(57)【要約】本発明は、疾患細胞に対する免疫応答の増強による疾患細胞の免疫療法およびワクチン治療の分野に関する。本発明の文脈では、これは、細胞内で転写されると異常型ポリペプチドの生成または発現の増加をもたらす異常型ＲＮＡ転写物をオリゴヌクレオチドを介して生成することによる、細胞内でのネオアンチゲンの操作によって行われる。これらのポリペプチドまたはそれに由来するペプチド断片の細胞外提示は、免疫系による検出のための抗原エピトープ（ネオアンチゲン）を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法であって、有効量のＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの前記細胞への投与を含み、前記ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡを標的にして前記標的ＲＮＡのコード配列を調節して、前記ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、方法。
【請求項２】
前記ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、スプライス調節オリゴヌクレオチドであるか、またはＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法。
【請求項３】
ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドがスプライス調節オリゴヌクレオチドである、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法であって、有効量のスプライス調節オリゴヌクレオチドの前記細胞への投与を含み、前記スプライス調節オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡを標的にして前記標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、前記ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、方法。
【請求項４】
ｄ）前記スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの前記標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入された異常型ＲＮＡ転写物を生成し、前記異常型ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）転写物が、内部ポリペプチド欠失をコードし、前記調節されたスプライシング事象において（例えば、１つ以上のエクソンのスキッピングによって）異常型ペプチド配列を含む異常型ポリペプチドを生成して、前記ペプチドエピトープを生成し、かつ／または
ｅ）前記スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの前記標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入された異常型ＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡなど）を生成し、前記異常型ＲＮＡ転写物が、前記標的ＲＮＡのイントロン領域からの１つ以上のコドンをコードし、前記イントロン領域に由来する前記１つ以上のコドンによってコードされる少なくとも１つ以上のペプチドを含む異常型ペプチド配列を含む異常型ポリペプチドを生成して、前記ペプチドエピトープを生成し、かつ／または
ｆ）前記スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの前記標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入されたコドンフレームシフトを含む異常型ＲＮＡ転写物を生成し、前記異常型ＲＮＡ転写物が、前記異常型ＲＮＡ転写物の前記コドンフレームシフト部またはその３’側の領域から転写された少なくとも１つのアミノ酸のＣ末端領域を有するポリペプチドを生成する、
請求項３に記載の方法。
ｇ）細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法であって、有効量のスプライス調節オリゴヌクレオチドの前記細胞への投与を含み、前記スプライス調節オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡを標的にして前記標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、前記ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、方法。
【請求項５】
前記細胞が、腫瘍、肺癌、乳癌、結腸癌細胞、転移した結腸癌細胞、または肝臓に転移した結腸癌細胞などの癌細胞である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
インビトロ法またはインビボ法である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記標的ＲＮＡが、癌細胞において過剰発現されるＲＮＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記ペプチドエピトープが前記細胞から分泌される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記ペプチドエピトープが、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子として前記細胞上に提示される、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ペプチドエピトープを含むポリペプチドが、膜結合ドメインをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＲＮＡが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ、例えばＣＥＭＩＰ、ＥＴＶ４、ＬＲＧ５、ＮＯＸ１、ＦＯＸＰ３、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＥＷＳＲ１、ＦＵＳ、ＰＡＲＰＢＰおよびＳＳ１８からなる群より選択される（例えば、ヒトの）ｐｒｅ−ｍＲＮＡである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
ａ．前記ｐｒｅ−ｍＲＮＡがＣＥＭＩＰであり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１〜８２または１９３〜２７４から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、または
ｂ．前記ｐｒｅ−ｍＲＮＡがＥＴＶ４であり、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、８３〜１６４から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、
請求項３〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシド、およびＬＮＡヌクレオシドから独立して選択される２’糖修飾ヌクレオシドなどの２’糖修飾ヌクレオシドを含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合などの修飾ヌクレオシド間結合を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−ＭＯＥオリゴヌクレオチドであるスプライス調節オリゴヌクレオチドである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）などのＬＮＡオリゴヌクレオチドであるスプライス調節オリゴヌクレオチドである、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、モルホリノオリゴヌクレオチドであるスプライス調節オリゴヌクレオチドである、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
対象における標的細胞を免疫調節する方法であって、
ａ．ペプチドエピトープを含む、またはペプチドエピトープをコードする薬剤を前記対象にワクチン接種する工程、
ｂ．ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを前記対象に投与する工程であって、前記ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、前記対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、前記標的ＲＮＡを調節して、前記ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、
ｃ．前記ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、前記ペプチドエピトープに対する前記対象の免疫応答を誘発または増強し、
ｄ．工程ａおよび工程ｂの順序が、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい、
方法。
【請求項１９】
対象における標的細胞を免疫調節する方法であって、
ａ．ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを前記対象に投与する工程であって、前記ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、前記対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、前記ＲＮＡを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．前記対象に前記ペプチドエピトープに特異的である抗体を投与する工程、
を含み、
ｃ．前記ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、前記ペプチドエピトープに対する前記対象の免疫応答を誘発または増強し、工程ａおよび工程ｂの順序が、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい、
方法。
【請求項２０】
対象における標的細胞を免疫調節する方法であって、ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを前記対象に投与する工程を含み、前記ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、前記対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的として、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成して、前記ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、前記ペプチドエピトープに対する前記対象の免疫応答を誘発または増強する、方法。
【請求項２１】
ＰＤＬ１阻害剤、ＰＤ１阻害剤またはＣＴＬＡ−４阻害剤などのチェックポイント阻害剤を前記対象に投与する工程をさらに含む、請求項１８〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
対象における疾患の免疫療法治療の方法であって、
ａ．ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドを前記対象に投与する工程であって、前記ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドが、前記対象の前記標的細胞内の標的ＲＮＡを標的にして、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．前記ペプチドエピトープに特異的である免疫療法抗体を前記対象に投与する工程、
を含み、
ｃ．前記標的細胞によって発現される前記ペプチドエピトープなど、前記ペプチドエピトープに対する前記対象の免疫応答を誘発または増強し、工程ａおよび工程ｂの順序が、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい、
方法。
【請求項２３】
癌の治療方法である、請求項１８〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記細胞が、腫瘍、肺癌、乳癌、結腸癌細胞、転移した結腸癌細胞、または肝臓に転移した結腸癌細胞などの癌細胞である、請求項１８〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
工程ａが、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法、または請求項１８もしくは請求項１８に従属する場合の請求項２２もしくは２３のいずれか一項に記載の方法を含み、工程ｃが、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法を含む、請求項１８〜２４に記載のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
細胞内でペプチドエピトープを生成するための、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２７】
細胞内でペプチドエピトープを生成するための、スプライス調節オリゴヌクレオチドの使用。
【請求項２８】
癌の免疫療法治療におけるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの使用であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを標的にして、癌細胞内でペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、前記免疫療法治療が、前記ペプチドエピトープを認識する治療用抗体の投与を含む、使用。
【請求項２９】
癌の免疫療法治療におけるスプライス調節オリゴヌクレオチドの使用であって、前記スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを標的にして、癌細胞内でペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、前記免疫療法治療が、前記ペプチドエピトープを認識する治療用抗体の投与を含む、使用。
【請求項３０】
癌ワクチン療法におけるスプライス調節オリゴヌクレオチドの使用であって、前記スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを標的にして、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、前記ワクチン療法が、前記ペプチドエピトープに対する前記対象の免疫応答の発生または増強をもたらす、使用。
【請求項３１】
癌の免疫療法治療におけるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの使用であって、前記ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを標的にして、癌細胞内でペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、前記免疫療法治療が、前記ペプチドエピトープを認識する治療用抗体の投与を含む、使用。
【請求項３２】
癌ワクチン療法におけるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの使用であって、前記ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを標的にして、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、前記ワクチン療法が、前記ペプチドエピトープに対する前記対象の免疫応答の発生または増強をもたらす、使用。
【請求項３３】
ＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜８２、または１９３〜２７４から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３４】
ＥＴＶ４  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３〜１６４から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３５】
配列１〜１６４、またはＯ１〜Ｏ１６４、もしくはＯ１６５〜Ｏ２４６からなる群より選択される化合物を含むかまたはそれらからなる、スプライス調節アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３６】
１８８、１８９、１９０、１９１または１９２の群から選択されるペプチドエピトープなどのペプチドエピトープを含む、ワクチンまたは免疫療法剤。
【請求項３７】
１８８、１８９、１９０、１９１または１９２の群から選択されるペプチドなどのペプチドであるかまたはそれを含む、ポリペプチド。
【請求項３８】
医療において使用するための、例えばワクチンまたは免疫療法剤として使用するための、１８８、１８９、１９０、１９１または１９２の群から選択されるペプチドなどのペプチドであるかまたはそれを含む、ポリペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、疾患細胞に対する免疫応答の増強による疾患細胞の免疫療法およびワクチン治療の分野に関する。本発明の文脈では、これは、ＲＮＡ転写物の調節、例えば、スプライス調節またはＲＮＡ編集を介して、例えば、細胞内で転写されると異常型ポリペプチドの生成または発現の増加をもたらす異常型ＲＮＡ転写物の、オリゴヌクレオチドを介した生成によって、細胞内でのネオアンチゲンの操作によって行われる。これらのポリペプチドまたはそれに由来するペプチド断片の細胞外提示は、免疫系による検出のための抗原エピトープ（ネオアンチゲン）を提供する。本発明の方法は、ワクチンまたは免疫療法剤の使用と組み合わせて、免疫系を刺激してネオアンチゲンを認識させることができる。
【背景技術】
【０００２】
スプライス調節アンチセンスオリゴヌクレオチドなどのＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび脊髄性筋萎縮症などの遺伝病の治療のために承認された、最初のアンチセンス化合物に含まれる。ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ標的を分解するのではなく、ＲＮＡ転写物を修飾して、未修飾のＲＮＡ転写物と比較して改変されたポリペプチドをコードできる転写物変異体を生成する。
【０００３】
ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドには、標的ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを変更するスプライス修飾オリゴヌクレオチド、または挿入、欠失もしくは置換（ＡからＧへの置換など）を導入でき、したがって、例えば開始コドンおよび終止コドンを修飾または挿入して、改変されたポリペプチドをコードする転写変異体を生成するのに使用できるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが含まれる。
【０００４】
最近、内因性ヒトＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）を動員して内因性転写物を単純かつプログラム可能な方法で編集する、アンチセンスオリゴヌクレオチドが開発された（Ｍｅｒｋｌｅ  ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９年２月；３７（２）：１３３−１３８（非特許文献1））。
【０００５】
いくつかの重要な生物学的プロセスは、選択的スプライシングの制御下にあり、すべてのヒトマルチエクソン遺伝子の９５％ほどが、潜在的に異なる機能のタンパク質を生成する選択的スプライシングを受ける。（Ｍａｔｌｉｎら，Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００５；６（５）：３８６−９８（非特許文献2）；ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００８；４０（１２）：１４１３−５（非特許文献3））。例えば、ＢＣＬＸのアイソフォームは、それぞれ抗アポトーシス性およびアポトーシス促進性である（Ｒｅｖｉｌら、Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００７；２７（２４）：８４３１−４１（非特許文献4））。したがって、選択的スプライシングの活性を厳密に調節および制御することが、細胞にとって重要である。しかしながら、以前に報告されたように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、スプライシングを手際よく摂動させて、所望の機能を有する選択的またはｄｅ  ｎｏｖｏ  ｍＲＮＡアイソフォームを作成するのに使用できる。例えば、Ｇｒａｚｉｅｗｉｃｚら、Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００８；１６（７）：１３１６−２２（非特許文献5）。
【０００６】
Ｖｏｒｍｅｈｒら、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４４２６（要約）（非特許文献6）は、変異型ＭＨＣクラスＩＩエピトープが癌に対する治療的免疫応答を促進することを報告している。Ｋａｈｌｅｓら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３４、１−１４、２０１８（非特許文献7）は、８，７０５人の患者からの腫瘍全体の選択的スプライシングの包括的な分析に言及している。
【０００７】
Ｓａｈｉｎ  ａｎｄ  Ｔｕｒｅｃｉ、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５９、１３５５−１３６０（２０１８）（非特許文献8）は、パーソナライズされた癌免疫療法用の癌ワクチンの技術を概説している：「癌は、遺伝子変化の蓄積によって特徴づけられる。体細胞変異は、自家Ｔ細胞によって外来性として認識され、理想的な癌ワクチン標的を構成する癌特異的ネオエピトープを生成することができる。すべての腫瘍は特有の変異の構成を有し、患者間で共有されるのはごく一部である。ゲノミクス、データサイエンス、および癌免疫療法の技術的進歩により、今やゲノム内の変異の迅速なマッピング、ワクチン標的の合理的な選択、および患者の個々の腫瘍に合わせてカスタマイズされた治療法のオンデマンド作成が可能である。」
【０００８】
Ｓａｈｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ、５４７巻、２２２−２２６頁（２０１７年７月１３日）（非特許文献9）は、パーソナライズされたＲＮＡミュータノームワクチンが癌に対する多重特異性治療免疫を動員することを報告している。
【０００９】
Ｎｅｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓは、特有の癌エピトープペプチドに基づいたネオアンチゲン療法を開発しており、例えば、Ｐａら、Ｎａｔｕｒｅ．２０１７年７月１３日；５４７（７６６２）：２１７−２２１（非特許文献10）を参照されたい。
【００１０】
Ｂｉｏｎｔｅｃｈは、癌免疫療法用にｍＲＮＡ技術を活用している。
【００１１】
これらのアプローチでは、ワクチンまたは免疫療法治療薬の選択または作成の前に、患者の腫瘍遺伝子発現およびエピトープ提示の特性評価が必要である。これは費用および時間がかかり、患者固有の治療法の開発を必要とするか、またはすでに承認された治療法がある癌のプロファイルに基づいていくつかの癌を治療する可能性を制限する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９年２月；３７（２）：１３３−１３８
【非特許文献２】Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００５；６（５）：３８６−９８
【非特許文献３】Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．２００８；４０（１２）：１４１３−５
【非特許文献４】Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２００７；２７（２４）：８４３１−４１
【非特許文献５】Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２００８；１６（７）：１３１６−２２
【非特許文献６】ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１４４２６（要約）
【非特許文献７】Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ３４、１−１４、２０１８
【非特許文献８】Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３５９、１３５５−１３６０（２０１８）
【非特許文献９】Ｎａｔｕｒｅ、５４７巻、２２２−２２６頁（２０１７年７月１３日）
【非特許文献１０】Ｎａｔｕｒｅ．２０１７年７月１３日；５４７（７６６２）：２１７−２２１
【発明の概要】
【００１３】
したがって、腫瘍の内因性エピトーププロファイルとは独立しており、したがって現行の癌ワクチンまたは免疫療法治療よりも幅広い患者グループの治療に使用できる、免疫療法または癌ワクチンを使用する治療的処置が必要である。これは、本発明の方法において、癌または腫瘍細胞におけるペプチドエピトープの操作（操作されたエピトープ）によって達成される。
【００１４】
本発明は、癌治療のさらなる効率化およびより広範囲での適用を目的とする分子標的免疫調節のためのスプライス調節オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの新しい使用を提供し、これは、免疫系の増強を誘発して抗腫瘍反応を開始するために、異常型転写物によってコードされるネオアンチゲンによる腫瘍細胞の「遺伝子タグ付け」を可能にする、ＲＮＡ転写物におけるスプライシング事象の調節またはＲＮＡ転写物の編集（異常型転写物の生成）という新規の概念による。
【００１５】
（例えば主要組織適合遺伝子複合体機構を介して）細胞表面に提示される、またはポリペプチド膜結合／膜貫通ドメインをコードする標的ｍＲＮＡを介して提示される異常型ポリペプチドの発現をスプライス調節剤またはＲＮＡ編集剤が誘導できる、多くの方法がある。あるいは、異常型ポリペプチドが分泌され得る。
【００１６】
Ｔ細胞応答の固有の生物学的シグナル増幅のためにスプライス調節またはＲＮＡ編集の有効性が低い場合でも、耐久性があり、潜在的に強力な抗腫瘍効果をもたらす可能性がある。癌細胞において発現が調節解除されているＲＮＡ転写物（非癌細胞と比較して過剰発現されているＲＮＡ転写物）などの標的細胞で発現される標的ＲＮＡを選択することにより、本発明を使用して免疫系を優先的または選択的に標的化して、標的細胞を攻撃することができる。
【００１７】
発明の説明
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの細胞への投与を含み、ここで、ＲＮＡ修飾は、標的ＲＮＡを標的にしてＲＮＡを調節し、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。
【００１８】
例として、ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、スプライス調節オリゴヌクレオチドまたはＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドであり得る。
【００１９】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドの細胞への投与を含む。ここで、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡのコード配列を調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡに核酸塩基の挿入、欠失または置換を導入し、それによって標的ＲＮＡのコード配列を変更することができる、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドである。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、アデノシンからイノシンへの塩基置換など、標的ＲＮＡに単一の塩基置換を導入することができる。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ修飾オリゴヌクレオチドは、ヒトＡＤＡＲを動員することができる。
【００２３】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のスプライス調節オリゴヌクレオチドの細胞への投与を含む。ここでスプライス調節オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。
【００２４】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のスプライス調節オリゴヌクレオチドの細胞への投与を含む。ここでスプライス調節オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入された異常型ＲＮＡ転写物を生成する。ここで異常型ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）転写物は、内部ポリペプチド欠失をコードし、調節されたスプライシング事象において（例えば、１つ以上のエクソンのスキッピングによって）異常型ペプチド配列を含む異常型ポリペプチドを生成して、ペプチドエピトープを生成する。
【００２５】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のスプライス調節オリゴヌクレオチドの細胞への投与を含む。ここでスプライス調節オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。スプライス調節オリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入された異常型ＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡなど）を生成する。ここで異常型ＲＮＡ転写物は、標的ＲＮＡのイントロン領域からの１つ以上のコドンをコードし、イントロン領域に由来する１つ以上のコドンによってコードされる少なくとも１つ以上のペプチドを含む異常型ペプチド配列を含む異常型ポリペプチドを生成して、ペプチドエピトープを生成する。
【００２６】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のスプライス調節オリゴヌクレオチドの細胞への投与を含む。ここでスプライス調節オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。スプライス調節オリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入されたコドンフレームシフトを含む異常型ＲＮＡ転写物を生成し、異常型ＲＮＡ転写物は、異常型ＲＮＡ転写物のコドンフレームシフト部またはその３’側の領域から転写された、少なくとも１つのアミノ酸のＣ末端領域を有するポリペプチドを生成する。
【００２７】
本発明は、本明細書ではネオアンチゲンペプチドと呼ばれ得るペプチドエピトープを細胞内で操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のスプライス調節オリゴヌクレオチドの細胞への投与を含む。ここで、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡスプライス事象（スプライス部位またはスプライス調節領域）を標的にしてＲＮＡ（本明細書では標的ＲＮＡと呼ばれる）のスプライシングをスプライス部位で調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。
【００２８】
本発明は、インビトロ方法またはインビボ方法であり得る。インビボでの使用の場合、ペプチドエピトープ（ネオアンチゲン）の発現を使用して、免疫応答を誘導または増強することができる。
【００２９】
本発明は、対象において標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．ペプチドエピトープを含むかまたはペプチドエピトープをコードする薬剤を、対象にワクチン接種する工程、
ｂ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、
ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【００３０】
本発明は、対象において標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．ペプチドエピトープに特異的である抗体を対象に投与する工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、ここで工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【００３１】
本発明は、対象における標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的にし、ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強する。
【００３２】
本発明は、対象における疾患の免疫療法治療の方法を提供し、前記方法は、
ａ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．ペプチドエピトープに特異的である免疫療法抗体を対象に投与する工程、
を含み、標的細胞によって発現されるペプチドエピトープなど、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【００３３】
本発明は、対象における標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、対象へのスプライス調節オリゴヌクレオチドの投与を含み、ここでスプライス調節オリゴヌクレオチドは、対象の標的細胞内のＲＮＡスプライス部位（イントロン／エクソン境界または他のＲＮＡスプライス調節領域など）を標的とし、スプライス部位でのＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ｍＲＮＡ転写物を生成し、異常型エピトープは、対象に対して免疫原性であり、標的細胞に対する対象の免疫応答を誘発または増強する。
【００３４】
本発明は、対象における標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．ペプチドエピトープを含む、またはペプチドエピトープをコードする薬剤を対象にワクチン接種する工程
ｂ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内のＲＮＡスプライス部位（ＲＮＡスプライス調節領域を含む）を標的とし、スプライス領域においてＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ｍＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、標的細胞に対する対象の免疫応答を誘発または増強し、
ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【００３５】
この方法は、標的細胞におけるペプチドエピトープの発現または発現の増強をもたらし、免疫応答の誘発または増強をもたらす。
【００３６】
いくつかの実施形態では、工程ａとｂとの間、またはｂとａとの間に、任意選択で待機工程ｃを採用して、例えば、対象に抗原ペプチドに対する適応免疫応答を獲得させること（工程ａ、ｃ、ｂの順序）、または標的細胞上でエピトープペプチドを発現させること（工程ｂ、ｃ、ａの順序）ができる。
【００３７】
本発明は、対象において標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内のＲＮＡスプライス部位を標的とし、スプライス領域においてＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．ペプチドエピトープに特異的である抗体を対象に投与する工程、
を含み、標的細胞に対する対象の免疫応答を誘発または増強し、ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【００３８】
この方法は、標的細胞におけるペプチドエピトープの発現または増強された発現をもたらし、特に抗体が工程ｂで投与された場合に、免疫応答の誘発または増強をもたらす。
【００３９】
工程ａおよびｂの間に待機工程ｃを実行して、例えば、標的細胞においてペプチドエピトープを発現させることができる（工程ａ、ｂ、ｃの順序）。
【００４０】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを生成するための、スプライス調節オリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００４１】
本発明は、例えば癌の免疫療法治療におけるスプライス調節オリゴヌクレオチドの使用を提供し、ここでスプライス調節オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡを標的にして、細胞、例えば癌細胞内で、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、免疫療法治療は、ペプチドエピトープを認識する治療用抗体の対象への投与を含む。
【００４２】
いくつかの実施形態では、１つを超えるスプライス調節オリゴヌクレオチド、例えば２つのスプライス調節オリゴヌクレオチドを使用して、異常型ポリペプチドの合成を誘導するのに効果的なスプライシングの調節を提供することができる。複数のスプライス調節オリゴヌクレオチドのそのような使用によって、スプライス調節領域を超える標的化が可能になり、増強されたスプライス調節効果を提供することができる。複数のスプライス調節オリゴヌクレオチドは、単一のオリゴヌクレオチド「ポリオリゴ」構築物として送達され得る。例えば、国際公開第２０１５／１１３９２２号を参照されたい。１つを超えるスプライス調節オリゴヌクレオチドは、（同じまたは異なるＲＮＡ標的内の）異なるスプライシング事象を標的とすることができ、したがって、１つを超える異常型ポリペプチドの生成をもたらすことができる。複数のスプライス調節オリゴヌクレオチドの使用は、それにより、複数のネオエピトープの合成を誘導することができ、対象において免疫応答を誘発するのに有利であり得る。
【００４３】
本発明は、癌ワクチン療法におけるスプライス調節オリゴヌクレオチドの使用を提供し、ここで、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡを標的にして、癌細胞において、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、ワクチン療法は、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答の発生または増強をもたらす。
【００４４】
本発明は、ＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜４１から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【００４５】
本発明は、ＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：４２〜８２から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【００４６】
本発明は、ＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９３〜２７４から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【００４７】
本発明は、ＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、化合物Ｏ１〜Ｏ４１から選択される。
【００４８】
本発明は、ＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、化合物Ｏ４２〜Ｏ８２から選択される。
【００４９】
本発明は、ＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、化合物Ｏ６５〜Ｏ２４６から選択される。
【００５０】
本発明は、ＥＴＶ４  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３〜１２３から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【００５１】
本発明は、ＥＴＶ４  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、化合物Ｏ８３〜Ｏ１２３から選択される。
【００５２】
本発明は、ＥＴＶ４  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここでアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１２４〜１６４から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【００５３】
本発明は、ＥＴＶ４  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、ここで、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、化合物Ｏ１２４〜Ｏ１６４から選択される。
【００５４】
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、本発明の方法および使用において使用され得る。
【００５５】
本発明は、ペプチドエピトープ、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８、１８９、１９０、１９１および１９２の群から選択されるペプチドエピトープを含むワクチンまたは免疫療法剤を提供する。
【００５６】
本発明は、ペプチド、例えば、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８、１８９、１９０、１９１および１９２の群から選択されるペプチドであるかまたはそれを含む、ポリペプチドを提供する。
【００５７】
本発明は、医療での使用、例えばワクチンまたは免疫療法剤としての使用のためのペプチド、例えばＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８、１８９、１９０、１９１および１９２の群から選択されるペプチドであるかまたはそれを含む、ポリペプチドを提供する。
【００５８】
本発明のペプチドエピトープ、ポリペプチド、ワクチンまたは免疫療法剤は、本発明の方法または使用において使用され得る。
【００５９】
本発明は、本明細書に記載または特許請求されているように、エクソソーム製剤におけるスプライス調節オリゴヌクレオチド、またはその使用を提供する。エクソソーム製剤は、標的組織または標的細胞、例えば癌細胞への送達を増強するのに有用である。
【００６０】
本発明は、三価ＧａｌＮＡｃ部分に共有結合したスプライス調節オリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートなど、本明細書に記載または特許請求されるスプライス調節オリゴヌクレオチドを含むコンジュゲート、またはその使用を提供する。ＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、肝細胞など、肝臓の標的細胞への送達を増強する。
【００６１】
本発明のＲＮＡ編集実施形態
最近、内因性ヒトＡＤＡＲ（ＲＮＡに作用するアデノシンデアミナーゼ）を動員して、内因性転写物を単純かつプログラム可能な方法で編集するアンチセンスオリゴヌクレオチドが開発された（Ｍｅｒｋｌｅ  ら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９年２月；３７（２）：１３３−１３８）。ＲＮＡ編集を仲介するのに使用され得るオリゴヌクレオチド設計は含む。
【００６２】
ペプチドをコードする標的ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）の配列に変化を導入する他の方法は、欠失、挿入または置換（ＲＮＡ編集事象）を導入するのに使用され得るＲＮＡ編集であることが理解されよう。欠失または置換は、例えば、フレームシフトを導入し、ＲＮＡ編集事象の下流に新規の抗原タンパク質配列をもたらし得る。標的ＲＮＡの終止コドンは（欠失、挿入または置換によって）標的とされ得、終止コドンの除去によって、ＲＮＡ編集事象の下流に新規の抗原配列の生成をもたらすことができる。フレームシフトＲＮＡ編集事象によって、終止コドンがフレームから外れる可能性もあり、それによっても、新規の抗原タンパク質配列の生成が起こる。
【００６３】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、アデノシンデアミナーゼ酵素を標的ＲＮＡに動員して、アデノシンデアミナーゼ事象を引き起こすことができる。アデノシンデアミナーゼはイノシン塩基の生成をもたらし、これはＡ→Ｇ置換として読み取られる。いくつかの有利な実施形態では、ＲＮＡ編集事象は、ＡからＩへの置換である。このようなＡ→Ｇ置換を使用して、
ｉ）内因性翻訳開始点の上流にＡＵＧ開始コドンを作成することができ、これにより、タンパク質産物のＮ末端にペプチドエピトープが作成される。例えば、内因性ＡＵＧ開始コドンの上流のＡＵＡトリプレットは、代替のＡＵＧ開始コドンになるようにＲＮＡ編集され得る。
ｉｉ）開始ＡＵＧのＩＵＧ（ＧＵＧ）への変更によって、下流の新しい／新規のＡＵＧ開始コドンの使用が起こり、それによって完全に新しいペプチド配列をもたらすフレーム外の翻訳を発生させる。
ｉｉｉ）内因性終止コドンの変更の結果、内因性終止コドンを通り過ぎて翻訳が起こる。したがって、ＲＮＡ標的において終止コドンＵＡＧ、ＵＧＡ、またはＵＡＡが編集されて、トリプトファンをコードするＵＧＧになり得る。内因性終止コドンを通り過ぎる翻訳により、タンパク質産物のＣ末端にペプチドエピトープが生じる。
【００６４】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを細胞に投与することを含む。ここで、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを標的にして、標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。
【００６５】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを細胞に投与することを含む。ここで、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを標的にして、標的ＲＮＡの核酸塩基を置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。
【００６６】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを細胞に投与することを含む。ここで、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを標的にして、標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。
【００６７】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを細胞に投与することを含む。ここで、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを標的にして、標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。
【００６８】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを細胞に投与することを含む。ここで、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを標的にして、標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。
【００６９】
本発明は、細胞内での、本明細書ではネオアンチゲンエピトープと呼ばれ得るペプチドエピトープを操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを細胞に投与することを含む。ここで、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、標的ＲＮＡを標的にして、標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。
【００７０】
アデノシンからイノシンへの置換は、イノシンが翻訳＊においてＧ核酸塩基として認識されるので、本発明のＲＮＡ編集方法の環境において特に有利な置換である。したがって、ＡからＩ（ＡからＧ＊とも呼ばれる）によって開始および終止コドンの編集が可能になり、新しい開始コドンもしくは終止コドンの導入、または既存の開始コドンもしくは終止コドンの欠失が可能になる。
【００７１】
本発明は、対象における標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．ペプチドエピトープを含む、またはペプチドエピトープをコードする薬剤を対象にワクチン接種する工程、
ｂ．ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、標的ＲＮＡのスプライシングを調節して標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失、または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、
ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【００７２】
本発明は、対象において標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失、または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．ペプチドエピトープに特異的である抗体を対象に投与する工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【００７３】
本発明は、対象における標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが、標的細胞内の標的ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強する。
【００７４】
本発明は、対象における疾患の免疫療法治療の方法を提供し、前記方法は、
ａ．ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失、または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．ペプチドエピトープに特異的である免疫療法抗体を対象に投与する工程、
を含み、標的細胞によって発現されるペプチドエピトープなど、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【００７５】
本発明は、対象における標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの対象への投与する工程であって、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、を含み、対象の標的細胞に対する免疫応答を誘発または増強し、ここで異常型エピトープは、対象に対して免疫原性である。
【００７６】
本発明は、対象における標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．ペプチドエピトープを含む、またはペプチドエピトープをコードする薬剤を対象にワクチン接種する工程
ｂ．ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失、または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、標的細胞に対する対象の免疫応答を誘発または増強し、
ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【００７７】
この方法は、標的細胞におけるペプチドエピトープの発現または発現の増強をもたらし、免疫応答の誘発または増強をもたらす。
【００７８】
いくつかの実施形態では、工程ａとｂとの間、またはｂとａとの間に、任意選択で待機工程ｃを採用して、例えば、対象に抗原ペプチドに対する適応免疫応答を獲得させること（工程ａ、ｃ、ｂの順序）、または標的細胞上でエピトープペプチドを発現させること（工程ｂ、ｃ、ａの順序）ができる。
【００７９】
本発明は、対象において標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内のＲＮＡスプライス部位を標的にして標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失、または置換して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．ペプチドエピトープに特異的である抗体を対象に投与する工程、
を含み、標的細胞に対する対象の免疫応答を誘発または増強し、ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【００８０】
この方法は、標的細胞にペプチドエピトープの発現または増強された発現をもたらし、特に抗体が工程ｂで投与された場合に、免疫応答の誘発または増強をもたらす。
【００８１】
工程ａとｂとの間に待機工程ｃを実行して、例えば、標的細胞においてペプチドエピトープを発現させることができる（工程ａ、ｂ、ｃの順序）。
【００８２】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを生成するための、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【００８３】
本発明は、例えば癌の免疫療法治療におけるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの使用を提供し、ここでＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡの核酸塩基を挿入、欠失、または置換して、細胞、例えば癌細胞内で、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、免疫療法治療は、ペプチドエピトープを認識する治療用抗体の対象への投与を含む。
【００８４】
本発明は、癌ワクチン療法におけるＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの使用を提供し、ここで、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡを標的にして、癌細胞内でペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、ワクチン療法は、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答の発生または増強をもたらす。
【図面の簡単な説明】
【００８５】
（図１）オリゴヌクレオチドによってｐｒｅ−ｍＲＮＡに誘導されるスプライス調節事象の概略図。エクソンジャンクションを破線で示し、新規ペプチド配列を赤い円で表示する。簡素にするために、単一のスプライス調節事象のみを示す。
（図２）ＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡのエクソン６とエクソン８との間の新規スプライスジャンクションは、特定のオリゴヌクレオチドによって誘導される。ＣＥＭＩＰエクソン７のスキッピング事象は、ＣＥＭＩＰ転写物の総合レベルのパーセンテージとして測定される。
（図３）ＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡのエクソン２７とエクソン２９との間の新規スプライスジャンクションは、特定のオリゴヌクレオチドによって誘導される。ＣＥＭＩＰエクソン２８のスキッピング事象は、ＣＥＭＩＰ転写物の総合レベルのパーセンテージとして測定される。
（図４）ＥＴＶ４  ｍＲＮＡのエクソン７とエクソン９との間の新規スプライスジャンクションは、特定のオリゴヌクレオチドによって誘導される。ＥＴＶ４エクソン８のスキッピング事象は、ＥＴＶ４転写物の総合レベルのパーセンテージとして測定される。
（図５）ＥＴＶ４  ｍＲＮＡのエクソン９とエクソン１１との間の新規スプライスジャンクションは、特定のオリゴヌクレオチドによって誘導される。ＥＴＶ４エクソン１０のスキッピング事象は、ＥＴＶ４転写物の総合レベルのパーセンテージとして測定される。
（図６）５６の肺扁平上皮癌の臨床サンプル（三角形）および正常なヒト組織の集合（円）における相対的なＰＡＲＰＢＰ遺伝子発現レベルを示す散布図。
（図７）ＧＴＥＸデータベースからのヒトの健康な組織におけるＰＡＲＰＢＰの遺伝子発現レベル（ＴＰＭ）を示す箱ひげ図。
（図８）ＣＥＭＩＰエクソン２８スキッピングを誘導するオリゴヌクレオチドで処理されたＣｏｌｏ−２０５細胞におけるＣＥＭＩＰおよびＧＡＰＤＨのキャピラリー電気泳動イムノアッセイ検出の可視化。初めの４レーンは、後の４レーンに示されるように免疫沈殿を使用してＣＥＭＩＰタンパク質が濃縮される前のライセートを含む。ＷＥＳ機器によって推定された測定分子量が示される。
（図９）ＣＥＭＩＰエクソン２８スキッピングを誘導するオリゴヌクレオチドによって誘導される新規ＣＥＭＩＰ  ｃ末端のキャピラリー電気泳動イムノアッセイ検出の可視化。Ｏ１９５の濃度が、レーンの上に示される。ＷＥＳ機器によって推定された測定分子量が示される。ＨＴＰＲ１抗体をローディングコントロールとして使用した。
（図１０）上のパネルは、Ｏ１９５治療ありおよびなしの両方のサンプルで同定された１５アミノ酸の野生型ＣＥＭＩＰ  Ｃ末端
2021536239.tif 000002
内に含まれる１１アミノ酸に対応する、同定されたＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。下のパネルは、予測された新規Ｃ末端
2021536239.tif 000003
の最後の１１アミノ酸の、同定されたＭＳ／ＭＳスペクトルを示す。このペプチド断片は、Ｏ１９５で処理されたサンプルでのみ同定された。
【発明を実施するための形態】
【００８６】
定義
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、当業者に一般的に理解されているように、２つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として定義される。このような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子またはオリゴマーとも称され得る。オリゴヌクレオチドは、通常、固相化学合成と、その後の精製によって研究室内で作製される。オリゴヌクレオチドの配列に言及する場合、共有結合したヌクレオチドまたはヌクレオシドの、核酸塩基部分の配列もしくは順序、またはその修飾に言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは、人工であり、化学的に合成され、典型的には精製または単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシドまたはヌクレオチドを含んでもよい。
【００８７】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることによって標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の単鎖オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドの全長にわたって内部（ｉｎｔｒａ）または相互（ｉｎｔｅｒ）の自己相補性の程度が５０％未満である限り、ヘアピンまたは分子間二重鎖構造（同じオリゴヌクレオチドの２分子間の二重鎖）を形成できることが理解される。
【００８８】
ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド
ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列間のハイブリダイゼーションを介して標的ＲＮＡを標的とすることができ、それにより、典型的にはＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列とＲＮＡ標的配列との間の相補性領域にわたって、標的ＲＮＡ内の１つ以上の核酸塩基の挿入、欠失、または置換をもたらすオリゴヌクレオチドである。ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、ＲＲＥ編集酵素の動員を可能にするさらなる領域（連続ヌクレオチド配列以外）を含み得る。さらなる領域は、例えば、二本鎖領域を含み得る。ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドの１つの有利な形態は、例えば、Ｍｅｒｋｌｅら，Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９年２月；３７（２）：１３３−１３８に開示されている、ＡＤＡＲ動員オリゴヌクレオチドであり、国際公開第１７０１０５５６号も参照されたい。ＲＮＡ編集法およびＲＮＡ編集オリゴヌクレオチド剤は、国際公開第１９０８４０６３号、国際公開第１９０７１２７４号、国際公開第１８１６１０３２号、国際公開第１８１３４３０１号、国際公開第１８０４１９７３号、国際公開第１７２２０７５１号、国際公開第１６０９７２１２号に開示されている。ＲＮＡ編集は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集ＲＮＡ編集によっても達成され得る。例えば、国際公開第１８２０８９９８号を参照されたい。
【００８９】
例として、Ｍｅｒｋｌｅら、に開示されているように、ＡＤＡＲ動員オリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドの３’領域、例えば１０〜２５ヌクレオチド長を含み得、これは標的ＲＮＡのＡ塩基（Ｉへと編集され、Ｇ核酸塩基として読み取られる）の位置にＣヌクレオシドを含むが、それ以外の場合は、標的ＲＮＡに相補的である（Ｃヌクレオシドでのミスマッチを除いて完全に相補的）。Ｃヌクレオシドは、３’領域内に位置し、通常は３’末端ヌクレオシドではない。ＣヌクレオシドおよびＣヌクレオシドに隣接するヌクレオシドは、ＲＮＡヌクレオチドであり得、３’領域の残りは、例えば、２’−Ｏ−メチルヌクレオシドまたは他の２’−Ｏ−アルキルヌクレオシドであり得る。例として、Ｃヌクレオシドは、隣接するＲＮＡヌクレオシド、およびＣヌクレオシドの３’に位置するさらなる６〜１２個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドを有し得る。Ｃヌクレオシドは、そこで単一のＲＮＡヌクレオシド、およびさらなる４〜８個の２’−Ｏ−メチルヌクレオシドに隣接し得る。３’末端は、例えば、末端２〜６個のヌクレオシド間のホスホロチオエートヌクレオシド間結合、例えば２〜６個の２’−Ｏ−メチルホスホロチオエート結合ヌクレオシドの領域の使用により、ヌクレアーゼから保護され得る。３’領域は、１０〜２５ヌクレオシド長、例えば１５〜２０、例えば１６、１７、１８、または１９ヌクレオシド長である。ＲＮＡ編集オリゴヌクレオチドは、さらに５’ＡＤＡＲ動員領域を含み得、ＡＤＡＲ動員領域は通常、標的配列から独立しており（すなわち、標的ＲＮＡへの相補性に依存しない）、通常、修飾ヌクレオシドの二本鎖領域を含み、二本鎖領域は、１つまたは２つのミスマッチヌクレオチド対（非塩基対形成ヌクレオシド）を含み得る。二本鎖領域は、ヘアピン構造によって形成され得る、すなわち、オリゴヌクレオチドは、５’領域がヘアピンを形成し、二本鎖領域を形成する単一のオリゴヌクレオチドである。あるいは、５’ＡＤＡＲ動員領域は、２つの相補的なオリゴヌクレオチド分子によって形成され得る。二本鎖領域は、例えば、長さ１５〜３０塩基対、例えば、２２〜２７または２５塩基対であり得、これには、例えば、１つまたは２つの非対形成塩基が含まれる。好適には、二本鎖領域は、２’−Ｏ−メチル、ＬＮＡおよび／または２’−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシドなどの修飾ヌクレオシドを含む。例として、Ｍｅｒｋｌｅら、Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１９年２月；３７（２）：１３３−１３８の図３ａを参照されたい。
【００９０】
連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書で用語「連続核酸塩基配列」および用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と互換的に使用される。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドの全ヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列、例えばＦ−Ｇ−Ｆ’ギャップマー領域を含み、場合によりさらなるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を含んでもよい。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。有利には、連続ヌクレオチド配列は、標的核酸に１００％相補性である。
【００９１】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドおよびポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的のために、天然に存在するヌクレオチドおよび非天然のヌクレオチドの両方を含む。天然では、ＤＮＡヌクレオチドおよびＲＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、および１つ以上のリン酸基（ヌクレオシドには存在しない）を含む。ヌクレオシドおよびヌクレオチドはまた、「単位」または「モノマー」と互換的に称されてもよい。
【００９２】
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」または「ヌクレオシド修飾」は、等価のＤＮＡヌクレオシドまたはＲＮＡヌクレオシドと比較して、糖部分または（核酸）塩基部分の１つ以上の修飾の導入によって修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施形態では、修飾ヌクレオシドは、修飾された糖部分を含む。用語修飾ヌクレオシドはまた、用語「ヌクレオシド類似体」または修飾「単位」または修飾「モノマー」と互換的に使用されてもよい。非修飾ＤＮＡまたはＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書でＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドと称される。ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの塩基領域における修飾を有するヌクレオシドは、Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対形成が可能であれば、依然として一般にＤＮＡまたはＲＮＡと称される。
【００９３】
修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド間結合」は、２つのヌクレオシドを互いに共有結合する、ホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者に一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施形態では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増大させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドの場合、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシド間のホスホジエステル結合を形成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、インビボ使用のためのオリゴヌクレオチドの安定化に特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドの領域、例えばギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、ならびに領域ＦおよびＦ’などの修飾ヌクレオシドの領域におけるヌクレアーゼ切断から保護する役割を果たし得る。
【００９４】
一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオシド間結合が、例えばヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性であるように、天然のホスホジエステルから修飾された１つ以上のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、またはヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えばヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を用いることにより決定することができ、これらの両方は当技術分野で周知である。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増強することができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と呼ばれる。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合が修飾され、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートを結合するヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識されるであろう。
【００９５】
好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。
【００９６】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態および製造の容易さのために特に有用である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも５０％のヌクレオシド間結合がホスホロチオアートであり、例えばオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列の少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、または例えば少なくとも９０％のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオアートである。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部がホスホロチオエートである。
【００９７】
核酸塩基
核酸塩基という用語は、ヌクレオシドおよびヌクレオチドに存在するプリン（例えばアデニンおよびグアニン）およびピリミジン（例えばウラシル、チミンおよびシトシン）部分を含み、これらは核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成する。本発明の文脈において、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーション中に機能的である修飾核酸塩基も包含する。この文脈において、「核酸塩基」は、天然に存在する核酸塩基、例えばアデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチンおよびヒポキサンチンと、非天然の変異体との両方を指す。このような変異体は、例えばＨｉｒａｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ  ４５  ｐａｇｅ  ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．３７  １．４．１に説明されている。
【００９８】
いくつかの実施形態では、核酸塩基部分は、プリンまたはピリミジンを修飾プリンまたはピリミジン、例えば置換プリンまたは置換ピリミジン、例えばイソシトシン、シュードイソシトシン、５−メチルシトシン、５−チアゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン、および２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基に変えることにより修飾される。
【００９９】
核酸塩基部分は、各々の対応する核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、ＣまたはＵにより示され得、各文字は、等価の機能の修飾核酸塩基を場合により含むことができる。例えば、例示のオリゴヌクレオチドにおいて、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃおよび５−メチルシトシンから選択される。場合により、ＬＮＡギャップマーについて、５−メチルシトシンＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【０１００】
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、１つ以上の糖修飾ヌクレオシドおよび／または修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを説明する。キメラオリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを説明するために文献で使用されている用語である。
【０１０１】
相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのＷａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対形成の能力を説明する。Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋ塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）およびアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは修飾核酸塩基を有するヌクレオシドを含んでもよく、例えば５−メチルシトシンは度々シトシンの代わりに使用され、したがって相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のＷａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対形成を包含することが理解されるであろう（例えばＨｉｒａｏ  ｅｔ  ａｌ（２０１２）Ａｃｃｏｕｎｔｓ  ｏｆ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ｖｏｌ  ４５  ｐａｇｅ  ２０５５およびＢｅｒｇｓｔｒｏｍ（２００９）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  Ｓｕｐｐｌ．３７  １．４．１を参照されたい）。
【０１０２】
本明細書で使用する場合、用語「相補性％」とは、核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）における、別の核酸分子（例えば、標的核酸または標的配列）の所与の位置の連続するヌクレオチドの配列に相補性である（例えば、Ｗａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対を形成する）、所与の位置の連続するヌクレオチド配列のヌクレオチドのパーセント数を意味する。このパーセント値は、２つの配列間で対を形成する（標的配列５’−３’とオリゴヌクレオチド配列３’−５’を整列させたとき）、整列した塩基の数を計数し、オリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で除し、１００を乗じることにより計算される。このような比較において、整列（塩基対を形成）しない核酸塩基／ヌクレオチドは、ミスマッチと称される。好ましくは、挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の相補性％の計算において許容されない。
【０１０３】
「完全に相補的な」という用語は、１００％の相補性を指す。
【０１０４】
同一性
用語「同一性」とは、本明細書で使用される場合、連続ヌクレオチド配列にわたって参照配列（例えば、配列モチーフ）に同一である、核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表される）を指す。したがって、同一性の百分率は、２つの配列（例えば、本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列および参照配列における）の間で同一の（一致する）整列された塩基の数を数え、その数をオリゴヌクレオチドのヌクレオチドの総数で割り、１００を掛けることにより計算される。したがって、同一性の百分率＝（一致×１００）／整列領域（例えば、連続ヌクレオチド配列）の長さ。挿入および欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算において許容されない。同一性の決定において、核酸塩基の化学的修飾は、核酸塩基がＷａｔｓｏｎ  Ｃｒｉｃｋ塩基対合を形成する機能的能力が保持される限り、無視されることが理解されるであろう（例えば、５−メチルシトシンは、％同一性の計算の目的のために、シトシンと同一であると見なされる）。
【０１０５】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズしている」または「ハイブリダイズする」は、２つの核酸鎖（例えば、オリゴヌクレオチドおよび標的核酸）が対向する鎖上の塩基対の間で水素結合を形成することにより二重鎖を形成するとして理解するべきである。２つの核酸鎖の間の結合の親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。これは、度々、オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二重鎖を形成する温度として定義される、融解温度（Ｔｍ）の観点から説明される。生理学的条件では、Ｔｍは、親和性に厳密に比例しない（Ｍｅｒｇｎｙ  ａｎｄ  Ｌａｃｒｏｉｘ，２００３，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ  １３：５１５−５３７）。標準状態ギブス自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性をより正確に表し、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋｄ）によって反応の解離定数（Ｋｄ）に関連付けられ、ここでＲは気体定数であり、Ｔは絶対温度である。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応の非常に低いΔＧ°は、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の強いハイブリダイゼーションを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃である反応に関連したエネルギーである。標的核酸に対するオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、自発的反応であり、自発的反応の場合のΔＧ°は、ゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Ｈａｎｓｅｎら，１９６５，Ｃｈｅｍ．Ｃｏｍｍ．３６−３８およびＨｏｌｄｇａｔｅら，２００５，Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙに説明されているような等温滴定熱量測定（ＩＴＣ）の使用により、実験的に測定することができる。当業者は、ΔＧ°測定のために市販の装置が入手可能であることを知るであろう。ΔＧ°は、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ，１９９８，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．９５：１４６０−１４６５に記載されているように、Ｓｕｇｉｍｏｔｏら，１９９５，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１１２１１−１１２１６およびＭｃＴｉｇｕｅら，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３：５３８８−５４０５に記載されている適切に誘導した熱力学パラメータを使用して、最近接モデルを用いることにより数値的に推定することもできる。その意図した核酸標的をハイブリダイゼーションによって調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施形態では、ハイブリダイゼーションの程度または強度は、標準状態でのギブスの自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、８〜３０ヌクレオチド長のオリゴヌクレオチドについて−１０ｋｃａｌの範囲未満、例えば−１５ｋｃａｌ未満、例えば−２０ｋｃａｌ未満、および例えば−２５ｋｃａｌ未満の概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、−１０〜−６０ｋｃａｌ、例えば−１２〜−４０、例えば−１５〜−３０ｋｃａｌ、または−１６〜−２７ｋｃａｌ、例えば−１８〜−２５ｋｃａｌの概算ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
【０１０６】
標的配列
用語「標的配列」とは、本明細書で使用される場合、標的核酸（ＲＮＡ）に存在するヌクレオチドの配列を指し、これは本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な標的核酸上の領域からなる。
【０１０７】
本発明のオリゴヌクレオチドは、本明細書で記載される標的配列などの、標的核酸のサブ配列といった、標的核酸に相補的な、またはハイブリダイズする、連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１０８】
オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に存在する標的配列に相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。連続ヌクレオチド配列（およびそれ故、標的配列）は、少なくとも１０個の連続ヌクレオチド、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０個、例えば１２〜２５個、例えば１４〜１８個の連続ヌクレオチドを含む。
【０１０９】
高親和性修飾ヌクレオシド
高親和性修飾ヌクレオシドは、修飾されたヌクレオチドであり、オリゴヌクレオチドに組み込まれると、例えば、融解温度（Ｔｍ）によって測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を高める。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、好ましくは、修飾ヌクレオシドあたり＋０．５〜＋１２℃、より好ましくは＋１．５〜＋１０℃、最も好ましくは＋３〜＋８℃の融解温度の上昇をもたらす。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野にて既知であり、例えば、多くの２’置換ヌクレオシドおよびロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Ｆｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３  ａｎｄ  Ｕｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３を参照されたい）。
【０１１０】
糖修飾
本発明のオリゴマーは、修飾された糖部分、すなわち、ＤＮＡおよびＲＮＡに見られるリボース糖部分と比較した場合の糖部分の修飾を有する１つ以上のヌクレオシドを含み得る。
【０１１１】
リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが、親和性および／またはヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを主な目的として作製されている。
【０１１２】
そのような修飾には、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）または二環式環（典型的には、リボース環（ＬＮＡ）のＣ２とＣ４炭素の間にバイラジカル架橋を有する）、または典型的にはＣ２とＣ３炭素の間の結合を欠く非結合リボース環（例えば、ＵＮＡ）で置き換えることにより、リボース環構造が修飾されているものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えばビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）または三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドには、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）、またはモルホリノ核酸の場合には、糖部分が非糖部分と置き換えられたヌクレオシドも含まれる。
【０１１３】
糖修飾には、リボース環上の置換基を、水素以外の基、またはＤＮＡヌクレオシドおよびＲＮＡヌクレオシド中に天然に存在する２’−ＯＨ基に変化させることを介して行われる修飾も含まれる。置換基は、例えば２’、３’、４’または５’位で導入され得る。
【０１１４】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨもしくは−ＯＨ以外の置換基を有し（２’置換ヌクレオシド）、または２’炭素とリボース環の第２の炭素との間に架橋を形成できる２’結合バイラジカルを含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’−４’バイラジカル架橋）ヌクレオシドである。
【０１１５】
実際、２’置換ヌクレオシドの開発には多くの注目が集まっており、多くの２’置換ヌクレオシドが、オリゴヌクレオチドに組み込まれた際に有益な特性を有することが見出されている。例えば、２’修飾糖は、向上した結合親和性、および／または増大したヌクレアーゼ耐性をオリゴヌクレオチドに提供することができる。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡおよび２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシドである。さらなる例については、例えばＦｒｅｉｅｒ＆Ａｌｔｍａｎｎ；Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．，１９９７，２５，４４２９−４４４３およびＵｈｌｍａｎｎ；Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，２０００，３（２），２９３−２１３、およびＤｅｌｅａｖｅｙ  ａｎｄ  Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２０１２，１９，９３７を参照されたい。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明である。
2021536239.tif 000004
本発明に関連して、２’置換は、ＬＮＡのような２’架橋分子を含まない。
【０１１６】
ロックド核酸（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、前記ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’を結合するバイラジカル（「２’−４’架橋」とも称される）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の立体配座を制限または固定する。これらのヌクレオシドは、文献にて架橋核酸または二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースのコンホメーションの固定は、ＬＮＡが相補的ＲＮＡまたはＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の増強（二重鎖安定化）に関連している。これは通常、オリゴヌクレオチド／補完二重鎖の融解温度を測定することにより決定され得る。
【０１１７】
非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、国際公開第００／６６６０４号、国際公開第９８／０３９３５２号、国際公開第２００４／０４６１６０号、国際公開第００／０４７５９９号、国際公開第２００７／１３４１８１号、国際公開第２０１０／０７７５７８号、国際公開第２０１０／０３６６９８号、国際公開第２００７／０９００７１号、国際公開第２００９／００６４７８号、国際公開第２０１１／１５６２０２号、国際公開第２００８／１５４４０１号、国際公開第２００９／０６７６４７号、国際公開第２００８／１５０７２９号、Ｍｏｒｉｔａら，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ＆Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｌｅｔｔ．１２，７３−７６、Ｓｅｔｈら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．２０１０，７５巻（５）１５６９−８１頁、およびＭｉｔｓｕｏｋａら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２００９，３７（４），１２２５−１２３８、およびＷａｎ  ａｎｄ  Ｓｅｔｈ，Ｊ．Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０１６，５９，９６４５−９６６７に開示されている。
【０１１８】
さらなる非限定的な、例示的なＬＮＡヌクレオシドは、スキーム１に開示されている。
スキーム１：
2021536239.tif 000005
【０１１９】
特定のＬＮＡヌクレオシドは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−β−Ｄ−オキシＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）およびＥＮＡである。
【０１２０】
特定の有利なＬＮＡは、β−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【０１２１】
モルホリノオリゴヌクレオチド
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、モルホリノヌクレオシドを含むか、またはそれからなる（すなわち、ホスホロジアミデートモルホリノオリゴマー（ＰＭＯ）としてのモルホリノオリゴマーでありる）。スプライス調節モルホリノオリゴヌクレオチドは、臨床使用が承認されており、例えば、デュシェンヌ型筋ジストロフィーの治療に使用される、ＤＭＤのフレームシフト変異を標的とする３０ｎｔモルホリノオリゴヌクレオチドである、エテプリルセンを参照のこと。モルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、以下の４つの連続するモルホリノヌクレオチドの説明に示されるように、ホスホロジアミデート基を介して連結されたメチレンモルホリン環など、リボースではなく６員のモルホリン環に結合した核酸塩基を有する。
2021536239.tif 000006
【０１２２】
いくつかの実施形態では、本発明のモルホリノオリゴヌクレオチドは、例えば、２０〜４０モルホリノヌクレオチド長、例えば、２５〜３５モルホリノヌクレオチド長であり得る。
【０１２３】
ＲＮａｓｅ  Ｈの活性および動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子と二重鎖を形成するときにＲＮａｓｅ  Ｈを動員する、その能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するインビトロ方法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力の決定に使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的な標的核酸配列が提供された場合、ｐｍｏｌ／ｌ／分で測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、ＤＮＡモノマーのみを含み、オリゴヌクレオチドの全モノマー間にホスホロチオアート結合を有するオリゴヌクレオチドを使用し、また国際公開第０１／２３６１３号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例９１〜９５により提供される方法論を使用したときに決定された初期率の少なくとも５％、例えば少なくとも１０％または２０％超を有する場合に、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員することができると見なされる。ＲＨａｓｅ  Ｈ活性の測定に使用するために、組換えヒトＲＮａｓｅ  Ｈ１が、Ｌｕｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ，Ｌｕｃｅｒｎｅ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。
【０１２４】
スプライス調節オリゴヌクレオチド
スプライス調節とは、アンチセンスオリゴヌクレオチドなどの薬剤の、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡのスプライシング事象を変化させる能力を指す。スプライス調節オリゴヌクレオチドは、イントロン／エクソン境界、またはスプライス事象を調節または制御するシスエレメントにハイブリダイズでき、相補的であり得る。これらは、本明細書でスプライス部位、またはスプライス調節エレメント、領域または配列と総称される。スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、スプライス調節オリゴヌクレオチドに言及するために当技術分野で一般的に使用される用語である。
【０１２５】
スプライス調節オリゴヌクレオチドの多数の設計が当技術分野で知られており、例えば、１３〜８０ヌクレオチド長のキメラオリゴマー化合物を開示する国際公開第２００７／０２８０６５号、およびＴＮＦＲ２転写物をスプライス調節してＴＮＦＲ２の可溶型をもたらすためのＬＮＡミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）アンチセンスオリゴヌクレオチドに言及する国際公開第２００７／０５８８９４号を参照されたい。さらなるスプライスモジュレーターアンチセンスオリゴヌクレオチドの設計は、例えば、以下に開示されている。Ｓａｚａｎｉら，Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖ．１３：１１９−１２８（２００３）：Ｃｈｉｌｄｓら，ＰＮＡＳ  ２００２年８月２０日：９９  １１０９１−１１０９６は、Ｃａｎｄｉｄａ  ａｌｂｉｃａｎｓのグループＩイントロンスプライシングのオリゴヌクレオチド指向阻害用のＬＮＡ／ＤＮＡミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）を開示する。Ｓａｚａｎｉら，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２００２  １２２８  −  １２３３は、マウスの異常型ＧＦＰレポーター遺伝子のスプライシングを修正する、完全に２’−Ｏ−ＭＯＥ修飾されたホスホロチオエートスプライスモジュレーターを開示する。Ｒｏｂｅｒｔｓら，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＴＨＥＲＡＰＹ  １４巻，４号、２００６年１０月、４７１−４７５頁は、マウスの異常型ＧＦＰレポーター遺伝子のスプライス調節用のＬＮＡミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）について報告する。Ａａｒｔｓｍａ−Ｒｕｓら，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００４）１１，１３９１−１３９８は、ＬＮＡ、２−Ｏ−メチルおよびモルフォリノエクソンをスキッピングするアンチセンスオリゴヌクレオチドを使用した、アンチセンスオリゴヌクレオチド類似体の、筋肉細胞中の標的ＤＭＤエクソン４６スキッピングについての比較分析に言及する。Ｈｕａら，ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２００７年４月｜第５巻｜第４号｜  ｅ７３は、エクソンを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドによるＳＭＮ２エクソン７封入の増強について言及する。Ｈａｖｅｎｓ  ａｎｄ  Ｈａｓｔｉｎｇｓ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２０１６  １  ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｗ５３３は、スプライシングのアンチセンス調節を総括している。国際公開第２００７／０４７９１３号は、スプライシング事象を調節するための標的部位であり得る、シススプライシングエレメントを同定するための方法に言及している。
【０１２６】
スプライシングを調節するためのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、好ましくは、非ＲＮａｓｅＨ媒介機構を介して機能する（したがって、それらは、有利には、ＲＮａｓｅＨ非依存性と呼ばれ得る）。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドスプライスモジュレーターは、ＲＮａｓｅＨを動員することができない。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドスプライスモジュレーターは、３を超える連続ＤＮＡヌクレオチドを含まないか、または４を超える連続ＤＮＡヌクレオチドを含まない。
【０１２７】
スプライス調節に使用されるオリゴヌクレオチドは、例えば、標的ＲＮＡに相補的な８〜４０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１２８】
スプライス調節に使用されるオリゴヌクレオチドは、例えば、標的ＲＮＡに相補的な８〜３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み得る。
【０１２９】
スプライス調節オリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列は、例えば８〜３０ヌクレオチド長、例えば１２〜２４ヌクレオチド長、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２または２３ヌクレオチド長であり得る。
【０１３０】
ＬＮＡスプライスモジュレーター
ＬＮＡオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡ標的に対する親和性が非常に高いため、効果の高いスプライスモジュレーターを作成する。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのＬＮＡヌクレオシドを含み、これらは、ＬＮＡスプライスモジュレーターと呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡおよびＬＮＡヌクレオシドの両方を含み、任意選択で、１つ以上の２−Ｏ−ＭＯＥヌクレオシド（本明細書ではＬＮＡミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）と呼ばれる）も含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つの２’−Ｏ−メチオキシエチルヌクレオシドおよびＬＮＡヌクレオシドの両方を含み、任意選択で、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドも含む。いくつかの実施形態では、ＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオチド（トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ））を含まない。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列を有するすべてのヌクレオシドは、独立して、ＬＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチルまたはＤＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列を有するすべてのヌクレオシドは、独立して、ＬＮＡまたはＤＮＡヌクレオシドである。いくつかのアンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列では、ＬＮＡおよびＤＮＡヌクレオシドの両方を含むか、または連続ヌクレオチド配列を有するすべてのヌクレオチドが、ＬＮＡまたはＤＮＡヌクレオチドである。
【０１３２】
本明細書に記載のＬＮＡスプライスモジュレーターは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、２’−Ｏ−ＭＯＥスプライスモジュレーターは、１０〜３０ヌクレオチド長、例えば、１２〜２０ヌクレオチド長である。
【０１３３】
２’−Ｏ−ＭＯＥスプライスモジュレーター
いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つの２’−Ｏ−メチオキシエチルヌクレオシドを含み、これらは、２’−Ｏ−ＭＯＥスプライスモジュレーターと呼ばれ得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、１つの２’−Ｏ−メチオキシエチルヌクレオシドおよびＬＮＡヌクレオシドの両方を含み、任意選択で、１つ以上のＤＮＡヌクレオシドも含む。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列を有するすべてのヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはその連続ヌクレオチド配列を有するすべてのヌクレオシドは、２’−Ｏ−メトキシエチルヌクレオシドである。本明細書に記載の２’−Ｏ−ＭＯＥスプライスモジュレーターは、１つ以上のホスホロチオエートヌクレオシド間結合をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチド、またはその連続ヌクレオチド配列のヌクレオシド間結合の全部が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施形態では、２’−Ｏ−ＭＯＥスプライスモジュレーターは、１２〜３０ヌクレオチド長である。完全には少なくとも１８ヌクレオチドの２−Ｏ−ＭＯＥオリゴヌクレオチド長が、標的ＲＮＡに十分な親和性を与えるのに好ましい。
【０１３４】
トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）
いくつかの実施形態では、オリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、本明細書で「トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）」と呼ばれる、親和性増強ヌクレオチドヌクレオシド類似体などのヌクレオチドヌクレオシド類似体の連続配列からなる。
【０１３５】
トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）は、一本鎖オリゴマー、またはその連続ヌクレオチド配列であり、ＤＮＡまたはＲＮＡヌクレオシドを含まず、したがって、ヌクレオシド類似体ヌクレオシドのみを含み、天然に存在しないヌクレオチドのみを含む。
【０１３６】
オリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）であってもよい。実際、様々なトータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）の設計は、特にスプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）として使用される場合、治療用オリゴマーとして非常に有効である。
【０１３７】
いくつかの実施形態では、トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）は、反復配列ＸＹＸまたはＹＸＹなどの少なくとも１つのＸＹＸまたはＹＸＹ配列モチーフを含むか、またはそれからなり、ＸはＬＮＡであり、Ｙは２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ単位および２’−フルオロＤＮＡ単位などの代替（すなわち、非ＬＮＡ）ヌクレオチド類似体である。上記の配列モチーフは、いくつかの実施形態では、例えば、ＸＸＹ、ＸＹＸ、ＹＸＹまたはＹＹＸであり得る。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）は、８〜１６ヌクレオチド、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、もしくは１５ヌクレオチド、例えば、８〜１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなってもよい。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、トータルマー（ｔｏｔａｏｌｍｅｒ）の連続ヌクレオチド配列は、少なくとも３０％、例えば少なくとも４０％、例えば少なくとも５０％、例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％、例えば少なくとも９０％、例えば９５％、例えば１００％のＬＮＡ単位を含む。残りの単位は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−ＯＭｅ−ＲＮＡ単位、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、ＬＮＡ単位、ＰＮＡ単位、ＨＮＡ単位、ＩＮＡ単位、および２’−ＭＯＥ  ＲＮＡ単位からなる群、または２’−ＯＭｅ  ＲＮＡ単位および２’−フルオロＤＮＡ単位の群から選択されるものなど、本明細書で言及される非ＬＮＡヌクレオチド類似体から選択されてもよい。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、トータルマー（ｔｏｔａｌｍｅｒ）は、ＬＮＡ単位トのみからなる連続ヌクレオチド配列からなるか、またはそれを含む。
【０１４１】
ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）
「ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）」という用語は、オリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列を指し、天然および非天然の両方のヌクレオチドであるＤＮＡヌクレオシドおよびヌクレオシド類似体ヌクレオシドを含む。ギャップマー、テールマー（ｔａｉｌｍｅｒ）、ヘッドマー（ｈｅａｄｍｅｒ）およびブロックマー（ｂｌｏｃｋｍｅｒ）とは対照的に、ＤＮＡ単位など、天然に存在するＤＮＡヌクレオチドヌクレオシドの５つを超える連続配列がない。
【０１４２】
本発明によるオリゴマーまたはその連続ヌクレオチド配列は、ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）であってもよい。実際、様々なミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）の設計は、特にスプライス調節／スプライススイッチングオリゴマー（ＳＳＯ）の場合、治療用オリゴマーとして非常に有効である。
【０１４３】
オリゴマー、またはその連続ヌクレオチド配列は、いくつかの実施形態では、ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）であってもよく、実際、それらの標的に効果的かつ特異的に結合するミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）の能力故に、ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）の治療用オリゴマーとしての使用は、標的ＲＮＡの低減に特に有効であると考えられる。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）は、ヌクレオチド類似体および天然に存在するヌクレオチドの、または１種のヌクレオチド類似体および第２のタイプのヌクレオチド類似体の繰り返しパターンの連続ヌクレオチド配列を含むか、またはそれらからなる。繰り返しパターンは、例えば、次のようになり得る：１つ置きもしくは２つ置きのヌクレオチドは、ＬＮＡなどのヌクレオチド類似体であり、残りのヌクレオチドは、ＤＮＡなどの天然に存在するヌクレオチドであるか、または本明細書で言及される２’フルオロ類似体の２’ＭＯＥなどの２’置換ヌクレオチド類似体、またはいくつかの実施形態では、本明細書で言及されるヌクレオチド類似体の群から選択されたものである。ＬＮＡ単位などのヌクレオチド類似体の繰り返しパターンは、固定位置、例えば５’末端または３’末端でヌクレオチド類似体と組み合わせられ得ることが認識されている。
【０１４５】
いくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーまたはミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）の第１のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体である。
【０１４６】
同じであっても異なっていてもよいいくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーまたはミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）の第２のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体である。
【０１４７】
同じであっても異なっていてもよいいくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーまたミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）の７番目および／または８番目のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体である。
【０１４８】
同じであっても異なっていてもよいいくつかの実施形態では、３’末端から数えて、オリゴマーまたはミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）の９番目および／または１０番目のヌクレオチドは、ＬＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体である。
【０１４９】
同じであっても異なっていてもよいいくつかの実施形態では、オリゴマーまたはミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）の５’末端は、ＬＮＡヌクレオチドなどのヌクレオチド類似体である。
【０１５０】
上記設計の特徴は、いくつかの実施形態では、ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）スプライス調節オリゴヌクレオチドなどのミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）設計に組み込まれ得る。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）は、４つを超える連続ＤＮＡヌクレオチド単位または３つを超える連続ＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）は、２つを超える連続ＤＮＡヌクレオチド単位の領域を含まない。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）は、少なくとも２つの連続ヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも２つの連続ＬＮＡ単位からなる少なくとも１つの領域を含む。
【０１５３】
いくつかの実施形態では、ミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）は、少なくとも３つの連続ヌクレオチド類似体単位、例えば少なくとも３つの連続ＬＮＡ単位からなる少なくとも１つの領域を含む。
【０１５４】
いくつかの実施形態では、本発明のミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）は、７つを超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えばＬＮＡ単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）は、６つを超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えばＬＮＡ単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）は、５つを超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えばＬＮＡ単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）は、４つを超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えばＬＮＡ単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）は、３つを超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えばＬＮＡ単位の領域を含まない。いくつかの実施形態では、本発明のミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）は、２つを超える連続ヌクレオチド類似体単位、例えばＬＮＡ単位の領域を含まない。
【０１５５】
コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分に共有結合したオリゴヌクレオチドを指す（コンジュゲート部分または領域Ｃまたは第３の領域）。
【０１５６】
１つ以上の非ヌクレオチド部分に対する本発明のオリゴヌクレオチドのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込み、または安定性に影響を及ぼすことにより、オリゴヌクレオチドの薬理学的性質を改善することができる。いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排泄、浸透性、および／または細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を調節または向上させる。特に、コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織または細胞型に標的化し、それにより、その器官、組織または細胞型におけるオリゴヌクレオチドの有効性を増強し得る。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織または器官内のオリゴヌクレオチドの活性を低下させるのに役立ち得る（例えば、非標的細胞型、組織または器官内のオフ標的活性または活性）。
【０１５７】
一実施形態では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば、細菌毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えば、キャプシド）またはそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１５８】
ＧａｌＮＡｃコンジュゲート
アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲｒ）に結合できるコンジュゲート部分は、肝臓の肝細胞を標的とするのに特に有用であり、したがって有利である。いくつかの実施形態では、本発明は、本発明のオリゴヌクレオチドおよびアシアロ糖タンパク質受容体を標的とするコンジュゲート部分を含むコンジュゲートを提供する。アシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）コンジュゲート部分は、ガラクトースと同等以上の親和性でアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＰＧＲ標的化部分）に結合することができる、１つ以上の炭水化物部分を含む。アシアロ糖タンパク質受容体に対する多数のガラクトース誘導体の親和性が研究されているか（例えば、Ｊｏｂｓｔ、Ｓ．Ｔ．ａｎｄ  Ｄｒｉｃｋａｍｅｒ、Ｋ．ＪＢ．Ｃ．１９９６、２７１、６６８６を参照）、または当技術分野で典型的な方法を使用して容易に決定される。
【０１５９】
一実施形態では、コンジュゲート部分は、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン、およびＮ−イソブタノイルガラクサミンからなる群より選択される、少なくとも１つのアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分を含む。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。
【０１６０】
ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分を生成するために、ＡＳＰＧＲ標的化部分（好ましくは、ＧａｌＮＡｃ）をコンジュゲート足場に付着させることができる。一般に、ＡＳＰＧＲ標的化部分は、足場の同じ末端にあり得る。一実施形態では、コンジュゲート部分は、アンチセンスオリゴヌクレオチドに結合され得るブランチャ分子に各ＧａｌＮＡｃ部分を結合するスペーサーに結合された、２〜４個の末端ＧａｌＮＡｃ部分からなる。
【０１６１】
さらなる実施形態では、コンジュゲート部分は、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分に関して、一価、二価、三価、または四価である。有利には、アシアロ糖タンパク質受容体標的化部分は、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分を含む。
【０１６２】
コンジュゲート部分を構成するＡＳＰＧＲ標的化足場は、例えば、ＧａｌＮＡｃ部分をそのＣ−１炭素を介してスペーサーに連結することによって生成することができる。好ましいスペーサーは、柔軟な親水性スペーサーである（米国特許第５８８５９６８号；Ｂｉｅｓｓｅｎら  Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｒｎ．１９９５、３９巻、１５３８〜１５４６頁）。好ましい柔軟な親水性スペーサーは、ＰＥＧスペーサーである。好ましいＰＥＧスペーサーは、ＰＥＧ３スペーサーである。分岐点は、２〜３つのＧａｌＮＡｃ部分または他のアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分の付着を可能にし、さらにオリゴヌクレオチドへの分岐点の付着を可能にする任意の小分子であり得、そのような構築物は、ＧａｌＮＡｃクラスターまたはＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分と呼ばれる。例示的な分岐点群は、ジリジンである。ジリジン分子は、３つのＧａｌＮＡｃ部分または他のアシアロ糖タンパク質受容体標的化部分が結合され得る３つのアミン基、およびジリジンがオリゴマーに結合され得るカルボキシル反応性基を含む。Ｋｈｏｒｅｖ、ｅｔ  ａｌ  ２００８  Ｂｉｏｏｒｇ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．Ｖｏｌ  １６、ｐｐ．５２１６は、適切な三価分岐剤の合成についても説明している。他の市販の分岐剤は、１，３−ビス−［５−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）ペンチルアミド］プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）］ホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号：１０−１９２０−ｘｘ）、トリス−２，２，２−［３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］エチル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号：１０−１９２２−ｘｘ）、および
トリス−２，２，２−［３−（４，４’−ジメトキシトリチルオキシ）プロピルオキシメチル］メチレンオキシプロピル−［（２−シアノエチル）−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホルアミダイト、および１−［５−（４，４’−ジメトキシ−トリチルオキシ）ペンチルアミド］−３−［５−フルオレノメトキシ−カルボニル−オキシ−ペンチルアミド］−プロピル−２−［（２−シアノエチル）−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）］−ホスホロアミダイト（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  カタログ番号：１０−１９２５−ｘｘ）である。
【０１６３】
他のＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分としては、例えば、国際公開第２０１４／１７９６２０号および同第２０１６／０５５６０１号および国際出願第ＰＣＴ／ＥＰ２０１７／０５９０８０号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているもの、ならびにＴｙｒ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−（アミノヘキシルＧａｌＮＡｃ）３（ＹＥＥ（ａｈＧａｌＮＡｃ）３などのＧａｌＮＡｃ部分が結合した小ペプチド；肝細胞上のアシアロ糖タンパク質受容体に結合するグリコトリペプチド（例えば、Ｄｕｆｆ、ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ、２０００、３１３、２９７を参照）；リジン系ガラクトースクラスタ（例えば、Ｌ３Ｇ４；Ｂｉｅｓｓｅｎ、ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｒｄｏｖａｓｃ．Ｍｅｄ．，１９９９、２１４）；およびコラン系ガラクトースクラスタ（例えば、アシアロ糖タンパク質受容体に対する炭水化物認識モチーフ）を挙げることができる。
【０１６４】
ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分、特に三価ＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分は、当該技術分野で公知の方法を用いてオリゴヌクレオチドの３’末端または５’末端に結合することができる。一実施形態では、ＡＳＧＰＲコンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの５’末端に結合する。
【０１６５】
いくつかの実施形態では、コンジュゲート部分は、以下に示すような三価のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）である。
2021536239.tif 000007
【０１６６】
リンカー
結合（ｌｉｎｋａｇｅ）またはリンカーは、１つ以上の共有結合を介して、ある関心対象の化学基またはセグメントを別の関心対象の化学基またはセグメントに連結する２つの原子間の接続である。コンジュゲート部分は、直接または連結部分（例えば、リンカーまたはテザー）を介してオリゴヌクレオチドに結合させることができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えばオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列またはギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’（領域Ａ）に共有結合する役割を果たす。
【０１６７】
本発明のいくつかの実施形態では、本発明のコンジュゲートまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、場合により、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドまたは連続ヌクレオチド配列（領域Ａまたは第１の領域）の間に位置するリンカー領域（第２の領域または領域Ｂおよび／または領域Ｙ）と、コンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）とを含み得る。
【０１６８】
領域Ｂは、哺乳動物の体内で通常遭遇するまたは遭遇するものに類似した条件下で切断可能である生理学的に不安定な結合を含むかまたはそれからなる、生体切断可能なリンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学的変換（例えば、切断）を受ける条件には、ｐＨ、温度、酸化もしくは還元条件または薬剤などの化学条件、および哺乳動物細胞で見られるまたは遭遇するものに類似した塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素または加水分解酵素またはヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施形態では、生体切断可能なリンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。ＤＮＡホスホジエステルを含む生体切断可能なリンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号（参照により本明細書に組み込まれる）により詳細に記載されている。本明細書の領域Ｄ’またはＤ”も参照されたい。
【０１６９】
領域Ｙは、必ずしも生体切断可能ではないが、主にコンジュゲート部分（領域Ｃまたは第３の領域）をオリゴヌクレオチド（領域Ａまたは第１の領域）に共有結合させるのに役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、エチレングリコール、アミノ酸単位またはアミノアルキル基などの反復単位の鎖構造またはオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域エレメント、Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−ＣまたはＡ−Ｙ−Ｃから構築することができる。いくつかの実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６〜Ｃ１２アミノアルキル基を含むＣ２〜Ｃ３６アミノアルキル基などのアミノアルキルである。好ましい実施形態では、リンカー（領域Ｙ）は、Ｃ６アミノアルキル基である。
【０１７０】
治療
本明細書で使用される用語「治療」は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患または障害）の治療、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。
【０１７１】
投与
本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、局所または腸内または非経口（静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、または髄腔内など）で投与され得る。
【０１７２】
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射もしくは注入、髄腔内または頭蓋内、例えば脳内または脳室内、硝子体内投与を含む非経口経路によって投与される。一実施形態では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の実施形態では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与される。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物は、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、または月に１回であり得る。
【０１７４】
詳細な説明
本発明は、本明細書ではネオアンチゲンペプチドと呼ばれ得るペプチドエピトープを細胞内で操作するための方法を提供し、前記方法は、有効量のスプライス調節オリゴヌクレオチドの細胞への投与を含む。ここで、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡスプライス事象を標的にしてＲＮＡ（本明細書では標的ＲＮＡと呼ばれる）のスプライシングをスプライス部位で調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する。
【０１７５】
この方法は、インビトロ方法またはインビボ方法であり得る。
【０１７６】
インビボでの使用の場合、ペプチドエピトープ（ネオアンチゲン）の発現を使用して、免疫応答を誘導または増強することができる。
【０１７７】
ペプチドエピトープ
ペプチドエピトープは、例えば主要組織適合遺伝子複合体、例えばＭＨＣクラスＩもしくはＩＩを介して、または異常型ポリペプチド内の膜固定ドメインを介して細胞表面に提示され得、またはいくつかの実施形態では、分泌されたポリペプチドの一部であり得る。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、スプライシング事象の調節がなければ細胞によって合成されない、新規のペプチドエピトープであり得る。ペプチドエピトープが細胞内で低レベルで発現する可能性も想定されるが（おそらくは稀な事象または検出レベル未満）、本発明の方法または使用は、調節されたスプライス事象の発現およびペプチドエピトープの生成の効果的な増強をもたらす。この文脈において、本発明の方法または使用での調節されたスプライシング事象は典型的には、通常は検出できないか、または稀な事象である。いくつかの実施形態では、異常型ＲＮＡは、スプライス調節オリゴヌクレオチドの非存在下では細胞に存在しないか、または標的遺伝子に由来するＲＮＡ集団の０．１％未満、例えば０．０１％未満または０．００１％未満に相当する。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは細胞から分泌される。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、ＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子（または両方）として細胞上に提示される。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープを含むポリペプチドは、膜結合ドメインをさらに含む。膜結合ドメイン（膜貫通ドメインなど）をコードする標的ＲＮＡを使用すると、ペプチドエピトープが細胞の外面に提示される可能性がある。
【０１８２】
ペプチドエピトープの細胞上での提示または細胞からの分泌は、上記の機構または他の任意の機構の組み合わせによって起こり得ることが理解されるであろう。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８：
2021536239.tif 000008
である。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８９：
2021536239.tif 000009
である。
【０１８５】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９０：
2021536239.tif 000010
である。
【０１８６】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９１：
2021536239.tif 000011
である。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、ペプチドエピトープは、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１９２：
2021536239.tif 000012
である。
【０１８８】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８、１８９、１９０、１９１、および１９２の群から選択されるペプチドエピトープなどのペプチドエピトープを含むワクチンを提供する。
【０１８９】
本発明は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１８８、１８９、１９０、１９１および１９２の群から選択されるペプチドなどのペプチドであるかまたはそれを含む、ポリペプチド、および治療におけるその使用、例えばワクチンとしての使用または免疫療法での使用を提供する。
【０１９０】
標的ＲＮＡ
標的ＲＮＡは、任意のペプチドまたはポリペプチドをコードするＲＮＡ、有利にはｐｒｅ−ｍＲＮＡであり得る  特定の癌が融合転写物の生成に関連していることは、よく知られている（例えば、特定の肉腫、例えば、Ｈｏｆｖａｎｄｅｒら、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｉｏｎ、９５巻、６０３−６０９頁（２０１５）を参照）。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、融合転写物であり得る。
【０１９１】
ｌｎｃＲＮＡは通常、非コードと考えられている一方で、しばしば短いポリペプチドをコードすることは明らかである（例えば、Ｒｉｏｎら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ、２７巻、６０４−６０５頁（２０１７）を参照）。いくつかの実施形態では、標的ＲＮＡは、ペプチドをコードするｌｎｃＲＮＡ、またはスプライシングの調節が異常型ポリペプチドの翻訳をもたらすｌｎｃＲＮＡのいずれかである。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、ＲＮＡ標的は、癌細胞において過剰発現されるｐｒｅ−ｍＲＮＡである（例えば、がんゲノムアトラスＴＣＧＡ）。
【０１９３】
標的ＲＮＡの例（およびそれらが過剰発現される癌の種類の非限定的な例）：ＣＥＭＩＰ（結腸癌）、ＥＴＶ４（結腸癌）、ＬＲＧ５（結腸癌）、ＮＯＸ１（結腸癌）、ＦＯＸＰ３（Ｔ−ＲＥＧＳ）、ＩＧＦ２ＢＰ３（一般的な癌）、ＭＡＧＥ−Ａ４（一般的な癌）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（一般的な癌）、ＥＷＳＲ１（肉腫、異常型スプライシング）、ＦＵＳ（肉腫、異常型スプライシング）、ＳＳ１８（肉腫、異常型スプライシング）。
【０１９４】
スプライシングの調節
スプライス調節は、イントロン／エクソンスプライス部位またはスプライス部位もしくはシス作用エレメントに隣接する領域、または他のスプライシング調節領域（集合的かつ互換的にスプライス調節エレメント、領域または配列と呼ばれる）を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によって達成され得る。
【０１９５】
世界的なＲＮＡシーケンシング技術の出現により、潜在的なスプライス調節オリゴヌクレオチドを適切な細胞系でスクリーニングして、スプライシング事象の調節に有効なスプライス調節オリゴヌクレオチド、および異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡの生成をもたらすスプライス調節オリゴヌクレオチドを同定することができる。
【０１９６】
スプライシングの調節は、ＲＮＡ標的のスプライス部位を標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドの使用によって達成することができ、そのようなオリゴヌクレオチドは、スプライシングに関与するｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列にハイブリダイズすることによって選択的スプライシングを調節し、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドとも呼ばれる。標的ＲＮＡのスプライシングを調節するために、スプライスモジュレーターは、イントロン／エクソン境界、またはスプライシング事象を調節するシスエレメントに相補的に、またはその近くに設計され得る（例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドに影響され得るスプライス調節事象を示す図１を参照されたい）。
【０１９７】
スプライス調節の例：（例については図１を参照のこと）
スプライス調節事象の多数の例を図１に示す。これは、スプライススキッピング、スプライス追加、およびスプライスシフトを含む、標的ＲＮＡにコードされるペプチド配列の変更をもたらすスプライス調節事象の非限定的な例である。
【０１９８】
スプライススキッピング：スプライススキッピングとは、標的ＲＮＡ（例えば、ｐｒｅ−ｍＲＮＡ）の少なくとも１つのエクソン領域（またはエクソンの一部）、および場合によりイントロン領域のスキッピングによってスプライシングが調節され、ＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）の領域からコードされる新しい、または異常型のポリペプチド配列をもたらす調節を指す。スキッピングは、隠れたスプライス部位または代替的３’もしくは５’スプライス部位を活性化することで可能になり得る。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入された異常型ＲＮＡ転写物を生成する。ここで、異常型ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）転写物は、内部ポリペプチド欠失をコードし、調節されたスプライシング事象において（例えば、１つ以上のエクソンのスキッピングによって）異常型ペプチド配列を含む異常型ポリペプチドを生成して、ペプチドエピトープを生成する。
【０２００】
スプライス追加：スプライス追加とは、イントロン領域に由来する少なくとも１つのコドンの包含によってスプライシングが調節され、その結果ポリペプチド鎖にコドンが追加され、ＲＮＡ（例えばｍＲＮＡ）の領域からコードされる新しいまたは異常型のポリペプチド配列をもたらす、調節を指す。スプライス追加は、隠れたスプライス部位または代替的３’もしくは５’スプライス部位を活性化することで可能になり得る。いくつかの実施形態では、追加は、コドンフレームシフト（シフトを参照）をもたらすか、または同じコドンフレームの維持をもたらし得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入された異常型ＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡなど）を生成する。ここで異常型ＲＮＡ転写物は、標的ＲＮＡのイントロン領域からの１つ以上のコドンをコードし、イントロン領域に由来する１つ以上のコドンによってコードされる少なくとも１つ以上のペプチドを含む異常型ペプチド配列を含む異常型ポリペプチドを生成して、ペプチドエピトープを生成する。
【０２０２】
スプライスシフト：スプライスシフトとは、コドンの一部の含有または欠失に関してスプライシングが調節されてフレームシフトの導入をもたらす、調節を指す。これは、フレームシフトの下流での異常型ポリペプチド配列、および場合により、さらに下流での終止コドン（未成熟の終止コドンまたは「遅延した」終止コドンであり得る）の生成をもたらす。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入されたコドンフレームシフトを含む異常型ＲＮＡ転写物を生成し、異常型ＲＮＡ転写物は、異常型ＲＮＡ転写物のコドンフレームシフト部またはその３’側の領域から転写された、少なくとも１つのアミノ酸のＣ末端領域を有するポリペプチドを生成する。
【０２０４】
コドンフレームシフト（スプライスシフト）に由来するペプチドエピトープ
いくつかの実施形態では、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節して（例えば、スプライス部位またはスプライス調節領域において）、調節されたスプライス部位に導入されたコドンフレームシフトによって異常型ｍＲＮＡ転写物を生成する。ここで、異常型ｍＲＮＡ転写物は、異常型ｍＲＮＡ転写物のコドンフレームシフト部またはその３’側の領域から転写された少なくとも１アミノ酸のＣ末端領域を有するポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、異常型ｍＲＮＡ転写物のコドンフレームシフト部またはその３’側の領域から転写されるＣ末端領域の長さは、少なくとも８アミノ酸長、例えば少なくとも９または１０アミノ酸長、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、または１４アミノ酸長である。ペプチドエピトープは、いくつかの実施形態では、異常型ＲＮＡのコドンフレームシフト部の上流の領域によってコードされるポリペプチドのＮ末端領域と、コドンフレームシフト部の下流でコードするＣ末端領域との組み合わせによって形成され得ることが理解されるであろう。あるいは、ペプチドエピトープは、コドンフレームシフト部またはその下流でコードするＣ末端領域から形成され得る。
【０２０５】
ペプチドエピトープは、例えば主要組織適合遺伝子複合体を介して、または上流の膜結合ドメインをコードする標的ＲＮＡの使用を介して、細胞表面に提示され得る。あるいは、ペプチドエピトープは分泌され得る。ポリペプチドのアイソフォームの分泌を増強するためのスプライス調節オリゴヌクレオチドの使用はよく知られており（例えば、ＴＮＦＲ２）、したがって、本発明の方法は、細胞表面に提示されるペプチドエピトープおよび分泌されるペプチドエピトープの両方をもたらし得ることも想定される。実際、ペプチドエピトープに対する免疫応答を誘発または増強する場合、これは非常に有利である可能性がある。
【０２０６】
細胞
本発明の文脈で言及される細胞は、インビトロまたはインビボであり得、疾患表現型に関連する細胞、例えば、標的ＲＮＡを発現している癌細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、疾患の表現型に関連しない同じ組織に由来する細胞と比較して、標的ＲＮＡを過剰発現している。実施例は、そのような標的ＲＮＡがどのように同定され得るかについての例示的な方法を提供する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、細胞は、腫瘍細胞、例えば、結腸癌細胞、転移した結腸癌細胞、または肝臓に転移した結腸癌細胞などの癌細胞である。
【０２０８】
いくつかの実施形態では、癌、または癌細胞は、膀胱癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、腎臓癌、白血病、肝臓癌、肺癌、黒色腫、リンパ腫、膵臓癌、前立腺癌、甲状腺癌、軟部組織肉腫、脳腫瘍、子宮頸癌、皮膚癌、骨癌、胆管癌、食道癌、胃癌、精巣癌、頭頸部癌からなる群より選択される。
【０２０９】
癌細胞を標的とすることのさらなる利点は、異常型ＲＮＡのナンセンス変異依存分解（ＮＭＤ）機構が通常、腫瘍細胞で低減または不活性化されることである（これは、例えばウイルス感染細胞にも共通する）。
【０２１０】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが肝臓および腎臓に優先的に取り込まれることはよく知られている。いくつかの実施形態では、細胞は、肝臓細胞または腎臓細胞である。
【０２１１】
しかしながら、機能の獲得（ペプチドエピトープの生成）をもたらす本発明の方法での使用の場合、標的ＲＮＡのスプライシング事象を調節するのに十分なオリゴヌクレオチドが細胞へ入る限り、オリゴヌクレオチドの高効率な標的細胞内への取り込みは、必ずしも必要ではない。免疫系によって提供される増幅を考慮して、例えば、０．５％以上のスプライシングの調節は、機能的な量のペプチドエピトープを生成するのに有効であり得る。したがって、本発明の方法は、肝臓または腎臓細胞での使用に限定されず、任意の組織または細胞タイプに一般的に適用可能であり得る。さらに、本発明者らの研究室からの最近の結果は、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドについて、ＲＮａｓｅＨ動員ギャップマーとは対照的に、オリゴヌクレオチドは、細胞への非常に低い取り込み量でスプライシング事象に重大な調節をもたらし得、しばしばもたらすことを示している。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、細胞は、肝細胞、腎臓細胞、腸間膜リンパ節細胞、骨髄細胞、免疫細胞、単球細胞、マクロファージ細胞、Ｔ細胞、Ｂ−細胞、脾臓細胞、子宮細胞、卵巣細胞、十二指腸細胞、結腸細胞、イリウム細胞、空腸細胞、アドピス細胞、肺細胞、筋肉細胞、胃細胞、膵臓細胞、心臓細胞、網膜細胞、脳細胞、神経細胞、樹状細胞、または背側根神経節細胞からなる群より選択され得る。
【０２１３】
スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、インビトロでの使用の場合、ジムノシス（ｇｙｍｎｏｓｉｓ）、トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを含む任意の適切な手段によって細胞に投与することができる。インビボでの使用の場合、全身送達または局所送達によって投与することができる。いくつかの実施形態では、細胞は、対象から単離された組織または細胞であり得、本発明の方法によって処置されてから対象に再導入される（エクスビボ投与）。
【０２１４】
癌標的ＲＮＡ
本発明の方法は、癌細胞を標的とするのに特に有用である。最初に、いくつかのＲＮＡ転写物の転写調節が癌細胞内で調節解除されることは、例えば、がんゲノムアトラス、ＴＣＧＡでよく知られている。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、ｐｒｅ−ｍＲＮＡは、ＣＥＭＩＰ、ＥＴＶ４、ＬＲＧ５、ＮＯＸ１、ＦＯＸＰ３、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＥＷＳＲ１、ＦＵＳ、およびＳＳ１８からなる群より選択される。
【０２１６】
インビボ治療方法および使用
本発明は、対象において標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．ペプチドエピトープを含む、またはペプチドエピトープをコードする薬剤を対象にワクチン接種する工程、
ｂ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、
ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【０２１７】
本発明は、対象において標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．ペプチドエピトープに特異的である抗体を対象に投与する工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【０２１８】
本発明は、対象における標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的にし、ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強する。
【０２１９】
本発明は、対象における疾患の免疫療法治療の方法を提供し、前記方法は、
ａ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．ペプチドエピトープに特異的である免疫療法抗体を対象に投与する工程、
を含み、標的細胞によって発現されるペプチドエピトープなど、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【０２２０】
本発明は、対象における標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、対象へのスプライス調節オリゴヌクレオチドの投与を含み、ここでスプライス調節オリゴヌクレオチドは、対象の標的細胞内のＲＮＡスプライス部位またはスプライス調節エレメントを標的とし、スプライス部位でのＲＮＡのスプライシングまたはスプライス調節エレメントを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ｍＲＮＡ転写物を生成し、異常型エピトープは対象に対して免疫原性であり、標的細胞に対する対象の免疫応答を誘発または増強する。
【０２２１】
本発明は、対象における標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．ペプチドエピトープを含む、またはペプチドエピトープをコードする薬剤を対象にワクチン接種する工程
ｂ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内のＲＮＡスプライス部位またはスプライス調節エレメントを標的とし、スプライス部位またはスプライス調節エレメントにおいてＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ｍＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、標的細胞に対する対象の免疫応答を誘発または増強し、
ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【０２２２】
この方法は、標的細胞におけるペプチドエピトープの発現または発現の増強をもたらし、免疫応答の誘発または増強をもたらす。
【０２２３】
いくつかの実施形態では、工程ａとｂとの間、またはｂとａとの間に、任意選択で待機工程ｃを採用して、例えば、対象に抗原ペプチドに対する適応免疫応答を獲得させること（工程ａ、ｃ、ｂの順序）、または標的細胞上でエピトープペプチドを発現させること（工程ｂ、ｃ、ａの順序）ができる。
【０２２４】
本発明は、対象における標的細胞を免疫調節する方法を提供し、前記方法は、
ａ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内のＲＮＡスプライス部位またはスプライス調節エレメントを標的とし、スプライス部位またはスプライス調節エレメントにおいてＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．ペプチドエピトープに特異的である抗体を対象に投与する工程、
を含み、標的細胞に対する対象の免疫応答を誘発または増強し、ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい。
【０２２５】
この方法は、標的細胞にペプチドエピトープの発現または増強された発現をもたらし、特に抗体が工程ｂで投与された場合に、免疫応答の誘発または増強をもたらす。
【０２２６】
工程ａとｂとの間に待機工程ｃを実行して、例えば、標的細胞においてペプチドエピトープを発現させることができる（工程ａ、ｂ、ｃの順序）。
【０２２７】
本発明は、細胞内でペプチドエピトープを生成するための、スプライス調節オリゴヌクレオチドの使用を提供する。
【０２２８】
本発明は、例えば癌の免疫療法治療におけるスプライススイッチングオリゴヌクレオチドの使用を提供し、ここでスプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡを標的にして、細胞、例えば癌細胞内でペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、免疫療法治療は、ペプチドエピトープを認識する治療用抗体の対象への投与を含む。
【０２２９】
本発明は、癌ワクチン療法におけるスプライススイッチングオリゴヌクレオチドの使用を提供し、ここで、スプライススイッチングオリゴヌクレオチドは、ＲＮＡを標的にして、癌細胞においてペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、ワクチン療法は、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答の発生または増強をもたらす。
【０２３０】
免疫療法
免疫療法は、対象（患者）自身の適応免疫系を使用および増強して疾患を治療する治療法であり、癌治療で広く使用され、癌免疫療法と呼ばれている。いくつかの実施形態では、免疫療法は、例えば、ペプチドエピトープに特異的な抗体であり得るか、または例えば、疾患、例えば癌に対する対象の免疫応答を増強する抗体であり得る抗体治療薬を使用する。
【０２３１】
ワクチンおよびワクチン接種
ワクチン接種とは、ワクチンで治療して疾患に対する免疫を作り出すことを意味する。ワクチン接種は、ワクチンに存在し得る、またはワクチンに存在する核酸でコードされ得る抗原に対する適応免疫系の活性化をもたらす（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはウイルスワクチンなどの形態、本明細書ではまとめて核酸ワクチンとして呼ばれる）。いくつかの実施形態では、ワクチンは、ペプチドエピトープ、またはペプチドエピトープをコードする核酸ワクチンを含む。対象への核酸ワクチンの送達は、対象におけるペプチドエピトープの発現をもたらし、それにより、ペプチドエピトープに対する免疫応答をもたらす。ワクチンはしばしば、対象による免疫の発達を増強するアジュバントを含む。
【０２３２】
いくつかの実施形態では、ワクチンは、癌細胞などの対象における癌を治療するために使用される。このようなワクチンは、癌ワクチンと呼ばれる。
【０２３３】
薬学的な塩
本発明で使用されるスプライス調節オリゴヌクレオチドは、それらの薬学的に許容される塩の形態で存在し得る。「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明の化合物の生物学的有効性および特性を保持し、適切な非毒性の有機もしくは無機酸または有機もしくは無機塩基から形成される従来の酸付加塩または塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸および硝酸などの無機酸に由来するもの、ならびにｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸などの有機酸に由来するものが含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、および第四級アンモニウム水酸化物、例えばテトラメチルアンモニウム水酸化物から誘導されるものが含まれる。医薬化合物の塩への化学修飾は、化合物の物理的および化学的安定性、吸湿性、流動性、および溶解性を向上させるために、薬剤師によく知られている手法である。これは例えば、Ｂａｓｔｉｎ，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ＆Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ２０００，４，４２７−４３５または  Ａｎｓｅｌ，Ｉｎ：Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，６ｔｈ  ｅｄ．（１９９５），ｐｐ．１９６および１４５６−１４５７に記載されている。例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩であり得る。
【０２３４】
さらなる態様では、本発明は、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはそのコンジュゲートの薬学的に許容される塩を利用する。好ましい実施形態では、薬学的に許容される塩は、ナトリウムまたはカリウム塩である。
【０２３５】
医薬組成物
さらなる態様では、本発明は、前述のオリゴヌクレオチドおよび／またはオリゴヌクレオチドコンジュゲートまたはその塩のいずれかと、薬学的に許容される希釈剤、担体、塩および／またはアジュバントとを含む医薬組成物を使用する。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、ナトリウム塩およびカリウム塩が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される希釈剤は、無菌リン酸緩衝生理食塩水である。いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５０〜３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容される希釈剤中で使用される。いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１０−１０００μｇの用量で投与される。
【０２３６】
本発明での使用に適した製剤は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，Ｐａ．，１７ｔｈ  ｅｄ．，１９８５に見られる。薬物送達の方法の簡単なレビューについては、例えば、Ｌａｎｇｅｒ（Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：１５２７−１５３３，１９９０）を参照のこと。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容される希釈剤、担体およびアジュバントの適切で好ましいさらなる例を提供する（参照により本明細書に組み込まれる）。適切な用量、製剤、投与経路、組成物、剤形、他の治療薬との組み合わせ、プロドラッグ製剤もまた、国際公開第２００７／０３１０９１号に提供されている。
【０２３７】
スプライス調節オリゴヌクレオチドの有利な製剤は、エクソソーム製剤である。
【０２３８】
オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、医薬組成物または製剤の調製のために、薬学的に許容される活性または不活性物質と混合されてもよい。医薬組成物の調製のための組成物および方法は、限定されるものではないが、投与経路、疾患の程度、または投与される用量を含む多くの基準に依存する。
【０２３９】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌されても、または滅菌フィルタにかけられてもよい。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装するか、または凍結乾燥することができ、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には３〜１１、より好ましくは５〜９または６〜８、最も好ましくは７〜８、例えば７〜７．５であろう。得られた固体形態の組成物は、錠剤またはカプセルの密封パッケージなどのように、各々が上記の薬剤または薬剤群の固定量を含む複数の単回用量単位で包装することができる。固体形態の組成物はまた、局所適用可能なクリームまたは軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブなどの柔軟な量の容器に包装することもできる。
【０２４０】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートはプロドラッグである。特にオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達されると、コンジュゲート部分は、いくつかの実施形態ではオリゴヌクレオチドから切断され得る。
【０２４１】
オリゴヌクレオチドの投与
本発明で使用されるオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、局所または腸内または非経口（静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、または髄腔内など）で投与され得る。
【０２４２】
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射もしくは注入、髄腔内または頭蓋内、例えば脳内または脳室内、硝子体内投与を含む非経口経路によって投与される。一実施形態では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の実施形態では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与される。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物は、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、または月に１回であり得る。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、オリゴヌクレオチドは、エクソソーム製剤で投与される。
【０２４５】
エクソソーム
エクソソームは、通常３０〜５００ｎｍの天然の生物学的ナノベシクルであり、機能的に活性なカーゴ（ｍｉＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ＤＮＡ、およびタンパク質など）を介した細胞間連絡に関与する。
【０２４６】
エクソソームはあらゆる種類の細胞から分泌され、唾液、血液、尿、乳などの体液にも豊富に含まれている。エクソソームの主な役割は、特定の細胞間で様々なエフェクターまたはシグナル伝達分子を送達することによって情報を伝達することである（Ａｃｔａ  Ｐｏｌ  Ｐｈａｒｍ．２０１４年７−８月；７１（４）：５３７−４３）。そのようなエフェクターまたはシグナル伝達分子は、例えば、タンパク質、ｍｉＲＮＡまたはｍＲＮＡであり得る。エクソソームは現在、ＲＮＡ治療用分子を含む様々な薬物分子の送達ビヒクルとして調査され、そのような分子の治療および診断への利用を拡大している。ｓｉＲＮＡ、アンチセンスオリゴヌクレオチド、および小分子などの合成分子をロードしたエクソソームの分野でのいくつかの開示は、そのような分子の、遊離薬物分子と比較した送達および有効性に関する利点を示唆するか、または表している（例えば、Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら  ２０１３  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  ６５：３９１−３９７、国際公開第２０１４／１６８５４８号、国際公開第２０１６／１７２５９８号、国際公開第２０１７／１７３０３４号、および国際公開第２０１８／１０２３９７号を参照）。
【０２４７】
エクソソームは、乳（乳エクソソーム）などの生物学的供給源から単離することができ、特に牛乳は、牛乳エクソソームを単離するための豊富な供給源である。例えば、Ｍａｎｃａら、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ（２０１８）８：１１３２１を参照されたい。
【０２４８】
本発明のいくつかの実施形態では、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、エクソソーム（エクソソーム製剤）にカプセル化され、一本鎖アンチセンスオリゴヌクレオチドをエクソソームにロードする例は、欧州特許出願第１８１９２６１４．８号に記載されている。本発明の方法では、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、エクソソーム製剤の形態で細胞または対象に投与され得、特に、エクソソーム製剤の経口投与が想定される。
【０２４９】
いくつかの実施形態では、スプライス調節オリゴヌクレオチドは、生体切断可能なリンカー（例えば、ホスホジエステル結合ＤＮＡヌクレオチドの領域）を介してスプライス調節オリゴヌクレオチドに共有結合し得る、例えば、コレステロールなどの親油性コンジュゲートと結合され得る。そのような親油性コンジュゲートは、スプライス調節オリゴヌクレオチドのエクソソームへの配合を容易にすることができ、標的細胞への送達をさらに増強することができる。
【０２５０】
チェックポイント阻害剤
本発明の治療方法および使用において使用され得る、治療的に承認された免疫チェックポイント阻害剤は、例えば、以下を含む。
2021536239.tif 000013
【０２５１】
治療
本明細書で使用される用語「治療」は、既存の疾患（例えば、本明細書で言及される疾患または障害）の治療、または疾患の予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）、すなわち予防（ｐｒｏｐｈｙｌａｘｉｓ）の両方を指す。したがって、本明細書で言及される治療は、いくつかの実施形態では、予防的であり得ることが認識されるであろう。
【０２５２】
投与
本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、局所または腸内または非経口（静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、または髄腔内など）で投与され得る。
【０２５３】
好ましい実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチドまたは医薬組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内または筋肉内注射もしくは注入、髄腔内または頭蓋内、例えば脳内または脳室内、硝子体内投与を含む非経口経路によって投与される。一実施形態では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の実施形態では、活性オリゴヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与される。
【０２５４】
いくつかの実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート、または医薬組成物は、０．１〜１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２〜１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５〜５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、週に１回、２週に１回、３週に１回、または月に１回であり得る。
【０２５５】
スプライス調節の実施形態
本発明の以下の実施形態は、本発明のスプライス調節の態様に関する。
【０２５６】
１．細胞内でペプチドエピトープを操作するための方法であって、有効量のスプライス調節オリゴヌクレオチドの細胞への投与を含み、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、標的ＲＮＡを標的にして標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、方法。
【０２５７】
２．実施形態１に記載の方法であって、
ａ）スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入された異常型ＲＮＡ転写物を生成し、異常型ＲＮＡ（ｍＲＮＡなど）転写物が、内部ポリペプチド欠失をコードし、調節されたスプライシング事象において（例えば、１つ以上のエクソンのスキッピングによって）異常型ペプチド配列を含む異常型ポリペプチドを生成して、ペプチドエピトープを生成し、かつ／または
ｂ）スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入された異常型ＲＮＡ転写物（ｍＲＮＡなど）を生成し、異常型ＲＮＡ転写物が、標的ＲＮＡのイントロン領域からの１つ以上のコドンをコードし、イントロン領域に由来する１つ以上のコドンによってコードされる少なくとも１つ以上のペプチドを含む異常型ペプチド配列を含む異常型ポリペプチドを生成して、ペプチドエピトープを生成し、かつ／または
ｃ）スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ｐｒｅ−ｍＲＮＡなどの標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、調節されたスプライシング事象によって導入されたコドンフレームシフトを含む異常型ＲＮＡ転写物を生成し、異常型ＲＮＡ転写物は、異常型ＲＮＡ転写物のコドンフレームシフト部またはその３’側の領域から転写された、少なくとも１つのアミノ酸のＣ末端領域を有するポリペプチドを生成する、方法。
【０２５８】
３．細胞が、腫瘍、肺癌、乳癌、結腸癌細胞、転移した結腸癌細胞、または肝臓に転移した結腸癌細胞などの癌細胞である、実施形態１または２のいずれか１つに記載の方法。
【０２５９】
４．インビトロ法またはインビボ法である、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の方法。
【０２６０】
５．標的ＲＮＡが癌細胞において過剰発現されるＲＮＡである、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【０２６１】
６．ペプチドエピトープが細胞から分泌される、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【０２６２】
７．ペプチドエピトープがＭＨＣクラスＩまたはＩＩ分子として細胞上に提示される、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の方法。
【０２６３】
８．ペプチドエピトープを含むポリペプチドが、膜結合ドメインをさらに含む、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０２６４】
９．ＲＮＡがｐｒｅ−ｍＲＮＡ、例えば  ＣＥＭＩＰ、ＥＴＶ４、ＬＲＧ５、ＮＯＸ１、ＦＯＸＰ３、ＩＧＦ２ＢＰ３、ＭＡＧＥ−Ａ４、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＥＷＳＲ１、ＦＵＳ、ＰＡＲＰＢＰおよびＳＳ１８からなる群より選択される（例えば、ヒトの）ｐｒｅ−ｍＲＮＡである、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０２６５】
１０．実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法であって、
ａ）ｐｒｅ−ｍＲＮＡがＣＥＭＩＰであり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、１〜８２または１９３〜２７４から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、または
ｂ）ｐｒｅ−ｍＲＮＡがＥＴＶ４であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、８３〜１６４から選択される配列と１００％の同一性を有する少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、方法。
【０２６６】
１１．スプライス調節オリゴヌクレオチドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ（ＭＯＥ）、２'−アミノ−ＤＮＡ、２'−フルオロ−ＲＮＡ、および２’−Ｆ−ＡＮＡヌクレオシド、およびＬＮＡヌクレオシドから独立して選択される２’糖修飾ヌクレオシドなどの２’糖修飾ヌクレオシドを含む、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２６７】
１２．スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合などの修飾ヌクレオシド間結合を含む、実施形態１〜１１のいずれか１つに記載の方法。
【０２６８】
１３．スプライス調節オリゴヌクレオチドが２’−Ｏ−ＭＯＥオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜１２のいずれか１つに記載の方法。
【０２６９】
１４．スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ＬＮＡミクスマー（ｍｉｘｍｅｒ）などのＬＮＡオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜１３のいずれか１つに記載の方法。
【０２７０】
１５．スプライス調節オリゴヌクレオチドがモルホリノオリゴヌクレオチドである、実施形態１〜１０のいずれか１つに記載の方法。
【０２７１】
１６．対象における標的細胞を免疫調節する方法であって、
ａ．ペプチドエピトープを含む、またはペプチドエピトープをコードする薬剤を対象にワクチン接種する工程、
ｂ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、
ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい、方法。
【０２７２】
１７．対象における標的細胞を免疫調節する方法であって、
ａ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．ペプチドエピトープに特異的である抗体を対象に投与する工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい、方法。
【０２７３】
１８．対象における標的細胞を免疫調節する方法であって、
スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
を含み、ペプチドエピトープを発現する標的細胞など、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強する、方法。
【０２７４】
１９．ＰＤＬ１阻害剤、ＰＤ１阻害剤またはＣＴＬＡ−４阻害剤などのチェックポイント阻害剤を対象に投与する工程をさらに含む、実施形態１６〜１８のいずれか１つに記載の方法。
【０２７５】
２０．対象における疾患の免疫療法治療の方法であって、
ａ．スプライス調節オリゴヌクレオチドを対象に投与する工程であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、対象の標的細胞内の標的ＲＮＡを標的とし、標的ＲＮＡのスプライシングを調節して、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成する、工程、
ｂ．ペプチドエピトープに特異的である免疫療法抗体を対象に投与する工程、
を含み、標的細胞によって発現されるペプチドエピトープなど、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答を誘発または増強し、ここで、工程ａおよび工程ｂの順序は、工程ａの次に工程ｂでも、工程ｂの次に工程ａでもよいし、または工程ａおよび工程ｂを同時に実行してもよい、方法。
【０２７６】
２１．癌の治療方法である、実施形態１６〜２０のいずれか１つに記載の方法。
【０２７７】
２２．細胞が、腫瘍、肺癌、乳癌、結腸癌細胞、転移した結腸癌細胞、または肝臓に転移した結腸癌細胞などの癌細胞である、実施形態１６〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【０２７８】
２３．工程ａが、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法、または実施形態１６もしくは実施形態１６に従属する場合の実施形態２０もしくは２１のいずれか１つに記載の方法を含み、工程ｃが、実施形態１〜１５のいずれか１つに記載の方法を含む、実施形態１６〜２２に記載のいずれか１つの方法。
【０２７９】
２４．細胞内でペプチドエピトープを生成するための、スプライス調節オリゴヌクレオチドの使用。
【０２８０】
２５．癌の免疫療法治療におけるスプライス調節オリゴヌクレオチドの使用であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを標的にして、癌細胞内でペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、免疫療法治療が、ペプチドエピトープを認識する治療用抗体の投与を含む、使用。
【０２８１】
２６．癌ワクチン療法におけるスプライス調節オリゴヌクレオチドの使用であって、スプライス調節オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡを標的にして、ペプチドエピトープを含む異常型ポリペプチドをコードする異常型ＲＮＡ転写物を生成し、ワクチン療法が、ペプチドエピトープに対する対象の免疫応答の発生または増強をもたらす、使用。
【０２８２】
２７．ＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１〜８２、または１９３〜２７４から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２８３】
２８．ＥＴＶ４  ｐｒｅ−ｍＲＮＡのスプライシングを調節できるアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：８３〜１６４から選択される配列と１００％の同一性を有する、少なくとも１０ヌクレオチド、例えば少なくとも１２ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む、アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２８４】
２９．配列１〜１６４、またはＯ１〜Ｏ１６４、もしくはＯ１６５〜Ｏ２４６からなる群より選択される化合物を含むかまたはそれらからなる、スプライス調節アンチセンスオリゴヌクレオチド。
【０２８５】
３０．１８８、１８９、１９０、１９１または１９２の群から選択されるペプチドエピトープなどのペプチドエピトープを含む、ワクチンまたは免疫療法剤。
【０２８６】
３１．１８８、１８９、１９０、１９１または１９２の群から選択されるペプチドなどのペプチドであるかまたはそれを含む、ポリペプチド。
【０２８７】
３２．医療において使用するための、例えばワクチンまたは免疫療法剤として使用するための、１８８、１８９、１９０、１９１または１９２の群から選択されるペプチドなどのペプチドであるかまたはそれを含む、ポリペプチド。
【実施例】
【０２８８】
実施例１．ＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡのエクソン６とエクソン８との間の新規スプライスジャンクションは、特定のオリゴヌクレオチドによって誘導される。（結果を図２に示す）：
転写物アイソフォームＣＥＭＩＰ−２０１転写物（ＥＮＳＴ０００００２２０２４４．７）に基づいて、エクソン６とエクソン８との間に新規のスプライスジャンクションを誘導するために、ＣＥＭＩＰエクソン７配列を標的とするオリゴヌクレオチドを設計した。
【０２８９】
４×１０３個のＣｏｌｏ−２０５細胞を９６ウェルプレート形式で播種し、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを添加したＲＰＭＩ培地で培養した。ＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列を標的とする４１の異なるオリゴヌクレオチドを（またはビヒクルのみ、ＰＢＳ）、２５μＭの最終濃度で細胞に添加した。４日後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して生成し、ｄｄＰＣＲ分析（Ｂｉｏｒａｄ）用に処理した。誘導されたエクソン６／エクソン８スプライスジャンクションを含むＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡの発現レベルは、全ＣＥＭＩＰ転写物のパーセンテージとして表される。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を分析に使用した。以下のプローブベースのアッセイを使用して、スプライシング事象を検出した。ＣＥＭＩＰエクソン６／エクソン８ジャンクション
2021536239.tif 000014
。野生型ＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡと比較して、誘導されたエクソン６／エクソン８ジャンクションは、配列をコードするｍＲＮＡにフレームシフトを、続いてＣＥＭＩＰ  Ｃ末端領域に新規の２８アミノ酸長ポリペプチド
2021536239.tif 000015
を発生させる。
【０２９０】
以下のＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドを使用して、スプライシング事象の変化を誘導した。ヌクレオシド間結合は、すべてホスホロチオネートである。大文字および小文字は、それぞれＬＮＡおよびＤＮＡ核酸塩基を示す。
2021536239.tif 000016
【０２９１】
実施例２．ＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡのエクソン２７とエクソン２９との間の新規スプライスジャンクションは、特定のオリゴヌクレオチドによって誘導される。（結果を図３に示す）：
転写物アイソフォームＣＥＭＩＰ−２０１転写物（ＥＮＳＴ０００００２２０２４４．７）に基づいて、エクソン２７とエクソン２９との間に新規のスプライスジャンクションを誘導するために、ＣＥＭＩＰエクソン２８配列に隣接または重複する部位でＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを設計した：
2021536239.tif 000017
（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２９７、大文字はエクソン２８ヌクレオチド、小文字は隣接するイントロン配列）。
【０２９２】
４×１０３個のＣｏｌｏ−２０５細胞を９６ウェルプレート形式で播種し、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを添加したＲＰＭＩ培地で培養した。ＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列を標的とする４１の異なるオリゴヌクレオチドを（またはビヒクルのみ、ＰＢＳ）、２５μＭの最終濃度で細胞に添加した。４日後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して生成し、ｄｄＰＣＲ分析（Ｂｉｏｒａｄ）用に処理した。誘導されたエクソン２７／エクソン２９スプライスジャンクションを含むＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡの発現レベルは、全ＣＥＭＩＰ転写物のパーセンテージとして表される。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を分析に使用した。以下のプローブベースのアッセイを使用して、スプライス事象を検出した。ＣＥＭＩＰエクソン２７／エクソン２９ジャンクション
2021536239.tif 000018
。野生型ＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡと比較して、誘導されたエクソン２７／エクソン２９ジャンクションは、配列をコードするｍＲＮＡでフレームシフトを、続いてＣＥＭＩＰ  Ｃ末端領域に新規の２１アミノ酸長ポリペプチド
2021536239.tif 000019
を発生させる。
【０２９３】
以下のＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドを使用して、スプライシング事象の変化を誘導した。ヌクレオシド間結合は、すべてホスホロチオネートである。大文字および小文字は、それぞれＬＮＡおよびＤＮＡ核酸塩基を示す。
2021536239.tif 000020
【０２９４】
実施例３．ＥＴＶ４  ｍＲＮＡのエクソン７とエクソン９との間の新規スプライスジャンクションは、特定のオリゴヌクレオチドによって誘導される。（結果を図４に示す）：
４×１０３個のＣｏｌｏ−２０５細胞を９６ウェルプレート形式で播種し、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを添加したＲＰＭＩ培地で培養した。ＥＴＶ４  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列を標的とする４１の異なるオリゴヌクレオチドを（またはビヒクルのみ、ＰＢＳ）、２５μＭの最終濃度で細胞に添加した。４日後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して生成し、ｄｄＰＣＲ分析（Ｂｉｏｒａｄ）用に処理した。誘導されたエクソン７／エクソン９スプライスジャンクションを含むＥＴＶ４  ｍＲＮＡの発現レベルは、全ＥＴＶ４転写物のパーセンテージとして表される。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を分析に使用した。以下のプローブベースのアッセイを使用して、スプライス事象を検出した。ＥＴＶ４エクソン７／エクソン９ジャンクション：
2021536239.tif 000021
。野生型ＥＴＶ４  ｍＲＮＡと比較して、誘導されたエクソン７／エクソン９ジャンクションは、エクソン８によってコードされる２５アミノ酸長のポリペプチドのインフレーム欠失を、次にＥＴＶ４タンパク質内の新規のポリペプチドジャンクションを生成する。（
2021536239.tif 000022
、下線は新しいジャンクション部位を示す）。
【０２９５】
以下のＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドを使用して、スプライシング事象の変化を誘導した。ヌクレオシド間結合は、すべてホスホロチオネートである。大文字および小文字は、それぞれＬＮＡおよびＤＮＡ核酸塩基を示す。
2021536239.tif 000023
【０２９６】
実施例４．ＥＴＶ４  ｍＲＮＡのエクソン９とエクソン１１との間の新規スプライスジャンクションは、特定のオリゴヌクレオチドによって誘導される。（結果を図５に示す）
４×１０３個のＣｏｌｏ−２０５細胞を９６ウェルプレート形式で播種し、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを添加したＲＰＭＩ培地で培養した。ＥＴＶ４  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列を標的とする４１の異なるオリゴヌクレオチドを（またはビヒクルのみ、ＰＢＳ）、２５μＭの最終濃度で細胞に添加した。４日後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して生成し、ｄｄＰＣＲ分析（Ｂｉｏｒａｄ）用に処理した。誘導されたエクソン９／エクソン１１スプライスジャンクションを含むＥＴＶ４  ｍＲＮＡの発現レベルは、全ＥＴＶ４転写物のパーセンテージとして表される。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を分析に使用した。以下のプローブベースのアッセイを使用して、スプライス事象を検出した。ＥＴＶ４エクソン９／エクソン１１ジャンクション：
2021536239.tif 000024
。野生型ＥＴＶ４  ｍＲＮＡと比較して、誘導されたエクソン９／エクソン１１ジャンクションは、配列をコードするｍＲＮＡでフレームシフトを、続いてＥＴＶ４  Ｃ末端領域に新規の２７アミノ酸長ポリペプチドを発生させる
2021536239.tif 000025
。
【０２９７】
以下のＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドを使用して、スプライシング事象の変化を誘導した。ヌクレオシド間結合は、すべてホスホロチオネートである。大文字および小文字は、それぞれＬＮＡおよびＤＮＡ核酸塩基を示す。
2021536239.tif 000026
【０２９８】
実施例５．操作ネオエピトープを生成するための候補ＲＮＡの発見
遺伝子操作ネオエピトープを生成するための候補ＲＮＡは、遺伝子発現データ（ＲＮＡ−ｓｅｑおよびマイクロアレイプロファイリングなど）の比較分析によって特定される。特に、目的の疾患細胞の発現プロファイルと正常組織（および／または正常細胞）のプロファイルとを比較することにより、疾患細胞で排他的または高度にアップレギュレートされる転写物（またはアイソフォーム）のサブセットが選択される。可能性のあるすべてのスプライススイッチ事象の包括的な分析をインシリコで実行して、スプライススイッチオリゴヌクレオチドへの曝露時に新規エピトープを生成する可能性があるものを定義する。このアプローチで特定された転写物の例は、ＣＥＭＩＰ（結腸癌）、ＥＴＶ４（結腸癌）、ＬＲＧ５（結腸癌）、ＮＯＸ１（結腸癌）、ＦＯＸＰ３（Ｔ−ＲＥＧＳ）、ＩＧＦ２ＢＰ３（一般的な癌）、ＭＡＧＥ−Ａ４（一般的な癌）、ＮＹ−ＥＳＯ−１（一般的な癌）、ＥＷＳＲ１（肉腫、異常型スプライシング）、ＦＵＳ（肉腫、異常型スプライシング）、ＳＳ１８（肉腫、異常型スプライシング）である。
【０２９９】
実施例６．肺扁平上皮癌用の操作ネオエピトープを生成するための候補ＲＮＡの発見（図６および図７に示す）
肺扁平上皮癌の５６臨床サンプルと正常なヒト組織とにおいて、２つのグループの遺伝子発現プロファイルを比較した（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ  Ｕ１３３に、２つのアレイ、５４，６７６のプローブを加えて測定）（副腎皮質腺、ｎ＝４；膀胱、ｎ＝３；乳房、ｎ＝３０；子宮頸部、ｎ＝３；結腸、ｎ＝８；食道、ｎ＝４；腎臓、ｎ＝３７；肝臓、ｎ＝２２；肺、ｎ＝６；肺上皮、ｎ＝２１；卵巣、ｎ＝４；膵臓、ｎ＝３７；前立腺、ｎ＝２４；骨格筋、ｎ＝１４；皮膚、ｎ＝４；小腸、ｎ＝３；胃、ｎ＝１９；精巣、ｎ＝１１；甲状腺、ｎ＝１０。ＰＡＲＰＢＰは、結果として最も差次的に発現する遺伝子の１つであった（ｐ値＝３．８５７ｅ−６９）。ＰＡＲＰＢＰプローブ２２００６０＿ｓ＿ａｔで測定された発現データを下図に示す。ピンクの三角形は肺扁平上皮癌のサンプルに対応し、青い点は正常組織を表す。以前の分析をさらに検証するために、ＰＡＲＰＢＰの発現をＧＴＥＸデータベース（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｔｅｘｐｏｒｔａｌ．ｏｒｇ／ｈｏｍｅ／ｇｅｎｅ／ＰＡＲＰＢＰ）で調査した。マイクロアレイデータと一致して、ＰＡＲＰＢＰは、健康なヒト組織の大部分ではごくわずかな発現を示し、ネオアンチゲン操作用の標的転写物としての使用の可能性を確認した。
【０３００】
ＰＡＲＰＢＰ−２０１、ＥＮＳＴ０００００３２７６８０．６
2021536239.tif 000027
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【０３０１】
コード配列：（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６５）
2021536239.tif 000031
【０３０２】
ＰＡＲＰＢＰエクソン６のスキッピングでフレームシフトが生じ、これにより、ＰＡＲＰＢＰタンパク質のＣ末端での新規の１５アミノ酸長のペプチド、および未成熟な終止コドンが生成される（ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１６６）。
2021536239.tif 000032
【０３０３】
実施例７．ＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡのエクソン２７とエクソン２９との間の新規スプライスジャンクションは、特定のオリゴヌクレオチドによって誘導され、実施例２よりも効果的な化合物を特定する拡張スクリーンである。（結果を表１に示す）
転写物アイソフォームＣＥＭＩＰ−２０１転写物（ＥＮＳＴ０００００２２０２４４．７）に基づいてエクソン２７とエクソン２９との間に新規のスプライスジャンクションを誘導するために、ＣＥＭＩＰエクソン２８配列に隣接または重複する部位でＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡを標的とするオリゴヌクレオチドを設計した（エクソン２８は、下線が引かれた配列であり、下線が引かれていない配列は、上流または下流のイントロン配列である）。
2021536239.tif 000033
【０３０４】
４×１０３個のＣｏｌｏ−２０５細胞を９６ウェルプレート形式で播種し、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを添加したＲＰＭＩ培地で培養した。ＣＥＭＩＰ  ｐｒｅ−ｍＲＮＡ配列（またはビヒクルのみ、ＰＢＳ）を標的とする８２の異なるオリゴヌクレオチドを、５μＭおよび２５μＭの最終濃度で細胞に添加した。４日後、細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡをｉＳｃｒｉｐｔ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃＤＮＡ合成キットを使用して生成し、ｄｄＰＣＲ分析（Ｂｉｏｒａｄ）用に処理した。誘導されたエクソン２７／エクソン２９スプライスジャンクションを含むＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡの発現レベルは、全ＣＥＭＩＰ転写物のパーセンテージとして表される。ＱｕａｎｔａＳｏｆｔソフトウェア（Ｂｉｏｒａｄ）を分析に使用した。以下のプローブベースのアッセイを使用して、スプライス事象を検出した。ＣＥＭＩＰエクソン２７／エクソン２９ジャンクション
2021536239.tif 000034
。野生型ＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡと比較して、誘導されたエクソン２７／エクソン２９ジャンクションは、配列をコードするｍＲＮＡでフレームシフトを、続いてＣＥＭＩＰ  Ｃ末端領域に新規の２１アミノ酸長ポリペプチド
2021536239.tif 000035
を発生させる。
【０３０５】
以下のＬＮＡ含有オリゴヌクレオチドを使用して、スプライシング事象の変化を誘導した。ヌクレオシド間結合は、すべてホスホロチオネートである。大文字および小文字は、それぞれＬＮＡおよびＤＮＡ核酸塩基を示す。オリゴおよび結果を以下の表に示す。
【０３０６】
（表１）データは、新規のエクソン２７／エクソン２９ジャンクションを含むＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡのパーセンタイルを示す。
2021536239.tif 000036
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【０３０７】
実施例８．Ｏ１９５によって誘導されるＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡのエクソン２７とエクソン２９の間の精密なヌクレオチドジャンクションの次世代シーケンシングによる検証。
ＣＥＭＩＰエクソン２７とＣＥＭＩＰエクソン２９との間の精密なヌクレオチドジャンクションは、次世代シーケンシングによって検証した。１．５×１０６個のＣｏｌｏ−２０５細胞を６ウェルプレート形式で播種し、５０μＭのビヒクル（ｎ＝２）またはＯ１９５（ｎ＝２）とともに４日間インキュベートした。細胞を回収し、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ抽出キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用してＲＮＡを抽出した。ｃＤＮＡ合成を行った後、キャプチャープローブ濃縮を使用してＣＥＭＩＰ  ｃＤＮＡを濃縮した。次に、イルミナＮＧＳシーケンシングを使用してＲＮＡｓｅｑを実行した。シーケンシングにより、予測されたジャンクションが実際にＯ１９５によって誘導されたことが確認された。アンチセンスオリゴヌクレオチド処理による新規スプライスジャンクションの誘導は、ジャンクションエクソン２７−エクソン２９ジャンクションに一致するリードと、野生型エクソン２７−エクソン２８ジャンクションに一致するリードとの間の比率として定量化した。Ｏ１９５は、８４％の効率でエクソン２８スキッピングを誘導することができた一方で、ビヒクルで処理したサンプルは、エクソン２８のスキップした形状が検出されないことを示した。
【０３０８】
実施例９．Ｏ１９５によって誘導されるＣＥＭＩＰタンパク質の分子量の変化（図８を参照）
１．５×１０６個のＣｏｌｏ−２０５細胞を６ウェルプレート形式で播種し、２５μＭのビヒクル（ｎ＝２）またはＯ１９５（ｎ＝２）とともに４日間インキュベートした。細胞を回収し、ＰＢＳで洗浄し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤（＃７８４４６、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を含む５００μｌのＩＰ溶解バッファー（＃８７７８７、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）で溶解した。ライセートの１０％をインプット対照として保存し、残りを２  μｇの抗ＣＥＭＩＰ抗体（ＮＢＰ１−５８０２９、Ｎｏｖｕｓ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）とともにインキュベートし、４°Ｃで一晩回転させた。１０μｌのタンパク質Ａ／Ｇアガロースビーズスラリー（＃２０４２１、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をライセートに加え、４°Ｃで１．５時間回転させた。ビーズを氷冷ＩＰ溶解バッファーで３回洗浄した後、イムノブロッティング分析のためにＷＥＳローディングバッファーに再懸濁した。ＧＡＰＤＨシグナルをローディングコントロールとして使用し、免疫沈降効率を確認した。ＣＥＭＩＰは容易に検出可能であり、すべての生物学的サンプルで正常にプルダウンされた。これは、ＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡスプライシングの操作がタンパク質翻訳を害さないことを示す。さらに、Ｏ１９５での処理によって、ビヒクルで処理されたサンプルと比較した場合、ＣＥＭＩＰ分子量の１７２  ＫＤａから１６４  ＫＤａへの明らかな減少が測定された。これらの結果は、Ｏ１９５での処理によってＣＥＭＩＰタンパク質が新規のＣ末端配列を提示し得ることを示唆している。
【０３０９】
実施例１０．ＣＥＭＩＰ  ｍＲＮＡのエクソン２７−エクソン２９ジャンクションの誘導後のＣＥＭＩＰの新規Ｃ末端の生成を認識する抗体（図９を参照）
ＣＥＭＩＰの新規Ｃ末端を標的とするポリクローナル抗体は、ＣＥＭＩＰの予測される新規Ｃ末端に対応するペプチド
2021536239.tif 000039
でウサギを免疫することによって生成した。４×１０３個のＣｏｌｏ−２０５細胞を９６ウェルプレート形式で播種し、１０％ＦＢＳおよび１％ｐｅｎ／ｓｔｒｅｐを添加したＲＰＭＩ培地で培養した。細胞を、７．５ｕＭおよび２２．５ｕＭの濃度のオリゴ１９５（２２３）とともにインキュベートした。４日後に５０ｕＬのＲＩＰＡバッファー（Ｔｈｅｍｏ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で細胞を回収した。細胞ライセートは、プロテインシンプルのＷｅｓシステムを製造業者の指示に従って使用して、キャピラリー電気泳動によって分析した。ＨＰＲＴ１を標的とする抗体が、ローディングコントロールとして含まれた。（アブカムａｂ１０９０２１）。図９に表示される結果は、オリゴ１９５で細胞を処理すると、約１６４  ＫＤａのサイズの強いバンドが誘導されることを示す。これは、新規のＣ末端を有する、予測される短縮型ＣＥＭＩＰタンパク質のサイズに対応する。
【０３１０】
実施例１１．Ｏ１９５によって誘導された新規Ｃ末端ペプチド配列の質量分析による検証（図１０を参照）。
ＣＥＭＩＰ免疫沈降サンプル（実施例９に記載されている）は、質量分析のために提出された。予想通り、ビヒクル処理サンプルとＯ１９５処理サンプルの両方に、野生型ＣＥＭＩＰタンパク質配列が含まれていた。驚くべきことに、Ｏ１９５で処理されたサンプルのみが、エクソン２８のスキッピングによって予測される新規のＣ末端ペプチドも示した。これらのデータは、Ｏ１９５によって誘導されるエクソン２８スキップアイソフォームが効率的に翻訳され、予測される新規Ｃ末端を生成することを示す。
【０３１１】
サンプル調製
免疫沈降したサンプルを６０μＬの１．５Ｘ  ＬＤＳバッファーで１５分間煮沸した。各溶出の半分は、１０％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＮｕＰＡＧＥ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用したＳＤＳ−ＰＡＧＥによって、ＭＥＳバッファー系で処理した。移動性領域を１０個の等しいサイズのセグメントに切り出し、以下のプロトコルでロボット（ＰｒｏＧｅｓｔ、ＤｉｇｉＬａｂ）を使用して、それぞれに対してゲル内消化を実施した。
・２５ｍＭ重炭酸アンモニウム、続いてアセトニトリルで洗浄した。
・６０°Ｃで１０ｍＭジチオスレイトールで還元した後、室温で５０ｍＭヨードアセトアミドでアルキル化した。
・シーケンシンググレードのトリプシン（Ｐｒｏｍｅｇａ）で３７°Ｃで４時間消化した。
・ギ酸で急冷し、上澄みをさらなる処理をせずに直接分析した。
【０３１２】
質量分析法
各ゲル消化物の半分は、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｕｍｏｓ質量分析計を接続したＷａｔｅｒｓ  ＮａｎｏＡｃｑｕｉｔｙ  ＨＰＬＣシステムを用いて、ナノＬＣ−ＭＳ／ＭＳで分析した。ペプチドをトラッピングカラムにロードし、７５μｍの分析カラムで３５０ｎＬ／分で溶出した。両方のカラムにＬｕｎａ  Ｃ１８樹脂（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ）を充填した。質量分析計はデータ依存モードで動作し、Ｏｒｂｉｔｒａｐは、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳについてそれぞれ、６０，０００ＦＷＨＭおよび１５，０００ＦＷＨＭで動作した。機器は、ＭＳおよびＭＳ／ＭＳに対して３秒サイクルで動作した。
サンプルごとに機器を５時間使用した。
【０３１３】
データ処理
Ｍａｓｃｏｔのローカルコピーを使用して、以下のパラメータでデータを検索した。
酵素：トリプシン／Ｐ
データベース：ＳｗｉｓｓＰｒｏｔ  Ｈｕｍａｎおよびカスタム配列＊（フォワードとリバースを連結して一般的な汚染物質を加えた）
固定修飾（ｆｉｘｅｄ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：カルバミドメチル（Ｃ）
変動修飾（ｖａｒｉａｂｌｅ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）：酸化（Ｍ）、アセチル（Ｎ−ｔｅｒｍ）、パイログル（Ｎ−ｔｅｒｍ  Ｑ）、脱アミド化（Ｎ、Ｑ）
質量値：モノアイソトピック
ペプチド質量耐性：１０  ｐｐｍ
断片の質量許容値：０．０２  Ｄａ
ミスクリベージ（Ｍｉｓｓｅｄ  Ｃｌｅａｖａｇｅ）の最大値：２
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2021536239.tif 000045
【図７】
2021536239.tif 000046
【図８】
2021536239.tif 000047
【図９】
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【図１０】
2021536239.tif 000049
【配列表】
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【国際調査報告】
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2021536239.tif 000051
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