(57)【要約】本明細書では、宿主生物から分泌される組換え発現産物の分解を抑制するための改変株、及びかかる改変株を使用する方法を開示する。【選択図】図５
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹＰＳ１−１プロテアーゼ及びＹＰＳ１−２プロテアーゼの活性を減弱または消失させてあるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）微生物であって、組換えポリペプチドを発現する、前記微生物。
【請求項２】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼはＹＰＳ１−１遺伝子によりコードされる、請求項１または請求項２に記載の微生物。
【請求項５】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む、請求項４に記載の微生物。
【請求項７】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む、請求項４に記載の微生物。
【請求項８】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４にある、請求項４に記載の微生物。
【請求項９】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８を含む、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼはＹＰＳ１−２遺伝子によりコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１２】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１３】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１４】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１５】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７にある、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１６】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子または前記ＹＰＳ１−２遺伝子またはその両方を変異またはノックアウトさせてある、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１７】
組換えタンパク質を発現する、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１８】
前記組換えタンパク質は、絹タンパク質由来の少なくとも１つのブロックポリペプチド配列を含む、請求項１７に記載の微生物。
【請求項１９】
前記組換えタンパク質は絹様ポリペプチドを含む、請求項１７に記載の微生物。
【請求項２０】
前記絹様ポリペプチドは、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３を含み、ここで、
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、
ｎ１は４〜８であり、
ｎ２は６〜２０であり、かつ
ｎ３は２〜２０である、
請求項１９に記載の微生物。
【請求項２１】
前記絹様ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む、請求項１９に記載の微生物。
【請求項２２】
１つ以上のさらなるプロテアーゼの活性を減弱または消失させてある、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２３】
前記１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＹＰＳ１−５、ＭＣＫ７、またはＹＰＳ１−３を含む、請求項２２に記載の微生物。
【請求項２４】
前記ＹＰＳ１−５遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿０６８８にある、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２５】
前記ＭＣＫ７プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含むＭＣＫ７遺伝子によりコードされる、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２６】
前記ＭＣＫ７遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２７】
前記ＭＣＫ７遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を含む、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２８】
前記ＭＣＫ７遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ１−１＿０３７９にある、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２９】
前記ＹＰＳ１−３プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含むＹＰＳ１−３遺伝子によりコードされる、請求項２３に記載の微生物。
【請求項３０】
前記ＹＰＳ１−３遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の微生物。
【請求項３１】
前記ＹＰＳ１−３遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む、請求項２３に記載の微生物。
【請求項３２】
前記ＹＰＳ１−３遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿０２９９にある、請求項２３に記載の微生物。
【請求項３３】
前記１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１３０からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項２２に記載の微生物。
【請求項３４】
前記１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１３０からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項２２に記載の微生物。
【請求項３５】
前記１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２２に記載の微生物。
【請求項３６】
前記１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２２に記載の微生物。
【請求項３７】
前記微生物は、３Ｘ、４Ｘまたは５Ｘのプロテアーゼノックアウトを含む、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むＹＰＳ１−１遺伝子とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含むＹＰＳ１−２遺伝子とを変異または欠失させることによって低下させた前記ＹＰＳ１−１及び前記ＹＰＳ１−２の活性を含む、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの改変微生物であって、
さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む組換え発現タンパク質を含む、前記微生物。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の微生物を含む、細胞培養物。
【請求項４０】
請求項１７〜３８のいずれか１項に記載の微生物を含む細胞培養物であって、
前記組換え発現タンパク質は、ＹＰＳ１−１及びＹＰＳ１−２の活性を減弱または消失させていない点以外は同一なＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ微生物を含む細胞培養よりも、分解が少ない、前記細胞培養物。
【請求項４１】
請求項１７〜３７のいずれか１項に記載の微生物を、前記組換え発現タンパク質の発現に好適な条件下で、培地で培養すること、及び
前記微生物または前記培地から前記組換えタンパク質を単離すること
を含む、分解が抑制された組換えタンパク質を生産する方法。
【請求項４２】
前記組換えタンパク質は前記微生物から分泌され、かつ、前記組換えタンパク質の単離は、前記分泌された組換えタンパク質を含む培地を回収することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記組換えタンパク質は、前記ＹＰＳ１−１及び前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼ活性を減弱または消失させてない点以外は同一な微生物により産生された前記組換えタンパク質と比較して、分解レベルが低い、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
組換え発現タンパク質の分解が抑制されるようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法であって、
ＹＰＳ１−１タンパク質及びＹＰＳ１−２タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトまたは変異させることを含む、前記方法。
【請求項４５】
ＹＰＳ１−３タンパク質、ＹＰＳ１−５タンパク質、またはＭＣＫ７タンパク質をコードする１つ以上のさらなる遺伝子をノックアウトまたは変異させることをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１３０からなる群から選択されるポリペプチドを含むタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子をノックアウトさせることをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記組換え発現タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０連続するアラニン残基を含むポリＡ配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記組換え発現タンパク質は絹様ポリペプチドを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記絹様ポリペプチドは、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３を含み、ここで、
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、
ｎ１は４〜８であり、
ｎ２は６〜２０であり、かつ
ｎ３は２〜２０である、
請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記組換え発現タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本開示は、細胞からのタンパク質もしくは代謝物を産生させるかまたは産生を増強させるための株最適化の方法に関する。本開示はまた、それらの方法から得られる組成物にも関する。特に、本開示は、酵母細胞により発現された組換えタンパク質の分解が抑制されるよう選択または遺伝子操作された酵母細胞、及び有用な化合物を製造するための酵母細胞培養方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
メチロトローフ酵母ピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）は組換えタンパク質の産生に広く使用されている。Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓは高い細胞密度に生育し、厳密に制御されたメタノール誘導性の導入遺伝子発現を提供し、合成培地中に異種タンパク質を効率的に分泌する。
【０００３】
しかしながら、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株の培養中、組換えにより発現させたタンパク質は回収可能となる前に分解されることがあり、組換えにより発現させたタンパク質の断片と低収量の完全長組換えタンパク質とが含まれたタンパク質混合物を生じさせる。したがって、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓにおけるタンパク質分解を減弱させる手段及び人工操作された株が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
いくつかの実施形態では、本明細書では、ＹＰＳ１−１プロテアーゼ及びＹＰＳ１−２プロテアーゼの活性を減弱または消失させてあるＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓという微生物を提供し、ここで、前記微生物は組換えポリペプチドを発現する。
【０００５】
いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−１プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−１プロテアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７を含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−１プロテアーゼはＹＰＳ１−１遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−１遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−１遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４にある。
【０００６】
いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−２プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−２プロテアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８を含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−２プロテアーゼはＹＰＳ１−２遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−２遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−２遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−２遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−２遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７にある。
【０００７】
いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−１遺伝子または前記ＹＰＳ１−２遺伝子、またはその両方を変異またはノックアウトさせてある。
【０００８】
いくつかの実施形態では、微生物は組換えタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、絹タンパク質由来の少なくとも１つのブロックポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は絹様ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドは、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３を含み、ここで、Ｘ１＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、ｎ１は４〜８であり、ｎ２は６〜２０であり、ｎ３は２〜２０である。いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、微生物の１つ以上のさらなるプロテアーゼの活性を減弱または消失させてある。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＹＰＳ１−５、ＭＣＫ７、またはＹＰＳ１−３を含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−５遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿０６８８にある。
【００１１】
いくつかの実施形態では、ＭＣＫ７プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含むＭＣＫ７遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ＭＣＫ７遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＭＣＫ７遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を含む。いくつかの実施形態では、ＭＣＫ７遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ１−１＿０３７９にある。
【００１２】
いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−３プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含むＹＰＳ１−３遺伝子によりコードされる。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−３遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−３遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む。いくつかの実施形態では、ＹＰＳ１−３遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿０２９９にある。
【００１３】
いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１３０からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１３０からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列によりコードされる。いくつかの実施形態では、１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によりコードされる。
【００１４】
いくつかの実施形態では、微生物は、３Ｘ、４Ｘまたは５Ｘのプロテアーゼノックアウトを含む。
【００１５】
また本明細書では、本発明のいくつかの実施形態に従って、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むＹＰＳ１−１遺伝子及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含むＹＰＳ１−２遺伝子を変異または欠失させることによって低下させたＹＰＳ１−１とＹＰＳ１−２の活性を含む、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの改変微生物も提供し、ここで、前記微生物はさらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む、組換えにより発現させたタンパク質を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態では、本明細書により、本明細書に記載のように、プロテアーゼが減弱された微生物を含む細胞培養物も提供される。
【００１７】
また、本明細書では、いくつかの実施形態に従って、本明細書に記載のようにＹＰＳ１−１及びＹＰＳ１−２の活性を減弱または消失させてある微生物を含む細胞培養物も提供し、ここで、かかる微生物は組換えによりタンパク質を発現し、前記組換えにより発現させたタンパク質は、ＹＰＳ１−１及びＹＰＳ１−２の活性を減弱または消失させていない点以外は同一なＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ微生物を含む細胞培養物よりも分解が少ない。
【００１８】
いくつかの実施形態では、本明細書により、分解が抑制された組換えタンパク質を生産する方法が提供され、これは、本明細書に記載のようにＹＰＳ１−１及びＹＰＳ１−２の活性を減弱または消失させてある微生物を、組換え発現タンパク質の発現に好適な条件下、培地中で培養すること、及び微生物または培地から組換えタンパク質を単離することを含む。
【００１９】
いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は前記微生物から分泌され、ここで、前記組換えタンパク質の単離は、前記分泌された組換えタンパク質を含む培地を回収することを含む。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、前記ＹＰＳ１−１及び前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼ活性を減弱または消失させてない点以外は同一な微生物により産生された前記組換えタンパク質と比較して分解レベルが低い。
【００２０】
また、本明細書では、組換えにより発現させたタンパク質の分解が抑制されるようＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法も提供し、これは、ＹＰＳ１−１タンパク質及びＹＰＳ１−２タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトまたは変異させることを含む。いくつかの実施形態では、組換えにより発現させたタンパク質の分解が抑制されるようＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法はさらに、ＹＰＳ１−３タンパク質、ＹＰＳ１−５タンパク質、またはＭＣＫ７タンパク質をコードする１つ以上のさらなる遺伝子をノックアウトまたは変異させることを含む。いくつかの実施形態では、組換えにより発現させたタンパク質の分解が抑制されるようＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法はさらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１３０からなる群から選択されるポリペプチドを含むタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子をノックアウトさせることを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態では、組換えにより発現させたタンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０連続するアラニン残基を含むポリＡ配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えにより発現させたタンパク質は絹様ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドは、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３を含み、ここで、Ｘ１＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、ｎ１は４〜８であり、ｎ２は６〜２０であり、ｎ３は２〜２０である。いくつかの実施形態では、組換えにより発現させたタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
前述及び他の、課題、特徴及び利点は、異なる図面を通して同種の参照符号が同じ部分を指す添付の図面で例示する、本発明の個々の実施形態に関する以下の説明から明らかとなるであろう。図面は必ずしも一定の縮尺で描かれているわけではなく、代わりに、本発明のさまざまな実施形態の原則を例示することに重点が置かれている。
【００２３】
【図１】ゼオシン耐性マーカーを有するＫＵ７０欠失プラスミドのマップである。
【図２】標的プロテアーゼ遺伝子欠失のためのホモロジーアームと共に用いるノーセオスリシンマーカーを含むプラスミドのプラスミドマップである。
【図３】図３Ａ及び図３Ｂは、ノーセオスリシン耐性マーカーに隣接する所望のプロテアーゼ遺伝子に指向するホモロジーアームを有するプロテアーゼノックアウト用カセットである。
【図４】単一ＫＯ株から単離されたタンパク質の代表的ウェスタンブロットであり、これらの株からのタンパク質分解を示す。
【図５】ダブルＫＯ株から単離されたタンパク質の代表的ウェスタンブロットであり、これらの株からのタンパク質分解を示す。
【図６】ＢＭＧＹまたはＹＰＤ中で継代培養したプロテアーゼＫＯが２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、及び５Ｘある株から単離されたタンパク質の代表的ウェスタンブロットであり、これらの株におけるタンパク質分解を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
詳細な説明
本発明のさまざまな実施形態の詳細を以下の説明にて記載する。本発明の他の特徴、課題、及び利点は、説明及び図面から、ならびに請求項から明らかとなるであろう。
【００２５】
定義
本明細書中で特に明記しない限り、本発明との関連で使用される科学用語及び技術用語は当業者が共通して理解する意味を持つものとする。さらに、文脈に別段の定めがない限り、単数形の用語には複数形が含まれるものとし、複数形の用語には単数形が含まれるものとする。用語「ａ」及び「ａｎ」には、文脈上他の意味に解すべき場合を除き、複数の指示対象が含まれる。一般に、本明細書に記載する生化学、酵素学、分子細胞生物学、微生物学、遺伝学ならびにタンパク質及び核酸化学ならびにハイブリダイゼーションとの関連で使用される術語及びそれらに関する技術は、当該技術分野で周知の一般的に使用されるものである。
【００２６】
特に明記しない限り、以下の用語は以下の意味を持つものと理解されるべきである。
【００２７】
用語「ポリヌクレオチド」または「核酸分子」とは、少なくとも１０塩基長ある、ヌクレオチドの重合体形態を指す。かかる用語には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡもしくは合成ＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡまたは合成ＲＮＡ）、ならびに非天然型ヌクレオチド類似体、非天然ヌクレオシド間結合、またはその両方を含有するＤＮＡもしくはＲＮＡの類似体が含まれる。核酸は、どのような形態学的コンホメーションにあってもよい。例えば、核酸は、一本鎖、二本鎖の、三本鎖、四重鎖、部分的二本鎖、分岐鎖、ヘアピン状、環状、またはパドロックドコンホメーションであり得る。
【００２８】
特に明記しない限り、「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ」という一般形式で本明細書に記載のあらゆる配列についての一例として、「ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む核酸」とは、少なくとも一部に、（ｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に記載の配列を有するか、または（ｉｉ）ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１に相補的な配列を有する核酸を指す。二者択一は文脈により決定される。例えば、核酸がプローブとして使用されている場合は、プローブは所望の標的に相補的でなければならないという要件により二者択一が決定される。
【００２９】
「単離された」ＲＮＡ、ＤＮＡまたは混合ポリマーとは、その自然宿主細胞において天然ポリヌクレオチドに天然で伴う他の細胞成分、例えば、それが天然で会合しているリボソーム、ポリメラーゼ及びゲノム配列などから実質的に分離されるものを言う。
【００３０】
「単離された」有機分子（例えば、絹タンパク質）は、由来している宿主細胞の細胞成分（膜脂質、染色体、タンパク質）、または宿主細胞が培養された培地から実質的に分離されるものを言う。かかる用語により、生体分子が他のあらゆる化学薬品から分離されていることが必ずしも必要とされるわけではないが、特定の単離生体分子はほぼ均一になるまで精製され得る。
【００３１】
用語「組換え型」とは、生体分子、例えば、遺伝子またはタンパク質であって、（１）その天然に生じる環境から除かれているもの、（２）自然界ではその遺伝子が見られるポリヌクレオチドの全部または一部に会合していないもの、（３）自然界では連結していないポリヌクレオチドに機能的に連結されているもの、または（４）自然界では生じないものを指す。「組換え型」という用語は、クローン化ＤＮＡ分離物、化学合成ポリヌクレオチド類似体、または、異種系により生物学的に合成されたポリヌクレオチド類似体、ならびにそのようなそのような核酸によりコードされるタンパク質及び／またはｍＲＮＡに関して使用され得る。
【００３２】
生物ゲノムの内在性核酸配列（またはその配列によりコードされるタンパク質産物）の発現が変化するよう、この内在性核酸配列に隣接して異種配列が置かれている場合、その内在性核酸配列は本明細書では「組換え型」とみなされる。この場合、異種配列は、その異種配列がそれ自体内在性（同一宿主細胞またはその子孫由来）または外因性（異なる宿主細胞またはその子孫由来）であるか否かにかかわらず、天然では内在性核酸配列に隣接していない配列である。例として、プロモーター配列は、宿主細胞のゲノムにある遺伝子の天然プロモーターを（例えば、相同組換えにより）置換して、この遺伝子の発現パターンが変化するようにすることができる。ここで、この遺伝子は、天然ではそれに隣接している配列の少なくともいくつかの配列から分離されているため「組換え型」と考えられるであろう。
【００３３】
核酸もまた、それが、ゲノム中の対応する核酸に対する、天然では生じない何らかの修飾を含有する場合に「組換え型」とみなされる。例えば、内在性コード配列は、それが人為的に、例えば、人の介入などによって導入された挿入、欠失または点変異を含有する場合は「組換え型」とみなされる。「組換え核酸」には、宿主細胞染色体内の非相同部位に組み込まれた核酸、及びエピソームとして存在する核酸構築体も含まれる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、参照核酸配列の「縮重変異型」という語句は、標準的遺伝暗号に従って翻訳され、参照核酸配列から翻訳されるアミノ酸配列と同一なアミノ酸配列を提供することができる核酸配列を包含する。用語「縮重オリゴヌクレオチド」または「縮重プライマー」は、必ずしも配列は同一ではないが１つ以上の特定セグメント内部で互いに相同な標的核酸配列とハイブリダイズすることができるオリゴヌクレオチドを意味するために使用される。
【００３５】
核酸配列において「配列同一性パーセント」または「同一な」という用語は、２つの配列中の残基で、一致度が最大となるよう整列させた場合に同じになるものを指す。配列同一性を比較する長さは、少なくとも約９ヌクレオチド、通常は少なくとも約２０ヌクレオチド、より一般には少なくとも約２４ヌクレオチド、典型的には少なくとも約２８ヌクレオチド、より典型的には少なくとも約３２ヌクレオチド、好ましくは少なくとも約３６以上のヌクレオチドの領域にわたり得る。ヌクレオチド配列同一性を測定するために使用できる当該技術分野で公知の異なるアルゴリズムが多数ある。例えば、ポリヌクレオチド配列は、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ  バージョン１０．０（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ）に同梱のプログラムであるＦＡＳＴＡ、ＧａｐまたはＢｅｓｔｆｉｔを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列の間で最も重複している領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。例えば、核酸配列間の配列同一性パーセントは、参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧ  バージョン６．１で提供されるとおり、ＦＡＳＴＡをそのデフォルトのパラメータ（文字列サイズは６、またスコア行列のファクターはＮＯＰＡＭ）で使用するか、またはＧａｐをそのデフォルトのパラメータを使用して決定することができる。別法として、配列はコンピュータプログラムのＢＬＡＳＴ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、Ｇｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）、Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７））、特にｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））を使用して比較することができる。
【００３６】
核酸またはその断片に言及した際の「実質的な相同性」または「実質的な類似性」という用語は、ヌクレオチドの適切な挿入または欠失を用いて別の核酸（またはその相補鎖）と至適に整列させた場合に、上述のようなＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴまたはＧａｐなどの周知の配列同一性アルゴリズムのいずれかで測定したヌクレオチド配列同一性が、ヌクレオチド塩基の少なくとも約７５％、８０％、８５％、好ましくは少なくとも約９０％、より好ましくは少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％または９９％においてあることを示す。
【００３７】
別法として、実質的な相同性または類似性は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で核酸またはその断片が別の核酸、別の核酸の鎖、またはその相補鎖とハイブリダイズする場合に存在する。核酸ハイブリダイゼーション実験における「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」及び「ストリンジェントな洗浄条件」は、多数の異なる物理的パラメータによって決まる。核酸ハイブリダイゼーションは、当業者に容易に理解されるように、塩濃度、温度、溶媒、ハイブリダイズする種の塩基組成、相補的領域の長さ、及びハイブリダイズする核酸間のヌクレオチド塩基のミスマッチ数のような条件による影響を受ける。ハイブリダイゼーションの特定のストリンジェンシーを達成するためにこれらのパラメータをいかに変えるかは、当業者により知られている。
【００３８】
一般に、「ストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、一連の特定条件下、個々のＤＮＡハイブリッドの熱融点（Ｔｍ）より約２５℃低い温度にて実施される。「ストリンジェントな洗浄」は、一連の特定条件下、個々のＤＮＡハイブリッドのＴｍよりも約５℃低い温度で実施される。Ｔｍは、標的配列の５０％が完全一致プローブとハイブリダイズする温度である。参照により本明細書に組み込まれるＳａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９），９．５１頁を参照のこと。本明細書の目的上、「ストリンジェントな条件」は、液相ハイブリダイゼーションでは、６ｘＳＳＣ（２０ｘＳＳＣは３．０ＭのＮａＣｌ及び０．３Ｍのクエン酸ナトリウムを含有）、１％ＳＤＳ中、６５℃で８〜１２時間ハイブリダイズさせ、その後、０．２ｘＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中、６５℃で２０分間の洗浄を２回行うという水性ハイブリダイゼーション（すなわち、ホルムアミド不含）として定義される。６５℃におけるハイブリダイゼーションは、ハイブリダイズする配列の長さ及び同一性パーセントなど多数の因子に依存して異なる率で生じることを熟練実施者は容易に理解するであろう。
【００３９】
本発明の核酸（ポリヌクレオチドとも呼ばれる）には、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖の両方、ならびに上記の合成形態及び混合ポリマーが含まれ得る。それらは、当業者に容易に理解されるように、化学的または生化学的に修飾されてよく、また非天然または誘導体化されたヌクレオチド塩基を含有してもよい。そのような修飾には、例えば、標識、メチル化、類似体を用いた１つ以上の天然に生じるヌクレオチドの置換、ヌクレオチド間修飾、例えば、非荷電結合（例えば、メチルホスホナート、ホスホトリエステル、ホスホルアミダート、カルバメート等）、荷電結合（例えば、ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等）、ペンダント部分（例えば、ポリペプチド）、インターカレーター（例えば、アクリジン、プソラレン等）、キレート剤、アルキル化剤、及び修飾結合（例えば、アルファアノマー型核酸等）などが含まれる。また、水素結合及び他の化学的相互作用を介して指定配列に結合する能力においてポリヌクレオチドを模倣する合成分子も含まれる。そのような分子は当該技術分野で公知であり、例えば、分子骨格にあるリン酸結合がペプチド結合で置換されるものなどが含まれる。他の修飾には、例えば、リボース環が架橋部分または他の構造、例えば、「ロックド」核酸に見られる修飾などを含有している類似体が含まれ得る。
【００４０】
「変異した」という用語は、核酸配列に適用する場合、ある核酸配列内のヌクレオチドが参照核酸配列と比較した場合に挿入、欠失または変更されていることを意味する。ある遺伝子座において単一の変更（点変異）を行ってよく、また複数のヌクレオチドについて単一遺伝子座においける挿入、欠失または変更を行ってもよい。さらに、ある核酸配列内で任意の数の遺伝子座において１つ以上の変更を行ってよい。核酸配列は、当該技術分野で公知の任意の方法で変異させてよく、これには、「エラープローンＰＣＲ」（ＰＣＲ産物の全長にわたり高率の点変異が得られるようＤＮＡポリメラーゼの複製忠実度が低い条件下でＰＣＲを実施する方法であり、例えば、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，１：１１−１５（１９８９）及びＣａｌｄｗｅｌｌ  ａｎｄ  Ｊｏｙｃｅ，ＰＣＲ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ａｐｐｌｉｃ．２：２８−３３（１９９２）を参照のこと）、及び「オリゴヌクレオチド指定突然変異」（対象の任意のクローン化ＤＮＡセグメントにおいて部位特異的変異の発生を可能にする方法であり、例えば、Ｒｅｉｄｈａａｒ−Ｏｌｓｏｎ  ａｎｄ  Ｓａｕｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４１：５３−５７（１９８８）を参照のこと）など変異誘発技術が挙げられるが、これに限定されるものではない。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「減弱させる」とは一般に機能的欠失を指し、これには、変異、部分的欠失もしくは完全欠失、挿入、または遺伝子配列、もしくは遺伝子配列の転写を制御する配列に対して行われる他の変更が含まれ、これにより遺伝子産物の産生を低減もしくは阻害するかまたは遺伝子産物を非機能的にする。いくつかの例では、機能的欠失はノックアウト変異として表される。減弱には、核酸配列を変化させること、遺伝子をより活性が低いプロモーターの制御下に置くこと、下方制御させること、対象遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ、リボザイムもしくはアンチセンスの配列を発現させることによるアミノ酸配列の変更、または当該技術分野で公知の他の任意の技術を介したアミノ酸配列の変更も含まれる。一例では、フィードバック阻害または産物でも反応体でもない組成物によって生じる阻害に対する特定酵素の感受性（経路非特異的フィードバック）を低くして、酵素活性が化合物の存在による影響を受けないようにする。他の場合には、活性が低くなるよう変化させた酵素は減弱していると呼ばれ得る。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「欠失」とは、核酸分子から１つ以上のヌクレオチドを、またはタンパク質から１つ以上のアミノ酸を除去し、その両側の領域が互いに連結されていることを指す。
【００４３】
本明細書で使用する場合、用語「ノックアウト」とは、発現または活性のレベルがゼロまで低下させられている遺伝子を指すことが意図される。いくつかの例では、遺伝子は、そのコード配列の一部または全部を欠失させることによりノックアウトされる。他の例では、遺伝子は、１つ以上のヌクレオチドをそのオープンリーディングフレーム内に導入し、それによりナンセンスタンパク質産物の翻訳、そうでない場合は非機能性タンパク質産物の翻訳をもたらすことによりノックアウトされる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「ベクター」とは、それに連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指すことが意図される。ベクターの一種は「プラスミド」であり、これは一般に、環状二本鎖のＤＮＡループで、その中にさらなるＤＮＡセグメントが連結され得るものを指すが、直鎖状二本鎖分子、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による増幅から生じるもの、または環状プラスミドの制限酵素での処理から生じるものなども含まれる。他のベクターには、コスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）及び酵母人工染色体（ＹＡＣ）が含まれる。ベクターのもう一種はウイルスベクターであり、その場合、さらなるＤＮＡセグメントがウイルスゲノム内に連結され得る（下記で詳述）。特定のベクターは、それが導入されている宿主細胞での自己複製能がある（例えば、宿主細胞で機能する複製起点を有するベクター）。他のベクターは、宿主細胞内に導入された際にその宿主細胞のゲノムに組み込まれ得るため、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定の好ましいベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を導くことができる。そのようなベクターを本明細書では「組換え発現ベクター」（または単に「発現ベクター」）と呼ぶ。
【００４５】
「機能的に連結された（Ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」または「機能的に連結された（ｏｐｅｒａｂｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」発現制御配列とは、その発現制御配列が対象遺伝子に隣接して、かかる対象遺伝子を制御する連結、ならびにトランスに作用するかまたは離れて作用して対象遺伝子を制御する発現制御配列を指す。
【００４６】
用語「発現制御配列」とは、それが機能的に連結されたコード配列の発現に影響を与えるために必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、核酸配列の転写、転写後事象及び翻訳を制御する配列である。発現制御配列には、転写開始、転写終結、プロモーター及びエンハンサーの適切な配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシング及びポリアデニル化のシグナルなど；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（例えば、リボソーム結合部位）；タンパク質安定性を高める配列；及び必要に応じ、タンパク質の分泌を高める配列が含まれる。そのような制御配列の性質は宿主生物に応じて異なり、原核生物では、そのような制御配列には一般にプロモーター、リボソーム結合部位、及び転写終結配列が含まれる。用語「制御配列」には、最低でも、発現にその存在が不可欠とされる全構成成分が含まれることが意図され、存在していると都合がよい追加の構成成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列なども含まれ得る。
【００４７】
用語「調節エレメント」とは、核酸分子の転写または翻訳に影響を与える任意の要素を指す。これらには、例として、調節タンパク質（例えば、転写因子）、シャペロン、シグナル伝達タンパク質、ＲＮＡｉ分子、アンチセンスＲＮＡ分子、マイクロＲＮＡ及びＲＮＡアプタマーが含まれるが、これに限定されない。調節エレメントは宿主生物にとって内在性であってよい。調節エレメントは宿主生物にとって外因性であってもよい。調節エレメントは、合成により発生した調節エレメントであってよい。
【００４８】
本明細書で使用する場合、用語「プロモーター」、「プロモーターエレメント」、または「プロモーター配列」とは、対象のヌクレオチド配列に連結させた場合に、その対象ヌクレオチド配列のｍＲＮＡへの転写を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーターは典型的に、必ずその位置というわけではないが、そのプロモーターによってｍＲＮＡへの転写が制御される対象ヌクレオチド配列の５’（すなわち、上流）に位置し、ＲＮＡポリメラーゼ及び転写開始用の他の転写因子が特異的に結合する部位を提供する。プロモーターは宿主生物にとって内在性であってよい。プロモーターは宿主生物にとって外因性であってもよい。プロモーターは、合成により発生した調節エレメントであってよい。
【００４９】
本明細書に記載の組換え遺伝子を発現させるために有用なプロモーターには、構成的プロモーター及び誘導性／抑制性プロモーターの両方が含まれる。本発明の人工的に操作された生物において複数の組換え遺伝子を発現させる場合、かかる異なる遺伝子は、異なるプロモーターによっても、また別々のオペロンにある同一プロモーターによっても制御することができ、また２つ以上の遺伝子の発現を、オペロンの一部としての単一プロモーターにより制御してもよい。
【００５０】
本明細書で使用する場合、用語「組換え宿主細胞」（または単に「宿主細胞」）とは、組換えベクターが導入されている細胞を指すことが意図される。かかる用語により、特定の対象細胞だけではなく、そのような細胞の子孫も指すことが意図されることを理解されるべきである。変異または環境の影響により継代とともに特定の修飾が起こり得るため、そのような子孫は事実、親細胞と同一ではない場合があるが、それでも本明細書で使用する用語「宿主細胞」の範囲内に含まれる。組換え宿主細胞は単離された細胞であっても培養で増殖させた細胞株であってもよく、または生きている組織もしくは生物中に存在している細胞であってもよい。
【００５１】
本明細書で使用する場合、用語「ペプチド」とは、短いポリペプチド、例えば、典型的に約５０アミノ酸長より短い、より典型的には約３０アミノ酸長より短いものを指す。本明細書で使用する用語は、類似体ならびに構造機能を模倣することで生物学的機能を模倣する模倣物を包含する。
【００５２】
用語「ポリペプチド」は、天然に生じるタンパク質と天然に生じないタンパク質の両方、ならびにその断片、変異体、誘導体及び類似体を包含する。ポリペプチドはモノマーでもポリマーでもよい。さらに、ポリペプチドは、各々が１つ以上の別個の活性を有する多数の異なるドメインを含んでよい。
【００５３】
「単離されたタンパク質」または「単離されたポリペプチド」という用語は、その起源または誘導体源という点で、（１）その天然の状態ではそれに付随する天然の会合成分と会合していないタンパク質またはポリペプチド、（２）自然界では見られない純度で存在するタンパク質またはポリペプチドであり、その場合、純度は、他の細胞物質の存在に関して判定可能である（例えば、同一種由来の他のタンパク質を含まない）、（３）異なる種から得た細胞が発現するタンパク質またはポリペプチド、または（４）自然界では生じないタンパク質またはポリペプチド（例えば、自然界に見られるポリペプチドの断片であるか、または自然界では見られないアミノ酸類似体もしくはアミノ酸誘導体または標準ペプチド結合以外の結合が含まれているもの）である。したがって、化学的に合成されたポリペプチド、または天然での起源となる細胞とは異なる細胞系で合成されたポリペプチドは、その天然での会合成分から「単離されている」。ポリペプチドまたはタンパク質は、当該技術分野で周知のタンパク質精製技術を使用して単離することにより、天然での会合成分を実質的に含まないようにしてもよい。このように定義した場合、「単離された」とは、そのように記載されたタンパク質、ポリペプチド、ペプチドまたはオリゴペプチドが必ずしもその天然の環境から物理的に除かれている必要はない。
【００５４】
用語「ポリペプチド断片」とは、完全長ポリペプチドと比較して欠失を有する、例えば、アミノ末端及び／またはカルボキシ末端などの欠失を有するポリペプチドを指す。好ましい実施形態では、ポリペプチド断片は、その断片のアミノ酸配列が天然に生じる配列での対応する位置と同一な連続配列である。断片は典型的に、少なくとも５、６、７、８、９または１０アミノ酸長、好ましくは少なくとも１２、１４、１６または１８アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２０アミノ酸長、より好ましくは少なくとも２５、３０、３５、４０または４５アミノ酸、よりさらに好ましくは少なくとも５０または６０アミノ酸長、よりさらに好ましくは少なくとも７０アミノ酸長である。
【００５５】
あるタンパク質をコードする核酸配列が、第２のタンパク質をコードする核酸配列と類似の配列を有する場合、そのタンパク質は第２のタンパク質に対し「相同性」を有するかまたは「相同」である。あるいは、あるタンパク質が第２のタンパク質に対する相同性を有するのは、その２つのタンパク質が「類似の」アミノ酸配列を有する場合である。（したがって、「相同タンパク質」という用語は、２つのタンパク質が類似のアミノ酸配列を有することを意味すると定義される）。本明細書で使用する場合、２つのアミノ酸配列領域間の相同性（特に、予測される構造類似性に関して）は、機能における類似性を意味すると解釈される。
【００５６】
タンパク質またはペプチドに関して「相同」を使用する場合、同一ではない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なることが多いと認識される。「保存的アミノ酸置換」は、あるアミノ酸残基が、化学的性質（例えば、電荷または疎水性）が類似する側鎖（Ｒ基）を持つ別のアミノ酸残基により置換されているものである。一般に、保存的アミノ酸置換ではタンパク質の機能特性は実質的に変化しない。２つ以上のアミノ酸配列が保存的置換により互いに異なっている場合、配列同一性パーセントまたは相同性の程度を上方修正してその置換の保存的性質について補正してよい。こうした修正を行う手段は当業者に周知である。例えば、Ｐｅａｒｓｏｎ，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４：３０７−３１及び２５：３６５−８９（参照により本明細書に組み込まれる）を参照のこと。
【００５７】
２０種の従来のアミノ酸及びそれらの略語は慣例に従う。参照により本明細書に組み込まれるＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ−Ａ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｇｏｌｕｂ  ａｎｄ  Ｇｒｅｎ  ｅｄｓ．，Ｓｉｎａｕｅｒ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ，Ｓｕｎｄｅｒｌａｎｄ，Ｍａｓｓ．，２ｎｄ  ｅｄ．１９９１）を参照のこと。２０種の従来のアミノ酸の立体異性体（例えば、Ｄ−アミノ酸）、非天然型アミノ酸、例えば、α−，α−二置換アミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸など、及び他の非従来型アミノ酸も本発明のポリペプチドの適切な構成成分であり得る。非従来型アミノ酸の例には、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタミン酸、ε−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルリジン、ε−Ｎ−アセチルリジン、Ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセチルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシリジン、Ｎ−メチルアルギニン、ならびに他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本明細書で使用するポリペプチド表記では、標準的使用及び慣例に従って左側末端はアミノ末端に対応し、右側末端はカルボキシ末端に対応する。
【００５８】
以下の６群はそれぞれ、互いに保存的置換であるアミノ酸を含有する：１）セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；２）アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）；３）アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）；４）アルギニン（Ｒ）、リジン（Ｋ）；５）イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、バリン（Ｖ）、及び６）フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）。
【００５９】
配列同一性パーセントとも呼ばれることがあるポリペプチドの配列相同性は典型的に、シークエンス解析ソフトウェアを使用して測定される。例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｅｎｔｅｒ，９１０  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ａｖｅｎｕｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．５３７０５を参照のこと。タンパク質解析ソフトウェアは、保存的アミノ酸置換を含めて、さまざまな置換、欠失及び他の修飾に対して割り当てられた相同性尺度を使用して類似配列を一致させる。例えば、ＧＣＧには、「Ｇａｐ」及び「Ｂｅｓｔｆｉｔ」などのプログラムが同梱されており、それらをデフォルトのパラメータで使用して、密接に関連するポリペプチド同士、例えば、異なる種の生物に由来する相同ポリペプチド同士などの配列相同性または配列同一性を、または野生型タンパク質とその変異タンパク質の間の配列相同性または配列同一性を決定することができる。例えば、ＧＣＧ  バージョン６．１を参照のこと。
【００６０】
異なる生物由来の配列を多数含むデータベースと特定のポリペプチド配列とを比較する際に有用なアルゴリズムはＢＬＡＳＴというコンピュータプログラム（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０）、Ｇｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔａｔｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔ．３：２６６−２７２（１９９３）、Ｍａｄｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：１３１−１４１（１９９６）、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）、Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，Ｇｅｎｏｍｅ  Ｒｅｓ．７：６４９−６５６（１９９７））、特に、ｂｌａｓｔｐまたはｔｂｌａｓｔｎ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７））である。
【００６１】
ＢＬＡＳＴｐの好ましいパラメータは、期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くコスト：１１（デフォルト）；ギャップを伸長するコスト：１（デフォルト）；最大アラインメント：１００（デフォルト）；文字列サイズ：１１（デフォルト）；表示件数：１００（デフォルト）；ペナルティー行列：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。
【００６２】
ＢＬＡＳＴｐの好ましいパラメータは、期待値：１０（デフォルト）；フィルター：ｓｅｇ（デフォルト）；ギャップを開くコスト：１１（デフォルト）；ギャップを伸長するコスト：１（デフォルト）；最大アラインメント：１００（デフォルト）；文字列サイズ：１１（デフォルト）；表示件数：１００（デフォルト）；ペナルティー行列：ＢＬＯＷＳＵＭ６２である。相同性を比較するポリペプチド配列の長さは一般に、少なくとも約１６アミノ酸残基、通常少なくとも約２０残基、より一般には少なくとも約２４残基、典型的に少なくとも約２８残基、好ましくは約３５残基より多くになる。多数の異なる生物に由来する配列を含むデータベースを検索する場合、アミノ酸配列を比較することが好ましい。アミノ酸配列を使用したデータベース検索は、ｂｌａｓｔｐ以外の当該技術分野で公知のアルゴリズムにより測定することができる。例えば、ポリペプチド配列は、ＧＣＧ  バージョン６．１のプログラムであるＦＡＳＴＡを使用して比較することができる。ＦＡＳＴＡは、問い合わせ配列と検索配列の間で最も重複している領域のアラインメント及び配列同一性パーセントを提供する。Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：６３−９８（１９９０）（参照により本明細書に組み込まれるものとする）。例えば、アミノ酸配列間の配列同一性パーセントは、参照により本明細書に組み込まれるＧＣＧ  バージョン６．１で提供されるＦＡＳＴＡをそのデフォルトのパラメータで使用して決定することができる（文字列サイズは２、またスコア行列はＰＡＭ２５０）。
【００６３】
本明細書全体及び請求項を通して、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という語句、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」もしくは「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述されている整数または整数群が包含されることを意味し、他のいかなる整数または整数群も除外されないことを意味することを理解されるであろう。
【００６４】
例示的な方法及び材料を以下に記載するが、本明細書に記載の方法及び材料と類似または同等のものも本発明を実施する際に使用可能であり、当業者には明らかとなるであろう。本明細書で言及される刊行物及び他の参考文献はいずれも、参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合は、定義も含め、本明細書が優先する。材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定的ではないことが意図される。
【００６５】
概要
本明細書は、例えば、プロテアーゼによる分解を低下させることなどにより、標的細胞で完全長の所望産物の産生を増加させるための組換え株及び組換え株の生産方法を提供する。
【００６６】
いくつかの実施形態では、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓのプロテアーゼ活性を減弱させるため、これらの酵素をコードする遺伝子は活性が低下または消失するよう不活性化または変異導入されている。これは、その遺伝子自体への変異もしくは挿入を介して、または遺伝子の調節エレメントの改変を介して行うことができる。これは、標準の酵母遺伝学技術によって達成可能である。そのような技術の例には二重相同組換えによる遺伝子置換が含まれ、そこでは、不活性化するべき遺伝子に隣接する相同領域をベクターにクローニングし、選択マーカー遺伝子（抗生物質耐性遺伝子または酵母菌株の栄養要求性を相補する遺伝子など）を隣接させる。
【００６７】
別法として、相同領域をＰＣＲで増幅させ、オーバーラップＰＣＲで選択マーカー遺伝子に連結することができる。その後、当該技術分野で公知の方法、例えば、電気穿孔法などによりかかるＤＮＡ断片をＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換する。その後、選択的条件下で増殖させる形質転換体を、標準技術、例えば、ゲノムＤＮＡのＰＣＲまたはサザンブロットなどにより遺伝子破壊事象について解析する。代替的実験では、単一相同組換えにより遺伝子不活性化を達成することができ、その場合、例えば、遺伝子のＯＲＦの５’末端を、やはり選択マーカー遺伝子を含有するプロモーター不含ベクター上にクローニングする。そのようなベクターが、標的遺伝子相同断片でのみベクターを切断する制限酵素を用いた消化によって線状になった時点で、かかるベクターをＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換する。標的遺伝子部位への組み込みは、ゲノムＤＮＡのＰＣＲまたはサザンブロットにより確認される。このようにする方法では、ベクター上にクローニングされた遺伝子断片の複製がゲノム内で達成され、標的遺伝子座の２つのコピー、すなわち、ＯＲＦが不完全なために（発現したとしても）短縮された不活性タンパク質を発現する第１のコピー、及び転写を誘導するプロモーターがない第２のコピーが生じる。
【００６８】
別法として、トランスポゾン変異誘発を使用して標的遺伝子を不活性化する。そのような変異体のライブラリーは、ＰＣＲで標的遺伝子内の挿入イベントについてスクリーニングを行うことができる。
【００６９】
人工操作／ノックアウトを行った株の機能的表現型（すなわち、欠損）は、当該技術分野で公知の技術を使用して評価することができる。例えば、人工操作株のプロテアーゼ活性の欠損は、当該技術分野で公知の多種多様な方法のいずれを使用しても確認することができ、特に、発色プロテアーゼ基質の加水分解活性アッセイ、選択プロテアーゼに対する基質タンパク質のバンドシフトなどがある。
【００７０】
本明細書に記載するプロテアーゼ活性の減弱をノックアウト変異以外の機構によって達成することができる。例えば、核酸配列を変化させること、遺伝子をより活性が低いプロモーターの制御下に置くこと、下方制御させること、対象遺伝子を標的とする干渉ＲＮＡ、リボザイムもしくはアンチセンスの配列を発現させることによるアミノ酸配列の変更、または当該技術分野で公知の他の任意の技術などによるアミノ酸配列の変更によって、所望のプロテアーゼを減弱させることができる。好ましい株では、ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４（ＹＰＳ１−１）及びＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７（ＹＰＳ１−２）（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６６及び６７を含むポリペプチド）にてコードされるプロテアーゼのプロテアーゼ活性は、上記方法のいずれかで減弱される。いくつかの態様では、本発明は、メチロトローフ酵母菌株、特にＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株に関し、ここで、ＹＰＳ１−１遺伝子及びＹＰＳ１−２遺伝子（例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１及びＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２に記載）は不活性化されている。いくつかの実施形態では、遺伝子をコードするさらなるプロテアーゼを本明細書で提供する方法に従ってノックアウトし、菌株により発現される所望のタンパク質産物のプロテアーゼ活性をさらに低下させてもよい。
【００７１】
組換え株の作製
本明細書は、例えば、組換え遺伝子を送達するベクターもしくはノックアウトするベクターを使用するかまたは所望の内在性遺伝子を減弱させる他の方法などで、株を形質転換して活性を低下させる方法を提供する。これらのベクターは、複製起点及び選択マーカー（典型的に抗生物質耐性であるが他の多くの方法が可能）を含有するベクター骨格、または標的細胞の染色体内への組み込みを可能にする線状断片という形態をとり得る。ベクターは、選択した生物及び挿入方法に対応していなければならない。
【００７２】
一旦ベクター要素が選択されたら、多くの異なる方法でベクターの構築を実施することができる。一実施形態では、ＤＮＡ合成サービスを利用しても、全ベクターを個々に作製する方法を使用してもよい。
【００７３】
一旦それぞれのベクターのＤＮＡ（挿入及び操作に必要なさらなる要素を含む）が得られたら、それをアセンブルする必要がある。可能なアセンブリ方法は多数あり、これには、制限酵素クローニング、平滑末端ライゲーション、及びオーバーラップアセンブリ［例えば、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｄ．Ｇ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｕｐ  ｔｏ  ｓｅｖｅｒａｌ  ｈｕｎｄｒｅｄ  ｋｉｌｏｂａｓｅｓ．Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｔｈｏｄｓ，６（５），３４３−３４５（２００９）、及びＧｅｎｅＡｒｔ  Ｋｉｔ（ｈｔｔｐ：／／ｔｏｏｌｓ．ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ．ｃｏｍ／ｃｏｎｔｅｎｔ／ｓｆｓ／ｍａｎｕａｌｓ／ｇｅｎｅａｒｔ＿ｓｅａｍｌｅｓｓ＿ｃｌｏｎｉｎｇ＿ａｎｄ＿ａｓｓｅｍｂｌｙ＿ｍａｎ．ｐｄｆ）を参照のこと］が含まれる（が、これに限定されない）。オーバーラップアセンブリは、要素のすべてが正しい位置に確実にアセンブルされ、いかなる望ましくない配列も導入されない方法を提供する。
【００７４】
上記で作製されたベクターは、標準の分子生物学技術、例えば、分子クローニングなどを使用して標的細胞に挿入することができる。一実施形態では、標的細胞は、所望産物の産生に必要とされる遺伝子をすでに含有するようすでに人工操作されているかまたは選択されているが、これを、以降のベクターの挿入中または挿入後に行ってもよい。
【００７５】
生物及びライブラリー要素の種類（プラスミドまたはゲノムの挿入）に応じて、ＤＮＡを含むベクターを挿入して細胞内に組み込むいくつかの公知の方法を使用してよい。これらには、例えば、局所環境からＤＮＡを取り込んで複製することができる微生物の形質転換、電気穿孔法もしくは化学的手段による形質転換、ウイルスもしくはファージを用いた形質導入、２つ以上の細胞の接合（ｍａｔｉｎｇ）、または異なる細胞からの接合（ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）が含まれ得る。
【００７６】
細菌細胞に組換えＤＮＡを導入するいくつかの方法が当該技術分野で公知であり、それらには、形質転換、形質導入、及び電気穿孔法（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９），Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙを参照のこと）が挙げられるが、これに限定されるものではない。形質転換用の市販のキット及び細菌宿主細胞の非限定的な例としては、ＮｏｖａＢｌｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅｓ（商標）（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，ＮＪ，ＵＳＡ）、Ｍａｘ  Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ（登録商標）ＤＨ５α（商標）、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、Ｏｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓ  Ｅ．ｃｏｌｉ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅコンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。電気穿孔法用の市販のキット及び細菌宿主細胞の非限定的な例としては、Ｚａｐｐｅｒｓ（商標）エレクトロコンピテントセル（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．，ＮＪ，ＵＳＡ）、ＸＬ１−Ｂｌｕｅエレクトロポレーション−コンピテントセル（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）、ＥｌｅｃｔｒｏＭＡＸ（商標）Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ  ＬＢＡ４４０４細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）が挙げられる。
【００７７】
真核細胞に組換え核酸を導入するいくつかの方法が当該技術分野で公知である。例示的な方法としては、トランスフェクション、電気穿孔法、リポソームによる核酸送達、宿主細胞へのマイクロインジェクション（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８９），Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ，Ｎ．Ｙを参照のこと）が挙げられる。真核細胞に組換え核酸をトランスフェクションするための市販のキット及び試薬の非限定的な例としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２０００、Ｏｐｔｉｆｅｃｔ（商標）試薬、リン酸カルシウムトランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐ．，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ＧｅｎｅＪａｍｍｅｒ（登録商標）トランスフェクション試薬、ＬｉｐｏＴＡＸＩ（登録商標）トランスフェクション試薬（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）が挙げられる。別法として、組換え核酸は、バキュロウイルスベクターの使用により昆虫細胞（例えば、ｓｆ９、ｓｆ２１、Ｈｉｇｈ  Ｆｉｖｅ（商標））内に導入され得る。
【００７８】
各クローンを別々に試験できるよう形質転換された細胞を単離する。一実施形態では、これは、形質転換された細胞だけが生き残って再生することを保証する選択薬剤を含有する（または欠いている）培地の１つ以上のプレートで塗抹培養することにより行う。この特定薬剤は、抗生物質（ライブラリーが抗生物質耐性マーカーを含有する場合）、代謝物欠如（栄養要求性の相補用）、または他の選択手段であってよい。細胞は増殖して個々のコロニーとなり、その各々が単一クローンを含有する。
【００７９】
タンパク質、代謝物、もしくは他の産物の所望される産生について、またはプロテアーゼ活性の低下について、コロニーのスクリーニングを行う。一実施形態では、産物の産生量または産生効率が最も高い（または十分に高い）組換え細胞がスクリーニングにより特定される。これには、分解産物の比率の低下または細胞培養物から回収される完全長の所望ポリペプチドの総量増大が含まれる。
【００８０】
このアッセイは、個々のクローンをマルチウェル培養プレートで１ウェルあたり１クローンにして増殖させることにより実施可能である。一旦細胞が適切なバイオマス密度に達した後、それらをメタノールで誘導する。ある時間の経過後、典型的に２４〜７２時間の誘導後、遠心機で高速回転させて細胞をペレット状にし、上清を除去することによって培養物を採取する。それぞれの培養物の上清は、その後、プロテアーゼ活性及び／またはタンパク質分解について試験され得る。
【００８１】
絹の配列
いくつかの実施形態では、本明細書に記載する低プロテアーゼ活性の改変株は組換えにより絹様ポリペプチド配列を発現する。いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチド配列は、１）、絹ポリペプチド配列由来の反復ドメインを混合して一致させることにより生成したブロック共重合体ポリペプチド組成物、及び／または２）、産業用に拡張可能な微生物から分泌させて有用な繊維を形成するのにサイズが十分に大きい（約４０ｋＤａ）ブロック共重合体ポリペプチドの組換え発現である。公開されているクモ糸ポリペプチドのアミノ酸配列のほぼすべてに由来する配列を含め、絹の反復ドメイン断片を人工的に操作した大きい（約４０ｋＤａ〜約１００ｋＤａ）ブロック共重合体ポリペプチドは、本明細書に記載の改変微生物で発現させることができる。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチド配列は、繊維形成能のある、高発現かつ高分泌のポリペプチドを産生するよう一致させ、設計される。いくつかの実施形態では、宿主改変株におけるプロテアーゼ遺伝子のノックアウトまたはプロテアーゼ活性の低下により、絹様ポリペプチドの分解が抑制される。
【００８２】
本明細書では、いくつかの実施形態において、絹ポリペプチド配列空間全体における絹ポリペプチドドメインを網羅的に組み合わせて混合することにより人工操作したブロック共重合体を発現及び分泌させる組成物を提供し、ここで、かかるブロック共重合体は分解が最小限である。本明細書のいくつかの実施形態では、分解が最小限の拡張可能な生物（例えば、酵母、真菌類、及びグラム陽性菌）においてブロック共重合体を分泌させる方法を提供する。いくつかの実施形態では、ブロック共重合体ポリペプチドは、０または１つ以上のＮ末端ドメイン（ＮＴＤ）、１つ以上の反復ドメイン（ＲＥＰ）、及び０または１つ以上のＣ末端ドメイン（ＣＴＤ）を含む。かかる実施形態のいくつかの態様では、ブロック共重合体ポリペプチドは、１００超のアミノ酸の単鎖ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、ブロック共重合体ポリペプチドは、参照によりその全体が組み込まれる国際公開公報第ＷＯ／２０１５／０４２１６４号、”Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｚｉｎｇ  Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｓｉｌｋ  Ｆｉｂｅｒｓ”に開示のブロック共重合体ポリペプチドの配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一なドメインを含む。
【００８３】
数種の天然クモ糸がこれまでに同定されている。自然に出糸されたクモ糸の各種の機械的性質は、そのクモ糸の分子組成と密接な関係があると考えられている。例えば、Ｇａｒｂ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｕｎｔａｎｇｌｉｎｇ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｗｉｔｈ  ｓｐｉｄｒｏｉｎ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｄｏｍａｉｎｓ，ＢＭＣ  Ｅｖｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１０：２４３（２０１０）、Ｂｉｔｔｅｎｃｏｕｒｔ，Ｄ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｆａｍｉｌｉｅｓ，ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ａｎｄ  ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｓｐｅｃｔｓ  ｏｆ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ，Ｇｅｎｅｔ．Ｍｏｌ．Ｒｅｓ．，１１：３（２０１２）、Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ．１６９−１８４（２０１１）、及びＨｕｍｅｎｉｋ，Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ：ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ｔｈｅ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐ  ｏｆ  ａ  ｎａｔｕｒａｌ  ｆｉｂｅｒ，Ｐｒｏｇ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｓｃｉ．，１０３，ｐｇ．１３１−８５（２０１１）を参照のこと。
【００８４】
例示
ブドウ状（ＡｃＳｐ）絹糸は、適度に高い強度と適度に高い伸縮性とが組み合わされた結果、靭性が高い傾向がある。ＡｃＳｐ絹糸は、しばしばポリセリンとＧＰＸのモチーフが組み込まれている大きいブロック（「集合体の反復」）サイズを特徴とする。管状（ＴｕＳｐまたは円筒状）絹糸は、直径が大きく、中程度の強度と高い伸縮性を有する傾向がある。ＴｕＳｐ絹糸は、そのポリセリンとポリスレオニンの含量、及び短いポリアラニン配列を特徴とする。大瓶状（ＭａＳｐ）絹糸は、高い強度と中程度の伸縮性を有する傾向がある。ＭａＳｐ絹糸は、２つのサブタイプであるＭａＳｐ１及びＭａＳｐ２のいずれか一方であり得る。ＭａＳｐ１絹糸は一般にＭａＳｐ２絹糸より低伸縮性であり、ポリアラニン、ＧＸ、及びＧＧＸのモチーフを特徴とする。ＭａＳｐ２絹糸は、ポリアラニン、ＧＧＸ、及びＧＰＸのモチーフを特徴とする。小瓶状（ＭｉＳｐ）絹糸は、中程度の強度と中程度の伸縮性を有する傾向がある。ＭｉＳｐ絹糸は、ＧＧＸ、ＧＡ、及びポリＡのモチーフを特徴とし、しばしば約１００のアミノ酸からなるスペーサーエレメントを含有する。鞭毛状（Ｆｌａｇ）絹糸は、非常に高い伸縮性と中程度の強度を有する傾向がある。Ｆｌａｇ絹糸は通常、ＧＰＧ、ＧＧＸ、及び短いスペーサーのモチーフを特徴とする。
【００８５】
それぞれの絹糸種の性質は種ごとに異なり得、ライフスタイルが異なるクモ（例えば、動き回らずに巣を張る造網性のクモと、徘徊して捕食するクモ）または進化的に古い方のクモは、上記説明とは異なる絹を産生する場合がある（クモの多様性及び分類についての記載は（Ｈｏｒｍｉｇａ，Ｇ．，ａｎｄ  Ｇｒｉｓｗｏｌｄ，Ｃ．Ｅ．，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃｓ，ｐｈｙｌｏｇｅｎｙ，ａｎｄ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｒｂ−ｗｅａｖｉｎｇ  ｓｐｉｄｅｒｓ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｅｎｔｏｍｏｌ．５９，ｐｇ．４８７−５１２（２０１４）、及びＢｌａｃｋｅｄｇｅ，Ｔ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ  ｗｅｂ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｐｉｄｅｒ  ｄｉｖｅｒｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｅｒａ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１０６：１３，ｐｇ．５２２９−５２３４（２００９）を参照のこと）。しかしながら、天然絹タンパク質の反復ドメインに対する配列類似性及び／またはアミノ酸組成類似性を有する合成ブロック共重合体ポリペプチドを使用して、天然絹繊維に対応する性質を再現する一貫した絹様繊維を商業規模で製造することが可能である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、推定絹配列の一覧は、例えば、「ｓｐｉｄｒｏｉｎ」、「ｆｉｂｒｏｉｎ」、「ＭａＳｐ」などの関連用語をＧｅｎＢａｎｋで検索して収集することができ、それらの配列を、別個に取り組んだ配列決定により得たさらなる配列と一緒にプールすることができる。その後、配列をアミノ酸に翻訳して重複エントリーをフィルタリングし、手作業で各ドメイン（ＮＴＤ、ＲＥＰ、ＣＴＤ）に分割する。いくつかの実施形態では、候補アミノ酸配列を、ピキア（コマガテラ）パストリス（Ｐｉｃｈｉａ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）ｐａｓｔｏｒｉｓ）での発現用に最適化されたＤＮＡ配列に逆翻訳する。ＤＮＡ配列をそれぞれ発現ベクターにクローニングし、Ｐｉｃｈｉａ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ）ｐａｓｔｏｒｉｓに形質転換する。いくつかの実施形態では、発現及び分泌の成功を示した各種の絹ドメインはその後、組み合わせ様式でアセンブルされ、繊維形成能のある絹分子が構築される。
【００８７】
絹ポリペプチドは特徴的に、反復ドメイン（ＲＥＰ）に非反復領域（例えば、Ｃ末端ドメイン及びＮ末端ドメイン）が隣接して構成される。一実施形態では、Ｃ末端ドメイン及びＮ末端ドメインのいずれも７５〜３５０アミノ酸長である。反復ドメインは図１に示すように階層構造を示す。反復ドメインは一連のブロック（反復単位とも呼ばれる）を含む。ブロックは、絹の反復ドメイン全体にわたり、ときに完全に、ときに不完全に（準反復ドメインを構成）繰り返される。ブロックの長さ及び組成は、異なる絹の種類間、また異なる種間で変わってくる。表１は、選択した種及び絹種のブロック配列例の一覧であり、さらなる例が、Ｒｉｓｉｎｇ，Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ：ｒｅｃｅｎｔ  ａｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｓ  ａｎｄ  ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．，６８：２，ｐｇ  １６９−１８４（２０１１）、及びＧａｔｅｓｙ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｔｒｅｍｅ  ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ，ａｎｄ  ｃｏｎｖｅｒｇｅｎｃｅ  ｏｆ  ｓｐｉｄｅｒ  ｓｉｌｋ  ｆｉｂｒｏｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２９１：５５１３，ｐｇ．２６０３−２６０５（２００１）に記載されている。場合によっては、ブロックを通常パターンで並べ、絹配列の反復ドメインに複数回（通常２〜８回）出現する、より大きなマクロリピートを形成してよい。反復ドメインまたはマクロリピートの内側で繰り返されるブロックと、反復ドメイン内で繰り返されるマクロリピートとを間隔エレメントで分離してよい。いくつかの実施形態では、ブロック配列はグリシンに富む領域と、それに続くポリＡ領域とを含む。いくつかの実施形態では、短い（約１〜１０）アミノ酸モチーフがブロック内に複数回出現する。本発明の目的上、円順列とは関係なく、異なる天然絹ポリペプチドに由来するブロックを選択することができる（すなわち、同定されたブロックが他の点で絹ポリペプチド間で類似の場合に円順列のため整列しないことがある）。したがって、例えば、ＳＧＡＧＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９４）という「ブロック」は本発明の目的上、ＧＳＧＡＧ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９５）と同じであり、またＧＧＳＧＡ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４９６）と同じであり、それらはいずれも互いに円順列にすぎない。所与の絹配列について選択された特定順列は、他の何よりも利便性により決定され得る（通常、Ｇで開始）。ＮＣＢＩデータベースから得た絹配列は、ブロック及び非反復領域に分割することができる。
【００８８】
（表１）ブロック配列試料
2021503275.tif 000003
2021503275.tif 000004
【００８９】
本発明特定の実施形態による、ブロック及び／またはマクロリピートドメイン由来の繊維形成ブロック共重合体ポリペプチドは、参照により組み込まれる国際公開公報第ＷＯ／２０１５／０４２１６４号に記載されている。ＧｅｎＢａｎｋなどのタンパク質データベースから得た天然絹配列、または新規に行った配列決定により得た天然絹配列はドメイン（Ｎ末端ドメイン、反復ドメイン、及びＣ末端ドメイン）により破壊される。合成後に集合させて繊維を構築するために選択されるＮ末端ドメイン及びＣ末端ドメインの配列には、天然アミノ酸配列情報及び本明細書に記載の他の修飾が含まれる。反復ドメインを反復配列に分解するが、この反復配列は、重要なアミノ酸情報を獲得する代表的ブロック（通常は１〜８で、絹の種類による）を含有する一方で、アミノ酸をコードするＤＮＡの大きさを、容易に合成可能な断片まで縮小する。いくつかの実施形態では、適切に形成されたブロック共重合体ポリペプチドは、少なくとも１つの反復配列を含む少なくとも１つの反復ドメインを含み、任意選択で、Ｎ末端ドメイン及び／またはＣ末端ドメインを隣接させる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、反復ドメインは少なくとも１つの反復配列を含む。いくつかの実施形態では、反復配列は１５０〜３００アミノ酸残基である。いくつかの実施形態では、反復配列は複数のブロックを含む。いくつかの実施形態では、反復配列は複数のマクロリピートを含む。いくつかの実施形態では、ブロックまたはマクロリピートは複数の反復配列全体において分割される。
【００９１】
いくつかの実施形態では、反復配列は、ＤＮＡアセンブリ要件を満たすため、グリシンで開始され、かつ、フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、システイン（Ｃ）、ヒスチジン（Ｈ）、アスパラギン（Ｎ）、メチオニン（Ｍ）、またはアスパラギン酸（Ｄ）で終わることはできない。いくつかの実施形態では、いくつかの反復配列は、天然配列と比べて変化させることができる。いくつかの実施形態では、反復配列は、ポリペプチドのＣ末端へのセリン付加などにより変化させることができる（Ｆ、Ｙ、Ｗ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、Ｍ、またはＤでの終止を回避するため）。いくつかの実施形態では、反復配列は、不完全ブロックに別のブロック由来の相同配列を充てんして改変することができる。いくつかの実施形態では、反復配列は、ブロックまたはマクロリピートの順序を再構成して改変することができる。
【００９２】
いくつかの実施形態では、非反復のＮ末端及びＣ末端のドメインを合成用に選択することができる。いくつかの実施形態では、Ｎ末端ドメインは、リーディングシグナル配列、例えば、ＳｉｇｎａｌＰにより同定されたものなどの除去によるものであり得る（Ｐｅｔｅｒｓｏｎ，Ｔ．Ｎ．，ｅｔ．Ａｌ．，ＳｉｇｎａｌＰ  ４．０：ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｓｉｇｎａｌ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｆｒｏｍ  ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ  ｒｅｇｉｏｎｓ，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，８：１０，ｐｇ．７８５−７８６（２０１１）。
【００９３】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端ドメイン配列、反復配列、またはＣ末端ドメイン配列は、アゲレノプシス・アペルタ（Ａｇｅｌｅｎｏｐｓｉｓ  ａｐｅｒｔａ）、アリアチプス・グロサス（Ａｌｉａｔｙｐｕｓ  ｇｕｌｏｓｕｓ）、アフォノペルマ・シーマニー（Ａｐｈｏｎｏｐｅｌｍａ  ｓｅｅｍａｎｎｉ）、アプトスチチュス種（Ａｐｔｏｓｔｉｃｈｕｓ  ｓｐ．）ＡＳ２１７、アプトスチチュス種ＡＳ２２０、アラネウス・ディアデマツス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｄｉａｄｅｍａｔｕｓ）、アラネウス・ゲムモイデス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｇｅｍｍｏｉｄｅｓ）、アラネウス・ヴェントリコサス（Ａｒａｎｅｕｓ  ｖｅｎｔｒｉｃｏｓｕｓ）、アルギオペ・アモエナ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｍｏｅｎａ）、アルギオペ・アルゲンタタ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ａｒｇｅｎｔａｔａ）、アルギオペ・ブルエンニチ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ）、アルギオペ・トリファスシアタ（Ａｒｇｉｏｐｅ  ｔｒｉｆａｓｃｉａｔａ）、アチポイデス・リヴェルシ（Ａｔｙｐｏｉｄｅｓ  ｒｉｖｅｒｓｉ）、アヴィキュラリア・ジュルエンシス（Ａｖｉｃｕｌａｒｉａ  ｊｕｒｕｅｎｓｉｓ）、ボスリオシルツム・カリフォルニカム（Ｂｏｔｈｒｉｏｃｙｒｔｕｍ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃｕｍ）、デイノピス・スピノサ（Ｄｅｉｎｏｐｉｓ  Ｓｐｉｎｏｓａ）、ディグエチア・カニチエス（Ｄｉｇｕｅｔｉａ  ｃａｎｉｔｉｅｓ）、ドロメデス・テネブロサス（Ｄｏｌｏｍｅｄｅｓ  ｔｅｎｅｂｒｏｓｕｓ）、エウアグルス・キソセウス（Ｅｕａｇｒｕｓ  ｃｈｉｓｏｓｅｕｓ）、エウプロスセノプス・オーストラリス（Ｅｕｐｒｏｓｔｈｅｎｏｐｓ  ａｕｓｔｒａｌｉｓ）、ガステラキャンタ・マンモサ（Ｇａｓｔｅｒａｃａｎｔｈａ  ｍａｍｍｏｓａ）、ヒポキルス・トレルリ（Ｈｙｐｏｃｈｉｌｕｓ  ｔｈｏｒｅｌｌｉ）、ククルカニア・ヒベルナリス（Ｋｕｋｕｌｃａｎｉａ  ｈｉｂｅｒｎａｌｉｓ）、ラトロデクツス・ヘスペルス（Ｌａｔｒｏｄｅｃｔｕｓ  ｈｅｓｐｅｒｕｓ）、メガヘクスラ・フルヴァ（Ｍｅｇａｈｅｘｕｒａ  ｆｕｌｖａ）、メテペイラ・グランディオサ（Ｍｅｔｅｐｅｉｒａ  ｇｒａｎｄｉｏｓａ）、ネフィラ・アンチポディアナ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ａｎｔｉｐｏｄｉａｎａ）、ネフィラ・クラヴァタ（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖａｔａ）、ネフィラ・クラヴィペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｃｌａｖｉｐｅｓ）、ネフィラ・マダガスカリエンシス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｍａｄａｇａｓｃａｒｉｅｎｓｉｓ）、ネフィラ・ピリペス（Ｎｅｐｈｉｌａ  ｐｉｌｉｐｅｓ）、ネフィレンギス・クルエンタタ（Ｎｅｐｈｉｌｅｎｇｙｓ  ｃｒｕｅｎｔａｔａ）、パラウィキシア・ビストリアタ（Ｐａｒａｗｉｘｉａ  ｂｉｓｔｒｉａｔａ）、ペウセチア・ヴィリダンス（Ｐｅｕｃｅｔｉａ  ｖｉｒｉｄａｎｓ）、プレクトレウリス・トリスチス（Ｐｌｅｃｔｒｅｕｒｙｓ  ｔｒｉｓｔｉｓ）、ポエシロセリア・レガリス（Ｐｏｅｃｉｌｏｔｈｅｒｉａ  ｒｅｇａｌｉｓ）、テトラグナタ・カウアイエンシス（Ｔｅｔｒａｇｎａｔｈａ  ｋａｕａｉｅｎｓｉｓ）、またはウロボルス・ディヴェルサス（Ｕｌｏｂｏｒｕｓ  ｄｉｖｅｒｓｕｓ）に由来し得る。
【００９４】
いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、アルファ接合因子ヌクレオチドコード配列に機能的に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、別の内在性または異種の分泌シグナルコード配列に機能的に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、３Ｘ  ＦＬＡＧヌクレオチドコード配列に機能的に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、６〜８のＨｉｓ残基などの他のアフィニティータグに機能的に連結される。
【００９５】
絹様ポリペプチド
いくつかの実施形態では、本明細書に開示するＰ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株は絹様ポリペプチドを発現するよう改変されている。絹様ポリペプチドの好ましい実施形態の製造方法は、参照により本明細書に組み込まれるＷＯ２０１５／０４２１６４で、特に、第１１４段落〜第１３４段落にて提供されている。そこでは、ＭａＳｐ２、例えば、Ａｒｇｉｏｐｅ  ｂｒｕｅｎｎｉｃｈｉ種などに由来する組換えクモ糸タンパク質断片配列に基づく合成タンパク質性共重合体が開示されている。２〜２０の反復単位が含まれた絹様ポリペプチドが記載されており、そこでは、各反復単位の分子量は約２０ｋＤａより大きい。共重合体の各反復単位内部には、多数の「準反復単位」に組織化されている約６０を超えるアミノ酸残基がある。いくつかの実施形態では、本開示に記載するポリペプチドの反復単位は、クモ牽引糸のＭａＳｐ２タンパク質配列に対する配列同一性が少なくとも９５％である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドの各「反復単位」は、２〜２０の「準反復」単位（すなわち、ｎ３は２〜２０である）を含む。準反復は正確な反復である必要はない。各反復は、連鎖状の準反復で構成され得る。方程式１は、本開示及び参照により組み込まれるＷＯ２０１５／０４２１６４に従った反復単位の組成を示す。各絹様ポリペプチドは、方程式１により定義される反復単位を１つ以上有し得る。
｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３。（方程式１）
【００９７】
組成の可変要素Ｘ１（「モチーフ」と呼ばれる）は、以下の方程式２に示すアミノ酸配列のいずれか１つに従い、Ｘ１は各準反復単位内で無作為に変動する。
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱ
（方程式２）
【００９８】
再び方程式１に言及すると、方程式１で「ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ」で表される準反復単位の組成要素は、「第１の領域」と呼ばれる。準反復単位は、一部は、その準反復単位内で第１の領域が４〜８回繰り返されて形成される。すなわち、ｎ１の値は、単一の準反復単位内で繰り返される第１領域単位の数を示し、かかるｎ１の値は４、５、６、７または８のいずれか１つである。「（Ａ）ｎ２」で表される組成要素（すなわち、ポリＡ配列）は「第２の領域」と呼ばれ、それぞれの準反復単位内でアミノ酸配列「Ａ」をｎ２回繰り返すことにより形成される。すなわち、ｎ２の値は、単一準反復単位内で繰り返される第２領域単位の数を示し、かかるｎ２の値は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドの反復単位は、方程式１及び２に記載の準反復を含有する配列に対する配列同一性が少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドの反復単位は、方程式１及び２に記載の準反復を含有する配列に対する配列同一性が少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。
【００９９】
さらなる実施形態では、３つの「長い」準反復には、３つの「短い」準反復単位が続く。短い準反復単位は、ｎ１＝４または５のものである。長い準反復単位は、ｎ１＝６、７または８のものと定義される。いくつかの実施形態では、短い準反復のいずれも、反復単位の各準反復単位内の同じ位置に同じＸ１モチーフを有する。いくつかの実施形態では、６つの準反復単位のうち３つ以下の準反復単位が同じＸ１モチーフを共有する。
【０１００】
さらなる実施形態では、反復単位は、反復単位内部で同じＸ１を続けて３回以上出現させて用いない準反復単位で構成される。さらなる実施形態では、反復単位は準反復単位で構成され、ここで、準反復のうち少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０の準反復は、反復単位の単一準反復単位内で同じＸ１を続けて３回以上用いない。
【０１０１】
したがって、いくつかの実施形態において、本明細書は、低分解性の絹様ポリペプチドを組換えにより発現して、細胞培養物から単離された産物に存在する完全長ポリペプチドの量を増大させる酵母菌株を提供する。いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドを発現する菌株は、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ株であり、ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４ノックアウト及びＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７ノックアウトを含む。
【０１０２】
同等物及び範囲
当業者は、慣用となっている範囲の実験方法を使用して、ここに記載される本発明に従った具体的な実施形態の多くの同等物を認識する、または確認することができるであろう。本発明の範囲は、上記の「発明を実施するための形態」に限定されることを意図しておらず、むしろその範囲は添付の特許請求の範囲に記載されるものである。
【０１０３】
請求項において、「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」などの冠詞は、別段の記載があるかまたは文脈から明らかに他の意味に解釈されない限り、１つまたは２つそれ以上を意味し得る。ある群の１つ以上の構成要素の間に「または」が含まれる請求項または記載は、その群の構成要素のうち１つ、２つ以上、もしくは全部が、所与の産物または工程に存在する、使用されている、もしくは他の点で関連していれば、別段の記載があるかまたは文脈から明らかに他の意味に解釈されない限り、要件を満たすものとみなされる。本発明には、所与の産物または工程に、群の構成要素が正確に１つ存在する、使用されている、もしくは他の点で関連している実施形態が含まれる。本発明には、所与の産物または工程に、群の構成要素の２つ以上または全部が存在する、使用されている、もしくは他の点で関連している実施形態が含まれる。
【０１０４】
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、非限定的で許容されることを意図するが、さらなる要素またはステップを含める必要はないことにも留意する。本明細書で用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」もそのように包含され開示される。
【０１０５】
範囲が与えられている場合は端点が含まれる。さらに、別段の定めがなく、文脈及び当業者の理解により他の意味が明らかでもない限り、範囲として表される値は、文脈で特に明確に指示されない限り、本発明の異なる実施形態における記述範囲内のいかなる特定の値もしくは部分的範囲も、その範囲の下限の１０分の１の単位までとることができることを理解されるべきである。
【０１０６】
すべての引用元、例えば、参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリー、及び本明細書で引用した技術は、たとえ引用中に明示的記述がない場合でも参照により本出願に組み込まれる。引用元の記述と本出願で矛盾がある場合は、本出願の記述が優先するものとする。
【０１０７】
小見出し及び表のタイトルは限定されることを意図しない。
【実施例】
【０１０８】
以下は、本発明を実施するための具体的な実施形態例である。それらの例は、あくまで事例を提供するのみであり、本発明の範囲を何ら限定するものではない。使用する数字（例えば、量、温度など）に関して正確さを保証するべく試みがなされたが、実験上の一部の誤差及び偏差は当然のことながら許容されるべきである。
【０１０９】
本発明の実施には、特に明記しない限り、当技術分野の技術の範囲内であるタンパク質化学、生化学、組換えＤＮＡ技術及び薬理学の従来方法が使用される。そのような技術は文献に十分な記載がある。例えば、Ｔ．Ｅ．Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ（Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９３）、Ａ．Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．，ｃｕｒｒｅｎｔ  ａｄｄｉｔｉｏｎ）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ｓ．Ｃｏｌｏｗｉｃｋ  ａｎｄ  Ｎ．Ｋａｐｌａｎ  ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，１９９０）、Ｃａｒｅｙ  ａｎｄ  Ｓｕｎｄｂｅｒｇ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３ｒｄ  Ｅｄ．（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ）  Ｖｏｌｓ  Ａ  ａｎｄ  Ｂ（１９９２）を参照のこと。
【０１１０】
実施例１：１８Ｂを発現している組換え酵母の作製
最初に、以降の編集及び工学的操作を容易にするため、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓの菌株を形質転換してＫＵ７０機能を抑止した。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（コマガテラ・ファフィ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ））株のＨＩＳ＋誘導体であるＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ１５８５１）を、ゼオシン耐性マーカーに隣接させたホモロジーアームからなる、ＫＵ７０座位を標的にするＤＮＡカセットを用いて電気穿孔した。カセットのマップを図１に示し、配列を表１０に記載する。ゼオシンを添加したＹＰＤ寒天プレートに形質転換体を播種した。この結果、ＫＵ７０機能が抑止された。
【０１１１】
その後、この株を、絹様ポリペプチドをコードする組換え遺伝子を発現するよう改変した。Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（Ｋｏｍａｇａｔａｅｌｌａ  ｐｈａｆｆｉｉ）株のＨＩＳ＋誘導体であるＧＳ１１５（ＮＲＲＬ  Ｙ１５８５１）を、絹様ポリペプチド（「１８Ｂ」）（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６３）の発現及び分泌が生じるよう組換えベクター（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２）を用いて形質転換した。形質転換は、参照により本明細書に組み込まれるＰＭＩＤ１５６７９０８３に記載の電気穿孔法により達成された。
【０１１２】
各ベクターには、組換えベクターにおいて絹様タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列と、それに隣接するプロモーター（ｐＧＣＷ１４）及び終結因子（ｔＡＯＸ１  ｐＡシグナル）とを有する１８Ｂ発現カセットが含まれる。組換えベクターはさらに、細菌及び酵母の形質転換体を選択する優性耐性マーカー、及び細菌の複製起点を含んだ。第１の組換えベクターには、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムのＡＯＸ２座位の３’に隣接するよう１８Ｂポリヌクレオチド配列の組み込みを誘導する指向性領域が含まれた。第１のベクターの耐性マーカーはＧ４１８（別名ジェネティシン）に対する耐性を付与した。第２の組換えベクターには、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓゲノムのＴＥＦ１座位の３’に隣接するよう１８Ｂポリヌクレオチド配列の組み込みを誘導する指向性領域が含まれた。第２のベクターの耐性マーカーはハイグロマイシンＢに対する耐性を付与した。
【０１１３】
実施例２：単一プロテアーゼＫＯ変異体のライブラリーの生成
組換え型Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ株において１８Ｂの形質転換及び分泌に成功した後、プロテアーゼをコードする６５のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を個別に欠失標的とした（表２）。細胞を、ノーセオスリシン耐性マーカーに隣接して約１１５０ｂｐのホモロジーアームを有するＤＮＡカセットを含んだベクターで形質転換した。ノーセオスリシン耐性マーカーを含むプラスミドマップを図２に示し、配列を表１１に記載する。
【０１１４】
それぞれの標的に使用されるホモロジーアームを表７に記載のプライマーで増幅させ、ノーセオスリシン耐性プラスミドに挿入した。ホモロジーアームをノーセオスリシンプラスミドに挿入して、図３Ａ及び図３Ｂに示すように、標的プロテアーゼに対する３’及び５’のホモロジーアームに挟まれたノーセオスリシン耐性マーカーを含むカセットを作製した。図３Ａには、ホモロジーアーム（ＨＡ１及びＨＡ２）に挟まれた耐性カセット（Ｎｏｕｒ耐性カセット）を示す。図３Ｂには、ノーセオスリシンマーカーの詳細を示し、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）（ｐＩＬＶ５）のＩＬＶ５遺伝子由来のプロモーター、ストレプトマイセス・ノウルセイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｎｏｕｒｓｅｉ）（ｎａｔ）由来のノーセオスリシンアセチルトランスフェラーゼ遺伝子、及びＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＣＹＣ１遺伝子由来のポリＡシグナルが含まれている。
【０１１５】
各ベクターのホモロジーアームは、表２に記載の６５の所望プロテアーゼ遺伝子座のうちの１つを標的とした。ノーセオスリシンを添加したＹＰＤ寒天プレートに形質転換体を播種し、３０℃で４８時間インキュベートした。
【０１１６】
（表２）Ｐ．Ｐａｓｔｏｒｉｓ株で欠失標的とされるプロテアーゼ
2021503275.tif 000005
【０１１７】
実施例３：タンパク質低分解性に関する単一プロテアーゼノックアウトクローンの試験。
得られたクローンを９６ウェルブロックの４００μＬの緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）に植菌し、１，０００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーションの後、各培養物の４μＬを使用して９６ウェルブロックの４００μＬのＢＭＧＹに接種し、その後、３０℃で４８時間インキュベートした。組換えタンパク質を抽出するため、細胞培養物にグアニジンチオシアン酸塩を最終濃度が２．５Ｍになるよう加えた。５分のインキュベーションの後、溶液を遠心分離にかけ、上清を採取してウェスタンブロットで解析した。
【０１１８】
各プロテアーゼノックアウトの代表的クローンについてのウェスタンブロットデータを図３に示す。単一プロテアーゼ欠失は、ウェスタンブロットで検出された絹断片の分布に識別可能な影響を示さなかった。
【０１１９】
実施例４：プロテアーゼのダブルノックアウトのライブラリーの生成
個々のＫＯに加え、ペアの異なるさまざまな組み合わせのプロテアーゼをノックアウトした。これらのプロテアーゼは、一部には、互いに対する代償性機能を有し得るパラログであったことから選択された。
【０１２０】
ダブルノックアウトを生じさせるため、実施例２で作製した単一プロテアーゼノックアウト株からノーセオスリシン耐性を消失させ、第２のプロテアーゼは、実施例２に記載の第２のノーセオスリシン耐性カセットでの形質転換により欠失させた。ノーセオスリシンを添加したＹＰＤ寒天プレートに形質転換体を播種し、３０℃で４８時間インキュベートした。試験したダブルプロテアーゼノックアウトを表３に記載する。
【０１２１】
（表３）絹様ポリペプチドを発現しているＰ．ＰａｓｔｏｒｉｓのプロテアーゼダブルＫＯ株
2021503275.tif 000006
【０１２２】
実施例５：タンパク質低分解性に関するダブルプロテアーゼノックアウトクローンの試験
得られたクローンを９６ウェルブロックの４００μＬの緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）に植菌し、１，０００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーションの後、各培養物の４μＬを使用して９６ウェルブロックの４００μＬのＢＭＧＹに接種し、その後、３０℃で４８時間インキュベートした。組換えタンパク質を抽出するため、細胞培養物にグアニジンチオシアン酸塩を最終濃度が２．５Ｍになるよう加えた。５分のインキュベーションの後、溶液を遠心分離にかけ、上清を採取してウェスタンブロットで解析した。
【０１２３】
図４は、異なるプロテアーゼダブルノックアウト株から得た代表的結果を示す。図示されるように、すべての被験単一ノックアウト株ではタンパク質分解が存在していたにもかかわらず、プロテアーゼノックアウトＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４とＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７との組み合わせ（表３の株３）では、分解産物のほぼ完全な消失をもたらした。他のどの組み合わせのプロテアーゼでも分解産物の消失はもたらされなかった。
【０１２４】
実施例６：さらなるプロテアーゼノックアウト株
実施例４及び実施例５に示すように、所望タンパク質の分解を減弱させるため、所望タンパク質（例えば、１８Ｂ）の産生能がある改変Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ細胞をＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４及びＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７でのプロテアーゼが欠失するよう形質転換した。完全長産物の産生が増強し、分解が最小限に抑えられるよう、１つ以上のさらなるプロテアーゼをさらにノックアウトした。
【０１２５】
さらなるノックアウトそれぞれについて、実施例２に記載の所望遺伝子に指向するホモロジーアームを有するノーセオスリシン耐性カセットを用いた形質転換により、さらなるプロテアーゼ遺伝子を単一プロテアーゼＫＯ（１Ｘ  ＫＯ）、ダブルプロテアーゼＫＯ（２Ｘ  ＫＯ）、三重プロテアーゼＫＯ（３Ｘ  ＫＯ）、または四重プロテアーゼＫＯ（４Ｘ  ＫＯ）から欠失させた。各株でノックアウトされたプロテアーゼ遺伝子を表４に示す。
【０１２６】
（表４）２Ｘ〜５ＸのＫＯ株
2021503275.tif 000007
【０１２７】
得られた細胞を選択培地プレート（栄養要求性または抗生物質耐性マーカーによる）で単離し、個々のクローンを以降の試験用に単離した。個々のクローンを産物タンパク質産生条件下、液体培養アッセイにより以下のとおり試験した。すなわち、各株の単離されたコロニーを９６ウェルブロックの４００μＬの緩衝グリセロール複合培地（ＢＭＧＹ）に植菌し、１，０００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で４８時間インキュベートした。４８時間のインキュベーションの後、各培養物の４μＬを使用して９６ウェルブロックの４００μＬのＢＭＧＹまたは４００μＬのＹＰＤ（酵母エキス・ペプトン・デキストロース培地）に接種し、その後、１，０００ｒｐｍで撹拌しながら３０℃で４８時間インキュベートした。
【０１２８】
細胞により発現されたタンパク質を以下のとおり単離して分解について解析した。すなわち、組換えタンパク質を抽出するため、細胞培養物にグアニジンチオシアン酸塩を最終濃度が２．５Ｍになるよう加えた。５分のインキュベーションの後、溶液を遠心分離にかけ、上清を採取してウェスタンブロットで解析した。
【０１２９】
図５は、ＢＭＧＹまたはＹＰＤに植菌した２Ｘ  ＫＯ、３Ｘ  ＫＯ、４Ｘ  ＫＯ及び５Ｘ  ＫＯ株から得た精製タンパク質のウェスタンブロットの結果を示す。図示されるように、ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４＋ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７のプロテアーゼノックアウトを有する株（表３の株３）からさらなるプロテアーゼ遺伝子を欠失させたところ、分解産物のさらなる消失がもたらされた。
【０１３０】
他の実施形態
使用されている語句は限定する語句ではなく説明する語句であり、添付の特許請求の範囲に記載の範囲内で本発明の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく、そのより広い態様において変更を行ってよいことを理解されるべきである。
【０１３１】
本発明は、いくつかの記載実施形態に関してかなり長く、かなり詳細に説明されているが、そのような個々の詳細もしくは実施形態の任意のもの、または特定の実施形態の任意のものに限定されるべきであるということを意図するものではなく、逆に、先行技術に照らして添付の特許請求の範囲の可能な限り最も広い解釈を得るため、そのような特許請求の範囲を基準にして解釈されるべきであり、そのため、本発明の意図される範囲が有効に包含されるべきである。
【０１３２】
本明細書で言及されるすべての刊行物、特許出願、特許及び他の参考文献は参照によりその全体が組み込まれる。矛盾がある場合は、定義も含め、本明細書が優先する。さらに、項目見出し、材料、方法、及び例は例示にすぎず、限定的ではないことが意図される。
【０１３３】
配列表
（表５）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓで欠失標的とされるプロテアーゼのオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列
2021503275.tif 000008
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【０１３４】
（表６）標的プロテアーゼのポリペプチド配列
2021503275.tif 000045
【０１３５】
（表７）プロテアーゼＯＲＦを標的にする５’及び３’の両ホモロジーアーム（ＨＡ）のフォワードプライマー（Ｆ）及びリバースプライマー（Ｒ）
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【０１３６】
（表８）改変配列を増幅させるフォワードプライマー及びリバースプライマー
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【０１３７】
（表９）１８Ｂベクター
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【０１３８】
（表１０）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでのＫＵ７０欠失用ＨＡアームを有するゼオシンカセット
2021503275.tif 000062
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【０１３９】
（表１１）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでのプロテアーゼ欠失用ノーセオスリシンカセット
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【０１４０】
（表１２）Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓでのプロテアーゼ欠失用ＨＡアームを有する例示的ノーセオスリシンカセット
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年6月3日(2020.6.3)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹＰＳ１−１プロテアーゼ及びＹＰＳ１−２プロテアーゼの活性を減弱または消失させてあるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）微生物であって、組換えポリペプチドを発現する、前記微生物。
【請求項２】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼはＹＰＳ１−１遺伝子によりコードされる、請求項１または請求項２に記載の微生物。
【請求項５】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項４に記載の微生物。
【請求項６】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む、請求項４に記載の微生物。
【請求項７】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含む、請求項４に記載の微生物。
【請求項８】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４にある、請求項４に記載の微生物。
【請求項９】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８を含む、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼはＹＰＳ１−２遺伝子によりコードされる、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１２】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含む、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１３】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１４】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含む、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１５】
前記ＹＰＳ１−２遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７にある、請求項１１に記載の微生物。
【請求項１６】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子または前記ＹＰＳ１−２遺伝子またはその両方を変異またはノックアウトさせてある、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１７】
組換えタンパク質を発現する、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１８】
前記組換えタンパク質は、絹タンパク質由来の少なくとも１つのブロックポリペプチド配列を含む、請求項１７に記載の微生物。
【請求項１９】
前記組換えタンパク質は絹様ポリペプチドを含む、請求項１７に記載の微生物。
【請求項２０】
前記絹様ポリペプチドは、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１４）を含み、ここで、
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１５）またはＧＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１６）またはＧＱＧＰＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１７）またはＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１８）またはＳＱであり、
ｎ１は４〜８であり、
ｎ２は６〜２０であり、かつ
ｎ３は２〜２０である、
請求項１９に記載の微生物。
【請求項２１】
前記絹様ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む、請求項１９に記載の微生物。
【請求項２２】
１つ以上のさらなるプロテアーゼの活性を減弱または消失させてある、先行請求項のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項２３】
前記１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＹＰＳ１−５、ＭＣＫ７、またはＹＰＳ１−３を含む、請求項２２に記載の微生物。
【請求項２４】
前記ＹＰＳ１−５遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿０６８８にある、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２５】
前記ＭＣＫ７プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含むＭＣＫ７遺伝子によりコードされる、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２６】
前記ＭＣＫ７遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２７】
前記ＭＣＫ７遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：７を含む、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２８】
前記ＭＣＫ７遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ１−１＿０３７９にある、請求項２３に記載の微生物。
【請求項２９】
前記ＹＰＳ１−３プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含むＹＰＳ１−３遺伝子によりコードされる、請求項２３に記載の微生物。
【請求項３０】
前記ＹＰＳ１−３遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含む、請求項２３に記載の微生物。
【請求項３１】
前記ＹＰＳ１−３遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３を含む、請求項２３に記載の微生物。
【請求項３２】
前記ＹＰＳ１−３遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿０２９９にある、請求項２３に記載の微生物。
【請求項３３】
前記１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１３０からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項２２に記載の微生物。
【請求項３４】
前記１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１３０からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、請求項２２に記載の微生物。
【請求項３５】
前記１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２２に記載の微生物。
【請求項３６】
前記１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３〜６６からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、または５０連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、請求項２２に記載の微生物。
【請求項３７】
前記微生物は、３Ｘ、４Ｘまたは５Ｘのプロテアーゼノックアウトを含む、請求項２２〜３６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項３８】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むＹＰＳ１−１遺伝子とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含むＹＰＳ１−２遺伝子とを変異または欠失させることによって低下させた前記ＹＰＳ１−１及び前記ＹＰＳ１−２の活性を含む、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの改変微生物であって、
さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む組換え発現タンパク質を含む、前記微生物。
【請求項３９】
請求項１〜３８のいずれか１項に記載の微生物を含む、細胞培養物。
【請求項４０】
請求項１７〜３８のいずれか１項に記載の微生物を含む細胞培養物であって、
前記組換え発現タンパク質は、ＹＰＳ１−１及びＹＰＳ１−２の活性を減弱または消失させていない点以外は同一なＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ微生物を含む細胞培養よりも、分解が少ない、前記細胞培養物。
【請求項４１】
請求項１７〜３７のいずれか１項に記載の微生物を、前記組換え発現タンパク質の発現に好適な条件下で、培地で培養すること、及び
前記微生物または前記培地から前記組換えタンパク質を単離すること
を含む、分解が抑制された組換えタンパク質を生産する方法。
【請求項４２】
前記組換えタンパク質は前記微生物から分泌され、かつ、前記組換えタンパク質の単離は、前記分泌された組換えタンパク質を含む培地を回収することを含む、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記組換えタンパク質は、前記ＹＰＳ１−１及び前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼ活性を減弱または消失させてない点以外は同一な微生物により産生された前記組換えタンパク質と比較して、分解レベルが低い、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
組換え発現タンパク質の分解が抑制されるようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法であって、
ＹＰＳ１−１タンパク質及びＹＰＳ１−２タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトまたは変異させることを含む、前記方法。
【請求項４５】
ＹＰＳ１−３タンパク質、ＹＰＳ１−５タンパク質、またはＭＣＫ７タンパク質をコードする１つ以上のさらなる遺伝子をノックアウトまたは変異させることをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８〜１３０からなる群から選択されるポリペプチドを含むタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子をノックアウトさせることをさらに含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４７】
前記組換え発現タンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０連続するアラニン残基を含むポリＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１９）を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記組換え発現タンパク質は絹様ポリペプチドを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記絹様ポリペプチドは、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１４）を含み、ここで、
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１５）またはＧＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１６）またはＧＱＧＰＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１７）またはＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１８）またはＳＱであり、
ｎ１は４〜８であり、
ｎ２は６〜２０であり、かつ
ｎ３は２〜２０である、
請求項４８に記載の方法。
【請求項５０】
前記組換え発現タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む、請求項４４に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００８】
いくつかの実施形態では、微生物は組換えタンパク質を発現する。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は、絹タンパク質由来の少なくとも１つのブロックポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えタンパク質は絹様ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドは、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１４）を含み、ここで、Ｘ１＝ＳＧＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１５）またはＧＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１６）またはＧＱＧＰＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１７）またはＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１８）またはＳＱであり、ｎ１は４〜８であり、ｎ２は６〜２０であり、ｎ３は２〜２０である。いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００２１】
いくつかの実施形態では、組換えにより発現させたタンパク質は、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、または１０連続するアラニン残基を含むポリＡ配列（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１９）を含む。いくつかの実施形態では、組換えにより発現させたタンパク質は絹様ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドは、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１４）を含み、ここで、Ｘ１＝ＳＧＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１５）またはＧＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１６）またはＧＱＧＰＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１７）またはＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１８）またはＳＱであり、ｎ１は４〜８であり、ｎ２は６〜２０であり、ｎ３は２〜２０である。いくつかの実施形態では、組換えにより発現させたタンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む。
[本発明1001]
ＹＰＳ1−1プロテアーゼ及びＹＰＳ1−2プロテアーゼの活性を減弱または消失させてあるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）微生物であって、組換えポリペプチドを発現する、前記微生物。
[本発明1002]
前記ＹＰＳ1−1プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：67と少なくとも95％同一なポリペプチド配列を含む、本発明1001の微生物。
[本発明1003]
前記ＹＰＳ1−1プロテアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：67を含む、本発明1001の微生物。
[本発明1004]
前記ＹＰＳ1−1プロテアーゼはＹＰＳ1−1遺伝子によりコードされる、本発明1001または本発明1002の微生物。
[本発明1005]
前記ＹＰＳ1−1遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1と少なくとも95％同一なポリヌクレオチド配列を含む、本発明1004の微生物。
[本発明1006]
前記ＹＰＳ1−1遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1の少なくとも15、20、25、30、40、または50連続するヌクレオチドを含む、本発明1004の微生物。
[本発明1007]
前記ＹＰＳ1−1遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1を含む、本発明1004の微生物。
[本発明1008]
前記ＹＰＳ1−1遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ4＿0584にある、本発明1004の微生物。
[本発明1009]
前記ＹＰＳ1−2プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：68と少なくとも95％同一なポリペプチド配列を含む、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1010]
前記ＹＰＳ1−2プロテアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：68を含む、本発明1009の微生物。
[本発明1011]
前記ＹＰＳ1−2プロテアーゼはＹＰＳ1−2遺伝子によりコードされる、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1012]
前記ＹＰＳ1−2遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2と少なくとも95％同一なポリヌクレオチド配列を含む、本発明1011の微生物。
[本発明1013]
前記ＹＰＳ1−2遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2の少なくとも15、20、25、30、40、または50連続するヌクレオチドを含む、本発明1011の微生物。
[本発明1014]
前記ＹＰＳ1−2遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2を含む、本発明1011の微生物。
[本発明1015]
前記ＹＰＳ1−2遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ3＿1157にある、本発明1011の微生物。
[本発明1016]
前記ＹＰＳ1−1遺伝子または前記ＹＰＳ1−2遺伝子またはその両方を変異またはノックアウトさせてある、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1017]
組換えタンパク質を発現する、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1018]
前記組換えタンパク質は、絹タンパク質由来の少なくとも1つのブロックポリペプチド配列を含む、本発明1017の微生物。
[本発明1019]
前記組換えタンパク質は絹様ポリペプチドを含む、本発明1017の微生物。
[本発明1020]
前記絹様ポリペプチドは、1つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ1］ｎ1−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ2｝ｎ3を含み、ここで、
Ｘ1＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、
ｎ1は4〜8であり、
ｎ2は6〜20であり、かつ
ｎ3は2〜20である、
本発明1019の微生物。
[本発明1021]
前記絹様ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：462によりコードされるポリペプチド配列を含む、本発明1019の微生物。
[本発明1022]
1つ以上のさらなるプロテアーゼの活性を減弱または消失させてある、先行本発明のいずれかの微生物。
[本発明1023]
前記1つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＹＰＳ1−5、ＭＣＫ7、またはＹＰＳ1−3を含む、本発明1022の微生物。
[本発明1024]
前記ＹＰＳ1−5遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ3＿0688にある、本発明1023の微生物。
[本発明1025]
前記ＭＣＫ7プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：7と少なくとも95％同一なポリヌクレオチド配列を含むＭＣＫ7遺伝子によりコードされる、本発明1023の微生物。
[本発明1026]
前記ＭＣＫ7遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：7の少なくとも15、20、25、30、40、または50連続するヌクレオチドを含む、本発明1023の微生物。
[本発明1027]
前記ＭＣＫ7遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：7を含む、本発明1023の微生物。
[本発明1028]
前記ＭＣＫ7遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ1−1＿0379にある、本発明1023の微生物。
[本発明1029]
前記ＹＰＳ1−3プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3と少なくとも95％同一なポリヌクレオチド配列を含むＹＰＳ1−3遺伝子によりコードされる、本発明1023の微生物。
[本発明1030]
前記ＹＰＳ1−3遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3の少なくとも15、20、25、30、40、または50連続するヌクレオチドを含む、本発明1023の微生物。
[本発明1031]
前記ＹＰＳ1−3遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3を含む、本発明1023の微生物。
[本発明1032]
前記ＹＰＳ1−3遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ3＿0299にある、本発明1023の微生物。
[本発明1033]
前記1つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：68〜130からなる群から選択されるポリペプチド配列と少なくとも95％同一なポリペプチド配列を含む、本発明1022の微生物。
[本発明1034]
前記1つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：68〜130からなる群から選択されるポリペプチド配列を含む、本発明1022の微生物。
[本発明1035]
前記1つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3〜66からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列と少なくとも95％同一なポリヌクレオチド配列によりコードされる、本発明1022の微生物。
[本発明1036]
前記1つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：3〜66からなる群から選択されるポリヌクレオチド配列の少なくとも15、20、25、30、40、または50連続するヌクレオチドを含むポリヌクレオチド配列によりコードされる、本発明1022の微生物。
[本発明1037]
前記微生物は、3Ｘ、4Ｘまたは5Ｘのプロテアーゼノックアウトを含む、本発明1022〜1036のいずれかの微生物。
[本発明1038]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：1を含むＹＰＳ1−1遺伝子とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：2を含むＹＰＳ1−2遺伝子とを変異または欠失させることによって低下させた前記ＹＰＳ1−1及び前記ＹＰＳ1−2の活性を含む、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの改変微生物であって、
さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：462によりコードされるポリペプチド配列を含む組換え発現タンパク質を含む、前記微生物。
[本発明1039]
本発明1001〜1038のいずれかの微生物を含む、細胞培養物。
[本発明1040]
本発明1017〜1038のいずれかの微生物を含む細胞培養物であって、
前記組換え発現タンパク質は、ＹＰＳ1−1及びＹＰＳ1−2の活性を減弱または消失させていない点以外は同一なＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ微生物を含む細胞培養よりも、分解が少ない、前記細胞培養物。
[本発明1041]
本発明1017〜1037のいずれかの微生物を、前記組換え発現タンパク質の発現に好適な条件下で、培地で培養すること、及び
前記微生物または前記培地から前記組換えタンパク質を単離すること
を含む、分解が抑制された組換えタンパク質を生産する方法。
[本発明1042]
前記組換えタンパク質は前記微生物から分泌され、かつ、前記組換えタンパク質の単離は、前記分泌された組換えタンパク質を含む培地を回収することを含む、本発明1041の方法。
[本発明1043]
前記組換えタンパク質は、前記ＹＰＳ1−1及び前記ＹＰＳ1−2プロテアーゼ活性を減弱または消失させてない点以外は同一な微生物により産生された前記組換えタンパク質と比較して、分解レベルが低い、本発明1041の方法。
[本発明1044]
組換え発現タンパク質の分解が抑制されるようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法であって、
ＹＰＳ1−1タンパク質及びＹＰＳ1−2タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトまたは変異させることを含む、前記方法。
[本発明1045]
ＹＰＳ1−3タンパク質、ＹＰＳ1−5タンパク質、またはＭＣＫ7タンパク質をコードする1つ以上のさらなる遺伝子をノックアウトまたは変異させることをさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1046]
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：68〜130からなる群から選択されるポリペプチドを含むタンパク質をコードする1つ以上の遺伝子をノックアウトさせることをさらに含む、本発明1044の方法。
[本発明1047]
前記組換え発現タンパク質は、少なくとも2、3、4、5、6、7、8、9、または10連続するアラニン残基を含むポリＡ配列を含む、本発明1044の方法。
[本発明1048]
前記組換え発現タンパク質は絹様ポリペプチドを含む、本発明1044の方法。
[本発明1049]
前記絹様ポリペプチドは、1つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ1］ｎ1−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ2｝ｎ3を含み、ここで、
Ｘ1＝ＳＧＧＱＱまたはＧＡＧＱＱまたはＧＱＧＰＹまたはＡＧＱＱまたはＳＱであり、
ｎ1は4〜8であり、
ｎ2は6〜20であり、かつ
ｎ3は2〜20である、
本発明1048の方法。
[本発明1050]
前記組換え発現タンパク質は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：462によりコードされるポリペプチド配列を含む、本発明1044の方法。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９４】
いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、アルファ接合因子ヌクレオチドコード配列に機能的に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、別の内在性または異種の分泌シグナルコード配列に機能的に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、３Ｘ  ＦＬＡＧヌクレオチドコード配列に機能的に連結され得る。いくつかの実施形態では、絹ポリペプチドヌクレオチドコード配列は、６〜８のＨｉｓ残基（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５２０）などの他のアフィニティータグに機能的に連結される。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９６】
いくつかの実施形態では、絹様ポリペプチドの各「反復単位」は、２〜２０の「準反復」単位（すなわち、ｎ３は２〜２０である）を含む。準反復は正確な反復である必要はない。各反復は、連鎖状の準反復で構成され得る。方程式１は、本開示及び参照により組み込まれるＷＯ２０１５／０４２１６４に従った反復単位の組成を示す。各絹様ポリペプチドは、方程式１により定義される反復単位を１つ以上有し得る。
｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１４）。（方程式１）
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９７】
組成の可変要素Ｘ１（「モチーフ」と呼ばれる）は、以下の方程式２に示すアミノ酸配列のいずれか１つに従い、Ｘ１は各準反復単位内で無作為に変動する。
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１５）またはＧＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１６）またはＧＱＧＰＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１７）またはＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１８）またはＳＱ
（方程式２）
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
再び方程式１に言及すると、方程式１で「ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５２１）で表される準反復単位の組成要素は、「第１の領域」と呼ばれる。準反復単位は、一部は、その準反復単位内で第１の領域が４〜８回繰り返されて形成される。すなわち、ｎ１の値は、単一の準反復単位内で繰り返される第１領域単位の数を示し、かかるｎ１の値は４、５、６、７または８のいずれか１つである。「（Ａ）ｎ２」（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５２２）で表される組成要素（すなわち、ポリＡ配列）は「第２の領域」と呼ばれ、それぞれの準反復単位内でアミノ酸配列「Ａ」をｎ２回繰り返すこと（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５２２）により形成される。すなわち、ｎ２の値は、単一準反復単位内で繰り返される第２領域単位の数を示し、かかるｎ２の値は、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０のいずれか１つである。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドの反復単位は、方程式１及び２に記載の準反復を含有する配列に対する配列同一性が少なくとも９５％である。いくつかの実施形態では、本開示のポリペプチドの反復単位は、方程式１及び２に記載の準反復を含有する配列に対する配列同一性が少なくとも８０％、または少なくとも９０％、または少なくとも９５％、または少なくとも９９％である。
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021503275000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年10月1日(2020.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＹＰＳ１−１プロテアーゼ及びＹＰＳ１−２プロテアーゼの活性を減弱または消失させてあるピキア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ）微生物であって、組換えポリペプチドを発現する、前記微生物。
【請求項２】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項３】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６７を含む、請求項１に記載の微生物。
【請求項４】
前記ＹＰＳ１−１プロテアーゼはＹＰＳ１−１遺伝子によりコードされ、該ＹＰＳ１−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含むか、または該ＹＰＳ１−１遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、もしくは５０連続するヌクレオチドを含むか、または該ＹＰＳ１−１遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むか、または該ＹＰＳ１−１遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ４＿０５８４にある、請求項１または請求項２に記載の微生物。
【請求項５】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８と少なくとも９５％同一なポリペプチド配列を含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項６】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：６８を含む、請求項５に記載の微生物。
【請求項７】
前記ＹＰＳ１−２プロテアーゼはＹＰＳ１−２遺伝子によりコードされ、該ＹＰＳ１−２遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２と少なくとも９５％同一なポリヌクレオチド配列を含むか、または該ＹＰＳ１−２遺伝子は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２の少なくとも１５、２０、２５、３０、４０、もしくは５０連続するヌクレオチドを含むか、または該ＹＰＳ１−２遺伝子はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含むか、または該ＹＰＳ１−２遺伝子は前記微生物の遺伝子座ＰＡＳ＿ｃｈｒ３＿１１５７にある、請求項１〜６のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項８】
前記ＹＰＳ１−１遺伝子または前記ＹＰＳ１−２遺伝子またはその両方を変異またはノックアウトさせてある、請求項１〜７のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項９】
組換えタンパク質を発現する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１０】
前記組換えタンパク質は、絹タンパク質由来の少なくとも１つのブロックポリペプチド配列を含むか、または前記組換えタンパク質は絹様ポリペプチドを含む、請求項９に記載の微生物。
【請求項１１】
前記絹様ポリペプチドは、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１４）を含み、ここで、
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１５）またはＧＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１６）またはＧＱＧＰＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１７）またはＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１８）またはＳＱであり、
ｎ１は４〜８であり、
ｎ２は６〜２０であり、かつ
ｎ３は２〜２０である、
請求項１０に記載の微生物。
【請求項１２】
前記絹様ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む、請求項１０に記載の微生物。
【請求項１３】
１つ以上のさらなるプロテアーゼの活性を減弱または消失させてある、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の微生物。
【請求項１４】
前記１つ以上のさらなるプロテアーゼは、ＹＰＳ１−５、ＭＣＫ７、またはＹＰＳ１−３を含む、請求項１３に記載の微生物。
【請求項１５】
ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１を含むＹＰＳ１−１遺伝子とＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２を含むＹＰＳ１−２遺伝子とを変異または欠失させることによって低下させた前記ＹＰＳ１−１及び前記ＹＰＳ１−２の活性を含む、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの改変微生物であって、
さらに、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む組換え発現タンパク質を含む、前記微生物。
【請求項１６】
請求項１〜１５のいずれか１項に記載の微生物を含む、細胞培養物。
【請求項１７】
請求項９〜１５のいずれか１項に記載の微生物を、前記組換え発現タンパク質の発現に好適な条件下で、培地で培養すること、及び
前記微生物または前記培地から前記組換えタンパク質を単離すること
を含む、分解が抑制された組換えタンパク質を生産する方法。
【請求項１８】
組換え発現タンパク質の分解が抑制されるようにＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓを改変する方法であって、
ＹＰＳ１−１タンパク質及びＹＰＳ１−２タンパク質をコードする遺伝子をノックアウトまたは変異させることを含む、前記方法。
【請求項１９】
前記組換え発現タンパク質は絹様ポリペプチドを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記絹様ポリペプチドは、１つ以上の反復配列｛ＧＧＹ−［ＧＰＧ−Ｘ１］ｎ１−ＧＰＳ−（Ａ）ｎ２｝ｎ３（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１４）を含み、ここで、
Ｘ１＝ＳＧＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１５）もしくはＧＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１６）もしくはＧＱＧＰＹ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１７）もしくはＡＧＱＱ（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：  ５１８）もしくはＳＱであり、
ｎ１は４〜８であり、
ｎ２は６〜２０であり、かつ
ｎ３は２〜２０である、または
前記絹様ポリペプチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４６２によりコードされるポリペプチド配列を含む、
請求項１９に記載の方法。
【国際調査報告】
2021503275.tif 000080
2021503275.tif 000081
2021503275.tif 000082