(57)【要約】本発明は、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）酵素、ＧＴ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は、操作されたスクロースシンターゼ（ＳｕＳ）酵素、ＳｕＳ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は、ＧＴ酵素を含む組成物、およびβ−グルコース結合を有する産物を作製するために操作されたＧＴ酵素を使用する方法を、さらに提供する。
2021532757.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号２に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２】
配列番号２０に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性であるポリペプチドを含む、請求項１に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、４１／７２／２３３／３３８、４１／７２／３３８、４１／１４４／２３３、４１／２３３、４１／２３３／３３８、６１、６１／８７／９１／１０７、６１／８７／９１／２５９、６１／９１／４３１、６１／１０７、６１／２５９／４２８、６１／４０７／４２８、６１／４１１、７２、７２／７６、７２／７６／１６３／１９７、７２／７６／１９５／２３３、７２／７６／１９７／２０４、７２／７６／２０７／２３３、７２／７６／２０７／３３８、７２／８１、７２／８１／１９５／２３３、７２／１３９／１９５／２０４、７２／１４４／３３８、７２／２００／２０４／２０７、７２／２０７、７６／１４４／１９７／２００、７６／１９５／１９７／２０４／２０７／２３３、７６／１９７／２０７／２３３、７６／２３３、８１／１３９／１４４／１９５／２００／２０４／２０７／２３３、８１／１４４／２３３、８１／１９７／２００／２０７／２３３／３３８、８１／２３３／３３８、８１／３３８、１０７、１０７／２５９、１３９／１４４／２３３、１４４／２３３、１４４／２３３／３３８、１５６／４０７、１６３／２３３／３３８、２００／２０４／２０７／２３３、２３３／３３８、および２５９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２０を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、７１、８０、８１、８１／２７０、８３、８５、９７、１２４、２６３、２８６、３３４、４０２、４２０および４５６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２０を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項５】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、４１／７２／２３３／３３８、４１／７２／３３８、６１、６１／９１／４３１、６１／２５９／４２８、６１／４０７／４２８、８１／１３９／１４４／１９５／２００／２０４／２０７／２３３および８１／１９７／２００／２０７／２３３／３３８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２０を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項６】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、７３／８１／１４４／２０７／２５９、７３／８１／１４４／２０７／２８５／４５１、７３／８１／２５９／２８５／４２６／４５１、７３／８１／２５９／４５１、７３／１１１／２８５／４５１、７３／１４４／２０７／２５２／４２６／４５１、７３／１４４／２０７／２５９／２８５／４２６／４５１、７３／１４４／２０７／２５９／２８５／４５１、７３／１４４／２０７／２５９／４２６／４５１、７３／１４４／２５９／２８５、７３／２５９／４２６／４５１、７３／２５９／４５１、８１／１１１／１４４／２０７／２８５／４５１、８１／１１１／２５９／４５１、８１／１４４／２０７／２５２／２８５／４２６、８１／１４４／２０７／２５９／４５１、８１／１４４／２５２／２５９／２８５／４５１、８１／１４４／２５９、８１／１４４／２５９／２８５、８１／１４４／２５９／４５１、８１／２０７／２５２／２５９／４５１、８１／２０７／２８５／４２６／４５１、８１／２８５、８１／２８５／４５１、１１１／１４４／２０７／２５２／２８５／４２６／４５１、１１１／１４４／２５２／２５９／２８５／４５１、１１１／１４４／２５９／２８５／４２６／４５１、１１１／２０７／２８５、１４４／２０７／２５２／２５９、１４４／２０７／２５９、１４４／２０７／２５９／２８５／４５１、１４４／２０７／２５９／４２６／４５１、１４４／２０７／２８５／４２６、１４４／２０７／４５１、１４４／２５２／２５９／２８５、１４４／２５２／２５９／２８５／４５１、１４４／２５２／２５９／４２６、１４４／２５２／２５９／４２６／４５１、１４４／２５９／２８５、１４４／２８５、１４４／２８５／４５１、１４４／４５１、２０７、２０７／２５２／２５９／４５１、２０７／２５２／４５１、２０７／２５９、２０７／２５９／４２６／４５１、２０７／２８５／４２６／４５１、２０７／４５１、２５２／２５９、２５９、２５９／２８５／４５１、２８５、および２８５／４５１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号３６を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項７】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、８１／１１１／１４４／２０７／２８５／４５１、１４４／２０７／２５２／２５９、１４４／２０７／２５９／２８５／４５１、１４４／２５２／２５９／４２６、１４４／２５２／２５９／４２６／４５１および１４４／２８５／４５１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号３６を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項８】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、８０／８１、８０／８１／８５、８０／８１／８５／２３８、８０／８１／８５／２５１／２５９、８０／８１／８５／２５２／２５６／２５９、８０／８１／８５／２５９、８０／８１／２５１／２５２／２５９、８０／８５、８０／８５／２３８、８０／８５／２３８／２５１／２５９、８０／８５／２５１、８０／８５／２５１／２５２、８０／８５／２５１／２５２／２５６／２５９、８０／８５／２５１／２５２／２５９、８０／８５／２５１／２５９、８０／８５／２５９、８０／２５９、８１／８５、８１／８５／２５１／２５２、８１／８５／２５９、８５、８５／２３８、８５／２５１、８５／２５１／２５２／２５６、８５／２５１／２５９、８５／２５６／２５９、１７５／４０２、２５１／２５２／２５９、２５９、２７０／４０２、および４２０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項９】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、３、５、７、９９、１５３、２３２／３１７、２５２、２７３、２９９、３２６、３９３、４０４、４０９、４２２、４４３、４５１および４５５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１０】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、８０／８１／８５、８０／８５、８０／８５／２５１／２５９、８５、８５／２５１／２５２／２５６、１７５／４０２および２７０／４０２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１１】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、８１／８５、８１／８５／１７５／２５９／４０２、８１／８５／２５１、８１／８５／２５１／２５９、８１／８５／２５９、８１／８５／２５９／４０２、８５、８５／１７５、８５／１７５／２５１、８５／１７５／２５１／２５９／４０２、８５／１７５／２５９、８５／１７５／２５９／４０２、８５／１７５／４０２、８５／２５９、８５／２５９／４０２、および８５／４０２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号４０６を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１２】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１５３、１５３／３２６、１５３／３２６／４４３、１５３／３２６／４４３／４５５、２３２、２３２／２７３／２９９、２３２／３９３／４５１、２９９／４５１、３２６、４０４および４５１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１３】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、２５、１１６、１４６、１７０、１７３、２２７、２９６、３００、３１５、３２７、３３０、３６１、４０８、４１２、４３８、４４８および４４９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１４】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１５３、２３２、２３２／３９３／４５１および４５１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１５】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１４６／１７０／１９６、１４６／１７０／１９６／２３２、１４６／１７０／１９６／２３２／４２３、１４６／１７０／１９６／２３２／４５１／４５５、１４６／１７０／１９６／４０８／４５１、１４６／１７０／２３２、１４６／１７０／２３２／４２３、１４６／１７０／２３２／４２３／４４８／４５１／４５５、１４６／１７０／２５９、１４６／１９６、１４６／１９６／２３２、１４６／１９６／２３２／２５９／４４８／４５１、１４６／１９６／４５５、１４６／２３２／２５９／４５５、１４６／２３２／３１５、１４６／２３２／３１５／４２３／４５１／４５５、１４６／２３２／３２６、１４６／２３２／４４８、１４６／２３２／４５１、および１４６／４１３／４５１／４５５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１６】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、９、１２、１０７、１３１、１５６、１６１、１６９、１９９、２０４、２０９、２３３、２６２、２８９、３３７および４１７から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１７】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１４６／１７０／１９６、１４６／１７０／１９６／２３２、１４６／１７０／１９６／２３２／４５１／４５５、１４６／１７０／２３２、１４６／１７０／２３２／４２３／４４８／４５１／４５５、１４６／１９６／２３２、１４６／１９６／２３２／２５９／４４８／４５１および１４６／２３２／４４８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１８】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、９／１２／１０７／１６１／１９９／２０９／３３７、９／１２／１６１／１６９／１９９／２０９／３３７、９／１２／１９９／２０４／２０９／３３７／４５５、９／１２／１９９／２０９／３３７／４５１／４５５、９／１０７／１３１／２０４／２５９／４１７／４５１、９／１０７／１５６／１６１／１９９／２０４／４１７／４５５、９／１０７／１６１／２０９／２５９／２８９／４５１／４５５、９／１３１／１５６／２０９／２８９／３３７、９／１３１／２０４／３３７／４５１、９／１５６／１６９／２０４／３３７、９／１６９／２０４／２８９／３３７／４５１／４５５、９／２０４、９／２０４／２５９／２８９、９／３３７、１２／１４／１０７／２０４／２８９／４５５、１２／１０７／１３１／２０４／２８９／３３７／４１７／４５１／４５５、１２／１０７／１５６／２０９／２８９／４５５、１０７／１６１／１６９／１９９／２０４／２５９／４５１、１０７／１９９／２０４／２８９、１０７／１９９／２０９／２５９／４５１／４５５、１０７／２０４、１５６／１６９／１９９／２０４／２０９／２５９／２８９、１６１／２０４／４１７、２０４／４５１／４５５、２８９、および４５１／４５５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項１９】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１６、５３、５４、７８、８０、９５、１１１、２２１、２５７、３３６、３４９、３９１、４１０、４１３、４２６および４３０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２０】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、９／１２／１９９／２０４／２０９／３３７／４５５、９／１３１／１５６／２０９／２８９／３３７、９／２０４、１２／１４／１０７／２０４／２８９／４５５、１０７／１６１／１６９／１９９／２０４／２５９／４５１、１０７／１９９／２０４／２８９および２０４／４５１／４５５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２１】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１６、１６／５９／８０／４１３、１６／８０、１６／８０／１１１、１６／８０／１１１／２５７、１６／８０／２２１／２５７／３３６／４１０、１６／８０／２２１／３３６／４１０、１６／８０／２５７、１６／１１１／２２１、１６／１１１／２２１／２５７／３９１、１６／２２１、１６／２２１／２５７、１６／２２１／２５７／３３６／３９１、１６／２２１／４１０、１６／２５７、１６／２５７／３３６／４１３／４２０、８０／１１１／２２１／２５７／４１０、１１１／２２１／２５７／３３６／３９１、１１１／２２１／２５７／３９１、２２１、および２２１／２５７から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２２】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、５、７、１４、６５、９１、９９、１０２、１１８、１３８、１９４、２５４、２８６、４１６、４１８および４２０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２３】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１６／８０／２２１／２５７／３３６／４１０、１６／１１１／２２１、１６／２２１／２５７、１６／２２１／４１０、１６／２５７、８０／１１１／２２１／２５７／４１０および２２１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２４】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、５、５／１４／９９、５／１４／４１６、５／９１、５／９１／１０２／１１８、５／９１／１０２／２５４／４１８、５／９１／１０６／２５４／２８６、５／９１／１１８／１９４／２５４／２８６、５／９１／１１８／１９４／２５４／４１８、５／９１／１１８／１９４／４１８、５／９１／１１８／２５４／２８６／４１８、５／９１／１１８／２８６、５／９１／１９４／２５４、５／９１／１９４／４１８、５／９１／２５４、５／９１／２５４／２８６、５／１０２／４１８、５／１１８／１９４／２８６／４１８、５／１１８／２５４、５／１１８／２８６、５／１９４、５／２５４／２８６、５／４１８、７／１４、７／１４／６５／９９、７／１４／９９／４１６、１４、１４／６５／９９／４１６、１４／９９、１４／９９／２５４、１４／９９／２５４／４１６、１４／９９／２５４／４１６／４５５、１４／９９／４１６、１４／１６７、１４／２５４、１４／４５５、９１、９１／１０２／１９４、９１／１１８、９１／１１８／１９４、９１／１１８／１９４／２８６、９１／１１８／１９４／４１８、９１／１１８／２８６、９１／１９４／２５４／２８６、９１／２８６、および１１８／２８６／４１８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号６７８を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２５】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、５／９１／１０６／２５４／２８６、５／９１／１１８／２８６、５／９１／２５４／２８６、１４、１４／６５／９９／４１６、１４／９９および１４／９９／２５４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号６７８を基準にして番号が付けられている、請求項２に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２６】
配列番号１２に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２７】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１６、１６／１２７／１６９、１６／１３４、１６／１４３／４２３、１６／１６９、１６／１６９／３９８／３９９、１６／１６９／４２３、１６／３９８、１６／３９８／３９９、１６／３９８／４２７、１６／４２３、１６／４２３／４２７、１３４、１４３、３９９／４２３および４２３／４２７から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２４を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２８】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、３、８、１１、４１、４４、５６、６０、１２２、１３５、１３７、１３８、１３９、１５８、１６４、１７６、２２１、２３２、２３３、２３５、２４８、２４９、２８１、２８４、２８５、３０１、３２２、３７２、３９２、４００、４２１、４２６、４２７、４３３、４４０、４４３および４４６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２４を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項２９】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１６、１６／１２７／１６９および１６／１６９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２４を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３０】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、３／２２／１９８／４２１、３／２２／４２１、３／２０１／２４８／３２２、３／２０１／２４８／３２２／３９２、１３／２３３／３３１／４４０、１３／４４０／４４３、２２／３２／５６／６０／１９８／２４８／３２２／３９２／４２１、２２／５６、２２／５６／１３７／１９８／２０１／２４８／３２２／３９２、２２／５６／１３７／１９８／２４８／３９２／４２１、２２／５６／１３７／３２２、２２／５６／１３７／３２２／３９２／４２３、２２／５６／１９８／２０２／２４８、２２／５６／１９８／２４８／３２２／３９２／４２１、２２／５６／１９８／２４８／４２１／４２３、２２／５６／４２１／４２３、２２／６０／３９２／４２１、２２／１３７、２２／１３７／１９８／２０２／２４８、２２／１９８／２０２／２４８／３９２、２２／２４８／３９２、２２／３９２、２２／４２１、２２／４２１／４２３、２２／４２３、４４／１６４／２３３、４４／１６４／２３３／３２９／３３１、４４／３３１、１２５、１２５／２３３／４４３／４４６、１６４／２２１／２３３／３３１／４４０／４４６、１６４／２３３／３３１／４４０、１６４／２３３／４４６、１６４／３３１、１６４／４４０、１６４／４４３、１９８／２０２／３９２、２２１／３２９／３３１、２３３、２３３／４４６、３２９、４２１／４２３、および４４３／４４６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号８５８を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３１】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、３／２２／１９８／４２１、１３／４４０／４４３、２２／５６／１９８／２０２／２４８、２２／１３７、２２／１９８／２０２／２４８／３９２、１６４／２２１／２３３／３３１／４４０／４４６、１６４／２３３／３３１／４４０および２３３／４４６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号８５８を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３２】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、８３／２０２／２３３、１６４、１６４／２０２、１６４／２０２／２３３／３３１、１６４／２０２／２４８／２７２、１６４／２０２／３３１、１６４／２０２／３３１／４２３、１６４／４２３、２０２／２３３、２０２／２３３／２４８、２０２／２３３／２４８／４２３、２０２／２４８、２０２／３３１、２０２／４２１／４２３、２０２／４２３、２０２／４４６、２３３、２４８、および４２３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３３】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、７、９、１０、５４、７３、８４、１０６、１１５、１１６、１３２、１６５、２８６、３０９、３８９、４０６、４２２および４３８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３４】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、８３／２０２／２３３、１６４、１６４／２０２、１６４／４２３、２０２／２３３／２４８および２３３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３５】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、７／９／７３／１６５／２８６、７／９／１６５／２８６、７／９／４２２、７／１１６／１６５／２８６、７／１６５、９／７３／１１６／１６５／２８６／４２２、９／２８６／３８９、５４、５４／８４、５４／４０６、７３、７３／１１６／１６５／２８６／３８９、７３／１１６／２８６、７３／１１６／２８６／４２２、７３／１６５／２８６、７３／２８６／３８９、７３／２８６／４２２、７３／４２２、８４、１１５、１１６、１１６／１６５、１１６／１６５／２８６／４２２、１１６／３８９、１６５、１６５／２８６、１６５／３８９、１６５／３８９／４２２、２８６、２８６／４２２、３８９／４２２、および４２２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３６】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１８５／１９０、２１９、２２０、２５５、２５７、３０２、３８５、３９５、３９５／４３７、３９９、４０１、４０９、４１２、４１６、４３４、４４１、４４５、４４７および４４９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３７】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、９／７３／１１６／１６５／２８６／４２２、５４、５４／８４、５４／４０６、７３／１１６／２８６／４２２、１１６／１６５／２８６／４２２および２８６／４２２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３８】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、５４、５４／１８５／１９０、５４／１８５／１９０／２１９／２５７／３０２／３８５／３８９／３９５／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／２１９／３８５、５４／１８５／１９０／２１９／３８５／３８９／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／２１９／３８５／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／２１９／３８５／４４５／４４７、５４／１８５／１９０／２１９／３８９／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／３０２、５４／１８５／１９０／３０２／３９５／３９９、５４／１８５／１９０／３８５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／３８９／３９５、５４／１８５／１９０／３８９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／３８９／４４５、５４／１８５／１９０／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／２１９／３８９、５４／１８５／２５７／３８９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／３０２／３８５／３９９／４４５／４４７、５４／１８５／３８５／３８９／３９５／４４１／４４５／４４９、５４／１８５／３８５／３９５／３９９／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／３８９／３９５／４４５／４４７、５４／１９０／２１９／２５７／３０２、５４／１９０／２１９／２５７／３９５／４４５／４４７／４４９、５４／１９０／２５７、５４／１９０／２５７／３０２／３９９、５４／１９０／２５７／３０９／３８５／３８９／３９５／３９９／４４５、５４／１９０／２５７／３８５／３８９、５４／１９０／２５７／３９５／４４５／４４９、５４／１９０／３０２／３８９、５４／１９０／３０２／３８９／３９５／３９９／４４５／４４７、５４／１９０／３８５／３８９／３９５／４４１／４４５、５４／１９０／３８５／３９５、５４／１９０／３８５／４４５／４４７／４４９、５４／１９０／３９５、５４／１９０／３９５／４４５／４４７、５４／２１９／３０２／３９５／４４１／４４５／４４７、５４／２１９／３８５／３８９／３９５／４４１／４４５／４４７、５４／２５７、５４／２５７／３８５／４４９、５４／２５７／３８９、５４／２５７／３９９、５４／２５７／４４１／４４７、５４／２５７／４４１／４４９、５４／３０２／３８５／３９９／４４１／４４５／４４７、５４／３０２／３８５／３９９／４４１／４４５／４４９、５４／３８５、５４／３８５／３８９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／３８９／３９５／３９９／４４７／４４９、１８５／１９０／２１９／２５７／３８９／３９５／４４５／４４７、１８５／１９０／２５７／３０２／３９５／４４１／４４５／４４７、１８５／１９０／２５７／３８５／３８９／３９９、１８５／１９０／２５７／３８５／３９９／４４５／４４７、１８５／１９０／２５７／３８９／３９５、１８５／１９０／２５７／３８９／３９５／３９９／４４１／４４７／４４９、１８５／１９０／３８５／３８９／４４１／４４５／４４７、１８５／１９０／３８９／４４７／４４９、１８５／１９０／３９５／３９９、１８５／２１９／２５７／３９９／４４５／４４７、１８５／２５７／３８５／３９５／３９９／４４５／４４７、１８５／３０２／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７／４４９、１８５／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７、１９０／２１９／２５７／３８５／３８９／４４１／４４５／４４７／４４９、１９０／２１９／３０２／３８５／３９９／４４５、１９０／２５７／３０２／３８５／３９９、１９０／２５７／３８５／３８９／３９９、１９０／２５７／３８５／３８９／４４５／４４７、１９０／２５７／３８５／３９５、１９０／２５７／３８５／４４１／４４５／４４７／４４９、１９０／２５７／３８９／３９５／４４１／４４５／４４７、１９０／２５７／３９９／４４７／４４９、１９０／３０２／３８５／３８９／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７、１９０／３８９、２１９／２５７／３８５／３８９／３９５／４４１／４４７／４４９、２１９／２５７／３９５、２１９／３８５／３８９／３９９／４４５／４４９、２１９／３９５、２５７／３８５／３８９／３９９、２５７／３８９／３９５／３９９／４４５／４４７、２５７／３８９／３９５／３９９／４４５／４４９、２５７／３８９／３９９、３０２／３８９／３９５／４４５、３８５／３８９、３８５／３９５、３８９／３９５／４４５／４４７、３９５／３９９、および３９９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１２１６を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項３９】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、５、１４、９６、１０８、１５７、１８１、１８８、２７８、２９３および３４１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１２１６を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４０】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、５４／１８５／１９０／２１９／２５７／３０２／３８５／３８９／３９５／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／３８５／４４７／４４９、５４／１９０／２５７／３０２／３８５／３９５／３９９、５４／１９０／３０２／３８９／３９５／３９９／４４５／４４７、５４／２５７／３８５／４４９、５４／２５７／３８９、および５４／３８９／３９５／３９９／４４７／４４９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１２１６を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４１】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１４／４２／５１／１０８／１８１、１４／４２／５１／１５７／３４１、１４／４２／３４１、１４／５１／９６／１５７、１４／５１／９６／１５７／３４１、１４／５１／９６／３４１、１４／５１／１０８、１４／５１／３４１、１４／９６、１４／９６／１０８／１３３、１４／９６／１０８／１８１／３４１、１４／９６／１０８／１８８、１４／９６／３４１、１４／１０８／１５７、１４／１０８／１５７／１８８、１４／１５７／１８１／２７８、１４／２７８、４２／９６／１５７／３４１、４２／１８８／３４１、９６／１０８／１８１／２９３、９６／１０８／１８８、９６／１０８／１８８／３４１、９６／１８８、１８１、１８８、および２９３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４２】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１２２、１４４、１４７、１８７、１９６、１９７、１９８、１９９、２０１、２６８および３２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４３】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１４／４２／３４１、１４／９６、１４／９６／１０８／１３３、１４／９６／１０８／１８１／３４１および１８８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４４】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１４７／１８８／１９６／２０１、１５２／１８７／１８８／３２４、１５２／１８８、１５２／１８８／１９６／１９８／１９９／３２４、１５２／１８８／１９６／１９９、１５２／１８８／１９６／２０１／３２４、１５２／１８８／３２４、１８８、１８８／１９６／１９８／１９９／２０１、１８８／１９６／１９８／１９９／２０１／３２４、１８８／１９６／１９８／２０１、１８８／１９６／１９８／３２４、１８８／１９６／２０１、１８８／１９８／１９９／２０１／３２４、１８８／１９８／１９９／２６８、１８８／１９８／２０１／３２４、１８８／１９８／３２４、１８８／１９９／２０１、１８８／２０１、１８８／２０１／３２４、および１８８／３２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１５１６を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４５】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼの前記ポリペプチド配列が、１５２／１８８／１９６／１９８／１９９／３２４、１８８／１９６／１９８／１９９／２０１、１８８／１９６／１９８／２０１、１８８／１９６／２０１、１８８／１９８／１９９／２６８、１８８／２０１および１８８／３２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１５１６を基準にして番号が付けられている、請求項２６に記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４６】
ベータ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼおよびベータ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼから選択される、請求項１から４５のいずれかに記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４７】
ＡＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）、ＣＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ＧＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、ＴＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＴＧＴ）およびＩＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＩＧＴ）から選択される、ＮＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼである、請求項１から４６のいずれかに記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４８】
ＡＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼである、請求項１から４７のいずれかに記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項４９】
ウラシル二リン酸以外の糖ドナーを優先的に使用する、請求項１から４８のいずれかに記載の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ。
【請求項５０】
請求項１から４８のいずれかで提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
【請求項５１】
請求項５０に記載の少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項５２】
少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項５１に記載のベクター。
【請求項５３】
請求項５０に記載の少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項５４】
請求項５１および／または５２に記載の少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞。
【請求項５５】
真核生物および原核生物から選択される、請求項５３または５４に記載の宿主細胞。
【請求項５６】
請求項１から４５のいずれかで提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを産生するための方法であって、請求項５３から５５のいずれかに記載の宿主細胞を、前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼが前記宿主細胞により産生されるような条件下で培養するステップを含む、方法。
【請求項５７】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼを回収するステップをさらに含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
請求項１から４５のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを含む組成物。
【請求項５９】
配列番号６に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項６０】
配列番号２２に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項６１】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、３／５４８、４、７、１２、４１、４２、４４、４７、５２、５７、５９、７１、８１、８５、９３、９７、１２２、１２９、１３４、１３６、１３９、１５４、１７５、２１５、２６６、２７０、３４３、３５８、３８１、３８８、４３４、４４２、５１９、５２４、５３２、５３６、５７０、５８９、６０３、６０６、６１５、６３５、６４１、６５２、７２４、７２７、および７３８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項６２】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、４１、５２、１３４、３８１、４４２、５１９、５２４および７２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項６３】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、２５／４４／５２／１３４／４３４／７２４、４１／４４／５２／９７／４４２／７１９／７２４、４１／４４／５２／１３４／４４２、４１／４４／５２／４３４／４４２／５３２／７２４、４１／４４／５２／４３４／７２４、４１／４４／１３６／３２９、４１／４４／１３６／４４２、４１／４４／５３２、４１／５２／９７／４３４／４４２／５３２／７２４、４１／５２／１３４／１３６／４３４、４１／５２／１３４／４４２／７２４、４１／５２／１３６、４１／５２／４３４、４１／５２／４３４／４４２、４１／５２／４３４／４４２／７２４、４１／５２／４４２、４１／９７／１３４／４３４／４４２／５３２／５５３、４１／１３４／４４２／５３２、４１／３２９／４４２、４１／４３４／４４２／５３２、４１／４３４／４４２／５３２／７２４、４１／４３４／５３２、４１／５３２、４４／５２／９７／４３４／４４２／７２４、４４／５２／９７／４４２／７２４、４４／５２／１３４／１３６／３２９／４３４／４４２／５３２、４４／５２／１３４／４３４／５３２、４４／１３６／３２９／４３４／５３２、４４／１３６／５３２、４４／４３４／４４２／５５３、５２、５２／９７、５２／９７／４３４／４４２、５２／９７／４４２、５２／９７／５３２、５２／１３４、５２／１３４／１３６／４３４、５２／１３４／１３６／４４２、５２／１３４／３２９／４３４、５２／１３４／３２９／５３２、５２／１３４／４３４／４４２／５３２／５５３、５２／１３４／４４２／７２４、５２／１３６、５２／１３６／４３４、５２／１３６／４３４／４４２、５２／１３６／４３４／４４２／５３２、５２／１３６／４３４／７２４、５２／１３６／４４２、５２／４３４、５２／４３４／４４２／５３２、５２／４３４／４４２／７２４、５２／４３４／５３２、５２／４４２、５２／４４２／５３２／７２４、５２／４４２／５５３／７２４、５２／４４２／７２４、５２／５３２、５２／５５３、５７／９７／４３４／４４２／７２４、９７／１３４／１３６／４４２／５３２、９７／１３４／１３６／５３２、９７／１３４／４４２、９７／１３６／４３４／４４２、９７／３２９／７２４、９７／４４２、１３４、１３４／１３６／４３４／４４２、１３４／１３６／４３４／４４２／５３２／５５３／７２４、１３４／１３６／４３４／４４２／５５３／７２４、１３４／１３６／４３４／５３２／７２４、１３４／１３６／４４２／５３２、１３４／４３４／４４２／７２４、１３６、１３６／４４２、１３６／４４２／７２４、１３６／５３２／７２４、４３４、４３４／４４２、４４２、４４２／７２４、および５３２／７２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項６４】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、３、４、２２、３２、３４、３８、４７／４８８、５１、５１／４３３、６２、７５／１６９、１０１、１６９、１９５／２１３、７０８および７１８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項６５】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、４４／５２／９７／４４２／７２４、５２／９７／４４２、９７／４４２および４３４／４４２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項６６】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、４／２２、４／２２／３４、４／２２／３４／３８、４／２２／３４／３８／１６９／７０８、４／２２／３４／４７／５１／１６９／２１３、４／２２／５１／７０８、４／２２／１０１、４／３４／３８／１０１、４／３４／７０８、４／６２／４３３／７０８、４／１６９、４／１６９／４３３、４／１６９／７０８、４／４３３、４／７０８、２２／３４、２２／３４／３８、２２／３４／１０１／１６９、２２／３４／１０１／１６９／１９５、２２／３４／１６９／７０８、２２／４７／１６９／４３３、２２／７５、３４／３８／６２、３４／６２／１６９／４３３、３４／１０１、６２／７０８、７５／１６９、１６９／７０８、および１９５／７０８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項６７】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、４、２２、３４、１２１、１６９、３４１、４１１、４３３、４４１、５１８、５２６、５２７、５２８、５４４、５５７、５５８、５６５、５８５、６０２、６０４、６２３、７０８、７３１および７７０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項６８】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、４、４／２２／３４／３８、４／１６９、４／１６９／４３３、４／４３３、６２／７０８および１６９／７０８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項６９】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、３４／６２／４１１／５２６／５５７、３４／６２／４１１／５５７／６０２／６０４、３４／６２／４４１／５５７／６２３、３４／６２／５１８／６２３、３４／６２／６２３／７３１、３４／１２１／４４１／５４４／６０４／６２３、３４／１２１／５２６／６０４／７３１、３４／４１１／４４１、３４／４１１／４４１／５１８／５２６／５５７／５６５／７３１、３４／４１１／４４１／５１８／５４４／５５７／５６５／７０８／７３１、３４／４１１／４４１／５１８／５８５／６０４／７７０、３４／４４１／５１８／５２６／５８５／６０４／７３１、３４／４４１／５２６／５６５／７０８／７７０、３４／４４１／５４４／５５７／５８５／６０２／６２３、３４／４４１／５８５／６２３／７０８／７３１、３４／５２６／５８５／６２３、６２／１２１／３２９／５１８／５５７／５６５／６２３／７０８、６２／１２１／４１１／４４１／５１８／５４４／５５７／５８５／６０４／６２３、６２／１２１／４４１／５１８／５２６／６２３／７７０、６２／１２１／４４１／５６５／５８５、６２／１２１／５１８／５５７／５８５／６０４／７０８／７７０、６２／４１１／５２６／５６５／６０４／６２３、６２／４１１／５８５／７３１、６２／４４１／５１８／５５７／６０４／６２３／７０８／７３１、６２／４４１／６２３／７０８／７７０、６２／４４１／７７０、１２１／４４１／５１８／５２６／６０２／６０４、１２１／４４１／５１８／５２６／６２３／７０８、１２１／４４１／５２６／５５７／５６５／７０８、１２１／６０４／７０８／７３１／７７０、４１１／４４１／５１８／５５７／６２３、４１１／４４１／５１８／７０８、４１１／４４１／６０４／６２３／７０８／７３１、４１１／５１８／５２６／６０４／６２３／７３１、４１１／５６５／６０４／６２３、４１１／５８５／６２３、４４１／５１８／５２６／５５７／５６５／６０２／６０４／６２３／７０８、４４１／５１８／５２６／５５７／５８５／６０４／６２３／７０８、４４１／５１８／５２６／６０４／６２３、４４１／５１８／５５７／５６５／５８５、４４１／５１８／５６５／６２３／７３１／７７０、４４１／５１８／５８５、４４１／５８５、４４１／５８５／６０２／６０４／６２３／７０８／７３１、４４１／７０８／７３１、５５７／６０２／６０４、５５７／６０４、５８５／６２３／７０８、および６２３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項７０】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、６３、６５、２６９、３２３、４０６、４１６、４６９、５１１および６４０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項７１】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、３４／６２／４４１／５５７／６２３、３４／４４１／５８５／６２３／７０８／７３１、６２／４４１／６２３／７０８／７７０、４１１／４４１／５１８／５５７／６２３、４１１／４４１／６０４／６２３／７０８／７３１、４４１／５１８／５２６／５５７／５８５／６０４／６２３／７０８、４４１／５１８／５５７／５６５／５８５、および４４１／５８５／６０２／６０４／６２３／７０８／７３１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項７２】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、３４、３４／６２、３４／６２／６５／６４０、３４／６２／３２３、３４／６３／６５／３２３／５２８／６４０、３４／６３／６５／４０６／５２８／６４０／７１３、３４／６３／３２３／５２６／５２８／６４０、３４／６３／４０６／５２８／６４０／７３１、３４／６５、３４／６５／５２８／６４０、３４／３２３／４０６／６４０、３４／３２３／６４０、３４／６４０、３８／６４０、６２／６３、６２／６３／６５／５２８／６４０、６２／６３／６９／３２３／４０６／６４０、６２／６３／５２６／６４０／７３１、６２／３２３／６４０、６３／６５／３２３／４０６／５２６／５２８／６４０／７３１、６３／６５／４０６／７３１、６３／６５／５２８／６４０／７３１、６３／６５／６４０、６３／３２３／４０６／６４０、６３／４０６、６３／４０６／６４０、６３／５２６／５２８／６４０／７３１、６３／７３１、３２３／４０６／６４０、３２３／４０６／６４０／７３１、３２３／５２６／５２８／６４０、３２３／５２６／６４０、３２３／６４０／７３１、４０６／６４０、５２６／５２８／６４０／７３１、および７３１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項７３】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、２８、３０、３０／１５８、３７、５９、１０２、１０８、１５８、１６４、１８３、１９１、２０６、２３５、３０７、３１１、４０９、４１９、５３３、５４３、５４６、５５９、６８３、７１０、７５２および７９３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項７４】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、３４／６２、３４／６５、３４／３２３／６４０、３４／６４０、３８／６４０および６３／６５／４０６／７３１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項７５】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、３４／６５／３２３／４０６／４１１／５６５、３４／３２３／４０６／４１１／５６５、３４／３２３／４０６／５６５／７３１、６２／６５／３２３／４０６／５６５、６２／６５／３２３／４０６／５６５／７３１、６２／６５／３２３／４１１／５６５、６２／６５／４０６／４１１／５６５／７３１、６２／３２３／４０６／４１１、６２／３２３／４０６／４１１／５６５、６２／３２３／４１１／５６５、６３／６５／３２３／４０６／５６５／７３１、６３／６５／４０６／４１１／５６５、６５／３２３／４０６／５６５、３２３／４０６／４１１／５６５、３２３／４１１／５６５、および６３６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２３２２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項７６】
前記操作されたスクロースシンターゼの前記ポリペプチド配列が、３４／６５／３２３／４０６／４１１／５６５、３４／３２３／４０６／４１１／５６５、６２／６５／３２３／４０６／５６５、６２／６５／４０６／４１１／５６５／６３６／７３１、６２／６５／４０６／４１１／５６５／７３１、６２／３２３／４０６／４１１、６２／３２３／４０６／４１１／５６５、および６２／３２３／４１１／５６５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、前記位置が、配列番号２３２２を基準にして番号が付けられている、請求項５９に記載の操作されたスクロースシンターゼ。
【請求項７７】
請求項５９から７６のいずれかで提供される少なくとも１つの操作されたスクロースシンターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチド。
【請求項７８】
請求項７７に記載の少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクター。
【請求項７９】
少なくとも１つの制御配列をさらに含む、請求項７８に記載のベクター。
【請求項８０】
請求項７８に記載の少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞。
【請求項８１】
請求項７８または請求項７９に記載のベクターを含む宿主細胞。
【請求項８２】
真核生物および原核生物から選択される、請求項８０および／または８１に記載の宿主細胞。
【請求項８３】
請求項５９から７６のいずれかで提供される少なくとも１つの操作されたスクロースシンターゼ改変体を産生するための方法であって、請求項８０から８２のいずれかに記載の宿主細胞を、前記操作されたスクロースシンターゼ改変体が前記宿主細胞により産生されるような条件下で培養するステップを含む、方法。
【請求項８４】
前記操作されたスクロースシンターゼ改変体を回収するステップをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
請求項６０から７５のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたスクロースシンターゼ改変体を含む組成物。
【請求項８６】
基質のグリコシル化のための方法であって、少なくとも１つの基質、請求項１から４５のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、および前記基質と前記グリコシルトランスフェラーゼとを、前記基質がグリコシル化されて少なくとも１つのグリコシル化産物を産生するような条件下で接触させるステップを含む、方法。
【請求項８７】
前記基質が、少なくとも１つのステビオールグリコシドを含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記グリコシル化産物が、少なくとも１つのモノグリコシル化および／またはポリグリコシル化産物を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８９】
レバウジオシドＭを産生するための方法であって、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＩ基質、ＮＤＰ−グルコース、ならびに請求項１から４５に記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記レバウジオシドＤおよびレバウジオシドＩ基質、ＮＤＰ−グルコース、ならびに前記グリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＭが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項９０】
レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＮＤＰ−グルコース、および請求項１から４５に記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ＮＤＰ−グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項９１】
レバウジオシドＤを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＮＤＰ−グルコース、および請求項１から４５に記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ＮＤＰ−グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＤが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項９２】
前記ＮＤＰ−グルコースが、ＡＤＰ−グルコース、ＣＤＰ−グルコース、ＴＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−グルコース、および／またはＩＤＴ−グルコースから選択される、請求項８６から９１のいずれかに記載の方法。
【請求項９３】
前記ＮＤＰ−グルコースが、ＵＤＰ−グルコースではない、請求項８６から９２のいずれかに記載の方法。
【請求項９４】
前記グリコシルトランスフェラーゼが、請求項１から２５および／または請求項２６から４５のいずれかに記載の少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼを含む、請求項８６から９３のいずれかに記載の方法。
【請求項９５】
レバウジオシドＭを産生するための方法であって、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＩ基質、ＡＤＰ−グルコース、ならびに請求項１から４５に記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＩ基質、ＡＤＰ−グルコース、ならびにグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＭが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項９６】
レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＡＤＰ−グルコース、および請求項１から４５に記載の少なくとも１つの操作されたＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ＡＤＰ−グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項９７】
レバウジオシドＤを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＡＤＰ−グルコース、および請求項１から４５に記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ＡＤＰ−グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＤが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項９８】
レバウジオシドＭを産生するための方法であって、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＩ基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、ならびに請求項１から４５に記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記レバウジオシドＤ基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＭが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項９９】
レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、および請求項１から４５に記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項１００】
レバウジオシドＤを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、および請求項１から４５に記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＤが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項１０１】
レバウジオシドＭを産生するための方法であって、少なくとも１つのステビオシドを含むおよび／またはステビオシドとｒｅｂＡの混合物を含むステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、ならびに請求項１から４５に記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＭが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項１０２】
レバウジオシドＭを産生する方法であって、ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、少なくとも１つのスクロースシンターゼ、および請求項１から４５に記載の少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、前記ステビオシド基質、ＮＤＰ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＡが先ず産生され、次いでレバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＩが産生され、最後にレバウジオシドＭが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む、方法。
【請求項１０３】
前記スクロースシンターゼが、請求項５９から７６のいずれかで提供される操作されたスクロースシンターゼである、請求項９８から１０２のいずれかに記載の方法。
【請求項１０４】
ワンポット反応として行われる、請求項８６から１０３のいずれかに記載の方法。
【請求項１０５】
逐次的に行われる、請求項８６から１０４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０６】
前記方法の前記ステップを反復するステップをさらに含む、請求項８６から１０４のいずれかに記載の方法。
【請求項１０７】
前記スクロースが、反復されるステップを通して再利用される、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記操作されたグリコシルトランスフェラーゼおよび／または他の反応成分が、再利用される、請求項１０６および／または１０１に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ステビオシド基質が、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａから抽出される、請求項８６から１０８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１０】
前記ステビオシド基質が、合成により産生される、請求項８６から１０８のいずれかに記載の方法。
【請求項１１１】
前記グリコシルトランスフェラーゼおよび／または前記スクロースシンターゼが、固定化されている、請求項８６から１１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１１２】
フルクトースを含む反応産物を産生する、請求項８６から１１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１１３】
前記フルクトースが、前記反応産物から除去される、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
洗浄ステップをさらに含む、請求項８６から１１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１１５】
少なくとも１つのカラムクロマトグラフィーステップをさらに含む、請求項８６から１１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１１６】
前記少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼが、請求項２６から４５のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼである、請求項８６から１１５のいずれかに記載の方法。
【請求項１１７】
前記少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼが、請求項１から２５のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼである、請求項８６から１１６のいずれかに記載の方法。
【請求項１１８】
前記少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼが、請求項２６から４５のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼであり、少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼが、請求項１から２５のいずれかに記載のグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼであることをさらに含む、請求項８６から１１７のいずれかに記載の方法。
【請求項１１９】
請求項５９から７６のいずれかに記載の少なくとも１つの操作されたスクロースシンターゼをさらに含む、請求項８６から１１８に記載の方法。
【請求項１２０】
請求項８６から１１９のいずれかに記載の方法に従って産生される、少なくとも１つのレバウジオシド。
【請求項１２１】
請求項１２０に記載のレバウジオシドを含む、組成物。
【請求項１２２】
請求項８６から８９、９２から９５、９８、および／または１０１から１２１のいずれかに記載の方法に従って産生される、レバウジオシドＭ。
【請求項１２３】
請求項１２２に記載のレバウジオシドＭを含む、組成物。
【請求項１２４】
請求項８６から９４、９６、９９、および／または１０１から１２１のいずれかに記載の方法に従って産生される、レバウジオシドＡ。
【請求項１２５】
請求項１２４に記載のレバウジオシドＡを含む、組成物。
【請求項１２６】
請求項８６から９４、９６、９９、および／または１０１から１２１のいずれかに記載の方法に従って産生される、レバウジオシドＩ。
【請求項１２７】
請求項１２６に記載のレバウジオシドＩを含む、組成物。
【請求項１２８】
請求項８６から９４、９７、および／または１００から１２１のいずれかに記載の方法に従って産生される、レバウジオシドＤ。
【請求項１２９】
請求項１２８に記載のレバウジオシドＤを含む、組成物。
【請求項１３０】
請求項１２２、１２４、１２６および／または１２８で提供される少なくとも２つのレバウジオシドを含む、組成物。
【請求項１３１】
請求項１２３、１２５、１２７および／または１２９で提供される少なくとも２つの組成物の混合物を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１８年７月３０日に出願した米国仮特許出願第６２／７１２，１９９号、および２０１８年７月３１日に出願した米国仮特許出願第６２／７１２，３２７号の優先権を主張するものであり、前記仮出願の両方は、それらの全体があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明は、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）酵素、ＧＴ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は、操作されたスクロースシンターゼ（ＳｕＳ）酵素、ＳｕＳ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は、ＧＴ酵素を含む組成物、およびβ−グルコース結合を有する産物を作製するために操作されたＧＴ酵素を使用する方法を、さらに提供する。本発明は、レバウジオシド（例えば、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩおよびレバウジオシドＤ）の産生のための組成物および方法をさらに提供する。本発明は、ＳｕＳ酵素を含む組成物、およびそれらを使用する方法も提供する。ＧＴおよびＳｕＳ酵素を産生する方法も提供される。
【０００３】
配列表、表またはコンピュータプログラムへの言及
配列表の公式コピーは、ファイル名が「ＣＸ８−１８０ＵＳＰ１Ａ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」であり、作成日が２０１８年７月３１日であり、サイズが８，９２９キロバイトである、ＡＳＣＩＩ形式のテキストファイルとして、本明細書と同時にＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で提出されている。ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で出願したこの配列表は、本明細書の一部であり、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
グルコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）は、活性化されたヌクレオシド糖からグリコシル残基を単量体および多量体アクセプター分子（例えば、他の糖、タンパク質、脂質、および他の有機基質）に翻訳後転移させる酵素である。したがって、これらの酵素は、置換リン酸脱離基を含有する活性化されたドナー糖基質を利用する。ドナー糖基質（すなわち、「グリコシルドナー」）は、一般的にヌクレオシド二リン酸糖として活性化される。しかし、ヌクレオシド一リン酸糖などの他の糖、脂質ホスフェート、および非置換ホスフェートも使用される（例えば、Ｌａｉｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ７７：２５．１−２５．３５  ［２００８］を参照されたい）。ＧＴは、基質および反応産物の立体化学に基づいて、保持型または反転型酵素のどちらかとして分類される。ドナーのアノマー結合の立体化学が保持される（例えば、アルファからアルファ）反応では、ＧＴは保持型酵素である。立体化学が反転する（例えば、アルファからベータ）反応では、ＧＴは反転型酵素である。これらのグリコシル化産物は、様々な代謝経路およびプロセスに関与する。実際、非常に多くの二糖、オリゴ糖および多糖の生合成は、様々なグリコシルトランスフェラーゼの作用を必要とする。グルコシル部分の転移は、アクセプターの生物活性、溶解度、および細胞内の輸送特性を変更し得る。ＧＴは、特定の化合物（例えば、複合糖質およびグリコシド）の標的化された合成、および差次的にグリコシル化された薬物、生物学的プローブ、または天然産物ライブラリーの産生に使用されている。一部の方法では、複合糖質合成のためのＧＴの大規模使用は、大量のグリコシルドナーを必要とし、したがって、そのような手法の費用を増大させる。放出されるヌクレオチドからのグリコシルドナーの再合成を可能にするために、ヌクレオチド再利用システムが開発された。これらの再利用システムはまた、反応中に形成されるヌクレオチド副産物の量を低減させ、それによって、ＧＴにより引き起こされる阻害を低減させる。それでもなお、ＧＴによる複合糖質の大規模産生に好適な改善された方法が、依然として必要とされている。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｌａｉｒｓｏｎら、Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（２００８）７７：２５．１〜２５．３５
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）酵素、ＧＴ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は、操作されたスクロースシンターゼ（ＳｕＳ）酵素、ＳｕＳ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は、ＧＴ酵素を含む組成物、およびβ−グルコース結合を有する産物を作製するために操作されたＧＴ酵素を使用する方法を、さらに提供する。本発明は、レバウジオシド（例えば、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩおよびレバウジオシドＤ）の産生のための組成物および方法をさらに提供する。本発明は、ＳｕＳ酵素を含む組成物、およびそれらを使用する方法も提供する。ＧＴおよびＳｕＳ酵素を産生する方法も提供される。
本発明は、配列番号２に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ改変体を提供する。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、配列番号２０に対して、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性であるポリペプチドを含む。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、４１／７２／２３３／３３８、４１／７２／３３８、４１／１４４／２３３、４１／２３３、４１／２３３／３３８、６１、６１／８７／９１／１０７、６１／８７／９１／２５９、６１／９１／４３１、６１／１０７、６１／２５９／４２８、６１／４０７／４２８、６１／４１１、７２、７２／７６、７２／７６／１６３／１９７、７２／７６／１９５／２３３、７２／７６／１９７／２０４、７２／７６／２０７／２３３、７２／７６／２０７／３３８、７２／８１、７２／８１／１９５／２３３、７２／１３９／１９５／２０４、７２／１４４／３３８、７２／２００／２０４／２０７、７２／２０７、７６／１４４／１９７／２００、７６／１９５／１９７／２０４／２０７／２３３、７６／１９７／２０７／２３３、７６／２３３、８１／１３９／１４４／１９５／２００／２０４／２０７／２３３、８１／１４４／２３３、８１／１９７／２００／２０７／２３３／３３８、８１／２３３／３３８、８１／３３８、１０７、１０７／２５９、１３９／１４４／２３３、１４４／２３３、１４４／２３３／３３８、１５６／４０７、１６３／２３３／３３８、２００／２０４／２０７／２３３、２３３／３３８、および２５９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、４１Ｅ／７２Ｐ／２３３Ｑ／３３８Ａ、４１Ｅ／７２Ｐ／３３８Ａ、４１Ｅ／１４４Ｑ／２３３Ｔ、４１Ｅ／２３３Ｑ、４１Ｅ／２３３Ｑ／３３８Ｖ、４１Ｅ／２３３Ｔ、４１Ｅ／２３３Ｔ／３３８Ｖ、６１Ｄ、６１Ｄ／８７Ｋ／９１Ｌ／１０７Ｌ、６１Ｄ／８７Ｋ／９１Ｌ／２５９Ｔ、６１Ｄ／１０７Ｖ、６１Ｄ／２５９Ｔ／４２８Ｉ、６１Ｄ／４０７Ｔ／４２８Ｉ、６１Ｅ／８７Ｋ／９１Ｌ／１０７Ｖ、６１Ｅ／９１Ｌ／４３１Ｍ、６１Ｅ／４１１Ｔ、７２Ｐ、７２Ｐ／７６Ｓ、７２Ｐ／７６Ｓ／１６３Ａ／１９７Ｋ、７２Ｐ／７６Ｓ／２０７Ｖ／３３８Ｖ、７２Ｐ／７６Ｔ、７２Ｐ／７６Ｔ／１９５Ｑ／２３３Ｔ、７２Ｐ／７６Ｔ／１９７Ｋ／２０４Ｔ、７２Ｐ／７６Ｔ／２０７Ｖ／２３３Ｑ、７２Ｐ／８１Ｔ、７２Ｐ／８１Ｔ／１９５Ｑ／２３３Ｑ、７２Ｐ／１３９Ｎ／１９５Ｑ／２０４Ｔ、７２Ｐ／１４４Ｑ／３３８Ｖ、７２Ｐ／２００Ｒ／２０４Ｔ／２０７Ｖ、７２Ｐ／２０７Ｖ、７６Ｓ／１４４Ｑ／１９７Ｋ／２００Ｒ、７６Ｓ／１９５Ｑ／１９７Ｋ／２０４Ｔ／２０７Ｖ／２３３Ｔ、７６Ｓ／１９７Ｋ／２０７Ｖ／２３３Ｑ、７６Ｓ／２３３Ｔ、８１Ｔ／１３９Ｎ／１４４Ｑ／１９５Ｑ／２００Ｒ／２０４Ｔ／２０７Ｖ／２３３Ｑ、８１Ｔ／１４４Ｑ／２３３Ｑ、８１Ｔ／１９７Ｋ／２００Ｒ／２０７Ｖ／２３３Ｑ／３３８Ａ、８１Ｔ／２３３Ｑ／３３８Ｖ、８１Ｔ／３３８Ｖ、１０７Ｖ、１０７Ｖ／２５９Ｔ、１３９Ｎ／１４４Ｑ／２３３Ｑ、１４４Ｑ／２３３Ｔ、１４４Ｑ／２３３Ｔ／３３８Ｖ、１５６Ｓ／４０７Ｔ、１６３Ａ／２３３Ｔ／３３８Ａ、２００Ｒ／２０４Ｔ／２０７Ｖ／２３３Ｔ、２３３Ｑ／３３８Ｖ、および２５９Ｔから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ａ４１Ｅ／Ｔ７２Ｐ／Ｗ２３３Ｑ／Ｃ３３８Ａ、Ａ４１Ｅ／Ｔ７２Ｐ／Ｃ３３８Ａ、Ａ４１Ｅ／Ｍ１４４Ｑ／Ｗ２３３Ｔ、Ａ４１Ｅ／Ｗ２３３Ｑ、Ａ４１Ｅ／Ｗ２３３Ｑ／Ｃ３３８Ｖ、Ａ４１Ｅ／Ｗ２３３Ｔ、Ａ４１Ｅ／Ｗ２３３Ｔ／Ｃ３３８Ｖ、Ｑ６１Ｄ、Ｑ６１Ｄ／Ａ８７Ｋ／Ｑ９１Ｌ／Ａ１０７Ｌ、Ｑ６１Ｄ／Ａ８７Ｋ／Ｑ９１Ｌ／Ｅ２５９Ｔ、Ｑ６１Ｄ／Ａ１０７Ｖ、Ｑ６１Ｄ／Ｅ２５９Ｔ／Ｋ４２８Ｉ、Ｑ６１Ｄ／Ｉ４０７Ｔ／Ｋ４２８Ｉ、Ｑ６１Ｅ／Ａ８７Ｋ／Ｑ９１Ｌ／Ａ１０７Ｖ、Ｑ６１Ｅ／Ｑ９１Ｌ／Ｄ４３１Ｍ、Ｑ６１Ｅ／Ｒ４１１Ｔ、Ｔ７２Ｐ、Ｔ７２Ｐ／Ｒ７６Ｓ、Ｔ７２Ｐ／Ｒ７６Ｓ／Ｌ１６３Ａ／Ｑ１９７Ｋ、Ｔ７２Ｐ／Ｒ７６Ｓ／Ｉ２０７Ｖ／Ｃ３３８Ｖ、Ｔ７２Ｐ／Ｒ７６Ｔ、Ｔ７２Ｐ／Ｒ７６Ｔ／Ｈ１９５Ｑ／Ｗ２３３Ｔ、Ｔ７２Ｐ／Ｒ７６Ｔ／Ｑ１９７Ｋ／Ｄ２０４Ｔ、Ｔ７２Ｐ／Ｒ７６Ｔ／Ｉ２０７Ｖ／Ｗ２３３Ｑ、Ｔ７２Ｐ／Ｈ８１Ｔ、Ｔ７２Ｐ／Ｈ８１Ｔ／Ｈ１９５Ｑ／Ｗ２３３Ｑ、Ｔ７２Ｐ／Ｋ１３９Ｎ／Ｈ１９５Ｑ／Ｄ２０４Ｔ、Ｔ７２Ｐ／Ｍ１４４Ｑ／Ｃ３３８Ｖ、Ｔ７２Ｐ／Ｋ２００Ｒ／Ｄ２０４Ｔ／Ｉ２０７Ｖ、Ｔ７２Ｐ／Ｉ２０７Ｖ、Ｒ７６Ｓ／Ｍ１４４Ｑ／Ｑ１９７Ｋ／Ｋ２００Ｒ、Ｒ７６Ｓ／Ｈ１９５Ｑ／Ｑ１９７Ｋ／Ｄ２０４Ｔ／Ｉ２０７Ｖ／Ｗ２３３Ｔ、Ｒ７６Ｓ／Ｑ１９７Ｋ／Ｉ２０７Ｖ／Ｗ２３３Ｑ、Ｒ７６Ｓ／Ｗ２３３Ｔ、Ｈ８１Ｔ／Ｋ１３９Ｎ／Ｍ１４４Ｑ／Ｈ１９５Ｑ／Ｋ２００Ｒ／Ｄ２０４Ｔ／Ｉ２０７Ｖ／Ｗ２３３Ｑ、Ｈ８１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｗ２３３Ｑ、Ｈ８１Ｔ／Ｑ１９７Ｋ／Ｋ２００Ｒ／Ｉ２０７Ｖ／Ｗ２３３Ｑ／Ｃ３３８Ａ、Ｈ８１Ｔ／Ｗ２３３Ｑ／Ｃ３３８Ｖ、Ｈ８１Ｔ／Ｃ３３８Ｖ、Ａ１０７Ｖ、Ａ１０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ、Ｋ１３９Ｎ／Ｍ１４４Ｑ／Ｗ２３３Ｑ、Ｍ１４４Ｑ／Ｗ２３３Ｔ、Ｍ１４４Ｑ／Ｗ２３３Ｔ／Ｃ３３８Ｖ、Ｃ１５６Ｓ／Ｉ４０７Ｔ、Ｌ１６３Ａ／Ｗ２３３Ｔ／Ｃ３３８Ａ、Ｋ２００Ｒ／Ｄ２０４Ｔ／Ｉ２０７Ｖ／Ｗ２３３Ｔ、Ｗ２３３Ｑ／Ｃ３３８Ｖ、およびＥ２５９Ｔから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０を基準にして番号が付けられている。
【０００７】
一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、７１、８０、８１、８１／２７０、８３、８５、９７、１２４、２６３、２８６、３３４、４０２、４２０および４５６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、７１Ｇ、７１Ｔ、８０Ｄ、８０Ｐ、８０Ｑ、８１Ａ、８１Ｌ、８１Ｍ、８１Ｓ、８１Ｔ、８１Ｖ、８１Ｖ／２７０Ｋ、８３Ｄ、８５Ｔ、８５Ｖ、９７Ｖ、１２４Ｐ、２６３Ｃ、２８６Ｌ、３３４Ｖ、４０２Ｉ、４２０Ｒおよび４５６Ｋから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｑ７１Ｇ、Ｑ７１Ｔ、Ｔ８０Ｄ、Ｔ８０Ｐ、Ｔ８０Ｑ、Ｈ８１Ａ、Ｈ８１Ｌ、Ｈ８１Ｍ、Ｈ８１Ｓ、Ｈ８１Ｔ、Ｈ８１Ｖ、Ｈ８１Ｖ／Ｑ２７０Ｋ、Ｐ８３Ｄ、Ａ８５Ｔ、Ａ８５Ｖ、Ａ９７Ｖ、Ａ１２４Ｐ、Ｔ２６３Ｃ、Ｖ２８６Ｌ、Ｉ３３４Ｖ、Ｅ４０２Ｉ、Ｅ４２０ＲおよびＳ４５６Ｋから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０を基準にして番号が付けられている。
【０００８】
一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、４１／７２／２３３／３３８、４１／７２／３３８、６１、６１／９１／４３１、６１／２５９／４２８、６１／４０７／４２８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、４１Ｅ／７２Ｐ／２３３Ｑ／３３８Ａ、４１Ｅ／７２Ｐ／３３８Ａ、６１Ｄ、６１Ｄ／２５９Ｔ／４２８Ｉ、６１Ｄ／４０７Ｔ／４２８Ｉ、６１Ｅ／９１Ｌ／４３１Ｍ、８１Ｔ／１３９Ｎ／１４４Ｑ／１９５Ｑ／２００Ｒ／２０４Ｔ／２０７Ｖ／２３３Ｑ、および８１Ｔ／１９７Ｋ／２００Ｒ／２０７Ｖ／２３３Ｑ／３３８Ａから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ａ４１Ｅ／Ｔ７２Ｐ／Ｗ２３３Ｑ／Ｃ３３８Ａ、Ａ４１Ｅ／Ｔ７２Ｐ／Ｃ３３８Ａ、Ｑ６１Ｄ、Ｑ６１Ｄ／Ｅ２５９Ｔ／Ｋ４２８Ｉ、Ｑ６１Ｄ／Ｉ４０７Ｔ／Ｋ４２８Ｉ、Ｑ６１Ｅ／Ｑ９１Ｌ／Ｄ４３１Ｍ、Ｈ８１Ｔ／Ｋ１３９Ｎ／Ｍ１４４Ｑ／Ｈ１９５Ｑ／Ｋ２００Ｒ／Ｄ２０４Ｔ／Ｉ２０７Ｖ／Ｗ２３３Ｑ、およびＨ８１Ｔ／Ｑ１９７Ｋ／Ｋ２００Ｒ／Ｉ２０７Ｖ／Ｗ２３３Ｑ／Ｃ３３８Ａから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０を基準にして番号が付けられている。
【０００９】
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、７３／８１／１４４／２０７／２５９、７３／８１／１４４／２０７／２８５／４５１、７３／８１／２５９／２８５／４２６／４５１、７３／８１／２５９／４５１、７３／１１１／２８５／４５１、７３／１４４／２０７／２５２／４２６／４５１、７３／１４４／２０７／２５９／２８５／４２６／４５１、７３／１４４／２０７／２５９／２８５／４５１、７３／１４４／２０７／２５９／４２６／４５１、７３／１４４／２５９／２８５、７３／２５９／４２６／４５１、７３／２５９／４５１、８１／１１１／１４４／２０７／２８５／４５１、８１／１１１／２５９／４５１、８１／１４４／２０７／２５２／２８５／４２６、８１／１４４／２０７／２５９／４５１、８１／１４４／２５２／２５９／２８５／４５１、８１／１４４／２５９、８１／１４４／２５９／２８５、８１／１４４／２５９／４５１、８１／２０７／２５２／２５９／４５１、８１／２０７／２８５／４２６／４５１、８１／２８５、８１／２８５／４５１、１１１／１４４／２０７／２５２／２８５／４２６／４５１、１１１／１４４／２５２／２５９／２８５／４５１、１１１／１４４／２５９／２８５／４２６／４５１、１１１／２０７／２８５、１４４／２０７／２５２／２５９、１４４／２０７／２５９、１４４／２０７／２５９／２８５／４５１、１４４／２０７／２５９／４２６／４５１、１４４／２０７／２８５／４２６、１４４／２０７／４５１、１４４／２５２／２５９／２８５、１４４／２５２／２５９／２８５／４５１、１４４／２５２／２５９／４２６、１４４／２５２／２５９／４２６／４５１、１４４／２５９／２８５、１４４／２８５、１４４／２８５／４５１、１４４／４５１、２０７、２０７／２５２／２５９／４５１、２０７／２５２／４５１、２０７／２５９、２０７／２５９／４２６／４５１、２０７／２８５／４２６／４５１、２０７／４５１、２５２／２５９、２５９、２５９／２８５／４５１、２８５、および２８５／４５１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号３６を基準にして番号が付けられている。
【００１０】
一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、７３Ｓ／８１Ｔ／１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５９Ｔ、７３Ｓ／８１Ｔ／１４４Ｑ／２０７Ｖ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、７３Ｓ／８１Ｔ／２５９Ｔ／２８５Ｓ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、７３Ｓ／８１Ｔ／２５９Ｔ／４５１Ｑ、７３Ｓ／１１１Ｔ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、７３Ｓ／１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５２Ｐ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、７３Ｓ／１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５９Ｔ／２８５Ｓ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、７３Ｓ／１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５９Ｔ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、７３Ｓ／１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５９Ｔ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、７３Ｓ／１４４Ｑ／２５９Ｔ／２８５Ｓ、７３Ｓ／２５９Ｔ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、７３Ｓ／２５９Ｔ／４５１Ｑ、８１Ｔ／１１１Ｔ／１４４Ｑ／２０７Ｖ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、８１Ｔ／１１１Ｔ／２５９Ｔ／４５１Ｑ、８１Ｔ／１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５２Ｐ／２８５Ｓ／４２６Ｉ、８１Ｔ／１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５９Ｔ／４５１Ｑ、８１Ｔ／１４４Ｑ／２５２Ｐ／２５９Ｔ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、８１Ｔ／１４４Ｑ／２５９Ｔ、８１Ｔ／１４４Ｑ／２５９Ｔ／２８５Ｓ、８１Ｔ／１４４Ｑ／２５９Ｔ／４５１Ｑ、８１Ｔ／２０７Ｖ／２５２Ｐ／２５９Ｔ／４５１Ｑ、８１Ｔ／２０７Ｖ／２８５Ｓ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、８１Ｔ／２８５Ｓ、８１Ｔ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、１１１Ｔ／１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５２Ｐ／２８５Ｓ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、１１１Ｔ／１４４Ｑ／２５２Ｐ／２５９Ｔ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、１１１Ｔ／１４４Ｑ／２５９Ｔ／２８５Ｓ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、１１１Ｔ／２０７Ｖ／２８５Ｓ、１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５２Ｐ／２５９Ｔ、１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５９Ｔ、１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５９Ｔ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５９Ｔ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、１４４Ｑ／２０７Ｖ／２８５Ｓ／４２６Ｉ、１４４Ｑ／２０７Ｖ／４５１Ｑ、１４４Ｑ／２５２Ｐ／２５９Ｔ／２８５Ｓ、１４４Ｑ／２５２Ｐ／２５９Ｔ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、１４４Ｑ／２５２Ｐ／２５９Ｔ／４２６Ｉ、１４４Ｑ／２５２Ｐ／２５９Ｔ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、１４４Ｑ／２５９Ｔ／２８５Ｓ、１４４Ｑ／２８５Ｓ、１４４Ｑ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、１４４Ｑ／４５１Ｑ、２０７Ｖ、２０７Ｖ／２５２Ｐ／２５９Ｔ／４５１Ｑ、２０７Ｖ／２５２Ｐ／４５１Ｑ、２０７Ｖ／２５９Ｔ、２０７Ｖ／２５９Ｔ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、２０７Ｖ／２８５Ｓ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、２０７Ｖ／４５１Ｑ、２５２Ｐ／２５９Ｔ、２５９Ｔ、２５９Ｔ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、２８５Ｓ、および２８５Ｓ／４５１Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号３６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｅ７３Ｓ／Ｈ８１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ、Ｅ７３Ｓ／Ｈ８１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｅ７３Ｓ／Ｈ８１Ｔ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｅ７３Ｓ／Ｈ８１Ｔ／Ｅ２５９Ｔ／Ｖ４５１Ｑ、Ｅ７３Ｓ／Ｓ１１１Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｅ７３Ｓ／Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｓ２５２Ｐ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｅ７３Ｓ／Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｅ７３Ｓ／Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｅ７３Ｓ／Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｅ７３Ｓ／Ｍ１４４Ｑ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ、Ｅ７３Ｓ／Ｅ２５９Ｔ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｅ７３Ｓ／Ｅ２５９Ｔ／Ｖ４５１Ｑ、Ｈ８１Ｔ／Ｓ１１１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｈ８１Ｔ／Ｓ１１１Ｔ／Ｅ２５９Ｔ／Ｖ４５１Ｑ、Ｈ８１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２８５Ｓ／Ａ４２６Ｉ、Ｈ８１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ／Ｖ４５１Ｑ、Ｈ８１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｈ８１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｅ２５９Ｔ、Ｈ８１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ、Ｈ８１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｅ２５９Ｔ／Ｖ４５１Ｑ、Ｈ８１Ｔ／Ｉ２０７Ｖ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ／Ｖ４５１Ｑ、Ｈ８１Ｔ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２８５Ｓ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｈ８１Ｔ／Ｅ２８５Ｓ、Ｈ８１Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｓ１１１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２８５Ｓ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｓ１１１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｓ１１１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｓ１１１Ｔ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２８５Ｓ、Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ、Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ、Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２８５Ｓ／Ａ４２６Ｉ、Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｖ４５１Ｑ、Ｍ１４４Ｑ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ、Ｍ１４４Ｑ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｍ１４４Ｑ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ／Ａ４２６Ｉ、Ｍ１４４Ｑ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｍ１４４Ｑ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ、Ｍ１４４Ｑ／Ｅ２８５Ｓ、Ｍ１４４Ｑ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｍ１４４Ｑ／Ｖ４５１Ｑ、Ｉ２０７Ｖ、Ｉ２０７Ｖ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ／Ｖ４５１Ｑ、Ｉ２０７Ｖ／Ｓ２５２Ｐ／Ｖ４５１Ｑ、Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ、Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２８５Ｓ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、Ｉ２０７Ｖ／Ｖ４５１Ｑ、Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ、Ｅ２５９Ｔ、Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｅ２８５Ｓ、およびＥ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号３６を基準にして番号が付けられている。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８１／１１１／１４４／２０７／２８５／４５１、１４４／２０７／２５２／２５９、１４４／２０７／２５９／２８５／４５１、１４４／２５２／２５９／４２６、１４４／２５２／２５９／４２６／４５１、および１４４／２８５／４５１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号３６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８１Ｔ／１１１Ｔ／１４４Ｑ／２０７Ｖ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５２Ｐ／２５９Ｔ、１４４Ｑ／２０７Ｖ／２５９Ｔ／２８５Ｓ／４５１Ｑ、１４４Ｑ／２５２Ｐ／２５９Ｔ／４２６Ｉ、１４４Ｑ／２５２Ｐ／２５９Ｔ／４２６Ｉ／４５１Ｑ、および１４４Ｑ／２８５Ｓ／４５１Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号３６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｈ８１Ｔ／Ｓ１１１Ｔ／Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ、Ｍ１４４Ｑ／Ｉ２０７Ｖ／Ｅ２５９Ｔ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑ、Ｍ１４４Ｑ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ／Ａ４２６Ｉ、Ｍ１４４Ｑ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ／Ａ４２６Ｉ／Ｖ４５１Ｑ、およびＭ１４４Ｑ／Ｅ２８５Ｓ／Ｖ４５１Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号３６を基準にして番号が付けられている。
【００１１】
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８０／８１、８０／８１／８５、８０／８１／８５／２３８、８０／８１／８５／２５１／２５９、８０／８１／８５／２５２／２５６／２５９、８０／８１／８５／２５９、８０／８１／２５１／２５２／２５９、８０／８５、８０／８５／２３８、８０／８５／２３８／２５１／２５９、８０／８５／２５１、８０／８５／２５１／２５２、８０／８５／２５１／２５２／２５６／２５９、８０／８５／２５１／２５２／２５９、８０／８５／２５１／２５９、８０／８５／２５９、８０／２５９、８１／８５、８１／８５／２５１／２５２、８１／８５／２５９、８５、８５／２３８、８５／２５１、８５／２５１／２５２／２５６、８５／２５１／２５９、８５／２５６／２５９、１７５／４０２、２５１／２５２／２５９、２５９、２７０／４０２、および４２０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８０Ｄ／８１Ａ、８０Ｄ／８１Ａ／８５Ｖ、８０Ｄ／８１Ａ／８５Ｖ／２３８Ｇ、８０Ｄ／８１Ａ／８５Ｖ／２５１Ｍ／２５９Ｔ、８０Ｄ／８１Ａ／８５Ｖ／２５２Ｐ／２５６Ｇ／２５９Ｔ、８０Ｄ／８５Ｖ、８０Ｄ／８５Ｖ／２３８Ｇ、８０Ｄ／８５Ｖ／２３８Ｇ／２５１Ｍ／２５９Ｔ、８０Ｄ／８５Ｖ／２５１Ｉ／２５２Ｐ／２５６Ｇ／２５９Ｔ、８０Ｄ／８５Ｖ／２５１Ｉ／２５９Ｔ、８０Ｄ／８５Ｖ／２５１Ｍ、８０Ｄ／８５Ｖ／２５１Ｍ／２５２Ｐ、８０Ｄ／８５Ｖ／２５１Ｍ／２５２Ｐ／２５６Ｇ／２５９Ｔ、８０Ｄ／８５Ｖ／２５９Ｔ、８０Ｄ／２５９Ｔ、８０Ｐ／８１Ａ／８５Ｖ／２５９Ｔ、８０Ｐ／８１Ａ／２５１Ｉ／２５２Ｐ／２５９Ｔ、８０Ｐ／８５Ｖ、８０Ｐ／８５Ｖ／２５１Ｍ／２５２Ｐ／２５９Ｔ、８１Ａ／８５Ｖ、８１Ａ／８５Ｖ／２５１Ｍ／２５２Ｐ、８１Ａ／８５Ｖ／２５９Ｔ、８５Ｖ、８５Ｖ／２３８Ｇ、８５Ｖ／２５１Ｆ、８５Ｖ／２５１Ｆ／２５９Ｔ、８５Ｖ／２５１Ｍ／２５２Ｐ／２５６Ｇ、８５Ｖ／２５６Ｇ／２５９Ｔ、１７５Ｄ／４０２Ｉ、２５１Ｉ／２５２Ｐ／２５９Ｔ、２５９Ｔ、２７０Ｋ／４０２Ｉ、および４２０Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｔ８０Ｄ／Ｔ８１Ａ、Ｔ８０Ｄ／Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ、Ｔ８０Ｄ／Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ／Ａ２３８Ｇ、Ｔ８０Ｄ／Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｍ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８０Ｄ／Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ／Ｓ２５２Ｐ／Ｌ２５６Ｇ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８０Ｄ／Ａ８５Ｖ、Ｔ８０Ｄ／Ａ８５Ｖ／Ａ２３８Ｇ、Ｔ８０Ｄ／Ａ８５Ｖ／Ａ２３８Ｇ／Ａ２５１Ｍ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８０Ｄ／Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｉ／Ｓ２５２Ｐ／Ｌ２５６Ｇ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８０Ｄ／Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｉ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８０Ｄ／Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｍ、Ｔ８０Ｄ／Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｍ／Ｓ２５２Ｐ、Ｔ８０Ｄ／Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｍ／Ｓ２５２Ｐ／Ｌ２５６Ｇ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８０Ｄ／Ａ８５Ｖ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８０Ｄ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８０Ｐ／Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８０Ｐ／Ｔ８１Ａ／Ａ２５１Ｉ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８０Ｐ／Ａ８５Ｖ、Ｔ８０Ｐ／Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｍ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ、Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｍ／Ｓ２５２Ｐ、Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ／Ｅ２５９Ｔ、Ａ８５Ｖ、Ａ８５Ｖ／Ａ２３８Ｇ、Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｆ、Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｆ／Ｅ２５９Ｔ、Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｍ／Ｓ２５２Ｐ／Ｌ２５６Ｇ、Ａ８５Ｖ／Ｌ２５６Ｇ／Ｅ２５９Ｔ、Ｅ１７５Ｄ／Ｅ４０２Ｉ、Ａ２５１Ｉ／Ｓ２５２Ｐ／Ｅ２５９Ｔ、Ｅ２５９Ｔ、Ｑ２７０Ｋ／Ｅ４０２Ｉ、およびＥ４２０Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、３、５、７、９９、１５３、２３２／３１７、２５２、２７３、２９９、３２６、３９３、４０４、４０９、４２２、４４３、４５１および４５５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、３Ｓ、５Ａ、５Ｈ、５Ｌ、５Ｔ、７Ａ、７Ｑ、９９Ｖ、１５３Ｃ、２３２Ｉ／３１７Ｌ、２５２Ａ、２７３Ｋ、２９９Ｍ、３２６Ａ、３２６Ｅ、３２６Ｎ、３２６Ｓ、３９３Ｉ、４０４Ｍ、４０４Ｖ、４０９Ｓ、４２２Ｉ、４４３Ａ、４５１Ｅ、４５１Ｖ、４５５Ｍおよび４５５Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｎ３Ｓ、Ｓ５Ａ、Ｓ５Ｈ、Ｓ５Ｌ、Ｓ５Ｔ、Ｔ７Ａ、Ｔ７Ｑ、Ｅ９９Ｖ、Ａ１５３Ｃ、Ｖ２３２Ｉ／Ｙ３１７Ｌ、Ｓ２５２Ａ、Ｓ２７３Ｋ、Ｖ２９９Ｍ、Ｇ３２６Ａ、Ｇ３２６Ｅ、Ｇ３２６Ｎ、Ｇ３２６Ｓ、Ｖ３９３Ｉ、Ｇ４０４Ｍ、Ｇ４０４Ｖ、Ａ４０９Ｓ、Ｍ４２２Ｉ、Ｓ４４３Ａ、Ｑ４５１Ｅ、Ｑ４５１Ｖ、Ｓ４５５ＭおよびＳ４５５Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８０／８１／８５、８０／８５、８０／８５／２５１／２５９、８５、８５／２５１／２５２／２５６、１７５／４０２、および２７０／４０２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８０Ｄ／８１Ａ／８５Ｖ、８０Ｄ／８５Ｖ／２５１Ｉ／２５９Ｔ、８０Ｐ／８５Ｖ、８５Ｖ、８５Ｖ／２５１Ｍ／２５２Ｐ／２５６Ｇ、１７５Ｄ／４０２Ｉ、および２７０Ｋ／４０２Ｉから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｔ８０Ｄ／Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ、Ｔ８０Ｄ／Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｉ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８０Ｐ／Ａ８５Ｖ、Ａ８５Ｖ、Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｍ／Ｓ２５２Ｐ／Ｌ２５６Ｇ、Ｅ１７５Ｄ／Ｅ４０２Ｉ、およびＱ２７０Ｋ／Ｅ４０２Ｉから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１７４を基準にして番号が付けられている。
【００１２】
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８１／８５、８１／８５／１７５／２５９／４０２、８１／８５／２５１、８１／８５／２５１／２５９、８１／８５／２５９、８１／８５／２５９／４０２、８５、８５／１７５、８５／１７５／２５１、８５／１７５／２５１／２５９／４０２、８５／１７５／２５９、８５／１７５／２５９／４０２、８５／１７５／４０２、８５／２５９、８５／２５９／４０２、および８５／４０２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８１Ａ／８５Ｖ、８１Ａ／８５Ｖ／１７５Ｅ／２５９Ｔ／４０２Ｅ、８１Ａ／８５Ｖ／２５１Ｉ、８１Ａ／８５Ｖ／２５１Ｉ／２５９Ｔ、８１Ａ／８５Ｖ／２５９Ｔ、８１Ａ／８５Ｖ／２５９Ｔ／４０２Ｅ、８５Ｖ、８５Ｖ／１７５Ｅ、８５Ｖ／１７５Ｅ／２５１Ｉ、８５Ｖ／１７５Ｅ／２５１Ｉ／２５９Ｔ／４０２Ｅ、８５Ｖ／１７５Ｅ／２５９Ｔ、８５Ｖ／１７５Ｅ／２５９Ｔ／４０２Ｅ、８５Ｖ／１７５Ｅ／４０２Ｅ、８５Ｖ／２５９Ｔ、８５Ｖ／２５９Ｔ／４０２Ｅ、および８５Ｖ／４０２Ｅから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ、Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ／Ｄ１７５Ｅ／Ｅ２５９Ｔ／Ｉ４０２Ｅ、Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｉ、Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ／Ａ２５１Ｉ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ／Ｅ２５９Ｔ、Ｔ８１Ａ／Ａ８５Ｖ／Ｅ２５９Ｔ／Ｉ４０２Ｅ、Ａ８５Ｖ、Ａ８５Ｖ／Ｄ１７５Ｅ、Ａ８５Ｖ／Ｄ１７５Ｅ／Ａ２５１Ｉ、Ａ８５Ｖ／Ｄ１７５Ｅ／Ａ２５１Ｉ／Ｅ２５９Ｔ／Ｉ４０２Ｅ、Ａ８５Ｖ／Ｄ１７５Ｅ／Ｅ２５９Ｔ、Ａ８５Ｖ／Ｄ１７５Ｅ／Ｅ２５９Ｔ／Ｉ４０２Ｅ、Ａ８５Ｖ／Ｄ１７５Ｅ／Ｉ４０２Ｅ、Ａ８５Ｖ／Ｅ２５９Ｔ、Ａ８５Ｖ／Ｅ２５９Ｔ／Ｉ４０２Ｅ、およびＡ８５Ｖ／Ｉ４０２Ｅから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０６を基準にして番号が付けられている。
【００１３】
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１５３、１５３／３２６、１５３／３２６／４４３、１５３／３２６／４４３／４５５、２３２、２３２／２７３／２９９、２３２／３９３／４５１、２９９／４５１、３２６、４０４および４５１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１５３Ｃ、１５３Ｃ／３２６Ｓ、１５３Ｃ／３２６Ｓ／４４３Ａ、１５３Ｃ／３２６Ｓ／４４３Ａ／４５５Ｍ、２３２Ｉ、２３２Ｉ／２７３Ｋ／２９９Ｍ、２３２Ｉ／３９３Ｉ／４５１Ｅ、２９９Ｍ／４５１Ｅ、３２６Ｅ、３２６Ｓ、４０４Ｖおよび４５１Ｅから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ａ１５３Ｃ、Ａ１５３Ｃ／Ｇ３２６Ｓ、Ａ１５３Ｃ／Ｇ３２６Ｓ／Ｓ４４３Ａ、Ａ１５３Ｃ／Ｇ３２６Ｓ／Ｓ４４３Ａ／Ｓ４５５Ｍ、Ｖ２３２Ｉ、Ｖ２３２Ｉ／Ｓ２７３Ｋ／Ｖ２９９Ｍ、Ｖ２３２Ｉ／Ｖ３９３Ｉ／Ｑ４５１Ｅ、Ｖ２９９Ｍ／Ｑ４５１Ｅ、Ｇ３２６Ｅ、Ｇ３２６Ｓ、Ｇ４０４ＶおよびＱ４５１Ｅから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、２５、１１６、１４６、１７０、１７３、２２７、２９６、３００、３１５、３２７、３３０、３６１、４０８、４１２、４３８、４４８および４４９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、２５Ａ、１１６Ｄ、１１６Ｒ、１１６Ｓ、１４６Ｇ、１７０Ｃ、１７０Ｇ、１７０Ｐ、１７０Ｓ、１７０Ｔ、１７３Ｓ、２２７Ｔ、２９６Ｖ、３００Ｓ、３１５Ｔ、３２７Ｙ、３３０Ｇ、３３０Ｔ、３６１Ｃ、４０８Ｃ、４０８Ｔ、４１２Ａ、４１２Ｋ、４１２Ｓ、４３８Ｑ、４４８Ｈおよび４４９Ｓから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｌ２５Ａ、Ｅ１１６Ｄ、Ｅ１１６Ｒ、Ｅ１１６Ｓ、Ｓ１４６Ｇ、Ｄ１７０Ｃ、Ｄ１７０Ｇ、Ｄ１７０Ｐ、Ｄ１７０Ｓ、Ｄ１７０Ｔ、Ｒ１７３Ｓ、Ｓ２２７Ｔ、Ｒ２９６Ｖ、Ａ３００Ｓ、Ｋ３１５Ｔ、Ｆ３２７Ｙ、Ｅ３３０Ｇ、Ｅ３３０Ｔ、Ｔ３６１Ｃ、Ｎ４０８Ｃ、Ｎ４０８Ｔ、Ｒ４１２Ａ、Ｒ４１２Ｋ、Ｒ４１２Ｓ、Ａ４３８Ｑ、Ｅ４４８ＨおよびＲ４４９Ｓから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている。一部の追加実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１５３、２３２、２３２／３９３／４５１、および４５１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１５３Ｃ、２３２Ｉ、２３２Ｉ／３９３Ｉ／４５１Ｅ、および４５１Ｅから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ａ１５３Ｃ、Ｖ２３２Ｉ、Ｖ２３２Ｉ／Ｖ３９３Ｉ／Ｑ４５１Ｅ、およびＱ４５１Ｅから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４０８を基準にして番号が付けられている。
【００１４】
一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１４６／１７０／１９６、１４６／１７０／１９６／２３２、１４６／１７０／１９６／２３２／４２３、１４６／１７０／１９６／２３２／４５１／４５５、１４６／１７０／１９６／４０８／４５１、１４６／１７０／２３２、１４６／１７０／２３２／４２３、１４６／１７０／２３２／４２３／４４８／４５１／４５５、１４６／１７０／２５９、１４６／１９６、１４６／１９６／２３２、１４６／１９６／２３２／２５９／４４８／４５１、１４６／１９６／４５５、１４６／２３２／２５９／４５５、１４６／２３２／３１５、１４６／２３２／３１５／４２３／４５１／４５５、１４６／２３２／３２６、１４６／２３２／４４８、１４６／２３２／４５１、および１４６／４１３／４５１／４５５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１４６Ｇ／１７０Ｓ／１９６Ｉ、１４６Ｇ／１７０Ｓ／２３２Ｉ、１４６Ｇ／１７０Ｓ／２３２Ｉ／４２３Ｋ／４４８Ｈ／４５１Ｅ／４５５Ｍ、１４６Ｇ／１７０Ｔ／１９６Ｉ／２３２Ｉ、１４６Ｇ／１７０Ｔ／１９６Ｉ／２３２Ｉ／４２３Ｋ、１４６Ｇ／１７０Ｔ／１９６Ｉ／２３２Ｉ／４５１Ｅ／４５５Ｒ、１４６Ｇ／１７０Ｔ／１９６Ｉ／４０８Ｔ／４５１Ｅ、１４６Ｇ／１７０Ｔ／２３２Ｉ／４２３Ｋ、１４６Ｇ／１７０Ｔ／２５９Ｅ、１４６Ｇ／１９６Ｉ、１４６Ｇ／１９６Ｉ／２３２Ｉ、１４６Ｇ／１９６Ｉ／２３２Ｉ／２５９Ｅ／４４８Ｈ／４５１Ｅ、１４６Ｇ／１９６Ｉ／４５５Ｒ、１４６Ｇ／２３２Ｉ／２５９Ｅ／４５５Ｍ、１４６Ｇ／２３２Ｉ／３１５Ｓ、１４６Ｇ／２３２Ｉ／３１５Ｓ／４２３Ｋ／４５１Ｅ／４５５Ｍ、１４６Ｇ／２３２Ｉ／３２６Ｅ、１４６Ｇ／２３２Ｉ／４４８Ｈ、１４６Ｇ／２３２Ｉ／４５１Ｅ、および１４６Ｇ／４１３Ｍ／４５１Ｅ／４５５Ｍから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｓ／Ｗ１９６Ｉ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｓ／Ｖ２３２Ｉ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｓ／Ｖ２３２Ｉ／Ｒ４２３Ｋ／Ｅ４４８Ｈ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｍ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｔ／Ｗ１９６Ｉ／Ｖ２３２Ｉ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｔ／Ｗ１９６Ｉ／Ｖ２３２Ｉ／Ｒ４２３Ｋ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｔ／Ｗ１９６Ｉ／Ｖ２３２Ｉ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｒ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｔ／Ｗ１９６Ｉ／Ｎ４０８Ｔ／Ｑ４５１Ｅ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｔ／Ｖ２３２Ｉ／Ｒ４２３Ｋ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｔ／Ｔ２５９Ｅ、Ｓ１４６Ｇ／Ｗ１９６Ｉ、Ｓ１４６Ｇ／Ｗ１９６Ｉ／Ｖ２３２Ｉ、Ｓ１４６Ｇ／Ｗ１９６Ｉ／Ｖ２３２Ｉ／Ｔ２５９Ｅ／Ｅ４４８Ｈ／Ｑ４５１Ｅ、Ｓ１４６Ｇ／Ｗ１９６Ｉ／Ｓ４５５Ｒ、Ｓ１４６Ｇ／Ｖ２３２Ｉ／Ｔ２５９Ｅ／Ｓ４５５Ｍ、Ｓ１４６Ｇ／Ｖ２３２Ｉ／Ｋ３１５Ｓ、Ｓ１４６Ｇ／Ｖ２３２Ｉ／Ｋ３１５Ｓ／Ｒ４２３Ｋ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｍ、Ｓ１４６Ｇ／Ｖ２３２Ｉ／Ｇ３２６Ｅ、Ｓ１４６Ｇ／Ｖ２３２Ｉ／Ｅ４４８Ｈ、Ｓ１４６Ｇ／Ｖ２３２Ｉ／Ｑ４５１Ｅ、およびＳ１４６Ｇ／Ｖ４１３Ｍ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｍから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている。
【００１５】
一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、９、１２、１０７、１３１、１５６、１６１、１６９、１９９、２０４、２０９、２３３、２６２、２８９、３３７および４１７から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、９Ｌ、１２Ｑ、１０７Ｃ、１３１Ａ、１５６Ｓ、１６１Ｅ、１６９Ｔ、１９９Ｓ、２０４Ｍ、２０９Ｙ、２３３Ｋ、２６２Ａ、２８９Ａ、３３７Ｎ、３３７Ｗおよび４１７Ｖから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｖ９Ｌ、Ｒ１２Ｑ、Ａ１０７Ｃ、Ｐ１３１Ａ、Ｃ１５６Ｓ、Ｌ１６１Ｅ、Ｅ１６９Ｔ、Ａ１９９Ｓ、Ｄ２０４Ｍ、Ｅ２０９Ｙ、Ｑ２３３Ｋ、Ｓ２６２Ａ、Ｋ２８９Ａ、Ｓ３３７Ｎ、Ｓ３３７ＷおよびＰ４１７Ｖから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１４６／１７０／１９６、１４６／１７０／１９６／２３２、１４６／１７０／１９６／２３２／４５１／４５５、１４６／１７０／２３２、１４６／１７０／２３２／４２３／４４８／４５１／４５５、１４６／１９６／２３２、１４６／１９６／２３２／２５９／４４８／４５１、および１４６／２３２／４４８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１４６Ｇ／１７０Ｓ／１９６Ｉ、１４６Ｇ／１７０Ｓ／２３２Ｉ、１４６Ｇ／１７０Ｓ／２３２Ｉ／４２３Ｋ／４４８Ｈ／４５１Ｅ／４５５Ｍ、１４６Ｇ／１７０Ｔ／１９６Ｉ／２３２Ｉ、１４６Ｇ／１７０Ｔ／１９６Ｉ／２３２Ｉ／４５１Ｅ／４５５Ｒ、１４６Ｇ／１９６Ｉ／２３２Ｉ、１４６Ｇ／１９６Ｉ／２３２Ｉ／２５９Ｅ／４４８Ｈ／４５１Ｅ、および１４６Ｇ／２３２Ｉ／４４８Ｈから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｓ／Ｗ１９６Ｉ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｓ／Ｖ２３２Ｉ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｓ／Ｖ２３２Ｉ／Ｒ４２３Ｋ／Ｅ４４８Ｈ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｍ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｔ／Ｗ１９６Ｉ／Ｖ２３２Ｉ、Ｓ１４６Ｇ／Ｄ１７０Ｔ／Ｗ１９６Ｉ／Ｖ２３２Ｉ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｒ、Ｓ１４６Ｇ／Ｗ１９６Ｉ／Ｖ２３２Ｉ、Ｓ１４６Ｇ／Ｗ１９６Ｉ／Ｖ２３２Ｉ／Ｔ２５９Ｅ／Ｅ４４８Ｈ／Ｑ４５１Ｅ、およびＳ１４６Ｇ／Ｖ２３２Ｉ／Ｅ４４８Ｈから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号４４０を基準にして番号が付けられている。
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、９／１２／１０７／１６１／１９９／２０９／３３７、９／１２／１６１／１６９／１９９／２０９／３３７、９／１２／１９９／２０４／２０９／３３７／４５５、９／１２／１９９／２０９／３３７／４５１／４５５、９／１０７／１３１／２０４／２５９／４１７／４５１、９／１０７／１５６／１６１／１９９／２０４／４１７／４５５、９／１０７／１６１／２０９／２５９／２８９／４５１／４５５、９／１３１／１５６／２０９／２８９／３３７、９／１３１／２０４／３３７／４５１、９／１５６／１６９／２０４／３３７、９／１６９／２０４／２８９／３３７／４５１／４５５、９／２０４、９／２０４／２５９／２８９、９／３３７、１２／１４／１０７／２０４／２８９／４５５、１２／１０７／１３１／２０４／２８９／３３７／４１７／４５１／４５５、１２／１０７／１５６／２０９／２８９／４５５、１０７／１６１／１６９／１９９／２０４／２５９／４５１、１０７／１９９／２０４／２８９、１０７／１９９／２０９／２５９／４５１／４５５、１０７／２０４、１５６／１６９／１９９／２０４／２０９／２５９／２８９、１６１／２０４／４１７、２０４／４５１／４５５、２８９、および４５１／４５５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、９Ｌ／１２Ｑ／１０７Ｃ／１６１Ｅ／１９９Ｓ／２０９Ｙ／３３７Ｎ、９Ｌ／１２Ｑ／１６１Ｅ／１６９Ｔ／１９９Ｓ／２０９Ｙ／３３７Ｗ、９Ｌ／１２Ｑ／１９９Ｓ／２０４Ｍ／２０９Ｙ／３３７Ｎ／４５５Ｒ、９Ｌ／１２Ｑ／１９９Ｓ／２０９Ｙ／３３７Ｗ／４５１Ｅ／４５５Ｒ、９Ｌ／１０７Ｃ／１３１Ａ／２０４Ｍ／２５９Ｅ／４１７Ｖ／４５１Ｅ、９Ｌ／１０７Ｃ／１５６Ｓ／１６１Ｅ／１９９Ｓ／２０４Ｍ／４１７Ｖ／４５５Ｒ、９Ｌ／１０７Ｃ／１６１Ｅ／２０９Ｙ／２５９Ｅ／２８９Ａ／４５１Ｅ／４５５Ｒ、９Ｌ／１３１Ａ／１５６Ｓ／２０９Ｙ／２８９Ａ／３３７Ｎ、９Ｌ／１３１Ａ／２０４Ｍ／３３７Ｎ／４５１Ｅ、９Ｌ／１５６Ｓ／１６９Ｔ／２０４Ｍ／３３７Ｎ、９Ｌ／１６９Ｔ／２０４Ｍ／２８９Ａ／３３７Ｗ／４５１Ｅ／４５５Ｒ、９Ｌ／２０４Ｍ、９Ｌ／２０４Ｍ／２５９Ｅ／２８９Ａ、９Ｌ／３３７Ｗ、１２Ｑ／１４Ｉ／１０７Ｃ／２０４Ｍ／２８９Ａ／４５５Ｒ、１２Ｑ／１０７Ｃ／１３１Ａ／２０４Ｍ／２８９Ａ／３３７Ｗ／４１７Ｖ／４５１Ｅ／４５５Ｒ、１２Ｑ／１０７Ｃ／１５６Ｓ／２０９Ｙ／２８９Ａ／４５５Ｒ、１０７Ｃ／１６１Ｅ／１６９Ｔ／１９９Ｓ／２０４Ｍ／２５９Ｅ／４５１Ｅ、１０７Ｃ／１９９Ｓ／２０４Ｍ／２８９Ａ、１０７Ｃ／１９９Ｓ／２０９Ｙ／２５９Ｅ／４５１Ｅ／４５５Ｒ、１０７Ｃ／２０４Ｍ、１５６Ｓ／１６９Ｔ／１９９Ｓ／２０４Ｍ／２０９Ｙ／２５９Ｅ／２８９Ａ、１６１Ｅ／２０４Ｍ／４１７Ｖ、２０４Ｍ／４５１Ｅ／４５５Ｒ、２８９Ａ、および４５１Ｅ／４５５Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｖ９Ｌ／Ｒ１２Ｑ／Ａ１０７Ｃ／Ｌ１６１Ｅ／Ａ１９９Ｓ／Ｅ２０９Ｙ／Ｓ３３７Ｎ、Ｖ９Ｌ／Ｒ１２Ｑ／Ｌ１６１Ｅ／Ｅ１６９Ｔ／Ａ１９９Ｓ／Ｅ２０９Ｙ／Ｓ３３７Ｗ、Ｖ９Ｌ／Ｒ１２Ｑ／Ａ１９９Ｓ／Ｄ２０４Ｍ／Ｅ２０９Ｙ／Ｓ３３７Ｎ／Ｓ４５５Ｒ、Ｖ９Ｌ／Ｒ１２Ｑ／Ａ１９９Ｓ／Ｅ２０９Ｙ／Ｓ３３７Ｗ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｒ、Ｖ９Ｌ／Ａ１０７Ｃ／Ｐ１３１Ａ／Ｄ２０４Ｍ／Ｔ２５９Ｅ／Ｐ４１７Ｖ／Ｑ４５１Ｅ、Ｖ９Ｌ／Ａ１０７Ｃ／Ｃ１５６Ｓ／Ｌ１６１Ｅ／Ａ１９９Ｓ／Ｄ２０４Ｍ／Ｐ４１７Ｖ／Ｓ４５５Ｒ、Ｖ９Ｌ／Ａ１０７Ｃ／Ｌ１６１Ｅ／Ｅ２０９Ｙ／Ｔ２５９Ｅ／Ｋ２８９Ａ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｒ、Ｖ９Ｌ／Ｐ１３１Ａ／Ｃ１５６Ｓ／Ｅ２０９Ｙ／Ｋ２８９Ａ／Ｓ３３７Ｎ、Ｖ９Ｌ／Ｐ１３１Ａ／Ｄ２０４Ｍ／Ｓ３３７Ｎ／Ｑ４５１Ｅ、Ｖ９Ｌ／Ｃ１５６Ｓ／Ｅ１６９Ｔ／Ｄ２０４Ｍ／Ｓ３３７Ｎ、Ｖ９Ｌ／Ｅ１６９Ｔ／Ｄ２０４Ｍ／Ｋ２８９Ａ／Ｓ３３７Ｗ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｒ、Ｖ９Ｌ／Ｄ２０４Ｍ、Ｖ９Ｌ／Ｄ２０４Ｍ／Ｔ２５９Ｅ／Ｋ２８９Ａ、Ｖ９Ｌ／Ｓ３３７Ｗ、Ｒ１２Ｑ／Ｖ１４Ｉ／Ａ１０７Ｃ／Ｄ２０４Ｍ／Ｋ２８９Ａ／Ｓ４５５Ｒ、Ｒ１２Ｑ／Ａ１０７Ｃ／Ｐ１３１Ａ／Ｄ２０４Ｍ／Ｋ２８９Ａ／Ｓ３３７Ｗ／Ｐ４１７Ｖ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｒ、Ｒ１２Ｑ／Ａ１０７Ｃ／Ｃ１５６Ｓ／Ｅ２０９Ｙ／Ｋ２８９Ａ／Ｓ４５５Ｒ、Ａ１０７Ｃ／Ｌ１６１Ｅ／Ｅ１６９Ｔ／Ａ１９９Ｓ／Ｄ２０４Ｍ／Ｔ２５９Ｅ／Ｑ４５１Ｅ、Ａ１０７Ｃ／Ａ１９９Ｓ／Ｄ２０４Ｍ／Ｋ２８９Ａ、Ａ１０７Ｃ／Ａ１９９Ｓ／Ｅ２０９Ｙ／Ｔ２５９Ｅ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｒ、Ａ１０７Ｃ／Ｄ２０４Ｍ、Ｃ１５６Ｓ／Ｅ１６９Ｔ／Ａ１９９Ｓ／Ｄ２０４Ｍ／Ｅ２０９Ｙ／Ｔ２５９Ｅ／Ｋ２８９Ａ、Ｌ１６１Ｅ／Ｄ２０４Ｍ／Ｐ４１７Ｖ、Ｄ２０４Ｍ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｒ、Ｋ２８９Ａ、およびＱ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１６、５３、５４、７８、８０、９５、１１１、２２１、２５７、３３６、３４９、３９１、４１０、４１３、４２６および４３０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１６Ｍ、５３Ｑ、５４Ｐ、７８Ｖ、８０Ａ、９５Ｗ、１１１Ｃ、１１１Ｇ、１１１Ｓ、２２１Ａ、２５７Ａ、３３６Ｒ、３４９Ｖ、３９１Ｒ、４１０Ｖ、４１３Ｌ、４２６Ｓおよび４３０Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｌ１６Ｍ、Ｋ５３Ｑ、Ｔ５４Ｐ、Ｌ７８Ｖ、Ｔ８０Ａ、Ｈ９５Ｗ、Ｔ１１１Ｃ、Ｔ１１１Ｇ、Ｔ１１１Ｓ、Ｆ２２１Ａ、Ｌ２５７Ａ、Ｋ３３６Ｒ、Ｉ３４９Ｖ、Ｌ３９１Ｒ、Ｉ４１０Ｖ、Ｖ４１３Ｌ、Ａ４２６ＳおよびＫ４３０Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、９／１２／１９９／２０４／２０９／３３７／４５５、９／１３１／１５６／２０９／２８９／３３７、９／２０４、１２／１４／１０７／２０４／２８９／４５５、１０７／１６１／１６９／１９９／２０４／２５９／４５１、１０７／１９９／２０４／２８９、および２０４／４５１／４５５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、９Ｌ／１２Ｑ／１９９Ｓ／２０４Ｍ／２０９Ｙ／３３７Ｎ／４５５Ｒ、９Ｌ／１３１Ａ／１５６Ｓ／２０９Ｙ／２８９Ａ／３３７Ｎ、９Ｌ／２０４Ｍ、１２Ｑ／１４Ｉ／１０７Ｃ／２０４Ｍ／２８９Ａ／４５５Ｒ、１０７Ｃ／１６１Ｅ／１６９Ｔ／１９９Ｓ／２０４Ｍ／２５９Ｅ／４５１Ｅ、１０７Ｃ／１９９Ｓ／２０４Ｍ／２８９Ａ、および２０４Ｍ／４５１Ｅ／４５５Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｖ９Ｌ／Ｒ１２Ｑ／Ａ１９９Ｓ／Ｄ２０４Ｍ／Ｅ２０９Ｙ／Ｓ３３７Ｎ／Ｓ４５５Ｒ、Ｖ９Ｌ／Ｐ１３１Ａ／Ｃ１５６Ｓ／Ｅ２０９Ｙ／Ｋ２８９Ａ／Ｓ３３７Ｎ、Ｖ９Ｌ／Ｄ２０４Ｍ、Ｒ１２Ｑ／Ｖ１４Ｉ／Ａ１０７Ｃ／Ｄ２０４Ｍ／Ｋ２８９Ａ／Ｓ４５５Ｒ、Ａ１０７Ｃ／Ｌ１６１Ｅ／Ｅ１６９Ｔ／Ａ１９９Ｓ／Ｄ２０４Ｍ／Ｔ２５９Ｅ／Ｑ４５１Ｅ、Ａ１０７Ｃ／Ａ１９９Ｓ／Ｄ２０４Ｍ／Ｋ２８９Ａ、およびＤ２０４Ｍ／Ｑ４５１Ｅ／Ｓ４５５Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号５２０を基準にして番号が付けられている。
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１６、１６／５９／８０／４１３、１６／８０、１６／８０／１１１、１６／８０／１１１／２５７、１６／８０／２２１／２５７／３３６／４１０、１６／８０／２２１／３３６／４１０、１６／８０／２５７、１６／１１１／２２１、１６／１１１／２２１／２５７／３９１、１６／２２１、１６／２２１／２５７、１６／２２１／２５７／３３６／３９１、１６／２２１／４１０、１６／２５７、１６／２５７／３３６／４１３／４２０、８０／１１１／２２１／２５７／４１０、１１１／２２１／２５７／３３６／３９１、１１１／２２１／２５７／３９１、２２１、および２２１／２５７から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１６Ｍ、１６Ｍ／５９Ｑ／８０Ａ／４１３Ｌ、１６Ｍ／８０Ａ、１６Ｍ／８０Ａ／１１１Ｃ、１６Ｍ／８０Ａ／１１１Ｓ／２５７Ａ、１６Ｍ／８０Ａ／２２１Ａ／２５７Ａ／３３６Ｒ／４１０Ｖ、１６Ｍ／８０Ａ／２２１Ａ／３３６Ｒ／４１０Ｖ、１６Ｍ／８０Ａ／２５７Ａ、１６Ｍ／１１１Ｃ／２２１Ａ／２５７Ａ／３９１Ｒ、１６Ｍ／１１１Ｓ／２２１Ａ、１６Ｍ／２２１Ａ、１６Ｍ／２２１Ａ／２５７Ａ、１６Ｍ／２２１Ａ／２５７Ａ／３３６Ｒ／３９１Ｒ、１６Ｍ／２２１Ａ／４１０Ｖ、１６Ｍ／２５７Ａ、１６Ｍ／２５７Ａ／３３６Ｒ／４１３Ｌ／４２０Ｇ、８０Ａ／１１１Ｓ／２２１Ａ／２５７Ａ／４１０Ｖ、１１１Ｓ／２２１Ａ／２５７Ａ／３３６Ｒ／３９１Ｒ、１１１Ｓ／２２１Ａ／２５７Ａ／３９１Ｒ、２２１Ａ、および２２１Ａ／２５７Ａから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｌ１６Ｍ、Ｌ１６Ｍ／Ｈ５９Ｑ／Ｔ８０Ａ／Ｖ４１３Ｌ、Ｌ１６Ｍ／Ｔ８０Ａ、Ｌ１６Ｍ／Ｔ８０Ａ／Ｔ１１１Ｃ、Ｌ１６Ｍ／Ｔ８０Ａ／Ｔ１１１Ｓ／Ｌ２５７Ａ、Ｌ１６Ｍ／Ｔ８０Ａ／Ｆ２２１Ａ／Ｌ２５７Ａ／Ｋ３３６Ｒ／Ｉ４１０Ｖ、Ｌ１６Ｍ／Ｔ８０Ａ／Ｆ２２１Ａ／Ｋ３３６Ｒ／Ｉ４１０Ｖ、Ｌ１６Ｍ／Ｔ８０Ａ／Ｌ２５７Ａ、Ｌ１６Ｍ／Ｔ１１１Ｃ／Ｆ２２１Ａ／Ｌ２５７Ａ／Ｌ３９１Ｒ、Ｌ１６Ｍ／Ｔ１１１Ｓ／Ｆ２２１Ａ、Ｌ１６Ｍ／Ｆ２２１Ａ、Ｌ１６Ｍ／Ｆ２２１Ａ／Ｌ２５７Ａ、Ｌ１６Ｍ／Ｆ２２１Ａ／Ｌ２５７Ａ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３９１Ｒ、Ｌ１６Ｍ／Ｆ２２１Ａ／Ｉ４１０Ｖ、Ｌ１６Ｍ／Ｌ２５７Ａ、Ｌ１６Ｍ／Ｌ２５７Ａ／Ｋ３３６Ｒ／Ｖ４１３Ｌ／Ｅ４２０Ｇ、Ｔ８０Ａ／Ｔ１１１Ｓ／Ｆ２２１Ａ／Ｌ２５７Ａ／Ｉ４１０Ｖ、Ｔ１１１Ｓ／Ｆ２２１Ａ／Ｌ２５７Ａ／Ｋ３３６Ｒ／Ｌ３９１Ｒ、Ｔ１１１Ｓ／Ｆ２２１Ａ／Ｌ２５７Ａ／Ｌ３９１Ｒ、Ｆ２２１Ａ、およびＦ２２１Ａ／Ｌ２５７Ａから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５、７、１４、６５、９１、９９、１０２、１１８、１３８、１９４、２５４、２８６、４１６、４１８および４２０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５Ｌ、５Ｍ、５Ｎ、５Ｑ、７Ｌ、１４Ｌ、６５Ｖ、９１Ｖ、９９Ｌ、９９Ｓ、１０２Ｒ、１１８Ｓ、１１８Ｖ、１３８Ｉ、１９４Ｐ、２５４Ｇ、２５４Ｔ、２５４Ｖ、２８６Ｌ、４１６Ｅ、４１８Ｄおよび４２０Ａから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｓ５Ｌ、Ｓ５Ｍ、Ｓ５Ｎ、Ｓ５Ｑ、Ｔ７Ｌ、Ｖ１４Ｌ、Ｉ６５Ｖ、Ｑ９１Ｖ、Ｅ９９Ｌ、Ｅ９９Ｓ、Ｋ１０２Ｒ、Ａ１１８Ｓ、Ａ１１８Ｖ、Ｌ１３８Ｉ、Ｓ１９４Ｐ、Ｓ２５４Ｇ、Ｓ２５４Ｔ、Ｓ２５４Ｖ、Ｖ２８６Ｌ、Ｄ４１６Ｅ、Ｅ４１８ＤおよびＥ４２０Ａから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１６／８０／２２１／２５７／３３６／４１０、１６／１１１／２２１、１６／２２１／２５７、１６／２２１／４１０、１６／２５７、８０／１１１／２２１／２５７／４１０、および２２１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１６Ｍ／８０Ａ／２２１Ａ／２５７Ａ／３３６Ｒ／４１０Ｖ、１６Ｍ／１１１Ｓ／２２１Ａ、１６Ｍ／２２１Ａ／２５７Ａ、１６Ｍ／２２１Ａ／４１０Ｖ、１６Ｍ／２５７Ａ、８０Ａ／１１１Ｓ／２２１Ａ／２５７Ａ／４１０Ｖ、および２２１Ａから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｌ１６Ｍ／Ｔ８０Ａ／Ｆ２２１Ａ／Ｌ２５７Ａ／Ｋ３３６Ｒ／Ｉ４１０Ｖ、Ｌ１６Ｍ／Ｔ１１１Ｓ／Ｆ２２１Ａ、Ｌ１６Ｍ／Ｆ２２１Ａ／Ｌ２５７Ａ、Ｌ１６Ｍ／Ｆ２２１Ａ／Ｉ４１０Ｖ、Ｌ１６Ｍ／Ｌ２５７Ａ、Ｔ８０Ａ／Ｔ１１１Ｓ／Ｆ２２１Ａ／Ｌ２５７Ａ／Ｉ４１０Ｖ、およびＦ２２１Ａから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６２６を基準にして番号が付けられている。
【００１６】
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５、５／１４／９９、５／１４／４１６、５／９１、５／９１／１０２／１１８、５／９１／１０２／２５４／４１８、５／９１／１０６／２５４／２８６、５／９１／１１８／１９４／２５４／２８６、５／９１／１１８／１９４／２５４／４１８、５／９１／１１８／１９４／４１８、５／９１／１１８／２５４／２８６／４１８、５／９１／１１８／２８６、５／９１／１９４／２５４、５／９１／１９４／４１８、５／９１／２５４、５／９１／２５４／２８６、５／１０２／４１８、５／１１８／１９４／２８６／４１８、５／１１８／２５４、５／１１８／２８６、５／１９４、５／２５４／２８６、５／４１８、７／１４、７／１４／６５／９９、７／１４／９９／４１６、１４、１４／６５／９９／４１６、１４／９９、１４／９９／２５４、１４／９９／２５４／４１６、１４／９９／２５４／４１６／４５５、１４／９９／４１６、１４／１６７、１４／２５４、１４／４５５、９１、９１／１０２／１９４、９１／１１８、９１／１１８／１９４、９１／１１８／１９４／２８６、９１／１１８／１９４／４１８、９１／１１８／２８６、９１／１９４／２５４／２８６、９１／２８６、および１１８／２８６／４１８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６７８を基準にして番号が付けられている。
【００１７】
一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５Ｌ／１４Ｌ／９９Ｌ、５Ｌ／１４Ｌ／４１６Ｅ、５Ｎ、５Ｎ／９１Ｖ、５Ｎ／９１Ｖ／１０２Ｒ／１１８Ｖ、５Ｎ／９１Ｖ／１０２Ｒ／２５４Ｔ／４１８Ｄ、５Ｎ／９１Ｖ／１０６Ｉ／２５４Ｔ／２８６Ｌ、５Ｎ／９１Ｖ／１１８Ｓ／１９４Ｐ／２５４Ｔ／４１８Ｄ、５Ｎ／９１Ｖ／１１８Ｓ／２５４Ｔ／２８６Ｌ／４１８Ｄ、５Ｎ／９１Ｖ／１１８Ｓ／２８６Ｌ、５Ｎ／９１Ｖ／１１８Ｖ／１９４Ｐ／２５４Ｔ／２８６Ｌ、５Ｎ／９１Ｖ／１１８Ｖ／１９４Ｐ／４１８Ｄ、５Ｎ／９１Ｖ／１９４Ｐ／２５４Ｔ、５Ｎ／９１Ｖ／１９４Ｐ／４１８Ｄ、５Ｎ／９１Ｖ／２５４Ｔ、５Ｎ／９１Ｖ／２５４Ｔ／２８６Ｌ、５Ｎ／１０２Ｒ／４１８Ｄ、５Ｎ／１１８Ｓ／１９４Ｐ／２８６Ｌ／４１８Ｄ、５Ｎ／１１８Ｓ／２８６Ｌ、５Ｎ／１１８Ｖ／２５４Ｔ、５Ｎ／１９４Ｐ、５Ｎ／２５４Ｔ／２８６Ｌ、５Ｎ／４１８Ｄ、７Ｌ／１４Ｌ、７Ｌ／１４Ｌ／６５Ｖ／９９Ｌ、７Ｌ／１４Ｌ／９９Ｓ／４１６Ｅ、１４Ｌ、１４Ｌ／６５Ｖ／９９Ｌ／４１６Ｅ、１４Ｌ／９９Ｌ、１４Ｌ／９９Ｌ／２５４Ｇ、１４Ｌ／９９Ｌ／２５４Ｇ／４１６Ｅ、１４Ｌ／９９Ｌ／２５４Ｇ／４１６Ｅ／４５５Ｒ、１４Ｌ／９９Ｌ／４１６Ｅ、１４Ｌ／９９Ｓ／４１６Ｅ、１４Ｌ／１６７Ｅ、１４Ｌ／２５４Ｇ、１４Ｌ／４５５Ｒ、９１Ｖ、９１Ｖ／１０２Ｒ／１９４Ｐ、９１Ｖ／１１８Ｖ、９１Ｖ／１１８Ｖ／１９４Ｐ、９１Ｖ／１１８Ｖ／１９４Ｐ／２８６Ｌ、９１Ｖ／１１８Ｖ／１９４Ｐ／４１８Ｄ、９１Ｖ／１１８Ｖ／２８６Ｌ、９１Ｖ／１９４Ｐ／２５４Ｔ／２８６Ｌ、９１Ｖ／２８６Ｌ、および１１８Ｖ／２８６Ｌ／４１８Ｄから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６７８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｓ５Ｌ／Ｖ１４Ｌ／Ｅ９９Ｌ、Ｓ５Ｌ／Ｖ１４Ｌ／Ｄ４１６Ｅ、Ｓ５Ｎ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ｋ１０２Ｒ／Ａ１１８Ｖ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ｋ１０２Ｒ／Ｓ２５４Ｔ／Ｅ４１８Ｄ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ｓ１０６Ｉ／Ｓ２５４Ｔ／Ｖ２８６Ｌ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ａ１１８Ｓ／Ｓ１９４Ｐ／Ｓ２５４Ｔ／Ｅ４１８Ｄ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ａ１１８Ｓ／Ｓ２５４Ｔ／Ｖ２８６Ｌ／Ｅ４１８Ｄ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ａ１１８Ｓ／Ｖ２８６Ｌ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ａ１１８Ｖ／Ｓ１９４Ｐ／Ｓ２５４Ｔ／Ｖ２８６Ｌ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ａ１１８Ｖ／Ｓ１９４Ｐ／Ｅ４１８Ｄ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ｓ１９４Ｐ／Ｓ２５４Ｔ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ｓ１９４Ｐ／Ｅ４１８Ｄ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ｓ２５４Ｔ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ｓ２５４Ｔ／Ｖ２８６Ｌ、Ｓ５Ｎ／Ｋ１０２Ｒ／Ｅ４１８Ｄ、Ｓ５Ｎ／Ａ１１８Ｓ／Ｓ１９４Ｐ／Ｖ２８６Ｌ／Ｅ４１８Ｄ、Ｓ５Ｎ／Ａ１１８Ｓ／Ｖ２８６Ｌ、Ｓ５Ｎ／Ａ１１８Ｖ／Ｓ２５４Ｔ、Ｓ５Ｎ／Ｓ１９４Ｐ、Ｓ５Ｎ／Ｓ２５４Ｔ／Ｖ２８６Ｌ、Ｓ５Ｎ／Ｅ４１８Ｄ、Ｔ７Ｌ／Ｖ１４Ｌ、Ｔ７Ｌ／Ｖ１４Ｌ／Ｉ６５Ｖ／Ｅ９９Ｌ、Ｔ７Ｌ／Ｖ１４Ｌ／Ｅ９９Ｓ／Ｄ４１６Ｅ、Ｖ１４Ｌ、Ｖ１４Ｌ／Ｉ６５Ｖ／Ｅ９９Ｌ／Ｄ４１６Ｅ、Ｖ１４Ｌ／Ｅ９９Ｌ、Ｖ１４Ｌ／Ｅ９９Ｌ／Ｓ２５４Ｇ、Ｖ１４Ｌ／Ｅ９９Ｌ／Ｓ２５４Ｇ／Ｄ４１６Ｅ、Ｖ１４Ｌ／Ｅ９９Ｌ／Ｓ２５４Ｇ／Ｄ４１６Ｅ／Ｓ４５５Ｒ、Ｖ１４Ｌ／Ｅ９９Ｌ／Ｄ４１６Ｅ、Ｖ１４Ｌ／Ｅ９９Ｓ／Ｄ４１６Ｅ、Ｖ１４Ｌ／Ｄ１６７Ｅ、Ｖ１４Ｌ／Ｓ２５４Ｇ、Ｖ１４Ｌ／Ｓ４５５Ｒ、Ｑ９１Ｖ、Ｑ９１Ｖ／Ｋ１０２Ｒ／Ｓ１９４Ｐ、Ｑ９１Ｖ／Ａ１１８Ｖ、Ｑ９１Ｖ／Ａ１１８Ｖ／Ｓ１９４Ｐ、Ｑ９１Ｖ／Ａ１１８Ｖ／Ｓ１９４Ｐ／Ｖ２８６Ｌ、Ｑ９１Ｖ／Ａ１１８Ｖ／Ｓ１９４Ｐ／Ｅ４１８Ｄ、Ｑ９１Ｖ／Ａ１１８Ｖ／Ｖ２８６Ｌ、Ｑ９１Ｖ／Ｓ１９４Ｐ／Ｓ２５４Ｔ／Ｖ２８６Ｌ、Ｑ９１Ｖ／Ｖ２８６Ｌ、およびＡ１１８Ｖ／Ｖ２８６Ｌ／Ｅ４１８Ｄから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６７８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５／９１／１０６／２５４／２８６、５／９１／１１８／２８６、５／９１／２５４／２８６、１４、１４／６５／９９／４１６、１４／９９、および１４／９９／２５４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６７８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５Ｎ／９１Ｖ／１０６Ｉ／２５４Ｔ／２８６Ｌ、５Ｎ／９１Ｖ／１１８Ｓ／２８６Ｌ、５Ｎ／９１Ｖ／２５４Ｔ／２８６Ｌ、１４Ｌ、１４Ｌ／６５Ｖ／９９Ｌ／４１６Ｅ、１４Ｌ／９９Ｌ、および１４Ｌ／９９Ｌ／２５４Ｇから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６７８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ｓ１０６Ｉ／Ｓ２５４Ｔ／Ｖ２８６Ｌ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ａ１１８Ｓ／Ｖ２８６Ｌ、Ｓ５Ｎ／Ｑ９１Ｖ／Ｓ２５４Ｔ／Ｖ２８６Ｌ、Ｖ１４Ｌ、Ｖ１４Ｌ／Ｉ６５Ｖ／Ｅ９９Ｌ／Ｄ４１６Ｅ、Ｖ１４Ｌ／Ｅ９９Ｌ、およびＶ１４Ｌ／Ｅ９９Ｌ／Ｓ２５４Ｇから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号６７８を基準にして番号が付けられている。
【００１８】
本発明は、配列番号１２に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたグリコシルトランスフェラーゼも提供する。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１６、１６／１２７／１６９、１６／１３４、１６／１４３／４２３、１６／１６９、１６／１６９／３９８／３９９、１６／１６９／４２３、１６／３９８、１６／３９８／３９９、１６／３９８／４２７、１６／４２３、１６／４２３／４２７、１３４、１４３、３９９／４２３、および４２３／４２７から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１６Ｔ、１６Ｔ／１２７Ｖ／１６９Ｅ、１６Ｔ／１３４Ｓ、１６Ｔ／１４３Ｇ／４２３Ｌ、１６Ｔ／１６９Ｅ、１６Ｔ／１６９Ｅ／３９８Ｍ／３９９Ｋ、１６Ｔ／１６９Ｅ／４２３Ｌ、１６Ｔ／３９８Ｍ、１６Ｔ／３９８Ｍ／３９９Ｋ、１６Ｔ／３９８Ｍ／４２７Ｓ、１６Ｔ／４２３Ｌ、１６Ｔ／４２３Ｌ／４２７Ｓ、１３４Ｓ、１４３Ｇ、３９９Ｋ／４２３Ｌ、および４２３Ｌ／４２７Ｓから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｌ１６Ｔ、Ｌ１６Ｔ／Ｑ１２７Ｖ／Ｐ１６９Ｅ、Ｌ１６Ｔ／Ａ１３４Ｓ、Ｌ１６Ｔ／Ｐ１４３Ｇ／Ｒ４２３Ｌ、Ｌ１６Ｔ／Ｐ１６９Ｅ、Ｌ１６Ｔ／Ｐ１６９Ｅ／Ａ３９８Ｍ／Ｑ３９９Ｋ、Ｌ１６Ｔ／Ｐ１６９Ｅ／Ｒ４２３Ｌ、Ｌ１６Ｔ／Ａ３９８Ｍ、Ｌ１６Ｔ／Ａ３９８Ｍ／Ｑ３９９Ｋ、Ｌ１６Ｔ／Ａ３９８Ｍ／Ｒ４２７Ｓ、Ｌ１６Ｔ／Ｒ４２３Ｌ、Ｌ１６Ｔ／Ｒ４２３Ｌ／Ｒ４２７Ｓ、Ａ１３４Ｓ、Ｐ１４３Ｇ、Ｑ３９９Ｋ／Ｒ４２３Ｌ、およびＲ４２３Ｌ／Ｒ４２７Ｓから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、３、８、１１、４１、４４、５６、６０、１２２、１３５、１３７、１３８、１３９、１５８、１６４、１７６、２２１、２３２、２３３、２３５、２４８、２４９、２８１、２８４、２８５、３０１、３２２、３７２、３９２、４００、４２１、４２６、４２７、４３３、４４０、４４３および４４６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、３Ｉ、３Ｖ、８Ｒ、１１Ｌ、１１Ｐ、４１Ｍ、４４Ｅ、５６Ａ、６０Ｔ、１２２Ｃ、１３５Ｖ、１３７Ｔ、１３８Ｋ、１３８Ｒ、１３９Ｔ、１５８Ｈ、１５８Ｖ、１６４Ａ、１６４Ｅ、１６４Ｎ、１６４Ｑ、１６４Ｓ、１７６Ｓ、２２１Ｄ、２３２Ａ、２３３Ｓ、２３３Ｔ、２３５Ｌ、２３５Ｍ、２４８Ｍ、２４９Ｒ、２８１Ｓ、２８４Ｖ、２８５Ａ、３０１Ｇ、３２２Ｒ、３７２Ｓ、３９２Ｖ、４００Ｃ、４２１Ａ、４２１Ｇ、４２６Ｓ、４２７Ａ、４２７Ｗ、４３３Ｇ、４３３Ｔ、４４０Ｌ、４４０Ｍ、４４３Ｇ、４４３Ｈ、および４４６Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｈ３Ｉ、Ｈ３Ｖ、Ｖ８Ｒ、Ｑ１１Ｌ、Ｑ１１Ｐ、Ｆ４１Ｍ、Ｙ４４Ｅ、Ｋ５６Ａ、Ｐ６０Ｔ、Ｌ１２２Ｃ、Ｌ１３５Ｖ、Ｑ１３７Ｔ、Ｇ１３８Ｋ、Ｇ１３８Ｒ、Ｉ１３９Ｔ、Ｆ１５８Ｈ、Ｆ１５８Ｖ、Ｈ１６４Ａ、Ｈ１６４Ｅ、Ｈ１６４Ｎ、Ｈ１６４Ｑ、Ｈ１６４Ｓ、Ｒ１７６Ｓ、Ｅ２２１Ｄ、Ｐ２３２Ａ、Ｐ２３３Ｓ、Ｐ２３３Ｔ、Ｑ２３５Ｌ、Ｑ２３５Ｍ、Ｉ２４８Ｍ、Ｄ２４９Ｒ、Ｇ２８１Ｓ、Ｌ２８４Ｖ、Ｓ２８５Ａ、Ｑ３０１Ｇ、Ｌ３２２Ｒ、Ａ３７２Ｓ、Ｉ３９２Ｖ、Ｖ４００Ｃ、Ｓ４２１Ａ、Ｓ４２１Ｇ、Ａ４２６Ｓ、Ｒ４２７Ａ、Ｒ４２７Ｗ、Ｎ４３３Ｇ、Ｎ４３３Ｔ、Ｉ４４０Ｌ、Ｉ４４０Ｍ、Ｃ４４３Ｇ、Ｃ４４３Ｈ、およびＲ４４６Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２４を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１６、１６／１２７／１６９、および１６／１６９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１６Ｔ、１６Ｔ／１２７Ｖ／１６９Ｅ、および１６Ｔ／１６９Ｅから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｌ１６Ｔ、Ｌ１６Ｔ／Ｑ１２７Ｖ／Ｐ１６９Ｅ、およびＬ１６Ｔ／Ｐ１６９Ｅから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２４を基準にして番号が付けられている。
【００１９】
一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、３／２２／１９８／４２１、３／２２／４２１、３／２０１／２４８／３２２、３／２０１／２４８／３２２／３９２、１３／２３３／３３１／４４０、１３／４４０／４４３、２２／３２／５６／６０／１９８／２４８／３２２／３９２／４２１、２２／５６、２２／５６／１３７／１９８／２０１／２４８／３２２／３９２、２２／５６／１３７／１９８／２４８／３９２／４２１、２２／５６／１３７／３２２、２２／５６／１３７／３２２／３９２／４２３、２２／５６／１９８／２０２／２４８、２２／５６／１９８／２４８／３２２／３９２／４２１、２２／５６／１９８／２４８／４２１／４２３、２２／５６／４２１／４２３、２２／６０／３９２／４２１、２２／１３７、２２／１３７／１９８／２０２／２４８、２２／１９８／２０２／２４８／３９２、２２／２４８／３９２、２２／３９２、２２／４２１、２２／４２１／４２３、２２／４２３、４４／１６４／２３３、４４／１６４／２３３／３２９／３３１、４４／３３１、１２５、１２５／２３３／４４３／４４６、１６４／２２１／２３３／３３１／４４０／４４６、１６４／２３３／３３１／４４０、１６４／２３３／４４６、１６４／３３１、１６４／４４０、１６４／４４３、１９８／２０２／３９２、２２１／３２９／３３１、２３３、２３３／４４６、３２９、４２１／４２３、および４４３／４４６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号８５８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、３Ｉ／２２Ｇ／１９８Ｑ／４２１Ｇ、３Ｉ／２２Ｇ／４２１Ｇ、３Ｉ／２０１Ａ／２４８Ｍ／３２２Ｒ、３Ｉ／２０１Ａ／２４８Ｍ／３２２Ｒ／３９２Ｖ、１３Ｑ／２３３Ｓ／３３１Ｖ／４４０Ｍ、１３Ｑ／４４０Ｍ／４４３Ｇ、２２Ｇ／３２Ｌ／５６Ａ／６０Ｔ／１９８Ｑ／２４８Ｍ／３２２Ｒ／３９２Ｖ／４２１Ｇ、２２Ｇ／５６Ａ、２２Ｇ／５６Ａ／１３７Ｔ／１９８Ｑ／２０１Ａ／２４８Ｍ／３２２Ｒ／３９２Ｖ、２２Ｇ／５６Ａ／１３７Ｔ／１９８Ｑ／２４８Ｍ／３９２Ｖ／４２１Ｇ、２２Ｇ／５６Ａ／１３７Ｔ／３２２Ｒ、２２Ｇ／５６Ａ／１３７Ｔ／３２２Ｒ／３９２Ｖ／４２３Ｌ、２２Ｇ／５６Ａ／１９８Ｑ／２０２Ｙ／２４８Ｍ、２２Ｇ／５６Ａ／１９８Ｑ／２４８Ｍ／３２２Ｒ／３９２Ｖ／４２１Ｇ、２２Ｇ／５６Ａ／１９８Ｑ／２４８Ｍ／４２１Ｇ／４２３Ｌ、２２Ｇ／５６Ａ／４２１Ｇ／４２３Ｌ、２２Ｇ／６０Ｔ／３９２Ｖ／４２１Ｇ、２２Ｇ／１３７Ｔ、２２Ｇ／１３７Ｔ／１９８Ｑ／２０２Ｙ／２４８Ｍ、２２Ｇ／１９８Ｑ／２０２Ｙ／２４８Ｍ／３９２Ｖ、２２Ｇ／２４８Ｍ／３９２Ｖ、２２Ｇ／３９２Ｖ、２２Ｇ／４２１Ｇ、２２Ｇ／４２１Ｇ／４２３Ｌ、２２Ｇ／４２３Ｌ、４４Ｅ／１６４Ａ／２３３Ｓ、４４Ｅ／１６４Ｅ／２３３Ｓ、４４Ｅ／１６４Ｅ／２３３Ｓ／３２９Ｌ／３３１Ｖ、４４Ｅ／３３１Ｖ、１２５Ｌ、１２５Ｌ／２３３Ｓ／４４３Ｇ／４４６Ｌ、１６４Ａ／２３３Ｓ／４４６Ｌ、１６４Ａ／３３１Ｖ、１６４Ａ／４４０Ｍ、１６４Ａ／４４３Ｇ、１６４Ｅ／２２１Ｄ／２３３Ｓ／３３１Ｖ／４４０Ｍ／４４６Ｌ、１６４Ｅ／２３３Ｓ／３３１Ｖ／４４０Ｍ、１９８Ｑ／２０２Ｙ／３９２Ｖ、２２１Ｄ／３２９Ｌ／３３１Ｖ、２３３Ｓ、２３３Ｓ／４４６Ｌ、３２９Ｌ、４２１Ｇ／４２３Ｌ、および４４３Ｇ／４４６Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号８５８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｈ３Ｉ／Ａ２２Ｇ／Ｇ１９８Ｑ／Ｓ４２１Ｇ、Ｈ３Ｉ／Ａ２２Ｇ／Ｓ４２１Ｇ、Ｈ３Ｉ／Ｇ２０１Ａ／Ｉ２４８Ｍ／Ｌ３２２Ｒ、Ｈ３Ｉ／Ｇ２０１Ａ／Ｉ２４８Ｍ／Ｌ３２２Ｒ／Ｉ３９２Ｖ、Ｌ１３Ｑ／Ｐ２３３Ｓ／Ｉ３３１Ｖ／Ｉ４４０Ｍ、Ｌ１３Ｑ／Ｉ４４０Ｍ／Ｃ４４３Ｇ、Ａ２２Ｇ／Ｉ３２Ｌ／Ｋ５６Ａ／Ｐ６０Ｔ／Ｇ１９８Ｑ／Ｉ２４８Ｍ／Ｌ３２２Ｒ／Ｉ３９２Ｖ／Ｓ４２１Ｇ、Ａ２２Ｇ／Ｋ５６Ａ、Ａ２２Ｇ／Ｋ５６Ａ／Ｑ１３７Ｔ／Ｇ１９８Ｑ／Ｇ２０１Ａ／Ｉ２４８Ｍ／Ｌ３２２Ｒ／Ｉ３９２Ｖ、Ａ２２Ｇ／Ｋ５６Ａ／Ｑ１３７Ｔ／Ｇ１９８Ｑ／Ｉ２４８Ｍ／Ｉ３９２Ｖ／Ｓ４２１Ｇ、Ａ２２Ｇ／Ｋ５６Ａ／Ｑ１３７Ｔ／Ｌ３２２Ｒ、Ａ２２Ｇ／Ｋ５６Ａ／Ｑ１３７Ｔ／Ｌ３２２Ｒ／Ｉ３９２Ｖ／Ｒ４２３Ｌ、Ａ２２Ｇ／Ｋ５６Ａ／Ｇ１９８Ｑ／Ｉ２０２Ｙ／Ｉ２４８Ｍ、Ａ２２Ｇ／Ｋ５６Ａ／Ｇ１９８Ｑ／Ｉ２４８Ｍ／Ｌ３２２Ｒ／Ｉ３９２Ｖ／Ｓ４２１Ｇ、Ａ２２Ｇ／Ｋ５６Ａ／Ｇ１９８Ｑ／Ｉ２４８Ｍ／Ｓ４２１Ｇ／Ｒ４２３Ｌ、Ａ２２Ｇ／Ｋ５６Ａ／Ｓ４２１Ｇ／Ｒ４２３Ｌ、Ａ２２Ｇ／Ｐ６０Ｔ／Ｉ３９２Ｖ／Ｓ４２１Ｇ、Ａ２２Ｇ／Ｑ１３７Ｔ、Ａ２２Ｇ／Ｑ１３７Ｔ／Ｇ１９８Ｑ／Ｉ２０２Ｙ／Ｉ２４８Ｍ、Ａ２２Ｇ／Ｇ１９８Ｑ／Ｉ２０２Ｙ／Ｉ２４８Ｍ／Ｉ３９２Ｖ、Ａ２２Ｇ／Ｉ２４８Ｍ／Ｉ３９２Ｖ、Ａ２２Ｇ／Ｉ３９２Ｖ、Ａ２２Ｇ／Ｓ４２１Ｇ、Ａ２２Ｇ／Ｓ４２１Ｇ／Ｒ４２３Ｌ、Ａ２２Ｇ／Ｒ４２３Ｌ、Ｙ４４Ｅ／Ｈ１６４Ａ／Ｐ２３３Ｓ、Ｙ４４Ｅ／Ｈ１６４Ｅ／Ｐ２３３Ｓ、Ｙ４４Ｅ／Ｈ１６４Ｅ／Ｐ２３３Ｓ／Ａ３２９Ｌ／Ｉ３３１Ｖ、Ｙ４４Ｅ／Ｉ３３１Ｖ、Ｆ１２５Ｌ、Ｆ１２５Ｌ／Ｐ２３３Ｓ／Ｃ４４３Ｇ／Ｒ４４６Ｌ、Ｈ１６４Ａ／Ｐ２３３Ｓ／Ｒ４４６Ｌ、Ｈ１６４Ａ／Ｉ３３１Ｖ、Ｈ１６４Ａ／Ｉ４４０Ｍ、Ｈ１６４Ａ／Ｃ４４３Ｇ、Ｈ１６４Ｅ／Ｅ２２１Ｄ／Ｐ２３３Ｓ／Ｉ３３１Ｖ／Ｉ４４０Ｍ／Ｒ４４６Ｌ、Ｈ１６４Ｅ／Ｐ２３３Ｓ／Ｉ３３１Ｖ／Ｉ４４０Ｍ、Ｇ１９８Ｑ／Ｉ２０２Ｙ／Ｉ３９２Ｖ、Ｅ２２１Ｄ／Ａ３２９Ｌ／Ｉ３３１Ｖ、Ｐ２３３Ｓ、Ｐ２３３Ｓ／Ｒ４４６Ｌ、Ａ３２９Ｌ、Ｓ４２１Ｇ／Ｒ４２３Ｌ、およびＣ４４３Ｇ／Ｒ４４６Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号８５８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、３／２２／１９８／４２１、１３／４４０／４４３、２２／５６／１９８／２０２／２４８、２２／１３７、２２／１９８／２０２／２４８／３９２、１６４／２２１／２３３／３３１／４４０／４４６、１６４／２３３／３３１／４４０、および２３３／４４６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号８５８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、３Ｉ／２２Ｇ／１９８Ｑ／４２１Ｇ、１３Ｑ／４４０Ｍ／４４３Ｇ、２２Ｇ／５６Ａ／１９８Ｑ／２０２Ｙ／２４８Ｍ、２２Ｇ／１３７Ｔ、２２Ｇ／１９８Ｑ／２０２Ｙ／２４８Ｍ／３９２Ｖ、１６４Ｅ／２２１Ｄ／２３３Ｓ／３３１Ｖ／４４０Ｍ／４４６Ｌ、１６４Ｅ／２３３Ｓ／３３１Ｖ／４４０Ｍ、および２３３Ｓ／４４６Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号８５８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｈ３Ｉ／Ａ２２Ｇ／Ｇ１９８Ｑ／Ｓ４２１Ｇ、Ｌ１３Ｑ／Ｉ４４０Ｍ／Ｃ４４３Ｇ、Ａ２２Ｇ／Ｋ５６Ａ／Ｇ１９８Ｑ／Ｉ２０２Ｙ／Ｉ２４８Ｍ、Ａ２２Ｇ／Ｑ１３７Ｔ、Ａ２２Ｇ／Ｇ１９８Ｑ／Ｉ２０２Ｙ／Ｉ２４８Ｍ／Ｉ３９２Ｖ、Ｈ１６４Ｅ／Ｅ２２１Ｄ／Ｐ２３３Ｓ／Ｉ３３１Ｖ／Ｉ４４０Ｍ／Ｒ４４６Ｌ、Ｈ１６４Ｅ／Ｐ２３３Ｓ／Ｉ３３１Ｖ／Ｉ４４０Ｍ、およびＰ２３３Ｓ／Ｒ４４６Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号８５８を基準にして番号が付けられている。
【００２０】
一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８３／２０２／２３３、１６４、１６４／２０２、１６４／２０２／２３３／３３１、１６４／２０２／２４８／２７２、１６４／２０２／３３１、１６４／２０２／３３１／４２３、１６４／４２３、２０２／２３３、２０２／２３３／２４８、２０２／２３３／２４８／４２３、２０２／２４８、２０２／３３１、２０２／４２１／４２３、２０２／４２３、２０２／４４６、２３３、２４８、および４２３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８３Ｙ／２０２Ｉ／２３３Ｓ、１６４Ｅ、１６４Ｅ／２０２Ｉ、１６４Ｅ／２０２Ｉ／２３３Ｓ／３３１Ｖ、１６４Ｅ／２０２Ｉ／２４８Ｉ／２７２Ｃ、１６４Ｅ／２０２Ｉ／３３１Ｖ、１６４Ｅ／２０２Ｉ／３３１Ｖ／４２３Ｌ、１６４Ｅ／４２３Ｌ、２０２Ｉ／２３３Ｓ、２０２Ｉ／２３３Ｓ／２４８Ｉ、２０２Ｉ／２３３Ｓ／２４８Ｉ／４２３Ｌ、２０２Ｉ／２４８Ｉ、２０２Ｉ／３３１Ｖ、２０２Ｉ／４２１Ｇ／４２３Ｌ、２０２Ｉ／４２３Ｌ、２０２Ｉ／４４６Ｌ、２３３Ｓ、２４８Ｉ、および４２３Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｈ８３Ｙ／Ｙ２０２Ｉ／Ｐ２３３Ｓ、Ｈ１６４Ｅ、Ｈ１６４Ｅ／Ｙ２０２Ｉ、Ｈ１６４Ｅ／Ｙ２０２Ｉ／Ｐ２３３Ｓ／Ｉ３３１Ｖ、Ｈ１６４Ｅ／Ｙ２０２Ｉ／Ｍ２４８Ｉ／Ｒ２７２Ｃ、Ｈ１６４Ｅ／Ｙ２０２Ｉ／Ｉ３３１Ｖ、Ｈ１６４Ｅ／Ｙ２０２Ｉ／Ｉ３３１Ｖ／Ｒ４２３Ｌ、Ｈ１６４Ｅ／Ｒ４２３Ｌ、Ｙ２０２Ｉ／Ｐ２３３Ｓ、Ｙ２０２Ｉ／Ｐ２３３Ｓ／Ｍ２４８Ｉ、Ｙ２０２Ｉ／Ｐ２３３Ｓ／Ｍ２４８Ｉ／Ｒ４２３Ｌ、Ｙ２０２Ｉ／Ｍ２４８Ｉ、Ｙ２０２Ｉ／Ｉ３３１Ｖ、Ｙ２０２Ｉ／Ｓ４２１Ｇ／Ｒ４２３Ｌ、Ｙ２０２Ｉ／Ｒ４２３Ｌ、Ｙ２０２Ｉ／Ｒ４４６Ｌ、Ｐ２３３Ｓ、Ｍ２４８Ｉ、およびＲ４２３Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、７、９、１０、５４、７３、８４、１０６、１１５、１１６、１３２、１６５、２８６、３０９、３８９、４０６、４２２および４３８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、７Ｔ、９Ｌ、１０Ｐ、５４Ｌ、５４Ｍ、７３Ｒ、７３Ｓ、８４Ｌ、１０６Ｓ、１１５Ａ、１１６Ｉ、１３２Ｒ、１６５Ｐ、２８６Ｇ、３０９Ｅ、３８９Ｅ、４０６Ｈ、４０６Ｍ、４０６Ｑ、４２２Ａ、４２２Ｔ、４２２Ｖ、４３８Ａ、および４３８Ｔから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｇ７Ｔ、Ｓ９Ｌ、Ｄ１０Ｐ、Ｓ５４Ｌ、Ｓ５４Ｍ、Ａ７３Ｒ、Ａ７３Ｓ、Ｙ８４Ｌ、Ａ１０６Ｓ、Ｎ１１５Ａ、Ｌ１１６Ｉ、Ｋ１３２Ｒ、Ｅ１６５Ｐ、Ｎ２８６Ｇ、Ｋ３０９Ｅ、Ｄ３８９Ｅ、Ｓ４０６Ｈ、Ｓ４０６Ｍ、Ｓ４０６Ｑ、Ｋ４２２Ａ、Ｋ４２２Ｔ、Ｋ４２２Ｖ、Ｅ４３８Ａ、およびＥ４３８Ｔから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８３／２０２／２３３、１６４、１６４／２０２、１６４／４２３、２０２／２３３／２４８、および２３３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、８３Ｙ／２０２Ｉ／２３３Ｓ、１６４Ｅ、１６４Ｅ／２０２Ｉ、１６４Ｅ／４２３Ｌ、２０２Ｉ／２３３Ｓ／２４８Ｉ、および２３３Ｓから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｈ８３Ｙ／Ｙ２０２Ｉ／Ｐ２３３Ｓ、Ｈ１６４Ｅ、Ｈ１６４Ｅ／Ｙ２０２Ｉ、Ｈ１６４Ｅ／Ｒ４２３Ｌ、Ｙ２０２Ｉ／Ｐ２３３Ｓ／Ｍ２４８Ｉ、およびＰ２３３Ｓから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号９９４を基準にして番号が付けられている。
【００２１】
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、７／９／７３／１６５／２８６、７／９／１６５／２８６、７／９／４２２、７／１１６／１６５／２８６、７／１６５、９／７３／１１６／１６５／２８６／４２２、９／２８６／３８９、５４、５４／８４、５４／４０６、７３、７３／１１６／１６５／２８６／３８９、７３／１１６／２８６、７３／１１６／２８６／４２２、７３／１６５／２８６、７３／２８６／３８９、７３／２８６／４２２、７３／４２２、８４、１１５、１１６、１１６／１６５、１１６／１６５／２８６／４２２、１１６／３８９、１６５、１６５／２８６、１６５／３８９、１６５／３８９／４２２、２８６、２８６／４２２、３８９／４２２、および４２２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、７Ｔ／９Ｌ／７３Ｒ／１６５Ｐ／２８６Ｇ、７Ｔ／９Ｌ／１６５Ｐ／２８６Ｇ、７Ｔ／９Ｌ／４２２Ａ、７Ｔ／１１６Ｉ／１６５Ｐ／２８６Ｇ、７Ｔ／１６５Ｐ、９Ｌ／７３Ｒ／１１６Ｉ／１６５Ｐ／２８６Ｇ／４２２Ａ、９Ｌ／２８６Ｇ／３８９Ｅ、５４Ｌ／８４Ｌ、５４Ｍ、５４Ｍ／４０６Ｍ、７３Ｒ、７３Ｒ／１１６Ｉ／１６５Ｐ／２８６Ｇ／３８９Ｅ、７３Ｒ／１１６Ｉ／２８６Ｇ、７３Ｒ／１１６Ｉ／２８６Ｇ／４２２Ａ、７３Ｒ／１６５Ｐ／２８６Ｇ、７３Ｒ／２８６Ｇ／３８９Ｅ、７３Ｒ／２８６Ｇ／４２２Ａ、７３Ｒ／２８６Ｇ／４２２Ｔ、７３Ｒ／４２２Ｔ、８４Ｌ、１１５Ａ、１１６Ｉ、１１６Ｉ／１６５Ｐ、１１６Ｉ／１６５Ｐ／２８６Ｇ／４２２Ａ、１１６Ｉ／３８９Ｅ、１６５Ｐ、１６５Ｐ／２８６Ｇ、１６５Ｐ／３８９Ｅ、１６５Ｐ／３８９Ｅ／４２２Ｔ、２８６Ｇ、２８６Ｇ／４２２Ａ、３８９Ｅ／４２２Ａ、および４２２Ｔから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｇ７Ｔ／Ｓ９Ｌ／Ａ７３Ｒ／Ｅ１６５Ｐ／Ｎ２８６Ｇ、Ｇ７Ｔ／Ｓ９Ｌ／Ｅ１６５Ｐ／Ｎ２８６Ｇ、Ｇ７Ｔ／Ｓ９Ｌ／Ｋ４２２Ａ、Ｇ７Ｔ／Ｌ１１６Ｉ／Ｅ１６５Ｐ／Ｎ２８６Ｇ、Ｇ７Ｔ／Ｅ１６５Ｐ、Ｓ９Ｌ／Ａ７３Ｒ／Ｌ１１６Ｉ／Ｅ１６５Ｐ／Ｎ２８６Ｇ／Ｋ４２２Ａ、Ｓ９Ｌ／Ｎ２８６Ｇ／Ｄ３８９Ｅ、Ｓ５４Ｌ／Ｙ８４Ｌ、Ｓ５４Ｍ、Ｓ５４Ｍ／Ｓ４０６Ｍ、Ａ７３Ｒ、Ａ７３Ｒ／Ｌ１１６Ｉ／Ｅ１６５Ｐ／Ｎ２８６Ｇ／Ｄ３８９Ｅ、Ａ７３Ｒ／Ｌ１１６Ｉ／Ｎ２８６Ｇ、Ａ７３Ｒ／Ｌ１１６Ｉ／Ｎ２８６Ｇ／Ｋ４２２Ａ、Ａ７３Ｒ／Ｅ１６５Ｐ／Ｎ２８６Ｇ、Ａ７３Ｒ／Ｎ２８６Ｇ／Ｄ３８９Ｅ、Ａ７３Ｒ／Ｎ２８６Ｇ／Ｋ４２２Ａ、Ａ７３Ｒ／Ｎ２８６Ｇ／Ｋ４２２Ｔ、Ａ７３Ｒ／Ｋ４２２Ｔ、Ｙ８４Ｌ、Ｎ１１５Ａ、Ｌ１１６Ｉ、Ｌ１１６Ｉ／Ｅ１６５Ｐ、Ｌ１１６Ｉ／Ｅ１６５Ｐ／Ｎ２８６Ｇ／Ｋ４２２Ａ、Ｌ１１６Ｉ／Ｄ３８９Ｅ、Ｅ１６５Ｐ、Ｅ１６５Ｐ／Ｎ２８６Ｇ、Ｅ１６５Ｐ／Ｄ３８９Ｅ、Ｅ１６５Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｋ４２２Ｔ、Ｎ２８６Ｇ、Ｎ２８６Ｇ／Ｋ４２２Ａ、Ｄ３８９Ｅ／Ｋ４２２Ａ、およびＫ４２２Ｔから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１８５／１９０、２１９、２２０、２５５、２５７、３０２、３８５、３９５、３９５／４３７、３９９、４０１、４０９、４１２、４１６、４３４、４４１、４４５、４４７および４４９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１８５Ｌ／１９０Ｐ、２１９Ｌ、２２０Ａ、２５５Ｒ、２５７Ｈ、３０２Ａ、３０２Ｈ、３０２Ｌ、３０２Ｒ、３０２Ｔ、３８５Ｍ、３８５Ｐ、３８５Ｓ、３９５Ａ、３９５Ｄ、３９５Ｈ、３９５Ｎ、３９５Ｓ／４３７Ｌ、３９９Ｒ、４０１Ｖ、４０９Ｌ、４１２Ｋ、４１６Ｎ、４３４Ｉ、４４１Ａ、４４１Ｋ、４４１Ｌ、４４１Ｒ、４４１Ｓ、４４５Ｋ、４４５Ｒ、４４７Ａ、４４７Ｒ、４４７Ｓ、４４７Ｖ、４４９Ａ、４４９Ｈ、および４４９Ｔから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ、Ｃ２１９Ｌ、Ｔ２２０Ａ、Ｐ２５５Ｒ、Ｎ２５７Ｈ、Ｎ３０２Ａ、Ｎ３０２Ｈ、Ｎ３０２Ｌ、Ｎ３０２Ｒ、Ｎ３０２Ｔ、Ｖ３８５Ｍ、Ｖ３８５Ｐ、Ｖ３８５Ｓ、Ｇ３９５Ａ、Ｇ３９５Ｄ、Ｇ３９５Ｈ、Ｇ３９５Ｎ、Ｇ３９５Ｓ／Ｅ４３７Ｌ、Ｑ３９９Ｒ、Ｌ４０１Ｖ、Ｔ４０９Ｌ、Ｉ４１２Ｋ、Ｋ４１６Ｎ、Ａ４３４Ｉ、Ｑ４４１Ａ、Ｑ４４１Ｋ、Ｑ４４１Ｌ、Ｑ４４１Ｒ、Ｑ４４１Ｓ、Ｎ４４５Ｋ、Ｎ４４５Ｒ、Ｎ４４７Ａ、Ｎ４４７Ｒ、Ｎ４４７Ｓ、Ｎ４４７Ｖ、Ｙ４４９Ａ、Ｙ４４９Ｈ、およびＹ４４９Ｔから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、９／７３／１１６／１６５／２８６／４２２、５４、５４／８４、５４／４０６、７３／１１６／２８６／４２２、１１６／１６５／２８６／４２２、および２８６／４２２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、９Ｌ／７３Ｒ／１１６Ｉ／１６５Ｐ／２８６Ｇ／４２２Ａ、５４Ｌ／８４Ｌ、５４Ｍ、５４Ｍ／４０６Ｍ、７３Ｒ／１１６Ｉ／２８６Ｇ／４２２Ａ、１１６Ｉ／１６５Ｐ／２８６Ｇ／４２２Ａ、および２８６Ｇ／４２２Ａから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｓ９Ｌ／Ａ７３Ｒ／Ｌ１１６Ｉ／Ｅ１６５Ｐ／Ｎ２８６Ｇ／Ｋ４２２Ａ、Ｓ５４Ｌ／Ｙ８４Ｌ、Ｓ５４Ｍ、Ｓ５４Ｍ／Ｓ４０６Ｍ、Ａ７３Ｒ／Ｌ１１６Ｉ／Ｎ２８６Ｇ／Ｋ４２２Ａ、Ｌ１１６Ｉ／Ｅ１６５Ｐ／Ｎ２８６Ｇ／Ｋ４２２Ａ、およびＮ２８６Ｇ／Ｋ４２２Ａから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１０８０を基準にして番号が付けられている。
【００２２】
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５４、５４／１８５／１９０、５４／１８５／１９０／２１９／２５７／３０２／３８５／３８９／３９５／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／２１９／３８５、５４／１８５／１９０／２１９／３８５／３８９／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／２１９／３８５／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／２１９／３８５／４４５／４４７、５４／１８５／１９０／２１９／３８９／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／３０２、５４／１８５／１９０／３０２／３９５／３９９、５４／１８５／１９０／３８５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／３８９／３９５、５４／１８５／１９０／３８９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／３８９／４４５、５４／１８５／１９０／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／２１９／３８９、５４／１８５／２５７／３８９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／３０２／３８５／３９９／４４５／４４７、５４／１８５／３８５／３８９／３９５／４４１／４４５／４４９、５４／１８５／３８５／３９５／３９９／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／３８９／３９５／４４５／４４７、５４／１９０／２１９／２５７／３０２、５４／１９０／２１９／２５７／３９５／４４５／４４７／４４９、５４／１９０／２５７、５４／１９０／２５７／３０２／３９９、５４／１９０／２５７／３０９／３８５／３８９／３９５／３９９／４４５、５４／１９０／２５７／３８５／３８９、５４／１９０／２５７／３９５／４４５／４４９、５４／１９０／３０２／３８９、５４／１９０／３０２／３８９／３９５／３９９／４４５／４４７、５４／１９０／３８５／３８９／３９５／４４１／４４５、５４／１９０／３８５／３９５、５４／１９０／３８５／４４５／４４７／４４９、５４／１９０／３９５、５４／１９０／３９５／４４５／４４７、５４／２１９／３０２／３９５／４４１／４４５／４４７、５４／２１９／３８５／３８９／３９５／４４１／４４５／４４７、５４／２５７、５４／２５７／３８５／４４９、５４／２５７／３８９、５４／２５７／３９９、５４／２５７／４４１／４４７、５４／２５７／４４１／４４９、５４／３０２／３８５／３９９／４４１／４４５／４４７、５４／３０２／３８５／３９９／４４１／４４５／４４９、５４／３８５、５４／３８５／３８９／４４１／４４５／４４７／４４９、５４／３８９／３９５／３９９／４４７／４４９、１８５／１９０／２１９／２５７／３８９／３９５／４４５／４４７、１８５／１９０／２５７／３０２／３９５／４４１／４４５／４４７、１８５／１９０／２５７／３８５／３８９／３９９、１８５／１９０／２５７／３８５／３９９／４４５／４４７、１８５／１９０／２５７／３８９／３９５、１８５／１９０／２５７／３８９／３９５／３９９／４４１／４４７／４４９、１８５／１９０／３８５／３８９／４４１／４４５／４４７、１８５／１９０／３８９／４４７／４４９、１８５／１９０／３９５／３９９、１８５／２１９／２５７／３９９／４４５／４４７、１８５／２５７／３８５／３９５／３９９／４４５／４４７、１８５／３０２／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７／４４９、１８５／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７、１９０／２１９／２５７／３８５／３８９／４４１／４４５／４４７／４４９、１９０／２１９／３０２／３８５／３９９／４４５、１９０／２５７／３０２／３８５／３９９、１９０／２５７／３８５／３８９／３９９、１９０／２５７／３８５／３８９／４４５／４４７、１９０／２５７／３８５／３９５、１９０／２５７／３８５／４４１／４４５／４４７／４４９、１９０／２５７／３８９／３９５／４４１／４４５／４４７、１９０／２５７／３９９／４４７／４４９、１９０／３０２／３８５／３８９／３９５／３９９／４４１／４４５／４４７、１９０／３８９、２１９／２５７／３８５／３８９／３９５／４４１／４４７／４４９、２１９／２５７／３９５、２１９／３８５／３８９／３９９／４４５／４４９、２１９／３９５、２５７／３８５／３８９／３９９、２５７／３８９／３９５／３９９／４４５／４４７、２５７／３８９／３９５／３９９／４４５／４４９、２５７／３８９／３９９、３０２／３８９／３９５／４４５、３８５／３８９、３８５／３９５、３８９／３９５／４４５／４４７、３９５／３９９、および３９９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１２１６を基準にして番号が付けられている。
【００２３】
一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５４Ｍ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／２１９Ｌ／２５７Ｈ／３０２Ｒ／３８５Ｐ／３８９Ｅ／３９５Ｈ／４４５Ｋ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／２１９Ｌ／３８５Ｐ／４４５Ｒ／４４７Ａ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／２１９Ｌ／３８５Ｓ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／２１９Ｌ／３８５Ｓ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４１Ｒ／４４５Ｒ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／２１９Ｌ／３８５Ｓ／３９５Ａ／３９９Ｒ／４４１Ｒ／４４５Ｋ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／２１９Ｌ／３８９Ｅ／３９５Ｈ／３９９Ｒ／４４１Ｓ／４４５Ｋ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／３０２Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／３０２Ｒ／３９５Ｈ／３９９Ｒ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／３８５Ｐ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／３８９Ｅ／３９５Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／３８９Ｅ／４４１Ｒ／４４５Ｒ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／３８９Ｅ／４４５Ｋ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４１Ｒ／４４５Ｋ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／２１９Ｌ／３８９Ｅ、５４Ｍ／１８５Ｌ／２５７Ｈ／３８９Ｅ／４４１Ｓ／４４５Ｒ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／３０２Ｈ／３８５Ｓ／３９９Ｒ／４４５Ｒ／４４７Ａ、５４Ｍ／１８５Ｌ／３８５Ｓ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／４４１Ｒ／４４５Ｋ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／３８５Ｓ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４５Ｒ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／４４５Ｋ／４４７Ａ、５４Ｍ／１９０Ｐ／２１９Ｌ／２５７Ｈ／３０２Ｈ、５４Ｍ／１９０Ｐ／２１９Ｌ／２５７Ｈ／３９５Ｈ／４４５Ｒ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１９０Ｐ／２５７Ｈ、５４Ｍ／１９０Ｐ／２５７Ｈ／３０２Ｈ／３９９Ｒ、５４Ｍ／１９０Ｐ／２５７Ｈ／３０９Ｎ／３８５Ｓ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４５Ｋ、５４Ｍ／１９０Ｐ／２５７Ｈ／３８５Ｓ／３８９Ｅ、５４Ｍ／１９０Ｐ／２５７Ｈ／３９５Ｄ／４４５Ｋ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１９０Ｐ／３０２Ｈ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４５Ｋ／４４７Ｓ、５４Ｍ／１９０Ｐ／３０２Ｒ／３８９Ｅ、５４Ｍ／１９０Ｐ／３８５Ｐ／３９５Ｄ、５４Ｍ／１９０Ｐ／３８５Ｐ／４４５Ｒ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１９０Ｐ／３８５Ｓ／３８９Ｅ／３９５Ｈ／４４１Ｓ／４４５Ｒ、５４Ｍ／１９０Ｐ／３９５Ａ、５４Ｍ／１９０Ｐ／３９５Ｈ／４４５Ｋ／４４７Ａ、５４Ｍ／２１９Ｌ／３０２Ｒ／３９５Ｈ／４４１Ｓ／４４５Ｒ／４４７Ａ、５４Ｍ／２１９Ｌ／３８５Ｐ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／４４１Ｒ／４４５Ｋ／４４７Ａ、５４Ｍ／２５７Ｈ、５４Ｍ／２５７Ｈ／３８５Ｓ／４４９Ｈ、５４Ｍ／２５７Ｈ／３８９Ｅ、５４Ｍ／２５７Ｈ／３９９Ｒ、５４Ｍ／２５７Ｈ／４４１Ｒ／４４７Ａ、５４Ｍ／２５７Ｈ／４４１Ｒ／４４９Ｈ、５４Ｍ／３０２Ｈ／３８５Ｐ／３９９Ｒ／４４１Ｓ／４４５Ｋ／４４７Ｓ、５４Ｍ／３０２Ｈ／３８５Ｓ／３９９Ｒ／４４１Ｓ／４４５Ｒ／４４９Ｈ、５４Ｍ／３８５Ｐ、５４Ｍ／３８５Ｐ／３８９Ｅ／４４１Ｒ／４４５Ｋ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４７Ａ／４４９Ｈ、１８５Ｌ／１９０Ｐ／２１９Ｌ／２５７Ｈ／３８９Ｅ／３９５Ａ／４４５Ｋ／４４７Ａ、１８５Ｌ／１９０Ｐ／２５７Ｈ／３０２Ｒ／３９５Ｄ／４４１Ｓ／４４５Ｒ／４４７Ｓ、１８５Ｌ／１９０Ｐ／２５７Ｈ／３８５Ｐ／３８９Ｅ／３９９Ｒ、１８５Ｌ／１９０Ｐ／２５７Ｈ／３８５Ｐ／３９９Ｒ／４４５Ｒ／４４７Ａ、１８５Ｌ／１９０Ｐ／２５７Ｈ／３８９Ｅ／３９５Ａ、１８５Ｌ／１９０Ｐ／２５７Ｈ／３８９Ｅ／３９５Ｈ／３９９Ｒ／４４１Ｓ／４４７Ｓ／４４９Ｈ、１８５Ｌ／１９０Ｐ／３８５Ｓ／３８９Ｅ／４４１Ｒ／４４５Ｋ／４４７Ｓ、１８５Ｌ／１９０Ｐ／３８９Ｅ／４４７Ｓ／４４９Ｈ、１８５Ｌ／１９０Ｐ／３９５Ｄ／３９９Ｒ、１８５Ｌ／１９０Ｐ／３９５Ｈ／３９９Ｒ、１８５Ｌ／２１９Ｌ／２５７Ｈ／３９９Ｒ／４４５Ｒ／４４７Ａ、１８５Ｌ／２５７Ｈ／３８５Ｓ／３９５Ａ／３９９Ｒ／４４５Ｒ／４４７Ａ、１８５Ｌ／３０２Ｒ／３９５Ｈ／３９９Ｒ／４４１Ｒ／４４５Ｋ／４４７Ｓ／４４９Ｈ、１８５Ｌ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４１Ｒ／４４５Ｒ／４４７Ａ、１９０Ｐ／２１９Ｌ／２５７Ｈ／３８５Ｓ／３８９Ｅ／４４１Ｓ／４４５Ｒ／４４７Ａ／４４９Ｈ、１９０Ｐ／２１９Ｌ／３０２Ｈ／３８５Ｐ／３９９Ｒ／４４５Ｒ、１９０Ｐ／２５７Ｈ／３０２Ｈ／３８５Ｐ／３９９Ｒ、１９０Ｐ／２５７Ｈ／３８５Ｐ／３８９Ｅ／３９９Ｒ、１９０Ｐ／２５７Ｈ／３８５Ｓ／３８９Ｅ／４４５Ｋ／４４７Ａ、１９０Ｐ／２５７Ｈ／３８５Ｓ／３９５Ｄ、１９０Ｐ／２５７Ｈ／３８５Ｓ／４４１Ｓ／４４５Ｒ／４４７Ｓ／４４９Ｈ、１９０Ｐ／２５７Ｈ／３８９Ｅ／３９５Ｈ／４４１Ｒ／４４５Ｒ／４４７Ａ、１９０Ｐ／２５７Ｈ／３９９Ｒ／４４７Ａ／４４９Ｈ、１９０Ｐ／３０２Ｈ／３８５Ｐ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４１Ｓ／４４５Ｋ／４４７Ｓ、１９０Ｐ／３８９Ｅ、２１９Ｌ／２５７Ｈ／３８５Ｓ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／４４１Ｒ／４４７Ａ／４４９Ｈ、２１９Ｌ／２５７Ｈ／３９５Ｈ、２１９Ｌ／３８５Ｓ／３８９Ｅ／３９９Ｒ／４４５Ｒ／４４９Ｈ、２１９Ｌ／３９５Ｈ、２５７Ｈ／３８５Ｐ／３８９Ｅ／３９９Ｒ、２５７Ｈ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４５Ｋ／４４７Ａ、２５７Ｈ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４５Ｋ／４４９Ｈ、２５７Ｈ／３８９Ｅ／３９９Ｒ、３０２Ｈ／３８９Ｅ／３９５Ｈ／４４５Ｒ、３８５Ｓ／３８９Ｅ、３８５Ｓ／３９５Ｄ、３８９Ｅ／３９５Ｄ／４４５Ｒ／４４７Ｓ、３９５Ｄ／３９９Ｒ、および３９９Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１２１６を基準にして番号が付けられている。
【００２４】
一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｓ５４Ｍ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｎ２５７Ｈ／Ｎ３０２Ｒ／Ｖ３８５Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｈ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｖ３８５Ｐ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｖ３８５Ｓ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｖ３８５Ｓ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｖ３８５Ｓ／Ｇ３９５Ａ／Ｑ３９９Ｒ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｈ／Ｑ３９９Ｒ／Ｑ４４１Ｓ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ３０２Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ３０２Ｒ／Ｇ３９５Ｈ／Ｑ３９９Ｒ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｖ３８５Ｐ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｎ４４５Ｋ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｃ２１９Ｌ／Ｄ３８９Ｅ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｎ２５７Ｈ／Ｄ３８９Ｅ／Ｑ４４１Ｓ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｎ３０２Ｈ／Ｖ３８５Ｓ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｖ３８５Ｓ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４５Ｋ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｖ３８５Ｓ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｎ２５７Ｈ／Ｎ３０２Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｎ２５７Ｈ／Ｇ３９５Ｈ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｎ３０２Ｈ／Ｑ３９９Ｒ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｋ３０９Ｎ／Ｖ３８５Ｓ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｋ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｓ／Ｄ３８９Ｅ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｇ３９５Ｄ／Ｎ４４５Ｋ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ３０２Ｈ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ｓ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ３０２Ｒ／Ｄ３８９Ｅ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｖ３８５Ｐ／Ｇ３９５Ｄ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｖ３８５Ｐ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｖ３８５Ｓ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｈ／Ｑ４４１Ｓ／Ｎ４４５Ｒ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｇ３９５Ａ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｇ３９５Ｈ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ、Ｓ５４Ｍ／Ｃ２１９Ｌ／Ｎ３０２Ｒ／Ｇ３９５Ｈ／Ｑ４４１Ｓ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ、Ｓ５４Ｍ／Ｃ２１９Ｌ／Ｖ３８５Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ、Ｓ５４Ｍ／Ｎ２５７Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｓ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｎ２５７Ｈ／Ｄ３８９Ｅ、Ｓ５４Ｍ／Ｎ２５７Ｈ／Ｑ３９９Ｒ、Ｓ５４Ｍ／Ｎ２５７Ｈ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４７Ａ、Ｓ５４Ｍ／Ｎ２５７Ｈ／Ｑ４４１Ｒ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｎ３０２Ｈ／Ｖ３８５Ｐ／Ｑ３９９Ｒ／Ｑ４４１Ｓ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ｓ、Ｓ５４Ｍ／Ｎ３０２Ｈ／Ｖ３８５Ｓ／Ｑ３９９Ｒ／Ｑ４４１Ｓ／Ｎ４４５Ｒ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｖ３８５Ｐ、Ｓ５４Ｍ／Ｖ３８５Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｎ２５７Ｈ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ａ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ、Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｎ３０２Ｒ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ４４１Ｓ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ｓ、Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｑ３９９Ｒ、Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｐ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ、Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ａ、Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｈ／Ｑ３９９Ｒ／Ｑ４４１Ｓ／Ｎ４４７Ｓ／Ｙ４４９Ｈ、Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｖ３８５Ｓ／Ｄ３８９Ｅ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ｓ、Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｎ４４７Ｓ／Ｙ４４９Ｈ、Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ、Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｇ３９５Ｈ／Ｑ３９９Ｒ、Ｆ１８５Ｌ／Ｃ２１９Ｌ／Ｎ２５７Ｈ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ、Ｆ１８５Ｌ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｓ／Ｇ３９５Ａ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ、Ｆ１８５Ｌ／Ｎ３０２Ｒ／Ｇ３９５Ｈ／Ｑ３９９Ｒ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ｓ／Ｙ４４９Ｈ、Ｆ１８５Ｌ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ、Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｓ／Ｄ３８９Ｅ／Ｑ４４１Ｓ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｎ３０２Ｈ／Ｖ３８５Ｐ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｒ、Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｎ３０２Ｈ／Ｖ３８５Ｐ／Ｑ３９９Ｒ、Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｑ３９９Ｒ、Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｓ／Ｄ３８９Ｅ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ、Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｓ／Ｇ３９５Ｄ、Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｓ／Ｑ４４１Ｓ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ｓ／Ｙ４４９Ｈ、Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｈ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ａ、Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｔ１９０Ｐ／Ｎ３０２Ｈ／Ｖ３８５Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｑ４４１Ｓ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ｓ、Ｔ１９０Ｐ／Ｄ３８９Ｅ、Ｃ２１９Ｌ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｓ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ４４１Ｒ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｃ２１９Ｌ／Ｎ２５７Ｈ／Ｇ３９５Ｈ、Ｃ２１９Ｌ／Ｖ３８５Ｓ／Ｄ３８９Ｅ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｒ／Ｙ４４９Ｈ、Ｃ２１９Ｌ／Ｇ３９５Ｈ、Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｑ３９９Ｒ、Ｎ２５７Ｈ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ、Ｎ２５７Ｈ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｋ／Ｙ４４９Ｈ、Ｎ２５７Ｈ／Ｄ３８９Ｅ／Ｑ３９９Ｒ、Ｎ３０２Ｈ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｈ／Ｎ４４５Ｒ、Ｖ３８５Ｓ／Ｄ３８９Ｅ、Ｖ３８５Ｓ／Ｇ３９５Ｄ、Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｎ４４５Ｒ／Ｎ４４７Ｓ、Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ、およびＱ３９９Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１２１６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５、１４、９６、１０８、１５７、１８１、１８８、２７８、２９３および３４１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１２１６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５Ｓ、１４Ｔ、９６Ｋ、９６Ｐ、１０８Ｅ、１５７Ｑ、１８１Ｌ、１８８Ｌ、２７８Ｌ、２９３Ｖおよび３４１Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含む。
【００２５】
一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｈ５Ｓ、Ｒ１４Ｔ、Ｇ９６Ｋ、Ｇ９６Ｐ、Ｎ１０８Ｅ、Ｎ１５７Ｑ、Ｍ１８１Ｌ、Ｅ１８８Ｌ、Ｖ２７８Ｌ、Ａ２９３ＶおよびＩ３４１Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１２１６を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５４／１８５／１９０／２１９／２５７／３０２／３８５／３８９／３９５／４４５／４４７／４４９、５４／１８５／１９０／３８５／４４７／４４９、５４／１９０／２５７／３０２／３８５／３９５／３９９、５４／１９０／３０２／３８９／３９５／３９９／４４５／４４７、５４／２５７／３８５／４４９、５４／２５７／３８９、および５４／３８９／３９５／３９９／４４７／４４９から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１２１６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／２１９Ｌ／２５７Ｈ／３０２Ｒ／３８５Ｐ／３８９Ｅ／３９５Ｈ／４４５Ｋ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１８５Ｌ／１９０Ｐ／３８５Ｐ／４４７Ａ／４４９Ｈ、５４Ｍ／１９０Ｐ／２５７Ｈ／３０２Ｒ／３８５Ｐ／３９５Ａ／３９９Ｒ、５４Ｍ／１９０Ｐ／３０２Ｈ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４５Ｋ／４４７Ｓ、５４Ｍ／２５７Ｈ／３８５Ｓ／４４９Ｈ、５４Ｍ／２５７Ｈ／３８９Ｅ、および５４Ｍ／３８９Ｅ／３９５Ｄ／３９９Ｒ／４４７Ａ／４４９Ｈから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１２１６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｃ２１９Ｌ／Ｎ２５７Ｈ／Ｎ３０２Ｒ／Ｖ３８５Ｐ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｈ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｆ１８５Ｌ／Ｔ１９０Ｐ／Ｖ３８５Ｐ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ２５７Ｈ／Ｎ３０２Ｒ／Ｖ３８５Ｐ／Ｇ３９５Ａ／Ｑ３９９Ｒ、Ｓ５４Ｍ／Ｔ１９０Ｐ／Ｎ３０２Ｈ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４５Ｋ／Ｎ４４７Ｓ、Ｓ５４Ｍ／Ｎ２５７Ｈ／Ｖ３８５Ｓ／Ｙ４４９Ｈ、Ｓ５４Ｍ／Ｎ２５７Ｈ／Ｄ３８９Ｅ、およびＳ５４Ｍ／Ｄ３８９Ｅ／Ｇ３９５Ｄ／Ｑ３９９Ｒ／Ｎ４４７Ａ／Ｙ４４９Ｈから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１２１６を基準にして番号が付けられている。
【００２６】
一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１４／４２／５１／１０８／１８１、１４／４２／５１／１５７／３４１、１４／４２／３４１、１４／５１／９６／１５７、１４／５１／９６／１５７／３４１、１４／５１／９６／３４１、１４／５１／１０８、１４／５１／３４１、１４／９６、１４／９６／１０８／１３３、１４／９６／１０８／１８１／３４１、１４／９６／１０８／１８８、１４／９６／３４１、１４／１０８／１５７、１４／１０８／１５７／１８８、１４／１５７／１８１／２７８、１４／２７８、４２／９６／１５７／３４１、４２／１８８／３４１、９６／１０８／１８１／２９３、９６／１０８／１８８、９６／１０８／１８８／３４１、９６／１８８、１８１、１８８、および２９３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１４Ｔ／４２Ｔ／５１Ｖ／１０８Ｅ／１８１Ｌ、１４Ｔ／４２Ｔ／５１Ｖ／１５７Ｑ／３４１Ｌ、１４Ｔ／４２Ｔ／３４１Ｌ、１４Ｔ／５１Ｖ／９６Ｋ／１５７Ｑ、１４Ｔ／５１Ｖ／９６Ｐ／１５７Ｑ／３４１Ｌ、１４Ｔ／５１Ｖ／９６Ｐ／３４１Ｌ、１４Ｔ／５１Ｖ／１０８Ｅ、１４Ｔ／５１Ｖ／３４１Ｌ、１４Ｔ／９６Ｋ、１４Ｔ／９６Ｋ／１０８Ｅ／１３３Ｉ、１４Ｔ／９６Ｋ／１０８Ｅ／１８８Ｖ、１４Ｔ／９６Ｋ／３４１Ｌ、１４Ｔ／９６Ｐ／１０８Ｅ／１８１Ｌ／３４１Ｌ、１４Ｔ／１０８Ｅ／１５７Ｑ、１４Ｔ／１０８Ｅ／１５７Ｑ／１８８Ｌ、１４Ｔ／１５７Ｑ／１８１Ｌ／２７８Ｌ、１４Ｔ／２７８Ｌ、４２Ｔ／９６Ｐ／１５７Ｑ／３４１Ｌ、４２Ｔ／１８８Ｌ／３４１Ｌ、９６Ｋ／１８８Ｌ、９６Ｐ／１０８Ｅ／１８１Ｌ／２９３Ｖ、９６Ｐ／１０８Ｅ／１８８Ｌ、９６Ｐ／１０８Ｅ／１８８Ｌ／３４１Ｌ、１８１Ｌ、１８８Ｌ、および２９３Ｖから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｒ１４Ｔ／Ｖ４２Ｔ／Ｎ５１Ｖ／Ｎ１０８Ｅ／Ｍ１８１Ｌ、Ｒ１４Ｔ／Ｖ４２Ｔ／Ｎ５１Ｖ／Ｎ１５７Ｑ／Ｉ３４１Ｌ、Ｒ１４Ｔ／Ｖ４２Ｔ／Ｉ３４１Ｌ、Ｒ１４Ｔ／Ｎ５１Ｖ／Ｇ９６Ｋ／Ｎ１５７Ｑ、Ｒ１４Ｔ／Ｎ５１Ｖ／Ｇ９６Ｐ／Ｎ１５７Ｑ／Ｉ３４１Ｌ、Ｒ１４Ｔ／Ｎ５１Ｖ／Ｇ９６Ｐ／Ｉ３４１Ｌ、Ｒ１４Ｔ／Ｎ５１Ｖ／Ｎ１０８Ｅ、Ｒ１４Ｔ／Ｎ５１Ｖ／Ｉ３４１Ｌ、Ｒ１４Ｔ／Ｇ９６Ｋ、Ｒ１４Ｔ／Ｇ９６Ｋ／Ｎ１０８Ｅ／Ｖ１３３Ｉ、Ｒ１４Ｔ／Ｇ９６Ｋ／Ｎ１０８Ｅ／Ｅ１８８Ｖ、Ｒ１４Ｔ／Ｇ９６Ｋ／Ｉ３４１Ｌ、Ｒ１４Ｔ／Ｇ９６Ｐ／Ｎ１０８Ｅ／Ｍ１８１Ｌ／Ｉ３４１Ｌ、Ｒ１４Ｔ／Ｎ１０８Ｅ／Ｎ１５７Ｑ、Ｒ１４Ｔ／Ｎ１０８Ｅ／Ｎ１５７Ｑ／Ｅ１８８Ｌ、Ｒ１４Ｔ／Ｎ１５７Ｑ／Ｍ１８１Ｌ／Ｖ２７８Ｌ、Ｒ１４Ｔ／Ｖ２７８Ｌ、Ｖ４２Ｔ／Ｇ９６Ｐ／Ｎ１５７Ｑ／Ｉ３４１Ｌ、Ｖ４２Ｔ／Ｅ１８８Ｌ／Ｉ３４１Ｌ、Ｇ９６Ｋ／Ｅ１８８Ｌ、Ｇ９６Ｐ／Ｎ１０８Ｅ／Ｍ１８１Ｌ／Ａ２９３Ｖ、Ｇ９６Ｐ／Ｎ１０８Ｅ／Ｅ１８８Ｌ、Ｇ９６Ｐ／Ｎ１０８Ｅ／Ｅ１８８Ｌ／Ｉ３４１Ｌ、Ｍ１８１Ｌ、Ｅ１８８Ｌ、およびＡ２９３Ｖから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１２２、１４４、１４７、１８７、１９６、１９７、１９８、１９９、２０１、２６８および３２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１２２Ｖ、１４４Ｖ、１４７Ｆ、１８７Ｋ、１９６Ｍ、１９６Ｐ、１９６Ｖ、１９７Ｖ、１９８Ａ、１９８Ｆ、１９９Ｇ、１９９Ｑ、１９９Ｓ、２０１Ｐ、２６８Ａ、３２４Ｋおよび３２４Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｌ１２２Ｖ、Ｌ１４４Ｖ、Ｓ１４７Ｆ、Ｔ１８７Ｋ、Ａ１９６Ｍ、Ａ１９６Ｐ、Ａ１９６Ｖ、Ｐ１９７Ｖ、Ｑ１９８Ａ、Ｑ１９８Ｆ、Ｎ１９９Ｇ、Ｎ１９９Ｑ、Ｎ１９９Ｓ、Ｇ２０１Ｐ、Ｙ２６８Ａ、Ｈ３２４ＫおよびＨ３２４Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１４／４２／３４１、１４／９６、１４／９６／１０８／１３３、１４／９６／１０８／１８１／３４１、および１８８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１４Ｔ／４２Ｔ／３４１Ｌ、１４Ｔ／９６Ｋ、１４Ｔ／９６Ｋ／１０８Ｅ／１３３Ｉ、１４Ｔ／９６Ｐ／１０８Ｅ／１８１Ｌ／３４１Ｌ、および１８８Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｒ１４Ｔ／Ｖ４２Ｔ／Ｉ３４１Ｌ、Ｒ１４Ｔ／Ｇ９６Ｋ、Ｒ１４Ｔ／Ｇ９６Ｋ／Ｎ１０８Ｅ／Ｖ１３３Ｉ、Ｒ１４Ｔ／Ｇ９６Ｐ／Ｎ１０８Ｅ／Ｍ１８１Ｌ／Ｉ３４１Ｌ、およびＥ１８８Ｌから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１４８８を基準にして番号が付けられている。
【００２７】
さらに一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１４７／１８８／１９６／２０１、１５２／１８７／１８８／３２４、１５２／１８８、１５２／１８８／１９６／１９８／１９９／３２４、１５２／１８８／１９６／１９９、１５２／１８８／１９６／２０１／３２４、１５２／１８８／３２４、１８８、１８８／１９６／１９８／１９９／２０１、１８８／１９６／１９８／１９９／２０１／３２４、１８８／１９６／１９８／２０１、１８８／１９６／１９８／３２４、１８８／１９６／２０１、１８８／１９８／１９９／２０１／３２４、１８８／１９８／１９９／２６８、１８８／１９８／２０１／３２４、１８８／１９８／３２４、１８８／１９９／２０１、１８８／２０１、１８８／２０１／３２４、および１８８／３２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１５１６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１４７Ｆ／１８８Ｅ／１９６Ｖ／２０１Ｐ、１５２Ｙ／１８７Ｋ／１８８Ｅ／３２４Ｋ、１５２Ｙ／１８８Ｅ、１５２Ｙ／１８８Ｅ／１９６Ｖ／１９８Ａ／１９９Ｑ／３２４Ｋ、１５２Ｙ／１８８Ｅ／１９６Ｖ／１９９Ｑ、１５２Ｙ／１８８Ｅ／１９６Ｖ／２０１Ｐ／３２４Ｋ、１５２Ｙ／１８８Ｅ／３２４Ｋ、１８８Ｅ、１８８Ｅ／１９６Ｖ／１９８Ａ／１９９Ｑ／２０１Ｐ、１８８Ｅ／１９６Ｖ／１９８Ａ／３２４Ｋ、１８８Ｅ／１９６Ｖ／１９８Ｆ／１９９Ｑ／２０１Ｐ／３２４Ｋ、１８８Ｅ／１９６Ｖ／１９８Ｆ／２０１Ｐ、１８８Ｅ／１９６Ｖ／２０１Ｐ、１８８Ｅ／１９８Ａ／１９９Ｑ／２６８Ａ、１８８Ｅ／１９８Ａ／２０１Ｐ／３２４Ｋ、１８８Ｅ／１９８Ａ／３２４Ｋ、１８８Ｅ／１９８Ｆ／１９９Ｑ／２０１Ｐ／３２４Ｋ、１８８Ｅ／１９９Ｑ／２０１Ｐ、１８８Ｅ／２０１Ｐ、１８８Ｅ／２０１Ｐ／３２４Ｋ、および１８８Ｅ／３２４Ｋから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１５１６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｓ１４７Ｆ／Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｇ２０１Ｐ、Ｆ１５２Ｙ／Ｔ１８７Ｋ／Ｌ１８８Ｅ／Ｈ３２４Ｋ、Ｆ１５２Ｙ／Ｌ１８８Ｅ、Ｆ１５２Ｙ／Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｑ１９８Ａ／Ｎ１９９Ｑ／Ｈ３２４Ｋ、Ｆ１５２Ｙ／Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｎ１９９Ｑ、Ｆ１５２Ｙ／Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｇ２０１Ｐ／Ｈ３２４Ｋ、Ｆ１５２Ｙ／Ｌ１８８Ｅ／Ｈ３２４Ｋ、Ｌ１８８Ｅ、Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｑ１９８Ａ／Ｎ１９９Ｑ／Ｇ２０１Ｐ、Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｑ１９８Ａ／Ｈ３２４Ｋ、Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｑ１９８Ｆ／Ｎ１９９Ｑ／Ｇ２０１Ｐ／Ｈ３２４Ｋ、Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｑ１９８Ｆ／Ｇ２０１Ｐ、Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｇ２０１Ｐ、Ｌ１８８Ｅ／Ｑ１９８Ａ／Ｎ１９９Ｑ／Ｙ２６８Ａ、Ｌ１８８Ｅ／Ｑ１９８Ａ／Ｇ２０１Ｐ／Ｈ３２４Ｋ、Ｌ１８８Ｅ／Ｑ１９８Ａ／Ｈ３２４Ｋ、Ｌ１８８Ｅ／Ｑ１９８Ｆ／Ｎ１９９Ｑ／Ｇ２０１Ｐ／Ｈ３２４Ｋ、Ｌ１８８Ｅ／Ｎ１９９Ｑ／Ｇ２０１Ｐ、Ｌ１８８Ｅ／Ｇ２０１Ｐ、Ｌ１８８Ｅ／Ｇ２０１Ｐ／Ｈ３２４Ｋ、およびＬ１８８Ｅ／Ｈ３２４Ｋから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１５１６を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１５２／１８８／１９６／１９８／１９９／３２４、１８８／１９６／１９８／１９９／２０１、１８８／１９６／１９８／２０１、１８８／１９６／２０１、１８８／１９８／１９９／２６８、１８８／２０１、および１８８／３２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１５１６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、１５２Ｙ／１８８Ｅ／１９６Ｖ／１９８Ａ／１９９Ｑ／３２４Ｋ、１８８Ｅ／１９６Ｖ／１９８Ａ／１９９Ｑ／２０１Ｐ、１８８Ｅ／１９６Ｖ／１９８Ｆ／２０１Ｐ、１８８Ｅ／１９６Ｖ／２０１Ｐ、１８８Ｅ／１９８Ａ／１９９Ｑ／２６８Ａ、１８８Ｅ／２０１Ｐ、および１８８Ｅ／３２４Ｋから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１５１６を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのポリペプチド配列は、Ｆ１５２Ｙ／Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｑ１９８Ａ／Ｎ１９９Ｑ／Ｈ３２４Ｋ、Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｑ１９８Ａ／Ｎ１９９Ｑ／Ｇ２０１Ｐ、Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｑ１９８Ｆ／Ｇ２０１Ｐ、Ｌ１８８Ｅ／Ａ１９６Ｖ／Ｇ２０１Ｐ、Ｌ１８８Ｅ／Ｑ１９８Ａ／Ｎ１９９Ｑ／Ｙ２６８Ａ、Ｌ１８８Ｅ／Ｇ２０１Ｐ、およびＬ１８８Ｅ／Ｈ３２４Ｋから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１５１６を基準にして番号が付けられている。
【００２８】
本発明は、本明細書で提供される操作されたグリコシルトランスフェラーゼであって、ベータ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼおよびベータ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼから選択される操作されたグリコシルトランスフェラーゼも提供する。一部の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、ＡＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＡＧＴ）、ＣＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＧＴ）、ＧＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＧＴ）、ＴＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＴＧＴ）およびＩＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＩＧＴ）から選択される、ＮＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼである。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、ＡＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼである。一部のさらなる実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、ウラシル二リン酸以外の糖ドナーを優先的に使用する。
【００２９】
本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドも提供する。本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクターも提供する。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの制御配列をさらに含む。本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つのグリコシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供する。本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つのベクターを含む宿主細胞をさらに提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、真核生物および原核生物から選択される。
【００３０】
本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを産生するための方法であって、本明細書で提供される宿主細胞を、操作されたグリコシルトランスフェラーゼが宿主細胞により産生されるような条件下で培養するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、操作されたグリコシルトランスフェラーゼを回収するステップをさらに含む。本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを含む組成物も提供する。
【００３１】
本発明は、配列番号６に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースシンターゼも提供する。一部の実施形態では、配列番号２２に対して、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、操作されたスクロースシンターゼ。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３／５４８、４、７、１２、４１、４２、４４、４７、５２、５７、５９、７１、８１、８５、９３、９７、１２２、１２９、１３４、１３６、１３９、１５４、１７５、２１５、２６６、２７０、３４３、３５８、３８１、３８８、４３４、４４２、５１９、５２４、５３２、５３６、５７０、５８９、６０３、６０６、６１５、６３５、６４１、６５２、７２４、７２７、および７３８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３Ｇ／５４８Ｒ、４Ｑ、４Ｔ、７Ｈ、７Ｌ、１２Ｋ、４１Ｑ、４１Ｓ、４２Ｄ、４２Ｅ、４２Ｉ、４４Ａ、４４Ｉ、４４Ｌ、４４Ｔ、４７Ａ、４７Ｇ、４７Ｒ、４７Ｔ、５２Ｇ、５２Ｑ、５２Ｓ、５２Ｔ、５２Ｖ、５７Ｈ、５７Ｙ、５９Ｍ、５９Ｔ、７１Ｑ、７１Ｔ、８１Ｈ、８１Ｐ、８１Ｑ、８５Ｔ、９３Ｉ、９７Ｓ、９７Ｔ、１２２Ｐ、１２９Ｑ、１３４Ｐ、１３４Ｑ、１３４Ｒ、１３６Ｇ、１３９Ｇ、１５４Ａ、１７５Ｓ、２１５Ｌ、２６６Ｒ、２７０Ｌ、３４３Ｌ、３５８Ｐ、３５８Ｑ、３８１Ｋ、３８１Ｒ、３８１Ｔ、３８１Ｙ、３８８Ａ、３８８Ｒ、３８８Ｓ、４３４Ｇ、４３４Ｌ、４４２Ｙ、５１９Ｃ、５１９Ｖ、５２４Ｒ、５２４Ｓ、５３２Ｅ、５３２Ｔ、５３２Ｙ、５３６Ｔ、５７０Ｋ、５８９Ｑ、６０３Ｍ、６０３Ｔ、６０６Ａ、６０６Ｐ、６１５Ｔ、６３５Ｇ、６３５Ｒ、６４１Ｉ、６４１Ｌ、６５２Ｒ、６５２Ｙ、７２４Ａ、７２４Ｓ、７２７Ｈ、７３８Ａ、および７３８Ｋから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｅ３Ｇ／Ｐ５４８Ｒ、Ｅ４Ｑ、Ｅ４Ｔ、Ｑ７Ｈ、Ｑ７Ｌ、Ｓ１２Ｋ、Ｋ４１Ｑ、Ｋ４１Ｓ、Ｔ４２Ｄ、Ｔ４２Ｅ、Ｔ４２Ｉ、Ｒ４４Ａ、Ｒ４４Ｉ、Ｒ４４Ｌ、Ｒ４４Ｔ、Ｐ４７Ａ、Ｐ４７Ｇ、Ｐ４７Ｒ、Ｐ４７Ｔ、Ｐ５２Ｇ、Ｐ５２Ｑ、Ｐ５２Ｓ、Ｐ５２Ｔ、Ｐ５２Ｖ、Ｗ５７Ｈ、Ｗ５７Ｙ、Ａ５９Ｍ、Ａ５９Ｔ、Ｒ７１Ｑ、Ｒ７１Ｔ、Ｌ８１Ｈ、Ｌ８１Ｐ、Ｌ８１Ｑ、Ｖ８５Ｔ、Ｖ９３Ｉ、Ａ９７Ｓ、Ａ９７Ｔ、Ａ１２２Ｐ、Ｅ１２９Ｑ、Ｖ１３４Ｐ、Ｖ１３４Ｑ、Ｖ１３４Ｒ、Ｑ１３６Ｇ、Ｋ１３９Ｇ、Ｈ１５４Ａ、Ｇ１７５Ｓ、Ｆ２１５Ｌ、Ｎ２６６Ｒ、Ｖ２７０Ｌ、Ｈ３４３Ｌ、Ｅ３５８Ｐ、Ｅ３５８Ｑ、Ｓ３８１Ｋ、Ｓ３８１Ｒ、Ｓ３８１Ｔ、Ｓ３８１Ｙ、Ｋ３８８Ａ、Ｋ３８８Ｒ、Ｋ３８８Ｓ、Ｙ４３４Ｇ、Ｙ４３４Ｌ、Ｈ４４２Ｙ、Ｔ５１９Ｃ、Ｔ５１９Ｖ、Ａ５２４Ｒ、Ａ５２４Ｓ、Ｓ５３２Ｅ、Ｓ５３２Ｔ、Ｓ５３２Ｙ、Ｅ５３６Ｔ、Ｒ５７０Ｋ、Ｓ５８９Ｑ、Ｑ６０３Ｍ、Ｑ６０３Ｔ、Ｍ６０６Ａ、Ｍ６０６Ｐ、Ｒ６１５Ｔ、Ｓ６３５Ｇ、Ｓ６３５Ｒ、Ｖ６４１Ｉ、Ｖ６４１Ｌ、Ｇ６５２Ｒ、Ｇ６５２Ｙ、Ｋ７２４Ａ、Ｋ７２４Ｓ、Ｅ７２７Ｈ、Ｓ７３８Ａ、およびＳ７３８Ｋから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２２を基準にして番号が付けられている。一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、４１、５２、１３４、３８１、４４２、５１９、５２４および７２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、４１Ｓ、５２Ｖ、１３４Ｒ、３８１Ｒ、４４２Ｙ、５１９Ｖ、５２４Ｒおよび７２４Ｓから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｋ４１Ｓ、Ｐ５２Ｖ、Ｖ１３４Ｒ、Ｓ３８１Ｒ、Ｈ４４２Ｙ、Ｔ５１９Ｖ、Ａ５２４ＲおよびＫ７２４Ｓから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２２を基準にして番号が付けられている。
【００３２】
一部の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、２５／４４／５２／１３４／４３４／７２４、４１／４４／５２／９７／４４２／７１９／７２４、４１／４４／５２／１３４／４４２、４１／４４／５２／４３４／４４２／５３２／７２４、４１／４４／５２／４３４／７２４、４１／４４／１３６／３２９、４１／４４／１３６／４４２、４１／４４／５３２、４１／５２／９７／４３４／４４２／５３２／７２４、４１／５２／１３４／１３６／４３４、４１／５２／１３４／４４２／７２４、４１／５２／１３６、４１／５２／４３４、４１／５２／４３４／４４２、４１／５２／４３４／４４２／７２４、４１／５２／４４２、４１／９７／１３４／４３４／４４２／５３２／５５３、４１／１３４／４４２／５３２、４１／３２９／４４２、４１／４３４／４４２／５３２、４１／４３４／４４２／５３２／７２４、４１／４３４／５３２、４１／５３２、４４／５２／９７／４３４／４４２／７２４、４４／５２／９７／４４２／７２４、４４／５２／１３４／１３６／３２９／４３４／４４２／５３２、４４／５２／１３４／４３４／５３２、４４／１３６／３２９／４３４／５３２、４４／１３６／５３２、４４／４３４／４４２／５５３、５２、５２／９７、５２／９７／４３４／４４２、５２／９７／４４２、５２／９７／５３２、５２／１３４、５２／１３４／１３６／４３４、５２／１３４／１３６／４４２、５２／１３４／３２９／４３４、５２／１３４／３２９／５３２、５２／１３４／４３４／４４２／５３２／５５３、５２／１３４／４４２／７２４、５２／１３６、５２／１３６／４３４、５２／１３６／４３４／４４２、５２／１３６／４３４／４４２／５３２、５２／１３６／４３４／７２４、５２／１３６／４４２、５２／４３４、５２／４３４／４４２／５３２、５２／４３４／４４２／７２４、５２／４３４／５３２、５２／４４２、５２／４４２／５３２／７２４、５２／４４２／５５３／７２４、５２／４４２／７２４、５２／５３２、５２／５５３、５７／９７／４３４／４４２／７２４、９７／１３４／１３６／４４２／５３２、９７／１３４／１３６／５３２、９７／１３４／４４２、９７／１３６／４３４／４４２、９７／３２９／７２４、９７／４４２、１３４、１３４／１３６／４３４／４４２、１３４／１３６／４３４／４４２／５３２／５５３／７２４、１３４／１３６／４３４／４４２／５５３／７２４、１３４／１３６／４３４／５３２／７２４、１３４／１３６／４４２／５３２、１３４／４３４／４４２／７２４、１３６、１３６／４４２、１３６／４４２／７２４、１３６／５３２／７２４、４３４、４３４／４４２、４４２、４４２／７２４、および５３２／７２４から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、２５Ｔ／４４Ｉ／５２Ｇ／１３４Ｒ／４３４Ｇ／７２４Ｓ、４１Ｓ／４４Ｉ／５２Ｇ／９７Ｔ／４４２Ｙ／７１９Ｔ／７２４Ｓ、４１Ｓ／４４Ｉ／５２Ｇ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ／７２４Ｓ、４１Ｓ／４４Ｉ／５２Ｇ／４３４Ｇ／７２４Ｓ、４１Ｓ／４４Ｉ／５２Ｖ／１３４Ｒ／４４２Ｙ、４１Ｓ／４４Ｉ／１３６Ｇ／３２９Ｑ、４１Ｓ／４４Ｉ／１３６Ｇ／４４２Ｙ、４１Ｓ／４４Ｉ／５３２Ｙ、４１Ｓ／５２Ｇ／１３４Ｒ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、４１Ｓ／５２Ｇ／１３６Ｇ、４１Ｓ／５２Ｖ／９７Ｔ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ／７２４Ｓ、４１Ｓ／５２Ｖ／１３４Ｒ／１３６Ｇ／４３４Ｇ、４１Ｓ／５２Ｖ／４３４Ｇ、４１Ｓ／５２Ｖ／４３４Ｇ／４４２Ｙ、４１Ｓ／５２Ｖ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、４１Ｓ／５２Ｖ／４４２Ｙ、４１Ｓ／９７Ｔ／１３４Ｒ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ／５５３Ａ、４１Ｓ／１３４Ｒ／４４２Ｙ／５３２Ｙ、４１Ｓ／３２９Ｑ／４４２Ｙ、４１Ｓ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ、４１Ｓ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ／７２４Ｓ、４１Ｓ／４３４Ｇ／５３２Ｙ、４１Ｓ／５３２Ｙ、４４Ｉ／５２Ｇ／１３４Ｒ／１３６Ｇ／３２９Ｑ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ、４４Ｉ／５２Ｖ／９７Ｔ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、４４Ｉ／５２Ｖ／９７Ｔ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、４４Ｉ／５２Ｖ／１３４Ｒ／４３４Ｇ／５３２Ｙ、４４Ｉ／１３６Ｇ／３２９Ｑ／４３４Ｇ／５３２Ｙ、４４Ｉ／１３６Ｇ／５３２Ｙ、４４Ｉ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５５３Ａ、５２Ｇ、５２Ｇ／９７Ｔ、５２Ｇ／９７Ｔ／４３４Ｇ／４４２Ｙ、５２Ｇ／９７Ｔ／４４２Ｙ、５２Ｇ／９７Ｔ／５３２Ｙ、５２Ｇ／１３４Ｒ、５２Ｇ／１３４Ｒ／１３６Ｇ／４３４Ｇ、５２Ｇ／１３４Ｒ／１３６Ｇ／４４２Ｙ、５２Ｇ／１３４Ｒ／３２９Ｑ／４３４Ｇ、５２Ｇ／１３４Ｒ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ／５５３Ａ、５２Ｇ／１３６Ｇ、５２Ｇ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ、５２Ｇ／４４２Ｙ、５２Ｇ／４４２Ｙ／５５３Ａ／７２４Ｓ、５２Ｇ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、５２Ｇ／５３２Ｙ、５２Ｇ／５５３Ａ、５２Ｖ／１３４Ｒ／３２９Ｑ／５３２Ｙ、５２Ｖ／１３４Ｒ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、５２Ｖ／１３６Ｇ／４３４Ｇ、５２Ｖ／１３６Ｇ／４３４Ｇ／４４２Ｙ、５２Ｖ／１３６Ｇ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ、５２Ｖ／１３６Ｇ／４３４Ｇ／７２４Ｓ、５２Ｖ／１３６Ｇ／４４２Ｙ、５２Ｖ／４３４Ｇ、５２Ｖ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、５２Ｖ／４３４Ｇ／５３２Ｙ、５２Ｖ／４４２Ｙ、５２Ｖ／４４２Ｙ／５３２Ｙ／７２４Ｓ、５２Ｖ／４４２Ｙ／５５３Ａ／７２４Ｓ、５２Ｖ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、５２Ｖ／５３２Ｙ、５７Ｃ／９７Ｔ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、９７Ｔ／１３４Ｒ／１３６Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ、９７Ｔ／１３４Ｒ／１３６Ｇ／５３２Ｙ、９７Ｔ／１３４Ｒ／４４２Ｙ、９７Ｔ／１３６Ｇ／４３４Ｇ／４４２Ｙ、９７Ｔ／３２９Ｑ／７２４Ｓ、９７Ｔ／４４２Ｙ、１３４Ｒ、１３４Ｒ／１３６Ｇ／４３４Ｇ／４４２Ｙ、１３４Ｒ／１３６Ｇ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ／５５３Ａ／７２４Ｓ、１３４Ｒ／１３６Ｇ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／５５３Ａ／７２４Ｓ、１３４Ｒ／１３６Ｇ／４３４Ｇ／５３２Ｙ／７２４Ｓ、１３４Ｒ／１３６Ｇ／４４２Ｙ／５３２Ｙ、１３４Ｒ／４３４Ｇ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、１３６Ｇ、１３６Ｇ／４４２Ｙ、１３６Ｇ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、１３６Ｇ／５３２Ｙ／７２４Ｓ、４３４Ｇ、４３４Ｇ／４４２Ｙ、４４２Ｙ、４４２Ｙ／７２４Ｓ、および５３２Ｙ／７２４Ｓから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ａ２５Ｔ／Ｒ４４Ｉ／Ｐ５２Ｇ／Ｖ１３４Ｒ／Ｙ４３４Ｇ／Ｋ７２４Ｓ、Ｋ４１Ｓ／Ｒ４４Ｉ／Ｐ５２Ｇ／Ａ９７Ｔ／Ｈ４４２Ｙ／Ａ７１９Ｔ／Ｋ７２４Ｓ、Ｋ４１Ｓ／Ｒ４４Ｉ／Ｐ５２Ｇ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｋ４１Ｓ／Ｒ４４Ｉ／Ｐ５２Ｇ／Ｙ４３４Ｇ／Ｋ７２４Ｓ、Ｋ４１Ｓ／Ｒ４４Ｉ／Ｐ５２Ｖ／Ｖ１３４Ｒ／Ｈ４４２Ｙ、Ｋ４１Ｓ／Ｒ４４Ｉ／Ｑ１３６Ｇ／Ｅ３２９Ｑ、Ｋ４１Ｓ／Ｒ４４Ｉ／Ｑ１３６Ｇ／Ｈ４４２Ｙ、Ｋ４１Ｓ／Ｒ４４Ｉ／Ｓ５３２Ｙ、Ｋ４１Ｓ／Ｐ５２Ｇ／Ｖ１３４Ｒ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｋ４１Ｓ／Ｐ５２Ｇ／Ｑ１３６Ｇ、Ｋ４１Ｓ／Ｐ５２Ｖ／Ａ９７Ｔ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｋ４１Ｓ／Ｐ５２Ｖ／Ｖ１３４Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｙ４３４Ｇ、Ｋ４１Ｓ／Ｐ５２Ｖ／Ｙ４３４Ｇ、Ｋ４１Ｓ／Ｐ５２Ｖ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ、Ｋ４１Ｓ／Ｐ５２Ｖ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｋ４１Ｓ／Ｐ５２Ｖ／Ｈ４４２Ｙ、Ｋ４１Ｓ／Ａ９７Ｔ／Ｖ１３４Ｒ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ／Ｖ５５３Ａ、Ｋ４１Ｓ／Ｖ１３４Ｒ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ、Ｋ４１Ｓ／Ｅ３２９Ｑ／Ｈ４４２Ｙ、Ｋ４１Ｓ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ、Ｋ４１Ｓ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｋ４１Ｓ／Ｙ４３４Ｇ／Ｓ５３２Ｙ、Ｋ４１Ｓ／Ｓ５３２Ｙ、Ｒ４４Ｉ／Ｐ５２Ｇ／Ｖ１３４Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｅ３２９Ｑ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ、Ｒ４４Ｉ／Ｐ５２Ｖ／Ａ９７Ｔ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｒ４４Ｉ／Ｐ５２Ｖ／Ａ９７Ｔ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｒ４４Ｉ／Ｐ５２Ｖ／Ｖ１３４Ｒ／Ｙ４３４Ｇ／Ｓ５３２Ｙ、Ｒ４４Ｉ／Ｑ１３６Ｇ／Ｅ３２９Ｑ／Ｙ４３４Ｇ／Ｓ５３２Ｙ、Ｒ４４Ｉ／Ｑ１３６Ｇ／Ｓ５３２Ｙ、Ｒ４４Ｉ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｖ５５３Ａ、Ｐ５２Ｇ、Ｐ５２Ｇ／Ａ９７Ｔ、Ｐ５２Ｇ／Ａ９７Ｔ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ、Ｐ５２Ｇ／Ａ９７Ｔ／Ｈ４４２Ｙ、Ｐ５２Ｇ／Ａ９７Ｔ／Ｓ５３２Ｙ、Ｐ５２Ｇ／Ｖ１３４Ｒ、Ｐ５２Ｇ／Ｖ１３４Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｙ４３４Ｇ、Ｐ５２Ｇ／Ｖ１３４Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｈ４４２Ｙ、Ｐ５２Ｇ／Ｖ１３４Ｒ／Ｅ３２９Ｑ／Ｙ４３４Ｇ、Ｐ５２Ｇ／Ｖ１３４Ｒ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ／Ｖ５５３Ａ、Ｐ５２Ｇ／Ｑ１３６Ｇ、Ｐ５２Ｇ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ、Ｐ５２Ｇ／Ｈ４４２Ｙ、Ｐ５２Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｖ５５３Ａ／Ｋ７２４Ｓ、Ｐ５２Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｐ５２Ｇ／Ｓ５３２Ｙ、Ｐ５２Ｇ／Ｖ５５３Ａ、Ｐ５２Ｖ／Ｖ１３４Ｒ／Ｅ３２９Ｑ／Ｓ５３２Ｙ、Ｐ５２Ｖ／Ｖ１３４Ｒ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｐ５２Ｖ／Ｑ１３６Ｇ／Ｙ４３４Ｇ、Ｐ５２Ｖ／Ｑ１３６Ｇ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ、Ｐ５２Ｖ／Ｑ１３６Ｇ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ、Ｐ５２Ｖ／Ｑ１３６Ｇ／Ｙ４３４Ｇ／Ｋ７２４Ｓ、Ｐ５２Ｖ／Ｑ１３６Ｇ／Ｈ４４２Ｙ、Ｐ５２Ｖ／Ｙ４３４Ｇ、Ｐ５２Ｖ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｐ５２Ｖ／Ｙ４３４Ｇ／Ｓ５３２Ｙ、Ｐ５２Ｖ／Ｈ４４２Ｙ、Ｐ５２Ｖ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｐ５２Ｖ／Ｈ４４２Ｙ／Ｖ５５３Ａ／Ｋ７２４Ｓ、Ｐ５２Ｖ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｐ５２Ｖ／Ｓ５３２Ｙ、Ｗ５７Ｃ／Ａ９７Ｔ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ａ９７Ｔ／Ｖ１３４Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ、Ａ９７Ｔ／Ｖ１３４Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｓ５３２Ｙ、Ａ９７Ｔ／Ｖ１３４Ｒ／Ｈ４４２Ｙ、Ａ９７Ｔ／Ｑ１３６Ｇ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ、Ａ９７Ｔ／Ｅ３２９Ｑ／Ｋ７２４Ｓ、Ａ９７Ｔ／Ｈ４４２Ｙ、Ｖ１３４Ｒ、Ｖ１３４Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ、Ｖ１３４Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ／Ｖ５５３Ａ／Ｋ７２４Ｓ、Ｖ１３４Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｖ５５３Ａ／Ｋ７２４Ｓ、Ｖ１３４Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｙ４３４Ｇ／Ｓ５３２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｖ１３４Ｒ／Ｑ１３６Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｓ５３２Ｙ、Ｖ１３４Ｒ／Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｑ１３６Ｇ、Ｑ１３６Ｇ／Ｈ４４２Ｙ、Ｑ１３６Ｇ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｑ１３６Ｇ／Ｓ５３２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｙ４３４Ｇ、Ｙ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙ、Ｈ４４２Ｙ、Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、およびＳ５３２Ｙ／Ｋ７２４Ｓから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３、４、２２、３２、３４、３８、４７／４８８、５１、５１／４３３、６２、７５／１６９、１０１、１６９、１９５／２１３、７０８および７１８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３Ａ、４Ｖ、２２Ｌ、２２Ｔ、３２Ｓ、３４Ｅ、３４Ｓ、３８Ｌ、３８Ｎ、３８Ｖ、３８Ｗ、４７Ｓ／４８８Ｎ、５１Ａ、５１Ｈ、５１Ｈ／４３３Ｐ、５１Ｔ、６２Ｉ、７５Ｉ／１６９Ａ、１０１Ｖ、１６９Ｅ、１９５Ｋ／２１３Ｔ、７０８Ｖおよび７１８Ｈから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられてい
る。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｅ３Ａ、Ｅ４Ｖ、Ｈ２２Ｌ、Ｈ２２Ｔ、Ｌ３２Ｓ、Ｔ３４Ｅ、Ｔ３４Ｓ、Ｒ３８Ｌ、Ｒ３８Ｎ、Ｒ３８Ｖ、Ｒ３８Ｗ、Ｐ４７Ｓ／Ｄ４８８Ｎ、Ｙ５１Ａ、Ｙ５１Ｈ、Ｙ５１Ｈ／Ｌ４３３Ｐ、Ｙ５１Ｔ、Ｖ６２Ｉ、Ｍ７５Ｉ／Ｑ１６９Ａ、Ｌ１０１Ｖ、Ｑ１６９Ｅ、Ｓ１９５Ｋ／Ａ２１３Ｔ、Ｔ７０８Ｖ、およびＡ７１８Ｈから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、４４／５２／９７／４４２／７２４、５２／９７／４４２、９７／４４２、および４３４／４４２から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、４４Ｉ／５２Ｖ／９７Ｔ／４４２Ｙ／７２４Ｓ、５２Ｇ／９７Ｔ／４４２Ｙ、９７Ｔ／４４２Ｙ、および４３４Ｇ／４４２Ｙから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｒ４４Ｉ／Ｐ５２Ｖ／Ａ９７Ｔ／Ｈ４４２Ｙ／Ｋ７２４Ｓ、Ｐ５２Ｇ／Ａ９７Ｔ／Ｈ４４２Ｙ、Ａ９７Ｔ／Ｈ４４２Ｙ、およびＹ４３４Ｇ／Ｈ４４２Ｙから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１６５２を基準にして番号が付けられている。
【００３３】
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、４／２２、４／２２／３４、４／２２／３４／３８、４／２２／３４／３８／１６９／７０８、４／２２／３４／４７／５１／１６９／２１３、４／２２／５１／７０８、４／２２／１０１、４／３４／３８／１０１、４／３４／７０８、４／６２／４３３／７０８、４／１６９、４／１６９／４３３、４／１６９／７０８、４／４３３、４／７０８、２２／３４、２２／３４／３８、２２／３４／１０１／１６９、２２／３４／１０１／１６９／１９５、２２／３４／１６９／７０８、２２／４７／１６９／４３３、２２／７５、３４／３８／６２、３４／６２／１６９／４３３、３４／１０１、６２／７０８、７５／１６９、１６９／７０８、および１９５／７０８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、４Ｖ／２２Ｌ／３４Ｅ、４Ｖ／２２Ｌ／５１Ａ／７０８Ｖ、４Ｖ／２２Ｌ／１０１Ｖ、４Ｖ／２２Ｔ、４Ｖ／２２Ｔ／３４Ｅ／３８Ｎ、４Ｖ／２２Ｔ／３４Ｅ／３８Ｖ／１６９Ａ／７０８Ｖ、４Ｖ／２２Ｔ／３４Ｅ／４７Ｓ／５１Ｈ／１６９Ａ／２１３Ｔ、４Ｖ／３４Ｅ／３８Ｎ／１０１Ｖ、４Ｖ／３４Ｅ／７０８Ｖ、４Ｖ／６２Ｉ／４３３Ｐ／７０８Ｖ、４Ｖ／１６９Ａ、４Ｖ／１６９Ａ／４３３Ｐ、４Ｖ／１６９Ａ／７０８Ｖ、４Ｖ／４３３Ｐ、４Ｖ／７０８Ｖ、２２Ｌ／３４Ｅ、２２Ｌ／３４Ｓ／１６９Ａ／７０８Ｖ、２２Ｌ／７５Ｉ、２２Ｔ／３４Ｅ／３８Ｖ、２２Ｔ／３４Ｅ／１０１Ｖ／１６９Ｅ、２２Ｔ／３４Ｅ／１０１Ｖ／１６９Ｅ／１９５Ｋ、２２Ｔ／４７Ｓ／１６９Ａ／４３３Ｐ、３４Ｅ／６２Ｉ／１６９Ｅ／４３３Ｐ、３４Ｅ／１０１Ｖ、３４Ｓ／３８Ｌ／６２Ｉ、６２Ｉ／７０８Ｖ、７５Ｉ／１６９Ａ、１６９Ａ／７０８Ｖ、および１９５Ｋ／７０８Ｖから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｅ４Ｖ／Ｈ２２Ｌ／Ｔ３４Ｅ、Ｅ４Ｖ／Ｈ２２Ｌ／Ｙ５１Ａ／Ｔ７０８Ｖ、Ｅ４Ｖ／Ｈ２２Ｌ／Ｌ１０１Ｖ、Ｅ４Ｖ／Ｈ２２Ｔ、Ｅ４Ｖ／Ｈ２２Ｔ／Ｔ３４Ｅ／Ｒ３８Ｎ、Ｅ４Ｖ／Ｈ２２Ｔ／Ｔ３４Ｅ／Ｒ３８Ｖ／Ｑ１６９Ａ／Ｔ７０８Ｖ、Ｅ４Ｖ／Ｈ２２Ｔ／Ｔ３４Ｅ／Ｐ４７Ｓ／Ｙ５１Ｈ／Ｑ１６９Ａ／Ａ２１３Ｔ、Ｅ４Ｖ／Ｔ３４Ｅ／Ｒ３８Ｎ／Ｌ１０１Ｖ、Ｅ４Ｖ／Ｔ３４Ｅ／Ｔ７０８Ｖ、Ｅ４Ｖ／Ｖ６２Ｉ／Ｌ４３３Ｐ／Ｔ７０８Ｖ、Ｅ４Ｖ／Ｑ１６９Ａ、Ｅ４Ｖ／Ｑ１６９Ａ／Ｌ４３３Ｐ、Ｅ４Ｖ／Ｑ１６９Ａ／Ｔ７０８Ｖ、Ｅ４Ｖ／Ｌ４３３Ｐ、Ｅ４Ｖ／Ｔ７０８Ｖ、Ｈ２２Ｌ／Ｔ３４Ｅ、Ｈ２２Ｌ／Ｔ３４Ｓ／Ｑ１６９Ａ／Ｔ７０８Ｖ、Ｈ２２Ｌ／Ｍ７５Ｉ、Ｈ２２Ｔ／Ｔ３４Ｅ／Ｒ３８Ｖ、Ｈ２２Ｔ／Ｔ３４Ｅ／Ｌ１０１Ｖ／Ｑ１６９Ｅ、Ｈ２２Ｔ／Ｔ３４Ｅ／Ｌ１０１Ｖ／Ｑ１６９Ｅ／Ｓ１９５Ｋ、Ｈ２２Ｔ／Ｐ４７Ｓ／Ｑ１６９Ａ／Ｌ４３３Ｐ、Ｔ３４Ｅ／Ｖ６２Ｉ／Ｑ１６９Ｅ／Ｌ４３３Ｐ、Ｔ３４Ｅ／Ｌ１０１Ｖ、Ｔ３４Ｓ／Ｒ３８Ｌ／Ｖ６２Ｉ、Ｖ６２Ｉ／Ｔ７０８Ｖ、Ｍ７５Ｉ／Ｑ１６９Ａ、Ｑ１６９Ａ／Ｔ７０８Ｖ、およびＳ１９５Ｋ／Ｔ７０８Ｖから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、４、２２、３４、１２１、１６９、３４１、４１１、４３３、４４１、５１８、５２６、５２７、５２８、５４４、５５７、５５８、５６５、５８５、６０２、６０４、６２３、７０８、７３１および７７０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、４Ｖ、２２Ｌ、２２Ｔ、３４Ｅ、１２１Ｄ、１６９Ａ、３４１Ｎ、４１１Ｉ、４３３Ｐ、４４１Ａ、４４１Ｌ、５１８Ｓ、５２６Ｈ、５２６Ｖ、５２７Ａ、５２７Ｑ、５２８Ｑ、５４４Ｈ、５５７Ｐ、５５８Ｇ、５６５Ｖ、５８５Ａ、６０２Ｐ、６０４Ａ、６２３Ａ、６２３Ｋ、６２３Ｑ、６２３Ｒ、７０８Ｖ、７３１Ａ、７３１Ｍ、７３１Ｑ、７３１Ｔ、および７７０Ｔから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｅ４Ｖ、Ｈ２２Ｌ、Ｈ２２Ｔ、Ｔ３４Ｅ、Ｅ１２１Ｄ、Ｑ１６９Ａ、Ｐ３４１Ｎ、Ｌ４１１Ｉ、Ｌ４３３Ｐ、Ｄ４４１Ａ、Ｄ４４１Ｌ、Ｒ５１８Ｓ、Ｔ５２６Ｈ、Ｔ５２６Ｖ、Ｅ５２７Ａ、Ｅ５２７Ｑ、Ｅ５２８Ｑ、Ｒ５４４Ｈ、Ｒ５５７Ｐ、Ｑ５５８Ｇ、Ｍ５６５Ｖ、Ｓ５８５Ａ、Ｖ６０２Ｐ、Ｎ６０４Ａ、Ｈ６２３Ａ、Ｈ６２３Ｋ、Ｈ６２３Ｑ、Ｈ６２３Ｒ、Ｔ７０８Ｖ、Ｄ７３１Ａ、Ｄ７３１Ｍ、Ｄ７３１Ｑ、Ｄ７３１Ｔ、およびＶ７７０Ｔから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、４、４／２２／３４／３８、４／１６９、４／１６９／４３３、４／４３３、６２／７０８、および１６９／７０８から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、４Ｖ、４Ｖ／２２Ｔ／３４Ｅ／３８Ｎ、４Ｖ／１６９Ａ、４Ｖ／１６９Ａ／４３３Ｐ、４Ｖ／４３３Ｐ、６２Ｉ／７０８Ｖ、および１６９Ａ／７０８Ｖから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｅ４Ｖ、Ｅ４Ｖ／Ｈ２２Ｔ／Ｔ３４Ｅ／Ｒ３８Ｎ、Ｅ４Ｖ／Ｑ１６９Ａ、Ｅ４Ｖ／Ｑ１６９Ａ／Ｌ４３３Ｐ、Ｅ４Ｖ／Ｌ４３３Ｐ、Ｖ６２Ｉ／Ｔ７０８Ｖ、およびＱ１６９Ａ／Ｔ７０８Ｖから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号１８２２を基準にして番号が付けられている。
【００３４】
さらに一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４／６２／４１１／５２６／５５７、３４／６２／４１１／５５７／６０２／６０４、３４／６２／４４１／５５７／６２３、３４／６２／５１８／６２３、３４／６２／６２３／７３１、３４／１２１／４４１／５４４／６０４／６２３、３４／１２１／５２６／６０４／７３１、３４／４１１／４４１、３４／４１１／４４１／５１８／５２６／５５７／５６５／７３１、３４／４１１／４４１／５１８／５４４／５５７／５６５／７０８／７３１、３４／４１１／４４１／５１８／５８５／６０４／７７０、３４／４４１／５１８／５２６／５８５／６０４／７３１、３４／４４１／５２６／５６５／７０８／７７０、３４／４４１／５４４／５５７／５８５／６０２／６２３、３４／４４１／５８５／６２３／７０８／７３１、３４／５２６／５８５／６２３、６２／１２１／３２９／５１８／５５７／５６５／６２３／７０８、６２／１２１／４１１／４４１／５１８／５４４／５５７／５８５／６０４／６２３、６２／１２１／４４１／５１８／５２６／６２３／７７０、６２／１２１／４４１／５６５／５８５、６２／１２１／５１８／５５７／５８５／６０４／７０８／７７０、６２／４１１／５２６／５６５／６０４／６２３、６２／４１１／５８５／７３１、６２／４４１／５１８／５５７／６０４／６２３／７０８／７３１、６２／４４１／６２３／７０８／７７０、６２／４４１／７７０、１２１／４４１／５１８／５２６／６０２／６０４、１２１／４４１／５１８／５２６／６２３／７０８、１２１／４４１／５２６／５５７／５６５／７０８、１２１／６０４／７０８／７３１／７７０、４１１／４４１／５１８／５５７／６２３、４１１／４４１／５１８／７０８、４１１／４４１／６０４／６２３／７０８／７３１、４１１／５１８／５２６／６０４／６２３／７３１、４１１／５６５／６０４／６２３、４１１／５８５／６２３、４４１／５１８／５２６／５５７／５６５／６０２／６０４／６２３／７０８、４４１／５１８／５２６／５５７／５８５／６０４／６２３／７０８、４４１／５１８／５２６／６０４／６２３、４４１／５１８／５５７／５６５／５８５、４４１／５１８／５６５／６２３／７３１／７７０、４４１／５１８／５８５、４４１／５８５、４４１／５８５／６０２／６０４／６２３／７０８／７３１、４４１／７０８／７３１、５５７／６０２／６０４、５５７／６０４、５８５／６２３／７０８、および６２３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている。
【００３５】
一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４Ｅ／６２Ｉ／４１１Ｉ／５２６Ｈ／５５７Ｐ、３４Ｅ／６２Ｉ／４１１Ｉ／５５７Ｐ／６０２Ｐ／６０４Ａ、３４Ｅ／６２Ｉ／４４１Ｌ／５５７Ｐ／６２３Ｋ、３４Ｅ／６２Ｉ／５１８Ｓ／６２３Ｋ、３４Ｅ／６２Ｉ／６２３Ｋ／７３１Ｑ、３４Ｅ／１２１Ｄ／４４１Ｌ／５４４Ｈ／６０４Ａ／６２３Ｋ、３４Ｅ／１２１Ｄ／５２６Ｈ／６０４Ａ／７３１Ｑ、３４Ｅ／４１１Ｉ／４４１Ｌ、３４Ｅ／４１１Ｉ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／５２６Ｈ／５５７Ｐ／５６５Ｖ／７３１Ｑ、３４Ｅ／４１１Ｉ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／５４４Ｈ／５５７Ｐ／５６５Ｖ／７０８Ｖ／７３１Ｑ、３４Ｅ／４１１Ｉ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／５８５Ａ／６０４Ａ／７７０Ｔ、３４Ｅ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／５２６Ｈ／５８５Ａ／６０４Ａ／７３１Ｑ、３４Ｅ／４４１Ｌ／５２６Ｈ／５６５Ｖ／７０８Ｖ／７７０Ｔ、３４Ｅ／４４１Ｌ／５４４Ｈ／５５７Ｐ／５８５Ａ／６０２Ｐ／６２３Ｋ、３４Ｅ／４４１Ｌ／５８５Ａ／６２３Ｋ／７０８Ｖ／７３１Ｑ、３４Ｅ／５２６Ｈ／５８５Ａ／６２３Ｋ、６２Ｉ／１２１Ｄ／３２９Ｑ／５１８Ｓ／５５７Ｐ／５６５Ｖ／６２３Ｒ／７０８Ｖ、６２Ｉ／１２１Ｄ／４１１Ｉ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／５４４Ｈ／５５７Ｐ／５８５Ａ／６０４Ａ／６２３Ｋ、６２Ｉ／１２１Ｄ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／５２６Ｈ／６２３Ｒ／７７０Ｔ、６２Ｉ／１２１Ｄ／４４１Ｌ／５６５Ｖ／５８５Ａ、６２Ｉ／１２１Ｄ／５１８Ｓ／５５７Ｐ／５８５Ａ／６０４Ａ／７０８Ｖ／７７０Ｔ、６２Ｉ／４１１Ｉ／５２６Ｈ／５６５Ｖ／６０４Ａ／６２３Ｋ、６２Ｉ／４１１Ｉ／５８５Ａ／７３１Ｑ、６２Ｉ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／５５７Ｐ／６０４Ａ／６２３Ｋ／７０８Ｖ／７３１Ｑ、６２Ｉ／４４１Ｌ／６２３Ｒ／７０８Ｖ／７７０Ｔ、６２Ｉ／４４１Ｌ／７７０Ｔ、１２１Ｄ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／５２６Ｈ／６０２Ｐ／６０４Ａ、１２１Ｄ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／５２６Ｈ／６２３Ｋ／７０８Ｖ、１２１Ｄ／４４１Ｌ／５２６Ｈ／５５７Ｐ／５６５Ｖ／７０８Ｖ、１２１Ｄ／６０４Ａ／７０８Ｖ／７３１Ｑ／７７０Ｔ、４１１Ｉ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／５５７Ｐ／６２３Ｋ、４１１Ｉ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／７０８Ｖ、４１１Ｉ／４４１Ｌ／６０４Ａ／６２３Ｋ／７０８Ｖ／７３１Ｑ、４１１Ｉ／５１８Ｓ／５２６Ｈ／６０４Ａ／６２３Ｋ／７３１Ｑ、４１１Ｉ／５６５Ｖ／６０４Ａ／６２３Ｒ、４１１Ｉ／５８５Ａ／６２３Ｋ、４４１Ｌ／５１８Ｓ／５２６Ｈ／５５７Ｐ／５６５Ｖ／６０２Ｐ／６０４Ａ／６２３Ｋ／７０８Ｖ、４４１Ｌ／５１８Ｓ／５２６Ｈ／５５７Ｐ／５８５Ａ／６０４Ａ／６２３Ｒ／７０８Ｖ、４４１Ｌ／５１８Ｓ／５２６Ｈ／６０４Ａ／６２３Ｒ、４４１Ｌ／５１８Ｓ／５５７Ｐ／５６５Ｖ／５８５Ａ、４４１Ｌ／５１８Ｓ／５６５Ｖ／６２３Ｒ／７３１Ｑ／７７０Ｔ、４４１Ｌ／５１８Ｓ／５８５Ａ、４４１Ｌ／５８５Ａ、４４１Ｌ／５８５Ａ／６０２Ｐ／６０４Ａ／６２３Ｒ／７０８Ｖ／７３１Ｑ、４４１Ｌ／７０８Ｖ／７３１Ｑ、５５７Ｐ／６０２Ｐ／６０４Ａ、５５７Ｐ／６０４Ａ、５８５Ａ／６２３Ｒ／７０８Ｖ、および６２３Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｔ３４Ｅ／Ｖ６２Ｉ／Ｌ４１１Ｉ／Ｔ５２６Ｈ／Ｒ５５７Ｐ、Ｔ３４Ｅ／Ｖ６２Ｉ／Ｌ４１１Ｉ／Ｒ５５７Ｐ／Ｖ６０２Ｐ／Ｎ６０４Ａ、Ｔ３４Ｅ／Ｖ６２Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５５７Ｐ／Ｈ６２３Ｋ、Ｔ３４Ｅ／Ｖ６２Ｉ／Ｒ５１８Ｓ／Ｈ６２３Ｋ、Ｔ３４Ｅ／Ｖ６２Ｉ／Ｈ６２３Ｋ／Ｄ７３１Ｑ、Ｔ３４Ｅ／Ｅ１２１Ｄ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５４４Ｈ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｋ、Ｔ３４Ｅ／Ｅ１２１Ｄ／Ｔ５２６Ｈ／Ｎ６０４Ａ／Ｄ７３１Ｑ、Ｔ３４Ｅ／Ｌ４１１Ｉ／Ｄ４４１Ｌ、Ｔ３４Ｅ／Ｌ４１１Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｔ５２６Ｈ／Ｒ５５７Ｐ／Ｍ５６５Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｔ３４Ｅ／Ｌ４１１Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｒ５４４Ｈ／Ｒ５５７Ｐ／Ｍ５６５Ｖ／Ｔ７０８Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｔ３４Ｅ／Ｌ４１１Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｓ５８５Ａ／Ｎ６０４Ａ／Ｖ７７０Ｔ、Ｔ３４Ｅ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｔ５２６Ｈ／Ｓ５８５Ａ／Ｎ６０４Ａ／Ｄ７３１Ｑ、Ｔ３４Ｅ／Ｄ４４１Ｌ／Ｔ５２６Ｈ／Ｍ５６５Ｖ／Ｔ７０８Ｖ／Ｖ７７０Ｔ、Ｔ３４Ｅ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５４４Ｈ／Ｒ５５７Ｐ／Ｓ５８５Ａ／Ｖ６０２Ｐ／Ｈ６２３Ｋ、Ｔ３４Ｅ／Ｄ４４１Ｌ／Ｓ５８５Ａ／Ｈ６２３Ｋ／Ｔ７０８Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｔ３４Ｅ／Ｔ５２６Ｈ／Ｓ５８５Ａ／Ｈ６２３Ｋ、Ｖ６２Ｉ／Ｅ１２１Ｄ／Ｅ３２９Ｑ／Ｒ５１８Ｓ／Ｒ５５７Ｐ／Ｍ５６５Ｖ／Ｈ６２３Ｒ／Ｔ７０８Ｖ、Ｖ６２Ｉ／Ｅ１２１Ｄ／Ｌ４１１Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｒ５４４Ｈ／Ｒ５５７Ｐ／Ｓ５８５Ａ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｋ、Ｖ６２Ｉ／Ｅ１２１Ｄ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｔ５２６Ｈ／Ｈ６２３Ｒ／Ｖ７７０Ｔ、Ｖ６２Ｉ／Ｅ１２１Ｄ／Ｄ４４１Ｌ／Ｍ５６５Ｖ／Ｓ５８５Ａ、Ｖ６２Ｉ／Ｅ１２１Ｄ／Ｒ５１８Ｓ／Ｒ５５７Ｐ／Ｓ５８５Ａ／Ｎ６０４Ａ／Ｔ７０８Ｖ／Ｖ７７０Ｔ、Ｖ６２Ｉ／Ｌ４１１Ｉ／Ｔ５２６Ｈ／Ｍ５６５Ｖ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｋ、Ｖ６２Ｉ／Ｌ４１１Ｉ／Ｓ５８５Ａ／Ｄ７３１Ｑ、Ｖ６２Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｒ５５７Ｐ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｋ／Ｔ７０８Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｖ６２Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｈ６２３Ｒ／Ｔ７０８Ｖ／Ｖ７７０Ｔ、Ｖ６２Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｖ７７０Ｔ、Ｅ１２１Ｄ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｔ５２６Ｈ／Ｖ６０２Ｐ／Ｎ６０４Ａ、Ｅ１２１Ｄ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｔ５２６Ｈ／Ｈ６２３Ｋ／Ｔ７０８Ｖ、Ｅ１２１Ｄ／Ｄ４４１Ｌ／Ｔ５２６Ｈ／Ｒ５５７Ｐ／Ｍ５６５Ｖ／Ｔ７０８Ｖ、Ｅ１２１Ｄ／Ｎ６０４Ａ／Ｔ７０８Ｖ／Ｄ７３１Ｑ／Ｖ７７０Ｔ、Ｌ４１１Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｒ５５７Ｐ／Ｈ６２３Ｋ、Ｌ４１１Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｔ７０８Ｖ、Ｌ４１１Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｋ／Ｔ７０８Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｌ４１１Ｉ／Ｒ５１８Ｓ／Ｔ５２６Ｈ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｋ／Ｄ７３１Ｑ、Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｒ、Ｌ４１１Ｉ／Ｓ５８５Ａ／Ｈ６２３Ｋ、Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｔ５２６Ｈ／Ｒ５５７Ｐ／Ｍ５６５Ｖ／Ｖ６０２Ｐ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｋ／Ｔ７０８Ｖ、Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｔ５２６Ｈ／Ｒ５５７Ｐ／Ｓ５８５Ａ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｒ／Ｔ７０８Ｖ、Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｔ５２６Ｈ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｒ、Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｒ５５７Ｐ／Ｍ５６５Ｖ／Ｓ５８５Ａ、Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｍ５６５Ｖ／Ｈ６２３Ｒ／Ｄ７３１Ｑ／Ｖ７７０Ｔ、Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｓ５８５Ａ、Ｄ４４１Ｌ／Ｓ５８５Ａ、Ｄ４４１Ｌ／Ｓ５８５Ａ／Ｖ６０２Ｐ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｒ／Ｔ７０８Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｄ４４１Ｌ／Ｔ７０８Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｒ５５７Ｐ／Ｖ６０２Ｐ／Ｎ６０４Ａ、Ｒ５５７Ｐ／Ｎ６０４Ａ、Ｓ５８５Ａ／Ｈ６２３Ｒ／Ｔ７０８Ｖ、およびＨ６２３Ｒから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている。さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、６３、６５、２６９、３２３、４０６、４１６、４６９、５１１および６４０から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、６３Ｇ、６３Ｓ、６３Ｔ、６５Ｃ、６５Ｌ、２６９Ｖ、３２３Ｇ、３２３Ｓ、３２３Ｔ、４０６Ｇ、４１６Ｆ、４６９Ｓ、５１１Ｌ、６４０Ａ、６４０Ｅ、６４０Ｈ、６４０Ｎ、６４０Ｒ、６４０Ｖおよび６４０Ｗから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ａ６３Ｇ、Ａ６３Ｓ、Ａ６３Ｔ、Ｔ６５Ｃ、Ｔ６５Ｌ、Ｉ２６９Ｖ、Ａ３２３Ｇ、Ａ３２３Ｓ、Ａ３２３Ｔ、Ｎ４０６Ｇ、Ｌ４１６Ｆ、Ｔ４６９Ｓ、Ｖ５１１Ｌ、Ｔ６４０Ａ、Ｔ６４０Ｅ、Ｔ６４０Ｈ、Ｔ６４０Ｎ、Ｔ６４０Ｒ、Ｔ６４０ＶおよびＴ６４０Ｗから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４／６２／４４１／５５７／６２３、３４／４４１／５８５／６２３／７０８／７３１、６２／４４１／６２３／７０８／７７０、４１１／４４１／５１８／５５７／６２３、４１１／４４１／６０４／６２３／７０８／７３１、４４１／５１８／５２６／５５７／５８５／６０４／６２３／７０８、４４１／５１８／５５７／５６５／５８５、および４４１／５８５／６０２／６０４／６２３／７０８／７３１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４Ｅ／６２Ｉ／４４１Ｌ／５５７Ｐ／６２３Ｋ、３４Ｅ／４４１Ｌ／５８５Ａ／６２３Ｋ／７０８Ｖ／７３１Ｑ、６２Ｉ／４４１Ｌ／６２３Ｒ／７０８Ｖ／７７０Ｔ、４１１Ｉ／４４１Ｌ／５１８Ｓ／５５７Ｐ／６２３Ｋ、４１１Ｉ／４４１Ｌ／６０４Ａ／６２３Ｋ／７０８Ｖ／７３１Ｑ、４４１Ｌ／５１８Ｓ／５２６Ｈ／５５７Ｐ／５８５Ａ／６０４Ａ／６２３Ｒ／７０８Ｖ、４４１Ｌ／５１８Ｓ／５５７Ｐ／５６５Ｖ／５８５Ａ、および４４１Ｌ／５８５Ａ／６０２Ｐ／６０４Ａ／６２３Ｒ／７０８Ｖ／７３１Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｔ３４Ｅ／Ｖ６２Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５５７Ｐ／Ｈ６２３Ｋ、Ｔ３４Ｅ／Ｄ４４１Ｌ／Ｓ５８５Ａ／Ｈ６２３Ｋ／Ｔ７０８Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｖ６２Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｈ６２３Ｒ／Ｔ７０８Ｖ／Ｖ７７０Ｔ、Ｌ４１１Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｒ５５７Ｐ／Ｈ６２３Ｋ、Ｌ４１１Ｉ／Ｄ４４１Ｌ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｋ／Ｔ７０８Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｔ５２６Ｈ／Ｒ５５７Ｐ／Ｓ５８５Ａ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｒ／Ｔ７０８Ｖ、Ｄ４４１Ｌ／Ｒ５１８Ｓ／Ｒ５５７Ｐ／Ｍ５６５Ｖ／Ｓ５８５Ａ、およびＤ４４１Ｌ／Ｓ５８５Ａ／Ｖ６０２Ｐ／Ｎ６０４Ａ／Ｈ６２３Ｒ／Ｔ７０８Ｖ／Ｄ７３１Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２０９２を基準にして番号が付けられている。
【００３６】
一部のさらなる実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４、３４／６２、３４／６２／６５／６４０、３４／６２／３２３、３４／６３／６５／３２３／５２８／６４０、３４／６３／６５／４０６／５２８／６４０／７１３、３４／６３／３２３／５２６／５２８／６４０、３４／６３／４０６／５２８／６４０／７３１、３４／６５、３４／６５／５２８／６４０、３４／３２３／４０６／６４０、３４／３２３／６４０、３４／６４０、３８／６４０、６２／６３、６２／６３／６５／５２８／６４０、６２／６３／６９／３２３／４０６／６４０、６２／６３／５２６／６４０／７３１、６２／３２３／６４０、６３／６５／３２３／４０６／５２６／５２８／６４０／７３１、６３／６５／４０６／７３１、６３／６５／５２８／６４０／７３１、６３／６５／６４０、６３／３２３／４０６／６４０、６３／４０６、６３／４０６／６４０、６３／５２６／５２８／６４０／７３１、６３／７３１、３２３／４０６／６４０、３２３／４０６／６４０／７３１、３２３／５２６／５２８／６４０、３２３／５２６／６４０、３２３／６４０／７３１、４０６／６４０、５２６／５２８／６４０／７３１、および７３１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４Ｅ、３４Ｅ／６２Ｉ、３４Ｅ／６２Ｉ／６５Ｃ／６４０Ｒ、３４Ｅ／６２Ｉ／３２３Ｇ、３４Ｅ／６３Ｓ／６５Ｃ／４０６Ｇ／５２８Ｄ／６４０Ｒ／７１３Ｖ、３４Ｅ／６３Ｓ／３２３Ｇ／５２６Ｔ／５２８Ｄ／６４０Ｒ、３４Ｅ／６３Ｓ／４０６Ｇ／５２８Ｄ／６４０Ｎ／７３１Ｑ、３４Ｅ／６３Ｔ／６５Ｃ／３２３Ｇ／５２８Ｄ／６４０Ｒ、３４Ｅ／６５Ｃ、３４Ｅ／６５Ｃ／５２８Ｄ／６４０Ｒ、３４Ｅ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／６４０Ａ、３４Ｅ／３２３Ｇ／６４０Ａ、３４Ｅ／６４０Ａ、３４Ｅ／６４０Ｒ、３８Ｈ／６４０Ｒ、６２Ｉ／６３Ｓ／６５Ｃ／５２８Ｄ／６４０Ａ、６２Ｉ／６３Ｓ／５２６Ｔ／６４０Ｒ／７３１Ｑ、６２Ｉ／６３Ｔ、６２Ｉ／６３Ｔ／６９Ｆ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／６４０Ｒ、６２Ｉ／３２３Ｇ／６４０Ｒ、６３Ｓ／６５Ｃ／６４０Ｒ、６３Ｓ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／６４０Ａ、６３Ｓ／４０６Ｇ、６３Ｓ／５２６Ｔ／５２８Ｄ／６４０Ｒ／７３１Ｑ、６３Ｓ／７３１Ｑ、６３Ｔ／６５Ｃ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／５２６Ｔ／５２８Ｄ／６４０Ｎ／７３１Ｑ、６３Ｔ／６５Ｃ／４０６Ｇ／７３１Ｑ、６３Ｔ／６５Ｃ／５２８Ｄ／６４０Ａ／７３１Ｑ、６３Ｔ／４０６Ｇ／６４０Ａ、３２３Ｇ／４０６Ｇ／６４０Ｎ、３２３Ｇ／４０６Ｇ／６４０Ｒ／７３１Ｑ、３２３Ｇ／５２６Ｔ／５２８Ｄ／６４０Ｒ、３２３Ｇ／５２６Ｔ／６４０Ｒ、３２３Ｇ／６４０Ａ／７３１Ｑ、４０６Ｇ／６４０Ｒ、５２６Ｔ／５２８Ｄ／６４０Ａ／７３１Ｑ、および７３１Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｔ３４Ｅ、Ｔ３４Ｅ／Ｖ６２Ｉ、Ｔ３４Ｅ／Ｖ６２Ｉ／Ｔ６５Ｃ／Ｔ６４０Ｒ、Ｔ３４Ｅ／Ｖ６２Ｉ／Ａ３２３Ｇ、Ｔ３４Ｅ／Ａ６３Ｓ／Ｔ６５Ｃ／Ｎ４０６Ｇ／Ｅ５２８Ｄ／Ｔ６４０Ｒ／Ａ７１３Ｖ、Ｔ３４Ｅ／Ａ６３Ｓ／Ａ３２３Ｇ／Ｈ５２６Ｔ／Ｅ５２８Ｄ／Ｔ６４０Ｒ、Ｔ３４Ｅ／Ａ６３Ｓ／Ｎ４０６Ｇ／Ｅ５２８Ｄ／Ｔ６４０Ｎ／Ｄ７３１Ｑ、Ｔ３４Ｅ／Ａ６３Ｔ／Ｔ６５Ｃ／Ａ３２３Ｇ／Ｅ５２８Ｄ／Ｔ６４０Ｒ、Ｔ３４Ｅ／Ｔ６５Ｃ、Ｔ３４Ｅ／Ｔ６５Ｃ／Ｅ５２８Ｄ／Ｔ６４０Ｒ、Ｔ３４Ｅ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｔ６４０Ａ、Ｔ３４Ｅ／Ａ３２３Ｇ／Ｔ６４０Ａ、Ｔ３４Ｅ／Ｔ６４０Ａ、Ｔ３４Ｅ／Ｔ６４０Ｒ、Ｒ３８Ｈ／Ｔ６４０Ｒ、Ｖ６２Ｉ／Ａ６３Ｓ／Ｔ６５Ｃ／Ｅ５２８Ｄ／Ｔ６４０Ａ、Ｖ６２Ｉ／Ａ６３Ｓ／Ｈ５２６Ｔ／Ｔ６４０Ｒ／Ｄ７３１Ｑ、Ｖ６２Ｉ／Ａ６３Ｔ、Ｖ６２Ｉ／Ａ６３Ｔ／Ｉ６９Ｆ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｔ６４０Ｒ、Ｖ６２Ｉ／Ａ３２３Ｇ／Ｔ６４０Ｒ、Ａ６３Ｓ／Ｔ６５Ｃ／Ｔ６４０Ｒ、Ａ６３Ｓ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｔ６４０Ａ、Ａ６３Ｓ／Ｎ４０６Ｇ、Ａ６３Ｓ／Ｈ５２６Ｔ／Ｅ５２８Ｄ／Ｔ６４０Ｒ／Ｄ７３１Ｑ、Ａ６３Ｓ／Ｄ７３１Ｑ、Ａ６３Ｔ／Ｔ６５Ｃ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｈ５２６Ｔ／Ｅ５２８Ｄ／Ｔ６４０Ｎ／Ｄ７３１Ｑ、Ａ６３Ｔ／Ｔ６５Ｃ／Ｎ４０６Ｇ／Ｄ７３１Ｑ、Ａ６３Ｔ／Ｔ６５Ｃ／Ｅ５２８Ｄ／Ｔ６４０Ａ／Ｄ７３１Ｑ、Ａ６３Ｔ／Ｎ４０６Ｇ／Ｔ６４０Ａ、Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｔ６４０Ｎ、Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｔ６４０Ｒ／Ｄ７３１Ｑ、Ａ３２３Ｇ／Ｈ５２６Ｔ／Ｅ５２８Ｄ／Ｔ６４０Ｒ、Ａ３２３Ｇ／Ｈ５２６Ｔ／Ｔ６４０Ｒ、Ａ３２３Ｇ／Ｔ６４０Ａ／Ｄ７３１Ｑ、Ｎ４０６Ｇ／Ｔ６４０Ｒ、Ｈ５２６Ｔ／Ｅ５２８Ｄ／Ｔ６４０Ａ／Ｄ７３１Ｑ、およびＤ７３１Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、２８、３０、３０／１５８、３７、５９、１０２、１０８、１５８、１６４、１８３、１９１、２０６、２３５、３０７、３１１、４０９、４１９、５３３、５４３、５４６、５５９、６８３、７１０、７５２および７９３から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、２８Ｈ、３０Ａ、３０Ｈ／１５８Ｈ、３０Ｍ、３０Ｑ、３７Ｌ、３７Ｍ、５９Ｔ、１０２Ｎ、１０２Ｔ、１０８Ｒ、１５８Ａ、１５８Ｋ、１６４Ｇ、１６４Ｑ、１６４Ｓ、１６４Ｔ、１８３Ｐ、１９１Ｌ、２０６Ｉ、２３５Ａ、３０７Ｅ、３０７Ｈ、３１１Ｌ、３１１Ｓ、４０９Ｓ、４１９Ｌ、４１９Ｖ、５３３Ｋ、５３３Ｒ、５４３Ａ、５４６Ｎ、５４６Ｑ、５４６Ｔ、５５９Ｒ、６８３Ｌ、６８３Ｖ、７１０Ａ、７１０Ｇ、７１０Ｓ、７１０Ｖ、７５２Ｒ、および７９３Ｇから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｒ２８Ｈ、Ｓ３０Ａ、Ｓ３０Ｈ／Ｒ１５８Ｈ、Ｓ３０Ｍ、Ｓ３０Ｑ、Ｑ３７Ｌ、Ｑ３７Ｍ、Ａ５９Ｔ、Ｓ１０２Ｎ、Ｓ１０２Ｔ、Ｑ１０８Ｒ、Ｒ１５８Ａ、Ｒ１５８Ｋ、Ａ１６４Ｇ、Ａ１６４Ｑ、Ａ１６４Ｓ、Ａ１６４Ｔ、Ｎ１８３Ｐ、Ｔ１９１Ｌ、Ｌ２０６Ｉ、Ｖ２３５Ａ、Ｎ３０７Ｅ、Ｎ３０７Ｈ、Ｑ３１１Ｌ、Ｑ３１１Ｓ、Ａ４０９Ｓ、Ｔ４１９Ｌ、Ｔ４１９Ｖ、Ｌ５３３Ｋ、Ｌ５３３Ｒ、Ｇ５４３Ａ、Ｐ５４６Ｎ、Ｐ５４６Ｑ、Ｐ５４６Ｔ、Ｋ５５９Ｒ、Ｒ６８３Ｌ、Ｒ６８３Ｖ、Ｅ７１０Ａ、Ｅ７１０Ｇ、Ｅ７１０Ｓ、Ｅ７１０Ｖ、Ｔ７５２Ｒ、およびＥ７９３Ｇから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４／６２、３４／６５、３４／３２３／６４０、３４／６４０、３８／６４０、および６３／６５／４０６／７３１から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４Ｅ／６２Ｉ、３４Ｅ／６５Ｃ、３４Ｅ／３２３Ｇ／６４０Ａ、３４Ｅ／６４０Ａ、３８Ｈ／６４０Ｒ、および６３Ｔ／６５Ｃ／４０６Ｇ／７３１Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｔ３４Ｅ／Ｖ６２Ｉ、Ｔ３４Ｅ／Ｔ６５Ｃ、Ｔ３４Ｅ／Ａ３２３Ｇ／Ｔ６４０Ａ、Ｔ３４Ｅ／Ｔ６４０Ａ、Ｒ３８Ｈ／Ｔ６４０Ｒ、およびＡ６３Ｔ／Ｔ６５Ｃ／Ｎ４０６Ｇ／Ｄ７３１Ｑから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２１８２を基準にして番号が付けられている。
【００３７】
さらに一部のさらなる実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４／６５／３２３／４０６／４１１／５６５、３４／３２３／４０６／４１１／５６５、３４／３２３／４０６／５６５／７３１、６２／６５／３２３／４０６／５６５、６２／６５／３２３／４０６／５６５／７３１、６２／６５／３２３／４１１／５６５、６２／６５／４０６／４１１／５６５／７３１、６２／３２３／４０６／４１１、６２／３２３／４０６／４１１／５６５、６２／３２３／４１１／５６５、６３／６５／３２３／４０６／５６５／７３１、６３／６５／４０６／４１１／５６５、６５／３２３／４０６／５６５、３２３／４０６／４１１／５６５、３２３／４１１／５６５、および６３６から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２３２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４Ｅ／６５Ｃ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ、３４Ｅ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ、３４Ｅ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／５６５Ｖ／７３１Ｑ、６２Ｉ／６５Ｃ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／５６５Ｖ、６２Ｉ／６５Ｃ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／５６５Ｖ／７３１Ｑ、６２Ｉ／６５Ｃ／３２３Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ、６２Ｉ／６５Ｃ／４０６Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ／７３１Ｑ、６２Ｉ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／４１１Ｉ、６２Ｉ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ、６２Ｉ／３２３Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ、６３Ｔ／６５Ｃ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／５６５Ｖ／７３１Ｑ、６３Ｔ／６５Ｃ／４０６Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ、６５Ｃ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／５６５Ｖ、３２３Ｇ／４０６Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ、３２３Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ、６３６Ａ、６３６Ｈ、および６３６Ｎから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２３２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｔ３４Ｅ／Ｔ６５Ｃ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ、Ｔ３４Ｅ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ、Ｔ３４Ｅ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｍ５６５Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｖ６２Ｉ／Ｔ６５Ｃ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｍ５６５Ｖ、Ｖ６２Ｉ／Ｔ６５Ｃ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｍ５６５Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｖ６２Ｉ／Ｔ６５Ｃ／Ａ３２３Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ、Ｖ６２Ｉ／Ｔ６５Ｃ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｖ６２Ｉ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ、Ｖ６２Ｉ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ、Ｖ６２Ｉ／Ａ３２３Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ、Ａ６３Ｔ／Ｔ６５Ｃ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｍ５６５Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ａ６３Ｔ／Ｔ６５Ｃ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ、Ｔ６５Ｃ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｍ５６５Ｖ、Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ、Ａ３２３Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ、Ｑ６３６Ａ、Ｑ６３６Ｈ、およびＱ６３６Ｎから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２３２２を基準にして番号が付けられている。一部のさらなる実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４／６５／３２３／４０６／４１１／５６５、３４／３２３／４０６／４１１／５６５、６２／６５／３２３／４０６／５６５、６２／６５／４０６／４１１／５６５／６３６／７３１、６２／６５／４０６／４１１／５６５／７３１、６２／３２３／４０６／４１１、６２／３２３／４０６／４１１／５６５、および６２／３２３／４１１／５６５から選択される１つまたは複数の位置に少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２３２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、３４Ｅ／６５Ｃ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ、３４Ｅ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ、６２Ｉ／６５Ｃ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／５６５Ｖ、６２Ｉ／６５Ｃ／４０６Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ／６３６Ｈ／７３１Ｑ、６２Ｉ／６５Ｃ／４０６Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ／７３１Ｑ、６２Ｉ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／４１１Ｉ、６２Ｉ／３２３Ｇ／４０６Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖ、および６２Ｉ／３２３Ｇ／４１１Ｉ／５６５Ｖから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２３２２を基準にして番号が付けられている。一部の追加の実施形態では、操作されたスクロースシンターゼのポリペプチド配列は、Ｔ３４Ｅ／Ｔ６５Ｃ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ、Ｔ３４Ｅ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ、Ｖ６２Ｉ／Ｔ６５Ｃ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｍ５６５Ｖ、Ｖ６２Ｉ／Ｔ６５Ｃ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ／Ｑ６３６Ｈ／Ｄ７３１Ｑ、Ｖ６２Ｉ／Ｔ６５Ｃ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ／Ｄ７３１Ｑ、Ｖ６２Ｉ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ、Ｖ６２Ｉ／Ａ３２３Ｇ／Ｎ４０６Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖ、およびＶ６２Ｉ／Ａ３２３Ｇ／Ｌ４１１Ｉ／Ｍ５６５Ｖから選択される少なくとも１つの変異または変異のセットを含み、これらの位置は、配列番号２３２２を基準にして番号が付けられている。
【００３８】
本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたスクロースシンターゼポリペプチドをコードする操作されたポリヌクレオチドも提供する。本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたスクロースシンターゼをコードする少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含むベクターをさらに提供する。一部の実施形態では、ベクターは、少なくとも１つの制御配列をさらに含む。本発明は、少なくとも１つのスクロースシンターゼをコードする少なくとも１つの操作されたポリヌクレオチドを含む宿主細胞も提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、少なくとも１つのスクロースシンターゼをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのベクターを含む。一部の実施形態（ｅｍｂｏｄｉｍｅｔｎｔｓ）では、宿主細胞は、真核生物および原核生物から選択される。本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたスクロースシンターゼ改変体を産生するための方法であって、本明細書で提供される宿主細胞を、操作されたスクロースシンターゼ改変体が宿主細胞により産生されるような条件下で培養するステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、方法は、操作されたスクロースシンターゼ改変体を回収するステップをさらに含む。本発明は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたスクロースシンターゼ改変体を含む組成物も提供する。
【００３９】
本発明は、基質のグリコシル化のための方法であって、少なくとも１つの基質、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、および基質とグリコシルトランスフェラーゼとを、基質がグリコシル化されて少なくとも１つのグリコシル化産物を産生するような条件下で接触させるステップを含む方法も提供する。一部の実施形態では、基質は、少なくとも１個のステビオールグリコシドを含む。一部の追加の実施形態では、グリコシル化産物は、少なくとも１つのモノグリコシル化および／またはポリグリコシル化産物を含む。
【００４０】
本発明は、レバウジオシドＭを産生するための方法であって、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＩ基質、ＮＤＰ−グルコース、ならびに本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、レバウジオシドＤおよびレバウジオシドＩ基質、ＮＤＰ−グルコース、ならびにグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＭが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む方法も提供する。
【００４１】
本発明は、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＮＤＰ−グルコース、および本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、ステビオシド基質、ＮＤＰ−グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む方法も提供する。
【００４２】
本発明は、レバウジオシドＤを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＮＤＰ−グルコース、および本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、ステビオシド基質、ＮＤＰ−グルコース、グリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＤが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む方法も提供する。
【００４３】
本明細書で提供される方法の一部の実施形態では、ＮＤＰ−グルコースは、ＡＤＰ−グルコース、ＣＤＰ−グルコース、ＴＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−グルコース、および／またはＩＤＴ−グルコースから選択される。一部のさらなる実施形態では、ＮＤＰ−グルコースは、ＵＤＰ−グルコースではない。
【００４４】
本発明は、レバウジオシドＭを産生するための方法であって、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＩ基質、ＡＤＰ−グルコース、ならびに本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＩ基質、ＡＤＰ−グルコース、ならびにグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＭが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む方法も提供する。
【００４５】
本発明は、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＡＤＰ−グルコース、および本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、ステビオシド基質、ＡＤＰ−グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む方法も提供する。
【００４６】
本発明は、レバウジオシドＤを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＡＤＰ−グルコース、および本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、ステビオシド基質、ＡＤＰ−グルコース、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＤが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む方法も提供する。
【００４７】
本発明は、レバウジオシドＭを産生するための方法であって、レバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＩ基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、ならびに本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、レバウジオシドＤ基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＭが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む方法も提供する。
【００４８】
本発明は、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、および本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＡおよび／またはレバウジオシドＩが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む方法も提供する。
【００４９】
本発明は、レバウジオシドＤを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、および本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＤが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む方法も提供する。
【００５０】
本発明は、レバウジオシドＭを産生するための方法であって、少なくとも１つのステビオシドを含むおよび／またはステビオシドとｒｅｂＡの混合物を含むステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、ならびに本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、スクロースシンターゼ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＭが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む方法も提供する。
【００５１】
本発明は、レバウジオシドＭを産生するための方法であって、ステビオシド基質、ＮＤＰ、スクロース、少なくとも１つのスクロースシンターゼ、および本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼを提供するステップ、ステビオシド基質、ＮＤＰ、およびグリコシルトランスフェラーゼを、レバウジオシドＡが先ず産生され、次いでレバウジオシドＤおよび／またはレバウジオシドＩが産生され、最後にレバウジオシドＭが産生されるような条件下で組み合わせるステップを含む方法も提供する。
【００５２】
本明細書で提供される方法の一部の実施形態では、スクロースシンターゼは、本明細書で提供される操作されたスクロースシンターゼである。本明細書で提供される方法の一部のさらなる実施形態では、方法は、ワンポット反応として行われる。一部の代替実施形態では、方法は、逐次的に行われる。さらに一部の追加の実施形態では、方法は、方法のステップを反復するステップをさらに含む。一部のさらなる実施形態では、スクロースは、反復されるステップを通して再利用される。一部の追加の実施形態では、操作されたグリコシルトランスフェラーゼおよび／または他の反応成分は、再利用される。さらに一部のさらなる実施形態では、ステビオシド基質は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａから抽出される。一部の追加の実施形態では、ステビオシド基質は、合成により産生される。さらに一部のさらなる実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼおよび／またはスクロースシンターゼは、固定化されている。一部のさらなる実施形態では、方法は、フルクトースを含む反応産物を産生する。さらに一部のさらなる実施形態では、フルクトースは、反応産物から除去される。一部の実施形態では、方法は、洗浄ステップをさらに含む。一部の追加の実施形態では、方法は、少なくとも１つのカラムクロマトグラフィーステップをさらに含む。方法のさらに一部の追加の実施形態では、少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、本明細書で提供されるグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼである。方法の一部の追加の実施形態では、少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、本明細書で提供されるグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼである。方法の一部の実施形態では、少なくとも１つの操作されたグリコシルトランスフェラーゼは、本明細書で提供されるグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼであり、本明細書で提供されるグリコシルトランスフェラーゼから選択されるベータ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼであることをさらに含む。一部の実施形態では、方法は、本明細書で提供される少なくとも１つの操作されたスクロースシンターゼをさらに含む。
【００５３】
本発明は、本明細書で提供される方法に従って産生される少なくとも１つのレバウジオシドも提供する。本発明は、本明細書で提供される方法に従って産生されるレバウジオシドを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、レバウジオシドＭは、本明細書で提供される方法に従って産生される。本発明は、本明細書で提供される方法に従って産生されるレバウジオシドＭを含む組成物も提供する。
【００５４】
一部の実施形態では、レバウジオシドＡは、本明細書で提供される方法に従って産生される。本発明は、本明細書で提供される方法に従って産生されるレバウジオシドＡを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、レバウジオシドＩは、本明細書で提供される方法に従って産生される。本発明は、本明細書で提供される方法に従って産生されるレバウジオシドＩを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、レバウジオシドＤは、本明細書で提供される方法に従って産生される。本発明は、本明細書で提供される方法に従って産生されるレバウジオシドＤを含む組成物も提供する。一部の実施形態では、レバウジオシドの混合物は、本明細書で提供される方法に従って産生される。本発明は、本明細書で提供される方法に従って産生されるレバウジオシドの混合物を含む組成物も提供する。一部の実施形態では、混合物は、本明細書で提供される方法に従って産生される少なくとも１つのレバウジオシドを含む少なくとも２つの組成物を含む。本発明は、本明細書で提供される少なくとも２つのレバウジオシドの混合物を含む組成物を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５５】
【図１】図１は、グリコシルトランスフェラーゼが、ヌクレオシドジホスホグルコース（ＮＤＰ−グルコース）、例えばＡＤＰ−グルコース、からのグルコシル基の、アクセプター、例えばＲ−ＯＨ（式中、Ｒは、任意のグリコシル、アルコキシ、カルボキシ、アミノカルボニル、ヘテロアルキル、ヘテロアルケニル、ヘテロアルキニル、カルボキシアルキル、アミノアルキル、ハロアルキル、アルキルチオアルキル、ヘテロシクロアルキル、ヘテロアリール、またはヘテロアリールアルキル基である）への転移を触媒する、酵素反応スキームを提供する図である。さらなる実施形態では、Ｒ−ＯＨは、ステビオシドまたはレバウジオシドＤであり、産物は、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、またはレバウジオシドＭである。ヌクレオシド二リン酸依存性シンターゼは、ＮＤＰ−グルコースを再生して副産物（例えば、フルクトース）を放出する、グルコースドナー（例えば、スクロース）からのグルコシル基のヌクレオシド二リン酸への転移を触媒する。
【００５６】
【図２】図２は、炭素に番号を付けたレバウジオシドＭの構造を提供する図である。
【００５７】
【図３】図３は、炭素に番号を付けたレバウジオシドＩの構造を提供する図である。
【発明を実施するための形態】
【００５８】
本発明は、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ（ＧＴ）酵素、ＧＴ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は、操作されたスクロースシンターゼ（ＳｕＳ）酵素、ＳｕＳ活性を有するポリペプチド、およびこれらの酵素をコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含むベクターおよび宿主細胞を提供する。本発明は、ＧＴ酵素を含む組成物、およびβ−グルコース結合を有する産物を作製するために操作されたＧＴ酵素を使用する方法を、さらに提供する。本発明は、レバウジオシド（例えば、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩおよびレバウジオシドＤ）の産生のための組成物および方法をさらに提供する。本発明は、ＳｕＳ酵素を含む組成物、およびそれらを使用する方法も提供する。ＧＴおよびＳｕＳ酵素を産生する方法も提供される。
【００５９】
別段の定義がない限り、本明細書で使用される全ての専門および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を一般に有する。一般に、本明細書で使用される命名法、ならびに下記の細胞培養、分子遺伝学、微生物学、有機化学、分析化学および核酸化学の実験手順は、当技術分野において周知かつ一般に利用されているものである。そのような技術は、周知であり、当業者に周知の非常に多くの教科書および参考文献に記載されている。標準的な技術またはそれらの改良形態が、化学合成および化学分析に使用される。本明細書において上記および下記両方で言及される全ての特許、特許出願、論文および刊行物は、これにより参照により本明細書に明確に組み込まれる。
【００６０】
本明細書に記載のものと同様または同等の任意の好適な方法および材料が本発明の実施の際に使用されるが、一部の方法および材料が本明細書に記載される。本発明が、記載される特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことは、これらの方法論、プロトコールおよび試薬はそれらが当業者によって使用される状況に依存して変わり得るので、理解されるはずである。したがって、直ぐ下で定義される用語は、本発明に総じて言及することによりさらに十分に説明される。
【００６１】
上述の概要および下記の詳細な説明の両方が、例示的かつ説明的なものに過ぎず、本発明を制限するものでないことを、理解されたい。本明細書で使用される節の見出しは、構成を目的としたものに過ぎず、記載される主題を限定するものと見なすべきでない。数値範囲は、範囲を規定する数を含む。したがって、本明細書で開示されるあらゆる数値範囲は、そのようなより広い数値範囲内に入るあらゆるより狭い数値範囲を、そのようなより狭い数値範囲が全て本明細書に明確に記載されているかのごとく包含するように意図されている。本明細書で開示されるあらゆる最大（または最小）数値限度は、あらゆる数値下（上）限を、そのような数値下（上）限が本明細書に明確に記載されているかのごとく含むことも、意図されている。
【００６２】
略号および定義
遺伝子コードされるアミノ酸について使用される略号は、従来通りであり、以下の通りである：アラニン（ＡｌａまたはＡ）、アルギニン（ＡｒｅまたはＲ）、アスパラギン（ＡｓｎまたはＮ）、アスパラギン酸（ＡｓｐまたはＤ）、システイン（ＣｙｓまたはＣ）、グルタミン酸（ＧｌｕまたはＥ）、グルタミン（ＧｌｎまたはＱ）、ヒスチジン（ＨｉｓまたはＨ）、イソロイシン（ＩｌｅまたはＩ）、ロイシン（ＬｅｕまたはＬ）、リシン（ＬｙｓまたはＫ）、メチオニン（ＭｅｔまたはＭ）、フェニルアラニン（ＰｈｅまたはＦ）、プロリン（ＰｒｏまたはＰ）、セリン（ＳｅｒまたはＳ）、トレオニン（ＴｈｒまたはＴ）、トリプトファン（ＴｒｐまたはＷ）、チロシン（ＴｙｒまたはＹ）、およびバリン（ＶａｌまたはＶ）。３文字略号が使用されるとき、特に、「Ｌ」もしくは「Ｄ」が先行する場合または略号が使用される文脈から明らかである場合を除き、アミノ酸は、α炭素（Ｃα）についてＬ立体配置であってもよく、またはＤ立体配置であってもよい。例えば、「Ａｌａ」は、α炭素についての立体配置の指定のないアラニンを示すが、「Ｄ−Ａｌａ」および「Ｌ−Ａｌａ」は、それぞれ、Ｄ−アラニンおよびＬ−アラニンを示す。１文字略号が使用されるとき、大文字は、α炭素についてＬ−立体配置のアミノ酸を示し、小文字は、α炭素についてＤ−立体配置のアミノ酸を示す。例えば「Ａ」は、Ｌ−アラニンを示し、「ａ」は、Ｄ−アラニンを示す。ポリペプチド配列が一連の１文字または３文字略号（またはその混合形）として提示されるとき、配列は、一般的な慣習に従ってアミノ（Ｎ）からカルボキシ（Ｃ）への方向で提示される。
【００６３】
遺伝子コードされるヌクレオシドについて使用される略号は、従来通りであり、次の通りである：アデノシン（Ａ）、グアノシン（Ｇ）、シチジン（Ｃ）、チミジン（Ｔ）、およびウリジン（Ｕ）。詳しい説明が特にない場合は、略記されたヌクレオシドは、リボヌクレオシドであることもあり、または２’−デオキシリボヌクレオシドであることもある。ヌクレオシドは、個別にまたは集合的に、リボヌクレオシドまたは２’−デオキシリボヌクレオシドのどちらかであると指定されることがある。核酸配列が、一連の１文字略号として提示されるとき、配列は、一般的な慣例に従って５’から３’方向に提示され、リン酸は示されない。
【００６４】
本発明に関して、本明細書での説明に使用される専門および科学用語は、別段の特別な定義がない限り、当業者によって一般に理解されている意味を有することとする。したがって、以下の用語は、以下の意味を有するように意図されている。
【００６５】
本明細書で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、別段の文脈による明確な指示がない限り、複数の言及対象を含む。したがって、例えば、「ポリペプチド（ａ  ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」は、１つより多くのポリペプチドを含む。
【００６６】
同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、置き換え可能であり、限定することを意図したものではない。したがって、本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」およびその同語源語は、それらの包括的な意味で使用される（すなわち、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」およびその対応する同語源語と同等である）。
【００６７】
様々な実施形態の説明が用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」を使用する場合、一部の具体的な事例では、実施形態が、その代わりに「から本質的になる」または「からなる」という言葉を使用して説明されることがあることは、当業者に理解されるであろう。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、特定の値についての許容される誤差を意味する。一部の事例では、「約」は、所与の値範囲の０．０５％、０．５％、１．０％または２．０％以内を意味する。一部の事例では、「約」は、所与の値の１標準偏差、２標準偏差、３標準偏差または４標準偏差以内を意味する。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「ＥＣ」番号は、国際生化学・分子生物学連合の命名法委員会（ｔｈｅ  Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）（ＮＣ−ＩＵＢＭＢ）の酵素命名法をいう。ＩＵＢＭＢ生化学分類は、酵素についての、それらが触媒する化学反応に基づく、数値分類体系である。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「ＡＴＣＣ」は、米国培養細胞系統保存機関（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）を指し、そのバイオレポジトリーコレクションは、遺伝子および株を含む。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「ＮＣＢＩ」は、米国国立生物学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）およびそこで提供されている配列データベースを指す。
【００７２】
「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」は、長さや翻訳後修飾（例えば、グリコシル化またはリン酸化）を問わず、アミド結合により共有結合で連結されている少なくとも２個のアミノ酸のポリマーを示すために、本明細書では同義的に使用される。この定義には、Ｄ−アミノ酸、Ｌ−アミノ酸、Ｄ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の混合物、Ｄ−アミノ酸を含むポリマー、Ｌ−アミノ酸を含むポリマー、およびＤ−アミノ酸とＬ−アミノ酸の混合物を含むポリマーが含まれる。
【００７３】
「アミノ酸」は、本明細書では、それらの一般に公知の３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ生化学命名法委員会により推奨される１文字記号のどちらかによって言及される。ヌクレオチドは、同様に、それらの一般に受け入れられている１文字コードによって言及され得る。
【００７４】
本明細書で使用される場合、「ポリヌクレオチド」および「核酸」は、共有結合で互いに連結されている２つまたはそれより多くのヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、完全にリボヌクレオチド（すなわち、ＲＮＡ）から構成されることもあり、完全に２’デオキシリボヌクレオチド（すなわち、ＤＮＡ）から構成されることもあり、またはリボヌクレオチドと２’デオキシリボヌクレオチドの混合物から構成されることもある。ヌクレオシドは、典型的には、標準的なホスホジエステル連結によって互いに連結されているが、ポリヌクレオチドは、１つまたは複数の非標準的連結を含むこともある。ポリヌクレオチドは、一本鎖状もしくは二本鎖状であることもあり、または一本鎖領域と二本鎖領域両方を含むこともある。さらに、ポリヌクレオチドは、典型的には、天然に存在するコード核酸塩基（すなわち、アデニン、グアニン、ウラシル、チミンおよびシトシン）で構成されているが、例えばイノシン、キサンチン、ヒポキサンチンなどのような、１つまたは複数の修飾および／または合成核酸塩基を含むこともある。一部の実施形態では、そのような修飾または合成核酸塩基は、アミノ酸配列をコードする核酸塩基である。
【００７５】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド」は、核酸塩基（すなわち、窒素含有塩基）と５炭糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）とを含むグリコシルアミンを指す。ヌクレオシドの非限定的な例としては、シチジン、ウリジン、アデノシン、グアノシン、チミジンおよびイノシンが挙げられる。対照的に、用語「ヌクレオチド」は、核酸塩基と５炭糖と１つまたは複数のリン酸基とを含むグリコシルアミンを指す。一部の実施形態では、ヌクレオシドをキナーゼによりリン酸化してヌクレオチドを生じさせることができる。
【００７６】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオシド二リン酸」は、核酸塩基（すなわち、窒素含有塩基）と５炭糖（例えば、リボースまたはデオキシリボース）と二リン酸（すなわち、ピロリン酸）部分とを含むグリコシルアミンを指す。本明細書における一部の実施形態では、「ヌクレオシド二リン酸」は、「ＮＤＰ」と略記される。ヌクレオシド二リン酸の非限定的な例としては、シチジン二リン酸（ＣＤＰ）、ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）、アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）、グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）、チミジン二リン酸（ＴＤＰ）、およびイノシン二リン酸が挙げられる。用語「ヌクレオシド」および「ヌクレオチド」は、一部の文脈では同義的に使用されることもある。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「コード配列」は、タンパク質のアミノ酸配列をコードする核酸（例えば、遺伝子）のその部分を指す。
【００７８】
本明細書で使用される場合、用語「生体触媒作用」、「生体触媒（の）」、「生体内変換」および「生合成」は、有機化合物に対する化学反応を行うための酵素の使用を指す。
【００７９】
本明細書で使用される場合、「グリコシルトランスフェラーゼ」（ＧＴ）は、活性化された糖ドナーからグリコシル残基を単量体および多量体アクセプター分子に転移する酵素能力があるポリペプチドを指す。一部の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、「グリコシルトランスフェラーゼ改変体」または「グリコシルトランスフェラーゼ組合せ改変体」と呼ばれる。一部の実施形態では、「グリコシルトランスフェラーゼ」は、ＵＤＰを放出してアクセプターβ−Ｄ−グルクロノシドを形成する、ＵＤＰ−α−Ｄ−グルクロン酸からのグルコース（ＵＤＰ−グルコースとしても公知）のアクセプターへの転移を触媒する、分類ＥＣ２．４．１．１７のＵＤＰ−グルクロノシルトランスフェラーゼ酵素を指す。糖質関連酵素データベース（ＣＡＺｙ）は、グリコシルトランスフェラーゼファミリーの継続的に更新されているリストを提供している。一部の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼは、これらに限定されないが、ＧＴ１ファミリーに分類される酵素を含む。一部の好ましい実施形態では、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ改変体は、ＡＤＰ−グルコースを優先的に利用する。一部の追加の実施形態では、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ酵素は、ＵＤＰ−グルコースを利用しない。一部のさらなる実施形態では、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ改変体は、ＡＤＰ−グルコース、ＣＤＰ−グルコース、ＴＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−グルコースおよび／またはＩＤＴ−グルコースを利用するが、ＵＤＰ−グルコースを利用しない。したがって、一部の好ましい実施形態では、本発明は、ＡＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ；ＡＧＴ）、ＣＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ；ＣＧＴ）、ＧＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ；ＧＧＴ）、ＴＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＴＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ；ＴＧＴ）、およびＩＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＩＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ；ＩＧＴ）を提供する。
【００８０】
本明細書で使用される場合、「ＮＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ」（ＮＤＰ−ＧＴ）は、ＮＤＰである活性化された糖ドナーからグリコシル残基を単量体および多量体アクセプター分子に転移する酵素能力があるポリペプチドを指す。一部の実施形態では、ＮＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼは、一般に、「グリコシルトランスフェラーゼ」と呼ばれる。実際、本明細書で使用される場合の用語「グリコシルトランスフェラーゼ」は、ＡＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ；ＡＧＴ）、ＣＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＣＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ；ＣＧＴ）、ＧＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＧＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ；ＧＧＴ）、ＴＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＴＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ；ＴＧＴ）、およびＩＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ（ＩＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ；ＩＧＴ）を含むがこれらに限定されない、ＮＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼを包含する。一部の実施形態では、本発明のグリコシルトランスフェラーゼ酵素は、ＡＤＰ−グルコース、ＣＤＰ−グルコース、ＴＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−グルコースおよび／またはＩＤＴ−グルコースを利用するが、ＵＤＰ−グルコースを利用しない。一部の追加の実施形態では、これらの酵素は、「改変体」または「組合せ改変体」（例えば、ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体）と呼ばれる。
【００８１】
本明細書で使用される場合、「トランスグリコシル化」は、グリコシル残基が二糖、三糖またはオリゴ糖ドナーから非グリコシル化またはグリコシル化ドナー分子に転移される反応を指す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「トランスグルコシル化」は、転移されるグリコシル残基がグルコースであり、二糖、三糖またはオリゴ糖ドナーがグルコースを含有する、トランスグリコシル化反応を指す。
【００８３】
本明細書で使用される場合、「グリコシル化」は、グリコシル残基とアクセプター分子との間のグリコシド結合の形成を指す。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「グルコシル化」は、グルコース残基とアクセプター分子との間のグリコシド結合の形成を指す。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「グリコシル」は、環状型の単糖、低級オリゴ糖またはオリゴ糖誘導体からヘミアセタールヒドロキシル基を除去することにより得られる一価フリーラジカルまたは置換基構造である有機基を指す。グリコシル基は、無機酸（例えば、リン酸）と反応してエステル（例えば、グルコース１−リン酸）を形成する。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「グリコシド」は、炭水化物（例えば、糖）がグリコシド結合により別の官能基に結合されている分子を指す。グリコシドを加水分解して、糖および非糖（すなわち、アグリコン）成分を生じさせることができる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、用語「ステビオールグリコシド」は、天然に存在するステビオールグリコシド（例えば、ステビオシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＭ（レバウジオシドＸとも呼ばれる）、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ）、および合成ステビオールグリコシド（例えば、酵素によってグルコシル化されたステビオールグリコシド）、ならびにこれらの組合せを含むがそれらに限定されない、ステビオールのグリコシドを指す。ステビオールおよびそのグリコシドの化学構造は、下にある（ＷＯ２０１３／１７６７３８を参照されたい）。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「ステビオシド基質」は、少なくとも１つのステビオールグリコシドを含む任意の好適な物質を指す。
【表Ａ−１】
2021532757.tif 000003
【表Ａ−２】
2021532757.tif 000004
【００８９】
本明細書で使用される場合、「スクロースシンターゼ」は、ＮＤＰおよびスクロースへのＮＤＰ−グルコース＋Ｄ−フルクトースの化学反応を可逆的に触媒するグリコシルトランスフェラーゼ酵素（ＥＣ２．４．１．１．１３）を指す。一部の実施形態では、本発明は、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓスクロースシンターゼ（「ＡｃＳｕＳ」）の改変体を提供する。一部の実施形態では、これらの酵素は、「スクロースシンターゼ改変体」、「ＳｕＳ」、「ＳＵＳ」、「ＳｕＳ改変体」、「ＳＵＳ改変体」、「スクロースシンターゼ組合せ改変体」、または「ＳｕＳ組合せ改変体」、または「ＳＵＳ組合せ改変体」と呼ばれる。一部の実施形態では、これらの改変体は、ウリジン以外のＮＤＰを優先的に利用する（すなわち、ＵＤＰ−グルコースではなく、ＡＤＰ−グルコース、ＣＤＰ−グルコース、ＴＤＰ−グルコース、ＧＤＰ−グルコースおよび／またはＩＤＰ−グルコースが、利用される）。一部の実施形態では、これらの改変体は、ＵＤＰ−グルコースを利用しない。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「ワンポット反応」は、１つの反応容器内での目的のレバウジオシドの産生を指す。一部の実施形態では、この用語は、ｒｅｂＡおよび／またはステビオシドを含むがこれらに限定されない出発物質からのｒｅｂＭの、他のレバウジオシド（例えば、ｒｅｂＤおよび／またはｒｅｂＩ）の中間体産生を伴う、産生に関して使用される。一部の実施形態では、ステビオシドのＲｅｂＡへの変換、ＲｅｂＡからＲｅｂＤおよび／またはＲｅｂＩへの変換、ならびにＲｅｂＤおよび／またはＲｅｂＩからＲｅｂＭへの変換が、１つの反応容器内で複数の酵素カスケードとして行われる。
【００９１】
本明細書で使用される場合、「野生型」および「天然に存在する」は、自然界に見られる形態を指す。例えば、野生型ポリペプチドまたはポリヌクレオチド配列は、生物に存在する配列であって、自然界の供給源から単離することができ、ヒトによる操作によって意図的に修飾されていない、配列である。
【００９２】
本明細書で使用される場合、細胞、核酸またはポリペプチドに関して使用されるときの「組換え」、「操作された」、および「天然に存在しない」は、そうしなければ自然界に存在しない様式で修飾されている物質またはこの物質の天然もしくはネイティブ形態に対応する物質を指す。一部の実施形態では、細胞、核酸またはポリペプチドは、天然に存在する細胞、核酸またはポリペプチドと同一であるが、合成物質からおよび／または組換え技術を使用する操作により産生または誘導される。非限定的な例としては、数ある中でも特に、ネイティブ（非組換え）形態の細胞内に見られない遺伝子を発現する、またはそうしなければ異なるレベルで発現されるネイティブ遺伝子を発現する、組換え細胞が挙げられる。
【００９３】
用語「配列同一性パーセント（％）」は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の比較を指すために本明細書で使用され、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインメントされた配列を比較することにより決定され、比較ウィンドウ内のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の部分は、これら２つの配列の最適なアラインメントのために参照配列と比較して付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含むことがある。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列に出現する位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性パーセンテージを得ることによって計算することができる。あるいは、パーセンテージは、同一の核酸塩基もしくはアミノ酸残基のいずれかが両方の配列に出現する位置の数または核酸塩基もしくはアミノ酸残基がギャップを用いてアラインメントされる位置の数を決定してマッチした位置の数を得、マッチした位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて配列同一性パーセンテージを得ることによって計算することができる。２配列のアラインメントに利用可能な多数の確立されたアルゴリズムがあることは、当業者には理解される。比較のための配列の最適なアラインメントは、当技術分野において公知であるように、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの局所相同性アルゴリズム（Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，  Ａｄｖ．  Ａｐｐｌ．  Ｍａｔｈ．，  ２：４８２  ［１９８１］）を含むがこれに限定されない、任意の好適な方法により、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの相同性アラインメントアルゴリズム（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ４８：４４３  ［１９７０］）により、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの類似性検索方法（Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８５：２４４４  ［１９８８］）により、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実行（例えば、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ＰａｃｋａｇｅのＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡ）により、または目視検査により、行うことができる。配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントの決定に好適であるアルゴリズムの例としては、これらに限定されないが、Ａｌｔｓｃｈｕｌらによって記載されているＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ  ２．０アルゴリズムが挙げられる（それぞれ、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ２１５：  ４０３−４１０  ［１９９０］；およびＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ３３８９−３４０２  ［１９７７］を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のウェブサイトを通して公的に入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントしたときにマッチするか何らか正の値の閾スコアＴを満たす、���い合わせ配列中の長さＷの短いワードを特定することによって、高スコアの配列対（ＨＳＰ）を先ず特定することを含む。Ｔは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．、上掲を参照されたい）。これらの最初の隣接ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための検索を開始するためのシードとしての役割を果す。次いで、ワードヒットが、累積アラインメントスコアを増加することができる限り、各配列に沿って両方向に拡大される。累積スコアは、ヌクレオチド配列についてはパラメーターＭ（マッチする残基対についての報酬スコア、常に＞０）およびＮ（ミスマッチの残基についてのペナルティスコア、常に＜０）を使用して計算される。アミノ酸配列については、累積スコアを計算するためにスコア行列が使用される。各方向のワードヒットの拡大は、累積アラインメントスコアがその最大達成値から量Ｘだけ低下すると、停止され；累積スコアが、１つもしくは複数の負のスコアの残基アラインメントの累積に起因してゼロもしくはそれ未満になると、停止され；またはどちらかの配列の末端に達すると停止される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、ＴおよびＸは、アラインメントの感度および速度を決定する。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列について）は、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）１１、期待値（Ｅ）１０、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列についてのＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、ワード長（Ｗ）３、期待値（Ｅ）１０、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列を使用する（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：１０９１５  ［１９８９］を参照されたい）。配列アラインメントおよび配列同一性％の例示的決定は、提供されているデフォルトパラメーターを使用して、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｐａｃｋａｇｅ（Ａｃｃｅｌｒｙｓ、Ｍａｄｉｓｏｎ  ＷＩ）のＢＥＳＴＦＩＴまたはＧＡＰプログラムを利用することができる。
【００９４】
本明細書で使用される場合、「参照配列」は、配列および／または活性比較の基準として使用される定義された配列を指す。参照配列は、より大きい配列のサブセット、例えば、完全長遺伝子またはポリペプチド配列のセグメントであることもある。一般に、参照配列は、核酸またはポリペプチドの長さ少なくとも２０ヌクレオチドまたはアミノ酸残基、長さ少なくとも２５残基、長さ少なくとも５０残基、長さ少なくとも１００残基または完全長である。２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、各々、（１）２配列間で類似している配列（すなわち、完全配列の一部分）を含むことがあり、かつ（２）２配列間で相違する配列をさらに含むことがあるので、２つの（またはそれより多くの）ポリヌクレオチドまたはポリペプチド間の配列比較は、配列類似性の局所領域を同定し、比較するために、「比較ウィンドウ」にわたって２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドの配列を比較することによって典型的に行われる。一部の実施形態では、「参照配列」は、一次アミノ酸配列に基づくことがあり、この場合、参照配列は、一次配列の１つまたは複数の変化を有し得る配列である。
【００９５】
本明細書で使用される場合、「比較ウィンドウ」は、少なくとも約２０の連続するヌクレオチド位置またはアミノ酸残基の概念上のセグメントであって、少なくとも２０個の連続するヌクレオチドまたはアミノ酸の参照配列と配列を比較することができ、比較ウィンドウ内のその配列の部分が、２配列の最適なアラインメントのために参照配列（付加も欠失も含まない）と比較して２０パーセントまたはそれ未満の付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含み得る、セグメントを指す。比較ウィンドウは、２０個の連続する残基より長いこともあり、必要に応じて３０、４０、５０、１００またはそれより長いウィンドウを含む。
【００９６】
本明細書で使用される場合、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列の番号付けの文脈で使用されるときの「〜に対応する」、「〜に対して」および「〜と比較して」は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列が参照配列と比較されるときの指定参照配列の残基の番号付けを指す。言い換えると、所与のポリマーの残基番号または残基位置は、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列内の残基の実際の番号の位置によるのではなく、参照配列に対して示される。例えば、所与のアミノ酸配列、例えば、操作されたグリコシルトランスフェラーゼのアミノ酸配列は、２配列間の残基マッチを最適化するためにギャップを導入することによって参照配列とアラインメントすることができる。これらの場合、ギャップが存在するが、所与のアミノ酸またはポリヌクレオチド配列中の残基の番号付けは、それがアラインメントされた参照配列に対して行われる。
【００９７】
本明細書で使用される場合、「実質的同一性」は、少なくとも２０残基位置の比較ウィンドウにわたって、多くの場合、少なくとも３０〜５０残基のウィンドウにわたって、参照配列と比較して少なくとも８０パーセントの配列同一性、少なくとも８５パーセントの同一性、少なくとも８９〜９５パーセントの間の配列同一性、またはより通常は少なくとも９９パーセントの配列同一性を有する、ポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列を指し、この配列同一性パーセンテージは、合計で参照配列の２０パーセントまたはそれ未満となる欠失または付加を含む配列と参照配列を比較ウィンドウにわたって比較することによって計算される。ポリペプチドに適用される一部の具体的な実施形態では、用語「実質的同一性」は、２つのポリペプチド配列が、最適にアラインメントされたとき、例えば、デフォルトギャップ重みを使用してプログラムＧＡＰまたはＢＥＳＴＦＩＴにより最適にアラインメントされたとき、少なくとも８０パーセントの配列同一性、好ましくは、少なくとも８９パーセントの配列同一性、少なくとも９５パーセントの配列同一性またはそれより高い配列同一性（例えば、９９パーセントの配列同一性）を共有することを意味する。一部の実施形態では、比較される配列中の同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換が異なる。
【００９８】
本明細書で使用される場合、「アミノ酸相違」および「残基相違」は、参照配列中の対応する位置におけるアミノ酸残基と比較した、ポリペプチド配列の位置におけるアミノ酸残基の相違を指す。一部の場合には、参照配列は、ヒスチジンタグを有するが、番号付けは、ヒスチジンタグのない同等の参照配列と比較して維持される。アミノ酸相違の位置は、本明細書では一般に「Ｘｎ」と呼ばれ、この場合のｎは、残基相違の基準となる参照配列中の対応する位置を指す。例えば、「配列番号４と比較してＸ９３位における残基相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチド位置におけるアミノ酸残基の相違を指す。したがって、配列番号４の参照ポリペプチドが９３位にセリンを有する場合には、「配列番号４と比較してＸ９３位における残基相違」は、配列番号４の９３位に対応するポリペプチドの位置におけるセリン以外の任意の残基のアミノ酸置換。本明細書におけるほとんどの事例では、ある位置における特定のアミノ酸残基相違は、「ＸｎＹ」として示され、この場合、「Ｘｎ」は、上記の通り対応する位置を指定し、「Ｙ」は、操作されたポリペプチドに見られるアミノ酸（すなわち、参照ポリペプチド中のものとは異なる残基）の１文字識別子である。一部の事例では（例えば、実施例で提示される表において）、本発明は、従来表記「ＡｎＢ」により示される特定のアミノ酸相違も提供し、この場合、Ａは、参照配列中の残基の１文字識別子であり、「ｎ」は、参照配列中の残基位置の番号であり、Ｂは、操作されたポリペプチドの配列中の残基置換の１文字識別子である。一部の事例では、本発明のポリペプチドは、参照配列と比較して１つまたは複数のアミノ酸残基相違を含み、これは、参照配列と比較して残基相違が存在する特定の位置のリストにより示される。一部の実施形態では、１個より多くのアミノ酸をポリペプチドの特定の残基位置に使用することができる場合、使用することができる様々なアミノ酸残基は、「／」によって隔てられている（例えば、Ｘ３０７Ｈ／Ｘ３０７ＰまたはＸ３０７Ｈ／Ｐ）。スラッシュは、所与の改変体内の複数の置換（すなわち、１つより多くの置換が所与の配列に、例えば組合せ改変体に、存在すること）を示すためにも使用され得る。一部の実施形態では、本発明は、保存的または非保存的アミノ酸置換を含む１つまたは複数のアミノ酸相違を含む操作されたポリペプチド配列を含む。一部の追加の実施形態では、本発明は、保存的アミノ酸置換と非保存的アミノ酸置換の両方を含む操作されたポリペプチド配列を提供する。
【００９９】
本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、類似の側鎖を有する異なる残基での残基の置換を指し、したがって、アミノ酸の同じまたは類似の定義されたクラス内のアミノ酸でのポリペプチド中のアミノ酸の置換を典型的には含む。例として、限定ではなく、一部の実施形態では、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸（例えば、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシン）で置換され；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、セリンおよびトレオニン）で置換され；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファンおよびヒスチジン）で置換され；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖（ｂａｓｉｓ  ｓｉｄｅ  ｃｈａｉｎ）を有する別のアミノ酸（例えば、リシンおよびアルギニン）で置換され；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）で置換され；および／または疎水性もしくは親水性アミノ酸は、それぞれ、別の疎水性もしくは親水性アミノ酸で置き換えられる。
【０１００】
本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、有意に異なる側鎖特性を有するアミノ酸でのポリペプチド中のアミノ酸の置換を指す。非保存的置換は、定義された群内ではなく定義された群間のアミノ酸を使用することがあり、（ａ）置換（例えば、プロリンでのグリシンの置換）の領域内のペプチド骨格の構造、（ｂ）電荷もしくは疎水性、または（ｃ）側鎖の嵩に影響を与える。例として、限定ではなく、例示的非保存的置換は、塩基性または脂肪族アミノ酸で置換された酸性アミノ酸；小さいアミノ酸で置換された芳香族アミノ酸；および疎水性アミノ酸で置換された親水性アミノ酸であり得る。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、「欠失」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の除去によるポリペプチドの修飾を指す。欠失は、操作されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素の酵素活性を保持しながら、および／または改善された特性を保持しながら、参照酵素を構成する１個もしくはそれより多くのアミノ酸、２個もしくはそれより多くのアミノ酸、５個もしくはそれより多くのアミノ酸、１０個もしくはそれより多くのアミノ酸、１５個もしくはそれより多くのアミノ酸、または２０個もしくはそれより多くのアミノ酸、アミノ酸の総数の最大１０％、またはアミノ酸の総数の最大２０％の除去を含むことができる。欠失は、ポリペプチドの内部部分および／または末端部分に関することがある。様々な実施形態では、欠失は、連続するセグメントを含むこともあり、または不連続であることもある。欠失は、典型的には、アミノ酸配列の中で「−」によって示される。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「挿入」は、参照ポリペプチドからの１個または複数のアミノ酸の付加によるポリペプチドの修飾を指す。挿入は、ポリペプチドの内部部分におけるものであることもあり、またはカルボキシもしくはアミノ末端へのものであることもある。本明細書で使用される場合の挿入は、当技術分野において公知であるような融合タンパク質を含む。挿入は、天然に存在するポリペプチド中のアミノ酸の連続したセグメントであることもあり、またはアミノ酸の１個もしくは複数によって隔てられていることもある。
【０１０３】
「機能的断片」および「生物活性断片」は、アミノ末端および／もしくはカルボキシ末端欠失ならびに／または内部欠失を有するが、残りのアミノ酸配列は、それが比較される配列（例えば、本発明の完全長操作されたグリコシルトランスフェラーゼ）中の対応する位置と同一である、ポリペプチドであって、完全長ポリペプチドの活性の実質的に全てを保持するポリペプチドを指すために、本明細書では同義的に使用される。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「単離されたポリペプチド」は、天然にそれに付随する他の夾雑物（例えば、タンパク質、脂質およびポリヌクレオチド）から実質的に分離されているポリペプチドを指す。この用語は、それらの天然に存在する環境または発現系から除去または精製された（例えば、宿主細胞内のまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏ合成による）ポリペプチドを包含する。組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、細胞内に存在することもあり、細胞培地に存在することもあり、または溶解物もしくは単離された調製物などの様々な形態で調製されることもある。したがって、一部の実施形態では、組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、単離されたポリペプチドであることがある。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「実質的に純粋なポリペプチド」または「精製されたタンパク質」は、ポリペプチド種が、存在する優勢種である（すなわち、モル濃度または重量ベースで、それが組成物中のいずれの他の個々の高分子種より存在量が多い）組成物を指し、一般に、目的種が、存在する高分子種のモルまたは重量％で少なくとも約５０パーセントを構成する場合には実質的に精製された組成物である。しかし、一部の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼを含む組成物は、５０％未満純粋（例えば、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、または約５０％）であるグリコシルトランスフェラーゼを含む。一般に、実質的に純粋なグリコシルトランスフェラーゼ組成物は、組成物中に存在する全高分子種のモルまたは重量％で約６０％またはそれより高い％、約７０％またはそれより高い％、約８０％またはそれより高い％、約９０％またはそれより高い％、約９５％またはそれより高い％、および約９８％またはそれより高い％を構成する。一部の実施形態では、目的種は、組成物が単一の高分子種から本質的になる本質的均質まで精製される（すなわち、従来の検出法により夾雑種を組成物中で検出することができない）。溶媒種、小分子（＜５００ダルトン）、および元素イオン種は、高分子種と見なされない。一部の実施形態では、単離された組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドは、実質的に純粋なポリペプチド組成物である。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「改善された酵素特性」は、酵素の少なくとも１つの改善された特性を指す。一部の実施形態では、本発明は、参照グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよび／または野生型グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドおよび／または別の操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドと比較して任意の酵素特性の改善を示す、操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを提供する。したがって、「改善」のレベルは、野生型はもちろん操作されたグリコシルトランスフェラーゼも含む、様々なグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド間で、決定および比較され得る。改善された特性は、これらに限定されないが、タンパク質発現の増加、熱活性の増加、熱安定性の増大、ｐＨ活性の増加、安定性の増大、酵素活性の増加、基質特異性のまたは親和性の増大、比活性の増加、基質または最終産物阻害に対する耐性の増大、化学的安定性の増大、化学選択性の改善、溶媒安定性の改善、酸性ｐＨに対する耐性の増大、タンパク質分解活性に対する耐性の増大（すなわち、タンパク質分解に対する感受性の低下）、凝集の低減、溶解度の増加、および温度プロファイルの変更のような特性を含む。追加の実施形態では、この用語は、スクロースシンターゼ酵素の少なくとも１つの改善された特性に関して使用される。一部の実施形態では、本発明は、参照スクロースシンターゼポリペプチドおよび／または野生型スクロースシンターゼポリペプチドおよび／または別の操作されたスクロースシンターゼポリペプチドと比較して任意の酵素特性の改善を示す、操作されたスクロースシンターゼポリペプチドを提供する。したがって、「改善」のレベルは、野生型はもちろん操作されたスクロースシンターゼも含む、様々なスクロースシンターゼポリペプチド間で、決定および比較され得る。
【０１０７】
本明細書で使用される場合、「酵素活性の増加」および「触媒活性の増強」は、参照酵素と比較して比活性（例えば、産生される産物／時間／タンパク質重量）の増加または基質の産物への変換パーセント（例えば、指定量の酵素を使用する指定期間内の出発量の基質の産物への変換パーセント）の上昇によって表され得る、操作されたポリペプチドの改善された特性を指す。一部の実施形態では、これらの用語は、参照グリコシルトランスフェラーゼ酵素と比較して比活性（例えば、産生される産物／時間／タンパク質重量）の増加または基質の産物への変換パーセント（例えば、指定量のグリコシルトランスフェラーゼを使用する指定期間内の出発量の基質の産物への変換パーセント）の上昇によって表され得る、本明細書で提供される操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの改善された特性を指す。一部の実施形態では、これらの用語は、本明細書で提供される改善されたスクロースシンターゼ酵素に関して使用される。本発明の操作されたグリコシルトランスフェラーゼおよびスクロースシンターゼの酵素活性を決定するための例示的方法は、実施例で提供される。Ｋｍ、Ｖｍａｘまたはｋｃａｔ（これらの変化は酵素活性の増加につながり得る）の古典的酵素特性を含む、酵素活性に関係する任意の特性が、影響を受け得る。例えば、酵素活性の改善は、対応する野生型酵素の酵素活性の約１．１倍から、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが誘導された天然に存在するグリコシルトランスフェラーゼまたは別の操作されたグリコシルトランスフェラーゼの２倍、５倍、１０倍、２０倍、２５倍、５０倍、７５倍、１００倍、１５０倍、２００倍ほどものまたはそれよりも高い酵素活性までであり得る。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、「変換」は、基質の対応する産物への酵素的変換（または生体内変換）を指す。「変換パーセント」は、指定条件下で期間内に産物に変換される基質のパーセントを指す。したがって、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの「酵素活性」または「活性」は、特定の期間内の産物への基質の「変換パーセント」として表すことができる。
【０１０９】
「ゼネラリスト（ｇｅｎｅｒａｌｉｓｔ）特性」を有する酵素（または「ゼネラリスト酵素」）は、親配列と比較して、広範な基質に対して改善された活性を示す酵素を指す。ゼネラリスト酵素は、あらゆる可能な基質に対して改善された活性を必ずしも実証しない。一部の実施形態では、本発明は、広範な立体的および電子的に多様な基質に対して親遺伝子と比較して同様のまたは改善された活性を示すことからゼネラリスト特性を有する、グリコシルトランスフェラーゼ改変体を提供する。加えて、本明細書で提供されるゼネラリスト酵素は、代謝物／産物の産生を増加させるために広範な多様な分子にわたって改善されるように操作された。
【０１１０】
用語「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、核酸ハイブリッドが安定している条件を指すために本明細書では使用される。当業者には公知であるように、ハイブリッドの安定性は、ハイブリッドの融解温度（Ｔｍ）に反映される。一般に、ハイブリッドの安定性は、イオン強度、温度、Ｇ／Ｃ含量、およびカオトロピック剤の存在の関数である。ポリヌクレオチドのＴｍ値は、融解温度を予測するための公知の方法を使用して計算することができる（例えば、Ｂａｌｄｉｎｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  １６８：７６１−７７７  ［１９８９］；Ｂｏｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ４８：１３９０  ［１９６２］；Ｂｒｅｓｓｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：８８９３−８８９７  ［１９８６］；Ｆｒｅｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８３：９３７３−９３７７  ［１９８６］；Ｋｉｅｒｚｅｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５：７８４０−７８４６  ［１９８６］；Ｒｙｃｈｌｉｋ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １８：６４０９−６４１２  ［１９９０］（誤植、Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  １９：６９８  ［１９９１］）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．、上掲；Ｓｕｇｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，  １９８１，  ｉｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｕｓｉｎｇ  Ｐｕｒｉｆｉｅｄ  Ｇｅｎｅｓ，  Ｂｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．［ｅｄｓ．］，  ｐｐ．  ６８３−６９３，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，  ＭＡ  ［１９８１］；およびＷｅｔｍｕｒ，  Ｃｒｉｔ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６：２２７−２５９  ［１９９１］を参照されたい）。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で開示されるポリペプチドをコードし、中等度にストリンジェントまたは高度にストリンジェントな条件などの定義された条件下で、本発明の操作されたグリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードする配列の相補配列とハイブリダイズする。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーションストリンジェンシー」は、核酸のハイブリダイゼーションの際の、洗浄条件などの、ハイブリダイゼーション条件を指す。一般に、ハイブリダイゼーション反応は、より低度のストリンジェンシーの条件下で行われ、これに様々な、しかしより高度な、ストリンジェンシーの洗浄が続く。用語「中等度にストリンジェントなハイブリダイゼーション」は、標的ＤＮＡが、標的ＤＮＡに対して約６０％の同一性、好ましくは、約７５％の同一性、約８５％の同一性とともに標的ポリヌクレオチドに対して約９０％より高い同一性を有する相補的核酸に結合することを可能にする条件を指す。例示的な中等度にストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃でのハイブリダイゼーション、続いて０．２×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳ中、４２℃での洗浄に相当する条件である。「高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション」は、定義されたポリヌクレオチド配列についての溶液条件下で決定された熱融解温度Ｔｍから約１０℃またはそれ未満である条件を一般に指す。一部の実施形態では、高ストリンジェンシー条件は、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で安定したハイブリッドを形成する核酸配列のみのハイブリダイゼーションを可能にする条件を指す（すなわち、ハイブリッドが、０．０１８Ｍ  ＮａＣｌ中、６５℃で、安定しない場合、それは、本明細書で企図されるような高ストリンジェンシー条件下で安定しないことになる）。高ストリンジェンシー条件は、例えば、０．１×ＳＳＰＥ、および０．１％ＳＤＳ中、６５℃での洗浄が続く、４２℃で５０％ホルムアミド、５×デンハート液、５×ＳＳＰＥ、０．２％ＳＤＳに相当する条件でのハイブリダイゼーションによって、提供され得る。別の高ストリンジェンシー条件は、０．１％（ｗ／ｖ）ＳＤＳを含有する５×ＳＳＣ中、６５℃でのハイブリダイゼーションおよび０．１％ＳＤＳを含有する０．１×ＳＳＣ中、６５℃での洗浄に相当する条件でのハイブリダイゼーションである。他の高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件、および中等度にストリンジェントな条件は、上記の参考文献に記載されている。
【０１１２】
本明細書で使用される場合、「コドン最適化された」は、コードされたタンパク質が目的の生物において効率的に発現されるような、タンパク質をコードするポリヌクレオチドのコドンの、その特定の生物において優先的に使用されるコドンへの変化を指す。遺伝コードは、大部分のアミノ酸が、「シノニム」または「同義」コドンと呼ばれるいくつかのコドンによって表されることから縮重しているが、特定の生物によるコドン使用頻度がランダムでなく、特定のコドントリプレットに偏っていることは、周知である。このコドン使用頻度の偏りは、所与の遺伝子、共通の機能または祖先起源の遺伝子、低コピー数タンパク質に対して高度に発現されるタンパク質、および生物のゲノムの凝集タンパク質コード領域に関して、より高度であり得る。一部の実施形態では、グリコシルトランスフェラーゼ酵素をコードするポリヌクレオチドは、発現に選択された宿主生物における最適な産生のためにコドン最適化され得る。
【０１１３】
本明細書で使用される場合、単独でまたは組み合わせて使用されるときの、「好ましい」コドン、「最適な」コドンおよび「高度のコドン使用頻度の偏り」コドンは、同義語として、同じアミノ酸をコードする他のコドンより高頻度でタンパク質コード領域において使用されるコドンを指す。好ましいコドンは、単一の遺伝子、共通の機能または起源の遺伝子のセット、高度に発現される遺伝子におけるコドン使用頻度に関して決定されることもあり、生物全体の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度に関して決定されることもあり、関連生物の凝集タンパク質コード領域におけるコドン頻度に関して決定されることもあり、またはこれらの組合せに関して決定されることもある。頻度が遺伝子発現レベルに伴って増加するコドンは、典型的には発現に最適なコドンである。例えば、クラスター解析または対応解析を使用する、多変量解析を含む、特定の生物におけるコドン頻度（例えば、コドン使用頻度、相対同義コドン使用頻度）およびコドン選好を決定するための様々な方法、ならびに遺伝子において使用されるコドンの有効数を決定するための様々な方法が、公知である（例えば、ＧＣＧ  ＣｏｄｏｎＰｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ；  ＣｏｄｏｎＷ，  Ｐｅｄｅｎ，  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｎｏｔｔｉｎｇｈａｍ；  ＭｃＩｎｅｒｎｅｙ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍ．，  １４：３７２−７３  ［１９９８］；Ｓｔｅｎｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２２２４３７−４６  ［１９９４］；およびＷｒｉｇｈｔ，  Ｇｅｎｅ  ８７：２３−２９  ［１９９０］を参照されたい）。多くの異なる生物についてのコドン使用頻度表が入手可能である（例えば、Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２０：２１１１−２１１８  ［１９９２］；Ｎａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｕｃｌ．  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，  ２８：２９２  ［２０００］；Ｄｕｒｅｔ，  ｅｔ  ａｌ．，  上掲；Ｈｅｎａｕｔ  ａｎｄ  Ｄａｎｃｈｉｎ，  ｉｎ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ａｎｄ  Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，  Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ，  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），  ＡＳＭ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ  Ｄ．Ｃ．，  ｐ．  ２０４７−２０６６  ［１９９６］を参照されたい）。コドン使用頻度を得るためのデータ源は、タンパク質をコードすることができる任意の利用可能なヌクレオチド配列に依拠す得る。これらのデータセットは、発現されるタンパク質（例えば、完全タンパク質コード配列−ＣＤＳ）をコードすること、発現される配列タグ（ＥＳＴＳ）をコードすること、またはゲノム配列の予測コード領域をコードすることが実際に公知である核酸配列を含む（例えば、Ｍｏｕｎｔ，  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ，  Ｃｈａｐｔｅｒ  ８，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，  Ｎ．Ｙ．  ［２００１］；Ｕｂｅｒｂａｃｈｅｒ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ２６６：２５９−２８１  ［１９９６］；およびＴｉｗａｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ａｐｐｌ．  Ｂｉｏｓｃｉ．，  １３：２６３−２７０  ［１９９７］を参照されたい）。
【０１１４】
本明細書で使用される場合、「制御配列」は、本発明のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現に必要または有利である全ての成分を含む。各制御配列は、ポリペプチドをコードする核酸配列にとってネイティブのものであってもよいし、または外来のものであってもよい。そのような制御配列としては、これらに限定されないが、リーダー、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、プロモーター配列、シグナルペプチド配列、開始配列および転写ターミネーターを含む。少なくとも、制御配列は、プロモーター、ならびに転写および翻訳停止シグナルを含む。制御配列は、制御配列とポリペプチドをコードする核酸配列のコード領域とのライゲーションを助長する特異的制限部位を導入するためにリンカーを備えていることもある。
【０１１５】
「作動可能に連結した」は、本明細書では、制御配列が、目的のポリヌクレオチドに対して相対的な位置に、制御配列が目的のポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を指令または調節するように適切に（すなわち、機能的関係で）配置されている構成と定義される。
【０１１６】
「プロモーター配列」は、目的のポリヌクレオチドの発現について宿主細胞により認識される核酸配列、例えばコード配列を指す。プロモーター配列は、目的のポリヌクレオチドの発現を媒介する転写制御配列を含有する。プロモーターは、変異体、切断型およびハイブリッドプロモーターを含む、選ばれる宿主細胞において転写活性を示す任意の核酸配列であり得、プロモーターを、宿主細胞にとって同種または異種のどちらかの細胞外または細胞内ポリペプチドをコードする遺伝子から得ることができる。
【０１１７】
「好適な反応条件」という句は、本発明のグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドが所望の産物化合物に基質を変換することができる、酵素的変換反応溶液における条件（例えば、酵素負荷量、基質負荷量、温度、ｐＨ、緩衝剤、共溶媒などの範囲）を指す。一部の例示的な「好適な反応条件」が本明細書で提供される。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「化合物負荷量」または「酵素負荷量」などにおける「負荷量」は、反応開始時の反応混合物中の成分の濃度または量を指す。
【０１１９】
本明細書で使用される場合、酵素的変換反応プロセスの文脈での「基質」は、本明細書で提供される操作された酵素（例えば、操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド）による作用を受ける化合物または分子を指す。
【０１２０】
本明細書で使用される場合、用語「バイオマス」、「バイオマス基質」、「セルロース系バイオマス」、「セルロース系供給材料」、および「セルロース基質」は、セルロースを含有する任意の材料を指す。バイオマスは、植物、動物または微生物に由来することがあり、農業、産業および林業残渣、産業および都市廃棄物、ならびにエネルギー目的で成長させた陸生および水生作物を、これらに限定されないが、含み得る。セルロース基質の例としては、これらに限定されないが、木材、木材パルプ、製紙用パルプ、トウモロコシ繊維、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穂軸、作物残渣、例えばトウモロコシ外皮、トウモロコシ茎葉、イネ科植物、小麦、麦わら、大麦、大麦わら、干し草、稲、稲わら、スイッチグラス、紙くず、紙加工およびパルプ処理廃棄物、木本または草本植物、果実または野菜の果肉、トウモロコシ穂軸、醸造用穀物、イネ科植物、もみ殻、綿、麻、亜麻、サイザル麻、サトウキビの絞りかす、ソルガム、大豆、スイッチグラス；穀物、木、枝、根、葉、木片、おがくず、低木、低木の茂み、野菜、果実および花の粉砕から得られる成分；ならびにこれらの任意の好適な混合物が挙げられる。一部の実施形態では、セルロース系バイオマスは、これらに限定されないが、栽培作物（例えば、スイッチグラス、コードグラス、ライグラス、ススキ、クサヨシまたはこれらの任意の組合せなどの、Ｃ４イネ科植物を含む、イネ科植物）、製糖残渣、例えば、これに限定されないが、絞りかす（例えば、サトウキビの絞りかす、ビートパルプ［例えば、サトウダイコン］、またはこれらの組合せ）、農業残渣（例えば、ダイズ茎葉、トウモロコシ茎葉、トウモロコシ繊維、稲わら、サトウキビわら、稲、もみ殻、大麦わら、トウモロコシ穂軸、麦わら、キャノーラわら、オート麦わら、オート麦の殻、トウモロコシ繊維、麻、亜麻、サイザル麻、綿、またはこれらの任意の組合せ）、果実の果肉、野菜の果肉、醸造用穀物、林業バイオマス（例えば、木材、木材パルプ、製紙用パルプ、再生木材パルプ繊維、おがくず、硬材、例えばポプラ材、軟材、またはこれらの組合せ）を含む。さらに、一部の実施形態では、セルロース系バイオマスは、紙加工およびパルプ処理廃棄物、新聞用紙、厚紙などを含むがこれらに限定されない、セルロース系廃材および／または林業廃材を含む。一部の実施形態では、セルロース系バイオマスは、一種類の繊維を含むが、一部の代替実施形態では、セルロース系バイオマスは、異なるセルロース系バイオマスに由来する繊維の混合物を含む。一部の実施形態では、バイオマスは、リグニナーゼおよび／またはセルラーゼ酵素を発現するトランスジェニック植物も含み得る（例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００８／０１０４７２４号を参照されたい）。
【０１２１】
本明細書で使用される場合、用語「スラリー」は、セルロース基質などの１つまたは複数の固体成分が分散されている水溶液を指す。
【０１２２】
本明細書で使用される場合、反応からの産物（例えば、ステビオールグリコシド）の収量の「増加」は、反応中に存在する特定の成分（例えば、ＧＨ酵素）が、目的の成分の非存在下だが同じ基質および他の置換基を用いて同じ条件下で行われた反応と比較して、より多くの産物を産生させる場合に起こる。
【０１２３】
本明細書で使用される場合、セルロースまたは他の多糖の「加水分解」は、基質中に存在する２つの単糖間のグリコシド結合の少なくとも一部が加水分解されるときに起こり、それによって、前に結合していた２つのモノマーから互いに解離することになる。
【０１２４】
特定の酵素の量が、反応を触媒することに関与する他の酵素と比較して約２％、約１％または約０．１％（ｗｔ／ｗｔ）未満であった場合、反応にはその特定の酵素が「実質的にない」ことになる。
【０１２５】
本明細書で使用される場合、液体（例えば、培養ブロス）を「分画すること」は、所望のタンパク質（例えば、レバウジオシド）が初期液体産物中より溶液中でのほうが全タンパク質に対して高いパーセンテージを構成する溶液を得るために分離プロセス（例えば、塩析沈殿、カラムクロマトグラフィー、サイズ排除、濾過）またはそのようなプロセスの組合せを適用することを意味する。
【０１２６】
本明細書で使用される場合、「出発組成物」は、少なくとも１つの基質を含む任意の組成物を指す。一部の実施形態では、出発組成物は、任意のセルロース基質を含む。
【０１２７】
一部の代替実施形態では、用語「出発組成物」は、少なくとも１つのステビオールグリコシドを含み、ステビオールグリコシドのうちの１つまたは複数が生体内変換の基質として作用する、任意の組成物を指す。一部の実施形態では、出発組成物は、水溶液として提供される。一部の実施形態では、出発組成物は、ステビオシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＭ（レバウジオシドＸとも呼ばれる）、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、および合成ステビオールグリコシド（例えば、酵素によってグルコシル化されたステビオールグリコシド）から選択される、少なくとも１つのステビオールのグリコシドを含む。一部の実施形態では、出発組成物は、２つまたはそれより多くのステビオールグリコシドを含む。一部の実施形態では、出発組成物は、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ植物材料（例えば、葉）の精製から得られる抽出物である。一部の代替実施形態では、出発組成物は、市販のステビア抽出物を含む。追加の出発組成物は、ステビオールグリコシドを単離および精製するために使用されるプロセスの副産物を含む。一部の実施形態では、出発組成物は、精製されたまたは部分的に精製されたステビオールグリコシド基質を含む。一部の実施形態では、出発組成物は、特定のステビオールグリコシドを約９９重量％より多く含む。
【０１２８】
一部の実施形態では、出発組成物は、少なくとも１つのグリコシドとセルロース系成分とを、少なくとも１つのステビオールグリコシド（例えば、レバウジオシドＡ、Ｄなど）を産生するための基質として含む。
【０１２９】
本明細書で使用される場合、酵素的変換プロセスの文脈での「産物」は、基質に対する酵素ポリペプチドの作用の結果として生じる化合物または分子を指す。本明細書で使用される場合、一部の実施形態では、この用語は、基質に対するグリコシルトランスフェラーゼポリペプチドの作用の結果として生じる化合物または分子を指す。一部の実施形態では、本発明により提供される産物は、ステビオールグリコシドである。一部の実施形態では、産物は、ステビオシド、ステビオールモノシド、ステビオールビオシド、ルブソシド、ズルコシドＢ、ズルコシドＡ、レバウジオシドＢ、レバウジオシドＧ、レバウジオシドＣ、レバウジオシドＦ、レバウジオシドＡ、レバウジオシドＩ、レバウジオシドＥ、レバウジオシドＨ、レバウジオシドＬ、レバウジオシドＫ、レバウジオシドＪ、レバウジオシドＭ（レバウジオシドＸとも呼ばれる）、レバウジオシドＤ、レバウジオシドＮ、レバウジオシドＯ、および合成ステビオールグリコシド（例えば、酵素によってグルコシル化されたステビオールグリコシド）から選択される、少なくとも１つのステビオールのグリコシドを含む。
【０１３０】
本明細書で使用される場合、用語「培養すること」は、任意の好適な条件下で（例えば、液体、ゲルまたは固体培地を使用して）微生物細胞の集団を増殖させることを指す。
【０１３１】
組換えポリペプチドは、当技術分野において公知の任意の好適な方法を使用して産生することができる。目的の野生型ポリペプチドをコードする遺伝子をプラスミドなどのベクター内にクローニングし、Ｅ．ｃｏｌｉなどの所望の宿主に発現させることができる。組換えポリペプチドの改変体を当技術分野において公知の様々な方法により生成することができる。実際、当業者に周知の多種多様な異なる変異誘発技術がある。加えて、変異誘発キットも、多くの商業的分子生物学供給業者から入手することができる。定義されたアミノ酸における特異的置換（部位指向性）、遺伝子の局所領域における特異的もしくはランダム変異（位置特異的）、または遺伝子全体にわたってのランダム変異誘発（例えば、飽和変異誘発）を行う方法を利用することができる。ＰＣＲを使用する一本鎖ＤＮＡもしくは二本鎖ＤＮＡの部位指向性変異誘発、カセット変異誘発、遺伝子合成、エラープローンＰＣＲ、シャフリング、および化学的飽和変異誘発、または当技術分野において公知の任意の他の好適な方法を含むがこれらに限定されない、酵素改変体を生成するための非常に多数の好適な方法が、当業者に公知である。発現させること、スクリーニングすることおよびアッセイすることができる改変体ライブラリーを生成するために、酵素をコードするポリヌクレオチドに変異誘発および定向進化方法を容易に適用することができる。任意の好適な変異誘発および定向進化方法が本発明において使用され、当技術分野において周知である（例えば、米国特許第５，６０５，７９３、５，８１１，２３８、５，８３０，７２１、５，８３４，２５２、５，８３７，４５８、５，９２８，９０５、６，０９６，５４８、６，１１７，６７９、６，１３２，９７０、６，１６５，７９３、６，１８０，４０６、６，２５１，６７４、６，２６５，２０１、６，２７７，６３８、６，２８７，８６１、６，２８７，８６２、６，２９１，２４２、６，２９７，０５３、６，３０３，３４４、６，３０９，８８３、６，３１９，７１３、６，３１９，７１４、６，３２３，０３０、６，３２６，２０４、６，３３５，１６０、６，３３５，１９８、６，３４４，３５６、６，３５２，８５９、６，３５５，４８４、６，３５８，７４０、６，３５８，７４２、６，３６５，３７７、６，３６５，４０８、６，３６８，８６１、６，３７２，４９７、６，３３７，１８６、６，３７６，２４６、６，３７９，９６４、６，３８７，７０２、６，３９１，５５２、６，３９１，６４０、６，３９５，５４７、６，４０６，８５５、６，４０６，９１０、６，４１３，７４５、６，４１３，７７４、６，４２０，１７５、６，４２３，５４２、６，４２６，２２４、６，４３６，６７５、６，４４４，４６８、６，４５５，２５３、６，４７９，６５２、６，４８２，６４７、６，４８３，０１１、６，４８４，１０５、６，４８９，１４６、６，５００，６１７、６，５００，６３９、６，５０６，６０２、６，５０６，６０３、６，５１８，０６５、６，５１９，０６５、６，５２１，４５３、６，５２８，３１１、６，５３７，７４６、６，５７３，０９８、６，５７６，４６７、６，５７９，６７８、６，５８６，１８２、６，６０２，９８６、６，６０５，４３０、６，６１３，５１４、６，６５３，０７２、６，６８６，５１５、６，７０３，２４０、６，７１６，６３１、６，８２５，００１、６，９０２，９２２、６，９１７，８８２、６，９４６，２９６、６，９６１，６６４、６，９９５，０１７、７，０２４，３１２、７，０５８，５１５、７，１０５，２９７、７，１４８，０５４、７，２２０，５６６、７，２８８，３７５、７，３８４，３８７、７，４２１，３４７、７，４３０，４７７、７，４６２，４６９、７，５３４，５６４、７，６２０，５００、７，６２０，５０２、７，６２９，１７０、７，７０２，４６４、７，７４７，３９１、７，７４７，３９３、７，７５１，９８６、７，７７６，５９８、７，７８３，４２８、７，７９５，０３０、７，８５３，４１０、７，８６８，１３８、７，７８３，４２８、７，８７３，４７７、７，８７３，４９９、７，９０４，２４９、７，９５７，９１２、７，９８１，６１４、８，０１４，９６１、８，０２９，９８８、８，０４８，６７４、８，０５８，００１、８，０７６，１３８、８，１０８，１５０、８，１７０，８０６、８，２２４，５８０、８，３７７，６８１、８，３８３，３４６、８，４５７，９０３、８，５０４，４９８、８，５８９，０８５、８，７６２，０６６、８，７６８，８７１、９，５９３，３２６、９，６６５，６９４、９，６８４，７７１，および全ての関連米国特許、ならびにＰＣＴおよび非米国対応特許；Ｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ａｎａｌ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．，  ２５４（２）：１５７−７８  ［１９９７］；Ｄａｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．，  ５７：３６９−７４  ［１９９６］；Ｓｍｉｔｈ，  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｇｅｎｅｔ．，  １９：４２３−４６２  ［１９８５］；Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｓｃｉｅｎｃｅ，  ２２９：１１９３−１２０１  ［１９８５］；Ｃａｒｔｅｒ，  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  Ｊ．，  ２３７：１−７  ［１９８６］；Ｋｒａｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ，  ３８：８７９−８８７  ［１９８４］；Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｇｅｎｅ，  ３４：３１５−３２３  ［１９８５］；Ｍｉｎｓｈｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐ．  Ｃｈｅｍ．  Ｂｉｏｌ．，  ３：２８４−２９０  ［１９９９］；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １７：２５９−２６４  ［１９９９］；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３９１：２８８−２９１  ［１９９８］；Ｃｒａｍｅｒｉ，  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １５：４３６−４３８  ［１９９７］；Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．，  ９４：４５０４−４５０９  ［１９９７］；Ｃｒａｍｅｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，  １４：３１５−３１９  ［１９９６］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｎａｔｕｒｅ，  ３７０：３８９−３９１  ［１９９４］；Ｓｔｅｍｍｅｒ，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ，  ９１：１０７４７−１０７５１  ［１９９４］；ＷＯ９５／２２６２５；ＷＯ９７／００７８；ＷＯ９７／３５９６６；ＷＯ９８／２７２３０；ＷＯ００／４２６５１；ＷＯ０１／７５７６７；およびＷＯ２００９／１５２３３６を参照されたく、これらの全てが、参照により本明細書に組み込まれる）。
【０１３２】
一部の実施形態では、変異誘発処理後に得られる酵素クローンは、酵素調製物を既定の温度（または他のアッセイ条件）に付すこと、および熱処理または他の好適なアッセイ条件後に残存する酵素活性の量を測定することによって、スクリーニングされる。次いで、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含有するクローンは、遺伝子から単離され、ヌクレオチド配列変化（もしあれば）を同定するためにシークエンシングされ、宿主細胞において酵素を発現させるために使用される。発現ライブラリーからの酵素活性の測定は、当技術分野において公知の任意の好適な方法（例えば、ＨＰＬＣ分析などの標準的な生化学技術）を使用して行うことができる。
【０１３３】
改変体が産生された後、それらを任意の所望の特性（例えば、高い活性もしくは活性の増加、または低い活性もしくは活性の低下、熱活性の増加、熱安定性の増大、および／または酸性ｐＨ安定性など）についてスクリーニングすることができる。一部の実施形態では、「組換えグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド」（本明細書では「操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド」、「改変体グリコシルトランスフェラーゼ酵素」、「グリコシルトランスフェラーゼ改変体」、および「グリコシルトランスフェラーゼ組合せ改変体」とも呼ばれる）が使用される。一部の実施形態では、「組換えスクロースシンターゼポリペプチド」（「操作されたスクロースシンターゼポリペプチド」、「改変体スクロースシンターゼ酵素」、「スクロースシンターゼ改変体」、および「スクロースシンターゼ組合せ改変体」とも呼ばれる）が使用される。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「ベクター」は、ＤＮＡ配列を細胞に導入するためのＤＮＡ構築物である。一部の実施形態では、ベクターは、ＤＮＡ配列にコードされたポリペプチドの好適な宿主における発現を果たすことができる好適な制御配列に作動可能に連結した発現ベクターである。一部の実施形態では、「発現ベクター」は、宿主細胞における発現を駆動するためのＤＮＡ配列（例えば、導入遺伝子）に作動可能に連結したプロモーター配列を有し、一部の実施形態では、転写ターミネーター配列も含む。
【０１３５】
本明細書では、用語「発現」は、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを含む。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、用語「産生する」は、細胞によるタンパク質および／または他の化合物の産生を指す。この用語は、転写、転写後修飾、翻訳、および翻訳後修飾を含むがこれらに限定されない、ポリペプチドの産生に関与する任意のステップを包含することが意図されている。一部の実施形態では、この用語は、細胞からのポリペプチドの分泌も包含する。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、アミノ酸またはヌクレオチド配列（例えば、プロモーター配列、シグナルペプチド、ターミネーター配列など）は、この配列が作動可能に連結した別の配列にとって、それら２つの配列が天然に会合していない場合、「異種」である。例えば、「異種ポリヌクレオチド」は、実験技術により宿主細胞に導入される任意のポリヌクレオチドであり、宿主細胞から除去され、実験操作に付され、そしてその後、宿主細胞に再導入されるポリヌクレオチドを含む。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、用語「宿主細胞」および「宿主株」は、本明細書で提供されるＤＮＡ（例えば、グリコシルトランスフェラーゼ改変体をコードするポリヌクレオチド）を含む発現ベクターのための好適な宿主を指す。一部の実施形態では、宿主細胞は、当技術分野において公知の組換えＤＮＡ技術を使用して構築されたベクターが形質転換されたまたはトランスフェクトされた真核または原核細胞である。
【０１３９】
用語「類似体」は、参照ポリペプチドと７０％より高い配列同一性、しかし１００％未満の配列同一性（例えば、７５％、７８％、８０％、８３％、８５％、８８％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％を超える配列同一性）を有する、ポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、類似体は、天然に存在するアミノ酸ばかりでなく、ホモアルギニン、オルニチンおよびノルバリンを含むがこれらに限定されない、１つまたは複数の天然に存在しないアミノ酸も含有する、ポリペプチドを意味する。一部の実施形態では、類似体はまた、１つまたは複数のＤ−アミノ酸残基、および２つまたはそれより多くのアミノ酸残基間の非ペプチド連結を含む。
【０１４０】
用語「有効量」は、所望の結果を生じさせるのに十分な量を意味する。当業者は、日常的な実験を使用することにより何が有効量を決定することができる。
【０１４１】
用語「単離された」および「精製された」は、それが天然に会合している少なくとも１つの他の成分から除去されている分子（例えば、単離された核酸、ポリペプチドなど）または他の成分を指すために使用される。用語「精製された」は、絶対純度を必要とせず、むしろ、相対的定義として意図されている。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「立体選択性」は、化学または酵素反応における１つの立体異性体の別の立体異性体に対する優先的形成を指す。立体選択性は、１つの立体異性体が他の立体異性体より選好される場合、部分的であり得、または１つの立体異性体のみが形成される場合、完全であり得る。立体異性体がエナンチオマーである場合、立体選択性は、エナンチオ選択性と呼ばれ、これは、両方のエナンチオマーの和における一方のエナンチオマーの分率（典型的にはパーセンテージとして報告される）である。これは、一般に、当技術分野ではその代わりに、そこから式［主エナンチオマー−副エナンチオマー］／［主エナンチオマー＋副エナンチオマー］に従って計算されるエナンチオマー過剰率（「ｅ．ｅ．」）として（典型的にはパーセンテージとして）報告される。立体異性体がジアステレオ異性体である場合、立体選択性は、ジアステレオ選択性と呼ばれ、これは、２つのジアステレオマーの混合物中の一方のジアステレオマーの分率（典型的にはパーセンテージとして報告される）であり、一般に、その代わりに、ジアステレオマー過剰率（「ｄ．ｅ．」）として報告される。エナンチオマー過剰率およびジアステレオマー過剰率は、立体異性体過剰率の種類である。
【０１４３】
本明細書で使用される場合、「位置選択性」および「位置選択的反応」は、結合生成または切断の１つの方向が、全ての他の可能な方向より優先的に起こる反応を指す。反応は、識別が完全であり、実質的に位置選択的（少なくとも７５％）である場合、完全（１００％）位置選択的であり得、または１つの部位での反応の産物が他の部位での反応の産物より優勢である場合、部分的位置選択的（ｘ％、この場合のパーセンテージは、目的の反応に依存して設定される）であり得る。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「熱安定性の」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）の高温（例えば、４０〜８０℃）への曝露後に、同じ高温に曝露された野生型酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持する、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを指す。
【０１４５】
本明細書で使用される場合、「溶媒安定性の」は、ある期間（例えば、０．５〜２４時間）の様々な濃度（例えば、５〜９９％）の溶媒（エタノール、イソプロピルアルコール、ジメチルスルホキシド［ＤＭＳＯ］、テトラヒドロフラン、２−メチルテトラヒドロフラン、アセトン、トルエン、酢酸ブチル、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルなど）への曝露後に、同じ濃度の同じ溶媒に曝露された野生型酵素と比較して同様の活性（例えば、６０％〜８０％より高い）を維持する、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを指す。
【０１４６】
本明細書で使用される場合、「熱および溶媒安定性の」は、熱安定性でもあり、溶媒安定性でもある、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチドを指す。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「還元剤」は、Ｆｅ＋３をＦｅ＋２に変換することができる化合物または作用物質を指す。例示的な還元剤は、アスコルビン酸であり、これは、一般に、Ｌ−アスコルビン酸の形態である。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「必要に応じた」および「必要に応じて」は、その後に記載される事象または状況が、起こることもありまたは起こらないこともあること、およびその記載が、事象または状況が起こる事例と、それが起こらない事例とを含むことを意味する。１つまたは複数の必要に応じた置換基を含有すると記載される任意の分子に関して、立体的に現実的なおよび／または合成により実現可能な化合物のみが含まれるように意図されていることが、当業者には理解されるであろう。「必要に応じて置換されている」は、化学基という用語または一連の化学基における全ての後続の修飾語句を指す。
【０１４９】
グリコシル化
グリコシル化は、安定性、薬力学、溶解度および膜輸送を含む、天然および合成産物の多くの特性を変更することができる。本発明は、様々なアグリコンおよびグリコシル化基質からの新しいグリコシル化化合物の生成に好適な組成物、方法および酵素を提供する。一部の実施形態では、本発明は、容易に得られる前駆体から公知のグリコシル化化合物を効率的に生成するための手段を提供する。一部の場合には、グリコシル化は、化学合成方法によって果たされる。しかし、これらの方法は、望ましくない化学物質およびプロセスを概して必要とし、混合産物（例えば、誤った位置に結合を有する、および／または望ましくないアノマー配置を有する）を生じさせる結果となり得る。さらに、炭水化物化学は、複数の保護および脱保護ステップを必要とする。
【０１５０】
対照的に、グリコシル化酵素は、温和な条件下で活性であり得、高い位置選択性および立体特異性を単一のステップで付与することができる。多くの天然に存在するグリコシル化代謝物は、様々な糖ヌクレオシドから糖部分を転移させるグリコシルトランスフェラーゼを使用してｉｎ  ｖｉｖｏで生成される。抗菌特性、抗腫瘍特性、天然甘味特性などを有する多くの二次代謝物を含む、多くの分子は、β−グリコシド結合で修飾された非リボソームペプチド、ポリケチドまたはテルペノイド骨格を含む。植物、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ、から抽出されるジテルペングリコシドの多くは、β連結グルコース分子を含有する。自然に、これらの分子は、ＵＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ酵素を使用してｉｎ  ｖｉｖｏでグリコシル化される。本発明は、新しい操作されたグリコシルトランスフェラーゼを使用して、ヌクレオシドジホスホグルコースからグルコース部分を基質（例えば、レバウジオシドＤまたはステビオシド）に転移させて、１つまたは複数のβ−グルコース連結産物（例えば、レバウジオシドＭ、レバウジオシドＡ、またはレバウジオシドＩ）を産生する方法（図１を参照されたい）を提供する。しかし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用される場合、ＵＤＰ−グルコースは、法外に高価および／または入手不可能であり得る。一部の追加の実施形態では、シンターゼ（例えば、スクロースシンターゼまたはトレハロースシンターゼ）は、逆方向に作用して、ヌクレオシド二リン酸およびグルコースドナー（例えば、スクロース、トレハロースまたはデンプン）からヌクレオシドジホスホグルコース化合物を形成する。
【０１５１】
したがって、グリコシル化は、香草、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉ、に由来するものなどの天然甘味料の産生に使用される。上述の通り、この植物は、多くの他の強力な甘味料より優れた高強度の甘味および知覚特性を特徴とする、いくつかのジテルペングリコシドを産生する。上述の甘味グリコシドは、一般的なアグリコン（すなわち、ステビオール）を有するが、Ｃ１３およびＣ１９位における炭水化物残基の数およびタイプが異なる。ステビオールグリコシドは、それらの分子構造ばかりでなく、それらの味覚特性も互いに異なる。通常、ステビオシドは、スクロースの８９〜１４３倍の甘味があるが、レバウジオシドＡは、スクロースの８５〜２４２倍の間の甘味があると報告されている（例えば、Ｋａｓａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎｉｐｐｏｎ  Ｋａｇａｋｕ  Ｋａｉｓｈｉ，  １９８１：７２６−７３５  ［１９８１］を参照されたい）。これらの一般的な化合物のうち、レバウジオシドＡは、収れん性が最も低く、苦味が最も少なく、後味の持続性が最も低い。したがって、レバウジオシドＡには主要ステビオールグリコシドの最も好ましい感覚的特質があり、レバウジオシドＡは、商品化されている。しかし、レバウジオシドＡは、Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａ  Ｂｅｒｔｏｎｉから単離される全グリコシドのほんの一部（約２０％）しか構成せず、ステビオシド（約７０％）および副次的ステビオールグリコシドが残部を構成する（例えば、ＦＡＯ，  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ａｎｄ  Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ  Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ，  ６３ｒｄ  ＪＥＣＦＡ，  Ｓｔｅｖｉｏｌ  Ｇｌｙｃｏｓｉｄｅｓ  ［２００４］を参照されたい）。天然に存在するが存在量がさらにより少ない化合物であるレバウジオシドＭは、レバウジオシドＸとしても公知であり、スクロースの２００〜３５０倍甘く、レバウジオシドＡと比較して低減された後味を有する（例えば、Ｐｒａｋａｓｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｏｏｄ，  ３：１６２−１７５  ［２０１４］を参照されたい）。したがって、例えば天然甘味料としての、レバウジオシドＭの商品化に関心が持たれているが、この化合物の実行可能な商業的合成経路は今のところない。
【０１５２】
操作されたグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド
本発明は、グリコシルトランスフェラーゼポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用する方法を提供する。説明がポリペプチドに関する場合、その説明がポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも説明することを理解されたい。一部の実施形態では、本発明は、野生型ＧＴ酵素と比較して改善された特性を有する、操作された、天然に存在しないＧＴ酵素を提供する。任意の好適な反応条件が本発明において使用される。一部の実施形態では、方法は、トランスフェラーゼ反応を行うための操作されたポリペプチドの改善された特性を分析するために使用される。一部の実施形態では、反応条件は、下記でおよび実施例でさらに説明されるように、ポリペプチドの濃度もしくは量、基質、補基質、緩衝剤、共溶媒、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、ならびに／または固体支持体上に固定化されたポリペプチドに伴う条件に関して改良される。
【０１５３】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＧＴポリペプチドは、野生型ＧＴ酵素と比較して改善された特性、例えば、ステビオールグリコシドのさらにグリコシル化されたステビオールグリコシドへの（例えば、ステビオシドのレバウジオシドＡへの、またはレバウジオシドＤのレバウジオシドＭへの）変換の点およびアデニンジホスホグルコースまたは他のヌクレオシド二リン酸の使用の点で改善された特性を有する。
【０１５４】
一部の実施形態では、反応条件を補足するために追加の反応成分または追加の技術が利用される。一部の実施形態では、これらは、酵素を安定化するかまたは酵素の不活性化を防止するための手段、産物阻害を低減させるための手段、反応の平衡をグルコシル化産物形成にシフトさせるための手段を講じることを含む。
【０１５５】
一部のさらなる実施形態では、基質化合物の産物化合物への変換のための上記のいずれのプロセスも、産物化合物の抽出；単離；精製；および結晶化、濾過または凍結乾燥から選択される１つまたは複数のステップをさらに含むことがある。上で開示されたプロセスにより産生される生体触媒反応混合物からグルコシル化産物を抽出、単離、精製および／または結晶化するための方法、技術およびプロトコールは、当業者に公知であり、および／または日常的な実験によって入手される。加えて、説明に役立つ方法が、下記の実施例で提供される。
【０１５６】
操作されたスクロースシンターゼポリペプチド
本発明は、操作されたスクロースシンターゼ（ＳｕＳ）ポリペプチド、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ポリペプチドを調製する方法、およびポリペプチドを使用する方法を提供する。説明がポリペプチドに関する場合、その説明がポリペプチドをコードするポリヌクレオチドも説明することを理解されたい。一部の実施形態では、本発明は、野生型ＳｕＳ酵素と比較して改善された特性を有する、操作された、天然に存在しないＳｕＳ酵素を提供する。任意の好適な反応条件が本発明において使用される。一部の実施形態では、方法は、シンターゼ反応を行うための操作されたポリペプチドの改善された特性を分析するために使用される。一部の実施形態では、反応条件は、下記でおよび実施例でさらに説明されるように、操作されたＳｕＳの濃度もしくは量、基質、緩衝剤、溶媒、ｐＨ、温度および反応時間を含む条件、ならびに／または固体支持体上に固定化された操作されたＳｕＳポリペプチドに伴う条件に関して改良される。
【０１５７】
一部の実施形態では、本明細書に記載の操作されたＳｕＳポリペプチドは、野生型ＳｕＳ酵素と比較して改善された特性、例えば、本明細書に記載の反応の点で改善された特性を有する。
【０１５８】
一部の実施形態では、反応条件を補足するために追加の反応成分または追加の技術が利用される。一部の実施形態では、これらは、酵素を安定化するかまたは酵素の不活性化を防止するための手段、産物阻害を低減させるための手段、反応の平衡をグルコシル化産物形成にシフトさせるための手段を講じることを含む。
【０１５９】
一部のさらなる実施形態では、基質化合物の産物化合物への変換のための上記のいずれのプロセスも、産物化合物の抽出、単離、精製、結晶化、濾過および／または凍結乾燥から選択される１つまたは複数のステップをさらに含むことがある。本明細書で提供されるプロセスにより産生される生体触媒反応混合物から産物（例えば、レバウジオシド）を抽出、単離、精製および／または結晶化するための方法、技術およびプロトコールは、当業者に公知であり、および／または日常的な実験によって入手される。加えて、説明に役立つ方法が、下記の実施例で提供される。
【０１６０】
操作されたポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、発現ベクターおよび宿主細胞
本発明は、本明細書に記載の操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、ポリペプチドを発現させることができる組換えポリヌクレオチドを作出するために遺伝子発現を制御する１つまたは複数の異種調節配列に動作可能に連結している。一部の実施形態では、操作された酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つの異種ポリヌクレオチドを含有する発現構築物は、対応する酵素ポリペプチドを発現させるために適切な宿主細胞に導入される。
【０１６１】
当業者には明らかであるように、タンパク質配列と様々なアミノ酸に対応するコドンについての知識とが利用可能であることによって、対象ポリペプチドをコードすることができる全てのポリヌクレオチドについての説明が得られる。同じアミノ酸が代替または同義コドンによりコードされる遺伝コードの縮重は、全てが操作された酵素（例えば、ＧＴまたはＳｕＳ）ポリペプチドをコードするものである極めて多数の核酸を作製することを可能にする。したがって、本発明は、可能なコドン選択肢に基づいて組合せを選択することによって本明細書に記載の酵素ポリペプチドをコードするものにされ得る酵素ポリヌクレオチドのありとあらゆる可能なバリエーションの産生のための方法および組成物を提供し、全てのそのようなバリエーションは、実施例で（例えば、様々な表で）提示されるアミノ酸配列を含む、本明細書に記載の任意のポリペプチドについて考えられ、具体的に開示されることになる。
【０１６２】
一部の実施形態では、コドンは、好ましくは、タンパク質産生のための選択された宿主細胞による利用のために最適化される。例えば、細菌において使用される好ましいコドンは、細菌における発現のために典型的に使用される。それ故、操作された酵素ポリペプチドをコードするコドン最適化ポリヌクレオチドは、完全長コード領域中のコトン位置の約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９０％より多くに好ましいコドンを含有する。
【０１６３】
一部の実施形態では、酵素ポリヌクレオチドは、酵素活性と本明細書で開示される特性を有する操作されたポリペプチドであって、本明細書で提供される配列番号から選択される参照配列に対して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれより高い同一性を有するアミノ酸配列、または任意の改変体（例えば、実施例で提供されるもの）のアミノ酸配列と、参照ポリヌクレオチドまたは実施例で開示される任意の改変体のアミノ酸配列と比較して１つまたは複数（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０カ所もしくはそれより多くのアミノ酸残基位置）の残基相違とを含む、操作されたポリペプチドをコードする。
【０１６４】
一部の実施形態では、ポリヌクレオチドは、本明細書で提供される任意のポリヌクレオチド配列から選択される参照ポリヌクレオチド配列、もしくはその相補配列、または本明細書で提供される改変体酵素ポリペプチドのいずれかをコードするポリヌクレオチド配列と、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができる。一部の実施形態では、高度にストリンジェントな条件下でハイブリダイズすることができるポリヌクレオチドは、参照配列と比較して１つまたは複数の残基相違を有するアミノ酸配列を含む酵素ポリペプチドをコードする。
【０１６５】
一部の実施形態では、本明細書における操作された酵素ポリペプチドのいずれかをコードする単離されたポリヌクレオチドは、酵素ポリペプチドの発現を助長するように様々な方法で操作される。一部の実施形態では、酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、１つまたは複数の制御配列が、酵素ポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドの発現を調節するために存在する、発現ベクターを含む。ベクターへのその挿入の前の単離されたポリヌクレオチドの操作は、利用される発現ベクターに依存して望ましいまたは必要であることがある。組換えＤＮＡ法を利用してポリヌクレオチドおよび核酸配列を修飾する技術は、当技術分野において周知である。一部の実施形態では、制御配列は、数ある中でも特に、プロモーター、リーダー配列、ポリアデニル化配列、プロペプチド配列、シグナルペプチド配列、および転写ターミネーターを含む。一部の実施形態では、好適なプロモーターは、宿主細胞選択に基づいて選択される。細菌宿主細胞について、本開示の核酸構築物の転写を指令するのに好適なプロモーターとしては、これらに限定されないが、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｌａｃオペロン、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒアガラーゼ遺伝子（ｄａｇＡ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓレバンスクラーゼ遺伝子（ｓａｃＢ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＬ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓマルトース生成アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＭ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓアルファ−アミラーゼ遺伝子（ａｍｙＱ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓペニシリナーゼ遺伝子（ｐｅｎＰ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｘｙｌＡおよびｘｙｌＢ遺伝子、ならびに原核生物ベータ−ラクタマーゼ遺伝子から得られるプロモーター（例えば、Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ７５：  ３７２７−３７３１  ［１９７８］を参照されたい）、ならびにｔａｃプロモーター（例えば、ＤｅＢｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８０：  ２１−２５  ［１９８３］を参照されたい）が挙げられる。糸状真菌宿主細胞についての例示的プロモーターとしては、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ酸安定性アルファ−アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒまたはＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｗａｍｏｒｉグルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉリパーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅアルカリプロテアーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアセトアミダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られるプロモーター（例えば、ＷＯ９６／００７８７を参��されたい）、ならびにＮＡ２−ｔｐｉプロモーター（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アルファ−アミラーゼの遺伝子からのプロモーターとＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子からのプロモーターのハイブリッド）、ならびにこれらの変異体、切断型およびハイブリッドプロモーターが挙げられる。例示的な酵母細胞プロモーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅガラクトキナーゼ（ＧＡＬ１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子に由来し得る遺伝子に由来し得る。酵母宿主細胞についての他の有用なプロモーターは、当技術分野において公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｙｅａｓｔ  ８：４２３−４８８  ［１９９２］を参照されたい）。
【０１６６】
一部の実施形態では、制御配列は、好適な転写ターミネーター配列（すなわち、転写を終結させるために宿主細胞により認識される配列）でもある。一部の実施形態では、ターミネーター配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の３’末端に作動可能に連結している。選ばれる宿主細胞において機能性である任意の好適なターミネーターが、本発明において使用される。糸状真菌宿主細胞についての例示的な転写ターミネーターは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼ、およびＦｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞についての例示的なターミネーターは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅシトクロムＣ（ＣＹＣ１）、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得ることができる。酵母宿主細胞についての他の有用なターミネーターは、当技術分野において公知である（例えば、Ｒｏｍａｎｏｓ  ｅｔ  ａｌ．、上掲を参照されたい）。
【０１６７】
一部の実施形態では、制御配列は、好適なリーダー配列（すなわち、宿主細胞による翻訳にとって重要であるｍＲＮＡの非翻訳領域）でもある。一部の実施形態では、リーダー配列は、酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の５’末端に作動可能に連結している。選ばれる宿主細胞において機能性である任意の好適なリーダー配列が、本発明において使用される。糸状真菌宿主細胞についての例示的リーダーは、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞に好適なリーダーは、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅエノラーゼ（ＥＮＯ−１）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ３−ホスホグリセリン酸キナーゼ、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルコールデヒドロゲナーゼ／グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＡＤＨ２／ＧＡＰ）の遺伝子から得られる。
【０１６８】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリアデニル化配列（すなわち、核酸配列の３’末端に作動可能に連結した配列であって、転写されたとき、転写されたｍＲＮＡにポリアデノシン残基を付加させるためのシグナルとして宿主細胞により認識される配列）でもある。選ばれる宿主細胞において機能性である任意の好適なポリアデニル化配列が、本発明において使用される。糸状真菌宿主細胞についての例示的なポリアデニル化配列としては、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓアントラニル酸シンターゼ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｏｘｙｓｐｏｒｕｍトリプシン様プロテアーゼ、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼの遺伝子が挙げられる。酵母宿主細胞についての有用なポリアデニル化配列は公知である（例えば、Ｇｕｏ  ａｎｄ  Ｓｈｅｒｍａｎ，  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．，  １５：５９８３−５９９０  ［１９９５］を参照されたい）。
【０１６９】
一部の実施形態では、制御配列は、シグナルペプチド（すなわち、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたアミノ酸配列をコードし、コードされたポリペプチドを細胞の分泌経路に方向付ける、コード領域）でもある。一部の実施形態では、核酸配列のコード配列の５’末端は、分泌されるポリペプチドをコードするコード領域のセグメントと翻訳リーディングフレーム内で天然で連結されるシグナルペプチドコード領域を本質的に含有する。あるいは、一部の実施形態では、コード配列の５’末端は、コード配列にとって外来のシグナルペプチドコード領域を含有する。発現されたポリペプチドを選ばれる宿主細胞の分泌経路に方向付ける任意の好適なシグナルペプチドコード領域が、操作されたポリペプチドの発現に使用される。細菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ＮＣＩＢ  １１８３７マルトース生成アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓアルファ−アミラーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓサブチリシン、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓベータ−ラクタマーゼ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ、ｎｐｒＳ、ｎｐｒＭ）、およびＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ  ｐｒｓＡの遺伝子からのものを含むがこれらに限定されない、シグナルペプチドコード領域である。さらなるシグナルペプチドは、当技術分野において公知である（例えば、Ｓｉｍｏｎｅｎ  ａｎｄ  Ｐａｌｖａ，  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  Ｒｅｖ．，  ５７：１０９−１３７  ［１９９３］を参照されたい）。一部の実施形態では、糸状真菌宿主細胞についての有効なシグナルペプチドコード領域としては、これらに限定されないが、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ  ＴＡＫＡアミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ中性アミラーゼ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ  ｉｎｓｏｌｅｎｓセルラーゼ、およびＨｕｍｉｃｏｌａ  ｌａｎｕｇｉｎｏｓａリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード領域が挙げられる。酵母宿主細胞についての有用なシグナルペプチドとしては、これらに限定されないが、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子およびＳａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅインベルターゼの遺伝子からのものが挙げられる。
【０１７０】
一部の実施形態では、制御配列は、ポリペプチドのアミノ末端に位置するアミノ酸配列をコードするプロペプチドコード領域でもある。結果として得られるポリペプチドは、「プロ酵素」、「プロポリペプチド」または「チモーゲン」と呼ばれる。プロポリペプチドは、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的または自己触媒的切断によって成熟活性ポリペプチドに変換され得る。プロペプチドコード領域は、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓアルカリプロテアーゼ（ａｐｒＥ）、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ中性プロテアーゼ（ｎｐｒＴ）、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅアルファ因子、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ  ｍｉｅｈｅｉアスパラギン酸プロテイナーゼ、およびＭｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａラクターゼの遺伝子を含むがこれらに限定されない、任意の好適な供給源から得ることができる（例えば、ＷＯ９５／３３８３６を参照されたい）。シグナルペプチド領域とプロペプチド領域の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド領域は、ポリペプチドのアミノ末端の隣に位置し、シグナルペプチド領域は、プロペプチド領域のアミノ末端の隣に位置する。
【０１７１】
一部の実施形態では、調節配列も利用される。これらの配列は、宿主細胞の増殖に関連してポリペプチドの発現の調節を助長する。調節系の例は、調節化合物の存在を含む、化学的または物理的刺激に応答して遺伝子発現をオンまたはオフにさせるものである。原核生物宿主細胞において、好適な調節配列としては、これらに限定されないが、ｌａｃ、ｔａｃおよびｔｒｐオペレータ系が挙げられる。酵母宿主細胞において、好適な調節配列としては、これらに限定されないが、ＡＤＨ２系またはＧＡＬ１系が挙げられる。糸状真菌において、好適な調節配列としては、これらに限定されないが、ＴＡＫＡアルファ−アミラーゼプロモーター、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼプロモーター、およびＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅグルコアミラーゼプロモーターが挙げられる。
【０１７２】
別の態様では、本発明は、操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドと、導入されることになる宿主の種類に依存して、プロモーターおよびターミネーター、複製起点などのような１つまたは複数の発現調節領域とを含む、組換え発現ベクターに関する。一部の実施形態では、本明細書に記載の様々な核酸および制御配列は、１つまたは複数の便利な制限部位を、そのような部位での酵素ポリペプチドをコードする核酸配列の挿入または置換を可能にするために含む、組換え発現ベクターを生じさせるために一緒に連結される。あるいは、一部の実施形態では、本発明の核酸配列は、核酸配列またはその配列を含む核酸構築物を発現のための適切なベクターに挿入することによって発現される。発現ベクターの作出を含む一部の実施形態では、コード配列は、ベクター内に、コード配列が発現のための適切な制御配列と作動可能に連結するように位置する。
【０１７３】
組換え発現ベクターは、便利に組換えＤＮＡ手順に付すことができ、酵素ポリヌクレオチド配列の発現を生じさせることができる、任意の好適なベクター（例えば、プラスミドまたはウイルス）であり得る。ベクターの選択は、ベクターとベクターが導入されることになる宿主細胞との適合性に典型的に依存する。ベクターは、直鎖状プラスミドであってもよく、または閉環状プラスミドであってもよい。
【０１７４】
一部の実施形態では、発現ベクターは、自己複製ベクター（すなわち、染色体外実体として存在し、その複製が染色体複製に依存しないベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、または人工染色体）である。ベクターは、自己複製を確実にするための任意の手段を含有し得る。一部の代替実施形態では、ベクターは、宿主細胞に導入されたとき、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体とともに複製されるものであり得る。さらに、一部の実施形態では、単一のベクターもしくはプラスミド、または宿主細胞のゲノムにおよび／もしくはトランスポゾンに導入されることになる全ＤＮＡを一緒に含有する２つもしくはそれより多くのベクターもしくはプラスミドが、利用される。
【０１７５】
一部の実施形態では、発現ベクターは、形質転換細胞の容易な選択を可能にする、１つまたは複数の選択可能なマーカーを含有する。「選択可能なマーカー」は、その産物が、殺生物剤またはウイルス抵抗性を、重金属に対する耐性を、栄養要求株に原栄養性を、およびこれらに類するものをもたらす、遺伝子である。細菌の選択可能なマーカーの例としては、これらに限定されないが、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓもしくはＢａｃｉｌｌｕｓ  ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓからのｄａｌ遺伝子、またはアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコールもしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーが挙げられる。酵母宿主細胞についての好適なマーカーとしては、これらに限定されないが、ＡＤＥ２、ＨＩＳ３、ＬＥＵ２、ＬＹＳ２、ＭＥＴ３、ＴＲＰ１およびＵＲＡ３が挙げられる。糸状真菌宿主細胞において使用するための選択可能なマーカーとしては、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミダーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅからのもの）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ；例えば、Ｓ．ｈｙｇｒｏｓｃｏｐｉｃｕｓからのもの）、ｈｐｈ（ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ）、ｎｉａＤ（硝酸レダクターゼ）、ｐｙｒＧ（オロチジン−５’−リン酸デカルボキシラーゼ；例えば、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓまたはＡ．ｏｒｚｙａｅからのもの）、ｓＣ（硫酸アデニルトランスフェラーゼ）、およびｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ならびにこれらの等価物が挙げられる。別の態様では、本発明は、本発明の少なくとも１つの操作された酵素ポリペプチドをコードする少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む宿主細胞であって、ポリヌクレオチドが、宿主細胞における操作された酵素（単数／複数）の発現のために１つまたは複数の制御配列に動作可能に連結している、宿主細胞を提供する。本発明の発現ベクターによりコードされるポリペプチドを発現させる際の使用に好適な宿主細胞は、当技術分野において周知であり、これらに限定されないが、細菌細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｆｌｕｖｉａｌｉｓ、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓおよびＳａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ細胞；真菌細胞、例えば、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅまたはＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ（ＡＴＣＣ受託番号２０１１７８））；昆虫細胞、例えば、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  Ｓ２およびＳｐｏｄｏｐｔｅｒａ  Ｓｆ９細胞；動物細胞、例えば、ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＢＨＫ、２９３およびＢｏｗｅｓ黒色腫細胞；ならびに植物細胞を含む。例示的な宿主細胞は、様々なＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ株（例えば、Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）およびＢＬ２１）も含む。
【０１７６】
したがって、別の態様では、本発明は、操作された酵素ポリペプチドを産生するための方法であって、操作された酵素ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを発現することができる宿主細胞を、ポリペプチドの発現に好適な条件下で培養するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態では、方法は、本明細書に記載されるような、酵素ポリペプチドを単離および／または精製するステップを、さらに含む。
【０１７７】
宿主細胞についての適切な培養培地および増殖条件は、当技術分野において周知である。酵素ポリペプチドの発現のためにポリヌクレオチドを細胞に導入するための任意の好適な方法が本発明で使用されることが、企図される。好適な技術としては、これらに限定されないが、電気穿孔、微粒子銃による粒子衝突、リポソーム媒介性トランスフェクション、塩化カルシウムトランスフェクション、およびプロトプラスト融合が挙げられる。
【０１７８】
説明に役立つことを意図したものであり、限定を意図したものではない、以下の代表的実施例で、本発明の様々な特徴および実施形態が例証される。
【実施例】
【０１７９】
実験
遂行した実験および結果を含む以下の実施例は、説明に役立つことを目的として提供するものに過ぎず、本発明を限定するものと解釈すべきでない。実際、下記の試薬および機器の多くには様々な好適な供給元がある。本発明をいずれかの試薬または機器物品についていずれかの特定の供給元に限定することを意図していない。
【０１８０】
下で開示する実験では、以下の略語が適用される：Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）、ｕＭおよびμΜ（マイクロモル濃度）；ｎＭ（ナノモル濃度）；ｍｏｌ（モル）；ｇｍおよびｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｕｇおよびμｇ（マイクログラム）；Ｌおよびｌ（リットル）；ｍｌおよびｍＬ（ミリリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｕｍおよびμｍ（マイクロメートル）；ｓｅｃ．（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈおよびｈｒ（時）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｒｐｍ（毎分回転数）；ｐｓｉおよびＰＳＩ（ポンド毎平方インチ）；℃（摂氏度）；ＲＴおよびｒｔ（室温）；ＣＶ（変動係数）；ＣＡＭおよびｃａｍ（クロラムフェニコール）；ＰＭＢＳ（ポリミキシンＢ硫酸塩）；ＩＰＴＧ（イソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド）；ＬＢ（ルリアブロス）；ＴＢ（テリフィックブロス）；ＳＦＰ（振盪フラスコ粉末）；ＣＤＳ（コード配列）；ＤＮＡ（デオキシリボ核酸）；ＲＮＡ（リボ核酸）；ｎｔ（ヌクレオチド；ポリヌクレオチド）；ａａ（アミノ酸；ポリペプチド）；Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ［ＣＧＳＣ］、Ｎｅｗ  Ｈａｖｅｎ、ＣＴから入手可能な、一般に使用されている実験室Ｅ．ｃｏｌｉ株）；ＡｃＳｕｓ（Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓスクロースシンターゼ）；ＳＵＳ、ＳｕＳおよびＳｕＳｙ（スクロースシンターゼ、これはスクロースシンテターゼとしても公知）；ＮＤＰ（ヌクレオシド二リン酸）；アデノシン二リン酸（ＡＤＰ）；シチジン二リン酸（ＣＤＰ）；グアノシン二リン酸（ＧＤＰ）；チミジン二リン酸（ＴＤＰ）；ウリジン二リン酸（ＵＤＰ）；イノシン二リン酸（ＩＤＰ）；ＧＴ（グリコシルトランスフェラーゼ）；ＵＧＴ（ＵＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ）；ＮＧＴ（ＮＤＰ−ヌクレオシド二リン酸依存性グリコシルトランスフェラーゼ）；ＡＧＴ（ＡＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ）；ＣＧＴ（ＣＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ）；ＧＧＴ（ＧＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ）；ＴＧＴ（ＴＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ）；ＩＧＴ（ＩＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ）；ＵＧＴ（ＵＤＰ−グルコース依存性グリコシルトランスフェラーゼ）；ｒｅｂ（レバウジオシド）；ｒｅｂＡ（レバウジオシドＡ）；ｒｅｂＤ（レバウジオシドＤ）；ｒｅｂＩ（レバウジオシドＩ）；ｒｅｂＭ（レバウジオシドＭ）；「Ｒｅｂ  Ａ  ６０」は、ステビオシドとレバウジオシドＡのそれぞれ約１：２混合物である；ＨＴＰ（ハイスループット）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＨＰＬＣ−ＵＶ（ＨＰＬＣ−紫外可視検出器）；１Ｈ  ＮＭＲ（プロトン核磁気共鳴分光法）；ＨＳＱＣ  ＮＭＲ（異種核一量子コヒーレンス分光法（ｈｅｔｅｒｏｎｕｃｌｅａｒ  ｓｉｎｇｌｅ  ｑｕａｎｔｕｍ  ｃｏｈｅｒｅｎｃｅ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）ＮＭＲ）；ＣＯＳＹ  ＮＭＲ（同種核相関分光法（ｈｏｍｏｎｕｃｌｅａｒ  ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ  ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ）ＮＭＲ）；Ａｃｏｒｎ（Ａｃｏｒｎ  Ｎ��Ｒ、Ｌｉｖｅｒｍｏｒｅ、ＣＡ）；ＦＩＯＰＣ（陽性対照に対する改善倍率）；ＳｉｇｍａおよびＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ；Ｄｉｆｃｏ（Ｄｉｆｃｏ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、ＢＤ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ＭＩ）；Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ、Ｗｅｓｔｗｏｏｄ、ＭＡ）；ＣｈｒｏｍａＤｅｘ（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ，Ｉｎｃ．、Ｉｒｖｉｎｅ、ＣＡ）；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの一部、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）；Ａｍｒｅｓｃｏ（Ａｍｒｅｓｃｏ，ＬＬＣ、Ｓｏｌｏｎ、ＯＨ）；Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ（Ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ，Ｌｔｄ．、Ｂｅｒｋｓｈｉｒｅ、ＵＫ）；Ｖａｒｉａｎ（Ｖａｒｉａｎ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ、ＣＡ）；Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ、ＣＡ）；およびＴｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｈｏｌｌａｎｄ、ＭＩ）。
【０１８１】
（実施例１）
合成、最適化およびアッセイ
この実施例では、グルコシル化活性を有するＵＧＴ酵素の合成、最適化およびアッセイに使用する方法を説明する。
【０１８２】
遺伝子合成および最適化：
ステビオールビオシドをグルコシル化して、レバウジオシドＢにすることおよびステビオシドをグルコシル化してレバウジオシドＡにすることが報告されている、野生型Ｓｔｅｖｉａ  ｒｅｂａｕｄｉａｎａポリペプチド（配列番号２）をコードするポリヌクレオチド配列（配列番号１）（例えば、Ｒｉｃｈｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｐｌａｎｔ  Ｊ．，  ４１：５６−６７  ［２００５］を参照されたい）をコドン最適化し、配列番号３の遺伝子として合成した。この合成遺伝子（配列番号３）をｐＣＫ１１０９００ベクター系（例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２００６／０１９５９４７号を参照されたい）にクローニングし、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）において発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０は、ｌａｃプロモーターの制御下でＵＧＴ酵素を発現した。進化ラウンドは、以下の実施例で説明する通りに行った。
【０１８３】
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）の産生：
振盪フラスコ手順を使用して、本明細書に記載の生体触媒プロセスで使用される特徴付けアッセイのためのグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を生成した。酵素の振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）調製によって、ＨＴＰアッセイで使用される細胞溶解物と比較して酵素のより精製された調製物（例えば、総タンパク質の＞３０％まで）が得られ、より濃縮された酵素溶液の使用も可能になる。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉの単一コロニーを、３０μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールと１％グルコースとを含有する５ｍＬのルリア−ベルターニブロスに接種した。細胞を３０℃のインキュベーターにおいて２５０ｒｐｍで振盪しながら一晩（少なくとも１６時間）増殖させた。１Ｌフラスコ内の３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含有する２５０ｍＬのテリフィックブロス（１２ｇ／Ｌのバクト−トリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）に培養物を添加して希釈して０．２の６００ｎｍ光学密度（ＯＤ６００）にし、３０℃で増殖させた。
【０１８４】
培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８になったときに、最終濃度１ｍＭまでＩＰＴＧを添加することにより、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を誘導した。次いで、インキュベーションを一晩（少なくとも１６時間）継続した。遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）により細胞を収集し、上清を廃棄した。細胞ペレットを２体積の２５ｍＭトリエタノールアミン緩衝剤、ｐＨ７．５に再懸濁させ、標準Ｅ．ｃｏｌｉ溶解に設定して４℃で維持したＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）高圧ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）に通した。細胞デブリを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、４５分、４℃）により除去した。清澄化溶解物上清を回収し、−８０℃で凍結させ、次いで、Ｈｉｓ親和性精製し、透析して精製タンパク質を生じさせたか、または凍結乾燥させて粗タンパク質の乾燥振盪フラスコ粉末を生じさせた。
【０１８５】
ステビオシドグルコシル化についてのＳＦＰのアッセイ：
ＳＦＰを再構成して２０ｇ／Ｌの粉末を得た。次いで、これらのストックの５０μＬを、３ｍＭ  ＭｇＳＯ４および１ｍＭステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度＞９４％）と２ｍＭウリジンジホスホグルコースを伴う５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．５の２００μＬの総反応体積で、希釈した。３０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、反応を行った。
【０１８６】
ＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析：
０．２％ギ酸を伴う０．５体積／体積のアセトニトリルで上記の反応物をクエンチし、遠心分離により沈殿させた。以下の計器およびパラメーターを用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより上清中のグリコシル化ステビオシド産物を検出した：
【表１】
2021532757.tif 000005
【０１８７】
配列番号４について活性を検出した。ステビオシドのレバウジオシドＡへの高度の変換（すなわち、＞９５％）が、上記のアッセイ試料のＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析で観察された。
【０１８８】
（実施例２）
配列番号４のＧＴ改変体
この実施例では、ＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号４に由来するＧＴポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。酵素のある特定の構造的特徴に関連する位置に変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号３によりコードされるＧＴ（すなわち、配列番号４）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する第１ラウンド（「ラウンド１」）の操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。ラウンド１における活性改善に関連する変異と次いでその後の進化ラウンドにおける活性改善に関連する変異とを組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、多くの追加の進化ラウンドを行った。次いで、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）増殖、発現、溶解物調製およびアッセイを使用して、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、スクリーニングした。
【０１８９】
ＨＴＰ増殖、発現および溶解物調製
細胞を９６ウェルプレートに採取し、１％グルコースと３０μｇ／ｍＬのＣＡＭとを含有するＬＢ培地中、３０℃、２００ｒｐｍ、湿度８５％で一晩増殖させた。次いで、一晩増殖させたもの２０μＬを、３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含有する３８０μＬのＴＢ増殖培地を含有するディープウェルプレートに移し、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、１８時間、３０℃、２００ｒｐｍ、湿度８５％でインキュベートした。細胞培養物を４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離し、培地を廃棄した。このようにして得た細胞ペレットを−８０℃で凍結させ、タイタープレートシェーカーを用いて室温で２時間、低速で振盪しながら２５０μＬの溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．５中の０．５ｇ／Ｌのリゾチームおよび０．５ｇ／ＬのＰＭＢＳ）中で溶解した。次いで、プレートを４０００ｒｐｍおよび４℃で２０分間、遠心分離し、清澄化溶解物上清を、下で説明するＨＴＰアッセイ反応に使用した。
【０１９０】
ＡＤＰ−グルコースからステビオシドへのグルコース転移についてのＨＴＰアッセイ
配列番号３改変体を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いて、２００μＬ反応物中５０μＬ溶解物の溶解物負荷量で、ならびに５０％エタノール中の２０ｍＭストック溶液からの１ｍＭステビオシド（ＣｈｒｏｍａＤｅｘ、純度＞９４％）の基質負荷量、および０．５ｍＭ  ＡＤＰ−グルコース（Ｓｉｇｍａ、純度＞９３％）の補基質負荷量で、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１８時間、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．５、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０℃。０．２％ギ酸を伴う１００μＬ／ウェルのアセトニトリルで反応物をクエンチし、１０分、４℃で遠心分離し、実施例１、表１．１に記載のＨＰＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより上清を分析した。
【０１９１】
野生型ＵＧＴ７６Ｇ１（配列番号４）とＡＤＰ−グルコースの存在下でのステビオシドからのレバウジオシドＡの形成は、無酵素対照と区別できなかった。配列番号４の野生型酵素とは対照的に、ステビオシドとＡＤＰ−グルコースからレバウジオシドＡを産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドは、同定された。これらの操作されたポリペプチドを表２．１に収載する。親構築物および改変体構築物は、親和性精製のためにＮ末端ヒスチジンタグを含有したが、明確にするために、タグを付けていない参照配列と比較して変異に番号を付けた。複数の進化ラウンド中に産生された改変体の振盪フラスコ規模の培養物を、実施例１で説明したようにタンパク質精製のために増殖させた。
【０１９２】
（実施例３）
グルコシル化活性を有するグリコシルトランスフェラーゼ酵素の合成、最適化およびアッセイ
この実施例では、グルコシル化活性を有するＵＧＴ酵素の合成、最適化およびアッセイに使用する方法を説明する。
【０１９３】
遺伝子合成および最適化
ベータ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼＳｏｌａｎｕｍ  ｔｕｂｅｒｏｓｕｍをコードするポリヌクレオチド配列をコドン最適化し、配列番号１１の遺伝子として合成した。これらの合成遺伝子をｐＣＫ１１０９００ベクター系（例えば、これにより参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，７１４，４３７号を参照されたい）にクローニングし、その後、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｗ３１１０（ΔｆｈｕＡ）において発現させた。Ｅ．ｃｏｌｉ株Ｗ３１１０は、ｌａｃプロモーターの制御下でＵＧＴ酵素を発現した。
【０１９４】
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）の産生
振盪フラスコ手順を使用して、本明細書に記載の生体触媒プロセスで使用される特徴付けアッセイのためのグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を生成した。酵素の振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）調製によって、ＨＴＰアッセイで使用される細胞溶解物と比較して酵素のより精製された調製物（例えば、総タンパク質の＞３０％まで）が得られ、より濃縮された酵素溶液の使用も可能になる。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉの単一コロニーを、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと１％グルコースとを含有する５ｍＬのルリア−ベルターニブロスに接種した。細胞を３０℃のインキュベーターにおいて２５０ｒｐｍで振盪しながら一晩（少なくとも１６時間）増殖させた。１Ｌフラスコ内の３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含有する２５０ｍＬのテリフィックブロス（１２ｇ／Ｌのバクト−トリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）に培養物を添加して希釈して０．２の６００ｎｍ光学密度（ＯＤ６００）にし、３０℃で増殖させた。
【０１９５】
培養物のＯＤ６００が０．６〜０．８になったときに、最終濃度１ｍＭまでＩＰＴＧを添加することにより、グリコシルトランスフェラーゼ遺伝子の発現を誘導した。次いで、インキュベーションを一晩（少なくとも１６時間）継続した。遠心分離（５０００ｒｐｍ、１５分、４℃）により細胞を収集し、上清を廃棄した。細胞ペレットを２体積の２５ｍＭトリエタノールアミン緩衝剤、ｐＨ７．５に再懸濁させ、標準Ｅ．ｃｏｌｉ溶解に設定して４℃で維持したＭＩＣＲＯＦＬＵＩＤＩＺＥＲ（登録商標）高圧ホモジナイザー（Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ）に通した。細胞デブリを遠心分離（１０，０００ｒｐｍ、４５分、４℃）により除去した。清澄化溶解物上清を回収し、−８０℃で凍結させ、次いで、Ｈｉｓ親和性精製し、透析して精製タンパク質を生じさせたか、または凍結乾燥させて粗タンパク質の乾燥振盪フラスコ粉末を生じさせた。
【０１９６】
精製タンパク質でのレバウジオシドＡグルコシル化についてのアッセイ
先ず、５０μＬの精製タンパク質を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤ｐＨ７．５、３ｍＭ塩化マグネシウム、１ｍＭレバウジオシドＡおよび０．５ｍＭウリジンジホスホグルコースからなる２００μＬの総反応体積で、希釈した。３０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１８時間、反応を行った。煮沸した酵素反応を陰性対照として使用した。０．２％ギ酸を伴う９０μＬのアセトニトリルで１０μＬの反応物をクエンチし、遠心分離により沈殿させた。実施例１、表１．１に記載のＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより上清中のグリコシル化レバウジオシドＡ産物を検出した。不良な可溶性発現にもかかわらず、配列番号１２は、ステビオールグリコシド基質におけるβ−１，２−グルコース結合の生成への高い比活性および良好な選択性を実証した。
【０１９７】
振盪フラスコ粉末でのレバウジオシドＡグルコシル化についてのアッセイ
凍結乾燥振盪フラスコ粉末を２０ｍｇ／ｍＬに再構成した。次いで、これらのストックの１０μＬを、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２と１ｍＭレバウジオシドＡ（純度＞９７％）と２ｍＭウリジンジホスホグルコース（ＵＤＰ−グルコース）とを伴う５０ｍＭリン酸カリウム（ＫＰｈｏｓ）緩衝剤、ｐＨ７の１００μＬの総反応体積で、希釈した。４０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、反応を行った。陰性対照より高い活性が配列番号１２について検出された。レバウジオシドＡのレバウジオシドＤへの低度の変換（すなわち、＜１０％）がＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析で観察された。
【０１９８】
（実施例４）
配列番号１２のＧＴ改変体
この実施例では、ステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号１２に由来するＧＴポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。酵素の表面残基に関連する位置に変異誘発を施した改変体遺伝子の組合せライブラリーを構築することによって、配列番号１１によりコードされるＧＴ（すなわち、配列番号１２）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ステビオールグリコシドへのβ−１，２−グルコシルトランスフェラーゼ活性を有する第１ラウンド（「ラウンド１」）の操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。ラウンド１における活性改善に関連する変異と次いでその後の進化ラウンドにおける活性改善に関連する変異とを組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、多くの追加の進化ラウンドを行った。次いで、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）増殖、発現、溶解物調製およびアッセイを使用して、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、スクリーニングした。
【０１９９】
ＨＴＰ増殖、発現および溶解物調製
細胞を９６ウェルプレートに採取し、１％グルコースと３０μｇ／ｍＬのＣＡＭとを含有するＬＢ培地中、３０℃、２００ｒｐｍ、湿度８５％で一晩増殖させた。次いで、一晩増殖させたもの２０μＬを、３０μｇ／ｍＬのＣＡＭを含有する３８０μＬのＴＢ増殖培地を含有するディープウェルプレートに移し、１ｍＭ  ＩＰＴＧで誘導し、１８時間、３０℃、２００ｒｐｍ、湿度８５％でインキュベートした。細胞培養物を４０００ｒｐｍ、４℃で１０分間、遠心分離し、培地を廃棄した。このようにして得た細胞ペレットを−８０℃で凍結させ、タイタープレートシェーカーを用いて室温で２時間、低速で振盪しながら２５０μＬの溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．５中の０．５ｇ／Ｌのリゾチームおよび０．５ｇ／ＬのＰＭＢＳ）中で溶解した。次いで、プレートを４０００ｒｐｍおよび４℃で２０分間、遠心分離し、清澄化溶解物上清を、下で説明するＨＴＰアッセイ反応に使用した。
【０２００】
レバウジオシドＡグルコシル化についてのＨＴＰアッセイ
酵素改変体を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いて、１００μＬ反応物中２５μＬ溶解物の溶解物負荷量で、ならびに５０％エタノール中の２０ｍＭストック溶液からの１ｍＭレバウジオシドＡ（Ｓｉｇｍａ、純度＞９６％）の基質負荷量、および０．５ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース（Ｓｉｇｍａ、純度＞９８％）の補基質負荷量で、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら４時間、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．５、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０℃。０．２％ギ酸を伴う０．５体積／体積のアセトニトリルで反応物をクエンチし、１０分、４℃での遠心分離により沈殿させた。水で１：２０希釈した後、実施例１、表１．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより上清中のグリコシル化産物を検出した。参照骨格配列より多い量でレバウジオシドＡからレバウジオシドＤを産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定し、後続の進化ラウンドに使用した。改変体の分析のために、実施例１で説明したように凍結乾燥粉末産生のための振盪フラスコ規模の培養物を増殖させた。
【０２０１】
振盪フラスコ溶解物特徴付けアッセイおよびレバウジオシドＡグルコシル化についての分析
先ず、２５０ｍＬ振盪フラスコ培養物を増殖させ、誘導し、溶解した。細胞デブリを実施例１で説明したように遠心分離により除去し、清澄化溶解物上清を回収した。次いで、１０μＬの溶解物を、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．５と３ｍＭ  ＭｇＣｌ２と１ｍＭレバウジオシドＡ（Ｓｉｇｍａ、純度＞９６％）と２ｍＭ  ＵＤＰ−グルコース（Ｓｉｇｍａ、純度＞９８％）との１００μＬの総反応体積で、希釈した。３０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら０〜１８時間、反応を行った。０．２％ギ酸を伴う０．５体積／体積のアセトニトリルで上記の反応物をクエンチし、遠心分離により沈殿させた。水で１：２０希釈した後、実施例１、表１．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＬＣ−ＭＳ／ＭＳにより上清中のグリコシル化産物を検出した。
【０２０２】
（実施例５）
配列番号６のスクロースシンターゼ改変体
この実施例では、スクロースおよびＡＤＰからのＡＤＰ−グルコースの産生の改善のための、コドン最適化Ａｃｉｄｏｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃａｌｄｕｓスクロースシンターゼポリヌクレオチド（配列番号５）に由来するスクロースシンターゼ（ＳｕＳ）ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。酵素のある特定の構造的特徴に関連する位置に飽和変異誘発を施した、および公開データベース内のホモログからの多様性を組み換えた、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号５によりコードされるＳｕＳ（すなわち、配列番号６）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースの合成への活性が改善された第１ラウンド（「ラウンド１」）の操作されたＳｕＳ改変体ポリペプチドを得た。ラウンド１における活性改善に関連する変異と次いでその後の進化ラウンドにおける活性改善に関連する変異とを組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、多くの追加の進化ラウンドを行った。次いで、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）増殖、発現、溶解物調製およびアッセイを使用して、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、スクリーニングした。
【０２０３】
スクロースからＡＤＰへのグルコース転移についてのＨＴＰアッセイ
配列番号５改変体（すなわち、配列番号６の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いて、１００μＬ反応物中２５μＬ溶解物の溶解物負荷量で、ならびに水中の６０％ストック溶液からの３０％ｗ／ｖスクロース（Ｓｉｇｍａ）の基質負荷量、および２ｍＭ  ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ、純度＞９５％）の補基質負荷量で、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：Ｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒにおいて２時間、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝剤、ｐＨ７．５、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、３０℃。反応物を９５℃で１０分間、熱でのクエンチを行い、次いで、文献から適応させた比色Ｄ−フルクトースデヒドロゲナーゼアッセイにより分析した（例えば、Ａｍｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｊ．  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，  １４５：８１４−８２３  ［１９８１］；およびＡｍｅｙａｍａ，  Ｍｅｔｈ．  Ｅｎｚｙｍｏｌ．，  ８９：２０−２９  ［１９８２］を参照されたい）。手短に述べると、一晩酵素結合アッセイを、９６ウェルプレートにおいて、フルクトース濃度が＜１ｇ／Ｌになるように希釈した２０μＬの試料と、２０μＬの１００ｍＭフェリシアン化カリウム（Ｓｉｇｍａ  Ｐ−８１３１）と、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）  Ｘ−１００を伴うｐＨ４．６マッキルバイン緩衝剤に溶解した０．８単位／ｍＬのフルクトースデヒドロゲナーゼ（Ｓｉｇｍａ  Ｆ４８９２）１６０μＬとを用いて行った。この反応は、フルクトースをＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６に定量的に変換するものであり、したがって、６７μＬの一晩反応物を、３３μＬの停止溶液（０．３ｗ／ｖ％ドデシル硫酸ナトリウム、Ｓｉｇｍａ  Ｌ−４５０９、８．１ｖ／ｖ％リン酸、Ｓｉｇｍａ  Ｐ−６５６０、および０．５ｗ／ｖ％硫酸第二鉄、Ｓｉｇｍａ  Ｆ−１１３５）に添加し、２０分間振盪してＫ４Ｆｅ（ＣＮ）６のプルシアンブルーへの完全変換を可能ならしめ、プレートリーダーを用いてこの吸光度を６９０ｎｍの波長で読み取ることにより、Ｋ４Ｆｅ（ＣＮ）６を比色分析で定量する。一次アッセイ後、配列番号６よりフルクトース形成活性が高い、したがって化学量論的ＡＤＰ−グルコース形成活性が高い、操作されたスクロースシンターゼ（ＳｕＳ）改変体ポリペプチドを、２ｗ／ｖ％スクロース（Ｓｉｇｍａ）のより低い基質負荷および１ｍＭ  ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ、＞９５％）の補基質負荷で３連でスクリーニングした。
【０２０４】
スクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＤへのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
以下のＨＴＰ酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、１ｍＭ硫酸マグネシウムと０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームとポリミキシンＢ硫酸塩（ＰＭＢＳ）とを伴う２５０μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物をＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に添加して２０倍希釈した。次いで、１０μＬの希釈されたＳｕＳ溶解物および２ｇ／ＬのＧＴ配列番号８を、１００μＬの反応体積で、約１ｍＭレバウジオシドＤの基質負荷量ならびに１ｍＭ  ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ、＞９５％）および１０ｍＭスクロース（Ｓｉｇｍａ）の補基質負荷量と組み合わせた。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら２時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ７、３ｍＭ  ＭｇＣｌ２、５０℃。０．２％ギ酸を伴う９０μＬアセトニトリルに１０μＬアッセイ混合物を添加することにより上記反応物をクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で１０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。
【表５】
2021532757.tif 000006
【０２０５】
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）の産生
振盪フラスコ手順を使用して、本明細書に記載の生体触媒プロセスで使用される特徴付けアッセイのためのグリコシルトランスフェラーゼポリペプチド振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を生成した。酵素の振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）調製によって、ＨＴＰアッセイで使用される細胞溶解物と比較して酵素のより精製された調製物（例えば、総タンパク質の＞３０％まで）が得られ、より濃縮された酵素溶液の使用も可能になる。目的の操作されたポリペプチドをコードするプラスミドを含有するＥ．ｃｏｌｉの単一コロニーを、３０μｇ／ｍｌのクロラムフェニコールと１％グルコースとを含有する５ｍＬのルリア−ベルターニブロスに接種した。細胞を３０℃のインキュベーターにおいて２５０ｒｐｍで振盪しながら一晩（少なくとも１６時間）増殖させた。１Ｌフラスコ内の３０μｇ／ｍｌのＣＡＭを含有する２５０ｍＬのテリフィックブロス（１２ｇ／Ｌのバクト−トリプトン、２４ｇ／Ｌの酵母抽出物、４ｍＬ／Ｌのグリセロール、６５ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７．０、１ｍＭ  ＭｇＳＯ４）に培養物を添加して希釈して０．２の６００ｎｍ光学密度（ＯＤ６００）にし、３０℃で増殖させた。
【０２０６】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびスクロースからレバウジオシドＤへのグルコシル転移についての分析
レバウジオシドＤからのレバウジオシドＭの形成を助長するためのスクロースおよびＡＤＰに対する操作されたＳｕＳ改変体の活性を特徴付けるために実験を行った。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ７と３ｍＭ塩化マグネシウムと１ｇ／ＬのレバウジオシドＤと１０ｍＭスクロースと１ｍＭ  ＡＤＰと２ｇ／ＬのＧＴ配列番号１０とを含有する１００μＬの総反応体積に０．１２５ｇ／Ｌの濃度で振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を添加した。反応を５０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１時間行った。０．２％ギ酸を伴う９０μＬアセトニトリルに１０μＬの反応混合物を添加することにより反応物をクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で１０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシドについて分析した。これらの結果に基づいて、酵素を最適化するために追加の進化ラウンドを行った。
【０２０７】
（実施例６）
スクロースシンターゼ改変体
前の進化ラウンドにおける活性改善に関連する変異を組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより、スクロースシンターゼ酵素の定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースの生成への活性を有する追加の反復ラウンドの操作されたＳｕＳ改変体ポリペプチドを得た。
【０２０８】
スクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡへのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
以下のＨＴＰ酵素結合アッセイを使用して、組合せライブラリーをスクリーニングした。ペレット状Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、１ｍＭ硫酸マグネシウムと０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームとポリミキシンＢ硫酸塩（ＰＭＢＳ）とを伴う４００μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物をＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５に添加して約９０倍希釈した。次いで、１０μＬの希釈されたＳｕＳ溶解物および１ｇ／ＬのＧＴ配列番号１４を、１００μＬの反応体積で、４．５〜７．５ｍＭレバウジオシドＡ９７の基質負荷量ならびに０．２〜０．２５ｍＭ  ＡＤＰ（Ｓｉｇｍａ、＞９５％）および３０ｍＭスクロース（Ｓｉｇｍａ）の補基質負荷量と組み合わせた。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら２時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、５５℃。上記の反応物を、９０〜１９０μＬの水に１０μＬのアッセイを添加することにより可溶化し、０．２％ギ酸を伴う９０μＬアセトニトリルに１０μＬの可溶化アッセイを添加することによりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で４．４〜６．７倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。分析後、ＧＴと結合してレバウジオシドＡに対する活性改善を示した操作されたＳｕＳ改変体ポリペプチドを同定した。
【０２０９】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびスクロースからレバウジオシドＡへのグルコシル転移についての分析
レバウジオシドＡからのレバウジオシドＤの形成を助長するためのスクロースおよびＡＤＰに対する操作されたＳｕＳ改変体の活性を特徴付けるために実験を行った。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と７．５ｍＭレバウジオシドＡ９７と３０ｍＭスクロースと０．２ｍＭ  ＡＤＰと１ｇ／ＬのＧＴ配列番号１４とを含有する１００μＬの総反応体積に、０．０２ｇ／Ｌの濃度で振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を添加した。反応を５０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１時間行った。反応物を水に添加して２０倍希釈することにより可溶化し、０．２％ギ酸を伴う９０μＬアセトニトリルに１０μＬの希釈された反応物を添加することによりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で４．４倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシドについて分析した。活性が参照配列より高く、レバウジオシドＡから産生されるレバウジオシドＤがより高レベルである、改変体を、さらなる定向進化のために、スクロースからＡＤＰにグルコースを転移させる再利用反応の触媒作用のために選択した。
【０２１０】
（実施例７）
配列番号２０のベータ−１，３−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号８５９８に由来するβ１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号１９によりコードされるＧＴ（すなわち、配列番号２０）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの７２種の操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。
【０２１１】
スクロースからＡＤＰへのグルコース転移、次いでＡＤＰ−グルコースからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰアッセイ
配列番号１９改変体（すなわち、配列番号２０の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例６で説明したように清澄化し、次いで、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６に添加して１０倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１時間、７５℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。１００μＬの反応物に１０μＬのプレインキュベートされた溶解物を用い、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％基質、０．０２５ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質、０．０５ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８、０．１２ｇ／Ｌのβ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼ（β１２ＧＴ）配列番号１６、および４０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＲａｐｉｄＦｉｒｅ−ＭＳ／ＭＳにより試料を分析した。ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを用いてレバウジオシドＡ６０からレバウジオシドＭを配列番号２０より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表７．１および表７．２に収載する。配列番号２０と比較して表７．３に示す改変体の分析のために、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表７−１】
2021532757.tif 000007
【表７−２】
2021532757.tif 000008
【表７−３】
2021532757.tif 000009
【表７−４】
2021532757.tif 000010
【０２１２】
ＳＦＰ特徴付けアッセイ、ならびにスクロースからＡＤＰへのグルコシル転移、次いでＡＤＰ−グルコースからステビオシドおよびレバウジオシドＤへのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を２０ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と１５ｍＭステビオシド（純度＞９５％）またはレバウジオシドＤと０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０５ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８と３７．５ｍＭスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中、０．００５〜０．１５ｇ／ＬのＳＦＰに希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら４時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で１５倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０５ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８と０．１２ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１６と３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中、０．０１〜０．３ｇ／ＬのＳＦＰを用いて、ワンポット反応を行った。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２０倍希釈し、２４時間、７５．１℃でインキュベートした後の１０μＬの粗振盪フラスコ溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
【表７−５】
2021532757.tif 000011
【０２１３】
これらの実験では、表７．３中の少なくとも４つの改変体は、レバウジオシドＡ６０から配列番号２０より多くのレバウジオシドＭを産生し、３つの改変体は、ステビオシドからより多くのレバウジオシドＡ、およびレバウジオシドＤからレバウジオシドＭも産生した。全ての改変体は、配列番号２０より熱安定性が低かった。配列番号３６を、ワンポットアッセイでのその優れた性能および熱安定性のわずかな低下のため、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２１４】
（実施例８）
配列番号３６のベータ−１，３−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号３６に由来するβ１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびＮ末端コード領域を標的化した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号３５によりコードされるＧＴ（すなわち、配列番号３６）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの５８種の操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。
【０２１５】
スクロースからＡＤＰへのグルコース転移、次いでＡＤＰ−グルコースからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰアッセイ
配列番号３５（すなわち、配列番号３６の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例６で説明したように清澄化し、次いで、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６に添加して２０倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら２時間、７５℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。１００μＬの反応物に１０μＬのプレインキュベートされた溶解物を用い、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％基質、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質、０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２２、０．０８ｇ／Ｌのβ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼ（β１２ＧＴ）配列番号８５８、および３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＲａｐｉｄＦｉｒｅ−ＭＳ／ＭＳにより試料を分析した。ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを用いてレバウジオシドＡ６０からレバウジオシドＭを配列番号３６より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表８．１に収載する。修飾Ｎ末端ＤＮＡコード配列を有するが、アミノ酸変異を有さない、４つの追加の改変体も、配列番号２７７／２７８、２７９／２８０、２８１／２８２、および２８３／２８４で同定した。配列番号３６と比較して表８．２に示す改変体の分析のために、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表８−１】
2021532757.tif 000012
【表８−２】
2021532757.tif 000013
【０２１６】
ＳＦＰ特徴付けアッセイ、ならびにスクロースからＡＤＰへのグルコシル転移、次いでＡＤＰ−グルコースからステビオシドおよびレバウジオシドＤへのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を２０ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と１５ｍＭステビオシド（純度＞９５％）またはレバウジオシドＤと０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０５ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２２と３７．５ｍＭスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中、０．００５〜０．１５ｇ／ＬのＳＦＰに希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら４時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で１５倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２２と０．０８ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号８５８と３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中、０．０１〜０．３ｇ／ＬのＳＦＰを用いて、ワンポット反応を行った。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２０倍希釈し、２４時間、７５．２℃でインキュベートした後の１０μＬの粗振盪フラスコ溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
【表８−３】
2021532757.tif 000014
【表８−４】
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【０２１７】
これらの実験では、表８．２中の２つのＮ末端修飾配列は、配列番号３６と同じことを果たし、６つの組合せ改変体は、３つ全ての基質に対してより良好に動作した。配列番号１７４を、３つ全ての基質に対するその優れた性能のため、さらなる酵素操作のための出発点として選択した。
【０２１８】
（実施例９）
配列番号１７４のベータ−１，３−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号１７４に由来するβ１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号１７３によりコードされるＧＴ（すなわち、配列番号１７４）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの６０種の操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。
【０２１９】
スクロースからＡＤＰへのグルコース転移、次いでＡＤＰ−グルコースからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰアッセイ
配列番号１７３改変体（すなわち、配列番号１７４の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例６で説明したように清澄化し、次いで、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６に添加して２５〜３３．３倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら２時間、７５℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。１００μＬの反応物に１０μＬのプレインキュベートされた溶解物を用い、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％基質、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質、０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１６５２、０．０８ｇ／Ｌのβ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼ（β１２ＧＴ）配列番号８５８、および３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＲａｐｉｄＦｉｒｅ−ＭＳ／ＭＳにより試料を分析した。ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを用いてレバウジオシドＡ６０からレバウジオシドＭを配列番号１７４より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表９．１および表９．２に収載する。加えて、表９．２に収載する飽和変異誘発改変体をさらに４つの条件下でアッセイした。１つは、１６時間、７０℃でインキュベートしたことを除き、上記のアッセイと同じであった。別の１つは、４０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０をリン酸カリウム希釈緩衝剤のプレインキュベーションに含めたことを除き、上記と同じであった。他の２つは、清澄化溶解物を５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６に添加して２５倍希釈し、７５℃で２時間プレインキュベートし、次いで、１０倍希釈して、１５ｍＭステビオールグリコシド９５％またはレバウジオシドＤと３０ｇ／Ｌのスクロースと０．０２ｇ／ＬのＡＤＰと５０ｍＭリン酸カリウムｐＨ６と０．０３ｇ／Ｌ  ＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１６５２とを含有する１００μＬの反応物にした、単一基質反応条件であった。これらの反応物を１６時間、６０℃でインキュベートし、水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による５倍希釈によりクエンチし、低温遠心分離により沈殿させた。次いで、上清を水で１５倍希釈し、ＲａｐｉｄＦｉｒｅ−ＭＳ／ＭＳにより分析した。配列番号１７４と比較して表９．３に示す改変体の分析のために、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表９−１】
2021532757.tif 000016
【表９−２】
2021532757.tif 000017
【表９−３】
2021532757.tif 000018
【表９−４】
2021532757.tif 000019
【０２２０】
ＳＦＰ特徴付けアッセイ、ならびにスクロースからＡＤＰへのグルコシル転移、次いでＡＤＰ−グルコースからステビオシドおよびレバウジオシドＤへのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を２０ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と１５ｍＭステビオシド（純度＞９５％）またはレバウジオシドＤと０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１６５２と３７．５ｍＭスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中、０．００５〜０．１５ｇ／ＬのＳＦＰに希釈した。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら４時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で１５倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１６５２と０．０８ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号８５８と３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中の０．０１〜０．３ｇ／ＬのＳＦＰを用いて、ワンポット反応を行った。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２０倍希釈し、２４時間、７５．２℃でインキュベートした後の１０μＬの粗振盪フラスコ溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
【表９−５】
2021532757.tif 000020
【表９−６】
2021532757.tif 000021
【０２２１】
これらの実験では、表９．３中の５つの改変体は、レバウジオシドＡ６０から配列番号１７４より多くのレバウジオシドＭを産生し、４つの改変体は、ステビオシドからより多くのレバウジオシドＡも産生し、これらの３つは、レバウジオシドＤからより多くのレバウジオシドＭも産生した。いくつかの改変体は、配列番号１９０より熱安定性が有意に高かった。最も熱安定性の高い改変体である配列番号３５０を、実施例８からの最良のＮ末端ＤＮＡ配列（配列番号２７９／２８０）を用いて再クローニングし、配列番号４０６であるこの酵素を、さらなる酵素操作の出発点として使用した。
【０２２２】
（実施例１０）
配列番号４０６のベータ−１，３−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化改善のための、配列番号４０６に由来するβ１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号４０５によりコードされるＧＴ（すなわち、配列番号４０６）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの１６種の操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。
【０２２３】
スクロースからＡＤＰへのグルコース転移、次いでＡＤＰ−グルコースからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰアッセイ
配列番号４０５改変体（すなわち、配列番号４０６の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例６で説明したように清澄化し、次いで、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６に添加して１５倍希釈し、別途、４０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％基質を伴う同じ緩衝剤に添加して１５倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら２時間、７５℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。１００μＬの反応物に１０μＬのプレインキュベートされた溶解物を用い、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％基質、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質、０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８２２、０．０６ｇ／Ｌのβ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼ（β１２ＧＴ）配列番号９９４、および３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＲａｐｉｄＦｉｒｅ−ＭＳ／ＭＳにより試料を分析した。ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを用いてレバウジオシドＡ６０からレバウジオシドＭを配列番号４０６より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表１０．１に収載する。
【表１０】
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【０２２４】
表１０．１に収載した改変体からの配列番号４０８を、レバウジオシドＡ６０％を伴うおよび伴わないリン酸カリウム緩衝剤中でのプレインキュベートに対する安定性の改善、ならびに２つの変異Ａ８５ＶおよびＥ２５９Ｔに関連する利点に基づいて、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２２５】
（実施例１１）
配列番号４０８のベータ−１，３−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号４０８に由来するβ１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号４０７によりコードされるＧＴ（すなわち、配列番号４０８）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの３９種の操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。
【０２２６】
スクロースからのＡＤＰへのグルコース転移、次いでＡＤＰ−グルコースからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰアッセイ
配列番号４０７改変体（すなわち、配列番号４０８の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例６で説明したように清澄化し、次いで、６０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６に添加して２０倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら２時間、７５℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。１００μＬの反応物に１０μＬのプレインキュベートされた溶解物を用い、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％基質、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質、０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８２２、０．０６ｇ／Ｌのβ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼ（β１２ＧＴ）配列番号１０８０、および３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＲａｐｉｄＦｉｒｅ−ＭＳ／ＭＳにより試料を分析した。ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを用いてレバウジオシドＡ６０からレバウジオシドＭを配列番号４０８より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表１１．１および表１１．２に収載する。配列番号４０８と比較して表１１．３に示す改変体の分析のために、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表１１−１】
2021532757.tif 000023
【表１１−２】
2021532757.tif 000024
【表１１−３】
2021532757.tif 000025
【０２２７】
ＳＦＰ特徴付けアッセイ、ならびにスクロースからＡＤＰへのグルコシル転移、次いでＡＤＰ−グルコースからステビオシドおよびレバウジオシドＤへのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を２０ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と１５ｍＭステビオシド（純度＞９５％）またはレバウジオシドＤと０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８２２と３７．５ｍＭスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中、０．００５〜０．１５ｇ／ＬのＳＦＰに希釈した。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら４時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で１５倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８２２と０．０６ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１０８０と３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中の０．０１〜０．３ｇ／ＬのＳＦＰを用いて、ワンポット反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、７５℃で２時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２０倍希釈し、２４時間、７５．２℃でインキュベートした後の１０μＬの粗振盪フラスコ溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
【表１１−４】
2021532757.tif 000026
【０２２８】
これらの実験では、表１１．３中の４つ全ての改変体は、レバウジオシドＡ６０から配列番号４０８より多くのレバウジオシドＭ、ステビオシドからより多くのレバウジオシドＡ、およびレバウジオシドＤからより多くのレバウジオシドＭを産生した。最も熱安定性の高い改変体である配列番号４４０を、さらなる酵素操作の出発点として使用した。
【０２２９】
（実施例１２）
配列番号４４０のベータ−１，３−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号４４０に由来するβ１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号４３９によりコードされるＧＴ（すなわち、配列番号４４０）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの３６種の操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。
【０２３０】
スクロースからＡＤＰへのグルコース転移、次いでＡＤＰ−グルコースからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰアッセイ
配列番号４４０改変体を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例６で説明したように清澄化し、次いで、８０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６に添加して２０倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら２時間、７５℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。１００μＬの反応物に１０μＬのプレインキュベートされた溶解物を用い、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％基質、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質、０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８２２、０．０６ｇ／Ｌのβ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼ（β１２ＧＴ）配列番号１０８０、および３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＲａｐｉｄＦｉｒｅ−ＭＳ／ＭＳにより試料を分析した。ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを用いてレバウジオシドＡ６０からレバウジオシドＭを配列番号４４０より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表１２．１および表１２．２に収載する。配列番号４４０と比較して表１２．３に示す改変体の分析のために、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表１２−１】
2021532757.tif 000027
【表１２−２】
2021532757.tif 000028
【表１２−３】
2021532757.tif 000029
【表１２−４】
2021532757.tif 000030
【０２３１】
ＳＦＰ特徴付けアッセイ、ならびにスクロースからＡＤＰへのグルコシル転移、次いでＡＤＰ−グルコースからステビオシドおよびレバウジオシドＤへのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を２０ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と１５ｍＭステビオシド（純度＞９５％）またはレバウジオシドＤと０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８２２と３７．５ｍＭスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中、０．００５〜０．１５ｇ／ＬのＳＦＰに希釈した。Ｔｈｅｒｍｏｔｒｏｎ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら４時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で１５倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８２２と０．０６ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１０８０と３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中の０．０１〜０．３ｇ／ＬのＳＦＰを用いて、ワンポット反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、８０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％と共に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中で２時間、７５℃でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。７８．５℃で２４時間インキュベートした５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中の１．５ｍｇ／ｍＬの振盪フラスコ粉末１０μＬを用いて、類似のワンポット反応も行った。
【表１２−５】
2021532757.tif 000031
【表１２−６】
2021532757.tif 000032
【０２３２】
これらの実験では、表１２．３中の８つ全ての改変体は、配列番号４４０より多くのレバウジオシドＭをレバウジオシドＡ６０からおよびレバウジオシドＤから産生した。改変体の全てはまた、レバウジオシドＡを形成するためのステビオシドのグルコシル化を触媒する点で活性が低かった。３つの基質に対して最も活性の高い改変体である配列番号５２０を、さらなる酵素操作の出発点として使用した。
【０２３３】
（実施例１３）
配列番号５２０のベータ−１，３−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号５２０に由来するβ１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号５１９によりコードされるＧＴ（すなわち、配列番号５２０）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの４４種の操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。
【０２３４】
スクロースからＡＤＰへのグルコース転移、次いでＡＤＰ−グルコースからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰアッセイ
配列番号５１９改変体（すなわち、配列番号５２０の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例６で説明したように清澄化し、次いで、１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６に添加して４９倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら２時間、７５℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。１００μＬの反応物に１０μＬのプレインキュベートされた溶解物を用い、４０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％基質、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質、０．０６ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２１８２、０．１２ｇ／Ｌのβ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼ（β１２ＧＴ）配列番号１２１６、および６０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を水での４０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＲａｐｉｄＦｉｒｅ−ＭＳ／ＭＳにより試料を分析した。ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを用いてレバウジオシドＡ６０からレバウジオシドＭを配列番号５２０より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表１３．１および表１３．２に収載する。配列番号５２０と比較して表１３．３に示す改変体の分析のために、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表１３−１】
2021532757.tif 000033
【表１３−２】
2021532757.tif 000034
【表１３−３】
2021532757.tif 000035
【０２３５】
ＳＦＰ特徴付けアッセイ、ならびにスクロースからＡＤＰへのグルコシル転移、次いでＡＤＰ−グルコースからステビオシドおよびレバウジオシドＤへのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を２０ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と１５ｍＭステビオシド（純度＞９５％）またはレバウジオシドＤと０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２１８２と３７．５ｍＭスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中、０．００５〜０．１５ｇ／ＬのＳＦＰに希釈した。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら４時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で１５倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と４０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２１８２と０．１２ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１２１６と６０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中の０．０１〜０．３ｇ／ＬのＳＦＰを用いて、ワンポット反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％と共に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中で２時間、７５℃でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での４０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２５倍希釈して２４時間、７５．２℃でインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
【表１３−４】
2021532757.tif 000036
【表１３−５】
2021532757.tif 000037
【０２３６】
これらの実験では、表１３．３中の７つ全ての改変体は、配列番号５２０より、多くのレバウジオシドＭをレバウジオシドＡ６０からおよびレバウジオシドＤから、ならびに多くのレバウジオシドＡをステビオシドから産生した。４つの改変体は、配列番号５２０と同様の熱安定性を有した。プレインキュベーションなしでステビオシドおよびＲｅｂＡ６０に対して最も高い活性を有する改変体である配列番号６２６を、さらなる酵素操作の出発点として使用した。
【０２３７】
（実施例１４）
配列番号６２６のベータ−１，３−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号６２６に由来するβ１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた、およびある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した、改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号６２５によりコードされるＧＴ（すなわち、配列番号６２６）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの４３種の操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。
【０２３８】
スクロースからＡＤＰへのグルコース転移、次いでＡＤＰ−グルコースからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰアッセイ
配列番号６２５改変体（すなわち、配列番号６２６の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例６で説明したように清澄化し、次いで、１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６に添加して１００倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら２時間、７５℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。１００μＬの反応物に１０μＬのプレインキュベートされた溶解物を用い、４０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％基質、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質、０．０６ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２１８２、０．０９ｇ／Ｌのβ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼ（β１２ＧＴ）配列番号１４８８、および６０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を水での４０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＲａｐｉｄＦｉｒｅ−ＭＳ／ＭＳにより試料を分析した。ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを用いてレバウジオシドＡ６０からレバウジオシドＭを配列番号６２６より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表１４．１および表１４．２に収載する。配列番号６２６と比較して表１４．３に示す改変体の分析のために、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表１４−１】
2021532757.tif 000038
【表１４−２】
2021532757.tif 000039
【表１４−３】
2021532757.tif 000040
【表１４−４】
2021532757.tif 000041
【０２３９】
ＳＦＰ特徴付けアッセイ、ならびにスクロースからＡＤＰへのグルコシル転移、次いでＡＤＰ−グルコースからステビオシドおよびレバウジオシドＤへのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を２０ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と１５ｍＭステビオシド（純度＞９５％）またはレバウジオシドＤと０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２１８２と３７．５ｍＭスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中、０．００５〜０．１５ｇ／ＬのＳＦＰに希釈した。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら４時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で１５倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と５０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０と０．０２５ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０７５ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２１８２と０．０９ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１４８８と７５ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中の０．０１〜０．３ｇ／ＬのＳＦＰを用いて、ワンポット反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％と共に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中で２時間、７５℃でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での５０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２５倍希釈して２４時間、７５．２℃でインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
【表１４−５】
2021532757.tif 000042
【表１４−６】
2021532757.tif 000043
【０２４０】
これらの実験では、表１４．３中の５つの改変体は、配列番号６２６より多くのレバウジオシドＭをレバウジオシドＡ６０から産生した。これらのうち、配列番号６７８である１つの改変体は、ステビオシドのレバウジオシドＡへのグルコシル化およびレバウジオシドＤのレバウジオシドＭへのグルコシル化に対する触媒作用も改善され、配列番号６２６より熱安定性が高かった。配列番号６７８であるこの活性かつ熱安定の改変体を、さらなる酵素操作の出発点として使用した。
【０２４１】
（実施例１５）
配列番号６７８のベータ−１，３−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号６７８に由来するβ１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号６７７によりコードされるＧＴ（すなわち、配列番号６７８）の定向進化を行った。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの４７種の操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。
【０２４２】
スクロースからＡＤＰへのグルコース転移、次いでＡＤＰ−グルコースからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰアッセイ
配列番号６７７改変体（すなわち、配列番号６７８の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。ペレットを溶解し、溶解物を実施例６で説明したように清澄化し、次いで、１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６に添加して７０倍希釈した。溶解物を熱でチャレンジするために、ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら２時間、７５℃でそれらの溶解物をプレインキュベートした。１００μＬの反応物に１０μＬのプレインキュベートされた溶解物を用い、５０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％基質、０．０２５ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質、０．０７５ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２３２２、０．０９ｇ／Ｌのβ−１，２−グリコシルトランスフェラーゼ（β１２ＧＴ）配列番号１４８８、および７５ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を水での５０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＲａｐｉｄＦｉｒｅ−ＭＳ／ＭＳにより試料を分析した。ｉｎ  ｓｉｔｕで合成されるＡＤＰ−グルコースを用いてレバウジオシドＡ６０からレバウジオシドＭを配列番号６７８より大量に産生するグリコシルトランスフェラーゼ改変体ポリペプチドを同定した。これらの操作されたポリペプチドを表１５．１に収載する。配列番号６７８と比較して表１５．２に示す改変体の分析のために、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、清澄化し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表１５−１】
2021532757.tif 000044
【表１５−２】
2021532757.tif 000045
【表１５−３】
2021532757.tif 000046
【０２４３】
ＳＦＰ特徴付けアッセイ、ならびにスクロースからＡＤＰへのグルコシル転移、次いでＡＤＰ−グルコースからステビオシドおよびレバウジオシドＤへのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を２０ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と１５ｍＭステビオシド（純度＞９５％）またはレバウジオシドＤまたはレバウジオシドＥ（β１，２ＧＴで処理したステビオシドから社内で調製した）と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．０２５ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２３２２と３７．５ｍＭスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中、０．０１２５〜０．２ｇ／ＬのＳＦＰに希釈した。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら４時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で１５倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０と０．０５ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と０．２ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２３２２と０．２ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１５１６と１５０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）との１００μＬの総反応体積中の０．０１２５〜０．２ｇ／ＬのＳＦＰを用いて、ワンポット反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％と共に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中で２時間、７５℃でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６時間、６０℃で反応物をインキュベートした。反応物を水での１００倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２５倍希釈して２４時間、７５．２℃でインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポット反応も行った。
【表１５−４】
2021532757.tif 000047
【０２４４】
これらの実験では、表１５．２中の３つの改変体は、配列番号６７８より多くのレバウジオシドＭをレバウジオシドＡ６０から産生した。これらのうち、配列番号７６８である１つの改変体は、熱安定性が配列番号６７８と少なくとも同様でもあった。したがって、配列番号７６８を、ＡＤＰ−グルコースからステビオシドおよびレバウジオシドＤへの、それぞれレバウジオシドＡおよびレバウジオシドＭの形成のための、グリコシル転移を触媒するために最良の酵素として、選択した。
【０２４５】
（実施例１６）
配列番号２４のベータ−１，２−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号２４に由来するＧＴポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号２３によりコードされるＧＴの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換え、および酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから１６種の操作された改変体を同定し（表１６．１）、飽和変異誘発ライブラリーから５１種を同定した（表１６．２）。
【０２４６】
スクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
配列番号２３改変体（すなわち、配列番号２４の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、４００μＬであり、溶解物を５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０に添加して１５０倍希釈し、１時間、７５℃でプレインキュベートした。次いで、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％（ＲｅｂＡ６０）基質と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と３０ｇ／Ｌのスクロースとを伴う１００μＬの反応体積中の、１０μＬの希釈された溶解物、０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２２および０．１ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号２０を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を、水への添加による２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により２０倍希釈した。ＲｅｂＡ６０に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表１６．１および１６．２に収載する。表１６．３に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表１６−１】
2021532757.tif 000048
【表１６−２】
2021532757.tif 000049
【表１６−３】
2021532757.tif 000050
【表１６−４】
2021532757.tif 000051
【表１６−５】
2021532757.tif 000052
【０２４７】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を４ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ９７（単一基質）またはＲｅｂＡ６０（ワンポット）と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰと２０（単一基質）または３０ｇ／Ｌ（ワンポット）のスクロースと０．０４ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２２と、ワンポット反応についてのみ、０．１５ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号３６とを含有する１００μＬの総反応体積中、０．００１３〜０．０４ｇ／Ｌに希釈した。６０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで４時間（単一基質）または１６〜１８時間（ワンポット）、反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、７５℃で１時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２００倍希釈して２４時間、６６．２℃でインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いて、類似の単一基質レバウジオシドＡ反応も行った。０．０１ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドＤおよびワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表１６．３に示す。
【表１６−６】
2021532757.tif 000053
【表１６−７】
2021532757.tif 000054
【０２４８】
これらの実験では、表１６．３中の３つの改変体は、配列番号２４と比較して、レバウジオシドＡのレバウジオシドＤへのグルコシル化に対する触媒作用、およびレバウジオシドＡ６０％のレバウジオシドＭへの変換に関与するβ１，２−グルコシル化に対する触媒作用が改善された。これらの改変体のうちの２つは、配列番号２４より熱安定性も高かった。これらのうち、プレインキュベートして最も改善された改変体である配列番号８５８を、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２４９】
（実施例１７）
配列番号８５８のベータ−１，２−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号８５８に由来するＧＴポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号８５７によりコードされるＧＴの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。４４種の操作された改変体を組合せライブラリーから同定した（表１７．１）。
【０２５０】
スクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
配列番号８５７改変体（すなわち、配列番号８５８の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、４００μＬであり、溶解物を５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０に添加して２００倍希釈し、２時間、７５℃でプレインキュベートした。次いで、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％（ＲｅｂＡ６０）基質と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と３０ｇ／Ｌのスクロースとを伴う１００μＬの反応体積中の、１０μＬの希釈された溶解物、０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１６５２および０．１ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号１７４を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を、水への添加による２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により２０倍希釈した。ＲｅｂＡ６０に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表１７．１に収載する。表１７．２に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表１７−１】
2021532757.tif 000055
【表１７−２】
2021532757.tif 000056
【０２５１】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を４ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ９７（単一基質）またはＲｅｂＡ６０（ワンポット）と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰと２０（単一基質）または３０ｇ／Ｌ（ワンポット）のスクロースと０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１６５２と、ワンポット反応についてのみ、０．１ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号１７４とを含有する１００μＬの総反応体積中、０．００１３〜０．０４ｇ／Ｌに希釈した。６０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで４時間（単一基質）または１６〜１８時間（ワンポット）、反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、７５℃で２時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で７０倍希釈して２４時間、７１．８℃でインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いて、類似の単一基質レバウジオシドＡ反応も行った。０．００５ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドＤおよびワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表１７．２に示す。
【表１７−３】
2021532757.tif 000057
【０２５２】
これらの実験では、表１７．２中の８つ全ての改変体は、配列番号８５８と比較して、レバウジオシドＡのレバウジオシドＤへのグルコシル化に対する触媒作用、およびレバウジオシドＡ６０％のレバウジオシドＭへの変換に関与するβ１，２−グルコシル化に対する触媒作用が改善された。両方の基質に対して最も活性の高い改変体である配列番号９９４を、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２５３】
（実施例１８）
配列番号９９４のベータ−１，２−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号９９４に由来するＧＴポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号９９４によりコードされるＧＴの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換え、および酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから１９種の操作された改変体を同定し（表１８．１）、飽和変異誘発ライブラリーから２５種を同定した（表１８．２）。
【０２５４】
スクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
配列番号９９４改変体（すなわち、配列番号９９４の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、４００μＬであり、溶解物を、２０ｇ／Ｌ（組合せライブラリー）または３０ｇ／Ｌ（飽和変異誘発ライブラリー）レバウジオシドＡ６０％を伴うまたは伴わない５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０に添加して１００倍希釈し、２時間、７５℃でプレインキュベートした。次いで、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％（ＲｅｂＡ６０）基質と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と３０ｇ／Ｌのスクロースとを伴う１００μＬの反応体積中の、１０μＬの希釈された溶解物、０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８２２および０．１ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号３５０を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を、水への添加による２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により２０倍希釈した。ＲｅｂＡ６０に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表１８．１および９０．２に収載する。表１８．３に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表１８−１】
2021532757.tif 000058
【表１８−２】
2021532757.tif 000059
【表１８−３】
2021532757.tif 000060
【表１８−４】
2021532757.tif 000061
【０２５５】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を４ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ９７（単一基質）またはＲｅｂＡ６０（ワンポット）と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰと２０（単一基質）または３０ｇ／Ｌ（ワンポット）のスクロースと０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８２２と、ワンポット反応についてのみ、０．１ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号３５０とを含有する１００μＬの総反応体積中、０．００１３〜０．０４ｇ／Ｌに希釈した。６０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで４時間（単一基質）または１６〜１８時間（ワンポット）、反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、７５℃で２時間、１０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％と共に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、１０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で７０倍希釈して２４時間、７１．８℃でインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポットＲｅｂＡ６０反応も行った。０．００５ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドＤおよびワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表１８．３に示す。
【表１８−５】
2021532757.tif 000062
【０２５６】
これらの実験では、表１８．３中の３つの改変体は、プレインキュベーション後に配列番号９９４と比較して、レバウジオシドＡのレバウジオシドＤへのグルコシル化に対する触媒作用が有意に改善された。最も熱安定性の高い改変体である配列番号１０８０を、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２５７】
（実施例１９）
配列番号１０８０のベータ−１，２−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号１０８０に由来するＧＴポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号１０７９によりコードされるＧＴの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換え、および酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから３３種の操作された改変体を同定し（表１９．１）、飽和変異誘発ライブラリーから３８種を同定した（表１９．２）。
【０２５８】
スクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
配列番号１０７９改変体（すなわち、配列番号１０８０の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、４００μＬであり、溶解物を、３０ｇ／Ｌ（組合せライブラリー）または１０ｇ／Ｌ（飽和変異誘発再試験）レバウジオシドＡ６０％を伴う５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０に添加して１００倍希釈し、２時間、７５℃でプレインキュベートした。次いで、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％（ＲｅｂＡ６０）基質と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と３０ｇ／Ｌのスクロースとを伴う１００μＬの反応体積中の、１０μＬの希釈された溶解物、０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８２２および０．１ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号３５０を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を、水への添加による２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により２０倍希釈した。ＲｅｂＡ６０に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表１９．１および１９．２に収載する。表１９．３に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表１９−１】
2021532757.tif 000063
【表１９−２】
2021532757.tif 000064
【表１９−３】
2021532757.tif 000065
【表１９−４】
2021532757.tif 000066
【表１９−５】
2021532757.tif 000067
【０２５９】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を４ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ９７もしくはステビオールグリコシド９５％（単一基質）またはＲｅｂＡ６０（ワンポット）と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰと２０（単一基質）または３０ｇ／Ｌ（ワンポット）のスクロースと０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号１８２２と、ワンポット反応についてのみ、０．１ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号４４０とを含有する１００μＬの総反応体積中、０．００１３〜０．０４ｇ／Ｌに希釈した。６０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで４時間（単一基質）または１６〜１８時間（ワンポット）、反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、７５℃で２時間、３０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％と共に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、３０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で７０倍希釈して２４時間、７１．８℃でインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポットＲｅｂＡ６０反応も行った。０．０１ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＥならびにワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表１９．３に示す。
【表１９−６】
2021532757.tif 000068
【０２６０】
これらの実験では、表１９．３中の２つの改変体は、配列番号１０８０と比較して、プレインキュベートせずに同様の活性、およびプレインキュベートするとより大きい活性を有した。より熱安定性の高い改変体である配列番号１２１６を、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２６１】
（実施例２０）
配列番号１２１６のベータ−１，２−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号１２１６に由来するＧＴポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号１２１５によりコードされるＧＴの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換え、および酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドへのグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから９１種の操作された改変体を同定し（表２０．１）、飽和変異誘発ライブラリーから１１種を同定した（表２０．２）。
【０２６２】
スクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
配列番号１２１５改変体（すなわち、配列番号１２１６の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、４００μＬであり、溶解物を、６０ｇ／Ｌ（組合せライブラリー）または８０ｇ／Ｌ（飽和変異誘発再試験）レバウジオシドＡ６０％を伴う５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０に添加して６０倍希釈し、２時間、７５℃でプレインキュベートした。次いで、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％（ＲｅｂＡ６０）基質と０．０１ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と３０ｇ／Ｌのスクロースとを伴う１００μＬの反応体積中の、１０μＬの希釈された溶解物、０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２１８２および０．１ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号５２０を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を、水への添加による２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により２０倍希釈した。ＲｅｂＡ６０に対してグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表２０．１および２０．２に収載する。表２０．３に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表２０−１】
2021532757.tif 000069
【表２０−２】
2021532757.tif 000070
【表２０−３】
2021532757.tif 000071
【表２０−４】
2021532757.tif 000072
【表２０−５】
2021532757.tif 000073
【表２０−６】
2021532757.tif 000074
【０２６３】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を４ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６と２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ９７もしくはステビオールグリコシド９５％（単一基質）またはＲｅｂＡ６０（ワンポット）と０．０２ｇ／ＬのＡＤＰと２０（単一基質）または３０ｇ／Ｌ（ワンポット）のスクロースと０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２１８２と、ワンポット反応についてのみ、０．１ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号５２０とを含有する１００μＬの総反応体積中、０．００１３〜０．０４ｇ／Ｌに希釈した。６０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで４時間（単一基質）または１６〜１８時間（ワンポット）、反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、７５℃で２時間、８０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％と共に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で７０倍希釈して２４時間、７１．８℃でインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポットＲｅｂＡ６０反応も行った。０．００５ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＥならびにワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表２０．３に示す。
【表２０−７】
2021532757.tif 000075
【表２０−８】
2021532757.tif 000076
【０２６４】
これらの実験では、表２０．３中の７つ全ての改変体は、プレインキュベートすると、配列番号１２１６と比較して改善された。より熱安定性の高い改変体である配列番号１４８８を、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２６５】
（実施例２１）
配列番号１４８８のベータ−１，２−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号１４８８に由来するＧＴポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号１４８７によりコードされるＧＴの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換え、および酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから２６種の操作された改変体を同定し（表２１．１）、飽和変異誘発ライブラリーから１７種を同定した（表２１．２）。
【０２６６】
スクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
配列番号１４８７改変体（すなわち、配列番号１４８８の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、４００μＬであり、溶解物を、１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％を伴う５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０に添加して６０または１００倍希釈し、２時間、７５℃でプレインキュベートした。次いで、５０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％（ＲｅｂＡ６０）基質と０．０２５ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と７５ｇ／Ｌのスクロースとを伴う１００μＬの反応体積中の、１０μＬの希釈された溶解物、０．０７５ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２１８２および０．２５ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号６２６を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を、水への添加による５０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により２０倍希釈した。ＲｅｂＡ６０に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表２１．１および２１．２に収載する。表２１．３に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表２１−１】
2021532757.tif 000077
【表２１−２】
2021532757.tif 000078
【表２１−３】
2021532757.tif 000079
【表２１−４】
2021532757.tif 000080
【０２６７】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を４ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６を含有する１００μＬの総反応体積中、０．００１３〜０．０４ｇ／Ｌに希釈した。単一基質反応は、２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ９７、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ、２０ｇ／Ｌのスクロース、および０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２１８２からなった。ワンポット反応は、５０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０２５ｇ／ＬのＡＤＰ、７５ｇ／Ｌのスクロース、０．０７５ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２１８２、および０．２５ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号６２６からなった。６０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで４時間（単一基質）または１６〜１８時間（ワンポット）、反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、７５℃で２時間、１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％と共に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を、水中１ｇ／Ｌの基質に希釈することにより可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で７０倍希釈して２４時間、７１．８℃でインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポットＲｅｂＡ６０反応も行った。０．００５ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＥならびにワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表２１．３に示す。
【表２１−５】
2021532757.tif 000081
【表２１−６】
2021532757.tif 000082
【０２６８】
これらの実験では、表２１．３中の１つの改変体は、単一基質、プレインキュベーションを伴うおよび伴わないワンポット、および２４時間熱安定性条件下で、配列番号１４４８と比べて同様にまたはより良好に動作した。配列番号１５１６であるこの改変体を、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２６９】
（実施例２２）
配列番号１５１６のベータ−１，２−ＡＤＰ−グリコシルトランスフェラーゼ改変体
この実施例では、ＡＤＰ−グルコースを使用するステビオールグリコシドのグルコシル化の改善のための、配列番号１５１６に由来するＧＴポリペプチドの進化およびスクリーニングの実験を説明する。配列番号１５１６によりコードされるＧＴの定向進化を、改変体遺伝子のライブラリーを構築することにより行った。ライブラリーは、本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えた。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するＨＴＰアッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースおよびステビオールグリコシドに対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する別のラウンドの操作されたＧＴ改変体ポリペプチドを得た。組合せライブラリーから２１種の操作された改変体を同定した（表２２．１）。
【０２７０】
スクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
配列番号１５１５改変体（すなわち、配列番号１５１６の改変体）を発現する清澄化Ｅ．ｃｏｌｉ培養溶解物の９６ウェルプレートを用いてアッセイを行った。溶解緩衝液の体積は、４００μＬであり、溶解物を、１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％を伴うおよび伴わない５０ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ６．０に添加して３３倍希釈し、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うプレートを２時間、７５℃でプレインキュベートした。次いで、５０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％（ＲｅｂＡ６０）基質と０．０２５ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補基質と７５ｇ／Ｌのスクロースとを伴う１００μＬの反応体積中の、１０μＬの希釈された溶解物、０．０７５ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２３２２および０．２５ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号６７８を用いて、アッセイを行った。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。反応物を、水への添加による５０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルへの添加による５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させ、上記の分析のために水への添加により２０倍希釈した。ＲｅｂＡ６０に対するグルコシルトランスフェラーゼ活性を有する得られた操作された改変体を表２２．１に収載する。表２２．２に収載する改変体については、振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表２２−１】
2021532757.tif 000083
【表２２−２】
2021532757.tif 000084
【０２７１】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を４ｇ／Ｌの濃度に再構成し、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６を含有する１００μＬの総反応体積中、０．０１３〜０．２ｇ／Ｌに希釈した。単一基質反応は、２０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ９７％またはステビオールグリコシド９５％、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ、２０ｇ／Ｌのスクロース、および０．０３ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２３２２からなった。ワンポット反応は、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０５ｇ／ＬのＡＤＰ、１５０ｇ／Ｌのスクロース、０．２ｇ／ＬのＳＵＳ  ＳＦＰ配列番号２３２２、および０．３ｇ／Ｌのβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼ（β１，３ＧＴ）ＳＦＰ配列番号６７８からなった。６０℃でＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで４時間（単一基質）または１６〜１８時間（ワンポット）、反応を行った。ＳＦＰ希釈物の一方のセットは、７５℃で２時間、１００ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％と共に５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中でプレインキュベートしたが、もう一方のセットはプレインキュベートしなかった。反応物を、水中１ｇ／Ｌの基質に希釈することにより可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により清澄化し、分析のために水で２０倍希釈した。実施例５、表５．１に記載のＳＰＥ−ＱＱＱによりグリコシル化産物を検出した。熱安定性を評価するために、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で７０倍希釈して２４時間、７１．８℃でインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いて、類似のワンポットＲｅｂＡ６０反応も行った。０．０１２５ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体による単一基質でのレバウジオシドＤおよびレバウジオシドＥならびにワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表２２．２に示す。
【表２２−３】
2021532757.tif 000085
【０２７２】
これらの実験では、表２２．２中の８つ全ての改変体は、両方の単一基質および両方のワンポットアッセイにおいて配列番号１５１６と比較して改善された。１つの改変体は、２４時間熱安定性条件で安定性もより高かった。配列番号１５１６であるこの改変体を、これらの振盪フラスコ粉末のうちのいくつかに存在した有益なアミノ酸変異Ｇ９６Ｋ（表２２．３）を導入することによりさらに操作して、配列番号１６４１／１６４２を生じさせた。配列番号１６４２であるこの酵素を、ＡＤＰ−グルコースからのステビオシドおよびレバウジオシドＡへの、それぞれレバウジオシドＥおよびレバウジオシドＤの形成のための、グリコシル転移を触媒するために、ならびにスクロースシンターゼおよびβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼを用いるワンポット反応でのレバウジオシドＭの形成のために、最良の酵素として選択した。
【０２７３】
（実施例２３）
配列番号２２のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリーを構築することによって、配列番号２１によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、このライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースの生成への活性が増加した別のラウンドの８８種の操作されたＳｕＳ改変体ポリペプチドを得た。
【０２７４】
レバウジオシドＭを形成するためのスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
以下のＨＴＰ酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、１ｍＭ硫酸マグネシウムと０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームとポリミキシンＢ硫酸塩（ＰＭＢＳ）とを伴う４００μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、１４．５ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６．０に添加して６０〜１２０倍希釈し、１〜１．５時間、７５〜７７℃でプレインキュベートした。次いで、１０μＬの希釈されプレインキュベートされたＳｕＳ溶解物、０．０８ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号２４、および０．２ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号２０を、２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および７．２ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。上記の反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。分析後、このワンポット反応で活性改善を示した操作されたＳｕＳ改変体ポリペプチドを同定した。それらを表２３．１に収載する。表２３．２に示すアミノ酸変異を有する改変体については、実施例１で説明したようにタンパク質を特徴付けるために振盪フラスコ規模の培養物を増殖させた。
【表２３−１】
2021532757.tif 000086
【表２３−２】
2021532757.tif 000087
【表２３−３】
2021532757.tif 000088
【表２３−４】
2021532757.tif 000089
【０２７５】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびレバウジオシドＭを形成するためのスクロースからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
レバウジオシドＡ６０％からのレバウジオシドＭの形成を助長するためのスクロースおよびＡＤＰに対するこれらの操作されたＳｕＳ改変体の活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を、リン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中の１４．５ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０中、０．０１６〜０．５ｇ／Ｌに構成し、アリコートを７５℃で１．５時間プレインキュベートした。１０μＬの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないＳｕＳ溶解物、０．０８ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号２４、および０．２ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号２０を、２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および７．２ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。上記の反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２０倍希釈して２０時間、７３．５℃で、１００μＬの反応体積で１５ｍＭのレバウジオシドＡ基質、０．０２ｍＭ  ＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）補因子、３７．５ｍＭスクロース補基質、９ｍＭフルクトースおよび０．５ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号２４と共にインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いる反応も行った。これらの単一基質反応物を４時間、６０℃でインキュベートし、次いで、水での４０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈および遠心分離による沈殿によりクエンチし、次いで、上清を水で７．５倍希釈し、上で説明したように分析した。０．００６ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表２３．２に示す。
【表２３−５】
2021532757.tif 000090
【０２７６】
表２３．２に収載した８つ全ての改変体は、３つ全てのアッセイにおいて配列番号２２と比べて同様にまたはより良好に動作した。配列番号１６５２を、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２７７】
（実施例２４）
配列番号１６５２のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリー、および本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えたライブラリーを構築することによって、配列番号１６５１によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースの生成に対する活性が増加した別のラウンドの１１１種の操作されたＳｕＳ改変体ポリペプチドを得た。
【０２７８】
レバウジオシドＭを形成するためのスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
以下のＨＴＰ酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、１ｍＭ硫酸マグネシウムと０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームとポリミキシンＢ硫酸塩（ＰＭＢＳ）とを伴う４００μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、１４．５ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６．０に添加して１２０倍希釈し、または４０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴う同じ緩衝剤に添加することにより２０倍希釈（組合せライブラリーについて）もしくは６０倍希釈（飽和変異誘発ライブラリーについて）し、２時間、７５℃でプレインキュベートした。次いで、１０μＬの希釈されプレインキュベートされたＳｕＳ溶解物、０．０８ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号８５８、および０．１４ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１７４を、２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および７．２ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。飽和変異誘発ライブラリーを、４０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６．０で２００倍希釈して２時間、７５℃でプレインキュベートした溶解物を使用して、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ、３０ｇ／Ｌのスクロース、７．２ｇ／Ｌのフルクトース、および０．１２ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号９９４を用いて、２０ｇ／Ｌでの単一基質レバウジオシドＡ９７％に関してもアッセイした。上記の反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。ワンポット反応で活性改善を示した、得られた操作されたスクロースシンターゼ改変体を、表２４．１および２４．２に収載する。表２４．３に収載する改変体については、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表２４−１】
2021532757.tif 000091
【表２４−２】
2021532757.tif 000092
【表２４−３】
2021532757.tif 000093
【表２４−４】
2021532757.tif 000094
【０２７９】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびレバウジオシドＭを形成するためのスクロースからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
レバウジオシドＡ６０％からのレバウジオシドＭの形成を助長するためのスクロースおよびＡＤＰに対するこれらの操作されたＳｕＳ改変体の活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を、４０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うおよび伴わないリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中、０．０１６〜０．５ｇ／Ｌに構成し、ＲｅｂＡ６０を伴う溶液を７５℃で２時間プレインキュベートした。１０μＬの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないＳｕＳ溶解物、０．０８ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号８５８、および０．１４ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１７４を、２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および７．２ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。上記の反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、４０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２０倍希釈して２４時間、７１．１℃で、１００μＬの反応体積で、上で説明した同じワンポット反応条件下でインキュベートした、１０μＬの粗清澄化溶解物を用いる反応も行った。０．０１２５ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表２４．３に示す。
【表２４−５】
2021532757.tif 000095
【０２８０】
表２４．３に収載した４つの改変体は、両方の活性アッセイで配列番号１６５２と同様に動作し、２４時間プレインキュベーションアッセイでは熱安定性がより高かった。配列番号１８２２である１つの改変体は、ワンポットアッセイでわずかにより高い活性を示し、この改変体を、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２８１】
（実施例２５）
配列番号１８２２のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリー、および本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えたライブラリーを構築することによって、配列番号１８２１によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースの生成に対する活性が増加した追加のラウンドの６３の操作されたＳｕＳ改変体ポリペプチドを得た。
【０２８２】
レバウジオシドＭを形成するためのスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
以下のＨＴＰ酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、１ｍＭ硫酸マグネシウムと０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームとポリミキシンＢ硫酸塩（ＰＭＢＳ）とを伴う４００μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、４０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６．０に添加して９０倍希釈し、２時間、７５℃でプレインキュベートした。このプレインキュベーション条件を用いて、および８０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０のプレインキュベーションを用いて、飽和変異誘発試料を再試験した。次いで、１０μＬの希釈されプレインキュベートされたＳｕＳ溶解物、０．０４ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号９９４、および０．０８ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号３５０を、２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および７．２ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。上記の反応物を水での２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。ワンポット反応で活性改善を示した、得られた操作されたスクロースシンターゼ改変体を、表２５．１および２５．２に収載する。表２５．３に収載する改変体については、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表２５−１】
2021532757.tif 000096
【表２５−２】
2021532757.tif 000097
【表２５−３】
2021532757.tif 000098
【０２８３】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびレバウジオシドＭを形成するためのスクロースからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
レバウジオシドＡ６０％からのレバウジオシドＭの形成を助長するためのスクロースおよびＡＤＰに対するこれらの操作されたＳｕＳ改変体の一部についての活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を、８０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うおよび伴わないリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中、０．０１６〜０．５ｇ／Ｌに構成し、ＲｅｂＡ６０を伴う溶液を７５℃で２時間プレインキュベートした。１０μＬの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないＳｕＳ溶解物、０．０４ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号９９４、および０．０８ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号３５０を、２０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および７．２ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。上記の反応物を水で２０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、４０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２００倍希釈して２４時間、７１．１℃で、１００μＬの反応体積で、上で説明した同じワンポット反応条件下でインキュベートした、１０μＬの粗清澄化溶解物を用いる反応も行った。０．０１２５ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表２５．３に示す。
【表２５−４】
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【０２８４】
表２５．３に収載した７つ全ての改変体は、両方の活性アッセイでおよび２４時間プレインキュベーションアッセイで配列番号１８２２と比べて同様にまたはより良好に動作した。７５℃で８０ｇ／ＬのレバウジオシドＡ６０％中での２時間プレインキュベーション後に最も活性の高い改変体である配列番号２０９２を、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２８５】
（実施例２６）
配列番号２０９２のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリー、および本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えたライブラリーを構築することによって、配列番号２０９２によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースの生成に対する活性が増加した別のラウンドの７４種の操作されたＳｕＳ改変体ポリペプチドを得た。
【０２８６】
レバウジオシドＭを形成するためのスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
以下のＨＴＰ酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、１ｍＭ硫酸マグネシウムと０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームとポリミキシンＢ硫酸塩（ＰＭＢＳ）とを伴う４００μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６．０に添加して５０〜１００倍希釈し、２時間、７５℃でプレインキュベートした。次いで、１０μＬの希釈されプレインキュベートされたＳｕＳ溶解物、０．０４ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１０８０、および０．２ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号４４０を、３０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および７．２ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。飽和変異誘発ライブラリーをまた、１０μＬの希釈されプレインキュベートされたＳｕＳ溶解物、０．２ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１０８０、および０．４３ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号４４０を、５０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０１ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、７５ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および１８ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で用いて、再試験した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。上記の反応物を、水中１〜１．５ｇ／Ｌの出発ＲｅｂＡ６０に希釈することにより可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。ワンポット反応で活性改善を示した、得られた操作されたスクロースシンターゼ改変体を、表２６．１および２６．２に収載する。表２６．３に収載する改変体については、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表２６−１】
2021532757.tif 000100
【表２６−２】
2021532757.tif 000101
【表２６−３】
2021532757.tif 000102
【表２６−４】
2021532757.tif 000103
【表２６−５】
2021532757.tif 000104
【０２８７】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびレバウジオシドＭを形成するためのスクロースからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
レバウジオシドＡ６０％からのレバウジオシドＭの形成を助長するためのスクロースおよびＡＤＰに対する操作されたＳｕＳ改変体の一部についての活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うおよび伴わないリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中、０．０１６〜０．５ｇ／Ｌに構成し、ＲｅｂＡ６０を伴う溶液を７５℃で２時間プレインキュベートした。１０μＬの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないＳｕＳ溶解物、０．０４ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１０８０、および０．２ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号４４０を、３０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０２ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、３０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および７．２ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。上記の反応物を水での３０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で１００倍希釈して２４時間、７１．１℃で、１００μＬの反応体積で、上で説明した同じワンポット反応条件下でインキュベートした、１０μＬの粗清澄化溶解物を用いる反応も行った。０．０１２５ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表２６．３に示す。
【表２６−６】
2021532757.tif 000105
【０２８８】
表２６．３に収載した８つ全ての改変体は、両方の活性アッセイでおよび２４時間プレインキュベーションアッセイで配列番号２０９２と比べて同様にまたはより良好に動作した。２４時間プレインキュベーション後に最も熱安定性の高い改変体である配列番号２１８２を、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２８９】
（実施例２７）
配列番号２１８２のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリー、および本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えたライブラリーを構築することによって、配列番号２１８２によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースの生成への活性が増加した別のラウンドの８０種の操作されたＳｕＳ改変体ポリペプチドを得た。
【０２９０】
レバウジオシドＭを形成するためのスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
以下のＨＴＰ酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、１ｍＭ硫酸マグネシウムと０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームとポリミキシンＢ硫酸塩（ＰＭＢＳ）とを伴う４００μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６．０に添加して７５〜１００倍希釈し、２時間、７５℃でプレインキュベートした。次いで、１０μＬの希釈されプレインキュベートされたＳｕＳ溶解物、０．２ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１２１６、および０．４３ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号５２０を、５０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０１ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、７５ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および１８ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。上記の反応物を水での５０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。ワンポット反応で活性改善を示した、得られた操作されたスクロースシンターゼ改変体を、表２７．１および９９．２に収載する。表２７．３に収載する改変体については、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表２７−１】
2021532757.tif 000106
【表２７−２】
2021532757.tif 000107
【表２７−３】
2021532757.tif 000108
【表２７−４】
2021532757.tif 000109
【０２９１】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびレバウジオシドＭを形成するためのスクロースからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
レバウジオシドＡ６０％からのレバウジオシドＭの形成を助長するためのスクロースおよびＡＤＰに対する操作されたＳｕＳ改変体の一部についての活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うおよび伴わないリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中、０．０１６〜０．５ｇ／Ｌに構成し、ＲｅｂＡ６０を伴う溶液を７５℃で２時間プレインキュベートした。１０μＬの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないＳｕＳ溶解物、０．２ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１２１６、および０．４３ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号５２０を、５０ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０１ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、７５ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および１８ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。上記の反応物を水での５０倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６に０．２ｇ／Ｌで溶解して２４時間、７１．１℃でインキュベートした１０μＬの振盪フラスコ粉末でも反応を行い、次いで、１００μＬの反応体積で、上で説明した同じワンポット反応条件下でアッセイした。０．０１２５ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表２７．３に示す。
【表２７−５】
2021532757.tif 000110
【０２９２】
表２７．３に収載した６つ全ての改変体は、両方の活性アッセイでおよび２４時間プレインキュベーションアッセイで配列番号２１８２と比べて同様にまたはより良好に動作した。２時間プレインキュベーションを伴わないワンポットアッセイで最も活性の高い改変体である配列番号２３２２を、さらなる酵素操作の出発点として選択した。
【０２９３】
（実施例２８）
配列番号２３２２のスクロースシンターゼ改変体
酵素のある特定の構造的特徴に飽和変異誘発を施した改変体遺伝子のライブラリー、および本発明の開発中に同定された産生改善に関連する変異を組み換えたライブラリーを構築することによって、配列番号２３２１によりコードされるスクロースシンターゼの定向進化を継続した。次に、これらのライブラリーをプレーティングし、増殖させ、下で説明するハイスループット（ＨＴＰ）アッセイを使用してスクリーニングして、ＡＤＰ−グルコースの生成への活性が増加した追加のラウンドの１８の操作されたＳｕＳ改変体ポリペプチドを得た。
【０２９４】
レバウジオシドＭを形成するためのスクロースからＡＤＰへの、それからレバウジオシドＡ６０へのグルコース転移についてのＨＴＰ結合アッセイ
以下のＨＴＰ酵素結合アッセイを使用して、ライブラリーをスクリーニングした。ペレット状Ｅ．ｃｏｌｉ培養物を、１ｍＭ硫酸マグネシウムと０．５ｍｇ／ｍＬのリゾチームとポリミキシンＢ硫酸塩（ＰＭＢＳ）とを伴う４００μＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５で溶解し、遠心分離により清澄化した。溶解物を、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６．０に添加して１００倍希釈し、２時間、７５℃でプレインキュベートした。次いで、１０μＬの希釈されプレインキュベートされたＳｕＳ溶解物、０．４ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１５１６、および０．９ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号６７８を、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０５ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、１５０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および３６ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。上記の反応物を水での１００倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。ワンポット反応で活性改善を示した、得られた操作されたスクロースシンターゼ改変体を、表２８．１に収載する。表２８．２に収載する改変体については、実施例１で説明したように振盪フラスコ規模の培養物を増殖させ、溶解し、凍結乾燥させて粉末にした。
【表２８−１】
2021532757.tif 000111
【表２８−２】
2021532757.tif 000112
【０２９５】
振盪フラスコ粉末特徴付けアッセイおよびレバウジオシドＭを形成するためのスクロースからレバウジオシドＡ６０へのグルコシル転移についての分析
レバウジオシドＡ６０％からのレバウジオシドＭの形成を助長するためのスクロースおよびＡＤＰに対する操作されたＳｕＳ改変体の一部についての活性を特徴付けるために実験を行った。振盪フラスコ粉末（ＳＦＰ）を、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴うおよび伴わないリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６中、０．１２５〜２ｇ／Ｌに構成し、ＲｅｂＡ６０を伴う溶液を７５℃で２時間プレインキュベートした。１０μＬの希釈され、プレインキュベートされたかまたはプレインキュベートされていないＳｕＳ溶解物、０．４ｇ／Ｌのβ１，２ＧＴ  ＳＦＰ配列番号１５１６、および０．９ｇ／Ｌのβ１，３ＧＴ  ＳＦＰ配列番号６７８を、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０、０．０５ｇ／ＬのＡＤＰ（Ａｍｒｅｓｃｏ、ウルトラピュアグレード）、１５０ｇ／Ｌのスクロース（蔗糖）、および３６ｇ／Ｌのフルクトースと共に、１００μＬの反応体積で使用した。以下の反応条件を使用した：ＴＨＥＲＭＯＴＲＯＮ（登録商標）タイタープレートシェーカーにおいて３００ＲＰＭで振盪しながら１６〜１８時間、５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６、６０℃。上記の反応物を水での１００倍希釈により可溶化し、０．２％ギ酸を伴うアセトニトリルでの５倍希釈によりクエンチし、遠心分離により沈殿させた。上清を水で２０倍希釈し、表５．１に記載の計器およびパラメーターを用いてＲａｐｉｄＦｉｒｅ  ＳＰＥ−ＭＳ／ＭＳによりステビオールグリコシド産物を検出した。熱安定性を評価するために、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０を伴う５０ｍＭリン酸カリウム緩衝剤、ｐＨ６で２５倍希釈して２４時間、７１．１℃でインキュベートした１０μＬの粗清澄化溶解物を用いる反応も行い、次いで、１００μＬの反応体積で、上で説明した同じワンポット反応条件下でアッセイした。０．０２５ｇ／ＬのＳＦＰ負荷量でのこれらの改変体によるワンポット反応でのレバウジオシドＭの熱安定性結果および産生レベルを表２８．２に示す。
【表２８−３】
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【０２９６】
表２８．２に収載した８つ全ての改変体は、両方の活性アッセイで配列番号２３２２と比べて同様にまたはより良好に動作し、これらのうちの３つは、１００ｇ／ＬのＲｅｂＡ６０中、７１．１℃での２４時間プレインキュベーション後に安定性がより高かった。３つの熱安定性のより高い改変体のうち、２時間プレインキュベーションを伴うおよび伴わないワンポットアッセイにおいて最も活性の高い改変体は、配列番号２４７８であった。配列番号２４７８であるこの改変体を、アミノ酸変異Ｑ６３６Ｈを導入することによりさらに操作して、配列番号２５０５／２５０６を生じさせた。配列番号２５０６であるこの酵素を、β−１，２−グリコシルトランスフェラーゼおよびβ−１，３−グリコシルトランスフェラーゼを用いるワンポット反応の状況下でＡＤＰ−グルコースを再生するためのスクロースからのＡＤＰへのグリコシル転移を触媒するために、ならびにステビオールグリコシド（例えば、レバウジオシドＡ６０％またはステビオールグリコシド９５％またはステビオールグリコシド８５％）からのレバウジオシドＭの形成のために、最良の酵素として選択した。
【０２９７】
本願に引用する全ての刊行物、特許、特許出願および他の文献は、個々の刊行物、特許、特許出願および他の文献の各々があらゆる目的で参照により本明細書に組み込まれると個々に示されている場合と同程度に、あらゆる目的でそれら全体がこれにより参照により本明細書に組み込まれる。
【０２９８】
様々な具体的な実施形態を例証し、説明してきたが、本発明の趣旨および範囲を逸脱することなく様々な変化を加えることができることが理解されるであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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