(57)【要約】  本明細書に記載されているものは、オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）をコードする単離された核酸断片に関し、オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）のヌクレオチド配列およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドはキラルアリールスルフィドに対する活性を有する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）をコードする単離された核酸断片およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）をコードする単離された核酸断片であって、前記オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）のヌクレオチド配列および前記レダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが一緒にキラルアリールスルフィドに対する活性を有し、
ａ）配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列および配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列を含んでなる核酸断片、
ｂ）配列番号１に相補的な配列を含んでなる核酸断片および配列番号２に相補的な配列を含んでなる核酸断片、
ｃ）ａ）の前記核酸断片またはｂ）の前記相補体に特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる核酸断片
の群から選択される、単離された核酸断片。
【請求項２】
前記オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）のヌクレオチド配列および前記レダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが一緒に活性を有する前記キラルアリールスルフィドが、式Ｉ： 
【化１】
2021503287.tif 000008
〔式中、ＸはＣまたはＮであり、
ＸがＮの場合、Ｒ１は存在せず、
ＸがＣの場合、Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６Ｏ−アルキルからなる群より選択され、
ｎは０または１であり、
Ｒ２はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ３はハロゲンまたはＨである〕
のアリールスルフィドである、請求項１に記載の単離された核酸断片。
【請求項３】
前記オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）のヌクレオチド配列および前記レダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが一緒に活性を有する前記キラルアリールスルフィドが、式Ｉ： 
【化２】
2021503287.tif 000009
〔式中、ＸはＮであり、
Ｒ１は存在せず、
ｎは１であり、
Ｒ２はＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３はハロゲンまたはＨである〕
のアリールスルフィドである、請求項２に記載の単離された核酸断片。
【請求項４】
請求項１に記載の単離された核酸断片を含んでなる組換え発現ベクターであって、
ａ）請求項１に記載の単離された核酸断片、および配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列を含んでなるｌａｃリプレッサーを含んでなる組換え発現ベクター、
ｂ）配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列を含んでなる組換え発現ベクター、
ｃ）配列番号４に相補的な配列を含んでなる組換え発現ベクター、
ｄ）ｂ）の前記核酸断片またはｃ）の前記相補体に特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる組換え発現ベクター
の群から選択される、組換え発現ベクター。
【請求項５】
前記オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）のヌクレオチド配列が、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性をもつポリペプチドをコードし、前記レダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）のヌクレオチド配列が、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性をもつポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離された核酸断片。
【請求項６】
前記オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）のヌクレオチド配列が配列番号５のポリペプチドをコードし、前記レダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）のヌクレオチド配列が配列番号６のポリペプチドをコードする、請求項１に記載の単離された核酸断片。
【請求項７】
式Ｉ： 
【化３】
2021503287.tif 000010
〔式中、ＸはＣまたはＮであり、
ＸがＮの場合、Ｒ１は存在せず、
ＸがＣの場合、Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルキル、またはＣ１−Ｃ６Ｏ−アルキルからなる群より選択され、
ｎは０または１であり、
Ｒ２はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ３はハロゲンまたはＨである〕
の化合物のＳ−スルフィニル−エナンチオマーへのエナンチオ選択的酸化のための、
請求項５に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）と請求項５に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とをあわせた使用、または
請求項５に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）と請求項６に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とをあわせた使用、または
請求項６に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）と請求項５に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とをあわせた使用、または
請求項６に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）と請求項６に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とをあわせた使用。
【請求項８】
２−クロロ−４−（メチルスルファニルメチル）ピリジンの２−クロロ−４−（（メチル−Ｓ−スルフィニル）メチル）ピリジンへのエナンチオ選択的酸化のための、請求項７に記載の使用。
【請求項９】
式Ｉの化合物のＳ−スルフィニル−エナンチオマーへのエナンチオ選択的酸化のための方法であって、
・式Ｉの化合物を用意すること、
・請求項５または６に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）と請求項５または６に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とを、ポリペプチドとして用意すること、
・式Ｉの化合物を、前記ポリペプチドと、ｐＨが５〜９の範囲、温度が１５〜４０℃の範囲で２〜４８時間反応させること
を含んでなる、方法。
【請求項１０】
請求項５または６に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）および請求項５または６に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）が、細胞培養培地中に用意された組換え細胞内で発現され、前記細胞が所定の細胞密度に達すると、前記式Ｉの化合物が前記細胞培養培地に直接加えられ、生成物が前記細胞培養培地に蓄積する、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
式Ｉの化合物が、請求項４に記載のポリペプチドの変換速度より低い濃度で、連続してまたは一定の時間間隔で加えられる、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
９５％より大きいｅｅ値をもつ酸化された式Ｉの化合物のＳ−エナンチオマーを形成するための、請求項１０または１１に記載の方法の使用。
【請求項１３】
酸化された式Ｉの化合物のＳ−エナンチオマーを１０〜６０ｇ／ｌ×時の速度で供給するための、請求項１０〜１２に記載の方法の使用。
【発明の詳細な説明】
【発明の背景】
【０００１】
キラルスルホキシドは、ビルディングブロック、キラル補助剤または活性医薬品成分として使用できる可能性を秘めている。それらのキラルである性質と、一部のエナンチオマー（例えばエソメプラゾール）は効力がその対掌体よりも高いという事実のために、不斉合成が必要である。例えばこれは、エナンチオマーの分取分離によって達成することができる。しかし、この合成経路は時間がかかり、より高い収率が望ましいことになる。
【発明の概要】
【０００２】
したがって、本発明の目的は、スルホキシドの純粋なエナンチオマーを提供するための、より効率的でかつより費用効果の高い代替方法を考案することであった。
【０００３】
本発明は、この目的を、オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）をコードする単離された核酸断片およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）をコードする単離された核酸断片を提供することによって達成するものであり、オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）のヌクレオチド配列およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドは一緒になってキラルアリールスルフィドに対する活性を有し、前記核酸断片は、
ａ）配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列および配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列を含んでなる核酸断片、
ｂ）配列番号１に相補的な配列を含んでなる核酸断片および配列番号２に相補的な配列を含んでなる核酸断片、
ｃ）ａ）の前記核酸断片またはｂ）の前記相補体（complementary）に特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる核酸断片
の群から選択される。
【０００４】
驚くべきことに、本明細書に記載の単離された核酸断片によってコードされるオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）は、一緒に、高い活性および高いエナンチオマー過剰率での、ヘテロ芳香族スルフィドなどのキラルアリールスルフィドにおけるスルホキシド形成、すなわちスルフィドの酸化を触媒することが見出された。
【０００５】
理論に縛られることを望むものではないが、本明細書に記載の単離された核酸断片によってコードされるオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）はスチレンモノオキシゲナーゼにあたると考えられる。
【発明の具体的説明】
【０００６】
本明細書で使用される場合、「スチレンモノオキシゲナーゼ」（「ＳＭＯ」と同義に使用される）という用語は、Ｅ１−Ｔｙｐモノオキシゲナーゼの群に属し、補因子としてＦＡＤに依存する酵素を指す。スチレンモノオキシゲナーゼ（ＳＭＯ）は、スチレンのビニル側鎖のスチレンオキシドへの選択的酸素添加を行う、またはインドールを酸化する酵素のクラスであると考えられている（Sadauskas et al. 2017）。これまでに報告されているほとんどのＳＭＯと同様に、本明細書に記載のポリペプチドも２つの構成要素の系を形成する。その２つの構成要素は、単一のオキシダーゼと単一のＦＡＤレダクターゼであり２つの別個の遺伝子、ＳｔｙＡとＳｔｙＢによってそれぞれコードされている。レダクターゼ（ＳｔｙＢ）はＮＡＤＨのみを用いてＦＡＤ補因子を還元し、オキシダーゼ（ＳｔｙＡ）がそれを利用して分子状酸素を活性化して酸化を触媒する。
【０００７】
本発明の発明者らは、２つの構成要素のＳＭＯ、すなわち本明細書に記載のポリペプチドを使用する生産規模での合成に十分に効率的に、エナンチオマー的に十分に純粋であり、かつ好適な量で、キラルアリールスルホキシド、すなわちこの場合は式Ｉによる酸化化合物のＳ−エナンチオマーのみを生成できることを初めて示した。他の生物のスチレンモノオキシゲナーゼがすでに報告されているが（Tischler et al. 2009、Tischler et al. 2012）、これは事実である。
【０００８】
「含んでなる」という用語は、記載された部品、ステップまたは構成要素の存在を特定すると解釈されるべきであるが、１つまたは複数の追加の部品、ステップまたは構成要素の存在を除外するものではない。
【０００９】
単数形の単語に言及する場合、複数形も包含されることが理解される。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による要素への言及は、文脈がたった１つの要素が存在することを明確に要求しない限り、１つより多い要素が存在する可能性を排除しない。したがって、不定冠詞「ａ」や「ａｎ」は通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００１０】
一般に触媒およびプロセス効率を決定するパラメーターを図８に示す。
【００１１】
ホールセルの酵素活性を測定する一般的な単位はＵ／ｇｃｄｗであり、ここでＵは単位、すなわちμｍｏｌ／分を表す。言い換えると、生体触媒が１Ｕの活性をもつ場合、１分間に１μｍｏｌの生成物を生成する。本明細書で使用される場合、酵素活性の単位は、使用されるバイオマス、すなわちグラム細胞乾燥重量（ｇｃｄｗ）を指す。したがって、４５０Ｕ／ｇｃｄｗの値は、１グラムの乾燥細胞が（細胞がまだ生きていたときに）４５０μｍｏｌ／分の反応を触媒し、したがって１分毎に４５０μｍｏｌ／分の生成物を生成したことを意味する。
【００１２】
基質変換、生成物の生成、エナンチオマー過剰率（ｅｅ）、空時収率（ＳＴＹ）のパラメーターを用いて、所与の酵素の適合性を確実に断定することができる。本明細書で使用される場合、「空時収率」という用語は、例えば、定められた時間内に培養容器中で培養された所与の量の細胞によって生成された収量を指す。例えば、下記の実施された実験で見られた空時収率は、２，３時間で約７０ｇ／ｌであった。
【００１３】
本明細書で使用される「オキシゲナーゼ」という用語は、酸素分子を基質に移動させることによって基質を酸化する酵素を指す。
【００１４】
本明細書で使用される「レダクターゼ」という用語は、電子をオキシゲナーゼに伝達する酵素を指す。
【００１５】
「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ（ｃＤＮＡおよび／もしくはゲノムＤＮＡ）、ＲＮＡ（好ましくはｍＲＮＡ）、ＰＮＡ、ＬＮＡならびに／またはモルホリノを含んでなる任意の一本鎖または二本鎖核酸分子を示すことを意図する。
【００１６】
本明細書で使用される場合、「核酸断片」という用語は、単離された核酸分子を指す。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「遺伝子」という用語は、細胞中のＲＮＡ分子に（例えばイントロン配列を含まないｍＲＮＡに直接）転写され、ポリペプチドの発現を調節できる調節領域に作動可能に連結された領域（転写領域）を含んでなるヌクレオチドからなるＤＮＡ配列を意味する。したがって、遺伝子は、非翻訳調節領域（例えばプロモーター、エンハンサー、リプレッサー）、例えば翻訳開始に関与する配列を含んでなる５’リーダー配列、（タンパク質）コード領域（ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）および例えば転写終結部位を含んでなる３’非翻訳配列などのいくつかの作動可能に連結された配列を含んでなることができる。
【００１８】
本明細書で使用される場合、「遺伝子の発現」または「遺伝子発現」という用語は、適切な調節領域、特にプロモーターに作動可能に連結されたＤＮＡ領域（コード領域）がｍＲＮＡ分子に転写されるプロセスを指す。次いでｍＲＮＡ分子は、例えば、翻訳開始およびアミノ酸鎖（ポリペプチド）への翻訳および翻訳終止コドンによる翻訳終結によって、細胞内で（転写後のプロセスによって）さらにプロセスされる。
【００１９】
本明細書で使用される場合、「野生型（Wild type）」（「野生型（wildtype）」または「野生型（wild-type）」とも書かれる）という用語は、それが自然において最も一般的に生じるような遺伝子の典型的な形態を指す。
【００２０】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、任意のペプチド、ポリペプチド、オリゴペプチドまたはタンパク質を指す。ポリペプチドは連続したアミノ酸からなり、ペプチド結合でつながっている。ポリマーは直鎖状であっても分岐状であってもよく、修飾されたアミノ酸を含んでなってもよく、非アミノ酸によって中断されていてもよい。ポリペプチドは、ヒト、非ヒト、および対応する天然のアミノ酸、ならびに天然のアミノ酸ポリマー、および非天然のアミノ酸ポリマーの人工的または化学的模倣物でありうる。この用語はまた、自然作用または化学的修飾のいずれかによって、例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質修飾、アセチル化、アシル化、リン酸化、または、限定されないが、蛍光マーカー、粒子、ビオチン、ビーズ、タンパク質、放射性標識、化学発光タグ、生物発光標識などの標識成分との結合などの他の操作によって改変されたアミノ酸ポリマーを包含する。
【００２１】
本明細書で使用される場合、パーセンテージとして表される、２つの関連するヌクレオチドまたはアミノ酸配列の「配列同一性」という用語は、比較される位置の数で割られた、同一の残基を有する２つの最適にアラインメントされた配列における位置の数（×１００）を指す。ギャップ、すなわち、残基が一方の配列には存在するが他方には存在しない位置は、同一でない残基をもつ位置とみなされる。２つの配列の「最適アラインメント」は、２つの配列を全長にわたってアラインメンすることによって見いだされる。言い換えれば、２つの同一の配列がアラインメントされた場合、配列同一性値は１００％である。
【００２２】
ヌクレオチドまたはアミノ酸残基のアラインメントされた配列は、典型的には、マトリクス内の行として表される。同一または類似の文字が連続する列にアラインメントされるように、ギャップが残基間に挿入される。
【００２３】
配列同一性を決定するために、欧州分子生物学オープンソフトウェアスイート（The European Molecular Biology Open Software Suite）（EMBOSS, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16(6): 276-277、例えばhttp://www.ebi.ac.uk/emboss/align/index.htmlを参照）のＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズム（Needleman and Wunsch, 1970, J Mol Biol 48(3):443-53）を、デフォルト設定（ギャップ開始ペナルティー＝１０（ヌクレオチドの場合）／１０（タンパク質の場合）およびギャップ伸長ペナルティー＝０．５（ヌクレオチドの場合）／０．５（タンパク質の場合））を用いて使用することができる。ヌクレオチドについては、使用されるデフォルトのスコアリングマトリックスはＥＤＮＡＦＵＬＬであり、タンパク質については、デフォルトのスコアリングマトリックスはＥＢＬＯＳＵＭ６２である。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「エナンチオマー」という用語は、重ね合わせることができない（同一でない）互いの鏡像である所与の分子の２つの立体異性体のうちの１つを指す。化合物中の単一のキラルな原子または類似の構造上の特徴によって、その化合物は、重ね合わせ不可で、それぞれが他方の鏡像である２つの考えられる構造を有するようになる。
【００２５】
キラリティーはいくつかの分子とイオンの幾何学的性質である。キラルな分子はその鏡像と重ね合わせることができない。不斉炭素中心の存在は、有機および無機分子にキラリティーを誘起するいくつかの構造的特徴の一つである。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「ラセミ体」または「ラセミ基質」という用語は、キラル分子の２つの立体異性体の混合物を指す。たいていの場合、ラセミ体はキラル分子の２つの立体異性体の量が等しい。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「相補的」という用語は、互いに特異的な相互作用を形成できる２つの核酸分子を指す。特異的相互作用では、２本の核酸鎖が反対の方向性に（in opposing polarities）あるとき、核酸の１本の鎖内のアデニン塩基は、第２の核酸鎖内のチミンと２つの水素結合を形成することができる。また、特異的相互作用では、２本の核酸鎖が反対の方向性にあるとき、核酸の１本の鎖内のグアニン塩基は、第２の核酸鎖内のシトシンと３つの水素結合を形成することができる。本明細書で言及される相補的核酸は、修飾された塩基をさらに含んでなることができ、修飾されたアデニンはチミンまたは修飾されたチミンと水素結合を形成することができ、修飾されたシトシンはグアニンまたは修飾されたグアニンと水素結合を形成することができる。
【００２８】
本明細書で使用される場合、「特異的にハイブリダイズする」という用語は、７％ＳＤＳ、１ｍＭ  ＥＤＴＡおよび１００ｍｇ／ｍｌのサケ精子ＤＮＡを含有するｐＨ７．２の０．５Ｍリン酸ナトリウムバッファーを含有するハイブリダイゼーション溶液中での、６５℃で１６時間の、問題の核酸配列の反応、ならびに９．５×ＳＳＣおよび０．１％ＳＤＳを含有する洗浄溶液中で６５℃にて２０分間２回洗浄することを指す。
【００２９】
本明細書で使用される場合、「エナンチオマー過剰率」または「ｅｅ値」という用語は、キラル物質の純度の尺度を指す。これは、試料が一方のエナンチオマーを他方のエナンチオマーよりも多量に含む程度を反映する。ｅｅ値は、試料中の両エナンチオマーの質量に基づいて、次式に従って計算される。ｅｅ＝（エナンチオマー１の質量−エナンチオマー２の質量）／（エナンチオマー１の質量＋エナンチオマー２の質量）＊１００。この例では、エナンチオマー１が目的とするエナンチオマーである。例えば、エナンチオマー１が７０ｇで、エナンチオマー２が３０ｇの試料のｅｅは４０％である。ラセミ混合物のｅｅは０％であり、一方で単一の完全に純粋なエナンチオマーのｅｅは１００％である。
【００３０】
ｅｅ値を決定する方法は当該技術分野で公知である。ｅｅ値は、例えば、それぞれキラルカラムを備えたガスまたは液体クロマトグラフィー装置を用いて測定することができる。
【００３１】
本酵素が選択的に反応を触媒する間に所与の生成物のＳ−エナンチオマーまたはＲ−エナンチオマーを生成するという事実に言及するとき、不斉反応およびエナンチオ選択性という用語が使用されうる。言い換えれば、選択的触媒作用によって、Ｒ−エナンチオマーまたはＳ−エナンチオマーのいずれかのエナンチオマー過剰が酵素の優先傾向（preference）に応じて生じる。
【００３２】
本明細書で使用される場合、「キラルアリールスルフィド」という用語は、アリール、すなわち芳香族炭化水素から誘導される官能基およびチオエーテルを含んでなるキラル化合物を指す。
【００３３】
いくつかの実施態様では、キラルアリールスルフィドは式Ｉ： 
【化１】
2021503287.tif 000002
〔式中、ＸはＣまたはＮであり、
ＸがＮの場合、Ｒ１は存在せず、
ＸがＣの場合、Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６Ｏ−アルキルからなる群より選択され、
ｎは０または１であり、
Ｒ２はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ３はハロゲンまたはＨである〕
の化合物である。
【００３４】
ハロゲンを含んでなる酸化されたアリールスルフィドのＳ−エナンチオマーが、酵素を用いた生産規模での合成に、十分に効率的に、エナンチオマーとして十分に純粋で、かつ適した量で生成できるという事実は、発明者らの知る限り、これまで示されていなかった。
【００３５】
いくつかの実施態様では、キラルアリールスルフィドは式Ｉ： 
【化２】
2021503287.tif 000003
〔式中、ＸはＮであり、
Ｒ１は存在せず、
ｎは１であり、
Ｒ２はＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３はハロゲンである〕
の化合物である。
【００３６】
オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）をコードする単離された核酸断片であって、オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）のヌクレオチド配列およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）のヌクレオチド配列によってコードされるポリペプチドが一緒にキラルアリールスルフィドに対する活性を有する単離された核酸断片の好ましい実施態様では、前記核酸断片は、
ａ）配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列および配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列を含んでなる核酸断片
ｂ）配列番号１に相補的な配列を含んでなる核酸断片および配列番号２に相補的な配列を含んでなる核酸断片、
ｃ）ａ）の前記核酸断片またはｂ）の前記相補体に特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる核酸断片
の群から選択される。
【００３７】
配列番号１と配列同一性をもつヌクレオチド配列を含んでなる核酸断片は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有し、
配列番号２と配列同一性をもつヌクレオチド配列を含んでなる核酸断片は、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【００３８】
更なる好ましい実施態様では、本明細書に記載の単離された核酸断片は、
ａ）配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列および配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列、または
ｂ）配列番号１に相補的な配列を含んでなる核酸断片および配列番号２に相補的な配列を含んでなる核酸断片、または
ｃ）ａ）の前記核酸断片もしくはｂ）の前記相補体に特異的にハイブリダイズする配列からなる核酸断片
からなる。
【００３９】
好ましいのは、
ａ）配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列および配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列、または
ｂ）配列番号１に相補的な配列を含んでなる核酸断片および配列番号２に相補的な配列を含んでなる核酸断片、または
ｃ）ａ）の前記核酸断片もしくはｂ）の前記相補体に特異的にハイブリダイズする配列からなる核酸断片
からなる前記単離された核酸断片において、
配列番号１と配列同一性をもつヌクレオチド配列からなる核酸断片は、配列番号１と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有し、
配列番号２と配列同一性をもつヌクレオチド配列からなる核酸断片は、配列番号２と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性を有する。
【００４０】
更なる態様では、本明細書に記載されているものは、本明細書に記載の単離された核酸断片を含んでなる組換え発現ベクターに関し、該組換え発現ベクターは、
ａ）請求項１に記載の単離された核酸断片および配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列を含んでなるｌａｃリプレッサーを含んでなる組換え発現ベクター、
ｂ）配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性をもつヌクレオチド配列を含んでなる組換え発現ベクター、
ｃ）配列番号４に相補的な配列を含んでなる組換え発現ベクター、
ｄ）ｂ）の前記核酸断片またはｃ）の前記相補体に特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる組換え発現ベクター
の群から選択される。
【００４１】
驚くべきことに、本明細書に記載の単離された核酸断片は、ｌａｃリプレッサー配列を含んでなるベクターから特に良好に発現されることが見出された。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「ベクター」または「組換え発現ベクター」または「発現ベクター」という用語は、外来の遺伝子材料を細胞に伝達するために使用される分子媒体を指す。ベクター自体は、一般に、挿入断片（目的の配列）とベクターの「骨格」として機能するより大きな配列からなるＤＮＡ配列である。別の細胞に遺伝情報を伝達するためのベクターの目的は、典型的には、標的細胞中の挿入断片を単離、増殖、または発現することである。
【００４３】
遺伝子発現のために１つの発現ベクターを使用する代わりに、２つ以上の発現ベクターを使用できること、または所与の宿主細胞において発現される単離された核酸断片を前記細胞のゲノムに挿入できることが当技術分野で公知である。さらに、これらの方法の組み合わせを使用することができる。
【００４４】
更なる好ましい実施態様では、本明細書に記載の単離された核酸断片を含んでなる組換え発現ベクターは、
ａ）本明細書に記載の単離された核酸断片および配列番号３と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性をもつヌクレオチド配列を含んでなるｌａｃリプレッサーを含んでなる組換え発現ベクター、
ｂ）配列番号４と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性をもつヌクレオチド配列を含んでなる組換え発現ベクター、
ｃ）配列番号４に相補的な配列を含んでなる組換え発現ベクター、
ｄ）ｂ）の前記核酸断片またはｃ）の前記相補体に特異的にハイブリダイズする配列を含んでなる組換え発現ベクター
の群から選択される。
【００４５】
本明細書に記載の単離された核酸断片の好ましい実施態様では、オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）のヌクレオチド配列は、配列番号５と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性をもつポリペプチドをコードし、レダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）のヌクレオチド配列は、配列番号６と少なくとも８０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９０％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％の配列同一性、より好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、最も好ましくは１００％の配列同一性をもつポリペプチドをコードする。
【００４６】
当業者は、そのアミノ酸配列を介して本明細書で特徴づけられるポリペプチドが、異なる核酸配列によってコードされうることを認識している。これは遺伝子コードの縮重の結果である。
【００４７】
この遺伝子コードの縮重の結果、アミノ酸は１つまたは複数のコドンによってコードされうる。異なる生物では、アミノ酸をコードするコドンは異なる頻度で使われる。コーディング核酸配列のコドンを、発現される配列が組み込まれるべき生物におけるそれらの使用の頻度に適合させることは、特定の植物細胞または植物において、翻訳されたタンパク質の量の増加および／または問題のｍＲＮＡの安定性に寄与しうる。問題の宿主細胞または宿主におけるコドンの使用の頻度は、当業者によって、ある特定のコドンが、ある特定のアミノ酸をコードするために使用される頻度に関して、問題の生物の可能な限り多くのコーディング核酸配列を調べることによって決定することができる。ある特定の生物のコドンの使用の頻度は当業者に公知であり、コンピュータプログラムに実装された特別に開発されたアルゴリズム（例えば、Grote et al., 2005, Nucleic Acids Research 33, W526-W531; doi: 10.1093/nar/gki376）を用いて簡単かつ迅速に決定することができる。そのようなアルゴリズムを使用するツールは、公的にアクセス可能であり、ウェブインターフェースとして、とりわけ、ワールドワイドウェブ上で、欧州バイオインフォマティクス研究所（ＥＭＢＬ−ＥＢＩ）などのようなさまざまな機関から無料で提供されている（例えば、http://www.jcat.de、http://gcua.schoedl.de/、http://www.kazusa.or.jp/codon/、http://www.entelechon.com/eng/cutanalysis.html、http://www.ebi.ac.uk/Tools/st/emboss_backtranseq/）。コーディング核酸配列のコドンを、その配列が発現されることが意図されている生物におけるそれらの使用の頻度に適合させることは、インビトロ突然変異誘発によって、または好ましくは遺伝子配列の新規（de novo）合成によって行うことができる。核酸配列の新規合成のための方法は、当業者に公知である。新規合成は、例えば、最初に個々の核酸オリゴヌクレオチドを合成すること、これらをそれに相補的なオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせて、その結果ＤＮＡ二本鎖を形成すること、次いで所望の核酸配列が得られるように個々の二本鎖オリゴヌクレオチドを連結することによって行うことができる。ある特定の標的生物にコドンが使用される頻度の適合を含む核酸配列の新規合成は、そのサービスを提供する会社（例えばＥｕｒｏｆｉｎｓ  ＭＷＧ）に外部委託することもできる。
【００４８】
いくつかの実施態様では、上記の単離された核酸断片は、オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）のヌクレオチド配列は配列番号５のポリペプチドをコードし、レダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）のヌクレオチド配列は配列番号６のポリペプチドをコードすることを特徴とする。
【００４９】
更なる態様では、本明細書に記載されているものは、式Ｉ： 
【化３】
2021503287.tif 000004
〔式中、ＸはＣまたはＮであり、
ＸがＮの場合、Ｒ１は存在せず、
ＸがＣの場合、Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ハロゲン、ＮＨ２、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６Ｏ−アルキルからなる群より選択され、
ｎは０または１であり、
Ｒ２はＣ１−Ｃ６アルキルであり、
Ｒ３はハロゲンまたはＨである〕
の化合物のＳ−スルフィニル−エナンチオマーへのエナンチオ選択的酸化のための、本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）の、本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とあわせた使用に関する。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「アルキル」という用語は、直鎖状または分枝状、置換または非置換、飽和または不飽和の炭化水素鎖を指すが、環式炭化水素鎖は指さない。
【００５１】
好ましい実施態様では、アルキルは、直鎖状、非置換、飽和炭化水素鎖である。
【００５２】
特に好ましい実施態様では、アルキルはエチル基またはメチル基である。
【００５３】
更なる好ましい実施態様では、Ｒ１は、Ｈ、ＮＯ２、ハロゲン、Ｃ１−Ｃ６アルキルまたはＣ１−Ｃ６Ｏ−アルキルからなる群より選択される。
【００５４】
好ましくは、ハロゲンは、フッ素、臭化物または塩化物から選択される。
【００５５】
本発明の使用のいくつかの実施態様では、本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）は、本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とあわせて、式Ｉ： 
【化４】
2021503287.tif 000005
〔式中、ＸはＮであり、
Ｒ１は存在せず、
ｎは１であり、
Ｒ２はＣ１−Ｃ３アルキルであり、
Ｒ３はハロゲンである〕
の化合物のＳ−スルフィニル−エナンチオマーへのエナンチオ選択的酸化のために使用される。
【００５６】
１つの実施態様では、式Ｉの化合物は、フェニルメチルスルフィド、４−メチルフェニルメチルスルフィド、４−フルオロフェニルメチルスルフィド、４−クロロフェニルメチルスルフィド、４−ブロモフェニルメチルスルフィド、４−メトキシフェニルメチルスルフィド、４−ニトロフェニルメチルスルフィド、エチルフェニルスルフィド、ベンジルメチルスルフィド、フェニルビニルスルフィド、２−クロロ−４−（メチルスルファニルメチル）ピリジンからなる群より選択される。
【００５７】
特に好ましい実施態様では、式Ｉの化合物は２−クロロ−４−（メチルスルファニルメチル）ピリジンである。
【００５８】
いくつかの実施態様では、配列番号５と８０％の配列同一性をもつオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）は、配列番号６と８０％の配列同一性をもつレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とあわせて、上記の使用に用いられる。
【００５９】
いくつかの実施態様では、配列番号５と８０％の配列同一性をもつオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）は、配列番号６のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とあわせて、上記の使用に用いられる。
【００６０】
いくつかの実施態様では、配列番号５のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）は、配列番号６と８０％の配列同一性をもつレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とあわせて、上記の使用に用いられる。
【００６１】
いくつかの実施態様では、配列番号５のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）は、配列番号６のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とあわせて、上記の使用に用いられる。
【００６２】
更なる態様では、本明細書に記載されているものは、式Ｉの化合物のＳ−スルフィニル−エナンチオマーへのエナンチオ選択的酸化のための方法に関し、
・前記式Ｉの化合物を用意すること、
・本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）と本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）とを一緒に、ポリペプチドとして用意すること、
・式Ｉの化合物を、前記ポリペプチドと、ｐＨが５〜９、温度が１５〜４０℃で２〜４８時間反応させること
を含んでなる。
【００６３】
この方法は、酸化された式Ｉの化合物のＳ−エナンチオマーを短時間に高収率でエナンチオ選択的に生成することを可能にする（図７を参照）。言い換えれば、驚くべきことに、本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）は、本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）と一緒に、式Ｉの化合物を酸化することを通して、選択的にＳ−エナンチオマーを生成することが見出された。
【００６４】
上記のように、反応は、５〜９のｐＨおよび１５〜４０℃の温度で０．５〜４８時間、好ましくは６〜８のｐＨおよび２５〜３５℃の温度で１〜２４時間、最も好ましくは７．２のｐＨおよび３０℃の温度で１〜４時間行われる。
【００６５】
本明細書に記載の方法は、本明細書に記載のポリペプチドを、精製されたオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）と精製されたレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）の混合物として、セルフリー酵素抽出物として用意することによって、またはオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）とレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）の両方を発現するホールセルを用意することによって実施することができる。
【００６６】
本明細書に記載の方法の好ましい実施態様では、本発明の方法は、酸化された式Ｉの化合物のＳ−エナンチオマーを用意する、すなわち酸化された式Ｉの化合物の前記Ｓ−エナンチオマーを生成するステップをさらに含んでなる。
【００６７】
本明細書に記載の方法の実施態様では、本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）および本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）は、細胞培養培地中に用意された組換え細胞に発現され、式Ｉの化合物は細胞培養物に直接加えられる。
【００６８】
ホールセル生体触媒作用を用いるこの方法は、いままでに報告されたホールセル生体触媒反応の生成速度を大幅に超えて（図５を参照）、非常に大量に生成物、すなわち酸化された式Ｉの化合物のＳ−エナンチオマーが生成された（図３および図４を参照）という利点を有する。さらに、以下に示すように、ホールセル生体触媒作用系で達成された比活性および結果として得られたＳＴＹは、細胞溶解物の使用よりも数桁高かった。
【００６９】
【表１】
2021503287.tif 000006
【００７０】
本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）などの補因子依存性酵素の場合、ホールセルでの触媒反応の別の利点は、微生物の代謝が生体内で補因子を再生できることである。これは、補因子ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの化学量論的添加は経済的でないので、特に有利である。
【００７１】
ホールセルバイオプロセスは、酸化的機能付与（oxyfunctionalization）（Schrewe et al., 2013）に関して報告されているが、本発明の発明者らは、キラルアリールスルホキシド、すなわちこの場合は酸化された式Ｉの化合物のＳ−エナンチオマーのみを、ＳＭＯ、すなわち本明細書に記載のポリペプチドをホールセル生体触媒として使用して、十分に効率的に、エナンチオマー的に十分に純粋に、生産スケールでの合成に適した量で生成できることを初めて示した。
【００７２】
本明細書で使用される場合、「生体触媒作用」という用語は、酵素によって触媒される反応を指す。
【００７３】
本明細書で使用される場合、「ホールセル生体触媒作用」という用語は、生細胞によって組換え的に発現された酵素による前記細胞中の触媒作用を指す。
【００７４】
本明細書に記載のホールセル生体触媒作用を用いる方法の好ましい実施態様では、本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）および本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）は、細胞培養培地中に用意された組換え細胞内で発現され、細胞が所定の細胞密度に達すると、式Ｉの化合物は細胞培養培地に直接加えられ、生成物、すなわち酸化された式Ｉの化合物のＳ−エナンチオマーが細胞培養培地に蓄積する。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「細胞生存度（cell viability）」という用語は、所与の一連の培養条件または実験的な変形形態下で生存する培養中の細胞の能力をいう。本明細書で使用されるこの用語はまた、特定の時点での培養中の生存細胞と死細胞の総数に対する、その時点での生存細胞の割合を指す。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「細胞密度」という用語は、所与の体積の培地中に存在する細胞の数を指す。
【００７７】
当業者は、細胞生存度および細胞密度を決定する方法を知っている。細胞密度の測定の一例は、６００ｎｍの波長における試料の吸光度、すなわち光学密度を測定することによるものである。これは、液体中の細菌または他の細胞の濃度を推定するための一般的な方法である。濃度の測定は、培養細胞集団の段階、すなわち、それが誘導期にあるのか、指数期にあるのか、または静止期にあるのかを示すことができる。
【００７８】
前記態様の１つの実施態様では、使用される組換え細胞は、イーコライ（E.coli）、シュードモナス属（Pseudomonas）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、バシラス属（Bacillus）、サッカロマイセス属（Saccharomyces）、ピキア属（Pichia）、および野生型株Ａ．バイリイ（baylyi）からなる群より選択される。
【００７９】
前記態様の好ましい実施態様では、使用される組換え細胞は、ＪＭ１０１、ＭＧ１６５５およびＷ３１１０、ＤＨ５α、ＤＨ１０Ｂ、ＪＭ１０９、ＢＬ２１（ＤＥ３）からなる群より選択されるイーコライである。
【００８０】
前記態様の１つの実施態様では、本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）および本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）、すなわちＡ．バイリイ（baylyi）由来のスチレンモノオキシゲナーゼを発現する組換え細胞は、所定の細胞密度に達するまで培養され、次いで細胞は集められ、洗浄され、培養容器に戻される。したがって、そのあとの生体触媒作用は、増殖が止まった生細胞で行われる。付加的または代替的に、ＭｇＳＯ４が細胞培養培地に加えられないか、または過少のＭｇＳＯ４が加えられる。したがって、ＭｇＳＯ４が消費されると、細胞は成長を停止する。窒素、リン酸塩および／または硫黄の供給を制限することによって、他の制限を導入することができる。
【００８１】
したがって、前記態様の好ましい実施態様では、本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）および本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）を発現する組換え細胞は、細胞密度がＯＤ６００で０．５〜２に達するまで、好ましくは細胞密度がＯＤ６００で０．６に達するまで培養され、次いで細胞は集められ、洗浄され、かつ／またはＭｇ供給が制限される。
【００８２】
本明細書に記載の方法の好ましい実施態様では、式Ｉの化合物は、オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）および本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）の変換速度より低い濃度で、連続的にまたは一定の時間間隔で加えられる。
【００８３】
言い換えれば、式Ｉの化合物の濃度は、オキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）が式Ｉの化合物をプロセスできる最大速度よりも低い。したがって、式Ｉの化合物が蓄積する前に、それは既に生成物に変換される。これは、式Ｉの化合物がより高い濃度で細胞に対して毒性である場合に、特に有利である。
【００８４】
当業者は、酵素が基質をプロセスできる最大速度を決定する方法を知っており、したがって、どのくらいの基質を所与の反応に連続的にまたは所与の時間間隔で加えることができるかを知っている。抽出物および生成物の毒性を理解するために、異なる濃度の抽出物および生成物の存在下で、産生株の増殖速度を測定する。
【００８５】
例えば、本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）および本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）を用いて、イーコライ細胞中で２−クロロ−４−（メチルスルファニルメチル）ピリジンを２−クロロ−４−（（メチル−Ｓ−スルフィニル）メチル）ピリジンにエナンチオ選択的に酸化する場合、１０ｍＭを超える基質濃度が細胞の増殖を完全に阻害することが見出された。生成物の毒性は有意に低かった。
【００８６】
したがって、時間間隔ごとに加えられる抽出物の量は、抽出物の毒性および細胞の最大変換速度によって決定される。例として、総活性が４５０Ｕ／ｇｃｗｄ（細胞乾燥重量）である細胞が使用される。この活性をもつ細胞では、細胞に害を与えずに、潜在的に毒性のある抽出物を添加できる最大速度は、理論的には約４５０μｍｏｌ／分であることになる。したがって、余裕を持って、１５０Ｕ／ｇｃｄｗの変換速度に相当する供給速度が通常用いられる。しかし、供給速度は、細胞を傷つけることなく、３００Ｕ／ｇｃｄｗの活性に相当するレベルにまで上げることができる。この例の細胞の活性は、より高く最大６００Ｕ／ｇｃｄｗまでも可能であり、より低い（１５０Ｕ／ｇｃｄｗ）ことも可能である。供給速度はそれに応じて変える必要がある。
【００８７】
低い基質濃度での本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）および本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）の非常に高い活性は、式Ｉの化合物を連続的にまたは一定の時間間隔で添加可能であるための必須の条件である。
【００８８】
ホールセル生体触媒作用は、「一相系」とも呼ばれる水性媒体中で、または「二相系」とも呼ばれる水性媒体と有機媒体の組み合わせ中で行うことができる。有機媒体は、酵素または微生物によって潜在的に変換されうる多くの商業的に興味深い有機化合物の溶解性が水性媒体中での不十分であることの結果として、生体触媒作用向けに開発されてきた。しかし、水／非極性媒体二相系の利点としては、水にやや難溶の化合物の生成だけでなく、水相での毒性化合物または阻害化合物の低い濃度の維持も挙げられる。典型的な有機相は、ＤＥＨＰ：ジ（２−エチルヘキシル）フタラートまたはビス（２−エチルヘキシル）フタラート、ＤＩＮＰ（ジイソノニルフタラート）、ＤＢＰ（ジブチルフタラート）およびＤＩＢＰ（ジイソブチルフタラート）である。次の第２の相も使用することができる：中鎖および長鎖アルカン（Ｃ１０−Ｃ１６）、長鎖アルキルアルコール（Ｃ１２−Ｃ１４）、エチルオリート、ブチルオリート、ブチルステアレートなどの長鎖脂肪酸のエステル、不飽和脂肪酸のアルコール（オレイルアルコール）、長鎖脂肪酸（Ｃ１０−Ｃ１２）、オレイン酸、シリコーン油、オリーブ油およびコーン油。
【００８９】
一般に、上記のホールセル生体触媒作用をさらに最適化するための選択肢がいくつかある。
【００９０】
例えば、生体触媒反応は、本明細書に記載のポリペプチドのさらに高い発現率を示す細胞で行うことができる。このより高い発現率はより高い酵素活性をもたらし、したがってより高い収率をもたらす。これらの高収率細胞で作られる活性の高い酸素の影響から生体触媒反応を保護するために、カタラーゼ、スーパーオキシドディスムターゼまたはグルタチオンペルオキシダーゼなどの追加の解毒酵素を本明細書に記載のポリペプチドと共発現させることができる。
【００９１】
さらに、本明細書に記載のポリペプチドの相互作用および宿主細胞の代謝に依存して、寄与する酵素すべての良好なバランスの変換速度を達成するために発現レベルを適合させることも得策でありうる。
【００９２】
したがって、代替的にまたはくわえて、可溶性または揮発性生成物の場合、潜在的に毒性のある生成物を連続的に除去することによって、より高いＳＴＹが可能である。例えばこれは、細胞の保持をプラスした連続培養または樹脂への生成物の永久結合の使用によって達成することができる。揮発性生成物の場合、前記揮発性生成物は気相を介して除去することができる。
【００９３】
更なる態様では、本明細書に記載されているものは、９５％を超えるｅｅ値をもつ酸化された式Ｉの化合物のＳ−エナンチオマーを形成するための本明細書に記載の方法の使用に関する。
【００９４】
驚くべきことに、その顕著な高い活性にくわえて、本明細書に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）および本明細書に記載のレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）は、インビトロでもおよび生体内でも、例えば、９５％超および部分的に９９％超の顕著なエナンチオマー過剰率をもつ酸化された式Ｉの化合物のＳ−エナンチオマーを生成することが見出された（図６および図７を参照）。
【００９５】
これは重要な発見である。医薬品の場合に典型的には、９８％のエナンチオマー過剰率（ｅｅ）という最小エナンチオマー純度が必須の条件であり、９８％を超えるエナンチオマー比は酵素的にも化学的合成によっても得ることは難しいからである。
【００９６】
さらに、上記のように、これまでに報告されたすべてのスチレンモノオキシゲナーゼは、基質許容性が非常に限られているので、この結果は予想外でもあった。
【００９７】
前記使用の別の好ましい実施態様では、酸化された式Ｉの化合物のＳ−エナンチオマーは、１０〜６０ｇ／ｌ×時の速度で、さらにより好ましくは２０〜５０ｇ／ｌ×時の速度で、最も好ましくは３０〜４０ｇ／ｌ×時の速度で生成される。
【００９８】
前記使用の特に好ましい実施態様では、２−クロロ−４−（（メチル−Ｓ−スルフィニル）メチル）ピリジンは、２−クロロ−４−（メチルスルファニルメチル）ピリジンから３０〜４０ｇ／ｌ×時の速度でエナンチオ選択的に生成される。
【００９９】
したがって、式Ｉの化合物のＳ−エナンチオマーのみへの選択的酸化は、その高い活性と組み合わせて、本明細書に記載のポリペプチドを、キラルスルホキシドの合成における多種多様な用途に対して非常に興味深いものにする。
【０１００】
くわえて、化学合成での酵素の使用は通常、廃棄物を減少させる。
【０１０１】
まとめると、これらの発見は、本明細書に記載のポリペプチドを、生産スケールでの合成に適したものにする。
【図面の簡単な説明】
【０１０２】
【図１】図１は本発明の一実施態様の反応の模式的な概要（schematic overview）を示す。この場合、基質は４−クロロフェニルメチルスルフィドである。この基質を細胞培養液に加えると、反応が細胞内で起こり、反応生成物が細胞培養液に蓄積する。
【図２】図２は、使用されたｐＳｔｙＡＢ＿ＡＤＰ１＿ｌａｃベクターの概略図（schematic illustration）を示す。
【図３】図３は、ｐＳｔｙＡＢ＿ＡＤＰ１＿ｌａｃベクターから発現されたＡ．バイリイ由来のスチレンモノオキシゲナーゼの比活性（正方形）および微生物増殖（ひし形）を培養時間に応じて示したものである。
【図４】図４のグラフは、生成物が生体内変換の２．３時間後に６２ｇ  Ｌ−１を超える非常に高い濃度に蓄積されたことを示す。調べた時間内に基質の蓄積は見られなかった。
【図５】図５の表は、ホールセル生体触媒作用の最大比生成速度が、文献から予想されうるものよりも驚くほど大幅に高かったことを示す。
【図６】図６の表は、本明細書に記載のＡ．バイリイのスチレンモノオキシゲナーゼがインビトロでさまざまな異なる基質を変換することを示す。
【図７】図７の表は、本明細書に記載のＡ．バイリイのスチレンモノオキシゲナーゼが生体内でさまざまな異なる基質を変換することを示す。
【図８】図８は、Schrewe et al. 2013によって文献発表されたセルフリーおよびホールセルプロセスの特徴づけおよび定量化のための重要なパラメーターを示す。
【実施例】
【０１０３】
以下の実施例は例示的なものであり、限定するものではない。本質的に類似した結果を達成するために変更できるさまざまな重要でないパラメーターを当業者なら認識するであろう。
【０１０４】
１）新規スチレンモノオキシゲナーゼの同定と特性づけ
潜在的に機能的な酵素を検出するために、既知のＳＭＯおよびモノオキシゲナーゼの遺伝子配列をプロモーターおよび／またはリボソーム進入部位についてスクリーニングした。次のステップで、さまざまなＳＭＯをイーコライなどに発現させた。さらに、さまざまなＳＭＯの構造モデルを作成し、さまざまなＳＭＯを潜在的基質２−クロロ−４−（メチルスルファニルメチル）ピリジンとの活性についてスクリーニングした。驚くべきことに、本明細に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）をそれぞれコードする単離された核酸断片は、２−クロロ−４−（メチルスルフィニルメチル）ピリジンの（Ｓ）−エナンチオマーを高いエナンチオマー過剰率で生成できることが見出された。
【０１０５】
詳細には、Ａ．バイリイ由来の本明細に記載のオキシゲナーゼサブユニット（ＳｔｙＡ）およびレダクターゼサブユニット（ＳｔｙＢ）をそれぞれコードする単離された核酸断片を発現させ、下表に示される各基質を使用してキラルスルホキシドが生成されることが示された。そのために、アシネトバクター属種ＡＤＰ１由来のＳｔｙＡユニットをＩＰＴＧで誘導可能なｐＥＴベクターにクローニングし、ＬＢ培地（１０ｇ／ｌトリプトン、５ｇ／ｌ酵母エキス、１０ｇ／ｌまたは２０ｇ／ｌ  ＮａＣｌ、１００μｇ／ｍｌアンピシリン、５０μｇ／ｍｌクロラムフェニコール）で増やしたイーコライＢＬ２１  ｐＬｙｓＳで発現させた。発現のために、５ｍｌの一晩培養物を、３ｌの培地が入った発酵槽または５００ｍｌの培地が入ったフラスコの種菌として使用した。培養物がＩＰＴＧ（０．１ｍＭ）を用いた組換え遺伝子発現誘導の閾値である光学濃度０．６に達するまで、細胞を３７℃で培養した。培養を２０℃でさらに１８時間行った。この間、発現がうまくいくと、インディゴの生成により培地が青色になった。細胞を集め、フレンチプレスを用いて細胞壁を破壊した。タンパク質は細胞抽出物の可溶性部分に局在し、遠心分離（＞２００００×ｇで４５分）によって分離した。目的タンパク質を、後に続く特徴づけに向けて精製した。
【０１０６】
アシネトバクター・バイリイ（Acinetobacter baylyi）種ＡＤＰ１由来のＳｔｙＢユニットを同様に発現させた。
【０１０７】
活性を調べるために、ＳｔｙＢユニット（レダクターゼ）を過剰に使用して、ＳｔｙＡユニット（オキシゲナーゼ）に十分な還元ＦＡＤを供給した。したがって、ＮＡＤＨはそれぞれの酵素反応において、ギ酸とＮＡＤからギ酸デヒドロゲナーゼによって生成された。
【０１０８】
酵素変換速度を反応速度分析のために１５分間毎分調べた。可能であれば、すなわち可溶性であれば、２ｍＭの基質を用いた。濁っている場合は、１ｍＭの基質を用いた。基質はエタノールに溶かした。プローブ中の反応を氷冷メタノールとアセトニトリルの１：１混合物で止めた後、ＨＰＬＣを用いて分析した。
【０１０９】
抽出物および生成物は、Ａｇｉｌｅｎｔ１１００  ＨＰＬＣ装置で分析した。
【０１１０】
結果を下表に示す。
【０１１１】
【表２】
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【０１１２】
２）新規ＳＭＯを用いたホールセル生体触媒作用
生成速度をさらに増加させるために、基質が潜在的に毒性であるにもかかわらず、生細胞を用いる最小培地中でホールセル生体触媒作用を用いて、生成物、すなわち２−クロロ−４−（メチルスルフィニルメチル）ピリジンのＳ−エナンチオマーを生成することを試みた。理想的には、ゆっくり増殖する細胞または増殖しない細胞、すなわち、休止しているが代謝的に活性な細胞を使用した。エナンチオマー過剰率（ｅｅ）値をさらに高めるために、新規ベクターｐＣｏｍ１０：ｌａｃベクターを開発した。
【０１１３】
詳細には、スチレンモノオキシゲナーゼサブユニットＳｔｙＡおよびＳｔｙＢを、ｐＳｔｙＡＢ＿ＡＤＰ１＿ｌａｃベクターからＭ９最小培地で培養したイーコライＪＭ１０１に発現させた。最大比活性を見出すために、誘導物質（１ｍＭ  ＩＰＴＧ）の添加後、予め定めた時点の後に試料を採取した。活発に増殖している培養から細胞を回収し、休止細胞活性の測定に用いた。図３に示すように、比活性は、誘導の時点から着実に増加し、誘導の４．８時間後に４５０±３０Ｕ／ｇｃｄｗの最大に達した。
【０１１４】
生体内変換（biotransformation）の成功は、基質変換、生成物生成、ならびにキラルＨＰＬＣおよびＧＣによって測定したエナンチオマー過剰率（ｅｅ）に基づいて評価した。
【０１１５】
詳細には、比活性を次のように定量した。ＳｔｙＡおよびＳｔｙＢを、ｐＳｔｙＡＢ＿ＡＤＰ１＿ｌａｃベクターを保有するイーコライＪＭ１０１で発現させた。細胞をＭ９最小培地で培養し、０，６〜０，８のＯＤで誘導した。３〜５時間後に細胞を集め、ＰＰバッファーで洗浄し、グルコースが入った同じバッファーに再懸濁した。次いで７５０μｌの細胞（必要に応じて希釈）を取り、２ｍｌチューブ中で、３０℃および１５００ｒｐｍに設定したサーモミクサーでインキュベートした。細胞懸濁液を予め５分間温め、次いで１００倍濃縮イソプロパノール原液から２ｍＭの基質を加えた。所望の時点の後、４０μＬの２０％（重量／体積）過塩素酸を加えて、反応を止めた。ホールセル生体触媒はｐＨ７．４から２．０へのｐＨシフトをもたらす過塩素酸の添加により直接不活性化される。過塩素酸の添加は生成物自体に影響を及ぼさなかったが、タンパク質は直ちに沈殿し、遠心分離によって分離した。
【０１１６】
Ｃ１８マトリックス（Ａｃｃｕｃｏｒｅ  Ｃ１８、３×１５０ｍｍ、粒径２．６μｍ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を含んだ非極性ＨＰＬＣカラムを備えたＤｉｏｎｅｘ  ＵｌｔｉＭａｔｅ  ３０００  ＨＰＬＣシステム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で、生成物、すなわち２−クロロ−４−（メチルスルフィニルメチル）ピリジンのＳ−エナンチオマーの分離に成功した。オーブンを３０℃に設定し、１０ｍＭリン酸アンモニウムバッファー８０％およびＡＣＮ２０％の均一濃度で（０〜６分）、それに続いてＡＣＮ９０％への勾配（６〜１８分）で分析物を溶出した。その後、カラムを１０ｍＭリン酸アンモニウムバッファー８０％およびＡＣＮ２０％で２分間再平衡化した。それぞれの試料を２μＬ注入した。有機化合物は、２１０ｎｍの波長でダイオードアレイ検出器（ＤＡＤ）を用いて吸収によって検出した。分析標準のための試料調製を次のように行った。抽出物または生成物の１００倍濃縮イソプロパノール原液の５μＬを４９５μＬのリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４、０．１Ｍ）に加え、続いてＡＣＮおよびＭｅＯＨの１対１（体積／体積）混合物を５００μＬ加えた。混合後、試料を遠心分離し、直接ＨＰＬＣ分析に供した。
【０１１７】
次のステップでは、工業技術スケール（technical scale）での調製が行われた。
【０１１８】
より大規模に生成物を生産するために、工業技術スケールバイオリアクター（総量３Ｌ）実験を行った。このために、イーコライＪＭ１０１（ｐＳｔｙＡＢ＿ＡＤＰ１＿ｌａｃ）を、２つのＲｕｓｈｔｏｎインペラを備えた３Ｌの攪拌タンク反応器で培養した。作業量は２Ｌに設定した。細胞をＭ９最少培地にてバッチモードで一晩培養し（１２時間、１．５％（重量／体積）グルコース）、続いてグルコース制限流加段階で培養した（６時間）。１５％リン酸と２５％（体積／体積）水酸化アンモニウムで滴定してｐＨを７．２に制御した。サブユニットＳｔｙＡおよびＳｔｙＢの遺伝子発現は、制限流加段階の開始１時間後にＩＰＴＧを用いて誘導した。酢酸生成を阻止し、グルコース供給の６時間後に約２０ｇｃｄｗ  Ｌ−１の細胞密度に達するために、増殖速度を〜０．１８時１に設定した。次に、細胞を遠心分離によって集め、２Ｌの０．１Ｍリン酸カリウムバッファー（ｐＨ７．４）に再懸濁した。ホールセル生体触媒の比活性を個別の休止細胞アッセイで測定した。１．５％グルコースのみをバイオリアクターに加えて、生細胞にエネルギーを供給した。一定の抽出物の供給（〜０．８２ｇ  分−１）、すなわち抽出物（２−クロロ−４−（メチルスルファニルメチル））ピリジンの供給を５分後に開始した。この抽出物の供給は、ホールセル生体触媒の利用可能な比活性が非常に高いので添加抽出物が直ちにより毒性の低い生成物、すなわち、２−クロロ−４−（メチルスルフィニルメチル）ピリジンのＳ−エナンチオマーに変換されることを確実にした。バイオマス、生成物／基質およびグルコース／酢酸の試料を１５分毎に回収した。
【０１１９】
このアプローチは、生成物の溶解度を超えるまで、検出可能な基質の蓄積なしに効率的な生成物の生成をもたらした。
【０１２０】
図４に示すように、生成物は、２．３時間後に６２ｇ  Ｌ−１を超える驚くほどに高い濃度に蓄積し、すなわち１時間当たり３０ｇ  Ｌ−１の生体内変化であった。調べた時間内に基質の蓄積は見られなかった。上記のように生成物を分析した。
【０１２１】
３）使用可能な基質の多様性
さらに、驚くべきことに、本明細書に記載のポリペプチドは、２−クロロ−４−（メチルスルファニルメチル）ピリジンを基質として受け入れるだけでなく、優れたエナンチオ選択性でさまざまな異なる基質を変換することが見出された。対応するスルフィドからエナンチオピュアなスルホキシドを生じることがこれまで示されてきた生体触媒は、適用したアリールスルフィドに強く依存した（Rioz-Martinez et al.、2010、Adam et al., 2005）ので、活性および極めて高いｅｅ値に関して観察された本発明の生体触媒の効率は予想外であった。詳細には、図６および図７に示した結果は、特許請求の範囲に記載の酵素が、生体内変換を用いてインビトロでも生体内でも優れたエナンチオ選択性でさまざまな異なる基質を変換することを示す。
【０１２２】
参考文献
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・  Julsing MK, Kuhn D, Schmid A, Buehler B. 2012a. Resting cells of recombinant E. coli show high epoxidation yields on energy source and high sensitivity to product inhibition. Biotechnol. Bioeng. 109:1109-1119. 
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021503287.tif 000020
2021503287.tif 000021
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