(57)【要約】  本明細書で提供される技術は、核酸および金属ナノクラスターを含む予め構築された複合体を使用し、標的核酸に結合した複合体を電磁放射線に曝露することによる、細胞のゲノムにおけるインビトロ、エキソビボまたはインビボでの標的核酸の改変のための方法に関する。【選択図】図１
2021508450.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞のゲノムにおけるインビトロ、エキソビボまたはインビボでの標的核酸の改変のための方法であって、
（ｉ）改変される標的核酸配列を提供すること、
（ｉｉ）核酸および金属ナノクラスターを含む予め構築された複合体を提供すること、
（ｉｉｉ）前記標的核酸に前記複合体を結合させること、
（ｉｖ）前記標的核酸に結合した前記複合体を電磁放射線に曝露することによって、前記標的核酸において１つまたは複数の一本鎖または二本鎖核酸切断を誘発すること
を含む、方法。
【請求項２】
含まれる前記核酸配列が異なる、複数の異なる予め構築された複合体が提供され、前記標的核酸に結合して、前記標的核酸に結合した前記複合体を電磁放射線に曝露した後に、前記標的核酸の異なる位置で、１つまたは複数の一本鎖または二本鎖核酸切断を誘発する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記複合体中の前記核酸が、ａ）前記標的核酸中の配列を認識し、この配列に結合する核酸配列、およびｂ）前記金属ナノクラスターの形成のための核形成配列を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記電磁放射線が、限定されないが、近紫外、可視、近赤外、赤外波長、またはマイクロ波、または電波を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
電磁放射線の供給源が連続波および／またはパルス化レーザーまたは放射線の任意のパルス化供給源である、請求項１から４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記複合体に含まれる前記核酸が、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、または限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはロックド核酸（ＬＮＡ）もしくはトレオース核酸（ＴＮＡ）もしくはグリコール核酸（ＧＮＡ）もしくはモルホリノもしくはこれらの誘導体を含む合成核酸の任意の他の形態である、請求項１から５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記複合体に含まれる前記核酸が、前記核酸の配列内に、または５’もしくは３’末端に、少なくとも１つの合成のまたは天然に存在する核酸塩基類似体を含み、前記核酸の機能化を目的とした任意のさらなる化学反応に適している、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記複合体が少なくとも２個の金属原子を含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記複合体の前記金属原子が、特に、銀、金または白金原子のような貴金属原子からなる群から選択される、遷移金属の群、限定されないが、ガリウムおよびタリウム原子を含むポスト遷移金属、限定されないが、アンチモンおよびテルル原子を含むメタロイド、限定されないが、ランタン、テルビウム、イッテルビウム、ガドリニウム原子を含むランタノイド原子、特に、セシウムおよびルビジウム原子からなる群から選択されるアルカリ金属、ならびにまたはこれらの金属クラスのうちのいずれか１つに属する２つ以上の元素の組み合わせを含む、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記複合体中の前記核酸が、最低でも１０ヌクレオチドの長さを含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記複合体の前記核酸に含まれ、前記標的ＤＮＡへの結合に関与する前記核酸配列が、前記標的核酸内の配列に相補的であるか、特異的に結合する少なくとも５個の連続的なヌクレオチドを含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が植物細胞であり、特に、タバコ（Nicotiana tabacum）またはベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）のようなナス科（Solanaceae family）由来の細胞からなる群から選択される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記細胞がヒトまたは動物の細胞であり、特に、腫瘍細胞、幹細胞、および多細胞生物の任意の組織または器官における細胞からなる群から選択される、請求項１から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記標的核酸配列がウイルス中に存在する、請求項１から１４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本明細書で提供される技術は、一般に、ゲノム編集（ＧＥ）技術の範疇に入り、核酸および金属ナノクラスターを含む予め構築された複合体を使用し、標的核酸に結合した複合体を電磁放射線に曝露することによる、細胞のゲノムにおけるインビトロ、エキソビボまたはインビボでの標的核酸の改変のための方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
天然に見られる様々な形質は、ある特定の遺伝子における１つまたは複数の変異の存在を反映し、こうした変異は、ＤＮＡ損傷後に惹起される修復機構の誤りとして起こることが多い。育種に容易に利用可能な形質のレパートリーを広げるために、化学物質および放射線によって誘導される突然変異によってゲノムを人工的に変化させるための方法が開発された。ごく最近、ｔｉｌｌｉｎｇ（Targeting Induced Local Lesions in Genomes）などのストラテジーが逆遺伝学ツールとして開発され、このツールも、大規模なＤＮＡ損傷、したがって突然変異を引き起こす化学物質または放射線の突然変異原の使用を必要とする。これらの古典的なアプローチは、育種に利用可能な実際に有用な形質の幅をかなり広げ、向上した植物品種の確立および発売を加速した。しかし、突然変異はランダムに誘発されるので、目的の突然変異を特定するための大規模なスクリーニング労力が、依然として必要とされる。さらに、多くの突然変異が同時に誘発されるので、所望の形質を示す系統を首尾よく特定した後に、バックグラウンド突然変異の大部分を除去するために、数ラウンドの戻し交配が必要とされる。部位特異的ヌクレアーゼ（ＳＤＮ）の発見およびゲノム編集の出現にともなって、ゲノム中の特定の予め決定した位置で、切断、したがって突然変異を誘発することが今や可能である。ゲノム中のこれらの位置は、それらの配列およびＤＮＡ修飾酵素の配列特異性によって規定される。実際に、高等真核細胞において二本鎖切断が生じる場合、これは、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路を介して修復されることが多く、これは、標的にされた遺伝子を突然変異させる小さな挿入または欠失（インデル）をもたらす。標的にされた領域に相同であるが、単一または少数の塩基突然変異を保有する二本鎖または一本鎖ＤＮＡの短い断片がヌクレアーゼとともに提供される場合、切断は、標的遺伝子中の少数のヌクレオチドを正確に編集することを可能にする相同組換え修復（ＨＤＲ）経路によって修復され得る。
【０００３】
微生物、植物および哺乳類のゲノム中にコードされる遺伝情報の予め規定された部位における制御された改変を達成するために、いくつかのゲノム編集（ＧＥ）技術が最近開発された。外来遺伝子の組み込みまたは既存の遺伝子の改変が制御されないランダムな様式で生じる、遺伝子導入に関する古典的な育種および従来のアプローチと対照的に、最近のＧＥ技術（特に、いわゆるデザイナーエンドヌクレアーゼに基づくもの）は、改変のための特定のゲノム部位を標的にすることができる。操作されたエンドヌクレアーゼは、内在性のＤＮＡ修復機構によって解消される二本鎖ＤＮＡ切断（ＤＳＢ）を起こす。動物および植物では、ＤＳＢに対する、広く認められている修復機構は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）である。これは、遺伝子の元の構造および機能を元に戻すことができるが、切断部位で少数のヌクレオチドの挿入または欠失をしばしば引き起こし、それによって、遺伝子機能の喪失をもたらすミスセンス、ナンセンスまたはフレームシフト突然変異を起こす、エラーを起こしやすい機構である。ゲノムＤＮＡ標的に相同なドナーＤＮＡがデザイナーヌクレアーゼと同時に導入される場合、ＤＳＢは、代わりに、元の配列を元に戻すことができる相同性依存的修復（ＨＤＲ）によってプロセシングされ得るか、または（ドナーＤＮＡが突然変異もしくはさらなる遺伝子を保有する場合）遺伝子変換または正確な導入遺伝子挿入をもたらすことができる。
【０００４】
最も広く使用されている現在のＧＥ技術は、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＮＦ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）またはクラスター化した規則的な配置の短い回文配列リピート（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９）に基づく。ヌクレアーゼに依拠しない代替のＧＥ方法はオリゴヌクレオチド指定変異誘発（ＯＤＭ）であり、これは、ＣＩＢＵＳ社によって商品化されている。ＯＤＭは、ドナー鋳型として一本鎖オリゴヌクレオチドを使用し、したがって、小さな挿入および欠失ならびに単一のまたはクラスター化したヌクレオチド変化を導入することができる。これらの技法はすべて、遺伝子機能研究、作物への新規形質の導入などの用途のために、バイオテクノロジーで首尾よく使用される。これらはまた、生物医学的用途のために、動物およびヒトの細胞および組織で集中的に研究されている。しかし、植物または動物の細胞におけるメガヌクレアーゼ、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓの持続性活性は、望まれないオフターゲット効果をしばしばもたらし得る。
【発明の概要】
【０００５】
したがって、細胞のゲノムにおけるインビトロ、エキソビボまたはインビボでのＧＥのための、より有効な特異的な方法が必要とされる。特に、解決されるべき技術的問題は、インビトロにおける、および／または生物／細胞のゲノムにおける核酸の改変のための、非トランスジェニックの、タンパク質フリーおよびヌクレアーゼフリーの非常に特異的かつ効率的な方法の開発である。さらに、本方法は、現在のＧＥ技術に関する文献で頻繁に報告される、予想外かつ望まれない突然変異が標的生物のゲノム中に導入されるオフターゲット効果を低減する／除去することを目的とする。
【０００６】
本開示は、核酸および金属ナノクラスターを含む予め構築された金属−ＤＮＡ量子クラスター複合体（今後はＱＣと称される）を使用し、標的核酸に結合したＱＣ複合体を電磁放射線へ曝露することによる、細胞のゲノムにおけるインビトロ、エキソビボまたはインビボでの標的核酸の改変のための方法に関する。本開示のこの方法では、ＱＣは新規なＧＥツールとして使用される。ＱＣは、特に、長さおよび配列が異なるＤＮＡオリゴヌクレオチドを鋳型とする５〜２０個の金属原子（例えば、銀または金）から構築される複合分子であり、これらのＤＮＡオリゴヌクレオチドは、直鎖状ＱＣ、ステムループまたはヘアピンなどの異なる型式を導き得る。ＱＣの合成は簡単であり、安価である。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを含む溶液で、金属原子は、アデニンおよびチミンではなくシトシンおよびグアニンに優先的に結合し、これらの化学的還元後に、これらは、ＤＮＡオリゴヌクレオチドがフォールディングする間にクラスターを形成する。フォールディングされたＱＣは、例えば、細胞、器官または生物のゲノムにおいて、標的ＤＮＡ配列を認識することができ、これに結合することができる突出一本鎖テールを有する（図１を参照されたい）。
【０００７】
したがって、本開示の一態様は、細胞のゲノムにおけるインビトロ、エキソビボまたはインビボでの標的核酸の改変のための方法であって、
（ｉ）改変される標的核酸配列を提供すること、
（ｉｉ）核酸および金属ナノクラスターを含む予め構築された複合体を提供すること、
（ｉｉｉ）標的核酸に複合体を結合させること、
（ｉｖ）標的核酸に結合した複合体を電磁放射線に曝露することによって、標的核酸において１つまたは複数の一本鎖または二本鎖核酸切断を誘発すること
を含む方法に関する。
【０００８】
別の態様は、ヌクレオチド配列を有する標的ＤＮＡの改変／編集のための複合体および方法に関し、本方法で使用される複合体は、標的核酸に結合した複合体を電磁放射線に曝露することによって、標的核酸において１つまたは複数の一本鎖または二本鎖核酸切断を誘発するために、例えば、ハイブリダイゼーションによって、ＤＮＡ標的のヌクレオチド配列の一部に結合するヌクレオチド配列、および金属ナノクラスターを含むヌクレオチド配列を含む。
【０００９】
開示される方法は、現在利用可能な最も一般的なＧＥ技法の主な欠点のうちの１つであるオフターゲット効果を低減する、またはさらには除去するといった、いくつかの技術的利点を有する。これは、光のような電磁放射線が特定の波長、エネルギーおよび強度でＱＣに当たっていない限り、ＱＣによって誘導される制御されない突然変異がないという事実による。ＱＣに当たっている電磁放射線パルスはまた、例えば、標的生物のゲノムの望まれない領域への損傷を防止するために、できるだけ短く維持されるべきである。
【００１０】
本開示を詳細に説明する前に、本開示は、本開示の特定の態様に限定されないことを理解されたい。本明細書で使用される用語は、特定の態様のみを説明することを目的とし、限定を意図したものではないことも理解されたい。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、文脈において別段明記しない限り、単数および／または複数の意味を含むことに留意されたい。さらに、数値によって区切られたパラメーター範囲が与えられる場合、その範囲は、これらの制限値を含むとみなされることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】還元金属原子とＤＮＡの自己構築による金属−ＤＮＡ量子クラスター（ＱＣ）の生成を示す図である。
【図２】ＱＣに基づく光誘導性ゲノム編集の概略図である。図は、標的ＤＮＡ中の所望の位置でＤＮＡ切断を誘発することができる例示的反応として、ＱＣに当たっている電磁放射線によって引き起こされるエネルギー共鳴効果および低エネルギー電子トンネリングを示す。
【図３】１０ｍｅｒ〜２０ｍｅｒまでのオリゴヌクレオチド配列をスクリーニングすることによる、ｅｙｆｐ遺伝子内のＡ／Ｔリッチ領域の特定および選択を示す図である。赤色の番号は、本発明のＱＣの設計および合成のために選択されるＡ／Ｔリッチ領域を示す。
【図４】ストレプトアビジン−ビオチン媒介性磁気分離による一本鎖ｅｙｆｐ遺伝子断片の単離のゲル電気泳動解析を示す図である。Ａ）フォワード方向の一本鎖遺伝子断片の単離；Ｂ）リバース方向の一本鎖遺伝子断片の単離。Ｍ＝ウルトラローレンジマーカー；１＝未結合二本鎖ｅｙｆｐ遺伝子断片；２〜４＝ストレプトアビジン−ビオチン捕獲後の第１、第２および第３の洗浄画分；５〜７＝ビオチン標識されていない一本鎖ｅｙｆｐ  ＤＮＡの放出を示す、第１、第２および第３の変性および洗浄画分。
【図５】標的一本鎖ｅｙｆｐ遺伝子断片（ｓｓＤＮＡ）への量子クラスターＱＣ＿６の結合研究の蛍光分光法解析を示す図である。曲線は、制御された温度条件下での２時間３０分のインキュベーション後の、ＤＮＡなしで、または磁気ビーズに固定化されたフォワード（ｆｗ）もしくはリバース（ｒｅｖ）方向の一本鎖ＤＮＡとともにインキュベートしたＱＣ＿６に対する最大励起波長で得られた放射スペクトルを示す。０分のまたは２時間３０分のインキュベーション後のＤＮＡを有さないＱＣ＿６の参照シグナルと比べたＱＣ＿６＋ｆｗ  ｓｓＤＮＡの蛍光の減衰は、標的遺伝子へのＱＣの結合の徴候を示す。
【図６】ＱＣ結合の蛍光顕微鏡解析を示す図である。上部パネルは、固定化されたフォワード（Ｆｗ）またはリバース（Ｒｅｖ）鎖を有する、および有さない、ストレプトアビジンでコーティングしたビーズの蛍光共焦点顕微鏡画像であり、この画像は、ＱＣ＿６の存在または非存在下での２時間３０分のインキュベーション後に取得した。下部パネルは透過光画像である。本実験全体を通して使用される照射条件下におけるビーズの固有の自家蛍光を排除するために、ｓｓＤＮＡを有さずかつＱＣを有さない対照ビーズを解析した。
【図７】Ａ）ｅｙｆｐ遺伝子の核酸配列およびＢ）本開示の遺伝子編集研究のために選択された、太字で示された高いＡおよびＴパーセント組成を有する２つの接近した領域を含む、ｅｙｆｐ遺伝子の断片の核酸配列を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
本開示は、金属原子（例えば、＜２０個の原子）のクラスターと、その周りをフォールディングしている間にクラスターの自己構築を促進するＤＮＡまたはＲＮＡオリゴヌクレオチドのような核酸と、電磁放射線源、特に、特定の波長で金属クラスターの電子軌道上の電子を励起させることができる、または金属ナノクラスターの温度変化を誘発するための光源との組み合わせに基づく、標的ＤＮＡの改変／編集のための方法に関する。核酸は、例えば、改変される目的の遺伝子をコードする標的ＤＮＡまたはＲＮＡ配列に、例えば、相補性によって結合することができる、例えば、少なくとも１０塩基対長の短い配列を含むことができる。この方法は、インビトロ、無細胞抽出物またはインビボにおいて、理想的には、細胞、器官および微生物、植物、動物またはヒトを含めた生物において、一本鎖および二本鎖ＤＮＡならびに任意のタイプのＲＮＡを含めた核酸にコードされる遺伝情報の非常に特異的な改変を達成することを目標とする。
【００１３】
本開示の方法は、細胞のゲノムにおけるインビトロ、エキソビボまたはインビボでの標的核酸の改変のための方法であって、
（ｉ）改変される標的核酸配列を提供すること、
（ｉｉ）核酸および金属ナノクラスターを含む予め構築された複合体を提供すること、
（ｉｉｉ）標的核酸に複合体を結合させること、
（ｉｖ）標的核酸に結合した複合体を電磁放射線に曝露することによって、標的核酸において１つまたは複数の一本鎖または二本鎖核酸切断を誘発すること
を含む方法に関する。
【００１４】
いくつかの有利な実施形態では、核酸および金属ナノクラスターを含む予め構築された複合体は、金属−ＤＮＡ−量子クラスター（ＱＣ）とも呼ばれる。そのようなＱＣの使用は、本開示による方法の中心となる。従来技術では、そのようなクラスターは、最近の総説（Tao Y.,Li M.,Ren J.,Qu X.(2015)Metal nanoclusters:novel probes for diagnostic and therapeutic applications Chem.Soc.Rev.44:8636-8663/Liu J.J.,Song X.-R.,Wang Y.-W.,Zheng A-X.,Chen G.N.,Yang H.H.(2012)Label-free and fluorescence turn on aptasensor for protein detection via target-induced silver nanoclusters formation.Anal.Chim.Acta 749:70-74.）で報告されたように、例えば、数ある中でも、一本鎖核酸上の配列を特異的に認識する可能性を含めたいくつかの用途に適している蛍光性ナノ複合ツールとして文献に記載されている。しかし、ゲノム編集のためのＱＣの使用は、まだ記載されていない。
【００１５】
ＱＣの合成は、従来技術に記載されている（Petty J.T.,Zheng J.,Hud N.V.,Dickson R.M.(2004)DNA-templated Ag nanocluster formation.J.Am.Chem.Soc.126:5207-5212、およびVosch T.,Antoku Y.,Hsiang J.C.,Richards C.I.,Gonzalez J.I.,Dickson R.M.(2007)'Strongly emissive individual DNA-encapsulated Ag nanoclusters as single-molecule fluorophores'、Proc.Natl.Acad.Sci.104:12616-12621）。
【００１６】
特に、本開示の点から見た「金属ナノクラスター」は、電子のフェルミ波長に近い物理的サイズ（金および銀について約０．５ｎｍ）を有する小数（例えば、２〜３０原子）の貴金属原子（例えば、金または銀原子）のコレクションである。金属原子は、シトシンのＮ３およびグアニンのＮ７を含めて、ＤＮＡの窒素原子に親和性を有し得る。特に、本開示による複合体中の金属ナノクラスターは、少なくとも２個の原子、より好ましくは２〜３０個の原子、さらにより好ましくは２〜１４個の原子を含む。
【００１７】
いくつかの有利な実施形態では、複合体中の金属ナノクラスターは、少なくとも２個の金属原子を含む。特に、複合体中の金属ナノクラスターは、限定されないが、銀、金または白金原子のような貴金属原子を含む遷移金属、限定されないが、ガリウムおよびタリウム原子を含むポスト遷移金属、限定されないが、アンチモンおよびテルル原子を含むメタロイド、限定されないが、ランタン、テルビウム、イッテルビウム、ガドリニウム原子を含むランタノイド原子、限定されないが、セシウムおよびルビジウム原子を含むアルカリ金属、ならびにまたはこれらの金属クラスのうちのいずれか１つに属する２つ以上の元素の組み合わせからなる群から選択される金属である。
【００１８】
いくつかの有利な実施形態では、得られたオリゴヌクレオチド鋳型化銀ナノクラスターはフルオロフォアの多用途セットである。これらは、生細胞イメージング、特定の金属イオンの検出、および一塩基多様性の特定を含めた、様々な用途に使用されている。これらのＤＮＡ／Ａｇ  ＮＣは非常に小さく、調製が比較的簡単であり、高いまたは調節可能な生体適合性を示す。これらは、一般に使用される有機色素よりもはるかに優れた光安定性を有し、数倍明るい可能性もある。有機色素および光ルミネセンスナノ結晶と異なって、これらは、銀酸化／還元またはナノクラスター（「ＮＣ」）再グループ化にかけられ、これによって、異なるＮＣ種の間で変換がもたらされる。これらの異なる種は、異なる色を有し得る。異なるＮＣ種の間の変換はよく理解されていないが、可逆的であり得、時間、温度、酸素および塩含有量を含めたいくつかの因子に依存する。
【００１９】
「核酸」はデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーであり、これは、天然に存在するヌクレオチドと同様の方法で核酸分子にハイブリダイズする天然ヌクレオチドの類似体を含むことができる。特定例では、核酸分子は一本鎖（ｓｓ）のＤＮＡまたはＲＮＡ分子、例えば、プローブまたはプライマーである。別の特定例では、核酸分子は二本鎖（ｄｓ）核酸、例えば、標的核酸である。改変核酸の例は、骨格が変化したもの、例えば、ペプチド核酸である。特に、複合体に含まれる核酸は、ＤＮＡ、またはＲＮＡ、またはＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、または限定されないが、ペプチド核酸（ＰＮＡ）もしくはロックド核酸（ＬＮＡ）もしくはトレオース核酸（ＴＮＡ）もしくはグリコール核酸（ＧＮＡ）もしくはモルホリノもしくはこれらの誘導体を含む合成核酸の任意の他の形態である。特に、標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡである。
【００２０】
本明細書で使用されるように、および上述されるように、「遺伝子改変」または「ゲノムを変化させる」または「標的核酸の改変」は、本開示による方法を使用して、遺伝子／核酸配列が除去または「ノックアウト」され得ることを意味する。特に、本開示は、特に、哺乳類または植物のゲノムのような真核生物のゲノムを、非トランスジェニックストラテジーを使用して、改変／編集するための方法に関する。
【００２１】
いくつかの有利な実施形態では、複合体に含まれる核酸は、核酸の配列内に、または５’もしくは３’末端に、少なくとも１つの合成のまたは天然に存在する核酸塩基類似体を含み、核酸の機能化を目的とした任意のさらなる化学反応に適している。
【００２２】
いくつかの有利な実施形態では、複合体中の核酸は、ａ）標的核酸中の配列を認識し、この配列に結合する核酸配列、およびｂ）金属ナノクラスターの形成のための核形成配列を含む。したがって、複合体の一部としての核酸は、例えば塩基相補性によって結合することができ、それによって、ＤＮＡ標的のヌクレオチド配列の一部とハイブリダイズするヌクレオチド配列、および金属ナノクラスターを含むヌクレオチド配列を含む。
【００２３】
特に、複合体に含まれる核酸は、「核形成配列」、すなわち、鋳型金属ナノクラスターを形成するために、金属原子と結合または会合することができるヌクレオチド配列を有する。核形成ヌクレオチド配列を含む核酸分子部分は、核酸分子の「核形成部分」と称される。例示的核形成配列は、従来技術で既知である。金属ナノクラスターと相互作用し、ＤＮＡ鋳型化金属ナノクラスターを形成するのに有用な特定の核形成配列は本明細書に開示されている。前に述べたように、蛍光レポーターとして使用するための金属ナノクラスターの例、およびＤＮＡオリゴヌクレオチド上に鋳型化金属ナノクラスターを生成する方法は既知である。例えば、米国特許公開第２０１１０２１２５４０号明細書および米国特許公開第２０１４０３４９２８９号明細書を参照されたい。
【００２４】
いくつかの実施形態では、複合体の核酸の核形成配列は、金属ナノクラスターの形成を支持する核形成配列として働くことができる、核酸中の二次構造の形成に関与する、限定されないが、少なくとも１つのｉ−モチーフ、またはグアニン四重鎖モチーフ、またはｇ−モチーフ、または任意の他のモチーフを含めた核酸モチーフにフォールディングすることができる。
【００２５】
いくつかの有利な実施形態では、核酸および金属ナノクラスターを含む予め構築された複合体は、単離された複合体である。「単離された」複合体（例えば、ＱＣ）は、実質的に、他の生物学的成分から分離されている、他の生物学的成分を除いて生成されている、または他の生物学的成分から精製されている。「単離された」核酸分子としては、標準的な精製方法によって精製された核酸分子、ならびに化学合成された核酸分子が挙げられる。単離されたものは、絶対的な純度を必要とせず、少なくとも５０％単離された、例えば、少なくとも７５％、８０％、９０％、９５％、９８％、９９％、またはさらには１００％単離された核酸分子を含むことができる。
【００２６】
前に述べたように、本開示の実施形態は、細胞のゲノムにおけるインビトロまたはエキソビボまたはインビボでの標的核酸の改変のための方法であって、
（ｉ）改変される標的核酸配列を提供すること、
（ｉｉ）核酸および金属ナノクラスターを含む予め構築された複合体（今後は、複合体と称される）を提供すること、
（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション、または限定されないが、例えば水素結合の形成を含む、任意の他の化学相互作用によって、標的核酸に複合体を結合させること、
（ｉｖ）標的核酸に結合した複合体を電磁放射線に曝露することによって、標的核酸において１つまたは複数の一本鎖または二本鎖核酸切断を誘発すること
を含む方法に関する。
【００２７】
本開示による方法は、限定されないが、電磁放射線と相互作用し、特に蛍光を発する、すなわち、外部の光源からの光子を吸収し、クラスターを取り囲む環境中にこれらの光子を放射するというＱＣの固有の特性により起こり得る量子効果に主に基づく。特に、考慮されるべき一態様は、ＱＣに接近して位置する場合に、標的遺伝子のＤＮＡ塩基の電子へのエネルギー移動をもたらすことができる共鳴効果によってエネルギー移動を誘発するという、これらのクラスターの特性である。その結果は、核酸の骨格を不安定にし得、それによって、核酸のリン酸と糖部分の間で切断の形成を誘発する、標的遺伝子（または、ＱＣが標的化ＲＮＡである場合はＲＮＡ転写産物）の核酸の塩基への一種のカスケード様エネルギー移動である。ガンマ線、Ｘ線または高エネルギーの短ＵＶ放射線などの電離放射線は、ＤＮＡ切断を誘発することが報告されており、例えば、がん患者における放射線療法の基礎であり、または自然ＤＮＡ突然変異の原因である。これらの放射線は、制御されない様式でＤＮＡ切断を引き起こす可能性があり、したがって、本発明の範囲には適さない。したがって、本発明の電磁放射線は電離放射線を含まない。本発明者らの方法は、目的の遺伝子の特定の領域に結合した場合にＱＣを使用して、光パルスによってＤＮＡ切断を誘発するために、これらの現象を利用することができるが、これらの現象によって限定されない。
【００２８】
いくつかの有利な実施形態では、核酸および金属ナノクラスターを含む予め構築された複合体は、ＤＮＡ標的のヌクレオチド配列の相補的配列にハイブリダイズすることにより、標的核酸に結合する。複合体のそのような相補的結合は、ある核酸分子の塩基が別の核酸分子の塩基と水素結合を形成する場合に生じる。通常は、塩基アデニン（Ａ）はチミジン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）に相補的であり、一方で、シトシン（Ｃ）はグアニン（Ｇ）に相補的である。例えば、あるｓｓＤＮＡ分子の配列５’−ＡＴＣＧ−３’は、別のｓｓＤＮＡの３’−ＴＡＧＣ−５’に結合して、ｄｓＤＮＡを形成することができる。この例では、配列５’−ＡＴＣＧ−３’は３’−ＴＡＧＣ−５’の逆相補鎖である。核酸分子は、各分子のすべての塩基の完全な水素結合があるとは限らない場合でさえ、互いに相補的であり得る。例えば、相補的核酸配列をともなうハイブリダイゼーションは、すべてではなくいくつかのヌクレオチド位置で相補体が結合するであろう異なるストリンジェンシーの条件下で生じ得る。
【００２９】
用語「ハイブリダイゼーション」は、ＤＮＡ、ＲＮＡの２つの鎖の相補性領域の間の、またはＤＮＡとＲＮＡの間の塩基対の形成であって、それによって、例えば二本鎖分子が生成される塩基対の形成と定義される。特定の程度のストリンジェンシーをもたらすハイブリダイゼーション条件は、ハイブリダイゼーション方法の性質ならびにハイブリダイズする核酸配列の組成および長さによって変動する。一般に、ハイブリダイゼーションの温度およびハイブリダイゼーション緩衝液のイオン強度（例えば、Ｎａ＋濃度）は、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを決定する。特定の程度のストリンジェンシーを達成するためのハイブリダイゼーション条件に関する計算は、Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, second edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Plainview, N.Y. (chapters 9 and 11)で論じられている。
【００３０】
典型的には、ＤＮＡ標的のヌクレオチド配列の一部と相補し、ハイブリダイズすることができる複合体ヌクレオチド配列に含まれる核酸の部分は、標的核酸分子に相補的である、少なくとも約１０個の連続的なヌクレオチド、例えば、少なくとも約１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９または約５０個の連続的なヌクレオチド、例えば、２０〜７０個のヌクレオチド、２０〜６０個のヌクレオチド、２０〜５０個のヌクレオチド、２０〜４０個のヌクレオチドまたは２０〜３０個のヌクレオチドを含む。プローブはまた、例えば、２０、２５、３５、４０、５０、７５または１００ヌクレオチドの長さ以下の最大長のものであり得る。配列の特異性は、典型的には、相補的配列上の相補的ヌクレオチドの数の増加とともに増大する。特に、複合体中の核酸は、最低でも１０ヌクレオチドの長さを含むが、最大ヌクレオチド配列長に限定されない。
【００３１】
いくつかの有利な実施形態では、複合体の核酸に含まれ、標的ＤＮＡへの結合に関与する核酸配列は、標的核酸内の配列に相補的であるか、特異的に結合する少なくとも５個の連続的なヌクレオチドを含む。
【００３２】
いくつかの有利な実施形態では、複合体の核酸に含まれ、標的ＤＮＡへの結合に関与する核酸配列は、標準のプリン／ピリミジンワトソン−クリック水素結合の代わりに、プリン／プリンおよびピリミジン／プリンフーグスティーンならびに逆フーグスティーン型水素結合も形成される三重らせん構造によって、結合することができる。本発明の方法は、三重らせん構造の形成に関する文献に記載されている規則に従ったオリゴヌクレオチドの設計を含む。オリゴヌクレオチドは、三重らせん構造の形成を促進することが報告されている塩基類似体をその配列中に含むことができる。
【００３３】
ＤＮＡ上に金属ナノクラスターを形成するために、いくつかの例では、正に荷電した金属イオン（例えば、Ａｇ＋原子）が、最初に、溶液中でｓｓＤＮＡ（例えば、シトシンヌクレオチド）に自発的に結合する。次いで、還元体（例えば、水素化ホウ素ナトリウム）が添加されて、原子の電荷が低減され（例えば、Ａｇ＋からＡｇ（０））、その後、金属原子「クラスター」が形成される。ｓｓＤＮＡは、金属クラスターが「制御不能に増殖する」のを防止する。
【００３４】
いくつかの有利な実施形態では、標的核酸は、原核細胞または真核細胞に由来するか、原核細胞または真核細胞のゲノム中に存在する。本開示の方法で改変することができる例示的真核性標的核酸は、哺乳動物の核酸、例えば、げっ歯類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット、有蹄動物、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウシ、ネコ、イヌ、霊長類、ヒトまたは非ヒト霊長類由来の核酸であり得る。植物ＤＮＡも本開示に従って改変することができる。例えば、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、トウモロコシ、ソルガム、オートムギ、コムギ、コメ、キャノーラまたはダイズ由来の核酸を改変することができる。藻類、線虫、昆虫（例えば、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）、カ、ショウジョウバエ、ミツバチまたはクモ）、魚、爬虫類、両生類および酵母などの他の生物由来の／中の標的核酸を改変することができることが、さらに意図される。いくつかの有利な実施形態では、標的核酸は、限定されないが、タバコ（Nicotiana tabacum）またはベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）のようなナス科（Solanaceae family）由来の細胞を含めた植物細胞のゲノム中に存在するか、こうしたゲノムに由来する。他の実施形態では、細胞は、限定されないが、腫瘍細胞、幹細胞、および多細胞生物の任意の組織または器官における細胞の群からの細胞を含めた、ヒトまたは動物の細胞である。他の実施形態では、標的ヌクレオチド配列は、ウイルス中に存在するか、ウイルスに由来する。
【００３５】
本開示の方法で標的核酸を改変することができる例示的細胞型としては、血液細胞、例えば、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、白血球、赤血球、マクロファージもしくは好中球；筋細胞、例えば、骨格細胞、平滑筋細胞もしくは心筋細胞；生殖細胞、例えば、精子もしくは卵子；上皮細胞；結合組織細胞、例えば、アディポサイト、線維芽細胞または骨芽細胞；ニューロン；星状細胞；間質細胞；腎細胞；膵細胞；肝細胞；またはケラチノサイトが挙げられる。
【００３６】
例えば、造血幹細胞または造血幹細胞から生じる細胞、例えば、赤血球、Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ナチュラルキラー細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージまたは血小板を含めて、特定の発達レベルでＤＮＡおよび／またはＲＮＡのような標的核酸を改変することができる細胞。他の細胞としては、骨髄間質細胞（間葉系幹細胞）もしくはそれから発達する細胞、例えば、骨細胞（オステオサイト）、軟骨細胞（コンドロサイト）、脂肪細胞（アディポサイト）もしくは他の種類の結合組織細胞、例えば、腱に見られるもの；神経幹細胞もしくはそれを生じさせる細胞（例えば、神経細胞（ニューロン）、星状細胞もしくは乏突起膠細胞が含まれる）；上皮幹細胞もしくは上皮幹細胞から生じる細胞、例えば、吸収細胞、杯細胞、パネート細胞、もしくは腸内分泌細胞、皮膚幹細胞、表皮幹細胞、または濾胞幹細胞が挙げられる。一般に、限定されないが、胚性幹細胞、成体幹細胞、全能性幹細胞または多能性幹細胞を含めた、任意のタイプの幹細胞を改変することができる。
【００３７】
しかし、細胞がヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）である場合は、ｈＥＳＣはヒト胚性幹細胞系統に由来し、ここでヒト胚性幹細胞系統は、ヒト胚が破壊されるプロセスによって得られていない。いくつかの有利な実施形態では、細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞もしくはｉＰＳＣとしても知られる）またはｉＰＳ細胞のような多能性細胞に由来する細胞である。特に、多能性細胞に由来する細胞は分化細胞である。
【００３８】
特に、本開示は、ゲノム工学のための、本開示による方法の使用に関し、但し、該使用が、手術または療法によるヒトまたは動物の体の治療のための方法ではないこと、および該使用が、ヒトの生殖細胞系の遺伝的同一性を改変するためのプロセスではないことを条件とする。いくつかの有利な実施形態では、該ゲノム工学は、真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変すること、真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変すること、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成すること、または遺伝子をノックアウトすることを含む。
【００３９】
いくつかの有利な実施形態では、本開示による方法は、動物におけるインビボ適用ではない。いくつかの有利な実施形態では、本開示による方法は、ヒトの生殖細胞系の遺伝的同一性を改変するプロセスではない。いくつかの有利な実施形態では、細胞はヒト胚に由来しない。
【００４０】
いくつかの有利な実施形態では、異なる配列の核酸および金属ナノクラスターを含む予め構築された１種より多い複合体が提供され、これは、標的核酸に結合して、標的核酸に結合した複合体を電磁放射線に曝露した後に、標的核酸の異なる位置で、１つまたは複数の一本鎖または二本鎖核酸切断を誘発する。
【００４１】
いくつかの有利な実施形態では、標的核酸における１つまたは複数の一本鎖または二本鎖核酸切断は、標的核酸に結合した複合体を電磁放射線に曝露することによって誘導される。
【００４２】
電磁放射線の例は、限定されないが、近紫外、可視、近赤外、赤外波長、またはマイクロ波、または電波を含む。特に、電磁放射線は非電離放射線である。
【００４３】
いくつかの有利な実施形態では、電磁放射線は、限定されないが、水銀もしくはキセノンアークランプ、金属ハライドアークランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、または限定されないが、紫外光から赤外光までの幅広い波長をカバーする連続波長放射もしくはパルス化放射をともなう固体または気体レーザーを含めた任意の光増幅誘導放出放射線装置（Light Amplification Stimulated Emission Radiation device）（レーザー）、またはマイクロ波もしくは電波供給源を含む群から選択される任意の放射装置から生じる。特に、電磁放射線の供給源は、連続波および／またはパルス化レーザーまたは放射線の任意のパルス化供給源である。
【００４４】
本開示による方法は、いくつかの研究分野および産業用途に適用することができ、これらには、限定されないが、
−  形質の質、例えば、飼料および食品のための、またはエネルギー生産のための、バイオマスおよび原材料生産のその能力の向上を目的とした、植物／作物の、
−  例えば、生物工学的用途のための酵素を含めたタンパク質、または生物医学的用途のためのワクチンもしくは抗体、または産業用途に関連する代謝物の産生のその能力を向上させるための、微生物の、
−  疾患を理解し、疾患と闘うことに対して、または細胞の機能不全を引き起こし、したがって病的状態を誘発する突然変異を修正することに対して、非常に高い関連性を有する生物学的経路を精査することを目的とした、動物またはヒト細胞の
ゲノム編集が含まれる。
【００４５】
ＤＮＡ切断はまた、細胞生物学研究に対して、または分子生物学用途、例えば、遺伝子機能の解明、例えば制限酵素に取って代わることによってインビトロで核酸の遺伝子操作を達成する可能性、分子クローニングアプローチにおけるその使用に関する制限などに対して、ソリューションを提供するバイオテクノロジー企業にも関係する。
【００４６】
これらは、この技術が提供することができる、生命科学における幅広い産業用途を示す数少ない例に過ぎず、こられは、限定されないが、現在の他のゲノム編集技術に関係するすべての用途も含む。
【実施例】
【００４７】
[実施例１]
ＱＣの合成
ＱＣの合成は、以下のステップ１〜１５に従って行う。
【００４８】
１．ＱＣの合成のためのオリゴヌクレオチドの適切な構造、例えば、直鎖状またはステムループまたはヘアピン構造を特定する。本明細書で提供される実施例では、直鎖状またはヘアピン構造のいずれかのオリゴヌクレオチドを選択する（配列の詳細については、以下のポイント２および３を参照されたい）。しかし、本明細書で提示する構造は、それに限定されるとみなされるべきではなく、例えば、オリゴヌクレオチドの５’末端と３’末端の両方にある、２つの直鎖状構造、２つのループ、または１つのループおよび１つの直鎖状構造の組み合わせも含むことができる。さらに、オリゴヌクレオチド配列内のループ構造も含むことができ、ここでは、ＱＣの核形成配列はオリゴヌクレオチドの中央に存在し、アニーリング領域は核形成配列の上流および下流に隣接している。そのような構造では、核形成配列は直鎖状モチーフでもよく、または例えば、ＱＣのフォールディングの際に、アニールしてヘアピンループ構造を形成する２つの相補性領域を含むように設計されてもよく、ここでは、アニーリング領域は、ヘアピンループ核形成配列の５’側および３’側、すなわち、上流および下流に位置する。同様のＱＣ構造が当業者に既知である。
【００４９】
２．以下を含むＱＣのＤＮＡ配列を選択し、設計する：
ａ．限定されないが、優先的にシトシンまたはグアニン（例えば、３〜１２個までのシトシンまたはグアニン）（両方とも、例えばＡｇ＋イオンに対して高親和性を有する）から構成される核形成配列。本発明の目的のために、核形成配列は以下の２つのストラテジーに従って設計することができる。
ｉ．核形成配列は編集される遺伝子中に存在せず、前に述べたようにシトシンから、またはシトシンとグアニンの組み合わせから、または例えば、定義された蛍光特性を有する、文献で報告された核形成配列に由来するより複雑なモチーフから優先的に構成され得る。本明細書で提供される実施例では、核形成配列は、８個のシトシンから構成される（配列情報について、以下のポイントｃ．を参照されたい）。さらに、例として、明るく安定なＱＣを生成することができる４ヌクレオチドすべての混合組成を有する配列も含まれる（以下のポイントｃ．を参照されたい）。
ｉｉ．核形成配列は目的の遺伝子中に存在し、５’または３’末端のいずれかでアニーリング領域に隣接している。本ストラテジーについては、アニーリング領域に隣接する領域の組成を考慮することが重要あり、したがって、蛍光性ＱＣの合成をもたらす組み合わせを特定するために、異なるアニーリング領域および核形成領域が試験されなければならない。そのようなＱＣ組成の例を以下に提供する（ポイントｃ．ＱＣ＿７を参照されたい）。
【００５０】
ｂ．例えば、相補的塩基対形成および水素結合の形成によって標的核酸へのＱＣの結合を確実にするための、標的核酸の組成に基づくＤＮＡ結合配列。ＤＮＡ結合配列は、好ましくは、アデニンおよび／またはチミン（Ａ／Ｔ）から構成されるべきである。したがって、本発明の範囲においては、Ａ／Ｔリッチ配列が標的遺伝子中で特定されるべきである。理想的には、これらのＡ／Ｔリッチ配列は、目的の遺伝子中に、およびおそらくそのＤＮＡが編集される細胞の全ゲノム中に１度より多く存在すべきでない。Ａ／Ｔに富む遺伝子領域は、プライマー設計のための標準的なソフトウェアを使用して特定し、選択基準として、長さおよびパーセントでのヌクレオチド組成を設定することができる。例えば、限定されないが、６０％閾値に設定されたＡ／Ｔパーセント組成を有する、限定されないが、１０〜２０塩基までの長さが、Ａおよび／またはＴに富む配列が特定されるまで、オリゴヌクレオチドの長さを変えることによって、毎回、標的遺伝子に対して、反復的にスクリーニングされる。上に提供される長さは例示的であり、Ａ／Ｔパーセント組成の閾値が満たされる限り、より長いオリゴヌクレオチド長を使用して標的遺伝子をスクリーニングすることもできるので、限定としてみなされるべきでない。したがって、Ａ／Ｔ出現のパーセントはまた、３０％〜８０％までの、より好ましくは６０％〜７０％までの、さらにより好ましくは少なくとも６０％の閾値に設定することができる。Ａ／Ｔリッチ領域を特定した後、ＱＣを構成するアニーリング領域の設計のための最終的な選択は、２つ以上のＡ／Ｔリッチ領域が、例えば、Ａ／Ｔ組成が６０％の閾値を下回る領域によって分離された、隣同士に位置する遺伝子領域が好ましいことを意味する近接基準に基づくべきである。２つ以上のそのようなＡ／Ｔリッチ配列を示す遺伝子領域は、より多くのＱＣを互いに極めて近接してアニールするのに適し得るので、好ましい。
【００５１】
本明細書で提供される実施例では、改変される標的遺伝子は高感度黄色蛍光タンパク質（ｅｙｆｐ）（配列番号１２）である。この遺伝子について、６０％に設定された閾値を上回る、Ａおよび／またはＴのパーセント組成を示す領域を図３（１から８までの番号が付けられた領域）に示す。ＱＣのアニーリング領域の設計のために選択した領域は、２つのＡ／Ｔリッチ領域の近接基準が満たされる、配列番号１２のヌクレオチド３６５から始まりヌクレオチド５１４までに位置する（配列番号１３について太字で強調され、図３において番号５＋６および７で示される領域）。
【００５２】
ｃ．ポイントａおよびｂに記載される手順に基づいて、いくつかのオリゴヌクレオチドを設計した。本明細書で提供されるｅｙｆｐ遺伝子実施例について、ポイントａおよびｂの基準に従って選択したオリゴヌクレオチドを以下の表１および２に列挙する：
【００５３】
【表１】
2021508450.tif 000003
【００５４】
【表２】
2021508450.tif 000004
【００５５】
３．上記のポイント１．〜２．で決定した配列を有するオリゴヌクレオチドを合成する。これは、通常は、合成サービスを提供しており、高い純度および完全性を有するオリゴヌクレオチドを納品することができる専門企業によって達成される。後者の要件は、本発明の方法の成功に非常に重要である。
【００５６】
４．ヌクレアーゼフリーの滅菌した脱イオン水または緩衝液、優先的に、中性またはわずかに酸性またはわずかにアルカリ性のｐＨの緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ８．０）中にオリゴヌクレオチドを溶解して、１００または５００μＭの濃度にする。
【００５７】
５．ヌクレアーゼフリーの水またはヌクレアーゼフリーの水で調製した緩衝液（例えば、リン酸ナトリウム緩衝液または前に述べたような他の緩衝液）中にオリゴヌクレオチドを希釈して、適切な濃度（例えば、２０μＭ）にする。
【００５８】
６．オリゴヌクレオチドの、特に、オリゴヌクレオチドの核形成領域の長さおよび組成に従って、金属イオンの濃度を選択する。典型的には、例えば核形成領域中のシトシンあたり１〜２モルの金属のモル比が選択される。より典型的には、オリゴヌクレオチドのモルあたり６〜１２モルまでの金属の一般比が使用される。より好ましくは、機能的ＱＣの形成を誘導するのに最も適したものを特定するために、いくつかの比が試験されることになる。一般に、アニーリング領域のいくつかのヌクレオチドもＱＣの形成に寄与し得る。これは、オリゴヌクレオチドごとに異なる可能性があり、ケースバイケースで試験すべきである。本明細書で提供される実施例では、金属溶液のモル濃度は、以下の式：
金属モル濃度＝溶液中のオリゴヌクレオチドのモル濃度×オリゴヌクレオチドの長さ×所望の金属対塩基のモル比
に従って、オリゴヌクレオチドの全長に基づいて計算する。
【００５９】
例えば、２４塩基から構成されるオリゴヌクレオチドの１０μＭ溶液に対して０．３という銀モル濃度対塩基比を得るために、溶液中の銀のモル濃度は以下のように計算すべきである：２４塩基×１０μモル／塩基×０．３モル比＝７２μモルの銀。例えば１ｍＭの硝酸銀原液から開始する場合、７２μＭ溶液を達成するために、５０μＬの反応量に対して、以下の容量の１ｍＭ硝酸銀をオリゴヌクレオチド溶液に加えるべきである：μＬ銀＝７２μＭ×５０μＬ／１０００μＭ＝３．６μＬ。
【００６０】
本明細書で提供される実施例では、最も蛍光性のＱＣの形成を誘導するものを特定するために、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．８および１の銀対塩基のモル比を試験した。本発明の範囲では、蛍光強度および安定性の好ましい特性を有するＱＣは、最高の銀対塩基比が０．４〜０．６の範囲であった。
【００６１】
７．ポイント６で提供した式に従って計算した選択した濃度の金属イオン（例えば、硝酸銀）の溶液を調製する。水に、またはオリゴヌクレオチドが溶解される同じ緩衝液に金属イオンを溶解する。中性またはわずかに酸性のｐＨを有する緩衝液が好ましく、例えば、限定されないが、例えば、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液、ｐＨ７．０、または２０ｍＭ酢酸アンモニウム緩衝液ｐＨ６．９、または３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ２０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液ｐＨ７．４、または１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−酢酸緩衝液ｐＨ８．０、または３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ  ２０ｍＭ酢酸カリウムｐＨ７．４である。
【００６２】
８．室温で少なくとも１５分間撹拌することによって、金属イオン溶液をオリゴヌクレオチドと混合する。金属原子とオリゴヌクレオチドの間の反応時間は、金属種に厳密に依存する（例えば、銀については１５分で十分であるが、金原子ついては数時間が必要とされ得る）。
【００６３】
９．還元剤の溶液を調製する。典型的には、還元剤は金属イオンに基づいて選択される。より典型的には、還元剤は水素化ホウ素ナトリウムである。還元剤は、滅菌したヌクレアーゼフリーの脱イオン水中で、またはオリゴヌクレオチドおよび金属イオンが溶解される同じ緩衝液中で、毎回新しく調製する。典型的には、還元剤の濃度は金属のモルあたり１モルである。
【００６４】
１０．反応混合物に還元剤をすばやく加え、室温で少なくとも１５分間撹拌する。反応の長さは金属に厳密に依存する（上記のポイント８を参照されたい）。典型的には、反応は、室温または４℃で２時間〜２４時間まで行う。室温で行う反応は４℃で一晩で完了し得る。
【００６５】
１１．反応が首尾よく生じたかどうかを評価するために、合成したＱＣを蛍光分光法によって特性評価する。ＱＣは特定の波長の光によって励起させられ、より長い波長の光を放射するべきである。励起および放射光は、それぞれの構築されたＱＣについて測定されるべきである。本明細書で提供される実施例に関して、最大蛍光励起および放射の波長を含めて、得られたＱＣの蛍光特性を以下の表３に示す。
【００６６】
【表３】
2021508450.tif 000005
【００６７】
１２．透析、脱塩、または適切な分子量カットオフを用いるダイアフィルトレーションによって、ＱＣを精製する。典型的には、３ｋＤａの分子量カットオフが本明細書に記載のＱＣに適する。それにもかかわらず、ＱＣの合成のために選択されるオリゴヌクレオチドの長さおよび分子量に応じて、１ｋＤａ、２ｋＤａまたはそれ以上の分子量カットオフのフィルターが必要とされる。このステップは、未反応試薬、例えば、金属イオンおよび還元剤の残留物をほぼ完全に除去するために必要とされ、ＱＣが合成される緩衝液を交換するために使用することもできる。ＱＣの濾過は、フィルターの製造者によって提供される指示書に基づいて行う。本明細書で提供される実施例では、ＱＣは、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）から構成される膜を有する３ｋＤａの分子量カットオフフィルターを使用して精製する。膜は、４００μｌのＤＮＡｓｅフリー蒸留水で予め平衡化する。平衡化は、フィルターチューブを５，０００ｇで１０分間遠心することによって行う。ＱＣを水または合成に使用した同じ緩衝液で１００μＬの体積にし、これを、平衡化したダイアフィルター中で６〜８分間、室温または４℃で５，０００ｇで濾過する。精製目的のために、フィルターによって保持されるＱＣを同じ体積の水または合成に使用した緩衝液に再懸濁し、遠心分離を１回または２回繰り返す。緩衝液交換を行うために、遠心分離した後にフィルターの上部に保持されるＱＣの体積を測定し、１／１０量の新しい緩衝液を加え、試料を５，０００ｇで再び遠心分離する。新しい緩衝液の１００％の濃度が達成されるまで、新しい緩衝液の濃度を毎回高めることによって、このステップを繰り返す。本明細書で提供される実施例では、緩衝液交換は、５ステップで緩衝液の濃度を上げることによって行い、１／１０、１／５、１／２の新しい緩衝液を含む溶液中にＱＣを希釈し、純粋な緩衝液中に最後に２回ＱＣを希釈する。これらのステップを合わせると、ＱＣの合成に使用した緩衝液を、例えば、標的遺伝子中のアニーリング配列にＱＣをアニーリングさせるのにより適した異なる緩衝液と完全に交換することが可能になる。
【００６８】
１３．ＱＣのさらなる精製はその用途次第である。本発明の目的において、未反応のオリゴヌクレオチドは電磁放射線による処理に反応しないであろうから、ＱＣの絶対的な純度は必要とされない。
【００６９】
１４．ＱＣの蛍光特性を確証するために、精製したオリゴヌクレオチドの最終的な特性評価を行う。これによって、ＤＮＡ切断の形成を達成するためにＱＣが曝露されることになる、最も妥当な励起光を特定することが可能になる。
【００７０】
１５．ＱＣを４８時間まで４℃で保存する。この保存時間を越えると、ＱＣは、金属クラスターのアンフォールディングの結果として、蛍光の不安定性および喪失を示す可能性がある。一般に、ＱＣの最も効率的な能力は、ＱＣが新しく合成される場合に得られる。しかし、その安定性に応じて、ＱＣは、合成から２〜４日の間依然として使用することができ、合成から１週後でさえも例外的に安定なものであり得る。原則として、遺伝子編集のために使用するより前にＱＣの蛍光特性を調べることが推奨される。
【００７１】
[実施例２]
インビトロでのゲノム編集のためのＱＣの使用
ゲノム編集は、例えば、さらなるクローニングまたはサブクローニングステップのために、標的ＤＮＡの配列の所望の位置に一本鎖または二本鎖切断を導入する目的で、プラスミドまたは直鎖状ＤＮＡに対してインビトロで行うことができる。
【００７２】
インビトロでの核酸配列の編集は、以下のステップに従って行う。
【００７３】
１．改変される標的核酸配列の選択。これは、編集される核酸中で１度だけ存在する配列を特定するために、慎重に行う。核酸中の配列は、シトシンまたはグアニンの長いストレッチを含むべきでなく、大量のアデニンおよびチミンを優先的に含むべきである。ＱＣＳがハイブリダイズするアニーリング領域を含む標的配列を選択するためのガイドラインは、実施例１に記載されている。
【００７４】
２．標的核酸の選択した領域は、ＱＣのＤＮＡ結合領域の設計のための配列情報を提供している。オリゴヌクレオチドの設計およびＱＣの合成は、実施例１に記載される手順に従って行う。
【００７５】
３．実施例１で提供されるガイドラインに従って、ＱＣを精製し、特性評価する。
【００７６】
４．次いで、精製したＱＣをプラスミドＤＮＡまたは目的の遺伝子の直鎖化部分と、いくつかのモル比で、例えば、１モルＱＣ対１モル標的ＤＮＡ、または例えば、１００モルＱＣ対１モル標的ＤＮＡで混合し、両方とも適切な緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ緩衝液）に溶解されている。一般に、標的ＤＮＡに対してＱＣの大きなモル過剰が好ましい。
【００７７】
本明細書で提供される実施例に関して、ｅｙｆｐ遺伝子の一部（配列番号１３を参照されたい）を、全長遺伝子から、または人工的に合成した遺伝子断片から開始し、５’末端にビオチン標識を有する、および有さない以下のプライマーを使用して、ＰＣＲによって増幅する。
リバースプライマー：
Ｙｆ＿ｒ＿６４１−５’−ＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣ−３’
Ｙｆ＿ｒ＿６４１−Ｂ  ５’−／Ｂｉｏ／ＴＣＡＣＣＴＴＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣ−３’（Ｂｉｏ＝ビオチン）
フォワードプライマー：
Ｙｆ＿ｆ＿５４５−５’−ＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧ−３’
Ｙｆ＿ｆ＿５４５−Ｂ  ５’−／Ｂｉｏ／ＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＴＣＣＴＧ−３’（Ｂｉｏ＝ビオチン）
ＰＣＲ条件を以下に提供する：
【００７８】
【表４】
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【００７９】
ポリメラーゼはハイフィデリティーＱ５ポリメラーゼ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ）であり、各反応に対する鋳型の量は１０ｐｇであり、プライマーの濃度は１０ピコモルである。ＰＣＲ増幅に続いて、当業者に周知である標準的なプロトコールに従って、ビオチン標識されたフォワードまたはリバース鎖を有する二本鎖ＤＮＡをストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズに結合させる。結合に続いて、未結合ＤＮＡを除去するために、いくつかの洗浄ステップを行う。その後、ＤＮＡを変性させるために、結合した遺伝子断片を０．２Ｍ水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）溶液で２分間、２回処理する。磁気分離によって、一方のＤＮＡ鎖のみをビーズ上に維持し、ビオチン標識されていない相補鎖を除去することが可能である。残りのビオチン標識されていない一本鎖ＤＮＡを除去するために、０．１Ｍ  ＮａＯＨを使用する第３の変性／洗浄ステップおよびビーズの製造者によって推奨される緩衝液を使用するいくつかの洗浄ステップも含まれる。次いで、標準的なプロトコールを使用するゲル電気泳動によって、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズへのビオチン標識された遺伝子断片の結合の効率を確認する。本明細書で提供される実施例に関して、一本鎖ＤＮＡの結合および回収効率の結果をフォワード鎖とリバース鎖の両方について図４に示す（パネルＡおよびＢ）。
【００８０】
５．その後、一本鎖ＤＮＡを用いて、標準的なアニーリングプロトコールを使用して、標的ＤＮＡ配列へのＱＣの結合を確認する。選択した結合手順によっては、例えば、編集される標的核酸配列を含むプラスミドＤＮＡまたは直鎖状ＤＮＡを前もって十分に変性させることが必要であろう。これは、プラスミドまたは直鎖状標的ＤＮＡを９５℃で少なくとも５分間インキュベートすることによって達成される。その後、ＤＮＡを４℃に急速に冷却する。４℃で予め平衡化したＱＣを標的ＤＮＡ溶液に加える。さらに、本明細書で提供される実施例では、ストレプトアビジンでコーティングした磁気ビーズに結合し、上記のアルカリ変性および磁気分離によって得られた直鎖状一本鎖ＤＮＡは、標的遺伝子の一部にＱＣを結合させるのに使用することができる。
【００８１】
６．編集される標的核酸へのＱＣのＤＮＡ結合領域のアニーリングを促進するために、プラスミドＤＮＡおよびＱＣから構成される得られた混合物を室温で１０分間インキュベートする。標的遺伝子へのＱＣのより高い結合特異性は、好ましくは、限定されないが、２０ｍＭ塩の濃度を有する酢酸ナトリウムまたは酢酸カリウムを含む３０ｍＭ  Ｈｅｐｅｓ緩衝液などの適切な緩衝液を使用して、達成することができる。本明細書で提供される実施例では、上記の緩衝液中で磁気ビーズに結合した一本鎖標的ＤＮＡを少なくとも１０分間氷上でインキュベートする。次いで、６０℃の温度に設定したプログラム可能な恒温振盪機に試料を移し、これを８分間インキュベートして、一本鎖ＤＮＡの自己アニーリングによる二次構造の解離を支持する。この予備的なインキュベーションの後、ＱＣを遺伝子の一本鎖標的ＤＮＡを含むビーズ懸濁液に加え、振盪機の温度制御を３８℃に設定する。このようにして、標的遺伝子とＱＣとの懸濁液を、３８℃の目標温度に達するまで、１分あたり約１℃の勾配で緩徐に冷却する。ＱＣおよび一本鎖ＤＮＡを３８℃での振盪下でさらに２〜３時間さらにインキュベートする。その後、磁気分離を使用して、一本鎖ＤＮＡがコーティングされたビーズを溶液から取り出す。ビーズが除かれた溶液の残存蛍光強度を蛍光光度計を使用して測定し、ビーズおよび標的ＤＮＡがない同じ条件下で処理したＱＣの参照溶液の蛍光強度と比較する。本明細書で提供される実施例では、ＱＣ＿６（配列および蛍光特性について、表１および２を参照されたい）は、フォワード一本鎖ＤＮＡにアニールし、対照のために、ＱＣが結合しないはずであるリバース一本鎖ＤＮＡにもアニールする。本解析の結果を図５および６に示す。標的ＤＮＡを含まない参照溶液と、およびリバース一本鎖ＤＮＡにアニールした溶液と比べた場合の、溶液中のＱＣ＿６の蛍光シグナルの鋭い低下または消光によって、ＱＣが良好な特異性で標的遺伝子に結合していることを示すことが可能である。蛍光顕微鏡を使用して確証研究を行うことができ、この場合、結合研究の終了後に、固定化された一本鎖標的ＤＮＡを有し、ＱＣとハイブリダイズした２μＬのビーズを顕微鏡グレードのガラススライドにピペットで移し、ＱＣの励起および放射最大に対応する励起波長および放射波長を使用して画像化する。本実施例のＱＣ＿６に関しては、調節可能な蛍光励起光を有する白色光レーザーを５９９ｎｍに設定する。照射されたビーズは、最高放射蛍光強度に対応する範囲内のＱＣの発光スペクトルをカバーするように調節可能な放射フィルターがその前に設定された高感度光電子増倍管検出器で画像化する。ＱＣ＿６とともにまたはＱＣ＿６なしで２時間３０分インキュベートした後の一本鎖のフォワードまたはリバース標的ＤＮＡでコーティングされたビーズの蛍光顕微鏡解析の結果を図６に示す。ビーズの自家蛍光またはビーズの表面へのＱＣの非特異的結合によるアーティファクトを排除するために、ＱＣ＿６の存在または非存在下における、一本鎖ＤＮＡのコーティングがないビーズからなる対照試料も画像化する。異なるビーズ試料のシグナル強度を比較するために、すべての画像は、レーザー強度について、および光電子��倍管検出器のゲインについて、同じ設定を使用して取得すべきである。
【００８２】
７．次いで、ＱＣと標的ＤＮＡの溶液を電磁放射線（ＥＲ）に曝露する。ＥＲの波長は、ＱＣの吸光度および放射特性に基づいて選択される。典型的には、電磁放射線は可視または近赤外または赤外の範囲内である。より典型的には、電磁放射線は、レーザーによって、より具体的には高頻度パルス化ができる多光子レーザーによって生成される。本明細書で提供される実施例に関して、ＱＣの特定の励起波長のいずれかのレーザー光（ＱＣ＿６の場合には、これは５９９ｎｍに設定した）を使用して、またはフェムト秒パルス化多光子レーザーを使用し、より長い波長の光子でのＱＣの二重光子励起を利用する（ＱＣ＿６の特定の場合では、励起は約１０４０ｎｍの波長に設定した）ことによって、ＱＣを照射する。
【００８３】
８．標的核酸およびＱＣから構成される複合体は、電磁放射線によるいくつかの照射ラウンドによって当てられる。ＥＲ処理の長さは、各標的ＤＮＡとＱＣの組み合わせに対して、毎回決定する。典型的には、ＥＲへの曝露は、制御されないＤＮＡ切断の自然形成を防止するように選択すべきである。したがって、ＱＣをともなわない標的ＤＮＡを、ＱＣを標的ＤＮＡにアニールさせる試料に使用される同じ照射条件に曝露する対照試料を含むことが常に必要である。
【００８４】
９．ＥＲへの曝露後、ＤＮＡ切断の形成を検証するために、標的ＤＮＡを解析する。これは、例えば、ゲル電気泳動、ＰＣＲ（例えば、プラスミドＤＮＡに対するローリングサークルＰＣＲ）または高感度分析的クロマトグラフィー分離を含めたいくつかの技法によって、達成される。
【００８５】
１０．次いで、標的ＤＮＡをシークエンシングすることによって、切断も確認する。
【００８６】
[実施例３]
細胞におけるゲノム編集のためのＱＣの使用
ゲノム編集は、例えば作物の不十分な能力に関与する望まれない遺伝子の機能を除去する目的で、または、疾患の発生の根底にあるシグナリング経路に関与する分子メカニズム精査することを目的として、例えばヒト起源の細胞における遺伝子の機能を研究するために、ゲノムＤＮＡに対して細胞中で行うことができる。
【００８７】
細胞における核酸の編集には以下のステップが関与する。
【００８８】
１．改変される標的核酸配列の選択。この配列は、宿主細胞の一倍体ゲノム中に１度だけ存在すべきである。前述のように、核酸中の配列は、シトシンまたはグアニンの長いストレッチを含むべきでなく、大量のアデニンおよびチミンを優先的に含むべきである。ＱＣがハイブリダイズするアニーリング領域を含めた、標的配列を選択するためのガイドラインは、上記の実施例１に記載されている。
【００８９】
２．標的核酸の選択した領域は、ＱＣのＤＮＡ結合領域の設計のための配列情報を提供している。オリゴヌクレオチドの設計およびＱＣの合成は、実施例に１記載される手順に従って行う。
【００９０】
３．合成し、精製したＱＣを、細胞の培養に適合する緩衝液、例えばリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）または細胞増殖培地に希釈する。あるいは、ＱＣの合成は緩衝液または培地中で直接行うことができる。
【００９１】
４．標的ＤＮＡに対して比較的高いモル過剰で、ＱＣを細胞と混合する。これは、改変される必要がある細胞におけるＱＣの均一な分布を確実にするために、および内在性ヌクレアーゼによるＱＣの分解の可能性に対抗するために、行う。
【００９２】
５．細胞膜を横切るＱＣの浸透が自発的に生じない場合、例えばトランスフェクションを含めた他のアプローチによって、ＱＣを導入する。細胞が植物細胞である場合は、文献に記載されている任意の方法によって細胞壁を消化することが必要である場合がある。これは、例えば、マセロザイムおよびセルラーゼなどを含む市販の消化溶液によって達成される。その後、得られたプロトプラストをＱＣとインキュベートして、ＱＣの浸透を促進する。これが自発的に達成され得ない場合は、十分に確立されたトランスフェクションプロトコールに従って、例えばポリ（エチレン）グリコールＰＥＧを使用して、プロトプラストをトランスフェクトする。
【００９３】
６．浸透の後、ＱＣを細胞とともに数時間から２４時間までインキュベートする。インキュベーション時間は、処理される細胞型に応じて、毎回決定しなければならない。
【００９４】
７．宿主細胞のゲノム中で二本鎖切断を誘発するために、ＱＣで処理した細胞をＥＲに曝露する。これは、ＥＲによる処理に対する細胞の感受性を検証するために、予備的な対照実験の設定を必要とする。各場合について、宿主細胞のＤＮＡ損傷および自然突然変異の天然の割合を超えて損傷（例えば、二本鎖切断）を誘発しない、ＥＲの強度および継続期間を検証すべきである。
【００９５】
８．ＱＣおよびＥＲによる処理の後、目的の標的遺伝子中の突然変異の出現を検証するために、細胞をいくつかの解析にかける。例えば、植物細胞中の標的遺伝子の突然変異が表現型変化（例えば、アルビノ突然変異体）を誘発する場合、いくつかの再生小植物をスクリーニングして、突然変異表現型を特定する。これらの小植物から抽出したゲノムＤＮＡを、次いで、突然変異を検証するため、および照射後にＱＣによってオフターゲット突然変異が生成された可能性があることを排除するために、目的の遺伝子を標的にする選択されたプライマーを用いるＰＣＲによる、およびＮＧシークエンシングによる解析にかける。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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