(57)【要約】  ＣＤ１９変異体、ＣＤ１９変異体を識別する方法及び例えば癌を治療するためにこうしたＣＤ１９変異体を使用する方法が記載される。
2021508443.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２のアミノ酸配列の少なくとも１つのアミノ酸置換を含むＣＤ１９変異体であって、配列番号２の前記アミノ酸配列を含むポリペプチドより安定している、ＣＤ１９変異体。
【請求項２】
配列番号２の前記アミノ酸配列を含むポリペプチドのものより少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、４００％又は５００％高い、安定性の測定されたレベルを有する、請求項１に記載のＣＤ１９変異体。
【請求項３】
配列番号２の前記アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してプロテアーゼ切断に対してより抵抗性である、請求項１又は２に記載のＣＤ１９変異体。
【請求項４】
配列番号２の前記アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してより熱安定性である、請求項１又は２に記載のＣＤ１９変異体。
【請求項５】
表１Ａ、表１Ｂ、表２Ａ、表２Ｂ、表３、表６、図８Ｂ、図１１、図１２Ｂ、図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ又は図１５Ｂに挙げられる配列番号２の１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＤ１９変異体。
【請求項６】
配列番号２のアミノ酸位置の以下のセット：５／７／９；１４／１６／１８；２９／３１；２９／３１／３３；３５／３７／３９；４５／４７／４９；５２／５４／５６；５９／６１／６３；６２／６４／６６；７６／７８／８０；８６／８８／９０；１６７／１６９／１７１；１７５／１７７／１７９；１９３／１９５／１９７；２０６／２０８／２１０；２０７／２０９／２１１；２１９／２２１／２２３；２４０／２４３；２２４／２２６／２２８；２４７／２４９／２５１；２５３／２５５／２５６；２５５／２５６；又は２６１／２６２／２６４／２６５の１つ又は複数にアミノ酸置換を含む、請求項１〜４のいずれか一項に記載のＣＤ１９変異体。
【請求項７】
前記アミノ酸置換は、表１Ｂ、表２Ｂ、表３、表６、図８Ｂ、図１１、図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ又は図１５Ｂに示される置換を含む、請求項６に記載のＣＤ１９変異体。
【請求項８】
抗ＣＤ抗体に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＤ１９変異体。
【請求項９】
腫瘍抗原に結合する、請求項１〜７のいずれか一項に記載のＣＤ１９変異体。
【請求項１０】
前記腫瘍抗原は、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ＣＥＡ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバールウイルス抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６若しくはＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｅｒｂＢ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＧＰＮＭＢ、ＥＧＰ１、ＦＯＬＲ１、内皮受容体、ＳＴＥＡＰ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ネクチン−４、ＡＧＳ−１６、グアナリルシクラーゼＣ、ＭＵＣ−１、ＣＦＣ１Ｂ、インテグリンα３鎖（ａ３ｂ１、ラミニン受容体鎖）、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、グリピカン３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１又はＭＡＧＥ  Ａ３である、請求項９に記載のＣＤ１９変異体。
【請求項１１】
（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）請求項２〜８のいずれか一項に記載のＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質。
【請求項１２】
前記抗原は、自己免疫障害に関連する抗原である、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記抗原は、感染因子抗原である、請求項１１に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、又はＶＨＨ、又はフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記ＣＤ１９変異体は、断片の抗体の軽鎖のＣ末端又はＮ末端に融合される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ＣＤ１９変異体は、断片の抗体の重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記ＣＤ１９変異体は、断片の抗体の軽鎖のＣ末端に融合される、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列又はその断片を含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を含み、前記部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失している、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を含み、前記部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失している、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を含み、前記部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失しており、前記部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を含み、前記部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失しており、前記部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、前記部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失している、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、前記部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失している、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、前記部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失しており、前記部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
前記ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、前記部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失しており、前記部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つに描かれる少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）を含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
前記ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つに描かれるＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である少なくとも１つのＣＤＲを含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
前記ＶＨＨは、表５Ａ及び／又は表５Ｂに描かれる群１〜１３のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
前記ＶＨＨは、表５Ａ及び／又は表５Ｂに描かれる群１〜１３のいずれか１つの（ｉ）ＣＤＲ１及びＣＤＲ２；（ｉｉ）ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；（ｉｉｉ）ＣＤＲ１及びＣＤＲ３；又は（ｉｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
前記ＶＨＨは、表５Ａ及び／又は表５Ｂに描かれる群１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又は群１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む、請求項１４に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
請求項１１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードする核酸。
【請求項３３】
請求項３２に記載の核酸を含む細胞。
【請求項３４】
請求項３２に記載の核酸を含むアデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はキメラＡＡＶ／ファージ（ＡＡＶＰ）ベクター。
【請求項３５】
請求項３２に記載の核酸を含む腫瘍溶解性ウイルスベクター。
【請求項３６】
前記腫瘍溶解性ウイルスベクターは、自律パルボウイルスベクター、粘液腫ウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、レオウイルスベクター、ピコナウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター又は水疱性口内炎ウイルスベクターである、請求項３５に記載の腫瘍溶解性ウイルスベクター。
【請求項３７】
請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のベクターを含む細胞。
【請求項３８】
腫瘍細胞である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
請求項３２に記載の核酸を含むレンチウイルス又はレトロウイルスベクター。
【請求項４０】
ＣＡＲをコードする核酸をさらに含む、請求項３９に記載のレンチウイルス又はレトロウイルスベクター。
【請求項４１】
請求項３９又は４０に記載のレンチウイルス又はレトロウイルスベクターを含む細胞。
【請求項４２】
Ｔ細胞である、請求項４１に記載の細胞。
【請求項４３】
腫瘍を有する対象を治療する方法であって、請求項１１〜３１のいずれか一項に記載の融合タンパク質、又は請求項４１若しくは４２に記載の細胞、又は請求項３４〜３６のいずれか一項に記載のベクターを前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項４４】
抗体、抗体薬物複合体又はＣＡＲ−Ｔ細胞を前記対象に投与するステップをさらに含み、前記抗体、前記抗体薬物複合体又は前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は、前記ＣＤ１９変異体に結合する、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
安定したＣＤ１９変異体を識別する方法であって、
ａ）複数のＣＤ１９ポリペプチドを取得するステップであって、各ＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸置換を有する、ステップ；
ｂ）前記複数のうちのＣＤ１９ポリペプチドが抗ＣＤ１９抗体又はその断片によって結合されているかどうかを決定するステップ；
ｃ）前記複数のうちのＣＤ１９ポリペプチドが、配列番号２の前記アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してプロテアーゼ切断に対してより抵抗性であるかどうかを決定するステップ；及び／又は
ｄ）前記複数のうちのＣＤ１９ポリペプチドが、配列番号２の前記アミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してより熱安定性であるかどうかを決定するステップ
を含み、ＣＤ１９ポリペプチドは、前記ポリペプチド（ｉ）が前記抗ＣＤ１９抗体若しくはその断片によって結合されており、（ｉｉ）が、配列番号２の前記アミノ酸配列を含む前記ポリペプチドと比較してプロテアーゼ切断に対してより抵抗性であり、且つ／又は（ｉｉｉ）が、配列番号２の前記アミノ酸配列を含む前記ポリペプチドと比較してより熱安定性である場合、安定したＣＤ１９変異体である、方法。
【請求項４６】
前記抗ＣＤ抗体は、ＦＭＣ６３又は４Ｇ７である、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記複数のＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号２の位置２、３、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３８、３９、４５、４７、４９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６６、６８、７０、７２、８４、９０、９３、９４、９９、１００、１０５、１０８、１１１、１１３、１１４、１１５、１２２、１２３、１２４、１２５、１２７、１３０、１３１、１３２、１３５、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４８、１４９、１５４、１６７、１６９、１７１、１８５、１８９、１９３、１９４、１９６、１９８、２０２、２０４、２０６、２０７、２０９、２１１、２１２、２１３、２１５、２１６、２１７、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２８、２２９、２３０、２３２、２３５、２４０、２４３、２４７、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６４、２６５、２６９又は２７１に１つ又は複数のアミノ酸置換を含む、請求項４５又は４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記複数のＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置の以下のセット：５／７／９；１４／１６／１８；２９／３１；２９／３１／３３；３５／３７／３９；４５／４７／４９；５２／５４／５６；５９／６１／６３；６２／６４／６６；７６／７８／８０；８６／８８／９０；１６７／１６９／１７１；１７５／１７７／１７９；１９３／１９５／１９７；２０６／２０８／２１０；２０７／２０９／２１１；２１９／２２１／２２３；２４０／２４３；２２４／２２６／２２８；２４７／２４９／２５１；２５３／２５５／２５６；２５５／２５６；又は２６１／２６２／２６４／２６５の１つ又は複数にアミノ酸置換を含む、請求項４５又は４６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１２月１５日に提出された米国仮特許出願第６２／５９９，２１１号明細書（この内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる）に対する優先権を主張する。
【背景技術】
【０００２】
ＣＤ１９（分化抗原群１９）としても知られるＢ−リンパ球抗原ＣＤ１９は、ヒトにおいてＣＤ１９遺伝子によりコードされるタンパク質である。ＣＤ１９は、ＣＤ１９ＣＡＲＴ細胞をはじめとする様々な免疫療法の標的である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００３】
本開示は、抗ＣＤ１９抗体に結合する能力及び／又は改善された安定性などの特定の機能属性を有するＣＤ１９変異体を識別する方法を提供する。従って、一部の態様では、本開示は、安定したＣＤ１９変異体を識別する方法を提供し、この方法は、ａ）複数のＣＤ１９ポリペプチドを取得又は提供するステップであって、各ＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸置換を有する、ステップ；ｂ）複数のうちのＣＤ１９ポリペプチドが抗ＣＤ１９抗体又はその断片によって結合されているかどうかを決定するステップ；ｃ）複数のうちのＣＤ１９ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してプロテアーゼ切断に対してより抵抗性であるかどうかを決定するステップ；及び／又はｄ）複数のうちのＣＤ１９ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してより熱安定性であるかどうかを決定するステップを含み、ＣＤ１９ポリペプチドは、ポリペプチド（ｉ）が抗ＣＤ１９抗体若しくはその断片によって結合されており、（ｉｉ）が、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してプロテアーゼ切断に対してより抵抗性であり、且つ／又は（ｉｉｉ）が、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してより熱安定性である場合、安定したＣＤ１９変異体である。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、ＦＭＣ６３又は４Ｇ７である。
【０００４】
一部の実施形態では、複数のＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号２の位置２、３、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３８、３９、４５、４７、４９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６６、６８、７０、７２、８４、９０、９３、９４、９９、１００、１０５、１０８、１１１、１１３、１１４、１１５、１２２、１２３、１２４、１２５、１２７、１３０、１３１、１３２、１３５、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４８、１４９、１５４、１６７、１６９、１７１、１８５、１８９、１９３、１９４、１９６、１９８、２０２、２０４、２０６、２０７、２０９、２１１、２１２、２１３、２１５、２１６、２１７、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２８、２２９、２３０、２３２、２３５、２４０、２４３、２４７、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６４、２６５、２６９又は２７１に１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、複数のＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置の以下のセット：５／７／９；１４／１６／１８；２９／３１；２９／３１／３３；３５／３７／３９；４５／４７／４９；５２／５４／５６；５９／６１／６３；６２／６４／６６；７６／７８／８０；８６／８８／９０；１６７／１６９／１７１；１７５／１７７／１７９；１９３／１９５／１９７；２０６／２０８／２１０；２０７／２０９／２１１；２１９／２２１／２２３；２４０／２４３；２２４／２２６／２２８；２４７／２４９／２５１；２５３／２５５／２５６；２５５／２５６；又は２６１／２６２／２６４／２６５の１つ又は複数にアミノ酸置換を含む。
【０００５】
別の態様では、本開示は、ＣＤ１９変異体、ＣＤ１９変異体を含む融合タンパク質、ＣＤ１９変異体をコードする核酸（又は融合タンパク質）及びこのようなＣＤ１９変異体又は融合タンパク質をコードする細胞治療薬を提供する。こうした組成物は、癌の治療及び／又は免疫応答を開始又は調節する上で有用である。
【０００６】
一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドのものより少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、４００％又は５００％高い、安定性の測定されたレベルを有する。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してプロテアーゼ切断に対してより抵抗性である。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してより熱安定性である。
【０００７】
一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、表１Ａ、表１Ｂ、表２Ａ、表２Ｂ、表３、表６、図８Ｂ、図１１、図１２Ｂ、図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ又は図１５Ｂに挙げられる配列番号２の１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
【０００８】
一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、配列番号２のアミノ酸位置の以下のセット：５／７／９；１４／１６／１８；２９／３１；２９／３１／３３；３５／３７／３９；４５／４７／４９；５２／５４／５６；５９／６１／６３；６２／６４／６６；７６／７８／８０；８６／８８／９０；１６７／１６９／１７１；１７５／１７７／１７９；１９３／１９５／１９７；２０６／２０８／２１０；２０７／２０９／２１１；２１９／２２１／２２３；２４０／２４３；２２４／２２６／２２８；２４７／２４９／２５１；２５３／２５５／２５６；２５５／２５６；又は２６１／２６２／２６４／２６５の１つ又は複数にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、アミノ酸置換は、表１Ｂ、表２Ｂ、表３、表６、図８Ｂ、図１１、図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ又は図１５Ｂに示される置換を含む。
【０００９】
一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、抗ＣＤ１９抗体に結合する。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、腫瘍抗原に結合する。一部の実施形態では、腫瘍抗原は、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ＣＥＡ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバールウイルス抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６若しくはＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｅｒｂＢ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＧＰＮＭＢ、ＥＧＰ１、ＦＯＬＲ１、内皮受容体、ＳＴＥＡＰ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ネクチン−４、ＡＧＳ−１６、グアナリルシクラーゼＣ、ＭＵＣ−１、ＣＦＣ１Ｂ、インテグリンα３鎖（ａ３ｂ１、ラミニン受容体鎖）、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、グリピカン３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１又はＭＡＧＥ  Ａ３である。
【００１０】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）ＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、抗原は、自己免疫障害に関連する抗原である。一部の実施形態では、抗原は、感染因子抗原である。一部の実施形態では、抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片は、ｓｃＦｖ、又はＶＨＨ、又はフィブロネクチンＩＩＩ型ドメインを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、断片の抗体の軽鎖のＣ末端又はＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、断片の抗体の重鎖のＣ末端又はＮ末端に融合される。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、断片の抗体の軽鎖のＣ末端に融合される。
【００１１】
一部の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列又はその断片を含む。一部の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を含み、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失している。一部の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を含み、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失している。一部の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を含み、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失しており、その部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つ又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している。一部の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を含み、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失しており、その部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している。一部の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失している。一部の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失している。一部の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失しており、その部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している。一部の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含み、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失しており、その部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している。
【００１２】
一部の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つに描かれる少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）を含む。一部の実施形態では、ＶＨＨは、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つに描かれるＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である少なくとも１つのＣＤＲを含む。一部の実施形態では、ＶＨＨは、表５Ａ及び／又は表５Ｂに描かれる群１〜１３のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨＨは、表５Ａ及び／又は表５Ｂに描かれる群１〜１３のいずれか１つの（ｉ）ＣＤＲ１及びＣＤＲ２；（ｉｉ）ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；（ｉｉｉ）ＣＤＲ１及びＣＤＲ３；又は（ｉｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。一部の実施形態では、ＶＨＨは、表５Ａ及び／又は表５Ｂに描かれる群１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又は群１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含む。
【００１３】
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載の融合タンパク質をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）ＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質をコードする核酸を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）ＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有する細胞を提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）ＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有するアデノウイルスベクター、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）ベクター又はキメラＡＡＶ／ファージ（ＡＡＶＰ）ベクターを提供する。一部の実施形態では、本開示は、（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）ＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有する腫瘍溶解性ウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスベクターは、自律パルボウイルスベクター、粘液腫ウイルスベクター、パラミクソウイルスベクター、レオウイルスベクター、ピコナウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、アデノウイルスベクター、単純ヘルペスウイルスベクター又は水疱性口内炎ウイルスベクターである。
【００１４】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）ＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、この細胞は、腫瘍細胞である。
【００１５】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）ＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有するレンチウイルス又はレトロウイルスベクターを提供する。一部の実施形態では、レンチウイルス又はレトロウイルスベクターは、ＣＡＲをコードする核酸をさらに含む。
【００１６】
一部の実施形態では、本開示は、（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）ＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有するレンチウイルス又はレトロウイルスベクターを含む細胞を提供する。一部の実施形態では、細胞は、Ｔ細胞である。
【００１７】
一部の実施形態では、本開示は、腫瘍を有する対象を治療する方法であって、（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）ＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質、（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）ＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質をコードするベクターを含有する細胞、或いは（ａ）抗原に結合する抗体若しくはスカフォールドポリペプチド又はその抗原結合断片と、（ｂ）ＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質をコードする核酸を含有するベクターを対象に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、この治療方法は、抗体、抗体薬物複合体又はＣＡＲ−Ｔ細胞を対象に投与するステップをさらに含み、抗体、抗体薬物複合体又はＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９変異体に結合する。
【００１８】
一部の実施形態では、本開示は、安定したＣＤ１９変異体を識別する方法を提供し、この方法は、ａ）複数のＣＤ１９ポリペプチドを取得するステップであって、各ＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列の１つ又は複数のアミノ酸置換を有する、ステップ；ｂ）複数のうちのＣＤ１９ポリペプチドが抗ＣＤ１９抗体又はその断片によって結合されているかどうかを決定するステップ；ｃ）複数のうちのＣＤ１９ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してプロテアーゼ切断に対してより抵抗性であるかどうかを決定するステップ；及び／又はｄ）複数のうちのＣＤ１９ポリペプチドが、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してより熱安定性であるかどうかを決定するステップを含み、ＣＤ１９ポリペプチドは、ポリペプチド（ｉ）が抗ＣＤ１９抗体若しくはその断片によって結合されており、（ｉｉ）が、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してプロテアーゼ切断に対してより抵抗性であり、且つ／又は（ｉｉｉ）が、配列番号２のアミノ酸配列を含むポリペプチドと比較してより熱安定性である場合、安定したＣＤ１９変異体である。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体は、ＦＭＣ６３又は４Ｇ７である。一部の実施形態では、複数のＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号２の位置２、３、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３８、３９、４５、４７、４９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６６、６８、７０、７２、８４、９０、９３、９４、９９、１００、１０５、１０８、１１１、１１３、１１４、１１５、１２２、１２３、１２４、１２５、１２７、１３０、１３１、１３２、１３５、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４８、１４９、１５４、１６７、１６９、１７１、１８５、１８９、１９３、１９４、１９６、１９８、２０２、２０４、２０６、２０７、２０９、２１１、２１２、２１３、２１５、２１６、２１７、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２８、２２９、２３０、２３２、２３５、２４０、２４３、２４７、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６４、２６５、２６９又は２７１に１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、複数のＣＤ１９ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸位置の以下のセット：５／７／９；１４／１６／１８；２９／３１；２９／３１／３３；３５／３７／３９；４５／４７／４９；５２／５４／５６；５９／６１／６３；６２／６４／６６；７６／７８／８０；８６／８８／９０；１６７／１６９／１７１；１７５／１７７／１７９；１９３／１９５／１９７；２０６／２０８／２１０；２０７／２０９／２１１；２１９／２２１／２２３；２４０／２４３；２２４／２２６／２２８；２４７／２４９／２５１；２５３／２５５／２５６；２５５／２５６；又は２６１／２６２／２６４／２６５の１つ又は複数にアミノ酸置換を含む。
【００１９】
本発明の他の特徴、目的及び利点は、以下の詳細な説明から明らかである。しかしながら、詳細な説明は、本発明の実施形態を示すものであるが、限定のためではなく、あくまで例示として提供されることを理解すべきである。本発明の範囲に含まれる様々な変更形態及び改変形態が詳細な説明から当業者に明らかになるであろう。
【００２０】
図面は、限定のためではなく、あくまで例示を目的とするものである。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】ＣＤ１９タンパク質（Ｔｅｄｄｅｒ，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．５：５７２−５７７（２００９）から再現）の概略図である。
【図１Ｂ】ＨＨＰｒｅｄサーバ（Ｓｏｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．３３：２４４−２４８（２００５））により予測されるＣＤ１９の細胞外部分の構造のリボンダイアグラムである。
【図２】トリプレットライブラリ設計を示す表である。２つ又は３つのアミノ酸を２７の異なる組合せで同時に多様化させた。これらの部位は、相同性モデル化により決定される潜在的な構造上の重要性（図１）及び無極性に基づいて選択した。
【図３】酵母ディスプレイ野生型ＣＤ１９に対する抗体結合の、フローサイトメトリーによる分析を描く。Ａｇａ２ｐとのＣ末端（上方）又はＮ末端（下方）融合物としてのＣＤ１９をディスプレイするように、酵母を誘導した。ディスプレイされたＣＤ１９を有する酵母を室温で維持するか又は７０℃で３０分インキュベートした後、冷却してから、完全長ＣＤ１９ディスプレイを検出するために表示の抗体及び抗ｃＭＹＣ抗体で標識した。フローサイトメトリーにより、二次抗体を用いて結合を検出した。
【図４】進化して抗体ＦＭＣ６３に結合するＣＤ１９の、フローサイトメトリーによる分析を描く。表示のコンビナトリアルライブラリ（選別されていないか又はＦＭＣ６３結合について濃縮された）をディスプレイする酵母をＦＭＣ６３及びＦＩＴＣ共役抗ｃＭＹＣ抗体（完全長ＣＤ１９を示すＣ末端エピトープを標識するため）、続いて抗マウス−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７と一緒にインキュベートした後、フローサイトメトリーにより評価した。
【図５Ａ】酵母ディスプレイ野生型ＣＤ１９のプロテイナーゼＫ切断を描くグラフである。野生型ＣＤ１９をディスプレイする酵母を３７℃のＰＢＳＡ中で表示量のプロテイナーゼＫと一緒に１０分間インキュベートした。酵母を洗浄し、Ｎ末端ＨＡ及びＣ末端ＭＹＣエピトープを抗体で標識し、フローサイトメトリーにより評価した。０．００２及び０．０２単位のプロテイナーゼＫは、Ａｇａ２ｐ−ＨＡディスプレイを維持しながら、ＣＤ１９切断を引き起こした。
【図５Ｂ】表示のエピトープを有する酵母ディスプレイＣＤ１９の概略図である。
【図６】改善されたＣＤ１９変異体の選択の、フローサイトメトリーによる分析を描く。ＣＤ１９ライブラリをディスプレイする酵母を３７℃のＰＢＳＡ中で０．００２単位のプロテイナーゼＫと一緒に１０分間インキュベートした。酵母を洗浄し、Ｎ末端ＨＡ及びＣ末端ＭＹＣエピトープを抗体で標識し、フローサイトメトリーにより評価した。最も高いＭＹＣ／ＨＡを有する変異体を収集した。
【図７】フローサイトメトリーを用いた、熱選択によるＣＤ１９の分析を描く。タイル１に単一の突然変異によるＣＤ１９をディスプレイする酵母をＣＤ１９ディスプレイのために３７℃で誘導し、ディスプレイのためにＦＩＴＣ共役抗ＭＹＣで標識した後、フローサイトメトリーにより分析した。上位５％を分析のために収集した。
【図８Ａ】側鎖及び色調と共に示される、多様化位置を有するＣＤ１９の概略図である。
【図８Ｂ】組み合わせたライブラリ設計に許容される例示的な配列のセットを示す表である。例えば、（第１列）部位１４、１６及び１８は、野生型配列ではＮ、Ｖ及びＱであるが、これらは、Ｔ、Ａ及びＷ；Ｅ、Ｗ及びＰ；Ｄ、Ｗ及びＲ；Ｔ、Ｖ及びＰ；又はＴ、Ｗ及びＰのいずれでもあり得る。
【図９】フローサイトメトリーを用いた、多重変異体ライブラリからの改善されたＣＤ１９変異体の選択を描く。表示するＣＤ１９集団（野生型クローン、２回選別三重ライブラリ又は２回選別組合せライブラリ）をディスプレイする酵母をＦＭＣ６３及びＦＩＴＣ共役抗ＭＹＣ抗体（完全長ＣＤ１９を示すようにＣ末端エピトープを標識するため）、続いて抗マウス−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７と一緒にインキュベートした後、フローサイトメトリーにより評価した。
【図１０Ａ−１０Ｂ】フローサイトメトリーによる多重変異体の特性決定を描く。野生型ＣＤ１９又は選別されたＣＤ１９集団をディスプレイする酵母を（ｉ）ＦＭＣ６３及びＦＩＴＣ共役抗ＭＹＣ抗体（完全長ＣＤ１９を示すようにＣ末端エピトープを標識するため）、続いて抗マウス−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７と一緒にインキュベートした後、フローサイトメトリーにより評価する（図１０Ａ）か；又は３７℃のＰＢＳＡ中で０．００２単位のプロテイナーゼＫと一緒に１０分間インキュベートした（図１０Ｂ）。酵母を洗浄し、Ｎ末端ＨＡ及びＣ末端ＭＹＣエピトープを抗体で標識し、フローサイトメトリーにより評価した。
【図１１】多重変異体ライブラリからの改善されたＣＤ１９変異体の配列解析を描く。ＦＭＣ６３結合及びプロテアーゼ抵抗性についての選択から出現したＣＤ１９変異体をシーケンシングした。多数のクローンについて、多様化位置のアミノ酸を示す。設計から選別集団への頻度の相対的変化を下の表に示す。
【図１２Ａ】結合リガンドを産生する多様性の潜在的領域をハイライトするＣＤ１９の細胞外ドメインのリボンダイアグラムである。オレンジ色：Ｉｇドメイン１ループ；青色：Ｉｇドメイン２ループ；赤色：Ｉｇドメインドメイン２シート。
【図１２Ｂ】例示的な多様性設計の表を示す。相同性モデルは、次のように決定した。Ｎ末端ドメイン、ドメインリンカー及びＣ末端ドメインを含むＣＤ１９の２５８残基アミノ酸配列を、デフォルトパラメータを用いてＨＨＰｒｅｄ（Ｓｏｅｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：２４４−２４８（２００５））に付した。次に、ＨＨＰｒｅｄ作成モデルを使用し、自動選択最良テンプレートオプションを用いてＭＯＤＥＬＬＥＲ（Ｅｓｗａｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｐｒｏｔｏｃ．Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａ．  ５．６．１−３２（２００６）ｄｏｉ：１０．１００２／０４７１２５０９５３．ｂｉ０５０６ｓ４７１１）を作成した。ＭＯＤＥＬＬＥＲのために最適な単一テンプレート（１ｑｚ１）を選択した（注：複数の最適テンプレートを選択するオプションも１ｑｚ１と類似の構造を出力した）。続いて、出力された構造を側鎖再パッキング及び全構造最小化によりＦｏｌｄｉｔ（Ｃｏｏｐｅｒ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４６６：７５６−７６０（２０１０））スタンドアローンで精緻化した。
【図１３】フローサイトメトリーを用いた、改善されたＣＤ１９リガンド変異体の選択を描く。標的結合及びＦＭＣ６３結合について２回濃縮されたＣＤ１９−Ｆｎ（抗ＥＧＦＲ）又はＣＤ１９−ｓｃＦｖ（抗ＨＥＲ２）集団をＦＭＣ６３及びビオチン共役ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２エクトドメインと共に、続いて抗マウス−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７及びストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８と一緒にインキュベートした後、フローサイトメトリーにより評価した。
【図１４Ａ】多重変異体ライブラリからのＣＤ１９／ＥＧＦＲ結合フィブロネクチンドメイン変異体の配列解析を描き；ＦＭＣ６３結合及びＥＧＦＲ結合についての選択から出現した変異体をシーケンシングした。多様化位置のアミノ酸を多数のクローンについて示す。設計から選別集団までの頻度の相対的変化を下の表に示す。
【図１４Ｂ】多重変異体ライブラリからのＣＤ１９／抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ変異体の配列解析を描き；ＦＭＣ６３結合及びＨＥＲ２結合についての選択から出現した変異体をシーケンシングした。多様化位置のアミノ酸を多数のクローンについて示す。設計から選別集団までの頻度の相対的変化を下の表に示す。
【図１４Ｃ】多重変異体ライブラリからのＣＤ１９／抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ変異体のさらなる配列解析を描き；ＦＭＣ６３結合及びＨＥＲ２結合についての選択から出現した変異体をシーケンシングした。多様化位置のアミノ酸を多数のクローンについて示す。
【図１４Ｄ】多重変異体ライブラリからのＣＤ１９／ＥＧＦＲ結合フィブロネクチンドメイン変異体の配列解析を描き；ＦＭＣ６３結合及びＥＧＦＲ結合についての選択から出現した変異体をシーケンシングした。多様化された位置のアミノ酸を多数のクローンについて示す。
【図１５Ａ】フローサイトメトリーによる、改善されたリガンド−ＣＤ１９変異体の選択を描く。標的結合及びＦＭＣ６３結合について濃縮されたＦｎ（抗ＥＧＦＲ）−ＣＤ１９又はｓｃＦｖ（抗ＨＥＲ２）−ＣＤ１９集団をＦＭＣ６３及びビオチン共役ＥＧＦＲ又はＨＥＲ２エクトドメインと共に、続いて抗マウス−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７及びストレプトアビジン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８と一緒にインキュベートした後、フローサイトメトリーにより評価した。
【図１５Ｂ】多重変異体ライブラリからのＣＤ１９／抗ＨＥＲ２ｓｃＦｖ変異体の配列解析を描き；ＦＭＣ６３結合及びＨＥＲ２結合についての選択から出現した変異体をシーケンシングした。多様化された位置のアミノ酸を多数のクローンについて示す。
【図１５Ｃ】ディープシーケンシングにより識別された多重突然変異（上方の上）又は単一突然変異（上方の下）の相対的アミノ酸頻度変化を描く。下の図は、３つの融合タンパク質に関して非選別ライブラリから機能性選別変異体への相対的アミノ酸頻度変化を描く（「ｃｔ  ＦｎＥＧＦＲ」＝ＣＤ１９−Ｆｎ３／ＥＧＦＲ；「ＣＴ  ｓｃＦｖＨＥＲ２」＝ＣＤ１９−ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２；「ＮＴｓｃＦｖＨＥＲ２」＝ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２−ＣＤ１９）。
【図１６】分泌されたＮ末端ＣＤ１９変異体−Ｆｎ３／ＥＧＦＲ融合タンパク質の検出を描く。
【図１７】分泌されたＮ末端ＣＤ１９変異体−ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２融合タンパク質の検出を描く。
【図１８】分泌されたＣ末端ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２−ＣＤ１９変異体融合タンパク質の検出を描く。
【図１９】Ｃ末端ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２−ＣＤ１９変異体融合タンパク質のＨｅｒ２陽性細胞に対する結合を描く。
【図２０】Ｃ末端ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２−ＣＤ１９変異体融合タンパク質による架橋に起因したＣＡＲ１９によるＨｅｒ２陽性細胞の殺傷を描く。
【図２１】分泌されたＣ末端ｓｃＦｖ／ＣＤ２０−ＣＤ１９変異体融合タンパク質の検出を描く。
【図２２】Ｃ末端ｓｃＦｖ／ＣＤ２０−ＣＤ１９変異体融合タンパク質のＣＤ２０陽性細胞に対する結合を描く。
【図２３】Ｃ末端ｓｃＦｖ／ＣＤ２０−ＣＤ１９変異体融合タンパク質による架橋に起因したＣＡＲ１９によるＣＤ２０陽性細胞の殺傷を描く。
【図２４】分泌されたマスク及び非マスクＣ末端セツキシマブ−ＣＤ１９変異体融合タンパク質の検出を描く。
【図２５】ｕＰＡの存在下において、非マスクＣ末端セツキシマブ−ＣＤ１９変異体融合タンパク質及びマスクＣ末端セツキシマブ−ＣＤ１９変異体融合タンパク質による架橋に起因したＣＡＲ１９によるＥＧＦＲ陽性細胞の殺傷を描く。
【図２６】分泌された、ＣＤ１９変異体タンパク質を含む二重特異性融合タンパク質の検出を描く。
【図２７】Ｃ末端トラスツズマブ−ＣＤ１９変異体融合タンパク質のＨｅｒ２陽性細胞に対する結合を描く。
【図２８】Ｃ末端トラスツズマブ−ＣＤ１９変異体融合タンパク質による架橋に起因したＣＡＲ１９によるＨｅｒ２陽性細胞の殺傷を描く。
【図２９】Ｃ末端リツキシマブ−ＣＤ１９変異体融合タンパク質のＣＤ２０陽性細胞に対する結合を描く。
【図３０】Ｃ末端リツキシマブ−ＣＤ１９変異体融合タンパク質による架橋に起因したＣＡＲ１９によるＣＤ２０陽性細胞の殺傷を描く。
【図３１】アグリコシルＣ末端トラスツズマブ−ＣＤ１９変異体融合タンパク質のＨｅｒ２陽性細胞に対する結合を描く。
【図３２】アグリコシルＣ末端リツキシマブ−ＣＤ１９変異体融合タンパク質のＣＤ２０陽性細胞に対する結合を描く。
【図３３】アグリコシルＣ末端リツキシマブ−ＣＤ１９変異体融合タンパク質による架橋に起因したＣＡＲ１９によるＣＤ２０陽性細胞の殺傷を描く。
【図３４】Ｎ末端短縮ＣＤ１９変異体−ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２融合タンパク質による架橋に起因したＣＡＲ１９によるＨｅｒ２陽性細胞の殺傷を描く。
【図３５】Ｕ９３７細胞に対する様々なＣＤ１９変異体−ＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ及びＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９変異体構築物の結合を描く。
【図３６】Ｕ９３７細胞に対する様々なＣＤ１９変異体−ＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ及びＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９変異体構築物の結合を描く。
【図３７】様々なＣＤ１９変異体−ＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ及びＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９変異体構築物のＥＣ５０の測定を描く。
【図３８】様々なＣＤ１９変異体−ＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ及びＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９変異体構築物の力価を描く。
【図３９】様々なＣＤ１９変異体−ＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ及びＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９変異体構築物の力価を描く。
【図４０】ＣＬＥＣ１２ａに対する様々なＣＤ１９変異体−ＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ及びＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９変異体構築物の結合を描く。
【図４１】ＣＬＥＣ１２ａに対する様々なＣＤ１９変異体−ＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ及びＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９変異体構築物の結合を描く。
【図４２】様々なＣＤ１９変異体−ＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ及びＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９変異体構築物による架橋に起因した、ＣＡＲ１９によるＣＬＥＣ１２ａ陽性細胞の殺傷を描く。
【図４３】様々なＣＤ１９変異体−ＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ及びＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９変異体構築物による架橋に起因した、ＣＡＲ１９によるＣＬＥＣ１２ａ陽性細胞の殺傷を描く。
【図４４】様々なＣＤ１９変異体−ＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ及びＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９変異体構築物による架橋に起因した、ＣＡＲ１９によるＣＬＥＣ１２ａ陽性細胞の殺傷の用量曲線を描く。
【図４５】様々なＣＤ１９変異体−ＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ及びＶＨＨ／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９変異体構築物による架橋に起因した、ＣＡＲ１９によるＣＬＥＣ１２ａ陽性細胞の殺傷のＥＣ５０を描く。
【図４６Ａ−４６Ｂ】構築物＃１８６のＶＨ及びＶＬドメイン、抗ＣＬＥＣ１２ａ  ＶＨＨ（クローン２Ｈ３）及びＣＤ１９変異体を含む二重特異性構築物の結合ＥＣ５０を描く。
【図４７Ａ−４７Ｂ】構築物＃１８６のＶＨ及びＶＬドメイン、抗ＣＬＥＣ１２ａ  ＶＨＨ（クローン２Ｈ３）及びＣＤ１９変異体を含む二重特異性構築物による架橋に起因した、ＣＡＲ１９によるＣＬＥＣ１２ａ陽性細胞の殺傷を描く。
【図４８】ＣＡＲ１９；ＣＤ１９；及び抗ＣＬＥＣ１２ａ  ｓｃＦｖを含む融合タンパク質をコードするレンチウイルスベクターに感染させた細胞からの融合構築物の発現及び分泌を描く。
【図４９】ＣＡＲ１９；ＣＤ１９；及び抗ＣＬＥＣ１２ａ  ｓｃＦｖを含む融合タンパク質をコードするレンチウイルスベクターに感染させた細胞によるＵ９３７及びＮＡＬＭ６細胞の殺傷を描く。
【図５０】酵母上に発現したＣＤ１９又はペプチドに対するｍａｂ３Ｂ１０の滴定を描く。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本発明を理解しやすくする目的で、初めにいくつかの用語を以下に定義する。下記の用語及び他の用語についてのさらに別の定義は、本明細書全体を通して記載する。
【００２３】
投与：本明細書で使用されるとき、用語「投与」は、対象又は体系に対する組成物の投与を指す。動物対象（例えば、ヒト）への投与は、任意の適切な経路によって行われ得る。例えば、一部の実施形態では、投与は、気管支（気管支内注入など）、口腔、腸内、皮下、動脈内、皮内、胃内、脊髄内、筋肉内、鼻内、腹腔内、髄腔内、静脈内、心室内、特定の器官内（例えば、肝臓内）、粘膜、鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（気管内注入によってなど）、経皮、膣内及び硝子体であり得る。一部の実施形態では、投与は、腫瘍内又は腫瘍周辺であり得る。一部の実施形態では、投与は、間欠投与を含み得る。一部の実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間にわたる持続投与（例えば、灌流）を含み得る。
【００２４】
養子細胞療法：本明細書で使用されるとき、「養子細胞療法」又は「ＡＣＴ」は、抗腫瘍活性を有する免疫細胞の癌患者への移入を含む。一部の実施形態では、ＡＣＴは、抗腫瘍活性を有するリンパ球の使用、これらの細胞数のインビトロでの拡大及び担癌宿主へのその注入を含む治療法である。
【００２５】
親和性：本明細書で使用されるとき、用語「親和性」は、抗原結合部分（例えば、本明細書に記載の抗体）と抗原標的（例えば、ＣＬＬ−１）との間の結合相互作用の特徴を指し、これは、結合相互作用の強度を示す。一部の実施形態では、親和性の尺度は、解離定数（ＫＤ）として表される。一部の実施形態では、抗体結合部分は、抗原標的に対する高い親和性（例えば、約１０−７Ｍ未満、約１０−８Ｍ未満又は約１０−９Ｍ未満のＫＤ）を有する。
【００２６】
改善：本明細書で使用されるとき、「改善」は、状態の予防、軽減及び／若しくは好転又は対象の状態の改善を指す。改善は、疾患、障害又は病状の完全な回復又は完全な予防を含むが、それを要求するわけではない。
【００２７】
アミノ酸：本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、その広い意味において、ポリペプチド鎖に組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質を指す。一部の実施形態では、アミノ酸は、一般的構造：Ｈ２Ｎ−Ｃ（Ｈ）（Ｒ）−ＣＯＯＨを有する。一部の実施形態では、アミノ酸は、天然に存在するアミノ酸である。一部の実施形態では、アミノ酸は、合成アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、ｄ−アミノ酸であり；一部の実施形態では、アミノ酸は、ｌ−アミノ酸である。「標準アミノ酸」は、天然に存在するペプチドに一般的に見出される２０の標準ｌ−アミノ酸のいずれかを指す。「非標準アミノ酸」は、それが合成により作製されるか、又は天然の供給源から得られるかにかかわらず、標準アミノ酸以外のあらゆるアミノ酸を指す。本明細書で使用されるとき、「合成アミノ酸」は、化学的に修飾されたアミノ酸を包含し、そうしたものとして、限定されないが、塩、アミノ酸誘導体（アミドなど）及び／又は置換物が挙げられる。ペプチド中のカルボキシ−及び／又はアミノ−末端アミノ酸をはじめとするアミノ酸は、メチル化、アミド化、アセチル化、保護基及び／又はその活性に有害に作用することなく、ペプチドの循環半減期を変えることができる他の化学基での置換によって修飾することができる。アミノ酸は、ジスルフィド結合に参加し得る。アミノ酸は、１つ又は複数の翻訳後修飾、例えば１つ又は複数の化学的実体（例えば、メチル基、酢酸基、アセチル基、リン酸基、ホルミル部分、イソプレノイド基、硫酸基、ポリエチレングリコール部分、脂質部分、炭水化物部分、ビオチン部分など）との結合を含み得る。用語「アミノ酸」は、「アミノ酸残基」と置き換え可能に使用され、遊離アミノ酸及び／又はペプチドのアミノ酸残基を指す場合もある。この用語が遊離アミノ酸又はペプチドの残基のいずれを指すにかかわらず、使用されることは文脈から明らかであろう。
【００２８】
抗体：本明細書で使用されるとき、用語「抗体」は、特定の標的抗原に対する特異的な結合を付与する上で十分な規定免疫グロブリン配列要素を含むポリペプチドを指す。当技術分野で公知のように、天然に産生されるインタクトな抗体は、互いに結合して、一般に「Ｙ字型」構造と呼ばれるものを形成する、２つの同じ重鎖ポリペプチド（各々約５０ｋＤ）と２つの同じ軽鎖ポリペプチド（各々約２５ｋＤ）からなるおよそ１５０ｋＤの四量体物質である。各重鎖は、少なくとも４つのドメイン（各々約１１０アミノ酸長）−アミノ末端可変（ＶＨ）ドメイン（Ｙ構造の先端に位置する）、続いて３つの定常ドメイン：ＣＨ１、ＣＨ２及びカルボキシ末端ＣＨ３（Ｙ字の幹の下端に位置する）からなる。「スイッチ」として知られる短い領域は、重鎖可変及び定常領域をつなげる。「ヒンジ」は、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを抗体の残り部分とつなげる。このヒンジ領域中の２つのジスルフィド結合は、２つの重鎖ポリペプチドをインタクトな抗体中の別のポリペプチドとつなげる。各軽鎖は、互いに他の「スイッチ」により隔てられた２つのドメイン、すなわちアミノ末端可変（ＶＬ）ドメインと、それに続くカルボキシ末端定常（ＣＬ）ドメインからなる。インタクトな抗体四量体は、２つの重鎖−軽鎖二量体から構成され、重鎖及び軽鎖は、単一のジスルフィド結合によって互いに結合され；他の２つのジスルフィド結合が重鎖ヒンジ領域を互いに結合することにより、二量体が互いに結合して四量体が形成される。天然に産生される抗体も典型的にはＣＨ２ドメインでグリコシル化される。天然抗体中の各ドメインは、圧縮された逆平行βバレル中に互いに接触して充填される２つのβシート（例えば、３、４又は５本鎖シート）から形成される「免疫グロブリンフォールド」を特徴とする構造を有する。各可変ドメインは、「補体決定領域」（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３）として知られる３つの超可変ループと、４つの幾分不変の「フレームワーク」領域（ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３及びＦＲ４）とを含む。天然抗体が折り畳まれると、ＦＲ領域は、ドメインの構造フレームワークを付与するβシートを形成すると共に、重鎖及び軽鎖の両方からのＣＤＲループ領域が３次元空間内で一緒になって、Ｙ字構造の先端に位置する単一の超可変抗原結合部位を形成する。天然に存在する抗体のＦｃ領域は、補体系の要素に、さらに例えば細胞傷害性を媒介するエフェクター細胞をはじめとするエフェクター細胞上の受容体にも結合する。当技術分野で公知のように、Ｆｃ受容体に対するＦｃ領域の親和性及び／又は他の結合属性は、グリコシル化又は他の修飾を介して調節することができる。一部の実施形態では、本開示に従って生成及び／又は使用される抗体は、修飾又は操作されたそのようなグリコシル化を有するＦｃドメインなどのグリコシル化Ｆｃドメインを含む。本開示の目的のために、いくつかの実施形態では、天然抗体に見出されるように十分な免疫グロブリンドメイン配列を含む任意のポリペプチド又はポリペプチドの複合体は、そのようなポリペプチドが天然に生成される（例えば、抗原に反応する生物によって産生される）か、又は組換え操作、化学的合成又は他の人工系若しくは方法によって生成されるかにかかわらず、「抗体」と呼ぶことができ、且つ／又は「抗体」として使用することができる。一部の実施形態では、抗体は、ポリクローナルであり；一部の実施形態では、抗体は、モノクローナルである。一部の実施形態では、抗体は、マウス、ウサギ、霊長類又はヒト抗体に特有の定常領域配列を有する。一部の実施形態では、抗体配列要素は、当技術分野で公知のように、完全にヒト由来であるか、又はヒト化、霊長類化、キメラなどである。さらに、本明細書で使用される用語「抗体」は、適切な実施形態（別の解釈が記載されているか、又は文脈から明らかでない限り）では、別の形態で抗体構造及び機能的特徴を使用することを目的とする、当技術分野で公知の又は開発された構築物又はフォーマットのいずれも指し得る。例えば、一部の実施形態では、本開示に従って使用される抗体は、限定されないが、以下：インタクトなＩｇＧ、ＩｇＥ及びＩｇＭ、二重又は多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、単鎖Ｆｖ、ポリペプチド−Ｆｃ融合物、Ｆａｂ、ラクダ抗体、マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、小モジュラー免疫薬（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（「ＳＭＩＰｓＴＭ」）、単鎖又はタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリン反復タンパク質又はＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）及びＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）から選択されるフォーマットである。一部の実施形態では、抗体は、天然に生成されていれば有する共有結合修飾（例えば、グリカンの結合）を欠如し得る。一部の実施形態では、抗体は、共有結合修飾（例えば、グリカン、ペイロード（例えば、検出可能な部分、治療薬部分、触媒部分など）又は別のペンダント基（例えば、ポリエチレングリコールなど））の結合）を含み得る。
【００２９】
抗体断片：本明細書で使用されるとき、「抗体断片」は、例えば、抗体の抗原結合領域又は可変領域など、インタクトな抗体の一部分を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；トリアボディ；テトラボディ；直鎖抗体；単鎖抗体分子；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。例えば、抗体断片は、単離された断片、「Ｆｖ」断片（重鎖及び軽鎖の可変領域からなる）、軽鎖及び重鎖可変領域がペプチドリンカーによって結合された組換え単鎖ポリペプチド分子（「ｓｃＦｖタンパク質」）並びに超可変領域を模倣するアミノ酸残基から構成される最小認識単位が挙げられる。多くの実施形態では、抗体断片は、親抗体の十分な配列を含有し、その場合、これは、親抗体が結合するのと同じ抗原に結合する断片であり；一部の実施形態では、断片は、親抗体と同等の親和性で抗原に結合し、且つ／又は抗原に対する結合について親抗体と競合する。抗体の抗原結合断片の例としては、限定されないが、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ｓｃＦｖ断片、Ｆｖ断片、ｄｓＦｖダイアボディ、ｄＡｂ断片、Ｆｄ’断片、Ｆｄ断片及び単離された相補性決定領域（ＣＤＲ）領域が挙げられる。抗体の抗原結合断片は、任意の手段で生成され得る。例えば、抗体の抗原結合断片は、インタクトな抗体の断片化によって酵素的若しくは化学的に生成され得、且つ／又は部分的抗体配列をコードする遺伝子から組換えにより生成され得る。代わりに又は加えて、抗体の抗原結合断片は、完全又は部分的に合成により生成され得る。抗体の抗原結合断片は、任意選択で単鎖抗体断片を含み得る。代わりに又は加えて、抗体の抗原結合断片は、例えば、ジスルフィド結合により互いに結合された複数の鎖を含み得る。抗体の抗原結合断片は、任意選択で多分子複合体を含み得る。機能的抗体断片は、一般的には、少なくとも約５０アミノ酸を含み、より一般的には、少なくとも約２００アミノ酸を含む。
【００３０】
抗原：用語「抗原」は、本明細書で使用されるとき、免疫応答を誘発する物質；及び／又はＴ細胞受容体（例えば、ＭＨＣ分子により提示される場合）又は抗体若しくは抗体断片に結合する物質を指す。一部の実施形態では、抗原は、体液性応答（例えば、抗原特異的抗体の産生を含む）を誘発し；一部の実施形態では、抗原は、細胞性応答（例えば、受容体が抗原と特異的に相互作用するＴ細胞を含む）を誘導する。一部の実施形態では、抗原は、抗体に結合して、生物内で特定の生理的応答を誘導し得るか、又は誘導しない場合もある。一般に、抗原は、例えば、小分子、核酸、ポリペプチド、炭水化物、脂質、ポリマー（一部の実施形態では生体ポリマー以外（例えば、核酸又はアミノ酸ポリマー以外））などの任意の化学的実体であり得るか又はそれを含み得る。一部の実施形態では、抗原は、ポリペプチドであるか又はそれを含む。一部の実施形態では、抗原は、グリカンであるか又はそれを含む。当業者であれば、一般に、抗原が、単離された形態又は純粋な形態で提供され得るか、或いは粗形態（例えば、細胞抽出物などの抽出物又は抗原含有供給源の他の比較的天然のままの調製物中に例えば他の材料を一緒に含む）で提供され得るか、或いは細胞上又は細胞中に存在し得ることが理解されるであろう。一部の実施形態では、抗原は、組換え抗原である。
【００３１】
およそ又は約：本明細書で使用されるとき、用語「およそ」又は「約」は、対象の１つ又は複数の値に適用される場合、記載の参照値と類似する値を指す。いくつかの実施形態では、用語「およそ」又は「約」は、別の記載があるか、又は文脈から別の解釈が明らかでない限り（そうした数値が、考えられる値の１００％を超える場合を除いて）、記載される参照値のいずれか（プラス又はマイナス）の方向に２５％、２０％、１９％、１８％、１７％、１６％、１５％、１４％、１３％、１２％、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％以内に入るか又はそれを下回る値の範囲を指す。
【００３２】
結合：用語「結合」は、本明細書で使用されるとき、典型的に、２つ以上の実体同士又はそれらの間の非共有結合を指すことが理解されるであろう。「直接」結合は、実体又は部分間の物理的接触を含み；間接結合は、１つ又は複数の中間実体との物理的接触による物理的相互作用を含む。２つ以上の実体間の結合は、典型的に、様々な状況（相互作用する実体若しくは部分が独立に研究される場合又はより複雑な系である場合（例えば、担体実体と共有若しくはそれ以外で結合する場合及び／又は生物系若しくは細胞中））のいずれでも評価することができる。
【００３３】
癌：用語「癌」、「悪性」、「新生物」、「腫瘍」及び「癌腫」は、本明細書において置き換え可能に使用され、相対的に異常な非制御的及び／又は自律的増殖を示し、それにより細胞増殖の制御の有意な喪失を特徴とする異常増殖表現型を呈示する細胞を指す。一般に、本出願において検出又は治療の対象となる細胞としては、前癌（例えば、良性）、悪性、前転移、転移及び非転移性細胞が挙げられる。本開示の教示は、あらゆる癌に関連し得る。ほんの少数の非限定的な例を挙げると、一部の実施形態では、本開示の教示は、例えば、白血病、リンパ腫（ホジキン及び非ホジキンリンパ腫）、骨髄性白血病、骨髄種及び骨髄増殖性疾患をはじめとする血液癌；肉腫、黒色腫、腺癌、固形組織の癌腫、口、咽喉、喉頭及び肺の扁平上皮癌、肝臓癌、前立腺、子宮頸部、膀胱、子宮及び子宮内膜癌などの泌尿生殖器の癌並びに網膜細胞癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、皮膚又は眼内黒色腫、内分泌系の癌、甲状腺の癌、副甲状腺の癌、頭部及び頚部癌、乳癌、胃腸の癌及び神経系の癌、パピローマなどの良性病変などの１つ又は複数の癌に適用される。
【００３４】
併用療法：本明細書で使用されるとき、用語「併用療法」は、対象が２つ以上の治療レジメン（例えば、２種以上の治療薬）に同時に曝露される状況を指す。一部の実施形態では、２種以上の薬剤を同時に投与し得；一部の実施形態では、そうした薬剤を順次投与し得；一部の実施形態では、そうした薬剤を重複投薬レジメンで投与する。
【００３５】
ドメイン：用語「ドメイン」は、実体の１区分又は一部分を指すよう本明細書で使用される。一部の実施形態では、「ドメイン」は、その実体の特定の構造的及び／又は機能的特徴に関連し、そのため、ドメインがその親実体の他の部分から物理的に分離されたとき、その特定の構造的及び／又は機能的特徴を実質的に又は完全に保持する。上記に代わり又は加えて、ドメインは、（親）実体から分離されて、異なる（レシピエント）実体と結合されたとき、親実体においてそれを特徴付ける１つ若しくは複数の構造的及び／若しくは機能的特徴をレシピエント実体において実質的に保持し、且つ／又はレシピエント実体に付与する実体の一部分であるか又はそれを含み得る。一部の実施形態では、ドメインは、分子（例えば、小分子、炭水化物、脂質、核酸若しくはポリペプチド）の１区分又は一部分である。一部の実施形態では、ドメインは、ポリペプチドの１区分であり；一部のそうした実施形態では、ドメインは、特定の構造的要素（例えば、特定のアミノ酸配列若しくは配列モチーフ、αヘリックス特徴、βシート特徴、コイルドコイル特徴、ランダムコイル特徴など）及び／又は特定の機能的特徴（例えば、結合活性、酵素活性、折り畳み活性、シグナル伝達活性など）を特徴とする。
【００３６】
剤形：本明細書で使用されるとき、用語「剤形」及び「単位剤形」は、治療しようとする患者の治療薬の物理的に個別の単位を指す。各単位は、所望の治療効果をもたらすように計算された予定量の活性物質を含有する。しかしながら、組成物の総投与量は、健全な医学的判断の範囲内で担当医によって決定されることが理解されるであろう。
【００３７】
投与レジメン：本明細書で使用されるとき、用語「投与レジメン」は、典型的には時間的間隔をあけて、対象に個別に投与される単位用量（典型的には２つ以上）のセットを指す。一部の実施形態では、所与の治療薬は、１つ又は複数の用量を含み得る、推奨される投与レジメンを有する。一部の実施形態では、投与レジメンは、各々が互いに同じ長さの時間的間隔をあけた複数の用量を含み；一部の実施形態では、投与レジメンは、複数の用量と、個々の用量間の少なくとも２つの異なる時間的間隔とを含む。一部の実施形態では、投与レジメン内の用量は全て同じ単位用量である。一部の実施形態では、投与レジメン内の様々な用量は異なる量である。一部の実施形態では、投与レジメンは、第１の投与量の第１の用量と、それに続いて第１の投与量と異なる第２の投与量の１つ又は複数回の追加用量を含む。一部の実施形態では、投与レジメンは、第１の投与量の第１の用量と、それに続いて第１の投与量と同じ第２の投与量の１つ又は複数回の追加用量を含む。一部の実施形態では、投与レジメンは、関連集団全体に投与される（すなわち治療投与レジメンである）とき、所望又は有益な転帰と相関する。
【００３８】
発現：本明細書で使用されるとき、核酸配列の「発現」は、以下の事象：（１）ＤＮＡ配列からのＲＮＡテンプレートの生成（例えば、転写による）；（２）ＲＮＡ転写物のプロセシング（例えば、スプライシング、編集、５’キャップ形成及び／又は３’末端形成による）；（３）ポリペプチド若しくはタンパク質へのＲＮＡの翻訳；及び／又は（４）ポリペプチド若しくはタンパク質の翻訳後修飾の１つ又は複数を指す。
【００３９】
融合タンパク質：本明細書で使用されるとき、用語「融合タンパク質」は一般に、各々が（１）天然に存在し、且つ／又は（２）ポリペプチドの機能性ドメインを表すペプチド部分に対して高度のアミノ酸同一性を示す少なくとも２つのセグメントを含むポリペプチドを指す。典型的には、少なくとも２つのこうしたセグメントを含むポリペプチドは、２つのセグメントが（１）同じペプチド中に天然に含まれず、且つ／又は（２）事前に単一ポリペプチド中で互いに連結されておらず、且つ／又は（３）人の手によって互いに連結されていない部分である場合に融合タンパク質であると考えられる。
【００４０】
遺伝子：本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子」は、当技術分野で理解されている意味を有する。当業者であれば、用語「遺伝子」が遺伝子調節配列（例えば、プロモータ、エンハンサーなど）及び／又はイントロン配列を含み得ることを理解するであろう。さらに、遺伝子の定義には、タンパク質をコードしないが、代わりにｔＲＮＡ、ＲＮＡｉ誘導物質などの機能性ＲＮＡ分子などをコードする核酸を示す場合も含まれることが理解されるであろう。明瞭化のために、本発明者らは、本出願で使用されるとき、用語「遺伝子」が、一般に、タンパク質をコードする核酸の一部分を指し；当業者に文脈から明らかとなるように、この用語は、任意選択で、調節配列を含む場合もあることを明記する。この定義が用語「遺伝子」の非タンパク質コード発現単位への適用を排除することは意図されず、むしろ、ほとんどの場合、本明細書で使用されるこの用語がタンパク質コード核酸を指すことを明らかにすることが意図される。
【００４１】
遺伝子産物又は発現産物：本明細書で使用されるとき、用語「遺伝子産物」又は「発現産物」は、一般に、遺伝子から転写されるＲＮＡ（プロセシング前及び／又は後）又は遺伝子から転写されるＲＮＡによってコードされるポリペプチド（修飾前及び／又は後）を指す。
【００４２】
同一性：本明細書で使用されるとき、用語「同一性」は、核酸分子（例えば、ＤＮＡ分子及び／若しくはＲＮＡ分子）間並びに／又はポリペプチド間の全体的関連性を指す。一部の実施形態では、核酸又はポリペプチドは、それらの配列が少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である場合、互いに「実質的に同一である」と考えられる。例えば、２つの核酸又はポリペプチド配列の同一性（％）の計算は、最適比較の目的で２つの配列をアライニングすることにより実施することができる（例えば、最適アラインメントのために第１及び第２の配列の一方又は両方にギャップを導入することができ、比較の目的で非同一配列を無視することができる）。特定の実施形態では、比較の目的でアラインメントした配列の長さは、参照配列の長さの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％又は実質的に１００％である。次に、対応する位置のヌクレオチドを比較する。第１の配列のある位置が、第２の配列の対応する位置と同じ残基（例えば、ヌクレオチド又はアミノ酸）によって占められている場合、その分子は、その位置で同一である。２つの配列間の同一性（％）は、ギャップの数、各ギャップの長さ（２つの配列の最適アラインメントのために導入する必要がある）を考慮に入れて、配列によって共有される同一の位置の数の関数である。配列の比較及び２つの配列間の同一性（％）の決定は、数学的アルゴリズムを用いて達成することができる。例えば、２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＭｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｍｉｌｌｅｒ，１９８９のアルゴリズムを用いて決定することができる。一部の例示的な実施形態では、ＡＬＩＧＮプログラムを用いて核酸配列の比較を実施する場合、ＰＡＭ１２０残基重み表、ギャップ長ペナルティ１２及びギャップペナルティ４を使用する。代わりに、２つのヌクレオチド配列間の同一性（％）は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリクスを使用するＧＣＧソフトウェアパッケージ中のＧＡＰプログラムを用いて決定することもできる。
【００４３】
免疫グロブリン単一可変ドメイン：本明細書で使用されるとき、用語「免疫グロブリン単一可変ドメイン」又は「単一可変ドメイン」は、別の可変免疫グロブリンドメインと対合することなく、抗原のエピトープと特異的に結合することができる免疫グロブリン可変ドメインを意味する。本発明の意味での免疫グロブリン単一可変ドメインの一例は、免疫グロブリン単一可変ドメインＶＨ及びＶＬ（ＶＨドメイン及びＶＬドメイン）などの「ドメイン抗体」である。免疫グロブリン単一可変ドメインの別の例は、本明細書に記載される通り、ラクダ類由来の「ＶＨＨドメイン」（又は単に「ＶＨＨ」）である。
【００４４】
免疫グロブリン可変ドメイン：本明細書で使用されるとき、用語「免疫グロブリン可変ドメイン」又は「可変ドメイン」は、４つの「フレームワーク領域」（当技術分野及び本明細書では、それぞれ「フレームワーク領域１」又は「ＦＲ１」；「フレームワーク領域２」又は「ＦＲ２」；「フレームワーク領域３」又は「ＦＲ３」；「フレームワーク領域４」又は「ＦＲ４」と呼ばれる）であるか又はそれらを含む免疫グロブリンドメインを意味し；これらのフレームワーク領域は、３つの「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」（当技術分野及び本明細書では、それぞれ「相補性決定領域１」又は「ＣＤＲ１」；「相補性決定領域２」又は「ＣＤＲ２」；「相補性決定領域３」又は「ＣＤＲ３」と呼ばれる）によって分断されている。一部の実施形態では、免疫グロブリン可変ドメインの全体構造又は配列は、以下のように表記することができる：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４。
【００４５】
改善する、増加する又は低減する：本明細書で使用されるとき、用語「改善する」、「増加する」若しくは「低減する」又は文法上の均等物は、本明細書に記載される治療の開始前の同じ個体の測定値又は本明細書に記載される治療の非存在下の対照個体（若しくは複数の対照個体）の測定値などのベースライン測定値と比した値を示す。
【００４６】
個体、対象、患者：本明細書で使用されるとき、用語「対象」、「個体」又は「患者」は、ヒト又は非ヒト哺乳動物対象を指す。治療対象である個体（「患者」又は「対象」とも呼ばれる）は、疾患、例えば癌に罹患している個体（胎児、乳児、小児、青年又は成人）である。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。
【００４７】
Ｋａ：本明細書で使用されるとき、「Ｋａ」は、抗原結合部分／抗原標的複合体を形成する特定の抗原結合部分と抗原標的の会合速度を指す。
【００４８】
Ｋｄ：本明細書で使用されるとき、「Ｋｄ」は、特定の抗原結合部分／抗原標的複合体の解離速度を指す。
【００４９】
ＫＤ：本明細書で使用されるとき、「ＫＤ」は、解離定数であり、これは、ＫｄとＫＤとの比（すなわちＫｄ／ＫＤ）から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。ＫＤ値は、当技術分野で十分に確立されている方法を用いて、例えば表面プラズモン共鳴を用いて又はＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサーシステムを用いることにより決定することができる。
【００５０】
リンカー：本明細書で使用されるとき、用語「リンカー」は、例えば、融合タンパク質において、天然のタンパク質中の特定の位置に出現するものと異なる適切な長さのアミノ酸配列を指し、これは、概して、柔軟であり、且つ／又は２つのタンパク質部分間にヘリックスなどの構造を挿入するように設計される。一般に、リンカーは、融合タンパク質の２つ以上のドメインがドメイン各々の生物学的活性の５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％以上を保持することを可能にする。リンカーは、スペーサと呼ばれることもある。一部の実施形態では、ポリペプチドリンカーは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００アミノ酸長であるか又はそれを超える。当技術分野で公知のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）を改変する際、様々な異なるリンカーエレメントを適切に使用することができる（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８；Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３）を参照されたい）。
【００５１】
核酸：本明細書で使用されるとき、「核酸」は、その広い意味で、オリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるか又は組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質を指す。一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるか又は組み込むことができる任意の化合物及び／又は物質である。文脈から明らかになるように、一部の実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／又はヌクレオシド）を指し；一部の実施形態では、「核酸」は、個別の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。一部の実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであるか又はＲＮＡを含み；一部の実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであるか又はＤＮＡを含む。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の天然の核酸残基であるか、それを含むか又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の核酸類似体であるか、それを含むか又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸類似体は、ホスホジエステル骨格を使用しない点で核酸と異なる。例えば、一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の「ペプチド核酸」であるか、それを含むか又はそれから構成され、ペプチド核酸は、当技術分野において公知であり、骨格中にホスホジエステル結合ではなく、ペプチド結合を有し、本発明の範囲内にあるとみなされる。上記に代わり又は加えて、一部の実施形態では、核酸は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ又は複数のホスホロチオエート及び／又は５’−Ｎ−ホスホロアミダイト結合を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の天然のヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン及びデオキシシチジン）であるか、それを含むか又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数の核酸類似体（例えば、２−アミノアデノシン、２−チオチミジン、イノシン、ピロロ−ピリミジン、３−メチルアデノシン、５−メチルシチジン、Ｃ−５ピロピニル−シチジン、Ｃ−５ピロピニル−ウリジン、２−アミノアデノシン、Ｃ５−ブロモウリジン、Ｃ５−フルオロウリジン、Ｃ５−ヨードウリジン、Ｃ５−プロピニル−ウリジン、Ｃ５−プロピニル−シチジン、Ｃ５−メチルシチジン、２−アミノアデノシン、７−デアザアデノシン、７−デアザグアノシン、８−オキソアデノシン、８−オキソグアノシン、０（６）−メチルグアニン、２−チオシチジン、メチル化塩基、挿入された塩基並びにこれらの組合せ）であるか、それを含むか又はそれから構成される。一部の実施形態では、核酸は、天然の核酸中のものと比較して、１つ又は複数の修飾糖（例えば、２’−フルオロリボース、リボース、２’−デオキシリボース、アラリボース及びヘキソース）を含む。一部の実施形態では、核酸は、ＲＮＡ又はタンパク質などの機能性遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態では、核酸は、１つ又は複数のイントロンを含む。一部の実施形態では、核酸は、天然供給源からの単離、相補的テンプレートに基づく重合による酵素的合成（インビボ又はインビトロ）、組換え細胞又は系における再生並びに化学的合成の１つ又は複数によって製造される。一部の実施形態では、核酸は、少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００残基長又はそれを上回る。一部の実施形態では、核酸は、一本鎖であり；一部の実施形態では、核酸は、二本鎖である。一部の実施形態では、核酸は、ポリペプチドをコードする少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有するか、又はポリペプチドをコードする配列の補体である。一部の実施形態では、核酸は、酵素活性を有する。
【００５２】
作動可能に連結された：本明細書で使用されるとき、「作動可能に連結された」は、記載の成分がその意図される様式で機能することを可能にする関係にある、並置を指す。コード配列と「作動可能に連結された」制御配列とは、コード配列の発現が制御配列と適合する条件下で達成されるように連結される。「作動可能に連結された」配列は、目的の遺伝子と連続する発現制御配列並びに目的の遺伝子を制御するためにトランスで又は間隔を置いて作用する発現制御配列の両方を含む。本明細書で使用される用語「発現制御配列」は、それらが連結されるコード配列の発現及びプロセシングを達成するのに必要なポリヌクレオチド配列を指す。発現制御配列は、適切な転写開始、終結、プロモータ及びエンハンサー配列；スプライシング及びポリアデニル化シグナルなどの効率的ＲＮＡプロセシングシグナル；細胞質ｍＲＮＡを安定化させる配列；翻訳効率を高める配列（すなわちコザック（Ｋｏｚａｋ）共通配列）；タンパク質安定性を高める配列；並びに必要に応じてタンパク質分泌を増大する配列を含む。こうした制御配列の性質は、宿主生物に応じて異なる。例えば、原核生物の場合、そうした制御配列は、一般に、プロモータ、リボソーム結合部位及び転写終結配列を含むが、真核生物の場合、典型的に、そうした制御配列は、プロモータと転写終結配列とを含む。用語「制御配列」は、存在が発現及びプロセシングに不可欠な成分を含むことが意図され、存在が有利な別の成分、例えばリーダ配列及び融合パートナー配列を含み得る。
【００５３】
ペプチド：本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」は、典型的には、相対的に短い、例えば約１００アミノ酸未満、約５０アミノ酸未満、２０アミノ酸未満又は１０アミノ酸未満の長さを有するペプチドを指す。
【００５４】
薬学的に許容される：本明細書で使用される用語「薬学的に許容される」は、健全な医学的判断の範囲内で、過剰な毒性、刺激、アレルギー反応又は他の問題若しくは合併症を起こすことなく、ヒト及び動物の組織と接触させる使用に好適であり、妥当な受益度／危険度比に相応する物質を指す。
【００５５】
ポリペプチド：本明細書で使用されるとき、「ポリペプチド」は、一般的に、ペプチド結合によって互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸の鎖である。一部の実施形態では、ポリペプチドは、各々が少なくとも１つのペプチド結合によって互いに結合された少なくとも３〜５のアミノ酸を含み得る。当業者であれば、ポリペプチドが、ときに、それでもなお任意選択で、ポリペプチド鎖に組み込まれ得る「非天然」アミノ酸又は他の実体を含むことが理解されるであろう。
【００５６】
プロモータ：本明細書で使用されるとき、「プロモータ」は、ポリヌクレオチド配列の特定の転写を開始する上で必要である、細胞の合成装置又は導入された合成装置によって認識されるＤＮＡ配列である。「構成性」プロモータは、遺伝子産物をコードするか、又はそれを規定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、細胞のほとんど若しくは全ての生理的条件下で、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。「誘導性」プロモータは、遺伝子産物をコードするか、又はそれを規定するポリヌクレオチドと作動可能に連結されると、実質的に、細胞中にプロモータ特異的誘導物質が存在するときに限って、細胞中で遺伝子産物を産生させるヌクレオチド配列である。
【００５７】
タンパク質：本明細書で使用されるとき、用語「タンパク質」は、ポリペプチド（すなわちペプチド結合によって互いに結合された少なくとも２つのアミノ酸の鎖）を指す。タンパク質は、アミノ酸以外の部分を含み得（例えば、糖タンパク質、プロテオグリカンなどであり得）、且つ／又は別の方法でプロセシング若しくは修飾され得る。当業者であれば、「タンパク質」が、細胞によって産生される通りの完全なポリペプチド鎖（シグナル配列を含むか又は含まない）であるか又はその一部分であり得ることを理解するであろう。当業者であれば、タンパク質が、ときに、例えば１つ若しくは複数のジスルフィド結合により連結されているか、又は他の手段で結合された２つ以上のポリペプチド鎖を含み得ることを理解するであろう。ポリペプチドは、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸又はその両方を含み得、当技術分野で公知の多様なアミノ酸修飾又は類似体のいずれを含み得る。有用な修飾として、例えば、末端アセチル化、アミド化、メチル化などが挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質は、天然アミノ酸、非天然アミノ酸、合成アミノ酸及びそれらの組合せを含み得る。
【００５８】
参照：本明細書で使用されるとき、「参照」は、比較が行われる標準又は対照を表す。例えば、一部の実施形態では、対象の薬剤、動物、個体、集団、サンプル、配列若しくは値を参照又は対照薬剤、動物、個体、集団、サンプル、配列若しくは値と比較する。一部の実施形態では、参照又は対照は、対象の試験又は決定と実質的に同時に試験及び／又は決定される。一部の実施形態では、参照又は対照は、任意選択で有形的表現媒体に組み入れられた履歴的参照又は対照である。典型的に、当業者は、参照又は対照が評価対象のものと同等の条件又は状況下で決定又は特性決定されることを理解するであろう。当業者であれば、考えられる特定の参照又は対照への信頼性及び／若しくはそれとの比較を正当化する上で十分な類似性がいつ存在するかを認識するであろう。
【００５９】
選択的結合：本明細書で使用されるとき、「選択的結合」、「選択的に結合する」、「特異的結合」又は「特異的に結合する」は、抗原結合部分及び抗原標的に関して、抗原結合部分が抗原標的と優先的に結合するが、抗原標的ではない実体と優先的に結合しないことを指す。抗原結合部分と非標的との間にある程度の非特異的結合が起こり得る。一部の実施形態では、抗原結合部分と抗原標的との間の結合が、抗原結合部分と非標的との間の結合と比較して２倍超、５倍超、１０倍超又は１００倍超である場合、抗原結合部分は、抗原標的と選択的に結合する。一部の実施形態では、結合親和性が約１０−５Ｍ未満、約１０−６Ｍ未満、約１０−７Ｍ未満、約１０−８Ｍ未満又は約１０−９Ｍ未満である場合、抗原結合部分は、抗原標的と選択的に結合する。
【００６０】
対象：「対象」とは、哺乳動物（例えば、ヒト、一部の実施形態では、出生前のヒト形態を含む）を意味する。一部の実施形態では、対象は、関連疾患、障害又は病状に罹患している。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害又は病状に罹患しやすい。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害又は病状の１つ又は複数の症状又は特徴を呈示する。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害又は病状のいずれの症状又は特徴も呈示しない。一部の実施形態では、対象は、疾患、障害又は病状の危険性に対する感受性に特有の１つ又は複数の特徴を有する者である。一部の実施形態では、対象は、患者である。一部の実施形態では、対象は、診断及び／又は療法が投与され、且つ／又は投与された個体である。
【００６１】
に罹患している：疾患、障害又は病状（例えば、癌）に「罹患している」個体は、疾患、障害又は病状を有すると診断され、且つ／又はその１つ若しくは複数の症状を呈示する。
【００６２】
症状が軽減される：本発明によれば、特定の疾患、障害又は病状の１つ又は複数の症状が程度（例えば、強度、重症度など）又は頻度において低減したとき、「症状が軽減される」。明瞭化のために、特定の症状の発症が遅れることも、その症状の頻度の軽減の一形態とみなされる。本発明を、症状が排除される場合のみに限定することは意図されない。本発明は、特に、１つ又は複数の症状が、完全に排除されていなくても、軽減される（並びにそれによって対象の病状が「改善される」）治療を考慮する。
【００６３】
治療薬：本明細書で使用されるとき、フレーズ「治療薬」は、概して、生物に投与されると、所望の薬理学的効果を誘発する任意の薬剤を指す。一部の実施形態では、薬剤は、適切な集団全体に統計的に有意な効果を示す場合、治療薬であるとみなされる。一部の実施形態では、適切な集団は、モデル生物の集団であり得る。一部の実施形態では、適切な集団は、特定の年齢群、性別、遺伝的背景、既往歴などの様々な基準によって定義され得る。一部の実施形態では、治療薬は、疾患、障害及び／又は病状の１つ又は複数の症状又は特徴の発症の緩和、改善、軽減、阻害、予防、遅延、その重症度の軽減及び／又はその発生率の低減のために使用することができる物質である。一部の実施形態では、「治療薬」は、ヒトへの投与のために市販が可能になる前に、政府機関によって承認されているか、又は承認を必要とする薬剤である。一部の実施形態では、「治療薬」は、ヒトへの投与のために処方箋を必要とする薬剤である。一部の実施形態では、治療薬は、本明細書に記載の細胞治療薬（例えば、本明細書に記載されるような発現構築物によりコード化される抗原結合受容体を含むか又はそれから構成される免疫細胞）である。
【００６４】
治療有効量：本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、治療薬投与レジメンに従い、疾患、障害及び／又は病状に罹患しているか又は罹患しやすい集団に投与されるとき、その疾患、障害及び／又は病状を治療する上で十分な量を意味する。一部の実施形態では、治療有効量は、疾患、障害及び／又は病状の１つ又は複数の症状の発生率及び／又は重症度を軽減し、その１つ又は複数の特徴を安定化させ、且つ／又はその発症を遅延させる量である。当業者であれば、用語「治療有効量」が、実際には、特定の個体において治療の成功の達成を要求しないことを認識するであろう。そうではなく、治療有効量は、そうした治療を必要とする患者に投与されるとき、有意な数の対象において特定の所望の薬理学的応答をもたらす量であり得る。例えば、一部の実施形態では、「治療有効量」は、集中療法に関連して、それを必要とする個体に投与されると、前記個体に起こる癌の支持プロセスを遮断、安定化、減衰若しくは逆転するか、又は前記個体における癌の支持プロセスを増強若しくは増加する量を指す。癌治療に関連して、「治療有効量」は、癌と診断された個体に投与されると、個体における癌のさらなる発生を予防、安定化、阻害又は軽減する量である。本明細書に記載される組成物の特に好ましい「治療有効量」は、悪性腫瘍の発生を逆転させる（治療的療法の場合）か、又は悪性腫瘍の寛解を達成若しくは持続させるのを助ける。個体における癌を治療するために個体に投与される治療有効量は、寛解を促進するか、又は転移を阻害するために投与される治療有効量と同じであるか又は異なり得る。ほとんどの癌治療と同様に、本明細書に記載される治療方法は、癌の「治癒」として解釈されるか、それに制限されるか、又は限定されるべきではなく；むしろ、これらの治療方法は、癌を「治療する」、すなわち癌を有する個体の健康に望ましい又は有益な変化をもたらすことを目的とする記載の組成物の使用に関する。こうした利益は、腫瘍学の分野の熟練した医療供給者によって認識されており、そのようなものとして、限定されないが、患者の病状の安定化、腫瘍サイズの減少（腫瘍退縮）、生活機能の改善（例えば、癌組織又は器官の機能改善）、それ以上の転移の減少又は阻害、日和見感染の減少、生存率の増加、痛みの軽減、運動機能の改善、認知機能の改善、エネルギーの感覚改善（活力、不快感の軽減）、良好な状態の感覚改善、正常な食欲の回復、健全な体重増加の回復並びにこれらの組合せが挙げられる。さらに、個体の特定の腫瘍の退縮（例えば、本明細書に記載の治療の結果として）は、膵臓腺癌などの腫瘍の部位から癌細胞のサンプルを採取し（例えば、治療過程を通して）、代謝及びシグナル伝達マーカのレベルについて癌細胞をテストして、分子レベルで、より低悪性の表現型への癌細胞の退縮を確認するために癌細胞の状態をモニターすることによって評価され得る。例えば、本発明の方法を使用することにより誘導される腫瘍退縮は、１つ又は複数の血管新生促進マーカの減少、抗血管新生マーカの増加、癌と診断された個体において異常活性を呈示する代謝経路、細胞間シグナル伝達経路又は細胞内シグナル伝達経路の正常化（すなわち癌に罹患していない正常な個体に見出される状態に向かう改変）を見出すことによって示される。当業者であれば、実施形態によっては、治療有効量を単回用量に製剤化及び／又は投与し得ることを認識するであろう。一部の実施形態では、例えば、投与レジメンの一環として、治療有効量を複数回の用量に製剤化及び／又は投与し得る。
【００６５】
形質導入：本明細書で使用されるとき、「形質導入」は、ウイルスベクターにより核酸を細胞中に導入する工程である。一部の実施形態では、形質導入は、細胞治療薬産生のためのリンパ球への核酸配列のウイルスベクター媒介性導入を表す。
【００６６】
形質転換：本明細書で使用されるとき、「形質転換」は、外性ＤＮＡを宿主細胞に導入するあらゆる工程を指す。形質転換は、当技術分野で周知の様々な方法を用いて天然又は人工的条件下で行われ得る。形質転換には、外来核酸配列を原核又は真核宿主細胞に挿入する任意の公知の方法を利用し得る。一部の実施形態では、特定の形質転換法は、形質転換しようとする宿主細胞に基づいて選択され、こうした方法として、限定されないが、ウイルス感染、エレクトロポレーション、交配、リポフェクションを挙げることができる。ウイルスベクター媒介性形質転換は、「形質導入」と呼ぶことができる。一部の実施形態では、「形質転換」細胞は、挿入されたＤＮＡが自律的複製プラスミドとして又は宿主染色体の一部としてのいずれかで複製可能であるという点で安定して形質転換されている。一部の実施形態では、形質転換細胞は、限定的な期間にわたり、導入された核酸を一過性発現する。
【００６７】
治療：本明細書で使用されるとき、用語「治療」（さらに「治療する」又は「治療すること」）は、特定の疾患、障害及び／又は病状（例えば、癌）の１つ又は複数の症状、特徴及び／又は原因を部分的又は完全に緩和、改善、軽減、阻害する、その発症を遅延させ、その重症度を軽減し、且つ／又はその発生率を低減する物質のあらゆる投与を指す。こうした治療は、関連疾患、障害及び／若しくは病状の徴候を示していない対象並びに／又は疾患、障害及び／若しくは病状の早期徴候のみを呈示している対象に対するものであり得る。代わりに又は加えて、こうした治療は、関連疾患、障害及び／又は病状の１つ又は複数の確定された徴候を示す患者に対するものでもあり得る。一部の実施形態では、治療は、関連疾患、障害及び／又は病状に罹患していると診断された対象に対するものであり得る。一部の実施形態では、治療は、関連疾患、障害及び／又は病状の発生の危険性増加と統計的に相関する１つ又は複数の感受性因子を有することがわかっている対象に対するものであり得る。
【００６８】
腫瘍浸潤リンパ球：本明細書で使用されるとき、用語「腫瘍浸潤リンパ球」は、癌（黒色腫など）に罹患した対象の白血球で、血流を出て、腫瘍に移動したものを指す。一部の実施形態では、腫瘍浸潤リンパ球は、腫瘍特異性を有する。
【００６９】
変異体：本明細書で使用されるとき、用語「変異体」は、参照実体との有意な構造同一性を示すが、参照実体と比較して１つ又は複数の化学的部分の存在又はレベルが参照実体と構造に異なる実体を指す。用語「変異体」及び「突然変異体」は、本明細書では置き換え可能に用いられる。多くの実施形態では、変異体は、その参照実体と機能的にも異なる。概して、特定の実体が参照実体の「変異体」であると適正にみなされるかどうかは、参照実体との構造同一性の程度に基づく。当業者に理解されるように、任意の生物学的又は化学的参照実体が特定の特徴的構造エレメントを有する。変異体は、定義により、１つ又は複数のそうした特徴的な構造エレメントを共有する別個の化学的実体である。ポリペプチドは、線状に若しくは３次元空間で互いに対して指定された位置を有し、且つ／又は特定の生物学的機能に寄与する複数のアミノ酸から構成される特徴的な配列エレメントを有し得る。例えば、変異体ポリペプチドは、ポリペプチド骨格と共有結合したアミノ酸配列の１つ若しくは複数の相違及び／又は化学的部分（例えば、炭水化物、脂質など）の１つ若しくは複数の相違において参照ポリペプチドと異なり得る。一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと全体的な配列同一性を示し、それは、少なくとも８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％又は９９％である。代わりに又は加えて、一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと少なくとも１つの特徴的な配列エレメントを共有しない。一部の実施形態では、参照ポリペプチドは、１つ又は複数の生物学的活性を有する。一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドの１つ又は複数の生物学的活性を共有する。一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドの１つ又は複数の生物学的活性を欠失している。一部の実施形態では、変異体ポリペプチドは、参照ポリペプチドと比較して低下又は増大したレベルの１つ又は複数の生物学的活性を示す。多数の実施形態では、ポリペプチドは、ポリペプチドが、特定の位置における少数の配列変化を除いて、親のものと同一のアミノ酸配列を有する場合、親又は参照ポリペプチドの「変異体」であるとみなされる。典型的に、親と比較して変異体の残基の２０％、１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％未満が置換されている。一部の実施形態では、変異体は、親と比較して１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１つの置換残基を有する。多くの場合、変異体は、非常に少数（例えば、５、４、３、２又は１つ未満）の置換された機能性残基（すなわち特定の生物学的活性に参加する残基）を有する。さらに、変異体は、典型的に、５、４、３、２又は１つ以下の付加又は欠失を有し、多くの場合、親と比較して付加又は欠失を含まない。さらに、任意の付加又は欠失は、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１０、約９、約８、約７、約６つ未満であり、一般に約５、約４、約３又は約２つ未満の残基である。一部の実施形態では、親又は参照ポリペプチドは、天然に存在するものである。
【００７０】
ベクター：本明細書で使用されるとき、「ベクター」は、それが結合する別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。一部の実施形態では、ベクターは、それらが、真核及び／又は原核細胞などの宿主細胞中で、連結される核酸の染色体外複製及び／又は発現が可能である。作動可能に連結された遺伝子の発現を指令することができるベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【００７１】
とりわけ、本開示は、ＣＤ１９変異体及びこうしたＣＤ１９変異体を含む組成物を識別する方法を提供する。スカフォールドベースの結合タンパク質は、例えば、抗体と同様に、特定の抗原標的に結合するそれらの可能性が知られている。いくつかのスカフォールド結合タンパク質は、安定したフレームワークコアを含み、推定抗原結合領域は、複数の置換を許容することができる。従って、スカフォールドフレームワークコアを合成により作製することができ、そこから様々な配列変異体のライブラリを構築することができる。配列多様性は、典型的に、潜在的抗原結合領域として役立ち得るループ構造又は他の外側表面など、タンパク質の外側表面に存在する。本開示は、抗原結合及び／又は安定性を呈示するＣＤ１９変異体をスクリーニング及び識別するステップを含む。
【００７２】
ＣＤ１９
ＣＤ１９は、Ｂ細胞発生のバイオマーカとして用いられる９５ｋＤａＩ型膜貫通糖タンパク質である（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１：３６（２０１２））。リンパ腫及び白血病におけるＣＤ１９発現は、特にキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞療法のための有効な治療標的とされている（Ｍａｕｄｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  １２５：４０１７−４０２４  （２０１５））。ＣＡＲＴ−Ｔ細胞療法におけるＣＤ１９の比類なく効果的な成果に基づき、腫瘍バイオマーカに直接結合するように作製された抗体−ＣＤ１９融合物又はＣＤ１９変異体を用いて、ＣＤ１９−腫瘍をＣＤ１９＋腫瘍に「変換する」ステップを含む治療アプローチが記載されている（例えば、国際公開第２０１７／０７５５３７号パンフレット及び同第２０１７／０７５５３３号パンフレットを参照されたい）。これらに関連して、適正なフォールディング、生物学的エピトープの提示及び安定性をはじめとするＣＤ１９細胞外領域の構造完全性は、分子療法の遂行に重要となり得る。
【００７３】
ＣＤ１９の細胞外領域は、２つのＣ２様免疫グロブリンドメインを含有すると仮定された（例えば、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．１：３６（２０１２）；Ｔｅｄｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．５：５７２−５７７（２００９）を参照されたい）。これは、相同性モデル化によって支持されている（Ｓｏｅｄｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．３３：２４４−２４８（２００５））（図１を参照されたい）。しかしながら、近年発表された構造から、ＣＤ１９がＣ２様免疫グロブリンドメインを含まないことが明らかにされた（Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８６：４９５−５００（２０１８））。
【００７４】
ヒトＣＤ１９のヌクレオチド配列及びＣＤ１９の特定のドメインのヌクレオチド配列が知られている（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｍ８４３７１．１を参照されたい）。例えば、ＣＤ１９の細胞外ドメインをコードするヌクレオチド配列は、
【化１】
2021508443.tif 000003
である。
【００７５】
ＣＤ１９の細胞外ドメインのアミノ酸配列は、
【化２】
2021508443.tif 000004
である。
【００７６】
本明細書で述べる通り、本開示は、ＣＤ１９変異体を提供する。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、本明細書に記載される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む完全長ＣＤ１９ポリペプチド又はその部分であるか又はそれを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、本明細書に記載される１つ又は複数のアミノ酸置換を含むＣＤ１９細胞外ドメイン又はその部分であるか又はそれを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、ＣＤ１９Ｃ２様Ｉｇドメインの一方又は両方（又はＩｇドメインの一方又は両方の部分）であるか又はそれを含み、それらの一方又は両方は、本明細書に記載される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、Ｃ末端の１つ又は複数のアミノ酸を欠失しており、且つＣ２様Ｉｇドメインの両方を含むＣＤ１９細胞外ドメインであるか又はそれを含み、及び本明細書に記載される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、Ｃ末端の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又はそれを超えるアミノ酸を欠失しており、且つＣ２様Ｉｇドメインの両方を含むＣＤ１９細胞外ドメインであるか又はそれを含み、及び本明細書に記載される１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
【００７７】
ＣＤ１９変異体を識別する方法
ＣＤ１９変異体は、特定の標的細胞外ドメイン置換を有する変異体（例えば、変異体のライブラリ）をスクリーニングすることによって識別することができる。こうしたアプローチを用いて、非免疫原性置換を最小限にしながら、全体的ＣＤ１９安定性を最大化することができる。加えて、１つ又は複数のシステムにおいて全体的多様性をスクリーニングできるように、ＣＤ１９変異体のライブラリのサイズを調整することも可能である。従って、一部の実施形態では、Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８６：４９５−５００（２０１８）により記載されるループ又はシートを含め、ＣＤ１９の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）及び／又はＣ２様Ｉｇドメインの一方又は両方を突然変異誘発のためのスカフォールドとして使用して、１つ又は複数の突然変異を含むＣＤ１９変異体（例えば、ＣＤ１９又はその部分（例えば、ＥＣＤ、Ｃ２様Ｉｇドメインの一方又は両方、Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８６：４９５−５００（２０１８）により記載される１つ若しくは複数のループ及び／又はそれらの部分）をスクリーニングした後、発現に基づき、且つ／又は本明細書に記載の１つ又は複数の機能性特徴（例えば、抗ＣＤ１９抗体との結合、標的抗原との結合及び／又は安定性）に基づいて選択することができる。
【００７８】
ＣＤ１９変異体をコードする変異体核酸配列を提供するために、当技術分野で公知のいくつかの方法を使用することができる。一部の実施形態では、抗ＣＤ１９抗体に結合し、且つ／又は特定の抗原に結合するＣＤ１９変異体をコードする核酸の識別及び／又は単離を可能にするスクリーニング手順を使用する。例示的な方法として、いわゆるバイオパニングステップを含み、これは、ファージディスプレイ（Ｋａｎｇ，Ａ．Ｓ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８８，４３６３−４３６６）、リボソームディスプレイ（Ｓｃｈａｆｆｉｔｚｅｌ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．１９９９．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１，１１９−１３５）、ＤＮＡディスプレイ（Ｃｕｌｌ，Ｍ．Ｇ．ｅｔ  ａｌ．１９９２．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８９，１８６５−１８６９）、ＲＮＡ−ペプチドディスプレイ（Ｒｏｂｅｒｔｓ，Ｒ．Ｗ．，Ｓｚｏｓｔａｋ，Ｊ．Ｗ．，１９９７．Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４，１２２９７−１２３０２）、共有結合性ディスプレイ（国際公開第９８／３７１８６号パンフレット）、細菌表面ディスプレイ（Ｆｕｃｈｓ，Ｐ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９，１３６９−１３７２）、酵母表面ディスプレイ（Ｂｏｄｅｒ，Ｅ．Ｔ．，Ｗｉｔｔｒｕｐ，Ｋ．Ｄ．，１９９７．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  １５，５５３−５５７）及び真核生物ウイルスディスプレイ（Ｇｒａｂｈｅｒｒ，Ｒ．，Ｅｒｎｓｔ，Ｗ．，２００１．Ｃｏｍｂ．Ｃｈｅｍ．Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ．Ｓｃｒｅｅｎ．４，１８５−１９２）などの技術から公知である。ＦＡＣＳ及び磁気ビーズソーティングも、標識抗ＣＤ１９抗体又は標識抗原を用いた濃縮（パニング）の目的に適用可能である。バイオパニングステップ後又は単独のいずれかでＥＬＩＳＡ（Ｄｒｅｈｅｒ，Ｍ．Ｌ．ｅｔ  ａｌ．１９９１．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３９，１９７−２０５）及びＥＬＩＳＰＯＴ（Ｃｚｅｒｋｉｎｓｋｙ，Ｃ．Ｃ．ｅｔ．ａｌ．１９８３．Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．６５，１０９−２１）などの免疫検出アッセイを使用することもできる。
【００７９】
ライブラリ
一部の実施形態では、ＣＤ１９の規定領域（例えば、ＥＣＤ又はその部分）をコード化し、且つ所定のアミノ酸に対して１つのコドンのみがある個別のオリゴヌクレオチドを合成することにより、ＣＤ１９変異体を作製し、スクリーニングする。これは、例えば、オリゴヌクレオチド内の各コドン位置に、野生型ポリペプチドの合成に必要なコドン又は所定のアミノ酸に対するコドンのいずれかを組み込むことによって達成することができる（例えば、米国特許出願公開第２００５０１３６４２８号明細書を参照されたい）。別の実施形態では、ウォークスルー突然変異誘発（ＷＴＭ）を使用することができる（例えば、米国特許第６，６４９，３４０号明細書；同第５，８３０，６５０号明細書；及び同第５，７９８，２０８号明細書を参照されたい）。ＷＴＭは、最小数のオリゴヌクレオチドで多重突然変異を達成することを可能にし、これらのオリゴヌクレオチドは、例えば、ドーピング技術を用いて個別に、バッチで生成した後、必要に応じて混合又はプールすることができる。
【００８０】
ライブラリの作製のためのオリゴヌクレオチドの混合物は、公知の方法により合成することができる。合成されたポリヌクレオチドは、標準的遺伝子工学技術を用いて好適なベクター中に挿入することができる。適切なベクター（例えば、ファージベクター、プラスミドなど）により、フィブロネクチン結合ドメイン分子の発現に好適な無細胞抽出液、ファージ、原核生物細胞に遺伝子を導入することができる。
【００８１】
一部の実施形態では、ＣＤ１９核酸配列を単鎖プラスミドに導入する。例えば、遺伝子は、ヘルパーファージを使用して単鎖分子の増殖を可能にする繊維状ファージ複製起点を有するファージベクター又はベクターにクローン化することができる。単鎖テンプレートを、所望の突然変異を提示する変性ポリヌクレオチドのセットでアニーリングして、伸長し、結合することができ、こうして各アナログ鎖を分子の集団に組み込み、この集団を適切な宿主に導入することができる（例えば、Ｓａｙｅｒｓ，Ｊ．Ｒ．ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１６：７９１−８０２（１９８８）を参照されたい）。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）方法を使用して、ポリヌクレオチドを遺伝子に組み込むこともできる。
【００８２】
ライブラリのサイズは、ＣＤ１９の標的領域（例えば、ＣＤ１９ＥＣＤ又はその部分）及び要望される配列多様性の量に応じて変動し得る。一部の実施形態では、ライブラリは、１０１５、１０１４、１０１３、１０１２、１０１１、１０１０、１０９、１０８、１０７又は１０６未満のＣＤ１９変異体を含有するように設計する。一部の実施形態では、ライブラリは、マイクロチップなどの固体支持体に結合させ得、好ましくは一般に認められている技術を用いて配列し得る。
【００８３】
一部の実施形態では、優れた抗原結合性及び／又は改善された化学物理的性質（可溶性若しくは安定性など）を有するＣＤ１９変異体を識別することができる。一部の実施形態では、識別されたＣＤ１９変異体を親和性成熟に付すことにより、標的抗原に対する結合分子の親和性／活性を増大する。
【００８４】
発現及びスクリーニング
上述した技術又は他の好適な技術のいずれかにより作製したポリヌクレオチドのライブラリを発現させた後、スクリーニングして、所望の構造及び／又は活性を有するＣＤ１９変異体を識別することができる。ＣＤ１９変異体の発現は、無細胞抽出液（及び例えばリボソームディスプレイ）、ファージディスプレイ、原核生物細胞又は真核生物細胞（例えば、酵母ディスプレイ）を用いて実施することができる。一部の実施形態では、細菌発現及びディスプレイシステムを用いて、ＣＤ１９変異体ライブラリを発現及びスクリーニングする。典型的に、本明細書に記載のＣＤ１９ポリペプチド又はその部分をリンカーペプチドにより別の表面分子と結合して、融合タンパク質を作製する。
【００８５】
一部の実施形態では、無細胞抽出液中で発現させることができるテンプレートとして役立つようにポリヌクレオチドを作製する。ベクター及び抽出液は、例えば、米国特許第５，３２４，６３７号明細書；同第５，４９２，８１７号明細書；同第５，６６５，５６３号明細書に記載されており、これらを使用することができる。ポリヌクレオチド（すなわち遺伝子型）をポリペプチド（すなわち表現型）と連結するためのリボソームディスプレイ及び他の無細胞技術を使用することができる（例えば、米国特許第６，３４８，３１５号明細書；同第６，２６１，８０４号明細書；同第６，２５８，５５８号明細書を参照されたい）。
【００８６】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドを大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系に発現させ（例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６−５１５（１９８９）；Ｓｋｅｒｒａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ９：２７３−２７８（１９９１）を参照されたい）、ＣＤ１９変異体を発現させて、培地及び／又は細菌の細胞質中に分泌させる（例えば、Ｂｅｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．１７８：４７６（１９８９）を参照されたい）。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、ｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ又はｐｅｌＢシグナル配列などのシグナル配列をコードする配列の３’末端に結合させる（例えば、Ｌｅｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．１６９：４３７９（１９８７）を参照されたい）。
【００８７】
一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、例えば、米国特許出願公開第２００４００７２７４０Ａ１号明細書；同第２００３０１０００２３Ａ１号明細書；及び同第２００３００３６０９２Ａ１号明細書に記載されている通り、分泌シグナル及び脂質化部分を用いて、原核生物、例えば大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の膜表面上に発現させる。
【００８８】
別の実施形態では、例えば、米国特許第６，４２３，５３８号明細書；同第６，３３１，３９１号明細書；及び同第６，３００，０６５号明細書に記載されている通り、例えば酵母ディスプレイを用いて、ポリヌクレオチドを真核生物細胞（例えば、酵母）に発現させる。酵母ディスプレイシステムでは、ａ−凝集素酵母接着受容体を使用して、細胞表面上にタンパク質をディスプレイする。ＣＤ１９変異体ライブラリは、Ａｇａ２タンパク質Ａとの融合パートナーとして発現され、標準的技術を用いて、ＣＤ１９変異体のライブラリをレシピエント酵母宿主にトランスフェクトすることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載されるリンカーは、ＣＤ１９ポリペプチド（又は部分）とＡｇａ２タンパク質Ａとの間に含まれる。発現した融合タンパク質は、細胞から分泌されて、Ａｇａ１タンパク質に結合したジスルフィドになり、これは、酵母細胞壁に接着する（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｐＹＤ１  Ｙｅａｓｔ  Ｄｉｓｐｌａｙ  ｐｒｏｄｕｃｔ  ｌｉｔｅｒａｔｕｒｅを参照されたい）。次に、フローサイトメトリー及び蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）又は磁気ビーズなどの公知の方法を用いて、酵母細胞をスクリーニング及び分離することができる。
【００８９】
ＣＤ１９変異体の発現のために、より高等な真核生物細胞を使用することも可能であり、例えば骨髄腫細胞（例えば、ＮＳ／０細胞）、ハイブリドーマ細胞、ＨＥＫ−２９３細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞といった哺乳動物細胞がある。ＣＤ１９変異体は、培地中に発現するか又はそうした細胞の表面上に発現するように設計することができる。
【００９０】
発現したＣＤ１９変異体のスクリーニングは、任意の適切な手段により達成することができる。例えば、標準的免疫アッセイ及び／又はアフィニティークロマトグラフィーにより結合活性を評価することができる。結合活性は、例えば、Ｂｉａｃｏｒｅ計器を用いてインビトロでアッセイすることもできる。一部の実施形態では、野生型ＣＤ１９より少なくとも２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％又はそれを超えて高いレベルで標的（例えば、本明細書に記載の標的抗原）に結合するＣＤ１９変異体が識別される。
【００９１】
一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体の安定性は、高温への曝露後のタンパク質レベルの測定並びに／又は酵素及び／若しくは化学処理後のタンパク質レベルの測定など、公知の技術を用いて評価することができる。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、高温、酵素及び／又は化学処理への曝露後、同じ条件に曝露された野生型ＣＤ１９のものより少なくとも３％、５％、７％、９％、１０％、１５％、２０％、４０％、６０％、８０％、１００％、１２０％、１４０％、１６０％、１８０％、２００％、２５０％、３００％、４００％、５００％又はそれを超えて高い、測定されたタンパク質レベルを有するものとして識別される。例えば、ＣＤ１９変異体は、同じ条件に曝露された野生型ＣＤ１９の対応する融解温度より約０．５、１、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、６、７、８、９又は１０℃高い融解温度を有し得る。
【００９２】
本明細書に記載の例示的な方法では、閾値レベルの安定性及び／又は改善されたレベルの安定性（例えば、野生型ＣＤ１９若しくは別のＣＤ１９変異体と比較して）を呈示するＣＤ１９変異体が識別される。例えば、ＣＤ１９ＥＣＤをコードするヌクレオチド配列を系統的に突然変異誘発して、第１のＣＤ１９変異体ライブラリを作製することができ、これを、安定性を呈示するＣＤ１９変異体についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、第１のＣＤ１９変異体ライブラリから識別された安定なＣＤ１９変異体をコードするヌクレオチド配列から第２のライブラリ（「サブ−ライブラリ」）を作製することができ、これを、安定性を呈示するＣＤ１９変異体についてさらにスクリーニングすることもできる。安定性を呈示するＣＤ１９変異体（例えば、第１及び／又は第２のライブラリから識別されたもの）を、本明細書に記載される１つ又は複数の組成物及び／又は方法に使用することができる。加えて又は代わりに、安定性を呈示するＣＤ１９変異体（例えば、第１及び／又は第２のライブラリから識別されたもの）を、特定の抗原、例えば本明細書に記載の抗原と結合する能力についてさらにスクリーニングすることができる。例えば、野生型ＣＤ１９と比較して、１つ又は複数のアミノ酸突然変異を有する安定なＣＤ１９変異体をコードするヌクレオチド配列を系統的に突然変異誘発して（すなわち安定性を賦与するものとして識別されたもの以外のアミノ酸をコードするコドンにおいて）、新しいライブラリを作製することができ、続いて、これを、特定の抗原、例えば本明細書に記載の抗原と結合する安定なＣＤ１９変異体についてスクリーニングすることができる。
【００９３】
抗原
一部の実施形態では、任意の抗原に選択的に結合するＣＤ１９変異体を識別する。例示的な標的抗原として、例えば、ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２、ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐ１５、ＣＥＡ、ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ、ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲ、エプスタインバールウイルス抗原ＥＢＶＡ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６若しくはＥ７、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｅｒｂＢ、ｐ１８５ｅｒｂＢ２、ｐ１８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３Ｈ１、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、β−カテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、α−フェトプロテイン、β−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、ＭＵＣ１６、ＩＬ１３Ｒα２、ＦＲα、ＶＥＧＦＲ２、ルイスＹ、ＦＡＰ、ＥｐｈＡ２、ＣＥＡＣＡＭ５、ＥＧＦＲ、ＣＡ６、ＣＡ９、ＧＰＮＭＢ、ＥＧＰ１、ＦＯＬＲ１、内皮受容体、ＳＴＥＡＰ１、ＳＬＣ４４Ａ４、ネクチン−４、ＡＧＳ−１６、グアナリルシクラーゼＣ、ＭＵＣ−１、ＣＦＣ１Ｂ、インテグリンα３鎖（ａ３ｂ１、ラミニン受容体鎖）、ＴＰＳ、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３０、ＣＤ７２、ＣＤ１８０、ＣＤ１７１（Ｌ１ＣＡＭ）、ＣＤ１２３、ＣＤ１３３、ＣＤ１３８、ＣＤ３７、ＣＤ７０、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ５６、ＣＤ７４、ＣＤ１６６、ＣＤ７１、ＣＬＬ−１／ＣＬＥＣ１２Ａ、ＲＯＲ１、グリピカン３（ＧＰＣ３）、メソテリン、ＣＤ３３／ＩＬ３Ｒａ、ｃ−Ｍｅｔ、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、グリコリピドＦ７７、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＢＣＭＡ、ＧＤ−２、ＭＹ−ＥＳＯ−１又はＭＡＧＥ  Ａ３が挙げられる。
【００９４】
例示的なＣＤ１９変異体
本明細書に記載の方法を用いて、野生型ＣＤ１９と比較して高レベルの安全性を呈示したＣＤ１９変異体を識別した。従って、一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、表１Ａ、表１Ｂ、表２Ａ、表２Ｂ、表３、表６、図８Ｂ、図１１、図１２Ｂ、図１４Ａ〜図１４Ｄ又は図１５Ｂに挙げられる配列番号２の１つ又は複数のアミノ酸置換を含む。
【００９５】
一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、配列番号２の以下のアミノ酸位置２、３、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１８、２０、２２、２５、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３８、３９、４５、４７、４９、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６１、６２、６３、６４、６６、６８、７０、７２、８４、９０、９３、９４、９９、１００、１０５、１０８、１１１、１１３、１１４、１１５、１２２、１２３、１２４、１２５、１２７、１３０、１３１、１３２、１３５、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４８、１４９、１５４、１６７、１６９、１７１、１８５、１８９、１９３、１９４、１９６、１９８、２０２、２０４、２０６、２０７、２０９、２１１、２１２、２１３、２１５、２１６、２１７、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２８、２２９、２３０、２３２、２３５、２４０、２４３、２４７、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６４、２６５、２６９又は２７１の１つ又は複数にアミノ酸置換を含む。これらの位置の例示的なアミノ酸置換は、表１Ａ、表２Ａ、表３、表６、図１１、図１２Ｂ、図１４Ａ〜図１４Ｄ又は図１５Ｂに示される。
【００９６】
一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、表６に示す通り、以下の位置の１つ又は複数に以下のアミノ酸置換の１つ又は複数を含む。
【００９７】
【表１】
2021508443.tif 000005
【００９８】
【表２】
2021508443.tif 000006
【００９９】
【表３】
2021508443.tif 000007
【０１００】
【表４】
2021508443.tif 000008
【０１０１】
【表５】
2021508443.tif 000009
【０１０２】
【表６】
2021508443.tif 000010
【０１０３】
【表７】
2021508443.tif 000011
【０１０４】
一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体は、配列番号２のアミノ酸位置の以下のセット：５／７／９；１４／１６／１８；２９／３１；２９／３１／３３；３５／３７／３９；４５／４７／４９；５２／５４／５６；５９／６１／６３；６２／６４／６６；７６／７８／８０；８６／８８／９０；１６７／１６９／１７１；１７５／１７７／１７９；１９３／１９５／１９７；２０６／２０８／２１０；２０７／２０９／２１１；２１９／２２１／２２３；２４０／２４３；２２４／２２６／２２８；２４７／２４９／２５１；２５３／２５５／２５６；２５５／２５６；又は２６１／２６２／２６４／２６５の１つ又は複数にアミノ酸置換を含む。これらの位置のセットにおける例示的なアミノ酸置換は、表１Ｂ、表２Ｂ、表３、表６、図８Ｂ、図１１、図１４Ａ、図１４Ｂ、図１４Ｃ、図１４Ｄ又は図１５Ｂに示される。
【０１０５】
本開示の方法を用いて、追加のＣＤ１９変異体を識別することができる。
【０１０６】
ＣＤ１９変異体を使用する方法
融合タンパク質
国際公開第２０１７／０７５５３７号パンフレット及び同第２０１７／０７５５３３号パンフレットは、一部に、抗原結合タンパク質（例えば、抗体若しくは断片又はスカフォールドポリペプチド若しくは断片）とＣＤ１９若しくはその断片又はそうした融合タンパク質をコードする発現構築物を含むか又はそれから構成される融合タンパク質を記載する。本明細書に記載のＣＤ１９変異体又は本開示の方法を用いて識別されるＣＤ１９変異体は、国際公開第２０１７／０７５５３７号パンフレット及び同第２０１７／０７５５３３号パンフレットに記載される任意のＣＤ１９ベースの構築物に含有させることができる。国際公開第２０１７／０７５５３７号パンフレット及び同第２０１７／０７５５３３号パンフレットに記載されている通り、こうした構築物は、癌の治療に有用である。
【０１０７】
従って、一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＤ１９変異体は、融合タンパク質、例えば本明細書に記載されるＣＤ１９変異体と、抗体、抗体断片、スカフォールドポリペプチド又はスカフォールドポリペプチド断片とを含む融合タンパク質の一部として含有させる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、別のタンパク質のアミノ（Ｎ）末端に融合したＣＤ１９変異体、例えば抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される抗体若しくは抗体断片又はスカフォールドポリペプチド若しくはその断片）のアミノ（Ｎ）末端に融合したＣＤ１９変異体であるか又はそれを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体又はその断片の軽鎖のアミノ末端に融合したＣＤ１９変異体であるか又はそれを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体又はその部分の重鎖のアミノ末端に融合したＣＤ１９変異体であるか又はそれを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９変異体融合タンパク質は、本明細書に記載のリンカーを含む。
【０１０８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、別のタンパク質のカルボキシル（Ｃ）末端に融合したＣＤ１９変異体、例えば抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載される抗体若しくは抗体断片又はスカフォールドポリペプチド若しくはその断片）のカルボキシル（Ｃ）末端に融合したＣＤ１９変異体であるか又はそれを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体又はその断片の軽鎖のカルボキシル末端に融合したＣＤ１９変異体であるか又はそれを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、抗体又はその部分の重鎖のカルボキシル末端に融合したＣＤ１９変異体であるか又はそれを含む。
【０１０９】
他の実施形態では、本開示は、国際公開第２０１７／０７５５３７号パンフレット及び同第２０１７／０７５５３３号パンフレットに記載されるような構成性又は誘導性発現構築物を含み、この発現構築物は、本明細書に記載のＣＤ１９変異体融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結された少なくとも１つのプロモータを含有する核酸配列を含む。
【０１１０】
抗体
本明細書に記載される通り、一部の実施形態では、本開示は、ＣＤ１９変異体と、抗体又はその断片とを含む融合タンパク質を提供する。このような融合タンパク質に任意の抗体を含有させることができる。一部の実施形態では、抗体は、抗腫瘍抗体である。有用な抗腫瘍抗体を記載する様々な論評記事が公開されている（例えば、Ａｄｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｅｍａｔｏｌ．Ｏｎｃｏｌ．Ｃｌｉｎ．Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ．２６：４４７−８１（２０１２）；Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ．Ｔｈｅｒ．７：１７８−８４（２０１３）；Ｓｃｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎ．１２：１４（２０１２）；及びＳｌｉｗｋｏｗｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４１：１１９２−１１９８（２０１３）を参照されたい）。表４は、既知の入手可能な抗体剤によってターゲティングされるいくつかのヒトポリペプチド抗原の非包括的なリストを示し、抗体剤が有用であると提唱されているいくつかの癌適応症を記載する。
【０１１１】
【表８】
2021508443.tif 000012
【０１１２】
【表９】
2021508443.tif 000013
【０１１３】
【表１０】
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【０１１４】
【表１１】
2021508443.tif 000015
【０１１５】
一部の実施形態では、本明細書に記載される融合タンパク質は、ＣＤ１９変異体と、抗体又はその断片とを含み、そうした抗体又はその断片として、例えばインタクトなＩｇＧ、ＩｇＥ又はＩｇＭ、二重又は多重特異性抗体（例えば、Ｚｙｂｏｄｉｅｓ（登録商標）など）、単鎖Ｆｖ、ポリペプチド−Ｆｃ融合物、Ｆａｂ、ラクダ科（ｃａｍｅｌｉｄ）抗体、マスクされた抗体（例えば、Ｐｒｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標））、小モジュラー免疫薬（Ｓｍａｌｌ  Ｍｏｄｕｌａｒ  ＩｍｍｕｎｏＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）（「ＳＭＩＰｓＴＭ」）、一本鎖又はタンデムダイアボディ（ＴａｎｄＡｂ（登録商標））、ＶＨＨ、Ａｎｔｉｃａｌｉｎｓ（登録商標）、Ｎａｎｏｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ミニボディ、ＢｉＴＥ（登録商標）、アンキリン反復タンパク質又はＤＡＲＰＩＮ（登録商標）、Ａｖｉｍｅｒｓ（登録商標）、ＤＡＲＴ、ＴＣＲ様抗体、Ａｄｎｅｃｔｉｎｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｌｉｎｓ（登録商標）、Ｔｒａｎｓ−ｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、Ａｆｆｉｂｏｄｉｅｓ（登録商標）、ＴｒｉｍｅｒＸ（登録商標）、ＭｉｃｒｏＰｒｏｔｅｉｎｓ、Ｆｙｎｏｍｅｒｓ（登録商標）、Ｃｅｎｔｙｒｉｎｓ（登録商標）及びＫＡＬＢＩＴＯＲ（登録商標）が挙げられる。
【０１１６】
いくつかの事例では、本明細書に記載されるＣＤ１９変異体は、本明細書に記載の抗体（若しくは断片）のＣ末端及び／又はＮ末端に配置（例えば、融合）させることができる。例えば、ＣＤ１９変異体を軽鎖若しくは部分（例えば、ＶＬ）のＣ末端及び／又はＮ末端並びに／或いは重鎖若しくは部分（例えば、ＶＨ）のＣ末端及び／又はＮ末端に融合させることができる。一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＤ１９変異体は、本明細書に記載の抗体（若しくは断片）内又は抗体ドメイン（例えば、ｓｃＦｖ）間に配置（例えば、融合）させることができる。例えば、融合タンパク質は、抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ、抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ及び変異体ＣＤ１９を様々な構成で含有することができる。こうした融合パートナーは、様々な構成、例えば抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ／ＣＤ１９変異体／抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ；抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ／ＣＤ１９変異体／抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ；ＣＤ１９変異体／抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ／抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ；ＣＤ１９変異体／抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ／抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ；抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ／抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ／ＣＤ１９変異体；及び／又は抗Ｈｅｒ２  ｓｃＦｖ／抗ＥＧＦＲ  ｓｃＦｖ／ＣＤ１９変異体の構成でそのような融合タンパク質内に存在し得る。
【０１１７】
一部の実施形態では、抗体は、本明細書に記載の抗原をターゲティングする。例えば、一部の実施形態では、抗体は、ＰＤ−１、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＩＤＯ、Ａ２ＡＲ、ＴＧＦβ、ＣＤ４７又は免疫抑制経路に関与する別のタンパク質をターゲティングする。例示的な、非限定的融合タンパク質として、抗ＰＤ１  ｓｃＦｖ；抗ＰＤ−Ｌ１  ｓｃＦｖ；抗ＣＤ３９  ｓｃＦｖ；又は抗ＣＤ７３  ｓｃＦｖを挙げることができる。
【０１１８】
一部の実施形態では、抗体は、１つ又は複数の感染因子をターゲティングする。例えば、抗体は、ＣＤ１６３をターゲティングし得る（Ｓｖｅｎｄｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．：Ｍｅｔｈｏｄｓ＆Ｃｌｉｎ．Ｄｅｖ．４：５０−６１（２０１７）を参照されたい）。一部の実施形態では、抗体は、細菌、例えば細菌Ｏ２５ｂ抗原（例えば、Ｇｕａｃｈａｌｌａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．６１：ｅ０１４２８−１７（２０１７）を参照されたい）；１つ若しくは複数のβバレルアセンブリ機構（ＢＡＭ）、例えばＢａｍＡ、ＢａｍＢ、ＢａｍＣ、ＢａｍＤ若しくはＢａｍＥ（例えば、ＭＡＢ１抗体）（例えば、Ｓｔｏｒｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  １１５：３６９２−３６９７（２０１８）を参照されたい）；又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）（例えば、Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，ｍＡｂｓ  ８：１６１２−１６１９（２０１６）に記載の抗黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）抗体）をターゲティングする。
【０１１９】
抗体又は断片は、抗体を合成するための当技術分野で知られる任意の方法により生成することができる（例えば、Ｈａｒｌｏｗ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，２ｎｄ  ｅｄ．１９８８）；Ｂｒｉｎｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １８２：４１−５０；国際公開第９２／２２３２４号パンフレット；同第９８／４６６４５号パンフレットを参照されたい）。キメラ抗体は、例えば、Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２９：１２０２に記載される方法を用いて生成することができ、また、ヒト化抗体は、例えば、米国特許第６，１８０，３７０号明細書に記載されている方法により生成することができる。
【０１２０】
単一ドメイン抗体
単一ドメイン抗体は、相補性決定領域が単一ドメインポリペプチドの一部である抗体である。例として、限定されないが、重鎖抗体、天然に軽鎖がない抗体、通常の４−鎖抗体、改変された抗体及び抗体由来のもの以外の単一ドメインスカフォールドが挙げられる。単一ドメイン抗体は、当技術分野で公知のいずれか又はいずれかの将来の単一ドメイン抗体であり得る。単一ドメイン抗体は、限定されないが、マウス、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ウシを含め、任意の種に由来するものであり得る。本開示の一態様によれば、本明細書で使用される単一ドメイン抗体は、軽鎖がない重鎖抗体として公知の天然の単一ドメイン抗体である。こうした単一ドメイン抗体は、例えば、国際公開第９４／０４６７８号パンフレットに開示されている。天然に軽鎖がない重鎖抗体由来のこうした可変ドメインは、本明細書において「ＶＨＨ」又は「ナノボディ」と呼ばれる。このようなＶＨＨ分子は、ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）、例えばラクダ、ヒトコブラクダ、ラマ、ビクーニャ、アルパカ及びグアナコにおいて増殖させた抗体から得ることができる。ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）以外の他の種（例えば、ヒト）も、天然に軽鎖がない重鎖抗体を産生することができ；こうしたＶＨＨは、本開示の範囲内である。
【０１２１】
ラクダ科（Ｃａｍｅｌｉｄａｅ）由来のＶＨＨドメインのアミノ酸残基は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ”，ＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  （Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ），Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ  ９１−３２４２（１９９１）により記載されるＶＨドメインの一般的番号付けに従って番号付けされる；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２３１：２５−３８（１９９９）も参照されたい。この番号付けに従い、ＦＲ１は、１〜３０位にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ１は、３１〜３５位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ２は、３６〜４９位にアミノ酸を含み、ＣＤＲ２は、５０〜６５位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ３は、６６〜９４位にアミノ酸残基を含み、ＣＤＲ３は、９５〜１０２位にアミノ酸残基を含み、ＦＲ４は、１０３〜１１３位にアミノ酸残基を含む。
【０１２２】
しかし（ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインについて当技術分野で公知の通り）、ＣＤＲの各々におけるアミノ酸残基の総数は、変動し得るため、Ｋａｂａｔ番号付けによって示されるアミノ酸残基の総数と一致しない可能性がある（すなわちＫａｂａｔ番号付けに従う１つ若しくは複数が実際の配列内に存在しないか、又は実際の配列がＫａｂａｔ番号付けによって許容される数よりも多いアミノ酸残基を含み得る）。これは、概して、Ｋａｂａｔに従う番号付けが実際の配列内のアミノ酸残基の実際の番号付けと一致するか又は一致しない場合があることを意味する。
【０１２３】
ＶＨドメインのアミノ酸残基の別の番号付け法が当技術分野で公知であり、この方法も、ＶＨＨドメインと類似の様式で適用することができる。しかしながら、本開示、特許請求の範囲及び図面では、別に指示のない限り、Ｋａｂａｔに従い、且つ前述のＶＨＨドメインに適用される番号付けに従うものとする。
【０１２４】
抗ＣＬＬ−１単一ドメイン抗体
ＭＩＣＬ又はＣＬＥＣ１２Ａとしても知られるヒトＣ型レクチン様分子−１（ＣＬＬ−１）は、ＩＩ型膜貫通糖タンパク質であり、且つ免疫調節に関与するＣ型レクチン様受容体の大きいファミリーのメンバーである。ＣＬＬ−１は、これまでに骨髄由来細胞から識別されている。ＣＬＬ−１の細胞内ドメインは、免疫チロシンベースの阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）及びＹＸＸＭモチーフを含有する。様々な細胞上のＩＴＩＭ含有受容体のリン酸化により、タンパク質チロシンホスファターゼＳＨＰ−１、ＳＨＰ−２及びＳＨＩＰの動員による活性化経路の阻害が起こる。ＹＸＸＭモチーフは、細胞活性化経路に関与するＰＩ−３キナーゼ、１３のｐ８５サブユニットに対する潜在的なＳＨ２ドメイン結合部位を有し、これは、骨髄細胞上の阻害及び活性化分子としてのＣＬＬ−１の二重の役割の可能性を明らかにしている。実際に、ＣＬＬ−１とＳＨＰ−１及びＳＨＰ−２との結合は、実験によりトランスフェクト及び骨髄由来細胞株において実証されている。
【０１２５】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列又はその断片（例えば、そのＣＬＬ−１結合断片）を有するＶＨＨであるか又はそれを含むＣＬＬ−１結合抗体を含有する融合タンパク質を提供する。本明細書に記載の配列のリストに示すように、配列番号２０３〜２２５の各々は、Ｎ末端にＶＨＨアミノ酸を、またＣ末端に下記のアミノ酸：（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃタグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）、及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を含む。従って、一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、（ｉ）〜（ｖ）の１つ若しくは複数を欠失している（及び／又は（ｉ）〜（ｖ）の１つ若しくは複数の部分を欠失している）。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失している。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失している。
【０１２６】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、（ｉ）〜（ｖ）の１つ若しくは複数を欠失（及び／又は（ｉ）〜（ｖ）の１つ若しくは複数の部分を欠失）しており、その部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸（すなわち（ｉ）〜（ｖ）に含まれるアミノ酸以外の）を欠失している。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失しており、その部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失しており、その部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している。
【０１２７】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、（ｉ）〜（ｖ）の１つ若しくは複数を欠失（及び／又は（ｉ）〜（ｖ）の１つ若しくは複数の部分を欠失）している。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失している。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失している。
【０１２８】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、（ｉ）〜（ｖ）の１つ若しくは複数を欠失（及び／又は（ｉ）〜（ｖ）の１つ若しくは複数の部分を欠失）しており、その部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つ又はそれを超える）追加のアミノ酸（すなわち（ｉ）〜（ｖ）に含まれるアミノ酸以外）を欠失している。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの１つ又は複数を欠失しており、その部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つのアミノ酸配列の部分（例えば、ＣＬＬ−１結合部分）と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を有するＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、配列番号２０３〜２２５の各々に描かれるＣ末端アミノ酸ＴＳＧＰＧＧＱＧＡＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬＧＡＨＨＨＨＨＨＧＡＳの全部を欠失しており、その部分は、１つ又は複数の（例えば、１、２、３、４、５つの又はそれを超える）追加のアミノ酸を欠失している。
【０１２９】
一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つに描かれる少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）を含むＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つに描かれる少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の部分を含むＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つに描かれるＣＤＲの１、２、３、４、５つ又はそれを超えるアミノ酸を欠失している。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つに描かれるＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一である少なくとも１つのＣＤＲを含むＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つに描かれる少なくとも１つのＣＤＲ（例えば、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３）の部分と少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供し、ここで、その部分は、配列番号２０３〜２２５のいずれか１つに描かれるＣＤＲの１、２、３、４、５つ又はそれを超えるアミノ酸を欠失している。
【０１３０】
一部の実施形態では、本開示は、表５Ａ及び／又は表５Ｂに描かれる群１〜１３のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２及び／又はＣＤＲ３を含むＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、表５Ａ及び／又は表５Ｂに描かれる群１〜１３のいずれか１つ（例えば、ＣＤＲは、１つの特定の群からのものであるか又はＣＤＲは、２つ以上の異なる群から選択される）の（ｉ）ＣＤＲ１及びＣＤＲ２；（ｉｉ）ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；（ｉｉｉ）ＣＤＲ１及びＣＤＲ３；又は（ｉｖ）ＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を含有する融合タンパク質を提供する。一部の実施形態では、本開示は、表５Ａ及び／又は表５Ｂに描かれるように、群１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群４のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群５のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群６のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群７のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群８のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群９のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群１０のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群１１のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；群１２のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３；又は群１３のＣＤＲ１、ＣＤＲ２及びＣＤＲ３を含むＶＨＨであるか又はそれを含む抗体を提供する。
【０１３１】
【表１２】
2021508443.tif 000016
【０１３２】
【表１３】
2021508443.tif 000017
【０１３３】
当業者に理解されるように、例えば分子生物学技術を用いて、任意のこうしたＣＤＲ配列を、本明細書に提供されるか又はそうでなければ当技術分野で公知の任意の他の抗体配列又はドメインと容易に組み合わせることができ、そうしたものとして、本明細書に開示されるか又は当技術分野で公知の任意のフォーマットの抗体又は結合分子中に存在し得るような、本明細書に開示されるか又は当技術分野で公知の任意のフレームワーク領域、ＣＤＲ若しくは定常領域又はそれらの部分がある。
【０１３４】
一部の実施形態では、本開示は、１つ若しくは複数の抗ＣＬＥＣ１２ａ抗体（又はそれらの部分）と、本明細書に記載される１つ又は複数のＣＤ１９変異体とを含む融合タンパク質を提供する。例えば、融合タンパク質は、様々な構成で抗Ｃｌｅｃ１２ａ  ｓｃＦｖ、突然変異体ＣＤ１９及び抗Ｃｌｅｃ１２ａ  ＶＨＨを含み得る。別の例では、個別の抗Ｃｌｅｃ１２ａ  ＶＨＨを様々な構成で突然変異体ＣＤ１９と組み合わせることができる。別の例では、個別の抗Ｃｌｅｃ１２ａ  ＶＨＨを様々な構成で、突然変異体ＣＤ１９と一緒に、骨髄性白血病細胞に存在する１つ又は複数の抗原をターゲティングするｓｃＦｖ又はＶＨＨと組み合わせることができる。
【０１３５】
本明細書に記載の抗体の抗原（例えば、ＣＬＬ−１）に対する結合特性は、当技術分野で公知の方法、例えば下記の方法の１つにより測定することができる：ＢＩＡＣＯＲＥ分析、酵素結合免疫吸着検査法（ＥＬＩＳＡ）、Ｘ線結晶学、配列解析及びスキャニング突然変異誘発。抗体と抗原（例えば、ＣＬＬ−１）との結合相互作用は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用いて分析することができる。ＳＰＲ又は生体分子相互作用解析（ＢＩＡ）では、相互作用体のいずれにも標識することなく、生体特異的相互作用をリアルタイムで検出する。ＢＩＡチップの結合表面での質量の変化（結合事象を示す）は、表面付近の光の屈折率の変化を引き起こす。屈折率の変化は、検出可能なシグナルをもたらし、これは、生体分子間のリアルタイム反応の指標として測定される。ＳＰＲを使用する方法は、例えば、米国特許第５，６４１，６４０号明細書；Ｒａｅｔｈｅｒ（１９８８）Ｓｕｒｆａｃｅ  Ｐｌａｓｍｏｎｓ  Ｓｐｒｉｎｇｅｒ  Ｖｅｒｌａｇ；Ｓｊｏｌａｎｄｅｒ  ａｎｄ  Ｕｒｂａｎｉｃｚｋｙ（１９９１）Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６３：２３３８−２３４５；Ｓｚａｂｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．５：６９９−７０５に記載されており、またＢＩＡｃｏｒｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ＡＢ（Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）によってオンライン情報源が提供されている。さらに、Ｓａｐｉｄｙｎｅ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ（Ｂｏｉｓｅ，Ｉｄ．）から入手可能なＫｉｎＥｘＡ（登録商標）（Ｋｉｎｅｔｉｃ  Ｅｘｃｌｕｓｉｏｎ  Ａｓｓａｙ）アッセイを使用することもできる。
【０１３６】
ＳＰＲからの情報を用いて、抗原（例えば、ＣＬＬ−１）に対する抗体の結合に関する、平衡解離定数（ＫＤ）、Ｋｏｎ及びＫｏｆｆなどの動態パラメータの正確且つ定量的尺度を取得することができる。こうしたデータを用いて、様々な分子を比較することができる。また、ＳＰＲからの情報を用いて、構造−活性相関（ＳＡＲ）を作成することもできる。特定の結合パラメータ、例えば高い親和性と相関する、所与の位置の変異体アミノ酸を識別することができる。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗体は、抗原（例えば、ＣＬＬ−１）に結合する高い親和性を呈示する。様々な実施形態において、抗原（例えば、ＣＬＬ−１）に対する本明細書に記載の抗体のＫＤは、約１０−４、１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、１０−１０、１０−１１、１０−１２、１０−１３、１０−１４又は１０−１５Ｍ未満である。いくつかの事例では、抗原（例えば、ＣＬＬ−１）に対する本明細書に記載の抗体のＫＤは、０．００１〜１ｎＭ、例えば０．００１ｎＭ、０．００５ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０５ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ又は１ｎＭである。
【０１３８】
スカフォールドポリペプチド
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載のＣＤ１９変異体と、スカフォールドポリペプチド（又はその断片）とを含む融合タンパク質を提供する。例えば、腫瘍抗原（例えば、本明細書に記載の腫瘍抗原）に結合するようにスカフォールドポリペプチド（又はその断片）を選択することができる。こうしたスカフォールドポリペプチド（又はその断片）は、例えば、フィブロネクチンドメイン（例えば、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン）、ＤＡＲＰｉｎ、アドヒロン、リポカリン／アンチカリン、プロテインＡ、アフィボディ、チオレドキシンなどを含む。例えば、融合タンパク質は、ＩＩＩ型フィブロネクチンドメイン−ＣＤ１９変異体融合タンパク質であるか又はそれを含み得る。
【０１３９】
マスクされた構築物
一部の実施形態では、本開示は、本明細書に記載される抗原結合タンパク質（例えば、本明細書に記載の抗体）のマスクされたバージョンを含む。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質は、本明細書に記載される抗体又は抗体断片のマスクされたバージョン（例えば、Ｓａｎｄｅｒｓｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（２０１５）７２：１４０５−１４１５；米国特許出願公開第２０１５／０１８３８７５号明細書；米国特許第８，５１３，３９０号明細書；及び同第９，１２０，８５３号明細書に記載されている、Ｐｒｏｂｏｄｙ（登録商標））を含む。一部の実施形態では、マスクされた構築物は、抗体若しくはその断片、マスキング部分、切断可能な部分及び／又はリンカーを含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、マスクされた構築物は、抗原結合タンパク質（例えば、抗体又はその断片）とマスキング部分を含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、抗原結合タンパク質に連結されて、タンパク質が特異的にその標的に結合する能力を低減する（抗原結合タンパク質を「マスクする」）ように配置されたアミノ酸配列である。一部の実施形態では、マスキング部分は、リンカーによって抗原結合タンパク質に連結される。一部の実施形態では、マスクされた抗原結合タンパク質のその標的に対する特異的結合は、標的に対する、「マスクされていない」抗原結合タンパク質の特異的結合と比較して又は親抗原結合タンパク質の特異的結合と比較して低減又は阻害される。一部の実施形態では、マスクされた抗原結合タンパク質は、標的に対して、測定可能な結合がないか若しくは測定可能な結合を実質的に示さず、且つ／又は標的に対する、マスクされていない抗原結合タンパク質の結合と比較して若しくは親抗原結合タンパク質の結合と比較して、例えばインビボで又は標的置換（Ｔａｒｇｅｔ  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ）インビトロイムノソルベントアッセイ（米国特許第８，５１３，３９０号明細書に記載）で測定したとき、例えば少なくとも２、４、６、８、１２、２８、２４、３０、３６、４８、６０、７２、８４、９６時間又は５、１０、１５、３０、４５、６０、９０、１２０、１５０、１８０日又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２ヶ月又はそれを上回って０．００１％、０．０１％、０．１％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％又は５０％以下を示す。
【０１４１】
一部の実施形態では、マスクされた抗原結合タンパク質のその標的に対する特異的結合は、標的に対する、マスクされていない抗原結合タンパク質の特異的結合と比較して又は親抗原結合タンパク質の特異的結合と比較して低減又は阻害される。標的に対するマスクされた抗原結合タンパク質のＫｄは、マスクされていない抗原結合タンパク質の特異的結合のもの又は親抗原結合タンパク質のものと比べて、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００，５００，０００，１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍以上又は５〜１０、１０〜１００、１０〜１，０００、１０〜１０，０００、１０〜１００，０００、１０〜１，０００，０００、１０〜１０，０００，０００、１００〜１，０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜１００，０００、１，０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００若しくは１００，０００〜１０，０００，０００倍高くなり得る。逆に、標的に対するマスクされた抗原結合タンパク質の結合親和性は、マスクされていない抗原結合タンパク質の特異的結合のもの又は親抗原結合タンパク質のものと比べて、少なくとも５、１０、２５、５０、１００、２５０、５００、１，０００、２，５００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００，５００，０００，１，０００，０００、５，０００，０００、１０，０００，０００、５０，０００，０００倍以上又は５〜１０、１０〜１００、１０〜１，０００、１０〜１０，０００、１０〜１００，０００、１０〜１，０００，０００、１０〜１０，０００，０００、１００〜１，０００、１００〜１０，０００、１００〜１００，０００、１００〜１，０００，０００、１００〜１０，０００，０００、１，０００〜１０，０００、１，０００〜１００，０００、１，０００〜１，０００，０００、１０００〜１０，０００，０００、１０，０００〜１００，０００、１０，０００〜１，０００，０００、１０，０００〜１０，０００，０００、１００，０００〜１，０００，０００若しくは１００，０００〜１０，０００，０００倍低くなり得る。
【０１４２】
マスキング部分は、当技術分野において知られており、例えば抗体又はその断片の既知結合パートナーを含む。一部の実施形態では、マスキング部分は、抗原結合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端の及び／又は内部部位（例えば、抗原結合ループ）内のアミノ酸配列である。一部の実施形態では、マスキング部分は、１つ又は複数のシステイン残基ペアであるか又はそれを含み、例えばそれによりシステインペア間にジスルフィド結合が形成される。一部のそうした実施形態では、ジスルフィド結合によって配座固定された構造が得られ、これは、例えば、還元剤によるジスルフィド結合の開裂によって「マスク解除」することができる。例示的なマスキング部分は、例えば、Ｓａｎｄｅｒｓｊｏｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ．Ｍｏｌ．Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉ．（２０１５）７２：１４０５−１４１５；米国特許出願公開第２０１５／０１８３８７５号明細書；米国特許第８，５１３，３９０号明細書及び同第９，１２０，８５３号明細書に記載されている。
【０１４３】
細胞治療薬
一部の実施形態では、本明細書に記載のＣＤ１９変異体をコードするか、又は本明細書に記載のＣＤ１９変異体を含むか若しくはそれから構成される融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を細胞治療薬に導入することができる。一部の実施形態では、細胞治療薬は、免疫細胞、例えば養子細胞療法において有用な細胞又は養子細胞療法に使用が可能な細胞から生成することができる。一部の実施形態では、細胞治療薬は、ＴＩＬ、Ｔ細胞、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＮＫ細胞、δ−γＴ細胞、調節Ｔ細胞又は末梢血単核細胞からなる群から選択される細胞型から生成される。本明細書で使用されるとき、「腫瘍浸潤リンパ球」又はＴＩＬは、血流から出て、腫瘍中に移動した白血球を指す。リンパ球は、Ｂ細胞、Ｔ細胞及びナチュラルキラー細胞を含む３つの群に区分することができる。本明細書で使用されるとき、「Ｔ細胞」は、ＣＤ３＋細胞を指し、ＣＤ４＋ヘルパー細胞、ＣＤ８＋細胞傷害性Ｔ細胞及びδ−γＴ細胞を含む。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、細胞治療薬は、細胞、例えば免疫細胞を、本明細書に記載のＣＤ１９変異体をコードする核酸又は本明細書に記載のＣＤ１９変異体を含むか若しくはそれから構成される融合タンパク質で遺伝子改変（例えば、形質転換）することによって生成される。一部の実施形態では、こうした核酸を組換え発現ベクターに導入する。組換え発現ベクターは、限定されないが、ＤＮＡ及びＲＮＡをはじめとするあらゆるタイプのヌクレオチドを含むことができ、これらは、一本鎖又は二本鎖、合成又は一部が天然供給源から得られるものであり得、天然、非天然又は改変ヌクレオチドを含有し得る。組換え発現ベクターは、天然若しくは非天然のヌクレオチド間結合又は両方のタイプの結合を含むことができる。
【０１４５】
組換え発現ベクターは、任意の好適な組換え発現ベクターであり得る。好適なベクターとしては、増殖及び拡大若しくは発現又はその両方のために設計されたもの、例えばプラスミド及びウイルスが挙げられる。例えば、ベクターは、ｐＵＣシリーズ（Ｆｅｒｍｅｎｔａｓ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｇｌｅｎ  Ｂｕｒｎｉｅ，Ｍｄ．）、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔシリーズ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，ＬａＪｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．）、ｐＥＴシリーズ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．）、ｐＧＥＸシリーズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びｐＥＸシリーズ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から選択することができる。また、λＧＴ１０、λＧＴ１１、λＺａｐＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、λＥＭＢＬ４及びλＮＭ１１４９などのバクテリオファージベクターも使用することができる。本開示に関して有用な植物発現ベクターの例として、ｐＢＩ０１、ｐＢＩ１０１．２、ｐＢＩ１０１．３、ｐＢＩ１２１及びｐＢＩＮ１９（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。本開示に関して有用な動物発現ベクターの例として、ｐｃＤＮＡ、ｐＥＵＫ−Ｃｌ、ｐＭＡＭ及びｐＭＡＭｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）が挙げられる。
【０１４６】
一部の実施形態では、組換え発現ベクターは、ウイルスベクターである。好適なウイルスベクターとして、限定されないが、レトロウイルスベクター、アルファウイルス、ワクシニア、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス及び鶏痘ウイルスが挙げられ、これらは、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を形質転換するネイティブ又は操作された能力を有するのが好ましい。
【０１４７】
細胞治療法などのエクスビボ用途では、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）に由来するγレトロウイルスベクターが初めて開発され、依然として使用されている。ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）をベースとするレンチウイルスベクターは、広く使用されている。レンチウイルスベクターを設計する上での一般的戦略は、複製可能なウイルスの産生の阻止を目的とするネイティブウイルス配列の欠失及び改変に基づく。従って、完全に複製可能なレンチウイルス（ＲＣＬ）への完全な組換えの可能性を阻止する目的でレンチウイルス構成体を３つ又は４つの異なるプラスミド構築物に分離する。ウイルスベクターゲノムは、最小でもトランスジーン発現カセット、長い末端反復（ＬＴＲ）及びパッケージングシグナルを含有する。ほとんどの場合、３つの追加プラスミドが、ウイルス産生及びパッケージングに必要な因子（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌ、ｅｎｖ）をもたらす。３’ＬＴＲからのプロモータ−エンハンサー領域も欠失させて、この領域からの転写、それに続くウイルス複製を阻止する（自己不活性化ベクター；ＳＩＮと呼ばれる）。エクスビボ細胞形質転換又は形質導入の不可欠のステップは、ウイルスベクターによる細胞の形質導入前又は後のいずれかに選択、拡大及び分化を可能にする、細胞の単離及び所望の細胞型の培養を含む。造血細胞の場合、これらのステップの大部分は、使い捨て採血及び処理バッグを用いるクローズドシステムで行われる。ＣＡＲ  Ｔ細胞療法のために、患者の血液細胞を採取した後、所望のＴ細胞集団を選択して、必要なレベルまで増殖させる。次に、これらの細胞を、所望の遺伝子カセットを担持するウイルスベクターで形質導入した後、１０億の細胞レベルまでＣＡＲ  Ｔ細胞拡大に付す。レンチウイルスベクターは、Ｔ細胞を効率的に形質導入することが証明されているため、親標的細胞にＣＡＲを導入するための好ましいベクターである。次に、拡大させた細胞を患者に再導入する。
【０１４８】
一部の実施形態では、Ｔ細胞を形質導入したベクターにより、ＣＤ１９タンパク質を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現させる。一部の実施形態では、Ｔ細胞を形質導入したベクターにより、ＣＤ１９タンパク質を認識するＣＡＲを発現させると共に融合タンパク質を発現させる。一部の実施形態では、２つのベクターを用いてＴ細胞を形質導入するが、その場合、１つは、ＣＡＲを発現させ、１つは、融合タンパク質を発現させる。
【０１４９】
組換え発現ベクターは、例えば、以下の文献に記載される標準的組換えＤＮＡ技術を用いて調製することができる：Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ  ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．２００１；及びＡｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，ＮＹ，１９９４。環状又は線状の発現ベクターの構築物を調製して、原核又は真核宿主細胞中で機能性の複製系を含有させることができる。複製系は、例えば、ＣｏｌＥｌ、２μプラスミド、λ、ＳＶ４０、ウシパピローマウイルスなどから得ることができる。
【０１５０】
組換え発現ベクターは、形質転換又はトランスフェクトされた宿主の選択を可能にする、１つ又は複数のマーカ遺伝子を含み得る。マーカ遺伝子は、バイオサイド耐性、例えば抗生物質、重金属などに対する耐性、原栄養性を提供するための栄養要求性宿主における相補性などを含む。組換え発現ベクターに好適なマーカ遺伝子として、例えば、ネオマイシン／Ｇ４１８耐性遺伝子、プロマイシン耐性遺伝子、ヒグロマイシン耐性遺伝子、ヒスチジノール耐性遺伝子、テトラサイクリン耐性遺伝子及びアンピシリン耐性遺伝子が挙げられる。
【０１５１】
本開示に関して有用なベクターは、「ネイキッド」核酸ベクター（すなわちそれらを包膜するタンパク質、糖及び／若しくは脂質がほとんど若しくは全くないベクター）又は他の分子と複合体化したベクターであり得る。ベクターと好適に組み合わせることができる他の分子として、限定されないが、ウイルスコート、カチオン性脂質、リポソーム、ポリアミン、金粒子並びに細胞分子をターゲッティングするリガンド、受容体又は抗体などのターゲティング部分が挙げられる。
【０１５２】
従来の形質転換又はトランスフェクション技術を用いて、ベクターＤＮＡを細胞、例えば免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）に導入することができる。本明細書で使用されるとき、用語「形質転換」、「トランスフェクション」及び「形質導入」は、外来の核酸（例えば、ＤＮＡ）を細胞に導入するための多様な当技術分野で承認されている技術を指すことが意図され、そうした技術として、リン酸カルシウム若しくは塩化カルシウム同時沈降、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクション、リポフェクション、遺伝子ガン又はエレクトロポレーションが挙げられる。
【０１５３】
一部の実施形態では、細胞、例えば免疫細胞（例えば、Ｔ細胞）を、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）又は特定のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現する組込み型ベクターで形質導入する。一部の実施形態では、組込み型発現ベクターは、レンチウイルスベクター又はレトロウイルスベクターである。一部の実施形態では、トランスポゾン技術を用いて発現構築物を導入する。一部の実施形態では、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）のエレクトロポレーションを用いて発現構築物を導入する。一部の実施形態では、組込み型ベクターは、複数のエレメント、例えばＣＡＲ配列及び１つ又は複数の追加エレメントを発現する。一部の実施形態では、追加エレメントとして、限定されないが、融合タンパク質、抗体又はその断片、天然タンパク質、サイトカイン及びペプチドが挙げられる。一部の実施形態では、切断可能エレメント、例えばＰ２Ａ又はＴ２Ａ配列により、１つ又は複数の追加エレメントからＣＡＲ配列を分離する。一部の実施形態では、例えば、発現された産物は、ＣＡＲ１９配列；２Ａ切断可能配列；ＣＤ１９若しくはドメイン又はその変異体；追加エレメント１；追加エレメント２を含む。一部の実施形態では、例えば、発現された産物は、ＣＤ１９若しくはドメイン又はその変異体；追加エレメント１；追加エレメント２；２Ａ切断可能配列；及びＣＡＲ１９配列を含む。一部の実施形態では、例えば、発現された産物は、ＣＡＲ１９配列；２Ａ切断可能配列；追加エレメント１；追加エレメント２；及びＣＤ１９若しくはドメイン又はその変異体を含む。一部の実施形態では、例えば、発現された産物は、追加エレメント１；ＣＤ１９若しくはドメイン又はその変異体；追加エレメント２；２Ａ切断可能配列；及びＣＡＲ１９配列を含む。
【０１５４】
タンパク質治療薬
一部の態様では、本明細書に記載のＣＤ１９変異体又はＣＤ１９変異体を含むか又はそれから構成される融合タンパク質を生成し、本明細書に記載の細胞治療薬によって生成されるものの代わりに又はそれに加えて、治療薬として使用することができる。こうしたポリペプチドは、例えば、医薬組成物などの組成物に含有させて、タンパク質治療薬として使用することができる。例えば、ＣＤ１９変異体を含むタンパク質治療薬は、ＣＤ１９をターゲティングする細胞治療薬、例えばＣＡＲ−Ｔ細胞又はＡＤＣと組み合わせて投与することができる。
【０１５５】
ポリペプチドを作製する様々な方法が当技術分野で公知であり、これらを用いて、タンパク質治療薬に含有させるポリペプチドを作製することができる。例えば、ポリペプチドは、ポリペプチドをコードする核酸を発現させるように操作された宿主細胞系を使用して、組換えにより生成することができる。遺伝子の組換え発現は、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有する発現ベクターの構築を含み得る。ポリヌクレオチドが得られたら、当技術分野で公知の技術を用いて、組換えＤＮＡ技術により、ポリペプチド生成のためのベクターを生成することができる。公知の方法を用いて、ポリペプチドコード配列と適切な転写及び翻訳制御シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。これらの方法は、例えば、インビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術及びインビボ遺伝子組換えを含む。
【０１５６】
発現ベクターを従来の技術によって宿主細胞に移入した後、トランスフェクトした細胞を従来の技術により培養して、ポリペプチドを生成することができる。
【０１５７】
様々な宿主発現ベクター系を使用することができる（例えば、米国特許第５，８０７，７１５号明細書を参照されたい）。こうした宿主発現系を用いて、ポリペプチドを生成することができ、必要に応じて後に精製することができる。こうした宿主発現系としては、ポリペプチドコード配列を含有する組換えバクテリオファージＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ若しくはコスミドＤＮＡ発現ベクターで形質転換させた細菌（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）及び枯草菌（Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ））などの微生物；ポリペプチドコード配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換させた酵母（例えば、サッカロミセス属（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ）及びピキア属（Ｐｉｃｈｉａ））；ポリペプチドコード配列を含有する組換えウイルス発現ベクター（例えば、バキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ））に感染させた昆虫細胞系；組換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス（ｃａｕｌｉｆｌｏｗｅｒ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス（ｔｏｂａｃｃｏ  ｍｏｓａｉｃ  ｖｉｒｕｓ）ＴＭＶ）に感染させた、又はポリペプチドコード配列を含有する組換えプラスミド発現ベクター（例えば、Ｔｉプラスミド）で形質転換させた植物細胞系；或いは哺乳動物細胞のゲノム由来のプロモータ（例えば、メタロチオネインプロモータ）又は哺乳動物ウイルス由来のプロモータ（例えば、アデノウイルス後期プロモータ；ワクシニアウイルス７．５Ｋプロモータ）を含有する組換え発現構築物を保有する哺乳動物細胞系（例えば、ＣＯＳ、ＣＨＯ、ＢＨＫ、２９３、ＮＳ０及び３Ｔ３細胞）が挙げられる。
【０１５８】
細菌系の場合、いくつかの発現ベクターを使用することができ、こうしたものとして、限定されないが、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターｐＵＲ２７８（Ｒｕｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３，ＥＭＢＯ  １２：１７９１）；ｐＩＮベクター（Ｉｎｏｕｙｅ＆Ｉｎｏｕｙｅ，１９８５，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．１３：３１０１−３１０９；Ｖａｎ  Ｈｅｅｋｅ＆Ｓｃｈｕｓｔｅｒ，１９８９，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４：５５０３−５５０９）などが挙げられる。グルタチオン５−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を含む融合タンパク質として外来ポリペプチドを発現させるために、ｐＧＥＸベクターも使用することができる。
【０１５９】
哺乳動物宿主細胞での発現の場合、ウイルスベースの発現系を使用することができる（例えば、Ｌｏｇａｎ＆Ｓｈｅｎｋ，１９８４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８  １：３５５−３５９を参照されたい）。適切な転写エンハンサーエレメント、転写終結因子などの含有によって発現の効率を高めることができる（例えば、Ｂｉｔｔｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８７，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６−５４４を参照されたい）。
【０１６０】
加えて、挿入された配列の発現を調節するか、又は所望する特定の様式で遺伝子産物を修飾及びプロセシングする宿主細胞株を選択することができる。様々な宿主細胞がタンパク質及び遺伝子産物の翻訳後プロセシング及び修飾のための特徴的且つ特異的機構を有する。発現されるポリペプチドの正しい修飾及びプロセシングを確実にするために、適切な細胞株又は宿主系を選択することができる。こうした細胞として、例えば、樹立された哺乳動物細胞株及び昆虫細胞株、動物細胞、真菌細胞及び酵母細胞が挙げられる。哺乳動物細胞としては、例えば、以下のものが挙げられる：ＢＡＬＢ／ｃマウス骨髄種細胞株（ＮＳＯ／ｌ、ＥＣＡＣＣ  Ｎｏ：８５１１０５０３）；ヒト網膜芽細胞（ＰＥＲ．Ｃ６，ＣｒｕＣｅｌｌ，Ｌｅｉｄｅｎ，Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）；Ｓ４０により形質転換させたサル腎臓ＣＶ１細胞株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５１）；ヒト胎児腎臓細胞株（懸濁培養のためにサブクローン化した２９３若しくは２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．，３６：５９，１９７７）；ヒト線維肉腫細胞株（例えば、ＨＴ１０８０）；ベビーハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞＋／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ａｎｄ  Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，７７：４２１６，１９８０）；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．，２３：２４３−２５１，１９８０）；サル腎細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１  ５８７）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨｅＬａ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ２）；イヌ腎細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ３４）；バッファロー（ｂｕｆｆａｌｏ）ラット腎細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ  ７５）；ヒト腎細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳房腫瘍（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣ  ＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，３８３：４４−６８，１９８２）；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；並びにヒト肝細胞株（Ｈｅｐ  Ｇ２）。
【０１６１】
組換えタンパク質の長期高収率生産のために、ポリペプチドを安定的に発現するように宿主細胞を操作する。プロモータ、エンハンサー、配列、転写終結因子、ポリアデニル化部位及び選択マーカをはじめとする、当技術分野で公知の適切な発現制御要素によって制御されるＤＮＡで宿主細胞を形質転換することができる。組換えＤＮＡ技術の当技術分野で周知の方法を用いて、所望の組換えクローンを選択することができる。
【０１６２】
本明細書に記載のタンパク質が組換え発現によって生成されたら、当技術分野で公知の任意の精製方法、例えばクロマトグラフィー（例えば、イオン交換、アフィニティ及びサイジングカラムクロマトグラフィー）、遠心分離、較差溶解度により、又は任意の他の標準的なタンパク質精製方法によりそれを精製することができる。例えば、プロテインＡカラムなどのアフィニティカラムを適切に選択し、クロマトグラフィーカラム、濾過、限外濾過、塩析及び透析法と組み合わせることにより、抗体を分離及び精製することができる（Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｅｄ  Ｈａｒｌｏｗ，Ｄａｖｉｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，１９８８を参照されたい）。さらに、本明細書に記載されるように、精製を促進するために、ポリペプチドを異種ポリペプチド配列に融合させることができる。上記に代わり又は加えて、化学的合成により、ポリペプチド又は融合タンパク質の一部又は全部を調製することもできる。
【０１６３】
ウイルス送達
一部の実施形態では、本明細書に記載の融合タンパク質（例えば、本明細書に記載のＣＤ１９変異体融合タンパク質）をコードする核酸をウイルスベクターに導入することができる。一部の実施形態では、こうしたウイルスベクターを用いて融合タンパク質を癌細胞（例えば、腫瘍細胞）に導入することができる。こうした融合タンパク質の導入により、対象の免疫系及び／又は１つ若しくは複数の追加治療薬に対する感受性を高めることができる（例えば、国際公開第２０１７／０７５５３３号パンフレットを参照されたい）。
【０１６４】
ベクター設計
本明細書に記載のＣＤ１９変異体融合タンパク質をコードする核酸配列をいくつかのタイプのベクターにクローン化することができる。例えば、プラスミド、ファージミド、ファージ誘導体、動物ウイルス及びコスミド中に核酸をクローン化することができる。他のベクターとして、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクター、シーケンシングベクター及びウイルスベクターを挙げることができる。別の例では、ベクターは、フォーミーウイルス（ＦＶ）ベクター、スプーマウイルスから作製されるタイプのレトロウイルスベクターであり得る。ウイルスベクター設計及び技術は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ，（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２００１）並びに他のウイルス学及び分子生物学便覧にあるように当技術分野で周知である。
【０１６５】
ウイルス形質導入
ウイルスは、多くの場合、感染宿主の免疫系による検出を回避しながら、特定の細胞型に核酸を送達するのに極めて効率的である。これらの特徴のために、特定のウイルスは、癌細胞、例えば固形腫瘍細胞への細胞療法標的の導入のためのビヒクルとして魅力的な候補となる。哺乳動物細胞への遺伝子移入のためにいくつかのウイルスベースの系が開発されている。ウイルスベクターの例として、限定されないが、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ関連ウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペス１ウイルス、ヘルペスウイルス、癌ウイルス（例えば、マウス白血病ウイルス）などが挙げられる。一般に、好適なベクターは、少なくとも１つの生物で機能性の複製起点、プロモータ配列、好都合な制限エンドヌクレアーゼ部位並びに１つ又は複数の選択性マーカを含有する（例えば、国際公開第０１／９６５８４号パンフレット；同第０１／２９０５８号パンフレット；及び米国特許第６，３２６，１９３号明細書）。
【０１６６】
レンチウイルス及びレトロウイルス形質導入は、レトロウイルス形質導入の効率を高めるために用いられるカチオン系ポリマー（臭化ヘキサメトリンとしても知られる）である、ポリブレン（ＳａｎｔａＣｒｕｚ  ｓｃ−１３４２２０；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  ＴＲ−１００３−Ｇ；Ｓｉｇｍａ  １０７６８９）の添加により増強することができる。
【０１６７】
例えば、レトロウイルスは、遺伝子送達系のプラットフォームを提供する。レトロウイルスは、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルスファミリーに属するエンベロープウイルスである。宿主細胞内に入ると、このウイルスは、ウイルス逆転写酵素を用いて、そのＲＮＡをＤＮＡに転写することにより複製する。レトロウイルスＤＮＡは、宿主ゲノムの一部として複製し、これは、プロウイルスと呼ばれる。当技術分野で公知の技術を用いて、選択した遺伝子をベクターに挿入し、レトロウイルス粒子内にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離し、対象の細胞にインビボで送達することができる。いくつかのレトロウイルスシステムが知られている（例えば、米国特許第５，９９４，１３６号明細書、同第６，１６５，７８２号明細書及び同第６，４２８，９５３号明細書を参照されたい）。
【０１６８】
レトロウイルスは、アルファレトロウイルス（Ａｌｐｈａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）の属（例えば、トリ白血病ウイルス）、ベータレトロウイルス（Ｂｅｔａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）の属；（例えば、マウス乳癌ウイルス）、デルタレトロウイルス（Ｄｅｌｔａｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）の属（例えば、ウシ白血病ウイルス及びヒトＴリンパ好性ウイルス）、イプシロンレトロウイルス（Ｅｐｓｉｌｏｎｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓ）の属（例えば、ウォールアイ皮膚肉腫ウイルス）並びにレンチウイルス（Ｌｅｎｔｉｖｉｒｕｓ）の属を含む。一部の実施形態では、レトロウイルスは、例えば、長いインキュベーション期間を特徴とする、レトロウイルス科（Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ）のウイルス属であるレンチウイルスである。レンチウイルスは、非分裂細胞に感染することができる点でレトロウイルスの中でもユニークであり；これらは、有意な量の遺伝子情報を宿主細胞のＤＮＡ中に送達することができるため、効率的な遺伝子送達ベクターとして使用することができる。いくつかの例では、レンチウイルスは、限定されないが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血（ＥＩＡ）及びビスナウイルスであり得る。レンチウイルス由来のベクターは、インビボで有意なレベルの遺伝子移入を達成する手段を提供する。
【０１６９】
一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクターである。アデノウイルスは、二本鎖ＤＮＡを含むウイルスの大きいファミリーである。アデノウイルスは、宿主の細胞機構を利用して、ウイルスＲＮＡ  ＤＮＡ及びタンパク質を合成しながら、宿主細胞のＤＮＡを複製する。アデノウイルスは、当技術分野において、複製及び非複製細胞の両方に作用すること、大きいトランスジーンを収容すること並びに宿主細胞ゲノムに組み込まれることなくタンパク質をコードすることがわかっている。
【０１７０】
一部の実施形態では、ＡＡＶＰベクターを使用する。ＡＡＶＰベクターは、原核生物−真核生物ベクターのハイブリッドであり、これは、組換えアデノ関連ウイルス及びファージの遺伝子シスエレメントのキメラである。ＡＡＶＰは、ファージ系及びＡＡＶベクター系の両方の選択したエレメントを組み合わせて、哺乳動物細胞の感染と組み合わせて宿主染色体への組込みを可能にしながら、細菌中で簡単に産生し、且つパッケージング限界をほとんど又は全く呈示し得ないベクターを提供する。適切なエレメントの多くを含有するベクターは、市販されており、標準的方法でさらに修飾して必要な配列を含有させることができる。中でも、ＡＡＶＰは、ヘルパーウイルス又はトランス活性化因子を必要としない。さらに、ＡＡＶキャプシド形成がないことから、哺乳動物細胞のＡＡＶのネイティブトロピズムが排除される。他の方法及び詳細は、米国特許第８，４７０，５２８号明細書及びＨａｊｉｔｏｕ  Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ，１２５：３５８−３９８に見出される。
【０１７１】
一部の実施形態では、ヒトパピローマ（ＨＰＶ）偽ウイルスを使用する。ＤＮＡプラスミドをパピローマウイルスＬ１及びＬ２キャプシドタンパク質にパッケージングして、ＤＮＡを効率的に送達することができる偽ビリオンを作製することができる。この封入により、ＤＮＡをヌクレアーゼから保護することができ、高レベルの安定性で標的送達が達成される。ウイルスベクターの使用に関連する安全性の懸念事項の多くがＨＰＶ偽ウイルスによって軽減され得る。他の方法及び例は、Ｈｕｎｇ，Ｃ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，７：７（ｅ４０９８３）；２０１２、米国特許第８，３９４，４１１号明細書及びＫｉｎｅｓ，Ｒ．，ｅｔ  ａｌ  Ｉｎｔ  Ｊ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ，２０１５に見出される。
【０１７２】
一部の実施形態では、腫瘍溶解性ウイルスを使用する。腫瘍溶解性ウイルス療法は、癌細胞中でこのウイルスを選択的に複製することができ、続いて例えば正常組織に作用することなく腫瘍内に拡散させることができる。代わりに、腫瘍溶解性ウイルスは、正常組織に損傷を起こすことなく細胞に優先的に感染し、殺傷することができる。腫瘍溶解性ウイルスは、それら自体、さらに感染した腫瘍細胞にも免疫応答を有効に誘導することもできる。典型的に、腫瘍溶解性ウイルスは、２つのクラスに属する：（Ｉ）優先的に癌細胞中で自然に複製し、且つヒトにおいて非病原性であるウイルス。例示的なクラス（Ｉ）腫瘍溶解性ウイルスは、自律パルボウイルス、粘液腫ウイルス（ポックスウイルス）、ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ；パラミクソウイルス）、レオウイルス及びセネカバレー（Ｓｅｎｅｃａ  ｖａｌｌｅｙ）ウイルス（ピコルナウイルス）を含む。第２のクラス（ＩＩ）は、ワクチンベクターとして使用するために遺伝子操作されたウイルスを含み、そうしたものとして、麻疹ウイルス（パラミクソウイルス）、ポリオウイルス（ピコルナウイルス）及びワクシニアウイルス（ポックスウイルス）が挙げられる。加えて、腫瘍溶解性ウイルスは、正常細胞では複製に必要な遺伝子の突然変異／欠失により遺伝子操作されているが、癌細胞ではされていないものも含み得、そうしたものとして、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス及び水泡口炎ウイルスが挙げられる。腫瘍溶解性ウイルスは、複数の経路をターゲティングして、腫瘍選択的方法で複製することができることから、その遺伝子抵抗性の確率が低いため、ウイルス形質導入方法として使用することができる。腫瘍内のウイルス用量は、インサイチュウイルス増幅により時間の経過と共に増加することができる（時間の経過と共に減少する小分子治療薬と比較して）ため、安全性の特徴を組み込むことができる（すなわち薬剤及び免疫感受性）。
【０１７３】
投与
本開示のいくつかの実施形態は、本明細書に記載の細胞治療薬（若しくはその集団）、本明細書に記載のタンパク質治療薬、細胞治療薬を含む組成物及び／又はタンパク質治療薬を含む組成物を、例えば対象を治療するのに有効な量で対象に投与する方法を含む。一部の実施形態では、本方法は、対象の癌を有効に治療する。
【０１７４】
一部の実施形態では、細胞治療薬は、オートロガス細胞を含み、これを、免疫細胞を採取した同じ対象に投与する。代わりに、免疫細胞を対象から採取し、これを、本明細書に記載の発現構築物で形質転換、例えば形質導入することによって細胞治療薬を取得し、これを別の対象に同種移入する。
【０１７５】
一部の実施形態では、細胞治療薬は、対象にオートロガスであり、対象は、対象から免疫細胞を単離する前に免疫学的にナイーブ、免疫されている、疾患状態又は別の状態であり得る。
【０１７６】
一部の実施形態では、対象への投与前に別のステップを実施することができる。例えば、本明細書に記載の発現構築物と免疫細胞とを接触（例えば、形質導入又はトランスフェクト）させた後及び対象への投与前に細胞治療薬をインビトロで拡大することができる。インビトロ拡大は、対象への投与前に１日以上、例えば２日以上、３日以上、４日以上、６日以上又は８日以上にわたって実施することができる。代わりに又は加えて、インビトロ拡大は、対象への投与前に２１日以下、例えば１８日以下、１６日以下、１４日以下、１０日以下、７日以下又は５日以下にわたって実施することができる。例えば、インビトロ拡大は、対象への投与前に１〜７日、２〜１０日、３〜５日又は８〜１４日にわたって実施することができる。
【０１７７】
一部の実施形態では、インビトロ拡大中、細胞治療薬を抗原（例えば、ＴＣＲ抗原）で刺激することができる。抗原特異的拡大は、任意選択で、例えば抗ＣＤ３抗体、抗Ｔａｃ抗体、抗ＣＤ２８抗体又はフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）など、リンパ球増殖を非特異的に刺激する条件下の拡大によって補うことができる。拡大された細胞治療薬を対象に直接投与し得るか、又は将来の使用、すなわち対象への後の投与のために凍結し得る。
【０１７８】
一部の実施形態では、細胞治療薬をインターロイキン−２（ＩＬ−２）でエクスビボ処置した後、癌患者に注入し、注入後に癌患者をＩＬ−２で治療する。さらに、一部の実施形態では、癌患者は、細胞治療薬の投与前に前処置的リンパ枯渇（免疫系の一時的アブレーション）を受けることができる。ＩＬ−２処置及び前処置的リンパ枯渇の組合せは、細胞治療薬の持続性を増大することができる。
【０１７９】
一部の実施形態では、サイトカインをコードする核酸で細胞治療薬を形質導入又はトランスフェクトし、この核酸は、サイトカインの構成性、調節可能又は一過性制御発現を提供するように操作することができる。好適なサイトカインとしては、例えば、収縮期中のＴリンパ球の生存を増大するために作用するサイトカインがあり、これは、メモリーＴリンパ球の形成及び生存を促進することができる。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、細胞治療薬は、癌治療薬などの別の治療薬の投与前、ほぼ同時又は投与後に投与する。癌治療薬は、例えば、化学療法薬、生物剤又は放射線治療であり得る。一部の実施形態では、細胞治療薬を受ける対象に、リンパ枯渇化学療法又は放射線療法などの免疫細胞の枯渇を引き起こすのに十分な治療を投与しない。
【０１８１】
本明細書に記載される細胞治療薬は、組成物、例えば細胞治療薬及び薬学的に許容される担体として、形成することができる。いくつかの実施形態では、組成物は、本明細書に記載の少なくとも１種の細胞治療薬と、薬学的に許容される担体、希釈剤及び／又は賦形剤を含む医薬組成物である。本明細書に記載の薬学的に許容される担体、例えばビヒクル、アジュバント、賦形剤及び希釈剤は、公知であり、当業者には容易に入手可能である。好ましくは、薬学的に許容される担体は、活性薬剤、例えば細胞治療薬に対して化学的に不活性であり、使用条件下で有害な副作用又は毒性を誘発しない。
【０１８２】
組成物は、例えば、静脈内、腫瘍内、動脈内、筋肉内、腹腔内、髄腔内、硬膜外及び／又は皮下投与経路などのいずれかの好適な経路による投与のために製剤化することができる。好ましくは、組成物は、非経口投与経路のために製剤化される。
【０１８３】
非経口に好適な組成物は、水性又は非水性、等張滅菌注射液であり得、これは、酸化防止剤、バッファー、静菌薬並びに例えば組成物を対象レシピエントの血液と等張にする溶質を含有することができる。水性又は非水性滅菌懸濁液は、１つ又は複数の懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤及び防腐剤を含有し得る。
【０１８４】
対象、特にヒトに投与される用量は、具体的な実施形態、使用される組成物、投与方法並びに治療しようとする具体的な部位及び対象によって変動し得る。しかし、用量は、治療応答をもたらす上で十分でなければならない。当技術分野の熟練した臨床医は、特定の医学的状態を治療又は予防するために、ヒト又は他の対象に投与すべき組成物の治療有効量を決定することができる。治療有効的であるのに必要な組成物の正確な量は、対象に特有の多くの考慮事項に加えて、例えば細胞治療薬の具体的な活性及び投与経路、腫瘍細胞及び／又は正常細胞に対して利用可能な１つ又は複数の抗原の量（例えば、腫瘍の大きさ若しくは腫瘍負荷の程度によって）などの様々な要因に応じて変動するが、これは、当業者の技術の範囲内である。一部の実施形態では、特定の癌適応症又は複数の適応症のための細胞治療薬の適切な用量は、用量漸増臨床試験で決定することができる。
【０１８５】
任意の好適な数の細胞治療用細胞を対象に投与することができる。本明細書に記載される単一の細胞治療用細胞で、治療利益を拡大及び提供することができるが、一部の実施形態では、１０２以上、例えば１０３以上、１０４以上、１０５以上又は１０８以上の細胞治療用細胞を投与する。代わりに又は加えて、１０１２以下、例えば１０１１以下、１０９以下、１０７以下又は１０５以下の本明細書に記載される細胞治療用細胞を対象に投与する。一部の実施形態では、１０２〜１０５、１０４〜１０７、１０３〜１０９又は１０５〜１０１０の本明細書に記載される細胞治療用細胞を投与する。
【０１８６】
本明細書に記載される細胞治療薬の用量は、哺乳類に一度に投与することもできるか、又は好適な期間にわたり、必要に応じて例えば毎日、週２回、毎週、隔週、月２回、隔月、年２回若しくは年毎に一連のサブ用量で投与することもできる。必要に応じて、有効量の細胞治療薬を含む１用量単位を単回１日用量として投与し得るか、又は１日の総用量を２、３、４回若しくはそれを上回って分割して毎日投与し得る。
【０１８７】
本明細書に記載されるポリペプチドは、医薬組成物中に組み込むことができる（例えば、タンパク質治療薬としての使用のために）。ポリペプチドを含む医薬組成物は、当業者に周知の方法によって製剤化することができる（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ｐｐ．１４４７−１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ  Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，ｅｄ．，１９ｔｈ  ｅｄ．１９９５）を参照されたい）。医薬組成物は、滅菌溶液若しくは水中懸濁液又は別の薬学的に許容される液体を含む注射液の形態で非経口投与することができる。例えば、医薬組成物は、滅菌水及び生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、矯味賦形剤、希釈剤、ビヒクル、防腐剤、結合剤などの薬学的に許容されるビヒクル又は媒体とポリペプチドを好適に組み合わせた後、一般に認められている製薬基準に必要な単位剤形中で混合することにより製剤化することができる。医薬製剤中に含有させる活性成分の量は、指定範囲内の好適な用量が供給されるような量である。
【０１８８】
注射のための滅菌組成物は、ビヒクルとして注射用蒸留水を用いて、一般的製薬基準に従って製剤化することができる。例えば、グルコース並びにＤ−ソルビトール、Ｄ−マンノース、Ｄ−マンニトール及び塩化ナトリウムなどの他の添加剤を含有する生理食塩水又は等張液を注射用水溶液として、任意選択で、好適な可溶化剤、例えばエタノールなどのアルコール及びプロピレングリコール又はポリエチレングリコールなどのポリアルコール並びにポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ−５０などのノニオン性界面活性剤などと組み合わせて使用し得る。
【０１８９】
油性液体の非限定的例として、ゴマ油及びダイズ油が挙げられ、これは、可溶化剤としての安息香酸ベンジル又はベンジルアルコールと組み合わされ得る。含有させることができる他の品目は、リン酸バッファー又は酢酸ナトリウムバッファーなどのバッファー、水酸化プロカインなどの無痛化薬、ベンジルアルコール又はフェノールなどの安定剤並びに酸化防止剤である。製剤化した注射液は好適なアンプルにパッケージングすることができる。
【０１９０】
投与経路は、非経口、例えば注射、経鼻投与、経肺投与又は経皮投与による投与であり得る。投与は、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射による全身又は局所のいずれであり得る。
【０１９１】
好適な投与手段は、対象の年齢及び状態に基づいて選択することができる。ポリペプチドを含有する医薬組成物の単回用量は、０．００１〜１０００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲から選択することができる。他方で、用量は、０．００１〜１０００００ｍｇ／体重の範囲内で選択することができるが、本開示は、このような範囲に限定されない。用量及び投与方法は、対象の体重、年齢、状態などに応じて変動し得るものであり、必要に応じて当業者により好適に選択することができる。
【０１９２】
腫瘍
本開示は、あらゆる腫瘍の治療において有用な技術を提供する。一部の実施形態では、腫瘍は、限定されないが、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、有毛細胞白血病、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、ランゲルハンス細胞組織球症、多発性骨髄腫又は骨髄増殖性腫瘍などの血液系腫瘍であるか又はそれを含む。
【０１９３】
一部の特定の実施形態では、腫瘍は、限定されないが、乳癌、扁平上皮細胞癌、結腸癌、頭部及び頚部癌、卵巣癌、肺癌、中皮腫、生殖泌尿器癌、直腸癌、胃癌又は食道癌などの固形腫瘍であるか又はそれを含む。
【０１９４】
一部の特定の実施形態では、腫瘍は、進行性腫瘍及び／又は不応性腫瘍であるか又はそれを含む。一部の実施形態では、腫瘍は、腫瘍（例えば、腫瘍から採取した生検試料などの組織サンプル）中に特定の病理が観察される場合及び／又はそうした腫瘍を有する癌患者が典型的に従来の化学療法の候補ではないとみなされる場合、進行していると特徴付けられる。一部の実施形態では、進行性として腫瘍を特徴付ける病理としては、腫瘍サイズ、遺伝子マーカの発現改変、腫瘍細胞による隣接器官及び／又はリンパ節の浸潤を挙げることができる。一部の実施形態では、腫瘍は、そうした腫瘍を有する患者が１つ若しくは複数１つ若しくは複数の既知の治療法（例えば、１つ若しくは複数１つ若しくは複数の従来の化学療法レジメン）に対して耐性である場合及び／又は特定の患者が１つ若しくは複数１つ若しくは複数のそうした既知の治療法に対して耐性（例えば、応答性の欠如）を示した場合、不応性と特徴付けられる。
【０１９５】
併用療法
一部の実施形態では、細胞治療薬及び／又はタンパク質治療薬は、第２の細胞治療薬、抗体薬物複合体、抗体及び／又はポリペプチドと組み合わせて投与する。一部の実施形態では、第２の細胞治療薬（例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞）による腫瘍のターゲッティング及び／又は殺傷の程度は、本明細書に記載の細胞治療薬又はタンパク質治療薬との併用療法の非存在下で観察又は測定されるレベルよりも高い（例えば、付加的又は相乗的である）。
【０１９６】
本明細書に記載される細胞治療薬及び／又はタンパク質治療薬を含む医薬組成物は、任意選択で、例えば化学療法薬又は生物剤といった癌治療薬などの１つ又は複数の別の治療薬を含有し得、且つ／又はそれと組み合わせて投与され得る。本明細書に記載の細胞治療薬と組み合わせて使用することができる化学療法薬の例として、以下のものが挙げられる：白金化合物（例えば、シスプラチン、カルボプラチン及びオキサリプラチン）、アルキル化剤（例えば、シクロホスファミド、イホスファミド、クロラムブシル、ナイトロジェンマスタード、チオテパ、メルファラン、ブスルファン、プロカルバジン、ストレプトゾシン、テモゾロミド、ダカルバジン及びベンダムスチン）、抗腫瘍抗生物質（例えば、ダウノルビシン、ドキソルビシン、イダルビシン、エピルビシン、ミトキサントロン、ブレオマイシン、マイトマイシンＣ、プリカマイシン及びダクチノマイシン）、タキサン（例えば、パクリタキセル及びドセタキセル）、代謝拮抗剤（例えば、５−フルオロウラシル、シタラビン、プレメトレキセド、チオグアニン、フロクスウリジン、カペシタビン及びメトトレキサート）、ヌクレオシド類似体（例えば、フルダラビン、クロファラビン、クラドリビン、ペントスタチン及びネララビン）、トポイソメラーゼ阻害剤（例えば、トポテカン及びイリノテカン）、ヒポメチル化剤（例えば、アダシチジン及びデシタビン）、プロテオソーム阻害剤（例えば、ボルテゾミブ）、エピドフィロトキシン（例えば、エトポシド及びテニポシド）、ＤＮＡ合成阻害剤（例えば、ヒドロキシウレア）、ビンカアルカロイド（例えば、ビクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン及びビンブラスチン）、チロシンキナーゼ阻害剤（例えば、イマチニブ、ダサチニブ、ニロチニブ、ソラフェニブ及びスニチニブ）、ニトロソウレア（例えば、カルムスチン、フォテムスチン及びロムスチン）、ヘキサメチルメラミン、ミトタン、血管新生阻害剤（例えば、タリドミド及びレナリドミド）、ステロイド（例えば、プレドニゾン、デキサメタゾン及びプレドニゾロン）、ホルモン剤（例えば、タモキシフェン、ラロキシフェン、ロイプロリド、ビカルアトミド、グラニセトロン及びフルタミド）、アロマターゼ阻害剤（例えば、レトロゾール及びアナストロゾール）、三酸化ヒ素、トレチノイン、非選択性シクロオキシゲナーゼ阻害剤（例えば、非ステロイド性抗炎症剤、サリチル酸塩、アスピリン、ピロキシカム、イブプロフェン、インドメタシン、ナプロシン、ジクロフェナク、トルメチン、ケトプロフェン、ナブメトン及びオキサプロジン）、選択性シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤又はこれらの任意の組合せ。
【０１９７】
本明細書に記載される組成物及び方法で使用することができる生物剤の例としては、以下のものが挙げられる：モノクローナル抗体（例えば、リツキシマブ、セツキシマブ、パネツムマブ、トシツモマブ、トラスツズマブ、アレムツズマブ、ゲムツズマブ、オゾガマイシン、ベバシズマブ、カツマキソマブ、デノスマブ、オビヌツズマブ、オファツムマブ、ラムシルマブ、ペルツズマブ、イピリムマブ、ニボルマブ、ニモツズマブ、ラムブロリズマブ、ピジリズマブ、シルツキシマブ、ＢＭＳ−９３６５５９、ＲＧ７４４６／ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＭＥＤＩ４７３６、トレメリムマブ若しくは本明細書の表１に列記するその他）、酵素（例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ）、サイトカイン（例えば、インターフェロン及びインターロイキン）、増殖因子（例えば、コロニー刺激因子及びエリスロポエチン）、癌ワクチン、遺伝子療法ベクター又はこれらの任意の組合せ）。
【０１９８】
一部の実施形態では、本明細書に記載される治療方法は、医学的状態の他の治療が失敗したか、又は他の手段による治療であまり成果がなかった対象に対して実施される。さらに、本明細書に記載される治療方法は、医学的状態の１つ又は複数の別の治療と一緒に実施することができる。例えば、本方法は、本明細書に記載の細胞治療薬及び／若しくはタンパク質治療薬又はそれらの組合せの投与前、ほぼ同時又は投与後に癌レジメン、例えば骨髄非破壊的化学療法、手術、ホルモン療法及び／又は放射線を投与するステップを含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の細胞治療薬及び／又はタンパク質治療薬が投与される対象は、抗生物質及び／又は１つ又は複数の別の薬剤で治療することもできる。
【０１９９】
本明細書に挙げる全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献は、その全内容が参照により本明細書に組み込まれるものとする。さらに、材料、方法及び例は、例示的に過ぎず、限定を意図するものではない。別に定義されない限り、本明細書で使用される技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者に一般に理解されるものと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと類似の又は均等な方法及び材料を本発明の実施又は試験に使用することができるが、好適な方法及び材料を本明細書に記載する。
【０２００】
本開示の例示的なアミノ酸及びヌクレオチド配列を以下の表に列挙する。
【０２０１】
【表１４】
2021508443.tif 000018
【０２０２】
【表１５】
2021508443.tif 000019
【０２０３】
【表１６】
2021508443.tif 000020
【０２０４】
【表１７】
2021508443.tif 000021
【０２０５】
【表１８】
2021508443.tif 000022
【０２０６】
【表１９】
2021508443.tif 000023
【０２０７】
【表２０】
2021508443.tif 000024
【０２０８】
本開示を以下の実施例によりさらに説明する。これらの実施例は、例示の目的で提供されるに過ぎず、本開示の範囲又は内容を何ら限定するものとして解釈すべきではない。
【実施例】
【０２０９】
実施例１  −  ＣＤ１９コンビナトリアルライブラリ
構造完全性が改善されたＣＤ１９（以後、ＣＤ１９；配列番号２と呼ぶ）の細胞外ドメインを、酵母表面ディスプレイ（Ｂｏｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１５：５５３−５５７（１９９７））及び蛍光活性化細胞選別（Ｃｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃ．１：７５５−７６８（２００６））を用いた選択によりコンビナトリアルライブラリから識別した。２つのコンビナトリアルライブラリを作製した。第１のライブラリでは、全てのアミノ酸を独立に全２０の正準アミノ酸に多様化した。すなわち、全ての単一残基突然変異を含有させた。唯一の例外は、多様化から排除したＬ１６５及びＳ１６６並びにＮＮＣ変性コドンを用いて１５のアミノ酸に多様化させたＳ１６４であったが、いずれも、タンパク質コード化遺伝子配列内にニッキングエンドヌクレアーゼ認識ＤＮＡ配列を含有させる要件として行った。第２のライブラリでは、追加及び相乗的突然変異を見出すために、２つ又は３つのアミノ酸の選択組合せを同時に突然変異させた（図２）。
【０２１０】
各多様化部位において、ＮＮＫコドンによるニッキング突然変異誘発（Ｗｒｅｎｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３：９２８−９３０（２０１６））を用いて、突然変異体ＣＤ１９遺伝子を作製し、ｐＣＴ−Ａｇａ２ｐ−ＣＤ１９−ＭＹＣ酵母ディスプレイベクターに導入し、酵母に形質転換した。単一及び三重突然変異ライブラリを、それらの多様化の位置に基づいてそれぞれ３つ及び２つのプールに分割して、それらの突然変異をイルミナ（Ｉｌｕｍｉｎａ）ディープシーケンシング（１回のリードでＣＤ１９遺伝子全体を効率的にシーケンシングすることはできない）により識別できるようにした。単一１は、配列番号２の部位１Ｐ〜９２Ｗに対応する。単一２は、配列番号２の部位９３Ｔ〜１５６Ｐに対応する。単一３は、配列番号２の部位１５７Ｐ〜２７２Ｋに対応する。三重１は、ドメイン１内のセット（図２の初めの１５列）に対応し、三重２は、ドメイン２内のセット（図２の後ろの１２列）に対応する。各ライブラリについて１０５〜１０６のユニークなライゲーション形質転換体を取得し、これらは、シングレットライブラリにおいて考えられる配列の２９〜９８倍のオーバーサンプリングをもたらし、トリプレットライブラリの１．１〜２．４倍のオーバーサンプリングをもたらした。
【０２１１】
次の３つの選択モードにより、ＣＤ１９変異体を各ライブラリから識別した：（１）立体構造依存性抗体ＦＭＣ６３及び４Ｇ７に結合する能力；（２）プロテイナーゼＫへの曝露時の切断に対する抵抗性；並びに（３）実施例２〜４に記載するように、熱ストレス（３７℃）下で誘導時の酵母表面ディスプレイの程度。
【０２１２】
実施例２．抗体結合
抗体ＦＭＣ６３及び４Ｇ７は、哺乳動物細胞培養物中に産生された野生型ＣＤ１９に結合するが、酵母ディスプレイ野生型ＣＤ１９に結合しないことが証明された（図３）。対照的に、抗体ＵｍＡｂ１０３及び３Ｂ１０は、酵母ディスプレイ野生型ＣＤ１９に実質的に結合した（図３）。特に、ＵｍＡｂ１０３及び３Ｂ１０は、ＣＤ１９の高温処理後でも酵母ディスプレイ野生型ＣＤ１９に結合することができた（図３）。これらの結果は、ＵｍＡｂ１０３及び３Ｂ１０が、酵母ディスプレイ野生型ＣＤ１９上に容易に提示される非立体構造エピトープに結合するのに対し、ＦＭＣ６３及び４Ｇ７が、野生型ＣＤ１９の酵母ディスプレイバージョン上に適切に再現されないエピトープに結合することを示唆している。
【０２１３】
従って、ＦＭＣ６３及び／又は４Ｇ７との結合を回復するＣＤ１９変異体は、構造的に改善されたＣＤ１９変異体として識別される。非選別ライブラリ中において、機能性突然変異体は、稀であるが、存在した（図４）。フローサイトメトリー選別により、これらの改善された変異体を分離し（図４）、これらをＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑディープシーケンシングにより識別した。統計解析から、有意に濃縮された変異体が明らかにされた（表１Ａ及び表１Ｂ）。
【０２１４】
【表２１】
2021508443.tif 000025
【０２１５】
【表２２】
2021508443.tif 000026
【０２１６】
実施例３．プロテアーゼ抵抗性
プロテイナーゼＫによる酵母ディスプレイ野生型ＣＤ１９の処理により、インキュベーション時間、プロテアーゼ濃度及びＣＤ１９安定性に応じて、タンパク質の部分的な切断が起こった。これは、Ｎ末端ＨＡエピトープシグナルの相対的な維持と共に、Ｃ末端ＭＹＣエピトープシグナルの低減により容易に測定することができる（図５）。単一及び三重突然変異体コンビナトリアルライブラリを選別して、プロテイナーゼＫ切断に対する抵抗性が改善された変異体を識別した（図６）。Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑディープシーケンシングは、改善された単離変異体を明らかにした（表２Ａ及び表２Ｂ）。
【０２１７】
【表２３】
2021508443.tif 000027
【０２１８】
【表２４】
2021508443.tif 000028
【０２１９】
実施例４．熱ストレス
さらに、変異体が誘導ディスプレイ中の熱ストレスに耐える能力についてもコンビナトリアルライブラリを選別した。酵母を３７℃で誘導したが、これは、熱安定性が低いタンパク質変異体のディスプレイの低減をもたらすことが証明された条件である（Ｓｈｕｓｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９２：９４９−９５６（１９９９）；Ｈａｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０１：８４−９６（２０１０））。ディスプレイが増大したＣＤ１９変異体を選択し（図７）、シーケンシングした（表３）。
【０２２０】
【表２５】
2021508443.tif 000029
【０２２１】
実施例５．第２世代ＣＤ１９  ＥＣＤコンビナトリアルサブライブラリ
抗体結合、プロテアーゼ抵抗性及び／又は耐熱性が改善したＣＤ１９変異体の選択は、独特の機能を備えた分子を識別するだけではなく、さらに進化した機能と組み合わせることができる変異体を識別する。初期ＣＤ１９操作から得られた１３セットの高度に有益な突然変異（ＣＤ１９  ＥＣＤにおける２９１の、３９の部位で）を組み合わせた。初期スクリーンにより、突然変異からの最大利益を備える３９の部位を識別したが、これにより、そうでなければ膨大となった配列空間の検索を制限した。さらに、３９の部位で考えられる全てのアミノ酸突然変異は、２０３９＝１０５０変異体をもたらすことになる。これらの部位での機能性突然変異の識別は、コンビナトリアルライブラリを７×１０７変異体に制限することを可能にした（図８）。
【０２２２】
このコンビナトリアルライブラリの解析から、野生型ＣＤ１９又は三重変異体に対して、実質的に高いＦＭＣ６３結合が明らかにされた（図９及び図１５Ｃ）。
【０２２３】
実施例６．操作されたＣＤ１９変異体の選択
プロテアーゼ抵抗性及びＦＭＣ６３との結合が増大したＣＤ１９多重突然変異体の選択により、ＦＭＣ６３との結合が改善し（図１０Ａ）、且つプロテアーゼ抵抗性が増大した（図１０Ｂ）集団を取得した。
【０２２４】
実施例７．ＣＤ１９リガンドライブラリの作製
ＣＤ１９  ＥＣＤは、短いリンカー領域により隔てられた２つのＩｇドメインから構成される（図１２）。ＣＤ１９  ＥＣＤを多様化して、様々な分子標的に対する新たな結合機能性をもたらす。例えば、ＣＤ１９リガンドライブラリを作製するために、Ｉｇドメイン１若しくはＩｇドメイン２の溶媒曝露ループ又はＩｇドメイン２のβシート表面を変化させる（図１２）。他の表面及び他の特定のアミノ酸も変化させる。ライブラリは、遺伝子レベル（＞１×１０８酵母形質転換体）で構築する（Ｗｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０，ｅ０１３８９５６（２０１５））。
【０２２５】
これらの突然変異は、安定性操作ＣＤ１９ドメインに関連して実施する（実施例６を参照されたい）。特に、図１２の例示的ライブラリ設計は、ＣＤ１９の構造完全性を改善することが認められた特定の部位における特定のアミノ酸の頻度を高める（実施例２〜６）ことにより、また構造完全性を妨げる部位におけるアミノ酸の頻度を低下させることによりさらに誘導される。
【０２２６】
実施例８．ＣＤ１９ベースリガンドの発見及び進化
磁気及びフローサイトメトリーの選択（Ｈａｃｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０１：８４−９６（２０１０）；Ｗｏｌｄｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  １０，ｅ０１３８９５６（２０１５）；Ａｃｋｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｐｒｏｇ．２５：７７４−７８３（２００９））、続いて界面活性剤可溶化ＥＧＦＲ＋細胞溶解物を用いたフローサイトメトリー選択を有する組換えＥＧＦＲエクトドメインを用いて、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）などの分子標的に対する結合体についてライブラリを選別した。対照タンパク質及びＥＧＦＲ−溶解物に対する除去選別を用いて、特異性を進化させる。特異的結合について濃縮された集団の遺伝子を酵母から分離し、シーケンシングして、ＣＤ１９  Ｉｇドメインの多様性及び完全性を評価する。エラープローンＰＣＲ及びループシャッフリング（Ｗｒｅｎｂｅｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  １３：９２８−９３０（２０１６））に続き、より厳格な選別を用いて、遺伝子を進化させる。
【０２２７】
実施例９．Ｎ末端ＣＤ１９−リガンド融合物
高度機能性配列空間の集中的な検索（実施例５）を達成した複合突然変異ライブラリを用いて、ＣＤ１９−リガンド融合物（リガンドのＮ末端側に位置するＣＤ１９を有する）にモジュール性（すなわちタンパク質融合物のメンバーとして機能する能力）を備えるＣＤ１９変異体を識別した。複合突然変異ライブラリをＥＧＦＲ結合フィブロネクチン又はＨＥＲ２結合単鎖抗体断片のいずれかのＮ末端に遺伝子学的に融合させた。ＦＭＣ６３結合及び標的（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２）結合の両方を可能にした変異体が収集される二重機能スクリーンを用いて、ライブラリを２回選別した。２回の二重選別後、二重機能性ＣＤ１９−リガンド融合物の個別の集団を取得した（図１３）。配列解析から、表示の部位で進化した完全長ＣＤ１９変異体が明らかにされた（図１４）。
【０２２８】
実施例１０．リガンド−Ｃ末端ＣＤ１９融合物
高度機能性配列空間の集中的な検索（実施例５）を達成する複合突然変異ライブラリを用いて、リガンド−ＣＤ１９融合物（リガンドのＣ末端側に位置するＣＤ１９を有する）にモジュール性（すなわちタンパク質融合物のメンバーとして機能する能力）を備えるＣＤ１９変異体を識別した。複合突然変異ライブラリをＥＧＦＲ結合フィブロネクチン又はＨＥＲ２結合単鎖抗体断片のいずれかのＣ末端に遺伝子学的に融合させた。ＦＭＣ６３結合及び標的（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２）結合の両方を可能にした変異体が収集される二重機能スクリーンを用いて、ライブラリを選別した。１回の選別後、二重機能性リガンド−ＣＤ１９融合物の個別の集団を取得した（図１５）。
【０２２９】
実施例１１．Ｎ末端ＣＤ１９−リガンド融合物の機能
ＣＤ１９変異体が融合タンパク質、例えばＮ末端ＣＤ１９−リガンド融合物のメンバーとして機能する能力をさらに実証するために、実施例９で識別した４つのＣＤ１９変異体をさらに試験した。図１４に示すＪＲＫ２、ＪＲＫ５、ＪＲＫ１４及びＪＲＫ１５に対応するアミノ酸置換を有するＣＤ１９変異体をＥＧＦＲ結合フィブロネクチンのＮ末端に遺伝子学的に融合した（ＣＤ１９−Ｆｎ３／ＥＧＦＲ；構築物＃２２７、２２８、２２９及び２３０；それぞれ配列番号３、４、５及び６）。これらの構築物の２つ（＃２２８及び＃２３０）をＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトすることにより、ＥＧＦＲ結合フィブロネクチンのＮ末端に融合された野生型ＣＤ１９（構築物＃１６０、配列番号７）と比較して、上清中への融合タンパク質の分泌が増加した（図１６）。４つの構築物全てを、それらがＥＧＦＲ陽性細胞に結合する能力及びそうした細胞の殺傷について分析した。４つの構築物は、全てその細胞に良好に結合し、さらに全てがその細胞を殺傷した。４つの構築物間で分泌レベル、結合又は殺傷能力に有意な差は見られなかった（データは示していない）。
【０２３０】
さらに、ＣＤ１９変異体ＪＲＫ１５をＨＥＲ２結合単鎖抗体断片のＮ末端に遺伝子学的に融合した融合タンパク質を試験した（ＣＤ１９−ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２構築物＃３１１；配列番号８）。また、野生型ＣＤ１９−ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２融合タンパク質（＃４２、配列番号９）と比較すると、ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２のＮ末端側に位置するＣＤ１９変異体ＪＲＫ１５では、約８倍の分泌増加が認められた（図１７）。
【０２３１】
実施例１２．リガンド−Ｃ末端ＣＤ１９融合物の機能
ＣＤ１９変異体がタンパク質融合物（例えば、リガンド−Ｃ末端ＣＤ１９融合物）のメンバーとして機能する能力をさらに実証するために、３つのＣＤ１９変異体をさらに試験した。ＣＤ１９変異体をＨＥＲ２結合単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２−ＣＤ１９）のＣ末端に遺伝子学的に融合した（構築物＃２６３、２６４及び２６５；それぞれ配列番号１０、１１及び１２）。ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトしたＨＥＲ２結合単鎖抗体断片（構築物＃４０；配列番号３８）のＣ末端に融合した野生型ＣＤ１９  Ｄ１＋２ドメインを含む融合タンパク質は、分泌することができなかった。しかし、Ｃ末端ＣＤ１９変異体を含む３つの構築物は、良好に分泌した（図１８）。
【０２３２】
ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２−ＣＤ１９融合タンパク質の（構築物２６３、２６４及び２６５）の各々を精製し、Ｈｅｒ２陽性ＳＫＯＶ３細胞に対する結合及びそれら細胞の殺傷について滴定した。図１９は、ＦＡＣＳ分析による、ＳＫＯＶ３細胞に結合した３つのｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２−ＣＤ１９構築物の検出を示す。抗Ｈｉｓ−ＰＥ及びＦＭＣ６３−ＰＥ抗体の両方により構築物が検出された。図２０は、３つのｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２−ＣＤ１９構築物の各々がＣＡＲ１９細胞と架橋し、これによりＨｅｒ２陽性ＳＫＯＶ３細胞の殺傷を招く各々の能力を示した。
【０２３３】
Ｃ末端に変異体ＣＤ１９を含む融合タンパク質の活性のさらなるエビデンスを取得するために、変異体ＣＤ１９を抗ＣＤ２０ｍＡｂ  Ｌｅｕ１６由来のｓｃＦｖのＣ末端側に配置した（構築物＃３０２、配列番号１３）。融合タンパク質の良好な分泌が観察された（図２１）。この構築物は、ＣＤ２０でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞に結合して殺傷するその能力についても試験した。図２２は、ＦＭＣ６３−ＰＥにより検出される通り、Ｌｅｕ１６抗ＣＤ２０ｓｃＦｖのＮ末端側に位置する野生型ＣＤ１９  Ｄ１＋Ｄ２を含む融合タンパク質（構築物＃８３、配列番号１４）と比較した、ＣＤ２０に対する構築物＃３０２の結合を示す。図２３は、構築物＃３０２がＣＡＲ１９細胞と架橋し、これによりＣＤ２０陽性２９３Ｔ細胞の殺傷を招く能力を示す。実際、構築物＃３０２は、野生型ＣＤ１９  Ｄ１＋Ｄ２融合タンパク質（構築物＃８３）と比較して、増大した殺傷を示し、これは、図２２に示す改善された結合が殺傷の増大をもたらし得ることを示唆している。
【０２３４】
これらのデータは、Ｃ末端にＣＤ１９変異体を含む融合タンパク質の機能性能力をさらに実証するものである。
【０２３５】
実施例１３．マスクされたＣＤ１９−リガンド融合物の機能
この実施例は、Ｎ末端がマスクされたｓｃＦｖのＣ末端に遺伝子学的に融合したＣＤ１９変異体の活性を評価することにより、ＣＤ１９変異体タンパク質の機能性能力をさらに実証する。公開されている（Ｄｅｓｎｏｙｅｒｓ  ＬＲ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（２０１３））通り、多数のプロテアーゼ（例えば、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベータ、ｕＰＡ）により切断可能なプロテアーゼ基質を含有するセツキシマブ由来の抗ＥＧＦＲｓｃＦｖのマスクされた形態のＣ末端にＣＤ１９変異体を融合した。最初に、マスクされたセツキシマブｓｃＦｖを作製し、試験して、それがプロテアーゼの非存在下ではＥＧＦＲに結合しないが、プロテアーゼ、例えばｕＰＡの活性化後に結合することを確認し、公開されたデータ（示していない）を十分に証明した。次に、マスクされていない（構築物＃３０７及び＃３０８、それぞれ配列番号１５及び１６）並びにマスクされた（構築物＃３０９及び＃３１０、それぞれ配列番号１７及び１８）セツキシマブ−ＣＤ１９構築物を作製した。これらの構築物は、ＦＭＣ６３結合及びＥＬＩＳＡにおけるＨＲＰ−抗Ｈｉｓにより検出され、また図２４に示す通り、マスク又は非マスクにかかわらず、良好に分泌された。
【０２３６】
マスクされた構築物の機能性を実証するために、マスク（構築物＃３０９）及び非マスク（構築物＃３０７）セツキシマブ−ＣＤ１９構築物を、それらがＥＧＦＲ陽性Ｈ２９２細胞の殺傷を架橋する能力について試験した。図２５は、非マスクｓｃＦｖ／セツキシマブ−ＣＤ１９構築物＃３０７が、ＣＡＲＴ１４０（ＣＡＲ１９−Ｔ細胞）によるＥＧＦＲ陽性細胞の殺傷を架橋することができたことを示す。対照的に、マスクｓｃＦｖ／セツキシマブ−ＣＤ１９構築物＃３０９は、ｕＰＡの存在下でのみ有意な殺傷を示した。従って、これは、マスクされた抗原結合タンパク質を含むＣＤ１９変異体Ｃ末端融合物が、安定し且つ機能性であったことを実証する。
【０２３７】
実施例１４．ＣＤ１９−マルチ−リガンド融合物の機能
この実施例は、ＣＤ１９変異体を２つの他のドメイン間に配置することができ、それがＮ又はＣ末端融合物に限定されないことを実証する。特に、この実施例は、２つのｓｃＦｖ間の中央に位置するＣＤ１９変異体の活性を実証する。このコンセプトを検証するために、マスクｓｃＦｖ／セツキシマブ−ＣＤ１９−ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２構築物（構築物＃３５４、配列番号１９）を作製した。図２６は、トランスフェクトされると、構築物＃３５４が良好に分泌されたことを示す。
【０２３８】
実施例１５．抗体軽鎖−ＣＤ１９融合物の機能
次に、抗体の軽鎖に変異体ＣＤ１９を含む融合タンパク質が機能性ｍＡｂ−ＣＤ１９融合タンパク質を産生することができるかどうかを評価した。このコンセプトを２つの融合タンパク質に関して検証した。第１の融合タンパク質の場合、変異体ＣＤ１９をトラスツズマブ抗体の軽鎖のＣ末端側に融合させた（軽鎖−ＣＤ１９融合物：構築物＃３７５、配列番号２０；重鎖：構築物＃３７６、配列番号２１）。第２の融合タンパク質の場合、変異体ＣＤ１９は、リツキシマブ抗体の軽鎖のＣ末端側に融合させた（軽鎖−ＣＤ１９融合物：構築物＃３７７、配列番号２２；重鎖：構築物＃３７８、配列番号２３）。
【０２３９】
トラスツズマブ−ＣＤ１９構築物（＃３７５／３７６）は、トランスフェクトした細胞から容易に分泌され、ＦＭＣ６３−ＰＥ及び抗ヒトＦｃ−ＦＩＴＣによるＦＡＣＳで検出される通り、Ｈｅｒ２陽性ＳＫＯＶ３細胞に強力に結合し（図２７）、ＣＡＲＴ２５４（ＣＡＲ１９Ｔ細胞）によるＨｅｒ２陽性ＳＫＯＶ３細胞の殺傷を強力に架橋した（図２８）。比較のために、野生型ＣＤ１９−ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２構築物を用意した。トラスツズマブ抗体の重鎖にグリコシル化部位を欠失した構築物（以下の実施例１６に記載）も図２８に含まれる。
【０２４０】
また、リツキシマブ−ＣＤ１９構築物（＃３７７／３７８）も、トランスフェクトした細胞から容易に分泌され、ＣＤ２０陽性ＨＥＫ２９３細胞に強力に結合し（図２９）、ＣＤ２０陽性ＨＥＫ２９３細胞の殺傷を強力に架橋した（図３０）。比較のために、Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ−ＣＤ１９構築物（構築物＃３０２、配列番号１３）を加えた。Ｌｅｕ１６ｓｃＦｖ−ＣＤ１９構築物は、約３ｎｍのＫｄを有するのに対し、リツキシマブベースの構築物、すなわち完全リツキシマブｍＡｂは、約１６ｐＭのＫｄを有した。
【０２４１】
実施例１６．アグリコシルｍＡｂ−ＣＤ１９融合物
トラスツズマブ−ＣＤ１９及びリツキシマブ−ＣＤ１９構築物を作製したが、この構築物では、ＣＤ１９変異体を軽鎖のＣ末端に遺伝子学的に融合し、Ｎ２９７Ａ突然変異を重鎖に生成して、単一グリコシル化部位を除去した。アグリコシルトラスツズマブ−ＣＤ１９構築物（軽鎖−ＣＤ１９融合物：構築物＃３７５、配列番号２０；アグリコシル重鎖：構築物＃３９３、配列番号２４）は、野生型トラスツズマブ−ＣＤ１９構築物（軽鎖−ＣＤ１９融合物：構築物＃３７５、配列番号２０；重鎖：構築物＃３７６、配列番号２１）のそれと同等の細胞結合を示した（図３１）。図２８は、野生型及びアグリコシルトラスツズマブ−ＣＤ１９構築物が殺傷について同等のＥＣ５０を有することを実証する。アグリコシルリツキシマブ−ＣＤ１９構築物（軽鎖−ＣＤ１９融合物：構築物＃３７７、配列番号２２；アグリコシル重鎖：構築物＃３９４、配列番号２５）は、野生型リツキシマブ−ＣＤ１９構築物（軽鎖−ＣＤ１９融合物：構築物＃３７７、配列番号２２；重鎖：構築物＃３７８、配列番号２３）と比較して、改善された結合（約２倍）を示した（図３２）。観察された結合の増大を、野生型構築物と比較した、アグリコシルリツキシマブ−ＣＤ１９構築物による細胞殺傷の増大に変換した（図３３）。
【０２４２】
実施例１７．様々なＣＤ１９短縮を含む融合タンパク質
特定のＣＤ１９融合物、例えば構築物＃４２は、最後の１１のアミノ酸が除去された、若干短縮されたＣＤ１９ＥＣＤを含んだ（本明細書では、「Ｄ１＋Ｄ２」又は「Ｄ１＋２」と呼ぶ）。完全長ＣＤ１９ＥＣＤを使用することができるかどうかを評価するために、別の構築物を評価した。具体的には、野生型ＣＤ１９−ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２（「Ｄ１＋Ｄ２」ＣＤ１９を含む構築物＃４２）の活性をＮｓＣＤ１９−ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２（すなわちＣＤ１９ＥＣＤ  Ｎ末端変異体＃２−トラスツズマブｓｃＦｖ；構築物＃３１１；配列番号８）及び短縮型ＮｓＣＤ１９−ｓｃＦｖ／Ｈｅｒ２（すなわちＣＤ１９  Ｄ１＋２Ｎ末端変異体＃２−トラスツズマブｓｃＦｖ；構築物＃３４０；配列番号３１）と比較した。Ｈｅｒ２陽性ＳＫＯＶ３細胞との結合は、ほぼ同じであり（データは示していない）、分泌又は効力に差はなく、且つＨｅｒ２陽性ＳＫＯＶ３細胞の殺傷は同等であった（図３４）。これは、この短縮が、安定なＣＤ１９変異体において同等に有効であることを実証するものである。
【０２４３】
実施例１８．ＶＨＨ  ＣＤ１９融合物
様々なＣＤ１９変異体と、Ｃｌｅｃ１２Ａを認識するラマＶＨＨとの融合タンパク質を作製した。ＶＨＨは、以下の表に示すクローン番号及び配列により表される。
【０２４４】
【表２６】
2021508443.tif 000030
【０２４５】
作製し、試験した融合タンパク質は、構築物＃１８６、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、３２０、３２１、３２３、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３３、３３４、３３５、３３７、３３８及び３５７（それぞれ配列番号５２、３９、４０、４１、４２、４３、４４、２６、４５、２８、４６、４７、２７、４８、４９、５０、５１、３０、２９及び５３）を含んだ。
【０２４６】
構築物＃２８９、２９１、２９２、２９３、３２１及び３３０（Ｎ末端にＣＤ１９変異体＃２を、またＣ末端に様々なＶＨＨを含む）を、Ｕ９３７細胞に結合する能力について試験した。図３５及び３６に示す通り、構築物＃２８９、２９１、２９２及び２９３は、３〜５ｎＭの類似するＥＣ５０でＵ９３７細胞に結合することができた。図３７に示すように、ＣＤ１９−ＶＨＨ１Ｂ１２／Ｃｌｅｃ１２Ａ（構築物＃３２１、配列番号２６）及びＶＨＨ１Ａ１０／Ｃｌｅｃ１２Ａ−ＣＤ１９（構築物＃３３０、配列番号２７）構築物は、いずれも１〜３ｎＭの範囲でＣｌｅｃ１２Ａ発現Ｕ９３７細胞に結合した。
【０２４７】
Ｎ末端にＣＤ１９変異体を、且つＣ末端にＶＨＨを含む様々な構築物又はＣ末端にＣＤ１９変異体を、且つＮ末端にＶＨＨ配列を含む構築物を、２９３Ｔ細胞での発現後に抗ＣＤ１９抗体ＦＭＣ６３に結合する能力についてアッセイした。図３８及び３９は、様々な構築物の力価を示す。これらの構築物は、それらがＣＬＥＣ１２ａに結合する能力についてもアッセイした。結果を図４０及び４１に示す。
【０２４８】
次に、ＣＡＲ−Ｔ２５４細胞によるＣＬＥＣ１２ａ発現Ｕ９３７細胞の殺傷を媒介するその能力について構築物をアッセイした。手短には、１×１０４個のＵ９３７細胞を丸底９６ウェルプレートのウェル内のＲＰＭＩ培地中でインキュベートした。１μｇ／ｍＬ及び２０ｎｇ／ｍＬの構築物を１ウェル当たり２５μＬの総量で添加した。ＣＡＲ−Ｔ２５４細胞を１：１０の比でＵ９３７細胞に添加した。４８時間後、細胞をスピンし、溶解させて、ルシフェラーゼレベルを測定した。図４２は、ルシフェラーゼレベルを示し、図４３は、様々な構築物の殺傷率（％）を示し、これにより、Ｃ末端融合物が、Ｎ末端融合物より効力が高いことがわかる。４つのＣ末端構築物（＃３２７、３３７、３３８及び３３０）並びに１つのＮ末端構築物（＃３２１）について用量殺傷曲線を作成した。手短には、１×１０４個のＵ９３７細胞を丸底９６ウェルプレートのウェル内のＲＰＭＩ培地中でインキュベートした。構築物を１μｇ／ｍＬから１ｎｇ／ｍＬまで１ウェル当たり２５μＬで滴下した。ＣＡＲ−Ｔ２５４細胞（ＣＡＲ１９Ｔ細胞）を１：１０の比でＵ９３７細胞に添加した。４８時間後、細胞をスピンし、溶解させて、ルシフェラーゼレベルを測定した。図４４に示すように、全ての構築物により最大Ｕ９３７細胞殺傷が達成された。図４５に示すように、ＥＣ５０を取得した。
【０２４９】
さらに、二重特異性構築物を作製し、アッセイした。二重特異性構築物は、Ｗｉｅｒｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ７：３２１−３０  （２０１５）に記載される抗ＣＬＥＣ１２ａ  ｓｃＦｖを含んだ。構築物＃１８６は、ＣＤ１９ドメイン１＋２及び抗ＣＬＬ１  ＶＨ及びＶＬドメインを含んだ（Ｗｉｅｒｓｍａ  ｅｔ  ａｌ．により記載される）。構築物＃１８６のＶＨ及びＶＬドメイン、抗ＣＬＥＣ１２ａ  ＶＨＨ（クローン２Ｈ３）及びＣＤ１９変異体＃２を含む二重特異性構築物（構築物＃３５７）を作製した。これらの構築物をＵ９３７細胞との結合についてアッセイした。手短には、Ｕ９３７細胞（５×１０４）をＦｃブロック、スピン、ペレット化し、融合タンパク質（７．５μｇ／ｍＬから出発）の３×段階希釈物１００μＬを添加し、４℃で３０分間インキュベートし、スピンし、２回洗浄して、ペレットに抗ＦＭＣ６３−ＰＥを添加した後、４℃で３０分間インキュベートした。次に、細胞をスピンし、２回洗浄し、固定した後、ＦＡＣＳにより分析した。図４６Ａ及び４６Ｂに示すように、構築物＃３５７の結合ＥＣ５０は、構築物＃３３０（対照）より低く、これは、構築物＃１８６のＥＣ５０より低かった。これらの構築物は、ＣＡＲ−Ｔ２５４細胞によるＣＬＥＣ１２ａ発現Ｕ９３７細胞の殺傷を媒介する能力についてもアッセイした。手短には、１×１０４個のＵ９３７細胞を丸底９６ウェルプレートのウェル内のＲＰＭＩ培地中でインキュベートした。１×１０５個のＣＡＲ−Ｔ２５４細胞を１：１０の比でＵ９３７細胞に添加した。構築物（出発濃度は、最終的に１μｇ／ｍＬ）の３×段階希釈物１００μＬを使用した。４８時間のインキュベーション後、ルシフェラーゼレベルを測定した。図４７Ａ及び４７Ｂに示すように、構築物＃３５７の殺傷ＥＣ５０は、構築物＃１８６又は＃３３０よりはるかに低かった。
【０２５０】
最後に、（ｉ）ＣＤ１９  ＣＡＲ、及び（ｉｉ）構築物＃１８６をコード化したレンチウイルスベクター（構築物＃２２１）を作製した。こうしたレンチウイルスベクターを用いて、ＣＤ１９ＣＡＲを発現し、構築物＃１８６の融合タンパク質を分泌するＣＡＲ  Ｔ細胞を生成した。このようなＴ細胞は、「ＣＡＲ２２１」細胞と呼ばれる。さらに、構築物＃１４２、１７３及び１７４を対照として作製した。図４８に示すように、活性化ＣＡＲ２２１細胞からの構築物＃２２１の発現は低かった。（「ＬＧ１４２」、「ＬＧ２２１」、「ＬＧ１７３」及び「ＬＧ１７４」は、それぞれ同じ構築物＃１４２、２２１、１７３及び１７４であるが、販売者により製造されたものであることに留意されたい）。図４９は、構築物＃２２１及びＬＧ２２１によるＵ９３７及びＮＡＬＭ６細胞の殺傷を実証する。
【０２５１】
実施例１９．ＣＤ１９エピトープ
ＦＭＣ６３及び３Ｂ１０結合の喪失を招いたアミノ酸位置を見出し（前述した系統的突然変異誘発ライブラリを用いて）、これらをＣＤ１９の構造にマッピングした（Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ８６：４９５−５００（２０１８））。両ｍＡｂのエピトープは、重複し、Ｎ末端及びＣ末端から離れており、形質膜に近接している。ＦＭＣ６３エピトープは、直鎖状ではないが、３Ｂ１０エピトープは、ＣＤ１９において直鎖ペプチド配列と直線状に並び、これは、耐熱性である３Ｂ１０エピトープと一致する（実施例２；図３に記載）。このペプチドを酵母ディスプレイにより発現させると、ｍＡｂ  ３Ｂ１０は、良好に結合した。驚くことに、ｍＡｂ  ３Ｂ１０は、酵母上に発現されたＣＤ１９  ＥＣＤとあまりよく結合しなかった。図５０を参照されたい。
【０２５２】
均等物
当業者であれば、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多数の均等物を認識するか、又はルーティンに過ぎない実験を使用して確認することができよう。本発明の範囲は、以上の説明に限定することが意図されるのではなく、以下の特許請求の範囲に記載される。
【０２５３】
配列表
配列番号１
【化３】
2021508443.tif 000031
配列番号２
【化４】
2021508443.tif 000032
構築物アミノ酸配列表
配列番号３
【化５】
2021508443.tif 000033
配列番号４
【化６】
2021508443.tif 000034
配列番号５
【化７】
2021508443.tif 000035
配列番号６
【化８】
2021508443.tif 000036
配列番号７
【化９】
2021508443.tif 000037
配列番号８
【化１０】
2021508443.tif 000038
配列番号９
【化１１】
2021508443.tif 000039
配列番号１０
【化１２】
2021508443.tif 000040
配列番号１１
【化１３】
2021508443.tif 000041
配列番号１２
【化１４】
2021508443.tif 000042
配列番号１３
【化１５】
2021508443.tif 000043
配列番号１４
【化１６】
2021508443.tif 000044
配列番号１５
【化１７】
2021508443.tif 000045
配列番号１６
【化１８】
2021508443.tif 000046
配列番号１７
【化１９】
2021508443.tif 000047
配列番号１８
【化２０】
2021508443.tif 000048
配列番号１９
【化２１】
2021508443.tif 000049
配列番号２０
【化２２】
2021508443.tif 000050
配列番号２１
【化２３】
2021508443.tif 000051
配列番号２２
【化２４】
2021508443.tif 000052
配列番号２３
【化２５】
2021508443.tif 000053
配列番号２４
【化２６】
2021508443.tif 000054
配列番号２５
【化２７】
2021508443.tif 000055
配列番号２６
【化２８】
2021508443.tif 000056
配列番号２７
【化２９】
2021508443.tif 000057
配列番号２８
【化３０】
2021508443.tif 000058
配列番号２９
【化３１】
2021508443.tif 000059
配列番号３０
【化３２】
2021508443.tif 000060
配列番号３１
【化３３】
2021508443.tif 000061
配列番号３２
【化３４】
2021508443.tif 000062
配列番号３３
【化３５】
2021508443.tif 000063
配列番号３４
【化３６】
2021508443.tif 000064
配列番号３５
【化３７】
2021508443.tif 000065
配列番号３６
【化３８】
2021508443.tif 000066
配列番号３７
【化３９】
2021508443.tif 000067
配列番号３８
【化４０】
2021508443.tif 000068
配列番号３９
【化４１】
2021508443.tif 000069
配列番号４０
【化４２】
2021508443.tif 000070
配列番号４１
【化４３】
2021508443.tif 000071
配列番号４２
【化４４】
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配列番号４３
【化４５】
2021508443.tif 000073
配列番号４４
【化４６】
2021508443.tif 000074
配列番号４５
【化４７】
2021508443.tif 000075
配列番号４６
【化４８】
2021508443.tif 000076
配列番号４７
【化４９】
2021508443.tif 000077
配列番号４８
【化５０】
2021508443.tif 000078
配列番号４９
【化５１】
2021508443.tif 000079
配列番号５０
【化５２】
2021508443.tif 000080
配列番号５１
【化５３】
2021508443.tif 000081
配列番号５２
【化５４】
2021508443.tif 000082
配列番号５３
【化５５】
2021508443.tif 000083
配列番号５４
【化５６】
2021508443.tif 000084
配列番号５５
【化５７】
2021508443.tif 000085
配列番号５６
【化５８】
2021508443.tif 000086
配列番号５７
【化５９】
2021508443.tif 000087
構築物ヌクレオチド配列表
配列番号５８
【化６０】
2021508443.tif 000088
配列番号５９
【化６１】
2021508443.tif 000089
配列番号６０
【化６２】
2021508443.tif 000090
配列番号６１
【化６３】
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配列番号６２
【化６４】
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配列番号６３
【化６５】
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配列番号６４
【化６６】
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配列番号６５
【化６７】
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配列番号６６
【化６８】
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配列番号６７
【化６９】
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配列番号６８
【化７０】
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配列番号６９
【化７１】
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配列番号７０
【化７２】
2021508443.tif 000100
配列番号７１
【化７３】
2021508443.tif 000101
配列番号７２
【化７４】
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配列番号７３
【化７５】
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配列番号７４
【化７６】
2021508443.tif 000104
配列番号７５
【化７７】
2021508443.tif 000105
配列番号７６
【化７８】
2021508443.tif 000106
配列番号７７
【化７９】
2021508443.tif 000107
配列番号７８
【化８０】
2021508443.tif 000108
配列番号７９
【化８１】
2021508443.tif 000109
配列番号８０
【化８２】
2021508443.tif 000110
配列番号８１
【化８３】
2021508443.tif 000111
配列番号８２
【化８４】
2021508443.tif 000112
配列番号８３
【化８５】
2021508443.tif 000113
配列番号８４
【化８６】
2021508443.tif 000114
配列番号８５
【化８７】
2021508443.tif 000115
配列番号８６
【化８８】
2021508443.tif 000116
配列番号８７
【化８９】
2021508443.tif 000117
配列番号８８
【化９０】
2021508443.tif 000118
配列番号８９
【化９１】
2021508443.tif 000119
配列番号９０
【化９２】
2021508443.tif 000120
配列番号９１
【化９３】
2021508443.tif 000121
配列番号９２
【化９４】
2021508443.tif 000122
配列番号９３
【化９５】
2021508443.tif 000123
配列番号９４
【化９６】
2021508443.tif 000124
配列番号９５
【化９７】
2021508443.tif 000125
配列番号９６
【化９８】
2021508443.tif 000126
配列番号９７
【化９９】
2021508443.tif 000127
配列番号９８
【化１００】
2021508443.tif 000128
配列番号９９
【化１０１】
2021508443.tif 000129
配列番号１００
【化１０２】
2021508443.tif 000130
配列番号１０１
【化１０３】
2021508443.tif 000131
配列番号１０２
【化１０４】
2021508443.tif 000132
配列番号１０３
【化１０５】
2021508443.tif 000133
配列番号１０４
【化１０６】
2021508443.tif 000134
配列番号１０５
【化１０７】
2021508443.tif 000135
配列番号１０６
【化１０８】
2021508443.tif 000136
配列番号１０７
【化１０９】
2021508443.tif 000137
配列番号１０８
【化１１０】
2021508443.tif 000138
【化１１１】
2021508443.tif 000139
配列番号１０９
【化１１２】
2021508443.tif 000140
【化１１３】
2021508443.tif 000141
配列番号１１０
【化１１４】
2021508443.tif 000142
【化１１５】
2021508443.tif 000143
配列番号１１１
【化１１６】
2021508443.tif 000144
【化１１７】
2021508443.tif 000145
配列番号１１２
【化１１８】
2021508443.tif 000146
【化１１９】
2021508443.tif 000147
【化１２０】
2021508443.tif 000148
ＶＨＨクローン配列
配列番号２０３（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１２１】
2021508443.tif 000149
配列番号２０４（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１２２】
2021508443.tif 000150
配列番号２０５（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１２３】
2021508443.tif 000151
配列番号２０６（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１２４】
2021508443.tif 000152
配列番号２０７（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１２５】
2021508443.tif 000153
配列番号２０８（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１２６】
2021508443.tif 000154
配列番号２０９（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１２７】
2021508443.tif 000155
配列番号２１０（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１２８】
2021508443.tif 000156
配列番号２１１（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１２９】
2021508443.tif 000157
配列番号２１２（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１３０】
2021508443.tif 000158
配列番号２１３（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１３１】
2021508443.tif 000159
配列番号２１４（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１３２】
2021508443.tif 000160
配列番号２１５（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１３３】
2021508443.tif 000161
配列番号２１６（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１３４】
2021508443.tif 000162
配列番号２１７（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１３５】
2021508443.tif 000163
配列番号２１８（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１３６】
2021508443.tif 000164
配列番号２１９（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１３７】
2021508443.tif 000165
配列番号２２０（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１３８】
2021508443.tif 000166
配列番号２２１（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１３９】
2021508443.tif 000167
配列番号２２２（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１４０】
2021508443.tif 000168
配列番号２２３（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１４１】
2021508443.tif 000169
配列番号２２４（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１４２】
2021508443.tif 000170
配列番号２２５（下線は、順にＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３を示し；Ｃ末端の太字の斜体は、（ｉ）９アミノ酸のリンカー（ＴＳＧＰＧＧＱＧＡ）、（ｉｉ）ｍｙｃ−タグ（ＥＱＫＬＩＳＥＥＤＬ）、（ｉｉｉ）２アミノ酸のリンカー（ＧＡ）、（ｉｖ）ヘキサ−ヒスチジンタグ（ＨＨＨＨＨＨ）及び（ｖ）追加の３アミノ酸（ＧＡＳ）を示す）
【化１４３】
2021508443.tif 000171
【図１】
2021508443.tif 000172
【図２】
2021508443.tif 000173
【図３】
2021508443.tif 000174
【図４】
2021508443.tif 000175
【図５】
2021508443.tif 000176
【図６】
2021508443.tif 000177
【図７】
2021508443.tif 000178
【図８】
2021508443.tif 000179
【図９】
2021508443.tif 000180
【図１０】
2021508443.tif 000181
【図１１−１】
2021508443.tif 000182
【図１１−２】
2021508443.tif 000183
【図１２】
2021508443.tif 000184
【図１３】
2021508443.tif 000185
【図１４Ａ−１】
2021508443.tif 000186
【図１４Ａ−２】
2021508443.tif 000187
【図１４Ｂ−１】
2021508443.tif 000188
【図１４Ｂ−２】
2021508443.tif 000189
【図１４Ｃ】
2021508443.tif 000190
【図１４Ｄ】
2021508443.tif 000191
【図１５Ａ】
2021508443.tif 000192
【図１５Ｂ】
2021508443.tif 000193
【図１５Ｃ−１】
2021508443.tif 000194
【図１５Ｃ−２】
2021508443.tif 000195
【図１６】
2021508443.tif 000196
【図１７】
2021508443.tif 000197
【図１８】
2021508443.tif 000198
【図１９】
2021508443.tif 000199
【図２０】
2021508443.tif 000200
【図２１】
2021508443.tif 000201
【図２２】
2021508443.tif 000202
【図２３】
2021508443.tif 000203
【図２４】
2021508443.tif 000204
【図２５】
2021508443.tif 000205
【図２６】
2021508443.tif 000206
【図２７】
2021508443.tif 000207
【図２８】
2021508443.tif 000208
【図２９】
2021508443.tif 000209
【図３０】
2021508443.tif 000210
【図３１】
2021508443.tif 000211
【図３２】
2021508443.tif 000212
【図３３】
2021508443.tif 000213
【図３４】
2021508443.tif 000214
【図３５】
2021508443.tif 000215
【図３６】
2021508443.tif 000216
【図３７】
2021508443.tif 000217
【図３８】
2021508443.tif 000218
【図３９】
2021508443.tif 000219
【図４０】
2021508443.tif 000220
【図４１】
2021508443.tif 000221
【図４２】
2021508443.tif 000222
【図４３】
2021508443.tif 000223
【図４４】
2021508443.tif 000224
【図４５】
2021508443.tif 000225
【図４６Ａ】
2021508443.tif 000226
【図４６Ｂ】
2021508443.tif 000227
【図４７Ａ】
2021508443.tif 000228
【図４７Ｂ】
2021508443.tif 000229
【図４８】
2021508443.tif 000230
【図４９】
2021508443.tif 000231
【図５０】
2021508443.tif 000232
【配列表】
2021508443000001.app
【国際調査報告】
2021508443.tif 000233
2021508443.tif 000234
2021508443.tif 000235