(57)【要約】  本出願は、核酸およびＣＡＲ修飾免疫細胞を含む治療薬、ならびにその使用に関与する。該治療薬は、第１の組成物と第２の組成物とを含んでおり、該第１の組成物は、腫瘍細胞および／または癌細胞内へ導入されるための標識ポリペプチドコード配列を有する核酸を含み；前記標識ペプチドは、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有し、それらは腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得；該細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列は、エピトープポリペプチドの１つ以上のアミノ酸配列を含んでおり；これにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列は、該エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まず；該第２の組成物は、キメラ抗原受容体修飾免疫細胞を含み；該キメラ抗原受容体修飾免疫細胞は、該標識ポリペプチドの該細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合し得る。本発明は、相乗的治療効果を達成する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
腫瘍および／または癌の治療のための治療薬であって：
（ａ）第１の組成物であって、前記第１の組成物が、第１の活性成分を第１の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第１の活性成分が、腫瘍細胞および／または癌細胞内へ導入されるための標識ポリペプチドコード配列を有する核酸を含むかまたは含有しており；前記標識ペプチドが、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有し、それらは腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得；前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列は、エピトープポリペプチドの１つ以上のアミノ酸配列を含んでおり；かつこれにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列は、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、該第１の組成物と；および
（ｂ）第２の組成物であって、これにおいて前記第２の組成物が、第２の活性成分を第２の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第２の活性成分が、キメラ抗原受容体修飾免疫細胞を含み；前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞が、前記標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合し得る、該第２の組成物と、
を含む該治療薬。
【請求項２】
前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、自然界に存在するタンパク質のアミノ酸配列に由来するか、または前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、前記自然界には存在しない人工的に合成されたアミノ酸配列である、請求項１に記載の治療薬。
【請求項３】
前記自然界に存在する前記タンパク質が、哺乳類の細胞内タンパク質、ウイルスタンパク質、および他の全ての非哺乳類タンパク質を含む、請求項２に記載の治療薬。
【請求項４】
前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のタグ：Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＳｔｒｅｐタグＩＩ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡＴタグ、Ｓタグ、Ｓ１タグ、プロテインＣタグ、ｔａｇ−１００タグ、Ｅ２タグ、ＴＡＰタグ、ＨＳＶタグ、ＫＴ３タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＲＦＰタグ、のアミノ酸配列を含む、請求項１に記載の治療薬。
【請求項５】
前記細胞外抗原決定領域の前記アミノ酸配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、または配列番号：５に示される通りである、請求項１に記載の治療薬。
【請求項６】
前記スペーサー部位が、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧのヒンジ領域、またはＩｇＤのヒンジ領域に由来し；好ましくは、前記スペーサー部位のアミノ酸配列が、配列番号：６に示される通りであり；ここで前記膜貫通部位が、ＣＤ８，ＣＤ３ζ、ＣＤ４，またはＣＤ２８の膜貫通領域に由来し；好ましくは、前記膜貫通部位のアミノ酸配列が、配列番号：７に示される通りである、請求項１に記載の治療薬。
【請求項７】
前記標識ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、または配列番号：１５に示される通りである、請求項１に記載の治療薬。
【請求項８】
前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡを含み；かつ前記ＲＮＡが前記ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡを含む、請求項１に記載の治療薬。
【請求項９】
前記第１の活性成分が、組換えウイルスであり、かつ前記組換えウイルスのゲノムが前記標識ポリペプチドコード配列を有しており；ここで、前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスを含む、請求項１に記載の治療薬。
【請求項１０】
前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつ遺伝的に変異されたウイルスまたは腫瘍溶解作用をもつ野生型ウイルスに由来し；好ましくは前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつアデノウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、セムリキフォレストウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、エコタイプエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびマラバ（Ｍａｌａｂａ）ウイルスに由来する、請求項９に記載の治療薬。
【請求項１１】
前記キメラ抗原受容体が、動作可能なようにかつ順次に連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを含み、かつ前記抗原結合ドメインが、前記標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合する、請求項１に記載の治療薬。
【請求項１２】
前記抗原結合ドメインのアミノ酸配列が、配列番号：４２、配列番号：４３、または配列番号：４４に示される通りである、請求項１１に記載の治療薬。
【請求項１３】
前記細胞内ドメインが、リンパ球細胞内活性化シグナル伝達領域および任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域に由来しており、これにおいて、前記細胞内活性化シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζまたはＤＡＰ１２の細胞内活性化シグナル伝達領域から選択され；前記任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域が、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および／またはＩＣＯＳＳの補助刺激シグナル伝達領域から選択される、請求項１１に記載の治療薬。
【請求項１４】
前記スペーサー領域が、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧのヒンジ領域、またはＩｇＤのヒンジ領域に由来し、かつ膜貫通領域が、ＣＤ８α、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、またはＣＤ２８の膜貫通領域に由来する、請求項１１に記載の治療薬。
【請求項１５】
前記キメラ抗原受容体の前記アミノ酸配列が、配列番号：４６、配列番号：４７、または配列番号：４８に示される通りである、請求項１１に記載の治療薬。
【請求項１６】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む、請求項１に記載の治療薬。
【請求項１７】
前記第１の組成物および前記第２の組成物が、一緒に混合されることなく、別々に治療薬中に存在する、請求項１に記載の治療薬。
【請求項１８】
前記第１の組成物が、治療上有効な量の前記ＤＮＡまたは治療上有効な量の前記ｍＲＮＡを含む、請求項８に記載の治療薬。
【請求項１９】
前記第１の組成物が、治療上有効な量の前記組換えウイルスを含む、請求項９に記載の治療薬。
【請求項２０】
前記第２の組成物が、治療上有効な量の前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞を含む、請求項１に記載の治療薬。
【請求項２１】
前記ＤＮＡが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化され；かつ前記ｍＲＮＡが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化されている、請求項８に記載の治療薬。
【請求項２２】
前記組換えウイルスが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化されている、請求項９に記載の治療薬。
【請求項２３】
前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞が、静脈内または局所に投与されるべく製剤化されている、請求項１に記載の治療薬。
【請求項２４】
前記治療薬が第１の組成物と第２の組成物とから構成される、請求項１に記載の治療薬。
【請求項２５】
腫瘍および／または癌の治療のための薬物の調製における、請求項１から請求項２４のいずれか１項に記載の治療薬の使用。
【請求項２６】
前記腫瘍および／または癌が：乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ（ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｔｕｍｏｒ）、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、請求項２５に記載の使用。
【請求項２７】
標識ポリペプチドであって、前記標識ポリペプチドが、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有すること、および前記標識ポリペプチドが、腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得ること；前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列が、エピトープポリペプチドの１つ以上のアミノ酸配列を含むこと；かつこれにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列が、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まないこと、を特徴とする標識ポリペプチド。
【請求項２８】
前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、自然界に存在するタンパク質のアミノ酸配列に由来するか、または前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、前記自然界には存在しない人工的に合成されたアミノ酸配列である、請求項２７に記載の標識ポリペプチド。
【請求項２９】
前記自然界に存在する前記タンパク質が、哺乳類の細胞内タンパク質、ウイルスタンパク質、および全ての他の非哺乳類タンパク質を含む、請求項２８に記載の標識ポリペプチド。
【請求項３０】
前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のタグ：Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＳｔｒｅｐタグＩＩ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡＴタグ、Ｓタグ、Ｓ１タグ、プロテインＣタグ、ｔａｇ−１００タグ、Ｅ２タグ、ＴＡＰタグ、ＨＳＶタグ、ＫＴ３タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＲＦＰタグ、のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載の標識ポリペプチド。
【請求項３１】
前記細胞外抗原決定領域の前記アミノ酸配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、または配列番号：５に示される通りである、請求項２７に記載の標識ポリペプチド。
【請求項３２】
前記スペーサー部位が、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧのヒンジ領域、またはＩｇＤのヒンジ領域に由来し；好ましくは、前記スペーサー部位のアミノ酸配列が、配列番号：６に示される通りであり；ここで前記膜貫通部位が、ＣＤ８，ＣＤ３ζ、ＣＤ４，またはＣＤ２８の膜貫通領域に由来し；好ましくは、前記膜貫通部位のアミノ酸配列が、配列番号：７に示される通りである、請求項２７に記載の標識ポリペプチド。
【請求項３３】
前記標識ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、または配列番号：１５に示される通りである、請求項２７に記載の標識ポリペプチド。
【請求項３４】
請求項２７から請求項３３のいずれか１項に記載の標識ポリペプチドのコード配列を有する、単離された核酸。
【請求項３５】
前記核酸が、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および前記標識ポリペプチドの前記コード配列を順次に含む、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３６】
前記核酸が、ＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む、請求項３４に記載の核酸。
【請求項３７】
組換え発現ベクターであって、前記組換え発現ベクターが、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および請求項２７から請求項３３のいずれか１項に記載の標識ポリペプチドのコード配列を順次に含む、組換え発現ベクター。
【請求項３８】
単離された組換えウイルスであって、前記組換えウイルスのゲノムが、順次にかつ動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および請求項２７から請求項３３のいずれか１つの前記標識ポリペプチドのコード配列を含んでおり、かつこれにおいて、前記標識ポリペプチドが腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得；かつ前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスを含む、単離された組換えウイルス。
【請求項３９】
前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスであり、かつ前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつ遺伝的に変異されたウイルスまたは腫瘍溶解作用をもつ野生型ウイルスに由来し；好ましくは前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつアデノウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、セムリキフォレストウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、エコタイプエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびマラバ（Ｍａｌａｂａ）ウイルスに由来する、請求項３８に記載の組換えウイルス。
【請求項４０】
順次にかつ動作可能なように連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを含む、キメラ抗原受容体であって、かつ前記抗原結合ドメインが、請求項２７から請求項３３のいずれか１項に記載の標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を認識しかつ結合し得ることを特徴とする、キメラ抗原受容体。
【請求項４１】
前記抗原結合ドメインのアミノ酸配列が、配列番号：４２、配列番号：４３、または配列番号：４４に示される通りである、請求項４０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４２】
前記細胞内ドメインが、リンパ球細胞内活性化シグナル伝達領域および任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域に由来し、これにおいて、前記細胞内活性化シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζまたはＤＡＰ１２の前記細胞内活性化シグナル伝達領域から選択され；前記任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域が、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および／またはＩＣＯＳＳの補助刺激シグナル伝達領域から選択される、請求項４０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４３】
前記スペーサー領域が、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧのヒンジ領域、またはＩｇＤのヒンジ領域に由来し、かつ前記膜貫通領域が、ＣＤ８α、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、またはＣＤ２８の膜貫通領域に由来する、請求項４０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４４】
前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列が、配列番号：４６、配列番号：４７、または配列番号：４８に示される通りである、請求項４０に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４５】
請求項４０から４４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体のコード配列を有する、単離されたＤＮＡ。
【請求項４６】
そのヌクレオチド配列が、配列番号：５３、配列番号：５４、または配列番号：５５に示される通りである、請求項４５に記載のＤＮＡ。
【請求項４７】
請求項４５または４６に記載のＤＮＡから転写された、単離されたｍＲＮＡ。
【請求項４８】
組換え発現ベクターであって、前記組換え発現ベクターが、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および請求項４０から４４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体のコード配列を順次に含む、組換え発現ベクター。
【請求項４９】
キメラ抗原受容体修飾免疫細胞であって、前記免疫細胞の表面が、請求項４０から４４のいずれか１項に記載のキメラ抗原受容体によって修飾される、キメラ抗原受容体修飾免疫細胞。
【請求項５０】
前記免疫細胞が、ＮＫ細胞またはＴ細胞である、請求項４９に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫細胞。
【請求項５１】
腫瘍および／または癌の治療のための相乗効果をもつ、コンビナトリアルドラッグのキットであって：
請求項１から２４のいずれか１項に記載の治療薬の前記第１の組成物を含む第１の容器と；
請求項１から２４のいずれか１項に記載の治療薬の前記第２の組成物を含む第２の容器であって、これにおいて前記第１の容器が前記第２の容器から分離されている該容器と；および、
投与のタイミングおよび経路を指定する指示書と、
を含むキット。
【請求項５２】
腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、請求項３４から３６のいずれか１項に記載の核酸の使用。
【請求項５３】
腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、請求項３８または３９に記載の組換えウイルスの使用。
【請求項５４】
腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、請求項４９または５０に記載のキメラ抗原受容体修飾免疫細胞の使用。
【請求項５５】
腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、請求項５１に記載のキットの使用。
【請求項５６】
前記腫瘍および／または癌が：乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ（ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｔｕｍｏｒ）、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、請求項５２から５５のいずれか１項に記載の使用。
【請求項５７】
腫瘍および／または癌を治療するための方法であって：
請求項１から２４のいずれか１項に記載の治療薬の前記第１の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している患者に投与すること；および
請求項１から２４のいずれか１項に記載の治療薬の前記第２の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している前記患者に投与すること、
を含む、該方法。
【請求項５８】
以下の工程：
１）前記第１の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している前記患者に投与すること；および
２）前記第１の組成物の投与後に、前記第２の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している前記患者に投与すること、
を、逐次的方法で含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記腫瘍および／または癌が：乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ（ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｔｕｍｏｒ）、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、請求項５７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医用生物工学の分野、および特に、核酸およびＣＡＲ修飾免疫細胞を含む治療薬、標識ポリペプチド、キメラ抗原受容体、コード核酸、発現ベクター、組換えウイルス、キット、ならびにその使用に属する。
【背景技術】
【０００２】
癌免疫療法は、身体の免疫系を活性化することにより、微小な残存癌病変を特異的に除去するかまたは癌細胞の増殖を有意に阻害する治療法である。この治療法には、長い奏効期間および小さい副作用という利点があり、近代の癌療法の第４の方法と称されている。近年、癌免疫療法には多くの進歩がなされてきた。雑誌「Ｓｃｉｅｎｃｅ」は、癌免疫療法を２０１３年における重要な科学的大躍進として列記した。キメラ抗原受容体ＣＡＲ修飾免疫細胞は、現在最も有効かつ有望な腫瘍細胞免疫療法製品である。ＣＡＲ免疫細胞技術は、抗体医薬の特異性と細胞療法の持続可能性とをもち、そして精密医療でありかつ個別化された医療である。次の５年間で、免疫療法は、ＣＡＲ免疫療法を含めて、化学療法に取って代わりかつ癌治療の標準療法となることが期待されている。現在、ＣＡＲ免疫療法は、主としてＴ細胞をキャリアとして使用し、悪性血液癌の治療において革命的な進歩を成し遂げた。世界市場は１００億ドルに達した。しかしながら、固形腫瘍の治療におけるＣＡＲ−Ｔの現在の結果は非常に良好とは言えず、安全性、有効性、および大量生産といった問題は、まだ解決される必要がある。これらの問題が解決された後には、ＣＡＲ免疫療法は１０００億ドルの固体腫瘍市場に徐々になだれ込んで行くであろう。
【０００３】
ＣＡＲは、人工的に修飾された受容体であり、かつそれ故に、任意の抗原を認識する特異的な受容体が免疫エフェクター細胞上に移植され得る。ＣＡＲの基本設計は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）結合領域、（通常はモノクローナル抗体抗原結合領域のｓｃＦＶフラグメントに由来する）、細胞外ヒンジ領域、膜貫通領域、および細胞内シグナル領域を含む。この受容体の様々な領域が異なる起源をもつことから、この受容体は、キメラ受容体と称される。簡単に言えば、ＣＡＲ−Ｔは、腫瘍細胞の表面上の抗原を認識する抗体と、Ｔ細胞を活性化して、Ｔ細胞が抗体のガイドの下に癌細胞を直接攻撃できるようにするのに必要なシグナル分子との結合物である。ＣＡＲ免疫細胞技術は、抗腫瘍免疫療法の開発における課題、すなわち腫瘍形成の免疫回避機構、を克服する。回避機構は、腫瘍細胞を免疫系の攻撃から保護することが可能であり、かつ主として、抗原に対するプロセシング能の低下、組織適合性複合体の発現低下、腫瘍表面上での抗原の発現低下、サイトカインの発現低下、および免疫抑制性分子の発現増加を含む。ＣＡＲ免疫細胞の標的は、細胞傷害性Ｔリンパ球のそれとは異なる。それは腫瘍表面上で抗原提示経路によって提示される抗原を攻撃することの代わりに、腫瘍細胞表面上でタンパク質または他の非タンパク質分子であってもよい特異的な分子を攻撃する。これらの分子の発現は、腫瘍細胞抗原に対するプロセシング能および組織適合性複合体の発現とは無関係である。それ故、ＣＡＲ免疫細胞の機能は、組織適合性複合体の調節によって制限されることはない。
【０００４】
しかしながら、ＣＡＲ−Ｔ技術にはなお、固形腫瘍の治療において大きな課題がある。主な問題には以下が含まれる：１）固形腫瘍は高度に不均一な、すなわち多様な、腫瘍抗原を発現し、そのことが癌細胞を免疫システムの監視から逃れやすくする。これは、血液癌とは異なる。例えば、ＣＤ１９白血病は、基本的にＣＤ１９陽性である。固形腫瘍抗原の多様性のために、全ての癌細胞を殺すのに適した適当な標的化部位を見つけることは困難であり、残存する標的化部位陰性の癌細胞が腫瘍の再発を引き起こす可能性がある。２）固形腫瘍の多くの腫瘍抗原は、また正常な組織においても発現され、そのことが腫瘍特異的なＣＡＲの設計を難しくしており、オフ・ターゲットの可能性が高く、かつターゲティング／オフ・ターゲット毒性のリスクが高い。３）Ｔ細胞は、腫瘍ホーミングに乏しい。固形腫瘍の細胞は、密度の高いマトリックスによって包まれて腫瘍微小環境を形成する。マトリックスは、動員された正常組織および骨髄由来の（間質）細胞によって組立てられ、免疫細胞がこのマトリックスバリア内に浸透するのを防止する。４）固形腫瘍は、強力な免疫抑制能を有しており、腫瘍微小環境内の多くの細胞は、免疫細胞の抗癌機能を阻害し得る。それ故、固形腫瘍内に浸潤するＣＡＲ−Ｔは、高度に有効な癌細胞殺傷効果を達成することができない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
先行技術における上記記載の問題を解決するため、本発明は治療薬、標識ポリペプチド、キメラ抗原受容体、コード核酸、発現ベクター、組換えウイルス、キット、およびそれらの使用を提供する。
【０００６】
具体的には、本発明は以下を提供する： 
（１）腫瘍および／または癌の治療のための治療薬であって：
（ａ）第１の組成物であって、前記第１の組成物が、第１の活性成分を第１の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第１の活性成分が、腫瘍細胞および／または癌細胞内へ導入されるための標識ポリペプチドコード配列を有する核酸を含むかまたは含有しており；前記標識ペプチドが、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有し、それらは腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得；前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列は、エピトープポリペプチドの１つ以上のアミノ酸配列を含んでおり；かつこれにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列は、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、該第１の組成物と；および
（ｂ）第２の組成物であって、これにおいて前記第２の組成物が、第２の活性成分を第２の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第２の活性成分が、キメラ抗原受容体修飾免疫細胞を含み；前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞が、前記標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合し得る、該第２の組成物と、
を含む該治療薬。
（２）前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、自然界に存在するタンパク質のアミノ酸配列に由来するか、または前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、前記自然界には存在しない人工的に合成されたアミノ酸配列である、（１）の治療薬。
（３）前記自然界に存在する前記タンパク質が、哺乳類の細胞内タンパク質、ウイルスタンパク質、および他の全ての非哺乳類タンパク質を含む、（２）の治療薬。
（４）前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のタグ：Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＳｔｒｅｐタグＩＩ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡＴタグ、Ｓタグ、Ｓ１タグ、プロテインＣタグ、ｔａｇ−１００タグ、Ｅ２タグ、ＴＡＰタグ、ＨＳＶタグ、ＫＴ３タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＲＦＰタグ、のアミノ酸配列を含む、（１）の治療薬。
（５）前記細胞外抗原決定領域の前記アミノ酸配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、または配列番号：５に示される通りである、（１）の治療薬。
（６）前記スペーサー部位が、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧのヒンジ領域、またはＩｇＤのヒンジ領域に由来し；好ましくは、前記スペーサー部位のアミノ酸配列が、配列番号：６に示される通りであり；ここで前記膜貫通部位が、ＣＤ８，ＣＤ３ζ、ＣＤ４，またはＣＤ２８の膜貫通領域に由来し；好ましくは、前記膜貫通部位のアミノ酸配列が、配列番号：７に示される通りである、（１）の治療薬。
（７）前記標識ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、または配列番号：１５に示される通りである、（１）の治療薬。
（８）前記核酸がＤＮＡまたはＲＮＡを含み；かつ前記ＲＮＡが前記ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡを含む、（１）の治療薬。
（９）前記第１の活性成分が、組換えウイルスであり、かつ前記組換えウイルスのゲノムが前記標識ポリペプチドコード配列を有しており；ここで、前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスを含む、（１）の治療薬。
（１０）前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつ遺伝的に変異されたウイルスまたは腫瘍溶解作用をもつ野生型ウイルスに由来し；好ましくは前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつアデノウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、セムリキフォレストウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、エコタイプエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびマラバ（Ｍａｌａｂａ）ウイルスに由来する、（９）の治療薬。
（１１）前記キメラ抗原受容体が、動作可能なようにかつ順次に連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを含み、かつ前記抗原結合ドメインが、前記標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合する、（１）の治療薬。
（１２）前記抗原結合ドメインのアミノ酸配列が、配列番号：４２、配列番号：４３、または配列番号：４４に示される通りである、（１１）の治療薬。
（１３）前記細胞内ドメインが、リンパ球細胞内活性化シグナル伝達領域および任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域に由来しており、これにおいて、前記細胞内活性化シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζまたはＤＡＰ１２の細胞内活性化シグナル伝達領域から選択され；前記任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域が、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および／またはＩＣＯＳＳの補助刺激シグナル伝達領域から選択される、（１１）の治療薬。
（１４）前記スペーサー領域が、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧのヒンジ領域、またはＩｇＤのヒンジ領域に由来し、かつ膜貫通領域が、ＣＤ８α、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、またはＣＤ２８の膜貫通領域に由来する、（１１）の治療薬。
（１５）前記キメラ抗原受容体の前記アミノ酸配列が、配列番号：４６、配列番号：４７、または配列番号：４８に示される通りである、（１１）の治療薬。
（１６）前記免疫細胞が、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含む（１）の治療薬であって；ここで前記ＮＫ細胞が、自家ＮＫ細胞、同種ＮＫ細胞、またはＮＫ細胞株を含み、かつ前記Ｔ細胞が、ナイーブＴ細胞もしくはそれらの前駆細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＴ細胞株を含む、（１）の治療薬。
（１７）前記第１の組成物および前記第２の組成物が、一緒に混合されることなく、別々に治療薬中に存在する、（１）の治療薬。
（１８）前記第１の組成物が、治療上有効な量の前記ＤＮＡまたは治療上有効な量の前記ｍＲＮＡを含む、（８）の治療薬。
（１９）前記第１の組成物が、治療上有効な量の前記組換えウイルスを含む、（９）の治療薬。
（２０）前記第２の組成物が、治療上有効な量の前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞を含む、（１）の治療薬。
（２１）前記ＤＮＡが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化され；かつ前記ｍＲＮＡが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化されている、（８）の治療薬。
（２２）前記組換えウイルスが、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化されている、（９）の治療薬。
（２３）前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞が、静脈内または局所に投与されるべく製剤化されている、（１）の治療薬。
（２４）前記治療薬が第１の組成物と第２の組成物とから構成される、（１）の治療薬。
（２５）腫瘍および／または癌の治療のための薬物の調製における、（１）から（２４）のいずれか１つの治療薬の使用。
（２６）前記腫瘍および／または癌が：乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ（ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｔｕｍｏｒ）、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、（２５）の使用。
（２７）標識ポリペプチドであって、前記標識ポリペプチドが、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有すること、および前記標識ポリペプチドが、腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得ること；前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列が、エピトープポリペプチドの１つ以上のアミノ酸配列を含むこと；かつこれにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列が、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まないこと、を特徴とする該標識ポリペプチド。
（２８）前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、自然界に存在するタンパク質のアミノ酸配列に由来するか、または前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、前記自然界には存在しない人工的に合成されたアミノ酸配列である、（２７）の標識ポリペプチド。
（２９）前記自然界に存在する前記タンパク質が、哺乳類の細胞内タンパク質、ウイルスタンパク質、および全ての他の非哺乳類タンパク質を含む、（２８）の標識ポリペプチド。
（３０）前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列が、以下のタグ：Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＳｔｒｅｐタグＩＩ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡＴタグ、Ｓタグ、Ｓ１タグ、プロテインＣタグ、ｔａｇ−１００タグ、Ｅ２タグ、ＴＡＰタグ、ＨＳＶタグ、ＫＴ３タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＲＦＰタグ、のアミノ酸配列を含む、（２７）の標識ポリペプチド。
（３１）前記細胞外抗原決定領域の前記アミノ酸配列が、配列番号：１、配列番号：２、配列番号：３、配列番号：４、または配列番号：５に示される通りである、（２７）の標識ポリペプチド。
（３２）前記スペーサー部位が、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧのヒンジ領域、またはＩｇＤのヒンジ領域に由来し；好ましくは、前記スペーサー部位のアミノ酸配列が、配列番号：６に示される通りであり；ここで前記膜貫通部位が、ＣＤ８，ＣＤ３ζ、ＣＤ４，またはＣＤ２８の膜貫通領域に由来し；好ましくは、前記膜貫通部位のアミノ酸配列が、配列番号：７に示される通りである、（２７）の標識ポリペプチド。
（３３）前記標識ポリペプチドのアミノ酸配列が、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、または配列番号：１５に示される通りである、（２７）の標識ポリペプチド。
（３４）（２７）から（３３）のいずれか１つの標識ポリペプチドのコード配列を有する、単離された核酸。
（３５）前記核酸が、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および（２７）から（３３）の任意の１つの標識ポリペプチドの前記コード配列を順次に含む、（３４）の核酸。
（３６）前記核酸が、ＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む、（３４）の核酸。
（３７）組換え発現ベクターであって、前記組換え発現ベクターが、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および（２７）から（３３）のいずれか１つの前記標識ポリペプチドの前記コード配列を順次に含む、該組換え発現ベクター。
（３８）単離された組換えウイルスであって、前記組換えウイルスのゲノムが、順次にかつ動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および（２７）から（３３）のいずれか１つの標識ポリペプチドのコード配列を含んでおり、かつこれにおいて、前記標識ポリペプチドが腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得；かつ前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスを含む、該単離された組換えウイルス。
（３９）前記組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスであり、かつ前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつ遺伝的に変異されたウイルスまたは腫瘍溶解作用をもつ野生型ウイルスに由来し；好ましくは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解作用をもつアデノウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、セムリキフォレストウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、エコタイプエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびマラバ（Ｍａｌａｂａ）ウイルスに由来する、（３８）の組換えウイルス。
（４０）動作可能なようにかつ順次に連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを含む、キメラ抗原受容体であって、かつ前記抗原結合ドメインが、（２７）から（３３）のいずれか１つの標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を認識しかつ結合し得ることを特徴とする、該キメラ抗原受容体。
（４１）前記抗原結合ドメインのアミノ酸配列が、配列番号：４２、配列番号：４３、または配列番号：４４に示される通りである、（４０）のキメラ抗原受容体。
（４２）前記細胞内ドメインが、リンパ球細胞内活性化シグナル伝達領域および任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域に由来し、これにおいて、細胞内活性化シグナル伝達領域が、ＣＤ３ζまたはＤＡＰ１２の前記細胞内活性化シグナル伝達領域から選択され；前記任意のリンパ球補助刺激シグナル伝達領域が、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および／またはＩＣＯＳＳの補助刺激シグナル伝達領域から選択される、（４０）のキメラ抗原受容体。
（４３）前記スペーサー領域が、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧのヒンジ領域、またはＩｇＤのヒンジ領域に由来し、かつ前記膜貫通領域が、ＣＤ８α、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、またはＣＤ２８の膜貫通領域に由来する、（４０）のキメラ抗原受容体。
（４４）前記キメラ抗原受容体のアミノ酸配列が、配列番号：４６、配列番号：４７、または配列番号：４８に示される通りである、（４０）のキメラ抗原受容体。
（４５）（４０）から（４４）の任意の１つのキメラ抗原受容体のコード配列を有する、単離されたＤＮＡ。
（４６）そのヌクレオチド配列が、配列番号：５３、配列番号：５４、または配列番号：５５に示される通りである、（４５）のＤＮＡ。
（４７）（４５）または（４６）のＤＮＡから転写された、単離されたｍＲＮＡ。
（４８）組換え発現ベクターであって、前記組換え発現ベクターが、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および（４０）から（４４）のいずれか１つのキメラ抗原受容体のコード配列を順次に含む、該組換え発現ベクター。
（４９）キメラ抗原受容体修飾免疫細胞であって、前記免疫細胞の表面が、（４０）から（４４）のいずれか１つのキメラ抗原受容体によって修飾される、該キメラ抗原受容体修飾免疫細胞。
（５０）前記免疫細胞が、ＮＫ細胞またはＴ細胞である（４９）のキメラ抗原受容体修飾免疫細胞であって；ここで前記ＮＫ細胞が、自家ＮＫ細胞、同種ＮＫ細胞、またはＮＫ細胞株を含み、かつ前記Ｔ細胞が、未発達型Ｔ細胞もしくはそれらの前駆細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＴ細胞株を含む、該キメラ抗原受容体修飾免疫細胞。
（５１）腫瘍および／または癌の治療のための相乗効果をもつ、コンビナトリアルドラッグのキットであって：
（１）から（２４）のいずれか１つの治療薬の前記第１の組成物を含む第１の容器と；
（１）から（２４）のいずれか１つの治療薬の前記第２の組成物を含む第２の容器であって、これにおいて前記第１の容器が前記第２の容器から分離されている該容器と；および、
投与のタイミングおよび経路を指定する指示書と、
を含む該キット。
（５２）腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、（３４）から（３６）のいずれか１つの核酸の使用。
（５３）腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、（３８）または（３９）の組換えウイルスの使用。
（５４）腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、（４９）または（５０）のキメラ抗原受容体修飾免疫細胞の使用。
（５５）腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、（５１）のキットの使用。
（５６）前記腫瘍および／または癌が：乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ（ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｔｕｍｏｒ）、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、（５２）から（５５）のいずれか１つの使用。
（５７）腫瘍および／または癌を治療するための方法であって：
（１）から（２４）のいずれか１つの治療薬の前記第１の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している患者に投与すること；および
（１）から（２４）のいずれか１つの治療薬の前記第２の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している前記患者に投与すること、
を含む、該方法。
（５８）以下の工程：
１）前記第１の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している前記患者に投与すること；および
２）前記第１の組成物の投与後に、前記第２の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している前記患者に投与すること、
を、逐次的方法で含む、（５７）の方法。
（５９）前記腫瘍および／または癌が：乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ（ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｔｕｍｏｒ）、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む、（５７）の方法。
【０００７】
先行技術に比較して、本発明は、以下の利点およびプラス効果を有する：
本発明は、腫瘍の治療におけるＣＡＲ修飾免疫細胞の効果を改善しかつ、腫瘍の治療におけるＣＡＲ修飾免疫細胞の適用を広げる目的で、腫瘍細胞および／または癌細胞の表面を標識するための外来標識ポリペプチドと、該標識ポリペプチドを認識するＣＡＲ修飾免疫細胞とを組合せた利用を提供して、腫瘍（特に固形腫瘍）抗原の発現の不均一性および腫瘍細胞および／または癌細胞の免疫監視からの回避という問題を効果的に解決し、腫瘍細胞および／または癌細胞に対するＣＡＲ修飾免疫細胞の認識感度を改善し、かつターゲティング／オフ・ターゲット毒性のリスクを効果的に低減して、それにより腫瘍細胞殺傷におけるＣＡＲ修飾免疫細胞の有効性を改善するようにする。腫瘍溶解性ウイルスが、腫瘍溶解性ウイルスの腫瘍溶解性殺傷効果に加えて、腫瘍細胞における外来標識ポリペプチドの発現を媒介するベクターとして使用される場合、該標識ポリペプチドを標的とするＣＡＲ修飾免疫細胞は、腫瘍溶解性ウイルスに感染された残存する腫瘍細胞を効果的に除去することができる。同時に、腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍微小環境を破壊することから、ＣＡＲ修飾免疫細胞の腫瘍ホーミング能が改善されることとなり、それにより固形腫瘍の治療の有効性がさらに増強される。
【０００８】
具体的には、本発明はまず、細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有する標識ポリペプチドのアミノ酸配列と、該標識ポリペプチドのコード配列を持つ核酸とを設計して、腫瘍細胞および／または癌細胞が該標識ポリペプチドを発現できるようにし、それらが最終的には、腫瘍細胞および／または癌細胞内へ核酸がトランスフェクトされた後、または核酸のウイルスゲノム内への挿入時に腫瘍細胞および／または癌細胞が組換えウイルスによって感染された後に、腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾されることとなる。標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列がエピトープポリペプチドの１つ以上のアミノ酸配列を含むことから、本発明は、固形腫瘍抗原の発現の不均一性および腫瘍の免疫監視からの回避という問題を効果的に解決する。本発明はまた、標識ポリペプチドをコードする核酸と、細胞外抗原決定領域（特にエピトープペプチド）を認識するＣＡＲ修飾免疫細胞とを含むかまたは含有する、活性成分の組合せであって、腫瘍細胞に対するＣＡＲ修飾免疫細胞の認識感度を改善し、かつＣＡＲ修飾免疫細胞の腫瘍細胞を殺す能力をさらに改善するようにする、該組合せも提案する。さらに、エピトープポリペプチドのアミノ酸配列が、自然状態では哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列中には含まれないという事実により、外来標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域（特にエピトープペプチド）を認識するＣＡＲ修飾免疫細胞が、患者において外来標識ポリペプチドで修飾されていない他の正常な細胞を認識して殺すことがない。それ故、本発明は、患者に対するＣＡＲ修飾免疫細胞のオフ・ターゲット毒性の可能性を大いに低減する。
【０００９】
さらに、本発明は、標識ポリペプチドをコードする核酸を、腫瘍溶解性ウイルスを介して腫瘍細胞および／または癌細胞内に導入して、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞および／または癌細胞を殺すのと同時に、上述の腫瘍表面上での外来エピトープポリペプチドの発現の有意な増強と、ＣＡＲ修飾免疫細胞の効果とを組み合わせることにより、さらに相乗的治療効果を達成できるようにする。腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍微小環境を破壊することから、ＣＡＲ修飾免疫細胞の腫瘍ホーミング能が改善され、それにより、腫瘍（特に固形腫瘍）治療の有効性がさらに増強される。加えて、ＣＡＲ修飾免疫細胞はまた、腫瘍溶解性ウイルスによって感染された後に複製サイクルを完了して充分な数の子孫ウイルスを産生することができずそれ故溶解されない腫瘍細胞を、効果的に除去することも可能であり；それにより、さらなる相乗効果を達成する。加えて、腫瘍溶解性ウイルスにより溶解された腫瘍細胞によって放出された抗原は、さらに身体自身の抗腫瘍免疫を活性化することができ、そのことが、単独で使用された腫瘍溶解性ウイルスまたはＣＡＲ修飾免疫細胞よりもより良好な腫瘍殺傷効果を達成することができる。その結果、相乗的治療効果が達成される。
【００１０】
本発明は、上記の考えから、有効な抗腫瘍生物学的製剤となるための強い開発展望をもつ新規な腫瘍治療概念を提供する。
【００１１】
定義
本明細書で用いる場合、用語「腫瘍」、「癌」、「腫瘍細胞」、および「癌細胞」は、当該技術分野において一般的に認識される意味を包含する。
【００１２】
本明細書で用いる場合、用語「腫瘍溶解性ウイルス」は、腫瘍細胞において選択的に複製しかつ腫瘍細胞を溶解できるウイルスを指す。
【００１３】
本明細書で用いる場合、用語「治療上有効な量」または「治療上有効な投与量」は、検出可能な治療効果もしくは阻害効果を示すか、または抗腫瘍応答を引き起こすのに有用な、機能的薬剤または医薬組成物の量を指す。効果は、当該技術分野において公知の任意のアッセイ法によって検出され得る。
【００１４】
本明細書で用いる場合、用語「投与する」または「投与」は、化合物、複合体、または組成物（ウイルスおよび細胞を含む）を、患者に提供することを指す。
【００１５】
本明細書で用いる場合、用語「患者」は、ヒトまたは非ヒト生物を指す。したがって、本明細書に記載された方法および組成物は、ヒトの疾患および獣医学的疾患の双方に適用可能である。いくつかの実施形態においては、患者は腫瘍を有する。ある場合には、患者は１つ以上のタイプの癌を同時に罹患し得る。
【００１６】
本明細書で用いる場合、用語「相乗効果」は、２つ以上の薬剤間に生じる、それらの個々の効果の合計よりもより大きい効果をもたらす効果を指す。
【００１７】
本明細書で用いる場合、用語「ｐｆｕ」または「プラーク形成単位」は、プラークを形成するウイルスの数を指す。
【００１８】
本明細書で用いる場合、用語「ＶＰ」は、ウイルス粒子の数を指す。
【００１９】
本明細書で用いる場合、用語「ＶＰ／ｋｇ」は、患者の体重１キログラム当たりの
ウイルス粒子の数を指す。
【００２０】
本明細書で用いる場合、用語「ＴＣＩＤ５０」は、５０％組織培養感染量を表し、組織培養物の５０％に感染をもたらしかつ細胞変性効果を引き起こすウイルス投与量を指す。
【００２１】
本明細書で用いる場合、用語「ＭＯＩ」または「多重感染度」は、ウイルス数と細胞数との間の比率、すなわち、ウイルス感染を開始するために細胞当たりに使用されるウイルス粒子の数を指す。ＭＯＩ＝ｐｆｕ／細胞、すなわち、細胞数×ＭＯＩ＝全ＰＦＵ。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】本発明の一概念を示す概略図である。
【図２】本発明の一実施形態における、５’末端から３’末端に向けてプロモーター、シグナルペプチド、細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を含む、標識ポリペプチドコード配列を含む核酸の構造を示す概略図である。
【図３】本発明の一実施形態における、Ｃｒｉｓｐｅｒ−Ｃａｓ９技術を用いて組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを調製する場合の、ドナープラスミドの構造の概略図である。左側から右側へ向けて、ｂｌａプロモーター、アンピシリン耐性遺伝子、ｐＵＣ開始部位、リーダーＲＮＡ−１（ｇＲＮＡ１）のスプライス部位、左ホモロジーアーム（ＬＨＲ４８０）、標識ポリペプチドＴＴ３コード配列、シグナルペプチドコード配列（示されず）、ｐＳプロモーター、ＬｏｘＰ部位、ｐ７．５プロモーター、ＰｕｒｏＧＦＰコード配列、ＬｏｘＰ部位、右ホモロジーアーム（ＲＨＲ５２０）、およびリーダーＲＮＡ−２（ｇＲＮＡ２）のスプライス部位である。
【図４】本発明の一実施形態における、ＤＤＶＶ−ＲＦＰ腫瘍溶解性ワクシニアウイルスゲノムのＴＫ部位を切断する、Ｃｒｉｓｐｅｒ  Ｃａｓ９の概略図である。上の図は、ＤＤＶＶ−ＲＦＰ腫瘍溶解性ワクシニアウイルスゲノムを表しており、下の図は、２つのリーダーＲＮＡにより媒介されるＴＫ遺伝子の左部分および右部分の切断を示す図である。
【図５】本発明の調製例１における、エレクトロトランスフェクション技術と、フローサイトメトリーにより検出された腫瘍細胞の表面上での標識ポリペプチドの発現とを用いた、腫瘍細胞の標識化の結果を示す図である。図５Ａおよび５Ｂは、それぞれＴＴ１およびＴＴ２で標識されたＪｕｒｋａｔ不死化Ｔリンパ球の結果を示す。図５Ｃ−Ｅは、それぞれ、ＴＴ３標識されたヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ、ヒト結腸直腸癌細胞ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ、およびヒト肝臓癌細胞ＳＫ−ＨＥＰ−１の結果を示す。図の横座標は、フローサイトメーターにより表示された蛍光強度の読取値であり、図の縦座標は、相対的な細胞数である。
【図６】本発明の実施例１における、標識されたＪｕｒｋａｔ細胞上のＴＴ１に対するＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロの殺傷実験の結果を示す図である。縦座標は、殺傷された後の腫瘍細胞の特異的溶解の％（すなわち、特異的溶解の比率）を表し；横座標は、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞の比率を表し；実線、すなわち「ＴＴ１−ＢＢＺ」は、ＴＴ１標識Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＴＴ１を標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞群の殺傷結果を示し；点線、すなわち「Ｍｏｃｋ」は、ＴＴ１標識Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するブランク電気的形質転換Ｔ細胞群（ネガティブコントロール群）の殺傷結果を示す。
【図７】本発明の実施例１における、標識されたＪｕｒｋａｔ細胞上のＴＴ２に対するＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロの殺傷実験の結果を示す図である。縦座標は、殺傷された後の腫瘍細胞の特異的溶解の％を表し；横座標は、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞の比率を表し；実線、すなわち「ＴＴ２−ＢＢＺ」は、ＴＴ２標識Ｊｕｒｋａｔ細胞上のＴＴ２を標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞群の殺傷結果を示し；点線、すなわち「Ｍｏｃｋ」は、ＴＴ２標識Ｊｕｒｋａｔ細胞に対するブランク電気的形質転換Ｔ細胞群（ネガティブコントロール群）の殺傷結果を示す。
【図８】本発明の実施例２における、標識されたＨＣＴ１１６−ｌｕｃ（Ａ）およびＪｕｒｋａｔ（Ｂ）細胞上のＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞の、インビトロの殺傷実験の結果を示す図である。縦座標は、殺傷された後の腫瘍細胞の特異的溶解の％を表し；横座標は、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞の比率を表し；実線、すなわち「ＣＡＲ−Ｔ／ＨＣＴ１１６ＴＴ３」および「ＣＡＲ−Ｔ／ＪｕｒｋａｔＴＴ３」は、それぞれＴＴ３を標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞群の結果を示し；点線、すなわち「ＷＴ  Ｔ／ＨＣＴ１１６ＴＴ３」および「ＷＴ  Ｔ／ＪｕｒｋａｔＴＴ３」は、それぞれ野生型Ｔ細胞群（ネガティブコントロール群）の結果を示す。
【図９】本発明の実施例３における、ＴＴ３で標識されるかまたは標識されていないＨＣＴ１１６−ｌｕｃ上のＴＴ３を標的とする、ＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロの殺傷実験の結果を示す図である。図Ａは、ＴＴ３で標識されたＨＣＴ１１６−ｌｕｃを示し、かつ図Ｂは、ＴＴ３で標識されていないＨＣＴ１１６−ｌｕｃを示す。縦座標は、殺傷された後の特異的に溶解された腫瘍細胞の比率を表し；横座標は、腫瘍細胞に対するエフェクター細胞の比率を表し；実線、すなわち「αＴＴ３−４１ＢＢζ」は、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞群の結果を示し；点線、すなわち「ＧＦＰ−ζ」は、ｍＧＦＰ−Ｚ修飾Ｔ細胞群（ネガティブコントロール群）の結果を示す。
【図１０】本発明の実施例４における、ＴＴ１またはＴＴ２を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞を、標識されたＪｕｒｋａｔ細胞と共培養した後の、ＩＮＦ−γ放出のＥｌｉｓｐｏｔの結果を示す図である。左のパネルは、ＥＬＩＳｐｏｔの実験ウェルの写真であり、右のパネルは、Ｅｌｉｓｐｏｔ分析の統計結果である。図において、「ブランク−Ｔ」は、ＣＡＲにより修飾されないＴ細胞群（コントロール群）を示し、「ＴＴ１  ＣＡＲ−Ｔ」および「ＴＴ２  ＣＡＲ−Ｔ」は、それぞれＴＴ１またはＴＴ２を標的とする、ＣＡＲによって修飾されたＴ細胞群を示す。右のパネルにおいて、横座標は、異なる標識ポリペプチドで標識されたＪｕｒｋａｔ細胞を表し、縦座標は、ＩＦＮ−γの相対数（５ｘ１０４個のＴ細胞当たりのスポット数によって示された）を表す。
【図１１】本発明の実施例５における、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−ＮＫ細胞（図ではＮＫａＴＴ３ＣＡＲとして示した）の、標識および未標識のＳＫＯＶ３−ｌｕｃまたはＳＫ−ＨＥＰ−１に対するインビトロの殺傷実験の結果を示す図である。図Ａは、ＴＴ３で標識されていないＳＫＯＶ３−ｌｕｃ（図ではＳＫＯＶ３として示される）の結果であり、図Ｂは、エレクトロトランスファーによってＴＴ３で標識されているＳＫＯＶ３−ｌｕｃ（図ではＳＫＯＶ３−ＥＰとして示される）の結果であり；図Ｃは、ＴＴ３で標識されていないＳＫ−ＨＥＰ−１（図ではＳＫ−ＨＥＰ−１として示される）の結果であり、図Ｄは、エレクトロトランスファーによってＴＴ３で標識されているＳＫ−ＨＥＰ−１（図ではＳＫ−ＨＥＰ−１−ＥＰとして示される）の結果である。これらの中では、ｍＧＦＰ−Ｚ修飾ＮＫ細胞（パネルではＮＫｍＧＦＰＺとして示される）をネガティブコントロールとして使用し；縦座標は、殺傷された後に特異的に溶解された腫瘍細胞の比率を示し；横座標は、異なる実験群を示し：標的細胞に対するエフェクター細胞の比率は、１０：１である。
【図１２】本発明の実施例６における、腫瘍細胞上のＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞の養子再注入（ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｒｅｉｎｆｕｓｉｏｎ）の殺傷効果を示す図である。腫瘍接種の７日後、マウスにそれぞれ、（１）ＰＢＳ、（２）コントロールＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔ、（３）ＴＴ３を標的とするＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔ、（４）ＴＴ３を標的とするＤＮＡ  ＣＡＲ−Ｔ、を与えた。図Ａは、それぞれ７日目および１４日目に、生物蛍光イメージングによって表示された、マウスにおける腫瘍を示す。図Ｂは１４日目のマウスにおけるＢＬ１腫瘍細胞の蛍光強度を示す。図Ｂにおいては、横座標は異なる処理群を表し、縦座標は、インビボイメージングシステムによって記録された、動物における腫瘍細胞の蛍光強度を表す。縦座標に示された蛍光放射率（単位は「ｐ／秒」、すなわち光子／秒、である）は、単位時間当たりに動物の表面から放射された光子の数を指す。
【図１３】本発明の調製例７における、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いて腫瘍細胞を標識した後の、フローサイトメトリーによって検出された、腫瘍細胞の表面上のＧＦＰの発現および標識ポリペプチドの発現の結果を示す図である。各パネルの左のピークは、抗体染色された野生型腫瘍細胞（組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる感染なし）のネガティブコントロール曲線であり、右のピークは、腫瘍細胞が組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで感染された４８時間後の、ＧＦＰ（図Ａ−Ｃ）またはＴＴ３（図Ｄ−Ｆ）の発現強度曲線である。図ＡおよびＤは、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ細胞の結果であり；図ＢおよびＥは、ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ細胞の結果であり；図ＣおよびＦは、ＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の結果である。各パネルの横座標は、フローサイトメトリーによって表示されたＧＦＰまたはＴＴ３の蛍光強度の読取り値を表し、縦座標は、相対的な細胞数を表す。
【図１４】本発明の実施例７における、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−ＮＫ細胞の、標識および未標識のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ、またはＳＫ−ＨＥＰ−１に対するインビトロの殺傷実験の結果を示す図である。図Ａは、ＴＴ３で標識されていないＳＫＯＶ３−ｌｕｃの結果であり；図Ｂは、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる感染時にＴＴ３で標識されているＳＫＯＶ３−ｌｕｃの結果であり；図Ｃは、ＴＴ３で標識されていないＳＫ−ＨＥＰ−１の結果であり；図Ｄは、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる感染時にＴＴ３で標識されているＳＫ−ＨＥＰ−１の結果である。各パネルの縦座標は、殺傷された後に特異的に溶解された腫瘍細胞の比率を表し、横座標は、異なる実験群を表しており；標的細胞に対するエフェクター細胞の比率は、１０：１である。
【図１５】本発明の実施例８における、標識または未標識のＳＫ−ＨＥＰ−１に対する、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロの殺傷実験の結果を示す図である。図Ａは、ＴＴ３で標識されていないＳＫ−ＨＥＰ−１の結果であり；図Ｂは、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる感染後の、ＴＴ３で標識されているＳＫ−ＨＥＰ−１の結果である（「＊＊＊」はｐ＜０．００１を示す）。各図の縦座標は、殺傷された後の特異的に溶解された腫瘍細胞の比率を表し、かつ横座標は、異なる実験群を表しており、標的細胞に対するエフェクター細胞の比率は、４０：１である。
【図１６】本発明の実施例９における、ＴＴ３を標識とするＣＡＲ−ＮＫ細胞が標識または未標識のＳＫ−ＨＥＰ−１と共培養された後の、ＧＭ−ＣＳＦの分泌を示す図である。図中、縦座標は、共培養の上清中のＧＭ−ＣＳＦの濃度（ｐｇ／ｍｌ）を表し、横座標は、異なる実験群を表す。図において、白色のカラムは、ＮＫ  ｍＧＦＰＺを表し、灰色のカラムは、ＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲを表し、かつ「＊＊」はｐ＜０．０１を意味する。
【図１７】本発明の実施例１０における、ＴＴ３を標識とするＣＡＲ−ＮＫ細胞が標識または未標識のＳＫ−ＨＥＰ−１と共培養された後の、ＩＦＮγ（図Ａ）およびＧＭ−ＣＳＦ（図Ｂ）の分泌を示す図である。図中、縦座標は、共培養の上清中のＩＦＮγ（図Ａ）またはＧＭ−ＣＳＦ（図Ｂ）の濃度（ｐｇ／ｍｌ）を表し、横座標は、異なる実験群を表す。図中、白色のカラムは、Ｔ  ｍＧＦＰＺを表し、灰色のカラムは、Ｔ  ａＴＴ３  ＣＡＲを表す。
【図１８】本発明の実施例１１における、免疫組織化学によって検出された、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腫瘍内投与後の、腫瘍組織におけるＴＴ３の発現を示す図である。図Ａ−Ｄは、それぞれ、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腫瘍内投与の７（Ａ）、１４（Ｂ）、２１（Ｃ）、２９（Ｄ）日後の、腫瘍組織におけるＴＴ３の発現を表す。各図における３つのセクションは、それぞれ３匹のマウスの腫瘍組織に由来し、倍率範囲は０．５から１．５倍までである。
【図１９】本発明の実施例１２における、皮下腫瘍の増殖に対する組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとＣＡＲ−ＮＫとの組合せの阻害効果を示す図である。図Ａは、異なる投与群のマウスにおける皮下腫瘍の増殖曲線を示す。横座標は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与後の日数を表し、縦座標は、腫瘍の体積を表す。図Ｂは、異なる投与群のマウスにおける皮下腫瘍の相対増殖率を、投与後の日数の関数として示す。横座標は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与後の日数を表し、縦座標は、腫瘍相対増殖率％を表す。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
本開示は、添付の図面を参照して、以下の好ましい実施形態の詳細な記載によってさらに説明されるが、それは限定的な意味において理解されるべきではく、当業者には、種々の変更および改良が、本開示の精神から離れることなく適宜に行われ得ること、それ故それらが本開示の範囲内であることが明らかであろう。
【００２４】
本発明者らは、先行技術における上述の欠点を認識し、理論的研究および実験検証を通して標識ポリペプチドを設計した。標識ポリペプチドは、腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得、かつ細胞外抗原決定領域を有する。本発明はまた、標識ポリペプチドを使用して腫瘍細胞および／または癌細胞を標識し、かつ標識ポリペプチドを認識するＣＡＲ修飾免疫細胞を組合せる戦略も提供し、それにより腫瘍（特に固形腫瘍）抗原の発現の不均一性および腫瘍細胞および／または癌細胞の免疫監視からの回避の問題を効果的に解決し、腫瘍細胞および／または癌細胞に対するＣＡＲ修飾免疫細胞の認識感度を改善し、かつターゲティング／オフ・ターゲット毒性のリスクを効果的に低減し、それによって腫瘍細胞殺傷におけるＣＡＲ修飾免疫細胞の有効性を改善するようにする。
【００２５】
具体的には、本発明の一態様は、腫瘍および／または癌の治療のための治療薬であって：
（ａ）第１の組成物であって、前記第１の組成物が、第１の活性成分を第１の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第１の活性成分が、腫瘍細胞および／または癌細胞内へ導入されるための標識ポリペプチドコード配列を有する核酸を含むかまたは含有しており；前記標識ポリペプチドが、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有し、それらは腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得；前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列は、エピトープポリペプチドの１つ以上のアミノ酸配列を含んでおり；かつこれにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列は、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まない、該第１の組成物と；および
（ｂ）第２の組成物であって、これにおいて前記第２の組成物が、第２の活性成分を第２の薬学的に許容される担体中に含み、かつ前記第２の活性成分が、キメラ抗原受容体修飾免疫細胞を含み；前記キメラ抗原受容体修飾免疫細胞が、前記標識ポリペプチドの前記細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合することができる、該第２の組成物と、
を含む該治療薬を提供する。
【００２６】
前記治療薬における前記活性成分は、以下に詳細に記載されるであろう。
【００２７】
標識ポリペプチド
本発明は、具体的には、腫瘍細胞および／または癌細胞を修飾するべく使用される、標識ポリペプチドのアミノ酸配列を設計するが、ここで該標識ポリペプチドは、動作可能なように連結された細胞外抗原決定領域、スペーサー部位、および膜貫通部位を有し、かつ腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得；前記細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列は、エピトープポリペプチドの１つ以上のアミノ酸配列を含んでおり；これにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のアミノ酸配列は、前記エピトープポリペプチドのアミノ酸配列を含まない。
【００２８】
本明細書で用いる場合、用語「細胞外抗原決定領域」は、細胞膜の外側に局在し、かつそれが細胞表面上で発現された場合にエピトープポリペプチドを含有する、標識ポリペプチドの部分を指す。
【００２９】
好ましくは、エピトープポリペプチドのアミノ酸配列は、自然界に存在するタンパク質のアミノ酸配列に由来するか、または前記エピトープポリペプチドの前記アミノ酸配列は、自然界には存在しない人工的に合成されたアミノ酸配列である。自然界に存在する該タンパク質は、哺乳類の細胞内タンパク質、および哺乳類以外の生物のタンパク質を含む。哺乳類以外の生物のたんぱく質は、ウイルスタンパク質、細菌タンパク質、真菌タンパク質、原生動物タンパク質、植物タンパク質、および哺乳類以外の他の動物のタンパク質を含む。
【００３０】
本発明のいくつかの実施形態においては、エピトープポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のタグ：Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＳｔｒｅｐタグＩＩ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡＴタグ、Ｓタグ、Ｓ１タグ、プロテインＣタグ、ｔａｇ−１００タグ、Ｅ２タグ、ＴＡＰタグ、ＨＳＶタグ、ＫＴ３タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＲＦＰタグ、等のアミノ酸配列に由来する。
【００３１】
上記のタグのアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は公知であり、当該技術分野において一般に使用される公的データベースから入手可能である。
【００３２】
本発明の好ましい実施形態においては、エピトープポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のタグ：ヒトＭｙｃタグ（対応する標識ポリペプチドはＴＴ１と表示される）、インフルエンザウイルスＨＡタグ（対応する標識ポリペプチドはＴＴ２と表示される）、ＳｔｒｅｐタグＩＩ（対応する標識ポリペプチドはＴＴ３と表示される）、に由来する。さらに好ましくは、エピトープポリペプチドのアミノ酸配列は、ヒトＭｙｃタンパク質の位置４１０から４１９のアミノ酸配列と一致するか；またはエピトープポリペプチドのアミノ酸配列は、インフルエンザウイルスＨＡタンパク質の位置１１９から１２７のアミノ酸配列と一致するか；またはエピトープポリペプチドのアミノ酸配列は、ＳｔｒｅｐタグＩＩ（ＳｔｒｅｐタグＩＩの詳細については、Ｔｈｏｍａｓ  Ｇ．Ｍ．Ｓｈｍｉｄｔ、Ｊｕｒｇｅｎ  Ｋｏｅｐｋｅ、Ｒｏｎａｌｄ  Ｆｒａｎｋ、およびＡｒｎｅ  Ｓｋｅｒｒａ著、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ  Ｂｅｔｗｅｅｎ  ｔｈｅ  Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ  Ａｆｆｉｎｉｔｙ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  ａｎｄ  ｉｔｓ  Ｃｏｇｎａｔｅ  Ｔａｒｇｅｔ，Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ”の文献を参照）と一致する。本発明の別の実施形態においては、ＴＴ１およびＴＴ２のエピトープポリペプチドのアミノ酸配列は、上記の配列の上流および下流へせいぜい１０アミノ酸まで伸長することができ、これにおいて、ヒトＭｙｃタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢにおいてＰ０１１０６アイソフォーム１と番号付けされたアミノ酸配列であってもよく、かつインフルエンザウイルスＨＡタンパク質のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢにおいてＱ０３９０９と番号付けされたアミノ酸配列であってもよい。
【００３３】
特定の実施形態においては、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列は、エピトープポリペプチドの１つ以上のアミノ酸配列を含み、これにおいて、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列がエピトープポリペプチドの複数のアミノ酸配列を含む場合、２つごとの隣接するエピトープポリペプチドは、動作可能なように連結される。例えば、それらはリンカーによって結合されるか、または何らリンカーなしに直接結合されてもよい。リンカーのアミノ酸配列は、例えば、Ｇ（標識ポリペプチドＣ１＆２ａ、Ｃ１＆２ｂにおいて使用される通り）、ＧＧＳ（Ｃ１＆２ａ、Ｃ１＆２ｂにおいて使用される通り）、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（ＴＴ１−ＴＴ３において使用される通り）であってもよい。
【００３４】
標識ポリペプチドの免疫原生を増強するため、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域は、好ましくはｎ個のエピトープポリペプチドを含み、ここでｎは、１以上の整数、例えば、ｎ＝１、２、３、４．．．などである。好ましくは、ｎは、１−１０の整数であり；ｎが２−５の整数であることもまた好ましく；ｎ＝２または３であることもまた好ましい。例えば、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域は、Ｍｙｃタグに由来する３つの反復したエピトープポリペプチド（例えば、ＴＴ１を参照）を含むか、またはＨＡタグに由来する３つの反復したエピトープポリペプチド（例えば、ＴＴ２を参照）を含むか、またはＳｔｒｅｐタグＩＩに由来する３つの反復したエピトープポリペプチド（例えば、ＴＴ３を参照）を含むか、または、Ｍｙｃタグに由来する３つの反復したエピトープポリペプチドとＨＡタグに由来する３つの反復したエピトープポリペプチドとを含むか（例えば、Ｃ１＆２ａ参照）、またはＭｙｃタグに由来する２つの反復したエピトープポリペプチドとＨＡタグに由来する２つの反復したエピトープポリペプチドとを含む（例えば、Ｃ１＆２ｂ参照）。
【００３５】
本発明の一実施形態においては、細胞外抗原決定領域のアミノ酸配列は、配列番号：１（ＴＴ１に対応）、配列番号：２（ＴＴ２に対応）、配列番号：３（ＴＴ３に対応）、配列番号：４（Ｃ１＆２ａに対応）、および配列番号：５（Ｃ１＆２ｂに対応）のように示される。
【００３６】
好ましくは、膜貫通部位は、ＣＤ８，ＣＤ３ζ、ＣＤ４，またはＣＤ２８の膜貫通領域に由来し、それらの完全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は公知であり、かつ当該技術分野において一般に使用される公的データベースから入手可能である。より好ましくは、膜貫通部位は、ヒトＣＤ２８αの膜貫通領域に由来する。なおさらに好ましくは、膜貫通部位のアミノ酸配列は、配列番号：７に示される通りのアミノ酸配列を含む。ＣＤ８は、αおよびβサブユニットから構成される膜貫通グリコシル化膜タンパク質である。それは、Ｔ細胞表面受容体と共に働いて、Ｔ細胞を特異抗原に結合させる。ＣＤ８は、ＭＨＣ  Ｉに特異的に結合して、細胞傷害性Ｔ細胞の殺傷効果を媒介する。膜貫通領域は、通常、細胞膜に広がる疎水性のアルファヘリックスである。
【００３７】
本発明の標識ポリペプチドにおいては、膜貫通部位と細胞外抗原決定領域とは、スペーサー部位によって結合され得る。この領域の構造は、細胞外抗原決定領域が様々な方向に適合されて、対応するＣＡＲの認識および結合を促進できるよう、フレキシブルであるべきである。スペーサー部位の最も単純な形状は、免疫グロブリンＩｇＧ１のヒンジ領域であり、また免疫グロブリンＣＨ２ＣＨ３領域の一部分であってもよい。本発明は、研究および実験を通して、スペーサー部位が好ましくはＣＤ８αのヒンジ領域に由来し、かつ膜貫通部位が好ましくはＣＤ８αの膜貫通領域に由来することを見出した。好ましくは、スペーサー部位のアミノ酸配列は、配列番号：６に示される通りである。より好ましくは、スペーサー部位および膜貫通部位は、スペーサー膜貫通部位を構成し、かつスペーサー膜貫通部位のアミノ酸配列は、ＣＤ８αの位置Ｙから２１０のアミノ酸配列と一致し、かつ１１８＜Ｙ＜１２８であり、Ｙは、整数である。これにおいて、ＣＤ８αのアミノ酸配列のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号は、Ｐ０１７３２でよい。すなわち、スペーサー膜貫通部位のアミノ酸配列は、好ましくはＣＤ８αの位置１１８から２１０より選択され、かつ位置１２８から２１０のアミノ酸配列を含む。例えば、スペーサー膜貫通部位のアミノ酸配列は、以下の群：ＣＤ８αの位置１１８から２１０、位置１１９から２１０、位置１２０から２１０、位置１２１から２１０、位置１２２から２１０、位置１２３から２１０、位置１２４から２１０、位置１２５から２１０、位置１２６から２１０、位置１２７から２１０、または位置１２８から２１０、から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列として示される。
【００３８】
本明細書で使用される用語「スペーサー部位」および「膜貫通部位」は、当該技術分野において公知である。詳細については、Ｙｕ  Ｓｈａｎｑｉａｎ著、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  ｔｈｅｏｒｙ」、Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、２００８年、およびＫｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ、Ｐａｕｌ  Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｍａｒｋ  Ｗａｌｐｏｒら著、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７版」を参照されたい。
【００３９】
本発明の標識ポリペプチドコード配列を有する核酸においては、シグナルペプチドコード配列は、好ましくは、標識ポリペプチドコード配列の５’末端の前に含まれ、かつ該シグナルペプチドは、標的タンパク質の細胞表面ヘの分泌をガイドする機能をもつ。本発明は、細胞外抗原決定領域とＧＭ−ＣＳＦα鎖からのシグナルペプチドとの組合せが、標識ポリペプチドが腫瘍細胞の表面上に発現されるのを可能にすることを見出した。ＧＭ−ＣＳＦα鎖シグナルペプチドは、本発明の標識ポリペプチドを分泌経路へ標的化するためのリーダー配列であり、そのコード配列はまず、細胞内で標識ポリペプチドのコード配列と一緒にタンパク質へ翻訳され、そして合成されたタンパク質を細胞内分泌経路内へガイドする。シグナルペプチドは、標識ポリペプチドが細胞表面上で発現される前に除去される。ＧＭ−ＣＳＦα鎖の完全長のアミノ酸配列およびヌクレオチド配列は公知であり、当該技術分野において一般に使用される公的データベースから入手可能である。好ましくは、シグナルペプチドのアミノ酸配列は、ヒトＧＭ−ＣＳＦα鎖の位置１から２２より選択される。より好ましくは、シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：８に示される通りである。これにおいて、ＧＭ−ＣＳＦα鎖のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１５５０９に由来する。
【００４０】
本発明の特定の実施形態においては、標識ポリペプチドは、順次にかつ動作可能なように連結された以下のアミノ酸配列：細胞外抗原決定領域（これは、エピトープポリペプチドの１つ以上のアミノ酸配列を含む）、スペーサー部位、および膜貫通部位、を含む。本発明のより特定的な実施形態においては、細胞外抗原決定領域のエピトープポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のペプチド：ヒト細胞内タンパク質Ｍｙｃに由来するＭｙｃタグ、インフルエンザウイルスのＨＡタンパク質に由来するＨＡタグ、自然界には存在しない人工的に合成された配列ＳｔｒｅｐタグＩＩ、のエピトープポリペプチドのアミノ酸配列に由来する。スペーサー部位は、ヒトＣＤ８αのヒンジ領域に由来し、かつ膜貫通部位は、ヒトＣＤ８αの膜貫通領域に由来する。
【００４１】
上述のように、シグナルペプチドは、細胞外抗原決定領域と動作可能なように連結され、細胞外抗原決定領域は、スペーサー部位と動作可能なように連結され、かつスペーサー部位は、膜貫通部位と動作可能なように連結される。例えば、それらはリンカーによって結合されるか、または何らリンカーなしに直接結合されてもよい。本発明の一実施形態においては、シグナルペプチドと細胞外抗原決定領域とは、リンカー、例えばＧＡＨＡＤＩＴＳ（ＴＴ１−ＴＴ３において使用されるような）、ＧＡＨＡＡＱＬＴＬＴＫＧＮＫ（Ｃ１＆２ａにおいて使用されるような）、ＧＡＨＡ（Ｃ１＆２ｂにおいて使用されるような）によって結合される。細胞外抗原決定領域とスペーサー部位とは、リンカー、例えば−Ａｌａ−Ｓｅｒ−、およびＧにより結合され、またスペーサー部位と膜貫通部位とは、リンカーなしに直接結合される。
【００４２】
本発明はさらに、標識ポリペプチドが２つのエピトープポリペプチドを同時に発現し得ることを見出した。具体的には、本発明は標識ポリペプチドＣ１＆２ａを設計したが、その抗原決定領域は、Ｍｙｃタグの３つの反復とＨＡタグの３つの反復とを含有する。本発明はまた、標識ポリペプチドＣ１＆２ｂも設計したが、その抗原決定領域は、Ｍｙｃタグの２つの反復とＨＡタグの２つの反復とを含有する。細胞膜表面上での標識ポリペプチドの発現をさらに安定化する目的で、ＴＩＧＩＴスペーサーがＣ１＆２ｂのスペーサー部位へ付加された。付加されたスペーサーのアミノ酸配列は、ＴＩＧＩＴの位置２４から１４０のアミノ酸配列と一致する。これにおいて、ＴＩＧＩＴのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ４９５Ａ１に由来する。より好ましくは、付加されたＴＩＧＩＴスペーサーのアミノ酸配列は、配列番号：９に示される通りであり、かつＣ１＆２ｂスペーサー膜貫通部位のアミノ酸配列は、配列番号：１０に示される通りである。
【００４３】
好ましくは、標識ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１１（ＴＴ１に対応）、配列番号：１２（ＴＴ２に対応）、配列番号：１３（ＴＴ３に対応）、配列番号：１４（Ｃ１＆２ａに対応）、または配列番号：１５（Ｃ１＆２ｂに対応）に示される通りである。
【００４４】
配列番号：１１：
【化１】
2021536435.tif 000002
【００４５】
これにおいて、太字はエピトープポリペプチドを示し、灰色部分はＣＤ８ヒンジ領域からのスペーサー部位を示し、かつ下線はＣＤ８膜貫通領域からの膜貫通部位を示す。
【００４６】
配列番号：１２：
【化２】
2021536435.tif 000003
【００４７】
これにおいて、太字はエピトープポリペプチドを示し、灰色はＣＤ８ヒンジ領域からのスペーサー部位を示し、かつ下線はＣＤ８膜貫通領域からの膜貫通部位を示す。
【００４８】
配列番号：１３：
【化３】
2021536435.tif 000004
【００４９】
これにおいて、太字はエピトープポリペプチドを示し、灰色はＣＤ８ヒンジ領域からのスペーサー部位を示し、かつ下線はＣＤ８膜貫通領域からの膜貫通部位を示す。
【００５０】
配列番号：１４：
【化４】
2021536435.tif 000005
【００５１】
これにおいて、太字はエピトープポリペプチドを示し、灰色はＣＤ８ヒンジ領域からのスペーサー部位を示し、かつ下線はＣＤ８膜貫通領域からの膜貫通部位を示す。
【００５２】
配列番号：１５：
【化５】
2021536435.tif 000006
【００５３】
これにおいて、太字はエピトープポリペプチドを示し、濃灰色はスペーサー部位のＴＩＧＩＴスペーサーからの部分を示し、淡灰色はスペーサー部位のＣＤ８ヒンジ領域からの部分を示し、かつ下線はＣＤ８膜貫通領域からの膜貫通部位を示す。
【００５４】
標識ポリペプチドコード配列を有する核酸
標識ポリペプチドコード配列は、細胞外抗原決定領域コード配列、スペーサー部位コード配列、および膜貫通部位コード配列を含んでおり、細胞外抗原決定領域コード配列は、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域をコードし、スペーサー部位コード配列は、標識ポリペプチドのスペーサー部位をコードし、そして膜貫通部位コード配列は、標識ポリペプチドの膜貫通部位をコードしている。細胞外抗原決定領域コード配列は、エピトープポリペプチドの１つ以上のコード配列を含み；これにおいて、自然状態では、哺乳類の細胞膜上のタンパク質または分泌タンパク質のコード配列は、エピトープポリペプチドのコード配列を含まない。
【００５５】
本発明のいくつかの実施形態においては、エピトープポリペプチドコード配列は、以下のタグ：Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＳｔｒｅｐタグＩＩ、Ｆｌａｇタグ、ＨＡＴタグ、Ｓタグ、Ｓ１タグ、プロテインＣタグ、ｔａｇ−１００タグ、Ｅ２タグ、ＴＡＰタグ、ＨＳＶタグ、ＫＴ３タグ、Ｖ５タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、Ｈｉｓタグ、またはＲＦＰタグなど、のコード配列に由来する。
【００５６】
好ましくは、エピトープポリペプチドコード配列は、以下のタグのコード配列：Ｍｙｃタグのコード配列、ＨＡタグのコード配列、およびＳｔｒｅｐタグＩＩのコード配列、に由来する。
【００５７】
特定の実施形態においては、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域のコード配列は、エピトープポリペプチドの１つ以上のコード配列を含んでおり、これにおいて、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域のコード配列がエピトープポリペプチドの複数のコード配列を含む場合、エピトープポリペプチドの２つごとの隣接するコード配列は、動作可能なように連結される。例えば、それらはリンカーコード配列によって結合されるか、または何らリンカーコード配列なしに直接結合されてもよい。
【００５８】
上述のように、標識ポリペプチドの免疫原性を増強するため、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域は、好ましくはｎ個のエピトープポリペプチドを含み、ここでｎは、１以上の整数、例えば、ｎ＝１、２、３、４などである。好ましくは、ｎは、１−１０の整数であり；ｎが２−５の整数であることもまた好ましく；ｎ＝２または３であることもまた好ましい。例えば、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域は、ヒトＭｙｃタンパク質に由来する３つの反復したエピトープポリペプチド、またはインフルエンザウイルスＨＡタンパク質に由来する２つの反復したエピトープポリペプチドを含み得る。それ故、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域のコード配列は、好ましくは、相応にエピトープポリペプチドのコード配列の３つの反復または２つの反復を含む。
【００５９】
本発明の好ましい実施形態においては、細胞外抗原決定領域のコード配列のヌクレオチド配列は、配列番号：１６（ＴＴ１に対応）；配列番号：１７（ＴＴ２に対応）、配列番号：１８（ＴＴ３に対応）、配列番号：１９（Ｃ１＆２ａに対応）、または配列番号：２０（Ｃ１＆２ｂに対応）に示される通りである。
【００６０】
好ましくは、膜貫通部位コード配列は、ＣＤ８、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、またはＣＤ２８の膜貫通領域のコード配列に由来する。より好ましくは、膜貫通部位コード配列は、ヒトＣＤ８αの膜貫通領域のコード配列に由来する。なおさらに好ましくは、膜貫通部位のコード配列のヌクレオチド配列は、配列番号：２１に示される通りのヌクレオチド配列を含む。
【００６１】
標識ポリペプチドコード配列においては、膜貫通部位コード配列と細胞外抗原決定領域コード配列とは、スペーサー部位コード配列によって結合され得る。スペーサー部位の最も単純な形状は、免疫グロブリンＩｇＧ１のヒンジ領域であり、それはまた免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域の一部分であってもよい。本発明は、研究および実験を通して、スペーサー部位のコード配列が、好ましくはＣＤ８αのヒンジ領域のコード配列に由来し、かつ膜貫通部位のコード配列が、好ましくはＣＤ８αの膜貫通領域のコード配列に由来することを見出した。好ましくは、スペーサー部位のコード配列のヌクレオチド配列は、配列番号：２２に示される通りである。より好ましくは、スペーサー部位のコード配列および膜貫通領域部位のコード配列は、スペーサー膜貫通部位のコード配列を構成し、スペーサー部位と膜貫通部位とは、リンカーなしに直接結合され得る。
【００６２】
本発明の標識ポリペプチドコード配列を有する核酸においては、シグナルペプチドコード配列は、好ましくは、標識ポリペプチドコード配列の５’末端の前に含まれており、かつ該シグナルペプチドコード配列は、シグナルペプチドをコードする。シグナルペプチドは、標的タンパク質の細胞表面ヘの分泌をガイドする機能を有しており、それは本発明の標識ポリペプチドを分泌経路へ標的化するためのリーダー配列である。そのコード配列はまず、細胞内で標識ポリペプチドのコード配列と一緒にタンパク質へ翻訳されて、合成されたタンパク質が細胞内分泌経路に入るのをガイドする。シグナルペプチドは、標識ポリペプチドが細胞表面上で発現される前に除去される。
【００６３】
好ましくは、シグナルペプチドコード配列のヌクレオチド配列は、ヒトＧＭ−ＣＳＦα鎖のシグナルペプチドコード配列に由来する。より好ましくは、シグナルペプチドコード配列のヌクレオチド配列は、配列番号：２３に示される通りである。
【００６４】
本発明の特性の実施形態においては、標識ポリペプチドコード配列を有する核酸は、動作可能なようにかつ順次に連結された以下のコード配列：シグナルペプチドコード配列、細胞外抗原決定領域コード配列（これは、エピトープポリペプチドの１つ以上のコード配列を含む）、スペーサー部位コード配列、および膜貫通部位コード配列、を含む。本発明のより特定的な実施形態においては、細胞外抗原決定領域のエピトープポリペプチドのコード配列は、以下のタグ：Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、ＳｔｒｅｐタグＩＩ、のコード配列に由来し；シグナルペプチドコード配列は、ヒトＧＭ−ＣＳＦα鎖のシグナルペプチドのコード配列に由来し；スペーサー部位コード配列は、ヒトＣＤ８αのヒンジ領域のコード配列に由来し、そして膜貫通部位コード配列は、ヒトＣＤ８αの膜貫通領域のコード配列に由来する。
【００６５】
上述のように、シグナルペプチドコード配列と細胞外抗原決定領域コード配列、細胞外抗原決定領域コード配列とスペーサー部位コード配列、スペーサー部位コード配列と膜貫通部位コード配列は、動作可能なように連結されており、例えば、それらはリンカーコード配列によって結合されるか、または何らリンカーコード配列なしに直接結合され得る。本発明の一実施形態においては、シグナルペプチドコード配列と細胞外抗原決定領域コード配列とは、リンカーコード配列、例えば、GGCGCGCATGCCGACATTACTAGT （ＴＴ１−ＴＴ３コード配列を有する核酸の任意の１つにおいてそれぞれ使用される通り）、GGCGCGCATGCCGCTCAGTTGACATTGACGAAGGGCAATAAA （Ｃ１＆２ａコード配列を有する核酸において使用される通り）、GGCGCGCATGCC （Ｃ１＆２ｂコード配列を有する核酸において使用される通り）によって結合される。細胞外抗原決定領域コード配列とスペーサー部位コード配列とは、リンカーコード配列、例えば、GCTAGC, GGG によって結合される。スペーサー部位コード配列と膜貫通部位コード配列とは、リンカーコード配列なしに直接結合される。
【００６６】
好ましくは、ＴＩＧＩＴスペーサー領域コード配列が、Ｃ１＆２ｂスペーサー部位コード配列へ付加され、これにおいて、ＴＩＧＩＴスペーサー領域コード配列は、ＴＩＧＩＴの位置２４から１４０のアミノ酸をコードし、ここで、ＴＩＧＩＴのアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ４９５Ａ１に由来する。好ましくは、ＴＩＧＩＴスペーサー領域コード配列は、配列番号：２４に示される通りのヌクレオチド配列を含む。好ましくは、Ｃ１＆２ｂのスペーサー膜貫通部位コード配列は、配列番号：２５に示される通りのヌクレオチド配列を含む。
【００６７】
好ましくは、標識ポリペプチドコード配列を有する核酸のヌクレオチド配列は、配列番号：２６（ＴＴ１に対応）、配列番号：２７（ＴＴ２に対応）、配列番号：２８（ＴＴ３に対応）、配列番号：２９（Ｃ１＆２ａに対応）、または配列番号：３０（Ｃ１＆２ｂに対応）に示される通りである。
【００６８】
好ましくは、標識ポリペプチドコード配列を有する核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み；かつＲＮＡは、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡを含む。
【００６９】
好ましくは、核酸は、動作可能なように連結されたプロモーターと標識ポリペプチドコード配列とを順次に含む。プロモーターの例は、ＣＭＶプロモーター、Ｔ７プロモーターなどといった、下流のＤＮＡ配列の転写を促進するための、当該技術分野において公知の任意のプロモーターを含む。
【００７０】
組換えウイルス
本発明の一実施形態においては、第１の活性成分は組換えウイルスであり、かつそのゲノムは、順次にかつ動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および標識ポリペプチドコード配列を有しており；これにおいて、該組換えウイルスは、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスを含む。
【００７１】
好ましくは、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解作用をもつ遺伝的に変異されたウイルスおよび腫瘍溶解作用をもつ野生型ウイルスに由来し；好ましくは、該組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解作用をもつアデノウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、セムリキフォレストウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、エコタイプエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびマラバ（Ｍａｌａｂａ）ウイルスに由来する。
【００７２】
腫瘍溶解性ウイルス療法には長い歴史がある。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、ポックスウイルス、ピコルナウイルス、パラミクソウイルス、レオウイルス、パルボウイルス、およびラブドウイルスを含め、多くのタイプのウイルスが腫瘍溶解性ウイルス開発のために修飾されてきた。これまでに、２つの腫瘍溶解性ウイルス（Ｈ１０１およびＴ−ＶＥＣ）が、臨床腫瘍治療に認可されている。腫瘍溶解性ウイルスは、人工的に修飾されたウイルスであり、その病原性遺伝子はノックアウトされておりかつ正常組織細胞内では基本的に複製することはできないが、しかし腫瘍細胞内では選択的に複製して腫瘍溶解作用を及ぼし得る。ワクシニアウイルスを例にとれば、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは一般に、遺伝学的生物工学による相同組換え技術を用いて、ワクシニアウイルスの内在性チミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子のノックアウト、またはＴＫおよびワクシニア増殖因子（ＶＧＦ）遺伝子のダブルノックアウトにより構築される。ＴＫは、ＤＮＡ合成の鍵酵素の一つである。ワクシニアウイルスは、複製プロセスの間に高濃度の核酸プールを形成して子孫ウイルスの円滑な複製を完了するために、ＴＫを使用する必要がある。ワクシニアウイルスはしばしば、ＶＧＦ遺伝子産物を介して宿主および周辺細胞の増殖を促進し、かつそれら自体の複製及び増殖を達成するが、一方、ＶＧＦ遺伝子なしでのワクシニアウイルスの正常細胞に対する損傷は、大いに低減される。ＴＫおよびＶＧＦ遺伝子の欠損により、正常細胞において複製するためのウイルスの能力は制限され、かつ腫瘍溶解性ウイルスベクター内に挿入された外来遺伝子の発現もまた大いに制限される。しかしながら、ＴＫ遺伝子は、腫瘍細胞の殆どの環境においては高度に発現され、そのことがワクシニアウイルスの複製およびパッケージングに好適な環境を提供するため、ワクシニアウイルスは腫瘍細胞内で選択的に複製しかつ腫瘍溶解する機能をもち、かつ腫瘍ウイルスベクター内に挿入された外来遺伝子が高度に発現されるようにする。直接的な腫瘍溶解作用に加えて、腫瘍溶解性ウイルスはまた、腫瘍細胞にホログラフィック（ｈｏｌｏｇｒａｐｈｉｃ）な腫瘍抗原を放出させて、身体の生来の抗腫瘍免疫を活性化し得ると同時に、腫瘍微小環境に対し一定の制御効果をもたらし得る。
【００７３】
本発明においては、標識ポリペプチドコード配列が腫瘍溶解性ウイルスのゲノム内に挿入され、それにより標識ポリペプチドコード核酸を腫瘍細胞および／または癌細胞内に挿入して、腫瘍溶解性ウイルスが腫瘍細胞および／または癌細胞内を殺し得ると同時に、腫瘍細胞の表面上での外来エピトープペプチドの発現が、ＣＡＲ修飾免疫細胞の効果と組合されて、相乗的な治療効果を達成するようにする。腫瘍溶解性ウイルスは腫瘍微小環境を破壊することから、ＣＡＲ修飾免疫細胞の腫瘍ホーミング能が改善され、それにより固形腫瘍の治療の有効性がさらに増強される。加えて、ＣＡＲ修飾免疫細胞はまた、腫瘍溶解性ウイルスにより感染された後に複製サイクルを完了して充分な数の子孫ウイルスを産生することができずそれ故溶解され得ない腫瘍細胞を、効果的に除去することもでき；それによりさらなる相乗効果を達成する。加えて、腫瘍溶解性ウイルスにより溶解された腫瘍細胞によって放出された抗原は、身体自体の抗腫瘍免疫をさらに活性化することができ、そのことが、腫瘍溶解性ウイルスまたはＣＡＲ修飾免疫細胞を単独で用いるよりも、より良好な腫瘍殺傷効果の達成を可能にし、それにより相乗的治療効果が達成される。
【００７４】
本発明の一実施形態においては、標識ポリペプチドコード配列を有する核酸（そのヌクレオチド配列が、例えば配列番号：２６−３０のいずれか１つであり得る）が、得られた複製選択的組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスのゲノム内に挿入される。
【００７５】
好ましくは、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子が機能的に欠損している組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスである。ＴＫ遺伝子は、外来ヌクレオチド配列を挿入することにより機能的に欠損され得る。ＶＧＦ遺伝子は、遺伝子ノックアウトまたは外来ヌクレオチド配列の挿入により機能的に欠損され得るが、しかしＶＧＦ遺伝子をノックアウトすることが好ましい。
【００７６】
本明細書で使用される用語「機能的欠損」または「機能的に欠損した」は、腫瘍溶解性ウイルスの遺伝子に言及する場合、腫瘍溶解性ウイルスが遺伝子の持つべき機能を及ぼすことができないこと、すなわち、機能が失われていることを意味する。この目的は、例えば、外来フラグメントを遺伝子内に挿入すること、または遺伝子のノックアウトにより達成され得る。
【００７７】
より好ましくは、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスは、Ｗｙｅｔｈ株またはＷＲ株である。
【００７８】
標識ポリペプチドコード配列がＴＫ遺伝子内に挿入されて、本発明の組換え腫瘍溶解性ウイルスを得ることができる。標識ポリペプチドコード配列はまた、ＶＧＦ遺伝子内に挿入されて、本発明の組換え腫瘍溶解性ウイルスを得ることもできる。
【００７９】
好ましい実施形態においては、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、ＶＧＦ遺伝子欠損をもつワクシニアウイルスである、ＶＳＣ２０ワクシニアウイルスを遺伝的に修飾することによって得られる。調製法については、科学文献：ＭｃＣａｒｔ，ＪＡら著、“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ”、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ」、２００１年、第６１巻、Ｐ．８５７１−８７５７、を参照のこと。遺伝的修飾は、外来標識ポリペプチドコード配列をＶＳＣ２０ワクシニアウイルスのＴＫ遺伝子内に挿入して、ＴＫ遺伝子を機能的欠損にすることを含む。
【００８０】
組換えウイルスのゲノムはまた、他の外来遺伝子、例えば、ピュロマイシン遺伝子、ｇｐｔ遺伝子、および／またはＬａｃＺ遺伝子を含む、外来スクリーニング遺伝子を組込んでもよい。外来スクリーニング遺伝子は、外来標識ポリペプチドをコードする遺伝子を精製する場合には、遺伝子ノックアウトシステム（例えば、ＬｏｘＰ）によりノックアウトされ得る。
【００８１】
いくつかの実施形態においては、本発明は、ワクシニアウイルス初期／後期プロモーターｐ７．５を採用して外来スクリーニング遺伝子を制御し、ワクシニアウイルス初期プロモーターｐＳＥＬを人工的に合成してシグナルペプチド配列および外来標識ポリペプチドコード配列を制御し、かつ外来スクリーニング遺伝子コード配列、シグナルペプチドコード配列、および標識ポリペプチドコード配列を、インビトロ細胞内組換え技術を通してワクシニアウイルスＶＳＣ２０株のＴＫ遺伝子領域内に挿入して、腫瘍溶解性ウイルスを構築する。二つのプロモーターは、それらが連続方式でそれぞれ調節する遺伝子の発現を開始する。
【００８２】
本発明の別の実施形態においては、Ｃｒｉｓｐｅｒ−Ｃａｓ９遺伝子編集技術を用いて、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを構築する。
【００８３】
好ましくは、Ｃｒｉｓｐｅｒ−Ｃａｓ９遺伝子編集法は、切断および相同組換えを２つの場所で同時に行うことができ、配列をノックアウトしかつ導入遺伝子を挿入するという目的を一度に達成するようにする。
【００８４】
好ましくは、Ｃｒｉｓｐｅｒ−Ｃａｓ９遺伝子編集法は、標的配列およびドナー配列を同時に切断して、相同組換えの効率を改善することができる。
【００８５】
本発明のＣｒｉｓｐｅｒ−Ｃａｓ９遺伝子編集法の切断および相同組換えの設計は、図３および図４に示されている。
【００８６】
具体的には、Ｃｒｉｓｐｅｒ−Ｃａｓ９システムは、リーダーＲＮＡおよびドナーＤＮＡを含み得る。
【００８７】
好ましくは、リーダーＲＮＡは、リーダーＲＮＡ−１およびリーダーＲＮＡ−２を含む。リーダーＲＮＡ−１のヌクレオチド配列は、好ましくは、ワクシニアウイルスＴＫ遺伝子の位置１２３から１４５におけるヌクレオチド配列と一致し、かつリーダーＲＮＡ−２のヌクレオチド配列は、好ましくは、ワクシニアウイルスＴＫ遺伝子の位置４１１から４３３におけるヌクレオチド配列と一致する。ＴＫ遺伝子のヌクレオチド配列のＧｅｎｂａｎｋ番号は、ＡＡＯ８９３７３．１であってよい。好ましくは、リーダーＲＮＡ−１のヌクレオチド配列は、配列番号：３１に示される通りであり、かつリーダーＲＮＡ−２のヌクレオチド配列は、配列番号：３２に示される通りである。
【００８８】
好ましくは、ドナーＤＮＡにおいて、左ホモロジーアームのヌクレオチド配列は、配列番号：３３に示される通りであり、かつ、右ホモロジーアームのヌクレオチド配列は、配列番号：３４に示される通りである。
【００８９】
好ましくは、ドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、上述のシグナルペプチドコード配列（例えば、配列番号：２３）および標識ポリペプチドコード配列を含み、またｐｕｒｏ−ＧＦＰコード配列も含む。ｐｕｒｏ−ＧＦＰコード配列のヌクレオチド配列は、配列番号：３５に示される通りである。
【００９０】
ｐｕｒｏ−ＧＦＰコード配列は、好ましくは、配列番号：３６に示される通りのヌクレオチド配列のプロモーターの制御下にあり、かつシグナルペプチドコード配列および標識ポリペプチドコード配列は、好ましくは、配列番号：３７に示される通りのヌクレオチド配列のプロモーターの制御下にある。
【００９１】
本発明の好ましい実施形態においては、ドナーＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号：３８に示される通りである。
【００９２】
キメラ抗原受容体
キメラ抗原受容体は、動作可能なように連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを順次に含む。抗原結合ドメインは、標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域を特異的に認識しかつ結合し得る。スペーサー領域は、抗原結合ドメインと膜貫通領域とを分離するために使用され、かつ細胞内ドメインはシグナル伝達のために使用される。
【００９３】
本明細書で使用される用語「抗原結合ドメイン」、「スペーサー領域」、「膜貫通領域」、および「細胞内ドメイン」の定義については、Ｙｕ  Ｓｈａｎｑｉａｎ著、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｏｒｙ  ｔｈｅｏｒｙ」、Ｈｉｇｈｅｒ  Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ  Ｐｒｅｓｓ、２００８年、およびＫｅｎｎｅｔｈ  Ｍｕｒｐｈｙ、Ｐａｕｌ  Ｔｒａｖｅｒｓ、Ｍａｒｋ  Ｗａｌｐｏｒ著、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、第７版」その他を参照されたい。
【００９４】
抗原結合ドメインは、好ましくは、図１に示されるような、リンカーを介して互いに結合され得る軽鎖および重鎖を含む単鎖抗体（ＳｃＦｖ）である。
【００９５】
本発明はさらに、ＴＴ１を標的とする抗原結合ドメインの軽鎖のアミノ酸配列が、抗Ｍｙｃ抗体（例えば、クローン９ｅ１０）の軽鎖の位置１から１１１のアミノ酸配列と一致すること（本発明の別の実施形態では、ＴＴ１を標的とする抗原結合ドメインの軽鎖のアミノ酸配列は、上記配列の下流に１０アミノ酸以下まで伸長され得る）、および重鎖のアミノ酸配列が、抗Ｍｙｃ抗体（例えば、クローン９ｅ１０）の重鎖の位置２３から１４３のアミノ酸配列と一致すること（本発明の別の実施形態では、ＴＴ１を標的とする抗原結合ドメインの重鎖のアミノ酸配列は、上記配列の上流および下流に１０アミノ酸以下まで伸長され得る）が好ましいことを見出した。
【００９６】
好ましくは、ＴＴ２を標的とする抗原結合ドメインの軽鎖のアミノ酸配列は、抗ＨＡ抗体（例えば、クローン１２ｃａ５）の軽鎖の位置２から１２１のアミノ酸配列と一致し（本発明の別の実施形態では、ＴＴ２を標的とする抗原結合ドメインの軽鎖のアミノ酸配列は、上記配列の下流に１０アミノ酸以下まで伸長され得る）、かつ重鎖のアミノ酸配列は、抗ＨＡ抗体（例えば、クローン１２ｃａ５）の重鎖の位置２から１１４のアミノ酸配列と一致する（本発明の別の実施形態では、ＴＴ２を標的とする抗原結合ドメインの重鎖のアミノ酸配列は、上記の配列の下流に１０アミノ酸以下まで伸長され得る）。
【００９７】
好ましくは、ＴＴ３を標的とする抗原結合ドメインの軽鎖のアミノ酸配列は、抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ抗体の軽鎖（例えば、特許文献、欧州特許出願公開第２８７１１８９号明細書を参照）と一致し、かつ重鎖のアミノ酸配列は、抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ抗体の重鎖（例えば、特許文献、欧州特許出願公開第２８７１１８９号明細書を参照）と一致する。
【００９８】
ここで、抗Ｍｙｃ抗体（クローン９ｅ１０）の軽鎖のアミノ酸配列は、ＰＤＢ：２ＯＲＢ＿Ｌ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/2ORB_L）のアミノ酸配列に由来することが可能であり、かつ抗Ｍｙｃ抗体（クローン９ｅ１０）の重鎖のアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ：ＣＡＡ７３２７１．１（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/CAA73271.1? report=genbank&log$=protalign&blast_rank=1&RID=P597FX1S014）のアミノ酸配列に由来することが可能である。軽鎖および重鎖を結合するリンカーのアミノ酸配列は、配列番号：３９に示される通りである。抗ＨＡ抗体（クローン１２ｃａ５）の軽鎖のアミノ酸配列は、ＰＤＢ：５ＸＣＳ＿Ｂ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/ protein/1258501213）のアミノ酸配列に由来することが可能であり、かつ抗ＨＡ抗体（クローン１２ｃａ５）の重鎖のアミノ酸配列は、ＰＤＢ：５ＸＣＳ＿Ａ（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/5XCS_A）のアミノ酸配列に由来することが可能である。軽鎖および重鎖を結合するリンカーのアミノ酸配列は、配列番号：４０に示される通りである。抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇ抗体の軽鎖および重鎖のアミノ酸配列は、特許文献、欧州特許出願公開第２８７１１８９号明細書に開示されたアミノ酸配列に由来することが可能であり、かつ軽鎖および重鎖を結合するリンカーのアミノ酸配列は、配列番号：４１に示される通りである。
【００９９】
より好ましくは、ＴＴ１、ＴＴ２、およびＴＴ３を標的とする抗原結合ドメインのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号：４２−４４に示される通りである。
【０１００】
細胞内ドメインは、ＴまたはＮＫ細胞を活性化するためのシグナル伝達において役割を果たす。初期にＴ細胞用に使用されたＣＡＲの細胞内ドメインは、ただ１つのシグナル分子を有しており、それは通常、免疫グロブリンＥの受容体関連ＦｃεＲＩγ（ＩｇＥに対し高親和性をもつ受容体の一サブユニット）、またはＴ細胞抗原受容体シグナルの本質的な伝達分子であるＣＤ３ζである。いくつかの細胞内ドメインは、１つ以上のＴ細胞活性化モチーフから構成されるＴ細胞活性化ドメインを含む。
【０１０１】
好ましくは、細胞内ドメインは、リンパ球細胞内活性化シグナル伝達領域、および任意で、リンパ球補助刺激シグナル伝達領域（０から２個の補助刺激伝達領域を含み得る）に由来する。好ましくは、前記細胞内活性化シグナル伝達領域は、ＣＤ３ζおよびＤＡＰ１２の細胞内シグナル領域に由来し、かつ補助刺激シグナル伝達領域は、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル領域に由来する。
【０１０２】
より好ましくは、本発明は、上述の抗原結合ドメインを４−１ＢＢおよびＣＤ３ζからの細胞内ドメインと組合せることで、ＴまたはＮＫ細胞に強力な標的腫瘍殺傷効果を及ぼすことを可能にするＣＡＲが得られ得ることを発見した。好ましくは、細胞内ドメインのアミノ酸配列は、４−１ＢＢの位置２０９から２５５，およびＣＤ３ζの位置５２から１６４より選択され、これにおいてＣＤ３ζのアミノ酸配列番号は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ２０９６３であり、また４−１ＢＢのアミノ酸配列番号は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｑ０７０１１である。細胞内ドメインのアミノ酸配列は、好ましくは、配列番号：４５に示される通りである。
【０１０３】
本発明は、スペーサー領域および膜貫通領域をさらに選択し、それにより抗原結合ドメイン−スペーサー領域−膜貫通領域−細胞内ドメインの、特定の組合せをもつＣＡＲを得る。スペーサー領域は、抗原結合ドメインと膜貫通領域とを結合する。この領域の構造は、抗原決定ドメインが様々な方向に適合可能であって、対応する認識および抗原への結合を促進するよう、フレキシブルであるべきである。スペーサー領域の最も単純な形状は、免疫グロブリンＩｇＧ１のヒンジ領域であり、かつそれはまた免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域の一部分であってもよい。膜貫通領域は、一般に細胞膜に広がる疎水性アルファヘリックスである。スペーサー領域は、ＣＤ８αのヒンジ領域、ＩｇＧのヒンジ領域、またはＩｇＤのヒンジ領域に由来し得る。膜貫通領域は、ＣＤ８αの膜貫通領域、ＣＤ３ζの膜貫通領域、ＣＤ４の膜貫通領域、またはＣＤ２８の膜貫通領域に由来し得る。
【０１０４】
本発明は、研究および実験を通して、スペーサー部位が、より好ましくはＣＤ８αのヒンジ領域に由来し、かつ膜貫通領域が、より好ましくはＣＤ８αの膜貫通領域に由来することを見出した。ＣＤ８は、αおよびβサブユニットから構成される、膜貫通グリコシル化膜タンパク質であり、それは、Ｔ細胞表面受容体と共に働いて、Ｔ細胞を特異抗原に結合させる。ＣＤ８は、ＭＨＣ  Ｉに特異的に結合し、かつ細胞傷害性Ｔ細胞の殺傷効果を媒介する。
【０１０５】
より好ましくは、スペーサー領域および膜貫通領域は、スペーサー膜貫通領域を構成し、かつスペーサー膜貫通領域のアミノ酸配列は、ＣＤ８αの位置Ｙから２１０のアミノ酸配列と一致し、かつ１１８＜Ｙ＜１２８であり、ここでＹは、整数である。ＣＤ８αのアミノ酸配列のＵｎｉＰｒｏｔＫＢ番号は、Ｐ０１７３２であってよい。言い換えれば、スペーサー膜貫通領域のアミノ酸配列は、好ましくは、ＣＤ８αの位置１１８から２１０より選択されかつ位置１２８から２１０のアミノ酸配列を含む。例えば、スペーサー膜貫通領域のアミノ酸配列は、以下の群：ＣＤ８αの位置１１８から２１０、位置１１９から２１０、位置１２０から２１０、位置１２１から２１０、位置１２２から２１０、位置１２３から２１０、位置１２４から２１０、位置１２５から２１０、位置１２６から２１０、位置１２７から２１０、または位置１２８から２１０、から選択されるいずれか１つのアミノ酸配列に示される通りである。
【０１０６】
好ましくは、キメラ抗原受容体の発現は、細胞表面ヘの標的タンパク質の分泌をガイドする機能をもつシグナルペプチドによってガイドされる。本発明は、上述の抗原結合ドメインと、ＧＭ−ＣＳＦα鎖からのシグナルペプチドとの組合せが、キメラ抗原受容体を免疫エフェクター細胞の表面上で効果的に発現させ得ることを見出した。ＧＭ−ＣＳＦα鎖シグナルペプチドは、本発明のキメラ抗原受容体を分泌経路へ標的化するリーダー配列であり、そのコード配列はまず、細胞内でキメラ抗原受容体のコード配列と一緒にタンパク質へ翻訳されて、合成されたタンパク質を細胞内分泌経路内へ入れるべくガイドする。シグナルペプチドはキメラ抗原受容体が細胞表面上で発現される前に除去される。
【０１０７】
好ましくは、シグナルペプチドのアミノ酸配列は、ＧＭ−ＣＳＦのアミノ酸配列の位置１から２２より選択され、これにおいて、シグナルペプチドのアミノ酸配列番号は、ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ−Ｐ１５５０９である。より好ましくは、シグナルペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：８に示される通りである。
【０１０８】
本発明の特定の実施形態においては、キメラ抗原受容体は、動作可能なように連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを順次に含む。本発明のより特定的な実施形態においては、抗原決定ドメインはＳｃＦｖであり、軽鎖および重鎖はそれぞれ抗−Ｍｙｃ、ＨＡ、またはＳｔｒｅｐタグ抗体の軽鎖および重鎖に由来し、スペーサー領域はヒトＣＤ８αのヒンジ領域に由来し、膜貫通領域はヒトＣＤ８αの膜貫通領域に由来し、かつ細胞内ドメインはＣＤ３ζおよび４−１ＢＢの細胞内シグナリング領域の組合せに由来する。
【０１０９】
本発明においては、シグナルペプチド、抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインは、順次に結合される。シグナルペプチドと抗原結合ドメイン、抗原結合ドメインとスペーサー領域、スペーサー領域と膜貫通領域、膜貫通領域と細胞内ドメインは、動作可能なように連結される。例えば、それらはリンカーによって結合されるか、または何らリンカーなしに直接結合され得る。本発明の一実施形態においては、シグナルペプチドと抗原結合ドメインとは、ＧＡＨＡなどのリンカーによって結合され、抗原結合ドメインとスペーサー領域とは、リンカー（リンカーは、例えば−Ａｌａ−Ｓｅｒ−である）により結合される一方、スペーサー領域と膜貫通領域、膜貫通領域と細胞内ドメインとは、リンカーなしに直接結合される。
【０１１０】
本発明の好ましい実施形態においては、キメラ抗原受容体のアミノ酸配列は、配列番号：４６（ＴＴ１の標的化に対応）、配列番号：４７（ＴＴ２の標的化に対応）、または配列番号：４８（ＴＴ３の標的化に対応）に示される通りである。
【０１１１】
配列番号：４６：
【化６】
2021536435.tif 000007
【０１１２】
濃灰色は、キメラ抗原受容体のｓｃＦｖを示し、イタリック体は、重鎖と軽鎖とを結合するリンカーを示し、淡灰色は、スペーサー領域を示し、一重下線は、膜貫通領域を示し、太字は、細胞内シグナル領域の４−１ＢＢからの部分を示し、かつ二重下線は、細胞内シグナル領域のＣＤ３ζからの部分を示す。
【０１１３】
配列番号：４７：
【化７】
2021536435.tif 000008
【０１１４】
濃灰色は、キメラ抗原受容体のＳｃＦｖを示し、イタリック体は、重鎖と軽鎖とを結合するリンカーを示し、淡灰色は、スペーサー領域を示し、一重下線は、膜貫通領域を示し、太字は、細胞内シグナル領域の４−１ＢＢからの部分を示し、かつ二重下線は、細胞内シグナル領域のＣＤ３ζからの部分を示す。
【０１１５】
配列番号：４８：
【化８】
2021536435.tif 000009
【０１１６】
濃灰色は、キメラ抗原受容体のＳｃＦｖを示し、イタリック体は、重鎖と軽鎖とを結合するリンカーを示し、淡灰色は、スペーサー領域を示し、一重下線は、膜貫通領域を示し、太字は、細胞内シグナル領域の４−１ＢＢからの部分を示し、かつ二重下線は、細胞内シグナル領域のＣＤ３ζからの部分を示す。
【０１１７】
キメラ抗原受容体コード配列
本発明のキメラ抗原受容体のコードＤＮＡは、動作可能なように連結された抗原結合ドメインコードエレメント、スペーサー領域コードエレメント、膜貫通コードエレメント、および細胞内ドメインコードエレメントを順次に含んでおり、それは、抗原結合ドメインコードエレメントによってコードされた抗原結合ドメインが本発明の標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域を認識しかつ結合し得ることを特徴とする。
【０１１８】
抗原結合ドメインのコードエレメントのヌクレオチド配列は、抗原結合ドメインのアミノ酸配列をコードする。好ましくは、ＴＴ１を標的とする抗原結合ドメインのコードエレメントのヌクレオチド配列は、配列番号：４９に示される通りである。好ましくは、ＴＴ２を標的とする抗原結合ドメインのコードエレメントのヌクレオチド配列は、配列番号：５０に示される通りである。好ましくは、ＴＴ３を標的とする抗原結合ドメインのコードエレメントのヌクレオチド配列は、配列番号：５１に示される通りである。
【０１１９】
細胞内ドメインコードエレメントのヌクレオチド配列は、細胞内ドメインのアミノ酸配列をコードする。好ましくは、細胞内活性化シグナル伝達領域のコードエレメントは、ＣＤ３ζおよびＤＡＰ１２の細胞内シグナル領域のコードＤＮＡに由来し、かつ補助刺激シグナル伝達領域のコードエレメントは、４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ２７、ＯＸ４０、ＧＩＴＲ、および／またはＩＣＯＳの細胞内シグナル領域のコードＤＮＡに由来する。より好ましくは、細胞内ドメインのコードエレメントは、４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル領域のコードＤＮＡに由来する。より好ましくは、細胞内ドメインのコードエレメントのヌクレオチド配列は、配列番号：５２に示される通りである。
【０１２０】
スペーサー領域コードエレメントは、好ましくは、ＣＤ８αヒンジ領域コードＤＮＡ、ＩｇＧヒンジ領域コードＤＮＡ、またはＩｇＤヒンジ領域コードＤＮＡに由来する。膜貫通領域コードエレメントは、好ましくは、ＣＤ８α膜貫通領域コードＤＮＡ、ＣＤ３ζ膜貫通領域コードＤＮＡ、ＣＤ４膜貫通領域コードＤＮＡ、またはＣＤ２８膜貫通領域コードＤＮＡに由来する。ここで、スペーサー領域コードエレメントは、より好ましくはＣＤ８αのヒンジ領域コードＤＮＡに由来し、かつ膜貫通領域コードエレメントは、より好ましくはＣＤ８αの膜貫通領域コードＤＮＡに由来する。
【０１２１】
好ましくは、スペーサー領域コードエレメントおよび膜貫通領域コードエレメンは、スペーサー膜貫通領域コードエレメンを構成し、かつそのヌクレオチド配列は、スペーサー膜貫通領域のアミノ酸配列をコードする。好ましくは、スペーサー領域コードエレメントのヌクレオチド配列は、配列番号：２２に示される通りの配列を含む。
【０１２２】
好ましくは、キメラ抗原受容体の発現は、シグナルペプチドによってガイドされ、かつシグナルペプチドのヌクレオチド配列は、シグナルペプチドのアミノ酸配列をコードする。好ましくは、シグナルペプチドのアミノ酸配列は、ＧＭ−ＣＳＦαのアミノ酸配列の位置１から２２より選択される。好ましくは、シグナルペプチドコードエレメントのヌクレオチド配列は、配列番号：２３に示される通りである。
【０１２３】
本発明の特定の実施形態においては、キメラ抗原受容体コードＤＮＡは、動作可能なように連結された抗原結合ドメインコードエレメント、スペーサー領域コードエレメント、膜貫通領域コードエレメント、および細胞内領域コードエレメントを順次に含んでおり、それは、抗原結合ドメインの軽鎖および重鎖のコードエレメントが、それぞれ抗−Ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、またはＳｔｒｅｐタグＩＩ抗体の軽鎖および重鎖のコードＤＮＡに由来すること、スペーサー領域コードエレメントがＣＤ８αのヒンジ領域コードＤＮＡに由来すること、膜貫通領域コードエレメントがＣＤ８αの膜貫通領域コードＤＮＡに由来すること、かつ細胞内ドメインが４−１ＢＢおよびＣＤ３ζの細胞内シグナル領域のコードＤＮＡに由来することを特徴とする。
【０１２４】
好ましくは、シグナルペプチドコード配列およびキメラ抗原受容体コード配列を有するＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号：５３（ＴＴ１の標的化に対応）、配列番号：５４（ＴＴ２の標的化に対応）、または配列番号：５５（ＴＴ３の標的化に対応）に示される通りである。
【０１２５】
ＣＡＲ修飾免疫細胞
前記免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含み；ここでＮＫ細胞は、自家ＮＫ細胞、同種ＮＫ細胞、またはＮＫ細胞株を含み、かつＴ細胞は、未発達型Ｔ細胞もしくはそれらの前駆細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＴ細胞株を含む。
【０１２６】
免疫細胞に対するキメラ抗原受容体の修飾は、レンチウイルス感染およびｍＲＮＡエレクトロトランスフェクションを介して実施され得る。
【０１２７】
好ましくは、第１の組成物および第２の組成物は、一緒に混合されることなく、別々に治療薬中に存在する。
【０１２８】
標識ポリペプチドコード配列を有する核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み；ＲＮＡは、ＤＮＡから転写されたｍＲＮＡを含む。好ましくは、第１の組成物は、治療上有効な量のＤＮＡ、または治療上有効な量のｍＲＮＡを含む。好ましくは、第１の組成物は、ＤＮＡまたはｍＲＮＡを０．０１−１０ｍｇ／日の投与量で含む。
【０１２９】
好ましくは、第１の組成物は、治療上有効な量の組換えウイルスを含む。より好ましくは、第１の組成物は、治療コースあたり、５ｘ１０７から５ｘ１０１２個のウイルス粒子、または５ｘ１０７から５ｘ１０１２ＰＦＵの総投与量の組換え腫瘍溶解性ウイルスを含む。
【０１３０】
好ましくは、第２の組成物は、治療上有効な量のＣＡＲ修飾免疫細胞を含む。好ましくは、治療コースあたり、体重１Ｋｇにつき１ｘ１０４から１ｘ１０９細胞の総投与量のＣＡＲ修飾免疫細胞が含まれる。
【０１３１】
ＤＮＡは、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化され得；ｍＲＮＡは、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化され得る。例えば、それはプラスミドの形状での直接腫瘍内注射によるか、またはリポソームによってパッケージされた後の腫瘍内注射によるか、またはナノ粒子（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアミノ酸、ポリエチレンイミン、またはキトサンなどといったポリマー）への結合後の腫瘍内注射によるか、或いは腫瘍内注射後のエレクトロトランスフェクションによりトランスフェクション率を高めることにより投与され得る。
【０１３２】
組換えウイルスは、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化され得る。
【０１３３】
ＣＡＲ修飾免疫細胞は、静脈内または局所投与により投与されるべく製剤化され得る。
【０１３４】
好ましくは、治療薬は、第１の組成物および第２の組成物から構成される。
【０１３５】
当業者は、本発明の治療薬がまた、薬学的または生理学的担体、賦形剤、希釈剤（生理食塩水、ＰＢＳ溶液を含む）を含めた適当な薬学的に許容される賦形剤、および糖、脂質、ポリペプチド、アミノ酸、酸化防止剤、アジュバント、保存料などを含めた種々の添加剤も含み得ることを理解し得る。
【０１３６】
本発明はまた、腫瘍および／または癌の治療のための薬物の調製における、治療薬の使用も提供する。
【０１３７】
腫瘍および／または癌は、乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ（ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｔｕｍｏｒ）、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む。
【０１３８】
本発明はまた、上述の本発明の標識ポリペプチドも提供する。標識ポリペプチドの種々の実施形態は、上記に記載される通りである。
【０１３９】
好ましくは、標識ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号：１１、配列番号：１２、配列番号：１３、配列番号：１４、または配列番号：１５に示される通りである。
【０１４０】
本発明はまた、本発明の標識ポリペプチドのコード配列を有する単離された核酸も提供する。核酸の種々の実施形態は、上記に記載される通りである。
【０１４１】
核酸は、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および本発明の標識ポリペプチドのコード配列を順次に含む。
【０１４２】
核酸は、ＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む。好ましくは、核酸はＤＮＡであり、かつそのヌクレオチド配列は、配列番号：２６、配列番号：２７、配列番号：２８、配列番号：２９、または配列番号：３０に記載される通りである。
【０１４３】
本発明はまた、組換え発現ベクターであって、これにおいて、該組換え発現ベクターが、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および本発明の標識ポリペプチドのコード配列を順次に含む、該組換え発現ベクターも提供する。
【０１４４】
２つ以上の標識ポリペプチドを同時に用いて腫瘍細胞を標識する目的で、組換え発現ベクターは、本発明の標識ポリペプチドの２つ以上のコード配列を含み得る。
【０１４５】
好ましくは、標識ポリペプチドのｍＲＮＡを調製するべく使用される組換え発現ベクター（例えば、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ１、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ２、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ３、ｐＦａｓｔｂａｃ１−Ｃ１＆２ａ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−Ｃ１＆２ｂ）は、順次に、ＣＭＶプロモーター、Ｔ７プロモーター、コザック配列をもつ５’ＵＴＲ、およびＧＭ−ＣＳＦα鎖シグナルペプチドコード配列を、本発明の標識ペプチドのコード配列の前に含んでおり；かつポリＡシグナルをもつアルファグロブリンの３’ＵＴＲを、本発明の標識ポリペプチドのコード配列の後ろに含む。本発明の組換え発現ベクターの上述の機能エレメントの組合せは、ＤＮＡの転写および翻訳を促進し、かつｍＲＮＡの安定性を増強し得る。本発明はまた、上述の機能エレメントの構造を以下に詳述されるように最適化して、それらの適切な機能をより良く果たすようにする。好ましくは、本発明においては、ＣＭＶプロモーターの配列は、配列番号：５６に示される通りである。ＣＭＶプロモーターの機能は、下流のＤＮＡ配列の転写を開始することである。
【０１４６】
好ましくは、本発明においては、Ｔ７プロモーターの配列は、配列番号：５７に示される通りである。Ｔ７プロモーターの機能は、下流のＤＮＡ配列の転写を開始することである。
【０１４７】
好ましくは、本発明においては、コザック配列をもつ５’ＵＴＲの配列は、配列番号：５８に示される通りであり；かつコザック配列をもつ５’ＵＴＲの機能は、ｍＲＮＡの翻訳効率を増強することである。
【０１４８】
好ましくは、本発明においては、ＧＭ−ＣＳＦα鎖シグナルペプチドコード配列の配列は、配列番号：２３に示される通りである。
【０１４９】
好ましくは、本発明においては、アルファグロブリンの３’ＵＴＲの配列は、配列番号：５９に示される通りであり；これは、ポリＡシグナルを含む。その機能は、ｍＲＮＡの安定性を強化することである。
【０１５０】
特定の実施形態においては、組換え発現ベクターの基本的なバックボーンは、市販のｐＦａｓｔｂａｃ１ベクターであり、次いでこれに上述のエレメントが挿入される。
【０１５１】
本発明は、３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲを最適化することから、例えば、Ｔａｉｌ−ＰＣＲを用いて、ポジティブ鎖にポリＡを、かつリバース鎖に対応するポリＴをもつＤＮＡ二本鎖鋳型を、組換え発現ベクターから合成することが可能である。これにより、ＤＮＡ鋳型の不安定性が低減され、かつｍＲＮＡがインビトロで合成され得る。ポジティブ鎖のポリＡにおけるＡの数（またはリバース鎖のポリＴにおけるＴの数）は、１４０から１７０の範囲内、好ましくは１５０から１７０、より好ましくはほぼ１５０（例えば、１５０）である。
【０１５２】
この組換え発現ベクターを腫瘍細胞内に導入するための方法は、ウイルスおよび非ウイルスによる方法を含む。非ウイルス法は、生物学的、物理学的、および化学的に媒介される遺伝子トランスフェクション法を含む。生物学的トランスフェクション法は、直接注射、受容体媒介性の遺伝子導入などを含む。物理学的トランスフェクション法は、エレクトロトランスフェクション、マイクロインジェクションなどを含む。化学的トランスフェクション法は、リポソームおよび種々のカチオン性ポリマー媒介性のトランスフェクションを含む。
【０１５３】
本発明はまた、単離された組換えウイルスであって、これにおいて、組換えウイルスのゲノムが、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および本発明の標識ポリペプチドのコード配列を順次に含んでおり、ここで、標識ポリペプチドが腫瘍細胞および／または癌細胞の表面上で修飾を形成するべく発現され得：かつ組換えウイルスが、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスまたは複製欠損性組換えウイルスを含む、該組換えウイルスも提供する。
【０１５４】
好ましくは、組換えウイルスは、複製選択的組換え腫瘍溶解性ウイルスであり、組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解作用をもつ遺伝的に変異されたウイルスおよび腫瘍溶解作用をもつ野生型ウイルスに由来し；好ましくは、前記組換え腫瘍溶解性ウイルスは、腫瘍溶解作用をもつアデノウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルス、麻疹ウイルス、セムリキフォレストウイルス、水疱性口内炎ウイルス、ポリオウイルス、レトロウイルス、レオウイルス、セネカバレーウイルス、エコタイプエンテロウイルス、コクサッキーウイルス、ニューカッスル病ウイルス、およびマラバ（Ｍａｌａｂａ）ウイルスに由来する。
【０１５５】
組換えウイルスの種々の実施形態は、上記に記載される通りである。
【０１５６】
本発明はまた、組換えウイルスを調製するための組換え発現ベクター（ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ３−ＰｕｒｏＧＦＰ（そのヌクレオチド配列は配列番号：３８に示される通りである））であって、ｐＳｐｒｏｍｏｔｅに対し動作可能なように連結された上記記載のＴＴ３標識ペプチドのコード配列（すなわち、配列番号：２８）と、ｐ７．５プロモーターに対し動作可能なように連結された上記記載のｐｕｒｏ−ＧＦＰスクリーニング遺伝子のコード配列と、ＬｏｘＰ部位と、左右のホモロジーアームと、およびｇＲＮＡ切断部位ドナーＤＮＡとを含む、該組換え発現ベクターも提供する。組換え発現ベクターは、Ｃｒｉｓｐｅｒ−Ｃａｓ９遺伝子編集技術を用いて組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを構築するべく使用される。
【０１５７】
本発明は、上述の機能エレメントの構造を以下に詳述されるように最適化して、それらの適切な機能をより良く果たすようにする。
【０１５８】
好ましくは、本発明においては、ｐＳプロモーターの配列は、配列番号：３７に示される通りである。ｐＳプロモーターの機能は、下流のＴＴ３標識ポリペプチドコード配列の転写を開始することである。
【０１５９】
好ましくは、本発明においては、ｐ７．５プロモーターの配列は、配列番号：３６に示される通りである。ｐ７．５プロモーターの機能は、下流のｐｕｒｏ−ＧＦＰコード配列の転写を開始することである。
【０１６０】
ましくは、本発明においては、ＬｏｘＰ部位の配列は、配列番号：６０に示される通りである。ＬｏｘＰ部位の機能は、スクリーニング遺伝子を除去するのに利便性を与えることである。
【０１６１】
好ましくは、本発明においては、左ホモロジーアームの配列は、配列番号：３３に示される通りであり、かつ右ホモロジーアームの配列は、配列番号：３４に示される通りである。ホモロジーアームの機能は、ワクシニアウイルスゲノムをドナープラスミドと相同的に組換えることである。
【０１６２】
好ましくは、本発明においては、ｇＲＮＡ−１切断部位の配列は、配列番号：６１に示される通りであり、かつｇＲＮＡ−２切断部位の配列は、配列番号：６２に示される通りである。ｇＲＮＡ切断部位の機能は、Ｃｒｉｓｐｅｒ−Ｃａｓ９がドナープラスミドを切断できるようにして、相同組換えの効率を改善するようにすることである。
【０１６３】
特定の実施形態においては、組換え発現ベクターの基本的なバックボーンは、市販のｐＦａｓｔｂａｃ１ベクターであり、次いでこれに上述のエレメントが挿入される。
【０１６４】
本発明はまた、キメラ抗原受容体であって、動作可能なように連結された抗原結合ドメイン、スペーサー領域、膜貫通領域、および細胞内ドメインを順次に含んでおり、かつ抗原結合ドメインが、本発明の標識ポリペプチドの細胞外抗原決定領域を認識しかつ結合することができることを特徴とする、該キメラ抗原受容体も提供する。
【０１６５】
キメラ抗原受容体の種々の実施形態は、上記に記載される通りである。
【０１６６】
好ましくは、キメラ抗原受容体のアミノ酸配列は、配列番号：４６（ＴＴ１の標的化に対応）、配列番号：４７（ＴＴ２の標的化に対応）、または配列番号：４８（ＴＴ３の標的化に対応）に示される通りである。
【０１６７】
本発明はまた、本発明のキメラ抗原受容体をコードするコード配列をもつ、単離されたＤＮＡも提供する。
【０１６８】
キメラ抗原受容体のコード配列をもつＤＮＡの種々の実施形態は、上記に記載される通りである。
【０１６９】
好ましくは、ＤＮＡのヌクレオチド配列は、配列番号：５３（ＴＴ１の標的化に対応）、配列番号：５４（ＴＴ２の標的化に対応）、または配列番号：５５（ＴＴ３の標的化に対応）に示される通りである。
【０１７０】
本発明はまた、本発明のＤＮＡから転写された、単離されたｍＲＮＡも提供する。
【０１７１】
本発明はまた、組換え発現ベクター（例えば、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ１−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ２−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ３−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ）であって、これにおいて該組換え発現ベクターが、動作可能なように連結されたプロモーター、シグナルペプチドコード配列、および本発明のキメラ抗原受容体コード配列を順次に含む、該組換え発現ベクターも提供する。
【０１７２】
好ましくは、組換え発現ベクターは、順次に、ＣＭＶプロモーター、Ｔ７プロモーター、コザック配列をもつ５’ＵＴＲ、およびＧＭ−ＣＳＦα鎖シグナルペプチドコード配列を、本発明のキメラ抗原受容体のコード配列の前に含んでおり；かつポリＡシグナルをもつアルファグロブリンの３’ＵＴＲを、本発明のキメラ抗原受容体のコード配列の後ろに含む。本発明の組換え発現ベクターの上述の機能エレメントの組合せは、ＤＮＡの転写および翻訳を促進し、かつｍＲＮＡの安定性を増強し得る。本発明はまた、上述の機能エレメントの構造を以下に詳述されるように最適化して、それらの適切な機能をより良く果たすようにする。
【０１７３】
好ましくは、本発明においては、ＣＭＶプロモーターの配列は、配列番号：５６に示される通りである。ＣＭＶプロモーターの機能は、下流のＤＮＡ配列の転写を開始することである。
【０１７４】
好ましくは、本発明においては、Ｔ７プロモーターの配列は、配列番号：５７に示される通りである。Ｔ７プロモーターの機能は、下流のＤＮＡ配列の転写を開始することである。
【０１７５】
好ましくは、本発明においては、コザック配列をもつ５’ＵＴＲの配列は、配列番号：５８に示される通りであり、かつその機能は、ｍＲＮＡの翻訳効率を増強することである。
【０１７６】
好ましくは、本発明においては、ＧＭ−ＣＳＦα鎖シグナルペプチドコード配列の配列は、配列番号：２３に示される通りである。
【０１７７】
好ましくは、本発明においては、アルファグロブリンの３’ＵＴＲの配列は、配列番号：５９に示される通りであり、それはポリＡシグナルを含む。その機能は、ｍＲＮＡの安定性を強化することである。
【０１７８】
特定の実施形態においては、組換え発現ベクターの基本的なバックボーンは、市販のｐＦａｓｔｂａｃ１ベクターであり、次いでこれに上述のエレメントが挿入される。
【０１７９】
本発明は、３’ＵＴＲおよび５’ＵＴＲを最適化することから、例えば、Ｔａｉｌ−ＰＣＲを用いて、ポジティブ鎖にポリＡを、かつリバース鎖に対応するポリＴをもつ、ＤＮＡ二本鎖鋳型を、組換え発現ベクターから合成することが可能である。これにより、ＤＮＡ鋳型の不安定性が低減され、かつｍＲＮＡがインビトロで合成され得る。ポジティブ鎖のポリＡにおけるＡの数（またはリバース鎖のポリＴにおけるＴの数）は、１４０から１７０の範囲内、好ましくは１５０から１７０、より好ましくはほぼ１５０（例えば、１５０）である。
【０１８０】
本発明はまた、その表面が本発明のキメラ抗原受容体により修飾される、ＣＡＲ修飾免疫細胞も提供する。
【０１８１】
免疫細胞は、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であってもよく；ここでＮＫ細胞は、自家ＮＫ細胞、同種ＮＫ細胞、またはＮＫ細胞株を含み、かつＴ細胞は、未発達型Ｔ細胞もしくはそれらの前駆細胞、エフェクターＴ細胞、メモリーＴ細胞、ＮＫＴ細胞、またはＴ細胞株を含む。
【０１８２】
キメラ抗原受容体は、レンチウイルス感染、トランスポゾン、およびｍＲＮＡエレクトロトランスフェクションを介して、免疫細胞を修飾し得る。
【０１８３】
本発明はまた腫瘍および／または癌の治療のための相乗効果をもつ、コンビナトリアルドラッグのキットであって：
本発明の治療薬の第１の組成物を含む第１の容器と；
本発明の治療薬の第２の組成物を含む第２の容器であって、これにおいて前記第１の容器が前記第２の容器から分離されている該容器と；および、
投与のタイミングおよび経路を指定する指示書と、
を含む、該キットも提供する。
【０１８４】
本発明はまた、腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、本発明の標識ポリペプチドのコード配列を有する、単離された核酸の使用も提供する。
【０１８５】
本発明はまた、腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、組換えウイルスの使用も提供する。
【０１８６】
本発明はまた、腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、ＣＡＲ修飾免疫細胞の使用も提供する。
【０１８７】
本発明はまた、腫瘍および／または癌の治療または予防のための薬物の調製における、キットの使用も提供する。
【０１８８】
腫瘍および／または癌は：乳癌、頭頸部腫瘍、滑膜癌、腎臓癌、結合組織癌、悪性黒色腫、肺癌、食道癌、結腸癌、直腸癌、脳癌、肝臓癌、骨癌、絨毛癌、ガストリノーマ、褐色細胞腫、プロラクチノーマ、フォン・ヒッペル・リンドウ病、ゾリンジャー・エリソン症候群、肛門癌、胆管癌、膀胱癌、尿管癌、神経膠腫、神経芽細胞腫、髄膜腫、脊髄腫瘍、骨軟骨腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、未知の原発部位の癌、カルチノイド、線維肉腫、パジェット病、子宮頸癌、胆嚢癌、眼の癌、カポジ肉腫、前立腺癌、精巣癌、皮膚扁平上皮癌、中皮腫、多発性骨髄腫、卵巣癌、膵内分泌腫瘍、グルカゴノーマ（ｇｌｕｃａｇｏｎ  ｔｕｍｏｒ）、膵臓癌、陰茎癌、下垂体癌、軟部組織肉腫、網膜芽細胞腫、小腸癌、胃癌、胸腺癌、トロホブラスト癌、胞状奇胎、子宮体癌、膣癌、外陰癌、菌状息肉症、インスリノーマ、心臓癌、髄膜癌、腹膜癌、胸膜癌、および血液癌を含む。
【０１８９】
腫瘍および／または癌を治療するための方法であって：
本発明の治療薬の第１の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している患者に投与すること；および
本発明の治療薬の第２の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している該患者に投与すること、
を含む、該方法も提供する。
【０１９０】
治療薬における第１の組成物および第２の組成物は、同時に（例えば、混合物として）、別々にしかし同時に（例えば、それぞれ腫瘍内および静脈内注射によって投与される）、または順次に（第１の組成物が最初に投与され、そして次に第２の組成物が投与される）投与され得る。
【０１９１】
好ましくは、方法は以下の工程：
１）第１の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している患者に投与すること；および
２）第１の組成物の投与後に、治療薬の第２の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している該患者に投与すること、
を、逐次的方法で含む。
【０１９２】
好ましくは、第１の組成物の投与の１から３０日後に、治療薬の第２の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している患者に投与すること。
【０１９３】
「第１の組成物の投与の１から３０日後に、治療薬の第２の組成物を、腫瘍および／または癌を罹患している患者に投与すること」というフレーズは、第２の組成物の最初の投与と第１の組成物の最初の投与との間の時間間隔が、１から３０日の範囲内（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３．．．３０日）であるか、または第２の組成物の最初の投与と第１の組成物の直近の投与との間の時間間隔が、１から３０日（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３．．．３０日）であることを意味する。好ましくは、第２の組成物の最初の投与と第１の組成物の直近の投与との間の時間間隔は、１から３０日（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３．．．３０日）である。
【０１９４】
本発明の好ましい実施形態においては、核酸の投与用量は、０．０１ｍｇ／日から１０ｍｇ／日、１日当たり１から３回、および連続して１から７日間である。
【０１９５】
本発明の好ましい実施形態においては、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与用量は：治療コースあたりの総投与量として、約５ｘ１０７から５ｘ１０１２個のウイルス粒子（単回投与もしくは複数回投与として）またはその範囲内の任意の値であり、或いは、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの投与用量は：治療コースあたりの総投与量として、約５ｘ１０７から５ｘ１０１２ＰＦＵ（単回投与もしくは複数回投与として）またはその範囲内の任意の値である。その正確な投与量はまた、医者の判断および各個人の固有の状況にも依存する。複数回投与の場合、それは１日に１から３回、１から７日間連続して投与される。
【０１９６】
本発明の好ましい実施形態においては、ＣＡＲ修飾免疫細胞の投与用量は、治療コースあたり、総投与量として、体重１Ｋｇにつき１ｘ１０４から１ｘ１０９細胞である。好ましくは、それは１日に１から３回、１から７日間連続して投与される。
【０１９７】
特定の実施形態においては、腫瘍および／または癌の治療のための方法はさらに、患者に対し、腫瘍および／または癌の治療のための他の医薬、および／または患者の免疫系を調節するための医薬を投与して、身体中のＣＡＲ修飾免疫細胞の数および機能を増強することを含む。腫瘍および／または癌の治療のための前記他の医薬は、これに限定されないが：化学療法薬、例えばシクロホスファミド、フルダラビン；放射線療法薬；免疫抑制剤、例えばシクロスポリン、アザチオプリン、メトトレキサート、ミコフェノラート、ＦＫ５０；抗体、例えばＣＤ３、ＩＬ−２、ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＴＮＦαに対する抗体を含む。
【０１９８】
ＤＮＡは、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化され得；ｍＲＮＡは、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化され得る。例えば、それはプラスミドの形状での直接の腫瘍内注射によるか、またはリポソーム内にパッケージされた後の腫瘍内注射によるか、またはナノ粒子（例えば、ポリ−Ｌ−リジン、ポリアミノ酸、ポリエチレンイミン、またはキトサンなどといったポリマー）への結合後の腫瘍内注射によるか、或いは腫瘍内注射後のエレクトロトランスフェクションによりトランスフェクション率を高めることにより投与され得る。
【０１９９】
組換えウイルスは、腫瘍内注射によりまたは静脈内に投与されるべく製剤化され得る。
【０２００】
ＣＡＲ修飾免疫細胞は、静脈内または局所投与により投与されるべく製剤化され得る。
【０２０１】
以下は、本発明の内容を、例としてさらに説明また例証するが、しかしこれらの例は、本発明の保護範囲を限定するものとして理解されるべきではない。
【実施例】
【０２０２】
他に特に指定しない限り、以下の実施例において使用される実験方法は、医用生物工学の分野における通常の実験手順、操作、材料、および条件を用いて実施される。
【０２０３】
他に特に指定しない限り、個々の薬剤のパーセント濃度（％）は、全て体積パーセント（％（ｖ／ｖ））を示す。
【０２０４】
他に特に指定しない限り、細胞培養は３７℃、５％ＣＯ２、および加湿（９５％相対湿度）の条件において行われる。
【０２０５】
以下の実施例において使用される実験材料の供給源は、以下の通りである：
ＰＢＭＣは、健康なドナーの末梢血に由来する。
ヒト組換えＩＬ−２（ｈｒＩＬ２）は、Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈより購入した。
ＤＰＢＳは、Ｇｉｂｃｏより購入した。
電気ショックカップは、Ｂｉｏ−Ｒａｄより購入した。
他に特に指定しない限り、ＦＢＳはＳｉｇｍａより購入した。
【０２０６】
ヒト卵巣癌細胞系ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ、ヒトＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔ、ヒト肝臓癌細胞系ＳＫ−ＨＥＰ−１、アフリカミドリザル腎細胞ＣＶ−１、ヒト骨芽細胞腫細胞１４３Ｂ細胞はＡＴＣＣより購入し、かつヒト結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６−ｌｕｃは、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒより購入した。
【０２０７】
ワクシニアウイルス（ＤＤＶＶ−ＲＦＰ）：腫瘍溶解性ワクシニアウイルスＤＤＶＶ−ＲＦＰは公知であり、それは、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスＷＲ株に属し（例えば、Ｘ  Ｓｏｎｇら著、“Ｔ−ｃｅｌｌ  Ｅｎｇａｇｅｒ−ａｒｍｅｄ  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  Ｅｎｈａｎｃｅｓ  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ”、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ」、２０１４年、第２２巻、第１号、Ｐ．１０２−１１１を参照）、ＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子の双方において機能的に欠損し、かつ外来性赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）遺伝子をもつ。ＲＦＰ遺伝子は、スクリーニング／レポーティングの役割を果たすのみであり、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスＤＤＶＶ−ＲＦＰの抗腫瘍機能は、ＴＫ遺伝子およびＶＧＦ遺伝子において機能的に欠損した腫瘍溶解性ワクシニアウイルスと実質的に同等である。さらに、腫瘍溶解性ワクシニアウイルスＤＤＶＶ−ＲＦＰはまた、当該技術分野における通常の技術を用いたＶＳＣ２０ワクシニアウイルスの遺伝的修飾によっても取得可能である。ＶＳＣ２０ワクシニアウイルスは、ＶＧＦ遺伝子を欠くワクシニアウイルスです。ＶＳＣ２０ワクシニアウイルスの調製方法については、ＭｃＣａｒｔ，ＪＡら著、“Ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｗｉｔｈ  ａ  ｔｕｍｏｒ−ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｍｕｔａｎｔ  ｌａｃｋｉｎｇ  ｔｈｙｍｉｄｉｎｅ  ｋｉｎａｓｅ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｇｅｎｅｓ”、「Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ」、２００１年、第６１巻、Ｐ．８７５１−８７５７、を参照されたい。遺伝的修飾は、人工的に合成されたワクシニアウイルス初期／後期プロモーターｐＳＥＬを用いて外来性ＤｓＲｅｄ遺伝子（すなわち、ＲＦＰ遺伝子）を調節すること、およびインビトロ細胞内組換え技術を用いてワクシニアウイルスＶＳＣ２０株のＴＫ遺伝子領域内にＤｓＲｅｄ遺伝子を挿入し、それにより腫瘍溶解性ウイルスＤＤＶＶ−ＲＦＰを構築することを含む。
【０２０８】
調製例１：エレクトロポレーション技術によりそれぞれＴＴ１、ＴＴ２、ＴＴ３、Ｃ１＆２ａ、Ｃ１＆２ｂで標識された腫瘍細胞の調製
５ｘ１０６個のＪｕｒｋａｔ、ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ、またはＳＫ−ＨＥＰ−１細胞と、それぞれＴＴ１（配列番号：１１）、ＴＴ２（配列番号：１２）、ＴＴ３（配列番号：１３）、Ｃ１＆２ａ（配列番号：１４）、Ｃ１＆２ｂ（配列番号：１５）コード配列（それぞれ調製例８の方法によって得られた）をもつ５μｇのｍＲＮＡとを、それぞれエレクトロトランスファー液Ｐ３（製品名「Ｐ３Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−ＸキットＬ」、Ｌｏｎｚａ、商品番号Ｖ４ＸＰ−３０１２）中で混合し、１００μｌのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）チューブ（製品名「Ｐ３Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−ＸキットＬ」、Ｌｏｎｚａ、商品番号Ｖ４ＸＰ−３０１２」）に入れて、氷浴中に５分間置いた。次に、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ）のエレクトロポレーターを使用し、かつその腫瘍細胞エレクトロトランスフェクションプログラムを用いてエレクトロトランスフェクションを行なった。エレクトロトランスフェクションの後、細胞を取出して、対応する腫瘍細胞培地中に置いた。Ｊｕｒｋａｔ培地は、ＲＰＭＩ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％  ＦＢＳ（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃおよびＨＣＴ１１６−ｌｕｃ培地は、ＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ＋１０％  ＦＢＳであり、かつＳＫ−ＨＥＰ−１培地は、ＥＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）＋１０％  ＦＢＳである。ＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を培地に添加して、１０ｎｇ／ｍＬの最終濃度とし、次いで３７℃のインキュベーター内で５％ＣＯ２中に置いて、一晩回復させた。２４時間後、細胞を収穫して、エレクトロトランスフェクトされた細胞をフローサイトメーター（ＢＤより購入、Ｃ６Ｓａｍｐｌａｒ）を用いて同定した。ＴＴ１、ＴＴ２、ＴＴ３、Ｃ１＆２ａ、またはＣ１＆２ｂでそれぞれ標識された腫瘍細胞が得られた。
【０２０９】
試験例１：エレクトロポレーションによる標識ペプチドをもつ腫瘍細胞の標識の検証
調製例１の方法に従って、それぞれＴＴ１（配列番号：１１）、ＴＴ２（配列番号：１２）、またはＴＴ３（配列番号：１３）コード配列（それぞれ調製例８の方法によって得られた）をもつｍＲＮＡを、Ｊｕｒｋａｔ不死化Ｔリンパ球、ヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ、ヒト結腸直腸癌細胞ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ、またはヒト肝臓癌細胞ＳＫ−ＨＥＰ−１に対し、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ）により、それぞれエレクトロトランスフェクトした。染色は、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｍｙｃ抗体（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗ＨＡ抗体（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いて行なった（希釈率はそれぞれ１：５０である）。細胞は、フローサイトメトリー（ＢＤより購入、Ｃ６Ｓａｍｐｌａｒ）により同定した。
【０２１０】
結果は図５に示されており、腫瘍細胞上でのＴＴ１、ＴＴ２、およびＴＴ３の高強度の発現が首尾よく検出された。それらの中で、Ｊｕｒｋａｔ不死化Ｔリンパ球は、ＴＴ１およびＴＴ２により標識され（図５Ａおよび５Ｂに示される通り）、ヒト卵巣癌細胞ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ（図５Ｃ）、ヒト結腸直腸癌細胞ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ（図５Ｄ）、およびヒト肝臓癌細胞ＳＫ−ＨＥＰ−１（図５Ｅ）は、ＴＴ３により標識された。図の左のピークは、上記の抗体で染色された野生型の腫瘍細胞（ネガティブコントロール曲線）であり、一方右のピークは、ＴＴ１、ＴＴ２、およびＴＴ３をそれぞれコードするｍＲＮＡのエレクトロトランスフェクション後の腫瘍細胞における、ＴＴ１（Ａ）、ＴＴ２（Ｂ）、またはＴＴ３（Ｃ−Ｅ）の発現強度曲線である。
【０２１１】
調製例２：それぞれＴＴ１、ＴＴ２、およびＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞の調製
２ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣ細胞を、１ｍｌのＴ細胞培地（１％  ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）を補足したＡＩＭＶ（Ｇｉｂｃｏ））中に再懸濁し、最終濃度１００ｎｇ／ｍｌのＯＫＴ３（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、および３００ＩＵ／ｍｌのｈｒＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を添加し、次いで２４ウェルプレートの１つのウェル内へインキュベートし、５％ＣＯ２中で３７℃の加湿された細胞培養インキュベーター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）内に置いた。最終濃度３００ＩＵ／ｍｌのｈｒＩＬ−２を、２から３日ごとに補足した。新鮮なＴ細胞の細胞培地を、細胞増殖の状態に応じて補足して、細胞の数を１ｘ１０６細胞／ｍｌに調整した。
【０２１２】
７から１４日間培養されたＴ細胞（１ｘ１０７細胞）、および４μｇのａＴＴ３−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζｍＲＮＡ（すなわち、配列番号：５５に示される通りのヌクレオチド配列に対応するｍＲＮＡ（調製例８の方法によって得られた））を、エレクトロトランスファー溶液Ｐ３（製品名Ｐ３Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−ＸキットＬ」、Ｌｏｎｚａ、商品番号Ｖ４ＸＰ−３０１２）中で混合し、１００μｌのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）チューブ（製品名「Ｐ３Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−ＸキットＬ」、Ｌｏｎｚａ、商品番号Ｖ４ＸＰ−３０１２」）に入れて、氷浴中で５分間凍結させた。次に、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ）およびそのＴ細胞エレクトロトランスフェクションプログラムを用いて、エレクトロトランスフェクションを行なった。エレクトロトランスフェクションの後、細胞を取出して、Ｔ培地中に置いた。３００ＩＵ／ｍｌ（最終濃度）のｈｒＩＬ−２および１０ｎｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、次いで５％ＣＯ２中で３７℃のインキュベーター内に置いて、一晩回復させた。２４時間後、細胞を収穫して、エレクトロトランスフェクトされた細胞をフローサイトメトリーにより同定した。ＴＴ３を標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞（すなわち、ａＴＴ３−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲ）が得られた。
【０２１３】
ＴＴ１およびＴＴ２を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞の調製は、ａＴＴ１−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζｍＲＮＡ（すなわち、配列番号：５３に示される通りのヌクレオチド配列に対応するｍＲＮＡ（調製例８の方法によって得られた））、ａＴＴ２−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζｍＲＮＡ（すなわち、配列番号：５４に示される通りのヌクレオチド配列に対応するｍＲＮＡ（調製例８の方法によって得られた））が使用されたことを除いて、上記の方法と同様である。
【０２１４】
実施例１：エレクトロトランスフェクションにより標識ポリペプチドで標識された腫瘍細胞上の該標識ポリペプチドを標的とする、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍殺傷能
この実施例は、エレクトロトランスフェクションにより標識された後の、Ｊｕｒｋａｔ細胞上の標識ポリペプチドを標的とする、ＣＡＲ−Ｔ細胞の殺傷能を試験した。調製例２の方法によって得られた、ＴＴ１またはＴＴ２を標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞、または非ＣＡＲ修飾Ｔ細胞を、それぞれ、調製例１の方法によって得られた、エレクトロトランスフェクションによりＴＴ１またはＴＴ２で標識されたヒトＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔ細胞と、Ｕ型９６ウェルプレートにおいて共培養し、上記のＣＡＲ−Ｔエフェクター細胞の、標的細胞に対する数の比（Ｅ：Ｔ）は、１．２５：１から２０：１の範囲である。各実験を３回繰返した。２時間の共培養の後、ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国）を用いて、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した：％特異的溶解＝（（実験群の放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））／（最大放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））ｘ１００．
【０２１５】
結果は、図６および７に示される：ネガティブコントロールＴ細胞群（Ｍｏｃｋ群、ＣＡＲコード化ｍＲＮＡの添加なし、Ｔ細胞はただブランクコントロールを用いてエレクトロトランスフェクトされただけ）に比較して、ＴＴ１またはＴＴ２でエレクトロトランスフェクトされたＪｕｒｋａｔ細胞上のＴＴ１またはＴＴ２を標的とする、ＣＡＲ−Ｔ細胞の殺傷能は、有意に増大され、かつ殺傷比は、それぞれ１５％および４０％まで増大され得る（Ｅ：Ｔ＝２０：１）。
【０２１６】
実施例２：標識ポリペプチドを標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞はエレクトロトランスフェクションにより標識ポリペプチドで標識された種々の腫瘍細胞を殺すことができる
この実施例は、エレクトロトランスフェクションにより標識された腫瘍細胞の殺傷について、ＣＡＲ−Ｔ細胞の広範なスペクトルを試験した。調製例２の方法によって得られた、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞、または野生型Ｔ細胞（ＣＡＲのネガティブコントロール群として）を、エレクトロトランスフェクションによりＴＴ３で標識された、ヒトＴ細胞系Ｊｕｒｋａｔ細胞またはヒト結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６−ｌｕｃと、Ｕ型９６ウェルプレートにおいて共培養し、上述のエフェクター細胞の、標的細胞に対する数の比（Ｅ：Ｔ）は、２．５：１から２０：１の範囲である。各実験を３回繰返した。２時間の共培養の後、ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国、より入手された）を用いて、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した：％特異的溶解＝（（実験群の放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））／（最大放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））ｘ１００．
【０２１７】
結果は、図８に示される：野生型Ｔ細胞に比較して、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞は、エレクトロトランスフェクションによりＴＴ３で標識されたＪｕｒｋａｔ細胞を有意に殺すばかりでなく、エレクトロトランスフェクションによりＴＴ３で標識されたＨＣＴ１１６−ｌｕｃ細胞も殺すことができ、かつ殺傷比は、それぞれ４０％超（ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ細胞）および３５％超（Ｊｕｒｋａｔ細胞）まで増大され得る（Ｅ：Ｔ＝２０：１）。
【０２１８】
実施例３：標識ポリペプチドを標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞はエレクトロトランスフェクションにより標識された腫瘍細胞を特異的に殺すことができる
この実施例は、本発明の標識ポリペプチドを標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞の、標識された腫瘍細胞に対する特異性を試験した。調製例２の方法によって得られた、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞またはｍＧＦＰ−Ｚ修飾Ｔ細胞（ＧＦＰ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ番号はＹＰ＿００２３０２３２６．１である）を、ａＴＴ３−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲの抗原結合ドメインを置換えるべく使用し、ＣＡＲのネガティブコントロール群として使用した）を、それぞれ、エレクトロトランスフェクションによりＴＴ３で標識されているかまたは標識されていないヒト結腸直腸癌細胞系ＨＣＴ１１６−ｌｕｃと、Ｕ型９６ウェルプレートにおいて共培養した。標的細胞に対するエフェクター細胞の数の比（Ｅ：Ｔ）は、５：１から２０：１の範囲である。各実験を３回繰返した。２時間の共培養の後、ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国、より入手された）を用いて、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した：％特異的溶解＝（（実験群の放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））／（最大放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））ｘ１００．
【０２１９】
結果は、図９に示される：ＣＡＲネガティブコントロール群（ｍＧＦＰ−Ｚ）に比較して、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞は、エレクトロトランスフェクションによりＴＴ３で標識されたＨＣＴ１１６−ｌｕｃ細胞を有意に殺すことができ（図９Ａ）、かつ殺傷比は、２０％超まで増大され得る（Ｅ：Ｔ＝２０：１）。未標識のＨＣＴ１１６−ｌｕｃ細胞については、ＣＡＲネガティブコントロール群とＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞とでは、ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ細胞の殺傷に殆ど差異がない。これはＴＴ３を標的とするＣＡＲの、ＴＴ３に対する特異性を証明する。
【０２２０】
実施例４：腫瘍細胞は２種類のエピトープポリペプチドを用いて標識され、かつ対応するＣＡＲ−Ｔ細胞によって認識され得る
２つのエピトープポリペプチドを１つの担体中にクローン化して、腫瘍細胞が２つのエピトープポリペプチドで同時に標識され得るようにし、それにより、異なるＣＡＲ−Ｔ細胞を用いて、標識された腫瘍細胞を同時にまたは順次に追跡して殺すことができる。さらに、調製例８に詳述される方法に従って、異なるスペーサー膜貫通領域を用いて、２つのエピトープポリペプチドをｐＦａｓｔｂａｃ１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）中にクローン化して、標識ポリペプチドＣ１＆２ａおよびＣ１＆２ｂを発現するベクターが得られ（それぞれ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−Ｃ１＆２ａおよびｐＦａｓｔｂａｃ１−Ｃ１＆２ｂ）、次いでＣ１＆２ａ（配列番号：１４）およびＣ１＆２ｂ（配列番号：１５）コード配列のｍＲＮＡを調製した。さらに、Ｃ１＆２ａまたはＣ１＆２ｂで標識されたＪｕｒｋａｔ細胞を、調製例１の方法に従って得た。ここで、Ｃ１＆２ａは、Ｍｙｃタグ由来の３つの反復したエピトープポリペプチドとＨＡタグ由来の３つの反復したエピトープポリペプチドとを含む。Ｃ１＆２ｂは、Ｍｙｃタグ由来の２つの反復したエピトープポリペプチドとＨＡタグ由来の２つの反復したエピトープポリペプチドとを含む。Ｃ１＆２ａのアミノ酸配列は、配列番号：１４に示される通りであり、かつＣ１＆２ｂのアミノ酸配列は、配列番号：１５に示される通りである。標識ポリペプチドＣ１＆２ａのコード配列をもつ核酸のヌクレオチド配列は、配列番号：２９に示される通りであり、かつ標識ポリペプチドＣ１＆２ｂのコード配列をもつ核酸のヌクレオチド配列は、配列番号：３０に示される通りである。
【０２２１】
ＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔ（Ｍａｂｔｅｃｈ）を用いて、腫瘍細胞による刺激の後のＣＡＲ−ＴのＩＦＮγ分泌を検出した。調製例２の方法によって得られた、ブランクコントロールでエレクトロトランスフェクトされた（Ｍｏｃｋ−Ｔ）、またはエレクトロトランスフェクションによりＴＴ１もしくはＴＴ２を標的とするＣＡＲのｍＲＮＡでエレクトロトランスフェクトされたＴ細胞を、それぞれ、調製例１の方法によって得られたＣ１＆２ａまたはＣ１＆２ｂで標識されたＪｕｒｋａｔ細胞と、ＩＦＮγ  ＥＬＩＳＰＯＴ検出プレート上で共培養し、標的細胞に対するＣＡＲ−Ｔエフェクター細胞の数比（Ｅ：Ｔ）は、１０：１である。各実験を３回繰返した。２４時間の共培養の後、現像を行なって、ＥＬＩＳＰＯＴポイントを、ソフトウェアＩｍｍｕｎｏｓｐｏｔを用いることによりカウントした。
【０２２２】
図１０に示されるように、左のパネルはＩＦＮγ  ＥＬＩＳｐｏｔの代表的な写真であり、右のパネルはＩＦＮγスポット数の統計結果である。ＣＡＲ修飾のないＴ細胞に比較して、ＴＴ１またはＴＴ２を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｃ１＆２ａまたはＣ１＆２ｂで標識されたＪｕｒｋａｔ細胞に対し、同時に応答し得る。ＴＴ１またはＴＴ２を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｃ１＆２ａよりもＣ１＆２ｂに対して、より強く応答する。
【０２２３】
調製例３：ＴＴ３を標的とするキメラ抗原受容体修飾ＮＫ細胞の調製
２０ｘ１０６個のヒトＰＢＭＣ細胞と、２ｍＬのＮＫ細胞活性化剤１（Ｓｃｈｅｎｚｈｅｎ  Ｄａｋｅｗｅより購入、ＤＫＷ３５−ＣＹＴ−ＮＫ００１）とを、４００ｍｌの、ＮＫ培地（ＮＫ培地はＡＩＭ  Ｖ（登録商標）培地（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）＋１％ヒト血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌより購入、商品番号ＨＰ１０２２ＨＩ））中で均一に混合し、Ｇ−Ｒｅｘ１００細胞培養装置（Ｗｉｌｓｏｎ  Ｗｏｌｆより購入）内に接種し、そしてＩＬ２（最終濃度：５０ＩＵ／ｍｌ）を添加し、３７℃の細胞培養インキュベーター内に置き、ＩＬ２の体積全体（最終濃度：５０ＩＵ／ｍｌ）を一日おきに補充し、１０日間培養し、次いで細胞を収穫してカウント。収穫された細胞から２０ｘ１０６個の細胞を取り、４００ｍｌのＮＫ培地中で別の２ｍＬのＮＫ細胞活性化剤１と均一に混合し、そして次にＧ−Ｒｅｘ１００細胞培養装置に戻して、同じ条件においてさらに７日間培養した。上述の１０日目の残りの細胞を、後の使用に向けて凍結し、１６日目の細胞を収穫してカウントした。２ｘ１０６個の細胞を、フローサイトメトリーによる細胞表現型分析用に取出した（それぞれ、抗ＣＤ３および抗ＣＤ５６抗体を使用：ＰＥコンジュゲート抗ヒトＣＤ３抗体、およびＡＰＣコンジュゲート抗ヒトＣＤ５６抗体（Ｍｉｌｔｅｎｙｉより購入）、１：５０希釈）。
【０２２４】
１６日間培養されたＮＫ細胞（１ｘ１０７細胞）と、４μｇのａＴＴ３−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζｍＲＮＡ（調製例８の方法によって得られた）とを、エレクトロトランスファー液Ｐ３（製品名「Ｐ３Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−ＸキットＬ」、Ｌｏｎｚａ、商品番号Ｖ４ＸＰ−３０１２）中で混合し、１００μｌのＮｕｃｌｅｏｃｕｖｅｔｔｅ（商標）チューブ（製品名「Ｐ３Ｐｒｉｍａｒｙ  Ｃｅｌｌ  ４Ｄ−ＸキットＬ」、Ｌｏｎｚａ、商品番号Ｖ４ＸＰ−３０１２）に入れて、氷浴中で５分間凍結させた。次に、４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（商標）システム（Ｌｏｎｚａ）を使用し、そのＮＫ細胞エレクトロトランスフェクションプログラムを、エレクトロトランスフェクション用に選択した。エレクトロトランスフェクションの後、細胞を取出して、ＮＫ細胞培地中に置き、５０ＩＵ／ｍｌのＩＬ２および１０ｎｇ／ｍＬのＤＮａｓｅを添加し、次いで３７℃のインキュベーター内で５％ＣＯ２中に置いて一晩回復させた。２４時間後、細胞を収穫して、エレクトロトランスフェクトされた細胞をフローサイトメーター（ＢＤより購入、Ｃ６  Ｓａｍｐｌａｒ）を用いて同定した。ＴＴ３を標的とするＣＡＲ修飾ＮＫ細胞（すなわち、ａＴＴ３−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲ）が得られた。
【０２２５】
実施例５：エレクトロトランスフェクションにより標識された腫瘍細胞上の標識ポリペプチドを標的とするＣＡＲ−ＮＫ細胞の腫瘍殺傷能
この実施例は、標識ポリペプチドを標的とするＣＡＲ修飾ＮＫ細胞の、エレクトロトランスフェクトされた標識されたＳＫＯＶ３−ｌｕｃまたはＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対する殺傷能力を試験した。ＴＴ３を標的とするＣＡＲ修飾ＮＫ細胞、またはｍＧＦＰ−Ｚ修飾ＮＫ細胞（ＧＦＰ配列（Ｇｅｎｂａｎｋ番号はＹＰ＿００２３０２３２６．１である）はａＴＴ３−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζＣＡＲの抗原結合ドメインを置換えるべく使用し、ＣＡＲのネガティブコントロール群として使用した）を、それぞれ、エレクトロトランスフェクションによりＴＴ３で標識された、ヒト卵巣癌細胞系ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ、またはヒト肝臓癌細胞系ＳＫ−ＨＥＰ−１と、Ｕ型９６ウェルプレートにおいて共培養し、標的細胞に対するＣＡＲ−ＮＫエフェクター細胞の数の比（Ｅ：Ｔ）は、１０：１である。各実験を３回繰返した。２時間の共培養の後、ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国）を用いて、ＣＡＲ−ＮＫ細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した：％特異的溶解＝（（実験群の放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））／（最大放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））ｘ１００．
【０２２６】
結果は図１１に示される。ネガティブコントロール群に比較して、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−ＮＫ細胞は、ＴＴ３でエレクトロトランスフェクトされたＳＫＯＶ３−ｌｕｃおよびＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対し、有意に高い殺傷能を有しており、かつ殺傷比は、それぞれ約４０％増大され得る。
【０２２７】
調製例４：ＴＴ３で安定的に標識されたＨＣＴ１１６−ｌｕｃ細胞系の調製
まず、ｍＲＮＡ合成に使用可能な組換え発現ベクターｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ３を、Ｃｌａｌ制限エンドヌクレアーゼを用いて直鎖化して、次に直鎖化されたフラグメントをゲル切出しによって回収した。４ｘ１０５個のＨＣＴ１１６−ｌｕｃ細胞を、６ウェルプレートの１つのウェルに接種した。２μｇの直鎖化されたプラスミドを、４μｌのＰ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）および１２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）と混合し、これを混合物１と命名し；６μｌのＬｉｐｏ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）を１２５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭと混合し、これを混合物２と命名した。混合物１および混合物２を混合して、混合物３と命名し、次いで室温で１５分間インキュベートした。６ウェルプレート内の培養液を捨て、２ｍｌの、ＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ＋１０％ＦＢＳ培養液を添加し、そして混合物３を培養液に添加した。トランスフェクションの２４時間後、培地を捨て、２ｍｌの新鮮なＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ＋１０％ＦＢＳ培地で置換えた。１週間の培養の後、ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ細胞を、ＦＩＴＣコンジュゲート抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔより購入、１：５０まで希釈）を用いて染色し（４℃で３０分間染色）、そしてＢＤ  ＦＡＣＳＡｒｉａＩＩソーターにより単一細胞ソーティングを行なった。ＴＴ３を発現する細胞（すなわち、ＦＩＴＣ陽性）がソートされ、これを、増殖培養後に使用し得る。
【０２２８】
調製例５：レンチウイルスによりＴＴ３を標的とするキメラ抗原受容体修飾Ｔ細胞の調製
ＴＴ３を標的とするキメラ抗原受容体のコード配列をもつＤＮＡのヌクレオチド配列（配列番号：５５に示される通り）を、第３世代の自己不活性化レンチウイルス発現ベクター（ＣＤ８１０Ａ-１；Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）内へ、当該技術分野における通常の技術に従って挿入した。レンチウイルスは、ＨＥＫ２９３ＦＴ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により産生された。ウイルス上清を収穫し、２５，０００ｒｐｍで３時間の超遠心分離により濃縮した。レンチウイルスが導入されたＣＡＲ−Ｔ細胞を調製するためには、まず、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いて、健康なドナーの新鮮血からヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離した。単離されたＰＢＭＣをヒトＣＤ３／ＣＤ２８ダイナビーズ（ｄｙｎａｂｅａｄｓ）（登録商標）（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて活性化した後、それらを５％ヒトＡＢ血清（Ｖａｌｌｅｙ  Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ）および３００ＩＵ／ｍｌのＩＬ−２（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ）を補足したＡＩＭ−Ｖ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）培地中で培養した。培養１週間後、活性化されたＰＢＭＣ細胞を、ＴＴ３を標的とするキメラ抗原受容体の配列を含むレンチウイルスで感染させ、使用に先立ちさらに１週間培養した。
【０２２９】
実施例６：ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞は、マウスにおいて、レンチウイルスによりＴＴ３で安定的に標識された腫瘍細胞を効果的に殺す
ヒト腫瘍を移植されたマウスモデルをさらに使用して、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞のインビトロの腫瘍殺傷効果を試験した。実験用マウスは、非肥満性糖尿病／重症複合型免疫不全／ＩＬ−２Ｒｙｃｎｕｌｌ（ＮＳＧ）マウス（６週齢から８週齢、雌）であった。各マウスに、ＴＴ３で標識された１ｘ１０７個のヒト結腸直腸細胞系ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ（調製例４によって調製された）を移植した。腫瘍移植の７日後、腫瘍増殖を、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍイメージングプラットフォームにおいて、インビボの生物学的イメージング技術（ＢＬＩ）を用いて観察し、腫瘍増殖を、イメージャー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、米国より購入）を用いて記録した。同様のＢＬＩ強度（ＢＬＩ強度は、インビボイメージャーによって記録された、マウス中の腫瘍細胞の蛍光強度を指す）をもつマウスを、各群に５匹のマウスで無作為に４つの群：リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）群、コントロールＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞群、ＴＴ３を標的とするＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞群、およびＴＴ３を標的とするＤＮＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞群に分けた。コントロールＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔ（ｍＧＦＰＺ−ＣＡＲでトランスフェクトした）およびＴＴ３を標的とするＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔは、調製例２の方法によって調製され、ＴＴ３を標的とするＤＮＡ  ＣＡＲ−Ｔは、調製例５の方法によって調製された。ＣＡＲ−Ｔ細胞群の全てのマウスに、マウス当たり１ｘ１０７細胞／回を腹腔内に注射し、そしてＰＢＳ群の各マウスには、１００μＬのＰＢＳを腹腔内注射した。細胞注射プロトコールは：腫瘍接種の７日目の注射である。マウスの挙動および生存を非常に注意深く観察し、腫瘍の発生状況をＢＬＩによって記録した。全ての光シグナルおよび画像は、Ｘｅｎｏｇｅｎインビボイメージングソフトウェアｖ２．５によって記録および分析した。
【０２３０】
図１２に示されるように、腫瘍移植後の１４日目に、腫瘍増殖状況は、ＰＢＳ群における腫瘍が増殖を続けたこと；コントロールＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞群（図では「コントロールＲＮＡ  ＣＡＲ／Ｔ」として示される）の全５匹において、腫瘍は増殖を停止し、かつ腫瘍サイズは、ＰＢＳ群よりも有意に小さかったこと；ＴＴ３を標的とするＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞群（図では「ＲＮＡ  ＣＡＲ／Ｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＴＴ３」として示される）においては、腫瘍増殖は緩和され、腫瘍サイズはコントロールＲＮＡ  ＣＡＲ／Ｔ群に比べて有意に小さかったこと；ＴＴ３を標的とするＤＮＡ  ＣＡＲ−Ｔ細胞群（図では「ＤＮＡ  ＣＡＲ／Ｔ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ＴＴ３」として示される）においては、腫瘍増殖は有意な軽減を示し、かつ腫瘍がほぼ完全に消えたこと、を示した。ＴＴ３を標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞が、ＴＴ３で標識された腫瘍をインビボで効果的に殺傷できることが見てとれる。
【０２３１】
ＤＮＡ  ＣＡＲ−ＴにおけるＣＡＲエレメントは、継続的に発現され、かつＣＡＲ−Ｔは抗原と出会った後に身体内で増幅を続け得ること；一方ＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔにおいては、ＣＡＲエレメントはＲＮＡであり、それは５日間から７日間にわたり発現され得るに過ぎないことから、ＤＮＡ  ＣＡＲ−ＴはＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔよりも良好である。これらの５日から７日の間に、発現レベルはどんどん低くなり、かつＲＮＡは、Ｔ細胞の増殖につれて徐々に希釈されることになる。それ故、ＤＮＡ  ＣＡＲ−Ｔは、ＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔよりもさらに有効である。ＤＮＡ  ＣＡＲ−Ｔは、単回の注射を要するに過ぎないが、一方ＲＮＡ  ＣＡＲ−Ｔは、複数回の注射を必要とする。しかしながら、ここでは１回のみの注射が使用された。
【０２３２】
調製例６：Ｃｒｉｓｐｅｒ−Ｃａｓ９によりゲノム中にＴＴ３を含む組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの調製
４ｘ１０５個のＣＶ−１細胞を、１０％ＦＢＳ（Ｓｉｇｍａ）を補足した２ｍｌのＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に再懸濁し、６ウェルプレート（Ｃｏｓｔａｒ）の１つのウェル内に接種した。一晩インキュベートした後、古い培地を捨てた。ワクシニアウイルス（ＤＤＶＶ−ＲＦＰ）を無血清ＤＭＥＭ培地で希釈し、１ｍｌのウイルス希釈物（０．０５ＭＯＩ）を細胞に添加した。ウイルス感染の４時間後、ウイルスを含む培地を捨て、次いで５％ＦＢＳを含む２ｍｌのＤＭＥＭ培地を添加した。１．５μｇのＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴより購入）、９ｐｍｏｌのリーダーＲＮＡ−１、および９ｐｍｏｌのトレーサーＲＮＡ（ＩＤＴより購入）を、３７．５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に希釈し、室温で１０分間インキュベートして、混合物１と命名した。別の１．５μｇのＣａｓ９タンパク質（ＩＤＴより購入）、９ｐｍｏｌのリーダーＲＮＡ−２、および９ｐｍｏｌのトレーサーＲＮＡ（ＩＤＴより購入）を、３７．５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中に希釈し、室温で１０分間インキュベートして、混合物２と命名した。６μｌのＬｉｐｏ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）および１５０μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを混合し、混合物３と命名した。混合物１、混合物２、および７５μｌの混合物３を一緒に混合し、室温で１５分間インキュベートし、混合物４と命名した。２μｇのドナープラスミドｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ３−ＰｕｒｏＧＦＰ（図３に示される通り）、４μｌのＰ３０００（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）、および７５μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭを一緒に混合し、そしてさらに７５μｌの混合物３と混合し、室温で１５分間インキュベートし、混合物５と命名した。最後に、混合物４および５を一緒に混合して、ＣＶ−１細胞の６ウェルプレートに添加した。トランスフェクションの４８時間後、上清および細胞を収集し、凍結および融解を反復して、組換えワクシニアウイルスを得た。１４３Ｂ細胞を組換えワクシニアウイルスで感染させ、緑色蛍光をもつ組換え体を見ることができた。緑色蛍光を用いて、組換え体をスポットスクリーニングにより精製し、そしてＴＴ３コード配列をもつ精製された組換えワクシニアウイルス（ｖｖＤＤ−ＴＴ３）が得られた。
【０２３３】
ドナープラスミドｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ３−ＰｕｒｏＧＦＰ（図３に示される通り）は、当該技術分野における通常の技術によって調製されたが、これには：まず、ｐＵＣ  ｏｒｉ、ＡｍｐＲ、ｂｌａプロモーター、ｆ１  ｏｒｉのみを保持して、Ｅｃｏｒ１、ｓａｌ１、ａｇｅ１、Ｈｉｎｄ３、Ｋｐｎ１、およびＣｌａクローニング部位を添加することを含む、ｐｆａｓｔｂａｃ１をリフォームしてｐＢＳ１プラスミドを生成すること；フラグメント１（ｅｃｏｒ１−ｇＲＮＡ１−ＬＨＲ４８０−ｓａｌ１）、フラグメント２（ｓａｌ１−ＴＴ３−ａｇｅ１）、フラグメント３（ａｇｅ１−ｐＳＥＬ−ｌｏｘｐ−ｐ７．５−ｈｉｎｄ３）、フラグメント４（ｈｉｎｄ３−ｐｕｒｏｍｙｃｉｎ−ｇｆｐ−ｌｏｘｐ−ｋｐｎ１）、およびフラグメント５（ｋｐｎ１−ＲＨＲ５２０−ｇＲＮＡ２−ｃｌａ１）を、それぞれＩＤＴにより合成すること；５つのフラグメントを順次に、ｐＢＳ１に連結すること、が含まれる。結果として得られたプラスミドのヌクレオチド配列は、配列番号：３８に示される通りである。
【０２３４】
調製例７：組換え腫瘍溶解性ウイルスを用いた感染により細胞表面上にＴＴ３を発現する腫瘍細胞の調製
０日目に、１．５ｘ１０６細胞のＳＫＯＶ３−ｌｕｃ、ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ、およびＳＫ−ＨＥＰ−１を、それぞれ１０ｃｍの細胞培養皿に接種した。１日目、細胞培地（ＳＫＯＶ３−ｌｕｃおよびＨＣＴ１１６−ｌｕｃの細胞培地は、ＭｃＣｏｙ５Ａ＋１０％ＦＢＳであり、ＳＫ−ＨＥＰ−１の培地は、ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳであった）を捨てた。調製例６の方法によって得られた組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ｖｖＤＤ−ＴＴ３）を、それぞれ、５ｍｌの対応する無血清細胞培地中に希釈し、次いで、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ、ＨＣＴ１１６−ｌｕｃ、およびＳＫ−ＨＥＰ−１細胞培養皿にそれぞれ添加した。感染のＭＯＩは、それぞれ０．０２、０．２、０．０２であり、細胞培養皿を３０分ごとに穏やかに振とうした。２時間の感染後、ウイルス希釈物を捨て、５％ＦＢＳを含む細胞培地（Ｓｉｇｍａ）（ＳＫＯＶ３−ｌｕｃおよびＨＣＴ１１６−ｌｕｃは、ＭｃＣｏｙ５Ａであり、ＳＫ−ＨＥＰ−１培地は、ＥＭＥＭであった）を添加した。４６時間のさらなる培養の後、細胞を収穫した。ビオチンコンジュゲート抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を一次抗体として使用し、かつストレプトアビジン−ＡＰＣを二次抗体として（双方とも１：５０まで希釈された）染色に使用した。フローサイトメトメーター（ＢＤより購入、Ｃ６  Ｓａｍｐｌａｒ）を用いて、細胞表面上のＴＴ３の発現を検出した。
【０２３５】
結果は図１３に示される。ＧＦＰの発現は首尾よく検出され得、かつＴＴ３は感染された腫瘍細胞の表面上で高度に発現された。
【０２３６】
実施例７：組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染により標識された腫瘍細胞上のＴＴ３を標的とするＣＡＲ−ＮＫ細胞のインビトロの殺傷効果
この実施例は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染後の、標識されたＳＫＯＶ３−ｌｕｃまたはＳＫ−ＨＥＰ−１細胞上の標識ポリペプチドを標的とする、ＣＡＲ修飾ＮＫ細胞の殺傷能を試験した。調製例３の方法によって得られた、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ修飾ＮＫ細胞、およびｍＧＦＰ−Ｚ修飾ＮＫ細胞（ＧＦＰを用いてａＴＴ３−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲの抗原結合ドメインを置換えた；ＣＡＲのネガティブコントロール群として使用）を、それぞれ、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によりＴＴ３で標識された、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃおよびＳＫ−ＨＥＰ−１（調製例７の方法に従って得られた；各タイプの腫瘍細胞を、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染の４８時間後にＮＫ細胞と混合した）、および未標識のＳＫＯＶ３−ｌｕｃおよびＳＫ−ＨＥＰ−１と、Ｕ型９６ウェルプレートにおいて共培養し、標的細胞に対するＣＡＲ−ＮＫエフェクター細胞の数の比（Ｅ：Ｔ）は、１０：１であった。各実験を３回繰返した。２時間の共培養後、ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国）を用いて、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した：％特異的溶解＝（（実験群の放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））／（最大放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））ｘ１００。
【０２３７】
結果は、図１４に示される。ネガティブコントロール群のｍＧＦＰ−Ｚ修飾ＮＫ細胞（図ではＮＫ  ｍＧＦＰＺとして示される）と比較して、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−ＮＫ細胞（図ではＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲとして示される）は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によりＴＴ３で標識された、ＳＫＯＶ３−ｌｕｃ（図ではＳＫＯＶ３−ｖｖＤＤとして示される）およびＳＫ−ＨＥＰ−１細胞（図ではＳＫ−ＨＥＰ−１−ｖｖＤＤとして示される）に対し、有意により高い殺傷能を有し、かつ殺傷比は、それぞれ約１８％および２３％まで増加され得る。
【０２３８】
調製例８：標識ポリペプチドＴＴ１、ＴＴ２、ＴＴ３、Ｃ１＆２ａ、Ｃ１＆２ｂをコードするｍＲＮＡのインビトロ合成、およびＴＴ１を標的とするａＴＴ１−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζｍＲＮＡ、ＴＴ２を標的とするａＴＴ２−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζｍＲＮＡ、ＴＴ３を標的とするａＴＴ３−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζｍＲＮＡのインビトロ合成。
組換え発現ベクターｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ１−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ２−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ３−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζの構築：当該技術分野における通常の技術に従いて、まず、順次にＴ７プロモーター、コザック配列をもつ５’ＵＴＲ、ＧＭ−ＣＳＦα鎖シグナルペプチド、ＥｃｏＲＩと、ＳｐｈＩと、ＳａｌＩと、ＨｉｎｄＩＩＩと、およびＣｌａＩとを含有する、マルチプルクローニングサイト、およびαグロブリン３’ＵＴＲ（ＡＩＴ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）を含むフラグメントを合成し、次いでｐＦａｓｔｂａｃ１ベクター（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）内に挿入し、ベクターｐＦＢＣＭＶ−Ｔ７が構築されるようにした。次に、以下の配列：ＥｃｏＲＩ制限部位のリンカー配列、ＴＴ１、ＴＴ２、またはＴＴ３を標的とするキメラ抗原受容体のコード配列、およびＳａｌＩ制限部位のリンカー配列、を含む別のフラグメントを合成した。ｐＦＢＣＭＶ−Ｔ７ベクターおよび合成された遺伝子フラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ（ＮＥＢ）二重消化反応に供し、消化産物を、ＤＮＡフラグメント回収用のアガロースゲルＤＮＡ回収キットを用いて回収し、次いで連結してＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）内に形質転換し、３７℃で１８時間培養した。単一クローンを採取し、３７℃において２５０ｒｐｍで１６時間培養し、プラスミドミニエクストラクションキット（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ  Ｔｅｋより購入）の使用によりプラスミドを抽出して、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ１−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ２−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ３−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζを得た。全てのプラスミドを、シーケンシングによって確認した。
【０２３９】
組換え発現ベクターｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ１、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ２、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ３、ｐＦａｓｔｂａｃ１−Ｃ１＆２ａ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−Ｃ１＆２ｂの構築：まず、上記の方法に従ってベクターｐＦＢＣＭＶ−Ｔ７を得、そして以下の配列：ＥｃｏＲＩ制限部位のリンカー配列、標識ポリペプチド（ＴＴ１、ＴＴ２、ＴＴ３、Ｃ１＆２ａ、またはＣ１＆２ｂ）のコード配列、ＳａｌＩ制限部位のリンカー配列、を含むフラグメントを合成した。ｐＦＢＣＭＶ−Ｔ７ベクターおよび合成された遺伝子フラグメントを、ＥｃｏＲＩおよびＳａｌＩ（ＮＥＢ）二重消化反応に供し、消化産物を、ＤＮＡフラグメント回収用のアガロースゲルＤＮＡ回収キットを用いて回収し、次いで連結してＯｎｅ  Ｓｈｏｔ（登録商標）Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  Ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ＴＯＰ１０ケミカルコンピテントセル（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓより購入）内に形質転換し、３７℃で１８時間培養した。単一クローンを採取し、３７℃において２５０ｒｐｍで１６時間培養し、プラスミドミニエクストラクションキット（Ｏｍｅｇａ  Ｂｉｏ  Ｔｅｋより購入）の使用によりプラスミドを抽出して、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ１、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ２、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ３、ｐＦａｓｔｂａｃ１−Ｃ１＆２ａ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−Ｃ１＆２ｂを得た。全てのプラスミドを、シーケンシングによって確認した。
【０２４０】
Ｔａｉｌ−ＰＣＲ技術を用いて、ポジティブ鎖にポリＡをもつ、かつリバース鎖に対応するポリＴをもつＤＮＡ二本鎖鋳型を、インビトロＲＮＡ合成に向けて大量に合成し、それによりＤＮＡ鋳型の不安定性を低減した。標的ポリペプチドＴＴ１、ＴＴ２、ＴＴ３、Ｃ１＆２ａ、またはＣ１＆２ｂのコード配列をもつＤＮＡを、Ｔａｉｌ−ＰＣＲにより、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ１、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ２、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ＴＴ３、ｐＦａｓｔｂａｃ１−Ｃ１＆２ａ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−Ｃ１＆２ｂベクターを、それぞれＤＮＡ鋳型として用いることによって増幅し、それぞれ標識ポリペプチドＴＴ１、ＴＴ２、ＴＴ３、Ｃ１＆２ａ、またはＣ１＆２ｂのコード配列をもつ直鎖化されたＤＮＡ鋳型を合成するようにした。
【０２４１】
キメラ抗原受容体コード配列をもつＤＮＡを、Ｔａｉｌ−ＰＣＲ増幅により、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ１−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ２−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ｐＦａｓｔｂａｃ１−ａＴＴ３−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζベクターをＤＮＡ鋳型として用いて取得し、それぞれキメラ抗原受容体ａＴＴ１−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ａＴＴ２−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζ、ａＴＴ３−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζのコード配列をもつ直鎖化されたＤＮＡ鋳型が合成されるようにした。Ｔａｉｌ−ＰＣＲ反応の条件は、ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔＲｅａｄｙＭｉｘ（２ｘ）の指示書を参照し、かつ反応系（５０μＬ）は以下の通りであった：
再蒸留水（核酸酵素なし）：２５μＬ
２ｘ  ＫＡＰＡ  ＨｉＦｉＨｏｔＳｔａｒｔ  Ｕｒａｃｉｌ＋ＲｅａｄｙＭｉｘ：２５μＬ
Ｐ７（配列番号：１５）（１００μＭ）：０．１５μＬ
Ｐ８（配列番号：１６）（１００μＭ）：０．１５μＬ
ベクターＤＮＡ鋳型（５００ｎｇ／μＬ）：０．５μＬ
【０２４２】
上記のＰＣＲ産物を、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを用いて同定した。同定後の正しい産物を、標識ポリペプチドＴＴ１、ＴＴ２、ＴＴ３、Ｃ１＆２ａ、またはＣ１＆２ｂのｍＲＮＡ（すなわち、配列番号：２６、２７、２８、２９、および３０にそれぞれ対応するｍＲＮＡ）、およびＴＴ１を標的とするａＴＴ１−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζｍＲＮＡ、ＴＴ２を標的とするａＴＴ２−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζｍＲＮＡ、ＴＴ３を標的とするａＴＴ３−ＣＤ８ａ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζｍＲＮＡ（すなわち、配列番号：５３、５４、および５５に示されるヌクレオチド配列にそれぞれ対応するｍＲＮＡ）のインビトロ合成に使用した。キャップ化されたｍＲＮＡは、ｍＲＮＡインビトロ合成キットを用いて合成され、該キットは、ｍＭＥＳＳＡＧＥｍＭＡＣＨＩＮＥ  Ｔ７  ＵＬＴＲＡ転写キット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国、より入手）またはｍＳｃｒｉｐｔ（商標）ＲＮＡシステム（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ、米国、より入手）であった。合成は、キットの指示書を追従し、かつキット中に提供された試薬を使用した。
【０２４３】
インビトロで合成されたｍＲＮＡ産物を分離し、１％（ｗ／ｖ）アガロースゲルを用いて同定した。同定後の正しいｍＲＮＡを、後の使用に向けて−８０℃に保存した。
【０２４４】
調製例９：組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染により細胞表面上にＴＴ３を発現するＳＫ−ＨＥＰ−１細胞の調製
０日目に、１ｘ１０６細胞のＳＫ−ＨＥＰ−１を、１０ｃｍの培養皿に接種した。１日目、細胞培地（ＥＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）を捨てた。調製例６の方法によって得られた組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ｖｖＤＤ−ＴＴ３）を、５ｍｌの対応する無血清細胞培地中に希釈し、次いでＳＫ−ＨＥＰ−１細胞培養皿に添加した。感染のＭＯＩは、それぞれ０．２５、または０．５０であり、細胞培養皿を３０分ごとに穏やかに振とうした。２時間の感染後、ウイルス希釈物を捨て、５％ＦＢＳを含むＥＭＥＭ細胞培地（Ｓｉｇｍａ）を添加した。２２時間のさらなる培養の後、細胞を収穫した。
【０２４５】
ビオチンコンジュゲート抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を一次抗体として使用し、かつストレプトアビジン−ＡＰＣを二次抗体として（双方とも１：５０まで希釈された）染色に使用した。フローサイトメトメーター（ＡＣＥＡ  Ｂｉｏｓｉｃｅｎｃｅｓ、Ｎｏｖｏｃｙｔｅより購入）を用いて、細胞表面上のＴＴ３の発現を検出した。結果として、ＧＦＰ発現が首尾よく検出され（ＧＦＰ発現はフローサイトメトリーによって直接検出され得る）、かつＴＴ３には、感染された腫瘍細胞の表面上で高強度の発現がある。
【０２４６】
実施例８：組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスによる感染によって標識された腫瘍細胞上のＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔのインビトロの殺傷効果
この実施例は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によって標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１細胞上の標識ポリペプチドを標的とする、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞の殺傷能を試験した。調製例２の方法によって得られた、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞、およびｍＧＦＰ−Ｚ修飾Ｔ細胞（ＧＦＰを用いてａＴＴ３−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲの抗原結合ドメインを置換えた；ＣＡＲのネガティブコントロール群として使用）を、それぞれ、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によりＴＴ３で標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１（調製例９の方法に従って得られた；腫瘍細胞は、０．２５ＭＯＩの組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた腫瘍細胞の感染の２４時間後に、上述のＴ細胞と混合した；ＳＫ−ＨＥＰ−１−ｖｖＤＤとして表示された）、および未標識のＳＫ−ＨＥＰ−１（ＳＫ−ＨＥＰ−１として表示された）と、Ｕ型９６ウェルプレートにおいて共培養した。標的細胞に対するＣＡＲ−Ｔエフェクター細胞の数の比（Ｅ：Ｔ）は、４０：１である（ＣＡＲ−Ｔエフェクター細胞の数は２ｘ１０５／ウェルである）。各実験を３回繰返した。３時間の共培養後、ＤＥＬＦＩＡ  ＥｕＴＤＡ細胞傷害性キット（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ、米国）を用いて、ＣＡＲ−Ｔ細胞の腫瘍細胞溶解能を検出した。殺傷効果は、以下の式を用いて計算した：％特異的溶解＝（（実験群の放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））／（最大放出（読取値）−ブランク群の放出（読取値））ｘ１００。
【０２４７】
結果は、図１５に示される。図１５Ａにおいて、ネガティブコントロール群では、ｍＧＦＰ−Ｚ修飾Ｔ細胞（図ではＴ  ｍＧＦＰＺとして示される）と、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞（図ではＴ  ａＴＴ３  ＣＡＲとして示される）との間で、未標識のＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対する殺傷能の点において、何ら有意差はなかった。図１５Ｂにおいては、ネガティブコントロール群におけるｍＧＦＰ−Ｚ修飾Ｔ細胞（図ではＴ  ｍＧＦＰＺとして示される）に比較して、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞（図ではＴ  ａＴＴ３  ＣＡＲとして示される）は、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によってＴＴ３で標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１細胞に対し、有意により高い殺傷能を有しており、かつ殺傷比は、３０％まで増加され得る。
【０２４８】
実施例９：組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によってＴＴ３で標識された腫瘍細胞と共培養された後の、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−ＮＫ細胞のサイトカイン分泌
この実験では、ＥＬＩＳＡを用いて、標識ポリペプチドを標的とするＣＡＲ修飾ＮＫ細胞の、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで感染された標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１細胞と一晩共培養された後の、ＧＭ−ＣＳＦの分泌を検査した。調製例３の方法に従って得られた、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ修飾ＮＫ細胞およびｍＧＦＰ−Ｚ修飾ＮＫ細胞（ＧＦＰを用いてａＴＴ３−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲの抗原結合ドメインを置換えた；ＣＡＲのネガティブコントロール群として使用）を、それぞれ、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によりＴＴ３で標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１（調製例９の方法に従って得られた；これにおいて腫瘍細胞は、それぞれ０．２５ＭＯＩまたは０．５０ＭＯＩの組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた腫瘍細胞の感染後２４時間に、上述のＮＫ細胞と混合された；それぞれＳＫ−ＨＥＰ−１−ｖｖＤＤ（０．２５ＭＯＩ）およびＳＫ−ＨＥＰ−１−ｖｖＤＤ（０．５ＭＯＩ）として示される）、ＴＴ３をコードするｍＲＮＡを用いたエレクトロトランスフェクションによってＴＴ３で標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１（調製例１の方法に従って得られた；ＳＫ−ＨＥＰ−１−ＥＰとして示される）、および未標識のＳＫ−ＨＥＰ−１（ＳＫ−ＨＥＰ−１として示される）と、２４ウェルプレートにおいて共培養した。上記のＣＡＲ−ＮＫエフェクター細胞と標的細胞との数の比（Ｅ：Ｔ）は、５：１である（ＣＡＲ−ＮＫエフェクター細胞の数は２．５ｘ１０４／ウェルである）。一晩の共培養の後、ＣＡＲ−ＮＫ細胞によるＧＭ−ＣＳＦ分泌を、ヒトＧＭ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ検出キット（Ｒ＆Ｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国）により検出した。各実験を２回繰返した。
【０２４９】
図１６に示されるように、ネガティブコントロール群のｍＧＦＰ−Ｚ修飾ＮＫ細胞（図ではＮＫ  ｍＧＦＰＺとして示される）と比較して、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−ＮＫ細胞（図ではＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲとして示される）は、ＴＴ３による刺激後に、より多くのＧＭ−ＣＳＦを分泌し得る。ＴＴ３をコードするｍＲＮＡを用いたエレクトロトランスフェクションによりＴＴ３標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１（図ではＳＫ−ＨＥＰ−１−ＥＰとして示される）との共培養の後、ＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲによるＧＭ−ＣＳＦ分泌は、ＮＫｍＧＦＰＺのそれよりも２．４倍であった。組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によってＴＴ３で標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１（それぞれ、ＳＫ−ＨＥＰ−１−ｖｖＤＤ（０．２５ＭＯＩ）およびＳＫ−ＨＥＰ−１−ｖｖＤＤ（０．５０ＭＯＩ））との共培養の後、ＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲによるＧＭ−ＣＳＦの分泌は、それぞれＮＫｍＧＦＰＺの約１．３２および１．６４倍であった。
【０２５０】
実施例１０：組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によって標識された腫瘍細胞と共培養された後の、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔのサイトカイン分泌
この実験では、ＥＬＩＳＡを用いて、標識ポリペプチドを標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞の、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスで感染された標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１細胞と一晩共培養された後の、ＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦの分泌を検査した。調製例３の方法に従って得られた、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ修飾Ｔ細胞およびｍＧＦＰ−Ｚ修飾Ｔ細胞（ＧＦＰを用いてａＴＴ３−ＣＤ８−４１ＢＢ−ＣＤ３ζ  ＣＡＲの抗原結合ドメインを置換えた；ＣＡＲのネガティブコントロール群として使用）を、それぞれ、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によりＴＴ３で標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１（調製例９の方法に従って得られた；これにおいて腫瘍細胞は、それぞれ０．２５ＭＯＩまたは０．５０ＭＯＩの組換え腫瘍溶解性ウイルスを用いた腫瘍細胞の感染後２４時間の、上述のＴ細胞と混合された；それぞれＳＫ−ＨＥＰ−１−ｖｖＤＤ（０．２５ＭＯＩ）およびＳＫ−ＨＥＰ−１−ｖｖＤＤ（０．５ＭＯＩ）として示される）、ＴＴ３をコード化するｍＲＮＡを用いたエレクトロトランスフェクションによってＴＴ３で標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１（調製例１の方法に従って得られた；ＳＫ−ＨＥＰ−１−ＥＰとして示される）、および未標識のＳＫ−ＨＥＰ−１（ＳＫ−ＨＥＰ−１として示される）と、２４ウェルプレートにおいて共培養した。上記のＣＡＲ−ＮＫエフェクター細胞と標的細胞との数の比（Ｅ：Ｔ）は、５：１である（ＣＡＲ−ＮＫエフェクター細胞の数は２．５ｘ１０４／ウェルである）。一晩の共培養の後、ヒトＩＦＮγ  ＥＬＩＳＡ検出キット（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国）を用いて、ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＩＦＮγの分泌を検出し、またヒトＧＭ−ＣＳＦ  ＥＬＩＳＡ検出キット（Ｒ＆Ｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ、米国）を用いて、ＣＡＲ−Ｔ細胞によるＧＭ−ＣＳＦ分泌を検出した。各実験を２回繰返した。
【０２５１】
図１７に示されるように、ネガティブコントロール群のｍＧＦＰ−Ｚ修飾Ｔ細胞（図ではＴ  ｍＧＦＰＺとして示される）と比較して、ＴＴ３を標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞（図ではＴ  ａＴＴ３  ＣＡＲとして示される）は、ＴＴ３による刺激後に、より多くのＩＦＮγおよびＧＭ−ＣＳＦを分泌し得る。ＴＴ３をコード化するｍＲＮＡを用いたエレクトロトランスフェクションによりＴＴ３標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１（図ではＳＫ−ＨＥＰ−１−ＥＰとして示される）との共培養の後の、Ｔ  ａＴＴ３  ＣＡＲのＩＦＮγの分泌は、Ｔ  ｍＧＦＰＺのそれよりも２倍であり（図１７Ａ）、かつＴ  ａＴＴ３  ＣＡＲのＧＭ−ＣＳＦ分泌は、Ｔ  ｍＧＦＰＺのそれよりも約４．４５倍であった（図１７Ｂ）。組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスを用いた感染によってＴＴ３で標識されたＳＫ−ＨＥＰ−１（それぞれ、ＳＫ−ＨＥＰ−１−ｖｖＤＤ（０．２５ＭＯＩ）およびＳＫ−ＨＥＰ−１−ｖｖＤＤ（０．５０ＭＯＩ））との共培養の後、Ｔ  ａＴＴ３  ＣＡＲのＩＦＮγの分泌は、それぞれ、Ｔ  ｍＧＦＰＺのそれよりも約１１．５倍および１４．２倍であり（図１７Ａ）、またＴ  ａＴＴ３  ＣＡＲのＧＭ−ＣＳＦの分泌は、それぞれＴ  ｍＧＦＰＺの約１０倍および１０倍であった（図１７Ｂ）。
【０２５２】
実施例１１：組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの腫瘍内注射後の腫瘍組織におけるＴＴ３の分布
実験用マウスは、非肥満性糖尿病／重症複合型免疫不全／ＩＬ−２Ｒｙｃｎｕｌｌ（ＮＣＧ）マウス（６週齢から８週齢、雌、Ｊｉａｎｇｓｕ  ｊｉｃｕｉ  Ｙａｏｋａｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄより入手）であった。各マウスに、１ｘ１０７個のヒト肝臓癌細胞系ＳＫ−ＨＥＰ−１を皮下移植した。腫瘍移植の６日後、良好な成形品質の８０から１２０ｍｍ３の範囲の腫瘍サイズをもつ１２匹のマウスを選択し、腫瘍内注射により、マウス当たり５０μｌの、５ｘ１０６ｐｆｕのｖｖＤＤ−ＴＴ３を注射した。ワクシニアウイルス注射の７、１４、２１、および２９日後に、それぞれ３匹のマウスを無作為に犠牲にし、皮下の腫瘍組織を剥き出しにした。腫瘍組織を外科用メスによって中央から切断し、固定し、パラフィン中に包埋して、厚さ５μｍの切片に調製した。全ての切片を、ヘマトキシリン（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．）で核染色用に染色し、そしてＴＴ３を、ビオチン抗Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇＩＩ抗体（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）を用いて同時に検出した。二次抗体は、ウサギ２段階検出キット（Ｂｅｉｊｉｎｇ  Ｚｈｏｎｇｓｈａｎ  Ｊｉｎｑｉａｏ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より入手）であり、かつ発色キットはＤＡＢ西洋ワサビペルオキシダーゼ発色キット（Ｓｈａｎｇｈａｉ  Ｂｅｙｏｔｉｍｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ．より入手）であった。最後に、切片のパノラミックスキャンを、Ｊｉａｎｇｆｅｎｇ自動デジタル病理切片スキャナーによって実施した。
【０２５３】
結果は、図１８に示される。図１８において、淡灰色は，ＴＴ３ネガティブな部分であり、濃灰色は、ＴＴ３ポジティブな領域であった。ｖｖＤＤ−ＴＴ３の腫瘍内注射の７、１４、２１、２９日後に、ＴＴ３の発現が腫瘍組織において検出できたこと、およびＴＴ３が腫瘍組織内に広く分布していたことが見てとれる。
【０２５４】
実施例１２：マウスにおける皮下腫瘍の増殖に対する、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスとＣＡＲ−ＮＫ細胞との組合せ投与の効果
実験用マウスは、非肥満性糖尿病／重症複合型免疫不全／ＩＬ−２Ｒｙｃｎｕｌｌ（ＮＣＧ）マウス（６週齢から８週齢、雌、Ｊｉａｎｇｓｕ  ｊｉｃｕｉ  Ｙａｏｋａｎｇ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｃｏ．，Ｌｔｄより入手）であった。各マウスに、１ｘ１０７個のヒト肝臓癌細胞系ＳＫ−ＨＥＰ−１を皮下移植した。腫瘍移植の６日後、良好な成形品質の８０から１２０ｍｍ３の範囲の腫瘍サイズをもつ３０匹のマウスを選択し、無作為に、各群に５匹のマウスで６つの群に分けた。第１の群は、「ブランクコントロール」群（ＩＬ−２／ＰＢＳ／０．９％ＮａＣｌ）であり、これにおいて、腫瘍接種の６日後に、５０μｌのＰＢＳを腫瘍内注射し（「投与後０日」として示される）、ＰＢＳ注射の１０日後（すなわち、投与後１０日）に、１００μｌの０．９％ＮａＣｌを腫瘍内注射し、そして投与後１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、および２６日にＩＬ−２を腹腔内注射した。第２の群は、「ｖｖＤＤ−ＴＴ３」群（すなわち、組換え腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの単剤群（ＩＬ−２／ｖｖＤＤ−ＴＴ３／０．９％ＮａＣｌ））であり、これにおいて、腫瘍接種の６日後に、５０μｌのｖｖＤＤ−ＴＴ３を腫瘍内注射し（「投与後０日」として示される）、ｖｖＤＤ−ＴＴ３注射の１０日後（すなわち、投与後１０日）に、１００μｌの０．９％ＮａＣｌを腫瘍内注射し、そして投与後１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、および２６日にＩＬ−２を腹腔内注射した。第３の群は、「ＮＫ  ｍＧＦＰＺ」群（すなわち、ネガティブＣＡＲ−ＮＫの単剤コントロール群（ＩＬ−２／ＰＢＳ／ＮＫ  ｍＧＦＰＺ）であり、これにおいて、腫瘍接種の６日後に、５０μｌのＰＢＳを腫瘍内注射し（「投与後０日」として示される）、ＰＢＳ注射の１０、１３、１６、１９、２３、２６日後（すなわち、投与後１０、１３、１６、１９、２３、２６日）に、１００μｌのＮＫ  ｍＧＦＰＺを腫瘍内注射し、そして投与後１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６日にＩＬ−２を腹腔内注射した。第４の群は、「ＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲ」群（すなわち、ポジティブＣＡＲ−ＮＫの単剤群（ＩＬ−２／ＰＢＳ／ＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲ）であり、これにおいて、腫瘍接種の６日後に、５０μｌのＰＢＳを腫瘍内注射し（「投与後０日」として示される）、ＰＢＳ注射の１０、１３、１６、１９、２３、および２６日後（すなわち、投与後１０、１３、１６、１９、２３、２６日）に、１００μｌのＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲを腫瘍内注射し、そして投与後１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６日にＩＬ−２を腹腔内注射した。第５の群は、「ｖｖＤＤ−ＴＴ３＋ＮＫ  ｍＧＦＰＺ」群（すなわち、組合せ投与コントロール群（ＩＬ−２／ｖｖＤＤ−ＴＴ３／ＮＫ  ｍＧＦＰＺ）であり、これにおいては、腫瘍接種の６日後に、５０μｌのｖｖＤＤ−ＴＴ３を腫瘍内注射し（「投与後０日」として示される）、ｖｖＤＤ−ＴＴ３注射の１０、１３、１６、１９、２３、および２６日後（すなわち、投与後１０、１３、１６、１９、２３、２６日）に、１００μｌのＮＫ  ｍＧＦＰＺを腫瘍内注射し、そして投与後１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６日にＩＬ��２を腹腔内注射した。第６の群は、「ｖｖＤＤ−ＴＴ３＋ＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲ」群（すなわち、本発明の組合せ投与群（ＩＬ−２／ｖｖＤＤ−ＴＴ３／ＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲ））であり、これにおいては、腫瘍接種の６日後に、５０μｌのｖｖＤＤ−ＴＴ３を腫瘍内注射し（「投与後０日」として示される）、ｖｖＤＤ−ＴＴ３注射の１０、１３、１６、１９、２３、および２６日後（すなわち、投与後１０、１３、１６、１９、２３、２６日）に、１００μｌのＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲを腫瘍内注射し、そして投与後１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６日にＩＬ−２を腹腔内注射した。ＮＫ  ｍＧＦＰＺおよびＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲは、調製例３の方法に従って調製された。ＣＡＲ−ＮＫ細胞は、マウス当たり１回当たり１ｘ１０７細胞の腫瘍内注射として投与し、ＩＬ−２は、マウス当たり１回当たり２００００ＩＵの量で腹腔内に注射し、ｖｖＤＤ−ＴＴ３の投与用量は、マウス当たり５ｘ１０６ｐｆｕであった。腫瘍の長径および短径を、グループ分けの日、第１の投与後の１週間に２回、および安楽死の前に、それぞれ、ノギスを用いて測定して記録した。腫瘍体積を計算し、腫瘍体積に基づいて腫瘍増殖曲線を描いた。腫瘍体積の計算式は、Ｖ＝（１／２）ｘ長径ｘ短径２である。相対腫瘍体積（ＲＴＶ）の計算式は、ＲＴＶ＝Ｖｔ／Ｖ０［式中、Ｖｔは、各測定によって得られた腫瘍体積であり、Ｖ０は、最初の腫瘍体積（投与前）であった］である。腫瘍相対増殖率の計算式（Ｔ／Ｃ）％は、Ｔ／Ｃ％＝（投与群の平均ＲＴＶ／ブランクコントロール群の平均ＲＴＶ）ｘ１００％であり、これにおいて、Ｔ／Ｃ％＜４０％の場合、モデル群のＲＴＶに対する実験群のＲＴＶは統計的にＰ＜０．０５であって、このことは、腫瘍増殖に対し阻害効果があることを意味する。反対に、Ｔ／Ｃ％＞４０％の場合には、腫瘍増殖に対する阻害効果はない。
【０２５５】
図１９Ａに示されるように、腫瘍移植の後、腫瘍の発育状態は、第１の群、すなわち「ブランクコントロール」群のマウスにおいては、腫瘍は継続的に増殖し；第２の群、すなわち「ｖｖＤＤ−ＴＴ３」群では、腫瘍増殖は有意に阻害され得；第３の群、すなわち「ＮＫ  ｍＧＦＰＺ」群、および第４の群、すなわち「ＮＫ  ａＴＴ３−ＣＡＲ」群では、腫瘍増殖は弱く遅延され得；第５の群、すなわち「ｖｖＤＤ−ＴＴ３＋ＮＫ  ｍＧＦＰＺ」群では、腫瘍増殖は「ｖｖＤＤ−ＴＴ３」群に比較してさらに阻害され得；第６の群、すなわち「ｖｖＤＤ−ＴＴ３＋ＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲ」群では、腫瘍増殖は第５の群に比較してさらに阻害され得、なおかつ腫瘍重量が減少され得たことを示した。図１９Ｂに示されるように、第６の群「ｖｖＤＤ−ＴＴ３＋ＮＫ  ａＴＴ３  ＣＡＲ」の相対腫瘍阻害率は、投与後２１日に４０％に達した一方、第２の群「ｖｖＤＤ−ＴＴ３」群および第５の群「ｖｖＤＤ−ＴＴ３＋ＮＫ  ｍＧＦＰＺ」群では、相対腫瘍阻害率は、投与後２８日に４０％に達した。ｖｖＤＤ−ＴＴ３と、ＴＴ３を標的とするＣＡＲにより修飾されたＮＫ細胞とは、腫瘍を特異的に処理しかつ腫瘍増殖をより迅速に阻害するべく組合わされ得ることが見てとれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５ＡＢ】
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【図５ＣＤ】
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【図５Ｅ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３ＡＢ】
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【図１３ＣＤ】
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【図１３ＥＦ】
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【図１４ＡＢ】
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【図１４ＣＤ】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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