(57)【要約】  本発明は、医薬品合成の分野に関し、特に（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オール誘導体の調製方法およびそれらの中間体に関する。上記調製方法は、式Ａ１の化合物から出発して実施される。【化１】2021516248.tif 000051（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オール誘導体の調製において、キラリティを酵素法により構築し、生成物を高い光学純度で調製した。上記調製方法は、ダルナビルの（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの重要な中間体を商業的に製造するために使用でき、工業生産に適した非常に経済的な経路である。
2021516248.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の構造を有する式Ｃｐまたは式Ｃｐ’の化合物。
【化１】
2021516248.tif 000039
（式中、Ｒ１、Ｒ２は水素またはヒドロキシル保護基であり、Ｒ２はヒドロキシル保護基である。）
【請求項２】
上記ヒドロキシル保護基は、アルキル、シリル、Ｃ２−１１のアシル、Ｃ４−９の環アルケニル、アリール、アラルキル、アロイル、フェニル、および置換フェニルであり、上記シリルは、テトラメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリブチルシリルおよびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルであり、上記アルキルはＣ１〜Ｃ８のアルキルであり、上記芳香族基は、フェニル、フラン、チオフェニル、またはインドール基であり、上記置換フェニル基は、アルキル置換フェニル基、アルコキシアルキル置換フェニル基、ニトロアルキル置換フェニル基、またはハロゲン置換フェニル基であり、上記アルキル置換フェニルは、ベンジル、ジフェニルメチル、およびトリフェニルメチル基であり、上記アルコキシアルキル基で置換されたフェニルは、ｐ−メトキシベンジルであり、上記ニトロアルキル基の置換フェニル基は、ｐ−ニトロベンジル基であり、上記ハロゲンで置換されたフェニルは、ｐ−クロロフェニル基であることを特徴とする請求項１に記載の化合物。
【請求項３】
キラルが式（Ｂ）の化合物または式（ｂ−２）の化合物から酵素還元反応によって構築される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの中間体化合物の調製方法であって、
【化２】
2021516248.tif 000040
式中、Ｒ１は、水素または水酸基の保護基であり；
上記酵素は、アルデヒド／ケトンレダクターゼであり、そのアミノ酸配列は、配列番号１に示されるタンパク質、または配列番号１による１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加後のアルデヒド／ケトン還元酵素活性を有するタンパク質、または配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアルデヒド／ケトン還元酵素活性と８０％を超える相同性を有するタンパク質である、調製方法。
【請求項４】
式Ｂの化合物の酵素還元反応によって構築され、さらに水酸基は保護基によって保護される、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの中間体の調製方法であって、
【化３】
2021516248.tif 000041
式中、Ｒ１の定義は請求項３と同じであり、Ｒ２は水酸基の保護基であり、酵素は請求項３のものと同じである、調製方法。
【請求項５】
Ｒ１は、Ｃ２−１１の直鎖もしくは分岐鎖のアシル基、ベンゾイル基、またはベンゼン環上の一置換もしくは多置換ベンゾイル基であり、当該一置換基もしくは多置換基はアルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、またはシアノ基である、請求項３または請求項４に記載の調製方法。
【請求項６】
請求項３より調製される中間体Ｃがさらなる還元および閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法。
【化４】
2021516248.tif 000042
（式中、Ｒ１の定義は請求項３と同じである。）
【請求項７】
請求項３より調製される中間体Ｃ−２が閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法。
【化５】
2021516248.tif 000043
（式中、Ｒ１の定義は請求項３と同じである。）
【請求項８】
請求項４より調製される中間体Ｃｐがさらなる還元および閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法。
【化６】
2021516248.tif 000044
（式中、Ｒ１およびＲ２の定義は請求項４と同じである。）
【請求項９】
請求項４より調製される中間体Ｃｐ−２が閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法。
【化７】
2021516248.tif 000045
（式中、Ｒ１およびＲ２の定義は請求項４と同じである。）
【請求項１０】
請求項３または４より調製される中間体Ｃ−２またはＣｐ−２がさらなる閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法。
【請求項１１】
上記式Ｂの化合物が、式Ａ２の化合物の、以下に示すアシル化反応によって調製されることを特徴とする請求項３または４に記載の調製方法。
【化８】
2021516248.tif 000046
（式中、Ｒ１は、Ｃ２−１１の直鎖もしくは分岐鎖のアシル基、ベンゾイル基、またはベンゼン環上の一置換もしくは多置換ベンゾイル基であり、当該一置換基もしくは多置換基はアルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、またはシアノ基である。）
【請求項１２】
上記式Ａ２の化合物が、式Ａ１の化合物の、以下に示すハロゲン化反応によって調製されることを特徴とする請求項１１に記載の調製方法。
【化９】
2021516248.tif 000047
（式中、Ｘは、ハロゲンである。）
【請求項１３】
ハロゲン化反応、アシル化反応、酵素還元反応、さらなる還元および閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法であり、
【化１０】
2021516248.tif 000048
式中、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒ１の定義は請求項３と同じであり、酵素の定義は請求項３と同じである、調製方法。
【請求項１４】
ハロゲン化反応、アシル化反応、酵素還元反応、保護反応、さらなる還元および閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法であり、
【化１１】
2021516248.tif 000049
式中、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒ１の定義は請求項３と同じであり、Ｒ２の定義は請求項４と同じであり、酵素の定義は請求項３と同じである、調製方法。
【請求項１５】
ハロゲン化反応、酵素還元反応、アシル化反応、保護反応、還元および閉環反応によって調製されることを特徴とする（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法。
【化１２】
2021516248.tif 000050
（式中、Ｘは、ハロゲンであり、Ｒ１の定義は請求項３と同じである。）
【請求項１６】
上記アルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子の塩基配列が配列番号２であることを特徴とする請求項３に記載の調製方法。
【請求項１７】
上記アルデヒド／ケトンレダクターゼは、遺伝子操作された細菌の全細胞、破砕酵素液、凍結乾燥粉末、または固定化酵素もしくは固定化細胞であることを特徴とする請求項３に記載の調製方法。
【請求項１８】
上記反応系における上記アルデヒド／ケトンレダクターゼである遺伝子操作された細菌の総細胞投入量が１０〜１００ｇ／Ｌであり、転化温度が２５〜３７℃であることを特徴とする請求項３に記載の調製方法。
【請求項１９】
上記反応は、溶媒の存在下で行われることを特徴とする請求項３に記載の調製方法。
【請求項２０】
上記溶媒は、水または緩衝液と有機溶媒とからなる混合溶媒であることを特徴とする請求項１９に記載の調製方法。
【請求項２１】
上記緩衝液は、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、Ｔｒｉ−ＨＣｌ緩衝液、クエン酸緩衝液またはＭＯＰＳ緩衝液のうちの１つまたは複数から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の調製方法。
【請求項２２】
上記有機溶媒は、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロパノール、ＤＭＦ、ＴＢＭＥ、ジクロロメタンおよび酢酸ビニルのうちの１つまたは複数から選択されることを特徴とする請求項２０に記載の調製方法。
【発明の詳細な説明】
【発明の詳細な説明】
【０００１】
本出願は、２０１８年３月１６日に中国特許庁に提出された、出願番号２０１８１０２２０５０６．１、「ヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製方法、その中間体、およびその調製方法」と題する中国特許出願の優先権を主張するものである。その内容の全ては、参照により本出願に組み込まれる。
【０００２】
＜技術分野＞
本発明は、医薬工業における有機合成の分野に関し、特にヘキサヒドロフロフラノール誘導体の調製方法およびそれらの中間体に関する。
【０００３】
＜背景技術＞
下記のＺ構造を有する化合物の化学名は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールである。
【０００４】
【化１】
2021516248.tif 000003
これは、ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フランの誘導体の１つである一方で、抗ＨＩＶ薬としてのダルナビルの中間体である。
【０００５】
ティボテック・ファーマシューティカルズ株式会社（Tibotec Pharmaceuticals Co., Ltd.）の、出願番号０２８１７６３９．１（出願日：２００２年９月６日）および２００５８００１０４００．Ｘの中国特許は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法を提供した。原料は、下記式（３）の化合物である。
【０００６】
【化２】
2021516248.tif 000004
式（３）の化合物は式（１）の出発原料から調製された。
【０００７】
【化３】
2021516248.tif 000005
住友化学株式会社の出願番号２００３８０１０９９２６．４の中国特許は、上記（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法を提供した。原料は、下記式（ＶＩＩＩ）の化合物である。
【０００８】
【化４】
2021516248.tif 000006
住友化学株式会社は、キラル触媒を用いてキラリティを発生させた。しかし、この戦略は商業規模での生産には適用できなかった。
【０００９】
ロンザ・リミテッド（Lonza Ltd.）による欧州特許出願ＥＰ２６３４１８０Ａ１（出願日：２０１２年１月３日）は、カルボニルレダクターゼによるカルボニル基の水酸基への還元を開示した。この特許は、多数の商業的に入手可能な酵素、例えば、サッカロマイセス・セレビシエ(saccharomyces cerevisiae)由来のＹＮＬ３３１Ｃを列挙している。また、式Ｉａに示す化合物が適切な立体配置であると言及した。
【００１０】
【化５】
2021516248.tif 000007
（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールがダルナビルの調製において重要な中間体であることを考慮すると、この重要な中間体の調製のためのより有益な方法を開発しなければならない。この方法は、高い収率および高いｄｅ値を有する重要な中間体を得ることができるだけでなく、低コストで穏やかな反応条件を有し、工業化に適している。
【００１１】
＜発明内容＞
本発明の（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法は、出発物質の選択およびキラル構成の構築から始まる。重要な中間体のキラリティを構築するための出発物質および酵素法は、すべての先行技術と比較して新規であり、工業化に適した低コストで穏やかな反応条件を有する。
【００１２】
本発明の技術的目的を達成するために、本発明は、以下の技術的スキームを提供する。
【００１３】
まず、本発明は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの中間体の調製方法を提供する。キラルは、式（Ｂ）の化合物または式（ｂ−２）の化合物から酵素還元反応によって構築した。
【００１４】
【化６】
2021516248.tif 000008
ここで、Ｒ１は、水素または水酸基の保護基である。
【００１５】
酵素は、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Saccharomyces kudriavzevii）株に由来するアルデヒド／ケトンレダクターゼなどの生物学的酵素である。タンパク質は、そのアミノ酸配列が配列番号１に示されるタンパク質、または配列番号１による１つ以上のアミノ酸残基の置換、欠失もしくは付加後のアルデヒド／ケトン還元酵素活性を有するタンパク質、または配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアルデヒド／ケトン還元酵素活性と８０％を超える相同性を有するタンパク質である。その塩基配列を配列表に配列番号２で示す。アルデヒド／ケトンレダクターゼは、遺伝子操作された細菌の全細胞、酵素破壊液、凍結乾燥粉末、または固定化酵素もしくは固定化細胞に由来し得る。
【００１６】
酵素の供給量は５０〜１００ｇ／Ｌ、反応温度は２５〜３７℃である。
【００１７】
ＮＡＤＰ＋またはＮＡＤＰＨである補酵素は、酵素還元反応に選択的に添加され得る。
【００１８】
グルコースデヒドロゲナーゼは、酵素還元反応に選択的に添加され得る。
【００１９】
酵素還元反応は、水または緩衝液と有機溶媒とからなる混合溶媒である溶媒の存在下で起きる。
【００２０】
緩衝液は、リン酸緩衝液、炭酸緩衝液、Ｔｒｉ−ＨＣｌ緩衝液、クエン酸緩衝液またはＭＯＰＳ緩衝液のうちの１つまたは複数から選択される。
【００２１】
有機溶媒は、ＤＭＳＯ、酢酸エチル、酢酸ブチル、イソプロパノール、ＤＭＦ、ＴＢＭＥ、ジクロロメタンおよび酢酸ビニルのうちの１つまたは複数から選択される。
【００２２】
基質が完全に利用されるまで本発明の酵素還元反応の生物変換処理をモニターするため、Ｈｐｌｃ−ＭｓおよびＨＰＬＣが用いられる。
【００２３】
さらに、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの中間体の調製方法は、式Ｂの化合物の酵素還元反応によって構築され、さらに水酸基は保護基によって保護される。
【００２４】
【化７】
2021516248.tif 000009
ここで、Ｒ１の定義は上記と同じであり、Ｒ２は水酸基の保護基であり、酵素の定義は上記と同じである。
【００２５】
上記調製方法において、Ｒ１基は、Ｃ２−１１の直鎖もしくは分岐鎖のアシルベンゾイル基、またはベンゼン環上の一置換もしくは多置換ベンゾイル基であることが好ましく、当該一置換基もしくは多置換基はアルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、またはシアノ基である。
【００２６】
一方、本発明は、中間体化合物Ｃのさらなる還元および閉環反応によって調製される（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法を提供する。
【００２７】
【化８】
2021516248.tif 000010
ここで、Ｒ１の定義は上記と同じである。
【００２８】
本発明は、中間体化合物Ｃｐのさらなる還元および閉環反応によって調製され得る（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法を提供する。
【００２９】
【化９】
2021516248.tif 000011
ここで、Ｒ１とＲ２の定義は上記と同じである。
【００３０】
本発明は、化合物の式Ｃ−２または式Ｃｐ−２の調製した化合物を選択的に分離した後に閉環反応によって調製され得る（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法を提供する。
【００３１】
式Ｂの化合物は、式Ａ２の化合物のアシル化によって調製され、その反応は以下のように示される。
【００３２】
【化１０】
2021516248.tif 000012
ここで、Ｒ１は、Ｃ２−１１の直鎖もしくは分岐鎖のアシルベンゾイル基、またはベンゼン環上の一置換もしくは多置換ベンゾイル基であり、当該一置換もしくは多置換基は、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、またはシアノ基である。
【００３３】
本発明の化合物Ａ２は、化合物Ａ１のハロゲン化により調製され、その反応は以下のように示される。
【００３４】
【化１１】
2021516248.tif 000013
ここで、Ｘはハロゲンである。
【００３５】
本発明は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法を開示し、好ましい実施形態は、ハロゲン化反応，アシル化反応，酵素還元反応、さらなる還元および閉環反応による調製である。
【００３６】
【化１２】
2021516248.tif 000014
ここで、Ｘはハロゲンであり、Ｒ１および酵素の定義は上記と同じである。
【００３７】
本発明は、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法を開示し、別の好ましい実施形態は、ハロゲン化反応、アシル化反応、酵素還元反応、水酸基の保護反応、さらなる還元および閉環反応による調製である。
【００３８】
【化１３】
2021516248.tif 000015
ここで、Ｘはハロゲンであり、Ｒ１の定義は請求項１の定義と同じであり、Ｒ２の定義は請求項２の定義と同じである。また、酵素の定義は上記と同じである。
【００３９】
本発明において、酵素法により構築されたキラル中心を有する化合物を保護して、以下の構造式を有する（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの中間体化合物を提供する。
【００４０】
【化１４】
2021516248.tif 000016
ここで、Ｒ１とＲ３は水素またはヒドロキシル保護基であり、Ｒ２はヒドロキシル保護基である。ヒドロキシル保護基は、アルキル、シリル、Ｃ２−１１のアシル、Ｃ４−９の環アルケニル、アリール、アラルキル、アロイル、フェニル、および置換フェニルである。シリルは、テトラメチルシリル、トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリブチルシリルおよびｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルである。アルキルはＣ１〜Ｃ８のアルキルである。芳香族基は、フェニル、フラン、チオフェニル、またはインドール基である。置換フェニル基は、アルキル置換フェニル基、アルコキシアルキル置換フェニル基、ニトロアルキル置換フェニル基、またはハロゲン置換フェニル基である。アルキル置換フェニルは、ベンジル、ジフェニルメチル、およびトリフェニルメチル基であり、アルコキシアルキル基で置換されたフェニルは、ｐ−メトキシベンジルであり、ニトロアルキル基の置換フェニル基はｐ−ニトロベンジル基であり、ハロゲンで置換されたフェニルはｐ−クロロフェニル基である。
【００４１】
ヒドロキシル保護基は、ベンゾイル、ベンゼン環上の一置換もしくは多置換ベンゾイル、ベンゾイル、ｔｅｒｔ−ブチル、またはベンジルであることが好ましい。
【００４２】
上記還元反応は、別のカルボニル基をヘミケタール生成物に還元する方法に関し、その反応を以下に示す。
【００４３】
【化１５】
2021516248.tif 000017
上記の２つの反応は、次のように直接表すことができる。
【００４４】
【化１６】
2021516248.tif 000018
Ｒ３はＲ２または水素である。Ｒ１とＲ２の定義は上記と同じである。
【００４５】
ヘミケタール生成物は分離することも、または分離せずに次の反応にさらに適用することもできる。例えば、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの閉環反応による調製は、
【００４６】
【化１７】
2021516248.tif 000019
であり、Ｒ３はＲ２または水素である。Ｒ１とＲ２の定義は上記と同じである。
【００４７】
ヘミアセタールへの還元反応に使用される還元剤は、ホウ素還元剤、アルミニウム還元剤、またはリチウムケイ素還元剤であってもよい。例えば、水素化ホウ素ナトリウム、シアノ水素化ホウ素ナトリウム、リチウムテトラヒドロアルミニウム、Ｒｅｄ−Ａｌ、水素化アルミニウムリチウム、水酸化ジイソブチルアルミニウム、リチウムジイソプロピルアミド、およびリチウムヘキサメチルジシラジドである。
【００４８】
閉環反応のための試薬は、当該分野では一般的な酸または塩基である。
【００４９】
本発明の好ましい実施形態は、最初にキラル中心を構築し、次に水酸基を選択的に保護し、次にそれをヘミケタール生成物に還元し、閉環反応を行って、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールを調製することである。
【００５０】
【化１８】
2021516248.tif 000020
Ｒ３はＲ２または水素である。Ｒ１とＲ２の定義は上記と同じである。
【００５１】
しかしながら、本発明の実施形態は、最初にヘミケタール生成物に還元することもでき、次いで、キラル中心を構築することができる。選択的に分離した後、閉環反応を行って、（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールを調製することができる。
【００５２】
【化１９】
2021516248.tif 000021
Ｒ３はＲ２または水素である。Ｒ１とＲ２の定義は上記と同じである。
【００５３】
本発明の上記のアシル化反応では、
【００５４】
【化２０】
2021516248.tif 000022
Ｒ１基は、好ましくは、Ｃ２−１１の直鎖もしくは分岐鎖のアシルベンゾイル基、またはベンゼン環上の一置換もしくは多置換ベンゾイル基である。
【００５５】
アシル化試薬は、置換安息香酸化合物またはその塩であり、置換安息香酸化合物の置換基は、アルキル基、アルコキシ基、ニトロ基、またはシアノ基などであってもよい。置換は、単置換または多置換であってもよい。
【００５６】
アシル化反応は、トリエチルアミン、炭酸ナトリウム、炭酸カリウム、重炭酸ナトリウムなどの有機塩基または無機塩基であり得る塩基の付加を含み得る。
【００５７】
Ｒ１は、ｔｅｒｔ−ブチル基などの別の置換基を有する。これは式Ａ３の化合物によって、または式Ａ２の化合物がｔｅｒｔ−ブチル酸と反応することによって変換することができ、式Ａ３の化合物は、式Ａ２の化合物によって調製された。
【００５８】
【化２１】
2021516248.tif 000023
上記式Ａ２の化合物は、化合物Ａ１のハロゲン化により調製され、その反応式を以下に示す。
【００５９】
【化２２】
2021516248.tif 000024
ここで、Ｘはハロゲンである。
【００６０】
本発明において、ハロゲン化反応に用いられる試薬は、ハロゲン化水素酸等である。
【００６１】
本発明の（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法は、還元後にハロゲン化反応、酵素還元反応、アシル化反応、閉環反応によって調製することもでき、反応を以下に示す。
【００６２】
【化２３】
2021516248.tif 000025
Ｘは水素であり、Ｒ１の定義は上記と同じである。
【００６３】
本発明により提供される（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法は、キラリティを構築するために酵素法を採用し、これにより、高い収率および高い光学純度を有する生成物を生成することができる。上述の欧州特許出願のような従来の方法は、カルボニルレダクターゼポリペプチドまたはカルボニルレダクターゼポリペプチドを含む微生物がカルボニル基の水酸基への還元を実現することを開示しているが、本発明で使用される酵素はより重要な利点を有し、これはより高い光学純度およびより好適な反応条件下での生成物の調製に反映される。本発明の（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オールの調製方法は、工業生産に適している。
【００６４】
＜実施例＞
本発明をさらに理解するために、以下は、本発明によって提供される（３Ｒ，３ａＳ，６ａＲ）−ヘキサヒドロフロ［２，３−ｂ］フラン−３−オール誘導体の調製方法、中間体および調製方法の詳細な記載である。これらの実施形態の説明は、本発明の特性をさらに特定することのみを意図しており、本発明の範囲または請求項の範囲を本発明に限定することを意図していないことを理解されたい。
【００６５】
（実施例１）
【００６６】
【化２４】
2021516248.tif 000026
化合物Ａ１、ジクロロメタンを反応瓶に加え、冷却した。臭化物を秤量し、ジクロロメタンで希釈した。希釈した臭化物を滴下ホッパーに移し、内部温度を制御するためにゆっくりと添加した。滴下後、内部反応温度を一定に保つ。水を添加し、温度を制御し、分離する。有機相を別の反応瓶に入れ、水を添加し、液体を抽出分離する。有機相を別の反応瓶に入れ、５％ＮａＨＣＯ３水溶液を加えて、液体を抽出分離した。有機相を別の反応瓶に入れ、上層の水相を合わせてジクロロメタンを加え、抽出分離した。廃棄した水相は有機相と組み合わされ、水を添加し、抽出し、分離し、廃棄した水相および下層の有機相は溶媒が排出されなくなるまでロータリーエバポレーター中で濃縮され、収率は９０〜９５％である。
【００６７】
（実施例２）
【００６８】
【化２５】
2021516248.tif 000027
アセトン、化合物Ａ２（Ｘは臭素）、安息香酸を反応瓶に加え、撹拌し、冷却した。滴下タンクにトリエチルアミンを添加し、内部温度の制御をゆっくりと開始した。滴下後、室温まで加熱し、反応物を撹拌した。反応後、濾過を行った。濾過後、濾液を真空蒸留のために蒸留瓶に移した。蒸留瓶に固体ペーストが見えるまで温度を５０〜６０℃に制御した。蒸留フラスコに酢酸エチルを供給し、よく撹拌して溶解させ、ボトル内での原料液反応の蒸留をシフトさせ、ボトル内で洗って飽和食塩水と反応させ、静置し、液体、水層を混合させ、酢酸エチル抽出物を加え、静置し、層状にし、水層を捨て、有機層を混合し、無水硫酸ナトリウムを有機層に加えて撹拌し、乾燥させ、吸引フィルターにかけた。濾液を真空蒸留用反応瓶に移し、反応液が固体ペーストになるまで５０〜６０℃で温度制御した。次いで、酢酸エチルの一部を添加し、撹拌して還流させて溶解させた。温度は５０〜６０℃で制御した。ｎ−ヘプタンを添加タンクに添加した。ゆっくりと冷却した後、撹拌を続け、濾過し、目的の固体粗生成物を乾燥させ、収率は７０〜７５％であった。
【００６９】
（実施例３）
アルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子の全細胞調製−遺伝子操作された細菌
組み換えアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌の調製方法は、Saccharomyces kudriavzevii由来のアルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子の配列を人工設計のために選択した。人工的に設計した配列を全遺伝子合成（ジェンスクリプト株式会社（GenScript Co., Ltd.）により委託）により合成し、発現ベクターｐＥＴ２８ａのＮｄｅ  ＩおよびＸｈｏ  Ｉ切断部位にクローニングして宿主細菌である大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株のコンピテント細胞を形質転換した。ポジティブインバーターを選択し、配列決定によって同定した後、組み換え発現を得た。組み換え型発現ベクターを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株に移入し、組み換え型アルデヒド／ケトンレダクターゼの発現を誘導できる組み換え型アルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌を得た。
【００７０】
組み換え型アルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌を、カナマイシンを含有するＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩培養して種培養用培地を得た。種培地に、カナマイシンを含有する培地の体積の１％で接種した。その後、３７℃で２〜５時間培養し、無菌ＩＰＴＧで誘導し、ＩＰＴＧの最終濃度は０．１ｍＭに達した。次に、それを２５℃で２０時間インキュベートした。最後に、Saccharomyces kudriavzeviiアルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子の全細胞を高速遠心分離により得た。遺伝子操作された細菌の全細胞を超音波法で破壊し、遺伝子操作された細菌の全細胞の酵素溶液をSaccharomyces kudriavzeviiから得た。アルデヒド／ケトンレダクターゼは、アミノ酸配列が配列番号１であるタンパク質であり、アルドステロンレダクターゼ遺伝子の塩基配列を配列表の「配列番号２」に示す。
【００７１】
誘導後、４５ｋＤａに明らかなタンパク質バンドが存在し、これは、アルデヒド／ケトンレダクターゼが組み換え細菌において高度に発現されたことを示す。Ｔｒｉｓ−ｈｃｌ、ＮＡＤＰＨ（ｐＨ８．０、２ｍｍｏｌ／Ｌ）、０．１ｍｍｏｌ／Ｌ基質
【００７２】
【化２６】
2021516248.tif 000028
、および適切な酵素を含む０．２５ｍｌの反応系でアルデヒド／ケトンレダクターゼの純タンパク質の酵素活性を測定した。３４０ｎｍにおける吸光度の低下を測定した。酵素活性単位（Ｕ）は、上記条件下で１分間当たり１ｕｍｏｌのＮＡＤＰＨの酸化を触媒するのに必要な酵素と定義した。
【００７３】
結果は、組み換え遺伝子操作されたアルデヒド／ケトンレダクターゼのアルデヒド／ケトン還元酵素活性が欧州特許（ＥＰ２６３４１８０Ａ１）の配列のそれと比較して２０％を超えて増加し、非変異アルデヒド／ケトンレダクターゼ配列のそれと比較して５０％を超えて増加したことを示した。
【００７４】
本発明の実施形態で使用されるアルデヒド／ケトンレダクターゼの遺伝子操作された細菌は、この方法によって調製される。
【００７５】
本発明の実施形態および対照実験において使用されるグルコースデヒドロゲナーゼは、シグマ−アルドリッチから購入した市販の酵素である。
【００７６】
ｅｅ値のアルゴリズム：
ee(syn)=([R,R]-[S,S])/([R,R]+[S,S])
ee(anti)=([R,S]-[S,R])/([R,S]+[S,R])
de={([R,S]+[S,R])-([R,R]+[S,S])}/{([R,S]+[S,R])+([R,R]+[S,S])}
酵素還元反応：
【００７７】
【化２７】
2021516248.tif 000029
工程１：１Ｌフラスコ中で反応を行い、反応系を３００ｍＬに制御し、滅菌リン酸カリウム緩衝液２６０ｍＬを用いて、フラスコ中のアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌の全細胞破砕用酵素液を懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを入れ、細胞を超音波により５０分間破壊した。次いで、２５ｇのグルコース、０．４２ｇのＮＡＤＰ＋を添加し、次いで、８ｇの反応物を秤量し、そしてそれを４０ｍＬのＤＭＳＯに溶解する。基質を有する脱脂ＤＭＳＯ溶液を振盪ボトルにゆっくり注ぎ、２時間反応させた後、１２ｇのグルコースを溶液に添加した。アルデヒド／ケトンが遺伝子操作された細菌の全細胞容積は７５ｇ／Ｌであり、グルコースデヒドロゲナーゼの投入量は２５ｍｇ／Ｌであった。温度は３７℃であり、転化反応は回転速度を２００ｒｐｍに制御した振盪機中で実施し、転化時間は１２時間であった。目的生成物の転化率は９７．８％であった。
【００７８】
工程２：工程１で得られた目的生成物の変換液を精製した。反応系に一定量の酢酸エチルを加え、３７℃で１５分間抽出した後、３回繰り返し、遠心分離により酢酸エチル層を分取し、分取した酢酸エチル層に５％無水硫酸マグネシウムを添加し、１５分間振り混ぜた後、ろ過して硫酸マグネシウムを除去した。次に、脱水した酢酸エチル層を高温減圧下で濃縮したところ、目的生成物は７．４１ｇであり、ｄｅ値は９６．２％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．５％であった。
【００７９】
（実施例４）
【００８０】
【化２８】
2021516248.tif 000030
固形の化合物Ｂ（Ｒ１はベンゾイル）（２０．００ｇ）を５００ｍｌの乾燥させた清潔な四つ口丸瓶に添加し、次いでトルエンを添加し、反応物を撹拌した。窒素保護下で真空置換し、窒素保護下で冷却する。トルエンを窒素保護下で定圧滴下漏斗に添加した。７０％赤色−Ａｌ溶液（２６．５０ｇ、２６．００ｍｌ）を、窒素保護下で定圧滴下漏斗に添加した。反応液を−１５〜−１０℃に冷却したら、赤色−Ａｌ溶液を滴下し、温度を調節し、滴下後、温度を保つ。純水と酢酸エチルを１０００ｍｌの四つ口丸瓶に順次加える。攪拌状態の１０００ｍｌの４つ口丸瓶に硫酸を添加し、それらを冷まして、温かいままにしておく。反応液を硫酸溶液に滴下する。０〜１０℃で溶液を調整した後、滴下して酢酸エチルを加えて撹拌する。１０％重炭酸ナトリウム溶液を清浄な１０００ｍｌ四つ口丸瓶に添加し、冷却し、撹拌を停止し、反応液を静置して層状にし、上部の有機層を撹拌のために１０％重炭酸ナトリウム溶液に移した。下部の水層に酢酸エチルを加えて抽出し、層状にした後、水層を捨てた。水溶液中の１０％重炭酸ナトリウム中への二次酢酸エチル層を一緒に混合した。次いで、撹拌し、温度を制御し、層状にした。アルカリ性水層に酢酸エチルを加えて抽出し、撹拌し、温度を制御した。純水の苛性洗浄有機層を洗浄撹拌しながら処理し、温度を制御し、層状にした。酢酸エチルで水層を抽出し続け、層状にし、水層を捨て、有機相を合わせる。硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、吸引濾過し、酢酸エチルを蒸発させ、生成物１７ｇ、収率８４．３３％を得た。
【００８１】
（実施例５）
【００８２】
【化２９】
2021516248.tif 000031
メタノール（１０．００ｍｌ）および化合物Ｃ（Ｒ１はベンゾイル）（１．００ｇ）を順番に反応瓶に加えた。反応液を−１５〜−５℃に冷却し、水酸化ナトリウム溶液（１０．００ｍｌ）を滴下した。添加後、混合物を一定温度に保ち、反応が完了するまで撹拌した。次に、１０％硫酸溶液（４．００ｇ）を添加した。滴下後、反応を続けて温度を保ち、次に飽和炭酸ナトリウム溶液を加えてｐＨを調整した。反応液を加熱し、減圧蒸留してメタノールを除去した後、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルを加えて有機層を抽出した後、塩化ナトリウムを加えた。次に、水層をジクロロメタンで抽出した。回収のため水層を分離し、真空蒸留により有機層を還元してジクロロメタンを除去した。０．３８ｇの生成物が得られ、収率は７３．７７％であった。
【００８３】
（実施例６）
【００８４】
【化３０】
2021516248.tif 000032
酵素の調製は実施例３と同じである。
【００８５】
工程１：５Ｌフラスコ中で反応を行い、反応系を２Ｌに制御し、滅菌リン酸カリウム緩衝液１．７Ｌを用いて、フラスコ中のアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌の全細胞を懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを入れ、細胞を超音波により５０分間破壊した。次いで、２５ｇのグルコース、０．４２ｇのＮＡＤＰ＋を添加し、次いで、８０ｇの反応物を秤量し、そしてそれを３００ｍＬのＤＭＳＯに溶解する。基質を有する脱脂ＤＭＳＯ溶液を振盪ボトルにゆっくり注ぎ、２時間反応させた後、１２ｇのグルコースを溶液に添加した。アルデヒド／ケトンが遺伝子操作された細菌の全細胞容積は７５ｇ／Ｌであり、グルコースデヒドロゲナーゼの投入量は２５ｍｇ／Ｌであった。温度は３７℃であり、転化反応は回転速度を２００ｒｐｍに制御した振盪機中で実施し、転化時間は１２時間であった。目的生成物の転化率は９７．８％であった。
【００８６】
工程２：式ＶＩＩＩの中間体化合物を含有する工程１からの生成物の精製。精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は７７．１ｇであり、ｄｅ値は９５．３％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．６％であった。
【００８７】
（実施例７）
【００８８】
【化３１】
2021516248.tif 000033
工程１：１Ｌフラスコ中で反応を行い、反応系を３００ｍＬに制御し、脱イオン水２５０ｍＬを用いて、フラスコ中のアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌の全細胞を懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを入れて、次いで、１０ｍｌのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）、０．２６ｇのＮＡＤＰ＋を添加し、次いで、１０ｇの反応物を秤量し、そしてそれを３０ｍＬの酢酸ブチルに溶解した。基質を有する酢酸ブチル溶液を振盪ボトルにゆっくり注ぎ、１時間反応させた後、１０ｍＬのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）を溶液に添加した。アルデヒド／ケトンが遺伝子操作された細菌の全細胞容積は７５ｇ／Ｌであり、グルコースデヒドロゲナーゼの投入量は２５ｍｇ／Ｌであった。温度は３７℃であり、転化反応は回転速度を２００ｒｐｍに制御した振盪機中で実施し、転化時間は１２時間であった。目的生成物の転化率は９７．８％であった。
【００８９】
工程２：工程１で得られた目的生成物の変換液を精製した。反応系に一定量の酢酸エチルを加え、３７℃で１５分間抽出した後、３回繰り返し、遠心分離により酢酸エチル層を分取し、分取した酢酸エチル層に５％無水硫酸マグネシウムを添加し、１５分間振り混ぜた後、ろ過して硫酸マグネシウムを除去した。次に、脱水した酢酸エチル層を高温減圧下で濃縮したところ、目的生成物は９．５５ｇであり、ｄｅ値は９９．１％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．７％であった。
【００９０】
１Ｈ  ＮＭＲ（６００ＭＨｚ、ＣＤＣｌ３）  δ  ２．２６９〜２．３０１（ｍ、１Ｈ、Ｊ＝６Ｈｚ）、２．３６７〜２．４０４（ｍ、１Ｈ）、２．９５４〜２．９９３（ｍ、１Ｈ、Ｊ＝６Ｈｚ）、３．４３８〜３．４６６（ｍ、１Ｈ）、３．５２０〜３．５４９（ｍ、１Ｈ）、４．２２７〜４．２６９（ｍ、１Ｈ）、４．２９８〜４．３２６（ｍ、１Ｈ）、４．３９１〜４．４２０（ｍ、１Ｈ）。ＭＳ（ＥＳＩ）：ｍ／ｚ２１０．０３［Ｍ＋Ｈ]＋。
【００９１】
（実施例８）
【００９２】
【化３２】
2021516248.tif 000034
工程１：５Ｌフラスコ中で反応を行い、反応系を２Ｌに制御し、脱イオン水１．５Ｌを用いて、フラスコ中のアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌の全細胞を懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを入れて、次いで、１０ｍｌのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）、３ｇのＮＡＤＰ＋を添加し、次いで、１００ｇの反応物を秤量し、そしてそれを３００ｍＬの酢酸ブチルに溶解した。基質を有する酢酸ブチル溶液を振盪ボトルにゆっくり注ぎ、１時間反応させた後、１００ｍＬのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）を溶液に添加した。アルデヒド／ケトンが遺伝子操作された細菌の全細胞容積は１００ｇ／Ｌであり、グルコースデヒドロゲナーゼの投入量は２５ｍｇ／Ｌであった。温度は２８℃であり、転化反応は回転速度を２００ｒｐｍに制御した振盪機中で実施し、転化時間は１２時間であった。目的生成物の転化率は９７．８％であった。
【００９３】
工程２：式ＶＩＩＩの中間体化合物を含有する工程１からの生成物の精製。精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は９．４２ｇであり、ｄｅ値は９６．９％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．４％であった。
【００９４】
（実施例９）
【００９５】
【化３３】
2021516248.tif 000035
工程１：１Ｌフラスコ中で反応を行い、反応系を３００ｍＬに制御し、脱イオン水２５０ｍＬを用いて、フラスコ中のアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌の全細胞を懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを入れて、次いで、１０ｍｌのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）、０．２６ｇのＮＡＤＰ＋を添加し、次いで、１０ｇの反応物を秤量し、そしてそれを３０ｍＬの酢酸ブチルに溶解した。基質を有する酢酸ブチル溶液を振盪ボトルにゆっくり注ぎ、１時間反応させた後、１０ｍＬのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）を溶液に添加した。アルデヒド／ケトンが遺伝子操作された細菌の全細胞容積は７５ｇ／Ｌであり、グルコースデヒドロゲナーゼの投入量は２５ｍｇ／Ｌであった。温度は３７℃であり、転化反応は回転速度を２００ｒｐｍに制御した振盪機中で実施し、転化時間は１２時間であった。目的生成物の転化率は９７．８％であった。
【００９６】
工程２：式ＶＩＩＩの中間体化合物を含有する工程１からの生成物の精製。精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は９．３７ｇであり、ｄｅ値は９７．１％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．５％であった。
【００９７】
（実施例１０）
【００９８】
【化３４】
2021516248.tif 000036
工程１：５Ｌフラスコ中で反応を行い、反応系を２Ｌに制御し、脱イオン水１．６Ｌを用いて、フラスコ中のアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌の全細胞を懸濁した。グルコースデヒドロゲナーゼを入れて、次いで、１００ｍｌのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）、０．２５ｇのＮＡＤＰ＋を添加し、次いで、１００ｇの反応物を秤量し、そしてそれを２００ｍＬの酢酸ブチルに溶解した。基質を有する酢酸ブチル溶液を振盪ボトルにゆっくり注ぎ、１時間反応させた後、１００ｍＬのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）を溶液に添加した。アルデヒド／ケトンが遺伝子操作された細菌の全細胞容積は５０ｇ／Ｌであり、グルコースデヒドロゲナーゼの投入量は２５ｍｇ／Ｌであった。温度は２５℃であり、転化反応は回転速度を２００ｒｐｍに制御した振盪機中で実施し、転化時間は１２時間であった。目的生成物の転化率は９７．８％であった。
【００９９】
工程２：式ＶＩＩＩの中間体化合物を含有する工程１からの生成物の精製。精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は９３．１ｇであり、ｄｅ値は９５．６％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９９．６％であった。
【０１００】
（実施例１１：対照実験）
【０１０１】
【化３５】
2021516248.tif 000037
工程１：１Ｌフラスコ中で反応を行い、反応系を３００ｍＬに制御し、脱イオン水２５０ｍＬを用いて、フラスコ中のアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌の全細胞を懸濁した。操作された細菌の細胞全体で使用されるアルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子のコード配列は、欧州特許ＥＰ２６３４１８０（特許ＥＰ２６３４１８０の配列番号１２）に公開されている配列に示されている通りである。配列は、全遺伝子合成（ジェンスクリプト株式会社（GenScript Co., Ltd.）により委託）により合成した。調製工程は実施例３を参照されたい。グルコースデヒドロゲナーゼを入れて、次いで、１０ｍｌのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）、０．２６ｇのＮＡＤＰ＋を添加し、次いで、１０ｇの反応物を秤量し、そしてそれを３０ｍＬの酢酸ブチルに溶解した。基質を有する酢酸ブチル溶液を振盪ボトルにゆっくり注ぎ、１時間反応させた後、１０ｍＬのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）を溶液に添加した。アルデヒド／ケトンが遺伝子操作された細菌の全細胞容積は７５ｇ／Ｌであり、グルコースデヒドロゲナーゼの投入量は２５ｍｇ／Ｌであった。温度は３７℃であり、転化反応は回転速度を２００ｒｐｍに制御した振盪機中で実施し、転化時間は１２時間であった。
【０１０２】
工程２：精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は８．１１ｇであり、ｄｅ値は８５.１％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は９３．３％であった。
【０１０３】
（実施例１２：対照実験）
【０１０４】
【化３６】
2021516248.tif 000038
工程１：１Ｌフラスコ中で反応を行い、反応系を３００ｍＬに制御し、脱イオン水２５０ｍＬを用いて、フラスコ中のアルデヒド／ケトンレダクターゼが遺伝子操作された細菌のサッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Saccharomyces kudriavzevii）の全細胞を懸濁した。操作された細菌の細胞全体で使用されるアルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子のコード配列は、配列番号３に公開されている配列に示されている通りである（アルデヒド／ケトンレダクターゼ遺伝子のコード配列は人工的に設計されていない）。配列は、全遺伝子合成（ジェンスクリプト株式会社（GenScript Co., Ltd.）により委託）により合成した。調製工程は実施例３を参照されたい。グルコースデヒドロゲナーゼを入れて、次いで、１０ｍｌのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）、０．２６ｇのＮＡＤＰ＋を添加し、次いで、１０ｇの反応物を秤量し、そしてそれを３０ｍＬの酢酸ブチルに溶解した。基質を有する酢酸ブチル溶液を振盪ボトルにゆっくり注ぎ、１時間反応させた後、１０ｍＬのグルコース（２.５ｍｏｌ／Ｌ）を溶液に添加した。アルデヒド／ケトンが遺伝子操作された細菌の全細胞容積は７５ｇ／Ｌであり、グルコースデヒドロゲナーゼの投入量は２５ｍｇ／Ｌであった。温度は３７℃であり、転化反応は回転速度を２００ｒｐｍに制御した振盪機中で実施し、転化時間は１２時間であった。
【０１０５】
工程２：精製工程は実施例３を参照されたい。目的生成物は７．７３ｇであり、ｄｅ値は７９.６％、ｅｅ（ａｎｔｉ）値は８８．７％であった。
【配列表】
2021516248000001.app
【国際調査報告】
2021516248.tif 000052
2021516248.tif 000053
2021516248.tif 000054
2021516248.tif 000055
2021516248.tif 000056
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