(57)【要約】  測定を実行するための方法は、重なり合わない多数の期間を含む測定時間にわたり容器とカバーとの間で相対的移動をもたらす段階を含む。容器とカバーとの間の距離は、各期間の少なくとも一部にわたって第1軸に沿って変化する。測定を実行するための装置は、支持体および支持体内に一組のウェルを含む容器と、カバーとを含む。カバーは：(1)容器に係合するよう構成されたデバイスと、(2)容器とカバーとの間に相対的移動をもたらすよう構成された制御サブシステムと、(3)測定サブシステムとを含む。
2021536572.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
容器内の流体の分子レベルを測定すると共に、流体(174)内に浸漬された生物学的試料(172)を保持するための一組のウェル(122)を備えた容器(120)の上方にカバー(110、130)の一部として取り付けるよう構成されたデバイス(110)を含む装置であって：
前記流体に浸漬されたプローブ(160)から光学信号を取得するよう配置された複数の光電子センサーであって、前記光学信号が、前記プローブのセンサー(162)における前記流体の分子レベルを表す複数の光電子センサーと；
前記デバイスと前記容器との相対位置を調節するよう構成可能な一組のアクチュエータと；
前記デバイスと前記容器との前記相対位置を変化させると共に、複数の相対位置で前記光学信号を取得するために前記一組のアクチュエータを制御する制御回路とを含む、装置。
【請求項２】
前記デバイス(110)は複数のアクチュエータを含み、前記複数のアクチュエータは、前記容器の前記一組のウェルによって画定される平面に対する前記プローブの前記センサーによって画定される平面の配向を制御するために、前記制御回路によって一緒に制御可能である、請求項1に記載の装置。
【請求項３】
前記制御回路は、前記プローブの前記センサーによって画定される平面と前記容器の前記一組のウェルによって画定される平面とを平行に維持するよう構成されている、請求項1および2のいずれかに記載の装置。
【請求項４】
前記デバイスと前記容器との前記相対位置の前記変化は運動の範囲にわたって、運動の範囲は10マイクロメートルと3ミリメートルとの間である、先行する請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項５】
流体(174)内に浸漬された生物学的試料(172)を保持するための一組のウェル(122)を備えた容器(120)の上方にカバーを形成するために、上述の請求項のいずれかに記載の前記デバイス(110)に取り付けられるよう構成された蓋(130)を含む装置であって、前記蓋が：
前記容器(120)の前記ウェル(122)を覆うよう構成された表面と；
一組のプローブであって、各プローブ(160)が、前記蓋の；前記表面から実質的に垂直に延伸する一組のプローブとを含み；
前記蓋の各プローブの位置が前記デバイスの光電子センサーの位置に対応し、前記蓋が前記デバイスに取り付けられると、前記プローブのセンサー(162)と対応する光電子センサー(112)との間に光路が形成されるように前記蓋が構成されており；
前記蓋の各プローブの前記位置が、前記容器の前記一組のウェルの1つのウェル内の位置に対応するように前記蓋がさらに構成されている、装置。
【請求項６】
前記デバイス(110)に固定的に取り付けられて前記カバーを形成する蓋(120)をさらに含み、前記蓋が：
前記容器(120)の前記ウェル(122)を覆うよう構成された表面と；
一組のプローブであって、各プローブ(160)が、前記蓋の；前記表面から実質的に垂直に延伸する一組のプローブとを含み；
前記蓋の各プローブの位置が前記デバイスの光電子センサーの位置に対応し、前記蓋が前記デバイスに取り付けられると、前記プローブのセンサー(162)と対応する光電子センサー(112)との間に光路が形成されるように前記蓋が構成されており；
前記蓋の各プローブの前記位置が、前記容器の前記一組のウェルの1つのウェル内の位置に対応するように前記蓋がさらに構成されている、装置。
【請求項７】
前記蓋(130)が無菌材料を含む、請求項5および6のいずれかに記載の装置。
【請求項８】
前記蓋(130)は、容器に取り付けられると、前記ウェルから前記デバイスの表面を分離することで、前記ウェル内の無菌環境を維持するよう構成されている、請求項5-7のいずれかに記載の装置。
【請求項９】
前記蓋は、前記ウェルを覆って形成されるよう構成されており、前記ウェルと前記装置の外の環境との間に気体経路を維持し、前記ウェルと前記環境との間に無菌バリアを維持する、請求項5-8のいずれかに記載の装置。
【請求項１０】
前記蓋が、任意のウェルおよび前記環境の中からまたは上方に直線状経路を形成することなく、前記ウェルと前記環境との間に蛇行状経路を形成するよう構成されている、請求項9に記載の装置。
【請求項１１】
前記蓋は一組の屈曲部分を含み、各屈曲部分は、前記蓋の他の部分よりも大きな可撓性を有しており、前記容器に対する前記デバイスの前記変化する相対位置にわたる移動において、前記蓋の少なくとも第1部分が前記容器と接触状態を維持し、前記屈曲部分によって前記第1部分から分離された前記蓋の少なくとも第2部分が前記デバイスと接触状態を維持する、請求項5-10のいずれかに記載の装置。
【請求項１２】
前記デバイスおよび前記蓋から形成された前記カバーが、前記容器を動かすことなく前記容器から取り外しできるよう構成されている、先行する請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項１３】
前記蓋が、前記蓋と前記デバイスの相対位置を固定するために、前記デバイスの対応する要素と係合するガイド要素を含む、先行する請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項１４】
前記ガイド要素は、前記デバイスの表面における突出および凹みの少なくとも一方を含む、請求項12に記載の装置。
【請求項１５】
前記蓋は半透明である、請求項5-14のいずれかに記載の装置。
【請求項１６】
前記蓋は無菌である、請求項5-15のいずれかに記載の装置。
【請求項１７】
前記蓋が一組の流体計量分配ポートを含み、前記ポートそれぞれが、前記蓋に貯蔵された流体を対応するウェル内に計量分配するよう構成されている、請求項5-16のいずれかに記載の装置。
【請求項１８】
前記デバイスは、1000グラム未満の質量を持つ、先行する請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項１９】
前記デバイスは、250グラム未満の質量を持つ、請求項18に記載の装置。
【請求項２０】
前記一組の屈曲部分は力を備えたばねを形成し、前記デバイスが、前記デバイスと前記容器との前記変化する相対位置にわたって前記屈曲部分を圧縮するのに十分の重量をそなえ、前記ばねが、前記変化する相対位置にわたって前記デバイスへの前記蓋の接触を維持するのに十分な力を印加する、請求項11-19のいずれかに記載の装置。
【請求項２１】
前記蓋(130)が前記デバイス(110)に固定的に取り付けられ、前記蓋の前記プローブと前記デバイスの前記光電子センサーとの位置合わせを、前記変化する相対位置の運動範囲にわたって維持する、請求項5に記載の装置。
【請求項２２】
前記デバイスは、前記蓋内の対応する要素からデータを受け取るためのデータインターフェースを含む、先行する請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項２３】
前記データインターフェースが、前記蓋の前記対応する要素の対応する電気接点に電気的に接触する電気接点を含む、請求項21に記載の装置。
【請求項２４】
前記データインターフェースは、前記蓋の表面の一部の画像を取得するための画像センサを含む、請求項21に記載の装置。
【請求項２５】
前記データインターフェースは、無線周波数通信装置を含む、請求項21に記載の装置。
【請求項２６】
前記データインターフェースは、前記アクチュエータと、前記センサーからの前記光学信号の取得とを制御するために前記制御回路に結合されている、請求項21-25のいずれかに記載の装置。
【請求項２７】
前記装置は前記容器(120)をさらに含み、前記蓋は前記デバイスに取り付けられると共に前記デバイスと前記容器との間に配置されて、前記流体の表面と前記環境との間に無菌バリアを維持し、各ウェルと前記環境との間に少なくともいくらかの気体通路が存在する、先行する請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項２８】
前記容器は複数のウェルを含み、前記蓋は、各ウェルに対応した少なくとも1つのプローブを備えるよう構成されている、請求項27に記載の装置。
【請求項２９】
前記蓋は、この単一のウェルに対応した多数のプローブを備えるよう構成されている、請求項27および28のいずれかに記載の装置。
【請求項３０】
多数の相対位置で取得されたセンサー値を表すデータを受け付けるよう構成されたデータ処理システムをさらに備えた、先行する請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項３１】
前記データ処理システムは、前記受け付けられたデータを組み合わせて前記生物学的試料による前記分子の消費速度を計算するよう構成された、請求項30に記載の装置。
【請求項３２】
前記データ処理システムは、前記センサー値から導き出された数量を表示するディスプレイを含む、請求項30および31のいずれかに記載の装置。
【請求項３３】
前記データ処理システムは、前記センサー値から導き出された前記数量を参照数量と組み合わせて表示するよう構成されている、請求項32に記載の装置。
【請求項３４】
前記分子が酸素を含む、先行する請求項のいずれかに記載の装置。
【請求項３５】
先行する請求項のいずれかに記載の装置を用いて容器内の流体の分子レベルを測定するための方法であって：
前記デバイスと前記容器との前記相対位置を調整する段階であって、前記容器の前記ウェルから前記容器の外の環境との気体経路を維持しつつ、前記流体の前記分子のレベルの勾配を実質的に乱すことなく、前記流体内で前記センサーを移動させることを含む調整する段階と；
センサー信号を前記相対位置のうちの複数で取得する段階と；
前記取得された信号から求められたデータを、前記デバイスとは別個のデータ処理システムへ前記デバイスから通信する段階とを含む、方法。
【請求項３６】
測定を実行するための方法であって：
多数の期間を含む測定時間にわたり容器(120)とプローブ(160)のアレイとの間で相対的移動をもたらす段階であって、前記容器と前記プローブ(160)のアレイとの間の距離が、各期間の少なくとも一部にわたって第1軸に沿って変化し：
前記容器は一組のウェルを含み、少なくとも1つのウェルは、試料(172)を支持すると共に流体(174)を含み、前記流体は、気体(180)に暴露された上面を備え、前記気体は一定の濃度の分子を備え、前記試料は、前記流体内の前記分子と相互作用し、
各プローブは、前記容器と前記プローブとの間の前記距離に依存するウェル(122)の底面からの距離で、前記流体内の前記分子の濃度を測定するよう構成されており、
前記相対的移動は、前記流体の前記上面の平面に対して実質的に垂直の軸に沿ったものである、相対的移動をもたらす段階と；
前記複数のプローブの2つ以上から、前記期間のうちの複数のそれぞれにわたって測定データを取得する段階であって、少なくとも第1プローブが、前記一組のウェルの第1ウェルに含まれた前記流体内で前記分子の濃度を測定するよう構成されており：
前記第1プローブから取得された測定データは、前記期間のうちの前記複数の第1期間内で、前記第1ウェルの前記底面から異なるそれぞれの距離で取得された少なくとも2つのデータ試料を含む、取得する段階と、を含む方法。
【請求項３７】
相対的移動をもたらす段階は、実質的に連続的な移動をもたらす、請求項36に記載の方法。
【請求項３８】
前記測定データを取得する際に；
前記第1期間内に取得された連続的なデータ試料間の最大経過時間は、運動後に前記流体の環境の安定化に必要な時間より少ない、請求項36に記載の方法。
【請求項３９】
前記最大経過時間は、前記連続的なデータ試料が取得されたそれぞれの距離間の差の二乗と、前記プローブの断面積との小さい方に関連付けられた時定数に少なくとも部分的に基づいた所定の閾値未満である、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
前記第1ウェルは、前記底面と前記第1ウェル内の前記流体の前記上面との間が少なくとも10ミクロンとなるように十分深い、請求項36に記載の方法。
【請求項４１】
測定を実行するための装置であって：
支持体および前記支持体内に一組のウェル(122)を含む容器(120)と；
カバーとを含み、前記カバーが：
デバイス(110)と；
一組のプローブ(160)を含む蓋(130)であって、前記一組のプローブは前記蓋の表面から延伸し、各プローブが前記容器のウェル内へ延伸し；
前記デバイスおよび前記蓋は、前記容器に係合するよう構成されており、前記デバイスが前記容器に係合すると、前記蓋の形状が、前記ウェルの上方の空気ギャップの任意部分と前記空気ギャップの外部の大気との間で直線経路の形成を防ぎ；
前記カバーは、前記容器と前記カバーとの間に相対的移動をもたらすよう構成された制御サブシステムをさらに含み、前記容器と前記カバーとの間の距離が、複数の機械的アクチュエータの動きに基づいて第1軸に沿って変化し、前記機械的アクチュエータそれぞれは、前記デバイス内の可動要素を移動させるよう構成されており、前記可動要素は、前記デバイスが前記容器に係合すると前記容器に接触する、蓋と、
前記プローブから伝搬する励起光を与えるよう構成されると共に、前記プローブ内に伝搬する発光を収集するよう構成された測定サブシステムとを含む、装置。
【請求項４２】
前記可動要素が可撓性隔膜を含む、請求項41に記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体を参照して本明細書に援用する2018年8月31日に提出された米国仮出願第62/725,787号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
細胞による酸素消費を測定するために様々な技法が使用されている。いくつかの技法は、調整細胞(例えば、培養細胞の無傷単層)を測定する開放技法(open-air techniques)である。いくつかの技法は、生体内での細胞測定が可能である。いくつかの技法は、マルチウェルプレート内の細胞(例えば、微量定量プレートのウェル内の細胞)の測定が可能である。いくつかの技法では、フラックスを推定するために(例えば、自己参照マイクロセンサーを用いて)、勾配内の2つの異なる位置間でプローブを用いて測定を行う。
【発明の概要】
【０００３】
少なくともいくつかの側面は、生物学的試料の無菌環境を維持しつつ、前記生物学的試料の酸素消費を継続的に(例えば、数日または数週間)測定し、試料(例えば、この試料を含む流体の表面)と環境との気体接触を維持し、流体中の酸素濃度勾配の乱れを最小化する必要性に対処する。少なくともいくつかの実施形態では、システムは、光電子センサーからなる耐久性手持ち型電子アレイの下方に取り付けられた無菌の使い捨てプローブ蓋を含む。前記プローブ蓋および電子センサーアレイは、標準的なマルチウェル組織培養プレートの上部に配置されている。前記使い捨て蓋の内部に一体化されると共に前記使い捨て蓋から垂直に延びる光プローブは、多数の組織ウェルの流体内に挿入される。前記システムは、細胞への酸素の全体的な運搬を妨げることを回避し、酸素濃度勾配の乱れを最小化するように設計されている。前記蓋は無菌であり、前記システムはインキュベーター内に設置できる。このように、前記システムは、細胞培養実験の間に、最大で数週間まで継続して使用するのに最適である。前記システムは、処理に対する細胞の応答を測定する(例えば、薬剤を加えた後の酸素消費量の変化を測定する)のに最適である。
【０００４】
一側面では、概して、装置は、容器内の流体の分子レベル(例えば、濃度、消費または生産率)を測定するのに使用される。前記装置は、容器の上方でカバーの一部として取り付けられるよう構成されたデバイスを含み、前記デバイスは、それぞれが流体に浸漬された生物学的試料を保持する1つ以上のウェルを備える。前記デバイスは、前記流体に浸漬されたプローブから光学信号を取得するよう配置された複数の光電子センサーを含む。これら光学信号は、前記プローブのセンサーにおける前記流体の分子レベルを表す。前記デバイスは、前記デバイスと前記容器との相対位置を調節するよう構成可能な一組のアクチュエータも含んでいる。前記デバイスの制御回路を用いて、前記デバイスと前記容器との前記相対位置を変化させると共に、複数の相対位置で前記光学信号を取得するために前記一組のアクチュエータを制御する。
【０００５】
前記デバイスが前記容器上で前記カバーの一部を形成する利点は、前記デバイスが前記容器と一緒に携帯可能である点である(例えば、前記デバイスで覆われた容器は「手持ち型」であり、ある位置から別の位置まで容易に移動でき、インキュベーターの棚などの上に配置できる)。
【０００６】
いくつか側面は、次の特徴のうち１つ以上を含むことができる。
【０００７】
前記容器の前記一組のウェルによって画定される平面に対する前記プローブの前記センサーによって画定される平面の配向を制御するために、前記制御回路によって一緒に制御可能な複数のアクチュエータが設けられている。この特徴の利点は、各センサーを、ウェル床面の上方の同じ高さに、かつ/または前記流体中で他のセンサーと同じ深さに保持できる点である。
【０００８】
前記制御回路は、前記プローブの前記センサーによって画定される平面および前記容器の前記一組のウェルによって画定される平面の相対的な配向を平行に維持するよう構成されている。
【０００９】
前記デバイスと前記容器との相対位置の前記変化は、運動の範囲にわたる。いくつかの例では、この運動の範囲は、10マイクロメートルと3ミリメートルとの間である。
【００１０】
別の側面では、概して、装置は蓋を含むか、あるいは上述した装置は、前記デバイスに取り付けて前記カバーを形成するよう構成された蓋をさらに含む。前記蓋は、前記容器の前記ウェルを覆うよう構成された表面を含む(すなわち、前記デバイスと前記蓋の組合せが前記容器を覆う)。前記蓋は、一組のプローブであって、各プローブが、前記蓋の前記表面から実質的に垂直に延伸する一組のプローブも含む。
【００１１】
前記蓋の各プローブの位置が、前記デバイスの光電子センサーの位置に対応し、前記蓋が前記デバイスに取り付けられると、前記プローブのセンサーと対応する光電子センサーとの間に光路が形成されるよう前記蓋が構成されている。例えば、前記蓋の各プローブの前記位置が、前記容器の前記一組のウェルの1つのウェル内の位置に対応するよう前記蓋がさらに構成されている。
【００１２】
前記蓋が前記デバイスに固定的に取り付けられ、前記蓋の前記プローブと前記デバイスの前記光電子センサーとの位置合わせを維持する。すなわち、前記デバイスは、強固で前記蓋およびそのプローブに対して容易に移動しないように固定され、取り付けられ、または配置されている。
【００１３】
前記蓋は無菌材料を含む。例えば、前記蓋は、容器に取り付けられると、前記ウェルから前記デバイスの表面を分離することで、前記ウェル内の無菌環境を維持するよう構成されている。前記デバイスから分離したこうした蓋を使用する利点は、前記ウェル内の前記生物学的試料を汚染する大きな危険を伴わずに前記デバイスが無菌状態を維持する必要がないことである。
【００１４】
前記蓋が、任意のウェルの中またはその上方から前記装置の外の環境への直線状経路を形成することなく、前記ウェルと前記環境との間に気体経路を形成するよう構成されている。こうすることで、前記環境は前記分子の貯留部となる。
【００１５】
前記蓋は、前記蓋の周縁部の近傍に前記蓋の屈曲部分を含み、前記屈曲部分は、前記蓋の他の部分よりも大きな可撓性を有しており、前記容器に対する前記デバイスの移動において、前記蓋の少なくとも第1部分が前記容器と接触状態を維持し、前記屈曲部分によって前記第1部分から分離された前記蓋の少なくとも第2部分が前記デバイスと接触状態を維持する。
【００１６】
前記デバイスおよび前記蓋から形成された前記カバーが、前記容器を動かすことなく前記容器から取り外しできるよう構成されている。
【００１７】
前記デバイスは、1000グラム未満の質量または250グラム未満の質量を持つ、先行する請求項のいずれかに記載の装置。
【００１８】
一組の屈曲部分が力を備えたばねを形成し、前記デバイスが、前記デバイスと前記容器との前記変化する相対位置にわたって前記屈曲部分を圧縮するのに十分の重量をそなえ、前記ばねが、前記変化する相対位置にわたって前記デバイスへの前記蓋の接触を維持する(すなわち、前記蓋の前記デバイスへの固定的な取り付けを維持する)のに十分な力を印加する。
【００１９】
前記デバイスが、前記蓋と前記デバイスの相対位置を固定するために、前記蓋の対応する要素と係合するガイド要素を含む。例えば、前記ガイド要素は、前記デバイスの表面における突出および凹みの少なくとも一方を含む。別の例としては、前記ガイド要素は、前記蓋内の磁石と係合するための磁石を含む。
【００２０】
前記デバイスは、前記蓋内の対応する要素からデータを受け取るためのデータインターフェースを含む。例えば、前記データインターフェースが、前記蓋の前記対応する要素の対応する電気接点に電気的に接触する電気接点を含む。別の例として、前記データインターフェースは、前記蓋の表面の一部の画像を取得するための画像センサーを含む。更に別の例として、前記データインターフェースは、無線周波数通信装置を含む。
【００２１】
前記データインターフェースは、前記アクチュエータと、前記センサーからの前記光学信号の取得とを制御するために前記制御回路に結合されている。
【００２２】
前記装置は、前記容器をさらに含む。
【００２３】
前記蓋は、前記デバイスに取り付けられると共に前記デバイスと前記容器との間に配置されて、前記流体の表面と前記環境との間に無菌バリアを維持し(例えば、前記流体の表面から前記装置の外の環境とに直線的な気体経路が存在しないように)、各ウェルと前記環境との間には少なくともいくらかの気体通路が存在する。
【００２４】
前記容器は複数のウェルを含み、前記蓋は、各ウェルに対応した少なくとも1つのプローブを備えるよう構成されている。代替的には、前記容器は単一のウェルを備え、前記蓋は、この単一のウェルに対応した多数のプローブを備えるよう構成されている。
【００２５】
前記装置は、多数の相対位置で取得されたセンサー値を表すデータを受け付けるよう構成されたデータ処理システムをさらに備えている。
【００２６】
前記データ処理システムは、前記受け付けられたデータを組み合わせて前記生物学的試料による前記分子の消費速度を計算するよう構成されている。
【００２７】
前記データ処理システムは、前記センサー値から導き出された数量を表示するディスプレイを含む。前記データ処理システムは、前記センサー値から導き出された前記数量を、参照数量と組み合わせて表示するよう構成されている。
【００２８】
前記分子は酸素を含む。
【００２９】
別の側面では、概して、上述した種類の蓋は、デバイスおよび容器と共に使用するよう構成されている。分離した蓋は、複数の実験にわたって再利用される前記デバイスとは別個に準備可能な費用対効果が大きい前記装置の消耗部分となるという利点がある。さらに、例えば異なるセンサーを備えた異なる種類の蓋(例えば、互いに交換のきく蓋)を用いて、異なる分子のレベルを測定することもできる。
【００３０】
別の側面では、概して、容器内の流体の分子レベルを測定するための方法は、上述した任意の装置を使用する。前記方法は、前記デバイスと前記容器との前記相対位置を調整する段階であって、前記容器の前記ウェルから前記容器の外の環境との気体経路を維持しつつ、前記流体の前記分子のレベルの勾配を実質的に乱すことなく、前記流体内で前記センサーを移動させることを含む調整する段階を含む。センサー信号は、前記相対位置のうちの複数で(例えば、前記分子の前記レベルの勾配場における様々な位置で)取得される。前記取得された信号から求められたデータは、前記デバイスとは別個のデータ処理システムへ前記デバイスから通信される。
【００３１】
別の側面では、概して、測定を実行するための方法は、多数の期間を含む測定時間(これら期間とは、例えば、前記測定時間の離散的な重なり合わない部分)にわたり容器と一組のプローブとの間で相対的移動をもたらす段階を含む。前記容器と前記プローブとの間の距離が、各期間の少なくとも一部にわたって第1軸に沿って変化する。前記容器は、一組のウェルを含む(例えば、複数のウェル)。少なくとも1つのウェル(例えば、各ウェル)は、試料を支持すると共に流体を含み、前記流体は、気体に暴露された上面を備え、前記気体は一定の濃度の分子を備え、前記試料は、前記流体内の前記分子を消費し、または他の様態で前記分子と相互作用する。各プローブは、前記容器と前記プローブとの間の前記距離に依存するウェルの底面からの距離で、前記流体内の前記分子の濃度を測定するよう構成されており、前記相対的移動は、前記流体の前記上面の平面に対して実質的に垂直の軸に沿ったものである。前記方法は、さらに、前記一組のプローブから、前記複数の期間のそれぞれにわたって測定データを取得する段階も含む。前記一組のウェルの第1ウェルに含まれた前記流体内で前記分子の濃度を測定するよう構成された少なくとも第1プローブに関しては：前記第1プローブから取得された測定データは、前記複数の期間の第1期間内で、前記第1ウェルの前記底面から異なるそれぞれの距離で取得された少なくとも2つのデータ試料を含み、前記第1期間内に取得された連続的なデータ試料間の最大経過時間は、例えば、連続的なデータ試料が取得された前記それぞれの距離間の差の二乗、すなわちこの特徴的長さの二乗(例えば、前記流体表面に平行な前記プローブの断面の直径)に関連付けられた時定数および/または前記流体内の前記分子の流れに関連付けられた拡散定数に、少なくとも部分的に基づいた所定の閾値未満である。
【００３２】
いくつかの実施形態では、前記第1ウェルは、前記底面と前記第1ウェル内の前記流体の前記上面との間が少なくとも10ミクロンとなるように十分深くなっている。
【００３３】
別の側面では、概して、測定を実行するための装置は、支持体および前記支持体(例えば、「ウェルプレート」または「マルチウェルプレート」)内に一組のウェル(例えば、複数のウェル)を含む容器と、カバーとを含む。前記カバーは、蓋とデバイスとを含む。前記蓋は、前記容器に係合するよう構成されている。前記蓋は一組のプローブを含み、各プローブは、前記蓋の表面から前記一組のウェルのうち対応するウェル内に延伸し、前記蓋は、前記デバイスに対する前記蓋上の前記プローブの位置を維持するよう前記デバイスに実質的に固定的に取り付けられており、前記ウェルと環境との間に無菌バリアを維持するための形状を備えている(例えば、蛇行状経路のみを形成し、前記ウェルの上方の空気ギャップの任意部分と、前記空気ギャップの外部の大気との間で直線経路の形成を防止する)。制御サブシステムは、前記容器と前記デバイスとの間に相対的移動をもたらすよう構成されており、前記容器と前記デバイスとの間の距離が、複数の機械的アクチュエータの動きに基づいて第1軸に沿って変化し、前記機械的アクチュエータそれぞれは、前記デバイス内の可動要素を移動させるよう構成されており、前記可動要素は、前記デバイスが前記容器に係合すると前記容器に接触し、(3)測定サブシステムは、前記複数のプローブの2つ以上から伝搬する励起光を与えるよう構成されると共に、前記複数のプローブの2つ以上の中に伝搬する発光を収集するよう構成されている。
【００３４】
いくつかの実施形態では、前記可動要素は可撓性隔膜を含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、前記デバイスは、小さいフォームファクタおよび低電力消費を備えている。小さいフォームファクタ、すなわち理想的には127.8 x 85.5~mm (すなわち、ある種の容器のフットプリント)程度と非常に小さく、質量も小さい(例えば、約250グラム未満または1000グラム未満)であれば、前記デバイスは、そうしたプラスチック製の容器の上部に設置でき、手持ち型デバイスにもなりうる。本明細書に記載された方法を用いればフォームファクタを小さくすることができる。最終的には、前記デバイスは、2.5ワット未満の電力を使用し、理想的には平均で0.5ワット未満、またはより理想的には0.1ワット未満の電力を使用し、前記デバイス全体は、周囲の温度をはっきり分かるほど上昇させることなく、USBによって電力供給を受けると共にインキュベーター(すなわち、密封された温度および湿度制御環境)内に配置することができる。
【００３６】
いくつか側面は、次の利点のうち１つ以上を備えることができる。
【００３７】
本明細書に記載した技法およびシステムは、前記容器の流体保持ウェルで化合物の消費および生産を測定するために使用できる。酸素が前記細胞によって消費される場所では、前記酸素濃度が前記環境(すなわち、例えば酸素などの前記化合物のガス溜)と平衡状態に保たれる前記流体の表面と、前記酸素濃度が消費によって飽和より低い前記細胞と、の間に勾配が形成される。定常状態では、酸素消費は、濃度勾配および酸素拡散定数に比例する。よって、前記ウェル内の酸素濃度は、測定可能でありかつ細胞酸素消費速度に変換可能である。前記システムのいくつかの実施形態では、直径が小さい酸素プローブのアレイがウェル内部に挿入され、一定のパターンで垂直に(前記ウェル底部の平面に垂直に)移動する。この移動パターン全体にわたって酸素濃度を読み出し可能である。プローブ移動は前記酸素勾配を乱すことがあり、前記システムは必ずしも完全な定常状態には達しないかもしれないが、これらの濃度測定値を、代謝活動の強い指標である細胞の酸素消費に対応した時系列の値を生成するためのアルゴリズムへの入力として使用できる。読取り値を用いれば、例えば、前記容器の流体保持ウェル内の化合物の平衡状態の測定または存在する細胞の空間的分布を含むいくつかの他のシステム特性も推測できる。この測定技法は、精度、前記細胞に対する最小の乱れ、および測定強健性(robustness)の点で従来技術に対する大きな利点を提供する。
【００３８】
本発明のその他の特徴および利点は、次の説明および特許請求の範囲から明らかとなるはずである。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】図1A-Bは、例示的な測定ユニットの断面図である。
【図２】ウェルの座標並進を図示するプロットである。
【図３】図3A-Dは、伸縮式ピンの一例の断面図である。
【図４】図4A-Cは、デバイスと培養プレートと間の例示的な屈曲式蓋の一例の断面図である。
【図５】図5A-Bは、例示的な屈曲および屈曲カバーの断面図である。
【図６】プローブ包絡線を図示するプロットである。
【図７】例示的な測定処理のブロックダイヤグラムである。
【図８】例示的な測定アルゴリズムのブロックダイヤグラムである。
【図９】測定システムの異なる実施形態に対応する例示的な測定値のプロットである。
【図１０】図10A-10Bは、測定システムの異なる実施形態に対応する例示的な測定値のプロットである。
【図１１】図11A-11Bは、測定システムの異なる実施形態に対応する例示的な測定値のプロットである。
【図１２】図12A-12Bは、測定システムの異なる実施形態に対応する例示的な測定値のプロットである。
【発明を実施するための最良の形態】
【００４０】
1 概観
測定ユニットと、測定ユニットを制御すると共に測定ユニットからデータを受け取るための関連した計算・制御回路(これらのうち一部は測定ユニット内に含まれかつ/または測定ユニットに結合してもよい)とを含む測定システムの様々な実施形態を用いて、培養細胞によって消費もしくは生産される酸素を測定し、または周囲環境との酸素平衡を測定する。このシステムは、非侵襲的で連続的なリアルタイム酸素消費測定値を与えることができる。これは、例えば、ほとんどまたはまったく流体対流がない場合に酸素消費を測定するのに有用である。さらに、これは、細胞が開放ウェル方式で培養されていて、流体への酸素運搬の主要な源がウェルの上部における空気・液体界面を介したものである場合の測定に適している。さらに、これは、細胞は哺乳類細胞であって、細胞が培養ウェルの底部に付着しているときに、有用である。様々な実施形態では、このシステムの異なる側面は、多種多様な培養フォームファクタのいずれにも適合可能である。
【００４１】
図1A-Bを参照すると、例示的な測定システムは、光電子センサー112のアレイを支持する耐久性(例えば、非消耗品の)デバイス110の下方に取り付けられた無菌の使い捨て(例えば、消耗品の)プローブ蓋130を備えた測定ユニット100を含む。図1Aは、図1Bに示した点Aを水平方向に見た断面図であり、図1Bは、図1Aに示した点Bに関する断面図である。プローブ蓋130および光電子センサー112のアレイは、培養プレート120(「容器(receptacle)」ともいう)の上部に配置されている。デバイス110および蓋130は合わせて「カバー」とも呼ばれ、この蓋は、このデバイスに結合されかつ多数のウェル122を含む培養プレート120を覆う表面である。光プローブ160は、使い捨て蓋130の内面内に一体化されており、かつ、使い捨て蓋130の内面から垂直に延びており、組織ウェル122の流体174内に挿入されている。例えば、プローブは一体型であり、蓋の残りの部分と同じ材料で成形されているが、いくつかの例では、プローブは、別の材料で作られた光ガイドを含み、蓋の残りの部分の中へ成形されている。後述するように、プローブ160の各々は、液体174に浸漬され、酸素濃度などの特性を光学発光に変換するプローブ先端162を含み、この光学発光は、対応するプローブを介してデバイス110内の光電子センサー112に渡される(例えば、プローブ先端162を励起するセンサー112から放出される光学信号に応答して)。次に、デバイス内の回路118は、測定値を保存し、かつ/またはそれらを外部処理システムに通信する。また、以下にさらに説明するように、デバイスは、例えば、蓋130を介してプレート120の上面を押圧するセパレータピン116を伸張することによって、デバイス110とプレート120の分離を変更できる電気的に制御されたアクチュエータ114(そのうちの1つのみが図1Aの断面図で示されている)を含み、それによって、ウェル122内のプローブ先端162位置の変更を制御することができる。
【００４２】
また、システムは、例えば回路118を介して、デバイス110とインターフェースする制御・データ記憶ハブも含むことができる。 このインターフェースは無線でも有線でもよい。この制御ハブは、多数の測定ユニットを同時にインターフェースできる。さらに、制御ハブは、データを遠隔でアクセスするためのインターフェースを提供でき、データの視覚化のホストとして機能できる。また、こうしたデータは、ハブを介してそのデータにアクセスしているリモートマシンを介してまたはハブが収集したデータを中継している別のリモートマシンを介して、リアルタイムで視覚化できる。
【００４３】
例示したシステムは、細胞への酸素の全体的な運搬を妨げることを回避し、酸素濃度勾配の乱れを最小化するように設計されている。蓋は無菌であり、測定ユニットはインキュベーター内に設置されている。このように、この例示的なシステムは、細胞培養実験の間、最大で数週間まで継続して使用するのに最適である。
【００４４】
ウェル内では、酸素が主に空気界面で流体に供給され、底部またはウェル内に浮遊する細胞が酸素を消費すると、ウェルの上部にある酸素飽和流体と、ウェルの底部(またはウェル内の細胞の位置)にある酸素濃度が低下した流体との間に酸素濃度の勾配が形成される。あるいは、ウェル内の細胞は、ウェルの上方にある空気中のこの気体と平衡になる別の化合物を生産したり消費したりすることがあり、ここでは、この気体の生産や消費を測定したり、流体に含まれる溶質の周囲環境との平衡を監視したりするのに有用である。この勾配の特性は、実験を通してウェル内で発生する酸素運搬の局所的な過渡状態を明らかにする。これらの特性は、フィックの法則によって記述され、細胞による酸素消費に直接関係している。
【００４５】
理論に縛られることを意図しないが、フィックの第一法則は、定常状態であると仮定して(無限小の長さのスケールで有効な仮定)拡散フラックスと濃度を関連付ける。
【００４６】
【数１】
2021536572.tif 000003
【００４７】
上記式で、Jは拡散フラックスで、Dは拡散係数で、φは濃度で、xは空間位置である。フィックの第二法則は、拡散が、濃度を時間tに関してどのように変化させるかを予測する。
【００４８】
【数２】
2021536572.tif 000004
【００４９】
動作時に、プローブはウェル内で上下動し(約1ミリメートルの長さ尺度)、このシステムは、勾配内で酸素濃度を記録する。処理されかつシステムの周知の動きと組み合わされたこうした濃度の読み取り値が、ユーザーに酸素消費量の読み出しを与える。
【００５０】
いくつかの実施形態では、システムは、以前のプローブ位置に対してプローブを正確に移動させるが、流体表面の位置または細胞の位置に対して絶対的な位置を与えない。このように、高さ(ウェルの底面に対する)および深さ(流体表面に対する)という用語は、物理的な流体表面(実験中に変化する可能性がある)またはウェルの底面(製造のばらつきに応じて変化する可能性がある)の正確な位置に対する絶対的な高さまたは深さの確実性を意味するものではなく、むしろ、近似的な(名目上の)位置に対応する空間内の基準点に対する理想化されたまたは近似的な高さもしくは深さを意味することを意図している。
【００５１】
システムの計算サブシステムは、相対位置での測定に基づく推定アルゴリズムを実行するように構成することができるので、必要なのは、プローブが測定対象の勾配内に存在するのを保証することだけである。いくつかのケースでは、これは、例えば、システムが正確な読み出しを提供しながら、絶対的な位置の不正確さを許容することができるので、固定プローブアプローチに対する有用な改善となる。このような絶対位置の不正確さは、以下のような多くの原因から生じる可能性がある：
・ウェルプレート寸法(例えば、深さ、容積、縁高さなど)の変動。
・流体体積の変動(例えば、蒸発によるものや、正しく較正されていないもしくは不正確なピペット、またはプレート容積のばらつき)。
・作動部品および蓋を含むシステム自体の様々な物理的構成要素を製造する上での変動。
【００５２】
絶対的な位置不正確さに対するシステムの許容度からもたらされる多くの商業的利益であって、いくつかの実施形態において発揮され得る多くの商業的利益がある。それらには次が含まれる：
・様々な異なるベンダーからの様々なプレートとの併用性。
・ 低許容度の製造工程で生産できることによる低コストでの製造可能性。例えば、蓋の製造では精密フライス削りではなく低コストの射出成形。
・顧客の使い勝手のよさ。蒸発および流体体積の不正確さの影響が最小限に抑えられる。絶対的な位置の正確性を維持するための再較正が不要である。
・より長いシステム耐用年数。システムは、位置の正確性に影響しかねない様々な部品の摩耗を許容できる。
【００５３】
2 例示的な測定ユニット
再び図1を参照すると、測定ユニット100は、液体174に浸漬された細胞172を含む開放ウェル122のアレイを備えた細胞培養プレート120を含む。 このプレート120の上には無菌の使い捨て蓋120が載置され、この蓋には、そこから細胞培養ウェル内に垂直に下方へ延びるプローブ160のアレイが備わっている。酸素感受性材料が、各ウェル122の培養流体174内に収容されたこれらのプローブの先端162に取り付けられている。耐久性デバイス110内の光電子センサー112のアレイは、プローブ蓋130に結合され(例えば、デバイス110の蓋130との接触を維持することによって光学的に)、センサー112は、プローブ160を介してセンサー112に達するプローブ先端162からの光学発光を処理することによって、プローブ先端162における酸素濃度を読み取る。プローブ160は、多数の位置で酸素濃度を測定するために、ウェル内で上下に移動される。アクチュエータ114は、プレート120に対するデバイス110の垂直方向に移動させ、それにより、ウェル122に対するプローブ先端162の相対的な動きをもたらす。ユニット100は、センサーで収集されたデータを処理し、保存し、アクセスを提供し、または表示するデータ・電力ハブに接続する。例示的な測定ユニットの異なる特徴の様々な実施形態をここで説明する。
【００５４】
2.1 センサーおよびアクチュエータを支持する耐久性デバイス
2.1.1 光センサーとプローブとの直接結合
一般に、様々な実施形態では、プローブ先端162は、細胞培養プレート120に対して上下に移動するように構成されている。いくつかの実施形態では、この相対的な移動は、筐体内などにプローブ蓋を固定し、ウェルプレートを垂直方向に振動させることによって達成できる。他の実施形態では、プローブ蓋は、ウェルプレートが静止している間、垂直方向に振動することができる。これは、例えば、インキュベーターの棚の上にプレートが載置されて、プローブ蓋がウェルプレートの上方で振動するような場合に、インキュベーターの棚の上で実行可能である。後に、この後者の種類の実施形態は説明する。
【００５５】
プローブ先端は、光電子機器に結合されるように構成することができる。光センサーは通常、プローブ上の感知材料を光電子機器から分離するために、フレキシブルな光ケーブルを使用している。感知エレクトロニクス機器とプローブ蓋とを結合するフレキシブルケーブルにより、蓋を自由に振動可能である。あるいは、いくつかの光学的感知環境では、光ケーブルが省略されており、例えば、顕微鏡と共に使用される場合には、光学信号が材料から直接読み取られる。これにより、センサー電子機器は、例えば、プレートリーダーと共に、プローブ材料に対して自由に移動することができる。以下に説明する実施形態では、光電子機器の垂直振動がプレートのウェル内のプローブ先端の垂直振動に直接対応するように、光ファイバが、デバイス内のセンサーアレイの光電子センサーに実質的に固定的に取り付けられている。
【００５６】
いくつかの実施形態では、直接結合が有利であり、その理由は、最小の長さのファイバーまたはライトパイプを採用することができ、システムの複雑さとサイズが減少し、光が失われうるインターフェースの数が減少し、信号強度が増加するためである。
【００５７】
2.1.2 可逆的結合
光電子センサー112のアレイを含む耐久性デバイス110は、使い捨て蓋130に固定的に取り付けられている。この固定的な取り付けは、使い捨て蓋130を取り外して交換することができるように可逆的である。いくつかの実施形態では、磁石(例えば、図1A-Bに示す135および136)を用いて、これら2つの部品を合体して保持し、両方の部品の位置合わせ特徴が、繰り返して接続可能であることを保証している(例えば、センサー112を対応するプローブ160と位置合わせするために)。オプションで、電磁石を使用して、心合わせまたは心狂いさせることができる対向する永久磁石を使用して、または永久磁石の作用を相殺するために電磁石を一時的にオンにすることによって、磁気保持特徴をオンまたはオフにすることができる。代替的には、摺動ロックまたは他の機械的機構を、デバイスに蓋を保持しかつ位置合わせするために使用できる。
【００５８】
2.1.3 電子機器およびデータ格納
耐久性装置110は、酸素濃度の読取り値を処理し、追加のセンサー入力を監視し、これらの入力に基づいて意思決定アルゴリズムを実行し、サンプリングおよび作動命令を与え、データハブと通信することを支援する電子回路110を含む。 これらの追加エレクトロニクス機器には、一般的な処理のためのマイクロコントローラと、高速制御や計算のための利用者書き込み可能グリッド・アレイ(FPGA)などの特殊なデジタル処理デバイスとが含まれる。エレクトロニクス機器には、デバイスの較正変数(calibration variables)を含むデバイス固有の情報を格納するための不揮発性メモリも含まれる。これらの較正変数は、発振器、増幅器、ゲイン抵抗、コンデンサなどを含む電子機器の差異を潜在的に計算に入れることができる。
【００５９】
アレイの各センサーには、特定の光学構成要素が存在する。これらの構成要素は、レンズ、二色性ミラー、第1面鏡、発光フィルタ、および励起フィルタの少なくとも一部を含むことができる。 発光素子(発光ダイオードLED)と光センサー(フォトダイオード)は、しばしば一体化レンズを備えている。
【００６０】
また、このデバイスは、データをデータハブに与えるために無線通信機能も含むことができる。これは、外部供給電力が乱れた場合に動作を継続的に実行することができるように、組込式の電力貯蔵装置(例えば、バッテリー)をさらに含むことができる。また、バックアップ電源によって、より広範な動作停止処理が可能になる。例えば、作動特徴を、耐久性デバイス内の安全な位置に引き込ませることができる。
【００６１】
2.1.4 付加的なセンサー
オプションの追加センサーには、大気圧、温度、および湿度センサーがあり、局所的な酸素飽和値の計算に使用できる。また、デバイスの配向を監視するためや、デバイスが搬送されているのか、インキュベーターの棚の上で安定しているかを確認するために、加速度計を含めてもよい。この情報は、移動パターンの自動開始と自動終了に有用である。温度センサーを用いて、ドアが開いたときなどのインキュベーター環境の安定性を監視できる。この目的のために環境光センサーを使用することもでき、これが消費電力を最小限に抑えるのに有用となりうる。酸素、温度、および加速度センサーは、ウェル内で培地が交換されたときを推測することもできる。相対湿度測定は、湿度レベルが低いと培地の蒸発率が高まるため、一般的なインキュベーターの監視にも役立つ。
【００６２】
センサーの読取り値から得られるパターンや閾値により、測定や連続動作の初期化や終了を自動的にトリガすることができる。このようにして、デバイスは、ユーザーの意図を賢く予測し、ボタンのような特定のユーザーインターフェース・メカニズムを必要としなくなる。また、加速度センサーは、作動機能による動作を検出するように構成することもできる。この構成では、加速度センサーを使用してシステム動作を監視し、システムが期待通りに動作していない場合は修正措置を講じることができる。
【００６３】
2.1.5 三点作動システム
いくつかの実施形態では、プレート120に対するデバイス110および蓋130の垂直方向(すなわち、ｚ軸方向)の運動は、単一のアクチュエータおよびリニアガイドによって達成され、その場合アクチュエータがデバイスおよびプレートの平行な配置を維持するので、プローブ先端を通る平面の、プレートに対する平行状態が維持される。好ましい代替実施形態では、ウェル内のプローブの垂直位置は、装置110および固定的に取り付けられた蓋130のxy平面内の3つの位置で高さを設定することによって制御することができる。 この分散型位置決めシステムは、複数のリニアガイドと単一のアクチュエータを使用する構成よりも複雑だが、3点作動の利点は、システムを、進行方向に垂直な平面内では比較的大きく、進行方向に平行な寸法に沿って小さくすることを可能にするという点にある。これら3つの作動点は、プローブ先端の平面をプレートと平行に保つために、互いに同期して作動させることができる。代替的に、蓋およびプローブ先端の対応する平面の傾きを制御することができるように、アクチュエータは、異なるアクチュエータ点においてデバイスとプレートとの異なる分離を達成するように動作させてもよい。例えば、このような代替案では、プローブによってはシステム内の他のプローブよりも長い距離を移動するものもある。
【００６４】
作動点は、標準的なマルチウェルプレートのフットプリント内に設定することができ、ここでは、それらは、ウェルの上部近くの平坦な表面を押圧することができる。代替的には、3つのウェルから細胞を除外してもよく、デバイスは、ウェル底部を押して離れることができる。作動点はまた、標準プレートのフットプリントの外側に位置してもよく、例えばインキュベーターの棚、またはウェルプレートをも保持する特別に設計されたプラットフォームを押すことができる。ウェルプレートまたは特別に設計されたプラットフォームの特徴が、作動点を受けることができる。これらの特徴は、単純なディンプルであってもよいし、正確な配置を実現するため、ディンプル/スロット/平面の組み合わせを運動学的カップリングとして使用することもできる。
【００６５】
3つの作動点の位置が与えられている場合にプローブの垂直位置を特定するために、xy座標系は、作動点の1つが原点に位置し、2番目の点がx軸上に位置するように平行移動できる。
【００６６】
すると、各ウェルの中心は、新たな組の軸に平行移動される。次に、原点における第1作動点と、新たなx軸での第2作動点との間の傾きが求められる。次に、新たなｘ軸と、新たなｙ軸に沿った第3作動点の値との間の傾きが求められる。この時点で、各ウェルの中心のz位置は、新たな組の軸に沿った各ウェルの中心の傾きと座標を使って求めることができる。
【００６７】
平行移動された座標系の画像を図2に示す。
【００６８】
2.1.6 エンコーダまたはステッパー、リミットスイッチ
アクチュエータは、ウェル内でのプローブの略絶対位置と、以前の位置に対する正確な位置関係を与えるように設計されている。1つの構成では、作動点は、耐久性デバイス110から延びるロッド116である。多くの可能な設計の中で、これらロッドは、アクチュエータ114内のねじ込みブッシュを介して耐久性デバイスに結合され得る。ロッドがその円筒軸の周りに回転されると、ロッドはデバイスに対して伸張したり、後退したりする。 別の構成では、傾斜を有する円盤がピンの上端に当接していて、円盤の最も厚い部分ではピンがデバイスから伸張され、円盤の最も薄い部分がピンと位置合わせされたときに、ピンがデバイス内に後退できる。さらに別の構成では、屈曲部を利用して、水平方向の運動を垂直方向の運動に変換する。さらなる構成では、アクチュエータが固定された高さに保持され、3本の親ねじが、デバイスの耐久性部分を昇降させるために使用される。
【００６９】
アクチュエータには多数のオプションが存在する。位置エンコーダと組み合わせたピエゾデバイスで作動させることができる。あるいは、エンコーダと組み合わせて直流電動機を使用してもよいし、サーボモータを採用してもよい。各サイクルが一定の角度でステッパーモータを回転させるため、ステッパーモータが実現する作動は有利である。よって、ステッパーは、正確な相対距離の並進には効果的である。
【００７０】
ステッパーモータは、デバイスの初期化時に使用できるリミットスイッチと一体化できる。リミットスイッチは、アクチュエータの絶対位置基準を与える。さらに、加速度センサーを用いて、例えば重力ベクトルの向きなどの絶対位置の決定を支援したり、または、加速度信号パターンの増大もしくは欠如による並進限界でのミスステップを監視したりできる。
【００７１】
いくつかの実施形態では、水平に配向されたステッパーモータは、トルクを増加させ、ステップサイズを減少させるためにギアヘッドと結合されている。そして、ギアヘッドは、回転軸を水平方向から垂直方向に変換するベベルギアを駆動する。作動ピンは、細かいピッチでねじ切りされており、耐久性デバイスに収容された適合するブッシュに結合される。ステッパーモータの各ステップは、ピンの伸張を約1 μm並進させる(1ステップあたりの目標並進量は0.01-10 μmである)。より大きなステップサイズでは、移動範囲全体でのステップ数が少なくて済むため、消費電力の面で理想的だが、より小さなステップサイズでは、よりスムーズな動作と精度の向上が可能となる。
【００７２】
移動方向が反転するとバックラッシュが発生する。このバックラッシュは、方向が逆になるたびに付加的ステップを追加することで、動作時に測定しかつ計算に入れることができる。さらに、ねじピッチが細かい親ねじを選択すれば、回転バックラッシの影響を最小限に抑えることができる。このように、名目上の角度バックラッシは、より小さい垂直バックラッシに変換される。モータに取り付けられたギアボックス、ピニオンとベベルギアの歯の比、および親ねじのねじピッチから得られる機械的優位性をバランスさせることによって、ステッパーのステップを垂直方向の位置変化に変換するためのシステムの総合的な機械的優位性を維持することができる。所定の角度バックラッシに対して、機械的な利点を集中させて親ねじで発生させることは、バックラッシを最小化する上で有利になる。
【００７３】
2.1.7 内部伸縮式ピン
ピンがベベルギアを介してステッパーモータに直接結合されている場合、ピンがデバイス内に伸縮する際にベベルギアの位置は一定であるべきである。ピンをベベルギアに対して摺動させるいくつかの方式がある。キー溝(または非円形)をピンのシャフトに切削加工すれば、ベベルギアは、ピンシャフトに沿って軸方向に摺動するが、回転はできない。この構成では、ピンがデバイス内に後退する際に、ピンの上面が上昇するため、デバイスは、ピンが完全に後退した状態で、ピンを収容するための十分な大きさが必要となる。いくつかの実施形態では、ベベルギアは、キー溝(または六角形のような別の非円形形状)を含むシャフトに剛性固定されている。このシャフトは、位置合わせ特徴を有する別の円筒状シャフトに挿入されている。この第2シャフトの外側には、ねじ山が形成されており、電子部品のねじ込みブッシュと接続している。この形式は、ベベルシャフトが作動ピン内部で入れ子式に伸縮するので垂直方向にコンパクトになる。図3A-Dは、伸縮式ピン300の例示的な実施形態を示す。
【００７４】
2.2 使い捨てプローブ蓋
2.2.1 ウェルへのプローブの挿入
蓋130は、プローブ160のアレイを含み、例えば、プローブは、蓋の内面から延伸する一体型のロッドとして形成されている。蓋がデバイス110に固定されると、各プローブは、デバイスのセンサーアレイ内のセンサー112に結合される。蓋(または蓋とデバイスの組み合わせ)は、すべてのプローブが平面的に一緒に移動するようにそれらを拘束する。プローブ160は、蓋の平面(すなわち、プレート120の上部に平行な水平面)に対して垂直なベクトルに沿って延伸ように構成されている。プローブは、x-y平面内で、ウェルプレート120内のウェルのアレイと位置合わせされるように構成されている。プローブは、ウェルの中心またはウェル内の他の特定位置(例えば、中心からオフセットした位置、側壁から一定の距離にある位置など)に位置合わせされるように構成することができ、さらに、多数のプローブが、単一のウェル内のパターンをカバーするように構成することができる。蓋のプローブの、ウェルプレート中心との位置合わせは、ウェルプレートのテーパ状の外壁と接続する蓋の垂直部分の内面の隆起によって達成され得る。テーパ状の壁を有する接続プレートおよび様々な外形寸法を有するプレートで柔軟性を持たせるために、これらの隆起は、屈曲部として構成することができる。プローブは、ウェル内で流体の上面を貫通するように構成され、ウェルの底部における(またはウェル内に懸濁している)細胞とプローブ先端との間の名目上のクリアランスが常に維持されるようにさらに構成されている。これは、プローブがウェル底部からある程度の名目上の距離(典型的には50-500 μm、より好ましくは100-400 μm)内を移動できないように、プレートの上面の特徴と接続する蓋の表面上の確実な止めによって達成され得る。プローブの進行方向に垂直なウェルの断面積は実質的に一定である。断面積が一定であることで、ウェル内でのプローブの絶対位置の重要性が最小限に抑えられる。
【００７５】
2.2.2 蓋が垂直移動並進を実現する
蓋は、プローブの軸に沿って並進する(蓋のわずかな傾きは無視される)。細胞がウェルの断面で均一に分布している場合、ウェル内には直線的な酸素の勾配が形成されうる。細胞の均一な分布および実質的に一定のウェル断面積の両方は、これらがプローブの絶対位置の重要性を最小限にするので、いくつかの実施形態の設計の重要な側面である。
【００７６】
蓋は、培養プレート上に配置され、培養ウェルの上部を覆う無菌バリアの効果を促進する。従って、非滅菌作動ピンは、培養プレートの表面に直接接触すべきでないが、(作動ピンが培養プレートのフットプリント内に含まれている場合には)代わりに蓋に接触し、それが次に培養プレートに接触すればよい。このように、蓋は、耐久性デバイス内の回路によって開始される作動の並進を可能にする機能を含むように構成して、ウェルプレートに対するプローブの相対的な位置を変化させることができる。より具体的には、蓋は、光電子センサーのアレイが、プローブをウェル内で垂直方向に移動させることができるように構成することができる。
【００７７】
蓋のいくつかの特徴を用いてこの機能を実現する。蓋は、プローブを拘束し、耐久性デバイスとそのセンサーアレイとを接続する剛性部分を含むように構成することができる。蓋とセンサーアレイデバイスとの間の接続の一側面は、接続部が蓋を拘束するように構成できるため、デバイスが移動するときに蓋がそれと共に移動することである。この拘束は、例えば、蓋とデバイスとを結合する磁気吸引力が存在する場合に達成される(2.1.2項参照)。 代替的に、これを達成するには、蓋がウェルプレートから最大に離れるようそれ自身を自然に強制的に延伸させ、デバイスが、蓋がウェルプレートに与える対向力の強さに対して十分な重量を与えることで、蓋がウェルプレートに完全に対して平坦に潰れるようにすればよい。蓋はまた、無菌バリアを壊すことなく、蓋の平面上での運動の並進を可能にする可撓性領域または摺動領域を提供するように構成することができる。
【００７８】
また、磁石で耐久性センサーアレイに対して蓋を可逆的に保持する構成において、保持力をオンまたはオフにできるように、磁石を配置したり、複数位置間で移動させたりしてもよい。あるいは、電磁石をオンまたはオフし、或いは永久磁石に対向するようにオンにすることができる。
【００７９】
代替構成では、蓋の特徴が蓋内で垂直に上下に摺動することができる場合、作動ピンがプレートのフットプリント内に留まる一方で、蓋の無菌バリアの周りに配置可能となる。作動ピンによって押圧されると、これらの受動ピンは、同様に、培養プレートの水平面を押圧することができる。
【００８０】
蓋の平面に無菌バリアを維持しながら、同時に蓋の平面を通る運動の並進を可能にするいくつかの構成がある。1つの構成では、可撓性隔膜が利用される。この隔膜は、作動ピンの並進に対する抵抗を最小にするように、折り畳まれるかまたは緩く所定の位置に保持することができる。このアプローチの潜在的な欠点は、厚い膜は、蓋によって押圧されたときに一定の厚さを維持しない可能性があり、蓋の厚さに対して比較的薄い膜は、ウェルに対してプローブが動く前に作動ピンが移動するよう構成されうるデッドスペースを生じることである。
【００８１】
第2の構成では、蓋内で垂直方向に摺動可能なピンが提供される。ピンの垂直配向を維持するためには、ピンにおける蓋の最下部の平面拘束と、ピンにおける蓋の最上部の平面拘束との間の垂直方向距離を最大化することが有用である。平面拘束は、例えば円筒の穿孔でよい。いくつかの実施形態では、例えば射出成形を容易にするために、蓋の厚さを最小限にすることが望ましい場合がある。蓋の厚みが最小であれば、垂直方向に摺動するピンを蓋の垂直方向の薄い壁に配置することができる。ピンの垂直方向の移動限界は、ピンと蓋との結合を維持するように拘束できる。この垂直拘束特徴は、ピンにおける2つの垂直束縛特徴と、ピンにおけるこれら2つの束縛特徴の間に位置する蓋における1つの垂直束縛特徴とで構成することができる。代替的には、垂直拘束特徴は、蓋における2つの束縛特徴と、蓋におけるこれら2つの垂直拘束特徴の間に位置するピンにおける1つの垂直拘束特徴とで構成されていてもよい。
【００８２】
第3の構成では、屈曲部を用いることで、耐久性デバイスおよびデバイスに支持されたセンサーアレイから、使い捨て蓋平面を介してウェルプレートの表面への並進運動が可能になる。この構成の利点は、移動特徴が蓋の同一平面内で(その移動軸に沿ってとは対照的に)蓋に拘束され、移動軸に沿った屈曲部の厚さが設計で選択可能な固定値であることを含む。具体的には、移動軸に沿った屈曲部の厚さの設定によって、デッドスペースを最小限に抑えることができる。最後に、屈曲部は、蓋の平面の利用可能な領域をより良く利用できる。いくつかの実施形態では、屈曲部は、蓋の周縁部の近傍に配置されている(例えば、図1Bに図示されているように)。
【００８３】
2.2.3 屈曲部荷重および中立位置
屈曲部がプレートを介して運動を並進するのに使用される場合は、屈曲部は、屈曲部の弛緩状態である中立位置が、移動限界の内側または外側の任意場所に位置するように構成することができる。具体的には、屈曲部のばね作用が蓋を耐久性センサーアレイから分離する傾向がないように、屈曲部の中立位置は、作動ピンの最大範囲の近くまたはそれを超えて選択することができる。
【００８４】
この構成では、屈曲部の剛性は、手持ち型センサーアレイ(約250g)の重量で屈曲部が完全に変形し、プローブがウェル内で最も低い位置まで下がるように設定されている。図1A-Bは、比較的可撓性のある部分132が、パッド133に結合されている蓋の屈曲部を示す。図4A-Cに別の図が示されており、耐久性センサーアレイが蓋の上に載置されていないときには(図4A)、屈曲部132、133が使い捨て蓋の重量を支持し、耐久性センサーアレイの重量下では完全に平坦に潰れていることを示す3つの使用状態を示す(図4B)。 作動ピン116が屈曲部のパッド133の上面に押し付けられると、センサーアレイの重量が使い捨て蓋から持ち上げられ、蓋が上昇するにつれて屈曲部が弛緩する(図4C)。磁石(例えば、図1A-Bの135、136)または他の結合機能を使用して、蓋が上昇するに際に、蓋と蓋読取装置との間の強固な結合を維持することができる。また、蓋の屈曲部による持ち上げ力は、センサーアレイと蓋を持ち上げるのに必要な作動ピンからの力を減少させる。
【００８５】
一般に、屈曲部分132は、蓋130の他の部分よりも大きな可撓性を有しており(例えば、材料の組成によるか、または屈曲部を形成する蓋ンの切り抜きの幾何学的形状による)、容器に対してデバイスが移動する際に、蓋の少なくとも第1部分が容器と接触状態を維持し、屈曲部分によって第1部分から分離された蓋の少なくとも第2部分(例えば、屈曲部のパッド133)がデバイスと接触状態を維持する。
【００８６】
2.2.4 独立型カバーを備えた蓋に組み込まれた屈曲部
並進を許容する蓋130の特徴は、蓋の表面の平面内にギャップを必要とすることがあるが、これらのギャップは、蓋によって形成される無菌バリアを低減させることがある。図5Aは、例示的なギャップ510を示す。図5Bに示す別個のカバー520は、蛇行状経路512が形成され無菌バリアが維持されるように、屈曲部の上に挿入することができる。別個のカバーを使用することで、蓋の製作が容易になる。代替構成では、蛇行状経路の特徴が直接蓋に組み込まれており、屈曲部は、組立時に蓋に取り付けられる独立部品である。
【００８７】
カバー520は、接着、溶媒結合、圧入、超音波溶接、または他の任意の技法を介して、蓋130に恒久的に取り付けられてもよい。一実施形態では、カバーは、完全な無菌バリアを維持する膜である。
【００８８】
2.2.5 蓋の半透明性
いくつかの実施形態では、蓋は、画像化するため光が蓋を通過することができるように(例えば、容器の透明な底部を介して見るために蓋を介して試料を照らすために)、無色で半透明である。例えば、蓋は、半透明または透明なアクリルまたはポリスチレンから形成される。デバイスに含まれる電子機器は不透明であるが、蓋によって形成された無菌バリアを妨げることなく、デバイスおよび含まれる電子機器を蓋から容易に分離することができる。
【００８９】
2.2.6 蓋の光集束特徴
いくつかの実施形態では、蓋は、広い領域からの光を捕捉し、その光を小さなプローブ材料に集束する光集束特徴を含む。これら集束特徴はまた、感知材料から放出された光を集光デバイス(例えば、フォトダイオード)にコリメートまたは集束させる。光集束・移動特徴は、光ファイバを含むことができ、この光ファイバは、硬質プラスチックまたはステンレス鋼管のような硬質材料で被覆されてもよい。細胞培養ウェル内に存在する光集束特徴の端部は、典型的には直径断面が250-800 μmの間の最小直径を有する。図6は、ウェル内の一定の高さで所定の位置に保持されたプローブの直径に依存する酸素濃度レベルの乱れの量を示す。この図は、細胞による酸素消費の後に零次酸素反応が続くことを仮定している(すなわち、基質制限されていない)。
【００９０】
ウェル内の細胞への酸素の運搬を乱さないように、また、プローブがウェル内を移動する際の流体の乱れを最小限に抑えるように、断面は最小化されている。光集束特徴の形状は、円筒形または円錐形でよく、プレートの上面側に集光のためのより大きな面積を有し、最大で4 mm、或いは最大で6 mmもの直径を有してもよい。オプションとして、プローブは、独立型の構成要素として製造し、例えば2.2.4項に記載された技法を使用して蓋と一体化させてもよい。
【００９１】
2.2.7 一体型の流体計量分配ポート
蓋は、ウェル内の細胞に加えられる薬剤などの少量の流体を保持するための容器を含むことができる。例えば、インキュベーター内で容器とカバーが平衡になった後、流体を試料に加え、酸素消費量の変化を測定して、流体が試料に与える影響を評価することができる。容器のアレイは、プレートのウェルと位置合わせ可能である。例えば米国特許第8318479号のような空圧式の方法または機械式の方法を含む、流体を計量分配するための様々な方法が存在する。さらに、容器の設計は、自然状態では閉じている多数の屈曲部を含むことができる。屈曲部の数は、それらが分離されたときに、流体の液滴を保持するための最小の表面積が存在するように、4から8または16までの多数であってもよい。この少量の流体は、例えば、最大20マイクロリットルまたは100マイクロリットル未満でよい。いずれの屈曲部の最大表面積も、流体の液滴にかかる重力が、屈曲部表面と液滴との間の表面張力からの力よりも大きくなるように設定することができる。閉位置における液滴と多数の屈曲部との間の表面張力は、液滴にかかる重力よりも大きくなることがある。また、屈曲部は、レセプタクルの上部にタブを含み、ピンが容器の上部に挿入されると、屈曲部が開き、容器内に含まれる流体が下方のウェル内に落下可能にすることができる。 いくつかの実施形態では、ピンが容器内に保持された流体に決して接触しないように、タブが位置決めされる。垂下した流体を保持するために利用可能な表面張力を最小にするように、レセプタクル屈曲部の下端は、点を備えるように設計することができる。
【００９２】
流体計量分配ポートを組み込むための別のオプションは、アクチュエータの位置に応じて傾斜が急になり下方の容器内の流体と混合するように流体を落下させる、浅い傾斜を備えた傾斜ウェルを設けることである。一般的には、既存のシステムの動作を利用した流体の計量分配方法を用いることができる。
【００９３】
2.2.8 較正特徴
使い捨て蓋は、一意の識別コード(例えば、図1A-Bに図示されているように、読み取り専用メモリ139に埋め込まれている)を含むことができ、これは、電子的に(例えば、図1A-Bに図示されているように、読取装置138がメモリ139と電気的に接触することによって)、光学的に、または他の方法で、耐久性電子デバイス110によって読み取ることができる。この識別コードまたはプロセスは、蓋の真正性を確認するために使用することができる。また、蓋は、較正および使用情報を格納すると共に蓋の真正性を確認するための電子機器を含むことができる。この較正情報は、光減衰率と酸素濃度との間の関係を示すシュテルン・ボルマー定数を潜在的に含むことができ、較正は、温度補償を実行するための情報、センサーの有用寿命を計算に入れるための情報、ならびにプローブの応答時間および、または関連する拡散定数に関連する較正情報を含むことができる。
【００９４】
2.2.9 内蔵型の蓋電子機器
蓋は、プローブ較正定数、識別コード、製造年月日、認証署名などのデータを格納するための電子機器(例えば、EEPROM)を含むことができる。このデータは、通信インターフェースを介して光電子センサーアレイによって読み取ることができる。また、この蓋電子機器は、蓋の着脱を検出するための機能を含むことができる。
【００９５】
3 例示的な測定プロセス
図7を参照すると、測定システムを動作する際に使用できる測定処理700の一例は、3つの異なる種類の手順を含み、プローブの移動パターンを制御すること(702)、センサーの読取り値を取得すること(704)、およびウェル環境のパラメータ、すなわち細胞酸素消費量を推定するためのアルゴリズムを実行すること(706)という、その幾つかの側面を同時に実行することができる。
【００９６】
3.1 連続的移動パターン
いくつかの実施形態では、測定システムは、一組のプローブを移動パターンに従って垂直方向に移動させる。記載されているパターンは、測定値が、それらが測定された高さに1対1で対応するように処理される様々な固定高さで一連の測定を行うように構成されたパターン(ステップパターン)とは異なる。ステップパターンでは、ある高さでの測定がプローブの以前の高さ(またはより一般的なパターン)と相関しないように動作を一時停止するように構成されている。記載されたシステムでは、移動パターンは、測定環境によって変換され出力信号を生成する入力波形として見ることができる。このように考察すれば、信号解析及び処理に用いられる技法を、計測プロセスを最適化するために、計測環境の特性評価や推定に利用することができる。
【００９７】
1つの種類の移動は、移動中に有意な休止(例えば、アクチュエータを制御するためにステッパーモータの使用に固有の休止よりも大きい休止)が存在しない連続的移動(例えば、流体中の質量移動の時間尺度で実質的に連続している)である。もう1つの種類は、プローブを2つの位置の間で比較的迅速に移動させた後、かなりの時間休止させる段階的な移動である。場合によっては、勾配が確立されるのに十分な長さの一時停止が行われる。勾配が少なくとも部分的に確立される「明確な停止」を使用するこの種の段階的パターンは、明確な停止(例えば、約50個の時定数よりも長い)が測定システムの応答性を低下させるため、測定処理700のいくつかの実施形態にとって最適ではない。記載された測定システムを使用して実行される測定処理700のいくつかの実施形態の重要な一側面は、勾配が再確立され、かつ/またはセンサーの読取り値が安定するために他のいくつかのシステムが必要とすることがある明確な停止なしに、移動パターンを使用して動作することができることである。さらに、移動速度は可変であるが、典型的には、ストークス流によって決定される無次元数の閾値によって設定される速度制限を超えないように、そしておそらくは拡散定数によって設定される速度制限を超えない程度に十分に遅い。
【００９８】
いくつかの実施形態では、移動パターンは、「連続的移動パターン」を含む。本明細書で使用される場合は、「連続的な移動」は、厳密に連続的な移動(すなわち、休止がない)、または、段階的運動における休止の持続時間がシステムの時定数に比べて比較的短い(例えば、約20個の時定数未満、または約10個の時定数未満)段階的移動のいずれかとして理解されることが意図されている。いくつかの例では、システム時定数は、プローブの直径に基づくことができ(例えば、移動速度に関する場合)、他の例では、システム時定数は、プローブの移動距離に基づくことができ(例えば、プローブによる勾配の乱れに対する安定化を待つ場合)、他の例では、時定数は、プローブと試料との間の距離に基づくことができ、他の例では、時定数は、試料と気液界面との間の距離に基づくことができる。このような連続的な移動は、外乱が散逸するための遅延を必要とせずにモデル化することができる態様で、濃度勾配の継続的で正確な外乱をもたらすことができる。
【００９９】
3.1.1 固定移動パターン
このシステムは、様々な種類の連続的移動パターンで動作可能である。これらの移動パターンには、正弦曲線、異なる周波数での多数の正弦曲線、のこ歯、シンク、チャープ、または確率的/不規則なパターン(例えば、ランダムウォーク)が含まれる。一般に、より広い範囲をカバーするパターンは、与えられたプローブセンサーの解像度に対してより良い解像度の測定を与える(すなわち、異なる勾配レベル(特に、低酸素消費量に対応するより低い/平坦な勾配レベル)に対してより敏感である)。一方、より頻繁に繰り返すパターン(すなわち、高速/短周期パターン)は、より高い時間分解能を達成することができ、消費の変化をより早く検出することができる。例えば、比較的高い周波数で、低い振幅(すなわち、小さな可動範囲)の正弦波パターンは、より急速に変化する高い勾配に対してより迅速に応答する一方、より遅い周波数で、より大きな振幅のパターンは、応答時間を犠牲にして、低い(すなわち、浅い)勾配に対してより良い精度を与える。さらに、チャープ移動パターンは、所定のプローブの応答時間を示すことができる。不規則なパターンは、規則的なパターンとの相関によって干渉を起こしてしまうような外部プロセスによって測定誤差が導入されないことを保証できる。
【０１００】
既知のパターンを使用して、センサー読取り値のノイズを濾過して除去することもでき、すなわち、センサー感度の効果的なゲインが得られる。例えば、移動パターンが正弦波であり、環境がフィックの法則の下でモデル化されている場合、信号は、基礎となる濃度勾配から得られる信号に影響を及ぼさずに通過させつつ、ノイズを減衰させるローパスまたはバンドパスフィルタでフィルタリングすることができる。波形としては、ステップパターンは広帯域の周波数を占有し、その結果、センサーの読取り値に含まれる関心のある信号も同様に占有する。従って、ステップパターンを使用する場合、関心のある信号を減衰させることなくセンサーノイズをフィルタリングすることは困難である。
【０１０１】
移動パターンの選択および構成は、システム性能のトレードオフをもたらすので、システムは、実験の種類およびユーザーが関心を持つ特性に応じて、異なるモードで動作するように構成することができる。ある構成では、ユーザーは、細胞の挙動におけるより高い周波数の変化を測定するために、より深い移動パターン(細胞により近い)を選択してもよい。別の構成では、上述したように、より良い解像度を得るために、より広い範囲をカバーするパターンをユーザーが選択してもよい。別の構成では、ユーザーは、細胞への酸素運搬に対するプローブの影響を最小限にするために、ウェル内のより高い位置で動作する移動パターンを選択してもよい。別の構成では、ユーザーは、細胞への酸素輸送を特定のプロファイルで調整する移動パターンを選択することができ、測定と環境制御の両方のためにシステムを同時に使用する。
【０１０２】
ユーザーには、選択肢のサブセットから、または短い質問調査によって所望の性能を選択するよう指示するようにシステムを構成可能であって、実際の移動パターンは、ユーザーからの入力に基づいて決定される。さらに、理想的な移動パターンは後述するように自動的に決定できる。
【０１０３】
3.1.2 動的移動パターン
ユーザーの関心に基づいて選択できるモードやパターンに加えて、システムは、実際の外部事象に基づいて自動的に移動を更新することができる。これらの異なるパターンモードは、システムのセンサーまたは外部センサーによって確認された環境状態に基づいて自動的にトリガすることができる。例えば、大部分またはすべてのウェルで低酸素勾配が検出された場合、最適な移動パターンは、細胞に近いより深いものでもよい。ほとんどまたはすべてのウェルで急な酸素勾配が検出された場合、より急な勾配での高解像度のために最適化された移動パターンを使用することもできる。移動パターンはまた、追加情報を最も必要とする方向を決定することに少なくとも部分的に基づいて自動的に決定してもよい(例えば、ウェルにカルマンフィルタの不確定性の状態を使用することによって)。さらに、すべてのプローブが同じ垂直パターンに沿って移動しないように、移動パターンを各作動点ごとに独立して設定することができる。 任意の数の次の特徴を用いて、測定システムのいくつかの実施形態で動的な移動パターンを実現できる。
(1)蓋には、電気的、能動的もしくは受動的、または非電気的(例えば、光学的、磁気的)のいずれかの特徴が含まれており、蓋が取り付けられたことを電子機器が感知可能である。
(2)電子機器には、加速度、温度、相対湿度、酸素分圧、周囲光、酸素、二酸化炭素、または他のガスの中心化(centration)、または他のセンサーをおそらくは含むことになる内蔵センサーが搭載されている。
(3)一連の移動の開始または終了は、蓋の取り付け(取り外し)や他のセンサーの読み取りによってトリガすることができる。
(4)移動パターンには、リミットスイッチを利用したゼロ化ステップが含まれており、加速度計/蓋の取り付けによってトリガされる。
(5)動作パターンの状態(次の動作の決定)は、システムの現在の状態(ダム、事前にプログラムされたパターン)だけでなく、1つ以上の内蔵センサーで計測された環境(被試験システム)の状態によっても調整される。例えば、センサーの読取り値は、以下うちの任意のものをいくつでも含むことができる：
a. 加速度計の読取り値は、プレートが持ち上げられたか、降ろされたことを示すか、または棚の上で水平でないことを示す。
b. 全体的に低消費速度であれば、プローブがウェル内でより低い位置に、またはより大きな範囲で移動するのに対し、高消費速度であれば逆をトリガすることができる。
c. 勾配が安定していれば、プローブをシフトしてウェル内でより低い位置に移動させることができ、作動速度を遅くすることができ、または振幅を増加させることができる。
d. 大気(または湿度などの他の環境要因)未満の温度読取り値は、培地の最近の変化を表すことがあり、プローブを単一位置に保持することが望ましいこともありうる。
【０１０４】
3.2 センサー読取り値
溶存酸素濃度の測定値を得るためのセンサー読取り値は、様々な方法で取得できる。光学特性が周囲の酸素環境に敏感な材料を用いることができる。この物質は、LEDからの光で励起され、光子の放出または分子酸素へのエネルギー移動(消光)によって基底状態に戻ることができる。発光量と発光の減衰率は、シュテルン・ボルマーの関係を介して酸素分圧と逆関係にある。励起光源の強度は、不規則なパターンで2段階(典型的にはオンとオフ)の間で調節することができる。この不規則なパターンは、擬似ランダムコードを介して生成することができ、これはローパスフィルタリングされた後、2つのレベルに離散化できる。このコードは、ASICまたはFPGAなどの論理回路から出力できる。応答は、アナログ/デジタル変換器を使用して読み取ることができ、デジタル化応答は、論理回路上で処理することができる。ADCの発光信号の各読取り値は、例えば再帰的方法を使用して、FPGAで処理することができ、いくらかの所定の読取り時間後の最終的なシステム応答は、さらに分析され、減衰率に変換することができる。そいした技法の例は、例えば、参照により本明細書に援用する米国特許第9,075,011号に、より詳細に記載されている(援用された文書で使用されている用語は、本明細書で使用されている用語と多少異なる場合があるかもしれないが、用語が矛盾している場合には、本明細書で使用されている用語が優先される)。
【０１０５】
処理は再帰的であるため、センサーの読取り時間は任意に設定することができる。センサーの読取り時間が短い場合は(1-100 ms)、より長い読取り時間(100-600 ms)に比べて、各センサーの読取り精度が低くなる可能性がる。すなわち、測定においてより高い感度および/または解像度を得るには、より長い持続時間のセンサー読取りを実行すればよく、あるいは、センサー読取り時間を短くすると、測定感度および/または分解能が犠牲になりうる。読取りが短い場合は、与えられたセンサーの前回の読取り値を使用して、アルゴリズムの起動エラーが最小化されるように再帰パターンを初期化できる。複数の短時間の読取り値を一緒に処理することで、下流の処理のための単一の高精度読取り値を生成できる。
【０１０６】
このセンサー方法の特性は、本システムの全体的な性能を最大化するために使用できる。移動パターン、測定モード、実験の種類に合わせて、センサーの読取り時間を変更することができる。例えば、より優れた時間分解能を得るために調整された移動パターンは、より短いセンサー読み取り時間の使用と一致させ、さらに優れた時間分解能を生成できる。あるいは、酸素消費/勾配測定の最大感度が望ましい場合は、より長いセンサー読み取り時間を、より高い分解能を得るために調整された移動パターンと組み合わせて使用できる。コスト、サイズ、または電力などの他のシステム制約を満足させるために、代替的な構成では、より長いセンサー読取り時間を、より小さな範囲の移動パターンと組み合わせて用いてもよい。動的に選択された移動パターンと同様に、このトレードオフ選択は、検出された環境条件に基づいて動的に実行できる。
【０１０７】
一般的に、このセンサー読取り方法によって提供される構成可能な読取り時間と分解能のトレードオフは、システム設計と動作に大きな柔軟性を与える。
【０１０８】
3.3 推定アルゴリズム
3.3.1 アルゴリズムの概要
いくつかの実施形態では、ウェル環境のパラメータを推定するためのアルゴリズムのステップの一例は、以下の通りである。
(1)移動周期に沿った時点tでセンサーの読取りが行われる。
(2)読取り値が、較正データと温度データを用いて酸素濃度測定値c(t)に変換される。
(3)深さc(z, t)の関数として濃度測定値を与えるために、センサー応答伝達関数とサイクルパターンに基づいて推定測定パターンの高さが計算される。
(4)新たな測定値と一組の以前の測定値を使用して、濃度対高さの回帰が実行され、1つ以上の離散的なパターンの高さでの濃度が補間される。
(5)補間された濃度に基づいてカルマン観測値が生成される。
(6)新しい観測値がカルマンフィルタに適用され、フィックの法則に基づく状態遷移モデルに従って推定値を更新する。
【０１０９】
図8を参照して、測定システムを動作させる際に使用できる推定処理の例は：時刻c(t)で濃度測定値を受信し、高さc(z, t)での濃度測定値を与えるために、センサー伝達関数の反転を適用し(802)；カルマン観測値を与えるために離散的な高さで濃度補間を実行し(804)；処理された測定値を与えるために、カルマンフィルタを適用する(806)段階を含む。
【０１１０】
3.3.2 センサー応答の考慮
センサープローブは、正確な測定データを与えるために計算に入れることができる応答遅延を有している。応答遅延を計算に入れるための1つの方法は、センサーが安定するのに十分な時間が経過するまで、所定の深さで停止し、読取り値を破棄することである。細胞の消費速度が可変である場合があり、長い固定休止が過渡的応答を低下させるので、この方式は、いくつかの実施形態では好ましくない場合もあり得る。連続的な移動パターンでは、センサーの読取り値は、プローブが現在配置されている深さでの濃度に対応する値で安定するとは限らない。1つのアプローチは、センサーの遅延に対して十分に遅い移動パターンを使用して、移動パターン内の所定のポイントでの読取り値が、ある閾値内で所定の深さでの実際の濃度に対応させることである。
【０１１１】
別のアプローチでは、センサーの応答遅延を、移動パターンの波形を入力とするシステム伝達関数とみなす。高さの関数としてセンサー読取り値を得るために、このセンサー伝達関数を測定または推定した後、補償することができる。この補正は、移動パターンに応じて時間シフトやスケーリングを必要とすることがある。正弦波パターンに関して、短い時間枠の概ね定常状態の勾配を想定すると、センサーの伝達関数は、センサー読取り値を減衰させ、移相させるローパスフィルタとしてモデル化することができる。このフィルタリングは、その後、デコンボリューション(すなわち、移相とマグニチュードスケーリング)によって補償することができる。この伝達関数は、定常状態の線形勾配または非定常状態の勾配(例えば、erf関数を使用してモデル化されたもの)を想定し、次に、移相(センサーラグ)を推定するための制約付き最適化アルゴリズム(例えば、力ずくの誤差最小化)を実行することによって、動的に計算することができる。
【０１１２】
3.3.3 観測モデル
図11Bに示すように、センサー応答が補償された後は、定常状態の勾配における濃度読取り値は、高さの線形関数となる。このことは、ウェルの底部における定常状態フラックス(すなわち、細胞酸素消費)と、上部表面における安定した大気条件状態とを備えた拡散勾配が形成されるとの予想と一致している。この時点で、これらの値は、一組均一で離散的な高さで濃度推定値を評価するために使用可能になり、カルマンフィルタに入力するためのカルマン観測値を与える。一組の少数の高さを用いた線形補間の例が図示されている。この補間段階によって、移動パターン内の任意の点におけるセンサー読取り値を使用しながら、より少ない濃度値のカルマン状態を使用できるようになる。
【０１１３】
3.3.4 カルマンフィルタ状態
カルマンフィルタ状態は、均一に間隔をおいた相対高さc0 ... cN-1での一組の濃度、細胞への/からの底部フラックスqc、上部フラックスqtから構成されている。状態の更新は、有限差分を使用してフィックの法則に従って計算することができる。
【０１１４】
例えば、N個の高さ濃度を備えた状態xは次の通り：
【０１１５】
【数３】
2021536572.tif 000005
【０１１６】
3.3.5 カルマン状態遷移モデル
カルマン状態遷移更新は、いくつかの実施形態では、モデル化ウェル環境のためのフィックの法則に少なくとも部分的に基づいて計算することができる。
【０１１７】
3.3.6 出力測定値
このシステムの主要な測定パラメータ出力は、フラックスqcのカルマン推定値だが、それは、これが細胞活動に直接関連し、酸素消費速度のような細胞活動の特定の測定値へとさらに処理することができるからである。これに加えて、カルマンフィルタの他の状態変数は、すべて出力測定推定値として使用することができる。これらの測定値からも、より高いレベルの測定値や事象が推測できる。高さの関数としての濃度推定値が特定の形状と一致する場合、不均一な細胞播種密度が推測される。さらに、低勾配ではあるが増大する勾配が多くのまたはすべてのウェルで検出された場合は、媒質変化事象を推測することもできる。これらの事象は、本明細書の他の箇所で説明したように、移動パターンの変化を自動的にトリガできる。
【０１１８】
一般的に、細胞による酸素消費が均一な場合、定常状態では、ウェル内の勾配は均一な一次元の線形勾配に減少する。これは、細胞密度も均一であることを前提としている。プローブの経路の直下で消費量が多くなると、ウェルの底部に向かって勾配が高く、ウェルの上部に向かって低くなり、プローブの経路に沿って上向きに湾曲した勾配が形成される。プローブの真下よりもプローブから離れた場所で消費量が多い場合は、その逆になり、プローブの経路に沿った勾配が下向きに湾曲する。この情報を使用して、システムは、ウェル内の細胞の不均一な分布をユーザーに知らせたり、予想されるバルク消費測定値またはウェル表面における測定範囲をユーザーに知らせたりできる。
【０１１９】
他の実施形態では、非線形時空モデル(例えば、外因性入力を有する非線形自己回帰移動平均モデルすなわちNARMAXモデル)が採用される(例えば、Stephen A. Billings.非線形システム同定：時間・周波数・時空領域におけるNARMAX法. ワイリー、2013年9月。ISBN 978-1-119-94359-4を参照のこと。)。このシナリオでは、現在のプローブ位置と濃度の読取り値の両方が入力として非線形モデルに入力され、このモデルを用いて、関心のある領域を通過する関心のある分子の運搬を含む基礎をなす系のパラメータを推定する。
【０１２０】
4 データの取り扱い
4.1 ソフトウェア
この測定システムは、様々な有用な動作を実行可能な多数のソフトウェアコンポーネントを実行するように構成できる計算サブシステムを含む。これらのコンポーネントは、デバイス内の回路で動作し、いくつかの実施形態では、光電子センサーアレイ(「使い捨てプローブ蓋」の項を参照のこと)に結合された組み込みソフトウェアと、データ処理および保存ソフトウェアと、データの可視化、デバイス制御、および一般的な実験室の機能のためのユーザーインターフェース・ソフトウェアとを含む。
【０１２１】
4.1.1 蓋一体化ソフトウェア
いくつかの実施形態では、デバイス内の組み込み素子(例えば、プロセッサまたは他の計算回路)にインストールされ、光電子センサーアレイに結合されたソフトウェアは、以下の任意のものに係わる機能を含む：
・光センサーの読み出し
・補助センサーの読み出し(温度、湿度、加速度計、気圧、環境光など)
・移動パターンを実行するための作動制御
・蓋の取り付けの検出
・蓋データの読み出し/書き込み
・蓋データの確認および認証
・データ処理および記憶システムとの通信インターフェース
【０１２２】
4.1.2 データ処理および格納
組み込み素子によって生成されたデータは、結合された二次システム上で実行されるソフトウェアによって付加的に処理、かつ格納してもよい。このソフトウェアは、例えば、デスクトップ上で実行してもよいし、サーバ上で実行してもよいし、組み込みOS上で実行してもよい。このソフトウェアは、ハードウェアコンポーネント間で分散させることができ、測定環境に対してローカルに存在しても、リモートに(すなわち、「クラウド」ソフトウェアとの通信を介して)存在してもよい。このソフトウェアは、データ測定値を後の分析のためデータベースに格納できる。このソフトウェアは、リアルタイムの可視化と監視のために、このデータをユーザーインターフェース・ソフトウェアに転送できる。また、このソフトウェアは、様々な方法でデバイスと通信することができ、USB、bluetooth、TCP/IP、WiFiなどの様々なプロトコルに依存してもよい。さらに、このソフトウェアは、冗長ストレージおよびデータ復旧のためのデータバックアップを実行できる。
【０１２３】
4.1.3 ユーザーインターフェース
システムは、ディスプレイ上にユーザーインターフェースをレンダリングするように構成されたソフトウェアによって管理されるユーザーインターフェースを介して監視および制御され、1つ以上の入力デバイスを介して入力を受信するように構成できる。このソフトウェアは、データ処理およびストレージソフトウェアと同じシステム上に存在してもよいし、タッチスクリーン・タブレットまたはワークステーションなどの別個のハードウェアデバイス上に存在してもよい。このソフトウェアは、従来のデスクトップアプリケーション、ウェブアプリケーション、モバイルアプリケーション、またはそれらの組み合わせでよい。そのソフトウェアは、ユーザーに提供されたシステム測定値を可視化できる。このソフトウェアによって、デバイスの動作制御や各種システムパラメータの設定が可能になる。
【０１２４】
また、このソフトウェアは、実験開始時刻、終了時刻、概要、メモ、事象、条件などのロギングなど、実験を行うのに便利な一般的な機能を含めることができる。
【０１２５】
また、このソフトウェアは、実験の結果を表示したり、実験のリアルタイムの実行時に任意の実験と比較するために、過去の実験から集計した結果を表示したりすることもできる。以前の実験から得られたこれらの結果は、同じデバイスで行った実験の結果であってもよいし、他のデバイスで行った実験の結果であってもよいし、他の研究室からの実験結果であってもよい。これらの以前の結果は、そのまま表示してもよいし、様々な技法を使って集計し、調整してもよい。
【０１２６】
4.1.4 実験の認証
また、システムソフトウェアは、実験室での実験の監査と検証のための実験認証機能を提供できる。科学データの捏造、改ざん、および盗用は重大な問題である。デジタル署名アルゴリズム(例えば、ECDSA)およびオプションでオンボード改ざん防止構成部品を使用することで、システムは、所与の実験に対して以下のことを保証するのに有用である：
・データの完全性：データは変更されていない(安全なオンボードデジタル署名)。
・属性：データは特定のデバイスによって記録されている(安全なオンボードデジタル署名)。
・データは特定の日時に記録されている(オンボード改ざん防止クロック)。
・データは特定の場所で記録されている(オンボード改ざん防止GPS)。
・優良実験室規範(GLP)の遵守。
【０１２７】
5 例示的な測定データ
図9は、指数チャープ移動パターンを使用した4つのセンサーからの1時間強の平均中心化された測定値(未較正)の例を示している。センサーは定常状態の線形勾配で動作しており、チャープ移動パターンの振幅は一定であるため、読取り値の振幅の変化は、移動パターン信号に作用するLTIフィルタまたは他のシステム伝達関数としてモデル化できる読取り値の周波数依存減衰を示す。注： y軸は、実験時間内の時間である。
【０１２８】
図10Aおよび10Bは、正弦波移動パターンを使用した4つのセンサーからの濃度測定値(図10A)、およびこのサイクルパターンに対する読取り値のセンサー応答(センサーラグ)を補償することなく、読み取り時のプローブ深さの関数としてのこれら濃度値(図10B)の例を示している。濃度対高さのプロファイルが、拡散の法則に基づいて予想されるプロファイルと一致しないため、データはさらに処理される。
【０１２９】
図11Aおよび11Bは、正弦波移動パターンを使用した4つのセンサーからの濃度測定値(図11A)、およびこのサイクルパターンに対する読取り値の概ね80秒のラグを補償した後のプローブ高さの関数としてのこれらの濃度値(図11B)の例を示している。補償後は、濃度対高さのプロファイルは、定常状態の線形勾配に従って線形を呈している。
【０１３０】
図12Aおよび12Bは、4つのセンサーのラグ補償された濃度値の集合から、N = 3の高さモデルのためのカルマン観測への変換の例を示す。バブルは、3つの高さのそれぞれで、回帰と補間に使用された値のクラスターを表している。破線は、各クラスターの線形回帰を表している。その後、各高さにおける濃度推定値(c1, c2, c3)を補間してカルマン状態を更新する。これらの線の傾き(dC/dz)はまた、プロファイル全体の非線形性の程度を推定するために使用することができる。これは、急速に変化するフラックスまたは不均一な消費分布(すなわち、不均一な細胞密度)のいずれかを示している可能性がある。注：x軸は、ウェル底部上のプローブの高さをマイクロメートル単位で表し、y軸は酸素濃度をミクロモル単位で表す。
【０１３１】
6 代替物および実装例
記載された実施形態のいくつかの代替物を使用できる。例えば、プローブは、例えば、様々な深さで酸素勾配を感知するために、ウェルに対して相対的に移動されるが、いくつかの代替案では、容器が固定状態を保ち、かつプローブが、例えばデバイスまたは他のなんらかのカバーの移動に伴って移動するのでなく、固定された基準(例えば、インキュベーター内の棚)に対して相対的に移動するのは容器である。
【０１３２】
多くの実施形態では、6、12、96個などのウェルのアレイを有する標準的な培養トレイが使用される。代替例では、細胞培養フラスコなどの単一ウェル容器を使用してもよく、単一ウェルに1つ以上の典型的には多数のプローブを入れてもよい。
【０１３３】
上述した技法は、デバイスまたはモジュール（例えば、制御モジュール及び/又は分析モジュール）上で実行するための命令を含むプログラムを使用して実施することができ、これらデバイスまたはモジュールは、これら命令を実行するための1つ以上のプロセッサまたは他の回路を含む。例えば、これら命令は、少なくとも1つのプロセッサおよび少なくとも1つのデータ記憶システム(例えば、揮発性および不揮発性メモリ、ならびに/または記憶媒体を含む)を含む1つ以上のプログラムされたまたはプログラム可能な計算デバイスまたはモジュール上で実行されるソフトウェアまたはファームウェアの手順を実行する。プログラムは、CD-ROMなどのコンピュータ読み取り可能な記憶媒体を含む任意の非一過性の媒体で提供されてもよく、汎用もしくは特殊目的のプログラム可能なコンピュータによって読み取り可能であってもよく、またはそれが実行されるコンピュータにネットワークなどの通信媒体を介して配信されてもよい。そうした各プログラムは、プログラムの手順を実行するために記憶媒体が装置によって読み取られたときに、計算デバイスを構成して動作させるために、そのデバイスによって読み取り可能な記憶媒体(例えば、ソリッドステートメモリもしくは媒体、または磁気もしくは光媒体)に記憶されていてもよいし、そのデバイスにダウンロードされていてもよい。
【０１３４】
上述の説明は、例示を意図したものであり、本発明の範囲の限定を意図したものではなく、本発明の範囲は、添付した特許請求の範囲を含む。他の実施形態も次の請求項の範囲に入る。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【国際調査報告】
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