおいてＮＧＧＮＣＣＮ配列を有する６つの二重部位（ＤＳ）を標的とした。図４２Ａ。トランスフェクションの７２時間後、標的部位に対してＴＩＤＥ解析を実施した。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９では、６つの部位全てにおいて、それらのうちの２つでは低効率であったが、インデルが誘導され、一方、ＳｐｙＣａｓ９では、４／６部位でインデルが誘導された。図４２Ｂ。これらの４つの部位のうち２つ（ＤＳ１およびＤＳ４）において、ＳｐｙＣａｓ９によりＮｍｅ２Ｃａｓ９の約７倍のインデルが誘導されたが、ＤＳ６ではＮｍｅ２Ｃａｓ９によりインデルの約３倍の増加が誘導された。ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑに関して、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９がＳｐｙＣａｓ９と比してそれぞれ同様に効率的である、より低く効率的である、またはより効率的である部位におけるオフターゲット切断を決定するために、標的ＤＳ２、ＤＳ４およびＤＳ６を選択した。
【０１７０】
３つの二重標的部位に加えて、３０〜５０％インデル率（細胞型に応じて）を有するＴＳ６標的部位を、マウスＰｃｓｋ９遺伝子およびＲｏｓａ２６遺伝子と共にＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ解析に供した。ＴＳ６標的は高度に効率的な遺伝子編集を受けることが公知であるので、オフターゲットプロファイルはより卓越したものになることが考えられた。さらに、次いでマウスＰｃｓｋ９およびＲｏｓａ２６部位を試験することにより、異なる細胞株におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９の忠実度、およびｉｎ  ｖｉｖｏゲノム編集の候補遺伝子座が明らかになる。結果的に、各Ｃａｓ９について、それらの同類ｓｇＲＮＡと共にトランスフェクションを実施し、ｄｓＯＤＮおよびＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑライブラリーを調製した。ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ解析により、ＴＩＤＥによって同様のパターンが観察された両方のＣａｓ９オルソログを用いた効率的なオンターゲット編集が実証された。オフターゲット同定に関しては、解析により、３つのＳｐｙＣａｓ９部位では予測された大きなオフターゲット部位の数（例えば、およそ１０〜１０００の間にわたる）を有するが、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は著しくきれいなオフターゲットプロファイルを有することが明らかになった。具体的には、同じ二重部位を標的とするＮｍｅ２Ｃａｓ９では、最大で１つのオフターゲット部位が示された。図４２Ｃを参照されたい。
【０１７１】
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑによって検出されたオフターゲット部位を確証するために、標的化ディープシーケンシングを実施して、ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑに依存しない編集（すなわち、ｄｓＯＤＮの同時トランスフェクションを伴わない）後の上位のオフターゲット遺伝子座におけるインデル形成を測定した。ＳｐｙＣａｓ９では試験したオフターゲット部位の大多数においてかなりの編集（一部の例では、対応するオンターゲット部位における編集よりも効率的）が示されたが、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９では、孤立したＤＳ２およびＤＳ６候補オフターゲット部位において検出可能なインデルは示されなかった。Ｒｏｓａ２６  ｓｇＲＮＡを用いると、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９により、Ｈｅｐａ１−６細胞においてＲｏｓａ２６−ＯＴ１部位で約１％の編集が誘導され、これと比較して、オンターゲット編集は約３０％であった。図４２Ｄ。
【０１７２】
次に、ＳｐｙＣａｓ９をＧＵＩＤＥ−ｓｅｑの基準として使用することを可能にするために、ＳｐｙＣａｓ９とＮｍｅ２Ｃａｓ９が重複しないＰＡＭを有するという事実に起因して、これらにより、両方のＣａｓ９の結合特性のＰＡＭ要件を同時に満たす５’−ＮＧＧＮＣＣ−３’配列が隣接する任意の二重部位（ＤＳ）を潜在的に編集することができる。これにより、全く同じオンターゲット部位に結合するｓｇＲＮＡを用いたオフターゲティングの対照比較が可能になる。各Ｃａｓ９およびそれらのそれぞれのｓｇＲＮＡを発現するマッチするプラスミドを使用して、ヒトゲノム全体を通した多数の遺伝子座において２８のＤＳを標的とした。プラスミド送達の７２時間後、各ヌクレアーゼによって標的とされる部位に対してＴＩＤＥ解析を実施した。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９により、１９の標的部位において、それらのうちの４つでは低効率（＜５％）であったが、インデルが誘導され、一方、ＳｐｙＣａｓ９では、２３の標的部位で、ある場合では＜５％の効率でインデルが誘導された。３つの二重標的部位はどちらのヌクレアーゼによる編集に対しても不応性であった。ＳｐｙＣａｓ９は全体的により効率的であることが明白であるが、部位の多くでどちらの酵素も同様の効率を有し、１７の部位のうち２つでは、どちらのヌクレアーゼによっても編集され、これらの条件下ではＮｍｅ２Ｃａｓ９の方が効率的であった。図４２Ｅを参照されたい。
【０１７３】
このオフターゲット部位はコンセンサスＮｍｅ２Ｃａｓ９  ＰＡＭ（ＡＣＴＣＣＣＴ）を有し、ガイドと相補的な領域のＰＡＭ遠位末端（すなわち、シードの外側）におけるミスマッチがたった３つであることには注目すべきである。図４２Ｆを参照されたい。これらのデータから、哺乳動物細胞におけるＮｍｅ２Ｃａｓ９によるゲノム編集の正確度が高度であることを示す本発明者らのＧＵＩＤＥ−ｓｅｑの結果が裏付けられ、補強される。
【０１７４】
これらの側面でのオンターゲット対オフターゲットを、各遺伝子座の標的化増幅、その後のＴＩＤＥ解析によって比較した。図４３Ａ。興味深いことに、ＴＩＤＥによっていずれかのｓｇＲＮＡについてのオフターゲット部位においてインデルを検出することはできなかったが、効率的なオンターゲット編集が観察された。さらに、これらのオフターゲットについてのリード計数はＳｐｙＣａｓ９の場合に観察されたものと比較して無視できるものであり、これにより、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が高度に特異的であることが示唆される（図４３Ｃ、それぞれ左対右）。これらのＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑの結果をさらに確証するために、ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋを使用して、ゲノム内の高度に同様の部位を伴う最も活性なｓｇＲＮＡのうちの２つについて潜在的なオフターゲット部位をコンピューターにより予測した（Zhu  et  al.,  2014）。これらを、Ｎ４ＣＸ  ＰＡＭ、および、大部分がＰＡＭ遠位領域内の２〜５つのミスマッチを用いて実施した。図４３Ｄ。総合すると、これらのデータから、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９が哺乳動物細胞における高忠実度のヌクレアーゼであることが示唆される。
【０１７５】
６．臨床的適用
一実施形態では、本発明は、ＡＡＶ送達による治療的ゲノム編集のための、小さな非拘束性ＰＡＭを用いる最初の小型、超高正確度Ｃａｓ９としてのＮｍｅ２Ｃａｓ９複合体を意図している。以前報告された超高正確度Ｃａｓ９オルソログは、小さくはあるが、本明細書に開示されるものよりも長いＰＡＭを有し、それにより、所与の遺伝子における標的部位が限定されること（およびＳａｕＣａｓ９の場合ではオフターゲットプロファイル）に起因してそれらの治療的使用が制限される。この不都合は、標的とすることができるのが特定のウインドウのみであるまたは精密なブロック欠失が必要とされる遺伝子座では悪化する。
【０１７６】
本明細書において確立される一体型ＡＡＶ送達プラットフォームを使用して、任意の組織における任意の遺伝子を標的とすることができる。さらに、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９の超高正確度により、標的遺伝子の精密な編集が可能になり、したがって、以前に観察されたオフターゲット活性に起因して生じる安全性の懸念が改善される。この目的に関して、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９には、既存のツールを補完するだけでなく、ウイルス性送達による治療的ゲノム編集のための好ましい選択になる潜在性がある。
【０１７７】
さらに、種々のＡｃｒによりＮｍｅ２Ｃａｓ９が阻害されることにより、特定のドメインを急速に進化させるようにＣａｓ９に課せられる可能性のある進化的圧力が示唆される。具体的には、ＡｃｒＩＩＣ５ＳｍｕではＮｍｅ２Ｃａｓ９が阻害されないことから、その阻害の機構がＰＩＤを通じたものである可能性が生じる。ＡｃｒＩＩＣ５Ｓｍｕが現在までＮｍｅ１Ｃａｓ９の最も強力な阻害剤であることを考慮して、ＡｃｒＩＩＣ５ＳｍｕはＮｍｅ１Ｃａｓ９を頑強にオフにするために使用することができるが、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９をオフにするためには使用することができないことが本明細書で意図されている。これは、多重化が、特異的なオルソログを制御する能力によって増強される細胞の状況において特に興味深い。
【０１７８】
最後に、公共のデータベース内には何千ものＣａｓ９オルソログが存在するが、そのうちのほんの少数のみが特徴付けられている。本明細書において意図されている一部の実施形態では、密接に関連するＣａｓ９オルソログにおいて天然の変形形態を活用して、２種の新規のＣａｓ９ヌクレアーゼ、すなわち、それぞれＮ４ＣＣ  ＰＡＭおよびＮ４ＣＡＡＡ  ＰＡＭを用いるＮｍｅ２Ｃａｓ９およびＮｍｅ３Ｃａｓ９を創出する。本明細書で提示されているデータから、密接に関連するオルソログでさえ、はるかに異なる性質を有する場合があることが実証される。例えば、これらのオルソログは、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９と全く同じｓｇＲＮＡを使用し、これにより、ｔｒａｃｒＲＮＡを予測することおよび各オルソログについて正しいスペーサーの長さを決定することの難しさが回避される。さらに、３種全てのヌクレアーゼに拡張するためにより短くより安定なｓｇＲＮＡ（化学修飾など）を作出することができる可能性がある。これらの特性により、ゲノム編集の試みを容易にし、タンパク質およびＲＮＡ操作に付随する費用を低減することができる。
【０１７９】
本明細書に記載の実施形態がＣａｓ９に制限されず、Ｃａｓ１２およびＣａｓ１３などの他のＣａｓタンパク質に適用することができることが当業者には明らかであるはずである。Ｃａｓ９の高頻度可変性はＰＩＤに制限されないことも理解されるはずである。本明細書では、所与のＣａｓ９と高度の相同性を共有するが、他の型の選択圧に起因して他のドメインは異なる株が存在すると考えられる。総合すると、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９は、治療的ゲノム編集のための現行のＣＲＩＳＰＲプラットフォームを改善する新規のヌクレアーゼである。
【０１８０】
Ｖ．ヌクレオチド送達プラットフォーム
上記のＡＡＶヌクレオチド送達系の他に、本発明は、大まかに均一な分布をもたらし、制御可能な放出速度を有する、核酸と適合性のいくつかの送達系を意図している。本発明の一部の実施形態は、本明細書に記載のＩＩ−Ｃ型Ｃａｓ９−ｓｇＲＮＡ複合体をコードする核酸送達系を意図している。
【０１８１】
核酸送達系の創出において有用である種々の異なる媒体を下に記載する。いかなる１つの媒体または担体も本発明を限定するものではない。任意の媒体または担体を別の媒体または担体と組み合わせることができることに留意されたい。例えば、一実施形態では、化合物に付着したポリマー微小粒子担体をゲル媒体と組み合わせることができる。
【０１８２】
本発明により意図される担体または媒体は、ゼラチン、コラーゲン、セルロースエステル、デキストラン硫酸、ペントサンポリサルフェート、キチン、糖類、アルブミン、フィブリンシーラント、合成ポリビニルピロリドン、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシド、ポリエチレンオキシドおよびポリプロピレンオキシドのブロックポリマー、ポリエチレングリコール、アクリレート、アクリルアミド、これだけに限定されないが２−ヒドロキシエチルメタクリレートを含めたメタクリレート、ポリ（オルトエステル）、シアノアクリレート、ゼラチン−レゾルシン−アルデヒド型生体接着剤、ポリアクリル酸ならびにその共重合体およびブロック共重合体を含む群から選択される材料を含む。
【０１８３】
微小粒子
本発明の一実施形態では、微小粒子を含む核酸送達系が意図されている。微小粒子は、リポソーム、ナノ粒子、マイクロスフェア、ナノスフェア、マイクロカプセル、およびナノカプセルを含むことが好ましい。本発明により意図される一部の微小粒子は、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）、これだけに限定されないがポリグリコール酸およびポリ乳酸を含めた脂肪族ポリエステル、ヒアルロン酸、改質多糖、キトサン、セルロース、デキストラン、ポリウレタン、ポリアクリル酸、疑似ポリ（アミノ酸）（psuedo-poly(amino  acids)）、ポリヒドロキシ酪酸関連共重合体、ポリ酸無水物、ポリメチルメタクリレート、ポリ（エチレンオキシド）、レシチンおよびリン脂質を含むことが好ましい。
【０１８４】
リポソーム
本発明の一実施形態では、本明細書に記載の核酸を付着させ、放出することができるリポソームが意図されている。リポソームは、リン脂質などの両親媒性分子で構成される、水性コアを取り囲む顕微鏡レベルの球状脂質二重層である。例えば、リポソームは、リン脂質ミセルの疎水性尾部の間に核酸を捕捉することができる。水溶性作用物質をコア内に閉じ込めることができ、脂質可溶性作用物質を殻様二重層に溶解させることができる。リポソームは、界面活性物質または他の乳化剤を使用せずに水溶性化学物質および水不溶性化学物質を媒体中で一緒に使用することを可能にするという点で特別な特性を有する。リポソームは、リン脂質を水性媒体中に強力に混合させることによって自然発生的に形成させることができる。水溶性化合物は、リン脂質を水和させることができる水溶液中に溶解される。したがって、リポソームが形成されると、これらの化合物が水性リポソーム中心部に捕捉される。リポソーム壁はリン脂質膜であり、油などの脂溶性材料を保持する。リポソームにより、組み入れられた化合物の制御放出がもたらされる。さらに、リポソームを、ポリエチレングリコールなどの水溶性ポリマーでコーティングして、薬物動態半減期を増大させることができる。本発明の一実施形態では、リポソーム作製を改良し、その結果、特別に設計された構造特性を有する安定な単層（ｕｎｉｌａｍｅｌｌａｒ（ｓｉｎｇｌｅ  ｌａｙｅｒ））リポソームをもたらすための超高せん断技術が意図されている。リポソームのこれらの独特の性質により、通常は不混和性の化合物の同時貯蔵およびそれらの制御放出能が可能になる。
【０１８５】
一部の実施形態では、本発明は、カチオン性およびアニオン性リポソーム、ならびに中性脂質を有するリポソームを意図している。カチオン性リポソームは、材料と脂肪酸リポソーム構成成分を混合し、それらに電荷を付随させることによって負に荷電した材料を含むことが好ましい。明白に、カチオン性またはアニオン性リポソームの選択は、最終的なリポソーム混合物の所望のｐＨに依存する。カチオン性リポソームの例としては、リポフェクチン、リポフェクタミン、およびリポフェクトエース（lipofectace）が挙げられる。
【０１８６】
本発明の一実施形態では、少なくとも１つの核酸の制御放出をもたらすリポソームを含む核酸送達系が意図されている。制御放出が可能なリポソームは、ｉ）生分解性かつ無毒性であり、ｉｉ）水溶性化合物と油溶性化合物の両方を保有し、ｉｉｉ）不応性化合物を可溶化し、ｉｖ）化合物の酸化を防ぎ、ｖ）タンパク質の安定化を促進し、ｖｉ）水和を制御し、ｖｉｉ）これだけに限定されないが、脂肪酸鎖長、脂肪酸脂質組成、飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の相対量、および物理的な立体配置などの二重層組成物中の変形形態によって化合物の放出を制御し、ｖｉｉｉ）溶媒依存性を有し、ｉｖ）ｐＨ依存性を有し、かつｖ）温度依存性を有することが好ましい。
【０１８７】
リポソームの組成物は、２つの分類に広範にカテゴリー化される。従来のリポソームは、一般に、糖脂質を含有してもしなくてもよい合成された同一鎖リン脂質を含んでよい安定化された天然のレシチン（ＰＣ）の混合物である。特別なリポソームは、ｉ）双極性脂肪酸；ｉｉ）組織標的化治療のための抗体に付着する能力；ｉｉｉ）これだけに限定されないが、リポタンパク質および炭水化物などの材料でコーティングされている；ｉｖ）多重封入ならびにｖ）エマルション適合性を含み得る。
【０１８８】
リポソームは、実験室において、これだけに限定されないが、超音波処理および振動などの方法によって容易に作出することができる。あるいは、化合物送達リポソームは市販されている。例えば、Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．が特異的送達要件のための特注設計リポソームを製造していることが公知である。
【０１８９】
マイクロスフェア、微小粒子およびマイクロカプセル
マイクロスフェアおよびマイクロカプセルは、一般に、均一な分布を維持し、化合物の安定な制御放出をもたらすことができ、生産および分配に関して経済的であるので、有用である。付随する送達ゲルまたは化合物浸透ゲルは透明であるか、あるいは、前記ゲルは医療関係者による可視化を容易にするために着色されていることが好ましい。
【０１９０】
マイクロスフェアは、商業的に入手可能である（Ｐｒｏｌｅａｓｅ（登録商標）、Ａｌｋｅｒｍｅ’ｓ：Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、Ｍａｓｓ．）。例えば、少なくとも１つの治療剤を含むフリーズドライした媒体を適切な溶媒中にホモジナイズし、噴霧して、２０〜９０μｍの範囲のマイクロスフェアを製造する。次いで、精製、封入および貯蔵の段階の間に持続放出の完全性を維持する技法が続く。Scott  et  al.,  Improving  Protein  Therapeutics  With  Sustained  Release  Formulations,  Nature  Biotechnology,  Volume  16:153-157  (1998)。
【０１９１】
生分解性ポリマーを使用することによってマイクロスフェア組成物を改変することにより、核酸放出の速度を制御する能力をもたらすことができる。Miller  et  al.,  Degradation  Rates  of  Oral  Resorbable  Implants  ｛Polylactates  and  Polyglycolates:  Rate  Modification  and  Changes  in  PLA/PGA  Copolymer  Ratios,  J.  Biomed.  Mater.  Res.,  Vol.  II:711-719  (1977)。
【０１９２】
あるいは、持続放出または制御放出マイクロスフェア調製物を、水中乾燥方法を使用して調製し、その場合、まず生分解性ポリマー金属塩の有機溶媒溶液を調製する。その後、核酸を溶解または分散させた媒体を生分解性ポリマー金属塩溶液に添加する。核酸と生分解性ポリマー金属塩の重量比は、例えば、約１：１０００００〜約１：１、好ましくは約１：２００００〜約１：５００、より好ましくは約１：１００００〜約１：５００であってよい。次に、生分解性ポリマー金属塩と核酸を含有する有機溶媒溶液を水相に注ぎ入れて油／水エマルションを調製する。次いで、油相中の溶媒を蒸発させて、マイクロスフェアをもたらす。最後に、次いでこれらのマイクロスフェアを回収し、洗浄し、凍結乾燥させる。その後、マイクロスフェアを減圧下で加熱して残留する水および有機溶媒を除去することができる。
【０１９３】
生分解性ポリマー金属塩と核酸の混合物に適合性であるマイクロスフェアの作製に有用な他の方法は、ｉ）コアセルベーション剤の段階的添加中の相分離；ｉｉ）粒子の凝塊形成を防止するために抗凝集剤を添加する、水中乾燥方法または相分離方法、およびｉｉｉ）噴霧乾燥方法によるものである。
【０１９４】
一実施形態では、本発明は、およそ１日から６カ月の間の持続時間にわたって核酸の制御放出を送達することが可能なマイクロスフェアまたはマイクロカプセルを含む媒体を意図している。一実施形態では、マイクロスフェアまたは微小粒子は、当該媒体が分配される際に医療実施者が明確にわかることができるように着色されていてよい。別の実施形態では、マイクロスフェアまたはマイクロカプセルは透明であってよい。別の実施形態では、マイクロスフェアまたは微小粒子に放射線不透過性の蛍光透視色素を浸透させる。
【０１９５】
制御放出マイクロカプセルは、遠心押出し、パンコーティングおよび気中懸濁などの公知の封入技法を使用することによって作製することができる。そのようなマイクロスフェアおよび／またはマイクロカプセルを操作して、所望の放出速度を達成することができる。例えば、Ｏｌｉｏｓｐｈｅｒｅ（登録商標）（Ｍａｃｒｏｍｅｄ）は、制御放出マイクロスフェア系である。これらの特定のマイクロスフェアは、５〜５００μｍの間にわたる均一なサイズで入手可能であり、生体適合性ポリマーおよび生分解性ポリマーで構成される。マイクロスフェアの特定のポリマー組成により核酸放出速度を制御し、その結果、バースト効果の有効な管理を含めた特注設計のマイクロスフェアを可能にすることができる。ＰｒｏＭａｘｘ（登録商標）（Ｅｐｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）は、タンパク質マトリクス送達系である。この系は、天然では水性であり、標準の医薬送達モデルに適応可能である。特に、ＰｒｏＭａｘｘ（登録商標）は、低分子薬物および高分子薬物の両方を送達する生物侵食性タンパク質マイクロスフェアであり、マイクロスフェアサイズおよび所望の放出特性の両方に関してカスタマイズすることができる。
【０１９６】
一実施形態では、マイクロスフェアまたは微小粒子は、腸間膜内ｐＨよりも低いｐＨにおいて安定であるｐＨ感受性封入材料を含む。腸間膜内の典型的な範囲は、ｐＨ７．６〜ｐＨ７．２である。したがって、マイクロカプセルは、７未満のｐＨで維持されるべきである。しかし、ｐＨの変動が予測される場合、マイクロカプセルの溶解に必要である異なるｐＨ基準に基づいてｐＨ感受性材料を選択することができる。したがって、封入される核酸は、溶解が望まれるｐＨ環境に関して選択され、安定性が維持されるように事前に選択されたｐＨで保管される。封入材（encapsulant）として有用なｐＨ感受性材料の例は、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（登録商標）Ｌ−１００またはＳ−１００（Ｒｏｈｍ  ＧＭＢＨ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートサクシネート、ポリ酢酸フタル酸ビニル、酢酸フタル酸セルロース、および酢酸トリメリット酸セルロースである。一実施形態では、脂質がマイクロカプセルの内部コーティングを構成する。これらの組成物では、これらの脂質は、これだけに限定されないが、脂肪酸とヘキシトール（hexitiol）無水物の部分エステル、およびトリグリセリドなどの食用脂肪であってよい。Lew  C.  W.,  Controlled-Release  pH  Sensitive  Capsule  And  Adhesive  System  And  Method.、米国特許第５，３６４，６３４号（参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１９７】
一実施形態では、本発明は、ゼラチン、またはゼラチンと同様の電荷密度を有し（すなわち、ポリ−Ｌ−リシン）、一次微小粒子を形成するための複合体として使用される他のポリマーカチオンを含む微小粒子を意図している。一次微小粒子は、以下の組成物の混合物として作製される：ｉ）ゼラチン（６０ブルーム、ブタ皮膚由来Ａ型）、ｉｉ）コンドロイチン４−硫酸（０．００５％〜０．１％）、ｉｉｉ）グルタルアルデヒド（２５％、グレード１）、ならびにｉｖ）１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ塩酸塩）、および超高純度スクロース（Ｓｉｇｍａ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．）。ゼラチンの供給源は重要であるとは考えられておらず、ウシ、ブタ、ヒト、または他の動物供給源に由来するものであってよい。一般には、ポリマーカチオンは１９，０００〜３０，０００ダルトンの間である。次いで、コンドロイチン硫酸を複合体に、コアセルベーション剤として硫酸ナトリウム、またはエタノールと共に添加する。
【０１９８】
微小粒子の形成後、核酸を微小粒子の表面に直接結合させる、または「橋」もしくは「スペーサー」を使用して間接的に付着させる。ゼラチンリシン基のアミノ基は容易に誘導体化されて、化合物の直接カップリングのための部位をもたらす。あるいは、アビジン−ビオチンなどのスペーサー（すなわち、標的化リガンド上の連結分子および誘導体化部分）も、標的化リガンドと微小粒子を間接的にカップリングするために有用である。微小粒子の安定性は、ＥＤＣ塩酸塩によって誘導されるグルタルアルデヒド−スペーサー架橋結合の量によって制御される。制御放出媒体はまた、グルタルアルデヒド−スペーサー架橋結合の最終的な密度によって経験的に決定される。
【０１９９】
一実施形態では、本発明は、フィブリノーゲンまたはトロンビンを含む組成物を核酸と共に噴霧乾燥することによって形成される微小粒子を意図している。これらの微小粒子は、可溶性であり、選択されたタンパク質（すなわち、フィブリノーゲンまたはトロンビン）により、微小粒子の壁が創出されることが好ましい。したがって、核酸が微小粒子のタンパク質壁内、およびその間に組み入れられる。Heath  et  al.,  Microparticles  And  Their  Use  In  Wound  Therapy.、米国特許第６，１１３，９４８号（参照により本明細書に組み込まれる）。微小粒子を生組織に適用した後、その後のフィブリノーゲンとトロンビンの反応により、組織シーラントが創出され、それにより、組み入れられた化合物が直近の周囲領域に放出される。
【０２００】
マイクロスフェアの形状は正確に球状である必要はなく、単に、外科的部位の中またはその上に（すなわち、開放または閉鎖）噴霧するまたは拡散させることが可能な非常に小さい粒子であることが当業者には理解されよう。一実施形態では、微小粒子は、ポリラクチド、ポリグリコリドおよびラクチド／グリコリド（ＰＬＧＡ）の共重合体、ヒアルロン酸、改質多糖ならびに任意の他の周知の材料からなる群より選択される生体適合性および／または生分解性材料で構成される。
【実施例】
【０２０１】
（実施例Ｉ）
一体型ｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶベクタープラスミドの構築
細菌Ｎｍｅ１Ｃａｓ９遺伝子をヒトにおける発現のためにコドン最適化し、Ｕ１ａ遍在プロモーターの下でＡＡＶ２プラスミドにクローニングした。ガイドＲＮＡは、Ｕ６プロモーター下にある。ｃａｓ９遺伝子は、４つの核局在化シグナルおよび３つのＨＡタグ配列をタンデムに含有する。アニーリングした合成オリゴヌクレオチドを使用し、ＳａｐＩ制限酵素を用いてプラスミドを消化して、ＳａｐＩで消化した骨格によって生成された突出部と適合性の突出部を有する二重鎖を生成することにより、スペーサー配列をｃｒＲＮＡカセットに挿入した。
【０２０２】
Ｕ１ａプロモーターの制御下にあるヒトコドン最適化Ｎｍｅ１Ｃａｓ９遺伝子およびＵ６プロモーターによって駆動されるｓｇＲＮＡカセットをＡＡＶ２プラスミド骨格にクローニングした。ＮｍｅＣａｓ９  ＯＲＦは、三重ＨＡエピトープタグに加えて、４つの核局在化シグナル−各末端に２つ−に挟まれていた。このプラスミドは、Ａｄｄｇｅｎｅから入手可能である（プラスミドＩＤ１１２１３９）。図６４を参照されたい。Ｈｐｄ、Ｐｃｓｋ９、およびＲｏｓａ２６を標的とするスペーサー配列を有するオリゴヌクレオチドを、ＳａｐＩクローニング部位にライゲーションすることによってｓｇＲＮＡカセットに挿入した。
【０２０３】
ＡＡＶベクター作製をＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＨｏｒａｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｃｅｎｔｅｒにおいて実施した。簡単に述べると、ＨＥＫ２９３細胞における三重プラスミドトランスフェクションによってプラスミドをＡＡＶ８カプシドにパッケージングし以前に記載されている通り沈降によって精製した。Gao  et  al.,  "Introducing  genes  into  mammalian  cells:  viral  vectors"  In:  Green  MR,  Sambrook  J,  editors.  Molecular  cloning:  a  laboratory  manual.  Volume  2.  4th  ed.  New  York:  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press;2012.  p.  1209-13。これらのスペーサーのオフターゲットプロファイルを、Ｂｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒ  ｐａｃｋａｇｅ  ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋを使用してコンピューターにより予測した。検索パラメーターをＮｍｅ１Ｃａｓ９設定に適合させた：ｇＲＮＡ．ｓｉｚｅ＝２４、ＰＡＭ＝“ＮＮＮＮＧＡＴＴ”、ＰＡＭ．−ｓｉｚｅ＝８、ＲＮＡ．ＰＡＭ．ｐａｔｔｅｒｎ＝“ＮＮＮＮＧＮＮＮ＄”、ｗｅｉｇｈｔｓ＝ｃ（０、０、０、０、０、０、０．０１４、０、０、０．３９５、０．３１７、０、０．３８９、０．０７９、０．４４５、０．５０８、０．６１３、０．８５１、０．７３２、０．８２８、０．６１５、０．８０４、０．６８５、０．５８３）、ｍａｘ．ｍｉｓｍａｔｃｈ＝６、ａｌｌｏｗｅｄ．ｍｉｓｍａｔｃｈ．ＰＡＭ＝７、ｔｏｐＮ＝１０，０００、ｍｉｎ．ｓｃｏｒｅ＝０。
【０２０４】
（実施例ＩＩ）
細胞培養およびトランスフェクション
マウスＨｅｐａ１−６ヘパトーマ細胞を１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を伴うＤＭＥＭ中、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーター内で培養した。ヒトＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＰＬＢ９８５細胞をそれぞれＤＭＥＭ培地およびＲＰＭＩ培地中で培養した。どちらにも、１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を補充した。Ｈｅｐａ  １−６細胞の一過性トランスフェクションをＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸを使用して実施し、一方、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に対してはＰｏｌｙｆｅｃｔトランスフェクション試薬（Ｑｉａｇｅｎ）を使用した。一過性トランスフェクションのために、トランスフェクションの２４時間前に、２４ウェルプレート中で１ウェル当たり細胞およそ１×１０５個を培養した。各ウェルに一体型ｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶプラスミド５００ｎｇを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ  ｗｉｔｈ  Ｐｌｕｓ  Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を製造者のプロトコールに従って使用してトランスフェクトした。２４ウェルプレート中、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞にＮｍｅ１Ｃａｓ９およびｓｇＲＮＡを発現する一体型プラスミド４００ｎｇを製造者のガイドラインに従ってトランスフェクトした（例えば、Ｐｓｃｋ９＆Ｒｏｓａ２６）。
【０２０５】
全ての細胞株を５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーター内で維持した。マウスＨｅｐａ１−６ヘパトーマおよびＨＥＫ２９３Ｔ細胞を１０％ＦＢＳおよび１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を伴うＤＭＥＭ中で培養した。Ｋ５６２細胞を、同じ条件で、しかしＩＭＤＭを使用して成長させた。ＩＭＲ−９０細胞をＥＭＥＭおよび１０％ＦＢＳ中で培養した。最後に、ＨＤＦａ細胞をＤＭＥＭおよび２０％ＦＢＳ中で成長させた。
【０２０６】
（実施例ＩＩＩ）
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９の発現および精製
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９を、Ｔ７プロモーター、その後に６×Ｈｉｓタグ、次いでタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼ切断部位を含有するｐＭＣＳＧ７ベクターにクローニングした。この構築物をＥ．ｃｏｌｉのＲｏｓｅｔｔａ２  ＤＥ３株に形質転換し、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９を発現させた。簡単に述べると、細菌培養物を３７℃でＯＤ６００が０．６に到達するまで成長させた。この時点で温度を１８℃まで下げ、その後、１ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加した。細胞を終夜成長させ、次いで、精製のために収集した。
【０２０７】
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９の精製を３つのステップで実施した：ニッケルアフィニティークロマトグラフィー、カチオン交換クロマトグラフィー、次いで、分子ふるいクロマトグラフィー。これらの詳細なプロトコールは、以前の刊行物において見いだすことができる（Jinek  et  al.,  Science  337,  816-821,  2012）。
【０２０８】
（実施例ＩＶ）
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９のリボ核タンパク質（ＲＮＰ）による送達
Ｎｅｏｎトランスフェクション系（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してＮｍｅ１Ｃａｓ９のＲＮＰによる送達を実施した。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およそ２０ピコモルおよびｓｇＲＮＡ  ２５ピコモルを緩衝液Ｒ中で混合し、室温で２０〜３０分インキュベートした。次いで、この予めアセンブルした複合体を細胞５０，０００〜１００，０００個と混合し、Ｎｅｏｎチップ１０μＬを使用して電気穿孔した。電気穿孔後、細胞を、抗生物質を伴わない妥当な培養培地を含有する２４ウェルプレートにプレーティングした。
【０２０９】
（実施例Ｖ）
細胞および組織からのＤＮＡ単離
トランスフェクションの７２時間後にＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）によって製造者のプロトコールに従って細胞からゲノムＤＮＡを単離した。流体力学的注射の１０日後または尾静脈へのベクター投与の５０日後にマウスを屠殺し、肝組織を収集し、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコールに従って用いてゲノムＤＮＡを単離した。
【０２１０】
（実施例ＶＩ）
インデル解析
ゲノム部位特異的プライマーおよびＨｉｇｈ  Ｆｉｄｅｌｉｔｙ（登録商標）２×ＰＣＲ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を用いたＰＣＲ増幅のためにゲノムＤＮＡ  ５０ｎｇを使用した。ＴＩＤＥ解析のために、ＱＩＡｑｕｉｃｋ（登録商標）ＰＣＲ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＰＣＲ産物３０μｌを精製し、サンガーシーケンシングに供した。以前に記載されている通りＴＩＤＥウェブツール（ｔｉｄｅ−ｃａｌｃｕｌａｔｏｒ．ｎｋｉ．ｎｌ／）を使用してインデル値を得た。Brinkman  et  al.,  Nucl.  Acids  Res.  (2014)。
【０２１１】
Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｔ７ＥＩ）アッセイのために、ＰＣＲ産物１０μｌをハイブリダイズさせ、１×ＮＥＢ  Ｂｕｆｆｅｒ  ２中Ｔ７エンドヌクレアーゼＩ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）０．５μｌを用いて１時間処理した。試料を２．５％アガロースゲルに流し、ＩｍａｇｅＭａｓｔｅｒ−ＴｏｔａｌＬａｂ（登録商標）プログラムを用いて定量化した。インデルパーセンテージを以前に記載されている通り算出した。Guschin  et  al.,  Engineered  Zinc  Finger  Proteins:  Methods  and  Protocols  (2010)。
【０２１２】
（実施例ＶＩＩ）
オフターゲット解析のためのＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ
ＧＵＩＤＥ−ｓｅｑ解析を以前に記載されている通り実施した。Tsai  et  al.,  Nature  Biotechnology  (2014)、Bolukbasi  et  al.,  Nature  Methods  (2015a)；Amrani  et  al.,  biorxiv.org/content/early/2017/08/04/172650  (2017)。
【０２１３】
簡単に述べると、Ｐｃｓｋ９遺伝子およびＲｏｓａ２６遺伝子を標的とする２つのスペーサーに関して、Ｈｅｐａ１−６細胞に一体型ｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶプラスミド５００ｎｇおよびアニーリングしたＧＵＩＤＥ−ｓｅｑオリゴヌクレオチド７．５ｐｍｏｌを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸ（登録商標）ｗｉｔｈ  Ｐｌｕｓ（登録商標）Ｒｅａｇｅｎｔ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を使用してトランスフェクトした。トランスフェクションの７２時間後にＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を用い、製造者のプロトコールに従ってゲノムＤＮＡを抽出した。ライブラリー調製、ディープシーケンシング、およびリード解析を以前に記載されている通り実施した。Tsai  et  al.,  Nature  Biotechnology  (2014)、Bolukbasi  et  al.,  Nature  Methods  (2015a)；Amrani  et  al.,  biorxiv.org/content/early/2017/08/04/172650  (2017)。
【０２１４】
（実施例ＩＸ）
ＡＡＶベクター作製
Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＨｏｒａｅ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ＣｅｎｔｅｒにおいてＨＥＫ２９３細胞における三重プラスミドトランスフェクションによってプラスミドをＡＡＶ８にパッケージングし、以前に記載されている通り沈降によって精製した。Gao  GP,  Sena-Esteves  M.  Introducing  Genes  into  Mammalian  Cells:  Viral  Vectors.  In:  Green  MR,  Sambrook  J,  eds.  Molecular  Cloning,  Volume  2:  A  Laboratory  Manual.  New  York:  Cold  Spring  Harbor  Laboratory  Press;  2012:1209-1313。
【０２１５】
（実施例Ｘ）
動物、ＡＡＶベクター注射、および肝組織処理
動物実験は全て、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｃｈｏｏｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅのガイドラインの下で承認されたものであった。流体力学的注射のために、Ｐｃｓｋ９を標的とする内毒素を含まないｓｇＲＮＡ−Ｎｍｅ１Ｃａｓ９−ＡＡＶプラスミド３０μｇの２．５ｍＬ、または対照としてＰＢＳ  ２．５ｍＬを９〜１８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈を介して注射した。ＡＡＶ８ベクター注射に関しては、９〜１８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、マウス１匹当たり４×１０１１ゲノムコピーを尾静脈を介して注射した。８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪマウスをｉｎ  ｖｉｖｏにおけるゲノム編集実験のために使用した。ｅｘ  ｖｉｖｏ実験のために、二細胞期に進行した胚をＥ０．５偽妊娠雌マウスの卵管に移入した。
【０２１６】
マウスをＣＯ２によって安楽死させ、肝臓を採取した。組織を４％パラホルムアルデヒド中に終夜固定し、パラフィンに包埋し、切片作製し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０２１７】
（実施例ＸＩ）
血清分析
ベクター投与の０日後、２５日後、および５０日後に顔面静脈から血液（約２００μＬ）を抜き取った。血清分離器（ＢＤ、Ｃａｔ番号３６５９６７）を使用して血清を単離し、アッセイまで−８０℃下で保管した。血清コレステロールレベルをＩｎｆｉｎｉｔｙ（商標）比色定量エンドポイントアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）によって、製造者のプロトコールに従って測定した。簡単に述べると、Ｄａｔａ−Ｃａｌ（商標）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ検定物質の段階希釈物をＰＢＳ中に調製した。９６ウェルプレート中、マウス血清または検定物質希釈物２μＬをＩｎｆｉｎｉｔｙ（商標）コレステロール液体試薬２００μＬと混合し、次いで、３７℃で５分間インキュベートした。ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）ＨＴマイクロプレートリーダーを使用して５００ｎｍにおける吸光度を測定した。
【０２１８】
（実施例ＸＩＩ）
高進化ＰＩＤを用いたＣａｓ９オルソログの発見
Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ種内の全てのＣａｓ９オルソログを見いだすためにＮｍｅ１Ｃａｓ９配列をｂｌａｓｔにかけた。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９に対して＞８０％同一性を有するオルソログをこの解析の残りのために選択した。次いで、それぞれのＰＩＤをＮｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤ（８２０番目のアミノ酸から１０８２番目まで）とＣｌｕｓｔａｌＷ２を使用してアラインメントし、ＰＩＤに変異のクラスターを有するものを選択した。
【０２１９】
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９ペプチド配列をＢＬＡＳＴ検索においてクエリとして使用して、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ株内の全てのＣａｓ９オルソログを見いだした。Ｎｍｅ１Ｃａｓ９に対して＞８０％同一性を有するオルソログを試験のために選択した。次いで、ＰＩＤをＮｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤ（残基８２０〜１０８２）とＣｌｕｓｔａｌＷ２（登録商標）を使用してアラインメントし、ＰＩＤに変異のクラスターを有するものをさらなる解析のために選択した。ＮｍｅＣａｓ９オルソログの無根の系統樹をＦｉｇＴｒｅｅ（ｔｒｅｅ．ｂｉｏ．ｅｄ．ａｃ．ｕｋ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ｆｉｇｔｒｅｅ）を使用して構築した。
【０２２０】
（実施例ＸＩＩＩ）
Ｎｍｅ２  Ｃａｓ９およびＮｍｅ３  Ｃａｓ９ならびにＡｃｒオルソログのクローニングおよび精製
６×Ｈｉｓタグを有する細菌発現プラスミドｐＭＳＣＧ７においてＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＮＥＢ）を使用してＮｍｅ１Ｃａｓ９のＰＩＤを置き換えるために、Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＮｍｅ３Ｃａｓ９のＰＩＤをｇＢｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）として注文した。構築物をＥ．ｃｏｌｉに形質転換し、発現させ、以前に記載されている通り精製した。
【０２２１】
簡単に述べると、それぞれのＣａｓ９プラスミドを含有するＲｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）細胞を３７℃で光学濃度が０．６になるまで成長させ、タンパク質発現を１ｍＭのＩＰＴＧにより、１８℃で１６時間にわたって誘導した。細胞を収集し、リゾチームおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を補充した溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＤＴＴ）中に超音波処理によって溶解させた。
【０２２２】
次いで、溶解物をＮｉ−ＮＴＡアガロースカラム（Ｑｉａｇｅｎ）に流し、結合したタンパク質を３００ｍＭのイミダゾールで溶出させ、透析して保管用緩衝液（２０ｍＭのＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、２５０ｍＭのＮａＣｌ、１ｍＭのＤＴＴ）中に入れた。Ａｃｒタンパク質に関しては、６×Ｈｉｓタグを付したタンパク質をＥ．ｃｏｌｉ株ＢＬ２１  Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）において発現させた。細胞を振とうインキュベーター中、３７℃で光学濃度（ＯＤ６００ｎｍ）が０．６になるまで成長させた。細菌培養物を１８℃まで冷却し、１ｍＭのＩＰＴＧを終夜発現のために添加することによってタンパク質発現を誘導した。翌日、細胞を収集し、１ｍｇ／ｍＬのリゾチームおよびプロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｓｉｇｍａ）を補充した溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのイミダゾール、１ｍＭのＤＴＴ）に再懸濁させ、Ｃａｓ９と同じプロトコールを使用してタンパク質を精製した。タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）プロテアーゼと共に４℃で終夜インキュベートすることによって６×Ｈｉｓタグを除去して、首尾よく切断された、タグが取り除かれたＡｃｒを単離した。
【０２２３】
（実施例ＩＶＸ）
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＡＭ発見アッセイ
ランダム化ＰＡＭ配列を有するプロトスペーサーのライブラリーを、オーバーラッピングＰＣＲを使用し、１０ヌクレオチドランダム化ＰＡＭを含有するフォワードプライマーを用いて生成した。
【０２２４】
ライブラリーをゲル精製し、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｓｇＲＮＡと共に精製されたＣａｓ９によるｉｎ  ｖｉｔｒｏ切断反応に供した。３００ｎＭのＣａｓ９：ｓｇＲＮＡ複合体を使用して３００ｎＭの標的断片を１×ＮＥ  Ｂｕｆｆｅｒ  ３．１（ＮＥＢ）中、３７℃で１時間にわたって切断した。次いで、反応物を、プロテイナーゼＫを用いて５０℃で１０分間処理し、１×ＴＡＥと共に４％アガロースゲルに流した。切断生成物を精製し、ライブラリー調製に供した。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００（登録商標）シーケンシングプラットフォームを使用してライブラリーの配列決定を行い、解析した。Ｒを使用して配列ロゴを生成した。
【０２２５】
（実施例ＸＶ）
トランスフェクションおよび哺乳動物ゲノム編集
ヒト化Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９発現およびＳｐｙＣａｓ９発現のために以前使用したｐＣＤｅｓｔ２プラスミドにＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙを使用してクローニングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびＨＥＫ２９３Ｔ−ＴＬＲ細胞のトランスフェクションを以前に記載されている通り実施した（Amrani  et  al.  2018）。Ｈｅｐａ１−６トランスフェクションに関しては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ＬＴＸを使用して、一体型ＡＡＶ．ｓｇＲＮＡ．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９プラスミド５００ｎｇを、２４ウェルプレートでトランスフェクションの２４時間前に培養した１ウェル当たりおよそ１×１０５個の細胞にトランスフェクトした。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を安定に発現するＫ５６２細胞に関しては、５０，０００〜１５０，０００個の細胞にＮｅｏｎチップ１０μＬを使用して５００  ｓｇＲＮＡプラスミドを電気穿孔した。
【０２２６】
全ての細胞におけるインデルを測定するために、トランスフェクションの７２時間後、細胞を収集し、ＤＮａｅｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してゲノムＤＮＡを抽出した。標的とされた遺伝子座をＰＣＲによって増幅し、サンガーシーケンシングを行い（Ｇｅｎｅｗｉｚ（登録商標））、ＴＩＤＥ（Brinkman  et  al.  2014）によって解析した。
【０２２７】
（実施例ＸＶＩ）
Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を安定に発現させるためのＫ５６２細胞のレンチウイルス形質導入
Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を安定に発現するＫ５６２細胞を以前に記載されている通り生成した。レンチウイルス産生のために、６ウェルプレート中、製造者によって推奨されているＴｒａｎｓＩＴ−ＬＴ１トランスフェクション試薬（Ｍｉｒｕｓ  Ｂｉｏ）を使用して、レンチウイルスベクターをＨＥＫ２９３Ｔ細胞にパッケージングプラスミド（Ａｄｄｇｅｎｅ  １２２６０＆１２２５９）と同時トランスフェクトした。２４時間後に、培地をトランスフェクトされた細胞から吸引し、新鮮なＤＭＥＭ培地の新鮮な１ｍＬで置き換えた。
【０２２８】
翌日、トランスフェクトされた細胞由来のウイルスを含有する上清を採取し、０．４５μｍのフィルターを通して濾過した。希釈していない上清１０μＬをポリブレン２．５μｇと共に使用して、６ウェルプレート中、約百万個のＫ５６２細胞に形質導入した。形質導入された細胞を、２．５μｇ／ｍＬのピューロマイシン含有培地を使用して選択した。
【０２２９】
（実施例ＸＶＩＩ）
哺乳動物ゲノム編集のためのＲＮＰによる送達
ＲＮＰ実験のために、Ｎｅｏｎ電気穿孔系を使用した。３×ＮＬＳ  Ｎｍｅ２Ｃａｓ９  ４０ピコモルをｉｎ  ｖｉｔｒｏで転写されたｓｇＲＮＡ  ５０ピコモルと共に緩衝液Ｒ中にアセンブルし、Ｎｅｏｎチップ１０μＬを使用して電気穿孔を行った。電気穿孔後、細胞を予め温めた、抗生物質を伴わない妥当な培養培地を含有する２４ウェルプレートにプレーティングした。電気穿孔パラメーター（電圧、幅、パルス数）は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞については１１５０ｖ、２０ｍｓ、２パルスであり、Ｋ５６２細胞については１０００ｖ、５０ｍｓ、１パルスであった。
【０２３０】
（実施例ＸＶＩＩＩ）
ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ
ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑ実験を軽微な改変を伴って以前に記載されている通り実施した（Amrani  et  al.,  2018）。
【０２３１】
簡単に述べると、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞に、Ｃａｓ９  ２００ｎｇ、ｓｇＲＮＡ  ２００ｎｇ、およびアニーリングしたＧＵＩＤＥ−ｓｅｑオリゴヌクレオチド７．５ｐｍｏｌを、ＳｐｙＣａｓ９またはＮｍｅ２Ｃａｓ９と共に二重部位を標的とするガイドについてＰｏｌｙｆｅｃｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用し、トランスフェクトした。Ｈｅｐａ１−６細胞を上記の通りトランスフェクトした。
【０２３２】
トランスフェクションの７２時間後に、ＤＮｅａｓｙ（登録商標）Ｂｌｏｏｄ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を製造者のプロトコールに従って用いてゲノムＤＮＡを抽出した。ライブラリー調製および配列決定を正確に以前に記載されている通り実施した。
【０２３３】
解析のために、標的部位とのミスマッチを１０カ所有する配列とマッチする部位を潜在的なオフターゲット部位とみなした。データをＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＧＵＩＤＥｓｅｑバージョン１．１．１７（Zhu  et  al.,  2017）を使用して解析した。
【０２３４】
（実施例ＸＩＸ）
標的化ディープシーケンシングおよび解析
ＧＵＩＤＥ−Ｓｅｑの結果を確認し、インデル率をより定量的に測定するために、標的化ディープシーケンシングを使用した。２ステップＰＣＲ増幅を使用して、各オンターゲット部位およびオフターゲット部位についてＤＮＡ断片を作製した。ＳｐｙＣａｓ９については、上位のオフターゲット位置を選択した。
【０２３５】
第１のステップにおいて、アダプターとの相補末端を伴うユニバーサル突出部を有する遺伝子座に特異的なプライマーを２×Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）ＰＣＲマスターミックス（ＮＥＢ）と混合して、突出部を有する断片を生成した。第２のステップにおいて、ユニバーサルフォワードプライマーおよびインデックス化（indexed）リバースプライマーを用いて精製されたＰＣＲ産物を増幅した。
【０２３６】
フルサイズ生成物（約２５０ｂｐの長さ）をゲル抽出し、ペアエンドＭｉＳｅｑ実行を使用して配列決定を行った。ＭｉＳｅｑデータ解析を正確に以前に記載されている通り実施した（Amrani  2018）。
【０２３７】
（実施例ＸＸ）
ＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋを使用したオフターゲット解析
ＴＳ２５およびＴＳ４７についての包括的なオフターゲット解析を、ＢｉｏｃｏｎｄｕｃｔｏｒパッケージＣＲＩＳＰＲｓｅｅｋを使用して実施した。
【０２３８】
ＳｐｙＣａｓ９と共有されないＮｍｅ２Ｃａｓ９の特性に適応させるために軽微な変化を行った。具体的には、以下の変化を使用した：ｇＲＮＡ．ｓｉｚｅ＝２４、ＰＡＭ＝「ＮＮＮＮＣＣ」、ＰＡＭ．ｓｉｚｅ＝６、ＲＮＡ．ＰＡＭ．ｐａｔｔｅｒｎ＝「ＮＮＮＮＣＮ」、ミスマッチが６つ未満のオフターゲット部位を採取した。ミスマッチの数および位置に基づいて上位の潜在的なオフターゲット部位を選択した。それぞれのｓｇＲＮＡによって標的とされる細胞由来のｇＤＮＡを使用し、各オフターゲット遺伝子座を増幅し、ＴＩＤＥによって解析した。
【０２３９】
（実施例ＸＸＩ）
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９送達および肝組織処理
動物手順は全て、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌにおけるＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）によって精査され、承認されたものであった。
【０２４０】
ＡＡＶ８ベクター注射に関しては、Ｐｃｓｋ９またはＲｏｓａ２６を標的として、８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスにマウス１匹当たり４×１０１１ゲノムコピーを尾静脈を介して注射した。ベクター投与の２８日後にマウスを屠殺し、分析のために肝組織を採取した。肝組織を４％ホルマリン中に終夜固定し、パラフィンに包埋し、切片作製し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。注射の０日後、１４日後および２８日後に顔面静脈から血液を抜き取り、血清分離器（ＢＤ、Ｃａｔ番号３６５９６７）を使用して血清を単離し、アッセイまで−８０℃で保管した。血清コレステロールレベルを、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）比色定量エンドポイントアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、製造者のプロトコールに従い、以前に記載されている通り（Ibraheim  et  al,  2018）測定した。
【０２４１】
（実施例ＸＸＩＩ）
動物および肝組織処理
流体力学的注射のために、Ｐｃｓｋ９を標的とする、内毒素を含まないＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９プラスミド３０μｇの２．５ｍＬ、またはＰＢＳ  ２．５ｍＬを９〜１８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに尾静脈から注射した。１０日後にマウスを安楽死させ、肝組織を収集した。ＡＡＶ８ベクター注射に関しては、１２〜１６週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスに、Ｐｃｓｋ９またはＲｏｓａ２６を標的とするベクターを使用し、マウス１匹当たり４×１０１１ゲノムコピーを尾静脈を介して注射した。ベクター投与の１４日後および５０日後にマウスを屠殺し、分析のために肝組織を採取した。
【０２４２】
Ｈｐｄ標的化のために、ＰＢＳ  ２ｍＬまたは内毒素を含まないＡＡＶ−ｓｇＲＮＡ−ｈＮｍｅ１Ｃａｓ９プラスミド３０μｇの２ｍＬを１５〜２１週齢の１型チロシン血症Ｆａｈノックアウトマウス（Ｆａｈｎｅｏ）に尾静脈を介して投与した。コードされるｓｇＲＮＡは、エクソン８（ｓｇＨｐｄ１）またはエクソン１１（ｓｇＨｐｄ２）内の部位を標的とするものであった。ＨＴ１マウスに１０ｍｇ／ＬのＮＴＢＣ（２−（２−ニトロ−４−−トリフルオロメチルベンゾイル）−１，３−シクロヘキサンジオン）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｃａｔ番号ＰＨＲ１７３１−１Ｇ）を飲料水中に入れて示されている時に給餌した。これらの実験では両方の性別を使用した。マウスを注射後７日間ＮＴＢＣ水で維持し、次いで、通常の水に切り換えた。体重を１〜３日ごとにモニターした。ＰＢＳを注射した対照マウスは、ＮＴＢＣ処置を除いた後、体重の２０％を失った後に瀕死になった場合屠殺した。
【０２４３】
マウスを本発明者らのプロトコールに従って安楽死させ、肝組織を薄く切り、断片を−８０℃で保管した。一部の肝組織を４％ホルマリン中に終夜固定し、パラフィンに包埋し、切片作製し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。
【０２４４】
（ＸＸＩＩＩ）
ウエスタンブロット
肝組織画分を粉砕し、ＲＩＰＡ溶解緩衝液１５０μＬに再懸濁させた。総タンパク質含有量をＰｉｅｒｃｅ（商標）ＢＣＡ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、製造者のプロトコールに従って推定した。組織由来のタンパク質合計２０μｇまたは組換えマウスプロタンパク質転換酵素９／ＰＣＳＫ９タンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、９２５８−ＳＥ−０２０）２ｎｇを４〜２０％Ｍｉｎｉ−Ｒｏｔｅａｎ（登録商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にローディングした。分離したバンドをＰＶＤＦ膜に転写し、５％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ−Ｇｒａｄｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒ溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて室温で２時間ブロッキングした。膜をウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ９４８５、１：２０００）またはヤギ抗ＰＣＳＫ９抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＦ３９８５、１：４００）と共に４℃で終夜インキュベートした。膜をＴＢＳＴで５回洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  １，７０６，５１５、１：４０００）およびロバ抗ヤギ二次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＨＡＦ１０９、１：２０００）と共に室温で２時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで５回洗浄し、Ｃｌａｒｉｔｙ（商標）ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用い、Ｍ３５Ａ  Ｘ−ＯＭＡＴ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｋｏｄａｋ）を使用して可視化した。
【０２４５】
（実施例ＸＸＩＶ）
体液性免疫応答
Ｎｍｅ１Ｃａｓ９に対する体液性ＩｇＧ１免疫応答をＥＬＩＳＡ（Ｂｅｔｈｙｌ；Ｍｏｕｓｅ  ＩｇＧ１  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ、Ｅ９９−１０５）により、製造者のプロトコールに従って、少しの改変を伴って測定した。簡単に述べると、Ｎｍｅ１Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の発現および３ステップ精製を実施した。１×コーティング緩衝液（Ｂｅｔｈｙｌ）中に懸濁させた組換えＮｍｅ１Ｃａｓ９またはＳｐｙＣａｓ９タンパク質合計０．５μｇを使用して、９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）をコーティングし、４℃で振とうしながら１２時間インキュベートした。ウェルを、１×Ｗａｓｈ  Ｂｕｆｆｅｒを使用して５分間、振とうしながら３回洗浄した。プレートを１×ＢＳＡ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（Ｂｅｔｈｙｌ）を用いて室温で２時間ブロッキングし、次いで、３回洗浄した。ＰＢＳを使用して血清試料を１：４０に希釈し、各ウェルに２連で添加した。試料を４℃で５時間インキュベートした後、プレートを５分にわたって３回洗浄し、ビオチン化抗マウスＩｇＧ１抗体（Ｂｅｔｈｙｌ；１×ＢＳＡ  Ｂｌｏｃｋｉｎｇ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ中１：１００，０００）１００μＬを各ウェルに添加した。室温で１時間インキュベートした後、プレートを４回洗浄し、ＴＭＢ基質１００μＬを各ウェルに添加した。プレートを暗所、室温で２０分間発色させ、次いで、ウェルごとにＥＬＩＳＡ  Ｓｔｏｐ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  １００μＬを添加した。黄色溶液の発色後、ＢｉｏＴｅｋ  Ｓｙｎｅｒｇｙ（登録商標）ＨＴマイクロプレートリーダーを使用して４５０ｎｍにおける吸光度を記録した。
【０２４６】
（実施例ＸＸＶ）
接合体のインキュベーションおよびトランスフェクション
【０２４７】
マウス系統および胚採取
動物実験は全て、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ  Ｍｅｄｉｃａｌ  ＳｃｈｏｏｌのＩｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ（ＩＡＣＵＣ）のガイダンスの下で行った。Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ（ストック番号００５３０４）マウスをＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから得た。全ての動物を１２時間光サイクルで維持した。交尾プラグが観察された日の光サイクルの中間を妊娠期間の胎生期０．５（Ｅ０．５）とみなした。Ｅ０．５に膨大部をピンセットで裂くことによって接合体を採取し、ヒアルロニダーゼを含有するＭ２培地中でインキュベートして卵丘細胞を除去した。
【０２４８】
ｉｎ  ｖｉｖｏにおけるＡＡＶ８．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９＋ｓｇＲＮＡ送達および肝組織処理
ＡＡＶ８ベクター注射に関しては、８週齢の雌Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪマウスに、マウス１匹当たり４×１０１１ゲノムコピーを、Ｐｃｓｋ９またはＲｏｓａ２６のいずれか内の確証された部位を標的とするｓｇＲＮＡと共に尾静脈を介して注射した。ベクター投与の２８日後にマウスを屠殺し、分析のために肝組織を採取した。肝組織を４％ホルマリン中に終夜固定し、パラフィンに包埋し、切片作製し、ヘマトキシリン・エオシン（Ｈ＆Ｅ）で染色した。注射の０日後、１４日後および２８日後に血液を顔面静脈から抜き取り、血清分離器（ＢＤ、Ｃａｔ番号３６５９６７）を使用して血清を単離し、アッセイするまで−８０℃で保管した。血清コレステロールレベルを、Ｉｎｆｉｎｉｔｙ（商標）比色定量エンドポイントアッセイ（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用し、製造者のプロトコールに従って、以前に記載されている通り測定した。Ibraheim  et  al.,  "All-in-One  Adeno-associated  Virus  Delivery  and  Genome  Editing  by  Neisseria  meningitidis  Cas9  in  vivo"  Genome  Biology  19:137  (2018)。
【０２４９】
抗ＰＣＳＫ９ウエスタンブロットに関しては、組織由来のタンパク質４０μｇまたはＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  Ｍｏｕｓｅ  ＰＣＳＫ９  Ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、９２５８−ＳＥ−０２０）２ｎｇをＭｉｎｉＰｒｏｔｅａｎ（登録商標）ＴＧＸ（商標）Ｐｒｅｃａｓｔ  Ｇｅｌ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にローディングした。分離したバンドをＰＶＤＦ膜に転写し、５％Ｂｌｏｃｋｉｎｇ−Ｇｒａｄｅ  Ｂｌｏｃｋｅｒ（登録商標）溶液（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を用いて室温で２時間ブロッキングした。次に、膜をウサギ抗ＧＡＰＤＨ抗体（Ａｂｃａｍ  ａｂ９４８５、１：２，０００）またはヤギ抗ＰＣＳＫ９抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＡＦ３９８５、１：４００）と共に終夜インキュベートした。膜をＴＢＳＴで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）とコンジュゲートしたヤギ抗ウサギ二次抗体（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  １７０６５１５、１：４，０００）、およびロバ抗ヤギ二次抗体（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  ＨＡＦ１０９、１：２，０００）と共に室温で２時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで再度洗浄し、Ｃｌａｒｉｔｙ（商標）ｗｅｓｔｅｒｎ  ＥＣＬ  ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用し、Ｍ３５Ａ  ＸＯＭＡＴ  Ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ（Ｋｏｄａｋ）を使用して可視化した。
【０２５０】
マウス接合体におけるｅｘ  ｖｉｖｏでのＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９送達
接合体を、３×１０９または３×１０８ＧＣのＡＡＶ６．Ｎｍｅ２Ｃａｓ９．ｓｇＴｙｒベクターを含有するＫＳＯＭ（Ｐｏｔａｓｓｉｕｍ−Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｅｄ  Ｓｉｍｐｌｅｘ  Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ  Ｍｅｄｉｕｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｃａｔ番号ＭＲ−１０６−Ｄ）の１５μｌ液滴中で５〜６時間インキュベートした（各液滴中４つの接合体）。インキュベーション後、接合体をＭ２ですすぎ、新鮮なＫＳＯＭに移し、終夜培養した。翌日、２細胞期に進行した胚を偽妊娠レシピエントの卵管に移入し、出産まで発育させた。
【０２５１】
（実施例ＸＸＶＩ）
定量化および統計解析
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＰＡＭ発見データの解析を、全ての統計解析についてＲ．ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６（登録商標）を使用して実施した。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９を使用した哺乳動物細胞実験に関しては、３回の独立した反復を実施し、ＴＩＤＥソフトウェアを使用してインデルパーセンテージを算出し、エラーバーはｓ．ｅ．ｍを示す。ＴＩＤＥパラメーターは、全ての図について、＜２０ヌクレオチドのインデルが定量化されるように設定した。Ｎｍｅ２Ｃａｓ９およびＳｐｙＣａｓ９の対照比較に関しては、平均インデルパーセンテージをＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｅｘｃｅｌ（登録商標）を使用して算出した。マウスにおけるｉｎ  ｖｉｖｏ実験に関しては、対照および試験被験体についてｎ＝５であった。Ｐ値は対応のない両側ｔ検定によって算出した。
【図１】
2021502097.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４−１】
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【図３４−２】
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【図３４−３】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３５−３】
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【図３６−１】
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【図３６−２】
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【図３７−１】
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【図３７−２】
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【図３７−３】
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【図３８】
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【図３９−１】
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【図３９−２】
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【図４０−１】
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【図４０−２】
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【図４０−３】
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【図４１】
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【図４２−１】
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【図４２−２】
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【図４２−３】
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【図４２−４】
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【図４３−１】
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【図４３−２】
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【図４３−３】
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【図４３−４】
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【図４３−５】
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【図４４−１】
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【図４４−２】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８−１】
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【図４８−２】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【国際調査報告】
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