(57)【要約】  ＳＣ−細胞の製造に有用な組成物および方法、ならびに細胞治療などの様々な用途に使用するためのＳＣ−細胞の単離された集団が、本明細書で開示される。【選択図】図６Ｃ
2021502830.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成するための方法であって、
Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性原始腸管細胞の集団を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤と形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子とを含む組成物と接触させることによって、前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成するステップを含み、前記クラスターが、フローサイトメトリーによって測定して最大約３０％のＣＨＧＡ陽性細胞および最大約３０％のＣＤＸ２陽性細胞を含む、方法。
【請求項２】
前記ＰＤＸ１陽性／ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を膵臓β細胞に分化させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＰＤＸ１陽性／ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞をＰＤＸ１陽性／ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞をインスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップをさらに含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記インスリン陽性内分泌細胞を膵臓β細胞に分化させるステップをさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
（ａ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性原始腸管細胞を含む細胞の集団を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤とＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子とを含む組成物と接触させることによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成するステップ；および
（ｂ）前記ＰＤＸ１陽性／ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む前記細胞クラスターを、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターに分化させるステップ
を含み、
非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターが、前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの前記増殖因子との前記接触なしで生成された比較可能な細胞クラスターより高いグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を有する、方法。
【請求項７】
前記細胞クラスターの前記ＧＳＩＳ刺激指数が、前記比較可能な細胞クラスターのものより少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、または少なくとも約３倍高い、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記細胞クラスターの前記ＧＳＩＳ刺激指数が、前記比較可能な集団のものより少なくとも約３倍高い、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＧＳＩＳ刺激指数が、第１のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌の、第２のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌に対する比として計算される、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記第１のグルコース濃度が、約１０〜約５０ｍＭであり、前記第２のグルコース濃度が、約１ｍＭ〜５ｍＭである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記第１のグルコース濃度が、約２０ｍＭであり、前記第２のグルコース濃度が、約２．８ｍＭである、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞クラスターが、フローサイトメトリーによって測定して前記比較可能な細胞クラスターより高いパーセンテージの前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞クラスターが、フローサイトメトリーによって測定して前記比較可能な細胞クラスターより少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、または少なくとも約１．５倍高いパーセンテージの前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞クラスターが、フローサイトメトリーによって測定して前記比較可能な細胞クラスターより約１．５倍高いパーセンテージの前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む、請求項６〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
（ａ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性原始腸管細胞を含む細胞の集団を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤とＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子とを含む組成物と接触させることによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成するステップ；および
（ｂ）前記ＰＤＸ１陽性／ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む前記細胞クラスターを、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターに分化させるステップ
を含み、
非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターが、フローサイトメトリーによって測定して、前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの前記増殖因子との前記接触なしで生成された比較可能な細胞クラスターと比較してより高いパーセンテージの前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む、方法。
【請求項１６】
前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターが、フローサイトメトリーによって測定して前記比較可能な細胞クラスターより少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、または少なくとも約１．５倍高いパーセンテージの前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターが、フローサイトメトリーによって測定して前記比較可能な細胞クラスターより約１．５倍高いパーセンテージの前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む、請求項１５または１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターが、前記比較可能な細胞クラスターと比較してより多いインスリン分泌をグルコース負荷に応答して示す、請求項６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターが、前記比較可能な細胞クラスターと比較して少なくとも約１．２、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５倍多いインスリン分泌をグルコース負荷に応答して示す、請求項６〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターが、前記比較可能な細胞クラスターと比較してより高いＧＳＩＳ刺激指数を示す、請求項６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターの前記ＧＳＩＳ刺激指数が、前記比較可能な細胞クラスターのものより少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、または少なくとも約３倍高い、請求項６〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターの前記ＧＳＩＳ刺激指数が、前記比較可能な細胞クラスターのものより少なくとも約３倍高い、請求項６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＧＳＩＳ刺激指数が、第１のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌の、第２のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌に対する比として計算される、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第１のグルコース濃度が、約１０〜約５０ｍＭであり、前記第２のグルコース濃度が、約１ｍＭ〜５ｍＭである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記第１のグルコース濃度が、約２０ｍＭであり、前記第２のグルコース濃度が、約２．８ｍＭである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２６】
前記非ネイティブ膵臓β細胞が、グルコース負荷に曝露されたときにｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を示す、請求項６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記非ネイティブ膵臓β細胞が、第１のＫ＋濃度に応答してインスリン分泌を示す、請求項６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターが、前記比較可能な細胞クラスターと比較してより多いインスリン分泌を第１のＫ＋濃度に応答して示す、請求項６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターが、前記比較可能な細胞クラスターと比較して少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．２倍、少なくとも約３．４倍、少なくとも約３．６倍、少なくとも約３．８倍、少なくとも約４倍多いインスリン分泌を第１のＫ＋濃度に応答して示す、請求項６〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路の前記阻害剤が、ＤＭＨ−１、その誘導体、類似体または変異体を含む、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記組成物が、約０．０１μＭ〜約１０μＭ、約０．０５μＭ〜約５μＭ、約０．１μＭ〜約１μＭ、または約０．１５μＭ〜約０．５μＭのＤＭＨ−１を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記組成物が、約０．２５μＭのＤＭＨ−１を含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３３】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの前記増殖因子が、アクチビンＡを含む、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記組成物が、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記組成物が、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項３３または３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記組成物が、約２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記組成物が、ＦＧＦファミリーからの増殖因子、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、プロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される分化因子をさらに含む、請求項１〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性原始腸管細胞を含む細胞の集団を、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培養培地中で分化させることによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成する方法。
【請求項３９】
前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む前記細胞クラスター中の細胞の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８５％が、フローサイトメトリーによって測定してＰｄｘ１陽性である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む前記細胞クラスター中の細胞の少なくとも約８５％が、フローサイトメトリーによって測定してＰｄｘ１陽性である、請求項３８または３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む前記細胞クラスター中の細胞の最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、または最大約１５％が、フローサイトメトリーによって測定してＣＤＸ２陽性細胞である、請求項３８〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む前記細胞クラスター中の細胞の最大約１５％が、フローサイトメトリーによって測定してＣＤＸ２陽性細胞である、請求項３８〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記培養培地が、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子、ＦＧＦファミリーからの増殖因子、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、プロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される分化因子をさらに含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記培養培地が、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子をさらに含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
（ａ）原始腸管細胞を含む細胞の集団を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤と、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子と、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とを含む培養培地中で培養することによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成するステップ；および
（ｂ）前記ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む前記細胞クラスターを、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターに分化させるステップ
を含む方法。
【請求項４６】
フローサイトメトリーによって測定して、少なくとも約５０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、最大約３０％クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞、および最大約３０％ＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞クラスター。
【請求項４７】
フローサイトメトリーによって測定して最大約２５％前記ＣＤＸ２陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む、請求項４６に記載の細胞クラスター。
【請求項４８】
フローサイトメトリーによって測定して最大約２０％前記ＣＤＸ２陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む、請求項４６に記載の細胞クラスター。
【請求項４９】
フローサイトメトリーによって測定して最大約２５％前記ＣＨＧＡ陽性細胞を含む、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項５０】
フローサイトメトリーによって測定して最大約１０％前記ＣＨＧＡ陽性細胞を含む、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項５１】
フローサイトメトリーによって測定して最大約５％前記ＣＨＧＡ陽性細胞を含む、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項５２】
フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約６０％前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項５３】
フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約６５％前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む、請求項４６〜５１のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項５４】
前記細胞クラスターのさらなる分化の結果として、非ネイティブ膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約５０％前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞と３０％より多くの前記クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞または３０％より多くの前記ＣＤＸ２陽性細胞とを含む比較可能な細胞クラスターから分化した前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む第２の細胞クラスターより高いグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を有する第１の細胞クラスターが生じる、請求項４６〜５３のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項５５】
請求項４６〜５４のいずれか一項に記載の細胞クラスターと、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤と、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子とを含む組成物。
【請求項５６】
ＢＭＰシグナル伝達経路の前記阻害剤が、ＤＭＨ−１またはその誘導体を含む、請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
約０．０１μＭ〜約１０μＭ、約０．０５μＭ〜約５μＭ、約０．１μＭ〜約１μＭ、または約０．１５μＭ〜約０．５μＭのＤＭＨ−１を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５８】
約０．２５μＭのＤＭＨ−１を含む、請求項５６に記載の組成物。
【請求項５９】
ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの前記増殖因子が、アクチビンＡを含む、請求項５５〜５８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６０】
約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６１】
少なくとも約５ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６２】
約２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む、請求項５９に記載の組成物。
【請求項６３】
線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーからの増殖因子、ソニックヘッジホグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子、プロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤からなる群から選択される分化因子をさらに含む、請求項５５〜６２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６４】
前記細胞クラスターが、培養培地中にある、請求項５５〜６３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６５】
約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をさらに含む、請求項５５〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６６】
約０．０５％（ｗ／ｖ）ＨＳＡをさらに含む、請求項５５〜６４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約６０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞および最大約４０％ＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞クラスター。
【請求項６８】
フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約７０％前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む、請求項６７に記載の細胞クラスター。
【請求項６９】
フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約８５％前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む、請求項６７に記載の細胞クラスター。
【請求項７０】
フローサイトメトリーによって測定して最大約３０％前記ＣＤＸ２陽性細胞を含む、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項７１】
フローサイトメトリーによって測定して最大約２０％前記ＣＤＸ２陽性細胞を含む、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項７２】
フローサイトメトリーによって測定して最大約１５％前記ＣＤＸ２陽性細胞を含む、請求項６７〜６９のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項７３】
前記細胞クラスターのさらなる分化の結果として、非ネイティブ膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約６０％前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞と４０％より多くの前記ＣＤＸ２陽性細胞とを含む比較可能な細胞クラスターから分化した前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む第２の細胞クラスターより高いグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を有する第１の細胞クラスターが生じる、請求項６７〜７２のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項７４】
ヒト血清アルブミンを含む培養培地中の請求項６７〜７３のいずれか一項に記載の細胞クラスターを含む組成物。
【請求項７５】
前記培養培地が、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含む、請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
前記培養培地が、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子、ＦＧＦファミリーからの増殖因子、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、プロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される分化因子をさらに含む、請求項７４または７５に記載の組成物。
【請求項７７】
原始腸管細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、および形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子と接触させることにより、前記原始腸管細胞の分化から得られる、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、前記接触を伴わない原始腸管細胞の分化から得られた比較可能な細胞クラスターと比較してより多い１立方マイクロメートル当たりの前記非ネイティブ膵臓β細胞の数を有する細胞クラスター。
【請求項７８】
前記比較可能な細胞クラスターと比較して少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、または１．６倍多い、１立方マイクロメートル当たりの前記非ネイティブ膵臓β細胞の数を有する、請求項７７に記載の細胞クラスター。
【請求項７９】
原始腸管細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、および形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子と接触させることにより、前記原始腸管細胞の分化から得られる、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、前記接触を伴わない原始腸管細胞の分化から得られた比較可能な細胞クラスターと比較してより多いインスリン分泌をグルコース負荷に応答して示す細胞クラスター。
【請求項８０】
前記比較可能な細胞クラスターと比較して少なくとも約１．２、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５倍多いインスリン分泌を示す、請求項７９に記載の細胞クラスター。
【請求項８１】
前記比較可能な細胞クラスターと比較してより高いＧＳＩＳ刺激指数を示す、請求項７９または８０に記載の細胞クラスター。
【請求項８２】
前記細胞クラスターの前記ＧＳＩＳ刺激指数が、前記比較可能な細胞クラスターのものより少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、または少なくとも約３倍高い、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項８３】
前記非ネイティブ膵臓β細胞を含む前記細胞クラスターの前記ＧＳＩＳ刺激指数が、前記比較可能な細胞クラスターのものより少なくとも約３倍高い、請求項７９〜８１のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項８４】
前記ＧＳＩＳ刺激指数が、第１のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌の、第２のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌に対する比として計算される、請求項８１〜８３のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項８５】
前記第１のグルコース濃度が、約１０〜約５０ｍＭであり、前記第２のグルコース濃度が、約１ｍＭ〜５ｍＭである、請求項８４に記載の細胞クラスター。
【請求項８６】
前記第１のグルコース濃度が、約２０ｍＭであり、前記第２のグルコース濃度が、約２．８ｍＭである、請求項８４に記載の細胞クラスター。
【請求項８７】
前記非ネイティブ膵臓β細胞が、グルコース負荷に曝露されたときにｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を示す、請求項７７〜８６のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項８８】
前記非ネイティブ膵臓β細胞が、第１のＫ＋濃度に応答してインスリン分泌を示す、請求項７７〜８７のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項８９】
前記比較可能な細胞クラスターと比較してより多いインスリン分泌を第１のＫ＋濃度に応答して示す、請求項７７〜８７のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項９０】
前記比較可能な細胞クラスターと比較して少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．２倍、少なくとも約３．４倍、少なくとも約３．６倍、少なくとも約３．８倍、少なくとも約４倍多いインスリン分泌を第１のＫ＋濃度に応答して示す、請求項７７〜８７のいずれか一項に記載の細胞クラスター。
【請求項９１】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法に従って産生された非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスター。
【請求項９２】
請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法に従って産生された非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターを含む医薬組成物。
【請求項９３】
請求項７７〜９０のいずれか一項に記載の細胞クラスターを含む医薬組成物。
【請求項９４】
請求項４６〜９０のいずれか一項に記載の細胞クラスターまたは請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法に従って産生された非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターを含むデバイスであって、対象に植え込まれたときインスリンを産生および放出するように構成されているデバイス。
【請求項９５】
半透膜をさらに含み、前記半透膜が、細胞を前記デバイス内に保持するように、および前記細胞により分泌されるインスリンの透過を可能にするように構成されている、請求項９４に記載のデバイス。
【請求項９６】
前記細胞が、前記半透膜によりカプセル化されている、請求項９５に記載のデバイス。
【請求項９７】
前記半透膜が、多糖またはポリカチオンで製造されている、請求項９５または９６に記載のデバイス。
【請求項９８】
前記半透膜が、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、生分解性ポリウレタン、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、アルギネート、アガロース、アガロースとゼラチン、デキストラン、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースならびにそれらの誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料で製造されている、請求項９５〜９７のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項９９】
前記半透膜が、アルギネートを含む、請求項９５〜９８のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１００】
前記細胞クラスターが、前記半透膜により包囲されたアルギン酸コアを含むマイクロカプセルに封入されている、請求項９５〜９９のいずれか一項に記載のデバイス。
【請求項１０１】
対象を処置する方法であって、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法に従って産生された非ネイティブ膵臓β細胞、請求項４６〜９０のいずれか一項に記載の細胞クラスター、請求項９２もしくは９３に記載の医薬組成物、または請求項９４〜１００のいずれか一項に記載のデバイスを前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項１０２】
前記対象が、代謝障害を有するかまたは代謝障害を発症するリスクが高い、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記対象が、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、および１．５型糖尿病からなる群から選択される糖尿病を有する、請求項１０１または１０２に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
[0001]本願は、２０１７年１１月１５日に出願した米国特許仮出願第６２／５８６，８０８号、および２０１８年５月９日に出願した米国特許仮出願第６２／６６９，１７０号の利益を主張するものであり、前記仮出願の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
[0002]糖尿病は、世界的に大きな医療問題である。２０１５年に国際糖尿病連合（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ｆｅｄｅｒａｔｉｏｎ）により報告されたように、世界中で４億人を超える人々が糖尿病およびその（ｔｉｓ）合併症で苦しんでいる。彼らのうち、５千万人より多くの人々が、インスリン注射を必要とする。異常なインスリン分泌をもたらす、膵島における膵臓β細胞の死滅または機能不全は、糖尿病の原因となり得る。幹細胞由来β細胞の生成は、糖尿病の治療的処置を行うことができる可能性がある、島および膵臓臓器の生成に向けての潜在的に有用な一歩になり得る。幹細胞由来組織によって処置可能であり得る急増している疾患の１つが、糖尿病である。Ｉ型糖尿病は、膵島におけるβ細胞の自己免疫性破壊の結果として起こり得る。ＩＩ型糖尿病は、末梢組織インスリン抵抗性およびβ細胞機能不全の結果として起こり得る。糖尿病患者、特に、Ｉ型糖尿病の罹患者は、新しいβ細胞の移植によって治癒され得る可能性がある。ヒト死体の島が移植された患者は、この戦略によって５年以上にわたって独立してインスリンを生産することができるが、この手法は、ドナー島の希少性および質のため制限される。幹細胞からのヒトβ細胞の無制限の供給の生成は、この治療を何百万人もの新たな患者に拡大することができ、幹細胞生物学を診療所に移すための重要なテストケースになり得る。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
[0003]一部の態様では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成するための方法であって、Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性原始腸管細胞の集団を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤と形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子とを含む組成物と接触させることによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成するステップを含み、クラスターが、フローサイトメトリーによって測定して最大約３０％ＣＨＧＡ陽性細胞および最大約３０％のＣＤＸ２陽性細胞を含む、方法が、本明細書で開示される。
【０００４】
[0004]一部の実施形態では、方法は、ＰＤＸ１陽性／ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を膵臓β細胞に分化させるステップをさらに含む。
[0005]一部の実施形態では、方法は、ＰＤＸ１陽性／ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を、ＰＤＸ１陽性／ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップをさらに含む。
【０００５】
[0006]一部の実施形態では、方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞をインスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップをさらに含む。
[0007]一部の実施形態では、方法は、インスリン陽性内分泌細胞を膵臓β細胞に分化させるステップをさらに含む。
【０００６】
[0008]一部の態様では、（ａ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性原始腸管細胞を含む細胞の集団を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤とＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子とを含む組成物と接触させることによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成するステップ；および（ｂ）ＰＤＸ１陽性／ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターに分化させるステップを含み；非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターが、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子との接触なしで生成された比較可能な細胞クラスターより高いグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を有する、方法が、本明細書で開示される。
【０００７】
[0009]一部の実施形態では、細胞クラスターのＧＳＩＳ刺激指数は、比較可能な細胞クラスターのものより少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、または少なくとも約３倍高い。一部の実施形態では、細胞クラスターのＧＳＩＳ刺激指数は、比較可能な集団のものより少なくとも約３倍高い。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ刺激指数は、第１のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌の、第２のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌に対する比として計算される。一部の実施形態では、第１のグルコース濃度は、約１０〜約５０ｍＭであり、第２のグルコース濃度は、約１ｍＭ〜５ｍＭである。一部の実施形態では、第１のグルコース濃度は、約２０ｍＭであり、第２のグルコース濃度は、約２．８ｍＭである。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して比較可能な細胞クラスターより高いパーセンテージの非ネイティブ膵臓β細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して比較可能な細胞クラスターより少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、または少なくとも約１．５倍高いパーセンテージの非ネイティブ膵臓β細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して比較可能な細胞クラスターより約１．５倍高いパーセンテージの非ネイティブ膵臓β細胞を含む。
【０００８】
[0010]一部の態様では、（ａ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性原始腸管細胞を含む細胞の集団を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤とＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子とを含む組成物と接触させることによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成するステップ；および（ｂ）ＰＤＸ１陽性／ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターに分化させるステップを含み；非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターが、フローサイトメトリーによって測定して、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子との接触なしで生成された比較可能な細胞クラスターと比較してより高いパーセンテージの非ネイティブ膵臓β細胞を含む、方法が、本明細書で開示される。
【０００９】
[0011]一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して比較可能な細胞クラスターより少なくとも約１．１倍、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．３倍、少なくとも約１．４倍、または少なくとも約１．５倍高いパーセンテージの非ネイティブ膵臓β細胞を含む。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して比較可能な細胞クラスターより約１．５倍高いパーセンテージの非ネイティブ膵臓β細胞を含む。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、比較可能な細胞クラスターと比較してより多いインスリン分泌をグルコース負荷に応答して示す。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、比較可能な細胞クラスターと比較して少なくとも約１．２、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５倍多いインスリン分泌をグルコース負荷に応答して示す。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、比較可能な細胞クラスターと比較してより高いＧＳＩＳ刺激指数を示す。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターのＧＳＩＳ刺激指数は、比較可能な細胞クラスターのものより少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、または少なくとも約３倍高い。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターのＧＳＩＳ刺激指数は、比較可能な細胞クラスターのものより少なくとも約３倍高い。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ刺激指数は、第１のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌の、第２のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌に対する比として計算される。一部の実施形態では、第１のグルコース濃度は、約１０〜約５０ｍＭであり、第２のグルコース濃度は、約１ｍＭ〜５ｍＭである。一部の実施形態では、第１のグルコース濃度は、約２０ｍＭであり、第２のグルコース濃度は、約２．８ｍＭである。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞は、グルコース負荷に曝露されたときにｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を示す。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞は、第１のＫ＋濃度に応答してインスリン分泌を示す。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、比較可能な細胞クラスターと比較してより多いインスリン分泌を第１のＫ＋濃度に応答して示す。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、比較可能な細胞クラスターと比較して少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．２倍、少なくとも約３．４倍、少なくとも約３．６倍、少なくとも約３．８倍、少なくとも約４倍多いインスリン分泌を第１のＫ＋濃度に応答して示す。一部の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、ＤＭＨ−１、その誘導体、類似体または変異体を含む。一部の実施��態では、組成物は、約０．０１μＭ〜約１０μＭ、約０．０５μＭ〜約５μＭ、約０．１μＭ〜約１μＭ、または約０．１５μＭ〜約０．５μＭのＤＭＨ−１を含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．２５μＭのＤＭＨ−１を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子は、アクチビンＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、約２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＦＧＦファミリーからの増殖因子、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、プロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される分化因子をさらに含む。
【００１０】
[0012]一部の態様では、Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性原始腸管細胞を含む細胞の集団を、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培養培地中で分化させることによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成するステップを含む方法が、本明細書で開示される。
【００１１】
[0013]一部の実施形態では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスター中の細胞の少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、または少なくとも約８５％は、フローサイトメトリーによって測定してＰｄｘ１陽性である。一部の実施形態では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスター中の細胞の少なくとも約８５％は、フローサイトメトリーによって測定してＰｄｘ１陽性である。一部の実施形態では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスター中の細胞の最大約４０％、最大約３０％、最大約２０％、または最大約１５％は、フローサイトメトリーによって測定してＣＤＸ２陽性細胞である。一部の実施形態では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスター中の細胞の最大約１５％は、フローサイトメトリーによって測定してＣＤＸ２陽性細胞である。一部の実施形態では、培養培地は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子、ＦＧＦファミリーからの増殖因子、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、プロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される分化因子をさらに含む。一部の実施形態では、培養培地は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子をさらに含む。
【００１２】
[0014]一部の態様では、（ａ）原始腸管細胞を含む細胞の集団を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤と、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子と、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）とを含む培養培地中で培養することによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを生成するステップ；および（ｂ）ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスターを、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターに分化させるステップを含む方法が、本明細書で開示される。
【００１３】
[0015]一部の態様では、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約５０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、最大約３０％クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞、および最大約３０％ＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞クラスターが、本明細書で開示される。
【００１４】
[0016]一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して最大約２５％ＣＤＸ２陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して最大約２０％ＣＤＸ２陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して最大約２５％ＣＨＧＡ陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して最大約１０％ＣＨＧＡ陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して最大約５％ＣＨＧＡ陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約６０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約６５％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む。
【００１５】
[0017]一部の実施形態では、細胞クラスターのさらなる分化の結果として、非ネイティブ膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約５０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞と３０％より多くのクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞または３０％より多くのＣＤＸ２陽性細胞とを含む比較可能な細胞クラスターから分化した非ネイティブ膵臓β細胞を含む第２の細胞クラスターより高いグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を有する第１の細胞クラスターが生じる。
【００１６】
[0018]一部の態様では、本明細書で開示される細胞クラスターと、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤と、形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子とを含む組成物が、本明細書で開示される。一部の実施形態では、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、ＤＭＨ−１またはその誘導体を含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．０１μＭ〜約１０μＭ、約０．０５μＭ〜約５μＭ、約０．１μＭ〜約１μＭ、または約０．１５μＭ〜約０．５μＭのＤＭＨ−１を含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．２５μＭのＤＭＨ−１を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子は、アクチビンＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも約５ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、約２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡを含む。一部の実施形態では、組成物は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーからの増殖因子、ソニックヘッジホグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子、プロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤からなる群から選択される分化因子をさらに含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、培養培地中にある。一部の実施形態では、組成物は、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）をさらに含む。一部の実施形態では、組成物は、約０．０５（ｗ／ｖ）ＨＳＡをさらに含む。
【００１７】
[0019]一部の態様では、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約６０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞および最大約４０％ＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞クラスターが、本明細書で開示される。
【００１８】
[0020]一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約７０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約８５％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して最大約３０％ＣＤＸ２陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して最大約２０％ＣＤＸ２陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、フローサイトメトリーによって測定して最大約１５％ＣＤＸ２陽性細胞を含む。
【００１９】
[0021]一部の実施形態では、細胞クラスターのさらなる分化の結果として、非ネイティブ膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約６０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞と４０％より多くのＣＤＸ２陽性細胞とを含む比較可能な細胞クラスターから分化した非ネイティブ膵臓β細胞を含む第２の細胞クラスターより高いグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を有する第１の細胞クラスターが生じる。
【００２０】
[0022]一部の態様では、ヒト血清アルブミンを含む培養培地中の本明細書で開示される細胞クラスターを含む組成物が、本明細書で開示される。一部の実施形態では、培養培地は、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含む。一部の実施形態では、培養培地は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子、ＦＧＦファミリーからの増殖因子、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、プロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される分化因子をさらに含む。
【００２１】
[0023]一部の態様では、原始腸管細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、および形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子と接触させることにより、原始腸管細胞の分化から得られる、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、接触を伴わない原始腸管細胞の分化から得られた比較可能な細胞クラスターと比較してより多い１立方マイクロメートル当たりの非ネイティブ膵臓β細胞の数を有する細胞クラスターが、本明細書で開示される。
【００２２】
[0024]一部の実施形態では、細胞クラスターは、比較可能な細胞クラスターと比較して少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、または１．６倍多い、１立方マイクロメートル当たりの非ネイティブ膵臓β細胞の数を有する。
【００２３】
[0025]一部の態様では、原始腸管細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、および形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子と接触させることにより、原始腸管細胞の分化から得られる、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターであって、接触を伴わない原始腸管細胞の分化から得られた比較可能な細胞クラスターと比較してより多いインスリン分泌をグルコース負荷に応答して示す細胞クラスターが、本明細書で開示される。
【００２４】
[0026]一部の実施形態では、細胞クラスターは、比較可能な細胞クラスターと比較して少なくとも約１．２、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５倍多いインスリン分泌を示す。一部の実施形態では、細胞クラスターは、比較可能な細胞クラスターと比較してより高いＧＳＩＳ刺激指数を示す。一部の実施形態では、細胞クラスターのＧＳＩＳ刺激指数は、比較可能な細胞クラスターのものより少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、または少なくとも約３倍高い。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターのＧＳＩＳ刺激指数は、比較可能な細胞クラスターのものより少なくとも約３倍高い。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ刺激指数は、第１のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌の、第２のグルコース濃度に応答してのインスリン分泌に対する比として計算される。一部の実施形態では、第１のグルコース濃度は、約１０〜約５０ｍＭであり、第２のグルコース濃度が、約１ｍＭ〜５ｍＭである。一部の実施形態では、第１のグルコース濃度は、約２０ｍＭであり、第２のグルコース濃度は、約２．８ｍＭである。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞は、グルコース負荷に曝露されたときにｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を示す。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞は、第１のＫ＋濃度に応答してインスリン分泌を示す。一部の実施形態では、細胞クラスターは、比較可能な細胞クラスターと比較してより多いインスリン分泌を第１のＫ＋濃度に応答して示す。一部の実施形態では、細胞クラスターは、比較可能な細胞クラスターと比較して少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．２倍、少なくとも約３．４倍、少なくとも約３．６倍、少なくとも約３．８倍、少なくとも約４倍多いインスリン分泌を第１のＫ＋濃度に応答して示す。
【００２５】
[0027]一部の態様では、本明細書で開示される方法に従って産生された非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターが、本明細書で開示される。
[0028]一部の態様では、本明細書で開示される方法に従って産生された非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターを含む医薬組成物が、本明細書で開示される。
【００２６】
[0029]一部の態様では、本明細書で開示される細胞クラスターを含む医薬組成物が、本明細書で開示される。
[0030]一部の態様では、本明細書で開示される細胞クラスターまたは本明細書で開示される方法に従って産生された非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターを含むデバイスであって、対象に植え込まれたときにインスリンを産生し、放出するように構成されているデバイスが、本明細書で開示される。
【００２７】
[0031]一部の実施形態では、デバイスは、半透膜をさらに含み、半透膜は、細胞をデバイス内に保持するように、および細胞により分泌されるインスリンの透過を可能にするように構成されている。一部の実施形態では、細胞は、半透膜によりカプセル化されている。一部の実施形態では、半透膜は、多糖またはポリカチオンで製造されている。一部の実施形態では、半透膜は、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、生分解性ポリウレタン、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、アルギネート、アガロース、アガロースとゼラチン、デキストラン、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースならびにそれらの誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、ならびにそれらの任意の組合せからなる群から選択される材料で製造されている。一部の実施形態では、半透膜は、アルギネートを含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、半透膜により包囲されたアルギン酸コアを含むマイクロカプセル内に封入されている。
【００２８】
[0032]一部の態様では、対象を処置する方法であって、本明細書で開示される方法に従って産生された非ネイティブ膵臓β細胞、本明細書で開示される細胞クラスター、本明細書で開示される医薬組成物、または本明細書で開示されるデバイスを対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で開示される。
【００２９】
[0033]一部の実施形態では、対象は、代謝障害を有するかまたは代謝障害を発症するリスクが高い。一部の実施形態では、対象は、Ｉ型糖尿病、ＩＩ型糖尿病、および１．５型糖尿病からなる群から選択される糖尿病を有する。
【００３０】
[0034]一部の実施形態では、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団を含む組成物であって、細胞が、グルコースでの誘導時に分泌されるインスリンの量と比較してより多い量のインスリンをＫＣｌでの誘導時に分泌する、組成物が、本明細書で提供される。一部の実施形態では、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団は、グルコースでの誘導時に分泌されるインスリンの量と比較して少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍多い量のインスリンをＫＣｌでの誘導時に分泌する。一部の実施形態では、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団は、とある量のシグナル伝達因子と接触される。
【００３１】
[0035]一部の実施形態では、シグナル伝達因子は、シグナル伝達因子と接触されない対応組成物と比較してインスリン産生の増加をもたらすのに十分な量で提供される。一部の実施形態では、増加は、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６または７倍増加である。
【００３２】
[0036]一部の実施形態では、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団を含む組成物であって、細胞が、ＫＣｌおよび／またはグルコースでの誘導時に、シグナル伝達因子の非存在下の比較可能な細胞と比較してより多い量のインスリンをシグナル伝達因子の存在下で分泌する、組成物も、本明細書で提供される。一部の実施形態では、細胞は、高グルコースの存在下ではより多量のインスリンを分泌するが、低グルコースの存在下では分泌しない。
【００３３】
[0037]一部の実施形態では、フローサイトメトリーによって判定して少なくとも６０％膵臓β細胞を含む、分化膵臓前駆細胞の集団も、本明細書で提供される。一部の実施形態では、集団は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％膵臓β細胞を含む。
【００３４】
[0038]一部の実施形態では、集団は、所定の基礎培地成分と接触させると、基礎培地成分と接触させていない比較可能な集団と比較してより高いパーセンテージの膵臓β細胞を含む。
【００３５】
[0039]一部の実施形態では、インスリン産生細胞を含むデバイスを対象に植え込むステップを含む方法であって、デバイスが対象の血糖値の低下に十分な量のインスリンを放出する、方法も、本明細書で提供される。一部の実施形態では、インスリン産生細胞は、グルコース応答性インスリン産生細胞である。一部の実施形態では、対象における血糖値の低下の結果として、グルコースの量が糖尿病閾値より低くなる。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物対象である。一部の実施形態では、哺乳動物対象は、ヒトである。一部の実施形態では、グルコースの量は、植え込みから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日後に糖尿病閾値より低い値に低下される。
【００３６】
[0040]一部の実施形態では、前駆細胞の集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏで膵臓β細胞の集団に分化させる方法であって、基礎培地成分を含む培養培地中で、浮遊状態で、前駆細胞の集団を培養するステップを含み、分化後の膵臓β細胞の集団のパーセンテージが、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％である、方法も、本明細書で提供される。一部の実施形態では、前駆細胞の集団は、胚性幹細胞の集団である。一部の実施形態では、前駆細胞の集団は、Ｏｃｔ４発現細胞の部分集団を含む。一部の実施形態では、Ｏｃｔ４発現細胞の部分集団のパーセンテージは、少なくとも９０％である。一部の実施形態では、膵臓β細胞の集団は、幹細胞由来β細胞の集団である。一部の実施形態では、培養培地は、０．１Ｌ、０．５Ｌ、または３Ｌの培地を含む。一部の実施形態では、分化後の膵臓β細胞の集団は、少なくとも２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０以上の刺激指数を有する。一部の実施形態では、刺激指数は、シグナル伝達因子を含む条件で決定される。
【００３７】
[0041]一部の実施形態では、本開示の方法に従って産生された、単離された膵臓β細胞の組成物が、本明細書で提供される。本開示の方法に従って産生された、単離された膵臓β細胞の医薬組成物が、本明細書で提供される。対象を処置する方法であって、本開示の方法に従って産生された、単離された膵臓β細胞を、対象に投与するステップを含む方法が、本明細書で提供される。
【００３８】
[0042]一部の実施形態では、少なくとも約２０％、３０％、４０％、または５０％ＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを含む組成物も、本明細書で開示される。一部の実施形態では、細胞の集団または細胞クラスターは、少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または８５％ＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の集団または細胞クラスターは、少なくとも約３０％、４０％、５０％、または５５％Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、細胞の集団または細胞クラスターは、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、または９５％ＣＨＧＡ＋細胞を含む。
【００３９】
[0043]一部の態様では、本開示は、島細胞産生を規模拡大するための組成物および方法に関する。一部の実施形態では、幹細胞の培養を、最大０．１Ｌに、最大０．２Ｌに、最大０．５Ｌに、最大１Ｌに、最大１．５Ｌに、最大２Ｌに、最大２．５Ｌに、最大３Ｌに、最大３．５Ｌに、最大４Ｌに、最大４．５Ｌに、または最大５Ｌに規模拡大することができる。一部の実施形態では、幹細胞の培養を最大６Ｌ、７Ｌ、８Ｌ、９Ｌまたは１０Ｌに規模拡大することができる。
【００４０】
[0044]本開示のさらなる態様および利点は、本開示の単に説明に役立つ実施形態が示され、記載される下記の詳細な説明から、当業者には容易に明らかになる。実現されることになる場合、本開示は、他のおよび異なる実施形態が可能であり、そのいくつかの詳細は、様々な明らかな点での変更が、すべて本開示を逸脱しない範囲で可能である。したがって、図面および説明は、本来、説明に役立つものと見なすべきであり、制限的なものと見なすべきではない。
【００４１】
参照による組込み
[0045]本明細書中で言及されるすべての公表文献、特許および特許出願は、個々の公表文献、特許または特許出願の各々が参照により組み込まれると具体的かつ個々に示されている場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００４２】
[0046]本開示の新規特徴は、添付の特許請求の範囲に詳細に示される。本開示の特徴および利点のよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、説明に役立つ実施形態を示す以下の詳細な説明、および付属の図面を参照することにより、得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４３】
【図１】[0047]島細胞集団についての３つの例示的な候補細胞株を表す。
【図２Ａ】[0048]図２Ａは、胚性幹細胞（ＥＳＣ）の例示的な２Ｄ培養物の形態を表す。
【図２Ｂ】[0049]図２Ｂは、例示的な２Ｄ培養物の細胞表面マーカーＳｏｘ１７またはＯｃｔ４を発現するＥＳＣのパーセンテージを表す。
【図３Ａ】[0050]図３Ａは、オンターゲットおよびオフターゲット前駆細胞についてのフローサイトメトリーデータ例を表す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、オンターゲットおよびオフターゲット前駆細胞についてのフローサイトメトリーデータ例を表す。
【図４】[0051]図４Ａは、３つの異なるプロトコールを使用して産生した例示的な幹細胞由来β（ＳＣ−β）細胞の比較を表す。図４Ｂは、３つの異なるプロトコールを使用して産生された例示的な幹細胞由来β（ＳＣ−β）細胞の比較を表す。
【図５】[0052]例示的なＳＣ−β細胞および天然膵島細胞の画像を表す。
【図６Ａ】[0053]図６Ａは、本明細書で開示される例示的な方法を使用して分化させたステージ４細胞に対する例示的な分化因子（ＬＤＮ）の効果を表す。
【図６Ｂ】図６Ｂは、本明細書で開示される例示的な方法を使用して分化させたステージ４細胞に対する例示的な分化因子（ＤＭＨ−１およびアクチビンＡ）の効果を表す。
【図６Ｃ】図６Ｃは、例示的な因子（ＤＭＨ−１およびアクチビンＡ）の漸増濃度で産生されたＳＣ−β細胞を使用するグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイの結果の例を表す。
【図７】[0054]低または高グルコース刺激での天然島細胞のインスリン分泌と例示的なＳＣ−β細胞のインスリン分泌の比較を表す。
【図８】[0055]ＳＣ−β細胞産物についてのプロセス開発目標を表す。
【図９Ａ】[0056]図９Ａは、ＳＣ−β細胞の例示的な０．１Ｌ培養の細胞画像を表す。
【図９Ｂ】[0057]図９Ｂは、ＳＣ−β細胞の例示的な０．５Ｌ培養の細胞画像を表す。
【図９Ｃ】[0058]図９Ｃは、ＳＣ−β細胞の例示的な３．０Ｌ培養の細胞画像を表す。
【図９Ｄ】[0059]図９Ｄは、ＳＣ−β細胞の例示的な０．１Ｌ、０．５Ｌおよび３Ｌ培養の拡大倍数を表す。
【図９Ｅ】[0060]図９Ｅは、ＳＣ−β細胞の例示的な０．１Ｌ、０．５Ｌおよび３Ｌ培養におけるＯｃｔ４発現細胞のパーセンテージを表す。
【図１０】[0061]凍結保存ＳＣ−β細胞のインスリン分泌と新鮮なＳＣ−β細胞のインスリン分泌の比較を表す。
【図１１】[0062]移植したＳＣ−島移植片の６ヶ月の時点での画像を表す。
【図１２】[0063]動物モデルにおけるＳＣ−β細胞植え込み前または後およびＳＣ−β細胞外植前または後の血糖値の結果の例を表す。
【図１３】[0064]例示的な分化細胞集団の比較を表す。
【図１４】[0065]カプセル化前およびマウスへの植え込みから３ヶ月後の例示的なＳＣ−島細胞の画像を表す。
【図１５】[0066]例示的なＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤ＬＤＮ１９３１８９（図中の「ＬＤＮ」）およびＤＭＨ−１の効果の一例を示す略図である。
【発明を実施するための形態】
【００４４】
[0067]以下の説明および例は、本開示の実施形態を詳細に例証するものである。本開示が、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、したがって変わることがあることを、理解されたい。本開示には本開示の範囲内に包含される非常に多くの変形形態および修飾形態があることは、当業者には理解されるであろう。
【００４５】
[0068]すべての用語は、当業者によって理解されるように理解されることを意図したものである。別段の定義がない限り、本明細書で使用されるすべての専門および科学用語は、本開示が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００４６】
[0069]本明細書で使用される節の見出しは、単に構成のためのものであり、記載される主題を限定すると見なすべきでない。
[0070]本開示の様々な特徴は、単一の実施形態に関連して説明されることがあるが、それらの特徴が別々に、または任意の好適な組合せで提供されることもある。逆に、本開示は、明確にするために別々の実施形態に関連して本明細書で説明されることがあるが、本開示が単一の実施形態で実行されることもある。
【００４７】
定義
[0071]以下の定義は、当技術分野における定義を補うものであり、本願に関するものであり、いずれかの関連および非関連ケースに、例えば、いずれかの所有者共通の特許および出願に、帰属するものではない。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を本開示の試験の実施に使用することができるが、好ましい材料および方法が本明細書に記載される。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態の説明を目的にしたものに過ぎず、限定となることを意図したものではない。
【００４８】
[0072]本願では、単数形の使用は、別段の記述がない限り、複数形を含む。本明細書で使用される場合、文脈による別段の明白な指図がない限り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」が複数の指示対象を含むことに、留意しなければならない。
【００４９】
[0073]用語「含む（動名詞形、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、ならびに他の語形、例えば、「含む（動詞一般形、ｉｎｄｌｕｄｅ）」、「含む（動詞三人称単数現在形、ｉｎｄｌｕｄｅｓ）」および「含む（分詞形、ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」の使用は、限定的でない。
【００５０】
[0074]本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「含む（動名詞形、ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに含む（動名詞形）の任意の語形、例えば、「含む（動詞一般形、ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」および「含む（動詞三人称単数現在形、ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」）、「有する（動名詞形、ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに有する（動名詞形）の任意の語形、例えば、「有する（動詞一般形、ｈａｖｅ）」および「有する（動詞三人称単数現在形、ｈａｓ）」）、「含む（動名詞形、ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに含む（動名詞形）の任意の語形、例えば、「含む（動詞三人称単数現在形、ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（動詞一般形、ｉｎｃｌｕｄｅ）」）、または「含有する（動名詞形、ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに含有する（動名詞形）の任意の語形、例えば、「含有する（動詞三人称単数現在形、ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（動詞一般形、ｃｏｎｔａｉｎ）」）という語は、包括的または非限定的であり、追加の、述べられていない要素および方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態を本開示の任意の方法または組成物に関して実行することができること、および逆に、本開示の任意の方法または組成物を本明細書で論じられる任意の実施形態に関して実行することができることが企図される。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を果たすことができる。
【００５１】
[0075]本明細書で使用される場合の参照数値およびその文法的等価表現に関する「約」という用語は、その数値自体、およびその数値からプラスまたはマイナス１０％の範囲の値を含むことができる。
【００５２】
[0076]「約」または「おおよそ」という用語は、当業者により決定されるような特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味し、この誤差の範囲は、値が測定または決定される方法、例えば、測定システムの限界に、ある程度、依存することになる。例えば、「約」は、当技術分野での実務に従って、１以内の標準偏差を意味することもあり、または１より大きい標準偏差を意味することもある。あるいは、「約」は、所与の値の２０％以下、１０％以下、５％以下、または１％以下の範囲を意味することもある。別の例では、「約１０」という量は、１０と、９〜１１の任意の量とを含む。さらに別の例では、参照数値に関して「約」という用語は、その値からプラスまたはマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲の値も含むことができる。あるいは、特に生体系または生物学的プロセスに関して、「約」という用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。特定の値が、本願および特許請求の範囲に記載されている場合、別段の記述がない限り、特定の値についての許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を想定すべきである。
【００５３】
[0077]本明細書で使用される場合の「糖尿病」という用語およびその文法的等価表現は、長期間にわたる高い血糖値を特徴とする疾患を指すことができ、そのような疾患である。例えば、本明細書で使用される場合の「糖尿病」という用語およびその文法的等価表現は、１型、２型、嚢胞性線維症関連、外科的、妊娠糖尿病、およびミトコンドリア糖尿病を含む、すべてのまたは任意の型の糖尿病を指すことができる。一部のケースでは、糖尿病は、遺伝性糖尿病の一形態であり得る。
【００５４】
[0078]「内分泌細胞」という用語は、特に明記されていない場合、「島」、「島細胞」、「島等価物」、「島様細胞」、「膵島」およびそれらの文法的等価表現などの、生物の膵臓に存在するホルモン産生細胞を指すことができる。ある実施形態では、内分泌細胞を膵臓前駆細胞または先駆体から分化させることができる。島細胞は、膵臓α細胞、膵臓β細胞、膵臓δ細胞、膵臓Ｆ細胞、および／または膵臓ε細胞を含むがこれらに限定されない、種々の型の細胞を含むことができる。島細胞は、細胞群、細胞クラスターなども指すことができる。
【００５５】
[0079]「前駆」細胞および「先駆」細胞という用語は、本明細書では同義で使用され、それが分化によって生じさせることができる細胞と比べて原始的である（例えば、完全分化細胞になるよりも前の発生経路または進行段階にある）細胞表現型を有する細胞を指すことができる。多くの場合、前駆細胞は、有意なまたは非常に高い増殖能も有することができる。前駆細胞は、発生経路に依存して、および細胞が発生し、分化する環境に依存して、複数の明確に異なる分化細胞型を生じさせることもあり、または単一の分化細胞型を生じさせることもある。
【００５６】
[0080]インスリン陽性内分泌細胞に関する用語としての「その先駆体」は、例えば、多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、膵臓前駆細胞または内分泌前駆細胞を含む、インスリン陽性内分泌細胞に分化することが、先駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化に好適な条件下で培養されたとき可能である、任意細胞を指すことができる。
【００５７】
[0081]「幹細胞由来β細胞」、「ＳＣ−β細胞」、「機能性β細胞」、「機能性膵臓β細胞」、「成熟ＳＣ−β細胞」という用語、およびそれらの文法的等価表現は、膵臓β細胞を示唆する少なくとも１つのマーカー（例えば、ＰＤＸ−１またはＮＫＸ６．１）を提示し、インスリンを発現し、内在性成熟β細胞に特有のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を示す、細胞（例えば、非ネイティブ膵臓β細胞）を指すことができる。一部の実施形態では、本明細書で使用される場合の「ＳＣ−β細胞」および「非ネイティブβ細胞」という用語は、置き換え可能である。一部の実施形態では、「ＳＣ−β細胞」は、成熟膵臓細胞を含む。本開示の方法は、任意の細胞を出発点として使用して任意のインスリン陽性内分泌細胞またはその先駆体からＳＣ−β細胞を誘導することが可能であるので、ＳＣ−β細胞が幹細胞に（例えば、直接）由来する必要がない（例えば、本発明はこのように限定されることを意図したものではないので、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、前駆細胞、部分的にリプログラミングされた体細胞（例えば、人工多能性幹細胞とそれが得られた元の体細胞との間の中間状態に部分的にリプログラミングされた体細胞）、複能性細胞、全能性細胞、前述の細胞のいずれかの分化転換バージョンを使用することができる）ことを理解されたい。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、複数回のグルコース負荷（例えば、少なくとも１回、少なくとも２回、または少なくとも３回以上の逐次的グルコース負荷）に対して応答を示す。一部の実施形態では、応答は、複数回のグルコース負荷に対する内在性島（例えば、ヒト島）の応答に似ている。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞の形態は、内在性β細胞の形態に似ている。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、内在性β細胞のＧＳＩＳ応答に似ているｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＳＩＳ応答を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、内在性β細胞のＧＳＩＳ応答に似ているｉｎ  ｖｉｖｏ  ＧＳＩＳ応答を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、内在性β細胞のＧＳＩＳ応答に似ているｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ  ＧＳＩＳ応答を示す。ＳＣ−β細胞のＧＳＩＳ応答を、ＳＣ−β細胞の宿主（例えば、ヒトまたは動物）への移植から２週間以内に観察することができる。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、分泌顆粒内にパッケージングされる。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、カプセル化された結晶性インスリン顆粒を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１より大きい刺激指数を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１．１より大きい刺激指数を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、２より大きい刺激指数を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、サイトカインに応答してサイトカイン誘導アポトーシスを示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞からのインスリンの分泌は、公知の抗糖尿病薬（例えば、分泌促進物質）に応答して増進される。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、単ホルモン性である。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、グルカゴン、ソマトスタチンまたは膵臓ポリペプチドなどの、他のホルモンを異常に共発現しない。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、低い複製速度を示す。一部の��施形態では、ＳＣ−β細胞は、グルコースに応答して細胞内Ｃａ２＋を増加させる。
【００５８】
[0082]本明細書で使用される場合、「インスリン産生細胞」という用語およびその文法的等価表現は、インスリンを分泌する膵臓前駆体、またはその先駆体、から分化した細胞を指すことができる。インスリン産生細胞は、本明細書でその用語が説明される通りの膵臓β細胞はもちろん、構成的または誘導性方式でインスリンを合成する（例えば、インスリン遺伝子を転写する、プロインスリンｍＲＮＡを翻訳する、およびプロインスリンｍＲＮＡを修飾してインスリンタンパク質にする）、発現する（例えば、インスリン遺伝子が有する表現型形質を現す）または分泌する（例えば、インスリンを細胞外空間に放出する）、膵臓β様細胞（例えば、インスリン陽性内分泌細胞）も含むことができる。例えば、本開示の方法に従ってインスリン陽性の内分泌細胞またはその先駆体をＳＣ−β細胞に分化させることにより産生される、インスリン産生細胞の集団は、膵臓β細胞であることもあり、または内在性β細胞の特徴を示しているβ様細胞（例えば、少なくとも１つ、もしくは少なくとも２つ最低限２つを有する細胞）であることもあり、内在性成体β細胞に似ているグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を示すことができる。例えば、本明細書で開示の方法により産生される、インスリン産生細胞の集団は、成熟膵臓β細胞またはＳＣ−β細胞を含むことができ、非インスリン産生細胞（例えば、インスリンを産生も分泌もしないことを除いて細胞様表現型の細胞）を含有することもできる。
【００５９】
[0083]「インスリン陽性β様細胞」、「インスリン陽性内分泌細胞」という用語、およびそれらの文法的等価表現は、膵臓β細胞を示唆する少なくとも１つのマーカーを示す、およびまたインスリンを発現するが、内在性β細胞に特有のグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を欠く、細胞（例えば、膵臓内分泌細胞）を指すことができる。
【００６０】
[0084]「β細胞マーカー」という用語は、膵臓β細胞に特異的に発現されるまたは存在する、タンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多形、スプライス変異体、タンパク質または核酸の断片、エレメントならびに他の分析物を、限定ではないが、指す。例示的なβ細胞マーカーとしては、膵臓および十二指腸ホメオボックス１（Ｐｄｘ１）ポリペプチド、インスリン、ｃ−ペプチド、アミリン、Ｅ−カドヘリン、Ｈｎｆ３β、ＰＣＩ／３、Ｂ２、Ｎｋｘ２．２、ＧＬＵＴ２、ＰＣ２、ＺｎＴ−８、Ｉｓｌ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、１  Ｉｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ−３ベータ、およびＭａｆＡ、ならびにＺｈａｎｇら、Ｄｉａｂｅｔｅｓ．５０（１０）：２２３１〜６（２００１）に記載されているものが挙げられるが、これらに限定されない。
【００６１】
[0085]「膵臓内分泌マーカー」という用語は、膵臓内分泌細胞に特異的に発現されるまたは存在する、タンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多形、スプライス変異体、タンパク質または核酸の断片、エレメントならびに他の分析物を、限定ではないが、指す。例示的な膵臓内分泌細胞マーカーとしては、Ｎｇｎ−３、ＮｅｕｒｏＤ、およびＩｓｌｅｔ−１が挙げられるが、これらに限定されない。
【００６２】
[0086]「膵臓前駆体」、「膵臓内分泌前駆体」、「膵臓先駆体」、「膵臓内分泌先駆体」という用語、およびそれらの文法的等価表現は、本明細書では同義で使用され、膵臓内分泌細胞、膵臓外分泌細胞または膵管細胞を形成することが可能な膵臓ホルモン発現細胞になることが可能である幹細胞を指すことができる。これらの細胞は、少なくとも１つの型の膵臓細胞、例えば、インスリンを産生するβ細胞、グルカゴンを産生するα細胞、ソマトスタチンを産生するδ細胞（もしくはＤ細胞）、および／または膵臓ポリペプチドを産生するＦ細胞への分化が決定している。そのような細胞は、次のマーカーのうちの少なくとも１つを発現することができる：ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ、ＩＳＬ−１、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、またはＡＲＸ。
【００６３】
[0087]本明細書で使用される場合の「Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆体」という用語は、膵臓β細胞などのＳＣ−β細胞に分化する能力がある膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞である細胞を指すことができる。Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆体は、マーカーＰｄｘ１を発現する。他のマーカーとしては、Ｃｄｃｐ１、またはＰｔｆ１ａ、またはＨＮＦ６またはＮＲｘ２．２が挙げられるが、これらに限定されない。Ｐｄｘ１の発現は、当業者に公知の任意の方法、例えば、抗Ｐｄｘ１抗体を使用する免疫化学的検査または定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評定することができる。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、ＮＫＸ６．１の発現を欠く。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、それがＮＫＸ６．１の発現を欠くことから、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞と言われることもある。
【００６４】
[0088]本明細書で使用される場合の「Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆体」という用語は、膵臓β細胞などのインスリン産生細胞に分化する能力がある膵臓内胚葉（ＰＥ）細胞である細胞を指すことができる。Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆体は、マーカーＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現する。他のマーカーとしては、Ｃｄｃｐ１、またはＰｔｆ１ａ、またはＨＮＦ６またはＮＲｘ２．２が挙げられるが、これらに限定されない。ＮＫＸ６．１の発現は、当業者に公知の任意の方法、例えば、抗ＮＫＸ６．１抗体を使用する免疫化学的検査、または定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評定することができる。一部のケースでは、ＮＫＸ６．１タンパク質または遺伝子は、「ＮＫＸ６−１」タンパク質または遺伝子と言われることもある。
【００６５】
[0089]本明細書で使用される場合の「Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆体」という用語は、転写因子ニューロゲニン−３（Ｎｇｎ３）を発現する膵臓内分泌細胞の先駆体を指すことができる。前駆細胞は、複能性幹細胞より多く分化されており、少数の細胞型にしか分化することができない。詳細には、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞には、５つの膵臓内分泌細胞型（α、β、δ、εおよびＰＰ）に分化する能力がある。Ｎｇｎ３の発現は、当業者に公知の任意の方法、例えば、抗Ｎｇｎ３抗体を使用する免疫化学的検査、または定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評定することができる。
【００６６】
[0090]「ＮｅｕｒｏＤ」および「ＮｅｕｒｏＤ１」という用語は、同義で使用され、膵臓内分泌前駆細胞に発現されるタンパク質およびそれをコードする遺伝子を特定するものである。
【００６７】
[0091]「分化（した）細胞」という用語またはその文法的等価表現は、天然の形態では、本明細書でその用語が定義される通りの多能性でない、任意の初代細胞を意図したものである。別の言い方をすると、「分化（した）細胞」という用語は、細胞の分化プロセスであまり特殊化していない細胞型の細胞（例えば、人工多能性幹細胞などの幹細胞）から誘導された、より特殊化した細胞型の細胞を指すことができる。理論に制限されることを望まないが、通常の個体発生過程では、多能性幹細胞は、膵臓細胞を形成することが可能な内胚葉細胞および他の内胚葉細胞型に先ず分化することができる。内胚葉細胞のさらなる分化は膵臓経路につながり、この経路で細胞の約９８％が外分泌、細管またはマトリックス細胞になり、約２％が内分泌細胞になる。初期内分泌細胞は、島前駆体であり、後にこの島前駆体は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチンまたは膵臓ポリペプチドを分泌するインスリン産生細胞（例えば、機能性内分泌細胞）にさらに分化することができる。内胚葉細胞もまた、内胚葉起源の他の細胞、例えば、肺、肝臓、腸、胸腺などに分化することができる。
【００６８】
[0092]本明細書で使用される場合、「体細胞」という用語は、生殖系列細胞の対語として、生物の身体を形成する任意の細胞を指すことができる。哺乳動物の場合、生殖系列細胞（「配偶子」としても公知）は、受精中に融合して接合子と呼ばれる細胞を産生する精子および卵子であり、全哺乳動物胚は、この細胞から発生する。哺乳動物の身体のあらゆる他の細胞型−精子および卵子、それらが作られる細胞（生殖母細胞）、ならびに未分化幹細胞は別として−は、体細胞である：内臓、皮膚、骨、血液および結合組織は、すべて体細胞で構成されている。一部の実施形態では、体細胞は、「非胚性体細胞」であり、「非胚性体細胞」とは、胚に存在も胚から得られもしない体細胞であって、そのような細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖の結果として生じない体細胞を意味する。一部の実施形態では、体細胞は、「成体体細胞」であり、「成体体細胞」とは、胚もしくは胎児以外の生物に存在する細胞、またはそのような生物から得られる細胞、またはそのような細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの増殖の結果として生じる細胞を意味する。別段の指示がない限り、少なくとも１つのインスリン陽性内分泌細胞またはその先駆体を、インスリンを産生するグルコース応答性の細胞に変換するための方法を、ｉｎ  ｖｉｖｏとｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で行うことができる（この場合、ｉｎ  ｖｉｖｏは、少なくとも１つのインスリン陽性内分泌細胞またはその先駆体が対象体内に存在するときに実施され、ｉｎ  ｖｉｔｒｏは、培養で維持されている分離された少なくとも１つのインスリン陽性内分泌細胞またはその先駆体を使用して実施される）。
【００６９】
[0093]本明細書で使用される場合、「成体細胞」という用語は、胚の発生後に体中に見られる細胞を指すことができる。
[0094]本明細書で使用される場合の「内胚葉細胞」という用語は、極初期胚における３つの一次生殖細胞層のうちの１つ（他の２つの生殖細胞層は、中胚葉および外胚葉である）からの細胞を指す。内胚葉は、三層の最内層である。内胚葉細胞は、分化して先ず胚性腸を生じさせ、次いで、気道、消化管（例えば、腸）、肝臓および膵臓の内層を生じさせる。
【００７０】
[0095]本明細書で使用される場合の「内胚葉起源の細胞」という用語は、内胚葉細胞から発生または分化した任意の細胞を指すことができる。例えば、内胚葉起源の細胞は、肝臓、肺、膵臓、胸腺、腸、胃および甲状腺の細胞を含む。理論により拘束されることを望まないが、肝臓前駆体および膵臓前駆体（ｐａｎｃｒｅａｓ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）（膵臓前駆体（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ）とも言われる）は、胚性前腸の内胚葉細胞から発生する。肝臓および膵臓前駆体は、それらの特殊化の直後に、著しく異なる細胞機能および再生能力を急速に獲得する。これらの変化は、脊椎動物間で高度に保存される誘導シグナルおよび遺伝子調節因子によって惹起される。臓器の発生および再生への関心は、肝不全およびＩ型糖尿病の治療的処置における肝細胞および膵臓β細胞に対する強い要求によって強められてきた。多様なモデル生物およびヒトにおける研究によって、肝臓および膵臓細胞の分化を惹起する、進化的に保存された誘導シグナルおよび転写因子ネットワークが解明されてきており、多様な幹細胞および前駆細胞型からの肝細胞およびβ細胞分化を促進する方法の指針が得られている。
【００７１】
[0096]本明細書で使用される場合の「胚体内胚葉」という用語は、内胚葉細胞から分化した細胞であって、ＳＣ−β（例えば、膵臓β細胞）に分化され得る細胞を指すことができる。胚体内胚葉細胞は、マーカーＳｏｘ１７を発現することができる。胚体内胚葉細胞に特有の他のマーカーとしては、ＭＩＸＬ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＸＣＲ４、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グースコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、ＣＭＫＯＲ１およびＣＲＩＰ１が挙げられるが、これらに限定されない。詳細には、本明細書での胚体内胚葉細胞は、Ｓｏｘ１７を発現し、一部の実施形態ではＳｏｘ１７およびＨＮＦ３Ｂを発現するが、有意なレベルのＧＡＴＡ４も、ＳＰＡＲＣも、ＡＰＦも、ＤＡＢも発現しない。胚体内胚葉細胞は、マーカーＰｄｘ１に対して陽性でない（例えば、それらは、Ｐｄｘ１陰性である）。胚体内胚葉細胞には、肝臓、肺、膵臓、胸腺、腸、胃および甲状腺のものを含むもの細胞に分化する能力がある。Ｓｏｘ１７および胚体内胚葉の他のマーカーの発現は、当業者に公知の任意の方法、例えば、免疫細胞化学的検査、例えば抗Ｓｏｘ１７抗体を使用する免疫化学的検査、または定量的ＲＴ−ＰＣＲによって評定することができる。
【００７２】
[0097]「膵臓内胚葉」という用語は、膵臓β細胞を含む複数の膵臓系列への分化が可能であるが、もはや非膵臓系列に分化する能力がない、内胚葉起源の細胞を指すことができる。
【００７３】
[0098]本明細書で使用される場合の「原始腸管細胞」または「腸管細胞」という用語は、内胚葉細胞から分化した細胞であって、ＳＣ−β（例えば、膵臓β細胞）に分化され得る細胞を指すことができる。原始腸管細胞は、次のマーカーのうちの少なくとも１つを発現する：ＨＮＰ１−β、ＨＮＦ３−βまたはＨＮＦ４−α。原始腸管細胞には、肺、肝臓、膵臓、胃および腸のものを含む細胞に分化する能力がある。ＨＮＦ１−βおよび原始腸管の他のマーカーの発現は、当業者に公知の任意の方法、例えば、免疫細胞化学的検査、例えば抗ＨＮＦ１−β抗体を使用する免疫化学的検査によって評定することができる。
【００７４】
[0099]本明細書で使用される場合の「幹細胞」という用語は、増殖およびより多くの前駆細胞を生じさせることが可能である、未分化細胞を指すことができ、前駆細胞には多数の母細胞を生成する能力があり、そしてまたこれらの母細胞は、分化したまたは分化可能な娘細胞を生じさせることができる。娘細胞自体を、増殖するように、および後に１つまたは複数の成熟細胞型に分化するが親の発生能を有する１つまたは複数の細胞を保持もする子孫を産生するように、誘導することができる。「幹細胞」という用語は、特定の状況下では、より特殊化または分化した表現型に分化する能力または潜在能力を有し、ある特定の状況下では、実質的に分化せずに増殖する能力を保持する、前駆体のサブセットを指すことができる。一実施形態では、幹細胞という用語は、末裔（子孫）が、胚細胞および組織の漸進的多様化の中で起こるように分化によって、例えば、完全に個別の特徴を獲得することによって、多くの場合異なる方向に、特殊化する、天然に存在する母細胞を一般に指す。細胞の分化は、多くの細胞分裂によって通常は起こる複雑なプロセスである。分化細胞は、自体が複能性細胞に由来する複能性細胞などに由来することもある。これらの複能性細胞の各々が幹細胞と見なされることもあるが、各々が生じさせることができる細胞型の範囲は、かなり異なり得る。一部の分化細胞は、より発生能が高い細胞を生じさせる能力も有する。そのような能力は、天然であることもあり、または様々な因子での処置によって人工的に誘導されることもある。多くの生物学的事例では、幹細胞は、１つより多くの明確に異なる細胞型の子孫を産生することができるため、「複能性」でもあるが、これは「幹細胞性」には必要でない。自己複製は、幹細胞の定義の他の古典的部分であるが、本文書で使用される場合には不可欠である。理論上は、自己複製は、２つの主要機序のどちらかによって起こり得る。幹細胞は、非対称に分裂することがあり、一方の娘は、幹状態を保持し、他方の娘は、何らかの明確に異なる他の特異的機能および表現型を発現する。あるいは、集団内の幹細胞の一部は、２つの幹へと対称に分裂することができ、したがって、全体として集団内に一部の幹細胞を維持するが、集団内の他の細胞は、分化した子孫のみを生じさせる。形式的には、幹細胞として始まる細胞は、分化した表現型へと進行し得るが、その後、「逆戻り」して幹細胞表現型を再発現すること（当業者によって「脱分化」または「再プログラミング」または「逆分化」と言われることが多い用語）が可能である。本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞」という用語は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胎盤幹細胞などを含む。
【００７５】
[00100]本明細書で使用される場合の「多能性」という用語は、異なる条件下で、１つより多くの分化細胞型に分化する、好ましくは、３つすべての生殖細胞層に特有の細胞型に分化する能力を有する、細胞を指すことができる。多能性細胞は、例えば、ヌードマウス奇形腫形成アッセイを使用して、１つより多くの細胞型に、好ましくは３つすべての胚葉に分化するそれらの能力によって主として特徴付けられる。多能性は、胚性幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても証明されるが、多能性についての好ましい試験は、３つの胚葉の各々の細胞に分化する能力を実証することである。そのような細胞を培養するだけではそれらの細胞が自然に多能性にならないことに留意されたい。リプログラミングされた多能性細胞（例えば、本明細書でその用語が定義される通りのｉＰＳ細胞）は、培養で限られた回数だけ分裂する能力を一般に有する初代細胞親と比べて、増殖能を失わずに長期間継代可能であるという特徴も有する。
【００７６】
[00101]本明細書で使用される場合、「ｉＰＳ細胞」および「人工多能性幹細胞」という用語は、同義で使用され、非多能性細胞、通常は成体体細胞から、例えば、１つまたは複数の遺伝子の強制発現を誘導することによって、人工的に得られる（例えば、誘導される、または完全な逆戻りによる）多能性幹細胞を指すことができる。
【００７７】
[00102]「表現型」という用語は、実際の遺伝子型に関係なく、一連の特定の環境条件および因子のもとで細胞または生物を規定する１つまたは多数の総合的な生物学的特徴を指すことができる。
【００７８】
[00103]「対象」、「患者」、または「個体」という用語は、本明細書では同義で使用され、細胞を得ることができる、および／または本明細書に記載の細胞での、予防的処置を含む、処置が施される、動物、例えばヒトを指すことができる。ヒト対象などの特定の動物に特異的である感染症、状態または病態の処置の場合、対象という用語は、その特定の動物を指すことができる。本明細書において同義で使用される場合の「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」は、哺乳動物、例えば、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、乳牛、ブタおよび非ヒト霊長類を含む。「対象」という用語はまた、哺乳類、爬虫類、両生類および魚類を含むがこれらに限定されない、任意の脊椎動物を包含する。しかし、有利には、対象は、哺乳動物、例えば、ヒト、または他の哺乳動物、例えば、飼育哺乳動物、例えばイヌ、ネコ、ウマなど、もしくは生産哺乳動物、例えば乳牛、ヒツジ、ブタなどである。「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」は、疾患または障害、例えば、糖尿病に限定されないが、糖尿病を有すると診断されたまたは有する疑いがある患者と、本明細書では言われる。
【００７９】
[00104]本明細書で使用される「投与すること」は、本明細書に記載される１つまたは複数の組成物を患者または対象に提供することを指すことができる。例として、限定でなく、組成物投与、例えば注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって行うことができる。１つまたは複数のそのような経路を利用することができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注入法によることもあり、または長期にわたって徐々に灌流することによることもある。代替的に、または同時に、投与は、経口経路によることがある。加えて、投与はまた、細胞のボーラスまたはペレットの外科的堆積によることもあり、または医療デバイスの留置によることもある。ある実施形態では、本開示の組成物は、本明細書に記載される核酸配列を発現する操作された細胞もしくは宿主細胞、または本明細書に記載される少なくとも１つの核酸配列を含むベクターを、増殖性障害の処置または予防に有効である量で含むことができる。医薬組成物は、本明細書に記載の細胞集団を、１つまたは複数の薬学的にまたは生理的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて含むことができる。そのような組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えばグリシン；抗酸化剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；ならびに保存剤を含むことができる。
【００８０】
[00105]単離された細胞に適用される場合の「処置する」、「処置すること」、「処置」という用語、およびそれらの文法的等価表現は、細胞を任意の種類のプロセスもしくは条件に付すこと、または細胞に対する任意の種類の操作もしくは手順を行うことを含む。対象に適用される場合、これらの用語は、個体に医療的または外科的注意、ケアまたは管理を施すことを指すことができる。個体は、通常は、病気であるか、損傷しているか、または集団の平均的メンバーと比べて病気になるリスクが上昇しており、そのような注意、ケアまたは管理を必要とする。
【００８１】
[00106]本明細書で使用される場合、「処置すること」および「処置」は、対象が疾患の少なくとも１つの症状の軽減、または疾患の好転、例えば、有益なもしくは所望の臨床結果を有する（ａｓ）ために有効な量の組成物を、対象に投与することを指すことができる。本発明では、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であるか検出不能であるかを問わず、１つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の低下、安定した（例えば、悪化しない）病態、疾患進行の遅延または緩徐化、病態の改善または緩和、および寛解（部分寛解であるか完全寛解あるかを問わず）を含むが、これらに限定されない。処理することは、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することも指すことができる。したがって、当業者は、処置が、疾患の完全治癒でないこともあるが、疾患状態を改善し得ることが分かる。本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、発症予防を含む。あるいは、処置は、疾患の進行が抑制または停止される場合、「有効」である。「処置」は、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することを意味することもある。処置を必要とする者は、ある心臓の状態を有すると既に診断された者はもちろん、遺伝的感受性、または体重、食事、健康状態などの他の要因に起因して、ある心臓の状態を発症する可能性が高い者も含む。
【００８２】
[00107]「治療有効量」、「治療量」という用語、またはその文法的等価表現は、必要な投薬量で、必要な期間にわたって、所望の治療結果を達成するために有効な量を指すことができる。治療有効量は、個体の病状、年齢、性別および体重、ならびに１または複数の対象において所望の応答を惹起する本明細書に記載される組成物の能力などの、要因によって変わり得る。投与すべき本開示の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍のサイズ、感染または転移の程度、および状態の個体差を考慮して、医師により決定され得る。
【００８３】
[00108]あるいは、患者または対象への本明細書に記載される１つまたは複数の組成物の投与の薬理学的および／または生理学的効果は、「予防的」であることがあり、例えば、効果は、疾患またはその症状を完全にまたは部分的に予防する。「予防有効量」は、必要な投薬量で、必要な期間にわたって、所望の予防結果（例えば、疾患発症の予防）を達成するために有効な量を指すことができる。
【００８４】
[00109]至る所で開示される一部の数値は、例えば、「Ｘは、少なくとももしくは少なくとも約１００；または２００［または任意の数値］である」と言われる。この数値は、その数自体、および下記のすべてを含む：
ｉ）Ｘは、少なくとも１００である；
ｉｉ）Ｘは、少なくとも２００である；
ｉｉｉ）Ｘは、少なくとも約１００である；および
ｉｖ）Ｘは、少なくとも約２００である。
【００８５】
[00110]これらの異なる組合せすべてが、至る所で開示される数値により包含される。開示されるすべての数値は、それが治療剤の投与を指すにせよ、日、月、年、重量、投薬量などを指すにせよ、特に反対の指示がない限り、この要領で解釈されたい。
【００８６】
[00111]至る所で開示される範囲は、例えば、「Ｘは、１〜２；もしくは２〜３日目［もしくは任意の数値範囲］に、または約１〜２；もしくは２〜３日目［もしくは任意の数値範囲］に投与される」と言われることもある。この範囲は、これらの数自体（例えば、範囲の終点）、および下記のすべてを含む：
ｉ）１日目〜２日目の間に投与されるＸ；
ｉｉ）２日目〜３日目の間に投与されるＸ；
ｉｉｉ）約１日目〜２日目の間に投与されるＸ；
ｉｖ）約２日目〜３日目の間に投与されるＸ；
ｖ）１日目〜約２日目の間に投与されるＸ；
ｖｉ）２日目〜約３日目の間に投与されるＸ；
ｖｉｉ）約１日目〜約２日目の間に投与されるＸ；および
ｖｉｉｉ）約２日目〜約３日目の間に投与されるＸ。
【００８７】
[00112]Ｉ．大要
[00113]島細胞の植え込みは、糖尿病患者の死滅したまたは機能不全のβ細胞を置換することができ、糖尿病を治癒させることができる可能性がある。植え込みに使用される幹細胞由来β細胞を産生するための組成物および方法が、本明細書で提供される。
【００８８】
[00114]本開示の態様は、原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓β細胞に分化させる方法に関する。一部のケースでは、方法は、原始腸管細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤と形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子とを含む組成物と、接触させるステップを含む。一部のケースでは、組成物は、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーからの増殖因子、ソニックヘッジホグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化因子、およびＲｈｏ関連プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の追加の分化因子をさらに含む。
【００８９】
[00115]一部のケースでは、本明細書で提供される方法は、原始腸管細胞を含む細胞の集団を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤とＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子とを含む第１の組成物と接触させることにより、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを生成するステップを含み、原始腸管細胞は、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性（ｐｏｓｔｉｖｅ）膵臓前駆細胞に分化される。一部のケースでは、接触は、約１日、２日、または３日間行われる。一部のケースでは、接触は、約１日行われる。一部のケースでは、原始腸管細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤とＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子とを含む組成物と接触させることにより、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞に分化される。一部のケースでは、生成するステップは、Ｐｄｘ１陽性（ｐｏｓｔｉｖｅ）、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子、ＦＧＦファミリーからの増殖因子、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子およびＲＯＣＫ阻害剤を含むがこれらに限定されない１つまたは複数の分化因子を含む第２の組成物と接触させることにより、Ｐｄｘ１陽性（ｐｏｓｔｉｖｅ）、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化させることをさらに含む。一部のケースでは、第２の組成物は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含まない。
【００９０】
[00116]一部のケースでは、本明細書で提供される方法は、原始腸管細胞を含む細胞の集団を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることにより、最大約３０％、最大約２５％、最大約２０％、最大約１５％、最大約１０％、最大約５％、最大約４％、最大約３％、最大約２％、または最大約１％ＣＨＧＡ陽性細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。一部のケースでは、本明細書で提供される方法は、原始腸管細胞を含む細胞の集団を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることにより、フローサイトメトリーによって測定して最大約最大約２５％、最大約２０％、最大約１５％、または最大約１０％ＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。一部のケースでは、本明細書で提供される方法は、原始腸管細胞を含む細胞の集団を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることにより、最大約３０％ＣＨＧＡ陽性細胞と最大約３０％ＣＤＸ２陽性細胞とを含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。一部のケースでは、本明細書で提供される方法は、原始腸管細胞を含む細胞の集団を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることにより、最大約２０％ＣＨＧＡ陽性細胞と最大約５％ＣＤＸ２陽性細胞とを含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。一部のケースでは、本明細書で提供される方法は、原始腸管細胞を含む細胞の集団を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることにより、最大約１５％ＣＨＧＡ陽性細胞と最大約３％ＣＤＸ２陽性細胞とを含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。
【００９１】
[00117]一部のケースでは、本明細書で提供されるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＤＭＨ−１、その誘導体、類似体または変異体を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供されるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＤＭＨ−１を含む。一部の実施形態では、方法は、原始腸管細胞を約０．０１μＭ〜約１０μＭ、約０．０５μＭ〜約５μＭ、約０．１μＭ〜約１μＭ、または約０．１５μＭ〜約０．５μＭのＤＭＨ−１と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、原始腸管細胞を約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．４２、０．４５、０．４８、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１、１．２、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、２．０、４．０、６．０、８．０、または１０μＭと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、方法は、原始腸管細胞を約０．２５μＭと接触させるステップを含む。一部のケースでは、原始腸管細胞を分化させる際に使用される場合のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９を含まない。
【００９２】
[00118]一部のケースでは、本明細書で提供される方法は、原始腸管細胞を含む細胞の集団を、ＤＭＨ−１またはその誘導体、類似体もしくは変異体と接触させることにより、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを生成するステップを含む。
【００９３】
[00119]特定の理論により拘束されることを望まないが、本明細書で開示される方法の一部の実施形態では、原始腸管細胞のＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞への分化中の、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害は、オフターゲット細胞、例えば、腸系列の細胞、またはＣＤＸ２遺伝子発現に対して陽性の細胞の生成の低減の一因になり得る。その一方で、一部のケースでは、原始腸管細胞のＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞またはＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞への分化中の、ＩＩ型受容体媒介ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の活性化は、単ホルモン性である、例えば、インスリンのみを分泌するがソマトスタチンまたはグルカゴンのような他の膵臓ホルモンを分泌しない成熟ＳＣ−β細胞ではなく、多ホルモン性細胞の生成を、一部のケースでは、もたらし得るニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）またはクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）の、早期誘導の低減の一因に、一部のケースでは、なり得る。ＢＭＰシグナル伝達経路とＴＧＦ−βシグナル伝達経路の間にクロストークがあり得る。一部のケースでは、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は、副作用、例えば、数ある中でも特にＩＩ型受容体媒介ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の遮断を有し得る。例えば、比較的低選択的なＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤ＬＤＮ１９３１８９による、図１５に示されているような、ＩＩ型受容体媒介ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害は、早期ＮＧＮ３／ＣＨＧＡ誘導をもたらすことがあり、それによって多ホルモン性細胞が生成される。ある特定の理論により拘束されることを望まないが、一部のケースでは、高選択的ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、例えば、ＤＭＨ−１またはその誘導体、類似体または変異体は、ＩＩ型受容体媒介ＴＧＦ−βシグナル伝達経路に対してより低い阻害効果を有し得る。一部の他のケースでは、特定の理論により拘束されることを望まないが、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と一緒にＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子とコインキュベーションすることで、比較的高い活性レベルのＩＩ型受容体媒介ＴＧＦ−βシグナル伝達経路を維持しつつ、ＢＭＰシグナル伝達経路の選択的阻害を生じさせることができる。一部のケースでは、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と一緒にＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子とコインキュベーションすることで、オフターゲット細胞、例えばＣＤＸ２陽性細胞の生成を低減させることができ、例えば、原始腸管細胞から分化した細胞におけるＮＧＮ３またはＣＨＧＡの早期誘導の結果としての多ホルモン性細胞の生成を低減させることもできる。
【００９４】
[00120]本開示の態様は、膵臓β細胞、例えばＳＣ−β細胞を生成する方法であって、ゼノフリー培養培地中で前駆細胞（例えば、ｉＰＳＣ細胞、胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、またはインスリン陽性内分泌細胞のような、幹細胞）を分化させるステップを含む方法に関する。動物起源の細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、他の動物からの産物を有することができない。一部のケースでは、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、いかなる非ヒト動物からの産物も有することができない。例えば、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）ではなく、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含むことができる。
【００９５】
[00121]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、血清アルブミンを欠く培養培地中で前駆細胞（例えば、ｉＰＳＣ細胞、胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、またはインスリン陽性内分泌細胞のような、幹細胞）を分化させることにより、膵臓β細胞、例えばＳＣ−β細胞を生成するステップを含む。一部のケースでは、培養培地中に血清アルブミンを使用しないまたはＨＳＡを使用する本明細書で提供される方法により生成された膵臓β細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターは、代わりにＢＳＡを使用することを除いて他の点では同一の方法により生成された膵臓β細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターと比較して、有意な改善を有することができる。この改善は、得られる最終細胞集団中のより高いパーセンテージの膵臓β細胞、より高いＧＳＩＳ応答（例えば、グルコース負荷に応答してより多いインスリン放出）、より高いＧＳＩＳ刺激指数、生成された細胞クラスター中の膵臓β細胞の分布のより高い均一性、またはこれらの任意の組合せを含み得る。
【００９６】
[00122]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培養培地中で幹細胞、例えばｈＥＳまたはｉＰＳ細胞を含む細胞の集団を分化させるステップを含む。一部のケースでは、幹細胞は、胚体内胚葉細胞に分化される。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培養培地中で胚体内胚葉細胞を含む細胞の集団を分化させるステップを含む。一部のケースでは、胚体内胚葉細胞は、原始腸管細胞に分化される。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培養培地中で原始腸管細胞を含む細胞の集団を分化させるステップを含む。一部のケースでは、原始腸管細胞は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞（例えば、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞またはＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞）に分化される。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培養培地中でＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団を分化させるステップを含む。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化される。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培養培地中でＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団を分化させるステップを含む。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、インスリン陽性内分泌細胞に分化される。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培養培地中でインスリン陽性内分泌細胞を含む細胞の集団を分化させるステップを含む。一部のケースでは、インスリン陽性内分泌細胞は、膵臓β細胞、例えば、ＳＣ−β細胞に分化される。
【００９７】
[00123]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約４％（ｗ／ｖ）、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）、約０．０２％（ｗ／ｖ）〜約２．５％（ｗ／ｖ）、約０．０３％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）、約０．０４％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）、約０．０４５％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、または約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含む培養培地の使用を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法は、約０．００１％、０．００２％、０．００２５％、０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０１２５％、０．０１５％、０．０１７５％、０．０２％、０．０２２５％、０．０２５％、０．０２７５％、０．０３％、０．０３２５％、０．０３５％、０．０３７５％、０．０４％、０．０４２５％、０．０４５％、０．０４７５％、０．０５％、０．０５２５％、０．０５５％、０．５７５％、０．０６％、０．０６２５％、０．０６５％、０．０６７５％、０．０７％、０．０７２５％、０．０７５％、０．０７７５％、０．０８％、０．０８５％、０．０９％、０．１％、０．１２％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、または４％、５％（ｗ／ｖ）ＨＳＡを含む培養培地の使用を含む。「ｗ／ｖ」という用語は、重量／体積のまたは単位体積当たりの重量のパーセンテージの省略である。例えば、１００ｍＬの培養培地中の１ｍｇのＨＳＡは、１％（ｗ／ｖ）の濃度を有する。
【００９８】
[00124]一部のケースでは、本明細書で提供される方法は、原始腸管細胞を含む細胞の集団を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることにより、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％Ｐｄｘ１陽性細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。一部のケースでは、本明細書で提供される方法は、原始腸管細胞を含む細胞の集団を、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることにより、最大約６０％、最大約５０％、最大約４０％、最大約３５％、最大約３０％、最大約２５％、最大約２２％、最大約２０％、最大約１８％、最大約１５％、最大約１４％、最大約１３％、最大約１１％、最大約１２％、最大約１０％、または最大約５％ＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。
【００９９】
[00125]本開示の態様は、少なくとも１つのインスリン陽性内分泌細胞またはその先駆体（例えば、ｉＰＳ細胞、ｈＥＳＣ、胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、ＰＤＸ１陽性膵臓前駆細胞、ＰＤＸ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞など）から幹細胞由来β（ＳＣ−β）細胞（例えば、成熟膵臓β細胞）を生成するための組成物および方法、ならびに細胞治療、アッセイ（例えば、薬物スクリーニング）および様々な処置方法における使用のためのそれらの組成物および方法により産生されたＳＣ−β細胞に関する。
【０１００】
[00126]一部の態様では、本開示は、ＳＣ−β細胞を産生するための幹細胞を選択するための方法および基準を提供する。一部の実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）である。一部の実施形態では、幹細胞は、Ｏｃｔ４を発現する細胞である。一部の実施形態では、出発幹細胞培養物は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または１００％のパーセンテージのＯｃｔ４発現細胞を含む。
【０１０１】
[00127]一部の態様では、本開示は、選択可能なマーカーを利用する必要なく、形態学的基準に基づいて、ならびにインスリンを発現する、１回または複数回のグルコース負荷に応答してインスリンを分泌する、成熟ＧＳＩＳ応答を示す、および膵臓においてｉｎ  ｖｉｖｏで島を構築する能力などの、機能的特徴に基づいて、検出可能であり、通常は、直径約９〜１５ｎｍの小さい紡錘状の細胞を有する、ＳＣ−β細胞の同定方法に関する。
【０１０２】
[00128]一部の態様では、本開示は、幹細胞分化のための基礎培地成分を同定する方法に関する。一部の実施形態では、基礎培地成分は、分化効率を上昇させることができる。一部の実施形態では、基礎培地成分は、オンターゲット前駆細胞集団（例えば、ＳＣ−β細胞集団）のパーセンテージを増加させることができる。一部の実施形態では、本開示の方法により産生されるオンターゲット前駆細胞集団のパーセンテージは、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または〜１００％である。一部の実施形態では、本開示の方法により産生されるＳＣ−β細胞集団のパーセンテージは、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、または〜１００％である。一部の実施形態では、本開示の方法により産生されるＳＣ−β細胞集団のパーセンテージは、ｃである。
【０１０３】
[00129]一部の態様では、本開示は、ＳＣ−β細胞を産生する組成物および方法であって、当技術分野において公知の標準的方法と比較してＳＣ−β細胞のパーセンテージが１．２〜３倍増加する結果となる、組成物および方法に関する。一部の実施形態では、増加倍数は、１．２〜１．５、１．５〜２、または２〜２．５である。産生されるＳＣ−β細胞は、内在性（例えば、天然）β細胞に匹敵する活性を示すことができ、凍結保存後に安定性を示すことができる。
【０１０４】
[00130]一部の態様では、本開示は、ＳＣ−β細胞活性（例えば、グルコースを感知するおよびインスリンを分泌する能力）を向上させることができるシグナル伝達因子を同定する方法に関する。候補小分子のスクリーニングを行って、有用なシグナル伝達因子を同定することができる。シグナル伝達因子を試験するために使用することができるアッセイの一例は、ＧＳＩＳアッセイである。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、シグナル伝達因子の存在下で少なくとも２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０以上の刺激指数を示す。
【０１０５】
[00131]ＩＩ．ＳＣ−β細胞
[00132]本開示のＳＣ−β細胞は、正常なβ細胞機能にとって重要であるβ細胞の多くの特有の特徴を共有する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏで示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、ＧＳＩＳ応答をｉｎ  ｖｉｖｏで示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ  ＧＳＩＳ応答を示す。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、内在性成熟膵臓β細胞のＧＳＩＳ応答に似ている。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、少なくとも１回のグルコース負荷に対してＧＳＩＳ応答を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、少なくとも２回の逐次的グルコース負荷に対してＧＳＩＳ応答を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、少なくとも３回の逐次的グルコース負荷に対してＧＳＩＳ応答を示す。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、複数回のグルコース負荷に対する内在性ヒト島のＧＳＩＳ応答に似ている。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、ヒトまたは動物への細胞の移植の直後に観察される。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、ヒトまたは動物への細胞の移植からおおよそ２４時間以内に観察される。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、ヒトまたは動物への細胞の移植からおおよそ１週間以内に観察される。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、ヒトまたは動物への細胞の移植からおおよそ２週間以内に観察される。一部の実施形態では、低グルコース濃度に応答して分泌されるインスリンと比較した高グルコース濃度に応答して分泌されるインスリンの比により特徴付けられるような細胞の刺激指数は、内在性成熟膵臓β細胞の刺激指数と類似している。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１より大きい刺激指数を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１以上の刺激指数を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１．１より大きい刺激指数を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１．１以上の刺激指数を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、２より大きい刺激指数を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１以上の刺激指数を示す。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、少なくとも２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、または５．０以上の刺激指数を示す。
【０１０６】
[00133]本開示の一部の実施形態は、ＳＣ−β細胞を含む、細胞培養物または細胞集団などの、細胞組成物であって、ＳＣ−β細胞が、少なくとも１つのインスリン陽性内分泌細胞またはその先駆体から誘導された、細胞組成物に関する。一部の実施形態では、細胞組成物は、インスリン陽性内分泌細胞を含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＮＫＸ６．１−膵臓前駆細胞を含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＰＤＸ１−膵臓前駆細胞を含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、原始腸管細胞を含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、胚体内胚葉細胞を含む。
【０１０７】
[00134]ある特定の実施形態に従って、化学的に誘導されたＳＣ−β細胞は、哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、そのようなＳＣ−β細胞は、ピューマＳＣ−β細胞である。一部の実施形態では、インスリン陽性内分泌細胞は、胚体内胚葉細胞、例えば、ヒト胚体内胚葉幹細胞から誘導された。ある特定の実施形態に従って、化学的に誘導されたＰＤＸ１陽性膵臓前駆体は、哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、そのようなＰＤＸ１陽性膵臓前駆体は、ヒトＰＤＸ１陽性膵臓前駆体である。
【０１０８】
[00135]本開示の他の実施形態は、本明細書で開示の方法により産生されたＳＣ−β細胞を含む、単離された細胞集団または細胞培養物などの、組成物に関する。本開示の一部の実施形態は、本明細書で開示の方法により産生された、化学的に誘導されたＳＣ−β細胞を含む、単離された細胞集団または細胞培養物などの、組成物に関する。そのような実施形態では、ＳＣ−β細胞は、ＳＣ−β細胞集団中の全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満を構成する。一部の実施形態では、組成物は、細胞集団中の全細胞の約９０％より多くを構成するＳＣ−β細胞の集団を含み、例えば、細胞集団中の全細胞の約少なくとも９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％、または少なくとも約９９％、または約少なくとも１００％は、ＳＣ−β細胞である。
【０１０９】
[00136]本開示のある特定の他の実施形態は、ＳＣ−β細胞と、ＳＣ−β細胞が誘導された元のインスリン陽性内分泌細胞またはそれらの先駆体との組合せを含む、単離された細胞集団または細胞培養物などの、組成物に関する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞が誘導される元のインスリン陽性内分泌細胞は、単離された細胞集団または培養物中の全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満、または約１％未満を構成する。
【０１１０】
[00137]本開示のさらなる実施形態は、本明細書に記載のプロセスにより産生された、単離された細胞集団または細胞培養物などの、組成物であって、化学的に誘導されたＳＣ−β細胞を多数派細胞型として含む組成物に関する。一部の実施形態では、本明細書に記載される方法およびプロセスは、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８７％、少なくとも約８６％、少なくとも約８５％、少なくとも約８４％、少なくとも約８３％、少なくとも約８２％、少なくとも約８１％、少なくとも約８０％、少なくとも約７９％、少なくとも約７８％、少なくとも約７７％、少なくとも約７６％、少なくとも約７５％、少なくとも約７４％、少なくとも約７３％、少なくとも約７２％、少なくとも約７１％、少なくとも約７０％、少なくとも約６９％、少なくとも約６８％、少なくとも約６７％、少なくとも約６６％、少なくとも約６５％、少なくとも約６４％、少なくとも約６３％、少なくとも約６２％、少なくとも約６１％、少なくとも約６０％、少なくとも約５９％、少なくとも約５８％、少なくとも約５７％、少なくとも約５６％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、少なくとも約５１％または少なくとも約５０％ＳＣ−β細胞を含む、単離された細胞培養物および／または細胞集団を産生する。
【０１１１】
[00138]別の実施形態では、細胞（または細胞培養物）の単離された細胞集団または組成物は、ヒトＳＣ−β細胞を含む。他の実施形態では、本明細書に記載の方法およびプロセスは、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％ＳＣ−β細胞を含む、単離された細胞集団を産生することができる。好ましい実施形態では、単離された細胞集団は、ヒトＳＣ−β細胞を含み得る。一部の実施形態では、細胞培養物または集団中のＳＣ−β細胞のパーセンテージは、培養物に残存するフィーダー細胞を顧慮せずに計算される。
【０１１２】
[00139]本開示のさらに別の態様は、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％ＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む細胞（または細胞培養物）の細胞集団または組成物に関する。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約２０％ＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約４０％ＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約５０％ＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約１７．９％ＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約４１．５％ＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約５０．６％ＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。
【０１１３】
[00140]一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％ＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約４０％ＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約６０％ＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約８５％ＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約３６．９％ＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約６３．４％ＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約８９．５％ＮＫＸ６．１＋細胞を含む。
【０１１４】
[00141]一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約３０％Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約５５％Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約２６．８％Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約５７．７％Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約５５．２％Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。
【０１１５】
[00142]一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約４０％ＣＨＧＡ＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約８５％ＣＨＧＡ＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、少なくとも約９５％ＣＨＧＡ＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約３７．７％ＣＨＧＡ＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約８７．５％ＣＨＧＡ＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される場合の細胞の細胞集団または組成物は、約９６．４％ＣＨＧＡ＋細胞を含む。
【０１１６】
[00143]本開示のさらに他の実施形態は、ＳＣ−β細胞と、ＳＣ−β細胞が分化された元のインスリン陽性内分泌細胞またはそれらの先駆体との混合物を含む、単離された細胞集団または細胞培養物などの、組成物に関する。例えば、約９５個のインスリン陽性内分泌細胞またはそれらの先駆体につき少なくとも約５個のＳＣ−β細胞を含む細胞培養物または細胞集団を、産生することができる。他の実施形態では、約５個のインスリン陽性内分泌細胞またはそれらの先駆体につき少なくとも約９５個のＳＣ−β細胞を含む細胞培養物または細胞集団を、産生することができる。さらに、ＳＣ−β細胞のインスリン陽性内分泌細胞またはそれらの先駆体に対する他の比を有する細胞培養物または細胞集団が、企図される。例えば、約１，０００，０００個、または少なくとも１００，０００個の細胞、または少なくとも１０，０００個の細胞、または少なくとも１０００個の細胞または５００個、または少なくとも２５０個または少なくとも１００個または少なくとも１０個のインスリン陽性内分泌細胞またはそれらの先駆体につき、少なくとも約１個のＳＣ−β細胞を含む組成物を、産生することができる。
【０１１７】
[00144]一部の態様では、本開示は、少なくとも約５０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞と、最大約３０％、２８％、２６％、２５％、２４％、２２％、２０％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、または２％クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞と、最大約３０％、２８％、２６％、２５％、２４％、２２％、２０％、１８％、１６％、または１５％ＣＤＸ２陽性細胞とを含む細胞クラスターを提供する。一部のケースでは、細胞クラスターは、最大約２０％ＣＤＸ２陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞を含む。一部のケースでは、細胞クラスターは、最大約５％ＣＨＧＡ陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、最大約２０％ＣＤＸ２陽性、ＮＫＸ６．１陽性細胞、および最大約５％ＣＨＧＡ陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも約６０％、６２％、６４％、６５％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、または９５％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも約６５％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む。
【０１１８】
[00145]一部の実施形態では、少なくとも約５０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞と、最大約３０％クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞と、最大約３０％ＣＤＸ２陽性細胞とを含む細胞クラスターは、約３０％より多くのクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞または約３０％より多くのＣＤＸ２陽性細胞を有する比較可能な細胞クラスターと比較して、特定の機能的特徴を有することができる。例えば、一部のケースでは、少なくとも約５０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞と、最大約３０％クロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞と、最大約３０％ＣＤＸ２陽性細胞とを含む細胞クラスターのさらなる分化の結果として、非ネイティブ膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約５０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞と３０％より多くのクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞または３０％より多くのＣＤＸ２陽性細胞とを含む比較可能な細胞クラスターから分化した非ネイティブ膵臓β細胞を含む第２の細胞クラスターより高いグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を有する第１の細胞クラスターが生じる。
【０１１９】
[00146]一部の態様では、本開示は、少なくとも約６０％、６２％、６４％、６５％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、または９０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞と、最大約４０％、３８％、３６％、３４％、３２％、３０％、２８％、２６％、２５％、２４％、２２％、２０％、１８％、１６％、１５％、１４％、１２％、または１０％ＣＤＸ２陽性細胞とを含む細胞クラスターを提供する。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも約８５％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、最大約１５％ＣＤＸ２陽性細胞を含む。一部のケースでは、細胞クラスターは、少なくとも約８５％Ｐｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞、および最大約１５％ＣＤＸ２陽性細胞を含む。
【０１２０】
[00147]一部の実施形態では、少なくとも約６０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞と、最大約４０％ＣＤＸ２陽性細胞とを含む細胞クラスターは、約４０％より多くのＣＤＸ２陽性細胞を有する比較可能な細胞クラスターと比較して、特定の機能的特徴を有することができる。例えば、一部のケースでは、少なくとも約６０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞と最大４０％ＣＤＸ２陽性細胞とを含む細胞クラスターのさらなる分化の結果として、非ネイティブ膵臓β細胞を含む第１の細胞クラスターであって、フローサイトメトリーによって測定して少なくとも約６０％Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞と４０％より多くのＣＤＸ２陽性細胞とを含む比較可能な細胞クラスターから分化した非ネイティブ膵臓β細胞を含む第２の細胞クラスターより高いグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を有する第１の細胞クラスターが生じる。
【０１２１】
[00148]一部の態様では、本開示は、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターを提供する。一部の実施形態では、本明細書で開示される細胞クラスターは、原始腸管細胞を、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、および形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子と接触させることによる、原始腸管細胞の分化から得られる。一部の実施形態では、細胞クラスターは、接触を伴わない原始腸管細胞の分化から得られた比較可能な第２の細胞クラスターと比較してより多い１立方マイクロメートル当たりの非ネイティブ膵臓β細胞の数を有する。一部の実施形態では、細胞クラスターは、比較可能な第２の細胞クラスターと比較して、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、または１．６倍多い、１立方マイクロメートル当たりの非ネイティブ膵臓β細胞の数を有する。
【０１２２】
[00149]一部のケースでは、本明細書で開示される非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤またはＴＧＦ−βファミリーからの増殖因子との接触を伴わない原始腸管細胞の分化から得られた比較可能な細胞クラスターと比較してより多いインスリン分泌をグルコース負荷に応答して示す。一部の実施形態では、細胞クラスターは、比較可能な第２の細胞クラスターと比較して少なくとも約１．２、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５倍多いインスリン分泌を示す。一部の実施形態では、細胞クラスターは、比較可能な第２の細胞クラスターと比較してより高いＧＳＩＳ刺激指数を示す。一部の実施形態では、細胞クラスターのＧＳＩＳ刺激指数は、第２の細胞クラスターのものより少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、または少なくとも約３倍高い。一部の実施形態では、細胞クラスターのＧＳＩＳ刺激指数は、第２の集団のものより少なくとも約３倍高い。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ刺激指数は、２０ｍＭグルコース負荷に応答してのインスリン分泌の、２ｍＭグルコース負荷に応答してのインスリン分泌に対する比として計算される。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞は、グルコース負荷に曝露されたときにｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を示す。一部のケースでは、非ネイティブ膵臓β細胞は、第１のＫ＋濃度に応答してインスリン分泌を示す。一部の実施形態では、細胞クラスターは、比較可能な第２の細胞クラスターと比較してより多いインスリン分泌を第１のＫ＋濃度に応答して示す。一部の実施形態では、細胞クラスターは、比較可能な第２の細胞クラスターと比較して少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．２倍、少なくとも約３．４倍、少なくとも約３．６倍、少なくとも約３．８倍、少なくとも約４倍多いインスリン分泌を第１のＫ＋濃度に応答して示す。
【０１２３】
[00150]一部のケースでは、本明細書で開示される細胞集団または細胞クラスターは、細胞選別プロセスを経ていない未選別の、例えば、単離された細胞集団または細胞クラスターである。一部の実施形態では、本明細書で開示される細胞クラスターは、所与の環境で、例えば３Ｄ浮遊培養で、培養された細胞の自己凝集により形成される細胞クラスターを指すことができる。一部の実施形態では、本明細書で開示される細胞クラスターは、本明細書に記載の分化プロセスの間に形成される中間細胞クラスターである。一部のケースでは、中間細胞クラスター、例えば、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスター（例えば、ステージ３細胞クラスター）、またはＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞クラスター（例えば、ステージ４細胞クラスター）は、細胞選別に付されない。一部のケースでは、細胞選別を受ける細胞集団は、本明細書で開示される中間細胞クラスターを形成できないことがある。例えば、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、細胞選別を受けた後、本明細書で開示の細胞クラスターを形成できないことがある。
【０１２４】
[00151]本明細書に記載の細胞選別は、細胞サイズ、形状（形態）、表面タンパク質発現、内因性シグナルタンパク質発現、またはこれらの任意の組合せの差異を頼りに複数の細胞から細胞の一群を単離するプロセスを指すことができる。一部のケースでは、細胞選別は、細胞をフローサイトメトリーに付すことを含む。フローサイトメトリーは、レーザーまたはインピーダンスに基づく生物物理的技術である。フローサイトメトリー中に、細胞を流体流に浮遊させ、それらを電子検出装置に通すことができる。細胞の光学的特性の１つまたは複数のパラメーター（例えば、レーザー励起時の発光波長）に基づくフローサイトメトリーの１つのタイプ、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）では、フローサイトメトリーを使用して、目的の細胞を物理的に分離し、それによって精製することができる。本明細書に記載の未選別の細胞クラスターは、活性細胞選別プロセス、例えばフローサイトメトリーに付されていない複数の細胞によって形成される細胞クラスターであり得る。一部のケースでは、本明細書で論じられる場合のフローサイトメトリーは、細胞に発現された１つまたは複数のシグナルペプチドに基づくこともある。例えば、細胞クラスターは、シグナルペプチド（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはｔｄＴｏｍａｔｏ）を発現する細胞を含むことができる。一部のケースでは、シグナルペプチドは、細胞におけるインスリン発現の指標として発現される。例えば、細胞クラスターは、インスリンプロモーターの制御下にあるＧＦＰをコードする外来性核酸配列を保有する細胞を含むことができる。インスリンプロモーターは、内在性プロモーターであることもあり、または外来性プロモーターであることもある。一部のケースでは、これらの細胞におけるＧＦＰの発現は、細胞におけるインスリン発現を示すことができる。したがって、ＧＦＰシグナルは、膵臓β細胞のマーカーであり得る。一部のケースでは、本明細書に記載の細胞選別は、磁性抗体または他のリガンドが、異なる細胞型を標識するために使用され、磁気特性の差異が細胞選別に使用され得る、磁気活性化フローサイトメトリーを含むことができる。
【０１２５】
[00152]本明細書に記載される、Ｐｄｘ１、ＮＫＸ６．１、インスリン、ＮＧＮ３またはＣＨＧＡのような、１つまたは複数の特定のマーカーを発現する細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーアッセイのような技法を使用して検出されるパーセンテージ値であり得る。一部のケースでは、フローサイトメトリーアッセイ中に、本明細書で論じられる細胞集団または細胞クラスターは、トリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓのような消化酵素中でのインキュベーションによって分散されて単個細胞浮遊液になる。分散された細胞をＰＢＳのような好適な緩衝液で洗浄し、遠心分離し、次いで４％ＰＦＡのような固定緩衝液に再懸濁させることができる。次いで、目的の細胞マーカーに対する一次抗体とのインキュベーションを行うことができ、その後、二次抗体とのインキュベーションを行うことができる。抗体インキュベーション後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによる分離に付すことができる。フローサイトメトリー以外の技法を使用して、本明細書に記載される細胞を特徴付けること、例えば、細胞パーセンテージを決定することもできる。細胞特徴付け方法の非限定的な例としては、遺伝子シーケンシング、顕微鏡技法（蛍光顕微鏡法、原子間力顕微鏡法）、核型分析、アイソエンザイム分析、ＤＮＡ特性、ウイルス感受性が挙げられる。
【０１２６】
[00153]一部の態様では、本開示は、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団を含む組成物であって、細胞が、グルコースでの誘導時に分泌されるインスリンの量と比較してより多い量のインスリンをＫＣｌ（例えば、約２０〜約５０ｍＭ、例えば約３０ｍＭ）での誘導時に分泌する、組成物に関する。一部の実施形態では、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団は、グルコースでの誘導時に分泌されるインスリンの量と比較して少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍多い量のインスリンをＫＣｌでの誘導時に分泌する。
【０１２７】
[00154]一部の態様では、本開示は、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団を含む組成物であって、細胞が、ＫＣｌおよび／またはグルコースでの誘導時に、シグナル伝達因子の非存在下の比較可能な細胞と比較してより多い量のインスリンをシグナル伝達因子の存在下で分泌する、組成物に関する。一部の実施形態では、細胞は、高グルコースの存在下ではより多量のインスリンを分泌するが、低グルコースの存在下では分泌しない。一部の実施形態では、高グルコース濃度は、約１０〜２０ｍＭである。一部の実施形態では、低グルコース濃度は、約２〜５ｍＭである。
【０１２８】
[00155]一部の態様では、本開示は、分化膵臓前駆細胞の集団を含む組成物であって、集団が、フローサイトメトリーによって判定して少なくとも６０％膵臓β細胞を含む組成物に関する。一部の実施形態では、集団は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％膵臓β細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、所定の基礎培地成分と接触させると、基礎培地成分と接触させていない比較可能な集団と比較してより高いパーセンテージの膵臓β細胞を含む。
【０１２９】
[00156]本明細書に記載される本開示の方法に従って生成される、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟した、ＳＣ−β細胞（例えば、膵臓β細胞）は、多くの利点を明示し、例えば、それらは、グルコース刺激インスリン分泌をｉｎ  ｖｉｔｒｏで行い、遺伝子発現および微細構造の点でヒト島β細胞に似ており、マウスに移植されたときにヒトインスリンを分泌して高血糖症を改善し、細胞治療（例えば、追加のおよび／または機能性のβ細胞を必要とする対象への移植）、薬物スクリーニング（例えば、インスリン産生／分泌、生存率、脱分化などについて）、研究（例えば、正常β細胞と糖尿病β細胞間の機能の相違を判定する）および組織工学（例えば、島を再構築する際に第１の細胞型としてＳＣ−β細胞を使用する）のための新たなプラットフォームを提供する。
【０１３０】
[00157]ＩＩＩ．幹細胞およびリプログラミング
[00158]ＳＣ−β細胞（例えば、成熟膵臓β細胞もしくはβ様細胞）またはその先駆体を産生するための幹細胞の使用が、本明細書で提供される。ある実施形態では、米国特許出願公開第２０１５０２４０２１２号および同第２０１５０２１８５２２号に記載されているのと同様のプロトコールを使用して、生殖細胞を幹細胞の代わりにまたは幹細胞とともに使用して少なくとも１つのＳＣ−β細胞を得ることができ、参考特許文献の各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。好適な生殖細胞は、例えば、最終月経期の約８〜１１週間後に採取されたヒト胎児材料に存在する始原生殖細胞から、調製することができる。実例となる生殖細胞調製方法は、例えば、Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６、１９９８および米国特許第６，０９０，６２２号に記載されている。
【０１３１】
[00159]ＳＣ−β細胞（例えば、膵臓β細胞）を生成する組成物および方法が、本明細書で提供される。一般に、本明細書で開示される方法に従って産生される少なくとも１つのＳＣ−β細胞またはその先駆体、例えば、膵臓前駆体は、異なる細胞の混合物または組合せ、例えば、例えば、原始腸管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆体、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆体、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞（例えば、β様細胞）および／または他の多能性もしくは幹細胞などの細胞の混合物を含むことができる。
【０１３２】
[00160]少なくとも１つのＳＣ−β細胞またはその先駆体を任意の好適な培養プロトコールに従って産生して、幹細胞または多能性細胞を所望の分化ステージに分化させることができる。一部の実施形態では、少なくとも１つのＳＣ−β細胞またはその先駆体は、少なくとも１つの多能性細胞が少なくとも１つのＳＣ−β細胞またはその先駆体に分化するのに好適な期間、それに好適な条件下で、少なくとも１つの多能性細胞を培養することにより産生される。
【０１３３】
[00161]一部の実施形態では、少なくとも１つのＳＣ−β細胞またはその先駆体は、ＳＣ−β細胞またはその先駆体の実質的に純粋な集団である。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞またはその先駆体の集団は、多能性細胞または分化細胞の混合物を含む。一部の実施形態では、集団ＳＣ−β細胞またはその先駆体は、胚性幹細胞または多能性細胞またはｉＰＳ細胞を実質的に含まないまたは欠いている。
【０１３４】
[00162]一部の実施形態では、体細胞、例えば、線維芽細胞を、対象から、例えば、組織検体、例えば皮膚検体などとして単離し、さらなる分化のために人工多能性幹細胞へとリプログラミングして、本明細書に記載の組成物および方法での使用のための少なくとも１つのＳＣ−β細胞またはその先駆体を産生することができる。一部の実施形態では、体細胞、例えば、線維芽細胞は、当業者に公知の方法により培養で維持され、一部の実施形態では、増やされた後、本明細書で開示の方法によりＳＣ−β細胞に変換される。
【０１３５】
[00163]一部の実施形態では、少なくとも１つのＳＣ−β細胞またはその先駆体は、当業者に公知の方法により培養で維持され、一部の実施形態では、増やされた後、本明細書で開示の方法によりＳＣ−β細胞に変換される。
【０１３６】
[00164]さらに、少なくとも１つのＳＣ−β細胞またはその先駆体、例えば、膵臓前駆体は、いずれの哺乳動物種からのものであってもよく、非限定的な例としては、マウス、ウシ、サル、ブタ、ウマ、ヒツジまたはヒト細胞が挙げられる。明確かつ簡潔にするために、本明細書における方法の記載は、哺乳動物の少なくとも１つのＳＣ−β細胞またはその先駆体に言及するが、本明細書に記載される方法のすべてを少なくとも１つのＳＣ−β細胞またはその先駆体の他の細胞型に容易に適用することができることは理解されるはずである。一部の実施形態では、少なくとも１つのＳＣ−β細胞またはその先駆体は、ヒト個体から採取される。
【０１３７】
[00165]幹細胞
[00166]本開示の実施形態は、膵臓β細胞またはそれらの先駆体の生成のための幹細胞の使用に関係し得る。本明細書で使用される場合の「幹細胞」という用語は、自己複製と分化細胞型の生成の両方を行う能力を有する細胞（例えば、植物幹細胞、脊椎動物幹細胞）を指すことができる（Ｍｏｒｒｉｓｏｎら、（１９９７）Ｃｅｌｌ  ８８：２８７〜２９８）。細胞個体発生に関して、形容詞「分化（した）（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ）」、または「分化（する）（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ）」は、相対語である。「分化（した）細胞」は、比較されている細胞よりも発生経路のさらに先に進んだ細胞であり得る。したがって、多能性幹細胞は、系列限定前駆細胞（例えば、中胚葉幹細胞）に分化することができ、そしてまたこれらの前駆細胞は、さらに限定された細胞（例えば、ニューロン前駆体）に分化することができ、これらのさらに限定された細胞は、分化が完了した細胞（例えば、最終分化細胞、例えば、ニューロン、心筋細胞など）に分化することができ、これらの細胞は、ある特定の組織型において特有の役割を果たし、さらに増殖する能力を保持することもあり、または保持しないこともある。幹細胞は、特異的マーカー（例えば、タンパク質、ＲＮＡなど）の存在と特異的マーカーの非存在の両方を特徴とし得る。幹細胞を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ両方の機能性アッセイ、特に、複数回分化した子孫を生じさせる幹細胞の能力に関するアッセイによって同定することもできる。ある実施形態では、宿主細胞は、成体幹細胞、体性幹細胞、非胚性幹細胞、胚性幹細胞、造血幹細胞、人工多能性幹細胞（ａｎ  ｉｎｃｌｕｄｅ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ）、および栄養膜幹細胞である。
【０１３８】
[00167]本明細書で提供される方法に使用することができる幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含み得る。本明細書で使用される場合の「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」という用語は、生物のすべての細胞型を産生することが可能な幹細胞を指すことができる。したがって、ＰＳＣは、生物のすべての胚葉（例えば、脊椎動物の内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の細胞を生じさせることができる。多能性細胞は、奇形腫を形成すること、および生存生物における外胚葉、中胚葉または内胚葉組織に寄与することが可能であり得る。植物の多能性幹細胞は、植物のすべての細胞型（例えば、根、茎、葉などの細胞）を生じさせることが可能であり得る。
【０１３９】
[00168]本開示の実施形態は、膵臓β細胞またはそれらの先駆体の生成のためのＰＳＣの使用に関係し得る。動物のＰＳＣを多数の異なる方法で得ることができる。例えば、胚性幹細胞（ＥＳＣ）は、胚の内部細胞塊から誘導することができる（Ｔｈｏｍｓｏｎら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．１９９８年１１月６日；２８２（５３９１）：１１４５〜７）が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、体細胞から誘導することができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｃｅｌｌ．２００７年１１月３０日；１３１（５）：８６１〜７２；Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｎａｔ  Ｐｒｏｔｏｃ．２００７；２（１２）：３０８１〜９；Ｙｕら、Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００７年１２月２１日；３１８（５８５８）：１９１７〜２０．Ｅｐｕｂ  ２００７年１１月２０日）。ＰＳＣという用語は、多能性幹細胞をそれらの起源に関係なく指すことができるため、ＰＳＣという用語は、ＥＳＣおよびｉＰＳＣという用語はもちろん、ＰＳＣのもう１つの例である胚性生殖幹細胞（ＥＧＳＣ）という用語も包含し得る。ＰＳＣは、樹立細胞株の形態であることもあり、ＰＳＣを一次胚組織から直接得ることができ、またはＰＳＣを体細胞から誘導することができる。
【０１４０】
[00169]本開示の実施形態は、膵臓β細胞またはそれらの先駆体の生成のためのＥＳＣの使用に関係し得る。「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」とは、胚から、通常は胚盤胞の内部細胞塊から、単離されるＰＳＣを意味し得る。ＥＳＣ株、例えば、ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；Ｍｉｚ−ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；およびＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））は、ＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙに収載されている。目的の幹細胞は、他の霊長類からの胚性幹細胞、例えば、アカゲザル幹細胞およびマーモセット幹細胞も含む。幹細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、齧歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などから得ることができる（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５；Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９２：７８４４；Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６、１９９８）。培養で、ＥＳＣは、大きい核−細胞質比、規定された境界および顕著な核小体を有する、扁平コロニーとして増殖することができる。加えて、ＥＳＣは、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびアルカリホスファターゼを発現することができるが、ＳＳＥＡ−１を発現することができない。ＥＳＣを生成する方法および特徴付ける方法の例は、例えば、米国特許第７，０２９，９１３号、米国特許第５，８４３，７８０号、および米国特許第６，２００，８０６号において見つけることができ、前記参考特許文献の各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。未分化形態のｈＥＳＣを増殖させる方法は、ＷＯ９９／２０７４１、ＷＯ０１／５１６１６、およびＷＯ０３／０２０９２０に記載されており、前記参考特許文献の各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４１】
[00170]「胚性生殖幹細胞」（ＥＧＳＣ）または「胚性生殖細胞」または「ＥＧ細胞」とは、生殖細胞および／または生殖細胞前駆体、例えば、始原生殖細胞、例えば、精子および卵子になることができるものから誘導される、ＰＳＣを意味し得る。胚性生殖細胞（ＥＧ細胞）は、上記の胚性幹細胞と同様の特性を有すると考えられる。ＥＧ細胞を生成する方法およびＥＧ細胞を特徴付ける方法の例は、例えば、米国特許第７，１５３，６８４号；Ｍａｔｓｕｉ，Ｙ．ら（１９９２）Ｃｅｌｌ  ７０：８４１；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．ら（２００１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９８：１１３；Ｓｈａｍｂｌｏｔｔ，Ｍ．ら（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９５：１３７２６；およびＫｏｓｈｉｍｉｚｕ，Ｕ．ら（１９９６）Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ、１２２：１２３５において見つけることができ、前記参考文献の各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１４２】
[00171]本開示の実施形態は、膵臓β細胞またはそれらの先駆体の生成のためのｉＰＳＣの使用に関係し得る。「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」とは、ＰＳＣでない細胞から（例えば、ＰＳＣよりも分化されている細胞から）誘導されるＰＳＣを意味する。ｉＰＳＣを、最終分化細胞を含む複数の異なる細胞型から誘導することができる。ｉＰＳＣは、大きい核−細胞質比、規定された境界および顕著な核を有する、扁平コロニーとして増殖する、ＥＳ細胞様形態を有することができる。加えて、ｉＰＳＣは、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ  １、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、およびｚｆｐ４２を含むがこれらに限定されない、当業者に公知の１つまたは複数の肝要な多能性マーカーを、発現することができる。ｉＰＳＣを生成する方法および特徴付ける方法の例は、例えば、米国特許出願公開第２００９００４７２６３号、同第２００９００６８７４２号、同第２００９０１９１１５９号、同第２００９０２２７０３２号、同第２００９０２４６８７５号、および同第２００９０３０４６４６号において見つけることができ、前記参考特許文献の各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。一般に、ｉＰＳＣを生成するために、体細胞に、多能性幹細胞になるように体細胞をリプログラミングするための当技術分野において公知のリプログラミング因子（例えば、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８など）が供給される。
【０１４３】
[00172]本開示の実施形態は、膵臓β細胞またはそれらの先駆体の生成のための体細胞の使用に関係し得る。「体細胞」とは、実験操作の非存在下で生物のすべての細胞型を通常は生じさせることができない、生物の任意の細胞を意味し得る。言い換えると、体細胞は、身体の３つすべての胚葉、例えば、外胚葉、中胚葉および内胚葉の細胞を天然に生成することができない、十分に分化された細胞であり得る。例えば、体細胞は、ニューロン前駆体と神経前駆体の両方を含むことができ、後者の神経前駆体は、中枢神経系のすべてのまたは一部の細胞型を天然に生じさせることができるが、中胚葉系列の細胞も内胚葉系列の細胞も生じさせることができない。
【０１４４】
[00173]ある特定の例では、幹細胞は、本明細書で開示の方法による少なくとも１つの分化因子または組成物への曝露前は未分化（例えば、特定の系列に決定されていない細胞）であり得るが、他の例では、幹細胞を本明細書に記載される少なくとも１つの分化因子または組成物の曝露前に１つまたは複数の中間細胞型に分化させることが望ましいこともある。ある特定の例では、幹細胞が増殖することおよび必要に応じて分化することができるように、好適な栄養素および必要に応じて他の細胞の存在下で、幹細胞を培養することができる。例えば、胚性線維芽細胞または線維芽細胞様細胞が、幹細胞の増殖を支援するために培養物に存在し得る。線維芽細胞は、幹細胞増殖の１ステージの間、存在し得るが、必ずしもすべてのステージに存在し得るとは限らない。例えば、線維芽細胞は、第１の培養ステージで幹細胞培養物に添加されることがあるが、１または複数の後続の培養ステージでは幹細胞培養物に添加されないことがある。
【０１４５】
[00174]本発明のすべての態様で使用される幹細胞は、任意の種類の組織（例えば、胚組織、例えば、胎児もしくは前胎児組織、または成体組織）に由来する任意の細胞であることができ、これらの幹細胞は、適切な条件下で異なる細胞型の子孫、例えば、３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）のうちの少なくとも１つのすべての誘導体を産生することが可能であるという特徴を有することができる。これらの細胞型を樹立細胞株の形態で用意することができ、またはそれらを一次胚組織から直接得て、分化に直接使用することができる。ＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙに収載されている細胞、例えば、ｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）；Ｍｉｚ−ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ−１、ＦＩＳＦ−６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；およびＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ（ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ））が、含まれる。一部の実施形態では、成熟、インスリン陽性細胞への化学的に誘導された分化に使用されるヒト幹細胞または多能性幹細胞の供給源は、ヒト胚の破壊を伴わなかった。一部の実施形態では、成熟、インスリン陽性細胞への化学的に誘導された分化に使用されるヒト幹細胞または多能性幹細胞の供給源は、ヒト胚の破壊を伴わない。
【０１４６】
[00175]別の例では、幹細胞を、固形組織を含む組織から単離することができる。一部の実施形態では、組織は、皮膚、脂肪組織（ｆａｔ  ｔｉｓｓｕｅ）（例えば、脂肪組織（ａｄｉｐｏｓｅ  ｔｉｓｓｕｅ））、筋肉組織、心臓または心組織である。他の実施形態では、組織は、例えば、臍帯血、胎盤、骨髄、または軟骨のものであるが、これらに限定されない。
【０１４７】
[00176]本明細書で提供される方法に使用することができる幹細胞は、Ｔｈｏｍｓｏｎら、（１９９８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８２：１１４５により記載されたようなヒト胚性幹（ｈＥＳ）細胞；他の霊長類からの胚性幹細胞、例えば、アカゲザル幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：７８４４）；マーモセット幹細胞（Ｔｈｏｍｓｏｎら（１９９６）Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．５５：２５４）；およびヒト胚性生殖（ｈＥＧ）細胞（Ｓｈａｍｂｌｏｆｔら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：１３７２６、１９９８）によって例示される、様々な型の胚細胞も含むことができる。分化系列が決定されている幹細胞、例えば、中胚葉幹細胞および他の初期心臓形成細胞（ｅａｒｌｙ  ｃａｒｄｉｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌｓ）（Ｒｅｙｅｓら、（２００１）Ｂｌｏｏｄ  ９８：２６１５〜２６２５；ＥｉｓｅｎｂｅｒｇおよびＢａｄｅｒ（１９９６）Ｃｉｒｃ  Ｒｅｓ．７８（２）：２０５〜１６などを参照されたい）も、本明細書で提供される方法に適用可能であり得る。幹細胞は、任意の哺乳動物種、例えば、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、齧歯類、例えば、マウス、ラット、ハムスター、霊長類などから得ることができる。一部の実施形態では、ヒト胚は、本明細書で開示の方法および組成物で使用される多能性幹細胞の供給源のため破壊されなかった。一部の実施形態では、ヒト胚は、本明細書で開示の方法および組成物で使用される多能性幹細胞の供給源のため破壊されない。
【０１４８】
[00177]内皮、筋肉および／または神経幹細胞の好適な供給源からの細胞の混合物は、本開示のために哺乳動物ドナーから採取することができる。好適な供給源は、造血性微小環境である。例えば、循環末梢血、好ましくは、動員される（例えば、補充される）ものは、対象から除去され得る。ある実施形態では、幹細胞は、リプログラミングされた幹細胞、例えば、体細胞または分化細胞から誘導された幹細胞であり得る。そのような実施形態では、脱分化幹細胞は、例えば、新生物細胞、腫瘍細胞およびがん細胞、または代替的に、リプログラミング誘導細胞、例えば、人工多能性幹細胞またはｉＰＳ細胞であり得るが、これらに限定されない。
【０１４９】
[00178]一部の実施形態では、本明細書に記載の膵臓β細胞は、有毛細胞、ケラチノサイト、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、成長ホルモン産生細胞、乳腺刺激ホルモン分泌細胞、クロム親和性細胞、傍濾胞細胞、グロムス細胞、メラニン形成細胞、神経細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、角膜実質細胞、網膜ミュラー細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン、膠細胞（例えば、乏突起膠細胞、星状膠細胞）、上衣細胞、松果体細胞、肺細胞（例えば、Ｉ型肺細胞、およびＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、杯細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、胃主細胞、壁細胞、小窩細胞、Ｋ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、杯細胞、パネート細胞、腸細胞、小襞細胞、肝細胞、肝星細胞（例えば、中胚葉からのクッパ−細胞）、胆嚢細胞、腺房中心細胞、膵臓星細胞、膵臓α細胞、膵臓β細胞、膵臓δ細胞、膵臓Ｆ細胞（例えば、ＰＰ細胞）、膵臓ε細胞、甲状腺（例えば、濾胞細胞）、副甲状腺（例えば、副甲状腺主細胞）、好酸性細胞、尿路上皮細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋衛星細胞、腱細胞、心筋細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、カハール介在細胞、血管芽細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞（例えば、糸球体内メサンギウム細胞および糸球体外メサンギウム細胞）、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、ストロマ細胞、間質細胞、テロサイト、単純上皮細胞、有足細胞、腎臓近位尿細管刷子縁細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、栓細胞、生殖細胞、精子、卵細胞、リンパ球、骨髄性細胞、内皮前駆細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、中胚葉性血管芽細胞、周皮細胞、壁細胞、脾細胞（例えば、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞、ミクロファージ、白血球）、栄養膜幹細胞のうちの１つまたは複数、またはこれらの任意の組合せから誘導され得る。
【０１５０】
[00179]リプログラミング
[00180]本明細書で使用される場合の「リプログラミング」という用語は、体細胞の分化状態を変更するまたは逆戻りさせるプロセスを指すことができる。細胞は、リプログラミング前に、部分的に分化していることもあり、または最終分化していることもある。リプログラミングは、体細胞の分化状態の多能性細胞への完全な逆戻りを包含し得る。分化のそのような完全な逆戻りは、人工多能性（ｉＰＳ）細胞を生じさせることができる。本明細書で使用される場合のリプログラミングは、細胞の分化状態の部分的な逆戻り、例えば、複能性状態への部分的な逆戻り、または多能性でも複能性でもない体細胞であって、それが生じる元の分化細胞の１つまたは複数の特異的特徴を喪失した細胞である体細胞への部分的な逆戻り、例えば、異なる体細胞型への分化細胞の直接リプログラミングも、包含し得る。リプログラミングは、接合子が成体に発達するときの細胞の分化中に起こる核酸修飾（例えば、メチル化）、クロマチン凝集、後成的変化、ゲノムインプリンティングなどの遺伝的パターンの少なくとも一部の変更、例えば、逆戻りを伴い得る。
【０１５１】
[00181]本明細書で使用される場合、「リプログラミング因子」という用語は、細胞が異なる細胞型または表現型に変わるような細胞「リプログラミング」、すなわち、分化および／または脱分化および／または分化転換に関連する分子を指すことができる。リプログラミング因子は、一般に、細胞分化、脱分化および／または分化転換に関連する遺伝子の発現に影響を与える。転写因子は、リプログラミング因子の例である。
【０１５２】
[00182]本明細書で使用される場合の「分化」という用語およびそれらの文法的等価表現は、あまり特殊化していない細胞（例えば、分化能がより高い、よりナイーブな細胞）が、より特殊化した細胞型（例えば、分化能がより低い、あまりナイーブでない細胞）になるプロセスを指すことができ；「脱分化」という用語は、より特殊化した細胞が、あまり特殊化していない細胞型（例えば、分化能がより高い、よりナイーブな細胞）になるプロセスを指すことができる。
【０１５３】
[00183]本開示の一部の実施形態では、方法は、小分子でないリプログラミング因子の使用を除外する。しかし、方法が、「通例の」組織培養成分、例えば、培養培地、血清、代用血清、サプリメント、抗生物質など、例えば、ＲＰＭＩ、腎上皮基礎培地（ＲＥＢＭ）、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ＣＭＲＬ  １０６６培地、Ｆ１２、ウシ胎仔血清（ｆｏｅｔａｌ  ｃａｌｆ  ｓｅｒｕｍ）（ＦＣＳ）、ウシ胎仔血清（ｆｏｅｔａｌ  ｂｏｖｉｎｅ  ｓｅｒｕｍ）（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）−１（ジペプチド、Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミン）、Ｂ２７、ヘパリン、プロゲステロン、プトレシン、ラミニン、ニコチンアミド、インスリン、トランスフェリン、亜セレン酸ナトリウム、セレン、エタノールアミン、ヒト上皮増殖因子（ｈＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、ノルマシン（ｎｏｒｍａｃｉｎ）、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシンおよびアンホテリシンなどを利用することがあることは、理解されるであろう。これらの典型的な組織培養成分（および組織培養に常例的に使用される他の類似の組織培養成分）が、本開示では小分子リプログラミング分子でないことを、理解されたい。これらの成分は、本明細書で定義される通りの小分子でなく、および／または本明細書で定義される通りのリプログラミング因子でない。
【０１５４】
[00184]したがって、ある実施形態では、本開示は、１つまたは複数の外来性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドリプログラミング因子を用いる細胞の培養ステップを含まない。したがって、ある実施形態では、本開示の方法は、例えば、誘導β細胞を産生することまたは、そうでなければ、本開示の細胞を分化、脱分化および／もしくは分化転換するように誘導することに関与する、トランスポゾン、ウイルス遺伝子導入ベクター（例えば、レトロウイルスベクター）、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチドまたはこれらの分子のうちのいずれかの断片を導入することによる、１つまたは複数の外来性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドリプログラミング因子の導入を含まない。
【０１５５】
[00185]すなわち、ある実施形態では、方法は、１つまたは複数の外来性ポリヌクレオチドまたはポリペプチドリプログラミング因子の非存在下で行われる。したがって、ある実施形態では、本開示の方法は、ポリペプチド転写因子；分化、脱分化および／もしくは分化転換の誘導に特に関連する他のポリペプチド因子；ポリペプチド転写因子をコードするポリヌクレオチド配列；分化、脱分化および／もしくは分化転換の誘導に特に関連する他のポリペプチド因子をコードするポリヌクレオチド配列；ｍＲＮＡ；干渉ＲＮＡ；マイクロＲＮＡ、ならびにこれらの断片の添加を伴わずに、小分子（例えば、ＨＤＡＣ阻害剤）を利用して細胞をリプログラミングすることを、理解されたい。
【０１５６】
[00186]ＩＶ  膵臓β細胞を生成する方法
[00187]一部のケースでは、本明細書に記載の膵臓β細胞（例えば、非ネイティブ膵臓β細胞もしくはＳＣ−β細胞）または膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、任意の出発細胞集団からｉｎ  ｖｉｔｒｏで生成される。例えば、出発細胞としては、限定ではないが、インスリン陽性内分泌細胞（例えば、Ｎｇｎ３陽性内分泌細胞）またはそれらの任意の先駆体、例えば、Ｎｋｘ６．１陽性膵臓前駆細胞、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞、原始腸管細胞、胚体内胚葉細胞、多能性幹細胞、胚性幹細胞、および人工多能性幹細胞を挙げることができる。一部のケースでは、方法は、リプログラミングされた細胞、部分的にリプログラミングされた細胞（例えば、体細胞、例えば、人工多能性細胞とそれが誘導された元の体細胞との間の中間状態で存在するように部分的にリプログラミングされた線維芽細胞）、分化転換細胞の、分化を含む。一部のケースでは、本明細書で開示される膵臓β細胞または膵臓β細胞を含む細胞クラスターを、インスリン陽性内分泌細胞またはその先駆体からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させることができる。一部のケースでは、膵臓β細胞または膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化される。一部のケースでは、膵臓β細胞または膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化される。一部のケースでは、膵臓β細胞または膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、原始腸管細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化される。一部のケースでは、膵臓β細胞または膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、胚体内胚葉細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化される。一部のケースでは、膵臓β細胞または膵臓β細胞を含む細胞クラスターは、多能性前駆細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化される。一部のケースでは、多能性幹細胞は、胚性幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される。上述のように、非ネイティブ膵臓β細胞は、それらを幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導することができるので、幹細胞由来β細胞（ＳＣ−β細胞）と呼ばれることもある。一部のケースでは、ＳＣ−β細胞、またはＳＣ−β細胞が誘導される元の多能性幹細胞は、ヒトのものである。一部のケースでは、ＳＣ−β細胞は、ヒトのものである。
【０１５７】
[00188]本開示の一態様は、幹細胞、例えば、ＥＳ細胞または多能性幹細胞、例えばｉＰＳ細胞を増やす方法に関する。一部のケースでは、幹細胞を、好適な培養培地、例えば、ＲＰＭＩ、腎上皮基礎培地（ＲＥＢＭ）、ダルベッコ変性イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＣＭＲＬ  １０６６培地中で培養し、増やすことができる。
【０１５８】
[00189]本開示の一部の態様は、膵臓β細胞、例えば非ネイティブ膵臓β細胞、または膵臓β細胞を含む細胞クラスターを生成する方法を提供する。一部のケースでは、方法は、現在利用可能なプロトコール、例えば、米国特許出願第１４／６８４，１２９号および同第１４／６８４，１０１に記載されているものであり得、前記参考特許文献の各々は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０１５９】
[00190]本開示の態様は、胚体内胚葉細胞を含む。本明細書で使用の胚体内胚葉細胞を、任意の供給源から採取することができ、または任意の好適なプロトコールに従って生成することができる。一部の態様では、多能性幹細胞、例えば、ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣは、内胚葉細胞に分化される。一部の態様では、内胚葉細胞（ステージ１）は、例えば、原始腸管細胞（ステージ２）、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞（ステージ３）、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞（ステージ４）、またはＮｇｎ３陽性内分泌前駆細胞もしくはインスリン陽性内分泌細胞（ステージ５）にさらに分化され、その後、ＳＣ−β細胞（ステージ６）へと誘導または成熟される。
【０１６０】
[00191]一部のケースでは、胚体内胚葉細胞は、集団内の少なくとも一部の多能性細胞を胚体内胚葉細胞に、例えば、多能性幹細胞の集団をｉ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの増殖因子およびｉｉ）ＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子と接触させて胚体内胚葉細胞への多能性幹細胞の少なくとも一部の分化を誘導することにより、分化させることによって得ることができ、この場合、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉に特有の少なくとも１つのマーカーを発現する。
【０１６１】
[00192]多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化するように誘導することが可能なＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子を（例えば、単独で、またはＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子と組み合わせて）、本明細書で提供される方法に使用することができる。一部のケースでは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子は、アクチビンＡを含む。一部のケースでは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子は、増殖分化因子８（ＧＤＦ８）を含む。多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化するように誘導することが可能な、任意のＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子を（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子と組み合わせて）、本明細書で提供される方法に使用することができる。一部のケースでは、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子は、ＣＨＩＲ９９Ｑ２１を含む。一部のケースでは、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔ３ａ組換えタンパク質を含む。
【０１６２】
[00193]一部のケースでは、集団内の少なくとも一部の多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させることは、多能性細胞の集団を、ｉ）アクチビンＡ、およびｉｉ）ＣＨＩＲ９９０２１と、胚体内胚葉細胞への集団内の多能性細胞の少なくとも一部の分化を誘導するのに好適な期間、例えば、約２日、約３日、約４日、または約５日間、接触させることにより達成され、この場合、胚体内胚葉細胞は、胚体内胚葉に特有の少なくとも１つのマーカーを発現する。
【０１６３】
[00194]一部の例では、方法は、多能性細胞の集団を、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子（例えば、アクチビンＡ）の好適な濃度、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬと接触させることにより、多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップを含む。一部のケースでは、方法は、多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの使用を含む。一部のケースでは、方法は、多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約２００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの使用を含む。
【０１６４】
[00195]一部の例では、方法は、多能性細胞の集団を、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子（例えば、ＣＨＩＲ９９０２１）の好適な濃度、例えば、約０．０１μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、または約２００μＭと接触させることにより、多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップを含む。一部のケースでは、方法は、多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約２μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。一部のケースでは、方法は、多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約５μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。
【０１６５】
[00196]一部のケースでは、本明細書で開示の方法により産生される胚体内胚葉細胞は、ノーダル、Ｔｍｐｒｓｓ２、Ｔｍｅｍ３０ｂ、Ｓｔ１４、Ｓｐｉｎｋ３、Ｓｈ３ｇｌ２、Ｒｉｐｋ４、Ｒａｂ１Ｓ、Ｎｐｎｔ、Ｃｌｉｃ６、Ｃｌｄｎ５、Ｃａｃｎａ１ｂ、Ｂｎｉｐ１、Ａｎｘａ４、Ｅｍｂ、ＦｏｘＡ１、Ｓｏｘ１７、およびＲｂｍ３５ａからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現し、少なくとも１つのマーカーの発現は、胚体内胚葉細胞が誘導された元の多能性幹細胞と比べて胚体内胚葉細胞において統計的に有意な量に増加される。一部のケースでは、本明細書で開示の方法により産生される胚体内胚葉細胞は、それが誘導された元の多能性幹細胞と比べて統計的に有意な量で、Ｇａｔａ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰおよびＤａｂ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現しない。一部のケースでは、本明細書で開示の方法により産生される胚体内胚葉細胞は、それが誘導された元の多能性幹細胞と比べて統計的に有意な量で、Ｚｉｃ１、Ｐａｘ６、Ｆｌｋ１およびＣＤ３１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現しない。一部のケースでは、本明細書で開示の方法により産生される胚体内胚葉細胞は、それが誘導された元の多能性幹細胞と比べて統計的に有意な量で、Ｓｍａｄ２のより高いリン酸化レベルを有する。一部のケースでは、本明細書で開示の方法により産生される胚体内胚葉細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腸管を形成する能力を有する。一部のケースでは、本明細書で開示の方法により産生される胚体内胚葉細胞は、腸細胞に特有の形態を有する細胞に分化することができ、腸細胞に特有の形態を有する細胞は、ＦｏｘＡ２および／またはクローディン６を発現する。一部のケースでは、本明細書で開示の方法により産生される胚体内胚葉細胞を、内胚葉起源の細胞にさらに分化させることができる。
【０１６６】
[00197]一部のケースでは、多能性幹細胞の集団は、いずれかの分化の前に、または分化の第１ステージの間、少なくとも１つのβ細胞分化因子の存在下で培養される。任意の多能性幹細胞、例えば、ヒト多能性幹細胞、またはヒトｉＰＳ細胞、または本明細書で論じられるような多能性幹細胞のいずれか、または他の好適な多能性幹細胞を使用することができる。一部のケースでは、本明細書に記載のβ細胞分化因子は、多能性幹細胞の集団の培養培地中に存在することができ、または多能性幹細胞の集団の増殖（例えば、複製する、または増やすこと）中にボーラスでもしくは定期的に添加されることもある。ある特定の例では、多能性幹細胞の集団を、いずれかの分化の前に少なくとも１つのβ細胞分化因子に曝露することができる。他の例では、多能性幹細胞の集団を、分化の第１ステージの間、少なくとも１つのβ細胞分化因子に曝露することもある。
【０１６７】
[00198]本開示の態様は、原始腸管細胞を含む。本明細書で使用の原始腸管細胞を、任意の供給源から採取することができ、または任意の好適なプロトコールに従って生成することができる。一部の態様では、胚体内胚葉細胞は、原始腸管細胞に分化される。一部の態様では、原始腸管細胞は、例えば、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞に、さらに分化され、その後、ＳＣ−β細胞へと誘導または成熟される。
【０１６８】
[00199]一部のケースでは、原始腸管細胞は、集団内の少なくとも一部の胚体内胚葉細胞を原始腸管細胞に、例えば、胚体内胚葉細胞を線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの増殖因子と接触させて原始腸管細胞への胚体内胚葉細胞の少なくとも一部の分化を誘導することにより、分化させることによって得ることができ、この場合、原始腸管細胞は、原始腸管細胞に特有の少なくとも１つのマーカーを発現する。
【０１６９】
[00200]胚体内胚葉細胞を原始腸管細胞に分化するように誘導することが可能なＦＧＦファミリーからの任意の増殖因子を（例えば、単独で、または他の因子と組み合わせて）、本明細書で提供される方法に使用することができる。一部のケースでは、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）を含む。一部のケースでは、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＦＧＦ２を含む。一部のケースでは、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＦＧＦ８Ｂを含む。一部のケースでは、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＦＧＦ  １０を含む。一部のケースでは、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＦＧＦ２１を含む。
【０１７０】
[00201]一部のケースでは、原始腸管細胞は、集団内の少なくとも一部の胚体内胚葉細胞を原始腸管細胞に、例えば、胚体内胚葉細胞をＫＧＦとある特定の期間、例えば、約１日、約２日、約３日、または約４日間接触させて原始腸管細胞への胚体内胚葉細胞の少なくとも一部分の分化を誘導することにより、分化させることによって得ることができる。
【０１７１】
[00202]一部のケースでは、方法は、胚体内胚葉細胞を、ＦＧＦファミリーからの増殖因子（例えば、ＫＧＦ）の好適な濃度、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬと接触させることにより、胚体内胚葉細胞を原始腸管細胞に分化させるステップを含む。一部のケースでは、方法は、胚体内胚葉細胞の原始腸管細胞への分化のための約５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦの使用を含む。一部のケースでは、方法は、胚体内胚葉細胞の原始腸管細胞への分化のための約１００ｎｇ／ｍＬのＫＧＦの使用を含む。
【０１７２】
[00203]本開示の態様は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を含む。本明細書で使用のＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、任意の供給源から採取することができ、または任意の好適なプロトコールに従って生成することができる。一部の態様では、原始腸管細胞は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化される。一部の態様では、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞に、さらに分化され、その後、ＳＣ−β細胞へと誘導または成熟される。
【０１７３】
[00204]一部の態様では、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、集団内の少なくとも一部の原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に、例えば、原始腸管細胞をｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子、ｉｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、ｉｖ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子、ｖｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化因子、およびｖｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させてＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞への原始腸管細胞の少なくとも一部の分化を誘導することにより、分化させることによって得ることができ、この場合、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１を発現する。
【０１７４】
[00205]一部の態様では、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、集団内の少なくとも一部の原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に、例えば、原始腸管細胞をｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子、ｉｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、ｉｖ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子、およびｖｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化因子と接触させてＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞への原始腸管細胞の少なくとも一部の分化を誘導することにより、分化させることによって得ることができ、この場合、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１を発現する。
【０１７５】
[00206]一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、集団内の少なくとも一部の原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に、例えば、原始腸管細胞をｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子、およびｖ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化因子と接触させてＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞への原始腸管細胞の少なくとも一部の分化を誘導することにより、分化させることによって得ることができ、この場合、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１を発現する。
【０１７６】
[00207]一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、集団内の少なくとも一部の原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に、例えば、原始腸管細胞をｉ）少なくとも１つのＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子、およびｉｉｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化因子と接触させることにより、分化させることによって得ることができ、この場合、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１を発現する。
【０１７７】
[00208]一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、集団内の少なくとも一部の原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に、例えば、原始腸管細胞をｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、およびｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子と接触させてＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞への原始腸管細胞の少なくとも一部の分化を誘導することにより、分化させることによって得ることができ、この場合、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１を発現する。
【０１７８】
[00209]原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能な任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せとともに）、本明細書で提供される方法に使用することができる。一部のケースでは、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ−１を含む。一部の例では、方法は、原始腸管細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１１８９）のとある濃度、例えば、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１μＭと接触させるステップを含む。一部の例では、方法は、原始腸管細胞を、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ−１）のとある濃度、例えば、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．７５μＭ、約２μＭ、約２．２μＭ、約２．５μＭ、約２．７５μＭ、約３μＭ、約３．２５μＭ、約３．５μＭ、約３．７５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭと接触させるステップを含む。
【０１７９】
[00210]原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能なＴＧＦ−βスーパーファミリーからの任意の増殖因子を（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せとともに）、使用することができる。一部のケースでは、ＴＧＦ−βファミリーからの増殖因子は、アクチビンＡを含む。一部のケースでは、ＴＧＦ−βファミリーからの増殖因子は、アクチビンＡまたはＧＤＦ８を含む。一部の例では、方法は、原始腸管細胞を、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子（例えば、アクチビンＡ）のとある濃度、例えば、約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１７ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約１９ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２１ｎｇ／ｍＬ、約２２ｎｇ／ｍＬ、約２３ｎｇ／ｍＬ、約２４ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約２６ｎｇ／ｍＬ、約２７ｎｇ／ｍＬ、約２８ｎｇ／ｍＬ、約２９ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬと接触させるステップを含む。
【０１８０】
[00211]原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能なＦＧＦファミリーからの任意の増殖因子を（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せとともに）、使用することができる。一部のケースでは、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）を含む。一部のケースでは、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ  １０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。一部の例では、方法は、原始腸管細胞を、ＦＧＦファミリーからの増殖因子（例えば、ＫＧＦ）のとある濃度、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬと接触させるステップを含む。
【０１８１】
[00212]原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能な任意のＳＨＨ経路阻害剤を（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せとともに）、使用することができる。一部のケースでは、ＳＨＨ経路阻害剤は、Ｓａｎｔ１を含む。一部の例では、方法は、原始腸管細胞を、ＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）のとある濃度、例えば、約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭと接触させるステップを含む。
【０１８２】
[00213]原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能な任意のＲＡシグナル伝達経路活性化因子を（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せとともに）、使用することができる。一部のケースでは、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、レチノイン酸を含む。一部の例では、方法は、原始腸管細胞を、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、レチノイン酸）のとある濃度、例えば、約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭと接触させるステップを含む。
【０１８３】
[00214]原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能な任意のＰＫＣ活性化因子を（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのＲＡシグナル伝達経路活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せとともに）、使用することができる。一部のケースでは、ＰＫＣ活性化因子は、ＰｄＢＵを含む。一部のケースでは、ＰＫＣ活性化因子は、ＴＰＢを含む。一部の例では、方法は、原始腸管細胞を、ＰＫＣ活性化因子（例えば、ＰｄＢＵ）のとある濃度、例えば、約１０μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、約７５μＭ、約８０μＭ、約１００μＭ、約１２０μＭ、約１４０μＭ、約１５０μＭ、約１７５μＭ、約１８０μＭ、約２００μＭ、約２１０μＭ、約２２０μＭ、約２４０μＭ、約２５０μＭ、約２６０μＭ、約２８０μＭ、約３００μＭ、約３２０μＭ、約３４０μＭ、約３６０μＭ、約３８０μＭ、約４００μＭ、約４２０μＭ、約４４０μＭ、約４６０μＭ、約４８０μＭ、約５００μＭ、約５２０μＭ、約５４０μＭ、約５６０μＭ、約５８０μＭ、約６００μＭ、約６２０μＭ、約６４０μＭ、約６６０μＭ、約６８０μＭ、約７００μＭ、約７５０μＭ、約８００μＭ、約８５０μＭ、約９００μＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、または約５ｍＭと接触させるステップを含む。
【０１８４】
[00215]原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能な任意のＲＯＣＫ阻害剤を（例えば、単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＰＫＣ活性化因子、および少なくとも１つのＲＡシグナル伝達経路活性化因子の任意の組合せとともに）、使用することができる。一部のケースでは、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、またはＨ−１１５２を含む。一部のケースでは、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２を含む。一部の例では、方法は、原始腸管細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ−２７６３２）のとある濃度、例えば、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭと接触させるステップを含む。
【０１８５】
[00216]一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、集団内の少なくとも一部の原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に、例えば、原始腸管細胞をレチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＬＤＮ１９３１８９、ＰｄＢＵ、Ｙ−２７６３２、およびアクチビンＡと好適な期間、例えば、約１日、約２日、約３日、または約４日間、接触させることにより、分化させることによって得ることができる。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、集団内の少なくとも一部の原始腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に、例えば、原始腸管細胞をレチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＬＤＮ１９３１８９、ＰｄＢＵ、Ｙ−２７６３２、およびアクチビンＡと約２日間接触させることにより、分化させることによって得ることができる。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、少なくとも一部の原始腸管細胞をＳ３培地中で分化させることにより得ることができる。
【０１８６】
[00217]本開示の態様は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を含む。本明細書で使用のＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、任意の供給源から採取することができ、または任意の好適なプロトコールに従って生成することができる。一部の態様では、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化される。一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、例えば、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞またはインスリン陽性内分泌細胞に、さらに分化され、その後、ＳＣ−β細胞へと誘導または成熟される。
【０１８７】
[00218]一部の態様では、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞からＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を産生する方法は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団（例えば、細胞クラスター化を促進するおよび／または細胞生存を促進する条件下にある）を、ａ）線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、ｂ）ソニックヘッジホグ経路阻害剤、および必要に応じてｃ）低濃度のレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化因子を含む、少なくとも２つのβ細胞分化因子と接触させて、集団内の少なくとも１つのＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞のＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞への分化を誘導するステップを含み、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、ＮＫＸ６．１を発現する。
【０１８８】
[00219]一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および必要に応じてｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化因子と接触させて、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞へのＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部の分化を誘導することにより得られ、この場合、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現する。
【０１８９】
[00220]一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ならびに必要に応じてｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの増殖因子と接触させて、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞へのＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部の分化を誘導することにより得られる。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、細胞クラスター化を促進する条件下にあるＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子と接触させることにより得られる。
【０１９０】
[00221]一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、多能性細胞の集団から産生される。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、ｉＰＳ細胞の集団から産生される。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、ＥＳＣ細胞の集団から産生される。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、胚体内胚葉細胞の集団から産生される。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞は、原始腸管細胞の集団から産生される。
【０１９１】
[00222]Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞をＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能なＦＧＦファミリーからの任意の増殖因子を（例えば、単独で、または少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子、および少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子の任意の組合せとともに）、本明細書で提供される方法に使用することができる。一部のケースでは、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）を含む。一部のケースでは、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ  １０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。一部の例では、方法は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＦＧＦファミリーからの増殖因子（例えば、ＫＧＦ）のとある濃度、例えば、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬと接触させるステップを含む。
【０１９２】
[00223]Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞をＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能な任意のＳＨＨ経路阻害剤を（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの増殖因子の任意の組合せとともに）、本明細書で提供される方法に使用することができる。一部のケースでは、ＳＨＨ経路阻害剤は、Ｓａｎｔ１を含む。一部の例では、方法は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）のとある濃度、例えば、約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭと接触させるステップを含む。
【０１９３】
[00224]Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞をＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能な任意のＲＡシグナル伝達経路活性化因子を（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの増殖因子の任意の組合せとともに）、使用することができる。一部のケースでは、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、レチノイン酸を含む。一部の例では、方法は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、レチノイン酸）のとある濃度、例えば、約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭと接触させるステップを含む。
【０１９４】
[00225]Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞をＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能な任意のＲＯＣＫ阻害剤を（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの増殖因子の任意の組合せとともに）、使用することができる。一部のケースでは、ＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビン、Ｙ−２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、または１４−１１５２を含む。一部の例では、方法は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＲＯＣＫ阻害剤（例えば、Ｙ−２７６３２）のとある濃度、例えば、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭと接触させるステップを含む。
【０１９５】
[00226]Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞をＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化するように誘導することが可能なＴＧＦ−βスーパーファミリーからの任意の活性化因子を（例えば、単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、およびＲＯＣＫ阻害剤の任意の組合せとともに）、使用することができる。一部のケースでは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの活性化因子は、アクチビンＡまたはＧＤＦ８を含む。一部の例では、方法は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＴＦＧ−βスーパーファミリーからの増殖因子（例えば、アクチビンＡ）のとある濃度、例えば、約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．２ｎｇ／ｍＬ、約０．３ｎｇ／ｍＬ、約０．４ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．６ｎｇ／ｍＬ、約０．７ｎｇ／ｍＬ、約０．８ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約１．２ｎｇ／ｍＬ、約１．４ｎｇ／ｍＬ、約１．６ｎｇ／ｍＬ、約１．８ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約２．２ｎｇ／ｍＬ、約２．４ｎｇ／ｍＬ、約２．６ｎｇ／ｍＬ、約２．８ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約３．２ｎｇ／ｍＬ、約３．４ｎｇ／ｍＬ、約３．６ｎｇ／ｍＬ、約３．８ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約４．２ｎｇ／ｍＬ、約４．４ｎｇ／ｍＬ、約４．６ｎｇ／ｍＬ、約４．８ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約５．２ｎｇ／ｍＬ、約５．４ｎｇ／ｍＬ、約５．６ｎｇ／ｍＬ、約５．８ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約６．２ｎｇ／ｍＬ、約６．４ｎｇ／ｍＬ、約６．６ｎｇ／ｍＬ、約６．８ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬと接触させるステップを含む。一部の例では、方法は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＴＦＧ−βスーパーファミリーからの増殖因子（例えば、アクチビンＡ）のとある濃度、例えば、約５ｎｇ／ｍＬと接触させるステップを含む。
【０１９６】
[00227]一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、細胞クラスター化を促進する条件下にあるＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、およびＲＡと５日間にわたって接触させることにより得られる。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、細胞クラスター化を促進する条件下にあるＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＲＡ、Ｙ２７６３２、およびアクチビンＡと５日間にわたって接触させることにより得られる。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、細胞クラスター化を促進する条件下にあるＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を、ＫＧＦと５日間にわたって接触させることにより得られる。一部のケースでは、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、Ｓ３培地中のＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を接触させることにより得られる。
【０１９７】
[00228]本開示の態様は、インスリン陽性内分泌細胞を含む。本明細書で使用のインスリン陽性内分泌細胞を任意の供給源から採取することができ、または任意の好適なプロトコールに従って生成することができ、一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞は、インスリン陽性内分泌細胞に分化され、一部の態様では、これらのインスリン陽性内分泌細胞が、例えば、ＳＣ−β細胞への誘導または成熟により、さらに分化される。
【０１９８】
[00229]一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞からインスリン陽性内分泌細胞を産生する方法は、ＮＫＸ６−１陽性膵臓前駆細胞を含む細胞の集団（例えば、細胞クラスター化を促進する条件下にある）を、ａ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤およびｂ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子と接触させて、集団内の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞（ｃｅｉｌ）は、インスリンを発現する。一部のケースでは、インスリン陽性内分泌細胞は、Ｐｄｘ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、Ｍａｆｂ、ｇｌｉｓ３、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、Ｚｎｔ８、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３および／またはインスリンを発現する。
【０１９９】
[00230]ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することが可能な任意のＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤を（例えば、単独で、または他のβ細胞分化因子、例えば、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子と組み合わせて）、使用することができる。一部のケースでは、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ−β受容体Ｉ型キナーゼシグナル伝達を含む。一部のケースでは、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩを含む。
【０２００】
[00231]ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することが可能な任意の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子を（例えば、単独で、または他のβ細胞分化因子、例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤と組み合わせて）、使用することができる。一部のケースでは、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子は、トリヨードチロニン（Ｔ３）を含む。
【０２０１】
[00232]一部のケースでは、方法は、細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞）の集団を少なくとも１つの追加の因子と接触させるステップを含む。一部のケースでは、方法は、Ｐｄｘ１陽性ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ｉｉｉ）γセクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、および必要に応じてｖ）プロテインキナーゼ阻害剤のうちの、少なくとも１つと接触させるステップを含む。
【０２０２】
[00233]一部のケースでは、方法は、細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞）の集団を少なくとも１つの追加の因子と接触させるステップを含む。一部のケースでは、方法は、Ｐｄｘ１陽性ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ｉｉｉ）γセクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、およびｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤のうちの、少なくとも１つと接触させるステップを含む。
【０２０３】
[00234]集団内のＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することが可能である任意のγセレクターゼ阻害剤（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／または甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子のいずれかと組み合わせて）。一部のケースでは、γセクレターゼ阻害剤は、ＸＸＩを含む。一部のケースでは、γセクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴを含む。一部の例では、方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、γセクレターゼ阻害剤（例えば、ＸＸＩ）のとある濃度、例えば、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０５μＭ、約０．０７５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約２．９μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．２μＭ、約５．４μＭ、約５．６μＭ、約５．８μＭ、約６μＭ、約６．２μＭ、約６．４μＭ、約６．６μＭ、約６．８μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、または約５０μＭと接触させるステップを含む。
【０２０４】
[00235]集団内のＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することが可能なＥＧＦファミリーからの任意の増殖因子を（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／または甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子のいずれかと組み合わせて）、使用することができる。一部のケースでは、ＥＧ  Ｆファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ベータセルリンを含む。一部のケースでは、ＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＥＧＦを含む。一部の例では、方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、ＥＧＦファミリーからの増殖因子（例えば、ベータセルリン）のとある濃度、例えば、約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２２ｎｇ／ｍＬ、約２４ｎｇ／ｍＬ、約２６ｎｇ／ｍＬ、約２８ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬと接触させるステップを含む。
【０２０５】
[00236]ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することが可能な任意のＲＡシグナル伝達経路活性化因子を（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／または甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子のいずれかと組み合わせて）、使用することができる。一部のケースでは、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、ＲＡを含む。一部の例では、方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、ＲＡシグナル伝達経路活性化因子（例えば、レチノイン酸）のとある濃度、例えば、約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭと接触させるステップを含む。
【０２０６】
[00237]ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することが可能な任意のＳＨＨ経路阻害剤を（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／または甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子のいずれかと組み合わせて）、本明細書で提供される方法に使用することができる。一部のケースでは、ＳＨＨ経路阻害剤は、Ｓａｎｔ１を含む。一部の例では、方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、ＳＨＨ経路阻害剤（例えば、Ｓａｎｔ１）のとある濃度、例えば、約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭと接触させるステップを含む。
【０２０７】
[00238]ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することが可能な任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／または甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子のいずれかと組み合わせて）、使用することができる。一部のケースでは、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ−１を含む。一部の例では、方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞を、ＢＭＰシグナル経路阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１１８９）のとある濃度、例えば、約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１μＭと接触させるステップを含む。
【０２０８】
[00239]一部のケースでは、細胞の集団は、必要に応じてプロテインキナーゼ阻害剤と接触される。一部のケースでは、細胞の集団は、プロテインキナーゼ阻害剤と接触されない。一部のケースでは、細胞の集団は、プロテインキナーゼ阻害剤と接触される。集団内のＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することが可能である任意のプロテインキナーゼ阻害剤（例えば、単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤および／または甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子のいずれかと組み合わせて）。一部のケースでは、プロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンを含む。
【０２０９】
[00240]一部のケースでは、方法は、細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞）の集団を、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３、ＲＡ、Ｓａｎｔ１、およびベータセルリンと７日間にわたって接触させて、集団内の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞は、インスリンを発現する。一部のケースでは、方法は、細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞）の集団を、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３、ＲＡ、Ｓａｎｔ１、ベータセルリン、およびＬＤＮ１９３１８９と７日間にわたって接触させて、集団内の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞（ｃｅｉｌ）は、インスリンを発現する。一部の実施形態では、１つまたは複数の分化因子は、ステージ５の一部分、例えば、ステージ５の期間の最初の１、２、３、４、５もしくは６日のみ、またはステージ５の期間の最後の１、２、３、４、５もしくは６日に添加される。一例では、細胞は、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤とステージ５の最初の２、３、４または５日間のみ接触され、その後、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、培養培地から除去される。別の例では、細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤とステージ５の間の最初の１、２または３日間のみ接触され、その後、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、培養培地から除去される。
【０２１０】
[00241]一部のケースでは、方法は、細胞（例えば、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞）の集団をＢＥ５培地中で培養して、集団内の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞は、インスリンを発現する。
【０２１１】
[00242]本開示の態様は、膵臓ベータ細胞（例えば、非ネイティブ膵臓β細胞）を生成することを含む。非ネイティブ膵臓β細胞は、一部のケースでは、内在性成熟β細胞と形態および機能の点で似ているが、それにもかかわらず、ネイティブβ細胞とは明確に異なる。
【０２１２】
[00243]一部のケースでは、本明細書で提供される方法を使用して生成されたインスリン陽性内分泌細胞は、単独で、または他の細胞型、例えば、その先駆体、例えば、幹細胞、胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞、もしくはＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞と一緒に、細胞クラスターを形成することができる。
【０２１３】
[00244]一部のケースでは、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞集団を、いかなる外来性分化因子（例えば、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子、ＰＫＣ活性化因子、ＴＧＦ−βスーパーファミリー、ＦＧＦファミリーもしくはＥＧＦファミリーからの増殖因子、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤、γセクレターゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、またはＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤）も添加することなく、ＳＣ−β細胞に成熟するように直接誘導することができる。
【０２１４】
[00245]一部のケースでは、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞集団をＳＣ−β細胞に成熟するように、インスリン陽性内分泌細胞を分化因子と接触させることにより、直接誘導することができる。分化因子は、本明細書に記載のＴＧＦ−βシグナル伝達経路の少なくとも１つの阻害剤および甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子を含むことができる。一部のケースでは、ＳＣ−β細胞を、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞の集団をＡｌｋ５ｉおよびＴ３と接触させることにより得ることができる。
【０２１５】
[00246]一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞をＮＳ−ＧＦ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、ＤＭＥＭ培地、またはＣＭＲＬ培地中で成熟させることができる。一部のケースでは、インスリン陽性内分泌細胞を、１０％ＦＢＳを補充したＣＭＲＬ培地中で成熟させることができる。一部のケースでは、インスリン陽性内分泌細胞を、１％ＨＳＡを補充したＤＭＥＭ培地中で成熟させることができる。他のケースでは、ＳＣ−β細胞は、２％ＢＳＡにより補完され得るＭＣＤＢ１３１培地中でインスリン陽性内分泌細胞を含有する細胞の集団を培養することによって得ることができる。一部のケースでは、ＳＣ−β細胞へのインスリン陽性内分泌細胞の成熟のための２％ＢＳＡを含有するＭＣＤＢ１３１培地は、本明細書に記載の小分子因子を含まないことがある。一部のケースでは、ＳＣ−β細胞へのインスリン陽性内分泌細胞の成熟のための２％ＢＳＡを含有するＭＣＤＢ１３１培地は、血清を含まない（例えば、ＦＢＳを含まない）ことがある。
【０２１６】
[00247]一部の態様では、本開示は、多能性細胞からＳＣ−β細胞を生成する方法であって、ａ）多能性幹細胞をＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子と３日間にわたって接触させることにより、集団内の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップと；ｂ）胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間にわたって接触させるプロセスにより、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原始腸管細胞に分化させるステップと；ｃ）原始腸管細胞をｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ−１またはＬＤＮ１９３１８９）、ｖ）ＰＫＣ活性化因子、およびｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスにより、原始腸管細胞の少なくとも一部をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップと；ｄ）細胞クラスター化を促進する条件下にあるＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞をｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および必要に応じてｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ならびに必要に応じてｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間にわたって１日おきに接触させるプロセスにより、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップであって、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞がＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現する、ステップと；ｅ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞をｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化因子、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ｖ）γセクレターゼ阻害剤、必要に応じてｖｉ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、および必要に応じてｖｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と５日〜７日の間の期間にわたって１日おきに接触させるプロセスにより、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップと；ｆ）外来性分化因子を含有しない培地（例えば、ＮＳ−ＧＦ培地、ＢＳＡを補充したＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７〜１４日の間の期間にわたって１日おきにＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞を培養して、ＳＣ−β細胞へのＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスにより、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部をＳＣ−β細胞に分化させるステップであって、ＳＣ−β細胞がＧＳＩＳ応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで示す、ステップとを含む方法を、提供する。一部のケースでは、ＧＳＩＳ応答は、内在性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に似ている。
【０２１７】
[00248]一部の態様では、本開示は、多能性細胞からＳＣ−β細胞を生成する方法であって、ａ）多能性幹細胞をＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子と３日間にわたって接触させることにより、集団内の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップと；ｂ）胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間にわたって接触させるプロセスにより、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原始腸管細胞に分化させるステップと；ｃ）原始腸管細胞をｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｖ）ＰＫＣ活性化因子、ｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖｉｉ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの増殖因子と２日間にわたって接触させるプロセスにより、原始腸管細胞の少なくとも一部をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップと；ｄ）細胞クラスター化を促進する条件下にあるＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞をｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および必要に応じてｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ならびに必要に応じてｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間にわたって１日おきに接触させるプロセスにより、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部分をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップであって、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞がＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現する、ステップと；ｅ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞をｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化因子、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ｖ）γセクレターゼ阻害剤、必要に応じてｖｉ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、および必要に応じてｖｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と５日〜７日の間の期間にわたって１日おきに接触させるプロセスにより、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップと；ｆ）外来性分化因子を含有しない培地（例えば、ＮＳ−ＧＦ培地、ＢＳＡを補充したＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７〜１４日の間の期間にわたって１日おきにＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞を培養してＳＣ−β細胞へのＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスにより、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部をＳＣ−β細胞に分化させるステップであって、ＳＣ−β細胞がＧＳＩＳ応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで示す、ステップとを含む方法を、提供する。一部のケースでは、ＧＳＩＳ応答は、内在性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に似ている。
【０２１８】
[00249]一部の態様では、本開示は、多能性細胞からＳＣ−β細胞を生成する方法であって、ａ）多能性幹細胞をＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子と３日間にわたって接触させることにより、集団内の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップと；ｂ）胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間にわたって接触させるプロセスにより、胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原始腸管細胞に分化させるステップと；ｃ）原始腸管細胞をｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＰＫＣ活性化因子、およびｖ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスにより、原始腸管細胞の少なくとも一部をＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップと；ｄ）細胞クラスター化を促進する条件下にあるＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞をｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および必要に応じてｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ならびに必要に応じてｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤およびｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間にわたって１日おきに接触させるプロセスにより、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部分をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞に分化させるステップであって、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞がＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現する、ステップと；ｅ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞をｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化因子、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化因子、ｖ）γセクレターゼ阻害剤、および必要に応じてｖｉ）上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの増殖因子と５日〜７日の間の期間にわたって１日おきに接触させるプロセスにより、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞の少なくとも一部をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞に分化させるステップと；ｆ）外来性分化因子を含有しない培地（例えば、ＮＳ−ＧＦ培地、ＢＳＡを補充したＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で７〜１４日の間の期間にわたって１日おきにＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞を培養して、ＳＣ−β細胞へのＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部のｉｎ  ｖｉｔｒｏ成熟を誘導するプロセスにより、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性内分泌細胞の少なくとも一部をＳＣ−β細胞に分化させるステップであって、ＳＣ−β細胞がＧＳＩＳ応答をｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで示す、ステップとを含む方法を、提供する。一部のケースでは、ＧＳＩＳ応答は、内在性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に似ている。
【０２１９】
[00250]第１の細胞クラスターから解離した細胞を培養するために使用される培地は、ゼノフリーであり得る。動物起源の細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、他の動物からの産物を有することができない。一部のケースでは、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、いかなる非ヒト動物からの産物も有することができない。例えば、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）ではなく、ヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含むことができる。例えば、培地は、約１％〜約２０％、約５％〜約１５％、約８％〜約１２％、約９％〜約１１％血清を含むことができる。一部のケースでは、培地は、約１０％の血清を含むことができる。一部のケースでは、培地は、小分子および／またはＦＢＳを含まないこともある。例えば、培地は、２％ＢＳＡが補充されたＭＣＤＢ１３１基礎培地を含むことができる。一部のケースでは、培地は、無血清である。一部の例では、培地は、外来性小分子、またはシグナル伝達経路アゴニストもしくはアンタゴニスト、例えば、線維芽細胞増殖因子ファミリーからの増殖因子（ＦＧＦ、例えば、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ  １０、もしくはＦＧＦ２１）、ソニックヘッジホグアンタゴニスト（例えば、Ｓａｎｔ１、Ｓａｎｔ２、Ｓａｎｔ４、Ｓａｎｔ４、Ｃｕｒ６１４１４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、シクロパミン、もしくはそれらの誘導体）、レチノイン酸シグナル伝達アゴニスト（例えば、レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＰＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、もしくはＣＤ２３１４）、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤（例えば、チアゾビビン、Ｙ−２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、もしくは１４−１１５２）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化因子（例えば、ホルボール１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート、ブリオスタチン１、もしくはそれらの誘導体）、ＴＧＦβスーパーファミリーのアンタゴニスト（例えば、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ  ４４６８５９−３３−２）、Ａ８３−０１、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ６６０４、ＳＢ−５２５３３４、ＳＤ−２０８、ＳＢ−５０５１２４、もしくはそれらの誘導体）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）１型受容体の阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９もしくはその誘導体）、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子（例えば、Ｔ３もしくはその誘導体）、ガンマセクレターゼ阻害剤（例えば、ＸＸＩ、ＤＡＰＴ、もしくはそれらの誘導体）、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の活性化因子（例えば、ＷＮＴ３ａもしくはアクチビンＡ）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリーからの増殖因子（例えば、ベータセルリンもしくはＥＧＦ）、広域キナーゼ（例えば、スタウロスポリンもしくはその誘導体）、非必須アミノ酸、ビタミンもしくは抗酸化剤（例えば、シクロパミン、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、もしくはそれらの誘導体）、または他の追加物、例えば、Ｎ−アセチルシステイン、硫酸亜鉛もしくはヘパリンを、含まないこともある。一部のケースでは、再凝集培地は、外来性細胞外マトリックス分子を含まないことがある。一部のケースでは、再凝集培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含まない。一部のケースでは、再凝集培地は、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビンおよびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎならびにこれらの混合物などの、他の細胞外マトリックス分子または材料も、溶解細胞膜調製物も、含まない。
【０２２０】
[00251]当業者には、培地に補充される血清アルブミンの濃度が様々であり得ることは理解されるであろう。例えば、培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１）は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、または約１５％ＢＳＡを含むことがある。他のケースでは、培地は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、または約１５％ＨＳＡを含むことがある。使用される培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１培地）は、旧来の基礎培地に見られない成分、例えば、微量元素、プトレシン、アデニン、チミジン、ならびにより高レベルの何らかのアミノ酸およびビタミンを含有することもある。これらの追加物は、培地への非常に低レベルの血清または規定成分の補充を可能にし得る。培地は、タンパク質および／または増殖因子を含まないこともあり、培地にＥＧＦ、ヒドロコルチゾンおよび／またはグルタミンが補充されることがある。培地は、１つまたは複数の細胞外マトリックス分子（例えば、細胞外タンパク質）を含むこともある。培地に使用される非限定的な例示的細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、ビグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンを挙げることができる。一部のケースでは、培地は、ＬＮ−３３２などのラミニンを含む。一部のケースでは、培地は、ヘパリンを含む。
【０２２１】
[00252]培養中に、培地を、例えば、培地中の細胞に最適な環境を提供するために、定期的に交換することができる。再凝集のために第１の細胞クラスターから解離した細胞を培養する場合、培地を少なくともまたは約４時間、１２時間、２４時間、４８時間、３日または４日おきに交換することができる。例えば、培地を４８時間おきに交換することができる。
【０２２２】
[00253]一部のケースでは、細胞を動的条件下で（例えば、細胞が浮遊培養中に定常的な運動または撹拌に付される条件下で）培養することができる。動的細胞培養の場合、細胞を容器（例えば、非接着性容器、例えば、スピナーフラスコ（例えば、２００ｍｌ〜３０００ｍｌ、例えば、２５０ｍｌのもの；１００ｍｌのもの）、または１２５ｍｌエルレンマイヤー）内で培養することができ、容器は、制御ユニットと接続することができ、したがって、制御された培養システムを提供することができる。一部のケースでは、細胞を、それらの増殖能を保ちつつ、非動的条件下で培養（例えば、静置培養）することができる。非動的細胞培養の場合、細胞を接着性培養容器内で培養することができる。接着性培養容器を、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着用の任意の基質でコーティングして、細胞への容器表面の接着性を向上させることができる。細胞接着用の基質は、幹細胞またはフィーダー細胞（使用される場合）を接着することを目的とする任意の材料であり得る。細胞接着用の基質は、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビンおよびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ、およびこれらの混合物、例えばＭａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ならびに溶解細胞膜調製物を含む。
【０２２３】
[00254]動的細胞培養容器（例えば、スピナーフラスコ）内の培地を撹拌することができる（例えば、撹拌機により）。回転速度は、再凝集した第２の細胞クラスターのサイズと相関し得る。回転速度を、第２の細胞クラスターのサイズが内在性膵島と同様になり得るように、制御することができる。一部のケースでは、回転速度は、第２の細胞クラスターのサイズが約７５μｍ〜約２５０μｍになり得るように制御される。動的細胞培養容器（例えば、スピナーフラスコ）の回転速度は、約２０回転毎分（ｒｐｍ）〜約１００ｒｐｍ、例えば、約３０ｒｐｍ〜約９０ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ〜約６０ｒｐｍ、約４５ｒｐｍ〜約５０ｒｐｍであり得る。一部のケースでは、回転速度は、約５０ｒｐｍであり得る。
【０２２４】
[00255]本明細書で提供される場合のステージ６細胞は、本明細書に記載の解離および再凝集プロセスに付されることもあり、または付されないこともある。一部のケースでは、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞クラスターを再凝集させることができる。細胞クラスターの再凝集は、インスリン陽性内分泌細胞を濃縮することができる。一部のケースでは、細胞クラスター中のインスリン陽性内分泌細胞をさらに膵臓β細胞に成熟させることができる。例えば、再凝集後、第２の細胞クラスターは、ネイティブ膵島に似ているｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＳＩＳを示すことができる。例えば、再凝集後、第２の細胞クラスターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＳＩＳを示す非ネイティブ膵臓β細胞を含むことができる。一部の実施形態では、再凝集プロセスは、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４３１７９の開示に従って行うことができ、前記参考特許文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２２５】
[00256]一部の実施形態では、本開示は、本明細書で提供される方法を使用して得られた非ネイティブ膵臓β細胞またはその先駆体の凍結保存に関する。一部の実施形態では、非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞集団を凍結保存によって保管することができる。例えば、非ネイティブ膵臓β細胞、例えば一部のケースではステージ６細胞を含む細胞集団を解離させて細胞浮遊液、例えば、単個細胞浮遊液にすることができ、その細胞浮遊液を凍結保存することができ、例えば、凍結保存溶液中で凍結させることができる。細胞の解離は、本明細書で提供される技法のいずれかにより、例えば、酵素的処理により、行うことができる。細胞を最高−２０℃、最高−３０℃、最高−４０℃、最高−５０℃、最高−６０℃、最高−７０℃、最高−８０℃、最高−９０℃、最高−１００℃、最高−１１０℃、最高−１２０℃、最高−１３０℃、最高−１４０℃、最高−１５０℃、最高−１６０℃、最高−１７０℃、最高−１８０℃、最高−１９０℃、または最高−２００℃の温度で凍結させることができる。一部のケースでは、細胞は、約−８０℃の温度で凍結される。一部のケースでは、細胞は、約−１９５℃の温度で凍結される。電気冷凍庫、固体二酸化炭素および液体窒素などの、しかしこれらに限定されない、任意の冷却方法を、凍結保存に必要な低温を提供するために使用することができる。一部のケースでは、特注の溶液と市販の溶液の両方を含む、当業者が入手できる任意の凍結保存溶液を、低温で保管するための細胞のインキュベーションに使用することができる。例えば、抗凍結剤を含有する溶液を使用することができる。抗凍結剤は、凍結損傷から細胞を保護するように構成されている薬剤であり得る。例えば、抗凍結剤は、凍結保存溶液のガラス転移温度を低下させることができる物質であり得る。使用することができる例示的な抗凍結剤としては、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロール）、デキストラン（例えば、デキストラン−４０）、およびトレハロースが挙げられる。他の効果のために追加の薬剤を凍結保存溶液に添加することができる。一部のケースでは、市販の凍結保存溶液、例えば、ＦｒｏｓｔａＬｉｆｅ（商標）、ｐＺｅｒｖｅ（商標）、Ｐｒｉｍｅ−ＸＶ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ  Ｓｙｎｔｈ−ａ−Ｆｒｅｅｚｅ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）ＦＲＳ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ、およびＣｒｙｏＤｅｆｅｎｄ（登録商標）Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｅｄｉａを、本明細書で提供される方法に使用することができる。
【０２２６】
[00257]Ｖ．分化因子
[00258]本開示の態様は、例えば、ＳＣ−β細胞（例えば、成熟膵臓β細胞）へのインスリン陽性内分泌細胞の成熟または他の前駆細胞の分化を誘導するために、前駆細胞（例えば、幹細胞、例えば、ｉＰＳ細胞、胚体内胚葉細胞、原始腸管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞、ＮＫＸ６．１陽性膵臓前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞）をβ細胞分化因子と接触させることに関する。一部の実施形態では、分化因子は、多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣ）の胚体内胚葉細胞への分化を、例えば、本明細書に記載される方法に従って、誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、胚体内胚葉細胞の原始腸管細胞への分化を、例えば、本明細書に記載される方法に従って、誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、原始腸管細胞のＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞への分化を、例えば、本明細書に記載される方法に従って、誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞のＮＫＸ６−１陽性膵臓前駆細胞への分化を、例えば、本明細書に記載される方法に従って、誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、ＮＫＸ６−１陽性膵臓前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を、例えば、本明細書に記載される方法に従って、誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、インスリン陽性内分泌細胞のＳＣ−β細胞への成熟を、例えば、本明細書に記載される方法に従って、誘導することができる。
【０２２７】
[00259]本明細書に記載される少なくとも１つの分化因子を本明細書で開示の方法に従って単独でまたは他の分化因子（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ａｃｔｏｒｓ）と組み合わせて使用してＳＣ−β細胞を生成することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載される少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、または少なくとも１０の分化因子が、ＳＣ−β細胞を生成する方法に使用される。
【０２２８】
[00260]トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリー
[00261]本開示の態様は、トランスフォーミング増殖因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの増殖因子の分化因子としての使用に関する。「ＴＧＦ−βスーパーファミリー」は、公知のＴＧＦβファミリーメンバーの構造的および機能的特徴を有するタンパク質を意味する。タンパク質のＴＧＦβファミリーは、タンパク質のＴＧＦβシリーズ、インヒビン（インヒビンＡおよびインヒビンＢを含む）、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢを含む）、ＭＩＳ（ミュラー管抑制因子）、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、ｄｐｐ（デカペンタプレジック）、Ｖｇ−１、ＭＮＳＦ（モノクローナル非特異的抑制因子）などを含むことができる。タンパク質のこのファミリーの活性は、様々な細胞型のある特定の受容体への特異的結合に基づき得る。このファミリーのメンバーは、それらの機能と相関する配列同一性の領域を、特にＣ末端に、共有し得る。ＴＧＦβファミリーは、百を超える明確に異なるタンパク質を含むことができ、これらのタンパク質のすべてが少なくとも１つのアミノ酸配列同一性領域を共有する。本明細書で開示される方法に使用することができるファミリーのメンバーは、それらのＧｅｎＢａｎｋ受託番号により識別されるような以下のタンパク質を、これらに限定されないが、含むことができる：Ｐ０７９９５、Ｐ１８３３１、Ｐ０８４７６、Ｑ０４９９８、Ｐ０３９７０、Ｐ４３０３２、Ｐ５５１０２、Ｐ２７０９２、Ｐ４２９１７、Ｐ０９５２９、Ｐ２７０９３、Ｐ０４０８８、Ｑ０４９９９、Ｐ１７４９１、Ｐ５５１０４、Ｑ９ＷＵＫ５、Ｐ５５１０３、Ｏ８８９５９、Ｏ０８７１７、Ｐ５８１６６、Ｏ６１６４３、Ｐ３５６２１、Ｐ０９５３４、Ｐ４８９７０、Ｑ９ＮＲ２３、Ｐ２５７０３、Ｐ３０８８４、Ｐ１２６４３、Ｐ４９００１、Ｐ２１２７４、Ｏ４６５６４、Ｏ１９００６、Ｐ２２００４、Ｐ２０７２２、Ｑ０４９０６、Ｑ０７１０４、Ｐ３０８８６、Ｐ１８０７５、Ｐ２３３５９、Ｐ２２００３、Ｐ３４８２１、Ｐ４９００３、Ｑ９０７５１、Ｐ２１２７５、Ｑ０６８２６、Ｐ３０８８５、Ｐ３４８２０、Ｑ２９６０７、Ｐ１２６４４、Ｑ９０７５２、Ｏ４６５７６、Ｐ２７５３９、Ｐ４８９６９、Ｑ２６９７４、Ｐ０７７１３、Ｐ９１７０６、Ｐ９１６９９、Ｐ２７０９１、Ｏ４２２２２、Ｑ２４７３５、Ｐ２０８６３、Ｏ１８８２８、Ｐ５５１０６、Ｑ９ＰＴＱ２、Ｏ１４７９３、Ｏ０８６８９、Ｏ４２２２１、Ｏ１８８３０、Ｏ１８８３１、Ｏ１８８３６、Ｏ３５３１２、Ｏ４２２２０、Ｐ４３０２６、Ｐ４３０２７、Ｐ４３０２９、Ｏ９５３９０、Ｑ９Ｒ２２９、Ｏ９３４４９、Ｑ９Ｚ１Ｗ４、Ｑ９ＢＤＷ８、Ｐ４３０２８、Ｑ７Ｚ４Ｐ５、Ｐ５０４１４、Ｐ１７２４６、Ｐ５４８３１、Ｐ０４２０２、Ｐ０１１３７、Ｐ０９５３３、Ｐ１８３４１、Ｏ１９０１１、Ｑ９Ｚ１Ｙ６、Ｐ０７２００、Ｑ９Ｚ２１７、Ｏ９５３９３、Ｐ５５１０５、Ｐ３０３７１、Ｑ９ＭＺＥ２、Ｑ０７２５８、Ｑ９６Ｓ４２、Ｐ９７７３７、ＡＡＡ９７４１５．１、ＮＰ−７７６７８８．１、ＮＰ−０５８８２４．１、ＥＡＬ２４００１．１、１  Ｓ４Ｙ、ＮＰ−００１００９８５６．１、ＮＰ−１−０３２４０６．１、ＮＰ−９９９１９３．１、ＸＰ−５１９０６３．���、ＡＡＧ１７２６０．１、ＣＡＡ４０８０６．１、ＮＰ−１−００１００９４５８．１、ＡＡＱ５５８０８．１、ＡＡＫ４０３４１．１、ＡＡＰ３３０１９．１、ＡＡＫ２１２６５．１、ＡＡＣ５９７３８．１、ＣＡＩ４６００３．１、Ｂ４０９０５、ＡＡＱ５５８１１．１、ＡＡＫ４０３４２．１、ＸＰ−５４０３６４．１、Ｐ５５１０２、ＡＡＱ５５８１０．１、ＮＰ−９９０７２７．１、ＣＡＡ５１１６３．１、ＡＡＤ５０４４８．１、ＪＣ４８６２、ＰＮ０５０４、ＢＡＢ１７６００．１、ＡＡＨ５６７４２．１、ＢＡＢ１７５９６．１、ＣＡＧ０６１８３．１、ＣＡＧ０５３３９．１、ＢＡＢ１７６０１．１、ＣＡＢ４３０９１．１、Ａ３６１９２、ＡＡＡ４９１６２．１、ＡＡＴ４２２００．１、ＮＰ−７８９８２２．１、ＡＡＡ５９４５１．１、ＡＡＡ５９１６９．１、ＸＰ−５４１０００．１、ＮＰ−９９０５３７．１、ＮＰ−１−００２１８４．１、ＡＡＣ１４１８７．１、ＡＡＰ８３３１９．１、ＡＡＡ５９１７０．１、ＢＡＢ１６９７３．１、ＡＡＭ６６７６６．１、ＷＦＰＧＢＢ、１２０１２７８Ｃ、ＡＡＨ３００２９．１、ＣＡＡ４９３２６．１、ＸＰ−３４４１３１．１、ＡＡ−１４８８４５．１、ＸＰ−１−１４８９６６．３、１４８２３５、Ｂ４１３９８、ＡＡＨ７７８５７．１、ＡＡＢ２６８６３．１、１７０６３２７Ａ、ＢＡＡ８３８０４．１、ＮＰ−５７１１４３．１、ＣＡＧ００８５８．１、ＢＡＢ１７５９９．１、ＢＡＢ１７６０２．１、ＡＡＢ６１４６８．１、ＰＮ０５０５、ＰＮ０５０６、ＣＡＢ４３０９２．１、ＢＡＢ１７５９８．１、ＢＡＡ２２５７０．１、ＢＡＢ１６９７２．１、ＢＡＣ８１６７２．１、ＢＡＡ１２６９４．１、ＢＡＡ０８４９４．１、Ｂ３６１９２、Ｃ３６１９２、ＢＡＢ１６９７１．１、ＮＰ−０３４６９５．１、ＡＡＡ４９１６０．１、ＣＡＡ６２３４７．１、ＡＡＡ４９１６１．１、ＡＡＤ３０１３２．１、ＣＡＡ５８２９０．１、ＮＰ−００５５２９．１、ＸＰ−５２２４４３．１、ＡＡＭ２７４４８．１、ＸＰ−５３８２４７．１、ＡＡＤ３０１３３．Ｉ、ＡＡＣ３６７４１．１、ＡＡＨ１０４０４．１、ＮＰ−０３２４０８．１、ＡＡＮ０３６８２．１、ＸＰ−５０９１６１．１、ＡＡＣ３２３１１．１、ＮＰ−６５１９４２．２、ＡＡＬ５１００５．１、ＡＡＣ３９０８３．１、ＡＡＨ８５５４７．１、ＮＰ−５７１０２３．１、ＣＡＦ９４１１３．１、ＥＡＬ２９２４７．１、ＡＡＷ３０００７．１、ＡＡＨ９０２３２．１、Ａ２９６１９、ＮＰ−００１００７９０５．１、ＡＡＨ７３５０８．１、ＡＡＤＯ２２０１．１、ＮＰ−９９９７９３．１、ＮＰ−９９０５４２．１、ＡＡＦ１９８４１．１、ＡＡＣ９７４８８．１、ＡＡＣ６００３８．１、ＮＰ９８９１９７．１、ＮＰ−５７１４３４．１、ＥＡＬ４１２２９．１、ＡＡＴ０７３０２．１、ＣＡＩ１９４７２．１、ＮＰ−０３１５８２．１、ＡＡＡ４０５４８．１、ＸＰ−５３５８８０．１、ＮＰ−１−０３７２３９．１、ＡＡＴ７２００７．１、ＸＰ−４１８９５６．１、ＣＡＡ４１６３４．１、ＢＡＣ３０８６４．１、ＣＡＡ３８８５０．１、ＣＡＢ８１６５７．２、ＣＡＡ４５０１８．１、ＣＡＡ４５０１９．１、ＢＡＣ２８２４７．１、ＮＰ−０３１５８１．１、ＮＰ���９９０４７９．１、ＮＰ−９９９８２０．１、ＡＡＢ２７３３５．１、Ｓ４５３５５、ＣＡＢ８２００７．１、ＸＰ−５３４３５１．１、ＮＰ−０５８８７４．１、ＮＰ−０３１５７９．１、１ＲＥＷ、ＡＡＢ９６７８５．１、ＡＡＢ４６３６７．１、ＣＡＡ０５０３３．１、ＢＡＡ８９０１２．１、ＩＥＳ７、ＡＡＰ２０８７０．１、ＢＡＣ２４０８７．１、ＡＡＧ０９７８４．１、ＢＡＣ０６３５２．１、ＡＡＱ８９２３４．１、ＡＡＭ２７０００．１、ＡＡＨ３０９５９．１、ＣＡＧＯ１４９１．１、ＮＰ−５７１４３５．１、１ＲＥＵ、ＡＡＣ６０２８６．１、ＢＡＡ２４４０６．１、Ａ３６１９３、ＡＡＨ５５９５９．１、ＡＡＨ５４６４７．１、ＡＡＨ９０６８９．１、ＣＡＧ０９４２２．１、ＢＡＤ１６７４３．１、ＮＰ−０３２１３４．１、ＸＰ−５３２１７９．１、ＡＡＢ２４８７６．１、ＡＡＨ５７７０２．１、ＡＡＡ８２６１６．１、ＣＡＡ４０２２２．１、ＣＡＢ９０２７３．２、ＸＰ−３４２５９２．１、ＸＰ−５３４８９６．１、ＸＰ−５３４４６２．１、１ＬＸＩ、ＸＰ−４１７４９６．１、ＡＡＦ３４１７９．１、ＡＡＬ７３１８８．１、ＣＡＦ９６２６６．１、ＡＡＢ３４２２６．１、ＡＡＢ３３８４６．１、ＡＡＴ１２４１５．１、ＡＡ０３３８１９．１、ＡＡＴ７２００８．１、ＡＡＤ３８４０２．１、ＢＡＢ６８３９６．１、ＣＡＡ４５０２１．１、ＡＡＢ２７３３７．１、ＡＡＰ６９９１７．１、ＡＡＴＩ２４１６．１、ＮＰ−５７１３９６．１、ＣＡＡ５３５１３．１、ＡＡ０３３８２０．１、ＡＡＡ４８５６８．１、ＢＡＣ０２６０５．１、ＢＡＣ０２６０４．１、ＢＡＣ０２６０３．１、ＢＡＣ０２６０２．１、ＢＡＣ０２６０１．１、ＢＡＣ０２５９９．１、ＢＡＣ０２５９８．１、ＢＡＣ０２５９７．１、ＢＡＣ０２５９５．１、ＢＡＣ０２５９３．１、ＢＡＣ０２５９２．１、ＢＡＣ０２５９０．１、ＡＡＤ２８０３９．１、ＡＡＰ７４５６０．１、ＡＡＢ９４７８６．１、ＮＰ−００１４８３．２、ＸＰ−５２８１９５．１、ＮＰ−５７１４１７．１、ＮＰ−００１００１５５７．Ｉ、ＡＡＨ４３２２２．１、ＡＡＭ３３１４３．１、ＣＡＧ１０３８１．１、ＢＡＡ３１１３２．１、ＥＡＬ３９６８０．１、ＥＡＡ１２４８２．２、Ｐ３４８２０、ＡＡＰ８８９７２．１、ＡＡＰ７４５５９．１、ＣＡＩ１６４１８．１、ＡＡＤ３０５３８．１、ＸＰ−３４５５０２．１、ＮＰ−１−０３８５５４．１、ＣＡＧ０４０８９．１、ＣＡＤ６０９３６．２、ＮＰ−０３１５８４．１、Ｂ５５４５２、ＡＡＣ６０２８５．１、ＢＡＡ０６４１０．１、ＡＡＨ５２８４６．１、ＮＰ−０３１５８０．１、ＮＰ−１−０３６９５９．１、ＣＡＡ４５８３６．１、ＣＡＡ４５０２０．１、Ｑ２９６０７、ＡＡＢ２７３３６．１、ＸＰ−５４７８１７．１、ＡＡＴ１２４１４．１、ＡＡＭ５４０４９．１、ＡＡＨ７８９０１．１、ＡＡ０２５７４５．１、ＮＰ−５７０９１２．１、ＸＰ−３９２１９４．１、ＡＡＤ２０８２９．１、ＡＡＣ９７１１３．１、ＡＡＣ６１６９４．１、ＡＡＨ６０３４０．１、ＡＡＲ９７９０６．１、ＢＡＡ３２２２７．１、ＢＡＢ６８３９５．１、ＢＡＣ０２８９５．１、ＡＡＷＳ１４５１．１、ＡＡＦ８２１８８．１、ＸＰ−５４４１８９．１、ＮＰ−���９０５６８．１、ＢＡＣ８０２１１．１、ＡＡＷ８２６２０．１、ＡＡＦ９９５９７．１、ＮＰ−５７１０６２．１、ＣＡＣ４４１７９．１、ＡＡＢ９７４６７．１、ＡＡＴ９９３０３．１、ＡＡＤ２８０３８．１、ＡＡＨ５２１６８．１、ＮＰ−００１００４１２２．１、ＣＡＡ７２７３３．１、ＮＰ−０３２１３３．２、ＸＰ−３９４２５２．１、ＸＰ−２２４７３３．２、ＪＨ０８０１、ＡＡＰ９７７２１．１、ＮＰ−９８９６６９．１、Ｓ４３２９６、Ｐ４３０２９、Ａ５５４５２、ＡＡＨ３２４９５．１、ＸＰ−５４２９７４．１、ＮＰ−０３２１３５．１、ＡＡＫ３０８４２．１、ＡＡＫ２７７９４．１、ＢＡＣ３０８４７．１、ＥＡＡ１２０６４．２、ＡＡＰ９７７２０．１、ＸＰ−５２５７０４．１、ＡＡＴ０７３０１．１、ＢＡＤ０７０１４．１、ＣＡＦ９４３５６．１、ＡＡＲ２７５８１．１、ＡＡＧ１３４００．１、ＡＡＣ６０１２７．１、ＣＡＦ９２０５５．１、ＸＰ−５４０１０３．１、ＡＡ０２０８９５．１、ＣＡＦ９７４４７．１、ＡＡＳ０１７６４．１、ＢＡＤ０８３１９．１、ＣＡＡ１０２６８．１、ＮＰ−９９８１４０．１、ＡＡＲ０３８２４．１、ＡＡＳ４８４０５．１、ＡＡＳ４８４０３．１、ＡＡＫ５３５４５．１、ＡＡＫ８４６６６．１、ＸＰ−３９５４２０．１、ＡＡＫ５６９４１．１、ＡＡＣ４７５５５．１、ＡＡＲ８８２５５．１、ＥＡＬ３３０３６．１、ＡＡＷ４７７４０．１、ＡＡＷ２９４４２．１、ＮＰ−７２２８１３．１、ＡＡＲＯ８９０１．１、ＡＡＯ１５４２０．２、ＣＡＣ５９７００．１、ＡＡＬ２６８８６．１、ＡＡＫ７１７０８．１、ＡＡＫ７１７０７．１、ＣＡＣ５１４２７．２、ＡＡＫ６７９８４．１、ＡＡＫ６７９８３．１、ＡＡＫ２８７０６．１、Ｐ０７７１３、Ｐ９１７０６、Ｐ９１６９９、ＣＡＧ０２４５０．１、ＡＡＣ４７５５２．１、ＮＰ−００５８０２．１、ＸＰ−３４３１４９．１、ＡＷ３４０５５．１、ＸＰ−５３８２２１．１、ＡＡＲ２７５８０．１、ＸＰ−１２５９３５．３、ＡＡＦ２１６３３．１、ＡＡＦ２１６３０．１、ＡＡＤ０５２６７．１、Ｑ９Ｚ１  Ｗ４、ＮＰ−１−０３１５８５．
２、ＮＰ−５７１０９４．１、ＣＡＤ４３４３９．１、ＣＡＦ９９２１７．１、ＣＡＢ６３５８４．１、ＮＰ−７２２８４０．１、ＣＡＥ４６４０７．１、ＸＰ−１−４１７６６７．１、ＢＡＣ５３９８９．１、ＢＡＢ１９６５９．１、ＡＡＭ４６９２２．１、ＡＡＡ８１１６９．１、ＡＡＫ２８７０７．１、ＡＡＬ０５９４３．１、ＡＡＢ１７５７３．１、ＣＡＨ２５４４３．１、ＣＡＧ１０２６９．１、ＢＡＤ１６７３１．１、ＥＡＡ００２７６．２、ＡＡＴ０７３２０．１、ＡＡＴ０７３００．１、ＡＡＮ１５０３７．１、ＣＡＨ２５４４２．１、ＡＡＫ０８１５２．２、２００９３８８Ａ、ＡＡＲ１２１６１．１、ＣＡＧＯ１９６１．１、ＣＡＢ６３６５６．１、ＣＡＤ６７７１４．１、ＣＡＦ９４１６２．１、ＮＰ−４７７３４０．１、ＥＡＬ２４７９２．１、ＮＰ−１−００１００９４２８．１、ＡＡＢ８６６８６．１、ＡＡＴ４０５７２．１、ＡＡＴ４０５７１．１、ＡＡＴ４０５６９．１、ＮＰ−０３３８８６．１、ＡＡＢ４９９８５．１、ＡＡＧ３９２６６．１、Ｑ２６９７４、ＡＡＣ７７４６１．１、ＡＡＣ４７２６２．１、ＢＡＣ０５５０９．１、ＮＰ−０５５２９７．１、ＸＰ−５４６１４６．１、ＸＰ−５２５７７２．１、ＮＰ−０６０５２５．２、ＡＡＨ３３５８５．１、ＡＡＨ６９０８０．１、ＣＡＧ１２７５１．１、ＡＡＨ７４７５７．２、ＮＰ−０３４９６４．１、ＮＰ−０３８６３９．１、０４２２２１、ＡＡＦ０２７７３．１、ＮＰ−０６２０２４．１、ＡＡＲ１８２４４．１、ＡＡＲ１４３４３．１、ＸＰ−２２８２８５．２、ＡＡＴ４０５７３．１、ＡＡＴ９４４５６．１、ＡＡＬ３５２７８．１、ＡＡＬ３５２７７．１、ＡＡＬ１７６４０．１、ＡＡＣ０８０３５．１、ＡＡＢ８６６９２．１、ＣＡＢ４０８４４．１、ＢＡＣ３８６３７．１、ＢＡＢ１６０４６．１、ＡＡＮ６３５２２．１、ＮＰ−５７１０４１．１、ＡＡＢ０４９８６．２、ＡＡＣ２６７９１．１、ＡＡＢ９５２５４．１、ＢＡＡ１１８３５．１、ＡＡＲ１８２４６．１、ＸＰ−５３８５２８．１、ＢＡＡ３１８５３．１、ＡＡＫ１８０００．１、ＸＰ−１−４２０５４０．１、ＡＡＬ３５２７６．１、ＡＡＱ９８６０２．１、ＣＡＥ７１９４４．１、ＡＡＷ５０５８５．１、ＡＡＶ６３９８２．１、ＡＡＷ２９９４１．１、ＡＡＮ８７８９０．１、ＡＡＴ４０５６８．１、ＣＡＤ５７７３０．１、ＡＡＢ８１５０８．１、ＡＡＳ００５３４．１、ＡＡＣ５９７３６．１、ＢＡＢ７９４９８．１、ＡＡＡ９７３９２．１、ＡＡＰ８５５２６．１、ＮＰ−９９９６００．２、ＮＰ−８７８２９３．１、ＢＡＣ８２６２９．１、ＣＡＣ６０２６８．１、ＣＡＧ０４９１９．１、ＡＡＮ１０１２３．１、ＣＡＡ０７７０７．１  ＡＡＫ２０９１２．１、ＡＡＲ８８２５４．１、ＣＡＣ３４６２９．１、ＡＡＬ３５２７５．１、ＡＡＤ４６９９７．Ｉ、ＡＡＮ０３８４２．１、ＮＰ−５７１９５１．２、ＣＡＣ５０８８１．１、ＡＡＬ９９３６７．１、ＡＡＬ４９５０２．１、ＡＡＢ７１８３９．１、ＡＡＢ６５４１５．１、ＮＰ−６２４３５９．１、ＮＰ−９９０１５３．１、ＡＡＦ７８０６９．１、ＡＡＫ４９７９０．１、ＮＰ−９１９３６７．２、ＮＰ−００１１９２．１、ＸＰ−５４４９４８．１、ＡＡＱ１８０１３���１、ＡＡＶ３８７３９．１、ＮＰ−８５１２９８．１、ＣＡＡ６７６８５．１、ＡＡＴ６７１７１．１、ＡＡＴ３７５０２．１、ＡＡＤ２７８０４．１、ＡＡＮ７６６６５．１、ＢＡＣ１１９０９．１、ＸＰ−１−４２１６４８．１、ＣＡＢ６３７０４．１、ＮＰ−０３７３０６．１、Ａ５５７０６、ＡＡＦ０２７８０．１、ＣＡＧ０９６２３．１、ＮＰ−０６７５８９．１、ＮＰ−０３５７０７．１、ＡＡＶ３０５４７．１、ＡＡＰ４９８１７．１、ＢＡＣ７７４０７．１、ＡＡＬ８７１９９．１、ＣＡＧ０７１７２．１、Ｂ３６１９３、ＣＡＡ３３０２４．１、ＮＰ−１−００１００９４００．１、ＡＡＰ３６５３８．１、ＸＰ−５１２６８７．１、ＸＰ−５１００８０．１、ＡＡＨ０５５１３．１、１ＫＴＺ、ＡＡＨ１４６９０．１、ＡＡＡ３１５２６．１。
【０２２９】
[00262]本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子は、天然に得られることもあり、または組換えであることもある。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子は、アクチビンＡを含む。「アクチビンＡ」という用語は、アクチビンＡの断片および誘導体を含むことができる。例示的なアクチビンＡの配列は、米国特許出願公開第２００９／０１５５２１８号（’２１８公報）に配列番号１として開示されている。アクチビンＡの他の非限定的な例は、’２１８公報の配列番号２〜１６に提供されており、アクチビンＡをコードする核酸の非限定的な例は、’２１８公報の配列番号３３〜３４に提供されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子は、’２１８公報の配列番号１と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含むことができる。
【０２３０】
[00263]一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子は、増殖分化因子８（ＧＤＦ８）を含む。「ＧＤＦ８」という用語は、ＧＤＦ８の断片および誘導体を含むことができる。ＧＤＦ８ポリペプチドの配列は、当業者には入手可能である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子は、ヒトＧＤＦ８ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＥＡＸ１０８８０）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２３１】
[00264]一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子は、ＧＤＦ８と密接に関連している増殖因子、例えば、増殖分化因子１１（ＧＤＦ１１）を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子は、ヒトＧＤＦ１１ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＦ２１６３０）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２３２】
[00265]一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの増殖因子を、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの増殖因子を模倣する作用因子に置き換えることができる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの増殖因子を模倣する例示的な作用因子としては、限定ではないが、ＩＤＥ１およびＩＤＥ２が挙げられる。
【０２３３】
[00266]骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤
[00267]本開示の態様は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤のβ細胞分化因子としての使用に関する。ＢＭＰシグナル伝達ファミリーは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの多様なサブセットである（Ｓｅｂａｌｄら  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．３８５：６９７〜７１０、２００４）。２０を超える公知のＢＭＰリガンドが、３つの明確に異なるＩＩ型（ＢＭＰＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩａ、およびＡｃｔＲＩＩｂ）および少なくとも３つのＩ型（ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６）受容体によって認識される。二量体リガンドは、受容体ヘテロマーの集合を助長し、それによって構成的に活性なＩＩ型受容体セリン／トレオニンキナーゼがＩ型受容体セリン／トレオニンキナーゼをリン酸化することが可能になる。活性化されたＩ型受容体は、ＢＭＰ応答性（ＢＲ−）ＳＭＡＤエフェクター（ＳＭＡＤ１、５および８）をリン酸化して、ＴＧＦシグナル伝達を同様に助長するｃｏ−ＳＭＡＤであるＳＭＡＤ４との複合体での核内移行を助長する。加えて、ＢＭＰシグナルは、ＳＭＡＤ非依存的様式でＭＡＰＫ  ｐ３８などの細胞内エフェクターを活性化することができる（ＮｏｈｅらＣｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １６：２９１〜２９９、２００４）。可溶性ＢＭＰアンタゴニスト、例えば、ノギン、コーディン、グレムリンおよびフォリスタチンは、リガンド隔離によりＢＭＰシグナル伝達を制限する。
【０２３４】
[00268]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＤＭＨ−１、またはその誘導体、類似体もしくは変異体を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、下記の化合物、または下記の化合物の誘導体、類似体もしくは変異体を含む：
【０２３５】
【化１】
2021502830.tif 000003
【０２３６】
[00269]
[00270]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ１９３１８９、１０６２３６８−２４−４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＤＭ  ３１８９、ＤＭ−３１８９としても公知；ＩＵＰＡＣ名：４−［６−（４−ピペラジン−１−イルフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノロン）を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、下記の化合物、または下記の化合物の誘導体、類似体もしくは変異体を含む：
【０２３７】
【化２】
2021502830.tif 000004
【０２３８】
[00271]
[00272]一部のケースでは、ＤＭＨ−１は、ＬＤＮ１９３１８９と比較してより選択的であり得る。本開示の一部の実施形態では、ＤＭＨ−１は、本明細書で提供される方法に特に有用であり得る。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、ＬＤＮ１９３１８９の使用を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、原始腸管細胞からＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を生成するためのＬＤＮ１９３１８９またはその誘導体、類似体もしくは変異体の使用を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物は、原始腸管細胞からＰｄｘ１陽性膵臓前駆細胞を生成するためのＤＭＨ−１またはその誘導体、類似体もしくは変異体の使用に関する。
【０２３９】
[00273]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９の類似体または誘導体、例えば、ＬＤＮ１９３１８９の塩、水和物、溶媒、エステルまたはプロドラッグを含む。一部の実施形態では、ＬＤＮ１９３１８９の誘導体（例えば、塩）は、ＬＤＮ１９３１８９塩酸塩を含む。
【０２４０】
[00274]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２０１１／００５３９３０号からの式Ｉの化合物を含む。
【０２４１】
[00275]ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤
[00276]本開示の態様は、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤のβ細胞分化因子としての使用に関する。
【０２４２】
[00277]一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ−β受容体Ｉ型キナーゼ（ＴＧＦ−β  ＲＩ）シグナル伝達を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ  ４４６８５９−３３−２；ＴＧＦ−Ｂ  ＲＩキナーゼのＡＴＰ競合的阻害剤；ＲｅｐＳｏｘとしても公知；ＩＵＰＡＣ名：２−［５−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジン）を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの類似体または誘導体である。
【０２４３】
[00278]一部の実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（別名「ＡＬＫ５ｉ」）の類似体または誘導体は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／００２１５１９号に記載の式Ｉの化合物である。
【０２４４】
[00279]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２０１０／０２６７７３１号に記載されているＴＧＦ−β受容体阻害剤である。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２００９／０１８６０７６号および同第２００７／０１４２３７６号に記載されているＡＬＫ５阻害剤を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａ  ８３−０１である。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａ  ８３−０１でない。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、Ａ  ８３−０１を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ４３１５４２である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ４３１５４２でない。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＳＢ  ４３１５４２を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、Ｄ  ４４７６である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、Ｄ  ４４７６でない。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、Ｄ  ４４７６を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ７８８３８８である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ７８８３８８でない。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＧＷ  ７８８３８８を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ  ３６４９４７である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ  ３６４９４７でない。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＬＹ  ３６４９４７を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ  ５８０２７６である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ  ５８０２７６でない。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＬＹ  ５８０２７６を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ５２５３３４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ５２５３３４でない。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＳＢ  ５２５３３４を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ５０５１２４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ５０５１２４でない。一部の実施形態では、本明細書に記載さ��る組成物および方法は、ＳＢ  ５０５１２４を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＤ  ２０８である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＤ  ２０８でない。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＳＤ  ２０８を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ６６０４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ６６０４でない。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＧＷ  ６６０４を除外する。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ７８８３８８である。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ７８８３８８でない。一部の実施形態では、本明細書に記載される組成物および方法は、ＧＷ  ７８８３８８を除外する。
【０２４５】
[00280]上記の化合物の一群からの以下のものは、様々な供給元から得ることができる：Ｓｉｇｍａ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １４５０８、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、Ｍｏ．、６３１７８−９９１６から入手可能なＬＹ−３６４９４７、ＳＢ−５２５３３４、ＳＤ−２０８、およびＳＢ−５０５１２４；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）、４８０  Ｓ．Ｄｅｍｏｃｒａｔ  Ｒｏａｄ、Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ、Ｎ．Ｊ．、０８０２７から入手可能な６１６４５２および６１６４５３；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ、９８０  Ｇｒｅａｔ  Ｗｅｓｔ  Ｒｏａｄ、Ｂｒｅｎｔｆｏｒｄ、Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ、ＴＷ８  ９ＧＳ、Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍから入手可能なＧＷ７８８３８８およびＧＷ６６０４；Ｌｉｌｌｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、Ｉｎｄ．  ４６２８５から入手可能なＬＹ５８０２７６；ならびにＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ、Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ  １４６２７、５０００  Ｄａｖｉｓ  Ｄｒｉｖｅ、Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ、Ｎ．Ｃ．、２７７０９−４６２７から入手可能なＳＭ１６。
【０２４６】
[00281]ＷＮＴシグナル伝達経路
[00282]本開示の態様は、ＷＮＴシグナル伝達経路の活性化因子のβ細胞分化因子としての使用に関する。
【０２４７】
[00283]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子は、ＣＨＩＲ９９０２１の誘導体、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１の塩、例えば三塩酸塩、ＣＨＩＲ９９０２１の塩酸塩を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子は、Ｗｎｔ３ａ組換えタンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＷＮＴグナル伝達経路活性化因子は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を含む。例示的なＧＳＫ３阻害剤としては、限定ではないが、３Ｆ８、Ａ  １０７０７２２、ＡＲ−Ａ  ０１４４１８、ＢＩＯ、ＢＩＯ−アセトキシム、ＦＲＡＴｉｄｅ、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、インジルビン−３’オキシム、ケンパウロン、Ｌ８０３、Ｌ８０３−ｍｔｓ、炭酸リチウム、ＮＳＣ  ６９３８６８、ＳＢ  ２１６７６３、ＳＢ  ４１５２８６、ＴＣ−Ｇ  ２４、ＴＣＳ  ２００２、ＴＣＳ  ２１３１１、ＴＷＳ  １１９、およびこれらのいずれかの類似体または誘導体が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法、組成物およびキットは、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化因子を除外する。
【０２４８】
[00284]線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）ファミリー
[00285]本開示の態様は、ＦＧＦファミリーからの増殖因子のβ細胞分化因子としての使用に関する。
【０２４９】
[00286]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの増殖因子は、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）を含む。ＫＧＦのポリペプチド配列は、当業者には入手可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの増殖因子は、ヒトＫＧＦポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ２１４３１）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２５０】
[00287]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの増殖因子は、ＦＧＦ２を含む。ＦＧＦ２のポリペプチド配列は、当業者には入手可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの増殖因子は、ヒトＦＧＦ２ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＮＰ＿００１９９７）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２５１】
[00288]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＦＧＦ８Ｂを含む。ＦＧＦ８Ｂのポリペプチド配列は、当業者には入手可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの増殖因子は、ヒトＦＧＦ８Ｂポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ４０９５４）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２５２】
[00289]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＦＧＦ１０を含む。ＦＧＦ１０のポリペプチド配列は、当業者には入手可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの増殖因子は、ヒトＦＧＦ１０ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＣＡＧ４６４８９）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２５３】
[00290]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＦＧＦ２１を含む。ＦＧＦ２１のポリペプチド配列は、当業者には入手可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの増殖因子は、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＱ８９４４４．１）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％、またはそれを超えて同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２５４】
[00291]ソニックヘッジホグ（ＳＨＨ）シグナル伝達経路
[00292]本開示の態様は、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤のβ細胞分化因子としての使用に関する。
【０２５５】
[00293]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、Ｓａｎｔ１を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ２を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ３を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ４を含む。一部の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、Ｃｕｒ６１４１４を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、フォルスコリンを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、トマチジンを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＹ９９４４を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、トリパラノールを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、化合物Ａまたは化合物Ｂ（米国特許出願公開第２００４／００６０５６８号に開示されているような）を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２００６／０２７６３９１号に開示されているようなヘッジホッグシグナル伝達に拮抗するステロイド系アルカロイド（例えば、シクロパミンまたはその誘導体）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法、組成物およびキットは、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤を除外する。
【０２５６】
[00294]レチノイン酸シグナル伝達経路
[00295]本開示の態様は、レチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターのβ細胞分化因子としての使用に関する。
【０２５７】
[00296]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターは、レチノイン酸シグナル伝達の活性化因子を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、レチノイン酸を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＲＡシグナル伝達経路活性化因子は、レチノイン酸受容体アゴニストを含む。本明細書で提供される方法および組成物における例示的なレチノイン酸受容体アゴニストとしは、限定ではないが、ＣＤ  １５３０、ＡＭ  ５８０、ＴＴＮＰＢ、ＣＤ  ４３７、Ｃｈ  ５５、ＢＭＳ  ９６１、ＡＣ  ２６１０６６、ＡＣ  ５５６４９、ＡＭ  ８０、ＢＭＳ  ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ  ２３１４が挙げられる。
【０２５８】
[00297]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターは、レチノイン酸シグナル伝達の阻害剤を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、ＤＥＡＢ（ＩＵＰＡＣ名：２−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］−３−プロパ−２−エニルベンズアルデヒド）を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、ＤＥＡＢの類似体または誘導体を含む。
【０２５９】
[00298]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニストを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるレチノイン酸受容体アンタゴニストは、（Ｅ）−４−［２−（５，６−ジヒドロ−５，５−ジメチル−８−フェニル−２−ナフタレニル）エテニル］安息香酸、（Ｅ）−４−［［（５，６−ジヒドロ−５，５−ジメチル−８−フェニルエチニル）−２−ナフタレニル］エテニル］安息香酸、（Ｅ）−４−［２−［５，６−ジヒドロ−５，５−ジメチル−８−（２−ナフタレニル）−２−ナフタレニル］エテニル］−安息香酸、および（Ｅ）−４−［２−［５，６−ジヒドロ−５，５−ジメチル−８−（４−メトキシフェニル）−２−ナフタレニル］エテニル］安息香酸を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸受容体アンタゴニストは、ＢＭＳ  １９５６１４（ＣＡＳ＃２５３３１０−４２−８）、ＥＲ  ５０８９１（ＣＡＳ＃１８７４００−８５−７）、ＢＭＳ  ４９３（ＣＡＳ＃１７０３５５−７８−９）、ＣＤ  ２６６５（ＣＡＳ＃１７０３５５−７８−９）、ＬＥ  １３５（ＣＡＳ＃１５５８７７−８３−１）、ＢＭＳ  ４５３（ＣＡＳ  ＃１６６９７７−４３−１）、またはＭＭ  １１２５３（ＣＡＳ＃３４５９５２−４４−５）を含む。
【０２６０】
[00299]ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法、組成物およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターを除外する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法、組成物およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化因子を除外する。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法、組成物およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤を除外する。
【０２６１】
[00300]プロテインキナーゼＣ
[00301]本開示の態様は、プロテインキナーゼＣ活性化因子のβ細胞分化因子としての使用に関する。プロテインキナーゼＣは、プロテインキナーゼ酵素の最大ファミリーの１つであり、様々なアイソフォームで構成されている。従来のアイソフォームとしては、α、βＩ、βＩＩ、γが挙げられ、新規アイソフォームとしては、δ、ε、η、θが挙げられ、非定型アイソフォームとしては、ξ、およびι／λが挙げられる。ＰＫＣ酵素は、主として細胞質性であるが、活性化されると膜に移行する。細胞質中で、ＰＫＣは、他のキナーゼによりリン酸化されるか、または自己リン酸化する。活性化されるために、一部のＰＫＣアイソフォーム（例えば、ＰＫＣ−ε）は、ジアシルグリセロール（「ＤＡＧ」）結合部位またはホスファチジルセリン（「ＰＳ」）結合部位に結合するための分子を必要とする。他のものは、二次結合メッセンジャーが全くなくても活性化され得る。ＤＡＧ部位に結合するＰＫＣ活性化因子としては、ブリオスタチン、ピコログ（ｐｉｃｏｌｏｇｕｅ）、ホルボールエステル、アプリシアトキシン、およびグニジマクリンが挙げられるが、これらに限定されない。ＰＳ部位に結合するＰＫＣ活性化因子としては、多価不飽和脂肪酸およびこれらの誘導体が挙げられるが、それらに限定されない。ＳＣ−β細胞への少なくとも１つのインスリン産生内分泌細胞またはその先駆体の分化を誘導することが、単独で、または１つもしくは複数のβ細胞分化因子との組合せで、可能である、任意のプロテインキナーゼＣ活性化因子を、本明細書に記載される方法、組成物およびキットにおいて使用することができると企図される。
【０２６２】
[00302]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化因子は、ＰｄｂＵを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化因子は、ＴＰＢを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化因子は、ＷＩＰＯ公開番号ＷＯ／２０１３／０７１２８２に記載されているような、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸硫酸エステル、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸硫酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸リン酸エステル、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸リン酸エステル、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチルインドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、線維芽細胞増殖因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン増殖因子、ホルモン、および増殖因子活性化因子を含む。一部の実施形態では、ブリオスタチンは、ブリオスタチン−１、ブリオスタチン−２、ブリオスタチン−３、ブリオスタチン−４、ブリオスタチン−５、ブリオスタチン−６、ブリオスタチン−７、ブリオスタチン−８、ブリオスタチン−９、ブリオスタチン−１０、ブリオスタチン−１１、ブリオスタチン−１２、ブリオスタチン−１３、ブリオスタチン−１４、ブリオスタチン−１５、ブリオスタチン−１６、ブリオスタチン−１７、またはブリオスタチン−１８を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法、組成物およびキットは、プロテインキナーゼＣ活性化因子を除外する。
【０２６３】
[00303]γセクレターゼ阻害剤
[00304]本開示の態様は、γセクレターゼ阻害剤のβ細胞分化因子としての使用に関する。
【０２６４】
[00305]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるγセクレターゼ阻害剤は、ＸＸＩを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるγセクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴを含む。本明細書で提供される方法および組成物における追加の例示的なγセクレターゼ阻害剤は、限定ではないが、米国特許第７，０４９，２９６号、同第８，４８１，４９９号、同第８，５０１，８１３号、およびＷＩＰＯ公開番号ＷＯ／２０１３／０５２７００に記載されているγセクレターゼ阻害剤を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法、組成物およびキットは、γセクレターゼ阻害剤を除外する。
【０２６５】
[00306]甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子
[00307]本開示の態様は、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子のβ細胞分化因子としての使用に関する。
【０２６６】
[00308]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子は、トリヨードチロニン（Ｔ３）を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子は、Ｔ３の類似体または誘導体を含む。本明細書で提供される方法および組成物におけるＴ３の例示的な類似体としては、選択的および非選択的甲状腺ホルモン模倣薬、ＴＲβ選択的アゴニスト−ＧＣ−１、ＧＣ−２４，４−ヒドロキシ−ＰＣＢ  １０６、ＭＢ０７８１１、ＭＢ０７３４４、３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）；選択的ＴＲ−βアゴニストＧＣ−１；３−ヨードチロナミン（Ｔ（１）ＡＭ）および３，３’，５−トリヨードチロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（ホルモンチロキシン（Ｔ（４））の生物活性代謝物）；ＫＢ−２１１５およびＫＢ−１４１；チロナミン；ＳＫＦ  Ｌ−９４９０１；ＤＩＢＩＴ；３’−ＡＣ−Ｔ２；テトラヨードチロ酢酸（Ｔｅｔｒａｃ）およびトリヨードチロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（チロキシン［Ｔ４］およびトリヨードチロニン［Ｔ３］アラニン鎖の酸化的脱アミノ化および脱カルボキシル化による）、３，３’，５’−トリヨードチロニン（ｒＴ３）（Ｔ４およびＴ３脱ヨウ素化による）、３，３’−ジヨードチロニン（３，３’−Ｔ２）および３，５−ジヨードチロニン（Ｔ２）（Ｔ４、Ｔ３、およびｒＴ３脱ヨウ素化による）、ならびに３−ヨードチロナミン（Ｔ１ＡＭ）およびチロナミン（Ｔ０ＡＭ）（Ｔ４およびＴ３脱ヨウ素化およびアミノ酸脱カルボキシル化による）、ならびにＴＨ構造類似体については、例えば、３，５，３’−トリヨードチロプロピオン酸（Ｔｒｉｐｒｏｐ）、３，５−ジブロモ−３−ピリダジノン−１−チロニン（Ｌ−９４０９０１）、Ｎ−［３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルフェノキシ）−フェニル］−オキサミド酸（ＣＧＳ  ２３４２５）、３，５−ジメチル−４−［（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ］酢酸（ＧＣ−１）、３，５−ジクロロ−４−［（４−ヒドロキシ−３−イソプロピルフェノキシ）フェニル］酢酸（ＫＢ−１４１）、および３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２６７】
[00309]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子は、Ｔ３のプロドラッグまたはプロホルモン、例えば、Ｔ４甲状腺ホルモン（例えば、チロキシンまたはＬ−３，５，３’，５’−テトラヨードチロニン）を含む。
【０２６８】
[00310]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化因子は、米国特許第７，１６３，９１８号に記載されているヨードチロニン組成物である。
【０２６９】
[00311]上皮増殖因子（ＥＧＦ）ファミリー
[00312]本開示の態様は、ＥＧＦファミリーからの増殖因子のβ細胞分化因子としての使用に関する。
【０２７０】
[00313]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ベータセルリンを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＥＧＦを含む。上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、大きい膜内在性タンパク質先駆体からタンパク質分解により切断される５３アミノ酸サイトカインである。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの増殖因子は、変異体ＥＧＦポリペプチド、例えば、米国特許第７，０８４，２４６号に開示されているような、ヒト野生型ＥＧＦポリペプチド配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する単離された上皮増殖因子ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの増殖因子は、米国特許第８，２４７，５３１号に開示されているような、ＥＧＦ受容体に結合し、作動させる、操作されたＥＧＦ突然変異体を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの増殖因子は、ＥＧＦファミリーにおけるシグナル伝達経路を活性化する作用因子に置き換えられる。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの増殖因子は、ＥＧＦを模倣する化合物を含む。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法、組成物およびキットは、ＥＧＦファミリーからの増殖因子を除外する。
【０２７１】
[00314]プロテインキナーゼ阻害剤
[00315]本開示の態様は、プロテインキナーゼ阻害剤のβ細胞分化因子としての使用に関する。
【０２７２】
[00316]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンを含む。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンの類似体を含む。本明細書で提供される方法および組成物におけるスタウロスポリンの例示的な類似体としては、限定ではないが、Ｒｏ−３１−８２２０、ビスインドリルマレイミド（Ｂｉｓ）化合物、１０’−｛５”−［（メトキシカルボニル）アミノ］−２”−メチル｝−フェニルアミノカルボニルスタウロスポリン、スタラログ（ｓｔａｒａｌｏｇ）（例えば、Ｌｏｐｅｚら、「Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｂｒｏａｄｅｎ  ｔｈｅ  ｓｃｏｐｅ  ｏｆ  ａｎａｌｏｇ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１３；１３５（４８）：１８１５３〜１８１５９を参照されたい）、およびｃｇｐ４１２５１が挙げられる。
【０２７３】
[00317]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、ＰＫＣβの阻害剤である。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、下記の構造を有するＰＫＣβの阻害剤、または下記の化合物の誘導体、類似体もしくは変異体である：
【０２７４】
【化３】
2021502830.tif 000005
【０２７５】
[00318]
[00319]一部の実施形態では、ＰＫＣβの阻害剤は、下記の構造を有するＧＳＫ−２化合物、または下記の化合物の誘導体、類似体もしくは変異体である：
【０２７６】
【化４】
2021502830.tif 000006
【０２７７】
[00320]
[00321]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＰＫＣの阻害剤は、ビスインドリルマレイミドである。例示的なビスインドリルマレイミドとしては、限定ではないが、ビスインドリルマレイミドＩ、ビスインドリルマレイミドＩＩ、ビスインドリルマレイミドＩｌｌ、塩酸塩、またはそれらの誘導体、類似体もしくは変異体が挙げられる。
【０２７８】
[00322]一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＰＫＣ阻害剤は、プソイドヒペリシン、またはその誘導体、類似体もしくは変異体である。一部の実施形態では、本明細書で提供される方法および組成物におけるＰＫＣ阻害剤は、インドルブリン−３−モノオキシム，５−ヨード（ｉｎｄｏｒｕｂｌｉｎ−３−ｍｏｎｏｘｉｍｃ，５−Ｉｏｄｏ）、またはその誘導体、類似体もしくは変異体である。ある特定の実施形態では、本明細書で開示される方法、組成物およびキットは、プロテインキナーゼ阻害剤を除外する。
【０２７９】
[00323]ＶＩ．医薬組成物
[00324]一部のケースでは、本開示は、疾患（例えば、糖尿病）の処置のための様々な方法に非ネイティブ膵臓β細胞（ベータ細胞）集団ならびに細胞成分および産物を用いることができる医薬組成物を提供する。ある特定のケースは、生細胞（例えば、単独でのまたは他の細胞型と混合された非ネイティブ膵臓β細胞）を含む医薬組成物を包含する。他のケースは、非ネイティブ膵臓β細胞成分（例えば、細胞溶解物、可溶性細胞画分、馴化培地、ＥＣＭ、もしくは前述のもののいずれかについての成分）または産物（例えば、非ネイティブ膵臓β細胞により、もしくは非ネイティブ膵臓β細胞からの遺伝子修飾、馴化培地によって、産生された栄養因子および他の生物学的因子）を含む医薬組成物を包含する。どちらのケースでも、医薬組成物は、他の活性薬剤、例えば、当業者に公知の抗炎症剤、外来性小分子アゴニスト、外来性小分子アンタゴニスト、抗アポトーシス剤、抗酸化剤および／または増殖因子をさらに含むことがある。
【０２８０】
[00325]本開示の医薬組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、培地または賦形剤）を用いて製剤化された非ネイティブ膵臓β細胞またはその成分もしくは産物を含むことができる。生物学的に適合性の担体または培地という用語と同義で使用され得る、薬学的に許容される担体（または培地）という用語は、治療的に投与される細胞および他の薬剤と適合性であるばかりでなく、人間および動物の組織と接触する使用に好適でもあり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の合併症を伴わない、試薬、細胞、化合物、材料、組成物および／または剤形を指すことができる。好適な薬学的に許容される担体としては、水、塩類溶液（例えば、リンゲル液）、アルコール、油、ゼラチン、および炭水化物、例えばラクトース、アミロースまたはデンプン、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンを挙げることができる。そのような調製物を滅菌することができ、必要に応じて補助剤、例えば、滑沢剤、保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすための塩、緩衝剤、および着色剤と混合することができる。細胞の成分および産物を含むが生細胞を含まない医薬組成物を、液体として製剤化することができる。生存非ネイティブ膵臓β細胞を含む医薬組成物を、液体、半固体（例えば、ゲル、ゲルカプセル、もしくはリポソーム）または固体（例えば、マトリックス、足場など）として製剤化することができる。
【０２８１】
[00326]ここで使用される場合、「薬学的に許容される」という用語は、正当な医学的判断の範囲内で、人間および動物の組織と接触する使用に好適であり、過度の毒性、刺激、アレルギー反応または他の問題もしくは合併症を伴わず、妥当な損益比に見合っている、化合物、材料、組成物および／または剤形を指すことができる。
【０２８２】
[00327]ここで使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、ある臓器または体部から別の臓器または体部への対象化合物の運搬または輸送に関与する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体もしくは固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルク、ステアリン酸マグネシウム、カルシウムもしくは亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒封入材を指すことができる。各担体は、製剤の他の成分と適合性であり、患者に有害でないという意味で、「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体としての機能を果たすことができる材料の一部の例としては、（１）糖、例えば、ラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロース、および酢酸セルロース；（４）粉末トラガカント：（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）滑沢剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルク；（８）賦形剤、例えば、カカオ脂および坐薬ワックス；（９）油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）パイロジェンフリー水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）増量剤、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸；（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；（２２）Ｃ２〜Ｃ１２アルコール、例えばエタノール；ならびに（２３）医薬製剤に利用される他の非毒性の適合性物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、離型剤、コーティング剤、甘味剤、着香剤、芳香剤、保存剤および抗酸化剤も、製剤に存在することがある。「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などのような用語は、本明細書では同義で使用される。
【０２８３】
[00328]細胞の集団に関して本明細書で使用される場合の「治療有効量」という表現は、細胞、例えばＳＣ−β細胞もしくは成熟膵臓β細胞、の集団内の、または本開示のＳＣ−β細胞を含む組成物中の、対象とする細胞の量であって、任意の医学的処置に適用可能な妥当な損益比で動物体内の細胞の少なくとも部分集団において何らかの所望の治療効果を生じさせるのに有効である量を意味する。例えば、グリコシル化ヘモグロビンレベル、空腹時血糖値、高インスリン血症などの、１型、１．５型または２型糖尿病についての少なくとも１つの症状の統計的に有意な、測定可能な変化を生じさせるのに十分である、対象に投与されるＳＣ−β細胞の集団の量。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。一般に、治療有効量は、対象の病歴、年齢、状態、性別、ならびに対象の病状の重症度およびタイプ、ならびに他の薬学的に活性な薬剤の投与によって変わり得る。
【０２８４】
[00329]医薬組成物は、当業者に周知であるような補助成分を含むことができる。例えば、それらは、抗酸化剤を、使用される抗酸化剤の種類に依存して変わる範囲で含有することができる。一般に使用される抗酸化剤についての妥当な範囲は、単位体積当たり約０．０１重量％〜約０．１５重量％のＥＤＴＡ、単位体積当たり約０．０１重量％〜約２．０重量％（％  ｗｅｉｇｈｔ  ｖｏｌｕｍｅ）の亜硫酸ナトリウム、および単位体積当たり約０．０１重量％〜約２．０重量％のピロ亜硫酸ナトリウムである。当業者は、上記の各々について単位体積当たり約０．１重量％の濃度を使用することができる。他の代表的な化合物としては、メルカプトプロピオニルグリシン、Ｎ−アセチルシステイン、β−メルカプトエチルアミン、グルタチオンおよび類似の種が挙げられるが、腎投与に好適な他の抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、およびその塩、または亜硫酸塩、またはピロ亜硫酸ナトリウムも利用することができる。
【０２８５】
[00330]標的組織における刺激を最小限に抑えるために、緩衝剤を使用して製剤のｐＨを約４．０〜約８．０の範囲内に維持することができる。直接腹腔内注射の場合、製剤は、ｐＨ７．２〜７．５、好ましくはｐＨ７．３５〜７．４５であるべきである。組成物は、腎臓への投与に好適な等張化剤も含むことがある。それらの中でも、塩化ナトリウムは、製剤を血液とほぼ等張にするのに好適である。
【０２８６】
[00331]ある特定のケースでは、医薬組成物は、増粘剤を用いて製剤化される。例示的な薬剤は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、およびポリビニルピロリドンである。医薬組成物は、必要に応じて添加される共溶媒を有することもある。好適な共溶媒としては、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＥＰＧ）、ポリソルベート、プロピレングリコール、およびポリビニルアルコールを挙げることができる。保存剤としては、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、酢酸もしくは硝酸フェニル水銀、チメロサール、またはメチルもしくはプロピルパラベンも挙げることができる。
【０２８７】
[00332]細胞、細胞成分または細胞産物を含む、医薬組成物は、当技術分野において公知のいくつかの送達方法のうちの１つまたは複数で患者の腎臓に送達することができる。一部のケースでは、組成物は、腎臓に（例えば、腎被膜上におよび／または腎被膜下に）送達される。別の実施形態では、組成物を、腎臓内の様々な位置に、定期的な腹腔内または腎内注射によって送達することができる。あるいは、組成物を、当業者に公知の他の剤形、例えば、既成のまたは生体内原位置で形成されるゲルまたはリポソームで、適用することができる。
【０２８８】
[00333]半固体または固体担体中の生細胞を含む医薬組成物は、腎被膜上または下への外科的植え込み用に製剤化される／され得る。液体組成物も外科手技により投与することができることは、理解されるはずである。特定のケースでは、半固体または固体医薬組成物は、非生分解性であることもあり、または生分解性であることもある、半透性ゲル、格子、細胞足場などを含むこともある。例えば、ある特定のケースでは、外来性細胞をそれらの周囲から隔離し、それにもかかわらずそれらの細胞による周囲細胞または血流への生体分子（例えばインスリン）の分泌および送達を可能にすることが、望ましいことまたは適切であることもある。これらのケースでは、細胞を、移植された細胞を宿主組織から物理的に離隔する非生分解性の選択的透過性バリアにより包囲されている、生存非ネイティブ膵臓β細胞、または非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞集団を含む、自律植え込み物として製剤化することができる。そのような植え込み物は、薬理学的に誘導される免疫抑制の非存在下で免疫細胞および巨大分子が移植された細胞を死滅させるのを防止する能力を有するので、「免疫保護的」と言われることもある。
【０２８９】
[00334]他のケースでは、様々な分解性ゲルおよびネットワークを本開示の医薬組成物に使用することができる。例えば、徐放性製剤に特に好適な分解性材料は、生体適合性ポリマー、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどを含む。
【０２９０】
[00335]他のケースでは、細胞を生分解性の、好ましくは生体再吸収性または生体吸収性の、足場またはマトリックス上または内に送達することが、望ましいことまたは適切であることがある。これらの通常は三次元の生体材料は、足場に接着している、足場内に分散されている、または足場内に捕捉されている細胞外マトリックス内に組み込まれている、生存細胞を含有する。身体の標的領域に植え込まれると、これらの植え込み物は、宿主組織と一体化し、その宿主組織内で移植された細胞が徐々に樹立される。
【０２９１】
[00336]本開示で使用され得る足場またはマトリックス（「フレームワーク」と総称されることもある）材料の例としては、不織マット、多孔質フォーム、または自己集合ペプチドが挙げられる。例えば、不織マットは、グリコール酸と乳酸の合成吸収性コポリマー（ＰＧＡ／ＰＬＡ）、フォームおよび／またはポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーを含む、繊維を使用して形成され得る。
【０２９２】
[00337]別の実施形態では、フレームワークは、生体吸収性材料、例えばＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンドまたはヒアルロン酸から製造されたマルチフィラメント糸で構成され得る、フェルトである。糸は、捲縮、切断、カード処理およびニードリングからなる標準的な布地加工技法を使用してフェルトにされる。別の実施形態では、細胞は、複合構造であり得るフォーム足場上に播種される。上述のケースの多くにおいて、フレームワークを有用な形状に成形することができる。さらに、非ネイティブ膵臓β細胞を、既成の非分解性外科用または植え込み可能デバイスを用いて培養することができることは、理解されるであろう。
【０２９３】
[00338]マトリックス、足場またはデバイスを、細胞の接種前に、細胞接着を増強するために処理することができる。例えば、接種前に、ナイロンマトリックスを０．１モルの酢酸で処理し、ポリリシン、ＰＢＳおよび／またはコラーゲンとともにインキュベートしてナイロンにコーティングすることができる。硫酸を使用して、ポリスチレンを同様に処理することができる。フレームワークの外面を、例えば、フレームワークのプラズマコーティングにより、または１つまたは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、ならびに／もしくは他の材料、数ある中でも、例えば、これらに限定されないが、ゼラチン、アルギネート、寒天、アガロースおよび植物ゴムの付加により、細胞の接着または増殖および組織の分化を向上させるように修飾することもできる。
【０２９４】
[00339]一態様では、本開示は、少なくとも１つの膵臓β細胞を含む細胞クラスターを含むデバイスを提供した。本明細書で提供されるデバイスを、対象に植え込まれたときにインスリンを産生し、放出するように、構成することができる。デバイスは、少なくとも１つの膵臓β細胞、例えば非ネイティブ膵臓β細胞を含む細胞クラスターを含むことができる。デバイス内の細胞クラスターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＳＩＳを示すことができる。デバイスは、半透膜をさらに含むことができる。半透膜を、デバイス内に細胞クラスターを保持し、細胞クラスターにより分泌されるインスリンの通過を可能にするように、構成することができる。デバイスの一部のケースでは、細胞クラスターを半透膜によりカプセル化することができる。カプセル化は、当業者に利用可能な任意の技法より行うことができる。半透膜はまた、当業者によって理解され、検証されるような、任意の好適な材料で製造することができる。例えば、半透膜を多糖またはポリカチオンで製造することができる。一部のケースでは、半透膜を、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、および他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、アルギネート、アガロース、アガロースとゼラチン、デキストラン、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースならびにそれらの誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、またはそれらの任意の組合せで製造することができる。一部のケースでは、半透膜は、アルギネートを含む。一部のケースでは、細胞クラスターは、半透膜により包囲されたアルギン酸コアを含むマイクロカプセルに封入されている。一部のケースでは、アルギン酸コアは、例えば、ＲＧＤ配列（アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）を有するオリゴペプチドと共有結合でコンジュゲートしているアルギン酸コアを含む足場を生成するように、修飾されている。一部のケースでは、アルギン酸コアは、例えば、安定性が増強された化学酵素的に改変されたアルギネートを有する共有結合によって強化されたマイクロカプセルを生成するように、修飾されている。一部のケースでは、アルギン酸コアは、例えば、アクリレート官能化リン脂質の生体内原位置での重合により構築される膜様フィルムを生成するように、修飾されている。一部のケースでは、マイクロカプセルは、エピメラーゼを使用して酵素的に修飾されたアルギネートで構成されており、一部のケースでは、マイクロカプセルは、マクロカプセル膜の隣接する層の間に共有結合性連結を含む。一部の実施形態では、マイクロカプセルは、フェノール部分とカップリングしたアルギネートを含む、サブシーブサイズカプセルを含む。一部のケースでは、マイクロカプセルは、アルギネート−アガロ���スを含む足場を含む。一部のケースでは、ＳＣ−β細胞は、アルギネートの中にカプセル化される前にＰＥＧで修飾されている。一部のケースでは、細胞、例えばＳＣ−β細胞、の単離された集団は、光反応性リポソームおよびアルギネートの中にカプセル化される。マイクロカプセルに利用されるアルギネートを、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、キトサン、ポリエステル中空繊維、コラーゲン、ヒアルロン酸、デキストランとＲＯＤ、ＢＨＤおよびポリエチレングリコールジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、ポリ（ＭＰＣ−ｃｏ−メタクリル酸ｎ−ブチル−ｃｏ−４−ビニルフェニルボロン酸）（ＰＭＢＶ）およびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、アガロース、アガロースとゼラチン、ならびにこれらが多層になったケースを、限定ではないが含む他の好適な生体材料に置き換えることができることは、理解されるはずである。一部のケースでは、本明細書で提供されるデバイスは、体外セグメント、例えば、デバイスが対象に植え込まれたときに対象の身体の外部に存在し得るデバイスの部分を含む。体外セグメントは、本明細書で提供される細胞または細胞クラスターを伴うまたは伴わない、デバイスの任意の機能性成分を含むことができる。
【０２９５】
[00340]ＶＩＩ．処置方法
[00341]対象の疾患を処置または予防するための方法が、さらに本明細書で提供される。本明細書で提供される、または本明細書で提供される方法に従って生成された、細胞クラスターまたは細胞を含む組成物を、対象に投与して、対象における膵臓機能の程度を回復させることができる。例えば、内在性膵島に似ている細胞クラスター、または内在性膵臓β細胞（例えば、非ネイティブ膵臓β細胞もしくはＳＣ−β細胞）に似ている細胞もしくはそれらの先駆体を対象に移植して、糖尿病を処置することができる。
【０２９６】
[00342]方法は、本願で開示される細胞クラスターまたは細胞を対象、例えば、それを必要とする対象に、移植するステップを含むことができる。「移植する（こと）」という用語は、対象への細胞または細胞クラスター、それらの細胞もしくは細胞クラスターの任意の部分、またはそれらの細胞、細胞クラスターもしくは任意の部分を含む任意の組成物の留置であって、導入された細胞または細胞クラスターの所望の部位への少なくとも部分的な局在をもたらす方法または経路による留置を指すことができる。細胞または細胞クラスターを、膵臓に直接植え込むことができ、または代替的に、植え込まれた細胞（複数）の少なくとも一部分もしくは植え込まれた細胞（単数）が依然として生存可能である対象体内の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与することができる。対象への投与後の細胞または細胞クラスターの生存期間は、数時間、例えば２４時間、〜数日のような短い期間から、数年のような長い期間までであり得る。一部の事例では、細胞もしくは細胞クラスター、またはそれらの細胞もしくは細胞クラスターの任意の部分を、非膵臓位置に、例えば、肝臓内にまたは皮下的に、例えば、カプセル（例えば、マイクロカプセル）でトランス投与して、植え込まれた細胞または細胞クラスターを植え込み位置に維持し、遊走を回避することもできる。
【０２９７】
[00343]本明細書で使用される場合、「処置すること」および「処置」は、対象が疾患の少なくとも１つの症状の軽減、または疾患の好転、例えば、有益なもしくは所望の臨床結果を有するために有効な量の組成物（例えば、細胞クラスターまたはそれらの一部分）を、対象に投与することを指すことができる。本開示では、有益なまたは所望の臨床結果は、検出可能であるか、検出不能であるかを問わず、１つまたは複数の症状の軽減、疾患の程度の低下、安定した（例えば、悪化しない）病態、疾患進行の遅延または緩徐化、病態の改善または緩和、および寛解（部分寛解または完全寛解）を含むが、これらに限定されない。処置することは、処置を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間を延長することも指すことができる。したがって、当業者は、処置が、疾患の完全治癒でないこともあるが、疾患状態を改善し得ることが、分かる。本明細書で使用される場合、「処置」という用語は、発症予防を含む。
【０２９８】
[00344]例示的な投与方法としては、注射、注入、点滴、吸入、または摂取が挙げられるが、これらに限定されない。「注射」は、限定ではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、脳室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内および胸骨内注射および注入を含む。好ましい実施形態では、組成物は、静脈内注射または注入により投与される。
【０２９９】
[00345]疾患または障害の「処置」、「予防」または「改善」とは、疾患または障害の発症を遅延させることまたは予防すること、そのような疾患または障害に関連する状態の進行を、進行または重症度の憎悪また悪化を、反転させること、軽減すること、改善すること、抑制すること、緩徐化することまたは停止させることを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％軽減される。
【０３００】
[00346]糖尿病の処置は、標準的な医療方法により決定される。糖尿病処置の目標は、糖値を安全にできる限り正常に近い値にすることである。一般に設定される目標は、食前の８０〜１２０ミリグラム毎デシリットル（ｍｇ／ｄｌ）および就寝時の１００〜１４０ｍｇ／ｄｌである。個々の医師は、他の要因、例えば、患者が低血糖反応を示す頻度に依存して、患者のための異なる目標を設定することができる。有用な医学的検査としては、血糖値を判定するための患者の血液および尿に関する検査、グリコシル化ヘモグロビンレベル（ＨｂＡ１ｃ；過去２〜３ヶ月にわたっての平均血糖値の測定、正常範囲は４〜６％である）についての検査、コレステロールおよび脂肪レベルについての検査、ならびに尿中タンパクレベルについての検査が挙げられる。そのような検査は、当業者に公知の標準的検査である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９８を参照されたい）。処置プログラムの成功は、より少数の患者を、糖尿病に関連する合併症、例えば、眼の疾患、腎疾患または神経疾患に関するプログラムに入れることにより判定することもできる。
【０３０１】
[00347]対象における糖尿病の発症を遅延させることは、糖尿病の少なくとも１つの症状、例えば、高血糖症、低インスリン血症、糖尿病網膜症、糖尿病性腎症、失明、記憶喪失、腎不全、心血管疾患（冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳血管疾患、アテローム動脈硬化症、および高血圧症を含む）、ニューロパチー、自律神経障害、高血糖性高浸透圧性昏睡またはこれらの組合せの発症の、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１ヶ月、少なくとも２ヶ月、少なくとも６ヶ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年、少なくとも３０年、少なくとも４０年以上にわたっての遅延を指し、対象の全生涯を含み得る。
【０３０２】
[00348]一部の態様では、本開示は、本明細書で提供される方法または細胞クラスター（例えば、インスリン産生細胞）を含むデバイスを対象に植え込むステップを含む方法であって、デバイスが、対象の血糖値の低下に十分な量のインスリンを放出する、方法に関する。一部の実施形態では、インスリン産生細胞は、グルコース応答性インスリン産生細胞である。
【０３０３】
[00349]一部の実施形態では、細胞もしくは細胞クラスターの移植または本明細書で提供されるデバイスにより誘導されるような、対象の血糖値の低下の結果として、グルコースの量が糖尿病閾値より低くなる。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物対象である。一部の実施形態では、哺乳動物の対象は、ヒトである。一部の実施形態では、グルコースの量は、植え込みから１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日後に糖尿病閾値より低い値に低下される。
【０３０４】
[00350]上に詳細に記載されているように、本開示の医薬組成物は、固体または液体形態での投与のために特別に製剤化することができ、（１）経口投与、例えば、水薬（水性もしくは非水性溶液もしくは懸濁液）、トローチ剤、糖衣丸、カプセル、丸剤、錠剤（例えば、頬側、舌下および全身性吸収を対象としたもの）、巨丸剤、粉末、顆粒、舌への適用のためのペースト；（２）例えば、皮下、筋肉内、静脈内もしくは硬膜外注射による、例えば、無菌溶液もしくは懸濁液、または徐放製剤としての、非経口投与；（３）例えば、皮膚に適用するための、クリーム、軟膏、もしくは徐放性パッチ、もしくはスプレーとしての、局所適用；（４）例えば、ペッサリー、クリームまたはフォームとして、膣内にもしくは直腸内に；（５）舌下に；（６）眼に；（７）経皮的に；（８）経粘膜的に；または（９）経鼻的に適しているものを含む。加えて、薬物送達システムを使用して、化合物を患者に植え込むことまたは注射することができる。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．２４：１９９〜２３６（１９８４）；Ｌｅｗｉｓ編「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１）；米国特許第３，７７３，９１９号、および米国特許第３５  ３，２７０，９６０号を参照されたい。
【０３０５】
[00351]本明細書における方法により処置することができる対象は、ヒトであることもあり、または非ヒト動物であることもある。一部のケースでは、対象は、哺乳動物であり得る。対象の例としては、霊長類、例えば、サル、チンパンジー、バンブー、またはヒトが挙げられるが、これらに限定されない。一部のケースでは、対象は、ヒトである。対象は、イヌ、ネコ、ウマ、乳牛、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどを含むがこれらに限定されない、非霊長類動物であることもある。一部のケースでは、処置を受ける対象は、それを必要とする対象、例えば、それを必要とするヒトである。
【０３０６】
[00352]ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えばヒトである。「患者」または「対象」という用語は、本明細書では同義で使用される。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、または乳牛であるが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、有利には、１型糖尿病、２型糖尿病または前糖尿病状態の動物モデルを表す対象として使用することができる。加えて、本明細書に記載される方法を使用して、飼育動物および／またはペットを処置することができる。対象は、男性であることもあり、または女性であることもある。対象は、糖尿病（例えば、１型もしくは２型）、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態と過去に診断されたことがある、あるいはそれに罹患しているまたはそれを有すると同定されたことがある者であって、場合によっては、必ずしもそうでなくてもよいが、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態の処置をまだ受けていない者であることがある。対象は、糖尿病にも前糖尿病状態にも罹患していない者であることもある。対象は、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態と診断されたことがある、あるいはそれに罹患していると同定されたことがあるが、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態についての１つまたは複数の処置を受けた結果として公知糖尿病リスク因子の改善を示す者であることもある。あるいは、対象は、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態を有すると過去に診断されたことがない者であることもある。例えば、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態の１つまたは複数のリスク因子を示す者であることもあり、あるいは糖尿病のリスク因子を示さない対象、あるいは糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態について無症状である対象であることもある。対象は、糖尿病もしくは前糖尿病状態に罹患しているまたはそれを発症するリスクがある者であることもある。対象は、本明細書で定義される通りの糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態と診断されたことがある、あるいはそれに罹患していると同定されたことがある者であることもあり、あるいは対象は、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または前糖尿病状態と過去に診断されたことも、それを有すると同定されたこともない者であることもある。
【０３０７】
[00353]方法は、当技術分野における任意の手段を使用して細胞クラスターを対象に移植するステップを含むことができる。例えば、方法は、細胞クラスターを腹腔、腎被膜下、腎被膜、網、皮下腔経由で、または膵床注入によって移植するステップを含むことができる。例えば、移植することは、被膜下移植すること、筋肉内移植すること、または門脈内移植すること、例えば門脈内注入であり得る。免疫保護的なカプセル化を実行して、細胞クラスターに免疫保護を与えることができる。一部のケースでは、本明細書で提供される処置方法は、移植片拒絶反応または植え込み物（例えば、細胞もしくはデバイス）に対する他の免疫応答をモジュレートまたは低減するための免疫応答モジュレーターを投与するステップを含むことができる。方法に使用することができる免疫応答モジュレーターの例としては、プリン合成阻害剤、例えばアザチオプリンおよびミコフェノール酸、ピリミジン合成阻害剤、例えばレフルノミドおよびテリフルノミド、葉酸代謝拮抗薬、例えばメトトレキサート、タクロリムス、シクロスポリン、ピメクロリムス、アベチムス、グスペリムス、レナリドミド、ポマリドミド、サリドマイド、ＰＤＥ４阻害剤、アプレミラスト、アナキンラ、シロリムス、エベロリムス、リダホロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、抗胸腺細胞グロブリン抗体、抗リンパ球グロブリン抗体、ＣＴＬＡ−４、その断片、ならびにその融合タンパク質、例えばアバタセプトおよびベラタセプト、ＴＮＦ阻害剤、例えばエタネルセプトおよびペグスネルセプト、アフリベルセプト、アレファセプト、リロナセプト、補体成分５に対する抗体、例えばエクリズマブ、抗ＴＮＦ抗体、例えばアダリムマブ、アフェリモマブ、セルトリズマブペゴル、ゴリムマブ、インフリキシマブおよびネレリモマブ、インターロイキン５に対する抗体、例えばメポリズマブ、抗ＩｇＥ抗体、例えばオマリズマブ、抗インターフェロン抗体、例えばファラリモマブ、抗ＩＬ−６抗体、例えばエルシリモマブ（Ｅｌｓｉｌｉｍｏｍａｂ）、ＩＬ−１２およびＩＬ−２３に対する抗体、例えばレブリキズマブおよびウステキヌマブ、抗ＩＬ−１７Ａ抗体、例えばセクキヌマブ、抗ＣＤ３抗体、例えばムロモナブ−ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブおよびビシリズマブ、抗ＣＤ４抗体、例えばクレノリキシマブ、ケリキシマブおよびザノリムマブ、抗ＣＤ１１ａ抗体、例えばエファリズマブ、抗ＣＤ１８抗体、例えばエルリズマブ、抗ＣＤ２０抗体、例えばオビヌツズマブ、リツキシマブ、オクレリズマブおよびパスコリズマブ、抗ＣＤ２３抗体、例えばゴミリキシマブおよびルミリキシマブ、抗ＣＤ４０抗体、例えばテネリキシマブおよびトラリズマブ、ＣＤ６２Ｌ／Ｌ−セレクチンに対する抗体、例えばアセリズマブ（Ａｓｅｌｉｚｕｍａｂ）、抗ＣＤ８０抗体、例えばガリキシマブ、抗ＣＤ１４７／ベイシジン抗体、例えばガビリモマブ（Ｇａｖｉｌｉｍｏｍａｂ）、抗ＣＤ１５４抗体、例えばルプリズマブ、抗ＢＬｙＳ抗体、例えばベリムマブおよびブリシビモド、抗ＣＴＬＡ−４抗体、例えばイピリムマブおよびトレメリムマブ、抗ＣＡＴ抗体、例えば、ベルチリムマブ、レルデリムマブ（Ｌｅｒｄｅｌｉｍｕｍａｂ）��よびメテリムマブ（Ｍｅｔｅｌｉｍｕｍａｂ）、抗インテグリン抗体、例えばナタリズマブ、インターロイキン６受容体に対する抗体、例えばトシリズマブ、抗ＬＦＡ−１抗体、例えばオデュリモマブ（Ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）、ＩＬ−２受容体／ＣＤ２５に対する抗体、例えばバシリキシマブ、ダクリズマブおよびイノリモマブ、Ｔリンパ球に対する抗体（ゾリモマブ・アリトクス（Ｚｏｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ））、例えばアトロリムマブ（Ａｔｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、セデリズマブ、フォントリズマブ、マスリモマブ、モロリムマブ（Ｍｏｒｏｌｉｍｕｍａｂ）、ペキセリズマブ、レスリズマブ、ロベリズマブ、シプリズマブ、タリズマブ、テリモマブ・アリトクス（Ｔｅｌｉｍｏｍａｂ  ａｒｉｔｏｘ）、バパリキシマブ（Ｖａｐａｌｉｘｉｍａｂ）、ならびにベパリモマブ（Ｖｅｐａｌｉｍｏｍａｂ）を挙げることができる。
【実施例】
【０３０８】
[00354]これらの実施例は、例証を目的として提供するものに過ぎず、本明細書で提供する請求項の範囲を限定するために提供するものではない。
実施例１
ＳＣ−β細胞産生のための細胞株の選択
[00355]胚性幹細胞（ＥＳＣ）細胞株をＳＣ−β細胞産生に使用することができる。ＥＳＣ細胞株選択の基準としては、２Ｄ培養システムでの一貫した拡大、３Ｄ培養への適応、分化能、ならびにｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでの機能を挙げることができる。細胞株の例を図１に示す。
【０３０９】
実施例２
ＥＳＣ細胞株の２Ｄ培養基準
[00356]選択したＥＳＣ細胞株の形態および組成の例を図２Ａおよび２Ｂに示す。この実施例では、非ＥＳＣ細胞マーカーＳｏｘ１７およびＥＳＣマーカーＯｃｔ４を発現する細胞をフローサイトメトリーによって検出した。９０％を超えるＥＳＣ細胞が、細胞集団において検出された。
【０３１０】
実施例３
ＥＳＣ細胞株の分化プロトコール
[00357]この実施例は、本開示による例示的な基礎培養培地が、オンターゲットおよびオフターゲット前駆体細胞により定量して向上した分化効率を有することができることを示す。図３Ａに示されているように、例示的成分を含有する基礎培地は、オンターゲット細胞のパーセンテージを増加させる一方で、オフターゲット細胞のパーセンテージを減少させることができる。図３Ｂは、細胞を本開示による例示的な分化プロトコールに従って分化させたとき、基礎培養培地の例示的な成分であるヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）が、その代わりにウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有する培養培地または血清アルブミンを有さない培養培地（「ＳＡなし」）と比較して、ステージ３の終了時にＰｄｘ１陽性細胞（Ｐｄｘ１＋）のパーセンテージを有意に増加させたことを示す。同時に、ＨＳＡの存在は、ＢＳＡを含有する培養培地またはＳＡなしで分化させた細胞と比較して、ステージ３の終了時にオフターゲットＣＤ２陽性（ｐｏｓｔｉｉｖｅ）（ＣＤＸ２＋）細胞のパーセンテージを有意に減少させた。データは、Ｐｄｘ１＋およびＣＤＸ２＋細胞のパーセンテージに対するＨＳＡの濃度依存的効果も実証した。
【０３１１】
[00358]ここで例証する別の例は、原始腸管（ＰＧＴ）細胞を、アクチビンＡ（２０ｎｇ／ｍＬ）とＤＭＨ−１（０．２５μＭ）とを含有する培地中でのＰＧＴ細胞のインキュベーションにより、Ｐｄｘ１陽性膵臓前駆細胞（ステージ３）に分化させることを含む、本開示による例示的な分化プロトコール（ｖ１０プロトコール）が、ステージ６分化の終了時にＮＫＸ６．１陽性、Ｃ−ペプチド陽性ＳＣ−β細胞のパーセンテージにより判定して、分化効率を有意に上昇させることができることを実証した。図４Ａおよび４Ｂに示されているように、ＳＣ−β細胞のパーセンテージは、プロトコールｖ１０により、ステージ３でのアクチビンＡとＤＭＨ−１の両方とのインキュベーションを伴わない他の例示的なプロトコール（ｖ８およびｖ９）と比較して増加された。プロトコールｖ１０を使用することにより、別の例示的なプロトコールと比較してＮＫＸ６．１陽性、Ｃ−ペプチド陽性ＳＣ−β細胞パーセンテージの１．５〜２倍増加を達成した。図４Ｂに示されているように、ｖ１０プロトコールにより生成した例示的な細胞クラスターは、３５％を超えるＮＫＸ６．１陽性、Ｃ−ペプチド陽性ＳＣ−β細胞を含んだ。
【０３１２】
[00359]本明細書で提供する例示的な方法（例示的なプロトコール）を使用して分化させたＳＣ−β細胞は、天然の膵島細胞に似ている。図５の画像データに示されているように、ＳＣ−β細胞は、天然の膵島細胞と同様の形態を有した。これらの画像は、β細胞特異的遺伝子およびインスリンを染色することにより生成した。
【０３１３】
実施例４
分化ＳＣ−β細胞の機能分析
[00360]本開示によるシグナル伝達因子（例えば、本明細書で開示する例示的な分化因子、例えば、アクチビンＡ、ＤＭＨ−１、ＬＤＮ１９３１８９、またはＡｌｋ５ｉ）は、本明細書で提供する例示的な方法を使用して生成したＳＣ−β細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ機能を向上させることができる。
【０３１４】
[00361]一例では、フローサイトメトリー分析は、ステージ３でのＬＤＮ１９３１８９の存在または非存在によって、本明細書で提供する１つの例示的な分化方法に従ってステージ４完了時に（例えば、ステージ４培養の完了時に）得られる細胞構成要素が変わることを示した。図６Ａに示されているように、この実施例では、ＰＧＴ細胞（ステージ２細胞）とＬＤＮ１９３１８９のインキュベーション（図中の「ＬＤＮ」）が、ステージ４完了時に得られる細胞集団中のＣＤＸ２陽性細胞のパーセンテージを明確に減少させた。その一方で、ＬＤＮ１９３１８９はまた、ステージ４完了細胞におけるクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）発現を促進した。
【０３１５】
[00362]別の実施例では、フローサイトメトリー分析は、ＰＧＴ細胞（ステージ２細胞）を含む細胞とある特定の例示的なシグナル伝達因子（例えば、アクチビンＡおよびＤＭＨ−１）とのインキュベーションが、本明細書で提供する１つの例示的な分化方法に従ってステージ４完了時に（例えば、ステージ４培養の完了時に）得られる細胞構成要素に影響を与えることを示した。図６Ｂに示されているように、この実施例では、図６Ａに示されているような他の実施例におけるＬＤＮ１９３１８９の効果と類似して、単独での０．５μＭのＤＭＨ１のインキュベーションは、ＤＭＨ１のインキュベーションなしと比較して、ＣＤＸ２を発現する細胞のパーセンテージを減少させたが、ＣＨＧＡを発現する細胞のパーセンテージを増加させた。しかし、０．５μＭのＤＭＨ−１および２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡ（図中の「ＡＡ」）のコインキュベーションは、ＤＭＨ−１もアクチビンＡも一切なしで得たステージ４完了細胞と比較して、ＣＤＸ２陽性細胞のパーセンテージを減少させたが、低レベル下で、ＣＨＧＡ陽性細胞のパーセンテージを制御もした。
【０３１６】
[00363]別の実施例では、ＰＧＴ細胞（ステージ２細胞）を含む細胞とある特定の例示的なシグナル伝達因子（例えば、アクチビンＡおよびＤＭＨ−１）とのインキュベーションは、ＳＣ−β細胞を含む、ステージ６で得た細胞集団のインスリン分泌を有意に向上させた。ｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイを使用して、インスリン分泌におけるＳＣ−β細胞の機能を定量した。図６Ｃに示されているように、ステージ３での例示的なシグナル伝達因子（ＤＭＨ−１およびアクチビンＡ）の添加は、低グルコース（２．８ｍＭ）、高グルコース（２０ｍＭ）、またはＫＣｌ（３０ｍＭのＫＣｌ＋２．８ｍＭのグルコース）の存在下でのＧＳＩＳ反応を向上させることが判明した。図により実証されるように、例示的なシグナル伝達因子（アクチビンＡおよびＤＭＨ−１）は、高グルコース刺激に応答してのインスリン分泌量を低グルコース刺激に応答してのインスリン分泌量で割ることによって計算して、ＧＳＩＳ刺激を有意に増加させた。例えば、ステージ３で２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび０．２５μＭのＤＭＨ−１を使用する例示的なプロトコールを用いて得たステージ６細胞の刺激指数は、ステージ３でアクチビンＡもＤＭＨ−１も使用しない例示的なプロトコールを用いて得たステージ６細胞より少なくとも３倍高かった。その一方で、アクチビンＡおよびＤＭＨ−１の添加はまた、ＫＣｌ刺激に応答してのインスリン分泌を濃度依存的様式で有意に増加させた。例えば、ステージ３で２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび０．２５μＭのＤＭＨ−１を使用する例示的なプロトコールを用いて得た例示的なステージ６細胞は、ステージ３でアクチビンＡもＤＭＨ−１も使用しない例示的なプロトコールを用いて得たステージ６細胞と比較して少なくとも３倍多いインスリンをＫＣｌ刺激に応答して分泌した一方で、ステージ３で１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡおよび０．２５μＭのＤＭＨ−１を用いて得たステージ６細胞は、同じＫＣｌ刺激に応答して約２倍多いインスリンを分泌した。
【０３１７】
実施例５
大規模でのＳＣ−β細胞の製造
[00364]ＳＣ−β細胞の産生を、大規模培養、例えば、図９Ａ〜９Ｃに示されているような０．１Ｌ、０．５Ｌおよび３Ｌ培養で試験した。細胞の拡大倍数は、培養規模を増加させたとき、増加された。Ｏｃｔ４発現細胞の集団を各々の大規模培養で定量し、大規模培養の各々は、１００％に近いＯｃｔ４発現細胞を産生した。
【０３１８】
[00365]産生されたＳＣ−β細胞は、凍結保存後、適切な機能（例えば、グルコースを感知してインスリンを分泌する能力）をなお維持していた。図１０に示されているように、新鮮ＳＣ−β細胞および凍結保存ＳＣ−β細胞を、グルコースを感知してインスリンを分泌するそれらの能力の点で比較した。凍結保存ＳＣ−β細胞は、匹敵する活性を示した。
【０３１９】
実施例６
ＳＣ−β細胞での動物モデルの処置
[00366]ＳＣ−β細胞を、必要に応じて、デバイス内に配置し、そのデバイスを植え込むことにより、動物モデル（例えば、糖尿病免疫不全マウス）に植え込んだ。組織試料を移植から６ヶ月後に採取した。組織試料の画像例を図１１に示す。移植したＳＣ−β細胞移植片は、多数のαおよびβ細胞を含有した。Ｃ−ペプチド、グルカゴンおよびＤＡＰＩを使用して、画像を染色した。
【０３２０】
[00367]カプセル化ＳＣ−β細胞は、動物モデル（例えば、糖尿病免疫不全マウス）の糖尿病を治癒させることができる。図１２に示されているように、マウスを、先ず、糖尿病を有するように誘導し、次いで、糖尿病を誘導した後にカプセル化ＳＣ−β細胞をマウスに植え込み、最後に、ある一定の時間後にＳＣ−β細胞を外植した。全プロセスを通して血糖値をモニターした。糖尿病を誘導した後、血糖値は、糖尿病閾値よりはるかに高い値へと上昇した。ＳＣ−β細胞の植え込み後、血糖値は、糖尿病閾値より低い値に降下した。外植後、血糖値は上昇して高い値に戻った。
【０３２１】
[00368]別の実施例では、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発生させた例示的なＳＣ−β細胞集団を充填したデバイスをマウスに植え込んだ。図１４は、カプセルデバイスへの細胞の封入前の、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで発生させたＳＣ島の画像、およびマウスへの植え込みから３ヶ月後にデバイスから除去した細胞の画像を示す。Ｃ−ペプチドおよびグルカゴン免疫染色により実証されるように、これらのカプセル化ＳＣ島は、マウスへの植え込み後に多数の生存β細胞を示す。
【０３２２】
実施例７
分化ＳＣ−β細胞の構成要素分析
[00369]例示的な分化ＳＣ−β細胞集団をフローサイトメトリーによって調査してそれらの構成要素を分析した。本開示の一部の態様に従って、３つの分化集団を３つの異なるプロトコールにより生成した。それらのフローサイトメトリー分析結果を図１３に示す。細胞集団１は、従来のプロトコールを使用して生成したが、細胞集団２および３は、本明細書で提供する場合の例示的プロトコールを使用して生成した。図１３に示されているように、細胞集団１、２および３はすべて、異なるマーカー発現パターンによって示唆されるように、異なる細胞型の混合物である。注目すべきことに、細胞集団３は、最高のβ細胞集団（ＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋）を有した。
【０３２３】
[00370]本開示の好ましい実施形態を本明細書に示し、説明したが、このような実施形態が例として提供されていることは当業者には明白であろう。非常に多くの変形、変更および置換が、本開示から逸脱することなく、今や当業者の心に浮かぶことであろう。本明細書に記載する本開示の実施形態の様々な代替形態を、本開示を実施する際に用いることができることは、理解されるはずである。以下の請求項が本開示の範囲を規定すること、ならびにこれらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにそれらの均等法／均等物が以下の請求項によってカバーされることを、意図している。
【図１】
2021502830.tif 000007
【図２Ａ】
2021502830.tif 000008
【図２Ｂ】
2021502830.tif 000009
【図３Ａ】
2021502830.tif 000010
【図３Ｂ】
2021502830.tif 000011
【図４】
2021502830.tif 000012
【図５】
2021502830.tif 000013
【図６Ａ】
2021502830.tif 000014
【図６Ｂ】
2021502830.tif 000015
【図６Ｃ】
2021502830.tif 000016
【図７】
2021502830.tif 000017
【図８】
2021502830.tif 000018
【図９Ａ】
2021502830.tif 000019
【図９Ｂ】
2021502830.tif 000020
【図９Ｃ】
2021502830.tif 000021
【図９Ｄ】
2021502830.tif 000022
【図９Ｅ】
2021502830.tif 000023
【図１０】
2021502830.tif 000024
【図１１】
2021502830.tif 000025
【図１２】
2021502830.tif 000026
【図１３】
2021502830.tif 000027
【図１４】
2021502830.tif 000028
【図１５】
2021502830.tif 000029
【国際調査報告】
2021502830.tif 000030
2021502830.tif 000031