(57)【要約】試料中の標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）を検出するための組成物及び方法が提供される。いくつかの実施形態では、本方法は、（ａ）試料を、（ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ（Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と、標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含む）、及び（ｉｉｉ）一本鎖であり（すなわち、「一本鎖検出ＤＮＡ」）、かつガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡと、接触させることと、（ｂ）一本鎖検出ＤＮＡの（Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質による）切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することと、を含む。また、例えば、細胞の内部で、一本鎖ＤＮＡ（例えば、非標的ｓｓＤＮＡ）を切断するための組成物及び方法も提供される。【選択図】図３Ａ
2021508238.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の標的ＤＮＡを検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、
（ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質、
（ｉｉ）前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と、前記標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含む、ガイドＲＮＡ、及び
（ｉｉｉ）一本鎖であり、かつ前記ガイドＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡ
と接触させることと、
（ｂ）前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質による前記一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することにより、前記標的ＤＮＡを検出することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記試料を前駆体ガイドＲＮＡアレイと接触させることを含み、前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、前記前駆体ガイドＲＮＡアレイを切断して、前記ガイドＲＮＡ及び少なくとも１つの追加のガイドＲＮＡを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記標的ＤＮＡが、二本鎖である、請求項１または２に記載の方法。
【請求項５】
前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記標的ＤＮＡが、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはパルボウイルスＤＮＡである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）またはＣａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）またはＣａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）タンパク質である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、細胞溶解物からのＤＮＡ分子を含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、細胞を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記接触が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの、細胞の内部で行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、真核細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記標的ＤＮＡが、２００ｆＭという低い濃度で検出され得る、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料中に存在する前記標的ＤＮＡの量を決定することを含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記決定が、
前記検出可能なシグナルを測定して試験測定値を生成することと、
参照試料または細胞によって生成される検出可能なシグナルを測定して、参照測定値を生成することと、
前記試験測定値を前記参照測定値と比較して、前記試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することと
を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
検出可能なシグナルの測定が、金ナノ粒子ベースの検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学検出、及び半導体ベースの感知のうちの１つ以上を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、蛍光発光色素対を含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記蛍光発光色素対が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断前に、ある量の検出可能なシグナルを生成し、前記検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に減少する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、切断される前に第１の検出可能なシグナルを生成し、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に第２の検出可能なシグナルを生成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に増加する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記蛍光発光色素対が、クエンチャー／蛍光体対である、請求項１８または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、２つ以上の蛍光発光色素対を含む、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記２つ以上の蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対及びクエンチャー／蛍光体対を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、修飾核酸塩基、修飾糖部分、及び／または修飾核酸結合を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試料中の核酸を増幅すること含む、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記増幅が、等温増幅を含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
前記等温増幅が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記増幅が、ステップ（ａ）の前記接触の前に開始する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記増幅が、ステップ（ａ）の前記接触と同時に開始する、請求項２７〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
試料中の標的ＤＮＡを検出するためのキットであって、
（ａ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と標的ＤＮＡに相補的なガイド配列とを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、または前記ガイドＲＮＡを含む前駆体ガイドＲＮＡアレイ、または前記前駆体ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、及び、
（ｂ）一本鎖であり、かつ前記ガイドＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない、標識された検出ＤＮＡ
を含む、前記キット。
【請求項３３】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質をさらに含む、請求項３２に記載のキット。
【請求項３４】
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３５】
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）またはＣａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）タンパク質である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３６】
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）またはＣａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）タンパク質である、請求項３３に記載のキット。
【請求項３７】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、蛍光発光色素対を含む、請求項３２〜３６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３８】
前記蛍光発光色素対が、ＦＲＥＴ対である、請求項３７に記載のキット。
【請求項３９】
前記蛍光発光色素対が、クエンチャー／蛍光体対である、請求項３７に記載のキット。
【請求項４０】
前記一本鎖検出ＤＮＡが、２つ以上の蛍光発光色素対を含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４１】
前記２つ以上の蛍光発光色素対が、第１の検出可能なシグナルを生成する第１の蛍光発光色素対、及び第２の検出可能なシグナルを生成する第２の蛍光発光色素対を含む、請求項４０に記載のキット。
【請求項４２】
核酸増幅成分をさらに含む、請求項３２〜４１のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４３】
前記核酸増幅成分が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）のための成分である、請求項４２に記載のキット。
【請求項４４】
一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を切断する方法であって、
標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む、核酸の集団を、
（ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び
（ｉｉ）前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と、前記標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含む、ガイドＲＮＡ
と接触させることを含み、
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、前記複数の非標的ｓｓＤＮＡを切断する、
前記方法。
【請求項４５】
前記試料を前駆体ガイドＲＮＡアレイと接触させることを含み、前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、前記前駆体ガイドＲＮＡアレイを切断して、前記ガイドＲＮＡ及び少なくとも１つの追加のガイドＲＮＡを生成する、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記接触が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの、細胞の内部である、請求項４４または請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記細胞が、真核細胞である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記真核細胞が、植物細胞である、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記非標的ｓｓＤＮＡが、前記細胞に対して外来性である、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記非標的ｓｓＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５２】
前記標的ＤＮＡが、二本鎖である、請求項４４〜５０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記標的ＤＮＡが、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはパルボウイルスＤＮＡである、請求項４４〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
本出願は、２０１７年１１月２２日に出願された米国仮特許出願第６２／５９０，１０６号、２０１８年２月５日に出願された米国仮特許出願第６２／６２６，５９３号、及び２０１８年２月１４日に出願された米国特許出願第１５／８９７，０８９号の利益を主張するものであり、これらの出願は参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
連邦政府の支援による研究に関する記述
本発明は、米国国立科学財団から授与された助成金番号１２４４５５７による政府の援助を受けて行われた。政府は、本発明において特定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
序文
細菌の適応免疫システムは、ＲＮＡ誘導核酸切断のために、ＣＲＩＳＰＲ（クラスター化された規則的な間隔の短い回文構造反復）及びＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）タンパク質を用いる。これにより、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ＲＮＡ誘導核酸干渉を介して細菌及び古細菌に適応免疫を付与する。抗ウイルス免疫を提供するために、処理されたＣＲＩＳＰＲアレイ転写産物（ｃｒＲＮＡ）は、スペーサーとして知られるウイルス由来のｃｒＲＮＡのセグメントに配列相補性を持つ核酸を認識する、Ｃａｓタンパク質含有監視複合体を用いて組み立てられる。
【０００４】
クラス２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステムは、ＲＮＡに結合された単一のＣａｓタンパク質（エフェクタータンパク質、例えば、Ｃｐｆ１などのＶ型Ｃａｓエフェクタータンパク質）が、標的化された配列への結合及び標的化された配列の切断を担う、合理化されたバージョンである。これらの最小限のシステムのプログラム可能な性質は、ゲノム操作の分野に変革をもたらし続ける汎用性の高い技術としてのそれらの使用を容易にしている。
【発明の概要】
【０００５】
クラス２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓシステム（例えば、Ｃａｓ１２ファミリーシステムなどのＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）は、単一のエフェクタータンパク質を含むエフェクターモジュールによって特徴付けられる。例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステムでは、エフェクタータンパク質（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼ（例えば、Ｃａｓ１２ａタンパク質））は、対応するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ１２ａガイドＲＮＡ）と相互作用（結合）し、ガイドＲＮＡと標的核酸分子内の標的配列との間の塩基対合を介して標的核酸中の特定の部位に標的化される、リボ核タンパク質（ＲＮＰ）複合体を形成する。
【０００６】
本開示は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質（例えば、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）及びＣ２ｃ１（Ｃａｓ１２ｂ）などのＣａｓ  １２タンパク質）が、標的ＤＮＡの検出によって活性化されると、非標的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を無差別に切断できる、という発見を利用する組成物及び方法を提供する。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）が、ガイドＲＮＡによって活性化される（試料が、ガイドＲＮＡがハイブリダイズする標的ＤＮＡを含む（すなわち、試料が標的化されたＤＮＡを含む）ときに発生する）と、タンパク質は、ｓｓＤＮＡ（すなわち、非標的ｓｓＤＮＡ、すなわち、ガイドＲＮＡのガイド配列がハイブリダイズしないｓｓＤＮＡ）を無差別に切断するヌクレアーゼとなる。したがって、標的化されたＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）が試料中に（例えば、いくつかの場合には、閾値量を超えて）存在するとき、結果は試料中のｓｓＤＮＡの切断であり、これは任意の簡便な方法を使用して（例えば、標識された一本鎖検出ＤＮＡを使用して）検出することができる。
【０００７】
試料中の標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）を検出するための組成物及び方法が提供される。いくつかの場合には、本方法は、（ａ）試料を、（ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）、（ｉｉ）ガイドＲＮＡ（Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域、及び標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列を含む）、ならびに（ｉｉｉ）一本鎖であり（すなわち、「一本鎖検出ＤＮＡ」）、かつガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡと、接触させることと、（ｂ）一本鎖検出ＤＮＡの（Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質による）切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することと、を含む。いくつかの場合には、一本鎖検出ＤＮＡは、蛍光発光色素対を含む（例えば、蛍光発光色素対は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対、クエンチャー／蛍光体対である）。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、ウイルスＤＮＡ（例えば、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、パルボウイルスなど）である。
【０００８】
また、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を切断するための組成物及び方法も提供される。いくつかの場合には、そのような方法は、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む、核酸の集団を、（ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）、ならびに（ｉｉ）（Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域、及び標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列を含む）ガイドＲＮＡと、接触させることを含み、ここで、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、該複数の非標的ｓｓＤＮＡを切断する。いくつかの場合には、接触は、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞などの細胞の内部で（例えば、インビトロ、エクスビボ、インビボで）行われる。
【０００９】
また、対象の方法を実践するための組成物（例えば、キット）も提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１０】
【図１Ａ】様々なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質のアミノ酸配列を提供する（Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂ配列が示される）。
【図１Ｂ】様々なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質のアミノ酸配列を提供する（Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂ配列が示される）。
【図１Ｃ】様々なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質のアミノ酸配列を提供する（Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂ配列が示される）。
【図１Ｄ】様々なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質のアミノ酸配列を提供する（Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂ配列が示される）。
【図１Ｅ】様々なＶ型１ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質のアミノ酸配列を提供する（Ｃａｓ１２ａ及びＣａｓ１２ｂ配列が示される）。
【図２】例示的なガイドＲＮＡ配列（例えば、ｃｒＲＮＡ反復配列及び例示的な単一ガイドＲＮＡ配列）及び例示的なＰＡＭ配列を提供する。
【図３Ａ】非相補鎖切断に関するデータを提示する。
【図３Ｂ】非相補鎖切断に関するデータを提示する。
【図４Ａ】Ｃａｓ１２ａによる非特異的ＤＮａｓｅ活性に関するデータを提示する。
【図４Ｂ】Ｃａｓ１２ａによる非特異的ＤＮａｓｅ活性に関するデータを提示する。
【図５Ａ】非標的鎖切断に関するデータを提示する。
【図５Ｂ】非標的鎖切断に関するデータを提示する。
【図６】ＲｕｖＣヌクレアーゼがｓｓＤＮＡのトランス切断の原因であることを示すことに関するデータを提示する。
【図７】Ｍ１３ファージｓｓＤＮＡの急速な「細断」に関するデータを提示する。
【図８】ＦＱベースアッセイを使用した検出に関するデータを提示する。
【図９Ａ】ＰＡＭ近位端でのミスマッチに関するデータを提示する。
【図９Ｂ】ＰＡＭ近位端でのミスマッチに関するデータを提示する。
【図１０】ターンオーバー動態に関するデータを提示する。
【図１１Ａ】対象の検出方法を使用したウイルス血清型の区別に関するデータを提示する。
【図１１Ｂ】対象の検出方法を使用したウイルス血清型の区別に関するデータを提示する。
【図１２】ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２ａによるＤＮＡ切断の概略モデルを提示する。
【図１３】図１３Ａ〜１３Ｃは、Ｃａｓ１２ａ標的認識が非特異的一本鎖ＤＮＡ切断を活性化することを示すデータを提示する。Ａ：５’オーバーハング粘着性の切断を示す切断部位を有するｄｓＤＮＡ基質を標的とするＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体の図解である。Ｂ：インビトロで環状の一本鎖Ｍ１３  ＤＮＡファージを標的とする精製されたＬｂａＣａｓ１２ａの経時変化は、強力な細断パターンを示す。Ｃ：Ｍ１３  ｓｓＤＮＡファージを標的とする精製されたＳｐｙＣａｓ９の経時変化である。
【図１４】図１４Ａ〜１４Ｃは、Ｃａｓ１２ａトランス切断活性が相補的活性化因子を必要とすることを示すデータを提示する。Ａ：示されたとおりのモル比のＬｂａＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡでインキュベートされた放射性標識された標的ｄｓＤＮＡ、またはＢ：非特異的ｓｓＤＮＡである。各点は、反応完了時、３７℃で３０分後の定量化された切断％を表す。Ｃ：ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ活性化因子を使用したＬｂＣａｓ１２ａトランス切断のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ動態である。
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、トランス切断活性化の特異性には、ＰＡＭ認識及びＤＮＡ巻き戻しが関与することを示すデータを提示する。Ａ：示された活性化因子を含む変性ＰＡＧＥゲル上のトランス切断産物である。Ｂ：示されたミスマッチを有するｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ活性化因子を使用して観察されたトランス切断速度である。Ｃ：ＬｂａＣａｓ１２ａは、２つの密接に関連するｄｓＤＮＡ  ＨＰＶ配列を区別することができる。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｃは、非特異的ｓｓＤＮＡ切断活性がＶ型ＣＲＩＳＰＲシステム全体で保存されていることを示すデータを提示する。Ａ：示されたＶ型エフェクタータンパク質を強調表示した系統樹である。Ｂ：ＩＩ型エフェクターＳｐｙＣａｓ９ではなく、Ｖ型エフェクタータンパク質にわたる活性化因子依存性トランス切断を示す切断ゲルである。Ｃ：シス及びトランス切断のＰＡＭ依存性及びＰＡＭ非依存性活性化のモデル。
【図１７】標的鎖認識が一本鎖ＤＮＡ切断のための前提条件であることを示すデータを提示する。
【図１８】図１８Ａ〜１８Ｃは、ＲｕｖＣヌクレアーゼが非特異的ＤＮａｓｅ活性の原因であることを示すデータを提示する。
【図１９】環状の一本鎖Ｍ１３  ＤＮＡファージが、事前に活性化されたＬｂａＣａｓ１２ａ複合体によってトランスで分解されることを示すデータを提示する。
【図２０】図２０Ａ〜２０Ｂは、ＬｂａＣａｓ１２ａがトランス切断のためにｄｓＤＮＡプラスミドによって活性化されることを示すデータを提示する。
【図２１】ＬｂａＣａｓ１２ａトランス切断が、相補的かつ非特異的なｓｓＤＮＡを分解するが、ｓｓＲＮＡは分解しないことを示すデータを提示する。
【図２２】Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ動態がｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ活性化因子による強力なトランス切断活性を明らかにすることを示すデータを提示する。
【図２３】ｄｓＤＮＡ活性化因子におけるＰＡＭ配列及びＰＡＭ近位ミスマッチがトランス活性化に対する特異性を提供することを示すデータを提示する。
【図２４】標記の検出方法（例えば、標識された検出ｓｓＤＮＡ）を使用して検出されたＨＰＶ検出アッセイの経時変化を示すデータを提示する。
【図２５】図２５Ａ〜２５Ｃは、Ｃａｓ１２ａ標的認識が非特異的一本鎖ＤＮＡ切断を活性化することを示すデータを提示する。
【図２６】図２６Ａ〜２６Ｄは、Ｃａｓ１２ａ  ｓｓＤＮＡトランス切断の動態に関連するデータを提示する。
【図２７】図２７Ａ〜２７Ｃは、トランス切断活性化の特異性及び保存を示すデータを提示する。
【図２８】図２８Ａ〜２８Ｄは、ＤＥＴＥＣＴＲによるヒト試料中のＨＰＶ１６型及び１８型の迅速な識別を示すデータを提示する。
【図２９】Ｃａｓ１２ａによるシス及びトランス切断のＰＡＭ依存性及びＰＡＭ非依存性活性化の概略モデルを提示する。
【図３０】Ｃａｓ１２及びＣａｓ９タンパク質の精製を示すデータを提示する。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｂは、ＬｂＣａｓ１２ａがＤＮＡ活性化された一般的なＤＮａｓｅであることを示すデータを提示する。
【図３２Ａ】標的鎖認識が一本鎖ＤＮＡ切断のための前提条件であることを示すデータを提示する。
【図３２Ｂ】標的鎖認識が一本鎖ＤＮＡ切断のための前提条件であることを示すデータを提示する。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｃは、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインが、活性化因子依存性、非特異的ＤＮａｓｅ活性の原因であることを示すデータを提示する。
【図３４】図３４Ａ〜３４Ｃは、ＬｂＣａｓ１２ａトランス切断が、相補的かつ非特異的ｓｓＤＮＡを分解するが、ｓｓＲＮＡは分解しないことを示すデータを提示する。
【図３５】図３５Ａ〜３５Ｂは、Ｃａｓ１２ａによる標的鎖切断が非特異的ｓｓＤＮａｓｅ活性の誘発に必要でないことを示すデータを提示する。
【図３６】図３６Ａ〜３６Ｅは、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ活性化因子による強力なトランス切断活性を明らかにするＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ分析を示すデータを提示する。
【図３７】ｄｓＤＮＡ活性化因子におけるＰＡＭ配列及びＰＡＭ近位ミスマッチがトランス活性化に対する特異性を提供することを示すデータを提示する。
【図３８】活性化因子依存性、非特異的ｓｓＤＮＡ切断活性が、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ干渉タンパク質全体で保存されることを示すデータを提示する。
【図３９】図３９Ａ〜３９Ｅは、Ｃａｓ１２ａが２つの密接に関連するＨＰＶ配列を区別することができることを示すデータを提示する。
【図４０】図４０Ａ〜４０Ｂは、Ｃａｓ１２ａ検出と組み合わせた等温増幅が、アトモルの感度を達成することができるＤＥＴＥＣＴＲをもたらすことを示すデータを提示する。
【図４１Ａ】ＤＥＴＥＣＴＲによるヒト細胞株及び患者試料中のＨＰＶ１６型及び１８型の識別を示すデータを提示する。
【図４１Ｂ】ＤＥＴＥＣＴＲによるヒト細胞株及び患者試料中のＨＰＶ１６型及び１８型の識別を示すデータを提示する。
【図４１Ｃ】ＤＥＴＥＣＴＲによるヒト細胞株及び患者試料中のＨＰＶ１６型及び１８型の識別を示すデータを提示する。
【図４１Ｄ】ＤＥＴＥＣＴＲによるヒト細胞株及び患者試料中のＨＰＶ１６型及び１８型の識別を示すデータを提示する。
【図４２】図４２Ａ〜４２Ｂは、ヒト臨床試料中のＰＣＲならびにＨＰＶのハイブリッドキャプチャ検証及び遺伝子型決定を示すデータを提示する。
【図４３Ａ】Ｃａｓ１２ｄ及びＣａｓ１２ｅタンパク質を使用したＤＥＴＥＣＴＲによる標的核酸の識別を示すデータを提示する。
【図４３Ｂ】Ｃａｓ１２ｄ及びＣａｓ１２ｅタンパク質を使用したＤＥＴＥＣＴＲによる標的核酸の識別を示すデータを提示する。
【図４４】ＤＥＴＥＣＴＲを使用した茶色または青い目の原因であるＨＥＲＣ２遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰ）の識別を示すデータを提示する。
【図４５】（ＤＥＴＥＣＴＲアッセイを使用した）ヒトの唾液からのＸＩＳＴ（Ｘ染色体内）またはＳＲＹ（Ｙ染色体内）遺伝子の検出によるＸまたはＹ染色体の識別を示すデータを提示する。
【図４６】迅速なポイントオブケア診断のプラットフォームとしてのＤＥＴＥＣＴＲを示す概略図を提示する。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
本明細書で互換的に使用される「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、リボヌクレオチドまたはデオキシヌクレオチドのいずれかである、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。したがって、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、一本鎖ＤＮＡ、二本鎖ＤＮＡ、マルチストランドＤＮＡ、一本鎖ＲＮＡ、二本鎖ＲＮＡ、マルチストランドＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、ならびにプリン及びピリミジン塩基、または他の天然の、化学的もしくは生化学的に修飾された、非天然の、または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーを包含する。
【００１２】
「オリゴヌクレオチド」という用語は、一本鎖または二本鎖核酸（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、または修飾核酸）の４〜１００ヌクレオチドのポリヌクレオチドを指す。しかしながら、本開示の目的に関して、オリゴヌクレオチドの長さに上限はない。オリゴヌクレオチドは、「オリゴマー」または「オリゴ」としても知られ、遺伝子から単離、転写（インビトロ及び／またはインビボで）、または化学的に合成することができる。「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語は、記載されている実施形態に適用可能である場合、一本鎖（センスまたはアンチセンスなど）及び二本鎖ポリヌクレオチドを含むことが理解されるべきである。
【００１３】
「ハイブリダイズ可能」または「相補的」または「実質的に相補的」とは、核酸（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ）が、非共有結合的に結合する、すなわち、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対及び／またはＧ／Ｕ塩基対を形成して、温度及び溶液のイオン強度の適切なインビボ及び／またはインビトロ条件下で、配列特異的な逆平行の様式で別の核酸に「アニーリング」または「ハイブリダイズ」する（つまり、核酸が、相補的な核酸に特異的に結合する）ことを可能にする、ヌクレオチドの配列を含むことを意味する。標準的なＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対合としては、チミジン／チミジン（Ｔ）とのアデニン／アデノシン（Ａ）対合、ウラシル／ウリジン（Ｕ）とのＡ対合、及びシトシン／シチジン（Ｃ）とのグアニン／グアノシン（Ｇ）対合が挙げられる。加えて、２つのＲＮＡ分子（例えば、ｄｓＲＮＡ）間のハイブリダイゼーションに関して、及びＤＮＡ分子のＲＮＡ分子とのハイブリダイゼーション（例えば、ＤＮＡ標的核酸が、ガイドＲＮＡと塩基対合する場合など）に関して、ＧはＵと塩基対合することもできる。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対合は、ｍＲＮＡ中のコドンとのｔＲＮＡ抗コドン塩基対合の文脈において、遺伝コードの縮重（すなわち、重複性）の部分的な原因となっている。したがって、本開示の文脈において、（例えば、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（例えば、ｄｓＲＮＡ二重鎖）の、ガイドＲＮＡと塩基対合する標的核酸（例えば、標的ＤＮＡ）の）Ｇは、Ｕ及びＣの両方に対して相補的であると見なされる。例えば、Ｇ／Ｕ塩基対は、ガイドＲＮＡ分子のタンパク質結合セグメント（ｄｓＲＮＡ二重鎖など）の所与のヌクレオチド位置で作製することができるが、その位置は非相補的とは見なされず、代わりに相補的と見なされる。
【００１４】
ハイブリダイゼーションは、２つの核酸が相補的な配列を含有することを必要とするが、塩基間のミスマッチは可能である。２つの核酸間のハイブリダイゼーションに適切な条件は、当該技術分野で周知の可変要素である、核酸の長さ及び相補性の程度に依存する。２つのヌクレオチド配列間の相補性の程度が大きいほど、それらの配列を有する核酸のハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）の値は大きくなる。典型的には、ハイブリダイズ可能な核酸の長さは、８ヌクレオチド以上（例えば、１０ヌクレオチド以上、１２ヌクレオチド以上、１５ヌクレオチド以上、２０ヌクレオチド以上、２２ヌクレオチド以上、２５ヌクレオチド以上、または３０ヌクレオチド以上）である。
【００１５】
ポリヌクレオチドの配列は、特異的にハイブリダイズ可能であるためにその標的核酸の配列に対して１００％相補的である必要はないことが理解されている。その上、ポリヌクレオチドは、１つ以上のセグメントにわたってハイブリダイズすることができ、介在性のまたは隣接するセグメントはハイブリダイゼーション事象（ループ構造またはヘアピン構造、「バルジ」など）に関与しない。ポリヌクレオチドは、それがハイブリダイズする標的核酸配列内の標的領域に対して、６０％以上、６５％以上、７０％以上、７５％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、９９．５％以上、または１００％の配列相補性を含むことができる。例えば、アンチセンス化合物の２０ヌクレオチド中１８ヌクレオチドが標的領域に相補的であり、それゆえに特異的にハイブリダイズするであろうアンチセンス核酸は、９０パーセントの相補性を示す。残りの非相補的なヌクレオチドは、相補的なヌクレオチドと密集しているか、あるいは相補的なヌクレオチドが散在していてもよく、互いにまたは相補的なヌクレオチドに近接する必要はない。核酸内の核酸配列の特定の区間の間の相補性パーセントは、任意の簡便な方法を使用して決定することができる。例示的な方法は、ＢＬＡＳＴプログラム（基本的なローカルアライメント検索ツール）及びＰｏｗｅｒＢＬＡＳＴプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９９０，２１５，４０３−４１０、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．，１９９７，７，６４９−６５６）を含むか、または、例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ（Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．，１９８１，２，４８２−４８９）のアルゴリズムを使用する、デフォルト設定を用いたＧａｐプログラム（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐａｃｋａｇｅ，Ｖｅｒｓｉｏｎ  ８  ｆｏｒ  Ｕｎｉｘ，Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐａｒｋ，Ｍａｄｉｓｏｎ  Ｗｉｓ．）を使用する。
【００１６】
「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」という用語は、本明細書で互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指し、これは、コードされた及びコードされていないアミノ酸、化学的もしくは生化学的に修飾されたかまたは誘導体化されたアミノ酸、ならびに修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドを含むことができる。
【００１７】
「結合」は、（例えば、ポリペプチドのＲＮＡ結合ドメイン、標的核酸への結合などへの言及に関して）本明細書で使用される場合、高分子間（例えば、タンパク質と核酸との間、ガイドＲＮＡと標的核酸との間など）の非共有結合性相互作用を指す。非共有結合性相互作用の状態にある間、高分子は「会合する」または「相互作用する」または「結合する」と言われる（例えば、分子Ｘが分子Ｙと相互作用すると言われる場合、分子Ｘが分子Ｙと非共有結合性様式で結合することを意味する）。結合相互作用の全ての構成要素が配列特異的である必要はないが（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基との接触）、結合相互作用の一部分は、配列特異的であり得る。結合相互作用は、一般に、１０−６Ｍ未満、１０−７Ｍ未満、１０−８Ｍ未満、１０−９Ｍ未満、１０−１０Ｍ未満、１０−１１Ｍ未満、１０−１２Ｍ未満、１０−１３Ｍ未満、１０−１４Ｍ未満、または１０−１５Ｍ未満の解離定数（Ｋｄ）を特徴とする。「親和性」は、結合の強さを指し、結合親和性の増加はより低いＫｄに相関している。
【００１８】
「結合ドメイン」は、別の分子に非共有結合的に結合することができるタンパク質ドメインを意味する。結合ドメインは、例えば、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合ドメイン）、及び／またはタンパク質分子（タンパク質結合ドメイン）に結合することができる。タンパク質結合ドメインを有するタンパク質の場合、それは、いくつかの場合には、それ自体に結合（して、ホモ二量体、ホモ三量体などを形成）することができ、かつ／または、それは、異なるタンパク質（複数可）の１つ以上の領域に結合することができる。
【００１９】
「保存アミノ酸置換」という用語は、類似した側鎖を有するアミノ酸残基のタンパク質における互換性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸の群は、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、及びイソロイシンからなり、脂肪族−ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸の群は、セリン及びスレオニンからなり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸の群は、アスパラギン及びグルタミンからなり、芳香族側鎖を有するアミノ酸の群は、フェニルアラニン、チロシン、及びトリプトファンからなり、塩基性側鎖を有するアミノ酸の群は、リジン、アルギニン、及びヒスチジンからなり、酸性側鎖を有するアミノ酸の群は、グルタメート及びアスパルテートからなり、硫黄含有側鎖を有するアミノ酸の群は、システイン及びメチオニンからなる。例示的な保存アミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン−グリシン、及びアスパラギン−グルタミンである。
【００２０】
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定の「配列同一性」のパーセントを有する。これは、整列したときに、そのパーセントの塩基またはアミノ酸が、それら２つの配列を比較したときに同一であり、かつ同じ相対位置にあることを意味する。配列同一性は、いくつかの異なる方法で決定することができる。配列同一性を決定するために、ワールドワイドウェブ上でｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｌｉ．ｇｏｖ／ＢＬＡＳＴ、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｔｃｏｆｆｅｅ／、ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｍｓａ／ｍｕｓｃｌｅ／、ｍａｆｆｔ．ｃｂｒｃ．ｊｐ／ａｌｉｇｎｍｅｎｔ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／〜ｐｈｙｒｅ２／などのサイトで入手可能である、様々な方法及びコンピュータープログラム（例えば、ＢＬＡＳＴ、Ｔ−ＣＯＦＦＥＥ、ＭＵＳＣＬＥ、ＭＡＦＦＴ、Ｐｈｙｒｅ２、など）を使用して、配列を整列させることができる。例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０），Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−１０を参照されたい。
【００２１】
本明細書で互換的に使用される「ＤＮＡ調節配列」「制御要素」、及び「調節要素」という用語は、非コード配列（例えば、ガイドＲＮＡ）もしくはコード配列（例えば、タンパク質コード）の転写を提供及び／または調節する、ならびに／あるいはコードされたポリペプチドの翻訳を調節する、転写及び翻訳制御配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナル、ターミネーター、タンパク質分解シグナルなどを指す。
【００２２】
本明細書で使用する場合、「プロモーター配列」とは、ＲＮＡポリメラーゼと結合し、下流（３’方向）のコードまたは非コード配列の転写を開始することができる、ＤＮＡ調節領域である。真核生物プロモーターは、常にではないが多くの場合、「ＴＡＴＡ」ボックス及び「ＣＡＴ」ボックスを含有する。誘導性プロモーターを含む様々なプロモーターを使用して、本開示の様々な核酸（例えば、ベクター）を駆動することができる。
【００２３】
本明細書で使用される場合、「天然型」または「非修飾」または「野生型」という用語は、核酸、ポリペプチド、細胞、または生物に適用される場合、天然に見出される核酸、ポリペプチド、細胞、または生物を指す。
【００２４】
本明細書で使用される場合、「組み換え」とは、特定の核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）が、自然分類系において見出される内因性核酸から区別可能な構造的コードまたは非コード配列を有する構築物をもたらすクローニング、制限、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、及び／またはライゲーションステップの様々な組み合わせの産物であることを意味する。ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ断片から、または一連の合成オリゴヌクレオチドから組み立てられて、細胞または無細胞転写及び翻訳システムに含有される組み換え転写単位から発現が可能である合成核酸を提供することができる。また、関連配列を含むゲノムＤＮＡも、組み換え遺伝子または転写単位の形成において使用することができる。非翻訳ＤＮＡの配列は、そのような配列がコード領域の操作または発現に干渉しない、オープンリーディングフレームから５’または３’に存在してもよく、実際に様々な機序による所望の産生物の産生を調節するように作用してもよい（下記の「ＤＮＡ調節配列」を参照）。あるいは、翻訳されていないＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ）をコードするＤＮＡ配列もまた、組み換えと見なされ得る。したがって、例えば、「組み換え」核酸という用語は、天然型ではない、例えば、ヒト介入を通して、それがなければ分離されている、配列の２つのセグメントの人工的な組み合わせによって作製されるものを指す。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学的合成手段によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子工学的技法によっての、いずれかで達成される。これは通常、コドンを、同じアミノ酸、保存的アミノ酸、または非保存的アミノ酸をコードするコドンで置換するために行われる。あるいは、所望の機能の核酸セグメントを一緒に接合して、所望の機能の組み合わせを生成するために実施される。この人工的な組み合わせは、多くの場合、化学的合成手段によって、または核酸の単離されたセグメントの人工的な操作、例えば、遺伝子工学的技法によっての、いずれかで達成される。組み換えポリヌクレオチドがポリペプチドをコードする場合、コードされるポリペプチドの配列は、天然型（「野生型」）であり得るか、または天然型配列のバリアント（例えば、変異体）であり得る。したがって、「組み換え」ポリペプチドという用語は、その配列が天然に発生しないポリペプチドを必ずしも指すわけではない。代わりに、「組み換え」ポリペプチドは、組み換えＤＮＡ配列によってコードされるが、ポリペプチドの配列は、天然型（「野生型」）か、または非天然型（例えば、バリアント、変異体など）であり得る。したがって、「組み換え」ポリペプチドは、ヒト介入の結果であるが、天然型アミノ酸配列であり得る。
【００２５】
「ベクター」または「発現ベクター」は、別のＤＮＡセグメント、すなわち、「挿入」が細胞内の結合されたセグメントの複製をもたらすように結合され得る、プラスミド、ファージ、ウイルス、またはコスミドなどのレプリコンである。
【００２６】
「発現カセット」は、プロモーターに動作可能に連結されたＤＮＡコード配列を含む。「動作可能に連結した」は、並立を指し、そのように記載される構成要素は、それらがその意図される様式で機能することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターは、当該プロモーターがその転写または発現に影響を及ぼす場合、コード配列と動作可能に連結している。
【００２７】
「組み換え発現ベクター」または「ＤＮＡ構築物」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ベクター及び１つの挿入を含むＤＮＡ分子を指す。組み換え発現ベクターは通常、挿入（複数可）を発現及び／もしくは増殖する目的のために、または他の組み換えヌクレオチド配列の構築のために生成される。挿入（複数可）は、プロモーター配列に動作可能に連結されてもされなくてもよく、ＤＮＡ調節配列に動作可能に連結されてもされなくてもよい。
【００２８】
任意の所与の成分、または成分の組み合わせは、非標識であり得るか、または標識部分で検出可能に標識され得る。いくつかの場合には、２つ以上の成分が標識されている場合、それらは互いに区別可能である標識部分で標識され得る。
【００２９】
分子及び細胞生化学における一般的な方法は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＨａＲＢｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ  ２００１）、Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ  Ｅｄ．（Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９９）、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ（Ｂｏｌｌａｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９６）、Ｎｏｎｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（Ｗａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９９）、Ｖｉｒａｌ  Ｖｅｃｔｏｒｓ（Ｋａｐｌｉｆｔ＆Ｌｏｅｗｙ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９５）、Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍａｎｕａｌ（Ｉ．Ｌｅｆｋｏｖｉｔｓ  ｅｄ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  １９９７）、及びＣｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄｏｙｌｅ＆Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ  １９９８）などの一般的な教科書において見出すことができ、それらの開示は参照により本明細書に組み込まれる。
【００３０】
本発明をさらに記載する前に、本発明は、記載される特定の実施形態に限定されず、したがって、言うまでもなく、変化し得ることを理解されたい。本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態を記載するためのものに過ぎず、本発明の範囲は添付の特許請求の範囲によってのみ限定されるため、限定するものとしては意図されないことも理解されたい。
【００３１】
値の範囲が提供される場合、文脈が別途明確に指示しない限り、下限値の単位の１０分の１までの、その範囲の上限値と下限値との間の各介在値、ならびにその表示範囲の任意の他の表示値または介在値が、本発明に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限値及び下限値は、独立して、そのより小さい範囲内に含まれてもよく、また、表示範囲内の任意の具体的な除外限度に従って、本発明に包含される。表示範囲がそれらの限界値のうちの一方または両方を含む場合、それらの包含される限界値のうちのいずれかまたは両方を除外する範囲もまた、本発明に包含される。
【００３２】
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する分野の当業者によって一般的に理解される意味と同じ意味を有する。本明細書に記載される方法及び材料と同様もしくは同等の任意の方法及び材料を、本発明の実践または試験においても使用することができるが、好ましい方法及び材料がこれから記載される。本明細書で言及される全ての刊行物は、それらの刊行物が引用されるものに関連して方法及び／または材料を開示及び記載するために、参照により本明細書に組み込まれる。
【００３３】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される場合、文脈が別途明らかに規定しない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は複数の指示対象を含むことに留意しなければならない。したがって、例えば、「Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質」への言及は、複数のそのようなＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質を含み、「ガイドＲＮＡ」への言及は、１つ以上のガイドＲＮＡ及び当業者に既知のそれらの同等物などへの言及を含む。特許請求の範囲があらゆる任意の要素を除外するように作成され得ることにさらに留意されたい。したがって、この記述は、特許請求の範囲の要素の列挙に関して、「単に」、「のみ」などのような排他的な用語法の使用、または「否定的な」制限の使用に対する先行基準として役立つことが意図される。
【００３４】
明確化のために別個の実施形態の文脈において記載される本発明のある特定の特徴を、単一の実施形態において組み合わせて提供することもできることが理解される。反対に、簡潔化のために単一の実施形態の文脈において記載される本発明の様々な特徴を、別個に、または任意の好適な副組み合わせで提供することもできる。本発明に関連する実施形態の全ての組み合わせは、本発明によって特異的に包含され、ありとあらゆる組み合わせが個々にかつ明示的に開示されたかのように本明細書に開示される。加えて、様々な実施形態及びそれらの要素の全ての副組み合わせもまた、本発明によって特異的に包含され、ありとあらゆるそのような副組み合わせが個々にかつ明示的に本明細書に開示されたかのように本明細書に開示される。
【００３５】
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日の前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によるそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。さらに、提供される刊行物の日付は、実際の刊行日とは異なる場合があり、別個に確認する必要があり得る。
【００３６】
詳細な説明
上記に記載のとおり、本発明者らは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃｐｆ１（Ｃａｓ１２ａ）及びＣ２ｃ１（Ｃａｓ１２ｂ）などのＣａｓ１２タンパク質が、標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）の検出によって活性化されると、非標的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を無差別に切断できるということを発見した。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、ガイドＲＮＡによって活性化される（ガイドＲＮＡが標的ＤＮＡの標的配列とハイブリダイズする（すなわち、試料が標的化されたＤＮＡを含む）ときに発生する）と、タンパク質は、ｓｓＤＮＡを無差別に切断するヌクレアーゼとなる（すなわち、ヌクレアーゼが非標的ｓｓＤＮＡ（すなわち、ガイドＲＮＡのガイド配列がハイブリダイズしないｓｓＤＮＡ）を切断する）。したがって、標的ＤＮＡが試料中に（例えば、いくつかの場合には、閾値量を超えて）存在するとき、結果は試料中のｓｓＤＮＡの切断であり、これは任意の簡便な方法を使用して（例えば、標識された一本鎖検出ＤＮＡを使用して）検出することができる。
【００３７】
試料中の標的ＤＮＡ（二本鎖または一本鎖）を検出するための組成物及び方法が提供される。いくつかの場合には、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）であり、ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡが使用される（すなわち、検出ｓｓＤＮＡは、非標的ｓｓＤＮＡである）。そのような方法は、（ａ）試料を、（ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質）、（ｉｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と、標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含む、ガイドＲＮＡ、及び（ｉｉｉ）一本鎖であり、かつガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡと、接触させることと、（ｂ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質による一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することにより、標的ＤＮＡを検出することと、を含むことができる。上述したように、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、試料が活性化される（ガイドＲＮＡがハイブリダイズする標的ＤＮＡを含む（すなわち、試料が標的化された標的ＤＮＡを含む）ときに発生する）と、ガイドＲＮＡによってＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）が活性化され、試料中に存在するｓｓＤＮＡ（非標的ｓｓＤＮＡを含む）を非特異的に切断するエンドリボヌクレアーゼとして機能する。したがって、標的化された標的ＤＮＡが試料中に（例えば、いくつかの場合には、閾値量を超えて）存在する場合、結果は試料中のｓｓＤＮＡ（非標的ｓｓＤＮＡを含む）の切断であり、これは任意の簡便な検出方法を使用して（例えば、標識された検出ｓｓＤＮＡを使用して）検出することができる。
【００３８】
また、一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）（例えば、非標的ｓｓＤＮＡ）を切断するための組成物及び方法も提供される。そのような方法は、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む、核酸の集団を、（ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び（ｉｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と、標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含む、ガイドＲＮＡと、接触させることを含むことができ、ここで、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、該複数の非標的ｓｓＤＮＡを切断する。そのような方法を使用して、例えば、細胞中の外来性のｓｓＤＮＡ（例えば、ウイルスＤＮＡ）を切断することができる。
【００３９】
対象の方法の接触ステップは、二価金属イオンを含む組成物中で実行することができる。接触ステップは、無細胞環境、例えば、細胞の外部で実行することができる。接触ステップは、細胞の内部で実行することができる。接触ステップは、インビトロ細胞で実行することができる。接触ステップは、エクスビボ細胞で実行することができる。接触ステップは、インビボ細胞で実行することができる。
【００４０】
ガイドＲＮＡは、ＲＮＡとして、またはガイドＲＮＡをコードする核酸として提供され得る（例えば、組み換え発現ベクターなどのＤＮＡ）。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、タンパク質として、またはタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、組み換え発現ベクターなどのＤＮＡ）として提供され得る。いくつかの場合には、２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、または６つ以上）のガイドＲＮＡが、（例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質によって個々の（「成熟」）ガイドＲＮＡに切断することができる前駆体ガイドＲＮＡアレイを使用して）提供され得る。
【００４１】
いくつかの場合には（例えば、ガイドＲＮＡ及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）と接触させるとき）、試料を測定ステップの前に２時間以下（例えば、１．５時間以下、１時間以下、４０分間以下、３０分間以下、２０分間以下、１０分間以下、または５分間以下、または１分間以下）接触させる。例えば、いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に４０分間以下接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に２０分間以下接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に１０分間以下接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に５分間以下接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に１分間以下接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に５０秒〜６０秒間接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に４０秒〜５０秒間接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に３０秒〜４０秒間接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に２０秒〜３０秒間接触させる。いくつかの場合には、試料を測定ステップの前に１０秒〜２０秒間接触させる。
【００４２】
試料中の標的ＤＮＡ（一本鎖または二本鎖）を検出するための本開示の方法は、高感度で標的ＤＮＡを検出することができる。いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、複数のＤＮＡ（標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製（例えば、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、または５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製）で存在する。いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、複数のＤＮＡ（標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む）を含む試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０１８個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製（例えば、１０１５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０１２個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０９個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製、または５個の非標的ＤＮＡあたり１つ以上の複製）で存在する。
【００４３】
いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製（例えば、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製）で存在する。
【００４４】
いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０１８個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製（例えば、１０１８個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０１５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０１２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０９個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製）で存在する。
【００４５】
いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、試料中に存在する標的ＤＮＡを検出することができ、標的ＤＮＡは、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製（例えば、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０２個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製）で存在する。
【００４６】
いくつかの場合には、試料中の標的ＤＮＡを検出するための対象の方法において、検出閾値は１０ｎＭ以下である。「検出閾値」という用語は、検出を行うために試料中に存在しなければならない標的ＤＮＡの最小量を記載するために本明細書で使用される。したがって、例示的な例として、検出閾値が１０ｎＭである場合には、標的ＤＮＡが１０ｎＭ以上の濃度で試料中に存在する場合にシグナルを検出することができる。いくつかの場合には、本開示の方法は、５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．０５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．０１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．００５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．００１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．０００５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．０００１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．００００５ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、０．００００１ｎＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１０ｐＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１ｐＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５００ｆＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、２５０ｆＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１００ｆＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５０ｆＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５００ａＭ（アトモル）以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、２５０ａＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１００ａＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５０ａＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１０ａＭ以下の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１ａＭ以下の検出閾値を有する。
【００４７】
いくつかの場合には、（対象の方法において標的ＤＮＡを検出するための）検出閾値は、５００ｆＭ〜１ｎＭ（例えば、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲である（濃度は、標的ＤＮＡを検出することができる、標的ＤＮＡの閾値濃度を指す）。いくつかの場合には、本開示の方法は、８００ｆＭ〜１００ｐＭの範囲の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１ｐＭ〜１０ｐＭの範囲の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、１０ｆＭ〜５００ｆＭ、例えば、１０ｆＭ〜５０ｆＭ、５０ｆＭ〜１００ｆＭ、１００ｆＭ〜２５０ｆＭ、または２５０ｆＭ〜５００ｆＭの範囲の検出閾値を有する。
【００４８】
いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、５００ｆＭ〜１ｎＭ（例えば、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲である。いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、８００ｆＭ〜１００ｐＭの範囲である。いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１ｐＭ〜１０ｐＭの範囲である。
【００４９】
いくつかの場合には、（対象の方法において標的ＤＮＡを検出するための）検出閾値は、１ａＭ〜１ｎＭ（例えば、１ａＭ〜５００ｐＭ、１ａＭ〜２００ｐＭ、１ａＭ〜１００ｐＭ、１ａＭ〜１０ｐＭ、１ａＭ〜１ｐＭ、１００ａＭ〜１ｎＭ、１００ａＭ〜５００ｐＭ、１００ａＭ〜２００ｐＭ、１００ａＭ〜１００ｐＭ、１００ａＭ〜１０ｐＭ、１００ａＭ〜１ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｎＭ、２５０ａＭ〜５００ｐＭ、２５０ａＭ〜２００ｐＭ、２５０ａＭ〜１００ｐＭ、２５０ａＭ〜１０ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｐＭ、５００ａＭ〜１ｎＭ、５００ａＭ〜５００ｐＭ、５００ａＭ〜２００ｐＭ、５００ａＭ〜１００ｐＭ、５００ａＭ〜１０ｐＭ、５００ａＭ〜１ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｎＭ、７５０ａＭ〜５００ｐＭ、７５０ａＭ〜２００ｐＭ、７５０ａＭ〜１００ｐＭ、７５０ａＭ〜１０ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｐＭ、１ｆＭ〜１ｎＭ、１ｆＭ〜５００ｐＭ、１ｆＭ〜２００ｐＭ、１ｆＭ〜１００ｐＭ、１ｆＭ〜１０ｐＭ、１ｆＭ〜１ｐＭ、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲である（濃度は、標的ＤＮＡを検出することができる、標的ＤＮＡの閾値濃度を指す）。いくつかの場合には、本開示の方法は、１ａＭ〜８００ａＭの範囲の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５０ａＭ〜１ｐＭの範囲の検出閾値を有する。いくつかの場合には、本開示の方法は、５０ａＭ〜５００ｆＭの範囲の検出閾値を有する。
【００５０】
いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１ａＭ〜１ｎＭ（例えば、１ａＭ〜５００ｐＭ、１ａＭ〜２００ｐＭ、１ａＭ〜１００ｐＭ、１ａＭ〜１０ｐＭ、１ａＭ〜１ｐＭ、１００ａＭ〜１ｎＭ、１００ａＭ〜５００ｐＭ、１００ａＭ〜２００ｐＭ、１００ａＭ〜１００ｐＭ、１００ａＭ〜１０ｐＭ、１００ａＭ〜１ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｎＭ、２５０ａＭ〜５００ｐＭ、２５０ａＭ〜２００ｐＭ、２５０ａＭ〜１００ｐＭ、２５０ａＭ〜１０ｐＭ、２５０ａＭ〜１ｐＭ、５００ａＭ〜１ｎＭ、５００ａＭ〜５００ｐＭ、５００ａＭ〜２００ｐＭ、５００ａＭ〜１００ｐＭ、５００ａＭ〜１０ｐＭ、５００ａＭ〜１ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｎＭ、７５０ａＭ〜５００ｐＭ、７５０ａＭ〜２００ｐＭ、７５０ａＭ〜１００ｐＭ、７５０ａＭ〜１０ｐＭ、７５０ａＭ〜１ｐＭ、１ｆＭ〜１ｎＭ、１ｆＭ〜５００ｐＭ、１ｆＭ〜２００ｐＭ、１ｆＭ〜１００ｐＭ、１ｆＭ〜１０ｐＭ、１ｆＭ〜１ｐＭ、５００ｆＭ〜５００ｐＭ、５００ｆＭ〜２００ｐＭ、５００ｆＭ〜１００ｐＭ、５００ｆＭ〜１０ｐＭ、５００ｆＭ〜１ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｎＭ、８００ｆＭ〜５００ｐＭ、８００ｆＭ〜２００ｐＭ、８００ｆＭ〜１００ｐＭ、８００ｆＭ〜１０ｐＭ、８００ｆＭ〜１ｐＭ、１ｐＭ〜１ｎＭ、１ｐＭ〜５００ｐＭ、１ｐＭ〜２００ｐＭ、１ｐＭ〜１００ｐＭ、１ｐＭ〜１０ｐＭ）の範囲である。いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１ａＭ〜５００ｐＭの範囲である。いくつかの場合には、試料中で標的ＤＮＡを検出することができる最小濃度は、１００ａＭ〜５００ｐＭの範囲である。
【００５１】
いくつかの場合には、対象の組成物または方法は、アトモル（ａＭ）の検出感度を示す。いくつかの場合には、対象の組成物または方法は、フェムトモル（ｆＭ）の検出感度を示す。いくつかの場合には、対象の組成物または方法は、ピコモル（ｐＭ）の検出感度を示す。いくつかの場合には、対象の組成物または方法は、ナノモル（ｎＭ）の検出感度を示す。
【００５２】
標的ＤＮＡ
標的ＤＮＡは、一本鎖（ｓｓＤＮＡ）または二本鎖（ｄｓＤＮＡ）であり得る。標的ＤＮＡが一本鎖である場合、標的ＤＮＡにおけるＰＡＭ配列に対する優先傾向または要件は存在しない。しかしながら、標的ＤＮＡがｄｓＤＮＡである場合、ＰＡＭは通常、標的ＤＮＡの標的配列に隣接して存在する（例えば、本明細書の他の箇所のＰＡＭの考察を参照されたい）。標的ＤＮＡの供給源は、例えば、下記に記載するような、試料の供給源と同一であり得る。
【００５３】
標的ＤＮＡの供給源は、任意の供給源であり得る。場合によっては、標的ＤＮＡは、ウイルスＤＮＡ（例えば、ＤＮＡウイルスのゲノムＤＮＡ）である。したがって、対象の方法は、（例えば、試料中の）核酸の集団の中のウイルスＤＮＡの存在を検出するためのものであり得る。また、対象の方法は、標的ＤＮＡの存在下で非標的ｓｓＤＮＡの切断に使用することもできる。例えば、方法が細胞内で行われる場合、対象の方法は、特定の標的ＤＮＡが細胞内に存在する場合（例えば、細胞がウイルスに感染し、ウイルス標的ＤＮＡが検出される場合）、細胞内の非標的ｓｓＤＮＡ（ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしないｓｓＤＮＡ）を無差別に切断するために使用することができる。
【００５４】
可能性のある標的ＤＮＡの例としては、例えば、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルスリンパ球、バラ色粃糠疹、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス）、ポックスウイルス（例えば、天然痘、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））、パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４  Ｇ１）、ジェミニウイルス、ナノウイルス、フィコドナウイルスなどのウイルスＤＮＡが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、寄生虫ＤＮＡである。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、細菌ＤＮＡ、例えば、病原性細菌のＤＮＡである。
【００５５】
試料
対象試料は、核酸（例えば、複数の核酸）を含む。「複数」という用語は、本明細書では、２つ以上を意味するために使用される。したがって、いくつかの場合には、試料は、２個以上（例えば、３個以上、５個以上、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または５，０００個以上）の核酸（例えば、ＤＮＡ）を含む。対象の方法を、試料中に（例えば、ＤＮＡなどの核酸の複合混合物中に）存在する標的ＤＮＡを検出する非常に高感度の方法として使用することができる。いくつかの場合には、試料は、配列が互いに異なる５つ以上のＤＮＡ（例えば、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１，０００個以上、または５，０００個以上のＤＮＡ）を含む。いくつかの場合には、試料は、１０個以上、２０個以上、５０個以上、１００個以上、５００個以上、１０３個以上、５×１０３個以上、１０４個以上、５×１０４個以上、１０５個以上、５×１０５個以上、１０６個以上、５×１０６個以上、または１０７個以上のＤＮＡを含む。いくつかの場合には、試料は、１０〜２０個、２０〜５０個、５０〜１００個、１００〜５００個、５００〜１０３個、１０３〜５×１０３個、５×１０３〜１０４個、１０４〜５×１０４個、５×１０４〜１０５個、１０５〜５×１０５個、５×１０５〜１０６個、１０６〜５×１０６個、または５×１０６〜１０７個、または１０７個超のＤＮＡを含む。いくつかの場合には、試料は、（例えば、配列が互いに異なる）５〜１０７個のＤＮＡ（例えば、５〜１０６個、５〜１０５個、５〜５０，０００個、５〜３０，０００個、１０〜１０６個、１０〜１０５個、１０〜５０，０００個、１０〜３０，０００個、２０〜１０６個、２０〜１０５個、２０〜５０，０００個、または２０〜３０，０００個のＤＮＡ）を含む。いくつかの場合には、試料は、配列が互いに異なる２０個以上のＤＮＡを含む。いくつかの場合には、試料は、細胞溶解物（例えば、真核細胞溶解物、哺乳動物細胞溶解物、ヒト細胞溶解物、原核細胞溶解物、植物細胞溶解物など）由来のＤＮＡを含む。例えば、いくつかの場合には、試料は、真核細胞、例えば、ヒト細胞などの哺乳動物細胞などの細胞由来のＤＮＡを含む。
【００５６】
「試料」という用語は、本明細書では、ＤＮＡを含むあらゆる試料（例えば、標的ＤＮＡがＤＮＡの集団の中に存在するかどうかを判決定するための）を意味するために使用される。試料は、任意の供給源に由来し得る。例えば、試料は、精製されたＤＮＡの合成的な組み合わせであり得、試料は、細胞溶解物、ＤＮＡ富化細胞溶解物、または細胞溶解物から単離された及び／もしくは精製されたＤＮＡであり得る。試料は、（例えば、診断の目的のために）患者由来であり得る。試料は、透過処理された細胞由来であり得る。試料は、架橋された細胞由来であり得る。試料は、組織切片の形態であり得る。試料は、架橋、続いて脱脂及び、均一な屈折率とする調節によって調製された組織由来であり得る。架橋、続いて脱脂及び、均一な屈折率とする調節によって得られた組織調製物の例は、例えば、Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ（２０１６）１４３，２８６２−２８６７  ｄｏｉ：１０．１２４２／ｄｅｖ．１３８５６０に記載されている。
【００５７】
「試料」は、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含むことができる。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、２５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、または１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つ未満の複製で試料中に存在する。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、１０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から２０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、２０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から５０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５０個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から５００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５００個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から５×１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、５×１０３個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０４個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０５個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製、１０６個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製から１０７個の非標的ＤＮＡあたり１つの複製で試料中に存在する。
【００５８】
好適な試料としては、唾液、血液、血清、血漿、尿、吸引液、及び生検試料が挙げられるが、これらに限定されない。したがって、患者に関する「試料」という用語は、生物学的起源の血液及び他の液体試料、固形組織試料、例えば、生検標本またはそれ由来の組織培養物もしくは細胞、ならびにそれらの子孫を包含する。定義はまた、調達後に任意の方法で、例えば、試薬を用いた処理、洗浄、またはある特定の細胞集団、例えば、がん細胞に対する濃縮などによって操作されている試料も含む。定義はまた、特定の種類の分子、例えば、ＤＮＡに対して濃縮されている試料も含む。「試料」という用語は、例えば、血液、血漿、血清、吸引液、脳脊髄液（ＣＳＦ）などの臨床試料などの生体試料を包含し、また、外科的切除によって得られた組織、生検によって得られた組織、培養中の細胞、細胞上清、細胞溶解物、組織試料、器官、骨髄、等も含む。「生体試料」は、それに由来する生物学的流体（例えば、がん細胞、感染細胞、など）、例えば、そのような細胞から得られるＤＮＡを含む試料（例えば、細胞溶解物またはＤＮＡを含む他の細胞抽出物）を含む。
【００５９】
試料は、任意の種々の細胞、組織、器官、または無細胞流体を含むことができるか、またはそれらから得ることができる。好適な試料の供給源としては、真核細胞、細菌細胞、及び古細菌細胞が挙げられる。好適な試料の供給源としては、単一細胞生物及び多細胞生物が挙げられる。好適な試料の供給源としては、単一細胞の真核生物；植物または植物細胞；藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー（Ｂｏｔｒｙｏｃｏｃｃｕｓ  ｂｒａｕｎｉｉ）、クラミドモナス・レインハルディ（Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ  ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ）、ナンノクロロプシス・ガディタナ（Ｎａｎｎｏｃｈｌｏｒｏｐｓｉｓ  ｇａｄｉｔａｎａ）、クロレラ・ピレノイドサ（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ  ｐｙｒｅｎｏｉｄｏｓａ）、サルガッサム・パテンス（Ｓａｒｇａｓｓｕｍ  ｐａｔｅｎｓ）、Ｃ．アガルド（Ｃ．ａｇａｒｄｈ）等；真菌細胞（例えば、酵母細胞）；動物細胞、組織、または器官；無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、刺胞動物、棘皮動物、線形動物、昆虫動物、クモ類など）由来の細胞、組織、または器官；脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、組織、流体、または器官；哺乳動物（例えば、ヒト、非ヒト霊長類、有蹄動物、ネコ、ウシ、ヒツジ、ヤギ等）由来の細胞、組織、流体、または器官などが挙げられる。好適な試料の供給源としては、線形動物、原生動物などが挙げられる。好適な試料の供給源としては、例えば、蠕虫類、マラリア原虫などの寄生虫が挙げられる。
【００６０】
好適な試料の供給源としては、６界、例えば、細菌（例えば、真正細菌）界、古細菌界、原生生物界、菌界、植物界、及び動物界のうちのいずれかの細胞、組織、または生物が挙げられる。好適な試料の供給源としては、藻類（例えば、緑藻、紅藻、灰色藻、シアノバクテリア）を含むがこれらに限定されない原生生物界の植物様メンバー；原生生物界の菌様メンバー、例えば、粘菌類、水生菌類など；原生生物界の動物様メンバー、例えば、鞭毛虫類（例えば、Ｅｕｇｌｅｎａ）、アメーバ様（例えば、アメーバ）、胞子虫類（例えば、アピコンプレックス（Ａｐｉｃｏｍｐｌｅｘａ）、ミクソゾア（Ｍｙｘｏｚｏａ）、微胞子虫類（Ｍｉｃｒｏｓｐｏｒｉｄｉａ））、及び繊毛虫類（例えば、ゾウリムシ（Ｐａｒａｍｅｃｉｕｍ））が挙げられる。好適な試料の供給源としては、以下の門：担子菌門（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｏｔａ）（棍棒状菌、例えば、ハラタケ属（Ａｇａｒｉｃｕｓ）、テングタケ属（Ａｍａｎｉｔａ）、ヤマドリタケ属（Ｂｏｌｅｔｕｓ）、アンズタケ属（Ｃａｎｔｈｅｒｅｌｌｕｓ）などのメンバー）、子のう菌類（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）を含む子嚢菌門）、ミコフィコフィタ（Ｍｙｃｏｐｈｙｃｏｐｈｙｔａ）（地衣類）、接合菌（Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ）（抱合菌）、及び不完全菌門（Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ）のうちのいずれかのメンバーを含むが、これらに限定されない、菌界のメンバーが挙げられる。好適な試料の供給源としては、以下の門分類：コケ植物門（Ｂｒｙｏｐｈｙｔａ）（例えば、蘚類）、ツノゴケ植物門（Ａｎｔｈｏｃｅｒｏｔｏｐｈｙｔａ）（例えば、ツノゴケ類）、ハプト植物門（Ｈｅｐａｔｉｃｏｐｈｙｔａ）（例えば、苔類）、ヒカゲノカズラ植物門（Ｌｙｃｏｐｈｙｔａ）（例えば、ヒカゲノカズラ）、トクサ類（Ｓｐｈｅｎｏｐｈｙｔａ）（例えば、トクサ）、プシロフィタ（Ｐｓｉｌｏｐｈｙｔａ）（例えば、マツバラン）、オフィオグロソフィタ（Ｏｐｈｉｏｇｌｏｓｓｏｐｈｙｔａ）、シダ類（Ｐｔｅｒｏｐｈｙｔａ）（例えば、シダ）、ソテツ植物（Ｃｙｃａｄｏｐｈｙｔａ）、ギンコフィタ（Ｇｉｎｇｋｏｐｈｙｔａ）、マツ植物門（Ｐｉｎｏｐｈｙｔａ）、マオウ門（Ｇｎｅｔｏｐｈｙｔａ）、及び被子植物（Ｍａｇｎｏｌｉｏｐｈｙｔａ）（例えば、顕花植物）のうちのいずれかのメンバーを含むが、これらに限定されない、植物界のメンバーが挙げられる。好適な試料の供給源としては、以下の門：海綿動物門Ｐｏｒｉｆｅｒａ）（海綿動物）、平板動物門（Ｐｌａｃｏｚｏａ）、直泳類（Ｏｒｔｈｏｎｅｃｔｉｄａ）（海洋無脊椎動物の寄生虫）、ひし形類（Ｒｈｏｍｂｏｚｏａ）、刺胞類（Ｃｎｉｄａｒｉａ）（サンゴ、イソギンチャク、クラゲ、ウミエラ、ウミシイタケ、キロネックス）、クシクラゲ門（Ｃｔｅｎｏｐｈｏｒａ）（有櫛動物）、扁形動物門（Ｐｌａｔｙｈｅｌｍｉｎｔｈｅｓ）（扁形動物）、ネメルチナ（Ｎｅｍｅｒｔｉｎａ）（紐形動物）、顎口動物門（Ｎｇａｔｈｏｓｔｏｍｕｌｉｄａ）（顎口動物）、腹毛動物門（Ｇａｓｔｒｏｔｒｉｃｈａ）、ワムシ類（Ｒｏｔｉｆｅｒａ）、鰓曳動物（Ｐｒｉａｐｕｌｉｄａ）、動ふん類（Ｋｉｎｏｒｈｙｎｃｈａ）、胴甲動物門（Ｌｏｒｉｃｉｆｅｒａ）、鉤頭虫門（Ａｃａｎｔｈｏｃｅｐｈａｌａ）、内肛動物（Ｅｎｔｏｐｒｏｃｔａ）、線虫類（Ｎｅｍｏｔｏｄａ）、類線虫類（Ｎｅｍａｔｏｍｏｒｐｈａ）、有輪動物門（Ｃｙｃｌｉｏｐｈｏｒａ）、軟体動物門（Ｍｏｌｌｕｓｃａ）（軟体動物）、星口動物門（Ｓｉｐｕｎｃｕｌａ）（星口動物）、環形動物門（Ａｎｎｅｌｉｄａ）（条虫）、緩歩動物門（Ｔａｒｄｉｇｒａｄａ）（緩歩動物）、有爪動物門（Ｏｎｙｃｈｏｐｈｏｒａ）（有爪動物）、節足動物門（Ａｒｔｈｒｏｐｏｄａ）（以下の亜門：きょう角亜門（Ｃｈｅｌｉｃｅｒａｔａ）、多足類（Ｍｙｒｉａｐｏｄａ）、六脚類（Ｈｅｘａｐｏｄａ）、甲殻類（Ｃｒｕｓｔａｃｅａ）を含み、きょう角亜門は例えばクモ類、メロストマ類（Ｍｅｒｏｓｔｏｍａｔａ）、及びウミグモ類（Ｐｙｃｎｏｇｏｎｉｄａ）を含み、多足類は例えばしん脚類（Ｃｈｉｌｏｐｏｄａ）（ムカデ）、倍脚類（Ｄｉｐｌｏｐｏｄａ）（ヤスデ）、少脚類（Ｐａｒｏｐｏｄａ）、及び結合類（Ｓｙｍｐｈｙｌａ）を含み、六脚類は昆虫動物を含み、甲殻類はエビ、オキアミ、フジツボ等を含む）、箒虫類（Ｐｈｏｒｏｎｉｄａ）、外肛類（Ｅｃｔｏｐｒｏｃｔａ）（外肛動物）、腕足類（Ｂｒａｃｈｉｏｐｏｄａ）、きょく皮動物門（Ｅｃｈｉｎｏｄｅｒｍａｔａ）（例えば、ヒトデ、ウミシイタケ、ウミユリ、ウニ、ナマコ、クモヒトデ、テヅルモヅル等）、毛顎動物門（Ｃｈａｅｔｏｇｎａｔｈａ）（毛顎動物）、半索動物門（Ｈｅｍｉｃｈｏｒｄａｔａ）（半索動物）、ならびに脊索動物門（Ｃｈｏｒｄａｔａ）のうちのいずれかのメンバーを含むが、これらに限定されない、動物界のメンバーが挙げられる。脊索動物門の好適なメンバーとしては、以下の亜門：尾索動物亜門（Ｕｒｏｃｈｏｒｄａｔａ）（海鞘類（Ａｓｃｉｄｉａｃｅａ）、サルパ類（Ｔｈａｌｉａｃｅａ）、及び幼形類（Ｌａｒｖａｃｅａ）を含むホヤ）；頭索動物亜門（Ｃｅｐｈａｌｏｃｈｏｒｄａｔａ）（ナメクジウオ）；ミクシニ（Ｍｙｘｉｎｉ）（ヌタウナギ）；及び脊椎動物亜門のうちのいずれかのメンバーが挙げられ、脊椎動物亜門のメンバーとしては、例えばペトロミゾンチダ（Ｐｅｔｒｏｍｙｚｏｎｔｉｄａ）（ヤツメウナギ）、軟骨魚綱（Ｃｈｏｎｄｒｉｃｈｔｈｙｃｅｓ）（軟骨魚類）、条鰭亜綱（Ａｃｔｉｎｏｐｔｅｒｙｇｉｉ）（硬骨魚類）、アクチニスタ（Ａｃｔｉｎｉｓｔａ）（シーラカンス）、ディプノイ（Ｄｉｐｎｏｉ）（肺魚類）、レプティリア（Ｒｅｐｔｉｌｉａ）（爬虫類、例えば、ヘビ、ワニ、ワニ、トカゲなど）、鳥綱（Ａｖｅｓ）（鳥類）、及び哺乳類（Ｍａｍｍａｌｉａｎ）（哺乳動物）のメンバーが挙げられる。好適な植物としては、任意の単子葉植物及び任意の双子葉植物が挙げられる。
【００６１】
好適な試料の供給源としては、生物から採取した細胞、流体、組織、もしくは器官、または生物から単離された特定の細胞もしくは細胞の集団等からが挙げられる。例えば、生物が植物である場合、好適な供給源としては、木部、師部、形成層、葉、根などが挙げられる。生物が動物である場合、好適な供給源としては、特定の組織（例えば、肺、肝臓、心臓、腎臓、脳、脾臓、皮膚、胎児組織など）、または特定の細胞の種類（例えば、ニューロン細胞、上皮細胞、内皮細胞、星状細胞、マクロファージ、グリア細胞、膵島細胞、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球など）が挙げられる。
【００６２】
いくつかの場合には、試料の供給源は、罹患した（または罹患した疑いがある）細胞、流体、組織、または器官である。いくつかの場合には、試料の供給源は、正常な（罹患していない）細胞、流体、組織、または器官である。いくつかの場合には、試料の供給源は、病原体に感染した（または感染した疑いがある）細胞、組織、または器官である。例えば、試料の供給源は、感染しているか、または感染していない個体であり得、試料は、その個体から採集された任意の生体試料（例えば、血液、唾液、生検、血漿、血清、気管支肺胞洗浄液、痰、糞便試料、脳脊髄液、微細針吸引液、スワブ試料（例えば、頬スワブ、子宮頸部スワブ、鼻腔スワブ）、間質液、滑液、鼻汁、涙液、軟膜、粘膜試料、上皮細胞試料（例えば、上皮細胞擦過物）、など）であり得る。いくつかの場合には、試料は、細胞を含まない液体試料である。いくつかの場合には、試料は、細胞を含み得る液体試料である。病原体としては、ウイルス、真菌類、蠕虫類、原虫動物、マラリア原虫、プラスモディウム属（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ）寄生虫、トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）寄生虫、シストソーマ属（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ）寄生虫などが挙げられる。「蠕虫類」としては、回虫、犬糸状虫、及び植物食性線虫（Ｎｅｍａｔｏｄａ）、吸虫（Ｔｅｍａｔｏｄａ）、鉤頭虫門、及び条虫（Ｃｅｓｔｏｄａ）が挙げられる。原虫感染症としては、ギアリダ属の種（Ｇｉａｒｄｉａ  ｓｐｐ．）、トリコモナス属の種（Ｔｒｉｃｈｏｍｏｎａｓ  ｓｐｐ．）、アフリカトリパノソーマ症、アメーバ赤痢、バベシア症、バランチジウム赤痢、Ｃｈａｇａ病、コクシジウム症、マラリア、及びトキソプラズマ症由来の感染症が挙げられる。寄生虫性／原生動物性病原体などの病原体の例としては、プラスモディウム・ファルシパルム（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ）、プラスモディウム・ビバクス（Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ  ｖｉｖａｘ）、トリパノソーマ・クルジ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｃｒｕｚｉ）、及びトキソプラズマ・ゴンディ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ  ｇｏｎｄｉｉ）が挙げられるが、これらに限定されない。真菌性病原体としては、クリプトコックス‐ネオフォルマンス（Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ）、ヒストプラスマ・カプスラーツム（Ｈｉｓｔｏｐｌａｓｍａ  ｃａｐｓｕｌａｔｕｍ）、コクシジオイデス・イミチス（Ｃｏｃｃｉｄｉｏｉｄｅｓ  ｉｍｍｉｔｉｓ）、ブラストマイセス・デルマチチジス（Ｂｌａｓｔｏｍｙｃｅｓ  ｄｅｒｍａｔｉｔｉｄｉｓ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、及びカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓ）が挙げられるが、これらに限定されない。病原性ウイルスとしては、例えば、免疫不全ウイルス（例えば、ＨＩＶ）、インフルエンザウイルス、デング、西ナイルウイルス、ヘルペスウイルス、黄熱病ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、パピローマウイルスなどが挙げられる。病原性ウイルスとしては、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルスリンパ球、バラ色粃糠疹、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス）、ポックスウイルス（例えば、天然痘、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））、パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４  Ｇ１）、ジェミニウイルス、ナノウイルス、フィコドナウイルスなどのＤＮＡウイルスなどを挙げることができる。病原体としては、例えば、ＤＮＡウイルス［例えば、パポバウイルス（例えば、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、ポリオーマウイルス）、ヘパドナウイルス（例えば、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ））、ヘルペスウイルス（例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）、水痘帯状疱疹ウイルス（ＶＺＶ）、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ヘルペスウイルスリンパ球、バラ色粃糠疹、カポジ肉腫関連ヘルペスウイルス）、アデノウイルス（例えば、アタデノウイルス、アビアデノウイルス、イクタデノウイルス、マストアデノウイルス、シアデノウイルス）、ポックスウイルス（例えば、天然痘、ワクシニアウイルス、牛痘ウイルス、サル痘ウイルス、オルフウイルス、偽牛痘、ウシ丘疹性口内炎ウイルス、タナ痘ウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、伝染性軟属腫ウイルス（ＭＣＶ））、パルボウイルス（例えば、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）、パルボウイルスＢ１９、ヒトボカウイルス、ブファウイルス、ヒトｐａｒｖ４  Ｇ１）、ジェミニウイルス、ナノウイルス、フィコドナウイルスなど］、マイコバクテリウム・ツベルクローシス（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ストレプトコッカス・アガラクティエ（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ａｇａｌａｃｔｉａｅ）、メチシリン耐性の黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、髄膜炎菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｍｅｎｉｎｇｉｔｉｄｉｓ）、ニューモコッカス（Ｐｎｅｕｍｏｃｏｃｃｕｓ）、クリプトコックス‐ネオフォルマンス、ヒストプラスマ・カプスラーツム、ヘモフィルスインフルエンザ菌Ｂ型、梅毒トレポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ  ｐａｌｌｉｄｕｍ）、ライム病スピロヘータ、シュードモナス・エルジノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｅｐｒａｅ）、ウシ流産菌（Ｂｒｕｃｅｌｌａ  ａｂｏｒｔｕｓ）、狂犬病ウイルス��インフルエンザウイルス、サイトメガロウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ型、単純ヘルペスウイルスＩＩ型、ヒト血清パルボ様ウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、麻疹ウイルス、アデノウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、Ｅｐｓｔｅｉｎ−Ｂａｒｒウイルス、マウス白血病ウイルス、ムンプスウイルス、水疱性口内炎ウイルス、シンドビスウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、いぼウイルス、ブルータングウイルス、センダイウイルス、ネコ白血病ウイルス、レオウイルス、ポリオウイルス、サルウイルス４０、マウス乳房腫瘍ウイルス、デングウイルス、風疹ウイルス、西ナイルウイルス、プラスモディウム・ファルシパルム、プラスモディウム・ビバクス、トキソプラズマ・ゴンディ、トリパノソーマ・ランゲリ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒａｎｇｅｌｉ）、トリパノソーマ・クルジ、トリパノソーマ・ローデシエンス（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｒｈｏｄｅｓｉｅｎｓｅ）、トリパノソーマ・ブルセイ（Ｔｒｙｐａｎｏｓｏｍａ  ｂｒｕｃｅｉ）、マンソン住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｍａｎｓｏｎｉ）、日本住血吸虫（Ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍａ  ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）、バベシア・ボービス（Ｂａｂｅｓｉａ  ｂｏｖｉｓ）、鶏球虫（Ｅｉｍｅｒｉａ  ｔｅｎｅｌｌａ）、回旋糸状虫（Ｏｎｃｈｏｃｅｒｃａ  ｖｏｌｖｕｌｕｓ）、熱帯リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ  ｔｒｏｐｉｃａ）、マイコバクテリウム・ツベルクローシス、センモウチュウ（Ｔｒｉｃｈｉｎｅｌｌａ  ｓｐｉｒａｌｉｓ）、タイレリア・パルバ（Ｔｈｅｉｌｅｒｉａ  ｐａｒｖａ）、胞状条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｈｙｄａｔｉｇｅｎａ）、ヒツジ条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｏｖｉｓ）、無鉤条虫（Ｔａｅｎｉａ  ｓａｇｉｎａｔａ）、単包条虫（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｇｒａｎｕｌｏｓｕｓ）、メソセストイデス・コルティ（Ｍｅｓｏｃｅｓｔｏｉｄｅｓ  ｃｏｒｔｉ）、マイコプラズマ・アルスリティディス（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  ａｒｔｈｒｉｔｉｄｉｓ）、Ｍ．ヒオリニス（Ｍ．ｈｙｏｒｈｉｎｉｓ）、Ｍ．オラレ（Ｍ．ｏｒａｌｅ）、Ｍ．アルギニニ（Ｍ．ａｒｇｉｎｉｎｉ）、アコレプラズマ・ライドラウィー（Ａｃｈｏｌｅｐｌａｓｍａ  ｌａｉｄｌａｗｉｉ）、Ｍ．サリバリウム（Ｍ．ｓａｌｉｖａｒｉｕｍ）及びＭ．ニューモニエ（Ｍ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）を挙げることができる。
【００６３】
検出可能なシグナルの測定
いくつかの場合には、対象の方法は、測定（例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）媒介型ｓｓＤＮＡ切断によって生成される検出可能なシグナルの測定）のステップを含む。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、一度活性化される（これは、ガイドＲＮＡがＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）の存在下で標的ＤＮＡとハイブリダイズするときに発生する）と非標的ｓｓＤＮＡを切断するため、検出可能なシグナルは、ｓｓＤＮＡが切断されるときに生成される任意のシグナルであり得る。例えば、いくつかの場合には、測定のステップは、金ナノ粒子ベースの検出（例えば、Ｘｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ  Ｉｎｔ  Ｅｄ  Ｅｎｇｌ．２００７；４６（１９）：３４６８−７０、及びＸｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．２０１０  Ｊｕｎ  １５；１０７（２４）：１０８３７−４１を参照）、蛍光偏光、コロイド相転移／分散（例えば、Ｂａｋｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２００４  Ｊａｎ  ８；４２７（６９７０）：１３９−４１）、電気化学的検出、半導体ベースの感知（例えば、Ｒｏｔｈｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．２０１１  Ｊｕｌ  ２０；４７５（７３５６）：３４８−５２、例えば、２’−３’環状ホスフェートの開口によって、及び溶液中の無機ホスフェートの放出によって、ホスファターゼを使用してｓｓＤＮＡ切断反応後にｐＨ変化を生成することができる）、及び標識された検出ｓｓＤＮＡの検出（詳細は本明細書の他の箇所を参照）のうちの１つ以上を含むことができる。そのような検出方法の読み出しは、任意の簡便な読み出しであり得る。可能性のある読み出しの例としては、検出可能な蛍光シグナルの測定された量、ゲル上のバンド（例えば、未切断基質に対する切断産物を表すバンド）の視覚的分析、色の存在または非存在の視覚的またはセンサーベースの検出（すなわち、色検出法）、及び電気シグナル（もしくはその特定の量）の存在または非存在、が挙げられるが、それらに限定されない。
【００６４】
いくつかの場合には、測定は、例えば、検出されるシグナルの量が、試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定するために使用することができるという意味において、定量的であり得る。いくつかの場合には、測定は、例えば、検出可能なシグナルの存在または非存在が、標的ＤＮＡ（例えば、ウイルス、ＳＮＰ等）の存在または非存在を示すことができるという意味において、定性的であり得る。いくつかの場合には、検出可能なシグナルは、標的ＤＮＡ（複数可）（例えば、ウイルス、ＳＮＰ等）が特定の閾値濃度を超えて存在しない限り、（例えば、所定の閾値レベルを超えて）存在しないであろう。いくつかの場合には、検出閾値は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）、ガイドＲＮＡ、試料体積、及び／または検出ｓｓＤＮＡ（使用される場合）の量を変更することによって滴定することができる。したがって、例えば、当業者によって理解されるように、いくつかの対照を、１つ以上の反応を設定するために必要に応じて使用することができ、それらの各々が、異なる閾値レベルの標的ＤＮＡを検出するために設定され、したがって、そのような一連の反応を使用して試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することができる（例えば、そのような一連の反応を使用して、「少なくともＸの濃度で」試料中に存在する標的ＤＮＡを決定することができる）。本開示の組成物及び方法の用途／使用の非限定的な例には、図４６に示されるものが含まれる。図は、試料の核酸がＣａｓ１２タンパク質と接触する前に増幅される（図４６中では「ＲＰＡ」と表示される）実施形態を表すが、同じ用途／使用（例えば、ＳＮＰ検出、がんスクリーニング、細菌感染の検出、抗生物質耐性の検出、ウイルス感染の検出など）を増幅ステップを含まない実施形態に適用することができる。本開示の組成物及び方法を使用して、任意のＤＮＡ標的を検出することができる。例えば、対象の試料が細胞のゲノムＤＮＡを含み得るため、核酸物質をゲノムに統合するいかなるウイルスも検出することができ、ガイドＲＮＡは統合ヌクレオチド配列を検出するように設計することができる。
【００６５】
いくつかの場合には、本開示の方法を使用して、試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む試料）中の標的ＤＮＡの量を決定することができる。試料中の標的ＤＮＡの量を決定することは、試験試料から生成された検出可能なシグナルの量を、参照試料から生成された検出可能なシグナルの量と比較することを含むことができる。試料中の標的ＤＮＡの量を決定することは、検出可能なシグナルを測定して試験測定値を生成することと、参照試料によって生成される検出可能なシグナルを測定して、参照測定値を生成することと、試験測定値を参照測定値と比較して、試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することと、を含む。
【００６６】
例えば、いくつかの場合には、試料中の標的ＤＮＡの量を決定するための本開示の方法は、ａ）試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む試料）を、（ｉ）標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイドＲＮＡ、（ｉｉ）試料中に存在するＲＮＡを切断するＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）、及び（ｉｉｉ）検出ｓｓＤＮＡと接触させることと、ｂ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）媒介型ｓｓＤＮＡ切断（例えば、検出ｓｓＤＮＡの切断）によって生成される検出可能なシグナルを測定して、試験測定値を生成することと、ｃ）参照試料によって生成される検出可能な信号を測定して、参照測定値を生成することと、ｄ）試験測定値を参照測定値と比較して、試料中の標的ＤＮＡの存在量を判定することとを含む。
【００６７】
別の例としては、いくつかの場合には、試料中の標的ＤＮＡの量を決定するための本開示の方法は、ａ）試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ＤＮＡを含む試料）を、（ｉ）各々が異なるガイド配列を有する２つ以上のガイドＲＮＡを含む前駆体ガイドＲＮＡアレイ、（ｉｉ）前駆体ガイドＲＮＡアレイを個々のガイドＲＮＡに切断し、また試料のＲＮＡも切断する、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）、及び（ｉｉｉ）検出ｓｓＤＮＡと接触させることと、ｂ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）媒介型ｓｓＤＮＡ切断（例えば、検出ｓｓＤＮＡの切断）によって生成される検出可能なシグナルを測定して、試験測定値を生成することと、ｃ）２つ以上の参照試料の各々によって生成される検出可能な信号を測定して、２つ以上の参照測定値を生成することと、ｄ）試験測定値を参照測定値と比較して、試料中の標的ＤＮＡの存在量を判定することとを含む。
【００６８】
試料中の核酸の増幅
いくつかの実施形態では、対象の組成物及び／または（例えば、細胞のゲノムＤＮＡ中のウイルスＤＮＡまたはＳＮＰなどの標的ＤＮＡの存在を検出するための）方法の感度は、検出を核酸増幅と組み合わせることによって増加させることができる。いくつかの場合には、試料中の核酸は、ｓｓＤＮＡを切断したＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質）と接触する前に増幅される（例えば、試料中の核酸の増幅は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質との接触前に開始することができる）。いくつかの場合には、試料中の核酸は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質）との接触と同時に増幅される。例えば、いくつかの場合には、対象の方法は、（例えば、試料を増幅成分と接触させることによって）試料の核酸を増幅してから、増幅された試料をＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質）と接触させることを含む。いくつかの場合には、対象の方法は、試料をＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質）と接触させるのと一緒に（同時に）試料を増幅成分と接触させることを含む。全ての成分（増幅成分及び検出成分、例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質、例えば、Ｃａｓ１２タンパク質、ガイドＲＮＡ、及び検出ＤＮＡ）が同時に添加される場合、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質）のトランス切断活性は、核酸が増幅を受けるのと同時に試料の核酸を分解し始める可能性がある。しかしながら、このような場合であっても、増幅及び検出を同時に行うことは、増幅せずに方法を実施する場合と比較して、依然として感度を高めることができる。
【００６９】
いくつかの場合には、特定の配列（例えば、ウイルスの配列、関心対象のＳＮＰを含む配列）は、例えば、プライマーを使用して、試料から増幅される。このように、ガイドＲＮＡがハイブリダイズするであろう配列は、対象の検出方法の感度を高めるために増幅することができ、これにより、試料中に存在する他の配列と比較して試料中に存在する関心対象の配列の複製の数を増加させるために、所望の配列の偏った増幅を達成することができる。例示的な一例として、所与の試料が特定のウイルス（または特定のＳＮＰ）を含むかどうかを決定するために対象の方法が使用されている場合、ウイルス配列（または非ウイルスゲノム配列）の所望の領域を増幅することができ、増幅された領域は、ウイルス配列（またはＳＮＰ）が実際に試料中に存在する場合、ガイドＲＮＡにハイブリダイズするであろう配列を含む。
【００７０】
前述のように、いくつかの場合には、核酸は、（例えば、増幅成分と接触させることによって）増幅してから、増幅された核酸をＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質）と接触させる。いくつかの場合には、増幅は、活性なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質）と接触する前に１０秒間以上（例えば、３０秒間以上、４５秒間以上、１分間以上、２分間以上、３分間以上、４分間以上、５分間以上、７．５分間以上、１０分間以上、等）発生する。いくつかの場合には、増幅は、活性なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質）と接触する前に２分間以上（例えば、３分間以上、４分間以上、５分間以上、７．５分間以上、１０分間以上、等）発生する。いくつかの場合には、増幅は、１０秒〜６０分（例えば、１０秒〜４０分、１０秒〜３０分、１０秒〜２０分、１０秒〜１５分、１０秒〜１０秒、１０秒〜５分、３０秒〜４０分、３０秒〜３０分、３０秒〜２０分、３０秒〜１５分、３０秒〜１０分、３０秒〜５分、１分〜４０分、１分〜３０分、１分〜２０分、１分〜１５分、１分〜１０分、１分〜５分、２分〜４０分、２分〜３０分、２分〜２０分、２分〜１５分、２分〜１０分、２分〜５分、５分〜４０分、５分〜３０分、５分〜２０分、５分〜１５分、または５分〜１０分）の範囲の期間にわたって発生する。いくつかの場合には、増幅は、５分〜１５分の範囲の期間にわたって発生する。いくつかの場合には、増幅は、７分〜１２分の範囲の期間にわたって発生する。
【００７１】
いくつかの場合には、試料を、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質）と接触させるのと同時に増幅成分と接触させる。いくつかのそのような場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、接触時に不活性であり、試料中の核酸が増幅されると活性化される。
【００７２】
様々な増幅方法及び成分が当業者に知られ、任意の簡便な方法を使用することができる（例えば、Ｚａｎｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓｐｏｔｏ，Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１３  Ｍａｒ；３（１）：１８−４３、Ｇｉｌｌ  ａｎｄ  Ｇｈａｅｍｉ，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ，Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ，２００８，２７：２２４−２４３、Ｃｒａｗ  ａｎｄ  Ｂａｌａｃｈａｎｄｒａｎａ，Ｌａｂ  Ｃｈｉｐ，２０１２，１２，２４６９−２４８６（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。核酸増幅としては、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、逆転写ｑＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）、ネステッドＰＣＲ、多重ＰＣＲ、非対称ＰＣＲ、タッチダウンＰＣＲ、ランダムプライマーＰＣＲ、ヘミネステッドＰＣＲ、ポリメラーゼサイクリングアセンブリ（ＰＣＡ）、コロニーＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、デジタルＰＣＲ、メチル化特異的ＰＣＲ（ＭＳＰ）、より低い変性温度での同時増幅ＰＣＲ（ＣＯＬＤ−ＰＣＲ）、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、配列間特異的ＰＣＲ（ＩＳＳ−ＰＣＲ）、全ゲノム増幅（ＷＧＡ）、逆ＰＣＲ、及び熱非対称インターレースＰＣＲ  （ＴＡＩＬ−ＰＣＲ）が挙げられる。
【００７３】
いくつかの場合には、増幅は等温増幅である。「等温増幅」という用語は、単一温度インキュベーションを使用することによってサーマルサイクラーを不要とすることができる、（例えば、酵素連鎖反応を使用する）核酸（例えば、ＤＮＡ）増幅の方法を示す。等温増幅は、増幅反応中の標的核酸の熱変性に依存せず、したがって、温度の複数の急激な変化を必要としなくてもよい、核酸増幅の一形態である。したがって、等温核酸増幅方法は、実験室環境の内部または外部で行うことができる。逆転写ステップと組み合わせることによって、これらの増幅方法を使用してＲＮＡを等温的に増幅することができる。
【００７４】
等温増幅方法の例としては、ループ型等温増幅（ＬＡＭＰ）、ヘリカーゼ依存型増幅（ＨＤＡ）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、ニッキング酵素増幅反応（ＮＥＡＲ）、ローリングサークル増幅（ＲＣＡ）、複数置換増幅（ＭＤＡ）、分岐（ＲＡＭ）、環状ヘリカーゼ依存型増幅（ＣＨＤＡ）、単一プライマー等温増幅（ＳＰＩＡ）、ＲＮＡ技術のシグナル媒介増幅（ＳＭＡＲＴ）自家持続配列複製（３ＳＲ）、ゲノムの指数的増幅反応（ＧＥＡＲ）、及び等温複数置換増幅（ＩＭＤＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７５】
いくつかの場合には、増幅は、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）である（例えば、米国特許第８，０３０，０００号、同第８，４２６，１３４号、同第８，９４５，８４５号、同第９，３０９，５０２号、及び同第９，６６３，８２０号（参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる）を参照されたい）。リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）は、２つの対向するプライマーを使用し（ＰＣＲに非常に類似）、３つの酵素、すなわちリコンビナーゼ、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）、及び鎖置換ポリメラーゼを用いる。リコンビナーゼはオリゴヌクレオチドプライマーを二本鎖ＤＮＡ中の相同配列とペアリングし、ＳＳＢはＤＮＡの置換された鎖に結合して、プライマーが置換されることを阻止し、鎖置換ポリメラーゼは、プライマーが標的ＤＮＡに結合している場所でＤＮＡ合成を開始する。ＲＰＡ反応に逆転写酵素を添加して、ｃＤＮＡを産生するための別個のステップを必要とすることなく、ＲＮＡならびにＤＮＡの検出を容易にすることができる。ＲＰＡ反応のための成分の一例は、以下のとおりである（例えば、米国特許第８，０３０，０００号、同第８，４２６，１３４号、同第８，９４５，８４５号、同第９，３０９，５０２号、同第９，６６３，８２０号参照）：５０ｍＭのトリスｐＨ８．４、８０ｍＭの酢酸カリウム、１０ｍＭの酢酸マグネシウム、２ｍＭのＤＴＴ、５％のＰＥＧ化合物（Ｃａｒｂｏｗａｘ−２０Ｍ）、３ｍＭのＡＴＰ、３０ｍＭのホスホクレアチン、１００ｎｇ／μｌのクレアチンキナーゼ、４２０ｎｇ／μｌのｇｐ３２、１４０ｎｇ／μｌのＵｖｓＸ、３５ｎｇ／μｌのＵｖｓＹ、２０００ＭのｄＮＴＰ、３００ｎＭの各オリゴヌクレオチド、３５ｎｇ／μｌのＢｓｕポリメラーゼ、及び核酸含有試料。
【００７６】
転写媒介増幅（ＴＭＡ）では、ＲＮＡポリメラーゼは、プライマー領域で操作されたプロモーターからＲＮＡを作製するために使用され、次いで、逆転写酵素は、プライマーからｃＤＮＡを合成する。次いで、第３の酵素、例えば、Ｒｎａｓｅ  Ｈを使用して、熱変性のステップなしにｃＤＮＡからＲＮＡ標的を分解することができる。この増幅技術は、自家持続配列複製（３ＳＲ）及び核酸配列ベースの増幅（ＮＡＳＢＡ）と同様であるが、使用される酵素は異なる。別の例としては、ヘリカーゼ依存型増幅（ＨＤＡ）は、ｄｓＤＮＡをほどいて一本鎖を作成するために、熱よりもむしろ熱安定性ヘリカーゼ（Ｔｔｅ−ＵｖｒＤ）を利用し、一本鎖は次いで、ポリメラーゼによるハイブリダイゼーション及びプライマーの伸長のために利用可能である。さらに別の例としては、ループ型増幅（ＬＡＭＰ）は、鎖置換能力を有する熱安定性ポリメラーゼ、及び４つ以上の特異的に設計されたプライマーのセットを用いる。各プライマーは、置換されるとヘアピンにスナップされるヘアピン端部を有するように設計されており、セルフプライミング及びさらなるポリメラーゼ伸長を容易にする。ＬＡＭＰ反応では、等温条件下で反応が進行するが、最初の熱変性ステップが二本鎖標的のために必要とされる。加えて、増幅は、様々な長さの産生物のラダーパターンを生じる。さらに別の例では、鎖置換増幅（ＳＤＡ）は、制限エンドヌクレアーゼの、その標的ＤＮＡの非修飾鎖に切れ目を入れる能力と、エキソヌクレアーゼ欠損ＤＮＡポリメラーゼの、切れ目で３’末端を伸長して下流のＤＮＡ鎖を置換する能力とを組み合わせる。
【００７７】
検出ＤＮＡ
いくつかの場合には、対象の方法は、試料（例えば、標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む試料）を、ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）、ｉｉ）ガイドＲＮＡ（または前駆体ガイドＲＮＡアレイ）、及びｉｉｉ）一本鎖であり、ガイドＲＮＡのガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡと接触させることを含む。例えば、いくつかの場合には、対象の方法は、試料を、蛍光発光色素対を含む標識された一本鎖検出ＤＮＡ（検出ｓｓＤＮＡ）と接触させることを含み、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、（標的ＤＮＡにハイブリダイズするガイドＲＮＡの文脈においてガイドＲＮＡに結合することによって）活性化された後に標識された検出ｓｓＤＮＡを切断し、測定された検出可能なシグナルは、蛍光発光色素対によって生成される。例えば、いくつかの場合には、対象の方法は、試料を、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対、またはクエンチャー／蛍光体対、またはそれら両方を含む、標識された検出ｓｓＤＮＡと接触させることを含む。いくつかの場合には、対象の方法は、試料を、ＦＲＥＴ対を含む標識された検出ｓｓＤＮＡと接触させることを含む。いくつかの場合には、対象の方法は、試料を、蛍光体／クエンチャー対を含む標識された検出ｓｓＤＮＡと接触させることを含む。
【００７８】
蛍光発光色素対は、ＦＲＥＴ対またはクエンチャー／蛍光体対を含む。ＦＲＥＴ対及びクエンチャー／蛍光体対の両方の場合において、対の一方の色素の発光スペクトルは、対の他方の色素の吸収スペクトルの領域と重複する。本明細書で使用される場合、「蛍光発光色素対」という用語は、「蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対」及び「クエンチャー／蛍光体対」（いずれの用語も以下でより詳細に記載される）の両方を包含するために使用される総称である。「蛍光発光色素対」という用語は、「ＦＲＥＴ対及び／またはクエンチャー／蛍光体対」という表現と互換的に使用される。
【００７９】
いくつかの場合には（例えば、検出ｓｓＤＮＡが、ＦＲＥＴ対を含む場合）、標識された検出ｓｓＤＮＡは、切断される前に、ある量の検出可能なシグナルを生成し、測定される検出可能なシグナルの量は、標識された検出ｓｓＤＮＡが切断される場合、低減される。いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡは、（例えば、ＦＲＥＴ対から）切断される前に第１の検出可能なシグナルを生成し、標識された検出ｓｓＤＮＡが（例えば、クエンチャー／蛍光体対から）切断される場合、第２の検出可能なシグナルを生成する。したがって、いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡは、ＦＲＥＴ対及びクエンチャー／蛍光体対を含む。
【００８０】
いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡは、ＦＲＥＴ対を含む。ＦＲＥＴは、それによって励起状態のフルオロフォアから極めて近接した第２の発色団へのエネルギーの無放射移動が起こるプロセスである。エネルギー移動が起こり得る範囲は、約１０ナノメートル（１００オングストローム）に限定され、転写の効率は、フルオロフォア間の分離距離に非常に敏感である。したがって、本明細書で使用される場合、「ＦＲＥＴ」（「蛍光共鳴エネルギー移動」、「Ｆｏｒｓｔｅｒ共鳴エネルギー移動」としても知られる）という用語は、ドナーの発光スペクトルがアクセプターの発光スペクトルと重複するように選択され、さらに、ドナー及びアクセプターが互いに極めて近接している（通常１０ｎｍ以下）場合、エネルギーの一部が量子結合効果によりドナーからアクセプターへ通過する際に、ドナーの励起がアクセプターの隆起及びアクセプターからの発光を生じさせるように選択された、ドナーフルオロフォア及び一致するアクセプターフルオロフォアが関与する物理現象を指す。したがって、ＦＲＥＴシグナルは、ドナー及びアクセプターの近接ゲージとして機能し、それらが互いに近接している場合にのみ生成されるシグナルである。ＦＲＥＴドナー部分（例えば、ドナーフルオロフォア）及びＦＲＥＴアクセプター部分（例えば、アクセプターフルオロフォア）は、本明細書では集合的に「ＦＲＥＴ対」と称される。
【００８１】
ドナーアクセプター対（ＦＲＥＴドナー部分及びＦＲＥＴアクセプター部分）は、本明細書では「ＦＲＥＴ対」または「シグナルＦＲＥＴ対」と称される。したがって、いくつかの場合には、対象の標識された検出ｓｓＤＮＡは、２つのシグナルパートナー（シグナル対）を含み、一方のシグナルパートナーがＦＲＥＴドナー部分である場合、他方のシグナルパートナーはＦＲＥＴアクセプター部分である。したがって、そのようなＦＲＥＴ対（ＦＲＥＴドナー部分及びＦＲＥＴアクセプター部分）を含む、対象の標識された検出ｓｓＤＮＡは、シグナルパートナーが極めて近接している場合（例えば、同じＲＮＡ分子上にある間）は、検出可能なシグナル（ＦＲＥＴシグナル）を示すが、パートナーが（例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）によるＲＮＡ分子の切断後に）分離している場合は、シグナルは減少する（または不在となる）。
【００８２】
ＦＲＥＴドナー及びアクセプター部分（ＦＲＥＴ対）は当業者に知られ、任意の簡便なＦＲＥＴ対（例えば、任意の簡便なドナー及びアクセプター部分対）を使用することができる好適なＦＲＥＴ対の例としては、表１に提示されるものが挙げられるが、それらに限定されない。また、Ｂａｊａｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｓｅｎｓｏｒｓ（Ｂａｓｅｌ）．２０１６  Ｓｅｐ  １４；１６（９）、及びＡｂｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１５  Ａｕｇ  ３；１０（８）：ｅ０１３４４３６も参照されたい。
【００８３】
（表１）ＦＲＥＴ対（ドナー及びアクセプターＦＲＥＴ部分）の例
2021508238.tif 000003
（１）５−（２−ヨードアセチルアミノエチル）アミノナフタレン−１−スルホン酸
（２）Ｎ−（４−ジメチルアミノ−３，５−ジニトロフェニル）マレイミド
（３）カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル
（４）４，４−ジフルオロ−４−ボラ−３ａ，４ａ−ジアザ−ｓ−インダセン
【００８４】
いくつかの場合には、検出可能なシグナルは、標識された検出ｓｓＤＮＡが切断されたときに生成される（例えば、いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡは、クエンチャー／蛍光体対を含む）。シグナルクエンチング対の一方のシグナルパートナーは、検出可能なシグナルを生成し、他方のシグナルパートナーは、第１のシグナルパートナーの検出可能なシグナルをクエンチするクエンチャー部分である（すなわち、クエンチャー部分は、シグナルパートナーが互いに近接している場合に、例えば、シグナル対のシグナルパートナーが極めて近接している場合に、シグナル部分からのシグナルが低減される（クエンチされる）ように、シグナル部分のシグナルをクエンチする）。
【００８５】
例えば、いくつかの場合には、検出可能なシグナルの量は、標識された検出ｓｓＤＮＡが切断されたときに増加する。例えば、いくつかの場合には、例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）による切断の前に両方が同一のｓｓＤＮＡ分子上に存在する場合、一方のシグナルパートナー（シグナル部分）によって示されるシグナルは、他方のシグナルパートナー（クエンチャ−シグナル部分）によってクエンチされる。そのようなシグナル対は、本明細書では「クエンチャー／蛍光体対」、「クエンチング対」、または「シグナルクエンチング対」と称される。例えば、いくつかの場合には、一方のシグナルパートナー（例えば、第１のシグナルパートナー）は、第２のシグナルパートナー（例えば、クエンチャー部分）によってクエンチされる検出可能なシグナルを生成するシグナル部分である。したがって、そのようなクエンチャー／蛍光体対のシグナルパートナーは、パートナーが分離された場合（例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）による検出ｓｓＤＮＡの切断後に）、検出可能なシグナルを生成するが、パートナーが近接している場合（例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）による検出ｓｓＤＮＡの切断前に）、シグナルはクエンチされる。
【００８６】
クエンチャー部分は、（例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）による検出ｓｓＤＮＡの切断前に）シグナル部分からのシグナルをクエンチすることができる。いくつかの場合には、クエンチャー部分は、シグナル部分からシグナルをクエンチし、クエンチャー部分の存在下（シグナルパートナーが互いに近接している場合）で検出されたシグナルは、クエンチャー部分の非存在下（シグナルパートナーが分離されている場合）で検出されたシグナルの９５％以下である。例えば、いくつかの場合には、クエンチャー部分の存在下で検出されるシグナルは、クエンチャー部分の非存在下で検出されるシグナルの９０％以下、８０％以下、７０％以下、６０％以下、５０％以下、４０％以下、３０％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、または５％以下である。いくつかの場合には、（例えば、バックグラウンドより高い）シグナルは、クエンチャー部分の存在下では検出されない。
【００８７】
いくつかの場合には、クエンチャー部分の非存在下で（シグナルパートナーが分離されている場合に）検出されるシグナルは、クエンチャー部分の存在下で（シグナルパートナーが互いに近接している場合に）検出されるシグナルより、少なくとも１．２倍大きい（例えば、少なくとも１．３倍、少なくとも１．５倍、少なくとも１．７倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも７倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、または少なくとも５０倍大きい）。
【００８８】
いくつかの場合には、シグナル部分は、蛍光標識である。いくつかのこのような場合では、クエンチャー部分は、蛍光標識からのシグナル（光シグナル）を（例えば、標識の発光スペクトルのエネルギーを吸収することによって）クエンチする。したがって、クエンチャー部分がシグナル部分に近接していない場合、シグナルはクエンチャー部分によって吸収されないため、蛍光標識からの発光（シグナル）は検出可能である。任意の簡便なドナーアクセプター対（シグナル部分／クエンチャー部分対）を使用することができ、多くの好適な対が当該技術分野で知られている。
【００８９】
いくつかの場合には、クエンチャー部分は、シグナル部分（本明細書では「検出可能な標識」とも称される）からエネルギーを吸収し、次いでシグナル（例えば、異なる波長の光）を発光する。したがって、いくつかの場合には、クエンチャー部分はそれ自体がシグナル部分であり（例えば、シグナル部分は、６−カルボキシフルオレセインであり得、クエンチャー部分は、６−カルボキシ−テトラメチルローダミンであり得る）、いくつかのそのような場合では、対はまた、ＦＲＥＴ対でもあり得る。いくつかの場合には、クエンチャー部分は、ダーククエンチャーである。ダーククエンチャーは、励起エネルギーを吸収し、エネルギーを別の方法で（例えば、熱として）消散することができる。したがって、ダーククエンチャーは、それ自体は最小の蛍光を有するか、または蛍光を有しない（蛍光を発光しない）。ダーククエンチャーの例は、米国特許第８，８２２，６７３号、及び同第８，５８６，７１８号、米国特許出願公開第２０１４０３７８３３０号、同第２０１４０３４９２９５号、及び同第２０１４０１９４６１１号、ならびに国際特許出願第ＷＯ２００１４２５０５号、及び同第ＷＯ２００１８６００１号（これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に含まれる）にさらに記載される。
【００９０】
蛍光標識の例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＡＴＴＯ色素（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ  、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ色素、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ色素、Ｓｅｔａ色素、ＩＲＩＳ色素、ＳｅＴａｕ色素、ＳＲｆｌｕｏｒ色素、Ｓｑｕａｒｅ色素、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、量子ドット、及びテザー蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９１】
いくつかの場合には、検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＡＴＴＯ色素（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ  、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ色素、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ色素、Ｓｅｔａ色素、ＩＲＩＳ色素、ＳｅＴａｕ色素、ＳＲｆｌｕｏｒ色素、Ｓｑｕａｒｅ色素、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ、及びＰａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅから選択される蛍光標識である。
【００９２】
いくつかの場合には、検出可能な標識は、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）色素、ＡＴＴＯ色素（例えば、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ  、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、ＡＴＴＯ  ７４０）、ＤｙＬｉｇｈｔ色素、シアニン色素（例えば、Ｃｙ２、Ｃｙ３、Ｃｙ３．５、Ｃｙ３ｂ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、Ｃｙ７、Ｃｙ７．５）、ＦｌｕｏＰｒｏｂｅｓ色素、Ｓｕｌｆｏ  Ｃｙ色素、Ｓｅｔａ色素、ＩＲＩＳ色素、ＳｅＴａｕ色素、ＳＲｆｌｕｏｒ色素、Ｓｑｕａｒｅ色素、フルオレセイン（ＦＩＴＣ）、テトラメチルローダミン（ＴＲＩＴＣ）、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ、Ｏｒｅｇｏｎ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｇｒｅｅｎ、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｏｒａｎｇｅ、量子ドット、及びテザー蛍光タンパク質から選択される蛍光標識である。
【００９３】
ＡＴＴＯ色素の例としては、ＡＴＴＯ  ３９０、ＡＴＴＯ  ４２５、ＡＴＴＯ  ４６５、ＡＴＴＯ  ４８８、ＡＴＴＯ  ４９５、ＡＴＴＯ  ５１４、ＡＴＴＯ  ５２０、ＡＴＴＯ  ５３２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ６Ｇ、ＡＴＴＯ  ５４２、ＡＴＴＯ  ５５０、ＡＴＴＯ  ５６５、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ３Ｂ、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１１、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｔｈｉｏ１２、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１０１、ＡＴＴＯ  ５９０、ＡＴＴＯ  ５９４、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１３、ＡＴＴＯ  ６１０、ＡＴＴＯ  ６２０、ＡＴＴＯ  Ｒｈｏ１４、ＡＴＴＯ  ６３３、ＡＴＴＯ  ６４７、ＡＴＴＯ  ６４７Ｎ、ＡＴＴＯ  ６５５、ＡＴＴＯ  Ｏｘａ１２、ＡＴＴＯ  ６６５、ＡＴＴＯ  ６８０、ＡＴＴＯ  ７００、ＡＴＴＯ  ７２５、及びＡＴＴＯ  ７４０が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９４】
Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ色素の例としては、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４０５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５１４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６１０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３５、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７００、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７５０、Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ（登録商標）７９０などが挙げられるが、これらに限定されない。
【００９５】
クエンチャー部分の例としては、ダーククエンチャー、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３）、Ｑｘｌクエンチャー、ＡＴＴＯクエンチャー（例えば、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、ＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１、ＱＳＹ色素（例えば、ＱＳＹ  ７、ＱＳＹ  ９、ＱＳＹ  ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、及び金ナノ粒子などの金属クラスター等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９６】
いくつかの場合には、クエンチャー部分は、ダーククエンチャー、Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））（例えば、ＢＨＱ−０、ＢＨＱ−１、ＢＨＱ−２、ＢＨＱ−３）、Ｑｘｌクエンチャー、ＡＴＴＯクエンチャー（例えば、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑ）、ジメチルアミノアゾベンゼンスルホン酸（ダブシル）、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＲＱ、Ｉｏｗａ  Ｂｌａｃｋ  ＦＱ、ＩＲＤｙｅ  ＱＣ−１、ＱＳＹ色素（例えば、ＱＳＹ  ７、ＱＳＹ  ９、ＱＳＹ  ２１）、ＡｂｓｏｌｕｔｅＱｕｅｎｃｈｅｒ、Ｅｃｌｉｐｓｅ、及び金属クラスターから選択される。
【００９７】
ＡＴＴＯクエンチャーの例としては、ＡＴＴＯ  ５４０Ｑ、ＡＴＴＯ  ５８０Ｑ、及びＡＴＴＯ  ６１２Ｑが挙げられるが、これらに限定されない。Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ（登録商標）（ＢＨＱ（登録商標））の例としては、ＢＨＱ−０（４９３ｎｍ）、ＢＨＱ−１（５３４ｎｍ）、ＢＨＱ−２（５７９ｎｍ）、ＢＨＱ−３（６７２ｎｍ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【００９８】
いくつかの検出可能な標識（例えば、蛍光色素）及び／またはクエンチャー部分の例については、例えば、Ｂａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｅｄ  Ｅｎｇ．２００９；１１：２５−４７、ならびに米国特許第８，８２２，６７３号、及び同第８，５８６，７１８号、米国特許出願公開第２０１４０３７８３３０号、同第２０１４０３４９２９５号、同第２０１４０１９４６１１号、同第２０１３０３２３８５１号、同第２０１３０２２４８７１号、同第２０１１０２２３６７７号、同第２０１１０１９０４８６号、同第２０１１０１７２４２０号、同第２００６０１７９５８５号、及び同第２００３０００３４８６号、ならびに国際特許出願第ＷＯ２００１４２５０５号、及び同第ＷＯ２００１８６００１号（これらの全ては、参照によりそれらの全体が本明細書に含まれる）を参照されたい。
【００９９】
いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡの切断は、比色分析の読み出しを測定することによって検出することができる。例えば、フルオロフォアの遊離（例えば、ＦＲＥＴ対からの遊離、クエンチャー／蛍光体対からの遊離など）は、検出可能なシグナルの波長シフト（及び、したがって色ずれ）をもたらすことができる。したがって、いくつかの場合には、対象の標識された検出ｓｓＤＮＡの切断は、色ずれによって検出することができる。このようなシフトは、ある色（波長）のシグナルの量の損失、別の色の量の増加、ある色の別の色に対する比率の変化、などのように表すことができる。
【０１００】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、クラス２のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質のサブタイプである。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム及びそれらのエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａなどのＣａｓ１２ファミリータンパク質）の例としては、例えば、Ｓｈｍａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７  Ｍａｒ；１５（３）：１６９−１８２：“Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｃｌａｓｓ  ２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ”を参照されたい。例としては、Ｃａｓ１２ファミリー（Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ）、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、及びＣ２ｃ９、ならびにＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）及びＣａｓＹ（Ｃａｓ１２ｄ）が挙げられるが、これらに限定されない。また、例えば、Ｋｏｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２０１７  Ｊｕｎ；３７：６７−７８：“Ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ  ｓｙｓｔｅｍｓ”も参照されたい。
【０１０１】
したがって、いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質（Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ）である。いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１２ｄ、またはＣａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質である。いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ａタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ｂタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ｃタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ｄタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ｅタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２（Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ）、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、及びＣ２ｃ９から選択されるタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、及びＣ２ｃ９から選択されるタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、及びＣ２ｃ５から選択されるタンパク質である。いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ１０及びＣ２ｃ９から選択されるタンパク質である。
【０１０２】
いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、（例えば、原核細胞において天然に発生する）天然型タンパク質である。他の場合では、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、天然型ポリペプチドではない（例えば、エフェクタータンパク質は、バリアントタンパク質、キメラタンパク質、融合パートナーを含むなどである）。天然型Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質の例としては、図１Ａ〜１Ｅに示されるものが挙げられるが、これらに限定されない。いずれのＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質も、本開示の組成物（例えば、核酸、キットなど）及び方法に好適であり得る（例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、（その標的ＤＮＡへのハイブリダイゼーション及びガイドＲＮＡの会合によって）活性化されると、ガイドＲＮＡと複合体を形成して非標的ｓｓＤＮＡのｓｓＤＮＡ切断活性を呈する限り）。
【０１０３】
いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ）（例えば、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２タンパク質）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ）（例えば、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２タンパク質）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ）（例えば、図１Ａ〜１Ｅのいずれか１つに示されるＣａｓ１２タンパク質）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ）（例えば、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２タンパク質）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２アミノ酸配列（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ）を含む。
【０１０４】
いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ａタンパク質（例えば、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２ａタンパク質）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ａタンパク質（例えば、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２ａタンパク質）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ａタンパク質（例えば、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２ａタンパク質）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ａタンパク質（例えば、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２ａタンパク質）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２ａアミノ酸配列を含む。
【０１０５】
いくつかの場合には、好適なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ａに示されるラクノスピラ科細菌（Ｌａｃｈｎｏｓｐｉｒａｃｅａｅ  ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＮＤ２００６  Ｃａｓ１２ａタンパク質アミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、好適なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ａに示されるアシダミノコッカス属の種（Ａｃｉｄａｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ）ＢＶ３Ｌ６  Ｃａｓ１２ａタンパク質アミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、好適なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ｂに示されるフランシセラ・ノビシダ（Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｎｏｖｉｃｉｄａ）Ｕ１１２  Ｃａｓ１２ａタンパク質アミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、好適なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ｂに示されるポルフィロモナス・マカカエ（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ  ｍａｃａｃａｅ）Ｃａｓ１２ａタンパク質アミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、好適なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ｃに示されるモラクセラ・ボボクリ（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ  ｂｏｖｏｃｕｌｉ）２３７  Ｃａｓ１２ａタンパク質アミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、好適なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ｃに示されるモラクセラ・ボボクリＡＡＸ０８＿００２０５  Ｃａｓ１２ａタンパク質アミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、好適なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ｄに示されるモラクセラ・ボボクリＡＡＸ１１＿００２０５  Ｃａｓ１２ａタンパ��質アミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、好適なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ｄに示されるチオミクロスピラ属の種（Ｔｈｉｏｍｉｃｒｏｓｐｉｒａ  ｓｐ．）ＸＳ５    Ｃａｓ１２ａタンパク質アミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、好適なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ｅに示されるブチリビブリオ属の種（Ｂｕｔｙｒｉｖｉｂｒｉｏ  ｓｐ．）ＮＣ３００５  Ｃａｓ１２ａタンパク質アミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、好適なＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ｅに示されるＡＡＣＣａｓ１２ｂアミノ酸配列と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。
【０１０６】
いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ｂタンパク質（例えば、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２ｂタンパク質）と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ｂタンパク質（例えば、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２ｂタンパク質）と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ｂタンパク質（例えば、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２ｂタンパク質）と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２ｂタンパク質（例えば、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２ｂタンパク質）と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、図１Ａ〜１Ｅに示されるＣａｓ１２ｂアミノ酸配列を含む。
【０１０７】
いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、またはＣ２ｃ９タンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、またはＣ２ｃ９タンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、またはＣ２ｃ９タンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、またはＣ２ｃ９タンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、Ｃ２ｃ５、Ｃ２ｃ１０、またはＣ２ｃ９アミノ酸配列を含む。
【０１０８】
いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、またはＣ２ｃ５タンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、またはＣ２ｃ５タンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、またはＣ２ｃ５タンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、またはＣ２ｃ５タンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、またはＣ２ｃ５アミノ酸配列を含む。
【０１０９】
いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、またはＣ２ｃ５タンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、またはＣ２ｃ５タンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、またはＣ２ｃ５タンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、またはＣ２ｃ５タンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ４、Ｃ２ｃ８、またはＣ２ｃ５アミノ酸配列を含む。
【０１１０】
いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ１０、またはＣ２ｃ９タンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ１０、またはＣ２ｃ９タンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ１０、またはＣ２ｃ９タンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ１０、またはＣ２ｃ９タンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃａｓ１２、Ｃ２ｃ１０、またはＣ２ｃ９アミノ酸配列を含む。
【０１１１】
いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ１０またはＣ２ｃ９タンパク質と２０％以上の配列同一性（例えば、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。例えば、いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ１０またはＣ２ｃ９タンパク質と５０％以上の配列同一性（例えば、６０％以上、７０％以上、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ１０またはＣ２ｃ９タンパク質と８０％以上の配列同一性（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ１０またはＣ２ｃ９タンパク質と９０％以上の配列同一性（例えば、９５％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の配列同一性）を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、Ｃ２ｃ１０またはＣ２ｃ９アミノ酸配列を含む。
【０１１２】
いくつかの場合には、対象のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、異種ポリペプチドと融合（コンジュゲート）している。いくつかの場合には、異種ポリペプチド（融合パートナー）は、亜細胞性局在を提供する。すなわち、異種ポリペプチドは、亜細胞性局在配列（例えば、核に対して標的化するための核局在シグナル（ＮＬＳ）、融合タンパク質を核外に保持する配列、例えば、核外搬出配列（ＮＥＳ）、融合タンパク質を細胞質中に保持したままにする配列、ミトコンドリアに対して標的化するためのミトコンドリア局在シグナル、葉緑体に対して標的化するための葉緑体局在シグナル、ＥＲ保持シグナル等）を含有する。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２タンパク質）はＮＬＳを含まないため、タンパク質は核を標的としない（これは、例えば、サイトゾルで非標的ｓｓＤＮＡを切断することが望ましい場合に有利であり得る。）。いくつかの場合には、異種ポリペプチドは、追跡及び／または精製を容易にするためのタグを提供することができる（すなわち、異種ポリペプチドは、検出可能な標識である）（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＹＦＰ、ＲＦＰ、ＣＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ｔｄＴｏｍａｔｏ等；ヒスチジンタグ、例えば、６ＸＨｉｓタグ；ヘマグルチニン（ＨＡ）タグ；ＦＬＡＧタグ；Ｍｙｃタグ等）。
【０１１３】
いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、核局在化シグナル（ＮＬＳ）（例えば、いくつかの場合には、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む（融合されている）。したがって、いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、１つ以上のＮＬＳ（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）を含む。いくつかの場合には、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端及び／もしくはＣ末端またはそれらの付近（例えば、それらの５０アミノ酸以内）に位置付けられる。いくつかの場合には、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端またはその付近（例えば、その５０アミノ酸以内）に位置付けられる。いくつかの場合には、１つ以上のＮＬＳ（２つ以上、３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｃ末端またはその付近（例えば、その５０アミノ酸以内）に位置付けられる。いくつかの場合には、１つ以上のＮＬＳ（３つ以上、４つ以上、または５つ以上のＮＬＳ）は、Ｎ末端及びＣ末端の両方またはそれらの付近（例えば、それらの５０アミノ酸以内）に位置付けられる。いくつかの場合には、ＮＬＳは、Ｎ末端に位置付けられ、ＮＬＳは、Ｃ末端に位置付けられる。
【０１１４】
いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、１〜１０個のＮＬＳ（例えば、１〜９、１〜８、１〜７、１〜６、１〜５、２〜１０、２〜９、２〜８、２〜７、２〜６、または２〜５個のＮＬＳ）を含む（と融合している）。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、２〜５個のＮＬＳ（例えば、２〜４、または２〜３個のＮＬＳ）を含む（融合する）。ＮＬＳの非限定な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１３６）を有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ、ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ（例えば、配列
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を有するヌクレオプラスミン二連ＮＬＳ）、アミノ酸配列
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を有するｃ−ｍｙｃ  ＮＬＳ、配列
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を有するｈＲＮＰＡ１  Ｍ９  ＮＬＳ、インポーチン−アルファ由来のＩＢＢドメインの配列
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、筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４２）及びＰＰＫＫＡＲＥＤ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４３）、ヒトｐ５３の配列ＰＱＰＫＫＫＰＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４４）、マウスｃ−ａｂｌ  ＩＶの配列
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、インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４６）及びＰＫＱＫＫＲＫ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４７）、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４８）、マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１４９）、ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列
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、ならびにステロイドホルモン受容体（ヒト）糖コルチコイドの配列
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に由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、ＮＬＳ（または複数のＮＬＳ）は、真核細胞の核中で検出可能な量のタンパク質の蓄積を駆動するのに十分な強度である。核中の蓄積の検出は、任意の好適な技法によって実施され得る。
【０１１５】
プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、ＤＮＡ標的化ＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の相補性の領域によって定義される標的配列において、標的ＤＮＡに結合する。多くのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエンドヌクレアーゼの場合と同様に、二本鎖標的ＤＮＡの部位特異的結合（及び／または切断）は、（ｉ）ガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間の塩基対合相補性、及び（ｉｉ）標的ＤＮＡ中の短いモチーフ［プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）と称される］の両方によって決定される位置において生じる。
【０１１６】
いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質のＰＡＭは、（例えば、標的ＤＮＡの非相補鎖の（相補鎖は、ガイドＲＮＡのガイド配列にハイブリダイズし、一方、非相補鎖は、ガイドＲＮＡに直接ハイブリダイズせず、かつ非相補鎖の逆相補体である））標的配列の５’の直近である。いくつかの場合には（例えば、本明細書に記載されるＣａｓ１２ａまたはＣａｓ１２ｂが使用される場合）、ＰＡＭ配列は５’−ＴＴＮ−３’である。いくつかの場合には、ＰＡＭ配列は５’−ＴＴＴＮ−３’である（例えば、図２を参照）。
【０１１７】
いくつかの場合には、異なるＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（すなわち、様々な種に由来するＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質）は、所望の特徴（例えば、異なるＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質の特定の酵素的特徴）を利用するために、提供される様々な方法における使用に有利であり得る。異なる種に由来するＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、標的ＤＮＡ中に異なるＰＡＭ配列を必要とし得る。したがって、選択した特定のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に対して、ＰＡＭ配列要件は、上記の５’−ＴＴＮ−３’または５’−ＴＴＴＮ−３’配列とは異なり得る。適切なＰＡＭ配列の特定のための様々な方法（インシリコ及び／またはウェットラボ法を含む）が当該技術分野において既知かつ慣例であり、任意の簡便な方法を使用することができる。
【０１１８】
ガイドＲＮＡ
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）に結合し、リボ核タンパク質複合体（ＲＮＰ）を形成して、標的ＤＮＡ内の特定の標的配列に複合体を標的化する核酸分子（例えば、天然のｃｒＲＮＡ）は、本明細書で「ガイドＲＮＡ」と称される。いくつかの場合には、ハイブリッドＤＮＡ／ＲＮＡは、ガイドＲＮＡがＲＮＡ塩基に加えてＤＮＡ塩基を含むように作製され得るが、「ガイドＲＮＡ」という用語は、本明細書では依然としてそのようなハイブリッド分子を包含するように使用されることを理解されたい。対象のガイドＲＮＡは、（標的ＤＮＡの標的配列にハイブリダイズする）ガイド配列（「スペーサー」とも称される）及び定常領域（例えば、ガイド配列に隣接し、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域）を含む。「定常領域」はまた、本明細書では「タンパク質結合セグメント」とも称され得る。いくつかの場合には、例えば、Ｃａｓ１２ａの場合、定常領域はガイド配列の５’である。
【０１１９】
ガイド配列
ガイド配列は、標的ＤＮＡの標的配列に相補的である（ハイブリダイズする）。いくつかの場合には、ガイド配列は、長さが１５〜２８ヌクレオチド（ｎｔ）（例えば、長さが１５〜２６、１５〜２４、１５〜２２、１５〜２０、１５〜１８、１６〜２８、１６〜２６、１６〜２４、１６〜２２、１６〜２０、１６〜１８、１７〜２６、１７〜２４、１７〜２２、１７〜２０、１７〜１８、１８〜２６、１８〜２４、または１８〜２２ｎｔ）である。いくつかの場合には、ガイド配列は、長さが１８〜２４ヌクレオチド（ｎｔ）である。いくつかの場合には、ガイド配列は、少なくとも１５ｎｔ長（例えば、少なくとも１６、１８、２０、または２２ｎｔ長）である。いくつかの場合には、ガイド配列は、少なくとも１７ｎｔ長である。いくつかの場合には、ガイド配列は、少なくとも１８ｎｔ長である。いくつかの場合には、ガイド配列は、少なくとも２０ｎｔ長である。
【０１２０】
いくつかの場合には、ガイド配列は標的ＤＮＡの標的配列に８０％以上（例えば、８５％以上、９０％以上、９５％以上、または１００％）相補的である。いくつかの場合には、ガイド配列は標的ＤＮＡの標的配列に１００％相補的である。いくつかの場合には、標的ＤＮＡは、ガイドＲＮＡのガイド配列と少なくとも１５ヌクレオチド（ｎｔ）の相補性を含む。
【０１２１】
定常領域
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）とともに使用することができるガイドＲＮＡの定常領域の例が、図２に提示される。
【０１２２】
いくつかの場合には、対象のガイドＲＮＡは、図２に示されるｃｒＲＮＡ反復配列のいずれか１つと７０％以上の同一性（例えば、８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のガイドＲＮＡは、図２に示されるｃｒＲＮＡ反復配列のいずれか１つと９０％以上の同一性（例えば、９５％以上、９８％以上、９９％以上、または１００％の同一性）を有するヌクレオチド配列を含む。いくつかの場合には、対象のガイドＲＮＡは、図２に示されるｃｒＲＮＡヌクレオチド配列を含む。
【０１２３】
いくつかの場合には、ガイドＲＮＡは、二本鎖ＲＮＡ二重鎖（ｄｓＲＮＡ二重鎖）を含む。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡは、２〜１２ｂｐ（例えば、２〜１０ｂｐ、２〜８ｂｐ、２〜６ｂｐ、２〜５ｂｐ、２〜４ｂｐ、３〜１２ｂｐ、３〜１０ｂｐ、３〜８ｂｐ、３〜６ｂｐ、３〜５ｂｐ、３〜４ｂｐ、４〜１２ｂｐ、４〜１０ｂｐ、４〜８ｂｐ、４〜６ｂｐ、または４〜５ｂｐ）の長さを有するｄｓＲＮＡ二重鎖を有する。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡは、長さが２ｂｐ以上（例えば、長さが３ｂｐ以上、４ｂｐ以上、５ｂｐ以上、６ｂｐ以上、または７ｂｐ以上）であるｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡは、対応する野生型ガイドＲＮＡのｄｓＲＮＡ二重鎖よりも長いｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡは、対応する野生型ガイドＲＮＡのｄｓＲＮＡ二重鎖よりも短いｄｓＲＮＡ二重鎖を含む。
【０１２４】
いくつかの場合には、ガイドＲＮＡの定常領域は、長さが１５ヌクレオチド（ｎｔ）以上（例えば、長さが１８ｎｔ以上、２０ｎｔ以上、２１ｎｔ以上、２２ｎｔ以上、２３ｎｔ以上、２４ｎｔ以上、２５ｎｔ以上、２６ｎｔ以上、２７ｎｔ以上、２８ｎｔ以上、２９ｎｔ以上、３０ｎｔ以上、３１ｎｔ以上、３２ｎｔ以上、３３ｎｔ以上、３４ｎｔ以上、または３５ｎｔ以上）である。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡの定常領域は長さが１８ｎｔ以上である。
【０１２５】
いくつかの場合には、ガイドＲＮＡの定常領域は、１２〜１００ｎｔ（例えば、１２〜９０、１２〜８０、１２〜７０、１２〜６０、１２〜５０、１２〜４０、１５〜１００、１５〜９０、１５〜８０、１５〜７０、１５〜６０、１５〜５０、１５〜４０、２０〜１００、２０〜９０、２０〜８０、２０〜７０、２０〜６０、２０〜５０、２０〜４０、２５〜１００、２５〜９０、２５〜８０、２５〜７０、２５〜６０、２５〜５０、２５〜４０、２８〜１００、２８〜９０、２８〜８０、２８〜７０、２８〜６０、２８〜５０、２８〜４０、２９〜１００、２９〜９０、２９〜８０、２９〜７０、２９〜６０、２９〜５０、または２９〜４０ｎｔ）の範囲の長さを有する。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡの定常領域は、２８〜１００ｎｔの範囲の長さを有する。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡの領域は、２８〜４０ｎｔの範囲の長さを有する５’のガイド配列である。
【０１２６】
いくつかの場合には、ガイドＲＮＡの定常領域は、対応する野生型ガイドＲＮＡの対応する領域と比較して短縮される（対応する領域よりも短い）。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡの定常領域は、対応する野生型ガイドＲＮＡの対応する領域と比較して拡張される（対応する領域よりも長い）。いくつかの場合には、対象のガイドＲＮＡは、長さが３０ヌクレオチド（ｎｔ）以上（長さが３４ｎｔ以上、４０ｎｔ以上、４５ｎｔ以上、５０ｎｔ以上、５５ｎｔ以上、６０ｎｔ以上、６５ｎｔ以上、７０ｎｔ以上、または８０ｎｔ以上）である。いくつかの場合には、ガイドＲＮＡは、長さが３５ｎｔ以上である。
【０１２７】
前駆体ガイドＲＮＡアレイ
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、例えば、前駆体のエンドリボヌクレアーゼ的切断により、前駆体ガイドＲＮＡを成熟ガイドＲＮＡに切断することができる。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、前駆体ガイドＲＮＡアレイ（タンデムに配列された複数のガイドＲＮＡを含む）を２つ以上の個々のガイドＲＮＡに切断することができる。したがって、いくつかの場合には、前駆体ガイドＲＮＡアレイは、２つ以上（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、２、３、４、または５）のガイドＲＮＡ（例えば、前駆体分子としてタンデムに配置される）を含む。換言すれば、いくつかの場合には、２つ以上のガイドＲＮＡがアレイ（前駆体ガイドＲＮＡアレイ）上に存在し得る。Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、前駆体ガイドＲＮＡアレイを個々のガイドＲＮＡに切断することができる。
【０１２８】
いくつかの場合には、対象のガイドＲＮＡアレイは、２つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、３つ以上、４つ以上、５つ以上、６つ以上、または７つ以上のガイドＲＮＡ）を含む。所与のアレイのガイドＲＮＡは、同じ標的ＤＮＡの異なる標的部位を標的とすることができ（すなわち、ハイブリダイズするガイド配列を含むことができ）（例えば、これにより検出の感度を高めることができ）、及び／または異なる標的ＤＮＡ分子（例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）、特定のウイルスの異なる株など）を標的とすることができ、例えば、ウイルスの複数の株を検出するために使用することができる。いくつかの場合には、前駆体ガイドＲＮＡアレイの各ガイドＲＮＡは、異なるガイド配列を有する。いくつかの場合には、前駆体ガイドＲＮＡアレイの２つ以上のガイドＲＮＡは、同じガイド配列を有する。
【０１２９】
いくつかの場合には、前駆体ガイドＲＮＡアレイは、同じ標的ＤＮＡ分子内の異なる標的部位を標的とする２つ以上のガイドＲＮＡを含む。例えば、いくつかの場合には、このようなシナリオは、いずれか１つが標的ＤＮＡ分子にハイブリダイズする場合、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）を活性化することによって検出感度を上げることができる。したがって、いくつかの場合には、対象の組成物（例えば、キット）または方法は、（前駆体ガイドＲＮＡアレイの文脈において、または前駆体ガイドＲＮＡアレイの文脈ではなく）２つ以上のガイドＲＮＡを含む（例えば、ガイドＲＮＡは成熟したガイドＲＮＡであり得る）。
【０１３０】
いくつかの場合には、前駆体ガイドＲＮＡアレイは、異なる標的ＤＮＡ分子を標的とする２つ以上のガイドＲＮＡを含む。例えば、このようなシナリオでは、潜在的な標的ＤＮＡのファミリーのいずれか１つが存在する場合に、陽性シグナルをもたらし得る。このようなアレイは、例えば、一塩基多型（ＳＮＰ）などのバリエーションに基づいて、転写産物のファミリーを標的とするために使用することができる（例えば、診断目的で）。このようなものは、ウイルスの多数の異なる株のうちのいずれか１つが存在するかどうかを検出するためにも有用であり得る。このようなものは、細菌の多数の異なる種、株、分離菌、またはバリアント（例えば、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍの異なる種、株、分離菌、またはバリアント、Ｎｅｉｓｓｅｒｉａの異なる種、株、分離菌、またはバリアント、黄色ブドウ球菌の異なる種、株、分離菌、またはバリアント、Ｅ．ｃｏｌｉの異なる種、株、分離菌、またはバリアント等）のうちのいずれか１つが存在するかどうかを検出するためにも有用であり得る。したがって、いくつかの場合には、対象の組成物（例えば、キット）または方法は、（前駆体ガイドＲＮＡアレイの文脈において、または前駆体ガイドＲＮＡアレイの文脈ではなく）２つ以上のガイドＲＮＡを含む（例えば、ガイドＲＮＡは成熟したガイドＲＮＡであり得る）。
【０１３１】
核酸の修飾
いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡ（及び／またはガイドＲＮＡ）は、核酸に新たなまたは強化された特徴（例えば、改善された安定性）を提供するために、１つ以上の修飾、例えば、塩基修飾、骨格修飾、糖修飾などを含む。当該技術分野で既知のとおり、ヌクレオシドは、塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環式塩基である。そのような複素環式塩基の２つの最も一般的なクラスは、プリン及びピリミジンである。ヌクレオチドは、ヌクレオシドの糖部分に共有結合したリン酸基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドの場合、リン酸基は、糖の２’、３’、または５’ヒドロキシル部分に連結し得る。オリゴヌクレオチドの形成において、リン酸基は、隣接するヌクレオシドと互いに共有結合して、線状ポリマー化合物を形成する。次に、この線状ポリマー化合物のそれぞれの末端は、さらに接合して環状化合物を形成することができるが、一般的には線状化合物が好適である。加えて、線状化合物は、内部ヌクレオチド塩基相補性を有し得、したがって完全にまたは部分的に二本鎖の化合物を生成するような方法で折り畳むことができる。オリゴヌクレオチド内では、リン酸基は一般に、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成していると称される。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の連結または骨格は、３′〜５′ホスホジエステル連結である。
【０１３２】
修飾骨格及び修飾ヌクレオシド間連結
好適な修飾の例としては、修飾された核酸骨格及び非天然のヌクレオシド間結合が挙げられる。修飾骨格を有する核酸は、骨格内にリン原子を保持するもの、及び骨格内にリン原子を有しないものを含む。
【０１３３】
リン酸原子を中に含有する好適な修飾オリゴヌクレオチド骨格としては、例えば、ホスホロチオエート、キラルホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホトリエステル、アミノアルキルホスホトリエステル、メチル及び他のアルキルホスホネート（３′−アルキレンホスホネート、５′−アルキレンホスホネート、及びキラルホスホネートを含む）、ホスフィネート、ホスホルアミダート（３′−アミノホスホルアミダート及びアミノアルキルホスホルアミダートを含む）、ホスホロジアミダート、チオノホスホロアミダート、チオノアルキルホスホネート、チオノアルキルホスホトリエステル、セレノホスフェート、及び通常３′−５′連結を有するボラノホスフェート、それらの２′−５′連結類似体、ならびに１つ以上のヌクレオチド間連結が、３′−３′、５′−５′、または２′−２′連結である、反転極性を有するものが挙げられる。反転極性を有する好適なオリゴヌクレオチドは、３′最端ヌクレオチド間連結において単一の３′−３′連結を含む、すなわち、塩基性であり得る単一の反転ヌクレオシド残基を含む（核酸塩基が欠失しているか、またはその代わりにヒドロキシル基を有する）。様々な塩（例えば、カリウムまたはナトリウムなど）、混合塩、及び遊離酸形態もまた含まれる。
【０１３４】
いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡ（及び／またはガイドＲＮＡ）は、１つ以上のホスホロチオエート及び／またはヘテロ原子ヌクレオシド間連結、特に−ＣＨ２−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｏ−ＣＨ２−（メチレン（メチルイミノ）またはＭＭＩ骨格として知られる）、−ＣＨ２−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−、及び−Ｏ−Ｎ（ＣＨ３）−ＣＨ２−ＣＨ２−を含む（天然のホスホジエステルヌクレオチド間連結は、−Ｏ−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−ＣＨ２−として表される）。ＭＭＩ型のヌクレオシド間結合は、上記で参照された米国特許第５，４８９，６７７号に開示されている。好適なアミドヌクレオシド間結合は、米国特許第５，６０２，２４０号に開示されている。
【０１３５】
例えば、米国特許第５，０３４，５０６号に記載されるような、モルホリノ骨格構造を有する核酸もまた好適である。例えば、いくつかの場合には、標識された検出ｓｓＤＮＡ（及び／またはガイドＲＮＡ）は、リボース環の代わりに６員モルホリノ環を含む。いくつかの場合には、ホスホロジアミダートまたは他の非ホスホジエステルヌクレオシド間連結は、ホスホジエステル連結に置き換わる。
【０１３６】
リン原子を中に含まない好適な修飾ポリヌクレオチド骨格は、短鎖アルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、混合ヘテロ原子及びアルキルもしくはシクロアルキルヌクレオシド間連結、または１つ以上の短鎖ヘテロ原子もしくは複素環式ヌクレオシド間連結により形成される骨格を有する。これらには、モルホリノ連結（部分的にヌクレオシドの糖部分から形成される）を有するもの、シロキサン骨格、スルフィド、スルホキシド及びスルホン骨格、ホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、メチレンホルムアセチル及びチオホルムアセチル骨格、リボアセチル骨格、アルケン含有骨格、スルファミン酸塩骨格、メチレンイミノ及びメチレンヒドラジノ骨格、スルホン酸及びスルホンアミド骨格、アミド骨格、ならびに混合Ｎ、Ｏ、Ｓ及びＣＨ２構成要素部分を有する他のものが含まれる。
【０１３７】
模倣体
標識された検出ｓｓＤＮＡ（及び／またはガイドＲＮＡ）は、核酸模倣物であり得る。「模倣体」という用語は、ポリヌクレオチドに適用される場合、ポリヌクレオチドを含むことが意図され、フラノース環のみまたはフラノース環及びヌクレオチド間連結の両方が、非フラノース基で置き換えられ、フラノース環のみの置換はまた、当該技術分野において代理糖であると称される。複素環式塩基部分または修飾された複素環式塩基部分は、適切な標的核酸とのハイブリダイゼーションのために維持される。優れたハイブリダイゼーション特性を有することが示されているポリヌクレオチド模倣体である、１つのそのような核酸は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）と称される。ＰＮＡにおいて、ポリヌクレオチドの糖骨格は、骨格、特にアミノエチルグリシン骨格を含有するアミドで置き換えられる。ヌクレオチドは保持され、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接的または間接的に結合する。
【０１３８】
優れたハイブリダイゼーション特性を有することが報告されている１つのポリヌクレオチド模倣体は、ペプチド核酸（ＰＮＡ）である。ＰＮＡ化合物中の骨格は、ＰＮＡにアミド含有骨格を与える２つ以上の連結されたアミノエチルグリシン単位である。複素環式塩基部分は、骨格のアミド部分のアザ窒素原子と直接的または間接的に結合する。ＰＮＡ化合物の調製を記載する代表的な米国特許としては、米国特許第５，５３９，０８２、同第５，７１４，３３１号、及び同第５，７１９，２６２号が挙げられるが、以下に限定されない。
【０１３９】
研究されているポリヌクレオチド模倣体の別のクラスは、モルホリノ環に結合した複素環式塩基を有する連結されたモルホリノ単位（モルホリノ核酸）に基づいている。モルホリノ核酸中のモルホリノモノマー単位を連結する、複数の連結基が報告されている。非イオン性オリゴマー化合物を提供するために、連結基の１つのクラスが選択された。非イオン性モルホリノ系オリゴマー化合物は、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を有する可能性がより低い。モルホリノ系ポリヌクレオチドは、細胞タンパク質との望ましくない相互作用を形成する可能性がより低いオリゴヌクレオチドの非イオン性模倣体である（Ｄｗａｉｎｅ  Ａ．Ｂｒａａｓｃｈ  ａｎｄ  Ｄａｖｉｄ  Ｒ．Ｃｏｒｅｙ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００２，４１（１４），４５０３−４５１０）。モルホリノ系ポリヌクレオチドは、米国特許第５，０３４，５０６号に開示されている。モノマーサブユニットを接合する様々な異なる連結基を有する、モルホリノクラスのポリヌクレオチド内の様々な化合物が調製されている。
【０１４０】
ポリヌクレオチド模倣体のさらなるクラスは、シクロヘキセニル核酸（ＣｅＮＡ）と称される。ＤＮＡ／ＲＮＡ分子中に通常存在するフラノース環が、シクロヘキセニル環で置き換えられる。ＣｅＮＡ  ＤＭＴ保護ホスホルアミダイトモノマーが調製され、古典的ホスホルアミダイト化学に続くオリゴマー化合物合成のために使用されている。完全に修飾されたＣｅＮＡオリゴマー化合物及びＣｅＮＡで修飾された特定の位置を有するオリゴヌクレオチドが調製され、研究されている（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０００，１２２，８５９５−８６０２を参照されたい）。一般に、ＤＮＡ鎖へのＣｅＮＡモノマーの組み込みは、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドのその安定性を増加させる。ＣｅＮＡオリゴアデニレートは、天然の複合体に対する同様の安定性を有するＲＮＡ及びＤＮＡ相補体との複合体を形成した。ＣｅＮＡ構造を天然の核酸構造に組み込むことの研究は、ＮＭＲ及び円二色性によって示され、容易な立体構造適応とともに進められた。
【０１４１】
さらなる修飾は、２′−ヒドロキシル基が糖環の４′炭素原子と連結し、それによって２′−Ｃ、４′−Ｃ−オキシメチレン連結を形成し、それによって二環式糖部分を形成するロックド核酸（ＬＮＡ）を含む。連結は、２’酸素原子及び４’炭素原子を架橋するメチレン（−ＣＨ２−）基であり得、式中、ｎは、１または２である（Ｓｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍｕｎ．１９９８，４，４５５−４５６）。ＬＮＡ及びＬＮＡ類似体は、相補的ＤＮＡ及びＲＮＡとの非常に高い二重鎖熱安定性（Ｔｍ＝＋３〜＋１０℃）、３’−エキソヌクレアーゼ分解に対する安定性、ならびに良好な溶解特性を示す。ＬＮＡを含有する強力かつ非毒性のアンチセンスオリゴヌクレオチドが記載されている（例えば、Ｗａｈｌｅｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，２０００，９７，５６３３−５６３８）。
【０１４２】
ＬＮＡモノマーであるアデニン、シトシン、グアニン、５−メチル−シトシン、チミン及びウラシルの合成及び調製は、それらのオリゴマー化、ならびに核酸認識特性とともに記載されている（Ｋｏｓｈｋｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ，１９９８，５４，３６０７−３６３０）。ＬＮＡ及びそれらの調製はまた、ＷＯ９８／３９３５２及びＷＯ９９／１４２２６にも記載されている。
【０１４３】
修飾糖部分
標識された検出ｓｓＤＮＡ（及び／またはガイドＲＮＡ）はまた、１つ以上の置換された糖部分も含むことができる。好適なポリヌクレオチドは、ＯＨ；Ｆ；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルケニル；Ｏ−、Ｓ−、もしくはＮ−アルキニル；またはＯ−アルキル−Ｏ−アルキルから選択される糖置換基を含み、それらのアルキル、アルケニル、及びアルキニルは、置換または非置換のＣ．ｓｕｂ．１〜Ｃ１０アルキルまたはＣ２〜Ｃ１０アルケニル及びアルキニルであってもよい。Ｏ（（ＣＨ２）ｎＯ）ｍＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＮＨ２、Ｏ（ＣＨ２）ｎＣＨ３、Ｏ（ＣＨ２）ｎＯＮＨ２、及びＯ（ＣＨ２）ｎＯＮ（（ＣＨ２）ｎＣＨ３）２が特に好適であり、ｎ及びｍは、１〜約１０である。他の好適なポリヌクレオチドは、Ｃ１〜Ｃ１０低級アルキル、置換低級アルキル、アルケニル、アルキニル、アルカリル、アラルキル、Ｏ−アルカリルもしくはＯ−アラルキル、ＳＨ、ＳＣＨ３、ＯＣＮ、Ｃｌ、Ｂｒ、ＣＮ、ＣＦ３、ＯＣＦ３、ＳＯＣＨ３、ＳＯ２ＣＨ３、ＯＮＯ２、ＮＯ２、Ｎ３、ＮＨ２、ヘテロシクロアルキル、ヘテロシクロアルカリル、アミノアルキルアミノ、ポリアルキルアミノ、置換シリル、ＲＮＡ切断基、レポーター基、インターカレーター、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を改善するための基、またはオリゴヌクレオチドの薬理学的特性を改善するための基、及び同様の特性を有する他の置換基から選択される糖置換基を含む。好適な修飾は、２’−メトキシエトキシ（２’−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ３、２’−Ｏ−（２−メトキシエチル）または２’−ＭＯＥとしても知られる）（Ｍａｒｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｌｖ．Ｃｈｉｍ．Ａｃｔａ、１９９５、７８、４８６−５０４）、すなわち、アルコキシアルコキシ基を含む。さらなる好適な修飾は、２’−ジメチルアミノオキシエトキシ、すなわち、本明細書の下記の実施例において記載される、Ｏ（ＣＨ２）２ＯＮ（ＣＨ３）２基（２’−ＤＭＡＯＥとしても知られる）、及び２’−ジメチルアミノエトキシエトキシ（当該技術分野では、２’−Ｏ−ジメチル−アミノ−エトキシ−エチルまたは２’−ＤＭＡＥＯＥとしても知られる）、すなわち、２’−Ｏ−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−Ｎ（ＣＨ３）２を含む。
【０１４４】
他の好適な糖置換基としては、メトキシ（−Ｏ−ＣＨ３）、アミノプロポキシ（−−Ｏ  ＣＨ２  ＣＨ２  ＣＨ２ＮＨ２）、アリル（−ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、−Ｏ−アリル（−−Ｏ−−  ＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）、及びフルオロ（Ｆ）が挙げられる。２’−糖置換基は、アラビノ（上）位またはリボ（下）位であってもよい。好適な２′−アラビノ修飾は、２′−Ｆである。同様の修飾が、オリゴマー化合物上の他の位置で、特に３′末端ヌクレオシド上のまたは２′−５′連結オリゴヌクレオチド内の糖の３′位、及び５′末端ヌクレオチドの５′位でなされもよい。オリゴマー化合物はまた、ペントフラノシル糖の代わりに、シクロブチル部分などの糖模倣体を有してもよい。
【０１４５】
塩基修飾及び置換
標識された検出ｓｓＤＮＡ（及び／またはガイドＲＮＡ）はまた、核酸塩基（当該技術分野では単に「塩基」と呼ばれることが多い）の修飾または置換を含み得る。本明細書で使用される場合、「非修飾」または「天然の」核酸塩基としては、プリン塩基アデニン（Ａ）及びグアニン（Ｇ）、ならびにピリミジン塩基チミン（Ｔ）、シトシン（Ｃ）、及びウラシル（Ｕ）が挙げられる。修飾核酸塩基としては、５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｍｅ−Ｃ）、５−ヒドロキシメチルシトシン、キサンチン、ヒポキサンチン、２−アミノアデニン、アデニン及びグアニンの６−メチル及び他のアルキル誘導体、アデニン及びグアニンの２−プロピル及び他のアルキル誘導体、２−チオウラシル、２−チオチミン及び２−チオシトシン、５−ハロウラシル及びシトシン、ピリミジン塩基の５−プロピニル（−Ｃ＝Ｃ−ＣＨ３）ウラシル及びシトシンならびに他のアルキニル誘導体、６−アゾウラシル、シトシン及びチミン、５−ウラシル（プソイドウラシル）、４−チオウラシル、８−ハロ、８−アミノ、８−チオール、８−チオアルキル、８−ヒドロキシル及び他の８−置換アデニン及びグアニン、５−ハロ、特に５−ブロモ、５−トリフルオロメチル及び他の５−置換ウラシル及びシトシン、７−メチルグアニン及び７−メチルアデニン、２−Ｆ−アデニン、２−アミノ−アデニン、８−アザグアニン及び８−アザアデニン、７−デアザグアニン及び７−デアザアデニン、ならびに３−デアザグアニン及び３−デアザアデニンが挙げられる。さらなる修飾核酸塩基としては、三環式ピリミジン、例えばフェノキサジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、フェノチアジンシチジン（１Ｈ−ピリミド（５，４−ｂ）（１，４）ベンゾチアジン−２（３Ｈ）−オン）、Ｇ−クランプ、例えば置換フェノキサジンシチジン（例えば、９−（２−アミノエトキシ）−Ｈ−ピリミド（５，４−（ｂ）（１，４）ベンゾキサジン−２（３Ｈ）−オン）、カルバゾールシチジン（２Ｈ−ピリミド（４，５−ｂ）インドール−２−オン）、ピリドインドールシチジン（Ｈ−ピリド（３′，２′：４，５）ピロロ（２，３−ｄ）ピリミジン−２−オン）が挙げられる。
【０１４６】
複素環式塩基部分としては、プリンまたはピリミジン塩基が他の複素環、例えば、７−デアザ−アデニン、７−デアザグアノシン、２−アミノピリジン、及び２−ピリドンで置換されるものも挙げられ得る。さらなる核酸塩基としては、米国特許第３，６８７，８０８号に開示されるもの、Ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｉｓｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  Ｏｆ  Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ａｎｄ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｐａｇｅｓ  ８５８−８５９，Ｋｒｏｓｃｈｗｉｔｚ，Ｊ．Ｉ．，ｅｄ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，１９９０に開示されるもの、Ｅｎｇｌｉｓｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗａｎｄｔｅ  Ｃｈｅｍｉｅ，Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９９１，３０，６１３によって開示されるもの、及びＳａｎｇｈｖｉ，Ｙ．Ｓ．，Ｃｈａｐｔｅｒ  １５，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ｐａｇｅｓ  ２８９−３０２，Ｃｒｏｏｋｅ，Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｌｅｂｌｅｕ，Ｂ．，ｅｄ．，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，１９９３によって開示されるものが挙げられる。これらの核酸塩基の一部は、オリゴマー化合物の結合親和性を増加させるのに有用である。これには、５−置換ピリミジン、６−アザピリミジン、ならびにＮ−２、Ｎ−６、及びＯ−６置換プリンが含まれ、２−アミノプロピルアデニン、５−プロピニルウラシル、及び５−プロピニルシトシンが挙げられる。５−メチルシトシン置換は、核酸二重鎖安定性を０．６〜１．２℃増加させることが示されており（Ｓａｎｇｈｖｉ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，ＣＲＣ  Ｐｒｅｓｓ，Ｂｏｃａ  Ｒａｔｏｎ，１９９３，ｐｐ．２７６−２７８）、例えば、２′−Ｏ−メトキシエチル糖修飾と組み合わされたとき、好適な塩基置換である。
【０１４７】
標的細胞への成分の導入
ガイドＲＮＡ（またはそれをコードするヌクレオチド配列を含む核酸）及び／またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、様々な周知の方法のいずれかによって宿主細胞に導入することができる。非限定的な例として、ガイドＲＮＡ及び／またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は脂質と組み合わせることができる。別の非限定的な例として、ガイドＲＮＡ及び／またはＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は粒子と組み合わせることができるか、または粒子に組み立てることができる。
【０１４８】
核酸及び／またはタンパク質を宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において既知であり、任意の簡便な方法を使用して、対象の核酸（例えば、発現コンストラクト／ベクター）を標的細胞（例えば、原核細胞、真核細胞、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞、ヒト細胞等）に導入することができる。好適な方法としては、例えば、ウイルス感染、形質移入、コンジュゲート、プロトプラスト融合、リポフェクション、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）媒介型形質移入、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介型形質移入、リポソーム媒介型形質移入、粒子ガン技術、リン酸カルシウム沈殿、直接マイクロインジェクション、ナノ粒子媒介型核酸送達（例えば、Ｐａｎｙａｍ  ｅｔ．，ａｌ．Ａｄｖ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖ  Ｒｅｖ．２０１２  Ｓｅｐ  １３．ｐｉｉ：Ｓ０１６９−４０９Ｘ（１２）００２８３−９．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ａｄｄｒ．２０１２．０９．０２３を参照）等が挙げられる。
【０１４９】
ガイドＲＮＡは、例えば、ガイドＲＮＡをコードするＤＮＡ分子として導入することができるか、またはＲＮＡ分子（もしくは適用可能な場合はハイブリッド分子）として直接提供することができる。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、タンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、プラスミド、発現ベクター、ウイルスベクターなど）として提供される。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、タンパク質として（例えば、関連ガイドＲＮＡなしで、または関連ガイドＲＮＡとともに、すなわち、リボ核タンパク質複合体−ＲＮＰとして）直接提供される。ガイドＲＮＡのように、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、任意の簡便な方法によって細胞に導入する（細胞に提供する）ことができ、そのような方法は、当業者に既知である。例示的な例として、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質は、細胞内に直接注入することができる（例えば、ガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードする核酸の有無にかかわらず）。別の例としては、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質とガイドＲＮＡ（ＲＮＰ）との予め形成された複合体を、細胞（例えば、真核細胞）に導入することができる（例えば、注射を介して、ヌクレオフェクションを介して、１つ以上の成分とコンジュゲートした、例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質とコンジュゲートした、ガイドＲＮＡとコンジュゲートした、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）を介して、など）。
【０１５０】
いくつかの場合には、核酸（例えば、ガイドＲＮＡ；Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸など）及び／またはポリペプチド（例えば、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質）は、粒子中の細胞（例えば、標的宿主細胞）に送達されるか、または粒子と会合する。「粒子」及び「ナノ粒子」という用語は、適切である場合、互換的に使用することができる。
【０１５１】
これは、例えば、粒子または脂質エンベロープを使用して達成することができ、例えば、リボヌクレオタンパク質（ＲＮＰ）複合体は、粒子、例えば、脂質またはリピドイド及び親水性ポリマー、例えば、カチオン性脂質及び親水性ポリマーを含む送達粒子を介して送達することができ、例えば、カチオン性脂質は、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウム−プロパン（ＤＯＴＡＰ）もしくは１，２−ジテトラデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＭＰＣ）を含み、及び／または親水性ポリマーは、エチレングリコールもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み、及び／または粒子は、コレステロールをさらに含む（例えば、配合物１からの粒子＝ＤＯＴＡＰ  １００、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  ０、コレステロール０；配合物番号２＝ＤＯＴＡＰ  ９０、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  １０、コレステロール０；配合物番号３＝ＤＯＴＡＰ  ９０、ＤＭＰＣ  ０、ＰＥＧ  ５、コレステロール５）。
【０１５２】
Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（もしくはタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むｍＲＮＡ）及び／またはガイドＲＮＡ（もしくはガイドＲＮＡをコードする１つ以上の発現ベクターなどの核酸）は、粒子または脂質エンベロープを使用して同時に送達され得る。例えば、リン脂質二層シェルによって封入されたポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアを有する生分解性コアシェル構造ナノ粒子を使用することができる。いくつかの場合には、自己集合生体付着性ポリマーに基づく粒子／ナノ粒子が使用され、そのような粒子／ナノ粒子は、例えば、脳へのペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達、及びペプチドの経鼻送達に適用され得る。疎水性薬物の経口吸収及び眼内送達などの他の実施形態もまた企図される。保護され、疾患の部位に送達される操作されたポリマーエンベロープを必要とする分子エンベロープ技術を使用することができる。約５ｍｇ／ｋｇの用量が、様々な要因、例えば、標的組織に応じて、単一または複数の用量で使用され得る。
【０１５３】
（例えば、米国特許公開第２０１１／０２９３７０３号に記載されているような）リピドイド化合物もまた、ポリヌクレオチドの投与において有用であり、使用することができる。一態様では、アミノアルコールリピドイド化合物は、細胞または対象に送達される薬剤と組み合わされて、マイクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルを形成する。アミノアルコールリピドイド化合物は、他のアミノアルコールリピドイド化合物、ポリマー（合成または天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、脂質等と組み合わされて、粒子を形成することができる。次いで、これらの粒子は、任意に、薬学的賦形剤と組み合わされて、医薬組成物を形成することができる。
【０１５４】
ポリ（ベータアミノアルコール）（ＰＢＡＡ）を使用することができ、ＷＯ２０１４１１８２７２（参照により本明細書に組み込まれる）及びＮａｉｒ，Ｊ  Ｋ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  １３６（４９），１６９５８−１６９６１）を参照して記載されるように、糖ベースの粒子、例えばＧａｌＮＡｃが使用され得る。いくつかの場合には、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）が使用される。球状核酸（ＳＮＡ（商標））構築物及びその他のナノ粒子（特に金ナノ粒子）を標的細胞に使用することができる。例えば、Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１  １３３：９２５４−９２５７、Ｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１  ７：３１５８−３１６２、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＣＳ  Ｎａｎｏ．２０１１  ５：６９６２−６９７０、Ｃｕｔｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１３７６−１３９１、Ｙｏｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１２  １２：３８６７−７１、Ｚｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２  １０９：１１９７５−８０、Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１２  ７：６３５−６３８、Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２  １３４：１６４８８−１６９１、Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，  Ｎａｔｕｒｅ  ２０１３  ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６、Ｃｈｏｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３  １１０（１９）：７６２５−７６３０、Ｊｅｎｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）、及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６−１９２を参照されたい。半固体及び柔らかいナノ粒子もまた、送達に好適である。エキソソームは、送達に使用することができる。エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送し、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる、内因性ナノベシクル粒子である。超電荷タンパク質は、細胞への送達に使用することができる。超電荷タンパク質は、異常に高い正または負の正味理論的電荷を有する、操作されたまたは天然型のタンパク質のクラスである。超負電荷及び超正電荷のタンパク質の両方は、熱的または化学的に誘導される凝集に耐える能力を呈する。超正電荷タンパク質はまた、哺乳動物細胞を透過することができる。カーゴをこれらのタンパク質、例えば、プラスミドＤＮＡ、ＲＮＡ、または他のタンパク質と会合させることは、インビトロ及びインビボの両方で、哺乳動物細胞へのこれらの高分子の機能的送達を容易にすることができる。細胞透過性ペプチド（ＣＰＰ）は、送達に使用することができる。ＣＰＰは、典型的に、リジンもしくはアルギニンなどの高い相対的存在量の正電荷アミノ酸を含有するか、または極性／電荷アミノ酸及び非極性疎水性アミノ酸の交互パターンを含有する配列を有するかのいずれかであるアミノ酸組成物を有する。
【０１５５】
関心対象の標的細胞
好適な標的細胞（ゲノムＤＮＡなどの標的核酸を含み得る）としては、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、クラミドモナス・レインハルディ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、クロレラ・ピレノイドサ、サルガッサム・パテンス、Ｃ．アガルド等、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物由来の細胞（例えば、ショウジョウバエ、蠕虫、棘皮動物、線形動物等）、昆虫の細胞（例えば、蚊、ミツバチ、農業害虫等）、クモ類動物の細胞（例えば、クモ、ダニ等）、脊椎動物由来の細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）、哺乳動物由来の細胞（例えば、齧歯類由来の細胞、ヒト由来の細胞、非ヒト哺乳動物の細胞、齧歯類の細胞（例えば、マウス、ラット）、ウサギ類の細胞（例えば、ウサギ）、有蹄類の細胞（例えば、ウシ、ウマ、ラクダ、ラマ、ビクーニャ、ヒツジ、ヤギ等）、海洋哺乳動物の細胞（例えば、クジラ、アザラシ、ゾウアザラシ、イルカ、アシカ等）等が挙げられるが、これらに限定されない。任意の種類の細胞が関心対象であり得る（例えば、幹細胞、例えば、胚幹（ＥＳ）細胞、誘導多能性幹（ｉＰＳ）細胞、生殖細胞（例えば、卵母細胞、精子、卵原細胞、精原細胞等）、成体細胞、体細胞、例えば、線維芽細胞、造血細胞、ニューロン、筋細胞、骨細胞、肝細胞、膵細胞、任意の段階にある胚のインビトロまたはインビボの胚細胞、例えば、１細胞、２細胞、４細胞、８細胞等の段階のゼブラフィッシュ胚等）。
【０１５６】
細胞は、確立された細胞株に由来し得るか、またはそれらは一次細胞であってもよく、「一次細胞」、「一次細胞株」、及び「一次培養物」は、本明細書では、対象に由来し、インビトロで培養物の限定数の継代、すなわち分裂にわたって増殖させた細胞及び細胞培養物を指すために互換的に使用される。例えば、一次培養物は、０回、１回、２回、４回、５回、１０回、または１５回継代されているが、危機段階を通過するには十分でない場合がある培養物である。典型的には、一次細胞株は、インビトロで１０継代未満にわたって維持される。標的細胞は、単細胞生物であり得、及び／または培養物中で増殖し得る。細胞が一次細胞である場合、それらは任意の簡便な方法によって個体から採取され得る。例えば、白血球は、アフェレーシス、白血球アフェレーシス、密度勾配分離等によって簡便に採取され得る一方、例えば、皮膚、筋肉、骨髄、脾臓、肝臓、膵臓、肺、腸、胃等の組織由来の細胞は、生検によって簡便に採取することができる。
【０１５７】
ガイドＲＮＡは、標的核酸にハイブリダイズすることによって特異性を提供するため、開示される方法における関心対象の有糸分裂及び／または有糸分裂後の細胞は、任意の生物の細胞（例えば、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、植物細胞、藻類細胞、例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、クラミドモナス・レインハルディ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、クロレラ・ピレノイドサ、サルガッサム・パテンス、Ｃ．アガルド等、真菌細胞（例えば、酵母細胞）、動物細胞、無脊椎動物の細胞（例えば、ショウジョウバエ、蠕虫、棘皮動物、線形動物等）、脊椎動物の細胞（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）、哺乳動物の細胞、齧歯類の細胞、ヒトの細胞等）を含み得る。
【０１５８】
植物細胞には、単子葉植物の細胞、及び双子葉植物の細胞が含まれる。細胞は、根細胞、葉細胞、木部の細胞、師部の細胞、形成層の細胞、頂端分裂組織細胞、実質細胞、厚角組織細胞、厚壁組織細胞等であり得る。植物細胞としては、農業作物、例えば小麦、トウモロコシ、米、モロコシ、キビ、大豆等の細胞が挙げられる。植物細胞としては、農業果物及びナッツ植物、例えば、アプリコット、オレンジ、レモン、リンゴ、プラム、ナシ、アーモンド等を産生する植物の細胞が挙げられる。
【０１５９】
細胞（標的細胞）の非限定な例としては、原核細胞、真菌細胞、細菌細胞、古細菌細胞、単細胞真核生物の細胞、原生生物細胞、植物由来の細胞（例えば、植物作物、果物、野菜、穀物、大豆、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）、小麦、種、トマト、米、キャッサバ、サトウキビ、カボチャ、乾草、ジャガイモ、綿、カンナビス、タバコ、顕花植物、球果植物、裸子植物、被子植物、シダ類、ヒカゲノカズラ類、ツノゴケ類、苔類コケ植物、苔類、双子葉植物、単子葉植物等由来の細胞等）、藻類細胞（例えば、ボツリオコッカス・ブラウニー、クラミドモナス・レインハルディ、ナンノクロロプシス・ガディタナ、クロレラ・ピレノイドサ、サルガッサム・パテンス、Ｃ．アガルド等）、海藻類（例えば、昆布）、真菌細胞（例えば、酵母細胞、マッシュルーム由来の細胞）、動物細胞、無脊椎動物（例えば、ショウジョウバエ、蠕虫、棘皮動物、線形動物等）由来の細胞、脊椎動物（例えば、魚類、両生類、爬虫類、鳥類、哺乳動物）由来の細胞、哺乳動物（例えば、有蹄類（例えば、ブタ、ウシ、ヤギ、ヒツジ）、齧歯類（例えば、ラット、マウス）、非ヒト霊長類、ヒト、ネコ科動物（例えば、ネコ）、イヌ科動物（例えば、イヌ）等）由来の細胞等が挙げられる。いくつかの場合には、細胞は、天然の生物に由来しない細胞である（例えば、細胞は、合成的に作製された細胞であり得、人工細胞とも称される）。
【０１６０】
細胞は、インビトロ細胞（例えば、確立された培養細胞株）であり得る。細胞は、エクスビボ細胞（個体由来の培養細胞）であり得る。細胞は、インビボ細胞（例えば、個体内の細胞）であり得る。細胞は、単離された細胞であり得る。細胞は、生物の内部の細胞であり得る。細胞は、生物であり得る。
【０１６１】
好適な細胞としては、ヒト胚幹細胞、胎児心筋細胞、筋線維芽細胞、間葉系幹細胞、自家移植拡張心筋細胞、脂肪細胞、全能性細胞、多能性細胞、血液肝細胞、筋芽細胞、成体肝細胞、骨髄細胞、間葉系細胞、胚性幹細胞、実質細胞、上皮細胞、内皮細胞、中皮細胞、線維芽細胞、骨芽細胞、軟骨細胞、外因性細胞、内因性細胞、幹細胞、造血幹細胞、骨髄由来の前駆細胞、心筋細胞、骨格細胞、胎児細胞、未分化細胞、多能性前駆細胞、単能性前駆細胞、単球、心筋芽細胞、骨格筋芽細胞、マクロファージ、毛細血管内皮細胞、異種細胞、同種細胞、及び出生後幹細胞が挙げられる。
【０１６２】
いくつかの場合には、細胞は、免疫細胞、ニューロン、上皮細胞、及び内皮細胞、または幹細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、単球、天然キラー細胞、樹状細胞、またはマクロファージである。いくつかの場合には、免疫細胞は、細胞毒性Ｔ細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、ヘルパーＴ細胞である。いくつかの場合には、免疫細胞は、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）である。
【０１６３】
いくつかの場合には、細胞は、幹細胞である。幹細胞は、成体幹細胞を含む。成体幹細胞はまた、体幹細胞とも称される。
【０１６４】
成体幹細胞は、分化組織中に存在するが、自己更新の特性及び複数の細胞型、通常は幹細胞が見出される組織に典型的な細胞型を生じる能力を保持する。体幹細胞の多くの例が当業者に既知であり、筋幹細胞、造血幹細胞、上皮幹細胞、神経幹細胞、間葉系幹細胞、哺乳動物幹細胞、腸幹細胞、中胚葉性幹細胞、内皮幹細胞、嗅官幹細胞、神経堤幹細胞等が挙げられる。
【０１６５】
関心対象の幹細胞としては、哺乳動物幹細胞が挙げられ、「哺乳動物」という用語は、ヒト、非ヒト霊長類、飼育動物及び家畜、ならびに動物園、研究室、競技用、または愛玩動物、例えば、イヌ、ウマ、ネコ、ウシ、マウス、ラット、ウサギ等を含む哺乳動物として分類される任意の動物を指す。いくつかの場合には、幹細胞は、ヒト幹細胞である。いくつかの場合には、幹細胞は、齧歯類（例えば、マウス、ラット）幹細胞である。いくつかの場合には、幹細胞は、非ヒト霊長類幹細胞である。
【０１６６】
キット
本開示は、例えば、複数のＤＮＡを含む試料中の、標的ＤＮＡを検出するためのキットを提供する。いくつかの場合には、キットは、（ａ）標識された検出ｓｓＤＮＡ（例えば、蛍光発光色素対、すなわち、ＦＲＥＴ対及び／またはクエンチャー／蛍光体対を含む標識された検出ｓｓＤＮＡ）と、（ｂ）（ｉ）ガイドＲＮＡ、及び／または該ガイドＲＮＡをコードする核酸、（ｉｉ）２つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、その各々が異なるガイド配列を有する）を含む前駆体ガイドＲＮＡアレイ、及び／または前駆体ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、ならびに（ｉｉｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）、及び／または該Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上と、を含む。いくつかの場合には、前駆体ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸は、ユーザによるガイド配列の挿入のための配列挿入部位を含む。
【０１６７】
いくつかの場合には、対象のキットは、（ａ）蛍光発光色素対、すなわち、ＦＲＥＴ対及び／またはクエンチャー／蛍光体対を含む標識された検出ｓｓＤＮＡと、（ｂ）（ｉ）ガイドＲＮＡ、及び／または該ガイドＲＮＡをコードする核酸、（ｉｉ）２つ以上のガイドＲＮＡ（例えば、その各々が異なるガイド配列を有する）を含む前駆体ガイドＲＮＡアレイ、及び／または前駆体ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、ならびに（ｉｉｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）、及び／または該Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質をコードする核酸のうちの１つ以上と、を含む。
【０１６８】
陽性対照
本開示のキット（例えば、標識された検出ｓｓＤＮＡ及びＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質を含むもの）はまた、陽性対照標的ＤＮＡも含み得る。いくつかの場合には、キットはまた、対照標的ＤＮＡにハイブリダイズするヌクレオチド配列を含む、陽性対照ガイドＲＮＡも含む。いくつかの場合には、陽性対照標的ＤＮＡは、様々な量で、別個の容器中に提供される。いくつかの場合には、陽性対照標的ＤＮＡは、様々な既知の濃度で、別個の容器中に、対照非標的ＤＮＡとともに提供される。
【０１６９】
核酸
開示のＲＮＡ（例えば、ガイドＲＮＡ及び前駆体ガイドＲＮＡアレイ）は、任意の簡便な方法（例えば、Ｔ７ポリメラーゼ、Ｔ３ポリメラーゼ、ＳＰ６ポリメラーゼなどのＲＮＡポリメラーゼ酵素を使用する、インビトロの化学合成）を使用して合成することができるが、ガイドＲＮＡ及び／または前駆体ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸もまた想定される。さらに、本開示のＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）は、タンパク質の形態で（例えば、キットの一部として）提供され得るが、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ及び／またはＤＮＡ）もまた提供され得る。
【０１７０】
例えば、いくつかの場合には、本開示のキットは、ガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸（例えば、ＤＮＡ、例えば、組み換え発現ベクター）を含む。いくつかの場合には、ヌクレオチド配列は、ガイド配列を含まないガイドＲＮＡをコードする。例えば、いくつかの場合には、核酸は、ガイドＲＮＡ（ガイド配列を含まないガイドＲＮＡ）の定常領域をコードするヌクレオチド配列を含み、ガイド配列をコードする核酸の挿入部位を含む。いくつかの場合には、本開示のキットは、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、例えば、組み換え発現ベクター）を含む。
【０１７１】
いくつかの場合には、本開示のキットは、前駆体ガイドＲＮＡアレイをコードするヌクレオチド配列を含む、核酸（例えば、ＤＮＡ、例えば、組み換え発現ベクター）を含む（例えば、いくつかの場合には、アレイの各ガイドＲＮＡは、異なるガイド配列を有する）。いくつかの場合には、アレイの１つ以上のコードされたガイドＲＮＡはガイド配列を有さず、例えば、核酸は、アレイの１つ以上のガイドＲＮＡのガイド配列（複数可）について挿入部位（複数可）を含むことができる。いくつかの場合には、対象のガイドＲＮＡは、前駆体ｃｒＲＮＡからのハンドルを含むことができるが、必ずしも複数のガイド配列を含む必要はない。
【０１７２】
いくつかの場合には、ガイドＲＮＡコード化ヌクレオチド配列（及び／または前駆体ガイドＲＮＡアレイコード化ヌクレオチド配列）は、プロモーター、例えば、原核細胞で機能するプロモーター、真核細胞で機能するプロモーター、哺乳動物細胞で機能するプロモーター、ヒト細胞で機能するプロモーターなどと動作可能に連結している。いくつかの場合には、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅなどのＣａｓ１２タンパク質）をコードするヌクレオチド配列は、プロモーター、例えば、原核細胞で機能するプロモーター、真核細胞で機能するプロモーター、哺乳動物細胞で機能するプロモーター、ヒト細胞で機能するプロモーター、細胞型特異的プロモーター、調節可能プロモーター、組織特異的プロモーターなどと動作可能に連結している。
【０１７３】
本開示の非限定的な態様の例
上記に記載される本主題の実施形態を含む態様は、単独で、または１つ以上の他の態様もしくは実施形態との組み合わせで有益であり得る。上記の記載を制限することなく、１〜４５（セットＡ）及び１〜５４（セットＢ）の番号が付けられた本開示のある特定の非限定的な態様が以下に提供される。本開示を読むと当業者には明らかであるように、個別に番号が付けられた態様の各々は、先行するまたは後続の個別に番号が付けられた態様のうちのいずれかとともに使用され得るか、または組み合わされ得る。これは、態様の全てのそのような組み合わせに対する支持を提供することが意図され、以下に明示的に提供される態様の組み合わせに制限されない。
【０１７４】
セットＡ
１．試料中の標的ＤＮＡを検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、
（ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質、
（ｉｉ）前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と、前記標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含む、ガイドＲＮＡ、及び
（ｉｉｉ）一本鎖であり、かつ前記ガイドＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡ
と接触させることと、
（ｂ）前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質による前記一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することにより、前記標的ＤＮＡを検出することと
を含む、前記方法。
２．前記試料を前駆体ガイドＲＮＡアレイと接触させることを含み、前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、前記前駆体ガイドＲＮＡアレイを切断して、前記ガイドＲＮＡ及び少なくとも１つの追加のガイドＲＮＡを生成する、１に記載の方法。
３．前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、１または２に記載の方法。
４．前記標的ＤＮＡが、二本鎖である、１または２に記載の方法。
５．前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．前記標的ＤＮＡが、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはパルボウイルスＤＮＡである、１〜４のいずれか１つに記載の方法。
７．前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質である、１〜４のいずれか１つに記載の方法。
８．前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）またはＣａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）タンパク質である、１〜６のいずれか１つに記載の方法。
９．前記試料が、細胞溶解物からのＤＮＡ分子を含む、１〜８のいずれか１つに記載の方法。
１０．前記試料が、細胞を含む、１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．前記接触が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの、細胞の内部で行われる、１〜１０のいずれか１つの方法。
１２．前記細胞が、真核細胞である、１１に記載の方法。
１３．前記標的ＤＮＡが、２００ｆＭという低い濃度で検出され得る、１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
１４．前記試料中に存在する前記標的ＤＮＡの量を決定することを含む、１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記決定が、
前記検出可能なシグナルを測定して試験測定値を生成することと、
参照試料または細胞によって生成される検出可能なシグナルを測定して、参照測定値を生成することと、
前記試験測定値を前記参照測定値と比較して、前記試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することと
を含む、１４に記載の方法。
１６．検出可能なシグナルの測定が、金ナノ粒子ベースの検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学検出、及び半導体ベースの感知のうちの１つ以上を含む、１〜１５のいずれか１つに記載の方法。
１７．前記一本鎖検出ＤＮＡが、蛍光発光色素対を含む、１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．前記蛍光発光色素対が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断前に、ある量の検出可能なシグナルを生成し、前記検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に減少する、１７に記載の方法。
１９．前記一本鎖検出ＤＮＡが、切断される前に第１の検出可能なシグナルを生成し、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に第２の検出可能なシグナルを生成する、１７に記載の方法。
２０．前記蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、１７〜１９のいずれか１つに記載の方法。
２１．検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に増加する、１７に記載の方法。
２２．前記蛍光発光色素対が、クエンチャー／蛍光体対である、１７または２１に記載の方法。
２３．前記一本鎖検出ＤＮＡが、２つ以上の蛍光発光色素対を含む、１７〜２２のいずれか１つに記載の方法。
２４．前記２つ以上の蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対及びクエンチャー／蛍光体対を含む、２３に記載の方法。
２５．前記一本鎖検出ＤＮＡが、修飾核酸塩基、修飾糖部分、及び／または修飾核酸結合を含む、１〜２４のいずれか１つに記載の方法。
２６．試料中の標的ＤＮＡを検出するためのキットであって、
（ａ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と標的ＤＮＡに相補的なガイド配列とを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、または前記ガイドＲＮＡを含む前駆体ガイドＲＮＡアレイ、または前記前駆体ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、及び、
（ｂ）一本鎖であり、かつ前記ガイドＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない、標識された検出ＤＮＡ
を含む、前記キット。
２７．Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質をさらに含む、２６に記載のキット。
２８．前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質である、２７に記載のキット。
２９．前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）またはＣａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）タンパク質である、２７に記載のキット。
３０．前記一本鎖検出ＤＮＡが、蛍光発光色素対を含む、２６〜２９のいずれか１つに記載のキット。
３１．前記蛍光発光色素対が、ＦＲＥＴ対である、３０に記載のキット。
３２．前記蛍光発光色素対が、クエンチャー／蛍光体対である、３０に記載のキット。
３３．前記一本鎖検出ＤＮＡが、２つ以上の蛍光発光色素対を含む、３０〜３２のいずれか１つに記載のキット。
３４．前記２つ以上の蛍光発光色素対が、第１の検出可能なシグナルを生成する第１の蛍光発光色素対、及び第２の検出可能なシグナルを生成する第２の蛍光発光色素対を含む、３３に記載のキット。
３５．一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を切断する方法であって、
標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む、核酸の集団を、
（ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び
（ｉｉ）前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と、前記標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含む、ガイドＲＮＡ
と接触させることを含み、
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、前記複数の非標的ｓｓＤＮＡを切断する、
前記方法。
３６．前記試料を前駆体ガイドＲＮＡアレイと接触させることを含み、前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、前記前駆体ガイドＲＮＡアレイを切断して、前記ガイドＲＮＡ及び少なくとも１つの追加のガイドＲＮＡを生成する、３５に記載の方法。
３７．前記接触が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの、細胞の内部である、３５または３６に記載の方法。
３８．前記細胞が、真核細胞である、３７に記載の方法。
３９．前記真核細胞が、植物細胞である、３８に記載の方法。
４０．前記非標的ｓｓＤＮＡが、前記細胞に対して外来性である、３７〜３９のいずれか１つに記載の方法。
４１．前記非標的ｓｓＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、４０に記載の方法。
４２．前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、３５〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４３．前記標的ＤＮＡが、二本鎖である、３５〜４１のいずれか１つに記載の方法。
４４．前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、３５〜４３のいずれか１つに記載の方法。
４５．前記標的ＤＮＡが、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはパルボウイルスＤＮＡである、３５〜４３のいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
セットＢ
１．試料中の標的ＤＮＡを検出する方法であって、
（ａ）前記試料を、
（ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質、
（ｉｉ）前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と、前記標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含む、ガイドＲＮＡ、及び
（ｉｉｉ）一本鎖であり、かつ前記ガイドＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない検出ＤＮＡ
と接触させることと、
（ｂ）前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質による前記一本鎖検出ＤＮＡの切断によって生成される検出可能なシグナルを測定することにより、前記標的ＤＮＡを検出することと
を含む、前記方法。
２．前記試料を前駆体ガイドＲＮＡアレイと接触させることを含み、前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、前記前駆体ガイドＲＮＡアレイを切断して、前記ガイドＲＮＡ及び少なくとも１つの追加のガイドＲＮＡを生成する、１に記載の方法。
３．前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、１または２に記載の方法。
４．前記標的ＤＮＡが、二本鎖である、１または２に記載の方法。
５．前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、１〜４のいずれか１つに記載の方法。
６．前記標的ＤＮＡが、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはパルボウイルスＤＮＡである、１〜４のいずれか１つに記載の方法。
７．前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質である、１〜４のいずれか１つに記載の方法。
８．前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）またはＣａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）タンパク質である、１〜６のいずれか１つに記載の方法。
９．前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）またはＣａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）タンパク質である、１〜６のいずれか１つに記載の方法。
１０．前記試料が、細胞溶解物からのＤＮＡ分子を含む、１〜９のいずれか１つに記載の方法。
１１．前記試料が、細胞を含む、１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
１２．前記接触が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの、細胞の内部で行われる、１〜１１のいずれか１つの方法。
１３．前記細胞が、真核細胞である、１２に記載の方法。
１４．前記標的ＤＮＡが、２００ｆＭという低い濃度で検出され得る、１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
１５．前記試料中に存在する前記標的ＤＮＡの量を決定することを含む、１〜１４のいずれか１つに記載の方法。
１６．前記決定が、
前記検出可能なシグナルを測定して試験測定値を生成することと、
参照試料または細胞によって生成される検出可能なシグナルを測定して、参照測定値を生成することと、
前記試験測定値を前記参照測定値と比較して、前記試料中に存在する標的ＤＮＡの量を決定することと
を含む、１５に記載の方法。
１７．検出可能なシグナルの測定が、金ナノ粒子ベースの検出、蛍光偏光、コロイド相転移／分散、電気化学検出、及び半導体ベースの感知のうちの１つ以上を含む、１〜１６のいずれか１つに記載の方法。
１８．前記一本鎖検出ＤＮＡが、蛍光発光色素対を含む、１〜１７のいずれか１つに記載の方法。
１９．前記蛍光発光色素対が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断前に、ある量の検出可能なシグナルを生成し、前記検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に減少する、１８に記載の方法。
２０．前記一本鎖検出ＤＮＡが、切断される前に第１の検出可能なシグナルを生成し、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に第２の検出可能なシグナルを生成する、１８に記載の方法。
２１．前記蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対である、１８〜２０のいずれか１つに記載の方法。
２２．検出可能なシグナルの量が、前記一本鎖検出ＤＮＡの切断後に増加する、１８に記載の方法。
２３．前記蛍光発光色素対が、クエンチャー／蛍光体対である、１８または２２に記載の方法。
２４．前記一本鎖検出ＤＮＡが、２つ以上の蛍光発光色素対を含む、１８〜２３のいずれか１つに記載の方法。
２５．前記２つ以上の蛍光発光色素対が、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）対及びクエンチャー／蛍光体対を含む、２４に記載の方法。
２６．前記一本鎖検出ＤＮＡが、修飾核酸塩基、修飾糖部分、及び／または修飾核酸結合を含む、１〜２５のいずれか１つに記載の方法。
２７．前記試料中の核酸を増幅すること含む、１〜２６のいずれか１つに記載の方法。
２８．前記増幅が、等温増幅を含む、２７に記載の方法。
２９．前記等温増幅が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を含む、２８に記載の方法。
３０．前記増幅が、ステップ（ａ）の前記接触の前に開始する、２７〜２９のいずれか１つに記載の方法。
３１．前記増幅が、ステップ（ａ）の前記接触と同時に開始する、２７〜２９のいずれか１つに記載の方法。
３２．試料中の標的ＤＮＡを検出するためのキットであって、
（ａ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と標的ＤＮＡに相補的なガイド配列とを含むガイドＲＮＡ、または前記ガイドＲＮＡをコードする核酸、または前記ガイドＲＮＡを含む前駆体ガイドＲＮＡアレイ、または前記前駆体ガイドＲＮＡアレイをコードする核酸、及び、
（ｂ）一本鎖であり、かつ前記ガイドＲＮＡの前記ガイド配列とハイブリダイズしない、標識された検出ＤＮＡ
を含む、前記キット。
３３．Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質をさらに含む、３２に記載のキット。
３４．前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２タンパク質である、３３に記載のキット。
３５．前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）またはＣａｓ１２ｂ（Ｃ２ｃ１）タンパク質である、３３に記載のキット。
３６．前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、Ｃａｓ１２ｄ（ＣａｓＹ）またはＣａｓ１２ｅ（ＣａｓＸ）タンパク質である、３３に記載のキット。
３７．前記一本鎖検出ＤＮＡが、蛍光発光色素対を含む、３２〜３６のいずれか１つに記載のキット。
３８．前記蛍光発光色素対が、ＦＲＥＴ対である、３７に記載のキット。
３９．前記蛍光発光色素対が、クエンチャー／蛍光体対である、３７に記載のキット。
４０．前記一本鎖検出ＤＮＡが、２つ以上の蛍光発光色素対を含む、３７〜３９のいずれか１つに記載のキット。
４１．前記２つ以上の蛍光発光色素対が、第１の検出可能なシグナルを生成する第１の蛍光発光色素対、及び第２の検出可能なシグナルを生成する第２の蛍光発光色素対を含む、４０に記載のキット。
４２．核酸増幅成分をさらに含む、３２〜４１のいずれか１つに記載のキット。
４３．前記核酸増幅成分が、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）のための成分である、４２に記載のキット。
４４．一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）を切断する方法であって、
標的ＤＮＡ及び複数の非標的ｓｓＤＮＡを含む、核酸の集団を、
（ｉ）Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質、及び
（ｉｉ）前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質に結合する領域と、前記標的ＤＮＡとハイブリダイズするガイド配列とを含む、ガイドＲＮＡ
と接触させることを含み、
前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、前記複数の非標的ｓｓＤＮＡを切断する、
前記方法。
４５．前記試料を前駆体ガイドＲＮＡアレイと接触させることを含み、前記Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質が、前記前駆体ガイドＲＮＡアレイを切断して、前記ガイドＲＮＡ及び少なくとも１つの追加のガイドＲＮＡを生成する、４４に記載の方法。
４６．前記接触が、インビトロ、エクスビボ、またはインビボでの、細胞の内部である、４４または４５に記載の方法。
４７．前記細胞が、真核細胞である、４６に記載の方法。
４８．前記真核細胞が、植物細胞である、４７に記載の方法。
４９．前記非標的ｓｓＤＮＡが、前記細胞に対して外来性である、４６〜４８のいずれか１つに記載の方法。
５０．前記非標的ｓｓＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、４９に記載の方法。
５１．前記標的ＤＮＡが、一本鎖である、４４〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５２．前記標的ＤＮＡが、二本鎖である、４４〜５０のいずれか１つに記載の方法。
５３．前記標的ＤＮＡが、ウイルスＤＮＡである、４４〜５２のいずれか１つに記載の方法。
５４．前記標的ＤＮＡが、パポバウイルス、ヘパドナウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、ポックスウイルス、またはパルボウイルスＤＮＡである、４４〜５２のいずれか１つに記載の方法。
【実施例】
【０１７６】
以下の実施例は、当業者に本発明の作成方法及び使用方法の完全な開示及び記載を提供するために提示するものであり、本発明者らが考える発明の範囲を限定することを意図するものではなく、また、以下の実験が実施した全てまたは唯一の実験であることを表すことを意図するものでもない。使用される数値（例えば、量、温度等）に関して正確さを確保する努力がなされているが、いくつかの実験誤差及び偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏温度であり、圧力は大気圧であるか、またはそれに近い。標準的な略語、例えば、ｂｐは塩基対（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｐｌはピコリットル（複数可）、ｓまたはｓｅｃは秒（複数可）、ｍｉｎは分（複数可）、ｈまたはｈｒは時間（複数可）、ａａはアミノ酸（複数可）、ｋｂはキロベース（複数可）、ｂｐは塩基対（複数可）、ｎｔはヌクレオチド（複数可）、ｉ．ｍ．は筋肉内の（に）、ｉ．ｐ．は腹腔内の（に）、ｓ．ｃ．は皮下の（に）、等が使用され得る。
【０１７７】
実施例１
図３Ａ〜３Ｂ。非相補鎖切断は、相補鎖認識によって決定される。非標的鎖（ＮＴＳ）（上部ゲル）または標的鎖（ＴＳ）（下部ゲル）の長さを変更して、Ｃａｓ１２切断の基質要件を決定した。ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体は放射性標識された基質よりも大過剰であり、切断産物はポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）を変性させることによって分解される。ＴＳがＮＴＳの長さに関係なく単一ヌクレオチドに切り取られたのに対し、ＮＴＳは、少なくとも１５ｎｔの相補的ＴＳが存在する場合にのみ切断された。
【０１７８】
図４Ａ〜４Ｂ。相補鎖結合は、Ｃａｓ１２ａによる非特異的ＤＮａｓｅ活性を引き出す。非相補的なランダムｓｓＤＮＡが、相補的標的鎖によるＣａｓ１２ａ活性化時に分解されやすいかどうかを試験した。ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体は放射性標識された基質よりも大過剰であり、切断産物はＰＡＧＥを変性させることによって分解される。放射性標識されたランダムｓｓＤＮＡ標的（青）は、ＬｂＣａｓ１２ａが「活性化因子」の相補的標的鎖と事前に複合化した場合にのみ分解した。放射性標識されたランダムｄｓＤＮＡ標的（青）を、切断から保護した。
【０１７９】
図５Ａ〜５Ｂ。非標的鎖は、少なくとも１５ｎｔの相補性を有する標的鎖の存在下でのみ切断された。ＬｂＣｐｆ１は、非標的鎖の長さに関係なく、標的鎖ＤＮＡを切断した。ＬｂＣｐｆ１は、標的鎖が少なくとも１５ｎｔの相補性を有した場合にのみ非標的鎖ＤＮＡを切断した。
【０１８０】
図６。ＲｕｖＣヌクレアーゼは、ｓｓＤＮＡのトランス切断の原因である。活性化因子標的鎖の存在下では、非特異的トランス切断は、触媒的に不活性なＲｕｖＣヌクレアーゼ（ｐＸＴ００２）では観察されなかった。トランス切断は、ＲＮＡ処理死変異体（ｐＸＴ００６）で依然として観察された。
【０１８１】
図７。Ｃａｓ１２ａの２つの相同体による標的化は、Ｍ１３ファージｓｓＤＮＡの急速な「細断」をもたらす。トランス基質としてＭ１３ファージ環状ｓｓＤＮＡを使用して、トランス切断に遊離５’または３’末端が必要かどうかを試験した。ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ及びＡｓＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡを、ｓｓＤＮＡ活性化因子（Ｍ１３ファージに対する配列相補性なし）と事前に複合化して、３７℃でＭ１３  ｓｓＤＮＡとインキュベートし、産生物を１．５％のアガロースゲルで分解して、ＳｙｂｅｒＧｏｌｄで視覚化した。急速な細断が最も早い時点（１分）で観察され、活性化因子依存性及びＲｕｖＣ依存性の両方であった。ＡｓＣａｓ１２ａで同じ傾向が観察され、この活性がＣａｓ１２ａ相同体全体で保存されている可能性が高いことを示唆した。
【０１８２】
図８．Ｃａｓ１２ａによるトランス切断は、ＦＱベースアッセイを使用して検出することができる。トランス切断を測定する処理能力を改善するために、ＤＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ基質（ＩＤＴ）を使用したＦＱベースアッセイをトランス活性化のためのプローブとして適応した。蛍光シグナルが、ＤＮＡリンカー及び隣接するクエンチャーを含有する基質の切断時に放出された。
【０１８３】
図９Ａ〜９Ｂ。トランス活性化は、二重鎖基質とのＰＡＭ近位端でのミスマッチに対して敏感であるが、一本鎖基質とはそうではない。ＦＱベースアッセイを使用して、トランス切断を活性化するためのミスマッチ耐性を試験した。ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡを、ＰＡＭ遠位端からＰＡＭ近位端までの２ｂｐのミスマッチを含有するｓｓＤＮＡもしくはｄｓＤＮＡ、または変異ＰＡＭと事前に複合化した。上のパネルは、ｓｓＤＮＡ（左）またはｄｓＤＮＡ（右）について、３７℃で１時間インキュベートした後のバックグラウンドを差し引いた最大蛍光を示す。下のパネルは、３７℃で１時間インキュベートした後に観察された切断速度を示す。ｓｓＤＮＡ基質の場合、ミスマッチは高い耐容性を示したが、ｄｓＤＮＡ基質の場合には、おそらく不十分なＲＮＡ鎖侵入に起因して、ＰＡＭ近位のミスマッチは耐容性が低かった。特に、Ｃａｓ１２ａがｓｓＤＮＡによって活性化される場合、トランス切断はＰＡＭ非依存性であった。
【０１８４】
図１０。ｄｓＤＮＡ標的（シス）切断が単一ターンオーバー動態に従うのに対し、ｓｓＤＮＡ（トランス）切断は複数ターンオーバーである。ターンオーバー動態を、それぞれのＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ比で放射性標識されたｄｓＤＮＡ（左）またはランダムｓｓＤＮＡ（右）をインキュベートすることにより、シス及びトランス切断についてアッセイした。各点は、３７℃でのＬｂＣａｓ１２ａとの３０分間のインキュベーション後の定量化された切断％（ＰＡＧＥの変性を介する）を表す。ｓｓＤＮＡ動態については、ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡを、放射性標識されたランダムｓｓＤＮＡを添加する前に、ｓｓＤＮＡ活性化因子と事前に複合化した。データは、ＬｂＣａｓ１２ａによるシス切断が単一ターンオーバーであるのに対し、トランス切断は複数ターンオーバーであることを示す。
【０１８５】
図１１Ａ〜１１Ｂ。Ｃａｓ１２ａによるトランスｓｓＤＮＡ切断を簡単な診断法として利用して、ウイルス血清型、例えばＨＰＶ及び他の臨床的に関連するＤＮＡウイルスなどを区別することができる。Ｃａｓ１２ａは、ピコモル濃度ほど低い標的を検出できる。ＬｂＣａｓ１２ａトランス活性を簡単な診断法として利用できることを示すために、ＤＮａｓｅ  Ａｌｅｒｔ基質を使用したＦＱベースアッセイを使用して、子宮頸癌の高リスク株と考えられている２つの密接に関連するＨＰＶ配列（ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８）を区別できるかどうかを試験した。ＬｂＣａｓ１２を、ＴＴＴＡ  ＰＡＭに隣接するＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８配列を標的とするｃｒＲＮＡとプレインキュベートする。２つの配列は６ヌクレオチド異なる。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の５００ｂｐ断片を、完全ＨＰＶゲノム（約８ｋｂ）のプロキシとしてプラスミド骨格にクローニングし（合計約６ｋｂ）、ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡと３７℃で３０分間（上）または１時間（下）インキュベートした。ＨＰＶ血清型は簡単に区別でき、方法は約１０ｐＭの標的まで検出することができた。この方法は、原則として、任意のＤＮＡウイルスを検出するために拡張することができ、臨床的に関連するＤＮＡウイルスの例を本明細書に列挙する。
【０１８６】
図１２。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２ａ／Ｃａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体によるＤＮＡ切断の統一モデルは、ＰＡＭ依存性（ｄｓＤＮＡ）またはＰＡＭ非依存性（ｓｓＤＮＡ）の様式で基質に結合する。ｄｓＤＮＡ  ＰＡＭが認識される場合、二重鎖はＲＮＡ鎖侵入によって調べられ、相補的標的鎖の認識によりＲｕｖＣヌクレアーゼが活性化され、巻き戻されたＴＳ及びＮＴＳの両方を切断する。また、相補的ｓｓＤＮＡの結合は、ＲｕｖＣヌクレアーゼを誘発して任意のｓｓＤＮＡを分解する。
【０１８７】
実施例２
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）は、細菌の適応免疫システムの構成要素として、ＤＮＡと結合し、それを切断するＲＮＡ誘導ＤＮＡ標的化酵素のファミリーに属する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９と同様に、Ｃａｓ１２ａ及び関連酵素もまた、二本鎖ＤＮＡ切断の部位で細胞に遺伝的変化を誘導する能力に基づいた強力なゲノム編集ツールである。Ｃａｓ１２ａのＤＮＡ基質選択性を調査する過程で、発明者らは、驚いたことに、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合が、線状及び環状ｓｓＤＮＡ分子の両方を完全に分解するのに十分な強力な非特異的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）切断活性を引き出すことを見出した。部位特異的ｄｓＤＮＡ切断を担う同じ活性部位によって触媒されるこの活性は、配列要件と無関係に、迅速な複数ターンオーバー切断動態でｓｓＤＮＡを細断した。ｓｓＤＮＡ切断の活性化は、密接に関連するウイルス血清型を区別するのに十分な特異性でガイドＲＮＡのガイド配列と一致するＤＮＡ標的配列の忠実な認識を必要とした。ここで提供されるデータは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９酵素では観察されない、Ｃａｓ１２ａ触媒型ｓｓＤＮＡ分解が、他のＣａｓ１２ファミリータンパク質の基本的な特性であることを示し、ＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３酵素のＲＮＡ誘発型の一般的なＲＮａｓｅ活性との、魅力的で驚くべき並行性を明らかにする。
【０１８８】
結果
細菌及び古細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ適応免疫は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを使用して、外来性の核酸を識別及び切断する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ファミリーの酵素は、ガイドＲＮＡ配列に相補的な配列で、２つの触媒ドメイン、ＲｕｖＣ及びＨＮＨによって誘導される二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断の精度に基づいて、真核生物における遺伝子編集用途のために広く展開されている。遺伝子編集のために利用される酵素の第２のファミリーであるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２ａ（以前はＣｐｆ１として知られた）は、ガイドＲＮＡ依存性ｄｓＤＮＡ切断のために単一の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ）を使用する（図１３Ａ）。Ｃａｓ９とは異なり、Ｃａｓ１２ａ酵素はまた、より長い前駆体転写産物からの個々のガイドＲＮＡを処理して、５’及び３’粘着末端を有するｄｓＤＮＡ切断を生成し、これは、遺伝子編集用途のためのＣａｓ１２ａに関心を集めている特徴である。ゲノム編集ツールとしてのその採択にもかかわらず、Ｃａｓ１２ａの基質特異性及びＤＮＡ切断メカニズムは未だ完全には解明されていない。
【０１８９】
Ｃａｓ１２ａ活性化のためのＤＮＡ基質の要件を調査する間に、ラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６  Ｃａｓ１２ａ（ＬｂａＣａｓ１２ａ）を、様々なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９オーソログの性能であるガイドＲＮＡ依存性一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）切断について試験した。精製されたＬｂａＣａｓ１２ａまたはＳｐｙＣａｓ９タンパク質を、環状の一本鎖Ｍ１３  ＤＮＡファージとの塩基対合相補性を有するガイドＲＮＡを用いて組み立てた。ＳｐｙＣａｓ９は部位特異的Ｍ１３切断を触媒し、予想どおり線形ファージ分子を生成したが、ＬｂａＣａｓ１２ａは驚くべきことに、配列特異的ＤＮＡ切断では説明することができない切断メカニズムによりＭ１３の急速かつ完全な分解を誘導した（図１３Ｂ）。この強力なｓｓＤＮＡ分解は、ＲｕｖＣ触媒ドメイン中に不活性化変異体を含有するＬｂａＣａｓ１２ａタンパク質を使用した実験においては観察されなかった。これらの結果は、ＬｂａＣａｓ１２ａが、ＲＮＡ依存性ｄｓＤＮＡ切断に使用されるのと同じ活性部位を必要とする、ユニークなｓｓＤＮＡ細断活性を保有することを示唆した。
【０１９０】
非標的鎖（ＮＴＳ）は、標的鎖（ＴＳ）がガイドＲＮＡとの少なくとも１５ｎｔの相補性を含有する場合にのみ切断された（図１７）。これらの結果は、ＴＳ認識がｓｓＤＮＡ切断の前提条件であることを示唆し、ＬｂａＣａｓ１２ａが非特異的ｓｓＤＮａｓｅ活性を保有する可能性を提起した。ＴＳで活性化されたＬｂａＣａｓ１２ａが任意のｓｓＤＮＡを切断できるという考えを試験するために、ＬｂａＣａｓ１２ａをｃｒＲＮＡ及び相補的ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ活性化因子と事前に複合化し、無関係な放射性標識されたｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、またはｓｓＲＮＡをトランスに導入した。注目すべきことに、ｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ活性化因子の両方がＬｂａＣａｓ１２ａをｓｓＤＮＡトランス基質をその５’末端標識にＲｕｖＣ依存性様式で完全に分解するように誘発したが、（図１８Ａ〜１８Ｃ、図１９、図２０Ａ〜２０Ｂ）、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＲＮＡトランス基質は、活性化複合体から保護されたままであった（図２１）。これらの知見は、ともに、Ｃａｓ１２ａ  ＤＮＡ結合が、ＲｕｖＣヌクレアーゼによる強力な非特異的ｓｓＤＮａｓｅトランス活性を引き出すことを明らかにした。
【０１９１】
トランス基質の急速な分解は、非特異的ｓｓＤＮＡトランス切断の動態が、ＬｂａＣａｓ１２ａが相補的ｄｓＤＮＡ基質を標的とするシス切断とは根本的に異なり得ることを示唆した。単一のＲｕｖＣヌクレアーゼが２つの異なるメカニズムによってどのように切断するかを調査するために、それぞれ、ｄｓＤＮＡ標的（シス）または非特異的ｓｓＤＮＡ（トランス）基質に対するＬｂａＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡまたはＬｂａＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ−ｓｓＤＮＡ活性化因子複合体のいずれかのモル比を滴定することによって、基質ターンオーバーを観察した。切断された標的ｄｓＤＮＡの割合は、ＬｂａＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡのＤＮＡに対するモル比に比例し、シス切断が単一ターンオーバーであることを示した（図１４Ａ）。対照的に、切断された非特異的ｓｓＤＮＡの割合は、下位等モル比で飽和し、トランス切断が複数ターンオーバー動態に従うことを明らかにした（図１４Ｂ）。トランス切断のＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ動態をさらに調査するために、リアルタイムのフルオロフォアクエンチャー（ＦＱ）標識ＤＮＡレポーターアッセイを適応させて、ＬｂａＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡがｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ活性化因子に安定して結合している条件下で非特異的ＤＮａｓｅ活性を測定した。ｓｓＤＮＡ活性化因子と事前に複合化したＬｂａＣａｓ１２ａは、５．１×１０８  ｓ−１  Ｍ−１の触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）をもたらす非常に強力な活性を明らかにした。ｄｓＤＮＡ活性化因子と事前に複合化した場合、触媒効率はほぼ一桁速くなり、拡散速度に接近して、１．７×１０９  ｓ−１  Ｍ−１のｋｃａｔ／Ｋｍ測定値であった（図１４Ｃ；図２２）。触媒効率におけるこれらの違いは、トランスｓｓＤＮＡ基質を切断するための最適な立体構造にＣａｓ１２ａ複合体を安定化させるための、ｄｓＤＮＡ活性化因子のＮＴＳの潜在的な役割を示唆した。
【０１９２】
次に、トランス切断に対する、ｄｓＤＮＡ活性化因子と比較したｓｓＤＮＡの基質特異性を検討した。最初に、標的結合の要件と一致して、ＰＡＭ認識が相補的ｄｓＤＮＡによる活性化に重要であるが、一致するｓｓＤＮＡには重要でないことを確認するために実験を行った（図１５Ａ）。活性化因子配列に沿ったミスマッチがトランス切断の速度に影響を与えることができるかどうかを試験するために、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ活性化因子のいずれかにおいて標的配列全体に２つの塩基対（ｂｐ）ミスマッチを導入した。ＦＱベースアッセイを使用して、ＬｂａＣａｓ１２ａにｃｒＲＮＡ及び活性化因子を事前に充填してからｓｓＤＮＡレポーターを添加し、蛍光シグナルにおけるリアルタイムの増加を、観察されるトランス切断速度のプロキシとして測定した。ｓｓＤＮＡ活性化因子配列全体のミスマッチは一般に十分に許容されたが、ＰＡＭまたはｄｓＤＮＡ活性化因子の「シード領域」のミスマッチはほとんど許容されなかった（図１５Ｂ、図２３）。ｄｓＤＮＡ活性化因子を使用したこれらの傾向は、ＰＡＭ認識及び一方向性のＤＮＡ巻き戻しがトランス切断に追加の制御を提供することを示唆する。しかしながら、ｃｒＲＮＡと標的鎖との間の相補的な広範な塩基が、トランス切断を活性化するための唯一の要件である。
【０１９３】
ＬｂａＣａｓ１２ａはトランス切断にｄｓＤＮＡ活性化因子を使用してより高い特異性を示したため、ＦＱベースアッセイを使用して、ＬｂａＣａｓ１２ａが２つの密接に関連するｄｓＤＮＡウイルスを区別するように容易にプログラムできるかどうかを試験した。原理の証明として、遷延性ＨＰＶ感染に続く子宮頸癌の全症例の約７０％を占めるヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）血清型１６（ＨＰＶ１６）及び１８（ＨＰＶ１８）を選択した。ＬｂａＣａｓ１２ａを、最初に、６ヌクレオチドだけ異なるＴＴＴＡ  ＰＡＭに隣接するＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８配列を標的とするｃｒＲＮＡと事前に複合化した（図１５Ｃ）。完全なＨＰＶゲノム（約８ｋｂ）のプロキシとして、ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８の５００ｂｐ断片を約５ｋｂのプラスミドにクローニングし、ＨＰＶ含有プラスミドをＬｂａＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡとインキュベートした。ＬｂａＣａｓ１２ａが少なくとも約１０ｐＭの同種のＨＰＶ標的の存在下にある場合にのみ、トランス切断の強力な活性化が観察され（図１５Ｄ、図２４）、これは、ｄｓＤＮＡ認識及びＬｂａＣａｓ１２ａによるトランス切断活性化の本来の特異性が、原則として、任意のｄｓＤＮＡウイルスを検出するために拡張できることを示唆した。
【０１９４】
次いで、このトランス切断活性が、Ｃａｓ１２ａファミリー間で、さらには進化的に異なるＶ型エフェクタータンパク質全体にわたって保存され得るかどうかを試験した。２つの証拠がこの可能性を示唆した。第一に、標的に結合したＣａｓ１２ｂ（以前はＣ２ｃ１として知られていた）の結晶構造は、そのＲｕｖＣ触媒ポケットが、Ｃａｓ１２ａに提案されたシス切断メカニズムと同様に、切断についてＴＳ及びＮＴＳの両方に適応することを示唆した。第二に、これらのサブタイプ間の低い配列及び構造類似性にもかかわらず、全てのＣａｓ１２タンパク質にわたる一貫した構造的特徴は、ポリペプチドのＣ末端付近のＲｕｖＣヌクレアーゼドメインである。したがって、アシダミノコッカス属の種（ＡｓｐＣａｓ１２ａ）及びフランシセラ・ノビシダ（ＦｎｏＣａｓ１２ａ）からの２つの追加のＣａｓ１２ａオーソログ、ならびにアリサイクロバチルス・アシドテレストリス（Ａｌｉｃｙｃｌｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｔｅｒｒｅｓｔｒｉｓ）（ＡａｃＣａｓ１２ｂ）からのＣａｓ１２ｂタンパク質を選択して、シス及びトランス切断について試験した（図１６Ａ）。異なる効率にもかかわらず、評価された全ての相同体は、相補的ｓｓＤＮＡ活性化因子と事前に複合体化された場合、非特異的ｓｓＤＮａｓｅ活性を示し（図１６Ｂ）、トランス切断がＣａｓ１２ファミリータンパク質の基本的な特性であることを示唆した。これらの実験は、ＤＮＡ標的化Ｖ型エフェクタータンパク質とＲＮＡ標的化ＶＩ型エフェクタータンパク質との間のトランス切断の機能的収束をさらに強調する。
【０１９５】
ここでのデータは、Ｃａｓ１２タンパク質ファミリーによる標的干渉のための新しいメカニズムを示唆しており、Ｃａｓ１２ガイドＲＮＡ複合体がＰＡＭ依存性（ｄｓＤＮＡ）またはＰＡＭ非依存性（ｓｓＤＮＡ）の様式でＤＮＡ基質に結合する新しいモデルがここで提案される（図１６Ｃ）。ｄｓＤＮＡ基質についてのＰＡＭ認識に続いて、ＲＮＡ鎖侵入及び標的認識はＲｕｖＣヌクレアーゼを活性化し、巻き戻されたＴＳを切断してＮＴＳを切り取り戻しし、それによって粘着性のｄｓＤＮＡ切断を生成し、ｓｓＤＮＡトランス切断を強力に活性化する。相補的ｓｓＤＮＡの結合は、ＰＡＭ認識及びＲＮＡ鎖侵入を迂回するが、ＲｕｖＣヌクレアーゼを誘発して任意のｓｓＤＮＡを分解するには十分である。
【０１９６】
実施例３：ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２ａ標的結合は無差別の一本鎖ＤＮａｓｅ活性を引き出す
ここで提示されるデータは、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合が、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ）における強力な無差別的一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）切断活性を、線形及び環状ｓｓＤＮＡ分子の両方を完全に分解するのに十分であるほど引き出すことを示す。データは、部位特異的ｄｓＤＮＡ切断を担う同じ活性部位によって触媒される、標的活性化非特異的ｓｓＤＮａｓｅ活性が、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２酵素の基本的な特性であることを示す。ｓｓＤＮＡ切断の活性化は、密接に関連するＤＮＡ配列を区別することができる特異性でガイドＲＮＡのガイド配列と一致するＤＮＡ標的配列の忠実な認識を必要とする。標的依存性Ｃａｓ１２  ｓｓＤＮａｓｅ活性化を等温増幅と組み合わせて、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ標的化ＣＲＩＳＰＲトランスレポーター（ＤＥＴＥＣＴＲ）と称される方法を作成し、これは、アトモルの核酸検出感度を達成した。ＤＥＴＥＣＴＲが、ヒト患者試料中のＤＮＡ（例えば、ＨＰＶ）の迅速かつ特異的な検出を容易にし、それによって核酸ベースのポイントオブケア診断のためのシンプルなプラットフォームを提供することをここに示す。
【０１９７】
細菌及び古細菌におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ適応免疫は、ＲＮＡ誘導ヌクレアーゼを使用して、外来性の核酸を標的とし、分解する。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ファミリーのタンパク質は、ガイドＲＮＡ配列に相補的な配列で、２つの触媒ドメイン、ＲｕｖＣ及びＨＮＨによって誘導される二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）切断の精度に基づいて、遺伝子編集用途のために広く展開されている。酵素の第２のファミリーであるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２ａ（Ｃｐｆ１）は、ガイドＲＮＡ依存性ｄｓＤＮＡ切断のために単一のＲｕｖＣ触媒ドメインを使用する（図２５Ａ）。Ｃａｓ９とは異なり、Ｃａｓ１２ａ酵素はＴリッチプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）を認識し、独自のガイドＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）成熟を触媒して、５’及び３’粘着末端を有するＰＡＭ遠位ｄｓＤＮＡ切断を生成し、これは、遺伝子編集用途のための関心を集めている特徴である。
【０１９８】
Ｃａｓ１２ａ活性化のための基質の要件を調査する間に、ラクノスピラ科細菌ＮＤ２００６  Ｃａｓ１２ａ（ＬｂＣａｓ１２ａ）を、多様なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９オーソログの能力であるガイドＲＮＡ依存性一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）切断について試験した。精製されたＬｂＣａｓ１２ａまたはストレプトコッカス・ピオゲネスＣａｓ９（ＳｐＣａｓ９）タンパク質（図３０）を、環状の一本鎖Ｍ１３  ＤＮＡファージを標的化するガイドＲＮＡ配列を用いて組み立てた。ＳｐＣａｓ９とは対照的に、ＬｂＣａｓ１２ａが、配列特異的ＤＮＡ切断では説明することができない切断メカニズムにより、Ｍ１３の急速かつ完全な分解を誘導したことを見出したのは驚くべきことであった（図２５Ｂ）。このｓｓＤＮＡ細断活性は、ＲｕｖＣ触媒ドメイン（Ｄ８３２Ａ）中の不活性化変異体を含有するＬｂＣａｓ１２ａタンパク質を使用しては観察されず、標的に結合したＬｂＣａｓ１２ａがガイドＲＮＡとの相補性に関係なく任意のｓｓＤＮＡを分解することができる可能性を提起した。この考えを試験するために、ＬｂＣａｓ１２ａまたはＳｐＣａｓ９を、異なるガイドＲＮＡ及びＭ１３ファージゲノム配列との配列相同性を有しないその相補的ｓｓＤＮＡを用いて組み立て、一本鎖Ｍ１３  ＤＮＡを反応物に添加した。注目すべきことに、ＬｂＣａｓ１２ａは、この相補的ｓｓＤＮＡ「活性化因子」の存在下でのみＭ１３分解を触媒し、活性はＳｐＣａｓ９では観察されなかった（図２５Ｃ）。これらの発見は、ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体のガイド相補的ｓｓＤＮＡへの結合が、強力な非特異的ｓｓＤＮＡトランス切断活性を引き出すことを明らかにした。
【０１９９】
図２５Ａ〜２５Ｃ。Ｃａｓ１２ａ標的認識は、非特異的一本鎖ＤＮＡ切断を活性化した。（Ａ）Ｃａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体はｄｓＤＮＡ基質と結合し、単一のＲｕｖＣヌクレアーゼを使用して５’オーバーハング粘着性切断を生成する。（Ｂ、Ｃ）（Ｂ）Ｍ１３ファージに相補的なガイドＲＮＡ、または（Ｃ）ガイドＲＮＡ及びＭ１３ファージに配列相同性のない相補的ｓｓＤＮＡ活性化因子と複合化された、精製されたＬｂＣａｓ１２ａ（左）及びＳｐＣａｓ９（右）を用いた代表的なＭ１３  ｓｓＤＮＡ切断経時変化である。
【０２００】
図３０。Ｃａｓ１２及びＣａｓ９タンパク質の精製。この試験において使用された全ての精製されたＣａｓ１２及びＣａｓ９タンパク質のＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルである。
【０２０１】
次に、ＬｂＣａｓ１２ａ触媒トランス切断活性のための要件を調査した。フルオロフォアクエンチャー（ＦＱ）標識レポーターアッセイを使用して、ＬｂＣａｓ１２ａをそのｃｒＲＮＡ及び相補的ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡ、または一本鎖ＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）のいずれかを用いて組み立て、無関係なｓｓＤＮＡ−またはｓｓＲＮＡ−ＦＱレポーターをトランスに導入した（図３１Ａ〜３１Ｂ）。ｃｒＲＮＡ相補的ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ（活性化因子）の両方がＬｂＣａｓ１２ａを、ｓｓＤＮＡ−ＦＱレポーター基質を切断するように誘発した（図３１Ａ）。しかしながら、ｓｓＲＮＡはトランス切断を活性化することができず、またＬｂＣａｓ１２ａによる分解の影響も受けず（図３１Ｂ）、ＬｂＣａｓ１２ａがＤＮＡ活性化された一般的なＤＮａｓｅ活性を保有することを確認した。
【０２０２】
図３１Ａ〜３１Ｂ。ＬｂＣａｓ１２ａは、ＤＮＡ活性化された一般的なＤＮａｓｅである。ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ−活性化因子をカスタムの（Ａ）トランス−ｓｓＤＮＡ−ＦＱ、または（Ｂ）トランス−ｓｓＲＮＡ−ＦＱレポーターと３７℃で１時間インキュベートした後に生成された最大蛍光シグナルの定量化であり、ＤＮａｓｅ  ＩまたはＲＮａｓｅ  Ａ対照が示される。エラーバーは平均値±標準偏差を表し、ここで、ｎ＝３反復である。
【０２０３】
ＬｂＣａｓ１２ａ触媒ｓｓＤＮＡ切断活性が部位特異的ｄｓＤＮＡ切断にどのように関係するのかを決定するために、ＬｂＣａｓ１２ａ活性化のための標的鎖（ＴＳ）及び非標的鎖（ＮＴＳ）の両方の長さの要件を、放射性標識されたオリゴヌクレオチドを使用して試験した。ＴＳ切断はＮＴＳ長に関係なく発生したが（図３２Ａ）、ＮＴＳ切断はＴＳがｃｒＲＮＡと少なくとも１５ヌクレオチド（ｎｔ）の相補性を含有した場合にのみ発生した（図３２Ｂ）。これは、ＴＳ認識がＮＴＳ切断の前提条件であることを示した。ＬｂＣａｓ１２ａがｄｓＤＮＡ基質の配列特異的結合及び切断後に非特異的ｓｓＤＮＡ切断に対して活性のままであるかどうかを試験するために、ｄｓＤＮＡプラスミドを最初にＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体で切断し、次いで無関係なｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡを反応物に添加した（図２６Ａ）。非特異的ｄｓＤＮＡ基質は無傷のままであったが、ｓｓＤＮＡはＲｕｖＣドメイン依存性様式で急速に分解した（図２６Ａ、図３３Ａ〜３３Ｃ、図３４Ａ〜３４Ｃ）。切断するには短すぎる切頭型活性化因子を使用して、次に、トランスｓｓＤＮＡ切断を活性化するには標的ＤＮＡ結合のみが必要であることを決定した（図３５Ａ〜３５Ｂ）。これらの結果は、ともに、ＲＮＡ誘導ＤＮＡ結合が、部位特異的ｄｓＤＮＡ切断及び非特異的ｓｓＤＮＡトランス切断の両方においてＬｂＣａｓ１２ａを活性化することを示す。
【０２０４】
図２６Ａ〜２６Ｄ。Ｃａｓ１２ａ  ｓｓＤＮＡトランス切断の動態。（Ａ）ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡによる配列特異的プラスミドＤＮＡ切断反応（上図）を、無関係な配列の別個の放射性標識されたｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ基質に導入した（下図）。経時変化は分を表す。（Ｂ）標的ｄｓＤＮＡまたは（Ｃ）非特異的ｓｓＤＮＡを、示されるとおりのモル比のＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡとインキュベートした。各点は、反応が完了した時点での、３７℃で３０分後の定量化されたパーセント切断の平均値を表す。エラーバーは平均値±標準偏差を表し、ここで、ｎ＝３反復である。（Ｄ）ｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡ活性化因子を使用したＬｂＣａｓ１２ａ触媒ｓｓＤＮＡトランス切断の代表的なＭｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎプロットである。測定されたｋｃａｔ／Ｋｍ値は平均値±標準偏差で報告し、ここで、ｎ＝３反復である。
【０２０５】
図３２Ａ〜３２Ｂ。標的鎖認識は、一本鎖ＤＮＡ切断のための前提条件である。（Ａ）放射性標識された標的鎖（ＴＳ）にアニーリングされた切頭型非標的鎖（ＮＴＳ）、（Ｂ）放射性標識されたＮＴＳにアニーリングされた切頭型ＴＳでの、ＬｂＣａｓ１２ａを使用した切断経時変化アッセイである。経時変化は分を表し、切断産物はＰＡＧＥを変性させることによって分解された。右側の概略図は、Ｃａｓ１２ａ媒介型粘着性切断を生成する、放射性標識されたＴＳ（Ａ）またはＮＴＳ（Ｂ）の切断を示す。
【０２０６】
図３３Ａ〜３３Ｃ。ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインは、活性化因子依存性、非特異的ＤＮａｓｅ活性の原因である。（Ａ）ＷＴ  ＬｂＣａｓ１２ａ、（Ｂ）ＲｕｖＣ触媒変異体（Ｄ８３２Ａ）、及び（Ｃ）ｃｒＲＮＡ処理変異体（Ｈ７５９Ａ）を使用した、ｓｓＤＮＡ活性化因子を含むまたは含まない、相補的ｄｓＤＮＡ及び非特異的ｓｓＤＮＡ基質の放射性標識された非標的鎖による切断経時変化ゲルである。経時変化は分を表し、切断産物はＰＡＧＥを変性させることによって分解された。
【０２０７】
図３４Ａ〜３４Ｃ。ＬｂＣａｓ１２ａトランス切断は、相補的かつ非特異的なｓｓＤＮＡを分解するが、ｓｓＲＮＡを分解しない。（Ａ）活性化因子なし、（Ｂ）１．２倍モル過剰のｓｓＤＮＡ活性化因子、または（Ｃ）１００倍モル過剰のｓｓＤＮＡ活性化因子を使用した、ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体の切断経時変化ゲルである。放射性標識された基質が示され、シスは相補的標的を示し、トランスは非相補的配列を示す。シス基質については、非標的鎖を放射性標識した。経時変化は分を表し、切断産物はＰＡＧＥを変性させることによって分解された。
【０２０８】
図３５Ａ〜３５Ｂ。Ｃａｓ１２ａによる標的鎖切断は、非特異的ｓｓＤＮａｓｅ活性の誘発に必要とされない。（Ａ）ｓｓＤＮＡ（１０〜２５ｎｔ）もしくはｄｓＤＮＡ（１０〜２５ｂｐ）基質のいずれかを含む放射性標識された標的鎖、または（Ｂ）ｓｓＤＮＡ（１０〜２５ｎｔ）もしくはｄｓＤＮＡ（１０〜２５ｂｐ）活性化因子のいずれかの存在下で放射性標識された非特異的ｓｓＤＮＡ基質を含む、ＬｂＣａｓ１２ａを使用した切断経時変化アッセイである。経時変化は分を表し、切断産物はＰＡＧＥを変性させることによって分解された。
【０２０９】
トランス基質の急速な分解は、ＬｂＣａｓ１２ａ触媒部位特異的ｄｓＤＮＡ（シス）切断及び非特異的ｓｓＤＮＡ（トランス）切断の動態が根本的に異なることを示唆した。化学量論的滴定実験は、シス切断が単一ターンオーバーである（図２６Ｂ）のに対し、トランス切断は複数ターンオーバーである（図２６Ｃ）ことを示した。Ｃａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体は、シス切断後もｄｓＤＮＡ標的に結合したままであるが、複合体はそのＰＡＭ遠位切断産物をＲｕｖＣ活性部位から放出し、ｓｓＤＮＡ基質へのアクセス及びターンオーバーを可能にする。ＦＱアッセイを使用して、ｓｓＤＮＡ活性化因子分子に結合したＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡが、１秒あたり約２５０の速度及び５．１×１０８ｓ−１Ｍ−１の触媒効率（ｋｃａｔ／Ｋｍ）でトランスｓｓＤＮＡ切断を触媒することを見出した。ｄｓＤＮＡ活性化因子に結合した場合、ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡは、拡散速度に接近する、１．７×１０９ｓ−１Ｍ−１のｋｃａｔ／Ｋｍの触媒効率で、１秒あたり約１２５０のターンオーバーを触媒した（図２６Ｄ、図３６Ａ〜３６Ｅ）。これらの違いは、ｄｓＤＮＡ活性化因子のＮＴＳが、トランスｓｓＤＮＡ切断のための最適な立体構造にＣａｓ１２ａ複合体を安定化させるのを助けることを示唆した。
【０２１０】
図３６Ａ〜３６Ｅ。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ分析はｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡ活性化因子による強力なトランス切断活性を明らかにした。０．１ｎＭの有効なＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ−活性化因子複合体を使用し、３７℃でＤＮａｓｅＡｌｅｒｔ基質濃度を上昇させる、（Ａ）ｓｓＤＮＡまたは（Ｃ）ｄｓＤＮＡ活性化因子の初期速度対時間の代表的なプロットである。Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎは、対応する（Ｂ）ｓｓＤＮＡまたは（Ｄ）ｄｓＤＮＡ活性化因子に適合する。（Ｅ）計算されたｋｃａｔ、Ｋｍ、及びｋｃａｔ／Ｋｍ値は平均値±標準偏差で報告され、ここで、ｎ＝３反復である。
【０２１１】
次に、トランス切断活性化の特異性を、ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ活性化因子のいずれかを使用して試験した。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２ａによるｄｓＤＮＡ結合に必要とされるＰＡＭ配列は、ｃｒＲＮＡ相補的ｄｓＤＮＡによる触媒活性化において重要であるが、ｃｒＲＮＡ相補的ｓｓＤＮＡの場合は重要ではないことを見出した（図２７Ａ）。ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ活性化因子分子のいずれかのｃｒＲＮＡ相補的配列に沿って導入された２つの塩基対（ｂｐ）ミスマッチは、ｓｓＤＮＡ−ＦＱレポーターのトランス切断速度を、ミスマッチの位置に応じて最大で約１００倍遅くした。ｄｓＤＮＡ活性化因子についてのみ、ＰＡＭ配列への変更またはｃｒＲＮＡとＰＡＭ隣接「シード領域」との間のミスマッチもまた、Ｃａｓ１２ａオフターゲット試験において観察されたミスマッチ耐性パターンと同様に、トランスｓｓＤＮＡ切断活性に対して大きな阻害効果を有した（図２７Ｂ、図３７）。これらのデータは、ともに、ＰＡＭ媒介型ｄｓＤＮＡ標的結合、及びトランスｓｓＤＮＡ切断を活性化するためのｃｒＲＮＡと標的鎖との間の塩基対合の役割と一致する。
【０２１２】
図２７Ａ〜２７Ｃ。トランス切断活性化の特異性及び保存。（Ａ）示された活性化因子の非存在下または存在下で、放射性標識された非特異的ｓｓＤＮＡ基質（Ｓ）と３７℃で３０分間インキュベートされたＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ。ＰＡＧＥを変性させることによって分解された産生物（Ｐ）。（Ｂ）示されたミスマッチを含むｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ活性化因子を使用したＬｂＣａｓ１２ａについて観察されたトランス切断速度。速度は３反復で測定された３つの異なる標的の平均を表し、エラーバーは平均値±標準偏差を表し、ここで、ｎ＝９（３つの独立した標的について３反復）である。（Ｃ）放射性標識されたシス（相補的）またはトランス（非相補的）基質を、ｓｓＤＮＡ活性化因子の存在下または非存在下で、Ｃａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡまたはＣａｓ９−ｓｇＲＮＡと３７℃と３０分間インキュベートした。シスｄｓＤＮＡ基質を、「酵素なし」レーンで使用した。基質（Ｓ）及びヌクレオチド産物（Ｐ）は、ＰＡＧＥを変性させることによって分解された。
【０２１３】
図３７。ｄｓＤＮＡ活性化因子におけるＰＡＭ配列及びＰＡＭ近位ミスマッチは、トランス活性化に対する特異性を提供した。３つの異なる標的配列のミスマッチ基質を使用したトランス切断動態の定量化であり、エラーバーは平均値±標準偏差を表し、ここで、ｎ＝３反復である。
【０２１４】
データは、全てのＶ型エフェクターが単一のＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含有することを考慮すると、このトランスｓｓＤＮＡ切断活性が他のＣａｓ１２ａ酵素、及びおそらくはより進化的に異なるＶ型ＣＲＩＳＰＲエフェクタータンパク質によって共有される特性である可能性があることを示唆した。この可能性と一致して、アシダミノコッカス属の種（ＡｓＣａｓ１２ａ）及びフランシセラ・ノビシダ（ＦｎＣａｓ１２ａ）由来の精製されたＣａｓ１２ａオーソログ、ならびにアリサイクロバチルス・アシドテレストリス（ＡａＣａｓ１２ｂ）由来のＣａｓ１２ｂタンパク質は、ｃｒＲＮＡ及び相補的ｓｓＤＮＡ活性化因子を用いて組み立てられた場合、全て非特異的ｓｓＤＮａｓｅ切断を触媒した（図２７Ｃ、図３８）。対照的に、試験されたＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９タンパク質は、いずれもトランスｓｓＤＮＡ切断の証拠を示さず（図２７Ｃ、図３８）、非特異的ｓｓＤＮＡ切断の標的依存性活性化が全てのＶ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１２タンパク質の基本的な特徴であることを示唆した。これらの結果は、Ｃａｓ１２酵素のＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｓｍ／Ｃｍｒ及びＶＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ１３エフェクターとの予期しない機能的収束を明らかにし、それぞれ、標的活性化された、非特異的ｓｓＤＮａｓｅまたはｓｓＲＮａｓｅ活性も示す。
【０２１５】
図３８。活性化因子依存性、非特異的ｓｓＤＮＡ切断活性は、Ｖ型ＣＲＩＳＰＲ干渉タンパク質全体で保存されることを見出した。放射性標識されたシス（相補的）またはトランス（非相補的）基質を、３７℃（ＡａＣａｓ１２ｂの場合は４７．５℃）で３０分間、ｓｓＤＮＡ活性化因子の存在下または非存在下でＣａｓ１２−ｃｒＲＮＡとインキュベートした。シスｄｓＤＮＡの場合、非標的鎖は５’末端標識されるが、標的鎖（ガイドＲＮＡに相補的）はシスｓｓＤＮＡに対して５’末端標識され、トランスｓｓＤＮＡ及びｄｓＤＮＡは非特異的ＤＮＡである。「酵素なし」レーンには、５’末端標識されたトランスｓｓＤＮＡを充填する。基質（Ｓ）及びヌクレオチド産物（Ｐ）は、ＰＡＧＥを変性させることによって分解される。
【０２１６】
次に、ＬｂＣａｓ１２ａを、特定のｄｓＤＮＡ配列に応答して蛍光読み出しを誘発するその能力に基づいて、臨床検体で使用するためのＤＮＡ検出プラットフォームとして転用できるかどうかを試験した。特に、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）の正確かつ迅速な識別は、１６型（ＨＰＶ１６）及び１８型（ＨＰＶ１８）が前がん病変の大部分を占めるＨＰＶ関連の前がん及びがんのリスクがある者の識別のために重要である。ＬｂＣａｓ１２ａ触媒トランスｓｓＤＮＡ切断がこれらの２つのｄｓＤＮＡウイルスを区別できるかどうかを試験するために、２つのＨＰＶ遺伝子型間で６塩基対だけ異なるＴＴＴＡ  ＰＡＭに隣接する２０ｎｔの標的配列を選択した（図３９Ａ〜３９Ｅ）。約５００ｂｐのＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８ゲノムの断片を含有するプラスミド（標的配列を含む）を、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８断片のいずれかを標的とするＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体及びクエンチされた蛍光ｓｓＤＮＡレポーターとともにインキュベートした。１時間後、ＬｂＣａｓ１２ａは、同種のＨＰＶ標的の存在下でのみ強固な蛍光シグナルを生成し、その識別は約１０ｐＭのプラスミドまで区別することができた（図３９Ａ〜３９Ｅ）。アッセイ感度を高めるために、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）による等温増幅をＬｂＣａｓ１２ａと組み合わせて、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ標的ＣＲＩＳＰＲトランスレポーター（ＤＥＴＥＣＴＲ）と称される迅速なワンポット検出法を開発した（図４０Ａ）。その同種のプラスミドを認識するようにプログラムされた場合、ＤＥＴＥＣＴＲはアトモルの感度で標的を識別することができた（図４０Ｂ）。
【０２１７】
図３９Ａ〜３９Ｅ。Ｃａｓ１２ａは２つの密接に関連するＨＰＶ配列を区別する。（Ａ）ｓｓＤＮＡ−ＦＱレポーターを使用したＣａｓ１２ａ検出の概略図とともに、６ヌクレオチドが異なるＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８ゲノム内の２０ｎｔの標的化配列のアラインメントを示す。３７℃で１時間、３０秒毎に取った蛍光測定値で、ＨＰＶ１６（上列）またはＨＰＶ１８（中央列）ゲノム断片及びＤＮａｓｅＡｌｅｒｔ基質を含有するｄｓＤＮＡプラスミドの存在下で、ｃｒＲＮＡ標的化（Ｂ）ＨＰＶ１６または（Ｃ）ＨＰＶ１６を用いて事前に組み立てられたＬｂＣａｓ１２ａを用いた蛍光経時変化を示す。（Ｄ）（Ｂ）及び（Ｃ）の経時変化から取得した最大蛍光シグナルである。エラーバーは平均値±標準偏差を表し、ここで、ｎ＝３反復である。
【０２１８】
図４０Ａ〜４０Ｂ。Ｃａｓ１２ａ検出と組み合わせた等温増幅によってＤＥＴＥＣＴＲを得、これはアトモルの感度を達成した。（Ａ）ＲＰＡによる等温増幅、及びｓｓＤＮＡ−ＦＱレポーターを使用したＣａｓ１２ａ検出からなるＤＥＴＥＣＴＲの概略図である。（Ｂ）ＤＥＴＥＣＴＲまたはＣａｓ１２ａ単独で検出された２つの独立したプラスミドの滴定である。ＤＥＴＥＣＴＲはアトモルの感度を達成することに留意されたい。エラーバーは平均値±標準偏差を表し、ここで、ｎ＝３反復である。
【０２１９】
ＨＰＶをより複雑な混合物において検出できるかどうかを評価するために、ＨＰＶ１６型（ＳｉＨａ）、１８型（ＨｅＬａ）に感染した、またはＨＰＶを含まない（ＢＪＡＢ）、培養ヒト細胞から抽出したＤＮＡを、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８内のＬ１遺伝子の超可変ループＶを標的とするｃｒＲＮＡと複合化されたＬｂＣａｓ１２ａに添加した（図２８Ａ）。
【０２２０】
ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ単独ではＨＰＶを検出するのに十分な感度がなかったのに対し、ＤＥＴＥＣＴＲはＨＰＶ１６型及び１８型をそれぞれＳｉＨａ細胞及びＨｅＬａ細胞中でのみ明確に識別した（図２８Ｂ、図４１Ａ〜４１Ｂ）。患者試料に対するＤＥＴＥＣＴＲの有用性を調査するために、ＨＰＶ感染についてＰＣＲベースの方法によって以前分析された２５のヒト肛門スワブからの粗製ＤＮＡ抽出物を試験した（図４２Ａ〜４２Ｂ）。１時間以内に、ＤＥＴＥＣＴＲは、ＨＰＶ型の不均一な混合物を含有する２５人の患者試料において、ＨＰＶ１６（２５／２５一致）及びＨＰＶ１８（２３／２５一致）の有無を正確に識別し、ＰＣＲベースの強度とＤＥＴＥＣＴＲシグナルとの間に良好な相関があった。（図２８Ｃ、図２８Ｄ；図４１Ｃ、図４１Ｄ；図４２Ａ〜４２Ｂ）。さらに、ＨＰＶ１６型または１８型に感染していなかったが、他の型のＨＰＶを含有していた検体における蛍光シグナルの不在は、ＤＥＴＥＣＴＲによる優れた特異性の指標であった。これらの結果は、ＣＲＩＳＰＲベースの診断のための新しいプラットフォームを示し、ＤＥＴＥＣＴＲが、原則として、関心対象の任意のＤＮＡ配列を高感度及び特異性で迅速に検出するように拡張できることを示唆する。
【０２２１】
図２８Ａ〜２８Ｄ。ＤＥＴＥＣＴＲによるヒト試料中のＨＰＶ１６型及び１８型の迅速な識別。（Ａ）Ｃａｓ１２ａによって標的化されるＬ１遺伝子の超可変ループＶ内のＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８配列の図である。強調表示された塩基は、５’ＰＡＭ配列を示す。（Ｂ）ヒートマップはＤＥＴＥＣＴＲによってヒト細胞株中で検出されたＨＰＶ１６型及び１８型の正規化された平均蛍光値を表し、正規化されたスケールは（Ｄ）に表される。（Ｃ）ＤＥＴＥＣＴＲによるＨＰＶ識別までのヒト肛門試料からのＤＮＡ抽出を示す概略図である。（Ｄ）ＰＣＲ（左）及びＤＥＴＥＣＴＲ（右）による２５人の患者試料中のＨＰＶ１６型及び１８型の識別である。ＤＥＴＥＣＴＲヒートマップは正規化された平均蛍光値を表す。
【０２２２】
図４１Ａ〜４１Ｄ。ＤＥＴＥＣＴＲによるヒト細胞株及び患者試料中のＨＰＶ１６型及び１８型の識別。（Ａ）ＤＥＴＥＣＴＲまたはＣａｓ１２ａ単独によるＨＰＶ検出の概略図である。（Ｂ）ＲＰＡ増幅を伴う、または伴わない、ＳｉＨａ（統合ＨＰＶ１６）、ＨｅＬａ（統合ＨＰＶ１８）、及びＢＪＡＢ（ＨＰＶなし）ヒト細胞株におけるＨＰＶ１６型または１８型の検出である。（Ｃ）２５のヒト肛門臨床試料中のＤＥＴＥＣＴＲによるＨＰＶ１６型または１８型の検出である。ＢＪＡＢ細胞株（ＨＰＶなし）が対照として使用される。エラーバーは平均値±標準偏差を表し、ここで、ｎ＝３反復である。（Ｄ）一元配置分散分析とＤｕｎｎｅｔｔの事後検定に基づいた、対照と試料群との差の、９５％の信頼区間のプロットであり、ここで、ｎ＝３反復である。強調表示された試料番号は、患者の試料中のＨＰＶ１６（左）またはＨＰＶ１８（右）の陽性検出を示し、ここで、＊＊ｐ≦０．０１及び＊＊＊ｐ≦０．００１である。
【０２２３】
図４２Ａ〜４２Ｂ。ヒト臨床試料中のＰＣＲならびにＨＰＶのハイブリッドキャプチャ検証及び遺伝子型決定。（Ａ）ＨＰＶ１６型（列２及び黄色の円）及び１８型（列３及びオレンジ色の円）のＰＣＲベースの検出の要約、ならびに患者試料中の２５のＰＣＲによる他の型のＨＰＶの識別である（列４）（２）。各ＰＣＲベースの検証に対して主観的な集中値（０〜４のスケール）を割り当てた（列２及び３）。（Ｂ）ＰＣＲ結果のヒートマップ図である。
【０２２４】
これらの知見は、ともに、ＰＡＭ依存性（ｄｓＤＮＡ）またはＰＡＭ非依存性（ｓｓＤＮＡ）の様式で相補的ＤＮＡ配列に結合するＣａｓ１２ガイドＲＮＡ複合体で始まる標的干渉の統一メカニズムを支持する（図２９）。宿主細菌内では、このような酵素活性化は、ｄｓＤＮＡ及びｓｓＤＮＡの両方のファージからの保護を同時に提供することができ得、ファージの複製または転写中に一時的に発生するｓｓＤＮＡ配列を標的とすることもでき得る。ゲノム編集の文脈において、Ｃａｓ１２による標的活性化ｓｓＤＮＡ切断は稀な事象であり得るが、複製フォーク、Ｒループ及び転写バブル、または相同組み換え修復に使用されるｓｓＤＮＡテンプレートで一時的に露出されたｓｓＤＮＡを切断する可能性がある。最後に、Ｃａｓ１２タンパク質のｓｓＤＮａｓｅ活性を引き出すことにより、ポイントオブケア診断用途のための核酸検出の速度、感度、及び特異性を向上させるための新しい戦略を提供する。
【０２２５】
図２９。Ｃａｓ１２ａによるシス及びトランス切断のＰＡＭ依存性及びＰＡＭ非依存性活性化のモデル。Ｃａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体は、ＰＡＭ依存性様式で相補的ｄｓＤＮＡに結合するか（上図）、またはＰＡＭ非依存性様式でｓｓＤＮＡに結合し（下図）、これは、ＲｕｖＣヌクレアーゼによる無差別ｓｓＤＮａｓｅ活性を引き出すのに十分である。また、Ｃａｓ１２タンパク質（例えば、Ｃａｓ１２ａ）は、ＰＡＭ遠位切断産物を放出することもでき、これは、ＲｕｖＣ活性部位を複数ラウンドの非特異的ｓｓＤＮＡ分解に晒す。
【０２２６】
（表２）この研究で使用した核酸
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【０２２７】
材料及び方法
タンパク質発現及び精製。ＳｐＣａｓ９及びＣａｓ１２タンパク質ならびに変異体をコードするＤＮＡ配列を、Ｎ末端１０×Ｈｉｓタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、及びＴＥＶプロテアーゼ切断部位を含有するカスタムｐＥＴベース発現ベクターにクローニングした。点変異を、アラウンドザホーンＰＣＲによって導入し、ＤＮＡ配列決定によって検証した。タンパク質を、以下の改変を加えて、記載のとおり精製した。ＳｐＣａｓ９またはＣａｓ１２発現プラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１６℃で１４時間、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ  Ｂｒｏｔｈ中で増殖させた。細胞を採取して、溶解緩衝液（５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、５００ｍＭのＮａＣｌ、５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、１ｍＭのＴＣＥＰ、０．５ｍＭのＰＭＳＦ、及び０．２５ｍｇ／ｍｌのリゾチーム）中で再懸濁し、超音波処理によって破壊し、Ｎｉ−ＮＴＡ樹脂を使用して精製した。４℃で一晩ＴＥＶ切断した後、カチオン交換クロマトグラフィー用のＨｉＴｒａｐ  Ｈｅｐａｒｉｎ  ＨＰカラムに接続されたＭＢＰＴｒａｐ  ＨＰカラムでタンパク質を精製した。最終ゲル濾過ステップ（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００）を、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、２００ｍＭのＮａＣｌ（またはＡａＣａｓ１２ｂの場合は２５０ｍＭのＮａＣｌ）、５％（ｖ／ｖ）のグリセロール、及び１ｍＭのＴＣＥＰを含有する溶出緩衝液で実行した。この研究で試験された全てのタンパク質を、図３０に示す。
【０２２８】
核酸調製。ＤＮＡ基質を、商業的に合成した（ＩＤＴ）。ＦＱレポーターアッセイでは、活性化ＤＮＡ二本鎖を、５倍モル過剰のＮＴＳを１倍ハイブリダイゼーション緩衝液（２０ｎＭのＴｒｉｓ−Ｃｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２）中でＴＳにアニーリングし、９５℃に加熱して、ベンチトップ上で徐冷することによって調製した。ＨＰＶ１６及びＨＰＶ１８断片をｇＢｌｏｃｋｓ（ＩＤＴ）として合成し、Ｇｉｂｓｏｎアセンブリを介してカスタムのｐＥＴベースのベクターにクローニングした。滴定実験用のプラスミドＤＮＡを、Ｑｕｂｉｔ蛍光光度計（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して定量化した。放射性標識された切断アッセイでは、ＰＡＧＥ精製されたＤＮＡオリゴを、記載のとおり調製した。
【０２２９】
ｓｇＲＮＡテンプレートを、ｐＵＣ１９ベクター、またはＴ７プロモーター、２０ヌクレオチドのターゲット配列、及びｓｇＲＮＡ足場を含有する重複プライマーからＰＣＲ増幅した。増幅されたＰＣＲ産物は、記載のとおり実施されたインビトロ転写反応においてＤＮＡテンプレートとして機能した。ｃｒＲＮＡを、１倍ハイブリダイゼーション緩衝液中でＴ７フォワードプライマーにアニーリングされた、逆補体配向でＴ７プロモーター、反復、及びスペーサーを含有する一本鎖ＤＮＡテンプレートを使用して、インビトロで転写した。
【０２３０】
ＤＮＡ切断アッセイ。一般に、Ｃａｓ１２ａ媒介型切断アッセイは、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭのＫＣｌ、１０ｍＭのＭｇＣｌ２、１％のグリセロール、及び０．５ｍＭのＤＴＴからなる切断緩衝液中で実行した。Ｍ１３標的化アッセイでは、３０ｎＭのＣａｓ１２ａを、３６ｎＭのＭ１３標的化ｃｒＲＮＡ（シス）または３６ｎＭのｃｒＲＮＡ及び４０ｎＭの相補的ｓｓＤＮＡ（活性化因子）（Ｍ１３（トランス）との配列相同性を有さない）のいずれかを用いて、を伴わずに、３７℃で１０分間、事前に組み立てた。反応を、１０ｎＭのＭ１３ｍｐ１８  ｓｓＤＮＡ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）を添加することによって開始し、３７℃で指定された時間インキュベートした。反応を、１５ｍＭのＥＤＴＡを含有するＤＮＡ充填緩衝液（３０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、０．２５％（ｗ／ｖ）のブロモフェノールブルー、０．２５％（ｗ／ｖ）のキシレンシアノール）でクエンチし、ＳＹＢＥＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で事前に染色された１．５％のアガロースゲルによって分離した。
【０２３１】
放射性標識された切断アッセイでは、使用した基質を、ガンマ３２Ｐ−ＡＴＰの存在下でＴ４  ＰＮＫ（ＮＥＢ）で５’末端標識した。ｄｓＤＮＡ基質については、非標的鎖を最初に５’末端標識し、次いで過剰な対応する標的鎖とアニーリングした。反応に使用したＣａｓ１２ａ（またはＳｐＣａｓ９）、ガイドＲＮＡ、及び３２Ｐ標識基質の濃度は、それぞれ、３０ｎＭ、３６ｎＭ、及び１〜３ｎＭ（特に記載のない限り）であった。反応物を、３７℃（または好熱性ＡａｃＣａｓ１２ｂの場合は４７．５°Ｃ）で３０分間（特に明記されていない限り）インキュベートし、ホルムアミド充填緩衝液（最終濃度４５％のホルムアミド及び１５ｍＭのＥＤＴＡ、微量のキシレンシアノール及びブロモフェノールブルー）で、９０℃で２〜３分間クエンチした。基質及び産生物を１２％の尿素変性ＰＡＧＥゲルで分解し、Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｔｙｐｈｏｏｎ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）で定量化した。
【０２３２】
基質ターンオーバー試験では、事前に組み立てられたＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡまたはＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ−活性化因子（標的ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ）を、３７℃で１０分間インキュベートし、３０ｎＭの事前に組み立てられたＲＮＰを、それぞれ、１５、３０、４５、及び６０ｎＭで様々な基質濃度を有する各反応物について使用した。
【０２３３】
フルオロフォアクエンチャー（ＦＱ）標識レポーターアッセイ。ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ複合体を、２００ｎＭのＬｂＣｐｆ１を２５０ｎＭのｃｒＲＮＡ及び４ｎＭの活性化因子（ｓｓＤＮＡ、ｄｓＤＮＡまたはｓｓＲＮＡ）と３７℃で３０分間インキュベートすることによって事前に組み立てた。ＬｂＣａｓ１２ａ複合体を、１倍結合緩衝液（２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００ｍＭのＫＣｌ、５ｍＭのＭｇＣｌ２、１ｍＭのＤＴＴ、５％のグリセロール、５０μｇ  ｍｌ−１のヘパリン）及び５０ｎＭのＤＮａｓｅＡｌｅｒｔ基質（商標）（ＩＤＴ）または２０μｌの反応液中のカスタムｓｓＤＮＡ／ｓｓＲＮＡ  ＦＱレポーター基質を含有する溶液中で５０ｎＭのＬｂＣａｓ１２ａ：６２．５ｎＭのｃｒＲＮＡ：１ｎＭの活性化因子の最終濃度に希釈することによって、反応を開始した。ＨＰＶ検出アッセイを、以下の改変を加えて、上記のとおり実行した。ＬｂＣａｓ１２ａを、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８標的化プラスミドを用いて事前に組み立て、１倍結合緩衝液、カスタムｓｓＤＮＡ−ＦＱレポーター、及び１、１０、１００、もしくは１０００ｎＭのＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８を含有するプラスミドを含有する溶液中で希釈した。反応物（２０μｌ、３８４ウェルマイクロプレートフォーマット）を、蛍光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｐｒｏ  Ｆ２００）で、３７℃で最大１２０分間インキュベートし、蛍光測定を３０秒毎に行った（ＤＮａｓｅＡｌｅｒｔ基質＝λｅｘ：５３５ｎｍ、λｅｍ：５９５ｎｍ、カスタムｓｓＤＮＡ／ｓｓＲＮＡ  ＦＱ基質＝λｅｘ：４８５ｎｍ、λｅｍ：５３５ｎｍ）。
【０２３４】
トランス切断速度を決定するために、バックグラウンド補正された蛍光値を、標的プラスミドの非存在下で行われた反応から得られた蛍光値を差し引くことによって計算した。得られたデータを、以下の式に従って、単一指数関数的減衰曲線（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）に適合した。切断された割合＝Ａ×（１−ｅｘｐ（−ｋ×ｔ））（式中、Ａは曲線の振幅、ｋは一次速度定数、及びｔは時間である）。
【０２３５】
Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ分析では、ＬｂＣａｓ１２ａ−ｃｒＲＮＡ−活性化因子（標的ｓｓＤＮＡまたはｄｓＤＮＡ）複合体を上記のとおり調製し、ＬｂＣａｓ１２ａ複合体を、１倍結合緩衝液及び０．００１、０．０１、０．１、０．２、０．５、１または２ｕＭのＤＮａｓｅＡｌｅｒｔ（商標）基質（ＩＤＴ）を含有する溶液中で５ｎＭのＬｂＣａｓ１２ａ：６．２５ｎＭのｃｒＲＮＡ：０．１ｎＭの活性化因子（有効な複合体＝０．１ｎＭ）の最終濃度に希釈することによって、反応を開始した。反応を、３７℃で最長３０分間、蛍光プレートリーダーでインキュベートし、３０秒毎に蛍光測定した（λｅｘ：５３５ｎｍ、λｅｍ：５９５ｎｍ）。初期速度（Ｖ０）を、線形回帰に適合することによって計算し、基質濃度に対してプロットして、Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ−Ｍｅｎｔｅｎ定数（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を以下の式に従って決定した。Ｙ＝（Ｖｍａｘ×Ｘ）／（Ｋｍ＋Ｘ）（式中、Ｘは基質濃度であり、Ｙは酵素速度である）。ターンオーバー数（ｋｃａｔ）を、以下の式によって決定した。ｋｃａｔ＝Ｖｍａｘ／Ｅｔ（式中、Ｅｔ＝０．１ｎＭ）。
【０２３６】
ヒト臨床試料の採集及びＤＮＡ調製。肛門試料のドナーを、ＵＣＳＦ  Ａｎａｌ  Ｎｅｏｐｌａｓｉａ  Ｃｌｉｎｉｃ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＡＮＣＲＥ）から募集した。この研究は、ＵＣＳＦ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈによって承認された。インフォームドコンセントを得た後、参加者は、肛門細胞診及びＨＰＶ検査のために、肛門スワブをＴｈｉｎｐｒｅｐ（商標）バイアルに挿入した。単層細胞診スライドを作製した後の、最初のスワブから残った細胞懸濁液を、ＨＰＶ  ＤＮＡ  ＰＣＲのために使用した。
【０２３７】
１．５ｍｌの細胞懸濁液をペレット化することにより、粗製ＤＮＡ調製物を作製した。ペレットを乾燥させた後、２００μｇ／ｍｌの濃度でプロテイナーゼＫ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む１００μｌのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ中に懸濁して、５６℃で１時間インキュベートし、次いでプロテイナーゼＫを熱失活した。この５μｌを、ＨＰＶコンセンサスＰＣＲに使用した。ヒト細胞株（ＳｉＨａ、ＨｅＬａ、ＢＪＡＢ）からのＤＮＡ調製を、以下の改変を加えて、上記のとおり実行した。１０６〜１０７個の細胞を採取し、プロテイナーゼＫを含む１００μＬのＴｒｉｓ−ＥＤＴＡ中に再懸濁して、５６℃で１時間後インキュベートし、次いでプロテイナーゼＫを熱失活した。１μｌのこの試料を、ＤＥＴＥＣＴＲ実験のために使用した。
【０２３８】
ＤＥＴＥＣＴＲアッセイ。ＤＥＴＥＣＴＲは、ＴｗｉｓｔＡｍｐ  Ｂａｓｉｃ（Ｔｗｉｓｔ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用してリコンビナーゼポリメラーゼ増幅（ＲＰＡ）を組み合わせた後、同反応物においてＣａｓ１２ａを検出した。簡潔に言えば、１μｌの試料、０．４８μＭのフォワード及びリバースプライマー、１倍の再水和緩衝液、１４ｍＭの酢酸マグネシウム、ならびにＲＰＡミックスを含有する、５０μｌの反応液を３７℃で１０分間インキュベートした。ＲＰＡ反応液（１８μｌ）を３８４ウェルマイクロプレートに移し、５０ｎＭのＬｂＣａｓ１２ａ：６２．５ｎＭのｃｒＲＮＡ：５０ｎＭのカスタムｓｓＤＮＡ−ＦＱレポーターを、反応液に直接添加した（最終体積２０μｌ）。反応液を、３７℃で１〜２時間、蛍光プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｐｒｏ  Ｆ２００）中でインキュベートし、１分毎に蛍光測定を行った（λｅｘ：４８５ｎｍ、λｅｍ：５３５ｎｍ）。
【０２３９】
ＤＥＴＥＣＴＲによるＨＰＶ識別のために、ヒト試料中のＨＰＶ１６型または１８型の検出値を、それぞれ、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８標的化ｃｒＲＮＡを使用して得られた最大平均蛍光シグナルに正規化した。一元配置分散分析とＤｕｎｎｅｔｔの事後検定を使用して、患者試料中のＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８を識別するための正のカットオフ（ｐ≦０．０５に設定）を決定した。このカットオフに基づいて、試料の１００％がＨＰＶ１６感染について正確に識別され（ＰＣＲベースの結果と２５／２５の一致）、一方、試料の９２％がＨＰＶ１８感染について正確に識別された（ＰＣＲベースの結果と２３／２５の一致）。
【０２４０】
ＨＰＶ遺伝子型決定及び検証。ＰＣＲを、前に記載されたように、ＭＹ０９／ＭＹ１１コンセンサスＨＰＶ  Ｌ１プライマーの修飾プール、ならびに、前に記載されてたように、検体適切性の指標としての、ヒトベータ−グロビンの増幅のためのプライマーを使用して実行した。４０増幅サイクル後、検体を、ビオチン標識ＨＰＶ  Ｌ１コンセンサスプローブ混合物を用いてプローブした。分離膜を、ビオチン標識プローブを用いてヒトベータ−グロビン遺伝子にプローブした。検体を、３８種類の異なるＨＰＶ型、６／１１、１６、１８、２６／６９、３０、３１、３２／４２、３３、３４、３５、３９、４５、５１、５２、５３、５４、５６、５７／２／２７、５８、５９、６１、６２、６６、６７、６８、７０、７１、７２、７３、８１、８２、８３、８４、８５、８６／８７、９０／１０６、９７、１０２／８９、ならびに２つの別個の混合物にハイブリダイズすることによって分類した。ミックス１は、７、１３、４０、４３、４４、５５、７４、及び９１を含有し、ミックス２は、３、１０、２８、２９、７７、７８及び９４を含有する。ベータ−グロビン遺伝子増幅に対して陰性である検体は、分析から除外した。ＰＣＲの結果を、以前に記載されたように、ドットブロット上のシグナル強度に基づいて０〜５のスケールで記録した。結果が１以上として記録された試料を、陽性と見なした。
【０２４１】
実施例４：Ｃａｓ１２ｄ及びＣａｓ１２ｅのトランス切断活性
トランス切断活性を、さらに２つのＶ型ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓエフェクタータンパク質、すなわちＣａｓＸ（Ｃａｓ１２ｅ）及びＣａｓＹ（Ｃａｓ１２ｄ）について、ＤＥＴＥＣＴＲアッセイを使用して示した（図４３Ａ〜４３Ｂ）。
【０２４２】
実施例５：茶色または青い目の原因であるＨＥＲＣ２遺伝子内の一塩基多型（ＳＮＰ）の識別
ＤＥＴＥＣＴＲを使用して、Ｃａｓ１２ａを使用して唾液試料から目の色ＳＮＰを検出した（図４４）。試料調製：５００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水を、約５００μＬのボランティアの唾液に添加し、１８００ｇで５分間遠心分離した。上清をデカントし、ペレットを０．２％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００を含む１００μＬのリン酸緩衝化生理食塩水中に再懸濁した後、９５℃で５分間インキュベートした。ＲＰＡ反応への直接入力として、１μＬの試料を使用した。これらの実験には以下の核酸を使用した。
【０２４３】
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【０２４４】
実施例６：ヒトの唾液からのＸＩＳＴ（Ｘ染色体内）またはＳＲＹ（Ｙ染色体内）遺伝子の検出によるＸまたはＹ染色体の識別
図４５は、ヒトの唾液からのＸＩＳＴ（Ｘ染色体内）またはＳＲＹ（Ｙ染色体内）遺伝子の検出によるＸまたはＹ染色体の識別を示すデータを提供する。これらの実験には以下の核酸を使用した。
【０２４５】
2021508238.tif 000020
【０２４６】
本発明を、その特定の実施形態を参照して記載したが、本発明の真の主旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更がなされてもよく、同等物に置き換えられてもよいことが、当業者によって理解されるべきである。加えて、特定の状態、材料、組成物、プロセス、プロセスのステップ（複数可）を本発明の目的、主旨、及び範囲に適応させるために、多くの改変がなされてもよい。全てのそのような改変は、本明細書に添付される特許請求の範囲内であることが意図される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２Ａ】
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【図３２Ｂ】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４１Ｃ】
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【図４１Ｄ】
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【図４２】
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【図４３Ａ】
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【図４３Ｂ】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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