(57)【要約】本開示は、Cas9ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼをコードする配列と、ジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNAまたはgRNAをコードする配列とを、対象に投与する段階を含む、その必要のある対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を治療または予防するための方法を提供する。投与によって、対象の心筋細胞の少なくとも一部においてジストロフィン発現が回復し、心収縮性が少なくとも部分的にまたは完全に回復し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Cas9ヌクレアーゼ、またはCas9ヌクレアーゼをコードする配列、および
ジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNA、または該gRNAをコードする配列
に心筋細胞を接触させる段階を含む、心筋細胞における変異体ジストロフィン遺伝子を編集するための方法。
【請求項２】
gRNAが、エクソン51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8、または55のスプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位を標的とする、請求項1記載の方法。
【請求項３】
gRNAが、SEQ ID NO：60〜705、712〜862、947〜2377のいずれか1つの配列を含むかまたはそれを標的とする、請求項1または請求項2記載の方法。
【請求項４】
ベクターが、gRNAまたはgRNAをコードする配列を含む、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
ベクターが、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項4記載の方法。
【請求項６】
ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項5記載の方法。
【請求項７】
AAVベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、およびヒツジAAVから選択される、請求項6記載の方法。
【請求項８】
非ウイルスベクターがプラスミドである、請求項5記載の方法。
【請求項９】
非ウイルスベクターがナノ粒子である、請求項5記載の方法。
【請求項１０】
第一ベクターが、gRNAまたはgRNAを含む配列を含み、第二ベクターが、Cas9またはCas9を含む配列を含む、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
第一ベクターおよび第二ベクターがAAVである、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
変異体ジストロフィン遺伝子が点変異を含む、請求項1〜11のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
点変異が偽エクソン変異である、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
変異体ジストロフィン遺伝子が欠失を含む、請求項1〜13のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
変異体ジストロフィン遺伝子が重複変異を含む、請求項1〜14のいずれか一項記載の方法。
【請求項１６】
Cas9ヌクレアーゼが、ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）から単離されるかまたはそれに由来する（spCas9）、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１７】
Cas9ヌクレアーゼが、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）から単離されるかまたはそれに由来する（saCas9）、請求項1〜15のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
ジストロフィンタンパク質を発現する、請求項1〜17のいずれか一項記載の方法に従って産生される心筋細胞。
【請求項１９】
人工多能性幹細胞（iPSC）に由来する、請求項18記載の心筋細胞。
【請求項２０】
治療有効量の請求項18または請求項19記載の心筋細胞を含む、組成物。
【請求項２１】
治療有効量の請求項20記載の組成物を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を治療または予防するための方法。
【請求項２２】
治療有効量が、患者において心収縮性を少なくとも部分的にまたは完全に回復する、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
Cas9ヌクレアーゼ、またはCas9ヌクレアーゼをコードする配列、および
ジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNA、または該gRNAをコードする配列
を含む、人工多能性幹細胞（iPSC）。
【請求項２４】
請求項23記載のiPSCに由来する心筋細胞を含む、組成物。
【請求項２５】
治療有効量の請求項24記載の組成物を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を治療または予防するための方法。
【請求項２６】
治療有効量が、患者において心収縮性を少なくとも部分的にまたは完全に回復する、請求項25記載の方法。
【請求項２７】
Cas9ヌクレアーゼ、またはCas9ヌクレアーゼをコードする配列、および
ジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNA、または該gRNAをコードする配列
を対象に投与する段階であって、該投与によって、対象の心筋細胞の少なくとも10％においてジストロフィン発現が回復する、段階
を含む、その必要のある対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を治療または予防するための方法。
【請求項２８】
gRNAが、エクソン51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8、または55のスプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位を標的とする、請求項27記載の方法。
【請求項２９】
gRNAが、SEQ ID NO：60〜705、712〜862、または947〜2377のいずれか1つの配列を含むかまたはそれを標的とする、請求項27または請求項28記載の方法。
【請求項３０】
ベクターが、gRNAまたはgRNAをコードする配列を含む、請求項27〜29のいずれか一項記載の方法。
【請求項３１】
ベクターが、ウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項30記載の方法。
【請求項３２】
ウイルスベクターが、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
AAVベクターが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、およびヒツジAAVから選択される、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
非ウイルスベクターがプラスミドである、請求項31記載の方法。
【請求項３５】
非ウイルスベクターがナノ粒子である、請求項31記載の方法。
【請求項３６】
第一ベクターが、gRNAまたはgRNAをコードする配列を含み、第二ベクターが、Cas9またはCas9をコードする配列を含む、請求項27〜35のいずれか一項記載の方法。
【請求項３７】
第一ベクターおよび第二ベクターがAAVである、請求項36記載の方法。
【請求項３８】
変異体ジストロフィン遺伝子が点変異を含む、請求項27〜37のいずれか一項記載の方法。
【請求項３９】
点変異が偽エクソン変異である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
変異体ジストロフィン遺伝子が欠失を含む、請求項27〜39のいずれか一項記載の方法。
【請求項４１】
変異体ジストロフィン遺伝子が重複変異を含む、請求項27〜40のいずれか一項記載の方法。
【請求項４２】
Cas9ヌクレアーゼが、ストレプトコッカス・ピオゲネスから単離されるかまたはそれに由来する（spCas9）、請求項27〜41のいずれか一項記載の方法。
【請求項４３】
Cas9ヌクレアーゼが、スタフィロコッカス・アウレウスのCas9から単離されるかまたはそれに由来する（saCas9）、請求項27〜42のいずれか一項記載の方法。
【請求項４４】
対象が、拡張型心筋症を患っている、請求項27〜43のいずれか一項記載の方法。
【請求項４５】
前記投与によって、対象の心筋細胞の少なくとも30％においてジストロフィン発現が回復する、請求項27〜44のいずれか一項記載の方法。
【請求項４６】
前記投与によって、心収縮性が少なくとも部分的に救済される、請求項27〜45のいずれか一項記載の方法。
【請求項４７】
前記投与によって、対象の心筋細胞の少なくとも50％においてジストロフィン発現が回復する、請求項27〜46のいずれか一項記載の方法。
【請求項４８】
前記投与によって、心収縮性が完全に救済される、請求項27〜47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
Cas9ヌクレアーゼ、またはCas9ヌクレアーゼをコードする配列、および
ジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNA、または該gRNAをコードする配列
に人工多能性幹細胞（iPSC）を接触させる段階；
iPSCを心筋細胞へと分化させる段階；ならびに
心筋細胞を対象に投与する段階
を含む、その必要のある対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を治療または予防するための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、2018年1月31日に出願された米国仮出願番号62/624,748への優先権を主張するものであり、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
連邦政府の資金支援条項
本発明は、米国立衛生研究所（NIH）によって授与された助成金番号HL-130253、HL-077439、DK-099653、およびAR-067294の下で政府支援によってなされた。政府は、本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
配列表
本願は、ASCIIフォーマットで電子提出されている配列表を含み、これは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。2019年1月31日に作成された前記ASCIIコピーは、UTFDP0002WO.txtと命名され、1,722,119バイトサイズである。
【０００４】
開示の分野
本開示は、分子生物学、医学および遺伝学の分野に関する。より具体的には、本開示は、エクソンスキッピングアプローチを使用してインビボで変異を修正するゲノム編集のための組成物およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００５】
背景
筋ジストロフィー（MD）は、運動を制御する骨格筋の進行性の衰弱および変性によって特徴付けられる、30を超える遺伝子疾患の一群である。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、男児のおよそ5000人に1人が罹患するMDの最も重度の形態の1つであり、進行性の筋衰弱および早期死亡によって特徴付けられる。心筋症および心不全が、DMDの共通する不治性かつ致死性の特徴である。この疾患は、細胞表面にあるジストログリカン複合体を基底細胞骨格と連結することによって収縮中の筋細胞膜の完全性を維持する大きな細胞内タンパク質であるジストロフィンをコードする遺伝子（DMD）の変異によって引き起こされる。ジストロフィン遺伝子の変異は、ジストロフィンの発現の喪失をもたらし、その結果、筋膜脆弱化および進行性筋消耗を引き起こす。
【発明の概要】
【０００６】
概要
CRISPR/Cas9によるゲノム編集は、疾患を引き起こす変異を修正または軽減するための有望な新規アプローチである。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、X連鎖ジストロフィン遺伝子（DMD）の3000を超える異なる変異によって引き起こされる心筋および骨格筋の致死的変性を伴う。これらの変異の大部分は、「ホットスポット」に集合している。本明細書の実施例に記載するように、変異ホットスポット内またはその近傍で最も一般的な変異体またはアウトオブフレームDMDエクソンのスキッピングを潜在的に可能にする、12個のエクソン中の保存されたRNAスプライス部位を無効にする挿入／欠失（インデル）変異を非相同末端結合によって導入することができる、最適なガイドRNAについてスクリーニングを実施した。エクソンスキッピングによるDMD変異の修正は、本明細書において、「ミオエディティング（myoediting）」と称される。概念実証研究において、ミオエディティングを、DMD遺伝子内に大きな欠失、点変異または重複を有する複数の患者由来の代表的な人工多能性幹細胞において実施して、誘導心筋細胞におけるジストロフィンタンパク質発現を効率的に回復した。3次元人工心筋（EHM）では、DMD変異のミオエディティングは、ジストロフィン発現および対応する機械的収縮力を回復した。心筋細胞の一部（30〜50％）の修正だけで、変異体EHM表現型を正常に近い対照レベルまで救済するのに十分であった。したがって、ミオエディティングを通じて、保存されたRNAスプライシングアクセプター／ドナー部位を無効にし、スプライシング機構を変異体またはアウトオブフレームエクソンのスキッピングに指向させることで、DMDに関連する心臓の異常の修正が、根底にあるこの疾患の遺伝学的基礎を取り除くことによって可能になることが示される。
【０００７】
したがって、いくつかの態様では、本開示は、Cas9ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼをコードする配列、およびジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNAまたはgRNAをコードする配列に、心筋細胞を接触させる段階を含む、心筋細胞における変異体ジストロフィン遺伝子を編集するための方法を提供する。
【０００８】
本開示はまた、Cas9ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼをコードする配列、およびジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNAまたはgRNAをコードする配列を、対象に投与する段階であって、該投与によって、対象の心筋細胞の少なくとも10％においてジストロフィン発現が回復する、段階を含む、その必要のある対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を治療または予防するための方法を提供する。
【０００９】
本開示はまた、Cas9ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼをコードする配列、およびジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNAまたはgRNAをコードする配列に、人工多能性幹細胞（iPSC）を接触させる段階;iPSCを心筋細胞へと分化させる段階;ならびに心筋細胞を対象に投与する段階を含む、その必要のある対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を治療または予防するための方法を提供する。
【００１０】
また、本開示の方法に従って産生される細胞（人工多能性幹細胞（iPSC）または心筋細胞など）、およびその組成物が提供される。いくつかの態様では、該細胞は、ジストロフィンタンパク質を発現する。
【００１１】
また、Cas9ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼをコードする配列、およびジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNAまたはgRNAをコードする配列を含む、人工多能性幹細胞（iPSC）が提供される。
【００１２】
本明細書において使用される場合、「1つの（a, an）」は、1つまたは複数を意味し得る。特許請求の範囲において使用される場合、語「含む」と併せて使用されたときに、語「1つの（a, an）」は、1つまたは2つ以上を意味し得る。
【００１３】
特許請求の範囲における用語「または」の使用は、択一的選択肢のみを指すことが明確に示されない限りまたは選択肢が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は、択一的選択肢のみと「および／または」を指す定義を支持する。本明細書において使用される場合、「別の」は、少なくとも2番目またはそれ以降のものを意味し得る。
【００１４】
本願を通して、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために採用される装置、方法についての固有の誤差変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。そのような固有の変動は、表明された値の±10％の変動であり得る。
【００１５】
本願を通して、別途指示のない限り、ヌクレオチド配列は、5'から3'への方向で列記され、アミノ酸配列は、N末端からC末端への方向で列記される。
【００１６】
本発明の他の目的、特徴、および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内の様々な変更および改変がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および具体例は、本発明の好ましい態様を示しながらも、例証の目的で与えられているにすぎないものと理解されるべきである。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示のある特定の局面をさらに実証するために含まれる。本開示は、本明細書に提示される具体的な態様の詳細な説明と組み合わせてこれらの図面の1つまたは複数を参照することによってさらによく理解されるであろう。
【図１】図1A〜1C. ミオエディティング戦略およびDMD中の上位12個のエクソンを標的とする最適なガイドRNAの特定。（図1A）保存されたスプライス部位は、SpCas9による開裂が可能となる、複数のNAGおよびNGG配列を含有する。数は、出現頻度（％）を示す。（図1B）ヒトDMDエクソンの構造。イントロン-エクソン接合部の形状は、スプライシング時にオープンリーディングフレームを維持する相補性を示している。赤色の矢印は、上位12個の標的とされるエクソンを示す。数は、エクソンの順序を示す。（図1C）上位12個のエクソンに対する対応するガイドRNA（gRNA）、SpCas9およびGFPを発現するプラスミドがトランスフェクトされたヒト293細胞におけるT7E1アッセイ。GFP+細胞およびGFP-細胞からのPCR産物を、CRISPR/Cas9媒介性ゲノム編集によって引き起こされるヘテロ二本鎖DNAに特異的であるT7エンドヌクレアーゼI（T7E1）で切断した。赤色の矢印は、T7E1の開裂バンドを示す。Mは、サイズマーカーレーンを表す。bpは、マーカーバンドの塩基対長を示す。
【図２−１】図2A〜2J. ミオエディティングによる、多様な変異を有するiPSC由来心筋細胞におけるジストロフィンmRNA発現の救済。（図2A）DMD iPSCのミオエディティングおよび3D-EHMに基づく機能性アッセイの図式。（図2B）ミオエディティングは、Del DMD iPSCにおけるエクソン51スプライスアクセプター部位を標的とする。DMD患者における欠失（エクソン48〜50）は、エクソン51中にフレームシフト変異を生み出す。赤色のボックスは、終止コドンを有するアウトオブフレームエクソン51を示す。DMD iPSCにおけるエクソン51スプライスアクセプターの破壊は、エクソン47から52までのスプライシングおよびジストロフィンオープンリーディングフレームの回復を可能にする。（図2C）ガイドRNAライブラリーを使用して、エクソン51の5'の配列を標的とする3つのガイドRNA（Ex51-g1、Ex51-g2、およびEx51-g3）を選択した。図2Cは、SEQ ID NO：2481を開示する。（図2D）未修正のDMD（Del）、修正されたDMD iPSC（Del-Cor.）およびWTから分化した心筋細胞のRT-PCR。エクソン51のスキッピングは、エクソン47から52までのスプライシング（下のバンド）およびDMDオープンリーディングフレームの回復を可能にする。（図2E）偽エクソン47A（pEx）についてのミオエディティング戦略。DMDエクソンは、青色のボックスで表される。終止コドンを有する偽エクソン47A（赤色）は、終止サインによってマークされている。黒色のボックスは、ミオエディティング媒介性インデルを示す。（図2F）pExの偽エクソン47AについてのガイドRNAの配列。DMDエクソンは、青色のボックスで表され、偽エクソンは、赤色のボックスとして表される（47A）。sgRNA、単一ガイドRNA。図2Fは、SEQ ID NO：2482〜2484をそれぞれ出現順に開示する。（図2G）ガイドRNA In47A-g1およびIn47A-g2による、WT、未修正のDMD（pEx）および修正されたDMD iPSC（pEx-Cor.）から分化したヒト心筋細胞のRT-PCR。偽エクソン47Aのスキッピングは、エクソン47から48までのスプライシング（下のバンド）およびDMDオープンリーディングフレームの回復を可能にする。
【図２−２】（図2H）エクソン55〜59の重複（Dup）についてのミオエディティング戦略。DMDエクソンは、青色のボックスで表される。重複エクソンは、赤色のボックスとして表される。黒色のボックスは、ミオエディティング媒介性インデルを示す。（図2I）Dupのイントロン54についてのガイドRNA（In54-g1、In54-g2、およびIn54-g3）の配列。図2Iは、SEQ ID NO：2485〜2487をそれぞれ出現順に開示する。（図2J）WT、未修正のDMD（Dup）および修正されたDMD iPSC（Dup-Cor.）から分化したヒト心筋細胞のRT-PCR。重複エクソン55〜59のスキッピングは、エクソン54から55までのスプライシングおよびDMDオープンリーディングフレームの回復を可能にする。RNAのRT-PCRを、表示のプライマーセット（FおよびR）を用いて実施した（表4）。
【図３】図3A〜3F. 免疫細胞化学およびウェスタンブロット解析は、ミオエディティングによって救済されたジストロフィンタンパク質発現を示す。（図3A〜3C）ジストロフィン発現の免疫細胞化学（緑色）は、ジストロフィン発現を欠いているDMD iPSC心筋細胞を示す。ミオエディティングの成功後、修正されたDMD iPSC心筋細胞は、ジストロフィンを発現する。免疫蛍光（赤色）は、心臓マーカートロポニン-Iを検出する。核は、ヘキスト色素（青色）によって標識されている。（図3D〜3F）WT（100および50％）、未修正（Del、pEx、およびDup）および修正されたDMD（Del-Cor#27、pEx-Cor#19、およびDup-Cor#6.）のiCMのウェスタンブロット解析。赤色の矢印（250kDを上回る）は、ジストロフィンの免疫反応性バンドを示す。青色の矢印（150kDを上回る）は、MyHCローディング対照の免疫反応性バンドを示す。kDは、タンパク質分子量を示す。スケールバー、100mm。
【図４】図4A〜4F. 救済されたDMD心筋細胞由来EHMは、増強されたFOC（収縮力）を示した。（図4A）EHM調製、培養、および収縮機能の解析についての実験準備。（図4B〜4D）DMD EHMにおける収縮不全は、ミオエディティングによって救済することができる。漸増細胞外カルシウム濃度に応答した各々個々のEHMの筋肉含量に対して正規化されたFOC; n=8/8/6/4/6/6/4/4; *P<0.05、2元配置分散分析（ANOVA）およびテューキーの多重比較検定による。表示のDMD系統を用いた並列実験からWT EHMデータを集め、図4に適用する（B〜D）。（図4E）WTに対して正規化された最大心筋細胞FOC。n=8/8/6/4/6/6/4/4; *P<0.05、1元配置ANOVAおよびテューキーの多重比較検定による。（図4F）修正された心筋細胞の力価測定は、EHMにおいて、表現型を部分的に救済するのに心筋細胞の30％が修復される必要があり、表現型を完全に救済する（100％ Del-Cor.）のに心筋細胞の50％が修復される必要があることを明らかにした。WT、Del、および100％ Del-Cor.は、図4に表示される通りのプールデータである。
【図５Ａ】図5A〜5B. CRISPR/Cas9によるDMD上位12個のエクソンのゲノム編集。（図5A）対応するガイドRNAを使用したSpCas9によって編集されたGPF＋ヒト293細胞由来のDMD上位12個のエクソン（51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8および55）のDNA配列（表5）。各試料のゲノムDNAからのPCR産物を、pCRII-TOPOベクターにサブクローニングし、個々のクローンを選び出して配列決定した。未編集の野生型（WT）配列は上部にあり、代表的な編集された配列は下部にある。欠失した配列は、黒色の破線に置き換えられている。赤色の小文字（ag）は、スプライスアクセプター部位（SA、イントロンの3'末端）を示す。青色の小文字（gt）は、スプライスドナー部位（SD、イントロンの5'末端）を示す。図5Aは、左欄にSEQ ID NO：2488〜2526、右欄にSEQ ID NO：2427〜2546をすべてそれぞれ出現順に開示する。
【図５Ｂ】（図5B）編集された293細胞からのRNAのRT-PCRは、標的とするDMD Dp140アイソフォームエクソン（51、53、46、52、50および55）の欠失を示す。黒色の矢印は、エクソン欠失を有するRT-PCR産物を示す。Mは、サイズマーカーレーンを表す。bpは、マーカーバンドの長さを示す。エクソン欠失バンドのRT-PCR産物の配列は、2個の隣接エクソンを含有したが、標的とするエクソンをスキップした。例えば、ΔEx51バンドのRT-PCR産物の配列は、エクソン51を除き、エクソン52に直接スプライシングされたエクソン50を確認した。図5Bは、SEQ ID NO：2547としての「GAGCCTGCAACA」、SEQ ID NO：2548としての「ATCGAACAGTTG」、SEQ ID NO：2549としての「AAAGAGTTACTG」、SEQ ID NO：2550としての「CAGAAGTTGAAA」、SEQ ID NO：2551としての「GTGAAGCTCCTA」およびSEQ ID NO：2552としての「TAAAAGGACCTC」を開示する。
【図６】図6A〜6D. DMD iPSCおよびiPSC由来心筋細胞における大きな欠失変異（Del. Ex47〜50）の修正。（図6A）SpCas9、gRNA（Ex51-g1、g2およびg3）およびGFPを発現するプラスミドがトランスフェクトされたヒト293細胞を使用したT7E1アッセイは、DMDエクソン51でのゲノム開裂を示す。赤色の矢印は、開裂産物を指し示す。M、マーカー；bp、塩基対。（図6B）SpCas9およびガイドRNA Ex51 g3によって編集されたGPF＋DMD Del iPSC由来のDMDエクソン51のDNA配列。ミオエディティングされたDMD iPSCの混合物のゲノムDNAからのPCR産物を、上記のように、pCRII-TOPOベクターにサブクローニングして配列決定した。未修正のエクソン51配列は上部にあり、代表的な編集された配列は下部にある。欠失した配列は、黒色の破線に置き換えられている。赤色の小文字（ag）は、スプライスアクセプター部位を示す。欠失したヌクレオチドの数は、（-）によって示される。図6Bは、SEQ ID NO：2553〜2561をそれぞれ出現順に開示する。（図6C）図2Dからの低いRT-PCRバンドの配列（Del-Cor.レーン）は、DMD ORF（エクソン47から52までのジストロフィン転写物）を再構成した、エクソン51のスキッピングを裏付けている。図6Cは、SEQ ID NO：2562を開示する。（図6D）免疫細胞化学は、iPSC由来心筋細胞混合物（Del-Cor.）および単一コロニー（Del-Cor-SC）におけるガイドRNA Ex51-g3を用いたSpCas9媒介性エクソンスキッピング後のジストロフィン発現を、WTおよび未修正の心筋細胞（Del）と比較して示す。緑色、ジストロフィン染色;赤色、トロポニンI染色;青色、核染色。スケールバー＝100μm。
【図７】図7A〜7D. DMD iPSCおよびiPSC由来心筋細胞における偽エクソン変異（pEx47A）の修正。（図7A）SpCas9、gRNA（pEx47A-g1およびg2）およびGFPを発現するベクターがヌクレオフェクトされたDMD pEx47A iPSCを使用したT7E1アッセイは、DMD偽エクソン47Aでのゲノム開裂を示す。赤色の矢印は、開裂産物を指し示す。M、マーカー；bp、塩基対。（図7B）SpCas9ならびにガイドRNA pEx47A-g1およびg2によって編集されたGPF＋DMD Del iPSC由来のDMD偽エクソン47AのDNA配列。ミオエディティングされたDMD iPSCの混合物のゲノムDNAからのPCR産物を、上記のように、サブクローニングして配列決定した。未修正の偽エクソン47A配列は上部にあり、代表的な編集された配列は下部にある。欠失した配列は、黒色の破線に置き換えられている。赤色の小文字（g）は、潜在スプライスアクセプター部位における点変異を示す。欠失したヌクレオチドの数は、（-）によって示される。図7Bは、SEQ ID NO：2563〜2567をそれぞれ出現順に開示する。（図7C）図2Gからの低いRT-PCRバンドの配列（pExレーンおよびpEx-Cor.レーン）は、DMD ORF（エクソン47から48までのジストロフィン転写物）を再構成した、偽エクソン47Aのスキッピングを裏付けている。図7Cは、SEQ ID NO：2568〜2569をそれぞれ出現順に開示する。（図7D）免疫細胞化学は、iPSC由来心筋細胞混合物（pEx-Cor.）および単一コロニー（pEx-Cor-SC）におけるガイドRNA pEx47A-g2を用いたSpCas9媒介性エクソンスキッピング後のジストロフィン発現を、WTおよび未修正の心筋細胞（pEx）と比較して示す。緑色、ジストロフィン染色；赤色、トロポニンI染色；青色、核染色。スケールバー＝100μm。
【図８】図8A〜8E. DMD iPSCおよびiPSC由来心筋細胞における大きな重複変異（Dup. Ex55〜59）の修正。（図8A）この挿入部位（In59-In54接合部）が、イントロン59を標的とするフォワードプライマー（F2）およびイントロン54を標的とするリバースプライマー（F1）を使用したPCRによって確認された（図2Hおよび表4）。重複特異的なPCRバンドは、WT細胞においては存在せず、Dup細胞において提示された。（図8B）SpCas9、gRNA（In54-g1、g2およびg3）およびGFPを発現するベクターと共に293細胞を使用したT7E1アッセイは、DMDイントロン54でのゲノム開裂を示す。赤色の矢印は、開裂産物を指し示す。M、マーカー；bp、塩基対。（図8C）重複エクソンを有するmRNAを、重複境界エクソン53とエクソン55に隣接するプライマー（エクソン53におけるフォワードプライマーEx53Fとエクソン59におけるリバースプライマーEx59R）を使用したRT-PCRによって半定量化した。同様に、重複エクソンを、重複境界エクソン59とエクソン60に隣接するプライマー（エクソン59におけるフォワードプライマーEx59Fとエクソン60におけるリバースプライマーEx60R）を使用したRT-PCRによって半定量化した。重複特異的なRT-PCRの上のバンド（赤色の矢印）は、WT細胞においては存在せず、Dup-Cor.細胞において劇的に減少した。（図8D）3つの代表的な修正された単一コロニー（Dup-Cor-SC #4、6および26）と未修正の対照（Dup）のPCR結果。コロニー4、6および26における重複特異的なPCRバンド（F2-R1）の非存在は、重複DNA領域の欠失を裏付けた。Mは、サイズマーカーレーンを表す。bpは、マーカーバンドの長さを示す。（図8E）免疫細胞化学は、iPSC由来心筋細胞混合物（Dup-Cor.）および単一コロニー（Dup-Cor-SC #6）におけるガイドRNA In54-g1を用いたSpCas9媒介性エクソンスキッピング後のジストロフィン発現を、WTおよび未修正の心筋細胞（Dup）と比較して示す。緑色、ジストロフィン染色;赤色、トロポニンI染色；青色、核染色。スケールバー＝100μm。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
詳細な説明
DMDは、ヒトにおいて特定されている4,000を超える独立した変異を有する新たな変異症候群である（dmd.nlのワールドワイドウェブ）。患者の変異の大部分は、ホットスポットに集合している欠失を含み、したがって、ある特定のエクソンをスキッピングする治療的アプローチが大規模な患者集団に適用される。エクソンスキッピングアプローチの論理的根拠は、DMD患者とベッカー型筋ジストロフィー（BMD）患者との間の遺伝的差異に基づく。DMD患者では、ジストロフィンmRNAのリーディングフレームが分断された結果、早期切断された非機能的ジストロフィンタンパク質をもたらす。BMD患者は、DMD遺伝子においてリーディングフレームを維持する変異を有しており、これによって、内部で欠失しているが部分的に機能的なジストロフィンの産生が可能となり、このことで、DMD患者と比較してはるかに軽度の病状を導く。
【００１９】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、男性のおよそ5000人に1人が患っており、X連鎖ジストロフィン遺伝子（DMD）の変異によって引き起こされる。これらの変異は、大きな欠失、大きな重複、点変異、および他の小さな変異を含む。棒状のジストロフィンタンパク質は、細胞骨格と筋細胞の細胞外マトリックスを連結し、原形質膜の完全性を維持する。それがなければ、筋細胞は変性する。DMDは多くの重度の症状を引き起こすが、拡張型心筋症がDMD患者の主要な死因の1つである。
【００２０】
CRISPR（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復）／Cas9（CRISPR関連タンパク質9）媒介性ゲノム編集は、遺伝性疾患の修正のための有望なツールとして出現した。簡単に述べると、Cas9またはCpf1などの操作されたRNAガイドヌクレアーゼは、短いプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列に隣接する標的とするゲノム遺伝子座に二本鎖切断（DSB）を生成する。DSBを修復するために3つの主要経路がある：（i）非相同末端結合（NHEJ）は、2つのDNA末端を直接結合し、不正確な挿入／欠失（インデル）変異を導く。（ii）相同組換え修復（HDR）は、姉妹染色分体または外因性DNAを修復鋳型として使用して、標的部位に正確な改変を生成する。（iii）マイクロホモロジー媒介末端結合（MMEJ）は、元々のDSBに隣接するヌクレオチド相同性の短い配列（5〜25塩基対）を使用して、切断された末端を結合し、マイクロホモロジー間の領域を欠失する。NHEJは、ほとんどの細胞タイプにおいてインデル変異を効果的に生成することができるが、HDRまたはMMEJ媒介性編集は、一般に、増殖性細胞に限定されると考えられる。
【００２１】
ジストロフィンの内部のインフレーム欠失は、比較的軽度の形態の筋ジストロフィーであるベッカー型筋ジストロフィー（BMD）に関連している。BMDの臨床的重症度がDMDに対して低いことがきっかけとなり、ジストロフィンオープンリーディングフレームを分断する変異をDMD遺伝子のスプライシングパターンを調節することによって回避する治療戦略として、エクソンスキッピングが発展してきた。いくつかの最近の研究は、CRISPR/Cas9媒介性ゲノム編集を使用することで、ヒト細胞およびマウスにおいて様々なタイプのDMD変異を修正した。いくつかは、ガイドRNAの対を活用して変異を修正しているが、それは、同時に起こるDNAの切断および大きな介在ゲノム配列（23〜725kb）の切除を必要とする。幸運にも、Cas9の最初にかつ最も広範に使用されている形態であるストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）のCas9（SpCas9）のPAM配列は、ユニバーサルスプライスアクセプター配列（AG）およびドナー配列（GG）のほとんどに対応したNAGまたはNGGを含有する。したがって、原理上は、スプライス接合部へのCas9の指向およびこれらのコンセンサス配列のインデルによる排除は、効率的なエクソンスキッピングを可能にすることができる。加えて、スプライス部位を分断する一回のDNAの開裂だけで、エクソン全体のスキッピングが可能となり得る。
【００２２】
ヒトにおいて特定されている個々のDMD変異が数千あることを考慮すると、そのような多数の変異をCRISPR/Cas9媒介性ゲノム編集によってどのように修正し得るかという明白な疑問が生じる。ヒトのDMD変異は、遺伝子の特定の「ホットスポット」領域（エクソン45〜55およびエクソン2〜10）に集合しているので、ホットスポット内またはその近傍にある12個の標的とするエクソン（「上位12個のエクソン」と呼ばれる）のうち1つまたは2つをスキッピングすると、原理上は、DMD患者の大部分（約60％）においてジストロフィン機能を救済することができる。ここで、CRISPR/Cas9を、単一ガイドRNAと共に使用することで、DMD変異の前の保存されたスプライスアクセプターもしくはドナー部位を破壊するか、または変異体もしくはアウトオブフレームエクソンを回避し、それによって、周囲のエクソン間のスプライシングが可能となり、変異を欠くインフレームジストロフィンタンパク質が再構築される。このアプローチは、隣接する変異ホットスポット内で最も一般的な変異したエクソンまたはアウトオブフレームエクソンのスキッピングが潜在的に可能となるDMDの12個のエクソンのスキッピングを誘導することができる最適なガイドRNAをスクリーニングすることによって最初に試験された。このアプローチの例として、ジストロフィン発現の回復は、エクソン欠失および偽エクソン点変異を保有する人工多能性幹細胞（iPSC）由来心筋細胞において実証される。最後に、ヒトiPSC由来3次元（3D）人工心筋（EHM）を使用して、DMDに関連する心収縮性の異常を克服するための遺伝子編集の有効性を試験した。DMD患者の拡張型心筋症（DCM）臨床表現型を再現している収縮不全がDMD EHMにおいて観察され、修正されたDMD EHMにおいては収縮機能が効果的に回復した。したがって、ゲノム編集は、遺伝的要因を排除し、DMDに関連する筋肉および心臓の異常を修正する強力な手段となる。
【００２３】
本開示のこれらのおよび他の局面は、以下でさらに詳細に記載される。
【００２４】
CRISPRシステム
CRISPR（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復）は、塩基配列の短い反復を含有するDNA遺伝子座である。各反復の後に、ウイルスへの事前曝露由来の「スペーサーDNA」の短いセグメントが続く。CRISPRは、配列決定された真正細菌ゲノムの約40％および配列決定された古細菌の90％に見いだされる。CRISPRは、CRISPRに関連するタンパク質をコードするCas遺伝子と関連していることが多い。CRISPR/Casシステムは、プラスミドおよびファージなどの外来遺伝エレメントに対する耐性を付与し、かつ獲得免疫の一形態を提供する、原核生物の免疫系である。CRISPRスペーサーは、真核生物におけるRNAiのように、これらの外因性遺伝エレメントを認識およびサイレンシングする。
【００２５】
CRISPR反復は、サイズが24〜48塩基対の範囲にある。これらは通常、ある程度の二分対称性を示す、つまりヘアピンなどの二次構造の形成を暗示するが、真に回文であるわけではない。反復は、同様の長さのスペーサーで隔てられている。いくつかのスペーサーは原核生物のゲノムと一致するが（自己ターゲティングスペーサー）、いくつかのCRISPRスペーサー配列は、プラスミドおよびファージ由来の配列と正確に一致する。新たなスペーサーは、ファージ感染に応答して迅速に付加され得る。
【００２６】
ガイドRNA（gRNA）
RNAにガイドされるタンパク質として、Cas9は、DNA標的の認識を指令する短いRNAを必要とする。Cas9は、PAM配列NGGを含有するDNA配列を選択的に調べるが、それはプロトスペーサー標的なしでここに結合することができる。しかしながら、Cas9-gRNA複合体は、二本鎖切断を生じるためにgRNAとの厳密な一致を必要とする。細菌におけるCRISPR配列は、複数のRNAで発現され、次いでRNAのガイド鎖を生じるためにプロセシングされる。真核生物系は、CRISPR RNAをプロセシングするために必要なタンパク質の一部を欠いているため、RNAポリメラーゼIII型プロモーターU6で発現される単一RNAにCas9ターゲティングに不可欠なRNA片を組み合わせるために合成構築物gRNAが作られた。合成gRNAは、最小長で100bpをわずかに上回り、PAM配列NGGの直前の20のプロトスペーサーヌクレオチドを標的とする部分を含む；gRNAは、PAM配列を含まない。
【００２７】
いくつかの態様では、gRNAは、野生型ジストロフィン遺伝子内のある部位を標的とする。例示的な野生型ジストロフィン遺伝子は、タンパク質ジストロフィン（GenBankアクセッション番号AAA53189; SEQ ID NO：5）をコードするヒトX染色体上に位置するヒト配列（GenBankアクセッション番号NC_000023.11を参照）を含み、その配列は、以下に再現される：
2021511803.tif 000002
【００２８】
いくつかの態様において、gRNAは、変異体ジストロフィン遺伝子内の部位を標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、ジストロフィンイントロンを標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、ジストロフィンエクソンを標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、表1に示されるジストロフィンアイソフォームの1つまたは複数で発現されかつ存在するジストロフィンエクソン中の部位を標的とする。複数の態様において、gRNAは、ジストロフィンスプライス部位を標的とする。いくつかの態様において、gRNAは、ジストロフィン遺伝子上のスプライスドナー部位を標的とする。複数の態様において、gRNAは、ジストロフィン遺伝子上のスプライスアクセプター部位を標的とする。
【００２９】
（表１）ジストロフィンアイソフォーム
2021511803.tif 000003
2021511803.tif 000004
2021511803.tif 000005
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2021511803.tif 000008
【００３０】
複数の態様において、ガイドRNAは、変異体DMDエクソンを標的とする。いくつかの態様において、変異体エクソンは、エクソン23または51である。いくつかの態様において、ガイドRNAは、ジストロフィン遺伝子のエクソン1、23、41、44、46、47、48、49、50、51、52、53、54、または55の少なくとも1つを標的とする。複数の態様において、ガイドRNAは、ジストロフィン遺伝子のイントロン44、45、50、51、52、53、54、または55の少なくとも1つを標的とする。好ましい態様において、ガイドRNAは、エクソン51またはエクソン23のスキッピングを誘導するように設計される。複数の態様において、gRNAは、エクソン51またはエクソン23のスプライスアクセプター部位を標的とする。
【００３１】
本明細書に開示の様々な組成物および方法において使用するための好適なgRNAおよびゲノム標的配列は、SEQ ID NO: 60〜705、712〜862、および947〜2377として提供される。
【００３２】
いくつかの態様において、gRNAまたはgRNA標的部位は、表5〜19に示すgRNAまたはgRNA標的部位のいずれか1つの配列を有する。
【００３３】
いくつかの態様において、本開示のgRNAは、DMD遺伝子に対応するコード配列または非コード配列内の標的配列に相補的である配列を含み、それ故、標的配列にハイブリダイズする。いくつかの態様において、Cpf1のためのgRNAは、直接反復骨格配列とそれに続く24ヌクレオチドのガイド配列を含有する、単一crRNAを含む。いくつかの態様において、crRNAの「ガイド」配列は、標的配列に相補的であるgRNAの配列を含む。いくつかの態様において、本開示のcrRNAは、標的配列に相補的ではないgRNAの配列を含む。本開示の「骨格」配列は、gRNAをCpf1ポリペプチドに連結する。本開示の「骨格」配列は、gRNA-Cas9構築物のtracrRNA配列と等価ではない。
【００３４】
いくつかの態様では、核酸は、gRNAをコードする1個または複数の配列を含み得る。いくつかの態様では、核酸は、gRNAをコードする、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個の配列を含み得る。いくつかの態様では、配列のすべてが同じgRNAをコードする。いくつかの態様では、配列のすべてが異なるgRNAをコードする。いくつかの態様では、配列の少なくとも2個が同じgRNAをコードし、例えば、配列の少なくとも3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19または20個が同じgRNAをコードする。
【００３５】
ヌクレアーゼ
Casヌクレアーゼ
CRISPR関連（cas）遺伝子は、CRISPR反復-スペーサーアレイに関連していることが多い。2013年現在、40種を超える異なるCasタンパク質ファミリーが記述されている。これらのタンパク質ファミリーのうち、Cas1は、異なるCRISPR/Casシステムの間で遍在しているようである。8つのCRISPRサブタイプ（Ecoli、Ypest、Nmeni、Dvulg、Tneap、Hmari、Apern、およびMtube）を定義するためにcas遺伝子および反復構造の特定の組み合わせが使用されており、その一部は、RAMP（repeat-associated mysterious protein）をコードする追加の遺伝子モジュールと関連している。単一のゲノム内に2つ以上のCRISPRサブタイプが存在し得る。CRISPR/Casサブタイプの散在的分布は、システムが微生物の進化中に遺伝子水平伝播を受けることを示唆している。
【００３６】
外因性DNAは、外見上、Cas遺伝子によりコードされたタンパク質によって小さなエレメント（長さがおよそ30塩基対）へとプロセシングされ、これが次に、リーダー配列の近くのCRISPR遺伝子座に何らかの形で挿入される。CRISPR遺伝子座からのRNAは、構成的に発現され、Casタンパク質によって個々の外部に由来する配列エレメントと隣接する反復配列とから構成される小さなRNAへとプロセシングされる。RNAは、他のCasタンパク質をガイドして、外因性遺伝エレメントをRNAまたはDNAレベルでサイレンシングする。CRISPRサブタイプ間の機能的多様性を、証拠が示唆している。Cse（CasサブタイプEcoli）タンパク質（大腸菌（E. coli）中のCasA〜Eと呼ばれる）は機能的複合体Cascadeを形成し、これが、CRISPR RNA転写物をCascadeの保持するスペーサー反復単位にプロセシングする。他の原核生物では、Cas6がCRISPR転写物をプロセシングする。興味深いことに、大腸菌でのCRISPRに基づくファージ不活性化は、CascadeおよびCas3を必要とするが、Cas1およびCas2を必要としない。パイロコッカス・フリオサス（Pyrococcus furiosus）および他の原核生物において見いだされるCmr（Cas RAMPモジュール）タンパク質は、相補的な標的RNAを認識および切断する小さなCRISPR RNAとの機能的複合体を形成する。RNAガイドCRISPR酵素は、V型制限酵素として分類される。
【００３７】
Cas9は、ヌクレアーゼ、すなわちDNAを切断するために特化した酵素であり、二重らせんの各鎖に対して1つずつの、2つの活性切断部位を有する。標的DNAを探し当てるCas9の能力を保持しながら、一方または両方の部位を不活性化し得る。Jinek et al. (2012) は、tracrRNAとスペーサーRNAを組み合わせることにより、Cas9と混合することで正しいDNA標的を発見および切断することができる「単一ガイドRNA」分子としたが、このような合成ガイドRNAは遺伝子編集に使用される。
【００３８】
Cas9タンパク質は、病原細菌および共生細菌において高度に濃縮されている。CRISPR/Cas媒介性遺伝子調節は、特に真核生物宿主との細菌の相互作用中の、内因性細菌遺伝子の調節に寄与し得る。例えば、フランシセラ・ノビシダ（Francisella novicida）のCasタンパク質Cas9は、ユニークな小さいCRISPR/Cas関連RNA（scaRNA）を使用して、F.ノビシダが宿主応答を弱め病原性を促進するのに不可欠な細菌性リポタンパク質をコードする内因性転写物を抑制する。生殖細胞系（接合体）へのCas9 mRNAおよびsgRNAの共注射を使用して、変異を持つマウスを作製できることが示されている。また、Cas9 DNA配列の送達も想定される。
【００３９】
CRISPR/Casシステムは、3種類のクラスに分けられる。クラス1は、いくつかのCasタンパク質をCRISPR RNA（crRNA）と一緒に使用して、機能的エンドヌクレアーゼを構築する。クラス2 CRISPRシステムは、単一のCasタンパク質をcrRNAと共に使用する。Cpf1は、約1,300アミノ酸のタンパク質を含有するクラスIIのV型CRISPR/Casシステムとして最近同定された。米国特許公報第2014/0068797号（参照によってその全体が組み入れられる）も参照されたい。
【００４０】
いくつかの態様では、本開示の組成物は、細菌スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）由来のCas9の小型バージョン（UniProtアクセッション番号J7RUA5）を含む。Cas9の小型バージョンは、野生型または完全長Cas9に勝る利点を提供する。いくつかの態様では、Cas9は、ストレプトコッカス・ピオゲネスのもの（spCas9）である。
【００４１】
Cpf1ヌクレアーゼ
プレボテラおよびフランシセラ1由来のクラスター化して規則的な配置の短い回文配列反復、すなわちCRISPR/Cpf1は、CRISPR/Cas9システムといくつかの類似性を有するDNA編集技術である。Cpf1は、クラスII CRISPR/CasシステムのRNAガイドエンドヌクレアーゼである。この獲得免疫機構は、プレボテラ細菌およびフランシセラ細菌に見いだされる。それは、ウイルスによる遺伝子損傷を防止する。Cpf1遺伝子は、CRISPR遺伝子座に関連しており、ガイドRNAを使用してウイルスDNAを発見および切断するエンドヌクレアーゼをコードする。Cpf1は、Cas9よりも小さくかつ単純なエンドヌクレアーゼであり、CRISPR/Cas9システムの制限の一部を克服する。
【００４２】
Cpf1は、多くの細菌種に見られる。ゲノム編集のためのツールへと発展した究極的なCpf1エンドヌクレアーゼは、それを保有していることが知られた最初の16種のうちの1種から採取された。
【００４３】
複数の態様において、Cpf1は、以下に示す配列を有する、アシダミノコッカス由来のCpf1酵素である（BV3L6種、UniProtアクセッション番号U2UMQ6; SEQ ID NO: 870）。
2021511803.tif 000009
【００４４】
いくつかの態様において、Cpf1は、以下に示す配列を有する、ラクノスピラ科由来のCpf1酵素である（ND2006種、UniProtアクセッション番号A0A182DWE3; SEQ ID NO: 871）。
2021511803.tif 000010
【００４５】
いくつかの態様において、Cpf1は、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの態様において、Cpf1は、ヒト細胞またはマウス細胞における発現のためにコドン最適化される。
【００４６】
Cpf1遺伝子座は、混合アルファ/ベータドメイン、RuvC-Iとそれに続くらせん領域、RuvC-IIおよびジンクフィンガー様ドメインを含有する。Cpf1タンパク質は、Cas9のRuvCドメインに似たRuvC様エンドヌクレアーゼドメインを有する。さらに、Cpf1は、HNHエンドヌクレアーゼドメインを有さず、Cpf1のN末端は、Cas9のアルファ-らせん認識ローブを有さない。
【００４７】
Cpf1 CRISPR-Casドメインアーキテクチャは、Cpf1が機能的にユニークであることを示し、クラス2のV型CRISPRシステムとして分類されている。Cpf1遺伝子座は、II型システムよりもI型およびIII型に似たCas1、Cas2、およびCas4タンパク質をコードする。データベース検索は、Cpf1ファミリータンパク質が多くの細菌種に豊富にあることを示唆している。
【００４８】
機能的なCpf1は、tracrRNAを必要とせず、それ故、crRNAのみが必要とされる。Cpf1は、Cas9よりも小さいだけでなく、より小さいsgRNA分子（Cas9のヌクレオチド数の半分に近い）も有するので、このことによってゲノム編集に利益をもたらす。
【００４９】
Cpf1-crRNA複合体は、Cas9によって標的とされるGリッチPAMとは対照的に、プロトスペーサー隣接モチーフ5'-YTN-3'（式中、「Y」はピリミジンであり、「N」は任意の核酸塩基である）または5'-TTN-3'の同定によって、標的DNAまたはRNAを切断する。PAMの同定後、Cpf1は、4または5ヌクレオチドオーバーハングの付着末端様DNA二本鎖切断を導入する。
【００５０】
CRISPR/Cpf1システムは、Cpf1酵素と、二重らせん上の正しいスポットを発見して複合体を位置付けて標的DNAを切断するガイドRNAとからなる。CRISPR/Cpf1システム活性は、3つの段階を有する：
適応：Cas1およびCas2タンパク質が、小さなDNA断片のCRISPRアレイへの適応を容易にする;
crRNAの形成：Casタンパク質をガイドする成熟crRNAを産生する、プレ-cr-RNAのプロセシング；および
干渉：Cpf1がcrRNAに結合して、二成分複合体を形成し、標的DNA配列を同定および切断する。
【００５１】
Cas9 対 Cpf1
Cas9は、DNAを切断するために2つのRNA分子を必要とする一方で、Cpf1は1つ必要とする。これらタンパク質はまた、DNAを異なる場所で切断し、編集部位を選択する際に研究者により多くの選択肢を提供する。Cas9は、DNA分子において両方の鎖を同じ位置で切断し、「平滑」末端を残す。Cpf1は、一方の鎖を他方よりも長く残し、扱いやすい「付着」末端を生じる。Cpf1は、Cas9と比較して、切断部位に新たな配列をより多く挿入できるようである。CRISPR/Cas9システムは遺伝子を効率的に無効にすることができるが、遺伝子を挿入することもノックインを生成することも困難である。Cpf1は、tracrRNAを欠き、TリッチPAMを利用し、DNAを突出型のDNA DSBを介して切断する。
【００５２】
まとめると、Cpf1システムとCas9システムとの間の重要な違いは、Cpf1が、異なるPAMを認識して、新たな標的可能性を実現すること、Cas9によって産生される平滑末端の代わりに4〜5ntの長い付着末端を生じ、遺伝子挿入の効率およびNHEJまたはHDRの間の特異性を増強すること、ならびに、Cas9切断部位からさらに離れたPAMからさらに離れた標的DNAを切断して、DNAの新たな切断可能性を実現することである。
【００５３】
（表２）Cas9とCpf1の違い
2021511803.tif 000011
【００５４】
他のヌクレアーゼ
いくつかの態様では、ヌクレアーゼは、Cas9またはCpf1ヌクレアーゼである。Cas9ヌクレアーゼおよびCpf1ヌクレアーゼに加え、他のヌクレアーゼを本開示の組成物および方法において使用してもよい。例えば、いくつかの態様では、ヌクレアーゼは、II型、V-A型、V-B型、V-C型、V-U型、VI-B型のヌクレアーゼである。いくつかの態様では、ヌクレアーゼは、Cas9、Cas12a、Cas12b、Cas12c、Tnp-B様、Cas13a（C2c2）、またはCas13bヌクレアーゼである。いくつかの態様では、ヌクレアーゼは、TALヌクレアーゼ、メガヌクレアーゼ、またはジンクフィンガーヌクレアーゼである。
【００５５】
CRISPR媒介性遺伝子編集
CRISPR/Cpf1またはCRISPR/Cas9（または別のヌクレアーゼ）を使用してDMD遺伝子を編集する際の最初の工程は、ゲノム標的配列を同定することである。本開示のgRNAのためのゲノム標的は、ジストロフィン遺伝子内の任意の約24ヌクレオチドのDNA配列であることができるが、但し、その配列がゲノムの残部と比較してユニークであるものとする。いくつかの態様において、ゲノム標的配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51、エクソン45、エクソン44、エクソン53、エクソン46、エクソン52、エクソン50、エクソン43、エクソン6、エクソン7、エクソン8、および/またはエクソン55内の配列に対応する。いくつかの態様において、ゲノム標的配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51、エクソン45、エクソン44、エクソン53、エクソン46、エクソン52、エクソン50、エクソン43、エクソン6、エクソン7、エクソン8、および/またはエクソン55の5’または3’スプライス部位である。いくつかの態様において、ゲノム標的配列は、ヒトジストロフィン遺伝子のエクソン51、エクソン45、エクソン44、エクソン53、エクソン46、エクソン52、エクソン50、エクソン43、エクソン6、エクソン7、エクソン8、および/またはエクソン55のすぐ上流または下流にあるイントロン内の配列に対応する。例示的なゲノム標的配列は表2、6、8、10、12、14、および19に見いだすことができる。
【００５６】
DMD遺伝子を編集する際の次の工程は、標的とする遺伝子領域内の全てのプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）配列を同定することである。標的配列は、PAMのすぐ上流でなければならない。全ての可能なPAM配列および推定標的部位が同定されたら、次の工程は、最も効率的なオンターゲット切断をもたらす可能性の高い部位を選択することである。gRNAターゲティング配列は標的配列と一致することが必要であり、gRNAターゲティング配列はゲノム内の追加の部位と一致してはならない。好ましい態様において、gRNAターゲティング配列は、標的と完全な相同性を有するが、ゲノムの他の場所では相同性を有さない。いくつかの態様において、所与のgRNAターゲティング配列は、ゲノム全体にわたり部分的な相同性が存在する追加の部位を有する。これらの部位は、「オフターゲット」と呼ばれ、gRNAを設計するときに考慮されるべきである。一般に、オフターゲット部位は、PAM配列の近くにミスマッチがある場合は効率的に切断されないので、相同性のないgRNAまたはPAM配列に近いミスマッチを有するものが最も高い特異性を有する。「オフターゲット活性」に加えて、所望の標的配列の切断（「オンターゲット活性」）を最大限にする要因が考慮されなければならない。各々が標的DNAと100％の相同性を有する2つのgRNAターゲティング配列が等価な切断効率をもたらすわけではないことは、当業者に公知である。実際に、切断効率は、選択された標的配列内の具体的なヌクレオチドに応じて増加も減少もし得る。最良のgRNAを設計するために、各々の潜在的なgRNAターゲティング配列の予測オンターゲット活性およびオフターゲット活性の詳細な調査が必要となる。潜在的なPAM配列および標的配列を探し、関連するgRNAをそれらの予測オンターゲット活性およびオフターゲット活性に基づいてランク付けできる、いくつかのgRNA設計プログラムが開発されている（例えば、CRISPRdirect、www.crispr.dbcls.jpで入手可能）。
【００５７】
次の工程は、所望のgRNAを合成およびクローン化することである。ターゲティングオリゴを合成し、アニーリングし、gRNA骨格を含有するプラスミドに標準的な制限-ライゲーションクローニングを使用して挿入することができる。しかしながら、正確なクローニング戦略は、選択されるgRNAベクターに依存する。Cpf1のためのgRNAは、Cas9のためのgRNAと比べ特に単純で、直接反復骨格配列とそれに続く約24ヌクレオチドのガイド配列を含有する単一crRNAからのみなる。
【００５８】
各gRNAは、次いで、1つまたは複数の標的細胞株において検証されるべきである。例えば、Cas9またはCpf1およびgRNAが細胞に送達された後に、ゲノム標的領域を、PCRを使用して増幅し、当業者に公知の方法に従って配列決定してよい。
【００５９】
いくつかの態様において、遺伝子編集は、インビトロで実施してもエクスビボで実施してもよい。いくつかの態様において、インビトロまたはエクスビボで、細胞を、Cas9またはCpf1と、ジストロフィンスプライス部位を標的とするgRNAとに接触させる。いくつかの態様において、細胞を、Cas9またはCpf1およびガイドRNAをコードする1つまたは複数の核酸と接触させる。いくつかの態様において、1つまたは複数の核酸を、細胞に、例えば、リポフェクションまたはエレクトロポレーションを使用して導入する。また、遺伝子編集を接合体で実施してもよい。複数の態様において、接合体に、Cas9またはCpf1およびジストロフィンスプライス部位を標的とするgRNAをコードする1つまたは複数の核酸を注射してよい。その後、接合体を宿主に注射してよい。
【００６０】
複数の態様において、Cas9またはCpf1は、ベクター上に提供される。複数の態様において、ベクターは、S.ピオゲネスに由来するCas9配列（SpCas9、SEQ ID NO. 872）を含有する。複数の態様において、ベクターは、S.アウレウスに由来するCas9配列（SaCas9、SEQ ID NO. 873）を含有する。複数の態様において、ベクターは、ラクノスピラ科細菌に由来するCpf1配列を含有する。例えば、Uniprotアクセッション番号A0A182DWE3; SEQ ID NO.871を参照されたい。複数の態様において、ベクターは、アシダミノコッカス細菌に由来するCpf1配列を含有する。例えば、Uniprotアクセッション番号U2UMQ6; SEQ ID NO.870を参照されたい。いくつかの態様において、Cas9またはCpf1配列は、ヒト細胞またはマウス細胞における発現のためにコドン最適化される。いくつかの態様において、ベクターは、蛍光活性化セルソーティング（FACS）を使用してCas9またはCpf1発現細胞を選別することを可能とするGFPなどの蛍光タンパク質をコードする配列をさらに含有する。いくつかの態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターである。
【００６１】
複数の態様において、gRNAはベクター上に提供される。いくつかの態様において、ベクターは、アデノ随伴ウイルスベクターなどのウイルスベクターである。複数の態様において、Cas9またはCpf1およびガイドRNAは、同じベクター上に提供される。複数の態様において、Cas9またはCpf1およびガイドRNAは、異なるベクター上に提供される。
【００６２】
いくつかの態様において、相同組換え修復を達成するために、細胞を一本鎖DMDオリゴヌクレオチドと追加で接触させる。いくつかの態様において、小さいインデルが、ジストロフィンのタンパク質リーディングフレームを回復させる（「リフレーミング」戦略）。リフレーミング戦略を使用するとき、細胞を単一gRNAと接触させてよい。複数の態様において、スプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位が破壊され、それが、エクソンスキッピングおよびタンパク質リーディングフレームの回復をもたらす（「エクソンスキッピング」戦略）。エクソンスキッピング戦略を使用するとき、細胞を2以上のgRNAと接触させてよい。
【００６３】
インビトロまたはエクスビボのCas9またはCpf1媒介性DNA切断の効率を、T7 E1アッセイなどの当業者に公知の技術を使用して評価してよい。DMD発現の回復を、RT-PCR、ウエスタンブロッティング、および免疫細胞化学などの当業者に公知の技術を使用して確認してよい。
【００６４】
いくつかの態様において、インビトロまたはエクスビボ遺伝子編集は、筋細胞または衛星細胞で実施される。いくつかの態様において、遺伝子編集は、iPSC細胞またはiCM細胞で実施される。複数の態様において、iPSC細胞を遺伝子編集後に分化させる。例えば、iPSC細胞は、編集後に筋細胞または衛星細胞へと分化させ得る。複数の態様において、iPSC細胞を、心筋細胞、骨格筋細胞、または平滑筋細胞へと分化させる。複数の態様において、iPSC細胞を心筋細胞へと分化させる。当業者に公知の方法に従って分化するようにiPSC細胞を誘導し得る。
【００６５】
いくつかの態様において、細胞をCas9またはCpf1およびgRNAと接触させることは、ジストロフィン発現を回復させる。複数の態様において、インビトロもしくはエクスビボで編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、野生型細胞と同程度のジストロフィンタンパク質のレベルを示す。複数の態様において、編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、ジストロフィンを、野生型ジストロフィン発現レベルの50％、60％、70％、80％、90％、95％、またはその間の任意の百分率のレベルで発現する。複数の態様において、インビトロもしくはエクスビボで編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、野生型細胞ものと同程度のミトコンドリア数を有する。複数の態様において、編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、野生型細胞の50％、60％、70％、80％、90％、95％、またはその間の任意の百分率の数のミトコンドリアを有する。複数の態様において、編集された細胞またはそれらに由来する細胞は、ベースラインで非編集細胞と比較して酸素消費率（OCR）の増加を示す。
【００６６】
核酸発現ベクター
上で考察した通り、ある特定の態様において、その後の精製および細胞/対象への送達のため、または遺伝子に基づく送達アプローチで直接使用するため、発現カセットを用いて転写因子産物を発現させる。Cas9またはCpf1およびジストロフィンスプライス部位を標的とする少なくとも1つのDMDガイドRNAをコードする1つまたは複数の核酸を含有する発現ベクターが本明細書に提供される。いくつかの態様において、Cas9またはCpf1をコードする核酸および少なくとも1つのガイドRNAをコードする核酸は、同じベクター上に提供される。さらなる態様において、Cas9またはCpf1をコードする核酸および少なくとも1つのガイドRNAをコードする核酸は、別々のベクター上に提供される。
【００６７】
発現は、ベクター内に適切なシグナルが提供されることを必要とし、このシグナルは、細胞において関心対象の遺伝子の発現を駆動するウイルスおよび哺乳動物の両供給源に由来するエンハンサー/プロモーターなどの様々な調節エレメントを含む。また、宿主細胞におけるメッセンジャーRNAの安定性および翻訳可能性を最適化するように設計されたエレメントも定義される。産物を発現する永続的な安定細胞クローンを樹立するための多数のドミナント薬物選択マーカーの使用条件も提供され、薬物選択マーカーの発現をポリペプチドの発現と関連付けるエレメントも提供される。
【００６８】
本出願全体を通して、「発現カセット」という用語は、核酸コード配列の一部または全てが転写および翻訳されることができる、すなわち、プロモーターの制御下にある、遺伝子産物をコードする核酸を含有する任意のタイプの遺伝子構築物を含むことを意味する。「プロモーター」は、遺伝子の特異的な転写を開始するために必要とされる、細胞の合成機構または導入された合成機構によって認識されるDNA配列を指す。「転写制御下」という語句は、プロモーターが、RNAポリメラーゼ開始および遺伝子の発現を制御するため、核酸に対して正確な位置および方向にあることを意味する。「発現ベクター」は、複製可能な遺伝子構築物に含まれており、したがって、複製起点、転写終結シグナル、ポリA領域、選択可能マーカー、および多目的クローニング部位の1つまたは複数を含む、発現カセットを含むことを意味する。
【００６９】
調節エレメント
プロモーターという用語は、RNAポリメラーゼIIのための開始部位の周辺に密集した転写制御モジュールの一群を指すために本明細書において使用される。どのようにプロモーターが組織化されるかについての考えの大部分は、HSVチミジンキナーゼ（tk）およびSV40初期転写単位のためのものを含む、いくつかのウイルスプロモーターの分析に由来する。より最近の研究によって拡大されたこれらの研究は、プロモーターが個別の機能的モジュールから構成されることを示しており、機能的モジュールは各々、およそ7〜20bpのDNAからなり、転写活性化タンパク質または抑制タンパク質のための1つまたは複数の認識部位を含有している。
【００７０】
各プロモーター内の少なくとも1つのモジュールは、RNA合成のための開始部位を位置付けるように機能する。これの最もよく知られている例は、TATAボックスであるが、哺乳動物末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ遺伝子のためのプロモーターおよびSV40後期遺伝子のためのプロモーターなどのTATAボックスを欠くいくつかのプロモーターにおいては、開始部位自体を覆う個別エレメントが、開始の場所を固定するのを助ける。
【００７１】
RNAポリメラーゼおよびPol IIIプロモーター
真核生物では、RNAポリメラーゼIII（Pol IIIとも呼ばれる）は、DNAを転写して、リボソーム5S rRNA、tRNAおよび他の低分子RNAを合成する。RNA Pol IIIによって転写される遺伝子は、「ハウスキーピング」遺伝子のカテゴリーに分類され、その発現は、すべての細胞タイプおよびほとんどの環境条件において必要とされる。それゆえ、Pol III転写の調節は主に、細胞成長の調節および細胞サイクルに関わっており、したがって、RNAポリメラーゼIIよりも少ない調節タンパク質しか必要としない。しかしながら、ストレス条件下では、タンパク質Maf1は、Pol III活性を抑制する。
【００７２】
転写プロセス（任意のポリメラーゼによる）では、3つの主要な段階がある：（i）開始、遺伝子のプロモーター上にRNAポリメラーゼ複合体の構築を必要とする；（ii）伸長、RNA転写物の合成；ならびに（iii）終結、RNA転写の終了およびRNAポリメラーゼ複合体の分解。
【００７３】
RNA Pol IIIの制御下にあるプロモーターは、リボソーム5S rRNA、tRNAおよび数種の他の低分子RNA、例えば、U6スプライセオソームRNA、RNase PおよびRNase MRP RNA、7SL RNA（シグナル認識粒子のRNA成分）、Vault RNA、Y RNA、SINE（短鎖散在反復配列）、7SK RNA、2つのマイクロRNA、数種の核小体低分子RNA、および数種の調節アンチセンスRNAについてのプロモーターを含む。
【００７４】
追加的なプロモーターおよびエレメント
いくつかの態様において、本開示のCas9またはCpf1構築物は、筋細胞特異的プロモーターによって発現される。この筋細胞特異的プロモーターは、構成的に活性なプロモーターであっても、誘導性プロモーターであってもよい。
【００７５】
追加のプロモーターエレメントは、転写開始の頻度を調節する。典型的には、これらは開始部位の30〜110bp上流の領域に位置するが、多数のプロモーターが開始部位の下流にも機能的エレメントを含有していることが最近になって示された。エレメントが反転したり互い相対的に移動したりするときにもプロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメント間の間隔はフレキシブルであることが多い。tkプロモーターでは、プロモーターエレメント間の間隔を50bp間隔にまで増加させることができ、そこからは活性が減退し始める。プロモーターに依存して、個々のエレメントは、協同的にまたは独立に機能して転写を活性化できるようである。
【００７６】
ある特定の態様において、ヒトサイトメガロウイルス（CMV）前初期遺伝子プロモーター、SV40初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルス長末端反復、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼなどのウイルスプロモーターを、関心対象のコード配列の高レベルの発現を得るために使用できる。発現のレベルが所与の目的に十分であるという条件で、関心対象のコード配列の発現を達成するための、当技術分野において周知である他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージのプロモーターの使用も同じく想定される。周知の特性を有するプロモーターを用いることによって、トランスフェクションまたは形質転換の後の関心対象のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを最適化することができる。さらに、特定の生理学的シグナルに応答して調節されるプロモーターを選択することにより、遺伝子産物の誘導性発現が可能となる。
【００７７】
エンハンサーは、同じDNA分子上の遠位に位置するプロモーターからの転写を増加させる遺伝エレメントである。エンハンサーは、プロモーターと同様に組織化される。すなわち、それらは、各々が1つまたは複数の転写タンパク質と結合する多くの個々のエレメントから構成される。エンハンサーとプロモーターとの間の基本的な差異は、機能性である。エンハンサー領域は全体として離れて転写を刺激することができなければならない；このことは、プロモーター領域またはその成分エレメントには当てはまる必要がない。その一方で、プロモーターは、特定の部位において特定の方向でRNA合成の開始を指令する1つまたは複数のエレメントを有しなければならないが、エンハンサーはこれらの特異性を欠いている。プロモーターおよびエンハンサーは、重複しかつ連続していることが多く、極めて類似したモジュール機構を有することが多いと見られる。
【００７８】
以下は、発現構築物において関心対象の遺伝子をコードする核酸と組み合わせて使用できるプロモーター/エンハンサーおよび誘導性プロモーター/エンハンサーの一覧である。加えて、あらゆるプロモーター/エンハンサー組み合わせ（Eukaryotic Promoter Data Base EPDBによる）を遺伝子の発現を駆動するために使用することもできる。真核細胞は、送達複合体の一部としてまたは追加の遺伝子発現構築物として適切な細菌ポリメラーゼが提供されれば、ある特定の細菌プロモーターからの細胞質転写を支援することができる。
【００７９】
プロモーターおよび/またはエンハンサーは、例えば、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、T細胞受容体、HLA DQ aおよび/またはDQ β、β-インターフェロン、インターロイキン-2、インターロイキン-2受容体、MHCクラスII 5、MHCクラスII HLA-Dra、β-アクチン、筋肉クレアチンキナーゼ（MCK）、プレアルブミン（トランスサイレチン）、エラスターゼI、メタロチオネイン（MTII）、コラゲナーゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン、t-グロビン、β-グロビン、c-fos、c-HA-ras、インスリン、神経細胞接着分子（NCAM）、α1-アンチトリパイン（antitrypain）、H2B（TH2B）ヒストン、マウスおよび/またはI型コラーゲン、グルコース調節タンパク質（GRP94およびGRP78）、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイドA（SAA）、トロポニンI（TN I）、血小板由来成長因子（PDGF）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、SV40、ポリオーマ、レトロウイルス、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、ならびにテナガザル白血病ウイルスであってよい。
【００８０】
いくつかの態様において、誘導性エレメントを使用してよい。いくつかの態様において、誘導性エレメントは、例えば、MTII、MMTV（マウス乳腺腫瘍ウイルス）、β-インターフェロン、アデノウイルス5 E2、コラゲナーゼ、ストロメリシン、SV40、ネズミ科MX遺伝子、GRP78遺伝子、α-2-マクログロブリン、ビメンチン、MHCクラスI遺伝子H-2κb、HSP70、プロリフェリン、腫瘍壊死因子、および/または甲状腺刺激ホルモンα遺伝子である。いくつかの態様において、誘導因子は、ホルボールエステル（TFA）、重金属、糖質コルチコイド、ポリ（rI）x、ポリ（rc）、ElA、ホルボールエステル（TPA）、インターフェロン、ニューカッスル病ウイルス、A23187、IL-6、血清、インターフェロン、SV40巨大T抗原、PMA、および/または甲状腺ホルモンである。本明細書に記載の誘導性エレメントのいずれかを本明細書に記載の誘導因子のいずれかと共に使用してよい。
【００８１】
特に興味深いものは、筋肉特異的プロモーターである。これらは、ミオシン軽鎖-2プロモーター、α-アクチンプロモーター、トロポニン1プロモーター；Na+/Ca2+交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、α7インテグリンプロモーター、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーターおよびαB-クリスタリン/低分子量熱ショックタンパク質プロモーター、α-ミオシン重鎖プロモーター、ならびにANFプロモーターを含む。いくつかの態様において、筋肉特異的プロモーターは、CK8プロモーターである。CK8プロモーターは、次の配列（SEQ ID NO.874）を有する。
2021511803.tif 000012
【００８２】
いくつかの態様において、筋細胞特異的プロモーターは、CK8eと呼ばれる、CK8プロモーターのバリアントである。CK8eプロモーターは、次の配列（SEQ ID NO.875）を有する。
2021511803.tif 000013
【００８３】
cDNAインサートが用いられる場合、典型的には、遺伝子転写物の適正なポリアデニル化を達成するため、ポリアデニル化シグナルを含めることが望ましい。ヒト成長ホルモンおよびSV40ポリアデニル化シグナルなどの任意のポリアデニル化配列を用いてよい。また、ターミネーターも発現カセットのエレメントとして想定される。これらのエレメントは、メッセージレベルを増強し、カセットから他の配列へのリードスルーを最小限に抑えるために役立つことができる。
【００８４】
治療用組成物
AAV-Cas9ベクター
いくつかの態様では、Cas9が、AAVベクターにパッケージングされ得る。いくつかの態様では、AAVベクターは、野生型AAVベクターである。いくつかの態様では、AAVベクターは、1つまたは複数の変異を含有する。いくつかの態様では、AAVベクターは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、およびヒツジAAVまたはそれらの任意の組み合わせのAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来する。
【００８５】
例示的なAAV-Cas9ベクターは、Cas9配列を含む中央配列領域に隣接する2つのITR（逆位末端リピート）配列を含有する。いくつかの態様では、ITRは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、およびヒツジAAVまたはそれらの任意の組み合わせのAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来する。いくつかの態様では、ITRは、あるAAV血清型についての完全長および／または野生型配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、ITRは、あるAAV血清型についての短縮配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、ITRは、あるAAV血清型についての伸長配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、ITRは、同じAAV血清型についての野生型配列と比較して配列バリエーションを含む配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、配列バリエーションは、置換、欠失、挿入、逆位、または転位の1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、ITRは、少なくとも100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149または150個の塩基対を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、ITRは、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149または150個の塩基対を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、ITRは、110±10個の塩基対長を有する。いくつかの態様では、ITRは、120±10個の塩基対長を有する。いくつかの態様では、ITRは、130±10個の塩基対長を有する。いくつかの態様では、ITRは、140±10個の塩基対長を有する。いくつかの態様では、ITRは、150±10個の塩基対長を有する。いくつかの態様では、ITRは、115、145、または141個の塩基対長を有する。
【００８６】
いくつかの態様では、AAV-Cas9ベクターは、1つまたは複数の核局在化シグナル（NLS）を含有し得る。いくつかの態様では、AAV-Cas9ベクターは、1、2、3、4、または5つの核局在化シグナルを含有する。例示的なNLSは、c-myc NLS（SEQ ID NO：884）、SV40 NLS（SEQ ID NO：885）、hnRNPAI M9 NLS（SEQ ID NO：886）、ヌクレオプラスミンNLS（SEQ ID NO：887）、インポーチン-アルファ由来のIBBドメインの配列
2021511803.tif 000014
、筋腫Tタンパク質の配列VSRKRPRP（SEQ ID NO：889）およびPPKKARED（SEQ ID NO：890）、ヒトp53の配列PQPKKKPL（SEQ ID NO：891）、マウスc-abl IVの配列SALIKKKKKMAP（SEQ ID NO：892）、インフルエンザウイルスNS1の配列DRLRR（SEQ ID NO：893）およびKQKKRK（SEQ ID NO：894）、肝炎ウイルスデルタ抗原の配列RKLKKKIKKL（SEQ ID NO：895）ならびにマウスMx1タンパク質の配列REKKKFLKRR（SEQ ID NO：896）を含む。さらなる許容される核局在化シグナルは、ヒトポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼの配列
2021511803.tif 000015
またはステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列
2021511803.tif 000016
などの二分核定位配列を含む。
【００８７】
いくつかの態様では、AAV-Cas9ベクターは、ベクターのパッケージングおよびCas9の発現を容易にする追加のエレメントを含み得る。いくつかの態様では、AAV-Cas9ベクターは、ポリA配列を含み得る。いくつかの態様では、ポリA配列は、ミニ−ポリA配列であり得る。いくつかの態様では、AAV-Cas9ベクターは、転移エレメントを含み得る。いくつかの態様では、AAV-Cas9ベクターは、調節エレメントを含み得る。いくつかの態様では、調節エレメントは、アクチベーターまたはリプレッサーである。
【００８８】
いくつかの態様では、AAV-Cas9は、1つまたは複数のプロモーターを含有し得る。いくつかの態様では、1つまたは複数のプロモーターは、Cas9の発現を駆動する。いくつかの態様では、1つまたは複数のプロモーターは、筋肉特異的プロモーターである。例示的な筋肉特異的プロモーターは、ミオシン軽鎖−2プロモーター、α−アクチンプロモーター、トロポニン1プロモーター、Na＋/Ca2＋交換体プロモーター、ジストロフィンプロモーター、α7インテグリンプロモーター、脳性ナトリウム利尿ペプチドプロモーター、αB−クリスタリン／低分子熱ショックタンパク質プロモーター、α−ミオシン重鎖プロモーター、ANFプロモーター、CK8プロモーターおよびCK8eプロモーターを含む。
【００８９】
いくつかの態様では、AAV-Cas9ベクターは、酵母、細菌、昆虫細胞、または哺乳動物細胞において産生するために最適化され得る。いくつかの態様では、AAV-Cas9ベクターは、ヒト細胞において発現するために最適化され得る。いくつかの態様では、AAV-Cas9ベクターは、バキュロウイルス発現系において発現するために最適化され得る。
【００９０】
AAV-sgRNAベクター
いくつかの態様では、少なくともgRNAをコードする第一配列およびgRNAをコードする第二配列が、AAVベクターにパッケージングされ得る。いくつかの態様では、少なくともgRNAをコードする第一配列、gRNAをコードする第二配列、およびgRNAをコードする第三配列が、AAVベクターにパッケージングされ得る。いくつかの態様では、少なくともgRNAをコードする第一配列、gRNAをコードする第二配列、gRNAをコードする第三配列、およびgRNAをコードする第四配列が、AAVベクターにパッケージングされ得る。いくつかの態様では、少なくともgRNAをコードする第一配列、gRNAをコードする第二配列、gRNAをコードする第三配列、gRNAをコードする第四配列、およびgRNAをコードする第五配列が、AAVベクターにパッケージングされ得る。いくつかの態様では、gRNAをコードする複数の配列が、AAVベクターにパッケージングされる。例えば、gRNAをコードする、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個の配列が、AAVベクターにパッケージングされ得る。いくつかの態様では、gRNAをコードする各配列は、異なる。いくつかの態様では、gRNAをコードする配列の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、または20個は、同じである。いくつかの態様では、gRNAをコードする配列のすべてが同じである。
【００９１】
いくつかの態様では、AAVベクターは、野生型AAVベクターである。いくつかの態様では、AAVベクターは、1つまたは複数の変異を含有する。いくつかの態様では、AAVベクターは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、およびヒツジAAVまたはそれらの任意の組み合わせのAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来する。
【００９２】
例示的なAAV-sgRNAベクターは、sgRNA配列を含む中央配列領域に隣接する2つのITR（逆位末端リピート）配列を含有する。いくつかの態様では、ITRは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、およびヒツジAAVまたはそれらの任意の組み合わせのAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来する。いくつかの態様では、ITRは、第一血清型のAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来し、そして、AAV-sgRNAベクターのカプシドタンパク質をコードする配列は、第二血清型のAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来する。いくつかの態様では、第一血清型および第二血清型は、同じである。いくつかの態様では、第一血清型および第二血清型は、同じではない。いくつかの態様では、第一血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、およびヒツジAAVである。いくつかの態様では、第二血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、およびヒツジAAVである。いくつかの態様では、第一血清型は、AAV2であり、第二血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、およびヒツジAAVである。いくつかの態様では、第一血清型は、AAV2であり、第二血清型は、AAV9である。
【００９３】
いくつかの態様では、第一ITRは、第一血清型のAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来し、第二ITRは、第二血清型のAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来し、そして、AAV-sgRNAベクターのカプシドタンパク質をコードする配列は、第三血清型のAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来する。いくつかの態様では、第一血清型および第二血清型は、同じである。いくつかの態様では、第一血清型および第二血清型は、同じではない。いくつかの態様では、第一血清型、第二血清型、および第三血清型は、同じである。いくつかの態様では、第一血清型、第二血清型、および第三血清型は、同じではない。いくつかの態様では、第一血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、またはヒツジAAVである。いくつかの態様では、第二血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、またはヒツジAAVである。いくつかの態様では、第三血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、またはヒツジAAVである。いくつかの態様では、第一血清型は、AAV2であり、第二血清型は、AAV4であり、第三血清型は、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、またはAAV11である。いくつかの態様では、第一血清型は、AAV2であり、第二血清型は、AAV4であり、第三血清型は、AAV9である。例示的なAAV-sgRNAベクターは、sgRNA配列を含む中央配列領域に隣接する2つのITR（逆位末端リピート）配列を含有する。いくつかの態様では、ITRは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、ヒツジAAVまたはそれらの任意の組み合わせのAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来する。いくつかの態様では、ITRは、あるAAV血清型についての完全長および／または野生型配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、ITRは、あるAAV血清型についての短縮配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、ITRは、あるAAV血清型についての伸長配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、ITRは、同じAAV血清型についての野生型配列と比較して配列バリエーションを含む配列を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、配列バリエーションは、置換、欠失、挿入、逆位、または転位の1つまたは複数を含む。いくつかの態様では、ITRは、少なくとも100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149または150個の塩基対を含むかまたはそれからなる。いくつかの態様では、ITRは、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149または150個の塩基対を含むかまたは��れからなる。いくつかの態様では、ITRは、110±10個の塩基対長を有する。いくつかの態様では、ITRは、120±10個の塩基対長を有する。いくつかの態様では、ITRは、130±10個の塩基対長を有する。いくつかの態様では、ITRは、140±10個の塩基対長を有する。いくつかの態様では、ITRは、150±10個の塩基対長を有する。いくつかの態様では、ITRは、115、145、または141個の塩基対長を有する。
【００９４】
いくつかの態様では、AAV-sgRNAベクターは、ベクターのパッケージングおよびsgRNAの発現を容易にする追加のエレメントを含み得る。いくつかの態様では、AAV-sgRNAベクターは、転移エレメントを含み得る。いくつかの態様では、AAV-sgRNAベクターは、調節エレメントを含み得る。いくつかの態様では、調節エレメントは、アクチベーターまたはリプレッサーを含む。いくつかの態様では、AAV-sgRNA配列は、非機能的配列または「スタッファー」配列を含み得る。本開示の例示的なスタッファー配列は、哺乳動物（ヒトを含む）のゲノム配列に対していくらかの（ゼロパーセントではない）同一性または相同性を有し得る。あるいは、本開示の例示的なスタッファー配列は、哺乳動物（ヒトを含む）のゲノム配列に対して同一性または相同性を有し得ない。本開示の例示的なスタッファー配列は、天然に存在する非コーディング配列またはAAVベクターの対象への投与後に転写も翻訳もされない配列を含み得るかまたはそれからなり得る。
【００９５】
いくつかの態様では、AAV-sgRNAベクターは、酵母、細菌、昆虫細胞、または哺乳動物細胞において産生するために最適化され得る。いくつかの態様では、AAV-sgRNAベクターは、ヒト細胞において発現するために最適化され得る。いくつかの態様では、AAV-Cas9ベクターは、バキュロウイルス発現系において発現するために最適化され得る。
【００９６】
いくつかの態様では、AAV-sgRNAベクターは、少なくとも1つのプロモーターを含む。いくつかの態様では、AAV-sgRNAベクターは、少なくとも2つのプロモーターを含む。いくつかの態様では、AAV-sgRNAベクターは、少なくとも3つのプロモーターを含む。いくつかの態様では、AAV-sgRNAベクターは、少なくとも4つのプロモーターを含む。いくつかの態様では、AAV-sgRNAベクターは、少なくとも5つのプロモーターを含む。例示的なプロモーターは、例えば、免疫グロブリン軽鎖、免疫グロブリン重鎖、T-細胞受容体、HLA DQ aおよび／またはDQβ、β-インターフェロン、インターロイキン-2、インターロイキン-2受容体、MHCクラスII 5、MHCクラスII HLA-Dra、β-アクチン、筋肉クレアチンキナーゼ（MCK）、プレアルブミン（トランスチレチン）、エラスターゼI、メタロチオネイン（MTII）、コラゲナーゼ、アルブミン、α-フェトタンパク質、t-グロビン、β-グロビン、c-fos、c-HA-ras、インスリン、神経細胞接着分子（NCAM）、α1-アンチトリパイン（antitrypain）、H2B（TH2B）ヒストン、マウスおよび／またはI型コラーゲン、グルコース調節タンパク質（GRP94およびGRP78）、ラット成長ホルモン、ヒト血清アミロイドA（SAA）、トロポニンI（TN I）、血小板由来成長因子（PDGF）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、SV40、ポリオーマ、レトロウイルス、パピローマウイルス、B型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、サイトメガロウイルス（CMV）、およびテナガザル白血病ウイルスを含む。さらなる例示的なプロモーターは、U6プロモーター、H1プロモーター、および7SKプロモーターを含む。
【００９７】
いくつかの態様では、gRNAをコードする配列またはゲノム標的配列は、SEQ ID NO：60〜705、712〜862、および947〜2377から選択される配列を含む。
【００９８】
薬学的組成物および送達法
また、本開示の1つまたは複数のベクターおよび／または核酸を含む組成物が本明細書に提供される。いくつかの態様では、組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含む。
【００９９】
臨床適用のために、薬学的組成物が、意図する適用に適した形態で調製される。一般に、これは、発熱性物質およびヒトまたは動物にとって有害であり得る他の不純物を本質的に含まない組成物を調製することを要する。
【０１００】
薬物、タンパク質、または送達ベクターを安定化し、標的細胞による取り込みを可能にするため、適切な塩および緩衝液が使用される。本開示の水性組成物は、薬学的に許容される担体または水性媒体に溶解または分散された有効量の薬物、ベクター、またはタンパク質を含む。「薬学的にまたは薬理学的に許容される」という語句は、動物またはヒトに投与されたときに有害反応、アレルギー反応、または他の不都合な反応を生じない分子実体および組成物を指す。本明細書において使用される場合、「薬学的に許容される担体」は、ヒトへの投与に適した医薬などの医薬の製剤化において使用するために許容される、溶媒、緩衝液、溶液、分散媒、コーティング剤、抗菌および抗真菌剤、等張および吸収遅延剤などを含む。薬学的に活性な物質のためのそのような媒体および作用物質の使用は、当技術分野において周知である。治療用組成物における使用において、本開示の活性成分と非適合性でないあらゆる慣用の媒体または作用物質を使用してよい。組成物のベクターまたは細胞を不活化しない条件で、補足的な活性成分を組成物に組み込むこともできる。
【０１０１】
いくつかの態様において、本開示の活性組成物は、従来の薬学的調製物を含み得る。本開示に係るこれらの組成物の投与は、標的組織が任意の一般的な経路を介して利用可能である限り、その経路を介するものであってよいが、一般には全身投与を含む。これは、経口、経鼻、または経頬を含む。あるいは、投与は、皮内注射、皮下注射、筋肉内注射、腹腔内注射、もしくは静脈内注射によっても、筋組織への直接注射によってもよい。前述のように、そのような組成物は、通常、薬学的に許容される組成物として投与されるであろう。
【０１０２】
活性化合物は、非経口投与されても腹腔内投与されてもよい。例として、遊離塩基または薬理学的に許容される塩としての活性化合物の溶液を、ヒドロキシプロピルセルロースなどの界面活性剤と適切に混合された水中で調製することができる。グリセロール、液体ポリエチレングリコール、およびそれらの混合物中で、ならびに油中で、分散液を調製することもできる。通常の保管および使用条件下で、これらの調製物は、一般に、微生物の増殖を防止するための保存剤を含有する。
【０１０３】
注射可能な使用に適した薬学的形態は、例えば、無菌の水性の溶液または分散液、および無菌の注射可能な溶液または分散液の即時調製のための無菌の粉末を含む。一般に、これらの調製物は、無菌であり、容易な注射可能性が存在する程度に流動性である。調製物は、製造および保管条件下で安定であるべきであり、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護されるべきである。適切な溶媒または分散媒は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、および液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、および植物油を含有してよい。適正な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング剤の使用によって、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含めることが好ましい。注射可能組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンを組成物中に使用することによってもたらされ得る。
【０１０４】
無菌の注射可能溶液は、活性化合物を適切な量で、所望により任意の他の成分（例えば、上に列挙した通り）と共に、溶媒に組み込み、続いて、濾過減菌することによって調製してよい。一般に、分散液は、例えば上に列挙した通りの基本的な分散媒および所望の他の成分を含有する無菌の媒体に、様々な滅菌された活性成分を組み込むことによって調製される。無菌の注射可能溶液の調製のための無菌の粉末の場合、好ましい調製の方法は、事前に滅菌濾過された溶液から活性成分と任意の追加の所望の成分との粉末を与える、真空乾燥および凍結乾燥の技術を含む。
【０１０５】
いくつかの態様において、本開示の組成物は、中性または塩の形態で製剤化される。薬学的に許容される塩は、例えば、無機酸（例えば、塩酸もしくはリン酸）からまたは有機酸（例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、マンデル酸など）から得られる、酸付加塩（タンパク質の遊離アミノ基と形成される）を含む。また、タンパク質の遊離カルボキシル基と形成される塩を、無機塩基（例えば、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、もしくは水酸化鉄）からまたは有機塩基（例えば、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ヒスチジン、プロカインなど）から得ることもできる。
【０１０６】
製剤化の後、溶液は、好ましくは、投薬製剤と適合性の様式で、かつ、治療的に有効であるような量で投与される。製剤は、注射可能溶液、薬物放出カプセルなどのような種々の剤形で容易に投与してよい。水性溶液での非経口投与のために、例えば、溶液は、一般に、適切に緩衝され、最初に、液体希釈剤が、例えば、十分な生理食塩水またはグルコースで等張にされる。そのような水性溶液を、例えば、静脈内、筋肉内、皮下、および腹腔内投与に使用してよい。好ましくは、特に本開示に照らして、当業者に公知であるような無菌の水性媒体が用いられる。例として、単一用量を、等張NaCl溶液1mlに溶解し、皮下注入液1000mlに添加しても、提案された注入部位に注射してもよい（例えば、"Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, pages 1035-1038 and 1570-1580を参照のこと）。処置される対象の状態に応じて、投薬量のある程度の変動が必然的に起こる。いずれにしても、投与責任者が、個々の対象のための適切な用量を決める。さらに、ヒトへの投与のために、調製物は、FDA Office of Biologics standardsによって必要とされるような無菌性、発熱性、一般的安全性、および純度の基準を満たすべきである。
【０１０７】
いくつかの態様において、本明細書に記載のCas9またはCpf1およびgRNAを、養子細胞移入（ACT）を使用して患者に送達してよい。養子細胞移入では、1つまたは複数の発現構築物が、患者を起源とする細胞（自己由来）または患者以外の1つまたは複数の個体を起源とする細胞（同種異系）にエクスビボで提供される。細胞は、その後、患者に導入されるかまたは再導入される。したがって、いくつかの態様において、Cas9またはCpf1およびジストロフィンスプライス部位を標的とするガイドRNAをコードする1つまたは複数の核酸が、細胞が患者に導入されるかまたは再導入される前に、細胞にエクスビボで提供される。
【０１０８】
細胞および細胞組成物
また、本開示の1つまたは複数の核酸を含む細胞が提供される。いくつかの態様では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様では、細胞は、筋細胞または衛星細胞である。いくつかの態様では、細胞は、人工多能性幹（iPS）細胞である。いくつかの態様では、細胞は、心筋細胞である。いくつかの態様では、細胞（例えば、心筋細胞）は、iPS細胞に由来する。
【０１０９】
また、本開示の1つまたは複数のベクターを含む組成物を含む細胞が提供される。いくつかの態様では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様では、細胞は、筋細胞または衛星細胞である。いくつかの態様では、細胞は、人工多能性幹（iPS）細胞である。いくつかの態様では、細胞は、心筋細胞である。いくつかの態様では、細胞（例えば、心筋細胞）は、iPS細胞に由来する。
【０１１０】
また、本開示の1つまたは複数の方法によって産生される細胞が提供される。いくつかの態様では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様では、細胞は、筋細胞または衛星細胞である。いくつかの態様では、細胞は、人工多能性幹（iPS）細胞である。いくつかの態様では、細胞は、心筋細胞である。いくつかの態様では、細胞（例えば、心筋細胞）は、iPS細胞に由来する。
【０１１１】
また、本開示の1つまたは複数の核酸を含む細胞を含む組成物が提供される。いくつかの態様では、組成物はさらに、薬学的に許容される担体を含む。
【０１１２】
治療的方法および使用
本開示はまた、細胞における変異体ジストロフィン遺伝子などのジストロフィン遺伝子を編集するための方法を提供する。いくつかの態様では、細胞は、ヒト細胞である。いくつかの態様では、細胞は、筋細胞または衛星細胞である。いくつかの態様では、細胞は、人工多能性幹（iPS）細胞である。いくつかの態様では、細胞は、心筋細胞である。いくつかの態様では、細胞（例えば、心筋細胞）は、iPS細胞に由来する。
【０１１３】
いくつかの態様では、本開示は、心筋細胞における変異体ジストロフィン遺伝子を編集するための方法であって、Cas9ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼをコードする配列、およびジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNAまたはgRNAをコードする配列に、心筋細胞を接触させる段階を含む、方法を提供する。変異体ジストロフィン遺伝子は、点変異（例えば、偽エクソン変異）、欠失、および／または重複変異などの、1つまたは複数の変異を含み得る。欠失は、少なくとも20、少なくとも50、少なくとも100、少なくとも500、少なくとも1000、少なくとも3000ヌクレオチド、少なくとも5000ヌクレオチドまたは少なくとも10,000ヌクレオチドの欠失であり得る。いくつかの態様では、欠失は、1つもしくは複数のエクソン、1つもしくは複数のイントロン、または1つのイントロンおよび1つのエクソンの少なくとも一部の欠失を含む。
【０１１４】
いくつかの態様では、本開示は、Cas9ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼをコードする配列、およびジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNAまたはgRNAをコードする配列を、対象に投与する段階であって、該投与によって、対象の心筋細胞の少なくとも10％においてジストロフィン発現が回復する、段階を含む、その必要のある対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を治療または予防するための方法を提供する。いくつかの態様では、投与によって、対象の心筋細胞の少なくとも20％、少なくとも30％、少なくとも40％、少なくとも50％、少なくとも60％、少なくとも70％、少なくとも80％、少なくとも90％、または少なくとも95％においてジストロフィン発現が回復する。平均でヒトの心臓は、およそ20〜30億の心筋細胞を有する。したがって、いくつかの態様では、投与によって、少なくとも2×108、少なくとも3×108、少なくとも4×108、少なくとも5×108、少なくとも6×108、少なくとも7×108、少なくとも8×108、少なくとも9×108、少なくとも10×108、少なくとも11×108、少なくとも12×108、少なくとも13×108、少なくとも14×108、少なくとも15×108、少なくとも16×108、少なくとも17×108、少なくとも18×108、少なくとも19×108、少なくとも20×108、少なくとも21×108、少なくとも22×108、少なくとも23×108、少なくとも24×108、少なくとも25×108、少なくとも26×108、少なくとも27×108、少なくとも28×108、少なくとも29×108、少なくとも30×108の対象の心筋細胞においてジストロフィン発現が回復する。いくつかの態様では、対象は、拡張型心筋症を患っている。いくつかの態様では、投与によって、心収縮性が少なくとも部分的に救済されるか、または心収縮性が完全に救済される。
【０１１５】
いくつかの態様では、その必要のある対象におけるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）を治療または予防するための方法であって、Cas9ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼをコードする配列、およびジストロフィン遺伝子のスプライスドナー部位もしくはスプライスアクセプター部位を標的とするgRNAまたはgRNAをコードする配列に、人工多能性幹細胞（iPSC）を接触させる段階;iPSCを心筋細胞へと分化させる段階;ならびに心筋細胞を対象に投与する段階を含む、方法が提供される。いくつかの態様では、少なくとも1×103、少なくとも1×104、少なくとも1×105、少なくとも1×106、少なくとも1×107または少なくとも1×108の心筋細胞が患者に投与される。
【０１１６】
gRNAは、例えば、心筋細胞ジストロフィン遺伝子のエクソン51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8、または55のスプライスドナー部位またはスプライスアクセプター部位を標的とし得る。いくつかの態様では、gRNAまたはゲノムターゲティング配列は、SEQ ID NO：60〜705、712〜862、947〜2377のいずれか1つの配列を有する。Cas9ヌクレアーゼは、例えば、S.ピオゲネスのcas9（spCas9）またはS.アウレウスのcas9（saCas9）から単離されるかまたはそれに由来し得る。
【０１１７】
いくつかの態様では、gRNAまたはgRNAをコードする配列を含むベクターが、心筋細胞と接触される。ベクターは、例えば、プラスミドまたはナノ粒子などの非ウイルスベクターであり得る。いくつかの態様では、ベクターは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターなどのウイルスベクターであり得る。いくつかの態様では、AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、およびヒツジAAVから選択される。
【０１１８】
いくつかの態様では、Cas9ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼをコードする配列およびgRNAまたはgRNAをコードする配列を含む単一ベクターが、心筋細胞と接触される。他の態様では、Cas9ヌクレアーゼまたはCas9ヌクレアーゼをコードする配列を含む第一ベクター、およびgRNAまたはgRNAをコードする配列を含む第二ベクターが、心筋細胞と接触される。第一および第二のベクターは、同じであっても異なっていてもよい。例えば、第一ベクターおよび第二ベクターが共に、AAVであってもよいし、第一ベクターがAAVであって、第二ベクターがプラスミドであってもよい。
【０１１９】
また、ジストロフィン欠陥を修正するための方法であって、細胞と本開示の1つまたは複数の組成物とを、ガイドRNA、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適した条件下で接触させる段階を含み、ガイドRNAが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのガイドRNA-Cas9複合体を形成し、少なくとも1つのガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を分断し、DMDエクソンの選択的スキッピングおよび／または再構成を誘導する、方法が提供される。いくつかの態様では、少なくとも1つのガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を分断し、ジストロフィンリーディングフレームの再構成を誘導する。いくつかの態様では、少なくとも1つのガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を分断し、ジストロフィンタンパク質リーディングフレームを回復する挿入をもたらす。いくつかの態様では、挿入は、単一アデノシンの挿入を含む。
【０１２０】
また、DMDエクソンの選択的スキッピングおよび／または再構成を誘導するための方法であって、細胞と本開示の1つまたは複数の組成物とを、ガイドRNAおよびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適した条件下で接触させる段階を含み、ガイドRNAおよび第二ガイドRNAが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのガイドRNA-Cas9複合体を形成し、少なくとも1つのガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を分断し、DMDエクソンの選択的スキッピングおよび／または再構成を誘導する、方法が提供される。
【０１２１】
また、ジストロフィンリーディングフレームにおいて再構成事象を誘導するための方法であって、細胞と本開示の1つまたは複数の組成物とを、ガイドRNAおよびCas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインの発現に適した条件下で接触させる段階を含み、ガイドRNAが、Cas9タンパク質またはそのヌクレアーゼドメインと複合体を形成して、少なくとも1つのガイドRNA-Cas9複合体を形成し、ガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を分断し、DMDエクソンの選択的スキッピングおよび／または再構成を誘導する、方法が提供される。いくつかの態様では、少なくとも1つのガイドRNA-Cas9複合体が、ジストロフィンスプライス部位を分断し、ヒトDMD遺伝子のエクソン51の選択的スキッピングおよび／または再構成を誘導する。
【０１２２】
また、その必要のある対象における筋ジストロフィーを治療または予防する方法であって、治療有効量の本開示の1つまたは複数の組成物を対象に投与する段階を含む方法が提供される。いくつかの態様では、組成物は、局所投与される。いくつかの態様では、組成物は、筋組織に直接投与される。いくつかの態様では、組成物は、筋肉内注入または注射によって投与される。いくつかの態様では、筋組織は、前脛骨筋組織、四頭筋組織、ヒラメ筋組織、隔膜組織、または心組織を含む。いくつかの態様では、組成物は、心腔内注射によって投与される。いくつかの態様では、組成物は、全身投与される。いくつかの態様では、組成物は、静脈内注入または注射によって投与される。いくつかの態様では、組成物の投与後、対象は、正常なジストロフィン陽性筋線維、および中心核を含有するモザイクジストロフィン陽性筋線維、またはそれらの組み合わせを示す。いくつかの態様では、組成物の投与後、対象は、組成物の投与前の正常なジストロフィン陽性筋線維の非存在またはその存在レベルと比較して、正常なジストロフィン陽性筋線維の出現またはその存在レベルの増加を示す。いくつかの態様では、組成物の投与後、対象は、組成物の投与前の中心核を含有するモザイクジストロフィン陽性筋線維の非存在またはその存在レベルと比較して、中心核を含有するモザイクジストロフィン陽性筋線維の出現またはその存在レベルの増加を示す。いくつかの態様では、組成物の投与後、対象は、組成物の投与前の血清CKレベルと比較して、減少した血清CKレベルを示す。一部の態様では、組成物の投与後、対象は、組成物の投与前の握力と比較して、改善された握力を示す。いくつかの態様では、対象は、新生児、幼児、子供、若年成人、または成人である。いくつかの態様では、対象は、筋ジストロフィーを有する。いくつかの態様では、対象は、筋ジストロフィーの遺伝的保因者である。いくつかの態様では、対象は、男性である。いくつかの態様では、対象は、女性である。いくつかの態様では、対象は、無症候性のように見え、DMD遺伝子産物の機能を損なうDMD遺伝子の一方または両方のコピーの変異が遺伝子診断によって明らかになる。いくつかの態様では、対象は、筋ジストロフィーの初期徴候または症状を呈する。いくつかの態様では、筋ジストロフィーの初期徴候または症状は、筋肉量の喪失または近位筋衰弱を含む。いくつかの態様では、筋肉量の喪失または近位筋衰弱は、一方もしくは両方の脚および／または骨盤で起こり、続いて、1つまたは複数の上体筋で起こる。いくつかの態様では、筋ジストロフィーの初期徴候または症状はさらに、仮性肥大、低持久力、起立困難、歩行困難、階段昇行困難またはそれらの組み合わせを含む。いくつかの態様では、対象は、筋ジストロフィーの進行性の徴候または症状を呈する。いくつかの態様では、筋ジストロフィーの進行性の徴候または症状は、筋組織消耗、筋組織と脂肪の置換、または筋組織と線維性組織の置換を含む。いくつかの態様では、対象は、筋ジストロフィーの後期徴候または症状を呈する。いくつかの態様では、筋ジストロフィーの後期徴候または症状は、異常な骨発達、脊柱湾曲、運動の喪失、および麻痺を含む。いくつかの態様では、対象は、筋ジストロフィーの神経学的徴候または症状を呈する。いくつかの態様では、筋ジストロフィーの神経学的徴候または症状は、知的障害および麻痺を含む。いくつかの態様では、組成物の投与は、対象が筋ジストロフィーの1つもしくは複数の進行性、後期または神経学的な徴候または症状を呈する前に行う。いくつかの態様では、対象は、18歳超、25歳超、または30歳超である。いくつかの態様では、対象は、18歳未満、16歳未満、12歳未満、10歳未満、5歳未満、または2歳未満である。また、その必要のある対象における筋ジストロフィーを処置するための治療有効量の本開示の1つまたは複数の組成物の使用が提供される。
【０１２３】
送達ベクター
発現ベクターを細胞に導入できる多数の方法が存在する。ある特定の態様において、発現構築物は、ウイルス、またはウイルスゲノムに由来する改変された構築物を含む。受容体媒介性エンドサイトーシスを介して細胞に侵入し、宿主細胞ゲノムに組み込まれ、ウイルス遺伝子を安定的かつ効率的に発現することができるある特定のウイルスは、哺乳動物細胞に外来遺伝子を移入するための魅力的な候補である。これらは、比較的低い外来DNA配列の収容量を有し、限定された宿主範囲を有する。さらに、許容細胞における発がん潜在性および細胞変性効果は、安全性の問題を提起する。これらは、8kBまでの外来遺伝物質しか収容できないが、種々の細胞株および実験動物に容易に導入することができる。
【０１２４】
インビボ送達のための好ましい方法の1つは、アデノウイルス発現ベクターの使用を伴う。「アデノウイルス発現ベクター」は、（a）構築物のパッケージングを支援すること、および（b）その中にクローニングされたアンチセンスポリヌクレオチドを発現することに十分な、アデノウイルス配列を含有する構築物を含むことを意味する。これに関して、発現は、遺伝子産物が合成されることを必要としない。
【０１２５】
発現ベクターは、遺伝子改変された形態のアデノウイルスを含む。36kBの直鎖状二本鎖DNAウイルスであるアデノウイルスの遺伝子組織化に関する知識により、アデノウイルスDNAの大きな断片を最大で7kBの外来配列で置換することが可能である。レトロウイルスとは対照的に、アデノウイルスDNAは、潜在的な遺伝毒性なしに、エピソーム様式で複製できるため、宿主細胞のアデノウイルス感染は、染色体組み込みをもたらさない。また、アデノウイルスは、構造的に安定しており、広範な増幅の後にもゲノム再編成は検出されていない。アデノウイルスは、細胞周期に関わらず、事実上全ての上皮細胞に感染することができる。現在のところ、アデノウイルス感染は、ヒトにおいて急性呼吸器疾患などの軽度の疾患にのみ関連付けられているようである。
【０１２６】
アデノウイルスは、ゲノムのサイズが中程度であり、操作が容易であり、力価が高く、標的細胞範囲が広く、感染性が高いため、遺伝子移入ベクターとして使用するのに特に適している。ウイルスゲノムの両端は、ウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである100〜200塩基対の逆位反復（ITR）を含有する。ゲノムの初期（E）領域および後期（L）領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される異なる転写単位を含有する。E1領域（E1AおよびE1B）は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。E2領域（E2AおよびE2B）の発現は、ウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成をもたらす。これらのタンパク質は、DNA複製、後期遺伝子発現、および宿主細胞シャットオフに関与している。ウイルスカプシドタンパク質の大半を含む後期遺伝子の産物は、主要後期プロモーター（MLP）によって生じた単一の一次転写物の有意なプロセシングの後にのみ発現される。MLP（16.8 m.u.に位置する）は、感染の後期に特に効率的であり、このプロモーターから生じたmRNAは全て、5'トリパータイトリーダー（TPL）配列を保有しており、このため翻訳のための好ましいmRNAである。あるシステムにおいて、組換えアデノウイルスは、シャトルベクターとプロウイルスベクターとの間の相同組換えから生成される。2種のプロウイルスベクター間の可能性のある組換えのため、このプロセスから野生型アデノウイルスが生成され得る。それ故、個々のプラークからウイルスの単一クローンを単離し、そのゲノム構造を調査することが重要である。
【０１２７】
複製欠損性である現在のアデノウイルスベクターの生成および増殖は、Ad5 DNA断片によってヒト胎児腎細胞から形質転換され、E1タンパク質を構成的に発現する、293と名付けられたユニークなヘルパー細胞株に依存する。E3領域は、アデノウイルスゲノムにとって不可欠でないため、現在のアデノウイルスベクターは、293細胞の補助により、E1領域、D3領域のいずれかまたは両方に外来DNAを保持する。本来、アデノウイルスは、野生型ゲノムのおよそ105％をパッケージングすることができ、それによって、約2kb余分のDNAを収容できる。E1領域およびE3領域において置換可能なおよそ5.5kbのDNAと組み合わせると、現在のアデノウイルスベクターの最大収容量は、7.5kb、またはベクターの全長の約15％未満である。アデノウイルスのウイルスゲノムの80％超が、ベクター骨格に残存し、ベクター媒介性の細胞傷害の起源となる。また、E1欠失ウイルスの複製欠損は不完全である。
【０１２８】
ヘルパー細胞株は、ヒト胎児腎細胞、筋細胞、造血細胞、または他のヒト胎児間葉系もしくは上皮系細胞などのヒト細胞に由来してよい。あるいは、ヘルパー細胞は、ヒトアデノウイルスに許容性の他の哺乳動物種の細胞に由来してもよい。そのような細胞は、例えば、Vero細胞または他のサル胎仔間葉系もしくは上皮系細胞を含む。上述の通り、好ましいヘルパー細胞株は、293である。
【０１２９】
293細胞を培養し、アデノウイルスを増殖させるための、改善された方法が、当技術分野において公知である。あるフォーマットにおいて、培地100〜200mlを含有する1リットルのシリコン処理スピナーフラスコ（Techne, Cambridge, UK）へ個々の細胞を接種することによって、天然細胞凝集物を成長させる。40rpmで撹拌した後、細胞生存能をトリパンブルーにより推定する。別のフォーマットにおいて、Fibra-Celマイクロキャリア（Bibby Sterlin, Stone, UK）（5g/l）を以下の通り用いる。培地5mlに再懸濁した細胞接種材料を、250mlの三角フラスコ内の担体（50ml）へ添加し、1〜4時間、時々撹拌しながら、静置する。次いで、培地を新鮮な培地50mlに交換し、振盪を開始する。ウイルス産生のため、細胞を、約80％コンフルエントにまで増殖させ、その後、培地を交換し（最終体積の25％に）、アデノウイルスを0.05のMOIで添加する。培養物を一晩静置し、その後、体積を100％に増加させ、さらに72時間、振盪を開始する。
【０１３０】
本開示のアデノウイルスは、複製欠損性であるかまたは少なくとも条件付きで複製欠損性である。アデノウイルスは、42種類の異なる公知の血清型またはサブグループA〜Fのいずれかのものであってよい。サブグループCの5型アデノウイルスは、本開示において使用するための条件付き複製欠損アデノウイルスベクターを得るための好ましい出発材料である。
【０１３１】
上述の通り、本開示に係る典型的なベクターは、複製欠損性であり、アデノウイルスE1領域を有しない。したがって、E1コード配列が除去された位置に、関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを導入することが、最も便利である。しかしながら、アデノウイルス配列内の構築物の挿入の位置は重要ではない。E3置換ベクターの欠失E3領域の代わりに、またはヘルパー細胞株もしくはヘルパーウイルスがE4欠損を補完するE4領域に、関心対象の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを挿入してもよい。
【０１３２】
アデノウイルスは、増殖および操作が容易であり、インビトロおよびインビボで広い宿主範囲を示す。このウイルス群は、高い力価、例えば、1ml当たり109〜1012のプラーク形成単位で得ることができ、高度に感染性である。アデノウイルスの生活環は、宿主細胞ゲノムへの組み込みを必要としない。アデノウイルスベクターによって送達される外来遺伝子は、エピソームであり、それ故、宿主細胞に対して低い遺伝毒性を有する。野生型アデノウイルスを用いた予防接種の研究において、副作用は報告されておらず、このことは、インビボ遺伝子移入ベクターとしての安全性および治療的潜在性を実証している。
【０１３３】
アデノウイルスベクターは、真核生物遺伝子発現およびワクチン開発において使用されている。動物研究は、組換えアデノウイルスが遺伝子治療にも使用できることを示唆した。異なる組織への組換えアデノウイルスの投与における研究は、気管滴注、筋肉注射、末梢静脈内注射、および脳への定位接種を含む。
【０１３４】
レトロウイルスは、逆転写のプロセスによって感染細胞においてそれらのRNAを二本鎖DNAへ変換できることを特徴とする、一本鎖RNAウイルスの一群である。次いで、生じたDNAは、プロウイルスとして細胞染色体へ安定的に組み込まれ、ウイルスタンパク質の合成を指令する。組み込みは、レシピエント細胞およびその子孫におけるウイルス遺伝子配列の保持をもたらす。レトロウイルスゲノムは、カプシドタンパク質、ポリメラーゼ酵素、およびエンベロープ成分をそれぞれコードする3種の遺伝子gag、pol、およびenvを含有する。gag遺伝子から上流に見いだされる配列は、ゲノムのビリオンへのパッケージングのためのシグナルを含有する。2つの長い末端反復（LTR）配列が、ウイルスゲノムの5'端および3'端に存在する。これらは、強力なプロモーター配列およびエンハンサー配列を含有し、宿主細胞ゲノムへの組み込みのためにも必要とされる。
【０１３５】
レトロウイルスベクターを構築するために、ある特定のウイルス配列の代わりに、関心対象の遺伝子をコードする核酸をウイルスゲノムに挿入し、複製欠損性であるウイルスを産生する。ビリオンを産生するため、gag遺伝子、pol遺伝子、およびenv遺伝子を含有するがLTRおよびパッケージング成分を有しないパッケージング細胞株を構築する。レトロウイルスLTRおよびパッケージング配列と一緒にcDNAを含有する組換えプラスミドをこの細胞株に導入したとき（例えば、リン酸カルシウム沈殿によって）、パッケージング配列は、組換えプラスミドのRNA転写物がウイルス粒子へパッケージングされることを可能にし、次いで、それが培養培地へ分泌される。次いで、組換えレトロウイルスを含有する培地を収集し、場合により濃縮し、遺伝子移入のために使用する。レトロウイルスベクターは、多種多様な細胞タイプに感染することができる。しかしながら、組み込みおよび安定的発現は、宿主細胞の分裂を必要とする。
【０１３６】
ウイルスエンベロープへの乳糖残基の化学的付加によるレトロウイルスの化学的修飾に基づいて、レトロウイルスベクターの特異的なターゲティングを可能にするように設計された新規アプローチが最近開発された。この修飾は、シアロ糖タンパク質受容体を介した肝細胞の特異的感染を可能とすることもできる。
【０１３７】
レトロウイルスエンベロープタンパク質および特異的細胞受容体に対するビオチン化抗体が使用される、組換えレトロウイルスのターゲティングのための異なるアプローチを使用してよい。抗体は、ストレプトアビジンを使用することによってビオチン成分を介してカップリングされる。主要組織適合複合体クラスI抗原およびクラスII抗原に対する抗体を使用することで、それらの表面抗原を保有する種々のヒト細胞へのエコトロピックウイルスのインビトロ感染が実証された。
【０１３８】
本開示の全ての局面において、レトロウイルスベクターの使用に関してある特定の制限がある。例えば、レトロウイルスベクターは、通常、細胞ゲノム内のランダムな部位に組み込まれる。これは、宿主遺伝子の中断を通してまたはウイルス調節配列の挿入を通して挿入変異誘発を導くことができ、これが隣接遺伝子の機能に干渉し得る。欠損レトロウイルスベクターの使用に関する別の懸念は、パッケージング細胞における複製能を有する野生型ウイルスの潜在的な出現である。これは、宿主細胞ゲノムに組み込まれたgag配列、pol配列、env配列の上流に組換えウイルス由来のインタクトな配列を挿入する、組換え事象からもたらされ得る。しかしながら、組換えの可能性を大幅に減少させるはずである新たなパッケージング細胞株が、現在入手可能である（例えば、Markowitz et al., 1988; Hersdorffer et al., 1990を参照のこと）。
【０１３９】
他のウイルスベクターを本開示において発現構築物として用いてよい。ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、およびヘルペスウイルスなどのウイルスに由来するベクターを用いてよい。これらは、様々な哺乳動物細胞のためのいくつかの魅力的な特徴を提供する。
【０１４０】
複数の態様において、AAVベクターは、複製欠損性または条件付き複製欠損性である。複数の態様において、AAVベクターは、組換えAAVベクターである。いくつかの態様において、AAVベクターは、血清型AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12、AAVRh74、AAV2i8、AAVRh10、AAV39、AAV43、AAVRh8、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ウマAAV、もしくはヒツジAAV、またはそれらの任意の組み合わせのAAVベクターから単離されるかまたはそれに由来する配列を含む。
【０１４１】
いくつかの態様において、単一のウイルスベクターを使用して、Cas9またはCpf1および少なくとも1つのgRNAをコードする核酸を細胞に送達する。いくつかの態様において、第一のウイルスベクターを使用してCas9またはCpf1が細胞に提供され、第二のウイルスベクターを使用して少なくとも1つのgRNAが細胞に提供される。
【０１４２】
いくつかの態様において、単一のウイルスベクターを使用して、Cas9またはCpf1および少なくとも1つのgRNAをコードする核酸を細胞に送達する。いくつかの態様において、第一のウイルスベクターを使用してCas9またはCpf1が細胞に提供され、第二のウイルスベクターを使用して少なくとも1つのgRNAが細胞に提供される。センスまたはアンチセンスの遺伝子構築物の発現を達成するために、発現構築物を細胞へ送達しなければならない。細胞は、筋細胞、衛星細胞、メサンジオブラスト（mesangioblast）、骨髄由来細胞、間質細胞、または間葉系幹細胞であってよい。複数の態様において、細胞は、心筋細胞、骨格筋細胞、または平滑筋細胞である。複数の態様において、細胞は、前脛骨筋、大腿四頭筋、ヒラメ筋、隔膜、または心臓における細胞である。いくつかの態様において、細胞は、人工多能性幹細胞（iPSC）または内部細胞塊細胞（iCM）である。さらなる態様において、細胞は、ヒトiPSCまたはヒトiCMである。いくつかの態様において、本開示のヒトiPSCまたはヒトiCMは、培養幹細胞株、成人幹細胞、胎盤幹細胞に由来しても、ヒト胚の破壊を必要としない成人または胚性幹細胞の別の起源に由来してもよい。細胞への送達は、細胞株の形質転換のための実験手順の場合のようにインビトロで達成しても、特定の疾患状態の処置の場合のようにインビボまたはエクスビボで達成してもよい。1つの送達機構は、発現構築物が感染性のウイルス粒子にカプシド封入されるウイルス感染を介する。
【０１４３】
培養哺乳動物細胞への発現構築物の移入のためのいくつかの非ウイルス法も本開示によって想定される。これらは、リン酸カルシウム沈殿、DEAE-デキストラン、エレクトロポレーション、直接マイクロインジェクション、DNA負荷リポソーム、およびリポフェクタミン-DNA複合体、細胞超音波処理、高速度微粒子弾を使用した遺伝子銃、ならびに受容体媒介性トランスフェクションを含む。これらの技術のいくつかを、インビボまたはエクスビボ使用にうまく適合させ得る。
【０１４４】
発現構築物を細胞に送達したら、関心対象の遺伝子をコードする核酸を、異なる部位において位置付けおよび発現してよい。ある特定の態様において、遺伝子をコードする核酸を、細胞のゲノムへ安定的に組み込んでよい。この組み込みは、相同組み換え（遺伝子置換）を介して類似の位置および方向であっても、ランダムな非特異的位置に組み込んでもよい（遺伝子強化）。なおさらなる態様において、核酸を、DNAの別個のエピソームセグメントとして細胞内に安定的に維持してよい。そのような核酸セグメントまたは「エピソーム」は、宿主細胞周期と無関係にまたは同期的に、維持および複製させるのに十分な配列をコードする。どのように発現構築物が細胞へ送達されるか、および細胞内のどこに核酸が残存するかは、用いられる発現構築物のタイプに依存する。
【０１４５】
なお別の態様において、発現構築物は、単純に裸の組換えDNAまたはプラスミドからなっていてもよい。構築物の移入は、物理的にまたは化学的に細胞膜を透過処理する前述の方法のいずれかによって実施してよい。これは、インビトロ移入に特に適用可能であるが、インビボ使用にも同様に適用してもよい。
【０１４６】
さらに別の態様において、細胞への裸のDNA発現構築物の移入は、粒子銃を含んでよい。この方法は、細胞膜を貫通し、細胞を死滅させることなく細胞に侵入することを可能にする高速度まで、DNAコート微粒子弾を加速させる能力に依存する。小さな粒子を加速させるためのいくつかの装置が開発されている。そのような装置の1つは、電流を発生させるために高電圧放出に依存し、次に、その電流が原動力を提供する。使用される微粒子弾は、タングステンまたは金のビーズなどの生物学的に不活性な物質からなる。
【０１４７】
いくつかの態様において、発現構築物は、対象の肝臓、皮膚、および/または筋組織に直接送達される。これは、銃と標的器官との間の任意の介在組織を排除するための、組織または細胞の外科的露出、すなわち、エクスビボ処置を必要し得る。この場合もやはり、特定の遺伝子をコードするDNAをこの方法を介して送達してもよく、なお本開示に組み入れられる。
【０１４８】
さらなる態様において、発現構築物をリポソーム中に捕捉させてよい。リポソームは、リン脂質二重膜および内部水性媒体を特徴とする小胞構造である。多層リポソームは、水性媒体によって分離された複数の脂質層を有する。これらは、リン脂質を過剰の水性溶液に懸濁させたときに自然に形成される。脂質成分が自己再配置を受けた後、閉じた構造を形成し、脂質二重層間に水および溶解した溶質を捕捉する。また、リポフェクタミン-DNA複合体も想定される。
【０１４９】
インビトロでの外来DNAのリポソーム媒介性核酸送達および発現は大きな成功を収めている。Lipofectamine 2000（商標）として公知の試薬が広く使用され、市販されている。
【０１５０】
ある特定の態様において、リポソームを血球凝集性ウイルス（HVJ）と複合体化させて、細胞膜との融合を容易にし、リポソームにカプセル封入されたDNAの細胞侵入を促進させ得る。他の態様において、リポソームを、核の非ヒストン染色体タンパク質（HMG-1）と複合体化しても、一緒に使用してもよい。なおさらなる態様において、リポソームを、HVJおよびHMG-1の両方と複合体化しても、一緒に使用してもよい。そのような発現構築物は、インビトロおよびインビボでの核酸の移入および発現での使用に成功しており、これらを本開示に適用可能である。細菌プロモーターがDNA構築物において用いられる場合、リポソーム内に適切な細菌ポリメラーゼを含めることも望ましい。
【０１５１】
特定の遺伝子をコードする核酸を細胞へ送達するために用いることができる他の発現構築物は、受容体媒介性送達ビヒクルである。これらは、ほぼ全ての真核細胞において受容体媒介性エンドサイトーシスによる巨大分子の選択的取り込みを利用する。様々な受容体の細胞タイプ特異的な分布のため、送達は高度に特異的であることができる。
【０１５２】
受容体媒介性遺伝子ターゲティングビヒクルは一般に、細胞受容体特異的なリガンドおよびDNA結合剤の2種の成分からなる。いくつかのリガンドが、受容体媒介性遺伝子移入のために使用されている。最も広範に特徴付けられているリガンドは、アシアロオロソムコイド（ASOR）およびトランスフェリンである。ASORと同じ受容体を認識する合成ネオ糖タンパク質が遺伝子送達ビヒクルとして使用されており、また、上皮増殖因子（EGF）も扁平上皮がん細胞へ遺伝子を送達するために使用されている。
【０１５３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、筋肉変性および早期死亡をもたらす、男児のおよそ5000人に1人が罹患する劣性X連鎖型の筋ジストロフィーである。この障害は、タンパク質ジストロフィン（GenBankアクセッション番号AAA53189; SEQ ID NO：5）をコードする、ヒトX染色体上に位置する、遺伝子ジストロフィン（GenBankアクセッション番号NC_000023.11を参照）の変異によって引き起こされる。
【０１５４】
ヒトでは、ジストロフィンmRNAは、79のエクソンを含有する。ジストロフィンmRNAは、選択的にスプライシングされ、様々なアイソフォームをもたらすことが知られている。例示的なジストロフィンアイソフォームを表1に列挙する。
【０１５５】
ネズミ科のジストロフィンタンパク質は、以下のアミノ酸配列（Uniprotアクセッション番号P11531、SEQ. ID. NO：869）を有する。
2021511803.tif 000017
【０１５６】
ジストロフィンは、細胞膜のジストログリカン複合体（DGC）に構造的安定性を提供する、筋組織内の重要な成分である。どちらの性別も変異を保有し得るが、女性は、骨格筋形態の疾患の影響を受けることはめったにない。
【０１５７】
変異は、性質および頻度が様々である。大きな遺伝的欠失が症例の約60〜70％において見られ、大きな重複が症例の約10％において見られ、そして、点変異体または他の小さな変化が症例の約15〜30％を占める。7000ほどの変異を調べたBladenら（2015）は、合計5,682の大きな変異（全変異の80％）を分類し、そのうち4,894（86％）が欠失（1エクソン以上）であり、784（14％）が重複（1エクソン以上）であった。1,445の小さな変異（1エクソンより小さい、すべての変異の20％）があり、そのうち358（25％）が小さな欠失であり、132（9％）が小さな挿入であった一方で、199（14％）がスプライス部位に影響を与えた。点変異は、合計で756（小さな変異の52％）であり、726（50％）がナンセンス変異、30（2％）がミスセンス変異であった。最後に、22（0.3％）の中央部イントロン変異が観察された。加えて、終止コドンリードスルー療法（全変異の10％）およびエクソンスキッピング療法（欠失の80％および全変異の55％）を含めたDMDに対する新規遺伝子療法から潜在的に恩恵を受ける変異がデータベース内で特定された。
【０１５８】
DMD対象の特徴および臨床症状
症状は、通常、2〜3歳の男児に現れ、早期幼児期に見られることもある。早期幼児期まで症状が現れなくても、検査室試験により、出生時に活性変異を保有する子供を特定することができる。筋肉量の損失に関連する脚および骨盤の進行性の近位筋衰弱が最初に観察される。最終的に、この衰弱は、腕、首、および他の領域に広がる。初期の徴候は、仮性肥大（ふくらはぎおよび三角筋の腫脹）、低持久力、および、助けなしで起立することが困難、または階段を上ることができないことを含み得る。病状が進行するにつれて、筋組織は、消耗を経験し、最終的には脂肪および線維性組織に置き換えられる（線維症）。10歳までに歩行を補助するために支持具が必要となることがあり、ほとんどの患者は、12歳までに車椅子に頼る。その後の症状は、脊椎湾曲を含め、骨格の変形を導く異常な骨発達を含み得る。進行性の筋肉劣化に起因して、運動の消失が起こり、最終的に麻痺に至る。知的障害が存在する可能性も、存在しない可能性もあるが、存在しても、子供が年を取るにつれて次第に悪化することはない。DMDに罹患している男性の平均余命は25歳前後である。
【０１５９】
進行性の神経筋障害であるデュシェンヌ型筋ジストロフィーの主な症状は、筋肉消耗に伴う筋衰弱であり、随意筋、とりわけ臀部、骨盤領域、大腿部、肩部、およびふくらはぎの随意筋が最初に侵される。筋衰弱はまた、後に、腕、首、および他の領域でも生じる。ふくらはぎが腫脹することが多い。症状は、通常、6歳より前に現れ、早期幼児期に現れることもある。他の身体症状は以下のとおりである。
1. ぎこちない歩き方、足踏み方、または走り方（患者は、ふくらはぎの筋肉緊張の増大のため、足の前部で歩く傾向がある。また、つま先歩きは、膝伸筋の衰弱に対する代償的適応である。）
2. 頻繁な転倒
3. 疲労
4. 運動技能（ランニング、ホッピング、ジャンピング）の障害
5. 股関節屈筋の短縮を導くおそれのある、腰椎の脊柱前彎過度。これは、姿勢全体、および歩き方、足踏み方、または走り方に影響を及ぼす。
6. アキレス腱および膝腱の筋拘縮は、結合組織において筋線維が短くなり線維形成を起こすので、機能を損なう。
7. 進行性の歩行困難
8. 筋線維の変形
9. 舌およびふくらはぎの筋肉の仮性肥大（腫脹）。筋組織は最終的に脂肪および結合組織により置き換えられるため、仮性肥大という語を用いる。
10. 脳内のジストロフィンの非存在または機能不全の結果であると考えられる、神経行動障害（例えば、ADHD）、学習障害（失読症）、および特定の認知技能（特に短期言語記憶）の非進行性衰弱の高いリスク
11. 歩く能力の最終的損失（通常は12歳までに）
12. 骨格の変形（場合によっては脊柱側彎を含む）
13. 臥位または座位から起き上がることが困難
【０１６０】
この病状は、しばしば、患者が最初の措置を講じたときから臨床的に観察することができ、通常、男児が9歳〜12歳の間に歩行能力が完全に失われる。DMDに罹患したほとんどの男性は、21歳までに、本質的に「首より下が麻痺する」ようになる。筋肉消耗は、脚および骨盤で始まり、次に肩および首の筋肉に進行し、続いて腕の筋肉および呼吸筋が損失する。ふくらはぎの筋肉の腫脹（仮性肥大）が一目瞭然である。心筋症、特に（拡張型心筋症）が一般的であり、鬱血性心不全または不整脈（不規則な心拍）の発症はごくまれである。
【０１６１】
ガワーズ徴候陽性は、下肢筋肉のより重度の障害を反映する。子供は、上肢で起き上がる：初めに腕と膝で立ち上がり、次いで手を脚の上まで「歩行させて」直立する。罹患した子供は、通常、より疲れやすく、同等者よりも全体的な力が弱い。クレアチンキナーゼ（CPK-MM）の血流レベルは極めて高い。筋電図検査（EMG）は、衰弱が神経への損傷ではなく筋組織の破壊によって引き起こされていることを示す。遺伝子検査は、Xp21遺伝子の遺伝的誤りを明らかにすることができる。筋生検（免疫組織化学もしくは免疫ブロッティング）または遺伝子検査（血液検査）は、ジストロフィンの非存在を確認するが、遺伝子検査の改善によってこれは不要になることが多い。
【０１６２】
DMD患者は以下を患いうる。
1. 異常な心筋（心筋症）
2. 鬱血性心不全または不規則な心拍リズム（不整脈）
3. 胸部および背部の変形（脊柱側彎）
4. ふくらはぎ、臀部、および肩の筋腫脹（4歳または5歳前後）。これらの筋肉は最終的に、脂肪および結合組織により置き換えられる（仮性肥大）。
5. 筋肉量の損失（萎縮）
6. かかと、脚の筋拘縮
7. 筋肉の変形
8. 食物または流体が肺に流入することに伴う肺炎および嚥下を含む、呼吸器障害（疾患の後期段階において）
【０１６３】
デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、X染色体の短腕に位置する遺伝子座Xp21のジストロフィン遺伝子の変異によって引き起こされる。ジストロフィンは、多くのサブユニットを含有するタンパク質複合体を通じて、各筋線維の細胞骨格を、基礎となる基底層（細胞外マトリックス）に接続する役割を担う。ジストロフィンが存在しないと、過剰なカルシウムが筋線維鞘（細胞膜）に浸透する。カルシウムおよびシグナル伝達経路の変化により水がミトコンドリアに侵入し、次いでミトコンドリアが破裂する。
【０１６４】
骨格筋ジストロフィーでは、ミトコンドリア機能不全が、ストレス誘発性サイトゾルカルシウムシグナルの増幅およびストレス誘発性活性酸素種（ROS）産生の増幅を生じる。いくつかの経路を含むが明確に理解されていない複雑なカスケードプロセスにおいて、細胞内の酸化ストレスの増加が筋線維鞘に損傷を与え、最終的には細胞死をもたらす。筋線維が壊死を起こし、最終的に脂肪および結合組織に置き換えられる。
【０１６５】
DMDは、X連鎖劣性パターンで遺伝する。女性が典型的にはこの疾患の保因者になり、男性が罹患する。典型的には、女性保因者は、罹患した息子を産むまでは変異を保有することに気付かないであろう。保因者の母親の息子は、母親から欠陥遺伝子を引き継ぐ可能性が50％ある。保因者の母親の娘は、保因者である可能性が50％であり、遺伝子の2つの正常コピーを有する可能性が50％ある。いかなる場合でも、罹患していない父親は、正常なYを息子に、または正常なXを娘に譲り渡す。DMDなどのX連鎖劣性状態の女性保因者は、X不活性化のパターンによっては症状を示し得る。
【０１６６】
フレーム外エクソンを並列することによってオープンリーディングフレーム（ORF）を破壊する、ヒトDMD遺伝子のエクソン51の前のエクソン欠失が、最も一般的なタイプのヒトDMD変異である。エクソン51のスキッピングは、原理上、エクソン欠失を有するDMD患者の13％においてDMD ORFを回復させることができる。
【０１６７】
デュシェンヌ型筋ジストロフィーは、男児の5000人に1人の発生率を有する。ジストロフィン遺伝子内の変異は、生殖細胞系伝達の間に遺伝するかまたは自発的に発生し得る。
【０１６８】
配列
以下の表は、本明細書に開示される組成物および方法と併せて使用するための例示的なプライマー、gRNAおよびゲノムターゲティング配列を提供する。
【０１６９】
（表４）DMD iPSCに対するプライマーの配列
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【０１７０】
（表５）上位12個のエクソンのゲノムターゲティング配列
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【０１７１】
（表６）ゲノム標的配列
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* この表において、大文字は、遺伝子のエクソン配列と整列するヌクレオチドを表す。小文字は、遺伝子のイントロン配列と整列するヌクレオチドを表す。
【０１７２】
（表７）gRNA配列
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* この表において、大文字は、遺伝子のエクソン配列と整列するsgRNAヌクレオチドを表す。小文字は、遺伝子のイントロン配列と整列するsgRNAヌクレオチドを表す。
【０１７３】
（表８）マウスDmdエクソン51におけるsgRNAについてのゲノム標的部位
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【０１７４】
（表９）マウスDmdエクソン51を標的とするgRNA配列
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【０１７５】
（表１０）ヒトDmdエクソン51を標的とするsgRNAについてのゲノム標的配列
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【０１７６】
（表１１）ヒトDmdエクソン51を標的とするsgRNA配列
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【０１７７】
（表１２）様々なヒトDmdエクソン中の部位を標的とするsgRNAについてのゲノム標的配列
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【０１７８】
（表１３）様々なヒトDmdエクソン中の部位を標的とするためのgRNA配列
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【０１７９】
（表１４）イヌDmdエクソン51を標的とするsgRNAについてのゲノムターゲティング配列
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【０１８０】
（表１５）イヌDmdエクソン51を標的とするためのgRNA配列
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【０１８１】
（表１６）エクソン43&45 gRNA配列
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【０１８２】
（表１７）エクソン43&45 gRNA配列
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【０１８３】
（表１８）gRNA配列
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*この表において、大文字は、遺伝子のエクソン配列と整列するsgRNAヌクレオチドを表す。小文字は、遺伝子のイントロン配列と整列するsgRNAヌクレオチドを表す。
【０１８４】
（表１９）追加のgRNAターゲティング配列
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【実施例】
【０１８５】
VII. 実施例
以下の実施例は、本開示の好ましい態様を実証するために含まれる。以下の実施例において開示される技術が、本開示の実践において良好に機能すると本発明者によって発見された技術を代表するものであり、したがって、これがその実践のための好ましい様式に相当すると見なすことができると、当業者は理解するはずである。しかしながら、当業者は、本開示に照らして、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、開示されている具体的な態様において多くの変更を行うことができ、それでも同様のまたは類似の結果を得ることができるものと理解するはずである。
【０１８６】
実施例1
CRISPR/Cas9によるゲノム編集は、疾患を引き起こす変異を修正または軽減するための有望な新規アプローチである。デュシェンヌ型筋ジストロフィー（DMD）は、X連鎖ジストロフィン遺伝子（DMD）の3000を超える異なる変異によって引き起こされる心筋および骨格筋の致死的変性に関連する。これらの変異の大部分は、「ホットスポット」に集合している。真核生物のスプライスアクセプターおよびスプライスドナー配列と原核生物のCRISPR/Cas9標的遺伝子の認識および開裂を支配するプロトスペーサー隣接モチーフ配列との間には偶然の対応がある。この対応を利用して、変異ホットスポット内またはその近傍で最も一般的な変異体またはアウトオブフレームDMDエクソンのスキッピングを潜在的に可能にする、12個のエクソン中の保存されたRNAスプライス部位を無効にする挿入／欠失（インデル）変異を非相同末端結合によって導入することができる、最適なガイドRNAをスクリーニングした。エクソンスキッピングによるDMD変異の修正は、本明細書において、「ミオエディティング」と称される。概念実証研究において、DMD遺伝子内に大きな欠失、点変異または重複を有する複数の患者由来の代表的な人工多能性幹細胞においてミオエディティングを実施して、誘導心筋細胞におけるジストロフィンタンパク質発現を効率的に回復した。3次元人工心筋（EHM）では、DMD変異のミオエディティングは、ジストロフィン発現および対応する機械的収縮力を回復した。心筋細胞の一部（30〜50％）の修正だけで、変異体EHM表現型を正常に近い対照レベルまで救済するのに十分であった。したがって、ミオエディティングを通じて、保存されたRNAスプライシングアクセプター／ドナー部位を無効にし、スプライシング機構を変異体またはアウトオブフレームエクソンのスキッピングに指向させることで、DMDに関連する心臓の異常の修正が、根底にあるこの疾患の遺伝学的基礎を取り除くことによって可能になる。
【０１８７】
DMD変異のホットスポット領域に関連する12個の異なるエクソンを標的とする最適なガイドRNAの特定
スキップされたときにDMD変異のホットスポット領域のほとんどでジストロフィンオープンリーディングフレームを潜在的に回復することができる、上位12個のエクソンの一覧を表5に示す。ヒトDMD変異の大部分をエクソンスキッピングによって修正することへの初期段階として、ヒトDMD遺伝子の上位12個のエクソンを標的とするガイドRNAのプールをスクリーニングした（図1Aおよび1B）。各エクソンの3'スプライス部位または5'スプライス部位それぞれを標的とする3〜6個のPAM配列（NAGまたはNGG）を選択した（図1Aおよび表5）。これらのガイドRNAをプラスミドSpCas9-2A-GFPにクローニングした。必須のスプライスドナーまたはアクセプター配列を除去するインデルは、対応する標的エクソンのスキッピングを可能にする。公知のDMD変異の頻度に基づいて、これらのガイドRNAは、DMD患者の最大60％においてジストロフィン機能を救済することができると予測される。
【０１８８】
ヒトゲノムにおけるこの戦略の実行可能性および有効性を試験するために、ヒト胎児腎293細胞（239細胞）を使用して、エクソン51のスプライスアクセプター部位を標的とした（図1C）。トランスフェクトされた293細胞を緑色蛍光タンパク質（GFP）発現によって選別し、ミスマッチ特異的T7E1エンドヌクレアーゼアッセイによって遺伝子編集効率を検出した（図6A）。エクソン51のスプライスアクセプター部位を標的とする3個のガイドRNA（Ex51-g1、Ex51-g2、およびEx51-g3）の能力を表5および図2Bに示す。GFP陽性の選別された293細胞において、Ex51-g3は、高い編集活性を示したが、Ex51-g1およびEx51-g2は、検出可能な活性はなかった。次に、エクソン51、45、53、44、46、52、50、43、6、7、8および55を含めた上位12個のエクソンを標的とするガイドRNAの開裂効率を評価した。各エクソンの最高の編集効率を有する1個または2個のガイドRNAを図1Cに示す。エクソン51、45、および55に対する選択されたガイドRNAは、PAMとしてNAGを使用する（表5）。ミオエディティングされた上位12個のエクソンからのゲノムポリメラーゼ連鎖反応（PCR）産物をクローニングして配列決定した（図5Aおよび表20）。必須のスプライス部位を除去したかまたはオープンリーディングフレームをシフトしたインデルが観察された（図5A）。脳および腎組織では、N末端短縮形態のジストロフィン（Dp140）が、イントロン44において選択的プロモーターから転写される。逆転写PCR（RT-PCR）産物の配列決定によって、293細胞においてDp140 mRNAにおける6個の標的とするエクソン（エクソン51、53、46、52、50、および55）のスキッピングが確認された（図5B）。
【０１８９】
（表２０）上位12個のエクソンに対するプライマーの配列
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【０１９０】
ミオエディティングによる多様なDMD患者の変異の修正
エクソンスキッピングによって異なるタイプのヒトDMD変異を修正する単一ガイドRNAの有効性を評価するために、代表的なタイプのDMD変異を有する3種のDMD iPSC系統を入手した：大きな欠失（Delと呼ばれる；エクソン48〜50を欠く）、偽エクソン変異（pExと呼ばれる；イントロン点変異によって引き起こされる）、および重複変異（Dupと呼ばれる）。簡単に述べると、全血から得た末梢血単核細胞（PBMC）を培養し、次いで、再プログラム化因子を発現する組換えセンダイウイルスベクターを使用してiPSCに再プログラム化した。エクソン48の大きな欠失を有するDMD患者由来のiPSC系統（別称Del）に対するiPSCミオエディティングにおいて変異を修正または回避するためのCas9およびガイドRNAを、ヌクレオフェクションによって細胞に導入した。次いで、処置された細胞のプールまたは単一クローンを、標準条件を使用して誘導心筋細胞（iCM）に分化させた。精製したiCMを使用して、3D-EHMを作製し、機能性アッセイを実施した（図2A）。
【０１９１】
大きな欠失変異の修正
DMD症例の約60〜70％が1つまたは複数のエクソンの大きな欠失によって引き起こされると推定される。ホットスポットにエクソン48〜50の大きな欠失を有するDMD患者由来のiPSC系統に対してミオエディティングを実施した。図2Bに示すように、大きな欠失は、フレームシフト変異を生み出し、エクソン51に未熟な終止コドンを導入する。エクソン51におけるスプライスアクセプターの破壊は、原理上は、エクソン47〜52のスプライシングを可能にし、それによって、オープンリーディングフレームが再構成される（図2Bおよび図6B）。理論上は、エクソン51のスキッピングは、DMD患者の約13％を潜在的に修正することができる。最適化されたガイドRNA Ex51-g3およびCas9（図2C）をこのiPSC系統にヌクレオフェクトした結果、ゲノム配列決定によって実証された通り、スプライスアクセプターの破壊またはNHEJによるエクソン51の再構成、および、オープンリーディングフレームの回復が成功した（図6B）。ミオエディティングされたDMD iPSC（Del-Cor.）のプールをiCMに分化させ、そして、エクソン47〜52の増幅からのRT-PCR産物の配列決定によってインフレームジストロフィンmRNA発現の救済が確認された（図2Dおよび図6C）。
【０１９２】
偽エクソン変異の修正
このアプローチを希少な変異にさらに拡張するために、イントロン47に自然発生点変異（c.6913-4037T>G）を有するDMD患者由来のiPSC内の点変異（別称pEx）を修正しようと試みた。この点変異は、新規のRNAスプライシングアクセプター部位（YnNYAG）を生成し、未熟な終結シグナルをコードするエクソン47Aの偽エクソンをもたらす（図2E）。変異を正確に標的とするように2個のガイドRNA（Ex47A-g1およびEx47A-g2）を設計した（図2Fならびに図7Aおよび7B）。図2Gに示すように、ミオエディティングは、潜在スプライスアクセプター部位を無効にし、偽エクソンを永続的にスキップし、それによって、修正された細胞（pEx-Cor.）において完全長ジストロフィンタンパク質が回復した。これらのDMD iCMにおいてRT-PCRによってエクソンスキッピングの有効性を試験した（図2G）。RT-PCR産物の配列決定は、エクソン47がエクソン48にスプライシングされたことを裏付けた（図7C）。
【０１９３】
注目すべきことは、野生型イントロンはSpCas9のPAM配列（NAG）を欠いているので、Ex47A-g2が変異体アレルのみを標的とすることである。さらに、この患者におけるT>G変異は、Cas9の疾患特異的PAM配列（AG）を生じる。また、このタイプの修正が正常なジストロフィンタンパク質をいかなる内部欠失もなく回復することも注目すべきことである（図7Bおよび7C）。
【０１９４】
大きな重複変異の修正
エクソン重複は、DMDを引き起こす特定された変異の約10〜15％を占める。ジストロフィンオープンリーディングフレームを分断する大きな重複（エクソン55〜59）を有するDMD患者由来のiPSC系統（別称Dup）に対してミオエディティングを試験した（図2H）。この患者由来の細胞における全ゲノムシーケンシングおよびコピー数変動プロファイルの解析を実施し、イントロン54における正確な挿入部位を特定した（図2H）。この挿入部位（In59-In54接合部）をPCRによって確認した（図8Aおよび表4）。
【０１９５】
重複エクソン55の5'隣接配列が同一であれば、この領域を標的とする1つのガイドRNAが、2つのDSBを作って重複領域全体（エクソン55〜59；約150kb）を欠失させることができるはずと仮説を立てた。この仮説を試験するために、イントロン54およびエクソン55の接合部の近くの配列を標的とするように3つのガイドRNA（In54-g1、In54-g2、およびIn54-g3）を設計した（図2I）。これらのガイドRNAによるDNA切断効率を、293細胞においてT7E1によって評価した（図8B）。Dup iPSCでの後続の実験のためにガイドRNA In54-g1を選択した。ミオエディティングされたDup iPSC混合物からのゲノムPCR産物をクローニングして、配列決定した（図8C）。
【０１９６】
重複変異の修正を確認するために、処置されたDMD iPSC（別称Dup-Cor.）のプールを心筋細胞に分化させた。重複エクソンを有するmRNAを、重複特異的プライマー（エクソン59におけるフォワードプライマーEx59Fおよびエクソン55におけるリバースプライマーEx55R）を使用したRT-PCRによって半定量化し、b-アクチン遺伝子の発現に対して正規化した（図2Jおよび表4）。予想通り、重複特異的なRT-PCRバンドは、野生型（WT）細胞においては存在せず、Dup-Cor.細胞において劇的に減少した。この結果を確認するために、エクソン53〜Ex55とEx59〜エクソン60の重複境界に対するRT-PCR（図8D）を実施した。重複特異的な上部バンドの強度は、修正されたiCMで減少した。処置された細胞混合物から単一コロニーを選び出した。重複特異的PCRプライマー（F2-R1）を使用して、修正されたコロニーをスクリーニングした（図8E）。3つの代表的な修正されたコロニー（Dup-Cor. #4、#6および#26）および未修正の対照（Dup）のPCR結果を図8Eに示す。コロニー4、6および26における重複特異的なPCRバンドの非存在は、重複DNA領域の欠失を裏付けた。
【０１９７】
ミオエディティングによる患者由来iCMにおけるジストロフィンタンパク質の回復
次に、処置されたiCMの単一コロニーおよびプールにおけるジストロフィンタンパク質の回復および安定発現を、免疫細胞化学（図3A〜3C、ならびに図6D、7Dおよび8F）およびウェスタンブロット解析（図24、D〜F）によって確認した。クローン選択および拡大なしでも、Del-Cor.、pEx-Cor.、およびDup-Cor.におけるiCMのほとんどは、ジストロフィン陽性であった（図3A〜3C、ならびに図6D、7Dおよび8F）。ミオエディティングされたDel iPSCの混合物から、2つのクローン（#16および#27）を選び出し、心筋細胞に分化させた。より高いジストロフィン発現レベルを有するクローン#27を後続の実験のために選択した（別称Del-Cor-SC）。修正されたpExについての1つの選択されたクローン（#19）をさらなる研究に使用した（別称pEx-Cor-SC）。修正されたDupについての2つの選択されたクローン（#26および#6）をiCMに分化させた。クローン#6を機能性アッセイの実験に使用した（別称Dup-Cor-SC）。修正されたiCMのジストロフィンタンパク質発現レベルは、免疫細胞化学およびウェスタンブロット解析によってWT心筋細胞と同等であると推定された（50〜100％）（図3）。
【０１９８】
ミオエディティングによる患者由来iCMの機能の回復
ジストロフィンmRNAおよびタンパク質発現を生化学的方法によって測定することに加えて、正常DMDおよび修正されたDMD iCMに由来する3D-EHMを使用したマクロスケールの機能性解析を使用した。簡単に述べると、グルコース除去することによってiPSC由来心筋細胞を代謝精製した。精製した心筋細胞をヒト包皮線維芽細胞（HFF）と70％：30％の比で混合した。細胞混合物をウシコラーゲンおよび無血清培地の混合物中で再構成した。培養下で4週間後、収縮実験を実施した（図4A）。
【０１９９】
8つのiPSC系統由来のEHMを試験した：（i）WT、（ii）未修正のDel、（iii）Del-Cor-SC、（iv）未修正のpEx、（v）pEx-Cor.、（vi）pEx-Cor-SC、（vii）未修正のDup、および（viii）Dup-Cor-SC。EHMにおけるDMDおよび修正されたDMD心筋細胞の機能性表現型決定により、WT EHMと比較して、すべてのDMD EHM（Del、pEx、およびDup）における収縮不全が明らかになった（図4B〜4E）。pExおよびDup EHMと比較してDelにおいてより際立った収縮不全が見られた。収縮力（FOC）は、DMD EHMにおいて顕著に低下し、修正されたDMD EHM（Del-Cor-SC、pEx-Cor-SC、およびDup-Cor-SC）において大幅に改善され（図4B〜4E）、Dup-Cor-SCにおいて心筋細胞の最大変力性能が完全に回復した（図4Dおよび4E）。
【０２００】
現行の遺伝子療法送達法は心筋の一部にしか作用することができないので、DCMの表現型を救済するために修正心筋細胞が何パーセント必要であるかという明白な疑問が生じる。この疑問に取り組むために、DMD細胞（Del）および修正されたDMD細胞（Del-Cor-SC）を正確に混合して、EHMにおいて広範な「治療効率」（10〜100％）をシミュレーションした（図4F）。これは、収縮性表現型の部分（30％）または最大（50％）救済のために心筋細胞の30〜50％が修復される必要があることを明らかにした（図4F）。これらの知見は、キャリアマウスの50％の心筋細胞におけるモザイクジストロフィン発現が正常に近い心臓表現型をもたらしたことを示している過去のインビボ研究と一致する。本発明者らの知見は、修正されたDMD EHMにおいて、WT EHMの同等レベルまで収縮不全が効率的に回復したことを示す。したがって、ミオエディティングは、EHMにおけるDMDの臨床表現型を救済するための高度に特異的かつ効率的なアプローチである。
【０２０１】
考察
DMD遺伝子は、260万個の塩基対を包含し、79個のエクソンをコードする、ヒトゲノムにおける最も大きな公知の遺伝子である。DMD遺伝子の大きなサイズおよび複雑な構造は、その高い自然発生変異率に寄与する。大きな欠失または重複（約77％）、小さなインデル（約12％）および点変異（約9％）を含む約3000の変異がヒトにおいて立証されている。これらの変異は主にエクソンに影響を及ぼすが、pEx変異についてここで示すように、イントロン変異がスプライシングパターンを変更し、疾患を引き起こし得る。
【０２０２】
CRISPR/Cas9遺伝子編集による多様なDMD変異の修正を潜在的に簡略化するために、DMD患者の約60％を占める上位12個のエクソンをスキッピングすることができるガイドRNAを特定した。したがって、DMD変異ごとに個々のガイドを設計することも、ガイドRNA対を用いて大きなゲノム領域を切除することも必要ない。
【０２０３】
むしろ、個々のエクソンのスキッピングによって多数の患者においてジストロフィン発現を回復できるように、患者の変異を分類することができる。実施例1に記載の概念実証研究において、ガイドRNAを1つだけ使用した最適化されたミオエディティングアプローチは、DMD集団のほとんどを網羅する大きな欠失、点変異および重複を含めた広範囲の変異タイプにおいてDMDオープンリーディングフレームを効率的に回復した。比較的大きく複雑な欠失であっても、複数のガイドRNAが同時の遠位部位での切断とDNA末端の結合を指令する必要なしに、スプライスアクセプターまたはドナー部位を排除するDNA配列中の単一切断によって修正することができる。エクソンスキッピングは主にDMDを軽度のBMDへと転換するが、本発明者らが本研究においてpExおよびDup変異について示した通り、重複または偽エクソン変異を有する患者の一部について、ミオエディティングは、変異を排除し、正常なジストロフィンタンパク質の産生を回復することができる。
【０２０４】
収縮不全および心室腔拡大によって特徴付けられる拡張型心筋症は、DMD患者における主要死因の1つである。しかしながら、心臓生理学および解剖学の顕著な種間差だけでなく、疾患の博物学、これらの動物の短い寿命（約2年）およびその小さな心臓サイズ（ヒト心臓サイズの1/3000）のために、心筋症は、一般に、若齢のDMDマウスモデルでは観察されない。2D細胞培養系および小さな動物モデルの制限および欠点を克服するために、ジストロフィン変異が心収縮性およびカルシウム濃度感受性を損なうことをヒトiPSC由来3D-EHMを使用して示した。DMD患者のDCM臨床表現型に類似しているDMD EHMにおいて収縮不全が観察された。ミオエディティングによって修正されたDMD EHMにおいて収縮不全が部分的〜完全に回復した。したがって、ゲノム編集は、遺伝的要因を排除し、DMDに関連する筋肉および心臓の異常を修正する有効な手段となる。本明細書に提示されたデータはさらに、EHMが、ミオエディティングの治療効率を見積もる好適な前臨床ツールとして役立つことを実証する。 
【０２０５】
ヒトCRISPR臨床試験は、中国および米国で承認を受けた。CRISPR/Cas9系についての1つの重要な懸念は、特異性であり、その理由は、オフターゲット効果がゲノムにおいて予想外の変異を引き起こし得るからである。（i）標的部位のインシリコ予測およびディープシーケンシングによるそれらの試験、ならびに（ii）不偏の全ゲノムシーケンシングを含め、起こり得るオフターゲット効果を評価するために複数のアプローチが開発されてきた。加えて、Cas9およびガイドRNA、対となったCas9ニッカーゼ、短縮型ガイドRNAならびに高忠実度または増強されたCas9の投与量の力価測定を含め、潜在的なオフターゲット効果を最小化するおよび／またはCRISPR/Cas9系の特異性を改善するためのいくつかの新たなアプローチが報告されている。ほとんどの研究は、インビトロ細胞培養系を使用していたが、本発明者らなどは、マウスにおける生殖細胞系統編集および出生後編集の本発明者らの過去の研究においてオフターゲット効果を観察しなかった。ヒト着床前胚における遺伝子編集の最近の研究によれば、編集されたゲノムにおいてもオフターゲット変異は検出されなかった。オフターゲット効果の包括的で広範な解析は本研究の範囲を超えるが、本発明者らは、結局のところ、潜在的な治療適用の前に個々のガイドRNAの起こり得るオフターゲット効果を徹底的に評価することが重要であることを承知している。
【０２０６】
材料および方法
プラスミド
2A-EGFPを有するヒトコドン最適化SpCas9遺伝子およびガイドRNA骨格を含有するpSpCas9（BB）-2A-GFP（PX458）プラスミドは、F. Zhangからの贈与であった（プラスミド#48138, Addgene）。ガイドRNAのクローニングを、Feng Zhang Lab CRISPRプラスミド説明書（addgene.org/crispr/zhang/）に従って行った。
【０２０７】
ヒト293細胞のトランスフェクションおよび細胞選別
製造業者の説明書に従ってリポフェクタミン2000トランスフェクション試薬（Thermo Fisher Scientific）によって細胞をトランスフェクトし、細胞を合計48〜72時間インキュベートした。細胞選別を、テキサス大学（UT）サウスウェスタン医学センターのフローサイトメトリー共同研究施設で実施した。トランスフェクトされた細胞をトリプシン−EDTA溶液を使用して解離させた。混合物を37℃で5分間インキュベートし、10％ウシ胎児血清を補充した温かいダルベッコ変法イーグル培地2mlを加えた。再懸濁した細胞を15mlのファルコンチューブに移し、穏やかに20回トリチュレートした。細胞を室温で5分間1300rpmにて遠心分離した。培地を除去し、2％ウシ血清アルブミン（BSA）を補充したリン酸緩衝食塩水（PBS）500mlに細胞を再懸濁した。細胞をメッシュカップに通してセルストレーナーチューブに濾過した。選別された単一細胞を、マイクロフュージチューブ中に、GFP＋細胞集団とGFP−細胞集団に分離した。
【０２０８】
ヒトiPSCの維持、ヌクレオフェクションおよび分化
DMD iPSC系統Delは、細胞バンク理化学研究所バイオリソースセンターから購入した（cell no. HPS0164）。WT iPSC系統は、D. Garry（ミネソタ大学）からの贈与であった。他のiPSC系統（pExおよびDup）は、UTサウスウェスタンウェルストンミオエディティング共同研究所で作製し、維持した。簡単に述べると、DMD患者の全血から得られたPBMCを培養し、次いで、再プログラム化因子を発現する組換えセンダイウイルスベクター（Cytotune 2.0, Life Technologies）を使用してiPSCに再プログラム化した。iPSCコロニーを、免疫細胞化学、マイコプラズマ検査およびテラトーマ形成によって検証した。ヒトiPSCを、mTeSRTM1培地（STEMCELL Technologies）中で培養し、およそ4日ごとに継代した（継代比率1：18）。ヌクレオフェクションの1時間前に、iPSCを10mM ROCK阻害剤（Y-27632）で処理し、Accutase（Innovative Cell Technologies Inc.）を使用して単一細胞に解離させた。細胞（1×106）をSpCas9-2A-GFPプラスミド5mgと混合し、P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X kit（Lonza）を製造業者のプロトコルに従って使用してヌクレオフェクトした。ヌクレオフェクション後、iPSCを、10mM ROCK阻害剤、ペニシリン-ストレプトマイシン（1：100）（Thermo Fisher Scientific）およびプリモシン（100mg/ml；InvivoGen）を補充したmTeSRTM1培地中で培養した。ヌクレオフェクションの3日後、上記のように蛍光活性化細胞選別によってGFP+およびGFP-を選別し、PCRおよびT7E1アッセイに供した。
【０２０９】
選別した細胞からのゲノムDNAの単離
プロテアーゼK（20mg/ml）をDirectPCR Lysis Reagent（Viagen Biotech Inc.）に終濃度1mg/mlまで加えた。細胞を4℃で10分間6000rpmにて遠心分離し、上清を廃棄した。氷上で維持された細胞ペレットを、DirectPCR／プロテアーゼK溶液50〜100mlに再懸濁し、55℃で>2時間または塊が観察されなくなるまでインキュベートした。粗溶解物を85℃で30分間インキュベートし、次いで、10秒間スピンした。NaClを終濃度250mMまで加え、続いて、0.7倍体積のイソプロパノールを加えてDNAを沈殿させた。DNAを4℃で5分間13,000rpmにて遠心分離し、上清を廃棄した。DNAペレットを70％ EtOH 1mlで洗浄し、水に溶解した。NanoDrop装置（Thermo Fisher Scientific）を使用してDNA濃度を測定した。
【０２１０】
標的とするゲノム領域のPCRによる増幅
PCRアッセイは、GoTaqポリメラーゼ（Promega）2ml、5×緑色GoTaq反応緩衝液20ml、25mM MgCl2 8ml、10mMプライマー2ml、10mMデオキシヌクレオチド三リン酸2ml、ゲノムDNA 8mlを含有し、二重蒸留H2O（ddH2O）を加えて100mlとした。PCR条件は、以下の通りであった：94℃で2分間、32×（94℃で15秒間、59℃で30秒間、および72℃で1分間）、72℃で7分間、次いで、4℃で保持した。PCR産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分析し、ダイレクトシーケンシングのためにQIAquick PCR Purification kit（Qiagen）を使用してゲルから精製した。これらのPCR産物を、製造業者の説明書に従ってpCRII-TOPOベクター（Invitrogen）にサブクローニングした。個々のクローンを選び出し、DNAを配列決定した。
【０２１１】
PCR産物のT7E1解析
ゲノムPCR試料25mlの以下の条件を使用した変性／復元によってミスマッチ二重鎖DNAを得た：95℃で10分間、95°〜85℃（-2.0℃/秒）、85℃で1分間、85°〜75℃（-0.3℃/秒）、75℃で1分間、75°〜65℃（-0.3℃/秒）、65℃で1分間、65°〜55℃（-0.3℃/秒）、55℃で1分間、55°〜45℃（-0.3℃/秒）、45℃で1分間、45°〜35℃（-0.3℃/秒）、35℃で1分間、35°〜25℃（-0.3℃/秒）、25℃で1分間、次いで、4℃で保持した。
【０２１２】
変性／復元に続いて、以下を試料に加えた：3mlの10×NEBuffer 2、0.3mlのT7E1（New England Biolabs）、およびddH2Oを加えて30mlとした。消化した反応物を37℃で1時間インキュベートした。未消化のPCR試料およびT7E1で消化したPCR産物を2％アガロースゲル電気泳動によって分析した。
【０２１３】
全ゲノムシーケンシング
全ゲノムシーケンシングは、血液試料をNovogene Corporationに送ることによって実施された。精製されたゲノムDNA（1.0mg）をDNA試料調製用のインプット材料として使用した。TruSeq Nano DNA HT Sample Preparation kit （Illumina）を製造業者の説明書に従って使用してシーケンシングライブラリーを作製した。簡単に述べると、音波処理によってDNA試料を350bpのサイズまで断片化した。DNA断片を平滑末端化し、Aテール付加し、そして、完全長アダプターとライゲーションして、さらにPCR増幅しながらIlluminaシーケンシングを行った。ライブラリーをIlluminaシーケンシングプラットフォームで配列決定し、ペアエンドリードを作製した。
【０２１４】
RNAの単離
TRIzol RNA単離試薬（Thermo Fisher Scientific）を製造業者の説明書に従って使用して細胞からRNAを単離した。
【０２１５】
心筋細胞の分化および精製
iPSCを、PBS被覆プレート内のTESR-E8（STEMCELL Technologies）中1：120 Matrigel上で適合および維持し、EDTA溶液（Versene, Thermo Fisher Scientific）を使用して週2回継代した。心臓分化のために、iPSCを5×104〜1×105細胞／cm2でプレーティングし、RPMI、2％ B27、200mM L-アスコルビン酸-2-リン酸セスキマグネシウム塩水和物（Asc；Sigma-Aldrich）、アクチビンA（9ng/ml；R&D Systems）、BMP4（5ng/ml；R&D Systems）、1mM CHIR99021（Stemgent）、およびFGF-2（5ng/ml；Miltenyi Biotec）で3日間誘導した；RPMI培地でさらに洗浄後、4日目〜13日目まで2％ B27および200mM Ascを補充したRPMI中で5mM IWP4（Stemgent）と共に細胞を培養した。心筋細胞を、13日目〜17日目まで、2.2mM乳酸ナトリウム（Sigma-Aldrich）、100mM b-メルカプトエタノール（Sigma-Aldrich）、ペニシリン（100U/ml）およびストレプトマイシン（100mg/ml）を含むグルコース不含RPMI（Thermo Fisher Scientific）中でグルコース除去することによって代謝精製した。心筋細胞の純度は、15回の独立した分化実行（細胞系統ごとに1〜3回）から、92±2％であった。
【０２１６】
EHM作製
規定の無血清EHMを作製するために、精製した心筋細胞をHFF（American Type Culture Collection）と70％：30％比で混合した。細胞混合物を、pH中和医療用ウシコラーゲン（1 EHM当たり0.4mg；LLC Collagen Solutions）と濃縮無血清培地［2×RPMI、インスリン不含の8％ B27、ペニシリン（200U/ml）およびストレプトマイシン（200mg/ml）］の混合物中で再構成し、インスリン不含の4％ B27、1％非必須アミノ酸、2mMグルタミン、300mMアスコルビン酸、IGF1（100ng/ml；AF-100-11）、FGF-2（10ng/ml；AF-100-18B）、VEGF165（5ng/ml；AF-100-20）、TGF-b1（5ng/ml；AF-100-21C；成長因子はすべてPeproTech社製）、ペニシリン（100U/ml）およびストレプトマイシン（100mg/ml）を含むIscove培地中で3日間培養した。3日間の凝縮期間の後、増張力性収縮を支持するためにEHMをフレキシブルホルダーに移した。4週間の全EHM培養期間の後に解析を行った。
【０２１７】
収縮機能の解析
37℃のオルガンバス内、ガス供給（5％ CO2/95％ O2）タイロード液（120mM NaCl、1mM MgCl2、0.2mM CaCl2、5.4mM KCl、22.6mM NaHCO3、4.2mM NaH2PO4、5.6mMグルコース、および0.56mMアスコルビン酸塩を含有する）中、等尺性条件下で収縮実験を実施した。200mAの5-ms方形波を用いて1.5 HzでEHMを電気刺激した。フランク・スターリングの法則に従って最大収縮期力振幅（FOC）が観察されるまで、EHMを125mm間隔で機械的に伸縮させた。漸増細胞外カルシウム（0.2〜4mM）に対する応答を調べて、最大変力性能を判定した。表示されている場合は、力を筋肉含量（フローサイトメトリーによって判定された場合のサルコメアa-アクチニン陽性細胞含量）に対して正規化した。
【０２１８】
EHM由来細胞のフローサイトメトリー
EHMの単一細胞懸濁液を既述の通り調製し、70％氷冷エタノール中で固定した。固定した細胞をヘキスト3342（10mg/ml；Life Technologies）で染色して、細胞二重体を除外した。サルコメアa-アクチニン染色（clone EA-53, Sigma-Aldrich）によって心筋細胞を特定した。細胞をLSRII SORPサイトメーター（BD Biosciences）に流し、DIVAソフトウェアを使用して分析した。1試料当たり少なくとも10,000の事象を分析した。
【０２１９】
免疫染色
iPSC由来心筋細胞をアセトンで固定し、免疫染色に供した。固定した心筋細胞を血清カクテル（2％正常ウマ血清／2％正常ロバ血清／0.2％ BSA/PBS）でブロッキングし、0.2％ BSA/PBS中のジストロフィン抗体（1：800；MANDYS8, Sigma-Aldrich）およびトロポニン-I抗体（1：200；H170, Santa Cruz Biotechnology）とインキュベートした。4℃で一晩インキュベートした後、これらを二次抗体［ビオチン化ウマ抗マウス免疫グロブリンG（IgG）（1：200；Vector Laboratories）およびフルオレセインコンジュゲートロバ抗ウサギIgG（1：50；Jackson ImmunoResearch）］と1時間インキュベートした。ヘキスト33342（Molecular Probes）で核を対比染色した。
【０２２０】
免疫染色しようとするEHM低温切片を融解し、さらに風乾させ、冷アセトン中で固定した（-20℃で10分間）。切片をPBS（pH 7.3）中で手短に平衡化し、次いで、血清カクテル（2％正常ウマ血清／2％正常ロバ血清／0.2％ BSA/PBS）で1時間ブロッキングした。ブロッキングカクテルをデカントし、洗浄をはさまずに0.2％ BSA/PBS中のジストロフィン/トロポニン一次抗体カクテル［マウス抗ジストロフィン、MANDYS8（1：800；Sigma-Aldrich）およびウサギ抗トロポニン-I（1：200；H170, Santa Cruz Bio-technology）］をアプライした。4℃で一晩インキュベートした後、未結合の一次抗体をPBS洗浄で除去し、0.2％ BSA/PBS中で希釈した二次抗体［ビオチン化ウマ抗マウスIgG（1：200；Vector Laboratories）およびローダミンロバ抗ウサギIgG（1：50；Jackson ImmunoResearch）］で切片を1時間プローブした。未結合の二次抗体をPBS洗浄で除去し、PBS中で希釈したフルオレセイン-アビジン-DCS（1：60；Vector Laboratories）と切片を10分インキュベートすることで最終ジストロフィン標識を行った。未結合のローダミンをPBS洗浄で除去し、ヘキスト33342（2mg/ml；Molecular Probes）で核を対比染色し、Vectashield（Vector Laboratories）を用いてスライドをカバーガラスで封入した。
【０２２１】
ウェスタンブロット解析
ヒトiPSC由来心筋細胞に対するウェスタンブロット解析を、ジストロフィンに対する抗体（ab15277, Abcam; D8168、Sigma-Aldrich）、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼに対する抗体（MAB374, Millipore）、および心臓ミオシン重鎖に対する抗体（ab50967, Abcam）を使用して実施した。ヤギ抗マウスおよびヤギ抗ウサギホースラディッシュペルオキシダーゼコンジュゲート二次抗体（Bio-Rad）を記載の実験に使用した。
【０２２２】
本明細書において開示および主張された組成物および/または方法は全て、本開示に照らして、過度の実験なしに作製および実施することができる。本開示の組成物および方法は、好ましい態様に関して記載されているが、本明細書に記載の組成物および/または方法ならびにその方法の工程または工程の順序に対して、本開示の概念、精神、および範囲から逸脱することなしに変更を適用してよいことは、当業者に明らかなことであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連しているある特定の作用物質を本明細書に記載の作用物質の代わりに使用しても、同じまたは類似の結果が達成されることが明らかであろう。当業者に明らかなそのような類似の代用物および修飾は全て、添付の特許請求の範囲によって定義される本開示の精神、範囲、および概念内にあるものと見なされる。
【０２２３】
VIII. 参照文献
以下の参照文献は、本明細書において記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供するという限りにおいて、参照によって本明細書に具体的に組み入れられる。
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【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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