(57)【要約】  動物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症を予防するための及び／又は処置するための組成物及び方法が説明されている。【選択図】図１
2021516258.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
動物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症を予防するための及び／又は処置するための組成物であって、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３ＢＰ５株（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５１０）；バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）９１８株（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５０８）及び１５ＡＰ４（ＰＴＡ−６５０７）を単独で含むか又はこれらの株に由来する培養上清と組み合わせて含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給与微生物成分を含む組成物。
【請求項２】
前記組成物は、体重増加の上昇、飼料率の増加、腸バリアの完全性の改善、死亡率の減少、及び糞便中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出の減少からなる群から選択される１種又は複数種の能力上の利点をもたらす、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
前記直接給与微生物は内生胞子の形態である、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項４】
前記組成物は、任意選択的にカプセル化され得る少なくとも１種の酵素をさらに含む、請求項１又は２に記載の組成物。
【請求項５】
前記組成物は、任意選択的にカプセル化され得る少なくとも１種の酵素をさらに含む、請求項３に記載の組成物。
【請求項６】
前記少なくとも１種の酵素は、フィターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、及びベータ−グルカナーゼからなる群から選択される、請求項４に記載の組成物。
【請求項７】
前記組成物は、飼料添加剤組成物又はプレミックスである、請求項１、２、５、又は６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
前記組成物は、飼料添加剤組成物又はプレミックスである、請求項３に記載の組成物。
【請求項９】
前記組成物は、飼料添加剤組成物又はプレミックスである、請求項４に記載の組成物。
【請求項１０】
請求項７に記載の飼料添加剤組成物を含む飼料。
【請求項１１】
請求項８又は９に記載の飼料添加剤組成物を含む飼料。
【請求項１２】
請求項７に記載の飼料添加剤組成物と、投与に関する指示書とを含むキット。
【請求項１３】
請求項８又は９に記載の飼料添加剤組成物と、投与に関する指示書とを含むキット。
【請求項１４】
動物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症を予防する及び／又は処置する方法であって、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３ＢＰ５株（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５１０）；バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）９１８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５０８）及び１５ＡＰ４（ＰＴＡ−６５０７）を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給与微生物成分を含む組成物の有効な量を投与することを含む方法。
【請求項１５】
前記組成物は、体重増加の上昇、飼料率の増加、腸バリアの完全性の改善、死亡率の減少、及び糞便中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出の減少からなる群から選択される１種又は複数種の能力上の利点をもたらす、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記直接給与微生物は内生胞子の形態である、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記組成物は、任意選択的にカプセル化され得る少なくとも１種の酵素をさらに含む、請求項１４又は１５に記載の方法。
【請求項１８】
前記組成物は、任意選択的にカプセル化され得る少なくとも１種の酵素をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記少なくとも１種の酵素は、フィターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、及びベータ−グルカナーゼからなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１種の酵素は、フィターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、及びベータ−グルカナーゼからなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
前記組成物は、飼料添加剤組成物又はプレミックスである、請求項１４、１５、１９、及び２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記組成物は、飼料添加剤組成物又はプレミックスである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記組成物は、飼料添加剤組成物又はプレミックスである、請求項１７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年３月６日に出願された米国仮特許出願第６２／６３９，１５８号明細書に対する優先権を主張し、この開示は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
当技術分野は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症を有する動物の予防及び／又は処置での直接給与微生物の使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、ほとんどの哺乳類及び鳥類の種の腸内のミクロフローラ又は生態系に通常生息するグラム陰性桿菌である。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、体細胞（Ｏ）抗原、莢膜（Ｋ）抗原、線毛（Ｆ）抗原、及び鞭毛（Ｈ）抗原に基づいて、１５０〜２００種の血清型又は血清群に分類される。ほとんどの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は共生生物であり、即ち、腸内に生息しているが宿主生物には害を及ぼさない。株のごく一部が病原性であり、この株が疾患を引き起こす病原性因子を産生する。一部の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、疾患と関連することが知られていない組み合わせで病原性遺伝子を保持しており、潜在的な病原性と見なされ得る。全ての大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、抗菌剤に対する耐性を示す遺伝子を保有し得る。
【０００４】
動物では、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の病原性株が様々な疾患の原因となっており、特に、生まれたばかりの子ウシにおける敗血症及び下痢、乳牛における急性乳腺炎、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）による慢性呼吸器疾患とも関連する大腸菌病であって、家禽において肝周囲炎、心膜炎、敗血症性肺、腹膜炎等が引き起こされる大腸菌病、並びにイヌにおけるアラバマロット（Ａｌａｂａｍａ  ｒｏｔ）の原因となっている。
【０００５】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、糞便を介して動物の身近な環境へと絶えず排出されており、屋内で飼育されている動物の檻、寝わら、及び床、並びに屋外の動物のための土壌を汚染する。この大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は長期間にわたり生き残る可能性があり、場合によっては１０週間を超えて生き残る可能性があり、且つスラリー及び堆肥を介して、施肥された田畑及び作物へと、並びに地下水及び地表水へと広がる可能性がある。
【０００６】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）は、汚染された飼料、取扱者、及び飲料水を介して他の動物へと伝播され、場合によっては、運搬トラック等の車両により農場から農場へと伝播される。感染症は、鳥類の場合には、経口経路により起こるか、又は汚染された粉塵の吸入を介して起こる。動物由来の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）はまた、直接接触により、又は堆肥の散布後の汚染された食物若しくは水の摂取により、又は屠殺場での枝肉の汚染後の肉の摂取により、ヒトに伝播される場合もある。毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）に起因する腸内感染症は、ブタ及び子ウシ等の幼若動物の最も一般的なタイプの大腸菌病であり、典型的には、重度の水様性下痢として現れる。ＥＴＥＣは、発展途上国世界における旅行者（「旅行者下痢」）及び小児の間の下痢の大きな原因でもある。
【０００７】
ブタでのＥＴＥＣは伝染性であることが多く、同一の株が、大量に、及び数匹の病気のブタで、及びバッチからバッチへと見出されている。この株は通常、おそらく免疫の発達に起因して、感染後数日にわたりのみ排出される。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
ヒト及び動物の両方の処置での抗生物質の使用は、現在では健康への大きな世界的脅威となっている抗菌薬耐性を生じさせてきた。健康上のこの世界的な懸念に対処するために、抗生物質の代替薬を開発することが追求されている。そのため、動物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症の予防及び／又は処置のための新規の且つ代替的なアプローチを発見することが必要とされている。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
一実施形態では、動物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症を予防するための及び／又は処置するための組成物であって、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３ＢＰ５株（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５１０）；バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）９１８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５０８）及び１５ＡＰ４（ＰＴＡ−６５０７）を含む直接給与微生物バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含む組成物が開示されている。
【００１０】
第２の実施形態では、本明細書で開示されている組成物は、動物中において１種又は複数種の能力上の利点をもたらし得、この能力上の利点は、体重増加の上昇、飼料率の増加、腸バリアの完全性の改善、死亡率の減少、及び糞便中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出の減少からなる群から選択される。
【００１１】
第３の実施形態では、直接給与微生物は内生胞子の形態である。
【００１２】
第４の実施形態では、本明細書で説明されている組成物の内のいずれかは、任意選択的にカプセル化され得る少なくとも１種の酵素をさらに含む。
【００１３】
第５の実施形態では、少なくとも１種の酵素は、フィターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、及びベータ−グルカナーゼからなる群から選択される。
【００１４】
第６の実施形態では、本明細書で説明されている組成物の内のいずれかは、飼料添加剤組成物又はプレミックスであり得る。
【００１５】
第７の実施形態では、本明細書で開示されている飼料添加剤組成物の内のいずれかを含む飼料が開示されている。
【００１６】
第８の実施形態では、本明細書で開示されている飼料添加剤組成物の内のいずれかと、投与に関する指示書とを含むキットが開示されている。
【００１７】
第９の実施形態では、動物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症を予防する及び／又は処置する方法であって、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３ＢＰ５株（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５１０）；バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）９１８（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５０８）及び１５ＡＰ４（ＰＴＡ−６５０７）を含む直接給与微生物を含む組成物の有効な量を投与することを含む方法が開示される。そのように投与される組成物は、動物中において１種又は複数種の能力上の利点をもたらし得、この能力上の利点は、体重増加の上昇、飼料率の増加、腸バリアの完全性の改善、死亡率の減少、及び糞便中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出の減少からなる群から選択される。この組成物は、本開示の上記で又は他の箇所で説明されている特徴の内のいずれかを包含し得る。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】腸の健康状態の指標としてのタイトジャンクションタンパク質の発現への常用飼料処置の効果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
引用されている全ての特許、特許出願、及び刊行物は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２０】
本開示では、多くの用語及び略語が使用されている。特に断らない限り、下記の定義が適用される。
【００２１】
１つの要素又は成分に先行する「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」という冠詞は、その要素又は成分の事例（即ち出現）の数に関して非制限的であることが意図されている。従って、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、１つ又は少なくとも１つを含むと読まれるべきであり、要素又は成分の単数語形は、その数が明らかに単数であることを意味しない限り、複数形も含む。
【００２２】
「含む」という用語は、特許請求の範囲で言及されている特徴、整数、工程、又は成分の存在を意味するが、１つ又は複数の他の特徴、整数、工程、成分、又はそれらの群の存在又は追加を排除するものではない。「含む」という用語は、「から本質的になる」及び「からなる」という用語により包含される実施形態を含むことが意図されている。同様に、「から本質的になる」という用語は、「からなる」という用語により包含される実施形態を含むことが意図されている。
【００２３】
存在する場合には、全ての範囲は包括的であり、且つ結合可能である。例えば、「１〜５」の範囲が列挙されている場合には、この列挙された範囲は、範囲「１〜４」、「１〜３」、「１〜２」、「１〜２及び４〜５」、並びに「１〜３及び５」等を含むと解釈すべきである。
【００２４】
数値と関連して本明細書で使用される場合、「約」という用語は、文脈中でこの用語が別途具体的に定義されていない限り、数値の±０．５の範囲を指す。例えば、「約６のｐＨ値」という語句は、このｐＨ値が別途具体的に定義されていない限り、５．５〜６．５のｐＨ値を指す。
【００２５】
本明細書全体を通して与えられる全ての数値の上限が、全てのより低い数値の限界を、あたかもそのようなより低い数値の限界が本明細書で明示されていたかのように含むことが意図されている。本明細書全体を通して与えられる全ての数値の下限は、全てのより高い数値の限界を、あたかもそのようなより高い数値の限界が本明細書で明示されていたかのように含むであろう。本明細書全体を通して与えられる全ての数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入る全てのより狭い数値範囲を、あたかもそのようなより狭い数値範囲が本明細書で全て明示されていたかのように含むであろう。
【００２６】
「動物」及び「対象」という用語は、本明細書において互換的に使用される。動物は、全ての非反芻動物（例えばヒト）及び反芻動物を含む。特定の実施形態では、動物は、ウマ及び単胃動物等の非反芻動物である。単胃動物の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：子ブタ、成長期ブタ、雌ブタ等のブタ（ｐｉｇ）及びブタ（ｓｗｉｎｅ）；七面鳥、アヒル、ニワトリ、ブロイラー鶏、産卵鶏等の家禽；サケ、マス、ティラピア、ナマズ、及びコイ等の魚；並びにエビ及びクルマエビ等の甲殻類。さらなる実施形態では、動物は、反芻動物（例えば、限定されないが、ウシ、若ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、バイソン、ムース、エルク、ヤク、水牛、シカ、ラクダ、アルパカ、ラマ、アンテロープ、プロングホーン、及びニルガイ）等の複胃（ｍｕｌｔｉｇａｓｔｒｉｃ）であり得る。
【００２７】
「反芻動物」という用語は、本明細書で使用される場合、主に微生物の作用により、消化の前に特殊な胃で植物ベースの食物を醗酵させることにより、この食物から栄養素を獲得し得る哺乳動物を指す。このプロセスは、典型的には、醗酵した摂取物（食い戻しとして知られている）を逆流させ、次いで再び咀嚼することを必要とする。植物物質をさらに分解して消化を刺激するために食い戻しを再び咀嚼するプロセスは、反芻と呼ばれている。約１５０種の反芻動物には、家畜種及び野生種の両方が含まれる。反芻動物として、ウシ、雌ウシ、ヤギ、ヒツジ、キリン、ヤク、シカ、エルク、アンテロープ、及びバッファロー等が挙げられるが、これらに限定されない。
【００２８】
「ＣＦＵ」という用語は、本明細書で使用される場合、「コロニー形成単位」を意味しており、単一の前駆細胞に由来する細胞の凝集体をコロニーが表す生存細胞の尺度である。
【００２９】
「直接給与微生物」（「ＤＦＭ」）という用語とは、本明細書で使用される場合、天然に存在する生きた（生存可能な）微生物の供給源のことである。ＤＦＭは、そのような天然に存在する微生物（例えば細菌株）の内の１種又は複数種を含み得る。ＤＦＭのカテゴリーには、胞子形成細菌（例えば、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）及びクロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ））、並びに非胞子形成細菌（例えば、乳酸菌、酵母、及び真菌）が含まれる。そのため、ＤＦＭという用語は、下記の内の１つ又は複数を包含する：直接給与細菌、直接給与酵母、直接給与酵母又は真菌、及びこれらの組み合わせ。
【００３０】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）は、胞子を形成するユニークなグラム陽性桿菌である。この胞子は非常に安定しており、熱、湿度、及びｐＨ範囲等の環境条件に耐え得る。この胞子は、動物により摂取されると活性な栄養細胞へと発芽し、食物及びペレット化飼料で使用され得る。
【００３１】
「バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分」という用語は、本明細書で使用される場合、（ｉ）本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）細菌株を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給与微生物、（ｉｉ）この株から作られたバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物から得られた上清、又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせを指す。
【００３２】
「飼料」及び「食物」は、非ヒト動物及びヒトによりそれぞれ食べられ、摂取され、消化されることが意図されているか又はそうされることに適した、あらゆる天然若しくは人工の常用飼料、若しくは食物等、又はそのような食物の成分をそれぞれ意味する。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「食物」という用語は広義で使用され、ヒト用の食物及び食品、並びに非ヒト動物用の食物（即ち飼料）を包含する。
【００３４】
「飼料」という用語は、家畜の飼育において動物に給与される製品に関して使用される。「飼料」及び「動物飼料」という用語は、互換的に使用される。好ましい実施形態では、食物又は飼料は、単胃動物及び複胃動物による消費用である。
【００３５】
「プロバイオティクス」という用語は、本明細書で使用される場合、生きた微生物（例えば、細菌又は酵母を含む）であって、例えば、十分な数で摂取されたか又は局所的に適用された場合に、宿主生物に有益な影響を及ぼす（即ち、この宿主生物に１種又は複数種の明らかな健康上の利益を付与することによる）微生物と定義される。プロバイオティクスは、１つ又は複数の粘膜表面での微生物バランスを改善し得る。例えば、この粘膜表面は、腸、尿路、気道、又は皮膚であり得る。「プロバイオティクス」という用語にはまた、本明細書で使用される場合、免疫系の有益な分岐を刺激し得、同時に粘膜表面（例えば腸）での炎症反応を減少させ得る生きた微生物も包含される。プロバイオティクス摂取に関しては下限も上限も存在しないが、１日用量として、少なくとも１０６〜１０１２、好ましくは少なくとも１０６〜１０１０、好ましくは１０８〜１０９ｃｆｕが、対象において有益な健康効果を得るのに有効であることが示唆されている。
【００３６】
「プレバイオティクス」という用語は、１種又は限られた数の有益な細菌の増殖及び／又は活性を選択的に刺激することにより、宿主に有益な影響を及ぼす非消化性食物成分を意味する。
【００３７】
「病原体」という用語は、本明細書で使用される場合、疾患のあらゆる原因物質を意味する。そのような原因物質として、細菌性原因物質、ウイルス性原因物質、及び真菌性原因物質等が挙げられ得るが、これらに限定されない。
【００３８】
「大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症」という用語は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）により引き起こされる下痢等の疾患又は感染症を意味する。
【００３９】
「に由来する」及び「から得られる」という用語は、問題の生物の株により産生されるか又は産生可能なタンパク質だけではなく、そのような株から単離されたＤＮＡ配列によりコードされ且つそのようなＤＮＡ配列を含む宿主生物中で産生されるタンパク質も指す。加えて、この用語は、合成及び／又はｃＤＮＡ起源のＤＮＡ配列によりコードされ且つ問題のタンパク質の識別可能な特徴を有するタンパク質を指す。
【００４０】
「有効な量」という用語は、動物に投与される特定の成分の、所望の効果を達成するのに十分な量を意味する。
【００４１】
一実施形態では、動物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症を予防するための及び／又は処置するための組成物であって、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３ＢＰ５株（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５１０）；バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）９１８株（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５０８）及び１５ＡＰ４株（ＰＴＡ−６５０７）を含む直接給与微生物バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含む組成物が開示されている。
【００４２】
第２の実施形態では、本明細書で開示されている組成物は、動物における１種又は複数種の能力上の利点をもたらし得、この能力上の利点は、体重増加の上昇、飼料率の増加、腸バリアの完全性の改善、及び糞便中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出の減少からなる群から選択される。
【００４３】
本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースのＤＦＭ成分は、生菌を含んでもよいし、上清を含んでもよいし、生菌及び培養上清の組み合わせであってもよい。好ましいバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースのＤＦＭ成分は、生菌である。
【００４４】
一実施形態では、このＤＦＭは胞子形成細菌株であってもよく、従って、ＤＦＭという用語は、胞子（例えば細菌胞子）で構成されてもよいし、この胞子を含んでもよい。そのため、「生菌」という用語は、本明細書で使用される場合、細菌胞子（例えば内生胞子又は分生子）を含み得る。或いは、本明細書で説明されている飼料添加剤組成物中のＤＦＭは、細菌胞子（例えば内生胞子又は分生子）で構成されていなくてもよいし、この微生物胞子を含まなくてもよい。
【００４５】
本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースのＤＦＭ成分は、下記の株の組み合わせである：
バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３ＢＰ５株  アクセッション番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５１０、
バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｆａｃｉｅｎｓ）９１８株  ＡＴＣＣアクセッション番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５０８、及び
バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｆａｃｉｅｎｓ）１０１３株  ＡＴＣＣアクセッション番号ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５０９。
【００４６】
３ＢＰ５株及び１０１３株は、２０１３年２月２８日公開された国際公開第２０１３−３２９０１３号パンフレットで説明されている。
【００４７】
１５ＡＰ４株は、２００５年１１月１７日に公開された米国特許出願公開第２００５−０２５５０９２号明細書で説明されている。
【００４８】
一部の実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースのＤＦＭ成分が熱耐性（ｈｅａｔ  ｔｏｌｅｒａｎｔ）であることが重要であり、即ち、胞子形成等の熱耐性（ｔｈｅｒｍｏｔｏｌｅｒａｎｔ）であることが重要である。このことは、飼料がペレット化される場合に特に当てはまる。桿菌（Ｂａｃｉｌｌｉ）は、増殖条件が不都合である場合に、安定した内生胞子を形成し得、熱、ｐＨ、湿度、及び殺菌剤に対して非常に耐性を示す。細菌／ＤＦＭが胞子形成体でない場合には、下記で説明するように、飼料加工に耐えるように保護されるべきである。
【００４９】
本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、培養物及び担体（使用される場合）として調製されてもよく、リボン又はパドルミキサーに入れられて約１５分にわたり混合され得るが、この時間を、増加させ得るか又は減少させ得る。この成分を、培養物と担体との均一な混合物が得られるようにブレンドする。最終製品は、好ましくは乾燥した流動性粉末である。従って、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、ａ：本明細書で説明されている３種のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌株、又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）培養物から得られる上清、又は１種若しくは複数種のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の細菌株と上清との両方の組み合わせを含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給与微生物を含み得る。次いで、そのようなバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を、動物飼料又は飼料プレミックスに添加し得る。このバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を、動物飼料の上に添加し得る（「トップ給与」）か、又は動物の飲料水等の液体に添加し得る。
【００５０】
本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースのＤＦＭでの個々の株の包含は、１％〜９９％で変動する割合であり得、好ましくは２５％〜７５％で変動する割合であり得る。
【００５１】
本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分の、動物飼料中における好適な投与量は、約１×１０３ＣＦＵ／ｇ飼料〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇ飼料の範囲であり得、好適には約１×１０４ＣＦＵ／ｇ飼料〜約１×１０８ＣＦＵ／ｇ飼料の範囲であり得、好適には約７．５×１０４ＣＦＵ／ｇ飼料〜約１×１０７ＣＦＵ／ｇ飼料の範囲であり得る。
【００５２】
当業者であれば、食品及び／又は農業産業で使用され且つ一般に動物による消費に適していると考えられる、本明細書で説明されている属内の微生物の特定の種及び／又は株に容易に気付くであろう。動物飼料は、家禽、ブタ、反芻動物、水産養殖、及びペットのための、トウモロコシ、コムギ、ソルガム、ダイズ、キャノーラ、ヒマワリ等の植物材料、又はこれらの植物材料若しくは植物タンパク質源の内のいずれかの混合物を含んでもよい。
【００５３】
「動物飼料」、「飼料（ｆｅｅｄ）」、及び「飼料（ｆｅｅｄｓｔｕｆｆ）」という用語は互換的に使用され、下記を含む群から選択される１種又は複数種の飼料材料を含み得る：ａ）穀類、例えば、小粒穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、及びこれらの組み合わせ）、並びに／又は大粒穀物（例えば、トウモロコシ若しくはソルガム）；ｂ）穀類の副産物、例えば、トウモロコシグルテンミール、可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（Ｄｉｓｔｉｌｌｅｒｓ  Ｄｒｉｅｄ  Ｇｒａｉｎｓ  ｗｉｔｈ  Ｓｏｌｕｂｌｅｓ）（ＤＤＧＳ）（特に、トウモロコシベースの可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（ｃＤＤＧＳ）、コムギふすま、コムギミドリング粉、コムギショーツ、コメふすま、もみ殻、カラスムギ殻、パーム核、及びシトラスパルプ；ｃ）ダイズ、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピン、エンドウ豆、ソラマメ、ワタ、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉及び骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエイ、コプラ、ゴマ等の供給源から得られるタンパク質；ｄ）植物源及び動物源から得られる油脂；並びに／又はｅ）ミネラル及びビタミン。
【００５４】
機能性飼料等の飼料として使用されるか又はこの飼料の調製で使用される場合には、本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、下記の内の１つ又は複数と併用されてもよい：栄養学的に許容される担体、栄養学的に許容される希釈剤、栄養学的に許容される添加剤、栄養学的に許容されるアジュバント、栄養学的有効成分。例えば、タンパク質、ペプチド、スクロース、ラクトース、ソルビトール、グリセロール、プロピレングリコール、塩化ナトリウム、硫酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、ギ酸ナトリウム、ソルビン酸ナトリウム、塩化カリウム、硫酸カリウム、酢酸カリウム、クエン酸カリウム、ギ酸カリウム、酢酸カリウム、ソルビン酸カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、酢酸マグネシウム、クエン酸マグネシウム、ギ酸マグネシウム、ソルビン酸マグネシウム、メタ重亜硫酸ナトリウム、メチルパラベン、及びプロピルパラベンからなる群から選択される少なくとも１種の成分が挙げられ得る。
【００５５】
好ましい実施形態では、本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を飼料成分と混合して、飼料を形成し得る。「飼料成分」という用語は、本明細書で使用される場合、飼料の全て又は一部を意味する。飼料の一部は、飼料の１種の成分を意味し得るか、又は飼料の複数種の成分（例えば、２種、若しくは３種、若しくは４種、若しくはより多く）を意味し得る。一実施形態では、「飼料成分」という用語は、プレミックス又はプレミックス成分を包含する。好ましくは、飼料は、飼い葉又はそのプレミックス、配合飼料又はそのプレミックスであり得る。本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含む飼料添加剤組成物は、配合飼料と混合されてもよいし、配合飼料のプレミックスと混合されてもよいし、飼い葉と混合されてもよいし、飼い葉成分と混合されてもよいし、飼い葉のプレミックスと混合されてもよい。
【００５６】
飼い葉という用語は、本明細書で使用される場合、（動物自身が探さなければならない食物ではなく）動物に与えられるあらゆる食物を意味する。飼い葉は、切断されている植物を包含する。
【００５７】
飼い葉という用語には、干し草、わら、サイレージ、圧縮飼料及びペレット化飼料、油及び混合飼料が含まれ、発芽した穀物及びマメ科植物も含まれる。
【００５８】
飼い葉を、下記から選択される植物の内の１つ又は複数から得ることができる：アルファルファ（ルーサン）、オオムギ、ミヤコグサ、アブラナ、キャベツ（Ｃｈａｕ  ｍｏｅｌｌｉｅｒ）、ケール、ナタネ（カノーラ）、ルタバガ（スウェーデンカブ）、チューリップ、クローバー、アルサイククローバー、レッドクローバー、地下クローバー、シロツメクサ、イネ科草本、偽エンバク（ｆａｌｓｅ  ｏａｔ  ｇｒａｓｓ）、ウシノケグサ、ギョウギシバ、スズメノチャヒキ、ヒースグラス（ｈｅａｔｈ  ｇｒａｓｓ）、牧草（自然と混ざった牧草地、草地に由来する、カモガヤ、ドクムギ、チモシー牧草、トウモロコシ（ｃｏｒｎ）（トウモロコシ（ｍａｉｚｅ））、キビ、カラスムギ、ソルガム、ダイズ、樹木（まぐさ（ｔｒｅｅ−ｈａｙ）用に刈り込まれた樹木の若枝）、コムギ、及びマメ類。
【００５９】
「配合飼料」という用語は、ミール、ペレット、ナッツ、ケーキ、又は粉砕物の形態の市販の飼料を意味する。配合飼料は、様々な原材料及び添加剤からブレンドされ得る。このブレンド物は、標的動物の特定の要件に従って配合される。
【００６０】
配合飼料は、１日に必要な栄養素の全てを提供する完全飼料であり得るか、飼料の一部（タンパク質、エネルギー）を提供する濃縮物であり得るか、又はミネラル及びビタミン等の追加の微量栄養素のみを提供するサプリメントであり得る。
【００６１】
配合飼料で使用される主成分は飼料用穀物であり、この飼料用穀物として、トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、カラスムギ、及びオオムギが挙げられる。
【００６２】
好適には、本明細書で言及されているプレミックスは、微量成分（例えば、ビタミン、ミネラル、化学保存料、抗生物質、発酵生成物、及び他の必須成分）から構成される組成物であり得る。プレミックスは、通常、市販の飼料にブレンドするのに適した組成物である。
【００６３】
本明細書で説明されている任意の飼料は、下記を含む群から選択される１種又は複数種の飼料材料を含み得る：ａ）穀類、例えば、小粒穀物（例えば、コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、及びこれらの組み合わせ）、並びに／又は大粒穀物（例えば、トウモロコシ、ソルガム）；ｂ）穀類の副産物、例えば、トウモロコシグルテンミール、可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（ＤＤＧＳ）、コムギふすま、コムギミドリング粉、コムギショーツ、コメふすま、もみ殻、カラスムギ殻、パーム核、及びシトラスパルプ；ｃ）ダイズ、ヒマワリ、ピーナッツ、ルピン、エンドウ豆、ソラマメ、ワタ、キャノーラ、魚粉、乾燥血漿タンパク質、肉及び骨粉、ジャガイモタンパク質、ホエイ、コプラ、ゴマ等の供給源から得られるタンパク質；ｄ）植物源及び動物源から得られる油脂；ｅ）ミネラル及びビタミン。
【００６４】
さらに、そのような飼料は、少なくとも３０重量％、少なくとも４０重量％、少なくとも５０重量％、又は少なくとも６０重量％の、トウモロコシ及びダイズミール、又はトウモロコシ及び全脂肪ダイズ、又はコムギミール若しくはヒマワリミールを含んでもよい。
【００６５】
加えて、又は代替として、飼料は、高繊維飼料を提供するために、少なくとも１種の高繊維飼料材料及び／又は少なくとも１種の高繊維飼料材料の少なくとも１種の副産物を含んでもよい。高繊維飼料材料の例として、下記が挙げられる：コムギ、オオムギ、ライムギ、カラスムギ、穀類からの副産物、例えばトウモロコシグルテンミール、可溶物添加蒸留粕乾燥穀類（ＤＤＧＳ）、コムギふすま、コムギミドリング粉、コムギショーツ、コメふすま、もみ殻、カラスムギ殻、パーム核、及びシトラスパルプ。下記の一部のタンパク質源も高線維と見なされ得る：ヒマワリ、ルピン、ソラマメ、及びワタ等の供給源から得られるタンパク質。
【００６６】
本明細書で説明されているように、飼料は、下記の内の１つ又は複数であり得る：配合飼料及びプレミックス、例えば、ペレット、ナッツ、又は（ウシ）ケーキ；作物又は作物残渣：トウモロコシ、ダイズ、ソルガム、カラスムギ、オオムギ、トウモロコシの茎葉、コプラ、わら、もみ殻、サトウダイコンの屑；魚粉；切断されたばかりの牧草及び他の飼料植物；肉及び骨粉；糖蜜；油粕（ｏｉｌ  ｃａｋｅ）及び油粕（ｐｒｅｓｓ  ｃａｋｅ）；オリゴ糖；保存された飼料植物：干し草及びサイレージ；海藻；種子及び穀物（全体、又は粉砕、摩砕等により調製されたもの）；発芽した穀物及びマメ科植物；酵母抽出物。
【００６７】
飼料という用語はまた、本明細書で使用される場合、一部の実施形態ではペットフードも包含する。ペットフードは、ドッグフード又はキャットフード等の、ペットによる消費が意図された植物性材料又は動物性材料である。ドッグフード及びキャットフード等のペットフードは、イヌ用のキブル等の乾燥形態であってもよいし、湿式缶詰形態であってもよい。キャットフードは、アミノ酸であるタウリンを含んでもよい。
【００６８】
飼料という用語はまた、一部の実施形態では魚用の餌も包含し得る。魚用の餌は、通常、捕獲された魚を良好な健康状態に保つのに必要な多量栄養素、微量元素、及びビタミンを含む。魚用の餌は、フレーク、ペレット、又はタブレットの形態であり得る。ペレット化形態（この一部は急速に沈む）は、大型の魚又は底生種に使用されることが多い。一部の魚用の餌はまた、観賞魚の発色を人工的に増強するために、ベータカロテン又は性ホルモン等の添加剤も含む。
【００６９】
同様に、「飼料」という用語に包含されるのは、鳥用の餌であり、この鳥用の餌には、バードフィーダーで使用される餌と、ペットの鳥に給与するために使用される餌との両方が含まれる。典型的には、鳥用の餌は様々な種子を含むが、スエット（牛脂又は羊脂）を包含してもよい。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「接触した」という用語は、製品（例えば飼料）への飼料添加剤組成物の間接的な又は直接的な塗布を指す。使用され得る塗布方法の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：飼料添加剤組成物を含む材料で製品を処理すること、飼料添加剤組成物と製品とを混合することによる直接的な塗布、製品表面上に飼料添加剤組成物を噴霧すること、又は飼料添加剤組成物の調製物中に製品を浸漬すること。
【００７１】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、好ましくは、製品（例えば飼料）と混合され得る。或いは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、飼料の乳濁液又は原料に含まれ得る。
【００７２】
一部の用途では、影響を受ける／処理される製品の表面上で、又はこの製品の表面にバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を利用可能にすることが重要である。
【００７３】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を塗布して、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分の制御された量を、製品（例えば、飼料、又は飼料の原料）に、散剤させ得、コーティングし得、及び／又は含浸させ得る。
【００７４】
本明細書で説明されているＤＦＭは適度な濃度で添加され得、例えば、約２×１０３ＣＦＵ／ｇ飼料〜約２×１０１１ＣＦＵ／ｇ飼料、好適には約２×１０６〜約１×１０１０、好適には約３．７５×１０７ＣＦＵ／ｇ飼料〜約１×１０１０ＣＦＵ／ｇ飼料の１日用量を付与する最終飼料製品中の濃度で添加され得る。
【００７５】
好ましくは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、最大約７０℃；最大約８５℃；又は最大約９５℃の熱処理に対して熱的に安定であるだろう。この熱処理は、約３０秒〜数分間実施され得る。「熱的に安定な」という用語は、特定の温度まで加熱する前に存在した／活性であったバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分の少なくとも約５０％が、室温にまで冷却した後もなお存在している／活性であることを意味する。特に好ましい実施形態では、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、粉末を製造するために均質化される。
【００７６】
或いは、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、参照により本明細書に組み込まれる国際公開第２００７／０４４９６８号パンフレットで説明されているような顆粒（ＴＰＴ顆粒と称される）に製剤化されている。
【００７７】
別の好ましい実施形態では、飼料添加剤組成物が顆粒に製剤化される場合には、この顆粒は、タンパク質の核の上にコーティングされた水和バリア塩を含む。そうした塩コーティングの利点は、耐熱性の改善、貯蔵安定性の改善、並びに１種又は複数種の細菌株を含む少なくとも１種のプロテアーゼ及び／又はＤＦＭに悪影響を及ぼす他の飼料添加剤に対する保護である。好ましくは、塩コーティングに使用される塩は、２０℃にて、０．２５を超える水分活性又は６０％を超える恒湿を有する。好ましくは、この塩コーティングは、Ｎａ２ＳＯ４を含む。
【００７８】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含む飼料は、飼料ペレット化プロセスを使用して製造され得る。任意選択的に、このペレット化工程は、ペレットの形成前に、蒸気処理又はコンディショニング段階を含み得る。粉末を含む混合物を、コンディショナー（例えば、蒸気注入を有するミキサー）に入れ得る。この混合物は、コンディショナー中で６０〜１００℃等の特定の温度まで加熱され、典型的な温度は、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、又は９５℃であるだろう。滞留時間は、数秒間から、数分間、さらには数時間まで可変であり得る。例えば、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、１分２分、５分、１０分、１５分、３０分、及び１時間。
【００７９】
顆粒に関して、少なくとも１つのコーティングは、この顆粒の少なくとも５５重量／重量％を占める水分水和物質を含み得；及び／又は少なくとも１つのコーティングは、２つのコーティングを含み得る。これら２つのコーティングは、水分水和コーティングと、水分バリアコーティングとであり得る。一部の実施形態では、この水分水和コーティングは、この顆粒の２５重量／重量％〜６０重量／重量％であり得、この水分バリアコーティングは、この顆粒の２重量／重量％〜１５重量／重量％であり得る。この水分水和コーティングは、無機塩、スクロース、デンプン、及びマルトデキストリンから選択され得、この水分バリアコーティングは、ポリマー、ガム、ホエイ、及びデンプンから選択され得る。
【００８０】
顆粒は、飼料ペレット化プロセスを使用して製造され得、飼料前処理プロセスは、最大数分にわたり７０℃〜９５℃（例えば８５℃〜９５℃）で行なわれ得る。
【００８１】
バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、コア；貯蔵後に、且つ顆粒が成分である蒸気加熱ペレット化プロセスの後に、少なくとも８０％の活性を保持する顆粒の活性剤；水分バリアコーティング；及び顆粒の少なくとも２５重量／重量％である水分水和コーティングを含む動物飼料用の顆粒であって、蒸気加熱ペレット化プロセスの前に０．５未満の水分活性を有する顆粒に製剤化され得る。
【００８２】
顆粒は、ポリマー及びガムから選択される水分バリアコーティングを有し得、水分水和物質は無機塩であり得る。水分水和コーティングは、顆粒の２５重量／重量％〜４５重量／重量％であり得、水分バリアコーティングは、顆粒の２重量／重量％〜１０重量／重量％であり得る。
【００８３】
顆粒は、最大数分にわたり８５℃〜９５℃で行なわれ得る蒸気加熱ペレット化プロセスを使用して製造され得る。
【００８４】
或いは、組成物は、消費に適した液体製剤中に存在し、好ましくは、そのような液体消費物は、バッファー、塩、ソルビトール、及び／又はグリセロールの内の１つ又は複数を含む。
【００８５】
また、飼料添加剤組成物は、例えば粉砕コムギ等の担体基材上に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を塗布する（例えば噴霧する）ことにより製剤化されてもよい。
【００８６】
一実施形態では、本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含むそのような飼料添加剤組成物を、プレミックスとして製剤化し得る。単なる例として、このプレミックスは、１種又は複数種の飼料成分を含み得、例えば、１種若しくは複数種のミネラル及び／又は１種若しくは複数種のビタミンを含み得る。
【００８７】
或いは、この組成物は、消費に適した液体製剤中に存在し、好ましくは、そのような液体消費物は、バッファー、塩、ソルビトール、及び／又はグリセロールの内の１つ又は複数を含む。
【００８８】
また、この飼料添加剤組成物は、例えば粉砕コムギ等の担体基材上に、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を塗布する（例えば噴霧する）ことにより製剤化されてもよい。
【００８９】
一実施形態では、本明細書で説明されているそのようなバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、プレミックスとして製剤化され得る。単なる例として、このプレミックスは、１種又は複数種の飼料成分を含み得、例えば、１種若しくは複数種のミネラル及び／又は１種若しくは複数種のビタミンを含み得る。
【００９０】
本明細書で開示されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、任意の適切な飼料材料への添加に適していることが理解されるであろう。
【００９１】
本明細書で使用される場合、飼料材料という用語は、動物により消費される基本的な飼料材料を指す。さらに、この飼料材料は、例えば、少なくとも１種又は複数種の未加工穀物、並びに／又は加工された植物性材料及び／又は動物性材料（例えば、ダイズミール若しくは骨粉）を含み得ることが理解されるであろう。
【００９２】
動物が異なると必要な飼料も異なり、且つ同じ動物であっても、この動物の飼育される目的に応じて必要な飼料が異なり得ることが、当業者に理解されるであろう。
【００９３】
好ましくは、飼料は、トウモロコシ（ｍａｉｚｅ）若しくはトウモロコシ（ｃｏｒｎ）、コムギ、オオムギ、ライコムギ、ライムギ、コメ、タピオカ、ソルガム、及び／又は副産物のいずれか、並びにダイズ平均、ナタネミール、キャノーラミール、綿実ミール、ヒマワリ種子平均、動物副産物ミール、及びこれらの混合物のようなタンパク質に富む成分を含む飼料材料を含み得る。より好ましくは、この飼料は、動物性脂肪及び／又は植物油を含み得る。
【００９４】
任意選択的に、飼料はまた、例えばカルシウム等の追加のミネラル、及び／又は追加のビタミンを含み得る。好ましくは、この飼料は、トウモロコシダイズミールミックスである。
【００９５】
別の態様では、飼料を製造する方法が提供される。飼料は、典型的には飼料ミルで製造され、この飼料ミルでは、最初に原料が好適な粒径に粉砕され、次いで適切な添加剤と混合される。次いで、飼料を、マッシュ又はペレットとして製造し得；後者は、典型的には、温度を目標レベルまで上昇させ、次いで飼料をダイに通して、特定のサイズのペレットを製造する方法を含む。このペレットを冷却する。続いて、脂肪及び酵素等の液体添加剤を添加し得る。飼料の製造はまた、特に、少なくとも蒸気の使用を含み得る好適な技術による、ペレット化の前の押し出し又は膨張を含むさらなる工程も含み得る。
【００９６】
この飼料は、家禽（例えば、ブロイラー、産卵鶏、ブロイラー種鶏、七面鳥、アヒル、ガチョウ、水鳥）、ブタ（全ての年齢区分）、ペット（例えば、イヌ、ネコ）、又は魚等の単胃動物用の飼料であり得、好ましくは、この飼料は家禽用である。
【００９７】
本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、動物飼料の上に置かれ得、即ちトップ給与され得る。或いは、本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、動物の飲料水等の液体に添加され得る。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「接触した」という用語は、製品（例えば飼料）への本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分の間接的な又は直接的な塗布を指す。
【００９９】
使用され得る塗布方法の例として下記が挙げられるが、これらに限定されない：バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含む材料で製品を処理すること、本明細書で説明されている飼料添加剤組成物バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分と、製品とを混合することによる直接的な塗布、製品表面上にそのような飼料添加剤組成物を噴霧すること、又は飼料添加剤組成物の調製物中に製品を浸漬すること。一実施形態では、本明細書で説明されている飼料添加剤組成物バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、好ましくは製品（例えば飼料）と混合される。或いは、飼料添加剤組成物は、飼料の乳濁液又は原料に含まれ得る。これにより、この組成物が能力上の利益を付与することが可能になる。
【０１００】
本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を調製する方法はまた、粉末をペレット化するさらなる工程も含み得る。この粉末を、当該技術分野で既知の他の成分と混合し得る。この粉末、又はこの粉末を含む混合物を、ダイに通して押し出し得、得られたストランドを、可変長の好適なペレットへと切断する。
【０１０１】
任意選択的に、このペレット化工程は、ペレットの形成前に、蒸気処理又はコンディショニング段階を含み得る。粉末を含む混合物を、コンディショナー（例えば、蒸気注入を有するミキサー）に入れ得る。この混合物は、コンディショナー中で６０〜１００℃等の特定の温度まで加熱され、典型的な温度は、７０℃、８０℃、８５℃、９０℃、又は９５℃であるだろう。滞留時間は、数秒間から、数分間、さらには数時間まで可変であり得る。例えば、５秒、１０秒、１５秒、３０秒、１分、２分、５分、１０分、１５分、３０分、及び１時間。
【０１０２】
動物が異なると必要な飼料も異なり、且つ同じ動物であっても、この動物の飼育される目的に応じて必要な飼料が異なり得ることが、当業者に理解されるであろう。
【０１０３】
任意選択的に、この飼料はまた、例えばカルシウム等の追加のミネラル、及び／又は追加のビタミンも含み得る。一部の実施形態では、この飼料は、トウモロコシダイズミールミックスである。
【０１０４】
飼料は、典型的には飼料ミルで製造され、この飼料ミルでは、最初に原料が好適な粒径に粉砕され、次いで適切な添加剤と混合される。次いで、飼料を、マッシュ又はペレットとして製造し得；後者は、典型的には、温度を目標レベルまで上昇させ、次いで飼料をダイに通して、特定のサイズのペレットを製造する方法を含む。このペレットを冷却する。続いて、脂肪及び酵素等の液体添加剤を添加し得る。飼料の製造はまた、特に、少なくとも蒸気の使用を含み得る好適な技術による、ペレット化の前の押し出し又は膨張を含むさらなる工程を含み得る。
【０１０５】
上述したように、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分、及び／又はこれを含む飼料を、任意の適切な形態で使用し得る。バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分、及び／又はこれを含む飼料を、固体若しくは液体の調製物、又はその代替物の形態で使用し得る。固体調製物の例として、粉末、ペースト、巨丸剤、カプセル、ペレット、錠剤、粉剤、及び顆粒が挙げられ、これらは、可溶性であってもよいし、噴霧乾燥されていてもよいし、凍結乾燥されていてもよい。液体調製物の例として、水溶液、有機溶液又は水性−有機溶液、懸濁液、及び乳濁液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１０６】
一部の用途では、飼料添加剤組成物を、飼料と混合してもよいし、飲料水で投与してもよい。
【０１０７】
本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を、飼料で許容される担体、希釈剤、又は添加剤と混合すること、及び（任意選択的に）包装することを含む、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分。
【０１０８】
飼料及び／又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を、少なくとも１種のミネラル及び／又は少なくとも１種のビタミンと組み合わせ得る。そのようにして得られた組成物を、本明細書ではプレミックスと称し得る。飼料は、少なくとも０．０００１重量％のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含み得る。好適には、飼料は、少なくとも０．０００５重量％；少なくとも０．００１０重量％；少なくとも０．００２０重量％；少なくとも０．００２５重量％；少なくとも０．００５０重量％；少なくとも０．０１００重量％；少なくとも０．０２０重量％；少なくとも０．１００重量％；少なくとも０．２００重量％；少なくとも０．２５０重量％；少なくとも０．５００重量％のバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分を含み得る。
【０１０９】
好ましくは、食物又はバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、少なくとも１種の生理学的に許容される担体をさらに含み得る。この生理学的に許容される担体は、好ましくは、マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、及びこれらの混合物の内の少なくとも１つから選択される。さらなる実施形態では、食物又は飼料は、金属イオンキレート剤をさらに含み得る。この金属イオンキレート剤は、ＥＤＴＡ又はクエン酸から選択され得る。
【０１１０】
一実施形態では、本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分（カプセル化されているか否かを問わない）は、下記の内の少なくとも１つから選択される少なくとも１種の生理学的に許容される担体と共に製剤化され得る：マルトデキストリン、石灰石（炭酸カルシウム）、シクロデキストリン、コムギ又はコムギ成分、スクロース、デンプン、Ｎａ２ＳＯ４、タルク、ＰＶＡ、ソルビトール、安息香酸塩、ソルベート、グリセロール、スクロース、プロピレングリコール、１，３−プロパンジオール、グルコース、パラベン、塩化ナトリウム、クエン酸塩、酢酸塩、リン酸塩、カルシウム、メタ重亜硫酸塩、ギ酸塩、及びこれらの混合物。
【０１１１】
一部の実施形態では、本明細書で説明されているバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの成分は、生理学的に許容される担体中に存在するであろう。好適な担体は、大きくて緩やかに代謝される巨大分子（例えば、タンパク質、ポリペプチド、リポソーム、多糖、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、ポリマー性アミノ酸、アミノ酸コポリマー、及び不活性ウイルス粒子）であり得る。薬学的に許容される塩（例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、及び硫酸塩等の鉱酸塩、又は酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、及び安息香酸塩等の有機酸の塩）を使用し得る。治療用組成物中の薬学的に許容される担体は、水、生理食塩水、グリセロール、及びエタノール等の液体をさらに含み得る。加えて、そのような組成物中には、湿潤剤、乳化剤、又はｐＨ緩衝物質等の補助物質が存在し得る。そのような担体は、患者による摂取のために、錠剤、丸剤、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、及び懸濁液として医薬組成物を製剤化することを可能にする。製剤化されると、対象に直接投与し得る。処置する対象は動物であり得る。
【０１１２】
本明細書で開示されている組成物は、動物中において１種又は複数種の能力上の利点（即ち、動物の能力）をもたらし得、この能力上の利点は、体重増加の上昇、飼料率の増加、腸バリアの完全性の改善、死亡率の減少、及び糞便中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出の減少からなる群から選択されると考えられる。
【０１１３】
好ましくは、「動物の能力」は、飼料効率、及び／又は動物の体重増加、及び／又は飼料転換率により決定される。
【０１１４】
「動物の能力の改善」は、本明細書で開示されている組成物を含まない飼料又は飼料添加剤組成物と比較した、飼料効率の増加、及び／又は体重増加の上昇、及び／又は飼料転換率の減少、及び／又は腸バリアの完全性の改善、及び／又は死亡率の減少、及び／又は糞便中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出の減少を意味する。
【０１１５】
好ましくは、「動物の能力の改善」は、飼料効率の増加、及び／又は体重増加の上昇、及び／又は飼料転換率の減少を意味する。本明細書で使用される場合、「飼料効率」という用語は、一定期間の間に、動物に食物を適宜給与するか又は規定量の食物を給与する場合に起こる、動物の体重増加の量を指す。
【０１１６】
「飼料効率の増加」は、飼料中における本発明に係る飼料添加剤組成物の使用による、前記飼料添加剤組成物が存在することなく給与した動物と比較した、飼料摂取の単位当たりの体重増加の上昇を意味する。
【０１１７】
本明細書で使用される場合、「飼料転換率」という用語は、動物の体重を規定量だけ増加させるために動物に給与される飼料の量を指す。
【０１１８】
飼料転換率の改善は、より低い飼料転換率を意味する。
【０１１９】
「より低い飼料転換率」又は「飼料転換率の改善」は、飼料中における飼料添加剤組成物の使用により、本明細書で開示されている飼料添加剤組成物を飼料が含まない場合に動物の体重を規定量だけ増加させるために必要とされる飼料の量と比較して、動物の体重を同量だけ増加させるために動物に給与する必要がある飼料の量が低いことを意味する。
【０１２０】
腸の完全性及び微生物叢は、腸の健康の維持に役立つと思われる。腸のバリアを支持することは、感染症及び炎症のリスクを減少させることに役立つ。例えば、タイトジャンクションとは、２個の細胞の密接に関連する領域のことであり、これらの細胞の膜は互いに結合して、流体に対して実質的に不透過性のバリアを形成する。タイトジャンクションの完全性を保護する能力により、動物の健康が改善され得る。タイトジャンクションはまた、さらなる細胞損傷をもたらす可能性がある「漏出性腸（ｌｅａｋｉｎｇ  ｇｕｔ）」を避けるためにも維持される必要がある。そのため、動物の身体への細菌の意図しない侵入を妨げる、よく調整されたバリア機能を維持する動物の能力を支持するか又は増加させることにより、腸の完全性を改善することが望ましい。
【０１２１】
タイトジャンクション（閉塞ジャンクション（ｏｃｃｌｕｄｉｎｇ  ｊｕｎｃｔｉｏｎ）としても既知である）とは、２個の細胞の密接に関連する領域のことであり、これらの細胞の膜は互いに結合して、流体に対して実質的に不透過性のバリアを形成する。腸の健康という観点から、タイトジャンクションは、良好な腸の完全性又は不十分な腸の完全性のどちらかにつながる可能性がある腸の上皮細胞間のチャネルのことである。良好な腸の完全性が存在する場合には、クローディン３及びオクルディン等のタイトジャンクションタンパク質は、より高いレベルで２個の上皮細胞の間で発現され、腸管内腔から体循環への病原体の転位を防止し得るバリアを提供するのに役立つ（透過性の減少）。クローディンは、タイトジャンクションタンパク質の最も重要なファミリであり、クローディン３は、これらのタイトジャンクションタンパク質をコードする遺伝子の内の１つである。オクルディンは、別の重要なタイトジャンクションタンパク質である。クローディン及びオクルディンは、同定された最初のタイトジャンクション内在性膜タンパク質であった。タイトジャンクションタンパク質ＲＮＡの測定は、タイトジャンクションが動物の消化管中で維持されていない場合には、病原体及び毒素の腸管内腔から体循環への転位を可能にし得る透過性が生じ得、そのため動物の健康を危険にさらすか、又は動物の死（例えば敗血症）さえももたらすことから、バリアの完全性と腸の健康との指標として機能し得る。
【０１２２】
本明細書で教示されている組成物を使用することによる、糞便中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出の減少により、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症のさらなるまん延が減少し得、同様に動物の能力が改善され得る。
【０１２３】
栄養素消化率は、本明細書で使用される場合、消化管又は消化管の特定の区域（例えば小腸）から消失する栄養素の割合を意味する。栄養素消化率を、対象に投与されたものと、対象の糞便中に出るものとの間の差異として測定してもよいし、対象に投与されたものと、消化管の特定の区域（例えば回腸）の消化管内容物中に残存するものと間の差異として測定してもよい。
【０１２４】
栄養素消化率は、本明細書で使用される場合、ある期間の最中の、栄養素の摂取と、排泄物の総回収量による排泄された栄養素との間の差異により測定してもよいし；又は動物により吸収されず且つ全消化管で若しくは消化管のある区域で消失した栄養素の量を研究者が算出することを可能にする不活性マーカーの使用により測定してもよい。そのような不活性マーカーは、二酸化チタン、酸化クロム、又は酸不溶性灰分であり得る。消化率を、飼料中における栄養素の百分率として表し得るか、又は飼料中における栄養素の質量単位当たりの可消化栄養素の質量単位として表し得る。
【０１２５】
栄養素消化率は、本明細書で使用される場合、デンプン消化率、脂肪消化率、タンパク質消化率、及びアミノ酸消化率を包含する。
【０１２６】
エネルギー消化率は、本明細書で使用される場合、（消費された飼料の総エネルギー）−（糞便の総エネルギー）又は（消費された飼料の総エネルギー）−（動物の消化管の特定の区域（例えば回腸）で残存する消化管内容物の総エネルギー）を意味する。代謝エネルギーは、本明細書で使用される場合、見かけの代謝エネルギーを指し、（消費された飼料の総エネルギー）−（糞便、尿、及び消化のガス状生成物に含まれる総エネルギー）を意味する。エネルギー消化率及び代謝エネルギーを、飼料の代謝エネルギーを算出するために窒素排出に関して適切な補正を行ない、栄養素の消化率の測定と同じ方法を使用して、総エネルギーの摂取と、糞便中に又は消化管の特定の区域に存在する消化管内容物中に排泄された総エネルギーとの間の差異として測定し得る。
【０１２７】
一部の実施形態では、本明細書で説明されている組成物は、対象中における食物性のヘミセルロース又は繊維の消化率又は利用を改善し得る。
【０１２８】
生存率という用語は、本明細書で使用される場合、生存している対象の数を意味する。「生存率の改善」という用語を、「死亡率の減少」と言い換え得る。
【０１２９】
「体重増加の上昇」は、飼料添加剤組成物が存在しない飼料を給与する動物と比較した、前記飼料添加剤組成物を含む飼料の給与時の動物の体重増加を指す。
【０１３０】
本明細書で開示されている組成物及び方法の非限定的な例として、下記が挙げられる：
１．動物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症を予防するための及び／又は処置するための組成物であって、バチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）３ＢＰ５株（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５１０）；Ｂ．アミロリケファシエンス（Ｂ．ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）９１８株（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５０８）及び１５ＡＰ４株（ＰＴＡ−６５０７）を単独で含むか又はこれらの株に由来する培養上清と組み合わせて含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給与微生物成分を含む組成物。
２．前記組成物は、体重増加の上昇、飼料率の増加、腸バリアの完全性の改善、死亡率の減少、及び糞便中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出の減少からなる群から選択される１種又は複数種の能力上の利点をもたらす、実施形態１に記載の組成物。
３．直接給与微生物は内生胞子の形態である、実施形態１又は２に記載の組成物。
４．前記組成物は、任意選択的にカプセル化され得る少なくとも１種の酵素をさらに含む、実施形態１又は２に記載の組成物。
５．前記組成物は、任意選択的にカプセル化され得る少なくとも１種の酵素をさらに含む、実施形態３に記載の組成物。
６．少なくとも１種の酵素は、フィターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、及びベータ−グルカナーゼからなる群から選択される、実施形態４に記載の組成物。
７．前記組成物は、飼料添加剤組成物又はプレミックスである、実施形態１、２、５、又は６のいずれか一つに記載の組成物。
８．前記組成物は、飼料添加剤組成物又はプレミックスである、実施形態３に記載の組成物。
９．前記組成物は、飼料添加剤組成物又はプレミックスである、実施形態４に記載の組成物。
１０．実施形態７に記載の飼料添加剤組成物を含む飼料。
１１．実施形態８又は９に記載の飼料添加剤組成物を含む飼料。
１２．実施形態７に記載の飼料添加剤組成物と、投与に関する指示書とを含むキット。
１３．実施形態８又は９に記載の飼料添加剤組成物と、投与に関する指示書とを含むキット。
１４．動物における大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に基づく感染症を予防する及び／又は処置する方法であって、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）３ＢＰ５株（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５１０）；バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）９１８株（ＮＲＲＬ  Ｂ−５０５０８）及び１５ＡＰ４株（ＰＴＡ−６５０７）を含むバチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）ベースの直接給与微生物成分を含む組成物の有効な量を投与することを含む方法。
１５．組成物は、体重増加の上昇、飼料率の増加、腸バリアの完全性の改善、及び糞便中での大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出の減少からなる群から選択される１種又は複数種の能力上の利点をもたらす、実施形態１４に記載の方法。
１６．直接給与微生物は内生胞子の形態である、実施形態１４又は１５に記載の方法。
１７．前記組成物は、任意選択的にカプセル化され得る少なくとも１種の酵素をさらに含む、実施形態１４又は１５に記載の方法。
１８．前記組成物は、任意選択的にカプセル化され得る少なくとも１種の酵素をさらに含む、実施形態１６に記載の方法。
１９．少なくとも１種の酵素は、フィターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、及びベータ−グルカナーゼからなる群から選択される、実施形態１７に記載の方法。
２０．少なくとも１種の酵素は、フィターゼ、プロテアーゼ、アミラーゼ、キシラナーゼ、及びベータ−グルカナーゼからなる群から選択される、実施形態１８に記載の方法。
２１．前記組成物は、飼料添加剤組成物又はプレミックスである、実施形態１４、１５、１９、及び２０のいずれか一つに記載の方法。
２２．前記組成物は、飼料添加剤組成物又はプレミックスである、実施形態１６に記載の方法。
【実施例】
【０１３１】
別途本明細書で定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ  ＡＮＤ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，２Ｄ  ＥＤ．，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９４）、及びＨａｌｅ  ＆  Ｍａｒｈａｍ，ＴＨＥ  ＨＡＲＰＥＲ  ＣＯＬＬＩＮＳ  ＤＩＣＴＩＯＮＡＲＹ  ＯＦ  ＢＩＯＬＯＧＹ，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎ．Ｙ．（１９９１）は、本開示で使用される用語の多くの一般的な辞書を当業者に提供する。
【０１３２】
本開示は、下記の実施例においてさらに定義される。実施例は、ある特定の実施形態を示しているものの、例示のみを目的として与えられていることを理解すべきである。上記の考察及び実施例から、当業者は、本開示の本質的な特徴を確認し得、且つ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な用途及び条件に適合するように様々な変更及び修正を加え得る。
【０１３３】
実施例１
Ｆ１８腸内毒素原性大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）でチャレンジした離乳ブタの成長能力、糞便の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出スコア、及び腸バリア機能への、バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）の３種の株をベースとする直接給与微生物（バチルス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）３ＢＰ５株、９１８株、１５ＡＰ４株）の効果
材料及び方法
飼育及び環境
動物及び実験プロトコルの使用は、Ａｎｉｍａｌ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅにより承認されている。基礎常用飼料を、給与時に、エネルギーとタンパク質とのバランスが取れているように、且つＮＲＣ（２０１２）により推奨されているようにこの年齢の成長期のブタの栄養素要求量を満たすか又は上回るように、配合する（表１）。
【０１３４】
この基礎常用飼料を分割し、次いで、表１に示すように直接給与微生物（ＤＦＭ）で処理する。飼料混合の最中では、ミキサーを洗い流して常用飼料の交差汚染を防止する。各バッチの開始、中間、及び終了での各処理常用飼料からサンプルを採取し、一緒にブレンドして、飼料中におけるＤＦＭを計数する。各処理常用飼料からのサンプルを、混合の最中に採取し、必要となるまで−２０℃で保管する。
【０１３５】
【表１−１】
2021516258.tif 000003
【０１３６】
【表１−２】
2021516258.tif 000004
【０１３７】
【表２】
2021516258.tif 000005
【０１３８】
実験設計
体重が６．４４±０．６４ｋｇの新たに離乳した雌雄混合（去勢ブタ及び若雌ブタそれぞれ５０％）ブタ合計７２匹を、１７日間の実験で使用する。各ブタを遺伝子検査して、Ｆ１８大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に対する感受性を確実なものにする。これらのブタを個々に秤量し、体重でブロックし、ブロック内で１〜４の常用飼料処置に無作為に割り当てる。これらのブタを、１個の檻当たり２匹のブタで収容し、これらのブタのチャレンジ状態に基づいて、下記の２つの別々の部屋の内の１つで飼育する：１８匹の非チャレンジコントロ−ルブタ（９個の檻；ＰＣ処置）のためのより小さい部屋、並びに５４匹のチャレンジブタ（２７個の檻；ＮＣ、ＮＣ＋ＤＦＭ１、及びＮＣ＋ＤＦＭ２に関する処置当たり９個の檻）のための他のより大きい部屋。全てのブタを、環境が管理された部屋で飼育する。各檻の片側には、ブタが飼料及び水を自由に摂取することが可能であるステンレス鋼製の自動給与器及び乳首給水器が備えられている。この実験を１７日にわたり実行した。この実験は、常用飼料への７日間の適応期間と、それに続く１０日間のチャレンジ期間とで構成された。離乳後７日目（この研究の７日目）に、ＮＣ処置群、ＮＣ＋ＤＦＭ１処置群、及びＮＣ＋ＤＦＭ２処置群のブタに、Ｆ１８毒素原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（ＥＴＥＣ）を経口感染させる。ＰＣ処置群には、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）でチャレンジしない。
【０１３９】
成長能力、並びに糞便サンプルの採取及び分析
体重及び飼料消費量を、０日目、７日目、及び１７日目（試験終了）に測定して、平均１日増加量（ＡＤＧ）、平均１日飼料摂取量（ＡＤＦＩ）、及び増加量対飼料比（Ｇ：Ｆ）をモニタリングする。７日目（チャレンジ直前）、並びに感染後（ｄｐｉ）１日目、２日目、３日目、４日目、５日目、６日目、７日目、及び１０日目に糞便スワブを採取し、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出を評価する。糞便スコアを、下記の尺度を使用して、盲検方式で毎日目視にてランク付けする：１＝固体；２＝半固体；３＝半液体；４＝液体。
【０１４０】
ｄｐｉ１０（この研究の最終日）に、各檻からの１匹のブタを捕獲ボルトにより安楽死させ、続いて失血させて下記の組織を採取する：新鮮な固定された回腸及び結腸のセグメント、並びに回腸及び結腸の消化管内容物。回腸組織のセグメントをＰＣＲにより分析して、タイトジャンクション（腸）の完全性に影響を及ぼすタイトジャンクションタンパク質のＲＮＡ発現を決定する。
【０１４１】
成長能力データを、共変数としての初期体重と共にＰＲＯＣ  ＭＩＸＥＤ（ＳＡＳ  ９．４）を使用して分析する。時間経過データを、ＰＲＯＣ  ＧＬＩＭＭＩＸでの反復測定として分析する。
【０１４２】
結果
成長能力：７日間の適応期間の最中に、４種の処置の間に、ＡＤＧ、ＡＤＦＩ、又はＧ：Ｆの有意差はない（Ｐ＞０．１０）。しかしながら、ＮＣ＋ＤＦＭ２による体重増加は、他の全ての処置と比べて数値的に大きい。ＮＣ＋ＤＦＭ２常用飼料によるブタは、この研究の最初の７日間の最中に０．７８１ｋｇ（最終体重−初期体重）増加し、ＰＣ、ＮＣ、及びＮＣ＋ＤＦＭ１はそれぞれ、０．２３９、０．１８８、及び０．３６５ｋｇ増加した（表３）。
【０１４３】
このことは、ＮＣ＋ＤＦＭ２常用飼料を給与したブタはまた、常用飼料適応の最初の７日間で、他の全ての処置と比べて、ＡＤＧ及びＧ：Ｆも数値的に高い（表３）ことを意味する。
【０１４４】
【表３】
2021516258.tif 000006
【０１４５】
１０日間のチャレンジ期間（この研究の８〜１７日目）後に、ＮＣ処置、ＮＣ＋ＤＦＭ１処置、及びＮＣ＋ＤＦＭ２処置によるブタは、ＰＣと比較して、最終ＢＷが低く（Ｐ＝０．００２）、ＡＤＧが低く（Ｐ＜．０００１）、且つＡＤＦＩが低い（Ｐ＝０．００２）（表４）。このことは、成功裏の大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）チャレンジの予想される結果である。しかしながら、ＮＣ処置群及びＮＣ＋ＤＦＭ１処置群のみは、コントロールと比べてＧ：Ｆが低い。
【０１４６】
ＮＣ＋ＤＦＭ２ブタは、中間Ｇ：Ｆが、ＮＣと比べて１９％高く（０．６４７対０．５４２）且つＰＣと統計的に類似する（表４）。
【０１４７】
ＤＦＭ２を給与したブタは、１０日間のチャレンジ期間の最中に２．４７７ｋｇ増加したが、ＮＣ又はＮＣ＋ＤＦＭ１を給与したブタはそれぞれ、２．３１２及び１．８８１ｋｇしか増加しなかった（表４）。
【０１４８】
【表４】
2021516258.tif 000007
【０１４９】
大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出スコア：全体的に、ＰＣ処置大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）排出スコア（ＳＳ）は、予想されるように、チャレンジ処置と比べて低い（Ｐ＜．０．０１、表６）。ＮＣ＋ＤＦＭ２処置により、ＮＣと比較して、２ｄｐｉでのＳＳは増加する（Ｐ＝０．０４）が、７ｄｐｉでのＳＳは減少する（Ｐ＝０．００３）（表５）。ＮＣ＋ＤＦＭ２は、ｄｐｉ５及び１０で、ＮＣに対してＳＳを数値的に減少させる（表５）。
【０１５０】
全体的に、ＮＣ＋ＤＦＭ１及びＮＣ＋ＤＦＭ２は、ＮＣと比較して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）糞便排出を数値的に減少させる（それぞれ、２．１２に対して１．９６及び２．０３；表６）。
【０１５１】
【表５】
2021516258.tif 000008
【０１５２】
【表６】
2021516258.tif 000009
【０１５３】
糞便スコア：感染後３日目から８ｄｐｉまで、ＰＣは、予想されるように、ＮＣと比べて糞便スコア（ＦＳ）が低い（Ｐ＜．０００１、表７）。２ｄｐｉでは、ＮＣ＋ＤＦＭ２を給与したブタは、ＮＣブタと比べてＦＳが高いが、ｄｐｉ７では、ＤＦＭ２ブタは、ＮＣブタと比べてＦＳが低い（Ｐ＜０．１０；表７）。
【０１５４】
同様に、ｄｐｉ４〜１０では、ＤＦＭ２を給与したブタは、ＮＣ給与ブタと比べてＦＣが数値的に低い。ＤＦＭ１は、いずれのｄｐｉでも、ＮＣと比べてＦＳを有意に減少させなかった（表７）。
【０１５５】
【表７】
2021516258.tif 000010
【０１５６】
タイトジャンクションタンパク質ＲＮＡ発現（腸の完全性）：
タイトジャンクション（閉塞ジャンクションとしても既知である）とは、２個の細胞の密接に関連する領域のことであり、これらの細胞の膜は互いに結合して、流体に対して実質的に不透過性のバリアを形成する。腸の健康という観点から、タイトジャンクションは、良好な腸の完全性又は不十分な腸の完全性のどちらかにつながる可能性がある腸の上皮細胞間のチャネルのことである。良好な腸の完全性が存在する場合には、クローディン３及びオクルディン等のタイトジャンクションタンパク質は、２個の上皮細胞の間で発現し、腸管内腔から体循環への病原体の転位を防止し得るバリアを提供するのに役立つ。クローディンは、タイトジャンクションタンパク質の最も重要なファミリであり、クローディン３は、これらのタイトジャンクションタンパク質をコードする遺伝子の内の１つである。オクルディンは、別の重要なタイトジャンクションタンパク質である。クローディン及びオクルディンは、同定された最初のタイトジャンクション内在性膜タンパク質であった。タイトジャンクションタンパク質ＲＮＡの測定は、タイトジャンクションが動物の消化管中で維持されていない場合には、病原体及び毒素の腸管内腔から体循環への転位を可能にし得る透過性が生じ得、そのため動物の健康を含むか、又は動物の死さえももたらすことから、バリアの完全性と腸の健康との指標として機能し得る。
【０１５７】
この実験では、常用飼料処置は、タイトジャンクションタンパク質クローディン３のＲＮＡ発現への有意な効果はないが；ＰＣは、ＮＣ及びＮＣ＋ＤＦＭ１と比べて数値的に高い（０．９８２対それぞれ０．６３８及び０．６４８；図１）ことが分かった。しかしながら、ＮＣ＋ＤＦＭ２は、ＰＣと数値的に類似するクローディン３のＲＮＡ発現を示す（０．９４５対０．９８２；図１）。
【０１５８】
処置（即ちＤＦＭ１又はＤＦＭ２）は、タイトジャンクションタンパク質オクルディンのＲＮＡ発現に対する有意な効果を有し、それにより、ＮＣ及びＮＣ＋ＤＦＭ１は、ＰＣと比べてオクルディン発現が低いが、ＮＣ＋ＤＦＭ２は、ＰＣとＮＣとの中間である（Ｐ＝０．０４５）。Ｐ値は、図１に示すように処置間の全体的な差違を示す。
【図１】
2021516258.tif 000011
【国際調査報告】
2021516258.tif 000012
2021516258.tif 000013
2021516258.tif 000014