(57)【要約】  本発明は、酵素的核酸合成法におけるアミン保護された部分の使用に関する。本発明はまた、前記アミン保護された部分本体、及び、前記アミン保護された部分を含むヌクレオチド三リン酸を製造する方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデニン、グアニン、シトシン、イソグアニン、イソシトシン及び２，６−ジアミノプリンなどのアミンが保護された含窒素複素環の誘導体の、酵素的核酸合成法における使用。
【請求項２】
式（Ｉ）の化合物の、
【化１】
2021503003.tif 000050
（式中、
Ｒ１は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、または−Ｏ−アルコキシを含む、脱保護されてヒドロキシル基を生じることのできる部分を表し、
Ｒ２は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、もしくは−Ｏ−アルコキシまたは任意の他の分子部分を表し、
Ｘは、−ＯＨ基または１以上のリン酸基、チオリン酸基、ボラノリン酸基もしくはイミドリン酸基、またはそれらの任意の組み合わせを表し、該基は酵素的付加能を付与する能力があり、
Ｒ３はアミン保護基を表し、該アミノ基は相補性塩基との水素結合塩基対に関与しており、該アミノ基の脱アミノ化は相補性塩基との水素結合の変更を生じることができ、かつ
Ｂは含窒素複素環を表す。）
酵素的核酸合成法における使用。
【請求項３】
前記式（Ｉ）の化合物は下記から選ばれる、請求項２記載の使用
【化２】
2021503003.tif 000051
（式中、Ｒ２は、−ＯＨまたは−Ｈなどの、請求項２で特定されたものである）。
【請求項４】
前記式（Ｉ）の化合物は、（Ｉ）ｂなどの、式（Ｉ）ｂから（Ｉ）ｊの化合物から選ばれる、請求項２記載の使用。
【請求項５】
Ｘは−ＯＨ基または三リン酸基を表す請求項２記載の使用。
【請求項６】
前記水素結合塩基対は、ワトソン−クリック型、フーグスティーン型、または代替的／拡張された遺伝子コードの塩基対から選ばれる、請求項２〜５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項７】
Ｒ１及びＲ２は独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、もしくは−Ｏ−アルコキシ、または適切なヒドロキシ保護基を表す、請求項２〜６のいずれか１項に記載の使用。
【請求項８】
Ｒ３は、アジド（−Ｎ３）、ベンゾイルアミン（Ｎ−ベンゾイルまたは−ＮＨＣＯＰｈ）、Ｎ−メチル（−ＮＨＭｅ）、イソブチリルアミン、ジメチルホルムアミジルアミン、９−フルオレニルメチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート、ベンジルカルバメート、アセトアミド（Ｎ−アセチルまたは−ＮＨＣＯＭｅ）、トリフルオロアセトアミド、プスラミド、ベンジルアミン（Ｎ−ベンジルまたは−ＮＨ−ＣＨ２−フェニル）、トリフェニルメチルアミン、ベンキシリデンアミン、トシルアミド、イソチオシアネート、Ｎ−アリル（Ｎ−ジメチルアリル（−ＮＨＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）など）及びＮ−アニソイル（−ＮＨＣＯＰｈ−ＯＭｅ）、例えば、アジド（−Ｎ３）、Ｎ−アセチル（−ＮＨＣＯＭｅ）、Ｎ−ベンジル（−ＮＨ−ＣＨ２−フェニル）、Ｎ−アニソイル（−ＮＨＣＯＰｈ−ＯＭｅ）、Ｎ−メチル（−ＮＨＭｅ）、Ｎ−ベンゾイル（−ＮＨＣＯＰｈ）、Ｎ−ジメチルアリル（−ＮＨＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）から選ばれる、請求項２〜７のいずれか１項に記載の使用。
【請求項９】
Ｂは、プリンもしくはピリミジン、またはそれらの誘導体から選ばれた含窒素複素環を表す、請求項２〜８のいずれか１項に記載の使用。
【請求項１０】
−Ｂ−Ｒ３は下式のいずれかを表す、請求項２〜９のいずれか１項に記載の使用
【化３】
2021503003.tif 000052
。
【請求項１１】
Ｒ３はアジド基（−Ｎ３）を表し、-Ｂ−Ｒ３は下記から選ばれる、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の使用
【化４】
2021503003.tif 000053
。
【請求項１２】
式（Ｉ）ａの化合物
【化５】
2021503003.tif 000054
（式中、 
Ｒ１は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、または−Ｏ−アルコキシを含む、脱保護されてヒドロキシル基を生じることのできる部分を表し、
Ｒ２は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、もしくは−Ｏ−アルコキシまたは任意の他の分子部分を表し、
Ｘは、１以上のリン酸基、チオリン酸基、ボラノリン酸基もしくはイミドリン酸基、またはそれらの任意の組み合わせを表し、該基は酵素的付加能を付与する能力があり、
Ｒ３はアミン保護基を表し、該アミノ基は相補性塩基との水素結合塩基対に関与しており、該アミノ基の脱アミノ化は相補性塩基との水素結合の変更を生じることができ、
Ｂは含窒素複素環を表す）。
【請求項１３】
Ｘは三リン酸基を表す、請求項１２記載の化合物。
【請求項１４】
Ｒ１及びＲ２は独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、もしくは−Ｏ−アルコキシまたは適切なヒドロキシ保護基を表す、請求項１２または１３に記載の化合物。
【請求項１５】
Ｒ３は、アジド（−Ｎ３）、ベンゾイルアミン（Ｎ−ベンゾイルまたは−ＮＨＣＯＰｈ）、Ｎ−メチル（−ＮＨＭｅ）、イソブチリルアミン、ジメチルホルムアミジルアミン、９−フルオレニルメチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート、ベンジルカルバメート、アセトアミド（Ｎ−アセチルまたは−ＮＨＣＯＭｅ）、トリフルオロアセトアミド、プスラミド、ベンジルアミン（Ｎ−ベンジルまたは−ＮＨ−ＣＨ２−フェニル）、トリフェニルメチルアミン、ベンキシリデンアミン、トシルアミド、イソチオシアネート、Ｎ−アリル（Ｎ−ジメチルアリル（−ＮＨＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）など）及びＮ−アニソイル（−ＮＨＣＯＰｈ−ＯＭｅ）、例えばアジド（−Ｎ３）、Ｎ−アセチル（−ＮＨＣＯＭｅ）、Ｎ−ベンジル（−ＮＨ−ＣＨ２−フェニル）、Ｎ−アニソイル（−ＮＨＣＯＰｈ−ＯＭｅ）、Ｎ−メチル（−ＮＨＭｅ）、Ｎ−ベンゾイル（−ＮＨＣＯＰｈ）、Ｎ−ジメチルアリル（−ＮＨＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）から選ばれる、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１６】
Ｂは、プリンまたはピリミジンから選ばれた含窒素複素環を表す、請求項１２〜１５のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項１７】
−Ｂ−Ｒ３は下式のいずれかを表す、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の化合物
【化６】
2021503003.tif 000055
。
【請求項１８】
Ｒ３はアジド基（−Ｎ３）を表し、Ｂは下記から選ばれる、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の化合物
【化７】
2021503003.tif 000056
。
【請求項１９】
（１）、（２）または（３）などの、式（１）から（２７）の化合物から選ばれる、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の化合物。
【請求項２０】
式（Ｖ）の化合物の製造方法であって、
【化８】
2021503003.tif 000057
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＢは、請求項２で特定されたとおりである）
式（Ｉ）の化合物を、
【化９】
2021503003.tif 000058
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＢは、請求項２で特定されたとおりである）
化学薬品で、電磁放射で、熱で、及び／または電流で、反応させることを含む、前記製造方法。
【請求項２１】
式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物の製造方法であって、
【化１０】
2021503003.tif 000059
（式中、Ｘ、Ｒ１及びＲ２は、請求項２で特定されたとおりである）
式（ＩＩ）ａ、（ＩＩＩ）ａまたは（ＩＶ）ａの化合物を、それぞれ、
【化１１】
2021503003.tif 000060
（式中、Ｘ、Ｒ１及びＲ２は、請求項２で特定されたとおりである）
化学薬品で、電磁放射で、及び／または電流で、反応させることを含む、前記製造方法。
【請求項２２】
請求項２１記載の式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物の製造方法であって、
式（ＶＩ）の化合物を、
【化１２】
2021503003.tif 000061
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＢは、請求項２で特定されたとおりである）
還元剤と反応させることを含む、前記製造方法。
【請求項２３】
前記還元剤は、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、または、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ）、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）及びトリス（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などのホスフィン系還元剤から選ばれる、請求項２２記載の製造方法。
【請求項２４】
式（ＶＩＩ）の化合物
【化１３】
2021503003.tif 000062
（式中、Ｒ２は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、もしくは−Ｏ−アルコキシまたは適切なヒドロキシ保護基を表し、
Ｘは、１以上のリン酸基、チオリン酸基、ボラノリン酸基もしくはイミドリン酸基、またはそれらの任意の組み合わせを表し、
Ｒ４はＣ２−６アルキル、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、アルコキシ、ビオチン、アルキルアミンまたはアジドを表す）。
【請求項２５】
請求項２４記載の式（ＶＩＩ）の化合物の、酵素的核酸合成法における使用。
【請求項２６】
前記酵素的核酸合成は、可逆的に停止された酵素的核酸合成法、並びに、鋳型依存性及び鋳型非依存性デノボ、酵素的核酸合成法から選ばれる、請求項１〜１１及び２５のいずれか１項に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、酵素的核酸合成法におけるアミン保護された部分(moiety)の使用に関する。本発明はまた、前記アミン保護された部分自体及び、前記アミン保護された部分を含むヌクレオチド三リン酸の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
核酸合成は現代の生物工学にとって必須である。生物工学分野における急速な発展は、科学界のＤＮＡ、ＲＮＡ及びタンパク質を人工合成する能力によって可能になった。
【０００３】
人工ＤＮＡ合成は、10億ポンド規模でさらに成長し続けている市場であるが、生物工学及び製薬会社が様々なペプチド治療薬、例えば糖尿病の治療のためのインスリンを開発することを可能にする。それは、研究者達が細胞タンパク質の特性評価を行って、我々の高齢化しつつある人口が今日直面している疾患、例えば心疾患及びがんの治療のための、新たな低分子治療法を開発することを可能にする。それは、Ｖｅｎｔｅｒ研究所が人工合成ゲノムを細菌細胞内に入れた2010年に実証したように、生命体創造への道さえも整えるものである。
【０００４】
しかしながら、現在のＤＮＡ合成技術は生物工学産業の要求を満たしていない。ＤＮＡ合成の利点は数多くあるものの、よく持ち出される問題が人工ＤＮＡ合成産業、ひいては生物工学分野の更なる成長を妨げている。それは成熟した技術であるにもかかわらず、長さが200ヌクレオチドより長いＤＮＡ鎖を合成することが事実上不可能であり、ほとんどのＤＮＡ合成会社は、たったの120ヌクレオチド以下を提供しているに過ぎない。これに比べて、平均的なタンパク質コード遺伝子は2000〜3000ヌクレオチドほどであり、平均的な真核生物ゲノムは数十億ヌクレオチドにもなる数である。このため、今日の主要な遺伝子合成会社は皆、重複する40〜60ｍｅｒ断片を合成してＰＣＲによって縫い合わせる様々な「合成と縫合わせ」技術に頼っている（Young,L.らの文献(2004)Nucleic Acid,Res.32,e59参照）。遺伝子合成産業によって提供される現行の方法は一般的に、通常の生産で３ｋｂまでの長さを可能としている。
【０００５】
１２０〜２００ヌクレオチドを上回るＤＮＡを一度に合成することができない原因は、ＤＮＡを生成する現行の方法論に起因しており、これは、合成化学（すなわちホスホロアミダイト技術）を用いてヌクレオチドを一度に１つずつ連結させてＤＮＡを作るものである。各ヌクレオチド連結ステップの効率は95.0〜99.0％効果的であるため、許容される収率で２００ヌクレオチドよりも長いＤＮＡを合成するのは数学的に不可能である。Ｖｅｎｔｅｒ研究所は、細菌の比較的小さいゲノムを合成するのに４年及び２千万米ドルを費やすことによって、この骨の折れるプロセスを例証した（Gibson,D.G.らの文献(2010)Science 329,52-56参照）。
【０００６】
ＤＮＡ配列決定の公知の方法は、鋳型依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用して、３’可逆的に停止されたヌクレオチドを、成長させる二本鎖の基質に付加する（Bentley,D.R.らの文献(2008)Nature 456,53-59参照）。「合成による配列決定」プロセスでは、付加された各ヌクレオチドは色素を含有し、ユーザーが鋳型鎖の正確な配列を同定することを可能にしている。二本鎖ＤＮＡにおいてではあるが、この技術により長さ500〜1000ｂｐの鎖を生産することができる。しかしながら、この技術は、既存の核酸鎖が鋳型として作用することを要求するので、最初からの(de novo)核酸合成には適さない。
【０００７】
-ＯＮＨ２化学的部分は、合成による配列決定（ＳＢＳ）、鋳型依存性酵素ＤＮＡ合成、及び鋳型非依存性酵素ＤＮＡ合成などの様々な生物工学応用に有用である（D.Hutterらの文献, Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids.29(2010)879-895参照）。-ＯＮＨ２化学的部分の有用性は特に、例えばヌクレオチド５’−三リン酸中の２’−デオキシリボースまたはリボースの３’−ＯＨ位などの、-ＯＨ官能基を可逆的に保護する能力に負っている。そのうえ、-ＯＣＨ２Ｎ３などの他の可逆的に停止する部分に比べて、-ＯＮＨ２化学的部分の小ささは、ポリメラーゼなどの酵素のための更に適した基質となることに寄与する。しかしながら、-ＯＮＨ２化学的部分の脱保護に必要な条件は短所となっている。-ＯＮＨ２を-ＯＨへ変換するために使用される通常の化学薬品は、酸性条件下での亜硝酸ナトリウムである。問題なことには、本明細書図１及び４並びに数多くの過去の研究に示されるように、亜硝酸ナトリウム存在下では、アデニン、グアニン及びシトシンの酸化的脱アミノ化が、かなりの割合で生じてしまう（F.Kaudewitz,Nature.183(1959)1829-1830,F.Kodamaらの文献,Mutat.Res. 40(1976)119-124,R.Shapiro,及びS.H.Pohl,Biochemistry.7(1968)448-455参照）。これら塩基の脱アミノ化はアデニンをヒポキサンチンへ、シトシンをウラシルへ、グアニンをキサンチンへ変換する。これらの変換により、ヒポキサンチンはシトシンと対をなし、ウラシルはアデニンと対をなすので、かなりの変異が生じてしまう。そして、これら変異は、合成生物学応用のための、特に鋳型非依存性酵素ＤＮＡ合成における、-ＯＮＨ２可逆的停止剤の実際の用途を制限している。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
フラボノイド及び他のフェノール性化合物の付加が、亜硝酸ナトリウム存在下での、核酸−含窒素複素環の脱アミノ化を減少させるための、可能な解決方法として提案されている（C. Oldreiveらの文献,Chem.Res.Toxicol.11(1998)1574-1579参照）。しかし今までの研究では、ある種の添加剤は核酸塩基の脱アミノ化を防止することが示されている一方、同じ添加剤が、可逆的な停止効果を得るために必要な３’-ＯＮＨ２の３’-ＯＨへの変換をも同様に阻害する。従って、フラボノイド及び他のフェノール性化合物の使用は、鋳型非依存性酵素ＤＮＡ合成に対しては用途が限られていた。
【０００９】
上記のとおり、現行で利用可能な方法が有する問題を克服できる改善された核酸合成法の提供が求められている。
【課題を解決するための手段】
【００１０】
（発明の概要）
本発明の第１の態様によれば、アデニン、グアニン、シトシン、イソグアニン、イソシトシン及び２，６−ジアミノプリンなどのアミンが保護された含窒素複素環の誘導体の、酵素的核酸合成法における使用が提供される。
【００１１】
本発明の更なる態様によれば、式（Ｉ）の化合物の、
【化１】
2021503003.tif 000002
（式中、
Ｒ１は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、または−Ｏ−アルコキシを含む、脱保護されてヒドロキシル基を生じることのできる部分を表し、
Ｒ２は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、もしくは−Ｏ−アルコキシまたは任意の他の分子部分を表し、
Ｘは、−ＯＨ基または１以上のリン酸基、チオリン酸基、ボラノリン酸基もしくはイミドリン酸基、またはそれらの任意の組み合わせを表し、該基は酵素的付加能を付与する能力があり、
Ｒ３はアミン保護基を表し、該アミノ基は相補性塩基との水素結合塩基対に関与しており、該アミノ基の脱アミノ化は相補性塩基との水素結合の変更を生じることができ、
Ｂは含窒素複素環を表す。）
酵素的核酸合成法における使用が提供される。
【００１２】
本発明の更なる態様によれば、式（Ｉ）ａの化合物、
【化２】
2021503003.tif 000003
（式中、
Ｒ１は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、または−Ｏ−アルコキシを含む、脱保護されてヒドロキシル基を生じることのできる部分を表し、
Ｒ２は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、もしくは−Ｏ−アルコキシまたは任意の他の分子部分を表し、
Ｘは、１以上のリン酸基、チオリン酸基、ボラノリン酸基もしくはイミドリン酸基、またはそれらの任意の組み合わせを表し、該基は酵素的付加能を付与する能力があり、
Ｒ３はアミン保護基を表し、該アミノ基は相補性塩基との水素結合塩基対に関与しており、該アミノ基の脱アミノ化は相補性塩基との水素結合の変更を生じることができ、かつ
Ｂは含窒素複素環を表す。）
が提供される。
【００１３】
本発明の更なる態様によれば、式（Ｖ）の化合物の製造方法であって、
【化３】
2021503003.tif 000004
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＢは、本明細書で特定されたとおりである）
式（Ｉ）の化合物を、
【化４】
2021503003.tif 000005
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＢは、本明細書で特定されたとおりである）
化学薬品で、電磁放射で、熱で、及び／または電流で、反応させることを含む、当該製造方法が提供される。
【００１４】
本発明の更なる態様によれば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物の製造方法であって、
【化５】
2021503003.tif 000006
（式中、Ｘ、Ｒ１及びＲ２は、本明細書で特定されたとおりである）
式（ＩＩ）ａ、（ＩＩＩ）ａまたは（ＩＶ）ａの化合物を、それぞれ、
【化６】
2021503003.tif 000007
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＢは、本明細書で特定されたとおりである）
化学薬品で、電磁放射で、熱で、及び／または電流で、反応させることを含む、当該製造方法が提供される。
【００１５】
本発明の更なる態様によれば、本明細書で特定された式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物の製造方法であって、式（ＶＩ）の化合物を、
【化７】
2021503003.tif 000008
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＢは、本明細書で特定されたとおりである）
還元剤と反応させることを含む、当該製造方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
（図面の簡単な説明）
【図１】亜硝酸ナトリウム（700ｍＭ）、酢酸ナトリウム、ｐＨ5.5（1Ｍ）の存在下で、室温での２’−デオキシアデノシン（1ｍＭ）の脱アミノ化量を示す経時変化である。（Ａ）ＬＣ−ＭＳは、Synergi Polar RPカラムを備えたBruker amaZonシステムで行った。溶媒は、Ａ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6）及びＢ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6［5％］／アセトニトリル［95％］）であった。Ａのグラジエント勾配Ｂ5-40％で、10分かけて0.5ｍＬ／分で実行した。データを、260ｎｍでの一連のＬＣクロマトグラムとして表示する。約2.6分のピークは２’−デオキシアデノシンに対応し、約1.3分のピークは２’−デオキシイノシン（酸化的脱アミノ化生成物）に対応する。（Ｂ）経時的な脱アミノ化率のプロット。（Ｃ）下式は２’−デオキシアデノシンが２’デオキシイノシンへ変換される、酸化的脱アミノ反応を示す。
【００１７】
【図２】亜硝酸ナトリウム（700ｍＭ）、酢酸ナトリウム、ｐＨ5.5（1Ｍ）の存在下で、室温でのＮ６−アジド−２’−デオキシアデノシン（0.5ｍＭ）の脱アミノ化量を示す経時変化であり、Synergi Polar RPカラムを備えたBruker amaZonシステムで行ったＬＣ−ＭＳで分析した。溶媒は、Ａ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6）及びＢ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6［5％］／アセトニトリル［95％］）であった。Ａのグラジエント勾配Ｂ5-40％で、10分かけて0.5ｍＬ／分で実行した。データは、上部ラベリングされた各時点での２つの波長の一連のＬＣクロマトグラムとして表示される。保持時間約4.5分のピークは、６−アジド２’−デオキシアデノシンに対応する。約2.6分（２’−デオキシアデノシン）または約１．３分（２’−デオキシイノシン；酸化的脱アミノ化生成物）には、ピークが顕著に欠如している。
【００１８】
【図３】ＬＣ−ＭＳ分析によると、６−アジド−２’−デオキシアデノシン（保持時間4.5分）をＴＣＥＰに曝露すると、２’−デオキシアデノシン（保持時間2.6分）へ定量的に変換される。分析はSynergi Polar RPカラムを備えたBruker amaZonシステムで行った。溶媒は、Ａ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6）およびＢ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6［5％］／アセトニトリル［95％］）である。Ａのグラジエント勾配Ｂ5-40％で、10分かけて0.5ｍＬ／分で実行した。
【００１９】
【図４】亜硝酸ナトリウム（700ｍＭ）、酢酸ナトリウム、ｐＨ5.5（1Ｍ）の存在下で、室温での２’−デオキシシトシン（1ｍＭ）の脱アミノ化量を示す経時変化である。（Ａ）ＬＣ−ＭＳは、Synergi Polar RPカラムを備えたBruker amaZonシステムで実行された。溶媒は、Ａ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6）及びＢ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6［5％］／アセトニトリル［95％］）であった。Ａのグラジエント勾配Ｂ5-25％で、10分かけて0.4ｍＬ／分で実行した。データを、260ｎｍでの一連のＬＣクロマトグラムとして表示する。約1.05分のピークは２’−デオキシシチジンに対応し、約1.15分のピークは２’−デオキシウリジン（酸化的脱アミノ化生成物）に対応する。（Ｂ）経時的な脱アミノ化率のプロット。（Ｃ）下式は２’−デオキシシチジン（ｄＣ）が２’−デオキシウリジン（ｄＵ）へ変換される、酸化的脱アミノ反応を示す。
【００２０】
【図５】亜硝酸ナトリウム（700ｍＭ）、酢酸ナトリウム、ｐＨ5.5（1Ｍ）の存在下で、室温でのＮ４−アジド−２’−デオキシシチジン（Ｎ４−アジドｄＣ；1ｍＭ）の脱アミノ化量であり、Synergi Polar RPカラムを備えたBruker amaZonシステムで行ったＬＣ−ＭＳで分析した。溶媒は、Ａ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6）及びＢ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6［5％］／アセトニトリル［95％］）であった。Ａのグラジエント勾配Ｂ5-25％で、10分かけて0.4ｍＬ／分で実行した。（Ａ）主要ピークの質量を有する最初の化合物を表すトレースにより、約2.7分の化合物はＮ４−アジドｄＣとして同定される。（Ｂ）上記のように亜硝酸塩溶液でインキュベートしたＮ４−アジドｄＣの経時変化である。データを、260ｎｍでの一連のＬＣクロマトグラムとして表示する。ｄＣ（還元生成物）またはｄＵ（脱アミノ化生成物）に対応するピークの顕著な欠如が見られることは、亜硝酸塩溶液でインキュベートしたｄＣ標準からの最初のトレースで確認できる。（Ｃ）Ｎ４−アジドｄＣは、還元剤で処理することにより容易にｄＣに変換される。その場合、ＴＣＥＰとのインキュベーションにより、Ｎ４−アジドｄＣからｄＣへの定量的な変換が行われる。
【００２１】
【図６】亜硝酸ナトリウム（700ｍＭ）、酢酸ナトリウム、ｐＨ5.5（1Ｍ）の存在下で、室温でのＮ４アセチル−２’−デオキシシチジン（Ｎ４−アセチルｄＣ）の脱アミノ化量であり、Synergi Polar RPカラムを備えたBruker amaZonシステムで行ったＬＣ−ＭＳで分析した。溶媒は、Ａ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6）及びＢ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6［5％］／アセトニトリル［95％］）であった。Ａのグラジエント勾配Ｂ5-25％で、10分かけて0.4ｍＬ／分で実行した。（Ａ）主要ピークの質量を有する最初の化合物を表すトレースにより、約2.1分の化合物はＮ４−アセチルｄＣとして同定される。（Ｂ）上記のように亜硝酸塩溶液でインキュベートしたＮ４−アセチルｄＣの経時変化である。データを、260ｎｍでの一連のＬＣクロマトグラムとして表示する。亜硝酸塩溶液でインキュベートしたｄＣ標準（図４参照）と比較して、ｄＣ（還元生成物）またはｄＵ（脱アミノ化生成物）に対応するピークの顕著な減少がある。（Ｃ）Ｎ４−アセチルｄＣは、容易にｄＣに変換される。そのような変換方法の１つには、40％メチルアミン水溶液での処理があり、（Ｄ）質量結果で確認されるように、2.1分のＮ４−アセチルｄＣピークの消滅と、1.05分のｄＣピークの出現をもたらすことから確認できる。
【００２２】
【図７】亜硝酸ナトリウム（700ｍＭ）、酢酸ナトリウム、ｐＨ5.5（1Ｍ）の存在下で、室温でのＮ６−アセチルアデノシン（Ｎ６−アセチルＡ）の脱アミノ化量であり、Synergi Polar RPカラムを備えたBruker amaZonシステムで行ったＬＣ−ＭＳで分析した。溶媒は、Ａ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6）及びＢ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6［5％］／アセトニトリル［95％］）であった。Ａのグラジエント勾配Ｂ5-25％で、10分かけて0.4ｍＬ／分で実行した。（Ａ）主要ピークの質量を有する最初の化合物を表すトレースにより、約1.8分の化合物はＮ６−アセチルＡとして同定される。（Ｂ）上記のように亜硝酸塩溶液でインキュベートしたＮ６−アセチルＡの経時変化である。データを、260ｎｍでの一連のＬＣクロマトグラムとして表示する。少量の脱アセチル化が48時間後に観察されたが、脱アミノ化生成物は全く検出されなかった。（Ｃ）Ｎ６−アセチルＡは、容易にｄＣに変換される。そのような方法の１つには、４０％メチルアミン水溶液での処理があり、その結果1.8分のＮ６−アセチルＡピークの消滅と、1.9分のＡピークの出現が見られ、アセチル化された化合物（310.50抽出）及び脱アセチル化された化合物（268.00抽出）に対応する抽出物の質量トレースで確認される。（Ｄ）Ｎ６−アセチルＡを脱アセチル化する別の方法には、炭酸カリウムを使用する方法がある。その場合、室温で50ｍＭ炭酸カリウム水溶液で処理すると、脱アセチル化された化合物が生じ、この場合も同様に310.50ピークの消失と268.00ピークの出現で証明される。
【００２３】
【図８】亜硝酸ナトリウム（700ｍＭ）、酢酸ナトリウム、ｐＨ5.5（1Ｍ）の存在下で、室温でのＮ６−ベンジル−２’−デオキシアデノシン（Ｎ６−ベンジルｄＡ；1ｍＭ）の脱アミノ化量であり、Synergi Polar RPカラムを備えたBruker amaZonシステムで行ったＬＣ−ＭＳで分析した。溶媒は、Ａ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6）及びＢ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6［5％］／アセトニトリル［95％］）であった。Ａのグラジエント勾配Ｂ5-25％で10分かけ、次に５分保持、を0.4ｍＬ／分で実行した。（Ａ）主要ピークの質量を有する最初の化合物を表すトレースにより、約10.8分の化合物はＮ６−ベンジルｄＡとして同定される。（Ｂ）上記のように亜硝酸塩溶液でインキュベートしたＮ６−ベンジルｄＣの経時変化である。データを、260ｎｍでの一連のＬＣクロマトグラムとして表示する。ｄＡ（脱ベンジル化生成物）またはデオキシイノシン（ｄＩ；脱アミノ化生成物）に対応するピークが、顕著に欠如している。
【００２４】
【図９】亜硝酸ナトリウム（700ｍＭ）、酢酸ナトリウム、ｐＨ5.5（1Ｍ）の存在下で、室温でのＮ４−アニソイル−２’−デオキシシチジン（Ｎ４−アニソイルｄＣ）の脱アミノ化量であり、Synergi Polar RPカラムを備えたBruker amaZonシステムで行ったＬＣ−ＭＳで分析した。溶媒は、Ａ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6）及びＢ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6［5％］／アセトニトリル［95％］）であった。Ａのグラジエント勾配Ｂ5-25％で、10分かけて0.4ｍＬ／分で実行した。（Ａ）主要ピークの質量を有する最初の化合物を表すトレースにより、約9.8分の化合物はＮ４−アニソイルｄＣとして同定される。（Ｂ）上記のように亜硝酸塩溶液でインキュベートしたＮ４−アニソイルｄＣの経時変化である。データを、260ｎｍでの一連のＬＣクロマトグラムとして表示する。亜硝酸塩溶液でインキュベートしたｄＣ標準と比較すると（図４参照）、ｄＣ（還元生成物）またはｄＵ（脱アミノ化生成物）に対応するピークが、顕著に減少している。（Ｃ）Ｎ４−アニソイルｄＣは、容易にｄＣに変換される。そのような方法の１つには、40％メチルアミン水溶液での処理があり、その結果約9.8分のＮ４−アニソイルｄＣピークの消滅と、1.05分のｄＣピークの出現が見られ、抽出物の質量トレースで確認される。（Ｄ）Ｎ４−アニソイルｄＣをｄＣへ脱アシル化する別の方法として、炭酸カリウムを使用する処理がある。その場合、室温で50ｍＭ炭酸カリウム水溶液で処理すると、脱アシル化された化合物ｄＣが生じる。
【００２５】
【図１０】亜硝酸ナトリウム（700ｍＭ）、酢酸ナトリウム、ｐＨ5.5（1Ｍ）の存在下で、室温でのＮ６−ジメチルアリルアミノプリンの脱アミノ化量であり、Synergi Polar RPカラムを備えたBruker amaZonシステムで行ったＬＣ−ＭＳで分析した。溶媒は、Ａ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6）及びＢ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6［5％］／アセトニトリル［95％］）であった。Ａのグラジエント勾配Ｂ5-25％で、10分かけて0.4ｍＬ／分で実行した。上記のように亜硝酸塩溶液でインキュベートしたＮ６−ジメチルアリルアミノプリンの経時変化を示す。データを、260ｎｍでの一連のＬＣクロマトグラムとして表示する。ｄＡまたはｄＩに対応するピークの顕著な欠如が見られる。
【００２６】
【図１１】アミン保護部分を有するヌクレオシド５’−三リン酸の酵素的取り込みを示す。設計されたターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを、塩化コバルト及び、５’−フルオロフォアを有するＤＮＡプライマー、並びに下記ヌクレオシド５’−三リン酸を含む適切なバッファ中で、37℃で10分間インキュベートした。（Ａ）レーン１：伸長制御なし；レーン２：Ｎ６−ベンジル−ｄＡＴＰ；レーン３：Ｎ６−ベンジル−ｒＡＴＰ；レーン４：Ｎ６−メチル−ｄＡＴＰ；レーン５：Ｎ６−メチル−ｒＡＴＰ（Ｂ）レーン１：伸長制御なし。レーン２：３’−Ｏ−アセチル−Ｎ４−ベンゾイル−ｄＣＴＰ（Ｃ）レーン１：伸長制御なし。レーン３：Ｎ６−ベンゾイル−ｄＡＴＰ；レーン４：Ｎ４−ベンゾイル−ｄＣＴＰ。  反応は、標準的な変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＴＢＥバッファ）で分析し、蛍光スキャナーで画像化した。
【００２７】
【図１２】亜硝酸ナトリウム（700ｍＭ）、酢酸ナトリウム、ｐＨ5.5（1Ｍ）の存在下で、室温での３’−アジド−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン（1ｍＭ）の脱アミノ化量であり、Synergi Polar RPカラムを備えたBruker amaZonシステムで行ったＬＣ−ＭＳで分析した。溶媒は、Ａ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6）及びＢ（20ｍＭ酢酸アンモニウム、ｐＨ4.6［5％］／アセトニトリル［95％］）であった。Ａのグラジエント勾配Ｂ5-25％で10分かけ、次に5分保持、を0.4ｍＬ／分で実行した。（Ａ）主要ピークの質量を有する最初の化合物を表すトレースにより、約12.5分の化合物は３’−アジド−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシシチジンとして同定される。（Ｂ）上記のとおり亜硝酸塩溶液でインキュベートした３’−アジド−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシシチジンの経時変化である。データを、260ｎｍでの一連のＬＣクロマトグラムとして表示する。ｄＣ（脱アシル化生成物）またはデオキシイノシン（脱アミノ化生成物）に対応するピークは、顕著に欠如しているが、一番下のｄＣの亜硝酸塩とのインキュベーションを示すトレース内では確認できる。（Ｃ）３’−アジド−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシシチジンを炭酸カリウムで処理することにより、３’−アジドｄＣが得られる。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
（発明の詳細な説明）
本発明の第１の態様によれば、アデニン、グアニン、シトシン、イソグアニン、イソシトシン及び２，６−ジアミノプリンなどのアミンが保護された含窒素複素環の誘導体の、酵素的核酸合成法における使用が提供される。
【００２９】
本発明の更なる態様によれば例えば、アデノシン、グアノシン及びシチジンなどのアミンが保護された含窒素複素環の誘導体の、酵素的核酸合成法における使用が提供される。
【００３０】
本明細書中での「アデノシン、グアノシン及びシチジンの誘導体」はそれらのデオキシ誘導体（即ち、デオキシアデノシン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジン）並びにそれらのリン酸誘導体（即ち、アデノシン一リン酸、アデノシン二リン酸、アデノシン三リン酸、グアノシン一リン酸、グアノシン二リン酸、グアノシン三リン酸、シチジン一リン酸、シチジン二リン酸、シチジン三リン酸及びそれらの全てのデオキシリボース体）に関する。
【００３１】
本発明の更なる態様によれば、式（Ｉ）の化合物の、
【化８】
2021503003.tif 000009
（式中、
Ｒ１は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、または−Ｏ−アルコキシを含む、脱保護されてヒドロキシル基を生じることのできる部分を表し、
Ｒ２は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、もしくは−Ｏ−アルコキシまたは任意の他の分子部分を表し、
Ｘは、−ＯＨ基または１以上のリン酸基、チオリン酸基、ボラノリン酸基もしくはイミドリン酸基、またはそれらの任意の組み合わせを表し、該基は酵素的付加能を付与する能力があり、
Ｒ３はアミン保護基を表し、該アミノ基は相補性塩基との水素結合塩基対に関与しており、該アミノ基の脱アミノ化は相補性塩基との水素結合の変更を生じることができ、かつ
Ｂは含窒素複素環を表す。）
酵素的核酸合成法における使用が提供される。
【００３２】
本発明の更なる態様によれば例えば、式（Ｉ）の化合物の、
【化９】
2021503003.tif 000010
（式中、
Ｒ１及びＲ２は独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルコキシ、シアノエチル、チオールまたは適切なヒドロキシ保護基を表し、
Ｘは、−ＯＨ基または１以上のリン酸基、チオリン酸基、ボラノリン酸基もしくはイミドリン酸基、またはそれらの任意の組み合わせを表し、
Ｒ３はアミン保護基を表し、該アミノ基は相補性塩基との水素結合塩基対に関与しており、
Ｂは含窒素複素環を表す。）
酵素的核酸合成法における使用が提供される。
【００３３】
前記酵素的核酸合成は、鋳型の存在下または非存在下での酵素的触媒作用によりヌクレオチドが核酸鎖へ付加されるプロセスすべてを言う。例えば、ある酵素的核酸合成法には、ターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼなどのＰｏｌＸファミリーポリメラーゼ、及び可逆的に停止された２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸またはリボヌクレオシド５’−三リン酸を使用する、鋳型非依存性デノボ核酸合成が含まれる。別の酵素的核酸合成法には、合成による配列決定法（ＳＢＳ）などの鋳型依存性核酸合成が含まれる。可逆的に停止された酵素的核酸合成とは、鋳型の存在下または非存在下での酵素的触媒作用により、可逆的に停止されたヌクレオチドが核酸鎖へ付加されるプロセスすべてを言う。可逆的に停止されたヌクレオチドとは、次に続くヌクレオチド付加をブロックする化学的部分を含有するヌクレオチドである。化学薬品で、電磁放射で、電流で、及び／または熱で、ヌクレオチド上の可逆的に停止する化学的部分を脱保護または除去すると、次に続くヌクレオチド付加が酵素的触媒作用により行われる。このように、本発明の一実施態様では、酵素的核酸合成法は、可逆的に停止された酵素的核酸合成法、並びに鋳型依存性及び鋳型非依存性デノボ酵素的核酸合成法から選択される。
【００３４】
式（Ｉ）の化合物は３種の相乗的な構成要素を含み、それは下記の通りにまとめることができる。
（ｉ）Ｒ３基。Ｒ３は通常、含窒素複素環上にあり、脱保護されてアミノ（−ＮＨ２）基を生じる化学的部分である。
（ｉｉ）Ｒ１基。Ｒ１は通常、糖の３’位にあり、脱保護されてヒドロキシル（−ＯＨ）基を生じる化学的部分である。そして、
（ｉｉｉ）Ｘ基。Ｘは通常、酵素的付加能力を付与する化学的部分（例えば、５’−三リン酸基）である。
【００３５】
理論によって本発明を限定するものではないが、Ｒ１、Ｒ３及びＸの組み合わせは、本明細書中に記載の酵素的核酸合成法が行われる間、構成要素（ｉ）中のアミノ基を変異から保護するヌクレオチド類似体を生じると考えられる。特に、前記酵素的核酸合成法は、Ｒ１が-ＯＮＨ２基で固定される、特徴的なＲ３、Ｘ及びＲ１を有するヌクレオチド類似体を含むこともできる。
【００３６】
一実施態様では、Ｒ１及びＲ２は独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、もしくは−Ｏ−アルコキシまたは適切なヒドロキシ保護基を表す。
【００３７】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は下記から選ばれる：
【化１０】
2021503003.tif 000011
（式中、Ｒ２は、−ＯＨまたは−Ｈなどの、本明細書で特定されたものである。）。
一実施態様では、Ｒ２はＨである。
【００３８】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ）ｂの化合物である：
【化１１】
2021503003.tif 000012
。
【００３９】
式（Ｉ）ｂの化合物は、化学的にはＮ６−アジド−２’−デオキシアデノシンとして知られる。式（Ｉ）ｂの化合物を亜硝酸ナトリウムへ暴露しても、図２に示されるような２’−デオキシイノシンへの変換は観察されない。好都合なことに、ＴＣＥＰまたは別の還元剤に曝露すると、図３に示される通り、式（Ｉ）ｂの化合物は容易に２’−デオキシアデノシンへ変換される。
【００４０】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ）ｃの化合物である：
【化１２】
2021503003.tif 000013
。
【００４１】
式（Ｉ）ｃの化合物は、化学的にはＮ４−アジド−２’−デオキシシチジンとして知られる。式（Ｉ）ｃの化合物を亜硝酸ナトリウムへ暴露しても、図４に示されるような２’−デオキシウラシルへの変換は観察されない。好都合なことに、ＴＣＥＰまたは別の還元剤に曝露すると図５に示される通り、式（Ｉ）ｃの化合物は容易に２’−デオキシシチジンへ変換される。このように、本発明は、酸性条件での亜硝酸ナトリウムなどの試薬存在下で、アデニン、グアニン及びシトシンが酸化的脱アミノ化する問題を解決する利点を提供する。
【００４２】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ）ｄの化合物である：
【化１３】
2021503003.tif 000014
。
【００４３】
式（Ｉ）ｄの化合物は、化学的にはＮ６−アセチル−２’−デオキシアデノシンとして知られる。式（Ｉ）ｄの化合物を亜硝酸ナトリウムへ暴露しても、図７に示される通り、２’−デオキシイノシンへの変換は観察されない。好都合なことに、メチルアミンの４０％水溶液、炭酸カリウム、水酸化アンモニウム、もしくはアンモニア（例えば、エタノール溶液）、または他の適切な試薬に曝露すると図７に示される通り、式（Ｉ）ｄの化合物は容易に２’−デオキシアデノシンへ変換される。
【００４４】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ）ｅの化合物である：
【化１４】
2021503003.tif 000015
。
【００４５】
式（Ｉ）ｅの化合物は、化学的にはＮ４−アセチル−２’−デオキシシチジンとして知られる。式（Ｉ）ｅの化合物を亜硝酸ナトリウムへ暴露しても、図６に示される通り、２’−デオキシウラシルへの変換は観察されない。好都合なことに、メチルアミンまたは他の塩基に曝露すると図６に示される通り、式（Ｉ）ｅの化合物は容易に２’−デオキシシチジンへ変換される。このように、本発明は、酸性条件での亜硝酸ナトリウムなどの試薬存在下で、アデニン、グアニン及びシトシンが酸化的脱アミノ化する問題を解決する利点を提供する。
【００４６】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ）ｆの化合物である：
【化１５】
2021503003.tif 000016
。
【００４７】
式（Ｉ）ｆの化合物は、化学的にはＮ６−ベンジル−２’−デオキシアデノシンとして知られる。式（Ｉ）ｆの化合物を亜硝酸ナトリウムへ暴露しても、図８に示される通り、２’−デオキシイノシンへの変換は観察されない。好都合なことに、適切な触媒（パラジウムまたはニッケルなど）の存在下で水素処理すると、式（Ｉ）ｆの化合物は容易に２’−デオキシアデノシンへ変換される。図１１に示される通り、化学種（Ｉ）ｆの三リン酸体は、ＤＮＡ合成プロセス中ではターミナルトランスフェラーゼ酵素の基質として働くことができる。このように、本発明は、酸化的脱アミノ化問題を解決するとともに、酵素的ＤＮＡ合成法での用途を提供するものである。
【００４８】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ）ｇの化合物である：
【化１６】
2021503003.tif 000017
。
【００４９】
式（Ｉ）ｇの化合物は、化学的にはＮ４−アニソイル−２’−デオキシシチジンとして知られる。式（Ｉ）ｇの化合物を亜硝酸ナトリウムへ暴露しても、図９に示される通り、２’−デオキシイノシンへの変換は観察されない。好都合なことに、メチルアミンもしくは炭酸カリウム、または別の適切な塩基もしくは試薬で処理すると、図９に示される通り、式（Ｉ）ｇの化合物は容易に２’−デオキシシチジンへ変換される。Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン及びＮ６−ベンゾイル−２’−デオキシアデノシンで見られたように、ベンゾイル部分のためにも同じ化学物質が適切である。
【００５０】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ）ｈの化合物である：
【化１７】
2021503003.tif 000018
。
【００５１】
式（Ｉ）ｈの化合物は、化学的にはＮ４−メチル−２’−デオキシシチジンとして知られる。本明細書で示されるように、二級アミンは亜硝酸塩溶液で引き起こされる酸化的脱アミノ化から保護される。従って、Ｎ−メチルは適切な保護基である。環外のＮ−メチルは、ＡｌｋＢなどの脱メチル化酵素（D.Liらの文献,Chem.Res.Toxicol.26(2013)1182-1187参照）で処理することにより、好適に除去できる。
【００５２】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ）ｉの化合物である：
【化１８】
2021503003.tif 000019
。
【００５３】
式（Ｉ）ｉの化合物は、化学的にはＮ６−メチル−２’−デオキシアデノシンとして知られる。本明細書で示されるように、二級アミンは亜硝酸塩溶液で引き起こされる酸化的脱アミノ化から保護される。従って、Ｎ−メチルは適切な保護基である。環外のＮ−メチルは、ＡｌｋＢなどの脱メチル化酵素（D.Liらの文献,Chem.Res.Toxicol.26(2013)1182-1187参照）で処理することにより、好適に除去できる。化学種（Ｉ）ｉの三リン酸体は、図１１に示される通り、ＤＮＡ合成プロセス中ではターミナルトランスフェラーゼ酵素の基質として働くことができる。このように、本発明は、酸化的脱アミノ化問題を解決するとともに、酵素的ＤＮＡ合成法での用途を提供するものである。
【００５４】
一実施態様では、式（Ｉ）の化合物は式（Ｉ）ｊの化合物である：
【化１９】
2021503003.tif 000020
。
【００５５】
式（Ｉ）ｊの化合物は、化学的には３’−アジド−Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシシチジンとして知られる。式（Ｉ）ｊの化合物を亜硝酸ナトリウムへ暴露しても、図１２に示される通り、３’−アジド−２’−デオキシイノシンへの変換は観察されない。好都合なことに、メチルアミンもしくは炭酸カリウム、または別の適切な塩基もしくは試薬で処理すると、図１２に示される通り、式（Ｉ）ｊの化合物は容易に３’−アジド−２’−デオキシシチジンへ変換される。（Ｉ）ｊに非常に近い関係の化合物の三リン酸化学種、Ｎ４−ベンゾイル−２’−デオキシシチジン三リン酸は、図１１に示される通り、ＤＮＡ合成プロセス中ではターミナルトランスフェラーゼ酵素による基質であるとみなされる。このように、本発明は、酸化的脱アミノ化問題を解決するとともに、酵素的ＤＮＡ合成法での用途を提供するものである。
【００５６】
一実施態様では、Ｘは−ＯＨ基を表す。一の代替的実施態様では、Ｘは、三リン酸基を表す。この実施態様の三リン酸基は、酵素的または化学的触媒作用により、核酸分子へ付加をするために、ヌクレオチジルトランスフェラーゼ（例えば、ポリメラーゼ）または任意の他の化学的部分と共に最も一般的に使用されている利点を有する。
【００５７】
本明細書中での「アミン」は−ＮＨ２基を示す。
【００５８】
本明細書中での「アミン保護基」は、相補性塩基との水素結合塩基対に関与しているアミン基を生成または「脱保護」できる全ての化学基を示す。最も一般的には、脱保護は、化学反応、最も好適には単純な、一段階の化学反応により起こる。一実施態様では、水素結合塩基対は、ワトソン−クリック型、フーグスティーン型、または代替的／拡張された遺伝子コードの塩基対から選ばれる。
【００５９】
Ｒ３のための適切なアミン保護基の例として、アジド（−Ｎ３）、ベンゾイルアミン（Ｎ−ベンゾイルまたは−ＮＨＣＯＰｈ）、Ｎ−メチル（−ＮＨＭｅ）、イソブチリルアミン、ジメチルホルムアミジルアミン、９−フルオレニルメチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート、ベンジルカルバメート、アセトアミド（Ｎ−アセチルまたは−ＮＨＣＯＭｅ）、トリフルオロアセトアミド、プスラミド（ｐｔｈｌａｍｉｄｅ）、ベンジルアミン（Ｎ−ベンジルまたは−ＮＨ−ＣＨ２−フェニル）、トリフェニルメチルアミン、ベンキシリデンアミン（ｂｅｎｘｙｌｉｄｅｎｅａｍｉｎｅ）、トシルアミド、イソチオシアネート、Ｎ−アリル（Ｎ−ジメチルアリル（−ＮＨＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）など）及びＮ−アニソイル（−ＮＨＣＯＰｈ−ＯＭｅ）、中でも例えばアジド（−Ｎ３）、Ｎ−アセチル（−ＮＨＣＯＭｅ）、Ｎ−ベンジル（−ＮＨ−ＣＨ２−フェニル）、Ｎ−アニソイル（−ＮＨＣＯＰｈ−ＯＭｅ）、Ｎ−メチル（−ＮＨＭｅ）、Ｎ−ベンゾイル（−ＮＨＣＯＰｈ）、Ｎ−ジメチルアリル（−ＮＨＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）が挙げられる。
【００６０】
一実施態様では、Ｂは、プリンもしくはピリミジン、またはそれらの誘導体から選ばれた含窒素複素環を表す。更なる実施態様では、Ｂ及びＲ３は組み合わされて下記分子構造をとり、その含窒素複素環は、式（Ｉ）の化合物の（デオキシ）リボース１’位へ結合されていてもよい：
【化２０】
2021503003.tif 000021
。
【００６１】
更なる実施態様では、Ｒ３はアジド基（−Ｎ３）を表し、Ｂは下記から選ばれる：
【化２１】
2021503003.tif 000022
。
【００６２】
本明細書中での用語「アジド（azideまたはazido）」は、−Ｎ３、詳細には−Ｎ＝Ｎ＋＝Ｎ−基を示す。アジドの範囲は、テトラゾリル部分が存在する場合まで広げることも好ましい。「アジド−テトラゾール」平衡は、Lakshmanらの文献(2010)J.Org.Chem.75,2461-2473により当業者に公知である。従って、本明細書のアジドに関する説明が本明細書で特定されるＲ３基へ適用される場合、下式で示されるように、テトラゾールの場合も同様に含まれる：
【化２２】
2021503003.tif 000023
。
【００６３】
この実施態様は、可逆的に-ＮＨ２基を保護する利点がある。-Ｎ３状態でブロック保護されている間、塩基（Ｂ）は脱アミノ化（例えば、亜硝酸ナトリウム存在下での脱アミノ化）されない。標準的なシトシン、アデニン、グアニンは、それぞれ４−アジドシトシン、６−アジドアデニン及び２−アジドグアニンを還元剤（例えば、ＴＣＥＰ）に曝露されることにより回収できる。従って、-Ｎ３基は、脱アミノ化、特に亜硝酸ナトリウム存在下での脱アミノ化に対する有効な保護基として働く。
【００６４】
本発明の化合物は、当業者に公知の酵素的核酸合成法へ容易に適用可能であり、非常に好ましい。本発明を限定するものではないが、核酸合成法は、例えばＷＯ2016/128731、ＷＯ2016/139477、ＷＯ2017/009663、ＧＢ1613185.6及びＧＢ1714827.1に記載されており、それらのそれぞれの内容は本明細書に資料として組み込まれる。
【００６５】
本発明の更なる態様によれば、式（Ｉ）ａの化合物
【化２３】
2021503003.tif 000024
（式中、
Ｒ１は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、または−Ｏ−アルコキシを含む、脱保護されてヒドロキシル基を生じることのできる部分を表し、
Ｒ２は、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、もしくは−Ｏ−アルコキシまたは任意の他の分子部分を表し、
Ｘは、１以上のリン酸基、チオリン酸基、ボラノリン酸基もしくはイミドリン酸基、またはそれらの組み合わせを表し、該基は酵素的付加能を付与する能力があり、
Ｒ３はアミン保護基を表し、該アミノ基は相補性塩基との水素結合塩基対に関与しており、該アミノ基の脱アミノ化は相補性塩基との水素結合の変更を生じることができ、
Ｂは含窒素複素環を表す。）
が提供される。
【００６６】
言及され得る本発明の更なる態様によれば例えば、式（Ｉ）ａの化合物
【化２４】
2021503003.tif 000025
（式中、
Ｒ１及びＲ２は独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルコキシ、シアノエチル、チオールまたは適切なヒドロキシ保護基を表し、
Ｘは、１以上のリン酸基、チオリン酸基、ボラノリン酸基もしくはイミドリン酸基、またはそれらの任意の組み合わせを表し、
Ｒ３はアミン保護基を表し、該アミノ基は相補性塩基との水素結合塩基対に関与しており、
Ｂは含窒素複素環を表す。）
が提供される。
【００６７】
一実施態様では、Ｘは三リン酸基を表す。
【００６８】
一実施態様では、Ｒ１及びＲ２は独立して−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、または−Ｏ−アルコキシを表す。
【００６９】
代替的実施態様では、Ｒ１及びＲ２は独立して、−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−Ｎ３、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、−Ｏ−アルコキシ、シアノエチル、チオール、または適切なヒドロキシ保護基を表す。
【００７０】
Ｒ３の適切なアミン保護基例として、アジド（−Ｎ３）、ベンゾイルアミン（Ｎ−ベンゾイルまたは−ＮＨＣＯＰｈ）、Ｎ−メチル（−ＮＨＭｅ）、イソブチリルアミン、ジメチルホルムアミジルアミン、９−フルオレニルメチルカルバメート、ｔ−ブチルカルバメート、ベンジルカルバメート、アセトアミド（Ｎ−アセチルまたは−ＮＨＣＯＭｅ）、トリフルオロアセトアミド、プスラミド、ベンジルアミン（Ｎ−ベンジルまたは−ＮＨ−ＣＨ２−フェニル）、トリフェニルメチルアミン、ベンキシリデンアミン、トシルアミド、イソチオシアネート、Ｎ−アリル（Ｎ−ジメチルアリル（−ＮＨＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）など）及びＮ−アニソイル（−ＮＨＣＯＰｈ−ＯＭｅ）、中でも例えばアジド（−Ｎ３）、Ｎ−アセチル（−ＮＨＣＯＭｅ）、Ｎ−ベンジル（−ＮＨ−ＣＨ２−フェニル）、Ｎ−アニソイル（−ＮＨＣＯＰｈ−ＯＭｅ）、Ｎ−メチル（−ＮＨＭｅ）、Ｎ−ベンゾイル（−ＮＨＣＯＰｈ）、Ｎ−ジメチルアリル（−ＮＨＣＨ２−ＣＨ＝ＣＨ２）が挙げられる。
【００７１】
一実施態様では、Ｂは、プリンまたはピリミジンから選ばれた含窒素複素環を表す。更なる実施態様では、Ｂ及びＲ３は組み合わされて下記分子構造をとり、その含窒素複素環は、式（Ｉ）の化合物の（デオキシ）リボース１’位へ結合されていてもよい：
【化２５】
2021503003.tif 000026
。
【００７２】
一実施態様では、Ｒ３はアジド基（−Ｎ３）を表し、Ｂは下記から選ばれる：
【化２６】
2021503003.tif 000027
。
【００７３】
言及され得る式（Ｉ）ａの特別な一種の化合物（１）は、Ｒ１は−ＯＮＨ２を表し、Ｒ２はＨを表し、Ｘは三リン酸基を表し、Ｂは下式で表され、
【化２７】
2021503003.tif 000028
Ｒ３はＮ３を表す化合物、即ち、式（１）の化合物である：
【化２８】
2021503003.tif 000029
。
【００７４】
式（１）の化合物は、下記合成スキームに従い調製できる：
【化２９】
2021503003.tif 000030
。
【００７５】
言及され得る式（Ｉ）ａの更なる特別な一種の化合物（２）は、Ｒ１は−ＯＮＨ２を表し、Ｒ２はＨを表し、Ｘは三リン酸基を表し、Ｂは下式で表され、
【化３０】
2021503003.tif 000031
Ｒ３はＮ３を表す化合物、即ち、式（２）の化合物である：
【化３１】
2021503003.tif 000032
。
【００７６】
式（２）の化合物は、下記合成スキームに従い調製できる：
【化３２】
2021503003.tif 000033
。
【００７７】
言及され得る式（Ｉ）ａの更なる特別な一種の化合物（３）は、Ｒ１は−ＯＮＨ２を表し、Ｒ２はＨを表し、Ｘは三リン酸基を表し、Ｂは下式で表され、
【化３３】
2021503003.tif 000034
Ｒ３はＮ３を表す化合物、即ち、式（３）の化合物である：
【化３４】
2021503003.tif 000035
。
【００７８】
式（３）の化合物は、下記合成スキームに従い調製できる：
【化３５】
2021503003.tif 000036
。
【００７９】
別の実施態様では、Ｒ３はアセチル（−Ａｃ）基を表し、Ｂは下記から選ばれる：
【化３６】
2021503003.tif 000037
。
【００８０】
別の実施態様では、Ｒ３はアニソイル基を表し、Ｂは下記から選ばれる：
【化３７】
2021503003.tif 000038
。
【００８１】
別の実施態様では、Ｒ３はベンジル基を表し、Ｂは下記から選ばれる：
【化３８】
2021503003.tif 000039
。
【００８２】
別の実施態様では、Ｒ３はベンジル（ｂｅｎｚｙｌ）基を表し、Ｂは下記から選ばれる：
【化３９】
2021503003.tif 000040
。
【００８３】
別の実施態様では、Ｒ３はメチル基を表し、Ｂは下記から選ばれる：
【化４０】
2021503003.tif 000041
。
【００８４】
別の実施態様では、Ｒ３はアリル基を表し、Ｂは下記から選ばれる：
【化４１】
2021503003.tif 000042
。
【００８５】
言及され得る式（Ｉ）ａの特別な化合物（４−２７）は、Ｒ１は−ＯＮＨ２を表し、Ｒ２はＨを表し、Ｘは、三リン酸基を表し、Ｂは上記記載の塩基を表す化合物であり、下記化合物を生じる：
【化４２】
2021503003.tif 000043
。
【００８６】
本発明の更なる態様によれば、式（Ｖ）の化合物の製造方法であって、
【化４３】
2021503003.tif 000044
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＢは、本明細書で特定されたとおりである）
式（Ｉ）の化合物を、
【化４４】
2021503003.tif 000045
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＢは、本明細書で特定されたとおりである）
化学薬品で、電磁放射で、熱で、及び／または電流で、反応させることを含む、当該製造方法が提供される。
【００８７】
本発明の更なる態様によれば、式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物の製造方法であって、
【化４５】
2021503003.tif 000046
（式中、Ｘ、Ｒ１及びＲ２は、本明細書で特定されたとおりである）
式（ＩＩ）ａ、（ＩＩＩ）ａまたは（ＩＶ）ａの化合物を、それぞれ、
【化４６】
2021503003.tif 000047
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２は、本明細書で特定されたとおりである）
化学薬品で、電磁放射で、及び／または電流で、反応させることを含む、当該製造方法が提供される。
【００８８】
本発明の更なる態様によれば、本明細書で特定された式（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物の製造方法であって、式（ＶＩ）の化合物を、
【化４７】
2021503003.tif 000048
（式中、Ｘ、Ｒ１、Ｒ２及びＢは、本明細書で特定されたとおりである）
還元剤と反応させることを含む、当該製造方法が提供される。
【００８９】
一実施態様では、還元剤は、β−メルカプトエタノール、ジチオスレイトール、または、トリス（ヒドロキシメチル）ホスフィン（ＴＨＰ）、トリス（ヒドロキシプロピル）ホスフィン（ＴＨＰＰ）及びトリス（２−カルボキシルエチル）ホスフィン（ＴＣＥＰ）などのホスフィン系還元剤から選ばれる。
【００９０】
本発明の更なる態様によれば、式（ＶＩＩ）の化合物
【化４８】
2021503003.tif 000049
（式中、
Ｒ２は−Ｈ、−ＯＨ、−ＯＮＨ２、−ＯＮＣ（ＣＨ３）２、−ＯＣＨ２Ｎ３、−ＯＣＨ２ＣＨＣＨ２、−ＯＰＯ３２−、−ＯＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ３、−ＯＣＯＣＨ３、−ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＮ、−Ｏ−メトキシエチル、−Ｏ−アルキル、もしくは−Ｏ−アルコキシまたは適切なヒドロキシ保護基を表し、
Ｘは、１以上のリン酸基、チオリン酸基、ボラノリン酸基もしくはイミドリン酸基、またはそれらの任意の組み合わせを表し、
Ｒ４は、Ｃ２−６アルキル、−Ｆ、−Ｃｌ、−Ｂｒ、−Ｉ、アルコキシ、ビオチン、アルキルアミンまたはアジドを表す。）
が提供される。
【００９１】
本発明の更なる態様によれば、式（ＶＩＩ）の化合物の、酵素的核酸合成法における使用が提供される。
【００９２】
一実施態様では、酵素的核酸合成は、可逆的に停止された酵素的核酸合成法、並びに鋳型依存性及び鋳型非依存性デノボ酵素的核酸合成法から選ばれる。
【００９３】
下記実施で本発明を例示する。
【実施例】
【００９４】
（実施例１：アジド保護された含窒素複素環を使用した酵素的ＤＮＡ合成）
下記ＤＮＡ合成法では、設計されたターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、３’−Ｏ−アミノキシで可逆的に停止された２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸をＤＮＡ鎖の３’末端に付加する。この付加工程は、目的の配列が合成されるまで繰り返される。３’−Ｏ−アミノキシ部分は、可逆的な停止効果を得るために、それぞれの付加サイクル後に（例えば、酸性亜硝酸ナトリウムで）脱アミノ化されなくてはならない。それぞれの付加サイクル後の脱アミノ化工程はまた、アミンを含む含窒素複素環（例えば、アデニン、シトシン、およびグアニン）の、変異原性脱アミノ化を生じる。
【００９５】
従って、本実施例では、含窒素複素環上のアミノ部分は、酸化的脱アミノ化（図１−４）を防ぐためにアジド基で保護される。例えば、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ４−アジドシチジン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ６−アジドアデニン−５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ２−アジドグアノシン−５’−三リン酸及び２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−５−エチルウリジン−５’−三リン酸の１種またはそれらの組み合わせが、設計されたＴｄＴ及び必要なバッファ成分の存在下で、それぞれの付加サイクルの間、ヌクレオチド形成ブロックとして使用される。
【００９６】
このようにして、アミン保護された含窒素複素環（例えば、Ｎ４−アジドシトシン、Ｎ６−アジドアデニン、Ｎ２−アジドグアニン）を備えたＤＮＡポリマーが合成される。全てのアミン保護された含窒素複素環が、還元剤（例えば、ＴＣＥＰ）へ暴露されると脱保護され、アミノ基が現れる。すると、ＤＮＡポリマーは、脱保護されたアミノ基を有する含窒素複素環（例えば、Ｎ４−アジドシトシンが脱保護されてシトシンとなり、Ｎ６−アジドアデニンが脱保護されてアデニンとなり、Ｎ２−アジドグアニンが脱保護されてグアニンとなる）から構成される。このＤＮＡポリマーは、下流に位置する分子生物学の応用のために使用できる。
【００９７】
（実施例２：Ｎ−アセチル保護された含窒素複素環を使用した酵素的ＤＮＡ合成）
下記ＤＮＡ合成法では、設計されたターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、３’−Ｏ−アミノキシで可逆的に停止された２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸をＤＮＡ鎖の３’末端に付加する。この付加工程は、目的の配列が合成されるまで繰り返される。３’−Ｏ−アミノキシ部分は、可逆的な停止効果を得るために、それぞれの付加サイクル後に（例えば、酸性亜硝酸ナトリウムで）脱アミノ化されなくてはならない。それぞれの付加サイクル後の脱アミノ化工程はまた、アミンを含む含窒素複素環（例えば、アデニン、シトシン、およびグアニン）の、変異原性脱アミノ化を生じる。
【００９８】
従って、本実施例では、含窒素複素環上のアミノ部分は、酸化的脱アミノ化を防ぐためにアセチル基で保護される（図６及び７）。例えば、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ４−アセチルシチジン５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ６−アセチルアデニン５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ２−アセチルグアノシン５’−三リン酸及び２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−５−エチルウリジン５’−三リン酸の１種またはそれらの組み合わせが、設計されたＴｄＴ及び必要なバッファ成分の存在下で、それぞれの付加サイクルの間、ヌクレオチド形成ブロックとして使用される。
【００９９】
このようにして、アミン保護された含窒素複素環（例えば、Ｎ４−アセチルシトシン、Ｎ６−アセチルアデニン、Ｎ２−アセチルグアニン）を備えたＤＮＡポリマーが合成される。全てのアミン保護された含窒素複素環が、塩基（例えば、炭酸カリウム）へ暴露されると脱アセチル化されて脱保護され、図６及び７に示される通り、アミノ基が現れる。すると、ＤＮＡポリマーは、脱保護されたアミノ基を備えた含窒素複素環（例えば、Ｎ４−アセチルシトシンは脱保護されてシトシンとなり、Ｎ６−アセチルアデニンは脱保護されてアデニンとなり、Ｎ２−アセチルグアニンは脱保護されてグアニンとなる）から構成される。このＤＮＡポリマーは、下流に位置する分子生物学の応用のために使用できる。
【０１００】
（実施例３：Ｎ−ベンゾイル−及びＮ−アニソイル保護された含窒素複素環を使用した酵素的ＤＮＡ合成）
下記ＤＮＡ合成法では、設計されたターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、３’−Ｏ−アミノキシで可逆的に停止された２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸をＤＮＡ鎖の３’末端に付加する。この付加工程は、目的の配列が合成されるまで繰り返される。３’−Ｏ−アミノキシ部分は、可逆的な停止効果を得るために、それぞれの付加サイクル後に（例えば、酸性亜硝酸ナトリウムで）脱アミノ化されなくてはならない。それぞれの付加サイクル後の脱アミノ化工程はまた、アミンを含む含窒素複素環（例えば、アデニン、シトシン、およびグアニン）の、変異原性脱アミノ化を生じる。
【０１０１】
従って、本実施例では、含窒素複素環上のアミノ部分は、酸化的脱アミノ化を防ぐためにベンゾイル基で保護される（図９及び１２）。例えば、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ４−ベンゾイルシチジン５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ６−ベンゾイルアデニン５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ２−ベンゾイルグアノシン５’−三リン酸及び２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−５−エチルウリジン５’−三リン酸の１種またはそれらの組み合わせが、設計されたＴｄＴ及び必要なバッファ成分の存在下で、それぞれの付加サイクルの間、ヌクレオチド形成ブロックとして使用される。
【０１０２】
このようにして、アミン保護された含窒素複素環（例えば、Ｎ４−ベンゾイルシトシン、Ｎ６−ベンゾイルアデニン、Ｎ２−ベンゾイルグアニン）を備えたＤＮＡポリマーが合成される。全てのアミン保護された含窒素複素環が、塩基（例えば、メチルアミン）へ暴露されると脱ベンゾイル化されて脱保護され、図９及び１２に示される通り、アミノ基が現れる。すると、ＤＮＡポリマーは、脱保護されたアミノ基を備えた含窒素複素環（例えば、Ｎ４−アセトリ（ａｃｅｔｌｙ）シトシンは脱保護されてシトシンとなり、Ｎ６−ベンゾイルアデニンは脱保護されてアデニンとなり、Ｎ２−ベンゾイルグアニンは脱保護されてグアニンとなる）から構成される。このＤＮＡポリマーは、下流に位置する分子生物学の応用のために使用できる。
【０１０３】
（実施例４：Ｎ−ベンジル保護された含窒素複素環を使用した酵素的ＤＮＡ合成）
下記ＤＮＡ合成法では、設計されたターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、３’−Ｏ−アミノキシで可逆的に停止された２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸をＤＮＡ鎖の３’末端に付加する。この付加工程は、目的の配列が合成されるまで繰り返される。３’−Ｏ−アミノキシ部分は、可逆的な停止効果を得るために、それぞれの付加サイクル後に（例えば、酸性亜硝酸ナトリウムで）脱アミノ化されなくてはならない。それぞれの付加サイクル後の脱アミノ化工程はまた、アミンを含む含窒素複素環（例えば、アデニン、シトシン、およびグアニン）の、変異原性脱アミノ化を生じる。
【０１０４】
従って、本実施例では、含窒素複素環上のアミノ部分は、酸化的脱アミノ化を防ぐためにベンジル基で保護される（図８）。例えば、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ４−ベンジルシチジン５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ６−ベンジルアデニン５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ２−ベンジルグアノシン５’−三リン酸及び２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−５−エチルウリジン５’−三リン酸の１種またはそれらの組み合わせが、設計されたＴｄＴ及び必要なバッファ成分の存在下で、それぞれの付加サイクルの間、ヌクレオチド形成ブロックとして使用される。
【０１０５】
このようにして、アミン保護された含窒素複素環（例えば、Ｎ４−ベンジルシトシン、Ｎ６−ベンジルアデニン、Ｎ２−ベンジルグアニン）を備えたＤＮＡポリマーが合成される。全てのアミン保護された含窒素複素環が、水素化分解（例えば、Ｐｄ−Ｃ）またはＤＭＳＯ中でｔｅｒｔ−ブトキシド及びＯ２処理されると、脱ベンジル化されて脱保護され、アミノ基が現れる。すると、ＤＮＡポリマーは、脱保護されたアミノ基を備えた含窒素複素環（例えば、Ｎ４−アセトリ（ａｃｅｔｌｙ）シトシンは脱保護されてシトシンとなり、Ｎ６−ベンジルアデニンは脱保護されてアデニンとなり、Ｎ２−ベンジルグアニンは脱保護されてグアニンとなる）から構成される。このＤＮＡポリマーは、下流に位置する分子生物学の応用のために使用できる。
【０１０６】
（実施例５：Ｎ−メチル保護された含窒素複素環を使用した酵素的ＤＮＡ合成）
下記ＤＮＡ合成法では、設計されたターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、３’−Ｏ−アミノキシで可逆的に停止された２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸をＤＮＡ鎖の３’末端に付加する。この付加工程は、目的の配列が合成されるまで繰り返される。３’−Ｏ−アミノキシ部分は、可逆的な停止効果を得るために、それぞれの付加サイクル後に（例えば、酸性亜硝酸ナトリウムで）脱アミノ化されなくてはならない。それぞれの付加サイクル後の脱アミノ化工程はまた、アミンを含む含窒素複素環（例えば、アデニン、シトシン、およびグアニン）の、変異原性脱アミノ化を生じる。
【０１０７】
従って、この実施例では、含窒素複素環上のアミノ部分は、メチル基で保護される。例えば、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ４−メチルシチジン５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ６−メチルアデニン５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ２−メチルグアノシン５’−三リン酸及び２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−５−エチルウリジン５’−三リン酸の１種またはそれらの組み合わせが、設計されたＴｄＴ及び必要なバッファ成分の存在下で、それぞれの付加サイクルの間、ヌクレオチド形成ブロックとして使用される。
【０１０８】
このようにして、アミン保護された含窒素複素環（例えば、Ｎ４−メチルシトシン、Ｎ６−メチルアデニン、Ｎ２−メチルグアニン）を備えたＤＮＡポリマーが合成される。全てのアミン保護された含窒素複素環が、脱メチル化酵素へ暴露されると脱メチル化されて脱保護され、アミノ基が現れる。アミン保護されたＤＮＡポリマーは、例えば、ＤＮＡ修復酵素ＡｌｋＢなどの、公知の脱メチル化酵素の混合物または単一の脱メチル化酵素で処理できる。すると、ＤＮＡポリマーは、脱保護されたアミノ基を備えた含窒素複素環（例えば、Ｎ４−アセトリ（ａｃｅｔｌｙ）シトシンは脱保護されてシトシンとなり、Ｎ６−メチルアデニンは脱保護されてアデニンとなり、Ｎ２−メチルグアニンは脱保護されてグアニンとなる）から構成される。このＤＮＡポリマーは、下流に位置する分子生物学の応用のために使用できる。
【０１０９】
（実施例６：Ｎ−アリル保護された含窒素複素環を使用した酵素的ＤＮＡ合成）
下記ＤＮＡ合成法では、設計されたターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼを使用して、３’−Ｏ−アミノキシで可逆的に停止された２’−デオキシヌクレオシド５’−三リン酸をＤＮＡ鎖の３’末端に付加する。この付加工程は、目的の配列が合成されるまで繰り返される。３’−Ｏ−アミノキシ部分は、可逆的な停止効果を得るために、それぞれの付加サイクル後に（例えば、酸性亜硝酸ナトリウムで）脱アミノ化されなくてはならない。それぞれの付加サイクル後の脱アミノ化工程はまた、アミンを含む含窒素複素環（例えば、アデニン、シトシン、およびグアニン）の、変異原性脱アミノ化を生じる。
【０１１０】
従って、本実施例では、含窒素複素環上のアミノ部分は、酸化的脱アミノ化を防ぐためにアリル基で保護される（図１０）。例えば、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ４−アリルシチジン５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ６−アリルアデニン５’−三リン酸、２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−Ｎ２−アリルグアノシン５’−三リン酸及び２’−デオキシ−３’−Ｏ−アミノキシ−５−エチルウリジン５’−三リン酸の１種またはそれらの組み合わせが、設計されたＴｄＴ及び必要なバッファ成分の存在下で、それぞれの付加サイクルの間、ヌクレオチド形成ブロックとして使用される。
【０１１１】
このようにして、アミン保護された含窒素複素環（例えば、Ｎ４−アリルシトシン、Ｎ６−アリルアデニン、Ｎ２−アリルグアニン）を備えたＤＮＡポリマーが合成される。全てのアミン保護された含窒素複素環が、テトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム処理されて、脱アリル化されて脱保護され、アミノ基が現れる。すると、ＤＮＡポリマーは、脱保護されたアミノ基を備えた含窒素複素環（例えば、Ｎ４−アセトリ（ａｃｅｔｌｙ）シトシンは脱保護されてシトシンとなり、Ｎ６−アリルアデニンは脱保護されてアデニンとなり、Ｎ２−アリルグアニンは脱保護されてグアニンとなる）から構成される。このＤＮＡポリマーは、下流に位置する分子生物学の応用のために使用できる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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