(57)【要約】  本開示は、一本鎖産物の生成のための非対称ＰＣＲ増幅法、並びにそれらに有用なプライマー及びキットを提供する。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による一本鎖ＤＮＡアンプリコンの製造方法であって、
（ａ）初期混合物に増幅ＰＣＲ条件下で熱サイクルの第一段階を受けさせ、それにより中間混合物を製造するステップ、ここで、初期混合物は、
（ｉ）核酸試料、
（ｉｉ）非対称プライマー対、
（ｉｉｉ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び
（ｉｖ）ＰＣＲ試薬
を含み、熱サイクルの第一段階は、少なくとも３つの温度によるサイクルを含み、該３つの温度は、
（１）変性のための標的核酸のＴmを超える第一の温度、
（２）プライマーアニーリングのための非伸長プライマーのＴm未満の第二の温度、及び
（３）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長に適した第三の温度
を含み、中間混合物は、標的核酸が試料中に存在する場合に、非伸長プライマーと伸長プライマーの双方から伸長させたＤＮＡアンプリコンを含み、
（ｂ）中間混合物に熱サイクルの第二段階を受けさせ、それにより、最終混合物を製造するステップ、ここで、熱サイクルの第二段階は、
（１）変性のための二本鎖ＤＮＡアンプリコンのＴmを超える第四の温度、
（２）第五の温度であって、
（ｉ）伸長プライマーのＴm未満であり、
（ｉｉ）非伸長プライマーのＴmを超え、かつ
（ｉｉｉ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長に適した第五の温度
によるサイクルを含み、最終混合物は、標的核酸が試料中に存在する場合に、一本鎖ＤＮＡアンプリコンを含む
を含む、前記方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の前に初期変性期間があり、任意に初期変性を第一の温度で実施してよい、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ｂ）に続いて追加の伸長期間があり、任意に追加の伸長を第五の温度で実施してよい、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
第一の温度と第四の温度が同一であり、及び／又は第三の温度と第五の温度が同一である、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
伸長プライマーの「Ｂ」領域が、「Ａ」領域の少なくとも一部の逆方向反復配列の相補体であり、又は「Ａ」領域の少なくとも一部の直接反復配列の相補体である、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
非伸長プライマーが、５’末伸長を有さないか、又は３ヌクレオチド以下の５’末伸長を有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
伸長プライマーが「Ｃ」領域を含み、任意に「Ｃ」領域が、単独で又は隣接する「Ａ」領域及び／又は「Ｂ」領域ヌクレオチドと組み合わせて、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を形成してよい、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
伸長プライマーのＴmが、少なくとも８℃だけ非伸長プライマーのＴmよりも高い、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
伸長プライマーの「Ａ」領域のＴmと非伸長プライマーのＴmが、３℃以下だけ異なる、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
（ａ）第一の温度が９５℃であり、
（ｂ）第二の温度が５８℃であり、
（ｃ）第三の温度が７２℃であり、
（ｄ）第四の温度が９５℃であり、
（ｅ）第五の温度が７２℃であり、又は
（ｆ）（ａ）〜（ｅ）の任意の組合せである、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
中間混合物中で非伸長プライマーと伸長プライマーの双方から伸長されたＤＮＡアンプリコンが、互いにハイブリダイズして二本鎖ＤＮＡアンプリコンを形成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
核酸試料が、試験核酸試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
核酸試料が、対照核酸試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
多重ＰＣＲ反応である、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
ＰＣＲを、ジェネリックプライマーの非存在下で実施する、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
第一段階が、標的核酸の双方の鎖の指数関数増幅をもたらし、及び／又は第二段階が、標的核酸の一本鎖の線形的増幅をもたらす、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
非対称プライマー対が、細菌配列又は真菌ＤＮＡ配列に対して相補的な配列を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
試料が生物学的試料であり、任意に生物学的試料が、
（ａ）血液、又はそれらから加工、抽出もしくは分別した試料、
（ｂ）腹膜灌流液、又はそれらから加工、抽出もしくは分別した試料、
（ｃ）尿、又はそれらから加工、抽出もしくは分別した試料、
（ｄ）痰、又はそれらから加工、抽出もしくは分別した試料、又は
（ｅ）創傷スワブ、又はそれらから加工、抽出もしくは分別した試料
であってよい、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
試料が、環境試料である、請求項１に記載の方法。
【請求項２０】
さらに、一本鎖ＰＣＲアンプリコンを検出することを含む、請求項１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
１．  背景技術
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、診断及び他の目的のためのアッセイのための、ゲノムＤＮＡ、及びＲＮＡから逆転写されたｃＤＮＡを含むＤＮＡの増幅伸長のために広く使用されている。ＰＣＲは、一本鎖鋳型を作成するための変性又は鎖融解、プライマーアニーリング、及び熱的に安定なＤＮＡポリメラーゼ、例えばサーマス・アクアティクス（Thermus aquaticus）（Ｔａｑ）ＤＮＡポリメラーゼによるプライマー伸長の一連の反復ステップである。
【０００２】
典型的な３ステップＰＣＲプロトコル（ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ（ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓら ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （ＵＳＡ） １９９０， Ｃｈａｐｔｅｒ １）を参照されたい）は、５秒超９３〜９５℃で変性又は鎖融解、１０〜６０秒間５５〜６５℃でプライマーアニーリング、及びＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼについてポリメラーゼが高い活性である温度で、例えば７２℃で１５〜１２０秒間プライマー伸長を含みうる。典型的な２ステップＰＣＲプロトコルは、プライマー伸長のための温度と同様のプライマーアニーリングのための温度、例えば６０℃又は７２℃を有することが異なりうる。３ステップＰＣＲ又は２ステップＰＣＲのいずれについても、増幅は、前述の一連のステップを複数回、典型的に２５〜４０回繰り返して反応混合物を循環することを含む。反応の過程中に、反応における個々のステップの時間及び温度は、サイクルごとに変化しないままであるか、又は反応の過程において１つ以上の点で変更されて効率を促進するかもしくは選択性を高めうる。
【０００３】
プライマー対及び標的核酸に加えて、ＰＣＲ反応混合物は、典型的に、デオキシリボヌクレオチド５’トリホスフェート（ｄＮＴＰ）、典型的に等モル濃度での熱安定性ポリメラーゼ、二価カチオン（典型的にＭｇ2+）、及び緩衝剤のそれぞれ４つを含む。逆転写酵素は、ポリメラーゼがその活性を有さない限り、典型的にＲＮＡ標的に含まれる。かかる反応物の体積は典型的に２５〜１００μｌである。多数の標的配列は同一の反応で増幅されうる。ｃＤＮＡ増幅の場合に、ＰＣＲにおいて使用されるポリメラーゼが逆転写酵素活性を有さない限り、ＰＣＲの前にＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写するための別の反応がある。特定のＰＣＲ増幅のサイクル数は、ａ）出発物質の量、ｂ）反応の効率、及びｃ）検出の方法及び感度又は生成物のその後の分析を含む、いくつかの要因に依存する。典型的なサイクリック増幅反応のためのサイクル条件、試薬濃度、プライマー設計、及び適切な装置は、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ， Ｆ． Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ （１９８８） Ｃｈａｐｔｅｒ １５：“Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，” Ｊ． Ｗｉｌｅｙ （Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．（ＵＳＡ）を参照されたい）。
【０００４】
理想的には、それぞれのアンプリコン分子のそれぞれの鎖は、一端でプライマーにハイブリダイズし（「結合」という）、そして続く合成のラウンドのための鋳型として機能する。したがって、プライマー伸長産物又はアンプリコンの生成速度は、それぞれのサイクル中に倍増する、指数関数的である。アンプリコンは、互いにハイブリダイズして二本鎖を形成する、プラス（＋）鎖とマイナス（−）鎖の双方を含む。
【０００５】
ＰＣＲ反応は、典型的に、対称であるように、すなわち、互いに等しいか又は数℃以内である「融解温度」又は「Ｔm」を有するように設計されたフォワードプライマー及びリバースプライマーを利用することによって二本鎖コピーを作成するために設計されている。プライマー設計のために慣用的に使用されるコンピューターソフトウェアプログラムは、大きなＴmの差異を回避するために使用者に警告し、かつ自動Ｔmマッチング機能を有する。
【０００６】
本明細書において記載される非対称ＰＣＲ法から典型的なＰＣＲを区別するために、典型的なＰＣＲを、本明細書では「対称」ＰＣＲという。したがって、対称ＰＣＲは、１つ以上の二本鎖アンプリコン分子の指数関数的増加をもたらし、それぞれのアンプリコンの双方の鎖が、複製のそれぞれのラウンド中に等量で蓄積される。対称ＰＣＲによる指数関数的増幅の効率は最終的に低下し、アンプリコンの蓄積速度が低下して停止する。対称ＰＣＲの速度論的分析は、反応が以下から構成されていることが明らかになる：ａ）標的配列の双方の鎖が指数関数的に増加するが、これまでに蓄積された生成物の量が、使用における特定の検出方法の検出可能なレベルを下回る間の検出されない増幅段階（初期サイクル）；ｂ）標的配列の双方の鎖が並行して増加し続け、生成物の量が検出される間に検出される増幅段階（追加のサイクル）；ｃ）アンプリコンの双方の鎖の合成が徐々に停止し、生成物の量が増加しなくなる間のプラトー段階（最終サイクル）。相補的アンプリコン鎖の濃度の増加が互いにハイブリダイズするため（リアニール）、対称反応が遅くなり停止し、これにより、別個のプライマーがそれぞれの標的鎖にハイブリダイズする能力が競合する。典型的に、反応は、目的を達成するために必要な正確なサイクル数に関係なく、検出可能な量の産物の蓄積を保証するのに十分な時間実行される。
【０００７】
ＰＣＲ反応において、一本鎖ＤＮＡを直接作成するための制限された使用を見出している技術は、「ａｓｙｍｍｅｔｒｉｃ ＰＣＲ．」（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． （ＵＳＡ） ８５： ７６５２−７６５６ （１９８８）； Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎ ａｎｄ Ｅｒｌｉｃｈ， １９９１、米国特許番号第５，０６６，５８４号（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔ． Ｎｏ． ５，０６６，５８４））である。従来の非対称ＰＣＲは、対称ＰＣＲとは異なり、プライマーの１つが他のプライマーの濃度の制限量、典型的には１／１００〜１／５で付加される。二本鎖アンプリコンは、対称ＰＣＲと同様に、初期の温度サイクル中に蓄積するが、しかし開始鋳型の数に依存して、典型的に１５〜２５ＰＣＲサイクル後に１つのプライマーが消耗される。一本鎖の直鎖増幅は、消耗されていないプライマーを使用して続くサイクル中に実施する。文献において報告されている非対称ＰＣＲ反応において使用したプライマーは、しばしば対称ＰＣＲにおいて使用するための同一の公知のプライマーである。Ｐｏｄｄａｒ（Ｐｏｄｄａｒ，２０００，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｐｒｏｂｅｓ １４：２５−３２）は、４０熱サイクルを含むエンドポイントアッセイによってアデノウイルス基質を増幅するための対称ＰＣＲ及び非対称ＰＣＲを比較した。Ｐｏｄｄａｒは、５０：１のプライマー比が最適であり、かつ非対称ＰＣＲアッセイの感度は優れていたが、しかしながら少ない数の標的分子を含むと思われる希薄な基質溶液については著しく低下したことを報告した。
【０００８】
したがって、例えば診断適用において、試料中で少量で存在する標的分子を検出することができる改善された非対称ＰＣＲ増幅方法が必要である。
【０００９】
２．  発明の要約
本開示は、改善された非対称ＰＣＲ法、並びにそれらに有用なプライマー及びキットに関する。
【００１０】
本開示の非対称ＰＣＲ法は、指数関数的段階と線形的段階の双方を含む。指数関数的段階の間に、標的核酸の双方の鎖が増幅される。線形的段階では、一方の鎖のみが増幅され、過剰に標的核酸の一本鎖をもたらす。
【００１１】
非対称ＰＣＲ法は、異なる長さ及び融解温度のプライマー対の使用により、過剰な一本鎖をもたらし、ここで、長いプライマーを本明細書において「伸長プライマー」といい、短いプライマーを本明細書において「非伸長プライマー」という。伸長プライマーは、非伸長プライマーよりも高い融解温度を有し、かつＰＣＲサイクルを使用して標的核酸の一本鎖を選択的に増幅するために使用でき、ＰＣＲサイクルでは、非伸長プライマーの融解温度よりも高いが、伸長プライマーの融解温度よりも低い温度でアニーリングステップを実施する。選択的増幅は、後続の検出アッセイにおいて調べられる標的鎖で濃縮されたＰＣＲ産物混合物を生じる。
【００１２】
伸長プライマーは、標的核酸に相補的な配列に加えて、同一のプライマーの標的結合部分に相補的である配列を含む５’伸長を含む。理論に縛られることなく、発明者は、５’伸長の使用が、伸長プライマー分子の分子内又は分子間ハイブリダイゼーションを可能にし、ＰＣＲ反応の開始時点でＰＣＲ反応に存在するＤＮＡ分子へのこれらの長いプライマーの任意の又は非特異的な結合を妨げると考えられる。これは、非特異的なＤＮＡ増幅を妨げ、かつ生物学的試料中に少量で存在する標的を増幅する場合に問題となりうるＰＣＲ産物における「ノイズ」を妨げる。
【００１３】
本開示の他の態様は、本明細書において記載される非対称ＰＣＲ法を実施するための試薬キットである。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】対称ＰＣＲ法において使用される従来のプライマーであってよい非伸長プライマー、並びに標的核酸に相補的である「Ａ」領域、「Ａ」領域の少なくとも一部の直接反復配列又は逆方向反復配列を含む「Ｂ」領域、及びスペーサー配列及び／又は全ての制限エンドヌクレアーゼ認識部位の一部を含みうる任意の「Ｃ」領域から構成される伸長プライマーを含む、本開示の非対称ＰＣＲ法に有用なプライマー対を示す。
【図２】図２Ａは、「Ｂ」領域が「Ａ」領域の少なくとも一部の逆方向反復配列を含む場合に生じる伸長プライマーの分子間ハイブリダイゼーションを示す。図２Ｂは、「Ｂ」領域が「Ａ」領域の少なくとも一部の直接反復配列を含む場合に生じる伸長プライマーの分子内ハイブリダイゼーションを示す。図２Ｃは、「Ｂ」領域が「Ａ」領域の少なくとも一部の逆方向反復配列を含む場合に生じる伸長プライマーの分子内ハイブリダイゼーションを示す。好ましくは、「Ａ」領域と「Ｂ」領域との間の相補性の領域は、「Ａ」領域の５’末端又はその近くにある。
【図３】図３は、本開示の非対称ＰＣＲ反応における変性ステップを示す。変性ステップにおいて、ＰＣＲ反応混合物（典型的には、標的核酸、非対称プライマー対、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及びＰＣＲ試薬を含むか、又は含む危険のある生物学的試料を含む）を、標的核酸の融点より高い温度まで加熱して、非対称プライマー対中の標的核酸（存在する場合）及び伸長プライマーを変性して、一本鎖を形成する。
【図４】図４は、非伸長プライマーの融解温度より下で生じる、本開示の非対称ＰＣＲ反応の指数関数的段階のアニーリングステップを示す。非対称プライマー対における非伸長プライマー及び伸長プライマーの双方は、それらのそれぞれの相補鎖にハイブリダイズする。図４は、ＰＣＲの初期サイクルで生じる、標的ＤＮＡへのアニーリング（ハイブリダイゼーション又は結合ともいう）を示すが、後続のサイクルにおいて、ＰＣＲ産物におけるプライマーと相補配列の間でアニーリングが生じる可能性がある。図５Ｂ及び図６において示すように、伸長プライマーにおいて「Ｂ」領域及び任意の「Ｃ」領域があるため、ＰＣＲ産物はこれらの配列又はその相補配列を有する。
【図５】図５Ａ及び図５Ｂは、本開示の非対称ＰＣＲ反応の指数関数的段階の伸長ステップを示し、その間、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、鋳型として相補的ＤＮＡを使用してプライマーＤＮＡを伸長する。伸長領域を破線で示す。図５Ａにおける鋳型は、標的ＤＮＡの鎖であり、図５Ｂにおける鋳型は、非対称プライマー対及び標的ＤＮＡを使用して生成したＰＣＲ産物の鎖である。
【図６】図６は、鋳型としてＰＣＲ産物鎖２を使用して、非伸長プライマーの融解温度より高く、かつ伸長プライマーの融解温度より低い温度で生じる、本開示の非対称ＰＣＲ反応の線形的段階の同時のアニーリング及び伸長ステップを示す。これは、ＰＣＲ産物鎖２の非対称増幅をもたらし、ＰＣＲ反応の終わりまでに、ＰＣＲ産物鎖１の分子と比較して過剰なＰＣＲ産物鎖２の分子をもたらす。
【図７】図７Ａは、トマト（Solanum lycopersicum）１７ＳリボソームＲＮＡ配列を示し、図７Ｂにおいて示される非対称プライマー対を使用して増幅される１６０塩基の標的領域を太字で示す。図７Ｂは、図７Ａにおいて太字で示されている１６０塩基領域の増幅のために有用な非対称プライマー対を示し、ここで、伸長プライマーの「Ａ」領域を通常のテキストで示し、かつ「Ｂ」領域（「Ａ」領域の二重下線部分の逆方向反復配列である）を太字で示す。この伸長プライマーは、任意の「Ｃ」領域を含まない。
【図８】図８は、黄色ブドウ球菌（S. aureus）のプライマー及びプローブを使用する本開示の非対称ＰＣＲ法における指数関数的及び線形サイクルの数を最適化するための研究の結果を示す。シグナル強度を、任意の単位（「ａ．ｕ．」）で測定する。
【図９】図９は、本開示の非対称ＰＣＲ法を介した低コピー数の標的の検出限界と、黄色ブドウ球菌のプライマー及びプローブを使用する従来の（対称）ＰＣＲとを比較する研究の結果を示す。シグナル強度を、任意の単位（「ａ．ｕ．」）で測定する。
【００１５】
４．  詳細な説明
４．１  定義
伸長プライマー：（ａ）標的鎖１の対応する領域に対して少なくとも７５％の配列同一性、又は標的鎖２における対応する領域に対して少なくとも７５％の配列相補性を有するその３’末端で「Ａ」領域；（ｂ）「Ａ」領域の少なくとも一部に対して相補的である配列を含むその５’末端の「Ｂ」領域；及び（ｃ）「Ａ」領域と「Ｂ」領域の間に配置された任意の「Ｃ」領域を含むＰＣＲプライマー。
【００１６】
非伸長プライマー：実質的に、標的鎖２における対応する領域に対して少なくとも７５％の配列同一性又は標的鎖１における対応する領域に対して少なくとも７５％の配列相補性を有するヌクレオチド配列からなるＰＣＲプライマー。非伸長プライマーに関する「実質的に〜からなる」という用語は、ヌクレオチド配列が、標的配列に対する（少なくとも７５％の）相補性の領域の５’側に３個以下の追加のヌクレオチドを含みうることを意味する。
【００１７】
プライマー対：５０００塩基対未満の領域内の同一の核酸分子の異なる鎖とハイブリダイズし、かつ該鎖からＤＮＡ重合反応を開始することができるフォワード及びリバースのプライマー対（それぞれ、標的配列における可能な変動について説明するために、配列変動を有するプライマーの混合物であってよい）。特定の実施形態において、プライマー対は、２５００塩基対未満又は１５００塩基対未満の領域内の同一の核酸分子の異なる鎖とハイブリダイズし、かつ該鎖からのＤＮＡ重合反応を開始することができる。
【００１８】
非対称プライマー対：伸長プライマー及び非伸長プライマーからなるプライマー対。
【００１９】
融解温度（Ｔm）：ＤＮＡの二本鎖が融解して一本鎖になる温度。デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）から構成される直鎖プライマーのＴmは、「パーセントＧＣ」法（ＰＣＲ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ， ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ， Ｉｎｎｉｓら ｅｄｓ．， Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ （Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ， Ｃａｌｉｆ． （ＵＳＡ） １９９０）又は「２（Ａ＋Ｔ）プラス４（Ｇ＋Ｃ）」法（Ｗａｌｌａｃｅら．， １９７９， Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ６ （１１）：３５４３−３５５７）又は「近傍（Ｎｅａｒｅｓｔ Ｎｅｉｇｈｂｏｒ）」法（Ｓａｎｔａ Ｌｕｃｉａ， １９９８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ９５： １４６０−１４６５； Ａｌｌａｗｉ及びＳａｎｔａ Ｌｕｃｉａ， １９９７， Ｂｉｏｃｈｅｍ． ３６：１０５８１−１０５９４）によって慣用的に算出されている。請求の目的のために、ＤＮＡのＴmは「近傍」法に従って算出され、かつ天然に生じない塩基（例えば、２−デオキシイノシン）はアデニンとして処理される。
【００２０】
プライマー：その３’末端で遊離ヒドロキシル基を有する少なくとも１２個のヌクレオチドのＤＮＡオリゴヌクレオチド。プライマーは、天然に生じるヌクレオチド及び天然に生じないヌクレオチドを含みうる（例えば、ユニバーサル塩基、例えば３−ニトロピロロール、５−ニトロインドール又は２−デオキシイノシンを含むヌクレオチドであり、２−デオキシイノシンが好ましい）。本記載内容が他を指示しない限り、「プライマー」という用語は、混合塩基がプライマーの設計及び構築に含まれ、それらが標的核酸分子中のバリアント配列にハイブリダイズできる場合に作成されるプライマー分子の混合物も指す。標的配列のバリアントは、種間又は種内バリアントであってよい。混合塩基についての標準名を表１において示す：
【表１】
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好ましくは、それぞれのプライマーは、標的核酸に対して相補性のある領域において３個以下の混合塩基を含む。いくつの実施形態において、プライマーは、標的核酸に対して相補性のある領域において０個、１個、２個又は３個の混合塩基を含む。
【００２１】
ジェネリックプライマー：配列が実質的に伸長プライマーの「Ｂ」領域からなるプライマー。好ましくは、本開示の非対称ＤＮＡ増幅法は、ジェネリックプライマーの非存在下で実施される。
【００２２】
直接反復配列：伸長プライマーの「Ｂ」領域の記載内容において、「直接反復配列」は、「Ａ」領域の一部に直接相補的であるヌクレオチド配列を意味する（すなわち、同一の５’から３’の順序で相補配列を有する）。
【００２３】
逆方向反復配列：伸長プライマーの「Ｂ」領域の記載内容において、「逆方向反復配列」は、「Ａ」領域の一部に逆相補的であるヌクレオチド配列を意味する（すなわち、反対の５’から３’の順序で相補配列を有する）。
【００２４】
ＰＣＲ試薬：本記載内容において特に規定されない限り、「ＰＣＲ試薬」という用語は、鋳型核酸、熱安定性ポリメラーゼ及びプライマー以外のＰＣＲ反応の成分をいう。ＰＣＲ試薬は、典型的に、ｄＮＴＰ（及び非標識ｄＮＴＰに加えて、標識した、例えば蛍光標識したｄＮＴＰを含みうる）、緩衝液、及び２価のカチオン（例えばＭｇＣｌ2）を含む塩を含む。
【００２５】
標的鎖１：標的鎖１は、非対称プライマー対の非伸長プライマーに相補的である、二本鎖標的核酸における鎖をいう。
【００２６】
標的鎖２：標的鎖２は、非対称プライマー対の非伸長プライマーにおける「Ａ」領域に相補的である、二本鎖標的核酸における鎖をいう。
【００２７】
ＰＣＲ産物鎖１：ＰＣＲ産物鎖１は、標的核酸と非対称プライマー対の非伸長プライマーに相補的である非対称プライマー対とから生成された二本鎖ＰＣＲ産物における鎖をいう。
【００２８】
ＰＣＲ産物鎖２：ＰＣＲ産物鎖２は、標的核酸と非対称プライマー対の伸長プライマーに相補的である非対称プライマー対とから生成された二本鎖ＰＣＲ産物における鎖をいう。
【００２９】
対応する：配列の同一性又は相補性を共有する異なる長さの２つの核酸鎖に関して、「対応する」という用語は、状況に応じて、双方の鎖に存在する配列の重複又は相補性の領域をいう。
【００３０】
約（Approximately）：整数に関して、「約」という用語は、整数を拡張して、０．５０まで低く、かつ０．４９まで高い分数値を含む。例えば、「約６８℃」の温度は、６７．５０℃〜６８．４９℃の温度を意味し、「約９５％」の配列同一性は、９４．５０％〜９５．４９％のパーセントでの配列同一性を意味する。
【００３１】
約（About）：量的な記載内容で使用される場合に、「約」という用語は、挙げた値の１０％まで上回り、挙げた値の１０％まで下回る値を含むと解釈されるべきである。範囲の記載内容において、「約」という用語は、挙げた範囲の上限を最大１０％まで上回り、下限を１０％まで下回る値を含むと解釈されるべきである。
【００３２】
核酸試料：標的核酸の源であってよい試料、又は標的でない核酸を含むか、もしくは核酸を含まない陰性対照（例えば、汚染又は非特異的増幅を測定又は検出するため）として使用されるダミー試料を意味する。核酸試料は、必ずしも標的ＤＮＡを含む必要はなく、例えば、診断試料の場合に、試料は、例えば段落４．３において記載されるように、標的核酸を含む疑いがあるか、又は標的核酸を含むリスクがある生物学的試料であってよい。
【００３３】
４．２．  プライマー設計
４．２．１．  伸長プライマー
伸長プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１における対応する領域に対して少なくとも７５％の配列同一性を有する。ある実施形態において、プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１における対応する領域に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の同一性を有する。さらに他の実施形態において、プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖１の対応する領域に対して１００％の配列同一性を有する。
【００３４】
言い換えれば、種々の実施形態において、伸長プライマーの「Ａ」領域は、標的鎖２における対応する領域の相補鎖に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は１００％の配列同一性を有する。典型的に、プライマー配列と標的配列との間に５’のミスマッチが多く配置されるほど、それらがＰＣＲ反応中に許容される可能性が高くなる。当業者は、標的鎖に対して１００％未満の配列同一性を有するが、未だ標的ＤＮＡを効率的に増幅することができるプライマー配列を容易に設計できる。
【００３５】
「Ａ」領域の少なくとも一部に相補的である「Ｂ」領域内の配列は、直接反復配列又は逆方向反復配列であってよい「Ｂ」領域が「Ａ」領域の一部の直接反復配列を含む場合に、異なる伸長プライマー分子が、図２Ｂにおいて示すように互いに分子間でハイブリダイズできる。「Ｂ」領域が「Ａ」領域の一部の逆方向反復配列を含む場合に、伸長プライマー分子が、図２Ｃにおいて示すように分子内で、又は図２Ａにおいて示すように互いに分子間でハイブリダイズできる。
【００３６】
「Ｂ」領域における配列に相補的である「Ａ」領域の一部が、「Ａ」領域の５’末端で又はその近くに（例えば、１、２、又は３ヌクレオチド以内）、すなわち「Ａ」領域が「Ｂ」領域（又は「Ｃ」領域が存在する場合は「Ｃ」領域）に隣接する場所で又はその近くにあることが好ましい。
【００３７】
伸長プライマーの「Ｂ」領域は、好ましくは６〜１２ヌクレオチド長であり、すなわち、好ましくは６ヌクレオチド長、７ヌクレオチド長、８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長、１０ヌクレオチド長、１１ヌクレオチド長又は１２ヌクレオチド長である。特定の実施形態において、伸長プライマーの「Ｂ」領域は、８〜１０ヌクレオチド長であり、すなわち、好ましくは８ヌクレオチド長、９ヌクレオチド長又は１０ヌクレオチド長である。
【００３８】
伸長プライマーに存在する場合に、「Ｃ」領域は、好ましくは１〜６ヌクレオチド長であり、すなわち、好ましくは１ヌクレオチド長、２ヌクレオチド長、３ヌクレオチド長、４ヌクレオチド長、５ヌクレオチド長、又は６ヌクレオチド長である。
【００３９】
伸長プライマーのＴmは、好ましくは（必須ではないが）約６８℃〜約８０℃である。特定の実施形態において、非伸長プライマーのＴmは、約７２℃〜約７８℃、例えば、約７２℃、約７３℃、約７４℃、約７５℃、約７６℃、約７７℃、又は約７８℃である。
【００４０】
領域「Ａ」と「Ｂ」の間に配置された任意の領域「Ｃ」は、「Ａ」と「Ｂ」領域の間のスペーサーとして機能でき、伸長プライマーを、ヘアピンループを形成し、及び／又は制限エンドヌクレアーゼ配列（好ましくは６カッター（6-cutter）配列）をＰＣＲ産物に導入させることができる。制限エンドヌクレアーゼ配列は、その全体が「Ｃ」領域内にあるか、又はそれぞれ、隣接する「Ｂ」及び「Ａ」領域からの５’配列及び／又は３’配列と一緒に、「Ｃ」領域の全て又は一部から形成される。標的核酸へのハイブリダイゼーションの干渉を最小限にするために、「Ｃ」領域は、好ましくは、標的鎖１又は標的鎖２に相補的ではない。
【００４１】
伸長プライマーのＴmは、好ましくは、非伸長プライマーのＴmよりも少なくとも約６℃高い。好ましくは、伸長プライマーは、非伸長プライマーのＴmよりも約１５℃〜３０℃高いＴmを有する。
【００４２】
伸長プライマーの「Ａ」領域のＴmは、好ましくは、標的に（少なくとも７５％）相補的な非伸長プライマーの一部（任意の５’伸長を除く）のＴmよりも約３℃以上高いか又は３℃以下低く、すなわち、標的にハイブリダイズするフォワードプライマーにおける領域のＴmは、好ましくは、標的にハイブリダイズするリバースプライマーにおける領域のＴmより約３℃以上高いか又は３℃以下低く、逆もまた同様である。
【００４３】
伸長プライマーの「Ａ」領域は、好ましくは、長さが少なくとも１２ヌクレオチドであり、好ましくは１２〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１４〜２５ヌクレオチドの範囲である。ある実施形態において、伸長プライマーの「Ａ」領域は、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長又は２０ヌクレオチド長である。
【００４４】
４．２．２．  非伸長プライマー
非伸長プライマーは、標的鎖２における対応する領域に対して少なくとも７５％の配列同一性のヌクレオチド配列を有する。ある実施形態において、非伸長プライマーは、標的鎖２における対応する領域に対して、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。さらに他の実施形態において、非伸長プライマーは、標的鎖２の対応する領域に対して１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。
【００４５】
言い換えれば、種々の実施形態において、非伸長プライマーは、標的鎖２における対応する１領域の相補鎖に対して、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、又は少なくとも９５％、又は１００％の配列同一性を有するヌクレオチド配列を有する。典型的に、プライマー配列と標的配列との間に５’のミスマッチが多く配置されるほど、それらがＰＣＲ反応中に許容される可能性が高くなる。当業者は、標的鎖に対して１００％未満の配列同一性を有するが、未だ標的ＤＮＡを効率的に増幅することができるプライマー配列を容易に設計できる。
【００４６】
非伸長プライマーは、さらに、１ヌクレオチド、２ヌクレオチド又は３ヌクレオチドの５’末を有してよい。
【００４７】
非伸長プライマーのＴmは、好ましくは（必須ではないが）約５０℃〜約６２℃である。特定の実施形態において、非伸長プライマーのＴmは、約５９℃〜約６２℃、例えば、約５９℃、約６０℃、約６１℃、又は約６２℃である。
【００４８】
非伸長プライマーのＴmは、好ましくは、伸長プライマーのＴmよりも少なくとも約６℃低い。好ましくは、非伸長プライマーは、伸長プライマーのＴmよりも約１５℃〜３０℃低いＴmを有する。
【００４９】
標的に（少なくとも７５％）相補的な非伸長プライマー（任意の５’伸長を除く）の領域のＴmは、好ましくは、伸長プライマーの「Ａ」領域のＴmのよりも約３℃以上高いか又は３℃以下低く、すなわち、標的にハイブリダイズするフォワードプライマーにおける領域のＴmは、好ましくは、標的にハイブリダイズするリバースプライマーにおける領域のＴmより約３℃以上高いか又は３℃以下低く、逆もまた同様である。
【００５０】
非伸長プライマーは、好ましくは、長さが少なくとも１２ヌクレオチドであり、好ましくは１２〜３０ヌクレオチド、より好ましくは１４〜２５ヌクレオチドの範囲である。ある実施形態において、非伸長プライマーは、１４ヌクレオチド長、１５ヌクレオチド長、１６ヌクレオチド長、１７ヌクレオチド長、１８ヌクレオチド長、１９ヌクレオチド長又は２０ヌクレオチド長である。
【００５１】
４．２．３．  ジェネリックプライマー
いくつかの非対称ＰＣＲ法において、例えば米国特許番号第８，７３５，０６７号（Ｕ．Ｓ． Ｐａｔｅｎｔ Ｎｏ． ８，７３５，０６７ Ｂ２）において記載されているように、フォワード及びリバースのプライマー対に加えて、プライマーの１つに追加された５’オリゴヌクレオチド末に類似した配列を有する第三の「ジェネリック」プライマーが使用される。ジェネリックプライマーは、最初のＰＣＲサイクル後の増幅反応に関係し、多重の増幅反応における異なる標的の増幅効率を「バランス」することを目的としている。
【００５２】
理論に縛られることではないが、本発明者は、本開示の記載内容において、実質的に、伸長プライマーの「Ｂ」領域の配列からなる配列を有するであろう米国特許番号第８，７３５，０６７号において記載されるようなジェネリックプライマーの包含物（かかるジェネリックプライマーは本明細書において「ジェネリックプライマー」といわれる）は、本開示の非対称プライマー対を使用して増幅効率を低下させるであろうと考える。したがって、本開示の非対称ＤＮＡ増幅法は、好ましくはジェネリックプライマーの非存在下で実施される。
【００５３】
関連する実施形態において、本開示の非対称ＤＮＡ増幅方法は、標的領域ごとに単一の非対称プライマー対を利用し、すなわち、個々のプライマーが、プライマーの特定の位置に混合塩基の包含物から生じる密接に関連する配列を有するプライマー分子の混合物であってよいことを認識する追加のプライマーを含まない。明確性及び誤解を避けるために、この実施形態は、多重増幅反応における複数の非対称プライマー対の使用を排除しないが、但し、単一の非対称プライマー対は、それぞれのアンプリコンのために使用される。
【００５４】
４．３．  標的配列及び試料調製
本開示のＰＣＲ法は、生物学的源又は環境源から核酸を増幅するために使用されうる。標的分子は、ウイルス、細菌、及び真核生物、原核生物、原生生物、植物、真菌、並びに全ての門及び綱の動物を含む、全ての分類学的分類の細胞及び組織に由来しうる。動物は、脊椎動物、哺乳動物、霊長類、及び特にヒトであってよい。血液、血清、血漿、組織、細胞、唾液、痰、尿、脳脊髄液、胸膜液、乳、涙、便、汗、精液、全細胞、細胞成分、及び細胞塗抹標本は、標的分子の適した源である。
【００５５】
ある特定の実施形態において、標的核酸分子は、ヒトの血液、尿、又は腹腔液中において見出されうる病原体、例えば、細菌、ウイルス又は真菌に由来する。かかる病原体の例は、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）、ヨーネ菌（Mycobacterium avium subsp paratuberculosis）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）（メチシリン感受性及びメチシリン耐性黄色ブドウ球菌（ＭＲＳＡ）を含む）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、肺炎連鎖球菌（Streptococcus pneumoniae）、ストレプトコッカス・アガラクチア（Streptococcus agalactiae）、インフルエンザ菌（Haemophilus influenzae）、パラインフルエンザ菌（Haemophilus parainfuluezae）、カタル球菌（Moraxella catarrhalis）、肺炎桿菌（Klebsiella pneumoniae）、大腸菌（Escherichia coli）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、アシネトバクター属種（Acinetobacter sp.）、百日咳菌（Bordetella pertussis）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、炭疽菌（Bacillus anthracis）、ノルカジア属種（Nocardia sp.）、放線菌属種（Actinomyces sp.）、肺炎マイコプラズマ（Mycoplasma pneumoniae）、クラミジア・ニューモニエ（Chlamydia pneumonia）、レジオネラ属種（Legionella species）、ニューモシスチス・ジロベシ（Pneumocystis jiroveci）、インフルエンザＡウイルス、サイトメガロウイルス、ライノウイルス、フェシウム菌（Enterococcus faecium）、アシネトバクター・バウマンニ（Acinetobacter baumannii）、コリネバクテリウム・アミコラツム（Corynebacterium amycolatum）、エンテロバクター・エロゲネス（Enterobacter aerogenes）、フェカリス菌（Enterococcus faecalis）ＣＩ４４１３、霊菌（Serratia marcescens）、腺疫菌（Streptococcus equi）、及びカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）を含むが、これらに制限されない。
【００５６】
標的核酸分子は、好ましくはＤＮＡであるが、ＲＮＡであってもよい。ＲＮＡ鋳型の場合に、ＰＣＲ反応において標的分子として使用するためにｃＤＮＡ分子を生じるために逆転写反応によってＰＣＲ反応を実施できる。逆転写反応は、同一の反応混合物中で、又はＰＣＲ反応とは別の反応混合物中で実施できる。逆転写の方法は、当該技術分野において周知である。
【００５７】
標的核酸分子は、初期ＰＣＲ混合物に組み込む前に、生物学試料又は環境試料から逆転写（ＲＮＡの場合に）、抽出及び／又は精製してよい。
【００５８】
いくつかの実施形態において、標的核酸分子は、米国特許公開番号第２０１７０２１８３５６号（U.S. Patent Publication No. 20170218356）（参照をもってその全体を本明細書に組み込まれたものとする）に記載されているようにビーズ法（bead beating process）によって抽出される。
【００５９】
４．４．  ＰＣＲ反応
４．４．１．  初期反応混合物
初期ＰＣＲ反応混合物は、以下を含む：
・核酸試料；
・非対称プライマー対；
・熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ；及び
・ＰＣＲ試薬。
【００６０】
核酸試料：試料核酸は、生物学的試料もしくは環境試料、又はそれらに由来する試料、例えば、それらから抽出又は精製されたＤＮＡを含みうる。生物学的試料は、例えば、血液、血清、血漿、組織、細胞、唾液、痰、尿、脳脊髄液、胸膜液、乳、涙、便、汗、精液、全細胞、細胞成分、細胞塗抹標本、又はそれらの抽出物又は誘導体であってよい。試料核酸は、陽性対象試料又は陰性対照試料であってもよい。陰性対照核酸試料は、核酸を含まないか、又は非対称プライマー対にハイブリダイズする配列を含まないことが公知である核酸を含みうる。
【００６１】
非対称プライマー対：ＰＣＲ反応における伸長プライマー及び非伸長プライマーの初期濃度は、それぞれ２００ｎＭ〜６μＭの範囲であってよい。伸長プライマー及び非伸長プライマーは、初期ＰＣＲ反応において等モル量で、例えば、それぞれ約２００ｎＭ〜１μＭの範囲の濃度で、例えばそれぞれ５００ｎＭの濃度で含まれてよい。代わりに、伸長プライマー及び非伸長プライマーは、初期ＰＣＲ反応において等モルでない量で含まれてよい。ある実施形態において、伸長プライマーの初期濃度は、好ましくは、非伸長プライマーの濃度を超えており、例えば、約２倍〜３０倍モル過剰である。したがって、ある態様において、伸長プライマーの濃度は、約１μＭ〜６μＭの範囲であり、かつ非伸長プライマーの濃度は、約５０ｎＭ〜２００ｎＭの範囲である。
【００６２】
非対称プライマー対は、任意の源からの核酸を増幅するために設計されてよく、かつ診断適用について、非対称プライマー対は、段落４．３において特定したような病原体からＤＮＡを増幅するために設計されてよい。
【００６３】
非対称プライマー対は、同時に多くの種に存在する保存された核酸配列、例えば細菌中で高度に保存された１６Ｓリボソーム配列を増幅できるように設計されてよい。
【００６４】
熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ：本開示の非対称ＰＣＲ反応において使用されうる熱安定性ポリメラーゼは、Ｖｅｎｔ（Ｔｌｉ／テルモコックス・リテラリス（Thermoccus Literalis））、Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ、Ｄｅｅｐ Ｖｅｎｔ ｅｘｏ−、Ｔａｑ（テルムス・アクアティクス（Thermus aquaticus））、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＬＡ Ｔａｑ、ＤｒｅａｍＴａｑTM、ＴｏｐＴａｑ、ＲｅｄＴａｑ、Ｔａｑｕｒａｔｅ、ＮｏｖａＴａｑTM、ＳｕｐｅｒＴａｑTM、Ｓｔｏｆｆｅｌ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、ＤｉｓｃｏｖｅｒａｓｅTMｄＨＰＬＣ、９°Ｎｍ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｔａｑ、ＬｏｎｇＡｍｐ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、ＯｎｅＴａｑ、Ｐｈｕｓｉｏｎ（登録商標）Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｆｌｅｘ、Ｃｒｉｍｓｏｎ Ｔａｑ、Ｈｅｍｏ ＫｌｅｎＴａｑ、ＫｌｅｎＴａｑ、Ｐｈｉｒｅ Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＩＩ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ Ｉ、ＤｙＮＡｚｙｍｅ ＩＩ、Ｍ−ＭｕｌＶ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ、ＰｙｒｏＰｈａｇｅ（登録商標）、Ｔｔｈ（サーマス・サーモフィラス（Thermos termophilus）ＨＢ−８）、Ｔｆｌ、ＡｍｌｉｔｈｅｒｍTM、バチルス属ＤＮＡ、ＤｉｓｐｌａｃｅＡｃｅTM、Ｐｆｕ（パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus））、Ｐｆｕ Ｔｕｒｂｏｔ、Ｐｆｕｎｄｓ、ＲｅｐｒｏＦａｓｔ、ＰｙｒｏＢｅｓｔTM、ＶｅｒａＳｅｑ、Ｍａｋｏ， Ｍａｎｔａ， Ｐｗｏ（パイロコッカス・ヴェッセイ（pyrococcus, woesei））、ＥｘａｃｔＲｕｎ、ＫＯＤ（サーモコッカス・コダカラエンシス（thermococcus kodakkaraensis））、Ｐｆｘ、ＲｅｐｒｏＨｏｔ、Ｓａｃ（スルホロブス・アシドカルダリウス（Sulfolobus acidocaldarius））、Ｓｓｏ（スルホロブス・ソルファタリカス（Sulfolobus solfataricus））、Ｔｒｕ（サーマス・ルバー（Thermus ruber））、Ｐｆｘ５０TM（サーモコッカス・ジリギ（Thermococcus zilligi））、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅTMＧＣ−Ｒｉｃｈ（ピロロブス・フマリウス（Pyrolobus fumarius））、パイロコッカス属種（Pyrococcus species）ＧＢ−Ｄ、Ｔｆｉ（サーマス・フィリホルミス（Thermus filiformis））、Ｔｆｉ ｅｘｏ−、ＴｈｅｒｍａｌＡｃｅTM、Ｔａｃ（サーモプラズマ・アシドフィリウム（Thermoplasma acidophilum））、Ｍｔｈ（メタノバクテリウム・サーモオートロフィカム（M. thermoautotrophicum））、Ｐａｂ（パイロコッカス・アビシ（Pyrococcus abyssi））、Ｐｈｏ（パイロコッカス・ホリコシイ（Pyrococcus horikosihi））、Ｂ１０３（ピコウイルス亜科（Picovirinae）バクテリオファージＢ１０３）、Ｂｓｔ（バチルス・ステアロサーモフィルス（Bacillus stearothermophilus））、Ｂｓｔ Ｌａｒｇｅ Ｆｒａｇｍｅｎｔ、Ｂｓｔ ２．０、Ｂｓｔ ２．０ ＷａｒｍＳｔａｒｔ、Ｂｓｕ、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒTM、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒTMＩＩ、ＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒTM ＩＩＩ、及びＴｈｅｒｍｉｎａｔｏｒTM Ｔを含むが、これらに制限されない。好ましい実施形態において、ＤＮＡポリメラーゼは、Ｔａｑポリメラーゼ、例えばＴａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ Ｅｘ Ｔａｑ、Ｈｏｔ Ｓｔａｒｔ ＬＡ Ｔａｑ、ＤｒｅａｍＴａｑTM、ＴｏｐＴａｑ、ＲｅｄＴａｑ、Ｔａｑｕｒａｔｅ、ＮｏｖａＴａｑTM又はＳｕｐｅｒＴａｑTMである。
【００６５】
ＰＣＲ試薬：ＰＣＲ試薬（ｄＮＴＰ、緩衝剤、塩）は、当業者に周知である。それらは、初期ＰＣＲ反応混合物に個別に添加するか、又は全体もしくは一部を、例えばＰＣＲマスターミックスの一部として事前に混合されてよい。
【００６６】
好都合なことには、ＰＣＲマスターミックスは、反応を開始する前に調製され、使用のために保存されてよい。ＰＣＲマスターミックスは、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ（所望の場合に、任意に蛍光標識したｄＮＴＰを含む）、緩衝剤及び／又は塩、並びに、任意に逆転写酵素及び種々の添加剤、例えば防腐剤を含んでよい。プライマー及び試料核酸は、典型的に、ＰＣＲマスターミックスに組み込まれないが、ＰＣＲ反応を開始する直前に初期ＰＣＲ反応混合物に組み込まれる。
【００６７】
本開示の方法は、ＰＣＲ容器、例えばＰＣＲ管中で初期反応混合物の成分を組み合わせることにより、熱サイクルを開始する前に初期反応混合物を形成する任意のステップをさらに含む。
【００６８】
４．４．２．  ＰＣＲ反応条件
本開示の非対称ＰＣＲ法において使用するための例示的な非対称サイクルのセットを表２において示す。
【表２】
2021503903.tif 000004
【００６９】
表２において示すサイクル数の範囲は、任意の非対称プライマー対に使用でき、かつ最適なサイクル数は、初期ＰＣＲ混合物中の標的ＤＮＡのコピー数に依存する：初期コピー数が多いほど少なくなるサイクル数が、線形的段階のための鋳型として機能するために十分な量のＰＣＲ産物を生成するために指数関数的段階で要求される。サイクル数の最適化は、当業者にとって日常的である。
【００７０】
表２において示す温度は、伸長プライマーのＴmが７２℃超であり（例えば７５〜８０℃）、非伸長プライマーのＴmが５８℃を超えるが７２℃未満である（例えば６０〜６２℃）場合に、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼが７２℃で活性がある場合に特に有用である。
【００７１】
サイクル時間、特に伸長時間は、プライマーの融解温度及びＰＣＲ産物の長さによって変動してよく、ＰＣＲ産物が長いほど、伸長時間が長くなる。経験から、伸長ステップは、アンプリコン１０００塩基あたり少なくとも６０秒であるべきである。伸長ステップは、アニーリングのための追加時間を提供するために、線形的段階で伸長されてよい。
【００７２】
４．５．  ＰＣＲ産物の検出
本明細書において記載の方法によって製造した濃縮させた一本鎖ＰＣＲ産物であるＰＣＲ産物鎖２は、検出のために蛍光標識で標識されうる。
【００７３】
蛍光標識は、ＰＣＲ中に蛍光標識したヌクレオチドの導入により、及び／又はＰＣＲのための標識したプライマーを使用することにより得られる。
【００７４】
適した蛍光成分の例は、ＦＩＴＣ、ＥＤＡＮＳ、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、６−ｊｏｅ、ＴＭＲ、Ａｌｅｘａ ４８８、Ａｌｅｘａ ５３２、“ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／Ｃ３”、“ＢＯＤＩＰＹ Ｒ６Ｇ”、“ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ”、Ａｌｅｘａ ５３２、“ＢＯＤＩＰＹ ＦＬ／Ｃ６”、“ＢＯＤＩＰＹ ＴＭＲ”、５−ＦＡＭ、“ＢＯＤＩＰＹ ４９３／５０３”、“ＢＯＤＩＰＹ ５６４”、“ＢＯＤＩＰＹ ５８１”、Ｃｙ３、Ｃｙ５、Ｒ１１０、ＴＡＭＲＡ、Ｔｅｘａｓ ｒｅｄ、及びｘ−ローダミンを含む。
【００７５】
蛍光成分は、ｄＮＴＰ、特に塩基としてシトシンを含むもの（シチジル酸、シチジン５’−リン酸、シチジン５’−二リン酸、シチジン５’−三リン酸、又はそれらのポリマー、又はシチジル酸を含むポリマー）に付着しうる。
【００７６】
ｄＮＴＰ標識の位置は、塩基（アミノ基）、リン酸基（ＯＨ基）、又はデオキシリボース部分（２’−又は３’−ＯＨ基）であってよい。好ましい位置は、塩基のいずれかである。
【００７７】
他のヌクレオチドと同様に、蛍光標識したｄＮＴＰは、ＰＣＲアンプリコンの双方の鎖にランダムな部位で、典型的にｄＣ部位で導入され、ＤＮＡポリメラーゼによって伸長されうる。
【００７８】
蛍光ｄＮＴＰは、高濃度で市販されており、それぞれ標識されていないｄＮＴＰの濃度を調整せずにＰＣＲ反応混合物に添加できる。ほとんどのＰＣＲ増幅について、ｄＮＴＰと蛍光ｄＮＴＰとの典型的な比率は、１００：１〜１０００：１である。したがって、蛍光標識したｄＮＴＰは、標識されていないｄＮＴＰ０．１％〜１％（モル）量でＰＣＲ試薬中に含まれてよい。
【００７９】
蛍光標識したＰＣＲ産物（例えば、本開示の方法において過剰に生成される一本鎖産物鎖２）の検出は、プローブ分子、例えばマイクロアレイに結合したプローブ分子へのハイブリダイゼーションを介して達せられる。適したマイクロアレイシステムは、米国特許番号第９，７３８，９２６号（U.S. Patent No. 9,738,926）において記載されているように、三次元架橋ポリマーネットワークを利用しており、その内容は参照をもって本明細書に組み込まれる。
【００８０】
４．６．  キット
本開示は、本明細書において記載される非対称ＰＣＲ法を実施するために適したキットをさらに提供する。キットは、典型的に少なくとも非対称プライマー対を含む。さらに、本開示のキットは、プローブ分子、ＤＮＡポリメラーゼ、標識されていないｄＮＴＰ、標識したｄＮＴＰ、緩衝液、塩溶液、又はそれらの任意の組み合わせを含んでよい。いくつかの試薬（例えば、ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰ、塩、及び／又は緩衝液）は、マスターミックスの形で事前に組み合わせることができる。
【００８１】
５．  実施例
初期ＰＣＲ反応を、フォワードプライマーについて伸長プライマー、及びリバースプライマーについて非伸長プライマーを使用して、黄色ブドウ球菌１６Ｓ遺伝子（プライマー配列を含まない）の５０６−ｂｐ領域を増幅するように設計した非対称プライマー対で実施した。核酸試料は、公知のコピー数の黄色ブドウ球菌ゲノムＤＮＡ（これらの研究のための標的ＤＮＡ）が添加されたヒトＤＮＡであった。フォワードプライマー（算出したＴm６８．１℃を有する）を、５’末端でＣｙ５で標識し、そして「Ａ」領域（算出したＴm６４．０９℃を有する）、「Ａ」領域の５’末端に相補的な「Ｂ」領域を含み、「Ａ」領域と「Ｂ」領域の間のスペーサーとして「Ｃ」領域を含まなかった。リバースプライマーは標的配列における他の塩基と塩基対を形成できるイノシンを含んだ。相補的な標的塩基に応じて、リバースプライマーのＴmは６０〜６１．９℃の範囲であった。初期ＰＣＲ反応を、以下ＰＣＲサイクルで実施した：
・９５℃で２分の初期変性期間、
・それぞれ９５℃で２０秒の変性、５８℃で１５秒のアニーリング、及び７２℃で４０秒の伸長からなる指数関数的サイクル、
・それぞれ９５℃で２０秒の変性、そして７２℃で同時のアニーリング／伸長からなる線形的サイクル、
・最後に、７２℃で２分の延長した伸長期間。
【００８２】
実験１において、標的ＤＮＡ分子の数、並びに指数関数的サイクル及び線形的サイクルを変動させて、標的核酸のコピー数について指数関数的サイクル及び線形的サイクルの数を最適化させた。含まれるリバース（非伸長プライマー）の量を、非伸長プライマーを指数関数的段階の終わりまでに使い果たすか又はほぼ使い果たし、非対称ＰＣＲの線形的段階まで非常に少ない非伸長プライマー分子が残るように決定した。これらの算出した結果を表３に示す：
【表３】
2021503903.tif 000005
【００８３】
実験１において生成したＰＣＲ産物の量を、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションによって定量した。結果を図８において示す。
【００８４】
実験２において、非対称ＰＣＲ及び対称ＰＣＲを使用して異なる鋳型濃度から生成したＰＣＲ産物の量を、それぞれ５００ｎＭのフォワードプローブ及びリバースプローブをＰＣＲ反応で使用して比較した。非対称反応について、使用した指数関数的サイクル及び線形的サイクルの数は、それぞれ３５及び２０であった。対称反応において、線形的サイクルを使用しなかった。
【００８５】
ＰＣＲ産物の量を、マイクロアレイへのハイブリダイゼーションによって検出した。結果を図９において示す。０．９５より大きいＲ2値は、いずれの場合も回帰直線がデータの有効な近似であることを示す。
【００８６】
６．  特定の実施形態
本開示は、以下の特定の実施形態により例示される。
【００８７】
１．  非対称ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）による一本鎖ＤＮＡアンプリコンの製造方法であって、
（ａ）初期混合物に増幅ＰＣＲ条件下で熱サイクルの第一段階を受けさせ、それにより中間混合物を製造するステップ、
ここで、初期混合物は
（ｉ）核酸試料、
（ｉｉ）非対称プライマー対、
（ｉｉｉ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、及び
（ｉｖ）ＰＣＲ試薬
を含み、熱サイクルの第一段階は、少なくとも３種の温度によるサイクルを含み、該３種の温度は、（１）変性のための標的核酸のＴmを超える第一の温度、（２）プライマーアニーリングのための非伸長プライマーのＴm未満の第二の温度、及び（３）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長に適した第三の温度を含み、
中間混合物は、標的核酸が試料中に存在する場合に、非伸長プライマーと伸長プライマーの双方から伸長させたＤＮＡアンプリコンを含み、
（ｂ）中間混合物に熱サイクルの第二段階を受けさせ、それにより、最終混合物を製造するステップ、
ここで、第二段階は、（１）変性のためのＤＮＡアンプリコンのＴm超える第四の温度、（２）（ｉ）伸長プライマーのＴm未満であり、（ｉｉ）非伸長プライマーのＴmを超え、かつ（ｉｉｉ）熱安定性ＤＮＡポリメラーゼによる伸長に適している第五の温度によるサイクルを含み、
最終混合物は、標的核酸が試料中に存在する場合に、一本鎖ＤＮＡアンプリコンを含む
を含む、前記方法。
２．  ステップ（ａ）を初期変性期間により実施する、実施形態１に記載の方法。
３．  初期変性を第一の温度で実施する、実施形態２に記載の方法。
４．  ステップ（ｂ）を、追加の伸長期間により実施する、実施形態１から３までのいずれかに記載の方法。
５．  追加の伸長を第五の温度で実施する、実施形態４に記載の方法。
６．  第一の温度及び第四の温度が同一である、実施形態１から５までのいずれかに記載の方法。
７．  第三の温度及び第五の温度が同一である、実施形態１から６までのいずれかに記載の方法。
８．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、「Ａ」領域の少なくとも一部の逆方向反復配列の相補体である、実施形態１から７までのいずれかに記載の方法。
９．  「Ｂ」領域が、少なくとも４ヌクレオチドの長さである、実施形態８に記載の方法。
１０．  「Ｂ」領域が、「Ａ」領域よりも３ヌクレオチド短い、実施形態８又は実施形態９に記載の方法。
１１．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、「Ａ」領域の少なくとも一部の直接反復配列の相補体である、実施形態１から７までのいずれかに記載の方法。
１２．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、少なくとも４ヌクレオチドの長さである、実施形態１１に記載の方法。
１３．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、「Ａ」領域よりも３ヌクレオチド短い、実施形態１１又は実施形態１２に記載の方法。
１４．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、７〜１５ヌクレオチドの長さである、実施形態１から１１までのいずれかに記載の方法。
１５．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、６〜１２ヌクレオチドの長さである、実施形態１４に記載の方法。
１６．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、８〜１０ヌクレオチドの長さである、実施形態１５に記載の方法。
１７．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、６ヌクレオチドの長さである、実施形態１５に記載の方法。
１８．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、７ヌクレオチドの長さである、実施形態１５に記載の方法。
１９．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、８ヌクレオチドの長さである、実施形態１５に記載の方法。
２０．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、９ヌクレオチドの長さである、実施形態１５に記載の方法。
２１．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、１０ヌクレオチドの長さである、実施形態１５に記載の方法。
２２．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、１１ヌクレオチドの長さである、実施形態１５に記載の方法。
２３．  伸長プライマーの「Ｂ」領域が、１２ヌクレオチドの長さである、実施形態１５に記載の方法。
２４．  非伸長プライマーが、５’末伸長を有さない、実施形態１から２３までのいずれかに記載の方法。
２５．  非伸長プライマーが、３ヌクレオチド以下の５’末伸長を有する、実施形態１から２３までのいずれかに記載の方法。
２６．  非伸長プライマーが、１２〜３５ヌクレオチドの長さである、実施形態１から２５までのいずれかに記載の方法。
２７．  非伸長プライマーが、１５〜２５ヌクレオチドの長さである、実施形態２６に記載の方法。
２８．  非伸長プライマーが、１８〜２０ヌクレオチドの長さである、実施形態２６に記載の方法。
２９．  伸長プライマーの「Ａ」領域が、１２〜３５ヌクレオチドの長さである、実施形態１から２８までのいずれかに記載の方法。
３０．  伸長プライマーの「Ａ」領域が、１５〜２５ヌクレオチドの長さである、実施形態２９に記載の方法。
３１．  伸長プライマーの「Ａ」領域が、１８〜２０ヌクレオチドの長さである、実施形態２９に記載の方法。
３２．  伸長プライマーが、「Ｃ」領域を含む、実施形態１から３１までのいずれかに記載の方法。
３３．  「Ｃ」領域が、１〜８ヌクレオチドの長さである、実施形態３２に記載の方法。
３４．  「Ｃ」領域が、単独で又は隣接する「Ａ」領域及び／又は「Ｂ」領域ヌクレオチドと組み合わせて、制限エンドヌクレアーゼのための認識部位を形成する、実施形態３２又は実施形態３３に記載の方法。
３５．  制限エンドヌクレアーゼが、６−カッターである、実施形態３４に記載の方法。
３６．  伸長プライマーのＴmが、少なくとも８℃だけ非伸長プライマーのＴmよりも高い、実施形態１から３５のいずれかに記載の方法。
３７．  伸長プライマーのＴmが、１０℃〜３０℃だけ非伸長プライマーのＴmよりも高い、実施形態３６に記載の方法。
３８．  伸長プライマーのＴmが、１５℃〜３０℃だけ非伸長プライマーのＴmよりも高い、実施形態３７に記載の方法。
３９．  伸長プライマーのＴmが、１２℃〜２０℃だけ非伸長プライマーのＴmよりも高い、実施形態３８に記載の方法。
４０．  伸長プライマーのＴmが、１３℃〜１７℃だけ非伸長プライマーのＴmよりも高い、実施形態３９に記載の方法。
４１．  伸長プライマーのＴmが、６８℃〜８０℃の範囲である、実施形態１から４０のいずれかに記載の方法。
４２．  伸長プライマーのＴmが、７３℃〜７７℃の範囲である、実施形態４１に記載の方法。
４３．  伸長プライマーのＴmが、７５℃である、実施形態４２に記載の方法。
４４．  非伸長プライマーのＴmが、５０℃〜６２℃の範囲である、実施形態１から４３のいずれかに記載の方法。
４５．  非伸長プライマーのＴmが、５８℃〜６２℃の範囲である、実施形態４４に記載の方法。
４６．  非伸長プライマーのＴmが、６０℃である、実施形態４５に記載の方法。
４７．  伸長プライマーの「Ａ」領域のＴmが、５０℃〜６２℃の範囲である、実施形態１から４６のいずれかに記載の方法。
４８．  伸長プライマーの「Ａ」領域のＴmが、５８℃〜６２℃である、実施形態４７に記載の方法。
４９．  伸長プライマーの「Ａ」領域のＴmが、６０℃である、実施形態４８に記載の方法。
５０．  伸長プライマーの「Ａ」領域のＴmと非伸長プライマーのＴmが、３℃以下だけ異なる、実施形態１から４９のいずれかに記載の方法。
５１．  第一の温度が９５℃である、実施形態１から５０までのいずれかに記載の方法。
５２．  第二の温度が５８℃である、実施形態１から５１までのいずれかに記載の方法。
５３．  第三の温度が７２℃である、実施形態１から５２までのいずれかに記載の方法。
５４．  第四の温度が９５℃である、実施形態１から５３までのいずれかに記載の方法。
５５．  第五の温度が７２℃である、実施形態１から５４でのいずれかに記載の方法。
５６．  中間混合物中で非伸長プライマーと伸長プライマーの双方から伸長されたＤＮＡアンプリコンが、互いにハイブリダイズして二本鎖ＤＮＡアンプリコンを形成する、実施形態１から５５までのいずれかに記載の方法。
５７．  ＰＣＲ反応により生成されたＤＮＡアンプリコンが、１００〜２５００ヌクレオチドの長さの範囲である、実施形態１から５６までのいずれかに記載の方法。
５８．  ＰＣＲ反応により生成されたＤＮＡアンプリコンが、２００〜２０００ヌクレオチドの長さの範囲である、実施形態５７に記載の方法。
５９．  ＰＣＲ反応により生成されたＤＮＡアンプリコンが、２５０〜１５００ヌクレオチドの長さの範囲である、実施形態５７に記載の方法。
６０．  ＰＣＲ反応により生成されたＤＮＡアンプリコンが、３００〜１０００ヌクレオチドの長さの範囲である、実施形態５７に記載の方法。
６１．  核酸試料が、試験核酸試料である、実施形態１から６０までのいずれかに記載の方法。
６２．  試験核酸試料が、標的核酸分子を含むか、又は標的核酸分子を含む危険性があるか、又は標的核酸分子を含む疑いがある、実施形態６１に記載の方法。
６３．  核酸試料が、対照核酸試料である、実施形態１から６０までのいずれかに記載の方法。
６４．  対照核酸試料が、１つ又は複数の標的核酸分子を含むことが公知の陽性対照試料である、実施形態６３に記載の方法。
６５．  対照核酸試料が、複数の標的核酸分子を含むことが公知の陽性対照試料である、実施形態６３に記載の方法。
６６．  多重ＰＣＲ反応である、実施形態１から６５までのいずれかに記載の方法。
６７．  初期混合物が、少なくとも２個の非対称プライマー対を含む、実施形態６６に記載の方法。
６８．  初期混合物が、２個、３個又は４個の非対称プライマー対を含む、実施形態６７に記載の方法。
６９．  初期混合物が、さらに対照プライマーを含む、実施形態６１から６８までのいずれかに記載の方法。
７０．  対照プライマーが、１つ又は複数の非対称プライマー対に相補的である１つ又は複数の標的配列とは異なる標的配列に相補的である、実施形態６９に記載の方法。
７１．  対照プライマーが、一本鎖プライマーである、実施形態６９又は実施形態７０に記載の方法。
７２．  対照プライマーが、非対称プライマー対である、実施形態６９又は実施形態７０に記載の方法。
７３．  ＰＣＲを、ジェネリックプライマーの非存在下で実施する、実施形態１から７２までのいずれかに記載の方法。
７４．  第一段階が、熱サイクル２０〜４０ラウンドを含む、実施形態１から７３までのいずれかに記載の方法。
７５．  第二段階が、熱サイクル３０〜３７ラウンドを含む、実施形態７４に記載の方法。
７６．  第一段階が、標的核酸の双方の鎖の指数関数的増幅をもたらす、実施形態１から７５までのいずれかに記載の方法。
７７．  第二段階が、熱サイクル１５〜２５ラウンドを含む、実施形態１から７６までのいずれかに記載の方法。
７８．  第二段階が、標的核酸の一本鎖の線形的増幅をもたらす、実施形態１から７７までのいずれかに記載の方法。
７９．  初期混合物における伸長プライマー及び非伸長プライマーのそれぞれの濃度が、２００ｎＭ〜６μＭの範囲である、実施形態１から７８までのいずれかに記載の方法。
８０．  初期混合物における伸長プライマー及び非伸長プライマーのそれぞれの濃度が、同一である、実施形態１から７９までのいずれかに記載の方法。
８１．  初期混合物における伸長プライマー及び非伸長プライマーのそれぞれの濃度が、１００ｎＭ〜１０００ｎＭの範囲である、実施形態８０に記載の方法。
８２．  初期混合物における伸長プライマー及び非伸長プライマーのそれぞれの濃度が、２５０ｎＭ〜７５０ｎＭの範囲である、実施形態８１に記載の方法。
８３．  初期混合物における伸長プライマー及び非伸長プライマーのそれぞれの濃度が、約５００ｎＭである、実施形態８２に記載の方法。
８４．  初期混合物における伸長プライマー及び非伸長プライマーの濃度が異なる、実施形態１から７９までのいずれかに記載の方法。
８５．  初期混合物における伸長プライマーの濃度が１μＭ〜６μＭの範囲である、実施形態８４に記載の方法。
８６．  初期混合物における非伸長プライマーの濃度が５０ｎＭ〜２００ｎＭの範囲である、実施形態８４又は実施形態８５に記載の方法。
８７．  伸長プライマーが、標識付けされている、実施形態１から８６までのいずれかに記載の方法。
８８．  伸長プライマーが、その５’末端に標識付けされている、実施形態８７に記載の方法。
８９．  標識が蛍光体である、実施形態８７又は実施形態８８に記載の方法。
９０．  非対称プライマー対が、細菌配列に対して相補的な配列を含む、実施形態１から８９までのいずれかに記載の方法。
９１．  細菌配列が、１６Ｓ ＤＮＡ配列である、実施形態９０に記載の方法。
９２．  細菌配列が、細菌の内部転写された領域のＤＮＡ配列である、実施形態９０に記載の方法。
９３．  非対称プライマー対が、真菌ＤＮＡ配列に対して相補的な配列を含む、実施形態１から８９までのいずれかに記載の方法。
９４．  試料が、生物学的試料である、実施形態１から９３までのいずれかに記載の方法。
９５．  生物学的試料が、血液、又はそれらから加工、抽出もしくは分別した試料である、実施形態９４に記載の方法。
９６．  生物学的試料が、腹膜灌流液、又はそれらから加工、抽出もしくは分別した試料である、実施形態９４に記載の方法。
９７．  生物学的試料が、尿、又はそれらから加工、抽出もしくは分別した試料である、実施形態９４に記載の方法。
９８．  生物学的試料が、痰、又はそれらから加工、抽出もしくは分別した試料である、実施形態９４に記載の方法。
９９．  生物学的試料が、創傷スワブ、又はそれらから加工、抽出もしくは分別した試料である、実施形態９４に記載の方法。
１００．  試料が、環境試料である、実施形態１から９３までのいずれかに記載の方法。
１０１．  さらに、一本鎖ＰＣＲアンプリコンを検出することを含む、実施形態１から１００までのいずれかに記載の方法。
１０２．  一本鎖ＰＣＲアンプリコンをプローブ分子にハイブリダイズすること、及びプローブ分子へのアンプリコンのハイブリダイゼーションを検出することを含む、実施形態１０１に記載の方法。
１０３．  プローブ分子が標識付けされている、実施形態１０２に記載の方法。
１０４．  プローブ分子が蛍光体で標識付けされている、実施形態１０３に記載の方法。
１０５．  プローブ分子が、少なくとも伸長プライマーの一部に相補的である、実施形態１０２から１０４のいずれかに記載の方法。
１０６．  プローブ分子が、少なくとも１５ヌクレオチドの長さである、実施形態１０５に記載の方法。
１０７．  プローブ分子が、伸長プライマーの「Ａ」領域の少なくとも８ヌクレオチドに相補的な領域を有する、実施形態１０５又は実施形態１０６に記載の方法。
１０８．  プローブ分子が、少なくとも非伸長プライマーの一部に相補的である、実施形態１０２から１０４のいずれかに記載の方法。
１０９．  プローブ分子が、少なくとも１５ヌクレオチドの長さである、実施形態１０８に記載の方法。
１１０．  プローブ分子が、伸長プライマーの「Ａ」領域の少なくとも８ヌクレオチドに相補的な領域を有する、実施形態１０８又は実施形態１０９に記載の方法。
【００８８】
種々の特定の実施形態を図示及び説明してきたが、本開示の趣旨及び範囲から逸脱することなく、種々の変更を行うことができることを理解されたい。
【００８９】
７．  参考文献の引用
本出願において引用された全ての刊行物、特許、特許出願及び他の文書は、それぞれ個々の刊行物、特許、特許出願又は他の文書が全ての目的のために参照をもって組み込まれることが個々に示されたかのように、全ての目的のために同程度にその全体が参照をもって本明細書に組み込まれる。本明細書において組み込まれる１つ又は複数の参考文献の教示と本開示との間に矛盾がある場合には、本明細書の教示が意図される。
【図１】
2021503903.tif 000006
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５−１】
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【図５−２】
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【図６】
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【図７−１】
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【図７−２】
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【図８】
2021503903.tif 000015
【図９】
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【配列表】
2021503903000001.app
【国際調査報告】
2021503903.tif 000017
2021503903.tif 000018
2021503903.tif 000019