(57)【要約】本発明は、ジオトリカム変異株およびその用途に関し、機能性微生物のスクリーニングおよび用途の技術分野に属する。前記変異株は突然変異誘発法によって得られ、赤色色素の収量を大幅に増加させることができ、２０１９年１月２４日に寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ:  Ｍ２０１９０８６で中国武漢の武漢大学の中国典型培養物寄託センターに寄託した。前記変異株は、天然色素生産の分野で広く使用され、赤色色素の生産コストを削減に有益であり、幅広い応用の見通しがある。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞の外部へ赤色色素と黄色色素を分泌できることを特徴とするジオトリカム。
【請求項２】
前記ジオトリカムの寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ:  Ｍ２０１９０８６であることを特徴とする請求項１に記載のジオトリカム。
【請求項３】
発酵による赤色色素の生産に用いられる請求項２に記載のジオトリカム。
【請求項４】
請求項２に記載のジオトリカムを発酵株として使用することを特徴とする赤色色素を生産する発酵方法。
【請求項５】
前記発酵方法は、振とうフラスコ発酵と発酵槽発酵を含むことを特徴とする請求項４に記載の発酵方法。
【請求項６】
前記発酵方法で使用される培地の成分およびその含量は、それぞれグルコース１０ｇ／Ｌ、ジャガイモ２００  ｇ／Ｌであることを特徴とする請求項５に記載の発酵方法。
【請求項７】
前記発酵方法では発酵温度が１５℃であり、発酵時間が１２ｄであることを特徴とする請求項５に記載の発酵方法。
【請求項８】
発酵による黄色色素の生産に用いられる請求項２に記載のジオトリカム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、機能性微生物のスクリーニングおよび用途の技術分野に属し、具体的には、ジオトリカム変異株および色素生産における用途に関する。
【背景技術】
【０００２】
色は食品の最初の感覚指標であり、人々の食物の選択に影響を与えるため、色素は食品加工業界で広く使用されている。異なる由来により食用色素は、天然色素と合成色素という２つのカテゴリに分類され得る。多くの合成色素は人体に有害であることが証明されており、食品への添加またはその添加量が厳しく制限され、天然色素は食品メーカーから徐々に支持されている。天然色素は、由来によって主に動物色素、植物色素、微生物色素およびミネラル色素などに分類される。現在、天然色素は市場シェアの３１％を占めており、合成色素の４０％を下回っているが、天然色素の市場シェアが益々増やし、市場の可能性が巨大である（Ｍａｐａｒｉ  ＡＳ  Ｓ,  Ｔｈｒａｎｅ  Ｕ  など）。
【０００３】
現在、様々な国での使用が承認されている天然食用色素のほとんどは、動植物の原料に由来している。しかし、動植物由来の天然色素は原料に大きく依存しており、規模を拡大は容易ではなく、また、原料の起源と気候条件が異なるため、製品の異なるバッチ間の差異が大きく（Ｓｐｅａｒｓ  Ｋ）、急速に成長している食品産業を満たすことができなくなる。近年、より多くの研究が代替の天然色素を見つけることに専念しており、これらの研究のほとんどは微生物色素、特に真菌色素に焦点を当てている。真菌色素には色が豊富で、安全で信頼性が高く、栄養機能とヘルスケア機能の両方を備えた真菌色素が多くあり、真菌は急速に成長し、栽培が容易で、大規模に簡単に生産でき、真菌色素は徐々に天然色素を取得する重要な方法になり、アスペルギルスによって生産されたモナスカス赤色素は東アジア諸国で広く使用され、２００６年に、Ｂｌａｋｅｓｌｅａｔｒｉｓｐｏｒａを使用してデンマークの会社によって生産されたβ-カロテノイドは欧州連合（Ｗｉｓｓｇｏｔｔ Ｕ、Ｂｏｒｔｌｉｋ Ｋ）によって消費のために承認された。最新の発酵技術を使用して真菌色素を生産し、条件を制御しやすく、自動化の度合いが高く、規模が大きく、上記の欠点を克服するだけでなく、貴重な土地資源を節約し、生産コストを削減できる。
【０００４】
中国は近年、真菌資源の開発で大きな進歩を遂げており、色素の使用に関する一定の経験を蓄積しているが、色素産生真菌の株はまだ比較的不足しており、真に工業化を実現する真菌色素の種類は非常に少なく、現代の食品産業における天然色素の生産ニーズを満たすにはほど遠い。したがって、新しい色素産生真株を開発し、株の色素収量を増加させる緊急の必要性があり、これは天然色素の製造コストを削減し、天然色素の使用を促進するのに役立つ。
【発明の概要】
【０００５】
これを考慮して、本発明は、ジオトリカム変異株およびその用途を提供する。前記株は突然変異誘発によって得られ、赤色色素の収量を大幅に増加させることができ、赤色色素の生産に広く使用することができる。
【０００６】
上記の目的を達成するために、本発明は以下の技術的解決策を提供する。
【０００７】
本発明は、寄託番号がＣＣＴＣＣ  ＮＯ:  Ｍ２０１９０８６であるジオトリカムの株を提供する。
【０００８】
本発明では、まず南極大陸のフィールズ半島地域の土壌から、赤色色素収量および黄色色素収量の高い真菌をスクリーニングし、この株がジオトリカム属に属することが証明された。赤色色素の収量をさらに増加させるために、本発明はさらに株のＡＲＴＰ突然変異誘発を受け、赤色色素収量が大幅に増加した突然変異体株をスクリーニングし、Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１８Ｃと命名された。本発明の出願人は、２０１９年１月２４日に中国武漢の武漢大学の中国型培養コレクションセンターに上記の変異株Ｇｅｏｍｙｃｅｓ ｓｐ．Ｗｎｆ-１８Ｃを寄託し、寄託番号はＣＣＴＣＣ ＮＯ：Ｍ２０１９０８６である。
【０００９】
本発明は、発酵による赤色色素の生産への前記ジオトリカムの用途も提供する。
【００１０】
本発明はまた、前記ジオトリカムを発酵株として使用する、赤色色素を生産するための発酵方法も提供する。
【００１１】
本発明のいくつか特定の実施形態では、前記発酵方法は、振とうフラスコ発酵および発酵槽発酵を含む。
【００１２】
本発明のいくつか特定の実施形態では、前記発酵方法で使用される培地の成分およびその含量はそれぞれ、
【００１３】
グルコース１０ｇ／Ｌ、ジャガイモ２００  ｇ／Ｌである。
【００１４】
本発明のいくつか特定の実施形態では、前記発酵方法における前記振とうフラスコ発酵の温度は１５℃であり、発酵時間は１２ｄである。
【００１５】
本発明のいくつか特定の実施形態では、前記発酵方法における前記発酵槽発酵の温度は１５℃であり、発酵時間は１２ｄである。
【００１６】
本発明はまた、発酵による黄色色素の生産における前記ジオトリカムの用途を提供する。
【００１７】
本発明は、南極の土壌試料から新しいジオトリカム株ＳＴ２をスクリーニングし、その赤色色素の収量がＧｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａのそれよりも著しく高い。振とうフラスコ発酵の１２日目に、ジオトリカム株ＳＴ２の発酵上澄み液のＯＤ５２５値は２４．６と高かった。
【００１８】
対照群のＧｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａと比較すると、２６．１％増加した。出願人は、ジオトリカム菌ＳＴ２の赤色色素の収量を増加するために、ＡＲＴＰ突然変異誘発により、赤色色素の収量が大幅に増加した変異株Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１８Ｃをスクリーニングした。該変異株の振とうフラスコ発酵の１２日目に、発酵上澄み液のＯＤ５２５値が３３．６と高く、開始株ＳＴ２より３６．５％増加し、Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａより７２．３％増加し、予想外の技術的効果を達成した。
【００１９】
また、変異株Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１８Ｃによって生成された黄色色素の品質がさらに向上した。該変異株によって生成された黄色色素の色値が４１であり、開始株ＳＴ２より７．８％増加し、予想外の技術的効果を達成した。
【００２０】
本発明によって提供される変異株Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１８Ｃは、天然色素生産の分野で広く使用され得、赤色色素の生産コストを削減するのに有益であり、幅広い応用の見通しがある。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明は、ジオトリカム変異株およびその用途を開示するものであり、当業者は明細書の内容から学び、プロセスパラメータを適切に改善することができる。特に、すべての類似の置換および変更が当業者には明らかであり、それらは本発明に含まれると見なされることに留意されたい。本発明の方法および用途は、好ましい実施例によって説明され、当業者は本発明の内容、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法および用途を変更または変更し組合せて、本発明の技術を実現・応用することができることは明らかである。
【００２２】
当業者は、本発明の特定の実施例に限定されることなく、本発明に記載された技術的解決策に基づいて、当該技術分野で他の従来の方法、実験プロトコル、および試薬を使用し得る。
【００２３】
本発明の実施例で使用される培地レシピは以下のとおりである。
ＰＤＡ  固体培地：ジャガイモ２００ｇ、グルコース２０ｇ、寒天１５ｇ、水１０００ｍＬ、
ＰＤＡ液体培地：ジャガイモ２００ｇ、グルコース１０ｇ、水１０００ｍＬ。
【００２４】
実施例１  赤色色素を生成する真菌のスクリーニングおよび分離
【００２５】
１、サンプルソース：２０１８年に第３４回南極科学研究によって収集されたフィールズ半島地域の土壌サンプル。
【００２６】
２、スクリーニング方法：
【００２７】
（１）サンプル希釈液の調製
正確にｌ．０ｇの土壌サンプルを計量し、９ｍｌ滅菌水を含む試験管に入れ、振盪によりサンプルを完全に分散させ、１：１０の土壌溶液から１ｍｌの土壌溶液を取り９ｍｌの滅菌水を加えて１:１００の土壌溶液を調製し、このようにして、１：１０００の土壌希釈溶液を調製する。
【００２８】
（２）株の予備スクリーニング
１００ｕｌの土壌希釈溶液をＰＤＡ培地プレート上に均一に塗布し、１５℃で３〜４日間培養し、培地上で成長したコロニーを観察し、赤色色素を生成する可能性のある真菌株を取り出す。
【００２９】
（３）株の再スクリーニング
予備スクリーニングによって得られた赤色色素を生成する可能性のある単一コロニーを、接種針で新しいＰＤＡ培地プレート上にスポットして培養し、コロニーの直径に対する赤い円の直径の比（ＨＣ値）が大きいコロニーを選択する。
【００３０】
（４）株の分離および精製
再スクリーニングされた株を、新しいＰＤＡ培地プレートに接種し、ストリークし、１５℃で３〜４日間培養し、培地上に成長したコロニーを観察し、ストリークを３回以上繰り返し、顕微鏡で何回も連続して単一形態の菌体を観察したため、株は分離および精製されることが分かる。
【００３１】
上記のステップの後、出願人は、それぞれＳＴ１、ＳＴ２、およびＳＴ３と命名された３つの精製された赤色色素を生成する真菌株をスクリーニングし得た。
【００３２】
（５）振とうフラスコ発酵検証
７ｍｌの滅菌水を培養皿に加えて、ＳＴ１、ＳＴ２、およびＳＴ３の単一コロニーを接種リングでこすり、培養皿を回転させてプレート上の細菌を滅菌水に完全に分散させ、ピペットを使用して菌懸濁液をＰＤＡ液体培地に加え、接種量を１０％にし、１５℃、１２０ｒ／ｍｉｎで１２日間培養し、発酵液を８０００ｒ／ｍｉｎで５ｍｉｎ遠心分離し、上澄み液を光路長１ｃｍの石英キュベットに入れ、発酵液のＯＤ５２５を分光光度計で測定する。その中、ＳＴ２株の発酵上澄み液のＯＤ５２５値が最も高く、２４．６に達した。これは、出願人によってスクリーニングし得られた３つの真菌の中でＳＴ２の赤色色素の収量が最も高いことを示している。
【００３３】
実施例２  赤色色素を生成する真菌の同定
【００３４】
実施例１で分離および精製し得られたＳＴ２株を使用して、コロニーの形態および分子生物学的方法を同定し、具体的な過程は以下の通りである。
【００３５】
１、固体プレート培養法
ＳＴ２株をＰＤＡ培地プレート上に接種し、１５℃で１０日間培養し、コロニーの直径は８〜１２ｍｍである。
コロニー形態：ＳＴ２株のコロニー初期階段で白く、発生の後期階段でフクシアになり、形状が丸く、平らに広がり、中央が平らで、胞子の茎が短く、コロニーの表面がふわふわしているか、ほとんど粉状であり、胞子の成長の後期階段でスチールグレーになり、コロニー裏面が初期階段で無色で、その後かすかな黄色に変わり、最後的にはフクシアに変わる。
【００３６】
２、分子生物学はＩＴＳ遺伝子同定を使用する
上記のＰＤＡ培地プレート上から１００ｍｇのＳＴ２株の菌糸を掻き取り、カラスビーズの付いた２ｍＬの遠心管に入れ、７５０μＬのＣＴＡＢ抽出液（２％  ｗ／ｖ  ＣＴＡＢ、１ｍｏｌ／Ｌ  ＮａＣｌ,  ０．１ｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ、０．０２ｍｏｌ／Ｌ  ＥＤＴＡ）を加え、遠心管をＰｒｅｃｅｌｌｙｓ  ２４  ホモジナイザーに置き遠心研磨し、液体を１．５ｍＬの遠心管に移し、１．５μＬのメルカプトエタノールを加え、６５℃の水浴を２時間行い、７５０μＬのクロロホルム：イソアミルアルコール（２４:１  ｖ／ｖ）を加え、転倒混和し、室温、１００００ｇ、１５ｍｉｎで遠心分離し、上層の液体を収集して、ＴａＫａＲａ  ＤＮＡ  フラグメント精製キットで精製し、精製したＤＮＡを-２０℃で保存する。プライマーを使用して、ＩＴＳシーケンスを増幅する。ＰＣＲ反応の条件は、９４℃で５ｍｉｎ、９４℃で３０ｓ、５５℃で３０ｓ、７２℃で１ｍｉｎ予備変性し、３０回繰り返し、７２℃で１０ｍｉｎ伸長した。
【００３７】
ＰＣＲ増幅して得られたＩＴＳ遺伝子の一部のフラグメントを上海サニーバイオテクノロジー株式会社に送り配列決定する。配列決定の結果、ＩＴＳ遺伝子シーケンスはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１であることを示した。
【００３８】
ＮＣＢＩ  ＢＬＡＳＴ  対照分析の後、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１はジオトリカムＧｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ｗｎｆ-１５Ａ由来のシーケンスＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２（ＧｅｎＢａｎｋ:  ＪＮ６３０６２９．１）と最も高い類似性を有し、９８．２％に達する。したがって、本発明によってスクリーニングし得られたＳＴ２株はジオトリカム属（Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．）株であり、ジオトリカムＧｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａと比較して、ＳＴ２株は複数のヌクレオチド変異を有する。出願人はＳＴ２株をジオトリカムＳＴ２（Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ＳＴ２）と命名した。
【００３９】
（１）Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＳＴ２  シーケンス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:１）
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【００４０】
（２）Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ｗｎｆ-１５Ａ  シーケンス（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ:２）
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【００４１】
実施例２  ジオトリカムＳＴ２株の赤色色素産生能力の分析
【００４２】
１、振とうフラスコ発酵
出願人はジオトリカムＳＴ２  菌懸濁液をＰＤＡ液体培地に加え、接種量を１０％とし、１５℃、１２０ｒ／ｍｉｎで１２日間培養し、発酵液の色変化を毎日一定の時間に観察および記録し、発酵液からサンプルを取り、８０００ｒ／ｍｉｎ、５ｍｉｎ遠心分離し、上澄み液を光路長１ｃｍの石英キュベット中に入れ、発酵液のＯＤ５２５を分光光度計で測定し、同時にＧｅｏｍｙｃｅｓｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａと対照し、具体的な結果を表１に示す。
【００４３】
観察結果から、ジオトリカムＳＴ２の発酵液は４日目から赤に変わり、５日目に発酵液はフクシアに変わり、時間の経過とともに、発酵液のフクシア色が濃くなり、且つ発酵液中の菌糸体の濃度も高くなる。これは、発酵の初期階段（７２ｈ以内）で、ジオトリカムＳＴ２は主に大量の栄養素を吸収し、細胞内に色素を保存し、４日目から色素を細胞の外に分泌し、発酵液が赤くなり、且つ菌糸体の濃度増加に従い、発酵液中の赤色色素の濃度も高くなる。
【００４４】
【表１】
2021511779.tif 000002
【００４５】
表１のデータから、本発明により提供されるジオトリカムＳＴ２株の７２ｈ以内の発酵では、その発酵上澄み液のＯＤ５２５値は基本的に０であり、４日目にＯＤ５２５値が２．４に増加し、且つ発酵時間の経過に伴い、ＯＤ５２５値が継続的に増加し、１２日目発酵では、対照群Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａ  発酵上澄み液の  ＯＤ５２５値が１９．５に達したが、ジオトリカムＳＴ２株発酵上澄み液のＯＤ５２５値が２４．６と高かった、対照群より２６．１％増加した。したがって、本発明により提供されるジオトリカムＳＴ２株は大量の赤色色素を分泌することができ、対照群Ｇｅｏｍｙｃｅｓｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａよりも赤色色素の収量が顕著に高く、予想外の技術的効果が得られたことがわかる。
【００４６】
２、発酵槽発酵
ジオトリカムＳＴ２菌懸濁液をＰＤＡ液体培地に加え、接種量を１０％とし、１５℃、１２０ｒ／ｍｉｎで３．５日間培養し、種溶液を得た。
１５０Ｌの発酵槽中にＰＤＡ液体培地、消泡剤を加え、蒸気滅菌し、１５°Ｃに冷却し、１０％の接種量に従って、種溶液を発酵槽中に入れ、発酵パラメータについては、１５℃、１１０ｒ／ｍｉｎ、空気流量５０-１００ＬＰＭである。１２ｄ連続し発酵培養し、発酵液中からサンプルを取り、８０００ｒ／ｍｉｎ、５ｍｉｎで遠心分離し、上澄み液を光路長１ｃｍの石英キュベット中に入れ、発酵上澄み液のＯＤ５２５値を分光光度計で測定する。同時にＧｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａと対照する。
【００４７】
その結果、１５０Ｌの発酵槽で１２ｄ連続発酵した後、対照群Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａ  発酵上澄み液の  ＯＤ５２５値は１６．７であるのに対して、本発明により提供されるジオトリカムＳＴ２  発酵上澄み液のＯＤ５２５値は２１．６と高かった、対照群より２９％増加した。したがって、本発明により提供されるジオトリカムＳＴ２株の赤色色素収量は対照群Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａよりも顕著に高い。
【００４８】
３、赤色色素抽出と検出
上記１５０Ｌの発酵槽発酵から得られた発酵液を遠心分離ボルト中に入れ、７５００ｒ／ｍｉｎ、１５ｍｉｎで遠心分離し、上澄み液を２００メッシュのふるいで濾過して菌体を除去し、得られたろ液は粗色素液であった。
【００４９】
ＤＰＨ-７２２  マクロポーラス吸着樹脂を使用して粗色素液を吸着し、飽和吸着が達成された後、クロマトグラフィーカラムに装填し、１５ｍＬ／ｍｉｎの流量で２つのカラムを洗浄し、その後同様の速度で７０％エタノールで色素を溶出し、溶出液を収集する。収集した色素溶出液を回転蒸発に供してエタノールを除去し、次いで真空凍結乾燥して赤色色素固体粉末を得た。
【００５０】
０．１ｇの赤色色素固体粉末を取り１００ｍＬの容量ボルトで体積を決定し、反転して溶解した後、希釈した溶液を光路長１ｃｍの石英キュベット中に入れ、その最大波長（５２５ｎｍ）の吸光度Ａを分光光度計で測定し、色値を算出する。
【００５１】
色値は、天然色素の主要な品質指標の１つであり、色素含有量のレベルと製品の着色の強さをある程度反映できる。
2021511779.tif 000003
ただし、Ａは試料溶液の実測吸光度を示し、ｃは試料溶液の濃度を示し、単位はグラム／ミリリットル（ｇ／ｍｌ）であり、１００は濃度換算係数である。
【００５２】
その結果、対照群Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａによって生成された赤色色素のＯＤ５２５値は１１．２であり、色値は１１２であるが、本発明により提供されるジオトリカムＳＴ２株によって生成された赤色色素のＯＤ５２５値は１４．４であり、色値は１４４であり、対照群よりも３０．９％増加したことが分かる。
【００５３】
従って、本発明により提供されるジオトリカムＳＴ２株によって生成された赤色色素はより良い品質を有し、予想外の技術的効果を達成したことを示す。
【００５４】
実施例３  ジオトリカムＳＴ２の黄色色素産生能力の分析
実施例２の前記粗色素液を、ＤＰＨ-７２２  マクロポーラス吸着樹脂を使用して色素を吸着し、飽和吸着が達成された後クロマトグラフィーカラムに装填し、１５ｍＬ／ｍｉｎの流量で２つのカラムを洗浄し、その後同様の速度で７０％エタノールを使用して色素を溶出し、溶出液を収集する。収集した色素溶出液を回転蒸発に供してエタノールを除去し、次いで真空凍結乾燥して、黄色色素である黄褐色の固体粉末を得た。この粉末は水溶性で、黄色の着色剤として使用できる。
【００５５】
０．１ｇの黄褐色の固体粉末をとり１００ｍＬの容量ボルト中に入れ体積を決定し、反転して溶解した後、希釈液を光路長１ｃｍの石英キュベット中に入れ、色素希釈液のＯＤ４４０値を分光光度計で測定した。
【００５６】
色値の測定方法は、０．１ｇの黄色色素固体サンプルを正確に量り、１００ｍＬの容量ボルト中に入れ、光路長１ｃｍのキュベットで最大波長（４４０ｎｍ）の吸光度Ａを測定し、色値を算出する。
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ただし、Ａは試料溶液の実測吸光度を示し、ｃは試料溶液の濃度を示し、単位はグラム／ミリリットル（ｇ／ｍｌ）であり、１００は濃度換算係数である。
【００５７】
その結果、本発明により提供されるジオトリカムＳＴ２株によって生成された黄色色素のＯＤ４４０値は３．８であり、色値は３８であることを示した。
【００５８】
実施例４  ＡＲＴＰ  プラズマ突然変異誘発によるスクリーニング
プラズマ中の活性粒子を微生物として使用し、微生物の細胞壁／膜の構造および透過性を変化させ、遺伝子の損傷を引き起こし、さらに微生物遺伝子シーケンスおよびその代謝ネットワークを大幅に変化させ、最終的に微生物を変異させる。
【００５９】
従来の突然変異誘発と比較して、ＡＲＴＰはＤＮＡの多様性の損傷を引き起こし、突然変異率が高く、かつ良好な遺伝安定性を有する突然変異株を入手できる。
【００６０】
プラズマ突然変異誘発による突然変異ランダム性が高く、突然変異の効果もランダムであり、予測が困難である。したがって、効果的な正の突然変異を得るために、技術者は通常、複数回の突然変異誘発を行う必要があり、スクリーニングの作業負荷が大きく、効果的な正の突然変異が得られない可能性がある。しかし、突然変異誘発の設備が簡単で、操作しやすく、且つ在短時で大量の突然変異体を得ることができるため、現在、効果的な突然変異誘発育種方法としてよく使用されている。
【００６１】
出願人は、さらにジオトリカムＳＴ２（Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ＳＴ２）を開始株とし、ＡＲＴＰ  プラズマ突然変異誘発により遺伝子組み換えして、赤色色素の収量をさらに増加させる。
【００６２】
１、突然変異誘発
７５％のアルコールを使用して操作台の内部を拭き、紫外線ランプをオンにして２０分間滅菌し、突然変異誘発操作の前にヘリウム（Ｈｅ）を通過させて機械の予熱を行う。
【００６３】
新鮮な培養皿上の単一コロニーを取り、６〜１０ｍＬの滅菌水で単一コロニーをこすり、菌懸濁液を３層ろ紙の方向からファンネルに移し、濾過し、５０ｍＬの三角ボルトにろ液を収集し、よく振って、血球カウント板を使用して１ｍＬの胞子の数をカウントする。希釈菌懸濁液中の胞子の数は１０５程度である。
【００６４】
パラメータの設定：該突然変異誘発装置では、プラズマ生成の開始ガスとして高純度ヘリウム（Ｈｅ）を使用し、電源は１００Ｗ、ＲＦ電力は１３Ｗ、作動距離は４ｍｍ、プラズマの温度は２８°Ｃ、ガス流量は１０ＳＬＭである。気流と放射距離が決定されると、サンプルに対するＡＲＴＰの影響は暴露時間に依存する。胞子懸濁液の突然変異誘発の暴露時間を、それぞれ１０ｓ、２０ｓ、３０ｓ、４０ｓ、５０ｓ、６０ｓに設定する。異なる暴露時間で照射した後、それぞれ胞子の数を計算し、死亡率を算出し、具体的な結果を表２に示した。
【００６５】
【表２】
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【００６６】
以上のように、出願人は、胞子懸濁液の突然変異誘発の暴露時間として４０ｓを選択した。
【００６７】
２、突然変異誘発の結果
１００μＬの突然変異誘発処理された胞子懸濁液をそれぞれＰＤＡ培地プレート中に入れ、均一に塗布し、コロニーがわずかに赤くなるまで１５℃で培養し、合計１０２個の赤くなった単一コロニーを選択し、それぞれＰＤＡ液体培地中に入れ、１５℃、１２０ｒ／ｍｉｎ、振とうフラスコ条件下で１２ｄ培養し、各株菌発酵上澄み液のＯＤ５２５値をそれぞれ測定し、同時に開始株ジオトリカムＳＴ２を対照群とする。
【００６８】
その結果、第１のループで突然変異誘発スクリーニングによって得られた１０２株の変異株のうちに、発酵上澄み液ＯＤ５２５値が開始株より高い変異株がなく、ただし、９１株の変異株のＯＤ５２５の値が開始株と基本的に同じであり、他の１１株の変異株発酵上澄み液ＯＤ５２５値は開始株よりも５〜７％も低かった。
【００６９】
出願人は、上記の方法に従って８ループの突然変異誘発スクリーニングを行い、最終的に発酵上澄み液ＯＤ５２５値が開始株より顕著に高い１株の変異株を得、Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１８Ｃと命名した。
【００７０】
該変異株をＰＤＡ液体培地中で１５℃、１２０ｒ／ｍｉｎ振とうフラスコ条件下で１２ｄ培養した後、その発酵上澄み液ＯＤ５２５値が３３．６と高く、開始株より３６．５％増加し、Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１５Ａより７２．３％増加した。したがって、変異株Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１８Ｃの赤色色素収量が大幅に向上し、予想外の技術的効果が得られたことを示している。
【００７１】
また、出願人は、実施例３に記載の方法を参照して、変異株Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１８Ｃ  発酵上澄み液中の黄色色素を収集し、黄色色素固体粉末を調製してその色値を測定した。その結果、該変異株によって生成された黄色色素の色値は４１であり、開始株より７．８％増加したことを示した。従って、変異株Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．ｗｎｆ-１８Ｃによって生成された黄色色素の品質がさらに改善され、予想外の技術的効果が得られたことを示している。
【００７２】
出願人は、２０１９年１月２４日に中国武漢の武漢大学の中国典型培養物寄託センターに変異株Ｇｅｏｍｙｃｅｓ  ｓｐ．  ｗｎｆ-１８Ｃを寄託番号ＣＣＴＣＣ  ＮＯ:  Ｍ２０１９０８６で寄託した。
【配列表】
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【国際調査報告】
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