(57)【要約】  本開示は、１つ以上の改変炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を含むシアル酸結合分子の群を提供する。改変ＣＢＭは、宿主免疫応答および／または抗薬物抗体（ＡＤＡ）の産生と関連する有害事象のリスクを低下させる。改変ＣＢＭは、治療にまたは薬剤として使用することができ、免疫応答および／または細胞成長の調節のための分子として特定の用途を見出すことができる。改変ＣＢＭはまた、アジュバント、例えば、粘膜アジュバントとして、さらにがん、敗血症および／または細胞表面シアル酸含有レセプターと結合する病原体によって引き起こされるか、もしくはもたらされる疾患の処置および／または予防にも使用することもできる。
2021511308.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
１つ以上の改変ファミリー４０炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ４０）を含む、シアル酸結合分子。
【請求項２】
１つ以上の改変ＣＢＭ４０が、参照配列に対して１つ以上の変異を含む、請求項１に記載のシアル酸結合分子。
【請求項３】
参照配列が、
（ｉ）野生型ファミリー４０ＣＢＭ配列；
（ｉｉ）Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅの野生型ＣＢＭ４０配列；
（ｉｉｉ）Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅのＮａｎＨシアリダーゼ配列；
（ｉｖ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの野生型ＣＢＭ４０配列；
（ｖ）Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅのＮａｎＡシアリダーゼ配列；
（ｖｉ）配列番号１の配列；
（ｖｉｉ）配列番号２の配列；
（ｖｉｉｉ）配列番号３の配列；および
（ｉｘ）配列番号４の配列
からなる群から選択される、請求項１または２に記載のシアル酸結合分子。
【請求項４】
変異が、
（ｉ）１つ以上のアミノ酸置換；
（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸除去；
（ｉｉｉ）１つ以上のアミノ酸付加／挿入；
（ｉｖ）１つ以上のアミノ酸／配列反転；および
（ｖ）１つ以上のアミノ酸／配列重複
からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
【請求項５】
シアル酸結合分子が、改変オリゴマー形成ドメインを含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
【請求項６】
改変オリゴマー形成ドメインが、参照配列に対して１つ以上の変異を含む、請求項５に記載のシアル酸結合分子。
【請求項７】
参照配列が、
（ｉ）野生型Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシュードアミニダーゼ配列；
（ｉｉ）受託番号Ｑ９Ｌ６Ｇ４として寄託されたＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシュードアミニダーゼアミノ酸配列；
（ｉｉｉ）配列番号１３の配列；および
（ｉｖ）配列番号１４の配列
からなる群から選択される、請求項５または６に記載のシアル酸結合分子。
【請求項８】
以下の構造：
CBM1(V239A V246G A162P)--CBM2(V239A V246G A162P)--TD(S342D R403K)
を含み、CBM1およびCBM2はCBM40配列由来であり、TDは三量体形成ドメイン由来である、請求項１〜７のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
【請求項９】
以下の配列を含む、シアル酸結合分子。
GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAFYNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALTPEEVQKRSGGSLGVPDFESDWFDVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARSSSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFATGYYRVRAWI
【請求項１０】
（ｉ）治療に
（ｉｉ）疾患の処置および／または予防を必要とする対象における疾患の処置および／または予防に；
（ｉｉｉ）（ヒトまたは動物対象における）免疫応答の調節に；
（ｉｖ）細胞成長、増殖および／または分化の調節に
（ｖ）アジュバントとして；
（ｖｉ）医薬として；
（ｖｉｉ）がんの処置に；および
（ｖｉｉｉ）細胞表面シアル酸含有レセプターと結合する病原体によって引き起こされるか、またはもたらされる疾患の処置および／または予防に、
使用するための、請求項１〜９のいずれか１項に記載のシアル酸結合分子。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、新規のシアル酸結合分子および同じものの（医学的使用を含む）使用を提供する。
【背景技術】
【０００２】
シアル酸結合炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅおよびＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ由来のものならびにそれらの多価型を含む）は、有効な抗菌剤であることが示されており、一部は、マウスをＨ７Ｎ９インフルエンザウイルスの致死的攻撃から守ることが示されている。生物学的製剤、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤは、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシュードアミニダーゼ（ｐｓｅｕｄａｍｉｎｉｄａｓｅ）（ＰａＴＤ）の三量体形成ドメインと遺伝的に融合したＳ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅノイラミニダーゼＡ（ＳｐＣＢＭ）のＣＢＭファミリー４０ドメインの２コピーを含む。タンパク質は、三量体形成ドメインにより組み合わされて、６コピーのＳｐＣＢＭを含むオリゴマーを形成する。
しかしながら、いかなるタンパク質ベースの治療薬（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ）を用いる場合も、生物学的製剤に対する患者の免疫応答と関連する有害作用のリスクがある。ある場合には、生物学的製剤は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）と薬物の間の免疫複合体（ＩＣ）の形成をもたらす可能性のあるＡＤＡの産生を誘導することもある。そのような複合体の存在は、有効性を低下させるか、もしくは治療薬の半減期を変えることもあり、または過敏症反応などの有害作用を引き起こす可能性もあるであろう。
タンパク質の免疫原性に影響を与える多くの因子が存在する。１つの重要な決定因子は、抗体産生につながるＴ細胞依存的な事象を誘発する可能性がある固有のエピトープの存在である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）内に生じるタンパク質抗原のプロセシングに由来する短いペプチドフラグメントを認識する。これらのフラグメントの一部は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）／主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と複合体を形成することになり、十分に安定して結合していれば、ＡＰＣの表面に運ばれ、Ｔ細胞に提示されることになる。Ｔ細胞レセプターによる非自己ペプチドの認識は、続いて起こる免疫応答を誘発する。
【発明の概要】
【０００３】
本開示は、シアル酸結合分子の新規の群を提供する。
本明細書に記載されているシアル酸結合分子は、１つ以上の改変炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ）を含んでもよい。
明記したとおり、いかなるタンパク質ベースの治療薬を用いる場合も、生物学的製剤に対する患者の免疫応答と関連する有害作用のリスクがある。生物学的製剤は、抗薬物抗体（ＡＤＡ）と薬物の間の免疫複合体（ＩＣ）の形成をもたらす可能性のあるＡＤＡの産生を誘発する場合もある。そのような複合体の存在は、有効性を低下させるか、もしくは治療薬の半減期を変えることもあり、または過敏症反応などの有害作用を引き起こす可能性もあるであろう。本開示のＣＢＭは、こうした有害作用のリスクを低下させるために改変された。
【０００４】
炭水化物結合モジュールは、複数のファミリーに分類され、ファミリー４０ＣＢＭ（ＣＢＭ４０）のメンバーと分類されるＣＢＭは、本明細書に記載されている改変分子の製造に有用な場合もある。ファミリー４０ＣＢＭは、およそ２００残基の分子を含み、ＧＨ３３シアリダーゼのＮ末端に見られることが多い。それらがＧＨ３３シアリダーゼのβ−プロペラに挿入されているのが見つかる場合がある。
したがって、本明細書に記載されているシアル酸結合分子は、１つ以上の改変ファミリー４０炭水化物結合モジュール（ＣＢＭ４０）を含んでもよい。
本明細書全体をとおして、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、実施形態が言及された特徴を「含み」、そのように他の特徴を含んでもよいことを示すよう使用される。ただし、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語はまた、関連する特徴「から本質的になる」または関連する特徴「からなる」実施形態を包含する場合もある。
【０００５】
上記に鑑み、本開示は、シアル酸結合要素を含む分子、例えば、シアル酸結合要素を含むより大きな分子を含んでもよい。明記したとおり、そのシアル酸結合要素（すなわち、シアル酸結合分子）自体は、改変ＣＢＭ、例えば、改変ＣＢＭ４０を含んでもよい（それからなるか、またはそれから本質的になってもよい）。（非限定）例として、本開示の分子は、シアル酸と結合する能力を示すことができるだけでなく、１つ以上の他の機能を有してもよい。例えば、本分子は、酵素活性を有してもよい。例えば、有用な分子は、（本明細書に記載される）改変ＣＢＭを含み、いくらかのシアリダーゼ活性を示してもよい。
一実施形態において、ＣＢＭは、酵素（例えば、シアリダーゼ）活性を有する分子の一部として提供されなくても、またはその分子内に含まれなくてもよい。
有用なシアル酸結合分子は、酵素部分およびシアル酸結合部分を含む融合タンパク質であってもよく、この場合、シアル酸結合部分は、本明細書に記載される改変ＣＢＭを含む。そのような場合には、酵素部分は、シアル酸結合部分と融合されてもよい。明記したとおり、任意の有用な融合タンパク質の酵素部分は、シアリダーゼ活性を含んでもよい（もしくはそれを有するか、またはそれを示してもよい）。
「改変された」という用語は、参照配列に対して１つ以上の変異を含む分子を包含する。
【０００６】
「参照配列」は、任意の野生型ＣＢＭ配列であってもよい。例えば、参照配列は、野生型ファミリー４０ＣＢＭ配列、例えば、Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＮａｎＨシアリダーゼまたはＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮａｎＡシアリダーゼの野生型ＣＢＭ配列を含んでも、それから本質的になっても、またはそれからなってもよい（その他の微生物に存在する類似または一致するＣＢＭ（ＣＢＭ４０を含む）が「ＣＢＭ」および／またはＣＢＭ参照配列という用語の範囲内に包含されることが認識されるべきである）。
したがって、改変ＣＢＭ配列は、一定のまたは特定の野生型ＣＢＭ由来であってもよい。
改変ＣＢＭ配列は、１つ以上の変異を含む野生型ＣＢＭ配列を含んでもよい。
【０００７】
１つ以上の変異は、機能的であってもよく、すなわち、それらは個々に（および／または独立して）あるいはまとめて（例えば、相乗的に）野生型ＣＢＭ（例えば、改変ＣＢＭが由来する野生型ＣＢＭ）の生理的、生物学的、免疫学的および／または薬理学的特性の１つ以上を調節しても（変えても、向上させても、または抑制／阻害しても）よい。特に、１つ以上の変異は、以下であってもよい。
（ｉ）ＣＢＭの免疫原性（もしくは抗原性）を変えてもよく；および／または
（ｉｉ）（ＣＢＭもしくは改変ＣＢＭを含む任意の多量体分子の）効力を変えてもよく（例えば、向上させてもよく）および／または
（ｉｉｉ）それらは、ＣＢＭの熱安定性を調節してもよい（例えば、向上させてもよい）；および／または
（ｉｖ）それらは、ＣＢＭの溶解性を調節してもよい（例えば、向上させてもよい）；および／または
（ｖ）それらは、分子の生体内半減期を調節してもよい（例えば、向上させてもよい）
【０００８】
「変異」は、野生型ＣＢＭ分子に対するいかなる変更を含んでもよい。例えば、「変異」という用語は、例えば、以下を含んでもよい。
（ｉ）１つ以上のアミノ酸置換（ここでは、１つ以上の野生型アミノ酸が別の（異なる）アミノ酸で置き換えられるか、または変えられ、「置換」という用語は、保存的アミノ酸置換を含むであろう）；および／または
（ｉｉ）１つ以上のアミノ酸除去（ここでは、１つ以上の野生型アミノ酸残基が除去される）；および／または
（ｉｉｉ）１つ以上のアミノ酸付加／挿入（ここでは、追加のアミノ酸残基が野生型（もしくは参照）一次配列に付加される）；および／または
（ｉｖ）１つ以上のアミノ酸／配列反転（通常、ここでは、一次配列中の２つ以上連続的なアミノ酸が反転される；および／または
（ｖ）１つ以上のアミノ酸／配列重複（ここでは、一次アミノ酸配列のアミノ酸もしくはその一部（例えば、一続きの５〜１０アミノ酸）が繰り返される）
明記したとおり、本開示による改変ＣＢＭは、本明細書に記載されている１つ以上の変異を含んでもよい。
【０００９】
例となる野生型ＣＢＭ（言い換えると、有用な改変ＣＢＭが由来し得る参照配列）は、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ  ＮａｎＡシアリダーゼであり、このアミノ酸配列は、受託番号Ｐ６２５７５として寄託され、配列番号１（１０３５アミノ酸）として下で再現されている。
配列番号１
MSYFRNRDID IERNSMNRSV QERKCRYSIR KLSVGAVSMI VGAVVFGTSP VLAQEGASEQ
PLANETQLSG ESSTLTDTEK SQPSSETELS GNKQEQERKD KQEEKIPRDY YARDLENVET
VIEKEDVETN ASNGQRVDLS SELDKLKKLE NATVHMEFKP DAKAPAFYNL FSVSSATKKD
EYFTMAVYNN TATLEGRGSD GKQFYNNYND APLKVKPGQW NSVTFTVEKP TAELPKGRVR
LYVNGVLSRT SLRSGNFIKD MPDVTHVQIG ATKRANNTVW GSNLQIRNLT VYNRALTPEE
VQKRSQLFKR SDLEKKLPEG AALTEKTDIF ESGRNGKPNK DGIKSYRIPA LLKTDKGTLI
AGADERRLHS SDWGDIGMVI RRSEDNGKTW GDRVTITNLR DNPKASDPSI GSPVNIDMVL
VQDPETKRIF SIYDMFPEGK GIFGMSSQKE EAYKKIDGKT YQILYREGEK GAYTIRENGT
VYTPDGKATD YRVVVDPVKP AYSDKGDLYK GNQLLGNIYF TTNKTSPFRI AKDSYLWMSY
SDDDGKTWSA PQDITPMVKA DWMKFLGVGP GTGIVLRNGP HKGRILIPVY TTNNVSHLNG
SQSSRIIYSD DHGKTWHAGE AVNDNRQVDG QKIHSSTMNN RRAQNTESTV VQLNNGDVKL
FMRGLTGDLQ VATSKDGGVT WEKDIKRYPQ VKDVYVQMSA IHTMHEGKEY IILSNAGGPK
RENGMVHLAR VEENGELTWL KHNPIQKGEF AYNSLQELGN GEYGILYEHT EKGQNAYTLS
FRKFNWDFLS KDLISPTEAK VKRTREMGKG VIGLEFDSEV LVNKAPTLQL ANGKTARFMT
QYDTKTLLFT VDSEDMGQKV TGLAEGAIES MHNLPVSVAG TKLSNGMNGS EAAVHEVPEY
TGPLGTSGEE PAPTVEKPEY TGPLGTSGEE PAPTVEKPEY TGPLGTAGEE AAPTVEKPEF
TGGVNGTEPA VHEIAEYKGS DSLVTLTTKE DYTYKAPLAQ QALPETGNKE SDLLASLGLT
AFFLGLFTLG KKREQ
【００１０】
配列番号１のＣＢＭ領域は、アミノ酸残基１２１〜３０５であり、この配列は、配列番号２と指定されている（その配列は以下である：VIEKEDVETN ASNGQRVDLS SELDKLKKLE NATVHMEFKP DAKAPAFYNL FSVSSATKKD EYFTMAVYNN TATLEGRGSD GKQFYNNYND APLKVKPGQW NSVTFTVEKP TAELPKGRVR LYVNGVLSRT SLRSGNFIKD MPDVTHVQIG ATKRANNTVW GSNLQIRNLT VYNRALTPEE VQKRS）。
よって、本開示は、配列番号２（および／または配列番号１）の改変型を含むシアル酸結合分子を提供する。配列番号２の改変型は、１つ以上の変異した残基を含んでもよく、この変異は、例えば、配列番号２の配列に対して行われたアミノ酸置換、付加／挿入、重複、除去および／または反転である。
【００１１】
例となるＶｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ  ＮａｎＨシアリダーゼアミノ酸配列は、受託番号Ａ５Ｆ７Ａ４として寄託され、配列番号３（７８１アミノ酸）として下で再現されている。
配列番号３
MRFKNVKKTA LMLAMFGMAT SSNAALFDYN ATGDTEFDSP AKQGWMQDNT NNGSGVLTNA
DGMPAWLVQG IGGRAQWTYS LSTNQHAQAS SFGWRMTTEM KVLSGGMITN YYANGTQRVL
PIISLDSSGN LVVEFEGQTG RTVLATGTAA TEYHKFELVF LPGSNPSASF YFDGKLIRDN
IQPTASKQNM IVWGNGSSNT DGVAAYRDIK FEIQGDVIFR GPDRIPSIVA SSVTPGVVTA
FAEKRVGGGD PGALSNTNDI ITRTSRDGGI TWDTELNLTE QINVSDEFDF SDPRPIYDPS
SNTVLVSYAR WPTDAAQNGD RIKPWMPNGI FYSVYDVASG NWQAPIDVTD QVKERSFQIA
GWGGSELYRR NTSLNSQQDW QSNAKIRIVD GAANQIQVAD GSRKYVVTLS IDESGGLVAN
LNGVSAPIIL QSEHAKVHSF HDYELQYSAL NHTTTLFVDG QQITTWAGEV SQENNIQFGN
ADAQIDGRLH VQKIVLTQQG HNLVEFDAFY LAQQTPEVEK DLEKLGWTKI KTGNTMSLYG
NASVNPGPGH GITLTRQQNI SGSQNGRLIY PAIVLDRFFL NVMSIYSDDG GSNWQTGSTL
PIPFRWKSSS ILETLEPSEA DMVELQNGDL LLTARLDFNQ IVNGVNYSPR QQFLSKDGGI
TWSLLEANNA NVFSNISTGT VDASITRFEQ SDGSHFLLFT NPQGNPAGTN GRQNLGLWFS
FDEGVTWKGP IQLVNGASAY SDIYQLDSEN AIVIVETDNS NMRILRMPIT LLKQKLTLSQ
N
【００１２】
配列番号３のＣＢＭ領域は、アミノ酸残基２５〜２１６であり、この配列は、配列番号４であってもよい（その配列は以下である：ALFDYNATGD TEFDSPAKQG WMQDNTNNGS GVLTNADGMP AWLVQGIGGR AQWTYSLSTN QHAQASSFGW RMTTEMKVLS GGMITNYYAN GTQRVLPIIS LDSSGNLVVE FEGQTGRTVL ATGTAATEYH KFELVFLPGS NPSASFYFDG KLIRDNIQPT ASKQNMIVWG NGSSNTDGVA AY）
よって、本開示は、配列番号４（および／または配列番号３）の改変型を含むシアル酸結合分子を提供する。配列番号４の改変型は、１つ以上の変異した残基を含んでもよく、この変異は、例えば、配列番号４の配列に対して行われたアミノ酸置換、付加／挿入、重複、除去および／または反転である。
【００１３】
明記したとおり、本明細書に記載されているシアル酸結合分子は、１つ以上の（例えば、２つ以上）の改変ＣＢＭを含んでもよい。シアル酸結合分子が２つ以上の改変ＣＢＭを含む場合、分子は、多価ＣＢＭと呼ばれる場合もある。多価ＣＢＭである（またはそれを含む）シアル酸結合分子は、アミノ酸／ペプチドリンカーによって連結された複数（２つ以上）の改変ＣＢＭを含むコンストラクトとして作製されてもよい。それぞれ改変ＣＢＭは、例えば、５、１０または１５アミノ酸を含むペプチドによって別のものと連結されてもよい。例として任意の１つ以上の以下のペプチドが２つ以上のＣＢＭを連結するために使用されて、多価ＣＢＭであるシアル酸結合分子が生成されてもよい。
（ｉ）５アミノ酸リンカー：      ALXGS
LQALG
GGXSG
GGALG
GGSLG
（ｉｉ）１０アミノ酸リンカー：  ALXGSGGGSG
LQALGGGGSL
（ｉｉｉ）１５アミノ酸リンカー：ALXGSGGGSGGGGSG
ここで、「X」は、任意のアミノ酸である。
【００１４】
使用のためのシアル酸結合分子は、１つ以上のオリゴマー形成ドメインをさらに含んでもよい。本開示のシアル酸結合分子のＣＢＭ要素と同様に、オリゴマー形成ドメインは、野生型オリゴマー形成ドメイン由来であってもよく、したがって、対応する野生型オリゴマー形成ドメイン配列に対して１つ以上の変異を含んでもよい。有用なオリゴマー形成ドメインは、自己会合して、多量体構造、例えば、三量体を形成する能力を示す。使用のための改変オリゴマー形成ドメインは、その同じオリゴマー形成特性を有する任意の分子を含んでもよい。誤解を避けるために、「オリゴマー形成ドメイン」という用語は、本明細書中で使用される場合、野生型オリゴマー形成ドメインだけでなく、改変されたもの（本明細書中で開示されている「改変オリゴマー形成ドメイン」）も包含する。
【００１５】
例えば、本開示によるシアル酸結合分子は、オリゴマー形成ドメインと結合、連結または融合した１つ以上（例えば、２つ）のＣＢＭ（例えば、本明細書に記載される１つ、２つ以上の改変ＣＢＭ）を含んでもよい。得られたシアル酸結合分子は、（多量体）ＣＢＭ：：オリゴマー形成ドメイン「融合物」である。
【００１６】
適したオリゴマー形成ドメインとしては、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシュードアミニダーゼから得ることができるものを挙げることができる。例となるＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａシュードアミニダーゼアミノ酸配列は、受託番号Ｑ９Ｌ６Ｇ４（ＰＡＯ５７９株由来）として寄託され、配列番号１３（４３８アミノ酸）として下で再現されている。類似する、一致するまたはその他の有用なオリゴマー形成ドメインが一般用語「オリゴマー形成ドメイン」の範囲内に包含され得ることを認識すべきである。
配列番号１３
MNTYFDIPHR LVGKALYESY YDHFGQMDIL SDGSLYLIYR RATEHVGGSD GRVVFSKLEG
GIWSAPTIVA QAGGQDFRDV AGGTMPSGRI VAASTVYETG EVKVYVSDDS GVTWVHKFTL
ARGGADYNFA HGKSFQVGAR YVIPLYAATG VNYELKWLES SDGGETWGEG STIYSGNTPY
NETSYLPVGD GVILAVARVG SGAGGALRQF ISLDDGGTWT DQGNVTAQNG DSTDILVAPS
LSYIYSEGGT PHVVLLYTNR TTHFCYYRTI LLAKAVAGSS GWTERVPVYS APAASGYTSQ
VVLGGRRILG NLFRETSSTT SGAYQFEVYL GGVPDFESDW FSVSSNSLYT LSHGLQRSPR
RVVVEFARSS SPSTWNIVMP SYFNDGGHKG SGAQVEVGSL NIRLGTGAAV WGTGYFGGID
NSATTRFATG YYRVRAWI
【００１７】
配列番号１３のオリゴマー形成ドメインは、アミノ酸残基３３３〜４３８であり、この配列は、配列番号１４であってもよい（その配列は以下である：VPDFESDWFS VSSNSLYTLS HGLQRSPRRV VVEFARSSSP STWNIVMPSY FNDGGHKGSG AQVEVGSLNI RLGTGAAVWG TGYFGGIDNS ATTRFATGYY RVRAWI）。
明記したとおり、本発明は、改変オリゴマー形成ドメインを利用してもよい。改変オリゴマー形成ドメインは、参照オリゴマー形成配列に対して１つ以上の変異を含むオリゴマー形成ドメインを含んでもよい。
「参照オリゴマー形成配列」は、例えば、上記の配列番号１３および１４を含む、任意の野生型オリゴマー形成ドメイン配列であってもよい。
したがって、改変オリゴマー形成ドメインは、一定のまたは特定の野生型オリゴマー形成ドメイン由来であってもよい。
改変オリゴマー形成ドメイン配列は、１つ以上の変異を含む野生型オリゴマー形成ドメイン配列を含んでもよい。
【００１８】
１つ以上の変異は、機能的であってもよく、すなわち、それらは個々に（および／または独立して）あるいはまとめて（例えば、相乗的に）野生型オリゴマー形成ドメイン（例えば、改変オリゴマー形成ドメインが由来する野生型オリゴマー形成ドメイン）の生理的、免疫学的、生物学的および／または薬理学的特性の１つ以上を調節しても（向上させてもまたは抑制／阻害しても）よい。上記のとおり、変異は、以下であってもよい。
（ｉ）オリゴマー形成ドメインの免疫原性（もしくは抗原性）を変えてもよく；および／または
（ｉｉ）（例えば、１つ以上の改変ＣＢＭを含む多量体分子の）効力を向上させてもよく；および／または
（ｉｉｉ）それらは、オリゴマー形成ドメインの熱安定性を調節してもよく（例えば、向上させてもよく）；および／または
（ｉｖ）それらは、オリゴマー形成ドメインの溶解性を調節してもよく（例えば、向上させてもよく）；および／または
（ｖ）それらは、オリゴマー形成ドメインの生体内半減期を調節してもよい（例えば、向上させてもよい）。
改変オリゴマー形成ドメインと関連した、「変異」という用語は、上で定義されたとおりである。
あらゆる場合において、変異は、ＣＢＭもしくはオリゴマー形成ドメインまたは同じものを含むシアル酸結合分子の免疫学的／抗原特性を調節してもよい。
【００１９】
タンパク質の免疫原性に影響を与える多くの因子が存在する。１つの重要な決定因子は、抗体産生につながるＴ細胞依存的な事象を誘発する可能性がある固有のエピトープの存在である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）内に生じるタンパク質抗原のプロセシングに由来する短いペプチドフラグメントを認識する。これらのフラグメントの一部は、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）／主要組織適合抗原複合体（ＭＨＣ）クラスＩＩ分子と複合体を形成することになり、十分に安定して結合していれば、ＡＰＣの表面に運ばれ、Ｔ細胞に提示されることになる。Ｔ細胞レセプターによる非自己ペプチドの認識は、続いて起こる免疫応答を誘発する。したがって、免疫原性の低いＣＢＭを提供するために、野生型ＣＢＭおよび／またはオリゴマー形成ドメインは、免疫原性／抗原性の領域（すなわち、免疫学的エピトープを持つまたは含む可能性がある領域またはドメイン）を特定するために分析されてもよい。免疫原性（または抗原性）は、例えば、特定のヒトまたは動物宿主に対して評価され得る特性であり、言い換えると、ＣＢＭおよび／またはオリゴマー形成ドメインは、どの領域またはドメインが特定の（例えば、ヒト）宿主において免疫原性／抗原性であり得るか判断するために分析されてもよい。免疫原性（または抗原性）は、例えば、スクリーニング技術におけるインシリコ（例えば、Ｔ細胞エピトープに関するスクリーニング：（例として）ＰｒｏＰｒｅｄインシリコ解析を含む）、Ｔ細胞増殖アッセイ、（ＰｒｏｉｍｍｕｎｅヒトドナーＴ細胞増殖アッセイを含む）およびその他の免疫学的技術を使用して評価されてもよい。タンパク質を「脱免疫化する（ｄｅｉｍｍｕｎｉｚｅ）」ための方法に関するさらなる情報は、内容全体が参照により組み込まれるJawa V, et al.((2013)T-cell dependent immunogenicity of protein therapeutics: Preclinical assessment and mitigation. Clin Immunol. 149, 534-555)およびSingh H, and Raghava GP((2001)ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. Bioinformatics. 17(12), 1236-7）から導き出すことができる。
【００２０】
これらの技術を使用して、ＣＢＭおよびオリゴマー形成ドメインの両方の免疫原性／抗原性領域を特定することが可能であった。図１は、ＳｐＣＢＭ配列（図１Ａ）およびＰａＴＤ配列（図１Ｂ）内の抗原性領域の完全な解析（ＰｒｏＰｒｅｄ予測）を示す。予測されるバインダー（ｂｉｎｄｅｒ）は青で色づけされ、それぞれの結合領域の最初の残基は赤で示されている。予測される抗原性ペプチド（緑のバー）およびＰｒｏｉｍｍｕｎｅ（紫のバー）は、配列の下に示されている。
【００２１】
例えば、ＳｐＣＢＭ分子内の残基１２７〜３００の間のさまざまな領域（図１Ａに示されるとおり）が免疫原性／抗原性ドメインを持つと特定された。例えば、残基１２７〜１３５、１４６〜１５４、１５４〜１６６、１５８〜１６６、１４３〜１５１、１４９〜１５７、１６７〜１７６、１６７〜１７８、１８２〜１９６、１８８〜１９６、１８５〜１９３、２０４〜２１２、２１３〜２２１、２２０〜２２８、２３９〜２４６、２３９〜２５４、２４１〜２４９、２４２〜２４９、２４１〜２５０、２４１〜２５１、２３９〜２５１、２３９〜２４９、２３９〜２４７、２４６〜２５４、２４３〜２５１、２５７〜２６５、２６７〜２７５、２８４〜３００、２８４〜２９９、２８４〜２９７、２８６〜２８４、２８６〜３００および２８９〜２９６にわたる領域は、免疫原性の可能性があると特定された（そのいくつかは少数のアレルと結合することが予測されるが、その他は、中程度または高度に免疫原性とみなされる）。
【００２２】
さらに具体的に、上記のインシリコおよび免疫学的（Ｔ細胞増殖）アッセイ）を使用して、下記残基にわたる領域：
配列番号１の１６７〜１７８（すなわち、配列：FYNLFSVSSATK）
配列番号１の１６７〜１８１（すなわち、配列：FYNLFSVSSATKKDE）
配列番号１の２３９〜２５１（すなわち、配列：VRLYVNGVLSRTS）
配列番号１の２３６〜２５０（すなわち、配列 KGRVRLYVNGVLSRT）
配列番号１の２４５〜２５４（すなわち、配列：GVLSRTSLRS）
配列番号１の２８６〜２９４（すなわち、配列 IRNLTVYNR）
は、免疫原性／抗原性と特定された。残基２４５〜２５４にわたる領域は顕著な免疫原性の場所であることが特定されていることに留意すべきである。
【００２３】
ＰａＴＤオリゴマー形成ドメイン内の残基３３６〜４２４の間の領域は、免疫原性／抗原性ドメインを持つと特定された。例えば、残基３３６〜３４４、３４０〜３４８、３４１〜３４９、３４８〜３５６、３５３〜３６３、３５５〜３６３、３５５〜３７０、３６２〜３７０、３６２〜３７０／３７１、３７５〜３８３、３７５〜３９０、４００〜４０７、４０２〜４１０、３９７〜４０５、４０３〜４１０および４１６〜４２４にわたる領域は、免疫原性の可能性があると特定された（そのいくつかは少数のアレルと結合することが予測されるが、その他は、中程度または高度に免疫原性とみなされる）。非限定例として、配列番号１３の残基３３８〜３５２は、免疫原性／抗原性ドメインを持つと特定された。
【００２４】
さらに具体的に、上記のインシリコおよび免疫学的（Ｔ細胞増殖）アッセイ）を使用して、下記残基にわたる領域：
配列番号１３の３４０〜３４９（すなわち、配列：WFSVSSNSLY）
配列番号１３の３５１〜３５９（すなわち、配列：LSHGLQRSP）
配列番号１３の３９８〜４０６（すなわち、配列：GSLNIRLGT）
配列番号１３の３９２〜４０６（すなわち、配列：GAQVEVGSLNIRLGT）
配列番号１３の３３８〜３５２（すなわち、配列：SDWFSVSSNSLYTLS）
は、免疫原性／抗原性と特定された。残基３４０〜３４９、３５１〜３５９および３９８〜４０６にわたる領域は、顕著な免疫原性の場所であることが特定されたことに留意すべきである。
まとめて、（ＣＢＭおよびオリゴマー形成ドメインの両方の）これらの領域は、「免疫原性／抗原性」の領域と呼ばれることになる。
したがって、使用のための改変ＣＢＭおよび／またはオリゴマー形成は、例えば、免疫原性／抗原性の上で特定された領域内の１つ以上のアミノ酸残基（またはアミノ酸配列）を変異させること（例えば、置換すること、除去すること、付加すること、反転させることおよび／または重複させること）によって形成することができる。
【００２５】
よって、本開示による改変ＣＢＭまたはオリゴマー形成ドメインは、改変された免疫原性（または抗原性）プロファイルを含んでもよい。言い換えると、野生型ＣＢＭまたはオリゴマー形成ドメインと比較した場合、本開示による改変ＣＢＭ／オリゴマー形成ドメインは、ヒトまたは動物宿主において免疫原性／抗原性が低くてもよい（または異なる免疫原性／抗原性であってもよい）。当業者は、ＣＢＭまたはオリゴマー形成ドメインの一次アミノ酸配列に導入される変異が、特定のエピトープをより高いまたは低い免疫原性にすることによって免疫原性を調節することができることを理解するであろう。
【００２６】
したがって、一態様において、本発明は、改変された免疫学的プロファイルを有するＣＢＭを得る方法であって、ＣＢＭ一次、二次および／または三次アミノ酸配列／構造のどの領域またはドメインが免疫原性であるかを判断することと、１つ以上の判断された免疫原性／抗原性の領域またはドメイン内の１つ以上のアミノ酸残基または配列を変異させることと、を含む方法を提供する。
さらに、本発明は、（上記のとおりの）改変された免疫学的プロファイルを有するＣＢＭを得る方法によって得ることができる改変ＣＢＭを提供する。
【００２７】
さらに、本開示は、改変された免疫学的プロファイルを有するオリゴマー形成ドメインを得る方法であって、オリゴマー形成ドメインＣＢＭ一次、二次および／または三次アミノ酸配列／構造のどの領域またはドメインが免疫原性であるかを判断することと、１つ以上の判断された免疫原性／抗原性の領域またはドメイン内の１つ以上のアミノ酸残基または配列を変異させることと、を含む方法を提供する。
さらに、本発明は、（上記のとおりの）改変された免疫学的プロファイルを有するオリゴマー形成ドメインを得る方法によって得ることができる改変オリゴマー形成ドメインを提供する。
本開示は、改変された多量体ＣＢＭを得る方法をさらに提供する。本方法は、
上記のとおり改変された免疫学的プロファイルを有する少なくとも１つのＣＢＭを得ることと、任意に上記のとおり改変された免疫学的プロファイルを有するオリゴマー形成ドメインを得ることと、
少なくとも１つの改変ＣＢＭを含む多量体ＣＢＭを作り出すことと、を含んでもよい。
【００２８】
ＣＢＭ／オリゴマー形成ドメインの免疫原性／抗原性は、個別のアミノ酸変異を受けてもよい。例えば、特定のアミノ酸残基が置き換えられる（別のもので置換される）か、または除去されてもよい。任意の所与の変異の影響を予測するために、改変された配列（参照配列に対して少なくとも１つの変異を含む配列）が、例えば、免疫原性配列（例えば、抗原配列内のＭＨＣ結合領域を含む）を特定するよう設計されたプログラムに提供されてもよい。当業者は、適したプログラムおよびシステムに精通しているであろうが、ＰｒｏＰｒｅｄが一例であり、このサーバの目的は、Sturniolo et. al., 1999による公開された文献から導き出される定量マトリックス（ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｍａｔｒｉｘ）を使用して抗原配列中のＭＨＣクラスＩＩ結合領域を予測することである。このサーバは、乱交雑性に結合領域の位置を特定するのを支援する。
ユーザーは、ＣＢＭ／オリゴマー形成ドメインの免疫原性／抗原性に影響があるが、同時に（ＣＢＭのシアル酸結合特性およびオリゴマー形成ドメインのオリゴマー形成特性に非常に重要な場合もある）タンパク質構造に影響を与えないであろう変異を特定することを目指すであろう。例えば、本明細書中で開示されている改変ＣＢＭは、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によって評価される場合にシアリルラクトースに対する結合親和性を維持してもよい。
【００２９】
上記に基づき、例としてＳｐＣＢＭ分子を使用して、１つ以上の以下の残基が、変異していてもよい。
残基１６７（Ｆ）、１６８（Ｙ）、１６９（Ｎ）、１７０（Ｌ）、１７１（Ｆ）、１７２（Ｓ）、１７３（Ｖ）、１７４（Ｓ）、１７５（Ｓ）、１７６（Ａ）、１７７（Ｔ）、１７８（Ｋ）、１７９（Ｋ）、１８０（Ｄ）、１８１（Ｅ）、２３６（Ｋ）、２３７（Ｇ）、２３８（Ｒ）、２３９（Ｖ）、２４０（Ｒ）、２４１（Ｌ）、２４２（Ｙ）、２４３（Ｖ）、２４４（Ｎ）、２４５（Ｇ）、２４６（Ｖ）、２４７（Ｌ）、２４８（Ｓ）、２４９（Ｒ）、２５０（Ｔ）、２５１（Ｓ）、２５２（Ｌ）、２５３（Ｒ）、２５４（Ｓ）、２８６（Ｉ）、２８７（Ｒ）、２８８（Ｎ）、２８９（Ｌ）、２９０（Ｔ）、２９１（Ｖ）、２９２（Ｙ）、２９３（Ｎ）および／または２９４（Ｒ）
【００３０】
上記に基づき、例としてＰａＴＤを使用して、１つ以上の以下の残基が、変異していてもよい。
残基３３８（Ｓ）、３３９（Ｄ）、３４０（Ｗ）、３４１（Ｆ）、３４２（Ｓ）、３４３（Ｖ）、３４４（Ｓ）、３４５（Ｓ）、３４６（Ｎ）、３４７（Ｓ）、３４８（Ｌ）、３４９（Ｙ）、３５０（Ｔ）、３５１（Ｌ）、３５２（Ｓ）、３５３（Ｈ）、３５４（Ｇ）、３５５（Ｌ）、３５６（Ｑ）、３５７（Ｒ）、３５８（Ｓ）、３５９（Ｐ）、３９２（Ｇ）、３９３（Ａ）、３９４（Ｑ）、３９５（Ｖ）、３９６（Ｅ）、３９７（Ｖ）、３９８（Ｇ）、３９９（Ｓ）、４００（Ｌ）、４０１（Ｎ）、４０２（Ｉ）、４０３（Ｒ）、４０４（Ｌ）、４０５（Ｇ）および／または４０６（Ｔ）。
【００３１】
「変異」という用語は、これらの残基を含む任意の領域（「免疫原性／抗原性領域）へのさらなるアミノ酸の付加を含むことに留意すべきである。さらに、「変異」という用語は、これらの領域内における任意の１つ以上のアミノ酸の重複および／または任意の配列の反転を含んでもよい。例えば、２つ以上（例えば、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５個（以上））のアミノ酸の短い配列が反転されてもよく（および／または重複していてもよい）。変異が置換である場合、置換アミノ酸は、他の１９の天然に生じるアミノ酸または人工もしくは合成アミノ酸のいずれか１つであってもよい。さらに、置換アミノ酸は、関連した位置にある野生型アミノ酸の誘導体または類似体であってもよい。
【００３２】
非限定例として、ＳｐＣＢＭに関して、１つ以上の以下の変異が生じさせられてもよく（なお、これらの変異のすべてがＣＢＭの免疫原性を調節することに向けられていなくてもよく）、例えば、１つ以上の変異（変異M156FおよびM185Iを含む）は、熱安定性を調節するために使用されてもよい。
（ｉ）    M156F
（ｉｉ）    Y168W（「Ｉｍ１５」と呼ぶ）
（ｉｉｉ）    L170A（「Ｉｍ１６」と呼ぶ）
（ｉｖ）    L170T（「Ｉｍ１７」と呼ぶ）
（ｖ）    V173G（「Ｉｍ１８」と呼ぶ）
（ｖｉ）    M185I
（ｖｉｉ）    V239A（「Ｉｍ１９」と呼ぶ）
（ｖｉｉｉ）    V239T（「Ｉｍ２０」と呼ぶ）
（ｉｘ）    V246G（「Ｉｍ２１」と呼ぶ）
（ｘ）    I286A（「Ｉｍ２２」と呼ぶ）
（ｘｉ）    Y292E（「Ｉｍ２３」と呼ぶ）
さらに、再び非限定例として、ＰａＴＤ分子に関して、以下の変異の１つ以上が生じさせられてもよい。
（ｉ）    S342D（「Ｉｍ２４」と呼ぶ）
（ｉｉ）    S345D（「Ｉｍ２５」と呼ぶ）
（ｉｉｉ）    L348D（「Ｉｍ２６」と呼ぶ）
（ｉｖ）    R403K（「Ｉｍ２７」と呼ぶ）
【００３３】
誤解を避けるために、上記（ｉ）〜（ｘｉ）として列挙されているＣＢＭ変異のいずれも、および（ｉ）〜（ｉｖ）として列挙されているＰａＴＤ変異のいずれも、個々におよび／または列挙されている変異の１つ以上の他の変異と組み合わせて生じさせられてもよい。例えば、残基１５６、１７０および１８５または２３９、２４６、２８６および２９２または１５６、１７０、１８５、２３９、２４６、２８６および２９２の２つ以上にある変異が組み合わされてもよい。さらに、または代替的に、残基２３９および２４６または２８６および２９２にある変異が組み合わされてもよい。
さらに、上で挙げた変異は例にすぎず、当然のことながら、所望の特性（例えば、ヒト宿主における免疫原性／抗原性の低下）を有するＣＢＭ／オリゴマー形成ドメインをもたらす、示した位置にあるあらゆる変異が本発明の範囲内に含まれるべきである。
【００３４】
この分野の当業者が１つ以上のアミノ酸変異をＣＢＭまたはオリゴマー形成ドメイン配列に導入するのを可能にする多くの技術が存在する。そうした技術のいずれかがここで使用されてもよく、それらとしては、例えば、（部位）特異的変異誘発（（ｓｉｔｅ−）ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、ＰＣＲ変異誘発、挿入変異誘発（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎａｌ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、符号タグ化変異誘発（ｓｉｇｎａｔｕｒｅ  ｔａｇｇｅｄ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）、トランスポゾン変異誘発および／または配列飽和変異誘発（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｓａｔｕｒａｔｉｏｎ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）を含む、変異誘発技術が挙げられる。本明細書に記載されている任意の１つ以上の変異を導入するために遺伝子合成技術も使用することができる。
任意の変異誘発手順に先立って、野生型ＣＢＭおよび／またはオリゴマー形成ドメイン核酸配列は、例えば、細菌（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）発現系などの発現系における発現のためにコドンが最適化される、コドン最適化処理に供されてもよい。
【００３５】
有用なシアル酸結合分子は、単量体改変ＣＢＭ（すなわち、単一の改変ＣＢＭ）を含む場合もあり、その他は、多量体、言い換えると、２つ以上のＣＢＭ（例えば、２つ以上の改変ＣＢＭ）を含む分子である場合もある。そのような場合には、シアル酸結合分子は、「多量体ＣＢＭ」と呼ばれることもある。複数のＣＢＭを含むシアル酸結合分子は、２つ以上の改変ＣＢＭを含んでもよく、その場合、シアル酸結合分子内のすべてではなくいくつかのＣＢＭが改変される。言い換えると、２つ以上のＣＢＭを含むシアル酸結合分子は、改変および未改変ＣＢＭの混合物を含んでもよい。
一実施形態において、シアル酸結合分子は、六量体ＣＢＭを含んでもよい。六量体ＣＢＭは、６つのＣＢＭ単量体を含む。大半の場合、六量体ＣＢＭは、２つの融合したＣＢＭを含み、それが、融合したオリゴマー形成（三量体形成）ドメインによりそれら自体にさらに結合される。
【００３６】
例として、有用な六量体ＣＢＭ分子の一般構造は、以下のとおり表すことができる。
【化１】
2021511308.tif 000003
上の概略（および一般）構造は、それぞれが２つのＣＢＭ（ＣＢＭ１およびＣＢＭ２）ならびにオリゴマー形成ドメイン（この場合、三量体形成ドメイン：ＴＤ）を含む３つの繰り返し単位を含むシアル酸結合分子を示す。
【００３７】
本明細書に記載されるとおり、ＣＢＭ部分の一方または両方は、本明細書に記載される改変ＣＢＭであってもよい。各繰り返し単位は、同じでも、または異なってもよく、言い換えると、同時に繰り返し単位のそれぞれが（改変されたまたは別の）２つのＣＢＭを含んでもよい。ＣＢＭのタイプおよび／または改変のレベルもしくは程度は、さまざまであってもよい。非限定例として、１つの繰り返し単位は、野生型配列を有する２つのＣＢＭを含んでもよい。別の１つは、１つが野生型配列を有し、１つが（本明細書に記載される１つ以上の変異を含む）改変された配列を有する２つの異なるＣＢＭを含んでもよい。第３の繰り返し単位は、２つの（本明細書に記載されている１つ以上の変異を含む）改変ＣＢＭを含んでもよい。当業者は、ＣＢＭタイプおよび／または配列（野生型対変異配列）の他の組み合わせが作製され、試験されてもよいことを理解するであろう。
【００３８】
非限定例として、以下は、六量体シアル酸結合分子を作製するために使用してもよい（「ＨＥＸ」単位と呼ぶ）個々の単位を表す。それぞれの場合において、ＨＥＸ単位は、２つの改変ＣＢＭ（ＣＢＭ１およびＣＢＭ２と示される）を含み、それぞれのＣＢＭに導入された特定の変異は括弧内に特定されている。「−−−−」記号は、（一方のＣＢＭを別のＣＢＭと、またはＣＢＭをオリゴマー形成ドメインと連結する）アミノ酸リンカーを示すことに留意すべきである。したがって、六量体シアル酸結合分子は、いくつか（例えば、３つ）のＨＥＸ単位から構成されてもよい。それぞれの場合において、（「ＴＤ」と示される）オリゴマー形成ドメインは、その単位を合わせて三量体として結合する。任意の所与の六量体は、見出しＨＥＸ１、ＨＥＸ２、ＨＥＸ３、ＨＥＸ４、ＨＥＸ５、ＨＥＸ６およびＨＥＸ１７として上（および下）に記載されている単位の同一のコピーを含んでもよいが、当業者は、さらなる選択肢が利用可能であることを理解するであろう。例えば、ＨＥＸ単位は、それぞれが異なる変異（本明細書において詳述されている選択肢から選択される１つ以上である変異）を有する２つのＣＢＭから構成されてもよい。
(i) HEX1
CBM1 (L170T V239A V246G I286A Y292E)-----CBM2 (L170T V239A V246G I286A Y292E)-----TD (S342D L348D R403K)
(ii) HEX2
CBM1 (V239A V246G I286A Y292E)----CBM2 (V239A V246G I286A Y292E)----TD (S342D R403K)
(iii) HEX3
CBM1 (V239A V246G I286A)-----CBM2 (V239A V246G I286A)-----TD (S342D R403K)
(iv) HEX4
CBM1 (V239A V246G)-----CBM2 (V239A V246G)-----TD (S342D)
(v) HEX5
CBM1 (V239A V246G)-----CBM2 (V239A V246G)-----TD (R403K)
(vi) HEX6
CBM1 (V239A V246G)-----CBM2 (V239A V246G)-----TD (S342D R403K)
(vii) HEX17
CBM1 (V239A V246G A162P)-----CBM2 (V239A V246G A162P)-----TD (S342D R403K)
【００３９】
なお、ＨＥＸ６およびＨＥＸ１７は、追加のＡ１６２Ｐ変異を除いて一致する。このプロリン変異（残基１６２にある野生型アラニンの置換）は、熱安定性を向上させることが示された（単一のＣＢＭ  Ｔｍが３〜４℃だけ）。プロリン変異の使用に関するさらなる情報は、一般的なアプローチを記載しているFu 2009, 'Increasing protein stability by improving beta-turns'(DOI 10.1002/prot.22509)から導き出すことができる。プロリン変異は、ＣＢＭ分子の予測される免疫原性に影響を及ぼさず（増加または低下させず）、他の変異、ＮもしくはＣ末端またはリガンド結合部位の近くに位置しない。むしろ予想外にも、熱安定性の中程度の向上を超えて、Ａ１６２Ｐ変異が、インビボ実験において、特に、ＨＥＸ６を使用して行われたそうした同じ実験と比較して著しい向上を示す六量体ＣＢＭ（すなわち、ＨＥＸ１７）をもたらすことが確認された。例えば、改変分子（特に、３×ＨＥＸ１７単位を含む分子）は、例えば、ＩＬ−８を含む、炎症促進サイトカインに対する調節を示す。実際に、３×ＨＥＸ１７単位を含む分子によるＩＬ−８の産生に対する調節効果（特に、阻害効果）は、他の試験された改変分子を超えて向上した。
【００４０】
Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名「ＳｐＯｒｉｇ」）アミノ酸配列と比較した、ＨＥＸ６およびＨＥＸ１７分子のアミノ酸配列は以下である。
SpOrig GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSAT
HEX6   GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAFYNLFSVSSAT
HEX17  GAMVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAFYNLFSVSSAT
SpOrig KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG
HEX6   KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG
HEX17  KKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTVEKPTAELPKG
SpOrig RVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT
HEX6   RARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT
HEX17  RARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIRNLTVYNRALT
SpOrig PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAF
HEX6   PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDAKAPAF
HEX17  PEEVQKRSGGGSGVIEKEDVETNASNGQRVDLSSELDKLKKLENATVHMEFKPDPKAPAF
SpOrig YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV
HEX6   YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV
HEX17  YNLFSVSSATKKDEYFTMAVYNNTATLEGRGSDGKQFYNNYNDAPLKVKPGQWNSVTFTV
SpOrig EKPTAELPKGRVRLYVNGVLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR
HEX6   EKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR
HEX17  EKPTAELPKGRARLYVNGGLSRTSLRSGNFIKDMPDVTHVQIGATKRANNTVWGSNLQIR
SpOrig NLTVYNRALTPEEVQKRSGGALGVPDFESDWFSVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS
HEX6   NLTVYNRALTPEEVQKRSGGSLGVPDFESDWFDVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS
HEX17  NLTVYNRALTPEEVQKRSGGSLGVPDFESDWFDVSSNSLYTLSHGLQRSPRRVVVEFARS
SpOrig SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIRLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT
HEX6   SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT
HEX17  SSPSTWNIVMPSYFNDGGHKGSGAQVEVGSLNIKLGTGAAVWGTGYFGGIDNSATTRFAT
SpOrig GYYRVRAWI
HEX6   GYYRVRAWI
HEX17  GYYRVRAWI
【００４１】
いかなる特定の使用または用途に縛られることを望まないが、本開示の分子は、
（ｉ）疾患の処置および／または予防を必要とする対象における疾患の処置および／または予防に；
（ｉｉ）（ヒトまたは動物対象における）免疫応答の調節に；
（ｉｉｉ）細胞成長、増殖および／または分化の調節に
（ｉｖ）アジュバントとして；および／または
（ｖｉ）医薬の製造に
有用な場合もある。
【００４２】
再びいかなる特定の使用に縛られることを望まないが、本開示の分子は、さまざまな疾患および／または状態、特に、病原体、とりわけ、細胞表面シアル酸含有レセプターに結合することができる病原体によって引き起こされるか、またはもたらされる疾患または状態の処置および／または予防に（薬剤として）使用されてもよい。本開示は、病原体、とりわけ、細胞表面シアル酸含有レセプターに結合することができる病原体によって引き起こされるか、またはもたらされる疾患および／または状態を患っているか、あるいはそれと接触したリスクがある対象、特にヒト対象の処置に有用な方法も提供することができる。例えば、「病原体」という用語は、細胞表面炭水化物と結合する、それを認識する、あるいは別の方法でそれと関連づけることができるあらゆる病原体、とりわけ、細胞に結合／付着する手段および／または細胞に入り込む手段として細胞表面（シアル酸）炭水化物の存在を活用または利用するよう進化した病原体を包含する場合もある。したがって、「病原体」という用語は、微生物病原体を含んでもよく、それらとしては、ＯｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅまたはＰａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅファミリーに属するウイルスなどの呼吸器病原体、例えば、インフルエンザおよびヒトパラインフルエンザ、ならびにＳｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ属（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅなど）に属する細菌および／またはＨａｅｍｏｐｈｉｌｕｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｚａｅ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａを挙げることができ、それらのすべてが哺乳動物細胞の表面にある炭水化物に結合することができる。当業者は、本明細書に記載されているタイプの病原体が最も頻繁にコロニー形成／侵入する哺乳動物細胞が、上皮細胞、とりわけ、粘膜管を覆う上皮細胞（例えば、呼吸上皮細胞）であることを理解するであろう。疾患を処置または予防するためにシアル酸結合分子をどのように使用することができるかの完全な開示に関しては、その内容全体を参照によって本明細書に組み込んだものとするＰＣＴ／ＧＢ２００９／００２１８９を参照のこと。
【００４３】
（ヒトまたは動物対象における）免疫応答の調節に関して、本明細書に記載されているさまざまなシアル酸結合分子（１つ以上の改変ＣＢＭを含む分子）は、免疫調節特性を有する。例えば（理論に縛られることを望まないが）、本開示のシアル酸結合分子は、宿主免疫応答を調節し、免疫系を刺激し、免疫系プロセス、経路および／またはその任意の構成成分の発現、機能および／または活性を調節する（例えば、増加または低減させる）。「刺激すること」という用語は、免疫応答に対して使用される場合、免疫源、抗原、病原体、疾患もしくは感染症に対する免疫系の迅速さおよび／または反応性を高める現象を包含する場合もある。理論に縛られることを望まないが、本明細書中で開示されているシアル酸結合分子と関連づけられるあらゆる免疫調節特性に加えて、本開示のシアル酸結合分子を投与されたか、またはそれと接触させられた対象は、感染症／疾患の発症により良く対処することができるようになる場合もある。シアル酸結合分子の免疫調節活性の完全な開示に関しては、内容全体を参照によって本明細書に組み込んだものとするＰＣＴ／ＧＢ２０１５／０５０１６１を参照のこと。
【００４４】
さらに、本開示のシアル酸結合分子（１つ以上の改変ＣＢＭを含んでもよい分子）が細胞成長および／または細胞活性の状況を調節するために使用されてもよいことが示された。「成長」および「活性」という用語は、細胞に対して使用される場合、細胞増殖、細胞生存性、細胞遊走、細胞代謝、細胞分化および／または細胞形態／表現型の１つ以上と関連づけられるプロセスおよび／または現象を含む場合もある。「成長」および／または「活性」という用語は、例えば、免疫系の特定の化合物、サイトカイン、ケモカインおよび１つ以上の環境因子（光、温度、圧力、機械的応力および同種のもの）に対する応答を含む、特定の外来性および／または内在性因子または刺激に対する細胞の応答をさらに含む場合もある。したがって、本明細書中で開示されているシアル酸結合分子は、細胞応答性のレベルを調節する（阻害する、低下させるまたは増加させる）ために使用することができる。したがって、本開示の任意の分子は、異常な細胞成長および／または活性によって引き起こされる、もたらされるおよび／または特徴づけられる疾患および／または状態の処置または予防あるいは同じものを処置または予防するための薬剤の製造に使用することができる。
【００４５】
いかなる特定の医学的用途に縛られることを望まないが、異常な細胞成長および／または活性によって引き起こされる、もたらされるまたは特徴づけられる疾患は、例えば、良性または悪性状態と呼ばれるか、または分類されるものを含む、細胞増殖および／または分化障害を含む場合もあることに留意すべきである。例えば、「細胞増殖および／または分化障害」という用語は、まとめて「がん」と呼ばれる疾患および／または状態を含む場合もある。「がん」という用語は、以下に限定されるものではないが、乳がん、骨がん、脳がん（神経膠腫）、膵がん、肺がん、前立腺がん、皮膚がん、卵巣がん、子宮頸がん、頭頸部がんおよび腸／結腸がんの形態と呼ばれるがんを含む場合もある。「がん」という用語はまた、まとめて「白血病」（慢性および急性の両方）と呼ばれる疾患および／または状態ならびに粘膜／粘膜関連の表面または組織に影響を及ぼすあらゆるがんを含む場合もある。
【００４６】
したがって、１つ以上の改変ＣＢＭを含んでもよい本明細書に記載されているシアル酸結合分子は、がんの処置および／または予防に用途を見出すことができる（すなわち、使用するためのものであってもよい）。本開示のシアル酸結合分子は、がんの処置および／または予防のための薬剤の製造にさらに使用されてもよい。細胞成長および／または細胞活性を調節するためにシアル酸結合分子をどのように使用することができるかの完全な開示については、内容全体を参照によって本明細書に組み込んだものとするＰＣＴ／ＧＢ２０１７／０５２８０８を参照のこと。
【００４７】
（１つ以上の改変ＣＢＭを含む）任意の本開示のシアル酸結合分子は、アジュバントとして使用されてもよく、それ自体が１つ以上の抗原に対する宿主免疫応答を増大させる、調節するまたは向上させるために１つ以上の抗原と組み合わせて使用されてもよい。本明細書中で開示されているシアル酸結合分子ベースのアジュバントは、任意のタイプの抗原と組み合わせることができるが、本開示の対象であるアジュバントは、特に、粘膜アジュバント、言い換えると、粘膜に投与される抗原とともに使用するためのアジュバントとして有用な場合もあることに留意すべきである。シアル酸結合分子をどのようにアジュバントとして使用することができるかの完全な開示に関しては、内容全体を参照によって本明細書に組み込んだものとするＰＣＴ／ＧＢ２０１７／０５２８０５を参照のこと。
【００４８】
本開示のシアル酸結合分子（１つ以上の改変ＣＢＭを含んでもよい分子）が敗血症の処置および／または予防に有用性を見出すことができることも示された。「敗血症」という用語は、感染性（例えば、ウイルス性、細菌性および／または真菌性）の病因を有する可能性のあるいくつかの疾患、状態および／または症候群に対して使用される。例えば、「敗血症」という用語は、ＳＩＲＳ（全身性炎症反応症候群：Singer et al, 2016: JAMA "The third International consensus definitions for sepsis and septic shockを参照）、敗血症（「感染過程に応じたＳＩＲＳ」と定義されることが多い）、重症敗血症（敗血症に誘発された臓器不全または組織低灌流を伴う敗血症である（それ自体が血圧低下、乳酸上昇または尿量減少として現れる場合もある）を伴う敗血症である）および敗血症性ショック（重症敗血症に加えて、例えば、静脈内輸液の投与にもかかわらず持続する低血圧）と呼ばれる疾患状態、状態あるいは症候群を含む場合もある。「敗血症」という用語は、ほとんどの場合、「細菌性敗血症」に起因する疾患、状態および／または症候群に対して使用される。細菌性敗血症は、血液中の細菌の存在から起きる可能性があり、「菌血症」または「敗血症（ｓｅｐｔｉｃａｅｍｉａ）」と呼ばれることもある。「敗血症」という用語はまた、血液中のＬＰＳ、毒素および／または膜断片などの細菌成分の存在によって引き起こされるか、またはもたらされる疾患および／または状態を包含する場合もある。このタイプの成分は、他の組織および／または臓器に存在する一次感染、例えば、肺、脳、皮膚、尿路、骨盤および／または腹部に存在する感染症から生じる場合もある。
敗血症の処置および／または予防にシアル酸結合分子をどのように使用することができるかの完全な開示に関しては、内容全体を参照によって本明細書に組み込んだものとするＰＣＴ／ＧＢ２０１７／０５２８００を参照のこと
【００４９】
本明細書に記載されている改変ＣＢＭおよび同じものを含む任意の分子は、その要素をいくつかの組織または細胞に向けるまたは送達するための他の要素と結合されても、結びつけられてももしくは連結されても、または関連づけられてもよい。このタイプの分子は、「治療的弾頭（ｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｗａｒｈｅａｄ）」または「複合物」としても知られている場合もある。理論に縛られることを望まないが、特定の細胞レセプターおよび膜結合分子における、本開示の分子内に含まれることもあるさまざまな改変ＣＢＭに対するリガンドの存在は、本明細書に記載されているさまざまな分子を、結合した異種分子（これらは、改変ＣＢＭまたは同じものを含む分子とは別個で異なる分子である）を前記細胞または前記細胞を含む組織に送達する手段として活用することを可能にする場合もある。結合したそのような分子は、例えば、がんを含むさまざまな疾患の処置に有用な場合もあり、この場合、本明細書に記載されている結合した分子（細胞の表面に発現する炭水化物に対して親和性を示す分子）は、そこに治療的および／または細胞傷害性部分を向けるために使用されてもよい。
例として、（任意の改変ＣＢＭまたは同じものを含む分子を含む）本明細書に記載される分子は、１つ以上（例えば、２、３、４つ以上）の例えば、治療的および／または細胞傷害性である部分と結合されてもよい。
有用な分子は、異種部分と結合した（連結された、結びつけられた、または別の方法で関連づけられた）本開示の改変ＣＢＭを含んでもよい。異種部分は、改変ＣＢＭ分子の一部の部分に結合されてもよい治療的および／または細胞傷害性部分を含んでもよい。
例えば、異種部分は、改変ＣＢＭ分子の一端または両端と結合されてもよい。異種部分は、さらにまたは代わりに改変ＣＢＭ分子の内部部分に結合されてもよい（またはさらには融合されてもよい）。当然のことながら、異種部分は改変ＣＢＭ分子に結合されるが、分子は（その結合も）、改変ＣＢＭ分子の炭水化物（シアル酸）結合特性を（実質的に）妨げても、除去しても、または低下させてもならない。
【００５０】
明記したとおり、異種部分は、本明細書に記載されている改変ＣＢＭ（または同じものを含む分子）のいずれか１つに対するリガンドを含むレセプターを発現する細胞または組織に影響を及ぼす疾患の処置に有用な薬物であってもよい。例えば、薬物は、がんおよび同種のものの処置に使用するための化学療法薬であってもよい。異種部分は、細胞を殺すか、または細胞のアポトーシスを誘導することができる細胞傷害性部分であってもよい。異種部分は、特定の細胞を特定の組織にまたは組織内にリクルートすることができる分子を含んでもよい。例えば、異種部分は、例えば、Ｔ細胞を、例えば、腫瘍またはがん組織にリクルートする手段として使用することができるＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）であってもよい。
本開示は、本明細書に記載のさまざまな使用、薬剤および方法に利用するための組成物を提供することができる。したがって、本明細書に記載されている任意の改変ＣＢＭ（または改変ＣＢＭを含む任意の分子）は、使用のために製剤化されてもよい。
都合上、組成物、製剤および同種のものについて記載する下記セクションに関して、本明細書に記載される改変ＣＢＭを含む分子、同じものを含む分子および同じものを含む任意の複合物（例えば、改変ＣＢＭ：：薬物複合物／融合物）はともに、一般用語「改変ＣＢＭを含む分子」に含まれることになることに留意すべきである。
【００５１】
改変ＣＢＭを含む分子は、治療または医薬組成物として使用するために製剤化されてもよい。さまざまな組成物は、１つ以上の本明細書に記載されている分子を含んでもよく、任意の所与の処置は、これらの組成物の１つ以上の投与（一緒、同時、または別々）が必要とされる場合もある。本開示による組成物は、１つ以上の他の治療的部分、例えば、１つ以上の疾患および／または状態の処置に有用な分子、小分子、抗体、オリゴヌクレオチドおよび同種のものをさらに含んでもよいことに留意すべきである。さらに、または代替的に、改変ＣＢＭは、１つ以上の他の（異なる）治療的要素とともに投与されてもよく、この場合、１つ以上の他の（異なる）治療的要素は、同じまたは異なる疾患の処置のために使用されてもよい。「ともに投与される」という用語は、１つ以上の他の治療的要素の投与の前、後および／またはそれと同時の改変ＣＢＭの投与を包含する。
本明細書に記載されている分子は、（経口を含む）経腸、非経口および／または局所投与用に製剤化されてもよく、当業者は、厳密な製剤化は投与経路に応じて変化する場合もあることを理解するであろう。
【００５２】
本発明による医薬組成物は、医薬品に通例使用される物質を含み、例えば、Remington's The Sciences and Practice of Pharmacy, 22nd Edition(Pharmaceutical Press 2012)および／またはHandbook of Pharmaceutical Excipients, 7th edition(compiled by Rowe et al, Pharmaceutical Press, 2012)に記載されているとおりに従来どおり調製されてもよく、これらの文献および参考文献のすべての内容全体を参照により組み込んだものとする。
【００５３】
本開示の治療または医薬組成物（改変ＣＢＭを含む分子を含み、本明細書に記載の薬剤または方法のいずれかに使用するための組成物）は、薬学的に許容される賦形剤、担体、アジュバントおよびバッファーの１つ以上とともに製剤化されてもよい。本組成物は、例えば、経口（経粘膜を含む）、非経口、経腸、筋肉内、皮下、静脈内投与されてもよく、または所望の効果（例えば、細胞成長／活性の調節、同じものと関連づけられる疾患／状態および／またはがんの処置または予防および／または腫瘍成長の調節）を達成するのに有用な任意の他の経路を介して投与されてもよい。明記したとおり、選択された投与経路に応じて、厳密な組成物の製剤化は、変化する場合もある。
【００５４】
改変ＣＢＭを含む分子を含み、対象に投与するための治療または医薬製剤は、化合物および／またはその炭水化物結合特性を不活性化するか、または変性させる可能性のある酵素、酸および他の天然の化合物／条件（例えば、免疫系の化合物（抗体を含む）、細胞およびプロセスを含む）の作用から分子を保護する材料中にコーティングされても、カプセル化されても、あるいは包まれてもよい。
【００５５】
本明細書に記載されている分子を含む組成物に使用するために利用可能な場合もあるさまざまな標準的な従来の賦形剤の中に、非経口、経腸、経口（経粘膜を含む）および他の投与の経路に適した、改変ＣＢＭを含む分子と有害な反応をしない薬学的に許容される有機または無機の担体物質がある。
改変ＣＢＭを含む分子が非経口投与用に製剤化される場合、組成物は、滅菌されてもよい。
本組成物は、油ベースの溶液もしくは水溶液、懸濁液および／またはエマルジョンを含んでもよい。
他の実施形態において、本組成物は、例えば、（溶解性もしくは生分解性）フィルム、ペッサリーまたは（座剤を含む）埋め込み剤（ｉｍｐｌａｎｔ）などの埋め込み剤の形をとってもよい。
本明細書に記載されている分子を含む医薬調製物は、安定剤、湿潤剤、乳化剤、塩（浸透圧に影響を与える際に使用するため）、バッファーおよび／または活性化合物と有害な反応をしないその他の物質と混合されてもよい。
本明細書に記載されている１つ以上の分子は、経口用に製剤化され、投与されてもよい。明記したとおり、経口投与は、それ自体が鼻腔内投与および／または吸入による投与を含むであろう、粘膜投与を含むであろう。
【００５６】
使用のための組成物としては、経口投与に適した固体剤形を挙げることができる。これらとしては、例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、散剤、および顆粒剤を挙げることができる。任意の所与の固体剤形において、改変ＣＢＭを含む分子（または同じものを含む任意の分子もしくは複合物）は、少なくとも１つの不活性な薬学的に許容される賦形剤と混合されてもよい。適した賦形剤の例としては、この分野の当業者にはわかるであろうが、例えば、充填剤もしくは増量剤、保水剤、湿潤剤、結合剤、崩壊剤、溶解抑制剤（ｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｅｒ）、吸収促進剤、吸着剤、滑沢剤またはそれらの混合物を挙げることができる。錠剤、丸剤またはカプセル剤は、緩衝剤をさらに含んでもよい。錠剤、糖衣錠、カプセル剤、丸剤および／または顆粒剤などの固体剤形はまた、胃腸環境および／または胃酸から保護するコーティングなどのコーティングおよびシェルを用いて調製することができる。
固体剤形は、不透明化剤（ｏｐａｃｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含んでもよく、腸管の特定の部分においてまたはそこへの活性剤（この場合、改変ＣＢＭを含む分子または同じものを含む複合物）の遅延放出を確保するよう製剤化されてもよい。
【００５７】
経口投与用の固体組成物は、それぞれの投薬が適切な用量の改変ＣＢＭを含む分子（または同じものを含む複合物）を含む単位剤形に製剤化され得る。任意の所与の固体剤形内に含まれる改変ＣＢＭを含む分子（または同じものを含む複合物）の厳密な量は、意図される使用に応じて変化することになる。固体組成物は、「単位用量」を含んでもよく、単位用量は、処置期間にわたって所望の効果（例えば、細胞成長および／または活性の調節）をもたらすよう算出された量の改変ＣＢＭを含む分子（または同じものを含む複合物）を含む。
経口投与用の液体剤形（明記したとおり）としては、乳剤、液剤、懸濁剤、シロップ剤、およびエリキシル剤を挙げることができ。液体剤形は、化合物または組成物に加えて、当該技術分野において一般的に使用される水またはその他の溶媒などの不活性希釈剤、可溶化剤および乳化剤を含んでもよい。
【００５８】
任意の本開示の分子は、任意の適切な量で使用されてもよい。明記したとおり、本分子は、経口、粘膜または非経口投与用に製剤化されてもよく、したがって、厳密な製剤化は、意図される投与経路および／または対象の生理的および／またはその他の特質によって決まる場合もある。任意の所与の用量に存在する改変ＣＢＭを含む分子の量は、０．１μｇ〜１０００μｇの範囲であってもよい。例えば、約０．１μｇ、０．２μｇ、０．３μｇ、０．４μｇ、０．５μｇ、１μｇ、１０μｇ、２０μｇ、２５μｇ、５０μｇ、１００μｇ、２００μｇ、３００μｇ、４００μｇ、５００μｇ、６００μｇ、７００μｇ、８００μｇまたは９００μｇの量である。より多い量の改変ＣＢＭ（または同じものを含む分子）が使用されてもよく、例えば、１ｍｇ〜１０ｍｇの範囲の量、例えば、約１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４μｇ、５ｍｇ、６ｍｇ、７ｍｇ、８ｍｇまたは９ｍｇの量である。選択された量の改変ＣＢＭ分子が、特定の体積の薬学的に許容される賦形剤、希釈剤および／またはバッファー中で製剤化されてもよい。賦形剤、希釈剤またはバッファーの体積は、約１０μｌ〜５ｍｌであってもよい。例えば、ＣＢＭ３２／４７／６７／７０分子の必要とされる量は、約１５μｌ、２０μｌ、２５μｌ、３０μｌ、３５μｌ、４０μｌ、４５μｌ、５０μｌ、５５μｌ、６０μｌ、６５μｌ、７０μｌ、７５μｌ、８０μｌ、８５μｌ、９０μｌ、９５μｌ、１００μｌ、２００μｌ、２５０μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ、９００μｌ、１ｍｌ、２ｍｌ、３ｍｌまたは４ｍｌと組み合わされてもよい（または製剤化されてもよい）。例えば、５μｇ／ｍｌ、１０μｇ／ｍｌ、２０μｇ／ｍｌ、２５μｇ／ｍｌ、５０μｇ／ｍｌ、１００μｇ／ｍｌ、２００μｇ／ｍｌ、３００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、６００μｇ／ｍｌ、７００μｇ／ｍｌ、８００μｇ／ｍｌまたは９００μｇ／ｍｌ、９５０μｇ／ｍｌ、１ｍｇ／ｍｌ、１．５ｍｇ／ｍｌ、２ｍｇ／ｍｌ、２．５ｍｇ／ｍｌ、３ｍｇ／ｍｌ、３．５ｍｇ／ｍｌ、４ｍｇ／ｍｌ、４．５ｍｇ／ｍｌ、５ｍｇ／ｍｌ、５．５ｍｇ／ｍｌ、６ｍｇ／ｍｌ、６．５ｍｇ／ｍｌ、７ｍｇ／ｍｌ、７．５ｍｇ／ｍｌ、８ｍｇ／ｍｌ、８．５ｍｇ／ｍｌ、９ｍｇ／ｍｌまたは９．５ｍｇ／ｍｌの用量を含む、約０．１μｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌの濃度の用量が使用されてもよい。
【００５９】
使用時、疾患（例えば、細胞増殖および／または分化障害あるいはがん）の処置および／または予防の一部として投与される改変ＣＢＭ分子の用量は、何日、何週、何か月または何年にわたって複数回投与されてもよい。例えば、最初の（または第１の）投与後、約（＋／−１または２日）３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、２１、２８および／または３５日後に改変ＣＢＭ分子の用量が再び投与されてもよい。複数の繰り返しの用量が、規則的な間隔で、例えば、先行する用量の後、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７または２８日毎に与えられてもよい。与えられる任意の日に、特定の用量の改変ＣＢＭ分子が１、２、３回以上投与されてもよい。毎回、改変ＣＢＭ分子は、適した処置に影響を及ぼすか、または特定の疾患もしくは状態に対する予防をもたらすよう（最良だと考えられる何らかの経路によって）投与されてもよい。
本発明は、以下を示す以下の図を参照して詳細に記載される。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】抗原性ペプチドのＰｒｏＰｒｅｄ予測を示す図である。Ａ．ＳｐＣＢＭ配列。Ｂ．ＰａＴＤ配列。予測されるバインダーは青で色づけされ、それぞれの結合領域の最初の残基は赤で示されている。Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ（緑のバー）およびＰｒｏｉｍｍｕｎｅ（紫のバー）によって予測される抗原性ペプチドを配列の下に示す。
【図２】野生型および変異ドメインの発現試験を示す図である。レーン１、Ｍ１２標準物質；レーン２、ＷＴＳｐＣＢＭ；レーン３〜１１、Ｉｍ１５〜Ｉｍ２３；レーン１２〜１５、Ｉｍ２４〜Ｉｍ２７；レーン１６、ＷＴ  ＰａＴＤ。Ａ）全細胞抽出物、Ｂ）可溶性抽出物。
【図３】ＳｐＣＢＭ構造におけるペプチド１６７〜１８１の位置を示す図である。
【図４】バリアントＩｍ２８〜Ｉｍ３４の発現およびＮｉ−ＮＴＡプルダウンを示す図である。
【図５】六量体構造上のＨＥＸ１７変異の部位を示す図である。個々のＳｐＣＢＭ（ｐｄｂコード４ｃ１ｘ）およびＰａＴＤ（ｐｄｂコード２ｗ３８）の結晶構造を組み合わせて六量体（すなわち、１分子当たり６コピーのＳｐＣＢＭおよび３コピーのＰａＴＤ）を作ることによってＨＥＸ１７の四次構造のモデルを作った。結合したリガンド（α２，３−シアリルラクトース）の位置を棒状（オレンジ）に示している。変異の位置も以下のように示す：青、Ａ１６２Ｐ変異の部位；水色、他の２つのＣＢＭ変異の部位；マゼンダ、ＴＤ変異の部位。
【図６】ＩＬ−８刺激を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。２４ｈまたは４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ＩＬ−８含有量をＥＬＩＳＡによって求めた。対照と処理細胞との間の統計的有意性を、Ｔｕｋｅｙ多重比較検定を使用した一元配置分散分析法を用いて判断した。
【図７Ａ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４ｈまたは４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図７Ｂ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４ｈまたは４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図７Ｃ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４ｈまたは４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図７Ｄ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４ｈまたは４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図７Ｅ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４ｈまたは４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図７Ｆ】炎症性メディエーターの多重分析を示すグラフである。１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７）の添加によってＡ５４９細胞を刺激した。６ｈ、２４ｈまたは４８ｈの時点において細胞上清を採取し、ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイを使用して炎症性メディエーターを分析した。対照および／またはＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図８】インフルエンザ菌株ＰＲ８により致死的攻撃をした場合のＣＢＭ処置マウスおよび未処置マウスの生存パーセンテージを示すグラフである。ＣＢＭ２、ＣＢＭ３およびＣＢＭ４は、それぞれＨＥＸ１７、ＨＥＸ６およびＷＴ（ＳｐＯｒｉｇ）を表す。ＣＢＭを単回投与した動物には、ＰＲ８による致死的攻撃の１日前に１００μｇのＣＢＭを与え、反復投与された動物にはＰＲ８攻撃の３日および１日前に２×０．１μｇのＣＢＭを与えた。
【図９】ＰＲ８感染中のＣＢＭ処置マウスおよび未処置マウスの臨床スコアを示すグラフである。ＣＢＭ２、ＣＢＭ３およびＣＢＭ４は、それぞれＨＥＸ１７、ＨＥＸ６およびＷＴ（ＳｐＯｒｉｇ）を表す。１〜５の上昇する臨床スコアは、それぞれ症状のない（１）から昏睡および死亡（５）を示す。
【図１０】ＰＲ８感染中のＣＢＭ処置マウスおよび未処置マウスの体重減少パーセンテージを示すグラフである。ＣＢＭ２、ＣＢＭ３およびＣＢＭ４は、それぞれＨＥＸ１７、ＨＥＸ６およびＷＴ（ＳｐＯｒｉｇ）を表す。
【図１１Ａ】ＰＲ８攻撃マウス試験からの２１日目の肺ホモジネートおよび血清組織の抗ｍＣＢＭ抗体分析を示すグラフである。ＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図１１Ｂ】ＰＲ８攻撃マウス試験からの２１日目の肺ホモジネートおよび血清組織の抗ｍＣＢＭ抗体分析を示すグラフである。ＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図１１Ｃ】ＰＲ８攻撃マウス試験からの２１日目の肺ホモジネートおよび血清組織の抗ｍＣＢＭ抗体分析を示すグラフである。ＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図１１Ｄ】ＰＲ８攻撃マウス試験からの２１日目の肺ホモジネートおよび血清組織の抗ｍＣＢＭ抗体分析を示すグラフである。ＷＴ六量体と六量体バリアントとの間の統計的有意性を、一元配置分散分析法（Ｔｕｋｅｙ多重比較検定）を使用して判断した。
【図１２ａ−１】３５日目のＢＡＬマウスサンプルの抗ＣＢＭ抗体レベルを示すグラフである。
【図１２ａ−２】３５日目のＢＡＬマウスサンプルの抗ＣＢＭ抗体レベルを示すグラフである。
【図１２ａ−３】３５日目のＢＡＬマウスサンプルの抗ＣＢＭ抗体レベルを示すグラフである。
【図１２ａ−４】３５日目のＢＡＬマウスサンプルの抗ＣＢＭ抗体レベルを示すグラフである。
【図１２ｂ−１】３５日目の血清マウスサンプルの抗ＣＢＭ抗体レベルを示すグラフである。
【図１２ｂ−２】３５日目の血清マウスサンプルの抗ＣＢＭ抗体レベルを示すグラフである。
【図１２ｂ−３】３５日目の血清マウスサンプルの抗ＣＢＭ抗体レベルを示すグラフである。
【図１２ｂ−４】３５日目の血清マウスサンプルの抗ＣＢＭ抗体レベルを示すグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
方法および結果
Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ：免疫原性領域の予測
Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａインシリコスクリーニング
インシリコＴ細胞エピトープスクリーニングは、４つの顕著な免疫原性集団および２つの境界の免疫原性集団を特定した。
顕著：
ドメイン    残基範囲        配列
ＳｐＣＢＭ  ２４５〜２５４  GVLSRTSLRS
ＰａＴＤ    ３４０〜３４９  WFSVSSNSLY
ＰａＴＤ    ３５１〜３５９  LSHGLQRSP
ＰａＴＤ    ３９８〜４０６  GSLNIRLGT
境界：
ドメイン    残基範囲        配列
ＳｐＣＢＭ  １６７〜１７８  FYNLFSVSSATK
ＳｐＣＢＭ  ２３９〜２５１  VRLYVNGVLSRTS
【００６２】
ＰｒｏｉｍｍｕｎｅヒトドナーＴ細胞増殖アッセイ
Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅ調査は、抗原性が高い２つの領域および抗原性が中程度の２つの領域を強調した。
抗原性が高い：
ドメイン    残基範囲        配列
ＳｐＣＢＭ  ２３６〜２５０  KGRVRLYVNGVLSRT
ＰａＴＤ    ３９２〜４０６  GAQVEVGSLNIRLGT
抗原性が中程度：
ドメイン    残基範囲        配列
ＳｐＣＢＭ  １６７〜１８１  FYNLFSVSSATKKDE
ＰａＴＤ    ３３８〜３５２  SDWFSVSSNSLYTLS
【００６３】
ＰｒｏＰｒｅｄインシリコ解析
さらなるインシリコツール、オンラインＰｒｏＰｒｅｄサーバ4も使用した。ＰｒｏＰｒｅｄサーバの結果を図１に示す。Ｎｏｒｄｉｃ  Ｂｉｏｐｈａｒｍａ／Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅエピトープの相対的な位置も強調され、３つの方法間で妥当な一致を示している。ＰｒｏＰｒｅｄは、上で挙げたエピトープに加えて、ＳｐＣＢＭドメインに別の１つの免疫原性エピトープを強く予測した。
ドメイン    残基範囲        配列
ＳｐＣＢＭ  ２８６〜２９４  IRNLTVYNR
個々のＣＢＭおよびＴＤドメインにある変異
免疫原性を低下させるであろう変異の設計を導くために、ＰｒｏＰｒｅｄを使用して、これらのペプチドの各残基をすべて代替残基に替える影響を試験した。アレルバインダー（ａｌｌｅｌｅ  ｂｉｎｄｅｒ）の予測される数を最も減少させたものが確認された。ＳｐＣＢＭおよびＴＤドメインの両方の結晶構造はわかっているため、タンパク質構造を明らかに妨害するであろう変異を導入する可能性を低下させるようこれらの変異のモデルも作った。
【００６４】
初めに、ＳｐＣＢＭに９つの単一の変異およびＰａＴＤに４つの単一の変異を導入し、それを以下に列挙する（「Ｉｍ」は、免疫原性変異体の略である）。
2021511308.tif 000004
注：Ｉｍ１〜Ｉｍ１４（示さず）は、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅデータが利用可能になる前にコドン最適化されていないバックグラウンドに変異誘発によって導入された。
ＷＴおよび変異コンストラクトの合成
ＷＴ  ＳｐＣＢＭ、ＷＴ  ＰａＴＤおよびバリアントＩｍ１５〜Ｉｍ２７をコードする遺伝子をＥ．ｃｏｌｉ発現のためにコドン最適化し、ＧｅｎｅＡｒｔによって合成した。その遺伝子を、その後、６Ｈｉｓタグ付きタンパク質としての発現のために社内でｐＨＩＳＴＥＶベクターにクローン化した。
【００６５】
発現および生物物理学的キャラクタリゼーション
溶解性を評価するために最初の発現試験を実施した。結果は、すべてが発現したが、すべてが溶解性な訳ではなかったことを示している（図２）。注：溶解性（またはその欠如）が必ずしも有用性の予測因子ではない。当業者は、タンパク質を製造または生産するとき、特定のプロセスには、（封入体および同種のものから）容易に精製されるため、不溶性材料の使用が必要とされることを理解するであろう。下流のプロトコルは、その後、溶解性などの特徴を調節するためにタンパク質を再構築してもよい。
【００６６】
発現試験の結果は、以下のことを示している。
・Ｉｍ１６（L170A）は、不溶性であるか、または非常に難溶性である
・Ｉｍ２５（ＴＤ、S345D）は、不溶性である
・Ｉｍ１５（Y168W）およびＩｍ１７（L170T）は、低下した溶解性を有する
・Ｉｍ１８（V173G）およびＩｍ２２（I286A）は、わずかに低下している。
・残りは、可溶性発現を示す。
１３の可溶性タンパク質をＥ．ｃｏｌｉにおいて発現させ、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）に続く６Ｈｉｓタグを除去するためのＴＥＶ消化、その後、リバースＩＭＡＣ（ｒｅｖｅｒｓｅ  ＩＭＡＣ）およびサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。
【００６７】
精製された１０のドメイン（ＷＴＳｐ、Ｉｍ１９、Ｉｍ２０、Ｉｍ２１、Ｉｍ２２、Ｉｍ２３、ＷＴＴＤ、Ｉｍ２４、Ｉｍ２６およびＩｍ２７）は、以下によってさらに特徴づけられた。
（ｉ）融解温度（Ｔｍ）を測定するためのＴｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ
（ｉｉ）三次構造をＷＴと比較するための近紫外円二色性（ＣＤ）
（ｉｉｉ）溶液中のオリゴマー状態を調べるための動的光散乱（ＤＬＳ）
（ｉｖ）シアリルラクトースに対する結合親和性を測定するための表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）
（ｖ）ＩＬ−８サイトカイン刺激の測定
【００６８】
その結果の概要を表１に示す。
【表１】
2021511308.tif 000005
表１．ＷＴドメインおよびそれらのバリアントの生物物理学的キャラクタリゼーションの定性的概要。色分けは、（緑’、オレンジおよび黄色を含む）緑から赤であり、ここでは、緑は、バリアントがその特定の特徴に関してそのＷＴ対応物とよく類似していることを示し、淡緑色（緑’）または黄色は、差の程度の増加を示す。赤またはオレンジは、顕著な差を示す。Ｎ／Ａ：タンパク質の溶解性／純度が不十分なため、これらのキャラクタリゼーションが実施されなかった。Ｎ／Ｄ：未決定。
【００６９】
Ｓｐペプチド１６７〜１８１：
Ｉｍ１５、Ｉｍ１６、Ｉｍ１７、Ｉｍ１８はすべて、不溶性または難溶性である（明記したとおり、これは、必ずしもタンパク質の有用性に影響を与える訳ではない）。これらは、「中程度に」抗原性の領域１６７〜１８１（FYNLFSVSSATKKDE）にある。この領域は、明らかに変化に非常に影響されやすい。
前の結果は、L170（およびI286）に隣接したM156FがＴｍを約４℃上昇させることを示している。
したがって、これはL170Tと組み合わせることができるであろう。M156Fは、予測される免疫原性を増加させない。
【００７０】
M185Iは、Ｔｍを５℃上昇させ、L170に平行する（図３）。この変異も含むことができるであろう。なお、M156Fのように、M185Iは予測される免疫原性を増加させないが、予測されるアレルバインダーの数をわずかに減少させる。
Ｓｐペプチド２３６〜２５０：
Ｉｍ１９、Ｉｍ２０、Ｉｍ２１はすべて、ＷＴと同様に挙動した。これらは、「高度に」抗原性の領域２３６〜２５０（KGRVRLYVNGVLSRT）にある。
トレオニン変異（Ｉｍ２０、V239T）よりもＩｍ１９（V239A）を選択した。予測される免疫原性に差はないが、Ｉｍ１９は、ＷＴ  Ｔｈｅｒｍｏｆｌｕｏｒ  Ｔｍおよび近紫外スペクトルとより一致している。これは、Ｉｍ２１（V246G）と組み合わされるであろう。
【００７１】
Ｓｐペプチド２８６〜２９４：
Ｉｍ２２（I286A）は、ＷＴと大まかに類似しているが、Ｉｍ２３（Y292E）は、低いリガンド親和性を示すようである。この領域、２８６〜２９４IRNLTVYNRは、Ｐｒｏｉｍｍｕｎｅによってはフラグが立たなかったが、ＰｒｏＰｒｅｄによっては免疫原性であると強く予測されている。
Ｉｍ２２がＷＴよりも低いＴｍを有するいくつかの指標がある。この残基は、M156に隣接しているため、M156Fが含まれた場合、異なるように挙動する可能性がある。
【００７２】
ＴＤペプチド３３８〜３５２：
Ｉｍ２４（S342D）およびＩｍ２６（L348D）は、ＷＴ三量体形成ドメインと類似の特徴を示すが、Ｉｍ２６のＴｍの低下がいくらか示唆される。これらは、「中程度に」抗原性の領域３３８〜３５２SDWFSVSSNSLYTLSにある。ＷＴ配列は、９つのアレルと結合することが予測されたが、Ｉｍ２４は、２つのアレルを予測し、Ｉｍ２４／Ｉｍ２６二重変異体は、１つのアレルを予測する。
ＴＤペプチド３９２〜４０６：
Ｉｍ２７（R403K）は、ＷＴと類似している。これは、「高度に」抗原性の領域３９２〜４０６GAQVEVGSLNIRLGTの一部である。この変異が導入されると、予測されるアレルは、２１から３に減少する。
【００７３】
複数の変異の組み合わせＩｍ２８〜３４の合成
以下の変異を導入した。
ｉ）M156F/L170T
ｉｉ）M156F/L170T/M185I：ＰｒｏＰｒｅｄにおいて、この領域に関して予測されるアレルは、ＷＴの３１からこの組み合わせの１９に減少している。
ｉｉｉ）V239A/V246G：ＰｒｏＰｒｅｄにおいて、この領域に関するアレルは、４４から３に減少している。
ｉｖ）I286A/Y292E：ＰｒｏＰｒｅｄにおいて、アレルは、４１から１に減少している。
ｖ）V239A/V246G/I286A/Y292Eは、先行する前の二重のものを組み合わせている。
ｖｉ）M156F/L170T/M185I/V239A/V246G/I286A/Y292Eは、すべてのＳｐ変異を組み合わせている
ｖｉｉ）ＴＤ：S342D/L348D/R403K：予測されるアレルは、ＴＤペプチド３３８〜３５２に関しては９から１に減少しており、ペプチドＴＤペプチド３９２〜４０６に関するアレルは、２１から３に減少している。この三重変異体は、すべてのＴＤ変異体を組み合わせている。これらはすべて、表面に露出し、ＴＤのＮ末端の遠位にあるため、六量体型のＳｐＣＢＭを妨げないことが予想されるであろう。
【００７４】
コンストラクトは、Ｉｍ２８〜Ｉｍ３４と呼ぶ。
（ＳｐＣＢＭ）バリアント  変異
Im28                    M156F/L170T
Im29                    M156F/L170T/M185I
Im30                    V239A/V246G
Im31                    I286A/Y292E
Im32                    V239A/V246G/I286A/Y292E
Im33                    M156F/L170T/M185I/V239A/V246G/I286A/Y292E
（ＰａＴＤ）バリアント    変異
Im34                    S342D/L348D/R403K
２．５  Ｉｍ２８〜Ｉｍ３４の発現および生物物理学的キャラクタリゼーション
単一の変異と同様に、組み合わせＩｍ２８〜Ｉｍ３４をＧｅｎｅＡｒｔによって合成し、発現解析のためにｐＨＩＳＴＥＶにサブクローニングした。Ｈｉｓタグ付き可溶性抽出物に対するニッケルビーズプルダウンも実施した（図４）。
【００７５】
六量体型
六量体コンストラクトＨＥＸ１〜ＨＥＸ１７の設計
六量体型（ＨＥＸ１〜ＨＥＸ１７と呼ぶ）をコードする遺伝子をＧｅｎｅＡｒｔによって合成した。
Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ
2021511308.tif 000006
【００７６】
タンデム型ＣＢＭコピーの反復配列を合成することに関連する問題を回避するために六量体型を２つの部分で合成した。第１の遺伝子は、第１のＣＢＭを含み、第２の部分は、第２のＣＢＭプラスＴＤを包含した。これらは、その後、同時にｐＨＩＳＴＥＶにクローン化して、発現時に三量体を形成するＳｐ２ＣＢＭＴＤコンストラクトを作り出すことができた。
第１の六量体、ＨＥＸ１は、ＣＢＭに変異L170T/V239A/V246G/I286A/Y292EおよびＴＤにS342D/L348D/R403Kを含んでいた。
個々のドメインの溶解性データは、ＨＥＸ１が可溶性ではなさそうであったことを示した（繰り返すが、必ずしも分子の有用性を反映する訳ではない）。さらなるコンストラクト、ＨＥＸ３を合成した。なおＨＥＸ２には、ＨＥＸ３と同じ変異が含まれたが、Ｙ２９２Ｅが追加された。
【００７７】
ＨＥＸ３を合成し、ｐＨＩＳＴＥＶベクターにサブクローニングした。発現は、すべての試験条件（変動する温度、ＩＰＴＧ濃度、誘導時の細胞密度、熱ショックあり、またはなし）下において不溶性であった。同じ３つの変異（V239A  V246G  I286A）を含むＣＢＭのみのドメインは、可溶性である。二重変異体（V239A  V246G）は、ＷＴと極めて類似して挙動する。よって、I286Aを含まず、一方または両方のいずれかのＴＤ変異を含むさらなるバリアント（ＨＥＸ４、ＨＥＸ５およびＨＥＸ６）を設計し、ＰＣＲ／ライゲーションによって構築した。
ＨＥＸ６に対する研究の間、ＨＥＸ６変異の異なる組み合わせを含むいくつかの他のバージョンを設計した（ＨＥＸ７〜ＨＥＸ１６の番号を付けた；特徴づけされていない）。
ＨＥＸ１７は、追加のA162P変異とともにＨＥＸ６変異を含む。このプロリン変異は、単一のＣＢＭ  Ｔｍを３〜４℃上昇させることが示された。プロリン変異は、他の変異、ＮもしくはＣ末端またはリガンド結合部位に近くない。
【００７８】
六量体バリアントのキャラクタリゼーション
発現、精製およびキャラクタリゼーションの結果を表２に示す。これらの結果に基づいて、ＨＥＸ６およびＨＥＸ１７を前に進めた。六量体上のＨＥＸ１７変異の位置を図５に示す。
【表２】
2021511308.tif 000007
表２．六量体Ｓｐ２ＣＢＭＴＤバリアントの生物物理学的キャラクタリゼーションの定性的概要。色分けは、緑から赤であり、ここでは、緑は、バリアントがその特定の特徴に関してそのＷＴ対応物とよく類似していることを示し、淡緑色（緑’）または黄色は、差の程度の増加を示す。赤またはオレンジは、顕著な差を示す。Ｎ／Ａ：タンパク質の溶解性／純度が不十分なため、これらのキャラクタリゼーションが実施されなかった。Ｎ／Ｄ：未決定。
【実施例】
【００７９】
（実施例１）
炎症性メディエーター。
目的：経時的に炎症性メディエーターのレベルを分析することによってｍＣＢＭ処理ヒト肺上皮細胞（Ａ５４９）の自然免疫応答を評価すること。
Ｓｐ２ＣＢＭＴＤの哺乳動物細胞への投与は、インビトロおよびインビボの両方において炎症促進応答を刺激した1、2。これが改変六量体シアル酸結合分子を用いても依然として観察されるかどうかを判断するために、１０μｇの生物学的製剤（Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６またはＨＥＸ１７の添加によって哺乳動物Ａ５４９細胞を刺激し、投与後の特定の時点に細胞培養培地を採取した。炎症性メディエーターの濃度をＥＬＩＳＡおよび多重アッセイの両方によって測定した。
ヒト１×Ｍｏｕｓｅ  ＣＸＣＬ１／ＫＣ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  Ｋｉｔ（Ｒ＆Ｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用したヒトＩＬ−８（試験のための基準サイトカイン）応答。刺激したＡ５４９細胞からのＩＬ−８の濃度レベルを図６に示す。Ａ５４９細胞が改変六量体ＨＥＸ１７により刺激されると、ＩＬ−８レベルがＳｐ２ＣＢＭＴＤ（別名ＳｐＯｒｉｇ）、またはＨＥＸ６刺激細胞と比較した場合よりも有意に低いことが明らかである。
【００８０】
ヒトＣｙｔｏｋｉｎｅ  １２−ｐｌｅｘアッセイ（Ｂｉｏ−Ｐｌｅｘ  Ｐｒｏ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用した炎症性メディエーター応答。図７は、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（ＷＴ、別名ＳｐＯｒｉｇ）、ＨＥＸ６およびＨＥＸ１７（バリアント）によるＡ５４９細胞刺激後の特定の時点（６ｈ、２４ｈ、４８ｈ）における培養培地からの１２の炎症性メディエーターの分析を示す。分析に先立って、サンプルを解凍し、ヒトＨＳ  Ｃｙｔｏｋｉｎｅ−１２  ｐｌｅｘアッセイ（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用する前にＰＢＳ中で１：４に希釈した。このデータは、以下のことを示している。
・ＨＥＸ１７は、ＳｐＯｒｉｇおよびＨＥＸ６と比較して、試験したほぼすべてのサイトカインのレベルに影響を及ぼしている。ＳｐＯｒｉｇおよびＨＥＸ６と比較した場合に、４８ｈの時点で分析物ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＦＮ−ガンマの観察された濃度（ｐｇ／ｍｌ）が有意に低下している。
・４８ｈの時点の対照と比較した場合、ＨＥＸ１７は、ＩＬ−５、およびＶＥＧＦ（まだ確認されていない）を除く試験したすべてのサイトカインのレベルを増加させたようである。
・ＨＥＸ６は、４８ｈの時点においてＳｐＯｒｉｇと比較してＩＬ−６刺激の低下のみを示した。
【００８１】
（実施例２）
インビボにおけるＰＲ８マウスデータ。
試験の目的は、致死性インフルエンザ感染症のマウスモデルにおいてＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ＳｐＯｒｉｇ）およびそのバリアントの効力を評価することであった。単独で病的状態または大量死を引き起こすかどうかを評価するために各候補タンパク質をインフルエンザ感染症でない状態でも投与した。
【００８２】
生存、臨床スコアおよび体重減少。
この結果は、ＣＢＭ２（ＨＥＸ１７）、ＣＢＭ３（ＨＥＸ６）またはＣＢＭ４（ＷＴ、ＳｐＯｒｉｇ）のいずれも、単独でいかなる明白な病的状態または大量死も引き起こさなかったことを示している。ＰＲ８インフルエンザウイルスによる致死的攻撃の１日前のＣＢＭ２（ＨＥＸ１７）、ＣＢＭ３（ＨＥＸ６）およびＣＢＭ４（ＷＴ、ＳｐＯｒｉｇ）のいずれかの単回の１００μｇ用量の投与がＰＲ８感染から保護し、最大の効力はＨＥＸ１７（１００％生存）で見られ、続いて、ＳｐＯｒｉｇ、次にＨＥＸ６であった（図８）。臨床スコアも、ＳｐＯｒｉｇおよびＨＥＸ６と比較してＨＥＸ１７で低かった（図９）。生き延びた単回高用量処置群のマウスはすべて、ピーク感染時に体重が減少したが、未処置の感染マウスとは対照的にすぐに回復した（図１０）。
【００８３】
ＰＲ８攻撃マウス試験からの肺ホモジネートおよび血清組織の抗ｍＣＢＭ抗体分析。
この試験の目的は、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤ（ＳｐＯｒｉｇ）の改変されたバリアントの改変された免疫原性エピトープがＰＲ８攻撃試験のマウスにおいて抗体レベルの低下を示せるかどうかを判定することであった（エピトープは、ヒトＭＨＣクラスＩＩ結合情報に基づいて改変されたことに留意すべきである）。これに関して、ＰＲ８攻撃試験から生き延びたマウスを２１日目に選別し、肺および血清を採取し、ＥＬＩＳＡ方式で被覆抗原ＳｐＯｒｉｇ（１μｇ／ウェル）に対する抗ｍＣＢＭ抗体、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＥおよびＩｇＭに関して試験した。図１１に示したデータは、以下のことを示した。
・改変タンパク質ＨＥＸ１７は、ＳＰＯＲＩＧと比較してマウス肺ＩｇＭレベルの有意な（ｐ＜０．０５）低下を示した。ＨＥＸ６処置については生き残っているマウスが１匹のみのため、ＨＥＸ１７およびＳｐＯｒｉｇのデータのみを統計分析した。
・ＳｐＯｒｉｇと比較して改変ＣＢＭで処置したマウスにおいて抗体レベルのわずかな低下傾向（肺ＩｇＡおよびＩｇＭ）のいくつかの指標がある。
【００８４】
（実施例３）
マウスにおけるｍＣＢＭ、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤおよびＨＥＸ１７の反復鼻腔内投薬の影響。
この試験の目的は、マウスにおける経時的なＳｐ２ＣＢＭＴＤ（ＳｐＯｒｉｇ）およびＨＥＸ１７の両方の反復投薬の臨床的影響および免疫応答を評価することであった。
実験手順
鼻腔内投薬。１、１５および２９日目に、マウスの群（薬剤毎に１０匹の雌、１０匹の雄のＢＡＬＢ／ｃマウス）に、４０μＬの固定体積で回復可能なガス麻酔（イソフルラン／酸素混合物）下において鼻腔内経路により２０μｇの滅菌ＰＢＳ、Ｓｐ２ＣＢＭＴＤまたはＨＥＸ１７のいずれかを投与した。
体重および投与後の所見。−１日目から試験終了（３５日目）まで週に２回すべてのマウスを計量した。用量投与後の最初の２ｈは１５分毎、その後、次の６ｈは３０分毎に投与後の所見を記録した。
【００８５】
組織サンプルの分析。ＥＬＩＳＡ方式でコーティング抗原としてＳｐ２ＣＢＭＴＤまたはＨＥＸ１７（１μｇ／ウェル）のいずれかに対する抗ＣＢＭ抗体応答（ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＭ）に関してマウス組織（血清および気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ））を試験した。さまざまな抗体タイプに対するＨＲＰ結合検出抗体のその発色基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）との反応後の各サンプルのＯＤ450nmにおける吸光度示数（基準バックグラウンドＯＤ620nm）を測定した。
【００８６】
結果：
臨床スコア。
マウスにおけるＳｐ２ＣＢＭＴＤおよびＨＥＸ１７の反復鼻腔内投薬の影響についてのさらなる試験は、いずれの分子も体重または食餌摂取にいかなる著しい影響もなかったことを明らかにしている。さらに、より後の用量において、ＨＥＸ１７は、より良好な認容性を示したようであり、いくつかの（回復する）臨床徴候（立毛、背中を丸めた姿勢、活動性低下、半ば閉じた眼および不規則な呼吸を含む）がＳｐ２ＣＢＭＴＤ投与後の限定された期間に確認された。
【００８７】
マウスの血清およびＢＡＬ組織の抗ｍＣＢＭ抗体分析。
図１２に示したデータは、１〜２９日目の間に２週間毎に２０μｇのＣＢＭの３用量をマウスに与えた場合、３５日後に適応免疫応答が両ＣＢＭに対して誘発されたことを示した。ＨＥＸ１７（エピトープが前に示されたヒトＭＨＣクラスＩＩ結合情報に基づいて改変された改変ＣＢＭまたは「脱免疫化」ＣＢＭの例）は、ＢＡＬおよび血清組織の両方においてＳｐ２ＣＢＭＴＤ処置マウスと比較してＩｇＡの有意な（ｐ＜０．０５）減少を実証した。これは、両被覆抗原に対して観察された。２つの候補間のＩｇＡ応答の差も雄および雌マウス間で著しかった。ＩｇＧ応答の差は、血清よりもＢＡＬサンプルでより明らかであった。Ｓｐ２ＣＢＭＴＤに対して試験した場合、ＢＡＬおよび血清サンプルの両方のＩｇＭレベルの有意な低下もあったが、これは、ＨＥＸ１７被覆プレートでは有意でなかった。
【図１Ａ】
2021511308.tif 000008
【図１Ｂ】
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【図２】
2021511308.tif 000010
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図７Ｆ】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
2021511308.tif 000026
【図１１Ｄ】
2021511308.tif 000027
【図１２ａ−１】
2021511308.tif 000028
【図１２ａ−２】
2021511308.tif 000029
【図１２ａ−３】
2021511308.tif 000030
【図１２ａ−４】
2021511308.tif 000031
【図１２ｂ−１】
2021511308.tif 000032
【図１２ｂ−２】
2021511308.tif 000033
【図１２ｂ−３】
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【図１２ｂ−４】
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【配列表】
2021511308000001.app
【国際調査報告】
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2021511308.tif 000037
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