(57)【要約】  本発明は、ヒドロキシラーゼとしてのタンパク質の使用、タンパク質を含む宿主細胞、ヒドロキシ−ピペコリン酸（ＨＰＡ）の生成におけるタンパク質または宿主細胞の使用、ＨＰＡを生成および精製する方法、タンパク質、突然変異タンパク質および突然変異タンパク質をコードする核酸、ならびにタンパク質をコードする核酸を含むベクターに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ヒドロキシラーゼとしてのタンパク質の使用であって、タンパク質が、
−  配列番号１のポリペプチド、またはピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するその機能的に活性な変異体であって、配列番号１のポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性を有する機能的な活性な変異体；および／または
−  配列番号２のポリペプチド、またはピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するその機能的に活性な変異体であって、配列番号２のポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性を有する機能的に活性な変異体
を含む、使用。
【請求項２】
配列番号１のポリペプチドの機能的に活性な変異体が、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し；または、配列番号２のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号２の親ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
タンパク質が、配列番号１または２のポリペプチドを含むかまたはそれからなる、請求項１または２のいずれかに記載の使用。
【請求項４】
タンパク質が、配列番号１のポリペプチドを含むかまたはそれからなる、請求項１〜３のいずれかに記載の使用。
【請求項５】
タンパク質が、ピペコリン酸（ＰＡ）、具体的にはＬ−ピペコリン酸（Ｌ−ＰＡ）をヒドロキシ−ピペコリン酸（ＨＰＡ）、具体的には５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（５−ＨＰＡ）、より具体的にはシス−５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（シス−５−ＨＰＡ）、さらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡ）にヒドロキシル化することができる、請求項１〜４のいずれかに記載の使用。
【請求項６】
タンパク質が
ｉ）少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の５−ＨＰＡに関する位置選択性；
ｉｉ）少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％のシス−５−ＨＰＡに関する立体選択性；および／または
ｉｉｉ）少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の変換率
によって特徴付けられる、請求項５に記載の使用。
【請求項７】
宿主細胞であって、以下を含む
ａ．請求項１および３〜６のいずれかに定義される配列番号１のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸、ここで該細胞が、ミクロモノスポラ  エキノスポラ細胞ではなく、具体的にはミクロモノスポラ属細胞ではなく、より具体的にはミクロモノスポラ科（細胞ではなく、なおより具体的にはミクロモノスポラ目細胞ではなく、さらにより具体的には放線菌門細胞ではなく、特に細菌細胞ではない；または
ｂ．請求項１および３〜６のいずれかに定義される配列番号２のポリペプチドまたは該ポリペプチドをコードする核酸、ここで、該細胞が、コルディア  ジェジュドネンシス細胞ではなく、具体的にはコルディア属細胞ではなく、より具体的にはフラボバクテリア科細胞ではなく、なおより具体的にはフラボバクテリア目細胞ではなく、さらにより具体的にはバクテロイデス門細胞ではなく、特に細菌細胞ではない；または
ｃ．（ｉ）請求項１および３〜６のいずれかに定義される配列番号１のポリペプチドおよび少なくとも１つの追加のアミノ酸もしくは（ｉｉ）請求項１〜６のいずれかに定義される配列番号１のポリペプチドの機能的に活性な変異体を含むタンパク質、または該タンパク質をコードする核酸、具体的に、該細胞が、ミクロモノスポラ  エキノスポラ細胞ではなく、具体的にはミクロモノスポラ属細胞ではなく、より具体的にはミクロモノスポラ科細胞ではなく、なおより具体的にはミクロモノスポラ目細胞ではなく、さらにより具体的には放線菌門細胞ではなく、特に細菌細胞ではない；または
ｄ．（ｉ）請求項１および３〜６のいずれかに定義される配列番号２のポリペプチドおよび少なくとも１つの追加のアミノ酸もしくは（ｉｉ）請求項１〜６のいずれかに定義される配列番号２のポリペプチドの機能的に活性な変異体を含むタンパク質、または該タンパク質をコードする核酸、具体的に、該細胞が、コルディア  ジェジュドネンシス細胞ではなく、具体的にはコルディア属細胞ではなく、より具体的にはフラボバクテリア科細胞ではなく、なおより具体的にはフラボバクテリア目細胞ではなく、さらにより具体的にはバクテロイデス門細胞ではなく、特に細菌細胞ではない；
前記宿主細胞。
【請求項８】
宿主細胞が、真核細胞、具体的には動物細胞、植物細胞もしくは真菌細胞であるか、または宿主細胞が、原核細胞であり、請求項７において定義されるタンパク質、ポリペプチドまたは核酸が天然には見いだされない、請求項７に記載の宿主細胞。
【請求項９】
ＨＰＡ、具体的には５−ＨＰＡ、より具体的にはシス−５−ＨＰＡ、さらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡ）の生成における、請求項１〜６のいずれかに定義されるタンパク質または請求項７もしくは８に記載の宿主細胞の使用。
【請求項１０】
酸素の存在下で請求項１〜６のいずれかに定義されるタンパク質を用いて、ＰＡ、特にＬ−ＰＡをヒドロキシル化することを含む、ＨＰＡを生成する方法。
【請求項１１】
ＨＰＡが、５−ＨＰＡ、具体的にはシス−５−ＨＰＡ、さらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
タンパク質が、請求項７または８に記載の宿主細胞において生成される、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
ヒドロキシル化が、酸素アクセプター／補基質、具体的にはα−ケトグルタル酸の存在下およびＦｅ２＋の存在下で行われる、請求項１０〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
ヒドロキシル化が、ｐＨ４．５〜８を有する水性環境において、５℃〜３０℃の温度でおよび／または５０ｍＭ〜５００ｍＭのα−ケトグルタル酸濃度で、２５ｍＭ〜２００ｍＭのＰＡ濃度、具体的にはＬ−ＰＡ濃度を用いて行われる、請求項１０〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
方法が、ＨＰＡ、具体的にはシス−５−ＨＰＡまたはさらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡを単離するステップを含んでもよい、請求項１０〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
宿主細胞、具体的には請求項７または８に記載の宿主細胞において、タンパク質をコードする核酸を発現させることを含む、請求項１〜６のいずれかに定義されるタンパク質を生成する方法。
【請求項１７】
ａ）請求項１〜６のいずれかに定義されるタンパク質をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞、具体的には請求項７または８に記載の宿主細胞に導入すること、
ｂ）請求項１〜６のいずれかに定義されるタンパク質の発現を可能にする条件下で該宿主細胞を増殖させること、
ｃ）該宿主細胞からタンパク質を単離してもよい
を含む、請求項１〜６のいずれかに定義されるタンパク質を生成する方法。
【請求項１８】
−  配列番号１のポリペプチド、ならびに特にＣ末端および／またはＮ末端の少なくとも１つの追加のアミノ酸；
−  配列番号２のポリペプチド、ならびに特にＣ末端および／またはＮ末端の少なくとも１つの追加のアミノ酸；
−  配列番号１のポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるが、配列番号１のポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性を有し、ピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有する、配列番号１のポリペプチドの機能的に活性な変異体；または
−  配列番号２のポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるが、配列番号２のポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性を有し、ピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有する、配列番号２のポリペプチドの機能的に活性な変異体
を含むかまたはそれからなるタンパク質であって、
具体的には、該タンパク質は、請求項２〜６のいずれかにあるようにさらに特徴付けられる、前記タンパク質。
【請求項１９】
請求項１８に記載のタンパク質をコードする核酸。
【請求項２０】
請求項１９に記載される核酸または請求項１〜６のいずれかに定義されるタンパク質をコードする核酸を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
政府支援の承認：本発明は、米国保健社会福祉省から授与された契約番号ＨＨＳＯ１００２０１６０００３８Ｃに基づく政府支援により行われた。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
本発明は、ヒドロキシラーゼとしてのタンパク質の使用、タンパク質を含む宿主細胞、ヒドロキシ−ピペコリン酸（ＨＰＡ）の生成におけるタンパク質または宿主細胞の使用、ＨＰＡを生成する方法、タンパク質、突然変異タンパク質、および突然変異タンパク質をコードする核酸を生成する方法、ならびにタンパク質をコードする核酸を含むベクターに関する。
【発明の概要】
【０００３】
環状ヒドロキシ−アミノ酸は、新しい治療薬候補を開発するための適切な構成要素である。これらの化合物は、ペプチドの合成におけるβ−ターン誘導剤であり、それ自体が良好な酵素阻害剤である。実際に、ヒドロキシ−アミノ酸の立体選択的な合成は、主に酵素阻害剤としてのこのクラスの化合物のいくつかの代表の潜在的な生物活性のために、過去数十年間に成長している分野である。具体的には、ヒドロキシル化ピペコリン酸などの立体配座が制約されたヒドロキシ−アミノ酸は、非常に興味深い標的分子である。例えば、化合物（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシ−ピペコリン酸は、Ｃａｌｌｉａｎｄｒａ  ｐｉｔｔｉｅｒｉおよびＳｔｏｐｈａｎｔｕｓ  ｓｃａｎｄｅｕｓから分離された天然生成物であり、シス−５−ヒドロキシ置換されたピペコリン酸骨格は、微生物由来のアルカロイドおよびさらには植物（フェブリフギン、シュードコンヒドリン）に頻繁に見いだされる。さらに、Ｂａｐｈｉａ  ｒａｃｅｍｏｓａの種子から分離されたトリヒドロキシ−ピペコリン酸は、特定のヒト肝臓ベータ−グルコシダーゼ阻害活性を有することが証明された。
【０００４】
５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（ＨＰＡ）は、ベータ−ラクタマーゼ阻害剤として作用する可能性を有するジアザビシクロオクタン誘導体などの薬理学的に活性な化合物の合成のための、用途の広い構成要素である（例えば、米国特許出願第２０１６／０２６４５７３号またはＰＣＴ公開第ＷＯ０２／１０１７２号を参照されたい）。
【０００５】
当該技術分野において、５−ヒドロキシ−ピペコリン酸誘導体およびそれらの類似体の化学合成の異なる方法、例えば、Ｄ−グルコースから開始するＮ−Ｂｏｃ−保護されたシス−（２Ｒ，３Ｓ）−３−ヒドロキシ−ピペコリン酸の立体選択的合成は公知である。しかしながら、ヒドロキシピペコリン酸の化学合成、具体的には位置選択的または立体選択的な合成は、多くの場合、効果がなく、複雑であり、および高価である。したがって、本発明者らは、特定の酵素の使用に基づく、５−ヒドロキシ−ピペコリン酸、具体的にはシス−５−ヒドロキシ−ピペコリン酸を生成および精製するための代替方法を提供することを目的とした。
【０００６】
本発明では、驚くべきことにヒドロキシラーゼ活性を示す２つのタンパク質が同定された。具体的には、ＰＨ０５およびＰＨ１２と呼ばれる２つの酵素は、ピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性、具体的にはＬ−ピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性、ならびに５−ＨＰＡの良好な位置選択性およびシス−５−ＨＰＡ、具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡの立体選択性によって特徴付けられることが示され得た（実施例を参照されたい）。
【０００７】
したがって、第１の態様では、本発明は、ヒドロキシラーゼとしてのタンパク質の使用に関し、タンパク質は、
−  配列番号１のポリペプチド、またはピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するその機能的に活性な変異体（機能的に活性な変異体は、配列番号１のポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性を有する）；および／または
−  配列番号２のポリペプチド、またはピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有するその機能的に活性な変異体（機能的に活性な変異体は、配列番号２のポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性を有する）
を含む。
【０００８】
酵素は、高分子生物学的触媒であり、通常、タンパク質であり、化学反応を促進する。酵素が作用し得る分子は基質であり、酵素は基質を生成物に変換する。すべての触媒と同様に、酵素は、その活性化エネルギーを低下させることにより反応速度を上昇させる。
【０００９】
ヒドロキシラーゼは、ヒドロキシル基（−ＯＨ）を化合物に導入する反応を触媒することができる酵素である。ヒドロキシル化は、多くの場合、有機化合物の酸化分解における最初のステップである。ヒドロキシラーゼは、通常、ヒドロキシル化される化合物に基づいて分類される。本ヒドロキシラーゼはプロリンをヒドロキシル化する；したがって、酵素は、プロリンヒドロキシラーゼと呼ばれる。プロリンヒドロキシラーゼは、ヒドロキシル化反応の活性部位にＦｅ２＋を使用するα−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼである。ジオキシゲナーゼ、または酸素トランスフェラーゼは、ヒドロキシル化に分子酸素を使用し、分子酸素（Ｏ２）の両原子を反応の生成物（単数または複数）に組み込む。プロリンヒドロキシラーゼを用いると、第１の酸素は、通常、コハク酸に変換される補基質であるα−ケトグルタル酸に移動し、第２の酸素原子はプロリンに移動する。多くの場合、アスコルビン酸（ビタミンＣ）は、鉄を還元型（Ｆｅ（ＩＩ））に戻すために使用される。
【００１０】
本発明に従えば、本発明に従って本明細書で定義されるタンパク質は、ヒドロキシラーゼとして使用される。これは、タンパク質を、ヒドロキシル化を可能にする条件下でヒドロキシル化される基質と接触させ、ヒドロキシル化が起きるようにすることを意味する。本明細書で定義されるように、タンパク質は、配列番号１または２のポリペプチドまたはその変異体を含む。
【００１１】
配列番号１および配列番号２のポリペプチドは、野生型と呼ばれ、プロリンヒドロキシラーゼ活性を示し、それによりヒドロキシラーゼとして使用され得る。
配列番号１のポリペプチドは、ミクロモノスポラ  エキノスポラ（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｅｃｈｉｎｏｓｐｏｒａ）（ミクロモノスポラ  パープレア（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｐｕｒｐｕｒｅａ））に由来し、以下のアミノ酸配列：
MRTHYVATVP LDDARLGEDL ERSLSLRWSE AYSDYIFGGS WNSCMLWAPG GDTGDGVVTN   60
YAYDRPPAFT AYADQLPYLR KLITDTADLD RLNFARLALV TNSVGIPHRD LLELDDLPNQ  120
SRNAHRMHIP LATDDNCLFT EGNTVYRMRQ GEIWFLDASV IHAVAVLSGI KRIHLMLDFV  180
DTPDPGSLLT VAGGTPDTGI PADRMVSRPA LTGPERASLL GLADVLTMDT FNEVFSIVIK  240
KHYRSDGGDD FVWSTLIDLA RGSADPAVLP HALKLRRYYT LERSAQELDP FSTVDPAVKE  300
（配列番号１）
を有する。
【００１２】
ミクロモノスポラ  エキノスポラは、グラム陽性であり、胞子形成の、一般的に好気性の細菌株であって、分岐した菌糸体を形成し、土壌および水中で腐生菌として見いだされる。
【００１３】
この種は、エンジイン抗生物質カリケアマイシンを生成することで公知である。科学的分類は、以下の通りである：
界：細菌
門：放線菌門
目：放線菌
科：ミクロモノスポラ
属：ミクロモノスポラ
種：エキノスポラ
配列番号２のポリペプチドは、コルディア  ジェジュドネンシス（Ｋｏｒｄｉａ  ｊｅｊｕｄｏｎｅｎｓｉｓ）に由来し、以下のアミノ酸配列：
MESKIIGKVN FEEHLLDKEL KLIDTFEFND SYSEYASGIW KTCMLWNRSG QKDDHLSIEH   60
DTYVKPTEYG KQLAYVNEII ANTFKKEHIK TVRLFMCING LIIPHKDYLE FKKGFTRIHI  120
PLKINEHALT SEEDVVYNMQ KGEIWFIEGR KIHSAANFSK VKRINLVIDF APDIPFEELF  180
LNSENYQPNL IPKISQRTQL KEEELGYIKG LSKIINEMNF DDILSILSKI HFYRNVSSEL  240
VFGWLDEIAT ASNNYNIQRK AQEVTDLLIR KGPINN                           276
（配列番号２）
を有する。
【００１４】
コルディア  ジェジュドネンシスは、グラム染色陰性であり、好気性、非胞子形成、無鞭毛性、非滑走性、および桿菌様の細菌株であり、韓国済州島にて、海と淡水泉が出会う地帯から単離された（Ｐａｒｋら、２０１４、Ｉｎｔ  Ｊ  Ｓｙｓｔ  Ｅｖｏｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、６４：６５７〜６６２）。科学的分類は、以下の通りである：
界：細菌
門：バクテロイデス
目：フラボバクテリウム
科：フラボバクテリウム
属：コルディア
種：ジェジュドネンシス（ｊｅｊｕｎｄａｎｅｎｓｉｓ）
配列番号１および配列番号２のポリペプチドは、ピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を示す。これは、以下のスキーム１に示されるように、これらのポリペプチドが、ピペコリン酸（ＰＡ）、具体的にはＬ−ピペコリン酸（Ｌ−ＰＡ）をヒドロキシピペコリン酸（ＨＰＡ）、好ましくは５−ヒドロキシピペコリン酸（５−ＨＰＡ）にヒドロキシル化し得ることを意味する：
スキーム１：
【００１５】
【化１】
2021503904.tif 000002
【００１６】
本発明に従えば、タンパク質は、配列番号１および／もしくは２（野生型）のポリペプチドまたはその機能的に活性な変異体を含み、機能的に活性な変異体は、野生型と少なくとも１つのアミノ酸が異なるが、ピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有する。すなわち、それはピペコリン酸（ＰＡ）、具体的にはＬ−ピペコリン酸（Ｌ−ＰＡ）をヒドロキシ−ピペコリン酸（ＨＰＡ）、好ましくは５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（５−ＨＰＡ）にヒドロキシル化することができる。それらの酵素活性のために、これらの変異体はまた、本発明においてヒドロキシラーゼとして使用することができる。ピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有する本発明による機能的に活性な変異体は、それぞれ配列番号１および２のポリペプチドと少なくとも７５％および７５％の配列同一性を有する。
【００１７】
酵素活性は、酵素の活性の尺度である。酵素活性のＳＩ単位は、カタール（１カタール＝１ｍｏｌ／ｓ）である。より実用的であり、一般的に使用される値は、酵素単位（Ｕ）＝１μｍｏｌ／分である。１Ｕは、１６．６７ナノカタールに対応する。１Ｕは、毎分１マイクロモルの基質の変換を触媒する酵素の量として定義される。活性を測定する場合の条件は、通常、標準化される：通常、２５℃または３０℃の温度、ならびに最大の基質変換率が得られるｐＨ値および基質濃度を採用する。酵素の比活性は、総タンパク質１ミリグラムあたりの酵素の活性である（μｍｏｌ／分／ｍｇで表される）。それは、総タンパク質１ミリグラムあたりの所与の条件下で、所与の量の時間内に酵素によって形成される生成物の量である。比活性は、反応の容積を乗じ、総タンパク質の量で除した反応の速度に等しい。ＳＩ単位は、カタール／ｋｇであるが、より実用的な単位は、μｍｏｌ／分／ｍｇである。比活性は、特定の（通常は飽和している）基質濃度での酵素処理能力の尺度であり、通常、純粋な酵素では一定である。酵素の分子量が公知である場合、代謝回転数、または活性酵素のμｍｏｌ生成物／秒／μｍｏｌは、比活性から計算することができる。代謝回転数は、各酵素分子が１秒あたりにその触媒サイクルを行う回数として視覚化することができる。
【００１８】
活性は、基質の消費または生成物の生成のいずれかを経時的に測定する酵素アッセイで測定することができる。基質および生成物の濃度を測定する多数の異なる方法が存在し、多くの酵素は、当業者に公知であるいくつかの異なる方法でアッセイされ得る。本発明において、対象とするタンパク質は、条件（例えば、Ｏ２、Ｆｅ２＋、α−ケトグルタル酸および任意選択でアスコルビン酸の存在）下で、ヒドロキシル化を促進する時間の間、ＰＡ、具体的にはＬ−ＰＡとインキュベートされる。適切な条件および時間は、実施例に示される。
【００１９】
ヒドロキシラーゼ活性、具体的にはピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を包含する酵素活性を測定する方法は、当業者に周知である。例示的な方法はまた、実施例に記載される。
【００２０】
本発明の好ましい実施形態では、配列番号１のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号１のポリペプチド（すなわち、対応する野生型）の少なくとも５％のピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性、より好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７０％、なおより好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列番号１のポリペプチドのピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有する。
【００２１】
本発明の別の好ましい実施形態では、配列番号２のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号２のポリペプチド（すなわち、対応する野生型）の少なくとも５％のピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性、より好ましくは少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％または７０％、なおより好ましくは少なくとも７５％、さらにより好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％の配列番号２のポリペプチドのピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有する。
【００２２】
さらに、機能的に活性な変異体は、それぞれ配列番号１および２のポリペプチドと少なくとも７５％および７５％の配列同一性の定義された配列同一性によって特徴付けられる。本明細書において使用される「少なくともＸ％同一である」または「少なくともＸ％の配列同一性」という用語は、本発明による変異体の配列が、１００個のアミノ酸のストレッチ内で、少なくともＸ個のアミノ酸残基が、対応する野生型配列の配列、すなわち、配列番号１または２の配列と同一であることによって特徴付けられるアミノ酸配列を有することを意味する。本発明による配列同一性は、例えば、配列比較の形態である配列アラインメントの方法によって測定することができる。配列アラインメントの方法は、当該技術分野において周知であり、例えば、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ（１９８８）に記載されている様々なプログラムおよびアラインメントアルゴリズムを包含する。さらに、配列解析プログラムであるｂｌａｓｔｐ、ｂｌａｓｔｎ、ｂｌａｓｔｘ、ｔｂｌａｓｔｎおよびｔｂｌａｓｔｘと関連した使用のために、ＮＣＢＩ  Ｂａｓｉｃ  Ｌｏｃａｌ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ  Ｓｅａｒｃｈ  Ｔｏｏｌ（ＢＬＡＳＴ）は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ、ＭＤ）を包含するいくつかの供給源、およびインターネットから利用可能である。配列番号１または２のアミノ酸配列に対する本発明による変異体の同一性のパーセンテージは、典型的には、標準的な設定でＮＣＢＩ  Ｂｌａｓｔ  ｂｌａｓｔｐを使用して特徴付けられる。
【００２３】
あるいは、配列同一性は、標準設定でソフトウェアＧＥＮＥｉｏｕｓを使用して測定することができる。
本発明による変異体は、１つ以上のアミノ酸欠失、具体的には少ない（例えば、最大１０個のアミノ酸の）Ｎおよび／またはＣ末端欠失、１つ以上の付加、具体的には少ない（例えば、最大１０個のアミノ酸の）Ｎおよび／またはＣ末端付加、１つ以上の置換、具体的には１つ以上の保存的アミノ酸置換、またはそれらの組み合わせを含み得る。保存的アミノ酸置換は、類似の側鎖を有する異なる残基による残基の置換を指し、したがって、典型的には、ポリペプチド中のアミノ酸の、同じまたは類似の定義されたクラスのアミノ酸内のアミノ酸による置換を伴う。例えば、限定されないが、脂肪族側鎖を有するアミノ酸は、別の脂肪族アミノ酸、例えば、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンで置換され得る；ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸は、ヒドロキシル側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、セリンおよびスレオニンで置換される；芳香族側鎖を有するアミノ酸は、芳香族側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、およびヒスチジンで置換される；塩基性側鎖を有するアミノ酸は、塩基性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、リジンおよびアルギニンで置換される；酸性側鎖を有するアミノ酸は、酸性側鎖を有する別のアミノ酸、例えば、アスパラギン酸またはグルタミン酸で置換される；疎水性または親水性アミノ酸は、それぞれ別の疎水性または親水性アミノ酸で置換される。保存的アミノ酸置換の例は、以下に列挙されたものを包含する。
元の残基                        保守的置換
Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ  他の脂肪族（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ）
他の非極性（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ）
Ｇｌｙ、Ｍｅｔ                  他の非極性（Ａｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｇｌｙ、Ｍｅｔ）
Ａｓｐ、Ｇｌｕ                  他の酸性（Ａｓｐ、Ｇｌｕ）
Ｌｙｓ、Ａｒｇ                  他の塩基性（Ｌｙｓ、Ａｒｇ）
Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ  他の極性（Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ）
Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ  他の芳香族（Ｈｉｓ、Ｔｙｒ、Ｔｒｐ、Ｐｈｅ）
Ｃｙｓ、Ｐｒｏ                  なし
本発明の一実施形態では、本発明による変異体は、最大５０、４０、３０、２０、特に１０個の付加、欠失、および／または置換を含み得る。
【００２４】
好ましい実施形態では、配列番号１のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し；または、配列番号２のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号２の親ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する。配列同一性は、上に詳述されるように測定され得る。より好ましくは、配列番号１のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号１のポリペプチドと少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９９％の配列同一性を有し；または、配列番号２のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号２の親ポリペプチドと少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００２５】
配列番号１のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号２のポリペプチドの機能的に活性な変異体よりも好ましい。
最も好ましくは、タンパク質は、配列番号１または２のポリペプチドを含むかまたはそれからなり、さらにより好ましくは、配列番号１のポリペプチドからなる。
【００２６】
配列番号１もしくは２のポリペプチドを含むタンパク質またはその機能的に活性な変異体は、ヒドロキシラーゼとして、すなわち、化合物へのヒドロキシル基（−ＯＨ）の導入を触媒する酵素として使用することができる。これのために、ヒドロキシル化される化合物は、条件（例えば、Ｏ２、Ｆｅ２＋、α−ケトグルタル酸および任意選択でアスコルビン酸の存在）下で、ヒドロキシル化を促進する時間の間、タンパク質とインキュベートされる。ヒドロキシル化される化合物は、好ましくはピペコリン酸（ＰＡ）、具体的にはＬ−ピペコリン酸（Ｌ−ＰＡ）であり、生成物は、ヒドロキシピペコリン酸（ＨＰＡ）、特に５−ヒドロキシピペコリン酸（５−ＨＰＡ）、具体的にはシス−５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（シス−５−ＨＰＡ）、さらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡ）である。
【００２７】
これに従って、ヒドロキシラーゼとして使用されるタンパク質は、ピペコリン酸（ＰＡ）、具体的にはＬ−ピペコリン酸（Ｌ−ＰＡ）をヒドロキシ−ピペコリン酸（ＨＰＡ）、具体的には５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（５−ＨＰＡ）に、ヒドロキシル化することができる。特定の実施形態では、異性体または立体特異的生成物を生成することが望ましい場合がある。したがって、ヒドロキシラーゼとして使用されるタンパク質は、より具体的にはピペコリン酸（ＰＡ）をシス−５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（シス−５−ＨＰＡ）にヒドロキシル化し、さらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡ）にヒドロキシル化することができる。
【００２８】
【化２】
2021503904.tif 000003
【００２９】
さらに好ましい実施形態では、タンパク質は、
ｉ）少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の５−ＨＰＡに関する位置選択性；
ｉｉ）少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％のシス−５−ＨＰＡに関する立体選択性；および／または
ｉｉｉ）少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の変換率
によって特徴付けられる。
【００３０】
上で詳述したように、特に、特定の特異性によって特徴付けられる生成物を得るために、ＰＡ、具体的にはＬ−ＰＡをヒドロキシル化することが望ましい場合がある。
一実施形態では、ＰＡを位置選択的にヒドロキシル化することが意図される。具体的には、例えば、３−ヒドロキシ−ピペコリン酸（３−ＨＰＡ）またはその混合物ではなく５−ＨＰＡを生成することが望ましい場合がある。したがって、少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％の５−ＨＰＡに関する位置選択性によって特徴付けられるタンパク質が好ましい。
【００３１】
本明細書で使用される「少なくともＸ％の位置選択性」という用語は、本発明により生成された１００個のＨＰＡ分子のうち、少なくともＸ個の分子が５−ＨＰＡであることを意味する。位置選択性のパーセンテージを測定するために、酵素反応で生成されたＨＰＡ分子が、炭素環のヒドロキシル基の位置について分析され得、化合物の量が、例えば、ＨＰＬＣ分析によって測定され得る（実施例を参照されたい）。
【００３２】
別の実施形態では、ＰＡ、具体的にはＬ−ＰＡを立体選択的にヒドロキシル化することが意図される。具体的には、例えば、トランス−５−ＨＰＡまたはその混合物ではなくシス−５−ＨＰＡを生成することが望ましい場合がある。したがって、少なくとも９０％、特に少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％のシス−５−ＨＰＡに関する立体選択性により特徴付けられるタンパク質が好ましい。
【００３３】
本明細書で使用される「少なくともＸ％の立体選択性」という用語は、本発明により生成された１００個の５−ＨＰＡ分子のうち、少なくともＸ個の分子がシス−５−ＨＰＡであることを意味する。立体選択性のパーセンテージを測定するために、酵素反応で生成された５−ＨＰＡ分子が、それらの立体配置について分析され得、化合物の量が、例えば、ＨＰＬＣ分析によって測定され得る（例えば、実施例で詳述されるように）。
【００３４】
さらに別の実施形態では、高収率の生成物を得ることが意図され得る。具体的には、大量の５−ＨＰＡ、特にシス−５−ＨＰＡを生成することが望ましい場合がある。したがって、少なくとも６０％、好ましくは少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも７５％、最も好ましくは少なくとも９５％の変換率によって特徴付けられるタンパク質が好ましい。
【００３５】
本明細書で使用される「少なくともＸ％の変換率」という用語は、１００個の基質（例えば、ＰＡ）のうち、少なくともＸ個の生成物が本発明により生成されることを意味する。変換率を測定するために、酵素反応の生成物および／または基質の数を、例えば、ＨＰＬＣ分析によって測定することができる（例えば、実施例で詳述されるように）。多くの場合、反応前の基質の数は既知であり、得られた生成物の数と比較することができる。あるいは、反応後の基質の数を測定および使用して、反応前の基質の数から反応後の基質の数を差し引くことによって、生成物の数を計算することができる。
【００３６】
別の態様では、本発明は、
ａ．細胞が、ミクロモノスポラ  エキノスポラ細胞ではなく、具体的にはミクロモノスポラ属細胞ではなく、より具体的にはミクロモノスポラ科細胞ではなく、なおより具体的にはミクロモノスポラ目細胞ではなく、さらにより具体的には放線菌門細胞ではなく、特に細菌細胞ではない、上に定義される配列番号１のポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸；または
ｂ．細胞が、コルディア  ジェジュドネンシス（Ｋｏｒｄｉａ  ｊｅｊｕｎｄａｎｅｎｓｉｓ）細胞ではなく、具体的にはコルディア属細胞ではなく、より具体的にはフラボバクテリア科細胞ではなく、なおより具体的にはフラボバクテリア目細胞ではなく、さらにより具体的にはバクテロイデス門細胞ではなく、特に細菌細胞ではない、上に定義される配列番号２のポリペプチドまたはポリペプチドをコードする核酸；
ｃ．（ｉ）上に定義される配列番号１のポリペプチドおよび少なくとも１つの追加のアミノ酸、もしくは（ｉｉ）上に定義される配列番号１のポリペプチドの機能的に活性な変異体を含むタンパク質またはタンパク質をコードする核酸であって、具体的に、細胞が、ミクロモノスポラ  エキノスポラ細胞ではなく、具体的にはミクロモノスポラ属細胞ではなく、より具体的にはミクロモノスポラ科細胞ではなく、なおより具体的にはミクロモノスポラ目細胞ではなく、さらにより具体的には放線菌門細胞ではなく、特に細菌細胞ではない、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸；
ｄ．（ｉ）上に定義される配列番号２のポリペプチドおよび少なくとも１つの追加のアミノ酸、もしくは（ｉｉ）上に定義される配列番号２のポリペプチドの機能的に活性な変異体を含むタンパク質またはタンパク質をコードする核酸であって、具体的には、細胞が、コルディア  ジェジュドネンシス細胞ではなく、具体的にはコルディア属細胞ではなく、より具体的にはフラボバクテリア科細胞ではなく、なおより具体的にはフラボバクテリア目細胞ではなく、さらにより具体的にはバクテロイデス門細胞ではなく、特に細菌細胞ではない、タンパク質またはタンパク質をコードする核酸
を含むタンパク質を含む宿主に関する。
【００３７】
宿主細胞は、外来分子、すなわち、その細胞において天然に見いだされない分子が導入されている細胞である。本発明において、これは、対応するタンパク質を生成するために細胞内で発現され得るアミノ酸または核酸であり得る。
【００３８】
上で詳述したように、配列番号１および配列番号２の配列のポリペプチドは、天然に見いだされる生物、具体的にはミクロモノスポラ  エキノスポラおよびコルディア  ジェジュドネンシスにそれぞれ由来する。
【００３９】
配列番号１の配列のポリペプチドまたは配列番号２の配列のポリペプチドは、対象とするポリペプチドを天然に含む細胞以外の細胞に移されるとすぐに、本発明による宿主細胞が得られる。
【００４０】
さらに、タンパク質が、配列番号１の配列のポリペプチドおよび配列番号２の配列のポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸が異なるとすぐに、それはもはや天然に見いだされるタンパク質とみられるべきではなく、本発明による宿主細胞を得るために任意の細胞に導入することができる。配列番号１および２の天然に見いだされるポリペプチドとの違いは、少なくとも１つのアミノ酸の付加によって得ることができる。あるいはまたは加えて、それは、上で定義された配列番号１および２のポリペプチドの変異体であり得る。
【００４１】
宿主細胞は、追加または代替として、本明細書に記載されるポリペプチドまたはタンパク質をコードする核酸を含み得、これは宿主細胞に導入され得る。
本発明の宿主細胞は、上の例外を除き、組換えＤＮＡ技術における適用に適した任意の種類の生物であり得、限定されないが、１つ以上の組換えタンパク質（単数または複数）の発現に適切なすべての種類の細菌および酵母株が含まれる。宿主細胞の例には、例えば、様々なＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓまたは大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）株が包含される。様々な大腸菌の細菌宿主細胞が当業者に公知であり、限定されないが、ＢＬ２１（ＤＥ３）、ＤＨ５−アルファ、ＨＢ１０１、ＭＶ１１９０、ＪＭ１０９、ＪＭ１０１、またはＸＬ−１ブルーなどの株が包含され、これらは、例えば、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ（ＭＡ、ＵＳＡ）、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＣＡ、ＵＳＡ）、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｗｌ、ＵＳＡ）またはＱｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）などの様々な供給業者から商業的に購入することができる。具体的に適切な宿主細胞はまた、実施例に記載され、すなわち、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞である。宿主細胞として使用することができるＢａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ株には、例えば、１０１２野生型：ｌｅｕＡ８  ｍｅｔＢ５  ｔｒｐＣ２  ｈｓｄＲＭＩおよび１６８  Ｍａｒｂｕｒｇ：ｔｒｐＣ２（Ｔｒｐ−）が包含され、これらは、例えば、ＭｏＢｉＴｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）から商業的に利用可能である。
【００４２】
アミノ酸または核酸配列を宿主細胞に導入する方法は、当該技術分野において周知であり、形質転換、具体的には化学的形質転換、トランスフェクション、リポフェクチン、サイトフェクチン、粒子ビーズ衝撃、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、またはウイルス感染などの技術が包含される。宿主細胞は、一過性にトランスフェクトされたか、または安定して形質転換された細胞株であり得る。
【００４３】
別の実施形態では、宿主細胞は、真核細胞、具体的には動物細胞（ヒトを包含する）、植物細胞または真菌細胞である。このような宿主細胞の例には、ＣＨＯ細胞；ＨｅＬａ細胞；肝細胞；ＣＶ−１細胞；Ｐ１９細胞；ＮＴ２／Ｄ１細胞；マウスＬ細胞；アフリカミドリザル腎臓細胞、例えば、ＣＯＳ−７細胞または他のＣＯＳ細胞；ヒト胎児腎臓細胞、例えば、ＨＥＫ  ２９３；ＤＧ４４細胞、Ｉｔｋ−細胞、マウスＮＩＨ  ３Ｔ３細胞および酵母細胞が含まれる。
【００４４】
別の好ましい実施形態では、宿主細胞は原核細胞であり、本発明に従って上で定義されるタンパク質、ポリペプチドまたは核酸は天然に見いだされない。原核細胞は、古細菌細胞または細菌細胞、具体的には、アシドバクテリウム門、放線菌門、アクイフェックス門、バクテロイデス門、クラミジア門、ディクティオグロムス門、フィブロバクター門、フソバクテリウム門、ゲンマティモナス門、レンティスファエラ門、プランクトマイセス門、プロテオバクテリア門、スピロヘータ門、テネリクテス門（モリクテス）、およびベルコミクロビウム門からなる群から選択される門の細胞であり得る。
【００４５】
さらなる態様では、本発明は、ＨＰＡ、具体的には５−ＨＰＡ、より具体的にはシス−５−ＨＰＡ、さらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ヒドロキシ−ピペコリン酸（（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡ）の生成における、本発明に従って上で定義されたタンパク質または宿主細胞の使用に関する。上で詳述したように、本発明のタンパク質は、ヒドロキシラーゼ活性を有し、好ましくはＰＡ、具体的にはＬ−ＰＡをＨＰＡ、具体的には５−ＨＰＡ、より具体的にはシス−５−ＨＰＡ、さらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡにヒドロキシル化することができる。したがって、この目的のために使用することができる。上および下記の技術用語の定義はまた、本発明のこの態様にも適用される。
【００４６】
さらなる態様では、本発明は、ＨＰＡを生成する方法に関し、本方法は、酸素の存在下で、本発明に従って上で定義されたタンパク質を用いて、ＰＡ、具体的にはＬ−ＰＡをヒドロキシル化することを含む。好ましい実施形態では、ＨＰＡは、５−ＨＰＡ、具体的にはシス−５−ＨＰＡ、さらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡである。上で詳述したように、本発明のタンパク質は、ヒドロキシラーゼ活性を有し、ＰＡ、具体的にはＬ−ＰＡをＨＰＡ、具体的にはシス−５−ＨＰＡ、さらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡにヒドロキシル化することができる。上記および下記の技術用語の定義はまた、本発明のこの態様に適用される。
【００４７】
本方法では、ＰＡ、具体的にはＬ−ＰＡは、ヒドロキシラーゼ活性を有するタンパク質と、本明細書で定義されるように、酸素の存在下、ＰＡ、具体的にはＬ−ＰＡのＨＰＡへのヒドロキシル化を可能にする条件下で接触される。通常、ヒドロキシラーゼは、分子酸素をヒドロキシル化に使用するα−ケトグルタル酸依存性ジオキシゲナーゼのファミリーに属する。次のスキームに従って、１つの酸素原子がＰＡに移されてＨＰＡを生成し、分子酸素の他方の酸素原子がアクセプター（補基質）に移される。
【００４８】
【数１】
2021503904.tif 000004
【００４９】
アクセプターは、本発明によるタンパク質によって酸素が移され得る任意の分子であり得る。適切なアクセプターには、α−ケトグルタル酸、α−ケトアジペートおよび他のα−ケト二酸同族体が包含されるが、しかしながら、α−ケトグルタル酸が好ましい。
【００５０】
典型的には、すべての試薬は、溶液中に存在し、反応を可能にする条件下にあり、これは、例えば、温度、圧力、ｐＨ、様々な成分の濃度、補因子の存在などに関して適切な反応条件を意味する。適切な条件は、実施例において例証されている。
【００５１】
通常、アッセイは、周囲温度または別の適切な温度（例えば、１５℃〜４０℃、１５℃、２５℃、または３７℃）で行われるが、５℃〜４０℃などの温度範囲全体で行われ得る。酵素反応は、通常、３０℃〜３７℃などの高温で行われるため、１５℃の温度により高い変換率が得られたことは驚くべきことである。したがって、１０℃〜３０℃の範囲の温度が好ましい。
【００５２】
接触／インキュベーション時間は、約５分〜数時間、好ましくは約１５時間〜２００時間、例えば、５０時間〜１００時間まで変動し得る。しかしながら、インキュベーション時間は、アッセイ形式、溶液の容量、基質および触媒の濃度、ヒドロキシル化されるＰＡの量などに依存する。
【００５３】
タンパク質は、溶液、凍結乾燥物として適用され、固定化され、または全細胞触媒として使用され得る（実施例を参照されたい）。好ましい実施形態では、タンパク質は、上で定義された宿主細胞において生成される。本発明の方法の間、それはまだ細胞に含有され得るか（実施例を参照されたい）か、またはそれから単離され得る。
【００５４】
好ましくは、ヒドロキシル化は、酸素アクセプター／補基質、具体的にはα−ケトグルタル酸の存在下、およびＦｅ２＋の存在下で行われる。当該技術分野において公知であるように、ガス供給用の装置を使用して酸素を提供することができる。酸素は、ガスの形態で、例えば、空気として、またはカルボゲン（二酸化炭素と酸素ガスの混合物）などの人工ガスとして供給され得る。ガスは、反応の他のすべての成分が含有される溶液または懸濁液に導入することができる。Ｆｅ２＋は、通常、可溶性の非毒性塩として提供され、その適切な例は当該技術分野において公知であり、硫酸鉄（ＩＩ）アンモニウム（モール塩）が包含される。
【００５５】
好ましい実施形態では、ヒドロキシル化が、ｐＨ４．５〜８を有する水性環境において、５℃〜３０℃の温度でおよび／または５０ｍＭ〜５００ｍＭのα−ケトグルタル酸濃度で、２５ｍＭ〜２００ｍＭのＰＡ、具体的にはＬ−ＰＡ濃度を用いて行われる。通気速度は、５０ｍＬ／分から最大２５０ｍＬ／分の範囲であり得る。
【００５６】
本発明の一実施形態では、ＨＰＡを生成する方法は、ＨＰＡ、具体的にはシス−５−ＨＰＡまたはさらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡを単離することを含む。ＨＰＡ、具体的にはシス−５−ＨＰＡまたはさらにより具体的には（２Ｓ，５Ｓ）−シス−５−ＨＰＡは、イオン交換クロマトグラフィーなどのクロマトグラフィーを包含する、当該技術分野において公知である任意の方法によって単離することができる。
【００５７】
別の態様では、本発明は、本発明との関連で、上で定義されたタンパク質を生成する方法に関し、本方法は、宿主細胞において、具体的には本発明との関連で、上で定義した宿主細胞において、タンパク質をコードする核酸を発現させることを含む。
【００５８】
原核生物または真核生物の宿主細胞における核酸の発現は、商業的使用および研究的使用のために相当量のタンパク質を生成するための手段を提供する。本発明によるタンパク質をコードする核酸を適切な宿主細胞（単数または複数）に導入して、組換え手段によってそれぞれのタンパク質を生成することができる。このアプローチは、適切なプラスミドベクターにそれぞれの核酸をクローニングすることを包含し得る。プラスミドベクターは、遺伝子クローニングに広く使用され、一時的にＤＮＡを透過させた細胞に容易に導入することができ、すなわち、形質転換することができる。核酸を含む宿主細胞は、適切な培地で培養することができ、本発明によるタンパク質は、培養細胞または培養培地から得ることができる。本発明によるタンパク質は、沈殿、遠心分離、クロマトグラフィー法、アフィニティー結合（例えば、タグを使用する）のような方法を包含する従来の方法で回収し、任意選択に精製することができる。核酸の発現は、（例えば、誘導性プロモーターの使用により）誘導可能であり得るか、または宿主細胞において構成的であり得る。
【００５９】
関連する態様では、本発明は、本発明との関連で、上で定義されたタンパク質を産生する方法を提供し、本方法は：
ａ）本発明との関連で、上で定義されたタンパク質をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞、具体的には本発明との関連で、上で定義された宿主細胞に導入すること、
ｂ）本発明との関連で、上で定義されたタンパク質の発現を可能にする条件下で宿主細胞を増殖させること、
ｃ）任意選択で宿主細胞からタンパク質を単離すること
を含む。
【００６０】
第１のステップとして、対象とする核酸を含むベクターを宿主細胞に導入する。当業者は、外因性核酸の発現に適切なベクター−宿主の組み合わせを選択することができる。膨大な目録の発現プラスミド、多数の操作された菌株、および多くの培養戦略などの、異種タンパク質を高レベルで生成するための多くの分子ツールおよびプロトコールが利用可能である。例えば、タンパク質をコードする核酸を含むベクターを宿主細胞に導入することにより、所望のアミノ酸配列を発現するために、ベクターは、本発明による核酸配列に加えて、発現を制御するための他の配列（例えば、プロモーター配列、ターミネーター配列およびエンハンサー配列）および微生物、昆虫細胞、動物培養細胞などを選択するための遺伝子マーカー（例えば、アンピシリン、ネオマイシンまたはカナマイシン耐性遺伝子）を含有し得る。さらに、ベクターは、本発明による核酸配列を反復形態で（例えば、タンデムで）含有し得る。ベクターは、遺伝子工学の分野において従来から使用されられている手順および手法に基づいて構築することができる。
【００６１】
第２のステップとして、宿主細胞は、本発明との関連で、上で定義されたタンパク質の発現を可能にする条件下で増殖される。本発明による宿主細胞の培養は、当業者に公知である日常的な手順である。これらの宿主細胞は、培養において培養することができる任意の種類の適切な細胞、好ましくは細菌細胞、例えば、大腸菌、具体的には大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）であり得る。
【００６２】
第３のおよび任意選択のステップとして、タンパク質は、宿主細胞から単離され得る。タンパク質をそれぞれの宿主細胞において発現させた後、細胞を回収し、目的のタンパク質を含有する細胞抽出物を調製するための出発材料として使用することができる。目的のタンパク質を含有する細胞抽出物は、細胞の溶解によって得られる。化学的、生物学的、酵素的および／または機械的な細胞溶解により細胞抽出物を調製する方法は、当業者に周知であり、限定されないが、例えば、低張塩処理、均質化、または超音波処理が包含される。その後、タンパク質は、本発明の先の態様に関して詳述したように単離され得る。
【００６３】
別の態様では、本発明は
−  配列番号１のポリペプチド、ならびに特にＣ末端および／またはＮ末端の少なくとも１つの追加のアミノ酸；
−  配列番号２のポリペプチド、ならびに特にＣ末端および／またはＮ末端にある、少なくとも１つの追加のアミノ酸；
−  配列番号１のポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるが、配列番号１のポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性を有し、ピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有する、配列番号１のポリペプチドの機能的に活性な変異体；または
−  配列番号２のポリペプチドと少なくとも１つのアミノ酸残基が異なるが、配列番号２のポリペプチドと少なくとも７５％の配列同一性を有し、ピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性を有する、配列番号２のポリペプチドの機能的に活性な変異体
を含むまたはそれからなるタンパク質に関し、具体的には、タンパク質は、本発明の特定の好ましい実施形態との関連で、上で定義されたようにさらに特徴付けられる。好ましい実施形態では、配列番号１のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号１のポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有し；または、配列番号２のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号２の親ポリペプチドと少なくとも８０％の配列同一性、好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも８５％の配列同一性、より好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９０％の配列同一性、最も好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９５％の配列同一性を有する。配列同一性は、上に詳述されるように測定され得る。より好ましくは、配列番号１のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号１のポリペプチドと少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは配列番号１のポリペプチドと少なくとも９９％の配列同一性を有し；または配列番号２のポリペプチドの機能的に活性な変異体は、配列番号２の親ポリペプチドと少なくとも９６％の配列同一性、好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９７％の配列同一性、より好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９８％の配列同一性、最も好ましくは配列番号２のポリペプチドと少なくとも９９％の配列同一性を有する。
【００６４】
当該技術分野において周知であるように、酵素は、それらの酵素活性を著しく損なうことなく突然変異させることができる。具体的には、少ない付加、欠失、または置換、特に保存的置換は、通常、酵素活性に関して重要ではない。これは、具体的には、Ｃおよび／もしくはＮ末端の突然変異、または触媒および結合部位外の突然変異に適用される。したがって、それらのタンパク質は本発明の主題である。上記および下記の技術用語の定義は、本発明のこの態様にも適用される。
【００６５】
別の態様では、本発明は、本発明の先の態様で定義されたタンパク質をコードする核酸に関する。
本明細書で使用される「核酸」という用語は、一般的に、本発明の先の態様で定義されたタンパク質をコードし、可変長であり得る任意のヌクレオチド分子に関する。本発明の核酸の例としては、限定されないが、プラスミド、ベクター、または、例えば、イオン交換クロマトグラフィーを包含する標準的な分子生物学手順によって単離され得る任意の種類のＤＮＡおよび／もしくはＲＮＡ断片が包含される。本発明の核酸は、本発明の宿主細胞などの特定の細胞または生物のトランスフェクションもしくは形質導入に使用することができる。
【００６６】
本発明の核酸分子は、ｍＲＮＡ、ｃＲＮＡもしくはＬＮＡ（ロックド核酸）などのＲＮＡの形態、または、例えばｃＤＮＡおよびゲノムＤＮＡを包含し、例えば、クローニングによって得られるか、もしくは化学合成技術によってまたはそれらの組み合わせによって得られるＤＮＡの形態であり得る。ＤＮＡは三本鎖、二本鎖または一本鎖であり得る。一本鎖ＤＮＡは、センス鎖としても公知でもあるコード鎖であり得、またはアンチセンス鎖とも呼ばれる非コード鎖であり得る。本明細書で使用される核酸分子はまた、とりわけ、一本鎖および二本鎖ＤＮＡ、一本鎖および二本鎖ＲＮＡの混合物であるＤＮＡ、ならびに一本鎖および二本鎖領域の混合物であるＲＮＡ、一本鎖領域、またはより典型的には二本鎖領域、もしくは三本鎖領域、または一本鎖領域および二本鎖領域の混合物であり得るＤＮＡおよびＲＮＡを含むハイブリッド分子を指す。さらに、本明細書で使用される核酸分子は、ＲＮＡもしくはＤＮＡ、またはＲＮＡとＤＮＡの両方を含む三本鎖領域を指す。
【００６７】
さらに、核酸は、１つ以上の修飾された塩基を含有し得る。このような核酸はまた、例えば、リボース−リン酸骨格において修飾を含有し、生理学的環境におけるこのような分子の安定性および半減期を増大させることができる。したがって、安定性のためまたは他の理由のために修飾された骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡは、その特徴が本明細書において意図されている「核酸分子」である。さらに、ほんの２つの例を挙げると、イノシンなどの異常な塩基、またはトリチル化塩基などの修飾塩基を含むＤＮＡまたはＲＮＡは、本発明との関連における核酸分子である。当業者に公知である多くの有用な目的を果たす、多種多様な修飾がＤＮＡおよびＲＮＡに行われていることが理解されよう。本明細書で使用される核酸分子という用語は、このような化学的、酵素的または代謝的に修飾された形態の核酸分子、ならびにとりわけ、単純なおよび複雑な細胞を包含する、ウイルスおよび細胞に特徴的であるＤＮＡおよびＲＮＡの化学形態を擁する。
【００６８】
さらに、本発明の先の態様で定義されたタンパク質をコードする核酸分子は、標準的なクローニング技術などの標準的な技術を使用して、調節配列、リーダー配列、異種マーカー配列または異種コード配列などの任意の所望の配列に機能的に連結して、融合タンパク質を作成することができる。
【００６９】
本発明の核酸は、一般的に、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼおよび／またはポリメラーゼおよび／またはリガーゼおよび／またはリコンビナーゼによる核酸の操作、または当業者に公知である核酸を生成するための他の方法によって、インビトロでまたは培養中の細胞において元々は形成され得る。
【００７０】
本発明の核酸は、発現ベクターなどのベクターに含まれ得、核酸は、宿主細胞における核酸の発現を促進することができるプロモーター配列に作動可能に連結される。
したがって、別の態様では、本発明は、本発明の先の態様で定義された核酸、または本発明との関連で、上で定義されたタンパク質をコードする核酸を含むベクターに関する。
【００７１】
本明細書で使用する場合、「発現ベクター」または「ベクター」という用語は、一般的に、細胞内で目的のタンパク質を発現するために使用することができる任意の種類の核酸分子を指す（本発明の核酸に関する上の詳細もまた参照されたい）。具体的には、本発明のベクターは、限定されないが、哺乳動物細胞、細菌細胞、および酵母細胞を包含する特定の宿主細胞においてタンパク質を発現するのに適切である、当業者に公知である任意のプラスミドまたはベクターであり得る。本発明の発現構築物はまた、本発明のタンパク質をコードする核酸であり得、発現を確実にするためにそれぞれのベクターへのその後のクローニングに使用される。タンパク質発現用のプラスミドおよびベクターは、当該技術分野において周知であり、例えば、Ｐｒｏｍｅｇａ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ）、Ｑｉａｇｅｎ（Ｈｉｌｄｅｎ、Ｇｅｒｍａｎｙ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ、ＵＳＡ）、またはＭｏＢｉＴｅｃ（Ｇｅｒｍａｎｙ）などの様々な供給業者から商業的に購入することができる。タンパク質発現の方法は、当業者に周知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、２０００（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ、３版）に記載されている。
【００７２】
ベクターは、複製起点、１つ以上の治療遺伝子および／または選択マーカー遺伝子、ならびにコードされたタンパク質の転写、翻訳および／または分泌を指示する調節エレメントなどの当該技術分野において公知である他の遺伝エレメントなどの、宿主細胞において複製を可能にする核酸配列をさらに包含してもよい。ベクターは、細胞を形質導入、形質転換または感染させるために使用され、それにより、細胞に、細胞に固有のもの以外の核酸および／またはタンパク質を発現させることができる。ベクターは、ウイルス粒子、リポソーム、タンパク質コーティングなどの、細胞への核酸の侵入を達成するのを助けるための材料を任意選択で含む。多数のタイプの適した発現ベクターが、標準的な分子生物学的技術によるタンパク質発現について当該技術分野において公知である。このようなベクターは、昆虫、例えばバキュロウイルス発現、または酵母、真菌、細菌もしくはウイルス発現系を包含する従来のベクタータイプの中から選択される。多数のタイプが当該技術分野で公知である他の適した発現ベクターはまた、この目的で使用することができる。このような発現ベクターを得る方法は周知である（例えば、前掲のＳａｍｂｒｏｏｋを参照されたい）。
【００７３】
上で詳述したように、本発明のタンパク質をコードする核酸は、タンパク質の発現を確実にするために、宿主細胞におけるタンパク質の発現を駆動するのに適切な配列に作動可能に連結される。しかしながら、請求された発現構築物が中間生成物を表し得ることは、本発明の範囲内に含まれ、これはその後、タンパク質の発現を確実にするために適切な発現ベクターにクローニングされる。本発明の発現ベクターは、限定されないが、ポリアデニル化シグナル、スプライスドナーおよびスプライスアクセプターシグナル、介在配列、転写エンハンサー配列、翻訳エンハンサー配列、薬物耐性遺伝子（単数または複数）などを包含する、すべての種類の核酸配列をさらに含み得る。任意選択で、薬物耐性遺伝子は、細胞周期特異的または細胞周期非依存的のいずれかであり得る内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）に作動可能に連結され得る。
【００７４】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」という用語は、一般的に、遺伝子エレメントがそれらの意図された目的のために協調して機能するように配置されることを意味し、例えば、その転写は、プロモーターによって開始され、本発明のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を介して進行する。すなわち、ＲＮＡポリメラーゼは、融合タンパク質をコードする配列をｍＲＮＡに転写し、次にスプライシングされてタンパク質に翻訳される。
【００７５】
本発明との関連で使用される「プロモーター配列」という用語は、一般的に、下流コーディング配列に作動可能に連結された任意の種類の調節ＤＮＡ配列を指し、前述のプロモーターは、細胞内で、ＲＮＡポリメラーゼに結合し、コードされたオープンリーディングフレームの転写を開始し、それにより前述の下流コーディング配列の発現を駆動することができる。本発明のプロモーター配列は、限定されないが、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、細胞周期特異的プロモーター、および細胞型特異的プロモーターを包含する、当業者に公知である任意の種類のプロモーター配列であり得る。
【００７６】
他に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語ならびに頭字語は、本発明の分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。分子生物学における一般的な用語の定義は、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓが１９９４年に発行したＢｅｎｊａｍｉｎ  Ｌｅｗｉｎ、Ｇｅｎｅｓ  Ｖ（ＩＳＢＮ  ０−１９−８５４２８７−９）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｌｔｄ．が１９９４年に発行したＫｅｎｄｒｅｗら（編）、Ｔｈｅ  Ｅｎｃｙｃｌｏｐｅｄｉａ  ｏｆ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＩＳＢＮ  ０−６３２−０２１８２−９）；およびＶＣＨ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．が１９９５年に発行したＲｏｂｅｒｔ  Ａ．Ｍｅｙｅｒｓ（編）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：ａ  Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＩＳＢＮ  １−５６０８１−５６９−８）に見いだすことができる。
【００７７】
本発明は、本明細書に記載される特定の方法論、プロトコール、および試薬に限定されない。これは、それらは変化し得るためである。本明細書に記載されるものと同様または同等の任意の方法および材料を本発明の実施において使用することができるが、好ましい方法および材料が本明細書に記載される。さらに、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的とし、本発明の範囲を限定することを意図するものではない。
【００７８】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかに他に指示しない限り、複数の参照を含む。同様に、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、および「範囲内に含む（ｅｎｃｏｍｐａｓｓ）」という単語は、排他的というよりはむしろ包括的であると解釈される。同様に、「または」という用語は、文脈が明らかに他に指示しない限り、「および」を含むことが意図されている。「複数」という用語は、２つ以上を指す。
【００７９】
以下の図面および実施例は、本発明の様々な実施形態を例示することを意図する。したがって、検討されている特定の改変は、本発明の範囲に対する制限として解釈されるべきではない。本発明の範囲から逸脱することなく、様々な同等物、変更、および改変を行うことができることは当業者には明らかであり、したがって、このような同等の実施形態が本明細書に含まれることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００８０】
【図１】シス−５−ＨＰＡおよび対応するジアステレオマーのトランス−５−ＨＰＡの参照標準の参照クロマトグラムを示す図である。
【図２Ａ】過剰発現したプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）全細胞を使用した例示的な分取スケール生体内形質転換を示す図である。図２Ａは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示す。６８．５時間後、９３％のＰＡ  １（３ｍｍｏｌ）が５−ＨＰＡ  ２に変換された。追加の１．５ｍｍｏｌのＰＡ  １（０．５×初期量）および３ｍｍｏｌのαＫＧを反応混合物に加えた。ＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への＞９８％の変換が、８９時間の総反応時間後に検出された。変換は、ＨＰＬＣ分析により測定された。図２Ｂは、Ｌ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換を測定するために、ダンシルクロリド誘導体化を使用した８９時間後の反応混合物のクロマトグラムを示す。８９時間の試料のクロマトグラムでは、ほんの微量の基質ＰＡ１が残っている。図２Ｃは、生成物２のジアステレオマー過剰率を測定するために、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用して８９時間後の反応混合物のクロマトグラムを示す。
【図２Ｂ】過剰発現したプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）全細胞を使用した例示的な分取スケール生体内形質転換を示す図である。図２Ａは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示す。６８．５時間後、９３％のＰＡ  １（３ｍｍｏｌ）が５−ＨＰＡ  ２に変換された。追加の１．５ｍｍｏｌのＰＡ  １（０．５×初期量）および３ｍｍｏｌのαＫＧを反応混合物に加えた。ＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への＞９８％の変換が、８９時間の総反応時間後に検出された。変換は、ＨＰＬＣ分析により測定された。図２Ｂは、Ｌ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換を測定するために、ダンシルクロリド誘導体化を使用した８９時間後の反応混合物のクロマトグラムを示す。８９時間の試料のクロマトグラムでは、ほんの微量の基質ＰＡ１が残っている。図２Ｃは、生成物２のジアステレオマー過剰率を測定するために、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用して８９時間後の反応混合物のクロマトグラムを示す。
【図２Ｃ】過剰発現したプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）全細胞を使用した例示的な分取スケール生体内形質転換を示す図である。図２Ａは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示す。６８．５時間後、９３％のＰＡ  １（３ｍｍｏｌ）が５−ＨＰＡ  ２に変換された。追加の１．５ｍｍｏｌのＰＡ  １（０．５×初期量）および３ｍｍｏｌのαＫＧを反応混合物に加えた。ＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への＞９８％の変換が、８９時間の総反応時間後に検出された。変換は、ＨＰＬＣ分析により測定された。図２Ｂは、Ｌ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換を測定するために、ダンシルクロリド誘導体化を使用した８９時間後の反応混合物のクロマトグラムを示す。８９時間の試料のクロマトグラムでは、ほんの微量の基質ＰＡ１が残っている。図２Ｃは、生成物２のジアステレオマー過剰率を測定するために、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用して８９時間後の反応混合物のクロマトグラムを示す。
【図３Ａ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図３、４および５は、それぞれ実施例３、４および５の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図３Ｂ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図３、４および５は、それぞれ実施例３、４および５の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図３Ｃ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図３、４および５は、それぞれ実施例３、４および５の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図４Ａ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図３、４および５は、それぞれ実施例３、４および５の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図４Ｂ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図３、４および５は、それぞれ実施例３、４および５の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図４Ｃ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図３、４および５は、それぞれ実施例３、４および５の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図５Ａ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図３、４および５は、それぞれ実施例３、４および５の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図５Ｂ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図３、４および５は、それぞれ実施例３、４および５の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図５Ｃ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図３、４および５は、それぞれ実施例３、４および５の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図６Ａ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ１２を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図６および７は、それぞれ実施例６および７の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図６Ｂ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ１２を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図６および７は、それぞれ実施例６および７の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図６Ｃ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ１２を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図６および７は、それぞれ実施例６および７の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図７Ａ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ１２を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図６および７は、それぞれ実施例６および７の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図７Ｂ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ１２を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図６および７は、それぞれ実施例６および７の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【図７Ｃ】様々な条件でプロリンヒドロキシラーゼＰＨ１２を使用した分取スケール生体内形質転換を示す図である。図６および７は、それぞれ実施例６および７の結果を示す。各図において、セクションＡは、異なる反応時間後のＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換を示し、セクションＢは、ダンシルクロリド誘導体化を使用したＬ−ＰＡ  １からＨＰＡ  ２への変換の測定を示し、セクションＣは、Ｆｍｏｃ誘導体化を使用した生成物２のジアステレオマー過剰率の測定を示す（図２参照）。
【実施例】
【００８１】
方法
反応設定：
生体触媒として、過剰発現された異なるプロリンヒドロキシラーゼ（ＰＨｓ）を含む大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）全細胞を使用した分取スケール生体内形質転換は、総容量３０ｍＬで行われた。他に明記されない限り、ＰＨｓを使用する反応は、ｐＨセンサーおよび温度センサーを包含するメカニカルスターラーを備えた１００ｍＬフラスコで（クライオスタットを使用して）１５℃で行われた。反応はｐＨ７．０で行われ、１〜２Ｍ  ＨＣｌ溶液およびＭｅｔｒｏｈｍの滴定システム（Ｔｉｔｒａｎｄｏ  ９０２、Ｔｏｕｃｈ  ｃｏｎｔｒｏｌ）を使用して一定に保たれた。以下の反応の説明に記載されている濃度は、開始体積（３０ｍＬ）に関連する。
【００８２】
Ｌ−ピペコリン酸（ＰＡ）（１）（２５ｍＭ〜１５０ｍＭ）を、ＰＨを発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）全細胞（８３ｇ／Ｌ湿潤細胞塊）を含有する緩衝液に溶解した。α−ケトグルタル酸二ナトリウム塩（αＫＧ）（２当量）、アスコルビン酸ナトリウム（０．０３当量）、モール塩（０．０１当量）および消泡剤Ｙ−３０（２％ｖ／ｖ）を緩衝液で調製したストック溶液から加えた。反応液を撹拌し、一定流量の水飽和空気を適用した（２５０ｍＬ／分）。１〜２Ｍ  ＨＣｌを加えてｐＨを一定に保った。
【００８３】
異なる反応時間の後、試料を採取し、ダンシルクロリド誘導体化後にＨＰＬＣにより分析した。ジアステレオマー過剰率は、フルオレニルメトキシカルボニルクロリド（ＦＭＯＣ）誘導体化後、ＨＰＬＣにより分析された。誘導体化およびＨＰＬＣ法を以下に記載する。
【００８４】
ダンシルクロリド誘導体化：
１００μＬの反応混合物を反応から採取し、１４，１００×ｇ．で１０分間、遠心分離した。２０μＬ（最終濃度５ｍＭ、２５８μｇ、２μｍｏｌ）の上清を新しい微量反応管に移し、２２０μＬ（２２μｍｏｌ）の１Ｍ  ＮａＨＣＯ３溶液を加えた。その後、アセトニトリル中の１６０μＬの６ｇ／Ｌダンシルクロリド溶液を加え、反応溶液をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ  ＴｈｅｒｍｏＭｉｘｅｒで５５℃、８５０ｒｐｍで１５分間振とうした。反応液を１４，１００×ｇで５分間遠心分離した。５０μＬの上清を、ＨＰＬＣを使用した変換測定に使用した。
【００８５】
ダンシルクロリド誘導体化後のＨＰＬＣ分析を使用した変換測定：
方法：  流量：        １ｍＬ／分
カラム温度：  ４０℃
固定相：      Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（２．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）
移動相：      Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．１％ＴＦＡ；Ｂ：ＡＣＮ＋０．１％ＴＦＡ
【００８６】
【表１】
2021503904.tif 000005
【００８７】
Ｆｍｏｃ誘導体化後のＨＰＬＣ分析によるジアステレオマー過剰率測定：
方法：  流量：        ２ｍＬ／分
カラム温度：  ３０℃
固定相：      Ｗａｔｅｒｓ  Ｘｂｒｉｄｇｅ  Ｃ１８（２．５μｍ、２．１×５０ｍｍ）
移動相：      Ａ：Ｈ２Ｏ＋０．０２％ギ酸；Ｂ：ＡＣＮ＋０．０２％ギ酸；希釈剤：ＡＣＮ
【００８８】
【表２】
2021503904.tif 000006
【００８９】
誘導体化：
試料の誘導体化のために、当業者に公知であるようなインラインの誘導体化プログラムが設定された。以下の試薬を誘導体化手順に使用した：１）ホウ酸緩衝液０．４Ｍ（ｐＨ１０．２；Ａｇｉｌｅｎｔから；製品番号５０６１−３３３９）、２）アセトニトリル、３）ＦＭＯＣ塩化物溶液（５０ｍｇ／ｍＬアセトニトリル溶液）。２容量の試薬１）を０．２５容量の試料と混合し、０．５容量の３）を加えた。得られた誘導体化混合物を混合し、注射前に０．１分間反応させた。注射後、注射針を１０μＬのアセトニトリルで洗浄した。
【００９０】
実施例１：新たに同定された異なるプロリンヒドロキシラーゼの比較
新しいプロリンヒドロキシラーゼを同定するために、４６個の遺伝子を選択した。対応するタンパク質をさらなる分析のために選択し、それらのヒドロキシラーゼ活性について試験した。タンパク質のうちの１８個は、Ｌ−ＰＡのヒドロキシラーゼ活性を示し、タンパク質のうちの３個は、５−ＨＰＡ位置異性体の主要な形成を示した。
【００９１】
残りの３つの酵素は、ヒドロキシラーゼ活性および良好な位置選択性を示した。
それらは、対応する酵素に適切であると以前に測定された以下の条件下（０．５ｍｌ）で立体選択性についてスクリーニングされた：
−  ミクロモノスポラ  エキノスポラ由来のＰＨ（ＰＨ０５と呼ばれる）：１０ｍＭ  ＰＡ、２０ｍＭ  αＫＧ、１．５ｍＭアスコルビン酸（ナトリウム塩）、０．５ｍＭモール塩、２５％（ｖ／ｖ）溶解物、ｐＨ５．５、５℃
−  ミクロモノスポラ  チョコリエンシス（Ｍｉｃｒｏｍｏｎｏｓｐｏｒａ  ｃｈｏｋｏｒｉｅｎｓｉｓ）由来のＰＨ（ＰＨ１１と呼ばれる）：１０ｍＭ  ＰＡ、２０ｍＭ  αＫＧ、１．５ｍＭアスコルビン酸（ナトリウム塩）、０．５ｍＭモール塩、９０％（ｖ／ｖ）溶解物、ｐＨ６．０、２５℃
−  コルディア  ジェジュドネンシス由来のＰＨ（ＰＨ１２と呼ばれる）：１０ｍＭ  ＰＡ、２０ｍＭ  αＫＧ、１．５ｍＭアスコルビン酸（ナトリウム塩）、０．５ｍＭモール塩、２５％（ｖ／ｖ）溶解物、ｐＨ６．０、２５℃。
【００９２】
細胞溶解物は、１ｇの湿潤細胞ペーストを２ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７）に再懸濁して調製された。当業者に公知であるように、細胞を超音波処理によって溶解した。反応前に遠心分離により細胞破片を除去した。酵素の反応条件は、詳細な特性付け前に測定された（結果を示さない）。
【００９３】
スクリーニングの結果は、以下のように要約され得る：
【００９４】
【表３】
2021503904.tif 000007
【００９５】
２つのプロリンヒドロキシラーゼ（ＰＨ０５およびＰＨ１２）は、十分なピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性および５−ＨＰＡの位置選択性、ならびに（Ｓ，Ｓ）−シス−５−ＨＰＡ（シス−５−ＨＰＡ）２の立体選択性によって特徴付けられるため、特に興味深いことが判明した。
【００９６】
プロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５は配列番号１に関し、プロリンヒドロキシラーゼＰＨ１２は配列番号２に関する。
【００９７】
実施例２：プロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５による分取スケール生体内形質転換の詳細な説明
プロリンヒドロキシラーゼＰＨ０５およびＰＨ１２がピペコリン酸ヒドロキシラーゼ活性および意図された位置選択性によって特徴付けられたという事実を考慮して、それらはさらに特徴付けられた：
【００９８】
【化３】
2021503904.tif 000008
【００９９】
ＰＡ  １からシス−５−ＨＰＡ  ２への分取スケール生体内形質転換は、ミクロモノスポラ  エキノスポラ（ＰＨ０５）由来のプロリンヒドロキシラーゼ（ＰＨ）を過剰発現させた大腸菌全細胞を生体触媒として使用して行われた。この反応は、基質供給アプローチおよびＭｅｔｒｏｈｍ  ｐＨ  Ｓｔａｔを使用して、１５℃で４．５ｍｍｏｌ  ＰＡ（１）スケール（５８０．５ｍｇ、約１９ｇ／Ｌ）で、８３．３ｇ／Ｌの全細胞３０ｍＬ容積で行われた。
【０１００】
Ｌ−ピペコリン酸（ＰＡ）（１）（０．３８７ｇ、３ｍｍｏｌ、１００ｍＭ）を、ＰＨ０５を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）全細胞（８３ｇ／Ｌ湿潤細胞塊）、α−ケトグルタル酸二ナトリウム塩（αＫＧ）（１．３５６ｇ、６ｍｍｏｌ、２００ｍＭ、２当量）、アスコルビン酸ナトリウム（０．０１８ｇ、０．０９ｍｍｏｌ、３ｍＭ、０．０３当量）およびモール塩（０．０１２ｇ、０．０３ｍｍｏｌ、１ｍＭ、０．０１当量）を含有する３０ｍＬリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７）に溶解した。６００μＬ（２％ｖ／ｖ）消泡剤Ｙ−３０を加えた。反応液を１５℃で撹拌し、一定流量の水飽和空気を適用した（２５０ｍＬ／分）。
【０１０１】
ＰＡ  １（１９５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、５０ｍＭ）およびαＫＧを反応に供給した（図１Ａに示すように、６８．５時間でのＰＡ、次の時間点後でのαＫＧ：５０時間（３４０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、５０ｍＭ）、６８．５時間（６７７ｍｇ、３ｍｍｏｌ、１００ｍＭ）、７５時間（１７０ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、２５ｍＭ）。
【０１０２】
８９時間中、３０ｍＬ（限界として設定）（３０ｍｍｏｌ）を消費する１Ｍ  ＨＣｌ溶液を加えることによりｐＨを一定に保った。
以前に行われた小スケール（約６．５ｍｇ／ｍＬ）の反応パラメーターの測定では、全細胞を使用したＰＨ０５触媒による反応の高い変換は、１５℃で吸気を使用して行われた反応で得ることができたことが示されている。また、高い変換を達成するには、αＫＧの追加供給が必要であることが判明した。異なる反応時間後の反応の進行を監視するために、試料は、異なる時間点（１時間、３時間、１８時間、２１時間、．．．、８９時間）で採取された（図２Ａ）。ＰＡ  １から５−ＨＰＡ  ２への変換をＨＰＬＣによりモニターした（図２Ｂを参照されたい）。
【０１０３】
６８．５時間後、９３％のＰＡ  １（３ｍｍｏｌ）がシス−５−ＨＰＡ  ２に変換された。追加の１．５ｍｍｏｌ  ＰＡ  １（０．５×初期量）および３ｍｍｏｌ  αＫＧ（２当量）を反応混合物に加えた。Ｌ−ＰＡ  １から（Ｓ，Ｓ）−シス−５−ＨＰＡ  ２への＞９８％の変換が、８９時間の総反応時間後に検出された。図２Ｂに、８９時間の反応時間後の反応混合物のＨＰＬＣ−クロマトグラムを示す。ダンシルクロリド誘導体化を事前に行った。８９時間の試料のクロマトグラムでは、基質ＰＡ  １のほんの微量のシグナルが残っている（ｔｒ約２．５５分）。ｔｒ約１．４５分のシグナルは、所望の生成物５−ＨＰＡ  ２に関する。
【０１０４】
生成物のジアステレオマー過剰率は、ＨＰＬＣを用いて、ならびにインラインの塩化フルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）誘導体化により測定された。図１Ｃに、細胞除去およびインラインのＦｍｏｃ誘導体化後の８９時間試料のＨＰＬＣ−クロマトグラムを示す。トランス−５−ＨＰＡ  ３は検出されなかった。トランス−５−ＨＰＡ  ３ジアステレオマーのシグナルは、保持時間ｔｒ約１．７分で予想されるが、ｔｒ約１．８分の５−シス−ＨＰＡ  ２のシグナルのみが視認される。このＨＰＬＣ法を使用して、約１％の残留ＰＡ  １を検出した。図２Ｃに視認さるように、インラインのＦｍｏｃ誘導体化を使用したＨＰＬＣクロマトグラムには、Ｆｍｏｃ誘導体化に関連する多数のバックグラウンドシグナルがある。
【０１０５】
この実験を完了するために、ＰＨ０５を含む、８３．３３ｇ／Ｌ（ＯＤ６００約５０）の全細胞触媒を使用して、３０ｍＬの反応容量中の４．５ｍｍｏｌ（５８０．５ｍｇ）ＰＡ  １（約１９ｇ／Ｌ）は、副産物が検出されることなく、５−シス−ＨＰＡ  ２に変換した（＞９８％）。
【０１０６】
実施例３：約１９ｇ／ＬのＰＡ  １濃度でのＰＨ０５、ならびに５０ｍＭおよび２００ｍＭでのαＫＧ添加による分取スケール生体内形質転換
Ｌ−ピペコリン酸（ＰＡ）（１）（０．３８７ｇ、３ｍｍｏｌ、１００ｍＭ）を、ＰＨ０５を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）全細胞（８３ｇ／Ｌ湿潤細胞塊）、α−ケトグルタル酸二ナトリウム塩（αＫＧ）（１．３５６ｇ、６ｍｍｏｌ、２００ｍＭ、２当量）、アスコルビン酸ナトリウム（０．０１８ｇ、３ｍＭ、０．０３当量）およびモール塩（０．０１２ｇ、０．０３ｍｍｏｌ、１ｍＭ、０．０１当量）を含有する３０ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７）に加えた。６００μＬ（２％ｖ／ｖ）の消泡剤Ｙ−３０を添加し、反応液を１５℃で撹拌し、一方、一定流量の水飽和空気を適用した（２５０ｍＬ／分）。
【０１０７】
追加量のＰＡ１およびαＫＧを反応に供給した（図３Ａに記載される）。ＰＡ  １（１９５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、５０ｍＭ）およびαＫＧ（１．３５６ｇ、６ｍｍｏｌ、２００ｍＭ）を７８時間で加え、αＫＧ（各３４０ｍｇ、約１．５ｍｍｏｌ、約５０ｍＭ）を以下の時間点：２３時間および９４．５時間の後に加えた。反応時間にわたって２Ｍ  ＨＣｌ溶液（１０ｍＬ、２６ｍｍｏｌ）を加えることにより、ｐＨを一定に保った。
【０１０８】
１１７時間後、ＰＡ  １から５−シス−ＨＰＡ  ２への約９９％の変換が検出された。結果を図３に示す。
【０１０９】
実施例４：約１９ｇ／ＬのＰＡ  １濃度でのＰＨ０５、ならびに２５ｍＭおよび１００ｍＭでのαＫＧ添加による分取スケール生体内形質転換
Ｌ−ピペコリン酸（ＰＡ）（１）（０．３８７ｇ、３ｍｍｏｌ、１００ｍＭ）を、ＰＨ０５を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）全細胞（８３ｇ／Ｌ湿潤細胞塊）、α−ケトグルタル酸二ナトリウム塩（αＫＧ）（１．３５６ｇ、６ｍｍｏｌ、２００ｍＭ、２当量）、アスコルビン酸ナトリウム（０．０１８ｇ、０．０９ｍｍｏｌ、３ｍＭ、０．０３当量）およびモール塩（０．０１２ｇ、０．０３ｍｍｏｌ、１ｍＭ、０．０１当量）を含有する３０ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７）に溶解した。６００μＬ（２％ｖ／ｖ）の消泡剤Ｙ−３０を加え、反応液を１５℃で撹拌し、一方、一定流量の水飽和空気を適用した（２５０ｍＬ／分）。
【０１１０】
追加量のＰＡ１およびαＫＧを反応に供給した（図４Ａに記載される）。ＰＡ  １（１９５ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、５０ｍＭ）およびαＫＧ（０．６７８ｇ、３ｍｍｏｌ、２当量、１００ｍＭ）を４８時間で加え、αＫＧ（各１７０ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、２５ｍＭ）を以下の時間点：１２、２２、３７、４３、６８、８３時間の後に加えた。反応時間にわたって２Ｍ  ＨＣｌ溶液（１３ｍＬ、２６ｍｍｏｌ）を加えることにより、ｐＨを一定に保った。
【０１１１】
９２時間後、ＰＡ  １からシス−５−ＨＰＡ  ２への９１％の変換が検出された。結果を図４に示す。
【０１１２】
実施例５：約３．２ｇ／ＬのＰＡ  １濃度でのＰＨ０５による分取スケール生体内形質転換
Ｌ−ピペコリン酸（ＰＡ）（１）（約０．１ｇ、０．７５ｍｍｏｌ、２５ｍＭ）を、ＰＨ０５を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）全細胞（８３ｇ／Ｌ湿潤細胞塊）、α−ケトグルタル酸二ナトリウム塩（αＫＧ）（０．３３８ｇ、１．５ｍｍｏｌ、５０ｍＭ、２当量）、アスコルビン酸ナトリウム（１．５ｍＭ）およびモール塩（０．５ｍＭ）を含有する３０ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７）に溶解した。６００μＬ（２％ｖ／ｖ）の消泡剤Ｙ−３０を加え、反応液を１５℃で撹拌し、一方、一定流量の水飽和空気を適用した（２５０ｍＬ／分）。反応時間にわたって１Ｍ  ＨＣｌ溶液（６ｍＬ、６ｍｍｏｌ）を加えることにより、ｐＨを一定に保った。
【０１１３】
４１時間後、ＰＡ  １からシス−５−ＨＰＡ  ２への５３％の変換が検出され、反応はさらに進行しなかった。結果を図５に示す。
【０１１４】
実施例６：１９ｇ／ＬのＰＡ  １濃度でのＰＨ１２による分取スケール生体内形質転換
【０１１５】
【化４】
2021503904.tif 000009
【０１１６】
Ｌ−ピペコリン酸（ＰＡ）（１）（０．１９４ｇ、１．５ｍｍｏｌ、５０ｍＭ）を、ＰＨ１２を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）全細胞（８３ｇ／Ｌ湿潤細胞塊）、α−ケトグルタル酸二ナトリウム塩（αＫＧ）（０．６７８ｇ、３ｍｍｏｌ、２当量、１００ｍＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（０．００９ｇ、０．０４５ｍｍｏｌ、１．５ｍＭ、０．０３当量）、モール塩（０．００６ｇ、０．０１５ｍｍｏｌ、０．５ｍＭ、０．０１当量）を含有する３０ｍＬリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７）に溶解し、６００μＬ（２％ｖ／ｖ）消泡剤Ｙ−３０を加えた。反応液を２５℃で撹拌し、一定流量の水飽和空気を適用した（２５０ｍＬ／分）。
【０１１７】
追加量のαＫＧ（３４０ｍｇ、約１．５ｍｍｏｌ、５０ｍＭ）を６時間後に加え、Ｌ−ピペコリン酸（ＰＡ）（１）（３８７ｍｇ、３ｍｍｏｌ、１００ｍＭ）およびα−ケトグルタル酸二ナトリウム塩（αＫＧ）（１．３５６ｇ、６ｍｍｏｌ、２当量、２００ｍＭ）を４４時間後に加えた。図６Ａに示されるように、様々な時間点の後に試料を採取した。反応時間にわたって１Ｍ  ＨＣｌ溶液（３０ｍＬ、３０ｍｍｏｌ）を加えることにより、ｐＨを一定に保った。
【０１１８】
６８時間後、１５０ｍＭの総基質濃度を使用してＰＡ  １の９３％変換が検出された。ＰＨ０５を使用した以前の実験とは対照的に、少量（＜１％）の３−ＨＰＡ  ４および２．６％（２Ｓ，５Ｒ）−トランス−５−ＨＰＡ  ３が検出された（図６を参照されたい）。
【０１１９】
実施例７：３．２ｇ／ＬのＰＡ  １濃度でのＰＨ１２による分取スケール生体内形質転換
Ｌ−ピペコリン酸（ＰＡ）（１）（約０．１ｇ、０．７５ｍｍｏｌ、２５ｍＭ）を、ＰＨ１２を発現する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）全細胞（８３ｇ／Ｌ湿潤細胞塊）、α−ケトグルタル酸二ナトリウム塩（αＫＧ）（０．３３９ｇ、１．５ｍｍｏｌ、２当量、５０ｍＭ）、アスコルビン酸ナトリウム（１．５ｍＭ）、モール塩（０．５ｍＭ）を含有する３０ｍＬのリン酸カリウム緩衝液（１００ｍＭ、ｐＨ７）に溶解した。６００μＬ（２％ｖ／ｖ）消泡剤Ｙ−３０を加えた。反応液を２５℃で撹拌し、一定流量の水飽和空気を適用した（２５０ｍＬ／分）。反応時間にわたって１Ｍ  ＨＣｌ溶液（５ｍＬ、５ｍｍｏｌ）を加えることにより、ｐＨを一定に保った。
【０１２０】
追加量のα−ケトグルタル酸二ナトリウム塩（αＫＧ）（約０．０８５ｇ、０．３７５ｍｍｏｌ、０．５当量、１２．５ｍＭ）を２１時間および２６時間後に反応に加えた。図７Ａに示される時間点の後に試料を採取した。
【０１２１】
４１時間後、２５ｍＭのＰＡ  １の総基質濃度を使用してＰＡ  １の＞９９％変換が検出された。高濃度のＰＨ１２を用いた実験とは対照的に、３−ＨＰＡ  ４および（２Ｓ，５Ｒ）−トランス−５−ＨＰＡ  ３形成は検出されなかった（図７を参照されたい）。
【図１】
2021503904.tif 000010
【図２Ａ】
2021503904.tif 000011
【図２Ｂ】
2021503904.tif 000012
【図２Ｃ】
2021503904.tif 000013
【図３Ａ】
2021503904.tif 000014
【図３Ｂ】
2021503904.tif 000015
【図３Ｃ】
2021503904.tif 000016
【図４Ａ】
2021503904.tif 000017
【図４Ｂ】
2021503904.tif 000018
【図４Ｃ】
2021503904.tif 000019
【図５Ａ】
2021503904.tif 000020
【図５Ｂ】
2021503904.tif 000021
【図５Ｃ】
2021503904.tif 000022
【図６Ａ】
2021503904.tif 000023
【図６Ｂ】
2021503904.tif 000024
【図６Ｃ】
2021503904.tif 000025
【図７Ａ】
2021503904.tif 000026
【図７Ｂ】
2021503904.tif 000027
【図７Ｃ】
2021503904.tif 000028
【配列表】
2021503904000001.app
【国際調査報告】
2021503904.tif 000029
2021503904.tif 000030
2021503904.tif 000031
2021503904.tif 000032