(57)【要約】  本明細書では、ステムループ構造を有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子が提供され、ステムループ構造のステム部分は、１つ以上のＴm上昇ヌクレオチドを含有する。また、標的遺伝子の発現を低減させるための方法及び組成物、ならびに目的の疾患を処置するための方法及び組成物が提供される。【選択図】図１
2021520355.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖核酸阻害剤分子であって、
２１〜６６ヌクレオチドを含み且つ第１の領域（Ｒ１）及び第２の領域（Ｒ２）を有するセンス鎖、ならびに
１５〜４０ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖を含み、前記センス鎖及びアンチセンス鎖が別々の鎖であり、
さらに、前記二本鎖核酸阻害剤分子が、前記センス鎖の前記第１の領域及び前記アンチセンス鎖により形成された第１の二重鎖（Ｄ１）を含み、前記第１の二重鎖が、１５〜４０塩基対長を有し、
前記センス鎖の前記第２の領域が、第１のサブ領域（Ｓ１）、第２のサブ領域（Ｓ２）、ならびに前記第１の領域及び第２の領域を連結するテトラループ（Ｌ）を含み、前記第１の領域及び第２の領域が、第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、
前記第２の二重鎖が、１〜６塩基対長を有し、少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドを含む、前記二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項２】
前記センス鎖が、２４〜３５、２８〜３５、または２６〜３０ヌクレオチドを有する、請求項１に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項３】
前記アンチセンス鎖が、１８〜２４、２１〜２３、または２２ヌクレオチドを有する、請求項１または２に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項４】
前記アンチセンス鎖が、３’末端に１〜６ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項５】
前記一本鎖オーバーハングが、２ヌクレオチド長である、請求項４に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項６】
前記第１の二重鎖が、１８〜３０、１８〜２４、または１９〜２１塩基対長を有する、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項７】
前記第２の二重鎖が、１〜５塩基対長または１〜３塩基対長を有する、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項８】
前記第２の二重鎖が、１〜１０のＴm上昇ヌクレオチドを含有し、１〜５塩基対長を有するか、または前記第２の二重鎖が、１〜６のＴm上昇ヌクレオチドを含有し、１〜３塩基対長を有する、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項９】
前記センス鎖が、２４〜３５ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が、２０〜２４ヌクレオチド長であり、前記第１の二重鎖が、１８〜２４塩基対長を有し、前記第２の二重鎖が、１〜５塩基対長、３〜５塩基対長、１〜３塩基対長、または１〜２塩基対長を有する、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項１０】
前記センス鎖が、２４〜３０ヌクレオチド長であり、前記アンチセンス鎖が、２０〜２４ヌクレオチド長であり、前記第１の二重鎖が、１８〜２４塩基対長を有し、前記第２の二重鎖が、１〜５塩基対長、３〜５塩基対長、１〜３塩基対長、または１〜２塩基対長を有する、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項１１】
前記第２の二重鎖が、３塩基対長、２塩基対長、または１塩基対長を有する、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項１２】
前記センス鎖の前記第１の領域が、２０ヌクレオチド長であり、前記センス鎖の前記第２の領域が、１０、８、または６ヌクレオチド長であり、
前記センス鎖の前記第１の領域及び前記アンチセンス鎖により形成された前記第１の二重鎖が、２０塩基対長を有し、
前記センス鎖の前記第２の領域の第１及び第２の核酸により形成された前記第２の二重鎖が、３塩基対長、２塩基対長、または１塩基対長を有し、前記テトラループが、４ヌクレオチド長であり、
前記アンチセンス鎖が、２２ヌクレオチド長であり、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項１３】
前記センス鎖の前記第２の領域が、６ヌクレオチド長であり、前記センス鎖の第２領域が、１塩基対長を有する、請求項１２に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項１４】
前記第２の二重鎖中の各ヌクレオチドが、Ｔm上昇ヌクレオチドである、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項１５】
前記二本鎖核酸阻害剤分子が、前記第２の二重鎖の外側にいかなる二環式ヌクレオチドも含有しない、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項１６】
前記テトラループが、ＵＮＣＧ、ＧＮＲＡ、もしくはＣＵＵＧ、Ａ／ＵＧＮＮ、ＧＧＵＧ、ＲＮＹＡ、もしくはＡＧＮＮから選択されるＲＮＡテトラループ、またはｄ（ＧＮＡＢ）、ｄ（ＣＮＮＧ）、もしくはｄ（ＴＮＣＧ）から選択されるＤＮＡテトラループである、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項１７】
前記テトラループが、配列ＧＡＡＡを有する、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項１８】
前記少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドが、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、Ｇクランプ及びそのアナログ、ヘキシトールヌクレオチド、ならびに修飾ヌクレオチドからなる群より選択され、前記修飾ヌクレオチドの糖部分の２’−炭素が、２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅで修飾されていない、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項１９】
前記修飾ヌクレオチドが、５−ブロモ−ウラシル、５−ヨードウラシル、５−プロピニル修飾ピリミジン、２−アミノアデニン、２−チオウリジン、５Ｍｅ−チオウリジン、またはプソイドウリジンである、請求項１８に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドが、少なくとも１つの二環式ヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項２１】
前記少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドが、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖａ、またはＶｂの構造を有する二環式ヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項２２】
前記少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドが、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、またはＩｆの構造を有する二環式ヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項２３】
前記少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドが、式ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、またはＩＩｄのうちの１つ以上の構造を有する二環式ヌクレオチドを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項２４】
前記少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドが、式ＩＩＩａ及び／またはＩＩＩｂの構造を有する二環式ヌクレオチドを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項２５】
前記少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドが、式ＩＶａ及び／またはＩＶｂの構造を有する二環式ヌクレオチドを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項２６】
前記少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドが、
2021520355.tif 000053
、
2021520355.tif 000054
、
2021520355.tif 000055
、
2021520355.tif 000056
、
2021520355.tif 000057
、
2021520355.tif 000058
、
2021520355.tif 000059
、
2021520355.tif 000060
、及び
2021520355.tif 000061
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒ2は、ＨまたはＣＨ3であり、Ｗa及びＷbはそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または別のヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドに前記二環式ヌクレオチドを結合させるヌクレオチド間結合基であり、ＷaまたはＷbの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドに前記二環式ヌクレオチドを結合させるヌクレオチド間結合基である）からなる群より選択される少なくとも１つの二環式ヌクレオチドを含む、請求項１〜２０のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項２７】
前記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドが、
2021520355.tif 000062
、または
2021520355.tif 000063
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒ2は、ＣＨ3であり、Ｗa及びＷbはそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または別のヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドに前記二環式ヌクレオチドを結合させるヌクレオチド間結合基であり、ＷaまたはＷbの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドに前記二環式ヌクレオチドを結合させるヌクレオチド間結合基である）である、請求項２６に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項２８】
前記少なくとも１つの二環式ヌクレオチドが、
2021520355.tif 000064
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒ2は、ＣＨ3であり、Ｗa及びＷbはそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または別のヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドに前記二環式ヌクレオチドを結合させるヌクレオチド間結合基であり、ＷaまたはＷbの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドに前記二環式ヌクレオチドを結合させるヌクレオチド間結合基である）である、請求項２６に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項２９】
前記少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドが、第１の環を含む二環式ヌクレオチドであり、前記第１の環が、フラノシルならびに前記フラノシルの２’−炭素及び４’−炭素を連結して第２の環を形成する架橋である、請求項１〜２０のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項３０】
前記フラノシルの前記２’−炭素及び前記４’−炭素を連結する前記架橋が、
ａ）４’−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’及び４’−ＣＨ2−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ1−Ｃ12アルキル、または例えば、４’−ＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−２’（ＢＮＡNCとしても知られる）または４’−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−２’（ＢＮＡNC［ＮＭｅ］としても知られる）を含む保護基である）、
ｂ）４’−ＣＨ2−２’、４’−（ＣＨ2）2−２’、４’−（ＣＨ2）3−２’、４’−（ＣＨ2）−Ｏ−２’（ＬＮＡとしても知られる）、４’−（ＣＨ2）−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ2）2−Ｏ−２’（ＥＮＡとしても知られる）、４’−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−２’（ｃＥｔとしても知られる）、及び４’−ＣＨ（ＣＨ2ＯＣＨ3）−Ｏ−２’（ｃＭＯＥとしても知られる）、ならびにそれらのアナログ、
ｃ）４’−Ｃ（ＣＨ3）（ＣＨ3）−Ｏ−２’及びそのアナログ、
ｄ）４’−ＣＨ2−Ｎ（ＯＣＨ3）−２’及びそのアナログ、
ｅ）４’−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−２’及びそのアナログ、
ｆ）４’−ＣＨ2−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ3）−２’及びそのアナログ、ならびに
ｇ）４’−ＣＨ2−Ｃ（＝ＣＨ2）−２’及びそのアナログ
からなる群より選択される、請求項２９に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項３１】
前記二本鎖核酸阻害剤分子が、前記第２の二重鎖の外側にいかなる二環式ヌクレオチドも含有しない、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項３２】
前記テトラループが、少なくとも１つのリガンドコンジュゲートヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項３３】
前記テトラループが、２つ、３つ、または４つのリガンドコンジュゲートヌクレオチドを含む、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項３４】
前記リガンドが、ＧａｌＮＡｃである、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項３５】
前記ＧａｌＮＡｃの前記糖部分の２’位が前記ヌクレオチドにコンジュゲートされる、請求項３４に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項３６】
さらに、前記センス鎖及び／または前記アンチセンス鎖の５’末端に５’−ホスファート模倣物を含む、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項３７】
前記二本鎖核酸阻害剤分子が、脂質ナノ粒子と共に製剤化される、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項３８】
前記脂質ナノ粒子が、コア脂質及びエンベロープ脂質を含み、前記コア脂質が、第１のカチオン性脂質及び第１のペグ化脂質を含み、前記エンベロープ脂質が、第２のカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、及び第２のペグ化脂質を含む、請求項３７に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項３９】
前記第１のカチオン性脂質が、ＤＬ−０４８であり、前記第１のペグ化脂質が、ＤＳＧ−ＭＰＥＧであり、前記第２のカチオン性脂質が、ＤＬ−１０３であり、前記中性脂質が、ＤＳＰＣであり、前記ステロールが、コレステロールであり、前記第２のペグ化脂質が、ＤＳＰＥ−ＭＰＥＧある、請求項３８に記載の二本鎖核酸阻害剤分子。
【請求項４０】
治療的有効量の先行請求項のいずれか１項に記載の二本鎖核酸阻害剤分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む、医薬組成物。
【請求項４１】
対象において標的遺伝子の発現を低減させるための方法であって、前記標的遺伝子の発現を低減させるのに十分な量で、それを必要とする対象に、先行請求項のいずれかに記載の二本鎖核酸阻害剤分子または医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項４２】
前記投与が、静脈内、筋肉内、または皮下投与を含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記対象が、ヒトである、請求項４１または４２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月１３日に出願された米国仮特許出願第６２／６５７，４２８号及び２０１８年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／７７８，７５５号の利益を主張し、これらの出願日に依拠し、これらの開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド（ＲＮＡ、ＤＮＡ、及びそれらのアナログ）のポリマー配列である。核酸阻害剤分子は、細胞内のＲＮＡレベルを調節し且つがん、ウイルス感染、及び遺伝障害の処置において近い将来の展望を実証しているオリゴヌクレオチドである。核酸阻害剤分子は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）を含む多様な機序を介してＲＮＡ発現を調節することができる。
【０００３】
ＲＮＡｉは、ほとんどの真核生物にみられる保存された経路であり、二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓＲＮＡ）は、ｄｓＲＮＡに相補的な配列を持つ標的遺伝子の発現を阻害する。代表的なＲＮＡｉ経路では、長いｄｓＲＮＡ分子は、ダイサー酵素により切断されて、低分子干渉ＲＮＡ（「ｓｉＲＮＡ」）と呼ばれる短いＲＮＡ二重鎖になる。ｓｉＲＮＡは、ダイサー、トランス活性化応答ＲＮＡ結合タンパク質（ＴＲＢＰ）、及びアルゴノート２（「Ａｇｏ２」）と会合して、場合によってはＲＮＡ誘導性サイレンシング複合体（「ＲＩＳＣ」）と呼ばれる複合体を形成することが示されている。Ａｇｏ２が活性化されると、標的ｍＲＮＡの切断に対してＲＩＳＣ複合体の配列特異性を誘導するｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（ガイド鎖とも呼ばれる）を使用して、標的ｍＲＮＡを切断するエンドヌクレアーゼである。
【０００４】
長年にわたり、様々な二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子構造が開発されている。例えば、ＲＮＡｉ阻害剤分子に関する初期の研究は、天然のｓｉＲＮＡを模倣する二本鎖核酸分子に焦点を当てており、各鎖は、１９〜２５ヌクレオチドのサイズであり、１〜５ヌクレオチドの少なくとも１つの３’オーバーハングを有する（例えば、米国特許第８，３７２，９６８号を参照のこと）。続いて、ダイサー酵素によりｉｎ  ｖｉｖｏでプロセシングされて、ＲＮＡｉ阻害剤分子を活性化する、より長い二本鎖ＲＮＡｉ阻害剤分子が開発された（例えば、米国特許第８，８８３，９９６号を参照のこと）。より最近の研究により、鎖のうちの１つが熱力学的に安定なテトラループ構造を含む構造を含む、少なくとも１つの鎖の少なくとも一端が分子の二本鎖標的化領域を越えて伸長する二本鎖核酸阻害剤分子の伸長が開発された（例えば、米国特許第８，５１３，２０７号、米国特許第８，９２７，７０５号、ＷＯ２０１０／０３３２２５、及びＷＯ２０１６／１００４０１（これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと）。
【０００５】
特定の場合では、化学的に修飾されたヌクレオチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏ投与後に呈する状態などの特定の条件下で所望され得る特性を導入するために、核酸阻害剤分子に導入されている。そのような化学的に修飾されたヌクレオチドとしては、例えば、ヌクレアーゼまたはオリゴヌクレオチドの構造もしくは活性を分解もしくは妨害する他の酵素に対して安定化するように、オリゴヌクレオチドの細胞取り込みを増加させるように、あるいはオリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するように設計されたものが挙げられる。
【０００６】
しかし、核酸阻害剤分子に所望の特性を付与するために、化学的に修飾されたヌクレオチドを使用するという要望は、化学的に修飾されたヌクレオチドが核酸阻害剤分子の活性に及ぼし得る任意の悪影響を最小化する（例えば、遺伝子標的ノックダウンの効力または期間のあらゆる低減を最小化する）という競合する要望とバランスをとる必要がある。
【発明の概要】
【０００７】
ステムループ構造を有するセンス鎖及び別のアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子が本明細書に開示され、ステムループ構造のステム部分は、少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドを含む。二本鎖核酸阻害剤分子は、以下を含有する：１）センス鎖（Ｓ）の第１の領域（Ｒ１）及びアンチセンス鎖（ＡＳ）間の第１の二重鎖（Ｄ１）、２）ステムループ構造のステムに対応するセンス鎖の第２の領域（Ｒ２）における第２の二重鎖（Ｄ２）、ならびに、３）Ｒ２の第１のサブ領域（Ｓ１）及び第２のサブ領域（Ｓ２）を連結するループ。図１０Ａ〜Ｃを参照のこと。通常は、二本鎖核酸阻害剤分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）の外側にＴm上昇ヌクレオチドを含有しない。加えて、ステムループ構造は通常、テトラループを含有し、センス鎖の５’または３’末端に位置する。これらの二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖の５’または３’末端に形成されたステム二重鎖（Ｄ２）に、Ｔm上昇ヌクレオチドを組み込むと、ｉｎ  ｖｉｖｏでの安定性及び活性の期間が増加し、且つステム二重鎖（Ｄ２）が効力を低減させることなく短縮されることが可能になる。例えば、図１０Ｄを参照のこと、例えば、図６及び実施例３、図９及び実施例５、ならびに図１２及び実施例６を参照のこと。ステム二重鎖（Ｄ２）に、単一塩基対のＴm上昇ヌクレオチド（すなわち、２つのＴm上昇ヌクレオチド）または単一の不対合Ｔm上昇ヌクレオチドでさえも組み込むと、効力が低減せず、Ｔm上昇ヌクレオチドを含まない対照と比較して、実際にｉｎ  ｖｉｖｏでの活性の期間が増加した。例えば、図１５Ａ及びＢならびに実施例５を参照のこと。
【０００８】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、
２０〜６６または２１〜６６ヌクレオチドを含み且つ第１の領域（Ｒ１）及び第２の領域（Ｒ２）を有するセンス鎖、
１５〜４０ヌクレオチドを含むアンチセンス鎖（センス鎖及びアンチセンス鎖は、別々の鎖である）、
センス鎖の第１の領域及びアンチセンス鎖により形成された第１の二重鎖（Ｄ１）（第１の二重鎖は、１５〜４０塩基対長を有する）を含み、
センス鎖の第２の領域（Ｒ２）は、第１のサブ領域（Ｓ１）、第２のサブ領域（Ｓ２）、ならびに第１の領域及び第２の領域を連結するテトラループ（Ｌ）を含み、第１の領域及び第２の領域は、第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、
第２の二重鎖は、１〜６塩基対長を有し、少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、第２の二重鎖は、３〜６塩基対長を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖は、１〜３塩基対長を有する。
【０００９】
特定の実施形態では、センス鎖は、２４〜３５ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、センス鎖は、２８〜３５ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、センス鎖は、２６〜３０ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、センス鎖は、２４ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、センス鎖は、２６ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、センス鎖は、２８ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、センス鎖は、３０ヌクレオチドを有する。
【００１０】
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２０〜２４ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２１〜２３ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチドを有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、３’末端に１〜６ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態では、一本鎖オーバーハングは、２ヌクレオチド長である。
【００１１】
特定の実施形態では、第１の二重鎖（Ｄ１）は、１８〜３０塩基対長を有する。特定の実施形態では、第１の二重鎖（Ｄ１）は、１８〜２４塩基対長を有する。特定の実施形態では、第１の二重鎖（Ｄ１）は、１９〜２１塩基対長を有する。特定の実施形態では、第１の二重鎖（Ｄ１）は、２０塩基対長を有する。
【００１２】
特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）は、１〜５塩基対長を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖は、１〜１０のＴm上昇ヌクレオチドを含有し、１〜５塩基対長を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）は、３〜５塩基対長を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖は、６〜１０のＴm上昇ヌクレオチドを含有し、３〜５塩基対長を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖は、１〜６つのＴm上昇ヌクレオチドを含有し、１〜３塩基対長を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖は、６つのＴm上昇ヌクレオチドを含み、３塩基対長を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖は、４つのＴm上昇ヌクレオチドを含み、２塩基対長を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖は、２つのＴm上昇ヌクレオチドを含み、１塩基対長を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖は、３塩基対長を有し、３、２、または１つの不対合Ｔm上昇ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖は、１または２塩基対長を有し、１または２つの不対合Ｔm上昇ヌクレオチドを含有する。
【００１３】
特定の実施形態では、センス鎖は、２８〜３５ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０〜２４ヌクレオチド長であり、第１の二重鎖は、１８〜２４塩基対長を有し、第２の二重鎖は、３〜５塩基対長を有する。特定の実施形態では、センス鎖は、２４〜３５ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０〜２４ヌクレオチド長であり、第１の二重鎖は、１８〜２４塩基対長を有し、第２の二重鎖は、１〜５塩基対長を有する。特定の実施形態では、センス鎖は、２４〜３５ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０〜２４ヌクレオチド長であり、第１の二重鎖は、１８〜２４塩基対長を有し、第２の二重鎖は、１〜３塩基対長を有する。
【００１４】
特定の実施形態では、センス鎖は、２４〜３０ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０〜２４ヌクレオチド長であり、第１の二重鎖は、１８〜２４塩基対長を有し、第２の二重鎖は、１〜５塩基対長、３〜５塩基対長、１〜３塩基対長、または１〜２塩基対長を有する。
【００１５】
特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）は、３塩基対長を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）は、２塩基対長を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）は、１塩基対長を有する。
【００１６】
特定の実施形態では、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）は、２０ヌクレオチド長であり、センス鎖（Ｒ２）の第２の領域は、６〜１０ヌクレオチド長であり、
センス鎖の第１の領域及びアンチセンス鎖により形成される第１の二重鎖（Ｄ１）は、２０塩基対長を有し、
センス鎖の第２の領域（Ｒ２）の第１のサブ領域（Ｓ１）及び第２のサブ領域（Ｓ２）により形成される第２の二重鎖（Ｄ２）は、１〜３塩基対長を有し、テトラループは、４ヌクレオチド長であり、
アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチド長であり、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態では、Ｒ２は、６ヌクレオチド長であり、Ｄ２は、１塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｒ２は、８ヌクレオチド長であり、Ｄ２は、２塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｒ２は、１０ヌクレオチド長であり、Ｄ２は、３塩基対長を有する。
【００１７】
特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）の各ヌクレオチドは、Ｔm上昇ヌクレオチドである。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）の外側にＴm上昇ヌクレオチドを含有しない。
【００１８】
特定の実施形態では、テトラループは、ＵＮＣＧ、ＧＮＲＡ、ＣＵＵＧ、Ａ／ＵＧＮＮ、ＧＧＵＧ、ＲＮＹＡ、ＡＧＮＮから選択されるＲＮＡテトラループ、またはｄ（ＧＮＡＢ）、ｄ（ＣＮＮＧ）、もしくはｄ（ＴＮＣＧ）から選択されるＤＮＡテトラループである。特定の実施形態では、テトラループは、配列ＧＡＡＡを有する。
【００１９】
特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、Ｇクランプ及びそのアナログ、ヘキシトールヌクレオチド、ならびに修飾ヌクレオチドからなる群より選択され、修飾ヌクレオチドは、糖部分の２’−炭素が２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅで修飾されていない。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、５−ブロモウラシル、５−ヨードウラシル、５−プロピニル修飾ピリミジン、２−アミノアデニン、２−チオウリジン、５Ｍｅ−チオウリジン、またはプソイドウリジンである。
【００２０】
特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチドである。特定の実施形態では、二環式ヌクレオチドは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖａ、またはＶｂの構造を有する。特定の実施形態では、少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、またはＩｆのうちの１つ以上の構造を有する。特定の実施形態では、少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、またはＩＩｄのうちの１つ以上の構造を有する。特定の実施形態では、少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式ＩＩＩａ及び／またはＩＩＩｂの構造を有する。特定の実施形態では、少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式ＩＶａ及び／またはＩＶｂの構造を有する。
【００２１】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオチドは、以下のうちの１つ以上である：
2021520355.tif 000003
2021520355.tif 000004
2021520355.tif 000005
2021520355.tif 000006
2021520355.tif 000007
2021520355.tif 000008
2021520355.tif 000009
2021520355.tif 000010
及び
2021520355.tif 000011
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒ2は、ＨまたはＣＨ3であり、Ｗa及びＷbはそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または別のヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドに二環式ヌクレオチドを結合させるヌクレオチド間結合基であり、ＷaまたはＷbの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドに二環式ヌクレオチドを結合させるヌクレオチド間結合基である）。
【００２２】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオチドは、以下のものである：
2021520355.tif 000012
または
2021520355.tif 000013
（式中、Ｂ、Ｗa、及びＷbは、上記の通りであり、Ｒ2は、ＣＨ3である）。
【００２３】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオチドは、以下のものである：
2021520355.tif 000014
（式中、Ｂ、Ｗa、及びＷbは、上記の通りであり、Ｒ2は、ＣＨ3である）。
【００２４】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオチドは、第１の環を含み、第１の環は、フラノシル、ならびにフラノシルの２’−炭素及び４’−炭素を連結して、第２の環を形成する架橋である。
【００２５】
特定の実施形態では、フラノシルの２’−炭素及び４’−炭素を連結する架橋は、以下からなる群より選択される：
ａ）４’−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’及び４’−ＣＨ2−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ1−Ｃ12アルキル、または例えば、４’−ＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−２’（ＢＮＡNCとしても知られる）または４’−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−２’（ＢＮＡNC［ＮＭｅ］としても知られる）を含む保護基である）、
ｂ）４’−ＣＨ2−２’、４’−（ＣＨ2）2−２’、４’−（ＣＨ2）3−２’、４’−（ＣＨ2）−Ｏ−２’（ＬＮＡとしても知られる）、４’−（ＣＨ2）−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ2）2−Ｏ−２’（ＥＮＡとしても知られる）、４’−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−２’（ｃＥｔとしても知られる）、及び４’−ＣＨ（ＣＨ2ＯＣＨ3）−Ｏ−２’（ｃＭＯＥとしても知られる）、ならびにそれらのアナログ、
ｃ）４’−Ｃ（ＣＨ3）（ＣＨ3）−Ｏ−２’及びそのアナログ、
ｄ）４’−ＣＨ2−Ｎ（ＯＣＨ3）−２’及びそのアナログ、
ｅ）４’−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−２’及びそのアナログ、
ｆ）４’−ＣＨ2−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ3）−２’及びそのアナログ、ならびに
ｇ）４’−ＣＨ2−Ｃ（＝ＣＨ2）−２’及びそのアナログ。
【００２６】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤は、第２の二重鎖の外側にいかなる二環式ヌクレオチドも含有しない。
【００２７】
特定の実施形態では、テトラループは、少なくとも１つのリガンドコンジュゲートヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、テトラループは、２つ、３つ、または４つのリガンドコンジュゲートヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、リガンドは、ＧａｌＮＡｃである。特定の実施形態では、ＧａｌＮＡｃは、糖部分の２’位のヌクレオチドにコンジュゲートされる。
【００２８】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤はさらに、センス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端に５’−ホスファート模倣物を含む。
【００２９】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、脂質ナノ粒子と共に製剤化される。特定の実施形態では、脂質ナノ粒子は、コア脂質及びエンベロープ脂質を含み、コア脂質は、第１のカチオン性脂質及び第１のペグ化脂質を含み、エンベロープ脂質は、第２のカチオン性脂質、中性脂質、ステロール、及び第２のペグ化脂質を含む。特定の実施形態では、第１のカチオン性脂質は、ＤＬ−０４８であり、第１のペグ化脂質は、ＤＳＧ−ｍＰＥＧであり、第２のカチオン性脂質は、ＤＬ−１０３であり、中性脂質は、ＤＳＰＣであり、ステロールは、コレステロールであり、第２のペグ化脂質は、ＤＳＰＥ−ｍＰＥＧである。
【００３０】
別の態様は、本明細書に記載の治療的有効量のステム／ループ含有二本鎖核酸阻害剤分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００３１】
別の態様は、標的遺伝子の発現を低減させるのに十分な量で二本鎖核酸阻害剤分子または医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における標的遺伝子の発現を低減させるための方法に関する。特定の実施形態では、投与ステップは、静脈内、筋肉内、または皮下投与を含む。特定の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００３２】
本明細書に組み込まれ且つ本明細書の一部を構成する添付の図面は、特定の実施形態を例示し、書かれた説明と共に、本明細書に開示の組成物及び方法の特定の原理を説明するのに役立つ。
【図面の簡単な説明】
【００３３】
【図１】実施例１で考察されるように、ヒトＳＡＡ１遺伝子（構築物１〜４）の同じ配列を標的とする４つの例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の構造を概略的に示す。構築物１のセンス鎖は、本明細書では「長いステム」と呼ばれる６塩基対のステム二重鎖、及びテトラループを含む。テトラループの各ヌクレオチドは、単一のＧａｌＮＡｃ分子にコンジュゲートされる。構築物１は、「ＬＳ／４ＧＮ」とも呼ばれる。構築物２のセンス鎖は、本明細書で「短いステム」と呼ばれる３塩基対のステム二重鎖、及びテトラループを含む。テトラループの各ヌクレオチドは、単一のＧａｌＮＡｃ分子にコンジュゲートされる。構築物２は、「ＳＳ／４ＧＮ」とも呼ばれる。構築物３は、３塩基対の短いステムを有し、テトラループの４ヌクレオチドのうちのわずか３つがＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされることを除いて、構築物２と同一である。構築物３は、「ＳＳ／３ＧＮ」とも呼ばれる。構築物４は、３塩基対の短いステムを有し、ステムに６つの二環式ヌクレオチドを含有することを除いて、構築物３と同一である。構築物４は、「ＳＳ／３ＧＮ−ＢＮＡ」とも呼ばれる。
【図２】実施例１で説明されるように、ｈＳＡＡ１を発現するＡＡＶ９ベクターを以前に投与されたＣＤ−１マウスに構築物１〜４（図１を参照のこと）を投与した後のヒトＳＡＡ１タンパク質のノックダウンを示す。構築物４（ＳＳ／３ＧＮ−ＢＮＡ）の短いステムに二環式ヌクレオチドが含まれると、長いステム及び短いステム対照と比較して、ｈＳＡＡ１ノックダウンの効力及び期間が改善された。
【図３Ａ】実施例２で考察されるように、ヒトＡＰＯＣ３遺伝子（構築物５〜１０）における同じ配列を標的とする６つの例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の構造を概略的に示す。構築物５〜１０では、アンチセンス（またはガイド）鎖の１位のヌクレオチドは、２’−ＯＭｅ修飾を含有する。長いステム構築物５（ＬＳ／４ＧＮ）及び８（ＬＳ／３ＧＮ）は、構築物５のテトラループが単一のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている４ヌクレオチドを含有する一方で、構築物８のテトラループが単一のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている３ヌクレオチドを含有することを除いて、同一である。短いステム構築物６（ＳＳ／４ＧＮ）及び９（ＳＳ／３ＧＮ）は、構築物６のテトラループが単一のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている４ヌクレオチドを含有する一方で、構築物９のテトラループが単一のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている３ヌクレオチドを含有することを除いて、同一である。短いステム構築物７（ＳＳ／４ＧＮ−ＢＮＡ）及び１０（ＳＳ／３ＧＮ−ＢＮＡ）は、それぞれ、構築物７及び１０がステム二重鎖に６つの二環式ヌクレオチドを含有することを除いて、構築物６（ＳＳ／４ＧＮ）及び９（ＳＳ／３ＧＮ）と同一である。
【図３Ｂ】実施例２で考察されるように、ヒトＡＰＯＣ３遺伝子（構築物１１〜１６）における同じ配列を標的とする６つの例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の構造を概略的に示す。構築物１１〜１６では、アンチセンス（またはガイド）鎖の１位のヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾を含有する。長いステム構築物１１（ＬＳ／４ＧＮ）及び１４（ＬＳ／３ＧＮ）は、構築物１１のテトラループが単一のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている４ヌクレオチドを含有する一方で、構築物１４のテトラループが単一のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている３ヌクレオチドを含有することを除いて、同一である。短いステム構築物１２（ＳＳ／４ＧＮ）及び１５（ＳＳ／３ＧＮ）は、構築物１２のテトラループが単一のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている４ヌクレオチドを含有する一方で、構築物１５のテトラループが単一のＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされている３ヌクレオチドを含有することを除いて、同一である。短いステム構築物１３（ＳＳ／４ＧＮ−ＢＮＡ）及び１６（ＳＳ／３ＧＮ−ＢＮＡ）は、それぞれ、構築物１３及び１６がステムに６つの二環式ヌクレオチドを含有することを除いて、構築物１２（ＳＳ／４ＧＮ）及び１５（ＳＳ／３ＧＮ）と同一である。
【図４】実施例２で説明されるように、ＣＤ−１マウスに構築物５〜１６（図３Ａ及び３Ｂを参照のこと）を投与した後のＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡのノックダウンを示す。構築物７（ＳＳ／４ＧＮ−ＢＮＡ）、１０（ＳＳ／３ＧＮ−ＢＮＡ）、１３（ＳＳ／４ＧＮ−ＢＮＡ）、及び１６（ＳＳ／３ＧＮ−ＢＮＡ）の短いステムに二環式ヌクレオチドが含まれると、長いステム及び短いステム対照と比較して、ＡＰＯＣ３ノックダウンの効力及び期間が改善された。
【図５】実施例３及び５で考察されるように、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子（構築物１７〜１９）の同じ配列を標的とする３つの例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の構造を概略的に示す。構築物１７（ＬＳ／３ＧＮ）及び１８（ＳＳ／３ＧＮ）は、構築物１７が長いステム（６塩基対）を含有し且つ構築物１８が短いステム（３塩基対）を含有することを除いて同一である。短いステム構築物１８及び１９（ＳＳ／３ＧＮ−ＢＮＡ）は、構築物１９がステムに６つの二環式ヌクレオチドを含有することを除いて、同一である。
【図６】実施例３に説明されるように、１１日目及び１９日目にｈＰＣＳＫ９発現プラスミドも投与されたＣＤ−１マウスへの構築物１７〜１９（図５を参照のこと）の投与から１２日目及び２０日目のヒトＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡのノックダウンを示す。構築物１９（ＳＳ／３ＧＮ−ＢＮＡ）の短いステムに二環式ヌクレオチドが含まれると、長いステム及び短いステム対照と比較して、ＰＣＳＫ９ノックダウンの効力及び期間が改善された。
【図７】実施例４で考察されるように、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子（構築物２０〜２１）における同じ配列を標的とする２つの例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の構造を概略的に示す。構築物２０（ＬＳ／３ＧＮ）及び２１（ＳＳ／３ＧＮ−ＢＮＡ）は、構築物２０が長いステム（６塩基対）を有し且つ構築物２１が６つの二環式ヌクレオチドを含有する短いステム（３塩基対）を有することを除いて、同一である。
【図８】実施例４で説明されるように、ｈＰＣＳＫ９を発現するＡＡＶ９ベクターを以前に投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスへの構築物２０及び２１（図７を参照のこと）の投与後のヒトＰＣＳＫ９タンパク質のノックダウンを示す。構築物２１（ＳＳ／３ＧＮ−ＢＮＡ）の短いステムに二環式ヌクレオチドが含まれると、長いステム対照と比較して、ＰＣＳＫ９ノックダウンの効力及び期間が改善された。
【図９】実施例５に説明されるように、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子（レポーター遺伝子）の３’非翻訳領域においてヒトＰＣＳＫ９標的部位を発現するＡＡＶ９ベクターを以前に投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスへの構築物１７及び１９（図５を参照のこと）の投与後のガウシアルシフェラーゼのノックダウンを示す。構築物１９（ＳＳ／３ＧＮ−ＢＮＡ）の短いステムに二環式ヌクレオチドが含まれると、長いステム対照と比較して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＰＣＳＫ９特異的ノックダウンの期間が向上した。
【図１０Ａ】アンチセンス鎖（「ＡＳ」）及びセンス鎖（「Ｓ」）を有する例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の概略図を示し、センス鎖は、ステムループ構造を含有する。
【図１０Ｂ】図１０Ａと同じ例示的な概略図を示す。図１０Ｂでは、センス鎖はさらに、アンチセンス鎖（ＡＳ）と共に二重鎖を形成する第１の領域（Ｒ１）、及び第２のサブ領域（Ｓ２）に第１のサブ領域（Ｓ１）を連結するループ（Ｌ）を含む第２の領域（Ｒ２）に分けられ、Ｓ１及びＳ２が本明細書では「ステム」または「ステム二重鎖」と呼ばれる二重鎖を形成するように互いに十分に相補的である。
【図１０Ｃ】図１０Ａ及び１０Ｂと同じ例示的な概略図を示す。図１０Ｃの概略図は、核酸阻害剤分子における第１の二重鎖（Ｄ１）及び第２の二重鎖（Ｄ２）を示す。第１の二重鎖（Ｄ１）は、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）及びアンチセンス鎖（ＡＳ）間に形成される。第２の二重鎖（Ｄ２）または「ステム」は、センス鎖（Ｓ）の第２の領域（Ｒ２）の第１のサブ領域（Ｓ１）及び第２のサブ領域（Ｓ２）間に形成される。
【図１０Ｄ】例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の概略図を示し、第２の二重鎖（Ｄ２）は、図１０Ｃに示される第２の二重鎖よりも短い。
【図１１Ａ】実施例６で考察されるように、目的の遺伝子配列を標的とする例示的な長いステム二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２２」）の構造を概略的に示す。構築物２２のセンス鎖は、６塩基対のステム二重鎖及びテトラループを含む。テトラループの４ヌクレオチドのうち２つは、単一のＧａｌＮＡｃ分子にコンジュゲートされる。
【図１１Ｂ】実施例６で考察されるように、目的の遺伝子配列を標的とする例示的な長いステム二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２３」）の構造を概略的に示す。構築物２３のセンス鎖は、６塩基対のステム二重鎖及びトリループを含む。構築物２３の構造は、構築物２３がテトラループの代わりにトリループを含有することを除いて、構築物２２の構造と同一である。
【図１１Ｃ】実施例６で考察されるように、目的の遺伝子配列を標的とする例示的な短いステム二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２４」）の構造を概略的に示す。構築物２４のセンス鎖は、ステムループ構造のステム部分の各ヌクレオチドがＢＮＡである３塩基対のステム二重鎖、及びテトラループを含む。テトラループの４ヌクレオチドのうち２つは、単一のＧａｌＮＡｃ分子にコンジュゲートされる。
【図１１Ｄ】実施例６で考察されるように、目的の遺伝子配列を標的とする例示的な短いステム二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２５」）の構造を概略的に示す。構築物２５のセンス鎖は、ステムループ構造のステム部分の各ヌクレオチドがＢＮＡである３塩基対のステム二重鎖、及びトリループを含む。構築物２５の構造は、構築物２５がテトラループの代わりにトリループを含有することを除いて、構築物２４の構造と同一である。
【図１１Ｅ】実施例６で考察されるように、目的の遺伝子配列を標的とする例示的な短いステム二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２６」）の構造を概略的に示す。構築物２６のセンス鎖は、ステムループ構造のステム部分の各ヌクレオチドがＢＮＡである２塩基対のステム二重鎖、及びテトラループを含む。テトラループの４ヌクレオチドのうち２つは、単一のＧａｌＮＡｃ分子にコンジュゲートされる。
【図１１Ｆ】実施例６で考察されるように、目的の遺伝子配列を標的とする例示的な短いステム二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２７」）の構造を概略的に示す。構築物２７のセンス鎖は、ステムループ構造のステム部分の各ヌクレオチドがＢＮＡである２塩基対のステム二重鎖、及びトリループを含む。構築物２７の構造は、構築物２７がテトラループの代わりにトリループを含有することを除いて、構築物２８の構造と同一である。
【図１１Ｇ】実施例６で考察されるように、目的の遺伝子配列を標的とする例示的な短いステム二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２８」）の構造を概略的に示す。構築物２８のセンス鎖は、ステムループ構造のステム部分の両方のヌクレオチドがＢＮＡである１塩基対のステム二重鎖、及びテトラループを含む。テトラループの４ヌクレオチドのうち２つは、単一のＧａｌＮＡｃ分子にコンジュゲートされる。
【図１１Ｈ】実施例６で考察されるように、目的の遺伝子配列を標的とする例示的な短いステム二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物２９」）の構造を概略的に示す。構築物２９のセンス鎖は、ステムループ構造のステム部分の両方のヌクレオチドがＢＮＡである１塩基対のステム二重鎖、及びトリループを含む。構築物２９の構造は、構築物２９がテトラループの代わりにトリループを含有することを除いて、構築物２８の構造と同一である。
【図１１Ｉ】実施例６で考察されるように、目的の遺伝子配列を標的とする例示的な長いステム二本鎖核酸阻害剤分子（「構築物３０」）の構造を概略的に示す。構築物３０のセンス鎖は、６塩基対のステム二重鎖及びテトラループを含む。テトラループの４ヌクレオチドのうち３つは、単一のＧａｌＮＡｃ分子にコンジュゲートされる。
【図１２】実施例６に記載されるように、ＣＤ−１マウスへの構築物２２〜３０（図１１Ａ〜Ｉを参照のこと）の投与の４日後に残存する標的遺伝子ｍＲＮＡのパーセントを示す。二環式ヌクレオチドを含有し且つ２または３塩基対のステムを有する短いステム構築物（構築物２４〜２７）は、６塩基対のステムを有する長いステム構築物（構築物２２、２３、及び３０）と比較して、標的遺伝子ｍＲＮＡの類似のノックダウンを示した。単一塩基対のステムを有するトリループ含有構築物（構築物２９）は、標的ｍＲＮＡ発現を低減させなかったが、単一塩基対のステムを有するテトラループ含有構築物（構築物２８）は、標的ｍＲＮＡ発現の強力な低減を示した。
【図１３】二本鎖核酸阻害剤分子を製剤化するために使用することができる脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の１つの非限定的実施形態を示す。ＬＮＰは、以下のコア脂質：ＤＬ−０４８（カチオン性脂質）及びＤＳＧ−ｍＰＥＧ（ペグ化脂質）ならびに以下のエンベロープ脂質：ＤＬ−１０３（カチオン性脂質）、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ−ｍＰＥＧ（ペグ化脂質）を含む。
【図１４Ａ】実施例５で考察されるように、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子（構築物１７及び１８）の同じ配列を標的とする２つの対照二本鎖核酸阻害剤分子の構造を概略的に示す。構築物１７及び１８は、構築物１７が長いステム（６塩基対）を含有し且つ構築物１８が短いステム（３塩基対）を含有することを除いて同一である。構築物１７も構築物１８も、ステムにＴm上昇ヌクレオチドを含有しない。
【図１４Ｂ】実施例５で考察されるように、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子（構築物１９、３１、及び３２）における同じ配列を標的とする３つの例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の構造を概略的に示す。斜線の円は、ＢＮＡを示す。構築物１８及び１９は、構築物１９がステムに６つの二環式ヌクレオチド（３つのＢＮＡ塩基対）を含有することを除いて同一である。構築物３１は、構築物３１がステムに４つの二環式ヌクレオチド（２つのＢＮＡ塩基対）を含有することを除いて、構築物１９と同一である。構築物３２は、構築物３２がステムに２つの二環式ヌクレオチド（１つのＢＮＡ塩基対）を含有することを除いて、構築物１９と同一である。
【図１４Ｃ】実施例５で考察されるように、ヒトＰＣＳＫ９遺伝子（構築物３３〜３５）における同じ配列を標的とする３つの例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の構造を概略的に示す。斜線の円は、ＢＮＡを示す。構築物３３は、ステムに３つの不対合二環式ヌクレオチド（３つのＢＮＡ）を含有する。構築物３４は、構築物３４がステムに２つの不対合二環式ヌクレオチド（２つのＢＮＡ）を含有することを除いて、構築物３３と同一である。構築物３５は、構築物３５がステムに１つの不対合二環式ヌクレオチド（１つのＢＮＡ）を含有することを除いて、構築物３３と同一である。
【図１５Ａ】実施例５に説明されるように、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子（レポーター遺伝子）の３’非翻訳領域においてヒトＰＣＳＫ９標的部位を発現するＡＡＶ９ベクターを以前に投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスへの構築物１７〜１９、３１、及び３２（図１４Ａ及び１４Ｂを参照のこと）の投与後２〜８週目のガウシアルシフェラーゼのノックダウンを示す。構築物１９、３１、及び３２の短いステムに３、２、または１つのＢＮＡ塩基対が含まれると、長いステム及び短いステムの対照と比較して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＰＣＳＫ９特異的ノックダウンの効力及び期間が改善された。
【図１５Ｂ】実施例５に説明されるように、ガウシアルシフェラーゼ遺伝子（レポーター遺伝子）の３’非翻訳領域においてヒトＰＣＳＫ９標的部位を発現するＡＡＶ９ベクターを以前に投与されたＣ５７ＢＬ／６マウスへの構築物３３〜３５（図１４Ｃを参照のこと）の投与後のガウシアルシフェラーゼのノックダウンを示す。構築物３３〜３５の短いステムに１、２、または３つの不対合二環式ヌクレオチド（ＢＮＡ）が含まれると、長いステム及び短いステム対照と比較して、ルシフェラーゼレポーター遺伝子のＰＣＳＫ９特異的ノックダウンの期間が改善され、期間は、ステム中の連続するＢＮＡの数が１から３に増加するにつれて改善する。
【図１６Ａ】実施例７で考察されるように、ヒトＡＰＯＣ３遺伝子（構築物５、７、３６、及び３７）における同じ配列を標的とする４つの例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の構造を概略的に示す。斜線の円は、ＢＮＡを示す。構築物５及び７を、実施例２にも使用した。構築物５は、ステムにＴm上昇ヌクレオチドを含まない長いステム（６塩基対）を含有する対照である。構築物７は、短いステム（３塩基対）を有し、ステムに６つの二環式ヌクレオチド（３つのＢＮＡ塩基対）を含有する。構築物３６は、構築物３６がステムに４つの二環式ヌクレオチド（２つのＢＮＡ塩基対）を含有することを除いて、構築物７と同一である。構築物３７は、構築物３７がステムに２つの二環式ヌクレオチド（１つのＢＮＡ塩基対）を含有することを除いて、構築物７と同一である。
【図１６Ｂ】実施例７で考察されるように、ヒトＡＰＯＣ３遺伝子（構築物３８〜４１）における同じ配列を標的とする４つの例示的な二本鎖核酸阻害剤分子の構造を概略的に示す。斜線の円は、ＢＮＡを示す。構築物３８は、短いステム（３塩基対）を有し、ステムの上鎖に連続して配置された３つの不対合二環式ヌクレオチド（３つのＢＮＡ−上部）を含有する。構築物３９は、短いステム（３塩基対）を有し、ステムの下鎖に連続して配置された３つの不対合二環式ヌクレオチド（３つのＢＮＡ−下部）を含有する。構築物４０は、構築物４０がステムに２つの不対合二環式ヌクレオチド（２つのＢＮＡ）を含有することを除いて、構築物３９と同一である。構築物４１は、構築物４１がステムに１つの不対合二環式ヌクレオチド（１つのＢＮＡ）を含有することを除いて、構築物３９と同一である。
【図１７】実施例７で説明されるように、ＣＤ−１マウスへの構築物５、７、及び３６〜４１（図１６Ａ及び１６Ｂを参照のこと）の投与後７日目の全血中のＡＰＯＣ３タンパク質のノックダウンを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
定義
本開示をより容易に理解するために、最初に、特定の用語が以下で定義される。以下の用語及び他の用語の追加の定義が、本明細書に記載され得る。下記の用語の定義が、参照により組み込まれる出願または特許の定義と矛盾する場合、本出願に記載の定義が、用語の意味を理解するために使用されなければならない。
【００３５】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるように、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数の指示対象を含む。従って、例えば、「方法」への言及は、１つ以上の方法、及び／または本明細書に記載の及び／または本開示などを読む時に当業者に明らかになるタイプのステップを含む、などである。
【００３６】
投与：本明細書で使用される場合、対象に組成物を「投与すること」は、対象に組成物を与えるか、適用するか、または接触させることを意味する。投与は、例えば、局所、経口、皮下、筋肉内、腹腔内、静脈内、髄腔内、及び皮内を含む多数の経路のいずれかにより達成することができる。
【００３７】
アシル：本明細書で使用される場合、「アシル」という用語は、アルキルカルボニル、シクロアルキルカルボニル、及びアリールカルボニル部分を指す。
【００３８】
アルコキシ：本明細書で使用される場合、「アルコキシ」という用語は、酸素原子を介して分子部分に結合しているアルキル基を指す。
【００３９】
アルケニル：本明細書で使用される場合、「アルケニル」という用語は、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有し且つ約２〜約２０の範囲の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基を指す。「置換アルケニル」は、１つ以上の置換基をさらに有するアルケニル基を指す。本明細書で使用される場合、「低級アルケニル」は、２〜約６の炭素原子を有するアルケニル部分を指す。
【００４０】
アルキル：本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、１〜約２０の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基を指す。それが本明細書に現れる時はいつでも、「Ｃ1−Ｃ6アルキル」などの数値範囲は、アルキル基が、１つのみの炭素原子、２つの炭素原子、３つの炭素原子など、６以下の炭素原子を含み得ることを意味するが、「アルキル」という用語は、炭素原子の数値範囲が指定されていない場合も含む。例えば、「アルキル」という用語は、Ｃ1−Ｃ10の部分範囲（例えば、Ｃ1−Ｃ6）を指し得る。「置換アルキル」は、置換基を有するアルキル部分を指す。本明細書で使用される場合、「低級アルキル」は、１〜約６の炭素原子を有するアルキル部分を指す。
【００４１】
アルキニル：本明細書で使用される場合、「アルキニル」は、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有し且つ約２〜約２０の範囲の炭素原子を有する直鎖または分枝鎖ヒドロカルビル基を指す。「置換アルキニル」は、１つ以上の置換基をさらに有するアルキニル基を指す。本明細書で使用される場合、「低級アルキニル」は、約２〜約６の炭素原子を有するアルキニル部分を指す。
【００４２】
アンチセンス鎖：二本鎖核酸阻害剤分子は、２つのオリゴヌクレオチド鎖：アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。アンチセンス鎖またはその領域は、標的核酸の対応する領域と部分的に、実質的に、または完全に相補的である。加えて、二本鎖核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖またはその領域は、二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖またはその領域と部分的に、実質的に、または完全に相補的である。特定の実施形態では、アンチセンス鎖はまた、標的核酸配列と非相補的なヌクレオチドを含有してもよい。非相補的ヌクレオチドは、相補的配列のいずれかの側にあっても、相補的配列の両側にあってもよい。特定の実施形態では、アンチセンス鎖またはその領域は、センス鎖またはその領域と部分的に、または実質的に相補的であり、非相補的ヌクレオチドは、相補性の１つ以上の領域の間に配置されてもよい（例えば、１つ以上のミスマッチ）。二本鎖核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖は、ガイド鎖とも呼ばれる。
【００４３】
およそ：本明細書で使用される場合、目的の１つ以上の値に適用される「およそ」または「約」という用語は、所定の参照値と同様の値を指す。特定の実施形態では、「およそ」または「約」という用語は、別途記載のない限りまたは別途文脈から明らかでない限り、所定の参照値のいずれかの（より大きいまたはより小さい）方向で２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、またはそれ以下に入る幅広い値を指す（そのような数が可能な値の１００％を超える場合を除く）。
【００４４】
アリール：本明細書で使用される場合、「アリール」という用語は、５〜１９の範囲の炭素原子を有する芳香族単環式または多環式基を指す。「置換アリール」は、１つ以上の置換基をさらに有するアリール基を指す。
【００４５】
二環式ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「二環式ヌクレオチド」という用語は、二環式糖部分を含むヌクレオチドを指す。
【００４６】
二環式糖部分：本明細書で使用される場合、「二環式糖部分」という用語は、第２の環を形成して、二環式構造がもたらされる４〜７員環の２つの原子を連結する架橋を含む（限定されないが、フラノシルを含む）４〜７員環を含む修飾糖部分を指す。通常、４〜７員環は、糖である。一部の実施形態では、４〜７員環は、フラノシルである。特定の実施形態では、架橋は、フラノシルの２’−炭素及び４’−炭素を連結する。
【００４７】
相補的：本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、（例えば、２つの対向する核酸または単一の核酸鎖の対向する領域上の）２ヌクレオチドが互いに塩基対を形成することを可能にする２ヌクレオチド間の構造的関係を指す。例えば、対向する核酸のピリミジンヌクレオチドに相補的である１つの核酸のプリンヌクレオチドは、互いに水素結合を形成することにより共に塩基対合し得る。一部の実施形態では、相補的ヌクレオチドは、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ様式で、または安定な二重鎖の形成を可能にする任意の他の様式で塩基対合し得る。「完全に相補的」または１００％の相補性は、第１のオリゴヌクレオチド鎖または第１のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントの各ヌクレオチドモノマーが、第２のオリゴヌクレオチド鎖または第２のオリゴヌクレオチド鎖のセグメントの各ヌクレオチドモノマーと塩基対を形成し得る状況を指す。１００％未満の相補性は、２つのオリゴヌクレオチド鎖（または２つのオリゴヌクレオチド鎖の２つのセグメント）のヌクレオチドモノマーの全てではないが一部が互いに塩基対を形成し得る状況を指す。「実質的な相補性」は、互いに９０％以上の相補性を示す２つのオリゴヌクレオチド鎖（または２つのオリゴヌクレオチド鎖のセグメント）を指す。「十分に相補的」は、標的ｍＲＮＡによりコードされるタンパク質の量の低減があるような、標的ｍＲＮＡ及び核酸阻害剤分子間の相補性を指す。
【００４８】
相補鎖：本明細書で使用される場合、「相補鎖」という用語は、もう一方の鎖に部分的に、実質的に、または完全に相補的である二本鎖核酸阻害剤分子の鎖を指す。
【００４９】
シクロアルキル：本明細書で使用される場合、「シクロアルキル」という用語は、３〜１２の炭素、例えば、３〜８つの炭素、例えば、３〜６つの炭素を含有する環状（すなわち環含有）炭化水素基を指す。「置換シクロアルキル」は、さらに１つ以上の置換基を有するシクロアルキル基を指す。
【００５０】
デオキシリボフラノシル：本明細書で使用される場合、「デオキシリボフラノシル」という用語は、天然に存在するＤＮＡにみられ且つ以下に示される２’−炭素に水素基を有するフラノシルを指す。
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【００５１】
デオキシリボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「デオキシリボヌクレオチド」という用語は、糖部分の２’位に水素基を有する（本明細書で定義される）天然ヌクレオチドまたは（本明細書で定義される）修飾ヌクレオチドを指す。
【００５２】
ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子：本明細書で使用される場合、「ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子」という用語は、センス鎖（パッセンジャー）及びアンチセンス鎖（ガイド）を有する二本鎖核酸阻害剤分子を指し、アンチセンス鎖またはアンチセンス鎖の一部は、標的ｍＲＮＡの切断において、アルゴノート２（Ａｇｏ２）エンドヌクレアーゼにより使用される。
【００５３】
二重鎖：本明細書で使用される場合、核酸（例えば、オリゴヌクレオチド）に関して「二重鎖」という用語は、ヌクレオチドの２つの逆平行配列の相補的塩基対合により形成される構造を指す。
【００５４】
賦形剤：本明細書で使用される場合、「賦形剤」という用語は、例えば、所望の一貫性または安定化効果を提供またはこれらに寄与するために、組成物に含まれ得る非治療剤を指す。
【００５５】
フラノシル：本明細書で使用される場合、「フラノシル」という用語は、４つの炭素原子及び１つの酸素原子を有する５員環を含む構造を指す。
【００５６】
ハロ：本明細書で使用される場合、「ハロ」及び「ハロゲン」という用語は、互換性があり、フッ素、塩素、臭素、及びヨウ素から選択される原子を指す。
【００５７】
複素環：本明細書で使用される場合、「複素環」または「複素環式」という用語は、環構造の一部として１つ以上のヘテロ原子（例えば、Ｎ、Ｏ、Ｓなど）を含有し且つ３〜１４の範囲の炭素原子を有する非芳香族環式（すなわち、環含有）基を指す。「置換複素環式」または「置換複素環」は、さらに１つ以上の置換基を有する複素環式基を指す。
【００５８】
ヌクレオチド間結合基：本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド間結合基」または「ヌクレオチド間結合」という用語は、２つのヌクレオシド部分を共有結合させることが可能な化学基を指す。通常は、化学基は、ホスホ基またはホスファイト基を含有するリン含有結合基である。ホスホ結合基は、ホスホジエステル結合、ホスホロジチオアート結合、ホスホロチオアート結合、ホスホトリエステル結合、チオノアルキルホスホナート結合、チオアルキルホスホトリエステル結合、ホスホルアミダイト結合、ホスホナート結合、及び／またはボラノホスファート結合を含むことを意味する。例えば、米国特許第３，６８７，８０８号、同第４，４６９，８６３号、同第４，４７６，３０１号、同第５，０２３，２４３号、同第５，１７７，１９６号、同第５，１８８，８９７号、同第５，２６４，４２３号、同第５，２７６，０１９号、同第５，２７８，３０２号、同第５，２８６，７１７号、同第５，３２１，１３１号、同第５，３９９，６７６号、同第５，４０５，９３９号、同第５，４５３，４９６号、同第５，４５５，２３３号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７６，９２５号、同第５，５１９，１２６号、同第５，５３６，８２１号、同第５，５４１，３０６号、同第５，５５０，１１１号、同第５，５６３，２５３号、同第５，５７１，７９９号、同第５，５８７，３６１号、同第５，１９４，５９９号、同第５，５６５，５５５号、同第５，５２７，８９９号、同第５，７２１，２１８号、同第５，６７２，６９７号、及び同第５，６２５，０５０号に開示されているように、多数のリン含有結合は、当該技術分野で周知である。他の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、限定されないが、シロキサン骨格；スルフィド、スルホキシド、及びスルホン骨格；ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格；リボアセチル骨格；アルケン含有主鎖；スルファマート骨格；メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格；スルホナート及びスルホンアミド骨格；ならびにアミド骨格を有するものを含む、リン原子を含有しない１つ以上のヌクレオチド間結合基、例えば、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオチド間結合、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環ヌクレオチド間結合を含有する。例えば、米国特許第５，０３４，５０６号、同第５，１６６，３１５号、同第５，１８５，４４４号、同第５，２１４，１３４号、同第５，２１６，１４１号、同第５，２３５，０３３号、同第５，２６４，５６２号、同第５，２６４，５６４号、同第５，４０５，９３８号、同第５，４３４，２５７号、同第５，４６６，６７７号、同第５，４７０，９６７号、同第５，４８９，６７７号、同第５，５４１，３０７号、同第５，５６１，２２５号、同第５，５９６，０８６号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６０２，２４０号、同第５，６０８，０４６号、同第５，６１０，２８９号、同第５，６１８，７０４号、同第５，６２３，０７０号、同第５，６６３，３１２号、同第５，６３３，３６０号、同第５，６７７，４３７号、同第５，７９２，６０８号、同第５，６４６，２６９号、及び同５，６７７，４３９号に開示されるように、非リン含有結合は、当該技術分野で周知である。
【００５９】
ループ：本明細書で使用される場合、「ループ」という用語は、核酸の一本鎖により形成される構造を指し、特定の一本鎖ヌクレオチド領域に隣接する相補領域は、相補領域間の一本鎖ヌクレオチド領域が二重鎖形成またはＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合から除外されるようにハイブリダイズする。ループは、任意の長さの一本鎖ヌクレオチド領域である。ループの例としては、ヘアピン及びテトラループのような構造に存在する不対合ヌクレオチドが挙げられる。
【００６０】
融解温度：本明細書中で使用される場合、「融解温度」または「Ｔm」は、二重鎖核酸の２つの鎖が分離する温度を意味する。Ｔmは多くの場合、二重鎖安定性または相補的な核酸もしくはその部分の２つの鎖の結合親和性の尺度として使用される。Ｔmは、ＵＶスペクトルを使用することにより、ハイブリダイゼーションの形成及び分解（融解）を決定するために測定することができる。ハイブリダイゼーション中に生じる塩基スタッキングは、ＵＶ吸収の低減（低色性）を伴う。従って、ＵＶ吸収の低減は、より高いＴmを示す。
【００６１】
修飾核酸塩基：本明細書で使用される場合、「修飾核酸塩基」という用語は、天然核酸塩基またはユニバーサル核酸塩基ではない任意の核酸塩基を指す。好適な修飾核酸塩基としては、ジアミノプリン及びその誘導体、アルキル化プリンまたはピリミジン、アシル化プリンまたはピリミジンチオール化プリンまたはピリミジンなどが挙げられる。他の好適な修飾核酸塩基としては、プリン及びピリミジンのアナログが挙げられる。好適なアナログとしては、１−メチルアデニン、２−メチルアデニン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ６−イソペンチルアデニン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンチルアデニン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアデニン、８−ブロモアデニン、２−チオシトシン、３−メチルシトシン、５−メチルシトシン、５−エチルシトシン、４−アセチルシトシン、１−メチルグアニン、２−メチルグアニン、７−メチルグアニン、２，２−ジメチルグアニン、８−ブロモグアニン、８−クロログアニン、８−アミノグアニン、８−メチルグアニン、８−チオグアニン、５−フルオロウラシル、５−ブロモウラシル、５−クロロウラシル、５−ヨードウラシル、５−エチルウラシル、５−プロピルウラシル、５−メトキシウラシル、５−ヒドロキシメチルウラシル、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウラシル、５−（メチルアミノメチル）ウラシル、５−（カルボキシメチルアミノメチル）−ウラシル、２−チオウラシル、５−メチル−２−チオウラシル、５−（２−ブロモビニル）ウラシル、ウラシル−５−オキシ酢酸、ウラシル−５−オキシ酢酸メチルエステル、プソイドウラシル、１−メチルプソイドウラシル、クオシン、ヒポキサンチン、キサンチン、２−アミノプリン、６−ヒドロキシアミノプリン、ニトロピロリル、ニトロインドリル及びジフルオロトリル、６−チオプリン及び２，６−ジアミノプリンニトロピロリル、ニトロインドリル及びジフルオロトリルが挙げられるが、これらに限定されない。通常は、核酸塩基は、窒素含有塩基を含有する。特定の実施形態では、核酸塩基は、窒素原子を含有しない。例えば、米国公開特許出願第２００８０２７４４６２号を参照のこと。
【００６２】
修飾ヌクレオシド：本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオシド」という用語は、ホスファート基または修飾ホスファート基（本明細書で定義される）に結合しておらず且つ修飾核酸塩基（本明細書で定義される）、ユニバーサル核酸塩基（本明細書で定義される）、または修飾糖部分（本明細書で定義される）のうちの１つ以上を含有する糖（例えば、デオキシリボースもしくはリボースまたはそのアナログ）とＮ−グリコシド結合している複素環式窒素塩基を指す。修飾またはユニバーサル核酸塩基（本明細書では塩基アナログとも呼ばれる）は一般に、ヌクレオシド糖部分の１’位に位置し、１’位のアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル以外の核酸塩基を指す。特定の実施形態では、修飾またはユニバーサル核酸塩基は、窒素含有塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含有しない。例えば、米国公開特許出願第２００８０２７４４６２号を参照のこと。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含有しない（無塩基）。本開示の文脈における好適な修飾もしくはユニバーサル核酸塩基または修飾糖が本明細書に記載される。
【００６３】
修飾ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「修飾ヌクレオチド」という用語は、ホスファート基または修飾ホスファート基（本明細書で定義される）に結合しており且つ修飾核酸塩基（本明細書で定義される）、ユニバーサル核酸塩基（本明細書で定義される）、または修飾糖部分（本明細書で定義される）のうちの１つ以上を含有する糖（例えば、リボースもしくはデオキシリボースまたはそのアナログ）とＮ−グリコシル結合している複素環式窒素塩基を指す。修飾またはユニバーサル核酸塩基（本明細書では塩基アナログとも呼ばれる）は一般に、ヌクレオシド糖部分の１’位に位置し、１’位のアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル以外の核酸塩基を指す。特定の実施形態では、修飾またはユニバーサル核酸塩基は、窒素含有塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含有しない。例えば、米国公開特許出願第２００８０２７４４６２号を参照のこと。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含有しない（無塩基）。本開示の文脈における好適な修飾もしくはユニバーサル核酸塩基、修飾糖部分、または修飾ホスファート基が本明細書に記載される。
【００６４】
修飾ホスファート基：本明細書で使用される場合、「修飾ホスファート基」という用語は、天然ヌクレオチドでは発生しないホスファート基の修飾を指し、リン原子を含むホスファート模倣物を含む本明細書に記載の天然に存在しないホスファート模倣物及びホスファート（例えば、アセタート）を含まないアニオン性ホスファート模倣物を含む。修飾ホスファート基はまた、本明細書に記載の、例えば、ホスホロチオアートを含むリン含有ヌクレオチド間結合基及び非リン含有結合基の両方を含む、天然に存在しないヌクレオチド間結合基を含む。
【００６５】
修飾糖部分：本明細書で使用される場合、「修飾糖部分」は、置換糖部分（本明細書で定義される）または糖アナログ（本明細書で定義される）を指す。
【００６６】
天然核酸塩基：本明細書で使用される場合、「天然核酸塩基」という用語は、ＲＮＡ及びＤＮＡの５つの主要な天然に存在する複素環式核酸塩基、すなわち、プリン塩基：アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基：チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）を指す。
【００６７】
天然ヌクレオシド：本明細書で使用される場合、「天然ヌクレオシド」という用語は、ホスファート基に結合していない天然糖部分（本明細書で定義される）とＮ−グリコシド結合している天然核酸塩基（本明細書で定義される）を指す。
【００６８】
天然ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「天然ヌクレオチド」という用語は、ホスファート基に結合している天然糖部分（本明細書で定義される）とＮ−グリコシド結合している天然核酸塩基（本明細書で定義される）を指す。
【００６９】
天然糖部分：本明細書で使用される場合、「天然糖部分」という用語は、リボフラノシル（本明細書で定義される）またはデオキシリボフラノシル（本明細書で定義される）を指す。
【００７０】
核酸阻害剤分子：本明細書で使用される場合、「核酸阻害剤分子」という用語は、標的遺伝子の発現を低減または除去するオリゴヌクレオチド分子を指し、オリゴヌクレオチド分子は、標的遺伝子ｍＲＮＡの配列を特異的に標的とする領域を含有する。通常は、核酸阻害剤分子の標的化領域は、核酸阻害剤分子の特定の標的遺伝子への効果を誘導するために、標的遺伝子ｍＲＮＡ上の配列に十分に相補的である配列を含む。核酸阻害剤分子は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、及び／または修飾ヌクレオチドを含んでもよい。
【００７１】
核酸塩基：本明細書で使用される場合、「核酸塩基」という用語は、天然核酸塩基（本明細書で定義される）、修飾核酸塩基（本明細書で定義される）、またはユニバーサル核酸塩基（本明細書で定義される）を指す。
【００７２】
ヌクレオシド：本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」という用語は、天然ヌクレオシド（本明細書で定義される）または修飾ヌクレオシド（本明細書で定義される）を指す。
【００７３】
ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」という用語は、天然ヌクレオチド（本明細書で定義される）または修飾ヌクレオチド（本明細書で定義される）を指す。
【００７４】
オーバーハング：本明細書で使用される場合、「オーバーハング」という用語は、二本鎖核酸阻害剤分子のいずれかの鎖のいずれかの末端にある末端非塩基対合ヌクレオチド（複数可）を指す。特定の実施形態では、オーバーハングは、第１の鎖または領域が二重鎖を形成する相補鎖の末端を越えて伸長する１つの鎖または領域からもたらされる。塩基対の水素結合を介して二重鎖を形成し得る２つのオリゴヌクレオチド領域の１つまたは両方は、２つのポリヌクレオチドまたは領域により共有される相補性の５’末端及び／または３’末端を越えて伸長する３’末端及び／または５’末端を有してもよい。二重鎖の３’末端及び／または５’末端を越えて伸長する一本鎖領域は、オーバーハングと呼ばれる。
【００７５】
医薬組成物：本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、薬理学的有効量の二本鎖核酸阻害剤分子及び薬学的に許容される賦形剤（本明細書で定義される）を含む。
【００７６】
薬学的に許容される賦形剤：本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される賦形剤」という用語は、賦形剤が、合理的な利益／リスク比に見合う、過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激、及びアレルギー反応）のないヒト及び／または動物での使用に適するものであることを意味する。
【００７７】
ホスファート模倣物：本明細書で使用される場合、「ホスファート模倣物」という用語は、ホスファート基の静電特性及び立体特性を模倣するオリゴヌクレオチドの５’末端の化学部分を指す。オリゴヌクレオチドの５’末端に結合することができる多くのホスファート模倣物が開発されている（例えば、米国特許第８，９２７，５１３号、Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２０１５，４３（６）：２９９３−３０１１を参照のこと）。通常は、これらの５’−ホスファート模倣物は、ホスファターゼ耐性結合を含む。好適なホスファート模倣物としては、全体が本明細書で参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１８／０４５３１７号に記載される５’−ホスホナート、例えば、５’−メチレンホスホナート（５’−ＭＰ）及び５’−（Ｅ）ビニルホスホナート（５’−ＶＰ）、ならびにオリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドの糖部分（例えば、リボースもしくはデオキシリボースまたはそのアナログ）の４’−炭素に結合している４′−ホスファートアナログ、例えば、４’−オキシメチルホスホナート、４’−チオメチルホスホナート、または４’−アミノメチルホスホナート、が挙げられる。特定の実施形態では、４’−オキシメチルホスホナートは、式−Ｏ−ＣＨ2−ＰＯ（ＯＨ）2または−Ｏ−ＣＨ2−ＰＯ（ＯＲ）2で表され、Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ3、アルキル基、または保護基から選択される。特定の実施形態では、アルキル基は、ＣＨ2ＣＨ3である。より通常は、Ｒは独立して、Ｈ、ＣＨ3、またはＣＨ2ＣＨ3から選択される。オリゴヌクレオチドの５’末端に対する他の修飾が開発されている（例えば、ＷＯ２０１１／１３３８７１を参照のこと）。
【００７８】
保護基：本明細書で使用される場合、「保護基」という用語は、所望の反応の特定の条件下で官能基を可逆的に非反応性にする基として、従来の化学的意味で使用される。所望の反応後に、保護基は、保護された官能基を脱保護するために除去されてもよい。全ての保護基は、合成される分子の実質的な比率を低下させない条件下で除去可能でなければなりない。
【００７９】
低減させる：本明細書で使用される「低減させる（ｒｅｄｕｃｅ）」または「低減させる（ｒｅｄｕｃｅｓ）」という用語は、当該技術分野で一般に認められている意味を指す。核酸阻害剤分子に関して、用語は一般に、核酸阻害剤分子の不存在下で観察されたもの以下の、遺伝子の発現、または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子もしくは同等のＲＮＡ分子のレベル、または１つ以上のタンパク質もしくはタンパク質サブユニットの活性の低減を指す。
【００８０】
リボフラノシル：本明細書で使用される場合、「リボフラノシル」という用語は、以下に示すように、天然に存在するＲＮＡ中にみられ且つ２’−炭素にヒドロキシル基を有するフラノシルを指す。
2021520355.tif 000016
【００８１】
リボヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「リボヌクレオチド」という用語は、糖部分の２’位にヒドロキシル基を有する天然ヌクレオチド（本明細書で定義）または修飾ヌクレオチド（本明細書で定義）を指す。
【００８２】
センス鎖：二本鎖核酸阻害剤分子は、２つのオリゴヌクレオチド鎖：アンチセンス鎖及びセンス鎖を含む。センス鎖またはその領域は、二本鎖核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖またはその領域に部分的に、実質的に、または完全に相補的である。特定の実施形態では、センス鎖はまた、アンチセンス鎖に対して非相補的であるヌクレオチドを含有してもよい。非相補的ヌクレオチドは、相補的配列のいずれかの側にあっても、相補的配列の両側にあってもよい。特定の実施形態では、センス鎖またはその領域がアンチセンス鎖またはその領域に部分的または実質的に相補的である場合、非相補的ヌクレオチドは、相補性の１つ以上の領域の間に配置されてもよい（例えば、１つ以上のミスマッチ）。センス鎖は、パッセンジャー鎖とも呼ばれる。
【００８３】
対象：本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、マウス、ウサギ、及びヒトを含む任意の哺乳動物を意味する。一実施形態では、対象は、ヒトである。「個体」または「患者」という用語は、「対象」と互換性のあることを意図される。
【００８４】
置換基または置換された：本明細書で使用される「置換基」または「置換された」という用語は、所与の構造中の水素ラジカルの置換基のラジカルとの置換を指す。任意の所与の構造における複数の位置が複数の置換基で置換され得る時、置換基は、別途指示のない限り、全ての位置で同じまたは異なっていてもよい。本明細書で使用される場合、「置換された」という用語は、有機化合物と適合性のある全ての許容可能な置換基を含むと考えられる。許容される置換基は、有機化合物の非環式及び環式の分枝状及び非分枝状の炭素環式及び複素環式の芳香族及び非芳香族置換基を含む。本開示は、有機化合物の許容される置換基によるいかなる方法でも限定されることが意図されない。
【００８５】
置換糖部分：本明細書で使用される場合、「置換糖部分」は、１つ以上の修飾を含むフラノシルを含む。通常は、修飾は、糖の２’−、３’−、４’−、または５’−炭素位置で行われる。特定の実施形態では、置換糖部分は、フラノシルの２’−炭素を４−炭素と連結する架橋を含む二環式糖部分である。
【００８６】
糖アナログ：本明細書で使用される場合、「糖アナログ」という用語は、フラノシルを含まず且つヌクレオチドの天然に存在する糖部分を置換し得る構造を指し、その結果、得られるヌクレオチドは、（１）オリゴヌクレオチドへの組み込み、及び（２）相補的ヌクレオチドへのハイブリダイゼーションが可能である。そのような構造は通常は、異なる原子数を含む環（例えば、４、６、もしくは７員環）などのフラノシルへの比較的単純な変化、フラノシルの酸素の非酸素原子（例えば、炭素、硫黄、もしくは窒素）との置換、または原子数の変化及び酸素の置換の両方を含む。そのような構造はまた、置換された糖部分について記載されたものに対応する置換を含み得る。糖アナログはまた、より複雑な糖代替物（例えば、非環系のペプチド核酸）を含む。糖アナログには、モルホリノ、シクロヘキセニル、及びシクロヘキシトールを含むが、これらに限定されない。
【００８７】
糖部分：本明細書で使用される場合、「糖部分」という用語は、ヌクレオチドまたはヌクレオシドの天然糖部分または修飾糖部分を指す。
【００８８】
標的部位：本明細書で使用される場合、「標的部位」、「標的配列」、「標的核酸」、「標的領域」、「標的遺伝子」という用語は、互換的に使用され、例えば、その標的配列に対して部分的に、実質的に、もしくは完全に、または十分に相補的である、ガイド／アンチセンス領域内に配列を含有するＲＮＡｉ阻害剤分子により媒介される切断のために「標的化された」ＲＮＡまたはＤＮＡ配列を指す。
【００８９】
テトラループ：本明細書で使用される場合、「テトラループ」という用語は、隣接するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋにハイブリダイズされたヌクレオチドの安定性に寄与する安定な２次構造を形成するループ（一本鎖領域）を指す。理論に制限されることなく、テトラループは、相互作用を積み重ねることにより、隣接するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対を安定化させ得る。さらに、テトラループ内のヌクレオチド間の相互作用は、非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合、スタッキング相互作用、水素結合、及び接触相互作用を含むが、これらに限定されない（Ｃｈｅｏｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  １９９０；３４６（６２８５）：６８０−２、Ｈｅｕｓ  ａｎｄ  Ｐａｒｄｉ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９９１；２５３（５０１６）：１９１−４）。テトラループは、ランダムな塩基で構成される単純なモデルループ配列から予想されるよりも高い、隣接二重鎖の融解温度（Ｔｍ）の上昇をもたらす。例えば、テトラループは、少なくとも２塩基対長の二重鎖を含むヘアピンに、１０ｍＭのＮａＨＰＯ４中で、少なくとも５０℃、少なくとも５５℃、少なくとも５６℃、少なくとも５８℃、少なくとも６０℃、少なくとも６５℃、または少なくとも７５℃の融解温度をもたらし得る。テトラループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含有してもよい。特定の実施形態では、テトラループは、４ヌクレオチドからなる。特定の実施形態では、テトラループは、５ヌクレオチドからなる。
【００９０】
ＲＮＡテトラループの例としては、テトラループのＵＮＣＧファミリー（例えば、ＵＵＣＧ）、テトラループのＧＮＲＡファミリー（例えば、ＧＡＡＡ）、及びＣＵＵＧテトラループを含むテトラループのＣＵＹＧファミリーが挙げられる。（Ｗｏｅｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ，１９９０，８７（２１）：８４６７−７１、Ａｎｔａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１９９１，１９（２１）：５９０１−５）。ＲＮＡテトラループの他の例としては、ＧＡＮＣ、Ａ／ＵＧＮＮ、及びＵＵＵＭテトラループファミリー（Ｔｈａｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｗｉｌｅｙ  Ｉｎｔｅｒｄｉｓｃｉｐ．ＲｅｖＲＮＡ，２０１４，５（１）：１−２８）ならびにＧＧＵＧ、ＲＮＹＡ、及びＡＧＮＮテトラループファミリー（Ｂｏｔｔａｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ．，２０１７，１１３：２５７−６７）が挙げられる。ＤＮＡテトラループの例としては、テトラループのｄ（ＧＮＮＡ）ファミリー（例えば、ｄ（ＧＴＴＡ））、テトラループのｄ（ＧＮＲＡ）ファミリー、テトラループのｄ（ＧＮＡＢ）ファミリー、テトラループのｄ（ＣＮＮＧ）ファミリー、及びテトラループのｄ（ＴＮＣＧ）ファミリー（例えば、ｄ（ＴＴＣＧ））が挙げられる。（Ｎａｋａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（４８）：１４２８１−１４２９２．Ｓｈｉｎｊｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｋａｉ  Ｋｏｅｎ  Ｙｏｋｏｓｈｕ，２０００，７８（２）：７３１）。
【００９１】
Ｔm上昇ヌクレオチド：本明細書で使用される場合、「Ｔm上昇ヌクレオチド」という用語は、Ｔm上昇ヌクレオチドを含まないオリゴヌクレオチド二重鎖と比較して、オリゴヌクレオチド二重鎖の融解温度（Ｔm）を上昇させるヌクレオチドを指す。Ｔm上昇ヌクレオチドには、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、Ｇクランプ及びそのアナログ、ならびにヘキシトールヌクレオチドが挙げられるが、これらに限定されない。修飾糖部分または修飾核酸塩基を有する特定の修飾ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド二重鎖のＴmを上昇させるために使用することもできる。本明細書で使用される場合、「Ｔm上昇ヌクレオチド」という用語は、特に、糖部分の２’位が２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆで修飾されているヌクレオチドを除外する。
【００９２】
トリループ：本明細書で使用される場合、「トリループ」という用語は、隣接するＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋにハイブリダイズされたヌクレオチドの安定性に寄与し且つ３ヌクレオチドからなる安定な２次構造を形成するループ（一本鎖領域）を指す。理論に制限されることなく、トリループは、トリループ内のヌクレオチドの非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合及び塩基スタッキング相互作用により安定化され得る。（Ｙｏｓｈｉｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １９９７；３６，４７６１−４７６７）。トライループはまた、ランダムな塩基で構成される単純なモデルループ配列から予想されるよりも高い、隣接する二重鎖の融解温度（Ｔｍ）の上昇をもたらし得る。トリループは、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド、及びそれらの組み合わせを含有してもよい。トリループの例としては、トリループのＧＮＡファミリー（例えば、ＧＡＡ、ＧＴＡ、ＧＣＡ、及びＧＧＡ）が挙げられる。（Ｙｏｓｈｉｚａｗａ  １９９７）。
【００９３】
治療的有効量：本明細書で使用される場合、「治療的有効量」または「薬理学的有効量」は、意図される薬理学的、治療的、または予防的結果をもたらすのに有効な二本鎖核酸阻害剤分子の量を指す。
【００９４】
ユニバーサル核酸塩基：本明細書で使用される場合、「ユニバーサル核酸塩基」は、天然に存在する核酸に通常みられる複数の塩基と対合し得且つ二重鎖中のそのような天然に存在する塩基と置換し得る塩基を指す。塩基は、天然に存在する塩基のそれぞれと対合することが可能である必要はない。例えば、特定の塩基は、プリンとのみもしくは選択的に、またはピリミジンとのみまたは選択的に対合する。ユニバーサル核酸塩基は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋまたは非Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ相互作用（例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ相互作用）を介して水素結合を形成することにより、塩基対合し得る。代表的なユニバーサル核酸塩基としては、イノシン及びその誘導体が挙げられる。
【００９５】
詳細な説明
本出願は、ステムループ構造を有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子を提供し、ステムループ構造のステム部分は、少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドを含有する。実施例に示されるように、二環式ヌクレオチドなどのＴm上昇ヌクレオチドをステムループ構造のステム部分に組み込むと、部分的には、ｉｎ  ｖｉｖｏでの標的ｍＲＮＡノックダウンの期間の増加により証明されるように、二本鎖核酸阻害剤分子の安定性の向上がもたらされる。二環式ヌクレオチドをステムループ構造のステム部分に組み込むと、効力を低減させることなくステム部分を短くすることができるので、より短いセンス鎖の使用も可能になる。より短いセンス鎖の使用は、時間及びコストの両方を低減する製造プロセスの利点をもたらす。ステムの長さの低減は、分子量の低減に起因して、モル基準でより多くの二本鎖核酸阻害剤分子を投与することが可能であるので、投与の利点をももたらす。
【００９６】
疾患を処置するための方法及び組成物を含む、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで標的遺伝子のレベルまたは発現を低減させるために、Ｔm上昇ヌクレオチド修飾ステムループ核酸阻害剤分子及びそれを含む組成物の使用方法も提供される。
【００９７】
Ｔm上昇ヌクレオチド
本明細書に開示の核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖、ならびにセンス鎖に存在するステムループ構造のステム部分（Ｄ２）に少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドを含有する。例えば、図１０Ｄを参照のこと。Ｔm上昇ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、Ｇクランプ及びそのアナログ、ヘキシトールヌクレオチド、または修飾ヌクレオチドを含むが、これらに限定されない。
【００９８】
二環式ヌクレオチド
二環式ヌクレオチドは通常、４〜７員環の２つの原子を連結して第２の環を形成して二環式構造をもたらす架橋を含む（限定されないが、フラノシルを含む）４〜７員環を有する糖部分を有する。そのような二環式ヌクレオチドは、二環式核酸及びロックされた核酸に対して、それぞれＢＮＡ及びＬＮＡを含む様々な名称を有する。二環式ヌクレオチドの合成及びそれらの核酸化合物への組み込みはまた、例えば、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．，１９９８，４，４５５−４５６、Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８、Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．，１９９８，８，２２１９−２２２２、Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９９８，６３，１００３５−１００３９、米国特許第７，４２７，６７２号、同第７，０５３，２０７号、同第６，７９４，４９９号、同第６，７７０，７４８号、同第６，２６８，４９０号、及び同第６，７９４，４９９号、ならびに公開米国出願第２００４０２１９５６５号、同第２００４００１４９５９号、同第２００３０２０７８４１号、同第２００４０１９２９１８号、同第２００３０２２４３７７号、同第２００４０１４３１１４号、及び同第２００３００８２８０７号（これらのそれぞれは、全体が参照により本明細書に組み込まれる）を含む文献に報告されている。
【００９９】
Ｔm上昇ヌクレオチドは、二環式糖部分を含む二環式ヌクレオチドであり得る。特定の実施形態では、二環式糖部分は、４〜７員の第１の環、及び糖部分の第１の環の任意の２つの原子を連結して第２の環を形成するノース型糖立体配置を形成する架橋を含む。特定の実施形態では、架橋は、第１の環の２’−炭素及び４’−炭素を連結して、第２の環を形成する。
【０１００】
通常、架橋は、２〜８の原子を含有する。特定の実施形態では、架橋は、３つの原子を含有する。特定の実施形態では、架橋は、４つの原子を含有する。特定の実施形態では、架橋は、５つの原子を含有する。特定の実施形態では、架橋は、６つの原子を含有する。特定の実施形態では、架橋は、７つの原子を含有する。特定の実施形態では、架橋は、８つの原子を含有する。特定の実施形態では、架橋は、８つを超える原子を含有する。
【０１０１】
特定の実施形態では、二環式糖部分は、フラノシルの２’−炭素及び４’−炭素を連結して第２の環を形成する架橋を含む置換フラノシルである。特定の実施形態では、二環式ヌクレオチドは、式Ｉの構造を有する：
2021520355.tif 000017
式Ｉ
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、
Ｇは、Ｈ、ＯＨ、ＮＨ2、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ2−Ｃ6アルケニル、Ｃ2−Ｃ6アルキニル、置換Ｃ1−Ｃ6アルキル、置換Ｃ2−Ｃ6アルケニル、置換Ｃ2−Ｃ6アルキニル、アシル、置換アシル、置換アミド、チオール、または置換チオであり、
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ1であり、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ベンゼン、またはピレンであり、
Ｗa及びＷbはそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または式Ｉで表されるヌクレオチドを別のヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドに結合させるヌクレオチド間結合基であり、ＷaまたはＷbの少なくとも１つは、式Ｉで表されるヌクレオチドをオリゴヌクレオチドに結合するヌクレオチド間結合基である）。
【０１０２】
式Ｉの特定の実施形態では、Ｇは、Ｈであり、Ｘは、ＮＲ1であり、Ｒ1は、ベンゼンまたはピレンである。式Ｉの特定の実施形態では、Ｇは、Ｈであり、Ｘは、Ｓである。
【０１０３】
式Ｉの特定の実施形態では、Ｇは、Ｈであり、Ｘは、Ｏである。
2021520355.tif 000018
式Ｉａ
【０１０４】
式Ｉの特定の実施形態では、Ｇは、Ｈであり、Ｘは、ＮＲ1であり、Ｒ1は、Ｈ、ＣＨ3、またはＯＣＨ3である。
2021520355.tif 000019
式Ｉｂ
【０１０５】
式Ｉの特定の実施形態では、Ｇは、ＯＨまたはＮＨ2であり、Ｘは、Ｏである。
【０１０６】
式Ｉの特定の実施形態では、Ｇは、ＯＨであり、Ｘは、Ｏである。
2021520355.tif 000020
式Ｉｃ
【０１０７】
式Ｉの特定の実施形態では、Ｇは、ＮＨ2であり、Ｘは、Ｏである。
2021520355.tif 000021
式Ｉｄ
【０１０８】
式Ｉの特定の実施形態では、Ｇは、ＣＨ3またはＣＨ2ＯＣＨ3であり、Ｘは、Ｏである。式Ｉの特定の実施形態では、Ｇは、ＣＨ3であり、Ｘは、Ｏである。
2021520355.tif 000022
式Ｉｅ
【０１０９】
式Ｉの特定の実施形態では、Ｇは、ＣＨ2ＯＣＨ3であり、Ｘは、Ｏである。
2021520355.tif 000023
式Ｉｆ
【０１１０】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオチドは、式ＩＩの構造を有する。
2021520355.tif 000024
式ＩＩ
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、
Ｑ1は、ＣＨ2またはＯであり、
Ｘは、ＣＨ2、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ1であり、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ベンゼン、またはピレンであり、
Ｑ1がＯの場合、Ｘは、ＣＨ2であり、
Ｑ1がＣＨ2である場合、Ｘは、ＣＨ2、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ1であり、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ベンゼン、またはピレンであり、
Ｗa及びＷbはそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または別のヌクレオチドにもしくはオリゴヌクレオチドに、式ＩＩで表されるヌクレオチドを結合するヌクレオチド間結合基であり、ＷaまたはＷbのうちの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドに、式ＩＩで表されるヌクレオチドを結合するヌクレオチド間結合基である）。
【０１１１】
式ＩＩの特定の実施形態では、Ｑ1は、Ｏであり、Ｘは、ＣＨ2である。
2021520355.tif 000025
式ＩＩａ
【０１１２】
式ＩＩの特定の実施形態では、Ｑ1は、ＣＨ2であり、Ｘは、Ｏである。
2021520355.tif 000026
式ＩＩｂ
【０１１３】
式ＩＩの特定の実施形態では、Ｑ1は、ＣＨ2であり、Ｘは、ＮＲ1であり、Ｒ1は、Ｈ、ＣＨ3、またはＯＣＨ3である。
2021520355.tif 000027
式ＩＩｃ
【０１１４】
式ＩＩの特定の実施形態では、Ｑ1は、ＣＨ2であり、Ｘは、ＮＨである。
2021520355.tif 000028
式ＩＩｄ
【０１１５】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオチドは、式ＩＩＩの構造を有する：
2021520355.tif 000029
式ＩＩＩ
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、
Ｑ2は、ＯまたはＮＲ1であり、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ベンゼン、またはピレンであり、
Ｘは、ＣＨ2、Ｏ、Ｓ、またはＮＲ1であり、Ｒ1は、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、Ｃ1−Ｃ6アルコキシ、ベンゼン、またはピレンであり、
Ｑ2がＯである場合、Ｘは、ＮＲ1であり、
Ｑ2がＮＲ1である場合、Ｘは、ＯまたはＳであり、
Ｗa及びＷbはそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または別のヌクレオチドにもしくはオリゴヌクレオチドに、式ＩＩＩで表されるヌクレオチドを結合するヌクレオチド間結合基であり、ＷaまたはＷbのうちの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドに、式ＩＩＩで表されるヌクレオチドを結合するヌクレオチド間結合基である）。
【０１１６】
式ＩＩＩの特定の実施形態では、Ｑ2は、Ｏであり、Ｘは、ＮＲ1である。式ＩＩＩの特定の実施形態では、Ｑ2は、Ｏであり、Ｘは、ＮＲ1であり、Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ6アルキルである。式ＩＩＩの特定の実施形態では、Ｑ2は、Ｏであり、Ｘは、ＮＲ1であり、Ｒ1は、ＨまたはＣＨ3である。
【０１１７】
式ＩＩＩの特定の実施形態では、Ｑ2は、Ｏであり、Ｘは、ＮＲ1であり、Ｒ1は、ＣＨ3である。
2021520355.tif 000030
式ＩＩＩａ
【０１１８】
式ＩＩＩの特定の実施形態では、Ｑ2は、ＮＲ1であり、Ｘは、Ｏである。式ＩＩＩの特定の実施形態では、Ｑ2は、ＮＲ1であり、Ｒ1は、Ｃ1−Ｃ6アルキルであり、Ｘは、Ｏである。
【０１１９】
式ＩＩＩの特定の実施形態では、Ｑ2は、ＮＣＨ3であり、Ｘは、Ｏである。
2021520355.tif 000031
式ＩＩＩｂ
【０１２０】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオチドは、式ＩＶの構造を有する：
2021520355.tif 000032
式ＩＶ
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、
Ｐ1及びＰ3は、ＣＨ2であり、Ｐ2は、ＣＨ2またはＯであり、Ｐ4は、Ｏであり、
Ｗa及びＷbはそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または別のヌクレオチドにもしくはオリゴヌクレオチドに、式ＩＶで表されるヌクレオチドを結合するヌクレオチド間結合基であり、ＷaまたはＷbのうちの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドに、式ＩＶで表されるヌクレオチドを結合するヌクレオチド間結合基である）。
【０１２１】
式ＩＶの特定の実施形態では、Ｐ1、Ｐ2、及びＰ3は、ＣＨ2であり、Ｐ4は、Ｏである。
2021520355.tif 000033
式ＩＶａ
【０１２２】
式ＩＶの特定の実施形態では、Ｐ1及びＰ3は、ＣＨ2であり、Ｐ2は、Ｏであり、Ｐ4は、Ｏである。
2021520355.tif 000034
式ＩＶｂ
【０１２３】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオチドは、式ＶａまたはＶｂの構造を有する：
2021520355.tif 000035
（式中、Ｂは、核酸塩基であり、
ｒ１、ｒ２、ｒ３、及びｒ４はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ12アルキル、置換Ｃ1−Ｃ12アルキル、Ｃ2−Ｃ12アルケニル、置換Ｃ2−Ｃ12アルケニル、Ｃ2−Ｃ12アルキニル、置換Ｃ2−Ｃ12アルキニル、Ｃ1−Ｃ12アルコキシ、置換Ｃ1−Ｃ12アルコキシ、ＯＴ1、ＳＴ1、ＳＯＴ1、ＳＯ2Ｔ1、ＮＴ1Ｔ2、Ｎ３、ＣＮ、Ｃ（＝Ｏ）ＯＴ1、Ｃ（＝Ｏ）ＮＴ1Ｔ2、Ｃ（＝Ｏ）Ｔ1、Ｏ─Ｃ（＝Ｏ）ＮＴ1Ｔ２、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝ＮＨ）ＮＴ1Ｔ2、Ｎ（Ｈ）Ｃ（＝Ｏ）ＮＴ1Ｔ2、もしくはＮ（Ｈ）Ｃ（＝Ｓ）ＮＴ1Ｔ2であり、Ｔ１及びＴ２はそれぞれ独立して、Ｈ、Ｃ1−Ｃ6アルキル、もしくは置換Ｃ1−Ｃ16アルキルであるか、または
ｒ１及びｒ２もしくはｒ３及びｒ４は共に、＝Ｃ（ｒ５）（ｒ６）であり、ｒ５及びｒ６はそれぞれ独立して、Ｈ、ハロゲン、Ｃ1−Ｃ12アルキル、もしくは置換Ｃ1−Ｃ12アルキルであり、
Ｗa及びＷbはそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または別のヌクレオチドにもしくはオリゴヌクレオチドに、式Ｖで表されるヌクレオチドを結合するヌクレオチド間結合基であり、ＷaまたはＷbのうちの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドに、式Ｖで表されるヌクレオチドを結合するヌクレオチド間結合基である）。
【０１２４】
特定の実施形態では、二環式糖部分は、フラノシルの２’−炭素及び４’−炭素を連結して第２の環を形成する架橋を含む置換フラノシルであり、フラノシルの２’−炭素及び４’−炭素を連結する架橋は、以下を含むが、これに限定されない：
ａ）４’−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（Ｒ）−２’及び４’−ＣＨ2−Ｎ（Ｒ）−Ｏ−２’（式中、Ｒは、Ｈ、Ｃ1−Ｃ12アルキル、または例えば、４’−ＣＨ2−ＮＨ−Ｏ−２’（ＢＮＡNCとしても知られる）、４’−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−２’（ＢＮＡNC［ＮＭｅ］としても知られる）を含む保護基である）（全体が本明細書で参照により組み込まれる米国特許第７，４２７，６７２号に記載の）、
ｂ）４’−ＣＨ2−２’、４’−（ＣＨ2）2−２’、４’−（ＣＨ2）3−２’、４’−（ＣＨ2）−Ｏ−２’（ＬＮＡとしても知られる）、４’−（ＣＨ2）−Ｓ−２’、４’−（ＣＨ2）2−Ｏ−２’（ＥＮＡとしても知られる）、４’−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−２’（ｃＥｔとしても知られる）、及び４’−ＣＨ（ＣＨ2ＯＣＨ3）−Ｏ−２’（ｃＭＯＥとしても知られる）、ならびにそれらのアナログ（全体が本明細書で参照により組み込まれる米国特許第７，３９９，８４５号に記載の）、
ｃ）４’−Ｃ（ＣＨ3）（ＣＨ3）−Ｏ−２’及びそのアナログ（全体が本明細書で参照により組み込まれる米国特許第８，２７８，２８３号に記載の）、
ｄ）４’−ＣＨ2−Ｎ（ＯＣＨ3）−２’及びそのアナログ（全体が本明細書で参照により組み込まれる米国特許第８，２７８，４２５号に記載の）、
ｅ）４’−ＣＨ2−Ｏ−Ｎ（ＣＨ3）−２’及びそのアナログ（全体が本明細書で参照により組み込まれる米国特許公開第２００４／０１７１５７０号に記載の）、
ｆ）４’−ＣＨ2−Ｃ（Ｈ）（ＣＨ3）−２’及びそのアナログ（全体が本明細書で参照により組み込まれるＣｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，２００９，７４，１１８−３４に記載の）、ならびに
ｇ）４’−ＣＨ2−Ｃ（＝ＣＨ2）−２’及びそのアナログ（全体が本明細書で参照により組み込まれる米国特許第８，２７８，４２６号に記載の）。
【０１２５】
特定の実施形態では、二環式ヌクレオチド（ＢＮ）は、以下のうちの１つ以上である：以下に示されるような（ａ）メチレンオキシＢＮ、（ｂ）エチレンオキシＢＮ、（ｃ）アミノオキシＢＮ、（ｄ）オキシアミノＢＮ、（ｅ）メチル（メチレンオキシ）ＢＮ（制約付きエチルまたはｃＥＴとも呼ばれる）、（ｆ）メチレン−チオＢＮ、（ｇ）メチレンアミノＢＮ、（ｈ）メチル炭素環ＢＮ、及び（ｉ）プロピレン炭素環ＢＮ。
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【０１２６】
上記（ａ）〜（ｉ）の二環式ヌクレオチドでは、Ｂは、核酸塩基であり、Ｒ2は、ＨまたはＣＨ3であり、Ｗa及びＷbはそれぞれ独立して、Ｈ、ＯＨ、ヒドロキシル保護基、リン部分、または別のヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチドに二環式ヌクレオチドを結合させるヌクレオチド間結合基であり、ＷaまたはＷbの少なくとも１つは、オリゴヌクレオチドに二環式ヌクレオチドを結合させるヌクレオチド間結合基である。
【０１２７】
オキシアミノＢＮ（ｄ）の一実施形態では、Ｒ2は、以下のようなＣＨ3である（ＢＮＡNC［ＮＭｅ］としても知られる）。
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【０１２８】
特定の実施形態では、二環式糖部分及びそのような二環式糖部分を組み込む二環式ヌクレオチドはさらに、異性体配置により定義される。特定の実施形態では、二環式糖部分またはヌクレオチドは、α−Ｌ立体配置である。特定の実施形態では、二環式糖部分またはヌクレオチドは、β−Ｄ立体配置である。例えば、特定の実施形態では、二環式糖部分またはヌクレオチドは、α−Ｌ立体配置（α−Ｌ  ＬＮＡ）の２’Ｏ，４’−Ｃ−メチレン架橋（２’−Ｏ−ＣＨ2−４’）を含む。特定の実施形態では、二環式糖部分またはヌクレオチドは、Ｒ立体配置のものである。特定の実施形態では、二環式糖部分またはヌクレオチドは、Ｓ立体配置のものである。例えば、特定の実施形態では、二環式糖部分またはヌクレオチドは、Ｓ立体配置の４’−ＣＨ（ＣＨ3）−Ｏ−２’架橋（すなわち、ｃＥｔ）を含む。
【０１２９】
三環式ヌクレオチド
特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、三環式ヌクレオチドであり得る。三環式ヌクレオチドの合成及び核酸化合物への組み込みはまた、例えば、Ｓｔｅｆｆｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１９９７；１１９：１１５４８−１１５４９、Ｓｔｅｆｆｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．１９９９；１２１（１４）：３２４９−３２５５、Ｒｅｎｎｅｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００２；１２４：５９９３−６００２、Ｉｔｔｉｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２００４；３２（１）：３４６−３５３、Ｓｃｈｅｉｄｅｇｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２００６；１２：８０１４−８０２３、Ｉｖａｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  ２００７；１７：５４−６５（これらのそれぞれは、全体が本明細書で参照により組み込まれる）を含む文献で報告されている。
【０１３０】
特定の実施形態では、三環式ヌクレオチドは、例えば、Ｌｅｕｍａｎｎ  ＣＪ，Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．２００２；１０：８４１−８５４ならびに公開された米国出願第２０１５／０２５９６８１号及び同第２０１８／０１６２８９７号（これらはそれぞれ、本明細書で参照により組み込まれる）で考察されるように、３’−炭素及び５’−炭素中心が、シクロプロパン環に融合しているエチレンで連結されるトリシクロヌクレオチド（トリシクロＤＮＡとも呼ばれる）である。特定の実施形態では、三環式ヌクレオチドは、フラノシルの２’−炭素及び４’−炭素を連結して、第２の環を形成する架橋を含む置換フラノシル環を含み、第３の融合環は、例えば、本明細書で参照により組み込まれる公開された米国出願第２０１５／０１１２０５５号で考察されるように、フラノシルの２’−炭素及び４’−炭素を連結する架橋のメチレン基に５’−炭素を連結する基から生じる。
【０１３１】
他のＴm上昇ヌクレオチド
二環式及び三環式ヌクレオチドに加えて、他のＴm上昇ヌクレオチドを、本明細書に記載の核酸阻害剤分子に使用することができる。例えば、特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、Ｇクランプ、グアニジンＧクランプ、もしくはそれらのアナログ（Ｗｉｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ，２００２；１１４：１２３及びＷｉｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｉｍ  Ａｃｔａ  ２００３；１１４：１２３）、ヘキシトールヌクレオチド（Ｈｅｒｄｅｗｉｊｎ，Ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ２０１０；７：１−５９）、または修飾ヌクレオチドである。修飾ヌクレオチドは、例えば、５−ブロモ−ウラシル、５−ヨード−ウラシル、５−プロピニル修飾ピリミジン、もしくは２−アミノアデニン（２，６−ジアミノプリンとも呼ばれる）（Ｄｅｌｅａｖｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．＆  Ｂｉｏｌ．２０１２；１９：９３７−５４）、または２−チオウリジン、５Ｍｅ−チオウリジン、及びプソイドウリジンを含む、本明細書に記載の修飾核酸塩基を有し得る。修飾ヌクレオチドは、Ｔm上昇ヌクレオチドの糖部分の２’−炭素が２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅで修飾されていないことを除いて、例えば、本明細書で参照により組み込まれる米国特許第８，９７５，３８９号に記載されるか、または本明細書に記載される修飾糖部分も有し得る。
【０１３２】
特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、三環式ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、Ｇクランプ、グアニジンＧクランプ、またはそれらのアナログである。特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、ヘキシトールヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、二環式または三環式ヌクレオチドである。特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、もしくはＧクランプ、グアニジンＧクランプ、またはそれらのアナログである。特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド、三環式ヌクレオチド、Ｇクランプ、グアニジンＧクランプ、もしくはそれらのアナログ、またはヘキシトールヌクレオチドである。
【０１３３】
特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、組み込み毎に、核酸阻害剤分子の第２の二重鎖（Ｄ２）のＴmを少なくとも２℃上昇させる。特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、組み込み毎に、Ｄ２のＴmを少なくとも３℃上昇させる。特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、組み込み毎に、Ｄ２のＴmを少なくとも４℃上昇させる。特定の実施形態では、Ｔm上昇ヌクレオチドは、組み込み毎に、Ｄ２のＴmを少なくとも５℃上昇させる。
【０１３４】
Ｔm上昇ヌクレオチド修飾核酸阻害剤分子
本出願は、ステムループ構造を有するセンス鎖及びアンチセンス鎖を有する二本鎖核酸阻害剤分子について開示し、ステムループ構造のステム部分は、少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドを含有し、センス鎖及びアンチセンス鎖は、それぞれ５’及び３’末端を有する別々の鎖であり、従って、連続するオリゴヌクレオチドを形成しない。代表的なステム／ループ含有二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖（「Ｓ」）及びアンチセンス鎖（「ＡＳ」）が強調された図１０Ａに示される。
【０１３５】
センス鎖はさらに、図１０Ｂ及び１０Ｃに示されるような、アンチセンス鎖（ＡＳ）と共に第１の二重鎖（Ｄ１）を形成する第１の領域（Ｒ１）、及び第２のサブ領域（Ｓ２）に第１のサブ領域（Ｓ１）を連結するループ（Ｌ）を含む第２の領域（Ｒ２）に分けることができる。Ｓ１及びＳ２は、ステムまたはステム二重鎖とも呼ばれる第２の二重鎖（Ｄ２）を形成するのに、互いに十分に相補的である。例えば、図１０Ｃ及び１０Ｄを参照のこと。特定の実施形態では、ループは、テトラループである。第２の二重鎖（Ｄ２）は、１つ以上のＴm上昇ヌクレオチドを含有する。通常は、Ｔm上昇ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチドである。しかし、本明細書に記載の全ての二本鎖核酸阻害剤分子では、本明細書に定義されるようないかなるＴm上昇ヌクレオチドも、二環式ヌクレオチドと置換することができる。通常は、二本鎖核酸阻害剤分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）の外側にいかなるＴm上昇ヌクレオチド（例えば、二環式ヌクレオチド）も含有しない。特定の実施形態では、二本鎖核酸分子は、ｄｓＲＮＡｉ阻害剤分子である。
【０１３６】
二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、センス鎖は、少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチド（例えば、二環式ヌクレオチド）を含有するステム二重鎖（Ｄ２）及びループ（Ｌ）を含有し、２０〜６６または２１〜６６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ステム二重鎖は、１〜６塩基対長である。特定の実施形態では、ステム二重鎖は、３〜６塩基対長である。特定の実施形態では、ステム二重鎖は、１〜３塩基対長である。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、１５〜４０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ループは、３〜２０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ループは、３〜８ヌクレオチド長である。通常、ループは、テトラループである。しかし、本明細書に記載の全ての二本鎖核酸阻害剤の実施形態では、テトラループは、ヌクレオチド配列ＧＡＡを有するトリループなどのトリループと置換することができる。
【０１３７】
特定の実施形態では、センス鎖は、ステム二重鎖（Ｄ２）及びテトラループ（Ｌ）を含有し、２０〜６６ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、１５〜４０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２４〜５４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２４〜４４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２４〜３８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ステム二重鎖（Ｄ２）及びテトラループ（Ｌ）を含有するセンス鎖の伸長部分は、鎖の３’末端にある。特定の他の実施形態では、ステム（Ｄ２）及びテトラループ（Ｌ）を含有するセンス鎖の伸長部分は、鎖の５’末端にある。
【０１３８】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖は、別々の鎖であり、１８〜２４塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、第２の二重鎖（Ｄ２）及びテトラループ（Ｌ）を含み、２４〜３６ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０〜２４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２８〜３６、２８〜３５、または２８〜３４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２４〜３５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２４〜３４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２６〜３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、３０〜３２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、３０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、３２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、３４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）は、１〜５塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、２塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、３塩基対長を有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、３’末端に１、２、３、または４ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。通常は、アンチセンス鎖の３’末端での一本鎖オーバーハングは、２ヌクレオチドからなる。
【０１３９】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖は、別々の鎖であり、１９〜２１塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、第２の二重鎖（Ｄ２）及びテトラループ（Ｌ）を含み、２４〜３４ヌクレオチド長であり、アンチセンス鎖は、２０〜２３ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２８〜３４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、センス鎖は、２４〜３０ヌクレオチド長であり、第２の二重鎖（Ｄ２）は、１〜３塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、２塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、３塩基対長を有する。特定の実施形態では、センス鎖は、３０〜３２ヌクレオチド長であり、Ｄ２は、３〜５塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、３塩基対長を有する。
【０１４０】
特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、３’末端に１〜６ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、３’末端に１、２、３、または４ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。通常は、アンチセンス鎖の３’末端での一本鎖オーバーハングは、２ヌクレオチドからなる。
【０１４１】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖は、別々の鎖であり、１９〜２１塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、１９〜２１ヌクレオチドの第１の領域（Ｒ１）、及び第２サブ領域（Ｓ２）に第１のサブ領域（Ｓ１）を連結するテトラループ（Ｌ）を含む６〜１６ヌクレオチドの第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、１〜６ヌクレオチド長であり、第２の二重鎖（Ｄ２）を形成するように互いに十分に相補的であり、アンチセンス鎖は、２０〜２４ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、アンチセンス鎖は、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態では、Ｒ２は、１０〜１６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、Ｒ２は、６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、Ｒ２は、８ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、Ｒ２は、１０ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、１〜５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、１〜３ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、３〜５ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、１ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、２ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、３ヌクレオチド長である。
【０１４２】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖は、別々の鎖であり、２０塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、２０ヌクレオチドの第１の領域（Ｒ１）、及び第２のサブ領域（Ｓ２）に第１のサブ領域（Ｓ１）を連結するテトラループ（Ｌ）を含む１０ヌクレオチドの第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、３ヌクレオチド長であり、３塩基対の第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチド長であり、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）の各ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチドであり、二本鎖核酸阻害剤分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）の外側にいかなる二環式ヌクレオチドも含有しない。特定の実施形態では、Ｄ２は、２塩基対を形成する４つの二環式ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１塩基対を形成する２つの二環式ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、３つの不対合二環式ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、２つの不対合二環式ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１つの二環式ヌクレオチドを含有する。他の箇所に記載されるように、これらの実施形態のそれぞれでは、二環式ヌクレオチドは、異なるＴm上昇ヌクレオチドで置換することができる。
【０１４３】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖は、別々の鎖であり、２０塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、２０ヌクレオチドの第１の領域（Ｒ１）、及び第２のサブ領域（Ｓ２）に第１のサブ領域（Ｓ１）を連結するテトラループ（Ｌ）を含む１０ヌクレオチドの第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、２ヌクレオチド長であり、２塩基対の第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチド長であり、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）の各ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチドであり、二本鎖核酸阻害剤分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）の外側にいかなる二環式ヌクレオチドも含有しない。特定の実施形態では、Ｄ２は、１塩基対を形成する２つの二環式ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、２つの不対合二環式ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１つの二環式ヌクレオチドを含有する。他の箇所に記載されるように、これらの実施形態のそれぞれでは、二環式ヌクレオチドは、異なるＴm上昇ヌクレオチドで置換することができる。
【０１４４】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖及びアンチセンス鎖を含み、センス鎖及びアンチセンス鎖は、別々の鎖であり、２０塩基対の第１の二重鎖（Ｄ１）を形成し、センス鎖は、２０ヌクレオチドの第１の領域（Ｒ１）、及び第２のサブ領域（Ｓ２）に第１のサブ領域（Ｓ１）を連結するテトラループ（Ｌ）を含む１０ヌクレオチドの第２の領域（Ｒ２）を有し、Ｓ１及びＳ２のそれぞれは、１ヌクレオチド長であり、１塩基対の第２の二重鎖（Ｄ２）を形成し、アンチセンス鎖は、２２ヌクレオチド長であり、３’末端に２ヌクレオチドの一本鎖オーバーハングを有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）の各ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチド（または二環式ヌクレオチド以外のＴm上昇ヌクレオチド）であり、二本鎖核酸阻害剤分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）の外側に、いかなる二環式ヌクレオチド（または二環式ヌクレオチド以外のＴm上昇ヌクレオチド）も含有しない。特定の実施形態では、テトラループは、以下の配列：ＵＮＣＧ（例えば、ＵＵＣＧ、ＵＣＣＧ、ＵＡＣＧ、もしくはＵＧＣＧ）、ＧＮＲＡ（例えば、ＧＡＡＡ、ＧＧＡＡ、ＧＡＧＡ、ＧＣＡＡ、もしくはＧＵＡＡ）、ＣＵＹＧ（例えば、ＣＵＵＧ）、ＧＡＮＣ、Ａ／ＵＧＮＮ（例えば、ＵＧＡＡ）、及びＵＵＵＭ、ＧＧＵＧ、ＲＮＹＡ（例えば、ＡＡＣＡ）、及びＡＧＮＮ（例えば、ＡＧＵＡ、ＡＧＡＡ、もしくはＡＧＧＧ）、ＧＧＡＧ、ＵＵＵＧ、ＣＡＡＣ、ＣＵＵＧＵ、ＧＡＣＡＡ、またはＧＡＡＧＡのうちの１つを有し、Ｎは、任意の核酸塩基であり、Ｒは、プリンであり、Ｙは、ピリミジンであり、Ｍは、ＡまたはＣである。特定の実施形態では、テトラループは、ＵＮＣＧ、ＧＮＲＡ、またはＣＵＵＧから選択されるＲＮＡテトラループである。特定の実施形態では、テトラループは、配列ＧＮＲＡを有する。特定の実施形態では、テトラループは、配列ＧＡＡＡを有する。特定の実施形態では、テトラループは、ｄ（ＧＮＡＢ）、ｄ（ＣＮＮＧ）、またはｄ（ＴＮＣＧ）から選択されるＤＮＡテトラループである。
【０１４５】
本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）は、１〜５塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１〜３塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１〜２塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、３〜４塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、３〜５塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、２塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、３塩基対長を有する。
【０１４６】
本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）は、２〜１２の二環式ヌクレオチドを含有し、３〜６塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１〜６つまたは２〜６つの二環式ヌクレオチドを含有し、１〜３塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１〜１０または２〜１０の二環式ヌクレオチドを含有し、３〜５塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１〜８つまたは２〜８つの二環式ヌクレオチドを含有し、３〜４塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、６つの二環式ヌクレオチドを含有し、３塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、４つの二環式ヌクレオチドを含有し、２塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、２つの二環式ヌクレオチドを含有し、１塩基対長を有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、３つの不対合二環式ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、２つの不対合二環式ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、Ｄ２は、１つの不対合二環式ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、Ｄ２の各ヌクレオチドは、二環式ヌクレオチドである。他の箇所に記載されるように、これらの実施形態のそれぞれでは、二環式ヌクレオチドは、異なるＴm上昇ヌクレオチドで置換することができる。
【０１４７】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）またはアンチセンス鎖にいかなる二環式ヌクレオチドも含有しない。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）の外側にいかなる二環式ヌクレオチドも含有しない。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、センス鎖の第１の領域（Ｒ１）またはアンチセンス鎖にいかなるＴm上昇ヌクレオチドも含有しない。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）の外側にいかなるＴm上昇ヌクレオチドも含有しない。
【０１４８】
二本鎖核酸分子の第２の二重鎖（Ｄ２）の１つ以上の二環式ヌクレオチドは、本明細書に記載のまたは別途当該技術分野で利用可能な二環式ヌクレオチドのうちのいずれかであり得る。特定の実施形態では、二本鎖核酸分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）に少なくとも２つの二環式ヌクレオチドを含有し、第２の二重鎖の各二環式ヌクレオチドは、同じである。特定の実施形態では、二本鎖核酸分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）に少なくとも２つの異なる二環式ヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、二本鎖核酸分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）に二環式ヌクレオチド以外の少なくとも２つのＴm上昇ヌクレオチドを含有し、第２の二重鎖のＴm上昇ヌクレオチドのそれぞれは、同じである。特定の実施形態では、二本鎖核酸分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）に少なくとも２つの異なるＴm上昇ヌクレオチド（二環式ヌクレオチド以外）を含有する。
【０１４９】
本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、二環式糖部分を含み、二環式糖部分は、フラノシルの２’−炭素及び４’−炭素を連結する架橋を含む置換フラノシルである。
【０１５０】
本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、ＩＶ、Ｖａ、またはＶｂの構造を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式Ｉの構造を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式ＩＩの構造を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式ＩＩＩの構造を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式ＩＶの構造を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式Ｖａの構造を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式Ｖｂの構造を有する。
【０１５１】
特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式Ｉａ、Ｉｂ、Ｉｃ、Ｉｄ、Ｉｅ、またはＩｆのうちの１つ以上の構造を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式ＩＩａ、ＩＩｂ、ＩＩｃ、またはＩＩｄのうちの１つ以上の構造を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式ＩＩＩａ及び／またはＩＩＩｂの構造を有する。特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチドは、式ＩＶａ及び／またはＩＶｂの構造を有する。
【０１５２】
特定の実施形態では、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つの二環式ヌクレオチド（ＢＮ）は、以下のうちの１つ以上である：（ａ）メチレンオキシＢＮ、（ｂ）エチレンオキシＢＮ、（ｃ）アミノオキシＢＮ、（ｄ）オキシアミノＢＮ、（ｅ）メチル（メチレンオキシ）ＢＮ（制約付きエチルまたはｃＥＴとも呼ばれる）、（ｆ）メチレン−チオＢＮ、（ｇ）メチレンアミノＢＮ、（ｈ）メチル炭素環ＢＮ、及び（ｉ）プロピレン炭素環ＢＮ。一実施形態では、少なくとも１つのＢＮは、（ａ）メチレンオキシＢＮ、または（ｄ）オキシアミノＢＮであり、Ｒ2は、ＣＨ3である。一実施形態では、少なくとも１つのＢＮは、オキシアミノＢＮ（ｄ）であり、Ｒ2は、ＣＨ3である。
【０１５３】
他の修飾
本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子は、第２の二重鎖（Ｄ２）中の少なくとも１つのＴm上昇ヌクレオチドに加えて、他のヌクレオチド修飾を含有し得る。通常は、二本鎖核酸阻害剤分子の複数のヌクレオチドは、ヌクレアーゼに対する耐性または免疫原性の低下などの分子の様々な特徴を改善するように修飾される。例えば、Ｂｒａｍｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９），Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，３７，２８６７−２８８１を参照のこと。多数のヌクレオチド修飾が、特に、核酸阻害剤分子のための、オリゴヌクレオチド分野で使用されている。そのような修飾は、糖部分、ホスホジエステル結合、及び核酸塩基を含む、ヌクレオチドの任意の部分で行うことができる。ヌクレオチド修飾の代表例としては、２’−Ｆ、２’−Ｏ−メチル（「２’−ＯＭｅ」または「２’−ＯＣＨ３」）及び２’−Ｏ−メトキシエチル（「２’−ＭＯＥ」または「２’−ＯＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３」）が挙げられるが、これらに限定されない。修飾はまた、本明細書に記載されるように、ヌクレオチドの糖部分の他の部分、例えば、５’−炭素で行うことができる。
【０１５４】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子はまた、当該技術分野で既知で、本明細書に記載されるように、１’−位にアデニン、グアニン、シトシン、チミン、及びウラシル以外の１つ以上の修飾核酸塩基を含み得る。特定の実施形態では、修飾またはユニバーサル核酸塩基は、窒素含有塩基である。特定の実施形態では、修飾核酸塩基は、窒素原子を含有しない。例えば、米国公開特許出願第２００８０２７４４６２号を参照のこと。特定の実施形態では、修飾ヌクレオチドは、核酸塩基を含有しない（無塩基）。修飾核酸塩基の代表例は、５’−メチルシトシンである。
【０１５５】
ＲＮＡ及びＤＮＡの天然に存在するヌクレオチド間結合は、３’から５’へのホスホジエステル結合である。修飾ホスホジエステル結合は、当該技術分野で既知で、本明細書に記載の、リン原子を含有するヌクレオチド間結合及びリン原子を含有しないヌクレオチド間結合を含む、天然に存在しないヌクレオチド間結合基を含む。通常は、二本鎖核酸阻害剤分子は、本明細書に記載の１つ以上のリン含有ヌクレオチド間結合基を含有する。他の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子のヌクレオチド間結合基のうちの１つ以上は、本明細書に記載の非リン含有結合である。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、１つ以上のリン含有ヌクレオチド間結合基及び１つ以上の非リン含有ヌクレオチド間結合基を含有する。
【０１５６】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、少なくとも１つのホスホロチオアートヌクレオチド間結合基を含有する。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、１０未満、例えば、５未満のホスホロチオアートヌクレオチド間結合基を含有する。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、４つのホスホロチオアートヌクレオチド間結合基を含有する。
【０１５７】
二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端は、ヒドロキシルまたはホスファート基などの天然置換基を含み得る。特定の実施形態では、ヒドロキシル基は、二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端に結合している。特定の実施形態では、ホスファート基は、二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端に結合している。通常は、ホスファートは、オリゴヌクレオチド合成前に、モノマーに添加される。他の実施形態では、５’−ホスファート化は、例えば、細胞質ゾルＣｌｐ１キナーゼにより、核酸阻害剤分子が細胞質ゾルに導入された後に自然に達成される。一部の実施形態では、５’末端ホスファートは、ホスファート基、例えば、５’−モノホスファート［（ＨＯ）2（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５’］、５’−ジホスファート［（ＨＯ）2（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５’］、または５’−トリホスファート［（ＨＯ）2（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−０−５′］である。
【０１５８】
二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端も修飾することができる。例えば、一部の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端は、ホスホルアミダート［（ΗΟ）2（Ｏ）Ρ−ΝΗ−５’、（ΗΟ）（ΝΗ2）（Ｏ）Ρ−Ｏ−５′］に結合している。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端は、ホスファート模倣物に結合している。好適なホスファート模倣物としては、５’−メチレンホスホナート（５’−ＭＰ）、５’−（Ｅ）−ビニルホスホナート（５’−ＶＰ）などの５’−ホスホナートが挙げられる。Ｌｉｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２０１２，１５０−８８３−９４、ＷＯ２０１４／１３０６０７。他の好適なホスファート模倣物としては、全体が本明細書で参照により組み込まれる国際公開特許第ＷＯ２０１８／０４５３１７号に記載のオリゴヌクレオチドの５’末端のヌクレオチドの糖部分（例えば、リボースもしくはデオキシリボースまたはそのアナログ）の４’−炭素に結合している４−ホスファートアナログが挙げられる。例えば、一部の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖及び／またはアンチセンス鎖の５’末端は、オキシメチルホスホナートに結合しており、オキシメチル基の酸素原子は、糖部分またはそのアナログの４’−炭素に結合している。他の実施形態では、ホスファートアナログは、チオメチルホスホナートまたはアミノメチルホスホナートであり、チオメチル基の硫黄原子またはアミノメチル基の窒素原子は、糖部分またはそのアナログの４’−炭素に結合している。
【０１５９】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。通常は、二本鎖核酸阻害剤分子は、５未満のデオキシリボヌクレオチドを含有する。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、１つ以上のリボヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子のヌクレオチドは全て、リボヌクレオチドである。
【０１６０】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子のステム（第２の二重鎖またはＤ２）の外側の１つ以上のヌクレオチドは、限定されないが、本明細書に記載の二環式または三環式ヌクレオチドに存在する修飾環構造を含む修飾環構造を有する糖部分、及びロックされていない核酸（「ＵＮＡ」）を含有する（例えば、Ｓｎｅａｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３），Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２，ｅ１０３（ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１３．３６）を参照のこと）。
【０１６１】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子の１つまたは２ヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾されている。通常は、グルタチオン感受性部分は、糖部分の２’−炭素に位置し、スルホニル基を含む。特定の実施形態では、グルタチオン感受性部分は、例えば、全体が本明細書で参照により組み込まれる国際公開第ＷＯ２０１８／０４５３１７号に記載されているように、ホスホラミダイトオリゴヌクレオチド合成法と適合性がある。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子の３つ以上のヌクレオチドは、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾されている。特定の実施形態では、ヌクレオチドのほとんどは、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾されている。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子の全てまたは実質的に全てのヌクレオチドが、グルタチオン感受性部分で可逆的に修飾されている。
【０１６２】
少なくとも１つのグルタチオン感受性部分は通常、二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖またはアンチセンス鎖の５’末端または３’末端ヌクレオチドに位置する。しかし、少なくとも１つのグルタチオン感受性部分は、二本鎖核酸阻害剤分子中の目的の任意のヌクレオチドに位置してもよい。
【０１６３】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、完全に修飾されており、センス鎖及びアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドが修飾され、通常は、全てのヌクレオチドは、糖部分の２’位が修飾されている。特定の実施形態では、完全修飾核酸阻害剤分子は、可逆的修飾を含有しない。一部の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子のセンス鎖の少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、または３６ヌクレオチドが修飾されている。一部の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子のアンチセンス鎖の少なくとも１つ、例えば、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４ヌクレオチドが修飾されている。
【０１６４】
特定の実施形態では、完全修飾核酸阻害剤分子は、１つ以上の可逆的グルタチオン感受性部分で修飾されている。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子の実質的に全てのヌクレオチドが修飾されている。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子のヌクレオチドの半分以上が、可逆的修飾以外の化学修飾で修飾されている。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子のヌクレオチドの半分未満が、可逆的修飾以外の化学修飾で修飾されている。修飾を核酸阻害剤分子上の基で行うことができるか、または異なる修飾ヌクレオチドを点在させることができる。
【０１６５】
二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、１つから全てのヌクレオチドは、２’−炭素が修飾されている。特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、２’−Ｆ、２’−ＯＭｅ、及び／または２’−ＭＯＥで部分的または完全に修飾されている。二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、１つから全てのリン原子が修飾されており、１つから全てのヌクレオチドは、糖部分の２’−炭素が修飾されている。
【０１６６】
二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチドは、糖部分の２’−炭素が修飾されている。二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖上の全てのヌクレオチドは、センス鎖の第２の領域（Ｒ２）のヌクレオチドを除いて、糖部分の２’−炭素が２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅで修飾されている。二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、ステム（第２の二重鎖またはＤ２）中のＴm上昇ヌクレオチドを除いて、糖部分の２’−炭素が２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅで修飾されている。二本鎖核酸阻害剤分子の特定の実施形態では、センス鎖及びアンチセンス鎖の全てのヌクレオチドは、ステム（第２の二重鎖またはＤ２）中のＴm上昇ヌクレオチド及びＧａｌＮＡｃなどの糖リガンド部分にコンジュゲートされるループ領域中のヌクレオチドを除いて、糖部分の２’−炭素が２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅで修飾されている。
【０１６７】
標的遺伝子発現を低減させる方法
本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子は、目的の任意の標的遺伝子の標的ｍＲＮＡ発現を低減させる方法で使用することができる。通常は、ｍＲＮＡ発現を低減させる方法は、試料またはそれを必要とする対象に、本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子を標的遺伝子のｍＲＮＡ発現を低減させるのに十分な量で投与することを含む。方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで実施されてもよい。
【０１６８】
標的ＲＮＡのレベルまたは活性は、当該技術分野で現在既知の、または後に開発される好適な方法により決定することができる。標的ＲＮＡ及び／または標的遺伝子の「発現」を測定するために使用される方法は、標的遺伝子及びそのコードされるＲＮＡの性質に依存し得ることを理解することができる。例えば、標的ＲＮＡ配列がタンパク質をコードする場合、「発現」という用語は、標的遺伝子（ゲノムまたは外因性起源のいずれかのもの）に由来するタンパク質または標的ＲＮＡ／転写物を指し得る。そのような場合、標的ＲＮＡの発現は、標的ＲＮＡ／転写の量を直接測定することにより、または標的ＲＮＡ／転写物によりコードされるタンパク質の量を測定することにより決定することができる。タンパク質は、タンパク質アッセイにおいて、例えば、染色もしくはイムノブロッティングにより、またはタンパク質が、測定することができる反応を触媒する場合、反応速度を測定することにより、測定することができる。全てのそのような方法は、当該技術分野で既知であり、使用することができる。標的ＲＮＡレベルが測定される場合、ＲＮＡレベルを検出するための当該技術分野で認められている方法を使用することができる（例えば、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロッティングなど）。上記の測定は、細胞、細胞抽出物、組織、組織抽出物、または別の好適な原料物質で行うことができる。
【０１６９】
医薬組成物
本開示は、本明細書に記載の治療的有効量の二本鎖核酸阻害剤分子及び薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物を提供する。
【０１７０】
これらの医薬組成物は、従来の滅菌技術により滅菌されても、滅菌濾過されてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装されても、凍結乾燥されてもよく、凍結乾燥調製物は、投与前に滅菌水性賦形剤と組み合わされる。調製物のｐＨは通常、３〜１１、より好ましくは、５〜９または６〜８、最も好ましくは、７〜８、例えば、７〜７．５であろう。
【０１７１】
本開示の医薬組成物は、治療的使用に適用される。従って、本開示の一態様は、限定されないが、疾患または状態に罹患しているヒトを含む対象に治療的有効量の本開示の医薬組成物を投与することにより、該対象を処置するために使用され得る医薬組成物を提供する。特定の実施形態では、疾患または状態は、本明細書に記載のがんである。
【０１７２】
特定の実施形態では、本開示は、処置を必要とする対象の処置用の薬品の製造のための、治療的有効量の本明細書に記載の医薬組成物の使用を特徴とする。特定の実施形態では、対象は、本明細書に記載のがんを有する。
【０１７３】
薬学的に許容される賦形剤
本開示に有用な薬学的に許容される賦形剤は通常、従来のものである。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ  Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，１５th  Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９７５）は、１つ以上の治療用組成物の医薬品送達に適する組成物及び製剤について記載する。薬学的に許容される賦形剤として役立ち得る材料の一部の例としては、以下が挙げられる：ラクトース、グルコース、及びスクロースなどの糖；トウモロコシデンプン及びジャガイモデンプンなどのデンプン；ナトリウムカルボキシメチルセルロース、エチルセルロース、及びセルロースアセタートなどのセルロース及びその誘導体；麦芽；ゼラチン；カカオバター及び坐剤ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及び大豆油などの油；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（等張食塩水；Ｒｉｎｇｅｒ溶液）；エチルアルコール；ｐＨ緩衝液；グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなどのポリオール；ならびに医薬製剤に用いられる他の非毒性適合性物質。
【０１７４】
剤形
医薬組成物は、通常の慣行に従って選択され得る任意の意図された投与経路のために、従来の賦形剤と共に製剤化されてもよい。
【０１７５】
一実施形態では、医薬組成物は、本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子を含有し、例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外注射による非経口投与に適する。通常は、本開示の医薬組成物は、非経口投与のために液体形態で製剤化される。
【０１７６】
非経口投与に適する剤形は通常、例として、滅菌水溶液、生理食塩水、プロピレングリコールなどの低分子量アルコール、ポリエチレングリコール、植物油、ゼラチン、エチルオレアートなどの脂肪酸エステルなどを含む、非経口投与に適する１つ以上のビヒクルを含む。非経口製剤は、糖、アルコール、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を意図されるレシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁剤もしくは増粘剤を含有してもよい。例えば、界面活性剤を使用することにより、適切な流動性を維持することができる。二本鎖核酸阻害剤を含有する液体製剤を凍結乾燥し、無菌の注射可能な溶液を用いる再構成の際の後の使用のために保存することができる。
【０１７７】
医薬組成物はまた、周知の技術を使用して、局所もしくは経皮投与、直腸もしくは膣投与、眼内投与、鼻腔内投与、口腔内投与、または舌下投与を含む他の投与経路のために製剤化されてもよい。
【０１７８】
送達剤
本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子は、例えば、米国特許第６，８１５，４３２号、同第６，５８６，４１０号、同第６，８５８，２２５号、同第７，８１１，６０２号、同第７，２４４，４４８号、及び同第８，１５８，６０１号に開示されるようなリポソーム及び脂質；米国特許第６，８３５，３９３号、同第７，３７４，７７８号、同第７，７３７，１０８号、同第７，７１８，１９３号、同第８，１３７，６９５号、ならびに米国公開特許出願第２０１１／０１４３４３４号、同第２０１１／０１２９９２１号、同第２０１１／０１２３６３６号、同第２０１１／０１４３４３５号、同第２０１１／０１４２９５１号、同第２０１２／００２１５１４号、同第２０１１／０２８１９３４号、同第２０１１／０２８６９５７号、及び同第２００８／０１５２６６１号に開示されるようなポリマー材料；取り込み、分布、または吸収を支援するためのカプシド、カプソイド、または受容体標的化分子を含む、他の分子、分子構造、または化合物の混合物と共に混合されても、カプセル化されても、コンジュゲートされても、他の方法で会合されてもよい。
【０１７９】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）中に製剤化される。脂質−核酸ナノ粒子は通常、複合体を形成するための脂質の核酸との混合時に、自然に形成される。所望の粒度分布に応じて、得られたナノ粒子混合物は、例えば、サーモバレル押出機、例えば、ＬＩＰＥＸ（登録商標）押出機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ  Ｌｉｐｉｄｓ，Ｉｎｃ）を使用して、ポリカーボネート膜（例えば、１００ｎｍのカットオフ）を通して任意に押し出すことができる。治療的使用のために脂質ナノ粒子を調製するために、ナノ粒子及び／または交換緩衝液を形成するために使用される溶媒（例えば、エタノール）を除去することが望ましい場合があり、これは、例えば、透析またはタンジェンシャルフロー濾過により達成することができる。核酸干渉分子を含有する脂質ナノ粒子の作製方法は、例えば、米国公開特許出願第２０１５／０３７４８４２号及び同第２０１４／０１０７１７８号に開示されるように、当該技術分野で既知である。
【０１８０】
特定の実施形態では、ＬＮＰは、カチオン性リポソーム及びペグ化脂質を含むコア脂質構成成分を含む。ＬＮＰはさらに、カチオン性脂質、構造脂質もしくは中性脂質、ステロール、ペグ化脂質、またはそれらの混合物などの１つ以上のエンベロープ脂質を含み得る。
【０１８１】
ＬＮＰに使用されるカチオン性脂質は、例えば、米国公開特許出願第２０１５／０３７４８４２号及び第２０１４／０１０７１７８号で考察されるように、当該技術分野で既知である。通常は、カチオン性脂質は、生理学的ｐＨで正味の正電荷を有する脂質である。特定の実施形態では、カチオン性リポソームは、ＤＯＤＭＡ、ＤＯＴＭＡ、ＤＬ−０４８、またはＤＬ−１０３である。特定の実施形態では、構造脂質または中性脂質は、ＤＳＰＣ、ＤＰＰＣ、またはＤＯＰＣである。特定の実施形態では、ステロールは、コレステロールである。特定の実施形態では、ペグ化脂質は、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ、ＤＳＧ−ＰＥＧ、ＤＭＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ、ＤＳＰＥ−ＰＥＧ２Ｋ、ＤＳＧ−ＰＥＧ２Ｋ、またはＤＳＧ−ｍＰＥＧである。一実施形態では、カチオン性脂質は、ＤＬ−０４８であり、ペグ化脂質は、ＤＳＧ−ｍＰＥＧであり、１つ以上のエンベロープ脂質は、ＤＬ−１０３、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＤＳＰＥ−ｍＰＥＧである。例えば、二本鎖核酸阻害剤分子を製剤化するために使用することができるＬＮＰの非限定的な一実施形態を示す図１３を参照のこと。
【０１８２】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、目的の組織へのオリゴヌクレオチドの送達を導くリガンドに共有結合的にコンジュゲートされる。そのようなリガンドの多くが調査されている。例えば、Ｗｉｎｋｌｅｒ，Ｔｈｅｒ．Ｄｅｌｉｖ．４（７）：７９１−８０９（２０１３）を参照のこと。例えば、二本鎖核酸阻害剤分子は、オリゴヌクレオチドの肝臓への取り込みを誘導するために、１つ以上の糖リガンド部分（例えば、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ））にコンジュゲートすることができる。例えば、米国特許第５，９９４，５１７号、米国特許第５，５７４，１４２号、ＷＯ２０１６／１００４０１を参照のこと。特定の実施形態では、１つ以上のリガンドは、二本鎖核酸阻害剤分子のテトラループに１つ以上のヌクレオチドにコンジュゲートされる。
【０１８３】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、テトラループに２〜４つの糖リガンド部分にコンジュゲートされる。一実施形態では、テトラループ中のヌクレオチドのうちの２つは、糖リガンド部分にコンジュゲートされる。一実施形態では、テトラループ中のヌクレオチドの３つは、糖リガンド部分にコンジュゲートされる。別の実施形態では、テトラループ内の４ヌクレオチドは、糖リガンド部分にコンジュゲートされる。特定の実施形態では、糖リガンド部分は、ＧａｌＮＡｃである。使用することができる他のリガンドは、マンノース−６−ホスファート、コレステロール、葉酸、トランスフェリン、及びガラクトースを含むが、これらに限定されない（他の例示的な具体的なリガンドについては、例えば、ＷＯ２０１２／０８９３５２を参照のこと）。
【０１８４】
リガンドは、それが目的の組織へのオリゴヌクレオチドの送達を誘導することが可能な限り、ヌクレオチドの任意の部分にコンジュゲートすることができる。特定の実施形態では、リガンド（例えば、ＧａｌＮＡｃ）は、糖部分の２’位のヌクレオチドにコンジュゲートされる。
【０１８５】
投与方法／処置
一実施形態は、治療的有効量の本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、障害の処置方法に関する。
【０１８６】
特定の実施形態では、本明細書に開示の医薬組成物は、増殖性、炎症性、自己免疫性、神経性、眼性、呼吸性、代謝性、皮膚病学的、聴覚性、肝臓、腎臓、または感染性疾患に関連する症状の処置または予防に有用であり得る。一実施形態は、治療的有効量の本明細書に記載の二本鎖核酸阻害剤分子を含む医薬組成物を対象に投与することを含む、増殖性、炎症性、自己免疫性、神経性、眼性、呼吸性、代謝性、皮膚病学的、聴覚性、肝臓、腎臓、または感染性疾患の処置方法に関する。
【０１８７】
特定の実施形態では、障害は、まれな疾患、慢性肝疾患、慢性腎疾患、心血管疾患、またはウイルス感染性疾患である。特定の実施形態では、障害は、原発性高シュウ酸尿症（ＰＨ１、ＰＨ２、もしくはＰＨ３）または特発性高シュウ酸尿症を含む高シュウ酸尿症である。特定の実施形態では、障害は、慢性腎障害（ＣＫＤ）である。特定の実施形態では、障害は、ピルビン酸脱水素酵素欠損症である。特定の実施形態では、障害は、α１アンチトリプシン（Ａ１ＡＴ）欠損症である。
【０１８８】
特定の実施形態では、障害は、がんである。そのようながんの非限定例としては、胆道癌、膀胱癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、脳癌、神経膠腫、星状細胞腫、乳癌、化生性癌、子宮頸癌、子宮頸部扁平上皮癌、直腸癌、大腸癌、結腸癌、遺伝性非ポリポーシス大腸癌、大腸腺癌、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮内膜癌、子宮内膜間質肉腫、食道癌、食道扁平上皮癌、食道腺癌、眼メラノーマ、ブドウ膜メラノーマ、胆嚢癌、胆嚢腺癌、腎細胞癌、淡明細胞型腎細胞癌、移行上皮癌、尿路上皮癌、ウイルムス腫瘍、白血病、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）、慢性リンパ球性（ＣＬＬ）、慢性骨髄性（ＣＭＬ）、慢性骨髄単球性（ＣＭＭＬ）、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝細胞癌、胆管癌、肝芽腫、肺癌、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、中皮腫、Ｂ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫、マントル細胞リンパ腫、Ｔ細胞リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、前駆Ｔリンパ芽球性リンパ腫／白血病、末梢Ｔ細胞リンパ腫、多発性骨髄腫、上咽頭癌（ＮＰＣ）、神経芽腫、口腔咽頭癌、口腔扁平上皮癌、骨肉腫、卵巣癌、膵癌、膵管腺癌、偽乳頭状新生物、腺房細胞癌、前立腺癌、前立腺腺癌、皮膚癌、メラノーマ、悪性メラノーマ、皮膚メラノーマ、小腸癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ  ｃａｎｃｅｒ）、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、消化管間質腫瘍（ＧＩＳＴ）、子宮癌、または子宮肉腫が挙げられる。通常は、本開示は、治療的有効量の本明細書に記載の医薬組成物を投与することによる、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ）、肝臓癌（ｌｉｖｅｒ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ）、肝臓癌（ｈｅｐａｔｏｍａ）、肝細胞癌、胆管癌、及び肝芽腫の処置方法を特徴とする。
【０１８９】
一部の実施形態では、本開示は、標的遺伝子の発現を低減するのに十分な量で、医薬組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、対象における標的遺伝子の発現を低減させるための方法を提供し、医薬組成物は、本明細書に記載される二本鎖核酸阻害剤分子及び同じく本明細書に記載される薬学的に許容される賦形剤を含む。
【０１９０】
標的遺伝子は、ヒト標的遺伝子などの任意の哺乳動物由来の標的遺伝子であり得る。任意の標的遺伝子は、本方法に従ってサイレンシングされてもよい。特定の実施形態では、標的遺伝子は、慢性肝疾患または慢性腎疾患に関連し、例えば、ＡＧＸＴ、ＧＲＨＰＲ、ＨＯＧＡ１、ＨＡＯ１、ＳＥＲＰＩＮＡ１、またはＬＤＨＡを含む。特定の実施形態では、標的遺伝子は、ウイルス感染性疾患に関連し、例えば、ＨＢＶ遺伝子またはＨＣＶ遺伝子を含む。特定の実施形態では、標的遺伝子は、心血管疾患に関連し、例えば、ＡＰＯＣ３またはＰＣＳＫ９を含む。特定の実施形態では、標的遺伝子は、例えば、アルコール代謝及び肝機能に関連し、ＡＬＤＨ２を含む。
【０１９１】
他の例示的な標的遺伝子としては、ＫＲＡＳ、第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ１、ＴＴＲ、ＰＤＧＦβ遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋ１／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵＮ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、β−カテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子、ｐ２１（ＷＡＦ１／ＣＩＰ１）遺伝子、ｐ２７（ＫＩＰ１）遺伝子、ＰＰＭ１Ｄ遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、カベオリンＩ遺伝子、ＭＩＢＩ遺伝子、ＭＴＡＩ遺伝子、Ｍ６８遺伝子、腫瘍抑制遺伝子の変異、ｐ５３腫瘍抑制遺伝子、及びそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１９２】
投与及びスケジュール
通常は、二本鎖核酸阻害剤分子は、非経口的に（例えば、静脈内、筋肉内、または皮下投与を介して）投与される。他の実施形態では、医薬組成物は、局所投与または全身投与を介して送達される。しかし、本明細書に開示の医薬組成物はまた、例えば、口腔、舌下、直腸、膣、尿道内、局所、眼内、鼻腔内、及び／または耳内を含む、当該技術分野で既知の任意の方法により投与されてもよく、この投与は、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、水性懸濁液、ゲル剤、噴霧剤、坐剤、膏薬、軟膏などを含んでもよい。
【０１９３】
特定の実施形態では、二本鎖核酸阻害剤分子は、１日当たりレシピエントの体重１キログラム当たり２０マイクログラム〜１０ミリグラム、１キログラム当たり１００マイクログラム〜５ミリグラム、１キログラム当たり０．２５ミリグラム〜５．０ミリグラム、または１キログラム当たり０．５〜３．０ミリグラムの投薬量で投与される。通常は、二本鎖核酸阻害剤分子は、１日当たりレシピエントの体重１キログラム当たり約０．２５〜２．０ミリグラムの投薬量で投与される。
【０１９４】
本開示の医薬組成物は、毎日または断続的に投与されてもよい。例えば、二本鎖核酸阻害剤分子の間欠投与は、週に１〜６日、月に１〜６日、週に１回、隔週に１回、月に１回、隔月に１回、３ヶ月毎に１回、または年に１回もしくは２回に投与されても、または複数回の年用量、月用量、週用量、もしくは日用量に分けられてもよい。一部の実施形態では、間欠投与は、最初の二本鎖核酸阻害剤分子の投与、それに続く（最大１週間、最大１ヶ月間、最大２ヶ月間、最大３ヶ月間、もしくは最大６ヶ月間以上の投与がない状態の）休止期間を伴うサイクルでの投与を意味し得、または、それは、１日おきに、１週間おきに、１ヶ月おきに、もしくは１年おきの投与を意味し得る。
【０１９５】
二本鎖核酸阻害剤分子の治療的有効量は、投与経路ならびに対象のサイズ及び体重などの患者の身体的特徴、疾患の進行または浸透の程度、対象の年齢、健康状態、ならびに性別に依存し得、これらの及び他の要因に応じて、必要次第で調整することができる。
【実施例】
【０１９６】
実施例１：ｉｎ  ｖｉｖｏでのＳＡＡ１  ｍＲＮＡノックダウン
ＣＤ−１雌マウスを研究群に分け、それらに、その群に指定された試験血清アミロイドＡ１（ＳＡＡ１）核酸阻害剤分子を投与した。実施例１で使用された試験ＳＡＡ１核酸阻害剤分子が図１に示される。ＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされるループのヌクレオチド及び二環式ヌクレオチドを除いて、試験ＳＡＡ１核酸阻害剤分子の１つおきのヌクレオチドは、糖部分の２’位が２’−Ｆまたは２’−ＯＭｅのいずれかで修飾されている。試験ＳＡＡ１核酸阻害剤分子は、以下の点で異なっていた：ステム部分の長さ（短い対長い）、二環式ヌクレオチドの有無、及びループ中のＧａｌＮＡｃの数（３対４）。図１のＳＡＡ１核酸阻害剤分子が、以下の表にまとめられる：
表１：図１のＳＡＡ１核酸阻害剤
2021520355.tif 000046
【０１９７】
短いステム構築物２及び３は、同一であり、唯一の差異は、ループ中のＧａｌＮＡｃの数である（４対３）。長いステム構築物１は、構築物１が６塩基対のステム二重鎖を有する一方で、構築物２が３塩基対のステム二重鎖を有することを除いて、短いステム構築物２と同一である。短いステム構築物３及び４は、同一であり、唯一の差異は、構築物４のステムに６つの二環式ヌクレオチドの存在がある。構築物４で使用される二環式ヌクレオチドは、ＢＮＡNC［ＮＭｅ］であり、二環式ヌクレオチドの２’−炭素及び４’−炭素を連結する架橋は、４’−ＣＨ2−Ｎ（ＣＨ3）−Ｏ−２’である。
【０１９８】
ＴＢＧ（チロキシン結合グロブリン）プロモーター下のヒトＳＡＡ１（ＮＭ＿０００３３１．５）遺伝子（ｈＳＡＡ１）をコードするＡＡＶ９（アデノ関連ウイルス）ベクターは、Ｖｉｇｅｎｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．により合成された。ＣＤ−１雌マウスにｈＳＡＡ１＿ＡＡＶ９ベクターを用いて、マウス１匹当たり５ｘ１０12コピーのウイルスゲノムを静脈内投与した。テールニックを使用して、毎週マウスから採血し、１０ｕｌの全血を得、直ちに、ｈＳＡＡ１  ＥＬＩＳＡ緩衝液中で１：２０に希釈し、分析まで、−２０℃で保存した。３週間後、ｈＳＡＡ１  ＥＬＩＳＡキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）カタログ番号ＫＨＡ００１１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用して、マウスの血液中のｈＳＡＡ１タンパク質の循環レベルを決定した。各群で同等のｈＳＡＡ１タンパク質の平均循環血中濃度を達成するために、３週目に、循環血中ｈＳＡＡ１濃度に基づいて、マウスを４群に分類した。次に、研究０日目に、マウスにＰＢＳまたは１ｍｇ／ｋｇのそれぞれのＳＡＡ１核酸阻害剤分子を皮下投与した。その後毎週、マウスから採血し、全血を収集し、分析して、実験の終了まで循環血中ｈＳＡＡ１レベルを測定した。循環血中ｈＳＡＡ１濃度は、それぞれのマウスに対する投与前（ｈＳＡＡ１＿ＡＡＶ９後３週目）レベル及び時間を一致させたＰＢＳ群に正規化することにより表された。
【０１９９】
二環式ヌクレオチドを含有する短いステム（ステム中の３塩基対）ＳＡＡ１核酸阻害剤分子を、二環式ヌクレオチドを含まない対応する短いステム対照と比較した。二環式ヌクレオチドを含まないより長いステム対照（ステム中の６塩基対）とも、それらを比較した。図２にみられるように、短いステムに二環式ヌクレオチドを含有するＳＡＡ１核酸阻害剤分子は、対応する短いステム及び長いステム対照と比較して、ＳＡＡ１ノックダウンの効力及び期間の大幅な改善を示した。
【０２００】
実施例２：肝臓におけるｉｎ  ｖｉｖｏでのＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡノックダウン
ＣＤ−１雌マウスを研究群に分け、それらに、その群に指定された試験アポリポタンパク質Ｃ３（ＡＰＯＣ３）核酸阻害剤分子を投与した。実施例２で使用された試験ＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子が図３Ａ及び３Ｂに示される。ＧａｌＮＡｃにコンジュゲートされているループ中のヌクレオチド及び二環式ヌクレオチドを除いて、試験ＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子中の１つおきのヌクレオチドは、糖部分の２’位が２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆのいずれかで修飾されている。試験ＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子は、以下の点で異なっていた：ステム部分の長さ（短い対長い）、二環式ヌクレオチドの有無、ループ中のＧａｌＮＡｃの数（３対４）、及びガイド鎖の１位（Ｇ１）（２’−ＯＭｅ対２’−Ｆ）。図３ＡのＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子は、以下の表にまとめられる：
表２：図３ＡのＡＰＯＣ３核酸阻害剤（Ｇ１での２’−ＯＭｅ）
2021520355.tif 000047
【０２０１】
長いステム構築物５及び８は、同一であり、唯一の差異は、ループ中のＧａｌＮＡｃの数である（４対３）。長いステム構築物５は、構築物５が６塩基対のステム二重鎖を有する一方で、構築物６が６つの二環式ヌクレオチドを含む３塩基対のステム二重鎖を有することを除いて、短いステム構築物６と同一である。短いステム構築物６及び７は、同一であり、唯一の差異は、構築物７のステムに６つの二環式ヌクレオチドの存在がある。構築物７で使用される二環式ヌクレオチドは、ＢＮＡNC［ＮＭｅ］である。短いステム構築物６及び９は、ループ中のＧａｌＮＡｃの数（４対３）を除いて同一である。同様に、ＢＮＡ含有短いステム構築物７及び１０は、ループ中のＧａｌＮＡｃの数（４対３）を除いて同一である。短いステム構築物９及び１０は、同一であり、唯一の差異は、構築物１０のステムに６つの二環式ヌクレオチドの存在がある。構築物１０で使用される二環式ヌクレオチドは、ＢＮＡNC［ＮＭｅ］である。
【０２０２】
図３ＢのＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子は、以下の表にまとめられる：
表３：図３ＢのＡＰＯＣ３核酸阻害剤（Ｇ１での２’−Ｆ）
2021520355.tif 000048
【０２０３】
長いステム（またはＬＳ）構築物１１及び１４は、同一であり、唯一の差異は、ループ中のＧａｌＮＡｃの数（４対３）である。長いステム構築物１１は、構築物１１が６塩基対のステム二重鎖を有する一方で、構築物１２が６つの二環式ヌクレオチドを有する３塩基対のステム二重鎖を有することを除いて、短いステム（またはＳＳ）構築物１２と同一である。短いステム構築物１２及び１３は、同一であり、唯一の差異は、構築物１３のステムに６つの二環式ヌクレオチドの存在がある。構築物１３で使用される二環式ヌクレオチドは、ＢＮＡNC［ＮＭｅ］である。短いステム構築物１２及び１５は、ループ中のＧａｌＮＡｃの数（４対３）を除いて同一である。同様に、ＢＮＡ含有短いステム構築物１３及び１６は、ループ中のＧａｌＮＡｃの数（４対３）を除いて同一である。短いステム構築物１５及び１６は、同一であり、唯一の差異は、構築物１６のステムに６つの二環式ヌクレオチドの存在がある。構築物１６で使用される二環式ヌクレオチドは、ＢＮＡNC［ＮＭｅ］である。
【０２０４】
動物に、指定されたＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子１ｍｇ／ｋｇを皮下投与した。２つの４ｍｍパンチ生検を採取することにより、肝臓組織を収集し、これを、後のｍＲＮＡ分析のために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に保存した。
【０２０５】
二環式ヌクレオチドを含有する短いステム（ステム中の３塩基対）ＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子を、二環式ヌクレオチドを含まない対応する短いステムバージョンと比較した。二環式ヌクレオチドを含まないより長いステムバージョン（ステム中の６塩基対）とも、それらを比較した。図４に示されるデータで示されるように、短いステムに二環式ヌクレオチドを含有するＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子は、対応する短いステム及び長いステム対照と比較して、２８日目に、野生型マウスでＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡのノックダウンの大幅な増加を示した。この傾向は、ガイド１位に２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆのいずれかを有する核酸阻害剤分子で観察された。傾向はまた、ループに使用されるＧａｌＮＡｃリガンドの数（４つのＧａｌＮＡｃ対３つのＧａｌＮＡｃ）にかかわらず同じであった。
【０２０６】
実施例３：ＨＤＩマウスモデルにおけるＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡノックダウン
ハイドロダイナミックインジェクション（ＨＤＩ）マウスモデルを使用して、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡノックダウンを研究した。ＨＤＩは、静脈尾注射を介してマウスの肝細胞に核酸を送達するために使用される方法である。本実験では、ＨＤＩを使用して、以下でより詳細に説明されるように、ヒトＰＣＳＫ９を含有するプラスミドＤＮＡを送達した。
【０２０７】
ＣＤ−１雌マウスを研究群に分け、それらに、その群に指定された試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子を投与した。実施例３で使用された試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子が図５に示される。ＧａｌＮＡｃ及び二環式ヌクレオチドにコンジュゲートされるループ中のヌクレオチドを除いて、試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子中の１つおきのヌクレオチドは、糖部分の２’位が２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆのいずれかで修飾されている（修飾パターン２または「Ｍ２」）。試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子は、以下の点で異なっていた：ステム部分の長さ（短い対長い）及び二環式ヌクレオチドの有無。図５のＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子が、以下の表にまとめられる：
表４：図５のＰＣＳＫ９核酸阻害剤
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【０２０８】
長いステム構築物１７は、構築物１７が６塩基対のステム二重鎖を有する一方で、構築物１８が３塩基対のステム二重鎖を有することを除いて、短いステム構築物１８と同一である。短いステム構築物１８及び１９は、同一であり、唯一の差異は、構築物１９のステムに６つの二環式ヌクレオチドの存在がある。構築物１６で使用される二環式ヌクレオチドは、ＢＮＡNC［ＮＭｅ］である。
【０２０９】
マウスに、指定された試験物質０．５ｍｇ／ｋｇを皮下投与した。マウスにおいてヒトＰＣＳＫ９を発現するように、プラスミドを設計した（ｐＣＤＮＡ３／ｈＰＣＳＫ９）。試験物質の皮下投与後１１日目または１９日目に、２ｍｌのｐＣＤＮＡ３／ｈＰＣＳＫ９（ＰＢＳに懸濁された１ｘ１０12コピー）を尾静脈の静脈注射によりマウスに投与した。１２日目または２０日目に、製造業者のプロトコールに従って、２つの４ｍｍパンチ生検を採取することにより、肝臓組織を収集し、ＲＮＡ単離、ｃＤＮＡ合成、及びｑ−ＲＴ  ＰＣＲに向けて処理した。
【０２１０】
図６に示されるように、短いステムに二環式ヌクレオチドを含有するＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子は、研究における対応する短いステム及び長いステム対照と比較して、効力及び期間（１２日目及び２０日目）の改善を示した。
【０２１１】
実施例４：ＡＡＶマウスモデルにおけるＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡノックダウン
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスに、ヒトＰＣＳＫ９を発現するアデノウイルス関連ウイルス（ＡＡＶ）プラスミド（ｐＡＡＶ９−ｈＰＣＳＫ９）であるｐＡＡＶ９−ｈＰＣＳＫ９（１ｘ１０12コピー）を静脈内注射した。毎週、外側尾静脈穿刺により動物から採血し、血液を血漿に処理した。製造者のプロトコール（ヒトＰＣＳＫ９  ＥＬＩＳＡキット、ａｂ２０９８８４、Ａｂｃａｍ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）に従って、ヒトＰＣＳＫ９発現を測定した。ヒトＰＣＳＫ９発現が安定した時、指定された試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子１ｍｇ／ｋｇを動物に皮下投与した。再度、ノックダウンの期間を決定するために、毎週、動物から採血した。
【０２１２】
これで使用された試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子が、図７に示される。試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子のヌクレオチド配列は、実施例３で使用されたものと同じである。ＧａｌＮＡｃ及び二環式ヌクレオチドにコンジュゲートされるループ中のヌクレオチドを除いて、試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子中の１つおきのヌクレオチドは、糖部分の２’位が２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆのいずれかで修飾されている（修飾パターン１または「Ｍ１」）。試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子は、以下の点で異なっていた：ステム部分の長さ（短い対長い）及び二環式ヌクレオチドの有無。図７のＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子が、以下の表にまとめられる：
表５：図７のＰＣＳＫ９核酸阻害剤
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【０２１３】
長いステム構築物２０は、６塩基対のステム二重鎖を有するが、短いステム構築物２１は、６つの二環式ヌクレオチドを含む３塩基対のステム二重鎖を有する。構築物２０及び２１の両方は、テトラループに３つのＧａｌＮＡｃコンジュゲートヌクレオチドを含有するが、テトラループの最初の３ヌクレオチドは、構築物２０にコンジュゲートされているＧａｌＮＡｃである一方、最後の３ヌクレオチドは、構築物２１にコンジュゲートされているＧａｌＮＡｃである。これらの差異以外は、構成２０及び２１は、同一である。構築物２１で使用される二環式ヌクレオチドは、ＢＮＡNC［ＮＭｅ］である。
【０２１４】
図８に示されるように、短いステムに二環式ヌクレオチドを含有するＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子は、対応する長いステム対照と比較して、効力及び期間（２〜７週目）の改善を示した。
【０２１５】
実施例５：ルシフェラーゼレポーターを使用したＡＡＶマウスモデルにおけるＰＣＳＫ９阻害
別の実験では、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ雌マウスに、ガウシアルシフェラーゼの３’非翻訳領域のＰＣＳＫ９標的部位を発現する異なるＡＡＶ９プラスミド（１×１０12コピー）を静脈内注射した。ＰＣＳＫ９標的部位は、本実験に使用される試験核酸阻害剤分子に特異的である。このように、ルシフェラーゼ発現は、試験核酸阻害剤分子がプラスミドＤＮＡ内で部位特異的切断を媒介する能力を測定するために使用することができる。毎週、外側尾静脈穿刺により動物から採血し、血液を血清に処理した。製造者のプロトコール（Ｐｉｅｒｃｅ（商標）ガウシアルシフェラーゼグローアッセイキット、＃１６１６１、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に従って、ガウシアルシフェラーゼ発現を測定した。ルシフェラーゼ発現が安定した時、動物に、指定された試験物質１ｍｇ／ｋｇを皮下投与した。ノックダウンの期間を決定するために、毎週、動物から採血した。
【０２１６】
使用された試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子が、図５に示される（構築物１７及び１９）。試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子のヌクレオチド配列は、実施例３及び４で使用されたものと同じである。ＧａｌＮＡｃ及び二環式ヌクレオチドにコンジュゲートされるループ中のヌクレオチドを除いて、試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子中の１つおきのヌクレオチドは、糖部分の２’位が２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆのいずれかで修飾されている（修飾パターン２または「Ｍ２」）。試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子は、以下の点で異なっていた：ステム部分の長さ（短い対長い）及び二環式ヌクレオチドの有無。本実験で使用されたＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子が、以下の表にまとめられる：
表６：ＰＣＳＫ９核酸阻害剤（図５）
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【０２１７】
短いステム構築物１９は、構築物１７が６塩基対のステム二重鎖を有する一方で、構築物１９が６つの二環式ヌクレオチドを含む３塩基対のステム二重鎖を有することを除いて、構築物１７と同一である。構築物１９で使用される二環式ヌクレオチドは、ＢＮＡNC［ＮＭｅ］である。
【０２１８】
このＡＡＶマウスモデルでは、ＡＡＶ９プラスミドを使用して部位特異的ＰＣＳＫ９標的配列と共にマウスをトランスフェクトした場合、短いステムに二環式ヌクレオチドを含有する核酸阻害剤分子は再度、いかなる二環式ヌクレオチドを含有していなかった長いステム対照と比較して効力の期間の向上を示した。短いステム構築物１９は、７週間の研究の全体を通してルシフェラーゼレベルを２０％未満に維持したが、長いステム対照（構築物１７）を用いたルシフェラーゼレベルは、４週目までに約２０％に増加し、７週目までに、約７０％まで着実に増加した。図９。
【０２１９】
関連研究では、上記のように、追加の試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子をこのＡＡＶマウスモデルで試験した。追加の試験ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子は、図１４Ｂ〜Ｃに示され、３つのＢＮＡ塩基対、２つのＢＮＡ塩基対、または１つのＢＮＡ塩基対、または３つの不対合ＢＮＡ、２つの不対合ＢＮＡ、または１つのＢＮＡを含有する短縮ステム構築物（３塩基対）を含有する。いかなるＢＮＡも含まず且つ長いステム構築物（合計６塩基対）または短縮ステム構築物（３塩基対）を含有する対照ＰＣＳＫ９核酸阻害剤分子も試験した（実施例３の構築物１７及び１８）。図１４Ａ。全ての試験及び対照ＰＣＳＫ９構築物は、２週間までにはＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡの強力なノックダウンを示したが、ステムに単一の不対合ＢＮＡを含有する構築物３５（図１４Ｃ）を含む、ＢＮＡ含有短縮ステム構築物はそれぞれ、ＢＮＡを全く含有しない親短縮ステム構築物と比較して、効力及び期間の改善を示した。図１５Ａ〜Ｂ。さらに、短縮ステムの単一のＢＮＡ塩基対は、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡノックダウンの期間及び効力を増加させるのに十分であったが、ステムにさらにＢＮＡ塩基対（例えば、２または３塩基対）を付加しても、さらに効力または期間を増強するようにはみえなかった。図１５Ａ。対照的に、ステムの片側に不対合ＢＮＡを付加すると、ステム中の連続するＢＮＡの数が増加するにつれて、ＰＣＳＫ９  ｍＲＮＡノックダウン活性が増加するようにみえた。図１５Ｂ。
【０２２０】
実施例６：テトラループ及びトリループを含有する核酸阻害剤分子を使用するＡＬＤＨ２標的遺伝子ｍＲＮＡのｉｎ  ｖｉｖｏノックダウン
３塩基対以上で、ステム（Ｄ２）の長さを短くすることが、ｍＲＮＡノックダウン活性にいかに影響するかを評価するために、ループに３または４ヌクレオチドのいずれかを有する追加の構築物を設計した。ＣＤ−１雌マウスを研究群に分け、それらに、その群に指定された試験核酸阻害剤分子を投与した。実施例６（構築物２２〜３０）で使用される試験核酸阻害剤分子は、図１１Ａ〜Ｉに示される。ＧａｌＮＡｃ及び二環式ヌクレオチドにコンジュゲートされるループ中のヌクレオチドを除いて、試験核酸阻害剤分子中の１つおきのヌクレオチドは、糖部分の２’位が２’−ＯＭｅまたは２’−Ｆのいずれかで修飾されている。試験核酸阻害剤分子は、以下の点で異なっていた：ステム部分の長さ（６塩基対、３塩基対、２塩基対、及び１塩基対）、二環式ヌクレオチドの有無、ループ部分の長さ（テトラループ対トリループ）、及びループ中のＧａｌＮＡｃの数。図１１Ａ〜Ｉの核酸阻害剤分子は、以下の表にまとめられる：
表７：図１１の試験核酸阻害剤
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【０２２１】
長いステム（６塩基対）構築物２２及び２３は、同一であり、唯一の差異は、ループ中のヌクレオチド数（テトラループ対トリループ）である。構築物３０は、構築物３０がテトラループにコンジュゲートされる３つのＧａｌＮＡｃを含有する一方で、構築物２２がテトラループにコンジュゲートされる２つのＧａｌＮＡｃを含有することを除いて、構築物２２と同一である。構築物２４（３塩基対ステム）は、構築物２４がテトラループを有する一方で、構築物２５がトリループを有することを除いて、構築物２５（３塩基対ステム）と同一である。構築物２６及び２７（２塩基対ステム）は、同一であり、唯一の差異は、構築物２６がテトラループを有する一方で、構築物２７がトリループを有することである。構築物２８及び２９（１塩基対ステム）は、同一であり、唯一の差異は、構築物２８がテトラループを有する一方で、構築物２９がトリループを有することである。構築物２４〜２９で使用される二環式ヌクレオチドは、ＢＮＡNC［ＮＭｅ］である。
【０２２２】
動物に、単一の０．５ｍｇ／ｋｇ用量の指定された試験核酸阻害剤分子を皮下投与し、投与の４日後にマウスを死亡させた。２つの４ｍｍパンチ生検を採取することにより、肝臓組織を収集し、これを、後のｍＲＮＡ分析のために、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（商標）ＲＮＡｌａｔｅｒ（商標）溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）に保存した。ＴｉｓｓｕｅＬｙｓｅｒ  ＩＩ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｖａｌｅｎｃｉａ，ＣＡ）を使用して、組織試料をＱＩＡｚｏｌ（登録商標）溶解試薬で均質化した。次に、製造者の指示に従って、ＭａｇＭＡＸ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙを使用してＲＮＡを精製した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）。大容量ｃＤＮＡ逆転写キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を使用してｃＤＮＡを調製した。ＣＦＸ３８４リアルタイムＰＣＲ検出システム（Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で、ＰＣＲのための標的配列に対するプライマーを使用した。
【０２２３】
短いステムの試験核酸阻害剤分子（構築物２４〜２９）を、対応する長いステムバージョンの試験核酸分子（構築物２２、２３、及び３０）と比較した。図１２に示されるように、ステムに３塩基対（６つの二環式ヌクレオチド）または２塩基対（４つの二環式ヌクレオチド）を含有する短いステム構築物（構築物２４〜２７）は、ステムに６塩基対を含有する（二環式ヌクレオチドを含まない）長いステム構築物（構築物２２、２３、及び３０）と比較して、標的遺伝子ｍＲＮＡの同様のノックダウンを示した。他方では、ステムに１塩基対（２つの二環式ヌクレオチド）を有する短いステム構築物（構築物２８及び２９）は、ループ中のヌクレオチド数に応じて、著しく異なるｍＲＮＡ阻害活性を示した。トリループを含有する構築物２９は、標的遺伝子ｍＲＮＡのノックダウン示さなかったが、テトラループを含有する構築物２８は、標的遺伝子ｍＲＮＡの実質的なノックダウンを示した。図１２。
【０２２４】
実施例７：血液中のｉｎ  ｖｉｖｏ  ＡＰＯＣ３タンパク質ノックダウン
ＣＤ−１雌マウスを研究群に分け、それらに、その群に指定された試験アポリポタンパク質Ｃ２（ＡＰＯＣ３）核酸阻害剤分子を投与した。動物に、指定されたＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子１ｍｇ／ｋｇを皮下投与した。ＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子の投与の７日後、側方尾静脈穿刺を介して、全血１０μＬを収集し、５０倍の冷リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で希釈した。希釈した全血をさらに１００倍に希釈して、全血の合計５０００倍に希釈した。製造者のプロトコールを使用して、マウスＡＰＯＣ３用に設計されたＣｌｏｕｄ−Ｃｌｏｎｅ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ酵素結合免疫吸着アッセイキット（ＳＥＢ８９０Ｍｕ）を使用して、希釈全血をＡＰＯＣ３タンパク質についてアッセイした。実験群の血中ＡＰＯＣ３濃度を、キットの標準曲線に基づいて逆算した。次に、データを変換して、陰性対照（ＰＢＳ）群と比較した全血中の相対ＡＰＯＣ３（％）を示す。
【０２２５】
この例で使用された試験ＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子が図１６に示される。それらは、３つのＢＮＡ塩基対、２つのＢＮＡ塩基対、もしくは１つのＢＮＡ塩基対、または３つの不対合ＢＮＡ、２つの不対合ＢＮＡ、または１つのＢＮＡを有する短縮ステム構築物（３塩基対）を含む。いかなるＢＮＡも含まず且つ長いステム構築物（合計６塩基対）を含有する対照ＡＰＯＣ３核酸阻害剤分子も試験した。全てのＢＮＡ含有構築物は、７日目に血液中のＡＰＯＣ３タンパク質で測定されるＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡのノックダウンを示したが、２つのＢＮＡ塩基対を含有する構築物３６は、他のＢＮＡ含有構築物よりもＡＰＯＣ３  ｍＲＮＡの阻害において効果が弱かった。図１７。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１１Ｆ】
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【図１１Ｇ】
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【図１１Ｈ】
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【図１１Ｉ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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