(57)【要約】  ＣＯ2生物変換方法は、ＣＯ2含有基質をバイオリアクターに供給するステップであって、ＣＯ2含有基質が約５〜約９０モル％のＣＯ2を含む、ステップ、およびナトリウム輸送性ＡＴＰアーゼを有する酢酸生成細菌によりＣＯ2含有基質を発酵させるステップを含む。１リットルあたり約０．０１グラム未満の酵母エキス、１リットルあたり約０．０１グラム未満の炭水化物を含む培地であって、ナトリウムイオン濃度が、細胞／分が約２９０〜約８７５０μｇ／グラムとなるナトリウム供給速度によって供給され、ｐＨが約４〜約６．９である、培地。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ガス状基質をバイオリアクターに供給するステップであって、ガス状基質が、ＣＯ2を含み、かつ約５〜約９０モル％のＣＯ2を含有する、前記ステップ、
酢酸生成細菌をバイオリアクターに供給するステップ、
１種または複数のナトリウムイオン源によって、バイオリアクターにナトリウムイオンを供給するステップ、ならびに
酢酸生成細菌および１種または複数のナトリウムイオン源を含む発酵ブロス中、ガス状基質を酢酸生成細菌により発酵させて、１種または複数の有機酸を生成するステップ
を含む、方法であって、
酢酸生成細菌が、バイオリアクター中で発酵する間活性であるナトリウム輸送性ＡＴＰアーゼを含み、
発酵ブロスが、１リットルあたり約０．０１グラム未満の酵母エキス、および１リットルあたり約０．０１グラム未満の炭水化物を含み、
ナトリウムイオンが、約２９０〜約８７５０μｇ／細胞グラム／分となるナトリウム供給速度で供給され、
発酵ブロスが、約４〜約６．９の範囲のｐＨに維持される、
前記方法。
【請求項２】
ＣＯ2含有ガス状基質が、工業用ガス、発酵装置のガス流およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
酢酸生成細菌が、アセトバクテリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、アセトゲニウム・キブイ（Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ  ｋｉｖｕｉ）、アセトアナエロビウム・ノテラエ（Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｎｏｔｅｒａｅ）、アセトバクテリウム・ウッディイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）、アルカリバクルム・バッキ（Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉ）ＣＰ１１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１７７２）、モーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、ルミノコッカス・プロダクツス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）およびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
酢酸生成細菌が、アセトバクテリウム・ウッディイである、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ナトリウムイオン源が、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択される化合物によって供給される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
有機酸が、１種または複数のＣ１−Ｃ１０有機酸である、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
有機酸が酢酸、酪酸またはそれらの混合物である、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ガス状基質をバイオリアクターに供給するステップであって、ガス状基質が、ＣＯ2およびＨ2を含み、かつ約５〜約９０モル％のＣＯ2を含有する、前記ステップ、
酢酸生成細菌をバイオリアクターに供給するステップ、
１種または複数のナトリウムイオン源によって、バイオリアクターにナトリウムイオンを供給するステップ、ならびに
酢酸生成細菌および１種または複数のナトリウムイオン源を含む発酵ブロス中、ガス状基質を酢酸生成細菌により発酵させて、１種または複数の有機酸を生成するステップ
を含む、方法であって、
酢酸生成細菌が、バイオリアクター中で発酵する間活性であるナトリウム輸送性ＡＴＰアーゼを含み、
発酵ブロスが、１リットルあたり約０．０１グラム未満の酵母エキス、１リットルあたり約０．０１グラム未満の炭水化物を含み、
ナトリウムイオンが、約２９０〜約８７５０μｇ／細胞グラム／分となるナトリウム供給速度で供給され、
発酵ブロスが、約４〜約６．９の範囲のｐＨに維持される、
前記方法。
【請求項９】
ガス状基質が、工業用ガス、発酵装置のガス流およびそれらの混合物からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
酢酸生成細菌が、アセトバクテリウム属細菌、アセトゲニウム・キブイ、アセトアナエロビウム・ノテラエ、アセトバクテリウム・ウッディイ、アルカリバクルム・バッキＣＰ１１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１７７２）、モーレラ・サーモアセチカ、モーレラ・サーモオートトロフィカ、ルミノコッカス・プロダクツスおよびそれらの組合せからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
酢酸生成細菌が、アセトバクテリウム・ウッディイである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
ナトリウムイオン源が、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択される化合物によって供給される、請求項８に記載の方法。
【請求項１３】
有機酸が、１種または複数のＣ１−Ｃ１０有機酸である、請求項８に記載の方法。
【請求項１４】
有機酸が酢酸、酪酸またはそれらの混合物である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
ＮＨ4+、Ｐ、Ｋ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｓｅ、Ｚｎ、ＷまたはＭｇの供給源のうちの１種または複数、
約８７５〜約３５，０００ｍｇ／Ｌのナトリウムイオン源、および
約０．００９〜約０．３９７ｍｇ／ＬのＭｏ源
を含む、組成物であって、
１リットルあたり約０．０１グラム未満の酵母エキス、および１リットルあたり約０．０１グラム未満の炭水化物を含み、
約４〜約６．９のｐＨを有する、
前記組成物。
【請求項１６】
ナトリウムイオン源が、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択される化合物によって供給される、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１７】
エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二コハク酸（ＥＤＤＳ）およびそれらの混合物からなる群から選択される錯化剤を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１８】
約８２〜約３２８０ｍｇ／ＬのＮＨ4+供給源、
約２０．１２〜約８０５ｍｇ／Ｌのリン源、または
約９８．３３〜約３９３３ｍｇ／Ｌのカリウム源
を含む、請求項１５に記載の組成物。
【請求項１９】
窒素が、水酸化アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびそれらの混合物からなる群から選択される窒素源から供給され、
リンが、リン酸、リン酸アンモニウム、リン酸カリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択されるリン源から供給され、
カリウムが、塩化カリウム、リン酸カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択されるカリウム源から供給される、
請求項１８に記載の組成物。
【請求項２０】
約０．８５〜約３４ｍｇ／Ｌの鉄源
約０．０７〜約２．８１ｍｇ／Ｌのニッケル源
約０．０３７〜約１．４９ｍｇ／Ｌのコバルト源
約０．０２７〜約１．１ｍｇ／Ｌのセレン源
約０．５９〜約２３．８ｍｇ／Ｌの亜鉛源
約８０．２５〜約３２１０ｍｇ／Ｌのタングステン源、または
約０．７１〜約２８．６９ｍｇ／Ｌのマグネシウム源
を含む、請求項１９に記載の組成物。
【請求項２１】
鉄が、塩化第一鉄、硫酸第一鉄およびそれらの混合物からなる群から選択される鉄源から供給され、
ニッケルが、塩化ニッケル、硫酸ニッケル、硝酸ニッケルおよびそれらの混合物からなる群から選択されるニッケル源から供給され、
コバルトが、塩化コバルト、フッ化コバルト、臭化コバルト、ヨウ化コバルトおよびそれらの混合物からなる群から選択されるコバルト源から供給され、
セレンが、Ｎａ2ＳｅＯ3、Ｃ3Ｈ6ＮＯ2Ｓｅおよびそれらの混合物からなる群から選択されるセレン源から供給され、
亜鉛が、ＺｎＳＯ4から供給され、
タングステンが、タングステン酸ナトリウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸カリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択されるタングステン源から供給され、
マグネシウムが、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウムからなる群から選択されるマグネシウム源から供給され、硫黄が、システイン、ナトリウムスルフィドおよびそれらの混合物からなる群から選択される硫黄源から供給される、
請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
ナトリウムイオン濃度が、約５００ｐｐｍ〜約８０００ｐｐｍである、請求項１５に記載の組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、それらのすべての全体が参照により本明細書に組み込まれている、２０１８年８月８日出願の米国仮特許出願第６２／７１６，０８３号、２０１８年８月８日出願の同第６２／７１６，０７１号、２０１８年８月８日出願の同第６２／７１６，０５３号、２０１８年１０月５日出願の同第６２／７４１，８７１号、および２０１８年１０月５日出願の同第６２／７４１，７９７号の利益を主張する。
二酸化炭素を生物変換する方法を提供する。より詳細には、本方法は、二酸化炭素を含有するガス流を酢酸生成細菌（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）に供給するステップを含む。本方法は、高いレベルの二酸化炭素の変換、および水素の利用を実現する。
【背景技術】
【０００２】
二酸化炭素の生成は、自然プロセス、ならびに石炭、石油および天然ガスなどの化石燃料の燃焼を含む工業的プロセスから起こる。一部には工業的プロセスにより、大気の二酸化炭素の濃度が、向上し続けている。二酸化炭素の濃度のこのような向上は、気候変化および地球規模の温暖化をもたらす、大気の変化の一因になり得る。二酸化炭素は、その高い酸化状態のために、生物的プロセスに利用することは困難である。
二酸化炭素に加えて、多くの工業的プロセスが、水素の生成をやはりもたらす。水素は、高いレベルの還元電位を有する。しかし、水素は、その高い可燃性の性質のため、貯蔵および利用が困難である。
二酸化炭素が多量に生成していることを鑑みると、二酸化炭素のフットプリントを低減することができる、細菌発酵システムが必要とされている。さらに、水素の還元電位を効果的に利用することができる、発酵システムが必要とされている。
【発明の概要】
【０００３】
方法は、ガス状基質をバイオリアクターに供給するステップを含む。ガス状基質は、ＣＯ2を含み、約５〜約９０モル％のＣＯ2を含有する。本方法は、酢酸生成細菌（ａｃｅｔｏｇｅｎｉｃ  ｂａｃｔｅｒｉａ）をバイオリアクターに供給するステップ、ナトリウムイオンを１種または複数のナトリウムイオン源により、バイオリアクターに供給するステップ、ならびに酢酸生成細菌および１種または複数のナトリウムイオン源を含む発酵ブロス中で、酢酸生成細菌によりガス状基質を発酵させて、１種または複数の有機酸を生成するステップを含む。酢酸生成細菌は、バイオリアクター中で発酵する間活性であるナトリウム輸送性ＡＴＰアーゼを含む。発酵ブロスは、１リットルあたり約０．０１グラム未満の酵母エキス、１リットルあたり約０．０１グラム未満の炭水化物を含み、ナトリウムイオン濃度は、細胞／分が約２９０〜約８７５０μｇ／グラムとなるナトリウム供給速度によって供給される。発酵ブロスは、約４〜約６．９の範囲のｐＨに維持される。
【０００４】
別の態様では、ガス状基質をバイオリアクターに供給する方法。ガス状基質は、ＣＯ2およびＨ２を含み、約５〜約９０モル％のＣＯ2を含有する。本方法は、酢酸生成細菌をバイオリアクターに供給するステップ、ナトリウムイオンを１種または複数のナトリウムイオン源により、バイオリアクターに供給するステップ、ならびに酢酸生成細菌および１種または複数のナトリウムイオン源を含む発酵ブロス中で、酢酸生成細菌によりガス状基質を発酵させて、１種または複数の有機酸を生成するステップを含む。酢酸生成細菌は、バイオリアクター中で発酵する間活性であるナトリウム輸送性ＡＴＰアーゼを含む。発酵ブロスは、１リットルあたり約０．０１グラム未満の酵母エキス、１リットルあたり約０．０１グラム未満の炭水化物を含み、ナトリウムイオン濃度は、細胞／分が約２９０〜約８７５０μｇ／グラムとなるナトリウム供給速度によって供給される。発酵ブロスは、約４〜約６．９の範囲のｐＨに維持される。
組成物は、ＮＨ4+、Ｐ、Ｋ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｓｅ、Ｚｎ、ＷまたはＭｇの供給源のうちの１種または複数源；約８７５〜約３５，０００ｍｇ／Ｌのナトリウムイオン源、約０．００９〜約０．３９７ｍｇ／ＬのＭｏ源を含む。である。本組成物は、１リットルあたり約０．０１グラム未満の酵母エキス、および１リットルあたり約０．０１グラム未満の炭水化物を含む。本組成物は、約４〜約６．９のｐＨを有する。
【０００５】
本開示の上で列挙された特徴が、詳細に理解され得るよう、実施形態への参照は、上で簡単に要約した本開示の一層具体的な記載を有することができ、これらの一部は、添付の図面に例示されている。しかし、添付の図面は、この開示の典型的な実施形態を例示しているに過ぎず、したがって、本発明の範囲を限定すると見なされるべきではなく、本開示の場合、他の等しく有効な実施形態を認めることができることに留意すべきである。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】バイオリアクター中で、アセトバクテリウム・ウッディイ（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｗｏｏｄｉｉ）による、ＣＯ2の変換率およびＨ2の変換率のグラフである。
【図２】アセトバクテリウム・ウッディイによる、酢酸生成を例示するグラフである。
【図３】５％のＣＯの存在下での、アセトバクテリウム・ウッディイの成長を説明するグラフである。
【図４】５％のＣＯの存在下での、アセトバクテリウム・ウッディイの成長を説明するグラフである。
【図５】成長培地中、キレート剤（ＥＤＴＡ）を使用しない、ｐＨ５．２における、ＣＯ2変換率、Ｈ2変換率、およびアセトバクテリウム・ウッディイの細胞密度を例示するグラフである。
【図６】成長培地中、キレート（錯化）剤として、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）を使用する、アセトバクテリウム・ウッディイの成長を説明するグラフである。
【図７】アセトバクテリウム・ウッディイによる、酢酸生成に及ぼすモリブデンの影響を例示するグラフである。
【図８】ガス流速必要量およびアセトバクテリウム・ウッディイの細胞密度に及ぼすモリブデンの影響を例示するグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下の記載は、限定的な意味でとらえられるべきではなく、単に、例示的な実施形態の一般原理を記載する目的でなされているに過ぎない。本開示の範囲は、特許請求の範囲を参照して、決定されるべきである。
定義
特に定義されていない限り、本開示に関して、本明細書全体を通して使用されている以下の用語は、以下の通り定義されており、以下に定義されている定義の単数形または複数形のどちらかを含むことができる。
任意の量を修飾する用語「約」は、実際の条件、例えば、実験室、パイロットプラントまたは生産設備において遭遇する量の変動を指す。例えば、混合物もしくは量に使用される成分または測定値の量は、「約」によって修飾される場合、製造プラントまたは実験室における実験条件において測定される際に通常、払われる注意の変動および程度を含む。例えば、生成物の構成成分の量は、「約」によって修飾されている場合、プラントまたは実験室における複数の実験における回分間の変動、および分析法に特有の変動を含む。「約」によって修飾されるか否かに関わらず、上記の量は、そのような量に等価であることを含む。本明細書において明記されており、かつ「約」によって修飾されている量はいずれも、「約」によって修飾されていない量として、本開示にやはり使用され得る。
【０００８】
用語「発酵装置」は、１つもしくは複数の容器および／または塔、あるいは配管からなる発酵装置／バイオリアクターを含み、これは、回分反応器、半回分反応器、連続反応器、連続撹拌槽式反応器（ＣＳＴＲ：ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ  ｓｔｉｒｒｅｄ  ｔａｎｋ  ｒｅａｃｔｏｒ）、気泡塔反応器、外部循環ループ式反応器、内部循環ループ式反応器、固定化細胞反応器（ＩＣＲ：ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｃｅｌｌ  ｒｅａｃｔｏｒ）、トリクルベッド反応器（ＴＢＲ：ｔｒｉｃｋｌｅ  ｂｅｄ  ｒｅａｃｔｏｒ）、流動床式バイオフィルム反応器（ＭＢＢＲ：ｍｏｖｉｎｇ  ｂｅｄ  ｂｉｏｆｉｌｍ  ｒｅａｃｔｏｒ）、ガスリフト式反応器、中空繊維膜バイオリアクター（ＨＦＭＢＲ：ｈｏｌｌｏｗ  ｆｉｂｒｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ）などの膜反応器、静的ミキサー、ガスリフト式発酵装置、または気−液接触に好適な他の容器もしくは他の装置を含む。
用語「発酵」、「発酵プロセス」または「発酵反応」などは、方法の成長期および生成物の生合成期の両方を包含することが意図されている。一態様では、発酵は、ＣＯ2の酢酸への変換を指す。
用語「細胞密度」は、発酵ブロスの単位体積あたりの微生物細胞の質量、例えば、グラム／リットルを意味する。
用語「ＣＯ2比取込み」は、１分間に単位時間あたりの微生物細胞の単位質量（ｇ）によって消費された、ＣＯ2のミリモル数での量、すなわち、ミリモル／グラム／分を意味する。
本明細書で使用する場合、生産性は、ＳＴＹとして表される。この態様では、アルコールの生産性は、ｇエタノール／（Ｌ日間）またはｇ酢酸／（Ｌ日間）として表される、ＳＴＹ（空間時間収率）として表されてもよい。
【０００９】
ＣＯ2含有ガス状基質
一態様では、本方法は、ＣＯ2含有ガス状基質をバイオリアクターに供給するステップを含む。ＣＯ2含有基質は、ＣＯ2を含む任意のガスを含むことができる。この態様では、ＣＯ2含有ガスは、工業用ガス、例えば発酵装置の排ガスを含めた発酵装置のガス流、およびそれらの混合物を含んでもよい。関連態様では、ＣＯ2含有基質は、水素を含んでもよく、または水素源とブレンドされて、Ｈ2対ＣＯ2の所望のレベルおよび比をもたらしてもよい。
【００１０】
工業用ガス：一態様では、本方法は、ＣＯ2含有ガス状基質をバイオリアクターに供給するステップであって、ＣＯ2含有ガス状基質が、工業用ガスから生成する、ステップを含む。工業用ガスの一部の例には、製鋼所ガス、工業煙道ガスおよび焼却炉の排気ガスが含まれる。工業用ガスの例には、鉄鋼製品の製造、非鉄製品の製造、石油精製プロセス、石炭のガス化、バイオマスのガス化、発電、カーボンブラック生産、アンモニア生産、メタノール生産、およびコークス製造の間に生成するガスを含む。水素源は、化石燃料、蒸気の改質、メタンの酸化、石炭のガス化および水の電気分解物を含んでもよい。
ガス状ＣＯ2含有基質は、その組成に応じて、発酵に導入する前に、ダスト粒子などのいかなる望ましくない不純物も除去するために、これを処理することがやはり望ましいことがある。例えば、ガス状基質は、公知の方法を使用してろ過されてもよく、またはスクラブ処理されてもよい。さらに、本方法は、ＣＯ2含有基質の組成に応じて、ＣＯ2含有基質を調節して、ＣＯ2および／またはＨ2の濃度を向上または低下させて、所望の範囲内に収まるようにするステップを含んでもよい。
【００１１】
発酵装置のガス流：一態様では、本方法は、ＣＯ2含有基質をバイオリアクターに供給するステップであって、ＣＯ2含有基質が、発酵装置のガス流となる、ステップを含む。発酵装置のガス流の一部の例には、合成ガスの発酵中に生成する発酵装置の排ガスを含む。合成ガスの発酵の一部の例は、参照により本明細書に組み込まれている、２００１年７月２３日に出願の、米国特許第７，２８５，４０２号に記載されている。
一態様では、本方法は、ＣＯを高い体積で含有する工業煙道ガスなどの、ガス状基質からのアルコールの生成を補助する適用性を有する。一部の態様では、ＣＯを含むガスは、炭素含有廃棄物、例えば、産業廃棄ガスから、または他の廃棄物のガス化に由来する。ＣＯ含有ガスの発酵は、発酵装置の排ガス中にＣＯ2をもたらすことがある。したがって、本方法は、そうでなければ、環境に排出されると思われる炭素を捕捉するための効果的な方法となる。この態様では、ＣＯ含有ガスの発酵に由来する排ガスは、約０．５モル％〜約５０モル％のＣＯを含むことがある。
【００１２】
ガス流のブレンド：特定の態様によれば、２種以上の供給源に由来する流れは、一緒にされて、かつ／またはブレンドされて、所望のかつ／または最適化された基質流を生成することができる。例えば、鉄鋼所からの排気ガスなどの高濃度のＣＯ2を含む流れが、鉄鋼所のコークス炉からの排ガスなどの高濃度のＨ2を含む流れと一緒にされ得る。
ＣＯ2含有生基質は、ＣＯ2含有基質の組成に応じて、発酵プロセスに直接、供給されてもよく、または適切なＨ2対ＣＯ2モル比を含むようさらに改変されてもよい。ＣＯ2含有基質は、約５〜約９０モル％のＣＯ2および約５〜約９０モル％のＨ2を含むことができる。一態様では、ＣＯ2含有ガス流は、約５〜約６６．６％のＣＯ2を含む。
別の態様では、ＣＯ2含有基質は、約０モル％〜約５０モル％のＣＯ、別の態様では、約０．５モル％のＣＯ〜約５０モル％のＣＯ、別の態様では、約０．５モル％のＣＯ〜約５モル％のＣＯ、および別の態様では、約２モル％のＣＯ〜約５モル％のＣＯを含んでもよい。
一態様では、酢酸生成細菌は、約４：１〜約１：２の比で、Ｈ2対ＣＯ2の消費モル比を有するであろう。したがって、バイオリアクターに供給される、Ｈ2およびＣＯ2を含む任意の基質ガスが、利用され得る。しかし、バイオリアクターに供給される基質ガスの最適レベルは、約４：１〜約１：１、別の態様では、約２：１、および別の態様では、約３．５：１〜約１．５：１となる、Ｈ2対ＣＯ2の比を有するであろう。
【００１３】
バイオリアクターの設計および操作
発酵装置の設計の説明は、それらのすべてが参照により本明細書に組み込まれている、どちらも２０１２年５月１５日に出願された、米国整理番号第１３／４７１，８２７号および同第１３／４７１，８５８号、ならびに２０１２年５月１６日に出願された、米国整理番号第１３／４７３，１６７号に記載されている。
発酵は、所望の発酵が起こるために適切な条件下（例えば、ＣＯ2対酢酸）で望ましくは行われるべきである。考慮される反応条件としては、圧力、温度、ガス流速、液体流速、培地のｐＨ、撹拌速度（撹拌槽式反応器が使用される場合）、接種材料レベル、および生成物による阻害を回避するため最大酢酸濃度が挙げられる。この態様では、本方法は、以下の範囲の反応条件を含む：
圧力：約０〜約５００ｐｓｉ；
温度：約３０℃〜約４２℃；
培地のｐＨ：約４〜約６．９；
撹拌速度：約１００〜約２０００ｒｐｍ；
本明細書に記載されている栄養素の供給。
【００１４】
酢酸生成細菌
一態様では、利用される微生物は、ナトリウム輸送性ＡＴＰアーゼとしてやはり説明され得る（膜生体エネルギー論の場合）、ナトリウムポンプを含む、酢酸生成細菌を含む。ナトリウム輸送性ＡＴＰアーゼは、参照により本明細書に組み込まれている、Muller, “Energy Conservation in Acetogenic Bacteria”, Appl. Environ. Microbiol. November 2003, vol. 69, no. 11, pp. 6345-6353に記載されている。ナトリウム輸送性ＡＴＰアーゼという用語は、ナトリウム依存性ＡＴＰアーゼと互換的に使用されてもよい。ナトリウム輸送性ＡＴＰアーゼを含むアセトゲンは、成長のため、その成長培地に約５００ｐｐｍのＮａＣｌを必要とする。アセトゲンが、ナトリウム輸送性ＡＴＰアーゼを含むかどうかを判定するため、アセトゲンは、約０〜約２０００ｐｐｍのＮａＣｌを含む約３０〜約５０ｍｌの成長培地を含有する血清ボトルに接種される。約５００ｐｐｍ以上のＮａＣｌ濃度における成長は、アセトゲンがナトリウム輸送性ＡＴＰアーゼを含むことを意味する。
【００１５】
この態様では、好適な微生物には、アセトバクテリウム（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属細菌、アセトゲニウム・キブイ（Ａｃｅｔｏｇｅｎｉｕｍ  ｋｉｖｕｉ）、アセトアナエロビウム・ノテラエ（Ａｃｅｔｏａｎａｅｒｏｂｉｕｍ  ｎｏｔｅｒａｅ）、アセトバクテリウム・ウッディイ、アルカリバクルム・バッキ（Ａｌｋａｌｉｂａｃｕｌｕｍ  ｂａｃｃｈｉ）ＣＰ１１（ＡＴＣＣ  ＢＡＡ−１７７２）、モーレラ・サーモアセチカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｃｅｔｉｃａ）、モーレラ・サーモオートトロフィカ（Ｍｏｏｒｅｌｌａ  ｔｈｅｒｍｏａｕｔｏｔｒｏｐｈｉｃａ）、ルミノコッカス・プロダクツス（Ｒｕｍｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｒｏｄｕｃｔｕｓ）およびそれらの組合せが含まれる。別の態様では、微生物は、アセトバクテリウム・ウッディイである。
【００１６】
培地組成および培地供給速度の制御
一態様によれば、発酵プロセスは、反応容器への好適な培地の添加によって開始される。反応容器に含有される液体は、任意のタイプの好適な栄養用培地または発酵用培地を含んでよい。栄養用培地は、使用される微生物の成長を可能にするために有効なビタミンおよびミネラルを含むであろう。殺菌は、必ずしも必要ではないことがある。
【００１７】
様々な培地の構成成分の濃度は、以下の通りである：
【表１】
2021532805.tif 000003
【００１８】
ビタミン溶液は、ｄ−ビオチン、チアミンＨＣｌおよびカルシウム−Ｄ−パントテン酸塩を含有する。
０．５ＭのＮａＯＨを使用して、ｐＨを約５．５５に維持した。時間あたりの細胞１グラムあたりのＮａＯＨの使用量の概算は、細胞１グラムあたり、０．１〜０．４ｍｌ／分であった。
【００１９】
プロセス操作は、約４〜約６．９、別の態様では、約５〜約６．５、別の態様では、約５．１〜約６、および別の態様では、約５．２〜約６の範囲のｐＨを維持する。培地は、約０．０１ｇ／Ｌ未満の酵母エキス、および約０．０１ｇ／Ｌ未満の炭水化物を含む。
この組成物はまた、１リットルあたり約４０〜約５００ｍｍｏｌ、別の態様では、１リットルあたり約４０〜約２５０ｍｍｏｌのナトリウムイオン濃度、および別の態様では、１リットルあたり約５０〜約２００ｍｍｏｌのナトリウムイオン濃度を含む。一態様では、ナトリウムイオン濃度は、約５００ｐｐｍ〜約８０００ｐｐｍ、別の態様では、約１０００ｐｐｍ〜約７０００ｐｐｍ、別の態様では、約３０００ｐｐｍ〜約６０００ｐｐｍ、別の態様では、約２０００〜約５０００ｐｐｍのＮａ、および別の態様では、約３０００〜約４０００ｐｐｍのＮａである。ナトリウムイオン源は、塩化ナトリウム、水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、重炭酸ナトリウム、重硫酸ナトリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択される化合物によって供給される。
組成物は、モリブデン源を含む。この態様では、モリブデン濃度は、約３．９７μｇ／Ｌ〜約３９６．５μｇ／Ｌ、および別の態様では、約７．９３μｇ／Ｌ〜約１９８．２５μｇ／Ｌである。モリブデン源としては、Ｎａ2ＭｏＯ4、ＣａＭｏＯ4、ＦｅＭｏＯ4およびそれらの混合物が挙げられる。
本組成物は、錯化剤も含んでもよい。この態様では、本組成物が約５．２以上のｐＨを有する場合、錯化剤が、組成物に含まれてもよい。錯化剤としては、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）、エチレンジアミン二コハク酸（ＥＤＤＳ）およびそれらの混合物を挙げることができる。
【００２０】
本組成物は、ＮＨ4+、Ｐ、Ｋ、Ｆｅ、Ｎｉ、Ｃｏ、Ｓｅ、ＺｎまたはＭｇの供給源のうちの１種または複数を含んでもよい。これらの元素の各々の供給源は、以下の通りとすることができる。
ＮＨ4+：窒素は、水酸化アンモニウム、塩化アンモニウム、リン酸アンモニウム、硫酸アンモニウム、硝酸アンモニウムおよびそれらの混合物からなる群から選択される窒素源から供給され得る。
Ｐ：リンは、リン酸、リン酸アンモニウム、リン酸カリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択されるリン源から供給され得る。
Ｋ：カリウムは、塩化カリウム、リン酸カリウム、硝酸カリウム、硫酸カリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択されるカリウム源から供給され得る。
Ｆｅ：鉄は、塩化第一鉄、硫酸第一鉄およびそれらの混合物からなる群から選択される鉄源から供給され得る。
Ｎｉ：ニッケルは、塩化ニッケル、硫酸ニッケル、硝酸ニッケルおよびそれらの混合物からなる群から選択されるニッケル源から供給され得る。
Ｃｏ：コバルトは、塩化コバルト、フッ化コバルト、臭化コバルト、ヨウ化コバルトおよびそれらの混合物からなる群から選択されるコバルト源から供給され得る。
Ｓｅ：セレンは、Ｎａ2ＳｅＯ3、Ｃ3Ｈ6ＮＯ2Ｓｅおよびそれらの混合物から供給され得る。
Ｚｎ：亜鉛は、ＺｎＳＯ4から供給され得る。
Ｗ：タングステンは、タングステン酸ナトリウム、タングステン酸カルシウム、タングステン酸カリウムおよびそれらの混合物からなる群から選択されるタングステン源から供給され得る。
Ｍｇ：マグネシウムは、塩化マグネシウム、硫酸マグネシウム、リン酸マグネシウムおよびそれらの混合物からなる群から選択されるマグネシウム源から供給され得る。
Ｓ：本組成物は、硫黄も含んでもよい。硫黄は、システイン、硫化ナトリウム、ＮａＨＳ、ＮａＨ2Ｓおよびそれらの混合物からなる群から選択される硫黄源から供給され得る。
【００２１】
発酵始動および始動後
始動：接種に際して、微生物の初期集団を供給するのに有効な、最初の供給ガスの供給速度が確立される。流出ガスの内容物を決定するために、流出ガスが分析される。ガス分析の結果を使用して、供給ガスの速度を制御する。この態様では、本方法は、１リットルあたり約０．１グラムの最小細胞密度をもたらす。別の態様では、本方法は、約０．０５〜約０．５、および別の態様では、約０．０１〜約１となる、初期細胞密度に対する計算したＣＯ2濃度（ｍｍｏｌ／分）の比を実現する。
一態様では、栄養素が培養物に添加されて、細胞成長速度を増大させることができる。好適な栄養素は、酵母エキスの非炭水化物画分を含んでもよい。
【００２２】
始動後：所望のレベルに到達すると、液相および細胞物質が、反応器から抜き取られ、培地が補充される。発酵プロセスは、開始細胞密度と比較した、細胞密度の増大に有効である。この態様では、本方法は、約２〜約５０グラム／リットル、別の態様では、約２〜約３０グラム／リットル、別の態様では、約２〜約２０グラム／リットル、別の態様では、約２〜約１０グラム／リットル、および別の態様では、約２〜約６グラム／リットルとなる平均細胞密度を実現する。
有機酸の生成：別の態様では、本方法は、Ｃ１−Ｃ１０有機酸源をもたらす。この態様では、本方法は、酸生成物、または発酵液体ブロスからの生成物を得るステップを含んでもよい。この態様では、約０．２〜約５０グラムの有機酸／リットル／日／ｇ細胞、別の態様では、約０．２〜約２０グラムの有機酸／リットル／日／ｇ細胞、別の態様では、約１０〜約５０グラムの有機酸／リットル／日／ｇ細胞、別の態様では、約１４〜約３０グラムの有機酸／リットル／日／ｇ細胞、別の態様では、約２〜約２０グラムの有機酸／リットル／日／ｇ細胞、および別の態様では、約１５〜約２５グラムの有機酸／リットル／日／ｇ細胞の有機酸比生産性を実現する。一態様では、有機酸は、酢酸、または酪酸、または両方の混合物である。
ＣＯ2およびＨ2の変換：本方法は、約０．０５〜約１．５ｍｍｏｌのＣＯ2／分／グラム乾燥細胞のＣＯ2取込み、約０．０８〜約１．５ｍｍｏｌのＨ2／分／グラム乾燥細胞のＨ2取込みを実現するのに有効である。本方法は、約２５〜約１００％のＣＯ2の変換率、別の態様では、約５０〜約１００％のＣＯ2の変換率、別の態様では、約７５〜約１００％のＣＯ2の変換率を実現するのに有効である。別の態様では、本方法は、約２５〜約１００％のＨ2の変換率、別の態様では、約５０〜約１００％のＨ2の変換率、別の態様では、約７５〜約１００％のＨ2の変換率を実現するのに有効である。
図１は、アセトバクテリウム・ウッディイによる、ＣＯ2変換率１０４、およびＨ2変換率１０２のグラフを示す。時間に対する、酢酸生成２０４、およびその移動平均２０２、および細胞密度２０６のグラフによる例示が、図２に示されている。
【実施例】
【００２３】
（実施例１）
アセトバクテリウム・ウッディイの調製
アセトバクテリウム・ウッディイの最初の凍結乾燥ペレットをドイツ微生物株保存機関ＤＳＭＺの株ＩＤ  ＤＳＭ−１０３０から得た。培養物を、リッチ培地（フルクトースおよび酵母エキス）を使用して、凍結乾燥ペレットから最初に得た。順応法を使用して、血清ボトル培地からフルクトースを除去し、この場合、成長培地中のフルクトースの濃度を、７５％、５０％、１０％と段階的に低下させた。成長速度およびガスの利用量を、順応の指示体として使用した（約５週間）。血清ボトル中の事前ｐＨ順応作業により、必要なｐＨを７．４から６．０に低下させた（３週間）。この時点で、培養物が増幅され、反応器に接種した。反応器中で、培養物をさらに順応させて、５．２〜５．７というより低いｐＨで成長させた。
【００２４】
（実施例２）
アセトバクテリウム・ウッディイの場合のＣＳＴＲ反応器の始動方法
ＣＯ2およびＨ2を含有する合成ガスを、本明細書に記載されている、ビタミン、微量金属、システイン（硫黄源として）および塩を含有する液状培地と共にアセトバクテリウム・ウッディイを含有する撹拌槽式バイオリアクターに連続的に導入した。
活発に成長中のアセトバクテリウム・ウッディイと共に、発酵培地を含有するＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｂｉｏｆｌｏｗ３１０反応器を始動した。反応器の撹拌速度は、２００ｒｐｍに設定した。この撹拌速度は、実験全体を通じて、２００から６００ｒｐｍへと向上させた。反応器への供給ガス流量は、４９ｍＬ／分の初期値から１３７ｍＬ／分へと向上させた。バイオリアクター中の温度は、実験全体にわたり、３３．５℃に維持した。バイオリアクターへの合成ガス供給材料の試料、およびバイオリアクターからの排ガス、およびバイオリアクター中の発酵ブロスを一定間隔で採取し、例えば、供給ガス、排ガスおよび発酵ブロスを、それぞれ、ほぼ毎日、２時間で１回、および４時間で１回サンプリングした。上記の試料の様々なガス構成成分の消費量または生成量、ブロスの酢酸濃度、および培養物の光学密度（細胞密度）を分析した。反応器の未使用の容積（ｕｎａｒｏｕｓｅｄ  ｖｏｌｕｍｅ）を、実験全体を通して、１６００〜１７５０ｍｌの間に維持した。同様に、反応器へのガス流量は、反応器への合成ガスを調節するマスフローコントローラーによってリアルタイムに測定した。供給合成ガス組成は、７０％のＨ2、２５％のＣＯ２および５％のＮ２とした。この実験を安定な操作が到達されると結論付けを行った。
【００２５】
細胞リサイクルシステム（ＣＲＳ）を反応器に取り付けた後に、実験を開始した。実験中に、反応器への栄養素（成長培地）の流速は、表に示されている通りとした。実験全体を通して、培地の供給速度を維持した。ｐＨ制御のための塩基（ＮａＯＨ）の供給速度は、０．１４〜０．４４ｍｌ／分とし、ＣＲＳにより、５．１〜５．４ｍＬ／分の透過物を反応器から抜き出した。
供給ガス中のＨ2およびＣＯ2は、細胞物質および酢酸に固定した。Ｈ2およびＣＯ2の除去は、入り口のガス組成を流出ガス組成と比較することによって計算した。構成成分ガスの取込みは、細菌によって変換されたガス分子の％で表す。この実験では、以下の変換率が実現された；Ｈ2：４０％〜５４％、ＣＯ2：２８％〜７０％。この実験では、酢酸生成の速度は、５〜２３ｇ／ｌ／日であった。
【００２６】
結果を以下の通り、要約することができる：
【表２】
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【００２７】
（実施例３）
アセトバクテリウム・ウッディイによるＣＯ2、ＣＯおよびＨ2の発酵
ビタミン、微量金属および塩を含有する慣用的な液状培地と共に、アセトバクテリウム・ウッディイを含有する撹拌槽式バイオリアクターに、ＣＯ2およびＨ2を含有するガスを連続的に導入した。発酵は、実施例２に記載されている通りに開始し、次に、安定な操作まで継続した。培地およびプロセス条件は、実施例２に記載されている。この実施例では、供給ガスは、５モル％のＣＯを含んだ。
図３および図４は、５％のＣＯの存在下での、アセトバクテリウム・ウッディイの成長を説明している。図３は、時間に対する、細胞密度３０２および酢酸の比生産性３０４を例示している。図４は、Ｈ2の変換率４０２、ＣＯの変換率４０４、ＣＯ2の変換率４０６および細胞密度４０８を例示している。
【００２８】
（実施例４）
成長培地中のキレート剤（ＥＤＴＡ）を含まない、ｐＨ５．２でのアセトバクテリウム・ウッディイ培養物の成長および維持
ＣＯ2およびＨ2を含有するガス流は、本明細書に記載されている成長培地と共に、アセトバクテリウム・ウッディイを含有する撹拌槽式バイオリアクターに連続的に導入した。
活発に成長中のアセトバクテリウム・ウッディイ（ＡＷ）と共に、発酵培地を含有するＮｅｗ  Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ  Ｂｉｏｆｌｏｗ１１５反応器を始動した。反応器の撹拌速度は、６００ｒｐｍに設定した。この撹拌速度は、実験全体を通して、一定に維持した。反応器への供給ガス流量は、３６．６ｍＬ／分〜４４．４ｍＬ／分に維持した。バイオリアクター中の温度は、実験全体にわたり、３３℃に維持した。Ｎａ＋レベルは、３５００〜４０００ｐｐｍに維持した。バイオリアクターへのガス供給材料の試料、およびバイオリアクターからの排ガス、およびバイオリアクター中の発酵ブロスを一定間隔で採取し、例えば、供給ガス、排ガスおよび発酵ブロスを、それぞれ、ほぼ毎日、２時間で１回、および４時間で１回サンプリングした。上記の試料の様々なガス構成成分の消費量または生成量、ブロスの酢酸濃度、および培養物の光学密度（細胞密度）を分析した。反応器の未使用の容積を、実験全体を通して、１９００〜２２７５ｍｌの間に維持した。同様に、反応器へのガス流量は、反応器への合成ガスを調節するマスフローコントローラーによってリアルタイムに測定した。この実験の供給合成ガス組成は、７０％のＨ2、２５％のＣＯ2および５％のＮ2とした。
【００２９】
細胞リサイクルシステム（ＣＲＳ）を反応器に取り付けた後に、実験を開始した。実験中に、反応器への栄養素（成長培地）の流速は、２．８ｍｌ／分に維持した。実験全体を通して、培地の供給速度を維持した。ｐＨを５．２に維持するための塩基（ＮａＯＨ）必要量の平均速度は、０．０７５ｍｌ／分であり、ＣＲＳにより、２．９ｍｌ／分の透過物を反応器から抜き取った。
供給ガス中のＨ2およびＣＯ2は、細胞物質および酢酸に固定した。Ｈ2およびＣＯ2の除去は、入り口のガス組成を流出ガス組成と比較することによって計算した。構成成分ガスの取込みは、細菌によって変換されたガス分子の％で表すことができる。
以下の変換率が達成された：
Ｈ2：２８％〜５４％。
ＣＯ2：４０％〜５９％。
酢酸生成の速度は、０．７９４９（ｇ／Ｌ／日）であった。
培養物の平均細胞密度は、１．９ｇ／Ｌであった。
ＣＯ2変換率５０２、Ｈ2変換率５０４および細胞密度５０６が図５に示されている。
【００３０】
（実施例５）
成長培地におけるＥＤＤＡの使用
発酵を実施例２に記載されている通りに開始し、キレート（錯化）剤として、エチレンジアミン二酢酸（ＥＤＤＡ）の使用を含んだ。ＡＷ培地に使用した金属の一部の溶解度は、ｐＨの向上と共に低下するので、キレート剤は、溶液中に金属を維持するために使用する。反応器ブロスのｐＨが、ｐＨ５．２を超えると、十分量の栄養素をＡＷに供給するために、キレート剤を使用する。図６は、代表的な９６時間の実験を示しており、この実験は、酢酸６０４の濃度の向上を生じると同時に、細胞密度６０２の維持が可能であることを例示している。
【００３１】
（実施例６）
細胞代謝に及ぼすモリブデン除去および再添加の影響
発酵は、実施例２に記載されている通りに開始し、次に、安定な操作になるまで継続した。成長培地からモリブデンを除去し、次に、酢酸生産性が、その開始濃度の７５％まで低下した後に、成長培地に再添加した。
図７は、その培地の流速７０５に対してプロットした酢酸生産性７０３を例示しており、垂直線は、成長培地からのモリブデンの除去および成長培地へのモリブデンの再添加を示している。約８１０累積時間時に開始し、ＨＡｃの下落傾向が観察され、モリブデンの除去は、約７９５累積時間時に行った。この下落傾向は減少して、頭打ちし、次に、約９００時間時に培地にモリブデンを再添加したことに対応して、上昇傾向へと反転した。
【００３２】
図８は、時間に対してプロットした細胞密度８０１およびガス流速（ＧＦＲ）８０６を例示しており、垂直線は、成長培地からのモリブデンの除去および成長培地へのモリブデンの再添加を示している。約８４０累積時間において開始し、必要なＧＦＲは、約７９５累積時間時に行ったモリブデン除去により低下した。この下落傾向は、約９００時間時に培地にモリブデンを戻したことに対応して、上昇傾向へと反転した。
本明細書に開示されている開示は、特定の実施形態、それらの実施例および用途により説明されているが、特許請求の範囲に説明されている本開示の範囲から逸脱することなく、当業者によって多数の修正および改変が本開示に行われ得る。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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