(57)【要約】  本発明は、生成物および組成物およびそれらの使用に関する。特に、本発明は、標的遺伝子発現を妨げる、または標的遺伝子発現を抑制する核酸産物およびこのような産物の治療的使用に関する。【選択図】図１
2021502411.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中の標的遺伝子の発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および前記第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、前記第１の鎖が、前記標的遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、前記第１および／または第２の鎖が、少なくとも２個のヌクレオチドの間にジチオリン酸結合を含む、核酸。
【請求項２】
前記第１の鎖が、５’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのいずれかの間にジチオリン酸結合を含まない、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
前記第１の鎖の３’末端で２，３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間にジチオリン酸結合を含むおよび／または前記第２の鎖の３’末端で２，３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間にジチオリン酸結合および／または前記第２の鎖の５’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間にジチオリン酸結合を含む、請求項１または２に記載の核酸。
【請求項４】
その末端でジチオリン酸結合が存在しない場合に前記第１の鎖上の３個の末端３’ヌクレオチドのそれぞれの間および／または３個の末端５’ヌクレオチドのそれぞれの間に、および／または前記第２の鎖の３個の３’末端ヌクレオチドのそれぞれの間および／または３個の５’ヌクレオチドのそれぞれの間にホスホロチオエート結合を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸。
【請求項５】
前記第１の鎖および第２の鎖が、別々の鎖である、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸。
【請求項６】
前記少なくとも１つの二重鎖領域が、１７〜２５個のヌクレオチド塩基対からなる、請求項１〜５のいずれかに記載の核酸。
【請求項７】
前記第１および／または第２の鎖上の１個または複数のヌクレオチドが、修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成する、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸。
【請求項８】
リガンドに結合される、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸。
【請求項９】
前記リガンドが、（ｉ）１個または複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分またはその誘導体、および（ｉｉ）リンカーを含み、前記リンカーが、少なくとも１個のＧａｌＮＡｃ部分またはその誘導体を前記核酸に結合する、請求項８に記載の核酸。
【請求項１０】
式（Ｉ）：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （Ｉ）
（式中、
Ｓは、サッカライドであり、好ましくは前記サッカライドはＮ−アセチルガラクトサミンであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ｍは１、２、または３であり；
Ｐは、リン酸または修飾リン酸、好ましくは非置換リン酸であり；
Ｘ２は、式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、ｎ＝１〜６であり；
Ａは、分岐ユニットであり、
Ｘ３は、架橋ユニットであり；
請求項１〜７のいずれか１項に記載の核酸が、リン酸または修飾リン酸、好ましくは、非置換リン酸を介してＸ３に結合される）の化合物を含むリガンドに結合される、請求項８または９に記載の核酸。
【請求項１１】
前記第１のＲＮＡ鎖が、式（Ｘ）：
【化１】
2021502411.tif 000101
の化合物であり、式中、ｂは、０または１であり；および
前記第２のＲＮＡ鎖が、式（ＸＩ）：
【化２】
2021502411.tif 000102
；
の化合物であり、式中、
ｃおよびｄは、独立に０または１であり；
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ前記第１および第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
Ｙは、ＯまたはＳ、好ましくはＯであり；
ｎは、０、１、２または３であり；および
Ｌ１は、それにリガンドが結合されるリンカーであり；かつ
ｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である、請求項８〜９のいずれかに記載の核酸。
【請求項１２】
細胞中の標的遺伝子の発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および前記第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、前記第１の鎖が、前記標的遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、
前記第１の鎖の３’末端で２個の末端ヌクレオチド間にジチオリン酸結合を含み、
前記第２の鎖の３’末端で２個の末端ヌクレオチド間におよび５’末端で２個の末端ヌクレオチド間にジチオリン酸結合を含み、
前記第１の鎖が、５’末端での２、３または４個の末端ヌクレオチドの間のジチオリン酸以外の結合を含む、核酸。
【請求項１３】
式（Ｉ）：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （Ｉ）
の化合物を含むリガンドに結合され、式中、
Ｓは、サッカライドであり、好ましくは前記サッカライドはＮ−アセチルガラクトサミンであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ｍは１、２、または３であり；
Ｐは、リン酸または修飾リン酸、好ましくは非置換リン酸であり；
Ｘ２は、式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、ｎ＝１〜６であり；
Ａは、分岐ユニットであり、
Ｘ３は、架橋ユニットであり；
リン酸または修飾リン酸を介してＸ３に結合される、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１４】
リガンドに結合され、前記第１のＲＮＡ鎖が、式（ＸＶ）：
【化３】
2021502411.tif 000103
の化合物であり、式中、ｂは、０または１であり；および
第２のＲＮＡ鎖が、式（ＸＶＩ）：
【化４】
2021502411.tif 000104
の化合物であり、式中、ｃおよびｄは、独立に０または１であり；
式中、
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ前記第１および第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
Ｙは、ＯまたはＳ、好ましくはＯであり；
Ｒ１は、Ｈまたはメチルであり；
ｎは、０、１、２または３であり；および
Ｌは、式（ＸＶ）および（ＸＶＩ）で同じまたは異なりおよび
−（ＣＨ２）ｑ−、ｑ＝２〜１２；
−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、ｒ＝２〜１２；
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、ｓ＝１〜５；
−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｔは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｕ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ（Ｏ）−、ｕは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｖは２〜１２である；
からなる群より選択され；
前記末端Ｃ（Ｏ）は、存在する場合、前記ＮＨ基に結合され；および
ｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である、請求項１２に記載の核酸。
【請求項１５】
前記第１のＲＮＡ鎖が、その５’末端で末端５’（Ｅ）ビニルホスホネートヌクレオチドを有しかつ前記末端５’（Ｅ）ビニルホスホネートヌクレオチドが好ましくは、リン酸ジエステル結合により前記第１の鎖中の前記第２のヌクレオチドに結合される、請求項１２〜１４のいずれかに記載の核酸。
【請求項１６】
前記第１の鎖のヌクレオチドが、奇数ヌクレオチド上で第１の修飾により修飾され、かつ偶数ヌクレオチド上で第２の修飾により修飾され、および前記第２の鎖のヌクレオチドが、奇数ヌクレオチド上で第２の修飾により修飾されかつ偶数ヌクレオチド上で前記第１の修飾により修飾され、前記第１の鎖が、５’から３’へ番号を付され、最も５’側のヌクレオチドが前記第１の鎖の番号１であり、かつ前記第２の鎖が、３’から５’へ番号を付され、最も３’側のヌクレオチドが前記第２の鎖の番号１であり、前記第１の修飾が好ましくは、２’ＯＭｅであり、前記第２の修飾が好ましくは、２’フルオロであり、かつ好ましくは両末端で平滑末端である、請求項１２〜１５のいずれかに記載の核酸。
【請求項１７】
前記第１の鎖の５’末端から位置２および１４でのヌクレオチドが、２’フルオロ修飾により修飾され、および前記第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する前記第２の鎖上のヌクレオチドが、２’フルオロ修飾により修飾され、および好ましくは残りのヌクレオチドが、２’ＯＭｅ修飾により修飾される、請求項１２〜１５のいずれかに記載の核酸。
【請求項１８】
前記第１の鎖の３’末端での前記２つの末端ヌクレオチド間の結合以外の両鎖の前記ヌクレオチド間の結合および前記第２の鎖の３’末端でのおよび５’末端での２つの末端ヌクレオチド間の結合の全てが、非置換リン酸結合である、請求項１２〜１７のいずれかに記載の核酸。
【請求項１９】
薬物としての使用のための、請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸および任意選択で送達ビークルおよび／または生理学的に許容可能な賦形剤および／または担体および／または希釈剤および／または緩衝液および／または保存剤を含む医薬組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸を含みかつ送達ビークル、好ましくは、リポソームおよび／または生理学的に許容可能な賦形剤および／または担体および／または希釈剤をさらに含む医薬組成物。
【請求項２１】
疾患、障害または症候群の予防また治療における請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸または請求項２０に記載の医薬組成物の使用。
【請求項２２】
治療を必要としている個体に請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸を含む組成物または請求項１９〜２０に記載の組成物を投与することを含む疾患、障害または症候群を予防または治療する方法であって、好ましくは前記核酸または組成物が、皮下に、静脈内にまたは経口、直腸または腹腔内経路などのいずれか他の適用経路を用いて前記対象に投与される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生成物および組成物およびそれらの使用に関する。特に、本発明は、標的遺伝子発現を妨げる、または標的遺伝子発現を抑制する核酸産物およびこのような産物の使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
発現したｍＲＮＡに相補的に結合できる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれている機序により遺伝子発現を阻止できることが示されている（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａｌ，１９９８およびＥｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ，２００１）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的、転写後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能を研究するための有用なツールとなってきた。ＲＮＡｉは、配列特異的多成分ヌクレアーゼであるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に組み込まれたサイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを破壊するＲＩＳＣ複合体により媒介される。ｓｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、およびミクロＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ（ｉＲＮＡ）は、遺伝子サイレンシング、すなわち、ｍＲＮＡ分子の分解によりタンパク質の遺伝子翻訳を抑制することにより、タンパク質の形成を妨げるオリゴヌクレオチドである。遺伝子サイレンシング剤は、医学における治療用途のためにますます重要になってきている。
【０００３】
ＷａｔｔｓおよびＣｏｒｅｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１２；Ｖｏｌ  ２２６，ｐ３６５−３７９）によると、核酸の設計に使用できるアルゴリズムは存在するが、完全なものは存在しない。アルゴリズムがＲＮＡ結合タンパク質の三次構造またはその関与などの因子を考慮していないために、効力の高いｓｉＲＮＡを特定するために、様々な実験方法を採用し得る。従って、最小のオフターゲット効果を有する効力の高い核酸を見つけることは、複雑なプロセスになる。これらの高度荷電分子の医薬品開発のために、それらが経済的に合成され、標的組織に送達され、細胞に入り、毒性の許容可能な制限内で機能できることが必要である。
【０００４】
しかし、一方で効力および標的特異性を維持しながら、細胞ヌクレアーゼによる分解を回避してＲＮＡなどの核酸を細胞へ送達することは、治療的使用のための核酸分子の開発の分野の研究者にとって難易度が高いことが明らかになった。
【０００５】
従って、オリゴヌクレオチド、特に二本鎖核酸ｓｉＲＮＡの効率的インビボ送達手段はますます重要になっており、特異的標的化および細胞外環境、特に血清タンパク質からの実質的な保護が必要である。特異的標的化を達成する１つの方法は、ターゲティング部分をｉＲＮＡ二本鎖薬剤に結合させることである。ターゲティング部分は、ｉＲＮＡ二本鎖薬剤を所定の標的部位に標的化するのを支援し、エンドサイトーシスによりなどの、細胞により取り込まれるべき結合された分子のための目的の受容体部位に対する適切なターゲティング部分を設計する必要がある。
【０００６】
しかし、これまでに開発された標的化リガンドは、必ずしもインビボ環境に通用するとは限らず、オリゴヌクレオチド治療薬、核酸および二本鎖ｓｉＲＮＡのインビボ送達のための、より効果的な、受容体特異的リガンド結合ｉＲＮＡ二本鎖薬剤およびそれらの作製方法の必要性が明らかである。
【０００７】
本発明は、送達システムのみではなく、核酸それ自体の構造に対処する。意外にも、本発明による核酸が高い安定性を有し、それが細胞中に入る前の核酸の分解を防止することが明らかになった。
【発明の概要】
【０００８】
本発明は、細胞中の標的遺伝子の発現を抑制するための核酸を提供し、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、前記第１の鎖が上記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第１および／または第２の鎖が少なくとも２個のヌクレオチドの間にジチオリン酸結合を含む。第１の鎖は、５’末端の２、３または４個の末端ヌクレオチドのいずれかの間にジチオリン酸結合を含み得ない。
【０００９】
第１および／または第２の鎖は、少なくとも２個の末端３’ヌクレオチド間のジチオリン酸結合を含み得、および／または第２の鎖は、少なくとも２個の末端５’ヌクレオチド間のジチオリン酸結合を含み得る。
【００１０】
核酸は、第１の鎖の３’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間のジチオリン酸結合を含み得る。核酸は、第２の鎖の３’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間のジチオリン酸結合を含み得る。核酸は、第２の鎖の５’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間にホスホロチオエートまたはジチオリン酸結合を含み得る。
【００１１】
本発明の核酸はまた、その末端でホスホロチオエート結合がない場合、第１の鎖上の３個の末端３’ヌクレオチドのそれぞれの間および／または３個の末端５’ヌクレオチドのそれぞれの間に、および／または第２の鎖の３個の末端３’ヌクレオチドのそれぞれの間および／または３個の末端５’ヌクレオチドのそれぞれの間にホスホロチオエート結合を含む。
【００１２】
核酸の第１の鎖および第２の鎖は、別々の鎖であり得る。核酸は、第１の鎖および第２の鎖を含む一本鎖を含み得る。
【００１３】
第１の鎖および／または前記第２の鎖はそれぞれ、１７〜３５個のヌクレオチド長であり、少なくとも１つの二重鎖領域は、１７〜２５個のヌクレオチド塩基対からなり得る。
【００１４】
核酸は、ａ）両端で平滑末端であり得る；ｂ）一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し得る；またはｃ）両端でオーバーハングを有し得る。
【００１５】
第１および／または第２の鎖上の１個または複数のヌクレオチドが修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成し得る。第１の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得る。第１の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが少なくとも第２の修飾により修飾され得、少なくとも第２の修飾は、１個または複数の奇数のヌクレオチド上の修飾とは異なる。１個または複数の修飾偶数ヌクレオチドの内の少なくとも１個は、１個または複数の修飾奇数ヌクレオチドの少なくとも１個に隣接し得る。
【００１６】
本発明の核酸では、複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得る。複数の偶数ヌクレオチドが第２の修飾により修飾され得る。第１の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得る。第１の鎖は、第２の異なる修飾により修飾された隣接するヌクレオチドも含み得る。
【００１７】
第２の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドは、第１の鎖の奇数ヌクレオチド上の修飾とは異なる修飾により修飾され得る、および／または第２の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドは、第１の鎖の奇数ヌクレオチド上の同じ修飾により修飾され得る。第２の鎖の１個または複数の修飾偶数ヌクレオチドの内の少なくとも１個は、１個または複数の修飾奇数ヌクレオチドに隣接し得る。第２の鎖の複数の奇数ヌクレオチドは、共通の修飾により修飾され得る、および／または複数の偶数ヌクレオチドは、第１の鎖の奇数ヌクレオチド上に存在する同じ修飾により修飾され得る。複数の奇数ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得、第２の修飾は、第１の鎖の奇数ヌクレオチド上の修飾とは異なる。
【００１８】
第２の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得、これは、第１の鎖の奇数ヌクレオチド上の修飾とは異なる第２の修飾であり得る。
【００１９】
本発明の核酸では、第１の鎖中のそれぞれの奇数ヌクレオチドおよび第２の鎖中のそれぞれの偶数ヌクレオチドは、共通の修飾により修飾され得、それぞれの偶数ヌクレオチドは、第２の修飾を有する第１の鎖中で修飾され得、それぞれの奇数ヌクレオチドは、第２の修飾を有する第２の鎖中で修飾され得る。
【００２０】
本発明の核酸は、第２の鎖の非修飾または異なって修飾されたヌクレオチドに対して、少なくとも１個のヌクレオチドだけシフトされた第１の鎖の修飾ヌクレオチドを有し得る。
【００２１】
第１の鎖は配列番号１の配列を含み得、および／または第２の鎖は配列番号２の配列を含み得る。
【００２２】
修飾（単数または複数）はそれぞれ独立に、３’−末端デオキシチミン、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ修飾、２’−アミノ修飾、２’−アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホラミデート修飾、５’−ホスホロチオエート基修飾、５’−リン酸または５’−リン酸模倣物修飾およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群より選択され得、および／または修飾ヌクレオチドは、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチドまたは非天然塩基含有ヌクレオチドのいずれか１個であり得る。少なくとも１つの修飾は、２’−Ｏ−メチルであり得、および／または少なくとも１つの修飾は２’−Ｆであり得る。
【００２３】
本発明の核酸は、リガンドと結合され得る。
【００２４】
本発明の核酸は、同じまたは異なる末端または鎖でのホスホロチオエート結合に加えて、第１および／または第２の鎖の末端の１、２または３個の３’ヌクレオチド間および／または５’ヌクレオチド間のジチオリン酸結合を含み得る。
【００２５】
本発明は、第２の態様として、細胞中の標的遺伝子の発現を抑制するための核酸を提供し、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖が上記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第１および／または第２の鎖が少なくとも２個の末端３’ヌクレオチドの間のジチオリン酸結合を含みおよび／または第２の鎖が少なくとも２個の末端５’ヌクレオチドの間のジチオリン酸結合を含み、核酸分子がリガンドに結合される。
【００２６】
従って、本発明で使用するためのリガンドは、（ｉ）１個または複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分およびその誘導体、および（ｉｉ）リンカーを含み得、リンカーは、ＧａｌＮＡｃ部分を前出のいずれかの態様で定義の配列に結合する。リンカーは、二価または三価または四価の分岐構造体であり得る。ヌクレオチドは、本明細書で定義のように修飾され得る。
リガンドは、式Ｉ：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （Ｉ）
を含み、式中：
Ｓはサッカライドであり、サッカライドはＮ−アセチルガラクトサミンであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ｍは１、２、または３であり；
Ｐは、リン酸または修飾リン酸（好ましくはチオリン酸）であり；
Ｘ２は、式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、ｎ＝１〜６であり；
Ａは、分岐ユニットであり、
Ｘ３は、架橋ユニットであり；
本発明による核酸は、リン酸または修飾リン酸（好ましくはチオリン酸）を介してＸ３に結合される。
【００２７】
従って、本発明は、次記の内の１つの構造を有する複合化核酸をさらに提供する。
【化１】
2021502411.tif 000003
2021502411.tif 000004
2021502411.tif 000005
2021502411.tif 000006
2021502411.tif 000007
式中、Ｚは、本明細書で定義の核酸である。
【００２８】
リガンドは、下記を含み得る。
【化２】
2021502411.tif 000008
【００２９】
本発明はまた、本明細書で定義の核酸または複合化核酸および１種または複数の生理学的に許容可能な賦形剤を含む組成物も提供する。
賦形剤は下記であり得る。
ｉ）カチオン性脂質、または薬学的に許容可能なその塩；
ｉｉ）ステロイド；
ｉｉｉ）ホスファチジルエタノールアミンリン脂質；
ｉｖ）ペグ化脂質。
【００３０】
組成物中のカチオン性脂質成分の含量は、脂質配合物の全脂質含量の約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、好ましくは脂質組成物の全脂質含量の約５９ｍｏｌ％であり得る。
組成物は；
次の構造を有するカチオン性脂質；
【化３】
2021502411.tif 000009
次の構造を有するステロイド；
【化４】
2021502411.tif 000010
次の構造を有するホスファチジルエタノールアミンリン脂質；
【化５】
2021502411.tif 000011
および次の構造を有するペグ化脂質；
【化６】
2021502411.tif 000012
を含み得る。
【００３１】
疾患または障害の治療または予防、および／または疾患または障害の治療または予防のための薬物の製造に使用するための本発明のいずれかの態様による核酸または複合化核酸も提供される。
【００３２】
本発明は、疾患または障害の治療または予防方法を提供し、方法は、本発明のいずれかの態様による核酸または複合化核酸を含む組成物を、治療を必要としている個体に投与することを含む。核酸または複合化核酸は、皮下に、静脈内にまたは経口、直腸または腹腔内などの任意の他の適用経路を用いて投与され得る。
【００３３】
本発明による核酸または複合化核酸の作製方法も同様に含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
本発明は、発現した標的遺伝子のＲＮＡ転写物に向けられた二本鎖核酸、およびその組成物に関する。これらの核酸は、標的遺伝子産物発現の低減が望ましい種々の疾患および障害の治療に使用できる。
【００３５】
本発明の第１の態様は、細胞中の標的遺伝子の発現を抑制するための核酸に関し、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖が抑制されるべき上記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第１および／または第２の鎖が少なくとも２個のヌクレオチドの間にジチオリン酸結合を含む。
【００３６】
任意選択で、第１および／または第２の鎖は、少なくとも２個の末端３’ヌクレオチド間のジチオリン酸結合を含み得、および／または第２の鎖は、少なくとも２個の末端５’ヌクレオチド間のジチオリン酸結合を含み得る。
【００３７】
任意選択で、第１の鎖は、５’末端での２、３または４個の末端ヌクレオチドのいずれかの間のジチオリン酸を含まず、換言すれば、それは、５’末端での２、３または４個の末端ヌクレオチドのいずれかの間のジチオリン酸結合以外の結合を含む。
【００３８】
関連の態様は、細胞中の標的遺伝子の発現を抑制するための核酸であり、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖が上記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部と少なくとも部分的に相補的であり、核酸が第１の鎖の３’末端での２個の末端ヌクレオチド間にジチオリン酸結合を含み、核酸が第２の鎖の２つの３’末端での末端ヌクレオチド間および５’末端での２個の末端ヌクレオチド間にジチオリン酸結合を含み、第１の鎖が２、３または４個の５’末端での末端ヌクレオチド間のジチオリン酸以外の結合を含む。好ましくは、ジチオリン酸以外のこの結合は、リン酸またはホスホロチオエートであり、より好ましくは、（非置換）リン酸である。好ましくは、第１の鎖の３’末端での２個の末端ヌクレオチド間の結合および第２の鎖の３’末端および５’末端での２個の末端ヌクレオチド間の結合以外の両鎖のヌクレオチド間の全ての結合は、非置換リン酸結合である。
【００３９】
核酸とは、ヌクレオチドを含む２つの鎖を含み、遺伝子発現を妨げることができる核酸を意味する。抑制は、完全でも、または部分的でもよく、標的化方式で遺伝子発現の下方調節をもたらす。核酸は、２つの別々のポリヌクレオチド鎖を含み、第１の鎖はガイド鎖でもあり、第２の鎖はパッセンジャー鎖でもあり得る。第１の鎖および第２の鎖は、自己相補的である同じポリヌクレオチド分子の一部であり折り重なって二本鎖分子を形成し得る。核酸はｓｉＲＮＡ分子であり得る。
【００４０】
核酸は、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはヌクレオチド類似体を含み得る。核酸は、二本鎖核酸部分または第１の鎖（当該技術分野においてガイド鎖としても既知である）の全部または一部および第２の鎖（当該技術分野においてパッセンジャー鎖としても既知である）の全部または一部により形成された二重鎖領域をさらに含む。二重鎖領域は、第１の鎖と第２の鎖との間で形成された最初の塩基対で始まり、第１の鎖と第２の鎖との間で形成された最後の塩基対で終わるもの（両端含む）として定義される。
【００４１】
二重鎖領域とは、ワトソン・クリック塩基対形成、または相補的なまたは実質的に相補的なオリゴヌクレオチド鎖間で二本鎖の形成を可能にする任意の他の方式により相互に塩基対を形成する２つの相補的なまたは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドにおける領域を意味する。例えば、２１個のヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、２１個のヌクレオチド単位の別のオリゴヌクレオチドと塩基対を形成でき、しかも、各鎖の１９個のヌクレオチドのみが相補的または実質的に相補的であり、そのため、「二重鎖領域」は１９個の塩基対からなる。残りの塩基対は、５’および３’オーバーハングとして、または一本鎖領域として存在し得る。さらに、二重鎖領域内で、１００％相補性は必要でなく、二重鎖領域内で実質的相補性が許容可能である。実質的相補性は、生物学的条件下でアニーリングできるような鎖間での相補性を意味する。２つの鎖が生物学的条件下でアニーリング可能かどうかを実験的に判定する技術は、当該技術分野において周知である。あるいは、２つの鎖を合成し、生物学的条件下で一緒に添加して、それらが相互にアニールするかどうかを判定することができる。
【００４２】
少なくとも１つの二重鎖領域を形成する第１の鎖および第２の鎖の一部は、完全に相補的であり得、および少なくとも部分的に相互に相補的である。
【００４３】
核酸の長さによっては、第１の鎖と第２の鎖との間の塩基相補性の観点からの完全一致は必ずしも必要ない。しかし、第１と第２の鎖は、生理的状態下でハイブリダイズできなければならない。
【００４４】
少なくとも１つの二重鎖領域における第１の鎖と第２の鎖との間の相補性は、両方の鎖でヌクレオチドミスマッチまたは付加／欠失ヌクレオチドが存在しないという点で、完全であり得る。あるいは、相補性は完全でなくてもよい。相補性は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％であり得る。
【００４５】
第１の鎖および第２の鎖は、それぞれ、少なくとも１５個の近接ヌクレオチドを含む相補性領域を含み得る。
【００４６】
核酸は、第１の鎖の全てまたは一部と標的核酸の一部との間で二重鎖領域の形成を含む。第１の鎖と標的配列との間で形成された最初の塩基対で始まり、第１の鎖と標的配列との間で形成された最後の塩基対で終わるもの（両端含む）として定義される第１の鎖と二重鎖領域を形成する標的核酸の一部は、標的核酸配列、すなわち単純に、標的配列である。第１の鎖と第２の鎖との間で形成された二重鎖領域は、第１の鎖と標的配列との間で形成された二重鎖領域と同じである必要はない。すなわち、第２の鎖は、標的配列とは異なる配列を有し得る；しかし、第１の鎖は、第２の鎖および標的配列の両方と二本鎖構造を形成できる必要がある。
【００４７】
第１の鎖と標的配列との間の相補性は、完全であり得る（両方の核酸のヌクレオチドミスマッチまたは付加／欠失ヌクレオチドがない）。
【００４８】
第１の鎖と標的配列との間の相補性は、完全でなくてもよい。相補性は、約７０％〜約１００％であり得る。より具体的には、相補性は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％、またはこれらの中間値であり得る。
【００４９】
第１の鎖と標的配列の相補的配列との間の同一性は、約７５％〜約１００％である。より具体的には、核酸が標的遺伝子の発現を低減または抑制できる限りにおいて、相補性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、またはこれらの中間値であり得る。
【００５０】
第１の鎖と標的配列との間の１００％未満の相補性を有する核酸は、第１の鎖と標的配列との間で完全な相補性を有する核酸と同じレベルに標的遺伝子の発現を低減できる可能性がある。あるいは、それは、標的遺伝子の発現を、完全な相補性を有する核酸により達成される発現レベルの２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％のレベルまで低減できる可能性がある。
【００５１】
さらなる態様では、本明細書に記載の核酸は、核酸であってもよい抑制剤の非存在下で観察されるレベルに比べて、細胞中の標的遺伝子発現を少なくとも１０％低減し得る。いずれかの前出の態様の全ての好ましい特徴はまた、この態様にも適用される。特に、細胞中の標的遺伝子の発現は、抑制剤（核酸であってもよい）の非存在下で観察されるレベルに比べて、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％またはそれ未満に低減され得る。
【００５２】
核酸は、それぞれ１９〜２５ヌクレオチド長さの第１の鎖および第２の鎖を含み得る。第１の鎖および第２の鎖は、異なる長さであり得る。
【００５３】
核酸は、１５〜２５ヌクレオチド対長さであり得る。核酸は、１７〜２３ヌクレオチド対長さであり得る。核酸は、１７〜２５ヌクレオチド対長さであり得る。核酸は、２３〜２４ヌクレオチド対長さであり得る。核酸は、１９〜２１ヌクレオチド対長さであり得る。核酸は、２１〜２３ヌクレオチド対長さであり得る。
【００５４】
核酸は、１９〜２５ヌクレオチド塩基対からなる二重鎖領域を含み得る。二重鎖領域は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基対からなり得、これは近接していてよい。
【００５５】
好ましくは、核酸はＲＮＡ干渉を媒介する。
【００５６】
さらなる態様では、記載されているように、核酸または複合化核酸は、核酸または複合化核酸の非存在下で観察される発現に比べて、その標的転写物の発現を少なくとも１５％低減し得る。いずれかの前出の態様の全ての好ましい特徴はまた、この態様にも適用される。特に、標的転写物の発現は、核酸もしくは複合化核酸の非存在下でまたは非サイレンシング対照の存在下で観察される発現よりも、少なくとも９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％もしくは１５％以下に、またはこれら未満に低減され得る。
【００５７】
本発明の核酸におけるジチオリン酸結合の使用は、キラル中心を有しどの非結合酸素が硫黄と置換されるかを制御できないホスホロチオエート結合に起因する、核酸分子集団の立体化学の変動を低減する。ジチオリン酸の使用は、その結合にキラル中心が存在しないことを確実にし、それにより、核酸分子中で使用されるジチオリンおよびホスホロチオエートの数に応じて、核酸分子集団中の全ての変動を低減または除去する。
【００５８】
さらに、理論に束縛されるものではないが、単一のジチオリン酸結合を２つのホスホロチオエート結合の代わりに使用でき、従って、本発明の核酸中の「非天然の」結合の数を減らすことができる。
【００５９】
核酸は、第１の鎖の３’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間のジチオリン酸結合を含み得る。核酸は、第２の鎖の３’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間のジチオリン酸結合を含み得る。核酸は、第２の鎖の５’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間にホスホロチオエートまたはジチオリン酸結合を含み得る。
【００６０】
本発明の核酸はまた、その末端にジチオリン酸結合が存在しない場合に第１の鎖上の３個の末端３’ヌクレオチドのそれぞれの間、および／または３個の末端５’ヌクレオチドのそれぞれの間、および第２の鎖の３個の３’末端ヌクレオチドのそれぞれの間および／または３個の５’末端ヌクレオチドのそれぞれの間にホスホロチオエート結合を含み得る。
【００６１】
本発明の核酸は、ホスホロチオエートおよびジチオリン酸結合の混合物を含み得、その事例は本明細書で提示される。本発明の核酸は、第１の鎖および第２の鎖のそれぞれの３’末端でジチオリン酸を含み得る。
【００６２】
核酸は、両端で平滑末端であり得る；一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し得る；または両端でオーバーハングを有し得る。
【００６３】
本明細書で使用される場合、「オーバーハング」は、当該技術分野において標準的なおよび通例の意味、すなわち、二本鎖核酸の相補鎖の末端ヌクレオチドを超えて伸びる核酸の一本鎖部分の意味を有する用語の「平滑末端」は、二本鎖核酸を含み、それにより、末端ヌクレオチドが塩基対であるかどうかに関係なく、両鎖が同じ位置で終わる。平滑末端にある第１の鎖および第２の鎖の末端ヌクレオチドは、塩基対であり得る。平滑末端にある第１の鎖および第２の鎖の末端ヌクレオチドは、対でない場合がある。平滑末端にある第１の鎖および第２の鎖の２個の末端ヌクレオチドは、塩基対であり得る。平滑末端にある第１の鎖および第２の鎖の末端の２つのヌクレオチドは、対でない場合がある。
【００６４】
本明細書で使用される場合、「非置換リン酸」は、天然に、例えば、天然のＤＮＡまたはＲＮＡ分子中で、２個のヌクレオチド間で通常認められる通常のリン酸を意味する。このようなリン酸は、本明細書では、単に「リン酸」、「非置換リン酸」または「リン酸ジエステル」と呼ばれる。
【００６５】
核酸は、一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し得る。核酸は、一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し得る。核酸は、両端で平滑末端であり得る。核酸は、第１の鎖の５’−末端および第２の鎖３’−末端を有する末端で、または第１の鎖の３’−末端および第２の鎖の５’−末端を有する末端で、平滑末端であり得る。
【００６６】
核酸は、３’−または５’−末端でオーバーハングを含み得る。核酸は、第１の鎖で３’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第２の鎖で３’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖で５’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第２の鎖で５’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖の５’−末端および３’−末端の両方でオーバーハングを有し得る。核酸は、第２の鎖の５’−末端および３’−末端の両方でオーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖で５’オーバーハングを有し、第２の鎖で３’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖で３’オーバーハングを有し、第２の鎖で５’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖で３’オーバーハングを有し、第２の鎖で３’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖で５’オーバーハングを有し、第２の鎖で５’−オーバーハングを有し得る。
【００６７】
第２の鎖または第１の鎖の３’−末端または５’−末端でのオーバーハングは、１、２、３、４および５個のヌクレオチド長さから選択され得る。任意選択で、オーバーハングは、１または２個のヌクレオチドからなり得、これは、修飾されてもまたは修飾されなくてもよい。
【００６８】
非修飾ポリヌクレオチド、特に、リボヌクレオチドは、細胞ヌクレアーゼにより分解される傾向があり得、従って、修飾／修飾ヌクレオチドは、本発明の核酸に含まれ得る。このような修飾は、ヌクレアーゼに対してそれらをより高い耐性にすることにより核酸を安定化させるのを助け得る。この向上した耐性は、ＲＮＡ干渉の媒介で核酸をより長い期間にわたり活性化させ、核酸が治療に使用される場合に特に望ましい。
【００６９】
本発明の核酸の第２および／または第１の鎖上の１個または複数のヌクレオチドは修飾され得る。
【００７０】
本発明の核酸の修飾は通常、限定されないが、インビトロおよびインビボ安定性および天然ＲＮＡ分子に対する固有のバイオアベイラビリティを含む潜在的制約を克服するために強力なツールを提供する。本発明による核酸は、化学修飾により修飾され得る。修飾核酸はまた、ヒトでのインターフェロン活性を誘導する可能性を最小限にできる。修飾は、標的細胞に対する核酸の機能的送達をさらに高め得る。本発明の修飾核酸は、第１の鎖または第２の鎖の一方または両方の１個または複数の化学修飾リボヌクレオチドを含み得る。リボヌクレオチドは、塩基、糖またはリン酸部分の化学修飾を含み得る。リボ核酸は、核酸または塩基の類似体による置換または挿入により修飾され得る。
【００７１】
本発明の１個または複数のオリゴヌクレオチドは、修飾され得る。核酸は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドは、第１の鎖上に存在し得る。修飾ヌクレオチドは、第２の鎖中に存在し得る。修飾ヌクレオチドは、二重鎖領域中に存在し得る。修飾ヌクレオチドは、二重鎖領域の外側、すなわち、一本鎖領域に存在し得る。修飾ヌクレオチドは、第１の鎖上に存在し得、二重鎖領域の外側に存在し得る。修飾ヌクレオチドは、第２の鎖上に存在し得、二重鎖領域の外側に存在し得る。第１の鎖の３’−末端ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。第２の鎖の３’−末端ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。第１の鎖の５’−末端ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。第２の鎖の５’−末端ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。
【００７２】
本発明の核酸は、１個の修飾ヌクレオチドを有し得、または本発明の核酸は約２〜４個の修飾ヌクレオチドを有し得、または核酸は約４〜６個の修飾ヌクレオチド、約６〜８個の修飾ヌクレオチド、約８〜１０個の修飾ヌクレオチド、約１０〜１２個の修飾ヌクレオチド、約１２〜１４個の修飾ヌクレオチド、約１４〜１６個の修飾ヌクレオチド、約１６〜１８個の修飾ヌクレオチド、約１８〜２０個の修飾ヌクレオチド、約２０〜２２個の修飾ヌクレオチド、約２２〜２４個の修飾ヌクレオチド、２４〜２６個の修飾ヌクレオチドまたは約２６〜２８個の修飾ヌクレオチドを有し得る。
【００７３】
それぞれの場合で、上記修飾ヌクレオチドを含む核酸は、上記修飾ヌクレオチドを含まない同じ核酸と比較して、少なくとも５０％のその活性を保持する。核酸は、上記修飾ヌクレオチドを含まない同じ核酸と比較して、その活性の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％または中間値を保持し、または上記修飾ヌクレオチドを含まない同じヌクレオチドの１００％を超える活性を有し得る。
【００７４】
修飾ヌクレオチドは、プリンまたはピリミジンであり得る。少なくとも半分のプリンが修飾され得る。少なくとも半分のピリミジンが修飾され得る。全てのプリンが修飾され得る。全てのピリミジンが修飾され得る。修飾ヌクレオチドは、３’−末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、非天然塩基含有ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基含有ヌクレオチド、ヌクレオチド、５’−リン酸または５’−リン酸模倣物を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合した末端ヌクレオチドからなる群より選択され得る。
【００７５】
核酸は、修飾ヌクレオチドを含むヌクレオチドを含み得、塩基は、２−アミノアデノシン、２，６−ジアミノプリン、イノシン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、キューオシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、ワイブトシン、ウィブトキソシン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクェオシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、３−メチルシチジン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、ベータ−Ｄ−マンノシルクェオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸および２−チオシチジンから選択される。塩基は、２，６−ジアミノプリンリボシド、ピリジン−４−オンリボシド、ピリジン−２−オンリボシド、フェニルリボシド、２，４，６−トリメトキシベンゼンリボシド、アミノフェニルリボシド、６−アザピリミジンリボシド、プロピンリボシドであり得る。
【００７６】
本明細書で考察の核酸には、非修飾ＲＮＡならびに修飾されて効力が向上したＲＮＡ、およびヌクレオシド代用物のポリマーが挙げられる。非修飾ＲＮＡは、核酸の成分、すなわち、糖類、塩基、およびリン酸部分が、天然で生ずるもの、例えば、人体中で天然に生じるものと同じまたは実質的に同じである。本明細書で使用される場合、修飾ヌクレオチドは、１個または複数のヌクレオチドの成分、すなわち、糖類、塩基およびリン酸部分が、天然で生じるものとは異なるヌクレオチドを意味する。それらは、無論、意図する修飾のために、修飾ヌクレオチドと呼ばれるが、ヌクレオチドではない分子、例えば、リボリン酸骨格が鎖間でハイブリダイゼーションを可能とする、すなわち、修飾ヌクレオチドがリボリン酸骨格を模倣する、非リボリン酸構築物で置換されているポリヌクレオチド分子も含む。
【００７７】
核酸内で生じる以下に記載の多くの修飾は、塩基、もしくはリン酸部分、またはリン酸部分の非結合Ｏの修飾のように、ポリヌクレオチド分子内で反復されるであろう。いくつかの事例では、修飾は、ポリヌクレオチド中の全ての可能な位置／ヌクレオチドで生じるであろうが、多くの場合、そうはならないであろう。修飾は、３’または５’末端位置でのみ生じ得、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４、５、または１０個のヌクレオチド中などの末端領域でのみ生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方で生じ得る。修飾は、本発明の核酸の二本鎖領域中でのみ生じ得るか、または本発明の核酸の一本鎖領域中でのみ生じ得る。非結合Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端でのみ生じ得、末端領域中、例えば、末端ヌクレオチド上の位置または鎖の最後の２、３、４または５個のヌクレオチド中でのみ生じ得、または二本鎖中、および／または一本鎖領域、特に末端で生じ得る。５’末端または３’末端はリン酸化され得る。
【００７８】
本発明の核酸の安定性は、オーバーハング中に、または修飾ヌクレオチドを含むことにより一本鎖オーバーハング中に、例えば、５’または３’オーバーハング中、または両方中に、特定の塩基を含むことにより、高め得る。プリンヌクレオチドは、オーバーハング中に含め得る。３’または５’オーバーハング中の全てのまたはいくつかの塩基が修飾され得る。修飾は、リボース糖の２’ＯＨ基での修飾の使用、リボヌクレオチドではなくデオキシリボヌクレオチドの使用、およびホスホロチオエート修飾などのリン酸基中の修飾の使用を含むことができる。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【００７９】
本発明のｄｓＲＮＡ薬剤のセンス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖での５’−または３’−オーバーハングは、リン酸化され得る。いくつかの実施形態では、オーバーハング領域は、２個のヌクレオチドの間にホスホロチオエートを有する２個のヌクレオチドを含むみ、２個のヌクレオチドは同じであるかまたは異なり得る。一実施形態では、オーバーハングは、センス鎖、アンチセンス鎖または両方の鎖の３’−末端に存在する。一実施形態では、この３’−オーバーハングは、アンチセンス鎖中に存在する。一実施形態では、この３’−オーバーハングは、センス鎖中に存在する。
【００８０】
ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解できる。しかし、核酸に対する化学修飾は、改善された特性を付与でき、ヌクレアーゼに対するより高い安定性をオリゴリボヌクレオチドに付与できる。
【００８１】
本明細書で使用される場合、修飾核酸は、下記の１種または複数を含むことができる。
（ｉ）変化、例えば、一方または両方の非結合リン酸酸素および／または１個または複数の結合リン酸酸素（本発明の核酸５’および３’末端であっても、結合と見なされる）の置換；
（ｉｉ）変化、例えば、リボース糖の成分の置換、例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルの置換；
（ｉｉｉ）リン酸部分の「デホスホ」リンカーによる置換；
（ｉｖ）天然塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボースリン酸骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）ＲＮＡの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換または部分の結合、例えば、蛍光標識部分のＲＮＡの３’または５’末端への結合。
【００８２】
用語の置換、修飾、変化は、天然の分子からの差異を示す。
特定の修飾については、以降でさらに詳細に考察する。
【００８３】
修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレン酸、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが含まれる。ジチオリン酸は、硫黄により置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸基中の１つ、それぞれまたは両方の非結合酸素は、独立に、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリール）の内のいずれか１つであり得る。
【００８４】
リン酸リンカーはまた、結合酸素の窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホネート）による置換により修飾できる。置換は、末端酸素で生じ得る。非結合酸素の窒素による置換が可能である。
【００８５】
修飾ヌクレオチドは、糖基の修飾を含み得る。２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換できる。
【００８６】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例には次記が挙げられる：アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；内部で２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋により、同じリボース糖の４’炭素に連結されている「ロックド」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）。
【００８７】
「デオキシ」修飾には次記が挙げられる：水素、ハロ、アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；および例えば、アミノ官能基によりで任意に置換されてもよいアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニル。特定の実施形態の他の置換基には、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロが挙げられる。
【００８８】
糖基は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する１個または複数の炭素を含むこともできる。従って、修飾ヌクレオチドは、アラビノースなどの糖を含み得る。修飾ヌクレオチドはまた、Ｃ−１’の位置の核酸塩基を欠く「脱塩基」糖を含むこともできる。これらの脱塩基糖は、１個または複数の構成糖原子の修飾をさらに含むことができる。
【００８９】
２’修飾を１つまたは複数のリン酸リンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて使用し得る。リン酸基は、非リン含有コネクターにより個別に置換できる。
【００９０】
リン酸基を置換できる部分の例には、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。特定の実施形態では、置換は、メチレンカルボニルアミノおよびメチレンメチルイミノ基を含み得る。リン酸リンカーおよびリボース糖は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドにより置換され得る。
【００９１】
例には、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代用物が挙げられる。特定の実施形態では、ＰＮＡ代用物が使用され得る。
【００９２】
オリゴヌクレオチドの３’および５’を修飾できる。このような修飾は、分子の３’末端または５’末端または両末端の位置であり得る。それらは、全体末端リン酸またはリン酸基の１個または複数の原子の修飾または置換を含むことができる。例えば、オリゴヌクレオチドの３‘および５’末端は、標識部分、例えば、フルオロフォア（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３またはＣｙ５色素）または保護基（例えば、硫黄、シリコン、ホウ素またはエステル系）などの他の機能性分子実体と結合できる。機能的分子実体は、リン酸基および／またはリンカーを介して糖に結合できる。リンカーの末端原子は、糖のリン酸基またはＣ−３’またはＣ−５’のＯ、Ｎ、ＳまたはＣ基の結合原子に連結またはこれを置換できる。あるいは、リンカーは、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に連結またはこれを置換できる。これらのスペーサーまたはリンカーには、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（例えば、ｎ＝３または６）、脱塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノ、またはビオチンおよびフルオレセイン試薬を挙げることができる。３’末端は、−ＯＨ基であり得る。
【００９３】
末端修飾の他の例には次記が挙げられる：色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ、ＥＤＴＡ、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセリン、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセリン、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジンイミダゾール複合体、テトラアザ大環状環のＥｕ３＋複合体）。
【００９４】
末端修飾は、活性の調節または分解に対する耐性の調節を含む多くの理由のために付加できる。活性の調節のために有用な末端修飾には、リン酸またはリン酸類似体を用いた５’末端の修飾が含まれる。本発明の核酸は、第１のまたは第２の鎖上で、５’末端で５’リン酸化され得るかまたはホスホリル類似体を含み得る。５’−リン酸修飾には、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングと適合する修飾が含まれる。好適な修飾には、次記が含まれる：５′−モノリン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５′）；５′−ジリン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５′）；５′−トリリン酸（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５′）；５′−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５′−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５′）；５′−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造体（Ｎ−Ｏ−５′−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５′）；５′−モノチオリン酸（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５′）；５′−モノジチオリン酸（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５′），５′−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５′）；酸素／硫黄置換モノリン酸、ジリン酸およびトリホスファテスの任意の追加の組み合わせ（例えば、５′−アルファ−チオトリリン酸、５′−ガンマ−チオトリリン酸、など）、５′−ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５′、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５′）、５′−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、など、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５′−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５′−ＣＨ２−）、５’ビニルホスホネート、５′−アルキルエテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル、など、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５′−）。
【００９５】
本発明の修飾核酸は、第１のおよび／または第２の鎖の１つまたは複数の末端上の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾を含み得る。任意選択で、第１の鎖のそれぞれのまたは両方の末端は、１個または２個または３個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含み得る。任意選択で、第２の鎖のそれぞれのまたは両方の末端は、１個または２個または３個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含み得る。任意選択で、第１の鎖の両端および第２の鎖の５’末端は、２個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含み得る。ホスホロチオエート修飾ヌクレオチドとは、ヌクレオチドと隣接するヌクレオチドとの間の結合が、標準的リン酸基の代わりにホスホロチオエート基を含むことを意味する。
【００９６】
末端修飾はまた、分布の監視のために有用であり得、このような場合、付加されるべき基には、フルオロフォア、例えば、フルオレセインまたはＡｌｅｘａ色素が挙げられる。末端修飾はまた、取り込みを高めるために有用であり、このために有用な修飾には、コレステロールが挙げられる。末端修飾はまた、ＲＮＡ薬剤の別の部分への架橋のために有用である。
【００９７】
アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルは、ＲＮＡで認められる最もよくある塩基である。これらの塩基は、修飾または置換されて改善された特性を有するＲＮＡをもたらす。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドは、これらの塩基または合成および天然の核酸塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン、イソグアノシン、またはツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ）ならびに上記修飾のいずれか１種を用いて調製できる。あるいは、上記塩基のいずれかの置換または修飾類似体および「ユニバーサル塩基」を採用できる。例としては、次記が挙げられる：２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよびシトシン；６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン；５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン；５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；およびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；またはＯ−アルキル化塩基。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「非対形成ヌクレオチド類似体」という用語は、限定されないが、６脱アミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＣなどの、非塩基対部分を含むヌクレオチド類似体を意味する。いくつかの実施形態では、非塩基対ヌクレオチド類似体は、リボヌクレオチドである。他の実施形態では、それはデオキシリボヌクレオチドである。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「末端官能基」という用語は、限定されないが、ハロゲン、アルコール、アミン、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒド、ケトン、エーテル基を含む。
【０１００】
特定の部分は、第１の鎖または第２の鎖の５’末端に連結され得、次記を含む：脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、２’Ｏアルキル修飾を含む修飾脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分；逆位脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分およびその修飾物、Ｃ６−イミノ−Ｐｉ；ＤＮＡおよびＲＮＡを含むミラーヌクレオチド；５’ＯＭｅヌクレオチド；および４’、５’−メチレンヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−リン酸アルキル；１，３−ジアミノ−２−プロピルリン酸、３−アミノプロピルリン酸；６−アミノヘキシルリン酸；１２−アミノドデシルリン酸；ヒドロキシプロピルリン酸；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；アルファヌクレオチド；トレオペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’、４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５，５’−逆位脱塩基部分；１，４−ブタンジオールリン酸；５’−アミノ；および架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分。
【０１０１】
本発明の核酸は、１種または複数の逆位ヌクレオチドとして、例えば、逆位チミジンまたは逆位アデニンを含み得る（例えば、Ｔａｋｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００２．ＪＢＣ  ２７７（２６）：２３８００−０６を参照）。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、遺伝子発現に関して、「抑制する」、「下方制御する」、または「低減する」という用語は、遺伝子の発現、または１種または複数のタンパク質またはタンパク質サブユニット（例えば、ｍＲＮＡ）をコードするＲＮＡ分子または等価ＲＮＡ分子のレベル、または１種または複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットまたはペプチドの活性が、本発明の核酸の非存在下で観察されるものより、またはヒト転写物に対し既知の相同性のないｓｉＲＮＡ（本明細書で非サイレンシング対照と呼ばれる）を基準にして、低いことを意味する。このような対照は、類似の方法で本発明の分子に結合および修飾され、同じ経路により標的細胞に送達され得る；例えば、発現は、抑制剤（これは核酸であってよい）の非存在下で、または非サイレンシング対照（これは標的配列に非相補的である核酸であってよい）の存在下で観察されるレベルより９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、またはそれ未満に低減され得る。
【０１０３】
本発明の核酸は、脱塩基ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合、用語の「脱塩基」は、塩基を欠くか、または１’位置の塩基の代わりに他の化学基、例えば、３’、３’−結合または５‘、５’−結合デオキシ脱塩基リボース誘導体、を有する部分を有する。
【０１０４】
核酸は、修飾された第２のおよび／または第１の鎖上に１個または複数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドが交互に修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成し得る。
【０１０５】
本明細書に記載の交互は、規則的に代わる代わる交替して起こることを意味する。換言すれば、交互は、反復して交替で起こることを意味する。例えば、１個のヌクレオチドが修飾される場合、次の隣接ヌクレオチドは修飾されず、その次の隣接ヌクレオチドは修飾される、等々。第１と第２の修飾が異なる場合、１個のヌクレオチドは、第１の修飾で修飾され得、次の隣接ヌクレオチドは第２の修飾により修飾され得、および次の隣接ヌクレオチドは第１の修飾により修飾される、等々。
【０１０６】
本発明の核酸の第１の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得、第１の鎖は５’側から３’側へ番号が付与され、最も５’側のヌクレオチドが第１の鎖のヌクレオチド番号１である。本明細書に記載の用語の「奇数」は、２で割り切れない数字を意味する。奇数の例は、１、３、５、７、９、１１などである。本発明の核酸の第１の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが修飾され得、第１の鎖は、５’側から３’側へ番号が付けられる。本明細書に記載の用語の「偶数」は、２で一様に割り切れる数字を意味する。偶数の例は、２、４、６、８、１０、１２、１４などである。本発明の核酸の第２の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得、第２の鎖は３’側から５’側へ番号が付与され、最も３’側のヌクレオチドが第２の鎖のヌクレオチド番号１である。本発明の核酸の第２の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが修飾され得、第２の鎖は、３’側から５’側へ番号が付けられる。
【０１０７】
第１および／または第２の鎖上の１個または複数のヌクレオチドが修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成し得る。第１の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得る。第１の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが少なくとも第２の修飾により修飾され得、少なくとも第２の修飾は、１個または複数の奇数のヌクレオチド上の修飾とは異なる。１個または複数の修飾偶数ヌクレオチドの内の少なくとも１個は、１個または複数の修飾奇数ヌクレオチドの少なくとも１個に隣接し得る。
【０１０８】
本発明の核酸では、第１の鎖中の複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得る。第１の鎖中の複数の偶数ヌクレオチドが第２の修飾により修飾され得る。第１の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得る。第１の鎖は、第２の異なる修飾により修飾された隣接するヌクレオチドも含み得る。
【０１０９】
第２の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドは、第１の鎖上の奇数ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾により修飾され得る、および／または第２の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドは、第１の鎖の奇数ヌクレオチドの同じ修飾により修飾され得る。第２の鎖の１個または複数の修飾偶数ヌクレオチドの内の少なくとも１個は、１個または複数の修飾奇数ヌクレオチドに隣接し得る。第２の鎖の複数の奇数ヌクレオチドは、共通の修飾により修飾され得、および／または複数の偶数ヌクレオチドは第１の鎖の奇数ヌクレオチド上に存在する同じ修飾により修飾され得る。第２の鎖上の複数の奇数ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得、第２の修飾は、第１の鎖の奇数ヌクレオチドの修飾とは異なる。
【０１１０】
第２の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得、これは、第１の鎖の奇数ヌクレオチドの修飾とは異なる第２の修飾であり得る。
【０１１１】
本発明の核酸では、第１の鎖中のそれぞれの奇数ヌクレオチドおよび第２の鎖中のそれぞれの偶数ヌクレオチドは、共通の修飾により修飾され得、それぞれの偶数ヌクレオチドは、第２の修飾を有する第１の鎖中で修飾され得、それぞれの奇数ヌクレオチドは、第２の修飾を有する第２の鎖中で修飾され得る。
【０１１２】
本発明の核酸は、第２の鎖の非修飾または異なって修飾されたヌクレオチドに対して、少なくとも１個のヌクレオチドだけシフトされた第１の鎖の修飾ヌクレオチドを有し得る。
【０１１３】
１個または複数またはそれぞれの奇数ヌクレオチドは、第１の鎖中で修飾され得、１個または複数またはそれぞれの偶数ヌクレオチドは、第２の鎖中で修飾され得る。一方または両方の鎖上の１個または複数またはそれぞれの交互ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得る。１個または複数またはそれぞれの偶数ヌクレオチドは、第１の鎖中で修飾され得、１個または複数またはそれぞれの偶数ヌクレオチドは、第２の鎖中で修飾され得る。一方または両方の鎖上の１個または複数またはそれぞれの交互ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得る。１個または複数またはそれぞれの奇数ヌクレオチドは、第１の鎖中で修飾され得、１個または複数またはそれぞれの奇数ヌクレオチドは、第２の鎖中で共通の修飾により修飾され得る。一方または両方の鎖上の１個または複数またはそれぞれの交互ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得る。１個または複数またはそれぞれの偶数ヌクレオチドは、第１の鎖中で修飾され得、１個または複数またはそれぞれの奇数ヌクレオチドは、第２の鎖中で共通の修飾により修飾され得る。一方または両方の鎖上の１個または複数またはそれぞれの交互ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得る。
【０１１４】
本発明の核酸は、１つまたは両方の鎖中で交互修飾の少なくとも２つの領域を有する一本鎖または二本鎖構築物を含み得る。これらの交互領域は、最大約１２個のヌクレオチドを含み得るが、好ましくは約３〜約１０個のヌクレオチドを含む。交互ヌクレオチドの領域は、本発明の核酸の１つまたは両方の鎖の末端に位置し得る。核酸は、各末端（３’および５’）に４〜約１０個のヌクレオチドの交互ヌクレオチドを含み得、これらの領域は、約５〜約１２個の近接非修飾または異なったまたは共通修飾ヌクレオチドにより分離され得る。
【０１１５】
第１の鎖の奇数ヌクレオチドは修飾され得、偶数ヌクレオチドが第２の修飾により修飾され得る。第２の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得、これは、第１の鎖の奇数ヌクレオチドの修飾と同じであり得る。第２の鎖の１個または複数のヌクレオチドはまた、第２の修飾により修飾され得る。第２の修飾を有する１個または複数のヌクレオチドは、相互に、および第１の鎖の奇数ヌクレオチドの修飾と同じである修飾を有するヌクレオチドに隣接し得る。第１の鎖はまた、２個のヌクレオチドの３’末端および５’末端間で、ホスホロチオエート結合を含み得る。第２の鎖は、５’末端の２個のヌクレオチド間で、ホスホロチオエート結合を含み得る。第２の鎖はまた、５’末端でリガンドに結合され得る。
【０１１６】
本発明の核酸は、共通の修飾により修飾された隣接ヌクレオチドを含む第１の鎖を含み得る。１個または複数のこのようなヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得る１個または複数のヌクレオチドに隣接し得る。第２の修飾を有する１個または複数のヌクレオチドは、隣接し得る。第２の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得、これは、第１の鎖の１個または複数ヌクレオチドの修飾の１つと同じであり得る。第２の鎖の１個または複数のヌクレオチドはまた、第２の修飾により修飾され得る。第２の修飾を有する１個または複数のヌクレオチドは、隣接し得る。第１の鎖はまた、２つのヌクレオチドの５’末端および３’末端間で、ホスホロチオエートを含み得る。第２の鎖は、２つのヌクレオチドの３’末端で、ホスホロチオエート結合を含み得る。第２の鎖はまた、５’末端でリガンドに結合され得る。
【０１１７】
１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５（第１の鎖上で５’側から３’側へ、および第２の鎖上で３’側から５’側へ）と番号が付されたヌクレオチドは、第１の鎖上の修飾により修飾され得る。２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４と番号が付されたヌクレオチドは、第１の鎖上で第２の修飾により修飾され得る。１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３の番号が付されたヌクレオチドは、第２の鎖上の修飾により修飾され得る。２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の番号が付されたヌクレオチドは、第２の鎖上で第２の修飾により修飾され得る。ヌクレオチドは、本発明の核酸のために、第１の鎖上で５’側から３’側へ、および第２の鎖上で３’側から５’側へ番号が付される。
【０１１８】
２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の番号が付されたヌクレオチドは、第１の鎖上の修飾により修飾され得る。１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３の番号が付されたヌクレオチドは、第１の鎖上の第２の修飾により修飾され得る。１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３の番号が付されたヌクレオチドは、第２の鎖上の修飾により修飾され得る。２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の番号が付されたヌクレオチドは、第２の鎖上で第２の修飾により修飾され得る。
【０１１９】
明らかに、第１のおよび／または第２の鎖が１９個のヌクレオチド長さなどの２５個のヌクレオチド長さより短い場合、修飾されるべき２０、２１、２２、２３、２４および２５の番号が付されたヌクレオチドは存在しない。当業者には、上記説明は、より短い鎖にもそれに応じて当てはまることが理解される。
【０１２０】
第１の鎖上の１個または複数の修飾ヌクレオチドは、共通の修飾を有する第２の鎖上の修飾ヌクレオチドと対形成し得る。第１の鎖上の１個または複数の修飾ヌクレオチドは、異なる修飾を有する第２の鎖上の修飾ヌクレオチドと対形成し得る。第１の鎖上の１個または複数の修飾ヌクレオチドは、第２の鎖上の非修飾ヌクレオチドと対形成し得る。第２の鎖上の１個または複数の修飾ヌクレオチドは、第１の鎖上の非修飾ヌクレオチドと対形成し得る。換言すれば、交互ヌクレオチドは、２つの鎖上で整列させることができ、例えば、第２の鎖の交互領域中の全ての修飾は、第１の鎖中の同一の修飾と対形成され、あるいは、他の鎖中で異種修飾（すなわち、第２のまたはさらなる修飾）と対形成している１つの鎖の交互領域中で共通の修飾を有する１ヌクレオチドだけ片寄らせることができる。別の選択肢は、それぞれの鎖中で異種修飾を有することである。
【０１２１】
第１の鎖上の修飾は、第２の鎖上で修飾ヌクレオチドに対して１ヌクレオチドだけシフトされ、それにより、共通修飾ヌクレオチドが相互に対形成されない。
【０１２２】
修飾（単数または複数）はそれぞれ独立に、３’−末端デオキシチミン、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ修飾、２’−アミノ修飾、２’−アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホラミデート修飾、５’−ホスホロチオエート基修飾、５’−リン酸または５’−リン酸模倣物修飾およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群より選択され得、および／または修飾ヌクレオチドは、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチドまたは非天然塩基含有ヌクレオチドのいずれか１個であり得る。
【０１２３】
少なくとも１つの修飾は、２’−Ｏ−メチルであり得、および／または少なくとも１つの修飾は２’−Ｆであり得る。本明細書に記載のさらなる修飾は、第１および／または第２の鎖上に存在し得る。
【０１２４】
本発明の核酸は、１つまたはいくつかの鎖末端に逆位ＲＮＡヌクレオチドを含み得る。このような逆位ヌクレオチドは、核酸に対し安定性をもたらす。好ましくは、核酸は、少なくとも１つの鎖の１つまたはいくつかの３’末端に、および／または第２の鎖の５’末端に、少なくとも１個の逆位ヌクレオチドを含む。より好ましくは、核酸は、第２の鎖の３’末端に逆位ヌクレオチドを含む。最も好ましくは、核酸は、第２の鎖の３’末端に逆位ＲＮＡヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、好ましくは逆位Ａである。逆位ヌクレオチドは、好ましくは、オーバーハングとしてではなく、他の鎖の反対側の対応するヌクレオチドとして鎖の末端に存在する。このような修飾を有する核酸は安定で、合成が容易である。
【０１２５】
本発明の説明の全体を通して、「同じまたは共通の修飾」は、いずれかのヌクレオチドに対する同じ修飾を意味し、メチル基またはフルオロ基などの基で修飾されたＡ、Ｇ、ＣまたはＵがそうである。同じヌクレオチド上の同じ付加物を意味すると解釈されるべきではない。例えば、２’Ｆ−ｄＵ、２’Ｆ−ｄＡ、２’Ｆ−ｄＣ、２’Ｆ−ｄＧは全て、同じまたは共通の修飾と見なされ、２’−ＯＭｅ−ｒＵ、２’−ＯＭｅ−ｒＡ；２’−ＯＭｅ−ｒＣ；２’−ＯＭｅ−ｒＧも同様である。２’Ｆ修飾は、２’ＯＭｅ修飾とは異なる修飾である。
【０１２６】
本発明のいくつかの代表的修飾核酸配列が実施例で示されている。これらの実施例は、例示を意図したものであって、限定的なものではない。
【０１２７】
好ましくは、核酸は、修飾および第２のまたはさらなる修飾を含み得、これらは、それぞれ、個別に、２’−Ｏ−メチル修飾および２’−Ｆ修飾を含む群から選択される。核酸は２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）である第１の修飾を含み、さらに、２’−Ｆである第２の修飾を含み得る。本発明の核酸はまた、ホスホロチオエート修飾および／またはデオキシ修飾を含み得、これらは、それぞれのまたは両鎖のそれぞれまたは任意の末端の末端１、２または３個のヌクレオチド中またはその間に存在し得る。
【０１２８】
本発明の核酸は、リガンドに結合されて、複合体を形成し得る。
【０１２９】
いくつかのリガンドは、エンドソーム溶解特性を有し得る。エンドソーム溶解性リガンドは、エンドソームの溶解および／または本発明の組成物またはその成分の、エンドソームから細胞の細胞質への輸送を促進する。エンドソーム溶解性リガンドは、ポリアニオン性ペプチドまたはペプチド模倣体であり得、これはｐＨ依存性膜活性および膜融合性を示す。エンドソーム溶解性成分は、ｐＨ変化の変化に応じて電荷またはプロトン化の変化を受ける化学基を含み得る。エンドソーム溶解性成分は、直鎖または分岐鎖であり得る。
【０１３０】
リガンドは、例えば、取り込みを高めるための、治療的修飾剤；例えば、分布を監視するための、診断化合物またはレポーター基；およびヌクレアーゼ耐性付与部分を含み得る。一般的な例は、脂質、ステロイド、ビタミン、糖類、タンパク質、ペプチド、ポリアミン、およびペプチド模倣物を含む。リガンドは、タンパク質、炭水化物、脂質などの天然の物質を含み得る。リガンドは、組換えまたは合成分子であってよい。
【０１３１】
リガンドはまた、標的化基、例えば、細胞または組織標的化薬剤を含み得る。標的化リガンドは、レクチン、糖タンパク質、脂質またはタンパク質であってよい。
【０１３２】
リガンドの他の例としては、色素、挿入剤、架橋剤、ポルフィリン、多環式芳香族炭化水素、人工エンドヌクレアーゼまたはキレート化剤、親油性の分子、アルキル化剤、リン酸、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ、ＭＰＥＧ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン、輸送／吸収促進物質、合成リボヌクレアーゼ、またはイミダゾールクラスターが挙げられる。
【０１３３】
リガンドは、タンパク質、例えば、糖タンパク質またはペプチドであり得る。リガンドはまた、ホルモンまたはホルモン受容体であり得る。それらはまた、脂質、レクチン、炭水化物、ビタミン、または補因子などの非ペプチド種も含み得る。
【０１３４】
リガンドは、例えば、細胞骨格を破壊することにより、核酸の細胞中への取込みを増大させ得る薬物などの物質であってよい。
【０１３５】
リガンドは、炎症応答を活性化することにより、核酸の細胞中への取込みを増大させ得る。このようなリガンドとしては、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、インターロイキン−１β、またはγインターフェロンが挙げられる。
【０１３６】
リガンドは、脂質または脂質系分子であってよい。脂質または脂質系分子は、好ましくは、血清タンパク質に結合する。好ましくは、脂質系リガンドはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を結合する。脂質または脂質系分子は、複合体の分解に対する耐性を高め、標的化または標的細胞中への輸送を高め、および／または血清タンパク質への結合を調節できる。脂質系リガンドは、標的組織への複合体の結合を調節するために使用できる。
【０１３７】
リガンドは、ステロイドであってよい。好ましくは、リガンドはコレステロールまたはコレステロール誘導体である。
【０１３８】
リガンドは、ビタミンなどの部分であってよく、これは、標的細胞により取り込まれる。例示的ビタミンとしては、ビタミンＡ、Ｅ、Ｋ、およびＢビタミンが挙げられる。ビタミンは、増殖細胞により取り込まれ得、これは、核酸を悪性または非悪性腫瘍細胞などの細胞に送達するのに有用であり得る。
【０１３９】
リガンドは、ヘリカル細胞浸透剤などの細胞浸透剤であってよい。好ましくは、このような薬剤は両親媒性である。
【０１４０】
リガンドは、ペプチドまたはペプチド模倣体であってよい。ペプチド模倣体は、天然ペプチドに類似の一定の三次元構造体へと折り畳むことができる分子である。ペプチドまたはペプチド模倣体リガンドは、天然または修飾ペプチド、または両方を含み得る。ペプチドまたはペプチド模倣体は、細胞浸透ペプチド、カチオン性ペプチド、両親媒性ペプチド、または疎水性ペプチドであり得る。ペプチド部分は、デンドリマーペプチド、立体構造規制ペプチド、または架橋ペプチドであり得る。ペプチド部分は、疎水性膜輸送配列を含み得る。ペプチド部分は、細胞膜を横切るペプチド、オリゴヌクレオチドおよびタンパク質、例えば、ＨＩＶ  Ｔａｔタンパク質（ＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ）およびショウジョウバエアンテナペディアタンパク質（ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ）などの大きな極性分子を保有できるペプチドであり得る。好ましくは、ペプチドまたはペプチド模倣体は、細胞標的化ペプチド、例えば、アルギニン−グリシン−アスパラギン酸（ＲＧＤ）−ペプチドである。
【０１４１】
リガンドは、例えば、微生物細胞または哺乳動物細胞に浸透できる細胞浸透ペプチドであり得る。
【０１４２】
リガンドは、薬物動態学調節物質であってよい。薬物動態学調節物質は、親油性物質、胆汁酸、ステロイド、リン脂質類似体、ペプチド、タンパク質結合物質、ＰＥＧ、ビタミン、などであってよい。
【０１４３】
２つ以上のリガンドが存在する場合、リガンドは全て同じ特性を有し得る、全てが異なる特性を有し得る、またはいくつかのリガンドは同じ特性を有し、その他のリガンドは異なる特性を有し得る。例えば、リガンドは、標的化特性を有し得る、エンドソーム溶解活性を有し得る、またはＰＫ調節特性を有し得る。好ましい実施形態では、全てのリガンドが異なる特性を有する。
【０１４４】
リガンドは、３’−末端、５’−末端、および／または内部位置で核酸に結合され得る。好ましくは、介在テザーまたはリンカーを介して核酸に結合される。
【０１４５】
いつかの実施形態では、核酸は、二本鎖核酸である。二本鎖核酸では、リガンドは一方または両方の鎖に結合され得る。いくつかの実施形態では、二本鎖核酸は、センス鎖に結合されたリガンドを含む。他の実施形態では、二本鎖核酸は、アンチセンス鎖に結合されたリガンドを含む。
【０１４６】
リガンドは、核酸分子の核酸塩基、糖部分、またはヌクレオシド間結合に結合され得る。プリン核酸塩基またはその誘導体への結合は、環内および環外原子を含む任意の位置で起こり得る。ピリミジンヌクレオチドその誘導体への結合はまた、任意の位置で起こり得る。ヌクレオシドの糖部分への結合は、任意の炭素原子で起こり得る。ヌクレオシド間結合への結合は、リン含有結合のリン原子またはリン原子に結合された酸素、窒素、または硫黄原子で起こり得る。アミンまたはアミド含有ヌクレオシド間結合では、結合は、アミンもしくはアミドの窒素原子で、または隣接する炭素原子に対し起こり得る。
【０１４７】
リガンドは通常、炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖または多糖である。リガンドは、リンカーにより核酸に結合され得る。リンカーは、一価、二価または三価の分岐リンカーであり得る。
【０１４８】
オリゴヌクレオチド、特に本発明の二本鎖核酸の細胞への効率的インビボ送達手段は重要であり、特異的標的化および細胞外環境、特に血清タンパク質からの実質的保護が必要である。特異的標的化を達成する１つの方法は、ターゲティング部分またはリガンドを核酸に結合することである。ターゲティング部分は、核酸を所定の標的部位に標的化するのを支援するものであり、エンドサイトーシスなどにより細胞に取り込まれるべき結合した分子のための目的の受容体部位に対する適切なターゲティング部分を結合する必要がある。ターゲティング部分またはリガンドは、特定の受容体を標的化できる任意の部分またはリガンドであり得る。
【０１４９】
例えば、アシアロ糖タンパク質（ＡＳＧＰ−Ｒ）は、高容量受容体であり、肝細胞上に極めて豊富に存在する。三分岐クラスターグリコシドの使用の最初の開示の１つは、米国特許第５，８８５，９６８号におけるものであった。３つのＧａｌＮＡｃリガンドを有し、リン酸基を含む複合体が既知であり、Ｄｕｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）に記載されている。ＡＳＧＰ−Ｒは、Ｄ−Ｇａｌよりも、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトシルアミン（ＧａｌＮＡｃ）に対し５０倍高い親和性を示す。
【０１５０】
レクチン発現肝細胞（アシアロ糖タンパク質受容体；ＡＳＧＰＲ）は、グリコシル化タンパク質または他のオリゴ糖の末端β−ガラクトシルサブユニットを特異的に認識し（Ｗｅｉｇｅｌ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，２００２）、ガラクトースまたはガラクトサミンの医薬品有効成分への共有結合カップリングにより、薬物を肝臓に送達するために使用できる（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｓ．；ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４  Ｎｏｖ  １１；２６９（４５）：２７８０３−６）。さらに、結合親和性は、多価効果により大きく高めることができ、これは、ターゲティングユニットの反復により達成される（Ｂｉｅｓｓｅｎ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９５  Ａｐｒ  ２８；３８（９）：１５３８−４６）。
【０１５１】
ＡＳＧＰＲは、末端β−ガラクトシル含有糖タンパク質の活性エンドソーム輸送のためのメディエーターであり、従って、ＡＳＧＰＲは、細胞に送達する必要がある核酸などの薬剤候補の標的化送達に極めて好適である（Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．）。
【０１５２】
サッカライドは、リガンドと呼ばれることもあり、標的細胞上の少なくとも１つのタイプの受容体に対して親和性を有するように選択され得る。特に、受容体は、哺乳動物肝臓細胞上にあり、例えば、肝臓アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）である。
【０１５３】
サッカライドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、グルコサミンおよびフコースから選択され得る。サッカライドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であり得る。
【０１５４】
リガンドは、（ｉ）１個または複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分およびその誘導体、および（ｉｉ）リンカーを含み得、リンカーは、ＧａｌＮＡｃ部分を前出のいずれかの態様で定義の核酸に結合する。リンカーは、二価または三価または四価の分岐構造体であり得る。ヌクレオチドは、本明細書で定義のように修飾され得る。
【０１５５】
「ＧａｌＮＡｃ」は、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを意味し、通常、文献中では、Ｎ−アセチルガラクトサミンと呼ばれる。「ＧａｌＮＡｃ」または「Ｎ−アセチルガラクトサミン」への言及は、β−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノースの両方を含む。β−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノースの両方は、互換的に使用され得る。好ましくは、本発明の化合物は、β−型、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースを含む。
【０１５６】
リガンドは、ＧａｌＮＡｃを含み得る。
リガンドは、式Ｉ：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （Ｉ）
の化合物を含み、式中：
Ｓはサッカライドであり、サッカライドはＮ−アセチルガラクトサミンであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ｍは１、２、または３であり；
Ｐは、リン酸または修飾リン酸（好ましくはチオリン酸）であり；
Ｘ２は、式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、ｎ＝１〜６であり；
Ａは、分岐ユニットであり、
Ｘ３は、架橋ユニットであり；
本発明による核酸は、リン酸または修飾リン酸（好ましくはチオリン酸）を介してＸ３に結合される。
【０１５７】
式Ｉでは、分岐ユニット「Ａ」は、３つに分岐し、３個のサッカライドリガンドを収容する。分岐ユニットは、リガンドおよび核酸に共有結合する。分岐ユニットは、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテルおよびヒドロキシアミノ基から選択される基を含む分岐脂肪族基を含み得る。分岐ユニットは、アルキルおよびエーテル基から選択される基を含み得る。
【０１５８】
分岐ユニットＡは、
【化７】
2021502411.tif 000013
から選択される構造を有し得、式中、各Ａ１は独立に、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり；および各ｎは独立に１〜２０の整数である。
分岐ユニットは、
【化８】
2021502411.tif 000014
から選択される構造を有し得、式中、各Ａ１は独立に、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり；および各ｎは独立に１〜２０の整数である。
分岐ユニットは、
【化９】
2021502411.tif 000015
から選択される構造を有し得、式中、Ａ１は、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり；および各ｎは独立に１〜２０の整数である。
分岐ユニットは、構造：
【化１０】
2021502411.tif 000016
を有し得る。
分岐ユニットは、構造：
【化１１】
2021502411.tif 000017
を有し得る。
分岐ユニットは、構造：
【化１２】
2021502411.tif 000018
を有し得る。
任意選択で、分岐ユニットは、炭素原子のみからなる。
【０１５９】
「Ｘ３」部分は、架橋ユニットである。架橋ユニットは直鎖であり、分岐ユニットおよび核酸に共有結合する。
Ｘ３は、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン−、式（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ０−Ｃ４アルキレン（Ｃｙ）Ｃ０−Ｃ４アルキレン−（式中、Ｃｙは置換もしくは非置換５員もしくは６員シクロアルキレン、アリーレン、ヘテロシクリレンまたはヘテロアリーレン環である）、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＳＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）Ｓ−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、および−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−Ｓ−Ｓ−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−から選択され得る。
Ｘ３は、式−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテルであり得る。Ｘ３は、式−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ４−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテルであり得、上記（Ｃ４−Ｃ２０アルキレン）は、Ｚに結合する。Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ３Ｈ６−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−、特に、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択され得、それぞれの場合で、−ＣＨ２−基はＡに結合される。
【０１６０】
リガンドは、式（ＩＩ）：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （ＩＩ）
の化合物を含み得、式中、
Ｓはサッカライドであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたはエチレングリコール基部（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ｍは１、２、または３であり；
Ｐは、リン酸または修飾リン酸（好ましくはチオリン酸）であり；
Ｘ２はＣ１−Ｃ８アルキレンであり；
Ａは；
【化１３】
2021502411.tif 000019
から選択される分岐ユニットであり；Ｘ３は、架橋ユニットであり；
本発明による核酸は、リン酸または修飾リン酸（好ましくはチオリン酸）を介してＸ３に結合される。
【０１６１】
分岐ユニットＡは、構造：
【化１４】
2021502411.tif 000020
を有し得る。
分岐ユニットＡは、構造：
【化１５】
2021502411.tif 000021
を有し得、式中、Ｘ３は、窒素原子に結合される。
【０１６２】
Ｘ３はＣ１−Ｃ２０アルキレンであり得る。好ましくは、Ｘ３は、−Ｃ３Ｈ６−、−Ｃ４Ｈ８−、−Ｃ６Ｈ１２−および  −Ｃ８Ｈ１６−、特に、−Ｃ４Ｈ８−、−Ｃ６Ｈ１２−および−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択される。
【０１６３】
リガンドは、式（ＩＩＩ）：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （ＩＩＩ）
の化合物を含み得、式中、
Ｓはサッカライドであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたはエチレングリコール基部（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ｍは１、２、または３であり；
Ｐは、リン酸または修飾リン酸（好ましくはチオリン酸）であり；
Ｘ２は、式−Ｃ３Ｈ６−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンエーテルであり；
Ａは、分岐ユニットであり、
Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ３Ｈ６−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ５Ｈ１０−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ７Ｈ１４−、および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択される式のアルキレンエーテルであり、それぞれの場合で、−ＣＨ２−基はＡに結合され；
本発明による核酸は、リン酸または修飾リン酸（好ましくはチオリン酸）を介してＸ３に結合される。
【０１６４】
分岐ユニットは、炭素を含み得る。好ましくは、分岐ユニットは炭素である。
Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ５Ｈ１０−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ７Ｈ１４−、および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択され得る。好ましくは、Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群より選択される。
【０１６５】
上記態様のいずれかに対し、Ｐは、修飾リン酸基である。Ｐは：
【化１６】
2021502411.tif 000022
で表すことができ、式中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立に、＝Ｏ、＝Ｓ、−Ｏ−、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＢＨ３、−ＯＣＨ２ＣＯ２、−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｒｘ、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｓ）ＯＲｘ、および−ＯＲｘであり、式中、Ｒｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
【化１７】
2021502411.tif 000023
は、化合物の残りの部分に対する結合を示す。
【０１６６】
修飾リン酸とは、１個または複数の酸素が置換されているリン酸基を意味する。修飾リン酸基の例には、ホスホロチオエート、ホスホロセレン酸、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルが含まれる。ジチオリン酸は、硫黄により置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸基中の１つ、それぞれまたは両方の非結合酸素は、独立に、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリール）の内のいずれか１つであり得る。
【０１６７】
リン酸リンカーはまた、結合酸素の窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホネート）による置換により修飾できる。置換は、末端酸素で生じ得る。非結合酸素の窒素による置換が可能である。
例えば、Ｙ１は−ＯＨであり、Ｙ２は＝Ｏまたは＝Ｓであり得；または
Ｙ１は−Ｏ−であり、Ｙ２は＝Ｏまたは＝Ｓであり得；
Ｙ１は＝Ｏであり、Ｙ２は−ＣＨ３、−ＳＨ、−ＯＲｘ、または−ＢＨ３であり得る。
Ｙ１は＝Ｓであり、Ｙ２は−ＣＨ３、−ＯＲｘまたは−ＳＨであり得る。
当業者なら、特定の事例では、Ｙ１とＹ２の間で非局在化が存在することを理解するであろう。
【０１６８】
好ましくは、修飾リン酸基は、チオリン酸基である。チオリン酸基には、ビチオリン酸（ｂｉｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（すなわち、Ｙ１はＳであり、Ｙ２は−Ｓ−である）およびモノチオリン酸（すなわち、Ｙ１は−Ｏ−であり、Ｙ２は＝Ｓであるか、またはＹ１は＝Ｏであり、Ｙ２は−Ｓ−である）が挙げられる。好ましくは、Ｐはモノチオリン酸である。発明者らは、リン酸基の代わりに、チオリン酸基を有する複合体が改善された効力およびインビボ作用持続時間を有することを発見した。
【０１６９】
Ｐは、エチルリン酸であってもよい（すなわち、Ｙ１は＝Ｏであり、Ｙ２はＯＣＨ２ＣＨ３である）。
【０１７０】
サッカライドは、リガンドと呼ばれることもあり、標的細胞上の少なくとも１つのタイプの受容体に対して親和性を有するように選択され得る。特に、受容体は、哺乳動物肝臓細胞上にあり、例えば、肝臓アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰ−Ｒ）である。
【０１７１】
上記のいずれかの態様に対し、サッカライドは、ガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、グルコサミンおよびフコースの内の１種または複数を有するＮ−アセチルから選択され得る。好ましくは、サッカライドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の２つの分子である。本発明の化合物は３つのリガンドを有し得、これらは、それぞれ、好ましくはＮ−アセチルガラクトサミンである。
【０１７２】
「ＧａｌＮＡｃ」は、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを意味し、通常、文献中では、Ｎ−アセチルガラクトサミンと呼ばれる。「ＧａｌＮＡｃ」または「Ｎ−アセチルガラクトサミン」への言及は、β−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノースの両方を含む。特定の実施形態では、β−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノースの両方は、互換的に使用され得る。好ましくは、本発明の化合物は、β−型、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースを含む。
【化１８】
2021502411.tif 000024
２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノース
【化１９】
2021502411.tif 000025
２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノース
【化２０】
2021502411.tif 000026
２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノース
【０１７３】
上記式（ＩＩＩ）の化合物のいずれかに対し、Ｘ１はエチレングリコール基部（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり得、ｍは１、２、または３である。Ｘ１は（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）（−ＣＨ２）２−であり得る。Ｘ１は（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２（−ＣＨ２）２−であり得る。Ｘ１は（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３（−ＣＨ２）２−であり得る。好ましくは、Ｘ１は、（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２（−ＣＨ２）２−である。あるいは、Ｘ１はＣ３−Ｃ６アルキレンである。Ｘ１はプロピレンであり得る。Ｘ１はブチレンであり得る。Ｘ１はペンチレンであり得る。Ｘ１はヘキシレンであり得る。好ましくは、アルキルは直鎖アルキレンである。特に、Ｘ１はブチレンであり得る。
【０１７４】
式（ＩＩＩ）の化合物に対して、Ｘ２は、式−Ｃ３Ｈ６−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンエーテル、すなわち、Ｃ３アルコキシメチレン、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２−である。
従って、本発明は、次記の内の１つの構造を有する複合化核酸をさらに提供する。
【化２１】
2021502411.tif 000027
2021502411.tif 000028
2021502411.tif 000029
2021502411.tif 000030
2021502411.tif 000031
式中、Ｚは、本明細書で定義の核酸である。
【０１７５】
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のリガンドは、第１の（アンチセンス）鎖の３’−末端および／または第２の（センス）鎖の３’−および／または５’−末端のいずれかに結合できる。核酸は、２個以上の式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）のリガンドを含むことができる。しかし、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の内の単一のリガンドが好ましい。理由は、単一のこのようなリガンドは、核酸を標的細胞に対して効率的に標的化するために十分であるためである。
【０１７６】
第１の（アンチセンス）鎖の５’−末端は、この位置のリガンドが核酸の生物活性を妨げる可能性があるために、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のリガンドに結合されないのが好ましい。
【０１７７】
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の単一リガンドを鎖の５’−末端に有する核酸は、３’−末端に同じリガンドを有する同じ核酸よりも、合成がより容易で、従ってより安価である。従って、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のいずれかの単一リガンドが、核酸の第２の鎖の５’−末端に結合する（複合化する）のが好ましい。
【０１７８】
一実施形態では、核酸は、脂質を含むリガンド、より好ましくは、コレステロールを含むリガンドに結合する。
【０１７９】
本発明の複合体は、本明細書で開示のいずれかのリガンドに結合した、本明細書で開示の任意の核酸を含むことができる。
【０１８０】
本発明はまた、細胞中の標的遺伝子の発現を抑制する複合体に関し、上記複合体は、本発明のいずれかの態様の核酸を含む核酸部分および少なくとも１つのリガンド部分を含み、上記少なくとも１つのリガンド部分がリンカー部分、好ましくはセリノール由来リンカー部分、および細胞のインビボ標的化のための標的化リガンドを含み、一方または両方のＲＮＡ鎖の３’および／または５’末端のみに結合され、第１のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されず、
（ｉ）第２のＲＮＡ鎖は、標的化リガンドの５’末端に結合され、（ａ）第２のＲＮＡ鎖はまた、標的化リガンドの３’末端でも結合され、第１のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｂ）第１のＲＮＡ鎖は、３’末端で標的化リガンドに対し結合され、第２のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｃ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方はまた、３’末端で標的化リガンドに対し結合され；もしくは
（ｉｉ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方は、３’末端で標的化リガンドに対し結合され、第２のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されない。
【０１８１】
本発明のある実施形態では、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）は、５’末端で標的化リガンドに結合され、第１のＲＮＡ鎖（すなわち、アンチセンス鎖）は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）の３’末端は、結合されず、それにより、図１６Ａに示される概略構造の複合体が形成される。
【０１８２】
本発明のある実施形態では、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）は、５’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）は、３’末端でも標的化リガンドに結合され、第１のＲＮＡ鎖（すなわち、アンチセンス鎖）の３’末端は、結合されず、それにより、図１６Ｂに示される概略構造の複合体が形成される。
【０１８３】
本発明のある実施形態では、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）および第１のＲＮＡ鎖（すなわち、アンチセンス鎖）の両方は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）の５’末端は結合されず、それにより、図１６Ｃに示される概略構造の複合体が形成される。
【０１８４】
本発明のある実施形態では、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）は５’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）および第１のＲＮＡ鎖（すなわち、アンチセンス鎖）の両方は、３’末端で標的化リガンドに結合され、それにより、図１６Ｄに示される概略構造の複合体が形成される。
【０１８５】
上記実施形態のいずれか１つで、
【化２２】
2021502411.tif 000032
は、リンカーを示し、これは、リガンドを核酸部分の末端に結合する；リガンドは、ＧａｌＮＡｃなどのＧａｌＮＡｃ部分であり得る；図１６Ｅに示す概略構造は、核酸部分を表す。
【０１８６】
これらの概略図は、第１のまたは第２のヌクレオチドの数を限定する意図はなく、この図は、塩基の相補性に対する何らかの限定またはいずれか他の限定を示すものでもない。
【０１８７】
リガンドは、単量体または多量体（例えば、二量体、三量体、など）であり得る。
リガンドは単量体で、これにより、単一標的化リガンド部分、例えば、単一ＧａｌＮＡｃ部分を含むのが適切である。
あるいは、リガンドは、二量体リガンドであり得、このリガンド部分は、セリノール由来リンカー部分または非セリノールリンカー部分などの２つのリンカー部分を含み、それぞれが単一の標的化リガンド部分に結合する。
リガンドは、三量体リガンドであり得、この場合、リガンドは、セリノール由来リンカー部分または非セリノールリンカー部分などの３個のリンカー部分を含み、それぞれが単一の標的化リガンド部分に結合する。
２個または３個のセリノール由来リンカー部分は、直列に、例えば、以下に示すように、結合し得る：
【化２３】
2021502411.tif 000033
式中、ｎは１または２であり、ＹはＳまたはＯである。
好ましくは、リガンドは単量体である。
【０１８８】
適切には、複合化ＲＮＡ鎖は、追加のリンカーを含むリンカー部分を介して標的化リガンドに結合され、追加のリンカーは、飽和非分岐または分岐Ｃ１−１５アルキル鎖であるか、またはこれを含み、任意選択で、１個または複数の炭素（例えば、１、２または３個の炭素、好適には、１個または２個、特に１個）がＯ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）ｐから選択されるヘテロ原子により置換され（ｐは０、１または２である）（例えば、ＣＨ２基がＯ、またはＮＨ、またはＳ、またはＳＯ２で置換され、または鎖の末端または分岐部上の−ＣＨ３基がＯＨまたはＮＨ２で置換される）、上記鎖は、１個または複数のオキソ基（例えば、１〜３個、例えば、１個の基）で任意に置換されてもよい。
適切には、リンカー部分は、セリノール由来リンカー部分である。
より適切には、追加のリンカーには、飽和非分岐Ｃ１−１５アルキル鎖を含み、１個または複数の炭素（例えば、１、２または３個の炭素、好適には、１個または２個、特に１個）が酸素原子により置換される。
より好適には、追加のリンカーは、ＰＥＧ鎖を含む。
より好適には、追加のリンカーは、飽和非分岐Ｃ１−１５アルキル鎖を含む。
より好適には、追加のリンカーは、飽和非分岐Ｃ１−６アルキル鎖を含む。
より好適には、追加のリンカーは、飽和非分岐Ｃ４またはＣ６アルキル鎖、例えば、Ｃ４アルキル鎖を含む。
【０１８９】
ある実施形態では、
【化２４】
2021502411.tif 000034
は、式（Ｖ）：
【化２５】
2021502411.tif 000035
の結合部分であり、式中、ｎ、ＹおよびＬ１は下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
従って、ある実施形態では、標的化リガンド部分は、式（ＶＩ）：
【化２６】
2021502411.tif 000036
の結合部分であり、式中、ｎ、ＹおよびＬ１は下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
適切には、
【化２７】
2021502411.tif 000037
は、式（ＸＩＶ）：
【化２８】
2021502411.tif 000038
の結合部分であり、式中、ｎ、Ｙ、Ｒ１およびＬは下記で定義され、Ｌは、標的化リガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃに結合され、ホスホロ基のＯはＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
適切には、標的化リガンド部分は、式（ＩＶ）：
【化２９】
2021502411.tif 000039
の結合部分であり、式中、ｎ、Ｙ、Ｒ１およびＬは下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
適切には、
【化３０】
2021502411.tif 000040
は、式（ＶＩＩ）：
【化３１】
2021502411.tif 000041
の結合部分であり、式中、ｎ、ＹおよびＬ２は下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
適切には、標的化リガンド部分は、式（ＶＩＩＩ）：
【化３２】
2021502411.tif 000042
の結合部分であり、式中、ｎ、ＹおよびＬ２は下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
適切には、
【化３３】
2021502411.tif 000043
は、式（ＩＸ）：
【化３４】
2021502411.tif 000044
の結合部分であり、式中、Ｆ、Ｙ、およびＬは下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
適切には、標的化リガンド部分は、式（ＩＸａ）：
【化３５】
2021502411.tif 000045
の結合部分であり、式中、Ｆ、Ｙ、およびＬは下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
適切には、Ｌは、
【化３６】
2021502411.tif 000046
である。
【０１９０】
上記構造のいずれかでは、適切には、リガンドは、ＧａｌＮＡｃおよびガラクトース部分、特に、ＧａｌＮＡｃ部分から選択される。あるいは、ＧａｌＮＡｃは、別の標的化リガンド、例えば、サッカライドで置換され得る。
【０１９１】
本発明のある実施形態では、第１のＲＮＡ鎖は、式（Ｘ）：
【化３７】
2021502411.tif 000047
の化合物であり、ｂは０または１であり；および第２のＲＮＡ鎖は式（ＸＩ）：
【化３８】
2021502411.tif 000048
；
の化合物であり、式中、
ｃおよびｄは、独立に０または１であり；
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ上記第１および第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
ＹはＯまたはＳであり；
ｎは０、１、２または３であり；および
Ｌ１は、リガンドが結合するリンカーであり；
およびｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である。
適切には、第１のＲＮＡ鎖は、式（ＸＶ）：
【化３９】
2021502411.tif 000049
の化合物であり、ｂは０または１であり；および
第２のＲＮＡ鎖は、式（ＸＶＩ）：
【化４０】
2021502411.tif 000050
の化合物であり、ｃおよびｄは独立に０または１であり；
式中、
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ上記第１および第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
ＹはＯまたはＳであり；
Ｒ１はＨまたはメチルであり；
ｎは０、１、２または３であり；および
Ｌは、式（ＸＶ）および（ＸＶＩ）で同じまたは異なり、Ｌは、
−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、ｒ＝２〜１２；
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、ｓ＝１〜５；
−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｔは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｕ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ（Ｏ）−、ｕは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｖは２〜１２である；
からなる群より選択され；
存在する場合、末端Ｃ（Ｏ）は、ＮＨ基に結合され；および
ｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である。
適切には、第１のＲＮＡ鎖は、式（ＸＩＩ）：
【化４１】
2021502411.tif 000051
の化合物であり、ｂは０または１であり；および
第２のＲＮＡ鎖は、式（ＸＩＩＩ）：
【化４２】
2021502411.tif 000052
の化合物であり、式中、
ｃおよびｄは、独立に０または１であり；
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ上記第１および第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
ＹはＯまたはＳであり；
ｎは０、１、２または３であり；および
Ｌ２は、式（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）で同じまたは異なり、Ｌ２は、ｂ、ｃおよびｄの括弧内の部分で同じまたは異なり、Ｌ２は、下記からなる群より選択され：
【化４３】
2021502411.tif 000053
；
または
ｎは０であり、Ｌ２は：
【化４４】
2021502411.tif 000054
であり、末端ＯＨ基が存在せず、その結果、次の部分が形成され；
【化４５】
2021502411.tif 000055
;
（式中、
Ｆは、飽和分枝または非分枝（例えば、非分岐）Ｃ１−８アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）鎖であり、炭素原子の１個が酸素原子で任意に置換されてもよいが、但し、上記酸素原子が、別のヘテロ原子（例えば、ＯまたはＮ原子）から少なくとも２個の炭素原子分だけ離されていることが条件である。
Ｌは、式（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）で同じまたは異なり、Ｌは、
−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、ｒ＝２〜１２；
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、ｓ＝１〜５；
−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｔは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｕ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ（Ｏ）−、ｕは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｖは２〜１２である；
からなる群より選択され；
末端Ｃ（Ｏ）（存在する場合）は、ＮＨ基に結合され；および
ｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である。
【０１９２】
ＧａｌＮＡｃが存在する上記式のいずれか１つでは、ＧａｌＮＡｃは、任意のその他の標的化リガンド、例えば、本明細書で記載のもので置換されてもよい。
適切には、ｂは０でｃは１でｄは１であり；ｂは１でｃは０でｄは１であり；ｂは１でｃは１でｄは０であり；またはｂは１でｃは１でｄは１である。
より適切には、ｂは０でｃは１でｄは１であり；ｂは１でｃは０でｄは１であり；またはｂは１でｃは１でｄは１である。
最も適切には、ｂは０でｃは１でｄは１である。
一実施形態では、ＹはＯである。別の実施形態では、ＹはＳである。
一実施形態では、Ｒ１はＨまたはメチルである。一実施形態では、Ｒ１はＨである。別の実施形態では、Ｒ１はメチルである。
一実施形態では、ｎは０、１、２または３である。適切には、ｎは０である。
一実施形態では、Ｌは、
−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、ｒ＝２〜１２；
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、ｓ＝１〜５；
−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｔは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｕ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ（Ｏ）−、ｕは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｖは２〜１２である；
からなる群より選択され；
末端Ｃ（Ｏ）は、ＮＨ基に結合される。
適切には、Ｌは、−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−（ｒ＝２〜１２）である。適切には、ｒ＝２〜６である。より適切には、ｒ＝４または６、例えば、４である。
適切には、Ｌは、
【化４６】
2021502411.tif 000056
である。
【０１９３】
Ｆ部分の例には、（ＣＨ２）１−６、例えば、（ＣＨ２）１−４、例えば、ＣＨ２、（ＣＨ２）４、（ＣＨ２）５、または（ＣＨ２）６、またはＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）２−３、例えば、ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ＣＨ３が挙げられる。
適切には、Ｌ２は、
【化４７】
2021502411.tif 000057
である。
適切には、Ｌ２は、
【化４８】
2021502411.tif 000058
である。
適切には、Ｌ２は、
【化４９】
2021502411.tif 000059
である。
適切には、Ｌ２は、
【化５０】
2021502411.tif 000060
である。
適切には、ｎは０であり、Ｌ２は：
【化５１】
2021502411.tif 000061
であり、末端ＯＨ基が存在せず、その結果、次の部分：
【化５２】
2021502411.tif 000062
が形成され；式中、Ｙは本明細書の別の箇所で定義の通りである。
【０１９４】
ｂ、ｃおよびｄの括弧で括られた部分内で、Ｌ２は通常同じである。ｂ、ｃおよびｄの括弧で括られた部分間で、Ｌ２は同じかまたは異なり得る。ある実施形態では、ｃの括弧で括られた部分のＬ２は、ｄの括弧で括られた部分のＬ２と同じである。ある実施形態では、ｃの括弧で括られた部分のＬ２は、ｄの括弧で括られた部分のＬ２とは同じではない。ある実施形態では、例えば、リンカー部分がセリノール由来リンカー部分である場合、ｂ、ｃおよびｄの括弧で括られた部分のＬ２は同じである。
【０１９５】
セリノール由来リンカー部分は、任意の立体化学、すなわち、Ｌ−セリン異性体、Ｄ−セリン異性体、ラセミセリンまたは異性体の他の組み合わせ由来の立体化学のセリノールをベースにしてよい。本発明の好ましい態様では、セリノール−ＧａｌＮＡｃ部分（ＳｅｒＧＮ）は、次の立体化学を有する：
【化５３】
2021502411.tif 000063
。
すなわち、セリン異性体由来の（Ｓ）セリノールアミダイトまたは（Ｓ）セリノールスクシネート固体担持構成単位をベースにする。
【０１９６】
一実施形態では、標的細胞は肝細胞である。
【０１９７】
本発明は、さらなる態様として、細胞中の標的遺伝子の発現を抑制するための核酸を提供し、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖が抑制されるべき上記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第１および／または第２の鎖が少なくとも２個の末端３’ヌクレオチド間のジチオリン酸結合を含みおよび／または第２の鎖が少なくとも２個の末端５’ヌクレオチド間のジチオリン酸結合を含み、核酸分子がリンカーを介して直接または間接的にリガンドに結合される。
【０１９８】
このような核酸は、本明細書で記載のリガンドに結合され得る。第１および／または第２の鎖のヌクレオチドは、本明細書で記載のように修飾され得る。
リガンドは、ＧａｌＮＡｃであってよい。
【０１９９】
切断可能な結合基は、細胞の外側では安定であるが標的細胞中に入ると切断されるリンカーである。切断は、リンカーが一緒に保持している２つの部分を放出する。
【０２００】
好ましい実施形態では、本発明の核酸は、標的細胞中でまたは第１の基準条件（これは、例えば、細胞内条件を模倣または表すように選択できる）下で、対象の血液中でよりも、または第２の基準条件（これは、例えば、血液または血清中で認められる条件を模倣または表すように選択できる）下の場合よりも、少なくとも１０倍以上、好ましくは、少なくとも１００倍急速に切断される切断可能な結合基を含む。
【０２０１】
切断可能な結合基は、切断薬剤、例えば、ｐＨ、レドックス電位、または分解性分子、の影響を受けやすい。分解性分子としては、酸化または還元酵素、還元剤（メルカプタンなど）、エステラーゼ、エンドソームまたは酸性環境を形成できる薬剤、一般的な酸、ペプチダーゼ、およびホスファターゼとして作用することにより酸切断可能な結合基を加水分解または分解できる酵素が挙げられる。
【０２０２】
切断可能な結合基は、ジスルフィド結合であり得、これは、ｐＨの影響を受けやすい。
【０２０３】
リンカーは、特定の酵素により切断できる切断可能結合基を含み得る。リンカーに組み込まれる切断可能な結合基のタイプは、標的細胞に依存し得る。例えば、エステル基を含むリンカーは、肝臓細胞が標的である場合に好ましい。ペプチダーゼに富む肝臓細胞および滑膜細胞などの標的化細胞の場合には、ペプチド結合を含むリンカーを使用できる。
【０２０４】
一般に、切断可能な結合基候補は、分解性薬剤（または条件）の候補結合基を切断する能力を試験することにより評価できる。血液中でまたは他の非標的組織との接触時に切断に耐える能力について切断可能な結合基候補を試験することも望ましいであろう。好ましい実施形態では、有用な候補化合物は、血液または血清中（または細胞外条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）と比較して、細胞中（または細胞内条件を模倣するように選択されたインビトロ条件下）で、少なくとも２、４、１０または１００倍速く切断される。
【０２０５】
一態様では、切断可能な結合基は、レドックス切断可能な結合基であり得る。レドックス切断可能な結合基は、ジスルフィド結合基であり得る。
【０２０６】
一態様では、結合基は、リン酸系切断可能結合基であり得る。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＳＨ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｓ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（ＯＨ）−Ｏ−、−Ｏ−Ρ（Ｏ）（Η）−Ｏ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｏ−、−Ｓ−Ｐ（Ｏ）（Ｈ）−Ｓ−、−Ｏ−Ｐ（Ｓ）（Ｈ）−Ｓ−である。好ましい実施形態は、−Ｏ−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）−Ｏ−である。
【０２０７】
一態様では、切断可能な結合基は、酸切断可能結合基であり得る。好ましくは酸切断可能結合基は、ｐＨが６．５以下の環境で切断されるか、または一般的な酸として機能し得る酵素などの薬剤により切断される。酸切断可能結合基の例としては、ヒドラゾン、エステル、およびアミノ酸のエステルが挙げられるが、これらに限定されない。酸切断可能基は、一般式−Ｃ＝ＮＮ−；Ｃ（Ｏ）Ｏ、または−ＯＣ（Ｏ）を有し得る。好ましい実施形態は、エステルの酸素（アルコキシ基）に結合した炭素がアリール基、置換アルキル基、またはジメチル、ペンチルまたはｔ−ブチルなどの三級アルキル基である場合の結合基である。
【０２０８】
一実施形態では、切断可能な結合基は、エステル系酸切断可能結合基であり得る。エステル系切断可能な結合基の例としては、限定されないが、アルキレン、アルケニレンおよびアルキニレン基のエステルが挙げられる。
【０２０９】
一実施形態では、切断可能な結合基は、ペプチド系切断可能結合基であり得る。ペプチド系切断可能結合基は、オリゴペプチド（例えば、ジペプチド、トリペプチドなど）およびポリペプチドを得るためにアミノ酸間で形成されたペプチド結合である。ペプチド系切断基は通常、アミノ酸間で形成されてペプチドおよびタンパク質が得られるペプチド結合（すなわち、アミド結合）に限定され、全アミド官能基を含まない。ペプチド系切断可能結合基は、一般式−ＮＨＣＨＲＡＣ（Ｏ）ＮＨＣＨＲＢＣ（Ｏ）−を有し、式中、ＲＡおよびＲＢは２つの隣接するアミノ酸のＲ基である。
【０２１０】
一本鎖の合成
化合物例は、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成できる。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築は、例えば、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施され得る。固相合成は、塩基または修飾構成単位担持ｌｃａａ  ＣＰＧから開始し得る。ホスホラミダイト合成カップリングサイクルは、１）ＤＭＴ除去、２）必要なＤＭＴマスクホスホラミダイトおよびベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）であり得る活性化剤を用いた鎖延長、３）非延長オリゴヌクレオチド鎖のキャッピング、続けて、ヨウ素（リン酸ジエステル結合が望ましい場合）またはＥＤＩＴＨ（ホスホロチオエートまたはジチオリン酸結合が望ましい場合）によるＰ（ＩＩＩ）からｐ（Ｖ）への酸化、および再度のキャッピング（Ｃａｐ／Ｏｘ／ＣａｐまたはＣａｐ／Ｔｈｉｏ／Ｃａｐ）、からなる。ジチオリン酸結合が望ましい場合には、ホスホラミダイト合成カップリングサイクルは、１）ＤＭＴ除去、２）必要なＤＭＴマスクチオホスホラミダイトを用いた鎖延長、３）非延長オリゴヌクレオチド鎖のキャッピング、続けて、ＥＤＩＴＨによるＰ（ＩＩＩ）からＰ（Ｖ）への酸化、および再びキャッピング（Ｃａｐ／Ｔｈｉｏ／Ｃａｐ）、からなる。三価の樹枝状ＧａｌＮＡｃクラスターのオンカラム複合化に対しては、必要な三価の分岐アミダイトＳＴ４１−ｐｈｏｓを用いた同じホスホラミダイト合成サイクルと、続いて、ＧａｌＮＡｃアミダイトＳＴ２３−ｐｈｏｓを用いた別の合成サイクルラウウンドが適用された。必要な構成単位は、商業的に入手でき、または合成については以下に記載する。
【０２１１】
全ての最終一本鎖生成物をＡＥＸ−ＨＰＬＣにより分析し、それらの純度を検査した。純度は、％ＦＬＰ（完全長生成物の％）で示し、これは、最終生成物のＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析のＵＶ出力における帰属生成物シグナル下のＵＶ面積のパーセンテージである。それぞれの一本鎖生成物の確認をＬＣ−ＭＳ分析により実施した。
【０２１２】
ＳＴ４１（ＳＴ４１−ｐｈｏｓ）ならびにＳＴ２３（ＳＴ２３−ｐｈｏｓ）のホスホラミダイト誘導体の合成は、国際公開第２０１７／１７４６５７号に記載されている通りに実施できる。
ＳＴ４１−ｐｈｏｓ：
【化５４】
2021502411.tif 000064
ＳＴ２３−ｐｈｏｓ：
【化５５】
2021502411.tif 000065
【０２１３】
二本鎖の合成
二本鎖複合体を得るために、必要な個別の一本鎖がＨ２Ｏ中の６０ＯＤ／ｍＬの濃度に溶解される。両方の個別のオリゴヌクレオチドを反応容器に一緒に加えることができる。より容易な反応監視のために、滴定を行うことができる。２６０ｎｍでのＵＶ−吸収により測定して、第１の鎖は、第２の鎖に比べて２５％過剰で添加される。上記反応混合物を、例えば、８０℃で５分間加熱後、ゆっくり室温に冷却する。二本鎖形成をイオン対逆相ＨＰＬＣにより監視し得る。残留一本鎖ＵＶ面積から、第２の鎖の必要量を計算して、反応混合物に添加できる。反応系を、例えば、８０℃に再度加熱後、ゆっくり室温に冷却する。残留一本鎖の検出が１０％未満になるまで、この手順を反復できる。
【０２１４】
本明細書に記載の核酸は、リポソームの形で脂質と配合され得る。このような配合物は、リポプレックスとして当該技術分野で呼ばれ得る。脂質／リポソームを含む組成物を用いて、本発明の核酸の標的細胞への送達を支援し得る。本明細書で記載の脂質送達システムは、複合化リガンドの代替として使用し得る。本明細書で記載の修飾が、脂質送達システムと共にまたはリガンド複合体送達システムと共に本発明の核酸を使用する場合、存在し得る。
【０２１５】
このようなリポプレックスは、下記を含む脂質組成物を含み得る：
ｉ）カチオン性脂質、または薬学的に許容可能なその塩；
ｉｉ）ステロイド；
ｉｉｉ）ホスファチジルエタノールアミンリン脂質；
ｉｖ）ペグ化脂質。
【０２１６】
カチオン性脂質はアミノカチオン性脂質であってよい。
カチオン性脂質は、式（ＸＩＸ）：
【化５６】
2021502411.tif 000066
を有し得る化合物または薬学的に許容可能なその塩であり、式中、
Ｘは、Ｏ、ＳまたはＮＨであり；
Ｒ１およびＲ２はそれぞれ独立に、Ｃ４−Ｃ２２直鎖または分岐鎖アルキル鎖またはＣ４−Ｃ２２直鎖または分岐鎖の１個または複数の二重結合を有するアルケニル鎖であり、アルキルまたはアルケニル鎖は、介在エステル、アミドまたはジスルフィドを任意に含み；
ＸがＳまたはＮＨである場合、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素、メチル、エチル、モノまたはポリアミン部分であり、またはＲ３およびＲ４は一緒に、ヘテロシクリル環を形成し；
ＸがＯである場合、Ｒ３およびＲ４はそれぞれ独立に、水素、メチル、エチル、モノまたはポリアミン部分であり、またはＲ３およびＲ４は一緒に、ヘテロシクリル環を形成し、またはＲ３は水素であり、およびＲ４はＣ（ＮＨ）（ＮＨ２）である。
【０２１７】
カチオン性脂質は、式（ＸＩＸＡ）：
【化５７】
2021502411.tif 000067
をまたは薬学的に許容可能なその塩を有し得る。
カチオン性脂質は、式（ＸＩＸＢ）：
【化５８】
2021502411.tif 000068
または薬学的に許容可能なその塩を有し得る。
カチオン性脂質成分の含量は、組成物の全脂質含量の約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％であり得る。特に、カチオン性脂質成分は、組成物の全脂質含量の約５９ｍｏｌ％である。
【０２１８】
組成物は、ステロイドをさらに含んでよい。ステロイドはコレステロールであり得る。ステロイドの含量は、組成物の全脂質含量の約２６ｍｏｌ％〜約３５ｍｏｌ％であり得る。より具体的には、ステロイドの含量は、脂質組成物の全脂質含量の約３０ｍｏｌ％であり得る。
【０２１９】
ホスファチジルエタノールアミンリン脂質は、次記からなる群から選択され得る：１，２−ジフィタノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰｈｙＰＥ）、１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＯＰＥ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＰＥ）、１，２−ジラウロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬＰＥ）、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、１，２−ジパルミトイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、１，２−ジリノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＬｏＰＥ）、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＰＯＰＥ）、１，２−ジエルコイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＥＰＥ）、１，２−ジスクアレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＤＳＱＰＥ）および１−ステアロイル−２−リノレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミン（ＳＬＰＥ）。リン脂質の含量は、組成物の全脂質含量の約１０ｍｏｌ％であり得る。
【０２２０】
ペグ化脂質は、１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリセロール、メトキシポリエチレングリコール（ＤＭＧ−ＰＥＧ）およびＣ１６−セラミド−ＰＥＧは、からなる群から選択され得る。ペグ化脂質の含量は、組成物の全脂質含量の約１〜５ｍｏｌ％であり得る。
【０２２１】
組成物中のカチオン性脂質成分の含量は、脂質組成物の全脂質含量の約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、好ましくは脂質組成物の全脂質含量の約５９ｍｏｌ％であり得る。
【０２２２】
組成物は、５５：３４：１０：１；５６：３３：１０：１；５７：３２：１０：１；５８：３１：１０：１；５９：３０：１０：１；６０：２９：１０：１；６１：２８：１０：１；６２：２７：１０：１；６３：２６：１０：１；６４：２５：１０：１；および６５：２４：１０：１から選択されるｉ）：ｉｉ）：ｉｉｉ）：ｉｖ）の成分のモル比を有し得る。
組成物は、次の構造を有するカチオン性脂質
【化５９】
2021502411.tif 000069
次の構造を有するステロイド
【化６０】
2021502411.tif 000070
次の構造を有するホスファチジルエタノールアミンリン脂質
【化６１】
2021502411.tif 000071
および次の構造を有するペグ化脂質
【化６２】
2021502411.tif 000072
を含み得る。
【０２２３】
中性リポソーム組成物は、例えば、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）またはジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）から形成され得る。アニオン性リポソーム組成物は、ホスファチジルグリセロールから形成され得るが、一方、アニオン性膜融合リポソームは、主としてジオレオイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＯＰＥ）から形成され得る。別のタイプのリポソーム組成物は、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、例えば、大豆ＰＣ、および卵ＰＣなどから形成され得る。別のタイプは、リン脂質および／またはホスファチジルコリンおよび／またはコレステロールの混合物から形成される。
【０２２４】
正電荷の合成カチオン性脂質、Ｎ−［１−（２，３−ジオレイルオキシ）プロピル］−Ｎ，Ｎ，Ｎ−トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）を使って、小さいリポソームを形成でき、これは、自発的に核酸と相互作用して脂質−核酸複合体を形成し、この複合体は組織培養細胞の細胞膜の負電荷脂質と融合できる。ＤＯＴＭＡ類似体も使用してリポソームを形成できる。
【０２２５】
本明細書で記載の脂質の誘導体および類似体もリポソームを形成するために使用し得る。
【０２２６】
核酸含有リポソームは、種々の方法により作製できる。一例では、リポソームの脂質成分は、洗浄剤に溶解され、脂質成分とミセルが形成される。例えば、脂質成分は、両親媒性カチオン性脂質または脂質複合体であり得る。洗浄剤は、高い臨界ミセル濃度を有することができ、非イオン性であり得る。洗浄剤の例としては、コレート、ＣＨＡＰＳ、オクチルグルコシド、デオキシコレート、およびラウロイルサルコシンが挙げられる。その後、核酸調製物は、脂質成分を含むミセルに加えられる。脂質上のカチオン基は、核酸と相互作用し、核酸の周りに凝縮してリポソームを形成する。凝縮後、例えば、透析により洗浄剤が除去され、核酸のリポソーム調製物を生じる。
【０２２７】
必要に応じ、凝縮反応中に、例えば、制御添加により、凝縮を助ける担体化合物を加えることができる。例えば、担体化合物は、核酸以外のポリマー（例えば、スペルミンまたはスペルミジン）であり得る。ｐＨも凝縮に有利なように調節されてよい。
【０２２８】
核酸配合物は、界面活性剤を含み得る。一実施形態では、核酸は、界面活性剤を含む乳剤として配合される。
【０２２９】
イオン化されていない界面活性剤は、非イオン性界面活性剤である。例としては、エチレングリコールエステル、プロピレングリコールエステル、グリセリルエステルなどの非イオン性エステル、非イオン性アルカノールアミド、および脂肪アルコールエトキシレート、プロポキシル化アルコール、およびエトキシ化／プロポキシル化ブロックポリマーなどのエーテルが挙げられる。
【０２３０】
水中に溶解または分散された場合に負電荷を有する界面活性剤は、アニオン性界面活性剤である。例としては、セッケンなどのカルボキシレート、アシルラクチレート、アミノ酸のアシルアミド、アルキルサルフェートおよびエトキシル化アルキルサルフェートなどの硫酸のエステル、アルキルベンゼンスルホネートなどのスルホネート、アシルイセチオネート、アシルタウレートおよびスルホスクシネート、ならびにリン酸が挙げられる。
【０２３１】
水中に溶解または分散された場合に正電荷を有する界面活性剤は、カチオン性界面活性剤である。例としては、四級アンモニウム塩およびエトキシ化アミンが挙げられる。
【０２３２】
正電荷または負電荷を有する能力を有する界面活性剤は、両性界面活性剤である。例としては、アクリル酸誘導体、置換アルキルアミド、Ｎ−アルキルベタインおよびホスファチドが挙げられる。
【０２３３】
「ミセル」は本明細書では、特定のタイプの分子構築物であり、その内部で両親媒性の分子が球状構造に配置され、それにより、分子の全ての疎水性の部分が内側を向き、親水性の部分を周囲水相と接触したまま残している。環境が疎水性の場合には、逆の配置が存在する。ミセルは、核酸、アルカリ金属アルキル硫酸塩、および少なくとも１種のミセル形成化合物の水溶液を混合することにより形成され得る。
【０２３４】
ミセル形成化合物の例としては、レシチン、ヒアルロン酸、ヒアルロン酸の薬学的に許容可能な塩、グリコール酸、乳酸、カモミール抽出物、キュウリ抽出物、オレイン酸、リノール酸、リノレン酸、モノオレイン、モノオレエート、モノラウラート、ボリジオイル、イブニングプリムローズオイル、メントール、トリヒドロキシオキソコラニルグリシンおよび薬学的に許容可能なその塩、グリセリン、ポリグリセリン、リシン、ポリリジン、トリオレイン、ポリオキシエチレンエーテルおよびその類似体、ポリドカノールアルキルエーテルおよびその類似体、ケノデオキシコール酸およびこれらの混合物が挙げられる。
【０２３５】
フェノールおよび／またはｍ−クレゾールを、混合ミセル組成物に加えて、安定化剤および保存剤として機能させ得る。グリセリンなどの等張性剤を添加し得る。
【０２３６】
核酸調製物は、微粒子などの粒子中に組み込まれ得る。微粒子は、噴霧乾燥、凍結乾燥、蒸発、流動床乾燥、真空乾燥、またはこれらの方法の組み合わせにより作製できる。
【０２３７】
本発明はまた、本発明の核酸または複合化核酸を含む組成物も提供する。医薬組成物は、薬物または診断薬として、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用し得る。例えば、本発明の核酸または複合化核酸は、送達担体（例えば、リポソーム）および／または担体、希釈剤などの賦形剤と組み合わせることができる。防腐剤および安定剤などの他の薬剤も添加できる。核酸または複合化核酸の送達方法は、当技術分野において既知であり、当業者の知識の範囲内にある。
【０２３８】
本発明の核酸または複合化核酸はまた、他の治療化合物と組み合わせて、別々に、または混合した単位用量として同時に、投与できる。本発明はまた、安定化剤、保存剤、希釈剤、緩衝剤などの生理学的に／薬学的に許容可能な賦形剤中の本発明による核酸または複合化核酸を含む医薬組成物も含む。
【０２３９】
医薬組成物は、固体または液体形態での投与用として特別に処方され得る。組成物は、経口投与、非経口的投与（例えば、皮下、筋肉内、静脈内、または硬膜外注射を含む）、局所投与、膣内または直腸内投与、舌下投与、眼投与、経皮投与、または経鼻投与用として処方され得る。皮下または静脈内による方法を用いた送達が好ましい。
【０２４０】
本発明の薬物および医薬組成物の投与量レベルは、定型的実験を用いて当業者により決定できる。一実施形態では、単位用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の核酸を含み得る。あるいは、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、または１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重、または０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。投与量レベルはまた、例えば、体表面積などのほかのパラメーターによっても計算し得る。
【０２４１】
医薬組成物は、無菌注射可能水性懸濁液または水溶液、または凍結乾燥形態であり得る。一実施形態では、医薬組成物は、凍結乾燥リポプレックスまたはリポプレックスの水性懸濁液を含み得る。リポプレックスは、好ましくは本発明の核酸を含む。このようなリポプレックスを用いて、本発明の核酸をインビトロまたはインビボで標的細胞へ送達し得る。
【０２４２】
本発明の医薬組成物および薬物は、薬学的有効量で哺乳動物対象に投与し得る。哺乳動物は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、ハムスターおよびモルモットから選択され得る。
【０２４３】
本発明のさらなる態様は、本発明の核酸もしくは複合化核酸、または疾患または障害の治療または予防に用いるための、本発明の核酸または複合化核酸を含む医薬組成物に関する。本発明は、安定化剤、保存剤、希釈剤、緩衝剤などの生理学的／薬学的に許容可能な賦形剤中の本発明による１種または複数のＲＮＡｉ分子を含む医薬組成物を含む。
【０２４４】
医薬組成物は、無菌注射可能水性懸濁液または水溶液、または凍結乾燥形態であり得る。
【０２４５】
薬学的に許容可能な組成物は、治療有効量の本発明によるいずれかの実施形態における１種または複数の核酸を、単独で採用してまたは１種または複数の薬学的に許容可能な担体、賦形剤および／または希釈剤と共に処方して含み得る。
【０２４６】
薬学的に許容可能な担体として機能し得る材料の例としては、下記が挙げられる：（１）糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース；（２）デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプン；（３）セルロース、およびその誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース；（４）トラガント末；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）潤滑剤、例えば、ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよび滑石；（８）賦形剤、例えば、カカオバターおよび坐剤ろう；（９）油類、例えば、ピーナッツ油、綿実油、ひまわり油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油および大豆油；（１０）グリコール、例えば、プロピレングリコール；（１１）ポリオール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール；（１２）エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル；（１３）寒天；（１４）緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質を含まない水；（１７）等張食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝剤液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）増量剤、例えば、ポリペプチドおよびアミノ酸；（２３）血清成分、例えば、血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬ；および（２２）医薬製剤で使用される他の非毒性適合物質。
【０２４７】
安定化剤は、核酸薬剤を安定化する薬剤、例えば、核酸と錯体を形成できるタンパク質、キレート化剤（例えば、ＥＤＴＡ）、塩、ＲＮアーゼ阻害剤、およびＤＮアーゼ阻害剤であり得る。
【０２４８】
いくつかの事例では、薬物の効果を持続させるために、皮下または筋肉注射からの薬物の吸収を遅らせるのが望ましい。これは、低い水溶性を有する結晶質または非晶質物質の懸濁液の使用により実現し得る。薬物の吸収速度はしたがって、その溶解速度に依存し、この溶解速度は、次に、結晶の大きさおよび結晶型に依存し得る。あるいは、非経口投与の薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビークル中に溶解または懸濁することにより実現される。
【０２４９】
本明細書で記載の核酸は、細胞中の標的遺伝子の発現を抑制可能である。本明細書で記載の核酸は、細胞中の標的遺伝子の発現を部分的に抑制可能である。抑制は完全、すなわち、本発明の核酸に非存在下での標的遺伝子発現の発現レベルの０％であり得る。標的遺伝子発現の抑制は、部分的であり得、すなわち、発現は、本発明の核酸の非存在下での標的遺伝子発現の１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または中間値であり得る。抑制は、ヒト対象などの対象に使用した場合、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、または最大３ヶ月間継続する。核酸または核酸を含む組成物は、毎週１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、５週毎に１回、６週毎に１回、７週毎に１回または８週毎に１回の使用のためであり得る。核酸は、皮下に、静脈内で使用するための、または経口、直腸または腹腔内などの任意の他の適用経路で使用するためのものであり得る。
【０２５０】
本発明の核酸で治療されているまたはこれを受けている細胞および／または対象では、標的遺伝子発現が、未治療細胞および／または対象に比べて、少なくとも約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは１００％だけ抑制され得る。抑制のレベルは、標的遺伝子の発現または過剰発現に関連する疾患の治療を可能にし得、または遺伝子産物の機能のさらなる調査を可能にし得る。
【０２５１】
標的遺伝子は、次記であり得る：第ＶＩＩ因子、Ｅｇ５、ＰＣＳＫ９、ＴＰＸ２、ａｐｏＢ、ＳＡＡ、ＴＴＲ、ＲＳＶ、ＰＤＧＦ  β遺伝子、Ｅｒｂ−Ｂ遺伝子、Ｓｒｃ遺伝子、ＣＲＫ遺伝子、ＧＲＢ２遺伝子、ＲＡＳ遺伝子、ＭＥＫＫ遺伝子、ＪＮＫ遺伝子、ＲＡＦ遺伝子、Ｅｒｋｌ／２遺伝子、ＰＣＮＡ（ｐ２１）遺伝子、ＭＹＢ遺伝子、ＪＵ遺伝子、ＦＯＳ遺伝子、ＢＣＬ−２遺伝子、ヘプシジン、活性化タンパク質Ｃ、サイクリンＤ遺伝子、ＶＥＧＦ遺伝子、ＥＧＦＲ遺伝子、サイクリンＡ遺伝子、サイクリンＥ遺伝子、ＷＮＴ−１遺伝子、β−カテニン遺伝子、ｃ−ＭＥＴ遺伝子、ＰＫＣ遺伝子、ＮＦＫＢ遺伝子、ＳＴＡＴ３遺伝子、サバイビン遺伝子、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ遺伝子、トポイソメラーゼＩ遺伝子、トポイソメラーゼＩＩα遺伝子、ｐ７３遺伝子での変異、ｐ２１（ＷＡＦ  ｌ／ＣＩＰｌ）遺伝子での変異、ｐ２７（ＫＩＰｌ）遺伝子での変異、ＰＰＭ  ＩＤ遺伝子での変異、ＲＡＳ遺伝子での変異、カベオリン遺伝子での変異、ＭＩＢ  Ｉ遺伝子での変異、ＭＴＡＩ遺伝子での変異、Ｍ６８遺伝子での変異、腫瘍抑制因子遺伝子での変異、およびｐ５３腫瘍抑制因子遺伝子での変異。
【０２５２】
本発明のさらなる態様は、疾患または障害の治療または予防のための薬物の製造における本発明の核酸または複合化核酸に関する。
【０２５３】
また、本発明には、疾患または障害の治療または予防の方法が含まれ、方法は、治療を必要としている個体への本明細書に記載の核酸または複合化核酸含む医薬組成物の投与を含む。核酸組成物は、毎週２回、毎週１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、５週毎に１回、６週毎に１回、７週毎に１回または８週毎に１回投与され得る。核酸は、皮下に、静脈内にまたは経口、直腸もしくは腹腔内などのいずれか他の適用経路を用いて対象に投与され得る。
【０２５４】
一実施形態では、対象は、核酸薬剤の初期量および１つまたは複数の維持量を投与される。維持量は初期量と同じまたはそれより少ない量、例えば、初期量の半分であり得る。維持量は、例えば、２、５、１０、または３０日毎に１回程度投与される。治療計画は、特定の疾患の性質、その重症度および患者の全身状態に応じて変化する、一定期間にわたり継続される。
【０２５５】
一実施形態では、組成物は、複数の核酸薬剤種を含む。別の実施形態では、核酸薬剤種は、天然の標的配列について、別の種とはオーバーラップせずまた隣接もしない配列を有する。別の実施形態では、複数の核酸薬剤種は、異なる天然の標的遺伝子に特異的である。別の実施形態では、核酸薬剤はアレル特異的である。
【０２５６】
本発明の核酸または複合化核酸はまた、他の治療化合物と組み合わせて、別々に、または、例えば、混合した単位用量として同時に使用するために投与できる。
【０２５７】
本発明の核酸または複合化核酸は、化学合成または核酸のインビトロ（例えば、ラン・オフ転写）またはインビボでの発現を含む当該技術分野における定型的方法を用いて作製できる。例えば、固相化学合成を用いて、または発現ベクターを用いて、作製できる。一実施形態では、発現ベクターは、本発明の核酸を標的細胞中で作製できる。
【０２５８】
本明細書で記載の核酸の合成方法は、当業者には既知である。
【０２５９】
化合物例を当業者に既知の方法に従って合成した。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築は、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施され得る。スキーム１は、固相オリゴヌクレオチド合成中にＧａｌＮＡｃ樹枝状クラスターを構築するのに必要なトレブラーアミダイトＣ４ｘｌｔ−ｐｈｏｓおよびＧａｌＮＡｃアミダイト（ＳＴ２３−ｐｈｏｓ）を示す。Ｃ４ＸＬＴ−ｐｈｏｓならびにＳＴ２３−ｐｈｏｓの合成は、国際公開第２０１７／１７４６５７号に記載の通りに実施し得る。
スキーム１：三価の樹枝状ＧａｌＮＡｃクラスターのオンカラム複合化に使用されるトレブラーアミダイトおよびＧａｌＮＡｃアミダイトの構造
【化６３】
2021502411.tif 000073
【０２６０】
樹枝状ＧａｌＮＡｃクラスター複合化ＳｉＲＮＡのオリゴヌクレオチド合成は、図１１示すスキーム２に概要が示される。
【０２６１】
オリゴヌクレオチド鎖構築は、塩基担持担体、例えば、化合物例Ａ０１４９（ＳＴＳ１２００９ＶＬ１５Ｌ４Ｂ）の場合のように、５’ＤＭＴ−２’ＦｄＵ−スクシネート−ｌｃａａ−ＣＰＧを用いて開始され得る。第１のジチオリン酸結合の導入のために、ホスホラミダイト合成カップリングサイクルは、１）ＤＭＴ除去、２）必要なＤＭＴマスクチオホスホラミダイトを用いた鎖延長、３）非延長オリゴヌクレオチド鎖のキャッピング、続けて、ＥＤＩＴＨによるＰ（ＩＩＩ）からＰ（Ｖ）への酸化、および再度のキャッピング（Ｃａｐ／Ｔｈｉｏ／Ｃａｐ）、からなる。その後、合成サイクルを、生成物が完全長に達するまで、リン酸ジエステルまたはホスホロチオエート結合が望まれるかどうかに応じて、標準的ＤＭＴ−ホスホラミダイトおよびＣａｐ／Ｏｘ／ＣａｐまたはＣａｐ／Ｔｈｉｏ／Ｃａｐを用いて反復し得る。三価の樹枝状ＧａｌＮＡｃクラスターのオンカラム複合化に対しては、必要な三価の分岐アミダイトＣ４ＸＬＴを用いる同じ合成サイクルと、続いて、ＧａｌＮＡｃアミダイトＳＴ２３を用いる別の合成サイクルラウウンドが適用され得る。この最後の合成装置ステップの完了時に、オリゴヌクレオチドが固体担体から切断され、追加の保護基がメチルアミン処理により除去され得る（ジチオリン酸が存在する場合には、２０ｍＭのＤＴＴの存在下で）。粗生成物は、その後、ＮａＣｌ勾配を適用するＡＥＸ−ＨＰＬＣにより精製され得る。ＩＥＸ精製由来の過剰な塩をＳＥＣにより除去して、最終生成物を得た。
【０２６２】
全ての最終一本鎖生成物をＡＥＸ−ＨＰＬＣにより分析し、それらの純度を検査し得る。純度は、％ＦＬＰ（完全長生成物の％）で示され、これは、最終生成物のＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析のＵＶ出力における帰属生成物シグナル下のＵＶ面積のパーセンテージであり得る。それぞれの一本鎖生成物（非修飾またはＧａｌＮＡｃ複合化オリゴヌクレオチド）の確認を、ＬＣ−ＭＳ分析により実施し得る。
【０２６３】
二本鎖ｓｉＲＮＡの二本鎖形成は、それぞれの一本鎖の等モル添加および８０℃への加熱により達成され得る。室温へのゆっくりした冷却は、完全な二本鎖形成をもたらす。二本鎖形成に続いて、ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ（イオン対逆相ＨＰＬＣ）が実施され得る。二本鎖純度は、％二本鎖で与えられ得、これは、ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ分析のＵＶ出力における帰属生成物シグナル下のＵＶ面積のパーセンテージである。
【０２６４】
本発明は、本明細書で記載の本発明のいずれかの態様による核酸もまた提供し、第１のＲＮＡ鎖は、末端５’（Ｅ）ビニルホスホネートヌクレオチドを有し、末端５’（Ｅ）ビニルホスホネートヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合により第１の鎖中の第２のヌクレオチドに結合されるのが好ましい。
【０２６５】
一実施形態では、第１の鎖は、２つ以上のリン酸ジエステル結合を含み得る。
一実施形態では、第１の鎖は、少なくとも末端の３つの５’ヌクレオチド間にリン酸ジエステル結合を含み得る。
一実施形態では、第１の鎖は、少なくとも末端の４つの５’ヌクレオチド間にリン酸ジエステル結合を含み得る。
一実施形態では、第１の鎖は、式（ＸＶＩＩ）：
（ｖｐ）−Ｎ（ｐｏ）［Ｎ（ｐｏ）］ｎ−    （ＸＶＩＩ）
を含み得、式中、「ｖｐ」は、５’（Ｅ）ビニルホスホネートであり、「Ｎ」はヌクレオチドであり、「ｐｏ」はリン酸ジエステル結合であり、ｎは１〜（第１の鎖中のヌクレオチドの総数−２）であり、好ましくは、ｎは１〜（第１の鎖中のヌクレオチドの総数−３）であり、より好ましくは、ｎは１〜（第１の鎖中のヌクレオチドの総数−４）である。
【０２６６】
一実施形態では、第１の鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート（ｐｓ）結合を含み得る。
一実施形態では、第１の鎖は、末端の２つの３’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合または末端の３つの３’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合をさらに含み得る。
一実施形態では、第１の鎖のその他のヌクレオチド間の結合は、リン酸ジエステル結合である。
一実施形態では、第１の鎖は、２つ以上のホスホロチオエート結合を含み得る。
【０２６７】
さらなる実施形態では、第２の鎖は、末端の２つの３’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合または末端の３つの３’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。
別のさらなる実施形態では、第２の鎖は、末端の２つの５’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合または末端の３つの５’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。
【０２６８】
ある実施形態では、末端５’（Ｅ）ビニルホスホネートヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチドである。
【０２６９】
末端５’（Ｅ）ビニルホスホネートヌクレオチドは、５’−末端の天然のリン酸基がＥ−ビニルホスホネートで置換されているヌクレオチドであり、この場合、５’リン酸化された鎖の末端ヌクレオチドの架橋５’−酸素原子がメチニル（−ＣＨ＝）基で置換されている：
【化６４】
2021502411.tif 000074
５’−末端に天然のリン酸を有するヌクレオチド
【化６５】
2021502411.tif 000075
５’末端に天然のＥ−ビニルホスホネートを有するヌクレオチド
【０２７０】
５’（Ｅ）ビニルホスホネートは５’−リン酸模倣物である。生物学的模倣物は、模倣されている元の分子と同じ機能を実行でき、元の分子に構造的に極めて類似の分子である。本発明の場合、５’（Ｅ）ビニルホスホネートは、正規の５’−リン酸の機能、例えば、効率的ＲＩＳＣ担持を可能とする機能を模倣する。さらに、その僅かに変化した構造のために、５’（Ｅ）ビニルホスホネートは、ホスファターゼなどの酵素による脱リン酸化から保護することにより、５’−末端ヌクレオチドを安定化できる。
【０２７１】
本発明の一態様は、細胞中の標的遺伝子の発現を抑制するための本明細書で開示の核酸であり、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖が上記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ＲＩＳＣによる核酸のプロセッシングを容易にするために、上記第１の鎖が複数の位置に修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドを含む。
【０２７２】
一態様では、「ＲＩＳＣによるプロセッシングを容易にする」は、核酸はＲＩＳＣによりプロセッシングされ得、例えば、いずれかの存在する修飾は、核酸がＲＩＳＣによりプロセッシングされることを可能とし、それにより、ｓｉＲＮＡ活性が適切に生じ得ることを意味する。
【０２７３】
第１の鎖の５’末端からの位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第１の鎖の位置１３に対応する第２の鎖のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０２７４】
第１の鎖上の位置に「対応する」第２の鎖上のヌクレオチドは、適切には、第１の鎖上のそのヌクレオチドと塩基対を形成するヌクレオチドである。
一態様では、第１の鎖の位置１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドは、第１の鎖の位置１３と塩基対を形成するヌクレオチドである。
一態様では、第１の鎖の位置１１に対応する第２の鎖上のヌクレオチドは、第１の鎖の位置１１と塩基対を形成するヌクレオチドである。
一態様では、第１の鎖の位置１２に対応する第２の鎖上のヌクレオチドは、第１の鎖の位置１２と塩基対を形成するヌクレオチドである。
【０２７５】
この命名法は、第２の鎖の他の位置にも適用され得る。例えば、二本鎖で平滑末端である１９マー核酸では、第１の鎖の位置１３は、第２の鎖の位置７と対を形成するであろう。第１の鎖の位置１１は、第２の鎖の位置９と対を形成するであろう。この命名法は、第２の鎖の他の位置にも適用され得る。
【０２７６】
第１の鎖の位置１３に対応するヌクレオチドは、適切には、二本鎖領域の第１のヌクレオチドから出発して、第２の鎖の３’から数えて第２の鎖の位置１３である。同様に、第２の鎖の位置１１は、適切には、二本鎖領域の第１のヌクレオチドから出発して、第２の鎖の３’から１１番目である。この命名法は、第２の鎖の他の位置にも適用され得る。
【０２７７】
一態様では、部分的に相補的な第１と第２の鎖の場合には、第１の鎖上の位置に「対応する」第２の鎖のヌクレオチドは、その位置がミスマッチが存在する位置である場合には、塩基対を形成するとは限らないが、命名法の原理は、まだ当てはまる。
【０２７８】
二重鎖領域全体で（全てのオーバーハング領域を無視して）完全に相補的であり、核酸の二本鎖領域内でミスマッチが存在しない第１と第２の鎖が好ましい。
【０２７９】
また、好ましいのは、次の核酸である。
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第１の鎖の位置１１に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第１の鎖の位置１１および１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０２８０】
一態様では、第１の鎖の位置１２に対応する第２の鎖上のヌクレオチドは、２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない。この核酸に対する制限は、本明細書で記載のいずれか他の制限でも認められ得る。
【０２８１】
従って、本発明の別の態様は、第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第１の鎖の位置１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸である。
【０２８２】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。
【０２８３】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾され、および第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０２８４】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾され、および第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。
【０２８５】
第１および／または第２の鎖のヌクレオチドの５０％超が２’Ｏ−メチル修飾を含み、例えば、好ましくは第１と第２の両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして測定して、第１および／または第２の鎖の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、もしくは８５％またはそれ超が２’Ｏ−メチル修飾を含む、本明細書で開示の核酸。
【０２８６】
第１および／または第２の鎖のヌクレオチドの５０％超が天然のＲＮＡ修飾を含み、例えば、好ましくは第１と第２の両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして測定して、第１および／または第２の鎖の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、もしくは８５％またはそれ超がこのような修飾を含む、本明細書で開示の核酸。好適な天然修飾には、２’Ｏメチルに加えて、その他の２’糖修飾、特にＤＮＡヌクレオチドをもたらす２’Ｈ修飾が含まれる。
【０２８７】
好ましくは、第１と第２両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして、２０％以下、例えば、１５％以下、または、例えば、１０％超の第１および／または第２の鎖上の２’Ｏメチル修飾ではない２’修飾を有するヌクレオチドを含む、本明細書で開示の核酸。
【０２８８】
好ましくは、両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして、２０％以下（例えば、１５％以下、または、例えば、１０％超）の第１および／または第２の鎖上の２’フルオロ修飾を含む、本明細書で開示の核酸。
【０２８９】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４および第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドを除いて、すべてのヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。好ましくは、２’Ｏ−メチルにより修飾されないヌクレオチドは、２’位置でフルオロにより修飾される。
【０２９０】
好ましいのは、核酸の全てのヌクレオチドが糖上の２’位置で修飾される、本明細書で開示の核酸である。好ましくは、これらのヌクレオチドは、２’Ｏ−メチル修飾ではなく、２’−フルオロ修飾により修飾される。
【０２９１】
本発明の核酸は、２’位置で２’Ｈにより修飾された１個または複数のヌクレオチドを含み得、従って、核酸内にＤＮＡヌクレオチドを有する。本発明の核酸は、第１の鎖の５’末端から数えて、第１の鎖の位置２および／または１４にＤＮＡヌクレオチドを含み得る。核酸は、第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上にＤＮＡヌクレオチドを含み得る。
一態様では、本発明の核酸当たり１個のＤＮＡが存在する。
【０２９２】
本発明の核酸は、１個または複数のＬＮＡヌクレオチドを含み得る。本発明の核酸は、第１の鎖の５’末端から数えて、第１の鎖の位置２および／または１４にＬＮＡヌクレオチドを含み得る。核酸は、第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上にＬＮＡを含み得る。
【０２９３】
一態様では、核酸は、第１の鎖で交互の２−Ｏメチル修飾および２フルオロ修飾により修飾され、位置２および１４（５’末端から出発して）は２’フルオロで修飾される。好ましくは、第２の鎖は、第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドで２’フルオロ修飾により修飾される。好ましくは第２の鎖は、相補（二本鎖）領域の最初の位置で開始して３’末端から数えて位置１１〜１３で２’フルオロ修飾により修飾され、残りの修飾は天然の修飾、好ましくは２’Ｏ−メチルである。
【０２９４】
一態様では、本発明の核酸は、１個または複数の逆位リボヌクレオチド、好ましくは、第２の鎖の３’末端で、５’−５’結合または３’−３’結合、好ましくは３’−３’結合を用いた逆位アデニンを含む。
【０２９５】
一態様では、核酸は、１、２、３または４つのジチオリン酸結合などの１つまたは複数のジチオリン酸結合を含む。好ましくは、第１と第２の鎖の５’および３’末端にそれぞれ１つずつ、最大で４つのジチオリン酸結合が存在する。
【０２９６】
全ての核酸の特徴は、本明細書で開示の全ての他の本発明の態様と組み合わせることができる。
【０２９７】
特に、好ましいのは、第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、核酸が下記の１つまたは複数または全てを含むｓｉＲＮＡ分子である核酸である：
（ｉ）好ましくは、第２の鎖の３’末端で３’−３’結合の、逆位ヌクレオチド；
（ｉｉ）１つまたは複数のジチオリン酸結合；
（ｉｉｉ）第１の鎖の位置１１または１３に対応する第２の鎖のヌクレオチドであって、２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、好ましくは、これらの位置の一方または両方が２’フルオロ修飾を含む、第２の鎖のヌクレオチド；
（ｉｖ）全てのヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチル修飾を有するヌクレオチドを含む核酸；
（ｖ）２０％以下の２’フルオロ修飾を有するヌクレオチドを含む核酸。
【０２９８】
また、本発明で提供されるのは、第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドおよび第２の鎖の５’末端から位置７および／または９または７〜９のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾され、および残りのヌクレオチドの少なくとも９０％が２’Ｏメチル修飾されるか、または別の天然２’修飾を含む、本明細書で開示の核酸である。
オーバーハングのない平滑末端化二本鎖１９塩基核酸で、特に好ましい例は：
【０２９９】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第２の鎖の５’末端からの位置７のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸である。
【０３００】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第２の鎖の５’末端からの位置９のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０３０１】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第２の鎖の５’末端からの位置７および９のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０３０２】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第２の鎖の５’末端からの位置７〜９のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０３０３】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第２の鎖の５’末端からの位置７および／または９、または７〜９のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。
【０３０４】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾され、および第２の鎖の５’末端からの位置７および／または９、または７〜９のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０３０５】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾され、および第２の鎖の５’末端からの位置７および／または９、または７〜９のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。
【０３０６】
第１および／または第２の鎖のヌクレオチドの５０％超が２’Ｏ−メチル修飾を含み、例えば、好ましくは第１と第２の両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして測定して、第１および／または第２の鎖の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、もしくは８５％またはそれ超が２’Ｏ−メチル修飾を含む、本明細書で開示の核酸。
【０３０７】
第１および／または第２の鎖のヌクレオチドの５０％超が天然のＲＮＡ修飾を含み、例えば、好ましくは第１と第２の両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして測定して、第１および／または第２の鎖の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、もしくは８５％またはそれ超がこのような修飾を含む、本明細書で開示の核酸。好適な天然修飾には、２’Ｏメチルに加えて、その他の２’糖修飾、特にＤＮＡヌクレオチドをもたらす２’Ｈ修飾が含まれる。
【０３０８】
好ましくは、第１と第２両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして、２０％以下、例えば、１５％以下、または、例えば、１０％超の第１および／または第２の鎖上の２’Ｏメチル修飾ではない２’修飾を有するヌクレオチドを含む、本明細書で開示の核酸。
【０３０９】
好ましくは、両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして、２０％以下（例えば、１５％以下、または、例えば、１０％超）の第１および／または第２の鎖上の２’フルオロ修飾を含む、本明細書で開示の核酸。
【０３１０】
第１の鎖の５’末端からの位置２および１４および第２の鎖の５’末端からの位置７および／または９のヌクレオチドを除き、全てのヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。好ましくは、２’Ｏ−メチルにより修飾されないヌクレオチドは、２’位置でフルオロにより修飾される。
【０３１１】
第１の鎖の５’末端からの位置２および１４および第２の鎖の５’末端からの位置７〜９のヌクレオチドを除き、全てのヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。好ましくは、２’Ｏ−メチルにより修飾されないヌクレオチドは、２’位置でフルオロにより修飾される。
【０３１２】
２０塩基対二重鎖領域を含む核酸では、第２の鎖は、好ましくは第１の鎖の位置１３，１２および１１にそれぞれ対応する二本鎖の５’末端から数えてヌクレオチド８または９または１０の２’Ｏ−メチル基を有さない。
【０３１３】
２１塩基対二重鎖領域を含む核酸では、第２の鎖は、好ましくは第１の鎖の位置１３，１２および１１にそれぞれ対応する二本鎖の５’末端から数えてヌクレオチド９または１０または１１の２’Ｏ−メチル基を有さない。
【０３１４】
本発明はまた、本明細書で開示の全ての修飾配列の非修飾配列にも関する。
本発明は、ここで以下の非限定的な図および実施例を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【０３１５】
【図１】末端位置で２つのホスホロチオエート（ＰＳ）、１つのＰＳ、２つのジチオリン酸（ＰＳ２）、および１つのＰＳ２を含むＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の血清安定性アッセイの結果を示す図である。
【図２】末端位置で２つのＰＳ、１つのＰＳ、２つのＰＳ２、および１つのＰＳ２を含み、ＧａｌＮＡｃ部分中にＰＳを含まないＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の血清安定性アッセイの結果を示す図である。
【図３】個々の末端で１つのＰＳ２を含むＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の血清安定性アッセイの結果を示す図である。
【図４】個々の末端で１つのＰＳ２を含むＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の活性を示す図である。
【図５】第２の鎖の５’−末端でおよび第２の鎖の３’−末端でそれぞれ１つのＰＳ２を含みリンカー部分中にＰＳを含まないＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の血清安定性アッセイの結果を示す図である。
【図６】第２の鎖の５’−末端でおよび第２の鎖の３’−末端でそれぞれ１つのＰＳ２を含みＧａｌＮＡｃ部分中にＰＳを含まないＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の活性を示す図である。
【図７】内部ＰＳを含まないＧａｌＮＡｃ部分と一緒に、種々のｓｉＲＮＡ末端でＰＳ２を含むｓｉＲＮＡ複合体配列を示す図である。
【図８】内部ＰＳを含まないＧａｌＮＡｃ部分と一緒に、種々のｓｉＲＮＡ末端でＰＳ２を含むＧａｌＮＡｃ  ｓｉＲＮＡ複合体の血清安定性を示す図である。
【図９】内部ＰＳを含まないＧａｌＮＡｃ部分と一緒に、種々のｓｉＲＮＡ末端でＰＳ２を含むＧａｌＮＡｃ  ｓｉＲＮＡ複合体のインビトロ活性を示す図である。
【図１０】は、ジチオリン酸結合を含む樹枝状三価のＧａｌＮＡｃ複合化オリゴヌクレオチドの合成フローチャートを示す。
【図１１】は、ジチオリン酸結合を含む別の樹枝状三価のＧａｌＮＡｃ複合化オリゴヌクレオチドの合成フローチャートを示す。
【図１２】異なるｓｉＲＮＡ末端でＰＳ２を含むＧａｌＮＡｃ  ｓｉＲＮＡ複合体のインビボｍＲＮＡ低減活性を示す図である。
【図１３】異なるｓｉＲＮＡ末端でＰＳ２を含むＧａｌＮＡｃ  ｓｉＲＮＡ複合体のインビボでの血清鉄低減活性を示す図である。
【図１４】内部ＰＳを含むまたは含まないＧａｌＮＡｃ部分と一緒に、種々のｓｉＲＮＡ末端でＰＳ２およびＰＳを含むＧａｌＮＡｃ  ｓｉＲＮＡ複合体のインビトロ活性を示す図である。
【図１５】第２の鎖の５’および３’末端で各１つのセリノール結合ＧａｌＮＡｃおよび末端ジチオリン酸を含むｓｉＲＮＡ複合体の活性を示す図である。
【図１６】リンカーを介してリガンドに結合された核酸の種々の実施形態の模式図を示す。
【０３１６】
実施例
実施例１
一般手順
ｓｉＲＮＡ修飾：ホスホロチオエート（ＰＳ）またはジチオリン酸結合（ＰＳ２）を有するｓｉＲＮＡの合成。
【０３１７】
化合物例を、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成した。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築は、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施した。
【０３１８】
オリゴヌクレオチド合成、脱保護および精製は、当技術分野において既知の標準的手順に従った。
【０３１９】
全てのオリゴヌクレオチドは、標準的ホスホラミダイト化学を用いて、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置で合成した。商業的に入手できる固体担体および２’Ｏ−メチルＲＮＡホスホラミダイト、２’フルオロ、２’デオキシＲＮＡホスホラミダイト（全て標準的保護、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，ＬｉｎｋＴｅｃｈ）およびチオホスホラミダイト（ＡＭ  Ｂｉｏｔｅｃｈ，ＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ）を製造者の推奨手順に従って使用した。
ＳＴ４１（ＳＴ４１−ｐｈｏｓ）ならびにＳＴ２３（ＳＴ２３−ｐｈｏｓ）のホスホラミダイト誘導体の合成は、国際公開第２０１７／１７４６５７号に記載されている通りに実施できる。
ＳＴ４１−ｐｈｏｓ：
【化６６】
2021502411.tif 000076
ＳＴ２３−ｐｈｏｓ：
【化６７】
2021502411.tif 000077
【０３２０】
付随的な試薬は、ＥＭＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。合成は、乾燥アセトニトリル中のホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液を用いて実施し、ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）（アセトニトリル中の０．３Ｍ）を活性化剤として使用した。カップリング時間は１５分であった。Ｃａｐ／ＯＸ／ＣａｐまたはＣａｐ／Ｔｈｉｏ／Ｃａｐサイクルを適用した（Ｃａｐ：Ａｃ２Ｏ／ＮＭＩ／ルチジン／アセトニトリル、酸化剤：ピリジン／Ｈ２Ｏ中の０．１ＭのＩ２）。ホスホロチオエートおよびジチオリン酸は、アセトニトリル中の５０ｍＭのＥＤＩＴＨを用いて導入した。その他の全ての試薬および溶媒は商業的に入手し、標準的試薬品質で使用した。
【０３２１】
ＤＭＴ切断は、トルエン中の３％ジクロロ酢酸で処理することにより行った。プログラム合成繰り返しの完了時に、ジエチルアミン（ＤＥＡ）洗浄を実施した。全てのオリゴヌクレオチドをＤＭＴオフモードで合成した。
【０３２２】
４０％のメチルアミン水溶液処理により、一本鎖をＣＰＧから切断した。得られた粗製オリゴヌクレオチドは、塩化ナトリウム勾配を用いて、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍのイオン交換クロマトグラフィー（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ、６ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。画分含有生成物をプールし、サイズ排除カラム（Ｚｅｔａｄｅｘ，ＥＭＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩し、凍結乾燥した。
【０３２３】
オリゴヌクレオチドの合成
全ての一本鎖オリゴヌクレオチドは、上記および図１０に記載の反応条件に従って合成された。
【０３２４】
全ての最終一本鎖生成物をＡＥＸ−ＨＰＬＣにより分析し、それらの純度を検査した。純度は、％ＦＬＰ（完全長生成物の％）で示し、これは、最終生成物のＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析のＵＶ出力における帰属生成物シグナル下のＵＶ面積のパーセンテージである。それぞれの一本鎖生成物（非修飾、アミノ修飾、前駆物質またはＧａｌＮＡｃ複合化オリゴヌクレオチド）の確認をＬＣ−ＭＳ分析により実施した。
【表１】
2021502411.tif 000078
【０３２５】
二本鎖形成
個別の一本鎖をＨ２Ｏ中の６０ＯＤ／ｍＬの濃度に溶解した。両方の個別のオリゴヌクレオチドを反応容器に一緒に加えた。反応監視を容易にするために、滴定を行った。２６０ｎｍでのＵＶ−吸収により測定して、第１の鎖を、第２の鎖に比べて２５％過剰で添加した。上記反応混合物を、例えば、８０℃で５分間に加熱後、ゆっくり室温に冷却した。二本鎖形成をイオン対逆相ＨＰＬＣにより監視した。残留一本鎖ＵＶ面積から、第２の鎖の必要量を計算し、反応混合物に添加した。反応系を８０℃に再度加熱後、ゆっくり室温に冷却した。残留一本鎖の検出が１０％未満になるまで、この手順を反復した。
【表２】
2021502411.tif 000079
【０３２６】
実施例２
末端位置で２つのＰＳ（ＳＴＳ１２００９Ｌ４）、１つのＰＳ（ＳＴＳ１２００９Ｖ２１Ｌ４）、２つのＰＳ２（ＳＴＳ１２００９Ｖ１６Ｌ４）、および１つのＰＳ２（ＳＴＳ１２００９Ｖ１５Ｌ４）を含むＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の血清安定性アッセイ。ＧａｌＮＡｃは第２の鎖の５’−末端に結合され、４つのＰＳにより内部的に安定化される。ホスホロチオエートおよびジチオリン酸はそれぞれ、第１の鎖の５’−末端、第１の鎖の３’−末端、および第２の鎖の３’−末端に配置された。５μＭのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体を５０％ＦＢＳと共に、３７℃で３日間インキュベートした。ＲＮＡを抽出し、２０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分析し、結果を図１に示す。「ＵＴ」は、未処理試料を示し、「ＦＢＳ」は、ＦＢＳ処理を示す。「対照」は、それほど安定化されていない異なる配列のＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体を示す。
配列を表３示す。
【表３】
2021502411.tif 000080
ｍＡ、ｍＵ、ｍＣ、ｍＧ：２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ
ｆＡ、ｆＵ、ｆＣ、ｆＧ：２’−Ｆ  ＲＮＡ
（ｐｓ）：ホスホロチオエート
（ｐｓ２）：ジチオリン酸
【０３２７】
実施例３
末端位置で２つのＰＳ（ＳＴＳ１２００９Ｌ４、ＳＴＳ１２００９Ｖ２０Ｌ５０）、１つのＰＳ（ＳＴＳ１２００９Ｖ１９Ｌ５０）、２つのＰＳ２（ＳＴＳ１２００９Ｖ１８Ｌ５０）、および１つのＰＳ２（ＳＴＳ１２００９Ｖ１７Ｌ５０）を含むＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の血清安定性アッセイ。変種の−Ｖ２０、−Ｖ１９、−Ｖ１８および−Ｖ１７では、ＧａｌＮＡｃは第２の鎖の５’−末端に結合され、ＰＳを全く含まない。ホスホロチオエートおよびジチオリン酸はそれぞれ、第１の鎖の５’−末端、第１の鎖の３’−末端、第２の鎖の５’−末端、および第２の鎖の３’−末端に配置された。ＳＴＳ１２００９Ｌ４は、第１の鎖の５’−末端、第１の鎖の３’−末端および第２の鎖の３’−末端で２つの末端ＰＳを含み、ＧａｌＮＡｃは第２の鎖の５’−末端に結合され、４つの内部ＰＳにより安定化される。５μＭのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体を５０％ＦＢＳと共に、３７℃で３日間インキュベートした。ＲＮＡを抽出し、２０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分析した。結果を図２に示す。「ＵＴ」は、未処理試料を示し、「ＦＢＳ」は、ＦＢＳ処理を示す。
配列を表４に示す。
【表４】
2021502411.tif 000081
ｍＡ、ｍＵ、ｍＣ、ｍＧ：２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ
ｆＡ、ｆＵ、ｆＣ、ｆＧ：２’−Ｆ  ＲＮＡ
（ｐｓ）：ホスホロチオエート
（ｐｓ２）：ジチオリン酸
【０３２８】
実施例４
個々の末端で１つのＰＳ２を含むＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の血清安定性アッセイ。ＧａｌＮＡｃは第２の鎖の５’−末端に結合され、４つのＰＳにより内部的に安定化される。ホスホロチオエート修飾は、第１の鎖（ＳＴＳ１２００９Ｖ３７Ｌ４）の５’−末端、第１の鎖（ＳＴＳ１２００９Ｖ３６Ｌ４）の３’−末端、および第２の鎖（ＳＴＳ１２００９Ｖ３４Ｌ４）の３’−末端に配置された。全ての他の非複合化両端は、各２つの末端ＰＳにより安定化された。ＳＴＳ１２００９Ｌ４は、第１の鎖の５’−末端、第１の鎖の３’−末端および第２の鎖の３’−末端で２つの末端ＰＳを含む。５μＭのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体を５０％ＦＢＳと共に、３７℃で３日間インキュベートした。ＲＮＡを抽出し、２０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分析した。結果を図３に示す。「ＵＴ」は、未処理試料を示し、「ＦＢＳ」は、ＦＢＳ処理を示す。「対照」は、それほど安定化されていない異なる配列のＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体を示す。
配列を表５に示す。
【表５】
2021502411.tif 000082
ｍＡ、ｍＵ、ｍＣ、ｍＧ：２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ
ｆＡ、ｆＵ、ｆＣ、ｆＧ：２’−Ｆ  ＲＮＡ
（ｐｓ）：ホスホロチオエート
（ｐｓ２）：ジチオリン酸
【０３２９】
実施例５
個々の末端で１つのＰＳ２を含むＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の活性。ＧａｌＮＡｃは第２の鎖の５’−末端に結合され、４つのＰＳにより内部的に安定化される。ホスホロチオエート修飾は、第１の鎖（ＳＴＳ１２００９Ｖ３７Ｌ４）の５’−末端、第１の鎖（ＳＴＳ１２００９Ｖ３６Ｌ４）の３’−末端、および第２の鎖（ＳＴＳ１２００９Ｖ３４Ｌ４）の３’−末端に配置された。全ての他の非複合化末端は、各２つの末端ＰＳにより安定化された。ＳＴＳ１２００９Ｌ４は、第１の鎖の５’−末端、第１の鎖の３’−末端および第２の鎖の３’−末端でそれぞれ２つの末端ＰＳを含む。実験は、初代培養マウス肝細胞で実施した。細胞を６ウェル当たり２５０，０００細胞の濃度で播種し、１００ｎＭ、１０ｎＭおよび１ｎＭのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡで処理した。１０ｎＭのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡおよび１μｇ／ｍｌのＡｔｕｆｅｃｔでのトランスフェクションは、対照として機能した。細胞を２４時間後に溶解し、総ＲＮＡを抽出し、Ｔｍｐｒｓｓ６およびＰｔｅｎのｍＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。結果を図４に示す。各バーは、３回の技術的繰り返しの平均±ＳＤを表す。配列を表５に示す。
【０３３０】
実施例６
第２の鎖の５’−末端でおよび第２の鎖の３’−末端でそれぞれ１つのＰＳ２を含むＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体（ＳＴＳ１２００９Ｖ４０Ｌ５０）の血清安定性アッセイ。ＧａｌＮＡｃは第２の鎖の５’−末端に結合されたが、いずれの内部ＰＳによっても安定化されない。ＳＴＳ１２００９Ｌ４は、第１の鎖の５’−末端、第１の鎖の３’−末端および第２の鎖の３’−末端で２つの末端ＰＳを含み、ＧａｌＮＡｃは第２の鎖の５’−末端に結合され、４つの内部ＰＳにより安定化される。５μＭのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体を５０％ＦＢＳと共に、３７℃で３日間インキュベートした。ＲＮＡを抽出し、２０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分析した。結果を図５に示す。「ＵＴ」は、未処理試料を示し、「ＦＢＳ」は、ＦＢＳ処理を示す。
配列を表６に示す。
【表６】
2021502411.tif 000083
ｍＡ、ｍＵ、ｍＣ、ｍＧ：２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ
ｆＡ、ｆＵ、ｆＣ、ｆＧ：２’−Ｆ  ＲＮＡ
（ｐｓ）：ホスホロチオエート
（ｐｓ２）：ジチオリン酸
【０３３１】
実施例７
第２の鎖の５’−末端でおよび第２の鎖の３’−末端でそれぞれ１つのＰＳ２を含むＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体（ＳＴＳ１２００９Ｖ４０Ｌ５０）の活性。ＧａｌＮＡｃは第２の鎖の５’−末端に結合されたが、いずれの内部ＰＳによっても安定化されない。ＳＴＳ１２００９Ｌ４は、第１の鎖の５’−末端、第１の鎖の３’−末端および第２の鎖の３’−末端でそれぞれ２つの末端ＰＳを含む。ここで、ＧａｌＮＡｃは第２の鎖の５’−末端に結合され、４つの内部ＰＳにより安定化される。実験は、初代培養マウス肝細胞で実施した。細胞を６ウェル当たり２５０，０００細胞の濃度で播種し、１００ｎＭ、１０ｎＭおよび１ｎＭのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡで処理した。ルシフェラーゼに対するｓｉＲＮＡのＧａｌＮＡｃ複合体（「ＧａｌＮＡｃ−Ｌｕｃ」）は、対照として機能する。細胞を２４時間後に溶解し、総ＲＮＡを抽出し、Ｔｍｐｒｓｓ６およびＰｔｅｎのｍＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。結果を図６に示す。各バーは、３回の技術的繰り返しの平均±ＳＤを表す。配列を表６に示す。
【０３３２】
実施例８
ＧａｌＮＡｃ部分の末端位置にホスホロチオエート、ジチオリン酸およびリン酸ジエステルを有するＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体の血清安定性アッセイ。ＧａｌＮＡｃは、センス鎖の５’−末端に結合され、４つのＰＳにより内部的に安定化される（ＳＴＳ１２００９Ｌ４）か、またはそれにより安定化されない場合は、代わりにリン酸ジエステル結合を使用する（ＳＴＳ１２００９Ｖ５４Ｌ５０−Ｖ５７Ｌ５０）。ホスホロチオエート修飾は、第１の鎖の５’−末端（−Ｖ５４Ｌ５０）、３’−末端のみで（−Ｖ５５Ｌ５０、−Ｖ５７Ｌ５０）または第２の鎖のみの３’−末端で（−Ｖ５６Ｌ５０）を除く、二本鎖のすべての末端位置に配置された。特定のデザインでは、リン酸ジエステルは、ｓｉＲＮＡ二本鎖の末端位置に使用された（−Ｖ５６Ｌ５０、−Ｖ５７Ｌ５０）。
【０３３３】
５μＭのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体を５０％ＦＢＳと共に、３７℃で３日間インキュベートした。ＲＮＡを抽出し、２０％ＴＢＥポリアクリルアミドゲル上で分析した。「ＵＴ」は、未処理試料を示し、「ＦＢＳ」は、ＦＢＳ処理を示す。「対照」は、それほど安定化されていない異なる配列のＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ複合体を示す。
配列を図７に、結果を図８に示す。
【０３３４】
実施例９
種々の末端安定化化学（ホスホロチオエート、ジチオリン酸、リン酸ジエステル）を含むＴｍｐｒｓｓ６標的化ｓｉＲＮＡのＧａｌＮＡｃ複合体を、初代培養マウス肝細胞での受容体媒介取り込みにより試験した。ＧａｌＮＡｃは、第２の鎖の５’−末端に結合され、４つのＰＳにより内部的に安定化される（ＳＴＳ１２００９Ｌ４）か、またはそれにより安定化されない場合は、代わりにリン酸ジエステル結合を使用する（ＳＴＳ１２００９Ｖ５４Ｌ５０−Ｖ５７Ｌ５０）。ホスホロチオエート修飾は、第１の鎖の５’−末端（−Ｖ５４Ｌ５０）、３’−末端のみで（−Ｖ５５Ｌ５０、−Ｖ５７Ｌ５０）または第２の鎖のみの３’−末端で（−Ｖ５６Ｌ５０）を除く、二本鎖のすべての末端位置に配置された。特定のデザインでは、リン酸ジエステルは、ｓｉＲＮＡ二本鎖の末端位置に使用された（−Ｖ５６Ｌ５０、−Ｖ５７Ｌ５０）。
【０３３５】
実験を、初代培養マウス肝細胞で実施した。細胞を９６ウェル当たり２０，０００細胞の濃度で播種し、１２５ｎＭ〜０．２ｎＭのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡで処理した。細胞を２４時間後に溶解し、総ＲＮＡを抽出し、Ｔｍｐｒｓｓ６およびＰｔｅｎのｍＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。各バーは、３回の技術的繰り返しの平均±ＳＤを表す。
配列を図７に、結果を図９に示す。
【０３３６】
実施例１０
１個または複数の末端でジチオリン酸結合を含むＴｍｐｒｓｓ６標的化ＧａｌＮＡｃ複合体は、血清鉄およびＴｍｐｒｓｓ６  ｍＲＮＡのインビボレベルを効果的に低減する。
ＳＴＳ１２００９Ｌ４およびＳＴＳ１２００９Ｖ３４Ｌ４は、４つのホスホロチオエート結合により内部で安定化されるＧａｌＮＡｃ部分を含む。ＳＴＳ１２００９Ｖ５４Ｌ５０は、内部ホスホロチオエート不含のＧａｌＮＡｃ部分を含む。ＳＴＳ１２００９Ｌ４では、全ての非複合化末端は、各２つのホスホロチオエートにより安定化される。ＳＴＳ１２００９Ｖ３４Ｌ４では、１つのジチオリン酸結合が第２の鎖の３’末端に存在し、一方、全ての他の非複合化末端は、それぞれ２つのホスホロチオエートにより安定化される。ＳＴＳ１２００９Ｖ５４Ｌ５０では、それぞれ１つのジチオリン酸が第１の鎖の３’末端、第２の鎖の５’末端および第２の鎖の３’末端に存在する。第１の鎖の５’末端は、２つのホスホロチオエートにより安定化される。これらのｓｉＲＮＡ複合体は、Ｔｍｐｒｓｓ６  ｍＲＮＡレベルおよび血清鉄レベルの用量依存性低減を示す。ジチオリン酸含有複合体ＳＴＳ１２００９Ｖ３４Ｌ４およびＳＴＳ１２００９Ｖ５４Ｌ５０は、ジチオリン酸を含まない基準化合物と同程度に活性である。従って、ホスホロチオエートの数は、活性を損なうことなく、１０個（ＳＴＳ１２００９Ｌ４）から８個（ＳＴＳ１２００９Ｖ３４Ｌ４）に、およびさらには２個（ＳＴＳ１２００９Ｖ５４Ｌ５０）に減らすことができる。ＳＴＳ１２００９Ｖ５７Ｌ５０は、第１の鎖の３’末端で、および第２の鎖の３’末端でそれぞれ１つのジチオリン酸結合を含む。両鎖の５’末端はリン酸ジエステルを含み、リンカー部分は内部リン酸ジエステルを含まない。このｓｉＲＮＡ複合体のインビボ活性は大きく低減される。
【０３３７】
Ｃ５７ＢＬ／６雄マウス（ｎ＝６）を３ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇおよび０．３ｍｇ／ｋｇのＧａｌＮＡｃ複合体で皮下治療した。肝臓切片を治療後７日に調製し、総ＲＮＡを組織から抽出し、ＴＭＰＲＳＳ６およびＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。加えて、血清鉄レベルを分析した。
配列を表７に、結果を図１２および１３に示す。
【０３３８】
実施例１１
末端ジチオリン酸を有するＧａｌＮＡｃ複合体はインビトロで活性である。
種々の末端安定化化学（ホスホロチオエート、ジチオリン酸、リン酸ジエステル）を含むＴｍｐｒｓｓ６標的化ｓｉＲＮＡのＧａｌＮＡｃ複合体を、初代培養マウス肝細胞で受容体媒介取り込みにより試験した。三分岐ＧａｌＮＡｃ部分が第２の鎖の５’−末端に結合され、Ｘ００２７、Ｘ０３４６、Ｘ０３４７中の４つのＰＳにより内部的に安定化される。この場合、第２の鎖の５’末端でホスホロチオエートは存在しない。Ｘ０２１４およびＸ０３４５では、ＧａｌＮＡｃ部分は、ホスホロチオエートを含まず、第２の鎖の５’末端でホスホロチオエートが存在する。Ｘ０２１４、Ｘ０３４５、Ｘ０３４６およびＸ０３４７では、ジチオリン酸修飾は、第１と第２の鎖の３’末端に存在する。第１の鎖の５’末端は、２つのホスホロチオエート（Ｘ０２１４、Ｘ０３４６）により安定化されるかまたは、リン酸ジエステル結合（Ｘ０３４５、Ｘ０３４７）を含む。記載した全ての複合体は、インビトロで標的ｍＲＮＡレベルを低減する。Ｘ０２１４およびＸ０３４６は、Ｘ０３４５およびＸ０３４７に比較して、低下された活性を示した。これは、第１の鎖の５’末端でのホスホロチオエートは、インビトロでｓｉＲＮＡの活性に悪影響を与えることを示唆する。
【０３３９】
実験を、初代培養マウス肝細胞で実施した。細胞を９６ウェル当たり２０，０００細胞の濃度で播種し、０．１ｎＭ、１ｎＭ、１０ｎＭおよび１００ｎＭのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡで処理した。細胞を２４時間後に溶解し、総ＲＮＡを抽出し、ＴＭＰＲＳＳ６およびＰＴＥＮのｍＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。各バーは、３回の技術的繰り返しの平均±ＳＤを表す。
配列を下表７に、データを図１４に示す。
【０３４０】
実施例１２
第２の鎖の５’および３’末端でそれぞれ１つのセリノール結合ＧａｌＮＡｃおよび末端ジチオリン酸を有するｓｉＲＮＡ複合体は、インビトロで活性である。
ＴＭＰＲＳＳ６標的化ＧａｌＮＡｃ−複合化ｓｉＲＮＡを、初代培養マウス肝細胞で受容体媒介取り込みにより試験した。Ｘ０４５４およびＸ０４５６の両方では、それぞれ１つのセリノール結合ＧａｌＮＡｃ部分を第２の鎖の５’および３’末端に結合した。両方の複合体は、第１の鎖の５’末端で（Ｅ）−ビニルホスホネートを含む。第１の鎖の５’末端でホスホロチオエートは存在しない。Ｘ０４５４では、それぞれ２つのホスホロチオエートが第１の鎖の３’末端でおよび第２の鎖の５’および３’末端で存在する。各ＧａｌＮＡｃ部分は１つのホスホロチオエートを含む。Ｘ０４５６では、それぞれ１つのホスホロチオエートが、第１の鎖の３’末端でおよび第２の鎖の５’および３’末端で最後の２つのヌクレオチド間に存在する。不確定の不斉中心はＸ０４５６には存在しない。１２５ｎＭのルシフェラーゼ標的化ＧａｌＮＡｃ複合化ｓｉＲＮＡを非標的化対照として用いた。これは、標的ｍＲＮＡレベルを低減しない。Ｔｍｐｒｓｓ６標的化複合体は両方とも、標的ｍＲＮＡのインビトロレベルを低減する。従って、ジチオリン酸は、第２の鎖の両端で単一ＧａｌＮＡｃ部分を有するｓｉＲＮＡの末端安定化に適用できる。
【０３４１】
実験を、初代培養マウス肝細胞で実施した。細胞を９６ウェル当たり２０，０００細胞の濃度で播種し、０．２ｎＭ、１ｎＭ、５ｎＭ、２５ｎＭ、および１２５ｎＭのＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡで処理した。細胞を２４時間後に溶解し、総ＲＮＡを抽出し、ＴＭＰＲＳＳ６およびＡｃｔｂのｍＲＮＡレベルをＴａｑｍａｎ  ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。各バーは、３回の技術的繰り返しの平均±ＳＤを表す。
配列を下表７に、データを図１５に示す。
【０３４２】
発明の記載
１．細胞中の標的遺伝子の発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖が上記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第１および／または第２の鎖が少なくとも２個のヌクレオチドの間にジチオリン酸結合を含む、核酸。
２．第１の鎖が、５’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのいずれかの間にジチオリン酸結合を含まない、記載１の核酸。
３．第１の鎖の３’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間にジチオリン酸結合を含む、記載１または２の核酸。
４．第２の鎖の３’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間にジチオリン酸結合を含む、記載１〜３の核酸。
５．第２の鎖の５’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間にホスホロチオエート結合または第２の鎖の５’末端で２、３または４個の末端ヌクレオチドのそれぞれの間にジチオリン酸結合を含む、記載１〜４のいずれか１つの核酸。
６．その末端にジチオリン酸結合が存在しない場合に第１の鎖上の３個の末端３’ヌクレオチドのそれぞれの間および／または３個の末端５’ヌクレオチドのそれぞれの間に、および／または第２の鎖の３個の３’末端ヌクレオチドのそれぞれの間および／または３個の５’末端ヌクレオチドのそれぞれの間にホスホロチオエート結合を含む、記載１〜５のいずれか１つに記載の核酸。
７．第１の鎖および第２の鎖が、別々の鎖である、記載１〜６のいずれかの核酸。
８．第１の鎖および第２の鎖を含む一本鎖を含む、記載１〜６のいずれかの核酸。
９．上記第１の鎖および／または上記第２の鎖が、それぞれ１７〜３５ヌクレオチド長である、記載１〜８のいずれかの核酸。
１０．少なくとも１つの二重鎖領域が、１７〜２５個のヌクレオチド塩基対からなる、記載１〜９のいずれかの核酸。
１１．記載１〜１０のいずれかの核酸であって、
ａ）両端で平滑末端であり；または
ｂ）一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し；または
ｃ）両端でオーバーハングを有する、核酸。
１２．第１および／または第２の鎖上の１個または複数のヌクレオチドが修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成する、記載１〜１１のいずれかの核酸。
１３．第１の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが修飾される、記載１２の核酸。
１４．第１の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが、少なくとも第２の修飾により修飾され、少なくとも第２の修飾が、記載１３の修飾とは異なる、記載１３の核酸。
１５．１個または複数の修飾偶数ヌクレオチドの内の少なくとも１個が、１個または複数の修飾奇数ヌクレオチドの少なくとも１個に隣接する、記載１４の核酸。
１６．複数の奇数ヌクレオチドが修飾される、記載１３〜１５のいずれか１つの核酸。
１７．複数の偶数ヌクレオチドが、第２の修飾により修飾される、記載１４〜１６のいずれか１つの核酸。
１８．第１の鎖が、共通の修飾により修飾される隣接するヌクレオチドを含む、記載１２〜１７のいずれかの核酸。
１９．第１の鎖が、記載１３の修飾とは異なる第２の修飾により修飾される隣接ヌクレオチドを含む、記載１３〜１８のいずれかの核酸。
２０．第２の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが、記載１３の修飾とは異なる修飾により修飾される、記載１３〜１９のいずれかの核酸。
２１．第２の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが、記載１３の修飾により修飾される、記載１３〜１９のいずれかの核酸。
２２．第２の鎖の１個または複数の修飾偶数ヌクレオチドの内の少なくとも１個が、１個または複数の修飾奇数ヌクレオチドに隣接する、記載２０または２１の核酸。
２３．第２の鎖の複数の奇数ヌクレオチドが、共通の修飾により修飾される、記載２０〜２２のいずれかの核酸。
２４．複数の偶数ヌクレオチドが、記載１３の修飾により修飾される、記載２０〜２３のいずれかの核酸。
２５．複数の奇数ヌクレオチドが、第２の修飾により修飾され、第２の修飾が記載１３の修飾とは異なる、記載２０〜２４のいずれかの核酸。
２６．第２の鎖が、共通の修飾により修飾される隣接するヌクレオチドを含む、記載２０〜２５のいずれかの核酸。
２７．第２の鎖が、記載１３の修飾とは異なる第２の修飾により修飾される隣接するヌクレオチドを含む、記載２０〜２６のいずれかの核酸。
２８．第１の鎖のそれぞれの奇数ヌクレオチドおよび第２の鎖のそれぞれの偶数ヌクレオチドが、共通の修飾により修飾される、記載１２〜２７のいずれか１つの核酸。
２９．第１の鎖のそれぞれの偶数ヌクレオチドが第２の修飾により修飾され、第２の鎖のそれぞれの奇数ヌクレオチドが、第２の修飾により修飾される、記載１３〜２８のいずれか１つの核酸。
３０．第１の鎖の修飾ヌクレオチドが、第２の鎖の非修飾または異なって修飾されたヌクレオチドに対し少なくとも１個のヌクレオチドだけシフトされている、記載２０〜２９のいずれか１つの核酸。
３１．第１の鎖が、配列番号１の配列を含む、記載１〜３０のいずれか１つの核酸。
３２．第２の鎖が、配列番号２の配列を含む、記載１〜３０のいずれか１つの核酸。
３３．修飾（単数または複数）が、それぞれ個別に、３’−末端デオキシチミン、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ修飾、２’−アミノ修飾、２’−アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホラミデート修飾、５’−ホスホロチオエート基修飾、５’リン酸または５’リン酸模倣物修飾およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群より選択される、記載８〜３２のいずれか１つの核酸。
３４．修飾が、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチドまたは非天然塩基含有ヌクレオチドの内のいずれか１つである、記載８〜３３のいずれか１つの核酸。
３５．少なくとも１つの修飾が、２’−Ｏ−メチルである、記載８〜３４のいずれか１つの核酸。
３６．少なくとも１つの修飾が、２’−Ｆである、記載８〜３５のいずれか１つの核酸。
３８．リガンドと結合される、記載１〜３７のいずれか１つの核酸。
３９．その末端にジチオリン酸が存在しない場合、第１および／または第２の鎖の末端の１、２または３個の３’ヌクレオチド間および／または５’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、記載１〜３８のいずれか１つの核酸。
４０．細胞中の標的遺伝子の発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖が抑制されるべき上記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第１および／または第２の鎖が少なくとも２個の末端３’ヌクレオチドの間のジチオリン酸結合を含み、および／または第２の鎖が少なくとも２個の末端５’ヌクレオチドの間のジチオリン酸結合を含み、核酸分子がリガンドに結合される、核酸。
４１．リガンドが、１個または複数のＧａｌＮＡｃリガンドおよびその誘導体を含む、記載３８〜４０のいずれかの核酸。
４２．リガンドが、（ｉ）１個または複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分およびその誘導体、および（ｉｉ）リンカーを含み、リンカーが、ＧａｌＮＡｃ部分を記載１〜４１のいずれかで定義の配列に結合する、記載３８〜４１のいずれかの核酸。
４３．ヌクレオチドが、記載１〜４２のいずれかで定義のように修飾される、記載４０の核酸。
４４．リガンドが、式Ｉ：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （Ｉ）
を含み、式中、
Ｓは、サッカライドであり、サッカライドはＮ−アセチルガラクトサミンであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ｍは１、２、または３であり；
Ｐは、リン酸または修飾リン酸（好ましくはチオリン酸）であり；
Ｘ２は、式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、ｎ＝１〜６であり；
Ａは、分岐ユニットであり、
Ｘ３は、架橋ユニットであり；
リン酸または修飾リン酸（好ましくはチオリン酸）を介してＸ３に結合される、記載１〜４３の核酸。
４５．次の構造：
【化６８】
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2021502411.tif 000085
2021502411.tif 000086
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の内の１つを有し、Ｚは記載１〜３９のいずれかの核酸である、複合化核酸。
４６．リガンドが、下記を含む、記載１〜４５のいずれかの核酸。
【化６９】
2021502411.tif 000089
４７．上記第１の鎖の５’末端から位置２および１４でのヌクレオチドが、２’フルオロ修飾により修飾され、および上記第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する上記第２の鎖上のヌクレオチドが、２’フルオロ修飾により修飾される、記載１〜２７、３１〜３２または３９〜４３のいずれかに記載の核酸。
４８．第１のＲＮＡ鎖は、式（ＸＶ）：
【化７０】
2021502411.tif 000090
の化合物であり、式中、ｂは０または１であり；および
第２のＲＮＡ鎖は、式（ＸＶＩ）：
【化７１】
2021502411.tif 000091
の化合物であり、ｃおよびｄは独立に０または１であり；
式中、
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ上記第１および第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｈまたはメチルであり；
ｎは、０、１、２または３であり；および
Ｌは、式（ＸＶ）および（ＸＶＩ）で同じまたは異なり、およびＬは、
−（ＣＨ２）ｑ−、ｑ＝２〜１２；
−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、ｒ＝２〜１２；
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、ｓ＝１〜５；
−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｔは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｕ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ（Ｏ）−、ｕは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｖは２〜１２である；
からなる群より選択され；
末端Ｃ（Ｏ）（存在する場合）は、ＮＨ基に結合され；および
ｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である記載1−４３、または４７のいずれかに記載の核酸。
４９．ｂは０でありｃは１でありｄは１である、記載４８の核酸。
５０．ｂは１でありｃは０でありｄは１である、記載４８の核酸。
５１．ｂは１でありｃは１でありｄは０である、記載４８の核酸。
５２．ｂは１でありｃは１でありｄは１である、記載４８の核酸。
５３．ＹはＯである、記載４８〜５２のいずれかの核酸。
５４．ＹはＳである、記載４８〜５２のいずれかの核酸。
５５．Ｒ１はＨである、記載４８〜５４のいずれかの核酸。
５６．Ｒ１はメチルである、記載４８〜５４のいずれかの核酸。
５７．ｎは０である、記載４８〜５６のいずれかの核酸。
５８．Ｌは、−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−であり、ｒ＝２〜１２である、記載４８〜５７のいずれかの核酸。
５９．ｒ＝２〜６である、記載５８の核酸。
６０．ｒ＝４または６、例えば、４である、記載５９の核酸。
６１．１〜６０の記載および式のいずれかで定義の核酸を含む組成物であって、
ｉ）カチオン性脂質、または薬学的に許容可能なその塩；
ｉｉ）ステロイド；
ｉｉｉ）ホスファチジルエタノールアミンリン脂質；
ｉｖ）ペグ化脂質、
を含む組成物。
６２．組成物中のカチオン性脂質成分の含量が、脂質組成物の全脂質含量の約５５ｍｏｌ％〜約６５ｍｏｌ％、好ましくは脂質組成物の全脂質含量の約５９ｍｏｌ％である、記載６１の組成物。
６３．配合物が、
次の構造を有するカチオン性脂質；
【化７２】
2021502411.tif 000092
次の構造を有するステロイド；
【化７３】
2021502411.tif 000093
次の構造を有するホスファチジルエタノールアミンリン脂質；
【化７４】
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および次の構造を有するペグ化脂質；
【化７５】
2021502411.tif 000095
を含む記載６２の組成物。
６４．記載１〜６３のいずれかの核酸または複合化核酸および生理学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
６５．疾患または障害の治療での使用のための記載１〜６４のいずれかの核酸または複合化核酸。
６６．疾患または障害の治療のための薬物の製造における記載１〜６５のいずれかの核酸または複合化核酸の使用。
６７．治療を必要としている個体に記載１〜６６のいずれか１つの核酸または複合化核酸を含む組成物を投与することを含む疾患または障害を治療する方法。
６８．核酸または複合化核酸分子が、対象の皮下にまたは静脈内に投与される、記載６７の方法。
６９．記載１〜６５のいずれかの核酸または複合化核酸を製造する方法。
【表７】
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2021502411.tif 000097
2021502411.tif 000098
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凡例
「Ａ」で終わる配列（Ｘ０４５６Ａのように）は、第１の鎖の配列であり、「Ｂ」で終わる配列（Ｘ０４５６Ｂのように）は、第２の鎖の配列である。
ｍＡ、ｍＵ、ｍＣ、ｍＧ：２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ
ｆＡ、ｆＵ、ｆＣ、ｆＧ：２’−Ｆ  ＲＮＡ
（ｐｓ）：ホスホロチオエート
（ｐｓ２）：ジチオリン酸
（ｖｐ）：ビニル−（Ｅ）−ホスホネート
【０３４３】
上記配列は、リンカーまたはリガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃまたは（ｐｓ）または（ｐｓ２）結合と共に開示され得る。これらはオプションであるが、配列表の配列の好ましい部分を形成する。
本明細書では、以下の略語が使用され得る。
【表８】
2021502411.tif 000100
【図１】
2021502411.tif 000105
【図２】
2021502411.tif 000106
【図３】
2021502411.tif 000107
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
2021502411.tif 000113
【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【国際調査報告】
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2021502411.tif 000122
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