(57)【要約】本開示は、無針回収を伴う、生物医学的材料のための閉鎖系極低温容器に指向している。該無針回収は、該容器内部の生物医学的材料に対する損傷を減らすことができ、該容器からの生物医学的材料のより多くの回収を可能にすることができ、かつ該容器からの該生物医学的材料の取り出しの最中のユーザに対する該閉鎖系極低温容器の曝露リスクを減らすことができる。いくつかの局面において、該容器は、養子細胞療法と関連する場合を含めて、細胞の組成物、たとえば操作された細胞を含む組成物を貯蔵またはパッケージングするために使用することができる。また、製造物、キット、および方法も提供される。2021502094.tif 000003
2021502094.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
上部および開放された底部を含む、バイアル；
該バイアルの内部に流体接続しており、かつ装填ポートを含む、該バイアルの該上部によって支持された入口チューブ；ならびに
該バイアル中の生物医学的材料への直接的なアクセスを提供する、該バイアルの該開放された底部に流体接続された無針回収ポート
を含む、生物医学的材料容器。
【請求項２】
前記装填ポートが無針装填ポートである、請求項1に記載の生物医学的材料容器。
【請求項３】
前記無針装填ポートがルアーロック接続フィッティングを含む、請求項2に記載の生物医学的材料容器。
【請求項４】
前記無針装填ポートの前記ルアーロック接続フィッティングと係合するように構成された第一のキャップをさらに含む、請求項3に記載の生物医学的材料容器。
【請求項５】
前記無針回収ポートがルアーロック接続フィッティングを含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の生物医学的材料容器。
【請求項６】
前記無針回収ポートの前記ルアーロック接続フィッティングと係合するように構成された第二のキャップをさらに含む、請求項5に記載の生物医学的材料容器。
【請求項７】
前記バイアルの前記上部によって支持されており、かつ該バイアルの内部に流体接続されている、エアベントチューブ
をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項に記載の生物医学的材料容器。
【請求項８】
前記エアベントチューブがフィルタを含む、請求項7に記載の生物医学的材料容器。
【請求項９】
前記フィルタが微生物バリアフィルタである、請求項8に記載の生物医学的材料容器。
【請求項１０】
前記バイアルの前記上部が、前記入口チューブと該バイアルの内部との間に流体接続された第一のチューブアダプタを含む、請求項1〜9のいずれか一項に記載の生物医学的材料容器。
【請求項１１】
前記バイアルの前記上部が、前記エアベントチューブと該バイアルの内部との間に流体接続された第二のチューブアダプタを含む、請求項7〜10のいずれか一項に記載の生物医学的材料容器。
【請求項１２】
前記第一のチューブアダプタおよび前記第二のチューブアダプタの、前記バイアルの内部への開口部が、壁によって隔てられている、請求項11に記載の生物医学的材料容器。
【請求項１３】
前記回収ポートが自己閉鎖型無針回収ポートである、請求項1〜12のいずれか一項に記載の生物医学的容器。
【請求項１４】
USPクラスVI準拠材料でできている、請求項1〜13のいずれか一項に記載の生物医学的材料容器。
【請求項１５】
生物医学的材料を、入口チューブの装填ポートを介してバイアルに注入する工程であって、該入口チューブが該バイアルの上部によって支持されている、該工程；および
該バイアルの開放された底部に流体接続された無針回収ポートを介して該バイアルから該生物医学的材料を回収する工程であって、該無針回収ポートが該バイアル中の該生物医学的材料への直接的なアクセスを提供する、該工程
を含む、生物医学的材料を貯蔵および回収する方法。
【請求項１６】
前記バイアル中で前記生物医学的材料を極低温凍結させる工程、および該バイアル中の極低温凍結された該生物医学的材料を解凍する工程をさらに含む、請求項15に記載の方法。
【請求項１７】
前記入口チューブをシールする工程をさらに含む、請求項15または16に記載の方法。
【請求項１８】
エアベントチューブが、前記バイアルの前記上部によって支持されており、かつ該バイアルの内部に流体接続されている、該エアベントチューブをシールする工程をさらに含む、請求項15〜17のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記バイアルから空気を抜くことができるように前記エアベントチューブを切開する工程をさらに含む、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
前記装填ポートが無針装填ポートである、請求項15〜19のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記無針装填ポートがルアーロック接続フィッティングを含む、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
前記無針回収ポートがルアーロック接続フィッティングを含む、請求項15〜21のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記エアベントチューブがフィルタを含み、かつ該エアベントチューブが、該エアベントチューブ中の該フィルタの位置よりも上でシールされる、請求項18〜22のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記回収ポートが自己閉鎖型無針回収ポートである、請求項15〜23のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
請求項1〜14のいずれか一項に記載の生物医学的材料容器と、細胞療法を含む組成物とを含む、製造物。
【請求項２６】
前記細胞療法が、組換え受容体を発現する遺伝子操作された細胞を含む、請求項25に記載の製造物。
【請求項２７】
前記組換え受容体がT細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）である、請求項26に記載の製造物。
【請求項２８】
前記遺伝子操作された細胞がT細胞を含む、請求項26または27に記載の製造物。
【請求項２９】
前記T細胞がCD4+および／またはCD8+である、請求項28に記載の製造物。
【請求項３０】
前記遺伝子操作された細胞が、対象から、任意でヒト対象から単離される細胞を含む、請求項26〜29のいずれか一項に記載の製造物。
【請求項３１】
前記遺伝子操作された細胞が、前記対象にとって自己由来である細胞を含む、請求項30に記載の製造物。
【請求項３２】
前記遺伝子操作された細胞が、前記対象にとって同種異系である細胞を含む、請求項30に記載の製造物。
【請求項３３】
前記組成物が凍結保護物質をさらに含む、請求項25〜32のいずれか一項に記載の製造物。
【請求項３４】
前記細胞療法に関する情報または該細胞療法を実施するための取り扱い指示を含む、ラベル
をさらに含む、請求項25〜32のいずれか一項に記載の製造物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連技術の相互参照
本出願は、2017年11月10日に出願された「閉鎖系極低温容器（CLOSED-SYSTEM CRYOGENIC VESSELS）」と題する米国特許仮出願第62/584,722号に対する優先権を主張する。同出願の内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
本開示の分野
本開示は、いくつかの局面において、生物医学的材料のための容器に関する。より具体的には、本開示は、特定の局面において、無針回収を伴う、生物医学的材料のための閉鎖系極低温容器に関する。いくつかの局面において、容器は、養子細胞療法と関連する場合を含めて、細胞の組成物、たとえば操作された細胞を含む組成物を貯蔵またはパッケージングするために使用することができる。
【背景技術】
【０００３】
背景
細胞および組織などの様々な生物医学的材料を、生物医学用途における使用のために生物医学的材料の生存能力を延ばすために、多様な容器、たとえば極低温保存のための容器に挿入することができる。使用する準備ができると、生物医学的材料を、たとえば注射針を使用することにより、容器から取り出すことができる。細胞を含む生物医学的材料の貯蔵のための改良された容器が本明細書に開示される。
【発明の概要】
【０００４】
概要
無針回収を伴う、生物医学的材料のための極低温容器が提供される。いくつかの態様において、極低温容器は閉鎖系容器である。本明細書に開示される生物医学的材料容器は、生物医学的材料の取り出しの最中のリスクを減らすことができる。具体的には、無針回収は、容器内部の生物医学的材料に対する損傷を減らすことができ、容器からの生物医学的材料のより多くの回収を可能にすることができ、かつ／または、容器からの生物医学的材料の取り出しの最中のユーザに対する生物医学的材料容器のリスクを減らすことができる。加えて、本明細書に開示される生物医学的材料容器の回収ポートは、注射針を要する回収ポートと比べ、ユーザ効率を高めることができる。
【０００５】
いくつかの態様において、生物医学的材料容器は、上部および開放された底部を有する、バイアル；バイアルの内部に流体接続しており、かつ装填ポートを含む、バイアルの上部によって支持された入口チューブ；ならびに、バイアル中の生物医学的材料への直接的なアクセスを提供する、バイアルの開放された底部に流体接続された無針回収ポートを含む。いくつかの態様において、装填ポートは無針装填ポートである。いくつかの態様において、無針装填ポートはルアーロック接続フィッティングを含む。いくつかの態様において、生物医学的材料容器は、無針装填ポートのルアーロック接続フィッティングと係合するように構成されたキャップを含む。いくつかの態様において、無針回収ポートはルアーロック接続フィッティングを含む。いくつかの態様において、生物医学的材料容器は、無針回収ポートのルアーロック接続フィッティングと係合するように構成されたキャップを含む。いくつかの態様において、生物医学的材料容器は、バイアルの上部によって支持されており、かつバイアルの内部に流体接続されている、エアベントチューブを含む。いくつかの態様において、エアベントチューブはフィルタを含む。いくつかの態様において、フィルタは微生物バリアフィルタである。いくつかの態様において、バイアルの上部は、入口チューブとバイアルの内部との間に流体接続されたチューブアダプタを含む。いくつかの態様において、バイアルの上部は、エアベントチューブとバイアルの内部との間に流体接続されたチューブアダプタを含む。いくつかの態様において、2つのチューブアダプタの、バイアルの内部への開口部は、壁によって隔てられている。いくつかの態様において、回収ポートは自己閉鎖型無針回収ポートである。いくつかの態様において、生物医学的材料容器はUSPクラスVI準拠材料でできている。
【０００６】
いくつかの態様において、生物医学的材料を貯蔵および回収する方法は、生物医学的材料を、入口チューブの装填ポートを介してバイアルに注入する工程であって、入口チューブがバイアルの上部によって支持されている、工程；および、バイアルの開放された底部に流体接続された無針回収ポートを介してバイアルから生物医学的材料を回収する工程であって、無針回収ポートがバイアル中の生物医学的材料への直接的なアクセスを提供する、工程を含む。いくつかの態様において、方法は、バイアル中で生物医学的材料を極低温凍結させる工程、およびバイアル中の極低温凍結された生物医学的材料を解凍する工程を含む。いくつかの態様において、方法は、入口チューブをシールする工程を含む。いくつかの態様において、方法は、エアベントチューブが、バイアルの上部によって支持されており、かつバイアルの内部に流体接続されている、エアベントチューブをシールする工程を含む。いくつかの態様において、方法は、バイアルから空気を抜くことができるようにエアベントチューブを切開する工程を含む。いくつかの態様において、装填ポートは無針装填ポートである。いくつかの態様において、無針装填ポートはルアーロック接続フィッティングを含む。いくつかの態様において、無針回収ポートはルアーロック接続フィッティングを含む。いくつかの態様において、エアベントチューブはフィルタを含み、かつエアベントチューブは、エアベントチューブ中のフィルタの位置よりも上でシールされる。
【０００７】
以下の詳細な説明から、さらなる利点が当業者には容易に明らかになるであろう。本明細書における例および詳細な説明は、例示的な性質のものとみなされるべきであり、限定的とみなされてはならない。
【図面の簡単な説明】
【０００８】
添付図面を参照しながら例示的な態様を説明する。
【図１】本明細書に開示される生物医学的材料容器の例を示す。
【図２】本明細書に開示される生物医学的材料容器の例をキャップとともに示す。
【図３Ａ】本明細書に開示される第一の自己閉鎖型回収ポートの断面を示す。
【図３Ｂ】注射器が取り付けられている場合の、第一の自己閉鎖型回収ポートの断面を示す。
【図４Ａ】本明細書に開示される第二の自己閉鎖型回収ポートの断面を示す。
【図４Ｂ】注射器が取り付けられている場合の、第二の自己閉鎖型回収ポートの断面を示す。
【０００９】
図中、別段の記述がない限り、類似の符番が類似の部品に対応する。たとえば、バイアル101はバイアル201と同じであることができる。加えて、図面は一定の尺度で描かれていない。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
詳細な説明
本明細書に開示される生物医学的材料容器は、針を介する生物医学的材料回収を必要とする（いくつかの態様において、針は、外部針および／または容器に接続されていない針である）容器のリスクの1つまたは複数を減らすことができる。場合によっては、針は、容器内部の生物医学的材料を損傷するおそれがある。たとえば、針は、生物医学的材料を剪断、破断、または偶発的に汚染することにより、容器内部の生物医学的材料に対する損傷および／または応力を生じさせるおそれがある。第二に、注射針は、たとえば容器に貫入すると、容器から生物医学的材料の全部を取り出すことはできないこともある。そのうえ、針、たとえば外部針は、いくつかの局面においては不注意な針刺しのせいで、針を扱う人に対して危険を呈することもある。
【００１１】
本明細書に開示される生物医学的材料容器は、無針回収ポートを提供することにより、生物医学的材料に対する応力および／または損傷を減らすことまたはなくすことができる。本明細書に開示される生物医学的材料容器は、いくつかの態様において、容器中の生物医学的材料への直接的なアクセスを提供することにより、生物医学的材料のより大きな、および／または完全な回収を可能にすることができる。本明細書に開示される生物医学的材料容器は、生物医学的材料の取り出しの最中にユーザへの不注意な針刺しを減らすことができ、かつ取り出しの効率を高めることができる。
【００１２】
本出願において参照される、特許文献、科学技術文献、およびデータベースを含むすべての刊行物は、あらゆる趣旨に関し、各個の刊行物が参照により個別に組み入れられる場合と同じ程度に、全体として参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載される定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、公開出願、および他の刊行物に記載される定義に反する場合または他のやり点でそれと一致しない場合には、本明細書に記載される定義が、参照により本明細書に組み入れられる定義にまさる。
【００１３】
本明細書において使用されるセクション見出しは、編成のためだけのものであり、記載される主題を限定するものと解釈されてはならない。
【００１４】
I. 生物医学的材料容器
本明細書に記載される容器は、様々な生物医学的材料、たとえばヒト、動物、昆虫および植物の細胞および／または組織のために使用することができる。いくつかの態様において、本明細書に記載される容器は、生物医学的材料の極低温貯蔵を含む、そのような生物医学的材料の貯蔵のために使用される。図1は、本明細書に開示される生物医学的材料容器の例を示す。生物医学的材料容器は、バイアル、たとえばバイアル101を含むことができる。容器に挿入された任意の生物医学的材料は、凍結、解凍および／またはその後の取り出しのために、バイアル中に貯蔵されることができる。そのようなものとして、バイアルは、液状生物医学的試料を受けるようにサイズ設定されることができる。いくつかの態様において、バイアルは、約1mL〜100mL、たとえば、1mL、2mL、3mL、4mL、5mL、6mL、7mL、8mL、9mL、10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、もしくは100mL、または少なくとも1mL、少なくとも2mL、少なくとも3mL、少なくとも4mL、少なくとも5mL、少なくとも6mL、少なくとも7mL、少なくとも8mL、少なくとも9mL、少なくとも10mL、少なくとも20mL、少なくとも30mL、少なくとも40mL、少なくとも50mL、少なくとも60mL、少なくとも70mL、少なくとも80mL、少なくとも90mL、もしくは少なくとも100mL、または少なくとも約1mL、少なくとも約2mL、少なくとも約3mL、少なくとも約4mL、少なくとも約5mL、少なくとも約6mL、少なくとも約7mL、少なくとも約8mL、少なくとも約9mL、少なくとも約10mL、少なくとも約20mL、少なくとも約30mL、少なくとも約40mL、少なくとも約50mL、少なくとも約60mL、少なくとも約70mL、少なくとも約80mL、少なくとも約90mL、もしくは少なくとも約100mL、または約1mL、約2mL、約3mL、約4mL、約5mL、約6mL、約7mL、約8mL、約9mL、約10mL、約20mL、約30mL、約40mL、約50mL、約60mL、約70mL、約80mL、約90mL、もしくは約100mLの貯蔵容量を有する。いくつかの態様において、バイアルは、約1〜10mL、約2〜10mL、約1〜5mL、約2〜5mL、約10mL、約5mL、または約2mLの貯蔵容量を有する。いくつかの態様において、バイアルは目盛り付きである。加えて、バイアルは、複数の生物医学的材料容器を輸送、凍結および／または解凍することができるような容器貯蔵装置、たとえば箱またはケイン（cane）に嵌まるようにサイズ設定されることができる。
【００１５】
バイアルは上部102および底部103を有することができる。いくつかの態様において、上部は開放された上部であることができ、かつ／または、底部は開放された底部であることができる。上部が開放されている場合、バイアルの開放された上部はキャップによってシールされることができる。いくつかの態様において、キャップはバイアルに気密シールされる。いくつかの態様において、キャップはバイアルにヒートシールされる。キャップとバイアルはいっしょになって液密な接続を形成することができる。いくつかの態様において、キャップは、キャップとバイアルが1つの部品として形成されるように、バイアルに内蔵されることもできる。
【００１６】
バイアルの上部はエアベントチューブ104および／または入口チューブ105を支持することができる。エアベントチューブおよび／または入口チューブはバイアル101の内部に流体接続されることができる。バイアルの上部はチューブアダプタを含むことができ、チューブアダプタは、エアベントチューブとバイアル内部との間および入口チューブとバイアル内部との間に流体接続（すなわち液密接続）されることができる。加えて、2つのチューブアダプタの、バイアル内部への開口部は、壁によって隔てられることができる。壁は、入口チューブからチューブアダプタを通って入る流体が他方のアダプタからエアベントチューブへと抜けることを防ぐことができる。
【００１７】
いくつかの態様において、エアベントチューブおよび／または入口チューブはフレキシブルであることができる。そのようなものとして、入口チューブは、生物医学的試料をより上手にバイアルに挿入するように操作されることができる。加えて、フレキシブルなエアベントチューブおよび／またはフレキシブルな入口チューブは、互いまたは他の生物医学的材料容器との干渉を避けるように操作されることができる。入口チューブは、生物医学的試料を受けるための装填ポート106を含むことができる。装填ポートは入口チューブに気密シールされることができる。いくつかの態様において、装填ポートは入口チューブにヒートシールされる。入口チューブと装填ポートはいっしょになって液密な接続を形成することができる。
【００１８】
装填ポートは多様な装填ポートであることができる。たとえば、装填ポートは、ニードルセプタムなどの標準的な針のための装填ポートであることができる。ニードルセプタムの場合、ニードルセプタムは、入口チューブとともに気密かつ液密なシールを提供するように構成されることができる。ニードルセプタムは、生物医学的試料をバイアルに注入することができるように、注射針によって穿孔されることができる。いくつかの態様において、ニードルセプタムは、一旦針が抜かれるとセルフシールするニードルセプタムであることができる。
【００１９】
いくつかの態様において、装填ポートは無針装填ポートであることができる。たとえば、無針装填ポートは、図1に示すようなルアーロック接続フィッティングであることができる。そのようなものとして、ルアーロック接続フィッティングを有する注射器を装填ポートのルアーロック接続フィッティングにねじ込むことができ、生物医学的試料を装填ポートおよび入口チューブ105に通してバイアルに挿入することができる。いくつかの態様において、装填ポートのルアーロック接続フィッティングはメスルアーロック接続フィッティングであることができる。そのようなものとして、オスルアーロック接続フィッティングを有する注射器を装填ポートのメスルアーロック接続フィッティングにねじ込むことができる。一旦、注射器が装填ポートに接続されると、生物医学的試料を装填ポートおよび入口チューブに通してバイアルに挿入することができる。
【００２０】
生物医学的試料が装填ポートおよび入口チューブを介してバイアルに挿入される場合、試料のセグメントが望まれることがある。セグメントが望まれる場合には、ユーザは、注射器プランジャを引き戻して、入口チューブ中、そのセグメントのための液体の上下に空間を作り出すことができる。次いで、ユーザは、空気を入口チューブに押し込んで、液柱セグメントを所望のレベルに配置することができる。セグメントが望まれる場合には、ユーザは、入口チューブ中の液体セグメントの上下で入口チューブをシールすることができる（たとえば、EVAチューブとの使用のために設計されたシーラを用いて）。加えて、ユーザはまた、貯蔵のためにセグメントを容易に折りたたむことができるように、下シールよりも下にさらなるシールを配置することができる。セグメントが望まれない場合には、ユーザはただ1つのシールをバイアルボディの近くに配置することができる。
【００２１】
いくつかの態様において、エアベントチューブはエアベントチューブ内にフィルタを含むことができる。いくつかの態様において、フィルタは気体透過性であることができるが、バイアル内に貯蔵された生物医学的試料に対しては不透過性であることができる。フィルタはまた、微生物バリアフィルタであることができる。エアベントチューブもまた、入口チューブと同様にシールされることができる。いくつかの態様において、エアベントチューブはフィルタよりも上でシールされる。一旦、エアベントチューブおよび入口チューブがシールされると、容器は閉鎖系となることができる。閉鎖系は、有害汚染物質への曝露および試料漏れから試料を保護することができる。一旦、閉鎖系が形成されると、より容易な貯蔵のために、余分なチューブを除くことができる。そして、容器を、極低温での貯蔵に備え、箱の中またはケインの上に配置することができる。
【００２２】
セグメントが必要である場合、容器を貯蔵装置から取り出し、取り出し後ただちにセグメントを切断することができる。バイアル中の生物医学的試料が必要である場合、容器を極低温貯蔵装置から取り出し、解凍することができる。解凍後、エアベントチューブを切開してベント通路を開くことができる。容器は、バイアルの底部に流体接続された回収ポート107を含むことができる。回収ポートは、貯蔵後、バイアルから生物医学的試料を取り出すために使用することができる。回収ポートはバイアルの底部に気密シールされることができる。いくつかの態様において、回収ポートはバイアルの底部にヒートシールされる。いくつかの態様において、回収ポートはバイアルの開放された底部を閉じることができる。バイアルの底部と回収ポートはいっしょになって液密接続を形成することができる。いくつかの態様において、回収ポートは、回収ポートを保護するためのリムーバブルカバーを含むことができる。
【００２３】
いくつかの態様において、回収ポートは無針回収ポートであることができる。そのようなものとして、無針回収ポートは、バイアル内の生物医学的試料への直接的なアクセスを提供することができる。したがって、生物医学的試料の回収はニードルセプタムの穿刺を要しない。無針回収ポートは、回収プロセス中、鋭利な針によって生じる、バイアル内の生物医学的材料に対する応力および／または損傷（すなわち剪断または破断）を除くことができる。無針回収ポートは、針の導入による生物医学的試料の偶発的な汚染の可能性を減らすことができる。加えて、針がバイアルに貫入する必要がないため、より多くの生物医学的材料をバイアルから取り出すことができる。本出願人らは、有針注射器を使用してニードルセプタムポートから試料を取り出す際に、平均で約0.3mLの生物医学的試料がバイアル中に残ることを見いだした。したがって、無針回収ポートは、取り出し後にバイアル中に残る生物医学的材料の量を、約0.3mL未満、約0.25mL未満、約0.2mL未満、約0.15mL未満、約0.1mL未満、約0.05mL未満、または約0.025mL未満にまで減らすことができる。いくつかの態様において、無針回収ポートは、バイアル中の生物医学的試料の全部を取り出すことができる。さらには、無針回収ポートは、バイアルからの生物医学的試料の取り出しを実際に行うユーザに対する曝露リスク（すなわち針刺し）の可能性を除くことができる。
【００２４】
いくつかの態様において、回収ポートは、図1に示すようなルアーロック接続フィッティングであることができる。そのようなものとして、ルアーロック接続フィッティングを有する注射器を回収ポートのルアーロック接続フィッティングにねじ込むことができ、生物医学的試料を回収ポートに通して取り出すことができる。いくつかの態様において、回収ポートのルアーロック接続フィッティングはメスルアーロック接続フィッティングであることができる。そのようなものとして、オスルアーロック接続フィッティングを有する注射器を回収ポートのメスルアーロック接続フィッティングにねじ込むことができる。一旦、注射器が回収ポートに接続されると、生物医学的試料を回収ポートに通してバイアルから取り出すことができる。
【００２５】
いくつかの態様において、無針回収ポートは自己閉鎖型回収ポートであることができる。たとえば、自己閉鎖型回収ポートは自己閉鎖型メスルアーであることができる。そのようなものとして、注射器が自己閉鎖型メスルアーに取り付けられると、フルー（flue）が回収ポートを通って自由に流れる。しかし、注射器が除かれると、回収ポートはぴったり閉じて液体損失をなくし、潜在的な感染を防ぐことができる。したがって、自己閉鎖型回収ポートを有することは、注射器が除かれる際に内容物が漏れるリスクを伴うことなく、ユーザが容器の内容物にアクセスすることを可能にすることができる。
【００２６】
図3A〜3Bおよび4A〜4Bは、注射器が取り付けられている自己閉鎖型回収ポートおよび注射器が取り付けられていない自己閉鎖型回収ポートの断面を示す。図3Aに示すように、回収ポート307は閉じている。そのようなものとして、圧縮可能な要素311が圧縮されておらず、それにより、回収ポートを閉じている。注射器310が回収ポート307に取り付けられると、図3Bに示すように、圧縮可能な要素311は圧縮され、それにより、回収ポートを開く。注射器310が除かれると、圧縮可能な要素311は圧縮を解除され、回収ポートを閉じる。図4Aを参照すると、回収ポート407は閉じている。そのようなものとして、圧縮可能な要素411は流体経路ウィンドウ412を覆う。注射器410が回収ポート408に取り付けられると、図4Bに示すように、圧縮可能な要素411は圧縮されて、もはや流体経路ウィンドウ412を覆わなくなり、それにより、流体が流体経路ウィンドウ412を通過することを可能にする。一旦、注射器410が除かれると、圧縮可能な要素411は圧縮を解除されて流体経路ウィンドウ412を覆い、それにより、回収ポートを閉じる。自己閉鎖型回収ポートの例は、ICU Medicalの無針コネクタ；VygonのVadsite無針コネクタ；Quest Medicalの無針注射部位およびBecton DickinsonのSmartSite（商標）無針バルブを含むが、それらに限定されない。
【００２７】
回収ポートおよび／または装填ポートは、図2に示すように、それぞれキャップ209および208を含むことができる。ポートのためのキャップはポートを損傷から保護することができる。加えて、回収ポート上のキャップは、容器を直立させるためのスタンドとして働くことができる。そのようなものとして、キャップは、容器を直立させるための、回収ポートそのものよりもかたよっていない面を提供することができる。いくつかの態様において、キャップは、ルアーロック接続フィッティングのためのキャップであるように構成されている。たとえば、キャップは、メスルアーロック接続フィッティングのためのキャップであるように構成されることができる。そのようなものとして、キャップは、メスルアーロック接続フィッティングにねじ込むためのねじ込みキャップであってもよい。
【００２８】
いくつかの態様において、本明細書に開示される生物医学的材料容器のすべての部品は、極低温（すなわち、−196℃の低さの温度）およびその後の解凍に耐えることができる。加えて、本明細書に開示される生物医学的容器のすべての部品は、USPクラスVI準拠材料から製造されることができる。加えて、本明細書に開示される生物医学的容器は、浸出物の許容限界に関してISO 10993-17および18に定められた要件を満たすことができる。本明細書に開示される生物医学的材料容器のすべての部品は、適切なプラスチック、たとえばポリスチレンまたはポリプロピレンで形成されることができる。加えて、本明細書に開示されるチューブは、ヒートシール能力を損なうことなく極低温に耐えることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示されるフレキシブルなチューブは、TYGON（登録商標）または類似の材料で形成されることができる。
【００２９】
加えて、生物医学的材料容器は、生物医学的材料容器の無菌性を保証するための線量を使用する電離放射線、たとえばガンマ線、電子ビームまたは高エネルギーX線を照射されてもよい。さらには、容器の様々な部品はすべて、耐放射線性材料、たとえばエチレンコポリマー、シリコーン、スチレンコポリマー、ポリスルホンなどから構築されることができる。いくつかの態様において、本明細書に開示される容器は、滅菌処理されることができ、また、さらなる滅菌処理なしで使える状態であることもできる。
【００３０】
II. 細胞組成物を製造および調製するための方法
いくつかの態様において、本明細書に提供される生物医学的材料容器は、たとえば、細胞療法を製造、生成、または生産することを含むプロセスと関連して、細胞を貯蔵するために使用することができる。いくつかの態様において、細胞療法は、細胞、たとえば組換え受容体、たとえばキメラ抗原受容体（CAR）で操作されたT細胞、たとえばCAR-T細胞を含む。いくつかの態様において、細胞は、閉鎖系から、本明細書に記載される複数の生物医学的材料容器の1つまたは複数の中へ発現させることができる。いくつかの態様において、細胞は、投与、たとえば単回投与または複数回投与のための量でバイアルの中へ製剤化されることができる。
【００３１】
いくつかの態様において、生物医学的材料容器は、1つまたは複数のさらなる処理工程、たとえば細胞の単離、分離、選択、活性化もしくは刺激、形質導入、培養、増大、洗浄、懸濁、希釈、濃縮、および／または製剤化の工程を含むプロセスを介して実施されることができる、細胞療法の製造、生成、または生産と関連して使用される。いくつかの態様において、細胞療法を生成または生産する方法は、対象から細胞を単離すること、調製すること、処理すること、1つまたは複数の刺激条件下で培養することを含む。いくつかの態様において、方法は、まず、生物学的試料から細胞、たとえば初代細胞を単離、たとえば選択または分離し；任意で、単離された細胞を、刺激試薬の存在下、刺激する工程の後、選択された細胞を、形質導入のためのウイルスベクター粒子とともにインキュベートし；形質導入された細胞を培養して、たとえば細胞を増大させ；形質導入された細胞を組成物に製剤化し、組成物を、提供される生物医学的材料容器に導入する、順に実施される処理工程を含む。いくつかの態様において、生成された操作された細胞は、凍結保存の前または後で、同じ対象に再び導入される。いくつかの態様においては、1つまたは複数の工程中、たとえば単離、選択、形質導入、および／または培養の前および／または後、細胞を凍結保存し、その後、解凍することができる。
【００３２】
いくつかの態様において、1つまたは複数の処理工程は、（a）細胞を含む生物学的試料（たとえば全血試料、軟膜試料、末梢血単核細胞（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球試料、アフェレーシス産物、または白血球アフェレーシス産物）を洗浄する工程、（b）たとえば、イムノアフィニティーベースの選択のための選択またはイムノアフィニティー試薬を用いる細胞のインキュベーションにより、所望の細胞サブセットまたは集団（たとえばCD4+および／またはCD8+T細胞）を試料から単離、たとえば選択する工程、（c）単離された、たとえば選択された細胞をウイルスベクター粒子とともにインキュベートする工程、（d）たとえば記載される方法を使用して細胞を培養、カルチベート、または増大する工程、および（e）形質導入された細胞を、たとえば薬学的に許容される緩衝剤中、凍結保存剤中、または他の適切な媒体中に製剤化する工程の1つまたは複数を含むことができる。いくつかの態様において、方法はさらに、細胞をウイルスベクター粒子とともにインキュベートする前、最中、および／または後で実施することができる、（e）細胞を刺激条件に曝露することによって細胞を刺激する工程を含むことができる。また、いくつかの態様においては、たとえば細胞の希釈、濃縮、および／または緩衝剤交換のための洗浄工程または懸濁工程の1つまたは複数のさらなる工程を、上記工程のいずれかの前または後で実施することもできる。いくつかの局面において、得られる操作された細胞組成物は、1つまたは複数の提供される生物医学的培養容器に導入される。
【００３３】
いくつかの態様において、提供される方法は、たとえば養子細胞療法における臨床使用のための細胞の調製における1つ、複数またはすべての工程が、細胞を非無菌条件に曝露することなく、また、無菌室またはキャビネットの使用を要することなく、実施されるように実施される。そのようなプロセスのいくつかの態様において、細胞は、すべて閉鎖系内で単離、分離、または選択され、形質導入され、洗浄され、任意で活性化または刺激され、製剤化される。そのようなプロセスのいくつかの局面において、細胞は、閉鎖系から発現され、生物医学的容器の1つまたは複数に導入される。いくつかの態様において、方法は自動化されたやり方で実施される。いくつかの態様において、工程の1つまたは複数は、閉鎖系または装置から離れて実施される。
【００３４】
いくつかの態様においては、細胞療法を製造、生成、または生産するための方法の他の処理工程の1つまたは複数を実施するために閉鎖系が使用される。いくつかの態様において、処理工程の1つまたは複数またはすべて、たとえば単離、選択、および／または濃縮、処理、形質導入および操作と関連するインキュベーション、ならびに製剤化工程は、組み込まれたもしくは自蔵されたシステム中のシステム、デバイス、もしくは装置を使用して、および／または自動化もしくはプログラム可能なやり方で実施される。いくつかの局面において、システムまたは装置は、ユーザが処理工程、単離工程、操作工程、および製剤化工程の様々な局面をプログラムし、該局面を制御し、該局面の結果を評価し、かつ／または該局面を調節することを可能にする、システムまたは装置と通信するコンピュータおよび／またはコンピュータプログラムを含む。一例において、システムは、国際特許出願公報番号WO2009/072003またはUS20110003380A1に記載されているシステムである。一例において、システムは、国際公報番号WO2016/073602に記載されているシステムである。
【００３５】
A. 試料からの細胞の単離または選択
いくつかの態様において、処理工程は、生物学的試料からの、たとえば対象、たとえば特定の疾患もしくは病気を有する対象、もしくは細胞療法を必要とする対象、もしくは細胞療法が施される対象から得られる生物学的試料、または該対象に由来する生物学的試料からの細胞またはその組成物の単離を含む。いくつかの局面において、対象はヒト、たとえば特定の治療介入、たとえば細胞が単離、処理および／または操作される養子細胞療法を必要とする患者である対象である。したがって、いくつかの態様における細胞は初代細胞、たとえば初代ヒト細胞である。いくつかの態様において、細胞はCD4+およびCD8+T細胞を含む。いくつかの態様において、細胞はCD4+またはCD8+T細胞を含む。試料は、組織、体液、および対象から直接的に採取される他の試料を含む。生物学的試料は、生物学的供給源から直接的に得られる試料または処理される試料であることができる。生物学的試料は、体液、たとえば血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿および汗、組織および臓器試料、たとえばそれらに由来する処理された試料を含むが、それらに限定されない。
【００３６】
いくつかの局面において、試料は、血液もしくは血液由来試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス産物であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシス産物に由来する。例示的な試料は、全血、末梢血単核細胞（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検材料、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸関連リンパ系組織、粘膜関連リンパ系組織、脾臓、他のリンパ系組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸部、精巣、卵巣、扁桃、もしくは他の臓器、および／またはそれらに由来する細胞を含む。細胞療法、たとえば養子細胞療法に関連する試料は、自家および同種異系由来の試料を含む。
【００３７】
いくつかの例において、対象の循環血からの細胞がたとえばアフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、いくつかの局面において、リンパ球、たとえばT細胞、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および／または血小板を含み、いくつかの局面において、赤血球および血小板以外の細胞を含む。
【００３８】
いくつかの態様においては、対象から捕集された血液細胞を洗浄して、たとえば血漿分画を除去し、後続の処理工程に備えて細胞を適切な緩衝剤または媒体に入れる。いくつかの態様においては、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄する。いくつかの態様において、洗浄液は、カルシウムおよび／またはマグネシウムおよび／または多くのもしくはすべての二価カチオンを含まない。いくつかの局面において、洗浄工程は、半自動化「フロースルー」遠心分離機（たとえばCobe 2991セルプロセッサ、Baxter）により、製造者の取り扱い指示にしたがって達成される。いくつかの局面において、洗浄工程は、タンジェント流ろ過（TFF）により、製造者の取り扱い指示にしたがって達成される。いくつかの態様においては、洗浄後、細胞を、多様な生体適合性緩衝剤、たとえばCa++/Mg++フリーのPBSに再懸濁させる。特定の態様においては、血液細胞試料の成分を除去し、細胞を直接的に培地中に再懸濁させる。
【００３９】
いくつかの態様において、調製方法は、単離、選択および／または濃縮および／または形質導入および操作のためのインキュベーションの前または後で、および／または操作された細胞のカルチべーションおよび／または収穫の後で、細胞を凍結、たとえば凍結保存する工程を含む。生物学的試料、たとえばT細胞またはT細胞組成物の凍結、凍結保存、または極低温保存のための例示的な方法は、全体として参照により本明細書に組み入れられるWO2018170188に記載されている方法を含む。いくつかの態様において、凍結および後続の解凍工程は、細胞集団中の顆粒球およびある程度には単球を除去する。いくつかの態様においては、たとえば血漿および血小板を除去するための洗浄工程の後、細胞を凍結溶液中に懸濁させる。いくつかの局面においては、多様な公知の凍結溶液およびパラメータのいずれかを使用し得る。いくつかの態様において、細胞は、12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％、もしくは5.0％または約12.5％、約12.0％、約11.5％、約11.0％、約10.5％、約10.0％、約9.5％、約9.0％、約8.5％、約8.0％、約7.5％、約7.0％、約6.5％、約6.0％、約5.5％、もしくは約5.0％のDMSO、または1％〜15％、6％〜12％、5％〜10％、もしくは6％〜8％のDMSO最終濃度の媒体および／または溶液中で凍結、たとえば凍結保存または凍結保護される。特定の態様において、細胞は、5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％、もしくは0.25％または約5.0％、約4.5％、約4.0％、約3.5％、約3.0％、約2.5％、約2.0％、約1.5％、約1.25％、約1.0％、約0.75％、約0.5％、もしくは約0.25％のHSA、または0.1％〜5％、0.25％〜4％、0.5％〜2％、もしくは1％〜2％のHSA最終濃度の媒体および／または溶液中で凍結、たとえば凍結保存または凍結保護される。一例は、20％DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン（HSA）を含むPBS、または他の適切な細胞凍結媒体の使用を含む。次いで、DMSOおよびHSAの最終濃度がそれぞれ10％および4％になるよう、それを培地で1：1に希釈する。次いで、細胞を一般に毎分1℃または約1℃の速度で−80℃または約−80℃まで凍結させ、液体窒素貯蔵タンクの蒸気相中に貯蔵する。
【００４０】
いくつかの態様において、細胞または集団の単離は、1つまたは複数の調製および／または非アフィニティーベースの細胞分離工程を含む。いくつかの例においては、細胞を、1つまたは複数の試薬の存在において洗浄、遠心分離および／またはインキュベートして、たとえば不要な成分を除き、所望の成分を濃縮し、特定の試薬に感受性の細胞を溶解または除去する。いくつかの例においては、細胞を、1つまたは複数の性質、たとえば密度、接着性、サイズ、特定の成分に対する感度および／または耐性に基づいて分離する。いくつかの態様において、方法は、密度ベースの細胞分離法、たとえば、赤血球の溶解およびPercollまたはFicoll勾配による遠心分離による、末梢血からの白血球の調製を含む。
【００４１】
いくつかの態様において、選択工程の少なくとも一部分は、選択試薬との細胞のインキュベーションを含む。たとえば選択法の一部としての選択試薬とのインキュベーションは、1つまたは複数の特定の分子、たとえば表面マーカ、たとえば表面タンパク質、細胞内マーカ、または核酸の細胞中または細胞上の発現または存在に基づく1つまたは複数の異なる細胞タイプの選択のための1つまたは複数の選択試薬を使用して実施され得る。いくつかの態様においては、そのようなマーカに基づく分離のための選択試薬を使用する任意の公知の方法を使用し得る。いくつかの態様において、選択試薬は、アフィニティーまたはイムノアフィニティーベースの分離である分離を生じさせる。たとえば、いくつかの局面において、選択は、細胞の発現または1つまたは複数のマーカ、通常は細胞表面マーカの発現レベルに基づく、たとえば、そのようなマーカに特異的に結合する抗体または結合パートナとのインキュベーションによる、細胞および細胞集団の分離のための試薬とのインキュベーション、次いで、一般に洗浄工程および抗体または結合パートナが結合した細胞の、抗体または結合パートナが結合していない細胞からの分離を含む。いくつかの態様において、選択および／またはプロセスの他の局面は、国際特許出願公報番号WO/2015/164675に記載されているとおりである。
【００４２】
そのようなプロセスのいくつかの局面においては、ある体積の細胞をある量の所望のアフィニティーベースの選択試薬と混合する。分離される細胞と、その細胞上のマーカに特異的に結合する分子、たとえば固体表面、たとえば粒子上の抗体または他の結合パートナとの間に好ましい高エネルギー相互作用を生じさせる任意のシステムまたは方法を使用して、イムノアフィニティーベースの選択を実施することができる。いくつかの態様において、方法は、細胞のマーカに特異的な選択物質（たとえば抗体）でコートされている粒子、たとえばビーズ、たとえば磁気ビーズを使用して実施される。粒子（たとえばビーズ）を、容器、たとえばチューブまたはバッグ中の細胞と、振とうまたは混合しながら、エネルギー的に好ましい相互作用の促進を支援するための一定の細胞密度：粒子（たとえばビーズ）比で、インキュベートまたは混合することができる。他の場合には、方法は、選択の全部または一部分が、遠心チャンバの内部キャビティ中、たとえば遠心回転下で実施される細胞の選択を含む。いくつかの態様において、選択試薬、たとえばイムノアフィニティーベースの選択試薬との細胞のインキュベーションは遠心チャンバ中で実施される。特定の態様において、単離または分離は、国際特許出願公報番号WO2009/072003またはUS20110003380A1に記載されたシステム、デバイスまたは装置を使用して実施される。一例において、システムは、国際公報番号WO2016/073602に記載されているシステムである。
【００４３】
いくつかの態様において、そのような選択工程またはその一部分（たとえば抗体でコートされた粒子、たとえば磁気ビーズとのインキュベーション）を遠心チャンバのキャビティ中で実施することにより、ユーザは、特定のパラメータ、たとえば様々な溶液の量、処理中の溶液の添加およびそのタイミングを制御することができ、それが、他の利用可能な方法と比べて利点を提供することができる。たとえば、インキュベーション中にキャビティ中の液量を減らす能力は、キャビティ中の細胞の総数に影響することなく、選択に使用される粒子（たとえばビーズ試薬）の濃度、ひいては溶液の化学ポテンシャルを高めることができる。これが、転じて、処理される細胞と、選択に使用される粒子との間のペアワイズ相互作用を増強することができる。いくつかの態様において、たとえば、本明細書に記載されるシステム、回路、および制御と関連している場合にインキュベーション工程をチャンバ中で実施することは、ユーザが、インキュベーション中の所望の時点で溶液のかく拌を実施することを可能にし、それもまた、相互作用を改善することができる。
【００４４】
いくつかの態様において、選択試薬との細胞のインキュベーションを含む、選択工程の少なくとも一部分は遠心チャンバ中で実施される。そのようなプロセスのいくつかの局面においては、ある体積の細胞を、同じ数の細胞および／または同じ量の細胞の選択のために類似の選択をチューブまたは容器中で製造者の取り扱い指示にしたがって実施する場合に通常用いられるよりもはるかに少ない量の所望のアフィニティーベースの選択試薬と混合する。いくつかの態様においては、細胞の選択のために、同じ数の細胞および／または同じ量の細胞の選択のために製造者の取り扱い指示にしたがってチューブまたは容器ベースのインキュベーションで用いられる同じ選択試薬の量の5％以下、10％以下、15％以下、20％以下、25％以下、50％以下、60％以下、70％以下、または80％以下である選択試薬の量が用いられる。
【００４５】
いくつかの態様において、細胞の選択、たとえばイムノアフィニティーベースの選択の場合、細胞は、チャンバのキャビティ中、選択試薬、たとえば、濃縮および／または枯渇することが望まれる細胞上の表面マーカに特異的に結合するが、組成物中の他の細胞上の表面マーカには結合しない分子、たとえば、任意で、足場、たとえばポリマーまたは表面、たとえばビーズ、たとえば磁気ビーズ、たとえばCD4およびCD8に特異的なモノクローナル抗体に結合された磁気ビーズに結合されている抗体とともに選択緩衝剤を含む組成物中でインキュベートされる。いくつかの態様において、前記のように、選択試薬は、選択がチューブ中で振とうまたは回転しながら実施される場合に、同じ数の細胞または同じ量の細胞のほぼ同じまたは類似の選択効率を達成するために通常使用されるまたは必要と考えられる選択試薬の量よりも実質的に少ない（たとえば、5％以下、10％以下、20％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下、または80％以下の量である）量でチャンバのキャビティ中の細胞に加えられる。いくつかの態様において、インキュベーションは、細胞および選択試薬への選択緩衝剤の添加とともに実施されて、たとえば10mL〜200mL、たとえば、少なくとも10mL、少なくとも20mL、少なくとも30mL、少なくとも40mL、少なくとも50mL、少なくとも60mL、少なくとも70mL、少なくとも80mL、少なくとも90mL、少なくとも100mL、少なくとも150mL、もしくは少なくとも200mL、または少なくとも約10mL、少なくとも約20mL、少なくとも約30mL、少なくとも約40mL、少なくとも約50mL、少なくとも約60mL、少なくとも約70mL、少なくとも約80mL、少なくとも約90mL、少なくとも約100mL、少なくとも約150mL、もしくは少なくとも約200mL、または約10mL、約20mL、約30mL、約40mL、約50mL、約60mL、約70mL、約80mL、約90mL、約100mL、約150mL、もしくは約200mL、または10mL、20mL、30mL、40mL、50mL、60mL、70mL、80mL、90mL、100mL、150mL、もしくは200mLの目標量を試薬のインキュベーションで達成する。いくつかの態様において、選択緩衝剤および選択試薬は細胞への添加の前に混合される。いくつかの態様において、選択緩衝剤および選択試薬は別々に細胞に加えられる。いくつかの態様において、選択インキュベーションは、定期的な静かな混合条件で実施され、それが、高い選択効率を達成しながらも、エネルギー的に好ましい相互作用の促進を支援し、それにより、より少ない全選択試薬の使用を可能にすることができる。
【００４６】
いくつかの態様において、選択試薬とのインキュベーションの全継続時間は、5分間〜6時間または約5分間〜約6時間、たとえば30分間〜3時間、たとえば、少なくとも30分間、少なくとも60分間、少なくとも120分間、もしくは少なくとも180分間、または少なくとも約30分間、少なくとも約60分間、少なくとも約120分間、もしくは少なくとも約180分間である。
【００４７】
いくつかの態様において、インキュベーションは一般に、混合条件下、たとえば、一般に比較的低い力または速度、たとえば細胞をペレット化するために使用されるよりも低い速度、たとえば600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜約1700rpm（たとえば、600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または約600rpm、約1000rpm、もしくは約1500rpmもしくは約1700rpm、または少なくとも600rpm、少なくとも1000rpm、もしくは少なくとも1500rpmもしくは少なくとも1700rpm）のスピンの存在下、たとえば試料またはチャンバもしくは他の容器の壁におけるRCF80g〜100gまたは約80g〜約100g（たとえば、約80g、約85g、約90g、約95g、もしくは約100g、または少なくとも80g、少なくとも85g、少なくとも90g、少なくとも95g、もしくは少なくとも100g）で実施される。いくつかの態様において、スピンは、そのような低速のスピンの後休止期間が来る繰り返し間隔、たとえばスピンおよび／または1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10秒間の休止、たとえば約1または約2秒間のスピンの後約5、約6、約7、または約8秒間の休止を使用して実施される。
【００４８】
いくつかの態様において、そのようなプロセスは、チャンバが一体化している完全閉鎖系内で実施される。いくつかの態様において、このプロセス（および、いくつかの局面においては、1つまたは複数のさらなる工程、たとえば細胞を含む試料、たとえばアフェレーシス試料を洗浄する事前の洗浄工程）は、自動化プログラムを使用して1つの閉鎖系中で洗浄および結合工程を完了するために、細胞、試薬および他の成分が適切なタイミングでチャンバに引き込まれ、チャンバから押し出され、遠心分離が実施されるような自動化されたやり方で実施される。
【００４９】
いくつかの態様においては、インキュベーションおよび／または細胞と選択試薬との混合の後、インキュベートされた細胞を分離にかけて、特定の試薬の存在または非存在に基づいて細胞を選択する。いくつかの態様において、分離は、選択試薬との細胞のインキュベーションが実施された同じ閉鎖系中で実施される。いくつかの態様においては、選択試薬とのインキュベーションの後、インキュベートされた細胞、たとえば選択試薬が結合している細胞を、細胞のイムノアフィニティーベースの分離のためのシステムに移す。いくつかの態様において、イムノアフィニティーベースの分離のためのシステムは、磁気分離カラムであるか、または磁気分離カラムを含む。
【００５０】
そのような分離工程は、試薬、たとえば抗体または結合パートナが結合している細胞がさらなる使用のために保持されるポジティブ選択および／または試薬、たとえば抗体または結合パートナが結合していない細胞が保持されるネガティブ選択に基づくことができる。いくつかの例においては、両方の分画がさらなる使用のために保持される。いくつかの局面において、不均一集団中の細胞タイプを特異的に識別する抗体が利用できない場合、ネガティブ選択が特に有用であることができ、そのような分離は、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカに基づいて最良に実施される。
【００５１】
いくつかの態様において、工程はさらに、たとえばアフィニティーベースの選択を実施することができるシステムまたは装置を使用する、インキュベートされた細胞のネガティブおよび／またはポジティブ選択を含む。いくつかの態様において、単離は、ポジティブ選択による特定の細胞集団の濃縮またはネガティブ選択による特定の細胞集団の枯渇によって実施される。いくつかの態様において、ポジティブまたはネガティブ選択は、それぞれポジティブまたはネガティブ選択された細胞上に発現する（マーカ+）、または相対的に高レベルで発現する（マーカhigh）1つまたは複数の表面マーカに特異的に結合する1つまたは複数の抗体または他の結合物質とともに細胞をインキュベートすることによって達成される。同じ選択工程、たとえばポジティブまたはネガティブ選択工程を複数回実施することができる。特定の態様において、ポジティブまたはネガティブ選択された分画は、たとえばポジティブまたはネガティブ選択工程を繰り返すことにより、選択のためのプロセスに付される。いくつかの態様において、選択は、2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、または9回超繰り返される。特定の態様においては、同じ選択が最大5回実施される。特定の態様においては、同じ選択工程が3回実施される。
【００５２】
選択は、特定のマーカを発現する特定の細胞集団または細胞の100％濃縮または除去を生じさせる必要はない。たとえば、特定のタイプの細胞、たとえばマーカを発現する細胞のポジティブ選択または濃縮とは、そのような細胞の数または割合を増すことを指し、マーカを発現しない細胞の完全な非存在を生じさせる必要はない。同様に、特定のタイプの細胞、たとえばマーカを発現する細胞のネガティブ選択、除去または枯渇とは、そのような細胞の数または割合を減らすことを指し、そのような細胞すべての完全な除去を生じさせる必要はない。
【００５３】
いくつかの例においては、複数回の分離工程が実施され、その中で、1つの工程からのポジティブまたはネガティブ選択された分画が別の分離工程、たとえば後続のポジティブまたはネガティブ選択に付される。いくつかの例においては、たとえば、細胞を、ネガティブ選択の標的にされたマーカにそれぞれが特異的な複数の抗体または結合パートナとともにインキュベートすることにより、1つの分離工程が、複数のマーカを同時に発現する細胞を枯渇させることもできる。同様に、様々な細胞タイプ上に発現した複数の抗体または結合パートナとともに細胞をインキュベートすることにより、複数の細胞タイプを同時にポジティブ選択することもできる。特定の態様においては、1つまたは複数の分離工程が繰り返され、かつ／または1回超実施される。いくつかの態様において、分離工程から得られるポジティブまたはネガティブ選択された分画は、たとえばポジティブまたはネガティブ選択を繰り返すことにより、同じ分離工程に付される。いくつかの態様においては、1つの分離工程が、たとえば、ポジティブ選択された細胞の収率を高めるため、ネガティブ選択された細胞の純度を高めるため、および／またはポジティブ選択された細胞をネガティブ選択された分画からさらに除去するために、繰り返されかつ／または1回超実施される。特定の態様においては、1つまたは複数の分離工程が2回、3回、4回、5回、6回、7回、8回、9回、10回、または10回超実施されかつ／または繰り返される。特定の態様においては、1つまたは複数の選択工程が1回〜10回、1回〜5回、または3回〜5回、実施されかつ／または繰り返される。特定の態様においては、1つまたは複数の選択工程が3回繰り返される。
【００５４】
たとえば、いくつかの局面において、1つもしくは複数の表面マーカがポジティブである細胞または高レベルの1つもしくは複数の表面マーカを発現する細胞、たとえばCD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、および／またはCD45RO+T細胞などのT細胞の特定の部分集団が、ポジティブまたはネガティブ選択技術によって単離される。いくつかの態様において、そのような細胞は、そのようなマーカに特異的に結合する1つまたは複数の抗体または結合パートナとのインキュベーションによって選択される。いくつかの態様において、抗体または結合パートナは、選択を実施するための固体支持体またはマトリックス、たとえば磁気ビーズまたは常磁性ビーズにたとえば直接的または間接的に結合させることができる。たとえば、抗CD3/抗CD28結合磁気ビーズ（たとえばDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expanderおよび／またはExp ACT（登録商標）ビーズ）を使用して、CD3+、CD28+T細胞をポジティブ選択することができる。
【００５５】
いくつかの態様において、T細胞は、非T細胞、たとえばB細胞、単球または他の白血球上に発現したマーカ、たとえばCD14のネガティブ選択によってPBMC試料から分離される。いくつかの局面においては、CD4+またはCD8+選択工程を使用して、CD4+ヘルパーおよびCD8+細胞傷害性T細胞を分離する。そのようなCD4+およびCD8+集団は、1つまたは複数のナイーブ、メモリ、および／またはエフェクタT細胞部分集団上に発現するかまたは相対的に高度に発現するマーカのポジティブまたはネガティブ選択により、部分集団へとさらに分類することができる。
【００５６】
いくつかの態様において、CD8+T細胞は、たとえば、それぞれの部分集団と関連した表面抗原に基づくポジティブまたはネガティブ選択により、ナイーブ、セントラルメモリ、エフェクタメモリおよび／またはセントラルメモリ幹細胞に関してさらに濃縮または枯渇される。いくつかの態様において、セントラルメモリT（TCM）細胞の濃縮は、効能を高める、たとえば、いくつかの局面においてはそのような部分集団において特にロバストである、投与後の長期生存率、増大、および／または生着を改善するために実施される。Terakura et al., (2012) Blood.1:72-82；Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照すること。いくつかの態様において、TCM濃縮CD8+T細胞をCD4+T細胞と合わせることが効能をさらに増強する。
【００５７】
いくつかの態様において、メモリT細胞は、CD8+末梢血リンパ球のCD62L+およびCD62L-サブセットの両方に存在する。たとえば抗CD8および抗CD62L抗体を使用して、CD62L-CD8+および／またはCD62L+CD8+分画に関してPBMCを濃縮または枯渇することができる。
【００５８】
いくつかの態様において、セントラルメモリT（TCM）細胞の濃縮は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および／またはCD127のポジティブまたは高い表面発現に基づき；いくつかの局面において、CD45RAおよび／またはグランザイムBを発現するかまたは高度に発現する細胞に関するネガティブ選択に基づく。いくつかの局面において、TCM細胞に関して濃縮されたCD8+集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇およびCD62Lを発現する細胞のポジティブ選択または濃縮によって実施される。1つの局面において、セントラルメモリT（TCM）細胞の濃縮は、CD4発現に基づいて選択された細胞のネガティブ分画から出発して、それを、CD14およびCD45RAの発現に基づくネガティブ選択およびCD62Lに基づくポジティブ選択に付すことによって実施される。
【００５９】
そのような選択は、いくつかの局面においては同時に実施され、他の局面においてはいずれかの順序で順次に実施される。いくつかの局面においては、CD8+T細胞集団または部分集団を調製する際に使用される同じCD4発現ベースの選択工程が、CD4+T細胞集団または部分集団を生成するためにも使用されて、CD4ベース分離からポジティブまたはネガティブ分画が保持され、任意で1つまたは複数のポジティブまたはネガティブ選択工程の後、方法の後続の工程に使用される。いくつかの態様において、CD4+T細胞集団の選択およびCD8+T細胞集団の選択は同時に実施される。いくつかの態様において、CD4+T細胞集団の選択およびCD8+T細胞集団の選択はいずれかの順序で順次に実施される。いくつかの態様において、細胞を選択するための方法は、米国特許出願公開第US20170037369号に記載されている方法を含むことができる。いくつかの態様において、選択されたCD4+T細胞集団および選択されたCD8+T細胞集団は、選択の後、合わされてもよい。いくつかの局面において、選択されたCD4+T細胞集団および選択されたCD8+T細胞集団は、容器またはバッグ、たとえばバイオリアクタバッグ中で合わされてもよいし、提供される生物医学的材料容器中で合わされてもよい。いくつかの態様において、選択されたCD4+T細胞集団および選択されたCD8+T細胞集団は別々に処理され、それにより、たとえば提供される方法にしたがって、選択されたCD4+T細胞集団は、CD4+T細胞を濃縮され、刺激試薬（たとえば抗CD3/抗CD28磁気ビーズ）とともにインキュベートされ、組換えタンパク質（たとえばCAR）をコードするウイルスベクターを用いて形質導入され、T細胞を増大させる条件下でカルチベートされ、選択されたCD8+T細胞集団は、CD8+T細胞を濃縮され、刺激試薬（たとえば抗CD3/抗CD28磁気ビーズ）とともにインキュベートされ、組換えタンパク質（たとえばCAR）をコードする、つまり、同じドナーからのCD4+T細胞を操作する場合と同じ組換えタンパク質をコードするウイルスベクターを用いて形質導入され、かつT細胞を増大させる条件下で培養される。
【００６０】
特定の態様においては、生物学的試料、たとえばPBMCまたは他の白血球の試料がCD4+T細胞の選択に付されて、ネガティブとポジティブの両方の分画が保持される。特定の態様においては、CD8+T細胞がネガティブ分画から選択される。いくつかの態様においては、生物学的試料がCD8+T細胞の選択に付されて、ネガティブとポジティブの両方の分画が保持される。特定の態様においては、CD4+T細胞がネガティブ分画から選択される。
【００６１】
特定の例においては、PBMC試料または他の白血球試料がCD4+T細胞の選択に付されて、ネガティブとポジティブの両方の分画が保持される。次いで、ネガティブ分画は、CD14およびCD45RAまたはCD19の発現に基づくネガティブ選択およびセントラルメモリT細胞に特徴的なマーカ、たとえばCD62LまたはCCR7に基づくポジティブ選択に付され、その場合、ポジティブ選択およびネガティブ選択はいずれかの順序で実施される。
【００６２】
CD4+Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することにより、ナイーブ、セントラルメモリおよびエフェクタ細胞へと分類され得る。CD4+リンパ球は標準的な方法によって得ることができる。いくつかの態様において、ナイーブCD4+Tリンパ球はCD45RO-、CD45RA+、CD62L+またはCD4+T細胞である。いくつかの態様において、セントラルメモリCD4+T細胞はCD62L+およびCD45RO+である。いくつかの態様において、エフェクタCD4+T細胞はCD62L-およびCD45RO-である。
【００６３】
一例において、ネガティブ選択によってCD4+T細胞を濃縮する場合、モノクローナル抗体カクテルは通常、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様において、抗体または結合パートナは、ポジティブおよび／またはネガティブ選択のための細胞の分離を可能にするために、固体支持体またはマトリックス、たとえば磁気ビーズまたは常磁性ビーズに結合される。たとえば、いくつかの態様において、細胞および細胞集団は、免疫磁気（またはアフィニティー磁気）分離技術を使用して分離または単離される（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In Vitro and In Vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher （著作権） Humana Press Inc., Totowa, NJで考察）。
【００６４】
いくつかの局面において、分離される細胞のインキュベートされた試料または組成物は、小さな磁化性または磁気応答性物質、たとえば磁気応答性粒子または微粒子、たとえば常磁性ビーズ（たとえばDynalbeadsまたはMACS（登録商標）ビーズ）を含む選択試薬とともにインキュベートされる。磁気応答性物質、たとえば粒子は一般に、分離することが望まれる、たとえばネガティブまたはポジティブ選択することが望まれる細胞または細胞集団上に存在する分子、たとえば表面マーカに特異的に結合する結合パートナ、たとえば抗体に直接的または間接的に取り付けられる。
【００６５】
いくつかの態様において、磁気粒子またはビーズは、特異的結合メンバー、たとえば抗体または他の結合パートナに結合した磁気応答性物質を含む。磁気分離法に使用するための多くの周知の磁気応答性物質、たとえば、参照により本明細書に組み入れられる、Moldayの米国特許第4,452,773号および欧州特許明細書EP452342Bに記載されているものが公知である。また、コロイドサイズの粒子、たとえばOwenの米国特許第4,795,698号およびLibertiらの米国特許第5,200,084号に記載されているものを使用してもよい。
【００６６】
抗体もしくは結合パートナまたはそのような抗体もしくは結合パートナに特異的に結合し磁気粒子もしくはビーズに付着している二次抗体もしくは他の試薬などの分子が、試料内の細胞上に存在する場合の細胞表面分子に特異的に結合する条件下で、インキュベーションは一般に実施される。
【００６７】
特定の態様において、磁気応答性粒子は、一次抗体または他の結合パートナ、二次抗体、レクチン、酵素またはストレプトアビジンでコートされている。特定の態様において、磁気粒子は、1つまたは複数のマーカに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着している。特定の態様においては、ビーズではなく細胞が一次抗体または結合パートナで標識された後、細胞タイプ特異的な二次抗体または他の結合パートナ（たとえばストレプトアビジン）でコートされた磁気粒子が加えられる。特定の態様においては、ストレプトアビジンでコートされた磁気粒子がビオチン化一次または二次抗体とともに使用される。
【００６８】
いくつかの局面において、分離は、試料が磁場に配置され、付着した磁気応答性または磁化性粒子を有する細胞が磁石に引き寄せられ、非標識の細胞から分離される手順で達成される。ポジティブ選択の場合、磁石に引き寄せられる細胞が保持され；ネガティブ選択の場合、引き寄せられない（非標識の）細胞が保持される。いくつかの局面においては、同じ選択工程中にポジティブ選択とネガティブ選択との組み合わせが実施され、その場合、ポジティブおよびネガティブ分画が、保持されてさらに処理されるか、またはさらなる分離工程に付される。
【００６９】
いくつかの態様において、アフィニティーベースの選択は、磁気活性化セルソーティング（MACS）（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を介する。磁気活性化セルソーティング（MACS）、たとえばCliniMACSシステムは、付着した磁化粒子を有する細胞の高純度選択が可能である。特定の態様において、MACSは、外部磁場の印加の後非標的種および標的種が逐次に溶出するモードで作動する。すなわち、磁化粒子に付着した細胞は所定の位置に保持され、付着していない種は溶出する。次いで、この第一の溶出工程が完了した後、磁場に捕らえられ、溶出を妨げられた種が、溶出され、回収されることができるようなやり方で解放される。特定の態様においては、非標的細胞が標識され、細胞の不均一集団から枯渇される。
【００７０】
いくつかの態様において、磁気応答性粒子は、その後にインキュベート、培養および／または操作される細胞に付着したまま残され；いくつかの局面において、粒子は、患者への投与のために細胞に付着したまま残される。いくつかの態様において、磁化性または磁気応答性粒子は細胞から除去される。磁化性粒子を細胞から除去するための方法は公知であり、たとえば、競合する非標識抗体、磁化性粒子、または切断可能なリンカーに結合した抗体などの使用を含む。いくつかの態様において、磁化性粒子は生分解性である。
【００７１】
B. 細胞の活性化および刺激
いくつかの態様において、1つまたは複数の処理工程は、単離された細胞、たとえば選択された細胞集団を刺激する工程を含む。インキュベーションは、遺伝子操作、たとえば、上記形質導入方法の態様から生じる遺伝子操作の前であってもよいかそれと関連してもよい。いくつかの態様において、刺激は、たとえば形質導入の前に、細胞の活性化および／または増殖を生じさせる。
【００７２】
いくつかの態様において、処理工程は、細胞、たとえば選択された細胞のインキュベーションを含み、インキュベーション工程は、細胞の培養、カルチベーション、刺激、活性化および／または増殖を含むことができる。いくつかの態様において、組成物または細胞は、刺激条件または刺激物質の存在下、インキュベートされる。そのような条件は、集団中の細胞の増殖、活性化、および／もしくは生き残りを誘導するように、抗原曝露を模倣するように、および／または、組換え抗原受容体の導入などの遺伝子操作のために細胞をプライミングするように設計された条件を含む。
【００７３】
いくつかの態様において、刺激および／または活性化のための条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、たとえば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、たとえばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナ、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された他の作用物質の1つまたは複数を含むことができる。
【００７４】
いくつかの態様において、刺激条件または作用物質は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達ドメインを刺激または活性化することができる1つまたは複数の作用物質、たとえばリガンドを含む。いくつかの局面において、作用物質は、T細胞中のTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを起動するか、または開始させる。そのような作用物質は、ITAM誘導シグナルの活性化を開始させるための一次シグナルを送達するのに適した作用物質、たとえば抗体、たとえばTCRに特異的な抗体、たとえば抗CD3を含むことができる。いくつかの態様において、刺激条件は、共刺激受容体を刺激することができる1つまたは複数の作用物質、たとえばリガンド、たとえば抗CD28または抗4-1BBを含む。いくつかの態様において、そのような作用物質および／またはリガンドは、固体支持体、たとえばビーズおよび／または1つまたは複数のサイトカインに結合していてもよい。刺激物質としては、抗CD3/抗CD28ビーズ（たとえばDYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expanderおよび／またはExpACT（登録商標）ビーズ）がある。任意で、増大方法はさらに、抗CD3および／または抗CD28抗体を培地に加える（たとえば少なくとも約0.5ng/mLの濃度で）工程を含み得る。いくつかの態様において、刺激物質は、IL-2、IL-7およびIL-15、たとえば、少なくとも約10単位／mL、少なくとも約50単位／mL、少なくとも約100単位／mL、または少なくとも約200単位／mLの濃度のIL-2を含む。
【００７５】
条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、たとえば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、たとえばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナ、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質の1つまたは複数を含むことができる。
【００７６】
いくつかの局面において、インキュベーションは、Riddellらに対する米国特許第6,040,177号、Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82および／またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701に記載されているものなどの技術にしたがって実施される。
【００７７】
いくつかの態様において、1つまたは複数の刺激条件または刺激物質の存在におけるインキュベーションの少なくとも一部分は、たとえば国際公報番号WO2016/073602に記載されているように、遠心チャンバの内部キャビティ中、たとえば遠心回転下で実施される。いくつかの態様において、遠心チャンバ中で実施されるインキュベーションの少なくとも一部分は、刺激および／または活性化を誘導するための試薬との混合を含む。いくつかの態様においては、細胞、たとえば選択された細胞が遠心チャンバ中で刺激条件または刺激物質と混合される。そのようなプロセスのいくつか局面においては、ある体積の細胞が、細胞培養プレートまたは他のシステム中で類似の刺激を実施する場合に通常用いられるよりもはるかに少ない量の1つまたは複数の刺激条件または物質と混合される。
【００７８】
いくつかの態様において、刺激物質は、選択が遠心チャンバ中、たとえばチューブまたはバッグ中、混合なしで定期的に振とうまたは回転しながら実施される場合に、同じ数の細胞または同じ量の細胞のほぼ同じまたは類似の効率の選択を達成するために通常使用されるまたは必要と考えられる刺激物質の量よりも実質的に少ない（たとえば、5％以下、10％以下、20％以下、30％以下、40％以下、50％以下、60％以下、70％以下、または80％以下の量である）量で、チャンバのキャビティ中の細胞に加えられる。いくつかの態様において、インキュベーションは、細胞および刺激物質へのインキュベーション緩衝剤の添加とともに実施されて、たとえば約10mL〜約200mLまたは約20mL〜約125mL、たとえば少なくとも10mL、少なくとも20mL、少なくとも30mL、少なくとも40mL、少なくとも50mL、少なくとも60mL、少なくとも70mL、少なくとも80mL、少なくとも90mL、少なくとも100mL、少なくとも105mL、少なくとも110mL、少なくとも115mL、少なくとも120mL、少なくとも125mL、少なくとも130mL、少なくとも135mL、少なくとも140mL、少なくとも145mL、少なくとも150mL、少なくとも160mL、少なくとも170mL、少なくとも180mL、少なくとも190mL、もしくは少なくとも200mL、または少なくとも約10mL、少なくとも約20mL、少なくとも約30mL、少なくとも約40mL、少なくとも約50mL、少なくとも約60mL、少なくとも約70mL、少なくとも約80mL、少なくとも約90mL、少なくとも約100mL、少なくとも約105mL、少なくとも約110mL、少なくとも約115mL、少なくとも約120mL、少なくとも約125mL、少なくとも約130mL、少なくとも約135mL、少なくとも約140mL、少なくとも約145mL、少なくとも約150mL、少なくとも約160mL、少なくとも約170mL、少なくとも約180mL、少なくとも約190mL、もしくは少なくとも約200mL、または約10mL、約20mL、約30mL、約40mL、約50mL、約60mL、約70mL、約80mL、約90mL、約100mL、約105mL、約110mL、約115mL、約120mL、約125mL、約130mL、約135mL、約140mL、約145mL、約150mL、約160mL、約170mL、約180mL、約190mL、もしくは約200mLの目標量を試薬のインキュベーションで達成する。いくつかの態様において、インキュベーション緩衝剤および刺激物質は細胞への添加の前に混合される。いくつかの態様において、インキュベーション緩衝剤および刺激物質は別々に細胞に加えられる。いくつかの態様において、刺激インキュベーションは、定期的な静かな混合条件で実施され、それが、細胞の刺激および活性化を達成しながらも、エネルギー的に好ましい相互作用の促進を支援し、それにより、より少ない全刺激物質の使用を可能にすることができる。
【００７９】
いくつかの態様において、インキュベーションは一般に、混合条件下、たとえば、一般に比較的低い力または速度、たとえば細胞をペレット化するために使用される速度よりも低い速度、たとえば600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜約1700rpm（たとえば、600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または約600rpm、約1000rpm、もしくは約1500rpmもしくは約1700rpm、または少なくとも600rpm、少なくとも1000rpm、もしくは少なくとも1500rpmもしくは少なくとも1700rpm）のスピンの存在下、たとえば試料またはチャンバもしくは他の容器の壁におけるRCF80g〜100gまたは約80g〜約100g（たとえば、80g、85g、90g、95g、もしくは100g、または約80g、約85g、約90g、約95g、もしくは約100g、または少なくとも80g、少なくとも85g、少なくとも90g、少なくとも95g、もしくは少なくとも100g）で実施される。いくつかの態様において、スピンは、そのような低速でのスピンの後休止期間、たとえばスピンおよび／または1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10秒間の休止、たとえば約1または2秒間のスピンの後約5、6、7、または8秒間の休止の繰り返し間隔を使用して実施される。
【００８０】
いくつかの態様において、たとえば刺激物質とのインキュベーションの全継続時間は、1時間〜96時間、1時間〜72時間、1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間、18時間〜30時間、もしくは12時間〜24時間または約1時間〜96時間、約1時間〜72時間、約1時間〜48時間、約4時間〜36時間、約8時間〜30時間、約18時間〜30時間、もしくは約12時間〜24時間、たとえば少なくとも6時間、少なくとも12時間、少なくとも18時間、少なくとも24時間、少なくとも36時間、もしくは少なくとも72時間、または少なくとも約6時間、少なくとも約12時間、少なくとも約18時間、少なくとも約24時間、少なくとも約36時間、もしくは少なくとも約72時間、または約6時間、約12時間、約18時間、約24時間、約36時間、もしくは約72時間である。いくつかの態様において、さらなるインキュベーションは、1時間〜48時間、4時間〜36時間、8時間〜30時間、もしくは12時間〜24時間、または約1時間〜48時間、約4時間〜36時間、約8時間〜30時間、もしくは約12時間〜24時間である。
【００８１】
C. 遺伝子操作
いくつかの態様において、処理工程は、組換えタンパク質をコードする核酸分子の導入を含む。そのような組換えタンパク質としては、組換え受容体、たとえばセクションIIIに記載されるいずれかがある。組換えタンパク質、たとえば組換え受容体をコードする核酸分子の、細胞への導入は、いくつかの公知のベクターのいずれかを使用して実施され得る。そのようなベクターは、ウイルスおよび非ウイルス系、たとえばレンチウイルスおよびガンマレトロウイルス系ならびにトランスポゾン系、PiggyBacまたはSleeping Beauty遺伝子導入系がある。例示的な方法は、ウイルス、たとえばレトロウイルスまたはレンチウイルスを介するもの、形質導入、トランスポゾン、およびエレクトロポレーションを含む、受容体をコードする核酸の導入のための方法を含む。
【００８２】
特定の態様において、細胞の組成物は、たとえば増殖および／または増大を促進する条件下で細胞をカルチベートする前に、操作、たとえば形質導入またはトランスフェクトされる。特定の態様において、細胞の組成物は、組成物が刺激条件下で刺激、活性化および／またはインキュベートされた後、操作される。特定の態様において、組成物は刺激された組成物である。特定の態様において、刺激された組成物は、事前に凍結保存および貯蔵されたものであり、操作の前に解凍される。
【００８３】
いくつかの態様において、遺伝子導入は、まず、細胞を、たとえばサイトカインまたは活性化マーカの発現によって計測される、増殖、生き残り、および／または活性化などの応答を誘導する刺激と合わせることなどによって刺激し、次いで活性化された細胞を形質導入し、臨床用途に十分な数まで培養して増大させることによって達成される。
【００８４】
いくつかの態様において、組換え核酸は、組換え感染ウイルス粒子、たとえばサルウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、およびヒト免疫不全ウイルス（HIV）に由来するベクターを使用して、細胞に導入される。
【００８５】
いくつかの態様において、組換え核酸はエレクトロポレーションによってT細胞に導入される（たとえば、Chicaybam et al, (2013) PLoS ONE 8(3): e60298およびVan Tedeloo et al. (2000) Gene Therapy 7(16): 1431-1437を参照）。いくつかの態様において、組換え核酸はトランスポジションによってT細胞に導入される（たとえば、Manuri et al. (2010) Hum Gene Ther 21(4): 427-437；Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74およびHuang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126を参照）。遺伝子物質を免疫細胞に導入し、発現させる他の方法は、リン酸カルシウムトランスフェクション（たとえば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.に記載）、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション；タングステン粒子促進微粒子銃（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)）およびリン酸ストロンチウムDNA共沈（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）を含む。
【００８６】
組換え産物をコードする核酸の導入のための他の手法およびベクターは、たとえば、国際特許出願公報番号WO2014055668および米国特許第7,446,190号に記載されているものである。
【００８７】
いくつかの態様において、細胞、たとえばT細胞は、増大中または増大後、たとえばT細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）をトランスフェクトされ得る。所望の受容体の遺伝子の導入のためのこのトランスフェクションは、たとえば任意の適切なレトロウイルスベクターを用いて実施することができる。そして、遺伝子改変された細胞集団を初期刺激（たとえばCD3/CD28刺激）から解放し、その後、第二のタイプの刺激、たとえば新たに導入された受容体で刺激することができる。この第二のタイプの刺激は、ペプチド／MHC分子の形態の抗原性刺激、遺伝子導入された受容体の同族（架橋性）リガンド（たとえばCARの天然リガンド）または新たな受容体のフレームワーク内で直接的に結合する（たとえば、受容体内の定常領域を認識することにより）任意のリガンド（たとえば抗体）を含み得る。たとえば、Cheadle et al, "Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol. 2012; 907:645-66またはBarrett et al., Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol. 65: 333-347 (2014)を参照すること。
【００８８】
場合によっては、細胞、たとえばT細胞が活性化されることを要しないベクターが使用されてもよい。いくつかのそのような例において、細胞は、活性化の前に選択および／または形質導入され得る。したがって、細胞は、細胞の培養の前または後で操作されてもよいし、場合によっては、培養の少なくとも一部分と同時またはその最中に操作されてもよい。
【００８９】
いくつかの局面において、細胞はさらに、サイトカインまたは他の因子の発現を促進するように操作される。さらなる核酸、たとえば導入のための遺伝子としては、たとえば導入される細胞の生存率および／または機能を促進することによって治療の効能を改善するためのもの；細胞の選択および／または評価のための遺伝子マーカを提供する、たとえばインビボ生存率または限局化を評価するための遺伝子；Lupton S. D. et al., Mol. and Cell Biol., 11:6 (1991)およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3:319-338 (1992)によって記載されるように、たとえば細胞をインビボでネガティブ選択感受性にすることによって安全性を改善するための遺伝子がある。また、ポジティブ選択可能な優性マーカをネガティブ選択可能なマーカと融合することによって得られる二機能性選択可能な融合遺伝子の使用を記載する、LuptonらによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の公報を参照すること。たとえば、Riddellらの米国特許第6,040,177号明細書のカラム14〜17を参照すること。
【００９０】
いくつかの態様において、導入は、組成物の1つまたは複数の細胞を、組換えタンパク質、たとえば組換え受容体をコードする核酸分子と接触させることによって実施される。いくつかの態様において、接触は、遠心分離、たとえばスピノキュレーション（たとえば遠心接種）によって実施することができる。そのような方法は、国際公報番号WO2016/073602に記載されている方法のいずれかを含む。例示的な遠心チャンバは、Biosafe SAによって製造販売されているもの、たとえばSepax（登録商標）およびSepax（登録商標）2システムとともに使用するためのもの、たとえばA-200/FおよびA-200遠心チャンバならびにそのようなシステムとともに使用するための様々なキットを含む。例示的なチャンバ、システムならびに処理機器およびキャビネットは、たとえば、米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号、および米国特許出願公開第US2008/0171951、号ならびに国際特許出願公報番号WO00/38762に記載されている。これらそれぞれの内容が全体として参照により本明細書に組み入れられる。そのようなシステムとともに使用するための例示的なキットは、BioSafe SAによって製品名CS-430.1、CS-490.1、CS-600.1、またはCS-900.2の下で販売されている使い捨てキットを含むが、それらに限定されない。
【００９１】
いくつかの態様において、システムは、他の機器、たとえば、形質導入工程およびシステム中で実施される1つもしくは複数の様々な他の処理工程、たとえば本明細書もしくは国際公報番号WO2016/073602に記載される遠心チャンバシステムによりもしくはそれと関連して実施されることができる1つもしくは複数の処理工程の局面を操作、自動化、制御、および／もしくはモニタするための機器とともに備えられかつ／またはそれと関連して配置される。この機器は、いくつかの態様において、キャビネット内に収容される。いくつかの態様において、機器はキャビネットを含み、そのキャビネットが、制御回路、遠心分離機、カバー、モータ、ポンプ、センサ、ディスプレイ、およびユーザインタフェースを収容するハウジングを含む。例示的な装置が米国特許第6,123,655号、米国特許第6,733,433号、およびUS2008/0171951に記載されている。
【００９２】
いくつかの態様において、システムは、一連の容器、たとえばバッグ、チューブ、ストップコック、クランプ、コネクタ、および遠心チャンバを含む。いくつかの態様において、容器、たとえばバッグは、形質導入される細胞およびウイルスベクター粒子を収容する1つまたは複数の容器、たとえばバッグを、同じ容器または別々の容器、たとえば同じバッグまたは別々のバッグの中に含む。いくつかの態様において、システムはさらに、チャンバに引き込まれる媒体、たとえば希釈剤および／または洗浄液および／または方法中に成分および／または組成物を希釈、再懸濁、および／または洗浄するための他の成分を収容する1つまたは複数の容器、たとえばバッグを含む。容器は、システム中の1つまたは複数の位置、たとえば入力ライン、希釈剤ライン、洗浄ライン、廃棄物ライン、および／または出力ラインに対応する位置で接続されることができる。
【００９３】
いくつかの態様において、チャンバは、チャンバをたとえばその回転軸を中心に回転させることができる遠心分離機と関連している。回転は、細胞の形質導入と関連するインキュベーションの前、最中、および／または後で、および／または他の処理工程の1つまたは複数において実施され得る。したがって、いくつかの態様において、様々な処理工程の1つまたは複数は、たとえば特定の力での回転下で実施される。チャンバは通常、遠心分離中にチャンバが垂直に座り、側壁および軸が垂直またはほぼ垂直になり、端壁が水平またはほぼ水平になるよう、垂直またはほぼ垂直に回転することができる。
【００９４】
いくつかの態様において、細胞、ウイルス粒子および試薬を含む組成物は、一般に相対的に低い力または速度、たとえば細胞をペレット化するために使用される速度よりも低い速度、たとえば600rpm〜1700rpmまたは約600rpm〜約1700rpm（たとえば、600rpm、1000rpm、もしくは1500rpmもしくは1700rpm、または約600rpm、約1000rpm、もしくは約1500rpmもしくは約1700rpm、または少なくとも600rpm、少なくとも1000rpm、もしくは少なくとも1500rpmもしくは少なくとも1700rpm）で回転させることができる。いくつかの態様において、回転は、たとえばチャンバまたはキャビティの内壁または外壁で測定して100g〜3200gまたは約100g〜約3200g（たとえば、100g、200g、300g、400g、500g、1000g、1500g、2000g、2500g、3000g、もしくは3200g、または約100g、約200g、約300g、約400g、約500g、約1000g、約1500g、約2000g、約2500g、約3000g、もしくは約3200g、または少なくとも100g、少なくとも200g、少なくとも300g、少なくとも400g、少なくとも500g、少なくとも1000g、少なくとも1500g、少なくとも2000g、少なくとも2500g、少なくとも3000g、もしくは少なくとも3200g、または少なくとも約100g、少なくとも約200g、少なくとも約300g、少なくとも約400g、少なくとも約500g、少なくとも約1000g、少なくとも約1500g、少なくとも約2000g、少なくとも約2500g、少なくとも約3000g、もしくは少なくとも約3200g）の力、たとえば相対遠心力で実施される。「相対遠心力」またはRCFという用語は一般に、回転軸と比べて、空間中の特定の点における、地球の重力に対する、物体または物質（たとえば細胞、試料もしくはペレットおよび／または回転させられるチャンバもしくは他の容器中の点）に加えられる有効力であると理解される。値は、重力、回転速度および回転の半径（回転軸と、RCFが測定されるところの物体、物質、または粒子との間の距離）を考慮に入れつつ、周知の公式を使用して決定され得る。
【００９５】
いくつかの態様において、遺伝子操作の少なくとも一部、たとえば形質導入中および／または遺伝子操作の後、細胞は、上記のように、遺伝子操作された細胞の培養、たとえば細胞のカルチベーションまたは増大のための容器、たとえばバッグ、たとえばバイオリアクタバッグアセンブリに移される。いくつかの態様において、細胞のカルチベーションまたは増大のための容器はバイオリアクタバッグ、たとえば灌流バッグである。
【００９６】
1.ベクターおよび方法
いくつかの態様において、処理工程は、組換えタンパク質をコードする核酸分子の、細胞への導入を含み、いくつかの公知のベクターのいずれかを使用して実施され得る。いくつかの態様において、ベクターは、組換え受容体をコードする核酸を含む。特定の態様において、ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである。場合によっては、ベクターはウイルスベクター、たとえばレトロウイルスベクター、たとえばレンチウイルスベクターまたはガンマレトロウイルスベクターである。
【００９７】
場合によっては、組換え受容体、たとえばキメラ抗原受容体（CAR）をコードする核酸は、シグナルペプチドをコードするシグナル配列を含む。シグナルペプチドの非限定的な例は、たとえば、GMCSFRアルファ鎖シグナルペプチド、CD8アルファシグナルペプチド、またはCD33シグナルペプチドを含む。
【００９８】
いくつかの態様において、ベクターは、ウイルスベクター、たとえばレトロウイルスまたはレンチウイルスベクター、非ウイルスベクター、またはトランスポゾン、たとえばSleeping Beautyトランスポゾン系、サルウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクター、レンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、たとえばガンマレトロウイルスベクター、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するレトロウイルスベクターを含む。
【００９９】
いくつかの態様において、ウイルスベクターまたは非ウイルスDNAは、異種組換えタンパク質をコードする核酸を含む。いくつかの態様において、異種組換え分子は、組換え受容体、たとえば抗原受容体、たとえば遺伝子サイレンシングのためのSBトランスポゾン、カプシドで包まれトランスポゾン、たとえばゲノム組換えのための相同二本鎖核酸またはレポータ遺伝子（たとえば蛍光タンパク質、たとえばGFP）またはルシフェラーゼ）であるか、またはそれを含む。
【０１００】
2. 形質導入のためのウイルスベクター粒子の調製
いくつかの態様において、組換え核酸は、組換え感染ウイルス粒子、たとえばサルウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターを使用して細胞に導入される。いくつかの態様において、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、たとえばガンマレトロウイルスベクターを使用してT細胞に導入される（たとえば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25；Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46; Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93；Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照）。
【０１０１】
いくつかの態様において、レトロウイルスベクターは、長い末端反復（LTR）配列、たとえば、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、または脾臓フォーカス形成ウイルス（SFFV）に由来するレトロウイルスベクターを有する。いくつかの態様において、レトロウイルスは、任意の鳥類または哺乳動物細胞に由来するものを含む。レトロウイルスは通常、両種指向性である、すなわち、ヒトを含むいくつかの種の宿主細胞に感染することができる。1つの態様においては、発現される遺伝子がレトロウイルスgag、polおよび／またはenv配列に取って代わる。いくつかの例示的なレトロウイルス系が記載されている（たとえば、米国特許第5,219,740号；同第6,207,453号；同第5,219,740号；Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990；Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852；Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037およびBoris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3: 102-109）。
【０１０２】
レンチウイルス形質導入の方法は公知である。例示的な方法が、たとえば、Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644；Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114およびCavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505に記載されている。
【０１０３】
いくつかの態様において、ウイルスベクター粒子は、レトロウイルスゲノムベースのベクター、たとえばレンチウイルスゲノムベースのベクターに由来するゲノムを含む。提供されるウイルスベクターのいくつかの局面において、組換え受容体、たとえばCARをコードする異種核酸は、ベクターゲノムの5'LTRおよび3'LTR配列の間に含まれる、および／または位置する。
【０１０４】
いくつかの態様において、ウイルスベクターゲノムは、レンチウイルスゲノム、たとえばHIV-1ゲノムまたはSIVゲノムである。たとえば、レンチウイルスベクターは、毒性遺伝子を多重弱毒化することによって生成されたものであり、たとえば、遺伝子env、vif、vpu、およびnefが欠失されて、ベクターを治療目的により安全にすることができる。レンチウイルスベクターは公知である。Naldini et al., (1996 and 1998)；Zufferey et al., (1997)；Dull et al., 1998、米国特許第6,013,516号および同第5,994,136号を参照すること。いくつかの態様において、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸の組み込み、選択および宿主細胞への核酸の導入に不可欠な配列を運ぶように構成されている。公知のレンチウイルスは、寄託機関またはコレクション、たとえばAmerican Type Culture Collection（「ATCC」：10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209）から容易に得ることができるか、または一般に利用可能な技術を使用して公知のソースから単離することができる。
【０１０５】
レンチウイルスベクターの非限定的な例は、レンチウイルス、たとえばヒト免疫不全ウイルス1（HIV-1）、HIV-2、サル免疫不全ウイルス（SIV）、ヒトTリンパ球向性ウイルス1（HTLV-1）、HTLV-2、またはウマ伝染性貧血ウイルス（E1AV）に由来するものを含む。たとえば、レンチウイルスベクターは、HIV毒性遺伝子を多重弱毒化することによって生成されたものであり、たとえば、遺伝子env、vif、vpr、vpu、およびnefが欠失されて、ベクターを治療目的により安全にする。レンチウイルスベクターは当技術分野において公知である。Naldini et al., (1996 and 1998)；Zufferey et al., (1997)；Dull et al., 1998、米国特許第6,013,516号および同第5,994,136号を参照すること。いくつかの態様において、これらのウイルスベクターは、プラスミドベースまたはウイルスベースであり、外来核酸の組み込み、選択および宿主細胞への核酸の導入に不可欠な配列を運ぶように構成されている。公知のレンチウイルスは、寄託機関またはコレクション、たとえばAmerican Type Culture Collection（「ATCC」：10801 University Blvd., Manassas, Va. 20110-2209）から容易に得ることができるか、または一般に利用可能な技術を使用して公知のソースから単離することができる。
【０１０６】
ウイルスベクターゲノムは通常、パッケージングまたはプロデューサ細胞株にトランスフェクトされることができるプラスミド形態で構築される。そのような例のいずれにおいても、組換えタンパク質、たとえば組換え受容体をコードする核酸は、ウイルスベクターの領域、たとえば一般にウイルスゲノムの非必須領域に挿入または配置される。いくつかの態様において、核酸は、特定のウイルス配列の代わりにウイルスゲノムに挿入されて、複製欠損性であるウイルスを製造する。
【０１０７】
ゲノムがウイルスベクターゲノムのRNAコピーを含むレトロウイルス粒子を製造するためには、多様な公知の方法のいずれかを使用することができる。いくつかの態様においては、少なくとも2つの成分がウイルスベースの遺伝子送達系の作製に関与する。1つ目は、構造タンパク質と、ウイルスベクター粒子を生成するために必要な酵素とを包含するパッケージングプラスミドであり、2つ目は、ウイルスベクターそのもの、すなわち、導入される遺伝子物質である。バイオセーフティーセーフガードをこれらの成分の一方または両方の設計に導入することができる。
【０１０８】
いくつかの態様において、パッケージングプラスミドは、エンベロープタンパク質以外のすべてのレトロウイルスタンパク質、たとえばHIV-1タンパク質を含むことができる（Naldini et al., 1998）。他の態様において、ウイルスベクターは、さらなるウイルス遺伝子、たとえば毒性と関連する遺伝子、たとえばvpr、vif、vpu、およびnefならびに／またはTat、つまりHIVの一次トランスアクチベータを欠くことができる。いくつかの態様において、レンチウイルスベクター、たとえばHIVベースのレンチウイルスベクターは、親ウイルスの3つの遺伝子：gag、pol、およびrevのみを含み、それが、組換えによる野生型ウイルスの再構成の可能性を減らすか、または除く。
【０１０９】
いくつかの態様において、ウイルスベクターゲノムは、ウイルスベクターゲノムから転写されたウイルスゲノムRNAをウイルス粒子の中にパッケージングするために必要なすべての成分を含むパッケージング細胞株に導入される。あるいはまた、ウイルスベクターゲノムは、関心対象の1つまたは複数の配列、たとえば組換え核酸に加えて、ウイルス成分をコードする1つまたは複数の遺伝子を含み得る。しかし、いくつかの局面においては、標的細胞中のゲノムの複製を防ぐために、複製に必要な内因性ウイルス遺伝子が除去され、パッケージング細胞株中に別々に提供される。
【０１１０】
いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、粒子を生成するために必要な成分を含む1つまたは複数のプラスミドベクターをトランスフェクトされる。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、LTR、cis作用パッケージング配列および関心対象の配列、すなわち抗原受容体、たとえばCARをコードする核酸を含む、ウイルスベクターゲノムを含むプラスミド；ならびにウイルス酵素および／または構造成分、たとえばGag、polおよび／またはrevをコードする1つまたは複数のヘルパープラスミドをトランスフェクトされる。いくつかの態様においては、複数のベクターを利用して、レトロウイルスベクター粒子を生成する様々な遺伝子成分を分離する。いくつかのこのような態様において、パッケージング細胞に別々のベクターを提供することは、他のやり方ならば複製能を有するウイルスを生成するおそれがある組換えイベントの可能性を減らす。いくつかの態様においては、レトロウイルス成分のすべてを有する単一のプラスミドベクターを使用することもできる。
【０１１１】
いくつかの態様において、レトロウイルスベクター粒子、たとえばレンチウイルスベクター粒子は、宿主細胞の形質導入効率を高めるために偽型化される。たとえば、レトロウイルスベクター粒子、たとえばレンチウイルスベクター粒子は、いくつかの態様において、VSV-G糖タンパク質で偽型化され、それが、形質導入されることができる細胞タイプに及ぶ広い細胞宿主範囲を提供する。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、たとえば、異種指向性、多指向性または両指向性エンベロープ、たとえばシンドビスウイルスエンベロープ、GALV、またはVSV-Gを含むよう、非天然エンベロープ糖タンパク質をコードするプラスミドまたはポリヌクレオチドをトランスフェクトされる。
【０１１２】
いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、レンチウイルスベクター粒子へのウイルスゲノムRNAのパッケージングのためにトランスで必要とされる、ウイルス調節および構造タンパク質を含む成分を提供する。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、レンチウイルスタンパク質を発現し、機能的なレンチウイルスベクター粒子を製造することができる任意の細胞株であり得る。いくつかの局面において、適切なパッケージング細胞株は、293（ATCC CCL X）、293T、HeLA（ATCC CCL 2）、D17（ATCC CCL 183）、MDCK（ATCC CCL 34）、BHK（ATCC CCL-10）、およびCf2Th（ATCC CRL 1430）細胞を含む。
【０１１３】
いくつかの態様において、パッケージング細胞株はウイルスタンパク質を安定的に発現する。たとえば、いくつかの局面においては、gag、pol、revおよび／または他の構造遺伝子を含むが、LTRおよびパッケージング成分を有しないパッケージング細胞株を構築することができる。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、異種タンパク質をコードする核酸分子および／またはエンベロープ糖タンパク質をコードする核酸を含むウイルスベクターゲノムとともに、1つまたは複数のウイルスタンパク質をコードする核酸分子を過渡的にトランスフェクトされることができる。
【０１１４】
いくつかの態様において、ウイルスベクターおよびパッケージングおよび／またはヘルパープラスミドは、トランスフェクションまたは感染によってパッケージング細胞株に導入される。パッケージング細胞株は、ウイルスベクターゲノムを含むウイルスベクター粒子を製造する。トランスフェクションまたは感染の方法は周知である。非限定的な例は、リン酸カルシウム、DEAE-デキストランおよびリポフェクション法、エレクトロポレーションおよびマイクロインジェクションを含む。
【０１１５】
組換えプラスミドとレトロウイルスLTRおよびパッケージング配列とを特別な細胞株に導入すると（たとえばリン酸カルシウム沈殿により）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子中にパッケージングされることを可能にし得、それがその後、培地中に分泌され得る。次いで、いくつかの態様においては組換えレトロウイルスを含む培地を捕集し、任意で濃縮し、遺伝子導入に使用する。たとえば、いくつかの局面においては、パッケージング細胞株へのパッケージングプラスミドと導入ベクターとのコトランスフェクションの後、ウイルスベクター粒子を培地から回収し、当業者によって使用される標準的な方法によって力価測定する。
【０１１６】
いくつかの態様においては、レトロウイルスベクター、たとえばレンチウイルスベクターを、レンチウイルス粒子の生成を可能にするためのプラスミドの導入により、パッケージング細胞株、たとえば例示的なHEK 293T細胞株中で製造することができる。いくつかの態様において、パッケージング細胞は、gagおよびpolをコードするポリヌクレオチドと、組換え受容体、たとえば抗原受容体、たとえばCARをコードするポリヌクレオチドとをトランスフェクトされる、および／またはそれらを含む。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、任意で、および／または追加的に、revタンパク質をコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトされかつ／またはそれを含む。いくつかの態様において、パッケージング細胞株は、任意で、および／または追加的に、非天然エンベロープ糖タンパク質、たとえばVSV-Gをコードするポリヌクレオチドをトランスフェクトされかつ／またはそれを含む。いくつかのそのような態様においては、細胞、たとえばHEK 293T細胞のトランスフェクションから約2日後、細胞上清は組換えレンチウイルスベクターを含み、それを回収し、力価測定することができる。
【０１１７】
回収および／または製造されたレトロウイルスベクター粒子は、記載される方法を使用して標的細胞を形質導入するために使用することができる。一旦、標的細胞に入ると、ウイルスRNAは逆転写され、核に移入され、宿主ゲノムに安定的に組み込まれる。ウイルスRNAの組み込みから1または2日後、組換えタンパク質、たとえば抗原受容体、たとえばCARの発現を検出することができる。
【０１１８】
D. 細胞のカルチべーションおよび／または増大
いくつかの態様において、提供される生物医学的材料容器または提供される製造物に貯蔵または移送することができる生物医学的材料は、操作された細胞をカルチベートする、たとえば、増殖および／または増大を促進する条件下で細胞をカルチベートするための1つまたは複数の工程を含む方法を使用して操作された細胞を含む。いくつかの態様において、操作された細胞は、遺伝子操作する工程、たとえば形質導入またはトランスフェクションによって組換えペプチドを細胞に導入する工程の後、増殖および／または増大を促進する条件下でカルチベートされる。特定の態様において、細胞は、刺激条件下でインキュベートされ、組換えポリヌクレオチド、たとえば組換え受容体をコードするポリヌクレオチドを形質導入またはトランスフェクトされた後、カルチベートされる。いくつかの態様において、カルチべーションは、濃縮されたT細胞の1つまたは複数のカルチベートされた組成物を製造する。いくつかの態様において、そのような条件は、集団中の細胞の増殖、増大、活性化、および／または生き残りを誘導するように設計され得る。特定の態様において、刺激条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、たとえば栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および／または刺激因子、たとえばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナ、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞の成長、分裂、および／または増大を促進するように設計された任意の他の作用物質の1つまたは複数を含むことができる。
【０１１９】
いくつかの態様において、操作された細胞は、加えられる細胞の培養のための細胞培地および／または細胞をたとえばフィードポートを介して充填されることができる容器中で培養される。細胞は、たとえば細胞の増大および／または増殖のために細胞の培養が望まれる任意の細胞源に由来することができる。
【０１２０】
いくつかの局面において、培地は、細胞、たとえばT細胞の成長、カルチべーション、増大、または増殖を支持する適合培地である。いくつかの局面において、培地は、塩、アミノ酸、ビタミン、砂糖、またはそれらの任意の組み合わせの混合物を含む液体であることができる。いくつかの態様において、培地はさらに、たとえば、インキュベーション中に細胞のカルチべーション、増大、または増殖を刺激するための、1つまたは複数の刺激条件または作用物質を含む。いくつかの態様において、刺激条件は、たとえばIL-2、IL-7、またはIL-15から選択される、1つまたは複数のサイトカインであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、サイトカインは組換えサイトカインである。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインはヒト組換えサイトカインである。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、T細胞によって発現される受容体および／またはT細胞に内在性である受容体に結合する、および／または結合することができる。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは、4−アルファヘリックスバンドルファミリーのサイトカインのメンバーであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、4−アルファヘリックスバンドルファミリーのサイトカインのメンバーは、インターロイキン-2（IL-2）、インターロイキン-4（IL-4）、インターロイキン-7（IL-7）、インターロイキン-9（IL-9）、インターロイキン12（IL-12）、インターロイキン15（IL-15）、顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）、および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）を含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、1つまたは複数のサイトカインはIL-15であるか、またはIL-15を含む。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインはIL-7であるか、またはIL-7を含む。特定の態様において、1つまたは複数のサイトカインは組換えIL-2であるか、または組換えIL-2を含む。
【０１２１】
いくつかの態様において、培養中またはインキュベーション中の、培地中の1つまたは複数のサイトカインの濃度は、独立して、1IU/mL〜1500IU/mLまたは約1IU/mL〜1500IU/mL、たとえば、1IU/mL〜100IU/mL、2IU/mL〜50IU/mL、5IU/mL〜10IU/mL、10IU/mL〜500IU/mL、50IU/mL〜250IU/mL、もしくは100IU/mL〜200IU/mL、50IU/mL〜1500IU/mL、100IU/mL〜1000IU/mL、もしくは200IU/mL〜600IU/mL、または約1IU/mL〜100IU/mL、約2IU/mL〜50IU/mL、約5IU/mL〜10IU/mL、約10IU/mL〜500IU/mL、約50IU/mL〜250IU/mL、もしくは約100IU/mL〜200IU/mL、約50IU/mL〜1500IU/mL、約100IU/mL〜1000IU/mL、もしくは約200IU/mL〜600IU/mLである。いくつかの態様において、1つまたは複数のサイトカインの濃度は独立して、少なくとも1IU/mL、少なくとも5IU/mL、少なくとも10IU/mL、少なくとも50IU/mL、少なくとも100IU/mL、少なくとも200IU/mL、少なくとも500IU/mL、少なくとも1000IU/mL、もしくは少なくとも1500IU/mL、または少なくとも約1IU/mL、少なくとも約5IU/mL、少なくとも約10IU/mL、少なくとも約50IU/mL、少なくとも約100IU/mL、少なくとも約200IU/mL、少なくとも約500IU/mL、少なくとも約1000IU/mL、もしくは少なくとも約1500IU/mLである。
【０１２２】
いくつかの局面において、細胞は、操作された細胞および培地の導入後の少なくとも一部分の時間、インキュベートされる。いくつかの態様において、刺激条件は一般に、一次免疫細胞、たとえばヒトTリンパ球の成長に適した温度、たとえば少なくとも約25℃、一般に少なくとも約30℃、一般に37℃または約37℃を含む。いくつかの態様において、濃縮されたT細胞の組成物は、25〜38℃、たとえば30〜37℃、たとえば37℃±2℃または約37℃±2℃の温度でインキュベートされる。いくつかの態様において、インキュベーションは、培養、たとえばカルチべーションまたは増大が所望または閾細胞密度、濃度、数または量を生じさせるまでの時間、実施される。いくつかの態様において、インキュベーションは、培養、たとえばカルチべーションまたは増大が生存可能細胞の所望または閾密度、濃度、数または量を生じさせるまでの時間、実施される。いくつかの態様において、インキュベーションは、24時間、48時間、72時間、96時間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、もしくはそれ以上または約24時間、約48時間、約72時間、約96時間、約5日間、約6日間、約7日間、約8日間、約9日間、もしくはそれ以上より長いか、または約24時間、約48時間、約72時間、約96時間、約5日間、約6日間、約7日間、約8日間、約9日間、もしくはそれ以上または24時間、48時間、72時間、96時間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、もしくはそれ以上にわたる。
【０１２３】
いくつかの態様において、細胞は、細胞培養中に二酸化炭素の目標量を維持するための条件下、インキュベートされる。いくつかの局面において、これは、成長中の最適なカルチべーション、増大、および増殖を保証する。いくつかの局面において、二酸化炭素（C02）の量は、10％〜0％（v/v）、たとえば8％〜2％（v/v）、たとえば5％または約5％（v/v） C02である。
【０１２４】
特定の態様において、培養は閉鎖系中で実施される。特定の態様において、培養は、閉鎖系中、無菌条件下で実施される。特定の態様において、培養は、提供されるシステムの1つまたは複数の工程と同じ閉鎖系中で実施される。いくつかの態様において、濃縮されたT細胞の組成物が閉鎖系から取り出され、カルチべーションのためにバイオリアクタに配置および／または接続される。カルチべーションに適したバイオリアクタの例は、GE Xuri W25、GE Xuri W5、Sartorius BioSTAT RM 20|50、Finesse SmartRocker Bioreactor SystemsおよびPall XRS Bioreactor Systemsを含むが、それらに限定されない。いくつかの態様において、バイオリアクタは、カルチべーション工程の少なくとも一部分中、細胞を灌流および／または混合するために使用される。
【０１２５】
いくつかの態様において、封入状態、接続状態および／またはバイオリアクタの制御下でカルチベートされる細胞は、カルチべーション中、バイオリアクタなしでカルチベートされる細胞、たとえば静的条件下、たとえば混合なし、揺動なし、モーションなし、および／または灌流なしでカルチベートされる細胞よりも急速に増大を起こす。いくつかの態様において、封入状態、接続状態および／またはバイオリアクタの制御下でカルチベートされる細胞は、14日、10日、9日、8日、7日、6日、5日、4日、3日、2日、60時間、48時間、36時間、24時間、または12時間以内に、閾増大、細胞数、および／または密度に達するか、またはそれを達成する。いくつかの態様において、封入状態、接続状態、および／またはバイオリアクタの制御下でカルチベートされる細胞は、細胞が封入状態、接続状態、および／またはバイオリアクタの制御下でカルチベートされない例示的および／または代替プロセスでカルチベートされる細胞の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも100％、少なくとも150％、少なくとも1倍、少なくとも2倍、少なくとも3倍、少なくとも4倍、少なくとも5倍の閾増大、細胞数、および／または密度に達するか、またはそれを達成する。
【０１２６】
いくつかの態様において、混合は、揺動および／またはモーショニングであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、細胞は、バイオリアクタとともに使用される容器、たとえばバッグを使用してインキュベートされる。場合によっては、バイオリアクタは、モーショニングまたは揺動に付されることができ、それが、いくつかの局面において、酸素移動を増すことができる。バイオリアクタのモーショニングは、バイオリアクタの水平軸に沿う回転、バイオリアクタの垂直軸に沿う回転、バイオリアクタの傾斜した水平軸に沿う揺動またはそれらの任意の組み合わせを含み得るが、それらに限定されない。いくつかの態様において、インキュベーションの少なくとも一部分は揺動させながら実施される。揺動速度および揺動角は、所望のかく拌を達成するように調節され得る。いくつかの態様において、揺動角は、20°、19°、18°、17°、16°、15°、14°、13°、12°、11°、10°、9°、8°、7°、6°、5°、4°、3°、2°、もしくは1°、または約20°、約19°、約18°、約17°、約16°、約15°、約14°、約13°、約12°、約11°、約10°、約9°、約8°、約7°、約6°、約5°、約4°、約3°、約2°、もしくは約1°である。特定の態様において、揺動角は6〜16°である。他の態様において、揺動角は7〜16°である。他の態様において、揺動角は8〜12°である。いくつかの態様において、揺動速度は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、1 12、13、14 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40rpmである。いくつかの態様において、揺動速度は4〜12rpm、たとえば4〜6rpmである。細胞培養増大の少なくとも一部分は、たとえば、5°〜10°、たとえば6°の角度で一定の揺動速度、たとえば5〜15RPM、たとえば6RMPまたは10RPMの揺動とともに実施される。
【０１２７】
いくつかの態様において、細胞、たとえば操作されたT細胞、たとえば操作されたCD4+T細胞または操作されたCD8+T細胞を含む組成物が界面活性剤の存在下でカルチベートされる。特定の態様において、細胞の組成物のカルチべーションは、たとえば混合、揺動、モーション、および／または灌流のせいでカルチべーション中に発生し得る剪断応力の量を減らす。特定の態様において、細胞、たとえば操作されたT細胞、たとえば操作されたCD4+T細胞または操作されたCD8+T細胞の組成物は界面活性剤とともにカルチベートされ、T細胞の少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、少なくとも95％、少なくとも99％、または99.9％が、カルチべーション中またはカルチべーションが完了してから少なくとも1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、または7日間超生き残る、たとえば生存可能である、および／または壊死、プログラム細胞死またはアポトーシスを起こさない。特定の態様において、細胞、たとえば操作されたT細胞、たとえば操作されたCD4+T細胞または操作されたCD8+T細胞の組成物は界面活性剤の存在下でカルチベートされ、細胞の50％未満、40％未満、30％未満、25％未満、20％未満、15％未満、10％未満、5％未満、1％未満、0.1％未満、または0.01％未満が、たとえば剪断または剪断誘発応力のせいで、細胞死、たとえばプログラム細胞死、アポトーシスおよび／または壊死を起こす。
【０１２８】
特定の態様において、細胞、たとえば操作されたT細胞、たとえば操作されたCD4+T細胞または操作されたCD8+T細胞の組成物は、0.1μl/ml〜10.0μl/ml、0.2μl/ml〜2.5μl/ml、0.5μl/ml〜5μl/ml、1μl/ml〜3μl/ml、または2μl/ml〜4μl/mlの界面活性剤の存在下でカルチベートされる。いくつかの態様において、細胞、たとえば操作されたT細胞、たとえば操作されたCD4+T細胞または操作されたCD8+T細胞の組成物は、0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2.0μl/ml、2.5μl/ml、5.0μl/ml、10μl/ml、25μl/ml、もしくは50μl/ml、または約0.1μl/ml、約0.2μl/ml、約0.4μl/ml、約0.6μl/ml、約0.8μl/ml、約1μl/ml、約1.5μl/ml、約2.0μl/ml、約2.5μl/ml、約5.0μl/ml、約10μl/ml、約25μl/ml、もしくは約50μl/ml、または少なくとも0.1μl/ml、少なくとも0.2μl/ml、少なくとも0.4μl/ml、少なくとも0.6μl/ml、少なくとも0.8μl/ml、少なくとも1μl/ml、少なくとも1.5μl/ml、少なくとも2.0μl/ml、少なくとも2.5μl/ml、少なくとも5.0μl/ml、少なくとも10μl/ml、少なくとも25μl/ml、もしくは少なくとも50μl/mlの界面活性剤の存在下でカルチベートされる。特定の態様において、細胞の組成物は2μl/mlまたは約2μl/mlの界面活性剤の存在下でカルチベートされる。
【０１２９】
いくつかの態様において、界面活性剤は、液体および／または固体の表面張力を減らす作用物質であるか、またはそれを含む。たとえば、界面活性剤は、脂肪アルコール（たとえばステリルアルコール）、ポリオキシエチレングリコールオクチルフェノールエーテル（たとえばTriton X-100）またはポリオキシエチレングリコールソルビタンアルキルエステル（たとえばポリソルベート20、40、60）を含む。特定の態様において、界面活性剤は、ポリソルベート80（PS80）、ポリソルベート20（PS20）、ポロキサマー188（P188）からなる群より選択される。例示的な態様において、既知組成フィード培地中の界面活性剤の濃度は、PS80約0.0025％〜約0.25％（v/v）、PS20約0.0025％〜約0.25％（v/v）、またはP188約0.1％〜約5.0％（w/v）である。
【０１３０】
いくつかの態様において、界面活性剤は、アニオン性界面活性剤、カチオン性界面活性剤、両性イオン性界面活性剤またはそれらに添加される非イオン性界面活性剤であるか、またはそれを含む。適切なアニオン性界面活性剤は、アルキルスルホネート、アルキルホスフェート、アルキルホスホネート、ラウリン酸カリウム、ステアリン酸トリエタノールアミン、ラウリル硫酸ナトリウム、ドデシル硫酸ナトリウム、アルキルポリオキシエチレン硫酸塩、アルギン酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、ホスファチジルグリセロール、ホスファチジルイノシン、ホスファチジルイノシトール、ジホスファチジルグリセロール、ホスファチジルセリン、ホスファチジル酸およびそれらの塩、カルボキシメチルセルロースナトリウム、コール酸および他の胆汁酸（たとえばコール酸、デオキシコール酸、グリココール酸、タウロコール酸、グリコデオキシコール酸）、およびそれらの塩（たとえばデオキシコール酸ナトリウム）を含むが、それらに限定されない。
【０１３１】
いくつかの態様において、適切な非イオン性界面活性剤は、グリセリルエステル、ポリオキシエチレン脂肪アルコールエーテル、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（ポリソルベート）、ポリオキシエチレン脂肪酸エステル、ソルビタンエステル、グリセロールモノステアレート、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、セチルアルコール、セトステアリルアルコール、ステアリルアルコール、アリールアルキルポリエーテルアルコール、ポリオキシエチレン−ポリオキシプロピレンコポリマー（ポロキサマー）、ポロキサミン、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、非結晶性セルロース、多糖類、たとえばデンプンおよびデンプン誘導体、たとえばヒドロキシエチルデンプン（HES）、ポリビニルアルコール、およびポリビニルピロリドンを含む。特定の態様において、非イオン性界面活性剤は、ポリオキシエチレンとポリオキシプロピレンとのコポリマーであり、好ましくは、プロピレングリコールとエチレングリコールとのブロックコポリマーである。そのようなポリマーは、PLURONIC（登録商標）F68またはKolliphor（登録商標）P188とも呼ばれる、商品名POLOXAMERの下で販売されている。ポリオキシエチレン脂肪酸エステルには、短いアルキル鎖を有するものが含まれる。そのような界面活性剤の一例がSOLUTOL（登録商標）HS15、ポリエチレン-660-ヒドロキシステアレートである。
【０１３２】
いくつかの態様において、適切なカチオン性界面活性剤は、天然リン脂質、合成リン脂質、第四級アンモニウム化合物、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、キトサン、ラウリルジメチルベンジルアンモニウム塩化物、アシルカルニチン塩酸塩、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（DDAB）、ジオレオイルトリメチルアンモニウムプロパン（DOTAP）、ジミリストイルトリメチルアンモニウムプロパン（DMTAP）、ジメチルアミノエタンカルバモイルコレステロール（DC-Chol）、1,2-ジアシルグリセロ-3-（O-アルキル）ホスホコリン、O-アルキルホスファチジルコリン、ハロゲン化アルキルピリジニウム、または長鎖アルキルアミン、たとえばn-オクチルアミンおよびオレイルアミンを含むが、それらに限定されない。
【０１３３】
両性イオン界面活性剤は、電気的に中性であるが、同じ分子内に局所的な正および負の電荷を有する。適切な両性イオン性界面活性剤は、両性イオン性リン脂質を含むが、それに限定されない。適切なリン脂質は、ホスファチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ジアシル−グリセロ−ホスホエタノールアミン（たとえばジミリストイル−グリセロ−ホスホエタノールアミン（DMPE）、ジパルミトイル−グリセロ−ホスホエタノールアミン（DPPE）、ジステアロイル−グリセロ−ホスホエタノールアミン（DSPE）、およびジオレオリル−グリセロ−ホスホエタノールアミン（DOPE））を含む。アニオン性および両性イオン性リン脂質を含むリン脂質の混合物が本発明において用いられてもよい。そのような混合物は、リゾリン脂質、卵または大豆リン脂質またはそれらの任意の組み合わせを含むが、それに限定されない。リン脂質は、アニオン性、両性イオン性、またはリン脂質の混合物のいずれであろうと、塩化または脱塩、水素化もしくは部分水素化または天然、半合成もしくは合成リン脂質であり得る。
【０１３４】
特定の態様において、界面活性剤はポロキサマー、たとえばポロキサマー188である。いくつかの態様において、細胞の組成物は、0.1μl/ml〜10.0μl/ml、0.2μl/ml〜2.5μl/ml、0.5μl/ml〜5μl/ml、1μl/ml〜3μl/ml、または2μl/ml〜4μl/mlのポロキサマーの存在下でカルチベートされる。いくつかの態様において、細胞の組成物は、0.1μl/ml、0.2μl/ml、0.4μl/ml、0.6μl/ml、0.8μl/ml、1μl/ml、1.5μl/ml、2.0μl/ml、2.5μl/ml、5.0μl/ml、10μl/ml、25μl/ml、もしくは50μl/ml、または約0.1μl/ml、約0.2μl/ml、約0.4μl/ml、約0.6μl/ml、約0.8μl/ml、約1μl/ml、約1.5μl/ml、約2.0μl/ml、約2.5μl/ml、約5.0μl/ml、約10μl/ml、約25μl/ml、もしくは約50μl/ml、または少なくとも0.1μl/ml、少なくとも0.2μl/ml、少なくとも0.4μl/ml、少なくとも0.6μl/ml、少なくとも0.8μl/ml、少なくとも1μl/ml、少なくとも1.5μl/ml、少なくとも2.0μl/ml、少なくとも2.5μl/ml、少なくとも5.0μl/ml、少なくとも10μl/ml、少なくとも25μl/ml、もしくは少なくとも50μl/mlの界面活性剤の存在下でカルチベートされる。特定の態様において、細胞の組成物は2μl/mlまたは約2μl/mlのポロキサマーの存在下でカルチベートされる。
【０１３５】
いくつかの局面において、CD4+およびCD8+細胞は、それぞれが閾量または細胞密度に達するまで、それぞれ別々に増大またはいっしょに増大させる。特定の態様において、カルチべーションは、細胞が閾量、濃度、および／または増大を達成すると、細胞を収穫することなどによって終了する。特定の態様において、カルチべーションは、細胞がカルチべーション開始時の細胞の量または密度に対して1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、もしくは10倍超の増大、または、約1.5倍、約2倍、約2.5倍、約3倍、約3.5倍、約4倍、約4.5倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、もしくは約10倍超の、または少なくとも1.5倍、少なくとも2倍、少なくとも2.5倍、少なくとも3倍、少なくとも3.5倍、少なくとも4倍、少なくとも4.5倍、少なくとも5倍、少なくとも6倍、少なくとも7倍、少なくとも8倍、少なくとも9倍、少なくとも10倍、もしくは少なくとも10倍超の増大を達成すると終了する。いくつかの態様において、閾増大は、たとえばカルチべーション開始時の細胞の量または密度に対して4倍の増大である。いくつかの態様において、カルチべーションは、細胞が細胞の閾全量、たとえば閾細胞数を達成すると、細胞を収穫することなどによって終了する。いくつかの態様において、カルチべーションは、細胞が閾全有核細胞（TNC）数を達成すると終了する。いくつかの態様において、カルチべーションは、細胞が閾生存可能細胞量、たとえば閾生存可能細胞数を達成すると終了する。いくつかの態様において、閾細胞数は、50×106個、100×106個、200×106個、300×106個、400×106個、600×106個、800×106個、1000×106個、1200×106個、1400×106個、1600×106個、1800×106個、2000×106個、2500×106個、3000×106個、4000×106個、5000×106個、10,000×106個、12,000×106個、15,000×106個、もしくは20,000×106個、または約50×106個、約100×106個、約200×106個、約300×106個、約400×106個、約600×106個、約800×106個、約1000×106個、約1200×106個、約1400×106個、約1600×106個、約1800×106個、約2000×106個、約2500×106個、約3000×106個、約4000×106個、約5000×106個、約10,000×106個、約12,000×106個、約15,000×106個、もしくは約20,000×106個、または少なくとも50×106個、少なくとも100×106個、少なくとも200×106個、少なくとも300×106個、少なくとも400×106個、少なくとも600×106個、少なくとも800×106個、少なくとも1000×106個、少なくとも1200×106個、少なくとも1400×106個、少なくとも1600×106個、少なくとも1800×106個、少なくとも2000×106個、少なくとも2500×106個、少なくとも3000×106個、少なくとも4000×106個、少なくとも5000×106個、少なくとも10,000×106個、少なくとも12,000×106個、少なくとも15,000×106個、もしくは少なくとも20,000×106個、または前記生存可能細胞閾値のいずれかである。
【０１３６】
特定の態様において、カルチべーションは、細胞が閾細胞数を達成すると終了する。いくつかの態様において、カルチべーションは、閾細胞数が達成されてから6時間後、12時間後、24時間後、36時間後、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、もしくは7日後もしくは7日超後に、または約6時間後、約12時間後、約24時間後、約36時間後、約1日後、約2日後、約3日後、約4日後、約5日後、約6日後、もしくは約7日後もしくは約7日後超に、または6時間以内、12時間以内、24時間以内、36時間以内、1日以内、2日以内、3日以内、4日以内、5日以内、6日以内、もしくは7日以内もしくは7日超以内に終了する。特定の態様において、カルチべーションは、閾細胞数が達成されてから1日後または約1日後に終了する。特定の態様において、閾密度は、0.1×106個/ml、0.5×106個/ml、1×106個/ml、1.2×106個/ml、1.5×106個/ml、1.6×106個/ml、1.8×106個/ml、2.0×106個/ml、2.5×106個/ml、3.0×106個/ml、3.5×106個/ml、4.0×106個/ml、4.5×106個/ml、5.0×106個/ml、6×106個/ml、8×106個/ml、もしくは10×106個/ml、または約0.1×106個/ml、約0.5×106個/ml、約1×106個/ml、約1.2×106個/ml、約1.5×106個/ml、約1.6×106個/ml、約1.8×106個/ml、約2.0×106個/ml、約2.5×106個/ml、約3.0×106個/ml、約3.5×106個/ml、約4.0×106個/ml、約4.5×106個/ml、約5.0×106個/ml、約6×106個/ml、約8×106個/ml、もしくは約10×106個/ml、または少なくとも0.1×106個/ml、少なくとも0.5×106個/ml、少なくとも1×106個/ml、少なくとも1.2×106個/ml、少なくとも1.5×106個/ml、少なくとも1.6×106個/ml、少なくとも1.8×106個/ml、少なくとも2.0×106個/ml、少なくとも2.5×106個/ml、少なくとも3.0×106個/ml、少なくとも3.5×106個/ml、少なくとも4.0×106個/ml、少なくとも4.5×106個/ml、少なくとも5.0×106個/ml、少なくとも6×106個/ml、少なくとも8×106個/ml、もしくは少なくとも10×106個/ml、または前記生存可能細胞閾値のいずれかである。特定の態様において、カルチべーションは、細胞が閾密度を達成すると終了する。いくつかの態様において、カルチべーションは、閾密度数が達成されてから6時間後、12時間後、24時間後、36時間後、1日後、2日後、3日後、4日後、5日後、6日後、もしくは7日後もしくは7日後超に、または約6時間後、約12時間後、約24時間後、約36時間後、約1日後、約2日後、約3日後、約4日後、約5日後、約6日後、もしくは約7日後もしくは約7日後超に、または6時間後以内、12時間後以内、24時間後以内、36時間後以内、1日後以内、2日後以内、3日後以内、4日後以内、5日後以内、6日後以内、もしくは7日後以内もしくは7日後超以内に終了する。特定の態様において、カルチべーションは、閾密度数が達成されてから１日後または約1日後に終了する。
【０１３７】
いくつかの態様において、インキュベーションの少なくとも一部分は静的条件下で実施される。いくつかの態様において、インキュベーションの少なくとも一部分は、たとえば、培養中に使用済み培地を灌流で出して新鮮な培地を灌流で入れるための灌流とともに実施される。いくつかの態様において、方法は、たとえばフィードポートを介して新鮮な培地を細胞培養物に灌流する工程を含む。いくつかの態様において、灌流中に加えられる培地は、1つまたは複数の刺激物質、たとえば1つまたは複数の組換えサイトカイン、たとえばIL-2、IL-7、および／またはIL-15を含む。いくつかの態様において、灌流中に加えられる培地は、静的インキュベーション中に使用される培地と同じである。
【０１３８】
いくつかの態様において、インキュベーションの後、容器、たとえばバッグは、細胞療法を製造、生成、または生産するための1つまたは複数の他の処理工程を実施するためのシステムに再び接続される、たとえば、遠心チャンバを含むシステムに再び接続される。いくつかの局面において、培養された細胞は、培養された細胞の製剤化のために、バッグから内部キャビティに移される。
【０１３９】
E. 組成物および製剤
いくつかの態様において、組換え抗原受容体、たとえばCARまたはTCRで操作された細胞を含む細胞の用量は、組成物または製剤、たとえば医薬組成物または製剤として提供される。そのような組成物は、疾患、病気、および障害の予防または治療のための方法を含む養子細胞療法にしたがって、または検出、診断および予後判定方法において、使用することができる。いくつかの態様において、そのような組成物または製剤は、提供される生物医学的材料容器の中に、および／または提供される製造物の構成要素として、貯蔵、収容、または移送されることができる。
【０１４０】
場合によっては、細胞は、細胞療法を製造、生成、または生産するための1つまたは複数の工程（たとえば、遠心チャンバおよび／または閉鎖系中で実施される）で処理され、かつ／または、操作された細胞は、細胞の製剤、たとえば、培養、たとえばカルチべーションおよび増大の前または後で提供される形質導入処理工程および／または前記1つまたは複数の他の処理工程から生じる遺伝子操作された細胞の製剤を含み得る。場合によっては、細胞は、投与、たとえば単回投与または複数回投与のための量に製剤化されることができる。いくつかの態様において、細胞の製剤化と関連する提供される方法は、形質導入された細胞、たとえば上記処理工程を使用して形質導入および／または増大された細胞を閉鎖系中で処理する工程を含む。いくつかの態様において、製剤化された細胞は、生物医学的材料容器、たとえば本明細書に提供されるバイアルに移送または導入することができる。
【０１４１】
特定の態様において、細胞、たとえば操作され、カルチベートされたT細胞の1つまたは複数の組成物が製剤化される。特定の態様において、細胞、たとえば操作され、カルチベートされたT細胞の1つまたは複数の組成物は、1つまたは複数の組成物が操作および／またはカルチベートされた後、製剤化される。
【０１４２】
いくつかの態様において、処理工程の1つまたは複数によって生成されたT細胞、たとえばCD4+および／またはCD8+T細胞は製剤化される。いくつかの局面において、対象由来の細胞の異なる集団および／またはサブタイプをそれぞれが含む複数の組成物が、たとえば、任意で特定の期間内の別々の、または独立した投与のために、別々に製造、生産または生成される。たとえば、細胞の異なる集団および／またはサブタイプを含む操作された細胞の別々の製剤は、それぞれCD8+およびCD4+T細胞および／またはそれぞれCD8+-およびCD4+-濃縮集団、たとえば組換え受容体を発現するように遺伝子操作された細胞を個々に含むCD4+および／またはCD8+T細胞を含むことができる。いくつかの態様においては、少なくとも1つの組成物が、組換え受容体を発現するように遺伝子操作されたCD4+T細胞とともに製剤化される。いくつかの態様においては、少なくとも1つの組成物が、組換え受容体を発現するように遺伝子操作されたCD8+T細胞とともに製剤化される。いくつかの態様において、用量の投与は、CD8+T細胞の用量またはCD4+T細胞の用量を含む第一の組成物の投与およびCD4+T細胞およびCD8+T細胞の用量の他方を含む第二の組成物の投与を含む。いくつかの態様において、CD8+T細胞の用量またはCD4+T細胞の用量を含む第一の組成物は、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の用量の他方を含む第二の組成物よりも前に投与される。いくつかの態様において、用量の投与は、CD8+T細胞の用量とCD4+T細胞の用量の両方を含む組成物の投与を含む。
【０１４３】
特定の態様において、細胞、たとえば操作され、カルチベートされたT細胞の1つまたは複数の組成物は、細胞の2つの別々の組成物、たとえば別々の操作および／またはカルチベートされた組成物であるか、またはそれらを含む。特定の態様においては、細胞の2つの別々の組成物、たとえば、同じ生物学的試料から選択、単離および／または濃縮され、別々に操作され、別々にカルチベートされたCD4+T細胞およびCD8+T細胞の2つの別々の組成物が別々に製剤化される。特定の態様において、2つの別々の組成物は、CD4+T細胞の組成物、たとえば操作および／またはカルチベートされたCD4+T細胞の組成物を含む。特定の態様において、2つの別々の組成物は、CD8+T細胞の組成物、たとえば操作および／またはカルチベートされたCD8+T細胞の組成物を含む。いくつかの態様において、CD4+T細胞およびCD8+T細胞の2つの別々の組成物、たとえば操作およびカルチベートされたCD4+T細胞および操作およびカルチベートされたCD8+T細胞の組成物は別々に製剤化される。いくつかの態様において、細胞の単一の組成物が製剤化される。特定の態様において、単一の組成物は、CD4+T細胞の組成物、たとえば操作および／またはカルチベートされたCD4+T細胞の組成物である。いくつかの態様において、単一の組成物は、製剤化の前に別々の組成物から合わされたCD4+およびCD8+T細胞の組成物である。
【０１４４】
いくつかの態様において、CD4+およびCD8+T細胞の別々の組成物、たとえば操作および／またはカルチベートされたCD4+TおよびCD8+T細胞の別々の組成物は単一の組成物へと合わされ、製剤化される。特定の態様において、CD4+TおよびCD8+T細胞の別々の製剤化された組成物は、製剤化が実施された、および／または完了した後、単一の組成物へと合わされる。特定の態様において、CD4+およびCD8+T細胞の別々の組成物、たとえば操作およびカルチベートされたCD4+TおよびCD8+T細胞の別々の組成物は別々の組成物として別々に製剤化される。
【０１４５】
いくつかの態様において、細胞は、容器、たとえばバイアル、たとえば本明細書に提供される生物医学的材料容器中の任意のバイアル中に製剤化されることができる。いくつかの態様において、細胞は、カルチべーション中に閾細胞数、密度および／または増大が達成されてから0日〜10日後、0日〜5日後、2日〜7日後、0.5日〜4日後、または1日〜3日後に製剤化される。特定の態様において、細胞は、カルチべーション中に閾細胞数、密度、および／または増大が達成された後に、またはカルチべーション中に閾細胞数、密度、および／または増大が達成されてから12時間後、18時間後、24時間後、1日後、2日後、もしくは3日後、または約12時間後、約18時間後、約24時間後、約1日後、約2日後、もしくは約3日後、または12時間後以内、18時間後以内、24時間後以内、1日後以内、2日後以内、もしくは3日後以内に製剤化される。いくつかの態様において、細胞は、カルチべーション中に閾細胞数、密度、および／または増大が達成されてから1日以内または約1日以内に製剤化される。
【０１４６】
いくつかの態様において、細胞は、いくつかの局面においては薬学的に許容される担体または賦形剤を含み得る薬学的に許容される緩衝剤中に製剤化される。いくつかの態様において、処理は、薬学的に許容されるまたは対象への投与のために望まれる媒体または製剤化緩衝剤への媒体の交換を含む。いくつかの態様において、処理工程は、形質導入および／または増大された細胞を洗浄して、細胞を、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体または賦形剤を含むことができる薬学的に許容される緩衝剤に入れ直す工程を含むことができる。薬学的に許容される担体または賦形剤を含むそのような医薬形態の例は、細胞および組成物を対象に投与するために許容される形態と関連して以下に記載されるもののいずれかであることができる。医薬組成物は、いくつかの態様において、疾患または病気を治療または予防するのに有効な量、たとえば治療的に有効または予防的に有効な量の細胞を含む。
【０１４７】
「薬学的に許容される担体」とは、医薬製剤中の、対象に対して非毒性である、有効成分以外の成分をいう。薬学的に許容される担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤を含むが、それらに限定されない。
【０１４８】
いくつかの局面において、担体の選択は、一部には、具体的な細胞および／または投与方法によって決まる。したがって、多様な適切な製剤がある。たとえば、医薬組成物は保存剤を含むことができる。適切な保存剤は、たとえば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムを含み得る。いくつかの局面において、2つまたはそれ以上の保存剤の混合物が使用される。保存剤またはその混合物は通常、組成物全体の約0.0001重量％〜約2重量％の量で存在する。担体は、たとえばRemington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)によって記載されている。薬学的に許容される担体は一般に、用いられる用量および濃度ではレシピエントに対して非毒性であり、緩衝剤、たとえばホスフェート、シトレートおよび他の有機酸；抗酸化物質、たとえばアスコルビン酸およびメチオニン；保存剤（たとえばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；アルキルパラベン、たとえばメチルまたはプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノールおよびm-クレゾール）；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；タンパク質、たとえば血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリン；親水性ポリマー、たとえばポリビニルピロリドン；アミノ酸、たとえばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンまたはリジン；単糖類、二糖類および他の炭水化物、たとえばグルコース、マンノースまたはデキストリン；キレート剤、たとえばEDTA；糖、たとえばスクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトール；塩形成性対イオン、たとえばナトリウム；金属錯体（たとえばZn-タンパク質複合体）；および／または非イオン性界面活性剤、たとえばポリエチレングリコール（PEG）を含むが、それらに限定されない。
【０１４９】
いくつかの局面においては、緩衝剤が組成物に含まれる。適切な緩衝剤は、たとえば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウムおよび様々な他の酸および塩を含む。いくつかの局面においては、2つまたはそれ以上の緩衝剤の混合物が使用される。緩衝剤またはそれらの混合物は通常、組成物全体の約0.001重量％〜約4重量％の量で存在する。投与可能な医薬組成物を調製するための方法は公知である。例示的な方法が、たとえばRemington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed. (May 1, 2005)でさらに詳細に記載されている。
【０１５０】
前記製剤は水溶液を含むことができる。製剤または組成物はまた、細胞によって治療される特定の適応症、疾患、または病気に有用な複数の成分、好ましくは、細胞に対して相補的な活性を有する成分を含み得、それぞれの活性は互いに悪影響を及ぼさない。そのような有効成分は、好適には、所期の目的に有効である量で組み合わさって存在する。したがって、いくつかの態様において、医薬組成物はさらに、他の薬学的に有効な作用物質または薬物、たとえば化学療法剤、たとえばアスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、メトトレキサート、パクリタキセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および／またはビンクリスチンを含む。
【０１５１】
いくつかの態様において、組成物は、いくつかの局面においては選択されたpHまで緩衝され得る無菌液状製剤、たとえば等張水溶液、懸濁液、エマルション、分散液、または粘性組成物として提供される。液状組成物は、たとえば水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、ポリオール（たとえばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）、およびそれらの適切な混合物を含む溶媒または分散媒であることができる担体を含むことができる。無菌注射溶液は、細胞を、たとえば適切な担体、希釈剤または賦形剤、たとえば無菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどと混合した溶媒に組み込むことによって調製することができる。組成物は、投与経路および所望の製剤に依存して、補助物質、たとえば湿潤剤、分散剤または乳化剤（たとえばメチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化または増粘添加剤、保存剤、香味剤、および／または着色剤を含むことができる。いくつかの局面においては、適切な製剤を調製するために、標準的な教本が参照されてもよい。
【０１５２】
組成物の安定性および無菌性を高める様々な添加物、たとえば抗菌保存剤、抗酸化物質、キレート剤および緩衝剤を加えることができる。微生物の活動の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、たとえばパラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸によって保証することができる。吸収を遅らせる作用物質、たとえばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用により、注射可能な剤形の吸収の延長をもたらすことができる。
【０１５３】
いくつかの態様において、製剤化緩衝剤は凍結保存剤を含む。いくつかの態様において、細胞は、1.0％〜30％ DMSO溶液、たとえば5％〜20％DMSO溶液または5％〜10％ DMSO溶液を含む凍結保存溶液とともに製剤化される。いくつかの態様において、凍結保存溶液は、たとえば、20％ DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン（HSA）もしくは他の適切な細胞凍結媒体を含むPBSであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、凍結保存溶液は、少なくとも7.5％または約7.5％ DMSOであるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、処理工程は、形質導入および／または増大された細胞を洗浄して、細胞を凍結保存溶液に入れ直す工程を含むことができる。いくつかの態様において、細胞は、12.5％、12.0％、11.5％、11.0％、10.5％、10.0％、9.5％、9.0％、8.5％、8.0％、7.5％、7.0％、6.5％、6.0％、5.5％、もしくは5.0％または約12.5％、約12.0％、約11.5％、約11.0％、約10.5％、約10.0％、約9.5％、約9.0％、約8.5％、約8.0％、約7.5％、約7.0％、約6.5％、約6.0％、約5.5％、もしくは約5.0％ DMSO、または1％〜15％、6％〜12％、5％〜10％、もしくは6％〜8％ DMSOの最終濃度の媒体および／または溶液中で凍結、たとえば凍結保存または凍結保護される。特定の態様において、細胞は、5.0％、4.5％、4.0％、3.5％、3.0％、2.5％、2.0％、1.5％、1.25％、1.0％、0.75％、0.5％、もしくは0.25％、または約5.0％、約4.5％、約4.0％、約3.5％、約3.0％、約2.5％、約2.0％、約1.5％、約1.25％、約1.0％、約0.75％、約0.5％、もしくは約0.25％ HSAまたは0.1％〜5％、0.25％〜4％、0.5％〜2％、または1％〜2％ HSAの最終濃度の媒体および／または溶液中で凍結、たとえば凍結保存または凍結保護される。
【０１５４】
特定の態様において、濃縮されたT細胞、たとえば刺激、操作および／またはカルチベートされたT細胞の組成物は、製剤化され、凍結保存された後、たとえば提供される生物医学的材料容器中である期間、貯蔵される。特定の態様において、製剤化され、凍結保存された細胞は、注入のために放出されるまで、貯蔵される。特定の態様において、製剤化され、凍結保存された細胞は、1日〜6ヶ月間、1ヶ月間〜3ヶ月間、1日〜14日間、1日〜7日間、3日間〜6日間、6ヶ月間〜12ヶ月間、または12ヶ月間超、貯蔵される。いくつかの態様において、細胞は、凍結保存され、1日、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、もしくは7日間、または約1日、約2日間、約3日間、約4日間、約5日間、約6日間、もしくは約7日間、または1日未満、2日間未満、3日間未満、4日間未満、5日間未満、6日間未満、もしくは7日間未満、貯蔵される。特定の態様において、細胞は、貯蔵の後解凍され、対象に投与される。特定の態様において、細胞は5日間または約5日間、貯蔵される。
【０１５５】
いくつかの態様において、製剤化は、細胞、たとえば培養または増大された細胞の洗浄、希釈または濃縮を含む1つまたは複数の処理工程を使用して実施される。いくつかの態様において、処理は、所望の濃度または数、たとえば所与の用量またはその分画で投与するための数の細胞を含む単位用量形態組成物への細胞の希釈または濃縮を含むことができる。いくつかの態様において、処理工程は、所望により、細胞の濃度を高めるための量削減を含むことができる。いくつかの態様において、処理工程は、所望により、細胞の濃度を下げるための量追加を含むことができる。いくつかの態様において、処理は、形質導入および／または増大された細胞への製剤化緩衝剤の量の追加を含む。いくつかの態様において、製剤化緩衝剤の量は、10mL〜1000mLまたは約10mL〜約1000mL、たとえば、少なくとも50mL、少なくとも100mL、少なくとも200mL、少なくとも300mL、少なくとも400mL、少なくとも500mL、少なくとも600mL、少なくとも700mL、少なくとも800mL、少なくとも900mL、もしくは少なくとも1000mL、または少なくとも約50mL、少なくとも約100mL、少なくとも約200mL、少なくとも約300mL、少なくとも約400mL、少なくとも約500mL、少なくとも約600mL、少なくとも約700mL、少なくとも約800mL、少なくとも約900mL、もしくは少なくとも約1000mL、または約50mL、約100mL、約200mL、約300mL、約400mL、約500mL、約600mL、約700mL、約800mL、約900mL、もしくは約1000mLである。
【０１５６】
いくつかの態様において、細胞は、容器、たとえばバッグまたは遠心チャンバ中で培養、たとえば刺激、操作および／またはカルチベートされる。いくつかの局面において、容器は第一の容器であり、培養された細胞は、第一の容器、たとえばバッグまたは遠心チャンバから、第一の容器に機能的に連結されている第二の容器、たとえば生物医学的材料容器へと急送または移送される。いくつかの態様において、生物医学的材料容器は、直前の処理工程の1つまたは複数に使用される第一の容器、たとえばバッグまたは遠心チャンバへの組み込みおよび／またはそれとの機能的接続のために構成されている、および／またはそれに組み込まれているか、またはそれと機能的に接続している。いくつかの態様において、生物医学的材料容器は、出力ラインまたは出力位置で第一の容器、たとえばバッグまたは遠心チャンバに接続されている。場合によっては、第一の容器、たとえばバッグまたは遠心チャンバは、入口チューブで生物医学的材料容器のバイアルに接続されている。
【０１５７】
いくつかの態様において、細胞組成物を製剤化するためのそのような処理工程は閉鎖系中で実施される。そのような処理工程の例は、細胞処理システムと対応する1つまたは複数のシステムまたはキットと関連する遠心チャンバ、たとえばBiosafe SAによって製造販売される遠心チャンバ、たとえばSepax（登録商標）またはSepax 2（登録商標）細胞処理システムとともに使用するための遠心チャンバを使用して実施することができる。例示的なシステムおよびプロセスが国際公報番号WO2016/073602に記載されている。いくつかの態様において、方法は、上記態様のいずれかにおいて製剤化緩衝剤、たとえば薬学的に許容される緩衝剤中で製剤化された細胞の得られた組成物である製剤化組成物の、遠心チャンバの内部キャビティからの急送または移送を実施する工程を含む。いくつかの態様において、製剤化組成物の急送または移送は、遠心チャンバを有する閉鎖系の一部として機能的に連結されている容器、たとえば本明細書に記載される生物医学的材料容器のバイアルへの急送または移送である。いくつかの態様において、生物医学的材料容器は、1つまたは複数の処理工程を実施する閉鎖系または装置への組み込みおよび／またはそれとの機能的接続のために構成されている、および／またはそれに組み込まれているか、またはそれと機能的に接続している。いくつかの態様において、生物医学的材料容器は、出力ラインまたは出力位置でシステムに接続されている。場合によっては、閉鎖系は、入口チューブで生物医学的材料容器のバイアルに接続されている。本明細書に記載される生物医学的材料容器とともに使用するための例示的な閉鎖系は、Sepax（登録商標）およびSepax（登録商標）2システムを含む。
【０１５８】
いくつかの態様において、組成物は、第一の容器、たとえば遠心チャンバまたは細胞処理システムから、製剤化組成物の急送のために容器、たとえば生物医学的材料容器の1つまたは複数を接続することができるポートとチューブラインの各端で対応するマルチウェイチューブマニホルドを含むマルチポーチ出力キットを介して、提供される生物医学的材料容器へと移送されることができる。いくつかの局面において、所望の数または複数のそのようなバイアルを、マルチポート出力のポートの1つまたは複数に、一般的には2つまたはそれ以上に、たとえば3つ、4つ、5つ、6つ、7つ、8つ、またはそれ以上に無菌接続することができる。たとえば、いくつかの態様においては、1つまたは複数の容器、たとえば生物医学的材料容器をポートまたはポートのすべてよりも少ないポートに取り付けることができる。したがって、いくつかの態様において、システムは、生物医学的材料容器の複数のバイアル中への出力組成物の急送を実施することができる。
【０１５９】
いくつかの局面において、細胞は、投与、たとえば単回投与または複数回投与のための量で、複数の出力容器、たとえば生物医学的材料容器のバイアルの1つまたは複数に急送または移送されることができる。たとえば、いくつかの態様において、生物医学的材料容器のバイアルは、それぞれが、所与の用量またはその分画における投与のための数の細胞を収容し得る。したがって、いくつかの局面において、各バイアルは、投与のための1つの単位用量を収容してもよいし、複数のバイアルのうちの1つ超、たとえば複数のバイアルのうちの2つまたは複数のバイアルのうちの3つがいっしょになって投与のための用量を構成するような所望の用量の分画を収容してもよい。
【０１６０】
したがって、本明細書に記載される生物医学的材料容器中のバイアルは一般に、投与される細胞、たとえばその1つまたは複数の単位用量を収容する。単位用量は、対象に投与される細胞の量または数であってもよいし、投与される細胞の数の2倍（またはそれ以上）であってもよい。それは、対象に投与される細胞の最低用量または可能な限り最低の用量であってもよい。
【０１６１】
いくつかの態様において、各バイアルは個々に細胞の単位用量を含む。したがって、いくつかの態様において、各容器は同じまたは概ねもしくは実質的に同じ数の細胞を含む。いくつかの態様において、各単位用量は、少なくとも1×106個、少なくとも2×106個、少なくとも5×106個、少なくとも1×107個、少なくとも5×107個、少なくとも1×108個、少なくとも2.5×108個、もしくは少なくとも5×108個、または少なくとも約1×106個、少なくとも約2×106個、少なくとも約5×106個、少なくとも約1×107個、少なくとも約5×107個、少なくとも約1×108個、少なくとも約2.5×108個、もしくは少なくとも約5×108個の操作された細胞、全細胞、T細胞、またはPBMCを含む。いくつかの態様において、各単位用量は、少なくとも2.5×107個もしくは少なくとも約2.5×107個、少なくとも5.0×107個もしくは少なくとも約5.0×107個、少なくとも1.5×108個もしくは少なくとも約1.5×108個、少なくとも3.0×108個もしくは少なくとも約3.0×108個、少なくとも4.5×108個もしくは少なくとも約4.5×108個、少なくとも8.0×108個もしくは少なくとも約8.0×108個、または少なくとも1.2×109個もしくは少なくとも約1.2×109個の操作された細胞、全細胞、T細胞、またはPBMCを含む。いくつかの態様において、各単位用量は、2.5×107個以下もしくは約2.5×107個以下、5.0×107個以下もしくは約5.0×107個以下、1.5×108個以下もしくは約1.5×108個以下、3.0×108個以下もしくは約3.0×108個以下、4.5×108個以下もしくは約4.5×108個以下、8.0×108個以下もしくは約8.0×108個以下、または1.2×109個以下もしくは約1.2×109個以下の操作された細胞、全細胞、T細胞、またはPBMCを含む。いくつかの局面において、バイアルに収容することができる細胞の例示的な用量は、本明細書、たとえばセクションIVに記載される任意の用量を含む。いくつかの局面において、対象に投与することができる細胞の例示的な用量は、本明細書、たとえばセクションIVに記載される任意の用量を含む。
【０１６２】
いくつかの態様において、各容器中の製剤化細胞組成物の量は、10mL〜100mL、たとえば、少なくとも20mL、少なくとも30mL、少なくとも40mL、少なくとも50mL、少なくとも60mL、少なくとも70mL、少なくとも80mL、少なくとも90mL、もしくは少なくとも100mL、または少なくとも約20mL、少なくとも約30mL、少なくとも約40mL、少なくとも約50mL、少なくとも約60mL、少なくとも約70mL、少なくとも約80mL、少なくとも約90mL、もしくは少なくとも約100mL、または約20mL、約30mL、約40mL、約50mL、約60mL、約70mL、約80mL、約90mL、もしくは約100mLである。いくつかの態様において、バイアル中の細胞は凍結保存することができる。いくつかの態様において、バイアルは、さらなる使用まで、液体窒素中に貯蔵することができる。
【０１６３】
いくつかの態様において、方法によって製造されるそのような細胞またはそのような細胞を含む組成物は、疾患または病気を治療するために対象に投与される。
【０１６４】
III. 組換えタンパク質
いくつかの態様において、本明細書に提供される生物医学的材料容器は、たとえば、細胞療法を製造、生成、または生産することを含むプロセスと関連して、組換えタンパク質、たとえば組換え受容体を発現するように操作されている生物医学的材料、たとえば細胞を含む組成物を保存、貯蔵および／または移送するために使用することができる。いくつかの態様において、提供される生物医学的材料容器に貯蔵することができる組成物または細胞は、組換え受容体、たとえばキメラ抗原受容体（CAR）で操作された細胞、たとえばT細胞、たとえばCAR-T細胞を含む。いくつかの態様において、組成物または細胞は、たとえば、治療法、たとえば養子細胞療法のための投与、たとえば単回投与または複数回投与のための量でバイアル中に製剤化することができる。
【０１６５】
いくつかの態様において、提供される生物医学的材料容器に保持、保存、移送または貯蔵することができる組成物または細胞は、本明細書、たとえばセクションIIに記載されるように操作および／またはカルチベートされた細胞を含む。いくつかの態様において、培養、たとえば細胞の増大またはカルチべーションのための方法は、遺伝子操作された、たとえば組換えタンパク質を形質導入された細胞に対して実施される。いくつかの態様において、組換えタンパク質は、組換え受容体、たとえば抗原受容体であるか、またはそれを含む。抗原受容体は、機能的な非TCR抗原受容体、たとえばキメラ抗原受容体（CAR）および他の抗原結合受容体、たとえばトランスジェニックT細胞受容体（TCR）を含み得る。受容体はまた、他の受容体、たとえば他のキメラ受容体、たとえば、特定のリガンドに結合し、CARに存在するものに類似する膜貫通および／または細胞内シグナル伝達ドメインを有する受容体を含み得る。
【０１６６】
CARを含む例示的な抗原受容体およびそのような受容体を操作しかつ細胞に導入するための方法は、たとえば国際特許出願公報番号WO200014257、WO2013126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、米国特許出願公開第US2002131960号、同第US2013287748号、同第US20130149337号、米国特許第6,451,995号、同第7,446,190号、同第8,252,592号、同第8,339,645号、同第8,398,282号、同第7,446,179号、同第6,410,319号、同第7,070,995号、同第7,265,209号、同第7,354,762号、同第7,446,191号、同第8,324,353号、および同第8,479,118号ならびに欧州特許出願番号EP2537416に記載されているもの、および／または、Sadelain et al., Cancer Discov. 2013 April; 3(4): 388-398；Davila et al. (2013) PLoS ONE 8(4): e61338；Turtle et al., Curr. Opin. Immunol., 2012 October; 24(5): 633-39；Wu et al., Cancer, 2012 March 18(2): 160-75に記載されているものを含む。いくつかの局面において、抗原受容体は、米国特許第7,446,190号に記載されているCARおよび国際特許出願公報番号WO/2014055668A1に記載されているものを含む。CARの例は、前述の刊行物、たとえばWO2014031687、US8,339,645、US7,446,179、US2013/0149337、米国特許第7,446,190号、米国特許第8,389,282号、Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013)；Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701、およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)のいずれかに記載されているCARを含む。また、WO2014031687、US8,339,645、US7,446,179、US2013/0149337、米国特許第7,446,190号、および米国特許第8,389,282号を参照すること。
【０１６７】
いくつかの態様において、組換えタンパク質をコードする核酸はさらに、たとえば、受容体を発現するための細胞の形質導入もしくは操作および／またはポリヌクレオチドによってコードされた分子を発現する細胞の選択および／または標的化を確認するために、1つまたは複数のマーカをコードする。いくつかの局面において、そのようなマーカは、異なる核酸またはポリヌクレオチドによってコードされてもよく、それもまた、遺伝子操作プロセス中に、通常は同じ方法、たとえば本明細書に提供される方法のいずれかによる、たとえば同じベクターまたはベクターのタイプによる形質導入によって導入され得る。
【０１６８】
いくつかの局面において、マーカ、たとえば形質導入マーカはタンパク質および／または細胞表面分子である。例示的なマーカは、天然の、たとえば内在性のマーカ、たとえば天然の細胞表面分子の短縮型変異体である。いくつかの局面において、変異体は、天然または内在性の細胞表面分子と比べ、低下した免疫原性、低下したトラフィッキング機能および／または低下したシグナル伝達機能を有する。いくつかの態様において、マーカは、細胞表面受容体の短縮バージョン、たとえば短縮型EGFR（tEGFR）である。いくつかの局面において、マーカは、CD34、NGFRまたは上皮成長因子受容体（たとえばtEGFR）の全部または一部（たとえば短縮形態）を含む。いくつかの態様において、マーカをコードする核酸は、リンカー配列、たとえば切断可能なリンカー配列をコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される。たとえばWO2014/031687を参照すること。いくつかの態様において、1つのプロモータが、自己切断ペプチド（たとえば2A配列）またはプロテアーゼ認識部位（たとえばフーリン）をコードする配列によって互いから切り離された2つまたは3つの遺伝子（たとえば、代謝経路の変調に関与する分子をコードし、組換え受容体をコードする）を1つのオープンリーディングフレーム（ORF）中に含むRNAの発現を指示し得る。したがって、ORFは1つのポリペプチドをコードし、それが、翻訳中（2Aの場合）または翻訳後、個々のタンパク質へと処理される。場合によっては、ペプチド、たとえばT2Aは、リボソームをして、2AエレメントのC末端におけるペプチド結合の合成をスキップさせて（リボソームスキッピング）、2A配列の端部と下流側の次のペプチドとの間の分離を招くことができる（たとえば、de Felipe. Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004)およびdeFelipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)を参照）。多くの2Aエレメントが公知である。本明細書に開示される方法および核酸に使用することができる2A配列の例は、非限定的に、米国特許公開第20070116690号に記載されている、口蹄疫ウイルス由来の2A配列（F2A）、馬鼻炎Aウイルス由来の2A配列（E2A）、Thosea asignaウイルス由来の2A配列（T2A）、および豚テシオウイルス-1由来の2A配列（P2A）を含む。
【０１６９】
いくつかの態様において、マーカは、T細胞上にも自然に見られずT細胞の表面にも自然に見られない分子、たとえば、細胞表面タンパク質またはその一部分である。
【０１７０】
いくつかの態様において、分子は、非自己分子、たとえば非自己タンパク質、すなわち、細胞が養子移入される宿主の免疫系によって「自己」と認識されないタンパク質である。
【０１７１】
いくつかの態様において、マーカは、治療機能を果たさず、かつ／または、遺伝子操作のための、たとえば、うまく操作された細胞を選択するためのマーカとして使用される以外の効果を生じさせない。他の態様において、マーカは、治療分子であってもよいし、何らかの所望の効果を他のやり方で発揮する分子、たとえば、インビボで遭遇される細胞のためのリガンド、たとえば、養子移入時に細胞の応答を増強および／または減衰させ、リガンドと遭遇するための共刺激分子または免疫チェックポイント分子であってもよい。
【０１７２】
A. キメラ抗原受容体
いくつかの態様において、CARは一般に、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分に連結した細胞外リガンド結合ドメイン、たとえば抗体またはその断片を含む細胞外部分を有する遺伝子操作された受容体である。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する膜貫通ドメインおよび／または細胞内ドメインを含む。そのような分子は通常、共刺激受容体と組み合わさって、天然の抗原受容体を通過するシグナルおよび／またはそのような受容体を通過するシグナルを模倣または近似する。
【０１７３】
いくつかの態様において、CARは、特定のマーカ、たとえば養子療法によって標的化される特定の細胞タイプ中で発現するマーカ、たとえば癌マーカおよび／または前記抗原のいずれかに対する特異性をもって構築される。したがって、CARは通常、抗体の1つまたは複数の抗原結合断片、ドメインもしくは部分または1つまたは複数の抗体可変ドメインおよび／または抗体分子を含む。いくつかの態様において、CARは、抗体分子の抗原結合部分、たとえば可変重鎖（VH）もしくはその抗原結合部分またはモノクローナル抗体（mAb）の可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）に由来する一本鎖抗体断片（scFv）を含む。
【０１７４】
いくつかの態様において、CARは、細胞の表面に発現する抗原、たとえばインタクトな抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合断片（たとえばscFv）を含む。
【０１７５】
いくつかの態様において、抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CA9、CAIXまたはG250とも知られる）、癌精巣抗原、癌精巣抗原1B（CTAG、NY-ESO-1およびLAGE-2とも知られる）、癌胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、CCモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、タイプIII上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5とも知られる）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体アルファ、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp10O）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役型受容体5D（GPRC5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbBダイマー、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体アルファ（IL-22Rα）、IL-13受容体アルファ2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、カッパ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、LRRC8A（Leucine Rich Repeat Containing 8 Family Member A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソセリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、癌胎児性抗原、メラノーマ優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、ROR1（Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG、5T4とも知られる）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1、TYRP1またはgp75とも知られる）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2、ドーパクロムトートメラーゼ、ドーパクロムデルタイソメラーゼ、またはDCTとも知られる）、血管内皮細胞増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮細胞増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異もしくは病原体発現抗原またはユニバーサルタグと関連する抗原および／またはビオチン化分子および／またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現された分子であるか、またはそれらを含む。いくつかの態様において受容体によって標的化される抗原は、B細胞悪性腫瘍と関連する抗原、たとえば多数の公知のB細胞マーカのいずれかを含む。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igカッパ、Igラムダ、CD79a、CD79b、もしくはCD30であるかまたはそれを含む。
【０１７６】
いくつかの態様において、抗原は、病原体特異抗原または病原体発現抗原であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、抗原はウイルス抗原（たとえば、HIV、HCV、HBVなど由来のウイルス抗原）、細菌抗原、および／または寄生虫抗原である。
【０１７７】
いくつかの態様において、CARは、TCR様抗体、たとえば、MHC−ペプチド複合体として細胞表面に提示される細胞内抗原、たとえば腫瘍関連抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合断片（たとえばscFv）を含む。いくつかの態様において、MHC−ペプチド複合体を認識する抗体またはその抗原結合部分は、組換え受容体、たとえば抗原受容体の一部として細胞上に発現することができる。抗原受容体としては、機能的な非TCR抗原受容体、たとえばキメラ抗原受容体（CAR）がある。一般に、ペプチド−MHC複合体に対するTCR様特異性を示す抗体または抗原結合断片を含むCARはまた、TCR様CARとも呼ばれ得る。
【０１７８】
いくつかの態様において、CARの細胞外部分、たとえばその抗体部分はさらに、スペーサ、たとえば、抗原認識成分、たとえばscFvと膜貫通ドメインとの間のスペーサ領域を含む。スペーサは、免疫グロブリン定常領域またはその変異体もしくは改変バージョンの少なくとも一部分、たとえばヒンジ領域、たとえばIgG4ヒンジ領域および／またはCH1/CLおよび／またはFc領域であり得るか、またはそれらを含み得る。いくつかの態様において、定常領域または一部分は、ヒトIgG、たとえばIgG4またはIgG1の定常領域または一部分である。スペーサは、スペーサが存在しない場合と比べて、抗原結合後の細胞の応答性増大を提供する長さであり得る。いくつかの例において、スペーサは、12個もしくは約12個のアミノ酸の長さであるか、または12個以下のアミノ酸の長さである。例示的なスペーサは、少なくとも約10〜229個のアミノ酸、約10〜200個のアミノ酸、約10〜175個のアミノ酸、約10〜150個のアミノ酸、約10〜125個のアミノ酸、約10〜100個のアミノ酸、約10〜75個アミノの酸、約10〜50個のアミノ酸、約10〜40個のアミノ酸、約10〜30個のアミノ酸、約10〜20個のアミノ酸、または約10〜15個のアミノ酸および前記範囲のいずれかの終点間の任意の整数のアミノ酸を含むスペーサを含む。いくつかの態様において、スペーサ領域は、約12個もしくはそれ未満のアミノ酸、約119個もしくはそれ未満のアミノ酸、または約229個もしくはそれ未満のアミノ酸を有する。例示的なスペーサは、IgG4ヒンジ単独、CH2およびCH3ドメインに連結したIgG4ヒンジまたはCH3ドメインに連結したIgG4ヒンジを含む。例示的なスペーサは、Hudecek et al. (2013) Clin. Cancer Res., 19:3153または国際特許出願公報番号WO2014/031687に記載されているものを含むが、それに限定されない。
【０１７９】
細胞外リガンド結合、たとえば抗原認識ドメインは一般に、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達成分、たとえば、CARの場合には抗原受容体複合体、たとえばTCR複合体を介する活性化および／または別の細胞表面受容体を介するシグナルを模倣するシグナル伝達成分に連結している。いくつかの態様においては、膜貫通ドメインが、細胞外リガンド結合ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する。いくつかの態様において、CARは、細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含む。1つの態様において、受容体、たとえばCAR中のドメインの1つと自然に関連している膜貫通ドメインが使用される。いくつかの例において、膜貫通ドメインは、アミノ酸置換によって選択または修飾されて、そのようなドメインの、同じまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインへの結合を回避して、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小限にする。
【０１８０】
いくつかの態様において、膜貫通ドメインは天然源または合成源に由来する。天然源である場合、ドメインは、いくつかの局面において、任意の膜結合または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域は、T細胞受容体、CD28、CD3イプシロン、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、またはCD154のアルファ、ベータ、またはゼータ鎖に由来する（すなわち、少なくともそれらの膜貫通領域を含む）ものを含む。膜貫通ドメインは、いくつかの態様において、合成である。いくつかの局面において、合成膜貫通ドメインは、主に疎水性残基、たとえばロイシンおよびバリンを含む。いくつかの局面においては、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが合成膜貫通ドメインの各端に見いだされる。いくつかの態様において、連結は、リンカー、スペーサ、および／または膜貫通ドメインによる連結である。
【０１８１】
いくつかの態様において、短いオリゴまたはポリペプチドリンカー、たとえば、2〜10個のアミノ酸の長さのリンカー、たとえば、グリシンおよびセリンを含むもの、たとえばグリシン−セリンダブレットが、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナル伝達ドメインとの間に存在し、それらの間に連結を形成する。
【０１８２】
組換え受容体、たとえばCARは一般に、少なくとも1つの細胞内シグナル伝達成分を含む。いくつかの態様において、受容体は、TCR複合体の細胞内成分、たとえば、T細胞活性化および細胞傷害性を媒介するTCR CD3鎖、たとえばCD3ゼータ鎖を含む。したがって、いくつかの局面において、抗原結合部分は1つまたは複数の細胞シグナル伝達モジュールに連結している。いくつかの態様において、細胞シグナル伝達モジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または他のCD膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、受容体、たとえばCARはさらに、1つまたは複数のさらなる分子、たとえばFc受容体γ、CD8、CD4、CD25、またはCD16の一部分を含む。たとえば、いくつかの局面において、CARまたは他のキメラ受容体は、CD3ゼータ（CD3ζ）またはFc受容体γと、CD8、CD4、CD25、またはCD16との間にキメラ分子を含む。
【０１８３】
いくつかの態様において、CARまたは他のキメラ受容体がライゲーションすると、受容体の細胞質ドメインまたは細胞内シグナル伝達ドメインが、免疫細胞、たとえば、CARを発現するように操作されたT細胞の正常なエフェクタ機能または応答の少なくとも1つを活性化する。たとえば、いくつかの状況において、CARは、T細胞の機能、たとえば細胞溶解活性またはTヘルパー活性、たとえばサイトカインまたは他の因子の分泌を誘導する。いくつかの態様においては、抗原受容体成分または共刺激分子の細胞内シグナル伝達ドメインの短縮部分が、たとえばそれがエフェクタ機能シグナルを伝達する場合には、インタクトな免疫刺激鎖の代わりに使用される。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、T細胞受容体（TCR）の細胞質配列を含み、また、いくつかの局面においては、天然の状況においてそのような受容体と協働して、抗原受容体係合後にシグナル伝達を開始させる共受容体および／またはそのような分子の任意の誘導体もしく変異体の細胞質配列および／または同じ機能を有する任意の合成配列を含む。
【０１８４】
天然TCRの状況において、完全な活性化は一般に、TCRを介するシグナル伝達だけでなく、共刺激シグナルをも必要とする。したがって、いくつかの態様においては、完全な活性化を促進するために、二次または共刺激シグナルを生成するための成分が同じくCARに含まれる。他の態様において、CARは、共刺激シグナルを生成するための成分を含まない。いくつかの局面においては、さらなるCARが同じ細胞中に発現し、二次または共刺激シグナルを生成するための成分を提供する。
【０１８５】
T細胞活性化は、いくつかの局面において、少なくとも2つのクラスの細胞質シグナル伝達配列：TCRを介する抗原依存的一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナル伝達配列）および抗原非依存的に作用して二次または共刺激シグナルを提供するもの（二次細胞質シグナル伝達配列）によって媒介されると説明される。いくつかの局面において、CARは、このようなシグナル伝達成分の一方または両方を含む。
【０１８６】
いくつかの局面において、CARは、TCR複合体の一次活性化を調節する一次細胞質シグナル伝達配列を含む。刺激的なやり方で作用する一次細胞質シグナル伝達配列は、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ、すなわちITAMとして知られるシグナル伝達モチーフを含み得る。ITAMを含む一次細胞質シグナル伝達配列の例は、TCRゼータ、FcRガンマ、FcRベータ、CD3ガンマ、CD3デルタ、CD3イプシロン、CD8、CD22、CD79a、CD79b、およびCD66dに由来するものを含む。いくつかの態様において、CAR中の細胞質シグナル伝達分子は、CD3ゼータに由来する細胞質シグナル伝達ドメイン、その一部分または配列を含む。
【０１８７】
いくつかの態様において、CARは、共刺激受容体、たとえばCD28、4-1BB、OX40、CD27、DAP10、およびICOSのシグナル伝達ドメインおよび／または膜貫通部分を含む。いくつかの局面において、同じCARが活性化成分と共刺激成分の両方を含む。
【０１８８】
いくつかの態様においては、活性化ドメインが1つのCAR内に含まれ、共刺激成分は、別の抗原を認識する別のCARによって提供される。いくつかの態様において、CARは、いずれも同じ細胞上に発現する、活性化または刺激CARおよび共刺激CARを含む（WO2014/055668を参照）。いくつかの局面において、CARは刺激または活性化CARであり；他の局面において、CARは共刺激CARである。いくつかの態様において、細胞はさらに、阻害性CAR（iCAR、Fedorov et al., Sci. Transl. Medicine, 5(215)(December, 2013)を参照）、たとえば異なる抗原を認識するCARを含み、それにより、第一の抗原を認識するCARを介して送られた活性化シグナルが、阻害性CARとそのリガンドとの結合によって減弱または阻害されて、たとえばオフターゲット効果を減らす。
【０１８９】
いくつかの態様において、CD8+細胞傷害性T細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、CD4+ヘルパーT細胞の細胞内シグナル伝達ドメインと同じである。いくつかの態様において、CD8+細胞傷害性T細胞の細胞内シグナル伝達ドメインは、CD4+ヘルパーT細胞の細胞内シグナル伝達ドメインとは異なる。
【０１９０】
特定の態様において、細胞内シグナル伝達領域は、CD3（たとえばCD3ゼータ）細胞内ドメインに連結したCD28膜貫通およびシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、CD3ゼータ細胞内ドメインに連結したキメラCD28およびCD137（4-1BB、TNFRSF9）共刺激ドメインを含む。
【０１９１】
いくつかの態様において、CARは、1つまたは複数の、たとえば2つまたはそれ以上の共刺激ドメインおよび活性化ドメイン、たとえば一次活性化ドメインを細胞質部分中に含む。例示的なCARは、CD3ゼータ、CD28、および4-1BBの細胞内成分を含む。
【０１９２】
場合によっては、CARは、第一世代、第二世代、および／または第三世代CARと呼ばれる。いくつかの局面において、第一世代CARは、抗原結合時、CD3鎖誘導シグナルだけを提供するCARであり；いくつかの局面において、第二世代CARは、そのようなシグナルと共刺激シグナルとを提供するCAR、たとえば、CD28またはCD137などの共刺激受容体からの細胞内シグナル伝達ドメインを含むCARであり；いくつかの局面において、第三世代CARは、様々な共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むCARである。
【０１９３】
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外リガンド結合部分、たとえば抗原結合部分、たとえば抗体またはその断片と、細胞内ドメインとを含む。いくつかの態様において、抗体または断片はscFvまたはシングルドメインVH抗体を含み、細胞内ドメインはITAMを含む。いくつかの局面において、細胞内シグナル伝達ドメインは、CD3ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖のシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとを連結する膜貫通ドメインを含む。いくつかの局面において、膜貫通ドメインはCD28の膜貫通部分を含む。細胞外ドメインと膜貫通とは直接的または間接的に連結することができる。いくつかの態様において、細胞外ドメインと膜貫通ドメインとはスペーサ、たとえば本明細書に記載される任意のスペーサによって連結される。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、T細胞共刺激分子の細胞内ドメインを、たとえば膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に含む。いくつかの局面において、T細胞共刺激分子はCD28または4-1BBである。
【０１９４】
いくつかの態様において、CARは、抗体、たとえば抗体断片と、CD28の膜貫通部分もしくはその機能的変異体であるかまたはそれを含む膜貫通ドメインと、CD28のシグナル伝達部分もしくはその機能的変異体およびCD3ゼータのシグナル伝達部分もしくはその機能的変異体を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかの態様において、CARは、抗体、たとえば抗体断片と、CD28の膜貫通部分もしくはその機能的変異体であるかまたはそれを含む膜貫通ドメインと、4-1BBのシグナル伝達部分もしくはその機能的変異体およびCD3ゼータのシグナル伝達部分もしくはその機能的変異体を含む細胞内シグナル伝達ドメインとを含む。いくつかのこのような態様において、受容体はさらに、Ig分子、たとえばヒトIg分子の一部分、たとえばIgヒンジ、たとえばIgG4ヒンジを含むスペーサ、たとえばヒンジのみスペーサを含む。
【０１９５】
いくつかの態様において、受容体、たとえばCARの膜貫通ドメインは、ヒトCD28の膜貫通ドメインまたはその変異体、たとえば、ヒトCD28（アクセッション番号P10747.1）の27アミノ酸膜貫通ドメインである。いくつかの態様において、細胞内ドメインは、ヒトCD28の細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体、たとえばその41アミノ酸ドメインおよび／または天然CD28タンパク質の位置186〜187においてLLからGGへの置換を有するそのようなドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内ドメインは、4-1BBの細胞内共刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体、たとえばヒト4-1BB（アクセッション番号Q07011.1）の42アミノ酸細胞質ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ヒトCD3ゼータ刺激シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体、たとえば、ヒトCD3ζ（アクセッション番号P20963.2）のアイソフォーム3の112アミノ酸細胞質ドメインまたは米国特許第7,446,190号に記載されているCD3ゼータシグナル伝達ドメインを含む。いくつかの局面において、スペーサは、IgGのヒンジ領域のみ、たとえばIgG4またはIgG1のヒンジのみを含む。他の態様において、スペーサは、CH2および/またはCH3ドメインに連結したIgヒンジ、たとえばIgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサは、CH2およびCH3ドメインに連結したIgヒンジ、たとえばIgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサは、CH3ドメインのみに連結したIgヒンジ、たとえばIgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサは、グリシン−セリンリッチ配列または他の可撓性リンカー、たとえば公知の可撓性リンカーであるか、またはそれを含む。
【０１９６】
たとえば、いくつかの態様において、CARは、抗原、たとえば本明細書に記載される抗原に特異的に結合する細胞外リガンド結合部分、たとえば抗原結合部分、たとえば抗体またはその断片、たとえばsdAbおよびscFv；スペーサ、たとえばIgヒンジ含有スペーサのいずれか；CD28の一部分である膜貫通ドメインまたはその変異体；CD28のシグナル伝達部分を含む細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体；およびCD3ゼータシグナル伝達ドメインのシグナル伝達部分またはその機能的変異体を含む。いくつかの態様において、CARは、抗原、たとえば本明細書に記載される抗原に特異的に結合する細胞外リガンド結合部分、たとえば抗原結合部分、たとえば抗体またはその断片、たとえばsdAbおよびscFv；スペーサ、たとえばIgヒンジ含有スペーサのいずれか；CD28の一部分である膜貫通ドメインまたはその変異体；4-1BBのシグナル伝達部分を含む細胞内シグナル伝達ドメインまたはその機能的変異体；およびCD3ゼータシグナル伝達ドメインのシグナル伝達部分またはその機能的変異体を含む。いくつかの態様において、そのようなCAR構築物はさらに、たとえばCARの下流に、T2Aリボソームスキップエレメントおよび／または短縮型EGFR（たとえばtEGFR）配列を含む。
【０１９７】
B. T細胞受容体（TCR）
いくつかの態様において、組換えタンパク質は、組換えT細胞受容体（TCR）であるか、またはそれを含む。いくつかの態様において、組換えTCRは、抗原、一般的には標的細胞上に存在する抗原、たとえば腫瘍特異抗原、自己免疫もしくは炎症性疾患と関連する特定の細胞タイプ上に発現する抗原またはウイルス病原体もしくは細菌病原体に由来する抗原に対して特異である。
【０１９８】
いくつかの態様において、TCRは、天然のT細胞からクローニングされたTCRである。いくつかの態様においては、標的抗原（たとえば癌抗原）に対する高アフィニティーT細胞クローンが同定され、患者から単離される。いくつかの態様において、標的抗原に対するTCRクローンは、ヒト免疫系遺伝子（たとえばヒト白血球抗原系、すなわちHLA）で操作されたトランスジェニックマウスにおいて作製されたものである。たとえば、腫瘍抗原を参照すること。たとえば、Parkhurst et al. (2009) Clin Cancer Res. 15:169-180およびCohen et al. (2005) J Immunol. 175:5799-5808を参照。いくつかの態様においては、標的抗原に対するTCRを単離するためにファージディスプレイが使用される（たとえば、Varela-Rohena et al. (2008) Nat Med. 14:1390-1395およびLi (2005) Nat Biotechnol. 23:349-354を参照）。
【０１９９】
いくつかの態様においては、T細胞クローンが得られた後、TCRアルファおよびベータ鎖が単離され、遺伝子発現ベクター中にクローニングされる。いくつかの態様において、TCRアルファおよびベータ遺伝子は、両鎖が共発現するよう、ピコルナウイルス2Aリボソームスキップペプチドを介して連結される。いくつかの態様において、TCRをコードする核酸はさらに、受容体を発現させるための細胞の形質導入または操作を確認するためのマーカを含む。
【０２００】
IV. 製造物およびキット
本明細書に提供されるものは、たとえばバイアル中の貯蔵またはパッケージングのために1つまたは複数の生物医学的材料容器に収容された細胞、たとえば操作された細胞を含む組成物を含む製造物である。いくつかの態様において、細胞の組成物は、薬学的に許容される賦形剤を含む。いくつかの態様において、細胞の組成物は、凍結保護物質、たとえばDMSOを含む。製造物は、操作された細胞に関する情報および／またはそれらの使用もしくは投与のための取り扱い指示を提供する、ラベルを含み得る。製造物は、提供される生物医学的材料容器上にあるかまたはそれに付随するラベルまたはパッケージ挿入物を含み得る。ラベルまたはパッケージ挿入物は、細胞、たとえば操作された細胞および／または生物医学的材料容器の使用に関する取り扱い指示を提供し得る。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が疾患または病気の治療のために使用されるということを示し得る。
【０２０１】
同じく提供されるものは、製造物および／または操作された細胞または細胞療法の用量の、たとえば操作された細胞の1つまたは複数の他の用量の対象への投与と関連して使用するための1つまたは複数のさらなる構成要素、疾患または病気を有する対象を診断するための試薬または1つまたは複数のさらなる医薬組成物、たとえば疾患または病気を治療するための、または操作された細胞と組み合わせて投与するための別の治療物質を含む組成物ならびに、任意で、取り扱い指示、たとえば、操作された細胞組成物を、養子細胞療法と関連させて、疾患または病気を有する対象に投与するための取り扱い指示および／または提供される生物医学的材料容器を使用または操作するための取り扱い指示を含むキットである。1つまたは複数の他の構成要素は、容器、たとえば提供されるさらなる生物医学的材料容器または別のバイアル、注射器、ボトル、IV溶液バッグなどにパッケージングされることができる。さらに、他の物質、たとえば他の緩衝剤、希釈剤、フィルタ、針、および／または注射器を含んでもよい。
【０２０２】
いくつかの態様において、製造物および／またはキットは、疾患または病気を治療するために細胞を対象に投与するための取り扱い指示を含む。いくつかの態様において、取り扱い指示は、細胞療法のための細胞の投与のための具体的な取り扱い指示、たとえば用量、タイミング、投与対象の選択および／または同定ならびに投与の条件を指定する。いくつかの態様において、取り扱い指示は、投与のための組成物に付随するラベルまたはパッケージ挿入物として含まれることができる。
【０２０３】
いくつかの態様において、取り扱い指示は、投与される細胞の用量を指定する。たとえば、いくつかの態様において、取り扱い指示に指定される用量は、約1×106〜3×108個、たとえば約1×107〜2×108個の範囲、たとえば1×107個、5×107個、1×108個、もしくは1.5×108個または前記数値のいずれか2つの間の範囲の数の全組換え受容体（たとえばCAR）発現細胞を含む。いくつかの態様において、患者は複数の用量を投与され、各用量または全用量は前記数値のいずれかの範囲内であることができる。
【０２０４】
いくつかの態様において、製造物は、組換え受容体を発現する複数のCD4+T細胞および／または組換え受容体を発現する複数のCD8+T細胞を含む。いくつかの態様において、製造物は、組換え受容体を発現する複数のCD4+T細胞を含み、さらに、同じ容器中に、組換え受容体を発現する複数のCD8+T細胞を含む。いくつかの態様において、凍結保護物質が細胞とともに含まれる。いくつかの態様において、製造物は、別々の容器に収容された、組換え受容体を発現する複数のCD4+T細胞と、組換え受容体を発現する複数のCD8+T細胞とを含む。
【０２０５】
いくつかの態様において、容器、たとえば生物医学的材料容器のバイアルは、約10×106個または約10×106個超のT細胞または組換え受容体発現T細胞、15×106個または約15×106個超のT細胞または組換え受容体発現T細胞、25×106個または約25×106個超のT細胞または組換え受容体発現T細胞を含む。いくつかの局面において、バイアルは、1mLあたり約1000万個〜1mLあたり約7000万個、1mLあたり約1000万個〜1mLあたり約5000万個、1mLあたり約1000万個〜1mLあたり約2500万個、1mLあたり約1000万個〜1mLあたり約1500万個、1mLあたり1500万個〜1mLあたり約7000万個、1mLあたり約1500万個〜1mLあたり約5000万個、1mLあたり約1500万個〜1mLあたり約2500万個、1mLあたり約2500万個〜1mLあたり約7000万個、1mLあたり約2500万個〜1mLあたり約5000万個、および1mLあたり約5000万個〜1mLあたり約7000万個の細胞を含む。
【０２０６】
いくつかの態様において、キットは、複数の細胞、たとえば操作された細胞または投与に指定された単位用量の細胞を収容するバイアルをそれぞれが含む複数の生物医学的材料容器を含む。
【０２０７】
いくつかの態様において、複数のバイアルまたは単位用量の細胞または製造物もしくはキット中の細胞は、集合的に、1×106もしくは約1×106個〜2×109もしくは約2×109個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、もしくは全末梢血単核細胞（PBMC）、2.5×107もしくは約2.5×107個〜1.2×109もしくは約1.2×109個のそのような細胞、5.0×107もしくは約5.0×107個〜4.5×108もしくは約4.5×108個のそのような細胞、または1.5×108もしくは約1.5×108個〜3.0×108もしくは約3.0×108個のそのような細胞を含む細胞の用量を含む。いくつかの態様において、複数のバイアルまたは単位用量の細胞は、集合的に、2.5×107もしくは約2.5×107個、5.0×107もしくは約5.0×107個、1.5×108もしくは約1.5×108個、3.0×108もしくは約3.0×108個、4.5×108もしくは約4.5×108個、8.0×108もしくは約8.0×108個、または1.2×109もしくは約1.2×109個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、または全PBMCを含む細胞の用量を含む。いくつかの態様において、複数のバイアルまたは単位用量の細胞は、集合的に、1×105もしくは約1×105個〜5×108個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、1×105個〜5×108個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、5×105もしくは約5×105個〜1×107個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞、または1×106もしくは約1×106個〜1×107個の全組換え受容体発現T細胞もしくは全T細胞；または各範囲の全PBMCを含む細胞の用量を含む。
【０２０８】
いくつかの局面において、製造物またはキットは、CD4+およびCD8+細胞またはCD4+受容体＋細胞およびCD8+受容体＋細胞の1つまたは複数の単位用量を含み、単位用量は、1×107もしくは約1×107個〜2×108もしくは約2×108個の組換え受容体発現T細胞、5×107もしくは約5×107個〜1.5×108もしくは約1.5×108個の組換え受容体発現T細胞、5×107もしくは約5×107個の組換え受容体発現T細胞、1×108もしくは約1×108個の組換え受容体発現T細胞、または1.5×108もしくは約1.5×108個の組換え受容体発現T細胞を含み、任意で、製造物またはキット中の情報または取り扱い指示は、1つまたは複数の単位用量および／またはそのような1つまたは複数の単位用量に相当する量の投与を指定する。場合によっては、製造物またはキットは、CD8+細胞の1つまたは複数の単位用量を含み、用量は5×106もしくは約5×106個〜1×108もしくは約1×108個の組換え受容体発現CD8+T細胞を含み、用量は1×107もしくは約1×107個〜0.75×108もしくは約0.75×108個の組換え受容体発現CD8+T細胞を含み、用量は2.5×107もしくは約2.5×107個の組換え受容体発現CD8+T細胞を含むか、または用量は5×107もしくは約5×107個の組換え受容体発現CD8+T細胞を含むか、または用量は0.75×108もしくは約0.75×108個の組換え受容体発現CD8+T細胞を含み、任意で、製造物またはキット中の情報は、1つまたは複数の単位用量および／またはそのような1つまたは複数の単位用量に相当する量の投与を指定する。
【０２０９】
いくつかの態様において、複数のバイアルまたは単位用量の細胞または製造物もしくはキット中の細胞は、集合的に、2.5×107もしくは約2.5×107個以下、5.0×107もしくは約5.0×107個以下、1.5×108もしくは約1.5×108個以下、3.0×108もしくは約3.0×108個以下、4.5×108もしくは約4.5×108個以下、8.0×108もしくは約8.0×108個以下、または1.2×109もしくは約1.2×109個以下の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、またはPBMCを含む細胞の用量を含む。いくつかの態様において、製造物またはキット中の細胞は、集合的に、1×108個以下の全組換え受容体発現T細胞または全T細胞、1×107個以下の全組換え受容体発現T細胞または全T細胞、0.5×107個以下の全組換え受容体発現T細胞または全T細胞、1×106個以下の全組換え受容体発現T細胞または全T細胞、0.5×106個以下の全組換え受容体発現T細胞または全T細胞または各数の全PBMCを含む細胞の用量を含む。
【０２１０】
いくつかの態様において、用量のT細胞は、CD4+T細胞、CD8+T細胞、またはCD4+およびCD8+T細胞を含む。
【０２１１】
いくつかの態様において、取り扱い指示は、投与計画および投与のタイミングを指定することができる。たとえば、いくつかの態様において、取り扱い指示は、細胞の複数の用量指定すること、たとえば、2つまたはそれ以上の用量を対象に投与することを指定することができる。いくつかの態様において、取り扱い指示は、第二の用量が第一の用量の投与から約4、約5、約6、約7、約8、約9、約10、約11、約12、約13、約14、約15、約16、約17、約18、約19、約20、もしくは約21日後に投与されるなどの複数の投与のタイミング、および／または各投与における投与量を指定することができる。
【０２１２】
いくつかの態様において、製造物またはキットは、組換え受容体を発現する複数のCD4+T細胞と、疾患または病気を有する対象に対し、複数のCD4+T細胞の全部または一部分を投与し、さらに、組換え受容体を発現するCD8+T細胞を投与するための取り扱い指示とを含む。いくつかの態様において、取り扱い指示は、CD8+細胞を投与する前にCD4+T細胞を投与することを指定する。場合によっては、取り扱い指示は、CD4+細胞を投与する前にCD8+T細胞を投与することを指定する。いくつかの態様において、製造物またはキットは、組換え受容体を発現する複数のCD8+T細胞と、疾患または病気を有する対象に対し、組換え受容体を発現する複数のCD8+T細胞およびCD4+T細胞の全部または一部分を投与するための取り扱い指示とを含む。いくつかの態様において、取り扱い指示は、細胞の投与計画および投与のタイミングを指定することができる。
【０２１３】
いくつかの局面において、取り扱い指示は、CD4+T細胞の全部または一部分およびCD8+T細胞の全部または一部分を0〜12時間、0〜6時間、または0〜2時間の間隔で投与することを指定する。場合によっては、取り扱い指示は、CD4+T細胞およびCD8+T細胞を2時間以下、1時間以下、30分以下、15分以下、10分以下、または5分以下の間隔で投与することを指定する。
【０２１４】
いくつかの態様において、取り扱い指示は、細胞もしくは細胞タイプの用量もしくは数および／または細胞タイプ、たとえば個々の集団もしくはサブタイプの比、たとえばCD4+細胞とCD8+細胞との比を指定する。いくつかの態様において、細胞の集団またはサブタイプは、たとえばCD8+細胞とCD4+細胞である。たとえば、いくつかの態様において、指示は、細胞が、5：1もしくは約5：1〜5：1もしくは約5：1（もしくは約1：5超かつ約5：1未満）、または1：3もしくは約1：3〜3：1もしくは約3：1（もしくは約1：3超かつ約3：1未満）、たとえば2：1もしくは約2：1〜1：5もしくは約1：5（もしくは約1：5超かつ約2：1未満）、たとえば、5：1、4.5：1、4：1、3.5：1、3：1、2.5：1、2：1、1.9：1、1.8：1、1.7：1、1.6：1、1.5：1、1.4：1、1.3：1、1.2：1、1.1：1、1：1、1：1.1、1：1.2、1：1.3、1：1.4、1：1.5、1：1.6、1：1.7、1：1.8、1：1.9：1：2、1：2.5、1：3、1：3.5、1：4、1：4.5、もしくは1：5、もしくは約5：1、約4.5：1、約4：1、約3.5：1、約3：1、約2.5：1、約2：1、約1.9：1、約1.8：1、約1.7：1、約1.6：1、約1.5：1、約1.4：1、約1.3：1、約1.2：1、約1.1：1、約1：1、約1：1.1、約1：1.2、約1：1.3、約1：1.4、約1：1.5、約1：1.6、約1：1.7、約1：1.8、1約：1.9： 約1：2、約1：2.5、約1：3、約1：3.5、約1：4、約1：4.5、もしくは約1：5の、複数の細胞集団またはサブタイプ、たとえばCD4+およびCD8+細胞またはサブタイプの出力比の許容範囲でまたは該出力比の許容範囲内で投与されることを指定する。いくつかの局面において、許容差は、所望の比から約1％以内、約2％以内、約3％以内、約4％以内、約5％以内、約10％以内、約15％以内、約20％以内、約25％以内、約30％以内、約35％以内、約40％以内、約45％以内、約50％以内であり、これらの範囲の間の任意の数値を含む）。
【０２１５】
特定の態様において、取り扱い指示は、細胞または細胞のサブタイプの個々の集団が、体重1キログラムあたり約100万個〜約1000億個の範囲、たとえば体重1キログラムあたり100万〜約500億個（たとえば約500万個、約2500万個、約5億個、約10億、約50億個、約200億個、約300億個、約400億個または前記値のいずれか2つによって定められる範囲）、たとえば、約1000万個〜約1000億個（たとえば約2000万個、約3000万個、約4000万個、約6000万個、約7000万個、約8000万個、約9000万個、約100億個、約250億個、約500億個、約750億個、約900億個または前記値のいずれか2つによって定められる範囲）、場合によっては約1億個〜約500億個（たとえば約1億2000万個、約2億5000万個、約3億5000万個、約4億5000万個、約6億5000万個、約8億個、約9億個、約30億個、約300億個、約450億個）、またはこれらの範囲の間のいずれかの値の量で対象に投与されることを指定する。投与量は、疾患もしくは障害および／または患者および／または他の治療に特有の属性に依存して異なり得る。
【０２１６】
いくつかの態様において、たとえば対象がヒトである場合、用量は、約2×109個よりも少ない全組換え受容体（たとえばCAR）発現細胞、T細胞または末梢血単核細胞（PBMC）、たとえば約1×106個〜2×109個、たとえば5×106個、1×107個、2.5×107個、5×107個、1×108個、1.5×108個、3×108個、4.5×108個、8×108個、または1.2×109個、または前記値のいずれか2つの間の範囲の数のそのような細胞を含む。いくつかの態様において、たとえば対象がヒトである場合、用量は、約5×108個よりも少ない全組換え受容体（たとえばCAR）発現細胞、T細胞または末梢血単核細胞（PBMC）、たとえば約1×106個〜5×108個、たとえば2×106個、5×106個、1×107個、5×107個、1×108個、または5×108個、または前記値のいずれか2つの間の範囲の数のそのような細胞を含む。
【０２１７】
いくつかの態様において、取り扱い指示は、1×106もしくは約1×106個〜2×109もしくは約2×109個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、または全末梢血単核細胞（PBMC）、2.5×107もしくは約2.5×107個〜1.2×109もしくは約1.2×109個のそのような細胞、5.0×107もしくは約5.0×107個〜4.5×108もしくは約4.5×108個のそのような細胞、または1.5×108もしくは約1.5×108個〜3.0×108もしくは約3.0×108個のそのような細胞を含む用量の投与を指定する。いくつかの態様において、取り扱い指示は、2.5×107もしくは約2.5×107個、5.0×107もしくは約5.0×107個、1.5×108もしくは約1.5×108個、3.0×108もしくは約3.0×108個、4.5×108もしくは約4.5×108個、8.0×108もしくは約8.0×108個、または1.2×109もしくは約1.2×109個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、または全PBMCを含む用量の投与を指定する。いくつかの態様において、取り扱い指示は、約1×105個〜5×108個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞または全末梢血単核細胞（PBMC）、約5×105個〜1×107個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、または全末梢血単核細胞（PBMC）、または約1×106個〜1×107個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、または全末梢血単核細胞（PBMC）を含む用量の投与を指定する。
【０２１８】
いくつかの態様において、細胞療法は、少なくとも1×105もしくは少なくとも約1×105個の全組換え受容体発現細胞、全T細胞、または全末梢血単核細胞（PBMC）、たとえば少なくとも1×106もしくは少なくとも1×106個、少なくとも1×107もしくは少なくとも約1×107個、少なくとも1×108もしくは少なくとも約1×108個のそのような細胞を含む細胞の用量の投与を含む。いくつかの態様において、数は、CD3+またはCD8+細胞、場合によっては、組換え受容体発現（たとえばCAR+）細胞の全数に関する。いくつかの態様において、細胞療法は、1×105もしくは約1×105個〜5×108個のCD3+もしくはCD8+全T細胞またはCD3+もしくはCD8+組換え受容体発現細胞、5×105もしくは約5×105個〜1×107個のCD3+もしくはCD8+全T細胞またはCD3+もしくはCD8+組換え受容体発現細胞または1×106もしくは約1×106個〜1×107個のCD3+もしくはCD8+全T細胞またはCD3+もしくはCD8+組換え受容体発現細胞を含む細胞の用量の投与を含む。いくつかの態様において、細胞療法は、1×105もしくは約1×105個〜5×108個の全CD3+/CAR+もしくはCD8+/CAR+細胞、5×105もしくは約5×105個〜1×107個の全CD3+/CAR+もしくはCD8+/CAR+細胞、または1×106もしくは約1×106個〜1×107個の全CD3+/CAR+もしくはCD8+/CAR+細胞を含む用量の投与を含む。
【０２１９】
いくつかの態様において、用量のT細胞はCD4+T細胞、CD8+T細胞、またはCD4+およびCD8+T細胞を含む。
【０２２０】
いくつかの態様において、たとえば対象がヒトである場合、取り扱い指示は、CD4+およびCD8+T細胞を含む1用量中に含める、用量のCD8+T細胞が、約1×106個〜5×108個の全組換え受容体（たとえばCAR）発現CD8+細胞、たとえば約5×106個〜1×108個のそのような細胞、たとえば1×107個、2.5×107個、5×107個、7.5×107個、1×108個、または5×108個の範囲の全そのような細胞または前記値のいずれか2つの間の範囲のそのような細胞を含むことを指定する。いくつかの態様において、患者は複数の用量を投与され、各用量または全用量は前記数値のいずれかの範囲内であることができる。いくつかの態様において、細胞の用量は、1×107または約1×107個〜0.75×108個の全組換え受容体発現CD8+T細胞、1×107個〜2.5×107個の全組換え受容体発現CD8+T細胞、1×107または約1×107個〜0.75×108個の全組換え受容体発現CD8+T細胞の投与を含む。いくつかの態様において、細胞の用量は、1×107個、2.5×107個、5×107個、7.5×107個、1×108個、もしくは5×108個、または約1×107個、約2.5×107個、約5×107個、約7.5×107個、約1×108個、もしくは約5×108個の全組換え受容体発現CD8+T細胞の投与を含む。
【０２２１】
いくつかの態様において、取り扱い指示は、細胞、たとえば組換え受容体発現T細胞の用量が、1つの用量として対象に投与されること、または2週間、1ヶ月間、3ヶ月間、6ヶ月間、1年間、またはそれ以上の期間内に1回だけ投与されることを指定する。
【０２２２】
いくつかの態様において、ラベルまたはパッケージ挿入物は、提供される生物医学的材料容器を、たとえば本明細書に提供される生物医学的材料を貯蔵および回収する方法のいずれかにしたがって使用または操作するための取り扱い指示を提供し得る。いくつかの態様において、ラベルまたはパッケージ挿入物は、生物医学的材料容器中のバイアルに、たとえば生物医学的材料、たとえば本明細書に記載される任意の細胞または細胞組成物を装填、挿入、または充填するための取り扱い指示を提供し得る。いくつかの態様において、ラベルまたはパッケージ挿入物は、生物医学的材料容器を操作、貯蔵、凍結、および／または解凍するための取り扱い指示を提供し得る。いくつかの態様において、ラベルまたはパッケージ挿入物は、生物医学的試料、たとえば本明細書に記載される任意の細胞または細胞組成物を生物医学的材料容器から回収するためまたは取り外すための取り扱い指示を提供し得る。
【０２２３】
定義
別段の定義がない限り、本明細書において使用されるすべての術語、表記、および他の科学技術用語または専門用語はすべて、特許請求される主題が関連する技術分野の当業者によって一般に理解されるものと同じ意味を有することが意図される。場合によっては、理解しやすさおよび／または参照しやすさのために、一般に理解される意味を有する用語が本明細書において定義されるが、本明細書におけるそのような定義の包含は、必ずしも、当技術分野において一般に理解されている定義との実質的な違いを表すものと解釈されるべきではない。
【０２２４】
本明細書における数値またはパラメータの前の「約」は、その数値またはパラメータそのものに対する変化を含む（かつ記載する）。たとえば、「約X」の記載は「X」の記載を含む。加えて、数値またはパラメータの文字列の後または前に付く「未満」、「よりも大きい」、「多くとも」、「少なくとも」、「以下」、「以上」、または類似の語句は、この語句が数値またはパラメータの文字列中の各数値またはパラメータに当てはまることを意味する。たとえば、バイアルからの取り出し後に残る試料量が約0.3mL未満、約0.25mL未満、または約0.2mL未満であることができるという記述は、バイアルからの取り出し後に残る試料量が約0.3mL未満、約0.25mL未満、または約0.2mL未満であることができることを意味する。
【０２２５】
本明細書において使用される単数形の「1つの（a）」、「1つの（an）」、および「その（the）」は、文脈がそうでないことを明確に指示しない限り、複数形を含むことを意図する。また、本明細書において使用される「および／または」という用語は、関連する挙げられた項目の1つまたは複数のあらゆる組み合わせを指し、それを包含するということが理解されよう。さらに、本明細書において使用される「含む（includes）」、「含む（including）」、「含む（comprises）」、および／または「含む（comprising）」という用語は、述べられた特徴、整数、工程、操作、要素、部品および／またはユニットの存在を指定するが、1つまたは複数の他の特徴、整数、工程、操作、要素、部品、ユニット、および／またはそれらの群の存在または追加を排除するものではないことが理解されよう。
【０２２６】
本明細書において使用される「ベクター」という用語とは、それが連結している別の核酸を増殖させることができる核酸分子をいう。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクターおよびそれが導入された宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それが機能的に連結している核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。ベクターとしては、ウイルスベクター、たとえばレトロウイルスベクター、たとえばガンマレトロウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターがある。
【０２２７】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は互換可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換細胞」を含み、それらは、継代数にかかわりなく、初代形質転換細胞およびそれに由来する子孫を含む。子孫は、核酸含量において親細胞と完全に同一でなくてもよく、変異を含んでもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたものと同じ機能または生物学的活性を有する変異体子孫もまた、本明細書に含まれる。
【０２２８】
本明細書において使用される、細胞または細胞集団が特定のマーカに関して「ポジティブ」であるという記述は、特定のマーカ、通常は表面マーカが細胞の上または中に検出可能に存在することを指す。表面マーカを指す場合、この用語は、フローサイトメトリーによる、たとえば、マーカに特異的に結合する抗体で染色し、当該抗体を検出することによる検出で、表面発現が存在することを指し、この場合、染色は、フローサイトメトリーにより、他の点では同一の条件下、アイソタイプマッチコントロールを用いる同じ手順を実施して検出される染色を実質的に上回るレベルで、および／またはマーカに関してポジティブであることが既知である細胞のレベルに実質的に類似するレベルで、および／またはマーカに関してネガティブであることが既知である細胞のレベルよりも実質的に高いレベルで、検出可能である。
【０２２９】
本明細書において使用される、細胞または細胞集団が特定のマーカに関して「ネガティブ」であるという記述は、特定のマーカ、通常は表面マーカが細胞の上または中に実質的に検出可能に存在しないことを指す。表面マーカを指す場合、この用語は、フローサイトメトリーによる、たとえば、マーカに特異的に結合する抗体で染色し、当該抗体を検出することによる検出で、表面発現が存在しないことを指し、この場合、染色は、フローサイトメトリーにより、他の点では同一の条件下、アイソタイプマッチコントロールを用いる同じ手順を実施して検出される染色を実質的に上回るレベルで、および／またはマーカに関してポジティブであることが既知である細胞のレベルを実質的に下回るレベルで、および／またはマーカに関してネガティブであることが既知である細胞のレベルと実質的に類似するレベルで、検出可能である。
【０２３０】
本明細書において使用される組成物とは、細胞を含む、2つまたはそれ以上の生成物、物質または化合物の任意の混合物をいう。組成物は、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。
【０２３１】
本明細書において使用される「対象」とは、哺乳動物、たとえばヒトまたは他の動物であり、通常はヒトである。
【０２３２】
本出願は、本文および図面中にいくつかの数値範囲を開示する。開示される数値範囲は本来、正確な範囲限定が本明細書中で一字一句述べられないとしても、終点を含む、開示された数値範囲内の任意の範囲または数値を支持する。理由は、本開示は、開示された数値範囲全体を通して実施することができるからである。
【０２３３】
上記の詳細な説明は、当業者が本開示を実現し、使用することを可能にするために提示され、特定の用途およびその要件に関連して提供される。好ましい態様に対する様々な改変が当業者には容易に明らかであり、本明細書に定められる一般的な原理は、開示の精神および範囲を逸脱することなく、他の態様および用途にも適用され得る。したがって、本開示は、示された態様に限定されることを意図したものではなく、本明細書に開示される原理および特徴と一致するもっとも広い範囲と一致する。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【国際調査報告】
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