(57)【要約】  本発明は、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６に対して新たな耐性を有する栽培ホウレンソウ植物、該植物の種子、細胞培養物および後代、前記耐性を有する植物の使用、ならびにそのような植物を生育および同定する方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ホウレンソウの野生近縁種であるドナーからの遺伝子移入断片を含むＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ種のホウレンソウ植物であって、前記遺伝子移入断片は単一の遺伝子を含み、ヘテロ接合型またはホモ接合型で少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６に対して耐性を付与し、かつ、前記遺伝子はヌクレオチド１０６（ＳＮＰ＿０１）にアデニンを有する配列番号１、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号１のヌクレオチド１１４に相当するヌクレオチド位置にアデニンを有する配列と連結されており、かつ／またはヌクレオチド１８４（ＳＮＰ＿０２）にシトシンを有する配列番号３、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号３のヌクレオチド１８４に相当するヌクレオチド位置にシトシンを有する配列と連結されている、前記植物。
【請求項２】
前記単一の遺伝子が、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース１０および１５に対する耐性を付与しない、請求項１に記載の植物。
【請求項３】
前記耐性遺伝子が、前記遺伝子がホモ接合型である場合にＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース１〜９、１１〜１４、１６および１７に対する耐性をさらに付与する、請求項１または２に記載の植物。
【請求項４】
前記耐性遺伝子が、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託されたホウレンソウ種子またはその後代に含まれる遺伝子である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の植物。
【請求項５】
前記ドナーがＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ種のものである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の植物。
【請求項６】
前記遺伝子移入断片が、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託されたホウレンソウ種子に含まれる断片、または前記耐性遺伝子を保持し、配列番号１および／または配列番号３をさらに保持する前記遺伝子移入断片のサブ断片である、請求項５に記載の植物。
【請求項７】
前記耐性遺伝子が、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子から生育されるホウレンソウ植物と別のホウレンソウ植物とを交雑させることにより得られる、請求項１〜６のいずれか一項に記載の植物。
【請求項８】
前記ホウレンソウ植物がハイブリッド植物であり、前記ハイブリッド植物がヘテロ接合型またはホモ接合型の前記耐性遺伝子を含むか、または前記ホウレンソウ植物がホモ接合型の前記耐性遺伝子を含む近交系植物または雄親系統または雌親系統である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の植物。
【請求項９】
前記ホウレンソウ植物が、サボイ、セミサボイ、フラットリーフもしくはスムーズリーフ、またはオリエンタルからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の植物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の植物が生育される、種子。
【請求項１１】
前記後代植物が前記耐性遺伝子を保持し、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列内の同等の位置におけるアデニンを有するＳＮＰ＿０１をさらに保持し、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列内の同等の位置におけるシトシンを有するＳＮＰ＿０２を保持する、請求項１〜９のいずれか一項に記載のホウレンソウ植物の後代植物。
【請求項１２】
前記後代植物が、自家受粉、交配、二重一倍体産生または形質転換からなる群から選択される１つ以上の方法によって産生される、請求項１１に記載の後代植物。
【請求項１３】
少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６に対する耐性を有するホウレンソウ植物を産生するための、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子またはその後代または請求項１〜９および１１〜１２のいずれか一項に記載の植物の使用。
【請求項１４】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のホウレンソウ植物または請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の後代植物の部分であって、該部分が、葉、葉の部分、茎、茎の部分、柄、柄の部分、芽、芽の部分、つぼみまたはつぼみの部分、挿し木、根、根の部分、根の先端、葉柄、葉柄の部分、子葉、子葉の部分、花、花の部分、花びら、花びらの部分、雄しべ、雄しべの部分、葯、葯の部分、花粉、柱頭、柱頭の部分、花柱、花柱の部分、子房、子房の部分、胚珠、胚珠の部分、種子、種子の部分、種皮、胚、胚の部分、胚軸、胚嚢、果実、果実の部分、細胞、プロトプラスト、カルス、小胞子、分裂組織、形成層であり、該植物の部分は、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６に対して耐性を付与する耐性遺伝子を保持し、かつ、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の相当する位置にアデニンを有するＳＮＰ＿０１、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の相当する位置にシトシンを有するＳＮＰ＿０２をさらに保持する、前記部分。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載のホウレンソウ植物または請求項１１〜１２のいずれか一項に記載の後代植物の少なくとも１つの細胞または組織を含んでなる細胞培養物または組織培養物、または請求項１４に記載の植物部分のいずれか１つからの少なくとも１つの細胞または組織を含む細胞培養物または組織培養物であって、前記細胞培養物または組織培養物は、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６に対して耐性を付与する耐性遺伝子を保持し、かつ、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の相当する位置にアデニンを有するＳＮＰ＿０１、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の相当する位置にシトシンを有するＳＮＰ＿０２をさらに保持する、前記細胞培養物または組織培養物。
【請求項１６】
請求項１５に記載の細胞培養物または組織培養物から再生されたホウレンソウ植物であって、前記植物は、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６に対して耐性を付与する耐性遺伝子を保持し、かつ、配列番号１のヌクレオチド１１４におけるアデニン、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の相当する位置にアデニンを有するＳＮＰ＿０１、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の相当する位置にシトシンを有するＳＮＰ＿０２をさらに保持する、前記ホウレンソウ植物。
【請求項１７】
ホウレンソウの野生近縁種であるドナーからの遺伝子移入断片を含むホウレンソウ植物を同定または選択する方法であって、前記遺伝子移入断片は単一の遺伝子を含み、前記遺伝子はヘテロ接合型およびホモ接合型で少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６に対して耐性を付与し、
配列番号１のヌクレオチド１０６（ＳＮＰ＿０１）のアデニンの存在、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列における配列番号１のヌクレオチド１０６に相当するヌクレオチド位置のアデニンの存在、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４（ＳＮＰ＿０２）のシトシンの存在、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列における配列番号１のヌクレオチド１８４に相当するヌクレオチド位置のシトシンの存在を決定すること
を含む、前記方法。
【請求項１８】
ホウレンソウの野生近縁種であるドナーからの遺伝子移入断片を含む栽培ホウレンソウ植物の細胞であって、前記遺伝子移入断片は単一の遺伝子を含み、前記遺伝子はヘテロ接合型およびホモ接合型で少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６に対して耐性を付与し、かつ、前記遺伝子はヌクレオチド１０６（ＳＮＰ＿０１）にアデニンを有する配列番号１、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号１のヌクレオチド１０６に相当するヌクレオチド位置にアデニンを有する配列と連結されており、かつ／またはヌクレオチド１８４（ＳＮＰ＿０２）にシトシンを有する配列番号３、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号３のヌクレオチド１８４に相当するヌクレオチド位置にシトシンを有する配列と連結されている、前記細胞。
【請求項１９】
ホウレンソウ植物または植物部分の同定における、配列番号１のＳＮＰ＿０１の使用または配列番号３のＳＮＰ＿０２の使用、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のＳＮＰ＿０１または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列のＳＮＰ＿０２の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース（race）に対して新たな耐性を有する栽培ホウレンソウ植物、該植物の種子、細胞培養物および後代、前記耐性を有する植物の使用、ならびにそのような植物を生育する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ホウレンソウ（Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ）は、Ａｍａｒａｎｔｈａｃｅａｅ科のＳｐｉｎａｃｉａ属の食用植物の一種である。それは西部および中央アジアの原産である。世界のそれらの地域では、ホウレンソウの野生近縁種であるＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａおよびＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａが見られる。
【０００３】
ホウレンソウは、世界の多くの地域で重要な野菜作物であり、ホウレンソウの生産量が最も多いのは中国（２０１２年の生産量は１９５０００００Ｍｔ）で、アメリカ、日本およびトルコがそれに続く（ＦＡＯＳＴＡＴ）。世界で約１００万ｈａのホウレンソウがアジアで栽培されており、ＥＵ、米国および日本でそれぞれ約３５０００ｈａが栽培されている（Ｃｏｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，Ｅｕｒ  Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐａｔｈｏｌ  １２９：１９３−２０５を参照されたい）。ホウレンソウの需要の増加の一部は、消費者の健康への意識の高まりとホウレンソウの有益な特性の認識によるものと考えられる。ホウレンソウの葉には、β−カロチン、ルテイン、葉酸、ビタミンＣ、カルシウム、鉄および抗酸化物質が豊富に含まれている（米国農務省国立栄養データベース）。新鮮なホウレンソウの需要は近年大幅に増加している。
【０００４】
最近の数十年にわたるこのような生産の増加により、それに付随して、ホウレンソウの最も有害な病原体の１つである、卵菌類のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ；Ｐ．  ｅｆｆｕｓａと同義語）のレースによって引き起こされるホウレンソウのべと病の発生率および重症度が増大している。１９９０年にはＰｆｓの３つのレースしか知られていなかったが、１９９０年から２０１７年の間に新たに１３のレースが確認されている。Ｐｆｓの新たなレースの出現により、この病原体はホウレンソウの生産にとって世界的に大きな脅威になっており、そのため新たな耐性の原因を特定する必要がある。
【０００５】
歴史的に、Ｐｆｓのレース１（Ｐｆｓ：０１またはＰｆｓ１）は１８２４年に最初に報告され、レース１への耐性は後に２つのイランにおける寄託（ＰＩ１４０４６７およびＰＩ１４０４６４）において確認され、Ｃａｌｉｆｌａｙ（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｚａｈａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｊｕｌｙ  １９５６）等の商業交配種に組み込まれた。１９５８年にはＰｆｓのレース２が出現し、数年後、レース１および２に耐性を付与する単一の優性遺伝子が同定された（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．１９６１  ａｎｄ  １９６２）。１９７６年にはレース３が出現し、１９９０年にはレース４が同定され、両方の株に対する耐性がすぐに見出された。その後の新たなレースの急速な出現は、さらなる新たな耐性遺伝子の同定およびそれらの商業品種への組み込み、ならびに分化苗試験等の規格化された試験の発達をもたらした（国際種子連盟−Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｐｉｎａｃｈ  Ｄｏｗｎｙ  Ｍｉｌｄｅｗ，Ｄｅｃ  ２０１５および“Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  Ｓｅｔｓ−Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ”，Ａｕｇ  ２０１６；ｗｏｒｌｄｓｅｅｄ  ｄｏｔ  ｏｒｇ／ｉｓｆ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ＿ｈｏｓｔｓ  ｄｏｔ  ｈｔｍｌのワールドワイドウェブを参照されたい）。これらの品種のいくつかは、以下の表１に示すように、Ｐｆｓの単離株のレースを決定するための判別宿主（host differential）としても使用される。
【０００６】
【表１】
2021511063.tif 000002
【０００７】
２０１６年にはべと病の新たなレースが同定された（Ｐｌａｎｔｕｍ  ｐｒｅｓｓ  ｒｅｌｅａｓｅ  Ｍａｒｃｈ  １５ｔｈ，２０１６）。単離株は、２０１５年３月に米国カリフォルニア州サリナスで最初に同定され、最初はＵＡ２０１５１９Ｂ（ＵＡ１５１９Ｂとも呼ばれる）と指定された。単離株は、標準的な一連の判別品種（differential variety）に対する試験において疾患の発生を評価され、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｗｏｒｋｉｎｇ  Ｇｒｏｕｐ  ｏｎ  Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ（ＩＷＧＰ）により、単離株が新たなレースであると判定された。同じ反応パターンの単離株が多くの場所で発生していることが明らかになり、ＩＷＧＰはそれをＰｆｓ：１６と命名した。これは、本明細書において表１として示されている標準的な判別表に追加された。
【０００８】
２０１８年に、別の新たなレースがＩＷＧＰによって、Ｐｆｓ１７（ＵＡ１０１４またはＵＳ１６０２）と命名された。また、単離株Ｐｆｓ１〜Ｐｆｓ１７を識別するために、国際種子連盟（ＩＳＦ）によって新しい判別宿主のセットが公開された。ｗｏｒｌｄｓｅｅｄ．ｏｒｇ／ｏｕｒ−ｗｏｒｋ／ｐｌａｎｔ−ｈｅａｌｔｈ／ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ−ｈｏｓｔｓ／のワールドワイドウェブで、「Ｓｐｉｎａｃｈ−ｄｏｗｎｙ−ｍｉｌｄｅｗ＿Ａｐｒｉｌ２０１８．ｐｄｆ」と呼ばれるリンク「Ｄｏｗｎｙ  Ｍｉｌｄｅｗ」のドキュメントを参照されたい）。
【０００９】
市販のホウレンソウの品種はほとんどが交配種であり、雄と雌との近交系を交配することによって生産されますが、いくつかの開放受粉させた品種も存在する。雄および雌の親系統は通常、それぞれ異なる耐性遺伝子を持っている。例えば、交配種のＡｎｄｒｏｍｅｄａ（Ｎｕｎｈｅｍｓにより交配；特許出願ＵＳ８５６３８０７を参照されたい）は、Ｐｆｓ１〜１２およびＰｆｓ１４に対して耐性である。この品種では、Ｐｆｓ１、３、５、８、９、１１、１２および１４に対する耐性が、１つの近交系の親系統からの耐性遺伝子によって付与され、Ｐｆｓ１〜１０に対する耐性が、他の近交系の親系統からの耐性遺伝子によって付与される。両方の親系統は耐性遺伝子がホモ接合型である。特に、一部の耐性遺伝子が優性でないか、かつ／または同じ遺伝子座にマッピングされており、既知の耐性遺伝子のすべてを交配種において積み重ねる（stack）ことができないため、耐性の最適な組み合わせは難題である。したがって、ホウレンソウの交配の分野では、追加の耐性遺伝子が常に望まれている。
【００１０】
ＷＯ２０１５０５４３３９には、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅに対する広範囲の耐性を付与するＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子移入された遺伝子座をゲノム中に含むＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａホウレンソウ植物」が記載されており、前記広範囲の耐性が「Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ。  ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）のレース７、１０、１１、１２、１３および１４に対する耐性、またはレース１〜１４およびＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）のＵＡ４７１２に対する耐性」（単離株ＵＡ４７１２は、後にＩＷＧＰによりＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）レース１５と命名された）を含むこと、「遺伝子移入された遺伝子座は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａのゲノム中で配列番号１または２と少なくとも９５％同一である配列に隣接して配置されることが規定されている」こと、および「Ｓ．  ｔｅｔｒａｎｄｒａからのＤＭ耐性は、公開されているマップの第６染色体上の０．０ｃＭのマーカーＥ３３／Ｍ６２−２３１と１０．３ｃＭのマーカーＥ３９／Ｍ４７−２０３との間に存在する」ことが記載されている（Ｋｈａｔｔａｋ  ｅｔ  ａｌ  ａｌ．，Ｅｕｐｈｙｔｉｃａ  １４８：３１１−３１８，２００６）。耐性付与遺伝子座に隣接して配置される、ＷＯ２０１５０５４３３９の配列番号１および２は、それぞれ配列番号４および５として本明細書に追加されている。
【００１１】
ＷＯ２０１３０６４４３６（ＥＰ２５８６２９４）には、「ホウレンソウ植物にべと病菌のレースＰｆｓ１、Ｐｆｓ２、Ｐｆｓ３、Ｐｆｓ４、Ｐｆｓ５、Ｐｆｓ６、Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１１、Ｐｆｓ１２、Ｐｆｓ１３およびＵＡ４４１０に対する耐性を付与するＲ６と命名された新たな耐性遺伝子」が記載されている（ＷＯ２０１３／０６４４３６の１９ページの表１も参照されたい；ＵＡ４４１０型株は、２０１１年以来、ＩＷＧＰによりＰｆｓ１４と指定されている）。マーカーは提供されていない。Ｒ６がＰｆｓのレース７、８および１０に対する耐性を付与することは記載されていない。
【００１２】
ＥＰ２９１２９４０（ＵＳ２０１５２４０２５６）には、「対立遺伝子Ａ、対立遺伝子Ｖｔおよび対立遺伝子Ｃからなるグループから選択される対立遺伝子の組み合わせ」によって付与されるＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａに耐性の植物・・・「対立遺伝子の組み合わせは対立遺伝子ＡおよびＣを含み、植物は少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレース７、８、１０、１１、１２、１４および単離株ＵＡ４７１２に耐性であるか；対立遺伝子の組み合わせは対立遺伝子ＡおよびＶｔを含み、植物は少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレース７、８、１０、１１、１２、１３および１４に耐性であるか；または対立遺伝子の組み合わせは対立遺伝子ＣおよびＶｔを含み、植物は少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレース７、８、１０、１１、１２、１３および単離株ＵＡ４７１２に耐性である」（下線を追加）ことが記載されている。単離株ＵＡ４７１２は、現在ではＰｆｓ１５として知られている。したがって、ＥＰ２９１２９４０に開示されている耐性は対立遺伝子の組み合わせに係るものである。
【００１３】
ＵＳ９４０２３６３には、「Ｒ１５対立遺伝子を含むホウレンソウ植物を同定する方法であって、前記対立遺伝子が少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレースＰｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、Ｐｆｓ：１３、Ｐｆｓ：１４、Ｐｆｓ：１５および単離株ＵＡ１０１４に対する耐性を付与し、かつ、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレースＰｆｓ：７に対する耐性を付与せず、前記対立遺伝子は、代表的なサンプルがＮＣＩＭＢアクセッション番号４２４６６でＮＣＩＭＢに寄託された種子から栽培された植物に見られるものである方法」、およびそのための２０ｃＭ（センチモルガン）内の４つのマーカー配列が記載されている。さらに、「・・・見出されたように、ホモ接合状態では、Ｒ１５対立遺伝子は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレースＰｆｓ：８に対する耐性、およびＰｆｓ：１０に対する少なくとも中間の耐性を付与する」。単離株ＵＡ１０１４は現在、ＩＷＧＰによって承認された番号を付与されたＰｆｓのレースではない。ＵＳ９４０２３６３には、「少なくともレースＰｆｓ：８、Ｐｆｓ：１０に対して中間の耐性を示し、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレースＰｆｓ：７に対する耐性を付与しない”ことが開示されている。Ｐｆｓ：８、Ｐｆｓ：１０に対する耐性は、以下のように機能することがさらに記載されている「対立遺伝子を付与するＲ１５耐性のホモ接合性またはヘテロ接合性の存在は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのＰｆｓ：８およびＰｆｓ：１０についての本発明の形質の発現に影響を与える」。
【００１４】
ＵＳ２０１７０１２７６４１には、「Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース１〜９、１１〜１５および単離株ＵＡ１０１４ＡＰＬＰに対する耐性を有するホウレンソウ植物」が記載されている。単離株ＵＡ１０１４ＡＰＬＰは現在、ＩＷＧＰによって承認された番号が付与されたＰｆｓのレースではない。ＵＳ２０１７０１２７６４１には、Ｐｆｓのレース１０に対する耐性は開示されていない。ＵＳ２０１７０１２７６４１には、Ｐｆｓのレース３〜５に対する耐性は開示されていない。耐性遺伝子のマーカーは開示されていない。
【００１５】
ＵＳ２０１７０１２７６４２には、「Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース１〜９、１１〜１５および単離株ＵＡ１０１４ＡＰＬＰに対する耐性を有するホウレンソウ植物」が開示されている。単離株ＵＡ１０１４ＡＰＬＰは現在、ＩＷＧＰによって承認された番号が付与されたＰｆｓのレースではない。ＵＳ２０１７０１２７６４２には、Ｐｆｓのレース１０に対する耐性は開示されていない。ＵＳ２０１７０１２７６４２には、Ｐｆｓのレース３〜５に対する耐性は開示されていない。耐性遺伝子のマーカーは開示されていない。
【００１６】
ＷＯ２０１７１９４０７３には、「少なくとも公式に認められたＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレースＰｆｓ：１、Ｐｆｓ：２、Ｐｆｓ：３、Ｐｆｓ：４、Ｐｆｓ：５、Ｐｆｓ：６、Ｐｆｓ：７、Ｐｆｓ：８、Ｐｆｓ：９、Ｐｆｓ：１０、Ｐｆｓ：１１、Ｐｆｓ：１２、Ｐｆｓ：１３、Ｐｆｓ：１４、Ｐｆｓ：１５およびＰｆｓ：１６に対する、Ｒ遺伝子非媒介性（non R-gene mediated）の広範囲のスペクトル耐性であって、前記耐性はｐ１０と指定された新たな遺伝子材によって引き起こされ、ｐ１０遺伝子座により引き起こされる前記耐性は少なくとも中間レベルのものである」こと、および「優性Ｒ遺伝子によって媒介される耐性と対照的に、本発明のｐ１０遺伝子座はホモ接合的に存在する場合にのみ耐性を提供する」ことが記載されている。
【００１７】
Ｃｏｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３には、Ｐｆｓ１−１５およびＵＡ１４１４、ＵＡ１０１２およびＵＡ１３１２を含む他のいくつかのＰ．  ｆａｒｉｎｏｓａの単離株に対して耐性である品種ＣｏａｔｉとＭｅｅｒｋａｔが記載されている。ＣｏａｔｉとＭｅｅｒｋａｔはＦ１の交配種である。Ｍｅｅｒｋａｔは後にＰｆｓのレース１６に対して感受性であることが示された（Ｐｌａｎｔｕｍ  ｐｒｅｓｓ  ｒｅｌｅａｓｅ，Ｍａｒｃｈ  １５ｔｈ  ２０１６）。
【００１８】
品種Ｃａｌｌｉｓｔｏ  Ｆ１は、Ｎｕｎｈｅｍｓによって交配されたホウレンソウ品種であり、ＨＲまたは高耐性と呼ばれるＰｆｓのレース１〜１４およびＰｆｓ１６に対する耐性を有する。それは交配種であり、Ｐｆｓ耐性は様々な優性遺伝子を積み重ねることにより得ることができる。ａ．ｏ．Ｃｏｒｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１に記載される遺伝子ＲＰＦ３（Ｒ３としても公知）は、Ｐｆｓ１６に対する耐性を付与する。
【００１９】
品種Ｎｏｖｉｃｏ  Ｆ１は、Ｎｕｎｈｅｍｓによって交配された産業型（industry type）のホウレンソウであり、ＨＲ（高耐性）と呼ばれるＰｆｓのレース１〜１２および１４〜１６に対する耐性を有する。それは交配種であり、Ｐｆｓ耐性は様々な優性遺伝子を積み重ねることにより得ることができる。ａ．ｏ．Ｃｏｒｒｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１に記載される遺伝子Ｒｐｆ３は、Ｐｆｓ１６に対する耐性を付与する。
【００２０】
品種Ｐａｌｃｏ  Ｆ１は、Ｎｕｎｈｅｍｓによって交配された産業型のホウレンソウであり、ＨＲと呼ばれるＰｆｓのレース１〜５、８、９、１１、１２、１４および１６に対する耐性を有する。それは交配種であり、Ｐｆｓ耐性は様々な優性遺伝子を積み重ねることにより得ることができる。Ｒｐｆ３は、Ｐｆｓ１６に対する耐性を付与する。
【００２１】
品種Ｓｃｏｒｐｉｕｓ  Ｆ１は、Ｎｕｎｈｅｍｓによって交配された生食用のホウレンソウであり、ＨＲと呼ばれるＰｆｓのレース１〜１４および１６に対する耐性を有する。それは交配種であり、Ｐｆｓ耐性は様々な優性遺伝子を積み重ねることにより得ることができる。Ｒｐｆ３は、Ｐｆｓ１６に対する耐性を付与する。
【００２２】
上記の品種Ａｎｄｒｏｍｅｄａ  Ｆ１は、Ｎｕｎｈｅｍｓによって交配された生食用のホウレンソウであり、ＨＲと呼ばれるＰｆｓのレース１〜１２および１４〜１６に対する耐性を有する。それは交配種であり、Ｐｆｓ耐性は様々な優性遺伝子を積み重ねることによって得ることができる。Ｒｐｆ３は、Ｐｆｓ１６に対する耐性を付与する。
【００２３】
他の様々な企業も、耐性遺伝子の蓄積を含むホウレンソウ品種を販売している。新しく導入されたホウレンソウの品種は、そのほとんどが交配種である。
【００２４】
ＷＯ２０１５０３６３７８には、「ＲＰＦ１３と指定される新たな優性耐性遺伝子」が開示されている。この遺伝子は、「単一の遺伝子により付与される、・・・少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース７〜１４に対する耐性」をもたらす。この遺伝子は、・・・さらに任意に、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース１〜６の１つ以上またはすべてに対する耐性、または少なくともＰｆｓ１〜２およびＰｆｓ４〜６に対する耐性を付与する。単離株ＵＡ４７１２は現在、Ｐｆｓ１５として知られている。本明細書の実施例でも示されるように、ＲＰＦ１３は、Ｐｆｓ１６に対する耐性を付与しない。
【００２５】
ＷＯ２０１５０３６４６９には、「ＲＰＦ１２と指定される新しい優性耐性遺伝子」が開示されている。この植物は、「単一の遺伝子により付与される、・・・少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース７〜１４に対する耐性」をもたらす。・・・ＲＰＦ１２は、・・・さらに任意に、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース１〜６の１つ以上またはすべてに対する耐性、または少なくともＰｆｓ１〜２およびＰｆｓ４〜６に対する耐性を付与する。本明細書の実施例でも示されるように、ＲＰＦ１２は、Ｐｆｓ１６に対する耐性を付与しない。同様に、品種ＰｅｇａｓｕｍはＲＰＦ１２を有し、レースＰｆｓ１６に対して感受性であることが記載されており、Ｃｏｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｋｏｉｋｅ，Ｒａｃｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｃｈ  ｄｏｗｎｙ  ｍｉｌｄｅｗ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅ，ＣＬＧＲＢ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，Ａｐｒｉｌ  １  ２０１６〜Ｍａｒｃｈ  ３１  ２０１７の表３を参照されたい。
【００２６】
ＥＰ２８４８１１４には、「本発明は、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース７〜１４に対する耐性を有するホウレンソウ植物を提供し、前記耐性は単一の遺伝子によって付与される。・・・ＲＰＦ１１は、・・・さらに任意に、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース１〜６の１つ以上に対する耐性を付与する。したがって、一つの態様において、ＲＰＦ１１遺伝子は、植物中でホモ接合型またはヘテロ接合型の場合、現在知られているすべての病原性Ｐｆｓレースであるレース１〜１４に対する耐性を付与する」ことが開示されている。本明細所の実施例でも示されるように、ＲＰＦ１１は、Ｐｆｓ１６に対する耐性を付与しない。同様に、品種Ｖｉｒｇｏ、ＶｏｌａｎｓおよびＡｎｔａｌｉａはＲＰＦ１１を有し、Ｐｆｓ１６に対して感受性であることが記載されており、Ｃｏｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  Ｋｏｉｋｅ，Ｒａｃｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｈｅ  ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｃｈ  ｄｏｗｎｙ  ｍｉｌｄｅｗ  ｐａｔｈｏｇｅｎ，ＣＬＧＲＢ  Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｐｏｒｔ，Ａｐｒｉｌ  １  ２０１６〜Ｍａｒｃｈ  ３１  ２０１７の表３を参照されたい。
【００２７】
Ｘｕ，  Ｃ．  ｅｔ  ａｌ．（２０１７，Ｎａｔ．  Ｃｏｍｍｕｎ．  ８，１５２７５  ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｃｏｍｍｓ１５２７５）「Ｄｒａｆｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｓｐｉｎａｃｈ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  １２０  Ｓｐｉｎａｃｉａ  ａｃｃｅｓｓｉｏｎｓ」（２０１７）により、ホウレンソウの中国品種Ｓｐ７５のゲノム配列が公開された。その配列は、ｓｐｉｎａｃｈｂａｓｅ．ｏｒｇのワールドワイドウェブにあるオンラインデータベース「ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅ」で分析することができる。ここでは、ホウレンソウの６つの染色体を、例えばブラスト分析により照会することができる。
【００２８】
育種家が、すべてのＩＷＧＰ承認Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａレース、すなわちＰｆｓレース１〜１６に対する耐性を有するホウレンソウ品種、または少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する耐性を有する品種を作出しようとする場合、育種家はいくつかの公知の耐性遺伝子を組み合わせる必要がある。Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａの公知のすべてのレースに対する耐性、またはＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する耐性を付与する単一の遺伝子は知られておらず、特に少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する優性耐性を付与する単一の遺伝子は知られていない。一部のＰｆｓ耐性遺伝子は対立遺伝子であるため、すべての耐性遺伝子を組み合わせること（すべての積み重ね（full stack））はできない。これにより耐性遺伝子の可能な組み合わせが制限されるため、新たな組み合わせを可能にする新たな遺伝子が強く求められている。
【００２９】
上記のＣｏｒｒｅｌｌ  ａｎｄ  ＫｏｉｋｅおよびＦｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）、Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｖｏｌ．９６  Ｎｏ．１，ｐａｇｅ１４５−１５２等の文献に基づいて、様々なＲＰＦ耐性遺伝子によってもたらされるＰｆｓレースに対する耐性は、以下のように要約することができる（−＝耐性、＋＝感受性）：
【表２】
2021511063.tif 000003
【００３０】
特にＰｆｓ１６およびＰｆｓ１７等の新たなレースに対する新たな耐性遺伝子を提供することが求められている。
【発明の概要】
【００３１】
本発明の目的は、ホウレンソウの野生近縁種からの遺伝子移入断片を含む栽培ホウレンソウ植物を提供することであり、前記断片は少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６、好ましくは少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する優性耐性を付与する単一の遺伝子を有する。さらに、少なくとも遺伝子がホモ接合型の場合、遺伝子はＰｆｓレース１〜７に対する耐性ならびにＰｆｓレース１２および１４に対する耐性を付与する。さらなる態様において、遺伝子は、Ｐｆｓ単離株ＵＡ０５１４および／または他のＰｆｓ単離株に対する耐性、特に新たなレースＰｆｓ１７に対する耐性も付与する。新たなレースＰｆｓ１７に対する耐性も優性であると思われる。このように、ホモ接合型である場合、前記遺伝子は、レースＰｆｓ１〜９、１１〜１４および１６および１７に対する耐性を付与し、それにより遺伝子がヘテロ接合型である場合、少なくともレース８、９、１１、１３、１６に対する耐性（およびおそらくはＰｆｓ１７に対する耐性も）もまた付与される。これらの他のレースに対する優性は、本明細書に記載されるように当業者によって容易に試験され得る。
【００３２】
遺伝子は、ホモ接合型またはヘテロ接合型のいずれの場合であっても、Ｐｆｓレース１０および１５に対する耐性を付与しない。
【００３３】
遺伝子を含む遺伝子移入断片は、ホウレンソウの野生近縁種からのものである。一つの好ましい態様において、ホウレンソウの野生近縁種は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａである。
【００３４】
耐性遺伝子はＲＰＦ１５と指定される。
【００３５】
ホモ接合型（２コピー）の場合、Ｐｆｓ１〜Ｐｆｓ９、Ｐｆｓ１１〜Ｐｆｓ１４およびＰｆｓ１６およびＰｆｓ１７のレースに対する耐性、すなわち公知の１７レースのうち合計で１５に対する耐性を付与する。重要なことに、耐性はレースＰｆｓ８、９、１１，１３および１６に対して優性であり（すなわち、ＲＰＦ１５遺伝子の１つのコピー、またはＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片は、特定のレースに対する耐性を付与するのに十分である）、おそらくＰｆｓ１７に対しても優性である。優性を試験または確認するために、感受性のホウレンソウ植物においてＲＰＦ１５遺伝子がヘテロ接合型で存在する必要があり、次いで、Ｐｆｓ１７等の様々なＰｆｓレースに対する耐性を試験することができる。ホウレンソウのゲノム中に遺伝子移入断片のコピーが１つしか存在しない場合でも、ＲＰＦ１５遺伝子が特定のレースに対する耐性を付与する場合は、そのレースに対する耐性が優性である。
【００３６】
ＲＰＦ１５遺伝子がホモ接合型である場合、Ｐｆｓ１２および１４に対する耐性は、中等度（intermediate）の耐性として分類され、これは、レースＰｆｓ１２またはＰｆｓ１４を接種された植物が白化および／または胞子形成のいくらかのわずかな兆候を示す場合があるものの、より後の段階においてであり、感受性の植物よりは極めて低い程度であることを意味する。通常の土壌状態において、該土壌において（後の段階においてではあるが）いくらかの疾患の兆候が進展する結果となるようなこれらのレースによる非常に高い疾患圧力がない限り、植物はこれらのレースに対する耐性を有する。したがって、本明細書の全体にわたり、ＲＰＦ１５により付与されるＰｆｓ１２およびＰｆｓ１４に対する「耐性」について言及され、該耐性とは、公知文献において知られているような、また、通常は記号（−）を用いて示されるような中等度の耐性であることが理解される。
【００３７】
一つの実施形態において、ＲＰＦ１５は、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する優性耐性、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する優性耐性を付与し、少なくともＲＰＦ１５がホモ接合型である場合には、Ｐｆｓレース１〜７に対する耐性、Ｐｆｓレース１２および１４に対する耐性、ならびにＰｆｓ単離株ＵＡ０５１４および他のＰｆｓ単離株に対する耐性をさらに付与する。したがって、本発明の目的は、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する優性耐性、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する優性耐性を付与し、かつ、前記遺伝子がホモ接合型である場合に、公式に指定された１７レースの少なくとも１５種（すなわち、Ｐｆｓ１〜９、Ｐｆｓ１１〜１４ならびにＰｆｓ１６および１７）に対する優性耐性を付与する単一の遺伝子を提供することである。
【００３８】
本発明の一つの態様において、ＲＰＦ１５は、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する優性耐性、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する優性耐性を付与し、少なくとも前記遺伝子（または前記遺伝子を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型である場合にはＰｆｓレース１、２、３、４、５、６および７に対する耐性をさらに付与し、前記遺伝子（または前記遺伝子を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型である場合にはＰｆｓレース１２および１４に対する耐性を付与する。
【００３９】
一つの態様において、ＲＰＦ１５遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１０６にアデニン（Ａ）を有するか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性（例えば、Ｅｍｂｏｓｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎｅｅｄｌｅを用いてペアで整列させた場合）を有する配列内の同等の位置にアデニンを有するＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチドに連結しており、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４にシトシン（Ｃ）を有するか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列内の同等の位置にシトシンを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドに連結している。したがって、一つの態様において、ホウレンソウ植物、または前記ホウレンソウ植物の部分、または種子、または細胞、またはホウレンソウ植物細胞の細胞培養物は、そのゲノム中に、ドナー植物からの遺伝子移入断片を含む組換え染色体を含み、該遺伝子移入断片は、配列番号１のヌクレオチド１０６にアデニンを有するＳＮＰ＿０１と連結されるか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、前記耐性ドナーＳＮＰ＿０１ヌクレオチドを保持する配列と連結され、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４にシトシンを有するＳＮＰ＿０２と連結されるか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、前記耐性ドナーＳＮＰ＿０２ヌクレオチドを保持する配列と連結されるＲＰＦ１５遺伝子を含む。ホウレンソウは二倍体であるため、ＳＮＰ＿０１およびＳＮＰ＿０２を有する遺伝子移入断片がホモ接合型で存在する場合、ＳＮＰ＿０１の植物の遺伝子型、すなわち配列番号１のヌクレオチド１０６はＡＡであり、ＳＮＰ＿０２の植物の遺伝子型、すなわち配列番号３のヌクレオチド１８４はＣＣである。ＳＮＰ＿０１を有する遺伝子移入断片がヘテロ接合形態で存在する場合、ＳＮＰ＿０１の植物の遺伝子型、すなわち配列番号１のヌクレオチド１０６はＡＣ、ＡＧまたはＡＴであり、ＳＮＰ＿０２を有する遺伝子移入断片がヘテロ接合形態で存在する場合、ＳＮＰ＿０２の植物の遺伝子型、すなわち配列番号１のヌクレオチド１８４はＣＡ、ＣＧまたはＣＴである。
【００４０】
一つの態様において、ＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片は、配列番号１のヌクレオチド１０６、または、例えばＥｍｂｏｓｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎｅｅｄｌｅを用いてペアで整列させた場合の同等のヌクレオチドにおいてアデニンを有する、配列番号１、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含み、かつ／または前記遺伝子移入断片は、配列番号３のヌクレオチド１８４、または、例えばＥｍｂｏｓｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎｅｅｄｌｅを用いてペアで整列させた場合の同等のヌクレオチドにおいてシトシンを有する、配列番号３、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列を含む。
【００４１】
本明細書において特定の位置、例えば配列番号１のヌクレオチド１０６、または配列番号３のヌクレオチド１８４、「または配列番号と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列のヌクレオチド１１４」におけるＳＮＰ遺伝子型に言及する場合、これは、ＳＮＰ遺伝子型が、変異体配列中、すなわち言及された配列番号と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を含む配列中の同じヌクレオチド（例えば、配列番号１のヌクレオチド１０６、または配列番号３のヌクレオチド１８４に相当する）と同じ（に対応する）ヌクレオチドにおいて変異体配列に存在することを意味する。例えば、変異体配列は１ヌクレオチドまたは数ヌクレオチド短い場合があり得るが、変異体配列と言及された配列番号とを組にして整列させた場合、変異体配列のどのヌクレオチドが同じヌクレオチドと同等であるか（対応するか）が分かる。ＳＮＰ＿０１の変異体配列において、例えば、これは言及された配列のヌクレオチド１０６に等しい、変異体配列のヌクレオチド番号１０５または１０７であり得る。ＳＮＰ＿０２の変異体配列において、例えば、これは言及された配列のヌクレオチド１８４に等しい、変異体配列のヌクレオチド番号１８３または１８５または１９０であり得る。
【００４２】
ホウレンソウの野生近縁種であるドナーからの遺伝子移入断片を含む栽培ホウレンソウ植物、または前記植物の部分、またはその種子を提供することも本発明の目的であり、前記断片は新たな耐性遺伝子ＲＰＦ１５を含み、それにより、前記植物は少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する優性耐性を示し、好ましくは少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する優性耐性を示す。栽培ホウレンソウ植物、またはその植物の部分、またはその種子は、少なくともＲＰＦ１５遺伝子がホモ接合型で存在する場合、Ｐｆｓレース１〜９の１つ以上に対して、Ｐｆｓ１１〜１４、１６〜１７に対して、ならびにＰｆｓ単離株ＵＡ０５１４ｓに対して耐性である。栽培ホウレンソウ植物に遺伝子移入された前記断片は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）であるか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであるＳＮＰ＿０１についての耐性ドナーヌクレオチドを有し、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシンであるか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンであるＳＮＰ＿０２についての耐性ドナーヌクレオチドを有する。
【００４３】
したがって、一つの態様において、ホウレンソウ、特にＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａの野生近縁種であるドナーからの遺伝子移入断片を含むホウレンソウ植物が提供され、この遺伝子移入断片は、遺伝子がホモ接合型であり、遺伝子移入断片が配列番号１のヌクレオチド１０６（ＳＮＰ＿０１）にアデニンを有し、それにより、遺伝子移入断片についてホモ接合性のホウレンソウ植物がＳＮＰ＿０１の遺伝子型「ＡＡ」を有する場合、かつ／または前記遺伝子断片は、配列番号３のヌクレオチド１８４（ＳＮＰ＿０２）にシトシンを有し、それにより該遺伝子移入断片についてホモ接合性であるホウレンソウ植物はＳＮＰ＿０２について遺伝子型「ＣＣ」を有する場合に、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース１〜９、１１〜１４および１６および１７に対する耐性を付与する遺伝子を含む。
【００４４】
また、栽培ホウレンソウ植物、または前記植物の部分、またはそのような植物を生育させることができる種子、または細胞、またはホウレンソウ細胞の細胞培養物を提供することも本発明の目的であり、前記部分または前記細胞は、耐性遺伝子ＲＰＦ１５を含む植物に再生することができ、前記栽培植物または再生植物は、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対して、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対して優性耐性を有し、好ましくは配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）であるか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであるＳＮＰ＿０１についての耐性ドナーヌクレオチドを有し、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシンであるか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性（例えば、Ｅｍｂｏｓｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎｅｅｄｌｅ、デフォルトのパラメータを用いてペアで整列させた場合）を有する配列の同等の位置におけるシトシンであるＳＮＰ＿０２についての耐性ドナーヌクレオチドを有する。栽培ホウレンソウ植物、その植物部分または前記種子は、少なくともＲＰＦ１５遺伝子（または遺伝子を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型である場合に、Ｐｆｓレース１〜７、１２および１４、またはさらに別の選択肢では、Ｐｆｓ単離株ＵＡ０５１４および／または他のＰｆｓ単離株に対してさらなる耐性を有する。
【００４５】
さらなる目的において、本発明は、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６および１７に対する耐性、および少なくともＲＰＦ１５遺伝子がホモ接合型である場合にＰｆｓレース１〜７、１２および１４に対するさらなる耐性、ならびにＰｆｓ単離株ＵＡ０５１４および／または他のＰｆｓ単離株に対するさらなる耐性を有する栽培ホウレンソウ植物を作出する方法を提供し、前記植物は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）であるか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであるＳＮＰ＿０１についての耐性ドナーヌクレオチドを有し、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシンであるか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性（例えば、Ｅｍｂｏｓｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎｅｅｄｌｅ、デフォルトのパラメータを用いてペアで整列させた場合）を有する配列の同等の位置におけるシトシンであるＳＮＰ＿０２についての耐性ドナーヌクレオチドを有する。
【００４６】
したがって、一つの態様において、ホウレンソウの野生近縁種であるドナーからの遺伝子移入断片を含む栽培ホウレンソウ植物が提供され、前記遺伝子移入断片は、ヘテロ接合型およびホモ接合型の場合に少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６および１７に対する耐性を付与する単一の遺伝子を含み、前記遺伝子は、ヌクレオチド１０６（ＳＮＰ＿０１）においてアデニンを有する配列番号１、または配列番号１と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号１のヌクレオチド１０６と同等のヌクレオチド位置にアデニンを有する配列に連結されており、かつ／またはヌクレオチド１８４（ＳＮＰ＿０２）においてシトシンを有する配列番号３、または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有し、配列番号３のヌクレオチド１８４と同等のヌクレオチド位置にシトシンを有する配列に連結されている。
【００４７】
ホウレンソウの野生近縁種であるドナーからの遺伝子移入断片を含むホウレンソウ植物、植物部分または細胞を同定または選択するための方法も提供され、前記遺伝子移入断片は、ヘテロ接合型およびホモ接合型の場合に少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を付与する単一の遺伝子を含み、前記方法は：
配列番号１のヌクレオチド１０６（ＳＮＰ＿０１）におけるアデニンの存在、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列における配列番号１のヌクレオチド１０６に相当するヌクレオチド位置におけるアデニンの存在を決定すること、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４（ＳＮＰ＿０２）におけるシトシンの存在、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列における配列番号３のヌクレオチド１８４に相当するヌクレオチド位置におけるシトシンの存在を決定することを含む。
【００４８】
この方法は、ＲＰＦ１５遺伝子によって付与されるものとして本明細書において言及されているＰｆｓレースの１つ以上に対する耐性表現型を試験することをさらに含んでもよい。
【００４９】
配列番号１のヌクレオチド１０６または変異体配列の同等のヌクレオチドにおけるアデニンの存在、および配列番号３のヌクレオチド１８４または変異体配列の同等のヌクレオチド（例えば、位置１９０）におけるシトシンの存在は、ＳＮＰ遺伝子型決定法、シーケンシング等の当技術分野で公知の様々な方法によって決定することができる。
【００５０】
また、本発明は、耐性遺伝子ＲＰＦ１５を含む栽培ホウレンソウ植物、その植物部分、またはそのような植物に生育させることができる種子、ならびに細胞または細胞培養物を提供し、前記遺伝子は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された栽培ホウレンソウ種子または前記種子から誘導される後代の中に存在するか、またはそれらから得ることができるか、またはそれらから誘導することができるような遺伝子である。
【００５１】
したがって、一つの態様において、ホウレンソウ、特にＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａの野生近縁種であるドナーからの遺伝子移入断片を含むホウレンソウ植物が提供され、この遺伝子移入断片は、遺伝子がヘテロ接合型である場合には少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を付与する遺伝子を含み、かつ、遺伝子がヘテロ接合型である場合にはレース１〜９、１１〜１４、１６および１７に対する耐性を付与する遺伝子を含み、かつ、前記遺伝子移入断片は、配列番号１のヌクレオチド１０６（ＳＮＰ＿０１）にアデニンおよび／または配列番号３のヌクレオチド１８４にシトシンを有し、前記遺伝子は、種子から生育した植物中に存在する遺伝子であり、その代表的な試料は受託番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託されている。
【００５２】
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３、１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を有するＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ種のホウレンソウ植物が提供され、前記耐性は単一遺伝子を含む遺伝子移入断片によって付与され、前記遺伝子移入断片は配列番号１のヌクレオチド１０６のＳＮＰ＿０１にアデニン、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４のシトシンを有し、前記遺伝子は、種子から生育した植物中に存在する遺伝子であり、その代表的な試料は受託番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託されている。
【００５３】
前記ホウレンソウ植物の後代植物も提供され、前記後代植物は、耐性遺伝子を含み、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるＳＮＰ＿０１のアデニン、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるＳＮＰ＿０２のシトシンを有する遺伝子移入断片を保持し、この遺伝子は、遺伝子がヘテロ接合型である場合にＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３、１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を付与する。
【００５４】
さらに、本発明は、ホウレンソウの野生近縁種であるドナーからの遺伝子移入断片を含む、栽培ホウレンソウ植物、その植物部分、またはそのような植物に生育させることができる種子、ならびに細胞または細胞培養物を提供し、上記断片は、耐性遺伝子ＲＰＦ１５を含み、この遺伝子移入断片は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８で寄託された栽培ホウレンソウ種子中に存在するか、またはそれから得ることができるか、またはそれから誘導することができる断片であるか、またはＲＰＦ１５を保持する上記遺伝子移入断片のサブ断片を含む。一つの態様において、上記遺伝子移入断片またはサブ断片は、配列番号１のヌクレオチド１０６においてアデニン（Ａ）を有するか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置においてアデニンを有するＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチドを含み、かつ／または上記遺伝子移入断片またはサブ断片は、配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）を有するか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性（例えば、Ｅｍｂｏｓｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎｅｅｄｌｅを用いてペアで整列させた場合）を有する配列の同等の位置にシトシンを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドを含む。
【００５５】
本発明はまた、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくは少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を有し、少なくとも耐性遺伝子がホモ接合型である場合にはＰｆｓレース１〜７、１２および１４の１つ以上に対する、およびＰｆｓ単離株ＵＡ０５１４に対するさらなる耐性を有する栽培ホウレンソウ植物、またはその種子、植物部分または細胞もしくは細胞培養物を作出または同定する方法を提供する。本発明はさらに、任意に配列番号１のヌクレオチド１０６にアデニン（Ａ）を有するか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にアデニンを有するＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチドを使用して、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４にシトシン（Ｃ）を有するか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性（例えば、Ｅｍｂｏｓｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  Ｎｅｅｄｌｅを用いてペアで整列させた場合）を有する配列の同等の位置にシトシンを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドを使用して、ＲＰＦ１５遺伝子またはＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片を同定、選択または検出する方法を提供する。
【００５６】
本発明の一つの態様において、耐性遺伝子ＲＰＦ１５は、配列番号１のヌクレオチド１０６にアデニン（Ａ）を有するか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にアデニンを有するＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチドと連結されており、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４にシトシン（Ｃ）を有するか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にシトシンを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドと連結されている。
【００５７】
一つの態様において、耐性遺伝子ＲＰＦ１５は、組換え染色体上の遺伝子移入断片またはそのような断片の一部に位置する。一つの実施形態において、遺伝子移入断片はホウレンソウゲノムの第３染色体上に位置し、第３染色体は、データベースＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅ中に見出され、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７、上記）に記載されている染色体である。ＳＮＰ＿０１は、データベース中の第３染色体の１０９０９５４ヌクレオチドに位置する。前記データベースにおいて、ＳＮＰ＿０２は第３染色体のヌクレオチド６０７７５１に位置している。ここで、ＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片を含まない栽培中国ホウレンソウ品種の配列において、ＳＮＰ＿０１は第３染色体のヌクレオチド１０９０９５４にアデニンを有し、ＳＮＰ＿０２は第３染色体のヌクレオチド６０７７５１にシトシンを有する。一つの態様において、ＲＰＦ１５遺伝子は、第３染色体のヌクレオチド６０７７５１のＳＮＰ＿０２（０．６Ｍｂ）と第３染色体のヌクレオチド１２１９９３０（１．２Ｍｂ）との間に位置する。したがって、ＲＰＦ１５遺伝子が見出される第３染色体の領域は比較的小さい（０．６Ｍｂ領域）。シーケンシングまたはファインマッピングにより、その領域をさらに絞り込むことができ、その領域に見出される遺伝子のＣｒｉｓｐｒ／Ｃａｓ遺伝子編集を使用して、領域中に存在する野生ドナーから遺伝子移入した遺伝子のうち、耐性表現型に寄与しているものを示すことができる。
【００５８】
他の態様において、ＲＰＦ１５遺伝子は、ＳＮＰ＿０１とＳＮＰ＿０２との間に位置し、これは、前記ＳＮＰマーカーが前記遺伝子の異なる側に位置することを意味する。本明細書における「単一遺伝子」への言及は、耐性の分離が、単一遺伝子または遺伝子座の分離比を有することが見出されたことを意味することに留意されたい（実施例を参照のこと）。「単一遺伝子」または遺伝子座として分離する遺伝子移入断片上に密接すて連結されるいくつかの遺伝子が存在する可能性があることを排除するものではない。
【００５９】
したがって、本発明の一つの態様において、栽培ホウレンソウ植物、またはそのような植物を生育することができる種子、または植物部分、または栽培ホウレンソウの細胞／細胞培養物は、ホウレンソウの野生近縁種からの遺伝子移入断片を含み、前記断片はＲＰＦ１５を含み、好ましくはＳＮＰ＿０１および／またはＳＮＰ＿３に野生ドナーＳＮＰヌクレオチドを含む。ＲＰＦ１５を含むＤＮＡ断片は、ホウレンソウの野生近縁種（耐性遺伝子のドナー）から遺伝子移入され、好ましい一つの態様においては、ホウレンソウの野生近縁種はＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａである。遺伝子は栽培ホウレンソウ（再生親）に遺伝子移入される。したがって、本発明は、ホウレンソウの野生近縁種からの遺伝子移入断片を含む栽培ホウレンソウ植物、またはそのような植物を生育することができる種子、植物部分、またはその細胞培養物を提供し、遺伝子移入断片はＲＰＦ１５遺伝子、および任意に配列番号１のヌクレオチド１０６にアデニン（Ａ）を含むか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にアデニンを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０１、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４にシトシン（Ｃ）を有するかまたは配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にシトシンを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０２を含む。
【００６０】
本発明の一つの態様において、本発明の植物は、遺伝子移入断片についてヘテロ接合性であり、配列番号１の位置１０６、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にヌクレオチドＡ、および／または配列番号３の位置１８４、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にヌクレオチドＣを有する１つの染色体を含む。本発明のさらに別の態様において、本発明の植物は、遺伝子移入断片についてホモ接合性であり、配列番号１の位置１０６、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にヌクレオチドＡ、および／または配列番号３の位置１８４、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にヌクレオチドＣを有する２つの染色体を有する。好ましくは２つの染色体は同じ遺伝子移入断片を有し、すなわち遺伝子移入断片のヌクレオチド配列ならびに断片のサイズおよび位置が同じである。
【００６１】
ＲＰＦ１５耐性遺伝子を含む植物または植物部分または細胞の選択に使用され得る１つ以上のＤＮＡマーカーを提供することがさらなる目的である。本明細書において提供される１つのマーカーは、配列番号１のヌクレオチド１０６にアデニン（Ａ）を有するか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にＡを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０１、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４にシトシン（Ｃ）を有するか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にＣを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０２である。ＲＰＦ１５遺伝子および／または遺伝子移入断片に連結された他のＤＮＡマーカーは、当業者によって、ドナーのＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａの断片を同定するために、例えばＮＣＩＭＢ４２６０８に存在する遺伝子移入断片を含む第３染色体の領域をシーケンシングすることによって構築することができる。Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａの断片とＳ．ｏｌｅｒａｃｅａとの間の多型は、例えば、ＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片を選択または同定するマーカーとして使用することができる。
【００６２】
当業者であれば、寄託された種子のゲノムをシーケンシングすることにより、単一の特定のＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナー植物／系統（遺伝子多型であり、第３染色体において置換されるＳ．ｏｌｅｒａｃｅａの配列とは異なり、他のＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ植物／系統とも異なる特定のヌクレオチド配列を有する）の遺伝子移入断片を同定することができる。また、ホウレンソウ植物が同じ耐性表現型を有する場合であっても、遺伝子移入断片を使用することによって、本発明の植物と他のホウレンソウ植物とを区別することができる。例えば、ＲＰＦ１５を含み、寄託された種子ＮＣＩＭＢ４２６０８のようなヌクレオチド配列を有する、本発明において使用される単一の特定のドナー植物は、ＮＣＩＭＢ４２６０７（ＲＰＦ１４を含む）、ＮＣＩＭＢ４２１５９（ＲＰＦ１２を含む）、ＮＣＩＭＢ４２１５８（ＲＰＦ１１を含む）の作出に使用されるドナー植物とは異なるドナー植物である。したがって、各遺伝子移入断片は、耐性遺伝子が異なるだけでなく、そのサイズ、染色体の領域およびヌクレオチド配列も固有のものである。
【００６３】
また、前記耐性遺伝子を含む植物または植物部分または細胞を作出または同定するための方法が提供される。いくつかの態様において、例えば、１つ以上の核酸プローブとＲＰＦ１５を含むことが予想される植物の核酸とをハイブリダイズする（例えば、配列番号１もしくは配列番号３、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、配列番号１のヌクレオチド１０６または同等の位置にアデニンを有する配列にハイブリダイズするか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、配列番号１のヌクレオチド１８４または同等の位置にシトシンを有する配列にハイブリダイズする）こと、または１つ以上の核酸プライマーを使用してＲＰＦ１５を含むことが予想される植物の核酸を増幅することを含む、ＲＰＦ１５と指定される耐性遺伝子、またはＳＮＰ＿０１もしくは配列番号１またはＳＮＰ＿０２もしくは配列番号３等の前記遺伝子に連結されたＤＮＡマーカーを選択、同定および／または検出するための方法が提供される。プライマーは、例えば、ＳＮＰ＿０１またはＳＮＰ＿０２を検出し、ＳＮＰ＿０１またはＳＮＰ＿０２のＳＮＰ遺伝子型を決定することができるように作製することができる。
【００６４】
ＲＰＦ１５は、ホウレンソウの野生近縁種（ドナーまたは耐性遺伝子ドナー）から栽培ホウレンソウ（再生親またはレシピエントとも呼ばれる）に、好ましくはＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａから遺伝子移入される。一つの態様において、ホウレンソウの野生近縁種からの遺伝子移入断片を含む栽培ホウレンソウ植物または植物部分が提供され、遺伝子移入断片はＲＰＦ１５遺伝子を含み、任意にＲＰＦ１５遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１０６にアデニン（Ａ）を有するか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にアデニンを有するＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチドに連結され、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４にシトシン（Ｃ）を有するか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にＣを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドに連結される。
【００６５】
また、ＲＰＦ１５を含む植物または植物部分または種子または細胞、または細胞培養物の同定のための遺伝子と物理的に連結された遺伝子の使用および／または分子マーカー（特に、一塩基多型またはＳＮＰ、より具体的には配列番号１のヌクレオチド１０６にアデニン（Ａ）を有するか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列における同等の位置にＡを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０１、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４にシトシン（Ｃ）を有するか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列における同等の位置にＣを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０２）の使用、およびＲＰＦ１５を含む植物または植物部分または種子または細胞、または細胞培養物の同定または作出においてそのようなマーカーを使用する方法が適用される。
【００６６】
一つの態様において、栽培ホウレンソウは、組換え染色体、特に組換え第３染色体（上記のＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７で言及される）を含み、前記染色体は、次に、ＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片を含み、任意に、一つの態様においては、遺伝子移入断片は、ＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド（すなわち、配列番号１のヌクレオチド１０６のアデニン、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にあるＡ）を有し、かつ／またはＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチド（すなわち、配列番号３のヌクレオチド１８４のシトシン、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にあるＣ）を有する。さらなる態様において、前記植物の残りの染色体は栽培ホウレンソウ染色体である。一つの実施形態において、組換え染色体は第３染色体である（上記のＸｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７で言及される）。
【００６７】
一つの態様において、遺伝子移入断片（ＲＰＦ１５を含む）は、第３染色体の上流部（ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅに存在するように）に存在し、前記上流部は、第３染色体の０Ｍｂ〜２．０Ｍｂである。一つの態様において、ＲＰＦ１５は、第３染色体の０．４Ｍｂから開始され１．５Ｍｂで終了する領域中に位置する。一つの態様において、遺伝子移入断片は、２Ｍｂ以下のサイズであり、ＲＰＦ１５遺伝子を含む。一つの態様において、遺伝子移入断片は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中に存在する断片と同じヌクレオチド配列および同じサイズを有し、ＲＰＦ１５遺伝子（本明細書に記載の耐性表現型を付与する）を含む。一つの態様において、遺伝子移入断片は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中に存在する断片と同じヌクレオチド配列を有し、ＲＰＦ１５遺伝子（本明細書に記載の耐性表現型を付与する）を含むが、寄託された種子中に見出される断片よりもサイズが小さい。したがって、例えば、フルサイズの断片の一部、例えばＲＰＦ１５遺伝子の両側が、組み換えによって除去され得る。一つの態様において、遺伝子移入断片は、ＲＰＦ１５ならびに配列番号１および／配列番号３をも含む。
【００６８】
一つの態様において、ＲＰＦ１５遺伝子および／または遺伝子移入断片および／または組換え染色体は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子、または前記種子から生育された植物、または配列番号１のヌクレオチド１０６にアデニン（Ａ）を有するか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にアデニンを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０１に任意に連結されており、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４にシトシン（Ｃ）を有するか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置にＣを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０２に任意に連結されているＲＰＦ１５遺伝子を保持する後代等のゲノム中にＲＰＦ１５遺伝子を保持するその後代中に存在する遺伝子および／または遺伝子移入断片および／または組換え染色体である。一つの態様において、後代はドナーのＳＮＰ＿０１ヌクレオチドおよび／またはドナーのＳＮＰ＿０２ヌクレオチドを保持するが、当業者はＲＰＦ１５遺伝子を保持するがドナーのＳＮＰ＿０１またはドナーのＳＮＰ＿０２またはその両方を欠き、したがってより短い遺伝子移入断片を含む植物を選択することもできる。したがって、一つの態様において、ＲＰＦ１５遺伝子が依然として存在している一方で、ＳＮＰ＿０１およびＳＮＰ＿０２のＳＮＰヌクレオチドは再生親のヌクレオチドであってもよい。当業者は、寄託された種子に存在するおよび／または後代に存在する遺伝子移入断片をシーケンシングして、植物の耐性表現型が本発明のＲＰＦ１５遺伝子によって付与されたものであるかどうかを決定することができる。遺伝子移入断片（および組み換えによって生成されるその任意のサブ断片）は、特定のドナーに由来する特定のゲノム配列であり、したがって固有のものである。
【００６９】
定義
本明細書において引用されるすべての特許文献および非特許文献は、その全体が参照により組み込まれる。
【００７０】
不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は、文脈で要素が１つだけであることが明確に要求されていない限り、複数の要素が存在する可能性を排除するものではない。したがって、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」は通常「少なくとも１つ」を意味する。
【００７１】
「植物品種」とは、知られている最下層の同じ植物分類群内の植物のグループであり、（植物育種者の権利の認識に関する条件が満たされているかどうかに関係なく）、特定の遺伝子型または遺伝子型の組み合わせに起因し、それらの特徴の少なくとも１つの発現によって他の植物群と区別することができ、それらの変化を伴うことなく増殖できることから本質的特徴と見なすことができる特徴の発現に基づいて定義することができる。したがって、「植物品種」という用語は、たとえ同じ種類であっても、１つまたは２つの遺伝子座または遺伝子（またはこれらの特定の遺伝子座または遺伝子に起因する表現型の特徴）の存在によって特徴付けられるが、他の遺伝子座または遺伝子に関しては互いに大幅に異なる場合には、植物のグループを表すために使用することはできない。
【００７２】
本明細書において「ホウレンソウ」または「栽培ホウレンソウ」または「栽培Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ」とは、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅａｃｅａ種の植物（または該植物を生育させることができる種子）、および食物を得るために人間によって育種され、農学的に良好な特徴を有するそのような植物の部分を指す。これには、育種系統（例えば、戻し交配系統、近交系）、栽培品種および品種（開放受粉されたものまたは雑種）等の栽培ホウレンソウが含まれる。これには、サボイ、フラットリーフ（flat-leaf）またはスムーズリーフ（smooth-leaf）ホウレンソウまたはセミサボイタイプ等のあらゆる種類のホウレンソウが含まれる。野生のホウレンソウ（すなわち、栽培されていないホウレンソウ）、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａおよびＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｋｅｓｔａｎｉｃａ等のホウレンソウの野生近縁種は、この定義には含まれない。
【００７３】
「ホウレンソウの野生近縁種」には、Ｓｐｉｎａｃｉａ科の非栽培植物、特にＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｅｔｒａｎｄｒａおよびＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａが含まれる。これらの種は、ＲＰＦ１５遺伝子のドナー植物、および任意に配列番号１のヌクレオチド１０６にアデニン（Ａ）を有するか、配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列における同等の位置にアデニンを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０１、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４にシトシン（Ｃ）を有するか、配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列における同等の位置にＣを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０２等のＲＦＰ１５遺伝子に連結されたＤＮＡマーカーとも呼ばれ；すなわち、ＲＰＦ１５遺伝子、および任意でＳＮＰ＿０１および／またはＳＮＰ＿０２を含む断片は、前記ドナー植物から得られるか、または得ることができる。「Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ」は、ホウレンソウの野生近縁種であり、ａ．ｏ．Ａｃｔａ  Ｉｎｓｔ．  Ｂｏｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃ．  ＵＲＳＳ，  Ｓｅｒ．  Ｉ．  Ｆａｓｃ．  ２，  １２３  （１９３６）に記載されている。本発明の一つの態様において、ＲＰＦ１５遺伝子のドナー植物は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ植物であり；一つの態様において、遺伝子移入断片は、ＮＣＩＭＢ４２６０８に移入されたＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナー系統の断片、またはその遺伝子移入断片のサブ断片（例えば、減数分裂性組み換えによって生成された小さい断片）であり、前記サブ断片はＲＰＦ１５耐性表現型を付与し、好ましくはＳＮＰ＿０１および／またはＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドを含む。
【００７４】
本明細書において使用される場合、「植物」という用語は、種子（植物を生育させることができる）、植物全体、または植物器官（例えば、収穫されたまたは収穫されていない葉等）等の植物の任意の部分、細胞、植物プロトプラスト、植物全体を再生することができる植物細胞または組織培養物、増殖性植物細胞（propagating plant cell）または非増殖植物細胞（non-propagating plant cell）、組織培養物中（ただし、例えば、植物または植物部分におけるin vivo）にない植物細胞、単離された植物細胞、植物カルス、プロトプラスト、小胞子、植物細胞集塊、植物移植物（plant transplant）、苗、植物中の完全な植物細胞、植物クローンまたはマイクロプロパゲーション（micro-propagation）、または植物の挿し木等の植物部分（例えば、収穫された組織または器官）、例えば、栄養繁殖物（vegetative propagation）、クローン繁殖植物、子葉、胚軸、葉、加工葉（processed leaf）、茎、柄、芽、つぼみ、根、根の先端、葉柄、花、花びら、雄しべ、葯、柱頭、花柱、子房、花粉粒、胚珠、胚、胚嚢、果実、分裂組織、形成層、種子（自家受粉または他家受粉後の植物において産生される）、母体組織である種子の部分、接ぎ木、接ぎ穂、根茎、これらのいずれか等の部分、またはその誘導物を含み、好ましくはそれらを得た植物と同じ遺伝子構成（または非常に類似した遺伝子構成）を有していることが好ましい。また、苗、発根前または発根後の挿し木、成熟および／または未成熟の植物、または成熟および／または未成熟の葉等の任意の発生段階が含まれる。「植物の種子」に言及する場合、これらは、植物が生育することができる種子、または自家受粉もしくは他家受粉後の植物において産生される種子のいずれかを指す。
【００７５】
「組織培養物」または「細胞培養物」とは、同じまたは異なるタイプの単離された細胞または植物組織に組織化されたそのような細胞の集合物を含むin vitro組成物を指す。ホウレンソウの組織培養物および細胞培養物、ならびにそれらからのホウレンソウ植物の再生はよく知られており、広く公開されている（例えば、Ｎｇｕｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｐｌａｎｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｒｅｐｏｒｔｓ，  Ｖｏｌ．７  Ｉｓｓｕｅ  １，  ｐ９９を参照されたい）。
【００７６】
本明細書において、「収穫された植物材料」とは、さらなる貯蔵および／またはさらなる使用のために収集された植物部分（例えば、植物全体から分離された葉）を指す。本明細書において使用される「収穫された葉」とは、ホウレンソウの葉、すなわち根系のない植物、例えば実質的にすべての（収穫された）葉を指す。収穫した葉は加工されてもよい。「収穫された種子」とは、系統または品種から収穫される種子、例えば自家受粉または他家受粉後に産生され、収集される種子を指す。
【００７７】
本明細書で使用される「後代（progeny）」または「後代（progenies）」または「子孫（descendant）」とは、ＲＰＦ１５耐性遺伝子をホモ接合型またはヘテロ接合型で有する（保持する）、および／または本明細書に記載されるＲＰＦ１５耐性表現型を有する本発明の植物から得られる（得ることができる）産物（offspring）、または最初のおよび／またはすべてのさらなる子孫を指す。後代は、細胞培養物もしくは組織培養物または植物部分の再生、または植物の自家受粉、または植物の種子の産生によって得ることができる。さらなる実施形態において、後代は、少なくとも１つのホウレンソウ植物と、同じまたは異なる品種または（育種）系統の別のホウレンソウ植物との交配、および／または戻し交配、および／または植物への遺伝子座の挿入、および／または突然変異によって得られるホウレンソウ植物も包含し得る。後代は、例えば、第一世代の後代であり、すなわち、後代は、例えば、伝統的な育種方法（自家受粉および／または交配）または再生によって親植物から直接的に由来する、得られる、得ることができる、または誘導され得る。しかしながら、「後代」という用語は、一般に、第２、第３、第４、第５、第６、第７またはそれ以上の世代等のさらなる世代、すなわち、例えば、伝統的な育種方法、再生または遺伝的形質転換技術によって前世代から由来する、得られる、得ることができる、または誘導され得る植物の世代を包含する。例えば、第２世代の後代は、上記の方法のいずれかによって第１世代の後代から産生され得る。また、倍加した半数体も後代である。
【００７８】
「植物系統」とは、例えば、１つ以上の品種を開発するために使用することができる育種系統である。「近交系」または「近交系親」は、数世代にわたって植物を自家受粉させることによって開発された植物系統であり、「Ｆ１交配種」（または雄の親系統と雌の親系統とを交配することによって作出される単交配種（single-cross hybrid））の親として使用することができる。「雄育種系統」または「雄親」または「雄親系統」とは、雄親、すなわち花粉ドナーである。「雌育種系統」または「雌親」または「雌親系統」とは、雌親、すなわち胚珠ドナーである。ホウレンソウの育種においては、雌の親は通常、雄の花の少なくとも３週間前に雌の花を作る。これにより、Ｆ１交配種の種子産生において自家受粉する雌の親系統の存在を防止または強く減少する。
【００７９】
「選抜（elite）ホウレンソウ植物」とは、植物、典型的には、栽培者が商業的に望ましい産物を収穫することを可能にする望ましい農業形質をもたらす遺伝子型を有する交配種である。「選抜親系統」とは、その交配後代に望ましい農業形質をもたらす遺伝子型を有する近交系の親である。さらに、「選抜雌親」とは良好な種子の生産者である。
【００８０】
「Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３等」とは、２つの親植物または親系統間の交配後の連続する関連世代を指す。２つの植物または系統を交配することによって産生される種子から生育した植物は、Ｆ１世代と呼ばれる。Ｆ１植物を自家受粉すると、Ｆ２世代等になる。
【００８１】
「交配種」とは、１つの植物系統または品種と別の植物系統と交配させることにより収穫された種子、および前記種子から生育した植物または植物部分を指す。
【００８２】
「交配」とは、２つの親植物の交配を指す。同様に「受粉」とは、異なる植物からの２つの配偶子の結合による受精を指す。
【００８３】
「自家受粉」とは、植物の自らの受粉、すなわち同じ植物からの配偶子の結合を指す。
【００８４】
本明細書において「伝統的な育種技術」という用語は、育種家に公知の交配、戻し交配、自家受粉、選択、染色体倍加、倍加単数体産生、胚救出（embryo rescue）、橋渡し種（bridge species）の使用、プロトプラスト融合、マーカー利用選抜（marker assisted selection）、突然変異育種等（すなわち、遺伝子改変／形質転換／トランスジェニック法以外の方法）を包含し、これらによって、例えば、ＲＰＦ１５耐性遺伝子が取得、同定、選択および／または移入され得る。
【００８５】
「戻し交配」とは、ＲＰＦ１５耐性遺伝子によって付与されるＰｆｓ耐性等の（単一の）形質を１つの遺伝的背景（「ドナー」とも呼ばれる；一般的に劣性の遺伝的背景であるが、必ずしもそうではない）から別の遺伝的背景（「再生親」または「レシピエント」とも呼ばれる；一般的に優性の遺伝的背景ではあるが、必ずしもそうではない）から移すことができる育種方法を指す。交配の産物（例えば、ドナー、例えばホウレンソウの野生近縁種と、レシピエント、例えば栽培ホウレンソウ系統との交配によって得られるＦ１植物；またはＦ１の自家受粉により得られるＦ２植物またはＦ３植物等）は、優性の遺伝的背景を持つ親（またはレシピエント）、例えば栽培された親に「戻し交配」される。戻し交配を繰り返した後、ドナーの遺伝的背景の形質、例えばＲＰＦ１５遺伝子は、再生された遺伝的背景に組み込まれる。この文脈における「遺伝子変換（gene converted）」または「変換植物（conversion plant）」または「単一遺伝子座変換（single locus conversion）」という用語は、戻し交配により作出され、再生親の所望の形態学的および／または生理学的特徴のすべてが、ドナーの親から移入された１つ以上の遺伝子（例えば、ＲＰＦ１５耐性遺伝子）に加えて回復されている植物を指す。
【００８６】
「再生」とは、in vitroの細胞培養物または組織培養物または栄養繁殖物からの植物の発生を指す。
【００８７】
「栄養繁殖（vegetative propagation）」、「栄養生殖（vegetative reproduction）」または「クローン繁殖」は本明細書において互換的に使用され、植物部分を取り、その植物部分から少なくとも根が形成されることを意味し、前記植物部分は、例えば、葉、葉の部分、茎、茎の部分、柄、柄の部分、芽、芽の部分、つぼみまたはつぼみの部分、挿し木、根、根の部分、根の先端、葉柄、葉柄の部分、子葉、子葉の部分、花、花の部分、花びら、花びらの部分、雄しべ、雄しべの部分、葯、葯の部分、花粉、柱頭、柱頭の部分、花柱、花柱の部分、子房、子房の部分、胚珠、胚珠の部分、種子、種子の部分、種皮、胚、胚の部分、胚軸、胚嚢、果実、果実の部分、細胞、プロトプラスト、カルス、小胞子、分裂組織、形成層である。植物全体が栄養繁殖によって再生される場合、「栄養繁殖物」または「栄養繁殖植物」とも呼ばれる。
【００８８】
「単一遺伝子座が変換された（変換）植物」とは、戻し交配を含むまたはからなる植物育種技術によって作出された植物を指し、ホウレンソウ植物の所望の形態学的および／または生理学的特性の実質的にすべてが、戻し交配技術を介して、および／または遺伝子形質転換によって植物に移入されている単一遺伝子座（例えば、ドナーからのＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子座）の特徴に加えて回復されている。
【００８９】
「導入遺伝子」または「キメラ遺伝子」とは、形質転換によってホウレンソウ植物のゲノムに導入されたＤＮＡ配列を含む遺伝子座を指す。そのゲノムに安定に組み込まれた導入遺伝子を含む植物は、「トランスジェニック植物」と呼ばれる。
【００９０】
「Ｐｆｓ」または「Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ」または「Ｐ．ｅｆｆｕｓａ」または「べと病」とは、卵菌類のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．のレースを指す。この定義には、少なくとも公式に認定されたレースおよび単離株が含まれる。Ｐｆｓ１〜Ｐｆｓ１７とは、公式に認定されたレースを指し、
これは、オランダのＮａｋｔｕｉｎｂｏｕｗ，  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  ４０，  ２３７０  ＡＡ  Ｒｏｅｌｏｆａｒｅｎｄｓｖｅｅｎから、またはＩＳＦ（国際種子連盟）により提供される参考資料を介して入手することができるホウレンソウの識別宿主（differential host）により識別することができる。公式に認定された病原性レースは広く存在している。「識別宿主」または「識別」とは、ａ．ｏ．オランダのＮａｋｔｕｉｎｂｏｕｗ，  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  ４０，  ２３７０  ＡＡ  Ｒｏｅｌｏｆａｒｅｎｄｓｖｅｅｎから、またはＩＳＦ（国際種子連盟）により提供される参考資料を介して入手することができる、Ｐｆｓレース１〜１７を識別するためのホウレンソウの識別宿主を指す。Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレース１６は、米国カリフォルニア州サリナスで最初（２０１５年３月）に同定され、後に広まった。その当初の指定はＵＡ２０１５１９Ｂであり、「識別品種の標準的な一連のセットにおける疾患の発生に基づいて特徴付けられた」。「レースＰｆｓ：１６は、Ｖｉｒｏｆｌａｙ、Ｒｅｓｉｓｔｏｆｌａｙ、Ｃｌｅｒｍｏｎｔ、Ｌａｚｉｏ、ＰｉｇｅｏｎおよびＭｅｅｒｋａｔの識別ホストに感染することができるが、Ｃａｌｉｆｌａｙ、Ｃａｍｐａｎｉａ、Ｂｏｅｉｎｇ（Ａｖｅｎｇｅｒ）、Ｌｉｏｎ、ＷｈａｌｅおよびＣａｌａｄｏｎｉａには感染することができない。」公式に認定されたレースになる可能性がある他の多くの単離株が存在する。Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅの重要な単離株はＵＡ０５１４である。
【００９１】
「Ｐｆｓ耐性植物」または「べと病耐性植物」、または「Ｐｆｓ耐性」もしくは「Ｐｆｓ耐性表現型」を有する植物とは、例えば、制御環境条件下における定性的耐性アッセイで決定されるような、Ｐｆｓの１つ以上の病原性レース（および病原性単離株）に対する耐性を有するホウレンソウ植物を指す。そのような耐性アッセイでは、複数の植物の遺伝子型（例えば、少なくとも１０の植物の少なくとも２つの複製）は、レースまたは単離株の胞子嚢懸濁液（sporangial suspension）を接種され、適切な条件下でインキュベートされる。適切なインキュベーション期間後（例えば、接種後７、８、９、１０、１１日またはそれ以上）、植物の症状を評価します。感受性のコントロールは、症状の評価時に胞子形成を示すはずである。子葉（および／または本葉／葉）に胞子形成を示す植物は「感受性」と見なされ、子葉（および／または本葉／葉）に胞子形成を示さない植物は「耐性」と見なされる。接種された植物の８５％超（好ましくは９０％または９５％超）が「耐性」植物として分類される植物遺伝子型は、レースまたは単離株に対する耐性を有すると見なされる。試験においては、栽培品種Ｖｉｒｏｆｌａｙ等の感受性のコントール植物の８５％超の接種植物（好ましくは９０％または９５％超の植物）が胞子形成を示すはずである。本発明における適切な試験は実施例に記載されているか、またはＩｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２００７  （Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｖｏｌ  ９１  Ｎｏ．  １１，  ｉｎ  Ｍａｔｅｒｉａｌｓ  ａｎｄ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｎ  ｐａｇｅ  １３９２  −  １３９４）もしくはＩＳＦ（国際種子連盟）のウェブサイト上のＣｏｒｒｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０，  “Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｓｐｉｎａｃｈ  Ｄｏｗｎｙ  Ｍｉｌｄｅｗ：  Ｐｅｒｏｎｓｐｏｒａ  ｆｅｒｉｎｏｓａ  ｆ．ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ  （Ｐｆｓ）”に記載されている。述べたように、いくつかのレースに対して、耐性は「中等度（intermediate）の耐性」としてさらにサブ分類され得、いくつかの植物がいくつかの小さな兆候を進展し得るように、耐性レベルがいくらか異なることを示す。本技術分野において、これは、耐性の記号の周りに丸括弧を付けることにより、すなわち「（−）」により示される。
【００９２】
本明細書において「ＲＰＦ１５」とは、ホウレンソウの野生近縁種からの単一遺伝子を指し、これは（遺伝子がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合には）少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を付与し、かつ、（少なくとも遺伝子がホモ接合型である場合には、しかしながら、おそらくは遺伝子がヘテロ接合型である場合にも）Ｐｆｓレース１〜７、レース１２および１４に対する（中等度の）耐性、ならびに単離株ＵＡ０５１４および／またはＰｆｓの他の病原性単離株に対するさらなる耐性をさらに付与する。本発明の一つの態様において、ホモ接合型のＲＰＦ１５によって付与される耐性は、Ｐｆｓレース１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１６および１７に対するものである本明細書において、耐性表現型は「ＲＰＦ１５遺伝子によって付与されるＰｆｓ耐性表現型」とも呼ばれる。本発明のさらなる態様において、ＲＰＦ１５は、ホウレンソウの野生近縁種であるドナーからの遺伝子移入断片上、または遺伝子移入断片の部分上に位置する。本発明のさらに別の態様において、ＲＰＦ１５はホウレンソウの野生近縁種から移入され、一つの態様において、ホウレンソウの野生近縁種はＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａである。本発明のさらなる態様において、ＲＰＦ１５は、第１のＤＮＡマーカーと第２のＤＮＡマーカーとの間に位置する。さらに別の態様において、ＲＰＦ１５は、配列番号１のヌクレオチド１０６のアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列における同等の位置のアデニンであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４のシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列における同等の位置のＣであるＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドに物理的に連結される。
【００９３】
「遺伝子座（locus）」（遺伝子座（loci）複数形）という用語は、例えば、遺伝子（例えば、ＲＰＦ１５遺伝子）または遺伝的マーカーが見出される染色体上の特定の場所または複数の場所または部位を意味する。本発明のホウレンソウにおいて、ＲＰＦ１５遺伝子を含む耐性遺伝子座は、ホウレンソウの野生近縁種から、例えば、Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ（すなわちドナー植物）の耐性系統から栽培ホウレンソウへ移入される。ＲＰＦ１５遺伝子が見出される遺伝子座は、配列番号１のヌクレオチド１０６のアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列における同等の位置のアデニンであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４のシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列における同等の位置のＣであるＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドに物理的および遺伝的に連結される。
【００９４】
「対立遺伝子」という用語は、特定の遺伝子座における遺伝子の１つ以上の代替形態のいずれかを意味し、そのすべての対立遺伝子は、特定の遺伝子座における１つの形質または特徴に関連する。生体の二倍体細胞においては、特定の遺伝子の対立遺伝子が染色体上の特定の場所、または遺伝子座（遺伝子座  複数形）に存在する。１つの対立遺伝子は、相同染色体のペアの各染色体に存在する。二倍体植物種は、特定の遺伝子座に多数の異なる対立遺伝子を含み得る。これらは、遺伝子の同一の対立遺伝子（ホモ接合）または２つの異なる対立遺伝子（ヘテロ接合）であり得る。
【００９５】
「遺伝子」という用語は、細胞内でメッセンジャーＲＮＡ分子（ｍＲＮＡ）に転写される領域（転写領域）と、作動可能に連結された調節領域（例えば、プロモーター）とを含む（ゲノム）ＤＮＡ配列を意味する。したがって、遺伝子の異なる対立遺伝子は、遺伝子の異なる代替形態であり、例えば、コードされたタンパク質のゲノムＤＮＡ配列（例えば、プロモーター配列、エクソン配列、イントロン配列等）、ｍＲＮＡおよび／またはアミノ酸配列における１つ以上のヌクレオチドの違いの形態として存在し得る。
【００９６】
「対立性検定（allelism test）」とは、２つの植物に見られる２つの表現型が同じ遺伝子によって、または異なる遺伝子によって決定されるかどうかを試験することができる遺伝子試験を指す。例えば、試験する植物を互いに交配させ、Ｆ１を自家受粉させ、Ｆ２後代間の表現型の分離が決定される。分離比は、遺伝子が対立遺伝子であるかどうかを示す。例えば、対立性検定を用いて、ＨＭＢＮ対立遺伝子がｄｗ−１およびｄｗ−２対立遺伝子について対立遺伝子ではなく、異なる遺伝子座にあることが示されているＥＰ１８１６９０８Ｂ１を参照されたい。
【００９７】
「遺伝子移入断片」または「遺伝子移入セグメント」または「遺伝子移入領域」とは、交配、または戻し交配等の伝統的な育種技術によって、同じまたは関連する種の別の植物に導入される染色体断片（または染色体部分または領域）を指し、すなわち、遺伝子移入断片とは、（戻し交配等の）「遺伝子移入される」という動詞によって言及される育種方法の結果である。ホウレンソウにおいては、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ等のホウレンソウの野生近縁種を使用して、野生ゲノムの断片を栽培ホウレンソウのゲノムに移入することができる。したがって、そのようなホウレンソウ植物は「Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａのゲノム」を有するが、ゲノム中にホウレンソウの野生近縁種の断片、すなわちドナー植物の遺伝子移入断片を含む。「遺伝子移入断片」という用語は染色体全体を包含するものではなく、染色体の一部のみを包含するものであることが理解される。遺伝子移入断片は大きくなる可能性があり、例えば、染色体の半分までになることがあるが、好ましくは、約１５Ｍｂ以下、約１０Ｍｂ以下、約９Ｍｂ以下、約８Ｍｂ以下、約７Ｍｂ以下、約６Ｍｂ以下、約５Ｍｂ以下、約４Ｍｂ以下、約３Ｍｂ以下、約２Ｍｂ以下、約１Ｍｂ（１００００００塩基対に等しい）以下、または約０．７Ｍｂ、０．６Ｍｂ、０．５Ｍｂ（５０００００塩基対に等しい）以下、約２０００００ｂｐ（２００キロ塩基対に等しい）以下、約１０００００ｂｐ（１００ｋｂ）以下、約５００００ｂｐ（５０ｋｂ）以下、約２５０００ｂｐ（２５ｋｂ）以下のようにより小さいことが好ましい。当業者であれば、所望の形質を付与する遺伝子を保持するそのようなドナー植物からの断片を、レシピエント植物に遺伝子移入することができる。その配列は特定のドナーに固有であるため、遺伝子移入断片を含む植物の全ゲノムのシーケンシングは、そのような遺伝子移入断片を特定のドナー種に由来するものとして同定し、特定のドナーを特定することを可能にする。
【００９８】
「ＲＰＦ１５耐性遺伝子を含む遺伝子移入断片」または「ＲＰＦ１５遺伝子移入断片」とは、ドナーに由来しＲＰＦ１５遺伝子を含む染色体の部分を指す。本発明の一つの態様において、遺伝子移入断片は、ドナーと栽培ホウレンソウ植物との間で多型であり、遺伝子移入断片の同定を可能にする、ＳＮＰ＿０１またはＳＮＰ＿０２等の１つ以上のマーカーをさらに含む。したがって、一つの態様において、ＲＰＦ１５遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１０６のアデニン（Ａ）、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置のアデニンであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４のシトシン（Ｃ）、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置のＣであるＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドと連結される。
【００９９】
「ＳＮＰ＿０１ドナーヌクレオチド」とは、第１のＳＮＰ位置、すなわち配列番号１のヌクレオチド位置１０６に存在するヌクレオチドアデニン、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置のアデニンを指す。
【０１００】
「ＳＮＰ＿０２ドナーヌクレオチド」とは、第２のＳＮＰ位置、すなわち配列番号３のヌクレオチド位置１８４に存在するヌクレオチドシトシン、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置のシトシンを指す。
【０１０１】
「配列同一性」は、全体的または局所的整列アルゴリズムを用いた２つのヌクレオチド配列の整列によって決定することができる。したがって、シーケンスとは、例えば、ＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴプログラムまたはＥｍｂｏｓｓプログラム「Ｎｅｅｄｌｅ」（デフォルトのパラメータを使用する、以下を参照されたい）において、それらが最適に配置されている場合に、「実質的に同一」または「本質的に類似」と呼ばれるように、配列同一性の少なくとも特定の最小のパーセンテージ（下記でさらに定義される）が共有されることを指す。これらのプログラムは、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈのグローバルアラインメントアルゴリズムを用いて、２つの配列を全長にわたって整列させ、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。一般的に、ギャップ生成ペナルティ＝１０およびギャップ伸長ペナルティ＝０．５のデフォルトのパラメータが使用される（ヌクレオチドおよびタンパク質のアラインメントの両方について）。ヌクレオチドの場合、使用されるデフォルトのスコアリングマトリックスはＤＮＡＦＵＬＬである。パーセント配列同一性の配列アラインメントおよびスコアは、例えば、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）のワールドワイドウェブで入手可能なＥＭＢＯＳＳ等のコンピュータープログラムを使用して決定することができる。あるいは、配列の類似性または同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等のデータベースに対して検索することによって決定することができるが、ヒットを検索してペアで整列させ、配列の同一性を比較する必要がある。パーセント配列同一性が少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上である場合（デフォルトのパラメータ、すなわち、ギャップ生成ペナルティ＝１０、ギャップ伸長ペナルティ＝０．５、核酸のスコアリングマトリックスＤＮＡＦＵＬＬを用いて、Ｅｍｂｏｓｓ「Ｎｅｅｄｌｅ」によって決定される）、２つの核酸配列は「実質的な配列同一性」を有する。
【０１０２】
同じ染色体上の遺伝子座間（例えば、分子マーカー間および／または表現型マーカー間）の「物理的距離」とは、塩基対（ｂｐ）、キロ塩基対（ｋｂ）またはメガ塩基対（Ｍｂ）で表される実際の物理的距離である。
【０１０３】
同じ染色体上の遺伝子座間（例えば、分子マーカー間および／または表現型マーカー間）の「遺伝的距離」は、交差頻度または組み換え頻度（ＲＦ）によって測定され、センチモルガン（ｃＭ）で示される。１ｃＭは１％の組換え頻度に対応する。組換え体が見つからない場合、ＲＦはゼロであり、遺伝子座は物理的に非常に接近しているか、または同一である。２つの遺伝子座が離れているほど、ＲＦは高くなる。
【０１０４】
「分子マーカー」は、特定のゲノムまたは染色体の位置または一塩基多型（ＳＮＰ）に関連するＤＮＡの断片であり、目的の遺伝子に近い、好ましくはＲＰＦ１５に近い染色体上に存在する。分子マーカーを使用して、ＤＮＡの特定の配列、またはゲノム内もしくは染色体上の特定の位置を特定し、または遺伝子移入断片を特定することができる。本明細書において、分子マーカーアッセイによって「検出可能」である１つ以上の分子マーカーについて言及する場合、これは、該マーカーが検出不可能でなければ、植物または植物部分がゲノム中に１つ以上のマーカーを含むことを意味する。一つの態様において、マーカーは一塩基多型（ＳＮＰ）であるが、ＲＦＬＰ、ＡＦＬＰ、ＲＡＰＤ、ＩＮＤＥＬ、ＤＮＡシーケンシング等の他の分子マーカーも同様に使用することができる。一つの態様において、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（ＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド）、または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンは、ＲＰＦ１５遺伝子およびＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片に連結しており、該耐性ドナーヌクレオチドは、（ＲＰＦ１５遺伝子を含む）遺伝子移入断片を含む植物、植物組織または植物部分を選択し、したがって耐性植物または植物部分（上記で定義したとおり）を選択および／または生成するのに使用することができる。さらなる態様において、配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（ＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド）、または配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンは、ＲＰＦ１５遺伝子およびＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片に連結しており、該耐性ドナーヌクレオチドは、（ＲＰＦ１５遺伝子を含む）遺伝子移入断片を含む植物、植物組織または植物部分を選択し、したがって耐性植物または植物部分（上記で定義したとおり）を選択および／または生成するのに使用することができる。遺伝子移入断片と栽培ホウレンソウとの間で多型である他のＳＮＰは、例えば、シーケンスシングまたはファインマッピングにより当業者により開発することができる。
【０１０５】
「隣接マーカー」とは、染色体上でＲＰＦ１５遺伝子の両側にある分子マーカーである。ファインマッピングまたはシーケンシングを用いて、隣接マーカーを同定することができる。例えば、ＳＮＰ＿０１および／またはＳＮＰ＿０２は、ＲＰＦ１５遺伝子の異なる側に位置する別のマーカーにより連結され、隣接マーカーを形成する。
【０１０６】
ＲＰＦ１５に連結されている、および／またはＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片上にある、例えば、ＳＮＰ＿０１またはＳＮＰ＿０２とＲＰＦ１５との間にあるか、またはＲＰＦ１５遺伝子座に隣接するか、または前記遺伝子座に物理的に連結されている他の分子マーカーを開発することができる。これは、例えば、ＲＰＦ１５遺伝子のファインマッピング、または染色体または染色体領域のシーケンシングによって行うことができる。これらのいずれかのマーカーは、ＲＰＦ１５遺伝子を含み、遺伝子がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合に少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６（好ましくは少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７）に対してＰｆｓ耐性（上記で定義される通り）を付与する遺伝子移入断片の同定および／または選択に使用することができる。例えば、ファインマッピングを行って、遺伝子移入断片上のＲＰＦ１５遺伝子に一層密接に連結されているマーカーを見つけることができる。ファインマッピングには、ＲＰＦ１５遺伝子がある染色体の異なる組み換えイベントを含む、（例えば、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子と感受性植物、例えば感受性系統または品種との交配種から派生した）組み換え植物の集団の作製、および（例えば、遺伝子移入断片の異なる大きさのサブ断片を含む）これらの組み換え植物のＲＰＦ１５遺伝子およびＤＮＡマーカーによって付与された耐性表現型についての分析を含む。これにより、ＲＰＦ１５遺伝子の位置をより正確に定義することができ、遺伝子に一層密接に連結されているマーカーを特定することができる。同様に、ＮＣＩＭＢアクセッション番号４２６０８として寄託された種子に見られる断片よりも小さい遺伝子移入断片（すなわち、サブ断片）を含む植物を作出することができる。あるいは、シーケンシングにより、ＲＰＦ１５遺伝子に密接に連結しているか、または該遺伝子内にあるマーカーを同定することができる。
【０１０７】
「マーカーアッセイ」または「遺伝子型アッセイ」という用語は、マーカー遺伝子型、例えばＳＮＰ遺伝子型を決定するために使用することができるアッセイを指す。例えば、ＳＮＰマーカーは、ＫＡＳＰアッセイ（ｋｐｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ．ｃｏ．ｕｋのワールドワイドウェブを参照されたい）または当業者に公知の他のアッセイを使用して検出することができる。
【０１０８】
「マーカー利用選抜」または「ＭＡＳ」または「マーカー支援育種」または「ＭＡＢ」とは、特定の遺伝子座または特定の染色体領域（例えば、遺伝子移入断片）に遺伝的および物理的に連結されている分子マーカーの存在を使用して、特定の遺伝子座または領域（例えば、遺伝子移入断片）の存在について植物（例えば、後代）を選択するプロセスである。例えば、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）、または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）、または配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＣであるＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチド、またはＲＰＦ１５遺伝子の近傍のいずれかのマーカーをＭＡＳにおいて用いて、ＲＰＦ１５遺伝子を有するホウレンソウ植物または植物部分を選択することができる。
【０１０９】
参照配列（reference sequence）に対して「実質的な配列同一性」を有するか、または参照配列と少なくとも８０％、例えば、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する核酸配列（例えば、ＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）に言及する場合、一つの実施形態においては、前記ヌクレオチド配列は所定のヌクレオチド配列と実質的に同一であると見なされ、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用して同定することができる。別の実施形態においては、核酸配列は、所定のヌクレオチド配列と比較して、１つ以上のヌクレオチドが置換、挿入または欠失されているが、依然としてストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用して同定することができる。
【０１１０】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」を使用して、所定のヌクレオチド配列と実質的に同一であるヌクレオチド配列を同定することができる。ストリンジェントな条件はシーケンスに依存しており、状況によって異なる。一般に、ストリンジェントな条件は、定義されたイオン強度とｐＨにおける特定の配列の熱融点（Ｔｍ）より約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（定義されたイオン強度とｐＨの下で）標的の配列の５０％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする温度である。典型的には、ｐＨ７で塩濃度が約０．０２モルであり、温度が少なくとも６０℃であるストリンジェントな条件が選択される。塩濃度を下げたり、温度を上げたりすることにより、ストリンジェンシーが高くなる。ＲＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば、１００ｎｔのプローブを使用したノーザンブロット）のストリンジェントな条件は、例えば、０．２×ＳＳＣにより６３℃で２０分間、または同等の条件で少なくとも１回洗浄を含む条件である。ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション（例えば、１００ｎｔのプローブを使用したサザンブロット）のストリンジェントな条件は、例えば、０．２×ＳＳＣにより少なくとも５０℃、通常約５５℃の温度で２０分間、または同等の条件で少なくとも１回（通常２回）の洗浄を含む条件である。Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）およびＳａｍｂｒｏｏｋ  ａｎｄ  Ｒｕｓｓｅｌｌ（２００１）も参照されたい。
【０１１１】
配列の簡単な説明
配列番号１は、配列番号１のヌクレオチド１０６においてＳＮＰ＿０１のアデニン（Ａ）を有するＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａの配列を示す。配列番号１は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中に存在する。
配列番号２は、配列番号２のヌクレオチド１０６においてグアニン（Ｇ）を有する、ＳＮＰ＿０１のＳ．ｏｌｅｒａｅａ（再生親）の配列を示す。
配列番号３は、配列番号３のヌクレオチド１８４におけるＳＮＰ＿０２のシトシン（Ｃ）を含むＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａを示す。配列番号３は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中に存在する。
配列番号４は、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ（再生親）のＳＮＰ＿０１の配列を示し、配列番号４のヌクレオチド１８４におけるグアニン（Ｇ）を含む。
配列番号５は、ＷＯ２０１５０５４３３９に記載されるべと病ＱＴＬに隣接するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ由来の隣接配列の１つを示す（ＷＯ２０１５０５４３３９の配列番号１に対応する）。
配列番号６は、ＷＯ２０１５０５４３３９に記載されるべと病ＱＴＬに隣接する、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ由来の別の隣接配列を示す（ＷＯ２０１５０５４３３９の配列番号２に対応する）。
配列番号７は、本発明の種子に存在する、配列番号５に対応する領域におけるＳ．ｏｌｅｒａｃｅａの配列を示し、代表的なサンプルは、番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託されている。
配列番号８は、本発明の種子に存在する、配列番号６に対応する領域におけるＳ．ｏｌｅｒａｃｅａの配列を示し、代表的なサンプルは、番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託されている。
配列番号９は、図１のＳｐｉｎａｃｈｂａｓｅ配列を示す。
配列番号１０は、図２のＳｐｉｎａｃｈｂａｓｅ配列を示す。
【図面の簡単な説明】
【０１１２】
【図１】図１は、Ｓｐｉｎａｃｈｂａｓｅの参照ゲノム配列と配列番号１（下段）とのアラインメントを示す。配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（ＳＮＰ＿０１）および参照ゲノムの同等の位置におけるアデニンを太字とする。ＳＮＰ＿０１はＳｐｉｎａｃｈｂａｓｅの中国系統の配列と多型ではないが、本発明で使用される感受性の再生親と比較して多型である。
【図２】図２は、Ｓｐｉｎａｃｈｂａｓｅの参照ゲノム配列と配列番号３（下段）とのアラインメントを示す。配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（ＳＮＰ＿０２）および参照ゲノムの同等の位置におけるグアニンを太字とする。
【図３】図３は、配列番号５（上段）と配列番号７（下段）とのアラインメントを示す。
【図４】図４は、配列番号６（上段）と配列番号８（下段）とのアラインメントを示す。
【発明の詳細な説明】
【０１１３】
本発明の植物および方法
一つの実施形態において、本発明によれば、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６、好ましくは少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を有する栽培ホウレンソウ植物が提供され、前記耐性は単一の優性遺伝子によって付与される。
【０１１４】
単一遺伝子は、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａの遺伝子１５に対する耐性のために、ＲＰＦ１５と呼ばれる。したがって、本発明によれば、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する優性耐性を付与するＲＰＦ１５が提供される。別の実施形態において、少なくともＲＰＦ１５遺伝子がホモ接合型の場合、ＲＰＦ１５はＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース１〜７に対する耐性をさらに付与し、少なくともＲＰＦ１５遺伝子がホモ接合型の場合、少なくともレース１２および１５に対する中等度の耐性をさらに付与する。本発明のさらなる態様において、ＲＰＦ１５は、単離株ＵＡ０５１４および／またはＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａの他の潜在的な病原性単離株に対する耐性を付与する。これらの他の単離株は、野外で発達する将来的な単離株を潜在的に含む。この遺伝子は、レース１０および１５に対する耐性を付与しない。ＲＰＦ１５遺伝子はＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａにおいて同定され、戻し交雑を介してＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ、好ましくは栽培ホウレンソウに導入された。ＲＰＦ１５遺伝子は単一の遺伝子である。この遺伝子は、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を優性遺伝的に継承する；すなわち、ホモ接合型のＲＰＦ１５を含む植物が、Ｖｉｒｏｆｌａｙ品種等の感受性植物と交配される場合、そのＦ１後代はすべて、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を示し、Ｆ２後代においては、前記耐性は、３（耐性）：１（感受性）の比率で分離する。ＲＰＦ１５遺伝子は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中にホモ接合型で存在し、すなわち、ＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片はホモ接合型で存在する。ＲＰＦ１５遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０１、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを有する耐性ドナーヌクレオチドＳＮＰ＿０２に連結されている。したがって、寄託された種子中に存在する遺伝子移入断片は、配列番号１および配列番号３を含み、すなわち、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン、および配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシンを含み、該アデニン（および配列番号１）およびシトシン（および配列番号３）はいずれも、寄託された種子中にホモ接合型で存在する（寄託された種子のＳＮＰ＿０１遺伝子型は「ＡＡ」であり、寄託された種子のＳＮＰ＿０２遺伝子型は「ＣＣ」である）。
【０１１５】
本発明の一つの態様において、Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ由来のＲＰＦ１５遺伝子は、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ種の栽培ホウレンソウ植物のゲノムにおいて遺伝子がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を付与する。
【０１１６】
Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａからのＲＰＦ１５遺伝子は、Ｐｆｓレース１０および１５に対する耐性を付与しない。
【０１１７】
本発明のさらなる態様において、Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ由来のＲＰＦ１５遺伝子は、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ種の栽培ホウレンソウ植物のゲノムにおいて少なくとも遺伝子がホモ接合型である場合、少なくともＰｆｓレース７、８、９、１１、１３および１６および１７、または少なくともレース６、７、８、９、１１、１３および１６および１７、または少なくともレース１〜９、１１、１３および１６および１７に対する耐性、ならびにレース１２および１４に対する耐性（少なくとも中等度の耐性）を付与し、かつ、ヘテロ接合型である場合、それらのレースのいくつかに対する耐性を付与する。
【０１１８】
本発明の別の態様において、ＲＰＦ１５は、栽培ホウレンソウ植物のゲノムにおいて少なくともＲＰＦ１５（またはＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型である場合、少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を付与し、かつ、レース１〜７、１２および１４に対するさらなる耐性を付与し、遺伝子（または遺伝子を含む遺伝子移入断片）がヘテロ接合型である場合、それらのレースのいくつかに対する耐性を付与する。
【０１１９】
本発明のさらなる態様において、ＲＰＦ１５は、栽培ホウレンソウ植物のゲノムにおいて、少なくともレース８、９、１１、１３および１６、好ましくは８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を付与し（ホモ接合型またはヘテロ接合型である場合）、かつ、ＲＰＦ１５（またはＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合、Ｐｆｓレース１に対するさらなる耐性を付与し、かつ／またはＲＰＦ１５（またはＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合、Ｐｆｓレース２に対するさらなる耐性を付与し、かつ／またはＲＰＦ１５（またはＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合、Ｐｆｓレース３に対するさらなる耐性を付与し、かつ／またはＲＰＦ１５（またはＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合、Ｐｆｓレース４に対するさらなる耐性を付与し、かつ／またはＲＰＦ１５（またはＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合、Ｐｆｓレース５に対するさらなる耐性を付与し、かつ／またはＲＰＦ１５（またはＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合、Ｐｆｓレース６に対するさらなる耐性を付与し、かつ／またはＲＰＦ１５（またはＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合、Ｐｆｓレース７に対するさらなる耐性を付与する。本発明のさらなる態様において、ＲＰＦ１５は、栽培ホウレンソウ植物のゲノムにおいてＲＰＦ１５（またはＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合、レース１２および／または１４に対する耐性、および／または単離株ＵＡ０５１４および／または別の病原性Ｐｆｓ単離株に対する耐性を付与する。
【０１２０】
本発明のさらなる態様において、ＲＰＦ１５遺伝子移入は、栽培ホウレンソウ植物において少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する耐性、好ましくは８、９、１１、１３、１６および１７に対する優性耐性を付与し、ＲＰＦ１５遺伝子（または該遺伝子を含む遺伝子移入断片）は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＡであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＣであるＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドと連結されている（含む）。これらのレースに対する耐性は、該耐性が優性であるため、遺伝子移入断片がホモ接合型またはヘテロ接合型である場合に付与される。他のレース、すなわちレース１〜７、１２および１４、ならびにＵＡ０５１４に対する耐性については、ＲＰＦ１５遺伝子がホモ接合型である場合にのみ耐性が見られるのか、それともＲＰＦ１５遺伝子がヘテロ接合型の場合にも（これらの１つ以上のレースについて）耐性が見られるのかは明らかではなく、すなわち、これはレースに対する耐性が優性であるか劣性であるかに依存する。レースに対する耐性が優性であるか劣性であるかは、例えば、ＲＰＦ１５についてヘテロ接合である植物および／またはＲＰＦ１５について分離された植物における耐性アッセイにより試験することができる。
【０１２１】
本発明のさらなる態様において、ＲＰＦ１５遺伝子移入断片は、栽培ホウレンソウ植物において少なくともＰｆｓレース１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１６および１７に対する耐性を付与し、ＲＰＦ１５遺伝子（または該遺伝子を含む遺伝子移入断片）は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＡであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＣであるＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドに連結されている（含む）。これらのレースに対する耐性は、少なくとも遺伝子移入断片がホモ接合型である場合に付与され、レースに対する耐性が優性であるか劣性であるかに応じて、任意に遺伝子移入断片がヘテロ接合型である場合にも付与される。Ｐｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する耐性が優性に付与されていることが見出された。レース１７に対する耐性も優性であると考えられる。ＲＰＦ１５がレース１、２、３、４、５、６、７、１２、１４および／または単離株ＵＡ０５１４に対する耐性を優性に付与するか劣性に付与するかを決定する必要がある。すでに述べたように、当業者であればこれを容易に決定することができる。ＲＰＦ１５（またはＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片）がホモ接合型で存在する場合、栽培ホウレンソウ植物はこれらのレースに対して耐性を有することが知られている。寄託された種子において、遺伝子移入断片はホモ接合型で存在する。したがって、上記の種子から生育された植物を、ＲＰＦ１５遺伝子を欠く植物と交配させてＦ１植物を作出することができ、耐性の付与が、ＲＰＦ１５がヘテロ接合型である場合に見られるのか（優性）、またはＲＰＦ１５がホモ接合型である場合にのみ見られるのか（劣性）を決定するために、Ｆ１および／またはＦ２および／またはＦ３個体群について、各Ｐｆｓレースに対する耐性を試験して決定することができる。すでに述べたように、前記遺伝子は、レース１０および１５に対する耐性を付与しない。
【０１２２】
ＲＰＦ１５遺伝子（すなわち、ＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片）をホモ接合型で含む栽培ホウレンソウ系統の種子の代表的なサンプルが、ブダペスト条約の下、ＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄにおいて、２０１６年７月１２日にＮｕｎｈｅｍｓ  ＢＶによってアクセッション番号４２６０７として寄託されている。したがって、本発明の一つの実施形態において、ＲＰＦ１５耐性遺伝子（または該遺伝子を含む遺伝子移入断片）は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中、またはアクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子から生育させた植物またはその部分から、または前記種子または前記植物または前記その部分に由来する細胞培養物において見出される遺伝子（または遺伝子移入断片）である。明らかに、ＮＣＩＭＢ４２６０８の後代も含まれ、その後代が核ゲノムにＲＰＦ１５遺伝子（または該遺伝子を含む遺伝子移入断片）を含むことは明らかである。
【０１２３】
本明細書において「ＲＰＦ１５遺伝子を含む」栽培ホウレンソウ植物または植物部分について言及する場合、これはホウレンソウ植物または植物部分が遺伝子移入断片を含み、この断片が染色体上のＲＰＦ１５遺伝子座において野生Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナーからのＲＰＦ１５遺伝子を含むことを意味すると理解される。一つの態様において、野生Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナーは寄託された種子と同じドナーであり、すなわち、Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａのＲＰＦ１５遺伝子およびＲＰＦ１５遺伝子を含む断片の配列は、寄託された種子におけるのと同じヌクレオチド配列を有する。これは、例えば、全ゲノムシーケンスによって決定することができる。あるいは、野生Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナーは、（例えば、同じＰｆｓ耐性を付与する）ＲＰＦ１５遺伝子を含むが、寄託された種子のＲＰＦ１５遺伝子または寄託された種子のＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する、異なる系統であり得る。
【０１２４】
ＲＰＦ１５をホモ接合型で含むＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ遺伝子移入断片を含み、種子の代表的なサンプルがＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された栽培ホウレンソウ系統は、Ｐｆｓレース１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４、１６、１７およびＵＡ０５１４に対する耐性を有する。
【０１２５】
ＲＰＦ１５遺伝子は、ホウレンソウの野生近縁種からの遺伝子移入断片上にある。本発明の一つの態様において、遺伝子移入断片はＳｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ由来であり、ＲＰＦ１５遺伝子に加えて、ＲＰＦ１５遺伝子に連結され、ＲＰＦ１５を含む断片を選択するために使用することができる分子マーカーを含む。配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（ＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド）は、遺伝子移入断片のＲＰＦ１５遺伝子に連結されていることが見出された。配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（ＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチド）は、遺伝子移入断片のＲＰＦ１５遺伝子に連結されていることが見出された。遺伝子移入断片を欠く感受性系統は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるグアニン（配列番号２に示す）および配列番号３のヌクレオチド１８４におけるグアニン（配列番号４に示す）またはＳｐｉｎａｃｈｂａｓｅに公開されるように第３染色体のヌクレオチド６０７７５１におけるグアニンのいずれかを含むことが見いだされ、（Ｅｍｂｏｓｓ  ｐｒｏｇａｍ  Ｎｅｅｄｌｅを使用した）対でのアラインメントから分かるように、このヌクレオチドは配列番号３または４のヌクレオチド１８４と同等の（図２の上段の配列の位置１９０にも示される）ヌクレオチドである。したがって、感受性のＳ．ｏｌｅｒａｃｅａ植物系統の配列は、ＳＮＰマーカー領域で変動を示し得る。したがって、一つの態様において、ＲＰＦ１５遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニンと連結しているか、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＡと連結しており、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシンと連結しているか、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＣと連結している。本発明の一つの態様において、耐性遺伝子ＲＰＦ１５は、ＲＰＦ１５によって付与されるのと同じＰｆｓ耐性表現型を有し（例えば、寄託された種子）、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（ＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド）、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを含み、かつ配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（ＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチド）、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンを含むＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ系統から取得されるかまたは取得可能である。
【０１２６】
本発明の別の態様において、ＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託されたホウレンソウ種子に存在する（および、それから得ることができる；またはそれから得られる；または誘導することができる；またはそれから誘導される）遺伝子移入または（ＲＰＦ１５を保持している）そのサブ断片であり、前記遺伝子移入断片（またはサブ断片）は、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に耐性を付与するＲＰＦ１５遺伝子を含む。一つの態様において、遺伝子移入断片は配列番号１および／または配列番号３も含む。
【０１２７】
寄託された種子中に存在する遺伝子移入断片は、特定のドナー系統に由来し、したがって独特のヌクレオチド配列を有する。寄託された種子から生育された植物と別のホウレンソウ植物とを交配し、遺伝子移入断片を含む後代を選択することにより、断片全体を他のホウレンソウ系統または品種に簡単に移すことができる。選択は、様々な方法、Ｐｆｓ耐性表現型により、および／または配列番号１を有する後代の選択により、および／またはシーケンシング、ＳＮＰ遺伝子型決定（ＳＮＰ＿０１のアデニンを含む後代の選択等）によることができる。
【０１２８】
断片は、１つ以上の分子マーカー（例えば、ＳＮＰマーカー、ＡＦＬＰマーカー、ＲＦＬＰマーカー等）、特に栽培ホウレンソウと野生ドナーからの遺伝子移入断片との間で多型である分子マーカーによっても同定することができる。典型的には、マッピング集団はマーカーの生成に使用される。例えば、遺伝子移入断片に特異的なマーカーを、ＲＰＦ１５遺伝子から６ｃＭ、５ｃＭ、４ｃＭ、３ｃＭ、２ｃＭ、１ｃＭ以内、および／またはＲＰＦ１５遺伝子から１Ｍｂ、０．９Ｍｂ、０．８Ｍｂ、０．７Ｍｂ、０．６Ｍｂ、０．５Ｍｂ、０．４Ｍｂ、０．３Ｍｂ、０．２Ｍｂ、０．１Ｍｂ以内またはそれ未満に生成することができる。特に好ましい実施形態において、ＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片は、ＮＣＩＭＢ４２６０８の種子を植物に生育させる工程を含む方法によって得ることができる。
【０１２９】
別の実施形態によれば、ＮＣＩＭＢ４２６０８の種子中に存在する遺伝子移入断片のサブ断片上にＲＰＦ１５遺伝子を含む栽培ホウレンソウ植物が提供される。そのような植物は、自家受粉またはＮＣＩＭＢ４２６０８の種子から生育させた植物と別のホウレンソウ植物とを交配し、より短い遺伝子移入断片を有する、すなわち、遺伝子移入断片内の相同染色体間で組換えイベントが発生し、それにより断片の一部が再結合されている後代を選択することにより作出することができる。例えば、ＮＣＩＭＢ４２６０８の種子中に存在する元のフルサイズの遺伝子移入断片の異なるサブ断片を有する組換え近交系を作出することができる。Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナー由来の元の遺伝子移入断片は、３．０Ｍｂ以下のサイズ、特に２．０Ｍｂ以下のサイズであると推定される。したがって、ＲＰＦ１５を含むサブ断片は、３．０Ｍｂ未満、１．０Ｍｂ、０．７Ｍｂ、０．６Ｍｂ、０．５Ｍｂ、０．４Ｍｂ、０．３Ｍｂ、０．２Ｍｂ、０．１Ｍｂまたはそれ以下等の２．０Ｍｂ未満であり、ＲＰＦ１５遺伝子を含む。任意に、サブ断片は配列番号１および／または配列番号２も保持する。
【０１３０】
上述したように、ＲＰＦ１５のマッピング集団において、Ｓ．ｔｕｒｋｉｓｔａｎｉｃａドナー由来のＳＮＰ＿０１のＳＮＰヌクレオチドは、配列番号２の位置１０６に示されるように、再生親（遺伝子移入を欠くＳ．ｏｌｅｒａｃｅａ）のＳＮＰヌクレオチドであるグアニンではなく、配列番号１の位置１０６におけるアデニンであり、前記ドナーのＳＮＰ＿０２のＳＮＰヌクレオチドは、配列番号４の位置１８４に示されるように、前記再生親のＳＮＰヌクレオチドであるグアニンではなく、配列番号３の位置１８４におけるシトシンである。配列番号２および配列番号４は、感受性系統において見られる。したがって、ＲＰＦ１５を含む遺伝子移入断片についてホモ接合性である二倍体ホウレンソウ植物は、各相同染色体のＳＮＰ＿０１位置におけるアデニン（すなわち、「ＡＡ」遺伝子型）、および各相同染色体のＳＮＰ＿０２位置におけるシトシン（すなわち、「ＣＣ」遺伝子型）を有する。遺伝子移入断片がヘテロ接合性であるホウレンソウ植物は、再生親の背景に応じて、一方の染色体のＳＮＰ＿０１位置にアデニンを有し、もう一方の染色体の同等の位置にグアニン、シトシンまたはチミンを有し（すなわち、「ＡＧ」または「ＡＣ」または「ＡＴ」遺伝子型）、かつ再生親の背景に応じて、一方の染色体のＳＮＰ＿０２位置にシトシンを有し、もう一方の染色体の同等の位置にグアニン、アデニンまたはチミンを有する（すなわち、「ＣＧ」または「ＣＡ」または「ＣＴ」遺伝子型）。
【０１３１】
本発明は、寄託された種子中に存在するＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナー由来の遺伝子移入断片（ＲＰＦ１５を含み、かつ、任意に配列番号１；および配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン、および／または配列番号３；および配列番号３のヌクレオチド１８４におけるアデニンを含む）、およびホウレンソウのゲノムの第３染色体上の同じ染色体座上にＲＰＦ１５を含む他のＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナー由来の遺伝子移入断片であって、寄託された種子中に存在する遺伝子移入断片の配列と１００％同一ではない（例えば、寄託された種子中に存在する遺伝子移入断片と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％の配列同一性を有する）ヌクレオチド配列を有する遺伝子移入断片を包含する。一つの態様において、そのような遺伝子移入断片はＳＮＰ＿０１および／またはＳＮＰ＿０２（ここで、ＳＮＰ＿０１は、ヌクレオチド１０６または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列におけるアデニンを有し、かつＳＮＰ＿０２は、ヌクレオチド１８４または配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列におけるシトシンを有する）。したがって、配列番号１および／または配列番号３のマーカー配列はまた、そのような異なるＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナーにおいて１００％同一でなくてもよい。本発明はさらに、ＲＰＦ１５を含み、任意に配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＡ、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＣを含む、他のＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナー由来のそのような遺伝子移入断片のサブ断片も包含する。
【０１３２】
したがって、本発明はまた、ＲＰＦ１５遺伝子を含む上記遺伝子移入断片のサブ断片を包含し、前記サブ断片は、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくは８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を付与するＲＰＦ１５遺伝子を含み、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中に存在する遺伝子移入断片の一部であるか、寄託された種子中に存在する遺伝子移入断片と実質的な配列同一性を有する異なるＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナーの遺伝子移入断片の一部である。本発明は、ＲＰＦ１５遺伝子を含み、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニンまたは配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチドを有し、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシンまたは配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンであるＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドを有するサブ断片を包含する。したがって、一つの態様において、遺伝子移入サブ断片は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された栽培ホウレンソウ種子中に見られる断片から得られ（および、それから得ることができ；またはそれから誘導することができ；またはそれから誘導され）、サブ断片はＲＰＦ１５遺伝子（および遺伝子によって付与されたＰｆｓ耐性表現型、および任意に配列番号１および／または配列番号３）を保持し、別の態様において、遺伝子移入断片は、第３染色体の同じ遺伝子座にＲＰＦ１５遺伝子を含む別のＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナーから得られる。このようなより短い遺伝子移入断片を含むホウレンソウ植物は、本発明の植物と別のホウレンソウ植物とを交配させ、ＲＰＦ１５遺伝子によって付与された耐性表現型を保持するが、より短い遺伝子移入断片を含む組み換え後代を選択することにより作出することができる。当業者であれば、例えば、寄託された種子から生育させた植物と別の栽培ホウレンソウ植物（例えば、Ｐｆｓレース８、９、１１、１３、１６、１７の１つ以上に対して感受性のある植物）と交配させ、次いで、Ｆ１後代を自家受粉させてＦ２集団を作出し、遺伝子移入断片において発生した組み換え（乗り換えイベント）を同定することができる。
【０１３３】
上述したように、ＷＯ２０１５０５４３３９では、第６染色体上のＱＴＬについて開示されている。遺伝子座はＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａから遺伝子移入され、広範囲のＰｆｓ耐性、特に「Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）のレース７、１０、１１、１２、１３および１４に対する耐性、またはＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ（Ｐｆｓ）のレース１〜１４およびＵＡ４７１２に対する耐性」を付与する。（ＵＡ４７１２はＰｆｓレース１５である）。第６染色体は実際にはＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅの第３染色体に対応している。本明細書において配列番号５および６として提供される、ＱＴＬに隣接する２つのＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ配列は、１．４Ｍｂ（配列番号５）および０．７Ｍｂ（配列番号６）に位置し、このＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａのＱＴＬは、第３染色体の０．７〜１．４Ｍｂに広がる断片上に位置する。
【０１３４】
発明者らはまた、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａのＱＴＬに隣接する配列が、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中に存在するかどうかについて試験を行った。実施例でさらに説明するように、寄託された種子中には、左側または右側の隣接配列（すなわち、配列番号５および６）のいずれも存在しなかった。その代わりに、Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａＤＮＡは、寄託された種子中の対応する染色体領域に存在した（配列番号７および８として提供される）。
【０１３５】
したがって、一つの態様において、ＲＰＦ１５を含む遺伝子移入を有する本発明の栽培ホウレンソウ植物は、ＷＯ２０１５０５４３３９に開示されている広範囲の耐性遺伝子座を含まない。
【０１３６】
ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中に存在する、ＲＰＦ１５遺伝子を含む本発明の遺伝子移入断片は、配列番号５または配列番号６を含まない。配列番号５および配列番号６は、ＷＯ２０１５０５４３３９に開示されているＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ由来の耐性付与遺伝子移入と連結されている。配列番号５および配列番号６は、本発明の遺伝子移入断片、またはＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された本発明の種子中には存在しない。ＲＰＦ１５遺伝子を含む、ＮＣＩＭＢ４２６０７として寄託された種子は、配列番号５と同等の領域において配列番号７を含む。ＲＰＦ１５遺伝子を含む、ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子は、配列番号６と同等の領域において配列番号８を含む。
【０１３７】
ＲＰＦ１５遺伝子は、いくつかの病原性Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａレース、すなわち少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に優性耐性を付与する単一の遺伝子であるため有用である。ＲＰＦ１５は、耐性ホウレンソウ品種を作出するのに使用することができる。当技術分野において、耐性遺伝子は一般に積み重ねられて（他の相補的耐性遺伝子と組み合わされて）、多数のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ種に対する耐性をもたらす。ハイブリッド品種において耐性遺伝子を積み重ねるために、遺伝子が優性耐性を付与する必要がある。一部の耐性遺伝子は対立遺伝子であり、可能な組み合わせの数を制限するため、これは二倍体ホウレンソウにおいてＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ耐性を付与するために特に重要である。したがって、本明細書に記載される物（例えば、植物、植物の部分、子孫植物等）は、先行技術に対して大幅な改善もたらすものである。
【０１３８】
一つの態様において、本発明によれば、ホウレンソウＦ１ハイブリッド植物および植物の部分（およびＦ１ハイブリッドを生育させることができる種子）が提供され、一つの親は、本発明のＲＰＦ１５遺伝子をホモ接合型で含む近交系である。他の親は感受性であり得、またはＲＰＦ１、ＲＰＦ２、ＲＰＦ３、ＲＰＦ４、ＲＰＦ５、ＲＰＦ６、ＲＰＦ７、ＲＰＦ８、ＲＰＦ９、ＲＰＦ１１、ＲＰＦ１２、ＲＰＦ１４、（ＷＯ２０１３／０６４４３６の）Ｒ６遺伝子、（ＷＯ２０１７／１９４０７３の）ｐ１０遺伝子、（ＷＯ２０１７／０８４７２４の）Ｒ１５遺伝子、またはＵＳ２０１７０１２７６４１もしくはＵＳ２０１７０１２７６４２に開示される遺伝子からなる群から選択されるＰ．ｆａｒｉｎｏｓａを含む近交親系統である。
【０１３９】
また、第１の親ホウレンソウ植物と第２の親ホウレンソウ植物とを交配し、得られたハイブリッドホウレンソウ種子を収穫することを含む、ハイブリッドホウレンソウ種子の生産方法が提供され、第１の親ホウレンソウ植物は、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくは８、９、１１、１３、１６および１７に対する優性耐性を付与するＲＰＦ１５遺伝子を含み、レース１０および１５に対する耐性を有するため；および／またはレース１〜７、１２および１４に対する耐性を有するために、別のべと病耐性遺伝子との積み重ねが必要である。したがって、一つの態様において、他の親は、ＲＰＦ１、ＲＰＦ２、ＲＰＦ３、ＲＰＦ４、ＲＰＦ５、ＲＰＦ６、ＲＰＦ７、ＲＰＦ８、ＲＰＦ９、ＲＰＦ１１、ＲＰＦ１２、（ＷＯ２０１３／０６４４３６の）Ｒ６遺伝子、（ＷＯ２０１７／１９４０７３の）ｐ１０遺伝子、（ＷＯ２０１７／０８４７２４の）Ｒ１５遺伝子、またはＵＳ２０１７０１２７６４１もしくはＵＳ２０１７０１２７６４２に開示される遺伝子からなる群から選択されるＰ．ｆａｒｉｎｏｓｅ耐性遺伝子を含む近交親系統である。また、Ｆ１ハイブリッドホウレンソウ種子、およびこの方法で生産された種子から生育されたハイブリッドホウレンソウ植物または植物部分も包含される。
【０１４０】
レース１０および／または１５に対する追加の耐性を提供するために、以下の遺伝子が最も好適である：レース１０についてＲＰＦ２、ＲＰＦ１１、ＲＰＦ１２、レース１５についてＲＰＦ１、ＲＰＦ２、ＲＰＦ４、ＲＰＦ６、ＲＰＦ７、ＲＰＦ８、ＲＰＦ１１、ＲＰＦ１２、Ｒ１５またはＵＳ２０１７０１２７６４１またはＵＳ２０１７０１２７６４２に開示される遺伝子。
【０１４１】
本発明の一つの態様において、ＲＰＦ１５耐性遺伝子を含むホウレンソウ植物は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子から生育されたホウレンソウ植物と別のホウレンソウ植物、例えば、Ｐｆｓ耐性遺伝子を欠くホウレンソウ植物（感受性植物）、または１つ以上の異なるＰｆｓ耐性遺伝子を含むホウレンソウ植物とを交配させることにより得ることができる（またはそれから得られる、またはそれから誘導することができる、またはそれから誘導される）。好適な感受性植物の例は、Ｖｉｒｏｆｌａｙ品種である。
【０１４２】
本発明のホウレンソウ植物は、例えば、ホモ接合型のＲＰＦ１５を含む近交系、またはホモ接合型またはヘテロ接合型のＲＰＦ１５遺伝子を含むＦ１ハイブリッドである。
【０１４３】
一つの実施形態において、本発明のＲＰＦ１５耐性遺伝子は、他のＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａの耐性遺伝子または耐性遺伝子座（例えば、ＲＰＦ１〜ＲＰＦ９、ＲＰＦ１１またはＲＰＦ１２、Ｒ６、Ｒ１５、またはＷＯ２０１５０５４３３９、ＷＯ２０１７１９４０７３およびＥＰ２９１２９４０に開示されている耐性等）と、または細菌（例えば、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｙｒｉｎｇａｅ  ｐｖ．ｓｐｉｎａｃｅａ；  Ｅｒｗｉｎｉａ  ｃａｒｏｔｏｖｏｒａ）、真菌（例えば、Ａｌｂｕｇｏ  ｏｃｃｉｄｅｎｔａｌｉｓ；Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ  ｄｅｍａｔｉｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅ；Ｓｔｅｍｐｈｙｌｉｕｍ  ｂｏｔｒｙｏｓｕｍ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａ）、ウイルス（例えば、カーリートップ（curly top）を引き起こすウイルス、または斑（speckles）を引き起こすウイルス、またはホウレンソウの胴枯れを引き起こすウイルス、またはホウレンソウのモザイクを引き起こすウイルス）、または線虫（例えば、クローバーシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｔｒｉｆｏｌｉｉ）、ネグサレセンチュウ（Ｐｒａｔｙｌｅｎｃｈｕｓ  ｓｐｐ．）、ネコブセンチュウ（Ｍｅｌｏｉｄｏｇｙｎｅ  ｓｐｐ．）またはサトウキビシストセンチュウ（Ｈｅｔｅｒｏｄｅｒａ  ｓｃｈａｃｈｔｉｉ））に対する耐性等の他の形質と組み合わせることができる。組み合わせは、例えば、伝統的な育種技術、例えば、本発明の植物に１つ以上の形質を導入するために、または本発明の植物のＲＰＦ１５遺伝子をそのような１つ以上の追加の形質を有する別のホウレンソウ植物に導入するために戻し交配することによって、または遺伝子編集または形質転換を含む他の技術によって行うことができる。一つの態様において、本発明の植物は、ＲＰＦ１５遺伝子のドナーとして使用され、一方で、別の態様において、本発明の植物は、１つ以上の他の形質のレシピエントとして使用される。当業者であれば、ＲＰＦ１５遺伝子を他の適切な耐性遺伝子と組み合わせることにより、現在知られているすべてのＰｆｓレース、すなわちＰｆｓ１〜１７に対する耐性を有するハイブリッド植物を得ることができる。例えば、ＲＰＦ１５を、ＲＰＦ１１またはＲＰＦ１２と組み合わせて、現在知られているすべてのＰｆｓレースに対する耐性を得ることができる。
【０１４４】
ＲＰＦ１５耐性遺伝子、またはそれが位置する遺伝子移入断片、またはＲＰＦ１５を含む断片のサブ断片は、当業者に公知の様々な方法によって、本発明の植物から別のホウレンソウ植物に移入することができる。したがって、ＲＰＦ１５耐性遺伝子のドナーは、例えば、寄託された種子から生育された植物、またはその後代植物であり得る。
【０１４５】
したがって、ＲＰＦ１５耐性遺伝子のドナーは、ＮＣＩＭＢ４２６０８、または前記寄託物から生育された植物の後代、前記植物の後代、または前記植物に由来する細胞培養物から生育された植物であり得る。導入されたＲＰＦ１５遺伝子は、レシピエント植物において、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性、およびＰｆｓレース１〜７、１２および１４の１つ以上（またはすべて）に対する耐性、およびＰｆｓ単離株ＵＡ０５１４に対する耐性を付与することができる。
【０１４６】
ＲＰＦ１５耐性遺伝子、またはそれが位置する遺伝子移入断片、または該遺伝子を含むそのサブ断片を使用して、ハイブリッド植物（例えば、Ｆ１ハイブリッド）、または近交系植物もしくはホモ接合性植物、任意に倍加半数体を作出することができる。さらなる態様において、近交系またはホモ接合性植物は、雄親系統、好ましくは雄選抜親（mail elite parent）である。さらに別の態様において、近交系またはホモ接合性植物は、雌親系統、好ましくは雌選抜親（female elite parent）である。雄の親系統と雌の親系統と交配して、ＲＰＦ１５（またはＲＰＦ１５を含み、任意に配列番号１および／または配列番号３を含む遺伝子移入断片）をホモ接合型で含むＦ１ハイブリッド種子を作出することができる。
【０１４７】
一つの実施形態において、親系統は、ＲＰＦ１５耐性遺伝子のドナーとして機能する。前記ドナー植物は、他のホウレンソウ植物と交配させることができ、Ｆ１、Ｆ２、Ｆ３または次世代の自家受粉後代、戻し交配後代（例えば、ＢＣ１、ＢＣ２、ＢＣ１Ｓ１、ＢＣ２Ｓ１、ＢＣ１Ｓ２等）等を含む後代を得ることができる。本発明の最初の植物と同じＰｆｓ耐性表現型を有する植物を、後代の中から同定および選択することができる。同様に、後代において、遺伝子移入断片は、遺伝子移入断片（例えば、ＳＮＰ＿０１）またはシーケンシング等を示すマーカーを検出することにより検出することができる。
【０１４８】
一つの態様において、近交系は、少なくともＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を有するＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅａｃｅａ種の栽培植物であり、前記耐性は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ（ＲＰＦ１５）から遺伝子移入される単一の遺伝子によって付与され、前記遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）、または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）、または配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＣであるＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドに連結されている。
【０１４９】
ＲＰＦ１５耐性遺伝子、またはそれが位置する遺伝子移入断片、またはそのサブ断片は、サボイ、セミサボイ、フラットリーフもしくはスムーズリーフまたはオリエンタルのホウレンソウ等の様々なタイプのホウレンソウに導入することもできる。好ましくは、サボイ、セミサボイ、フラットリーフもしくはスムーズリーフまたはオリエンタルの栽培ホウレンソウ植物はハイブリッド植物である。
【０１５０】
一つの実施形態において、Ｐｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を有する栽培ホウレンソウ植物が包含され、前記耐性は、ホウレンソウの野生近縁種、好ましくはＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａから移入された単一の優性遺伝子ＲＰＦ１５によって付与され、この遺伝子は、配列番号１または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、ＳＮＰ＿０１においてアデニンを有する配列、および／または配列番号３または配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、ＳＮＰ＿０２においてシトシンを有する配列に連結されている。ＲＰＦ１５遺伝子は、ホウレンソウの野生近縁種の様々な系統、特にＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ種の系統で同定することができ、栽培ホウレンソウに遺伝子移入することができる。そうするために、当業者であれば、例えば、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであり、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）を有するか、かつ／または配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンを有するＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチドの存在について、そのような系統をスクリーニングし、かつ／またはＰｆｓ耐性表現型および任意に遺伝的形質（単一遺伝子として）を試験してその系統にＲＰＦ１５が含まれているかどうかを判断することができる。任意に、シーケンス、ファインマッピング、対立性検定等を行って、系統内の遺伝子が実際にＲＰＦ１５遺伝子であるかどうかを確認することもできる。
【０１５１】
特定の態様において、栽培植物におけるＰｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａに対する耐性は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａからの遺伝子移入断片によって付与される。したがって、栽培ホウレンソウ植物は、Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａに由来するＲＰＦ１５遺伝子を含み、任意に配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、好ましくは少なくとも９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＡであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）を有するかまたは配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＣを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドに連結されている。
【０１５２】
耐性遺伝子ＲＰＦ１５の存在は、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６（好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７）についての耐性試験、任意にＰｆｓレース１〜７、１２および１４の１つ以上に対する耐性、および／または単離株ＵＡ０５１４および／または他のＰｆｓ単離株に対する耐性によっても決定することができる。さらに、レース１０および１５に対する感受性もＲＰＦ１５の存在を裏付けるものである。別の実施形態において、遺伝子がドナーからレシピエント植物に移入されたことを示すために、Ｐｆｓレースに対する耐性、またはＰｆｓレースの選択を使用することができる。したがって、例えば、交配におけるレシピエント親が特定のＰｆｓレースに対する耐性を欠く場合、そのレースに対して耐性を有する後代植物の選択によりＲＰＦ１５遺伝子の移入が示される。
【０１５３】
栽培ホウレンソウ植物（すなわち、ホウレンソウ系統または品種）における耐性遺伝子の存在についての試験は、例えば、制御された環境条件下での定性的耐病性アッセイを含む。当業者であれば、そのようなアッセイに異なるプロトコルを適用することに精通している。要するに、植物の遺伝子型が試験される複数の植物の苗木（例えば、少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０またはそれ以上の植物）に、試験するＰｆｓレースの種菌を接種し、苗木を病原菌にとって好ましい条件下でインキュベートする。インキュベーションの数日後、植物を、感染症状、特に子葉および／または葉（例えば、最初の本葉）における胞子形成について評価し、各植物を、「耐性」（胞子形成の兆候を示さない）または「感受性」（胞子形成を示す）として分類した。すべての植物の遺伝子型の特定の割合が「耐性」と分類される場合、例えば約８５％超、９０％超、９５％超、９８％超、９９％超（または１００％）である場合、ホウレンソウ植物の遺伝子型はテストしたレースに対する耐性を有する。当然のことながら、１つ以上の対照植物（例えば、感受性の系統または感受性品種、耐性の系統または品種）も同じ処理および環境条件を使用したアッセイに含め、アッセイが期待どおりに機能することを確認する必要がある。
【０１５４】
ＲＰＦ１５の存在についてのこのような試験は、Ｐｆｓの任意の単離株またはレースを使用して、遺伝子についてホモ接合性またはヘテロ接合性である植物で行うことができる。遺伝子がヘテロ接合型で存在する場合において、試験により植物が耐性と分類される場合には、耐性は優性である。単純な試験は、耐性遺伝子を含む植物と少なくとも１つのＰｆｓレースに感受性である（すなわち、バックグラウンド耐性を有さない）植物とを交配させ、そのＰｆｓレースに対する耐性についてＦ１後代を試験することを含む。そのＦ１後代がそのＰｆｓレースに対する耐性を有する場合、耐性は優性であると結論付けられる。このような試験の結果、ＲＰＦ１５はＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくは１７に対する優性耐性を付与するという結論に至った。優性の単一遺伝子遺伝の別の適切な試験は、耐性遺伝子を含む植物と、すべてのＰｆｓレースに対して感受性である植物とを交配させ、その交配からの後代を自家受粉させてＦ２世代を作出し、Ｐｆｓレースに対する耐性の分離を観察することである。分離が、感受性植物に対する耐性植物の比として３：１である場合、耐性は優性一遺伝子性である。遺伝子がホモ接合型で存在する場合においてのみ、試験により植物が耐性と分類される場合には、耐性は劣性遺伝する。
【０１５５】
ホウレンソウ植物または植物部分（例えば、細胞）におけるＲＰＦ１５耐性遺伝子（または該遺伝子を含む遺伝子移入断片）の存在も直接的に決定することができる。当業者は、本発明のＲＰＦ１５を含む栽培ホウレンソウ植物（例えば、後代植物）またはホウレンソウ植物の部分、または細胞または細胞培養物のスクリーニング、選択または同定の方法が、ＳＰＦ＿０１等のＲＰＦ１５遺伝子または遺伝子座に連結された１つ以上の分子マーカーを検出することによって達成され得ることを認識する。したがって、一つの態様において、ＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）を有するかまたは配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＣを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチド、および／またはＲＰＦ１５に連結された他のいずれかの分子マーカー、および／またはＲＰＦ１５遺伝子を含むＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａの遺伝子移入断片の存在によって検出可能である。したがって、当業者によって、遺伝子移入断片を含むゲノム、特にゲノム中の第３染色体は、遺伝子移入断片を欠き、代わりにＳ．ｏｌｅｒａｃｅａのゲノム配列を含むゲノム、特にゲノムの第３染色体と区別することができる。
【０１５６】
ＲＰＦ１５遺伝子は第３染色体の最初に位置し、第３染色体の０Ｍｂで始まり２．０Ｍｂに至る領域（Ｓｐｉｎａｃｈｂａｓｅにおいて見出される）、特に０．４Ｍｂで始まり１．５Ｍｂで終わる領域に位置する。したがって、この領域がシーケンシングされ、Ｓ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ配列を含み、任意に遺伝子に連結されたＳＮＰ＿０１マーカー（配列番号１）および／またはＳＮＰ＿０２マーカー（配列番号３）も含み、植物がＲＰＦ１５遺伝子によって付与される耐性表現型を含む場合、植物または植物の部分（例えば、細胞）は、本発明のＲＰＦ１５遺伝子を含む。
【０１５７】
別の態様において、本発明によれば、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８の寄託物中に存在するように、遺伝子移入断片または遺伝子移入断片のサブ断片の一部としてＲＰＦ１５を含む栽培ホウレンソウ種子が提供される。本発明によれば、ＲＰＦ１５を含む複数の栽培ホウレンソウ種子も提供され、好ましくは容器内に含まれる。
【０１５８】
本発明によれば、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａのレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する優性耐性を付与し、かつ（潜在的に断片がホモ接合型である場合に限り）Ｐｆｓレース１〜７および単離株ＵＡ０５１４に対する耐性、任意にレース１２および１４、および／または他のＰｆｓ単離株に対する耐性を付与する、ホウレンソウの野生近縁種であるドナーからの遺伝子移入断片を含む栽培ホウレンソウ植物がさらに提供される。本発明の一つの態様において、断片はＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａから移入される。本発明の別の態様において、遺伝子移入断片は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中に存在する遺伝子移入、またはその断片の短い断片である。したがって、本発明は、上述の遺伝子移入断片のサブ断片を含む栽培ホウレンソウ植物も包含し、前記サブ断片は、Ｐｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する優性耐性、および（潜在的に断片がホモ接合型の場合に限り）Ｐｆｓレース１〜７、１２および１４に対する耐性および単離株ＵＡ０５１４および／または他のＰｆｓ単離株に対する耐性を付与する。本発明はさらに、前記サブ断片を含む栽培ホウレンソウ植物を包含し、前記サブ断片は、ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中に存在する遺伝子移入断片の一部である。より短いサブ断片は、ＲＰＦ１５遺伝子を保持する。
【０１５９】
本発明の栽培ホウレンソウ植物は、ハイブリッド植物、特にＦ１ハイブリッド、または近交系植物、例えば、Ｆ１ハイブリッド種子の生産またはホモ接合性植物、任意に倍加半数体植物の親として使用することができる近交系であり得る。
【０１６０】
ＲＰＦ１５遺伝子は、任意のホウレンソウ系統または品種に導入することができる。
【０１６１】
言い換えれば、ＲＰＦ１５遺伝子は、代表的なサンプルがＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子から生育された植物、またはそこから誘導されＲＰＦ１５遺伝子を保持するホウレンソウ植物からの遺伝子移入によって、他のホウレンソウ植物に導入することができる。したがって、寄託された種子は、寄託物から直接的に得ることはできないが、（例えば、後にリリースされる市販品種を通じて）間接的に得られ、本発明のＲＰＦ１５遺伝子を含むホウレンソウ植物と同様に、本発明のＲＰＦ１５耐性遺伝子の供給源である。
【０１６２】
ＲＰＦ１５遺伝子の他の供給源が、例えば、ホウレンソウの野生近縁種（特に、同じＰｆｓ耐性表現型を持ち、かつ／または本明細書において提供されるＲＰＦ１５に連結されたマーカーＳＮＰ＿０１および／またはＳＮＰ＿０２の一方または両方を含む他のＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａ系統）において同定され得、例えば、対立性検定を使用して、Ｐｆｓ耐性表現型を付与する別の遺伝子が同じ遺伝子であるかまたは異なる遺伝子であるかを決定することができる。同様に、シーケンシングを使用してＲＰＦ１５遺伝子の存在を確認することができる。別の遺伝子が同じ遺伝子であるかどうかを確認する別の方法は、本発明のＲＰＦ１５遺伝子に連結された少なくとも１つの分子マーカーの開発、および前記マーカーが別の遺伝子を含む植物で生じるかどうかを分析することを含む。適切なマーカーの例は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）、または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）、または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるＣを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドである。
【０１６３】
一つの態様において、以下の工程を含む、ＲＰＦ１５遺伝子を含む栽培ホウレンソウ植物を作出するための方法が提供される：
ａ）本明細書に記載されるＲＰＦ１５遺伝子を含むホウレンソウ植物と別のホウレンソウ植物とを交配させて後代植物を生産する工程；
ｂ）任意に工程ａの後代植物を１回以上自家受粉させて、次世代の自家受粉後代を生産し、任意に種子を生産する工程。
【０１６４】
一つの実施形態において、工程ａ）の別のホウレンソウ植物は、Ｐｆｓレース８、９、１１、１３および１６または１７の少なくとも１つに対して感受性である。さらなる実施形態において、工程ａ）の別のホウレンソウ植物は、近交系植物またはホモ接合性植物または雄親系統または雌親系統、または好ましくは選抜雄親系統または選抜雌親系統である。
【０１６５】
別の態様において、工程ａ）および任意に工程ｂ）を含む方法が提供され、下記の工程が続く：
ｃ）ＲＰＦ１５耐性遺伝子を含む工程ａまたはｂの後代植物を、後代植物が少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を有するかどうか、および／または配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニンまたは配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを含むかどうか、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンを含むかどうか；および／またはＲＰＦ１５遺伝子を含むＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａからの遺伝子移入断片を含むかどうかを決定することにより同定する工程；
ｄ）任意に工程ｃで同定された後代植物と別のホウレンソウ植物とを交配させて後代植物または後代種子を生産する工程。
【０１６６】
別の実施形態において、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する耐性、好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性を付与し、任意にＰｆｓレース１〜７、１２および１４の１つ以上に対する耐性、および／または単離株ＵＡ０５１４および／または他のＰｆｓ単離株に対する耐性を付与する）ＲＰＦ１５遺伝子を含むホウレンソウ植物が提供され、
ａ）ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子から得ることができる（または種子中に存在する）、配列番号１および／または配列番号３を含む遺伝子移入断片を含むホウレンソウ植物と、別のホウレンソウ植物とを交配させる工程；
ｂ）任意に工程ａの後代植物を１回以上自家受粉させて、次世代の自家受粉後代を生産し、任意に植物において生産された種子を収集する工程
を含む。
【０１６７】
一つの実施形態において、工程ａ）の別のホウレンソウ植物は、Ｐｆｓレース８、９、１１、１３および１６または１７の少なくとも１つに対して感受性である。さらなる実施形態において、工程ａ）の別のホウレンソウ植物は、近交系植物またはホモ接合性植物または雄親系統または雌親系統、または好ましくは選抜雄親系統または選抜雌親系統である。
【０１６８】
別の態様において、工程ａ）および任意に工程ｂ）を含む方法が提供され、下記の工程が続く：
ｃ）ＲＰＦ１５耐性遺伝子を含む工程ａまたはｂの後代植物を、後代植物が少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する耐性を有するかどうか、および／または配列番号１および／または配列番号３を含むかどうかを決定することにより同定する工程；
ｄ）任意に工程ｃで同定された後代植物と別のホウレンソウ植物とを交配させて後代植物または種子を生産する工程。
【０１６９】
両方の方法に関して、以下が本明細書に包含される：一つの態様において、工程ａ）の植物は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子中に見出されるＲＰＦ１５遺伝子を含む。ホウレンソウ植物は、寄託種子を用いることにより、または用いて作出され、該寄託種子はＰｆｓ耐性表現型（およびそれを付与するＲＰＦ１５遺伝子）を保持し、かつ、任意に配列番号１および／または配列番号３を保持する。これには、寄託種子を使用して作出された市販のホウレンソウ品種が含まれる。したがって、ａ）のホウレンソウ植物は、例えば、ＮＣＩＭＢ４２６０８に見出されるような（または、それから得ることができる；それから得られる；それから誘導することができる；それから誘導される）、本発明のＲＰＦ１５遺伝子を含む。
【０１７０】
工程ｃ）における選択（または同定）は、表現型に基づいて（すなわち、Ｐｆｓ耐性アッセイを使用して）、および／または、例えば、ＲＰＦ１５遺伝子、または配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンであるＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドの遺伝子座に連結された分子マーカーの検出等の分子的方法、またはシーケンシング等の他の方法に基づいて行うことができる。
【０１７１】
上記の方法において、工程（ａ）におけるホウレンソウ植物は、好ましくは、ホモ接合型でＲＰＦ１５遺伝子（すなわち、ＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片またはそのサブ断片）を含む。工程ａ）において、耐性を有するホウレンソウ植物は、一つの態様において、ａ）における植物が耐性であるＰｆｓレースの少なくとも１つに対して感受性である別のホウレンソウ植物と交配される。ｂ）における２番目の親が、ａ）における植物が耐性であるＰｆｓレースの少なくとも１つに対して感受性であるホウレンソウ植物である場合、工程（ｄ）および／または（ｆ）における選択は、現在そのレースに対して耐性を有する植物の選択に基づく。
【０１７２】
上記の方法において、ＲＰＦ１５遺伝子によって付与されるＰｆｓ耐性表現型を保持するが、寄託された種子中に存在するものよりも小さい遺伝子移入断片を有する植物を選択および／または同定することもできる。これにより、遺伝子移入断片と結びついたＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａの否定的な特性を取り除くことができるため、利点がある。したがって、組み換えにより遺伝子移入断片のサイズを縮小し、より小さな遺伝子移入断片を含むが耐性付与遺伝子を保持する植物を選択することが好ましい。したがって、一つの態様において、ホウレンソウ植物においてＰｆｓ耐性付与部分（すなわち、ＲＰＦ１５遺伝子）が保持される限り、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子に由来する（または、それから誘導される；またはそれから誘導することができる；またはそれから得られる；またはそれから得ることができる）すべてのサイズの遺伝子移入断片を有するホウレンソウが本明細書に包含される。上述したように、その存在は、当技術分野において、表現型的に、および／または公知の分子的方法を使用して試験／選択することができる。
【０１７３】
以下の工程を含む、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６（好ましくは８、９、１１、１３、１６および１７）に対する優性な耐性を有するホウレンソウ植物を作出する方法も提供される：
ａ）Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ種の第１のホウレンソウ植物と、Ｐｆｓレース８、９、１１、１３および１６または１７の１つ以上に対して感受性である第２のホウレンソウ植物とを交配させる工程であって、第１のホウレンソウ植物はＰｆｓレース８，９、１１、１３、１６および１６に対する（好ましくはレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する）耐性を有し、前記耐性はＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａから遺伝子移入された単一の遺伝子によって付与され、該遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを有するＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）を有するかまたは配列番号３と少なくとも９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドに連結されている；
ｂ）交配の後代から生育させた植物を１回以上自家受粉させて、次世代の自家受粉後代を生産する、および／または、上記の交配の後代から生育させた植物または次世代の自家受粉後代から生育させた植物と、Ｐｆｓレース８、９、１１、１３、１６または１７の１つ以上に対して感受性であるホウレンソウ植物とを戻し交配させる工程；および
ｃ）工程ｂ）における後代植物の中から、工程ａ）における第１の親植物の単一遺伝子を含むホウレンソウ植物を同定する工程。
【０１７４】
一つの態様において、（ＲＰＦ１５遺伝子に連結している）ＳＮＰ＿０１の遺伝子型を使用して、工程ｃ）において植物が同定される。ＳＮＰ＿０１のヌクレオチドはアデニン、すなわちドナーヌクレオチドである。したがって、一つの態様において、植物は、ドナーＳＮＰ＿０１ヌクレオチドを含む遺伝子移入断片を含む。
【０１７５】
別の態様において、（ＲＰＦ１５遺伝子に連結している）ＳＮＰ＿０２の遺伝子型を使用して、工程ｃ）において植物が同定される。ＳＮＰ＿０２のヌクレオチドはシトシン、すなわちドナーヌクレオチドである。したがって、一つの態様において、植物は、ドナーＳＮＰ＿０２ヌクレオチドを含む遺伝子移入断片を含む。
【０１７６】
上記の方法によって生産された植物もまた、本発明の実施形態である。
【０１７７】
また、ホウレンソウ植物または植物部分において、本明細書に記載されるＲＰＦ１５遺伝子の存在をスクリーニング、同定または検出するための方法であって：
ａ）以下からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰマーカーを検出する分子マーカーアッセイを使用して、栽培ホウレンソウ植物または植物部分、またはそのような植物または植物部分のＤＮＡをスクリーニングする工程：
ｉ）配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを有するＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド；
ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチド；
ｉｉｉ）ＲＰＦ１５遺伝子またはＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片に連結している別のマーカー；および、任意に、
ｂ）配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーＳＮＰヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンであるＳＮＰ＿０２の耐性ドナーＳＮＰヌクレオチド；および／またはＲＰＦ１５遺伝子またはＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片に連結している別のマーカーを含む植物または植物部分を同定または選択する工程
を含む方法が提供される。
【０１７８】
さらに別の態様において、栽培ホウレンソウ植物が本明細書に記載されるＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片を含むかどうかを検出する方法が提供され、前記方法は：
ａ）以下からなる群から選択される少なくとも１つのＳＮＰマーカーを検出する分子マーカーアッセイを使用して、植物または植物部分（または該植物または植物部分から得られるＤＮＡ）をスクリーニングする工程を含む：
ｉ）配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを有するＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド；および／または
ｉｉ）配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチド；および／または
ｉｉｉ）ＲＰＦ１５遺伝子またはＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片に連結している別のマーカー。
【０１７９】
上記の方法のいずれかから誘導される、得られる、得ることができる、または誘導することができる、または同定もしくは検出される栽培ホウレンソウ植物または植物部分も本発明の実施形態であり、前記植物は、ＲＰＦ１５またはＲＰＦ１５遺伝子を含む前記植物部分（または、該遺伝子、および任意に該遺伝子に連結しているマーカーを含む遺伝子移入断片）によって付与される少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する（好ましくは少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する）耐性を有する。
【０１８０】
本発明の植物を使用して、ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子から得ることができる（それに存在する；それから誘導することができる；それから得られる、またはそれから誘導される）本発明のＰｆｓ耐性遺伝子を有するまたは保持する後代を作出することができる。後代を作出するために、本発明のホウレンソウと別のホウレンソウ植物とを１回以上自家受粉および／または交配させる、種子を収集することができる。後代植物におけるＲＰＦ１５遺伝子の存在は、Ｐｆｓ耐性表現型、および／またはＲＰＦ１５遺伝子または遺伝子座に連結している分子マーカー（例：ＳＮＰマーカー）等の分子法によって決定することができる（すなわち、ＲＰＦ１５遺伝子を含む後代植物を同定／選択することができる）。
【０１８１】
本発明によれば、さらに、ＲＰＦ１５遺伝子の使用（および、該遺伝子を含む遺伝子移入断片の使用）により、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する（好ましくは少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する）耐性、任意にレース１、２、３、４、５、６、７、１２、１４および単離株ＵＡ０５１４に対する耐性を付与することが意図される。これに対して、同時に、前記遺伝子（遺伝子移入断片）は、Ｐｆｓレース１０および１５に対する耐性を付与しない。
【０１８２】
一つの実施形態において、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する（好ましくは少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する）耐性、任意にさらにＰｆｓレース１〜７、１２、１４の１つ以上に対する耐性、および／または任意に単離株ＵＡ０５１４および／または他のＰｆｓ単離株に対する耐性を有する栽培ホウレンソウ植物を作出するための、ホウレンソウ植物、または（例えば、自家受粉によって得られる）前記植物の後代、または再生可能な細胞もしくは細胞培養物、または栄養繁殖させることができる植物部分の使用が提供され、前記植物の代表的な種子は、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託されている。
【０１８３】
別の実施形態において、本発明は、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する（好ましくは少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する）耐性、任意にさらにＰｆｓレース１〜７、１２、１４の１つ以上に対する耐性、および／または任意に単離株ＵＡ０５１４および／または他のＰｆｓ単離株に対する耐性を有する栽培ホウレンソウ植物を作出するための、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子から、または（例えば、自家受粉により得られる）その後代から得ることができる遺伝子移入断片によって付与される少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する（好ましくは少なくとも８、９、１１、１３、１６および１７に対する）耐性を有するホウレンソウ植物の使用が意図される。
【０１８４】
種子
本発明によれば、本発明の任意の植物を生育させることができる種子が提供される。さらに、本発明によれば、そのような種子が複数提供される。本発明の種子は、（ＲＰＦ１５耐性表現型を有する植物に基づく）表現型的に、および／または分子的方法を使用して、ＲＰＦ１５耐性遺伝子の存在により、他の種子と区別することができる。
【０１８５】
一つの態様において、複数の種子が容器（例えば、バッグ、カートン、缶等）に包装される。容器はどのようなサイズでも構わない。種子は、パッキング前にペレット化され（錠剤またはペレットを形成し）、および／または種子コーティングを含む様々な化合物で処理される。
【０１８６】
本発明の一つの実施形態において、ホウレンソウ種子はプライミングされている（primed）。プライミング（priming）は、種子の発芽と土壌からの出芽の均一性を高め、野菜の高さの秩序を高めるために、種子に対して行われる水ベースのプロセスである。プライミングにより、最初の苗木の出現から最後の苗木の出現までの時間が短縮される。ホウレンソウ種子をプライミングする方法は、当技術分野でよく知られている（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１０、Ｓｅｅｄ  Ｓｃｉ．  ＆  Ｔｅｃｈｎｏｌ．  ３８：４５−５７を参照されたい）。別の実施形態において、ホウレンソウ種子は作物保護で処理されるか、フィルムコーティングされるか、ペレット化される。フィルムコーティングと作物保護による処理は、一般に組み合わせて行われ、例えば、ＵＳ２０１７０１２７６７０を参照されたい。
【０１８７】
植物部分と栄養繁殖
さらなる態様において、本発明の植物から得られる（それから得ることができる）植物部分、および前記植物部分を含む容器またはパッケージが本明細書において提供される。
【０１８８】
好ましい実施形態において、植物部分は、本発明のホウレンソウ植物の葉または複数の葉、または葉の部分、好ましくは収穫された葉である。そのような葉は、落ちていてもよく、束になっていてもよく、新鮮であってもよく（例えば、容器、例えばバッグ内にある）、冷凍されていてもよく、ブランチングされていてもよく、または茹でられていてもよい。そのような葉は、新鮮なものでも加工されたものでもよく、食品や飼料製品の一部であってもよい。葉はその発達のどの段階で収穫されてもよいが、好ましい段階は未成熟葉（baby leaf）および成熟葉である。
【０１８９】
本発明の植物の他の植物部分としては、葉、葉の部分、茎、茎の部分、柄、柄の部分、芽、芽の部分、つぼみまたはつぼみの部分、挿し木、根、根の部分、根の先端、葉柄、葉柄の部分、子葉、子葉の部分、花、花の部分、花びら、花びらの部分、雄しべ、雄しべの部分、葯、葯の部分、花粉、柱頭、柱頭の部分、花柱、花柱の部分、子房、子房の部分、胚珠、胚珠の部分、種子、種子の部分、種皮、胚、胚の部分、胚軸、胚嚢、果実、果実の部分、細胞、プロトプラスト、カルス、小胞子、分裂組織、形成層等が挙げられる。上述の植物部分の発達の様々な段階が本発明に包含される。
【０１９０】
種子としては、例えば、自家受粉後に本発明の植物上で生産される種子、または他家受粉、例えば、本発明の植物と別のホウレンソウ植物由来の花粉との受粉、または別のホウレンソウ植物と本発明の植物の花粉との受粉の後に生産される種子が挙げられる。
【０１９１】
一つの態様において、植物の部分または種子は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを有するＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンを有するＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドについて、ドナーＳＮＰヌクレオチドの存在によって特定することができる。
【０１９２】
さらなる態様において、植物部分は植物細胞である。さらなる態様において、植物部分は、再生不可能な細胞または再生可能な細胞である。別の態様において、植物細胞は体細胞である。一つの態様において、細胞はその天然の場所から単離される。
【０１９３】
再生不可能な細胞とは、in vitro培養により植物全体に再生することができない細胞である。再生不可能な細胞は、本発明の植物または植物部分（例えば、葉）内にあってもよい。再生不可能な細胞は、種子中の細胞、または前記種子の種皮中の細胞であり得る。成熟した葉、成熟した茎または成熟した根を含む成熟した植物器官は、少なくとも１つの再生不可能な細胞を含む。ベビーリーフホウレンソウの葉等の成熟した植物器官はまた、少なくとも１つの再生不可能な細胞を含む。
【０１９４】
さらに、本発明のホウレンソウ植物のin vitro細胞培養物または組織培養物が提供され、細胞培養物または組織培養物は、例えば、限定されないが、葉、葉の部分、茎、茎の部分、柄、柄の部分、芽、芽の部分、つぼみまたはつぼみの部分、挿し木、根、根の部分、根の先端、葉柄、葉柄の部分、子葉、子葉の部分、花、花の部分、花びら、花びらの部分、雄しべ、雄しべの部分、葯、葯の部分、花粉、柱頭、柱頭の部分、花柱、花柱の部分、子房、子房の部分、胚珠、胚珠の部分、種子、種子の部分、種皮、胚、胚の部分、胚軸、胚嚢、果実、果実の部分、細胞、プロトプラスト、カルス、小胞子、分裂組織、形成層、体細胞、非生殖細胞または生殖細胞等の上記の植物部分に由来する。
【０１９５】
したがって、一つの態様によれば、Ｐｆｓレース８，９、１１、１３および１６に対する（好ましくは、少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する）耐性を有するＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ種のホウレンソウ植物の部分に由来する細胞または組織を含む細胞培養物または組織培養物が提供され、前記耐性は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａから遺伝子移入された単一の遺伝子によって付与され、この遺伝子は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを含むＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチドに連結されており、かつ／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンを含むＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドに連結されている。
【０１９６】
一つの態様において、細胞または組織は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを含むＳＮＰ＿０１のドナー遺伝子型、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンを含むＳＮＰ＿０２のドナー遺伝子型の存在によって特定することができる。
【０１９７】
上記の植物部分のいずれかから再生される、または上記の細胞もしくは組織培養物から再生されるホウレンソウ植物も提供され、前記再生植物は（ＲＰＦ１５遺伝子によって付与される）Ｐｆｓ耐性表現型を有し、すなわち本発明のＲＰＦ１５遺伝子（または、ＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片）を保持する。この植物は、本発明の植物の栄養繁殖とも呼ばれる。
【０１９８】
本発明の植物の収穫された葉、および１つ以上の本発明の植物の複数の葉を含むパッケージも提供される。したがって、これらの葉は、本発明のＲＰＦ１５遺伝子を含み、最初に使用された植物全体および／または再生植物について、例えば、連結している分子マーカーまたは表現型によって検出することができる。葉は、いずれの発達段階でも収穫することができる。葉を収穫するための好ましい発達段階は、成熟段階および未成熟葉段階である。
【０１９９】
本発明によれば、本明細書に記載される植物部分を含むかまたはそれからなる食品または飼料製品も提供される。食品または飼料製品は、新鮮であっても加工されていてもよく、例えば、缶に詰められていてもよく、蒸されていてもよく、茹でられていてもよく、揚げられていてもよく、ブランチングされていてもよく、および／または冷凍されていてもよい。例としては、本発明の植物の葉または葉の部分を含むサラダまたはサラダ混合物、または冷凍されたホウレンソウのパッケージである。
【０２００】
本発明のホウレンソウ植物またはその後代はＲＰＦ１５遺伝子によって付与されるＰｆｓ耐性表現型を保持し、かつ、任意に配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを含むＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）または配列番号１と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンを含むＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドを含み、かつ／またはＮＣＩＭＢ４２６０８に存在するＲＰＦ１５遺伝子および任意に上記ＳＮＰ＿０１および／またはＳＮＰ＿０２（または配列番号１および／または配列番号３）を含む遺伝子移入断片またはサブ断片を保持し、かつ、上述した植物の部分は輸送および／または新鮮な販売のために適切に梱包することができる。そのような部分は、限定するものではないが、葉、挿し木、花粉、葉の部分等の実生または植物から得ることができる任意の細胞、組織および器官を包含する。
【０２０１】
葉は、未成熟な葉または未成熟なホウレンソウのような未熟な状態、または成熟した状態で収穫され得る。植物、植物またはそれらの部分は、単独で、または他の植物もしくは材料と一緒に容器（例えば、バッグ、カートン、缶等）に詰められてもよい。部分は保管され、かつ／またはさらに処理することができる。したがって、本発明の植物、その後代、および上述の植物部分から得られるそのような葉またはその部分等の１つ以上の部分を含む食品または飼料製品も包含される。例えば、本発明の植物（新鮮および／または加工済み）の植物部分を含む缶、箱、木箱、バッグ、カートン、ガス置換放送（Modified Atmosphere Packaging）、フィルム（例えば、生分解性フィルム）等のような容器も本明細書において提供される。
【０２０２】
植物と後代
別の実施形態において、本発明のホウレンソウ植物の植物および部分、ならびに本発明のホウレンソウ植物の後代が提供され、例えば、種子から生育され、有性生殖または栄養繁殖によって作出され、上記の植物部分から再生され、または細胞培養物または組織培養物から再生され、再生された（種子繁殖された、または再生された、または栄養繁殖された）植物は、任意に配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを含むＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチドと連結しているＲＰＦ１５遺伝子によって付与される少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する耐性（好ましくは少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性）（任意にさらにＰｆｓレース１、２、３、４、５、６、７、１２および１４の１つ以上に対する耐性、および／または任意に単離株ＵＡ０５１４および／または他のＰｆｓ単離株に対する耐性）を有する。
【０２０３】
一つの態様において、本発明のホウレンソウ植物の後代植物は、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンを含むＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンを含むＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドに連結されたＲＰＦ１５耐性遺伝子を保持する後代植物である。
【０２０４】
別の態様において、後代植物は、Ｐｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する耐性（好ましくは少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する耐性）を有するＳｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａ種のホウレンソウ植物であり、該耐性は、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａから導入される単一遺伝子ＲＰＦ１５によって付与され、該遺伝子は、一つの態様において、配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（Ａ）または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるアデニンであるＳＮＰ＿０１の耐性ドナーヌクレオチド、および／または配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（Ｃ）または配列番号３と少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の同等の位置におけるシトシンであるＳＮＰ＿０２の耐性ドナーヌクレオチドに連結している。好ましくは、ＲＰＦ１５の存在は、ＳＮＰ＿０１および／またはＳＮＰ＿０２の上記ドナーヌクレオチドおよび／またはＲＰＦ１５または遺伝子移入断片に連結している別のマーカーにより同定することができる。
【０２０５】
上述したように、植物、後代または栄養繁殖が、ＲＰＦ１５遺伝子によって付与されるＰｆｓ耐性表現型を含むかどうかは、例えば、上記または実施例に記載されるＰｆｓ耐病性アッセイを用いて；および／または分子マーカー分析、ＤＮＡシーケンシング（例えば、遺伝子移入を同定するための全ゲノムシーケンシング等）、染色体彩色（chromosome paintinig）等の分子技術を用いて表現型的に試験することができる。
【０２０６】
さらに、本発明によれば、例えば、１回以上自家受粉することにより、および／または本発明の植物と異なる品種の別のホウレンソウ植物または育種系統とを、または本発明のホウレンソウ植物とを１回以上交差受粉することにより得られる後代等の（ＲＰＦ１５遺伝子により付与される）Ｐｆｓ耐性表現型を有するまたは保持する後代が提供される。特に、本発明によれば、ＮＣＩＭＢ４２６０８の（において見出される）（Ｐｆｓ耐性表現型を付与する）ＲＰＦ１５遺伝子を保持する後代が提供される。一つの態様において、本発明によれば、自家受粉、交配、突然変異、二倍体産生または形質転換からなる群から選択される１つ以上の方法によりＲＰＦ１５耐性を有するホウレンソウ植物から産生される後代植物等の、ＲＰＦ１５耐性を有する後代植物が提供される。突然変異は、自然突然変異またはヒト誘発突然変異または体細胞突然変異であり得る。一つの実施形態において、本発明の植物または種子はまた、（例えば、照射、化学的変異誘発、熱処理、ＴＩＬＬＩＮＧ等によって）変異させることができ、かつ／または植物の１つ以上の特性を変更するために変異された種子または植物を選択することができる（例えば、天然変異体、ソマクローナル変異体等）。同様に、本発明の植物は、形質転換および再生され得、それにより、１つ以上のキメラ遺伝子が植物に導入される。形質転換は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介形質転換または微粒子銃等の標準的な方法を使用して実施することができ、それに続いて形質転換細胞の選択および植物への再生が行われる。本発明の植物またはその後代を所望の形質を付与する導入遺伝子で形質転換することにより、所望の形質（例えば、害虫または耐病性、除草剤耐性、殺菌剤耐性または殺虫剤耐性等を付与する遺伝子）を植物またはその後代に導入することができ、形質転換植物は、ＲＰＦ１５遺伝子およびそれにより付与されるＰｆｓ耐性表現型を保持し、所望の形質を有する。
【０２０７】
一つの態様において、本発明の植物の一倍体植物および／または二重一倍体植物が本明細書に包含され、ＲＰＦ１５遺伝子によって、またはＲＰＦ１５遺伝子を含む遺伝子移入断片によって付与される、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する（好ましくは少なくともレース８，９、１１、１３、１６および１７に対する）耐性を有し、任意にさらにＰｆｓレース１、２、３、４、５、６、７、１２および１４の１つ以上に対する耐性、および／または任意に単離株ＵＡ０５１４および／または他のＰｆｓ単離株に対する耐性を有する。一倍体および二重一倍体（ＤＨ）植物は、例えば、葯または小胞子の培養および植物全体への再生によって生産することができる。ＤＨ産生のために、コルヒチン処理等の既知の方法を使用して染色体倍加を誘導することができる。したがって、一つの態様において、記載されるようなＰｆｓ耐性表現型を有するホウレンソウ植物が提供され、該植物は二重一倍体植物である。
【０２０８】
別の実施形態において、本発明は、本発明の植物を自家で交配させるか、または異なるホウレンソウ植物と交配させ、得られた種子を収穫することを含む、ホウレンソウ種子を生産する方法に関する。さらなる実施形態において、本発明は、この方法に従って生産された種子および／またはそのような種子を生育させることによって生産されたホウレンソウ植物に関する。したがって、本発明の植物は、ホウレンソウ種子の生産において、雄親および／または雌親として使用することができ、それにより、前記種子から生育される植物は、ＲＰＦ１５遺伝子の存在により、少なくともＰｆｓ８、９、１１、１３および１６に対する（好ましくは少なくともレース８、９、１１、１３、１６および１７に対する）耐性を有し、任意にＰｆｓレース１、２、３、４、５、６、７、１２および１４の１つ以上、および／または単離株ＵＡ０５１４および／または他のＰｆｓ単離株に対する耐性を有する。
【０２０９】
したがって、一つの態様において、本発明のホウレンソウ植物の後代が提供され、該後代植物は、自家受粉、交配、突然変異、二重一倍体産生または形質転換によって産生され、該後代は、本明細書に記載されるＲＰＦ１５耐性遺伝子（およびそれによって付与される表現型）を保持し、例えば、アクセッション番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託された種子から生育されたホウレンソウ植物と別のホウレンソウ植物とを交配することにより得ることができる。換言すれば、一つの態様において、種子寄託物ＮＣＩＭＢ４２６０８中に存在する／それに見出される／それに由来する（またはそれから誘導することができる）耐性遺伝子または遺伝子座（または該遺伝子または遺伝子座を含む遺伝子移入断片）は、後代植物に保持される。
【０２１０】
分子マーカーはまた、ＲＰＦ１５耐性遺伝子または遺伝子座を含む植物（またはそれから得られる植物部分または核酸）の同定を助けるために使用することができる。例えば、ＲＰＦ１５耐性遺伝子または遺伝子座に遺伝的に物理的に密接に連結している１つ以上の分子マーカーを開発することができる。これは、（ＲＰＦ１５を有する）耐性を有するホウレンソウ植物と感受性のホウレンソウ植物とを交配し、その交配種から分離集団（例えば、Ｆ２または戻し交配集団）を作出することによって行うことができる。次いで、分離集団をＰｆｓ耐性について表現型分類し、例えば、ＳＮＰ（一塩基多型）、ＡＦＬＰ（増幅断片長多型；例えば、ＥＰ５３４８５８を参照されたい）等の分子マーカーまたはその他を用いて遺伝子型分類し、かつ、ソフトウェア分析によって、分離集団のＰｆｓ耐性形質と共分離する分子マーカーが同定され、ＲＰＦ１５耐性遺伝子または遺伝子座に対するそれらの順序および遺伝的距離（ｃｅｎｔｉＭｏｒｇａｎ距離、ｃＭ）を同定することができる。ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅに対するＢＬＡＳＴ分析により、第３染色体上の物理的な位置を決定することができる。隣接するマーカーが特定される場合（ＲＰＦ１５遺伝子のいずれかの側）、ＲＰＦ１５がマーカーの間に位置する第３染色体の物理領域を特定することができる。
【０２１１】
ＲＰＦ１５耐性遺伝子座と密接に連結している分子マーカー、例えば、５ｃＭ以下の距離のマーカーは、ＲＰＦ１５耐性遺伝子または遺伝子座を含む遺伝子移入断片を含むまたは保持する植物（例えば、本発明の植物または本発明の植物の後代）または植物部分の検出および／または選択に使用することができる。そのような密接に連結している分子マーカーは、育種プログラム、すなわちマーカー支援選択（ＭＡＳ）において、表現型選択を置き換える（または表現型選択に加えて使用する）ことができる。好ましくは、連結しているマーカーがＭＡＳにおいて使用される。マーカーとして使用することができる１つの配列は、記載されるＳＮＰ＿０１を含む配列である。より好ましくは、隣接マーカー、すなわち、ＲＰＦ１５遺伝子または遺伝子座のいずれかの側の１つのマーカーをＭＡＳにおいて使用することができる。
【０２１２】
当業者は、本明細書に開示される配列番号１、配列番号３および寄託された種子を使用して、当該分野で公知の方法を使用することにより、ＲＰＦ１５遺伝子自体の配列を同定することもできる。例えば、第３染色体領域のシーケンシングを行い、その配列と、例えば、ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅにおける配列とを比較することにより、ＲＰＦ１５遺伝子自体を同定するために、遺伝子移入断片状のオープンリーディングフレームを同定することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるＲＰＦ１５遺伝子の改変は、遺伝子の機能を証明するために使用することができる。したがって、当業者はまた、ＲＰＦ１５遺伝子における（例えば、プロモーター、タンパク質コード配列、他の調節配列における）誘導された突然変異を含む植物を作出することができる。ＲＰＦ１５遺伝子に誘発された突然変異を含む植物は、本明細書に包含される。
【０２１３】
一つの態様において、ＲＰＦ１５遺伝子に連結している１つ以上のマーカーの存在について、ホウレンソウ種子、植物または植物部分、またはそのような種子、植物または植物部分からのＤＮＡをスクリーニングし、任意に選択する方法が提供される。
【０２１４】
他の態様において、ＲＰＦ１５遺伝子は、１つ以上の核酸プローブ、核酸プライマー、またはそれらの組み合わせを使用して検出することができる。
【０２１５】
したがって、一つの態様において、ＲＰＦ１５遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を使用して、ＲＰＦ１５遺伝子を含む植物または植物部分から得られるゲノムＤＮＡにハイブリダイズする１つ以上の核酸プローブによって検出することができる。
【０２１６】
核酸プローブは、例えば、配列番号１を含む（または配列番号１と少なくとも９０％、９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の１０６と同等の位置におけるアデニンを含む）ＤＮＡ分子、または配列番号３を含む（または配列番号３と少なくとも９０％、９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列の１８４と同等の位置におけるシトシンを含む）ＤＮＡ分子、またはそのいずれかの相補配列であり得る。別の態様において、ＲＰＦ１５遺伝子は、ＲＰＦ１５遺伝子に連結しているゲノムＤＮＡを増幅する１つ以上の核酸プライマーによって検出することができる。例えば、プライマーは、上述の配列番号１または配列番号１と９０％、９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、１０６と同等の位置にアデニンを有する配列、または配列番号３または配列番号３と９０％、９１％、９２、％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有し、１８４と同等の位置にシトシンを有する配列を含む核酸分子を増幅することができる。好適なプライマーは、例えば、ＳＮＰマーカーの７０〜１００ｂｐ上流および７０〜１００ｂｐ下流であり、該マーカーを増幅するフォワードおよびリバースのプライマーを設計するために選択することができる。プライマーは、例えば、ＳＮＰ遺伝子型決定のために、例えば、ＳＮＰ＿０１および／またはＳＮＰ＿０２についてのＳＮＰ遺伝子型を検出するためのＫＡＳＰアッセイでにおいて使用することができる。
【０２１７】
植物または植物部分における目的の形質（すなわち、ＲＰＦ１５遺伝子または遺伝子座）の相対的な存在または不在を特定することができる他のタイプの分子マーカーおよび／または他のアッセイも、育種目的に有用である。
【０２１８】
本発明の技術分野において、ＤＮＡ配列のヌクレオチドにおいて、不明確なコードが知られており（ＩＵＰＡＣコードを参照されたい）、例えば、ＹはＣまたはＴを表し；ＫはＴまたはＧを表し；ＲはＡまたはＧを表す。
【０２１９】
寄託情報
Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｏｌｅｒａｃｅａの種子の代表的な番号ＮＣＩＭＢ４２６０８は、２０１６年７月１２日にブダペスト条約に基づいてＮｕｎｈｅｍｓ  Ｂ．Ｖ．によってＮＣＩＭＢ  Ｌｔｄ．、Ｆｅｒｇｕｓｏｎ  Ｂｕｉｌｄｉｎｇ、Ｃｒａｉｂｓｔｏｎｅ  Ｅｓｔａｔｅ、Ｂｕｃｋｓｂｕｒｎ、Ａｂｅｒｄｅｅｎ  ＡＢ２１  ９ＹＡ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍ（ＮＣＩＭＢ）に寄託された。寄託へのアクセスは、この出願の係属中に、要求に応じて権利を与えられると米国特許庁の局長によって決定された者
が利用することができる。３７  Ｃ．Ｆ．Ｒ．§１．８０８（ｂ）の下、寄託された材料の公衆への入手可能性について寄託者によって課されたすべての制限は、特許の付与時に取消不能の形で解除される。寄託は３０年の期間、または最新の要求から５年もしくは特許の法的強制力のある存続期間のいずれか長い間維持され、その期間中にそれが実行不可能になった場合は置き換えられる。出願人は、この出願に関するこの特許または植物品種保護法（７  ＵＳＣ  ２３２１以下参照）に基づいて付与された権利を放棄しない。
【０２２０】
記載された本発明の製品および方法の様々な改変および変形は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく当業者に明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して説明されてきたが、請求される本発明は、そのような特定の実施形態に過度に限定されるべきではないことを理解されたい。実際に、植物育種、化学、生物学、植物病理学または関連分野の当業者に明らかな、本発明を実施するための記載された様式の様々な改変は、以下の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
【０２２１】
本発明は以下の実施例においてさらに例示され、これらは例示のみを目的とするものであり、決して本発明を限定することを意図するものではない。
【実施例】
【０２２２】
１−野生ドナーの選択および野生ドナーからのＲＰＦ１５遺伝子の栽培ホウレンソウへの交配
いくつかの野生のアクセッションについて、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅのレース１〜１６および単離株ＵＡ０５１４の感染に対する耐性を試験した。Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａアクセッションは、少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する耐性を有することが見出され、選択された。
【０２２３】
選択された植物（耐性ドナー）を、Ｐｆｓに対する既知のバックグラウンド耐性を有さない栽培ホウレンソウ植物と交配させた。後代植物を、選択された植物（ドナー）が示すような少なくともＰｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対するＰｆｓ耐性について試験し、耐性を有する後代植物を選択し、上記の栽培ホウレンソウ植物と戻し交配し、数世代にわたって自家受粉させて遺伝子移入断片をホモ接合型で含む系統を作出した。このように、Ｓｐｉｎａｃｉａ  ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａドナーからの耐性が栽培ホウレンソウ植物に遺伝子移入された。このようにして得られた植物系統の種子を、ＮＣＩＭＢに番号ＮＣＩＭＢ４２６０８として寄託した。
【０２２４】
２−ＲＰＦ１５遺伝子を含む栽培ホウレンソウのＰｆｓ耐性表現型
Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ感染に対する耐性を、（オランダのａ．ｏ．Ｎａｋｔｕｉｎｂｏｕｗから入手可能な）異なるセットを使用して試験した。
【０２２５】
ＮＣＩＭＢ４２６０８種子（ＲＰＦ１５遺伝子を含む）から生育されたホウレンソウ植物を、ＢＶＢ基質（Ｅｕｒｏｖｅｅｎ、Ｇｒｕｂｂｅｎｖｏｒｓｔ）を含むトレーに前記異なるセットおよびチェックとして機能する他の遺伝子型からのホウレンソウ植物と共に植え、Ａｇｒａ−ｖｅｒｍｉｃｕｌｉｔｅ（Ｐｕｌｌ、Ｒｈｅｎｅｎ）で覆った。試験ごとに、１つの遺伝子型から少なくとも１０の植物を１つまたは２つの複製で試験した。トレーを、１２時間の日長で、１２℃／１５℃（昼／夜）の気候セル（climate cell）に置いた。播種後１４日に、Ｐｅｒｏｎｏｓｐｏｒａ  ｆａｒｉｎｏｓａ  ｆ．  ｓｐ．  ｓｐｉｎａｃｉａｅの病原性レースの胞子嚢懸濁液（２．５×１０５／ｍｌ）を噴霧することにより、植物に接種した。このようにして、病原性レースを検定した。接種された植物を、相対湿度１００％の透明なプラスチック素材で２４時間覆い、この期間の後、プラスチックを上部から取り除き、相対湿度を８０％に低下させた。
【０２２６】
１０日後、Ｉｒｉｓｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００７；Ｐｌａｎｔ  Ｄｉｓ．  ９１：１３９２−１３９６）によって記載されているように、子葉および本葉における病原体の胞子形成の症状に基づいて、植物を「耐性」または「感受性」と評価した。胞子形成の証拠を示す植物系統を「感受性」と見なした。系統の個体の少なくとも８５％が胞子形成を示さなかった植物系統を「耐性」と見なした。耐性植物に再接種して、耐性と最初に評価された植物が感染を免れたか、またはそれらが本当に耐性であったかを評価した。これらの植物は、２回目の接種から１０日後に再び評価された。植物の１５％未満が「感受性」（すなわち、８５％を超える植物が胞子形成を示さない）に分類される遺伝子型を、耐性遺伝子型と見なした。
【０２２７】
ＮＣＩＭＢ４２６０８においてホモ接合型で存在する新しい耐性遺伝子ＲＰＦ１５は、Ｐｆｓ１、２、３、４、５、６、７、８、９、１１、１２、１３、１４および１６ならびに単離株ＵＡ０５１４に対する耐性を付与することが見出された。表２は、（ホモ接合的にＲＰＦ１５を含む）ＮＣＩＭＢ４２６０８種子から生育されたホウレンソウ植物の耐性を示す。
【０２２８】
ＲＰＦ１１、ＲＰＦ１２またはＲＰＦ１３のホモ接合系統は、Ｐｆｓレース１６に対する耐性を有さないことが見出された。
【０２２９】
【表３】
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【０２３０】
表１の感受性および耐性の異なる品種をチェックとして使用したところ、表１に示した基準により予測される通りの挙動を示した（データは示していない）。
【０２３１】
【表４】
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【０２３２】
３−他のホウレンソウ植物へのＲＰＦ１５耐性形質の遺伝子移入
別の実験において、ＮＣＩＭＢ４２６０８種子から生育されたホウレンソウ植物を、試験対象のレースに感受性である別のホウレンソウ植物と（父親として）交配した。実施例２に記載されるように、Ｆ１集団の植物について、Ｐｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対するＰｆｓ耐性を試験した。ヘテロ接合性Ｆ１植物は、Ｐｆｓレース８、９、１１、１３および１６に対する耐性を保持することが観察され、したがって、これらのレースに対する耐性が優性であると結論付けられた。Ｆ２集団においては、これらのレースに対する耐性は３（耐性）：１（感受性）の比率で分離した。
【０２３３】
４−ＲＰＦ１５に連結しているマーカーの開発およびアラインメント
（ＲＰＦ１５遺伝子を含む）ＮＣＩＭＢ４２６０８のホウレンソウ植物と、ＲＰＦ１５耐性遺伝子を有さず、Ｐｆｓに対するバックグラウンド耐性を有さないホウレンソウ植物とを交配させることにより、Ｆ２集団を作出した。連鎖マッピングを行い、ＲＰＦ１５遺伝子に連結している二つの単一ヌクレオチド多型マーカー（ＳＮＰ）である、表３に示すＳＮＰ＿０１およびＳＮＰ＿０２を同定した。
【０２３４】
【表５】
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【０２３５】
配列番号１はヌクレオチド１０６におけるアデニンを含み、配列番号２はヌクレオチド１０６におけるグアニンを含む。配列番号３はヌクレオチド１８４におけるシトシンを含み、配列番号４はヌクレオチド１８４におけるグアニンを含む。配列番号１および配列番号２は２０４ｂｐである。配列番号３および配列番号４は２９９ｂｐである。上述したように、再生親は感受性を有する。
【０２３６】
配列番号１および２は、（中国ホウレンソウ系統ＳＰ７５の）ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅゲノム配列に対するＢＬＡＳＴ分析にも使用された。この分析により、配列番号１および２が第３染色体上に位置し、ヌクレオチド１０９１０５９で始まり、ヌクレオチド１０９０８５６で終わり、ＳＮＰ＿０１がＳＰ７５のヌクレオチド１０９０９５４（このヌクレオチドにＡを含む）にあることが示された。
【０２３７】
ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅのゲノム配列と配列番号１との対でのアラインメントにおいて、２つの配列は９７％配列同一性を有していた（Ｅｍｂｏｓｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  ‘Ｎｅｅｄｌｅ’、デフォルトのパラメータを使用した対でのアラインメント）（図１を参照されたい、ＳＮＰ＿０１は太字）。したがって、いずれもＳＮＰ＿０１の位置にアデニンを有していた。
【０２３８】
また、配列番号３および４は、（中国ホウレンソウ系統ＳＰ７５の）Ｓｐｉｎａｃｈｂａｓｅのゲノム配列に対するＢＬＡＳＴ分析に使用された。この分析により、配列番号３および４が第３染色体上に位置し、ヌクレオチド６０７９４０で始まり、ヌクレオチド６０７６３６で終わり、ＳＮＰ＿０２がヌクレオチド６０７７５１（このヌクレオチドにＧを含む）にあることが示された。
【０２３９】
ＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅのゲノム配列と配列番号３との対でのアラインメントにおいて、２つの配列は９６％配列同一性を有していた（Ｅｍｂｏｓｓ  ｐｒｏｇｒａｍ  ‘Ｎｅｅｄｌｅ’、デフォルトのパラメータを使用した対でのアラインメント）（図２を参照されたい、ＳＮＰ＿０２は太字）。これに対して、配列番号３はヌクレオチド位置１８４（ＳＮＰ＿０２）にシトシンを有しており、配列番号４はヌクレオチド位置１８４（ＳＮＰ＿０２）にグアニンを有しており、前記参照ゲノムも配列番号３および配列番号４のヌクレオチド位置１８４（ＳＮＰ＿０２）と同等の位置にグアニンを有していた。
【０２４０】
図１および２は、配列番号１または配列番号３と他の配列、例えば、配列番号１または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列との対での配列アラインメントにより、ＳＮＰ＿０１およびＳＮＰ＿０２の両方、すなわち配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニンおよび配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（いずれもＳ．ｔｕｒｋｅｓｔａｎｉｃａからの遺伝子移入断片に存在する）が、配列番号１または配列番号３と１００％同一でない配列において同定できることを示す。本明細書において、このような配列におけるヌクレオチドの位置は、配列番号１の位置１０６または配列番号３の位置１８４と「同等」のヌクレオチドの位置と呼ばれる。
【０２４１】
配列番号１のヌクレオチド１０６におけるアデニン（ＳＮＰ＿０１）、および配列番号３のヌクレオチド１８４におけるシトシン（ＳＮＰ＿０２）、または配列番号１または配列番号３と少なくとも９０％の配列同一性を有する配列の同等のヌクレオチドにおけるアデニンを使用して、ＲＰＦ１５が位置している遺伝子移入断片を含む植物および植物部分を選択することができる。
【０２４２】
５−他の耐性遺伝子マーカーの試験
ＷＯ２０１５０５４３３９は特許出願であり、少なくともＰｆｓレース７、１０、１１、１２、１３および１４に対する耐性を付与する量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）を含むＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａからの遺伝子移入について説明するものである。前記出願には、ＷＯ２０１５０５４３３９に記載されるＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａドナーのＱＴＬに隣接するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ隣接配列、配列番号１および配列番号２が開示されており、すなわち、それらは、少なくともＰｆｓレース７、１０、１１、１２、１３および１４に対する耐性を付与するＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ遺伝子に隣接している。以下において「左側Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ隣接マーカー」と呼ばれるＷＯ２０１５０５４３３９の配列番号１は、配列番号５として本願に追加され、かつ、以下において「右側Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ隣接マーカー」と呼ばれるＷＯ２０１５０５４３３９の配列番号２は、配列番号６として本願に追加された。
【０２４３】
本発明者らによって寄託された植物系統を、前記左側および右側のＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ隣接マーカーの存在について試験した。前記特許に記載されている２つの隣接配列領域のそれぞれについて、ＮＣＩＭＢ４２６０８から生育されたホウレンソウ植物のＤＮＡの対応する領域を増幅する２つのプライマーペアを設計した。合計８つのＰＣＲプライマーを整列させ、領域内のＰＣＲ断片が得られるようにＪＣｅａｓａｒを使用してin silicoでチェックした。
【０２４４】
ＮＣＩＭＢ４２６０８種子から生育されたホウレンソウ植物のＤＮＡに対して、左側Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ隣接マーカーを使用して、ＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、予想される断片長についてアガロースゲル上で検証した。断片は予想されたサイズであり、シーケンシングした。シーケンシングされた材料の断片を、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒにおける２つの隣接配列領域のそれぞれのコンティグ（contig）に整列させた。これらのコンティグに基づいて、ＮＣＩＭＢ４２６０８種子から生育されたホウレンソウ植物は、左側Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ隣接マーカーを含まなかった。その代わりに、ＮＣＩＭＢ４２６０８の種子とそれから生育された植物は、本願に配列番号７（Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ）として追加された別の配列（Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ配列）を有していることが見出された。２つの配列間のアラインメントを図３に示す。寄託された種子には、左側Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ隣接配列が存在しないことは明らかである。
【０２４５】
ＮＣＩＭＢ４２６０８種子から生育されたホウレンソウ植物のＤＮＡに対して、右側Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ隣接マーカーのプライマーペアの組み合わせを使用して、第２のＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物を、予想される断片長についてアガロースゲル上で検証した。断片は予想されたサイズであり、シーケンシングした。シーケンスシングされた材料の断片を、Ｓｅｑｕｅｎｃｈｅｒにおける２つの隣接配列領域のそれぞれのコンティグ（contig）に整列させた。これらのコンティグに基づいて、ＮＣＩＭＢ４２６０８種子から生育されたホウレンソウ植物は、右側Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ隣接マーカーを含まなかった。その代わりに、ＮＣＩＭＢ４２６０８の種子とそれから生育された植物は、本願に配列番号８として追加された別の配列（Ｓ．ｏｌｅｒａｃｅａ）を有していることが改めて見出された。２つの配列間のアラインメントを図４に示す。寄託された種子には、右側Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａの隣接配列が存在しないことは明らかである。何をどのように調整したかを示してください。
【０２４６】
したがって、左側または右側のどちらのＳ．ｔｅｔｒａｎｄｒａ隣接マーカーもＮＣＩＭＢ４２６０８に存在しない。ＮＣＩＭＢ４２６０８は、染色体の領域にＳ．ｏｌｅｒａｃｅａ配列の配列番号７および８を含む。明らかに、本発明の他の栽培ホウレンソウ系統または品種は、それらのゲノム中に配列番号７および／または配列番号８、または配列番号７および８のいずれかと少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する配列を含み得る。
【０２４７】
興味深いことに、これらの配列を使用してＳｐｉｎａｃｈＢａｓｅでＢＬＡＳＴ分析を行うと、これらは、上記特許出願ＷＯ２０１５０５４３３９において述べられているように、第６染色体ではなく第３染色体に配置されているように見える。
【０２４８】
【表６】
2021511063.tif 000008
【０２４９】
したがって、Ｓ．ｔｅｔｒａｎｄｒａのＱＴＬは、第３染色体の０．７Ｍｂと１．４１Ｍｂとの間にあるように見える。
【０２５０】
６−ＲＰＦ１５のファインマッピング
ＮＣＩＭＢ４２６０８種子（ＲＰＦ１５遺伝子を含む）から生育されたホウレンソウ植物と、ＲＰＦ１５耐性遺伝子を含まず、Ｐｆｓに対するバックグラウンド耐性を含まないホウレンソウ植物とを交配させることにより、さらなる分離集団が作出される。また、ＲＰＦ１５が見出だされた染色体領域にさらにＳＮＰが追加される。さらなるマッピングが行われ、ＲＰＦ１５遺伝子に連結しているより多くの一塩基多型マーカー（ＳＮＰ）マーカーが生成される。
【０２５１】
参考文献
Correll et al. 2011, Eur J Plant Pathol 129:193-205
Correll et al. 2010, ISFのウェブサイトにある“Guidelines for Spinach Downy Mildew: Peronspora ferinosa f.sp. spinaciae (Pfs)”
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Smith, P.G., R.E. Webb, and C.H. Luhn. 1962. Immunity to race 2 of spinach downy mildew. Phytopathology 52:597-599.
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Plantum press release, Denomination of Pfs: 16, a new race of downy mildew in spinach March 15 2016
International Seed Federation Guidelines for Spinach Downy Mildew Peronospora farinosa f. sp. spinaciae (Pfs) Jim Correll, Lindsey du Toit, Steven Koike, and Kees van Ettekoven, dec 2015; http://www.worldseed.org/isf/differential_hosts.html
Xu, C. et al. (2017, Nat. Commun. 8, 15275 doi: 10.1038/ncomms15275) “Draft genome of spinach and transcriptome diversity of 120 Spinacia accessions” (2017)
【図１】
2021511063.tif 000009
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021511063.tif 000014
2021511063.tif 000015
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