(57)【要約】  本発明の結核診断方法は、被検体のサンプルに酸性物質を処理して結核抗原複合体から抗原を解離する前処理過程によりサンプル内の遊離結核抗原を増加させることで結核抗原と検出抗体の反応性を向上させることができ、結核の臨床現場即時検査が可能であり、迅速で簡単な検出方法として臨床現場即時検査にすぐ活用することができる。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
被検体から採取したサンプルに含まれた結核抗原複合体から抗原を解離するために酸性物質を処理するステップと、
解離した抗原を含むサンプルまたは解離した抗原を中和するために中和試薬を処理するステップと、
解離した抗原に特異的に結合可能な抗体を処理するステップとを含む、結核診断方法。
【請求項２】
前記被検体から採取したサンプルは、血液（全血、血漿、血清）、尿、喀痰、唾液、関節液、口腔粘膜液（oral mucosal transudate）および脳下垂体からなる群から選択される、請求項１に記載の結核診断方法。
【請求項３】
前記抗原は、Ｍｐｔ６４、ＥＳＡＴ６（the ６‐kDa early secreted antigenic target）、ＣＦＰ１０（the １０‐kDa culture filtrate protein）、Ａｇ８５（the antigen ８５ complex）、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５Ｂ、Ａｇ８５Ｃ、ＨｓｐＸ、ＬＡＭおよび３８ｋＤａタンパク質からなる群から選択される、請求項１に記載の結核診断方法。
【請求項４】
前記酸性物質は、グリシンバッファー（glycine buffer）、クエン酸塩バッファー（citrate buffer）および酢酸塩バッファー（acetate buffer）からなる群から選択される、請求項１に記載の結核診断方法。
【請求項５】
前記酸性物質のｐＨは、２．０〜４．０である、請求項１に記載の結核診断方法。
【請求項６】
前記中和試薬を処理するステップは、塩基性バッファー溶液または塩基性バッファー乾燥パッドを使用して行われる、請求項１に記載の結核診断方法。
【請求項７】
前記抗体を処理するステップは、抗体‐標識体接合体が処理された乾燥パッドを使用して行われる、請求項１に記載の結核診断方法。
【請求項８】
前記中和試薬を処理するステップおよび前記抗体を処理するステップは、塩基性バッファー溶液に抗体‐標識体接合体が添加された溶液；または塩基性バッファー溶液に抗体‐標識体接合体が添加された溶液を凍結乾燥した固相物を使用して同時に行われる、請求項１に記載の結核診断方法。
【請求項９】
被検体から採取したサンプルに含まれた結核抗原複合体から抗原を解離するための酸性試薬と、
解離された抗原を中和するための中和試薬と、
抗体が固定化された固相体（solid phase）とを含む、結核検査用キット。
【請求項１０】
前記キットは、免疫クロマトグラフィキットまたはＥＬＩＳＡ（enzyme‐linked immunosorbent assay）キットである、請求項９に記載の結核検査用キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、結核にかかったか否かを診断することができる結核遊離型抗原の比率を増加させることで、結核の迅速な臨床現場即時検査が可能な方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
結核菌（mycobacterium tuberculosis）の感染による感染症である結核は、世界的に発病率が高く、死亡率も高い疾病と知られている。結核を発病初期に診断して治療できなかった場合には死亡に至る可能性が高く、様々な結核診断方法に関する研究が必要である。
【０００３】
結核の診断方法としては様々な方法が知られている。ツベルクリン皮膚反応検査（tuberculin skin test、ＴＳＴ）は、高い敏感度を有し且つ安価であるものの、特異性が低くて結核診断の信頼度が低いという欠点がある。結核菌の培養方法は、信頼度が最も高い検索方法であるが、結核菌を分離および培養するため危険性が高く、培養期間が長くて、診断結果を得るまで非常に長い時間がかかるという欠点がある。最近、液体培地を利用して培養期間を短縮する方法が導入されているが、非結核性抗酸菌との鑑別のためのさらなる確定診断テストが必要であるという問題がある。核酸増幅（nucleic acid amplification）法は、迅速で高い敏感度を示し、薬剤耐性も区別可能であるが、高価な装備と人手が必要となるため、結核診断製品のニーズが高い低所得国での使用は難しいという問題がある。
【０００４】
結核の迅速な診断および治療のためには、臨床現場即時検査（point of care test、ＰＯＣＴ）が可能な結核診断方法が必要である。結核の臨床現場即時検査方法の一つである顕微鏡を利用した塗抹染色は、訓練された専門家と実験室が必要であり、敏感度が低くて、診断の正確性が低い。血清学的結核診断方法は、患者の血液や血清を採取し、結核菌の感染によって生成された抗体を診断する方法であり、現在、迅速で安価な抗体診断製品が商業化しており、数分内に結果の確認が可能で、専門家を必要としないという利点があるが、活動性結核と潜伏性結核の区別が難しく敏感度が非常に低い。結核菌の抗原を介する診断方法は、喀痰、血清、尿や脳下垂体にある結核菌抗原検出により結核を診断する方法であって、様々な製品があるが、結核菌の培養が必要であったり、正確度、敏感度などが低いことがある。結核菌抗原検出による結核診断方法の例としては、韓国登録特許第１０‐１５２４１０９号などが挙げられる。
【０００５】
本発明は、かかる結核の診断方法の問題を解決すべく、結核にかかった患者に形成された抗原複合体を簡単な方法で解離し、抗原複合体の解離によって増加した遊離型抗原を利用して、簡単且つ迅速に結核臨床現場即時検査が可能な方法を提供する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００６】
【特許文献１】韓国登録特許第１０‐１５２４１０９号
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明は、結核の臨床現場即時検査のために被検者から採取した試料に含まれた抗原複合体から抗原を解離して遊離型抗原を増加させ、増加した遊離型抗原を利用して結核の臨床現場即時検査が可能な方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、被検体から採取したサンプルに酸性物質を処理した後、結核菌の分泌抗原に対する抗体を処理する結核診断方法を提供する。
【０００９】
本発明は、被検体から採取したサンプルに含まれた結核抗原複合体から抗原を解離するための酸性試薬、解離し抗原を中和するための中和試薬および抗体が固定化された固相体（solid phase）を含む結核検査用キットを提供する。
【発明の効果】
【００１０】
本発明は、高い正確度および敏感度を有する結核の臨床現場即時検査方法を提供することができる。本発明の結核診断方法は、簡単且つ迅速で、臨床現場即時検査にすぐ適用することができる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】本発明の結核診断方法の過程を示す図である（TB patient serum； 結核患者の血清）。
【図２】本発明の一実施形態で使用した免疫クロマトグラフィストリップ（Immunochromatography strip）のラミネーション構造を示す図である。
【図３】本発明の結核診断方法による結核診断結果を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下、本発明について具体的に説明する。本明細書で使用される用語は、別に定義しない場合、当該分野において通常の知識を有する者が一般的に理解している内容に解釈すべきである。本明細書の図面および実施例は、通常の技術者が本発明を容易に理解し実施するためのものであって、図面および実施例で発明の要旨を不明瞭にし得る内容は省略可能であり、本発明は図面および実施例に限定されるものではない。
【００１３】
本発明は、結核を臨床現場即時検査することができる方法に関し、被検体から採取したサンプルに酸性物質を処理した後、結核菌の分泌抗原に対する抗体を処理する結核診断方法または結核診断のための情報を提供する方法を提供することができる。
【００１４】
具体的には、本発明は、被検者のサンプル（試料）を採取するステップと、サンプルに酸性物質を処理するステップと、サンプルを中和するステップと、結核菌特異抗原に対する抗体を処理するステップとを含む結核診断方法を提供することができる。
【００１５】
本発明において、被検者は、結核にかかっているか感染の可能性があるヒトおよび動物を含み、結核を診断するための対象の全体を意味し得る。
【００１６】
本発明において、被検者のサンプル（または試料）は、血液（全血、血漿、血清）、尿、喀痰、唾液、関節液、口腔粘膜液（oral mucosal transudate）および脳下垂体からなる群から選択される一つ以上が好ましいが、これに制限されるものではない。被検者のサンプルは、結核菌によって生成される結核菌抗原複合体が存在し得るサンプルをいずれも含むことができる。
【００１７】
本発明において、酸性物質は、被検者のサンプルに含まれている結核菌抗原複合体から結核菌抗原を解離するための物質全般を含むことができる。酸性物質は、グリシンバッファー（glycine buffer）、クエン酸塩バッファー（citrate buffer）、および酢酸塩バッファー（acetate buffer）からなる群から選択される一つ以上であり、グリシンバッファーが好ましいが、これに制限されるものではない。結核菌抗原複合体から結核菌抗原を解離することができる酸性物質であれば、特に制限されず使用可能である。本発明において、結核菌抗原複合体は、結核菌抗原が他の生体分子、化合物または人工物質と結合して形成され得る複合体を意味し得る。例えば、抗原‐抗原複合体や抗原‐抗体複合体が代表的であるが、これに制限されるものではない。
【００１８】
本発明において、酸性物質のｐＨは、１．０〜６．０、１．０〜５．５、１．０〜５．０、１．０〜４．５、１．０〜４．０、２．０〜６．０、２．０〜５．５、２．０〜５．０、２．０〜４．５、好ましくは、２．０〜４．０である。本発明において、酸性物質の濃度は、０．０５〜２．０Ｍ、０．０５〜１．５Ｍ、０．０５〜１．０Ｍ、０．０５〜０．５Ｍ、０．０５〜０．１Ｍ、０．１〜２Ｍ、０．１〜１．５Ｍ、０．１〜１．０Ｍ、０．１〜０．９Ｍ、０．１〜０．８Ｍ、０．１〜０．７Ｍ、０．１〜０．６Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、好ましくは、０．０５〜２．０である。抗原複合体の種類によって抗原‐抗原または抗原‐抗体の結合強度が異なり得、酸性物質の濃度は、使用する中和試薬の種類によって異なり得る。
【００１９】
抗原‐抗原複合体の例として、Ａｇ８５Ａ、Ａｇ８５ＢおよびＡｇ８５ＣのようなＡｇ８５複合体（Ａｇ８５ complex）があり、Ａｇ８５複合体は、宿主細胞（host cell）のフィブロネクチン（fibronectin）およびエラスチン（Elastin）タンパク質と結合して結核菌の感染活動に寄与すると知られている。抗原‐抗原複合体の他の例として、ＣＦＰ‐１０とＥＳＡＴ６は、ＲＤ１遺伝子でともに発現するＣＦＰ‐１０およびＥＳＡＴ６タンパク質であり、これらがヘテロダイマー（heterodimer）をなして形成されたＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６が挙げられ、ＣＦＰ１０／ＥＳＡＴ６は、結核菌の病原性に寄与すると知られている。
【００２０】
抗原‐抗体複合体は、結核患者の血液のような体液で形成される免疫複合体（immune complex）であり、結核菌が分泌する分泌抗原に特異的なＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭなどの発現によって形成される複合体を含むことができる。
【００２１】
本発明において、結核菌抗原複合体から解離する結核菌分泌抗原は、Ｍｐｔ６４、Ｅｓａｔ６（the ６‐kDa early secreted antigenic target）、Ｃｆｐ１０（the １０‐kDa culture filtrate protein）、ＨｓｐＸ（１４kDa）、３８ｋＤａタンパク質（３８kDa protein）、ＬＡＭおよびＡｇ８５（the antigen ８５ complex）からなる群から選択される一つ以上であってもよく、これに制限されるものではない。
【００２２】
本発明において、結核菌抗原特異抗体は、Monoclonal（またはpolyclonal）anti‐ＣＦＰ１０ antibody、Monoclonal（またはpolyclonal）anti‐Ａｇ８５Ａ antibody、Monoclonal（またはpolyclonal）anti‐Ａｇ８５Ｂ antibody、Monoclonal（またはpolyclonal）anti‐Ａｇ８５Ｃ antibody、Monoclonal（またはpolyclonal）anti‐ＥＳＡＴ６ antibody、Monoclonal（またはpolyclonal）anti‐ＨｓｐＸ（１４kDa）antibody、Monoclonal（またはpolyclonal）anti‐Ｍｐｔ６４ antibody、Monoclonal（またはpolyclonal）anti‐３８kDa antibodyおよびMonoclonal（またはpolyclonal）anti‐ＬＡＭ antibodyからなる群から選択される一つ以上であってもよく、これに制限されるものではない。
【００２３】
本発明の結核診断方法は、より具体的には、以下のような方法からなることができる。
【００２４】
本発明の結核診断方法は、被検体からサンプルを採取するステップと、サンプルに含まれた結核抗原複合体から抗原を解離するために酸性物質を処理するステップと、解離した抗原を含むサンプルまたは解離した抗原を中和するために中和試薬を処理するステップと、解離した抗原に特異的に結合可能な抗体を処理するステップとを含む方法であり得る。
【００２５】
被検体からサンプルを採取するステップは、サンプルの種類（喀痰、尿、血液など）に応じて公知の検出方法により行われてもよく、特に制限されるものではない。
【００２６】
被検体から採取したサンプルには、結核菌抗原によって形成された抗原複合体が存在することがあり、抗原複合体から抗原を解離するために、酸性物質を処理するステップを行う。酸性物質をサンプルに処理すると、抗原複合体から抗原が解離し、サンプルに遊離型抗原（free antigen）が増加する。遊離型抗原の増加に伴い、以降処理される結核菌抗原に特異的な抗体による抗原‐抗体反応も増加し、結核診断の正確性および敏感度が向上することができる。
【００２７】
被検体から採取したサンプルに酸性物質を処理した後、中和ステップを経るが、酸性のサンプルまたはサンプルに含まれた抗原を中和する。中和ステップは、遊離型抗原と抗体を反応させるために適した環境を提供するために必要である。中和のための中和試薬は、塩基性物質であれば特に制限されず、先に使用した酸性物質、抗原の種類、以降処理する抗体の種類などによって適宜使用することができる。中和試薬は、例えば、TRIS（tris‐［hydroxymethyl］‐aminomethane）、カーボネート（carbonate）およびボレート（borate）からなる群から選択される一つ以上を使用することができるが、これに制限されるものではない。サンプルと中和試薬は、１:１〜１:１０体積比で反応させることが好ましいが、これに制限されるものではなく、使用試薬とサンプルの酸性程度によって適宜調節することができる。
【００２８】
本発明において、中和試薬のｐＨは、８．０〜１０．５、８．０〜１１．０、９．０〜１０．０、９．０〜１０．５、９．０〜１１．０、好ましくは、８．０〜１０．０である。
【００２９】
本発明において、中和試薬の濃度は、０．０２〜０．５Ｍ、０．０２〜０．４Ｍ、０．０２〜０．３Ｍ、０．０２〜０．２Ｍ、０．０３〜０．５Ｍ、０．０３〜０．４Ｍ、０．０３〜０．３Ｍ、０．０３〜０．２Ｍ、０．０４〜０．５Ｍ、０．０４〜０．４Ｍ、０．０４〜０．３Ｍ、０．０４〜０．２Ｍ、０．０５〜０．５Ｍ、０．０５〜０．４Ｍ、０．０５〜０．３Ｍ、０．０５〜０．２Ｍ、０．０６〜０．５Ｍ、０．０６〜０．４Ｍ、０．０６〜０．３Ｍ、０．０６〜０．２Ｍ、０．０７〜０．５Ｍ、０．０７〜０．４Ｍ、０．０７〜０．３Ｍ、０．０７〜０．２Ｍ、０．０８〜０．５Ｍ、０．０８〜０．４Ｍ、０．０８〜０．３Ｍ、０．０８〜０．２Ｍ、０．０９〜０．５Ｍ、０．０９〜０．４Ｍ、０．０９〜０．３Ｍ、０．０９〜０．２Ｍ、０．１〜０．５Ｍ、０．１〜０．４Ｍ、０．１〜０．３Ｍ、０．１〜０．２Ｍである。中和試薬の濃度は、使用する酸性物質および結核抗原複合体の種類によって異なり得る。
【００３０】
本発明の一実施形態によると、結核抗原のうちＡｇ８５を検出するために酸性物質として０．０５〜２．０Ｍのグリシンを処理するときに、中和試薬として０．１〜０．５Ｍのトリス（TRIS）を処理すると、Ａｇ８５の検出効果が著しく上昇することができる。本発明の他の一実施形態によると、結核抗原のうちＣＦＰ１０を検出するために酸性物質として０．０５〜１．０Ｍのグリシンを処理するときに、中和試薬として０．０２〜０．２Ｍのトリス（TRIS）を処理すると、ＣＦＰ１０の検出効果が著しく上昇することができる。本発明のさらに他の一実施形態によると、結核抗原のうちＥＳＡＴ６を検出するために酸性物質として０．０５〜１．０Ｍのグリシンを処理するときに、中和試薬として０．０２〜０．２Ｍのトリス（TRIS）を処理すると、ＥＳＡＴ６の検出効果が著しく上昇することができる。
【００３１】
中和ステップの後または中和試薬処理とともにサンプルに抗体を処理し、サンプルに含まれた遊離型抗原を含む結核菌抗原と抗原‐抗体反応を誘導することができる。抗体の検出対象である結核菌抗原の種類に応じて適宜選択することができ、特に制限されるものではない。抗体は、抗原の検出のための検出抗体（detection antibody）として抗原と複合体をなす他のタンパク質と競争反応を誘導する。抗体は、標識体（indicator）が結合した標識抗体（labeled antibody）が好ましいが、これに制限されるものではない。標識抗体は、抗体‐標識体接合体（antibody-indicator conjugant）と表記することができる。標識体は、金ナノ粒子、ペルオキシダーゼ（peroxidase）といった酵素、蛍光物質（fluorescent substance）、ラテックスビーズ（latex bead）、セルロースナノビーズといった様々な染色物質を使用することができるが、これに制限されるものではない。
【００３２】
抗体処理の後、サンプルの抗原と抗体が結合したものを検出するために、免疫検出ステップを行うことができる。免疫検出のための方法は、特に制限されず、公知の様々な免疫検出方法を使用して抗体と結核菌抗原との結合によって結核にかかったか否かを診断することができる。本発明の一実施形態によると、中和バッファー（neutralization buffer）の中の抗原‐検出抗体を免疫クロマトグラフィ（immunochromatography）やマイクロプレート（microplate）に固定化された他の抗体（immobilized antibody）と反応させ、洗浄および発色反応により結核にかかったか否かを最終的に確認することができる。
【００３３】
本発明は、以上の結核診断方法を行うことができ、結核の臨床現場即時検査に使用することができる結核診断用キットを提供することができる。
【００３４】
本発明の結核診断用キットは、被検体から採取したサンプルに含まれた結核抗原複合体から抗原を解離するための酸性試薬と、解離された抗原を中和するための中和試薬と、抗体が固定化された固相体（solid phase）とを含むことができる。
【００３５】
本発明において、結核診断用キットは、抗体が固定化された固相体や抗原‐抗体反応のために使用する物質である抗体、酵素、標識物質（放射能物質、蛍光物質など）などの種類に応じて、免疫クロマトグラフィキット、ELISA（enzyme‐linked immunosorbent assay）キットまたは競合アッセイ（competition assay）キットとして作製することができる。
【００３６】
本発明の結核診断用キットは、必要に応じて、結核抗原に特異的であるか固定化した抗体と結合することができる抗体をさらに含むことができる。
【００３７】
以下、本発明を実施するための実施例について説明する。実施例は、本発明を実施するための一つの例示に相当するものであって、本発明が実施例によって限定して解釈されてはならない。
【００３８】
［実施例１］
（１）免疫クロマトグラフィ法を利用した結核診断
結核にかかった被検体から採取した血清または血漿サンプルを、酸性物質であるｐＨ２．０〜４．０の１．０Ｍグリシン（glycine）に１／１０（サンプル／酸性物質）の体積比で混合した後、３０分以内に前処理して反応させた。
【００３９】
グリシンに反応させたサンプルに含まれた遊離型抗原検出による結核診断のために、免疫クロマトグラフィテスト装置を以下のように製造した。
【００４０】
‐抗体固定化：ＮＣメンブレン上に抗体をライン状に分注して乾燥し、固定化した。
【００４１】
‐中和パッドの構成：ｐＨ８．０の１００ｍＭTris‐HCl、０．５〜２．０％カゼイン（casein）、０．５〜２％界面活性剤（Tween２０、Triton X‐１００）、２０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌを処理したバッファーを製造し、ガラス繊維（glass fiber）に浸漬して乾燥し、中和パッドを構成した。
【００４２】
‐中和バッファー：ｐＨ８．０以上の１００ｍＭ Tris‐HCl、０．５〜２．０％カゼイン（casein）、０．５〜２％界面活性剤（Tween２０、Triton X‐１００）、２０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌを処理したバッファーを製造した。
【００４３】
‐抗体‐金接合体（gold‐antibody conjugate）の製造：４０〜６０ｎｍサイズの金コロイド（colloidal gold）にマウス由来抗結核抗原モノクローナル抗体を１〜１０μｇ／ｍｌで反応させ、ブロッキング試薬（blocking agent）としてカゼインや牛血清アルブミン（bovine serum albumin、ＢＳＡ）を０．１〜１．０％で処理した後、洗浄し、精製された抗結核抗体‐金接合体を得た。
【００４４】
‐接合体パッド（conjugate pad）の製造：抗結核抗体‐金接合体をスクロース（sucrose）とＢＳＡが添加されたリン酸緩衝液（phosphate buffer）に適正濃度で処理し、０．４５μｍフィルタで濾過した後、接合体パッドに浸漬し、乾燥してパッドを構成した。
【００４５】
‐免疫クロマトグラフィストリップの製造：抗体固定化ＮＣメンブレン、中和パッド、抗体‐金接合体が処理された接合体パッドを使用し、図２のように免疫クロマトグラフィストリップを製造した。
【００４６】
（２）免疫クロマトグラフィ法を利用した結核診断
結核にかかった被検体から採取した血清または血漿サンプルを酸性物質であるｐＨ２．０〜４．０の１．０Ｍグリシン（glycine）に１／１０（サンプル／酸性物質）の体積比で混合した後、３０分以内に前処理して反応させた。
【００４７】
グリシンに反応させたサンプルに含まれた遊離型抗原検出による結核診断のために、免疫クロマトグラフィテスト装置を以下のように製造した。
【００４８】
‐抗体固定化：ＮＣメンブレン上に抗体をライン状に分注して乾燥し、固定化した。
【００４９】
‐中和抗体：ｐＨ８．０の１００ｍＭ Tris‐HCl、０．５〜２．０％カゼイン（casein）、０．５〜２％界面活性剤（Tween２０、Triton X‐１００）、２０〜５００ｍＭ  ＮａＣｌを処理したバッファーを製造し、４０〜６０ｎｍサイズの金コロイド（colloidal gold）にマウス由来抗結核抗原モノクローナル抗体を１〜１０μｇ／ｍｌで反応させ、ブロッキング試薬（blocking agent）としてカゼインや牛血清アルブミン（bovine serum albumin、ＢＳＡ）を０．１〜１．０％で処理した後、洗浄し、精製された抗結核抗体‐金接合体を添加した後、安定剤としてＰＥＧ、デキストラン（dextran）、ＰＶＡ、スクロース（sucrose）、トレハロース（trehalose）、マンニトール（mannitol）などの成分を適量追加した。このように液状の中和抗体またはこれをさらに１６〜４８時間凍結乾燥を行って乾燥した中和抗体を製造した。
【００５０】
‐免疫クロマトグラフィストリップの製造：抗体固定化ＮＣメンブレンおよびクロマトグラフィのためのガラス繊維（Glass fiber）またはセルロースパッド（cellulose Pad）類を使用し、図２と同一の構造の免疫クロマトグラフィストリップを製造した。
【００５１】
以上で製造した免疫クロマトグラフィストリップにグリシンで前処理した被検体のサンプル自体または前処理した被検体のサンプルと中和バッファーまたは前処理した被検体のサンプルと中和抗体を適正の比率で混合して処理し、結核抗原検出の結果を確認した（図３）。
【００５２】
結核抗原であるＣＦＰ‐１０検出のために、抗体として抗ＣＦＰ‐１０抗体を使用した。
【００５３】
結核抗原検出の結果、グリシンで前処理したサンプルの場合、免疫クロマトグラフィストリップの検査線の位置で明らかなバンドが示され、結核抗原が検出されることを確認することができた。しかし、グリシンで前処理していないサンプルの場合、検査線の位置でバンドがほとんど示されず、結核抗原の検出程度が非常に低かった。
【００５４】
結核抗原として、Ａｇ８５検出のために抗Ａｇ８５抗体を使用した場合（実施例２〜３４参照）にもグリシンで前処理したサンプルの場合、免疫クロマトグラフィストリップの検査線の位置で明らかなバンドが示され、結核抗原が検出されたことを確認することができたが、グリシンで前処理していないサンプルの場合、検査線の位置でバンドがほとんど示されず、結核抗原の検出程度が非常に低かった。
【００５５】
かかる結果は、一般的な抗原‐抗体反応では結核にかかったか否かの正確な判別が難しい患者（結核抗原複合体によって検出抗原が十分でない患者など）であっても、本発明の結核診断方法では正確な診断が可能であることを示す。
【００５６】
また、免疫クロマトグラフィストリップは、簡単に製造することができ、製造コストも低く、臨床現場即時検査に本発明の結核診断方法をすぐ適用し、活用することができる。
【００５７】
［実施例２〜実施例３４］
実施例１のような方法で結核抗原検出を実施した。使用した酸性物質、中和試薬、抗体および検出有無は、以下の［表１］、［表２］、［表３］、［表４］に示した。
【００５８】
検出有無は、計２０個の免疫クロマトグラフィストリップで検査線に示されたバンド（結核抗原複合体で解離された結核抗原と使用抗体の結合によって表示）の数により確認し、以下の式によって計算した結果、６０％以上の場合、検出強度を高いとし、２０％以上６０％未満の場合、検出強度は低いとし、２０％未満の場合、未検出とした。
【００５９】
検出強度＝［検査線にバンドが示された免疫クロマトグラフィストリップの数／総免疫クロマトグラフィストリップの数］＊１００
（臨床現場即時検査に使用するためには、肉眼ですぐ判別することができるか否かが重要であるため、検査線のバンドが示されるか否かは肉眼で判別した。）
【００６０】
【表１】
2021508836.tif 000003
【００６１】
［表１］の結果によると、Glycineの濃度が０．５〜２．０Ｍ、TRISの濃度範囲が０．１〜０．５Ｍであるときに、結核‐抗原複合体でＡｇ８５Ｂの効果的な解離および検出が可能であることを確認することができた。
【００６２】
【表２】
2021508836.tif 000004
【００６３】
［表２］の結果によると、Glycineの濃度が０．０５〜１．０Ｍ、TRISの濃度範囲が０．０２〜０．２Ｍであるときに、結核‐抗原複合体でＣＦＰ１０の効果的な解離および検出が可能であることを確認することができた。
【表３】
2021508836.tif 000005
【００６４】
［表３］の結果によると、Glycineの濃度が０．０５〜１．０Ｍ、TRISの濃度範囲が０．０２〜０．２Ｍであるときに、結核‐抗原複合体でＥＳＡＴ６の効果的な解離および検出が可能であることを確認することができた。
【００６５】
【表４】
2021508836.tif 000006
【００６６】
［表４］の結果によると、中和試薬としてBorateおよびCarbonateを使用したときにも、結核抗原複合体からＡｇ８５Ｂ、ＣＦＰ１０およびＥＳＡＴ６の効果的な解離および検出が可能であることを確認することができた。
【００６７】
以上の結果から、酸性物質の処理および中和試薬の処理により、結核抗原複合体から結核抗原（ＣＦＰ１０、Ａｇ８５、ＥＳＡＴ６）の効果的な解離および検出が可能であることを確認することができた。
【図１】
2021508836.tif 000007
【図２】
2021508836.tif 000008
【図３】
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【国際調査報告】
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