(57)【要約】  本発明は、硫化水素を検出するための、または硫化水素の濃度を測定するための組成物、および生体内の炎症、低酸素損傷を有する組織、または癌を診断またはイメージングするための有効成分と同じものを含む組成物に関する。本発明に従う、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物（９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸）を含む、硫化水素を検出するための、または硫化水素の濃度を測定するための組成物は、インビボおよびインビトロレベルにおいて硫化水素の検出または濃度測定を可能にし、およびそのため、硫化水素を検出するため、および硫化水素の濃度を測定するため、およびさらにまた硫化水素のインビボでの生物学的な役割を発見するため、とくに、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー病、心臓血管虚血、および脳血管虚血からなる群から選択される疾患または低酸素組織において硫化水素を検出する、イメージングする、および定量的に測定するために、効果的に使用され得る。
2021536508.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素を検出するための組成物：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【請求項２】
アルファ−ヒドロキシ酸が、以下の式２
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
で表される化合物である、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項３】
アルファ−ヒドロキシ酸が、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルコヘプトン酸、ガラクトン酸、Ｄ−グルカル酸、酒石酸、クエン酸、グリコール酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、およびＤ−グルクロン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項４】
組成物が硫化水素と反応し、不溶性材料を形成し、それによってイメージングを可能にする、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項５】
組成物が、対象動物から単離される組織または細胞において硫化水素を検出する、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項６】
組成物が、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー認知症、心臓血管虚血、脳血管虚血、および低酸素症からなる群から選択される疾患において硫化水素を検出する、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項７】
９９ｍＴｃを、式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩と反応させるステップを含有する、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素を検出するための組成物の調製方法：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）；
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【請求項８】
還元剤、安定剤、賦形剤、およびバッファーからなる群から選択される１以上のアジュバントがさらに使用され得る、請求項７に記載の調製方法。
【請求項９】
９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素の濃度を測定するための組成物：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【請求項１０】
式１で表される化合物を含む、硫化水素が発生する疾患をイメージングするための組成物：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒは、独立して水素またはヒドロキシル基であり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【請求項１１】
疾患が、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー認知症、心臓血管虚血、脳血管虚血、および低酸素症からなる群から選択される、請求項１０に記載のイメージングするための組成物。
【請求項１２】
疾患が、リウマチ性関節炎、非リウマチ性炎症性関節炎、ライム病に関連する関節炎、腎盂腎炎、腎炎、炎症性骨関節炎、髄膜炎、骨髄炎、炎症性腸疾患、虫垂炎、膵炎、敗血症、細菌感染に起因する炎症性疾患、心筋梗塞、心臓虚血、アンギーナ、狭心症、心筋症、心内膜炎、動脈硬化症、敗血症、糖尿病、脳卒中、肝硬変、喘息、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、ダウン症候群、肺がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がん、肝臓がん、脳がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍、胃がん、結腸がん、膵臓がん、膀胱がん、食道がん、および頭／首がんからなる群から選択される、請求項１０に記載のイメージングするための組成物。
【請求項１３】
式１で表される化合物を含む、硫化水素が発生する疾患を診断するための組成物：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒは、独立して水素またはヒドロキシル基であり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【請求項１４】
式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、およびアジュバントを含む、式１で表される化合物を調製するためのキット：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒは、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【請求項１５】
アジュバントが、ＳｎＣｌ２、アスコルビン酸、ゲンチシニン酸（gentisinic acid）、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、ナトリウムホスファート、マンニトール、グルコース、ラクトース、およびナトリウムアスコルバートからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１４に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
関連出願の相互参照
本特許出願は、２０１９年９月１１日に出願された国際出願Ｎｏ．ＰＣＴ／ＫＲ２０１９／０１１８４８の国内段階であり、２０１８年９月１１日に出願された韓国出願Ｎｏ．１０−２０１８−０１０８２３４からの優先権の利益を主張し、その各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
１．本発明の分野
本発明は、硫化水素を検出するための、または硫化水素の濃度を測定するための組成物、および、生体内の炎症、低酸素損傷を有する組織、または癌を診断またはイメージングするための、活性成分と同じものを含む組成物に関する。
２．関連技術の記載
硫化水素ガスは、卵などのたんぱく質を腐敗させることにより引き起こされ、およびその悪臭で有名である。このガスは主に、有機物で汚染された自然の火山、土壌、または水資源から発生し、および正常なまたは疾患状態の生物から発生され得る。加えて、硫化水素は、動物の体において病気のタイプに応じて、病気の状態を改善または悪化させることが見出されている。したがって、自然の土壌、空気、水資源の汚染レベルを測定するため、または生体の病的状態を診断するためには、硫化水素を検出して定量化する必要がある。
【０００３】
加えて、硫化水素は、人体内のさまざまな炎症反応、低酸素症、心血管疾患、脳卒中、血管新生、血管拡張、癌、ダウン症候群、認知症、糖尿病、およびハンチントン病などの多くの疾患に関連していると報告されている。したがって、その検出は、さまざまな病気を診断し、予後を予測するために、極めて重要である。
【０００４】
結果的に、メチレンブルー法、イオン選択性電極法、モノブロモオビマン−ＨＰＬＣ法、チオブロモビマン−ＧＣ法、および電流検出法などの多くの方法が開発され、およびサンプル中の硫化水素濃度を測定することが報告されている(KR Olson, et al., Nitric Oxide (2014) 41;11-26)。しかしながら、これらの方法は、単に血液などのサンプル中の硫化水素の濃度を測定するだけであるため、その分布をより正確に知ることは実行不能である。
【０００５】
硫化水素を蛍光で検出する方法が開発され、硫化水素の発生部位をイメージにおいて表すことを実行可能にした。しかしながら、蛍光は透過性において弱く、それゆえヒトまたは大型動物において発生する硫化水素を検出するためにもイメージングするためにも使用できない。それは、マウスおよびゼブラフィッシュなどの極めて小さい動物、またはミトコンドリアなどの細胞内器官における硫化水素の発生を検出およびイメージングするためにのみ使用され得る（MD Hammers、et al。、J Am Chem Soc（2015）137：10216-10223; Y Chen、et al.、Angew Chem Int Ed（2013）52：1688-1691; K Sasakura、et al.、J Am Chem Soc（2011）133：18003-18005; AR Lippert、et al.、J Am Chem Soc（2011）133：10078-10080; N Kumar、et al.、Coord Chem Rev（2013）257：2335-2347）。
【０００６】
低温化学発光による検出方法もまた開発されているが、この方法は、小さい動物にしか適用できないという問題を有する（J Cao、et al.、Chem Sci（2015）6：1979-1985）。
【０００７】
最近、強い透過力で放射線を放出する放射性同位元素を使用して硫化水素を検出する方法が開発された。この方法において、６４Ｃｕ放出陽電子が硫化水素と結合し、不溶性の６４ＣｕＳを形成し、および硫化水素発生サイトに堆積し、このサイトの放射能を検出およびイメージングする（S Sarkar、et al.、Angew Chem Int Ed（2016）55：9365 -9370;韓国特許公開第10-2017-0018121）。上記の方法は、ＰＥＴ（陽電子放出断層撮影）を使用して、ヒトの体の深部の硫化水素発生部位を高解像度でイメージングされ得る。しかしながら、Ｃｕ−６４は高価なターゲット材料であるＮｉ−６４に高価なサイクロトロンを使用して陽子線を照射する必要があるため、価格が極めて高く、使用に多くの制限がある。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の概要
本発明の目的は、硫化水素を検出するための、または硫化水素の濃度を測定するための組成物を提供することである。
本発明の別の目的は、炎症、低酸素損傷を有する組織、またはがんを診断またはイメージングするための組成物を提供することである。
上記の目的を達成するために、本発明のある側面において、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素を検出するための組成物が提供される：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【０００９】
本発明の別の側面において、９９ｍＴｃを、式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩と反応させるステップを含有する、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素を検出するための組成物の調製方法が提供される：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【００１０】
本発明の別の側面において、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素の濃度を測定するための組成物が提供される：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【００１１】
本発明の別の側面において、式１で表される化合物を含む、硫化水素が発生する疾患をイメージングするための組成物が提供される：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒは、独立して水素またはヒドロキシル基であり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【００１２】
本発明の別の側面において、式１で表される化合物を含む、硫化水素が発生する疾患を診断するための組成物が提供される：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒは、独立して水素またはヒドロキシル基であり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【００１３】
本発明の別の側面において、式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、およびアジュバントを含む、式１で表される化合物を調製するためのキットが提供される：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒは、独立して水素またはヒドロキシル基であり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【００１４】
有利な効果
９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する式１（９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸）で表される化合物を含む、本発明に従う硫化水素を検出または硫化水素の濃度を測定するための組成物は、インビトロおよびインビボレベルにおいて、硫化水素の検出または濃度測定を可能にし、およびしたがって、硫化水素を検出するため、および硫化水素の濃度を測定するため、およびさらにまたインビボにおける硫化水素の生物学的役割を発見するために、とくに、血管新生、炎症、癌、アルツハイマー病、心血管虚血、および脳血管虚血からなる群から選択される疾患において、または低酸素組織において硫化水素を検出、イメージング、および定量的に測定するために有利に使用され得る。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、α−ヒドロキシ酸の式を表すダイアグラムである。
【図２】図２は、アセトンおよび生理食塩水を使用するＩＴＬＣ−ＳＧによって、アルファ−ヒドロキシ酸としてＤ−グルコン酸を使用し、例１の方法に従って、９９ｍＴｃでラベル化された９９ｍＴｃ−グルコン酸を展開することによる、ラベル化効率を測定することの結果を表す一連のグラフである。
【００１６】
【図３】図３は、アセトンおよび生理食塩水を使用するＩＴＬＣ−ＳＧによって、α−ヒドロキシ酸としてＤ−グルコヘプトナートを使用し、例１の方法に従って、９９ｍＴｃでラベル化された９９ｍＴｃ−グルコヘプトナートを展開することによる、ラベル化効率を測定することの結果を表す一連のグラフである。
【図４】図４は、アセトンおよび生理食塩水を使用するＩＴＬＣ−ＳＧによって、アルファ−ヒドロキシ酸としてＤ−グルカラートを使用し、例１の方法に従って、９９ｍＴｃでラベル化された９９ｍＴｃ−グルカラートを展開することによる、ラベル化効率を測定することの結果を表す一連のグラフである。
【図５】図５は、アセトンおよび生理食塩水を使用するＩＴＬＣ−ＳＧによって、アルファ−ヒドロキシ酸としてシトラートを使用し、例１の方法に従って、９９ｍＴｃでラベル化された９９ｍＴｃ−シトラートを展開することによる、ラベル化効率を測定することの結果を表す一連のグラフである。
【００１７】
【図６】図６は、アセトンおよび生理食塩水を使用するＩＴＬＣ−ＳＧによって、アルファ−ヒドロキシ酸としてＬ−タートラートを使用し、例１の方法に従って、９９ｍＴｃでラベル化された９９ｍＴｃ−タートラートを展開することによる、ラベル化効率を測定することの結果を表す一連のグラフである。
【図７】図７は、アセトンおよび生理食塩水を使用するＩＴＬＣ−ＳＧによって、アルファ−ヒドロキシ酸としてＤ−グルクロナートを使用し、例１の方法に従って、９９ｍＴｃでラベル化された９９ｍＴｃ−グルクロナートを展開することによる、ラベル化効率を測定することの結果を表す一連のグラフである。
【図８】図８は、実験例２で実施された、９９ｍＴｃ−アルフス−ヒドロキシ酸とＮａＨＳおよび様々な活性硫化物との反応後に発生する不溶性物質のパーセンテージを表すグラフである。
【００１８】
【図９】図９は、実験例３で実施された、９９ｍＴｃ−アルフス−ヒドロキシ酸を異なる濃度のＮａＨＳと反応させることによって生成される不溶性物質の量を表すグラフである。
【図１０】図１０は、実験例５において実施された、炎症を誘発するためのマウスの足の裏へのカラギーナン、および他の足への生理食塩水、次いで９９ｍＴｃ−グルコン酸および９９ｍＴｃ−グルコヘプトナートの投与を実施した１時間後に得られた一連のＳＰＥＣＴ／ＣＴイメージである。
【図１１】図１１は、実験例６において実施された、ラットの中大脳動脈を２時間閉塞し、再灌流し、９９ｍＴｃ−グルコン酸と［１８Ｆ］ＦＤＧを同時に投与した後、１時間後に抽出、自動放射、ＴＴＣ染色したラット脳の一連のイメージである。
【００１９】
好ましい態様の記載
本発明のある側面において、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素を検出するための組成物が提供される：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
アルファ−ヒドロキシ酸は、以下の式２
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
で表される化合物であり得る。
【００２０】
加えて、アルファ−ヒドロキシ酸は、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルコヘプトン酸、ガラクトン酸、Ｄ−グルカル酸、酒石酸、クエン酸、グリコール酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸およびＤ−グルクロン酸からなる群から選択され得る。
【００２１】
硫化水素を検出するための組成物は、硫化水素と反応し、不溶性材料を形成し、それによってイメージングを可能にする。よって、硫化水素を検出するために使用され得る。
硫化水素を検出するための組成物は、対象動物から単離された組織または細胞における硫化水素を検出し得る。
【００２２】
組織または細胞は、硫化水素が発生した組織または細胞、または、硫化水素が発生した、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー認知症、心臓血管虚血、脳血管虚血、および低酸素症からなる群から選択される疾患の組織または細胞であり得る。加えて、組織または細胞は、リウマチ性関節炎、非リウマチ性炎症性関節炎、ライム病に関連する関節炎、腎盂腎炎、腎炎、炎症性骨関節炎、髄膜炎、骨髄炎、炎症性腸疾患、虫垂炎、膵炎、敗血症、細菌感染に起因する炎症性疾患、心筋梗塞、心臓虚血、アンギーナ、狭心症、心筋症、心内膜炎、動脈硬化症、敗血症、糖尿病、脳卒中、肝硬変、喘息、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、ダウン症候群、肺がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がん、肝臓がん、脳がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍、胃がん、結腸がん、膵臓がん、膀胱がん、食道がんおよび頭／首がんからなる群から選択される疾患の組織または細胞であり得る。
【００２３】
硫化水素を検出するための組成物は、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー認知症、心臓血管虚血、脳血管虚血および低酸素症からなる群から選択される疾患において硫化水素を検出し得る。このとき、疾患は、硫化水素発生疾患または低酸素組織であり得る。
本発明の硫化水素を検出するための組成物は、活性スルフィド（active sulfide）の中で、ＮａＨＳ（硫化水素）のみを選択的に検出するため、それは硫化水素の検出のために効果的に使用され得る（実験例２）。
【００２４】
本発明の別の側面において、本発明は、９９ｍＴｃを、式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩と反応させるステップを含有する、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素を検出するための組成物の調製方法を提供する。
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【００２５】
式２で表されるアルファヒドロキシ酸は、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルコヘプトン酸、ガラクトン酸、Ｄ−グルカル酸、酒石酸、クエン酸、グリコール酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸およびＤ−グルクロン酸からなる群から選択され得る。
アルカリ金属は、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、ルビジウム（Ｒｂ）およびセシウム（Ｃｓ）からなる群から選択され得る。
【００２６】
アルカリ土類金属は、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、ストロンチウム（Ｓｒ）およびバリウム（Ｂａ）からなる群から選択され得る。
【００２７】
具体的に言うと、上の調製方法は、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ-ヒドロキシ酸、すなわち式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸にテクネチウム複合体を合成することによる、式１で表される化合物を得るための方法である。
【００２８】
本発明の調製方法において、ジェネレータにおいて発生される９９ｍＴｃが使用されたが、ジェネレータから即時に放出された９９ｍＴｃは、酸化数＋７をもつ極めて安定な形態のペルテクネチウム酸として存在し、およびしたがってラベル化されなかった。したがって、それを還元することによって酸化数を減らす必要がある。このとき、還元剤は、一般的に使用される還元剤である限り、限定せずに使用され得る。本発明の一態様において、ＳｎＣｌ２が還元剤として使用されたが、必ずしもそれに限定されるわけではない。
【００２９】
アルファ−ヒドロキシ酸を９９ｍＴｃで容易におよび都合よくラベル化するために、安定剤、賦形剤、またはバッファーが他の添加剤としてさらに使用され得る。
ＳｎＣｌ２、アスコルビン酸、ゲンチシニン酸（gentisinic acid）、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、ナトリウムホスファート、マンニトール、グルコース、ラクトース、ナトリウムアスコルバート等は、他の添加剤として使用され得る。
本発明に従う調製方法は、アルファ−ヒドロキシ酸を、９９ｍＴｃで、ほとんど１００％のラベル化効率でラベル化することができた（実験例１）。
【００３０】
本発明の別の側面において、本発明は、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素の濃度を測定するための組成物を提供する。［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
【００３１】
アルファ−ヒドロキシ酸は、以下の式２で表される化合物であり得る。
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
加えて、式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸は、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルコヘプトン酸、ガラクトン酸、Ｄ−グルカル酸、酒石酸、クエン酸、グリコール酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸およびＤ−グルクロン酸からなる群から選択され得る。
【００３２】
硫化水素の濃度を測定するための組成物は、硫化水素と反応し、不溶性材料を形成し、硫化水素の濃度が測定され得る。
硫化水素の濃度を測定するための組成物は、対象動物から単離された組織または細胞における硫化水素の濃度を測定し得る。
【００３３】
組織または細胞は、硫化水素が発生した組織または細胞、または、硫化水素が発生した血管新生、炎症、がん、‘アルツハイマー認知症、心臓血管虚血、脳血管虚血および低酸素症からなる群から選択される疾患の組織または細胞であり得る。加えて、組織または細胞は、リウマチ性関節炎、非リウマチ性炎症性関節炎、ライム病に関連する関節炎、腎盂腎炎、腎炎、炎症性骨関節炎、髄膜炎、骨髄炎、炎症性腸疾患、虫垂炎、膵炎、敗血症、細菌感染に起因する炎症性疾患、心筋梗塞、心臓虚血、アンギーナ、狭心症、心筋症、心内膜炎、動脈硬化症、敗血症、糖尿病、脳卒中、肝硬変、喘息、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、ダウン症候群、肺がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がん、肝臓がん、脳がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍、胃がん、結腸がん、膵臓がん、膀胱がん、食道がん、および頭／首がんからなる群から選択される疾患の組織または細胞であり得る。
【００３４】
硫化水素の濃度を測定するための組成物は、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー認知症、心臓血管虚血、脳血管虚血および低酸素症からなる群から選択される疾患における硫化水素を検出し得る。このとき、疾患は、硫化水素発生疾患または低酸素組織であり得る。
不溶性物質の形成の度合いは、硫化水素の濃度に従って変化するため、硫化水素の濃度を測定するための組成物は、硫化水素の濃度を測定するために効果的に使用され得る（実験例３）。
【００３５】
本発明の別の側面において、本発明は、式１で表される化合物を含む、硫化水素が発生する疾患をイメージングするための組成物を提供する。
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒは、独立して水素またはヒドロキシル基であり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
【００３６】
アルファ−ヒドロキシ酸は、以下の式２で表される化合物であり得る。
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
【００３７】
加えて、アルファ−ヒドロキシ酸は、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルコヘプトン酸、ガラクトン酸、Ｄ−グルカル酸、酒石酸、クエン酸、グリコール酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸およびＤ−グルクロン酸からなる群から選択され得る。
硫化水素が発生する疾患をイメージングするための組成物は、硫化水素と反応し、不溶性材料を形成し、硫化水素がイメージングされ得る。
疾患は、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー認知症、心臓血管虚血、脳血管虚血および低酸素症からなる群から選択され得る。
【００３８】
加えて、疾患は、リウマチ性関節炎、非リウマチ性炎症性関節炎、ライム病に関連する関節炎、腎盂腎炎、腎炎、炎症性骨関節炎、髄膜炎、骨髄炎、炎症性腸疾患、虫垂炎、膵炎、敗血症、細菌感染に起因する炎症性疾患、心筋梗塞、心臓虚血、アンギーナ、狭心症、心筋症、心内膜炎、動脈硬化症、敗血症、糖尿病、脳卒中、肝硬変、喘息、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、ダウン症候群、肺がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がん、肝臓がん、脳がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍、胃がん、結腸がん、膵臓がん、膀胱がん、食道がん、および頭／首がんからなる群から選択され得る。
【００３９】
硫化水素が発生される疾患をイメージングするための組成物は、本発明に従って、硫化水素が発生する炎症を起こした組織をイメージングすることができ、および、イメージングするための処理組成物の摂取量が増加するか否かをとおして濃度の増加が知られることができ、イメージングだけでなく、濃度の上昇もまた確認されることができる。加えて、硫化水素濃度は蛍光アッセイをとおして定量化および数値で表現され得るため、それは、炎症を起こした組織における硫化水素の濃度を測定するために効果的に使用され得る（実験例４および５）。
【００４０】
加えて、本発明に従うイメージングのための組成物を使用して、中大脳動脈閉塞後の再灌流における硫化水素濃度における上昇から、再灌流組織において硫化水素が発生したことが確認された。中大脳動脈閉塞後の再灌流組織における硫化水素の検出、濃度測定、およびイメージングが実行可能であることもまた確認された（実験例６）。
【００４１】
本発明の別の側面において、本発明は、式１で表される化合物を含む、硫化水素が発生する疾患を診断するための組成物を提供する。
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒは、独立して水素またはヒドロキシル基であり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
アルファ−ヒドロキシ酸は、以下の式２で表される化合物であり得る。
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【００４２】
加えて、アルファ−ヒドロキシ酸は、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルコヘプトン酸、ガラクトン酸、Ｄ−グルカル酸、酒石酸、クエン酸、グリコール酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸およびＤ−グルクロン酸からなる群から選択され得る。
硫化水素が発生する疾患を診断するための組成物は、硫化水素と反応し、不溶性材料を形成し、硫化水素が発生する疾患の診断が実行可能である。
疾患は、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー認知症、心臓血管虚血、脳血管虚血および低酸素症からなる群から選択され得る。
【００４３】
加えて、疾患は、リウマチ性関節炎、非リウマチ性炎症性関節炎、ライム病に関連する関節炎、腎盂腎炎、腎炎、炎症性骨関節炎、髄膜炎、骨髄炎、炎症性腸疾患、虫垂炎、膵炎、敗血症、細菌感染に起因する炎症性疾患、心筋梗塞、心臓虚血、アンギーナ、狭心症、心筋症、心内膜炎、動脈硬化症、敗血症、糖尿病、脳卒中、肝硬変、喘息、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、ダウン症候群、肺がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がん、肝臓がん、脳がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍、胃がん、結腸がん、膵臓がん、膀胱がん、食道がん、および頭／首がんからなる群から選択され得る。
【００４４】
本発明に従って、硫化水素が発生する疾患を診断するための組成物は、硫化水素が発生する炎症組織をイメージングすることができ、イメージングのための処理組成物の摂取量が増加するかをとおして濃度増加が知られることができ、イメージングだけでなく、濃度の上昇も確認され得る。加えて、硫化水素濃度は蛍光分析をとおして定量化および数値で表現され得るため、それは、炎症性疾患を診断するためだけでなく、進行を評価するためにも効果的に使用され得る（実験例５）。
加えて、本発明に従ってイメージングのための組成物を使用して、中大脳動脈閉塞後の再灌流における硫化水素濃度の上昇から、再灌流組織に硫化水素が発生したことが確認された。再灌流組織は、中大脳動脈閉塞後に診断できることもまた確認された（実験例６）。
【００４５】
本発明の別の側面において、本発明は、式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、およびアジュバントを含む、式１で表される化合物を調製するためのキットを提供する：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒは、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【００４６】
式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸は、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルコヘプトン酸、ガラクトン酸、Ｄ−グルカル酸、酒石酸、クエン酸、グリコール酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸およびＤ−グルクロン酸からなる群から選択され得る。
【００４７】
アジュバンドは、ＳｎＣｌ２、アスコルビン酸、ゲンチシニン酸（gentisinic acid）、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、ナトリウムホスファート、マンニトール、グルコース、ラクトース、およびナトリウムアスコルバートからなる群の少なくとも１つから選択され得る。
アルカリ金属は、リチウム（Ｌｉ）、ナトリウム（Ｎａ）、カリウム（Ｋ）、ルビジウム（Ｒｂ）およびセシウム（Ｃｓ）からなる群から選択され得る。
【００４８】
アルカリ土類金属は、マグネシウム（Ｍｇ）、カルシウム（Ｃａ）、ストロンチウム（Ｓｒ）およびバリウム（Ｂａ）からなる群から選択され得る。
キットは、アルファ−ヒドロキシ酸の９９ｍＴｃでの容易および便利なラベル化のために、アジュバンドを包含し得る。アジュバンドは、安定剤、賦形剤、またはバッファーでもよく、および具体的に言うと他の添加剤として、ＳｎＣｌ２、アスコルビン酸、ゲンチシニン酸（gentisinic acid）、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、ナトリウムホスファート、マンニトール、グルコース、ラクトース、ナトリウムアスコルバート等が使用され得る。
【００４９】
具体的に言うと、キットは、式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、およびアジュバントとして塩化スズなどの還元剤を包含する凍結乾燥キットであり得る。このとき、ラベル化効率を最適化するために、キットは、キット内のｐＨを３〜１０、好ましくは４〜７に調整することによって調製され得る。
９９ｍＴｃは、キットに添加され、それは、室温〜１００℃にて１時間以内にアルファ−ヒドロキシ酸を９９ｍＴｃでラベル化して使用され得る。
【００５０】
キットは、抗酸化剤および賦形剤を加えて含有し得る。このとき、抗酸化剤は、放射性同位元素でラベル化されたα−ヒドロキシ酸が酸化または放射線分解によって劣化することを防ぐためのものである。ビタミンＣまたはゲンチジン酸は、抗酸化剤として使用され得る。抗酸化剤および賦形剤は、キットの単位投与量あたり約０〜５００ｍｇ含有され得る。
キットは、不活性ガス環境下、滅菌容器内で凍結または凍結乾燥されてもよい。キットは、病院で使用する注射液を準備するためのバッファー滅菌バイアル、生理食塩水、シリンジ、フィルター、カラム、およびその他の補助装置をさらに包含してもよい。かかる改変は、当業者によく知られている。
【００５１】
キットは、室温〜１００℃にて１時間以内に９９ｍＴｃでのラベル化によって使用され得る。
【００５２】
９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する式１（９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸）で表される化合物を含む、本発明による硫化水素を検出または硫化水素の濃度を測定するための組成物は、インビトロおよびインビボレベルにおいて硫化水素の検出または濃度測定を可能にし、およびそのため、有利なことに、硫化水素を検出することおよび硫化水素濃度を測定することのために、およびさらにまたインビボにおける硫化水素の生物学的な役割を発見するために、とくに、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー病、心臓血管虚血、および脳血管虚血からなる群から選択される疾患においてまたは低酸素組織において硫化水素を発見すること、イメージングすること、および定量的に測定することのために使用され得る。
【００５３】
加えて、９９ｍＴｃは、他の放射性同位元素よりも供給が容易であり、および価格競争力があるため、それは経済的な利点を有する。
以下、本発明は、以下の例および実験例により詳細に説明される。
しかしながら、以下の例および実験例は、本発明を単に例示するためのものであり、本発明の内容は、それに限定されるものではない。
【００５４】
例１：９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸（９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸）の調製
Ｄ−グルコナート、Ｄ−グルコヘプトナート、Ｄ−グルカラート、シトラート、Ｌ−タートラート、およびＤ−グルクロナートは、アルファ−ヒドロキシ酸として選択され、および各アルファ−ヒドロキシ酸を以下の方法により９９ｍＴｃでラベル化した。ラベル化に使用した蒸留水はすべて、窒素ガスを１時間吹き込んだ後に使用した。各０．３Ｍのα−ヒドロキシ酸の１００μＬにナトリウムアスコルバート（２５ｍｇ／ｍＬ）１０μＬを添加し、ＳｎＣｌ２・２Ｈ２Ｏ（０．０５ＭＨＣｌ中２．５ｍｇ／ｍＬ）５０μＬを添加し、続いてよく混合した。ジェネレータから得られた９９ｍＴｃ（３ｍＣｉ）１４０μＬをそこへ添加し、室温で２０分間、または１００℃で１０分間加熱してラベル化した。
【００５５】
実験例１：ラベル化効率の測定
例１で調製した９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸（９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸）のラベル化効率を測定するために、以下の実験を実施した。各９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸のラベル化効率を測定した結果を図２〜７に示す。
具体的には、ラベル化効率を、ＩＴＬＣ（Instant Thin Layer Chromatography）によって測定した。長さ１０ｃｍ、幅１ｃｍのＩＴＬＣプレートの底から１ｃｍの位置に１〜５μＬのサンプルをロードした後、プレートをアセトンまたは生理食塩水を含有する展開槽に入れ、および展開した。展開完了すると、Ｒａｄｉｏ−ＴＬＣスキャナーを使用して放射能をスキャンした。このとき、アセトンで展開したとき、ラベル化されていない９９ｍＴｃのみが溶媒に沿って上昇し、およびラベル化された９９ｍＴｃおよびコロイド状の９９ｍＴｃが原点（origin）に残った。生理食塩水で展開したとき、コロイド状の９９ｍＴｃは原点に残り、およびラベル化されていない９９ｍＴｃおよびラベル化された９９ｍＴｃは溶媒に沿って上昇した。
図２〜７に示すように、すべてのα−ヒドロキシ酸でほぼ１００％のラベル化効率が示された。
【００５６】
実験例２：９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸とＮａＨＳおよび様々な活性スルフィドとの反応の評価
本発明に従って９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸と、ＮａＨＳ（硫化水素）を包含する様々な活性硫化物との反応性を評価するために、以下の実験を実施し、およびその結果を図８および表１に示す。
具体的には、例１において調製された９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸を生理食塩水で５倍に希釈し、および次いで各希釈剤１００μＬを取り、各１００μＬに、０．４ｍＭのＮａＨＳ、４ｍＭのグルタチオン、０．４ｍＭのシステイン、０．４ｍＭの亜硫酸ナトリウム、０．４ｍＭの硫酸ナトリウム、０．４ｍＭのチオ硫酸ナトリウム、および０．４ｍＭのＮＯＮＯａｔｅ（ＮＯ発生試薬）を含有する０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）を添加し、および３７℃にて１５分間反応させた。次いで、生理食塩水でＩＴＬＣを展開し、原点に残存する放射能のパーセンテージを決定した。生理食塩水で展開したとき、原点に残存する放射能は不溶性物質から作られ、その部位に沈着されていた。
以下の表１は、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸と活性スルフィドとの反応の後に生成する不溶性物質のパーセンテージを示す。
【００５７】
【表１】
2021536508.tif 000003
【００５８】
表１に示すように、９９ｍＴｃでラベル化されたグルコナート、グルコヘプトナート、およびグルカラートは、ＮａＨＳと最も反応した。具体的にいうと、９９ｍＴｃ−グルコナートは、最大であり、８７．８±４．３％の不溶性物質を生成し、９９ｍＴｃ−グルコヘプトナートは、６８．８±５．７％の不溶性物質を生成し、および９９ｍＴｃ−グルカラートは、３７．０±４．７％の不溶性物質を生成した。一方、９９ｍＴｃ−シトラートは８．３±１．０％の不溶性物質を生成し、これは相対的に低かったが、他の活性化硫化物と比較して硫化水素と最も反応性が高かった。例１において調製された他の９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸、９９ｍＴｃ−タートラートおよび９９ｍＴｃ−グルクロナートは、９９ｍＴｃ−シトラートと同様の結果を示した。
【００５９】
表１の結果をグラフにまとめ、および図８に示す。
図８に示すとおり、９９ｍＴｃラベル化されたグルコナート、グルコヘプトナート、グルカラートはＮａＨＳとのみ反応し、３７．０〜８７．８％の不溶性物質を生成したが、他の活性硫化物と反応せず、硫化水素以外の活性硫化物との反応は極めて低かったことを意味する。一方、９９ｍＴｃ−シトラートはＮａＨＳによってさえ、不溶性物質をあまり生成しなかった。
【００６０】
本発明による９９ｍＴｃラベル化されたα−ヒドロキシ酸は、グルタチオン、システイン、亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硫酸チオナトリウム、ＮＯおよびリン酸バッファーなどのＮａＨＳ以外の活性物質と反応することにより、１５％未満の不溶性物質を生成した。９９ｍＴｃでラベル化されたα−ヒドロキシ酸は、不溶性物質の生成が少ないため、イメージに表示されなかった。
すなわち、本発明による９ｍＴｃラベル化されたα−ヒドロキシ酸は、活性硫化物の中からＮａＨＳ（硫化水素）のみを選択的に検出し、およびしたがって硫化水素の検出に効果的に使用され得ることが確認された。
【００６１】
実験例３：ＮａＨＳ濃度による９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸の反応度の評価
本発明の９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸のＮａＨＳ（硫化水素）濃度による反応度を評価するために、以下の実験を行い、その結果を図９に示す。
具体的に、例１において調製された９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸を生理食塩水で５倍に希釈し、および次いで各希釈剤１００μＬを取り、それへ０〜０．４ｍＭのＮａＨＳを含有する０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）１００μＬを添加し、続いて３７℃で１５分間反応させた。次いで、不溶性物質の割合を決定するために、ＩＴＬＣを、生理食塩水を使用して展開した。
表９に示すとおり、９９ｍＴｃ−グルコン酸は硫化水素と反応し、および不溶性物質を最も生成し、０．１ｍＭ未満の濃度で濃度が増加するにつれて不溶性物質の生成が増加することが確認された。しかしながら、０．１ｍＭを超える濃度で平衡に達した。
【００６２】
９９ｍＴｃ−グルコヘプトナートは、硫化水素の濃度が高くなるにつれて、不溶性物質の生成が徐々に増加することが確認された。
９９ｍＴｃ−グルカラートもまた、硫化水素の濃度が高くなるにつれて、不溶性物質の生成が徐々に増加することが確認された。
一方、９９ｍＴｃ−シトラートは不溶性物質をほとんど生成しないことが確認された。
【００６３】
以上の結果から、本発明の９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸による不溶性物質の生成は、硫化水素の濃度によって変化することが確認され、およびしたがって、それは硫化水素の濃度測定に効果的に使用され得る。
【００６４】
実験例４：硫化水素が生成した炎症を起こしたイメージングの観察
硫化水素は、カラギーナンの投与によって誘発された炎症を起こした組織で発生したことが報告されている（Li L、Bhatia M、Zhu YZ、etal。FASEBJ。（2005）19：1196-1198; Bhatia M、Sidhapuriwala J、 Moochhala SM、etal。BrJPharmacol。（2005）145：141-144。）したがって、本発明に従って９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸を投与したとき、硫化水素が発生した炎症を起こした組織のイメージングが可能かどうかを確認するために、以下の実験を実施した。
【００６５】
＜４−１＞炎症を起こした組織のイメージング
１％カラギーナンを含有する生理食塩水３０μＬをマウスの右後足に注射し、および生理食塩水３０μＬをマウスの左後足に注射した。４時間後、例１でラベル化された３００μＣｉの９９ｍＴｃ−グルコナートまたは９９ｍＴｃ−グルコヘプトナートをマウスの尾静脈に注射した。１時間後、ＳＰＥＣＴ−ＣＴで後足を撮影し、結果を図１０に示す。
図１０に示すとおり、両方のイメージは、炎症が誘発された足の放射性同位元素摂取量が多い結果を示す。
言い換えれば、９９ｍＴｃ−グルコナートと９９ｍＴｃ−グルコヘプトナートの両方は、カラギーナンを投与された炎症を起こしたエリアの放射能が、生理食塩水を投与されたエリアの放射能よりも明らかに高いことを示した。したがって、硫化水素が生成した炎症を起こしたエリアをイメージングできることが証明された。
【００６６】
＜４−２＞炎症を起こしたエリアにおける硫化水素濃度の評価
炎症を起こしたエリアの硫化水素濃度が正常なエリアの硫化水素濃度よりも高いことを確認するために、文献に記載されている方法（AD Ang、A Konigstorfer、GI Giles、M Bhatia. AdvBiolChem、2012、2：360-365）を使用し以下のとおり測定した。４時間後、二酸化炭素ガスでマウスを安楽死させ、および足首を切り、および体重を測定した。氷で冷やした５０ｍＭ炭酸ナトリウムバッファー（ｐＨ９）５００μＬを添加し、３０秒間穏やかに、１分３０秒適度に、そして３０秒間激しく均質化した。１２００ｘｇで５分間遠心分離した後、上清を取得し、それに３５０μＬの１％酢酸亜鉛と５０μＬの１．５Ｍ水酸化ナトリウムの混合溶液４００μＬを添加し、続いてよく混合した。１２００ｘｇで５分間遠心分離した後、上清を捨てた。沈殿したペレットに、窒素を飽和させた蒸留水１ｍＬを添加し、１分間ボルテックスさせることにより混合させた。１２００ｘｇで５分間遠心分離した後、上清を捨てた。１ｇ／Ｌのアスコルビン酸を含む１６０μＬの２５ｍＭ水酸化ナトリウム溶液をペレットに加え、よく混合した。７．２Ｍ塩酸に溶解させた２０μＬの４７．５ｍのＭＤＭＰＤおよび１．２Ｍ塩酸に溶解した２０μＬの８０ｍＭのＦｅＣｌ３を添加し、および１０秒間ボルテックスした。室温で１５分間反応させた後、６６５ｎｍで吸光度を測定した。同じ方法で測定した標準サンプルを用いて標準定量曲線を作成し、および次いで定量した。
【００６７】
定量化の結果、生理食塩水で処理した足の硫化水素濃度は１９．８±４．４μＭ（ｎ＝３）であったが、カラギーナンで処理した足の硫化水素濃度は４３．７±３．５μＭ（ｎ＝３）、２倍以上になった。したがって、９９ｍＴｃ−グルコナートおよび９９ｍＴｃ−グルコヘプトナートの摂取量の増加は、硫化水素濃度の増加と相関していることが確認された。
【００６８】
本発明に従う９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸は、硫化水素が発生される炎症を起こした組織をイメージングすることができ、および濃度の増加は、処理された９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸の摂取が増加するかをとおして知られることができ、それゆえイメージングだけでなく、濃度の増加も確認できる。加えて、硫化水素濃度は蛍光分析により定量化および数値で表現され得るため、それは、炎症を起こした組織における硫化水素濃度の測定に効果的に使用され得る。
【００６９】
実験例５：中大脳動脈閉塞後に再灌流したマウス脳のイメージングの観察
マウスの脳内の血流が遮断されて再灌流された１２時間後に、脳内の硫化水素濃度が上昇したことが報告されている（Ren C、Du A、Li D、etal. BrainRes.（2010）1345：197 -205.）。そこで、本発明の９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸を投与したとき、中大脳動脈閉塞後の再灌流マウス脳において硫化水素濃度を測定およびイメージングできるかを確認するため、以下の実験を実施し、および結果を図１１に示す。
【００７０】
具体的には、中大脳動脈閉塞後の再灌流モデルは、Koizumiらの方法に従って構築された（Koizumi J、YoshidaY、Nakazawa T、et al. Jpn J Stroke（1986）8：1-8）。ケタミン（８０ｍｇ／ｋｇ）の筋肉内注射によりマウスを麻酔し、および頸動脈、内頸動脈、外頸動脈を首の皮膚を切開することにより順番に分離した。次いで、２７ゲージの針で外頸動脈に穴を開け、およびシリコーンでコーティングされたナイロン４．０糸を約１７ｍｍ挿入して中大脳動脈を閉じ、および２時間後にナイロン糸を再び取り外して血流を再開した。マウスの皮膚を縫合し、および１２時間回復させ、および例１において調製した９９ｍＴｃ−グルコン酸の１ｍＣｉと［１８Ｆ］ＦＤＧの１ｍＣｉを混合し、およびマウスの尾静脈に投与した。１時間後、マウスをエーテルで麻酔し、および頭蓋骨を解剖することにより脳を摘出した。抽出した脳を用いて厚さ１ｍｍの冠状切片を作製し、凍結し、およびＢＡＳ２５００イメージプレート(Fuji Film Co.)に−２０℃の冷凍庫で２０分間曝露した。切片を２０時間放置して１８Ｆの放射能を減衰させ、および冷凍庫で２４時間イメージプレートに曝露した。曝露した組織を１％の２，３，５−テトラゾリウムクロライド（ＴＴＣ）溶液で染色した。図１１において、ＴＴＣ染色は生きている脳組織を表し、［１８Ｆ］ＦＤＧはグルコース代謝の程度を表し、および９９ｍＴｃ−グルコン酸は硫化水素の発生部位を示す。
【００７１】
図１１に示すとおり、生きている組織はＴＴＣによって赤く染色された。［１８Ｆ］ＦＤＧイメージは糖代謝を示し、ＴＴＣで染色された赤いエリアとほぼ重なっていることがわかり得る。９９ｍＴｃ−グルコナートは、完全に死んだ脳組織や正常な脳組織ではなく、境界エリアで摂取されたため、再灌流後の損傷領域で摂取され、硫化水素の発生が高いと推定できる。
【００７２】
以上の結果から、中大脳動脈閉塞後の再灌流組織では硫化水素濃度が上昇したため、再灌流組織において硫化水素が発生したことが確認された。
加えて、本発明による９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸を使用して、硫化水素の検出、濃度測定、および中大脳動脈閉塞後の再灌流組織のイメージングが可能であることが確認された。
【００７３】
実験例６：９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸を投与した組織における９９ｍＴｃ蓄積の確認
以下の実験を、本発明による９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸が硫化水素を含む組織に投与されたときに９９ｍＴｃが蓄積されたかを確認するために実施した。
【００７４】
具体的には、ＮａＨＳを１．７ｍｇ／ｍＬの濃度でマトリゲルに溶解させ、およびＢＡＬＢ／ｃマウスの背中に５０μＬ皮下注射し、および１ｍＣｉの９９ｍＴｃ−グルコン酸を尾静脈に注射した。１時間後、マトリゲルを回収し、秤量し、および放射能を測定した。結果を使用して、摂取量（％ＩＤ／ｇ）を組織重量あたりの注入量に対して計算した。
【００７５】
９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する式１で表される化合物（９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸）を含む、本発明による硫化水素を検出または硫化水素の濃度を測定するための組成物は、様々な活性硫化物中、硫化水素のみを選択的に検出することができ、および不溶性物質の発生の度合いは、硫化水素の濃度に応じて変化した。
【００７６】
本発明の組成物を使用して、硫化水素の濃度を測定でき、硫化水素が発生した炎症を起こした組織のイメージング、および発生した硫化水素濃度の上昇を確認でき、硫化水素濃度を蛍光分析によって定量化および数値で表現できた。加えて、本発明の組成物を使用して、硫化水素の検出、濃度測定、および中大脳動脈閉塞後の再灌流組織のイメージングが可能であることが確認された。
【００７７】
したがって、本発明に従う、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物（９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸）を含む、硫化水素を検出するための、または硫化水素の濃度を測定するための組成物は、インビトロおよびインビボレベルにおいて硫化水素の検出または濃度測定を可能にし、およびそのため、硫化水素を検出するため、および硫化水素の濃度を測定するため、およびさらにまた硫化水素のインビボでの生物学的な役割を発見するため、とくに、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー病、心臓血管虚血、および脳血管虚血からなる群から選択される疾患または低酸素組織において硫化水素を検出する、イメージングする、および定量的に測定するために、有利に使用され得る。
加えて、９９ｍＴｃは他の放射性同位元素よりも供給が容易で価格競争力があるため、経済的な利点を有する。
【００７８】
産業上の利用可能性
本発明に従う、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物（９９ｍＴｃ−アルファ−ヒドロキシ酸）を含む、硫化水素を検出するための、または硫化水素の濃度を測定するための組成物は、インビトロおよびインビボレベルにおいて硫化水素の検出または濃度測定を可能にし、およびそのため、硫化水素を検出するため、および硫化水素の濃度を測定するため、およびさらにまた硫化水素のインビボでの生物学的な役割を発見するため、とくに、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー病、心臓血管虚血、および脳血管虚血からなる群から選択される疾患または低酸素組織において硫化水素を検出する、イメージングする、および定量的に測定するために、有利に使用され得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年5月7日(2021.5.7)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素を検出するための組成物：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【請求項２】
アルファ−ヒドロキシ酸が、以下の式２
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
で表される化合物である、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項３】
アルファ−ヒドロキシ酸が、Ｄ−グルコン酸、Ｄ−グルコヘプトン酸、ガラクトン酸、Ｄ−グルカル酸、酒石酸、クエン酸、グリコール酸、Ｄ−乳酸、Ｌ−乳酸、およびＤ−グルクロン酸からなる群から選択される、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項４】
組成物が硫化水素と反応し、不溶性材料を形成し、それによってイメージングを可能にする、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項５】
組成物が、対象動物から単離される組織または細胞において硫化水素を検出する、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項６】
組成物が、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー認知症、心臓血管虚血、脳血管虚血、および低酸素症からなる群から選択される疾患において硫化水素を検出する、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項７】
９９ｍＴｃを、式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩と反応させるステップを含有する、９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素を検出するための組成物の調製方法：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）；
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【請求項８】
還元剤、安定剤、賦形剤、およびバッファーからなる群から選択される１以上のアジュバントがさらに使用され得る、請求項７に記載の調製方法。
【請求項９】
９９ｍＴｃでラベル化されたアルファ−ヒドロキシ酸を有する、式１で表される化合物を含む、硫化水素の濃度を測定するための組成物：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【請求項１０】
組成物が、硫化水素を検出することによって、硫化水素が発生する疾患をイメージングするために使用される、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項１１】
疾患が、血管新生、炎症、がん、アルツハイマー認知症、心臓血管虚血、脳血管虚血、および低酸素症からなる群から選択される、請求項１０に記載のイメージングするための組成物。
【請求項１２】
疾患が、リウマチ性関節炎、非リウマチ性炎症性関節炎、ライム病に関連する関節炎、腎盂腎炎、腎炎、炎症性骨関節炎、髄膜炎、骨髄炎、炎症性腸疾患、虫垂炎、膵炎、敗血症、細菌感染に起因する炎症性疾患、心筋梗塞、心臓虚血、アンギーナ、狭心症、心筋症、心内膜炎、動脈硬化症、敗血症、糖尿病、脳卒中、肝硬変、喘息、パーキンソン病、アルツハイマー病、認知症、ダウン症候群、肺がん、乳房がん、子宮がん、卵巣がん、肝臓がん、脳がん、前立腺がん、甲状腺がん、神経内分泌腫瘍、胃がん、結腸がん、膵臓がん、膀胱がん、食道がん、および頭／首がんからなる群から選択される、請求項１０に記載のイメージングするための組成物。
【請求項１３】
組成物が、硫化水素を検出することによって、硫化水素が発生する疾患を診断するために使用される、請求項１に記載の硫化水素を検出するための組成物。
【請求項１４】
式２で表されるアルファ−ヒドロキシ酸またはそのアルカリ金属またはアルカリ土類金属塩、およびアジュバントを含む、硫化水素を検出するための、式１で表される化合物を調製するためのキット：
［式１］
Ｏ＝９９ｍＴｃ（Ｏ＝ＣＯ−−ＣＨＯ−−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２）２
（式１において、
Ｒは、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）
［式２］
ＨＯＯＣ−ＣＨＯＨ−（ＣＨＲ１）ｍ−ＣＨ２Ｒ２
（式２において、
Ｒ１およびＲ２は、独立して水素または−ＯＨであり、および、
ｍは、０〜２０の整数である）。
【請求項１５】
アジュバントが、ＳｎＣｌ２、アスコルビン酸、ゲンチシニン酸（gentisinic acid）、塩化カルシウム、塩化ナトリウム、ナトリウムホスファート、マンニトール、グルコース、ラクトース、およびナトリウムアスコルバートからなる群から選択される少なくとも１つである、請求項１４に記載のキット。
【国際調査報告】
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