(57)【要約】  様々な態様において、細胞、組織または臓器の輸送および／または凍結保存に使用される組成物を提供する。本発明の輸送用および／または凍結保存用の組成物は、少なくとも、ナリンゲニン、緩衝系および糖成分を含む。いくつかの実施形態において、前記細胞、組織または臓器は、ヒト毛包、ヒト毛包由来細胞または尿由来細胞である。
2021532833.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．ナリンゲニン、
ｂ．緩衝系および
ｃ．糖成分
を含む、細胞、組織または臓器の輸送用組成物。
【請求項２】
ナリンゲニンの濃度が約０．０１μＭ〜約１０μＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
ナリンゲニンの濃度が約０．０１μＭ〜約０．２５μＭである、請求項１に記載の組成物。
【請求項４】
前記緩衝系が、
ａ．約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、
ｂ．約２ｍＭ〜約２０ｍＭの重炭酸水素塩、
ｃ．約６ｍＭ〜約２５ｍＭのリン酸水素塩、または
これらの組み合わせ
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５】
前記緩衝系が、
ａ．約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、
ｂ．約３ｍＭ〜約９ｍＭの重炭酸水素塩、
ｃ．約１０ｍＭ〜約１５ｍＭのリン酸水素塩、または
これらの組み合わせ
を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６】
前記糖成分が、約２ｍＭ〜約２５ｍＭのＤ−グルコースを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７】
前記糖成分が、約９ｍＭ〜約１５ｍＭのＤ−グルコースを含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項８】
ａ．約２０ｍＭ〜約１２０ｍＭのナトリウムイオン、
ｂ．約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、
ｃ．約１０ｍＭ〜約７０ｍＭの塩化物イオン、
ｄ．約２ｍＭ〜約１２ｍＭのカリウムイオン、
ｅ．約０．１ｍＭ〜約１ｍＭのマグネシウムイオン、
ｆ．約０．２ｍＭ〜約１０ｍＭのアラニルグルタミン、
ｇ．約０．０１μＭ〜約１０μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項９】
ａ．約７０ｍＭ〜約９０ｍＭのナトリウムイオン、
ｂ．約０．０３ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、
ｃ．約４０ｍＭ〜約６０ｍＭの塩化物イオン、
ｄ．約２ｍＭ〜約５ｍＭのカリウムイオン、
ｅ．約０．４ｍＭ〜約０．７ｍＭのマグネシウムイオン、
ｆ．約１ｍＭ〜約５ｍＭのアラニルグルタミン、
ｇ．約０．０５μＭ〜約０．２５μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１〜７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１０】
ａ．約０．１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのインスリン、
ｂ．約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、
ｃ．約５ｎＭ〜約５０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１１】
ａ．約８μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬのインスリン、
ｂ．約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬのトランスフェリン、
ｃ．約２０ｎＭ〜約４０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１２】
ａ．約１０単位／ｍＬ〜約２００単位／ｍＬのペニシリン、
ｂ．約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１３】
ａ．約８０単位／ｍＬ〜約１２０単位／ｍＬのペニシリン、
ｂ．約０．０８ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１４】
前記細胞、組織または臓器が、ヒト毛包、ヒト毛包由来細胞または尿由来細胞である、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１５】
細胞、組織または臓器の輸送用組成物であって、
ａ．約０．０１μＭ〜約０．２５μＭのナリンゲニン、
ｂ．約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、
ｃ．約３ｍＭ〜約９ｍＭの重炭酸水素塩、
ｄ．約１０ｍＭ〜約１５ｍＭのリン酸水素塩、
ｅ．約９ｍＭ〜約１５ｍＭのＤ−グルコース、
ｆ．約７０ｍＭ〜約９０ｍＭのナトリウムイオン、
ｇ．約０．０３ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、
ｈ．約４０ｍＭ〜約６０ｍＭの塩化物イオン、
ｉ．約２ｍＭ〜約５ｍＭのカリウムイオン、
ｊ．約０．４ｍＭ〜約０．７ｍＭのマグネシウムイオン、
ｋ．約１ｍＭ〜約５ｍＭのアラニルグルタミン、および
ｌ．約０．０５μＭ〜約０．２５μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸
を含む、組成物。
【請求項１６】
前記細胞、組織または臓器を凍結保存する前に、該細胞、組織または臓器の輸送に使用される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
ａ．ナリンゲニン、
ｂ．緩衝系および
ｃ．糖成分
を含む、細胞、組織または臓器の凍結保存用組成物。
【請求項１８】
ナリンゲニンの濃度が約０．０１μＭ〜約１０μＭである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項１９】
ナリンゲニンの濃度が約０．０１μＭ〜約０．２５μＭである、請求項１７に記載の組成物。
【請求項２０】
前記緩衝系が、
ａ．約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、
ｂ．約２ｍＭ〜約２０ｍＭの重炭酸水素塩、
ｃ．約６ｍＭ〜約２５ｍＭのリン酸水素塩、または
これらの組み合わせ
を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２１】
前記緩衝系が、
ａ．約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、
ｂ．約３ｍＭ〜約９ｍＭの重炭酸水素塩、
ｃ．約１０ｍＭ〜約１５ｍＭのリン酸水素塩、または
これらの組み合わせ
を含む、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２２】
前記糖成分が、約２ｍＭ〜約２５ｍＭのＤ−グルコースを含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記糖成分が、約９ｍＭ〜約１５ｍＭのＤ−グルコースを含む、請求項１７〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２４】
ａ．約２０ｍＭ〜約１２０ｍＭのナトリウムイオン、
ｂ．約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、
ｃ．約１０ｍＭ〜約７０ｍＭの塩化物イオン、
ｄ．約２ｍＭ〜約１２ｍＭのカリウムイオン、
ｅ．約０．１ｍＭ〜約１ｍＭのマグネシウムイオン、
ｆ．約０．２ｍＭ〜約１０ｍＭのアラニルグルタミン、
ｇ．約０．０１μＭ〜約１０μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２５】
ａ．約７０ｍＭ〜約９０ｍＭのナトリウムイオン、
ｂ．約０．０３ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、
ｃ．約４０ｍＭ〜約６０ｍＭの塩化物イオン、
ｄ．約２ｍＭ〜約５ｍＭのカリウムイオン、
ｅ．約０．４ｍＭ〜約０．７ｍＭのマグネシウムイオン、
ｆ．約１ｍＭ〜約５ｍＭのアラニルグルタミン、
ｇ．約０．０５μＭ〜約０．２５μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１７〜２３のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２６】
ａ．約０．１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのインスリン、
ｂ．約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、
ｃ．約５ｎＭ〜約５０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１７〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２７】
ａ．約８μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬのインスリン、
ｂ．約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬのトランスフェリン、
ｃ．約２０ｎＭ〜約４０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２８】
ａ．約１０単位／ｍＬ〜約２００単位／ｍＬのペニシリン、
ｂ．約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１７〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項２９】
ａ．約８０単位／ｍＬ〜約１２０単位／ｍＬのペニシリン、
ｂ．約０．０８ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１７〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３０】
ａ．約０．００１ｇ／ｍＬ〜約０．２ｇ／ｍＬのデキストラン４０、
ｂ．約１０ｍＭ〜約６０ｍＭのショ糖、
ｃ．約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１７〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３１】
ａ．約０．０３ｇ／ｍＬ〜約０．０７ｇ／ｍＬのデキストラン４０、
ｂ．約２０ｍＭ〜４０ｍＭのショ糖、
ｃ．約２．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、または
これらの組み合わせ
をさらに含む、請求項１７〜２９のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３２】
前記細胞、組織または臓器が、ヒト毛包、ヒト毛包由来細胞または尿由来細胞である、請求項１７〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項３３】
細胞、組織または臓器の凍結保存用組成物であって、
ａ．約０．０１μＭ〜約０．２５μＭのナリンゲニン、
ｂ．約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、
ｃ．約３ｍＭ〜約９ｍＭの重炭酸水素塩、
ｄ．約１０ｍＭ〜約１５ｍＭのリン酸水素塩、
ｅ．約９ｍＭ〜約１５ｍＭのＤ−グルコース、
ｆ．約７０ｍＭ〜約９０ｍＭのナトリウムイオン、
ｇ．約０．０３ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、
ｈ．約４０ｍＭ〜約６０ｍＭの塩化物イオン、
ｉ．約２ｍＭ〜約５ｍＭのカリウムイオン、
ｊ．約０．４ｍＭ〜約０．７ｍＭのマグネシウムイオン、
ｋ．約１ｍＭ〜約５ｍＭのアラニルグルタミン、
ｌ．約０．０５μＭ〜約０．２５μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、
ｍ．約０．０３ｇ／ｍＬ〜約０．０７ｇ／ｍＬのデキストラン４０、
ｎ．約２０ｍＭ〜４０ｍＭのショ糖、および
ｏ．約５％（ｖ／ｖ）未満のジメチルスルホキシド
を含む、組成物。
【請求項３４】
前記細胞、組織または臓器を輸送した後に、該細胞、組織または臓器の凍結保存に使用される、請求項１７〜３３のいずれか１項に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
先行出願の相互参照
本出願は、2018年7月30日に出願された「細胞および／または組織の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物」という名称の米国仮特許出願第62/711,808号の優先権を主張するものであり、この出願の内容は参照によりその全体が本明細書に援用される。
【０００２】
本明細書は、概して、生きた細胞、組織および臓器の輸送用および／または凍結保存用の組成物に関する。特に、本明細書は、ヒトおよび動物の非侵襲的な部位から採取された生きた細胞、組織および臓器の輸送および／または凍結保存に使用するための、ナリンゲニン、緩衝系および糖成分を含む組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
細胞、組織および臓器の輸送または凍結保存に使用される組成物は現在数多く存在する。例えば、生きた細胞、組織および臓器の輸送および保存は、輸送中に浸透圧平衡が維持され、温度ストレスが最小限に抑えられ、アポトーシスおよび／または細胞壊死が抑制されるように処方された液体組成物中において、体温以下の温度（例えば４〜８℃）で行われる。先行技術による体温以下での細胞の保存に使用される組成物の例として、HypoThermosol（登録商標）、AQIX（登録商標）、およびビアスパン（Viaspan）（登録商標）が挙げられる。これらの組成物を含む先行技術による組成物は、様々な種類の細胞、組織および臓器用の保存培地として効果的に使用されてきたが、輸送（特に郵便による輸送）に最適化されたものではない。輸送に関する問題としては、温度の変動、極端な温度への暴露、ぶつかり合いや振動、郵便や宅配便の遅延、輸出入の遅延、税関での遅延、物流の問題（例えば遠隔地への配送）などが挙げられる。非侵襲的な部位から採取された細胞、組織および臓器（例えば、毛包、毛包由来細胞および尿由来細胞）は、このような輸送に関する問題による影響を受ける。前述の輸送に関する問題が原因となって、特に２４時間を超える輸送を行った後に、細胞の生存率が至適以下になってしまうことが度々起こる。したがって、凍結保存用、移植用および／または治療用の細胞、組織および臓器の適性が輸送によって損なわれる場合が多い。特に、先行技術による組成物は、小さな細胞や組織、特に毛包との使用を意図したものではない。さらに、特許取得済みの組成物である前述のHypothermosol（米国特許第005405742(A)号明細書、米国特許第006045990(A)号明細書）やAQIX（欧州特許第2175718(B1)号明細書）は、静脈内注入や血管外注入などにおいて、血液量の減少および再潅流障害を最小限に抑えるための体温以下の代用血液として使用することを意図したものである。
【０００４】
凍結保存を目的として細胞、組織および臓器を輸送する場合がある。凍結保存は、将来的な使用のために維持することを目的として、例えば液体窒素により−１９６℃もの極めて低温に暴露させることによって、細胞、組織および臓器を生物学的に不活性な状態で保存することを指す。先行技術では、細胞を凍結から保護する液体組成物を用いて、細胞、組織および臓器を前述のような低温で保存する。先行技術において、このような凍結保存用組成物には様々な種類のものが存在し、細胞内の生物学的構成物が氷晶による損傷を受けないように凍結保護剤を含むものが多い。さらに、先行技術による凍結保存溶液は、生体材料の解凍からの回復を補助するアポトーシスレギュレーターなどの成分も含有している。先行技術における凍結保存溶液の例として、CryoStor（登録商標）、セルバンカー（登録商標）、Synth-a-Freeze（登録商標）およびmFreSR（登録商標）が挙げられる。
【０００５】
CryoStor、セルバンカー、Synth-a-FreezeおよびmFreSRによって、生存を維持しながらの細胞、組織および臓器の凍結保存が可能になったが、現在入手可能な組成物は、非侵襲的な部位から採取された細胞、組織および臓器（例えば、毛包、毛包由来細胞、尿由来細胞など）の凍結保存には最適化されていない。特に、凍結保存する前に、２４時間を超える郵便で細胞、組織および臓器を輸送した場合、現在入手可能な組成物による解凍後の生存率は至適以下となる。
【０００６】
前述の事項に加えて、細胞、組織および臓器の輸送および凍結保存に使用される先行技術による組成物は、化学的組成の不明な血清成分および／または動物由来成分を重要な栄養源（脂質、ビタミン、ホルモン、微量元素など）として含むことが多い。化学的組成の不明な血清成分および／または動物由来成分をこのような組成物に使用すると、病原体による汚染やバッチ間の変動などのリスクが生じることが報告されている。さらに、このような組成物中に入れた細胞、組織および臓器をヒトに使用する場合、免疫反応や拒絶反応が起こる可能性があり、細胞、組織および臓器を治療に使用できなくなったり、ヒトレシピエントに損傷を与える恐れがある。輸送用組成物および凍結保存用組成物に含まれる化学的組成の不明な血清成分および／または動物由来成分の量を低減することは、細胞、組織および臓器の治療への適用性および臨床的適用性の維持に重要である。
【０００７】
さらに、先行技術では、輸送用組成物および凍結保存用組成物は、一般に、１０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド（「DMSO」）を凍結保護剤として含んでいる。DMSOは効果的な凍結保護剤であるが、このような濃度のDMSOは、細胞、組織および臓器に対して有毒であることも知られている。輸送用組成物および凍結保存用組成物におけるDMSOの使用量を低減させると、毒性が低減され、細胞、組織および臓器への損傷を防げる可能性がある。さらに、これらの組成物中のDMSO含量を低下させると、移植および／または治療用途に対する細胞、組織および臓器の適性が損なわれることを防ぐことができると考えられる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
様々な態様において、実施形態は、ナリンゲニン、緩衝系および糖成分を含む、細胞、組織または臓器の輸送用組成物に関する。いくつかの実施形態において、前記細胞、組織または臓器は、ヒト毛包、ヒト毛包由来細胞または尿由来細胞である。
【０００９】
いくつかの実施形態によれば、前記輸送用組成物中のナリンゲニンの濃度は、約０．０１μＭ〜約１０μＭである。別の実施形態によれば、前記輸送用組成物中のナリンゲニンの濃度は、約０．０１μＭ〜約０．２５μＭである。
【００１０】
いくつかの実施形態によれば、前記輸送用組成物の緩衝系は、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの重炭酸水素塩、約６ｍＭ〜約２５ｍＭのリン酸水素塩、またはこれらの組み合わせを含む。別の実施形態によれば、前記輸送用組成物の緩衝系は、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、約３ｍＭ〜約９ｍＭの重炭酸水素塩、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭのリン酸水素塩、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態によれば、前記輸送用組成物の糖成分は、約２ｍＭ〜約２５ｍＭのＤ−グルコースを含む。別の実施形態によれば、前記輸送用組成物の糖成分は、約９ｍＭ〜約１５ｍＭのＤ−グルコースを含む。
【００１２】
いくつかの実施形態によれば、前記輸送用組成物は、約２０ｍＭ〜約１２０ｍＭのナトリウムイオン、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、約１０ｍＭ〜約７０ｍＭの塩化物イオン、約２ｍＭ〜約１２ｍＭのカリウムイオン、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭのマグネシウムイオン、約０．２ｍＭ〜約１０ｍＭのアラニルグルタミン、約０．０１μＭ〜約１０μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、またはこれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記輸送用組成物は、約７０ｍＭ〜約９０ｍＭのナトリウムイオン、約０．０３ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭの塩化物イオン、約２ｍＭ〜約５ｍＭのカリウムイオン、約０．４ｍＭ〜約０．７ｍＭのマグネシウムイオン、約１ｍＭ〜約５ｍＭのアラニルグルタミン、約０．０５μＭ〜約０．２５μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態によれば、前記輸送用組成物は、約０．１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのインスリン、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、約５ｎＭ〜約５０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記輸送用組成物は、約８μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬのインスリン、約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬのトランスフェリン、約２０ｎＭ〜約４０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１４】
いくつかの実施形態によれば、前記輸送用組成物は、約１０単位／ｍＬ〜約２００単位／ｍＬのペニシリン、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、またはこれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記輸送用組成物は、約８０単位／ｍＬ〜約１２０単位／ｍＬのペニシリン、約０．０８ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、またはこれらの組み合わせを含む。
【００１５】
一態様において、前記輸送用組成物は、約０．０１μＭ〜約０．２５μＭのナリンゲニン、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、約３ｍＭ〜約９ｍＭの重炭酸水素塩、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭのリン酸水素塩、約９ｍＭ〜約１５ｍＭのＤ−グルコース、約７０ｍＭ〜約９０ｍＭのナトリウムイオン、約０．０３ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭの塩化物イオン、約２ｍＭ〜約５ｍＭのカリウムイオン、約０．４ｍＭ〜約０．７ｍＭのマグネシウムイオン、約１ｍＭ〜約５ｍＭのアラニルグルタミン、および約０．０５μＭ〜約０．２５μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸を含む。
【００１６】
いくつかの実施形態において、前記輸送用組成物は、細胞、組織または臓器を凍結保存する前に、該細胞、組織および臓器の輸送に使用してもよい。
【００１７】
様々な態様において、実施形態は、ナリンゲニン、緩衝系および糖成分を含む、細胞、組織または臓器の凍結保存用組成物に関する。いくつかの実施形態において、前記細胞、組織または臓器は、ヒト毛包、ヒト毛包由来細胞または尿由来細胞である。
【００１８】
いくつかの実施形態によれば、前記凍結保存用組成物中のナリンゲニンの濃度は、約０．０１μＭ〜約１０μＭである。別の実施形態によれば、前記凍結保存用組成物中のナリンゲニンの濃度は、約０．０１μＭ〜約０．２５μＭである。
【００１９】
いくつかの実施形態によれば、前記凍結保存用組成物の緩衝系は、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの重炭酸水素塩、約６ｍＭ〜約２５ｍＭのリン酸水素塩、またはこれらの組み合わせを含む。別の実施形態によれば、前記凍結保存用組成物の緩衝系は、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、約３ｍＭ〜約９ｍＭの重炭酸水素塩、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭのリン酸水素塩、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２０】
いくつかの実施形態によれば、前記凍結保存用組成物の糖成分は、約２ｍＭ〜約２５ｍＭのＤ−グルコースを含む。別の実施形態によれば、前記凍結保存用組成物の糖成分は、約９ｍＭ〜約１５ｍＭのＤ−グルコースを含む。
【００２１】
いくつかの実施形態によれば、前記凍結保存用組成物は、約２０ｍＭ〜約１２０ｍＭのナトリウムイオン、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、約１０ｍＭ〜約７０ｍＭの塩化物イオン、約２ｍＭ〜約１２ｍＭのカリウムイオン、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭのマグネシウムイオン、約０．２ｍＭ〜約１０ｍＭのアラニルグルタミン、約０．０１μＭ〜約１０μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、またはこれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記凍結保存用組成物は、約７０ｍＭ〜約９０ｍＭのナトリウムイオン、約０．０３ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭの塩化物イオン、約２ｍＭ〜約５ｍＭのカリウムイオン、約０．４ｍＭ〜約０．７ｍＭのマグネシウムイオン、約１ｍＭ〜約５ｍＭのアラニルグルタミン、約０．０５μＭ〜約０．２５μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２２】
いくつかの実施形態によれば、前記凍結保存用組成物は、約０．１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのインスリン、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬのトランスフェリン、約５ｎＭ〜約５０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記凍結保存用組成物は、約８μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬのインスリン、約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬのトランスフェリン、約２０ｎＭ〜約４０ｎＭの亜セレン酸ナトリウム、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２３】
いくつかの実施形態によれば、前記凍結保存用組成物は、約１０単位／ｍＬ〜約２００単位／ｍＬのペニシリン、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、またはこれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記凍結保存用組成物は、約８０単位／ｍＬ〜約１２０単位／ｍＬのペニシリン、約０．０８ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態によれば、前記凍結保存用組成物は、約０．００１ｇ／ｍＬ〜約０．２ｇ／ｍＬのデキストラン４０、約１０ｍＭ〜約６０ｍＭのショ糖、約０．１％（ｖ／ｖ）〜約２０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、またはこれらの組み合わせをさらに含む。いくつかの実施形態によれば、前記凍結保存用組成物は、約０．０３ｇ／ｍＬ〜約０．０７ｇ／ｍＬのデキストラン４０、約２０ｍＭ〜４０ｍＭのショ糖、約２．５％（ｖ／ｖ）〜約１０％（ｖ／ｖ）のジメチルスルホキシド、またはこれらの組み合わせを含む。
【００２５】
一態様において、前記凍結保存用組成物は、約０．０１μＭ〜約０．２５μＭのナリンゲニン、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭの合成生物学的緩衝液、約３ｍＭ〜約９ｍＭの重炭酸水素塩、約１０ｍＭ〜約１５ｍＭのリン酸水素塩、約９ｍＭ〜約１５ｍＭのＤ−グルコース、約７０ｍＭ〜約９０ｍＭのナトリウムイオン、約０．０３ｍＭ〜約１ｍＭのカルシウムイオン、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭの塩化物イオン、約２ｍＭ〜約５ｍＭのカリウムイオン、約０．４ｍＭ〜約０．７ｍＭのマグネシウムイオン、約１ｍＭ〜約５ｍＭのアラニルグルタミン、約０．０５μＭ〜約０．２５μＭの（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸、約０．０３ｇ／ｍＬ〜約０．０７ｇ／ｍＬのデキストラン４０、約２０ｍＭ〜４０ｍＭのショ糖、および約５％（ｖ／ｖ）未満のジメチルスルホキシドを含む。
【００２６】
いくつかの実施形態において、前記凍結保存用組成物は、細胞、組織または臓器を輸送した後に、該細胞、組織および臓器の凍結保存に使用してもよい。
【００２７】
本明細書に記載の様々な実施形態の理解を深め、それらがどのように実施されうるのかをより明確に示すため、一例として以下の添付図面を参照する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】非限定的な実施形態による、細胞、組織および臓器の輸送および凍結保存に使用してもよい経路の一例を示すフローチャートである。
【００２９】
【図２】様々な輸送用組成物中で２日間にわたり輸送した後の、ヒトから引き抜いた毛包の生存率を示すグラフである。
【００３０】
【図３】様々な輸送用組成物において、新鮮な対照の生存率と比較した場合の、ヒトから引き抜いた毛包の相対生存率の経時変化を示したグラフである。
【００３１】
【図４】様々な凍結保存用組成物中で５日間にわたり凍結保存した後の、ヒトから引き抜いた毛包の生存率を示すグラフである。
【００３２】
【図５】様々な組成物中で２日間にわたり輸送後、５日間凍結保存した後の、ヒトから引き抜いた毛包の生存率を新鮮な対照に対する相対値として示したグラフである。
【００３３】
【図６】化学的組成の明らかな無血清条件において新鮮な毛包から増殖させたケラチノサイトの一例を示す写真である。
【発明を実施するための形態】
【００３４】
以下の説明および本明細書に記載の実施形態は、本発明の原理および態様の特定の実施形態の一例または複数の例を説明する目的で提供する。これらの例示は、本発明およびその原理を説明することを目的として提供され、本発明およびその原理を限定するものではない。別段の記載がない限り、本明細書において使用されるあらゆる用語および語句は、通常とは異なる意味が明確に示されていたり、これらの用語または語句が使用されている文脈から通常とは異なる意味が明らかでない限り、当技術分野において使用されている意味を含む。
【００３５】
本明細書において、通常、当業者であれば、「含む」という用語が、請求項に記載の特徴、構成要素または群の存在を意味し、１種以上の別の特徴、構成要素または群の存在や付加を除外するものではないと理解できるであろう。
【００３６】
本明細書において、通常、当業者であれば、「輸送」という用語が、非制御下の化学的動態による損傷を受けやすい細胞小器官、細胞、組織、細胞外マトリックス、臓器またはその他の生物学的構成物などの物品のある場所から別の場所への移動を意味することを理解できるであろう。また、本明細書において「輸送」は、非制御下の化学的動態による損傷を受けやすい細胞小器官、細胞、組織、細胞外マトリックス、臓器またはその他の生物学的構成物などの物品の短期間の保存を含む場合もある。輸送は、郵便による輸送も含むことがある。輸送中に様々な問題が発生する可能性があり、例えば、温度の変動、極端な温度への暴露、ぶつかり合いや振動、郵便や宅配便の遅延、輸出入の遅延、税関での遅延、および物流の問題（例えば遠隔地への配送）などが含まれる。いくつかの実施形態によれば、細胞、組織および臓器の輸送に使用してもよい組成物が提供される。本明細書において「輸送用組成物」は、このような組成物を指すために使用されるが、必ずしもこのような組成物に限定されない。
【００３７】
本明細書において、通常、当業者であれば、「凍結保存」という用語が、非制御下の化学的動態による損傷を受けやすい細胞小器官、細胞、組織、細胞外マトリックス、臓器またはその他の生きた生物学的構成物を、超低温での冷却（通常、固体二酸化炭素を用いた−８０℃での冷却、または液体窒素を用いた−１９６℃での冷却）により保存する方法を意味することを理解できるであろう。いくつかの実施形態によれば、細胞、組織および臓器の凍結保存に使用してもよい組成物が提供される。本明細書において「凍結保存用組成物」は、このような組成物を指すために使用されるが、必ずしもこのような組成物に限定されない。
【００３８】
本明細書において「細胞、組織および臓器」とは、細胞小器官、細胞、組織、細胞外マトリックス、臓器またはその他の生きた生物学的構成物を指してもよい。いくつかの実施形態によれば、細胞、組織および臓器は、ヒトの細胞、組織および臓器であってもよい。別の実施形態によれば、細胞、組織および臓器は、非ヒトの細胞、組織および臓器であってもよい。非ヒトの細胞、組織および臓器は、哺乳類の細胞、組織および臓器を含んでいてもよく、特にげっ歯類由来の細胞、組織および臓器であってもよい。いくつかの実施形態によれば、細胞、組織および臓器は、非侵襲的な部位から採取され、ヒトから引き抜かれた毛包、毛包由来細胞（ケラチノサイトなど）、尿由来細胞および口腔粘膜細胞を含んでいてもよい。いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物に入れて輸送および／または凍結保存された細胞、組織および臓器を、研究に使用してもよく、かつ／または臨床用途および治療用途に使用してもよい。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物を使用することによって、回収率が良好となり、例えば、研究用途での将来的な使用、または細胞ベースの治療法の出発材料としての将来的な使用に備えて、正常な細胞集団を得ることができる。
【００３９】
本明細書において、通常、当業者であれば、「有効量」という用語が、細胞、組織もしくは臓器の生存率を維持するのに十分な量、または細胞、組織もしくは臓器の生存率の低下を抑制するのに十分な量であると理解できるであろう。本発明の実施形態の場合、有効量は、輸送および／または凍結保存された細胞、組織または臓器の生存率を維持するのに十分な量、または輸送および／または凍結保存された細胞、組織または臓器の生存率の低下を抑制するのに十分な量を含みうるが、これらに限定されない。
【００４０】
本発明は、ナリンゲニンが、輸送用組成物および／または凍結保存用組成物中の細胞、組織または臓器の生存率の維持または生存率の低下の抑制に寄与するという発見に関する。ナリンゲニンとは、主に柑橘類に見出されるフラバノン類である。ナリンゲニンは抗酸化活性を示すことから、フリーラジカルによる損傷から細胞、組織および臓器を保護することができることを当業者であれば理解できるであろう。さらに、ナリンゲニンは、細胞、組織および臓器の輸送および／または凍結保存に好適な別の特性も有すると考えられる。例えば、ナリンゲニンは、抗真菌性、抗細菌性および抗ウイルス性を示すことが報告されており（例えば、参考文献［４］および［５］を参照されたい）、これらの特性は、望ましくない外部汚染を防ぎ、輸送用組成物および／または凍結保存用組成物に必要とされる抗生物質の量を低減するのに有用である。低濃度のナリンゲニンが組成物中に含まれていると、ケラチノサイトの増殖を誘導することができ（例えば、参考文献［６］を参照されたい）、輸送および凍結保存からの速やかな回復が可能になることを当業者であれば理解できるであろう。さらに、ナリンゲニンは、熱ショックタンパク質の誘導物質であることも報告されており（例えば、参考文献［７］を参照されたい）、輸送中および凍結保存中の突然の温度変化（高温または低温）からの保護効果を発揮する可能性がある。ナリンゲニンは、医薬用途に有望であることが臨床試験で示されている（例えば、参考文献［２１］を参照されたい）。
【００４１】
本発明のいくつかの実施形態に従って、ナリンゲニン、緩衝系および糖成分を含む組成物を提供する。この組成物は、細胞、組織および臓器の輸送および／または凍結保存に使用してもよい。本発明の組成物は、細胞環境を模倣し、細胞、組織および臓器を損傷から保護し、輸送後および／または凍結保存後の細胞、組織および臓器の生存率、回復および／または有用性が改善するように処方されていることが好ましい。本発明のいくつかの実施形態において、様々な化合物からなる本発明の組成物は、ケラチノサイト細胞の生存率が最適化される濃度で提供される。本明細書において開示された輸送用組成物および／または凍結保存用組成物に含まれる各成分は、いずれも医薬品グレードであり、かつ／または動物由来成分を含まないことが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよい。
【００４２】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、ナリンゲニンを約０．０１μＭ〜約１０μＭの濃度で含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、ナリンゲニンを約０．０１μＭ〜約０．２５μＭの濃度で含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、少なくとも１種の別のフラボノイドをナリンゲニンと組み合わせて含んでいてもよい。
【００４３】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は緩衝系を含む。いくつかの実施形態によれば、緩衝系を使用することによって、ＣＯ２インキュベーターの外の体温以下の条件でも、本発明の組成物を生理学的に適切な約７．４のｐＨに維持することが可能となる。一態様において、前記緩衝系は、HEPESやBESなどの合成生物学的緩衝液を含んでいてもよい。HEPESと類似したｐＨを有する好適な合成生物学的緩衝液であれば、どのようなものを使用してもよい。合成生物学的緩衝液の濃度は、約１５ｍＭ〜約４５ｍＭであってもよい。
【００４４】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物の緩衝系は、前記合成生物学的緩衝液の代わりに約２ｍＭ〜約２０ｍＭの重炭酸水素塩を含んでいてもよく、前記合成生物学的緩衝液に加えて、約２ｍＭ〜約２０ｍＭの重炭酸水素塩をさらに含んでいてもよい。重炭酸水素塩の濃度は約３ｍＭ〜約９ｍＭであることが好ましい。
【００４５】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物の緩衝系は、前記緩衝液の代わりに約６ｍＭ〜約２５ｍＭのリン酸水素塩を含んでいてもよく、前記緩衝液に加えて、約６ｍＭ〜約２５ｍＭのリン酸水素塩をさらに含んでいてもよい。リン酸水素塩の濃度は約１０ｍＭ〜約１５ｍＭであることが好ましい。
【００４６】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は糖成分を含む。好適な糖であれば、どのような種類のものを使用してもよい。好適な糖成分として、グルコース、マンニトールおよびショ糖が挙げられるが、これらに限定されないことを当業者であれば理解できるであろう。いくつかの実施形態によれば、糖成分はグルコースであり、Ｄ−グルコースであることが好ましい。当業者であれば、グルコースがエネルギー源として機能することを理解できるであろう。グルコースは、ATPおよびその他のエネルギー貯蔵性ヌクレオチド三リン酸の生成を補助し、NADPおよびNADの高エネルギー水素の生成も補助する。さらに、細胞における適切なエネルギー代謝は、解糖経路、ペントースリン酸経路、クエン酸回路などの、グルコースが関与する複数の経路に依存することがある。いくつかの実施形態によれば、グルコースの濃度は約２ｍＭ〜約２５ｍＭであり、約９ｍＭ〜約１５ｍＭであることがより好ましい。
【００４７】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、ATPの材料となるアデノシンをさらに含んでいてもよい。
【００４８】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、細胞環境、組織環境および臓器環境に存在する正常な細胞外液中の濃度に基づいたイオン濃度のナトリウム、カルシウム、カリウム、塩化物、マグネシウムまたはこれらの組み合わせを含み、好ましくは、クレブス−リンガー平衡塩類溶液に類似するものであってもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。別の実施形態によれば、本発明の組成物は、正常な細胞外環境よりも少ない量のナトリウム、塩化物、カルシウムまたはこれらの組み合わせを含む。当業者であれば、塩類が、細胞、組織および臓器に対して生理学的に適切な浸透圧平衡を維持する役割を果たしうることを理解できるであろう。また、各種のイオンおよびカチオンは、細胞膜における溶質ポンプ活性を介して、必要とされる生化学的機能をシグナル伝達経路に対して果たしうる。例えば、ケラチノサイトは、カルシウムに感受性を示す場合があり、１ｍＭを超えるカルシウム濃度で終末角化および／または細胞死が誘導される。
【００４９】
本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物の実施形態のいくつかにおいて、ナトリウムイオンの濃度は、約２０ｍＭ〜約１２０ｍＭである。ナトリウムイオンの濃度は、約７０ｍＭ〜約９０ｍＭであることがより好ましい。
【００５０】
本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物の実施形態のいくつかにおいて、カルシウムイオンの濃度は、約０．０１ｍＭ〜約１ｍＭである。カルシウムイオンの濃度は、約０．０３ｍＭ〜約１ｍＭであることがより好ましい。好ましい一実施形態では、本発明の組成物は、ケラチノサイトの終末角化を抑制または予防するために、約０．０６ｍＭのカルシウムを含む。当業者であれば、ケラチノサイトの角化がカルシウムにより制御されることを理解できるであろう。約１ｍＭ以上の濃度のカルシウムが、ケラチノサイトの重層化および終末角化を誘導することが過去に報告されている。さらに、特に、引き抜いた毛包からケラチノサイトを増殖させる際の増殖性細胞源として、終末角化したケラチノサイトは有効性が低いことが報告されており、場合によっては使用できないことも報告されている（例えば、参考文献［１］を参照されたい）。
【００５１】
本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物の実施形態のいくつかにおいて、塩化物イオンの濃度は、約１０ｍＭ〜約７０ｍＭである。塩化物イオンの濃度は、約４０ｍＭ〜約６０ｍＭであることがより好ましい。
【００５２】
本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物の実施形態のいくつかにおいて、カリウムイオンの濃度は、約２ｍＭ〜約１２ｍＭである。カリウムイオンの濃度は、約２ｍＭ〜約５ｍＭであることがより好ましい。
【００５３】
本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物の実施形態のいくつかにおいて、マグネシウムイオンの濃度は、約０．１ｍＭ〜約１ｍＭである。マグネシウムイオンの濃度は、約０．４ｍＭ〜約０．７ｍＭであることがより好ましい。どのような組み合わせの塩類でも使用可能であることが好ましい（例えばＫＣｌとＮａＣｌの組み合わせが挙げられる）。最終的なイオン濃度は同じであることが好ましい。
【００５４】
当業者であれば、グルタミンが窒素源として細胞の増殖に重要であることを理解できるであろう。グルタミンは、代謝経路の様々な制御因子およびエネルギー担体（NAD、NADH、プリンヌクレオチドなど）の合成にも重要である（例えば、参考文献［２］を参照されたい）。グルコース濃度が低い場合、グルタミンがエネルギー源として使用されることがある（例えば、参考文献［２］を参照されたい）。一方で、グルタミンは長期保存に対して不安定であることが報告されている。グルタミンは、時間の経過とともに非酵素的にアンモニアとピログルタミン酸に容易に分解され、細胞、組織および臓器に対して有毒な環境を形成する場合がある。いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、Ｌ−グルタミンとＬ−アラニンを含む安定型グルタミンであるアラニルグルタミンを含み、このアラニルグルタミンにより、細胞、組織および臓器の長期保存が容易となる。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物中のアラニルグルタミンの濃度は、約０．２ｍＭ〜約１０ｍＭであり、約１ｍＭ〜約５ｍＭであることがより好ましい。
【００５５】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、抗酸化剤である（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸（ビタミンＥ類似体）（例えばトロロックス（登録商標））をさらに含む。当業者であれば、（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸が、ケラチノサイトを使用する場合に特に重要であり、紫外線Ｂにより誘導されたＨ２Ｏ２による細胞死を低減し、生存率が向上することを理解できるであろう（例えば、参考文献［３］を参照されたい）。（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸を使用することによって、輸送過程および／または凍結保存過程において（例えば解凍中に）生じる酸化ストレスが低減されうる。いくつかの実施形態によれば、（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の濃度は、約０．０１μＭ〜約１０μＭであり、濃度は約０．０５μＭ〜約０．２５μＭであることがより好ましい。
【００５６】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸の代わりにビタミンＥを含んでいてもよい。
【００５７】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、血清も動物由来成分も含有していない。当業者であれば、血清およびその他の動物由来成分が、様々な増殖培地ならびに輸送用組成物および凍結保存用組成物において、アミノ酸、脂質、ホルモン、ビタミンおよび微量元素の供給源として従来から使用されていることを理解しているだろう。しかし、血清およびその他の動物由来成分の使用は、病原体による汚染やバッチ間の不整合などのリスクを伴いうる。さらに、血清およびその他の動物由来成分中の外来化合物は、ヒトでの臨床や治療において有害な免疫反応を起こしうることが報告されている。
【００５８】
近年、化学的組成の明らかな無血清代替物の開発が進んでいる。細胞、組織および臓器に対して有用であることが確認されている３種の血清中化合物として、インスリン、トランスフェリンおよびセレン（亜セレン酸ナトリウムの形態）がある。当業者であれば、インスリンが、グルコースとアミノ酸の取り込みと利用を制御しており、トランスフェリンが、細胞のホメオスタシスの維持に重要なイオン担体であり、亜セレン酸ナトリウムが、ケラチノサイトの適切な維持のための微量元素として好ましいことを理解できるであろう。セレンはセレンタンパク質の構成成分であり、適切な細胞の健康状態を保つため、数多くの酵素および構成成分が微量のセレンを必要とすると考えられる。また、ケラチノサイトでは、セレンは適切な細胞の機能および健康状態に必要とされることがあり、紫外線Ｂの照射によるアポトーシスを予防し、ケラチノサイトの増殖を促進し、幹細胞性を保持させ、細胞老化を予防し、老化におけるホメオスタシスを維持して複製寿命を延長しうることが報告されている（例えば、参考文献［８］を参照されたい）。いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、インスリン、トランスフェリン、セレン（亜セレン酸ナトリウムの形態）、またはこれらの組み合わせをさらに含んでいてもよい。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、約０．１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは約８μｇ／ｍＬ〜約１２μｇ／ｍＬの濃度のインスリンを含んでいてもよい。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、約１μｇ／ｍＬ〜約２０μｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬの濃度のトランスフェリンを含んでいてもよい。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、約５ｎＭ〜約５０ｎＭの濃度、より好ましくは約２０ｎＭ〜約４０ｎＭの濃度の亜セレン酸ナトリウムを含んでいてもよい。
【００５９】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、アポトーシスによる細胞死を最小限に抑えるため、カスパーゼ阻害剤をさらに含んでいてもよい。
【００６０】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物は、本発明の組成物における細菌汚染を最小限に抑えるため、少なくとも１種の抗生物質をさらに含んでいてもよい。細菌汚染を最小限に抑えるのに好適な抗生物質またはその組み合わせであれば、どのようなものを使用してもよい。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、ペニシリン、ストレプトマイシンまたはこれらの組み合わせを含む。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、約１０単位／ｍＬ〜約２００単位／ｍＬの濃度、より好ましくは約８０単位／ｍＬ〜約１２０単位／ｍＬの濃度でペニシリン抗生物質を含んでいてもよい。別の実施形態またはさらなる実施形態によれば、本発明の組成物は、約０．０１ｍｇ／ｍＬ〜約１ｍｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは約０．０８ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬの濃度でストレプトマイシン抗生物質を含んでいてもよい。
【００６１】
いくつかの実施形態によれば、本発明の凍結保存用組成物は、少なくとも１種の凍結保護剤をさらに含む。凍結保護剤により細胞の凍結挙動を調節して、凍結保存の過程において発生しうる細胞、組織および臓器への損傷を防ぐことができることを当業者であれば理解できるであろう。凍結保存の過程において、細胞内または細胞外で氷晶が形成されることにより、細胞が冷却による損傷を受けるリスクある。例えば、細胞を過度に急速に凍結すると、細胞内に残留する水分が多くなり、その水分が凝集してできた大きな氷晶により細胞が物理的な損傷を受けることがある。徐冷した場合、細胞は速やかに水分を失うことから、細胞の内部での凍結を防ぐことができると考えられるが、細胞の体積が極端に収縮する場合がある。凍結保存の過程において、細胞内で問題が生じることもある。徐冷した場合の細胞の収縮は、核膜を変形させ、クロマチンの周囲にＤＮＡが密に詰め込まれていると、ＤＮＡの破壊が起こりうることが報告されている（例えば、参考文献［９］を参照されたい）。また、細胞の大きさが小さくなることで高分子が密集すると、ＤＮＡ修復機構が抑制され、遺伝子の損傷が起こることも報告されている（例えば、参考文献［９］を参照されたい）。さらに、徐冷中に急速に水分が失われることによって、細胞が高浸透圧ストレスにさらされる可能性もある。凍結保護剤は、水分の移動速度と氷晶の成長速度に影響を与えることがあり、これらを変化させることによって、細胞内、組織内または臓器内のタンパク質を安定化させて、細胞、組織または臓器を氷晶の形成から保護することが報告されている（例えば、参考文献［１０］を参照されたい）。
【００６２】
細胞、組織および臓器の適切な凍結保存には、効果的な凍結保護剤の選択が必須であると考えられる。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、デキストラン４０、ショ糖およびDMSOから選択される少なくとも１種の凍結保護剤を含んでいてもよい。デキストラン４０は、グルコース単位からなる多糖類であり、その平均分子量は約４０，０００であり、血漿増量剤中に含まれる重要な化合物として一般に使用されていることを当業者であれば熟知しているであろう。別の用途では、デキストラン４０は、安全かつ／または効果的な凍結保護剤として作用し、氷晶の形成を抑制することができる。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、約０．００１ｇ／ｍＬ〜約０．２ｇ／ｍＬの濃度、より好ましくは約０．０３ｇ／ｍＬ〜約０．０７ｇ／ｍＬの濃度のデキストラン４０を凍結保護剤として含んでいてもよい。ショ糖を非透過型凍結保護剤として使用してもよい。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、約１０ｍＭ〜約６０ｍＭの濃度、より好ましくは約２０ｍＭ〜約４０ｍＭのショ糖を凍結保護剤として含んでいてもよい。
【００６３】
いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、凍結保護剤としてDMSOを含んでいてもよい。DMSOは、凍結保護剤として一般に使用されており、広範囲の様々な種類の細胞、組織および臓器に効果的であることが長年にわたって示されてきたことを当業者であれば熟知しているであろう。DMSOは細胞膜を容易に透過して細胞を保護することが報告されているようであるが、このような細胞への進入は、細胞の水分量を変化させ、細胞に損傷を与えることがある。また、DMSOは、室温で細胞に対して有毒であることが報告されており、動物およびヒトに有害な反応を起こす可能性があるため、臨床用途または治療用途で使用する前に、細胞、組織および臓器からDMSOをできる限り除去すべきである（例えば、参考文献［１１］を参照されたい）。先行技術では、DMSOは通常１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度で使用される。DMSOは、細胞に損傷を与えることがあることが報告されていることから、輸送用組成物および／または凍結保存用組成物中のDMSOの使用量を低減することが望ましいと考えられる。いくつかの実施形態によれば、本発明の組成物は、約０．１％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）〜約２０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度、より好ましくは約２．５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）〜約１０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の濃度のDMSOを含む。好ましい一実施形態によれば、DMSOの濃度は約５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）である。
【００６４】
いくつかの実施形態によれば、本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物の最終的なモル浸透圧濃度は約１９０ｍＯｓｍ／ｋｇ〜約３８０ｍＯｓｍ／ｋｇであり、ｐＨは約６．９〜７．５である。
【００６５】
いくつかの実施形態によれば、まず、細胞、組織または臓器の保存に凍結保存用組成物を使用し、次に、同じ細胞、組織または臓器の輸送および／または保存に輸送用組成物を使用する。別の実施形態によれば、まず、細胞、組織または臓器の短期間の輸送および／または保存に輸送用組成物を使用し、次に、同じ細胞、組織または臓器の長期保存に凍結保存用組成物を使用する。図１を参照すると、本発明の輸送用組成物および凍結保存用組成物の様々な非限定的な実施形態において使用してもよい輸送経路および凍結保存経路の一例が示されている。本発明のいくつかの実施形態によれば、目的の細胞、組織および臓器を輸送用組成物に入れ、実験、分析、治療および／または凍結保存を目的として、第１の場所から第２の場所（例えば実験室や診療所など）へと、これらの細胞、組織および臓器を生きたまま輸送してもよい。いくつかの実施形態において、次に、これらの細胞、組織および臓器を凍結保存用組成物に入れて、凍結保存過程に付す。好ましい一実施形態によれば、将来的な実験、分析および／または治療に必要とされるまで、生存率を有意に低下させることなく、細胞、組織および臓器を任意の期間にわたって凍結保存してもよい。この例は説明を目的としたものであり、本発明の使用を何ら限定するものではない。
【００６６】
本発明のいくつかの実施形態によれば、輸送用組成物は、約２５℃で所定期間（例えば２日間）にわたる輸送後の生存率が約５０％を超えて維持されるように、より好ましくは、約４℃で所定期間（例えば２日間）にわたる輸送後の生存率が約８０％に維持されるように処方される。この輸送用組成物は、現在入手可能なその他の組成物（例えばHypoThermosolなど）よりも効果が高いことが好ましいが、必ずしもそうでなくてもよい。図２を参照すると、ヒトから引き抜いた毛包を様々な輸送用組成物中で２日間輸送した後の生存率が示されている。第１の工程として、ヒトから引き抜いた毛包を３種の輸送用培地に入れた。使用した輸送用培地は、１）本発明による輸送用培地、２）比較例としての輸送用培地HypoThermosol、および３）対照としての、マグネシウムもカルシウムも含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（「DPBS」）であった。第２の工程として、温度を約２５℃または約４℃に維持しながら、毛包を約２日間にわたり模擬輸送した。２日後に、新鮮な対照に対する毛包の生存率をAlamarBlueアッセイにより測定した。一元配置分散分析およびTukeyの事後検定により、本発明の輸送用組成物を、比較例としてのHypoThermosolおよびDPBS対照と比較したところ、p<0.05の統計学的有意差が得られる。この試験を５回繰り返した。
【００６７】
栄養素を添加していない対照としての、マグネシウムもカルシウムも含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（「DPBS」）、比較例としての輸送用組成物Hypothermosol FRS、または本発明の実施形態による輸送用組成物において、ヒトから引き抜いた毛包の相対生存率の経時変化を調べた結果を図３に示す。輸送温度は４℃に設定した。新たに引き抜いた後、輸送していないヒト毛包対照の生存率と、輸送後のヒト毛包の生存率を比較することによって相対生存率を算出した。各時点において、AlamarBlueアッセイにより生存率を測定した。この試験を３回繰り返した。図３では、２４時間後において、本発明の実施形態による輸送用組成物中で輸送したヒト毛包が、その他の種類の組成物と比べて比較的高い生存率を維持できることが示されている。この結果は、所在地、郵便の遅延、輸出入の遅延、税関での遅延などによって、ほとんどの配送物の輸送時間が２４時間を超えうる郵便により細胞、組織および臓器を輸送する際に重要である。
【００６８】
ヒトから引き抜いた毛包を５日間凍結保存した後の生存率を図４に示す。ヒト毛包を引き抜き、４種の凍結保存用組成物に入れた。使用した凍結保存用組成物は、１）本発明の実施形態による５％DMSO含有凍結保存用組成物、２）DMSOを含有しないこと以外は、本発明の実施形態と同様の凍結保存用組成物、３）５％DMSOを含むCryoStor CS5、および４）DMEM中に５％DMSOと１０％FBSを含む標準的な凍結保存用組成物であった。凍結保存を行う前に、CoolCell LX凍結保存用コンテナを使用して、これらの異なる組成物中の毛包を約１℃／分の一定速度で約−８０℃まで冷却した。次に、毛包を入れたバイアルを気相式液体窒素凍結保存タンクで５日間保存した。凍結保存の開始から５日後に、毛包を入れたバイアルを３７℃の水浴中で急速解凍した。次に、凍結保存していない新鮮毛包に対する毛包の相対生存率をAlamarBlueアッセイで測定した。一元配置分散分析およびTukeyの事後検定により、本発明の実施形態による５％DMSO含有凍結保存用組成物を、CryoStor CS5および標準的な凍結保存用組成物と比較したところ、p<0.05の統計学的有意差が得られた。本発明の実施形態による５％DMSO非含有凍結保存用組成物とCryoStor CS6の間には統計学的有意差は認められなかった（Ｎ＝６）。
【００６９】
ヒトから引き抜いた毛包を２日間輸送し、その後５日間凍結保存した後の生存率を図５に示す。ヒト毛包を引き抜き、３種の輸送用組成物に入れた。使用した輸送用組成物は、１）本発明の実施形態による輸送用組成物、２）比較例としての輸送用組成物HypoThermosol、および３）標準的な組成物としての、マグネシウムもカルシウムも含まないダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（「DPBS」）であった。次に、温度を約２５℃または約４℃に維持しながら、毛包を２日間にわたり模擬輸送した。２日後、新鮮な対照に対する輸送後の毛包の生存率（Ｖｔ）をAlamarBlueアッセイにより測定した。凍結保存後の生存率を評価するため、ヒト毛包を引き抜き、４種の凍結保存用組成物に入れた。使用した凍結保存用組成物は、１）本発明の実施形態による前記５％DMSO含有凍結保存用組成物、２）DMSOを含有しないこと以外は、本発明の実施形態と同様の凍結保存用組成物、３）５％DMSOを含むCryoStor CS5、および４）DMEM中に５％DMSOと１０％FBSを含む標準的な凍結保存用組成物であった。凍結保存を行う前に、CoolCell LX凍結用コンテナを使用して、これらの異なる組成物中の毛包を約１℃／分の低下速度で約−８０℃まで冷却した。次に、毛包を入れたバイアルを気相式液体窒素凍結保存タンクで５日間保存した。凍結保存の開始から５日後に、毛包を入れたバイアルを約３７℃の水浴中で急速に解凍した。次に、凍結保存していない新鮮な毛包に対する凍結保存後の毛包の相対生存率（Ｖｃ）をAlamarBlueアッセイにより測定した。一元配置分散分析およびTukeyの事後検定により、本発明の輸送用組成物と本発明の一実施形態による５％DMSO含有凍結保存用組成物または５％DMSO非含有凍結保存用組成物の併用を、HypoThermosolとCryoStor CS5の併用および標準的な輸送用培地と標準的な凍結保存用培地の併用と比較したところ、p<0.05の統計学的有意差が得られた（Ｎ＝６）。
【００７０】
図４および図５は、５％DMSO含有CryoStor CS5と比較したときの、DMSOを添加した場合およびDMSOを添加していない場合の本発明の輸送用組成物および／または凍結保存用組成物の有効性を示す。
【００７１】
本発明のいくつかの実施形態によれば、本明細書において開示された輸送用組成物および凍結保存用組成物は、好ましくは、（図１に示すように）細胞、組織および／または臓器の輸送および／または凍結保存を行うために一緒に使用してもよいことから（ただし、必ずしも一緒に使用しなくてもよい）、これらの輸送用組成物および凍結保存用組成物は互いに類似したものであってもよい。
【００７２】
毛包から単離された細胞は、再生医療において様々に利用できる可能性があることを当業者であれば理解できるであろう。成長期の毛髪は、頭皮から直接引き抜いて得ることができる。頭皮から直接引き抜かれた成長期の毛髪は、ろう質の毛小皮（キューティクル）と、これとは明確に区別可能な毛球および外毛根鞘とを有し、毛球および外毛根鞘は、毛髪再生力および創傷治癒力が高いケラチノサイトおよびその他の細胞を含む（例えば、参考文献［１２］、［１３］および［１４］を参照されたい）。毛包由来のケラチノサイトを（図６に示すように）培養して、iPS細胞株の作製に使用してもよく、OCT4、SOX2、KLF4およびc-MYCを用いたレトロウイルスによる形質導入におけるリプログラミングの総効率は、約１％近くに達するが、これに対して、線維芽細胞培養物を用いた場合のリプログラミング効率は約０．０１％未満に留まる（例えば、参考文献［１５］および［１６］を参照されたい）。
【００７３】
化学的組成の明らかな無血清条件における新鮮毛包からのケラチノサイトの増殖の一例を図６に示す。ライカ社製のDMi 8位相差顕微鏡を使用して100倍で写真を撮影した。８日目までに、ケラチノサイトのコンフルエントな単層が得られ、これをトリプシン処理することにより、さらに拡大培養することができた。実験プロトコルは、Hungら（2015）の手順に従った（参考文献［２０］を参照されたい）。本発明の好ましい実施形態に従って輸送および凍結保存を行った後でも、ケラチノサイトの増殖が認められた。
【００７４】
当業者であれば、単一の尿試料から様々な種類の細胞を回収できることを容易に理解でき、例えば、尿路上皮様細胞、平滑筋様細胞、内皮様細胞および／もしくは間質様細胞、ならびに／または幹細胞様の特徴を示し、「尿由来幹細胞」（「USC」）と呼ばれる細胞の亜集団などを回収することができるが、これらに限定されない。USCは、好ましくは、排泄された尿中に約０．２％の割合で含まれていてもよく、その平均回収率は、尿１００ｍＬあたり５〜１０個であってもよいが、これらの割合には限定されず、腎糸球体中の血管壁幹細胞に由来することが報告されている（例えば、参考文献［１７］を参照されたい）。USCは接着性があり、８２％の成功率で培養できることが報告されている（例えば、参考文献［１８］を参照されたい）。USCは、初期の継代では間葉系幹細胞マーカー（CD117、CD73、CD90、CD105）を発現するが、造血幹細胞マーカーは陰性である（例えば、参考文献［１８］を参照されたい）。USCは、尿路上皮細胞系、平滑筋細胞系、神経細胞前駆細胞系、骨細胞系、脂肪細胞系および軟骨細胞系に分化することができる多能性幹細胞であると考えられている（例えば、参考文献［１７］および［１８］を参照されたい）。さらに、ケラチノサイトと同様に、iPS細胞を作製する際の前駆細胞としてUSCを使用すると、線維芽細胞を用いた従来の方法よりも作製期間が短縮され（１２日間）、高効率になることが報告されている（例えば、参考文献［１９］を参照されたい）。このような高いiPS細胞の作製効率は、c-mycおよびklf4という２種のリプログラミング因子が内在性に発現されていることと、USCにおいて観察されるテロメラーゼ活性が高いことに起因していると考えられる（例えば、参考文献［１９］を参照されたい）。このように、USCは、再生医療、特に尿路および／または腎臓の修復に関して様々に利用できる可能性がある。
【００７５】
前述の説明は例示のみを目的としたものであり、当業者であれば、開示された本発明の範囲から逸脱することなく、実施形態に変更を加えてもよいことを理解できるであろう。本発明の範囲内における変更は、本開示を参照することにより、当業者には明らかであり、そのような変更は添付の特許請求の範囲内にあるものとする。
【００７６】
現時点において好ましい本発明の実施形態について述べてきた。前述の説明は例示を目的として示したものであり、網羅的なものではなく、本明細書に開示された形態そのものに本発明を限定するものではない。前述の教示を踏まえて、別の変更、変形および改変が可能であり、このような変更、変形および改変は、当業者に明らかであるとともに、本発明の要旨および範囲から逸脱することなく、本発明の別の実施形態による設計および製造に使用してもよい。本発明の範囲は、詳細な説明によって限定されず、本明細書の一部を構成する請求項のみによって限定されるものとする。
【実施例】
【００７７】
本発明を以下の実施例により説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されない。以下の実施例は、本発明の理解を深めるために述べるが、本発明の範囲を何ら限定するものではなく、限定するものとして解釈すべきでない。以下の実施例には、当業者に公知の従来法の詳細な説明は含まれない。
【００７８】
実施例１−輸送用組成物の処方
この実施例では、細胞、組織および臓器を輸送するための本発明の一態様による輸送用組成物の好ましい処方について述べる。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態において、ナリンゲニンの原液とトロロックスの原液を、最終濃度が１００ｍＭになるようにDMSO中でそれぞれ調製する。次に、最終濃度が０．４ｍＭになるように（DMSOの最終濃度：０．４％（ｖ／ｖ））、エンドトキシンフリーのmilli-Q水で各原液を希釈することにより、ナリンゲニンの使用液とトロロックスの使用液を調製する。
【００８０】
エンドトキシンフリーのmilli-Q精製水５００ｍＬに、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム六水和物、重炭酸ナトリウム、無水第二リン酸ナトリウム、HEPES、Ｄ−グルコースおよびアラニルグルタミンを撹拌しながら添加し、１０倍溶液を作製する。
【００８１】
１０倍溶液は、
ａ．４８５ｍＭ  ＮａＣｌ、
ｂ．４０ｍＭ  ＫＣｌ、
ｃ．０．６ｍＭ  ＣａＣｌ２、
ｄ．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２六水和物、
ｅ．６０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、
ｆ．１２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、
ｇ．２３０ｍＭ  HEPES、
ｈ．１１０ｍＭ  Ｄ−（＋）−グルコースおよび
ｉ．２０ｍＭ  Ａｌａ−Ｇｌｎ
を含む。
【００８２】
各成分が完全に溶解した後、使い捨ての０．２２μｍ滅菌フィルターシステムを使用して溶液をろ過滅菌する。長期保存する場合は、この１０倍溶液から重炭酸ナトリウムを省く代わりに、１倍溶液に重炭酸ナトリウムを新たに加えてもよい。１０倍溶液は４〜８℃で保存する。
【００８３】
エンドトキシンフリーのmilli-Q精製水４５ｍＬで１０倍溶液５ｍＬを希釈することにより、１倍溶液を調製する。得られた１倍溶液はよく混合する。
【００８４】
ナリンゲニンの使用液を１倍溶液で希釈して０．０５μＭとし、トロロックスの使用液を１倍溶液で希釈して０．１μＭとする。
【００８５】
１倍の最終溶液は、
ａ．４８．５ｍＭ  ＮａＣｌ、
ｂ．４ｍＭ  ＫＣｌ、
ｃ．０．０６ｍＭ  ＣａＣｌ２、
ｄ．０．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２六水和物、
ｅ．６ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、
ｆ．１２ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、
ｇ．２３ｍＭ  HEPES、
ｈ．１１ｍＭ  Ｄ−（＋）−グルコース、
ｉ．２ｍＭ  Ａｌａ−Ｇｌｎ、
ｊ．０．０５μＭ  ナリンゲニン、
ｋ．０．１μＭ  トロロックス［（±）−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチルクロマン−２−カルボン酸］および
ｌ．０．０００５％（ｖ／ｖ）DMSO（ナリンゲニンとトロロックスに使用した溶媒；最終濃度は０．０００５％（ｖ／ｖ）を超えないこと）
を含む。
【００８６】
１倍の最終溶液をよく混合した後、使い捨ての０．２２μｍ滅菌フィルターシステムでろ過滅菌し、４℃で保存する。
【００８７】
実施例２−凍結保存用組成物の処方
以下の実施例では、細胞、組織および臓器を凍結保存するための本発明の一態様による凍結保存用組成物の好ましい処方について述べる。
【００８８】
本発明の好ましい実施形態において、最終濃度が１００ｍＭになるようにDMSO中で調製したナリンゲニンの原液を含む処方と、最終濃度が１００ｍＭになるようにDMSO中で調製したトロロックスの原液を含む処方を調製する。次に、最終濃度が０．４ｍＭになるように、マグネシウムもカルシウムも含まないDPBSで各原液を希釈することにより、ナリンゲニンの使用液とトロロックスの使用液を調製する。
【００８９】
エンドトキシンフリーのmilli-Q精製水５００ｍＬに、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム六水和物、重炭酸ナトリウム、無水第二リン酸ナトリウム、HEPES、Ｄ−グルコースおよびアラニルグルタミンを撹拌しながら添加し、１０倍溶液を作製する。
【００９０】
１０倍溶液は、
ａ．４８５ｍＭ  ＮａＣｌ、
ｂ．４０ｍＭ  ＫＣｌ、
ｃ．０．６ｍＭ  ＣａＣｌ２、
ｄ．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２六水和物、
ｅ．６０ｍＭ  Ｎａ２ＣＯ３、
ｆ．１２０ｍＭ  Ｎａ２ＨＰＯ４、
ｇ．２３０ｍＭ  HEPES、
ｈ．１１０ｍＭ  Ｄ−（＋）−グルコースおよび
ｉ．２０ｍＭ  Ａｌａ−Ｇｌｎ
を含む。
【００９１】
エンドトキシンフリーのmilli-Q精製水４５ｍＬで１０倍溶液５ｍＬを希釈することにより、１倍溶液を調製する。得られた１倍溶液はよく混合する。
【００９２】
ナリンゲニンの使用液を１倍溶液で希釈して０．０５μＭとし、トロロックスの使用液を１倍溶液で希釈して０．１μＭとする。最終濃度が５％（ｗ／ｖ）になるようにデキストラン４０を１倍溶液に加え、最終濃度が１％（ｗ／ｖ）になるようにショ糖を１倍溶液に加える。最終濃度が５％（ｖ／ｖ）になるようにDMSOを１倍溶液に加える。
【００９３】
１倍溶液をよく混合した後、使い捨ての０．２２μｍ滅菌フィルターシステムでろ過滅菌し、４℃で保存する。
【００９４】
別の実施形態では、実施例１に記載の１倍溶液に、デキストラン４０、ショ糖およびDMSOを加える。最終濃度が５％（ｗ／ｖ）になるようにデキストラン４０を加え、最終濃度が１％（ｗ／ｖ）になるようにショ糖を加え、最終濃度が５％（ｖ／ｖ）になるようにDMSOを加える。
【００９５】
用語の説明
本出願の目的に関して、「Ｘ、ＹおよびＺのうちの少なくとも１つ」または「１つ以上のＸ、ＹおよびＺ」という用語は、Ｘのみ、Ｙのみ、Ｚのみ、またはＸ、ＹおよびＺのうちの２つ以上の任意の組み合わせ（例えば、ＸＹＺ、ＸＹＹ、ＹＺ、ＺＺ）を指す。
【００９６】
本出願において、「一実施形態」、「実施形態」、「実施」、「変形」などは、本明細書に記載の実施形態、実例または変形が、特定の態様、特徴、構造または特性を含んでいてもよいことを指すが、すべての実施形態、実例または変形が、必ずしもその態様、特徴、構造または特性を含むわけではない。さらに、これらの語句は、本明細書の別の部分で言及された同じ実施形態を指す場合があるが、必ずしもそうでなくてもよい。また、特定の一実施形態に関して特定の態様、特徴、構造または特性が述べられている場合、明示的に述べられているか否かにかかわらず、このようなモジュール、態様、特徴、構造または特性が、別の実施形態に影響を及ぼしたり、別に実施形態と関連したりすることは、当業者の知識の範囲内である。換言すれば、明らかな不整合や本質的な不適合がない限り、あるいは具体的に除外されていない限り、任意の構成要素または特徴を、別の実施形態の別の構成要素または別の特徴と組み合わせてもよい。
【００９７】
任意の構成要素を除外するために、請求項が記載される場合があることにも留意されたい。つまり、この留意事項は、請求項に記載の構成要素の引用や「否定的な」限定の使用に関連する「単独」や「のみ」などの排他的な用語の使用に関する前提となる。「好ましくは」、「好ましい」、「好まれる」、「任意で」および「であってもよい」という用語、ならびにこれらに類似の用語は、記載の事項、状態または工程が、本発明において（必須ではなく）任意の特徴であることを示すために使用される。
【００９８】
単数形の「a」、「an」および「the」は、明確な別段の記載がない限り、複数のものを含む。「および／または」という用語は、この用語に関連する事項のいずれか１つ、それらの任意の組み合わせ、またはそのすべてを意味する。「１つ以上」という用語は、特に、この用語が使用されている記載を参照することによって、当業者であれば容易に理解することができる。
【００９９】
「約」は、所定の数値が、±５％、±１０％、±２０％または±２５％の範囲で変動することを指してもよい。例えば、いくつかの実施形態において「約５０」％は、４５〜５５％の範囲で変動しうる。整数値の範囲の場合、「約」は、この範囲の上限よりも大きい整数値および／または下限よりも小さい整数値のうちの１つまたは２つを含みうる。本明細書で別段の記載がない限り、「約」は、本発明の組成物の機能または本発明の実施形態の点で同等な、本明細書に記載の範囲に近似した数値および範囲を含む。
【０１００】
特に詳細な説明の提供などの何らかの目的において、本明細書に記載された範囲はいずれも、あらゆる可能な部分範囲およびその組み合わせ、ならびにその範囲を構成する個々の数値（特に整数値）を包含することを、当業者であれば理解できるであろう。本明細書に記載の範囲は、この範囲に含まれる個々の特定の数値、整数値、小数値または同一物を含む。本明細書に記載の範囲はいずれも、同じ範囲を少なくとも等分、３等分、４等分、５等分または１０等分に分割したものも十分に記載されており、このような分割された範囲で本発明を実施可能であることを容易に理解できるであろう。例えば、本明細書に記載の範囲はいずれも、容易に、低域、中域、高域といった３等分などにすることができるが、これに限定されない。
【０１０１】
また、「最大で」、「少なくとも」、「超える」、「未満」、「よりも大きい」、「以上」といった用語はいずれも、記載された数値を含むとともに、前述したように、部分範囲に分割可能な範囲も指すことを当業者であれば理解できるであろう。同様に、本明細書に記載の比率はいずれも、より広い範囲の比率に含まれるあらゆる下位の比率を含む。
【０１０２】
参考文献
【０１０３】
[1.] Boyce, S.T. & Ham, R.G. (1983). Calcium-regulated differentiation of normal human epidermal keratinocytes in chemically defined clonal culture and serum-free serial culture. The Journal of Investigative Dermatology, 81: 33s-40s.
【０１０４】
[2.] Stumvoll, M., Perriello, G., Meyer, C. & Gerich, J. (1999). Role of glutamine in human carbohydrate metabolism in kidney and other tissues. Kidney International, 55: 778-792.
【０１０５】
[3.] Peus, D., Meves, A., Pott, M., Beyerle, A. & Pittelkow, MR. (2001). Vitamin E analog modulates UVB-induced signaling pathway activation and enhances cell survival. Free Radical Biology & Medicine, 30: 425-432.
【０１０６】
[4.] Frabasile, S., Koishi, A.C., Kuczera, D., Silveira, G.F., Verri, W.A., dos Santos, C.N.D. & Bordignon, J. (2017). The citrus flavanone naringenin impairs dengue virus replication in human cells. Nature Scientific Reports, 7: 41864.
【０１０７】
[5.] Menanteau-Ledouble, S., Krauss, I., Santos, G., Fibi, S., Weber, B. & El-Matbouli, M. (2015). Effect of a phytogenic feed additive on the susceptibility of Onchorhynchus mykiss to Aeromonas salmonicida. Diseases of Aquatic Organisms, 115: 57-66.
【０１０８】
[6.] Madaan, A., Joshi, V., Kishore, A., Verma, R., Singh, A.T., Jaggi, M & Sung, Y.K. (2017). In vitro hair growth promoting effects of naringenin and hesperetin on human dermal papilla cells and keratinocytes. American Journal of Dermatology and Venereology, 6: 51-57.
【０１０９】
[7.] Noda, S., Tanabe, S. & Suzuki, T. (2013). Naringenin enhances intestinal barrier function through the expression and cytoskeletal association of tight junction proteins in Caco-2 cells. Molecular Nutrition & Food Research, 57: 2019-2028.
【０１１０】
[8.] Jobeili, L., Rousselle, P., Beal, D., Blouin, E., Roussel, A.M., Damour, O. & Rachidi, W. (2017). Selenium preserves keratinocyte stemness and delays senescence by maintaining epidermal adhesion. Aging, 9: 2302-2315.
【０１１１】
[9.] Kopeika, J., Thornhill, A. & Khalaf, Y. (2014). The effect of cryopreservation on the genome of gametes and embryos: principles of cryobiology and critical appraisal of the evidence. Human Reproduction Update, 0: 1-19.
【０１１２】
[10.] Gao, D. & Critser, J.K. (2000). Mechanisms of Cryoinjury in Living Cells. ILAR Journal, 41: 187-196.
【０１１３】
[11.] Chaytor, J.L., Tokarew, J.M., Wu, L.K., Leclere, M., Tam, R.Y., Capicciotti, C.J., Guolla, L., von Moos, E., Findlay, C.S., Allan, D.S., Ben, R.N. (2012). Inhibiting ice recrystallization and optimization of cell viability after cryopreservation. Glycobiology, 22: 123-133.
【０１１４】
[12.] Mistriotis, P. and Andreadis S.T. (2013). Hair follicle: a novel source of multipotent stem cells for tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Engineering: Part B, 19: 265-278.
【０１１５】
[13.] Gho, C.G., Braun, J.E., Neumann, H.A. & Ramaekers, F.C. (2004) Human follicular stem cells: their presence in plucked hair and follicular cell culture. British Journal of Dermatology, 150: 860-868.
【０１１６】
[14.] Ansell, D.M., Kloepper, J.E., Thomason, H.A., Paus, R. & Hardman, M.J. (2011) Exploring the “Hair Growth-Wound Healing Connection”: Anagen Phase Promotes Wound Re-Epithelialization. Journal of Investigative Dermatology, 131: 518-528.
【０１１７】
[15.] Aasen, T. and Izpisua Belmonte, J.C. (2010). Isolation and cultivation of human keratinocytes from skin or plucked hair for the generation of induced pluripotent stem cells. Nature, 5: 371-382.
【０１１８】
[16.] Petit, I., Kesner, N.S., Karry, R., Robicsek, O., Aberdam, E., Muller, F.J., Aberdam, D. & Ben-Shachar, D. (2012). Induced pluripotent stem cells from hair follicles as a cellular model for neurodevelopmental disorders. Stem Cell Research, 8: 134-140.
【０１１９】
[17.] Bharadwaj, S., Liu, G., Shi, Y., Wu, R., Yang, B., He, T., Fan, Y., Lu, X., Zhou, X., Liu, H., Atala, A., Rohozinski, J. & Zhang, Y. (2013). Multipotential Differentiation of Human Urine-Derived Stem Cells: Potential for Therapeutic Applications in Urology. Stem Cells, 31: 1840-1856.
【０１２０】
[18.] Long, T., Wu, R., Lu, X., Deng, J., Qin, D., Zhang, Y. (2015). Urine-Derived Stem Cells for Tissue Repair in the Genitourinary System. Stem Cell Research & Therapy, 5: 317-321.
【０１２１】
[19.] Zhou, T., Benda, C., Dunzinger, S., Huang, Y., Ho, J.C., Yang, J., Wang, Y., Zhang, Y., Zhuang, Q., Li, Y., Bao, X., Tse, H., Grillari, J., Grillari-Voglauer, R., Pei, D. & Esteban, M.A. (2012). Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols, 7: 2080-2089.
【０１２２】
[20.] Hung, S.C.S., Pebay, A., & Wong, R.C.B. (2015). Generation of integration-free human induced pluripotent stem cells using hair-derived keratinocytes. Journal of Visualized Experiments, 102: e53174.
【０１２３】
[21.] Salehi, B., Fokou, P.V.T., Sharifi-Rad, M., Zucca, P., Pezzani, R., Martins, N., & Sharifi-Rad, J. (2019). The Therapeutic Potential of Naringenin: A Review of Clinical Trials. Pharmaceuticals, 12: 10.3390/ph12010011
【図１】
2021532833.tif 000003
【図２】
2021532833.tif 000004
【図３】
2021532833.tif 000005
【図４】
2021532833.tif 000006
【図５】
2021532833.tif 000007
【図６】
2021532833.tif 000008
【国際調査報告】
2021532833.tif 000009
2021532833.tif 000010