(57)【要約】方法は、１つまたは複数のシークエンシングデバイスから、ヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識から検出された生データを取得するステップと、生データを処理して、１つまたは複数のシークエンシングデバイスの学習可能な自動塩基決定モジュールによって生成された塩基決定と、生データに関連付けられた実際の値との比較を実行するステップとを含み、塩基決定により、生データから１つまたは複数の個々のヌクレオチドが同定される。比較に基づいて、取得された生データの少なくとも一部を使用して、学習可能な自動塩基決定モジュールに対する更新が作成され、更新は、１つまたは複数のシークエンシングデバイスに利用可能となる。
2021511829.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸のヌクレオチドを同定するための方法であって、
少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサを使用して、
核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、
前記データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することとを実行するステップを含む方法。
【請求項２】
前記深層学習モデルが、畳み込みニューラルネットワークを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記深層学習モデルが、コネクショニスト時間分類（ＣＴＣ）適合ニューラルネットワークモデルを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
核酸のヌクレオチドを同定する出力は、複数のヌクレオチドの各々に関して、ヌクレオチドが核酸に取り込まれている確率を示す個々の時系列の値を含む、請求項１乃至３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
核酸のヌクレオチドを同定する出力は、複数のヌクレオチドの各々に関して、ヌクレオチドが核酸に取り込まれている確率を含み、
方法は、核酸中の複数のヌクレオチドの最初の１つを、最初のヌクレオチドが核酸に取り込まれている確率が閾値確率を超えたときに、同定するステップをさらに含む、請求項１乃至４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記トレーニング済みの深層学習モデルへの入力として前記データを提供することは、
前記データを複数の期間に編成することと、
核酸の少なくとも１つのヌクレオチドを示す対応する出力を取得するために、各期間の前記データを前記トレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供することとを含む、請求項１乃至５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記トレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供される個々の期間に対応する出力は、複数のヌクレオチドの各々に関して、ヌクレオチドが前記期間中に核酸に取り込まれている確率を示す値を示す、請求項１乃至６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記トレーニング済みの深層学習モデルへの入力として前記データを提供することは、
前記データの複数の部分を識別することと、各部分はヌクレオチドの取り込みイベントの個々の１つに対応しており、
前記データの前記複数の部分の各々を、前記トレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、前記データの一部に対応する出力を取得することとを含む、請求項１乃至７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
前記データの一部に対応する出力は、核酸に取り込まれたヌクレオチドを同定する、請求項１乃至８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０】
複数の核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたトレーニングデータにアクセスするステップと、
前記トレーニングデータおよび複数の核酸中の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報を使用して深層学習モデルをトレーニングして、前記トレーニング済みの深層学習モデルを取得するステップと、をさらに含む、請求項１乃至９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１】
前記光放射が一連の光パルスに応答的であり、前記データは、少なくともいくつかの光パルスの各々に関して、光パルス後の期間内における複数の間隔の各々において検出された光子の個々の数を含んでいる、請求項１乃至１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２】
核酸のヌクレオチドを同定するためのシステムであって、
少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサと、
命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体と、を備え、前記命令は、前記少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、前記少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに、
核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、
前記データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することとを実行させる、システム。
【請求項１３】
命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、前記命令は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、前記少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに
核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、
前記データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することとを実行させる、少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項１４】
核酸のヌクレオチドを同定するための深層学習モデルをトレーニングする方法であって、
少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサを使用して、
複数の核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、
前記データおよび複数の核酸中の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報を使用して深層学習モデルをトレーニングすることと、を実行するステップを含む、方法。
【請求項１５】
前記データおよび前記複数の核酸中の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する前記情報を使用して前記深層学習モデルをトレーニングすることは、
前記データの少なくとも一部を前記深層学習モデルへの入力として提供して、複数の核酸中の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する出力を取得することと、
前記出力によって同定された少なくとも１つの核酸のヌクレオチドと、前記情報によって同定された少なくとも１つの核酸のヌクレオチドとの間の差異に基づいて、前記深層学習モデルをトレーニングすることとを含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記深層学習モデルを再トレーニングして、更新された深層学習モデルを取得するステップと、
前記深層学習モデルの更新を１つまたは複数のシークエンシングデバイスに伝達するステップと、をさらに含む、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記深層学習モデルは、畳み込みニューラルネットワークを含む、請求項１４乃至１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記深層学習モデルは、コネクショニスト時間分類（ＣＴＣ）適合ニューラルネットワークモデルを含む、請求項１４乃至１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の核酸中の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する前記情報は、前記複数の核酸中の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、前記データは、少なくとも１つの核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベントに対応するデータを含み、前記深層学習モデルをトレーニングすることは、
少なくとも１つの核酸のヌクレオチド配列を反転することと、
少なくとも１つの核酸に関する取り込みイベントに対応するデータおよび少なくとも１つの核酸に関するヌクレオチドの反転配列を使用して、前記深層学習モデルをトレーニングすることと、を含む、請求項１４乃至１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスするステップと、
前記データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得するステップとをさらに含む、請求項１４乃至１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータと、核酸のヌクレオチドを同定する出力とを使用して前記深層学習モデルを再トレーニングするステップをさらに含む、請求項１４乃至２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記データにアクセスすることは、複数の光検出器によって収集されたデータを取得することを含む、請求項１４乃至２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記光放射が一連の光パルスに応答的であり、前記データは、少なくともいくつかの光パルスの各々に関して、光パルス後の期間内における複数の間隔の各々において検出された光子の個々の数を含む、請求項１４乃至２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
核酸のヌクレオチドを同定するための深層学習モデルをトレーニングするシステムであって、
少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサと、
命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体と、を備え、前記命令は、前記少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、前記少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに、
複数の核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、
前記データおよび複数の核酸中の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報を使用して深層学習モデルをトレーニングすることと、を実行させる、システム。
【請求項２５】
命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、前記命令は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、前記少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに、
核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、
前記データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することとを実行させる、少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体。
【請求項２６】
核酸のヌクレオチドを同定するための方法であって、
少なくとも１つのハードウェアプロセッサを使用して、
ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、光放射は、一連の光パルスに応答的であり、前記データは、少なくともいくつかの光パルスの各々に関して、光パルス後の期間内の複数の間隔の各々において検出された光子の個々の数を含み、
前記データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することを実行するステップを含む、方法。
【請求項２７】
前記データは、一連の光パルスにおける第１の光パルス後の第１の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子の個々の数を示すデータを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記データは、一連の光パルスにおける第２の光パルス後の第２の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子の個々の数をさらに含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記データを前記トレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、列を有するデータ構造に前記データを配置することを含み、
第１の列は、一連の光パルスにおける第１の光パルス後の第１の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子数を保持し、
第２の列は、一連の光パルスにおける第２の光パルス後の第２の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子数を保持する、請求項２６乃至２８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３０】
前記データを前記トレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、データを画像に配置することを含み、前記画像の各ピクセルは、少なくともいくつかのパルスのうちの１つの後の期間のある間隔において検出されたいくつかの光子を特定する、請求項２６乃至２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記データを前記トレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、行を有するデータ構造にデータを配置することを含み、各行は、少なくともいくつかの光パルスに対応する個々の間隔における多数の光子を保持する、請求項２６乃至３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記データを前記トレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、
データの複数の部分を識別することと、各部分は核酸のヌクレオチドの個々に１つに対応しており、
前記データの前記複数の部分の各々を、前記トレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供して、前記データの一部に対応する出力を取得することとを含む、請求項２６乃至３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
核酸の個々のヌクレオチドに対応するものとしてデータの一部を同定することは、
データの一部における複数の間隔の最初の１つにおけるいくつかの光子を、データの一部における最初の間隔から離れた複数の間隔のうちの少なくとも１つにおけるいくつかの光子と比較することを含む、請求項２６乃至３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記機械学習モデルは、深層学習モデルを含む、請求項２６乃至３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
深層学習モデルは、畳み込みニューラルネットワークを含む、請求項２６乃至３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記機械学習モデルは、コネクショニスト時間分類（ＣＴＣ）適合ニューラルネットワークモデルを含む、請求項２６乃至３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
複数の核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたトレーニングデータにアクセスするステップと、
トレーニングデータおよび複数の核酸中の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報を使用して前記機械学習モデルをトレーニングして、トレーニング済みの機械学習モデルを得るステップと、をさらに含む、請求項２６乃至３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
核酸のヌクレオチドを同定するシステムであって、
少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサと、
命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体と、を備え、前記命令は、前記少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、前記少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに、
ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、光放射は、一連の光パルスに応答的であり、前記データは、少なくともいくつかの光パルスの各々に関して、光パルス後の期間内の複数の間隔の各々において検出された光子の個々の数を含み、
前記データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することとを実行させる、システム。
【請求項３９】
命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体であって、前記命令は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、前記少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに、
ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、光放射は、一連の光パルスに応答的であり、前記データは、少なくともいくつかの光パルスの各々に関して、光パルス後の期間内の複数の間隔の各々において検出された光子の個々の数を含み、
前記データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することとを実行させる、少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、概して、生物学的シークエンシングのための自動化されたパルス決定および塩基決定方法に関し、より具体的には、シークエンシングデバイス用の機械学習可能なパルス決定および塩基決定に関する。
【背景技術】
【０００２】
核酸（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ），リボ核酸（ＲＮＡ））のシークエンシングには、標的である核酸の各ヌクレオチドを同定することが含まれる。いくつかの核酸のシークエンシング方法には、標的核酸の相補的な核酸鎖に取り込まれた時に各ヌクレオチドを同定する工程が含まれる。シークエンシングの工程で相補鎖の一連のヌクレオチドを同定することにより標的核酸鎖のヌクレオチド配列を同定することができる。
【発明の概要】
【０００３】
一態様によれば、核酸のヌクレオチドを同定するための方法が提供される。方法は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサを使用して、核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することとを実行することを含む。
【０００４】
一実施形態によれば、深層学習モデルは、畳み込みニューラルネットワークを含む。一実施形態によれば、深層学習モデルは、コネクショニスト時間分類（ＣＴＣ：ｃｏｎｎｅｃｔｉｏｎｉｓｔ  ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ）適合ニューラルネットワークモデルを含む。
【０００５】
一実施形態によれば、核酸のヌクレオチドを同定する出力は、複数のヌクレオチドの各々に関して、ヌクレオチドが核酸に取り込まれている確率を示す個々の時系列の値を含む。一実施形態によれば、核酸のヌクレオチドを同定する出力は、複数のヌクレオチドの各々に関して、ヌクレオチドが核酸に取り込まれている確率を含み、方法は、核酸中の複数のヌクレオチドの最初の１つを、最初のヌクレオチドが核酸に取り込まれている確率が閾値確率を超えたときに、同定するステップをさらに含む。
【０００６】
一実施形態によれば、データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供することは、データを複数の期間に編成することと、核酸の少なくとも１つのヌクレオチドを示す対応する出力を取得するために、各期間のデータをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供することとを含む。一実施形態によれば、トレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供される個々の期間に対応する出力は、複数のヌクレオチドの各々に関して、ヌクレオチドがその期間中に核酸に取り込まれている確率を示す値を示す。
【０００７】
一実施形態によれば、データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供することは、データの複数の部分を識別することと、各部分は、ヌクレオチドの取り込みイベントの個々の１つに対応しており、データの複数の部分の各々をトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、データの一部に対応する出力を取得することとを含む。一実施形態によれば、データの一部に対応する出力は、核酸に取り込まれたヌクレオチドを同定する。
【０００８】
一実施形態によれば、方法は、複数の核酸のヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたトレーニングデータにアクセスするステップと、トレーニングデータおよび複数の核酸中の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報を使用して、深層学習モデルをトレーニングして、トレーニング済みの深層学習モデルを取得するステップとをさらに含む。
【０００９】
一実施形態によれば、光放射は一連の光パルスに応答的であり、データは、少なくともいくつかの光パルスの各々に関して、光パルス後の期間内における複数の間隔の各々において検出され光子の個々の数を含む。
【００１０】
別の態様によれば、核酸のヌクレオチドを同定するシステムが提供される。システムは、少なくともコンピュータハードウェアプロセッサと、命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体とを備え、命令は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに、核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することと、を実行させる。
【００１１】
別の態様によれば、命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体が提供される。命令は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに、核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することとを実行させる。
【００１２】
別の態様によれば、核酸のヌクレオチドを同定するための深層学習モデルをトレーニングする方法が提供される。方法は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサを使用して、複数の核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、データおよび複数の核酸中の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報を使用して、深層学習モデルをトレーニングすることとを実行するステップを含む。
【００１３】
一実施形態によれば、データおよび複数の核酸の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報を使用して深層学習モデルをトレーニングすることは、データの少なくとも一部を深層学習モデルへの入力として提供して、複数の核酸の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する出力を取得することと、出力によって同定された少なくとも１つの核酸のヌクレオチドと、情報によって特定された少なくとも１つの核酸のヌクレオチドとの間の差異に基づいて、深層学習モデルをトレーニングすることとを含む。
【００１４】
一実施形態によれば、この方法はさらに、深層学習モデルを再トレーニングして、更新された深層学習モデルを取得するステップと、深層学習モデルに対する更新を１つまたは複数のシークエンシングデバイスに伝達するステップとをさらに含む。
【００１５】
一実施形態によれば、深層学習モデルは、畳み込みニューラルネットワークを含む。一実施形態によれば、深層学習モデルは、コネクショニスト時間分類（ＣＴＣ）適合ニューラルネットワークモデルを含む。
【００１６】
一実施形態によれば、複数の核酸における少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報は、複数の核酸中の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、データは、少なくとも１つの核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベントに対応するデータを含み、深層学習モデルをトレーニングすることは、少なくとも１つの核酸のヌクレオチド配列を反転することと、少なくとも１つの核酸に関する取り込みイベントに対応するデータおよび少なくとも１つの核酸のヌクレオチドの反転配列を使用して、深層学習モデルをトレーニングすることとを含む。
【００１７】
一実施形態によれば、方法は、核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスするステップと、データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得するステップとをさらに含む。
【００１８】
一実施形態によれば、方法は、核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータと、核酸のヌクレオチドを同定する出力とを使用して、深層学習モデルを再トレーニングするステップをさらに含む。
【００１９】
一実施形態によれば、データにアクセスすることは、複数の光検出器によって収集されたデータを取得することを含む。一実施形態によれば、光放射は一連の光パルスに応答的であり、データは、少なくともいくつかの光パルスの各々に関して、光パルス後の期間内における複数の間隔の各々において検出され光子の個々の数を含む。
【００２０】
別の態様によれば、核酸のヌクレオチドを同定するための深層学習モデルをトレーニングするシステムが提供される。システムは、少なくともコンピュータハードウェアプロセッサと、命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体とを備え、命令は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに、複数の核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、データおよび複数の核酸中の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報を使用して、深層学習モデルをトレーニングすることと、を実行させる。
【００２１】
別の態様によれば、命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体が提供される。命令は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに、核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することとを実行させる。
【００２２】
別の態様によれば、核酸のヌクレオチドを同定するための方法が提供される。方法は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサを使用して、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、光放射は一連の光パルスに応答的であり、データは、少なくともいくつかの光パルスの各々に関して、光パルス後の期間内の複数の間隔の各々において検出された光子の個々の数を含んでおり、データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することとを実行するステップを含む。
【００２３】
一実施形態によれば、データは、一連の光パルスにおける第１の光パルス後の第１の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子の個々の数を示すデータを含む。一実施形態によれば、データは、一連の光パルスにおける第２の光パルス後の第２の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子の個々の数をさらに含む。
【００２４】
一実施形態によれば、データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、列を有するデータ構造にデータを配置することを含み、第１の列は、一連の光パルスにおける第１の光パルス後の第１の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子数を保持し、第２列は、一連の光パルスの第２の光パルス後の第２の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子数を保持する。一実施形態によれば、データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、データを画像に配置することを含み、画像の各ピクセルは、少なくともいくつかのパルスのうちの１つの後の時間間隔において検出されたいくつかの光子を特定する。一実施形態によれば、データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、行を有するデータ構造にデータを配置することを含み、各行は、少なくともいくつかの光パルスに対応する個々の間隔における多数の光子を保持する。
【００２５】
一実施形態によれば、データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、データの複数の部分を識別することと、各部分は、核酸のヌクレオチドの個々の１つに対応しており、データの複数の部分の各々を、トレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供して、データの一部に対応する出力を取得することとを含む。一実施形態によれば、データの一部を核酸の個々のヌクレオチドに対応するものとして同定することは、データの一部における複数の間隔の最初の１つにおけるいくつかの光子を、データの一部における最初の間隔から離れた複数の間隔のうちの少なくとも１つにおけるいくつかの光子と比較することを含む。
【００２６】
一実施形態によれば、機械学習モデルは、深層学習モデルを含む。一実施形態によれば、深層学習モデルは、畳み込みニューラルネットワークを含む。一実施形態によれば、機械学習モデルは、コネクショニスト時間分類（ＣＴＣ）適合ニューラルネットワークモデルを含む。
【００２７】
一実施形態によれば、方法は、複数の核酸のヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたトレーニングデータにアクセスするステップと、トレーニングデータおよび複数の核酸中の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報を使用して機械学習モデルをトレーニングして、トレーニング済みの機械学習モデルを取得するステップとをさらに含む。
【００２８】
別の態様によれば、核酸のヌクレオチドを同定するためのシステムが提供される。システムは、少なくともコンピュータハードウェアプロセッサと、命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体とを備え、命令は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、光放射は、一連の光パルスに応答的であり、データは、少なくともいくつかの光パルスの各々に関して、光パルス後の期間内の複数の間隔の各々において検出された光子の個々の数を含んでおり、データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することとを実行させる。
【００２９】
別の態様によれば、命令を格納する少なくとも１つの非一時的なコンピュータ可読記憶媒体が提供される。命令は、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサによる実行時に、少なくとも１つのコンピュータハードウェアプロセッサに、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスすることと、光放射は、一連の光パルスに応答的であり、データは、少なくともいくつかの光パルスの各々に関して、光パルス後の期間内の複数の間隔の各々において検出された光子の個々の数を含んでおり、データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することと、を実行させる。
【００３０】
別の態様によれば、方法は、処理デバイスを用いて、ヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識から検出された生データを取得するステップと、機械学習技術を適用して、生データから１つまたは複数の個々のヌクレオチドを自動的に同定するステップとを含む。
【００３１】
別の態様によれば、方法は、１つまたは複数のシークエンシングデバイスから、ヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識から検出された生データを取得するステップと、コンピューティングデバイスを使用して、生データを処理して、１つまたは複数のシークエンシングデバイスの学習可能な自動塩基決定モジュールによって生成された塩基決定と、生データに関連付けられた実際の値との比較を実行するステップと、塩基決定により、生データからの１つまたは複数の個々のヌクレオチドが同定され、比較に基づいて、取得した生データの少なくともいくつかを使用して、学習可能な自動塩基決定モジュールへの更新を作成するステップと、更新を１つまたは複数のシークエンシングデバイスが利用できるようにするステップとを含む。
【図面の簡単な説明】
【００３２】
本願の様々な態様及び実施形態は、以下の図面を参照して説明されている。図面は、必ずしも縮尺通りではないことを理解されたい。なお、複数の図面に表示されている構成は、それらが表示される全図面において同一の参照番号で示されている。
【図１】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、学習可能な塩基決定を使用するシークエンシングデバイスが使用され得る例示的なエコシステムの概略図である。
【図２】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、図１の例示的なエコシステム内で好循環を実施するための例示的なプロセスを示す高レベルのフロー図である。
【図３】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、機械学習可能な塩基決定器を実施する方法の実施形態と併せて使用され得る例示的なシークエンシングシステムの概略図である。
【図４】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、図３に示される例示的なシークエンシングシステムのより詳細な概略図である。
【図５】ＡおよびＢは、本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、例示的なシークエンシングマシンの統合デバイスをさらに詳細に示す断面図である。
【図６】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、励起後の経時的な光子放射の確率のプロットおよび光検出器によって検出された時間ビン内の光子数の分布を示す図である。
【図７】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、核酸のシークエンシング中に光検出器によって経時的に検出された光強度のプロットである。
【図８】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、異なるヌクレオチドに対する点のクラスターを示す、ヌクレオチドの取り込みイベントの時間パラメータの強度対時間ビン比率のプロットである。
【図９】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、図８に示されたクラスターの境界および重心位置を示すプロットである。
【図１０】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、ヌクレオチドの取り込みイベントに対応する点の異なるヌクレオチドの重心の位置までの相対距離を示す強度対時間パラメータのプロットである。
【図１１】本明細書で説明される技術の実施形態による、学習可能な塩基決定器を実施する方法のフロー図である。
【図１２】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、図１１の方法への入力であり得る例示的なデータトレースである。
【図１３】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、図１２におけるパルスデータの二次元散布プロットである。
【図１４】本明細書で説明する技術のいくつかの実施形態による、画像を分析するように構成された例示的な畳み込みニューラルネットワークの層を示す概略図である。
【図１５】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、学習可能な塩基決定器を実施する方法を示すフロー図である。
【図１６】Ａ〜Ｄは、本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、４つの塩基種類の各々に関するパルストレースデータの４つの異なる例示的な正規化２Ｄ行列表現をそれぞれ示す。
【図１７】Ａ〜Ｄは、本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、塩基シグネチャの各々に対する一連の正規化された時間ビン１および時間ビン２の光子数を示す。
【図１８】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、学習可能な塩基決定器を実施する方法を示すフロー図である。
【図１９】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、図１８の方法によって使用される時間ビン１および時間ビン２の光子数の生のトレースの例を示すプロットである。
【図２０】Ａ〜Ｃは、本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、異なるサイズのウィンドウに亘って適用される畳み込みニューラルネットワークに図１９の生トレースデータを入力することによって生成される実行塩基カウント確率を示すプロットである。
【図２１】本明細書に記載される技術のいくつかの実施形態による、スペクトログラムプロットおよびスペクトログラムプロットの正規化された大きさのプロットを図示する。
【図２２】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、学習可能な塩基決定器を実施する方法を示すフロー図である。
【図２３】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、関連する塩基標識による一対の単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ）入力データセグメントを示す。
【図２４】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、関連する塩基標識による一対のシミュレートされた入力データセグメントを示す。
【図２５】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、シミュレートされたデータトレースと比較するための実際のデータトレースの４００フレームのセグメントである。
【図２６】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、実際のデータから取り込まれた、バックグラウンドを差し引いた時間ビンの比率の適合分布である。
【図２７】本明細書に記載される技術のいくつかの実施形態による、実際のデータから取り込まれた、ベースラインを超える比率としての塩基強度の適合分布である。
【図２８】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、図２６および図２７の分布の交差である。
【図２９】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、４００フレームのセグメントに亘るシステムノイズの例示的なプロットである。
【図３０】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、４００フレームのトレースの長さに亘る時間ビンの比率をシミュレートする例示的なプロットである。
【図３１】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、図２９および図３０のプロットを使用して、システムノイズをビン１の成分およびビン２の成分に分割する例示的なプロットである。
【図３２】本明細書に記載されている技術のいくつかの実施形態による、４００フレームのトレース上にランダムに配置された明瞭な塩基取り込み信号の例示的なプロットである。
【図３３】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、図３２のランダムな明瞭な信号トレースを図３１のベースラインノイズプロットに加えることによって生成されたシミュレーショントレースの例示的なプロットである。
【図３４】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、アーチファクトが誇張されたレベルに適用されたシミュレーションされたトレースの例示的なプロットである。
【図３５】本明細書に記載される技術のいくつかの実施形態による、融合パルスを表すように見える時間ビン１および時間ビン２の光子数の生のトレースの例を示すプロットである。
【図３６】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、図２２のＣＴＣベースのモデルを使用して図３５のデータから直接塩基を決定するために使用される確率分布である。
【図３７】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態を実施する際に使用され得る例示的なコンピューティングデバイスのブロック図である。
【図３８Ａ】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベントから取得され得る例示的なデータを示す。
【図３８Ｂ】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、図３８Ａのデータを配置するための例示的なデータ構造である。
【図３９Ａ】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、核酸のヌクレオチドを同定するための深層学習モデルをトレーニングするための例示的なプロセスである。
【図３９Ｂ】本明細書に記載されている技術のいくつかの実施形態による、核酸のヌクレオチドを同定するためにトレーニング済みの深層学習モデルを使用するための例示的なプロセスである。
【図４０】本明細書に記載されている技術のいくつかの実施形態による、核酸のヌクレオチドを同定するための例示的な畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ：ｃｏｎｖｏｌｕｔｉｏｎａｌ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）の構造である。
【図４１】本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、核酸のヌクレオチドを同定するための例示的なコネクショニスト時間分類（ＣＴＣ）適合モデルのブロック図である。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本明細書で説明される実施形態は、概して、ＤＮＡおよびＲＮＡなどの核酸のシークエンシングに関し、特に、センサから取得されたデータに基づいてヌクレオチドを自動的に同定するための技術に関する。核酸をシークエンシングすることにより、標的核酸のヌクレオチドの順番と位置とを決定することができる。核酸をシークエンシングする方法は、合成によるシークエンシングに基づくものであり、その方法では、標的核酸に相補的である新規に合成された核酸鎖の中にヌクレオチドが取り込まれた際にヌクレオチドの同一性が決定される。シークエンシング中には、重合酵素（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ）が標的の核酸分子の標識部位に結合して（例えば、アタッチして）、重合酵素の活性を用いてプライマーにヌクレオチドを付加又は取り込ませる。これは、プライマー伸長反応と一般に呼ばれる。
【００３４】
本発明者らは、機械学習モデルを使用して核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）のヌクレオチドを同定するための新規の技術を開発した。機械学習モデルを使用して核酸のヌクレオチドを同定する従来の技術では、核酸のヌクレオチド取り込みについて収集されたデータから抽出するための「有益な」特徴を識別するために、人間（例えば、ドメインエキスパート）の関与を必要とする場合がある。発明者らは、核酸のヌクレオチドを確実に同定するために機械学習モデルによって使用され得る一連の特徴を識別することは困難であることを認識しており、このようにすることは、「特徴工学」と呼ばれる、候補特徴セットの反復試行錯誤を含む。結局、そのような「特徴工学」は、ヌクレオチドの同定に使用するのに最適な特徴を決定できず、次善の同定性能につながる可能性がある。
【００３５】
本発明者らは、ヌクレオチドを同定するために使用する個々の特徴を手動で決定する必要がない、核酸のヌクレオチドを同定するための機械学習技術を開発した。むしろ、いくつかの実施形態において、深層学習技術を使用して、深層学習モデルをトレーニングして、センサデータを直接（または、小さな前処理により）処理することによって、収集されたデータ中のどの情報がヌクレオチド同定作業に関して有用であるかを自動的に学習し、トレーニング済み深層学習モデルを使用して、ヌクレオチドの取り込みイベント中に、蛍光標識によって検出された光放射に基づいてヌクレオチドを同定する。
【００３６】
従って、いくつかの実施形態は、核酸のヌクレオチド（例えば、アデノシン、チミン、グアニン、および／またはシトシン）を同定するための方法を提供する。方法は、（１）核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、（例えば、光パルスに応答する）ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスするステップと、（２）データをトレーニング済みの深層学習モデル（例えば、再帰型ニューラルネットワーク、畳み込みニューラルネットワーク、および／またはコネクショニスト時間分類適合ニューラルネットワークモデル）への入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得するステップとを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、核酸のヌクレオチドを同定する出力は、複数のヌクレオチドの各々に関して、ヌクレオチドが核酸に取り込まれている確率を示す個々の時系列の値を含む。いくつかの実施形態では、核酸のヌクレオチドを同定する出力は、複数のヌクレオチドの各々に関して、ヌクレオチドがヌクレオチドに取り込まれている確率を含み、方法は、核酸中の複数のヌクレオチドの最初の１つを、最初のヌクレオチドが核酸に取り込まれている確率が閾値確率を超えたときに、同定するステップをさらに含む。
【００３８】
いくつかの実施形態では、コンピュータハードウェアプロセッサは、データを期間に編成することと、核酸の少なくとも１つのヌクレオチドを示す対応する出力を取得するために、各期間のデータをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供することとによって、データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供し得る。いくつかの実施形態では、トレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供されるデータの個々の期間に対応する出力は、複数のヌクレオチドの各々に関して、ヌクレオチドがその期間中に核酸に取り込まれている確率を示す。
【００３９】
いくつかの実施形態では、データをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供することは、データの複数の部分を識別するステップと、各部分はヌクレオチドの取り込みイベントの個々の１つに対応しており、データの複数の部分の各々をトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供して、データの一部に対応する出力を取得することを含む。いくつかの実施形態では、データの一部に対応する出力によって、核酸に取り込まれたヌクレオチドが同定される。
【００４０】
いくつかの実施形態では、核酸のヌクレオチド（例えば、アデノシン、チミン、グアニン、および／またはシトシン）を同定するための方法が提供される。方法は、少なくとも１つのハードウェアプロセッサを使用して、ヌクレオチド（アデノシン、チミン、グアニン、および／またはシトシンなど）に結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスするステップと、光放射は、一連の光パルスに応答的であり、データは、少なくともいくつかの光パルスの各々に関して、光パルス後の期間内の複数の間隔の各々において検出された光子の個々の数を含んでおり、データをトレーニング済みの機械学習モデル（例えば、畳み込みニューラルネットワークおよび／またはコネクショニスト時間分類適合ニューラルネットワークモデル）への入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得するステップとを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、データは、一連の光パルスにおける第１の光パルス後の第１の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子の個々の数を示すデータを含む。いくつかの実施形態では、データは、一連の光パルスにおける第２の光パルス後の第２の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子の個々の数をさらに含む。いくつかの実施形態では、データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、列を有するデータ構造（例えば、行列）にデータを配置することを含み、第１の列は、一連の光パルスにおける第１の光パルス後の第１の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子数を保持し、第２の列は、一連の光パルスにおける第２の光パルス後の第２の期間における第１および第２の時間間隔の各々における光子数を保持する。いくつかの実施形態では、データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、行を有するデータ構造（例えば、行列）にデータを配置することを含み、各行は、少なくともいくつかの光パルスに対応する個々の間隔における多数の光子を保持する。いくつかの実施形態では、データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、データを画像に配置することを含み、画像の各ピクセルは、少なくともいくつかのパルスのうちの１つの後の時間間隔において検出されたいくつかの光子を特定する。
【００４２】
いくつかの実施形態では、データをトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供することは、データの複数の部分を識別することと、各部分は、核酸のヌクレオチドの個々の１つに対応しており、データの複数の部分の各々をトレーニング済みの機械学習モデルへの入力として提供して、データの一部に対応する出力を取得することとを含む。いくつかの実施形態では、データの一部を核酸の個々ヌクレオチドに対応するものとして同定することは、データの一部における複数の間隔の最初の１つにおけるいくつかの光子を、データの一部における最初の間隔から離れた複数の間隔のうちの少なくとも１つにおけるいくつかの光子と比較することを含む。
【００４３】
いくつかの実施形態では、核酸のヌクレオチド（例えば、アデノシン、チミン、グアニン、および／またはシトシン）を同定するための深層学習モデル（例えば、畳み込みニューラルネットワーク、および／またはコネクショニスト時間分類適合ニューラルネットワーク）をトレーニングする方法が提供される。この方法は、実行するためのコンピュータハードウェアプロセッサを使用して、複数の核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に、ヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射から取得されたデータにアクセスするステップと、データおよび複数の核酸中の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報を使用して、深層学習モデルをトレーニングするステップとを含む。
【００４４】
いくつかの実施形態において、データおよび複数の核酸の少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報を使用して深層学習モデルをトレーニングするステップは、データの少なくとも一部を深層学習モデルへの入力として提供して、複数の核酸の少なくとも１つのヌクレオチドを同定する出力を取得することと、出力によって同定された少なくとも１つの核酸のヌクレオチドと、情報によって特定された少なくとも１つの核酸のヌクレオチドとの間の差異に基づいて、深層学習モデルをトレーニングすることとを含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、方法は、深層学習モデルを再トレーニングして、更新された深層学習モデルを取得するステップと、深層学習モデルに対する更新を１つまたは複数のシークエンシングデバイスに伝達するステップとを含む。いくつかの実施形態では、複数の核酸における少なくともいくつかのヌクレオチドを同定する情報は、複数の核酸中の少なくとも１つのヌクレオチド配列を含み、データは、少なくとも１つの核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベントに対応するデータを含み、深層学習モデルをトレーニングすることは、少なくとも１つの核酸のヌクレオチド配列を反転することと、少なくとも１つの核酸に関する取り込みイベントに対応するデータおよび少なくとも１つの核酸のヌクレオチドの反転配列を使用して、深層学習モデルをトレーニングすることとを含む。
【００４６】
本明細書で説明する技術は、核酸（例えば、ＤＮＡおよび／またはＲＮＡ）のシークエンシングを改善するために、深層学習モデルをシークエンシングデバイスに統合する。この技術は、深層学習モデルをトレーニングして、核酸へのヌクレオチドの取り込み（例えば、光検出器）から取得されたシークエンシングデータ（例えば、蛍光標識の検出された光放射）から特徴を識別する。次に、トレーニング済みの深層学習モデルをシークエンシングデバイスに統合し、かつ使用して、核酸の合成中に核酸のヌクレオチドを同定する。トレーニング済みの深層学習モデルの統合により、核酸のヌクレオチドが同定される精度が向上し、シークエンシングデバイスが核酸をシークエンシングする信頼性および精度が改善される。
【００４７】
各ヌクレオチドは、励起に応答して光を放射する蛍光分子（例えば、フルオロフォア）に結合され、蛍光分子は、異なる種類のヌクレオチド間で判別するためにヌクレオチドの各種類を標識するために使用される。例えば、各標識が異なる１つの核酸塩基に対応するように、例えば、第１標識はアデニン（Ａ）に、第２標識はシトシン（Ｃ）に、第３標識はグアニン（Ｇ）に、第４標識はチミン（Ｔ）に対応するように、一組の４つの標識がＤＮＡに存在する核酸塩基を標識するために使用される。標識は、リンカー分子を介して直接又は間接的にヌクレオチドに化学結合させることによりヌクレオチドに結合される。
【００４８】
プライマー伸長反応中には、ヌクレオチドとそれに結合された蛍光標識は、合成された相補的な核酸の中にヌクレオチドが取り込まれる際に重合酵素によって担持される。蛍光標識は、ヌクレオチドが合成された核酸の中に取り込まれた時に光のパルスによって励起されて標識が備える特性の光を放射する。いくつかの実施形態では、標識は、リンカー分子を介して直接又は間接的にヌクレオチドの末端のリン酸基に結合しており、ヌクレオチドが取り込まれる過程で重合酵素の活性によってヌクレオチドから離脱または遊離される（例えば、リン酸基結合の切断）。励起に応答して蛍光標識により放射される光を検出して分析することによって、取り込まれた核酸を同定することができる。プライマー伸長反応が起きている間に、合成された核酸に追加された各ヌクレオチドに対して励起と検出と分析とが実施される。標的核酸の配列は、合成された核酸の相補的な配列から決定することができる。
【００４９】
蛍光標識から放射される光は、他の標識からその標識を判別し、従ってヌクレオチドを同定することに使用することができるいくつかの特性を備える。これらの特性には、強度（例えば、光を放射する確率）、時間特性（例えば、励起後の光子放射の確率の減衰速度、取り込み時のパルス持続時間、および／または取り込み前後のパルス間隔持続時間）、スペクトル特性（例えば、放射される光の波長）、またはそれらの任意の組み合わせが含まれる。蛍光標識から放射された光は、１つまたは複数のこれらの特定を検出することができる光検出器によって検出される。適切な光検出器の例は、２０１５年８月７日に出願され、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる、「受信した光子の時間ビニングのための統合デバイス」と題する米国特許出願第１４／８２１，６５６号に記載されている。上記文献に開示されているように、光検出器は、光子の到達時間を検出する機能を備え、標識から放射される光の時間特性を決定することができる。放射された光の時間特性を検出することにより、次に、異なる時間特性を有する光を放射する標識を判別することが可能になる。時間特性の一例は、蛍光寿命である。フルオロフォアなどの蛍光分子は、励起に応答して光子を放射し得る。蛍光分子が光子を放射する確率は、励起後の時間の経過と共に低下する。この確率の減衰速度は、指数関数的であり得る。「寿命」は、この確率の減衰がどのくらい速く起こるかの特性である。減衰が速いことは、短寿命であると言え、減衰がゆっくりであることは、長寿命であると言える。蛍光分子から放射された光の時間特性を検出することにより、異なる寿命を有する蛍光分子を判別することができる。異なる寿命を有する蛍光分子により異なるヌクレオチドを標識することによって、検出した光の時間特性に基づいてヌクレオチドを判別することが可能である。
【００５０】
前述の米国特許出願第１４／８２１，６５６号に記載されている光検出器は、ナノ秒またはピコ秒の分解能で光子の到着時間を検出することができ、かつ入射光子の到着時間を時間ビニングすることができる。光子の放射は確率的であるため、標識は複数回励起されて、生じた光子放射は時間ビニングされ得る。そのような計測を複数回行うことによって、励起イベント後に光子が到着した時間のヒストグラムを作成することができる。この情報を分析して、放射された光の時間特性を計算することができ、この時間特性に基づいて、ある標識を別の標識から判別することができる。
【００５１】
本明細書で説明されるシステム、デバイス、および方法の実施形態は、光検出器からのデータを分析して、検出された光の特性に基づいて核酸の配列を決定することができるシークエンシング機器のエコシステムを提供する。いくつかの実施形態では、これらの技術は、光検出器からのデータのストリームを分析するために実施され得、これにより、データが光検出器によって収集されている間に、核酸のシークエンシングがリアルタイムで可能になり得る。いくつかの実施形態では、これらの技術は、取得後の後の時点で光検出器からのデータを分析するために実施されてもよい。これらの技術は、例えば、学習可能な「パルス決定器」および／または学習可能な「塩基決定器」によって実施され得、これらは、シークエンシング機器または他のデバイスのソフトウェアおよび／またはハードウェアモジュールであり得る。パルス決定および塩基決定に関する追加の詳細は、以下でさらに詳細に説明されるが、一般的に言えば、「パルス決定器」は、生のセンサデータを分析して、標識から蛍光パルスが発生したときの期間を識別し、標識が結合しているヌクレオチドがポリメラーゼによってオリゴヌクレオチド鎖に取り込まれていることを通知する。「塩基決定器」は、パルス決定器によって特定された期間内に検出された光の特性を分析して、ヌクレオチドの種類を決定、又は「判定」する。使用中に配備されたシークエンシング機器によってより多くのデータが取得されると、１つまたは複数のデータ処理技術を使用して、学習可能なパルス／塩基決定器の性能を分析し、その結果、アーキテクチャをその改良バージョンにより更新または置換することができる（改良バージョンも継続的な分析と再トレーニングの対象となる可能性がある）。データを分析するための従来の技術は、システムの予想される物理学および化学の第一原理計算に基づくモデルを使用することを含み得る。対照的に、本明細書で説明する技術のいくつかの実施形態の機械学習技術は、取得データから導出される観測システム動作を含む、観測システム動作に基づくモデルの更新を可能にすることができ、これは、静的モデルを生成するために使用される仮定とは異なり得る。
【００５２】
本明細書で説明する技術は、生の強度トレースから直接塩基を同定することを含むデータの分析を可能にすることができ、これにより、パルス決定ステップを含ませることの必要性を排除または低減することができる。
【００５３】
最初に図１を参照すると、学習可能な塩基決定を使用するシークエンシングデバイスが使用され得る例示的なエコシステム１００の概略図が示されている。シークエンシングデバイスによって使用され得る例示的な学習アーキテクチャに関するさらなる詳細は、以下でさらに詳細に説明される。いずれの場合でも、シークエンシング機器／デバイス（「シーケンサ」）１０２は、１つまたは複数の場所に配備され得、かつ場所および物理リソースの条件に応じて、有線または無線方式でネットワーク１０４に接続され得る。リアルタイムであろうと、取得後の後の時点であろうと、シークエンシングデバイス１０２から取得されたシークエンシングデータは、１つまたは複数のネットワーク１０４を介してアップロードされ、かつ１つまたは複数のデータベース１０６に格納され得る。いくつかの実施形態では、シークエンシングデータは、個々の時間ビンに対する生の時間強度トレースとしてアップロードされ得る。例えば、データは、第１のビンによって検出された経時的な光子数を有する光検出器の第１のビンに対する時間強度トレースと、第２のビンによって検出された経時的な光子数を有する光検出器の第２のビンに対する時間強度トレースとを含み得る。いくつかの実施形態では、表現は、データのサイズを縮小するように設計された関数に生の時間強度トレースを通すことによって計算され得る。関数は、時間強度トレースから特徴を抽出して、抽出された特徴が時間強度トレースのコンテンツ情報を識別し、かつ結果の表現に含まれるようにすることができる。表現は、塩基決定器の後続の実行を可能にするフォーマットを有し得る。このような技術は、データのアップロード前に適用することができ、データのサイズを縮小すると、アップロードプロセスを改善することができる。
【００５４】
シークエンシングデータは、例えば、シークエンシングデバイス１０２によって利用される１つまたは複数の学習可能な塩基決定方法の精度を向上させるために、分析、注釈付け、およびトレーニングに関して、１つまたは複数のワークステーション１０８を介してアクセス可能であり得る。有利には、例えば、１つまたは複数のネットワーク１０４を介してダウンロードすることによって、塩基決定アルゴリズムに対する定期的な更新を、シークエンシングデバイス１０２が利用できるようにすることができる。本明細書で説明される技術の態様はこの点に限定されないため、他のコンピューティングデバイス（単数または複数）（例えば、単一のコンピューティングデバイス、単一の物理的な場所に同時配置されるか、または互いに離間した複数の物理的な場所に配置された複数のコンピューティングデバイス、クラウドコンピューティングシステムの１つまたは複数のコンピューティングデバイス部分、その他）は、塩基決定アルゴリズムのいくつかまたは全ての態様を実施してもよいことを理解されたい。そのような実施形態では、他のコンピューティングデバイス（単数または複数）は、塩基決定アルゴリズムへの定期的な更新を受信し得る。図１は、データレビュー１１０、塩基決定フィードバック１１２、およびＡＩトレーニング１１４などの様々な機能を実行するために使用される複数のワークステーション１０８を示すが、単一のワークステーション１０８が１つ、いくつか、または全てのそのような機能を実行し得ることが理解されるであろう。図１の特定の表示は、そのようなエコシステム１００内の好循環（またはサイクル）を表すのに有用であり、それにより、デバイス１０２は、より多くのデータが収集されるにつれて、経時的に性能が向上し、そのデータは、デバイス１０２によって使用される人工知能をトレーニングし、改善するために使用される。
【００５５】
次に図２を参照すると、図１の例示的なエコシステム１００内で提案された好循環を実施するための例示的なプロセスを示す高レベルのフロー図が示されている。処理２０２で示されるように、配備されたシークエンシングデバイスから、生のトレースデータ（例えば、第１および第２の時間ビンの光子数）が、ユーザによって提供された予想される塩基決定の参照配列（そのような情報が利用可能な場合）とともに取得され、そのデータは、中央リポジトリ（例えば、図１のデータベース１０６）に送信されてもよい。ここで、ユーザは、例えば、匿名のシークエンシングデータを送信することに同意する顧客であるか、または種々の診断目的のいずれかのためにシークエンシング動作を実行するＲ＆Ｄ技術者であり得る。生データは、例えば、図１のワークステーション１０８を使用して表示およびダウンロードされ得る。
【００５６】
次に、処理２０４において示されるように、配備されたシークエンシング装置からの生データは、学習に適した形式に処理され得る。これには、例えば、特徴の計算（事前に計算された特徴を必要とするイベントモデルが使用される場合）および標識の割り当てが必要になる場合がある。この状況では、「標識」は、光子強度の各トレースに対応する塩基決定の真の値を指す。一実施形態では、標識は、パルス／塩基決定モデル（学習可能またはその他）の以前の反復を使用して導出された時間的パルスイベントに対する個々の塩基の１対１マッピングを含むように離散化され得る。代替的に、標識は、パルスまたはトレースセグメントが１つまたは複数の参照塩基に関連付けられるように、以前のモデル用いたパルス／塩基決定と、任意の参照ゲノムに対する配列アラインメントとによって導出することができる。さらに別のアプローチでは、教師なし方法が使用されてもよく、この方法では、処理中にトレースの特定の領域との調整を試みることなく、参照配列のみが保存され、その代わりに、モデルのトレーニング中に編集距離に基づくコスト関数（例えば、ニューラルハッシュ関数）を使用する。生データは、例えば、一回限りのジョブとして処理されるか、または新たに蓄積されたデータに関してスケジュールに従って処理されて処理済みデータを生成することが想定される。
【００５７】
処理２０６において、現在の製作学習可能なパルス／塩基決定器は、そのパフォーマンスを経時的に追跡するために、着信データに対するベンチマークにされ得る。この比較情報を用いて、処理２０８において示されるように、学習アルゴリズムへの更新が行われ得る。このような更新は、例えば、既存のアーキテクチャを新たなデータに基づいて再トレーニングすることによって、あるいは、利用可能な最新データの一部または全てに基づいてトレーニングされる新たなアーキテクチャを導入することによって実施することができる。モデルトレーニングは、処理されたデータおよびモデルアーキテクチャを選択することによってキューに入れられ、それによって、記憶された重みを有するトレーニング済みのモデルが生成される。新たなデータに対する既存のアーキテクチャの再トレーニングおよび補足トレーニングは、データが取得されると自動的に実行されてもよく、処理２１０において示されるように、パフォーマンスが追跡されて、更新されたハイパーパラメータおよび／または重みを有するモデルの新たなバージョンが、顧客データの分散分析を処理するために顧客のシークエンシングデバイスまたはクラウドにリリースされ、かつアップロードされるべきであるか、および／またはリリースされ、かつアップロードされる時期が決定される。ここで、モデルの評価は、トレーニング済みのモデルおよび処理されたデータを選択することによってキューに入れられ、それによって、予測値および／またはベンチマークが生成される。そのようなベンチマークは、例えば、精度または他の基準によって、表示および／またはソートされてもよく、（例えば、異なる機器／ダイセットに関して同じテストセットを使用して）「リーダーボード（ｌｅａｄｅｒｂｏａｒｄ）」がモデルに対して確立されてもよい。
【００５８】
塩基決定器の進行状況を追跡するためのこのようなシステムを作成することの付随的な利点の１つは、システムが、任意の数の学習プロジェクトをサポートするための一般的なフレームワークとして設計され得ることである。例えば、このシステムは、新たなデータが絶えず発生することを考慮して、モデルのパフォーマンスを追跡することが所望される任意のタスクに適用され得る。例えば、このシステムは、学習可能な一塩基多型（ＳＮＰ：ｓｉｎｇｌｅ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍｓ）決定器、癌の予後予測因子などをトレーニングするために使用できる。
【００５９】
本明細書で説明する学習可能なパルス／塩基決定アルゴリズムの精度は、これらの複雑なパターンを学習するようにモデルをトレーニングするためにより多くのデータが利用可能になるにつれて、向上することが理解されるであろう。本明細書でさらに詳細に説明するように、追加のデータ生成に関して追加の技術が使用され得る。例えば、実際のシークエンシングデータの容易に観察可能なマクロ特性のいくつかをシミュレートする、本質的に無制限の量のデータを生成するデータシミュレータが作成され得る。そのようなシミュレートされたデータに基づいてモデルをトレーニングすることにより、実際のデータを使用してより詳細なトレーニングを適用する前に、モデルの重みのいくつかを事前設定することが可能となる。この「事前トレーニング」の後、モデルは、重要な課題であるパルスを決定する方法の多数の例に提示される。その場合、モデルは、実際のデータのより微妙な特性のいくつかを考慮して、塩基を決定する機能を微調整するだけで済むようになる。加えて（以下でさらに詳細に説明するように）、各トレースの順方向および逆方向の両方を見ること（それによってデータが２倍になる）、および各信号ウィンドウの時間変換を含むデータセットを拡大することを含む、データ拡張（ｄａｔａ  ａｕｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ）技術を実際のデータに適用することができる。
【００６０】
いくつかの実施形態では、学習可能なパルス／塩基決定器は、繰り返し更新されてもよい。いくつかの実施形態では、シーケンサによって使用される１つまたは複数のモデルを定期的に再トレーニングするために、学生−教師トレーニングアプローチが実施されてもよい。モデル（単数および複数）は、モデルの以前のバージョンから取得したデータおよび標識を使用して再トレーニングされ得る。例えば、シーケンサ用のモデルは、最初のトレーニング済みのモデルを取得するために一組のトレーニングデータを使用してトレーニングされ得る。最初のトレーニング済みのモデルは、「教師モデル」と呼ばれ得る。次に、教師モデルを使用して、核酸（単数または複数）の取り込みイベントからのトレースデータを使用して、１つまたは複数の核酸のヌクレオチドを同定し得る。次に、核酸（単数または複数）のヌクレオチドを同定するモデルの１つまたは複数の出力および対応するトレースデータをトレーニングデータとして使用して、モデルを再トレーニングして、第２のトレーニング済みのモデルを取得し得る。第２のトレーニング済みのモデルは、教師モデルの「学生モデル」と呼ばれ得る。学生モデルは、教師モデルよりも正確に核酸を同定し得る。このプロセスは、シーケンサのモデル（単数または複数）を更新するために定期的に実行される。これは、シーケンサのウェルの物理的特性の変化を考慮し、シーケンサの精度を反復的に改善し得る。
【００６１】
次に図３を参照すると、以下に説明する自動化された機械学習可能なパルスおよび塩基決定技術の実施形態と併せて使用し得る例示的なシークエンシングシステム３００（例えば、図１のシーケンサ１０２）の概略図が示されている。しかしながら、本明細書に記載された技術は、他のタイプのシークエンシングシステムにおいて実施され得ることが理解されるべきである。一般的に言えば、例示的なシークエンシングシステム３００は、複数の試料ウェルを有する統合デバイス３０４とインタフェースするように構成された機器３０２を含み、個々の試料ウェル３０６は、統合デバイス３０４の表面上に配置された標本（図示せず）から試料を受信するように構成される。標本は、多数の試料を含み、いくつかの実施形態では、異なる種類の試料を含む。複数個の試料ウェルは、試料ウェルの少なくとも一部が、１つの標本から１つの試料を受信することができるような適切な寸法および形状を有する。いくつかの実施形態では、いくつかの試料ウェルは、１個の試料を含むが、別のウェルは０個、２個、又はそれ以上の試料を含むなど、試料ウェル内部の試料数は、試料ウェル間で異なってもよい。
【００６２】
いくつかの実施形態では、標本は、多数の１本鎖ＤＮＡ鋳型を含み、統合デバイスの表面上にある各試料ウェルは、１本鎖ＤＮＡ鋳型を受信するような寸法に設定され、かつ形状に形成される。１本鎖ＤＮＡ鋳型は、統合デバイスの試料ウェルの少なくとも一部が１本鎖ＤＮＡ鋳型を含むように、統合デバイスの試料ウェル間に分布され得る。標本は、タグ付きｄＮＴＰｓをも含み、タグ付きｄＮＴＰｓは、試料ウェルの中に入って試料ウェル内の１本鎖ＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡの鎖の中に取り込まれた際にヌクレオチドの同定を可能にする。そのような例では、「試料」とは、１本鎖ＤＮＡと、ポリメラーゼによって取り込まれるタグ付きｄＮＴＰｓの双方を指す。いくつかの実施形態では、標本は、１本鎖ＤＮＡ鋳型を含み、タグ付きｄＮＴＰｓは、ヌクレオチドが試料ウェル内部でＤＮＡの相補鎖に取り込まれる時に試料ウェルに導入される。この技術では、ヌクレオチドの取り込みのタイミングは、タグ付ｄＮＴＰｓを統合デバイスの試料ウェルに導入するタイミングによって制御され得る。
【００６３】
励起エネルギーは、統合デバイスのピクセルアレイとは別個の機器３０２の励起源３０８から提供される。励起エネルギーは、統合デバイスの要素によって試料ウェル３０６内の照明領域を照明するために１つまたは複数のピクセル（図１には図示せず）に少なくとも部分的に向けられる。照明領域内部に位置して励起エネルギーにより照射された場合には、標識は、放射エネルギーを放射し得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の励起源３０８は、システム３０２の機器の一部であり、機器３０２および統合デバイス３０４の構成要素は、励起エネルギーを１つまたは複数のピクセルに向けるように構成される。
【００６４】
次に、試料から放射された放射エネルギーは、統合デバイス３０４のピクセル内の１つまたは複数のセンサ３１０によって検出され得る。検出された放射エネルギーの特性は、放射エネルギーに対応する標識を同定するための表示を提供する。そのような特性には、任意の適切な種類の特性が含まれ、例えば、センサによって検出される光子の到着時間、センサによって検出される時間経過とともに蓄積される光子の量、及び２以上のセンサに亘る光子の分布のうちの少なくともいずれか１つが含まれる。いくつかの実施形態では、センサ３１０は、試料の放射エネルギー（例えば、蛍光寿命）に対応する１つまたは複数の時間特性の検出を可能にする構成を有し得る。励起エネルギーのパルスが、統合デバイスを通過して伝搬した後、センサ３１０が、光子の到着時間の分布を検出し、光子の到着時間の分布は、試料の放出エネルギーの時間特性の表示（例えば、蛍光寿命の代替物）を提供し得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のセンサは、標識から放射された放射エネルギーの確率の表示（例えば、蛍光強度）を提供する。いくつかの実施形態では、複数のセンサは、放射エネルギーの空間分布を得るように寸法が設定され、かつ配置される。１つまたは複数のセンサからの出力信号は、次に、複数の標識間で標識を判別するために使用され、複数の標識は、標本内の試料を同定するために使用され得る。
【００６５】
さらなる例示として、図４は、図３の例示的なシークエンシングシステム３００のより詳細な概略図である。この場合も、システム３００は、機器３０２とインタフェースする統合デバイス３０４を含む。いくつかの実施形態では、機器３０２は、機器３０２の一部として集積された１つまたは複数の励起源３０８を含み得る。いくつかの実施形態では、励起源３０８は、機器３０２および統合デバイス３０４の両方の外部にあり、機器３０２は、励起源３０８から励起エネルギーを受け取り、それを統合デバイス３０４に指向させるように構成され得る。統合デバイス３０４は、統合デバイス３０４を受承して励起源３０８との正確な光学的位置合わせによって統合デバイス３０４を保持するための任意の適切なソケットを使用して、機器３０２とインタフェースし得る。励起源３０８はまた、機器内に配置され得、かつ統合デバイス３０４に励起エネルギーを提供するように構成され得る。図４に概略的に示されるように、統合デバイス３０４は、複数の個別のピクセルを有し、ピクセル３１２の少なくとも一部は、試料の独立した分析を実行し得る。そのようなピクセル３１２は、励起源が励起する複数のピクセルのピクセルとは別個のピクセルが励起源３０８から励起エネルギーを受信するため、「受動源ピクセル」と呼ばれ得る。ピクセル３１２は、試料を受容するように構成された試料ウェル３０６と、励起源３０８によって供給される励起エネルギーにより試料を照射することに応答して試料から放射される放射エネルギーを検出するためのセンサ３１０との両方を有する。試料ウェル３０６は、試料への励起エネルギーの送達および試料からの放射エネルギーの検出を容易にするために、統合デバイス３０４の表面に近接して試料を保持し得る。
【００６６】
励起源３０８からの励起エネルギーを統合デバイス３０４の試料ウェル３０６に誘導および結合するための光学要素は、統合デバイス３０４および機器３０２の両方に組み込まれ得る。そのような励起源からウェルまでの要素は、例えば、励起エネルギーを統合デバイス３０４に結合するために統合デバイス３０４に配置された１つまたは複数の格子カプラーと、機器３０２からピクセル３１２の試料ウェル３０６に励起エネルギーを送達するための導波路とを含み得る。いくつかの実施形態では、統合デバイス３０４上に配置された要素は、試料ウェル３０６からセンサ３１０に向かって放射エネルギーを指向させるように機能し得る。試料ウェル３０６、励起源からウェルまでの光学系の一部、および試料ウェルからセンサまでの光学系は、統合デバイス３０４上に配置されている。励起源３０８および励起源からウェルまでの構成要素の一部は、機器３０２内に配置される。いくつかの実施形態では、単一の構成要素が、励起エネルギーを試料ウェル３０６に結合することと、試料ウェル３０６からセンサ３１０に放射エネルギーを送達することとの両方の役割を果たし得る。励起エネルギーを試料ウェルに結合したり放射エネルギーをセンサに指向させたりするために、統合デバイスに含まれる適切な構成要素の例は、（１）米国特許出願第１４／８２１，６８８号明細書の「分子をプロービングし、検出し、且つ分析するための統合デバイス」、及び（２）米国特許出願第１４／５４３，８６５号明細書の「分子をプロービングし、検出し、且つ分析するための外部光源を備えた統合デバイス」に開示されており、引用によりその全体を援用する。
【００６７】
図４の実施形態における複数のピクセル３１２に関して、個々のピクセル３１２は、それ自体の個々の試料ウェル３０６および少なくとも１つのセンサ３１０と関連付けられる。複数のピクセル３１２は、アレイ状に配置されてもよく、アレイ中のピクセル数は任意であってもよい。統合デバイス３０４内のピクセルの数は、約１０，０００ピクセルから１，０００，０００ピクセルの範囲、またはその範囲内の任意の値または任意の値の範囲であり得る。いくつかの実施形態では、ピクセルは、５１２ピクセル×５１２ピクセルのアレイに配置される。統合デバイス３０４および機器３０２は、大きなピクセルアレイ（例えば、１０，０００を超えるピクセル）に対応するデータを処理するためのマルチチャネル高速通信リンク（図示せず）を含み得る。
【００６８】
図４においてさらに示されるように、機器３０２は、統合デバイスインタフェース３１４を介して統合デバイス３０４とインタフェースする。統合デバイスインタフェース３１４は、例えば、励起源３０８から統合デバイス３０４への励起エネルギーの結合を促進または向上させるために、統合デバイス３０４を機器３０２に配置および／または位置合わせするための構成要素を含み得る。励起源３０８は、励起エネルギーを少なくとも１つの試料ウェルに送達するように配置される任意の適切な光源であり得る。適切な励起源の例は、前述の米国特許出願第１４／８２１，６８８号に記載されている。いくつかの実施形態では、励起源３０８は、統合デバイス３０４に励起エネルギーを送達するために組み合わされた複数の励起源を含む。そのような複数の励起源は、複数の励起エネルギーまたは波長を生成するように構成され得る。統合デバイスインタフェース３１４は、統合デバイス３０４のピクセル３１２内のセンサ３１０からの読み出し信号を受信し得る。統合デバイスインタフェース３１４は、統合デバイス３０４を統合デバイスインタフェース３１４に固定することによって、統合デバイス３０４が機器３０２に取り付けられるように設計されてもよい。
【００６９】
さらに図４を参照すると、機器３０２は、機器３０２の動作を制御するためのユーザインタフェース３１６をさらに含む。ユーザインタフェース３１６は、例えば、機器の機能を制御するために使用されるコマンドおよび／または設定などの情報を、ユーザが機器に入力するのを可能にするように構成されている。いくつかの実施形態では、ユーザインタフェース３１６は、ボタン、スイッチ、ダイヤル、および音声命令のためのマイクロフォンを含み得る。さらに、ユーザインタフェース３１６により、ユーザが、統合デバイス上のセンサからの読み出し信号によって得られる適切なアライメントおよび／または情報などの、機器および／または統合デバイスの性能に関するフィードバックを受信することが可能である。いくつかの実施形態では、ユーザインタフェース３１６は、可聴フィードバックを提供するためにスピーカを使用し、かつ視覚的フィードバックを提供するためにインジケータライトおよび／または表示画面を使用してフィードバックを提供し得る。いくつかの実施形態では、機器３０２は、外部コンピューティングデバイス３２０との接続に使用されるコンピュータインタフェース３１８を含む。任意の適切なコンピュータインタフェース３１８およびコンピューティングデバイス３２０が使用され得る。例えば、コンピュータインタフェース３１８は、ＵＳＢインタフェースまたはファイヤワイヤ（ＦｉｒｅＷｉｒｅ（登録商標））インタフェースであり得る。コンピューティングデバイス３２０は、ラップトップまたはデスクトップコンピュータなどの任意の汎用コンピュータであり得る。コンピュータインタフェース３１８は、機器３０２とコンピューティングデバイス３２０との間の情報通信を可能にする。機器３０２を制御および／または構成するための入力情報は、機器３０２のコンピュータインタフェース３１８と通信するコンピューティングデバイス３２０を介して提供され得る。さらに、出力情報は、コンピュータインタフェース３１８を介してコンピューティングデバイス３２０によって受信され得る。そのような出力情報は、例えば、機器３０２および／または統合デバイス３１２の性能に関するフィードバック、およびセンサ３１０の読み出し信号からの情報を含み得る。機器３０２は、センサ３１０から受信したデータを分析し、かつ／または制御信号を励起源３０８に送信するための処理デバイス３２２をも含み得る。いくつかの実施形態では、処理デバイス３２２は、汎用プロセッサ、特別に適合したプロセッサ（例えば、１つまたは複数のマイクロプロセッサまたはマイクロコントローラコアなどの中央処理デバイス（ＣＰＵ）、フィールドプログラマブルゲートアレイ（ＦＰＧＡ）、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、カスタム集積回路、デジタル信号プロセッサ（ＤＳＰ）、またはそれらの組み合わせ）を含み得る。いくつかの実施形態では、センサ３１０からのデータの処理は、処理デバイス３２２と外部コンピューティングデバイス３２０との両方によって実行され得る。他の実施形態では、コンピューティングデバイス３２０は省略されてもよく、センサ３１０からのデータの処理は、処理デバイス３２２によって完全に実行され得る。
【００７０】
次に図５Ａを参照すると、ピクセル３１２の行を示す統合デバイス３０４の断面概略図が示されている。各ピクセル３１２は、試料ウェル３０６と、対応するセンサ３１０とを含む。センサ３１０は、センサ３１０が試料ウェル３１２内の試料（図示せず）から放射された放射エネルギーを受信するように、試料ウェル３０６に整列配置され得る。適切なセンサの例は、前述の米国特許出願第１４／８２１，２５６号に記載されている。
【００７１】
前述したように、統合デバイス３０４に結合された励起源３０８は、統合デバイス３０４の１つまたは複数のピクセルに励起エネルギーを提供し得る。さらなる例として、図５Ｂは、励起源３０８を統合デバイス３０４に結合して、励起エネルギー３２４を統合デバイス３０４の試料ウェル３０６に提供する（その経路は破線で示される）ことを示す断面概略図である。励起源３０８を統合デバイスに配置して整列させるために、統合デバイス３０４の外に配置された構成要素（図示せず）を使用し得る。そのような構成要素は、例えば、レンズ、ミラー、プリズム、アパーチャ、減衰器、および／または光ファイバなどの光学要素を含み得る。１つまたは複数の位置合わせ構成要素の制御を可能にするために、追加の機械的構成要素が機器３０２に含まれ得る。そのような機械的構成要素には、例えば、アクチュエーター、ステッピングモーター、および／またはノブが含まれ得る。
【００７２】
統合デバイス３０４は、励起エネルギー３２４を統合デバイス３０４内のピクセル３１２に向かって指向させる構成要素を含む。より具体的には、各ピクセル３１２内では、励起エネルギーは、ピクセルに関連付けられた試料ウェル３０６に結合される。図５Ｂは、ピクセル３１２の行内の各試料ウェル３０６への励起エネルギー結合を示しているが、いくつかの実施形態では、励起エネルギーが任意の行内の全てのピクセル３１２に結合されなくてもよい。いくつかの実施形態では、励起エネルギーは、統合デバイス３０４のピクセル３１２の行内の一部のピクセル３１２または試料ウェル３０６に結合し得る。励起エネルギー３２４は、試料ウェル３０６内に配置された試料を照射し得る。試料は、励起エネルギーによって照明されると励起状態に達し得る。試料が励起状態にあるとき、試料は、図５Ｂに示されるように、放射エネルギー３２６を放射し、その放射エネルギー３２６は、センサ３１０によって検出される。いくつかの実施形態では、センサ３１０は、複数のサブセンサを含み得る。
【００７３】
分析される試料は、ピクセル３１２の試料ウェル３０６内に導入される。試料は、生物試料又は化学試料などの任意の他の適切な試料であり得る。さらに、試料は、複数の分子を含み、試料ウェル３０６は、１個の分子を分離するように構成され得る。いくつかの例では、試料ウェル３０６の大きさは、試料ウェル内に１個の分子を閉じ込めるように機能し、それにより、１個の分子に対して測定を行うことが可能である。励起源３０８は、試料ウェル３０６内の照明領域内に試料がある間に、試料または試料に結合、または試料に関連付けられた少なくとも１つの蛍光標識を励起するために、励起エネルギーを試料ウェル３０６に送達するように構成され得る。
【００７４】
励起源が試料ウェルに励起エネルギーを送達すると、ウェル内の少なくとも１つの試料が蛍光を発し、その結果生じた放射がセンサ３１０によって検出される。本明細書で使用されているように、「試料が蛍光を発する」又は「試料が放射線を放出する」又は「試料からの放射」という言い回しは、蛍光タグ、標識、又はレポーター、試料自体、又は試料に結合した反応産物が、放出放射線を生成することを意味する。
【００７５】
統合デバイス３０４の１つまたは複数の構成要素は、センサ３１０に向かって放射エネルギーを指向させ得る。放射エネルギーまたは複数の放射エネルギーは、センサ３１０によって検出され、少なくとも１つの電気信号に変換され得る。電気信号は、図４に関連して既に説明したように、統合デバイスインタフェース３１４を介して機器３０２に接続された統合デバイス３０４の回路内の導電線に沿って伝達される。その後、電気信号は、図４に示すコンピューティングデバイス３２０および／または処理デバイス３２２などの、機器３０２上または機器３０２外のいずれかに配置された適切なコンピューティングデバイスによって処理および／または分析される。
【００７６】
動作時には、励起源を用いてウェル内の試料を励起して、試料が放射した信号をセンサにより検出することによって、試料ウェル内の試料が並行して分析される。試料からの放射エネルギーは、対応するセンサで検出されて、少なくとも１つの電気信号に変換される。いくつかの実施形態では、取得された信号は、統合デバイスで処理され、又は処理デバイス及びコンピューティングデバイスのうちの少なくともいずれか一方で処理するために機器に送達され得る。試料ウェルからの信号は、別のピクセルに対応する信号とは別々に受信されて処理され得る。
【００７７】
いくつかの実施形態では、試料は、１つまたは複数の標識により標識付けされて、標識に対応する放射は機器によって判別可能である。例えば、センサは、特定の標識からの放射エネルギーに依存する寿命を判別するために使用される電気信号を形成するために放射エネルギーから光子を電子に変換する。試料を標識するために異なる寿命を有する標識を使用することにより、センサで検出された電気信号に基づいて、試料を特定することができる。
【００７８】
試料は、複数種の分子を含み、異なる蛍光標識は、分子の種類に一義的に対応する。励起中又は励起後には、蛍光標識は、放射エネルギーを放射し得る。放射エネルギーの１つまたは複数の特性は、試料内の１つまたは複数の分子種を識別するために使用し得る。複数種の分子を判別するために使用される放射エネルギーの特性には、蛍光寿命の値、強度、及び放射波長のうちの少なくともいずれか１つが含まれ得る。センサは、光子、例えば放射エネルギーの光子を検出して、上記特性の１つまたは複数を示す電気信号を提供する。いくつかの実施形態では、センサからの電気信号は、１つまたは複数の時間間隔に亘って光子の到着時間の分布についての情報を生成し得る。光子の到着時間の分布は、励起エネルギーのパルスが励起源から放射されてから光子が検出された時までの時間に対応する。時間間隔の値は、その時間間隔に検出されたいくつかの光子に対応する。複数の時間間隔に亘る相対値は、放射エネルギーの時間的な特徴（例えば、寿命）の表示を提供し得る。試料を分析する工程には、分布内の複数の異なる時間間隔に対する値を比較することによって標識を判別する工程が含まれる。いくつかの実施形態では、強度の表示は、分布内の全ての時間ビンに亘っていくつかの光子を決定することによって提供される。
【００７９】
本明細書で使用されている「核酸」という用語は、１つまたは複数の核酸サブユニットからなる分子を一般に指す。核酸には、アデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、チミン（Ｔ）、ウラシル（Ｕ）、又はその派生物から選択された１つまたは複数のサブユニットが含まれる。いくつかの例では、核酸は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、リボ核酸（ＲＮＡ），又はそれらの派生物である。核酸は、１本鎖又は２本鎖である。核酸は、円形である場合もある。
【００８０】
本明細書で使用されている「ヌクレオチド」という用語は、核酸サブユニットを一般に指し、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ、又はＵ、又はその異形体又はその類似体が含まれる。ヌクレオチドには、伸長する核酸鎖に取り込まれる任意のサブユニットが含まれる。そのようなサブユニットは、Ａ，Ｃ，Ｇ，Ｔ，又はＵ、または１つまたは複数の相補的なＡ，Ｃ，Ｇ，Ｔ，又はＵに特異的であるか、又はプリン（即ち、Ａ又はＧ，又はそれらの異形体又は類似体）、もしくはピリミジン（即ち、Ｃ，Ｔ，Ｕ、又はその異形体又は類似体）に相補的である任意のサブユニットとすることができる。
【００８１】
ヌクレオチドは、ヌクレオシドおよび少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個またはそれ以上のリン酸（ＰＯ３）基を一般に含む。ヌクレオチドは、核酸塩基、５炭糖（リボース又はデオキシリボース）、及び１つまたは複数のリン酸基を含む。リボヌクレオチドは、糖がリボースであるヌクレオチドである。デオキシリボヌクレオチドは、糖がデオキシリボースであるヌクレオチドである。ヌクレオチドは、ヌクレオシド一リン酸、又はヌクレオシドポリリン酸である。ヌクレオチドは、例えば、デオキシリボヌクレオシド三リン酸等のデオキシリボヌクレオシドポリリン酸とすることができ、デオキシリボヌクレオシドポリリン酸は、デオキシアデノシン三リン酸（ｄＡＴＰ）、デオキシシチジン三リン酸（ｄＣＴＰ）、デオキシグアノシン三リン酸（ｄＧＴＰ）、デオキシウリジン三リン酸（ｄＵＴＰ）、およびデオキシチミジン三リン酸（ｄＴＴＰ）ｄＮＴＰから選択され得、検出可能な標識（例えば、フルオロフォア）を含む。
【００８２】
センサ３１０に関して、光検出器は、標識を励起源３０８に（例えば、レーザーパルスによって）曝露することに応答して、標識からの入射光子の到着を時間ビンに入れることができる。標識は繰り返し励起されて、標識からの入射光子の到達が時間ビニングされる。例えば、１０ミリ秒（ｍｓ）の計測時間中に、レーザーの励起パルスが、標識を励起するために１００メガヘルツ（ＭＨｚ）の周波数で放射される。標識は低い確率で光子を放射し得る（例えば、１０，０００回の励起当たり１光子放射）。標識が、１０ｍｓの期間内に多数回（例えば、１００万回）励起されると、約１００個の光子が受信され得る。いくつかの例では、標識は、励起源に暴露されても励起されず光子を放射しない場合があり、これが、放射確率が低い原因になり得る。上述したように、励起に対応する入射光子の到達時間は、時間ビニングされる。従って、光検出器は、各時間ビン内の光子数を表す信号を提供することができる。
【００８３】
さらに説明するために、図６は、光検出器が、入射光子の到着時間を８つの時間ビンに時間ビニングした例を示すグラフである。光子放射の確率は時間とともに減衰するため、より早い時間の時間ビンの方が、その後の時間ビンより多くの光子を含んでいる。標識を繰り返し励起して放射される光子のタイミングを検出することによって、図６に示されるように、時間の経過に伴って減衰する光子放射の確率に近いヒストグラムが作成される。
【００８４】
測定期間（例えば、１０ｍｓ）に亘って検出された光の強度は、各時間ビンで検出された光子数を表す値を合計することによって、パルス決定器によって算出され得る。例えば、図６に示されるように、光検出器が、入射光子の到着を８つの時間ビンにビニングする場合、８つの時間ビンで検出された光子数が強度を決定するために合計される。しかしながら、任意の数の時間ビンを使用されてもよい。光検出器が２つの時間ビンを有する場合には、２つの時間ビンで検出された光子数を表す値が強度を決定するために合計される。例えば、第１の時間ビンが１００個の光子含み、第２の時間ビンが５０個の光子を含む場合には、これらの値は合計されて１５０個の光子の強度となる。代替的には、合計の光子強度を計測する目的で、１つの独立した時間ビンが存在してもよい。
【００８５】
光検出器からのデータストリームの計測時間間隔の間に受信された光の強度が決定される。例えば、光検出器が１０ｍｓ間隔で計測を行う場合には、１０ｍｓ毎に時間ビンを合計することによって、各計測間隔の間の強度が決定される。その結果、時間の経過と共に検出された光の強度を表すデータが決定される。
【００８６】
学習可能なパルス／塩基決定アーキテクチャに対するアプローチおよび実施形態を説明する前に、上記で取得された生のセンサデータからヌクレオチドを同定するための非学習可能な自動化アプローチを検討することが背景として有用であり得る。従って、図７は、検出された強度対時間を表す数分間の例示的なトレースを示す。トレースには有意なベースラインと分散が存在すること及び実際のパルスは信号対ノイズ比が低いことが多いことから、取り込みイベントに対応するパルスを同定することは困難である。従って、ヌクレオチドを決定するための１つの可能なアプローチは、取り込みイベントに対応して光のバーストが放射される時間を識別するために、強度対時間データを用いてパルス発見アルゴリズムを実行することである。
【００８７】
より具体的には、１つの可能なアプローチは、信号の平均と分散とにシフトが発生した時期、例えば、バックグラウンド（即ち、パルス間）から信号（即ち、パルス）への変化およびその逆の変化が生じた時期を決定するトレースデータ上での変更点アルゴリズムを実行することである。各変化点が識別された後、変化点レベル（例えば、強度）に基づいて、閾値によってパルス領域からパルス間領域（パルスとパルスとの間の領域）が分離される。この閾値は、ヒストグラム、カーネル密度推定、又はｋ−平均クラスタリングを用いて手動で決定される。別の可能なアプローチは、トレースの平均値／中央値および分散を分析して、標準偏差の一定の値または平均値／中央値以上の数の増加としてパルスを定義することである。さらに別の可能なアプローチは、パルスまたはパルス間状態のいずれかで状態マシンを使用して、両者間の交互切り替えを判断することである。閾値は、２つの状態間の遷移を定義する。いくつかの実施形態では、（極端に短いパルスや極端に長いパルスは、偽陽性となることが多いため）最小又は最大持続時間閾値を満たさないパルスを取り除く等、パルスのフィルタリングが行われる。後者の２つのアプローチは、データが取得されるときにデータに対して処理することができるという付加的な利点があるが、変更点アルゴリズムは、処理するためには全てのデータが必要である。
【００８８】
放射された光の強度に基づいてヌクレオチドの取り込みイベントに対応するパルスを特定することに加えて、放射された光の他の特性を使用して、強度に加えて、または強度の代替として、パルスを識別してもよい。例えば、強度を使用することの代替として、またはそれに加えて、放射された光の時間特性に基づいてパルスが識別されてもよい。異なるヌクレオチドは、異なる時間特性を備えた光を放射する分子で標識付けされて、取り込みイベントの開始時と終了時とを決定するために時間特性が分析される。特定の例として、異なる蛍光標識は、励起に応答した光子放射の確率が経過時間とともに減衰する、異なる「寿命」または速度を有し得る。計測された寿命の変化は、取り込みイベントの開始又は終了を示し得る。
【００８９】
さらに別の技術では、強度と時間特性（単数または複数）の両方を使用して、取り込みイベントが発生する時間を識別してもよい。例として、時間特性の変化は、強度に基づいてパルスを識別する精度を高めるために使用され得る。上述したように、第１に、光の強度は、各取り込みイベントの間に取得され得、かつ各組の時間ビン内の時間ビンを合計することによって算出され得る。しかしながら、強度は、時間ビンを合計することによって取得される必要はなく、異なる方法で計測され、かつ／または決定されてもよい。次に、パルス発見アルゴリズムを強度対時間データに対して実行して、取り込みイベントに対応して光バーストが放射される時間を識別する。次に、取り込みイベント中に放射された光の時間パラメータ（単数または複数）が決定される。識別されたパルスが評価され、可能であれば、時間パラメータ（単数または複数）に基づいて精緻化される。例えば、長いパルス（例えば、閾値量よりも大きい長さを有する）が識別された場合、パルス中に放射された光の時間パラメータ（単数または複数）が評価され得る。時間パラメータがパルス中に大幅にシフトする場合（例えば、閾値量以上に変化した場合、または異なるヌクレオチドを表し得る量以上に変化した場合）、１つの長いパルスではなく２つの別々のパルスを識別するように最初のパルス決定が修正され得る。時間パラメータにシフトが生じた時間は、２つのパルス間の時間的な境界に対応し得る。時間パラメータがパルス中に大幅にシフトしない場合（例えば、変化しないか、または比較的少量だけ変化しない場合）、最初のパルス決定は変更されない。従って、強度に基づく最初のパルス決定の結果は、時間パラメータ（単数または複数）を用いて評価され、かつ／または精緻化され得る。
【００９０】
さらに他のアプローチでは、時間パラメータ（単数または複数）を使用して最初のパルス決定が実施されてもよく、パルスは、強度情報を使用して精緻化され得る。実施されるパルス検出アルゴリズムの種類に関係なく、パルス決定器は、取り込みイベントに対応するパルスが発生した時間を識別する。各パルスについて、パルス決定器は、開始時間と終了時間、開始時間と持続時間、又は終了時間と持続時間を識別し得る。そのようなパルスが生じた時間は、蛍光標識、つまりそれに結合したヌクレオチドを同定するために分析される。
【００９１】
光検出器からのデータのストリームに対してパルス決定を実行した後、次に、塩基決定アルゴリズムを利用して、各取り込みイベントに対する光の１つまたは複数の特性を分析することができる。１つのアプローチでは、パルス決定器は、パルスが発生した時間を塩基決定器に伝達する。任意選択で、パルス決定器は、各時間ビンで受信された光子数に関する情報、各測定期間で算出された強度、または任意の他の適切な情報などの追加情報を塩基決定器に伝達し得る。次に、強度は、例えば、上述したように、各組の時間ビン内の時間ビンを合計することなどによって、各取り込みイベントに対して取得される。代替的に、塩基決定器は、パルス決定器から強度を直接受信してもよい。
【００９２】
強度は、パルス決定器によって識別された取り込みイベントの持続時間で正規化される。例えば、取り込みイベントが計測間隔の２倍の長さで続く場合には、強度は、２つの計測間隔に対する時間ビンを合計して、２で除算することによって算出され得る。例えば、取り込みイベントが２０ミリ秒（ｍｓ）持続し、計測間隔が１０ｍｓであり且つ光子が２つの時間ビンにグループ分けされている場合には、強度は、第１計測の２つの時間ビンで収集された光子と、第２計測の２つの時間ビンで収集された光子を合計した後、２で除算することによって算出され得る。そのような計算は、２０ｍｓの取り込みイベントに亘る平均強度の計算であると考えられ得る。
【００９３】
加えて、各取り込みイベントに関して時間パラメータが決定される。時間パラメータは、励起後の時間経過に伴う標識による光子放射の確率の減衰を表し得る。任意の適切な時間パラメータが使用され得る。例えば、蛍光寿命は、時間ビンに指数を当てはめることによって計算され得（例えば、図６に示されるように）、蛍光寿命は、時間パラメータとして使用され得る。時間経過に伴う光子放射の確率の減衰を表す時間パラメータを決定するために、複数の異なる時間ビンの光子数（又はその代表値）が比較される。例えば、入射光子の到着が２つの時間ビンにビニングされた場合には、２つのビンに関して光子数の比率が計算されて、この比率が時間パラメータとして使用される。ある意味では、ビンの比率は、輝度寿命を計算する代わりになり得る。この比率は、任意の適切な方法で算出され得る。例えば、２つの時間ビンが使用される場合、比率を生成するために、励起イベントに時間的に最も近い時間ビンの光子数が第２の時間ビンの光子数で除算される。時間ビンの光子数または光子数を表す値は、（例えば、一組の時間ビンに亘る合計強度によって）正規化され、正規化された値を使用して、時間パラメータが決定される。代替的に、最大光子数を有する時間ビンが、時間パラメータとして使用され得る。最大光子数を有する時間ビンを決定するために、時間ビンに対する光子数が互いに比較される。２つの時間ビンが存在する例では、第１の時間ビンの光子数が第２の時間ビンの光子数と比較される。より大きい光子数を有するビンが、時間パラメータとして選択されて、蛍光分子の判別に使用される。例えば、一方の蛍光分子が比較的短い寿命を有する場合には、第１の時間ビン（励起イベントに時間的に最も近い）が最大光子数を有する可能性があり、他方の蛍光分子が比較的長い寿命を有する場合には、別の時間ビン（励起イベントから時間的に離間している）が最大光子数を有する可能性がある。
【００９４】
さらなる例として、図８は、各取り込みイベントの強度および時間パラメータを２次元空間内の点でプロットしたグラフであり、強度および時間パラメータは、それぞれの軸上にある。この例では、時間パラメータは、水平（ｘ）軸にプロットされ、強度は、垂直（ｙ）軸にプロットされている。４つの異なる標識が、強度、時間パラメータ、又はその双方に基づいて互いに判別が可能なヌクレオチドに対して使用される。図８から分かるように、各取り込みイベントに関して計測された強度および時間パラメータをプロットすることによって、４つのヌクレオチドＡ、Ｃ、Ｇ、Ｔに対応する４つの点のクラスターが得られる。
【００９５】
１つのアプローチでは、クラスタリングアルゴリズムを点に対して実行して、各取り込みイベントに対する点を４つのクラスターのうちの１つに割り当てることができる。例えば、クラスタリングアルゴリズムは、ｎ次元空間でパルスのｋ平均クラスタリングを実行する。ここで、ｋは、４（Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｔ）であり、ｎは、塩基決定に使用される基準の数である。代替的に、４つ以上のクラスターが割り当てられてもよく、即ち、ｋが４より大きいクラスタリングが実行されてもよい。これは、場合によっては、クラスターが良好に分離されないことがあり、点を４つ以上のクラスターにグループ化することが有利であることを認識した上で実行されることが好ましい。そのような例では、同一のヌクレオチドに２以上のクラスターが割り当てられる場合がある。さらに、外れ値である点を除去するためにフィルタリングが実行されてもよい。例えば、点が、予測された範囲外の時間パラメータおよび／または強度を有している場合には、そのような点は、クラスタリングアルゴリズムから排除され、かつ／またはどのヌクレオチドグループにも割り当てられることはない。
【００９６】
任意の適切な点の数、例えば、５０個より大きい、１００個より大きい、５００個より大きい点が、クラスタリングアルゴリズムに提供されてもよい。クラスタリングアルゴリズムにより、各点は、４つの（又は、それ以上）クラスターのうちの１つにグループ分けされる。図８の例では、強度および時間パラメータの２つの基準が使用されているため、ｎ＝２である。従って、強度と時間パラメータとしての時間ビンとの比率を使用した２次元の例が、図８にプロットされている。しかしながら、他の基準が使用されてもよいことが理解されるべきである。
【００９７】
別の二次元の例は、時間パラメータとスペクトルパラメータの両方を取得することを含み、図８の垂直（ｙ）軸上には強度ではなく、スペクトルパラメータが表される。この例では、スペクトル情報が、各取り込みイベントに対して放射された光に関して取得され、かつヌクレオチドの判別に使用される。また、２つに限定されず、任意の数の基準が使用され得ることも理解されたい。例えば、取り込みイベントに対するスペクトル情報は、強度および時間パラメータに加えて取得され、強度、時間パラメータ、およびスペクトル情報が個々の軸上にある３次元空間内の点としてプロットされる。
【００９８】
点をグループ分けした後、最初のグループ分けの工程に使用した数以上の基準を用いてグループ分けの精度を高めることは有利であり得る。この目的のために、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）または他の教師付き分類器を使用することができ、クラスタリング標識を初期トレーニングデータとして使用することができる。この工程は、分類器の最新の反復結果を次の反復のトレーニングデータとして用いて収束するまで繰り返される。クラスタリングアルゴリズムを使用して点をクラスターに割り当てることができるが、クラスタリングアルゴリズムを使用することなく点がグループに割り当てられてもよい。点のグループ間の境界は、クラスタリングアルゴリズムを実行することなく決定されてもよい。
【００９９】
クラスタリングに続いて、点のクラスターがヌクレオチドに割り当てられる。この割り当ては、標識の既知の特性に基づいて実行され得る。例えば、図８のプロットでは、Ｔに対する標識は強度が高く寿命が最も短いこと、Ａに対する標識は強度が低く寿命が中程度であること、Ｇに対する標識は強度が高く寿命が中程度であること、Ｃに対する標識は強度が高く寿命が最も長いことが分かっている。点からなるクラスターは、クラスターの相対位置を用いて塩基に割り当てられ得る。例えば、寿命が最も短いクラスターにはＴが割り当てられ、寿命が最も長いクラスターにはＣが割り当てられ、強度が最も低いクラスターにはＡが割り当てられ、残りのクラスターにはＧが割り当てられ得る。各クラスターの点には、クラスターのヌクレオチドが割り当てられ得る。強度および時間特性の各計測の時間に関する情報を記録することによりヌクレオチド鎖の配列を決定することができる。
【０１００】
いくつかの実施形態では、上記したアプローチは、機器の較正に適用されてもよい。いくつかの実施形態では、初期較正が行われた後、全ての点をヌクレオチドに割り当てるためにクラスタリングアルゴリズムを実行する必要がない場合がある。代わりに、較正基準が、点をヌクレオチドの種類に割り当てるために決定され得る。例えば、較正中にクラスタリングアルゴリズム（例えば、ｋ平均）を実行することによって識別されたクラスター重心が、核酸のヌクレオチドを同定するために使用され得る。いくつかの実施形態では、シーケンサ（例えば、シークエンシングデバイス）は、核酸の既知のヌクレオチドに関連するデータを使用してクラスタリングを実行することにより、較正され得る。例えば、コンピュータシステムは、１つまたは複数の既知のＤＮＡまたはＲＮＡ配列のヌクレオチドに関連するトレースデータを使用し得る。システムは、ヌクレオチドを同定するために使用することができるクラスター重心を取得するために、データを使用してクラスタリングアルゴリズムを実行するように構成され得る。既知のヌクレオチドに関連するデータ点を用いてクラスタリングアルゴリズムを実行することにより、システムは、異なるヌクレオチドをより正確に判別するクラスター重心を取得し得る。較正から取得されたクラスター重心は、未知のヌクレオチドを同定するために使用され得る。例えば、システムは、較正から決定された重心の各々からのデータ点の距離（例えば、ユークリッド距離）を決定し、決定された距離に基づいてデータ点に対するヌクレオチドを同定し得る。例えば、ヌクレオチドは、データ点に近い重心に関連付けられているものとして同定され得る。
【０１０１】
一例として、ヌクレオチドのクラスタリングまたは割り当てに続いて、異なる種類のヌクレオチド間の境界が決定され得る。境界は、図９に示されるように、位相空間の領域を定義する関数であり得る。位相空間の軸は、強度、時間パラメータ、放射波長、及びレーザーパルスの励起波長のうちの少なくともいずれか１つを含み得る。一例として、図９に示すように、異なるヌクレオチド間の境界９００を描く、２次元空間における線分または曲線が選択され得る。高次空間では、境界は、表面又はより高次元物体（「超平面」と呼ばれる）であり得る。境界９００が決定されると、境界に対する点の位置を評価することによって、点をヌクレオチドに割り当てることができ、クラスタリングを実行する必要はない。従って、いくつかの実施形態では、シークエンシング機器は、境界９００を描くために較正され得る。較正の工程は、核酸のシークエンシングの工程と同様に同じ組の標識を用いて実施され得る。較正を実行する別の例として、クラスター重心が決定され、これにより、どのクラスターが個々の点に最も近い重心を有するかに基づいて、点をヌクレオチドに割り当てることができる。決定された較正基準の種類に関係なく、較正基準は、後で使用するために（例えば、機器のメモリに）格納される。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、シーケンサの較正は、個々のウェルごとに実行されてもよい。コンピュータシステムは、ウェル内のヌクレオチドの取り込みから取得されたデータを使用して、個々のウェルに対してクラスタリングアルゴリズム（例えば、ｋ平均）を実行するように構成され得る。これにより、シーケンサの個々のウェルに合わせて微調整されたモデルがシーケンサに提供される。いくつかの実施形態では、シーケンサの較正は、複数のウェルに対して実行され得る。システムは、シーケンサの複数のウェル内のヌクレオチドの取り込みから取得されたデータを使用して、クラスタリングアルゴリズムを実行するように構成され得る。いくつかの実施形態では、システムは、複数のウェルに使用され得る一般化モデルを取得するように構成され得る。いくつかの実施形態では、システムは、個々のウェルの一般化モデルを精緻化するように構成され得る。例えば、システムは、ウェル内のヌクレオチドの取り込みから取得されたデータに基づいて、個々のウェルに対する一般化モデルのクラスター重心を修正し得る。複数のウェルに対して単一のモデルを較正することにより、各個々のウェルからのデータが少なくて済むという利点があり、従って、各個々のウェルに対して別個のモデルをトレーニングする場合よりも、較正のために使用するデータを収集するための実行時間が短縮される。一般化モデルを使用する別の利点は、単一のモデルを記憶することにより、シーケンサの各ウェルに対して別々のモデルを記憶する場合よりもメモリが少なくて済むということである。
【０１０３】
較正は、任意の適切な時に実施され得る。例えば、較正は、機器を最初に使用する前、新たな組の標識を使用する時、機器を使用する環境条件を変更する時、または機器の構成要素の経年劣化する使用期間後に、行うことが望ましい。較正は、ユーザからの要求に応じて、例えば、機器のボタンを押すことによって、又は別の装置から当該機器に較正命令を送信することによって、又はスケジュールに基づいて自動的に、又は機器ソフトウェアの性能が最適でないとの判断に応答して、必要に応じて実施し得る。較正基準が取得されると、検出された点を較正基準に対して評価することによってシークエンシングをより迅速に実施することができる。
【０１０４】
より具体的には、１つまたは複数の較正基準に基づいてヌクレオチドを同定するために、アルゴリズムが塩基決定器によって使用され得る。上記の塩基決定と同様に、計測した光パラメータ（例えば、強度および時間パラメータ）を記憶された較正情報を使用して評価することによって、ヌクレオチドが同定されるように、光のパラメータ（例えば、強度および時間パラメータ）が決定される。例えば、記憶されている較正情報がヌクレオチドのクラスターの間にある１つまたは複数の境界を含む場合には、点を境界と比較することにより点をヌクレオチドに割り当てることができ、これは、クラスタリングを実行するよりもより計算量的に効率的である。別例では、ある点からヌクレオチドのクラスターの４つの重心の各重心までの距離を算出して、点を重心が最も近いヌクレオチドに割り当てることによって、点がヌクレオチドに割り当てられる。この技術は、計測した強度および時間パラメータを表す点１０００を示す図１０に示されている。図１０には、４つのヌクレオチドに対応する標識の重心も示されている。どの重心が最も近いかを決定するために、点１０００から４つの重心の各々までの距離が算出され、どの重心が点１０００から最も短い距離に配置されているかに基づいてヌクレオチドが割り当てられる。図１０の例に示されるように、点１０００が、ヌクレオチド「Ａ」に対応する標識の重心に最も近い。従って、点１０００は、ヌクレオチド「Ａ」に対応すると決定される。
【０１０５】
このようにヌクレオチドを同定することは、取り込みイベントに関連する点の第１部分でクラスタリングを実行することと、較正基準を使用して、点の第２部分で塩基決定を実行することとを含むことができる。第１部分は、較正基準における所望のレベルの正確性を提供するために、任意の適切な数の点を含む。
【０１０６】
さらに、点が特定の種類のヌクレオチドに対応しているという信頼度レベルが決定され得る。一例として、図９に示される重心などの、領域の重心からの点の距離を使用して、点の信頼度レベルを決定し得る。重心までの距離が短い点は、その点がヌクレオチドに対応していると正しく同定された可能性が非常に高いことを示す高い信頼度レベルを有するが、重心からの距離が大きい点は、他の点よりもある重心に単により近いというだけで、正しく同定される可能性は低い。この例では、信頼度レベルは、点と重心との間の距離、又は点と重心間の距離を点と１つまたは複数の他の重心間との距離とを比較することに基づいて定量化され得る。別例では、較正基準がクラスター間にある１つまたは複数の境界を含む場合には、信頼度レベルは、点と１つまたは複数の境界との間の距離を決定することによって定量化し得る。ある境界により近い点には、より低い信頼度レベルが付けられる。いくつかの実施形態では、各ヌクレオチドの同定に関する信頼度レベルが、ヌクレオチドの同定を記憶することに加えて記憶される。
【０１０７】
信頼度レベルは、較正基準と、較正基準が較正データに適合している程度とに依存し得る。較正基準が較正データによく適合していればしているほど、異なる点に対する信頼度レベルは、より高くなり得る。特に、信頼度レベルは、パルス決定器によって識別されたパルスの信号対ノイズ比に依存し得るため、信頼度レベルは、点に対応する取り込みイベントの持続時間に依存し得る。一例として、持続時間が長いことは、パルス決定器が２つの連続した取り込みイベント、例えば同一種のヌクレオチドの複数の取り込みイベントを同定することができなかったことを示す。いくつかの実施形態では、塩基決定器は、パルス決定器と通信して、パルス決定器に取り込みイベントの持続時間の再評価を要求し得る。
【０１０８】
場合によっては、以前に導出された境界（例えば、ＳＶＭモデル）を新たなパルス決定に適用して、各パルス決定イベントにおいて取り込まれた適切なヌクレオチドを決定し得る。パルス決定基準が最初に基準化され、その後、以前に導出された境界を適用して取り込みイベントを分類することができる。複数のピクセルからパルス決定データの全データを標準化する境界を導出するためには、較正データセットにデータを含ませる前に、アレイの各ピクセルからのパルス決定データの各データセットを基準化（正規化）することが必要である。強度基準を基準化すること、強度についてのみクラスタリングを行うこと、１つまたは複数クラスターを強度の平均又は中間値として用いることにより、入ってくる全てのパルス決定の強度基準を正規化することができる。この基準化又は正規化は、較正の段階及び保存された較正データを用いて塩基決定する段階の双方に適用される。これには、アレイの各ピクセルに境界を生成する必要がないという利点があり（これはパフォーマンスの向上である）、全てのデータが通常ＲＡＭに一度に収まらないような非常に大きなアレイにスケーリングできる。さらなる利点は、強度で分離して一組の較正データに対して基準化又は正規化することが必要なパルス数がより少なくて済むため、実施時間が短縮できる点である。このアプローチによれば、基準化又は正規化する係数を作成する前に、記憶してグループ化しておかなければならないパルスが少なくて済むため、ピクセルアレイからのデータを取得することとほぼリアルタイムで塩基決定を出力することができる。
【０１０９】
この時点までに、非学習可能なアルゴリズムベースのパルスおよび塩基決定技術の様々な例が説明されており、それらに関する追加の情報は、２０１７年６月１日に出願された「パルス決定器およびベース決定器」と題する同時係属中の米国特許出願第１５／６１１，５７３号に見出すことができ、その内容が全て本明細書に組み込まれる。そのようなプロセスはまた、様々な機械学習および／または深層学習技術から利益を得ることができ、それらによって改善されることがさらに理解される。
【０１１０】
従って、本明細書でさらに開示されるのは、他の態様の中でも特に、以前の実行を使用して、将来の実行における塩基決定モデルをトレーニングする学習可能な塩基決定の実施形態である。これにより、配備されたデバイスは、使用するたびに生成されるデータから恩恵を受けるため、配備されたデバイスの時間の経過に伴うパフォーマンスの向上が可能になる。さらに、本明細書に記載されている実施形態は、塩基決定精度を改善し、これはまた、標準的なバイオインフォマティクス応用をより良くすることができる。
【０１１１】
次に、図１１を参照すると、一実施形態による、学習可能な塩基決定器を実施する方法１１００のフロー図が示されている。図１１に示すように、方法１１００は、センサからの生の強度トレースデータを取得することにより、処理１１０２で開始される。次に、処理１１０４に示されるように、生の強度トレースデータを使用して、パルスが、バックグラウンドノイズレベルを超える総強度トレースの領域として識別される。この最初のパルス決定処理は、上記の技術と同様の方法で、例えば、図１２に示すトレースで示されるように実行され得る。このような２つの領域が図１２の１２０２および１２０４で示されているが、これは、必ずしもそこに存在する全てのパルス領域の完全な付加情報ではないことが理解されよう。
【０１１２】
次に、塩基決定を可能にするために、パルスデータを使用して、その特性が計算または決定される。上記したように、教師なしのアルゴリズム的な方法でパルスデータを処理する１つの方法は、強度値および寿命値を計算し、その結果を２次元散布図（例えば、図１３に示す）にプロットして、そのプロットを４つのクラスターに分割して、塩基を割り当てることである。しかしながら、本実施形態では、強度および寿命以外の他の特性も使用され得る。再び図１１を参照すると、処理１１０６において、方法１１００は、識別されたパルスのいくつかの特性（例えば、強度、寿命、クラスタリング結果における４つの重心の各々のまでの距離、信号対バックグラウンド比、およびｚ正規化強度および寿命）を決定する。さらに、そのような特性データをアルゴリズム的にクラスタリングする代わりに、方法１１００は、次に、処理１１０８に移行して、（ストック塩基決定とアライメントされた）参照塩基を各パルスに関連付ける。次に、処理１１１０に示すように、決定された特性（特徴）が与えられると、トレーニング済みの機械学習アルゴリズムを使用して塩基を予測する。トレーニング済みの機械学習アルゴリズムによって達成される結果は、参照塩基のアラインメントの正確性に依存することが理解されよう。有利なことに、そのようなアルゴリズムはより多くのデータでトレーニングされるので、塩基決定がより良くなるはずである。
【０１１３】
図１１に関連して説明されているような、特徴ベースの機械学習トレーニング済み塩基決定器の１つの注目すべき特徴は、塩基決定器が各パルスから抽出すべき特徴を把握することに依存するということである。最も重要な特徴が既知である場合（例えば、強度および寿命）でも、特徴を計算または定量的に決定する複数の方法があり得る（例えば、パルスの長さに亘る最小値、最大値、平均値）。パルストレースの他の側面は、機械学習のトレーニング済みのアルゴリズムに有用な方法で要約されるかもしれないが、そのような要約は、どの情報が実際にアルゴリズムに実際に有用であるかについての「当て推量」にすぎないと考えられる。従って、生のパルストレース値を単純に供給し、関連する特徴を抽出するのに最適な方法をアルゴリズムに決定させることが有利であり得る。
【０１１４】
そのようなアプローチは、例えば、畳み込みニューラルネットワークを使用することによって実施されてもよい。例えば、画像認識（例えば、フェイスブック（Ｆａｃｅｂｏｏｋ（登録商標））での自動顔タグ付け（ａｕｔｏ  ｆａｃｅ−ｔａｇｇｉｎｇ）、テスラ（Ｔｅｓｌａ（登録商標））オートパイロットの障害物検出）の分野では、ピクセルにおける定義された高さおよび幅のいくつかのフィルタが画像上でスキャンされ、各ウィンドウのコンテンツを要約する計算が実行される。これらの畳み込みフィルタを使用することで、画像の近接領域で特徴を計算することができる。一般的な応用は顔認識であり、これは、ディープニューラルネットワークがどのようにして独自の特徴抽出を実行することができるかを実証している。ネットをトレーニングして物体を区別する際に、生の画像が提供される。これに関する一般的な例の１つは、ネコとイヌの区別である。畳み込みニューラルネットワークは、個々の画像の各々に対してフィルタを実行し、それにより、ネコをイヌから区別するネコに共通の特徴（例えば、目の形、ひげなど）を推定し得るが、中間ネットワークの表現は、多くの場合、人間には理解できない。これらのアプローチは、画像解析に関連して論じられているが、これらの技術は、光検出器によって生成されるパルストレース値に対応する値のアレイとして表されるデータを含む、他のタイプのデータに適用することができることを理解されたい。そのような実施において、畳み込みニューラルネットワークは、シークエンシングデータを使用してトレーニングされ、個々のヌクレオチドを同定するシークエンシングデータから特徴を抽出し得、トレーニングされた畳み込みニューラルネットワークは、抽出された特徴を適用して、後で取得されたシークエンシングデータなどのシークエンシングデータにおいてヌクレオチドを同定し得る。
【０１１５】
図３８Ａは、本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベントに関連する蛍光標識による光放射から取得され得るデータ３８００の例を示す。例えば、データ３８００は、図３を参照して上述したシークエンシングシステム３００のセンサ３１０によって取得され得る。
【０１１６】
データ３８００は、光パルス後の複数の時間間隔の各々において検出されたいくつかの光子を示す。本明細書では、いくつかの光子を「光子数」と呼ぶ。図３８Ａに示される例では、データ３８００は、３つの光パルス後の時間間隔中に（例えば、シークエンシングシステム３００のセンサ３１０によって）検出された多数の光子を含む。時間間隔は、本明細書では「ビン」または「時間ビン」と呼ばれる。図３８Ａに示される例では、データ３８００は、（１）第１のパルス後の期間３８０２の第１の時間間隔３８０２Ａ、第２の時間間隔３８０２Ｂ、および第３の時間間隔３８０２Ｃで検出されたいくつかの光子と、（２）第２のパルス後の期間３８０４の第１の時間間隔３８０４Ａ、第２の時間間隔３８０４Ｂ、および第３の時間間隔３８０４Ｃで検出されたいくつかの光子と、（３）第３のパルス後の期間３８０６の第１の時間間隔３８０６Ａ、第２の時間間隔３８０６Ｂ、および第３の時間間隔３８０６Ｃで検出されたいくつかの光子とを含む。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、光のパルス後の期間における時間間隔の各々は、等しいか、または実質的に等しい持続時間であり得る。いくつかの実施形態では、光のパルス後の期間における時間間隔は、変化する持続時間を有し得る。いくつかの実施形態では、データは、各光パルス後の固定された数の時間間隔で検出された多数の光子を含み得る。データは、光パルスに続く各期間において３つの時間間隔を含むが、本明細書で説明する技術の態様はこの点に限定されないため、データは任意の適切な数の時間間隔にビニングされ得る。また、図３８Ａの例は、３つの光パルスに続く３つの期間に関するデータを示すが、本明細書で説明される技術の態様がこの点に限定されないため、データ３８００は、任意の適切な数の光パルス後の期間中に収集されたデータを含み得る。また、図３８Ａの例は、ある期間の間隔が別々であることを示しているが、いくつかの実施形態では、間隔が重複してもよい。
【０１１８】
図３８Ｂは、本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、機械学習モデルへの入力として提供され得る図３８Ａからのデータ３８００の例示的な配置を示す。例えば、データ構造３８１０は、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得するために、深層学習モデル（例えば、ニューラルネットワーク）への入力として生成され得る。
【０１１９】
図３８Ｂに示されるように、データ３８００からの光子数は、複数の一連の値を含むデータ構造３８１０に配置されてもよい。いくつかの実施形態では、データ構造３８１０は、行列（例えば、アレイ、一組のリンクされたリスト）をエンコードする２次元データ構造であってもよい。一連の値の各々が、行列の行または列を形成してもよい。理解され得るように、データ構造３８１０は、画像の値を格納するものと考えることができ、画像の各「ピクセル」は、対応する光パルス後の特定の期間における個々の時間間隔に対応し、ピクセルの値は、時間間隔の間に検出された光子数を示す。
【０１２０】
図３８Ｂに示される例では、データ構造３８１０は、列において複数の一連のデータを含む。各列は、本明細書では「フレーム」と呼ばれる。データ構造３８１０は、（１）最初の光パルス後の期間３８０２の時間間隔３８０２Ａ〜Ｃにおいて検出された光子Ｎ１１、Ｎ１２、Ｎ１３の数を特定する第１のフレームと、（２）第２の光パルス後の期間３８０４の時間間隔３８０４Ａ〜Ｃにおいて検出された光子Ｎ２１、Ｎ２２、Ｎ２３の数を特定する第２のフレームと、（３）第３の光パルス後の期間３８０６の時間間隔３８０６Ａ〜Ｃにおいて検出された光子Ｎ３１、Ｎ３２、Ｎ３３の数を特定する第３のフレームとを含む。図３８Ｂに示される例は３つのフレームを示すが、本明細書で説明される技術の態様はこの点に限定されないため、データ構造３８１０は、任意の適切な数のフレームからのデータを保持し得る。
【０１２１】
図３８Ｂに示される例では、データ構造３８１０は、行において複数の一連のデータを含む。各行は、光の各パルスに対して特定のビンで検出された多数の光子を特定する。データ構造３８１０は、（１）最初の光パルス後の期間３８０２における第１の間隔３８０２Ａ内の光子数（Ｎ１１）と、（２）第２の光パルス後の期間３８０４における第１の間隔３８０４Ａ内の光子数（Ｎ２１）と、（３）第３の光パルス後の期間３８０６における第１の間隔３８０６Ａ内の光子数（Ｎ３１）とを含む第１の一連の値を含む。データ構造３８１０は、（１）最初の光パルス後の期間３８０２における第２の間隔３８０２Ｂ内光子数（Ｎ１２）と、（２）第２の光パルス後の期間３８０４における第２の間隔３８０４Ｂ内の光子数（Ｎ２２）と、（３）第３の光パルス後の期間３８０６における第２の間隔３８０６Ｂ内の光子数（Ｎ３２）とを含む第２の一連の値を含む。データ構造３８１０は、（１）最初の光パルス後の期間３８０２における第３の間隔３８０２Ｃ内の光子数（Ｎ１３）と、（２）第２の光パルス後の期間３８０４における第３の間隔３８０４Ｃ内の光子数（Ｎ２３）と、（３）第３の光パルス後の期間３８０６における第３の間隔３８０６Ｃ内の光子数（Ｎ３３）とを含む第３の一連の値を含む。
【０１２２】
図３９Ａは、本明細書に記載されている技術のいくつかの実施形態による、核酸のヌクレオチドを同定するための深層学習モデルをトレーニングするための例示的なプロセス３９００を示す。プロセス３９００は、任意の適切なコンピュータシステムによって実行される。例えば、プロセス３９００は、図１を参照して上記で説明されたワークステーション１０８によって実行される。プロセス３９００は、本明細書で説明される深層学習モデルをトレーニングするために実行される。例えば、プロセス３９００は、図４０を参照して以下で説明される畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）４０００をトレーニングするために実行され得る。別の例として、プロセス３９００は、図４１を参照して以下で説明されるコネクショニスト時間分類（ＣＴＣ）適合ニューラルネットワークモデル４１００をトレーニングするために実行され得る。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、深層学習モデルはニューラルネットワークであってもよい。例えば、深層学習モデルは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）であり得、ＣＮＮは、ＣＮＮへの入力として提供される一組のデータに対するヌクレオチドを同定する出力を生成する。いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークの一部は、別々にトレーニングされ得る。例えば、深層学習モデルは、入力データを１つまたは複数の特徴の値にエンコードする第１の部分を有する。深層学習モデルは、特徴（単数または複数）の値を入力として受信して、核酸の１つまたは複数のヌクレオチドを同定する出力を生成する第２の部分を含み得る。
【０１２４】
プロセス３９００は、ブロックで開始され、ここで、プロセス３９００を実行するシステムは、核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に蛍光標識による光放射から取得されたトレーニングデータにアクセスする。いくつかの実施形態では、データは、１つまたは複数のシーケンサによる核酸へのヌクレオチドの取り込み中に、１つまたは複数のセンサ（例えば、光検出器（単数または複数））によって収集される。いくつかの実施形態では、光放射は、一連の光パルスに応答的である。データは、各光パルス後の期間の複数の時間間隔において検出されたいくつかの光子を含み得る。いくつかの実施形態では、システムは、図３８Ｂを参照して上述したデータ構造３８１０などの１つまたは複数のデータ構造にデータを配置するように構成され得る。
【０１２５】
次に、プロセス３９００は、ブロック３９０４に移行し、ここで、システムは、（１）ブロック３９０２においてアクセスされたデータ、および（２）核酸の１つまたは複数のヌクレオチドを同定する情報を使用して深層学習モデルをトレーニングする。本明細書において、深層学習モデルの例について説明する。いくつかの実施形態では、核酸の１つまたは複数のヌクレオチドを同定する情報は、各核酸についてのヌクレオチドの所定の配列を含み得る。いくつかの実施形態では、システムは、（１）ブロック３９０２においてアクセスされたデータを深層学習モデルへの入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得することと、（２）出力によって同定されたヌクレオチドと核酸の所定のヌクレオチドとの間の差異に基づいて、深層学習モデルをトレーニングすることとによって、深層学習モデルをトレーニングするように構成され得る。例えば、システムは、決定された差異に基づいて、深層学習モデルの１つまたは複数のパラメータを更新するように構成され得る。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、システムは、標識付けされたトレーニングデータに基づいて教師あり学習を使用して深層学習モデルをトレーニングするように構成され得る。例えば、１つまたは複数の核酸を同定する情報は、ブロック３９０２において取得されたデータに関する標識であり得る。いくつかの実施形態では、ブロック３９０２において取得されたデータの一部は、深層学習モデルへの入力として提供され得、データの一部に対応する深層学習モデルの出力は、データの一部に関する標識と比較され得る。次に、深層学習モデルの１つまたは複数のパラメータは、深層学習モデルの出力と、深層学習モデルへの入力として提供されたデータの一部に関する標識との間の差異に基づいて更新される。この差異は、深層学習モデルが、現在のパラメータのセットで構成されている場合に、標識を再現する際に、どの程度良好に動作するのかを示す指標を提供し得る。例えば、深層学習モデルのパラメータは、確率的勾配降下法および／またはニューラルネットワークのトレーニングに適した他の任意の反復最適化技術を使用して更新され得る。
【０１２７】
ブロック３９０４において深層学習モデルをトレーニングした後、プロセス３９００はブロック３９０６に移行し、システムはトレーニング済みの深層学習モデルを記憶する。システムは、深層学習モデルの１つまたは複数のトレーニング済みのパラメータの値（単数または複数）を記憶し得る。例えば、深層学習モデルは、１つまたは複数のニューラルネットワークを含み得る。システムは、ニューラルネットワーク（単数または複数）のトレーニング済みの重みの値を記憶し得る。システムは、核酸のヌクレオチドを同定する際に使用するためのトレーニング済みの深層学習モデルを記憶するように構成され得る。
【０１２８】
いくつかの実施形態では、システムは、深層学習モデルを再トレーニングするための新たなデータを取得するように構成され得る。例えば、システムは、ニューラルネットワークのパラメータを更新するためにシステムが使用し得る新たなトレーニングデータ（例えば、核酸配列および関連データ）を受信し得る。いくつかの実施形態では、システムは、トレーニング済みの深層学習モデルによって生成された１つまたは複数の出力を使用して深層学習モデルを再トレーニングするように構成され得る。例えば、モデルによって生成された出力（単数または複数）および対応する入力データは、トレーニングデータとして使用され得る。いくつかの実施形態では、システムは、データおよび（例えば、図３９Ｂを参照して後述するプロセス３９１０を実行することから得られる）核酸の核酸を同定する出力を使用してトレーニング済みの深層学習モデルを繰り返し更新するように構成され得る。例えば、システムは、入力データを第１のトレーニング済みの深層学習モデル（例えば、教師モデル）に提供し、１つまたは複数の核酸の１つまたは複数のヌクレオチドを同定する出力を取得するように構成され得る。次に、システムは、入力データおよび出力を使用して深層学習モデルを再トレーニングして、第２のトレーニング済みの深層学習モデル（例えば、学生モデル）を取得する。
【０１２９】
いくつかの実施形態では、システムは、シーケンサ（例えば、シーケンサ３０４）の各ウェルについて別個の深層学習モデルをトレーニングするように構成され得る。深層学習モデルは、ウェルから取得されたデータを使用して、個々のウェルに対してトレーニングされ得る。深層学習モデルは、ウェルの特性に合わせて調整され得る。いくつかの実施形態では、システムは、シーケンサの複数のウェル内の核酸を同定するために使用される一般化された深層学習モデルをトレーニングするように構成され得る。一般化された深層学習モデルは、複数のウェルから集約されたデータを使用してトレーニングされ得る。
【０１３０】
図３９Ｂは、本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、核酸のヌクレオチドを同定するためにプロセス３９００から取得されたトレーニング済みの深層学習モデルを使用するための例示的なプロセス３９１０を示す。プロセス３９１０は、任意の適切なコンピュータシステムによって実行される。例えば、プロセス３９１０は、図１を参照して上記で説明されたワークステーション１０８によって実行される。プロセス３９１０は、本明細書で説明される１つまたは複数のトレーニング済みの深層学習モデルを使用して実行される。例えば、プロセス３９１０は、図４０を参照して以下で説明される畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）４０００を使用して実行される。別の例として、プロセス３９００は、図４１を参照して以下で説明されるＣＴＣ適合ニューラルネットワークモデル４１００を使用して実行され得る。
【０１３１】
プロセス３９１０は、ブロック３９１２で開始され、ここで、システムは、核酸に関するヌクレオチドの取り込みイベント中に蛍光標識による光放射から取得されたデータにアクセスする。いくつかの実施形態では、データは、シーケンサによる核酸へのヌクレオチドの取り込み中に、１つまたは複数のセンサ（例えば、光検出器（単数または複数））によって収集されたデータから取得され得る。いくつかの実施形態では、光放射は、一連の光パルスに応答的である。データは、各光パルス後の期間の複数の時間間隔において検出されたいくつかの光子を含み得る。例えば、データは、図３８Ａを参照して上述したデータ３８００であり得る。いくつかの実施形態では、システムは、図３８Ｂを参照して上述したデータ構造３８１０にデータを配置するように構成され得る。
【０１３２】
次に、プロセス３９００はブロック３９１２に進行し、ここで、システムは、ブロック３９０６においてアクセスされたデータをトレーニング済みの深層学習モデルへの入力として提供する。いくつかの実施形態では、システムは、データを複数の期間に分割し、各期間のデータを一連の入力としてトレーニング済みの深層学習モデルに提供して、各入力に対する出力を取得するように構成され得る。例えば、システムは、データの各一部をＣＮＮ４０００への入力として提供し、データの一部に対するヌクレオチドを同定する出力を取得し得る。いくつかの実施形態では、システムは、データを期間で分割することなく入力として提供して、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得するように構成され得る。例えば、システムは、ブロック３９１２において取得されたデータをＣＴＣ適合ニューラルネットワークモデル４１００への入力として提供し、核酸のヌクレオチド配列を同定する出力を取得し得る。
【０１３３】
次に、プロセス３９００は、ブロック３９１６に移行し、ここで、システムは、核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得する。いくつかの実施形態では、システムは、複数の期間の各々について出力を取得するように構成され得る。出力は、期間中に核酸に取り込まれたヌクレオチドを示し得る。例えば、出力は、タイマ期間中に核酸に取り込まれる様々なヌクレオチドの確率を示す値であり得る。いくつかの実施形態では、システムは、核酸のヌクレオチドを同定する単一の出力を取得するように構成され得る。例えば、システムは、核酸のヌクレオチドを同定する一連の配列の文字を受信し得る。別の例として、システムは、各ヌクレオチドに関する一連の確率を受信し得る。システムは、核酸のヌクレオチドを同定する確率を使用するように構成され得る。
【０１３４】
ブロック３９１０においてトレーニング済みの深層学習モデルから核酸のヌクレオチドを同定する出力を取得した後、プロセス３９００はブロック３９１２に戻り、システムは別の核酸のヌクレオチドを同定するためにプロセス３９１０を再度実行することを開始する。
【０１３５】
さらなる例として、図１４は、画像１４０２を分析するように構成された例示的な畳み込みニューラルネットワーク１４００の層を示す概略図である。図示されるように、畳み込みニューラルネットワークは、画像１４０２を受信するための入力層１４０４と、出力を提供するための出力層１４０６と、入力層１４０４と出力層１４０６との間に接続された複数の隠れ層１４０８とを含む。複数の隠れ層１４０８は、畳み込みおよびプーリング層１４１０と、高密度層１４１２とを含む。
【０１３６】
入力層１４０４は、畳み込みニューラルネットワーク１４００への入力を受信し、その入力は画像１４０２であり得る。画像１４０２は、２つのビンからの２×Ｎ行列の光子数などの行列の値を有し得る。さらに、入力層１４０４の後には、１つまたは複数の畳み込みおよびプーリング層１４１０が続く。畳み込み層は、畳み込み層への入力（例えば、画像１４０２）よりも空間的に小さい（例えば、幅および／または高さが小さい）一組のフィルタを含み得る。各フィルタは、畳み込み層への入力とともに畳み込まれて、各空間位置におけるそのフィルタの応答を示す活性化マップ（例えば、２次元活性化マップ）を生成することができる。畳み込み層の後には、畳み込み層の出力をダウンサンプリングして、次元を減少させるプーリング層が続く。
【０１３７】
畳み込みおよびプーリング層１４１０の後に、高密度層１４１２が続く。高密度層１４１２は、前の層（例えば、畳み込み層またはプーリング層）から入力を受信し、次の層（例えば、出力層１４０６）に出力を提供する１つまたは複数のニューロンをそれぞれ有する１つまたは複数の層を含み得る。高密度層１４１２は、所与の層内の各ニューロンが前の層内の各ニューロンから入力を受信し、後続の層内の各ニューロンに出力を提供するため、「高密度」として説明され得る。高密度層１４１２の後には、畳み込みニューラルネットワークの出力を提供する出力層１４０６が続く。出力は、例えば、一組のクラス（例えば、異なるヌクレオチド）の中から、画像１４０２（または画像１４０２の任意の部分）がどのクラス（例えば、ヌクレオチドの種類）に属するかの表示であり得る。核酸シークエンシングの状況では、クラスは特定の種類のヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｇ、Ｔ、Ｃ）に対応し得る。
【０１３８】
図１４に示される畳み込みニューラルネットワーク１４００は、１つの例示的な実施形態にすぎず、他の実施形態が採用されてもよいことが理解されるべきである。例えば、図１４に示す１つまたは複数の層を畳み込みニューラルネットワークに追加するか、または畳み込みニューラルネットワークから削除してもよい。畳み込みニューラルネットワークに追加され得る付加的な例示的な層は、正規化線形ユニット（ｒｅｃｔｉｆｉｅｄ  ｌｉｎｅａｒ  ｕｎｉｔｓ（ＲｅＬＵ））層、パッド層、連結層（ｃｏｎｃａｔｅｎａｔｅ  ｌａｙｅｒ）、およびアップスケール層を含む。アップスケール層は、層への入力をアップサンプリングするように構成され得る。ＲｅＬＵ層は、正規化線形関数（ランプ関数とも呼ばれる）を伝達関数として入力に適用するように構成される。パッド層は、入力の１つまたは複数の次元をパディングすることによって、層への入力のサイズを変更するように構成される。連結層は、複数の入力を単一の出力に結合する（例えば、複数の層からの入力を結合する）ように構成される。
【０１３９】
塩基決定に関して、図１５は、別の実施形態による、学習可能な塩基決定器を実施する方法１５００を示すフロー図である。パルストレースデータの特定の特性を決定および／または算出する代わりに、データは画像と同様に分析および処理され、４つのクラス（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇ）の低次元データ、即ち、一定の時間に亘る第１および第２の時間ビンにおける光子数を使用する畳み込みニューラルネットワーク（例えば、図１４のネットワーク１４００）に供給される。図１５に示されるように、方法１５００は、センサからの生の強度トレースデータの取得により、処理１５０２において開始される。次に、処理１５０４に示されるように、生の強度トレースデータを使用して、パルスが、バックグラウンドノイズレベルを超える総強度トレースの領域として識別される。特に、処理１５０２および１５０４は、図１１の処理１１０２および１１０４とそれぞれ同様であり、さらに、最初のパルス決定処理は、上記の技術と同様の方法で、例えば、図１２に示すトレースで示されるように実行され得る。
【０１４０】
処理１５０６では、パルストレースデータが、入力信号の正規化された２Ｄ行列表現を生成するために正規化され、処理１５０８に示すように、塩基決定のための畳み込みニューラルネットワーク（例えば、図１４のネットワーク１４００）に適用される。入力信号の正規化に関して、いくつかのアプローチを使用して、生のトレースを正規化された範囲に変換することが企図される。例えば、正規化は、トレースにおける全ての測定値に亘る平均からの標準偏差の数をカウントすることによって（ｚスコア）、またはこれらのストラテジーの組み合わせによって（例えば、最初にｚスコアを介して変換し、次に、−１から１の範囲にスケーリングすることによって）、０と１の間、−１と１の間で線形に行われる。さらなる例として、図１６Ａ〜１６Ｄは、４つのクラス（Ａ、Ｔ、Ｃ、Ｇそれぞれ）の低次元データの例であり、それぞれが一定の時間に亘る第１および第２の光子数（時間ビン１、時間ビン２）を使用している。より具体的には、図１６Ａは、塩基シグネチャＡのパルストレースデータ（画像と同様）特性の正規化された２Ｄ行列表現の４つの例を示し、図１６Ｂは、塩基シグネチャＴのパルストレースデータ特性の正規化された２Ｄ行列表現の４つの例を示し、図１６Ｃは、塩基シグネチャＣのパルストレースデータ特性の正規化された２Ｄ行列表現の４つの例を示し、図１６Ｄは、塩基シグネチャＧのパルストレースデータ特性の正規化された２Ｄ行列表現の４つの例を示す。パルストレースデータの２Ｄ行列表現は、積み重ねられたベクトルと考えることができ、個々のベクトルは、光検出器の異なる時間ビンに対応し、ベクトルにおける値は、時間の経過に伴う光子数に対応する。ニューラルネットワークの畳み込みフィルタを２Ｄ行列表現に適用することは、１つまたは複数の畳み込みフィルタを、時間次元に沿って（個々の時間ビンに対して）、および／または、異なるベクトルに亘って（同じ時間に対応する異なる時間ビンの値に対して）通過させることを含み得る。２Ｄ行列表現の正規化を含む実施形態では、正規化は、ベクトルの最小値および／または最大値に基づいてベクトルをスケーリングすることを含み、これは、結果として生じる正規化されたデータが値の範囲内に収まるようにシークエンシングデータを取得する際に使用される異なるパラメータ（例えば、異なるシークエンシング実行に亘って使用されるレーザーパワー）を考慮する。
【０１４１】
ここで図１７Ａ〜１７Ｄを参照すると、各塩基シグネチャに関する一連の正規化された時間ビン１および時間ビン２の光子数が示され、図１７Ａは、塩基シグネチャＡに関する正規化された光子数分布を示し、図１７Ｂは、塩基シグネチャＴに関する正規化された光子数分布を示し、図１７Ｃは、塩基シグネチャＣに関する正規化された光子数分布を示し、図１７Ｄは、塩基シグネチャＧに関する正規化された光子数分布を示す。図１７Ａ、１７Ｂ、１７Ｃ、および１７Ｄは、異なるヌクレオチドの各々に関する全てのトレースに亘る光子数の要約を表し、かつ図１６Ａ、１６Ｂ、１６Ｃ、１６Ｄに示されるデータを含むデータから導出される。注目されるように、正規化された時間ビン１および時間ビン２の光子数の分布は、区別可能な塩基シグネチャを反映している。多くのアパーチャに亘って算出されたこれらの分布では、ビン間にオーバーラップが存在しているが、個々のパルストレース図１７Ａ〜１７Ｄは、典型的には、絶対光子数において同時に上下に移動するこれらの値の間で良好な分離を維持することに留意されたい。従って、これらは、特に、傾向が人間の目でかなり簡単にわかることを考えると、畳み込みニューラルネットワークによって学習できるシグネチャである可能性が高い（これは、ＤＬアルゴリズムが良好に機能することを示す優れた指標である）。
【０１４２】
図１１の学習可能な塩基決定の実施形態に関して、畳み込みニューラルネットワークの「画像」アプローチは、より高い性能限界を有し得、従って、大量の生データからより多くの利益を得る。即ち、アルゴリズムは標識を予測する方法を学習する必要があるだけでなく、特徴自体の表現も学習する必要があるため、畳み込みモデルをトレーニングするためにより多くのデータが必要である。機能ベースのモデルでは、トレーナーは情報価値があると分かっているモデル特徴を供給し得るため、標識のみを学習する必要があり、少ないデータを使用する。一方、畳み込みベースのＤＬモデルは、十分なデータがあれば、人間のトレーナーが事前に計算するよりも、「優れた」特徴を学習し得る。
【０１４３】
要約すると、畳み込みニューラルネットを特徴とする深層学習の塩基決定アルゴリズムを使用して、二重光子時間ビン空間内の塩基を同定するために、顔認識技術に幾分類似したタスクを実行することができる。この解決策は、トレースを前処理してパルスイベントを抽出し、トレースから切り取られた各パルスの静的スナップショットを「画像処理」ニューラルネットワークに供給することによって、生のパルスデータに適用することができる。
【０１４４】
この点に関して、上記の自動化されたパルスおよび塩基決定アプローチ（深層学習技術および畳み込みニューラルネットワークを使用するものを含む）の各々は、塩基決定の前に、生のセンサデータからパルス決定またはパルス識別の何らかの方法を最初に組み込んでいる。従って、本明細書に記載されるさらなるアプローチは、パルスおよび塩基決定を全て１つのステップで実行するための実施形態を提供する。これにより、例えば、ニューラルネットが、各塩基（Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）からのパルスがどのように「見える」かという情報に支援されて、パルスを決定する方法を学習することが可能となる。このようなアプローチは、所与の強度閾値を超えるが、塩基の特性ではないスプリアスフリッカを除去するのにさらに役立ち得る。
【０１４５】
次に図１８を参照すると、別の実施形態による、学習可能な塩基決定器を実施する方法１８００を示すフロー図が示されている。一般的に、塩基を決定する畳み込みニューラルネットワークは、より長いトレースに直接適用される。前の実施形態と同様に、方法１８００は、センサからの生の強度トレースデータの取得により、処理１８０２において開始される。ニューラルネットワークは、入力として特定の「画像」形状を期待するため（例えば、ネットワークは、特定の数のフレームチャンク内の塩基を同定するようにトレーニングされる）、方法は処理１８０４に移行して、最初に強度トレースデータを選択された時間フレーム幅にセグメント化する。一実施形態では、データは５０フレームのチャンクに分割され得るが、これよりもより多い数またはより少ない数のフレームのチャンクが使用され得ることを理解されたい。次に、所与のフレーム幅内で、方法１８００は、処理１８０６において畳み込みニューラルネットワークを適用して、データを、各塩基種類に対する塩基イベントの時間領域に亘る実行確率に変換する。
【０１４６】
図４０は、本明細書に記載されている技術のいくつかの実施形態による、核酸のヌクレオチドを同定するための畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）４０００の例示的な構造を示す。いくつかの実施形態では、ＣＮＮ４０００は、図３９Ａを参照して上記で説明されたプロセス３９００を実行することによってトレーニングされ得る。いくつかの実施形態では、プロセス３９００から取得されたトレーニング済みのＣＮＮ４０００を使用して、図３９Ｂを参照して上記で説明されたプロセス３９１０を実行する。いくつかの実施形態では、畳み込みニューラルネットワーク４０００は、図１８を参照して上記で説明されたプロセス１８００において使用される。
【０１４７】
図４０の例示的な実施形態では、ＣＮＮ４０００は入力４００２Ａを受信する。いくつかの実施形態では、入力４００２Ａは、光パルス後の期間の時間間隔における多数の光子を特定するフレームの集合であり得る。いくつかの実施形態では、入力４００２Ａは、図３８Ｂを参照して上述したデータ構造３８１０などのデータ構造に配置され得る。図４０の例示的な実施形態では、入力４００２Ａは、２×５０の入力行列を形成する２つの時間間隔の間の５０フレームのデータを含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、ＣＮＮ４０００は、入力４００２Ａが１つまたは複数のフィルタにより畳み込まれる１つまたは複数の畳み込み層４００２を含む。図４０の例示的な実施形態では、入力４００２Ａは、第１の畳み込み層において第１の一連の１６個の２×３フィルタにより畳み込まれる。１６個のフィルタによる畳み込みにより、１６×４８の出力４００２Ｂが生成される。いくつかの実施形態では、ＣＮＮ４０００は、第１の畳み込み層の後にプーリング層を含む。例えば、ＣＮＮ４０００は、第１の畳み込み層の出力のウィンドウ内の最大値を取ることによってプーリングを実行して、出力４００２Ｂを取得する。
【０１４９】
図４０の例示的な実施形態では、次に、第１の畳み込み層の出力４００２Ｂが、第２の畳み込み層内の第２の組の１つまたは複数のフィルタにより畳み込まれる。出力４００２Ｂは、一組の１つまたは複数の１×６フィルタにより畳み込まれて、出力４００２Ｃが取得される。いくつかの実施形態では、ＣＮＮ４０００は、第２の畳み込み層の後にプーリング層（例えば、最大プーリング層）を含む。
【０１５０】
図４０の例示的な実施形態では、ＣＮＮ４０００は、畳み込み層４００２の出力が平坦化されて、平坦化された出力４００６Ａを生成する平坦化ステップ４００４を含む。いくつかの実施形態では、ＣＮＮ４０００は、８×４３出力行列を１次元ベクトルに変換することによって出力４００２Ｃを平坦化するように構成され得る。図４０の例示的な実施形態では、８×４３出力４００２Ｃは、１×３４４ベクトル４００６Ａに変換される。ベクトル４００６Ａは、各可能性のあるクラスに対するスコアを生成するために、全結合層に入力される。図４０の例示的な実施形態において、可能性のあるクラスは、ヌクレオチドのアデノシン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）、およびブランク（−）である。次に、全結合層の出力に対してｓｏｆｔｍａｘ演算４００６が実行され、出力４０１０が取得される。いくつかの実施形態では、ｓｏｆｔｍａｘ演算４００６は、各クラスに関するスコアを個々の確率に変換する。次に、ａｒｇｍａｘ演算４００８が出力４０１０に対して実行され、分類が取得される。ａｒｇｍａｘ演算４００８は、出力４０１０で最も高い確率を有するクラスを選択する。例えば、出力は、入力４００２Ａによって表される期間中に取り込まれたヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｃ、Ｇ、またはＴ）を同定し得る。別の例として、ブランク（−）の分類を出力することにより、出力は、期間中にヌクレオチドが核酸に取り込まれなかったことを識別し得る。
【０１５１】
さらに説明すると、図１９は、時間ビン１および時間ビン２の光子数の生のトレースを示すプロットである（例えば、処理１８０２から取得されたもの）。次に、このデータを使用して、図２０Ａ〜２０Ｃは、生のトレースデータを様々なサイズのウィンドウに適用される畳み込みニューラルネットワークに入力することによって生成される実行塩基カウント確率を示すプロットである。図示された特定の例では、図２０Ａのプロットは、上述で説明したように５０フレームの予測フレーム幅を使用している。図２０Ｂは２５の予測フレーム幅を使用し、図２０Ｃは５の予測フレーム幅を使用している。これらの例から、単一のウィンドウ内で２以上のパルスをキャプチャすることによってデータを混乱させる可能性が低いため、ウィンドウを小さくすることで、実際にはより明確な確率ピークが生成されることに留意されたい。一方、塩基を正確に決定するためには、十分なパルスをキャプチャする必要があるというトレードオフがある。図２０Ａから２０Ｃにさらに示されているように、５０％の確率（破線で示されている）での単純な閾値処理は、実際の整列可能な配列を生成するという点で、塩基決定の使用に対して許容可能であるが、塩基決定の精度は、生のセンサデータからパルス決定トレースを事前にセグメント化して識別する前述の技術によって達成可能なものよりも低くてもよい。あるいは、確率空間におけるピーク決定パラメータを調整することもできるが、その場合、プロセスに余分なステップが追加されるというトレードオフがある（２ステップのパルス決定および塩基決定アプローチと同様）。畳み込みによりパルス決定を実行する別の利点は、時間ビン１および時間ビン２の両方のビンに亘る付加的な強度ではなく、両方の値を別々に使用して、パルスが発生する場所を予測することができるため、塩基決定に加えて、より正確なパルス決定につながる可能性があることである。
【０１５２】
事前にセグメント化されたパルスなしで、学習可能な塩基決定を実施して、トレースから直接塩基を決定する別の可能なアプローチは、音声認識用のモデルを利用する。音声認識は、多くの点で塩基決定に類似している。例えば、コネクショニスト時間的分類（ＣＴＣ）モデルは、音声のスニペット（長さが不確定の多次元波形）と、文字または音素の不確定リストとしての標識とを入力として取り入れる。特別なコスト関数により、長さが不明なこれらの標識に対するモデル出力の調整／最適化が可能になる。この概念を説明するために、図２１は一対のプロットを示し、下側のプロットは、「She had your dark suit in greasy wash water all year（彼女はあなたのダークスーツを脂まみれの洗濯水に一年中入れていた）」という音声フレーズのスペクトログラムである、上側のプロットはスペクトログラムの正規化された大きさを示す。
【０１５３】
これは、ネットワークが任意の長さの波形から可変数のシンボル（塩基決定）を学習することが望まれる塩基決定問題に対する非常に良い類似点である。さらに、トレーニングのためにアルゴリズムにこのタイプのデータを供給する機能は、パルスごとに正確な標識を割り当てるためにデータを事前に整列させるといういくつかの問題を軽減し、代わりに、「アンカーポイント」が確立されていることが合理的に確実である場合には、ウィンドウごとに標識を割り当てる。これは、参照配列への塩基のアラインメントが良好であったことを意味する。
【０１５４】
この点に関し、図２２は、別の実施形態による、学習可能な塩基決定器を実施する方法２２００を示すフロー図である。前の実施形態と同様に、方法２２００は、センサからの生の強度トレースデータの取得により、処理２２０２において開始される。次に、処理２２０４において、強度トレースデータは、最初に事前にセグメント化されることなく正規化される。処理２２０４において適用される正規化プロセスは、シーケンス実行と、異なるシーケンス実行を取得するために使用されるパラメータとの間の変動を考慮するために、データ内の値が範囲内にあるように、強度トレースデータを正規化することを含む。次に、処理２２０６に示すように、コネクショニスト時間分類モデルを正規化された強度トレースデータに適用して、様々な長さの波形から塩基決定を識別する。
【０１５５】
本発明者らは、そのようなモデルを供給するためのセグメント化された単一光子アバランシェダイオード（ＳＰＡＤ：ｓｉｎｇｌｅ−ｐｈｏｔｏｎ  ａｖａｌａｎｃｈｅ  ｄｉｏｄｅ）入力データを使用して、塩基決定のモデルをトレーニングすることに成功した。図２３は、ＳＰＡＤ入力データのこのような２つのセグメントを、関連する塩基標識とともに示す。さらに、ＣＴＣモデルは非常に複雑である可能性があるため、実際のシークエンシングデータには似ていないが、ＣＴＣを使用して予備的な解を取得するために重要な全ての特性に一致するような簡略化されたデータをシミュレートすることも可能である。ここで、一対の例示的なシミュレートされたデータセグメントが図２４に示される。各塩基は、時間ビン１と時間ビン２との間に差異がないように、単純に強度が割り当てられることに留意されたい。
【０１５６】
図４１は、本明細書で説明される技術のいくつかの実施形態による、核酸のヌクレオチドを同定するためのコネクショニスト時間分類（ＣＴＣ）適合ニューラルネットワークモデル４１００の例を示す。いくつかの実施形態では、図３９Ａを参照して上述したプロセス３９００を実行することにより、ＣＴＣ適合ニューラルネットワークモデル４１００がトレーニングされ得る。いくつかの実施形態では、プロセス３９００から取得されたトレーニング済みのＣＴＣ適合ニューラルネットワークモデル４１００を使用して、図３９Ｂを参照して上記で説明されたプロセス３９１０を実行する。いくつかの実施形態では、ＣＴＣ適合ニューラルネットワークモデル４１００は、図２２を参照して上記で説明されたプロセス２２００において使用される。
【０１５７】
図４１の例示的な実施形態では、モデル４１００は、核酸シーケンサ４１２０からデータを受信するように構成される。例えば、シーケンサ４１２０は、図３を参照して上記で説明されたシークエンシングシステム３００であり得る。いくつかの実施形態では、モデル４１００は、シーケンサ４１２０によって生成されたデータを受信するように構成され得る。データは、核酸のヌクレオチドの取り込み中にヌクレオチドに結合された蛍光標識によって検出された光放射からアクセスされ得る。いくつかの実施形態では、データは、図３８Ｂを参照して上記で説明したように、複数の一連の光子および／またはフレームとして配置される。いくつかの実施形態では、シーケンサ４１２０から取得されたデータの一部は、モデル４１００への一連の入力として提供され得る。例えば、モデル４１００は、４００個の光パルスの各々の後の２つの時間間隔で検出された多数の光子を特定する最初の２×４００の入力を受信するように構成される。
【０１５８】
図４１の例示的な実施形態では、モデル４１００は、特徴抽出器４１０４を含む。いくつかの実施形態では、特徴抽出器は、トレーニング済みのオートエンコーダのエンコーダであり得る。オートエンコーダはトレーニングされ、オートエンコーダからのデコーダは、特徴抽出器４１０４として実施され得る。エンコーダは、入力を１つまたは複数の特徴値４１０６としてエンコードするように構成され得る。
【０１５９】
図４１の例示的な実施形態では、特徴抽出器４１０４によって決定された特徴値４１０６は、予測器４１０８に入力され、予測器４１０８は、各可能性のあるクラスに対する一連の確率値を示す確率行列４１１０を出力する。図４１の例示的な実施形態では、クラスは、核酸に組み込むことができるヌクレオチド（例えば、アデニン（Ａ）、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、およびチミン（Ｔ）、およびブランク（−））を含む。一例として、予測器４１０８は、クラスの各々に対する一連の５０個の確率値を示す５×５０の行列を出力する。確率行列４１１０を使用して、核酸シーケンサ４１２０から受信したデータに対応するヌクレオチド配列を同定する出力４１３０を生成することができる。いくつかの実施形態では、ヌクレオチド配列は、確率行列４１１０から決定され得る。例えば、ヌクレオチドの出力４１３０を取得するためにビーム検索が実行される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、特徴抽出器４１０４は、予測器４１０８とは別にトレーニングされる。例えば、特徴抽出器４１０４は、オートエンコーダをトレーニングすることによって取得される。次に、オートエンコーダからのエンコーダが特徴抽出器４１０４として使用される。いくつかの実施形態では、予測器４１０８は、ＣＴＣ損失関数４１１２を使用して別々にトレーニングされる。ＣＴＣ損失関数４１１２は、出力４１３０を生成するために使用することができる出力を生成するように予測器４１０８をトレーニングする。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、複数の確率行列が組み合わされる。第２の入力は、シーケンサ４１２０から取得されたデータからアクセスされる。第２の入力は、シーケンサ４１２０から取得されたデータの第２の部分である。いくつかの実施形態では、第２の入力は、シーケンサ４１２０から取得されたデータ内のいくつかの点だけシフトすることによって取得される。例えば、第２の入力は、シーケンサ４２０から取得されたデータ内の８点をシフトすることによって取得された第２の４００×２の入力行列である。第２の入力に対応する確率行列は、予測器４１０８から取得され、第１の入力に対応する第１の確率行列と組み合わされる。例えば、第２の確率行列は、第１の確率行列に加えられてもよい。別の例として、第２の確率行列は、シフトされて、第１の確率行列に加えられてもよい。次に、組み合わされた確率行列を使用して、核酸のヌクレオチド配列を同定する出力４１３０が取得される。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、特徴抽出器４１０４は、ニューラルネットワークである。いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークは、畳み込みニューラルネットワーク（ＣＮＮ）である。いくつかの実施形態では、ＣＮＮは、１つまたは複数の畳み込み層および１つまたは複数のプーリング層を含む。ＣＮＮは、シーケンサ４１２０からの入力が１組のフィルタで畳み込まれる第１の畳み込み層を含む。例えば、入力は、１×１のストライドを使用して一組の１６×１０×２のフィルタで畳み込まれて、１６×４００×２の出力が生成される。活性化関数が、第１の畳み込み層の出力に適用され得る。例えば、ＲｅＬＵ活性化関数は、第１の畳み込み層の出力に適用され得る。いくつかの実施形態では、ＣＮＮは、第１の畳み込み層の後に第１のプーリング層を含む。いくつかの実施形態では、ＣＮＮは、第１の畳み込み層の出力にｍａｘｐｏｏｌ演算を適用する。例えば、１×１のストライドを使用して２×２のフィルタを１６×４００×２の出力に適用して、２００×１の出力が取得される。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、ＣＮＮは、第２の畳み込み層を含む。第２の畳み込み層は、第１のプーリング層の出力を入力として受信する。例えば、第２の畳み込み層は、第１のプーリング層の２００×１の出力を入力として受信することができる。第２の畳み込み層は、第２のセットのフィルタを用いた畳み込みを含む。例えば、第２の畳み込み層では、２００×１の入力が１×１のストライドを使用して第２の組の１６×１０×１のフィルタで畳み込まれて、１６×２００の出力が生成される。活性化関数が第２の畳み込み層の出力に適用される。例えば、ＲｅＬＵ活性化関数は、第２の畳み込み層の出力に適用される。いくつかの実施形態では、ＣＮＮは、第２の畳み込み層の後に第２のプーリング層を含む。いくつかの実施形態では、ＣＮＮは、第２の畳み込み層の出力にｍａｘｐｏｏｌ演算を適用する。例えば、４×１ストライドを用いて４×１のフィルタが第２の畳み込み層の１６×２００の出力に適用されて、１６×５０の出力が取得される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、特徴抽出器４１０４は、再帰性ニューラルネットワーク（ＲＮＮ：ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｎｅｕｒａｌ  ｎｅｔｗｏｒｋ）であり得る。例えば、特徴抽出器４１０４は、シーケンサ４１２０から受信したデータを１つまたは複数の特徴の値としてエンコードするようにトレーニングされたＲＮＮである。いくつかの実施形態では、特徴抽出器４１０４は、長期短期記憶（ＬＳＴＭ：ｌｏｎｇ  ｓｈｏｒｔ−ｔｅｒｍ  ｍｅｍｏｒｙ）ネットワークであり得る。いくつかの実施形態では、特徴抽出器４１０４は、ゲート付き回帰型ユニット（ＧＲＵ：ｇａｔｅｄ  ｒｅｃｕｒｒｅｎｔ  ｕｎｉｔ）ネットワークであり得る。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、予測器４１０８は、ニューラルネットワークであり得る。いくつかの実施形態では、ニューラルネットワークはＧＲＵネットワークであり得る。いくつかの実施形態では、ＧＲＵネットワークは双方向であり得る。一例として、ＧＲＵネットワークは、ＧＲＵネットワークへの入力として提供される特徴抽出器４１０４の１６×５０の出力を受信する。例えば、ＧＲＵネットワークは、５０×１２８の出力を生成する６４の隠れ層を有する。いくつかの実施形態では、ＧＲＵネットワークは、ｔａｎｈ活性化関数を使用する。いくつかの実施形態では、予測器４１０８は、全結合層を含む。ＧＲＵネットワークの出力は、５×５０の出力行列を生成する全結合層への入力として提供される。５×５０の行列は、各可能性のある出力クラスに関する一連の値を含む。いくつかの実施形態では、予測器４１０８は、全結合層の出力に対してｓｏｆｔｍａｘ関数を適用して確率行列４１１０を取得するように構成される。
【０１６６】
シミュレートされたデータセット（実際の２ビンＳＰＡＤデータまたは統合チップデータのいずれかでシミュレート）には、例えば、以下の利点がある。（１）エラーモードを理解するのに役立つことによって、生データの成分からそのような成分が「ゼロから」生成される。（２）新規の深層学習アーキテクチャを作成するために使用できる無制限のデータの可能性。（３）最初に深層学習モデルを、非常に単純なデータ（例えば、ＳＮＲが高く、アーチファクトがない）によりトレーニングし、シミュレーションされたシークエンシングエラーおよびノイズを調整して、モデルが特定のタイプの信号アーチファクトの検出にどのように適しているか、あるいは適していないかを評価する機能。（４）いくつかの深層学習モデルをシミュレーションデータ上で事前にトレーニングし、その後、実際のデータでトレーニングしてネットワークの重みを微調整する可能性。しかしながら、シミュレートされたデータは、実際のデータが大量に利用可能になる前に、大規模でエラーの多いデータを処理するモデルおよび機能を探索するための単なるツールおよび代替であることを理解されたい。
【０１６７】
図２５〜図３４は、シミュレートされたトレースを生成するための実施形態をさらに詳細に示す。図２５を特に参照すると、実際のトレースの４００フレームのセグメントが示されており、何らかの類似した特性を生成できることが望ましい（正確な塩基が取り込まれている必要はないが）。シミュレートされたデータを生成するために、様々な信号特性を記述する分布が使用され得、例えば、実際のＳＰＡＤデータから適合され得る。図２６および図２７は、それぞれ、バックグラウンドを差し引いた時間ビンの比率および塩基強度（ベースラインを超える比率としての）の適合分布の例である。図２８のプロットからわかるように、これらの２つの分布を交差させることにより、４つの塩基間の良好な区別が提供される。しかしながら、特定のレベルのＳＮＲが与えられた場合、ＡとＣの間にいくらかの重複が存在し得る。
【０１６８】
これらの分布および他の分布を使用して、信号の要素を重ねることでトレースが構築され得る。最初は、システムノイズ（ポアソンノイズとしても知られる）が考慮される。これは、塩基取り込みイベントの有無に関係なく、デバイスセンサによって読み取られる光子を表す。４００フレームのセグメントに亘るシステムノイズの例示的なプロットを図２９に示す。さらに、時間ビンの比率に関するシステムノイズが考慮される。即ち、バックグラウンドノイズ光子は、取り込み信号からの光子と同様に、検出回路によってビン１およびビン２に分割される。しかしながら、ノイズ光子のビニングを導く特定の色素特性はない。従って、１つのアプローチは、パルスイベントの外側で分布を時間ビンの比率（ビン２／（ビン１＋ビン２））に適合させ、この分布からランダムに引き出して、トレースの長さに亘って時間ビンの比率をシミュレートすることである。４００フレームのセグメントに亘るシステムノイズのこの時間ビニングの例示的なプロットが図３０に示される。図２９のプロットにおけるノイズの強度および図３０のプロットにおける時間ビンの比率が与えられると、図３１のプロットに示すように、システムノイズは、そのビン１およびビン２の成分に分割される。
【０１６９】
ノイズがない場合、各塩基取り込みは、理想的には、本質的に方形波信号を生成すべきである。シミュレートされたトレースについては、所与のテンプレート上のランダムな開始位置で、塩基決定を生成する。次に、パルスの持続時間および時間ビンの比率、ならびにパルス間の持続時間が、実際のデータへの適合分布に基づいてシミュレーションされる。図３２は、４００フレームのトレース上にランダムに配置された明瞭な塩基取り込み信号の例示的なプロットを示す。実際のシステムでは、ノイズと信号の両方が同時に存在し、それぞれの光子が各ビンで加算される。従って、ベースラインノイズ以外のアーチファクトがない「明瞭な」トレースは、信号およびノイズのトレースを単純に加算したものとなる。図３３は、図３２のランダムな明瞭な信号トレースを図３１のベースラインノイズプロットに加算することによって生成された例示的なシミュレートされたトレースを示す。
【０１７０】
図２５の実際のデータトレースと比較すると、図３３のシミュレートされたデータトレースは良好に比較され、明瞭なデータが必要とされる場合、モデル構築目的に有益である。一方、特定のシークエンシングアーチファクトの存在下で学習できることも望ましい。シミュレートされ得るこのようなアーチファクトの例は、必ずしもこれらに限定されないが、暗色色素（消失または半強度パルスにつながる）、融合パルス（パルス間でベースラインへの復帰なし）、点滅パルス（パルスは途中で中断され、その後再開される）、ベースラインジャンプ（例えば、色素付着による）、レーザードリフト（ベースラインの漸増／漸減）を含み得る。これらのアーチファクトの一部は加算的なもの（例えば、ベースラインジャンプ）であり得るが、他のアーチファクトは乗算的なもの（例えば、レーザードリフト）であり得る。さらに説明すると、図３４は、誇張されたレベルに適用された上記の各アーチファクトを有するシミュレーショントレースの別のセグメントを示す。しかしながら、予測可能なアーチファクトの領域で動作するモデルの性能をテストするには、一度に１つまたは２つのアーチファクトのみを追加する方が実用的である。
【０１７１】
上記したように、ＣＴＣ損失関数を使用して最適化された深層学習モデルをトレーニングする利点の１つは、パルス決定ステップを排除し、生のトレースから直接塩基を予測することができることである。さらに、このようなパラダイムにより、モデルの入力および出力のサイズを変化させることができ、これにより、トレースのウィンドウおよび塩基の対応するウィンドウのアルゴリズム例を提供することができる。塩基のウィンドウを提供することで、標識付けの精度が向上する。さらに、モデルがトレースのウィンドウおよび塩基の対応するウィンドウのいくつかの例にさらされた後、モデルは、パルスおよび塩基決定を同時に最適化することによって、パルスおよび塩基決定方法を学習する。即ち、モデルは、塩基を決定するときにパルスの特性を考慮するのに加えて、パルスを決定するかどうかを決定するときに塩基の特性を考慮し得る。このアプローチを１つのステップにまとめることにより、アルゴリズムは、パルス決定を必要とせずに、複数のＡ、複数のＴ、複数のＣ、および複数のＧを信号内で直接発見する機能を有する。パルスを決定することを決定する際に使用され得る塩基の特性の１つのタイプは、時間ビンの光子数の比率を含み得る。例えば、ポテンシャルパルスが、特定の塩基（例えば、Ａ、Ｃ、Ｔ、Ｇ）に関して観測された時間ビン光子数の比率と同様の時間ビン光子数の比率を有する場合、ポテンシャルパルスは、特定の塩基であるとしてモデルによって識別され得る。しかしながら、ポテンシャルパルスが、特定の塩基に関して観測された時間ビン光子数の比率と異なるかまたは一致しない場合、モデルは、ポテンシャルパルスを拒絶し得る。
【０１７２】
一体型パルス／塩基決定器のさらに他の利点は、モデルが、２段階のパルス決定器および塩基決定器では困難である場合をより簡単に識別できることである。例えば、図３５は、「融合」パルスを有する生のセンサトレースデータを示し、図３６は、ＣＴＣベースのモデルを使用して、図３５のデータから塩基を直接決定するための対応する確率分布（０＝Ａ、１＝Ｃ、２＝Ｇ、３＝Ｔ、４＝塩基なし）である。図３５からわかるように、最後の２つのパルス３５０２、３５０４は、共に融合しているように見え、この場合、独立したパルス決定器が処理する（例えば、イベント全体を単一のパルスとして決定する）ことは困難であろう。しかしながら、この一見融合したように見えるパルスの２つの個別のパルス３５０２、３５０４は、全く異なる時間ビン１および時間ビン２の特性を有するため（時間ビン１は第１のパルス３５０２でより低く、第２のパルス３５０４でより高い）、一体型パルス／塩基決定器は、これを２つの別個のパルスとして（例えば、異なる塩基における図３６の確率分布における２つのスパイクとして）区別することができる。従って、モデルは、塩基の特性を使用してパルスを決定する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本明細書で説明される技術は、１つまたは複数のコンピューティングデバイスを使用して実行され得る。しかしながら、実施形態は、特定のタイプのコンピューティングデバイスによる動作に限定されない。さらなる例として、図３７は、例示的なコンピューティングデバイス３７００のブロック図である。コンピューティングデバイス３７００は、１つまたは複数のプロセッサ３７０２および１つまたは複数の有形の非一時的なコンピュータ可読記憶媒体（例えば、メモリ３７０４）を含み得る。メモリ３７０４は、有形の非一時的なコンピュータ記録可能媒体に、実行時に上記の機能のいずれかを実施するコンピュータプログラム命令を格納し得る。プロセッサ３７０２は、メモリ３７０４に接続され、そのようなコンピュータプログラム命令を実行して、機能を実現および実行させる。
【０１７４】
コンピューティングデバイス３７００はまた、コンピューティングデバイスが他のコンピューティングデバイスと（例えば、ネットワークを介して）通信することができるネットワーク入力／出力（Ｉ／Ｏ）インタフェース３７０６を含み、かつ、１つまたは複数のユーザＩ／Ｏインタフェース３７０８も含み、コンピューティングデバイスは、１つまたは複数のユーザＩ／Ｏインタフェース３７０８を介してユーザに出力を提供し、かつユーザから入力を受信する。ユーザＩ／Ｏインタフェースは、キーボード、マウス、マイクロフォン、ディスプレイデバイス（例えば、モニタまたはタッチスクリーン）、スピーカ、カメラ、および／または他の様々なタイプのＩ／Ｏデバイスなどのデバイスを含み得る。
【０１７５】
上述した実施形態は、多くの方法で実施することができる。例えば、実施形態は、ハードウェア、ソフトウェア、又はそれらの組み合わせを用いて実施し得る。ソフトウェアで実施する場合、ソフトウェアコードは、単一のコンピューティングデバイスで提供されるか、複数のコンピューティングデバイスに分散されるかに関係なく、任意の適切なプロセッサ（例えば、マイクロプロセッサ）またはプロセッサの集合上で実行することができる。上述した機能を実行する任意の構成要素又は構成要素の集合は、上述の機能を制御する１つまたは複数のコントローラとして一般的に考えられることを理解されたい。１つまたは複数のコントローラは、専用ハードウェア、またはマイクロコードまたはソフトウェアを使用して上記の機能を実行するようにプログラムされた汎用ハードウェア（例えば、１つまたは複数のプロセッサ）など、様々な方法で実施することができる。
【０１７６】
この点に関して、本明細書で説明される実施形態の１つの実施は、１つまたは複数のプロセッサ上での実行時に、１つまたは複数の実施形態の上記の機能を実行するコンピュータプログラム（即ち、複数の実行可能な命令）がエンコードされた少なくとも１つのコンピュータ可読記憶媒体（例えば、ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリまたは他のメモリ技術、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタル多用途ディスク（ＤＶＤ）、または他の光ディスクストレージ、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスクストレージまたは他の磁気ストレージデバイス、または他の有形の非一時的なコンピュータ可読記憶媒体）を含むことを理解されたい。コンピュータ可読媒体は、本明細書で説明される技術の態様を実施するために、記憶されているプログラムが任意のコンピューティングデバイスにロードできるように移送可能である。加えて、実行時に、上述した機能の任意の１つを実行するコンピュータプログラムの参照は、ホストコンピュータ上で動作するアプリケーションプログラムに限定されないことを理解されたい。むしろ、コンピュータプログラムおよびソフトウェアという用語は、本明細書では一般的な意味で使用され、１つまたは複数のプロセッサをプログラムして本明細書で説明する技術の態様を実施するために使用することができる任意のタイプのコンピュータコード（例えば、アプリケーションソフトウェア、ファームウェア、マイクロコード、または他の形式のコンピュータ命令）を指す。
【０１７７】
本明細書で説明される技術の様々な態様は、単独で、組み合わせて、または前述の実施形態において具体的に開示されていない様々な構成で使用することができ、従って、その用途において、上述の説明または図面に示されている構成要素の詳細および構成に限定されない。例えば、一実施形態で説明された態様は、別の実施形態で説明された態様と任意の方法で組み合わせることができる。
【０１７８】
また、本明細書で説明される技術は、方法として具現化されてもよく、その例は、図２、１１、１５、１８、２２、および３９Ａ〜Ｂを参照して含んで上記したように提供される。方法の一部として実行される処理は、任意の適切な方法で順序が付けられてもよい。従って、実施形態は、例示的な実施形態では逐次的な工程として示されているが、図示されている順序とは異なる順序で工程を実施すること、及びいくつかの工程を同時に実施することも可能である。
【０１７９】
請求項の要素を修飾するために、請求項に「第１」、「第２」、「第３」等の順序を示す用語が使用されているが、これは、請求項のある１つの要素の優先度や、先行性や、順序を示すか、又はある方法を実施する時間的な順序を示すものではなく、単なる標識として同じ名前を有する（が序数を使用する）他の要素からある名前を有する別の請求項の要素を区別するために使用されている。
【０１８０】
また、本明細書で使用されている言い回しや用語は、説明を目的としたものであり、限定的なものと見なすべきではない。本明細書における「含む」、「備える」、または「有する」、「含有する」、「含む」、およびそれらの変形の使用は、その後に列挙される項目およびその均等物ならびに追加の項目を包含することを意味する。
【０１８１】
特許請求の範囲および上記の明細書では、「備える」、「含む」、「運ぶ」、「有する」、「含有する」、「関与する」、「保持する」、「構成する」などの全ての移行句等は、制限のないものとして、すなわち、限定することなく含むことを意味すると理解されるべきである。「からなる」および「本質的にからなる」という移行句のみが、それぞれクローズドまたはセミクローズド移行句とする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【図４０】
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【図４１】
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【国際調査報告】
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