(57)【要約】本開示は、ゲノム工学、特に、ＣＩＳＨ遺伝子の標的化された遺伝子改変の分野にある。一局面では、内在性ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン２またはエクソン３内にゲノム改変を含む、遺伝子改変された細胞が提供される。別の局面では、上記ゲノム改変は、挿入および／または欠失からなる群より選択される。別の局面では、上記ＣＩＳＨ遺伝子に１個または複数の導入遺伝子が組み込まれている。別の局面では、上記導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、免疫調節因子、操作されたまたは外因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする。
2021502085.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
内在性ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン２またはエクソン３内にゲノム改変を含む、遺伝子改変された細胞。
【請求項２】
前記ゲノム改変が、挿入および／または欠失からなる群より選択される、請求項１に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項３】
前記ＣＩＳＨ遺伝子に１個または複数の導入遺伝子が組み込まれている、請求項１または請求項２に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項４】
前記導入遺伝子が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、免疫調節因子、操作されたまたは外因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする、請求項３に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項５】
前記操作されたＴＣＲが、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）である、請求項４に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項６】
ＣＩＳＨ遺伝子が、ヌクレアーゼによる切断後に改変されている、請求項１から５のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項７】
前記ヌクレアーゼが、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、ＴＡＬＥＮおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系からなる群より選択される、請求項６に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項８】
前記ヌクレアーゼが、表２に示す標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む、請求項６または請求項７に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項９】
前記ジンクフィンガーヌクレアーゼが、認識ヘリックスを含む４、５または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質を含み、さらに、前記ジンクフィンガータンパク質が、ＳＢＳ＃５９４８８、ＳＢＳ＃５９４８９、ＳＢＳ＃５９４４０、ＳＢＳ＃５９４４１、ＳＢＳ＃５９５５８、ＳＢＳ＃５９５５７、ＳＢＳ＃５９５８１またはＳＢＳ＃５９５８０と命名されたタンパク質の認識ヘリックス領域を含む、請求項７または請求項８に記載の遺伝子改変された細胞。
【請求項１０】
造血幹細胞、エフェクターＴ細胞および調節性Ｔ細胞からなる群より選択される、請求項１から９のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞、またはその後代である細胞。
【請求項１１】
認識ヘリックス領域をそれぞれ含む６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質であって、ＳＢＳ＃５９４８８、ＳＢＳ＃５９４８９、ＳＢＳ＃５９４４０、ＳＢＳ＃５９４４１、ＳＢＳ＃５９５５８、ＳＢＳ＃５９５５７、ＳＢＳ＃５９５８１またはＳＢＳ＃５９５８０と命名されたタンパク質の認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質。
【請求項１２】
請求項１１に記載のジンクフィンガータンパク質と、野生型のもしくは操作された切断ドメインまたは野生型のもしくは操作された切断ハーフドメインとを含む融合タンパク質。
【請求項１３】
請求項１１または請求項１２に記載の１種または複数のタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１１もしくは請求項１２に記載の１種もしくは複数のタンパク質、および／または請求項１３に記載の１種もしくは複数のポリヌクレオチドを含む、単離された細胞。
【請求項１５】
エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞および造血幹細胞からなる群より選択される、請求項１４に記載の単離された細胞、またはその後代である細胞。
【請求項１６】
請求項１１もしくは請求項１２に記載の１種もしくは複数のタンパク質、請求項１３に記載の１種もしくは複数のポリヌクレオチド、および／または請求項１４もしくは請求項１５に記載の１種もしくは複数の単離された細胞を含む、キット。
【請求項１７】
請求項１から１５のいずれか一項に記載の遺伝子改変された細胞を生成する方法であって、前記細胞に、ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン２またはエクソン３における標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む１種または複数のヌクレアーゼをコードする、１種または複数のポリヌクレオチドを導入するステップを含み、前記ヌクレアーゼが、前記ＣＩＳＨ遺伝子に結合し、これを切断し、これにより、前記細胞を遺伝子改変する、方法。
【請求項１８】
前記遺伝子改変された細胞が、前記ＣＩＳＨ遺伝子に組み込まれ、前記細胞において発現される導入遺伝子を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
タンパク質を必要とする被験体に前記タンパク質を提供する方法であって、請求項３から１５のいずれかに記載の遺伝子改変された細胞を投与するステップを含み、前記細胞が、前記被験体において導入遺伝子を発現する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、２０１７年１１月９日に出願された米国特許仮出願第６２／５８３，７２４号、および２０１８年８月８日に出願された米国特許仮出願第６２／７１６，００２号の利益を主張し、これらの出願の開示全体を、参照により本明細書に組み込む。
【０００２】
本開示は、ゲノム工学、特に、サイトカイン誘導性ＳＨ２含有タンパク質（ＣＩＳＨまたはＣＩＳ）遺伝子の標的化された改変の分野にある。
【背景技術】
【０００３】
細胞は、直接的接触により、または細胞外空間に分子「メッセージ」を放出することにより、互いに情報伝達して、適切な細胞表面受容体複合体を発現する標的細胞における増殖、遊走、分化を協調させ、遺伝子発現の変化に影響を与える。多くのサイトカインおよび増殖因子に関して、受容体結合は、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路によって標的細胞内にシグナルトランスダクションを惹起する。例えば、Ａａｒｏｎｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９６（５５７３）：１６５３−５；Ｒａｗｌｉｎｇｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００４）  Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ  １１７（Ｐｔ  ８）：１２８１−３；およびＪａｔｉａｎｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｇｅｎｅｓ  Ｃａｎｃｅｒ  １（１０）：９７９−９３を参照されたい。リガンドの非存在下では、受容体の細胞質末端は、ヤヌスチロシンキナーゼファミリーの不活性メンバー（ＪＡＫ１〜３またはＴｙｋ２）と会合する。リガンド結合は、２個またはそれよりも多い受容体サブユニットの間の受容体複合体の形成を誘導し、ＪＡＫタンパク質を極めて接近させ、トランスリン酸化を介した活性化を可能にする。次に、活性化されたＪＡＫは、受容体の細胞質ドメインにおけるチロシン残基をリン酸化して、シグナル伝達性転写因子（ＳＴＡＴ）タンパク質のうち１種のための結合部位を作製することができる。
【０００４】
哺乳動物には７種のＳＴＡＴタンパク質、ＳＴＡＴ１〜４、ＳＴＡＴ５ａ、ＳＴＡＴ５ｂおよびＳＴＡＴ６が存在する。各ＳＴＡＴタンパク質の構造内には、受容体におけるホスホチロシン含有部位への結合を方向付けるＳｒｃ相同性−２（ＳＨ２）ドメイン（Ｓａｄｏｗｓｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８６）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  ６（１２）：４３９６−４０８を参照）があり、当該部位において、ＳＴＡＴタンパク質は、それ自身がＪＡＫキナーゼによってチロシンリン酸化され得る。リン酸化されると、ＳＴＡＴタンパク質は、ホモまたはヘテロ二量体を形成し、核に輸送され、核内で、ＤＮＡに結合し、近傍遺伝子の転写を刺激する。ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路は、成長、細胞増殖および免疫応答の調節において鍵となる役割を果たすため、この系の調節不全は、がんまたは炎症性疾患の発症に寄与し得る。
【０００５】
ＳＴＡＴ活性化は、細胞内タンパク質のサイトカインシグナル抑制因子（ＳＯＣＳ）およびサイトカイン誘導ＳＨ２（ＣＩＳＨ）ドメイン含有ファミリーをコードする遺伝子のセットの発現を急速に誘導する。例えば、Ｐａｌｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ３０（１２）：５９２−６０２；Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ７（６）：４５４−６５；Ｔｒｅｎｇｏｖｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２（１）：１−２９を参照されたい。ＳＯＣＳ／ＣＩＳＨタンパク質は、可変的な配列および機能のＮ末端ドメインと、それに続くＳＨ２ドメインおよびＣ末端ＳＯＣＳドメインを含有し、このＳＯＣＳドメインは、標的タンパク質をユビキチンで標識するＥ３ユビキチンリガーゼ複合体のアセンブリを方向付け、プロテアソームによる分解のために標的タンパク質をマークする。ＳＯＣＳ／ＣＩＳＨタンパク質は、受容体におけるホスホチロシン部位への結合に関してＳＴＡＴと競合し、これにより、ＳＴＡＴ活性化を阻害することにより、また、様々なタンパク質におけるユビキチン沈着を方向付け、そのターンオーバーを増強することにより、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達を阻害する。よって、ＳＯＣＳ／ＣＩＳＨタンパク質は、サイトカインおよび増殖因子シグナル伝達をモジュレートし、リガンドがもはや存在しない場合にシグナルの減衰を増強するための古典的な負のフィードバックループを確立する。一部のＳＯＣＳタンパク質は、ＪＡＫの直接的阻害、および他のＳＯＣＳタンパク質のターンオーバーの増強等、追加的な活性を有し、受容体シグナルトランスダクションの調節に関するさらなる複雑さに寄与する。Ｋｅｒｓｈａｗ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  Ｔｒａｎｓ．  ４１（４）：１０４２−７を参照されたい。
【０００６】
ＣＩＳＨ（ＣＩＳとしても公知）は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）受容体（ＥＰＯＲ）におけるリガンド結合後に急速に誘導される（３０分以内）遺伝子として同定された最初のＳＯＣＳタンパク質であった。Ｙｏｓｈｉｍｕｒａ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  ＥＭＢＯ  Ｊ  １４（１２）：２８１６−２６を参照されたい。ＣＩＳＨ発現は、適切な細胞型において、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、ＩＬ−３および顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）によっても誘導された。免疫沈降解析は、ＣＩＳＨタンパク質が、ＩＬ−３Ｒベータ鎖およびＥＰＯＲに安定して結合したが、これはリガンド結合後のみであることを実証し、受容体のチロシンリン酸化が要求されたことを示唆する。ＣＩＳＨタンパク質の過剰発現は、細胞成長を抑制し、ＣＩＳＨが、シグナルトランスダクションに負の効果を有したことを示す。その後、ＣＩＳＨ発現は、ＳＴＡＴ５活性化に依存性であることが示され、いくつかのＳＴＡＴ５結合部位が、ＣＩＳＨプロモーター領域において見出された。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｂｌｏｏｄ  ８９（９）：３１４８−５４を参照されたい。さらに、ＣＩＳＨは、ＳＴＡＴ５のＥＰＯ依存性活性化を阻害し、他のＳＴＡＴ５依存性受容体の活性を抑制し、ＣＩＳＨが、ＳＴＡＴ５のためのフィードバックモジュレーターであることを示す。
【０００７】
多種多様なＳＴＡＴ５依存性受容体が、ＣＩＳＨ発現を誘導し、これは、成長ホルモン（ＧＨ）、プロラクチン（ＰＲＬ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、レプチン、ＩＬ−２、ＩＬ−５およびＩＬ−９を含む（ただし、これらに限定されない）。Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｙａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２４（３）：３１２−６を参照されたい。ＣＩＳＨは、ＧＨ受容体（ＧＨＲ）、ＰＲＬ受容体およびＩＬ−２受容体ベータ鎖に結合し、それから生じるシグナル伝達を阻害し、ＧＨＲの内部移行および非活性化を促進することが示された。Ｒａｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（５０）：３５５５３−６１；Ｅｎｄｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １３３（１）：１０９−１３；Ａｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７４（４２）：３０２６６−７２；Ｌａｎｄｓｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２８０（４５）：３７４７１−８０を参照されたい。Ｃｉｓｈ  ｍＲＮＡの発現は、いくつかの組織（肝臓、腎臓、心臓、胃、肺、卵巣および骨格筋）において見出される。Ｐａｌｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  ３０（１２）：５９２−６０２；Ａｎｄｅｒｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  １３８（３）：５３７−４４；Ｃｌａｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ  ５４（７）：１９８８−９７を参照されたい。非常に多くの重要なサイトカインおよび増殖因子のシグナル伝達装置におけるその明らかな関与にもかかわらず、Ｃｉｓｈノックアウトマウスは、欠損が最小であった（免疫応答の僅かな変化を除いて）。Ｐａｌｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ３０（１２）：５９２−６０２；Ｔｒｅｎｇｏｖｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ａｍ  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２（１）：１−２９を参照されたい。これは、他のＳＯＣＳファミリータンパク質の代償的な活性によって起こる可能性がある。推定標的遺伝子の生物学に対するＣＩＳＨの効果が、ベータ−アクチンプロモーターから駆動されたＣｉｓｈを構成的に発現するトランスジェニックマウスにおいて観察された。このようなマウスは、Ｓｔａｔ５ａおよび／またはＳｔａｔ５ｂ欠乏マウスに似た表現型である、低下した体重、乳腺発達の欠損、ならびに低下した数のガンマ／デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞およびＮＫＴ細胞を有した。Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １９（９）：６３９６−４０７を参照されたい。
【０００８】
ＣＩＳＨは、多くのサイトカインおよび増殖因子によるシグナル伝達に潜在的に影響を与えるため、ＣＩＳＨ活性およびバリアントが、感染性疾患およびがんに関連すると判明したことは、驚くには当たらない。いくつかの研究は、ある特定のＣＩＳＨ多型を保有する被験体における、マラリア、レプトスピラ症、Ｂ型肝炎ウイルスおよび結核を含む、様々な感染病原体に対する易罹患性増加を示した。Ｋｈｏｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３６２（２２）：２０９２−１０１；Ｅｓｔｅｖｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９（９）：ｅ１０８５３４；Ｈｕ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ  ９（６）：ｅ１００８２６；Ｔｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ  ６４（４）：２６１−５；Ｊｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｇｅｎｅｔ  Ｅｖｏｌ  ２８：２４０−４；Ｓｕｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  ＰＬｏＳ  ９（３）：ｅ９２０２０を参照されたい。全研究に共通した１種のリスク対立遺伝子（ｒｓ４１４１７１、転写開始から−２９２）は、代替対立遺伝子（ａｌｔｅｒｎａｔｅ  ａｌｌｅｌｅ）と比較して、末梢血単核細胞におけるより低いレベルのＣＩＳＨ発現を呈した。Ｋｈｏｒ  ａｎｄ  Ｓｕｎ、上記参照を参照されたい。乳がんにおいて、ＣＩＳＨの発現レベルは、正常組織と比較して、乳癌およびがん細胞系において上昇し、ＣＩＳＨが、細胞外シグナル調節キナーゼ（ＥＲＫ）を活性化するその能力により腫瘍形成に寄与し得るという推測を導いた。Ｒａｃｃｕｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｂｒ．  Ｊ．  Ｃａｎｃｅｒ  ８９（３）：５２４−３２。ＣＩＳＨバリアントは、乳牛における乳汁産生形質にも関連する。Ａｒｕｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｆｒｏｎｔ  Ｇｅｎｅｔ  ６：３４２を参照されたい。
【０００９】
Ｔ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を介して刺激に応答する際に、古典的なＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達経路を利用しないが、Ｔ細胞が、ＣＤ３に対する抗体によって活性化されると、Ｃｉｓｈ発現は、急速に誘導される（３０分以内）。Ｊｉ、上記参照；Ｃｈｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｉｎｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １５（３）：４０３−９；Ｐａｌｍｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２１２（１２）：２０９５−１１３；Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １４（７）：７３２−４０を参照されたい。ＳＴＡＴ５は、おそらく、ＴＣＲ関連リンパ球特異的プロテインチロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）によって、ＴＣＲ刺激後に急速にリン酸化される。Ｗｅｌｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２８３（５３９９）：  ２２２−５を参照されたい。ＩＬ−２発現も、ＴＣＲ刺激によって誘導されるが、これは、Ｃｉｓｈ誘導を説明するには遅すぎる動態である。Ｙａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．、上記参照；Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  １９１（６）：９８５−９４を参照されたい。Ｉｎ  ｖｉｖｏでは、Ｃｉｓｈ発現は、抗原ナイーブＴ細胞において低かったが、ワクチン接種後に収集された抗原を経験したセントラルメモリー（ＴＣＭ）およびエフェクターメモリー（ＴＥＭ）ＣＤ８＋Ｔ細胞において漸進的に増加した。Ｓａｌｌｕｓｔｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９９）  Ｎａｔｕｒｅ  ４０１（６７５４）：７０８−１２を参照されたい。
【００１０】
Ｔ細胞応答性におけるＣｉｓｈの役割も試験された。ＣＤ４プロモーターからのｉｎ  ｖｉｖｏでのＣｉｓｈのトランスジェニック発現は、ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞区画における構成的発現を有するマウスを生成した。Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．、上記参照を参照されたい。循環Ｔ細胞亜集団は、影響されなかったが、予想される抑制された応答性の代わりに、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、高められたＴＣＲ誘導性増殖およびサイトカイン発現ならびに増加した生存を呈した。循環Ｔ細胞集団も、Ｃｉｓｈノックアウトマウスにおいて正常であったが、やはり、ＴＣＲ刺激に対する増強された応答（増殖およびサイトカイン産生）が、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞サブセットの両方においてｉｎ  ｖｉｔｒｏで観察された。Ｐａｌｍｅｒ  ａｎｄ  Ｙａｎｇ、上記参照を参照されたい。ＣｉｓｈトランスジェニックマウスにおけるＣＤ４＋Ｔ細胞の増強された応答性は、ＣｉｓｈおよびプロテインキナーゼＣシータの間の相互作用に起因した一方、ＣｉｓｈによるＣＤ８  Ｔ細胞活性の阻害は、ホスホリパーゼＣ−ガンマ１の分解増強に起因したため、Ｃｉｓｈ作用の分子基盤も不明確であった。
【００１１】
Ｃｉｓｈ欠乏マウスにおける増強されたＴ細胞活性の帰結の１つは、黒色腫モデルにおける確立された腫瘍に対する、養子移入された抗原特異的ＣＤ８  Ｔ細胞の、耐久性があり、より攻撃的な応答であった。Ｐａｌｍｅｒ、上記参照を参照されたい。加えて、ヒトＴ細胞におけるＣＩＳＨ発現の低下は、共形質導入された腫瘍特異的ＴＣＲの機能性を増強した。これらのデータは、ＴＣＲシグナル伝達を抑える負のフィードバック活性の一部の軽減が、腫瘍に対するより強力な免疫反応性を産生し得ることを示唆する。しかし、マウスモデルにおける増加した抗黒色腫活性は、より大きい眼性自己免疫に関連した。同様に、Ｃｉｓｈ欠乏マウスの他の系統において大きな発生上の欠損がなかったとしても、ＴＨ２およびＴＨ９  ＣＤ４  Ｔ細胞サブセットの増強された発生に明らかに起因する、年長の動物（＞６ヶ月）における自発性肺疾患が発症した。これらの研究は、免疫調節に伴う共通の課題を説明する；過大な抑制は、患者を、感染および腫瘍発症に対して脆弱なままにし、過大な刺激は、自己免疫または慢性炎症性疾患をもたらし得る。
【００１２】
ジンクフィンガータンパク質（「ＺＦＰ」）またはＴＡＬエフェクタードメイン（「ＴＡＬＥ」）由来のＤＮＡ結合ドメインを含む組換え転写因子、ならびに標的ＤＮＡ部位に特異的に結合するように全て設計された、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（「ＺＦＮ」）、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系およびホーミングエンドヌクレアーゼを含む操作されたヌクレアーゼは、内在性遺伝子の遺伝子発現を調節する能力を有し、ゲノム工学、遺伝子療法、ならびにがんおよび炎症等の障害の処置において有用である。例えば、その開示全体があらゆる目的のために参照により組み込まれる、米国特許第９，８７７，９８８号；同第９，３９４，５４５号；同第９，１５０，８４７号；同第９，２０６，４０４号；同第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第８，９５６，８２８号；同第８，９３６，９３６号；同第８，９４５，８６８号；同第８，８７１，９０５号；同第８，５８６，５２６号；同第８，５６３，３１４号；同第８，３２９，９８６号；同第８，３９９，２１８号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号；同第２００５／０２０８４８９号；同第２００５／００２６１５７号；同第２００５／００６４４７４号；同第２００６／００６３２３１号；同第２００８／０１５９９９６号；同第２０１０／０２１８２６４号；同第２０１２／００１７２９０号；同第２０１１／０２６５１９８号；同第２０１３／０１３７１０４号；同第２０１３／０１２２５９１号；同第２０１３／０１７７９８３号；同第２０１３／０１７７９６０号；および同第２０１５／００５６７０５号を参照されたい。さらに、ゲノム編集および遺伝子療法における使用のための潜在性を有することもできる、アルゴノート系（例えば、「ＴｔＡｇｏ」として公知の、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来、Ｓｗａｒｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｎａｔｕｒｅ  ５０７（７４９１）：  ２５８−２６１を参照されたい）に基づく標的化ヌクレアーゼが開発中である。
ヌクレアーゼ媒介性遺伝子療法を使用して、１種もしくは複数の不活性化された遺伝子を有するように、および／または細胞に、当該細胞において以前に産生されたことがない産物を発現させるように（例えば、導入遺伝子挿入により、および／または内在性配列の補正により）、細胞を遺伝子操作することができる。導入遺伝子挿入の使用の例として、１種もしくは複数の新規治療タンパク質をコードする１種もしくは複数の遺伝子の挿入、細胞もしくは個体において欠如しているタンパク質をコードするコード配列の挿入、変異した遺伝子配列を含有する細胞における野生型遺伝子の挿入、および／またはｓｈＲＮＡもしくはｓｉＲＮＡ等の構造的核酸をコードする配列の挿入が挙げられる。内在性遺伝子配列の「補正」の有用な適用の例として、疾患関連遺伝子変異の変更、スプライス部位をコードする配列における変更、調節性配列における変更、およびタンパク質の構造的特徴をコードする配列の標的化された変更が挙げられる。相同組換え修復（ＨＤＲ）、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）駆動過程における末端捕捉のいずれかによって、導入遺伝子構築物を挿入することができる。例えば、米国特許第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；同第７，８８８，１２１号；および同第８，７０３，４８９号を参照されたい。
これらの操作された転写因子およびヌクレアーゼを使用した臨床試験は、これらの分子が、がん、ＨＩＶおよび／または血液障害（異常ヘモグロビン症および／または血友病等）を含む様々な状態を処置することができることを示した。例えば、Ｙｕ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  ＦＡＳＥＢ  Ｊ．  ２０：４７９−４８１；Ｔｅｂａｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７０（１０）：９０１を参照されたい。よって、これらのアプローチは、疾患の処置に使用することができる。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１３】
【特許文献１】米国特許第９，０４５，７６３号明細書
【特許文献２】米国特許第９，００５，９７３号明細書
【特許文献３】米国特許第７，８８８，１２１号明細書
【特許文献４】米国特許第８，７０３，４８９号明細書
【非特許文献】
【００１４】
【非特許文献１】Ｙｕら、ＦＡＳＥＢ  Ｊ．（２００６）２０：４７９〜４８１
【非特許文献２】Ｔｅｂａｓら、Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ（２０１４）３７０（１０）：９０１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１５】
しかし、依然として、ＣＩＳＨ調節が所望されるがん、炎症性障害および他の疾患の処置および／または予防のための、ＣＩＳＨ遺伝子補正およびドナー送達のための追加的な方法および組成物の必要がある。
【００１６】
本発明は、遺伝子療法およびゲノム工学における使用のための組成物および方法について記載する。具体的には、記載されている方法および組成物は、内在性ＣＩＳＨ遺伝子（変異体または野生型）のヌクレアーゼ媒介性ゲノム改変（例えば、１個または複数の挿入および／または欠失）に関する。ゲノム改変（複数可）は、標的遺伝子を不活性化する（例えば、ヌクレアーゼによる遺伝子の切断後のＮＨＥＪによる）挿入および／または欠失（「インデル」）；例えば、がんもしくは炎症性状態を有する被験体において欠如もしくは欠乏しているタンパク質の、タンパク質コード配列を含む導入遺伝子（ドナー）の標的化された挿入、および／または補正用ドナー（例えば、変異体遺伝子を有する細胞における機能的ＣＩＳＨを回復させる配列）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、および／またはＨＬＡ複合体の１種もしくは複数の構成成分もしくは調節因子またはそれを含む融合タンパク質（例えば、Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−ＥまたはＢ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｇ融合タンパク質）の標的化された挿入を含むことができる。遺伝子改変および／またはこのような改変を含む細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏ方法において使用することができる。
【００１７】
ある特定の態様では、内在性ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン２またはエクソン３内にゲノム改変を含む、遺伝子改変された細胞が、本明細書に提供される。このような遺伝子改変された細胞の集団も提供される。ゲノム改変は、１個または複数の挿入および／または欠失（インデル）、および／またはＣＩＳＨ遺伝子への１個または複数の導入遺伝子の組込み（例えば、導入遺伝子は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、免疫調節因子（例えば、ＰＤ１、ＣＴＬＡ−４等）、操作されたまたは外因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）（例えば、抗体結合Ｔ細胞受容体（ＡＣＴＲ）をコードする）を含むことができる。ある特定の態様では、ＣＩＳＨ遺伝子は、ヌクレアーゼ（例えば、１種もしくは複数のジンクフィンガーヌクレアーゼ、１種もしくは複数のＴＡＬＥＮおよび／または１種もしくは複数のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系）による切断後に改変される。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、表２に示す標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメイン、例えば、ＳＢＳ＃５９４８８、ＳＢＳ＃５９４８９、ＳＢＳ＃５９４４０、ＳＢＳ＃５９４４１、ＳＢＳ＃５９５５８、ＳＢＳ＃５９５５７、ＳＢＳ＃５９５８１またはＳＢＳ＃５９５８０と命名されたタンパク質の認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質等、認識ヘリックスを含む４、５または６個のジンクフィンガードメインを含むジンクフィンガータンパク質を含むジンクフィンガーヌクレアーゼを含む。本明細書に記載されている細胞のいずれかの後代である遺伝子改変された細胞（および斯かる細胞の集団）も提供される。一部の実施形態では、細胞は、造血幹細胞、エフェクターＴ細胞および調節性Ｔ細胞からなる群より選択される。
【００１８】
他の態様では、認識ヘリックス領域をそれぞれ含む６個のジンクフィンガードメインを含む、ジンクフィンガータンパク質であって、ＳＢＳ＃５９４８８、ＳＢＳ＃５９４８９、ＳＢＳ＃５９４４０、ＳＢＳ＃５９４４１、ＳＢＳ＃５９５５８、ＳＢＳ＃５９５５７、ＳＢＳ＃５９５８１またはＳＢＳ＃５９５８０と命名されたタンパク質の認識ヘリックス領域を含むジンクフィンガータンパク質が、本明細書に提供される。野生型のまたは操作された切断ドメインまたは切断ハーフドメインとジンクフィンガータンパク質との融合を含む、本明細書に記載されているジンクフィンガータンパク質のいずれかを含む融合タンパク質も提供される。本明細書に記載されているＺＦＰおよび／または融合タンパク質のうち１種または複数をコードする１種または複数のポリヌクレオチドも提供される。タンパク質（例えば、ＺＦＰまたは融合タンパク質）のうち１種もしくは複数および／またはそのようなタンパク質をコードするポリヌクレオチドのうち１種もしくは複数を含む、単離された細胞（例えば、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞および／または造血幹細胞）も提供される。本明細書に記載されているタンパク質のうち１種もしくは複数、ポリヌクレオチドのうち１種もしくは複数、および／または１種もしくは複数の単離された細胞を含むキットも提供される。
【００１９】
他の態様では、本発明は、本明細書に記載されている遺伝子改変された細胞を生成する方法であって、ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン２またはエクソン３における標的部位に結合するＤＮＡ結合ドメインを含む１種または複数のヌクレアーゼをコードする、１種または複数のポリヌクレオチドを細胞に導入するステップを含み、ヌクレアーゼが、ＣＩＳＨ遺伝子に結合し、これを切断し、これにより、細胞を遺伝子改変する、方法を提供する。ある特定の実施形態では、遺伝子改変された細胞は、ＣＩＳＨ遺伝子に組み込まれ、細胞において発現される、導入遺伝子を含む。それを必要とする被験体にタンパク質を提供する方法であって、本明細書に記載されている遺伝子改変された細胞を投与するステップを含み、細胞が、被験体において導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ、免疫調節因子および／またはＡＣＴＲ等）を発現する、方法も提供される。
【００２０】
一態様では、１種または複数のヌクレアーゼを使用した、ＣＩＳＨ遺伝子の標的化された改変のための方法および組成物が、本明細書に開示されている。ヌクレアーゼ、例えば、操作されたメガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）（用語「１つのＺＦＮ」は、１対のＺＦＮを含む）、ＴＡＬＥ−ヌクレアーゼ（制限エンドヌクレアーゼおよび／またはメガヌクレアーゼ由来のヌクレアーゼドメインとＴＡＬＥエフェクタードメインとの融合を含むＴＡＬＥＮ（メガＴＡＬＥおよびコンパクトＴＡＬＥＮ等）（用語「１つのＴＡＬＥＮ」は、１対のＴＡＬＥＮを含む）、Ｔｔａｇｏ系および／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系が、細胞におけるＣＩＳＨ遺伝子の遺伝子座におけるＤＮＡの切断に使用される。ＣＩＳＨ遺伝子は、切断後に（例えば、挿入および／または欠失（「インデル」）による）、および／またはドナー導入遺伝子の標的化された挿入によって、不活性化することができる。ドナー導入遺伝子は、相同組換え修復（ＨＤＲ）または非相同性修復機構（例えば、ＮＨＥＪドナー捕捉）により挿入することができる。本明細書に記載されているヌクレアーゼは、標的ＤＮＡに二本鎖切断（ＤＳＢ）または一本鎖切断（ニック）を誘導することができる。一部の実施形態では、２種のニッカーゼが、２個のニックを導入することにより、ＤＳＢの作製に使用される。一部の事例では、ニッカーゼは、ＺＦＮであるが、他の事例では、ニッカーゼは、ＴＡＬＥＮまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓニッカーゼである。本明細書に記載されているヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ等）のいずれも、ＣＩＳＨ遺伝子のイントロンおよび／またはエクソン（例えば、エクソン２または３）（重複するイントロンおよびエクソンの配列を含む）、例えば、表２に示す配列の９〜２０個またはそれよりも多い（９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０個またはそれよりも多い）近接または非近接アミノ酸を含む標的部位を含む、例えば、表２に示す標的配列を標的とすることができる。
【００２１】
一態様では、ゲノム内のＣＩＳＨ遺伝子における標的部位に結合する、天然に存在しないジンクフィンガータンパク質（ＺＦＰ）であって、１種または複数の操作されたジンクフィンガー結合ドメインを含むＺＦＰが、本明細書に記載されている。一実施形態では、ＺＦＰは、目的の標的ゲノム領域を切断するジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）であり、ＺＦＮは、１種または複数の操作されたジンクフィンガー結合ドメイン、およびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、様々な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼから得ることができ、野生型であり得るまたは操作されたものであり得る（変異体）。一実施形態では、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。ある特定の実施形態では、ジンクフィンガータンパク質のジンクフィンガードメインは、表１の単一の行に示す通りに順序付けられた認識ヘリックスドメインを有する。このようなジンクフィンガータンパク質を含むヌクレアーゼは、いずれかのリンカー配列（例えば、これを切断ドメインに連結する）およびいずれかの切断ドメイン（例えば、ＥＬＤ変異体等の二量体形成変異体；４１６、４２２、４４７、４４８および／または５２５のうち１種または複数に変異を有するＦｏｋＩドメイン；および／またはニッカーゼ機能性をもたらす触媒ドメイン変異体）を含むことができる。例えば、米国特許第８，７０３，４８９号；同第９，２００，２６６号；同第８，６２３，６１８号；および同第７，９１４，７９６号；ならびに米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＺＦＮのＺＦＰは、表２に示す配列（配列番号４０〜４７）内の９〜１８個またはそれよりも多いヌクレオチドの標的部位に結合する。
【００２２】
別の態様では、ゲノム内のＣＩＳＨ遺伝子における標的部位（例えば、表２に示す標的配列、配列番号４０〜４７の少なくとも９または１２個の（例えば、９〜２０個またはそれよりも多い）ヌクレオチドを含む標的部位）に結合する転写活性化因子様エフェクター（ＴＡＬＥ）タンパク質であって、ＴＡＬＥが、１個または複数の操作されたＴＡＬＥ結合ドメインを含む、ＴＡＬＥタンパク質が本明細書に記載されている。一実施形態では、ＴＡＬＥは、目的の標的ゲノム領域を切断するヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）であり、ＴＡＬＥＮは、１個または複数の操作されたＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む。切断ドメインおよび切断ハーフドメインは、例えば、様々な制限エンドヌクレアーゼおよび／またはホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）から得ることができる。一実施形態では、切断ハーフドメインは、ＩＩＳ型制限エンドヌクレアーゼ（例えば、ＦｏｋＩ）に由来する。他の実施形態では、切断ドメインは、メガヌクレアーゼに由来し、このメガヌクレアーゼドメインは、ＤＮＡ結合機能性を示すこともできる。
【００２３】
別の態様では、ゲノム内のＣＩＳＨ遺伝子における標的部位に結合するＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系であって、１個または複数の操作されたシングルガイドＲＮＡまたは機能的等価物、およびＣａｓ９ヌクレアーゼを含むＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系が本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、シングルガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）は、表２に示す標的部位（配列番号４０〜４７）の９、１２個またはそれよりも多い近接ヌクレオチドを含む配列に結合する。
【００２４】
本明細書に記載されているヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）は、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロン等、ＣＩＳＨ遺伝子内のもしくはこれに隣接するコードまたは非コード領域における、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内の、目的の領域に結合することができるおよび／またはこれを切断することができる。
【００２５】
別の態様では、１種または複数のヌクレアーゼ（例えば、本明細書に記載されているＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）をコードするポリヌクレオチドが本明細書に記載されている。ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡとなることができる。一部の態様では、ｍＲＮＡは、化学的に改変されていてよい（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（２）：１５４−１５７を参照）。
【００２６】
別の態様では、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書に記載されている１種または複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）をコードするポリヌクレオチドを含む、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ発現ベクターが本明細書に記載されている。一実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）である。一態様では、ウイルスベクターは、組織特異的親和性を示す。
【００２７】
別の態様では、１種または複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、Ｔｔａｇｏおよび／またはＴＡＬＥＮ）発現ベクターを含む宿主細胞が本明細書に記載されている。
【００２８】
別の態様では、本明細書に記載されている発現ベクターを含む医薬組成物が提供される。一部の実施形態では、医薬組成物は、２種以上の発現ベクターを含むことができる。一部の実施形態では、医薬組成物は、第１のポリヌクレオチドを含む第１の発現ベクター、および第２のポリヌクレオチドを含む第２の発現ベクターを含む。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、異なる。一部の実施形態では、第１のポリヌクレオチドおよび第２のポリヌクレオチドは、実質的に同じである。医薬組成物は、ドナー配列（例えば、ＬＳＤまたは血友病等の疾患または障害において欠如または欠乏しているタンパク質をコードする導入遺伝子）をさらに含むことができる。一部の実施形態では、ドナー配列は、発現ベクターに付随している。
【００２９】
一部の実施形態では、ＣＩＳＨ  ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥまたはｓｇＲＮＡまたはメガヌクレアーゼ）、および野生型のまたは操作された切断ドメインまたは切断ハーフドメインを含む、融合タンパク質が提供される。
【００３０】
本明細書に記載されているヌクレアーゼは、遺伝子のコード領域内で、または例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロン等、遺伝子内のもしくはこれに隣接する非コード配列において、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの非転写領域内で、ＣＩＳＨ遺伝子に結合することができるおよび／またはこれを切断することができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、表２に示すＣＩＳＨ配列内の９〜２０個またはそれよりも多いヌクレオチドの標的部位に結合する。
【００３１】
別の態様では、ＤＮＡ結合分子（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ等）およびヌクレアーゼ（切断）ドメインを含むヌクレアーゼを含む、本明細書に記載されているヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）のうち１種または複数を含む組成物が本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、組成物は、薬学的に許容される賦形剤と組み合わせた、１種または複数のヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、組成物は、各セットが異なる特異性を有する、２またはそれよりも多いセット（対）のヌクレアーゼを含む。他の態様では、組成物は、異なる型のヌクレアーゼを含む。一部の実施形態では、組成物は、ＣＩＳＨ−ヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチドを含むが、他の実施形態では、組成物は、ＣＩＳＨ−特異的ヌクレアーゼタンパク質を含む。またさらなる実施形態では、組成物は、１種または複数のドナー分子、例えば、そのいずれかの機能的断片を含む機能的ＣＩＳＨタンパク質（複数可）をコードするドナーを含む。好ましい実施形態では、ドナーは、操作されたまたは外因性のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）遺伝子、ＡＣＴＲ配列をコードする遺伝子、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）遺伝子、および／またはＢ２ＭおよびＨＬＡ−Ｅおよび／またはＨＬＡ−Ｇを含む融合タンパク質等、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および／または他の免疫調節性タンパク質（複数可）をコードする配列を含む。他の態様では、ドナーは、細胞が機能的ＣＩＳＨを発現するように、細胞における変異体ＣＩＳＨ遺伝子に組み込まれる補正用配列を含む。
【００３２】
別の態様では、本明細書に記載されている１種または複数のヌクレアーゼまたはヌクレアーゼ構成成分（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系のヌクレアーゼドメイン）をコードするポリヌクレオチドが本明細書に記載されている。ポリヌクレオチドは、例えば、ｍＲＮＡまたはＤＮＡとなることができる。一部の態様では、ｍＲＮＡは、化学的に改変されていてよい（例えば、Ｋｏｒｍａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２９（２）：１５４−１５７を参照）。他の態様では、ｍＲＮＡは、ＡＲＣＡキャップを含むことができる（米国特許第７，０７４，５９６号；および同第８，１５３，７７３号を参照）。さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、未改変および改変ヌクレオチドの混合物を含むことができる（米国特許出願公開第２０１２／０１９５９３６号を参照）。別の態様では、プロモーターに作動可能に連結された、本明細書に記載されている１種または複数のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを含むヌクレアーゼ発現ベクターが本明細書に記載されている。一実施形態では、発現ベクターは、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶベクターである。
【００３３】
別の態様では、本明細書に記載されている１種もしくは複数のヌクレアーゼ、１種もしくは複数のヌクレアーゼ発現ベクター、および／または１種もしくは複数のドナーを含む、宿主細胞が本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＣＩＳＨ遺伝子を不活性化する挿入および／または欠失、例えば、ヌクレアーゼによる切断後のＮＨＥＪ（インデル）による不活性化、または切断後の１個もしくは複数の外因性配列（例えば、導入遺伝子）の挿入による不活性化を含む。ある特定の実施形態では、ＣＩＳＨ特異的ヌクレアーゼによって媒介される外因性配列の組込みが、ＣＩＳＨタンパク質の機能的バージョンを提供するように、宿主細胞は、１種または複数の遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ遺伝子）の変異体バージョンを含む。宿主細胞を、１種または複数のヌクレアーゼ発現ベクターにより、安定して形質転換するもしくは一過的にトランスフェクトするまたはこれらの組合せを行うことができる。一実施形態では、宿主細胞は、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞または幹細胞、例えば、造血幹細胞または人工多能性幹細胞である。他の実施形態では、１種または複数のヌクレアーゼ発現ベクターは、宿主細胞において１種または複数のヌクレアーゼを発現する。別の実施形態では、宿主細胞は、外因性ポリヌクレオチドドナー配列（例えば、ＣＩＳＨタンパク質をコードする）をさらに含むことができる。本明細書に記載されている実施形態のいずれかにおいて、宿主細胞は、胚細胞、例えば、１種または複数のマウス、ラット、ウサギまたは他の哺乳動物の細胞胚（例えば、非ヒト霊長類）を含むことができる。一部の実施形態では、宿主細胞は、組織を構成する。内在性ＣＩＳＨ遺伝子（例えば、内在性ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン２または３）に改変（例えば、組み込まれたドナー配列）を含む、多能性、全能性、複能性または分化した細胞を含む、本明細書に記載されている細胞の後代である細胞または細胞系も記載されている。ある特定の実施形態では、内在性ＣＩＳＨ遺伝子（例えば、内在性ＣＩＳＨのエクソン２またはエクソン３）に改変（例えば、組み込まれたドナー配列）を含む、本明細書に記載されている分化した細胞が本明細書に記載されており、この分化した細胞は、本明細書に記載されている幹細胞の後代である。
【００３４】
別の態様では、細胞におけるＣＩＳＨ遺伝子を切断するための方法であって、（ａ）ヌクレアーゼ（複数可）が発現され、１種または複数のＣＩＳＨ遺伝子が切断されるような条件下で、１種または複数のＣＩＳＨ遺伝子を標的とする１種または複数のヌクレアーゼをコードする１種または複数のポリヌクレオチドを細胞に導入するステップを含む方法が本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼによる切断後に、標的ＣＩＳＨ遺伝子におけるゲノム配列は、例えば、本明細書に記載されているヌクレアーゼ（またはヌクレアーゼをコードするベクター）を使用して切断され、ドナー配列が細胞において発現されるように、「ドナー」配列は、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系による標的化された切断後に遺伝子に挿入される。ドナー配列は、機能的ＣＩＳＨタンパク質をコードすることができる。一部の実施形態では、ドナー配列は、部分的ＣＩＳＨ遺伝子配列を含む。好ましい実施形態では、ドナーは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）等、免疫調節分子を含む。さらに、ドナー配列は、別々の送達機構（例えば、裸のポリヌクレオチドとしてｍＲＮＡ形態で、またはＬＮＰ送達により送達されるヌクレアーゼ、およびＡＡＶ等のウイルスベクターを使用して送達されるドナー）に存在するヌクレアーゼ送達系（例えば、非ウイルスベクター、ＬＮＰまたはウイルスベクター）に存在することができる、またはその代わりに、別々のおよび／または異なる核酸送達機構を使用して細胞に導入することができる。ＣＩＳＨ遺伝子座へのドナーヌクレオチド配列の挿入は、それぞれ内在性ＣＩＳＨ遺伝的制御エレメントの制御下における導入遺伝子の発現をもたらすことができる。一部の態様では、目的の導入遺伝子の挿入は、インタクトな外因性タンパク質配列の発現をもたらし、いかなるＣＩＳＨコードアミノ酸も欠く。他の態様では、発現される外因性タンパク質は、融合タンパク質であり、導入遺伝子およびＣＩＳＨ遺伝子によってコードされるアミノ酸を含む。一部の実例では、ＣＩＳＨ配列は、外因性タンパク質のアミノ（Ｎ）末端部分に存在するであろうが、他の実例では、ＣＩＳＨ配列は、外因性タンパク質のカルボキシ（Ｃ）末端部分に存在するであろう。他の実例では、ＣＩＳＨ配列は、外因性タンパク質のＮおよびＣ末端部分の両方に存在するであろう。ドナーは、ＣＩＳＨの発現が回復されるように、ＣＩＳＨタンパク質を発現しない（または正常野生型レベルを下回るレベルで発現する）変異体内在性ＣＩＳＨ遺伝子に組み込まれる「補正用」配列となることもできる。
【００３５】
一部の実施形態では、本発明は、ｉｎ  ｖｉｖｏでのＣＩＳＨプロモーターの制御下における導入遺伝子の発現に使用することができる方法および組成物について記載する。一部の態様では、導入遺伝子は、目的の治療タンパク質をコードすることができる。本発明の方法をタンパク質置換えに使用することができるように、導入遺伝子は、タンパク質をコードすることができる。一部の態様では、導入遺伝子は、Ｔ細胞応答性をモジュレートし、がんまたは免疫関連状態を処置および／または予防するタンパク質をコードする。
【００３６】
一部の実施形態では、導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ、野生型および操作されたＴＣＲ、例えば、ＡＣＴＲ）が、ＣＩＳＨのエクソン領域、例えば、エクソン２またはエクソン３に組み込まれるように、ヌクレアーゼ標的および／または切断部位は、ＣＩＳＨ遺伝子のエクソンに存在する。導入遺伝子は、ｉｎ  ｖｉｖｏ、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｔｒｏで別の目的の内在性または外因性プロモーターの制御下に置くことができ、この外因性プロモーターは、導入遺伝子の発現を駆動する。よって、（内在性または外因性プロモーターから）発現された導入遺伝子を含む本明細書における遺伝子改変された細胞は、細胞培養における（導入遺伝子からの）タンパク質（このタンパク質は単離することができる）の産生のためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ方法において、またはそれを必要とする被験体にタンパク質を提供する（例えば、がんを有する被験体にＣＡＲを、または被験体において異常に発現されるもしくは発現されないタンパク質を提供する）ためのｅｘ  ｖｉｖｏ（細胞療法）方法のために使用することができる。
【００３７】
別の態様では、内在性遺伝子を改変する方法が記載されており、この方法は、ドナーが、ヌクレアーゼによって標的化された内在性遺伝子に組み込まれるように、ＣＩＳＨタンパク質をコードする１種または複数のドナー配列の存在下で、１種または複数のヌクレアーゼ（例えば、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系）をコードする１種または複数のポリヌクレオチドを細胞に投与するステップを含む。１個または複数のドナー分子（複数可）の組込みは、相同組換え修復（ＨＤＲ）により、または非相同末端結合（ＮＨＥＪ）関連修復によって発生する。ある特定の実施形態では、１または複数対のヌクレアーゼが用いられ、これらのヌクレアーゼは、同じまたは異なる核酸によってコードされ得る。
【００３８】
さらに別の態様では、遺伝子改変されたＣＩＳＨ遺伝子を含む細胞（例えば、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞または幹細胞）が本明細書に提供される。ある特定の実施形態では、遺伝子改変された細胞は、ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン２および／またはエクソン３内に遺伝子改変、例えば、ヌクレアーゼによって作製された改変を含む。ある特定の実施形態では、遺伝子改変されたＣＩＳＨ遺伝子は、ＣＩＳＨ遺伝子における表２に示す配列の９〜２０塩基対の標的部位に標的化されたヌクレアーゼによる切断後に１個または複数の挿入および／または欠失（インデルとして公知）を含み、遺伝子は、ヌクレアーゼによる切断後に不活性化される。遺伝子改変は、標的部位（複数可）および／または切断部位（複数可）内に、および／または標的部位の縁の１〜５０塩基対内に存在し得る。他の実施形態では、改変は、本明細書に記載されている通り、ヌクレアーゼによる切断後に外因性配列、例えば、導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ、免疫調節因子、操作されたもしくは外因性のＴＣＲまたはＡＣＴＲ等）の挿入を含む。ある特定の実施形態では、細胞は、本明細書に記載されている方法によって作製される。他の好ましい実施形態では、導入遺伝子は、ＣＩＳＨのエクソン（例えば、表２に示す配列の９〜２０ヌクレオチドの配列の５〜１０塩基対中またはその内部が挙げられるがこれらに限定されない、エクソン２または３）に組み込まれる。組み込まれた導入遺伝子を含む細胞は、内在性プロモーター（例えば、それぞれＣＩＳＨプロモーター）から導入遺伝子を発現することができる、またはその代わりに、導入遺伝子は、導入遺伝子の発現を駆動する外因性プロモーター等、調節および制御エレメントを含むことができる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子を含む細胞は、ゲノムに組み込まれたウイルスベクター配列を全く含まない。本明細書に記載されている遺伝子改変された細胞は、タンパク質産生（組み込まれた導入遺伝子からの）等、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ使用に、および／またはがんもしくは炎症性疾患の処置における使用のための分子のスクリーニングのためを含む、変更されたＣＩＳＨ遺伝子を有する細胞もしくは動物モデルの提供に使用することができる。加えて、本明細書に記載されている遺伝子改変された細胞は、細胞の提供により、それを必要とする被験体にタンパク質を提供すること（ｅｘ  ｖｉｖｏ細胞療法）が挙げられるがこれに限定されない、ｉｎ  ｖｉｖｏ使用に使用することができる。
【００３９】
本明細書に記載されている方法および組成物のいずれかにおいて、細胞は、いずれかの真核細胞となることができる。ある特定の実施形態では、細胞は、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞または幹細胞である。他の実施形態では、細胞は、患者由来、例えば、自家ＣＤ３４＋（造血）幹細胞（例えば、顆粒球コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）投与により骨髄から末梢血へと患者において動員された）である。ＣＤ３４＋細胞を採集、精製、培養し、ヌクレアーゼおよび／またはＣＩＳＨドナー（例えば、アデノウイルスベクタードナー）をいずれか適した方法によって細胞に導入することができる。
【００４０】
一部の態様では、幹細胞または成熟細胞は、細胞療法に、例えば、成熟細胞を使用したＴ細胞移植に使用することができる。他の実施形態では、Ｔ細胞移植における使用のための細胞は、別の目的の遺伝子改変を含有する。一態様では、Ｔ細胞は、がんマーカーに特異的な挿入されたキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含有する。さらなる態様では、挿入されたＣＡＲは、Ｂ細胞悪性疾患に特徴的なＣＤ１９マーカーに特異的である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、自己免疫性疾患に特異的なＣＡＲを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、調節性Ｔ細胞であり、移植片拒絶の予防に有用なＣＡＲを含む。
【００４１】
別の態様では、本発明の方法および組成物は、例えば、Ｂ細胞悪性疾患（例えば、Ｂ細胞急性リンパ芽球性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、Ｂ細胞非ホジキンリンパ腫（Ｂ−ＮＨＬ）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）およびホジキンリンパ腫（Ｗａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１７）  Ｊ．  Ｈｅｍａｔｏｌ  Ｏｎｃｏｌ  １０（１）：５３）等のがんの処置または炎症性疾患（例えば、大腸炎、Ｂｌａｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２２（５）：１０１８−１０２８を参照）の処置における使用のための、本明細書に記載されている組成物（ヌクレアーゼ、医薬組成物、ポリヌクレオチド、発現ベクター、細胞、細胞系および／またはトランスジェニック動物等の動物）の使用を提供する。ある特定の実施形態では、このような組成物は、がんまたは炎症性障害の処置における使用のための、薬物ライブラリーおよび／または他の治療組成物（すなわち、抗体、構造的ＲＮＡ等）のスクリーニングにおいて使用される。斯かるスクリーニングは、マニピュレートされた細胞系または初代細胞を用いて細胞レベルで始めることができ、動物全体の処置（例えば、獣医学またはヒトの治療法）のレベルまで進めることができる。よって、ある特定の態様では、それを必要とする被験体におけるがんまたは炎症を処置および／または予防する方法であって、本明細書に記載されている１種または複数のヌクレアーゼ、ポリヌクレオチドおよび／または細胞を被験体に投与するステップを含む方法が本明細書に記載されている。方法は、ｅｘ  ｖｉｖｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏとなることができる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている細胞（例えば、ＣＩＳＨ遺伝子に組み込まれた導入遺伝子を含む細胞）は、被験体に投与される。本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、細胞は、被験体に由来する幹細胞（患者由来の幹細胞）となることができる。
【００４２】
本明細書に記載されている組成物および方法のいずれかにおいて、ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡ形態で、および／または１種もしくは複数の非ウイルス、ＬＮＰもしくはウイルスベクター（複数可）を使用して導入される。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）は、ｍＲＮＡ形態で導入される。他の実施形態では、導入遺伝子は、ウイルスベクター、例えば、ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９、ＡＡＶ  ｒｈ１０、ＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６を含むアデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）を使用して、またはレンチウイルスもしくは組込み欠損レンチウイルスベクターにより導入され、ヌクレアーゼ（複数可）は、ｍＲＮＡ形態で導入される。またさらなる実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）およびドナーは両者共に、１種または複数のウイルスまたは非ウイルスベクターを使用して導入される。ヌクレアーゼおよびドナーは、同じベクターで、同じ型の異なるベクターで、または異なる型の異なるベクターで運ぶことができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）は、ｍＲＮＡ形態で導入され（例えば、電気穿孔により）、ドナーは、ＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ２／６）、レンチウイルスまたは組込み欠損レンチウイルスを使用して導入される。ある特定の実施形態では、ドナーは、一本鎖ＤＮＡとして導入される。
【００４３】
ヌクレアーゼ（複数可）およびドナーは、同時発生的にまたは順番に導入することができる。逐次に導入される場合、ヌクレアーゼおよびドナーの投与の間に、任意の期間（例えば、数秒間〜数時間）が経過してよい。ある特定の実施形態では、ドナーが導入され、１２〜３６時間（またはその間のいずれかの時間）後に、ヌクレアーゼ（複数可）が細胞に導入される。ある特定の実施形態では、改変された細胞は、数時間〜数日間（またはその間のいずれかの時間）インキュベートされ、次いで、アリコートに分けられ、凍結される。
【００４４】
本発明の組成物および方法を使用して、細菌、昆虫、酵母、魚類、哺乳動物（非ヒト哺乳動物を含む）および植物細胞等の原核または真核細胞が挙げられるがこれらに限定されない、任意の細胞を改変することができる。ある特定の実施形態では、細胞は、免疫細胞、例えば、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋等）、樹状細胞、Ｂ細胞その他である。他の実施形態では、細胞は、多能性、全能性または複能性幹細胞、例えば、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋）、胚性幹細胞その他である。本明細書に記載されている方法または組成物のいずれかにおいて、ＣＩＳＨコード導入遺伝子を含有する細胞は、幹細胞または前駆細胞となることができる。本発明の方法および組成物と共に使用することができる特異的な幹細胞型は、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）および造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞）を含む。ｉＰＳＣは、患者試料および／または正常対照に由来することができ、患者由来のｉＰＳＣは、目的の遺伝子における正常もしくは野生型遺伝子配列へと変異させることができる、または正常細胞は、目的の遺伝子における公知疾患対立遺伝子へと変更することができる。同様に、造血幹細胞は、患者またはドナーから単離することができる。次に、このような細胞は、ＣＡＲ等の機能的タンパク質（複数可）を発現するように操作され、拡大増殖され（ｅｘｐａｎｄ）、次いで、患者に再導入される。ある特定の実施形態では、細胞は、患者由来の造血幹細胞である。他の実施形態では、細胞は、ＣＯＳ、ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＣＨＯ−ＤＧ４４、ＣＨＯ−ＤＵＸＢ１１、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ、ＣＨＯＫ１ＳＶ）、ＶＥＲＯ、ＭＤＣＫ、ＷＩ３８、Ｖ７９、Ｂ１４ＡＦ２８−Ｇ３、ＢＨＫ、ＨａＫ、ＮＳ０、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３（例えば、ＨＥＫ２９３−Ｆ、ＨＥＫ２９３−Ｈ、ＨＥＫ２９３−Ｔ）およびｐｅｒＣ６細胞である。
【００４５】
よって、外因性配列（ＣＡＲ等）の発現を伴うまたは伴わないＣＩＳＨの不活性化を含む、ＣＩＳＨ遺伝子発現をモジュレートするための方法および組成物が本明細書に記載されている。組成物および方法は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ、ｉｎ  ｖｉｖｏまたはｅｘ  ｖｉｖｏでの使用のためのもので有り得、ＣＩＳＨ遺伝子に標的化されたＤＮＡ結合ドメインを含む人工転写因子またはヌクレアーゼを投与するステップを含み、必要に応じて、ヌクレアーゼの場合、ヌクレアーゼによる切断後にＣＩＳＨ遺伝子に組み込まれるドナーを用いる。ある特定の実施形態では、細胞は、がんまたは炎症性疾患に存在するものである。他の実施形態では、細胞は、本明細書に記載されている方法のいずれかによって改変され、改変された細胞は、それを必要とする被験体（例えば、がんまたは炎症性障害を有する被験体）に投与される。本明細書に記載されている方法によって作製された細胞を含む、遺伝子改変されたＣＩＳＨ遺伝子（例えば、外因性配列）を含む遺伝子改変された細胞（例えば、幹細胞、前駆細胞、Ｔ細胞、筋肉細胞等）も提供される。このような細胞を使用して、例えば、それを必要とする被験体に細胞（複数可）を投与することにより、またはその代わりに、細胞によって産生されたタンパク質を単離し、それを必要とする被験体にタンパク質を投与することにより（酵素補充療法）、がんまたは炎症性疾患を有する被験体に治療タンパク質（複数可）を提供することができる。
【００４６】
本発明の核酸、タンパク質および／または細胞を含むキットも提供される。キットは、ヌクレアーゼをコードする核酸（例えば、ＲＮＡ分子、または適した発現ベクターに含有されたＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏもしくはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系コード遺伝子）、またはヌクレアーゼタンパク質のアリコート、ドナー分子、適した幹細胞性改変因子、細胞、本発明の方法を行うための指示、その他を含むことができる。
【００４７】
上述および他の態様は、全体として本開示を踏まえれば、当業者には容易に明らかとなるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、ＣＩＳＨ遺伝子（配列番号４８）のエクソン２および３（影付き）を含む部分的配列を示し、また、遺伝子における例示的なヌクレアーゼ標的部位（囲み枠内）を示す。
【００４９】
【図２】図２Ａ〜図２Ｄは、表示条件下における処置に付したＴ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。図２Ａ（「偽（Ｍｏｃｋ）」）は、細胞をヌクレアーゼ試薬で処置しなかったが、それ以外は他の細胞と同じ仕方で処置した場合の結果を示す。図２Ｂ（「ＡＡＶのみ」）は、細胞がＡＡＶ−ＧＦＰドナーのみを受けた結果を示す。図２Ｃ（「ＺＦＮのみ」）は、細胞がＣＩＳＨ標的化ヌクレアーゼのみを受けた（ｍＲＮＡとして投与された）結果を示し；図２Ｄ（「ＺＦＮ＋ＡＡＶ」）は、細胞がＡＡＶ−ＧＦＰドナーおよびＣＩＳＨ標的化ＺＦＮの両方による処置に付された結果を示す。図示されている通り、ＧＦＰがほとんど（ＡＡＶのみ）または全く（偽およびＺＦＮのみ）発現されなかった他の全処置条件と比較して、ヌクレアーゼおよびドナーで処置した細胞の少なくとも７５％が、ＧＦＰを発現した。
【００５０】
【図３】図３は、表示条件下における処置に付したエフェクターＴ細胞のＦＡＣＳ解析を示す。「ドナー単独」は、ＡＡＶ−ｈＰＧＫ−ＧＦＰドナーのみを受けた細胞を指し、「ＺＦＮ＋ドナー」は、ＡＡＶ−ｈＰＧＫ−ＧＦＰドナーおよびＣＩＳＨ標的化ＺＦＮの両方による処置に付された細胞を指す。図示されている通り、ＧＦＰを全く発現しなかったＡＡＶドナー単独で処置した細胞と比較して、ヌクレアーゼおよびドナーで処置した細胞のほぼ７２．６％が、ＧＦＰを発現した。
【００５１】
【図４】図４は、表示条件下における処置に付したエフェクターＴ細胞のＭｉｓｅｑ遺伝子型解析の結果を示すグラフである。「偽」は、ヌクレアーゼ試薬で処置しなかったが、それ以外は他の細胞と同じ仕方で処置した細胞を指し；「ＰＧＫ−ＧＦＰドナー」は、ＡＡＶ−ｈＰＧＫ−ＧＦＰドナーのみを受けた細胞を指し；「ＺＦＮ」は、ＣＩＳＨ標的化ヌクレアーゼのみがｍＲＮＡとして投与された細胞を指し；「ＺＦＮ＋ＰＧＫ−ＧＦＰドナー」は、ＡＡＶ−ｈＰＧＫ−ＧＦＰドナーおよびＣＩＳＨ標的化ＺＦＮの両方による処置に付された細胞を指す。図示されている通り、対立遺伝子のほぼ９０％が、ヌクレアーゼ（ＺＦＮおよびＺＦＮ＋ドナー）で処置した細胞において改変されている一方、ＡＡＶドナーおよびＺＦＮの両方で処置した細胞のみが、ドナーの高レベル（ほぼ４５％）の標的化された組込み（ＴＩ）を生じた。ＡＡＶドナー単独または偽で処置した群は、検出可能なレベルのゲノム改変がなかった。
【００５２】
【図５】図５は、表示条件下における処置に付したエフェクターＴ細胞のＭｉｓｅｑ遺伝子型解析を示すグラフである。「偽」は、ヌクレアーゼ試薬で処置しなかったが、それ以外は他の細胞と同じ仕方で処置した細胞を指し、「ＺＦＮ＋ドナー」は、対応するＡＡＶ−ＧＦＰドナーと共に、ＡＡＶＳ１またはＣＩＳＨ標的化ＺＦＮのいずれかによる処置に付された細胞を指す。図示されている通り、対立遺伝子のほぼ５０〜６０％が、ヌクレアーゼ（ＺＦＮ＋ドナー）で処置した細胞において改変されている一方、偽群は、検出可能なレベルのゲノム改変がなかった。
【００５３】
【図６】図６は、Ｌｕｍｉｎｅｘ解析により免疫賦活性サイトカイン分泌によって評価された、エフェクターＴ細胞機能データを示すグラフである。「ＺＦＮ＋ドナー」は、対応するＡＡＶ−ＧＦＰドナーと共に、ＡＡＶＳ１またはＣＩＳＨ標的化ＺＦＮのいずれかによる処置に付された細胞を指す。図示されている通り、ＣＩＳＨへの導入遺伝子ドナーのＴＩは、ゲノムのセーフハーバー（ｓａｆｅ  ｈａｒｂｏｒ）遺伝子座ＡＡＶＳ１へのＴＩと比較して、エフェクターＴ細胞の免疫賦活性機能増加（すなわち、ＴＮＦα上方調節）をもたらし、これはおそらく、大多数の細胞におけるＣＩＳＨ発現のノックアウトによるものであろう。
【発明を実施するための形態】
【００５４】
細胞（例えば、Ｔ細胞またはＣＤ３４＋造血幹細胞等のリンパ球前駆体）のＣＩＳＨ遺伝子への導入遺伝子タンパク質（例えば、ＣＡＲ、ＴＣＲ、ＡＣＴＲおよび／または他のいずれかの治療タンパク質）導入遺伝子の組込みによる改変を含む、ＣＩＳＨ遺伝子の標的化された改変のための組成物および方法が、本明細書に開示されている。方法および組成物は、エフェクターＴ細胞（ＣＤ４＋またはＣＤ８＋）および調節性Ｔ細胞（ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７ｌｏ、ＦＯＸＰ３＋）の改変に使用することができる。このような前駆体から、がん、炎症性障害、自己免疫性疾患または移植片を有する被験体において機能的タンパク質を発現する細胞への、その後のｉｎ  ｖｉｖｏ分化が、細胞によってもたらされ、この細胞が、レシピエント患者において疾患を処置および／または予防することができるように、細胞は患者への注入に適する。このような幹細胞から、機能的ＣＩＳＨタンパク質を発現する細胞への、その後のｉｎ  ｖｉｖｏ分化が、患者における疾患（例えば、がん、炎症性障害等）を処置および／または予防するように、本明細書に記載されている遺伝子改変された細胞（例えば、ＣＩＳＨ遺伝子におけるインデルおよび／または導入遺伝子）は患者への注入に適する。加えて、本明細書に記載されている細胞（細胞または細胞系の集団）をｉｎ  ｖｉｔｒｏで使用して、スクリーニングのための細胞、細胞系もしくは動物モデルを産生することができる、および／または組み込まれた導入遺伝子からタンパク質を産生することができ、このタンパク質を単離し、被験体の処置に使用することができる。
【００５５】
本発明は、がん、炎症性障害、自己免疫性疾患または移植片を処置および／または予防するタンパク質、またはＴ細胞を再び方向付ける（ｒｅｄｉｒｅｃｔ）ための受容体として機能するタンパク質を含む、いずれかの機能的タンパク質をコードする配列を含むドナーの組込みが挙げられるがこれらに限定されない、ＣＩＳＨ遺伝子に対するいずれかの遺伝子改変を企図する。
【００５６】
全般
本明細書に開示されている方法の実施、ならびに本明細書に開示されている組成物の調製および使用は、別段の指示がなければ、当業者の技能範囲内の通りに、分子生物学、生化学、クロマチン構造および解析、計算化学、細胞培養、組換えＤＮＡならびに関連分野における従来技法を用いる。これらの技法は、文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＣＬＯＮＩＮＧ：  Ａ  ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ  ＭＡＮＵＡＬ，  Ｓｅｃｏｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  １９８９  ａｎｄ  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  ２００１；Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．，  ＣＵＲＲＥＮＴ  ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，  Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，  １９８７  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｕｐｄａｔｅｓ；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ；Ｗｏｌｆｆｅ，  ＣＨＲＯＭＡＴＩＮ  ＳＴＲＵＣＴＵＲＥ  ＡＮＤ  ＦＵＮＣＴＩＯＮ，  Ｔｈｉｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９９８；ＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌ．  ３０４，  ”Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ”  （Ｐ．Ｍ．  Ｗａｓｓａｒｍａｎ  ａｎｄ  Ａ．  Ｐ．  Ｗｏｌｆｆｅ，  ｅｄｓ．），  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，  １９９９；およびＭＥＴＨＯＤＳ  ＩＮ  ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ  ＢＩＯＬＯＧＹ，  Ｖｏｌ．  １１９，  ”Ｃｈｒｏｍａｔｉｎ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ”  （Ｐ．Ｂ．  Ｂｅｃｋｅｒ，  ｅｄ．）  Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｔｏｔｏｗａ，  １９９９を参照されたい。
【００５７】
定義
用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、互換的に使用され、直鎖状または環状コンフォメーションで、一本または二本鎖形態のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドポリマーを指す。本開示の目的のため、これらの用語は、ポリマーの長さに関する限定として解釈するべきではない。これらの用語は、天然のヌクレオチドの公知アナログ、ならびに塩基、糖および／またはリン酸部分が改変されたヌクレオチド（例えば、ホスホロチオエート骨格）を包含することができる。一般に、特定のヌクレオチドのアナログは、同じ塩基対形成特異性を有する；すなわち、Ａのアナログは、Ｔと塩基対形成するであろう。
【００５８】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基のポリマーを指すように互換的に使用されている。この用語は、１個または複数のアミノ酸が、対応する天然に存在するアミノ酸の化学的アナログまたは改変された誘導体である、アミノ酸ポリマーにも適用される。
【００５９】
「結合」は、巨大分子間の（例えば、タンパク質および核酸の間の）配列特異的な、非共有結合性相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限りにおいて、結合相互作用の全ての構成成分が、配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基との接触）。斯かる相互作用は一般に、１０−６Ｍ−１またはそれよりも低い解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けられる。「親和性」は、結合の強度を指す：増加した結合親和性は、より低いＫｄと相関する。
【００６０】
「結合ドメイン」は、別の分子に非共有結合的に結合することができる分子である。結合分子は、例えば、ＤＮＡ分子（ジンクフィンガータンパク質もしくはＴＡＬエフェクタードメインタンパク質等のＤＮＡ結合タンパク質、またはシングルガイドＲＮＡ）、ＲＮＡ分子（ＲＮＡ結合タンパク質）および／またはタンパク質分子（タンパク質結合タンパク質）に結合することができる。タンパク質結合分子の場合、これは、それ自体と結合（して、ホモ二量体、ホモ三量体等を形成）することができる、および／または異なるタンパク質（単数または複数）の１個または複数の分子に結合することができる。結合分子は、２種類以上の結合活性を有することができる。例えば、ジンクフィンガータンパク質は、ＤＮＡ結合、ＲＮＡ結合およびタンパク質結合活性を有する。よって、人工ヌクレアーゼおよび転写因子のＤＮＡ結合構成成分を含むＤＮＡ結合分子として、ＺＦＰ、ＴＡＬＥおよびｓｇＲＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。
【００６１】
「ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、その構造が亜鉛イオンの配位を介して安定化される結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である１個または複数のジンクフィンガーを介して配列特異的様式でＤＮＡに結合する、タンパク質、またはより大型のタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーＤＮＡ結合タンパク質という用語は、多くの場合、ジンクフィンガータンパク質またはＺＦＰと省略される。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメイン（ＺＦＮのためのヌクレアーゼドメインまたはＺＦＰ−ＴＦのための転写調節ドメイン）を含むことができる。用語「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」は、１つのＺＦＮと共に、二量体形成して標的遺伝子を切断する、１対のＺＦＮ（対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２」または「対」と称される）を含む。
【００６２】
「ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメイン」または「ＴＡＬＥ」は、１個または複数のＴＡＬＥリピートドメイン／単位を含むポリペプチドである。リピートドメインは、その同族標的ＤＮＡ配列へのＴＡＬＥの結合に関与する。単一の「リピート単位」（「リピート」とも称される）は、典型的に、３３〜３５アミノ酸の長さであり、天然に存在するＴＡＬＥタンパク質内の他のＴＡＬＥリピート配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号および同第９，４５８，２０５号を参照されたい。人工ヌクレアーゼおよび転写因子は、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび機能的ドメイン（ＴＡＬＥＮのためのヌクレアーゼドメインまたはＴＡＬＥＮ−ＴＦのための転写調節ドメイン）を含むことができる。用語「ＴＡＬＥＮ」は、１つのＴＡＬＥＮと共に、二量体形成して標的遺伝子を切断する、１対のＴＡＬＥＮ（対のメンバーは、「左および右」または「第１および第２」または「対」と称される）を含む。
【００６３】
ジンクフィンガーおよびＴＡＬＥ結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガーまたはＴＡＬＥタンパク質の認識ヘリックス領域の操作（１個または複数のアミノ酸の変更）により、所定のヌクレオチド配列に結合するように「操作」することができる。したがって、操作されたＤＮＡ結合タンパク質（ジンクフィンガーまたはＴＡＬＥ）は、天然に存在しないタンパク質である。ＤＮＡ結合タンパク質を操作するための方法の非限定的な例は、設計および選択である。設計されたＤＮＡ結合タンパク質は、その設計／組成が主に合理的基準に起因する、自然界に発生しないタンパク質である。設計のための合理的基準は、現存するＺＦＰおよび／またはＴＡＬＥ設計および結合データの情報を記憶するデータベースにおける情報を処理するための、置換規則およびコンピュータ処理されたアルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第６，１４０，０８１号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；および同第８，５８５，５２６号を参照されたい；また、国際特許公開番号ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６；およびＷＯ０３／０１６４９６を参照されたい。
【００６４】
「選択された」ジンクフィンガータンパク質またはＴＡＬＥは、その産生が、主としてファージディスプレイ、相互作用トラップまたはハイブリッド選択等の経験的プロセスに起因する、自然界に見出されないタンパク質である。例えば、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；同第８，５８６，５２６号；ならびに国際特許公開番号ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；およびＷＯ０２／０９９０８４を参照されたい。
【００６５】
「ＴｔＡｇｏ」は、遺伝子サイレンシングに関与すると考えられる原核生物アルゴノートタンパク質である。ＴｔＡｇｏは、細菌Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓに由来する。例えば、Ｓｗａｒｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｂｉｄ，  Ｇ．  Ｓｈｅｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  Ｕ．Ｓ．Ａ．  １１１，  ６５２を参照されたい。「ＴｔＡｇｏ系」は、例えば、ＴｔＡｇｏ酵素による切断のためのガイドＤＮＡを含む、要求される全ての構成成分である。
【００６６】
「組換え」は、非相同末端結合（ＮＨＥＪ）によるドナー捕捉、および相同組換えが挙げられるがこれらに限定されない、２つのポリヌクレオチドの間での遺伝情報交換のプロセスを指す。本開示の目的のため、「相同組換え（ＨＲ）」は、例えば、相同組換え修復機構による細胞における二本鎖切断の修復中に起こる、斯かる交換の特殊化された形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列相同性を要求し、「標的」分子（すなわち、二本鎖切断を経験した分子）の鋳型修復のために「ドナー」分子を使用し、ドナーから標的への遺伝情報の移入をもたらすため、「非クロスオーバー遺伝子変換」または「短縮経路（ｓｈｏｒｔ  ｔｒａｃｔ）遺伝子変換」として様々に公知である。いずれか特定の理論に制約されることは望まないが、斯かる移入は、切断された標的およびドナーの間に形成するヘテロ二重鎖ＤＮＡのミスマッチ補正、および／またはドナーが、標的の一部になるであろう遺伝情報の再合成に使用される、「合成依存性鎖アニーリング」、および／または関連プロセスが関与し得る。斯かる特殊化されたＨＲは、多くの場合、ドナーポリヌクレオチドの配列の一部または全体が標的ポリヌクレオチドに取り込まれるような、標的分子の配列の変更をもたらす。
【００６７】
本開示の方法において、本明細書に記載されている１種または複数の標的化ヌクレアーゼは、標的配列（例えば、細胞クロマチン）の所定の部位に二本鎖切断（ＤＳＢ）を作製する。ＤＳＢは、相同組換え修復または非相同組換え修復機構により欠失および／または挿入をもたらすことができる。欠失は、いずれかの数の塩基対を含むことができる。同様に、挿入は、例えば、切断領域におけるヌクレオチド配列に対する相同性を必要に応じて有する「ドナー」ポリヌクレオチドの組込みを含む、いずれかの数の塩基対を含むことができる。ドナー配列は、物理的に組み込むことができる、またはその代わりに、ドナーポリヌクレオチドは、相同組換えによる切断の修復のための鋳型として使用され、細胞クロマチンにおけるドナーと同様に、ヌクレオチド配列の全体または一部の導入をもたらす。よって、細胞クロマチンにおける第１の配列は、変更することができ、ある特定の実施形態では、ドナーポリヌクレオチドに存在する配列へと変換することができる。よって、用語「置き換える」または「置換え」の使用は、あるヌクレオチド配列の、別のヌクレオチド配列による置換えを表すものと理解することができ（すなわち、情報的な意味での配列の置換え）、あるポリヌクレオチドの、別のポリヌクレオチドによる物理的または化学的な置換えを必ずしも要求するものではない。
【００６８】
本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、追加的な対のジンクフィンガータンパク質、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を、細胞内の追加的な標的部位の追加的な二本鎖切断に使用することができる。
【００６９】
本明細書に記載されている方法のいずれかを、いずれかのサイズのドナーの挿入に、および／または目的の遺伝子（複数可）の発現を破壊するドナー配列の標的化された組込みによって、細胞における１種もしくは複数の標的配列の部分的もしくは完全な不活性化に使用することができる。部分的にまたは完全に不活性化された遺伝子を有する細胞系も提供される。
【００７０】
本明細書に記載されている方法のいずれかにおいて、外因性ヌクレオチド配列（「ドナー配列」または「導入遺伝子」）は、目的の領域におけるゲノム配列に対して相同であるが同一ではない配列を含有し、これにより、相同組換えを刺激して、目的の領域に非同一配列を挿入することができる。よって、ある特定の実施形態では、目的の領域における配列に対して相同であるドナー配列の部分は、置き換えられるゲノム配列に対して約８０〜９９％の間（またはその間のいずれかの整数）の配列同一性を示す。他の実施形態では、例えば、１個のみのヌクレオチドが、１００を超える近接塩基対のドナーおよびゲノム配列の間で異なる場合、ドナーおよびゲノム配列の間の相同性は、９９％よりも高い。ある特定の事例では、新たな配列が目的の領域に導入されるように、ドナー配列の非相同部分は、目的の領域に存在しない配列を含有することができる。これらの実例では、非相同配列は一般に、目的の領域における配列に対して相同または同一である、５０〜１，０００塩基対（またはその間のいずれかの整数値）または１，０００を超えるいずれかの数の塩基対の配列に挟まれる。他の実施形態では、ドナー配列は、第１の配列に対して非相同であり、非相同組換え機構によってゲノムに挿入される。
【００７１】
「切断」は、ＤＮＡ分子の共有結合骨格の破損を指す。切断は、ホスホジエステル結合の酵素的または化学的加水分解が挙げられるがこれらに限定されない、種々の方法によって惹起することができる。一本鎖切断および二本鎖切断の両方が可能であり、二本鎖切断は、２回の別個の一本鎖切断事象の結果として発生し得る。ＤＮＡ切断は、平滑末端または付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｎｄ）のいずれかの産生をもたらすことができる。ある特定の実施形態では、融合ポリペプチドが、標的化された二本鎖ＤＮＡ切断に使用される。
【００７２】
「切断ハーフドメイン」は、第２のポリペプチド（同一または異なるのいずれか）と一緒になって、切断活性（好ましくは、二本鎖切断活性）を有する複合体を形成する、ポリペプチド配列である。用語「第１および第２の切断ハーフドメイン」；「＋および−切断ハーフドメイン」ならびに「右および左切断ハーフドメイン」は、二量体形成する切断ハーフドメインの対を指すように互換的に使用される。
【００７３】
「操作された切断ハーフドメイン」は、別の切断ハーフドメイン（例えば、別の操作された切断ハーフドメイン）と偏性の（ｏｂｌｉｇａｔｅ）ヘテロ二量体を形成するように改変された切断ハーフドメインである。それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号も参照されたい。
【００７４】
用語「配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡとなることができ；直鎖状、環状または分枝状となることができ、一本鎖または二本鎖のいずれかとなることができる、いずれかの長さのヌクレオチド配列を指す。用語「ドナー配列」は、ゲノムに挿入されるヌクレオチド配列を指す。ドナー配列は、いずれかの長さ、例えば、２〜１００，０００，０００の間のヌクレオチドの長さ（またはその間のもしくはそれを上回る（ｔｈｅｒｅａｂｏｖｅ）いずれかの整数値）、好ましくは、約１００〜１００，０００の間のヌクレオチドの長さ（またはその間のいずれかの整数）、より好ましくは、約２０００〜２０，０００の間のヌクレオチドの長さ（またはその間のいずれかの値）、さらにより好ましくは、約５〜１５ｋｂの間（またはその間のいずれかの値）となることができる。
【００７５】
「クロマチン」は、細胞ゲノムを含む核タンパク質構造である。細胞クロマチンは、核酸、主としてＤＮＡ、ならびにヒストンおよび非ヒストン染色体タンパク質を含むタンパク質を含む。真核細胞クロマチンの大部分は、ヌクレオソームの形態で存在し、ヌクレオソームにおいて、ヌクレオソームコアは、ヒストンＨ２Ａ、Ｈ２Ｂ、Ｈ３およびＨ４をそれぞれ２個ずつ含む八量体と会合したおよそ１５０塩基対のＤＮＡを含み；リンカーＤＮＡ（生物に依存して可変的な長さの）は、ヌクレオソームコアの間に延在する。ヒストンＨ１の分子は一般に、リンカーＤＮＡと会合する。本開示の目的のため、用語「クロマチン」とは、原核生物および真核生物の両方の、あらゆる種類の細胞核タンパク質を包含することを意図する。細胞クロマチンは、染色体およびエピソームクロマチンの両方を含む。
【００７６】
「染色体」は、細胞のゲノムの全体または部分を含むクロマチン複合体である。細胞のゲノムは多くの場合、細胞のゲノムを構成する全染色体の集合体である、その核型によって特徴付けされる。細胞のゲノムは、１本または複数の染色体を含むことができる。
【００７７】
「エピソーム」は、細胞の染色体核型の一部でない核酸を含む、複製する核酸、核タンパク質複合体または他の構造である。エピソームの例として、プラスミドおよびある特定のウイルスゲノムが挙げられる。
【００７８】
「到達可能領域」は、核酸に存在する標的部位が、標的部位を認識する外因性分子によって結合され得る、細胞クロマチンにおける部位である。いずれか特定の理論に制約されることは望まないが、到達可能領域は、ヌクレオソーム構造中にパッケージングされていない領域であることが考えられる。到達可能領域の別個の構造は、多くの場合、化学的および酵素的プローブ、例えば、ヌクレアーゼに対するその感受性によって検出することができる。
【００７９】
「標的部位」または「標的配列」は、結合に十分な条件が存在するのであれば、結合分子が結合するであろう、核酸の部分を画定する核酸配列である。標的部位は、いずれかの長さ、例えば、９〜２０またはそれよりも多いヌクレオチドの長さとなることができ、結合したヌクレオチドは、近接または非近接となることができる。
【００８０】
「外因性」分子は、細胞に通常存在しないが、１種または複数の遺伝学的、生化学的または他の方法によって細胞に導入することができる分子である。「細胞における通常の存在」は、細胞の特定の発生ステージおよび環境条件に関して決定される。よって、例えば、筋肉の胚発生中にのみ存在する分子は、成体筋肉細胞に関して外因性分子である。同様に、熱ショックによって誘導される分子は、熱ショックを与えていない細胞に関して外因性分子である。外因性分子は、例えば、機能不全性内在性分子の機能性バージョン、または正常に機能する内在性分子の機能不全性バージョンを含むことができる。
【００８１】
外因性分子は、とりわけ、コンビナトリアルケミストリープロセスによって生成されるもの等の小分子、またはタンパク質、核酸、炭水化物、脂質、糖タンパク質、リポタンパク質、多糖等の巨大分子、上述の分子のいずれかの改変された誘導体、または上述の分子のうち１個もしくは複数を含むいずれかの複合体となることができる。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含み、一本または二本鎖となることができ；直鎖状、分枝状または環状となることができ；いずれかの長さとなることができる。核酸は、二重鎖を形成することができる核酸と共に、三重鎖形成核酸を含む。例えば、米国特許第５，１７６，９９６号および同第５，４２２，２５１号を参照されたい。タンパク質として、ＤＮＡ結合タンパク質、転写因子、クロマチンリモデリング因子、メチル化ＤＮＡ結合タンパク質、ポリメラーゼ、メチラーゼ、デメチラーゼ、アセチラーゼ、デアセチラーゼ、キナーゼ、ホスファターゼ、インテグラーゼ、リコンビナーゼ、リガーゼ、トポイソメラーゼ、ギラーゼおよびヘリカーゼが挙げられるがこれらに限定されない。
【００８２】
外因性分子は、内在性分子と同じ型の分子、例えば、外因性タンパク質または核酸となることができる。例えば、外因性核酸は、感染性ウイルスゲノム、細胞に導入されたプラスミドもしくはエピソーム、または細胞に通常存在しない染色体を含むことができる。細胞への外因性分子の導入のための方法は、当業者にとって公知であり、そのようなものとして、脂質媒介性移入（すなわち、中性およびカチオン性脂質を含むリポソーム）、電気穿孔、直接的注射、細胞融合、微粒子銃、リン酸カルシウム共沈殿、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介性移入およびウイルスベクター媒介性移入が挙げられるがこれらに限定されない。外因性分子は、内在性分子と同じ型の分子であるが、細胞が由来する種とは異なる種に由来することもできる。例えば、ヒト核酸配列は、マウスまたはハムスターに本来由来する細胞系に導入することができる。
【００８３】
対照的に、「内在性」分子は、特定の環境条件下で特定の発生ステージにおいて特定の細胞に通常存在する分子である。例えば、内在性核酸は、染色体、ミトコンドリア、葉緑体もしくは他のオルガネラのゲノム、または天然に存在するエピソーム核酸を含むことができる。追加的な内在性分子は、タンパク質、例えば、転写因子および酵素を含むことができる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、用語「外因性核酸の産物」は、ポリヌクレオチドおよびポリペプチド産物の両方、例えば、転写産物（ＲＮＡ等のポリヌクレオチド）および翻訳産物（ポリペプチド）を含む。
【００８５】
「融合」分子は、２個またはそれよりも多いサブユニット分子が、好ましくは共有結合により連結された分子である。サブユニット分子は、同じ化学型の分子となることができる、または異なる化学型の分子となることができる。第１の型の融合分子の例として、融合タンパク質（例えば、ＺＦＰまたはＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインおよび１個または複数の活性化ドメインの間の融合）および融合核酸（例えば、上記に記載の融合タンパク質をコードする核酸）が挙げられるがこれらに限定されない。第２の型の融合分子の例として、三重鎖形成核酸およびポリペプチドの間の融合、ならびに副溝結合剤および核酸の間の融合が挙げられるがこれらに限定されない。
【００８６】
細胞における融合タンパク質の発現は、細胞への融合タンパク質の送達、または細胞への融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドの送達に起因することができ、そこで、ポリヌクレオチドが転写され、転写物が翻訳されて、融合タンパク質を生成する。トランススプライシング、ポリペプチド切断およびポリペプチドライゲーションが、細胞におけるタンパク質の発現に関与することもできる。細胞へのポリヌクレオチドおよびポリペプチド送達のための方法は、本開示の他の箇所に提示されている。
【００８７】
「遺伝子」は、本開示の目的のため、遺伝子産物（下記を参照）をコードするＤＮＡ領域と共に、遺伝子産物の産生を調節するあらゆるＤＮＡ領域を含み、この場合、斯かる調節性配列が、コード配列および／または転写される配列に隣接するか否かを問わない。したがって、遺伝子は、プロモーター配列、ターミネーター、リボソーム結合部位および配列内リボソーム進入部位等の翻訳調節配列、エンハンサー、サイレンサー、インスレーター、境界エレメント、複製起点、マトリクス付着部位、ならびに遺伝子座制御領域を含むが、必ずしもこれらに限定されない。
【００８８】
「遺伝子発現」は、遺伝子に含有されている情報から遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的な転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、構造的ＲＮＡまたは他のいずれかの型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されたタンパク質となることができる。遺伝子産物は、キャッピング、ポリアデニル化、メチル化および編集等のプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化（ｍｙｒｉｓｔｉｌａｔｉｏｎ）およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も含む。
【００８９】
遺伝子発現の「モジュレーション」は、遺伝子の活性の変化を指す。発現のモジュレーションとして、遺伝子活性化および遺伝子抑制を挙げることができるがこれらに限定されない。ゲノム編集（例えば、切断、変更、不活性化、ランダム変異）を使用して、発現をモジュレートすることができる。遺伝子不活性化は、本明細書に記載されているＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を含まない細胞と比較した、遺伝子発現の何らかの低下を指す。よって、遺伝子不活性化は、部分的または完全となることができる。
【００９０】
「目的の領域」は、例えば、外因性分子を結合することが望ましい、遺伝子、または遺伝子内のもしくはそれに隣接する非コード配列等、細胞クロマチンのいずれかの領域である。結合は、標的化されたＤＮＡ切断および／または標的化された組換えの目的のためとなることができる。目的の領域は、例えば、染色体、エピソーム、オルガネラゲノム（例えば、ミトコンドリア、葉緑体）または感染性ウイルスゲノムに存在することができる。目的の領域は、遺伝子のコード領域内、例えば、リーダー配列、トレーラー配列もしくはイントロン等の転写される非コード領域内、またはコード領域の上流もしくは下流のいずれかの、非転写領域内となることができる。目的の領域は、単一のヌクレオチド対もの小ささ、または最大２，０００ヌクレオチド対の長さ、またはいずれかの整数値のヌクレオチド対となることができる。
【００９１】
「真核」細胞として、幹細胞（多能性および複能性）を含む、真菌細胞（酵母等）、植物細胞、動物細胞、哺乳動物細胞およびヒト細胞（例えば、Ｔ細胞）が挙げられるがこれらに限定されない。
【００９２】
「エフェクターＴ細胞」（Ｔｅｆｆ）は、刺激に対して直ちに作用するＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞である。このような細胞は、分化後の細胞媒介性免疫における中心的な役割を果たす。Ｔ細胞は、抗原提示細胞による刺激後に活性化され、細胞傷害性分子および抗体の産生等の決定的なエフェクター機能を行うエフェクターＴ細胞へと分化する。エフェクターＴ細胞は、炎症（例えば、感染）の部位へと遊走し、ケモカインを産生して、追加的な免疫細胞をリクルートする。
【００９３】
「調節性Ｔ細胞」（Ｔｒｅｇ）は、サプレッサーＴ細胞としても公知であり、免疫系をモジュレートし、自家抗原に対する寛容を維持し、自己免疫性疾患を予防するＴ細胞の亜集団である。Ｔｒｅｇは、免疫抑制性であり、一般に、エフェクターＴ細胞の誘導および増殖を抑制または下方調節する。Ｔｒｅｇは、ＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ１２７ｌｏかつＦＯＸＰ３＋である。
【００９４】
用語「自家」は、材料が後に再導入されることになる個体と同じ個体に由来する任意の材料を指す。
【００９５】
用語「同種異系」は、材料が導入される個体と同じ種の異なる個体に由来する任意の材料を指す。１個または複数の遺伝子座における遺伝子が同一でない場合、２つまたはそれよりも多い個体は、互いに同種異系であると言われる。一部の態様では、同じ種の個体由来の同種異系材料は、抗原性に相互作用するには、遺伝的に十分に似ていない場合がある。
【００９６】
用語「操作可能な連結」および「操作可能に連結された」（または「作動可能に連結された」）は、２個またはそれよりも多い構成成分（配列エレメント等）の並置に関して互換的に使用され、この並置において、両方の構成成分が正常に機能し、構成成分のうち少なくとも１個が、他の構成成分のうち少なくとも１個により発揮される機能を媒介することができる可能性を認めるように、構成成分が配置されている。説明として、転写調節配列が、１種または複数の転写調節因子の存在または非存在に応答して、コード配列の転写のレベルを制御する場合、プロモーター等の転写調節配列は、コード配列に操作可能に連結されている。転写調節配列は一般に、コード配列とシスで操作可能に連結されているが、それと直接的に隣接している必要はない。例えば、エンハンサーは、近接していないにもかかわらず、コード配列に操作可能に連結された転写調節配列である。
【００９７】
融合ポリペプチドに関して、用語「操作可能に連結された」は、構成成分のそれぞれが、他の構成成分に連結した状態で、このように連結されていない場合と同じ機能を行うという事実を指すことができる。例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインが、活性化ドメインに融合された融合ポリペプチドに関して、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、活性化ドメインが、遺伝子発現を上方調節することができる場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインは、操作可能な連結状態にある。ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインが、切断ドメインに融合された融合ポリペプチドの場合、融合ポリペプチドにおいて、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメイン部分が、その標的部位および／またはその結合部位に結合することができる一方で、切断ドメインが、標的部位の近傍でＤＮＡを切断することができる場合、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ＴｔＡｇｏまたはＣａｓ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメインは、操作可能な連結状態にある。
【００９８】
タンパク質、ポリペプチドまたは核酸の「機能的断片」は、その配列が、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同一ではないが、依然として、全長タンパク質、ポリペプチドまたは核酸と同じ機能を保持する、タンパク質、ポリペプチドまたは核酸である。機能的断片は、対応するネイティブ分子より多い、より少ないもしくは同じ数の残基を保有することができる、および／または１個もしくは複数のアミノ酸もしくはヌクレオチド置換を含有することができる。核酸の機能（例えば、コード機能、別の核酸にハイブリダイズする能力）を決定するための方法は、本技術分野で周知である。同様に、タンパク質機能を決定するための方法が周知である。例えば、ポリペプチドのＤＮＡ結合機能は、例えば、フィルター結合、電気泳動移動度シフトまたは免疫沈降アッセイによって決定することができる。ＤＮＡ切断は、ゲル電気泳動によってアッセイすることができる。Ａｕｓｕｂｅｌ，  ｅｔ  ａｌ．、上記参照を参照されたい。別のタンパク質と相互作用するタンパク質の能力は、例えば、共免疫沈降、ツーハイブリッドアッセイまたは相補性によって、遺伝学的および生化学的の両方で、決定することができる。例えば、Ｆｉｅｌｄｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｎａｔｕｒｅ  ３４０：２４５−２４６；米国特許第５，５８５，２４５号および国際特許公開番号ＷＯ９８／４４３５０を参照されたい。
【００９９】
「ベクター」は、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる。典型的には、「ベクター構築物」、「発現ベクター」および「遺伝子移入ベクター」は、目的の遺伝子の発現を方向付けることができ、遺伝子配列を標的細胞に移入することができる、任意の核酸構築物を意味する。よって、この用語は、クローニングおよび発現ビヒクルと共に、組込み用ベクターを含む。
【０１００】
用語「被験体」および「患者」は、互換的に使用され、ヒト患者および非ヒト霊長類等の哺乳動物、ならびにウサギ、イヌ、ネコ、ラット、マウスおよび他の動物等の実験動物を指す。したがって、用語「被験体」または「患者」は、本明細書で使用される場合、本発明のヌクレアーゼ、ドナーおよび／または遺伝子改変された細胞を投与することができる、いずれかの哺乳動物患者または被験体を意味する。本発明の被験体は、障害を有する被験体を含む。
【０１０１】
「自己免疫性疾患」は、免疫系が自己抗原を攻撃する疾患である。自己免疫性疾患の例として、円板状エリテマトーデス／深在性エリテマトーデス／凍瘡状エリテマトーデス／腫脹性エリテマトーデス腎症（ｔｕｍｉｄｕｓ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ  ｎｅｐｈｒｏｐａｔｈｙ）が挙げられ、キメラ受容体は、円板状エリテマトーデス／深在性エリテマトーデス／凍瘡状エリテマトーデス／腫脹性エリテマトーデス腎症に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。円板状エリテマトーデス／深在性エリテマトーデス／凍瘡状エリテマトーデス／腫脹性エリテマトーデス腎症に関連する自己抗原の例として、ＡＮＡが挙げられるがこれに限定されない。
【０１０２】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、橋本病であり、キメラ受容体は、橋本病に関連する自己抗原を含む。橋本病に関連する自己抗原の例として、甲状腺ペルオキシダーゼおよびサイログロブリンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０３】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、ＮＭＤＡＲ脳炎であり、キメラ受容体は、ＮＭＤＡＲ脳炎に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。ＮＭＤＡＲ脳炎に関連する自己抗原の例として、抗Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸受容体（ＮＲ１サブユニット）が挙げられるがこれに限定されない。
【０１０４】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、自己免疫性溶血性貧血であり、キメラ受容体は、自己免疫性溶血性貧血に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。自己免疫性溶血性貧血に関連する自己抗原の例として、Ｒｈ式血液型抗原およびＩ抗原が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０５】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、尋常性天疱瘡であり、キメラ受容体は、尋常性天疱瘡に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。尋常性天疱瘡に関連する自己抗原の例として、Ｄｓｇｌ／３が挙げられるがこれに限定されない。
【０１０６】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、水疱性類天疱瘡であり、キメラ受容体は、水疱性類天疱瘡に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。水疱性類天疱瘡に関連する自己抗原の例として、ＢＰ１８０およびＢＰ２３０が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１０７】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、重症筋無力症であり、キメラ受容体は、重症筋無力症に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。重症筋無力症に関連する自己抗原の例として、アセチルコリンニコチン性シナプス後受容体が挙げられるがこれに限定されない。
【０１０８】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、グレーブス病であり、キメラ受容体は、グレーブス病に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。グレーブス病に関連する自己抗原の例として、サイロトロピン受容体が挙げられるがこれに限定されない。
【０１０９】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）であり、キメラ受容体は、特発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。特発性血小板減少性紫斑病に関連する自己抗原の例として、血小板インテグリンおよびＧｐＩＩｂ：ＩＩＩａが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１０】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、グッドパスチャー症候群であり、キメラ受容体は、グッドパスチャー症候群に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。グッドパスチャー症候群に関連する自己抗原の例として、コラーゲンアルファ−３（ＩＶ）鎖が挙げられるがこれに限定されない。
【０１１１】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、関節リウマチであり、キメラ受容体は、関節リウマチに関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。関節リウマチに関連する自己抗原の例として、リウマチ因子およびカルパスタチンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１２】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、若年性特発性関節炎であり、キメラ受容体は、若年性特発性関節炎に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。若年性特発性関節炎に関連する自己抗原の例として、ＲＦ、シトルリン化タンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１３】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、多発性硬化症であり、キメラ受容体は、多発性硬化症に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。多発性硬化症に関連する自己抗原の例として、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）、ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドおよびアルファ−ベータ−クリスタリンが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１４】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、セリアック病であり、キメラ受容体は、セリアック病に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。セリアック病に関連する自己抗原の例として、組織トランスグルタミナーゼ（ＴＧ２）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１５】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、悪性貧血であり、キメラ受容体は、悪性貧血に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。悪性貧血に関連する自己抗原の例として、胃壁細胞の内因子が挙げられるがこれに限定されない。
【０１１６】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、白斑症であり、キメラ受容体は、白斑症に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。白斑症に関連する自己抗原の例として、６５ｋＤａ抗原が挙げられるがこれに限定されない。
【０１１７】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、ベーチェット病であり、キメラ受容体は、ベーチェット病に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。ベーチェット病に関連する自己抗原の例として、ホスファチジルセリン、リボソームリンタンパク質および抗好中球細胞質抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１８】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、強皮症であり、キメラ受容体は、強皮症に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。強皮症に関連する自己抗原の例として、Ｓｃｌ−７０、Ｕ１−ＲＮＰが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１１９】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、乾癬であり、キメラ受容体は、乾癬に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。乾癬に関連する自己抗原の例として、カルパスタチンが挙げられるがこれに限定されない。
【０１２０】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、潰瘍性大腸炎（ＵＣ）およびクローン病であり、キメラ受容体は、ＵＣおよびクローン病に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。ＵＣおよびクローン病に関連する自己抗原の例として、ＡＮＡが挙げられるがこれに限定されない。
【０１２１】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、シェーグレン症候群であり、キメラ受容体は、シェーグレン症候群に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。シェーグレン症候群に関連する自己抗原の例として、ＳＳＡおよび抗ＳＳＢが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２２】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、ウェゲナー肉芽腫症であり、キメラ受容体は、ウェゲナー肉芽腫症に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。ウェゲナー肉芽腫症に関連する自己抗原の例として、ＡＮＡおよびＡＮＣＡが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２３】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、多発性筋炎または皮膚筋炎であり、キメラ受容体は、多発性筋炎または皮膚筋炎に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。多発性筋炎または皮膚筋炎に関連する自己抗原の例として、Ｊｏ−１が挙げられるがこれに限定されない。
【０１２４】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、原発性胆汁性肝硬変であり、キメラ受容体は、原発性胆汁性肝硬変に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。原発性胆汁性肝硬変に関連する自己抗原の例として、抗ミトコンドリア抗体、ｇｐ２１０、ｐ６２、ｓｐ１００が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２５】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、抗リン脂質症候群（ＡＰＳ）であり、キメラ受容体は、抗リン脂質症候群に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。抗リン脂質症候群に関連する自己抗原の例として、抗リン脂質抗体が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２６】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、混合性結合組織病（ＭＣＴＤ）であり、キメラ受容体は、混合性結合組織病に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。混合性結合組織病に関連する自己抗原の例として、Ｕｌ−ＲＮＰ、Ｕｌ−７０  ｋｄ  ｓｎＲＮＰが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２７】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、ミラー・フィッシャー症候群であり、キメラ受容体は、ミラー・フィッシャー症候群に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。ミラー・フィッシャー症候群に関連する自己抗原の例として、ＧＱｌｂガングリオシドが挙げられるがこれに限定されない。
【０１２８】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、ギラン・バレー症候群であり、キメラ受容体は、ギラン・バレー症候群に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。ギラン・バレー症候群に関連する自己抗原の例として、ＧＭ１、アシアロＧＭ１およびＧＤｌｂが挙げられるがこれらに限定されない。
【０１２９】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、急性運動性軸索性神経障害であり、キメラ受容体は、急性運動性軸索性神経障害に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。急性運動性軸索性神経障害に関連する自己抗原の例として、ＧＭ１が挙げられるがこれに限定されない。
【０１３０】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、自己免疫性肝炎であり、キメラ受容体は、自己免疫性肝炎に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。自己免疫性肝炎に関連する自己抗原の例として、抗核抗体（ＡＮＡ）および抗平滑筋抗体（ＡＳＭＡ）、抗肝臓−腎臓ミクロソーム−１抗体（ＡＬＫＭ−１）および抗肝臓サイトゾル抗体−１（ＡＬＣ−１）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３１】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、疱疹状皮膚炎であり、キメラ受容体は、疱疹状皮膚炎に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。疱疹状皮膚炎に関連する自己抗原の例として、ＩｇＡ抗筋内膜抗体が挙げられるがこれに限定されない。
【０１３２】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、チャーグ・ストラウス症候群であり、キメラ受容体は、チャーグ・ストラウス症候群に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。チャーグ・ストラウス症候群に関連する自己抗原の例として、抗好中球細胞質抗体（ＡＮＣＡ）が挙げられるがこれに限定されない。
【０１３３】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、顕微鏡的多発血管炎であり、キメラ受容体は、顕微鏡的多発血管炎に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。顕微鏡的多発血管炎に関連する自己抗原の例として、ＡＮＣＡが挙げられるがこれに限定されない。
【０１３４】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、ＡＮＣＡ脈管炎であり、キメラ受容体は、ＡＮＣＡ脈管炎に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。ＡＮＣＡ脈管炎に関連する自己抗原の例として、好中球顆粒タンパク質（ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ  ｇｒａｎｕｌｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ）が挙げられるがこれに限定されない。
【０１３５】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、急性リウマチ熱であり、キメラ受容体は、急性リウマチ熱に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。急性リウマチ熱に関連する自己抗原の例として、連鎖球菌細胞壁抗原が挙げられるがこれに限定されない。
【０１３６】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、１型糖尿病（ＴＩＤ）であり、キメラ受容体は、ＴＩＤに関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。ＴＩＤに関連する自己抗原の例として、インスリン（ＩＡＡ）、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＡまたはＧＡＤ）およびプロテインチロシンホスファターゼ（ＩＡ２またはＩＣＡ５１２）が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３７】
一実施形態では、自己免疫性疾患は、膜性腎症であり、キメラ受容体は、膜性腎症に関連する自己抗原（またはそのバリアントもしくは断片）を含む。膜性腎症に関連する自己抗原の例として、ＰＬＡ２Ｒ１およびＴＨＳＤ７Ａ１が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１３８】
「幹細胞性」は、幹細胞様様式で作用する、いずれかの細胞の相対的能力（すなわち、全能性、多能性または寡能性（ｏｌｉｇｏｐｏｔｅｎｔｃｙ）、およびいずれか特定の幹細胞が有し得る拡大増殖されるまたは無限の自己再生の程度）を指す。「ＡＣＴＲ」は、外因性に供給された抗体に結合することができる操作されたＴ細胞構成成分である、抗体結合Ｔ細胞受容体である。ＡＣＴＲ構成成分への抗体の結合は、抗体によって認識される抗原と相互作用するようにＴ細胞を武装させ、当該抗原に遭遇すると、Ｔ細胞を含むＡＣＴＲが誘発されて、抗原と相互作用する（米国特許出願公開第２０１５／０１３９９４３号を参照）。
【０１３９】
融合分子
細胞における選択された標的遺伝子（例えば、ＣＩＳＨ）の切断に有用な組成物、例えば、ヌクレアーゼが、本明細書に記載されている。ある特定の実施形態では、融合分子の１種または複数の構成成分（例えば、ヌクレアーゼ）は、天然に存在する。他の実施形態では、融合分子の構成成分のうち１種または複数（例えば、ヌクレアーゼ）は、天然に存在しない、すなわち、ＤＮＡ結合分子および／または切断ドメイン（複数可）において操作されている。例えば、天然に存在するヌクレアーゼのＤＮＡ結合部分は、選択された標的部位に結合するように変更されていてよい（例えば、同族結合部位とは異なる部位に結合するように操作された、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系またはメガヌクレアーゼのシングルガイドＲＮＡ）。他の実施形態では、ヌクレアーゼは、異種ＤＮＡ結合および切断ドメインを含む（例えば、異種切断ドメインを有する、ジンクフィンガーヌクレアーゼ；ＴＡＬエフェクタードメインＤＮＡ結合タンパク質；メガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメイン）。よって、少なくとも１つのＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、メガヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼその他が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかのヌクレアーゼを本発明の実施において使用することができ、これらのヌクレアーゼは、標的遺伝子を切断し、この切断は、標的遺伝子のゲノム改変（例えば、切断された遺伝子への挿入および／または欠失）をもたらす。
【０１４０】
ヌクレアーゼ複合体の操作された切断ハーフドメインパートナーの独立した滴定により切断活性の特異性を増加させる方法も、本明細書に記載されている。一部の実施形態では、２つのパートナー（半分の切断ドメイン）の比は、１：２、１：３、１：４、１：５、１：６、１：８、１：９、１：１０または１：２０の比またはその間のいずれかの値で与えられる。他の実施形態では、２つのパートナーの比は、１：３０を超える。他の実施形態では、２つのパートナーは、１：１とは異なるように選択される比で配備される。個々にまたは組み合わせて使用される場合、本発明の方法および組成物は、オフターゲット切断活性の低下により、標的化特異性の驚くべきかつ予想外の増加を提供する。これらの実施形態において使用されるヌクレアーゼは、ＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ、ＣＲＩＳＰＲ／ｄＣａｓおよびＴｔＡｇｏ、またはこれらのいずれかの組合せを含むことができる。
【０１４１】
Ａ．ＤＮＡ結合分子
本明細書に記載されている融合分子は、タンパク質ドメインおよび／またはポリヌクレオチドＤＮＡ結合ドメインを含む、いずれかのＤＮＡ結合分子（ＤＮＡ結合ドメインとも称される）を含むことができる。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、表２に示す配列（配列番号４０〜４７）の９〜１２個の近接ヌクレオチドを含む配列に結合する。
【０１４２】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている組成物および方法は、ドナー分子に結合するためおよび／または細胞のゲノムにおける目的の領域に結合するために、メガヌクレアーゼ（ホーミングエンドヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインを用いる。天然に存在するメガヌクレアーゼは、１５〜４０塩基対の切断部位を認識し、一般的に、４つのファミリーへとグループ化される：ＬＡＧＬＩＤＡＤＧファミリー、ＧＩＹ−ＹＩＧファミリー、Ｈｉｓ−ＣｙｓｔボックスファミリーおよびＨＮＨファミリー。例示的なホーミングエンドヌクレアーゼは、Ｉ−ＳｃｅＩ、Ｉ−ＣｅｕＩ、ＰＩ−ＰｓｐＩ、ＰＩ−Ｓｃｅ、Ｉ−ＳｃｅＩＶ、Ｉ−ＣｓｍＩ、Ｉ−ＰａｎＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩ、Ｉ−ＰｐｏＩ、Ｉ−ＳｃｅＩＩＩ、Ｉ−ＣｒｅＩ、Ｉ−ＴｅｖＩ、Ｉ−ＴｅｖＩＩおよびＩ−ＴｅｖＩＩＩを含む。これらの認識配列は公知である。米国特許第５，４２０，０３２号および同第６，８３３，２５２号；Ｂｅｌｆｏｒｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２５：３３７９−３３８８；Ｄｕｊｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｇｅｎｅ  ８２：１１５−１１８；Ｐｅｒｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ２２，  １１２５−１１２７；Ｊａｓｉｎ  （１９９６）  Ｔｒｅｎｄｓ  Ｇｅｎｅｔ．  １２：２２４−２２８；Ｇｉｍｂｌｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２６３：１６３−１８０；Ａｒｇａｓｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２８０：３４５−３５３およびＮｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓカタログも参照されたい。加えて、ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合特異性は、非天然標的部位に結合するように操作することができる。例えば、Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｏｌｅｃ．  Ｃｅｌｌ  １０：８９５−９０５；Ｅｐｉｎａｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：２９５２−２９６２；Ａｓｈｗｏｒｔｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｎａｔｕｒｅ  ４４１：６５６−６５９；Ｐａｑｕｅｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ７：４９−６６；および米国特許出願公開第２００７／０１１７１２８号を参照されたい。ホーミングエンドヌクレアーゼおよびメガヌクレアーゼのＤＮＡ結合ドメインは、ヌクレアーゼ全体としての文脈で変更することができる（すなわち、ヌクレアーゼが、同族切断ドメインを含むように）、または異種切断ドメインに融合することができる。
【０１４３】
他の実施形態では、本明細書に記載されている方法および組成物において使用されるヌクレアーゼのうち１種または複数のＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するまたは操作された（天然に存在しない）ＴＡＬエフェクターＤＮＡ結合ドメインを含む。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ属の植物病原性細菌は、重要な作物植物において多くの疾患を引き起こすことが公知である。Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓの病原性は、植物細胞に２５種を超える異なるエフェクタータンパク質を注射する、保存されたＩＩＩ型分泌（Ｔ３Ｓ）装置に依存する。これらの注射されるタンパク質の中でも、植物転写活性化因子を模倣し、植物トランスクリプトームをマニピュレートする転写活性化因子様（ＴＡＬ）エフェクターが挙げられる（Ｋａｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８：６４８−６５１を参照）。これらのタンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよび転写活性化ドメインを含有する。最も良く特徴付けされたＴＡＬ−エフェクターの１つは、Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ  ｃａｍｐｅｓｔｇｒｉｓ  ｐｖ．Ｖｅｓｉｃａｔｏｒｉａ由来のＡｖｒＢｓ３である（Ｂｏｎａｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｍｏｌ  Ｇｅｎ  Ｇｅｎｅｔ  ２１８：１２７−１３６および国際特許公開番号ＷＯ２０１０／０７９４３０を参照）。ＴＡＬ−エフェクターは、タンデムリピートの中央集中ドメインを含有し、各リピートは、これらのタンパク質のＤＮＡ結合特異性にとって鍵となる、およそ３４アミノ酸を含有する。加えて、これらは、核局在化配列および酸性転写活性化ドメインを含有する（総説については、Ｓｃｈｏｒｎａｃｋ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）  Ｊ  Ｐｌａｎｔ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  １６３（３）：２５６−２７２を参照）。加えて、植物病原性細菌Ｒａｌｓｔｏｎｉａ  ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍにおいて、Ｒ．ｓｏｌａｎａｃｅａｒｕｍ次亜種１系統ＧＭＩ１０００および次亜種４系統ＲＳ１０００におけるＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリーと相同である、ｂｒｇ１１およびｈｐｘ１７と命名された２種の遺伝子が見出された（Ｈｅｕｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００７）  Ａｐｐｌ  ａｎｄ  Ｅｎｖｉｒ  Ｍｉｃｒｏ  ７３（１３）：４３７９−４３８４を参照）。これらの遺伝子は、互いにヌクレオチド配列が９８．９％同一であるが、ｈｐｘ１７のリピートドメインにおける１，５７５ｂｐの欠失によって異なる。しかし、両方の遺伝子産物は、ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓのＡｖｒＢｓ３ファミリータンパク質と４０％未満の配列同一性を有する。例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【０１４４】
これらのＴＡＬエフェクターの特異性は、タンデムリピートに見出される配列に依存する。反復した配列は、およそ１０２ｂｐを含み、リピートは典型的に、互いに９１〜１００％相同である（Ｂｏｎａｓ，  ｅｔ  ａｌ．、同書）。リピートの多型は通常、位置１２および１３に設置され、位置１２および１３における高頻度可変性二残基（ＲＶＤ）の同一性と、ＴＡＬ−エフェクターの標的配列における近接ヌクレオチドの同一性の間には１対１の対応があると思われる（Ｍｏｓｃｏｕ  ａｎｄ  Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，  （２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０１およびＢｏｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２６：１５０９−１５１２を参照）。実験によると、位置１２および１３におけるＨＤ配列がシトシン（Ｃ）への結合をもたらし、ＮＧがＴに結合し、ＮＩがＡ、Ｃ、ＧまたはＴに、ＮＮがＡまたはＧに結合し、ＩＮＧがＴに結合するような、これらのＴＡＬ−エフェクターのＤＮＡ認識のための天然コードが決定された。これらのＤＮＡ結合リピートは、リピートの新たな組合せおよび数を有するタンパク質へとアセンブルされて、新たな配列と相互作用し、植物細胞において非内在性レポーター遺伝子の発現を活性化することができる人工転写因子を作製した（Ｂｏｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．、同書）。操作されたＴＡＬタンパク質は、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインに連結されて、ＴＡＬエフェクタードメインヌクレアーゼ融合体（ＴＡＬＥＮ）を生じた。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号；Ｃｈｒｉｓｔｉａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  １８６（２）：７５７−６１  ｅｐｕｂ  １０．１５３４／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．１１０．１２０７１７を参照されたい。ある特定の実施形態では、ＴＡＬＥドメインは、米国特許第８，５８６，５２６号に記載されているＮ−キャップおよび／またはＣ−キャップを含む。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、細胞のゲノムのｉｎ  ｖｉｖｏ切断および／または標的化された切断に使用されるヌクレアーゼのうち１種または複数のＤＮＡ結合ドメインは、ジンクフィンガータンパク質を含む。好ましくは、ジンクフィンガータンパク質は、最適な標的部位に結合するように操作されているという点において、天然に存在しない。例えば、これら全ての全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｅｅｒｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ２０：１３５−１４１；Ｐａｂｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｂｉｏｃｈｅｍ．  ７０：３１３−３４０；Ｉｓａｌａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：６５６−６６０；Ｓｅｇａｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １２：６３２−６３７；Ｃｈｏｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｃｕｒｒ．  Ｏｐｉｎ．  Ｓｔｒｕｃｔ．  Ｂｉｏｌ．  １０：４１１−４１６；米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，６８９，５５８号；同第７，０３０，２１５号；同第６，７９４，１３６号；同第７，０６７，３１７号；同第７，２６２，０５４号；同第７，０７０，９３４号；同第７，３６１，６３５号；同第７，２５３，２７３号；および米国特許出願公開第２００５／００６４４７４号；同第２００７／０２１８５２８号；同第２００５／０２６７０６１号を参照されたい。
【０１４６】
操作されたジンクフィンガー結合ドメインは、天然に存在するジンクフィンガータンパク質と比較して、新規の結合特異性を有することができる。操作方法として、合理的設計と様々な種類の選択が挙げられるがこれらに限定されない。合理的設計は、例えば、三つ組（または四つ組）ヌクレオチド配列および個々のジンクフィンガーアミノ酸配列を含むデータベースの使用を含み、このデータベースにおいて、各三つ組または四つ組ヌクレオチド配列は、特定の三つ組または四つ組配列に結合するジンクフィンガーの１種または複数のアミノ酸配列に関連付けられる。例えば、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、共同所有される米国特許第６，４５３，２４２号および同第６，５３４，２６１号を参照されたい。
【０１４７】
ファージディスプレイおよびツーハイブリッド系を含む例示的な選択方法は、米国特許第５，７８９，５３８号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，４１０，２４８号；同第６，１４０，４６６号；同第６，２００，７５９号；および同第６，２４２，５６８号；ならびに国際特許公開番号ＷＯ９８／３７１８６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／８８１９７；ならびに英国特許第２，３３８，２３７号に開示されている。加えて、ジンクフィンガー結合ドメインに対する結合特異性の増強は、例えば、共同所有される国際特許公開番号ＷＯ０２／０７７２２７に記載されている。
【０１４８】
加えて、上述および他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／または多指（ｍｕｌｔｉ−ｆｉｎｇｅｒｅｄ）ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５個またはそれよりも多いアミノ酸の長さのリンカーを含む、いずれか適したリンカー配列を使用して一体に連結することができる。６個またはそれよりも多いアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に、適したリンカーのいずれかの組合せを含むことができる。
【０１４９】
ＺＦＰは、１個または複数のヌクレアーゼ（切断）ドメインに作動可能に会合（連結）して、ＺＦＮを形成することができる。用語「１つのＺＦＮ」は、二量体形成して標的遺伝子を切断する、１対のＺＦＮを含む。方法および組成物を使用して、オフターゲット部位として公知の他の意図されない切断部位と比べて、その意図される標的に対して、ヌクレアーゼ対を含むＺＦＮの特異性を増加させることもできる（米国特許出願公開第２０１８００８７０７２号を参照）。よって、本明細書に記載されているヌクレアーゼは、そのＤＮＡ結合ドメイン骨格領域のうち１個もしくは複数に変異を、および／またはそのヌクレアーゼ切断ドメインに１個もしくは複数の変異を含むことができる。このようなヌクレアーゼは、ＤＮＡ骨格におけるホスフェートと非特異的に相互作用することができるＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメイン（「ＺＦＰ骨格」）内のアミノ酸への変異を含むことができるが、ＤＮＡ認識ヘリックスに変化を含まない。よって、本発明は、ヌクレオチド標的特異性に要求されないＺＦＰ骨格におけるカチオン性アミノ酸残基の変異を含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこのような変異は、カチオン性アミノ酸残基を中性またはアニオン性アミノ酸残基に変異させることを含む。一部の実施形態では、ＺＦＰ骨格におけるこのような変異は、極性アミノ酸残基を中性または非極性アミノ酸残基に変異させることを含む。好ましい実施形態では、変異は、ＤＮＡ結合ヘリックスと比べて、位置（−５）、（−９）および／または位置（−１４）に作製される。一部の実施形態では、ジンクフィンガーは、（−５）、（−９）および／または（−１４）に１個または複数の変異を含むことができる。さらなる実施形態では、多指ジンクフィンガータンパク質における１個または複数のジンクフィンガーは、（−５）、（−９）および／または（−１４）に変異を含むことができる。一部の実施形態では、（−５）、（−９）および／または（−１４）におけるアミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）またはリシン（Ｋ））は、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ａｓｐ（Ｎ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｔｙｒ（Ｙ）および／またはグルタミン（Ｑ）へと変異される。
【０１５０】
一部の態様では、ＤＮＡ結合ドメイン（例えば、ＺＦＰ、ＴＡＬＥ、ｓｇＲＮＡ等）は、ＣＩＳＨ遺伝子を標的とする。ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合ドメインは、ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン領域、例えばエクソン２またはエクソン３を標的とする。
【０１５１】
標的部位（例えば、ＣＩＳＨ遺伝子のイントロンおよび／またはエクソン内の）の選択；ＺＦＰ、ならびに融合タンパク質（およびこれをコードするポリヌクレオチド）の設計および構築のための方法は、当業者にとって公知であり、米国特許第６，１４０，０８１号；同第５，７８９，５３８号；同第６，４５３，２４２号；同第６，５３４，２６１号；同第５，９２５，５２３号；同第６，００７，９８８号；同第６，０１３，４５３号；同第６，２００，７５９号；ならびに国際特許公開番号ＷＯ９５／１９４３１；ＷＯ９６／０６１６６；ＷＯ９８／５３０５７；ＷＯ９８／５４３１１；ＷＯ００／２７８７８；ＷＯ０１／６０９７０；ＷＯ０１／８８１９７；ＷＯ０２／０９９０８４；ＷＯ９８／５３０５８；ＷＯ９８／５３０５９；ＷＯ９８／５３０６０；ＷＯ０２／０１６５３６；およびＷＯ０３／０１６４９６に詳細に記載されている。
【０１５２】
加えて、上述および他の参考文献に開示されている通り、ジンクフィンガードメインおよび／または多指ジンクフィンガータンパク質は、例えば、５個またはそれよりも多いアミノ酸の長さのリンカーを含む、いずれか適したリンカー配列を使用して一体に連結することができる。６個またはそれよりも多いアミノ酸の長さの例示的なリンカー配列については、米国特許第６，４７９，６２６号；同第６，９０３，１８５号；および同第７，１５３，９４９号も参照されたい。本明細書に記載されているタンパク質は、タンパク質の個々のジンクフィンガーの間に、適したリンカーのいずれかの組合せを含むことができる。
【０１５３】
ある特定の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の一部である。例えば、米国特許第８，６９７，３５９号および米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号を参照されたい。系のＲＮＡ構成成分をコードするＣＲＩＳＰＲ（クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート）遺伝子座、およびタンパク質をコードするｃａｓ（ＣＲＩＳＰＲ関連）遺伝子座（Ｊａｎｓｅｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｍｏｌ．  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．  ４３：１５６５−１５７５；Ｍａｋａｒｏｖａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００２）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３０：４８２−４９６；Ｍａｋａｒｏｖａ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００６）．  Ｂｉｏｌ．  Ｄｉｒｅｃｔ  １：７；Ｈａｆｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  ＰＬｏＳ  Ｃｏｍｐｕｔ．  Ｂｉｏｌ．  １：ｅ６０）は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼ系の遺伝子配列を構成する。微生物宿主におけるＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、ＣＲＩＳＰＲ関連（Ｃａｓ）遺伝子と共に、ＣＲＩＳＰＲ媒介性核酸切断の特異性をプログラミングすることができる非コードＲＮＡエレメントの組合せを含有する。
【０１５４】
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲは、最も良く特徴付けされた系の１つであり、４つの逐次ステップにおいて標的化されたＤＮＡ二本鎖切断を実行する。第一に、２種の非コードＲＮＡである、プレｃｒＲＮＡアレイおよびｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第二に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、プレｃｒＲＮＡのリピート領域にハイブリダイズし、プレｃｒＲＮＡから、個々のスペーサー配列を含有する成熟ｃｒＲＮＡへのプロセシングを媒介する。第三に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体は、標的認識の追加的な要件である、ｃｒＲＮＡにおけるスペーサーおよびプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の隣にある標的ＤＮＡにおけるプロトスペーサーの間のワトソン・クリック塩基対形成を介して、Ｃａｓ９を標的ＤＮＡに方向付ける。最後に、Ｃａｓ９は、標的ＤＮＡの切断を媒介して、プロトスペーサー内に二本鎖切断を作製する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の活性は、３つのステップを含む：（ｉ）「適応」と呼ばれるプロセスにおける、将来の攻撃を予防するための、ＣＲＩＳＰＲアレイへの外来性ＤＮＡ配列の挿入、（ｉｉ）関連するタンパク質の発現、ならびにアレイの発現およびプロセシングと、それに続く、（ｉｉｉ）外来性核酸によるＲＮＡ媒介性干渉。よって、細菌細胞において、いわゆる「Ｃａｓ」タンパク質のうちいくつかは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の天然の機能と関与し、外来性ＤＮＡ等の挿入等の機能における役割を果たす。
【０１５５】
ある特定の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、天然に存在するＣａｓタンパク質の「機能的誘導体」となることができる。ネイティブ配列ポリペプチドの「機能的誘導体」は、ネイティブ配列ポリペプチドと共通した定性的な生物学的特性を有する化合物である。「機能的誘導体」として、対応するネイティブ配列ポリペプチドと共通した生物活性を有することを条件に、ネイティブ配列の断片ならびにネイティブ配列ポリペプチドおよびその断片の誘導体が挙げられるがこれらに限定されない。本明細書で企図される生物活性は、ＤＮＡ基質を断片へと加水分解する機能的誘導体の能力である。用語「誘導体」は、ポリペプチドのアミノ酸配列バリアント、その共有結合改変、および融合体の両方を包含する。Ｃａｓポリペプチドまたはその断片の適した誘導体として、Ｃａｓタンパク質またはその断片の変異体、融合体、共有結合改変が挙げられるがこれらに限定されない。Ｃａｓタンパク質またはその断片を含むＣａｓタンパク質と共に、Ｃａｓタンパク質またはその断片の誘導体は、細胞から得ることができるもしくは化学合成することができる、またはこれら２種の手順の組合せによって得ることができる。細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生する細胞、またはＣａｓタンパク質を天然に産生し、より高い発現レベルで内在性Ｃａｓタンパク質を産生するように、もしくは外因性に導入された核酸からＣａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作された細胞となることができ、この核酸は、内在性Ｃａｓと同じまたは異なるＣａｓをコードする。一部の事例では、細胞は、Ｃａｓタンパク質を天然に産生せず、Ｃａｓタンパク質を産生するように遺伝子操作されている。一部の実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＡＡＶベクターを介した送達のための小型のＣａｓ９オルソログである（Ｒａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｎａｔｕｒｅ  ５１０：１８６）。
【０１５６】
一部の実施形態では、ＤＮＡ結合分子は、ＴｔＡｇｏ系の一部である（Ｓｗａｒｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．、同書；Ｓｈｅｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．、同書を参照）。真核生物において、遺伝子サイレンシングは、タンパク質のアルゴノート（Ａｇｏ）ファミリーによって媒介される。このパラダイムにおいて、Ａｇｏは、小型（１９〜３１ｎｔ）ＲＮＡに結合されている。このタンパク質−ＲＮＡサイレンシング複合体は、小型ＲＮＡおよび標的の間のワトソン・クリック塩基対形成を介して標的ＲＮＡを認識し、標的ＲＮＡをエンドヌクレアーゼ的に（ｅｎｄｏｎｕｃｌｅｏｌｙｔｉｃａｌｌｙ）切断する（Ｖｏｇｅｌ  （２０１４）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３４４：９７２−９７３）。対照的に、原核生物Ａｇｏタンパク質は、小型一本鎖ＤＮＡ断片に結合し、外来性（多くの場合、ウイルス）ＤＮＡを検出および除去するように機能する可能性がある（Ｙｕａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  １９，  ４０５；Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ  ５１：５９４；Ｓｗａｒｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．、同書）。例示的な原核生物Ａｇｏタンパク質は、Ａｑｕｉｆｅｘ  ａｅｏｌｉｃｕｓ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓおよびＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＡｇｏタンパク質を含む。
【０１５７】
最も良く特徴付けされた原核生物Ａｇｏタンパク質の１つは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ由来のＡｇｏタンパク質である（ＴｔＡｇｏ；Ｓｗａｒｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．、同書）。ＴｔＡｇｏは、５’リン酸基を有する１５ｎｔまたは１３〜２５ｎｔの一本鎖ＤＮＡ断片のいずれかと会合する。ＴｔＡｇｏによって結合されたこの「ガイドＤＮＡ」は、ＤＮＡのサードパーティ（ｔｈｉｒｄ−ｐａｒｔｙ）分子におけるワトソン・クリック相補的ＤＮＡ配列に結合するようにタンパク質−ＤＮＡ複合体を方向付けるように機能する。このようなガイドＤＮＡにおける配列情報が、標的ＤＮＡの同定を可能にしたら、ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体は、標的ＤＮＡを切断する。斯かる機構は、その標的ＤＮＡに結合される際のＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ複合体の構造によっても支持される（Ｇ．  Ｓｈｅｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．、同書）。Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ由来のＡｇｏ（ＲｓＡｇｏ）は、同様の特性を有する（Ｏｌｏｖｎｉｋｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．、同書）。
【０１５８】
任意のＤＮＡ配列の外因性ガイドＤＮＡを、ＴｔＡｇｏタンパク質にローディングすることができる（Ｓｗａｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．、同書）。ＴｔＡｇｏ切断の特異性は、ガイドＤＮＡによって方向付けられるため、外因性の研究者指定の（ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ）ガイドＤＮＡにより形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体は、したがって、ＴｔＡｇｏ標的ＤＮＡ切断を、研究者指定の相補的標的ＤＮＡに方向付けるであろう。このようにして、ＤＮＡに標的化された二本鎖切断を作製することができる。ＴｔＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系（または他の生物由来のオルソロガスＡｇｏ−ガイドＤＮＡ系）の使用は、細胞内におけるゲノムＤＮＡの標的化された切断を可能にする。斯かる切断は、一本または二本鎖のいずれかとなることができる。哺乳動物ゲノムＤＮＡの切断のため、哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されたＴｔＡｇｏのバージョンを使用することが好ましくなるであろう。さらに、ＴｔＡｇｏタンパク質が細胞膜透過性ペプチドに融合されている、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで形成されたＴｔＡｇｏ−ＤＮＡ複合体で細胞を処置することが好ましくなり得る。さらに、摂氏３７度で改善された活性を有するように変異誘発により変更されたＴｔＡｇｏタンパク質のバージョンを使用することが好ましくなり得る。Ａｇｏ−ＲＮＡ媒介性ＤＮＡ切断を使用して、ＤＮＡ切断の活用のための技術分野で標準の技法を使用した、遺伝子ノックアウト、標的化された遺伝子付加、遺伝子補正、標的化された遺伝子欠失を含む一式の結果に影響を与えることができる。
【０１５９】
よって、ヌクレアーゼは、ドナー（導入遺伝子）を挿入することが望まれるいずれかの遺伝子における標的部位に特異的に結合する、ＤＮＡ結合分子を含む。
【０１６０】
Ｂ．切断ドメイン
いずれか適した切断ドメインを、ＤＮＡ結合ドメインに操作可能に連結して、ヌクレアーゼを形成することができる。例えば、ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合して、ＺＦＮ（種々の生物におけるゲノム改変における使用のためを含む、その操作された（ＺＦＰ）ＤＮＡ結合ドメインを介してその意図する核酸標的を認識し、ヌクレアーゼ活性によりＺＦＰ結合部位付近でＤＮＡをカットさせることができる機能的実体）を作製した。例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号；ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２０１０５５号を参照されたい。同様に、ＴＡＬＥ  ＤＮＡ結合ドメインをヌクレアーゼドメインに融合して、ＴＡＬＥＮを作製した。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号を参照されたい。
【０１６１】
上に記す通り、切断ドメインは、ＤＮＡ結合ドメインにとって異種となることができ、例えば、ジンクフィンガーＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼ由来の切断ドメイン、またはＴＡＬＥＮ  ＤＮＡ結合ドメインおよび切断ドメイン、またはメガヌクレアーゼＤＮＡ結合ドメインおよび異なるヌクレアーゼ由来の切断ドメインである。異種切断ドメインは、いずれかのエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼから得ることができる。切断ドメインが由来し得る例示的なエンドヌクレアーゼとして、制限エンドヌクレアーゼおよびホーミングエンドヌクレアーゼが挙げられるがこれらに限定されない。ＤＮＡを切断する追加的な酵素が公知である（例えば、Ｓ１ヌクレアーゼ；ダイズヌクレアーゼ；膵ＤＮａｓｅ  Ｉ；小球菌ヌクレアーゼ；酵母ＨＯエンドヌクレアーゼ）。これらの酵素（またはその機能的断片）のうち１種または複数を、切断ドメインおよび切断ハーフドメインの供給源として使用することができる。
【０１６２】
同様に、切断ハーフドメインは、切断活性のために二量体形成を要求する、上に表記されているいずれかのヌクレアーゼまたはその部分に由来することができる。一般に、融合タンパク質が切断ハーフドメインを含む場合、２つの融合タンパク質が、切断に要求される。その代わりに、２つの切断ハーフドメインを含む単一のタンパク質を使用することができる。２つの切断ハーフドメインは、同じエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することができる、または各切断ハーフドメインは、異なるエンドヌクレアーゼ（またはその機能的断片）に由来することができる。加えて、それぞれの標的部位への２つの融合タンパク質の結合が、例えば二量体形成によって、切断ハーフドメインに機能的切断ドメインを形成させることが可能な互いに対する空間的配向性で、切断ハーフドメインを置くように、２つの融合タンパク質のための標的部位は、好ましくは、互いに関して配置される。よって、ある特定の実施形態では、標的部位の縁付近は、５〜８ヌクレオチドまたは１５〜１８ヌクレオチドによって分離される。しかし、いずれかの整数のヌクレオチドまたはヌクレオチド対が、２つの標的部位の間に介在し得る（例えば、２〜５０ヌクレオチド対またはそれよりも多く）。一般に、切断の部位は、標的部位の間に置かれている。
【０１６３】
制限エンドヌクレアーゼ（制限酵素）は、多くの種に存在し、ＤＮＡ（認識部位において）に配列特異的に結合し、結合部位でまたはその付近でＤＮＡを切断することができる。ある特定の制限酵素（例えば、ＩＩＳ型）は、認識部位から除去される部位でＤＮＡを切断し、分離可能な結合および切断ドメインを有する。例えば、ＩＩＳ型酵素ＦｏｋＩは、一方の鎖においてその認識部位から９ヌクレオチドにおいて、また、他方の鎖においてその認識部位から１３ヌクレオチドにおいて、ＤＮＡの二本鎖切断を触媒する。例えば、米国特許第５，３５６，８０２号；同第５，４３６，１５０号；および同第５，４８７，９９４号；ならびにＬｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８９：４２７５−４２７９；Ｌｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９３）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：２７６４−２７６８；Ｋｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４ａ）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９１：８８３−８８７；Ｋｉｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４ｂ）  Ｊ．  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ２６９：３１，９７８−３１，９８２を参照されたい。よって、一実施形態では、融合タンパク質は、少なくとも１種のＩＩＳ型制限酵素由来の切断ドメイン（または切断ハーフドメイン）、および操作されていても操作されていなくてもよい、１個または複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。
【０１６４】
その切断ドメインが結合ドメインから分離可能な、例示的なＩＩＳ型制限酵素は、ＦｏｋＩである。この特定の酵素は、二量体として活性がある。Ｂｉｔｉｎａｉｔｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９５：１０，５７０−１０，５７５。したがって、本開示の目的のため、開示されている融合タンパク質において使用されるＦｏｋＩ酵素の部分は、切断ハーフドメインと考慮される。よって、ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使用した標的化された二本鎖切断および／または細胞配列の標的化された置換えのため、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインをそれぞれ含む２つの融合タンパク質を使用して、触媒活性がある切断ドメインを再構成することができる。その代わりに、ジンクフィンガー結合ドメインおよび２つのＦｏｋＩ切断ハーフドメインを含有する単一のポリペプチド分子を使用することもできる。ジンクフィンガー−ＦｏｋＩ融合体を使用した標的化された切断および標的化された配列変更のためのパラメータは、本開示の他の箇所に提供されている。
【０１６５】
切断ドメインまたは切断ハーフドメインは、切断活性を保持する、または多量体形成（例えば、二量体形成）して機能的切断ドメインを形成する能力を保持する、タンパク質のいずれかの部分となることができる。
【０１６６】
例示的なＩＩＳ型制限酵素は、その全体が本明細書に組み込まれる、国際特許公開番号ＷＯ０７／０１４２７５に記載されている。追加的な制限酵素も、分離可能な結合および切断ドメインを含有し、これは、本開示によって企図される。例えば、Ｒｏｂｅｒｔｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００３）  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．  ３１：４１８−４２０を参照されたい。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、切断ドメインは、例えば、これら全ての開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第８，６２３，６１８号；同第７，８８８，１２１号；同第７，９１４，７９６号；および同第８，０３４，５９８号；ならびに米国特許出願公開第２０１１／０２０１０５５号に記載されている通り、ホモ二量体形成を最小化または防止する、１個または複数の操作された切断ハーフドメイン（二量体形成ドメイン変異体とも称される）を含む。ＦｏｋＩの位置４４６、４４７、４７９、４８３、４８４、４８６、４８７、４９０、４９１、４９６、４９８、４９９、５００、５３１、５３４、５３７および５３８におけるアミノ酸残基は全て、ＦｏｋＩ切断ハーフドメインの二量体形成に影響を与えるための標的である。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、ＦｏｋＩに由来し、下に示す野生型全長ＦｏｋＩと比べてナンバリングされた、アミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８および／または５２５（例えば、米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号を参照）のうち１個または複数に１個または複数の変異を含む：
【化１】
2021502085.tif 000003
これらの変異は、ＦｏｋＩドメインおよびＤＮＡ分子の間の非特異的相互作用を減少させる。他の実施形態では、ＦｏｋＩに由来する切断ハーフドメインは、アミノ酸残基４１４〜４２６、４４３〜４５０、４６７〜４８８、５０１〜５０２および／または５２１〜５３１のうち１個または複数に変異を含む。変異は、ＦｏｋＩと相同の天然の制限酵素に見出される残基への変異を含むことができる。ある特定の実施形態では、変異は、置換、例えば、異なるアミノ酸、例えば、セリン（Ｓ）による野生型残基の置換、例えば、Ｒ４１６ＳまたはＫ５２５Ｓである。好ましい実施形態では、位置４１６、４２２、４４７、４４８および／または５２５における変異は、無荷電のまたは負に荷電したアミノ酸による正に荷電したアミノ酸の置換えを含む。別の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、１個または複数のアミノ酸残基４１６、４２２、４４７、４４８または５２５における変異に加えて、アミノ酸残基４９９、４９６および４８６に変異を含む。好ましい実施形態では、本発明は、操作された切断ハーフドメインが、位置４１６、４２２、４４７、４４８または５２５における１個または複数の変異に加えて、位置４８６における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基がＧｌｕ（Ｅ）残基に置き換えられ、位置４９９における野生型Ｉｌｅ（Ｉ）残基がＬｅｕ（Ｌ）残基に置き換えられ、位置４９６における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基がＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基に置き換えられたポリペプチド（「ＥＬＤ」または「ＥＬＥ」）を含む、融合タンパク質を提供する。
【０１６９】
２個以上の変異を有する切断ドメインを使用することができ、例えば、「Ｅ４９０Ｋ：Ｉ５３８Ｋ」と命名された操作された切断ハーフドメインを産生するための、一方の切断ハーフドメインにおける位置４９０（Ｅ→Ｋ）および５３８（Ｉ→Ｋ）における変異、ならびに「Ｑ４８６Ｅ：Ｉ４９９Ｌ」と命名された操作された切断ハーフドメインを産生するための、別の切断ハーフドメインにおける位置４８６（Ｑ→Ｅ）および４９９（Ｉ→Ｌ）における変異；位置４８６における野生型Ｇｌｎ（Ｑ）残基をＧｌｕ（Ｅ）残基に、位置４９９における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｅｕ（Ｌ）残基に、位置４９６における野生型Ａｓｎ（Ｎ）残基をＡｓｐ（Ｄ）またはＧｌｕ（Ｅ）残基に置き換える変異（それぞれ「ＥＬＤ」および「ＥＬＥ」ドメインとも称される）；位置４９０、５３８および５３７（野生型ＦｏｋＩと比べてナンバリング）における変異、例えば、位置４９０における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、位置５３８における野生型Ｉｓｏ（Ｉ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、位置５３７における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置き換える変異を含む操作された切断ハーフドメイン（それぞれ「ＫＫＫ」および「ＫＫＲ」ドメインとも称される）；および／または位置４９０および５３７（野生型ＦｏｋＩと比べてナンバリング）に変異、例えば、位置４９０における野生型Ｇｌｕ（Ｅ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基に、位置５３７における野生型Ｈｉｓ（Ｈ）残基をＬｙｓ（Ｋ）残基またはＡｒｇ（Ｒ）残基に置き換える変異を含む、操作された切断ハーフドメイン（それぞれ「ＫＩＫ」および「ＫＩＲ」ドメインとも称される）が挙げられる。例えば、あらゆる目的のため、その開示全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第７，９１４，７９６号；同第８，０３４，５９８号；および同第８，６２３，６１８号を参照されたい。他の実施形態では、操作された切断ハーフドメインは、「シャーキー（Ｓｈａｒｋｅｙ）」および／または「シャーキー」変異を含む（Ｇｕｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１０）  Ｊ．  Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４００（１）：９６−１０７を参照）。
【０１７０】
その代わりに、ヌクレアーゼは、いわゆる「開裂（ｓｐｌｉｔ）酵素」技術を使用して、核酸標的部位においてｉｎ  ｖｉｖｏでアセンブルすることができる（例えば、米国特許出願公開第２００９／００６８１６４号を参照）。斯かる開裂酵素の構成成分は、別々の発現構築物において発現させることができる、または個々の構成成分が、例えば、自己切断２ＡペプチドもしくはＩＲＥＳ配列によって分離された、１つのオープンリーディングフレームにおいて連結することができる。構成成分は、個々のジンクフィンガー結合ドメイン、またはメガヌクレアーゼ核酸結合ドメインのドメインとなることができる。
【０１７１】
ヌクレアーゼは、例えば、米国特許第８，５６３，３１４号に記載されている酵母に基づく染色体系において、使用に先立ち活性に関してスクリーニングすることができる。
【０１７２】
Ｃａｓ９関連のＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系は、２つのＲＮＡ非コード構成成分：ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡアレイ（同一のダイレクトリピート（ＤＲ）を間に置いたヌクレアーゼガイド配列（スペーサー）を含有する）を含む。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系を使用して、ゲノム工学を達成するために、これらのＲＮＡの両方の機能が存在する必要がある（Ｃｏｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  Ｓｃｉｅｎｃｅｘｐｒｅｓｓ  １／１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ  １２３１１４３を参照）。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒＲＮＡおよびプレｃｒＲＮＡは、別々の発現構築物を介してまたは別々のＲＮＡとして供給される。他の実施形態では、キメラＲＮＡが構築され、この場合、操作された成熟ｃｒＲＮＡ（標的特異性を付与）が、ｔｒａｃｒＲＮＡ（Ｃａｓ９との相互作用を供給）に融合されて、キメラｃｒ−ＲＮＡ−ｔｒａｃｒＲＮＡハイブリッド（シングルガイドＲＮＡとも命名されている）を作製する（Ｊｉｎｅｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３３７：８１６−８２１；Ｊｉｎｅｋ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１３）  ｅＬｉｆｅ  ２：ｅ００４７１．  ＤＯＩ：  １０．７５５４／ｅＬｉｆｅ．００４７１およびＣｏｎｇ、同書を参照）。
【０１７３】
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系が使用される。Ｆｒａｎｃｉｓｅｌｌａ  ｓｐｐにおいて同定されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃｐｆ１系は、ヒト細胞において頑強なＤＮＡ干渉を媒介する、クラス２  ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系である。機能的に保存されているが、Ｃｐｆ１およびＣａｓ９は、そのガイドＲＮＡおよび基質特異性を含む多くの側面で異なる（Ｆａｇｅｒｌｕｎｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１５）  Ｇｅｎｏｍ  Ｂｉｏ  １６：２５１を参照）。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１タンパク質の間の主要な差は、Ｃｐｆ１が、ｔｒａｃｒＲＮＡを利用せず、よって、ｃｒＲＮＡのみを要求することである。ＦｎＣｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、４２〜４４ヌクレオチド長（１９ヌクレオチドリピートおよび２３〜２５ヌクレオチドスペーサー）であり、二次構造を保持する配列変化を許容する単一のステム−ループを含有する。加えて、Ｃｐｆ１  ｃｒＲＮＡは、Ｃａｓ９によって要求されるほぼ１００ヌクレオチドの操作されたｓｇＲＮＡよりも有意に短く、ＦｎＣｐｆｌのためのＰＡＭ要件は、置換鎖における５’−ＴＴＮ−３’および５’−ＣＴＡ−３’である。Ｃａｓ９およびＣｐｆ１の両方が、標的ＤＮＡに二本鎖切断を作製するが、Ｃａｓ９は、そのＲｕｖＣおよびＨＮＨ様ドメインを使用して、ガイドＲＮＡのシード配列内における平滑末端カットを作製する一方、Ｃｐｆ１は、ＲｕｖＣ様ドメインを使用して、シードの外側に付着カットを産生する。Ｃｐｆ１は、決定的なシード領域から離れて付着カットを作製するため、ＮＨＥＪは、標的部位を破壊せず、したがって、所望のＨＤＲ組換え事象が起こるまで、Ｃｐｆ１が同じ部位をカットし続けることができることを確実にするであろう。よって、本明細書に記載されている方法および組成物において、用語「Ｃａｓ」が、Ｃａｓ９およびＣｐｆ１タンパク質の両方を含むことが理解される。よって、本明細書で使用される場合、「ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系」は、ヌクレアーゼおよび／または転写因子系の両方を含む、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓおよび／またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃｐｆ１系の両方をいう。
【０１７４】
標的部位
上に詳細に記載されている通り、ＤＮＡ結合ドメインは、選択したあらゆる配列に結合するように操作することができる。操作されたＤＮＡ結合ドメインは、天然に存在するＤＮＡ結合ドメインと比較して、新規結合特異性を有することができる。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼ（複数可）は、ＣＩＳＨ遺伝子、例えば、遺伝子のイントロンおよび／またはエクソン（例えば、エクソン２または３）を標的とする。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、表２に示す配列内の９〜２０個またはそれよりも多いヌクレオチド（近接または非近接）の標的部位に結合する。
【０１７６】
ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼは、ヒト細胞におけるＡＡＶＳ１、ＨＰＲＴ、ＡＬＢおよびＣＣＲ５遺伝子、ならびにマウス細胞におけるＲｏｓａ２６（例えば、米国特許第７，８８８，１２１号；同第７，９７２，８５４号；同第７，９１４，７９６号；同第７，９５１，９２５号；同第８，１１０，３７９号；同第８，４０９，８６１号；同第８，５８６，５２６号；ならびに米国特許出願公開第２００３／０２３２４１０号；同第２００５／０２０８４８９号；同第２００５／００２６１５７号；同第２００６／００６３２３１号；同第２００８／０１５９９９６号；同第２０１０／００２１８２６４号；同第２０１２／００１７２９０号；同第２０１１／０２６５１９８号；同第２０１３／０１３７１０４号；同第２０１３／０１２２５９１号；同第２０１３／０１７７９８３号；および同第２０１３／０１７７９６０号を参照）、ならびに植物におけるＺｐ１５遺伝子座（米国特許第８，３２９，９８６号を参照）等、「セーフハーバー」遺伝子座を標的とする。
【０１７７】
適した標的遺伝子の追加的な非限定的な例として、ベータ（β）グロビン遺伝子（ＨＢＢ）、ガンマ（δ）グロビン遺伝子（ＨＢＧ１）、Ｂ細胞リンパ腫／白血病１１Ａ（ＢＣＬ１１Ａ）遺伝子、クルッペル様因子１（ＫＬＦ１）遺伝子、ＣＣＲ５遺伝子、ＣＸＣＲ４遺伝子、ＰＰＰ１Ｒ１２Ｃ（ＡＡＶＳ１）遺伝子、ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）遺伝子、アルブミン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、ロイシンリッチリピートキナーゼ２（ＬＲＲＫ２）遺伝子、ハンチンチン（Ｈｕｎｇｔｉｎｇｉｎ）（Ｈｔｔ）遺伝子、ロドプシン（ＲＨＯ）遺伝子、嚢胞性線維症膜コンダクタンス調節因子（ＣＦＴＲ）遺伝子、サーファクタントタンパク質Ｂ遺伝子（ＳＦＴＰＢ）、Ｔ細胞受容体アルファ（ＴＲＡＣ）遺伝子、Ｔ細胞受容体ベータ（ＴＲＢＣ）遺伝子、プログラム細胞死１（ＰＤ１）遺伝子、細胞傷害性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ−４）遺伝子、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）Ａ遺伝子、ＨＬＡ  Ｂ遺伝子、ＨＬＡ  Ｃ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＰＡ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＱ遺伝子、ＨＬＡ−ＤＲＡ遺伝子、ＬＭＰ７遺伝子、抗原ペプチド輸送体（ＴＡＰ）１遺伝子、ＴＡＰ２遺伝子、タパシン遺伝子（ＴＡＰＢＰ）、クラスＩＩ主要組織適合複合体トランス活性化因子（ＣＩＩＴＡ）遺伝子、ジストロフィン遺伝子（ＤＭＤ）、グルココルチコイド受容体遺伝子（ＧＲ）、ＣＩＳＨ遺伝子、Ｒａｇ−１遺伝子、ＲＦＸ５遺伝子、ＦＡＤ２遺伝子、ＦＡＤ３遺伝子、ＺＰ１５遺伝子、ＫＡＳＩＩ遺伝子、ＭＤＨ遺伝子および／またはＥＰＳＰＳ遺伝子が挙げられる。一部の態様では、ヌクレアーゼ（複数可）は、チェックポイント阻害剤遺伝子、例えば、ＰＤ−１、ＣＴＬＡ４、阻害性リガンドのＢ７ファミリーの受容体に結合するおよび／またはこれを切断する、またはＬＡＧ３、２Ｂ４、ＢＴＬＡ、ＴＩＭ３、Ａ２ａＲおよびキラー細胞抑制受容体（ＫＩＲおよびＣ型レクチン受容体）を介したシグナル伝達に関与する受容体もしくはリガンド遺伝子（Ｐａｒｄｏｌｌ  （２０１２）  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ  １２（４）：２５２を参照されたい）、ＨＬＡ複合体遺伝子（クラスＩ：ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、ＨＬＡ−Ｅ、ＨＬＡ−Ｆ、ＨＬＡ−Ｇ、Ｂ２Ｍ；クラスＩＩ：ＨＬＡ−ＤＭＡ、ＨＬＡ−ＤＯＡ、ＨＬＡ−ＤＰＡ１、ＨＬＡ−ＤＱＡ、ＨＬＡ−ＤＲＡ、ＨＬＡ−ＤＭＢ、ＨＬＡ−ＤＯＢ、ＨＬＡ−ＤＰＢ１、ＨＬＡ−ＤＱＢ、ＨＬＡ−ＤＲＢ）もしくはＴＣＲ；および／またはＨＬＡ複合体のためのペプチドローディングプロセスおよび抗原プロセシングに関与する産物（例えば、ＴＡＰ、タパシン、カルレチキュリン、カルネキシン、ＬＭＰ２、ＬＭＰ７またはＥｒｐ５７）をコードする遺伝子を切断する。例えば、米国特許第８，９５６，８２８号および同第８，９４５，８６８号を参照されたい。
【０１７８】
ドナー
ある特定の実施形態では、本開示は、細胞のゲノムへの外因性配列（例えば、治療タンパク質をコードする導入遺伝子）のヌクレアーゼ媒介性の標的化された組込みに関する。上に記す通り、例えば、指定の領域の欠失および／または変異体遺伝子の補正のための、または野生型遺伝子の発現増加のための、外因性配列（「ドナー配列」または「ドナー」または「導入遺伝子」とも呼ばれる）の挿入。ドナー配列が、典型的に、これが配置されるゲノム配列と同一でないことが容易に明らかとなるであろう。ドナー配列は、２つの相同性の領域に挟まれた非相同配列（例えば、導入遺伝子）を含有して、目的の場所における効率的なＨＤＲを可能にすることができる、または非相同組換え修復機構により組み込むことができる。例えば、米国特許第９，０４５，７６３号；同第９，００５，９７３号；および同第７，８８８，１２１号を参照されたい。その上、ドナー配列は、細胞クロマチンにおける目的の領域と相同でない配列を含有するベクター分子を含むことができる。ドナー分子は、細胞ＤＮＡに対し相同性の、いくつかの不連続領域を含有することができる。さらに、目的の領域に通常存在しない配列の標的化された挿入のため、前記配列は、ドナー核酸分子に存在し、目的の領域における配列に対し相同性の領域に挟まれることができる。
【０１７９】
ヌクレアーゼと同様に、ドナーは、いずれかの形態で導入することができる。ある特定の実施形態では、ドナーは、本技術分野で公知の方法によってＤＮＡおよび／またはウイルスベクターを使用して導入することができる。例えば、米国特許第９，００５，９７３号；同第８，９３６，９３６号；および同第８，７０３，４８９号を参照されたい。ドナーは、二本または一本鎖形態で細胞に導入することができる。ドナーは、環状または直鎖状形態で細胞に導入することができる。直鎖状形態で導入される場合、ドナー配列の末端は、当業者に公知の方法によって保護することができる（例えば、エキソヌクレアーゼによる分解から）。例えば、１個または複数のジデオキシヌクレオチド残基が、直鎖状分子の３’末端に付加される、および／または自己相補的オリゴヌクレオチドが、一方もしくは両方の末端にライゲーションされる。例えば、Ｃｈａｎｇ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８４：４９５９−４９６３；Ｎｅｈｌｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７２：８８６−８８９を参照されたい。分解から外因性ポリヌクレオチドを保護するための追加的な方法として、末端アミノ基（複数可）の付加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホルアミデート（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄａｔｅ）、およびＯ−メチルリボースまたはデオキシリボース残基等の改変されたヌクレオチド間連結の使用が挙げられるがこれらに限定されない。
【０１８０】
ある特定の実施形態では、ドナーは、１ｋｂの長さを超える、例えば、２〜２００ｋｂの間、２〜１０ｋｂの間（またはその間のいずれかの値）の配列（例えば、導入遺伝子とも称されるコード配列）を含む。ドナーは、少なくとも１個のヌクレアーゼ標的部位を含むこともできる。ある特定の実施形態では、ドナーは、例えば、１対のＺＦＮ、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏまたはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓヌクレアーゼのための、少なくとも２個の標的部位を含む。典型的には、ヌクレアーゼ標的部位は、導入遺伝子の切断のため、導入遺伝子配列の外側、例えば、導入遺伝子配列に対して５’および／または３’にある。ヌクレアーゼ切断部位（複数可）は、いずれかのヌクレアーゼ（複数可）のためのものとなることができる。ある特定の実施形態では、二本鎖ドナーに含有されるヌクレアーゼ標的部位（複数可）は、切断されたドナーが相同性非依存的方法により組み込まれる内在性標的の切断に使用される、同じヌクレアーゼ（複数可）のためのものである。
【０１８１】
ドナーは、その発現が、組込み部位における内在性プロモーターによって、すなわち、ドナーが挿入される内在性遺伝子の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように、挿入することができる。しかし、ドナーが、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含むことができることが明らかであろう。
【０１８２】
ドナー分子は、内在性遺伝子の全てもしくは一部が発現されるまたは全く発現されないように、内在性遺伝子に挿入することができる。一部の実施形態では、導入遺伝子は、ＣＩＳＨ遺伝子の内在性遺伝子座に組み込まれて、変異体バージョン（例えば、ＣＩＳＨ遺伝子の機能的バージョンを欠如または欠乏している患者由来の細胞において）を補正し、例えば、導入遺伝子は、内在性ＣＩＳＨ遺伝子、例えば、ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン（例えば、エクソン２またはエクソン３）に組み込まれる。他の実施形態では、導入遺伝子は、機能的タンパク質が発現されるように、ＣＩＳＨ遺伝子の内在性遺伝子座に組み込まれる。よって、ドナーは、ＣＡＲ、操作されたもしくは外因性のＴＣＲ（米国特許第８，９５６，８２８号を参照）および／またはＡＣＴＲ（米国特許出願公開第２０１７／０２８１６８２号）ならびにこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない、機能的タンパク質を産生するいずれかのタンパク質コード配列を含むことができる。
【０１８３】
さらに、発現に要求されないが、外因性配列は、転写もしくは翻訳調節性または他の配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列および／またはポリアデニル化シグナルを含むこともできる。その上、スプライスアクセプター配列が含まれてもよい。
【０１８４】
本明細書に記載されているドナー配列において運ばれる導入遺伝子は、ＰＣＲ等の本技術分野で公知の標準技法を使用して、プラスミド、細胞または他の供給源から単離することができる。使用のためのドナーは、環状のスーパーコイル、環状のほどけた、直鎖状その他を含む、様々な種類のトポロジーを含むことができる。その代わりに、ドナーは、標準オリゴヌクレオチド合成技法を使用して化学合成することができる。加えて、ドナーは、メチル化されていてもよく、メチル化を欠いていてもよい。ドナーは、細菌または酵母人工染色体（ＢＡＣまたはＹＡＣ）の形態となることができる。
【０１８５】
本明細書に記載されているドナーポリヌクレオチドは、１個または複数の非天然塩基および／または骨格を含むことができる。特に、本明細書に記載されている方法を使用して、メチル化シトシンを有するドナー分子の挿入を実行して、目的の領域における転写静止状態を達成することができる。
【０１８６】
外因性（ドナー）ポリヌクレオチドは、いずれかの目的の配列（外因性配列）を含むことができる。例示的な外因性配列として、いずれかのポリペプチドコード配列（例えば、ｃＤＮＡ）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、切断酵素認識部位、および様々な種類の発現構築物が挙げられるがこれらに限定されない。マーカー遺伝子として、抗生物質抵抗性（例えば、アンピシリン抵抗性、ネオマイシン抵抗性、Ｇ４１８抵抗性、ピューロマイシン抵抗性）を媒介するタンパク質をコードする配列、有色または蛍光または発光タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、増強型緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、ならびに増強された細胞成長および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ）をコードする配列が挙げられるがこれらに限定されない。エピトープタグは、例えば、１または複数コピーのＦＬＡＧ、Ｈｉｓ、ｍｙｃ、Ｔａｐ、ＨＡまたはいずれかの検出可能なアミノ酸配列を含む。
【０１８７】
一部の実施形態では、ドナーは、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ））、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子、および上述のうちいずれかの機能的断片が挙げられるがこれらに限定されない、細胞におけるその発現が所望されるいずれかのポリペプチドをコードするポリヌクレオチドをさらに含む。コード配列は、例えば、ｃＤＮＡとなることができる。
【０１８８】
ある特定の実施形態では、外因性配列は、標的化された組込みを起こした細胞の選択を可能にするマーカー遺伝子（上述）、および追加的な機能性をコードする連結された配列を含むことができる。マーカー遺伝子の非限定的な例として、ＧＦＰ、薬物選択マーカー（複数可）その他が挙げられる。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、例えば、変異した内在性配列を置き換えるための野生型遺伝子を含むことができる。例えば、野生型（または他の機能的）ＣＩＳＨ遺伝子配列は、遺伝子の内在性コピーが変異された幹細胞のゲノムに挿入することができる。導入遺伝子は、内在性遺伝子座に挿入することができる、またはその代わりに、セーフハーバー遺伝子座に標的化することができる。
【０１９０】
本明細書の教示に従った斯かる発現カセットの構築は、分子生物学の技術分野で周知の方法論を利用する（例えば、ＡｕｓｕｂｅｌまたはＭａｎｉａｔｉｓを参照）。トランスジェニック動物を生成するための発現カセットの使用前に、適した細胞系（例えば、初代細胞、形質転換細胞または不死化細胞系）に発現カセットを導入することにより、選択された制御エレメントに関連するストレス誘導因子に対する発現カセットの応答性を検査することができる。
【０１９１】
さらに、発現に要求されないが、外因性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、２Ａペプチドをコードする配列、および／またはポリアデニル化シグナルとなることもできる。さらに、目的の遺伝子の制御エレメントをレポーター遺伝子に作動可能に連結して、キメラ遺伝子を作製することができる（例えば、レポーター発現カセット）。
【０１９２】
非コード核酸配列の標的化された挿入を達成することもできる。アンチセンスＲＮＡ、ＲＮＡｉ、ｓｈＲＮＡおよびマイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）をコードする配列を、標的化された挿入に使用することもできる。
【０１９３】
追加的な実施形態では、ドナー核酸は、追加的なヌクレアーゼ設計のための特異的標的部位である非コード配列を含むことができる。その後、本来のドナー分子が切断され、別の目的のドナー分子の挿入によって改変されるように、追加的なヌクレアーゼを細胞において発現させることができる。このようにして、特定の目的の遺伝子座またはセーフハーバー遺伝子座における形質スタッキングを可能にする、ドナー分子の反復的な組込みを生成することができる。
【０１９４】
細胞
よって、遺伝子改変されたＣＩＳＨ遺伝子を含む遺伝子改変された細胞が本明細書に提供される。遺伝子改変された細胞は、非コードまたはコード領域、例えば、ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン２および／またはエクソン３内を含む、ＣＩＳＨ遺伝子内のどの箇所が改変されていてもよい。ある特定の実施形態では、改変は、本明細書に記載されている方法によって産生された細胞（例えば、Ｔ細胞または幹細胞）を含む、細胞における機能的タンパク質を発現する導入遺伝子の組込みを含む。導入遺伝子は、１種または複数のヌクレアーゼを使用して、標的化された様式で、細胞のゲノムに組み込まれる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、例えば、がん患者または炎症性疾患患者において、ＣＩＳＨ遺伝子に組み込まれる。導入遺伝子は、ＣＩＳＨのいずれかのイントロンおよび／またはエクソン領域、例えば、エクソン２またはエクソン３に組み込むことができる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、表２に示す少なくとも９塩基対の標的部位に、またはそのいずれかの側の５〜１０ヌクレオチド以内に組み込まれる。よって、ＣＩＳＨ遺伝子のエクソン２または３に組み込まれた導入遺伝子（機能的タンパク質を発現する）を含む遺伝子改変された細胞と共に、遺伝子改変を含むこのような細胞の後代である細胞が本明細書に提供される。
【０１９５】
ランダム組込みとは異なり、標的化された組込みは、導入遺伝子が、指定の遺伝子に組み込まれることを確実にする。導入遺伝子は、標的遺伝子におけるどの箇所にも組み込むことができる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子は、ヌクレアーゼ切断部位にまたはその付近に、例えば、切断部位の上流または下流の１〜３００（またはその間の（ｔｈｅｒｅｂｅｔｗｅｎ）いずれかの値）塩基対以内に、より好ましくは、切断部位のいずれかの側の１〜１００塩基対（またはその間のいずれかの値）以内に、さらにより好ましくは、切断部位のいずれかの側の１〜５０塩基対（またはその間のいずれかの値）以内に組み込まれる。ある特定の実施形態では、導入遺伝子を含む組み込まれる配列は、いかなるベクター配列（例えば、ウイルスベクター配列）も含まない。
【０１９６】
細胞および細胞系が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの細胞型を、導入遺伝子を含むように、本明細書に記載されている通りに遺伝子改変することができる。本明細書に記載されている導入遺伝子含有細胞の他の非限定的な例として、Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋等）；樹状細胞；Ｂ細胞；自家（例えば、患者由来の）または異種多能性、全能性もしくは複能性幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋細胞、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞その他）が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されている細胞は、患者に由来するＣＤ３４＋細胞である。細胞は、培養において遺伝子改変することができる、またはその代わりに、本明細書に記載されているヌクレアーゼおよび／またはドナーを被験体に提供することにより、ｉｎ  ｖｉｖｏで遺伝子改変することができる。
【０１９７】
本明細書に記載されている細胞は、例えば、ｅｘ  ｖｉｖｏ治療法による、障害を有する被験体におけるがんまたは炎症性疾患の処置および／または予防において有用である。標準技法を使用して、ヌクレアーゼ改変された細胞を拡大増殖し、次いで患者に再導入することができる。例えば、Ｔｅｂａｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０１４）  Ｎｅｗ  Ｅｎｇ  Ｊ  Ｍｅｄ  ３７０（１０）：９０１を参照されたい。幹細胞の場合、被験体への注入後に、これらの前駆体から、機能的ＣＩＳＨタンパク質を発現する細胞へのｉｎ  ｖｉｖｏ分化も発生する。本明細書に記載されている細胞を含む医薬組成物も提供される。加えて、細胞は、患者への投与に先立ち凍結保存することができる。
【０１９８】
本明細書に記載されている細胞およびｅｘ  ｖｉｖｏ方法は、被験体（例えば、哺乳動物被験体）における障害（例えば、がんまたは炎症性疾患）の処置および／または予防を提供し、同種異系骨髄移植またはガンマレトロウイルス送達等、継続的な予防的医薬品投与または危険な手順の必要を排除する。そのようなものとして、本明細書に記載されている発明は、免疫調節が望ましいがん、炎症性疾患および他の状態を処置および／または予防する、より安全で、対費用効果が高く、時間効率の良い仕方を提供する。
【０１９９】
送達
本明細書に記載されているヌクレアーゼ、このようなヌクレアーゼをコードするポリヌクレオチド、ドナーポリヌクレオチド、ならびにタンパク質および／またはポリヌクレオチドを含む組成物は、いずれか適した手段によって送達することができる。ある特定の実施形態では、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、ｉｎ  ｖｉｖｏで送達される。他の実施形態では、ヌクレアーゼおよび／またはドナーは、患者へのｅｘ  ｖｉｖｏ送達において有用な改変細胞の提供（細胞療法）のために、単離された細胞（例えば、自家または異種幹細胞）に送達される。
【０２００】
本明細書に記載されているヌクレアーゼを送達する方法は、例えば、これら全ての開示の全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，４５３，２４２号；同第６，５０３，７１７号；同第６，５３４，２６１号；同第６，５９９，６９２号；同第６，６０７，８８２号；同第６，６８９，５５８号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号に記載されている。
【０２０１】
本明細書に記載されているヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物は、構成成分のうち１種または複数をコードする配列を含有する、裸のＤＮＡおよび／またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ならびにベクターを含む、いずれかの核酸送達機構を使用して送達することもできる。プラスミドベクター、ＤＮＡミニサークル、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ポックスウイルスベクター；ヘルペスウイルスベクターおよびアデノ随伴ウイルスベクター等、ならびにこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない、いずれかのベクター系を使用することができる。それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，５３４，２６１号；同第６，６０７，８８２号；同第６，８２４，９７８号；同第６，９３３，１１３号；同第６，９７９，５３９号；同第７，０１３，２１９号；および同第７，１６３，８２４号；ならびに米国特許出願公開第２０１４／０３３５０６３号も参照されたい。さらに、これらの系のいずれかが、処置に必要とされる配列のうち１種または複数を含むことができることが明らかであろう。よって、１種または複数のヌクレアーゼおよびドナー構築物が、細胞に導入される場合、ヌクレアーゼおよび／またはドナーポリヌクレオチドは、同じ送達系または異なる送達機構において運ぶことができる。複数の系が使用される場合、各送達機構は、１種のまたは複数種のヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物（例えば、１種もしくは複数のヌクレアーゼをコードするｍＲＮＡ、および／または１種もしくは複数のドナー構築物を保有するｍＲＮＡもしくはＡＡＶ）をコードする配列を含むことができる。
【０２０２】
従来のウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子移入方法を使用して、細胞（例えば、哺乳動物細胞）および標的組織にヌクレアーゼおよびドナー構築物をコードする核酸を導入することができる。非ウイルスベクター送達系は、ＤＮＡプラスミド、ＤＮＡミニサークル、裸の核酸、およびリポソームまたはポロクサマー等の送達ビヒクルと複合体形成した核酸を含む。ウイルスベクター送達系は、細胞への送達後に、エピソームまたは組み込まれたゲノムのいずれかを有する、ＤＮＡおよびＲＮＡウイルスを含む。遺伝子療法手順の総説については、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  （１９９２）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５６：８０８−８１３；Ｎａｂｅｌ  ＆  Ｆｅｌｇｎｅｒ  （１９９３）  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：２１１−２１７；Ｍｉｔａｎｉ  ＆  Ｃａｓｋｅｙ  （１９９３）  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６２−１６６；Ｄｉｌｌｏｎ  （１９９３）  ＴＩＢＴＥＣＨ  １１：１６７−１７５；Ｍｉｌｌｅｒ  （１９９２）  Ｎａｔｕｒｅ  ３５７：４５５−４６０；Ｖａｎ  Ｂｒｕｎｔ  （１９８８）  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６（１０）：１１４９−１１５４；Ｖｉｇｎｅ  （１９９５）  Ｒｅｓｔｏｒａｔｉｖｅ  Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅ  ８：３５−３６；Ｋｒｅｍｅｒ  ＆  Ｐｅｒｒｉｃａｕｄｅｔ  （１９９５）  Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｂｕｌｌｅｔｉｎ  ５１（１）：３１−４４；Ｈａｄｄａｄａ，  ｅｔ  ａｌ．，  ｉｎ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｔｏｐｉｃｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｄｏｅｒｆｌｅｒ  ａｎｄ  Ｂｏｅｈｍ  （ｅｄｓ．）  （１９９５）；およびＹｕ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：１３−２６を参照されたい。
【０２０３】
核酸の非ウイルス送達の方法は、電気穿孔、リポフェクション、マイクロインジェクション、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、イムノリポソーム、ポリカチオンまたは脂質：核酸コンジュゲート、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）、裸のＤＮＡ、裸のＲＮＡ、キャッピングされたＲＮＡ、人工ビリオン、およびＤＮＡの薬剤増強された取り込みを含む。例えば、Ｓｏｎｉｔｒｏｎ  ２０００系（Ｒｉｃｈ−Ｍａｒ）を使用したソノポレーション（ｓｏｎｏｐｏｒａｔｉｏｎ）を、核酸の送達に使用することもできる。
【０２０４】
追加的な例示的な核酸送達系は、Ａｍａｘａ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（Ｃｏｌｏｇｎｅ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｍａｘｃｙｔｅ、Ｉｎｃ．（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ、Ｍａｒｙｌａｎｄ）、ＢＴＸ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｈｏｌｌｉｓｔｏｎ、ＭＡ）およびＣｏｐｅｒｎｉｃｕｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  Ｉｎｃ．によって提供される核酸送達系を含む（例えば、米国特許第６，００８，３３６号を参照）。リポフェクションは、例えば、米国特許第５，０４９，３８６号；同第４，９４６，７８７号；および同第４，８９７，３５５号）に記載されており、リポフェクション試薬は、商業販売されている（例えば、Ｔｒａｎｓｆｅｃｔａｍ（商標）およびＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎ（商標））。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適したカチオン性および中性脂質は、Ｆｅｌｇｎｅｒ、国際特許公開番号ＷＯ９１／１７４２４、ＷＯ９１／１６０２４の脂質を含む。一部の態様では、ヌクレアーゼは、ｍＲＮＡとして送達され、導入遺伝子は、ウイルスベクター、ミニサークルＤＮＡ、プラスミドＤＮＡ、一本鎖ＤＮＡ、直鎖状ＤＮＡ、リポソーム、ナノ粒子その他等、他のモダリティにより送達される。
【０２０５】
免疫脂質（ｉｍｍｕｎｏｌｉｐｉｄ）複合体等の標的化されたリポソームを含む脂質：核酸複合体の調製は、当業者にとって周知である（例えば、Ｃｒｙｓｔａｌ  （１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４０４−４１０；Ｂｌａｅｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２：２９１−２９７；Ｂｅｈｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ５：３８２−３８９；Ｒｅｍｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９４）  Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇａｔｅ  Ｃｈｅｍ．  ５：６４７−６５４；Ｇａｏ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２：７１０−７２２；Ａｈｍａｄ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．  ５２：４８１７−４８２０；米国特許第４，１８６，１８３号；同第４，２１７，３４４号；同第４，２３５，８７１号；同第４，２６１，９７５号；同第４，４８５，０５４号；同第４，５０１，７２８号；同第４，７７４，０８５号；同第４，８３７，０２８号；および同第４，９４６，７８７号を参照）。
【０２０６】
追加的な送達方法は、送達しようとする核酸の、ＥｎＧｅｎｅＩＣ送達ビヒクル（ＥＤＶ）へのパッケージングの使用を含む。このようなＥＤＶは、二特異性抗体を使用して、標的組織に特異的に送達され、この二特異性抗体において、抗体の一方のアームが、標的組織に対する特異性を有し、他方のアームが、ＥＤＶに対する特異性を有する。抗体が、ＥＤＶを標的細胞表面に運び、次いで、ＥＤＶが、エンドサイトーシスによって細胞に入れられる。細胞の中に入ると、内容物が放出される（ＭａｃＤｉａｒｍｉｄ  ｅｔ  ａｌ．  （２００９）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２７（７）：６４３を参照）。
【０２０７】
操作されたＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系をコードする核酸の送達のためのＲＮＡまたはＤＮＡウイルスに基づく系の使用は、ウイルスを身体内の特異的細胞に標的化し、ウイルスペイロードを核に輸送するための、高度に進化したプロセスを活用する。ウイルスベクターは、被験体に直接的に投与することができる（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、またはｉｎ  ｖｉｔｒｏでの細胞の処置に使用することができ、改変された細胞が被験体に投与される（ｅｘ  ｖｉｖｏ）。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系の送達のための従来のウイルスに基づく系として、遺伝子移入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴、ワクシニアおよび単純ヘルペスウイルスベクターが挙げられるがこれらに限定されない。挿入された導入遺伝子の長期発現をもたらすことが多い、レトロウイルス、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルス遺伝子移入方法により、宿主ゲノムにおける組込みが可能である。その上、高い形質導入効率が、多くの異なる細胞型および標的組織において観察された。
【０２０８】
外来性エンベロープタンパク質を取り込み、標的細胞の潜在的標的集団を拡大増殖させることにより、レトロウイルスの親和性を変更することができる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に形質導入または感染し、典型的に、高いウイルス力価を産生することができるレトロウイルスベクターである。レトロウイルス遺伝子移入系の選択は、標的組織に依存する。レトロウイルスベクターは、最大６〜１０ｋｂの外来性配列のためのパッケージング容量を有するシス作用性末端反復配列で構成される。最小シス作用性ＬＴＲが、ベクターの複製およびパッケージングに十分であり、これは次いで、標的細胞への治療用遺伝子の組込みに使用されて、永続的な導入遺伝子発現をもたらす。広く使用されているレトロウイルスベクターは、マウス白血病ウイルス（ＭｕＬＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）およびこれらの組合せに基づくレトロウイルスベクターを含む（例えば、Ｂｕｃｈｓｃｈｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：２７３１−２７３９；Ｊｏｈａｎｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９２）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６６：１６３５−１６４０；Ｓｏｍｍｅｒｆｅｌｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９０）  Ｖｉｒｏｌ．  １７６：５８−５９；Ｗｉｌｓｏｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．６３：２３７４−２３７８；Ｍｉｌｌｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９１）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６５：２２２０−２２２４；国際特許公開番号ＷＯ１９９４／０２６８７７を参照）。
【０２０９】
一過的発現が好ましい適用において、アデノウイルスに基づく系を使用することができる。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型における非常に高い形質導入効率が可能であり、細胞分裂を要求しない。斯かるベクターにより、高力価かつ高レベルの発現が得られた。このベクターは、比較的単純な系において多量に産生することができる。アデノ随伴ウイルス（「ＡＡＶ」）ベクターは、例えば、核酸およびペプチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生において、ならびにｉｎ  ｖｉｖｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏ遺伝子療法手順のために、標的核酸による細胞の形質導入にも使用される（例えば、Ｗｅｓｔ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８７）  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １６０：３８−４７；米国特許第４，７９７，３６８号；国際特許公開番号ＷＯ９３／２４６４１；Ｋｏｔｉｎ  （１９９４）  Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ５：７９３−８０１；Ｍｕｚｙｃｚｋａ  （１９９４）  Ｊ．  Ｃｌｉｎ．  Ｉｎｖｅｓｔ．  ９４：１３５１を参照）。組換えＡＡＶベクターの構築は、米国特許第５，１７３，４１４号；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８５）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ５：３２５１−３２６０；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８４）  Ｍｏｌ．  Ｃｅｌｌ．  Ｂｉｏｌ．  ４：２０７２−２０８１；Ｈｅｒｍｏｎａｔ  ＆  Ｍｕｚｙｃｚｋａ  （１９８４）  ＰＮＡＳ  ８１：６４６６−６４７０；およびＳａｍｕｌｓｋｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９８９）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ６３：０３８２２−３８２８を含むいくつかの刊行物に記載されている。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８、ＡＡＶ８．２、ＡＡＶ９およびＡＡＶ  ｒｈ１０、ならびにＡＡＶ２／８、ＡＡＶ２／５およびＡＡＶ２／６等の偽型ＡＡＶを含む、いずれかのＡＡＶ血清型を使用することができる。
【０２１０】
臨床試験における遺伝子移入のために、少なくとも６種のウイルスベクターアプローチを現在利用することができ、これは、形質導入剤を生成するためのヘルパー細胞系に挿入された遺伝子による欠損ベクターの補完を伴うアプローチを利用する。
【０２１１】
ｐＬＡＳＮおよびＭＦＧ−Ｓは、臨床試験において使用されてきたレトロウイルスベクターの例である（Ｄｕｎｂａｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｂｌｏｏｄ  ８５：３０４８−３０５；Ｋｏｈｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｎａｔ．  Ｍｅｄ．  １：１０１７−１０２；Ｍａｌｅｃｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  ＰＮＡＳ  ９４：２２  １２１３３−１２１３８）。ＰＡ３１７／ｐＬＡＳＮは、遺伝子療法治験において使用された最初の治療用ベクターであった（Ｂｌａｅｓｅ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２７０：４７５−４８０  （１９９５））。５０％またはそれを超える形質導入効率が、ＭＦＧ−Ｓパッケージングベクターに観察された（Ｅｌｌｅｍ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ．  ４４（１）：１０−２０；Ｄｒａｎｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  １：１１１−２）。
【０２１２】
組換えアデノ随伴ウイルスベクター（ｒＡＡＶ）は、欠損および非病原性パルボウイルスアデノ随伴２型ウイルスに基づく有望な代替遺伝子送達系である。全ベクターが、導入遺伝子発現カセットを挟むＡＡＶ  １４５塩基対（ｂｐ）逆位末端リピートのみを保持するプラスミドに由来する。形質導入細胞のゲノムへの組込みによる、効率的な遺伝子移入および安定した導入遺伝子送達は、このベクター系のための鍵となる特色である（Ｗａｇｎｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｌａｎｃｅｔ  ３５１：９１１７  １７０２−３；Ｋｅａｒｎｓ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９：７４８−５５）。ＡＡＶ１、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０、ならびにこれらの全バリアントを含む他のＡＡＶ血清型を、本発明に従って使用することもできる。
【０２１３】
複製欠損組換えアデノウイルスベクター（Ａｄ）は、高力価で産生することができ、いくつかの異なる細胞型に容易に感染する。大部分のアデノウイルスベクターは、導入遺伝子が、Ａｄ  Ｅ１ａ、Ｅ１ｂおよび／またはＥ３遺伝子を置き換えるように操作される；その後、複製欠損ベクターは、欠失された遺伝子機能をトランスで供給するヒト２９３細胞において繁殖される。Ａｄベクターは、肝臓、腎臓および筋肉において見出される細胞等、非分裂の分化した細胞を含む、複数の型の組織にｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入することができる。従来のＡｄベクターは、大きい運搬容量を有する。臨床試験におけるＡｄベクターの使用の例は、筋肉内注射による抗腫瘍免疫化のためのポリヌクレオチド治療法が関与した（Ｓｔｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：１０８３−９）。臨床試験における遺伝子移入のためのアデノウイルスベクターの使用の追加的な例として、Ｒｏｓｅｎｅｃｋｅｒ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ２４：１  ５−１０；Ｓｔｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ９（７）：１０８３−１０８９；Ｗｅｌｓｈ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２：２０５−１８；Ａｌｖａｒｅｚ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９７）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：５９７−６１３；Ｔｏｐｆ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ５：５０７−５１３；Ｓｔｅｒｍａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｈｕｍ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ７：１０８３−１０８９が挙げられる。
【０２１４】
パッケージング細胞は、宿主細胞に感染することができるウイルス粒子の形成に使用される。斯かる細胞は、アデノウイルスをパッケージングする２９３細胞、およびレトロウイルスをパッケージングするψ２細胞またはＰＡ３１７細胞を含む。遺伝子療法において使用されるウイルスベクターは通常、核酸ベクターをウイルス粒子へとパッケージングする産生細胞系によって生成される。ベクターは典型的に、パッケージングおよびその後の宿主への組込み（該当する場合）に要求される最小ウイルス配列を含有し、他のウイルス配列は、発現されるべきタンパク質をコードする発現カセットによって置き換えられている。欠損しているウイルス機能は、パッケージング細胞系によってトランスで供給される。例えば、遺伝子療法において使用されるＡＡＶベクターは典型的に、パッケージングおよび宿主ゲノムへの組込みに要求される、ＡＡＶゲノム由来の逆位末端リピート（ＩＴＲ）配列のみを保有する。ウイルスＤＮＡは、他のＡＡＶ遺伝子、すなわち、ｒｅｐおよびｃａｐをコードするがＩＴＲ配列を欠くヘルパープラスミドを含有する細胞系においてパッケージングされる。細胞系は、ヘルパーとしてのアデノウイルスにも感染される。ヘルパーウイルスは、ＡＡＶベクターの複製およびヘルパープラスミドからのＡＡＶ遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ＩＴＲ配列を欠くため、有意な量でパッケージングされない。アデノウイルスによる汚染は、例えば、ＡＡＶよりもアデノウイルスの感受性が高い加熱処置によって低減させることができる。
【０２１５】
多くの遺伝子療法適用において、特定の組織型に対し高度な特異性で遺伝子療法ベクターが送達されることが望ましい。したがって、ウイルスベクターは、ウイルスの外表面におけるウイルスコートタンパク質との融合タンパク質としてリガンドを発現させることにより、所与の細胞型に対する特異性を有するように改変することができる。リガンドは、目的の細胞型上に存在することが公知の受容体に対する親和性を有するように選択される。例えば、Ｈａｎ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９５）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９２：９７４７−９７５１は、モロニーマウス白血病ウイルスを、ｇｐ７０に融合されたヒトヘレグリンを発現するように改変することができ、この組換えウイルスが、ヒト上皮増殖因子受容体を発現するある特定のヒト乳がん細胞に感染することを報告した。この原理は、標的細胞が受容体を発現し、ウイルスが細胞表面受容体のリガンドを含む融合タンパク質を発現する、他のウイルス−標的細胞対へと拡大することができる。例えば、繊維状ファージは、実質的にあらゆる選択された細胞受容体に対して特異的結合親和性を有する抗体断片（例えば、ＦＡＢまたはＦｖ）をディスプレイするように操作することができる。上述は、ウイルスベクターに主として適用されるが、同じ原理を、非ウイルスベクターに適用することができる。斯かるベクターは、特異的標的細胞による取り込みに有利に働く、特異的取り込み配列を含有するように操作することができる。
【０２１６】
遺伝子療法ベクターは、典型的に、後述する通り、全身性投与（例えば、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、舌下または頭蓋内注入）、局所的適用によって、または肺吸入により、個々の被験体への投与によってｉｎ  ｖｉｖｏで送達することができる。その代わりに、ベクターは、個々の患者から外植された細胞（例えば、リンパ球、骨髄吸引液、組織生検）または普遍的ドナー造血幹細胞等、ｅｘ  ｖｉｖｏで細胞に送達し、続いて、通常、ベクターを取り込んだ細胞の選択後に、患者に細胞を再移植することができる。
【０２１７】
ヌクレアーゼおよび／またはドナー構築物を含有するベクター（例えば、レトロウイルス、アデノウイルス、リポソーム等）は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の形質導入のため、生物に直接的に投与することもできる。その代わりに、裸のＤＮＡを投与することができる。投与は、注射、注入、局所的適用、吸入および電気穿孔が挙げられるがこれらに限定されない、血液または組織細胞との最終的な接触への分子の導入に通常使用される経路のいずれかによる。斯かる核酸を投与する適した方法は、利用することができ、当業者にとって周知であり、特定の組成物の投与に２種以上の経路を使用することができるが、特定の経路が、多くの場合、別の経路よりも速効性でより有効な反応をもたらすことができる。
【０２１８】
本明細書に記載されているポリヌクレオチドの導入に適したベクターは、非組込みレンチウイルスベクター（ＩＤＬＶ）を含む。例えば、Ｏｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９６）  Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９３：１１３８２−１１３８８；Ｄｕｌｌ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：８４６３−８４７１；Ｚｕｆｆｅｒｙ，  ｅｔ  ａｌ．  （１９９８）  Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  ７２：９８７３−９８８０；Ｆｏｌｌｅｎｚｉ，  ｅｔ  ａｌ．  （２０００）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２５：２１７−２２２；米国特許第８，９３６，９３６号を参照されたい。
【０２１９】
薬学的に許容される担体は、一部には、投与される特定の組成物と共に、組成物の投与に使用される特定の方法によって決定される。したがって、後述する通り、利用できる医薬組成物の多種多様な適した製剤が存在する（例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，  １７ｔｈ  ｅｄ．，  １９８９を参照）。
【０２２０】
同じまたは異なる系を使用して、ヌクレアーゼコード配列およびドナー構築物を送達することができることが明らかであろう。例えば、ドナーポリヌクレオチドは、ＡＡＶによって運ぶことができる一方、１種または複数のヌクレアーゼは、ｍＲＮＡによって運ぶことができる。さらに、異なる系は、同じまたは異なる経路（筋肉内注射、尾静脈注射、他の静脈内注射、腹腔内投与および／または筋肉内注射）によって投与することができる。複数のベクターは、同時にまたはいずれか逐次の順序で送達することができる。
【０２２１】
ｅｘ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏ投与の両方のための製剤は、液体中の懸濁物または乳化した液体を含む。活性成分は多くの場合、薬学的に許容され、活性成分と適合性である賦形剤と混合される。適した賦形剤は、例えば、水、食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールその他、およびこれらの組合せを含む。加えて、組成物は、湿潤剤もしくは乳化剤、ｐＨ緩衝剤、安定化剤、または医薬組成物の有効性を増強する他の試薬等、少量の補助的物質を含有することができる。
【０２２２】
適用
本明細書に開示されている方法および組成物は、例えば、Ｔ細胞応答性をモジュレートするタンパク質の提供により、がん、炎症性障害および他の疾患のための治療法を提供するためのものである。細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで改変することができる、またはｅｘ  ｖｉｖｏで改変し、その後、被験体に投与することができる。よって、方法および組成物は、障害の処置および／または予防を提供する。
【０２２３】
導入遺伝子（例えば、ＣＡＲ導入遺伝子、ＨＬＡ遺伝子、操作されたもしくは外因性のＴＣＲ遺伝子またはＡＣＴＲ）の標的化された組込みを使用して、異常なＣＩＳＨ関連遺伝子を補正する、野生型遺伝子（例えば、治療タンパク質）を挿入する、または内在性遺伝子の発現を変化させることができる。例えば、ＣＡＲをコードする導入遺伝子を細胞に組み込んで、機能的なＣＡＲタンパク質を産生する細胞を提供することができる。ゲノム編集は、欠陥のある内在性遺伝子における変異（例えば、点変異）の補正を含み、これにより、遺伝子の発現を回復させ、障害を処置することもできる。
【０２２４】
ある特定の実施形態では、１種または複数のＣＡＲが、ＣＩＳＨ遺伝子に組み込まれる。ＣＡＲ導入遺伝子は、本技術分野で公知であり、共刺激ドメインおよび活性化ドメインを含む細胞内シグナル伝達部分に連結された、特定の抗原に対する特異性を有する細胞外単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。共刺激ドメインは、例えば、ＣＤ２８に由来することができ、活性化ドメインは、例えば、ＣＤ３−ゼータに由来することができる。ＣＡＲ導入遺伝子は、２、３、４個またはそれよりも多い共刺激ドメインを含むことができる。ＣＡＲ  ｓｃＦｖは、例えば、ＮＨＬ、ＣＬＬおよび非Ｔ細胞ＡＬＬが挙げられるがこれらに限定されない、全正常Ｂ細胞およびＢ細胞悪性疾患を含むＢ細胞系列における細胞によって発現される膜貫通タンパク質である、ＣＤ１９を標的とするように設計することができる。例えば、米国特許第９，８５５，２９８号を参照されたい。ＣＡＲ導入遺伝子（複数可）に加えてまたはその代わりに、２０１８年８月８日に出願された米国特許出願第１６／０５８，３０７号に記載されているＢ２ＭおよびＨＬＡ−Ｇおよび／またはＨＬＡ−Ｅの融合体が挙げられるがこれらに限定されない、１種または複数のＨＬＡ、Ｂ２Ｍおよび／または他の免疫調節性タンパク質をＣＩＳＨ遺伝子に組み込むことができる。
【０２２５】
非限定的な例として、本明細書に記載されている方法および組成物は、Ｂ細胞白血病等のがんおよび／または大腸炎等の炎症性疾患の処置および／または予防に使用することができる。
【０２２６】
次の実施例は、ヌクレアーゼがジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）を含む、本開示の例示的な実施形態に関する。これは、単なる例証を目的としており、他のヌクレアーゼ、例えば、ＴＡＬＥＮ、ＴｔＡｇｏおよびＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系、操作されたＤＮＡ結合ドメインを有するホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）、および／または天然に存在するもしくは操作されたホーミングエンドヌクレアーゼ（メガヌクレアーゼ）ＤＮＡ結合ドメインおよび異種切断ドメインの融合体、および／またはメガヌクレアーゼおよびＴＡＬＥタンパク質の融合体を使用することができることが認められるであろう。例えば、追加的なヌクレアーゼは、本明細書（例えば、表２）に開示されている配列の９〜１２個の近接ヌクレオチドを含む配列に結合するように設計することができる。
【実施例】
【０２２７】
（実施例１：ＣＩＳＨに標的化されたジンクフィンガータンパク質ヌクレアーゼ（ＺＦＮ））
Ｕｒｎｏｖ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００５）  Ｎａｔｕｒｅ  ４３５（７０４２）：６４６−６５１、Ｐｅｒｅｚ，  ｅｔ  ａｌ．  （２００８）  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２６（７）：８０８−８１６に基本的に記載され、米国特許第６，５３４，２６１号に記載されている通りに、ＣＩＳＨに標的化されたジンクフィンガータンパク質を設計し、ｍＲＮＡ、プラスミド、ＡＡＶまたはアデノウイルスベクターに取り込んだ。表１は、例示的なＣＩＳＨ  ＺＦＰ  ＤＮＡ結合ドメインのＤＮＡ結合ドメイン内の認識ヘリックス、およびこれらのＺＦＰのための標的部位を示す（ＤＮＡ標的部位は大文字で示し；非接触ヌクレオチドは小文字で示す）。ＺＦＰ認識ヘリックスによって接触される標的部位におけるヌクレオチドは大文字で示し；非接触ヌクレオチドは小文字で示す。ＴＡＬＥＮおよび／またはｓｇＲＮＡも、本技術分野で公知の方法に従って、表２に示すＣＩＳＨ配列に対して設計する（例えば、表２に示す標的部位の９〜２０個またはそれよりも多い（９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１個またはそれよりも多くを含む）ヌクレオチド（近接または非近接）を含む標的部位）。例えば、米国特許第８，５８６，５２６号（ＴＡＬＥＮのために正準または非正準ＲＶＤを使用）および米国特許出願公開第２０１５／００５６７０５号を参照されたい。
【表１】
2021502085.tif 000004
【表２】
2021502085.tif 000005
【０２２８】
切断活性に関して、全てのＺＦＮの対での組合せを検査した。ある範囲のｍＲＮＡ（１００ｕＬトランスフェクション反応における３Ｅ６個のＴ細胞につき、０．５μｇ〜６μｇ）にわたるＣＩＳＨ標的化ＺＦＮをコードするｍＲＮＡにより、活性化されたＴ細胞を電気穿孔した。Ｔ細胞をトランスフェクション後３〜４日間拡大増殖させ、ゲノムＤＮＡを採集し、ＣＩＳＨ編集効率をディープシークエンシングによって評価する。表３（表中、パーセント切断が、表示の投薬量における表示の対により示されており、例えば、６μｇ  ｍＲＮＡを使用した対５９４８８／５９４８９を使用した、ＣＩＳＨ遺伝子の８９％切断）に示す通り、全ての対が活性であることが判明した。
【表３】
2021502085.tif 000006
【０２２９】
これらの設計が、正準または非正準リンカー（フィンガー間）が挙げられるがこれらに限定されない、フィンガーモジュールのいずれかの間に、および／またはＺＦＰおよび切断ドメインの間にいずれかのリンカーを、および／または米国特許第９，３９４，５３１号に記載されている通りＺＦＰおよび切断ドメインの間にリンカーを含むことができることが明らかであろう。米国特許第８，７７２，４５３号および米国特許出願公開第２０１５／００６４７８９号も参照されたい。
【０２３０】
さらに、ヌクレアーゼ（ＺＦＮ、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ系およびＴＡＬＥＮ）のいずれかは、操作された切断ドメイン、例えば、米国特許第８，６２３，６１８号に開示されているヘテロ二量体（例えば、ＥＬＤおよびＫＫＲ操作された切断ドメイン）および／または米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号に記載されている通り位置４１６、４２２、４４７、４４８および／または５２５に１個または複数の変異を有する切断ドメインを含むことができる。ＺＦＮは、米国特許出願公開第２０１８／００８７０７２号に記載されている通り、ＺＦＰの骨格残基に１個または複数の変異を含むこともできる。これらの変異体は、本明細書に記載されている例示的なＤＮＡ結合ドメインと併せて使用した。
【０２３１】
（実施例２：標的化されたＣＩＳＨドナー挿入）
ＡＡＶ  ＧＦＰドナーを使用したＣＩＳＨ遺伝子座への標的化された組込みも行った。先ず、ＡＡＶ  ＧＦＰドナーは、ＣＩＳＨ切断部位に対して５’および３’で相同性アームに挟まれたＧＦＰ発現カセットをコードするように構築した。細胞が、ＣＩＳＨ標的化ＺＦＮで処置され、ＡＡＶドナーと同時投与される場合、挟んでいる相同性アームは、相同組換え修復経路によるＣＩＳＨ切断部位へのＧＦＰ発現カセットの標的化された挿入の媒介に必要である。本実験において、活性化されたＴ細胞は、ＣＩＳＨ  ｍＲＮＡにより電気穿孔され、ＡＡＶ  ＧＦＰドナーと同時投与される。％ＧＦＰ陽性細胞のＦＡＣＳ解析によって、７日後に標的化された組込み効率を評価した。
【０２３２】
図２および図３に示す通り、ＧＦＰ発現のためのＦＡＣＳ解析は、本明細書に記載されているＣＩＳＨ標的化ヌクレアーゼおよびドナーの両方を受けた細胞において、ドナー（ＧＦＰ）挿入の少なくとも７０％の効率が得られたことを示した。
【０２３３】
（実施例３：ＡＡＶＳ１セーフハーバー遺伝子座と比較した、ＣＩＳＨにおけるドナー挿入後の増強された免疫賦活性活性化）
ＡＡＶ  ＧＦＰドナーを使用して、ＣＩＳＨまたはＡＡＶＳ１遺伝子座への標的化された組込みも行った。先ず、ＡＡＶ  ＧＦＰドナーは、ＣＩＳＨまたはＡＡＶＳ１切断部位に対して５’および３’で相同性アームに挟まれたＧＦＰ発現カセットをコードするように構築した。細胞が、ＣＩＳＨまたはＡＡＶＳ１標的化ＺＦＮ（ＣＩＳＨ特異的ＺＦＮ：ＳＢ５９４４０／ＳＢ５９４４１（上の表１に示す通り）；ＡＡＶＳ１特異的ＺＦＮ（米国特許第９，９５７，５２６号に記載されているＳＢ３００５４およびＳＢ３００３５と命名されたＺＦＰを含む）で処置され、対応するＡＡＶドナーと同時投与される場合、挟んでいる相同性アームは、相同組換え修復経路によるＣＩＳＨまたはＡＡＶＳ１切断部位へのＧＦＰ発現カセットの標的化された挿入の媒介に必要である。本実験において、活性化されたエフェクターＴ細胞は、ＣＩＳＨまたはＡＡＶＳ１  ＺＦＮ  ｍＲＮＡにより電気穿孔され、対応するＡＡＶ  ＧＦＰドナーと同時投与される。Ｍｉｓｅｑ解析によって、７日後にゲノム改変効率を評価した。
【０２３４】
図５に示す通り、本明細書に記載されているＣＩＳＨまたはＡＡＶＳ１標的化ヌクレアーゼおよびＡＡＶ  ＧＦＰドナーの両方を受けた細胞において、高レベルのゲノム改変効率が得られた。図６は、おそらく、サイトカインシグナル抑制因子（ＳＯＣＳ）ファミリーのメンバーであるＣＩＳＨの発現のノックアウトが原因で、ＣＩＳＨにおけるＧＦＰドナーの標的化された組込みが、ＴＣＲ媒介性活性化により、エフェクターＴ細胞免疫賦活性機能を増強することを実証する。
【０２３５】
（実施例４：Ｅｘ  ｖｉｖｏ方法）
ＣＩＳＨ遺伝子に組み込まれた導入遺伝子（例えば、ＣＡＲおよび／または他の治療用導入遺伝子）を含む、本明細書に記載されている遺伝子改変された細胞（例えば、Ｔ細胞または造血幹細胞）が、がんまたは炎症性障害患者に投与される。細胞の投与（単一または複数の投薬）は、細胞療法における公知のいずれかの方法によって為される。疾患または障害（またはその症状）は、投与後に改善される。
【０２３６】
本明細書で言及されているあらゆる特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３７】
明瞭な理解を目的として、説明および実施例として少し詳しく開示を提供してきたが、当業者であれば、本開示の精神または範囲から逸脱することなく、様々な変更および修正を実施できることが明らかであろう。したがって、先の記述および実施例は、限定として解釈するべきではない。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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