(57)【要約】Ｅ３領域中に欠失または改変を有する腫瘍選択的組換えアデノウイルスが記載されている。アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）を発現するが、残っている６つのＥ３遺伝子のうち少なくとも３つの欠失を有する組換えアデノウイルスは、ウイルス複製の増強を示す。組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞における選択的複製を可能にし、ウイルスを肝臓から脱標的化する追加の改変をさらに含む。がん処置のための組換えアデノウイルスの使用が記載されている。
2021520789.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
改変されたＥ１ａタンパク質をコードするＥ１Ａ領域と、
アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）をコードし、１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋから選択される少なくとも３つのＥ３遺伝子のコード配列中に改変を含み、前記改変が、前記コードされるタンパク質の発現を妨げる、Ｅ３領域と、
Ｅ４ｏｒｆ６／７コード配列の欠失を含むＥ４領域と
を含む、組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２】
前記改変されたＥ１ａタンパク質が、
ＬＸＣＸＥモチーフの欠失、
残基２〜１１の欠失、
Ｃ１２４Ｇ置換、
Ｙ４７Ｈ置換、
Ｙ４７Ｈ置換およびＣ１２４Ｇ置換、または
Ｙ４７Ｈ置換、Ｃ１２４Ｇ置換および残基２〜１１の欠失
を含む、請求項１に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項３】
前記少なくとも３つのＥ３遺伝子が、１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９ｋを含む、請求項１または請求項２に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項４】
前記１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９ｋ遺伝子が欠失している、請求項３に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項５】
前記１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９ｋ遺伝子が、開始コドンの変異、未熟停止コドンを導入する変異、または両方を含む、請求項３に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項６】
前記少なくとも３つのＥ３遺伝子が、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋを含む、請求項１または請求項２に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項７】
前記ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子が欠失している、請求項６に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項８】
前記ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子が、開始コドンの変異、未熟停止コドンを導入する変異、または両方を含む、請求項６に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項９】
前記少なくとも３つのＥ３遺伝子が、１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項１０】
前記１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子が欠失している、請求項９に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項１１】
前記１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子が、開始コドンの変異、未熟停止コドンを導入する変異、または両方を含む、請求項９に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項１２】
Ｅ４ｏｒｆ３の欠失をさらに含む、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項１３】
ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合された標的化リガンドと、野生型ＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）タンパク質またはラパログに結合可能な変異体ＦＲＢタンパク質に融合されたアデノウイルスファイバータンパク質とをさらにコードする、請求項１から１２のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項１４】
前記標的化リガンドが、単一ドメイン抗体である、請求項１３に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項１５】
前記単一ドメイン抗体が、ＥＧＦＲに対して特異的である、請求項１４に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項１６】
肝臓からアデノウイルスを脱標的化するための少なくとも１つの改変を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項１７】
ヘキソンタンパク質中に変異を含む、請求項１６に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項１８】
前記ヘキソン変異が、Ｅ４５１Ｑ変異である、請求項１７に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項１９】
肝臓特異的マイクロＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位をさらに含む、請求項１６から１８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２０】
前記肝臓特異的マイクロＲＮＡのための前記１つまたは複数の結合部位が、Ｅ１Ａの３’−ＵＴＲ中に位置する、請求項１９に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２１】
前記肝臓特異的マイクロＲＮＡがｍｉＲ−１２２である、請求項１９または請求項２０に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２２】
キメラファイバータンパク質をコードする、請求項１から２１のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２３】
前記キメラファイバータンパク質が、第１のアデノウイルス血清型由来のファイバーシャフトと、第２のアデノウイルス血清型由来のファイバーノブとを含む、請求項２２に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２４】
前記第１のアデノウイルス血清型がＡｄ５であり、前記第２のアデノウイルス血清型が、Ａｄ３、Ａｄ９、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ３４またはＡｄ３７である、請求項２３に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２５】
前記第１のアデノウイルス血清型がＡｄ５であり、前記第２のアデノウイルス血清型がＡｄ３４である、請求項２３に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２６】
前記Ａｄ３４ファイバーノブが、ＣＤ４６との結合を妨げる、または阻害する改変を含む、請求項２５に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２７】
ＲＧＤペプチドを含むように改変されたファイバータンパク質をコードする、請求項１から２５のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２８】
異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含む、請求項１から２７のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項２９】
前記異種ＯＲＦが、レポーター遺伝子を含む、請求項２８に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項３０】
前記異種ＯＲＦが、治療用遺伝子を含む、請求項２８に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項３１】
前記異種ＯＲＦが、自己切断ペプチドコード配列および前記ＡＤＰコード配列と同じリーディングフレーム内に、それと作動可能に連結している、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項３２】
前記自己切断ペプチドが、２Ａペプチドである、請求項３１に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項３３】
前記２Ａペプチドが、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）ペプチドまたはＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチドを含む、請求項３２に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項３４】
前記ゲノムの前記ヌクレオチド配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７または配列番号５９に対して少なくとも９５％同一である、請求項１に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項３５】
前記ゲノムの前記ヌクレオチド配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７または配列番号５９に対して少なくとも９９％同一である、請求項１に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項３６】
前記ゲノムの前記ヌクレオチド配列が、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７または配列番号５９を含む、請求項１に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項３７】
請求項１から３６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含む、単離された細胞。
【請求項３８】
請求項１から３６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノムまたは請求項３７に記載の単離された細胞と、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項３９】
請求項１から３６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含む単離されたアデノウイルス。
【請求項４０】
請求項３９に記載の組換えアデノウイルスと、薬学的に許容される担体とを含む、組成物。
【請求項４１】
腫瘍細胞の生存度を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞を、請求項１から３６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム、請求項３９に記載のアデノウイルスまたは請求項３８もしくは請求項４０に記載の組成物と接触させることを含む、方法。
【請求項４２】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ法である、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記方法が、ｉｎ  ｖｉｖｏ法であり、前記腫瘍細胞を接触させることが、治療有効量の、前記組換えアデノウイルスゲノム、前記アデノウイルスまたは前記組成物を、腫瘍を有する被験体に投与することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
被験体における腫瘍の進行を阻害するかまたは腫瘍の体積を低減させる方法であって、前記被験体に、治療有効量の、請求項１から３６のいずれか一項に記載の前記組換えアデノウイルスゲノム、請求項３９に記載のアデノウイルスまたは請求項３８もしくは請求項４０に記載の組成物を投与し、それによって、前記被験体における腫瘍の進行を阻害するか、または腫瘍の体積を低減させることを含む、方法。
【請求項４５】
被験体におけるがんを処置する方法であって、前記被験体に、治療有効量の、請求項１から３６のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノム、請求項３９に記載の組換えアデノウイルスまたは請求項３８もしくは請求項４０に記載の組成物を投与し、それによって、前記被験体におけるがんを処置することを含む、方法。
【請求項４６】
前記ゲノムの前記ヌクレオチド配列が、配列番号２、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５５、配列番号５６または配列番号５８に対して少なくとも９５％同一である、組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項４７】
前記ゲノムの前記ヌクレオチド配列が、配列番号２、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５５、配列番号５６または配列番号５８に対して少なくとも９９％同一である、請求項４６に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項４８】
前記ゲノムの前記ヌクレオチド配列が、配列番号２、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５５、配列番号５６または配列番号５８を含む、請求項４６に記載の組換えアデノウイルスゲノム。
【請求項４９】
請求項４６から４８のいずれか一項に記載の組換えアデノウイルスゲノムを含む単離されたアデノウイルス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１８年４月９日に出願された米国仮出願第６２／６５５，００９号（その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）の利益を主張する。
【０００２】
分野
本開示は、ウイルス複製を増強する、Ｅ３領域中の欠失またはその他の改変を有する腫瘍選択的組換えアデノウイルスに関する。本開示は、がん処置のための組換えアデノウイルスの使用にさらに関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
がんは、毎年５０万人超の死亡の主な原因である複合な、衰弱性疾患である。がんのためのより有効な、選択的な、安全な処置が大いに必要である。化学療法および手術などの既存の処置は、すべての悪性細胞を排除することはまれであり、治療利益を上回り得る有害な副作用を示すことも多い。
【０００４】
現在のがん処置の欠点の多くに対処する可能性を有する１つのアプローチとして、腫瘍溶解性アデノウイルス療法がある（Pesonen  et  al.,  Molecular  Pharmaceutics  8(1):12-28,  2010）。アデノウイルス（Ａｄ）は、自己複製性生物学的機械である。アデノウイルスは、タンパク質コートで覆われた直鎖二本鎖３６ｋｂ  ＤＮＡゲノムからなる。アデノウイルスは、細胞の複製機構に侵入し、乗っ取って複製し、組み立てられると、溶解性細胞死を誘導して、周囲の細胞に広がる。これらの極めて同一の細胞制御が、がんでは変異による標的とされる。この知見を利用して、誘導ミサイルのように働く、腫瘍細胞に特異的に感染し、複製し、細胞を溶解して、可能性ある耐性を克服しながら遠位転移を見つけ出し、破壊できる数千のウイルス後代を放出する合成ウイルスを作出できる。したがって、腫瘍溶解性ウイルス設計の目的は、がん細胞において特異的に複製するが、正常細胞は無傷のまま残すウイルスを作製することである。しかし、がん細胞において選択的に複製し得るウイルスの設計には大きな課題があった。したがって、高効率でがん細胞において選択的に複製するウイルスが依然として必要である。さらに、多数の腫瘍溶解性ウイルスが、臨床試験においてヒトがん患者で安全が証明されているが、ほとんどは、進行がんの処置における有効性で欠けていた。そのようなものとして、依然として、現在の最先端技術と比較して増強された効力を有するウイルスを開発する必要がある。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Pesonen  et  al.,  Molecular  Pharmaceutics  8(1):12-28,  2010
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
要旨
腫瘍細胞において増強された複製動態を示す組換えアデノウイルスが開示される。腫瘍細胞において複製が増強された組換えアデノウイルスをコードする組換えアデノウイルスゲノムも記載される。
【０００７】
改変されたＥ１Ａタンパク質をコードするＥ１Ａ領域と、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）をコードし、１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋから選択される少なくとも３つのＥ３遺伝子のコード配列中に改変を有し、改変が、コードされるタンパク質の発現を妨げるＥ３領域と、Ｅ４ｏｒｆ６／７コード配列の改変（欠失など）を含むＥ４領域とを含む組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において提供される。
【０００８】
一部の実施形態では、組換えアデノウイルスゲノムは、標的化リガンドをさらにコードする、キメラファイバータンパク質をさらにコードする、肝臓からアデノウイルスを脱標的化するための少なくとも１つの改変をさらに含む、異種オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）をさらに含む、Ｅ４ｏｒｆ３の欠失をさらに含む、またはそれらの任意の組合せである。
【０００９】
本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノムを含む単離された細胞が、さらに提供される。また、組換えアデノウイルスゲノムを含む組成物も提供される。
【００１０】
本明細書において開示される組換えアデノウイルスを含む組成物と同様に、組換えアデノウイルスゲノムによってコードされる組換えアデノウイルスが、さらに提供される。
【００１１】
腫瘍細胞を、本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノム、組換えアデノウイルスまたは組成物と接触させることによって、腫瘍細胞の生存度を阻害する方法が、さらに提供される。
【００１２】
また、被験体に、治療有効量の、本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノム、組換えアデノウイルスまたは組成物を投与することによって、被験体における腫瘍の進行を阻害するかまたは腫瘍の体積を低減させる方法および被験体におけるがんを処置する方法も提供される。
【００１３】
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９のうちいずれか１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列を有する組換えアデノウイルスゲノムも記載される。配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８および５９のうちいずれか１つに対して少なくとも９５％同一であるヌクレオチド配列によってコードされる組換えアデノウイルスが、さらに記載される。
【００１４】
本開示の上述およびその他の目的および特性は、以下の詳細な説明、続いて添付の図面への参照により、さらに明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、Ａ５４９肺がん細胞におけるＷＴ  Ａｄ５レポーターウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１およびＥ３欠失ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４の複製を比較する一対のグラフである。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４の７つのＥ３遺伝子のうちの６つの欠失は、ＷＴウイルスと比較して強化された複製をもたらした。
【００１６】
【図２】図２は、腫瘍溶解性ウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２１（Ｅ３遺伝子ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋを欠く）の複製動態を、６つのＥ３遺伝子（ＲＩＤα、ＲＩＤβ、４．７ｋ、１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９．ｋ）を欠いている対応するウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ８１９と比較する一対のグラフおよび表である。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８１９は、試験した全てのがん細胞株において優れた複製を示した。
【００１７】
【図３】図３は、コクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）陰性細胞におけるＷＴＡｄ５レポーターウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１の複製動態をＡｄＳｙｎ−ＣＯ９６４と示す一対のグラフである。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９６４は、Ａｄ５シャフトおよびＡｄ３４ノブで構成されるキメラファイバータンパク質を発現する合成Ａｄ５ウイルスである。Ａｄ３４ノブドメインの発現は、ＣＡＲ陰性細胞におけるウイルス複製の強化につながった。
【００１８】
【図４】図４は、ＣＡＲ陰性細胞における、Ｅ３欠失腫瘍溶解性のＡｄ５（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００）の複製を、Ａｄ３４ノブドメイン（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２）を発現する、対応するＥ３欠失腫瘍溶解性ウイルスと比較する一対のグラフである。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は、複数の細胞株においてＡｄ５ノブ発現ウイルスと比較して強化された複製動態を示した。
【００１９】
【図５】図５Ａ〜５Ｂは、Ａ５４９肺腫瘍異種移植モデルにおけるＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２のｉｎ  ｖｉｖｏ効能を示す一対のグラフである。乳房皮下脂肪に５×１０６細胞を注入することによって、ヒトＡ５４９腫瘍細胞をヌードマウスに接種した。腫瘍が約１６４ｍｍ３の平均体積に到達したとき（０日目）、マウスを異なる処置群（１群につきｎ＝８マウス）に無作為化した。マウスに、ＰＢＳ（食塩水）の単一の腫瘍内（ＩＴ）注射または示したウイルスの８×１０６ＰＦＵの単一の注射を与えた。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１はＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合としてＹＰｅｔ蛍光団をコードするが、さもなければ野生型Ａｄ５である。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００（図５Ａ）およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２（図５Ｂ）の両方は、「野生型」ＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１と比較して強化された抗腫瘍活性を示した。
【００２０】
【図６】図６は、正常位ＨＳ５７８Ｔトリプルネガティブ乳がんモデルにおけるＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２のｉｎ  ｖｉｖｏ効能を示すグラフである。右の乳房皮下脂肪に１００μｌのＨＢＳＳ中の５×１０６細胞を注入することによって、ヒトＨＳ５７８Ｔ腫瘍細胞を７週齢ＮＳＧマウスに接種した。腫瘍が約１６８ｍｍ３の平均体積に到達したとき（０日目）、マウスを異なる処置群（１群につきｎ＝８マウス）に無作為化した。マウスに、０、７および１４日目に５０μｌの全体積のＰＢＳ（食塩水）またはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２（２×１０８ＰＦＵ）の３用量を与えた。食塩水処置群の全ての動物は、腫瘍負荷のために３０日目以前に屠殺しなければならなかった。
【００２１】
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組換えアデノウイルスの安全性および毒性の研究の結果を示すグラフである。０日目および再び７日目に異なる群のマウス（１群につきｎ＝５マウス）に、２００μｌの体積の４つの異なるウイルスを示した用量で静脈内投与した。肝臓毒性を調査するために、生存（図７Ａ）および上昇した肝酵素（図７Ｂ）についてマウスを次に分析した。（図７Ａ）生存および毒性の肉眼的徴候について、マウスを１４日目までモニタリングした。ＷＴ  Ａｄ５は４×１０９ＰＦＵの用量で致死性の毒性を引き起こしたが、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３１はこの用量で許容された。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は、２×１０１０ＰＦＵのさらにより高い用量でも許容された。（図７Ｂ）血液試料を−２日目（投与前）、２日目（投与１の４８時間後）および９日目（投与２の４８時間後）に全てのマウスから採取し、以降の分析のために冷凍した。血液試料は、様々な肝酵素、例えばアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の存在について調査した。示す結果は、様々な処置群からの２日目の出血からの平均ＡＳＴおよびＡＬＴレベルである。全てのマウスからのＡＳＴおよびＡＬＴの平均投与前レベルも示す。
【図７Ｂ】図７Ａ〜７Ｂは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおける組換えアデノウイルスの安全性および毒性の研究の結果を示すグラフである。０日目および再び７日目に異なる群のマウス（１群につきｎ＝５マウス）に、２００μｌの体積の４つの異なるウイルスを示した用量で静脈内投与した。肝臓毒性を調査するために、生存（図７Ａ）および上昇した肝酵素（図７Ｂ）についてマウスを次に分析した。（図７Ａ）生存および毒性の肉眼的徴候について、マウスを１４日目までモニタリングした。ＷＴ  Ａｄ５は４×１０９ＰＦＵの用量で致死性の毒性を引き起こしたが、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３１はこの用量で許容された。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は、２×１０１０ＰＦＵのさらにより高い用量でも許容された。（図７Ｂ）血液試料を−２日目（投与前）、２日目（投与１の４８時間後）および９日目（投与２の４８時間後）に全てのマウスから採取し、以降の分析のために冷凍した。血液試料は、様々な肝酵素、例えばアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の存在について調査した。示す結果は、様々な処置群からの２日目の出血からの平均ＡＳＴおよびＡＬＴレベルである。全てのマウスからのＡＳＴおよびＡＬＴの平均投与前レベルも示す。
【００２２】
【図８】図８は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００の毒性を示す表である。０日目、６日目および１２日目に異なる群のマウス（１群につきｎ＝５マウス）に、２００μｌの体積の２つの異なるウイルスを示した用量で静脈内投与した。毒性を調査するために、マウスを次に生存について分析した。ＷＴ  Ａｄ５は０．８×１０９ＰＦＵの用量で５匹のマウスのうちの２匹において致死性の毒性を誘導し、３．２×１０９ＰＦＵのより高い用量で全てのマウスを死滅させたのに対して、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００は１×１０９ＰＦＵおよび４×１０９ＰＦＵのわずかにより高い用量でより安全であった。
【００２３】
【図９】図９は、Ａ５４９肺腫瘍異種移植モデルにおける静脈内送達されたＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２のｉｎ  ｖｉｖｏ効能を示すグラフである。乳房皮下脂肪に５×１０６細胞を注入することによって、ヒトＡ５４９腫瘍細胞をＮＳＧマウスに接種した。腫瘍が約１８４ｍｍ３の平均体積に到達したとき（０日目）、マウスを異なる処置群（１群につきｎ＝８マウス）に無作為化した。マウスに、ＰＢＳ（食塩水）の単一の注射またはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２の２×１０９ＰＦＵの単一のＩＶ注射を与えた。食塩水処置群の全ての動物は、腫瘍負荷のために３３日目以前に屠殺しなければならなかった。野生型Ａｄ５は２×１０９ＰＦＵの用量で送達できなかったが、その理由は、この用量が死をもたらすからである。
【００２４】
【図１０】図１０は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２の腫瘍選択的複製を示すグラフのセットである。ヒトＡ５４９細胞（肺腫瘍）またはヒト初代小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ−正常肺）を、４つの異なる腫瘍溶解性ウイルスによって１細胞につき０．１２ウイルス粒子のＭＯＩで感染させた。全てのウイルスは、ウイルス複製／増大の経時的定量化を可能にするレポーターとして、ＹＰｅｔ蛍光団をコードする。ウイルス感染の直後に、６〜７日間にわたってＹＰｅｔ＋ウイルス感染細胞の数を定量化するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ画像化システムにおいて１時間ごとに１回、ウイルス感染細胞を画像化した。データは、経時的なＹＰｅｔ＋細胞の数として表される。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００が腫瘍選択的複製を付与するΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７変異ならびに肝臓脱標的化ヘキソン変異を有すること以外は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００は同一のウイルスである。同様に、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２がΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７変異ならびに肝臓脱標的化ヘキソン変異を有すること以外は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は同一のウイルスである。腫瘍細胞では、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１とそれぞれ比較してウイルス増大／複製の類似したレベルを示した。しかし正常肺細胞では、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１と比較して有意に減弱された増大／複製を示した。
【００２５】
【図１１】図１１は、アデノウイルス複製に及ぼすＥ３Ｂ領域の欠失または抑止の影響を実証する棒グラフである。ヒトＡ５４９肺腫瘍細胞における複製速度を判定するために、蛍光ベースのウイルス動態学的（ＦＢＶＫ）アッセイを使用して４つの異なる組換えウイルスを調査した。グラフは、Ｙｐｅｔ蛍光性タンパク質をコードする各組換えアデノウイルスのｌｎ−ｓｌｏｐｅ値を示す。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８６９では、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子（Ｅ３Ｂ遺伝子）は、全てゲノムから欠失していた。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９９６では、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子（Ｅ３Ｂ遺伝子）の発現は、開始コドンを変異させることによって、または未熟停止コドンをコードするようにゲノムを変異させることによって抑止されていた。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４では、６つのＥ３遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ）は、ゲノムから欠失していた。
【００２６】
【図１２】図１２は、アデノウイルス複製に及ぼすＥ３Ａ領域の欠失または抑止の影響を示す棒グラフである。ヒトＡ５４９肺腫瘍細胞における複製速度を判定するために、ＦＢＶＫアッセイで４つの異なるウイルスを調査した。グラフは、Ｙｐｅｔ蛍光性タンパク質をコードする各組換えアデノウイルスのｌｎ−ｓｌｏｐｅ値を示す。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１００２では、１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９ｋ遺伝子（Ｅ３Ａ遺伝子）は、全てゲノムから欠失していた。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９９９では、同じＥ３Ａ遺伝子が欠失し、このウイルスはＥ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７およびヘキソン［Ｅ４５１Ｑ］改変をさらに含む。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００では、Ｅ３ＡおよびＥ３Ｂ遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ）はゲノムから欠失し、このウイルスはＥ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７およびヘキソン［Ｅ４５１Ｑ］改変をさらに含む。
【００２７】
【図１３】図１３は、Ｅ４ｏｒｆ３の欠失がウイルス複製に影響を及ぼさないことを示す棒グラフである。Ａ５４９ヒト肺腫瘍細胞における複製速度を判定するために、ＦＢＶＫアッセイで２つのウイルスを調査した。棒グラフは、各組換えアデノウイルスのｌｎ−ｓｌｏｐｅ値を示す。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３４７は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３４７におけるＥ４ｏｒｆ３の欠失を除いて同一である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
配列表
添付の配列表に列挙されている核酸配列およびアミノ酸配列は、３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．１．８２２に定義されるように、ヌクレオチド塩基の標準的な略字およびアミノ酸の３文字コードを使用して示されている。それぞれの核酸配列の一方の鎖のみが示されているが、相補鎖は、提示された鎖に対する任意の参照により含まれると理解される。配列表は、２０１９年４月８日に作成された１．３６ＭＢのＡＳＣＩＩテキストファイルとして提出されており、参照により本明細書に組み込まれる。添付の配列表においては、以下の通りである。
配列番号１は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３５のヌクレオチド配列である。
配列番号２は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２１のヌクレオチド配列である。
配列番号３は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２０のヌクレオチド配列である。
配列番号４は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ８１９のヌクレオチド配列である。
配列番号５は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２０のヌクレオチド配列である。
配列番号６は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４のヌクレオチド配列である。
配列番号７は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００のヌクレオチド配列である。
配列番号８は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０６７のヌクレオチド配列である。
配列番号９は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０６８のヌクレオチド配列である。
配列番号１０は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０６９のヌクレオチド配列である。
配列番号１１は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ９６４のヌクレオチド配列である。
配列番号１２は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１のヌクレオチド配列である。
配列番号１３は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２のヌクレオチド配列である。
配列番号１４は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１１３９のヌクレオチド配列である。
配列番号１５は、Ｐ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号１６は、Ｆ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号１７は、Ｅ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号１８は、Ｔ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号１９は、Ｎ末端にＧＳＧを含む改変されたＰ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号２０は、Ｎ末端にＧＳＧを含む改変されたＦ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号２１は、Ｎ末端にＧＳＧを含む改変されたＥ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号２２は、Ｎ末端にＧＳＧを含む改変されたＴ２Ａのアミノ酸配列である。
配列番号２３は、Ａｄ５  Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。
配列番号２４は、Ａｄ５  Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥのアミノ酸配列である。
配列番号２５は、Ａｄ５  Ｅ１Ａ  Ｃ１２４Ｇのアミノ酸配列である。
配列番号２６は、Ａｄ５  Ｅ１Ａ  Δ２−１１のアミノ酸配列である。
配列番号２７は、Ａｄ５  Ｅ１Ａ  Ｙ４７Ｈ  Ｃ１２４Ｇのアミノ酸配列である。
配列番号２８は、Ａｄ５  Ｅ１Ａ  Δ２−１１  Ｙ４７Ｈ  Ｃ１２４Ｇのアミノ酸配列である。
配列番号２９は、Ａｄ５  Ｅ４ｏｒｆ６／７のアミノ酸配列である。
配列番号３０は、Ａｄ５ファイバーのアミノ酸配列である。
配列番号３１は、Ａｄ５  ＦＲＢ−ファイバーのアミノ酸配列である。
配列番号３２は、Ａｄ５  ＦＲＢ＊−ファイバーのアミノ酸配列である。
配列番号３３は、ＥＧＦＲＶＨＨ−ＧＳ−ＦＫＢＰのアミノ酸配列である。
配列番号３４は、Ａｄ５ヘキソンのアミノ酸配列である。
配列番号３５は、Ａｄ５ヘキソンＥ４５１Ｑのアミノ酸配列である。
配列番号３６は、種Ａ（Ａｄ１２）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。
配列番号３７は、種Ｂ（Ａｄ７）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。
配列番号３８は、種Ｃ（Ａｄ２）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。
配列番号３９は、種Ｃ（Ａｄ５）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。
配列番号４０は、種Ｄ（Ａｄ９）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。
配列番号４１は、種Ｅ（Ａｄ４）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。
配列番号４２は、種Ｆ（Ａｄ４０）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。
配列番号４３は、種Ｇ（Ａｄ５２）Ｅ１Ａのアミノ酸配列である。
配列番号４４は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１のヌクレオチド配列である。
配列番号４５は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０５６のヌクレオチド配列である。
配列番号４６は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１２５０のヌクレオチド配列である。
配列番号４７は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０８９のヌクレオチド配列である。
配列番号４８は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３２０のヌクレオチド配列である。
配列番号４９は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３２１のヌクレオチド配列である。
配列番号５０は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３２５のヌクレオチド配列である。
配列番号５１は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３４２のヌクレオチド配列である。
配列番号５２は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３６２のヌクレオチド配列である。
配列番号５３は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１４０３のヌクレオチド配列である。
配列番号５４は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１４０４のヌクレオチド配列である。
配列番号５５は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ８６９のヌクレオチド配列である。
配列番号５６は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ９９６のヌクレオチド配列である。
配列番号５７は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ９９９のヌクレオチド配列である。
配列番号５８は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１００２のヌクレオチド配列である。
配列番号５９は、合成アデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３４７のヌクレオチド配列である。
配列番号６０は、Ａｄ３４ファイバーのアミノ酸配列である。
【００２９】
Ｉ．略語
Ａｄ  アデノウイルス
ＡＤＰ  アデノウイルス死タンパク質
ＣＡＲ  コクサッキーアデノウイルス受容体
ＥＧＦＲ  上皮増殖因子受容体
ＥＲＡＶ  ウマ鼻炎Ａウイルス
ＦＢＶＫ  蛍光に基づくウイルス動態
ＦＫＢＰ  ＦＫ５０６結合タンパク質
ＦＭＤＶ  口蹄疫ウイルス（ｆｏｏｄ  ａｎｄ  ｍｏｕｔｈ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｖｉｒｕｓ）
ＦＲＢ  ＦＫＢＰ−ラパマイシン結合
ＩＶ  静脈内
ＩＴ  腫瘍内
ｍｉＲ  マイクロＲＮＡ
ＭＯＩ  感染多重度
ｍＴＯＲ  ラパマイシンの哺乳動物標的
ＯＲＦ  オープンリーディングフレーム
ＰＳＡ  前立腺特異的抗原
ＰＴＶ１  ブタテッショウウイルス−１
Ｒｂ  網膜芽細胞腫
ＲＧＤ  アルギニン−グリシン−アスパラギン酸
ＴａＶ  Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス
ＵＴＲ  非翻訳領域
ＷＴ  野生型
【００３０】
ＩＩ．用語および方法
別途注記されない限り、技術用語は、従来の使用法に従って使用される。分子生物学における一般用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓによって１９９４年に刊行されたＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．によって１９９４年に刊行されたＫｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，  Ｉｎｃ．によって１９９５年に刊行されたＲｏｂｅｒｔ  Ａ．  Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：  ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見出すことができる。
【００３１】
本開示の様々な実施形態の考察を容易にするために、特定の用語の説明を、以下に提供する。
【００３２】
２Ａペプチド：一部のＲＮＡウイルス、例えば、ピコルナウイルスによってコードされる自己切断ペプチドの一種である。２Ａペプチドは、リボソームが２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするようにし、２Ａ配列の末端と下流のペプチドとの分離をもたらすことによって機能する（Ｋｉｍら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６巻（４号）、ｅ１８５５６、２０１１年）。「切断」は、２ＡペプチドのＣ末端に見出されるグリシン残基とプロリン残基との間に生じる。例示的な２Ａペプチドとしては、本明細書において配列番号１５〜１８として記載されている、Ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）、および口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）によってコードされる２Ａペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。一部の実施形態では、２Ａペプチドは、切断効率を改善するために、Ｎ末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを含む（配列番号１９〜２２）。
【００３３】
アデノウイルス：線形二本鎖ＤＮＡゲノムおよび正二十面体キャプシドを有する、非エンベロープ型ウイルスである。ヒトアデノウイルスには、少なくとも６８種類の血清型が公知であり、７つの種（種Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ、およびＧ）に分類される。異なる血清型のアデノウイルスは、異なる種類の疾患と関連付けられており、一部の血清型は、呼吸器疾患（主として種ＢおよびＣ）、結膜炎（種ＢおよびＤ）、ならびに／または胃腸炎（種ＦおよびＧ）を引き起こす。
【００３４】
アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）：他の細胞に感染するために細胞の溶解およびアデノウイルスの放出を媒介する、アデノウイルス感染の後期に合成されるタンパク質である。ＡＤＰは、核膜、小胞体、およびゴルジ体に局在化する、１０１個のアミノ酸の内在性膜糖タンパク質である。ＡＤＰは、以前、Ｅ３−１１．６Ｋと称されていた）。
【００３５】
投与：被験体に、治療剤（例えば、組換えウイルスまたは組換えウイルスゲノム）などの薬剤を、任意の有効な経路によって提供することまたは与えることである。例示的な投与経路としては、注射（皮下、筋肉内、皮内、腹腔内、腫瘍内、骨内および静脈内など）、経口、管内、舌下、直腸、経皮、鼻内、膣、および吸入の経路が挙げられるが、これらに限定されない。
【００３６】
抗体：抗原のエピトープを認識し、結合する（例えば、特異的に認識し、特異的に結合する）、少なくとも軽鎖および／または重鎖免疫グロブリン可変領域を含むポリペプチドリガンド。免疫グロブリン分子は、重鎖および軽鎖から構成され、その各々は、重鎖可変（ＶＨ）領域および軽鎖可変（ＶＬ）領域と呼ばれる可変領域を有し、それらは一緒になって抗体によって認識される抗原を結合することに関与している。抗体は、無傷の免疫グロブリンおよび抗体のバリアントおよび一部（断片）、例えば、単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨドメイン抗体またはラクダ科ＶＨＨ抗体）、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ）’２断片、一本鎖Ｆｖタンパク質（「ｓｃＦｖ」）およびジスルフィド安定化Ｆｖタンパク質（「ｄｓＦｖ」）を含む。ｓｃＦｖタンパク質は、免疫グロブリンの軽鎖可変領域および免疫グロブリンの重鎖可変領域がリンカーによって結合されている融合タンパク質であり、一方ｄｓＦｖでは、鎖の会合を安定化するためにジスルフィド結合を導入するように、鎖が変異されている。「抗体」という用語はまた、遺伝子操作された形態、例えば、キメラ抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）およびヘテロコンジュゲート抗体も含む（例えば、二重特異性抗体）。Pierce  Catalog  and  Handbook,  1994-1995  (Pierce  Chemical  Co.,  Rockford,  IL);  Kuby,  J.,  Immunology,  3rd  Ed.,  W.  H.  Freeman  &  Co.,  New  York,  1997も参照のこと。
【００３７】
化学療法剤：異常な細胞成長によって特徴付けられる疾患の処置において治療的有用性を有する任意の化学薬剤。このような疾患として、腫瘍、新生物およびがんならびに過形成性成長によって特徴付けられる疾患、例えば、乾癬が挙げられる。一実施形態では、化学療法剤は、放射性化合物である。一実施形態では、化学療法剤は、生物製剤、例えば、治療用モノクローナル抗体（例えば、ＰＤ−１、ＰＤＬ−１、ＣＴＬＡ−４、ＥＧＦＲ、ＶＥＧＦに対して特異的なものなど）である。当業者は、有用である化学療法剤を容易に同定することができる（例えば、Slapak  and  Kufe,  Principles  of  Cancer  Therapy,  Chapter  86  in  Harrison's  Principles  of  Internal  Medicine,  14th  edition;  Perry  et  al.,  Chemotherapy,  Ch.  17  in  Abeloff,  Clinical  Oncology  2nd  ed.,  (C)  2000  Churchill  Livingstone,  Inc;  Baltzer,  L.,  Berkery,  R.  (eds.):  Oncology  Pocket  Guide  to  Chemotherapy,  2nd  ed.  St.  Louis,  Mosby-Year  Book,  1995;  Fischer,  D.S.,  Knobf,  M.F.,  Durivage,  H.J.  (eds):  The  Cancer  Chemotherapy  Handbook,  4th  ed.  St.  Louis,  Mosby-Year  Book,  1993を参照されたい）。併用化学療法は、がんを処置するための１種を超える薬剤の投与である。
【００３８】
キメラ：起源が異なる少なくとも２つの部分から構成されるものである。本開示の文脈において、「キメラアデノウイルス」とは、少なくとも２つの異なる血清型に由来する（例えば、Ａｄ５および第２の血清型のアデノウイルスに由来する）遺伝物質および／またはタンパク質を有するアデノウイルスである。この文脈において、「キャプシド交換型」アデノウイルスとは、キャプシドタンパク質が、１つの血清型のアデノウイルスに由来し、残りのタンパク質が、別のアデノウイルス血清型に由来する、キメラアデノウイルスを指す。同様に、「キメラファイバー」とは、少なくとも２つの異なる血清型のアデノウイルスに由来するアミノ酸配列を有するファイバータンパク質である。例えば、キメラファイバーは、Ａｄ５由来のファイバーシャフトおよび第２の血清型のアデノウイルス（例えば、Ａｄ３４）に由来するファイバーノブから構成され得る。
【００３９】
接触させること：直接的な物理的会合におくことであり、固体形態および液体形態の両方を含む。
【００４０】
欠失：アデノウイルスタンパク質コード配列（例えば、Ｅ４ｏｒｆ６／７コード配列）の「欠失」を含むアデノウイルスゲノムとは、タンパク質コード配列の完全欠失またはタンパク質の発現がないことをもたらす部分欠失を有するアデノウイルスを指す。
【００４１】
脱標的化された：本開示の文脈では、「脱標的化された」アデノウイルスは、特定の細胞または組織種にもはや感染しない、またはもはや実質的に感染しないような、ウイルスの親和性を変更する１つまたは複数の改変を含む、組換えまたは合成アデノウイルスである。一部の実施形態では、組換えまたは合成アデノウイルスは、キャプシド変異、例えば、肝臓からウイルスを脱標的化するヘキソンタンパク質における変異（例えば、Ｅ４５１Ｑ）を含む。一部の実施形態では、組換えまたは合成アデノウイルスは、特定の細胞または組織種に天然に感染しない、または実質的に感染しないアデノウイルスに由来する天然キャプシドを含む。本明細書における一部の実施形態では、組換えまたは合成アデノウイルスは、肝臓脱標的化される、および／または脾臓脱標的化される。
【００４２】
Ｅ１Ａ：アデノウイルス初期領域１Ａ（Ｅ１Ａ）遺伝子およびこの遺伝子から発現されるポリペプチドである。Ｅ１Ａタンパク質は、細胞を、細胞周期に入れることによって、ウイルスゲノム複製における役割を果たす。本明細書において使用されるとき、「Ｅ１Ａタンパク質」という用語は、Ｅ１Ａ遺伝子から発現されるタンパク質を指し、この用語には、あらゆるアデノウイルス血清型によって産生されるＥ１Ａタンパク質が含まれる。例として、野生型Ａｄ５  Ｅ１Ａタンパク質のアミノ酸配列は、配列番号２３として本明細書に示されており、改変されたＡｄ５  Ｅ１Ａ配列は、配列番号２４〜２８として本明細書において提供される。さらに、様々な異なるアデノウイルス血清型に由来する野生型Ｅ１Ａタンパク質配列は、配列番号３６〜４３として本明細書において示されている。一部の実施形態では、改変されたＥ１Ａタンパク質は、配列番号２４、２５、２６、２７、２８、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２または４３のうちいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。本明細書において企図される改変されたＥ１Ａタンパク質は、腫瘍細胞と比較して正常細胞における組換えアデノウイルスの複製欠損に寄与するものである。本明細書において開示される改変されたＥ１Ａタンパク質は、Ａｄ５  Ｅ１Ａタンパク質である。しかし、任意の所望の血清型において対応する改変を行うことができ、従って、本開示によって包含される。例えば、ヒトアデノウイルスのすべての種が、ＬＸＣＸＥモチーフを含有し、Ａｄ５では、ＬＴＣＨＥに対応する（配列番号２３の残基１２２〜１２６）。同様に、残基２〜１１の欠失およびＹ４７ＨおよびＣ１２４Ｇ置換は、Ａｄ５（例えば、配列番号５）に関して番号付けられているが、任意の他の血清型に導入され得る。
【００４３】
Ｅ３：アデノウイルス初期領域３（Ｅ３）遺伝子および遺伝子から発現されるポリペプチドである。ヒトアデノウイルスでは、７種のＥ３タンパク質（５’から３’にコードされる）：１２．５ｋ（ｇｐ１２．５ｋＤａとしても知られる）、６．７ｋ（ＣＲ１αとしても知られる）、１９ｋ（ｇｐ１９ｋとしても知られる）、ＡＤＰ（ＣＲ１βまたは１１．６ｋとしても知られる）、ＲＩＤα（１０．４ｋ）、ＲＩＤβ（１４．９ｋ）および１４．７Ｋがある。ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋタンパク質は、受容体内部移行分解複合体（ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ  ｃｏｍｐｌｅｘ）（ＲＩＤ）を成し、これが、核膜に局在化し、感染した細胞を宿主の抗ウイルス応答から保護するように、ＣＤ９５（ＦａｓＬ受容体）ならびにＴＮＦＲ１および２（ＴＮＦ／ＴＲＡＩＬ受容体）を含む様々な受容体のエンドサイトーシスおよび分解を引き起こす。６．７ｋタンパク質は、感染細胞のアポトーシスモジュレーションに関与し、１９ｋタンパク質は、感染宿主細胞膜においてクラスＩ  ＭＨＣタンパク質の挿入を阻害することが公知である。ＡＤＰは、感染細胞の溶解を媒介する。１２．５ｋタンパク質の機能は、未知である。本明細書で使用される場合、Ｅ３Ａ遺伝子は、１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９ｋ遺伝子を含み、Ｅ３Ｂ遺伝子は、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子を含む。本明細書において一部の実施形態では、組換えアデノウイルスゲノムは、Ｅ３Ａ遺伝子の欠失、Ｅ３Ｂ遺伝子の欠失または両方を含む。他の実施形態では、組換えアデノウイルスゲノムは、Ｅ３Ａ遺伝子もしくはＥ３Ｂ遺伝子、または両方のコード配列中に変異を含み、その結果、変異が、コードされるタンパク質の発現を妨げる。
【００４４】
Ｅ４：アデノウイルス初期領域３（Ｅ４）遺伝子および遺伝子によって発現されるポリペプチドである。ヒトアデノウイルスでは、Ｅ４領域は、Ｅ４ｏｒｆ１、Ｅ４ｏｒｆ２、Ｅ４ｏｒｆ３、Ｅ４ｏｒｆ４、Ｅ４ｏｒｆ６およびＥ４ｏｒｆ６／７を含む少なくとも６種のタンパク質をコードする。本明細書における一部の実施形態では、組換えアデノウイルスゲノムは、Ｅ４ｏｒｆ６／７の欠失を含む。一部の例では、組換えアデノウイルスゲノムは、Ｅ４ｏｒｆ３の欠失をさらに含む。
【００４５】
Ｅ４ｏｒｆ６／７：アデノウイルスＥ４遺伝子によってコードされるタンパク質である。「Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質」という用語は、任意のアデノウイルス血清型に由来するＥ４遺伝子によって産生されるＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質を含む。例として、野生型Ａｄ５  Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質のアミノ酸配列が、配列番号２９として本明細書に示されている。一部の実施形態では、Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、配列番号２９のうちいずれか１つに対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％の配列同一性を有するタンパク質を含む。本明細書において企図される改変されたＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、腫瘍細胞と比較して正常細胞において組換えアデノウイルスの複製欠損に寄与するものである。一部の実施形態では、改変されたＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、そのＥ２Ｆ結合部位を無効にするかもしくは損なう、および／またはＥ２Ｆ相互作用を損なう変異（例えば、欠失）を含む。他の実施形態では、改変されたＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、Ｅ２Ｆ４の効率的な転座に必要である核局在化シグナルを欠失するかまたは損なう改変を含む。Ｅ４ｏｒｆ６／７の例示的改変を、以下の節においてさらに論じる。
【００４６】
上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）：細胞外タンパク質リガンドのＥＧＦファミリーのメンバーの細胞表面受容体である。ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ−１およびＨＥＲ１としても公知である。多数の種類のがんが、ＥＧＦＲの過剰発現につながる変異を含有する。
【００４７】
ファイバー：アデノウイルスのファイバータンパク質は、細胞表面受容体への結合を媒介する、三量体タンパク質である。ファイバータンパク質は、長いＮ末端側のシャフトおよび球状のＣ末端側のノブから構成される。
【００４８】
ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）：タンパク質フォールディングシャペロンとして機能する真核生物において発現されるタンパク質のファミリーである。ＦＫＢＰは、ラパマイシンと結合するその能力について公知である。例示的ＦＫＢＰ配列は、配列番号３３の残基１３２〜２３８として本明細書において示されている。
【００４９】
ＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）：ラパマイシンと結合するラパマイシン哺乳動物標的（ｍＴＯＲ）のドメインである。ＦＲＢの例示的配列は、配列番号３１の残基５４７〜６３６として本明細書において示されている。ラパマイシンおよびラパログの両方と結合することが可能であるＦＲＢの変異体形態（本明細書において、「ＦＲＢ＊」と呼ばれる）（ＡＰ２１９６７としても公知）は、配列番号３２の残基５４７〜６３６として本明細書において示されている。ＦＲＢ＊は、配列番号３２の残基６２０に対応する、ヒトｍＴＯＲの位置２０９８でのトレオニンのロイシンへの置換（Ｔ２０９８Ｌ）を含有する。
【００５０】
蛍光タンパク質：特定の波長の光に曝露したときに、ある特定の波長の光を放出するタンパク質である。蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＥＧＦＰ、ＡｃＧＦＰ１、Ｅｍｅｒａｌｄ、Ｓｕｐｅｒｆｏｌｄｅｒ  ＧＦＰ、Ａｚａｍｉ  Ｇｒｅｅｎ、ｍＷａｓａｂｉ、ＴａｇＧＦＰ、ＴｕｒｂｏＧＦＰ、ＹＰｅｔおよびＺｓＧｒｅｅｎなど）、青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ、ＥＢＦＰ２、Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ｔ−Ｓａｐｐｈｉｒｅ、Ａｚｕｒｉｔｅ、およびｍＴａｇＢＦＰなど）、シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ、ｍＥＣＦＰ、Ｃｅｒｕｌｅａｎ、ＣｙＰｅｔ、ＡｍＣｙａｎ１、Ｍｉｄｏｒｉ−Ｉｓｈｉ  Ｃｙａｎ、ｍＴｕｒｑｕｏｉｓｅ、およびｍＴＦＰ１など）、黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ、Ｔｏｐａｚ、Ｖｅｎｕｓ、ｍＣｉｔｒｉｎｅ、ＹＰｅｔ、ＴａｇＹＦＰ、ＰｈｉＹＦＰ、ＺｓＹｅｌｌｏｗ１、およびｍＢａｎａｎａ）、橙色蛍光タンパク質（Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ、Ｋｕｓａｂｉｒａ  Ｏｒａｎｇｅ２、ｍＯｒａｎｇｅ、ｍＯｒａｎｇｅ２、およびｍＴａｎｇｅｒｉｎｅ）、赤色蛍光タンパク質（ｍＲｕｂｙ、ｍＡｐｐｌｅ、ｍＳｔｒａｗｂｅｒｒｙ、ＡｓＲｅｄ２、ｍＲＦＰ１、ＪＲｅｄ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＨｃＲｅｄ１、ｍＲａｓｐｂｅｒｒｙ、ｄＫｅｉｍａ−Ｔａｎｄｅｍ、ＨｃＲｅｄ−Ｔａｎｄｅｍ、ｍＰｌｕｍ、ＡＱ１４３、ｔｄＴｏｍａｔｏ、およびＥ２−Ｃｒｉｍｓｏｎ）、遠赤色蛍光タンパク質（例えば、Ｋａｔｕｓｈｋａ２Ｓ）、橙色／赤色蛍光タンパク質（ｄＴｏｍａｔｏ、ｄＴｏｍａｔｏ−Ｔａｎｄｅｍ、ＴａｇＲＦＰ、ＴａｇＲＦＰ−Ｔ、ＤｓＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ２、ＤｓＲｅｄ−Ｅｘｐｒｅｓｓ（Ｔ１）、およびＤｓＲｅｄ−Ｍｏｎｏｍｅｒ）、ならびにこれらの修飾されたバージョンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００５１】
融合タンパク質：少なくとも２つの異なる（異種）タンパク質またはペプチドに由来するアミノ酸配列を含有するタンパク質である。融合タンパク質は、例えば、２つの異なる（異種）タンパク質の少なくとも一部分をコードする核酸配列から操作された核酸配列の発現によって、生成することができる。融合タンパク質を作出するためには、核酸配列は、同じリーディングフレーム内になければならず、内部終止コドンを含有してはならない。融合タンパク質、特に、短い融合タンパク質は、化学的合成によって生成することもできる。
【００５２】
異種：異種タンパク質または異種ポリペプチドとは、異なる供給源または種に由来するタンパク質またはポリペプチドを指す。同様に、異種ＯＲＦは、異なる供給源または種に由来するＯＲＦである。
【００５３】
ヘキソン：主要なアデノウイルスキャプシドタンパク質である。Ａｄ５に由来する例示的ヘキソン配列は、配列番号３４として本明細書において示されている。Ｅ４５１Ｑ置換を含む変異体ヘキソン配列は、配列番号３５として本明細書において示されている。
【００５４】
免疫調節性タンパク質：免疫系を変化させる（例えば、活性化する、強化する、または抑制する）タンパク質である。免疫調節因子としては、サイトカイン（インターロイキン２（ＩＬ−２）、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＧＭ−ＣＳＦ、ＦＬＴ３リガンド、またはインターフェロンなど）、ケモカイン（ＣＣＬ３、ＣＣＬ２６、ＣＸＣＬ７、ＣＸＣＬ９、およびＣＸＣＬ１０など）、Ｔ細胞活性化リガンド（抗ＣＤ３抗体または同種抗原など）、共刺激分子（Ｂ７．１／Ｂ７．２、ＯＸ４０Ｌ、４−１−ＢＢＬ、またはＣＤ４０Ｌなど）、チェックポイント遮断阻害剤（抗ＰＤ−１抗体または抗ＣＴＬＡ４抗体など）、ならびに小分子免疫調節因子が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５５】
単離された：「単離された」生物学的構成要素（核酸分子、タンパク質、ウイルス、または細胞など）は、その構成要素が天然に存在する、生物の細胞もしくは組織または生物自体における他の生物学的構成要素、例えば、他の染色体および染色体外ＤＮＡおよびＲＮＡ、タンパク質、ならびに細胞から実質的に分離または精製されている。「単離された」核酸分子およびタンパク質には、標準的な精製方法によって精製されたものが含まれる。この用語はまた、宿主細胞における組換え発現によって調製された核酸分子およびタンパク質、ならびに化学的に合成された核酸分子およびタンパク質を包含する。
【００５６】
マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）：植物、動物およびウイルスにおける遺伝子発現を調節する一本鎖ＲＮＡ分子である。マイクロＲＮＡをコードする遺伝子は、転写されて、一次転写物マイクロＲＮＡ（プリｍｉＲＮＡ）を形成し、これがプロセシングされて、前駆体マイクロＲＮＡ（プレｍｉＲＮＡ）と呼ばれる短いステム−ループ分子を形成し、続いて、ヌクレオチド鎖切断性に切断して、成熟マイクロＲＮＡを形成する。成熟マイクロＲＮＡは、およそ２１〜２３ヌクレオチドの長さであり、１つまたは複数の標的メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の３’ＵＴＲと部分的に相補的である。マイクロＲＮＡは、標的ｍＲＮＡの切断を促進することによって、または細胞転写物の翻訳を遮断することによって遺伝子発現をモジュレートする。本開示の文脈では、「肝臓特異的マイクロＲＮＡ」は、肝臓において優先的に発現されるマイクロＲＮＡ、例えば、肝臓のみにおいて発現されるマイクロＲＮＡまたは他の臓器もしくは組織種と比較して肝臓において有意により多く発現されるマイクロＲＮＡである。
【００５７】
修飾：核酸の配列またはタンパク質配列における変化である。例えば、アミノ酸配列の修飾には、例えば、置換、挿入、および欠失、またはそれらの組合せが含まれる。挿入には、アミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに配列内への単一もしくは複数のアミノ酸残基の挿入が含まれる。欠失は、タンパク質配列からの、１つまたは複数のアミノ酸残基の除去によって特徴付けられる。本明細書における一部の実施形態では、修飾（置換、挿入、または欠失など）は、タンパク質の特定の活性の低減または強化など、機能の変化をもたらす。本明細書において使用されるとき、「Δ」または「デルタ」は、欠失を指す。例えば、Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥとは、ＬＸＣＸＥモチーフの欠失を有するＥ１Ａポリペプチドを指す。置換修飾は、少なくとも１つの残基が、除去され、その場所に異なる残基が挿入されているものである。アミノ酸置換は、典型的に、単一の残基のものであるが、いくつかの異なる位置で同時に生じてもよい。置換、欠失、挿入、またはそれらの任意の組合せを、最終的な変異体の配列に到達するように組み合わせてもよい。これらの修飾は、タンパク質をコードするＤＮＡにおけるヌクレオチドの修飾によって調製することができ、それによって、この修飾をコードするＤＮＡが産生される。公知の配列を有するＤＮＡの所定の部位において、挿入、欠失、および置換の変異を行うための技法は、当該技術分野において周知である。「修飾された」タンパク質、核酸、またはウイルスは、上記に概説された１つまたは複数の修飾を有するものである。
【００５８】
新形成、悪性疾患、がん、および腫瘍：新生物は、過剰な細胞分裂の結果として生じる、組織または細胞の異常な増殖である。新生物性増殖により、腫瘍が産生され得る。個体における腫瘍の量は、「腫瘍量」であり、腫瘍の数、体積、または重量として測定することができる。転移しない腫瘍は、「良性」と称される。周囲の組織に侵入する、および／または転移し得る腫瘍は、「悪性」と称される。悪性腫瘍は、「がん」とも称される。
【００５９】
血液系がんは、血液または骨髄のがんである。血液系（または造血系）がんの例としては、白血病、例えば、急性白血病（急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、ならびに骨髄芽球性、前骨髄球性（ｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃ）、骨髄単球性、単球性、および赤白血病など）、慢性白血病（慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髄性白血病、および慢性リンパ性白血病など）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫（無痛性および高悪性度形態）、多発性骨髄腫、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞性白血病、ならびに脊髄形成異常が挙げられる。一部の事例では、リンパ腫は、固形腫瘍とみなされる。
【００６０】
固形腫瘍は、通常は嚢胞も液体区域も含有しない、異常な組織の塊である。固形腫瘍は、良性の場合も悪性の場合もある。異なる種類の固形腫瘍は、それらを形成する細胞の種類に応じて命名される（肉腫、癌腫、およびリンパ腫など）。肉腫および癌腫など、固形腫瘍の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、および他の肉腫、滑膜性腫瘍、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、リンパ性悪性疾患、膵臓がん、乳がん、肺がん、卵巣がん、前立腺がん、肝細胞癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺乳頭状癌、褐色細胞腫、脂腺癌、乳頭状癌、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染新形成、乳頭状腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、ヘパトーム、胆管癌、絨毛癌、ウイルムス腫瘍、子宮頸がん（ｃｅｒｖｉｃａｌ  ｃａｎｃｅｒ）、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌、黒色腫、ならびにＣＮＳ腫瘍（膠腫など（脳幹膠腫および混合性膠腫など）、膠芽腫（多形性膠芽腫としても公知である）星状細胞腫、ＣＮＳリンパ腫、胚細胞腫、髄芽細胞腫、神経鞘腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｏｇｉｏｍａ）、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫（ｍｅｎａｎｇｉｏｍａ）、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、および脳転移など）が挙げられる。
【００６１】
腫瘍溶解性ウイルス：増殖性障害の細胞、例えば、がん／腫瘍細胞を、選択的に殺滅させるウイルスである。がん細胞の殺滅は、当該技術分野において確立されている任意の方法、例えば、生存細胞数を決定すること、またはがん細胞における細胞変性効果、アポトーシス、もしくはウイルスタンパク質の合成（例えば、複製に必要なウイルス遺伝子の代謝標識、イムノブロット、もしくはＲＴ−ＰＣＲによって）または腫瘍のサイズの低減を検出することによって、検出することができる。
【００６２】
作動可能に連結した：第１の核酸配列が、第２の核酸配列との機能的関係にある場合、第１の核酸配列は、第２の核酸配列に作動可能に連結している。例えば、プロモーターが、コーディング配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コーディング配列に作動可能に連結している。一般に、作動可能に連結したＤＮＡ配列は、連続的であり、２つのタンパク質コーディング領域を接合する必要がある場合、同じリーディングフレーム内にある。
【００６３】
薬学的に許容される担体：本開示において有用な薬学的に許容される担体（ビヒクル）は、従来のものである。E.  W.  MartinによるRemington's  Pharmaceutical  Sciences、Mack  Publishing  Co.、Easton、PA、第１５版（１９７５年）は、１つまたは複数の治療用化合物、分子、または薬剤（例えば、本明細書において開示される組換えウイルスまたは組換えウイルスゲノム）の薬学的送達に好適な組成物および製剤について記載している。一般に、担体の性質は、用いられる具体的な投与様式に依存することになる。例えば、非経口製剤は、通常、ビヒクルとして、水、生理食塩水、平衡塩類溶液、水性デキストロース、グリセロールなどといった、薬学的および生理学的に許容される流体を含む、注射可能な流体を含む。固体組成物（例えば、粉末、丸剤、錠剤、またはカプセルの形態）については、従来の非毒性の固体担体は、例えば、医薬品グレードのマンニトール、ラクトース、デンプン、またはステアリン酸マグネシウムを含み得る。生物学的に中性な担体に加えて、投与しようとする医薬組成物は、少量の非毒性補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、保存剤、およびｐＨ緩衝剤など、例えば、酢酸ナトリウムまたはモノラウリン酸ソルビタンを含有してもよい。
【００６４】
ポリペプチド、ペプチド、またはタンパク質：モノマーがアミノ酸残基であり、それらが、アミド結合を通じて一緒に接合された、ポリマーである。アミノ酸が、アルファアミノ酸である場合、Ｌ−光学異性体またはＤ−光学異性体のいずれも使用することができる。用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」は、本明細書において互換可能に使用される。これらの用語は、１つまたは複数のアミノ酸残基が、対応する天然に存在するアミノ酸の人工的な化学的模倣体であるアミノ酸ポリマー、ならびに天然に存在するアミノ酸ポリマー、および天然に存在しないアミノ酸ポリマーに適用される。「残基」または「アミノ酸残基」という用語には、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドに組み込まれているアミノ酸への参照が含まれる。
【００６５】
ポリペプチドにおける保存的置換は、タンパク質配列における１つのアミノ酸残基を、類似の生物学的特質を有する異なるアミノ酸残基の代わりに使用することである。典型的に、保存的置換は、結果として得られるポリペプチドの活性にほとんど影響を及ぼさないかまたは全く影響を及ぼさない。例えば、１つまたは複数の保存的置換（例えば、１つを上回らない、２つを上回らない、３つを上回らない、４つを上回らない、または５つを上回らない置換）を含むタンパク質またはペプチドは、野生型のタンパク質またはペプチドの構造および機能を保持する。ポリペプチドは、例えば、部位特異的変異誘発またはＰＣＲなどの標準的な手順を使用して、そのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を操作することによって、１つまたは複数の保存的置換を含有するように産生させることができる。一実施例では、そのようなバリアントは、抗体の交差反応性または抗体が免疫応答を誘導する能力を試験することによって、容易に選択することができる。保存的置換の例を、以下に示す。
【表３】
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【００６６】
保存的置換は、一般に、（ａ）置換の区域における、例えば、シートコンフォメーションもしくはヘリックスコンフォメーションとしての、ポリペプチド骨格の構造、（ｂ）標的部位における分子の電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩高さを維持する。
【００６７】
一般に、タンパク質特質に最も大きな変化をもたらすことが予測される置換は、非保存的なもの、例えば、（ａ）親水性残基、例えば、セリルもしくはスレオニルが、疎水性残基、例えば、ロイシル、イソロイシル、フェニルアラニル、バリル、もしくはアラニルを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、（ｂ）システインもしくはプロリンが、任意の他の残基を置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、（ｃ）電気陽性の側鎖を有する残基、例えば、リシル、アルギニル、もしくはヒスタジルが、電気陰性の残基、例えば、グルタミルもしくはアスパルチルを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化、または（ｄ）嵩高い側鎖を有する残基、例えば、フェニルアラニンが、側鎖を有さないもの、例えば、グリシンを置換する（もしくはそれらによって置換される）変化であろう。
【００６８】
疾患を予防、処置、または緩和する(ameliorate)こと：疾患を「予防すること」とは、疾患の完全な発症を阻害することを指す。「処置すること」とは、疾患または病態の発症が開始された後に、その徴候または症状を緩和する治療的介入を指す。「緩和すること」とは、疾患の徴候または症状の数または重症度の低減を指す。
【００６９】
精製された：「精製された」という用語は、絶対的な純度を必要とするものではなく、相対的な用語として意図される。したがって、例えば、精製されたペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物は、天然に会合するタンパク質および他の混入物質から、全体または部分的に単離されているものである。ある特定の実施形態では、「実質的に精製された」という用語は、細胞、細胞培養培地、または他の粗調製物から単離されており、初期調製物の様々な構成要素、例えば、タンパク質、細胞残屑、および他の構成要素を除去するために分画に供されている、ペプチド、タンパク質、ウイルス、または他の活性化合物を指す。
【００７０】
ラパマイシン：公知の免疫抑制および抗増殖特質を有する小分子である。ラパマイシンは、シロリムスとしても知られる、細菌Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓの産物として最初に発見されたマクロライドである。ラパマイシンは、ｍＴＯＲと結合し、その活性を阻害する。ラパログ（ＡＰ２１９６７としても公知）は、ラパマイシンの類似体である。
【００７１】
組換え：組換え核酸分子、タンパク質、またはウイルスは、天然に存在しない配列を有するもの、または他の点で別個である配列の２つのセグメントの人工的な組合せによって作製された配列を有するものである。この人工的な組合せは、化学的合成によって、または単離された核酸分子のセグメントの人工的な操作によって、例えば、遺伝子操作技法によって、達成することができる。「組換え」という用語には、天然の核酸分子、タンパク質、またはウイルスの一部分の付加、置換、または欠失のみによって変化されている、核酸、タンパク質、およびウイルスも含まれる。
【００７２】
複製欠損：（腫瘍細胞と比較して）非腫瘍細胞において「複製欠損」を呈するアデノウイルスは、正常細胞において、腫瘍細胞と比較して低減されたウイルス複製を呈するアデノウイルスを指す。複製欠損は、例えば、腫瘍細胞と比較して、正常細胞におけるウイルス後期タンパク質発現の欠如、ウイルスＤＮＡ合成の低減、Ｅ２Ｆ標的遺伝子（例えば、サイクリンＡおよびＢ）を誘導する能力の低減、Ｓ期進入を誘起する能力の低減、ならびに／または細胞殺滅を誘導する能力の低減によって、明らかである。
【００７３】
ＲＧＤペプチド：トリアミノ酸モチーフアルギニン−グリシン−アスパラギン酸を有するペプチドである。ＲＧＤモチーフは、多数の基質タンパク質、例えば、フィブロネクチン、フィブリノゲン、ビトロネクチンおよびオステオポンチンに見出され、細胞外基質との細胞間接着において役割を果たす。
【００７４】
自己切断ペプチド：リボソームがＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするように誘導し、そのペプチド配列と下流のポリペプチドとの分離をもたらす、ペプチドである。ウイルスによってコードされる２Ａペプチドは、自己切断ペプチドの一種である。ウイルスによってコードされる２Ａペプチドとしては、例えば、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）、およびＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）に由来する２Ａペプチドが挙げられる。
【００７５】
配列同一性：２つもしくはそれよりも多い核酸配列間または２つもしくはそれよりも多いアミノ酸配列間における同一性または類似性は、配列間の同一性または類似性として表される。配列同一性は、同一性の割合として測定することができ、割合が高いほど、配列がより同一である。配列類似性は、類似性（保存的アミノ酸置換を考慮に入れる）の割合として測定することができ、割合が高いほど、配列がより類似している。
【００７６】
比較のための配列のアラインメント方法は、公知である。様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムが、説明されている：ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ、Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．、２巻４８２頁、１９８１年；ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、４８巻、４４３頁、１９７０年；ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ、８５巻、２４４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、Ｇｅｎｅ、７３巻、２３７〜４４頁、１９８８年；ＨｉｇｇｉｎｓおよびＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ、５巻、１５１〜３頁、１９８９年；Ｃｏｒｐｅｔら、Ｎｕｃ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．、１６巻、１０８８１〜９０頁、１９８８年；Ｈｕａｎｇら、Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｐｐｌｓ．  ｉｎ  ｔｈｅ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、８巻、１５５〜６５頁、１９９２年；ならびにＰｅａｒｓｏｎら、Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏ．、２４巻、３０７〜３１頁、１９９４年。Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜１０頁、１９９０年は、配列アラインメント方法および相同性の計算に関する詳細な考察を提示している。
【００７７】
ＮＣＢＩのＢａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．、２１５巻、４０３〜１０頁、１９９０年）が、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）およびインターネットを含む、複数の供給元から、配列分析プログラムｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎ、およびｔｂｌａｓｔｘと併せて使用するために、入手可能である。追加の情報は、ＮＣＢＩのウェブサイトにおいて見出すことができる。
【００７８】
血清型：特徴的な抗原セットによって区別される緊密に関連する微生物（ウイルスなど）の群である。
【００７９】
被験体：ヒトおよび非ヒト哺乳動物、例えば、獣医学被験体（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ネコ、イヌ、ブタおよび非ヒト霊長類）を含むカテゴリーの、生きた多細胞脊椎動物の生物である。
【００８０】
合成：研究室において人工的な手段によって産生されたものであり、例えば、合成核酸またはタンパク質は、研究室において化学的に合成され得る。
【００８１】
標的化リガンド：本開示の文脈では、「標的化リガンド」は、組換えアデノウイルスを、標的化リガンドに対して特異的な受容体または結合タンパク質を発現する特定の細胞型に向けるタンパク質である。一部の実施形態では、標的化リガンドは、腫瘍において過剰発現される細胞表面タンパク質に対して特異的な抗体である（例えば、ＥＧＦＲ）。
【００８２】
治療剤：被験体に適正に投与された場合に、所望の治療または予防効果を誘導することが可能である、化学的化合物、小分子、組換えウイルスまたはその他の組成物、例えば、アンチセンス化合物、抗体（モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、例えば、拮抗性ｍＡｂなど）、ペプチドまたは核酸分子である。例えば、がんのための治療剤として、がんの発生または転移を防ぐまたは阻害する薬剤が挙げられる。
【００８３】
治療有効量：特定の医薬品または治療剤（例えば、組換えウイルス）で処置されている被験体または細胞において、所望される効果を達成するのに十分なそれらの量である。薬剤の有効量は、処置されている被験体または細胞、ならびに治療用組成物の投与様式を含むがこれらに限定されない、複数の因子に依存し得る。
【００８４】
ベクター：宿主細胞において複製し、および／または宿主細胞に組み込まれるベクターの能力を撹乱することなく、外来核酸の挿入を可能にする核酸分子である。ベクターは、宿主細胞において複製することを可能にする核酸配列、例えば、複製起点を含み得る。ベクターはまた、１つまたは複数の選択マーカー遺伝子およびその他の遺伝要素を含み得る。発現ベクターは、挿入される遺伝子（単数または複数）の転写および翻訳を可能にする必要な調節配列を含有するベクターである。
【００８５】
別途説明されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって広く理解されているものと同じ意味を有する。単数形の「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」という用語は、文脈により別途明確に示されない限り、複数形の参照物を含む。「ＡまたはＢを含む」とは、Ａ、もしくはＢ、またはＡおよびＢを含むことを意味する。核酸またはポリペプチドに関して与えられる、すべての塩基サイズまたはアミノ酸サイズ、およびすべての分子量または分子質量値は、およそのものであり、説明のために提供されることを、さらに理解されたい。本明細書において記載されるものに類似であるかまたはそれと同等である方法および材料を、本開示の実施または試験において使用することができるが、好適な方法および材料が、以下に記載されている。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾が生じた場合には、用語の説明を含め、本明細書が優先される。加えて、材料、方法、および実施例は、例示に過ぎず、限定することを意図するものではない。
【００８６】
ＩＩＩ．いくつかの実施形態の概要
Ｅ３領域中に改変（欠失、置換および／または挿入など）を有する腫瘍選択的組換えアデノウイルスが記載される。特に、本開示は、Ｅ３タンパク質発現が無効にされるような少なくとも３つのＥ３遺伝子（Ｅ３Ａ遺伝子またはＥ３Ｂ遺伝子など）の改変（例えば、欠失）または７つのＥ３遺伝子のうち６つ（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ）の改変（例えば、欠失）が、ＷＴ  Ｅ３領域を有するアデノウイルスに対するウイルス複製の増強（少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも１００％、少なくとも２００％または少なくとも５００％の増大など）につながるという知見を記載する。組換えアデノウイルスは、腫瘍細胞における選択的複製を可能にし、ウイルスを肝臓から脱標的化する追加の改変をさらに含み得る。がん処置のための組換えアデノウイルスの使用が記載される。また、腫瘍溶解性ウイルスのレポーターウイルスバージョンも記載され、これは、患者の腫瘍細胞が、腫瘍溶解性ウイルスに対して反応性である可能性が高いか否かを決定するためなどに診断用試薬として使用され得る。
【００８７】
本明細書において開示される特異的改変は、アデノウイルス５（Ａｄ５）ゲノム配列に関して記載されている。しかし、同一改変および欠失は、任意のヒトアデノウイルス血清型において行うことができる。腫瘍選択性、肝臓脱標的化、誘導可能再標的化、キメラファイバータンパク質を介した再標的化のためのアデノウイルス改変およびその他の改変は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ２０１６／０４９２０１（その全体が参照によって本明細書中に組み込まれる）に詳述されている。
【００８８】
改変されたＥ１ａタンパク質をコードするＥ１Ａ領域と、アデノウイルス死タンパク質（ＡＤＰ）をコードし、１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋから選択される少なくとも３つのＥ３遺伝子のコード配列中に改変（遺伝子またはその一部の変異、例えば、アミノ酸置換または欠失など）を含み、改変（例えば、欠失）が、コードされるタンパク質の発現を妨げるＥ３領域と、Ｅ４ｏｒｆ６／７コード配列の改変（例えば、欠失）を有するＥ４領域とを含む組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において提供される。
【００８９】
一部の実施形態では、改変されたＥ１Ａタンパク質は、ＬＸＣＸＥモチーフの欠失、残基２〜１１の欠失、Ｃ１２４Ｇ置換、Ｙ４７Ｈ置換、Ｙ４７Ｈ置換およびＣ１２４Ｇ置換またはＹ４７Ｈ置換、Ｃ１２４Ｇ置換および残基２〜１１（例えば、番号付けが配列番号２３に対してである）の欠失を含む。
【００９０】
組換えアデノウイルスゲノムの一部の実施形態では、少なくとも３つのＥ３遺伝子は、１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９ｋ（Ｅ３Ａ遺伝子）を含む。一部の例では、１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９ｋ遺伝子が欠失している。他の例では、１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９ｋ遺伝子は、変異した開始コドン、未熟停止コドンを導入する変異または両方を含む。特定の例では、１２．５ｋ遺伝子、６．７ｋ遺伝子および／または１９ｋ遺伝子は、Ｍ１Ｓアミノ酸置換をコードする。
【００９１】
組換えアデノウイルスゲノムの他の実施形態では、少なくとも３つのＥ３遺伝子は、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ（Ｅ３Ｂ遺伝子）を含む。一部の例では、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子が欠失している。他の例では、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子は、変異した開始コドン、未熟停止コドンを導入する変異または両方を含む。特定の例では、ＲＩＤα遺伝子は、Ｍ１Ｋ置換をコードし、ＲＩＤβ遺伝子は、Ｍ１Ｋ、Ｃ３０ＧおよびＭ６０停止置換をコードし、ならびに／または１４．７ｋ遺伝子は、Ｍ１Ｋ、Ｍ９停止、Ｍ３１停止およびＭ３９停止置換をコードする。
【００９２】
さらに他の実施形態では、少なくとも３つのＥ３遺伝子は、１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ（ＡＤＰを除くすべてのＥ３遺伝子）を含む。一部の例では、１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子が欠失している。他の例では、１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子は、変異した開始コドン、未熟停止コドンを導入する変異または両方を含む。特定の例では、ＲＩＤα遺伝子は、Ｍ１Ｋ置換をコードし、ＲＩＤβ遺伝子は、Ｍ１Ｋ、Ｃ３０ＧおよびＭ６０停止置換をコードし、ならびに／または１４．７ｋ遺伝子は、Ｍ１Ｋ、Ｍ９停止、Ｍ３１停止およびＭ３９停止置換をコードする。
【００９３】
一部の実施形態では、組換えアデノウイルスゲノムは、Ｅ４ｏｒｆ３の欠失をさらに含む。
【００９４】
一部の実施形態では、ゲノムは、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合された標的化リガンドと、野生型ＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）タンパク質またはラパログに結合可能な変異体ＦＲＢタンパク質に融合されたアデノウイルスファイバータンパク質とをさらにコードする。一部の例では、標的化リガンドは、単一ドメイン抗体、例えば、ＥＧＦＲに対して特異的である単一ドメイン抗体である。
【００９５】
一部の実施形態では、ゲノムは、肝臓からアデノウイルスを脱標的化するための少なくとも１つの改変をさらに含む。一部の例では、改変は、ヘキソンタンパク質中の変異、例えば、Ｅ４５１Ｑ変異（例えば、番号付けが配列番号３４に対してである）である。一部の例では、改変は、肝臓特異的マイクロＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位である。特定の例では、肝臓特異的マイクロＲＮＡのための１つまたは複数の結合部位は、Ｅ１Ａの３’−ＵＴＲ中に位置する。肝臓特異的マイクロＲＮＡは、例えば、ｍｉＲ−１２２、ｍｉＲ−３０またはｍｉＲ−１９２であり得る。
【００９６】
一部の実施形態、ゲノムは、キメラファイバータンパク質をコードする。一部の例では、キメラファイバータンパク質は、第１のアデノウイルス血清型由来のファイバーシャフトと、第２のアデノウイルス血清型由来のファイバーノブとを含む。特定の例では、第１のアデノウイルス血清型はＡｄ５であり、第２のアデノウイルス血清型は、Ａｄ３、Ａｄ９、Ａｄ１１、Ａｄ１２、Ａｄ３４またはＡｄ３７である。非限定的な一例では、第１のアデノウイルス血清型はＡｄ５であり、第２のアデノウイルス血清型はＡｄ３４である。一例では、Ａｄ３４ファイバーノブは、ＣＤ４６との結合を妨げる、または阻害する改変、例えば、Ｆ２４２Ｓを含む（野生型Ａｄ３４ファイバー配列は、配列番号６０として本明細書において示されている）。
【００９７】
一部の実施形態では、ゲノムは、ＲＧＤペプチドを含むように改変されたファイバータンパク質をコードする。
【００９８】
一部の実施形態では、ゲノムは、異種ＯＲＦをさらに含む。一部の例では、異種ＯＲＦは、自己切断ペプチドコード配列およびＡＤＰコード配列と同じリーディングフレーム内に、それと作動可能に連結している。一部の例では、自己切断ペプチドは、２Ａペプチドである。特定の例では、２Ａペプチドは、ブタテッショウウイルス−１（ＰＴＶ１）２Ａ（Ｐ２Ａ）ペプチド、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ（Ｆ２Ａ）ペプチド、ウマ鼻炎Ａウイルス（ＥＲＡＶ）２Ａ（Ｅ２Ａ）ペプチドまたはＴｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス（ＴａＶ）２Ａ（Ｔ２Ａ）ペプチドを含む。
【００９９】
一部の例では、異種ＯＲＦは、レポーター遺伝子である。一部の例では、レポーター遺伝子は、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質、黄色蛍光タンパク質または赤色（または近赤外）蛍光タンパク質をコードする。特定の例では、蛍光タンパク質は、ＹＰｅｔ、ｍＣｈｅｒｒｙまたはＫａｔｓｕｓｈｋａ２Ｓである。他の例では、レポーター遺伝子は、ウイルス複製のバイオマーカーとして血清中で検出され得る可溶性因子をコードする。特定の非限定的な例では、可溶性因子は、ＰＳＡである。さらに他の例では、レポーター遺伝子は、画像化プローブ、例えば、ルシフェラーゼ、金属タンパク質、ヨウ化ナトリウム共輸送体またはチミジンキナーゼ、例えば、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ−ｔｋ）をコードする。
【０１００】
他の例では、異種ＯＲＦは、例えば、ＲＮＡｉ配列、タンパク質、抗体またはその結合断片、ケモカイン、サイトカイン、免疫調節物質または酵素をコードする治療用遺伝子である。一部の例では、治療用遺伝子は、免疫調節性タンパク質をコードする。
【０１０１】
特定の非限定的な例では、免疫調節性タンパク質は、サイトカイン（例えば、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＩＬ−９、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−３３、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−７、ＩＬ−１０、ＩＬ−１５、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＦＮα、ＩＦＮβ、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＴＧＦβ、リンホトキシンＡ（ＬＴＡ）、ＧＭ−ＣＳＦ、ＨＭＧＢ１およびＦＬＴ３リガンドであるが、これらに限定されない）である。
【０１０２】
他の特定の例では、免疫調節性タンパク質は、ケモカイン（例えば、ＩＬ−８、ＣＣＬ５、ＣＣＬ１７、ＣＣＬ２０、ＣＣＬ２２、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、ＣＸＣＬ１３、ＣＸＣＬ１２、ＣＣＬ１９、ＣＣＬ２１、ＣＸＣＲ２、ＣＣＲ２、ＣＣＲ４、ＣＣＲ５、ＣＣＲ６、ＣＣＲ７、ＣＣＲ８、ＣＸＣＲ３、ＣＸＣＲ４、ＣＸＣＲ５およびＣＲＴＨ２であるが、これらに限定されない）である。
【０１０３】
他の特定の例では、免疫調節性タンパク質は、Ｔ細胞刺激リガンド（例えば、細胞表面抗ＣＤ３、二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー（ＢｉＴｅ）、Ｔ細胞刺激性ＭＨＣ／ＨＬＡ分子（同種異系の）または腫瘍抗原であるが、これらに限定されない）または共刺激分子（Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＬＩＧＨＴ、ＩＣＯＳまたは４−１ＢＢＬなど）である。
【０１０４】
さらに他の例では、治療用遺伝子は、抗体（ｍＡｂ、例えば、拮抗性ｍＡｂなど）、抗体の抗原結合性断片または可溶性アンタゴニストをコードする。このような分子の特定の非限定的な例として、抗ＶＥＧＦ、抗ＴＧＦ−β、可溶性ＴＧＦ−β受容体、抗ＰＤ−１、ＰＤ−ＩＬおよびＬＡｇ３が挙げられる
【０１０５】
一部の実施形態では、ゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７または配列番号５９に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一である。一部の例では、ゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１３、配列番号１４、配列番号４７、配列番号４８、配列番号４９、配列番号５０、配列番号５１、配列番号５２、配列番号５３、配列番号５４、配列番号５７または配列番号５９を含むかまたはそれからなる。
【０１０６】
また、本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノムを含む単離された細胞（哺乳動物細胞、例えば哺乳動物腫瘍細胞など）が本明細書において提供される。
【０１０７】
本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノムと、薬学的に許容される担体、例えば、水または生理食塩水とを含む組成物が、さらに提供される。
【０１０８】
また、本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノムを含む単離されたアデノウイルスが提供される。単離されたアデノウイルスと、薬学的に許容される担体（水または生理食塩水など）とを含む組成物が、さらに提供される。
【０１０９】
腫瘍細胞を、本明細書において記載される組換えアデノウイルスゲノム、アデノウイルスまたは組成物と接触させることによって、腫瘍細胞の生存度を阻害する方法が、さらに提供される。一部の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。他の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法であり、腫瘍細胞を接触させることは、治療有効量の、組換えアデノウイルスゲノム、アデノウイルスまたは組成物を、腫瘍を有する被験体に投与することを含む。
【０１１０】
また、被験体における腫瘍の進行を阻害するかまたは腫瘍の体積を低減させる方法が提供される。本方法は、被験体に、治療有効量の、本明細書において記載される組換えアデノウイルスゲノム、アデノウイルスまたは組成物を投与することを含む。
【０１１１】
被験体におけるがんを処置する方法が、さらに提供される。本方法は、被験体に、治療有効量の、本明細書において開示される組換えアデノウイルスゲノム、組換えアデノウイルスまたは組成物を投与することを含む。
【０１１２】
また、ゲノムのヌクレオチド配列が、配列番号２、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５５、配列番号５６または配列番号５８に対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％同一である組換えアデノウイルスゲノムが、本明細書において提供される。一部の実施形態では、ゲノムのヌクレオチド配列は、配列番号２、配列番号６、配列番号１１、配列番号１２、配列番号４５、配列番号４６、配列番号５５、配列番号５６または配列番号５８を含むかまたはそれからなる。組換えアデノウイルスゲノムを含む単離されたアデノウイルスが、さらに提供される。
【０１１３】
ＩＶ．野生型および変異体ウイルス配列
配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９のうちいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一であるヌクレオチド配列を含む組換えアデノウイルスゲノムが開示される。特定の例では、組換え核酸は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる。
【０１１４】
また、組換えアデノウイルスゲノムを含むベクター（プラスミドまたはウイルスベクターなど）が提供される。一部の実施形態では、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９のうちいずれか１つに対して少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一である核酸分子を含むベクターが提供される。一部の例では、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８または５９のうちいずれか１つのヌクレオチド配列を含むかまたはそれからなる核酸分子を含むベクターが提供される。
【０１１５】
本明細書において開示される組換えアデノウイルスによって発現される、例示的野生型および変異体アデノウイルスタンパク質配列を、以下に提供する。
【０１１６】
Ｅ１ＡおよびＥ４ｏｒｆ６／７変異体
以下のＥ１Ａ配列では、ＬＸＣＸＥモチーフは下線によって示されている。このモチーフは、Ａｄ５  Ｅ１Ａ（配列番号２３）のアミノ酸１２２〜１２６に存在する。Ｙ４７ＨおよびＣ１２４Ｇ置換は、太字で示されている。Ｅ１ＡおよびＥ４ｏｒｆ６／７の改変（欠失を含む）は、本明細書において開示される組換えアデノウイルスの腫瘍選択的複製に寄与する。
【０１１７】
【化１】
2021520789.tif 000004
【化２】
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【化３】
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【化４】
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【０１１８】
Ｅ２Ｆとの結合を排除するかもしくは損なう、または核局在化シグナルを欠失するかもしくは損なう改変されたＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質をコードするゲノムを有する組換えアデノウイルスが、本明細書において企図される。一部の例では、改変されたＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、Ｅ２Ｆ結合部位を欠失する／損なうためにＣ末端での約６０、約５０、約４０、約３０、約２０または約１０個のアミノ酸の欠失を含む。他の例では、Ｅ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、Ｅ２Ｆ結合を無効にするかまたは損なう、Ｃ末端の１０個のアミノ酸における欠失、フレームシフトもしくは挿入またはタンパク質のＣ末端３分の１からの３３個のアミノ酸の欠失を含む。一部の実施形態では、変異は、Ｅ２Ｆ相互作用を損なうアミノ酸８１〜９１を含む。
【０１１９】
他の例では、改変されたＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、Ｅ２Ｆ４の効率的な転座に必要である核局在化配列を無効にする５８個のアミノ酸のＮ末端欠失を含む。Ａｄ２およびＡｄ５  Ｅ４ｏｒｆ６／７のアミノ酸１３から３８の間に位置する８個のアルギニン残基があり、これはこの領域の２５％超のアルギニン含量と一致する。Ｅ４ｏｒｆ６のＮ末端におけるアルギニン残基の全体的なクラスター化は、他のアデノウイルス血清型において維持されている。アルギニン残基１６、１８、２１、２２、２７および／または２９をアラニンと置換する変異（またはこの領域による核局在化を無効にするその他の適当な残基）が企図される。
【０１２０】
他の例では、改変されたＥ４ｏｒｆ６／７タンパク質は、Ｅ４ｏｒｆ６／７の能力を排除するかまたは阻害して、Ｅ２Ｆ二重部位占有を誘導する１つまたは複数の改変を含む。特定の非限定的な例として、Ｆ１２５のプロリン、アラニン、リシン、アスパラギン酸もしくはグルタミン酸への変異またはＤ１２１のＰ、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｇ、Ｆへの変異（アミノ酸位置は、配列番号２９に対してである）が挙げられる。
【０１２１】
その他のＥ４ｏｒｆ６／７変異として、Ｔ１３３Ａ、Ｒ１０１Ａ、Ｑ１０５ＰまたはＥ２Ｆ単一部位占有を妨げる任意の変異、アルファヘリックスを破壊し、Ｅ２Ｆ結合を妨げるＭ８４ＮもしくはＰ、Ｇ、Ｋ、Ｌ、Ｈおよび／またはＥ９３ＡもしくはＫ、Ｐ、Ｇ、Ｒ、Ｌ、Ｍ（アミノ酸位置は、配列番号２９に対してである）が挙げられる。その他の企図される変異として、Ｔ１３３ＱもしくはＡ、Ｋ、Ｇ、Ｐ、Ｌ、Ｈ、Ｇ１４１Ｌ、Ｐ、Ｋ  Ｈ、Ｆ、ＡまたはＶ１４９Ｎ、Ｋ、Ｐ、Ｈ、Ｇ、Ｅ、Ｄ（アミノ酸位置は、配列番号２９に対してである）が挙げられる。
【０１２２】
また、組換えアデノウイルスおよびＥ４ｏｒｆ６／７の部分または完全欠失を有する組換えアデノウイルスゲノムも企図される。
【０１２３】
ファイバー配列
以下の組換えＡｄ５ファイバー配列では、ＦＲＢ配列に下線が引かれている。ＦＲＢ＊中に存在する変異は太字で示されている。
【０１２４】
【化５】
2021520789.tif 000008
【化６】
2021520789.tif 000009
【化７】
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【０１２５】
Ｖ．自己切断ペプチド配列
自己切断ペプチドは、リボソームがＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするように誘導し、そのペプチド配列と下流のポリペプチドとの分離をもたらす、ペプチドである。自己切断ペプチドの使用により、単一のＯＲＦから、自己切断ペプチドに隣接する複数のタンパク質の発現が可能となる。ウイルスによってコードされる２Ａペプチドは、自己切断ペプチドの一種である。
【０１２６】
他の自己切断ペプチドと同様に、２Ａペプチドは、リボソームが２ＡエレメントのＣ末端におけるペプチド結合の合成をスキップするようにし、２Ａ配列の末端と下流のペプチドとの分離をもたらすことによって機能する（Ｋｉｍら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ、６巻（４号）、ｅ１８５５６、２０１１年）。「切断」は、２ＡペプチドのＣ末端に見出されるグリシン残基とプロリン残基との間に生じる。例示的な２Ａペプチドとしては、ＴａＶ、ＥＲＡＶ、ＰＴＶ１、およびＦＭＤＶによってコードされる２Ａペプチド、またはそれらの修飾バージョンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１２７】
本明細書における特定の実施例では、２Ａペプチドは、ＰＴＶ１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、ＦＭＤＶ  ２Ａ（Ｆ２Ａ）、ＥＲＡＶ  ２Ａ（Ｅ２Ａ）、またはＴａＶ  ２Ａ（Ｔ２Ａ）を含み、これらの配列は、配列番号１５〜１８として、以下に示され、本明細書に記載されている。
P2A:  ATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号１５）
F2A:  VKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP（配列番号１６）
E2A:  QCTNYALLKLAGDVESNPGP（配列番号１７）
T2A:  EGRGSLLTCGDVEENPGP（配列番号１８）
【０１２８】
一部の実施例では、２Ａペプチドは、切断効率を改善するために、Ｎ末端に、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙを含むように修飾される。修飾されたＰ２Ａ、Ｆ２Ａ、Ｅ２Ａ、およびＴ２Ａの配列は、配列番号１９〜２２として、以下に示され、本明細書に記載されている。
修飾されたP2A:  GSGATNFSLLKQAGDVEENPGP（配列番号１９）
修飾されたF2A:  GSGVKQTLNFDLLKLAGDVESNPGP  (配列番号20)
修飾されたE2A:  GSGQCTNYALLKLAGDVESNPGP  (配列番号21)
修飾されたT2A:  GSGEGRGSLLTCGDVEENPGP  (配列番号22)
【０１２９】
一部の実施形態では、２Ａポリペプチドは、本明細書において開示される２Ａポリペプチドのバリアントである。バリアントは、野生型または本明細書において開示される修飾された２Ａポリペプチドに対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはそれよりも高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含み得る。バリアントは、例えば、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のうちのいずれか１つの２Ａポリペプチドから、少なくとも１つのＮ末端アミノ酸が欠失しているもの、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸が欠失しているものを含み得る。バリアントは、配列番号１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２２のうちのいずれか１つの２Ａポリペプチドから、少なくとも１つのＣ末端アミノ酸が欠失しているもの、例えば、１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸が欠失しているものを含み得る。バリアントは、少なくとも１個、２個、３個、４個、または５個のアミノ酸置換、例えば、保存的アミノ酸置換も含み得る。
【０１３０】
ＩＶ．医薬組成物
本明細書中に開示される組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノムを含む組成物が、本明細書において提供される。本組成物は、必要に応じて、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏでの製剤化および投与に好適である。必要に応じて、本組成物は、提供される薬剤のうちの１つまたは複数および薬学的に許容される担体を含む。好適な担体およびそれらの製剤は、Remington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy、第２２版、Loyd  V.  Allenら編、Pharmaceutical  Press（２０１２年）に記載されている。薬学的に許容される担体としては、生物学的にもそれ以外にも望ましくないことのない材料が挙げられる。すなわち、この材料は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことも、この材料が含有されている医薬組成物中の他の構成成分と有害な様式で相互作用することもなく、被験体に投与される。被験体に投与される場合、担体は、必要に応じて、活性成分の分解を最小限に抑え、被験体における有害な副作用を最小限に抑えるように選択される。
【０１３１】
組換えウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノムは、公知の方法に従って、例えば、静脈内投与、例えば、ボーラスまたは長期間にわたる連続注入によって、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内（intracerobrospinal）、皮下、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、経口、局所、腫瘍内、または吸入の経路によって、投与される。投与は、局所的であっても全身的であってもよい。本組成物は、局所、経口、非経口、静脈内、関節内、腹腔内、筋肉内、皮下、体腔内（intracavity）、経皮、肝内、頭蓋内、腫瘍内、骨内、噴霧化／吸入、または気管支鏡法を介した設置によるものを含む、複数の投与経路のうちのいずれかを介して投与することができる。したがって、本組成物は、局所的処置が所望されるか全身処置が所望されるかに応じて、また処置しようとする領域に応じて、いくつかの手段で投与される。
【０１３２】
一部の実施形態では、投与のための組成物は、薬学的に許容される担体、（例えば、水性担体）中に溶解した、本明細書において記載される組換えアデノウイルス（または組換えゲノム）を含む。様々な水性担体、例えば、緩衝食塩水などを、使用することができる。これらの溶液は、滅菌であり、通常、望ましくない物質を含まない。これらの組成物は、滅菌することができる。本組成物は、生理学的条件に近づけるために、必要に応じて、薬学的に許容される補助物質、例えば、ｐＨ調整剤および緩衝剤、毒性調整剤など、例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、乳酸ナトリウムなどを含有してもよい。これらの製剤における活性な薬剤の濃度は、広範に変動し得、主として、選択された具体的な投与様式および被験体の必要性に応じて、流体の体積、粘度、体重などに基づいて、選択されるであろう。
【０１３３】
医薬製剤、特に、組換えウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノムの医薬製剤は、所望される度合いの純度を有する組換えアデノウイルス（または組換えアデノウイルスゲノム）を、任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と混合することによって、調製することができる。そのような製剤は、凍結乾燥製剤または水溶液であり得る。
【０１３４】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度で、レシピエントにとって非毒性である。許容される担体、賦形剤、または安定剤は、酢酸塩、リン酸塩、クエン酸塩、および他の有機酸；抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸）、保存剤、低分子量ポリペプチド；タンパク質、例えば、血清アルブミンもしくはゼラチン、または親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；ならびにアミノ酸、単糖類、二糖類、および他の炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、もしくはデキストリン；キレート剤；ならびにイオン性および非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート）；塩形成対イオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；ならびに／または非イオン性界面活性剤であり得る。組換えアデノウイルス（または組換えアデノウイルスをコードする１つもしくは複数の核酸）は、任意の適切な濃度の感染単位で、製剤化することができる。
【０１３５】
経口投与に好適な製剤は、（ａ）液体溶液、例えば、希釈剤、例えば、水、生理食塩水、またはＰＥＧ  ４００中に懸濁させた、有効量の組換えアデノウイルス、（ｂ）それぞれ所定の量の活性成分を液体、固体、顆粒、またはゼラチンとして含有するカプセル、サシェ剤（sachet）、または錠剤、（ｃ）適切な液体中の懸濁物、および（ｄ）好適なエマルジョンからなり得る。錠剤形態には、ラクトース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、リン酸カルシウム、トウモロコシデンプン、ジャガイモデンプン、微晶質セルロース、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、および他の賦形剤、着色剤、充填剤、結合剤、希釈剤、緩衝剤、加湿剤（moistening  agent）、保存剤、矯味矯臭剤、色素、崩壊剤、ならびに薬学的に適合性のある担体のうちの１つまたは複数が含まれ得る。ロゼンジ形態は、活性成分を、矯味矯臭薬、例えば、スクロース中に、ならびに活性成分に加えて当該技術分野において公知の担体を含有する、活性成分を不活性基剤、例えば、ゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシアのエマルジョン、ゲルなどに含む香錠に、含み得る。
【０１３６】
組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノムは、単独または他の好適な構成成分と組み合わせて、吸入によって投与されるエアロゾル製剤にすることができる（すなわち、それらは、「噴霧化」することができる）。エアロゾル製剤は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの加圧された許容される噴霧体に入れることができる。
【０１３７】
非経口投与、例えば、例として、関節内（関節の中）、静脈内、筋肉内、腫瘍内、皮内、腹腔内、および皮下の経路によるものに好適な製剤としては、水性および非水性の等張性滅菌注射溶液（抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にするための溶質を含有し得る）、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、および保存剤を含み得る水性および非水性の滅菌懸濁物が挙げられる。提供される方法において、組成物は、例えば、静脈内注入によって、経口、局所、腹腔内、膀胱内、腫瘍内、または髄腔内に、投与することができる。非経口投与、腫瘍内投与、および静脈内投与が、好ましい投与方法である。化合物の製剤は、単回用量または複数回用量の密封された容器、例えば、アンプルおよびバイアルで提示され得る。
【０１３８】
注射溶液および懸濁物は、前述の種類の滅菌の粉末、顆粒、および錠剤から調製することができる。アデノウイルスによって形質導入もしくは感染させた細胞、またはｅｘ  ｖｉｖｏ療法については核酸をトランスフェクトした細胞もまた、上述のように静脈内または非経口で投与することができる。
【０１３９】
医薬調製物は、単位剤形であり得る。そのような形態では、調製物は、適切な量の活性な構成成分を含有する単位用量にさらに分割される。したがって、医薬組成物は、投与の方法に応じて、様々な単位剤形で投与され得る。例えば、経口投与に好適な単位剤形としては、粉末、錠剤、丸剤、カプセル、およびロゼンジが挙げられるが、これらに限定されない。
【０１４０】
一部の実施形態では、組成物は、少なくとも２種の異なる組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノム、例えば、異なる細胞受容体と結合する組換えアデノウイルスを含む。例えば、組成物中の組換えアデノウイルスのうち少なくとも１種は、キメラファイバータンパク質を発現し得る。あるいは、組換えアデノウイルスは、標的化リガンドが組成物中のウイルス間で異なる標的化リガンド−ＦＫＢＰ融合タンパク質をコードすることによって異なる細胞受容体を標的とし得る。一部の例では、組成物は、２種、３種、４種、５種または６種の異なる組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノムを含む。
【０１４１】
ＶＩＩ．処置の方法
本明細書において開示される組換えアデノウイルスおよび組換えアデノウイルスゲノム組成物は、治療的または予防的処置のために投与することができる。特に、被験体において腫瘍細胞の生存度を阻害する方法、被験体における腫瘍の進行を阻害する方法、被験体において腫瘍体積を低減させる方法、被験体において転移の数を低減させる方法および／または被験体において癌を処置する方法が、提供される。したがって、一部の例では、本方法は、例えば、処置なし（例えば、本明細書において開示される組換えアデノウイルスおよび組換えアデノウイルスゲノム組成物を用いる処置の前）と比較して少なくとも２０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％または少なくとも９９．５％まで、腫瘍細胞の生存度を低減し、腫瘍の進行を低減し、腫瘍体積を低減し、腫瘍サイズを低減し、転移の数を低減する、またはそれらの組合せである。
【０１４２】
本方法は、被験体に、治療有効量の組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノム（またはその組成物）を投与することを含む。全体を通じて記載されるように、アデノウイルスまたは医薬組成物は、静脈内、血管内、髄腔内、筋肉内、皮下、腫瘍内、腹腔内、または経口を含むがこれらに限定されない、任意の多数の方法で投与される。必要に応じて、本方法は、被験体に、１つまたは複数の追加の治療剤を投与することをさらに含む。一部の実施形態では、治療剤は、化学療法剤である。他の実施形態では、治療剤は、免疫モジュレーターである。さらに他の実施形態では、治療剤は、ＣＤＫ阻害剤、例えば、ＣＤＫ４阻害剤である。
【０１４３】
一部の実施形態では、がんまたは腫瘍は、肺、前立腺、結腸直腸、乳房、甲状腺、腎臓、もしくは肝臓のがんもしくは腫瘍であるか、または白血病の一種である。一部の事例では、がんは、転移性である。一部の実施例では、腫瘍は、乳腺、下垂体、甲状腺、もしくは前立腺の腫瘍；脳、肝臓、髄膜、骨、卵巣、子宮、もしくは子宮頸部（cervix）の腫瘍；単球性もしくは骨髄性の白血病；腺癌、腺腫、星状細胞腫、膀胱腫瘍、脳腫瘍、バーキットリンパ腫、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、腎臓癌、肝臓癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、直腸癌、皮膚癌、胃癌、精巣癌、甲状腺癌、軟骨肉腫、絨毛癌、線維腫、線維肉腫、膠芽腫、膠腫、ヘパトーム、組織球腫、平滑筋芽腫(leiomyoblastoma)、平滑筋肉腫、リンパ腫、脂肪肉腫細胞、乳房腫瘍、髄芽細胞腫、骨髄腫、形質細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫、骨原性肉腫、膵臓腫瘍、下垂体腫瘍、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、肉腫、睾丸腫瘍、胸腺腫、またはウイルムス腫瘍である。腫瘍には、原発性固形腫瘍および転移性固形腫瘍の両方が含まれ、乳房、結腸、直腸、肺、口腔咽頭部、下咽頭、食道、胃、膵臓、肝臓、胆嚢および胆管、小腸、尿路（腎臓、膀胱、および尿路上皮を含む）、女性生殖管（子宮頸部、子宮、および卵巣、ならびに絨毛癌および妊娠性絨毛性疾患を含む）、男性生殖管（前立腺、精嚢、精巣、および生殖細胞腫瘍を含む）、内分泌腺（甲状腺、副腎、および下垂体を含む）、および皮膚の癌腫、ならびに血管腫、黒色腫、肉腫（骨および軟組織から生じるもの、ならびにカポジ肉腫を含む）、ならびに脳、神経、眼、および髄膜の腫瘍（星状細胞腫、膠腫、膠芽腫、網膜芽細胞腫、神経腫、神経芽細胞腫、神経鞘腫、および髄膜腫を含む）が含まれる。一部の態様では、白血病などの造血系悪性疾患（すなわち、緑色腫、形質細胞腫、ならびに菌状息肉腫のプラークおよび腫瘍、ならびに皮膚Ｔ細胞性リンパ腫／白血病）により生じる固形腫瘍、ならびにリンパ腫（ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫の両方）の処置において生じる固形腫瘍が、処置され得る。加えて、処置は、本明細書において記載される腫瘍からの転移の予防に有用であり得る。
【０１４４】
治療的適用において、組換えアデノウイルスもしくは組換えアデノウイルスゲノムまたはそれらの組成物は、治療有効量または治療有効用量で、被験体に投与される。この使用に有効な量は、疾患の重症度および患者の全般的な健康状態に依存するであろう。本組成物の単回投与または複数回投与が、患者によって必要とされ、許容される、投薬量および頻度に応じて、投与され得る。「患者」または「被験体」には、ヒトおよび他の動物の両方、特に、哺乳動物が含まれる。したがって、本方法は、ヒト治療および獣医学的適用のいずれにも適用可能である。
【０１４５】
修飾された配列を有するアデノウイルスの有効量は、個体ごとに決定され、少なくとも部分的に、使用される具体的な組換えアデノウイルス、個体のサイズ、年齢、性別、ならびに増殖している細胞のサイズおよび他の特徴に基づく。例えば、ヒトの処置については、少なくとも１０３プラーク形成単位（ＰＦＵ）の組換えウイルスが使用され、例えば、増殖している細胞または存在する新生物の種類、サイズ、および数に応じて、少なくとも１０４、少なくとも１０５、少なくとも１０６、少なくとも１０７、少なくとも１０８、少なくとも１０９、少なくとも１０１０、少なくとも１０１１、または少なくとも１０１２ＰＦＵ、例えば、およそ１０３〜１０１２ＰＦＵの組換えウイルスが使用される。有効量は、約１．０ｐｆｕ／体重ｋｇ〜約１０１５ｐｆｕ／体重ｋｇ（例えば、約１０２ｐｆｕ／体重ｋｇ〜約１０１３ｐｆｕ／体重ｋｇ）であり得る。
【０１４６】
組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノムは、単回用量または複数回用量（例えば、２回、３回、４回、６回、またはそれよりも多い用量）で、投与される。複数回用量は、同時発生的または継続的に（例えば、数日間もしくは数週間の期間にわたって）投与され得る。
【０１４７】
一部の実施形態では、提供される方法は、被験体に、１つまたは複数の追加の治療剤、例えば、抗がん剤または他の治療的処置（腫瘍の外科切除など）を投与することを含む。例示的な抗がん剤としては、化学療法剤、例えば、有糸分裂阻害剤、アルキル化剤、代謝拮抗物質、挿入抗生物質（intercalating  antibiotic）、増殖因子阻害剤、細胞周期阻害剤、酵素、トポイソメラーゼ阻害剤、抗生存剤（anti-survival  agent）、生物学的応答修飾因子、抗ホルモン剤（例えば、抗アンドロゲン剤）、抗血管新生剤、およびＣＤＫ阻害剤などが挙げられるが、これらに限定されない。他の抗がん処置としては、放射線療法およびがん細胞を特異的に標的化する抗体（例えば、治療用モノクローナル抗体）が挙げられる。
【０１４８】
アルキル化剤の非限定的な例としては、ナイトロジェンマスタード（メクロレタミン、シクロホスファミド、メルファラン、ウラシルマスタード、またはクロラムブシルなど）、アルキルスルホネート（ブスルファンなど）、ニトロソ尿素（カルムスチン、ロムスチン、セムスチン、ストレプトゾシン、またはダカルバジンなど）が挙げられる。
【０１４９】
代謝拮抗物質の非限定的な例としては、葉酸類似体（メトトレキセートなど）、ピリミジン類似体（５−ＦＵまたはシタラビンなど）、およびプリン類似体、例えば、メルカプトプリンまたはチオグアニンが挙げられる。
【０１５０】
天然産物の非限定的な例としては、ビンカアルカロイド（ビンブラスチン、ビンクリスチン、またはビンデシンなど）、エピポドフィロトキシン（エトポシドまたはテニポシドなど）、抗生物質（ダクチノマイシン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、ブレオマイシン、プリカマイシン、またはマイトマイシンＣなど）、および酵素（Ｌ−アスパラギナーゼなど）が挙げられる。
【０１５１】
その他の薬剤の非限定的な例としては、白金配位錯体（シスプラチンとしても公知であるシス−ジアミン−ジクロロ白金ＩＩなど）、置換尿素（ヒドロキシ尿素など）、メチルヒドラジン誘導体（プロカルバジンなど）、および副腎皮質抑制剤（ミトタンおよびアミノグルテチミドなど）が挙げられる。
【０１５２】
ホルモンおよびアンタゴニストの非限定的な例としては、副腎皮質ステロイド（プレドニゾンなど）、プロゲスチン（カプロン酸ヒドロキシプロゲステロン、酢酸メドロキシプロゲステロン、および酢酸メゲストロール（magestrol  acetate）など）、エストロゲン（ジエチルスチルベストロールおよびエチニルエストラジオールなど）、抗エストロゲン薬（タモキシフェンなど）、ならびにアンドロゲン（プロピオン酸テストステロンおよびフルオキシメステロンなど）が挙げられる。
【０１５３】
よく使用される化学療法薬の例として、アドリアマイシン、アルケラン、Ａｒａ−Ｃ、ＢｉＣＮＵ、ブスルファン、ＣＣＮＵ、カルボプラチン（Carboplatinum）、シスプラチン（Cisplatinum）、シトキサン、ダウノルビシン、ＤＴＩＣ、５−ＦＵ、フルダラビン、ハイドレア、イダルビシン、イホスファミド、メトトレキセート、ミトラマイシン、マイトマイシン、ミトキサントロン、ナイトロジェンマスタード、タキソール（または他のタキサン類、例えば、ドセタキセル）、ベルバン（Velban）、ビンクリスチン、ＶＰ−１６が挙げられるが、いくつかのより新しい薬物としては、ゲムシタビン（Ｇｅｍｚａｒ）、ハーセプチン、イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ−１１）、ロイスタチン、ナベルビン、リツキサンＳＴＩ−５７１、タキソテール、トポテカン（ハイカムチン）、ゼローダ（カペシタビン）、ゼベリン（Ｚｅｖｅｌｉｎ）およびカルチトリオールが挙げられる。
【０１５４】
使用することができる免疫調節因子の非限定的な例としては、ＡＳ−１０１（Ｗｙｅｔｈ−Ａｙｅｒｓｔ  Ｌａｂｓ．）、ブロピリミン（Ｕｐｊｏｈｎ）、ガンマインターフェロン（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＩＬ−２（ＣｅｔｕｓまたはＨｏｆｆｍａｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）、ヒト免疫グロブリン（Ｃｕｔｔｅｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）、ＩＭＲＥＧ（Ｎｅｗ  Ｏｒｌｅａｎｓ、Ｌａ．のＩｍｒｅｇより）、ＳＫ＆Ｆ  １０６５２８、およびＴＮＦ（腫瘍壊死因子、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
【０１５５】
一部の例では、投与される追加の治療剤は、生物製剤、例えば、モノクローナル抗体、例えば、３Ｆ８、アバゴボマブ（Abagovomab）、アデカツムマブ（Adecatumumab）、アフツズマブ、アラシズマブ（Alacizumab）、アレムツズマブ、アルツモマブペンテテート（Altumomab  pentetate）、アナツモマブマフェナトクス（Anatumomab  mafenatox）、アポリズマブ、アルシツモマブ、バビツキシマブ（Bavituximab）、ベクツモマブ（Bectumomab）、ベリムマブ、ベジレソマブ、ベバシズマブ、ビバツズマブメルタンシン（Bivatuzumab  mertansine）、ブリナツモマブ（Blinatumomab）、ブレンツキシマブベドチン、カンツズマブメルタンシン、カプロマブペンデチド、カツマキソマブ、ＣＣ４９、セツキシマブ、シタツズマブボガトクス（Citatuzumab  bogatox）、シクスツムマブ、クリバツズマブテトラキセタン（Clivatuzumab  tetraxetan）、コナツムマブ、ダセツズマブ、デツモマブ（Detumomab）、エクロメキシマブ（Ecromeximab）、エクリズマブ、エドレコロマブ、エプラツズマブ、エルツマキソマブ（Ertumaxomab）、エタラシズマブ、ファルレツズマブ（Farletuzumab）、フィギツムマブ（Figitumumab）、ガリキシマブ、ゲムツズマブオゾガマイシン、ギレンツキシマブ（Girentuximab）、グレムバツムマブベドチン（Glembatumumab  vedotin）、イブリツモマブチウキセタン、イゴボマブ（Igovomab）、イムシロマブ（Imciromab）、インテツムマブ、イノツズマブオゾガマイシン、イピリムマブ、イラツムマブ（Iratumumab）、ラベツズマブ、レクサツムマブ、リンツズマブ、ロルボツズマブメルタンシン（Lorvotuzumab  mertansine）、ルカツムマブ（Lucatumumab）、ルミリキシマブ、マパツムマブ、マツズマブ、メポリズマブ、メテリムマブ（Metelimumab）、ミラツズマブ、ミツモマブ（Mitumomab）、モロリムマブ（Morolimumab）、ナコロマブタフェナトクス（Nacolomab  tafenatox）、ナプツモマブエスタフェナトクス、ネシツムマブ、ニモツズマブ（Nimotuzumab）、ノフェツモマブメルペンタン、オファツムマブ、オララツマブ、オポルツズマブモナトクス（Oportuzumab  monatox）、オレゴボマブ（Oregovomab）、パニツムマブ、ペムツモマブ（Pemtumomab）、ペルツズマブ、ピンツモマブ（Pintumomab）、プリツムマブ（Pritumumab）、ラムシルマブ、リロツムマブ（Rilotumumab）、リツキシマブ、ロバツムマブ（Robatumumab）、サツモマブペンデチド（Satumomab  pendetide）、シブロツズマブ（Sibrotuzumab）、ソネプシズマブ（Sonepcizumab）、タカツズマブテトラキセタン、タプリツモマブパプトクス（Taplitumomab  paptox）、テナツモマブ（Tenatumomab）、ＴＧＮ１４１２、チシリムマブ（トレメリムマブ）、チガツズマブ（Tigatuzumab）、ＴＮＸ−６５０、トラスツズマブ、トレメリムマブ、ツコツズマブセルモロイキン（Tucotuzumab  celmoleukin）、ベルツズマブ、ボロシキシマブ（Volociximab）、ボツムマブ（Votumumab）、もしくはザルツムマブ、またはそれらの組合せである。一部の例では、治療用抗体は、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１に対して特異的である（拮抗性ｍＡｂ、例えば、アテゾリズマブ、ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＢＮＳ−９３６５５８（ニボルマブ）、ペンブロリズマブ、ピディリズマブ、ＣＴ０１１、ＡＭＰ−２２４、ＡＭＰ−５１４、ＭＥＤＩ−０６８０、ＢＭＳ−９３６５５９、ＢＭＳ９３５５５９、ＭＥＤＩ−４７３６、ＭＰＤＬ−３２８０ＡまたはＭＳＢ−００１０７１８Ｃなど）。
【０１５６】
一部の例では、追加の治療薬は、それぞれ、ＣＴＬＡ−４、ＬＡＧ−３またはＢ７−Ｈ３アンタゴニスト、例えば、Ｔｒｅｍｅｌｉｍｕｍａｂ、ＢＭＳ−９８６０１６およびＭＧＡ２７１である。
【０１５７】
一部の例では、追加の治療薬は、ＰＤ−１またはＰＤＬ−１のアンタゴニストである。
【０１５８】
一部の種類のがんの別の一般的な処置は、外科処置、例えば、がんまたはその一部分の外科切除である。処置の別の例は、腫瘍を根絶させるか外科切除の前にそれを退縮させるのを補助するために、放射線療法、例えば、放射性材料またはエネルギー（外部光線療法など）を、腫瘍部位に投与することである。
【０１５９】
ＣＤＫ（サイクリン依存性キナーゼ）阻害剤は、ＣＤＫの機能を阻害する薬剤である。提供される方法において使用するためのＣＤＫ阻害剤の非限定的な例としては、ＡＧ−０２４３２２、ＡＴ７５１９、ＡＺＤ５４３８、フラボピリドール、インジスラム、Ｐ１４４６Ａ−０５、ＰＤ−０３３２９９１、およびＰ２７６−００が挙げられる（例えば、Lapennaら、Nature  Reviews、８巻、５４７〜５６６頁、２００９年を参照されたい）。他のＣＤＫ阻害剤としては、ＬＹ２８３５２１９、パルボシクリブ、ＬＥＥ０１１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、汎ＣＤＫ阻害剤ＡＴ７５１９、セリシクリブ（seliciclib）、ＣＹＣ０６５、ブチロラクトンＩ、ヒメニアルジシン（hymenialdisine）、ＳＵ９５１６、ＣＩＮＫ４、ＰＤ０１８３８１２、またはファスカプリシン（fascaplysin）が挙げられる。
【０１６０】
一部の実施例では、ＣＤＫ阻害剤は、広範囲阻害剤（フラボピリドール、オロモウシン、ロスコビチン、ケンパウロン、ＳＮＳ−０３２、ＡＴ７５１９、ＡＧ−０２４３２２、（Ｓ）−ロスコビチン、またはＲ５４７など）である。他の実施例では、ＣＤＫ阻害剤は、特異的阻害剤（ファスカプリシン、リュビジン（ryuvidine）、プルバラノール（purvalanol）Ａ、ＮＵ２０５８、ＢＭＬ−２５９、ＳＵ  ９５１６、ＰＤ０３３２９９１、またはＰ−２７６−００など）である。
【０１６１】
薬剤および投薬量の選択は、処置されている所与の疾患に基づいて、当業者によって容易に決定することができる。薬剤または組成物の組合せは、並行して（例えば、１つの混合物として）、別個であるが同時に（例えば、別個の静脈ラインを介して）、または順次に（例えば、１つの薬剤がまず投与され、その後に第２の薬剤が投与される）のいずれかで投与され得る。したがって、組合せという用語は、２つまたはそれよりも多い薬剤または組成物の並行投与、同時投与、または順次投与を指して使用される。
【０１６２】
本明細書において開示される方法によると、被験体には、有効量の、本明細書において提供される薬剤のうちの１つまたは複数が投与される。有効量は、所望される生理学的応答（例えば、がん細胞の殺滅）をもたらすのに必要な任意の量として定義される。治療剤は、典型的に、１日当たり約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１０００ｍｇ／ｋｇの初回投薬量で投与される。約０．０１ｍｇ／ｋｇ〜約５００ｍｇ／ｋｇ、または約０．１ｍｇ／ｋｇ〜約２００ｍｇ／ｋｇ、または約１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ、または約１０ｍｇ／ｋｇ〜約５０ｍｇ／ｋｇの用量範囲を、使用することができる。投薬量は、しかしながら、被験体の要件、処置されている状態の重症度、および用いられている化合物に応じて変動し得る。例えば、投薬量は、特定の被験体において診断されたがんの種類およびステージを考慮して、経験的に決定され得る。被験体に投与される用量は、提供される方法の文脈では、患者において経時的に有益な治療応答をもたらすのに十分であるものとする。特定の状況にとって適正な投薬量の決定は、当業者の技能の範囲内である。したがって、薬剤を投与するのに有効な量およびスケジュールは、当業者によって経験的に決定され得る。投薬量は、望ましくない交差反応、アナフィラキシー反応などといった実質的な有害な副作用を引き起こすまでに多量であるべきではない。投薬量は、いずれかの禁忌が生じた場合には、個々の医師によって調整することができる。所与のクラスの医薬品の適切な投薬量についてのガイダンスは、文献において見出すことができる。
【０１６３】
腫瘍細胞を、本明細書において開示される組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルスゲノム、またはその組成物と接触させることによって、腫瘍細胞の生存度または増殖を阻害する方法が、本明細書において提供される。一部の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法である。他の実施形態では、本方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏ方法であり、腫瘍細胞を接触させることは、組換えアデノウイルス、組換えアデノウイルスゲノム、または組成物を、腫瘍を有する被験体に投与することを含む。
【０１６４】
被験体に、治療有効量の、本明細書において開示される組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノム（またはその組成物）を投与することによって、被験体における腫瘍の進行を阻害するか、または腫瘍の体積を低減させる方法が、さらに提供される。
【０１６５】
被験体に、治療有効量の、本明細書において開示される組換えアデノウイルスまたは組換えアデノウイルスゲノム（またはその組成物）を投与することによって、被験体におけるがんを処置する方法もまた、提供される。
【０１６６】
以下の実施例は、ある特定の具体的な特性および／または実施形態を例示するために提供される。これらの実施例は、本開示を、記載される特定の特性または実施形態に限定するとみなされるものではない。
【実施例】
【０１６７】
（実施例１）
強化された複製動態を有する合成アデノウイルス
この実施例は、様々な改変を有する合成アデノウイルスを記載する。一部のウイルスは、少なくとも３つのＥ３遺伝子に１つまたは複数の改変、例えば３つもしくは６つのＥ３遺伝子の欠失、または、強化されたウイルス複製を可能にした、３つもしくは６つのＥ３遺伝子の発現を阻止する改変を含む。一部の場合には、組換えウイルスは、他の改変、例えば、肝臓脱標的化変異、腫瘍選択性変異、標的化リガンド、キメラファイバータンパク質および／またはレポーター遺伝子を含む。
【０１６８】
【表１−１】
2021520789.tif 000011
【表１−２】
2021520789.tif 000012
【表１−３】
2021520789.tif 000013
【表１−４】
2021520789.tif 000014
【表１−５】
2021520789.tif 000015
【０１６９】
ウイルス記載：
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３５（配列番号１）は、Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７、ΔＥ３−ＲＩＤα／β、ΔＥ３−１４．７ｋの腫瘍溶解性変異および肝臓脱標的化ヘキソン変異Ｅ４５１Ｑを有する腫瘍選択的ウイルスである。このウイルスは、ラパマイシン依存性またはＡＰ２１９６７依存性のＥＧＦＲ標的化遺伝子ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰおよびＦＲＢ＊−ファイバーも発現する。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３５の生成および特徴付けは、参照により完全に本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６／０４９２０１に記載される。
【０１７０】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２１（配列番号２）は、蛍光性レポータータンパク質（ＹＰｅｔ）をコードするＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３５の改変バージョンである。ＹＰｅｔは、Ｐ２Ａ自己切断ペプチド配列およびＡＤＰ（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ）による融合タンパク質として発現される。このウイルスはレポーターを発現するので、どの患者がＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３５療法に応答する可能性が最も高いか判定するために使用することができる。例えば、生検からの腫瘍細胞においてウイルスが複製することができるかどうか判定するために、がん患者からの腫瘍生検を使用することができた。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２１は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３５の複製を支持する腫瘍細胞の遺伝子変異または遺伝子発現プロファイルを同定するために、ヒトがん細胞株のパネルをスクリーニングするために使用することもできた。これらのデータは、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３５療法に応答する可能性がある腫瘍の「サイン」を同定するために使用することができた。
【０１７１】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２０（配列番号３）は、３つの追加のＥ３遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９ｋ）の欠失によってＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３５と異なる、腫瘍溶解性ウイルスである。したがって、このウイルスは、１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋを欠いている。
【０１７２】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８１９（配列番号４）は、蛍光性レポータータンパク質（ＹＰｅｔ）をコードするＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２０の改変バージョンである。ＹＰｅｔレポーターは、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質としてコードされる。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２０と同様に、このウイルスは６つのＥ３遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋ）を欠いている。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８１９は強化された効力を示し、腫瘍細胞株においてＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２１より速く複製する。どのがんタイプがおよびどの患者がＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２０に応答する可能性が最も高いか規定するために、このウイルスは、様々ながん細胞株ならびに患者由来の腫瘍試料を感染させるために使用することができる。したがって、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８１９は、処置の開始前にどの患者がＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２０療法に応答する可能性があるか特定するために使用することができる。
【０１７３】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２０（配列番号５）は、ＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合としてＡＤＰ  ＯＲＦからのＥＧＦＲＶＨＨ−ＦＫＢＰ融合タンパク質（ＥＧＦＲ＋腫瘍細胞への再標的化のために）を発現するＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２０の改変バージョンである。
【０１７４】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４（配列番号６）は、Ｅ３遺伝子のうちの６つ（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋ）が欠失している野生型Ａｄ５のＥ３欠失バージョンである。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４は、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質としてアデノウイルスＡＤＰ  ＯＲＦからのＹＰｅｔ蛍光性レポーターを発現する。このウイルスは強化された効力を示し、腫瘍細胞株において野生型Ａｄ５より速く複製する。
【０１７５】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００（配列番号７）は、肝臓からウイルスを脱標的化する（静脈内送達を可能にするために）ヘキソンＥ４５１Ｑ変異も含有し、腫瘍選択的複製を付与するＥ１Ａ  ＬＸＣＸＥおよびＥ４ｏｒｆ６／７欠失を有する、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４の改変バージョンである。このウイルスも、ＹＰｅｔレポーターをＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質としてコードする。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００は、複製の非常に高い速度を示す。
【０１７６】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０６７（配列番号８）は、ＹＰｅｔレポーターを含有しないＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００のバージョンである。このウイルスは、療法候補である。
【０１７７】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０６８（配列番号９）は、ファイバーＨＩループにＲＧＤ含有ペプチドを有することによってＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０６７と異なる。この改変は、ウイルスが代替の感染経路としてＲＧＤ−インテグリン相互作用を利用することを可能にすることによって、向性を増大させる。
【０１７８】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０６９（配列番号１０）は、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質としてＹＰｅｔレポーターをコードすること以外は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０６８と同一である。
【０１７９】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９６４（配列番号１１）は、Ａｄ５ファイバーノブがＡｄ３４ファイバーノブによって置き換えられた、改変Ａｄ５ウイルスである。このウイルスも、ＹＰｅｔレポーターをＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質として発現する。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９６４は、試験した複数の細胞株、特に低いコクサッキーアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）を有するかまたはそれを有しない細胞株において、ＷＴ  Ａｄ５およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３５と比較して強化された複製を示す。これは、Ａｄ３４ノブが、全ての有核細胞で発現されるＣＤ４６に結合し、したがって、ウイルスがＣＡＲを発現しない細胞に入ることを可能にするという事実によるかもしれない。
【０１８０】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１（配列番号１２）は、キメラＡｄ５／Ａｄ３４ファイバーもコードするが、６つのＥ３遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋ）の欠失によって、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９６４と異なる。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１も、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質として発現されるＹＰｅｔレポーターを含む。
【０１８１】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２（配列番号１３）は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１の肝臓脱標的化腫瘍選択的バージョンである。具体的には、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は、Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７の腫瘍溶解性変異、ならびに肝臓脱標的化ヘキソン変異Ｅ４５１Ｑを含む。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２も、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質として発現されるＹＰｅｔレポーターを含む。このウイルスは、ＣＡＲを発現しない様々な細胞株において強力な複製を示し、ＷＴ  Ａｄ５よりかなり強力である。Ａｄ３４ノブおよび特異的Ｅ３遺伝子の欠失の組合せは、広範囲のがん細胞株にわたって強化された効力を有するウイルスをもたらす。
【０１８２】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１１３９（配列番号１４）は、レポーター遺伝子を含有しないこと以外はＡｄＳｙｎ−ＣＯ１１４２と同一である。したがって、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１１３９は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１１４２の治療的バージョンである。
【０１８３】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１（配列番号４４）は、ＹＰｅｔレポーターをＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質として発現するＷＴ  Ａｄ５である。このウイルスは、本明細書に記載される研究で対照として使用される。
【０１８４】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０５６（配列番号４５）は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９６４の肝臓脱標的化腫瘍選択的バージョンである。具体的には、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０５６は、Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７の腫瘍溶解性変異、ならびに肝臓脱標的化ヘキソン変異Ｅ４５１Ｑを含む。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０５６は、Ａｄ５ファイバーノブがＡｄ３４ファイバーノブによって置き換えられた、改変Ａｄ５ウイルスである。それも、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質として発現されるＹＰｅｔレポーターを含む。
【０１８５】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１２５０（配列番号４６）は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０５６の非レポーターバージョンである。このウイルスは、療法候補である。
【０１８６】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０８９（配列番号４７）は、推定上のＡｄ３４ファイバーＤＧループにＲＧＤ含有ペプチド（ＲＧＤ４Ｃ）を有することによって、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２と異なる。ＲＧＤ４Ｃは、ファイバーアミノ酸５１２（ノブアミノ酸１１２に対応する）の後に挿入される。この改変は、ウイルスが代替の感染経路としてＲＧＤ−インテグリン相互作用を利用することを可能にすることによって、向性を増大させる。
【０１８７】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３２０（配列番号４８）は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００のＹＰｅｔ蛍光団がＫａｔｕｓｈｋａ２Ｓ蛍光団で置き換えられること以外は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００と同一である。
【０１８８】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３２１（配列番号４９）は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２のＹＰｅｔ蛍光団がＫａｔｕｓｈｋａ２Ｓ蛍光団で置き換えられること以外は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２と同一である。
【０１８９】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３２５（配列番号５０）は、キメラＡｄ５／Ａｄ３４ファイバー、６つのＥ３遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋ）の欠失、Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７の腫瘍溶解性変異を含む、肝臓脱標的化（ヘキソンＥ４５１Ｑ）、腫瘍選択的アデノウイルスである。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３２５も、ヒト前立腺特異抗原（ＰＳＡ）をＰＳＡ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質として発現する。このウイルスは、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２のＹＰｅｔ蛍光団がＰＳＡで置き換えられること以外は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２と同一である。
【０１９０】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３４２（配列番号５１）は、キメラＡｄ５／Ａｄ３４ファイバーをコードし、６つのＥ３遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋ）の欠失を含む、肝臓脱標的化、腫瘍選択的アデノウイルスである。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３４２は、Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７の腫瘍溶解性変異、肝臓脱標的化ヘキソン変異Ｅ４５１Ｑ、ならびにＬｕｃ２：ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質として発現されるＬｕｃ２：ＹＰｅｔレポーターもコードする。このウイルスは、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２のＹＰｅｔ蛍光団がホタルルシフェラーゼ２：ＹＰｅｔ融合タンパク質で置き換えられること以外は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２と同一である。
【０１９１】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３６２（配列番号５２）は、Ｆ２４２Ｆ変異を有するキメラＡｄ５／Ａｄ３４ファイバータンパク質をコードし、６つのＥ３遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋ）の欠失を含む、肝臓脱標的化、腫瘍選択的アデノウイルスである。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３６２は、Ｅ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７の腫瘍溶解性変異、ならびに肝臓脱標的化ヘキソン変異Ｅ４５１Ｑを含む。このウイルスも、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質として発現されるＹＰｅｔレポーターを含む。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３６２はＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２とほとんど同一であるが、ＣＤ４６への結合を抑止する点変異（Ｆ２４２Ｓ）をＡｄ３４ノブドメインに有することによって異なる。
【０１９２】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１４０３（配列番号５３）は、推定上のＡｄ３４ファイバーＨＩループにＲＧＤ含有ペプチド（ＲＧＤ４Ｃ）を有することによって、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２と異なる。ＲＧＤ４Ｃは、ファイバーアミノ酸５４７（ノブアミノ酸１４７に対応する）の後に挿入される。この改変は、ウイルスが代替の感染経路としてＲＧＤ−インテグリン相互作用を利用することを可能にすることによって、向性を増大させる。
【０１９３】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１４０４（配列番号５４）は、推定上のＡｄ３４ファイバーＩＪループにＲＧＤ含有ペプチド（ＲＧＤ４Ｃ）を有することによって、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２と異なる。ＲＧＤ４Ｃは、ファイバーアミノ酸５６９（ノブアミノ酸１６９に対応する）の後に挿入される。この改変は、ウイルスが代替の感染経路としてＲＧＤ−インテグリン相互作用を利用することを可能にすることによって、向性を増大させる。
【０１９４】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８６９（配列番号５５）は、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰレポーターを有することおよびＥ３Ｂ遺伝子の欠失（ΔＲＩＤα、ΔＲＩＤβ、Δ１４．７ｋ）によって、ＷＴ  Ａｄ５と異なる。
【０１９５】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９９６（配列番号５６）は、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰレポーターおよびＥ３Ｂ遺伝子の発現の抑止を有することによって、ＷＴ  Ａｄ５と異なる。ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋの発現は、各遺伝子の開始コドンの変異および１つまたは複数の未熟停止コドンの挿入によって抑止される。
【０１９６】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９９９（配列番号５７）は、腫瘍選択性変異（Ｅ１ＡΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７）、肝臓脱標的化変異（ヘキソン［Ｅ４５１Ｑ］）およびＥ３Ａ遺伝子の欠失（Δ１２．５ｋ、Δ６．７ｋ、Δ１９ｋ）を有することによって、ＷＴ  Ａｄ５と異なる。このウイルスも、ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰレポーターを有する。
【０１９７】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１００２（配列番号５８）は、レポーター（ＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ）の所有およびＥ３Ａ遺伝子の欠失（Δ１２．５ｋ、Δ６．７ｋ、Δ１９ｋ）によって、ＷＴ  Ａｄ５と異なる。
【０１９８】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３４７（配列番号５９）は、キメラＡｄ５／Ａｄ３４ファイバー、Ｅ３遺伝子１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋの欠失、Ｅ４ｏｒｆ３の欠失、ならびにＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合タンパク質として発現されるＹＰｅｔレポーターを有する、肝臓脱標的化、腫瘍選択的ウイルスである。このウイルスは、Ｅ４ｏｒｆ３欠失をさらに含むこと以外は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２と同一である。本明細書に記載される研究は、Ｅ４ｏｒｆ３の欠失が腫瘍細胞におけるウイルス複製に負の影響を及ぼさないことを示す。
【０１９９】
（実施例２）
Ｅ３欠失アデノウイルスの複製動態
実施例１に記載される組換えアデノウイルスの複製動態は、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０１７／１４７２６５（参照により本明細書に完全に組み込まれる）に開示されるように、蛍光ベースのウイルス動態（ＦＢＶＫ）アッセイを使用して判定した。簡潔には、ＦＢＶＫアッセイは、感染後に発現される蛍光性レポーター（一般的にＹＰｅｔ）をコードするアデノウイルスの動態を判定するために使用することができる。蛍光強度の測定は、いくつかのウイルス生活環の期間にわたる感染細胞の数に比例する読取りを提供する。時間に対する感染細胞内の指数関数的増殖の半対数プロットは、指数関数的増殖速度または複製速度に比例した直線を与える。特定の細胞株における各ウイルスの複製速度は、「ｌｎ  ｓｌｏｐｅ」として報告される。より高いｌｎ  ｓｌｏｐｅは、複製のより速い速度を示す。
【０２００】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８１９、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２１、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２の複製は、複数の異なるタイプのがん細胞株および正常な小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ）におけるＦＢＶＫアッセイを使用して試験した。複製速度を、各ウイルスについて判定した（単位＝１／日数）。結果は、６つのＥ３遺伝子を欠くウイルスが、これらの遺伝子を欠かない対応物ウイルスより速く複製することを実証した。
【０２０１】
図１〜４は、下で議論するように、特定の合成アデノウイルスの複製動態の直接比較を示す。
【０２０２】
６つのＥ３遺伝子（ＡＤＰ以外の全てのＥ３遺伝子）の欠失の複製への影響を試験するために、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１（ＷＴ  Ａｄ５）の複製をＡ５４９細胞においてＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４と比較した。図１に示すように、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４のｌｎ  ｓｌｏｐｅはＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１のｌｎ  ｓｌｏｐｅより大きく、Ｅ３遺伝子の欠失が複製を強化することを示した。複数の異なるがん細胞株において、類似した結果が見出された。
【０２０３】
別の研究では、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２１の複製を、ＭＤＡ−ＭＢ−４５３乳がん細胞においてＡｄＳｙｎ−ＣＯ８１９と比較した。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２１は、３つのＥ３遺伝子（ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋ）を欠いている、肝臓脱標的化腫瘍溶解性ウイルスである。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８１９は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２１と同じ変異を含有するが、６つのＥ３遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７Ｋ）の欠失を有する。図２に示すように、さらなる３つのＥ３遺伝子の欠失は、複製の強化につながった。複数の他のがん細胞株において、類似した結果が見出された。
【０２０４】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９６４は、キメラファイバータンパク質（Ａｄ５ファイバーシャフトおよびＡｄ３４ファイバーノブ）を発現する、Ａｄ５レポーター発現ウイルスである。このウイルスの複製は、ＣＡＲ陰性細胞株（ＨＳ５７８Ｔ）において試験した。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１は、対照として使用した。図３に示すように、Ａｄ５ノブドメインを有する対照ウイルスと比較して、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９６４はＣＡＲ陰性細胞において強化された複製を示す。
【０２０５】
次に、６つのＥ３遺伝子を欠いている肝臓脱標的化腫瘍選択的レポーターウイルス（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００）の複製を、同じ変異を有するが、キメラファイバータンパク質（Ａｄ５シャフトおよびＡｄ３４ノブ）をさらに発現するウイルス（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２）と比較した。これらのウイルスの複製は、ＣＡＲ陰性細胞株ＨＳ５７８Ｔにおいて試験した。結果は、ウイルスがＡｄ３４ノブドメインを有するファイバータンパク質を発現するとき、ＣＡＲ陰性細胞における複製が強化されることを実証する（図４）。
【０２０６】
（実施例３）
腫瘍細胞株の一団における組換え腫瘍溶解性アデノウイルスの複製速度
組換えアデノウイルスＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８１９、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８２１、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９６４、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０５６、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０６９、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０８９、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３６２、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３２０、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３２１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３４２を、様々な脳、乳房、結腸、頭頸部、肺、前立腺および皮膚がん細胞株において蛍光ベースのウイルス動態（ＦＢＶＫ）アッセイを使用して、それらの複製速度について調査した。データは、表２Ａおよび２Ｂに示す。
【０２０７】
【表２Ａ−１】
2021520789.tif 000016
【表２Ａ−２】
2021520789.tif 000017
【表２Ａ−３】
2021520789.tif 000018
【０２０８】
【表２Ｂ−１】
2021520789.tif 000019
【表２Ｂ−２】
2021520789.tif 000020
【表２Ｂ−３】
2021520789.tif 000021
【０２０９】
（実施例４）
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００のｉｎ  ｖｉｖｏ特徴付け
強化されたウイルス複製を示した組換えアデノウイルスをさらに特徴付けるために、追加の研究を実行した。
【０２１０】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏのＦＢＶＫアッセイによって実証されるように、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２の両方は、ＷＴ  Ａｄ５と比較して腫瘍細胞において強化された効力／複製を有するＥ３欠失ウイルスである（上の表２Ａおよび２Ｂを参照する）。Ａ５４９肺腫瘍異種移植モデルにおいて、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２のｉｎ  ｖｉｖｏ効能を次に試験した。乳房皮下脂肪に５×１０６細胞を注入することによって、ヒトＡ５４９腫瘍細胞をヌードマウスに接種した。腫瘍が約１６４ｍｍ３の平均体積に到達したとき（０日目）、マウスを異なる処置群（１群につきｎ＝８マウス）に無作為化した。マウスに、ＰＢＳの単一の腫瘍内（ＩＴ）注射、またはＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１、ＡｄＳｙｎ−１０００もしくはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２の８×１０６ＰＦＵの単一の注射を与えた。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１はＹＰｅｔ−Ｐ２Ａ−ＡＤＰ融合としてＹＰｅｔ蛍光団をコードするが、さもなければ野生型Ａｄ５である。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００（図５Ａ）およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２（図５Ｂ）の両方は、「野生型」ＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１と比較して強化された抗腫瘍活性を示した。
【０２１１】
ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は、ＨＳ５７８Ｔ正常位トリプルネガティブ乳がん腫瘍モデルにおいても試験した。右の乳房皮下脂肪に１００μｌのＨＢＳＳ中の５×１０６細胞を注入することによって、ヒトＨＳ５７８Ｔ腫瘍細胞を７週齢ＮＳＧマウスに接種した。腫瘍が約１６８ｍｍ３の平均体積に到達したとき（０日目）、マウスを異なる処置群（１群につきｎ＝８マウス）に無作為化した。マウスに、０、７および１４日目に５０μｌの全体積のＰＢＳまたはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２（２×１０８ＰＦＵ）の３用量を与えた。
【０２１２】
図６に示すように、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２処置マウスの腫瘍体積は、４０日間の研究期間にわたって低いままであった。ＰＢＳ処置群の全ての動物は、腫瘍負荷のために３０日目以前に屠殺しなければならなかった。
【０２１３】
下記の研究は、腫瘍選択性変異（ΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７）および肝臓脱標的化ヘキソン変異（Ｅ４５１Ｑ）の組合せが、ＷＴ  Ａｄ５と比較してＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００のより良好な安全性／毒性プロファイルをもたらすことを示し、これは、転移がんの処置のために、これらのウイルスのより高い用量の静脈内（ＩＶ）安全送達を可能にするために重要である。０日目および再び７日目に、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０２、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２を、２００μｌの体積の８×１０８、４×１０９または２×１０１０の用量で、Ｃ５７ＢＬ／６マウス（１群につきｎ＝５マウス）の異なる群に静脈内投与した。肝臓毒性を調査するために、生存（図７Ａ）および上昇した肝酵素（図７Ｂ）についてマウスを次に分析した。
【０２１４】
生存および毒性の肉眼的徴候について、マウスを１４日目までモニタリングした（図７Ａ）。ＷＴ  Ａｄ５は４×１０９ＰＦＵの用量で致死性の毒性を引き起こしたが、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３１はこの用量で許容された。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は、２×１０１０ＰＦＵのさらにより高い用量でも許容された。血液試料を−２日目（投与前）、２日目（投与１の４８時間後）および９日目（投与２の４８時間後）に全てのマウスから採取し、以降の分析のために冷凍した。血液試料は、様々な肝酵素、例えばアラニントランスアミナーゼ（ＡＬＴ）およびアスパラギン酸トランスアミナーゼ（ＡＳＴ）の存在について調査した。示す結果は、様々な処置群からの２日目の出血からのＡＳＴおよびＡＬＴレベルの平均である（図７Ｂ）。全てのマウスからのＡＳＴおよびＡＬＴの平均投与前レベルも示す。これらのデータは、正常細胞（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１８１）におけるウイルス複製を制限するΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７変異ならびにＡｄＳｙｎ−ＣＯ３３１に存在するヘキソン脱標的化変異の両方が、ＷＴ  Ａｄ５と比較して低減された毒性につながることを示す。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は、２×１０１０ＰＦＵのより高い用量でさえ低減された肝臓毒性を示し、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２に存在するこれらの異なる変異の組合せが毒性のさらなる低減につながることを実証した。
【０２１５】
図８は、ＢＡＬＢ／ｃマウスにおけるＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００の毒性を示す表である。０日目、６日目および１２日目に異なる群のマウス（１群につきｎ＝５マウス）に、２００μｌの体積の２つの異なるウイルスを図に掲載した用量で静脈内投与した。毒性を調査するために、マウスを次に生存について分析した。ＷＴ  Ａｄ５は０．８×１０９ＰＦＵの用量で５匹のマウスのうちの２匹において致死性の毒性を誘導し、３．２×１０９ＰＦＵのより高い用量で全てのマウスを死滅させたのに対して、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００は１×１０９ＰＦＵおよび４×１０９ＰＦＵのわずかにより高い用量でより安全であった。これらのデータは、腫瘍細胞におけるその強化された複製および死滅効力にもかかわらず、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００に存在する腫瘍選択性変異および肝臓脱標的化ヘキソン変異のために、ＷＴ  Ａｄ５より良好な安全性プロファイルを実証することを示す。
【０２１６】
Ａ５４９肺がん異種移植モデルにおけるＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２のＩＶ送達の効能を評価するために、別の研究を実行した。乳房皮下脂肪に５×１０６細胞を注入することによって、ヒトＡ５４９腫瘍細胞をＮＳＧマウスに接種した。腫瘍が約１８４ｍｍ３の平均体積に到達したとき（０日目）、マウスを異なる処置群（１群につきｎ＝８マウス）に無作為化した。マウスに、ＰＢＳの単一の注射またはＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２の２×１０９ＰＦＵの単一のＩＶ注射を与えた。図９に示すように、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２処置動物において、腫瘍体積は３３日間の研究期間にわたって低いままであった。対照的に、食塩水処置群の全ての動物は、腫瘍負荷のために３３日目以前に屠殺しなければならなかった。野生型Ａｄ５は２×１０９ＰＦＵの用量で送達できなかったが、その理由は、この用量が死をもたらすからである。
【０２１７】
次に、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２を、正常（非腫瘍細胞）において評価した。ヒトＡ５４９細胞（肺腫瘍）またはヒト初代小気道上皮細胞（ＳＡＥＣ−正常肺）を、４つの異なる腫瘍溶解性ウイルス（ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２）のうちの１つによって１細胞につき０．１２ウイルス粒子のＭＯＩで感染させた。全てのウイルスは、ウイルス複製／増大の経時的定量化を可能にするレポーターとして、ＹＰｅｔ蛍光団をコードする。ウイルス感染の直後に、６〜７日間にわたってＹＰｅｔ＋ウイルス感染細胞の数を定量化するために、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺＯＯＭ画像化システムにおいて１時間ごとに１回、ウイルス感染細胞を画像化した。データは、経時的なＹＰｅｔ＋細胞の数として表される。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００が腫瘍選択的複製を付与するΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７変異ならびに肝臓脱標的化ヘキソン変異を有すること以外は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００は同一のウイルスである。同様に、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２がΔＬＸＣＸＥおよびΔＥ４ｏｒｆ６／７変異ならびに肝臓脱標的化ヘキソン変異を有すること以外は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は同一のウイルスである。腫瘍細胞では、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１とそれぞれ比較してウイルス増大／複製の類似したレベルを示した（図１０）。しかし正常肺細胞では、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４１と比較して有意に減弱された増大／複製を示した。これらのデータは、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２は腫瘍細胞において強力な複製を実証するが、それらの複製は正常細胞において有意に減弱されることを示す。
【０２１８】
（実施例５）
Ｅ３Ａ、Ｅ３Ｂおよび／またはＥ４ｏｒｆ３の欠失または改変
アデノウイルス複製動態に及ぼすＥ３Ａ遺伝子だけまたはＥ３Ｂ遺伝子だけの抑止の影響を評価するために、研究を実行した。Ｅ３Ｂ遺伝子の役割を評価するために、ヒトＡ５４９肺腫瘍細胞における複製速度を判定するために、蛍光ベースのウイルス動態学的（ＦＢＶＫ）アッセイを使用して、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８６９、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９９６およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４を調査した（図１１）。データは、Ｙｐｅｔ蛍光性タンパク質をコードする各組換えアデノウイルスのｌｎ−ｓｌｏｐｅ値として報告される。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８６９では、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子（Ｅ３Ｂ遺伝子）は、ゲノムから欠失している。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９９６では、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子（Ｅ３Ｂ遺伝子）の発現は、開始コドンを変異させることによって、または未熟停止コドンをコードするようにゲノムを変異させることによって抑止される。このように、遺伝子はゲノムになお存在するが、遺伝子はウイルス感染の間に発現されない。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４では、６つのＥ３遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ）は、ゲノムから欠失している。これらのデータは、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ遺伝子の欠失または発現の抑止が、ウイルス複製の増加につながることを示す。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ８７４における追加のＥ３遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９ｋ）の欠失は、複製動態のさらなる増加につながる。
【０２１９】
Ｅ３Ａ遺伝子の役割を評価するために、ヒトＡ５４９肺腫瘍細胞における複製速度を判定するために、ＦＢＶＫアッセイにおいて、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ４２１、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１００２、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９９９およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００を調査した（図１２）。データは、Ｙｐｅｔ蛍光性タンパク質をコードする各組換えアデノウイルスのｌｎ−ｓｌｏｐｅ値として報告される。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１００２では、１２．５ｋ、６．７ｋおよび１９ｋ遺伝子（Ｅ３Ａ遺伝子）は、ゲノムから欠失している。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ９９９では、同じＥ３Ａ遺伝子が欠失し、このウイルスはＥ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７およびヘキソン［Ｅ４５１Ｑ］改変をさらに含む。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００では、Ｅ３ＡおよびＥ３Ｂ遺伝子（１２．５ｋ、６．７ｋ、１９ｋ、ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ）はゲノムから欠失し、このウイルスはＥ１Ａ  ΔＬＸＣＸＥ、ΔＥ４ｏｒｆ６／７およびヘキソン［Ｅ４５１Ｑ］改変をさらに含む。これらのデータは、Ｅ３Ａ遺伝子の欠失がウイルス複製の軽度の増加につながることを示す。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０００におけるＥ３Ｂ遺伝子（ＲＩＤα、ＲＩＤβおよび１４．７ｋ）の追加の欠失は、複製動態のさらなる増加につながる。
【０２２０】
ウイルス複製動態に及ぼすＥ４ｏｒｆ３の欠失の影響を評価するために、さらなる研究を実行した。Ａ５４９ヒト肺腫瘍細胞における複製速度を判定するために、ＦＢＶＫアッセイでＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３４７を調査した（図１３）。グラフは、各組換えアデノウイルスのｌｎ−ｓｌｏｐｅ値を示す。ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１０４２およびＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３４７は、ＡｄＳｙｎ−ＣＯ１３４７におけるＥ４ｏｒｆ３の欠失を除いて同一である。これらのデータは、腫瘍細胞におけるウイルス複製に負の影響を及ぼさずにＥ４ｏｒｆ３をＡｄ５において欠失させることもできることを実証する。
【０２２１】
本開示の原理を適用することができる多数の可能性のある実施形態を考慮して、例示された実施形態が、本開示の例にすぎず、本開示の範囲を限定するものとして捉えられるものではないことを認識されたい。むしろ、本発明の範囲は、以下の特許請求の範囲によって定められる。したがって、本発明者らは、これらの特許請求の範囲の範囲および趣旨の範囲内のものすべてに関して、本発明者らの発明として権利を主張する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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