(57)【要約】  Rabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定するための方法であって、次のステップ：(a) REP1を含む試料を用意するステップ；(b) ステップ(a)の試料を、Rab6a、Rabゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（Rab GGTase）および脂質供与体基質と接触させるステップ；ならびに(c) 脂質付加されたRab6a生成物を検出するステップを含む方法。【選択図】図１２Ｃ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Rabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定するための方法であって、
(a) REP1タンパク質を、Rab6aタンパク質、Rabゲラニルゲニルトランスフェラーゼ（Rab GGTase）および脂質供与体基質と接触させて、脂質付加されたRab6aを生成させるステップ；および
(b) 脂質付加されたRab6aを検出するステップ
を含む前記方法。
【請求項２】
試料がREP1タンパク質を含有する、請求項1に記載の方法。
【請求項３】
REP1タンパク質を含有する試料が細胞から分離されるか、または細胞から得られ、その細胞がREP1タンパク質を発現するように遺伝子操作されている、請求項2に記載の方法。
【請求項４】
REP1タンパク質を含有する試料が細胞溶解物を含む、請求項3に記載の方法。
【請求項５】
REP1タンパク質が、REP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するウイルスベクターから発現される、請求項1〜4のいずれか1つに記載の方法。
【請求項６】
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項5に記載の方法。
【請求項７】
Rab6aタンパク質またはRab GGTaseが実質的に純粋である、請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法。
【請求項８】
Rab6aタンパク質およびRab GGTaseが実質的に純粋である、請求項1〜6のいずれか1つに記載の方法。
【請求項９】
Rab6a:Rab GGTaseモル比が約1:2-3である、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１０】
Rab6a:Rab GGTaseモル比が1:2-3である、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１１】
Rab6a:Rab GGTaseモル比が約1:2.5である、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１２】
Rab6a:Rab GGTaseモル比が1:2.5である、請求項1〜8のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１３】
脂質供与体基質が、ゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）またはその類似体を含む、請求項1〜12のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１４】
脂質供与体基質が、ビオチン-ゲラニルピロリン酸（BGPP）を含む、請求項1〜13のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１５】
脂質付加されたRab6aの検出が、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ウェスタンブロット分析、またはオートラジオグラフィーを含む、請求項1〜14のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１６】
REP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するAAVベクターが、コロイデレミアの治療に使用するために作製される、請求項6〜15のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１７】
脂質付加されたRab6aが検出され、REP1タンパク質、またはREP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するAAVベクターがコロイデレミアの治療での使用に適している、請求項6〜16のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１８】
脂質付加されたRab6aの検出がさらに、脂質付加されたRab6aの量を定量することを含む、請求項1〜17のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１９】
脂質付加されたRab6aの量が絶対量である、請求項18に記載の方法。
【請求項２０】
脂質付加されたRab6aの量が相対量である、請求項18に記載の方法。
【請求項２１】
脂質付加されたRab6aの量が、対照量または参照レベルに対して相対的である、請求項20に記載の方法。
【請求項２２】
Rabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定するための、Rab6aタンパク質の使用。
【請求項２３】
REP1タンパク質が細胞から分離されるか、または細胞から得られ、その細胞がREP1タンパク質を発現するように遺伝子操作されている、請求項22に記載の使用。
【請求項２４】
細胞がREP1タンパク質を含有しており、その細胞がREP1タンパク質を発現するように遺伝子操作されている、請求項22に記載の使用。
【請求項２５】
REP1タンパク質が細胞の溶解物から分離されるか、または細胞の溶解物から得られ、その細胞がREP1タンパク質を発現するように遺伝子操作されている、請求項22に記載の使用。
【請求項２６】
細胞溶解物がREP1タンパク質を含有しており、その細胞はREP1タンパク質を発現するように遺伝子操作されている、請求項22に記載の使用。
【請求項２７】
REP1タンパク質が、REP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するウイルスベクターから発現される、請求書23〜26のいずれか1つに記載の使用。
【請求項２８】
ウイルスベクターがアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである、請求項27に記載の使用。
【請求項２９】
REP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するAAVベクターが、コロイデレミアの治療に使用するために作製される、請求項22〜28のいずれか1つに記載の使用。
【請求項３０】
脂質付加されたRab6aが検出され、REP1タンパク質、またはREP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するAAVベクターがコロイデレミアの治療での使用に適している、請求項22〜29のいずれか1つに記載の使用。
【請求項３１】
Rab6aタンパク質が実質的に純粋である、請求項22〜30のいずれか1つに記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2017年10月17日提出の仮出願USSN 62/573,522、および2018年2月28日提出の仮出願USSN 62/636,722の利益を主張するものであって、そのそれぞれの内容は参照によりそのまま本明細書に含められる。
配列表の編入
【０００２】
2018年10月16日に作成された、59 KBサイズの“NIGH-005_001WO_SeqList.txt”名のテキストファイルの内容は、参照によりそのまま本明細書に組み入れられる。
【０００３】
技術分野
本発明は、Rabエスコートタンパク質1（REP1）の活性測定に用いるアッセイに関する。具体的には、本発明は、アッセイにおいてプレニル化の基質としてRab6aを使用することに関するが、より詳細には、このREP1は遺伝子治療ベクターを用いて細胞に送達されたものである。
【背景技術】
【０００４】
開示内容の背景
コロイデレミアは、冒された眼の細胞にREP1導入遺伝子の機能的コピーを提供することによって、首尾よく治療することができる。具体的には、その疾患を治療するために機能性REP1をコードするヌクレオチド配列を眼に送達するために、アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターを使用することができることが明らかとなっている。コロイデレミアの遺伝子治療が臨床上の現実となりつつあるので、特に、新たな遺伝子治療ベクターをテストするために、ならびに臨床的ベクターストックの品質管理検査として、外部から導入されたREP1の活性を測定するための、信頼性の高い高感度なアッセイが必要である。本明細書は、外部から導入されたREP1の活性を測定するための、信頼性の高い高感度なアッセイを提供する。
【発明の概要】
【０００５】
本発明者らは、驚くべきことに、Rab27a（RAB27Aともいう）が最適なプレニル化アッセイ基質を提供するという通説的理解にもかかわらず、プレニル化反応の基質としてRab6a（RAB6Aともいう）を使用することが、Rabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定するための、より感度の高い方法を提供することを見出した。Rab6aは、プレニル化を検出するアッセイにおいて高感度をもたらすだけでなく、有益なシグナル対ノイズ比、シグナルのより望ましいダイナミックレンジ、および、より優れた一貫性も提供する。
【０００６】
さらに、本発明者らは、Rab6aに基づくアッセイの高感度化を利用して、REP1をコードするベクター、具体的には、臨床での使用に適したAAV遺伝子治療ベクターなどの、AAV遺伝子治療ベクターの活性を正確かつ確実に測定することができることを実証した。
【０００７】
本明細書は、Rabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定するための方法を提供するが、その方法は次のステップを含む：（a）REP1タンパク質を、Rab6aタンパク質、Rabゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（Rab GGTase）および脂質供与体基質と接触させて、脂質付加されたRab6aを生成させるステップ；ならびに
（b）脂質付加されたRab6aを検出するステップ。
【０００８】
本明細書のRabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定する方法に関するある実施形態において、試料はREP1タンパク質を含有する。ある実施形態において、REP1タンパク質を含有する試料は、細胞から分離されるか、または細胞から得られるが、その細胞はREP1タンパク質を発現するように遺伝子操作されている。ある実施形態において、REP1タンパク質を含む試料は、細胞溶解物を含む。
【０００９】
本明細書のRabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定する方法に関するある実施形態において、REP1タンパク質は、REP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するウイルスベクターから発現される。ある実施形態において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。
【００１０】
本明細書のRabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定する方法に関するある実施形態において、Rab6aタンパク質またはRab GGTaseは実質的に純粋である。ある実施形態において、Rab6aタンパク質およびRab GGTaseは実質的に純粋である。ある実施形態において、Rab6a：Rab GGTaseモル比は、約1:2-3である。ある実施形態において、Rab6a：Rab GGTaseモル比は、1:2-3である。ある実施形態において、Rab6a：Rab GGTaseモル比は、約1:2.5である。ある実施形態において、Rab6a：Rab GGTaseモル比は、1:2.5である。
【００１１】
本明細書のRabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定する方法に関するある実施形態において、脂質供与体基質は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）またはその類似体を含む。ある実施形態において、脂質供与体基質は、ビオチン-ゲラニルピロリン酸（BGPP）を含む。
【００１２】
本明細書のRabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定する方法に関するある実施形態において、脂質付加されたRab6aの検出は、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ウェスタンブロット分析またはオートラジオグラフィーを含む。
【００１３】
本明細書のRabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定する方法に関するある実施形態において、REP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するAAVベクターは、コロイデレミア治療に使用するために作製される。ある実施形態において、脂質付加されたRab6aが検出されると、REP1タンパク質、またはREP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するAAVベクターは、コロイデレミアの治療での使用に適している。
【００１４】
本明細書のRabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定する方法に関するある実施形態において、脂質付加されたRab6aの検出は、さらに、脂質付加されたRab6aの量を数値化（定量）することを含む。ある実施形態において、脂質付加されたRab6aの量は絶対量である。ある実施形態において、脂質付加されたRab6aの量は相対量である。ある実施形態において、脂質付加されたRab6aの量は、対照量または参照レベル(基準レベル)に対して相対的である。
【００１５】
本明細書は、Rabエスコートタンパク質1（REP1）タンパク質の活性を測定するためのRab6aタンパク質の使用を提供する。
【００１６】
本明細書のREP1タンパク質の活性を測定するためのRab6aタンパク質の使用に関するある実施形態において、REP1タンパク質は、細胞から分離されるか、または細胞から得られるが、その細胞はREP1タンパク質を発現するように遺伝子操作されている。ある実施形態において、細胞はREP1タンパク質を含有し、その細胞はREP1タンパク質を発現するように遺伝子操作されている。ある実施形態において、REP1タンパク質は、細胞溶解物から分離されるか、または細胞溶解物から得られるが、その細胞はREP1タンパク質を発現するように遺伝子操作されている。ある実施形態において、細胞溶解物はREP1タンパク質を含有し、その細胞溶解物は細胞から分離されるか、または細胞から得られ、その細胞はREP1タンパク質を発現するように遺伝子操作されている。
【００１７】
本明細書のREP1タンパク質の活性を測定するためのRab6aタンパク質の使用に関するある実施形態において、REP1タンパク質は、REP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するウイルスベクターから発現される。ある実施形態において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。ある実施形態において、REP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するAAVベクターは、コロイデレミアの治療に使用するために作製される。ある実施形態において、脂質付加されたRab6aが検出されると、REP1タンパク質、またはREP1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含有するAAVベクターは、コロイデレミアの治療での使用に適している。
【００１８】
本明細書のREP1タンパク質の活性を測定するためのRab6aタンパク質の使用に関するある実施形態において、Rab6aタンパク質は実質的に純粋である。
【００１９】
本開示は、Rabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を決定するための方法を提供するが、その方法は次のステップを含む：（a）REP1を含有する試料を用意するステップ；（b）ステップ(a)の試料をRab6a、Rabゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（Rab GGTase）および脂質供与体基質と接触させるステップ；ならびに（c）脂質付加されたRab6a生成物を検出するステップ。
【００２０】
たとえば、本発明の方法は、標的細胞へのREP1の送達に適した、またはベクターストック（たとえば医薬品ストック）の品質管理分析に適した、遺伝子治療ベクターを検査するためのものとすることができる。
【００２１】
遺伝子治療ベクターの検証は、クリニックでの遺伝子治療の安全で有効な実施のために必須である。分析および品質管理ステップのために、対照実験または参照レベルとの比較は、既知の、または認定された標準と比較した遺伝子治療ベクターもしくはREP1の活性の指標を提供することができる（たとえば、既知の、または認定された標準よりも優れているかまたは悪い）。これを用いて、遺伝子治療ベクターストックが特定の標的および規制に合致するかどうかを検証することができる。
【００２２】
ある実施形態において、一次参照標準（主要参照標準）として定義されるREP1、またはREP1をコードするAAVベクターの試料と比較を行う。本発明の方法は、たとえば、試験試料および一次参照標準に関して並行して実施することができる。試験試料の効力、生物学的活性および/または挙動は、たとえば、一次参照標準と比較して定義することができる。
【００２３】
言い換えれば、本発明の方法は、たとえば、遺伝子治療ベクター、好ましくはREP1をコードするヌクレオチド配列を含有するAAVベクター粒子を、品質管理分析し、（たとえばコロデレミアの治療に）有効であると検証するために使用することができ、好ましくは、本発明の方法によって測定されるベクターのアウトプット活性または有効性が、（たとえば対照実験または参照レベルと比較して）閾値活性を超えるか、または指定の目標範囲内であれば、それはそのベクターが遺伝子治療目的に適していることを示す。
【００２４】
したがって、別の態様において、本発明の方法は、Rabエスコートタンパク質1（REP1）をコードする遺伝子治療ベクター（好ましくはAAVベクター）の品質管理分析のためのものである。
【００２５】
もう一つの態様において、本発明は、Rabエスコートタンパク質1（REPI）をコードする遺伝子治療ベクター（好ましくはAAVベクター）の品質管理分析の方法を提供するが、その方法は次のステップを含む：
（a） ベクターにより細胞に形質導入し、その細胞をREP1の発現に適した条件下で培養し、細胞を溶解してREP1を含有する試料を用意するステップ；
（b） ステップ（a）の試料をRab6a、Rabゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（Rab GGTase）および脂質供与体基質と接触させるステップ；ならびに
（c） 脂質付加されたRab6a生成物を検出するステップ。
【００２６】
したがって、本方法は、ステップ(a)〜(c)を含む多数の実験の実行を含む可能性があり、そうした実験におけるREP1含有試料に関連するパラメータはさまざまに変化するが、他のパラメータ（たとえば、Rab6a、Rab GGTaseおよび脂質供与体基質に関連するパラメータ）は一定に保たれる。そのようなパラメーターとしては、たとえば、関連タンパク質（たとえばREP1）のアミノ酸配列、細胞内でREP1を発現するために使用される、ベクター中に含まれるREP1コードヌクレオチド配列、REP1をコードするヌクレオチド配列を細胞に送達するために使用されるベクターの種類（たとえば、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター型などのウイルスベクター型）、REP1の濃度、および/またはREP1コードヌクレオチド配列を細胞に送達するために使用されるベクターの感染多重度（MOI）などが挙げられる。好ましい実施形態において、本方法は、（たとえば用量反応曲線を作成するために）REP1をコードするヌクレオチド配列を細胞に送達するために使用されるベクターについて、さまざまなMOIで、ステップ(a)〜(c)を含む多くの実験を行うことを含んでいる。
【００２７】
ある実施形態において、脂質付加されたRab6a生成物の検出は、脂質付加Rab6a生成物の量を定量することを含む。好ましい実施形態において、脂質付加Rab6a生成物の検出は、対照または参照レベルと比較して脂質付加Rab6a生成物の量を定量することを含む。定量は、たとえば、一次参照標準として定義されているREP1、またはREP1をコードするAAVベクターのサンプルと比較して行うことができる。本発明の方法は、たとえば、試験試料および一次参照標準について並行して実施することができる。試験試料の効力および/または挙動は、たとえば、一次参照標準と比較して定義することができる。
【００２８】
ある実施形態において、本方法は、脂質付加されたRab6a生成物（たとえば、ゲラニルゲラニル化またはビオチン-ゲラニル化などの、プレニル化されたRab6a）の量を、対照実験、たとえばREP1の既知のまたは標準試料を用いた実験から測定された量と比較する追加ステップを含む。
【００２９】
別の実施形態において、本方法は、脂質付加されたRab6a生成物（たとえば、ゲラニルゲラニル化またはビオチン-ゲラニル化などの、プレニル化されたRab6a）の量を、参照レベル（基準レベル）と比較する追加のステップを含む。
【００３０】
ある実施形態において、REP1を含有する試料は、REP1を発現するように遺伝子操作された細胞に由来する。好ましくは、REP1を含有する試料は、REP1を発現するように遺伝子操作された細胞の溶解物である。好ましくは、REP1を発現するように遺伝子操作された細胞を提供するために、REP1をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターにより細胞をトランスフェクトするか、または形質導入する。好ましくは、ベクターはウイルスベクターである。
【００３１】
ある実施形態において、REP1は、REP1をコードするヌクレオチド配列を含有するウイルスベクターを用いて発現される。
【００３２】
ある実施形態において、ウイルスベクターはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターである。好ましくは、ウイルスベクターは、ウイルスベクター粒子の形をとる。
【００３３】
AAVベクターは、いかなる血清型であってもよい（たとえば、任意のAAV血清型ゲノムおよび/またはカプシドタンパク質を含む）。好ましくは、ベクターは、眼の細胞に感染するか、または形質導入する、能力を有する。
【００３４】
ある実施形態において、AAVベクターは、AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10または11ゲノムを含む。別の実施形態において、AAVベクターは、AAV血清型2、4、5または8ゲノムを含む。好ましくは、AAVベクターはAAV血清型2ゲノムを含む。
【００３５】
ある実施形態において、AAVベクター粒子は、AAV血清型1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、または11のカプシドタンパク質を含む。別の実施形態において、AAVベクター粒子は、AAV血清型2、4、5または8のカプシドタンパク質を含む。AAV血清型8カプシドタンパク質は、たとえば、AAV8 / Y733F変異型カプシドタンパク質であってもよい。好ましくは、AAVベクター粒子は、AAV血清型2カプシドタンパク質を含む。
【００３６】
ある実施形態において、AAVベクター粒子は、AAV2ゲノムおよびAAV2カプシドタンパク質（AAV2/2）；AAV2ゲノムおよびAAV5カプシドタンパク質（AAV2/5）；またはAAV2ゲノムおよびAAV8カプシドタンパク質（AAV2/8）を含有する。好ましくは、AAVベクター粒子は、AAV2ゲノムおよびAAV2カプシドタンパク質（AAV2/2）を含有する。
【００３７】
AAVベクター粒子は、1つもしくは複数の天然に存在するAAVの、キメラ、シャッフル型またはカプシド修飾型であってもよい。詳細には、AAVベクター粒子は、同一ベクター内に異なる血清型、クレード、クローンまたは単離株のAAVに由来するカプシドタンパク質配列を含有することができる（すなわち、シュードタイプベクター）。したがって、ある実施形態において、AAVベクターは、シュードタイプAAVベクター粒子の形をとる。
【００３８】
ある実施形態において、REP1はヒトREP1である。
【００３９】
ある実施形態において、REP1は、配列番号5に対して、少なくとも70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含有し、このアミノ酸配列は配列番号5によって表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持していることが好ましい。
【００４０】
ある実施形態において、REP1をコードするヌクレオチド配列は、配列番号6または7に対して、少なくとも70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の同一性を有するヌクレオチド配列を含有し、このヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質は、配列番号5によって表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持していることが好ましい。
【００４１】
ある実施形態において、REP1をコードするヌクレオチド配列は、配列番号5に対して、少なくとも70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％ 、96％、97％、98％、99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有し、このアミノ酸配列は配列番号5によって表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持していることが好ましい。
【００４２】
ある実施形態において、Rab6aおよび/またはRab GGTaseは実質的に純粋である。
【００４３】
ある実施形態において、Rab6aは、配列番号1に対して、少なくとも70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含有するが、このアミノ酸配列は、配列番号1によって表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持していることが好ましい。
【００４４】
ある実施形態において、Rab GGTaseは、配列番号3もしくは8、好ましくは配列番号8に対して、少なくとも70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含有するが、このアミノ酸配列は、配列番号8によって表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持していることが好ましい；ならびに/または、Rab GGTaseは、配列番号4もしくは9、好ましくは配列番号9に対して、少なくとも70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％または100％の同一性を有するアミノ酸配列を含有するが、このアミノ酸配列は、配列番号9によって表されるタンパク質の天然の機能を実質的に保持していることが好ましい。
【００４５】
別の実施形態において、Rab6a：Rab GGTaseのモル比は、約1：0.25〜3、1：0.3〜2.9、1：0.35〜2.8、1：0.4〜2.7、1：0.45〜2.6、または1：0.5〜2.5、好ましくは約1：0.5〜2.5である。
【００４６】
ある実施形態において、Rab6a：Rab GGTaseのモル比は、約1：2〜3、1：2.1〜2.9、1：2.2〜2.8、1：2.3〜2.7、または1：2.4〜2.6、好ましくは約1：2.4〜2.6である。ある実施形態において、Rab6a：Rab GGTaseのモル比は、約1：2、1：2.1、1：2.2、1：2.3、1：2.4、1：2.5、1：2.6、1：2.7、1：2.8、1：2.9、または1：3、好ましくは約1：2.5である。
【００４７】
別の実施形態において、Rab6a：Rab GGTaseのモル比は、約1：0.25〜0.75、1：0.3〜0.7、1：0.35〜0.65、1：0.4〜0.6または1：0.45〜0.55、好ましくは約1：0.4〜0.6である。ある実施形態において、Rab6a：RabGGTaseのモル比は、約1：0.25、1：0.3、1：0.35、1：0.4、1：0.45、1：0.5、1：0.55、1：0.6、1：0.65、1：0.7または1：0.75、好ましくは約1：0.5である。
【００４８】
ある実施形態において、脂質供与体基質は、ゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）またはその類似体である。好ましくは、脂質供与体基質は、検出可能なマーカーで標識される。たとえば、脂質供与体基質は、同位体標識されていてもよく（たとえば、脂質供与体基質は3Hを含有することができる）、または蛍光基、エピトープまたはビオチン部分を含有することができる。
【００４９】
好ましい実施形態において、脂質供与体基質は、ビオチン-ゲラニルピロリン酸（BGPP）である。
【００５０】
ある実施形態において、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ウェスタンブロット分析またはオートラジオグラフィーを使用して脂質付加Rab6a生成物を検出する。好ましい実施形態において、脂質付加されたRab6a生成物はELISAを用いて検出される。ELISAは、たとえば、サンドイッチELISAとすることができる。
【００５１】
好ましい実施形態において、ビオチン標識脂質付加Rab6a生成物は、ビオチンに特異的な検出試薬、たとえばストレプトアビジンを用いて検出される。好ましくは、ビオチン標識脂質付加Rab6a生成物は、ビオチンに特異的な検出試薬、たとえばストレプトアビジン（たとえば、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲート）を用いてウエスタンブロット分析により検出される。より好ましくは、ビオチン標識された脂質付加Rab6a生成物は、ビオチンに特異的な検出試薬、たとえばストレプトアビジンを用いてELISAにより検出される。
【００５２】
ある実施形態において、本方法は、コロイデレミアの治療に使用するためのREP1をコードする遺伝子治療ベクターの活性を測定（決定）するためのものである。
【００５３】
別の態様において、本発明は、Rabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定するためのRab6aの使用を提供する。
【００５４】
REP1の活性、Rab6a、Rab GGTase、脂質供与体基質およびREP1を測定する方法は、本明細書に記載の通りとすることができる。
【００５５】
別の態様において、本発明は、Rabエスコートタンパク質1（REP1）をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターの効力（有効性）を判定するための方法を提供するが、その方法は以下のステップを含む：（a）REP1を含有する試料を用意するステップであって、そのREP1が、REP1をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターを用いて発現される前記ステップ；（b）ステップ（a）の試料を、Rab6a、Rabゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（Rab GGTase）および脂質供与体基質と接触させるステップ；ならびに（c）脂質付加されたRab6a生成物を検出するステップ。
【００５６】
別の態様において、本発明は、Rabエスコートタンパク質1（REP1）をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターの効力を判定するためのRab6aの使用を提供する。
【００５７】
好ましくは、この方法および使用は、コロイデレミアの治療に使用するためのベクターの効力を判定するためのものである。
【００５８】
ベクター、REP1、Rab6a、Rab GGTase、脂質供与体基質、脂質付加Rab6a生成物、検出方法、ならびに方法および使用の他の特徴は、本明細書に記載の通りとすることができる。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
提出された特許又は特許出願は、カラーで実行された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含むこの特許又は特許出願公開の写しは、官庁により、求めに応じてそして必要な費用の支払いにより提供されるであろう。
【図１】図１A〜Dは、非形質導入細胞、およびAAV-GFPまたはAAV-REP1のいずれかにより形質導入された細胞（MOI = 10,000gp /細胞）を使用し、基質としてRab27aを用いたin vitroプレニル化反応後の、取り込まれたビオチン化脂質供与体のウエスタンブロット（WB）分析を示す一連の写真である。  実験には、独立して調製された3セットの溶解物を要した。10μgの溶解物を用いて総容量12.5μlでプレニル化反応をセットアップした。陽性対照に2μMの魚類REP1を添加した。検出時間は2分とした。  （A）細胞溶解物中のヒトREP1レベルのWB分析（1：1000）。非形質導入細胞（＃4、＃9および＃12）は、REP1の内因性レベルを示す。AAV-GFPで形質導入された細胞（＃5、＃10および＃3）は、形質導入されていない細胞と同様のREP1の内因性レベルを示す。AAV-REP1で形質導入された細胞（＃6、＃11および＃14）は、形質導入されていない細胞およびAAV-GFP形質導入細胞と比較してREP1レベルの増加を示す。陽性対照（+ ve）は、内因性REP1レベルを示す。  （B）ローディングコントロールとしてのβアクチンのWB分析（1：15000）。βアクチンのレベルは、分析したすべてのサンプルにおいて同様である。  （C）Rab27a中に取り込まれたビオチン化脂質供与体のWB分析（1：10000）。非形質導入細胞およびAAV-GFP形質導入細胞は、Rab27aにおいてビオチンの検出可能な取り込みを示さない。AAV-REP1で形質導入された細胞は、ある程度のビオチンがRab27aに取り込まれていることを示している（＃6、＃11および＃14）。陽性対照は、魚類REP1活性の結果として、すべての中で最も強いバンドを示す。（D）Image Studio Liteソフトウェアを用いた（C）のWB分析の半定量化。
【図２】図２Ａ〜Ｄは、非形質導入細胞、およびAAV-GFPまたはAAV-REP1のいずれかにより形質導入された細胞（MOI = 10,000gp /細胞）を使用し、基質としてRab27aを用いたin vitroプレニル化反応後の、取り込まれたビオチン化脂質供与体のウエスタンブロット（WB）分析を示す一連の写真である。  実験は、独立して調製された2セットの溶解物を要した。プレニル化反応は、30μgの溶解物を用いて、総量22μlでセットアップした。陽性対照に1μMの魚類REP1を添加した。検出時間は2分とした。  （A）細胞溶解物中のヒトREP1レベルのWB分析（1：1000）。未形質導入細胞（＃9および＃12）は、REP1の内因性レベルを示す。AAV-GFPで形質導入された細胞（＃10および＃13）は、形質導入されていない細胞と同様のREP1の内因性レベルを示す。AAV-REP1で形質導入された細胞（＃11および＃14）は、形質導入されていない細胞およびAAV-GFP形質導入細胞と比較してREP1レベルの増加を示す。陽性対照（+ ve）は、内因性REP1レベルを示す。  （B）ローディングコントロールとしてのβアクチンのWB分析（1：15000）。βアクチンのレベルは、分析したすべてのサンプルにおいて同様である。  （C）Rab27a中に取り込まれたビオチン化脂質供与体のWB分析（1：10000）。非形質導入細胞およびAAV-GFP形質導入細胞は、Rab27aにおいてビオチンの検出可能な取り込みを示さない。AAV-REP1で形質導入された細胞は、ある程度のビオチンがRab27aに取り込まれていることを示している（＃11および＃14）。陽性対照は、魚類REP1活性の結果として、すべての中で最も強いバンドを示す。  （D）Image Studio Liteソフトウェアを用いた（C）のWB分析の半定量化。
【図３】図３Ａ〜Ｄは、非形質導入細胞、およびAAV-GFPまたはAAV-REP1のいずれかにより形質導入された細胞（MOI = 10,000gp /細胞）を使用し、基質としてRab6aを用いたin vitroプレニル化反応後の、取り込まれたビオチン化脂質供与体のウェスタンブロット（WB）分析を示す一連の写真である。  この実験は、独立して調製された2セットの溶解物を要した。プレニル化反応は、20μlの総量で20μgの溶解物を用いてセットアップした。陽性対照に1μMの魚類REP1を添加した。検出時間は2分とした。  （A）細胞溶解物中のヒトREP1レベルのWB分析（1：1000）。未形質導入細胞（＃9および＃12）は、REP1の内因性レベルを示す。AAV-GFPで形質導入された細胞（＃10および＃13）は、形質導入されていない細胞と同様のREP1の内因性レベルを示す。AAV-REP1で形質導入された細胞（＃11および＃14）は、形質導入されていない細胞およびAAV-GFP形質導入細胞と比較してREP1レベルの増加を示す。陽性対照（+ ve）は、内因性REP1レベルを示す。  （B）ローディングコントロールとしてのβアクチンのWB分析（1：15000）。βアクチンのレベルは、分析したすべてのサンプルにおいて同様である。  （C）Rab6a中に取り込まれたビオチン化脂質供与体のWB分析（1：10000）。非形質導入細胞およびAAV-GFP形質導入細胞は、Rab6aにおいてビオチンの取り込みが非常に低い。AAV-REP1で形質導入された細胞は、ビオチンがRab6aに取り込まれていることを示す（＃11および＃14）。陽性対照は、魚類REP1活性の結果として、すべての中で最も強いバンドを示す。  （D）Image Studio Liteソフトウェアを用いた（C）のWB分析の半定量化。
【図４】図４Ａ〜Ｄは、非形質導入細胞、およびAAV-REP1により形質導入された細胞（MOI = 250、1,000、5,000、10,000および20,000gp /細胞）を使用し、基質としてRab6aを用いたin vitroプレニル化反応後の、取り込まれたビオチン化脂質供与体のウェスタンブロット（WB）分析を示す一連の写真である。  プレニル化反応は、20μgの溶解物を用いて総量15μlでセットアップした。陽性対照に0.5μMの魚類REP1を添加した。検出時間は2分とした。  （A）細胞溶解物中のヒトREP1レベルのWB分析（1：2500）。非形質導入細胞は、REP1の内因性レベルを示す。AAV-REP1で形質導入された細胞は、使用されるMOIと直接相関するREP1レベルの増加を示す。陽性対照（+ ve）は、内因性REP1レベルを示す。  （B）ローディングコントロールとしてのβアクチンのWB分析（1：50,000）。βアクチンのレベルは、分析したすべてのサンプルにおいて同様である。  （C）Rab6a中に取り込まれたビオチン化脂質供与体のWB分析（1：10,000）。非形質導入細胞は、Rab6aにおける非常に低いビオチン取り込みを示す。AAV-REP1で形質導入された細胞は、さらに多くのビオチンがRab6aに取り込まれていることを示す。陽性対照は、魚類REP1活性の結果として、すべての中で最も強いバンドを示す。  （D）Image Studio Liteソフトウェアを用いた（C）のWB分析の半定量化。
【図５】図５Ａ〜Ｄは、非形質導入細胞、およびAAV-REP1により形質導入された細胞（MOI = 10,000gp /細胞）を使用し、基質としてRab6aを用いたin vitroプレニル化反応後の、取り込まれたビオチン化脂質供与体のウェスタンブロット（WB）分析を示す一連の写真である。  プレニル化反応は、20μgの溶解物を用いて総量15μlでセットアップした。陽性対照に0.5μMの魚類REP1を添加した。検出時間はREP1 /アクチンで2分、ビオチンで30秒とした。  （A）細胞溶解物中のヒトREP1レベルのWB分析（1：2500）。非形質導入細胞は、REP1の内因性レベルを示す。AAV-REP1で形質導入された細胞は、REP1レベルの増加を示す。陽性対照（+ ve）は、内因性REP1レベルを示す。  （B）ローディングコントロールとしてのβアクチンのWB分析（1：50,000）。βアクチンのレベルは、分析したすべてのサンプルにおいて同様である。  （C）Rab6a中に取り込まれたビオチン化脂質供与体のWB分析（1：10,000）。非形質導入細胞は、Rab6aにおける非常に低いビオチン取り込みを示す。AAV-REP1で形質導入された細胞は、Rab6aへのビオチン取り込みの増加を示す。陽性対照は、魚類REP1活性の結果として、すべての中で最も強いバンドを示す。  （D）Image Studio Liteソフトウェアを用いた（C）のWB分析の半定量化。
【図６】図６Ａ〜Ｄは、非形質導入ARPE-19細胞、およびAAV-REP1で形質導入されたARPE-19細胞におけるin vitroプレニル化反応後の、取り込まれたビオチン化脂質供与体のウエスタンブロット（WB）分析を示す一連の写真である。  プレニル化反応は、15μlの溶解物を用いて総量45μlでセットアップした。陽性対照に0.1μMの魚類REP1を添加した。REP1 /アクチンの検出時間：2分；ビオチン：30秒。  実験は以下の細胞を用いて並行して行った：（a）非形質導入細胞（＃86および＃87）；ならびに（b）細胞+ AAV-REP1 MOI 10,000（＃90および＃91） - R＆Dグレードベクター。  （A）細胞溶解物中のヒトREP1レベルのWB分析（1：2,500）。非形質導入細胞は、REP1の内因性レベルを示す。AAV-REP1で形質導入された細胞は、REP1レベルの増加を示す。陽性対照（+ ve）は、内因性REP1レベルを示す。  （B）ローディングコントロールとしてのβアクチンのWB分析（1：50,000）。βアクチンのレベルは、分析したすべてのサンプルにおいて同様である。  （C）Rab6a中に取り込まれたビオチン化脂質供与体のWB分析（1：10,000）。非形質導入細胞は、Rab6aにおけるビオチンの取り込みが非常に低い。AAV-REP1で形質導入された細胞は、Rab6aへのビオチン取り込みの増加を示す。ポジティブコントロールは、魚類REP1活性の結果として、すべての中で最も強いバンドを示す。  （D）Image Studio Liteソフトウェアを用いた（C）のWB分析の半定量化。
【図７】図７Ａ〜Ｄは、非形質導入HT1080細胞、およびAAV-REP1で形質導入されたHT1080細胞における、in vitroプレニル化反応後の、取り込まれたビオチン化脂質供与体のウェスタンブロット（WB）分析を示す一連の写真である。  20μlの溶解物を用いて総容量20μlとしてプレニル化反応をセットアップした。陽性対照に0.1μMの魚類REP1を添加した。REP1 /アクチンの検出時間：2分；ビオチン：30秒。  実験は以下の細胞を用いて並行して行った：（a）非形質導入細胞（＃56および＃57）;（b）細胞+ AAV-REP1 MOI 10,000（＃60および＃61） - R＆Dグレードベクター；ならびに（c）細胞+ AAV-REP1 MOI 10,000（＃64および＃65） - 臨床グレードのベクター。  （A）細胞溶解物中のヒトREP1レベルのWB分析（1：2,500）。非形質導入細胞は、REP1の内因性レベルを示す。AAV-REP1で形質導入された細胞は、REP1レベルの増加を示す。陽性対照（+ ve）は、内因性REP1レベルを示す。（B）ローディングコントロールとしてのβアクチンのWB分析（1：50,000）。βアクチンのレベルは、分析したすべてのサンプルにおいて同様である。（C）Rab6a中に取り込まれたビオチン化脂質供与体のWB分析（1：10,000）。非形質導入細胞は、Rab6aにおけるビオチン取り込みのベースラインレベルを示す；AAV-REP1で形質導入された細胞は、Rab6aへのビオチン取り込みの増加を示す。（D）Image Studio Liteソフトウェアを用いた（C）のWB分析の半定量化。
【図８−１】図８Ａ〜Ｅは、非形質導入細胞、ならびにAAV-REP1（MOI = 250、1,000、5,000、10,000および20,000gp /細胞）で形質導入された細胞において、Rab6aおよびRab27a基質を比較するin vitroプレニル化反応後の、取り込まれたビオチン化脂質供与体のウェスタンブロット（WB）を示す一連の写真及びグラフである。  プレニル化反応は、15μlの総容量で20μgの溶解物、ならびに2つの異なる基質：Rab27a（左側のレーンおよびプロット;赤色）およびRab6a（右側のレーンおよびプロット;青色）を用いてセットアップした。陽性対照（各基質に1つずつ）に0.1μMの魚類REP1を添加した。検出時間：2分。（A）細胞溶解物中のヒトREP1レベルのWB分析（1：2,500）。非形質導入細胞は、REP1の内因性レベルを示す。AAV-REP1で形質導入された細胞は、使用されるMOIと直接相関するREP1レベルの増加を示す。陽性対照（+ ve）は、内因性REP1レベルを示す。（B）ローディングコントロールとしてのβアクチンのWB分析（1：50,000）。βアクチンのレベルは、分析したすべてのサンプルにおいて同様である。（C）Rab27aおよびRab6aに取り込まれたビオチン化脂質供与体のWB分析。非形質導入細胞はビオチンのRabタンパク質への取り込みが非常に低いことを示すが、これはMOIが増加するにつれて増加する。陽性対照は、魚類REP1活性の結果として、強いビオチン取り込みを示す。（D）Image Studio Liteソフトウェアを用いた（C）のWB分析の半定量化。（E）の4つのプロットに示すように、データはPrismソフトウェアを用いてプロットした。
【図８−２】（E）使用されたMOIの全域にわたるビオチン化基質のバンド密度値（上の2つのプロット）ならびに使用されたMOIの全域にわたるビオチン化基質とREP1との割合（下の2つのプロット）。
【図９−１】図９Ａ〜Ｄは、非形質導入細胞において種々のプレニル化反応条件を比較するin vitroプレニル化反応後の、取り込まれたビオチン化脂質供与体のウェスタンブロット（WB）分析を示す一連の写真及びグラフである。  プレニル化反応は、総量15μLとして20μgの溶解物、ならびに2つの異なる基質：Rab27a（赤色）およびRab6a（青色）を用いてセットアップした。陽性対照（各基質に1つずつ）に、組換えヒトREP1を添加した。検出時間：2分。  （A）Rab27aおよびRab6aに取り込まれたビオチン化脂質供与体のWB分析。ビオチン取り込みのレベルは、反応における全タンパク質の量に正比例する。陽性対照は、魚類REP1活性の結果として、強いビオチン取り込みを示す。  （B）ローディングコントロールとしてのβアクチンのWB分析（1：50,000）。βアクチンのレベルは、反応に使用される全細胞溶解物の量と符合し、サンプル間で類似している。  （C）細胞溶解物中のヒトREP1レベルのWB分析（1：2,500）。非形質導入細胞は、REP1の内因性レベルを示す。陽性対照（+ ve）は、より高密度のREP1を示す。
【図９−２】（D）Image Studio Liteソフトウェアを用いた（A）のWB分析の半定量。Prismソフトウェアを用いてデータをプロットした。強調された値は、基質間でより高い差異が検出された条件についてのものである。
【図１０】AAV-REP1形質導入細胞におけるプレニル化の基質としてのRab27aとRab6aとの比較を示すグラフである。
【図１１】図11A-Bは、Rab27aおよびRab6aが293細胞溶解物に由来する内在性REP1によるプレニル化を受けることを示す、表、写真およびグラフである。A) in vitroでプレニル化反応に用いられた実験条件(#)の総括図であって、細胞溶解物の量（I：2.5μg；5μg；10μg；20μg）、GGT-IIの濃度（II：0.5μM；1μM；2μM）、およびRab基質（Rab27aまたはRab6a）の濃度（III：0.16μM；0.8μM；4μM）に関する。陽性対照（#17：+）：組換えヒトREP1を添加した細胞溶解物。B) SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析後に、プレニル化反応生成物において検出された、タンパク質発現（ヒトREP1およびβアクチン）およびビオチン取り込み。ビオチン化Rab基質バンドの濃度測定分析を棒グラフに示す（条件1-16）。
【図１２Ａ】図12A-Dは、293細胞のAAV2による形質導入後にヒトREP1の効力を評価するのに、Rab6aがRab27aよりふさわしいことを示す、一連の写真およびグラフである。A) 293細胞は、AAV2-REP1のMOIを増加させて（100; 500; 1,000; 5,000; 10,000; 20,000および50,000）、形質導入された。タンパク質発現（ヒトREP1およびβアクチン）およびビオチンの取り込みは、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析後にプレニル化反応生成物（20μg）において検出された（3連のうち代表的な画像）。
【図１２Ｂ】B) AAV2-REP1のlog (MOI)に対する標準化REP1（対応するアクチンレベルに対して補正）の非線形回帰プロット。データは、シグモイド型4パラメーターフィットを用いて解析した（95% CI；制約：bottom >0; hill slope =1）。符号は6連の平均±SEMである。
【図１２Ｃ】C) AAV2-REP1による293細胞の形質導入（n=3）後にビオチン化Rab27aおよびRab6aについて得られ、内因性レベル（MOI = 0）に対して補正された、バンド密度値のプロット。Rab6aは、MOI 10,000、20,000および50,000においてRab27aより有意に高い値を示した（ボンフェローニの多重比較検定による二元配置分散分析（ANOVA）；**p=0.0042; ****p<0.0001）。
【図１２Ｄ】D) 標準化REP1ごとのビオチン取り込みの濃度測定値をRab27aおよびRab6aの両者についてプロットし、線形回帰によって分析した（Rab27a, Y = 6.335*X - 0.6392; Rab6a, Y = 12.6*X + 0.9576）。
【図１３】図13A-Bは、他の細胞株によるin vitroプレニル化基質としてのRab6aの検証を示す一連の写真である。タンパク質発現（ヒトREP1およびβアクチン）およびビオチン取り込みは、細胞への形質導入、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析後に、プレニル化反応生成物において検出された（1回の実験で2連とした）。HT-1080細胞(A)およびARPE-19細胞(B)は、rAAV2/2-REP1（MOI 1,000; 10,000および30,000 gc/細胞）により形質導入され、プレニル化反応は、それぞれ20μgおよび10μgの総タンパク質量をもって調製された。陽性対照（+ rREP1）は、組換え魚類REP1タンパク質を添加した、形質導入されていない細胞溶解物を用いて調製された（HT-1080について25 nM；ARPE-19にについては11 nM）。
【図１４】図14A-Dは、Rab27aおよびRab6aがいずれも、293細胞溶解物由来の内因性REP1によるプレニル化を受けることを示す、表(A)、6枚の写真(B)、3枚のグラフ(C)、および表(D)である。A) in vitroプレニル化反応で用いられた実験条件（#1-#8）の総括表であって、細胞溶解物の総量（2,5；5；10；20μg）、GGT-IIの濃度（0,5；1；2μM）、およびRab基質（Rab27aまたはRab6a）の濃度（0.16；0.8；4μM）に関する。陽性対照（+ve）：組換え魚類REP1（25 nM）を添加した細胞溶解物。B) SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析後に、プレニル化反応生成物において検出された、タンパク質発現（ヒトREP1およびβアクチン）およびビオチン取り込み（3回の独立した実験の代表的なもの）。C) さまざまな量の全細胞溶解物、GGT-II濃度、またはRab基質濃度を用いた場合の、Rab27aおよびRab6aの両者におけるビオチン取り込みを評価する条件セットに関するプロット（n=3）。D) C) のデータセットで行われた統計分析の総括表。二元配置ANOVA検定は、「条件」および「基質」を要因として、条件ごとに（全細胞溶解物、GGT-II濃度、またはRab基質濃度）独立して行われた。それぞれの検定のp値および有意性、ならびにRab27aとRab6aとの比較のためのボンフェローニの多重比較検定が詳細に与えられる。
【図１５】図15A-Dは、293細胞のrAAV2/2形質導入後にヒトREP1の生物学的活性を評価するために、Rab6aの方がRab27aより感度が高いことを示す、3枚の写真(A)および3枚のグラフ(B-D)である。A) 293細胞は、rAAV2/2-REP1のMOIを増加させて(100; 300; 1,000; 3,000; 10,000; 30,000; 100,000および300,000)形質導入された。タンパク質発現（ヒトREP1およびβアクチン）およびビオチン取り込みは、SDS-PAGEおよびウェスタンブロット分析後に、プレニル化反応生成物（20μg）において検出された（3回の独立した実験の代表的画像）。B) rAAV2/2-REP1 (log gc/細胞)に対する標準化REP1（対応するアクチンレベルに対して補正）の非線形回帰プロット。データは、シグモイド型4パラメーターフィットを用いて解析した（95%信頼区間；R2=0.8625）。符号は6連の平均±SEMである。C) rAAV2-REP1のMOI（log gc/細胞）に対するビオチン取り込みの非線形回帰プロット。データは、シグモイド型4パラメーターフィットを用いて解析した（95%信頼区間；Rab6aについてR2=0.8873；Rab27aについてR2=0.8772）。符号は3連の平均±SEMである。Rab6aは、MOI 10,000 (**, p=0.0097)、30,000 (***,p=0.0002)、ならびに100,000および300,000 (****, p<0.0001)において、Rab27aよりも、統計的に有意に高いビオチン取り込みを示した（ボンフェローニの多重比較検定による二元配置ANOVA）。D) RAB6A (R2=0.8959, Y=18.82*X+0.4803) およびRAB27A (R2=0.533, Y=6.569*X+0.9042)に関する、非形質導入対照に対して補正された、基質へのビオチン取り込みの、標準化された過剰発現REP1に対する線形回帰プロット。
【図１６】図16A-Bは、REP1を検出する酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）を示すグラフ(A)およびrhREP1検量線標準試料の表(B)である。プレートを、ウサギ抗CHMポリクローナル抗体（Sigma HPA003231）2μg/mL、ウェル当り100μLでコーティングした。ブロック/洗浄はThermo Fisher Scientific社製Superblockを用いて行った。検量線標準試料は、ジチオスレイトール（DTT）を含まないプレニル化バッファー中に0.5-100 ng/mLのrhREP1 (NAC)を含有するものとした。検出には、0.5μg/mLのビオチン化マウスモノクローナル2F1 (Merck)を用いた。ビオチン化はMiltenyiキットを用いて行った。形質導入細胞および非形質導入細胞の溶解物試料は、DTTを含まない溶解バッファーで1:100または1:1000に希釈した。
【図１７】図17は、REP1を検出するELISAを用いたREP1効力アッセイの結果を示す表である。細胞は、感染効率（MOI）10,000でREP1ベクターENG1014Aを用いて形質導入し、それを溶解して、REP1をELISAにより検出した。Non-trans = 非形質導入対照、Trans = 形質導入細胞。試料は1:100希釈した。
【図１８】図18A-Cは、典型的なrAAV2-REP1効力アッセイREP1 ELISAを示す、グラフ(A)および1対の表（BおよびC）である。(A)は濃度（x軸）に対する生データ（光学密度、y軸）を示す。(B)はrhREP1検量線標準試料の表である。(C)はrhREP1精度プロファイル（n = 10）を示す表である。
【図１９】図19A-Bは、プレニル化の原理およびアッセイを示す、表(A)および図(B)である。
【図２０】図20は、遺伝子治療におけるin vitroプレニル化アッセイによる評価を示す表である。
【図２１】図21A-Cは、プレニル化の割合によるRabの序列を示す、1対のプロット（A、C）および図（B）である。
【図２２】図22は、非プレニル化Rab（バックグラウンド）プールの検出、および非プレニル化プールでのRab27aとの同時染色を示す図である。WT細胞を左側、CHM細胞を右側に示す。野生型細胞において、非プレニル化Rabはビオチンで検出される。シグナルは低いことが予想される。CHM細胞において、非プレニル化プールにおける非プレニル化RabおよびRab27aの検出は、高いシグナルを生じることが予想される。
【図２３】図23A-Cは、ウェスタンブロットの写真(A)および非プレニル化Rabのバンド強度の定量を示す1対のグラフ(B、C)である。(A)において非プレニル化Rabは緑色、Rab27aは赤色で示す。WT = 野生型試料(n = 10)、CHM = コロイデレミア試料(n = 12)。(B)において、WTおよびCHM試料中のアクチンに対する非プレニル化Rabの割合を、対応のないt検定によって比較した（p = 0.0362）。(C)において、WTおよびCHM試料中のアクチンに対する非プレニル化Rab27aの割合を、対応のないt検定によって比較した（p = 0.0044）。
【図２４】図24は、in vitroプレニル化アッセイによる評価を示す表である。
【図２５】図25は、機能アッセイのための12ウェルプレートテストにおいてrAAV2.REP1のプレニル化活性を示すウェスタンブロットの一連の3枚の写真である。AAV2.REP1.ENG1014-AベクターのMOIの増加を利用する。左枠：細胞は40μLのバッファーで溶解した。右枠：細胞は50μLのバッファーで溶解した。上から下に向かって、hREP1 (83 KDa)、アクチン(42 KDa)およびビオチン化Rab6a (24 KDa)を示す。それぞれの枠内のレーンは、左から右に向かって、0 MOI、300 MOI、1,000 MOI、3,000 MOI、10,000 MOI、30,000 MOI、および0 MOI + 魚類REP1タンパク質である。タンパク質サイズは上から下に、00、75、48、35および25 KDaとして左側に示される。
【図２６】図26A-Cは、機能アッセイのための12ウェルプレートテストにおいてrAAV2.REP1のプレニル化活性を示す3つのプロットである。50μL細胞溶解物は、前の結果と符合するデータをもたらした。実験は反応当り15μgタンパク質を使用した。(A) 標準化REP1（a.u. REP1/a.u.アクチン）をy軸に示し、log gc/細胞としてのMOI、rAAV2/2-REP1をx軸上に示す。白抜きの丸は、40μLバッファーで溶解した細胞のREP1を示し（R2 = 0.9845）、黒丸は50μLバッファーで溶解した細胞のREP1を示す（R2 = 0.999）。(B) 基質へのビオチン取り込み（a.u.）をy軸に示し、log gc/細胞としてMOI、rAAV2/2-REP1をx軸上に示す。白抜きの丸は、40μLバッファーで溶解した細胞のREP1を示し（R2 = 0.9997）、黒丸は50μLバッファーで溶解した細胞のREP1を示す（R2 = 0.9992）。(C) 非形質導入対照に対して補正された、基質へのビオチン取り込み（a.u.）をy軸に示し、標準化された過剰発現REP1（a.u. REP1/a.u.アクチン）をx軸に示す。×は40μLバッファーで溶解した細胞のRab6aを示し（R2 = 0.8805, Y= 16.2*X-4.066）、白抜きの丸は50μLバッファーで溶解した細胞のRab6aを示す（R2 = 0.9957, Y=16.99*X-2.011）。a.u. = 吸光度単位。
【図２７】図27は、PCRによって測定されたAAV力価を示すグラフである。X軸上は、1x1012 DNase耐性粒子(DRP)/mL、1x1011 DRP/mL、および平衡塩類溶液（BSS）中1x1011 DRP/mLの初期力価の試料である。Y軸に示すのは、試料をグラフの右側に記載のように処理した後に測定した力価である。
【図２８】図28は、高用量の1x1012 DRP/mLおよびMOI 10,000においてAAV2.REP1.ENG1014-Aベクターを用いた適合性研究におけるrAAV2.REP-1のプレニル化活性を示すウェスタンブロットの一連の3枚の写真である。上から下に向かって：hREP1 (83 KDa)、アクチン(42 KDa)、およびビオチン化Rab6a (24 KDa)を示す。タンパク質サイズは左側に、上から下に向かって、180、135、100、75、63、48、35、25、20、17、および11 KDaと示される。試料は、左から右に向かって、3連で、次のとおりである：非形質導入対照、ベースラインベクターによる形質導入細胞、4℃で6時間保持されたベクターによる形質導入細胞、4℃で6時間保持され180分後に注入されたベクターによる形質導入細胞、4℃で6時間およびシリンジ内で180分保持されたベクターによる形質導入細胞、ならびに陽性対照としての魚類REP1（単一試料）。
【図２９】図29は、低用量の1x1011 DRP/mLおよびMOI 10,000においてAAV2.REP1.ENG1014-Aベクターを用いた適合性研究におけるrAAV2.REP-1のプレニル化活性を示すウェスタンブロットの一連の3枚の写真である。上から下に向かって：hREP1 (83 KDa)、アクチン(42 KDa)、およびビオチン化Rab6a (24 KDa)を示す。タンパク質サイズは左側に、上から下に向かって、180、135、100、75、63、48、35、25、20、17、および11 KDaと示される。試料は、左から右に向かって、3連で、次のとおりである：非形質導入対照、ベースラインベクターによる形質導入細胞、4℃で6時間保持されたベクターによる形質導入細胞、4℃で6時間保持され180分後に注入されたベクターによる形質導入細胞、4℃で6時間およびシリンジ内で180分保持されたベクターによる形質導入細胞、ならびに陽性対照としての魚類REP1（単一試料）。
【図３０】図30A-Bは、AAV2.REP1.ENG1014-Aベクターを用いた適合性研究におけるrAAV2.REP-1のプレニル化活性に関するウェスタンブロットの半定量を示す1対のプロットである。(A)は、標準化REP1を示す。バンド密度値（a.u.）はy軸、高用量の1x1012 DRP/mLおよび低用量の1x1011 DRP/mLのAAV2-REP1はx軸とする。(B)は標準化されたビオチン化Rab6aを示す。バンド密度値（a.u.）はy軸、高用量の1x1012 DRP/mLおよび低用量の1x1011 DRP/mLのAAV2-REP1はx軸とする。(A)および(B)において、それぞれの用量の棒グラフは、左から右に向かって、非形質導入対照、ベースラインベクターによる形質導入細胞、4℃で6時間保持されたベクターによる形質導入細胞、4℃で6時間保持され20℃で180分後に注入されたベクターによる形質導入細胞、4℃で6時間および20℃でシリンジ内で180分保持されたベクターによる形質導入細胞を示す。
【００６０】
詳細な説明
コロイデレミアは、眼の脈絡膜、網膜色素上皮および視細胞の変性をもたらす希少疾患である。罹患した男性は、典型的には、10代で夜盲症、20代から30代の間に進行性の周辺視力低下、さらに40代で完全な失明を示す。女性キャリアは、生涯を通じて良好な視力を維持する可能性があるが、軽度の症状、中でも特に夜盲症を示すことがあり、時にはより重度の表現型を有することもある。
【００６１】
コロイデレミアは、Rabエスコートタンパク質1（REP1）をコードするCHM遺伝子の変異によって引き起こされる。REP1と75％相同であるRabエスコートタンパク質2（REP2）は、体のほとんどの細胞においてあらゆるREP1欠損を補う。しかしながら、REP2は、眼のREP1欠損を補うことができない。これが、標的Rab GTPaseの正常なプレニル化を維持するには不十分なRabエスコートタンパク質活性をもたらし、細胞の機能障害、そして最終的には細胞死を引き起こす。
【００６２】
コロイデレミアは、冒された眼の細胞にREP1導入遺伝子の機能的コピーを提供することによって首尾よく治療することができる（MacLaren, RE et al. (2014） Lancet 383：1 129-37）。具体的には、疾患を治療するために機能性REP1をコードするヌクレオチド配列を眼に送達するために、アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子治療ベクターを使用することができることが示されている。コロイデレミアの遺伝子治療が臨床上の現実となりつつあるので、特に、新たな遺伝子治療ベクターをテストするために、ならびに臨床的ベクターストックの品質管理検査として、外部から導入されたREP1の活性を測定するための、信頼性の高い高感度なアッセイが必要である。
【００６３】
REP1をアッセイするための既存の方法は、プレニル化基質としてRab27aを使用する（Tolmachova, T. et al. (2012) J. Gene Med. 14: 158-168; Tolmachova, T. et al. (2013) J. Mol. Med. 91: 825-837; Vasireddy, V. et al. (2013) PLoS ONE 8: e61396; および Black, A. et al. (2014) J. Gene Med. 16: 122-130）。これはおそらく、コロイデレミアの発症機序におけるRab27aの多大な関与の当然の結果としてそうなったのであろう。たとえば、他のRabが適切にプレニル化されている一方で、Rab27aはコロデレミア細胞においてプレニル化されない状態で存在することが示されている（Seabra, M.C. et al. (1995) J. Biol. Chem. 270: 24420-24427）。さらに、Rab27aは、コロイデレミアにおいて最も初期に変性する2つの部位、網膜色素上皮および脈絡膜毛細血管において高レベルで発現されている。
【００６４】
しかしながら、Rab27aのプレニル化に依存するアッセイは、非常に弱いシグナルを生じる。その結果、こうしたアッセイは感度が低く、臨床遺伝子治療ベクターの確実なスクリーニングには適さない可能性がある。したがって、REP1活性を測定し、遺伝子治療ベクターをテストするために使用することができる、より信頼性の高い高感度のアッセイがぜひとも必要である。
【００６５】
コロイデレミア（CHM）は、Rabエスコートタンパク質1（REP1）をコードするCHM遺伝子の変異に起因する、稀なx染色体連鎖劣性網膜ジストロフィーである。コロイデレミアは、網膜色素上皮（RPE）および視細胞の変性をもたらす。CHMはヒト細胞において普遍的に発現され、Rabエスコートタンパク質1（REP1）をコードする。REP1は、Ras様GTPaseスーパーファミリーの中の最新のファミリーである、Rab GTPaseのC末端転写後修飾に関与する。プレニル化として知られるこの修飾は、Rabゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（RGGTまたはGGT-II）によって触媒され、1つもしくは複数のC20（ゲラニルゲラニル）イソプレノイド鎖の「プレニル化モチーフ」内のシステイン残基との共有結合をもたらす。REP1は、プレニル化されていないRabをGGT-IIに提示すること、および/またはプレニル化されたRabを小胞輸送に関与する目的地である膜まで送り届けることによって、アシストする。
【００６６】
コロイデレミア様遺伝子（CHML）は、Rabエスコートタンパク質2（REP2）をコードする。REP2はそのアミノ酸配列の95%がREP1と共通であって、研究から、REP2が人体のほとんどの細胞においてREP1欠損を補うことができることが明らかになっている。しかしながら、REP2は、眼のREP1欠損を完全には補うことができない。コロイデレミア患者では、眼におけるRab GTPaseのプレニル化が損なわれ、それに起因して細胞の機能障害、そして最終的には細胞死が生じる。
【００６７】
REP1は、生体外(in vitro)で再現可能な反応であるRab GTPaseのプレニル化を通じて細胞内輸送において役割を担う。アデノ随伴ウイルス（AAV）遺伝子置換療法は、コロイデレミアのための治療である。コロイデレミアは、冒された眼の細胞にCHM遺伝子の機能的コピーを提供することによって治療することができる。具体的には、CHMをコードする組換えアデノ随伴ウイルス（rAAV）ベクターを網膜下に投与することができる。したがって、コロイデレミア治療用のベクターの生物学的活性を評価するためのアッセイが必要である。たとえば、rAAV2/2-REP1の生物学的活性を測定するための、信頼性のある高感度なin vitroアッセイが必要である。プレニル化反応は、REP1生物活性を検査するためにin vitroで再現することができる。ウイルス形質導入後のプレニル化アッセイのための1つの基質はRab27aである。Rab27aタンパク質は、1995年にCHMリンパ芽球の細胞質画分において最初に同定された。in vitroのプレニル化アッセイのためのもう1つの基質は、もう1つのRabタンパク質であるRab6aである。プレニル化反応でのビオチン化脂質供与体の取り込みに対する、これら2つのRabタンパク質、Rab27aおよびRab6aの反応をin vitroでアッセイすることが可能であり、それを用いて、コロイデレミア用AAVベクターの生物学的活性を評価するためのロバストで高感度なアッセイを確立することができる。
【００６８】
本発明のさまざまな好ましい特徴（特定事項）および実施形態を、これより非限定的な実施例によって説明する。
【００６９】
本発明の実施は、特に明記しない限り、化学、生化学、分子生物学、微生物学および免疫学の従来技術を使用するが、それらは当業者の能力の範囲内である。このような技術は文献に説明されている。たとえば、Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F.M. et al. (1995 and periodic supplements) Current Protocols in Molecular Biology, Ch. 9, 13 and 16, John Wiley & Sons; Roe, B., Crabtree, J. and Kahn, A. (1996) DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; Polak, J.M. and McGee, J.O'D. (990) In Situ Hybridization: Principles and Practice, Oxford University Press; Gait, M.J. (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; and Lilley, D.M. and Dahlberg, J.E. (1992) Methods in Enzymology: DNA Structures Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA, Academic Pressを参照されたい。これらの一般的なテキストは、それぞれ参考として本明細書に組み入れられる。
【００７０】
プレニル化
小さなGTPaseをin vitroで検出する以前の方法は、放射性標識プレニルドナーを用いていた。放射性標識は、フルオロフォアまたはビオチン基のいずれかに置き換えることができる。REP1はすべての細胞および組織で遍在的に発現するため、どちらのアプローチにも培養細胞ライセート（溶解物）の使用を伴う。ビオチン含有イソプレノイド（ビオチン標識ゲラニルピロリン酸、B-GPP）のタンパク質取り込みは、蛍光ベースの方法に比べて感度が優れているため、プレニル化タンパク質の検出に使用することができる。
【００７１】
イソプレノイド部分の付加によるタンパク質の脂質付加（脂質化）は、哺乳動物プロテオームの最大2％に影響を及ぼす翻訳後修飾である。そのような脂質付加は、標的タンパク質と細胞膜との可逆的結合を可能にし、タンパク質-タンパク質相互作用を調節することもできる。
【００７２】
好ましくは、本明細書で言及される脂質付加はプレニル化であり、したがって、脂質供与体基質および脂質付加Rab6a生成物はそれぞれプレニル供与体基質およびプレニル化Rab6a生成物である。
【００７３】
プレニル化は特定の形の翻訳後修飾であって、そのゲラニルゲラニルまたはファルネシル部分は（またはいずれの類似体も）、チオエーテル結合を介してタンパク質の1つまたは2つのC末端システイン残基に結合する。
【００７４】
好ましくは、プレニル化は、ゲラニルゲラニル部分またはその類似体（たとえば、ビオチン-ゲラニル部分）を標的タンパク質（たとえば、Rab6a）に付加することである。
【００７５】
タンパク質に結合したゲラニルゲラニル部分（タンパク質は網掛けの円で模式的に示される）は、以下のとおりである。
【００７６】
【化１】
2021502820.tif 000003
【００７７】
タンパク質に結合したファルネシル部分（タンパク質は網掛けの円で模式的に示される）は、以下のとおりである。
【００７８】
【化２】
2021502820.tif 000004
【００７９】
「類似体（アナログ）」という用語は、脂質（たとえば、ゲラニルゲラニルまたはファルネシル）部分または脂質供与体基質に関係して本明細書で使用され、検出などの特定の目的に適した官能基を含むように修飾された化合物を指す。類似体は、修飾によって（本発明の活性アッセイの目的にむけて）実質的に妨げられない形で、プレニル化機構（すなわち、REP1およびRab GGTase）によって、基質のタンパク質に付加することができる。
【００８０】
したがって、上記部分の類似体には、特定の目的のために人工的に作製された部分（たとえば、アッセイでの検出に適した標識部分）が含まれる。具体的には、Nguyenら（Nguyen, U.T. et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5: 227-235）は、in vitroタンパク質プレニル化反応において検出可能な、以下のビオチン-ゲラニル部分を開発した（ビオチン-ゲラニル部分がタンパク質に結合していることが示されており、タンパク質は網掛けの円で模式的に示される）。
【００８１】
【化３】
2021502820.tif 000005
【００８２】
Rab6a
Rab6a（Ras関連タンパク質Rab-6A）は、哺乳類のRab GTPaseファミリーのメンバーであり、それ自体GTPaseのRas様スーパーファミリーの中で最大のものである。
【００８３】
Rab GTPase（Rabタンパク質としても知られている）は、末梢膜タンパク質であり、小胞形成、アクチンおよびチューブリンネットワークに沿った小胞の移動、ならびに膜融合を含む、膜輸送の調節に関与する。Rab6aの主な機能は、ゴルジ複合体から小胞体へのタンパク質輸送の調節であると理解される。
【００８４】
Rab GTPaseは、典型的には、2つのC末端システイン残基に共有結合したプレニル基（特に、ゲラニルゲラニル基）を介して細胞膜に固定される。
【００８５】
Rab GTPaseは、2つのコンフォメーション、すなわち不活性のGDP結合型；および活性のあるGTP結合型を示す。GDP-からGTP-結合型への変換は、GDP / GTP交換因子（GEF）によって触媒され、したがってこの因子はRab GTPaseを活性化する。逆に、Rab GTPaseによるGTP加水分解は、GTPase活性化タンパク質（GAP）によって強めることが可能であり、したがってGAPはRab不活性化をもたらす。
【００８６】
ある実施形態において、Rab6aはヒトRab6aである。
【００８７】
Rab6aのアミノ酸配列の一例は、NCBIアクセッション番号NP_942599.1の下に寄託された配列である（配列番号１）。
【００８８】
Rab6aのアミノ酸配列の一例は以下のとおりである。
2021502820.tif 000006
2021502820.tif 000007
【００８９】
Rab6aをコードするヌクレオチド配列の一例は、NCBIアクセッション番号NM_198896.1の下に寄託された配列である（配列番号１３）。
【００９０】
Rab6aをコードするヌクレオチド配列の一例は以下のとおりである。
2021502820.tif 000008
【００９１】
さらなるRab6aをコードする例示的ヌクレオチド配列は：
2021502820.tif 000009
2021502820.tif 000010
である。
【００９２】
Rab27aの例示的アミノ酸配列は：
2021502820.tif 000011
である。
【００９３】
Rabゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（Rab GGTase）
Rabゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（Rab GGTase；ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼIIとしても知られる）は、もっぱらRabファミリーのGTPaseをプレニル化するタンパク質プレニルトランスフェラーゼである。
【００９４】
Rab GGTaseは、通常、天然では、Rab GTPaseのC末端システイン残基への2つのゲラニルゲラニル基の転移を触媒する。それぞれのゲラニルゲラニル基は、システイン残基とのチオエーテル結合を介してRab GTPアーゼに結合する。
【００９５】
Rab GGTaseは、さまざまな誘導体化ホスホイソプレノイドを結合させる能力を有することが示されており、Rab GTPase基質（例えば、Rab6a）へのそれらの付加を触媒することができる。たとえば、Nguyen ら（Nguyen, U.T. et al. (2009) Nat. Chem. Biol. 5: 227-235）は、ビオチン-ゲラニル部分のRab GTPaseへの付加の成功を実証した。
【００９６】
Rab GGTaseは、αサブユニットおよびβサブユニットからなるヘテロ二量体酵素である。
【００９７】
ある実施形態において、Rab GGTaseはヒトRab GGTaseである。好ましい実施形態において、Rab GGTaseはラットRab GGTaseである。
【００９８】
Rab GGTaseαサブユニットのアミノ酸配列の例は、NCBIアクセッション番号NP_004572.3（配列番号１０）およびNP_113842.1の下に寄託された配列である（配列番号１１）。
【００９９】
Rab GGTアーゼαサブユニットのアミノ酸配列の例は下記のとおりである。
2021502820.tif 000012
及び
2021502820.tif 000013
2021502820.tif 000014
および
2021502820.tif 000015
【０１００】
Rab GGTaseβサブユニットのアミノ酸配列の例は、NCBIアクセッション番号NP_004573.2（配列番号４）およびNP_619715.1（配列番号１２）の下に寄託された配列である。
【０１０１】
Rab GGTaseβサブユニットのアミノ酸配列の例は以下のとおりである。
2021502820.tif 000016
及び
2021502820.tif 000017
及び
2021502820.tif 000018
【０１０２】
脂質供与体基質
Rab GTPaseに脂質部分を付加するために、Rab GGTaseは、基質として、脂質（たとえば、ゲラニゲラニルまたはビオチン-ゲラニル）供与体基質の形の脂質部分を使用することができる。これらは、典型的には脂質部分のピロリン酸誘導体である。
【０１０３】
たとえば、ゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）またはビオチン-ゲラニルピロリン酸（BGPP）は、ゲラニゲラニルまたはビオチン-ゲラニル部分を基質であるRab GTPアーゼにそれぞれ転移させるRab GGTaseによる、脂質供与体基質として使用することができる。
【０１０４】
ゲラニルゲラニルピロリン酸は、次の構造を有する：
【化４】
2021502820.tif 000019
ビオチン-ゲラニルピロリン酸は、次の構造を有する：
【化５】
2021502820.tif 000020
【０１０５】
Rabエスコートタンパク質１（REP1）
Rabエスコートタンパク質（REP）は、プレニル化されていないRab GTPaseをRab GGTaseに提示し、プレニル化Rab GTPaseを標的の膜に運ぶ機能を果たす。
【０１０６】
Rab GTPaseは、Rab GGTasesによって認識されるべきプレニル化部位にコンセンサス配列を含まない。しかしながら、基質の認識はREP1を介して行われ、REP1は、保存領域を介してRab GTPアーゼに結合した後、プレニル化のための基質をRab GGTaseに提示する。
【０１０７】
プレニル化されると、脂質アンカーはRab GTPアーゼを不溶性にする。したがって、REPがゲラニゲラニル基に結合して可溶化し、標的細胞膜へのRab GTPアーゼの送達を助けることが必要である。
【０１０８】
REP1は、Rabタンパク質ゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ成分Aとしても知られている。さらに、REP1をコードする遺伝子は、CHM遺伝子としても知られている。
【０１０９】
ある実施形態において、REP1はヒトREP1である。
【０１１０】
REP1のアミノ酸配列の一例は以下のとおりである：
2021502820.tif 000021
【０１１１】
REP1のアミノ酸配列の一例は以下のとおりである：
2021502820.tif 000022
2021502820.tif 000023
【０１１２】
REP1をコードするヌクレオチド配列の一例は以下のとおりである：
2021502820.tif 000024
2021502820.tif 000025
【０１１３】
REP1をコードするヌクレオチド配列の他の例は以下のとおりである：
2021502820.tif 000026
2021502820.tif 000027
【０１１４】
REP1をコードするヌクレオチド配列の他の例は以下のとおりである：
2021502820.tif 000028
2021502820.tif 000029
【０１１５】
REP1をコードするヌクレオチド配列の他の例は以下のとおりである：
2021502820.tif 000030
2021502820.tif 000031
【０１１６】
REP1の変異体の例はさらに、国際公開第2012/114090号に記載されている（参考として本明細書に組み入れられる）。
【０１１７】
活性測定（活性決定）
ある態様において、本発明は、Rabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定するための方法を提供するが、その方法は以下のステップを含む：（a）REP1を含有する試料を用意するステップ；（b）ステップ（a）の試料をRab6a、Rabゲラニルゲラニルトランスフェラーゼ（RabGGTase）および脂質供与体基質と接触させるステップ；ならびに（c）脂質付加されたRab6a生成物を検出するステップ。
【０１１８】
別の態様において、本発明は、Rabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定するためのRab6aの使用を提供する。
【０１１９】
少量の試薬が存在する場合（たとえば、遺伝子治療試薬の場合のように）特に重要である、低レベルの標的の検出を可能にするため、アッセイ感度は考慮すべき重要な要素である。しかしながら、アッセイシグナルのダイナミックレンジを最大にすることも重要であって、これは、たとえば、低感度または高感度をもたらす試薬と相関しない可能性がある。
【０１２０】
本発明の方法および使用は、Rab GTPaseのプレニル化に関与する他の試薬、たとえばRab GGTaseまたは脂質供与体基質の活性、またはプレニル化基質としてのRab GTPaseの活性をテストするのではなく、REP1の活性をテストするためのものである。たとえば、本発明の方法は、標的細胞へのREP1の送達、またはベクターストック（例えば、医薬品ストック）の品質管理分析に適した遺伝子治療ベクターをテストするためのものであってもよい。
【０１２１】
ある実施形態において、REP1を含有する試料は、REP1を発現するように遺伝子操作された細胞由来である。好ましくは、REP1を発現するように遺伝子操作された細胞を提供するために、REP1をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターで細胞をトランスフェクションするか、または細胞に形質導入する。好ましくは、ベクターはウイルスベクターである。
【０１２２】
ある実施形態において、REP1は、REP1をコードするヌクレオチド配列を含有するウイルスベクターを用いて発現される。
【０１２３】
REP1を発現するように遺伝子操作された細胞（そのような細胞の集団であってもよい）は、REP1の遺伝子操作および発現に適した任意の細胞、たとえば、細胞株由来の細胞（たとえば、HEK293）とすることができる。細胞は、たとえば、ヒト細胞またはマウス細胞とすることができる。好ましくは、細胞はヒト細胞である。細胞は、たとえば、網膜色素上皮または視細胞のような網膜細胞であってもよい。ある実施形態において、細胞はHEK293細胞である。別の実施形態において、細胞はARPE-19細胞である。もう1つの実施形態では、細胞はHT1080細胞である。
【０１２４】
Rab6aおよび/またはRab GGTaseは、好ましくは、繰り返し行われる実験においてそれらのもたらす変化が最小限となるか、またはなくなるように、標準的な供給源から得られる。好ましくは、Rab6aおよび/またはRabGGTaseは、実質的に純粋である（すなわち、本発明の方法または使用を妨害するタンパク質夾雑物を実質的に含まない）。
【０１２５】
したがって、本方法または使用は、REP1を含有する試料に関するパラメータが変化する複数の実験（たとえば、ステップ（a）〜（c）を含む）の実行を含むことができるが、他のパラメータ（たとえば、Rab6a、Rab GGTaseおよび脂質ドナー基質）は一定に保たれる。そのようなパラメーターには、たとえば、関連タンパク質（たとえば、REP1）のアミノ酸配列、細胞内でREP1を発現するために使用されるベクターに含まれるREP1コードヌクレオチド配列、REP1をコードするヌクレオチド配列を細胞に送達するために使用されるベクター型（たとえば、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター型などのウイルスベクター型）、REP1の濃度、および/またはREP1をコードするヌクレオチド配列を細胞に送達するために使用されるベクターの感染多重度（MOI）などを含めることができる。
【０１２６】
「活性」という用語は、本明細書において、Rab GTPase（たとえば、Rab6a）の脂質付加を促進するREP1の能力を表すために使用される。REP1は脂質付加自体を触媒しないが、Rab GGTaseがその基質であるRab GTPaseの脂質付加を触媒するために必要である。したがって、REP1の活性は、一定の条件下で脂質付加されたRab GTPase（すなわち、Rab6a）の量を測定することによって測定することができる。
【０１２７】
「効力（有効性）」という用語は、本明細書において、REP1をコードするヌクレオチド配列を含有するベクターの効力に関して使用され、ベクターによってトランスフェクションまたは形質導入される細胞にREP1活性を提供するベクターの能力を指す。
【０１２８】
本明細書で使用する「脂質付加Rab6a生成物」という用語は、脂質部分が付加されたRab6aを指す。好ましくは、脂質付加Rab6a生成物は、ゲラニルゲラニル化Rab6aまたはビオチン-ゲラニル化Rab6aなどのプレニル化Rab6aである。
【０１２９】
好ましくは、脂質付加Rab6a生成物を検出するステップは、脂質付加Rab6a生成物の量の数量化をもたらす。
【０１３０】
脂質付加Rab6aの検出は、任意の適当な方法、たとえば、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ウエスタンブロット、オートラジオグラフィー（たとえば、トリチウム化脂質供与体基質の同位体標識を利用する）、クロマトグラフィー（たとえば、HPLCまたはFPLC）および/または質量分析法に基づく方法（たとえば、LC / MS）によって測定することができる。
【０１３１】
ある実施形態において、脂質付加Rab6a生成物は、ウェスタンブロットを用いて検出される。好ましい実施形態では、脂質付加されたRab6a生成物はELISAを用いて検出される。
【０１３２】
例として、プレニル化反応は、ビオチン-ゲラニルピロリン酸脂質供与体基質を用いて、本発明の方法に従って実施することができる。反応生成物は、たとえばストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートと直接インキュベートすることによって脂質付加Rab6a生成物（すなわち、ビオチン-ゲラニル化Rab6a）を検出することができる、ウエスタンブロット分析に供することができる。脂質付加されたRab6a（すなわち、ビオチン-ゲラニル化Rab6a）の定量は、得られたウエスタンブロットの濃度測定分析によって達成することが可能であり、これは適当な手段によって（たとえば、Image Studio Liteソフトウェア（LI-COR）を使用して）実施することができる。
【０１３３】
さらに他の例として、プレニル化反応は、ビオチン-ゲラニルピロリン酸脂質供与体基質を用いて、本発明の方法に従って実施することができる。この反応の生成物をELISA分析に供することができるが、このELISA分析ではRab6aを直接プレート上に固定化するか、またはプレートに付着した抗体を使用して（すなわち、サンドイッチELISA）固定化することができる；そして次に、脂質付加されたRab6a生成物（すなわち、ビオチン-ゲラニル化Rab6a）を、たとえば、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートとインキュベートすることによって検出することができる。脂質付加されたRab6a（すなわち、ビオチン-ゲラニル化Rab6a）の定量は、任意の適当な手段（たとえば、分光光度計、蛍光光度計または照度計を用いた検出）によって達成することができる。
【０１３４】
必要に応じて（たとえば対照のために）、反応に存在するREP1の量の検出、またはβアクチンの量の検出（たとえば、ローディング対照として）のような、追加の検出ステップを本発明の方法に組み入れることができる。
【０１３５】
ある実施形態において、本方法は、脂質付加されたRab6a生成物（たとえば、ゲラニルゲラニル化またはビオチン-ゲラニル化などのプレニル化Rab6a）の量を、既知の、または標準のREP1サンプルを用いた実験といった、対照実験から測定される量と比較する追加ステップを含む。
【０１３６】
別の実施形態において、本方法は、脂質付加Rab6a生成物（たとえば、ゲラニルゲラニル化またはビオチン-ゲラニル化などのプレニル化Rab6a）の量を参照レベルと比較する追加ステップを含む。
【０１３７】
このような対照実験または参照レベルとの比較は、既知の標準、または標準であると認められているものに対するREP1活性の評価基準を与えることができる（たとえば、既知標準、または標準であると認められているものよりも優れているかまたは悪い）。
【０１３８】
本発明の方法は、たとえば、コロイデレミアの治療のための遺伝子治療ベクター、好ましくはREP1コードヌクレオチド配列を含有するAAVベクター粒子、の品質管理分析に使用することができ、本発明の方法によって測定されたこのベクターのアウトプット活性または効力が閾値活性を上回るかまたは一定の標的範囲内にあること（たとえば、対照実験または参照レベルとの比較による）は、ベクターが遺伝子治療の目的に適していることを示す。
【０１３９】
プレニル化反応の条件（たとえば、本発明の方法のステップ（b）で生じる条件）は、それらがRab6aのプレニル化を実質的に妨害しない限り、特に限定されない。
【０１４０】
REP1を含有する試料は、任意の適当な形で調製することができるが、たとえば、試料は、約50mM HEPES、50mM NaCl、2mM MgCl2、1mM DTTおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）を含有する約pH 7.5のプレニル化バッファー中で調製することができる。
【０１４１】
REP1を含有する試料は、たとえば、総タンパク質として約1〜100、1〜75、1〜50、1〜40、1〜30、1〜20または1〜10μgを含有することができる。REP1を含有する試料は、たとえば、総タンパク質として約10〜100、10〜75、10〜50、10〜40、10〜30または10〜20μgを含有することができる。好ましくは、REP1を含有する試料は、総タンパク質として約10〜30g、たとえば約10、15、20、25または30μgの総タンパク質を含有する。
【０１４２】
Rab6aは、たとえば、約0.1〜25、0.1〜20、0.1〜15、0.1〜10または0.1〜5μM、好ましくは約0.1〜5μMの濃度とすることができる。Rab6aは、約0.1〜1μMの低濃度とすることができる。Rab6aは、例えば約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25μM、好ましくは約4μMの濃度とすることができる。特定の実施形態において、Rab6aは、例えば約0.16μM、0.8μM又は4μMの濃度とすることができる。
【０１４３】
Rab GGTaseは、たとえば、約0.1〜25、0.1〜20、0.1〜15、0.1〜10、0.1〜5または0.1〜2.5μM、好ましくは、約0.1〜2.5μMの濃度とすることができる。Rab GGTaseは、たとえば、約0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25μM、好ましくは約2μMの濃度とすることができる。特定の実施形態において、Rab GGTaseは、例えば約0.5μM、1μM又は2μMの濃度とすることができる。
【０１４４】
脂質供与体基質（たとえば、ビオチン-ゲラニルピロリン酸（BGPP））は、たとえば、約1〜25、1〜20、1〜15、1〜10または1〜5μM、好ましくは約1〜5μMの濃度とすることができる。脂質供与体基質（たとえば、ビオチン-ゲラニルピロリン酸（BGPP））は、例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24または25μM、好ましくは約4μMの濃度とすることができる。
【０１４５】
プレニル化反応は、任意の適当なバッファー中で行うことができるが、たとえば、反応は、約50mM HEPES、50mM NaCl、2mM MgCl2、1mM DTTおよびプロテアーゼインヒビターカクテル（Roche）を含有する約pH7.5のプレニル化バッファー中で行うことができる。
【０１４６】
プレニル化反応は、任意の適当な温度（たとえば、約37℃）で任意の適当な時間にわたって実施することができる。たとえば、プレニル化反応は、約1〜10、1〜7.5、1〜5、1〜2.5または1〜2時間、好ましくは約1〜2時間行うことができる。プレニル化反応は、たとえば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9または10時間、好ましくは約2時間行うことができる。
【０１４７】
コロイデレミア
コロイデレミアは、眼の脈絡膜、網膜色素上皮および視細胞の、まれなX連鎖性進行性変性である。罹患した男性の典型的な自然経過は、10代で夜盲症を発症し、続いて20代および30代で末梢視力を進行性に喪失し、40代で全盲に至る。女性キャリアは、軽度の症状、中でも特に夜盲症を有するが、時に、より重度の表現型を有することがある。
【０１４８】
コロイデレミアは、X染色体21q領域に位置するCHM遺伝子の変異によって引き起こされる。REP1と75％相同であるRabエスコートタンパク質2（REP2）は、体のほとんどの細胞においてREP1欠損を補う。しかしながら、いまだ明確でない理由により、REP2は、眼のREP1欠損を補うことができない。これは、標的Rab GTPaseの正常なプレニル化を維持するには不十分なRabエスコートタンパク質活性をもたらし、細胞機能不全および最終的には細胞死を引き起こし、主に外網膜および脈絡膜に影響を及ぼす。
【０１４９】
コロイデレミアは、眼の冒された細胞にREP1導入遺伝子の機能的なコピーを提供することによって、治療を成功させることができる（MacLaren、REら（2014）Lancet 383：1 129-37）。
【０１５０】
ベクター
ベクターとは、ある環境から別の環境へと、ある実体の移動を可能にするかまたは容易にするツールである。本発明によると、そして一例として、組換え核酸技術において使用されるいくつかのベクターは、核酸のセグメント（たとえば、異種cDNAセグメントなどの異種DNAセグメント）などの実体を、標的細胞に移すことを可能にする。このベクターは、細胞内の異種核酸（たとえば、DNAまたはRNA）を維持する目的、核酸セグメントを含有するベクターの複製を容易にする目的、または核酸セグメントによってコードされるタンパク質の発現を促進する目的を果たすことができる。
【０１５１】
ベクターは非ウイルス性またはウイルス性とすることができる。組換え核酸技術において使用されるベクターの例としては、プラスミド、染色体、人工染色体およびウイルスが挙げられるが、これらに限定されない。ベクターは、たとえば、ネイキッド核酸（たとえば、DNAまたはRNA）であってもよい。最も単純な形態では、ベクター自体が目的のヌクレオチドであってもよい。
【０１５２】
本発明で使用されるベクターは、たとえばプラスミドまたはウイルスベクターとすることができ、ポリヌクレオチドの発現のためのプロモーター、および、場合によってはプロモーターの調節因子を含んでいてもよい。
【０１５３】
ウイルスベクター
好ましい実施形態において、本発明のベクターはウイルスベクターである。好ましくは、ウイルスベクターは、ウイルスベクター粒子の形をとる。
【０１５４】
ウイルスベクターは、たとえばアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターとすることができる。好ましくは、ウイルスベクターはAAVベクターである。
【０１５５】
「遺伝子治療ベクター」という用語は、本明細書では、遺伝子治療における使用に適したベクターを指し、例えば、ウイルス（例えば、AAV）ベクターおよびベクター粒子を含む。
【０１５６】
ある実施形態において、本明細書のウイルスベクターおよびベクター粒子は、遺伝子治療に使用することができる。重要なことは、本明細書のウイルスベクターおよびベクター粒子が、保管、およびAVV遺伝子治療用の注入デバイスの通過後に、生体適合性および安定性を維持していることである。ある実施形態において、本明細書のウイルスベクターおよびベクター粒子は、TMN 200バッファー中に希釈され、生体適合性および安定性を維持することができる。TMN 200バッファーは、20 mM Tris (pH 8.0に調整)、1 mM MgCl2および200 mM NaClを含有する。
【０１５７】
物理的なウイルスゲノム力価の測定は、ベクターの特性評価の一部であって、遺伝子治療期間を通じてウイルスベクターおよびウイルス粒子の効力および安全性を確認するための一段階である。ある実施形態において、AAV力価を測定するための方法は、定量的PCR（qPCR）を含む。結果に影響しうるさまざまな変数があり、それは、標準物質として使用されるDNAの立体構造、または試料調製時の酵素消化などである。たとえば、力価を測定すべきウイルスベクターもしくは粒子の標品を、プラスミドを用いて作成された希釈検量線と対比することができる。ある実施形態において、検量線に用いられるプラスミドDNAは、スーパーコイル状の立体構造をとる。ある実施形態において、検量線に用いられるプラスミドDNAは線状の立体構造をとる。線状化プラスミドは、たとえばHindIII制限酵素による消化によって調製され、アガロースゲル電気泳動により可視化され、メーカーの説明書に従ってQIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を用いて精製することができる。検量線の作成に使用されるプラスミド内で切断する、他の制限酵素も適切である可能性がある。ある実施形態において、標準物質としてのスーパーコイル状プラスミドの使用は、AAVベクターの力価を、線状プラスミドの使用と比べて有意に増加させた。
【０１５８】
AAVゲノム力価の定量のため、精製AAVベクターからDNAを抽出するために、2つの酵素的方法を使用することができる。ある実施形態において、AAVベクターはDNase Iにより単独で消化することができる。ある実施形態において、AAVベクターは、DNase I、および追加のプロテイナーゼK処理により二重に消化することができる。その後、CFX Connect Real-Time PCR Detection System (BioRad)により、導入遺伝子配列に特異的なプライマーおよびTaqmanプローブを用いてqPCRを行うことができる。
【０１５９】
バリアント、誘導体、類似体、相同体および断片
本明細書で言及される特定のタンパク質およびヌクレオチドに加えて、本発明はまた、そのバリアント、誘導体、類似体、相同体および断片の使用も包含する。
【０１６０】
本発明の文脈において、任意の所与の配列のバリアントは、(アミノ酸残基であれ核酸残基であれ)残基の特定の配列が、当該ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの機能を実質的に保持するように改変された配列である。バリアント配列は、天然に存在するタンパク質中に存在する少なくとも1つの残基の付加、欠失、置換（substitution）、修飾、置き換え（replacement）および/またはバリエーションによって得ることができる。
【０１６１】
本発明のタンパク質またはポリペプチドに関連して本明細書で使用される「誘導体」という用語は、得られたタンパク質またはポリペプチドがその内在性機能の少なくとも1つを実質的に保持することを条件として、配列からの、もしくは配列への、1つ（または複数）のアミノ酸残基の、任意の置換（substitution）、バリエーション、修飾、置き換え（replacement）、欠失、および/または付加を含む。
【０１６２】
本明細書で使用される「類似体（アナログ）」という用語は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドに関連して、任意のミメティック、すなわち、それが模倣するポリペプチドまたはポリヌクレオチドの内在性機能の少なくとも1つを有する化合物を含む。
【０１６３】
典型的には、アミノ酸置換は、改変された配列が必要な活性または能力を実質的に保持する限り、たとえば1、2もしくは3個から10もしくは20個の置換まで行うことができる。アミノ酸置換には、天然に存在しないアナログの使用を含めることができる。
【０１６４】
本発明で使用されるタンパク質はまた、サイレントな変化を生じて、結果として機能的に同等なタンパク質をもたらす、アミノ酸残基の欠失、挿入または置換を有することができる。内在性機能が保持されている限り、アミノ酸残基の極性、電荷、溶解性、疎水性、親水性および/または両親媒性の類似性に基づいて、意図的なアミノ酸置換を行うことができる。たとえば、負の電荷を持つアミノ酸には、アスパラギン酸およびグルタミン酸がある；正の電荷を持つアミノ酸にはリジンおよびアルギニンがある；ならびに、同様の親水性値を有する無荷電極性頭部基を有するアミノ酸としては、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニンおよびチロシンが挙げられる。
【０１６５】
保存的置換は、たとえば、下記の表に従って行うことができる。第2列の同一ブロック内のアミノ酸、好ましくは第3列の同一行のアミノ酸を、相互に置換することができる：
【０１６６】
【表１】
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【０１６７】
本明細書で使用される「相同体（ホモログ）」という用語は、野生型アミノ酸配列および野生型ヌクレオチド配列と一定の相同性を有するもの（エンティティ)を意味する。「相同性」という用語は、「同一性」と同じとみなすことができる。
【０１６８】
相同性配列は、対象の配列に対して、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%または90%同一、好ましくは少なくとも95%または97%または99%同一であるとされるアミノ酸配列を含むことができる。典型的には、相同体は、対象のアミノ酸配列と同一の活性部位等を含む。相同性は類似性（すなわち、類似した化学的性質/機能を有するアミノ酸残基)の観点から考えることもできるが、本発明の文脈においては、相同性を配列同一性の観点から表現することが好ましい。
【０１６９】
相同性配列は、対象の配列に対して、少なくとも50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%または90%同一、好ましくは少なくとも95%または97%または99%同一であるとされるヌクレオチド配列を含むことができる。相同性は類似性の観点から考えることもできるが、本発明の文脈においては、相同性を配列同一性の観点から表現することが好ましい。
【０１７０】
好ましくは、本明細書において詳細に記載されている配列番号のいずれかに対して、あるパーセント同一性を有する配列への言及は、言及された配列番号の全長にわたって、記載されたパーセント同一性を有する配列を指す。
【０１７１】
相同性比較は、目で見て行うことができるが、より一般的には、容易に入手できる配列比較プログラムを用いて行うことができる。
【０１７２】
パーセント相同性は、一続きの連続した配列にわたって計算することができるが、すなわち、一方の配列を他の配列とアラインし、一方の配列中の各アミノ酸配列を一度に一残基ずつ、他の配列中の対応するアミノ酸と直接比較する。これは「ギャップなし」（”ungapped”）アライメントと呼ばれる。典型的には、このようなギャップなしのアラインメントは、比較的少数の残基にわたってのみ実行される。
【０１７３】
これは非常に単純で一貫性のある方法であるが、これは、たとえば、それ以外は同一である配列ペアにおいて、ヌクレオチド配列における1つの挿入もしくは欠失が、それ以降のコドンをアラインメントから外れさせ、結果的に、グローバルアラインメントを行ったとき、パーセント相同性の大幅な低下をもたらす可能性があるということを、考慮に入れることができない。こうした理由により、ほとんどの配列比較方法は、考えられる挿入および欠失を、全体としての相同性スコアに過度にペナルティを与えずに考慮に入れる最適なアラインメントを生成するようにデザインされている。これは、ローカルな相同性を最大化するように、配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。
【０１７４】
しかしながら、こうしたより複雑な方法は、同数の同一アミノ酸について、できる限り少数のギャップを有する配列アラインメントが、2つの比較配列間でのより高い関係性を反映して、多数のギャップを有する配列より高いスコアを得るように、アラインメント時に生じる各ギャップに「ギャップペナルティ」を割り当てる。典型的には「アフィンギャップコスト」が使用されるが、これは、ギャップの存在に対して比較的高いコストを課し、ギャップにおいてそれぞれ後に続く残基にはより少ないペナルティを課すものである。これはもっとも一般的に使用されるギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティは、当然のことながら、よりギャップの少ない最適化されたアライメントを生成することになる。ほとんどのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティの修正を可能にする。しかしならが、このような配列比較用ソフトウェアを使用する場合、デフォルト値を使用することが好ましい。たとえば、GCG Wisconsin Bestfitパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトギャップペナルティは、ギャップについて-12であり、各伸長については-4である。
【０１７５】
したがって、最大パーセント相同性の計算は、最初に、ギャップペナルティを考慮して最適なアライメントを生成する必要がある。このようなアライメントを実行するために適当なコンピュータプログラムは、GCG Wisconsin Bestfitパッケージ（university of wisconsin, U.S.A.; Devereux et al.(1984) Nucleic Acids Res. 12; 387）である。配列比較を行うことができる他のソフトウェアの例には、BLASTパッケージ（Ausubel et al. (1999) ibid - Ch. 18を参照されたい）、FASTA（Atschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 403-410）および比較ツールのGENEWORKSパッケージが含まれるが、これらに限定されない。BLASTおよびFASTAはいずれもオフライン検索およびオンライン検索で利用することができる（Ausubel et al. (1999) ibid, pages 7-58 to 7-60を参照されたい）。しかしながら、用途によっては、GCG Bestfitプログラムの使用が好ましい。BLAST 2 Sequencesと呼ばれるもう1つのツールも、タンパク質およびヌクレオチド配列を比較するために利用することができる（FEMS Microbiol. Lett. (1999) 174: 247-50; およびFEMS Microbiol. Lett. (1999) 177: 187-8）。
【０１７６】
同一性に関して、最終的なパーセント相同性を決定することができるが、アラインメントプロセスはそれ自体、典型的には、オール・オア・ナッシングのペア比較に基づくものではない。そうではなくて、化学的類似性または進化的距離に基づいて、それぞれのペア比較にスコアを割り当てる、調整された類似性スコア行列が一般に使用される。通常使用されるこのような行列の例は、BLASTパッケージプログラム用のデフォルト行列であるBLOSUM62行列である。GCG Wisconsinプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値、または指定があればカスタム記号比較表のいずれかを使用する(より詳細にはユーザマニュアルを参照されたい)。用途によっては、GCGパッケージのパブリックデフォルト値を使用することが好ましいが、他のソフトウェアの場合には、BLOSUM62のようなデフォルト行列を使用することが好ましい。
【０１７７】
ソフトウェアが最適なアラインメントを作成したら、パーセント相同性、好ましくはパーセント配列同一性を算出することが可能となる。ソフトウェアは、典型的には、配列比較の一環としてこれを行い、数値結果をもたらす。
【０１７８】
本発明の全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの、「断片」は、バリアントでもあって、この用語は典型的には、機能として、またはたとえばアッセイにおいて、目的とする、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの選択された領域を指す。したがって、「断片」は、全長ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの一部であるアミノ酸または核酸配列をいう。
【０１７９】
このようなバリアントは、部位特異的変異誘発などの標準的な組換えDNA技術を用いて調製することができる。挿入が行われることになる場合、挿入部位の両側に天然に存在する配列に相当する5'および3'隣接領域とともに挿入部をコードする合成DNAを作製することができる。隣接領域は、配列を1つもしくは複数の適切な酵素で切断して、合成DNAを切断部にライゲートすることができるように、天然に存在する配列中の部位に対応する利用しやすい制限酵素部位を含有する。次いで、本発明に従ってDNAを発現させて、コードされたタンパク質を作製する。これらの方法は、DNA配列の操作のための、当技術分野で公知の多数の標準的な技術を例示するに過ぎず、他の公知の技術も使用することができる。
【０１８０】
コドン最適化
本発明で使用されるポリヌクレオチドは、コドン最適化することができる。コドン最適化は、すでにWO1999/41397およびWO2001/79518に記載されている。異なる細胞では、特定のコドンの使い方に相違がある。このコドンの偏りは、細胞型における特定のtRNAの相対存在量の偏りに対応している。配列中のコドンを変化させて、対応するtRNAの相対存在量と一致するようコドンを調整することによって、発現を増加させることができる。同様に、対応するtRNAが特定の細胞型において稀であることが知られているコドンを意図的に選択することによって、発現を減少させることが可能である。このようにして、追加的な翻訳制御を利用することができる。
【０１８１】
（実施例）
材料および方法（実施例１−２）
細胞形質導入およびハーベスト
培養したHEK293細胞を、一定範囲の感染多重度（MOI、ゲノム粒子/細胞）でrAAV2/2-REP1により処理した。rAAV2/2-GFPを対照ベクターとして並行して使用し、導入遺伝子発現が生じるかどうか蛍光をモニターした。
【０１８２】
形質導入されていない細胞、ならびに+AAV-GFP形質導入細胞および+AAV-REP1形質導入細胞の実験を並行して行った。
【０１８３】
以下のプロトコルを用いて形質導入後5日目に細胞溶解物を調製した：細胞をPBSで洗浄し、プレニル化バッファー、pH 7.5（50 mM HEPES、50 mM NaCl、2 mM MgCl2、1 mM DTTおよびプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)）とともに5分間、氷上でインキュベートした；次に細胞を、細胞スクレーパで掻き取って1.5 mlチューブに入れ、氷上で15分間インキュベートした；続いて、細胞を、1 mLシリンジに取り付けた26-Gシリンジ針の中に20回通して、細胞を破壊した。
【０１８４】
溶解した細胞を、4℃にて1500xgで5分間遠心分離した。次に、上清をセルロースプロピオネートチューブに移し、4℃にて100000xgで1時間遠心分離した。第2の遠心分離ステップから得られた上清を、in vitroプレニル化反応（下記）に使用した。
【０１８５】
総タンパク質定量
メーカーの説明書にしたがって、Bradford法を用いて全細胞タンパク質濃度を定量した（Quick Stat(商標名)Bradford 1x Dye Reagent, BioRad, #500-0205）。サンプルの値は標準曲線から外挿された。
【０１８６】
in vitroプレニル化反応
プレニル化バッファー中で、凍結細胞溶解物（10-30μg）、2μM Rab GGTase、4μM Rabタンパク質（Rab27aまたはRab6a）、ならびに、脂質供与体として5μMビオチン-ゲラニルピロリン酸（BGPP）を用いてプレニル化反応をセットアップした。すべての反応には、新鮮なGDP（グアノシン二リン酸、20μM）およびDTT（1 mM）を添加した。
【０１８７】
陽性対照試料のために、魚類REP1（量については個々の実験を参照されたい）を、未形質導入細胞から得られた溶解物を含有するプレニル化反応物に添加した。
【０１８８】
反応物を37℃にて2時間インキュベートし、次いで試料バッファー（Laemmliバッファー、2x濃縮物、Sigma #S3401）の添加により停止させた。このバッファーは、4% SDS、20%グリセロール、10% 2-メルカプトエタノール、0.004%ブロモフェノールブルーおよび0.125 M Tris-HCl、約pH 6.8、を含有する。
【０１８９】
ウェスタンブロット（WB）を行って、ヒトREP1、βアクチン（ローディング対照として）およびビオチン化Rabタンパク質（Rab27aまたはRab6a)を検出した。
【０１９０】
ヒトREP1を検出するために、Millipore製のマウスモノクローナル抗体を使用した（クローン2F1、#MABN52）。βアクチンの検出のために、Thermo Fisher Scientific製のマウスモノクローナル抗体を使用した（クローンAC-15、#AM4302）。両方とも検出の後に、二次抗体標識化ステップ（ロバ抗マウスHRP、Abcam、#ab98799)を行った。
【０１９１】
適切なRab基質へのビオチン化脂質供与体の取り込みは、ストレプトアビジン-HRP（Thermo Fisher Scientific、#43-4323）とともに直接インキュベートすることによって検出された。
【０１９２】
すべての膜は、ECL基質およびOdyssey FC検出システム（Ll-COR）を用いて検出された。バンドの強度は、Image Studio Liteソフトウェア（LI-COR）を用いて定量的に分析された。
【０１９３】
実施例１−プレニル化基質としてのRab27a
基質としてRab27aを使用するプレニル化アッセイの感度をテストするために、次の細胞を用いて並行して実験を行った：(a) 形質導入されていない細胞；(b) AAV-GFPによりMOI 10000で形質導入された細胞；および(c) AAV-REP1によりMOI 10000で形質導入された細胞。
【０１９４】
プレニル化反応は、総容量12.5μL中に10μgの溶解物を用いてセットアップされた。陽性対照は、2μMの魚類REP1を添加した。
【０１９５】
この結果は、Rab27aが、AAV-REP1による細胞の形質導入後にREP1機能を評価するためのプレニル化アッセイのための基質となることを示す（図1）。しかしながら、WB半定量から得られるシグナルはあまり強くない。
【０１９６】
WBバンドの強度を増加させるために、全細胞タンパク質の量を増やして、この実験を繰り返した。
【０１９７】
プレニル化反応は、総容量22μL中に溶解物30μgを用いてセットアップされた。陽性対照は、1μMの魚類REP1を添加した。
【０１９８】
この結果は、Rab27aが、AAV-REP1による細胞の形質導入後にREP1機能を評価するためのプレニル化アッセイのための基質として機能することを確認する（図2）。さらに、WBシグナルの強度は、10μgの溶解物を用いて得られたデータと比較して増加した。しかしながら、シグナルは依然としてあまり強くない。理想的には、細胞がAAV-REP1で形質導入されたときに、プレニル化Rabタンパク質のより大きな増加が観察されるはずである。
【０１９９】
実施例２−プレニル化基質としてのRab6a
基質としてRab6aを使用するプレニル化アッセイの感度をテストするために、次の細胞を用いて並行して実験を行った（実施例１で使用したのと同じ細胞溶解物）：
(a) 形質導入されていない細胞；(b) AAV-GFPによりMOI 10000で形質導入された細胞；および(c) AAV-REP1によりMOI 10000で形質導入された細胞。プレニル化反応は、総容量20μL中に20μgの溶解物を用いてセットアップされた。陽性対照は、1μMの魚類REP1を添加した。
【０２００】
この結果は、Rab6aが、AAV-REP1による細胞の形質導入後にREP1機能を評価するためのプレニル化アッセイのための有効な基質であることを示す（図3）。
【０２０１】
WBシグナル強度は、図2に示すデータと比較して、より少ない総タンパク質を使用したにもかかわらず、AAV-REP1形質導入細胞について約10倍増加した。さらに、陽性対照のバンド強度は、図2に示すデータと比較して約100倍強く、Rab6a系アッセイの感度の増加が確認される。
【０２０２】
データはまた、感度の増加が、内在性レベルの差異の検出も可能にすることを示しており、それはアッセイをさらに正確なものにする。
【０２０３】
プレニル化基質としてRab6aを使用することでもたらされるアッセイ感度の増加を実証することに成功した後、本発明者らは、Rab6aプレニル化がAAV-REP1の量と相関しているかどうかというAAV-REP1の検討について、さまざまなMOIを用いて、アッセイを繰り返した。
【０２０４】
以下の細胞を用いて並行して実験を行った：(a) 形質導入されていない細胞；(b) MOI 250でAAV-REP1により形質導入された細胞；(c) MOI 1000でAAV-REP1により形質導入された細胞；(d) MOI 5000でAAV-REP1により形質導入された細胞；(e) MOI 10000でAAV-REP1により形質導入された細胞；および(f) MOI 20000でAAV-REP1により形質導入された細胞。
【０２０５】
プレニル化反応は、総容量15μL中に20μgの溶解物を用いてセットアップされた。陽性対照は、0.5μMの魚類REP1を添加した。
【０２０６】
この結果は、Rab6aが、AAV-REP1による細胞の形質導入後にREP1機能を評価するためのプレニル化アッセイのための有効な基質であることを確認し（図4）、さらに、Rab6a内のビオチン化脂質供与体の取り込みが、細胞形質導入に使用されるAAV-REP1の量と相関することを実証する。
【０２０７】
有効なアッセイ基質としてのRab6aの検証に続いて、本発明者らは、本発明者らの第I相臨床試験において現在使用されているAAV-REP1ベクターをテストした（MacLaren, R.E. et al. (2014) Lancet 383: 1129-37）。
【０２０８】
以下の細胞を用いて並行して実験を行った
(a) 形質導入されていない細胞（#29、#30および#31）；
(b) MOI 10,000でAAV-REP1により形質導入された細胞（#32、#33および#34）；および
(c) MOI 10,000でGMPグレードAAV-REP1により形質導入された細胞（#35、#36および#37）。
【０２０９】
プレニル化反応は、総容量15μL中に20μgの溶解物を用いてセットアップされた。陽性対照は、0.5μMの魚類REP1を添加した。
【０２１０】
この結果は、以前の実験と一致し、Rab6a内のビオチン化脂質供与体の取り込みが、細胞形質導入に使用されるAAV-REP1の量と相関することを確認するものである（図5）。
【０２１１】
実施例３−ARPE-19細胞を用いたプレニル化反応における基質としてのRab6a
細胞形質導入およびハーベスト
培養したARPE-19細胞を、10,000ゲノム粒子/細胞のMOIでrAAV2/2-REP1により処理した。形質導入後13日目に細胞溶解物を調製した：細胞をPBSで洗浄し、プレニル化バッファー、pH7.5（50 mM HEPES、50 mM NaCl、2 mM MgCl2、1 mM DTTおよびプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)）とともに氷上でインキュベートした。細胞を、細胞スクレーパを用いて掻き取って1.5mLチューブに入れ、氷上で15分間インキュベートした。その後、1mLのシリンジに取り付けた26-Gシリンジ針に細胞を20回通して破壊した。細胞を、1,500 gで、4℃にて5分間回転させた。次に、上清をセルロースプロピオネートチューブに移して、100,000 gで4℃にて1時間遠心分離した。この上清をin vitroプレニル化反応に使用した。
【０２１２】
総タンパク質定量
メーカーの説明書にしたがってBradford法を用いて全細胞タンパク質を定量した（Quick Stat（商標名）Bradford 1x Dye Reagent, BioRad、#500-0205）。サンプルの値は標準曲線から外挿された。
【０２１３】
in vitroプレニル化反応
プレニル化反応は、プレニル化バッファー中で、凍結細胞溶解物（15μg）、2μM Rab GGTase、4μM Rabタンパク質(Rab6a)、および、脂質供与体として、5μMビオチン-ゲラニルピロリン酸を用いてセットアップされた。すべての反応は、新鮮なGDP（20μM）およびDTT（1 mM）を添加した。陽性対照試料において、形質導入されていない細胞の溶解物を含有するプレニル化反応物に、魚類REP1を添加した（量については実験を参照されたい）。
【０２１４】
反応物を37℃にて2時間インキュベートし、次いでSDS-PAGE試料バッファーの添加により停止させた。
【０２１５】
ヒトREP-1、βアクチン（ローディング対照）およびビオチン化Rabタンパク質（Rab27aまたはRab6a）を検出するために、ウェスタンブロッティング（WB）を行った。ヒトREP1を検出するために、millipore製のマウスモノクローナル抗体を使用した（クローン2F1、#MABN52）。βアクチンを検出するために、Thermo Fisher Scientific製のマウスモノクローナル抗体を使用した（クローンAC-15、#AM4302）。両者の検出に続いて、二次抗体標識化ステップ（ロバ抗マウスHRP、Abcam、#ab98799）を行った。適切なRab基質へのビオチン化脂質供与体の取り込みは、ストレプトアビジン-HRP（Thermo Fisher Scientific、#43-4323）とともに直接インキュベートすることによって、検出された。すべてのメンブレンは、ECL基質およびOdyssey FC検出システム（LI-COR）を用いて検出された。バンドの強度は、Image Studi Liteソフトウェア(LI-COR)を用いて定量的に分析された。
【０２１６】
結果および考察
ARPE-19細胞(ヒト網膜色素上皮細胞)において基質としてRab6aを用いたプレニル化アッセイをテストするために、以下の細胞を用いて並行して実験を行った：(a) 未形質導入細胞（#86および#87）；および(b) 細胞 + AAV-REP1 MOI 10,000（#90および#91）- R&Dグレードベクター。  プレニル化反応は、総容量45μL中15μgの溶解物を使用して、セットアップされた。陽性対照は0.1μMの魚類REP1を添加した。
【０２１７】
この結果は、Rab6aが、AAV-REP1によるARPE-19細胞の形質導入後にREP1機能を評価するための、プレニル化アッセイのための基質として機能することを示す。
【０２１８】
実施例４−HT1080細胞を用いたプレニル化反応における基質としてのRab6a
細胞形質導入およびハーベスト
培養したHT1080細胞を、10、000ゲノム粒子/細胞のMOIでrAAV2/2-REP1により処理した。形質転換後5日目に細胞溶解物を調製した：細胞をPBSで洗浄し、プレニル化バッファー、pH7.5（50 mM HEPES、50 mM NaCl、2 mM MgCl2、1 mM DTTおよびプロテアーゼインヒビターカクテル(Roche)）とともに氷上でインキュベートした。細胞を、細胞スクレーパを用いて掻き取って1.5mLチューブに入れ、氷上で15分間インキュベートした。その後、1 mLのシリンジに取り付けた26-Gシリンジ針に細胞を20回通して破壊した。細胞を、4℃にて1,500gで5分間回転させた。次に、上清をセルロースプロピオネートチューブに移して、4℃にて1時間100,000 gで遠心分離した。この上清をin vitroプレニル化反応に使用した。
【０２１９】
総タンパク質定量
メーカーの説明書にしたがってBradford法を用いて全細胞タンパク質を定量した（Quick Stat（商標名）Bradford 1x Dye Reagent, BioRad、#500-0205）。サンプルの値は標準曲線から外挿された。
【０２２０】
in vitroプレニル化反応
プレニル化反応は、プレニル化バッファー中で、凍結細胞溶解物（20μg）、2μM Rab GGTase、4μM Rabタンパク質(Rab6a)、および、脂質供与体として、5μMビオチン-ゲラニルピロリン酸を用いてセットアップされた。すべての反応は、新鮮なGDP（20μM）およびDTT（1 mM）を添加した。陽性対照試料において、形質導入されていない細胞の溶解物を含有するプレニル化反応に、魚類REP1を添加した（量については実験を参照されたい）。
【０２２１】
反応物を37℃にて2時間インキュベートし、次いでSDS-PAGE試料バッファーの添加により停止させた。
【０２２２】
ヒトREP-1、βアクチン（ローディング対照）およびビオチン化Rabタンパク質（Rab27aまたはRab6a）を検出するために、ウェスタンブロッティング（WB）を行った。ヒトREP1を検出するために、millipore製のマウスモノクローナル抗体を使用した（クローン2F1、#MABN52）。βアクチンを検出するために、Thermo Fisher Scientific製のマウスモノクローナル抗体を使用した（クローンAC-15、#AM4302）。両者の検出に続いて、二次抗体標識化ステップ（ロバ抗マウスHRP、Abcam、#ab98799）を行った。適当なRab基質へのビオチン化脂質供与体の取り込みは、ストレプトアビジン-HRP（Thermo Fisher Scientific、#43-4323）とともに直接インキュベートすることによって、検出された。すべてのメンブレンは、ECL基質およびOdyssey FC検出システム（LI-COR）を用いて検出された。バンドの強度は、Image Studi Liteソフトウェア(LI-COR)を用いて定量的に分析された。
【０２２３】
HT1080細胞において基質としてrab6aを用いてプレニル化アッセイをテストするために、以下の細胞を用いて並行して実験を行った：(A) 未形質導入細胞（#56および#57）；(B) 細胞 + AAV-REP1 MOI 10,000（#60および#61）- R&Dグレードベクター；および(C) 細胞 + AAV-REP1 MOI 10,000（#60および#61）- 臨床グレードベクター。
【０２２４】
プレニル化反応は、総容量20μL中20μgの溶解物を使用して、セットアップされた。陽性対照は0.1μMの魚類REP1を添加した。
【０２２５】
この結果は、Rab6aが、AAV-REP1によるHT1080細胞の形質導入後にREP1機能を評価するための、プレニル化アッセイのための基質として機能することを示す。
【０２２６】
実施例５−プレニル化反応における基質としてのRab27aとRab6aとの比較
図4に示す実験で使用されたのと同じ細胞溶解物を使用した：
(a) 形質導入されていない細胞、(b) 細胞 + AAV-REP1 MOI 250；(c) 細胞 + AAV-REP1 MOI 1,000；(d) 細胞 + AAV-REP1 MOI 5,000；(e) 細胞 + AAV-REP1 MOI 10,000；および(f) 細胞 + AAV-REP1 MOI 20,000。
【０２２７】
プレニル化反応は、総容量15μL中20μgの溶解物を使用し、さらに2つの異なる基質：Rab27aおよびRab6aを用いてセットアップされた。基質ごとに1つの陽性対照に、0.1μMの魚類REP1を添加した。試料は、SDS-PAGE上に並行して泳動し、同時に検出した。
【０２２８】
Rab27aおよびRab6aはいずれも、AAV-REP1による細胞の形質導入後にREP1機能を評価するための、プレニル化アッセイのための基質として機能する。
【０２２９】
ビオチン化脂質供与体の取り込みは、使用された基質のそれぞれについて、細胞形質導入に使用されたAAV-REP1の量と相関している（図8）。
【０２３０】
ビオチン化Rab6aから得られるバンド密度は、Rab27aについてのものよりも高く、これは、Rab6aのほうが、相対力価及び／又は生物学的活性を測定（決定）するための平行線検定に適した基質であることを示す。
【０２３１】
実施例６−異なる条件を用いたプレニル化反応における基質としてのRab27aおよびRab6aの能力の比較
形質導入されていない293細胞溶解物を、Rab27aおよびRab6aを用いた本実験で使用するために調製した。テストした条件は、図9の表に示されている。試料は、SDS-page上で並行して泳動され、同時に検出された。
【０２３２】
Rab27aおよびRab6aはいずれも、内在性REP1機能を評価するためのプレニル化アッセイのための基質として機能する。
【０２３３】
ビオチン化脂質供与体の取り込みは、使用される基質の各々について、反応における総タンパク質量と相関する。
【０２３４】
条件を比較すると、反応中のRab基質の濃度が、シグナルにもっとも影響を及ぼすようである。
【０２３５】
Rab27aと比較して、Rab6aが使用される場合には、ビオチン化基質が2.5倍増加する。
【０２３６】
実施例７−AAV2-REP1により形質導入された溶解物におけるプレニル化反応の基質としてのRab27aとRab6aの比較
AAV2-REP1（R&Dグレートの材料）のMOIを増加させることによって、新たな溶解物（3連）を調製した：(a) 形質導入されていない細胞；(b) 細胞 + AAV-REP1 MOI 100；(c) 細胞 + AAV-REP1 MOI 500；(d) 細胞 + AAV-REP1 MOI 1,000；(e) 細胞 + AAV-REP1 MOI 5,000；(f) 細胞 + AAV-REP1 MOI 10,000；(g) 細胞 + AAV-REP1 MOI 20,000；および(h) 細胞 + AAV-REP1 MOI 50,000。
【０２３７】
総容量10μLにおいて、総タンパク質20μg、Rab基質（Rab27aまたはRab6a）2μM、およびRab GGTase 2μMを用いて、プレニル化反応物を調製した。各基質に1つの陽性対照に、0.1μMの魚類REP1を添加した。
【０２３８】
繰り返し行われたそれぞれの実験から得られた試料をSDS-PAGE上で並行して泳動し、ビオチン化基質（1：10,000）、ローディング対照としてのβアクチン(1：50,000)、ならびにヒトREP1（1：2,500）について、Image Studio Liteソフトウェアを用いて検出した。ビオチン化基質に対するバンド密度の半定量から得られたデータを、Prismソフトウェアを用いてプロットした（図10）。
【０２３９】
βアクチンのレベルは、分析された全ての試料において同様であった。形質導入されていない細胞(陽性対照試料)は、REP1の内在性レベルを示した。AAV-REP1により形質導入された細胞は、用いられたMOIと直接相関する、REP1レベルの増加を示した。陽性対照は、魚類REP1活性の結果として、さらに強いビオチン取り込みを示す。
【０２４０】
すべての3回繰り返した実験に関する、要因として基質およびMOIを用いた2元配置分散分析から、これら2つの要因が極めて有意（0.0001）であることが明らかになった。一定のMOIにおける基質の効果に関するボンフェローニ（Bonferroni）の多重比較検定は、MOI 5,000において（p=0.0023）、ならびにそれを上回るすべてにおいて（p<0.0001）、対比較の有意差を示した。
【０２４１】
Rab27aおよびRab6aはいずれも、AAV-REP1による細胞の形質導入後にREP1機能を評価するための、プレニル化アッセイのための基質として機能する。
【０２４２】
ビオチン化された基質のバンド密度の半定量は、Rab27aについて得られた値よりもRab6aの値の方が有意に高いことを示すのみである。
【０２４３】
実施例８−コロイデレミア遺伝子治療のための生物学的活性としてのRab6aのプレニル化
蛍光法と比べて感度が優れているため、ビオチン含有イソプレノイド（ビオチン標識ゲラニルピロリン酸、B-GPP）のタンパク質取り込みを用いて、プレニル化タンパク質を検出した。この種のアッセイを確立する第1段階は、内在性REP1活性を検出するプレニル化反応条件の最適化であった（図11）。すべての反応は、同一の細胞溶解物を使用して、並行して行った。初めに、さまざまな量の、293細胞（HEK293またはヒト胎児腎臓293としても知られる）由来の全細胞溶解物をテストした（2.5μg、5μg、10μgおよび20μg）が、GGT-II (2μM)およびRab基質 (4μM、Rab27aまたはRab6a)の濃度は一定に保持した。次に、より低い濃度のGGT-II (1および0.5μM)および基質(0.8および0.16μM)を、20μgの全細胞溶解物を用いてテストした（図11A）。2つの基質がいずれもin vitroで用量依存的に内在性REP1によってプレニル化された（図11Bの上図、条件1-4および9-12）ことは、2つの基質を両方とも、AAV2導入REP1の生物学的活性を評価するために使用することができることを示唆する。さらに、総タンパク質量を同一に保持すると、GGT-II濃度、ならびに基質濃度はともに、用量依存的にビオチン取り込みに影響を与えた（図11Bの下図、条件5-8および13-16）。Rab6aで得られるシグナルは、バンド密度値によって測定された、テストされたすべての対応する条件において、Rab27aで得られるものより一貫して高かった（図11C）。この差異は、2.5倍もの高さとなりうる（条件4および12において0.8対1.8；条件7および15において0.3対0.75）。
【０２４４】
次に、一定範囲の感染効率（MOI、ゲノムコピー数/細胞すなわちgc/細胞として定義される）のAAV2-REP1を用いて293細胞に形質導入した。プレニル化反応は、CHM遺伝子を増加させる実験モデルで2つのRabタンパク質を基質としてテストするために、2つの基質を用いて並行して行った（図12A）。REP1発現とAAV2-REP1のMOIとの間の非線形関係を前提として、カーブフィッティング分析のために使用するモデルは、4パラメーターロジスティック（4-PL）回帰モデルとした（図12B）。log (IC50)が4.578である、前記log (IC50)（IC50 = 37,887 MOI）、すなわち基底反応と最大反応との間の中間（中点）の反応を与えるMOIは約38,000である。ビオチンの取り込みによって測定されるビオチン化基質の量を、AAV2-REP1のMOIに対してプロットした（図12C）。基質およびMOIを要因とする二元配置ANOVAは、2つの要因がいずれも有意であることを明らかにした（n=3, p<0.0001）。それぞれの基質について非形質導入細胞（MOI=0）と対比したビオチン取り込みに関するボンフェローニの多重比較検定から、そのビオチン取り込みが、Rab27aでは、MOI 20,000 (p=0.0329)および50,000 (p<0.0001)において統計的に有意であることが判明した。Rab6aについては、非形質導入細胞を超えるビオチン取り込みが、MOI 5,000 (p=0.0196) およびそれを上回るMOI (p<0.0001)において、統計的に有意であることが判明した。最後に、REP1に対する、それぞれの基質でのビオチン取り込みとの関係を、図12Dにプロットした。2つのパラメーターはいずれも、非形質導入細胞に存在する内在レベルに対して補正した。2つのデータに関する線形回帰分析から、標準化された過剰発現REP1の単位当たりの、Rab6aに関するビオチン取り込みが、Rab27aに関するものより一貫して高いことが示された。Rab6aデータセットはまた、回帰分析に対してよりよいフィットを示した（R2 = 0.892、これに対してRab27aはR2 = 0.6313）。まとめると、データによれば、Rab6aはプレニル化活性の変化を測定するための基質としての使用に関してより高感度である。
【０２４５】
in vitroプレニル化アッセイで基質としてRab6aを使用することを評価するために、他の細胞株に同様に形質導入した。プレニル化反応は、基質としてRab6aを用いて調製し、得られた結果を図3に示す。HT-1080（ヒト線維肉腫)およびARPE-19（ヒトRPE）細胞株の両者に、MOI 1,000、10,000および30,000で形質導入した（それぞれ図13Aおよび13B）。いずれの場合も、ビオチン化基質のレベルはREP1の量に比例しており、本方法が他の細胞株において再現可能であることを示す。
【０２４６】
細胞もしくは細胞株がREP1欠損細胞もしくは細胞株となるように改変されていないならば、内在性レベルのREP1が細胞もしくは細胞内に存在する。したがって、実測応答を最大化するアッセイは、内在性タンパク質とベクター導入遺伝子発現タンパク質を区別することによって、優れた特性を提供する。
【０２４７】
本研究は、AAV2導入REP1の生物学的活性をin vitroで測定するための、ビオチン化脂質供与体およびRab基質の使用を実証する。本明細書に記載のアッセイは、AAV遺伝子治療ベクターの生物学的活性を評価するための高感度で再現性のあるin vitro検査を提供する。
【０２４８】
Rab6aはプレニル化率に関してRab27aとまさに対極にある：Rab6aは、Rabタンパク質プレニル化率の序列のトップにあるので、より高い活性の、より高感度な計測値をもたらすことになる。したがって、本明細書は、生物学的活性のアッセイにおいて基質として使用するために、Rab6aとRab27aとを比較する。データによれば、2つの基質はいずれも、非形質導入細胞においてプレニル化活性を測定するために使用することができる。AAV2導入REP1との反応においてそれぞれの基質がどのような挙動をとるかを判定するために、2つの基質をテストした。REP1発現とMOIとの関係は直線的ではなく対数的である。シグモイド型曲線は、このプロトコルで測定可能な、外部導入された導入遺伝子から発現されるREP1の量に限界があることを示すものであるが、本実験においてその量には到達しなかった。2つのデータについて実施した線形回帰分析によれば、Rab6aのほうが、標準化REP1が直線的である範囲内で（図12Bにおいて、〜1から〜2 log gc/細胞）、ビオチン取り込みが高い（図12D）。したがって、Rab6aは、過剰発現REP1の単位当たり、どれほどのビオチンが取り込まれるかをより正確に予測する基質である。
【０２４９】
Rab6aの使用を、他の細胞株でさらに検証した。HT-1080細胞は、REP1を導入するレンチウイルス構築物をテストするために、また、コロイデレミア遺伝子治療試験（NCT01461213）においてAAV2-REP1の使用後にREP1発現を確認するために、すでに使用されたことがある。ARPE-19細胞は、それがコロイデレミア遺伝子治療の標的細胞型と類似しているために選択された。2つの細胞株は、in vitroプレニル化プロトコルに続くRab6aへのビオチン取り込みに関して、293細胞のように反応したことから、このアッセイは再現性があり、細胞型特異的でないようであると確認された。
【０２５０】
まとめると、データは、Rab6aのin vitroプレニル化が、AAV2による細胞への形質導入後のREP1導入遺伝子による発現活性をテストするための、より高感度でロバストな方法であることを示す。
【０２５１】
実施例９−プレニル化反応の基質としてのRab27aとRab6aの比較
293細胞を用いてRab27aおよびRab6aにおけるビオチン取り込みの相違を検討する際に、標準条件として、全細胞抽出物（20μg）、GGT-II（2μM）およびRab基質（4μM）を使用した。このアッセイを確立する際の最初のステップは、内在性REP1活性を検出するようにプレニル化反応条件を最適化することであった（図14）。検討した実験条件を図14Aに示すが、これは全細胞タンパク質の量（2.5、5、10および20μg）、GGT-II濃度（0.5、1および2μM）およびRab基質、Rab27aまたはRab6aのいずれかの濃度（0.16、0.8および4μM）を含む。3つの別々の細胞溶解物を用いて、3つの独立した実験を行った。反応生成物にウェスタンブロット分析を行ったが、その1つの代表例を図14Bに示す。陽性対照（+ve）反応は、2μMのGGT-IIおよび4μMのRab6aを用いて実施し、組換え魚類REP1（25 nM）を添加した。陽性対照ウェルでのビオチン取り込みのバンド強度（図14B、右側）は、反応に関与するすべての基質が適切な条件であったことを証明するものである。3つすべての実験において、2つの基質は、ビオチンの取り込みによって測定されるように、用量依存的に内在性REP1によってin vitroでプレニル化されることが観察された（図14Bおよび14C）。2つのどちらを用いても、rAAV2/2導入REP1の生物学的活性を評価することができる。統計的データ解析としては、3つの独立した二元配置ANOVAを行って、検討した条件のそれぞれについてRab27aとRab6aのビオチン取り込みを比較した。「条件」（全細胞溶解物）および「基質」を要因とする二元配置ANOVAは、2つの要因がともに、条件#1-#4での変動要因に有意に寄与していることを明らかにした（図14D；n=3；それぞれp=0.0102 およびp=0.0014）。しかしながら、ビオチン取り込みに関するボンフェローニの多重比較検定は、20μgの全細胞溶解物を使用した場合、Rab6aがRab27aより有意に多くのB-GPPを取り込んでいることを明らかにした（図14D；p=0.009）。同じアプローチを、GGT-II濃度（条件#4-#6）およびRab基質濃度（条件#4、#7および#8）の両者の影響の分析に使用した。GGT
-II濃度を「条件」とする二元配置ANOVA解析から、この場合「基質」のみが変動要因に寄与することが明らかになった（図14D；n=3；p=0.0145）。ビオチン取り込みに関するボンフェローニの多重比較検定は、GGT-II濃度を変化させたときRab27aとRab6aの間に統計的有意差がないことを明らかにした（図14D；ns）。Rab基質濃度に関して（条件#4、#7および#8）、二元配置ANOVA分析は、「条件」および「基質」の両方が変動要因に寄与する要因であることを示した（図14D；n=3；それぞれp=0.0382およびp=0.0044）。ビオチン取り込みに関するボンフェローニの多重比較検定は、4μMのRab基質を使用した場合、Rab6aがRab27aより有意に多くのB-GPPを取り込んでいることを明らかにした（p=0.0263）。これらのデータは、Rab基質の相違が、検討されたすべての条件において得られた結果に影響を及ぼしたことを示す。さらに、反応におけるGGT-II濃度は、基質へのビオチン取り込みに対してもっとも寄与の小さい要因であるが、これはおそらくそれが過剰に使用されたためと考えられる。
【０２５２】
CHM遺伝子を増加させるシナリオに沿って2つのRabタンパク質を基質として検討した。rAAV2/2-REP1を用いて一定の範囲で感染効率（MOI、ゲノムコピー数/細胞、すなわちgc/細胞として定義される）を増加させて（100；300；1,000；3,000；10,000；30,000；100,000；300,000）293細胞に形質導入する、3つの独立した実験を行った（図15）。プレニル化反応生成物は、ローディングコントロールとしてアクチンを用いて、それぞれの実験において同時に分析した；代表的なウェスタンブロットを図15Aに示す。2つの陽性対照反応（Rab基質ごとに1つ）は、非形質導入細胞溶解物に組換え魚類REP1（25 nM）を添加して、並行して実施した。
【０２５３】
ウェスタンブロットで検出されたREP1量が細胞に添加されたウイルス粒子量と相関すること（図15A、上図）：REP1のバンド密度がMOIの増加につれて増加することが観察された。4パラメーターロジスティック（4-PL）回帰モデルを用いて、（対応するアクチンバンド密度に対して）標準化されたREP1バンド密度をMOIに対してプロットした（対数目盛）（図15B）。このモデルは、この実験において細胞が生物学的に限られた系であり、MOIの増加はある時点でその系を飽和させ、REP1生成を止めることになることを考慮した。回帰モデルは制約なしで実行され（R2=0.8625）、曲線の上限が5.191任意単位（a.u.）の標準化REP1となる最良適合値を予測した。この適合（フィット）に関するlog(IC50)は5.255 a.u.となり、これはMOI 179,735 gc/細胞に相当したが、それは検討された範囲に含まれる。
【０２５４】
Rab基質へのビオチン取り込みに関して（図15A、下図）、Rab6aへの取り込みがRab27aよりも広範囲にわたって検出されることがさらに観察された。図15BのREP1に関するものと同様の理論的根拠にしたがって、2つの基質へのビオチン取り込み（バンド密度として測定される）をともに、形質導入に用いられたrAAV2/2-REP1のMOIに対してプロットした（図15C）。非形質導入試料でそれぞれのRabについて得られたベースライン値（3つの独立した実験の平均）は、水平の点線で表した（RAB6A、5.009 ± 1.25 a.u.；RAB27A、0.577 ± 0.19 a.u.）。4-PL回帰モデルをそれぞれのRab基質について制約なしで行って、2つのR2を図15Cに示す（Rab27a、R2=0.8772；Rab6a、R2=0.8873）。Rab6aの曲線の上限に関する最良適合予測は92.83 a.u.となり、log(IC50)は4.912となって、これはMOI 81,694 gc/細胞に相当した。Rab27aについては、曲線の上限は53.8 a.u.となり、log(IC50)は5.514となって、これはMOI 326,488 gc/細胞に相当した。それぞれの基質に関するlog(IC50)値の相違は、このアッセイにおけるそれらの感度を意味するものであった：Rab6aへのビオチン取り込みは、Rab27aより広範囲にわたって検出可能であり、Rab27aは検出についてより低い勾配および限界を呈する。これらの知見は、同じデータセットで行われた、「MOI」および「基質」を要因とする二元配置ANOVAによって補強された：両者はいずれも有意であることが判明した（n=3; p<0.0001）。さらに、検討されたそれぞれのMOIにおける基質へのビオチン取り込みに関するボンフェローニの多重比較検定は、そうした取り込みがMOI 10,000 (p=0.0097)、30,000 (p=0.0002)、ならびに100,000および300,000 (p<0.0001)において、Rab27aよりRab6aで有意に高いことを明らかにした。Rab6aはrAAV2/2-REP1の所与のMOIにおいて、ビオチンの取り込みに優れていた。
【０２５５】
Rab6aは、rAAV2/2-REP1の生物学的活性を測定する基質としての使用に対して、より高感度であった。基質におけるビオチン取り込みの値はそれぞれ、対応する非形質導入試料に対して補正され、標準化された過剰発現REP1に対してプロットされた（図15D）。その結果得られた線形回帰分析から、REP1単位当たりのRab6aのビオチン取り込みは、Rab27aより高いことが示された（それぞれ、Y=18.82*X+0.4803 対 Y=6.569*X+0.9042）。Rab6aデータセットはまた、回帰に対してより良い適合を示した（R2=0.8959、Rab27aに関するR2=0.533に対して）。
【０２５６】
in vitroプレニル化反応アッセイでの基質としてのRab6aの使用を、他の細胞株で確認した。rAAV2/2-REP1を用いて、定性分析と同様の方法で、細胞株HT-1080（ヒト線維肉腫）およびARPE-19（ヒトRPE）に形質導入した。いずれの場合も、代表的なMOI 1,000、10,000、および30,000 gc/細胞を用いて、1回の実験で2つのウェル（反復）に形質導入した。陽性対照は、それぞれの非形質導入細胞溶解物に組換え魚類REP1を添加して（HT-1080は25 nM；ARPE-19は11 nM）、並行して行った。プレニル化生成物をウェスタンブロット分析に供し、その結果を図13に示す。293細胞で見られたのと同様に、形質導入に用いられたMOI、REP1の発現、およびRab6aのビオチン取り込みの間に相関関係が観察された（図13Aおよび13B）。しかしながら、ARPE-19について検出されたREP1レベル、および対応するビオチン化Rab6aは、全体として、HT-1080および293細胞についてよりも低かった。ARPE-19細胞はサイズが大きく、各ウェルにシードされる細胞数の減少、ならびにゲルにロードできる細胞溶解物の総量に対する容量制限が必要であった。
【０２５７】
本明細書は、rAAV2/2導入REP1の生物学的活性をin vitroで測定するためにビオチン化脂質供与体およびRab基質を使用することを初めて報告するものである。その目的は、コロイデレミアのためのrAAV遺伝子治療ベクターの生物学的活性を評価するために、再現性のある高感度のin vitro検査を提供することである。
【０２５８】
Rab27aのプレニル化不足が、コロイデレミアのRPE細胞の変性の、分子的原因の1つであるが、ただし他の細胞性変動がコロイデレミア表現型に寄与している可能性もある。たとえば、Rab27aは、コロイデレミアのリンパ芽球においてプレニル化不足となるRabタンパク質のサブセットの1つである。Rab27aは、REP1およびREP2に対して同様に良好に結合するが、他のRabタンパク質と比べて、REP1よりREP2に対する親和性が低い。Rab27a-REP1複合体がGGT-IIに対してRab27a-REP2より高い親和性を有するため、Rab27aがプレニル化されずに蓄積する可能性がある。さらにRab27aはRabタンパク質の中で、GTP加水分解の速度がもっとも遅いものの1つであり、プレニル化速度のもっとも遅いものの1つでもある。
【０２５９】
ビオチン化脂質供与体は、生物学的アッセイにおいて有益である。米国食品医薬品局（FDA）により規定されるように、生物学的アッセイは、「所与の結果をもたらす特異的能力に関係している、生成物の活性を測定する定量分析」である。in vitroでプレニル化を評価する単純で高感度な方法は、ビオチン化脂質供与体を使用すれば可能となる。非プレニル化Rabタンパク質レベルは、HeLa、リンパ芽球、線維芽細胞、およびiPS由来RPE細胞においてビオチン標識プレニル供与体を用いてすでに検出されている。
【０２６０】
Rab6a基質は、過剰発現REP1の単位当たり、どれほどのビオチンが取り込まれるかを、Rab27aより正確に予測する。HEK293細胞は本研究で選択した細胞株であった。HEK293細胞は、FDAの推奨にしたがって遺伝子治療産物のための効力試験を開発するための特徴を有する。HEK293細胞は、認定された細胞株供給者から市販され、医薬品適正製造基準（cGMP）に準拠したマスターセルバンクとして入手できる。さらに、REP1が広範に発現していることに起因して、REP1を欠損した安定した細胞株がない場合、存在するREP1の内在性レベルが常に存在することになる。したがって、測定される応答を最大化するアッセイは、内在性REP1とベクター導入遺伝子発現REP1とを区別するために最も有益である。Rab27aをRab6aと比較した。Rab6aは、プレニル化速度に関してRab27aとはまさに対極にある：それはRabタンパク質のプレニル化率の序列の最上位にある。Rab6aは、より感度の高い生物学的活性の計測値をもたらした。生物学的活性アッセイにおいて基質として使用するために、Rab6aをRab27aと比較した。2つの基質はいずれも、293非形質導入細胞においてプレニル化活性を測定するために使用することができた。Rab6aで得られたバンド密度は、常にRab27aより高かった。2つの基質がrAAV2/2導入REP1と反応してどのような挙動をとるかについて検討した。REP1の発現は、細胞の形質導入に使用されたrAAV2/2-REP1の量に比例する。REP1発現とMOIとの関係性に関する統計的最良適合は、直線的ではなくて対数的であるが、それは、細胞が、形質導入できるrAAVの量に限界のある系であることに起因する。シグモイド型曲線は、このプロトコルで測定可能な、外部導入された導入遺伝子から発現されるREP1の量に限界があることを示す。本明細書の実験ではこの限界に達しなかった。これはRab基質におけるビオチン取り込みにも当てはまる。Rab6aは、ビオチン取り込みの測定に使用するのに、Rab27aより効率の良い基質であるが、それはその範囲が広く急勾配であるためである。両者のデータセットについて行われた線形回帰分析によれば、Rab6aは、標準化REP1が直線となる範囲内においてより高いビオチン取り込みを示す。
【０２６１】
他の細胞株においてRab6aの使用をさらに評価した。ARPE-19細胞は、コロイデレミア遺伝子治療の標的細胞型との類似性のため選択された。2つの細胞株はいずれも、in vitroプレニル化プロトコル後のRab6aへのビオチン取り込みに関して、293細胞と同様に反応した。このアッセイは再現性があり、細胞型特異的ではないと思われる。
【０２６２】
総じて、本発明のデータによれば、Rab6aのin vitroプレニル化は、rAAV2/2による細胞への形質導入後にREP1活性を検査するためのロバストな方法である。Rab6aは、rAAV2/2-REP1の効力アッセイにおいて基質として使用すると、より高感度であると思われるが、それは、Rab6aが基質としてRab27aより正確に、ウイルスベクターバッチ間のわずかな相違を検出できるからである。本明細書は、たとえば臨床試験に関連した遺伝子治療を含めて、コロイデレミア遺伝子治療においてAAVベクターの生物学的活性を評価するためのin vitroプレニル化アッセイの開発に、有益な改善を提供する。
【０２６３】
実施例１０−生体適合性および安定性および濃度の評価
臨床シナリオを模した設定で、保管およびAAV遺伝子治療用注入デバイス通過後の、AAV製剤の生体適合性および安定性を評価した。rAAV2.REP1について2つの用量および希釈剤を検討した。物理的損失であれ、生物学的機能（たとえば、REP1プレニル化活性）の喪失であれ、ベクターの損失があったかどうかを判定するために、試料を集めて分析した。
【０２６４】
TMN200中1E+12の高用量ベクターを、10倍希釈法を用いて、TMN200および平衡塩類溶液（BSS）中に希釈した。ベースライン試料および3つの独立した充填済み外科用デバイス（41Gテフロン(登録商標)チップを有する23G針）を4℃にて30分、その後室温にて90分および180分保持した。すべての時点で、注入された「シリンジ」サンプルから試料を集め、qPCRを用いて物理的力価（DRP/mL）を測定した。REP1タンパク質発現および活性のレベルは、WB、ならびに、ベースライン、30分4℃、および180分室温においてビオチン化脂質供与体を用いたin vitroプレニル化により測定した。
【０２６５】
反復試料相互の適切な正確さを確認するためにゲノム力価分析を行った。BSSで希釈された試料のゲノム力価には、ベースラインレベルと比べて、検討したすべての時点で有意な損失があった（60-70%低下）。したがって、これらは、タンパク質分析から除外した。TMN200で希釈された試料は、どの時点についてもベースラインに対して有意な相違を示さなかった。4℃および180分の試料は、ベースラインと比べて、持続するREP1発現を示した。同様に、ビオチン化Rab基質のレベルはベースラインから変動しなかった。
【０２６６】
TMN200を希釈剤として使用することで、AAV製剤の物理的力価は、低希釈でも確保され、最長3.75時間の期間にわたって、薬剤の発現および機能のレベルも確保された。
【０２６７】
物理的なウイルスゲノム力価の測定は、ベクターの特性解析の一環であり、遺伝子治療中のデリバリーに対するウイルス粒子の効力および安全性を確保するための重要なステップである。AAV力価を測定するためのもっとも一般的な方法は、定量的PCR（qPCR）である。結果に影響しうるさまざまな変数は、たとえば標準物質として使用されたDNAの立体構造、または試料調製中の酵素消化などである。
【０２６８】
DNA標準の立体構造の影響を分析するために、スーパーコイル状のプラスミドおよび線状化型を用いて2つの標準曲線を作成した。線状化プラスミドは、HindIII制限酵素による消化によって調製し、アガロースゲル電気泳動により可視化して、QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen)を用いてメーカーの説明書にしたがって精製した。各プラスミド標準物質（プラスミドDNAの109-103コピー）の7段階希釈物を用いて、標準曲線を作成した。精製AAVベクターからDNAを抽出するために、2つの酵素的方法を使用した：DNaseによる1回消化、および追加的なプロテイナーゼK処理による2回消化。導入遺伝子配列に特異的なプライマーおよびTaqmanプローブを用いてCFX Connect Real-Time PCR Detection System (BioRad)によりqPCRを行った。
【０２６９】
標準物質としてスーパーコイル状のプラスミドを使用すると、線状化プラスミドを用いた場合と比べてAAVベクターの力価は有意に増大した（p < 0.0001、対応のあるt検定）。得られたデータに基づいて、力価の絶対値差分は、スーパーコイル状標準を使用すると、線状化型標準と比べて約4.6倍高い。DNaseにより処理された試料と、追加のプロテイナーゼK処理による同試料との間に、力価の有意な差異は認められなかった（p=0.075、対応のあるt検定）。
【０２７０】
標準DNAの立体構造は、qPCRによる絶対定量に影響を及ぼし、スーパーコイル状プラスミドを使用した場合、AAV力価を過大に見積もることになる。こうした結果は、研究目的のみならず、臨床試験における治療の安全性および効力を保証するためにも、AAVベクターについて信頼性のある正確な力価を得るために線状化プラスミドを使用することの重要性を強調する。
【０２７１】
材料および方法
AAVベクター作製：CAGプロモーターの制御下にCHM導入遺伝子を含有するAAVベクターウイルスベクターを、標準プロトコル(Zolotukhin, S, et al. (1999). Gene Ther. 6: 973-985)にしたがって、一部変更しつつ作製した。要約すると、リン酸カルシウムによりHEK293（293ヒト胎児腎臓）細胞にコトランスフェクトして、ウイルス粒子を細胞溶解物から、イオジキサノール不連続遠心分離およびヘパリンクロマトグラフィーを用いて精製した。ウイルスストックは、製剤バッファー（注射用蒸留水中20 mM Tris pH 8.0、1 mM MgCl2、200 mM NaCl、pH 8）中4.95E+12 DRP/mLの濃度で調製した。
【０２７２】
細胞培養：HEK293細胞（ヒト胎児腎臓、#85120602, Culture Collections, Public Health England, Salisbury, UK）は、MEM培地中で培養した。HT1080細胞（ヒト線維肉腫、#85111505, Culture Collections, Public Health England, Salisbury, UK）は、DMEM中で培養した。ARPE-19細胞（ヒトRPE、#CRL-2302, ATCC via LGC Standards, Middlesex, UK）は、DMEM:F12中で培養した。MEM培地にはL-グルタミン（2.mM）を添加した。3種の培地にはすべて、ペニシリン（100単位/mL）、ストレプトマイシン（100μg/mL）、非必須アミノ酸（1%）および10%ウシ胎仔血清を添加した。細胞は、5% CO2環境中37℃にて維持された。RPE-J細胞（ラット網膜色素上皮、#CRL-2240, ATCC via LGC Standards, Middlesex, UK）は、L-グルタミン（2 mM）、ペニシリン（100単位/mL)、ストレプトマイシン（100μg/mL）、非必須アミノ酸（1%）および4%ウシ胎仔血清を添加したDMEM中で培養した。細胞は、5% CO2環境中34℃にて維持された。
【０２７３】
細胞形質導入および全細胞溶解物の調製：形質導入実験のために、すべての細胞を形質導入の前日に6ウェルプレートにシードした：293、9.5E+05細胞/ウェル；HT1080、4E+05細胞/ウェル；ARPE-19、2E+05細胞/ウェル。rAAV2/2による形質導入は、一定範囲の感染効率（MOI、すなわちゲノム粒子/細胞）にて実施し、培地交換は形質導入の3日後（dpt）およびその後2-3日ごとに行った。細胞溶解物は5 dptに、以下のように調製した：細胞をPBSで洗浄し、氷上で、プロテアーゼ阻害剤（cOmplete（商標名）Mini、Roche, Welwyn, UK）を添加したプレニル化バッファー（50 mM HEPES、50 mM NaCl、2 mM MgCl2、1 mM DTT、 pH 7.5）とともにインキュベートした。細胞スクレーパーを用いて細胞を掻き取って1.5 mLチューブに入れ、氷上で15分間インキュベートした後、1 mLシリンジに取り付けた26-G針を20回通過させて破壊した。細胞を4℃にて1,500 RCFで5分間遠心分離し、上清をプロピオン酸セルロースのチューブに移し、4℃にて100,000 RCFで1時間遠心分離した。その上清を全細胞溶解物として、in vitroプレニル化反応のために保存した。メーカーの説明書にしたがってブラッドフォード法を用いて（Quick Start（登録商標）Bradford 1x Dye Reagent、Bio-Rad, Hertfordshire, UK）総タンパク質含量を測定し、試料の値を、シグモイド型4パラメーターロジスティック回帰による標準曲線から外挿した。
【０２７４】
in vitroプレニル化：プレニル化反応は、全細胞溶解物（最大20μg）、組換えラットRab GGTase（2μM、Jena Biosciences, Jena, Germany）、組換えヒトRabタンパク質（Rab27A、Abnova  Corporation, UK；Rab6A、Jena Biosciences, Jena, Germany）、ならびに、脂質供与体としてビオチン標識ゲラニルピロリン酸（B-GPP、5μM、Jena Biosciences, Jena, Germany）を用いて、プレニル化バッファー中で構成した。すべての反応に、新調製のグアノシン5’-二リン酸（GDP、20μM、Merck Millipore, Watford, UK）およびDTT（1 mM、Thermo-Fisher Scientific, Loughborough, UK）を添加した。陽性対照は、組換えREP1タンパク質（魚類His-REP1、Jena Biosciences, Jena, Germany、またはヒトHis-REP1、Nightstar Therapeutics Ltd., UK）を添加した非形質導入細胞溶解物を用いて調製した。反応は、37℃にて2時間インキュベートし、その後Laemmliサンプルバッファーの添加により止めた。
【０２７５】
ウェスタンブロット分析：反応生成物を、10%プレキャストポリアクリルアミドゲル（Criterion（登録商標）、Bio-Rad, Hertfordshire, UK）上でSDS-PAGEに供し、PVDFメンブレン（TransBlot Turbo、Bio-Rad, Hertfordshire, UK）に転写し、ブロッキングバッファー[PBS+0.1% Tween20 (PBST)+3%ウシ血清アルブミン(BSA)]で45分間ブロックした。タンパク質発現のために、メンブレンを抗βアクチン（AM4302、Thermo-Fisher Scientific, Loughborough, UK；1:50,000）一次抗体用、および抗ヒトREP1（MABN52、Merck Millipore, Watford, UK；1:2,500）一次抗体用に別々に、ブロッキングバッファー中で1時間、攪拌しながらインキュベートした。メンブレンをPBSTにより3x7分洗浄し、HRP標識二次抗体とともに30分間ブロッキングバッファー（1:10,000）中でインキュベートし、前記のように再度洗浄し、Clarity ECL（Bio-Rad, Hertfordshire, UK）およびOdyssey Imaging System（LI-COR Biosciences, Cambridge, UK）を用いて検出した。適当なRab基質へのビオチン化脂質供与体の取り込みは、30分間のストレプトアビジン-HRP（Thermo-Fisher Scientific, Loughborough, UK）との直接インキュベーションによって検出した。デンシトメトリーデータ分析は、ImageStudio Liteソフトウェア（LI-COR Biosciences, Cambridge, UK）を用いて行った。
【０２７６】
統計分析：REP1発現レベルは、ローディングコントロールのアクチンに対して標準化された。標準化REP1を、10を底とする対数に変換されたAAV2-REP1のMOIに対してプロットし、95%信頼区間（CI）、Hill slope = 1、およびbottom>0の制約で、4パラメーターロジスティック（4-PL）回帰モデルに当てはめた（6回反復の平均±SEM）。それぞれのMOIでの2つの基質へのビオチン取り込みを、基質およびMOIを要因とする二元配置分散分析（ANOVA）を用いて比較した（3回反復の平均±SEM）。ボンフェローニ検定を適用し、多重比較を補正した（95% CI）。それぞれの基質におけるビオチン取り込みを、（非形質導入対照試料に対して補正された）標準化REP1レベルに対してプロットし、線形回帰によって分析した（95% CI）。すべての統計分析は、Windows版Prism 7（San Diego, CA, USA）を用いて行った。
【０２７７】
図14および15について、Rab27aおよびRab6a両者のビオチン取り込みを、異なる実験条件を用いて、「基質」および「条件」を要因とする二元配置ANOVAにより比較した（3回反復の平均±SEM）。ボンフェローニの検定を適用し、多重比較を補正した（95%信頼区間（CI））。（対応するアクチンレベルに対して補正された）標準化REP1を、10を底とする対数に変換されたrAAV2/2-REP1のMOI（log gc/細胞）に対してプロットし、95% CI、制約なしで、4パラメーターロジスティック（4-PL）回帰モデルに当てはめた（6回反復の平均±SEM）。２つの基質におけるビオチン取り込みを、rAAV2/2-REP1のMOI（log gc/細胞）に対してプロットし、95% CI、制約なしで、4パラメーターロジスティック（4-PL）回帰モデルに当てはめた（3回反復の平均±SEM）。それぞれのMOIについて基質ごとのビオチン取り込みを、「基質」および「MOI」を要因とする二元配置ANOVAにより比較した。ボンフェローニの検定を適用し、多重比較を補正した（95% CI）。各基質におけるビオチン取り込みを、（非形質導入対照試料に対して補正された）標準化REP1レベルに対してプロットし、線形回帰によって分析した（95% CI）。すべての統計分析は、Windows版Prism 7（San Diego, CA, USA）を用いて行った。
【０２７８】
参照による組み入れ
上記の明細書に記載された全ての刊行物は、参考として本明細書に組み入れられる。本発明の記載された方法および使用のさまざまな修正および変更は、本発明の範囲および精神から逸脱することなく、当業者には明らかであろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に関連して記載されているが、当然のことながら、クレームされた本発明は、そのような特定の実施形態に必要以上に限定されるべきではない。実際に、本発明を実施するための、記載された様式のさまざまな変更は、生化学およびバイオテクノロジーまたは関連分野の当業者には明白であって、以下の請求項の範囲内にあることを意図するものである。
【０２７９】
他の実施形態
本開示の特定の実施形態が例証され記載されたが、本開示の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の他の変更及び改変を行うことができる。添付の特許請求の範囲は、本開示の範囲内にある全てのかかる変更及び改変を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８−１】
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【図８−２】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】平成31年2月21日(2019.2.21)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Rabエスコートタンパク質1（REP1）の活性を測定するための生体外の方法であって、
(a) REP1タンパク質を、Rab6aタンパク質、Rabゲラニルゲニルトランスフェラーゼ（Rab GGTase）および脂質供与体基質と接触させて、脂質付加されたRab6aを生成させるステップ、ここでアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターがREP1タンパク質をコードする配列を含み(AAV-REP1)、該AAV-REP1ベクターが細胞当たり少なくとも5000ゲノムコピー(gc/細胞)の感染多重度（MOI）にて提供され、該REP1タンパク質が細胞内で発現される；および
(b) 脂質付加されたRab6aを検出するステップ
を含む前記方法。
【請求項２】
Rab6aタンパク質またはRab GGTaseが実質的に純粋である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
Rab6aタンパク質およびRab GGTaseが実質的に純粋である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
脂質供与体基質が、ゲラニルゲラニルピロリン酸（GGPP）またはその類似体を含む、請求項１〜３のいずれか1つに記載の方法。
【請求項５】
脂質供与体基質が、ビオチン-ゲラニルピロリン酸（BGPP）を含む、請求項１〜３のいずれか1つに記載の方法。
【請求項６】
脂質付加されたRab6aの検出が、酵素結合免疫吸着検定法（ELISA）、ウェスタンブロット分析、またはオートラジオグラフィーを含む、請求項１〜５のいずれか1つに記載の方法。
【請求項７】
AAV-REP1ベクターが、コロイデレミアの治療に使用するために作製される、請求項１〜６のいずれか1つに記載の方法。
【請求項８】
脂質付加されたRab6aが検出され、該AAV-REP1ベクターがコロイデレミアの治療での使用に適している、請求項１〜７のいずれか1つに記載の方法。
【請求項９】
脂質付加されたRab6aの検出がさらに、脂質付加されたRab6aの量を定量することを含む、請求項１〜８のいずれか1つに記載の方法。
【請求項１０】
脂質付加されたRab6aの量が絶対量である、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
脂質付加されたRab6aの量が相対量である、請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
脂質付加されたRab6aの量が、対照量または参照レベルに対して相対的である、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
対照量または参照レベルが、非形質導入細胞から測定された脂質付加されたRab6aのレベルであり、該非形質導入細胞が内在性REP1を発現する、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
細胞当たり少なくとも5000ゲノムコピー(gc/細胞)の感染多重度（MOI）が、非形質導入細胞から決定された脂質付加されたRab6aのレベルと比較して、統計的に有意なレベルの脂質付加されたRab6aをもたらす、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
AAV-REP1が細胞当たり少なくとも38,000ゲノムコピー(gc/細胞)の感染多重度（MOI）にて提供され、前記MOIが、過剰発現されたREP1の単位当たりの脂質化されたRab6aの基礎レベルと、過剰発現されたREP1の単位当たりの脂質化されたRab6aの最大レベルの間で等距離の、過剰発現されたREP1の単位当たりの脂質化されたRab6aのレベルを提供する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
AAV-REP1が細胞当たり少なくとも81,000ゲノムコピー(gc/細胞)の感染多重度（MOI）にて提供され、前記MOIが、過剰発現されたREP1の単位当たりの脂質化されたRab6aの基礎レベルと、過剰発現されたREP1の単位当たりの脂質化されたRab6aの最大レベルの間で等距離の、過剰発現されたREP1の単位当たりの脂質化されたRab6aのレベルを提供する、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
AAV-REP1が細胞当たり少なくとも10,000、30,000、100,000、又は300,000ゲノムコピー(gc/細胞)の感染多重度（MOI）にて提供される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
AAV-REP1ベクターがAAV2ゲノムを含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
AAV-REP1ベクターがAAV2カプシドタンパク質を含む、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
AAV-REP1ベクターがCAGプロモーターを含み、REP1タンパク質をコードする配列が前記CAGプロモーターの制御下にある、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
細胞がヒト細胞である、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
細胞が網膜細胞である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
細胞が網膜色素上皮(RPE)細胞である、請求項２１または２２に記載の方法。
【国際調査報告】
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