(57)【要約】  生体試料を、構造体上または構造体内に配置して、生体試料の温度を低下させることと、閉じたチャンバ内に生体試料を含む状態で、チャンバに真空を適用して、チャンバ内の圧力を低下させることと、チャンバを冷却して、チャンバ内の温度を低下させることと、チャンバ内の生体試料に熱を適用することと、を含む、哺乳動物の細胞または組織の生体試料を凍結乾燥するための方法。生体試料には、幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、精子、卵母細胞、胚、卵巣組織、子宮組織または精巣組織のうちの１つ以上が挙げられる。
2021511080.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
哺乳動物の細胞または組織の生体試料を凍結乾燥するための方法であって、前記方法が、前記生体試料の液滴、小体積またはスライスのうちの１つ以上を、構造体上または構造体内に配置して、前記生体試料の温度を下げることと、閉じたチャンバ内に前記生体試料を含む状態で、前記チャンバに真空を適用して、前記チャンバ内の圧力を低下させることと、冷却して、前記チャンバ内の温度を低下させることと、前記チャンバ内の前記生体試料に熱を適用することと、を含む、方法。
【請求項２】
前記構造体が予冷された金属表面であり、前記生体試料が、前記予冷された表面が前記チャンバ内にあるときに、前記予冷された金属表面上に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記構造体が予冷された金属表面またはバイアルであり、前記生体試料が、前記予冷された金属表面上または前記チャンバの外部の前記バイアル内に配置され、前記予冷された表面またはバイアルが、その後、前記チャンバ内に配置される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記生体試料が、ヒト起源もしくは動物起源のいずれかの幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞のうちの１つ以上を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記生体試料が、精子、卵母細胞、胚、卵巣組織、子宮組織または精巣組織のうちの１つ以上を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記生体試料が、凍結乾燥溶液で希釈される、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＬＹＯ溶液が、ａ）ＤＭＳＯおよび炭水化物、またはｂ）ＤＭＳＯおよびタンパク質から構成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記ＬＹＯ溶液が、スクロース、ソルビトール、グルコースデキストランおよびトレハロースのうちの１つ以上と、ＤＭＳＯ、ＥＧ、ＰＧ、グリセロールのうちの１つ以上の凍結保護物質、ならびにＨＳＡ、ＦＣＳのうちの１つ以上の高分子、およびアスタキサンチン、ＥＧＣＧ、アスコルビン酸のうちの１つ以上の抗酸化剤と、の組み合わせである、請求項６に記載の方法。
【請求項９】
前記ＬＹＯ溶液が、ＴＣＭ−１９９、トリス、ＰＢＳまたはヘペスＴａｌｐ、ＲＰＭＩ−１６４０、ダルベッコ改変イーグル培地のうちの１つ以上を含む緩衝液または培地溶液と一緒にされる、請求項６に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＬＹＯ溶液が、トリス培地、卵黄、トレハロース、およびソルビトールを含む、請求項６に記載の方法。
【請求項１１】
前記ＬＹＯ溶液が、１０％のＤＭＳＯおよび１０％のＨＳＡを含有する、請求項６に記載の方法。
【請求項１２】
最終濃度に到達するまで、徐々に低下する濃度の前記ＬＹＯ溶液に前記生体試料を曝露することをさらに含む、請求項６〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記チャンバ内の前記温度を制御する工程をさらに含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記チャンバを冷却する工程が、前記チャンバの少なくとも一部を、極低温流体の容器に挿入する工程を含む、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記極低温流体が、液体窒素であり、前記チャンバ内の凝縮器が、前記チャンバが液体窒素の前記容器内に配置されたとき、前記液体窒素のレベルより上に留まる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記極低温流体が、液体窒素であり、前記生体試料が、前記チャンバが液体窒素の前記容器内に配置されたとき、前記液体窒素のレベルより上に留まる、請求項１４に記載の方法。
【請求項１７】
前記極低温流体が、液体窒素であり、前記チャンバ内の温度が、前記液体窒素の前記レベルに対する前記チャンバ内の凝縮器のレベルによって調節される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１８】
前記生体試料が、ゆっくりとした速度で、−３℃から−１０℃の間の播種温度まで、さらに−７℃から−５０℃の間の氷点下温度まで冷却される、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記チャンバが、ポリカーボネート、ポリプロピレン、またはテフロン（登録商標）のプラスチック材料から構成されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法
【請求項２０】
前記Ｌｙｏ溶液が、凍結保護添加剤の比率と細胞濃度との間の割合である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記凍結保護添加剤が、ＤＭＳＯまたはトレハロースである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
哺乳動物の細胞または組織の生体試料を凍結乾燥および再水和するための方法であって、
ａ）少なくとも１つの生体試料を含有する担体を、第１のＬＹＯ溶液に挿入することと、
ｂ）前記第１のＬＹＯ溶液から前記担体を除去し、前記担体を第２のＬＹＯ溶液中に配置することであって、前記第２のＬＹＯ溶液が、前記第１のＬＹＯ溶液とは異なる、除去して配置することと、
ｃ）前記担体をデバイスのチャンバに配置することであって、前記チャンバが、前記少なくとも１つの生体試料を保持するための容器と、前記チャンバ内の温度を低下させるための凝縮器とを有する、配置することと、
ｄ）前記チャンバに真空を適用して、前記チャンバ内の圧力を低下させ、前記チャンバ内の温度を低下させ、前記少なくとも１つの生体試料を加熱することにより、前記少なくとも１つの生体試料を凍結乾燥することと、
ｅ）工程（ｃ）の後、前記デバイスから前記担体を除去し、前記担体を第３の溶液に挿入し、続いて、前記第３の溶液から前記担体を除去し、前記担体を第４の溶液に挿入して、前記少なくとも１つの生体試料を再水和することと、を含む、方法。
【請求項２３】
前記生体試料が、幹細胞の再水和のための培地中にソルビトール、スクロースおよび／またはトレハロースのうちの１つ以上を含む糖を含有する再水和溶液中で、２２℃、３０℃、または３７℃の温度で再水和される、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記乾燥した細胞が、ＵＶなどの照射に曝露される、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
前記チャンバが、２リットル以下の容積を有する、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記チャンバが、１リットル以下の容積を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記生体試料から前記チャンバ内の前記凝縮器までの距離が、１０ｃｍ以下である、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記生体試料から前記凝縮器までの距離が、２ｃｍ以下である、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
試料を、卵黄溶液中のソルビトール、スクロースおよびトレハロースのうちの１つ以上を含む糖と、精子の再水和のためのＴＲＩＳ培地と、胚、卵母細胞または卵巣組織の再水和のための１Ｍトレハロースもしくはスクロースと、を含有する再水和溶液中で３７℃の温度で再水和するための方法。
【請求項３０】
哺乳動物の細胞または組織の生体試料を凍結乾燥する方法であって、前記方法が、生体試料を、閉じたチャンバを有するデバイスに配置することであって、前記閉じたチャンバが、圧力を低減させる前記デバイス内の領域として定義され、前記チャンバが、１．５リットル以下の容積を有する、配置することと、前記チャンバに真空を適用して、前記チャンバ内の圧力を低下させることと、前記チャンバを冷却して、前記チャンバ内の温度を低下させることと、前記チャンバ内の前記生体試料に熱を適用することと、を含む、方法。
【請求項３１】
前記容積が、１リットル以下である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記生体試料が、ヒト起源もしくは動物起源のいずれかの幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞のうちの１つ以上を含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記生体試料が、精子、卵母細胞、胚、卵巣組織、子宮組織または精巣組織のうちの１つ以上を含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３４】
哺乳動物の細胞または組織の生体試料を凍結乾燥する方法であって、前記方法が、生体試料を、閉じたチャンバを有するデバイスに配置することであって、前記閉じたチャンバが、圧力を低減させる前記デバイス内の領域として定義され、前記チャンバが、その中に定義された容積を有し、前記デバイスが、前記チャンバ内に凝縮器を有し、前記生体試料が、前記凝縮器と前記生体試料との間の距離が、１０ｃｍ以下であるように、前記チャンバ内に配置される、配置することと、前記チャンバに真空を適用して、前記チャンバ内の圧力を低下させることと、前記チャンバを冷却して、前記チャンバ内の温度を低下させることと、前記チャンバ内の前記生体試料に熱を適用することと、を含む、方法。
【請求項３５】
前記生体試料から前記凝縮器までの距離が、２ｃｍ以下である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
哺乳動物の細胞または組織の生体試料を凍結乾燥するための方法であって、
ａ）生体試料を、閉じたチャンバを有するデバイスに配置することであって、前記閉じたチャンバが、圧力を低減させる前記デバイス内の領域として定義される、配置することと、
ｂ）前記デバイスを、極低温流体の容器に配置して、前記チャンバを冷却することと、
ｃ）前記チャンバに真空を適用して、前記チャンバ内の圧力を低下させることと、
ｄ）前記チャンバ内の前記生体試料に熱を適用することと、を含む、方法。
【請求項３７】
前記デバイスを極低温流体の前記容器内に配置して、前記チャンバを冷却する工程が、凝縮器を極低温流体から離間するように前記凝縮器を前記チャンバ内に配置して、前記凝縮器が流体の外側に留まるようにする、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記生体試料から前記凝縮器までの距離が、１０ｃｍ以下である、請求項３６または３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記生体試料から前記凝縮器までの距離が、２ｃｍ以下である、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記生体試料が、ヒト起源もしくは動物起源のいずれかの幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞のうちの１つ以上を含む、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記生体試料が、精子、卵母細胞、胚、卵巣組織、子宮組織または精巣組織のうちの１つ以上を含む、請求項３７〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記チャンバが、２リットル以下の容積を有する、請求項３６〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記チャンバの容積が、１リットル以下である、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
哺乳動物の細胞または組織の生体試料を凍結乾燥するためのデバイスであって、
ａ）第１の内部空間を有する第１の容器であって、前記第１の内部空間の内部環境に曝される前記生体試料を保管するように構成され、かつ前記生体試料からの氷晶の昇華を促進するように構成されている、第１の容器と、
ｂ）水蒸気の固体への相転移を促進するために低温環境に曝されるように構成された凝縮器であって、前記凝縮器が、前記第１の内部空間と連通する第２の内部空間を有し、前記第１および第２の内部空間が、前記生体試料および前記凝縮器が前記同じチャンバ内にあるように閉じたチャンバを形成し、前記チャンバが真空ポンプに連結可能である、凝縮器と、を備え、
ｃ）前記第１の容器および前記凝縮器が、前記閉じた内部空間と外部環境との間の粒子の交換を防止するように構成されている、デバイス。
【請求項４５】
前記凝縮器にエネルギーを供給して前記凝縮器と前記第１および第２の内部空間とを冷却するための冷却要素をさらに備える、請求項４４に記載のデバイス。
【請求項４６】
前記デバイスが、前記凝縮器を冷却するために極低温流体の容器内に配置可能である、請求項４５に記載のデバイス。
【請求項４７】
前記極低温流体が、第１のレベルで前記容器内にあり、前記凝縮器が、前記極低温流体から離間した前記容器内に配置可能であるため、前記凝縮器が、前記極低温流体の外側に留まる、請求項４６に記載のデバイス。
【請求項４８】
極低温流体の前記容器と組み合わされ、昇降要素が、前記容器内に配置され、前記昇降要素が、前記極低温流体レベルより上の位置で前記凝縮器を支持し、前記昇降要素が、前記極低温流体レベルより上の前記凝縮器の距離を調整するように調整可能である、請求項４７に記載のデバイス。
【請求項４９】
前記第１の容器が、複数の生体試料を受容するための複数の空洞を含む、請求項４７に記載のデバイス。
【請求項５０】
前記閉じたチャンバの内部容積が、２．０リットル以下である、請求項４７に記載のデバイス。
【請求項５１】
前記閉鎖されたチャンバの内部容積が、１．０リットル以下である、請求項５０に記載のデバイス。
【請求項５２】
哺乳動物の細胞または組織の生体試料を凍結乾燥するためのデバイスであって、
ａ）前記生体試料を保持するためのホルダーであって、閉じたチャンバ内に位置する、ホルダーと、
ｂ）前記閉じたチャンバを冷却するために、前記閉じたチャンバ内に配置された凝縮器と、
ｃ）前記閉じたチャンバと連通し、かつ真空源と連通する入口と、を備え、
ｄ）前記閉じたチャンバが、前記真空源によって圧力が低減される領域を画定し、前記閉じたチャンバが、２リットル未満の容積を有する、デバイス。
【請求項５３】
前記閉じたチャンバの内部容積が、１リットル以下である、請求項５２に記載のデバイス。
【請求項５４】
別個のデバイスに含有される哺乳動物の細胞または組織の複数の生体試料を凍結乾燥する方法であって、
ａ）第１の容器に第１の生体試料を含有する第１のデバイスを配置することであって、前記第１の容器が、その中に極低温流体を含有する、配置することと、
ｂ）第２の生体試料を含有する第２のデバイスを、その中に前記極低温流体を含有する前記第１の容器に配置することと、
ｃ）真空ポンプを作動させて、前記第２のデバイスの第２のチャンバに真空を適用することなく、前記第１のデバイスの第１のチャンバの圧力を低下させることと、を含む、方法。
【請求項５５】
前記第１の容器への真空を遮断する工程と、前記第１のデバイスが前記極低温流体内に留まる間に同じ真空ポンプから前記第２の容器に真空を適用する工程と、をさらに含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記第１および第２のデバイスが、真空を選択的に開き、かつ遮断するためのバルブを有する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
前記第１および第２の生体試料が、ヒト起源もしくは動物起源のいずれかの幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞のうちの１つ以上を含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記第１および第２の生体試料が、精子、卵母細胞、胚、卵巣組織、子宮組織または精巣組織のうちの１つ以上を含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年１月２２日に出願された仮出願第６２／６１９，９３４号および２０１８年２月２５日に出願された仮出願第６２／６３４，８６８号からの優先権を主張するものである。これらの各出願の内容全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本出願は、精子、卵母細胞、胚、生殖組織および幹細胞などの生体試料を凍結乾燥する方法、およびこのような凍結乾燥を実施するためのデバイスに関する。
【背景技術】
【０００３】
凍結保存は、両性の配偶子ならびに多くの家畜および野生生物種の胚にかなり適している。様々な種には独自の側面、感度、および制限があるが、生殖質は凍結保存、保管でき、最終的には生殖補助医療プログラムで使用することができる。しかしながら、この有効な凍結保存方法は、大きな代償を伴う。液体窒素（ＬＮ）下の保管での凍結保存試料の維持は、維持費が高く、専用の専門施設および訓練を受けたスタッフが必要である。さらに、配送は煩雑で非常に高価であり、保証され、かつ継続的なＬＮ供給が必要である。さらに不利な点は、「汚れた」ＬＮが原因で、または汚染された試料が原因のいずれかで試料間で病原体が伝染するリスクがあることである。生体試料を液体窒素で保管する際のもう１つの欠点は、タンクの誤動作および試料の不可逆的な損失のリスクである。これらの本質的な問題のほかに、ＬＮの工業生産ならびに流通、および専用の保管施設のエネルギー需要は、深刻な環境への影響があり、大量の二酸化炭素排出量を残す。
【０００４】
液体窒素凍結保存に代わるものを提供することは有利であろう。このような代替案は、コストを削減し、プロセスを簡略化し、汚染のリスクを削減し、かつ環境への影響を最小限に抑えることによって、前述の制限および欠点を克服するであろう。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、精子細胞、卵母細胞、胚および卵巣、子宮ならびに精巣などの生殖組織の凍結乾燥の乾燥プロセスを提供することにより、精子細胞、卵母細胞、胚および生殖組織を含む生体試料のための液体窒素凍結保存の欠点および欠陥を克服する。本明細書に開示された装置を使用して、生体試料を特別な凍結乾燥溶液／溶液（複数）に浸漬し、次いで凍結および乾燥させる。その後の再水和の結果は、体外受精（ＩＶＦ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、着床前遺伝子スクリーニング（ＰＧＳ）を含む遺伝子スクリーニング、着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）を含む遺伝子診断テスト、およびその他などの生殖補助医療技術に使用することができるようなものである。
【０００６】
本発明の液体窒素凍結保存代替案はまた、幹細胞保存にも利用され得る。
【０００７】
本発明は、凍結乾燥保存のためのプロセスおよびこのようなプロセスを実施するためのデバイスの両方を提供し、これらの両方は以下に詳細に記載される。本プロセスには、生体試料を急速に凍結すること、圧力を低下させること、および昇華によって氷を除去することを伴う、低温脱水プロセスを伴う。これは、プロセスを有利にスピードアップする小体積で実行される。
【０００８】
本発明の一態様によれば、哺乳動物の細胞または組織などの生体試料を凍結乾燥するための方法が提供され、本方法は、生体試料の液滴、小体積またはスライスのうちの１つ以上を、チャンバを有するデバイス内に配置することと、閉じたチャンバ内に生体試料を含む状態で、チャンバに真空を適用して、チャンバ内の圧力を低下させることと、チャンバを冷却してチャンバ内の温度を低下させることと、チャンバ内の生体試料に熱を適用することと、を含む。
【０００９】
いくつかの実施形態では、試料の温度を上げるために、生体試料は、予冷された表面がチャンバ内にあるときに予冷された金属表面上に配置され、他の実施形態では、生体試料は、予冷された金属表面上またはチャンバの外側のバイアル内に配置され、その後、予冷された表面がチャンバ内に配置される。
【００１０】
本明細書の方法のいくつかの実施形態では、生体試料には、ヒト起源もしくは動物起源のいずれかの精子、卵母細胞、胚、卵巣組織、子宮組織または精巣組織幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、または人工多能性幹細胞のうちの１つ以上が挙げられる。
【００１１】
いくつかの実施形態では、生体試料は、ＬＹＯ溶液中で希釈される。いくつかの実施形態では、ＬＹＯ溶液は、ａ）ＤＭＳＯおよび炭水化物、またはｂ）ＤＭＳＯおよびタンパク質から構成される。いくつかの実施形態では、ＬＹＯ溶液は、スクロース、ソルビトール、グルコースデキストランおよびトレハロースのうちの１つ以上と、ＤＭＳＯ、ＥＧ、ＰＧ、グリセロールなどの凍結保護物質、ならびにＨＳＡ、ＦＣＳなどの高分子、およびアスタキサンチン、ＥＧＣＧ、アスコルビン酸などの抗酸化剤との組み合わせである。いくつかの実施形態では、ＬＹＯ溶液は、ＴＣＭ−１９９、トリス、ＰＢＳまたはヘペスＴａｌｐ、ＲＰＭＩ−１６４０、ダルベッコ改変イーグル培地の１つ以上を含む緩衝液または培地溶液と一緒にすることができる。いくつかの実施形態では、ＬＹＯ溶液は、トリス培地、卵黄、トレハロースおよびソルビトールから構成される。いくつかの実施形態では、ＬＹＯ溶液は、１０％のＤＭＳＯおよび１０％のＨＳＡを含有する。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本方法は、最終濃度に到達するまで、徐々に低下する濃度のＬＹＯ溶液に試料を曝露することを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、チャンバを冷却する工程は、チャンバの少なくとも一部を液体窒素または他の極低温流体の容器に挿入する工程を含む。チャンバ内の凝縮器および／または生体試料は、いくつかの実施形態では、チャンバが液体窒素の容器内に配置されたとき、液体窒素のレベルより上に留まることができる。チャンバ内の温度は、いくつかの実施形態では、液体窒素のレベルに対するチャンバ／凝縮器のレベルによって調節される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、生体試料は、ゆっくりとした速度で、−３℃から−１０℃の間の播種温度まで、さらに−７℃から−５０℃の間の氷点下温度まで冷却される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、チャンバは、ポリカーボネート、ポリプロピレンまたはテフロン（登録商標）のプラスチック材料から構成される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、Ｌｙｏ溶液は、凍結保護添加剤の比率と細胞濃度との間の割合である。いくつかの実施形態では、凍結保護添加剤は、ＤＭＳＯまたはトレハロースである。
【００１７】
本発明の別の態様によれば、ａ）少なくとも１つの生体試料を含有する担体を、第１のＬＹＯ溶液中に挿入することと、ｂ）第１のＬＹＯ溶液から担体を除去し、担体を第２のＬＹＯ溶液中に配置することであって、第２のＬＹＯ溶液が、第１のＬＹＯ溶液とは異なる、除去して配置することと、ｃ）担体をデバイスのチャンバ内に配置することであって、チャンバが、少なくとも１つの生体試料を保持するための容器と、チャンバ内の温度を低下させるための凝縮器とを有する、配置することと、ｄ）チャンバに真空を適用して、チャンバ内の圧力を低下させ、チャンバ内の温度を低下させ、少なくとも１つの生体試料を加熱することにより、少なくとも１つの生体試料を凍結乾燥することと、ｅ）工程（ｃ）の後、デバイスから担体を除去し、担体を第３の溶液中に挿入し、続いて、担体を第３の溶液から除去し、担体を第４の溶液中に挿入して、少なくとも１つの生体試料を再水和することと、を含む、生体試料を凍結乾燥および再水和する方法が提供される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、試料は、幹細胞の再水和のための培地中にソルビトール、スクロースおよび／またはトレハロースのうちの１つ以上を含む糖を含有する再水和溶液中で、２２℃、３０℃または３７℃の温度で再水和される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、乾燥した細胞は、ＵＶなどの照射に曝露される。
【００２０】
好ましい実施形態では、チャンバは２リットル以下の容積を有し、より好ましい実施形態では、１．５リットル以下の容積を有し、より好ましい実施形態では、１リットル以下の容積を有する。
【００２１】
好ましい実施形態では、生体試料から凝縮器までの距離は１０ｃｍ以下であり、より好ましい実施形態では、生体試料から凝縮器までの距離は２ｃｍ以下である。
【００２２】
別の態様によれば、試料を、卵黄溶液中のソルビトール、スクロースおよびトレハロースなどの糖と、精子の再水和のためのＴＲＩＳ培地と、胚、卵母細胞または卵巣組織の再水和のための１Ｍトレハロースもしくはスクロースと、を含有する再水和溶液中で３７℃の温度で再水和するための方法が提供される。
【００２３】
別の態様によれば、生体試料を、閉じたチャンバを有するデバイスに配置することを含み、閉じたチャンバが、圧力を低減させるデバイス内の領域として定義され、チャンバが、１．５リットル以下の容積を有する、生体試料を凍結乾燥するための方法が提供される。この方法は、真空をチャンバに適用してチャンバ内の圧力を低下させることと、チャンバを冷却してチャンバ内の温度を低下させることと、生体試料に熱を適用することと、をさらに含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、容積は１リットル以下である。
【００２５】
本発明の別の態様によれば、生体試料を凍結乾燥するための方法が提供され、本方法は、生体試料を、閉じたチャンバを有するデバイスに配置することを含み、閉じたチャンバが、圧力を低減させるデバイス内の領域として定義され、チャンバが、その中に定義された容積を有する。デバイスは、チャンバ内に凝縮器を有し、生体試料は、凝縮器と試料との間の距離が１０ｃｍ以下であるようにチャンバ内に配置される。この方法は、真空をチャンバに適用してチャンバ内の圧力を低下させることと、チャンバを冷却してチャンバ内の温度を低下させることと、生体試料に熱を適用することと、をさらに含む。
【００２６】
いくつかの実施形態では、生体試料から凝縮器までの距離は、２ｃｍ以下である。
【００２７】
本発明の別の態様によれば、ａ）閉じたチャンバを有するデバイス内に生体試料を配置することであって、閉じたチャンバが、圧力を低減させるデバイス内の領域として定義される、配置することと、ｂ）デバイスを極低温流体の容器に配置して、チャンバを冷却することと、ｃ）チャンバに真空を適用して、チャンバ内の圧力を低下させることと、ｄ）生体試料およびチャンバに熱を適用することと、を含む、生体試料を凍結乾燥するための方法が提供される。
【００２８】
前述では、チャンバは開いており、次いで、試料の配置後に閉じられる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、デバイスを極低温流体の容器内に配置してチャンバを冷却する工程は、凝縮器を極低温流体から離間するように凝縮器をチャンバ内に配置して、凝縮器が流体の外側に留まるようにする。極低温流体は、液体窒素であり得る。
【００３０】
好ましくは、生体試料から凝縮器までの距離は１０ｃｍ以下であり、より好ましくは、生体試料から凝縮器までの距離は２ｃｍ以下である。
【００３１】
好ましくは、チャンバは２リットル以下の容積を有し、より好ましい実施形態では、１．５リットル以下の容積を有し、より好ましい実施形態では、１リットル以下の容積を有する。
【００３２】
本発明の別の態様によれば、ａ）第１の内部空間を有する第１の容器であって、第１の内部空間の内部環境に曝される生体試料を保管するように構成され、かつ生体試料からの氷晶の昇華を促進するように構成されている、第１の容器と、ｂ）水蒸気の固体への相転移を促進するために低温環境に曝されるように構成された凝縮器であって、凝縮器が、第１の内部空間と連結可能かつそれと連通することができる第２の内部空間を有し、第１および第２の内部空間が、生体試料および凝縮器が同じチャンバ内にあるように閉じたチャンバを形成し、チャンバが真空ポンプに連結可能である、凝縮器と、を備え、ｃ）第１の容器および凝縮器が、閉じた内部空間と外部環境との間の粒子の交換を防止するように構成されている、生体試料を凍結乾燥するためのデバイスが提供される。
【００３３】
いくつかの実施形態では、デバイスは、エネルギーを供給して凝縮器と第１および第２の内部空間とを冷却するための冷却要素をさらに備え、他の実施形態では、デバイスは、凝縮器を冷却するために極低温流体の容器内に配置可能である。いくつかの実施形態では、極低温流体は第１のレベルで容器内にあり、凝縮器は極低温流体から離間した容器内に配置可能であるため、凝縮器は流体の外側に留まる。
【００３４】
極低温流体、例えば液体窒素の容器は、いくつかの実施形態では、極低温流体レベルより上の位置で凝縮器を支持する昇降要素を含むことができ、昇降要素は、極低温流体レベルより上の凝縮器の距離を調整するように調整可能であり得る。
【００３５】
本発明の別の態様によれば、ａ）生体試料を保持するためのホルダーと、ｂ）チャンバを冷却するために閉じたチャンバ内に配置された凝縮器と、ｃ）チャンバと連通し、かつ真空源と連通する入口と、を備え、ｄ）閉じたチャンバが、真空源によって圧力が低減される領域を画定し、閉じたチャンバが、２リットル未満の容積を有する、生体試料を凍結乾燥するためのデバイスが提供される。いくつかの実施形態では、閉じたチャンバの内部容積は、１．５リットル以下であり、いくつかの実施形態は、１リットル以下である。
【００３６】
本発明の別の態様によれば、ａ）第１の容器に第１の生体試料を含有する第１のデバイスを配置することであって、第１の容器が、その中に極低温流体を含有する、配置することと、ｂ）第２の生体試料を含有する第２のデバイスを、その中に極低温流体を含有する第１の容器に配置することと、ｃ）真空ポンプを作動させて、第２のデバイスの第２のチャンバに真空を適用することなく、第１のデバイスの第１のチャンバの圧力を低下させることと、を含む、別個のデバイスに含有される複数の生体試料を凍結乾燥する方法が提供される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、方法は、第１のチャンバへの真空を遮断する工程と、第２のデバイスが極低温流体内にある間に同じ真空ポンプから第２のチャンバに真空を適用する工程と、を含む。第１および第２のデバイスは、真空を選択的に開き、かつ遮断するためのバルブを有することができる。
【００３８】
生体試料には、ヒト起源もしくは動物起源のいずれかの幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、精子、卵母細胞、胚、卵巣組織、子宮組織または精巣組織のうちの１つ以上が挙げられる。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
本発明が関係する当業者が、本明細書に開示される外科用装置を作製および使用する方法をより容易に理解するように、その好ましい実施形態が、図面を参照して以下で詳細に説明される。
【００４０】
【図１】本発明の一実施形態による、１つ以上の生体試料を凍結乾燥するためのデバイスの概略図である。
【図２】本発明の別の実施形態による、１つ以上の生体試料を凍結乾燥するためのデバイスの概略図である。
【図３】本発明の別の実施形態による、能動冷却を利用して、１つ以上の生体試料を凍結乾燥するためのデバイスの側面斜視図である。
【図４】本発明の別の実施形態による、受動冷却を利用して、１つ以上の生体試料を凍結乾燥するためのデバイスの側面斜視図である。
【図５】受動冷却を利用して、１つ以上の生体試料を凍結乾燥するためのデバイスの代替実施形態の側面図である。
【図６】極低温流体容器内の凝縮器のレベルを変更するための昇降要素の側面図である。
【図７】本発明の別の実施形態による、１つ以上の生体試料を凍結乾燥するためのデバイスにおける容器および凝縮器の上部の切り取り図である。
【図８】生体試料を保管するための２つのトレイを有する本発明の容器の代替実施形態の切り取り図である。
【図９Ａ−Ｂ】生体試料を保管するための本発明の容器の別の実施形態の斜視図である。
【図１０Ａ】生体試料を保管するための本発明の容器の別の実施形態の側面図である。
【図１０Ｂ】生体試料を凍結乾燥するためのデバイスの別の実施形態の側面図である。
【図１０Ｃ】液体窒素容器内に示されたデバイスの別の実施形態の切り取り図である。
【図１０Ｄ】図１０Ｃのデバイスの内部構成要素を示す。
【図１１Ａ】試料を凍結乾燥するためのシステムの図である。
【図１１Ｂ】試料を凍結乾燥するためのデバイスのブロック図である。
【図１２】本発明の方法の一実施形態による、精子の試料を凍結乾燥するためのシステムを示す。
【図１３Ａ】本発明の別の実施形態による、生体試料を凍結乾燥するためのシステムを示す。
【図１３Ｂ】図１３Ａの方法に従って生体試料を凍結乾燥するための全体的な工程を描くフローチャートである。
【図１４】本発明の１つの方法による、生体試料を再水和する方法を示す。
【図１５】図１３Ａおよび図１４の方法に従って描かれた凍結乾燥プロセスおよび再水和の工程を示すフローチャートである。
【図１６】本明細書に記載された試験による、照射された凍結精子（左）と照射された凍結乾燥精子（右）の中空精子染色（Ｈｏｌｌｏｗｓｐｅｒｍ  ｓｔａｉｎｉｎｇ）を示す。
【図１７】本明細書に記載された試験による、新鮮な対照および凍結乾燥組織について、再水和およびヘマトキシリンエオシンで染色した後の結果を示す。
【図１８】凍結した試料（ａ、ｂ）および凍結乾燥した試料（ｃ、ｄ）の顕微鏡画像を示す。
【図１９】ＬＹＯ溶液中で凍結した走査型電子顕微鏡画像を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
本発明は、生体試料を凍結乾燥するためのデバイスおよびこのような凍結乾燥のための方法を提供する。生体試料は、哺乳動物の細胞または組織であり得る。生体試料には、例えば、ヒト起源もしくは動物起源のいずれかの卵母細胞、胚、精子、生殖組織、卵巣組織、子宮組織、精巣組織、幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞などが挙げられる。本発明はまた、凍結乾燥プロセス後に使用するための試料の再水和を提供する。
【００４２】
本発明のデバイスは、その中に含有される生体試料を損傷することなく、閉じたチャンバ内で昇華を有利にもたらす。昇華があまりに早く開始するプロセスでは、試料に悪影響を及ぼす。本発明のデバイスは、小体積を利用し、短時間で所望の真空圧力に到達し、これにより、試料を損傷することなく昇華を達成することができる。さらに、本発明のデバイスは、無菌性を維持するという利点を有する。そのサイズのため、デバイスは滅菌器に配置できる。さらに、デバイスのコストを削減するそのサイズおよび単純さのために、デバイスは、ある特定の実施形態では、使用後の処分のための使い捨て材料から形成され得る。
【００４３】
本発明の凍結乾燥デバイスは、チャンバ内の温度を下げるための凝縮器、閉じたチャンバ内の圧力を低下させるための真空、および昇華プロセスのための容器内の生体試料を加熱するためのヒーター（凝縮器から間隔を置いた）を備えた閉じたチャンバを作成し、これらすべては、以下で詳しく説明される。これは、以下で詳細に論議される図１１Ａおよび１１Ｂの図にも示されている。
【００４４】
本発明の方法は、試料を凍結乾燥するためのデバイスを使用し、その後、使用のために所望の時間に再水和する。様々な方法を以下に詳細に説明し、試験結果のいくつかの例は、本発明の凍結乾燥方法の付随する有利な結果を示している。
【００４５】
最初に、生体試料を凍結乾燥するためのデバイスは、図１〜１０Ｄと関連して議論される。図１〜５は、１つ以上の生体試料を支持および凍結乾燥する（例えば、凍結乾燥する（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ））ための様々な実施形態を例示している。以下の説明では、特に明記しない限り、２つ以上の図に共通の構成要素は同じ参照番号で参照される。加えて、特に別段の記載がない限り、本説明で説明または参照される実施形態は、そこに説明または参照される他の任意の実施形態に追加および／または代替することができる。
【００４６】
これらのデバイスでは、２つの内部容器が設けられており、１つは生体試料（複数可）を支持（保管）するもので、もう１つは凝縮器を含有しているものである。２つの容器の内部空間は連通しており、外部環境から密封された閉じたチャンバとも称される閉じた内部空間を共に形成する。閉じた内部空間に真空が適用され、空間内の圧力を低下させる。デバイスは、温度を低下させるために、以下で説明する受動冷却または能動冷却のいずれかによって冷却される。試料は、容器内のバイアルまたは他のホルダーに保持され、様々な方法で加熱される。これらの機能により、試料に損傷を与えることなく昇華が達成される。
【００４７】
試料を凍結乾燥するためのデバイス
最初に図１の実施形態に目を向けると、１つ以上の生体試料１０２を凍結乾燥する（凍結乾燥する（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ））ためのデバイスが、概略的に示され、参照番号１００によって表記されている。このデバイスは、内部空間１１０を有する試料支持または試料保管（保持）容器１０４を備える。説明を簡単にするために、試料保持容器１０４は、本明細書では、「第１の内部空間」を有する「第１の容器」とも称される。この実施形態では、凝縮器１０６は、容器１０４の下に配置され、内部空間１１２を有する。説明を簡単にするために、凝縮器１０６の内側の空間１１２は、第２の内部空間１１２とも称される。第１の内部空間１１０および第２の内部空間１１２は、それらが第１の連結要素１０８を介して連結して、共に「閉じた内部空間」を構成するときに流体連通している。したがって、閉じた内部空間は、第１の容器１０４、凝縮器１０６、および連結要素１０８の内部空間によって画定される。示されるように、連結要素１０８は、容器１０４と凝縮器１０６との間のより狭い通路を形成するが、他の形状および寸法が代わりに提供され得る。
【００４８】
凝縮器１０６は、この密封された容積を不完全真空にするために、密封された容積（または言い換えれば、密封された空間）からガス分子を除去するように構成されたデバイスである真空ポンプ１１４に連結している。ポンプ１１４の凝縮器１０６への連結は、ポンプ１１４が第２の連結要素または接続チューブ１１８を介して連結される凝縮器１１６の開口部１１６を介して行われる。様々なタイプのポンプを利用することができる。いくつかの実施形態では、例えば、真空ポンプは、真空を１Ｔｏｒｒ未満に低減させる。連結具１１８は、ポンプ１１４から凝縮器１０６までの通路を提供する。図１の実施形態では、真空ポンプ１１４は、凝縮器１０６に直接的に連結しており、すなわち、真空ポンプ１１４は、凝縮器の壁の開口部１１６を介して連結し、凝縮器１０６の第２の内部空間１１２の圧力に影響を与える。第２の内部空間１１２は閉じた内部空間の一部を形成するので、真空ポンプ１１４は、第２の内部空間１１２と連通している第１の内部空間１１０を含む閉じた内部空間内の圧力に影響を与える。したがって、真空ポンプ１１４は、第１の容器１０４に間接的に連結していると考えられる。すなわち、真空ポンプ１１４は、第２の内部空間１１２に直接的に連結し、かつ第１の内部空間１１０に間接的に連結していると考えることができる。
【００４９】
代替実施形態では、真空ポンプ１１４は、第１の容器１０４に直接的に連結することができ、同時に第１の容器１０４の開口部および凝縮器の開口部と連通する第１の連結要素１０８などの連結要素を介して凝縮器１０６に間接的に連結することができる。あるいは、真空ポンプ１１４は、連結要素１０８の開口部を介して第１の連結要素１０８に取り付けることもでき、第１の容器１０４と凝縮器１０６との両方に間接的に連結している。しかしながら、これらの変更例のいずれでも、第１と第２の内部空間が連通しているため、真空ポンプを閉じた内部空間のいずれかの部分に接続すると、密封された容積を変換する、すなわち、閉じた内部空間の圧力を低下させるという所望の目的を達成する。
【００５０】
第１の容器１０４は、本明細書では、略して「試料」または「試料（複数）」と呼ばれる、１つ以上の生体試料１０２を保管するように構成されている。すなわち、本明細書の説明において、「試料」という用語が第１の容器または他のホルダー／担体の議論で使用される場合、デバイスの機能および目的を理解するために、用語「試料」が、単一の試料または複数の試料を意味すると解釈されるべきであるように、複数の試料もまた企図されることを理解されたい。
【００５１】
図１では、例として３つの試料が示されているが、これは非限定的であり、１つの試料、２つの試料、４〜１０個の試料、または適用可能な任意の数の試料を第１の容器に保管し、デバイス１００によって凍結乾燥することができる。すなわち、第１の容器１０４は、所望／必要に応じて、１つの試料または複数の試料（すなわち、１つ以上の試料）を保管するように構成されてもよい。生体試料は、第１の容器１０４の内側にそれらを保持し、温度もしくは負圧によって、またはさらには機械的損傷によって引き起こされるかまたは生じる損傷からそれらを保護するための任意の適用可能な方法によってデバイスに配置することができる。試料は、ガラスバイアル、クライオバイアル、またはヒーターからホルダーまでの、かつバイアルを通って試料までの熱伝達を可能にする他のタイプのバイアルなどのバイアル内に配置して、本明細書に記載の昇華を促進することができる。試料はまた、予冷された金属表面上に配置することもでき、予冷された表面は、デバイス内にあるか、あるいはデバイスの外側にあり、これは試料をデバイス内に配置された表面上に堆積した後である。バイアルは、デバイス内に配置する前に予冷され得る。
【００５２】
バイアル内の試料は、赤外線ランプによる照射によるか、または例えば、電気加熱、高周波などの他のエネルギー源によるなどの様々な方法で昇華のために加熱され得る。温度を測定するための熱電対および温度を制御するためのコントローラも設けられ、例えば、図１に概略的に示される。熱電対、コントローラ、ヒーターは、図１に関連してだけ概略的に示されているが、本明細書に開示されている他のデバイスにも適用可能である。
【００５３】
図２は、１つ以上の生体試料を凍結乾燥するためのデバイスの代替実施形態の概略図である。デバイス２００は、本明細書では第１の容器２０２とも称される試料支持（保持／保管）容器２０２と、図２の図において第１の容器２０２の下に位置付けられた凝縮器２０４とを有する。この実施形態では、第１の容器２０２は凝縮器２０４に直接的に連結し、すなわち、第１の容器と凝縮器とを分離する図１のような連結（接続）要素１０８を有していない。図１のデバイス１００と同様に、第１の容器２０２の内側の空間は、第１の内部空間２０６を構成し、凝縮器２０４の内側の空間は、第２の内部空間２０８を構成し、共に閉じた内部空間またはチャンバを形成する。しかしながら、図１のデバイス１００とは異なり、デバイス２００では、第１の内部空間２０６は、閉じた内部空間を形成する第２の内部空間２０８に直接的に連結している。すなわち、この実施形態では、連結は、図１の連結要素１０８などの連結要素なしで行われる。
【００５４】
デバイス１００およびデバイス２００は両方とも、１つ以上の生体試料を乾燥凍結するための実施形態を例示している。本明細書で言及されない限り、デバイス１００またはデバイス２００が（図１または２、もしくはその構成要素と同様に）言及されるとき、それに適用されるものはすべて、他のデバイス（または図もしくは構成要素）にも当てはまる。例えば、ある特定の説明が第１の容器１０４に関して提供されている場合、この説明は、第１の容器２０２にも適用可能であり、凝縮器２０４への言及は、凝縮器１０６にも適用可能であり、第１の内部空間１１０への言及は、第１の内部空間２０６にも適用可能である、などである。
【００５５】
容器１０４と同様に、容器２０２、および生体試料を支持するために本明細書に開示される他の容器のいずれかは、１つ以上の試料、例えば１〜１０個の試料を支持（保管）するように構成されている。
【００５６】
図１の凝縮器１０６と同様に、図２の凝縮器２０４は、直接的または間接的に真空ポンプ１１４に連結することができる。図２では、これは、開口部１１６を介してポンプ１１４から凝縮器２０４への通路を提供している第２の連結要素１１８を介してポンプ１１４に直接的に連結して示されている。
【００５７】
容器１０４と同様に、容器２０２および本明細書に開示される他の容器内の生体試料は、本明細書に記載されるような様々な方法によって加熱される。
【００５８】
一般に、本明細書に開示される本発明の実施形態によるデバイスは、デバイスが配置される外部環境から隔離された閉じた内部空間を囲む。このようにして、空気、または外部環境からの他のガスが、閉じた内部空間に侵入することが防止される。さらに、デバイスの閉じた内部空間内に閉じ込められたガスは、ポンプ１１４によって汲み出されない限り、閉じた内部空間を離れて外部環境に出ることが防止される。したがって、さらに閉じた内部空間からガス状の内容物を汲み出すために、閉じた内部空間内の圧力は外部圧力を下回る。例えば、外圧が大気圧の場合、真空を適用することにより、閉じた内部空間内の圧力が大気圧よりも低くなるであろう。したがって、閉じた内部空間は、不完全真空に変わることになる。簡単にするために、そこからガス状の内容物を汲み出すことに起因する閉じた内部空間は、略して「真空」と称される。
【００５９】
圧力および温度が物質の状態図（３つの相が熱力学的平衡で共存するように定義されている）で物質の三重点を下回ると、昇華が起こり、中間液相を通過せずに固相から気相に直接遷移する。１つ以上の試料１０２（または試料２１０）などの生体試料は、水を含む。したがって、本発明の実施形態によれば、閉じた内部空間内の圧力および温度が水の昇華を可能にするほど十分に低い場合、試料は乾燥する。したがって、閉じた内部空間内の温度を考慮して、圧力および温度が水の三重点を下回るまで真空ポンプを作用させる必要がある。したがって、真空ポンプは、昇華を可能にするために圧力をこのような低圧に低減させるように構成されることが好ましい。昇華が発生するためには、水の三重点を下回る必要があるが、吸熱プロセスであるため、熱を必要とすることに留意されたい。
【００６０】
次いで、試料（複数可）で水の昇華が発生すると、凝縮器で水蒸気を凝縮（または堆積）し、その後第１の容器（容器１０４または２０２など）を凝縮器（凝縮器１０６または２０４など）から分割して、環境からの湿気の侵入を防ぐために第１の容器を密封し、これにより第１の容器に保存された乾燥試料（複数可）を残す。
【００６１】
図３は、１つ以上の生体試料を凍結乾燥するためのデバイスの代替実施形態を示している。デバイス３００は、試料支持（保持）容器３０２（本明細書では第１の容器とも称される）、容器３０２の下に示される凝縮器３０４、および出口３０６を含む。デバイス３００は、その第１の容器３０２が凝縮器３０４に直接的に連結しているので、図２のデバイス２００のタイプであるが、出口３０６が凝縮器ではなく第１の容器３０２にあるという点でデバイス２００とは異なる。したがって、図２のポンプ１１４と同様であり得る真空ポンプ３１４（概略的に示される）は、試料を保持する第１の容器３０２に直接接続可能（連結可能）であり、凝縮器３０４に間接的に接続可能である。容器３０２および凝縮器３０４はそれぞれ、閉じた内部空間または閉じたチャンバを共に形成する内部空間を有する。
【００６２】
デバイス３００は、内部冷却機構３０８を含む。内部冷却機構は、冷却コイル３１０および冷却ユニット３１２を含む。冷却機構３０８は、例えば、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（商標）によるＥＫ（商標）浸漬式クーラーなど、現在市場に出ている機構であり得る。図３の実施形態では、冷却コイル３１０は、凝縮器３０４の外部およびチャンバの外部にあり得、冷却ユニット３１２は、凝縮器の外部にあり得、この実施形態では、コイル３１０の下に示される。その結果、内部冷却機構３０８は、デバイス３００の壁を横断する必要がある。真空ポンプの作動時に、閉じた内部空間は不完全真空になるため、壁横断は、封止され、低圧条件ならびに低温条件に耐える必要があり、そうでないと、内部冷却機構が作動すると故障するであろう。横断が失敗すると、低圧の発生が悪化し、低圧条件が失われ、昇華が停止する。さらに、横断が失敗すると、試料および／または極低温流体の無菌性も損なわれる可能性もあるが、これについては以下で論議する。冷却機構の外部配置は、コイル上での凝縮はもたらさず、凝縮は壁にのみに生じることに留意されたい。
【００６３】
上述のように、試料支持容器１０４、２０２、したがってまた試料支持容器３０２および本明細書に開示される他の試料支持容器は、乾燥した生体試料を不完全真空で保存するために、凝縮器から分割され、密封することができる。この分割および真空ポンプ３１４の切断時に、第１の容器１０４、２０２、または３０２もしくは他の試料支持容器を密封するために、出口３０６もまた密封される必要がある。したがって、デバイス３００は、ポンプの切断前に閉じることができる弁３１４を含み、それにより、生体試料（複数可）を含む容器内の低圧を維持する。様々な実施形態では、様々なタイプの弁を利用して出口を密封することができる。
【００６４】
本明細書の他の実施形態とも弁を利用して、圧力を維持することができる。すなわち、弁は、凝縮器（例えば、凝縮器１０６、２０４、３０４）または第１の連結要素１０８の出口など、デバイスの他の部分に位置付けられた出口とも使用することができる。
【００６５】
上記で説明したように、デバイス３００は、デバイスの壁を横切る冷却機構３０８を有する。図１のデバイス１００および図２のデバイス２００に戻ると、デバイスの壁の横断を必要としない代替の冷却方法を使用することができる。この代替方法では、デバイスの凝縮器（およびいくつかの実施形態では、試料支持／運搬容器）も、極低温流体を含有する容器に挿入される。様々な極低温流体を使用できることに留意されたい。したがって、以下の説明は主に液体窒素の使用について言及しているが、代替的に液体空気ならびに二酸化炭素、窒素スラッシュなどの他の極低温流体を使用できるため、これは非限定的であることを理解されたい。
【００６６】
極低温流体容器内の温度、および閉じた内部空間内の低圧が、水の状態図における水の三重点よりも低い限り、凝縮器および試料を含有する第１の容器が、液体窒素に浸される必要がないことを留意されたい。図４および５は、凝縮器と流体との直接接触を必要とせずに冷却するために極低温流体を利用する実施形態を示している。
【００６７】
液体窒素を使用すると、試料をそのガラス転移温度よりも低い低温に保つことができ、凝縮はガラス転移温度よりも低いことに留意されたい。また、デバイスを液体窒素容器内に配置すると、液体窒素はチャンバの外に残ったままである。
【００６８】
図４に目を向けると、凍結乾燥デバイスは、一般に参照番号４００で表記されている。デバイス４００は、第１の容器４０４（試料を含有する）を凝縮器４０６に連結する連結部材４０２を含むとき、試料保持容器および凝縮器が直接的に連結するので、デバイス４００は、図１のデバイス１００と同様のタイプのデバイスである。このような連結具は、第１の容器４０４内の第１の内部空間４０８と凝縮器４０６内の第２の内部空間４１０とを接続する。デバイス４００は、液体窒素のレベルが４１８で示されている液体窒素容器４１２（または他の極低温流体を保持する容器）に挿入された第１の容器４０４ならびに凝縮器４０６と共に示されている。図示するように、凝縮器４０６も第１の容器４０８も、それらが流体ライン４１８の上にあるので、液体窒素に浸されていない。液体窒素容器４１２内の低温は、液体窒素に固有であり、したがって、デバイス４００を固有の低温に曝すことにより、冷却が受動的に促進される。これは、能動冷却とは異なり、例えば、冷蔵庫によって、または図３のユニット３１２などの冷却ユニットによって環境を冷却するために、エネルギー（電気エネルギーなど）の投資を必要とする。
【００６９】
凝縮器４１０の壁の出口４１６は、ポンプ１１４と同様に真空ポンプ４１４（概略的に示される）を連結するために使用され、出口４１６は液体窒素容器４１４の外部に位置付けられている。連結要素１１８は、ポンプ４１４を出口４１６に接続する。液体窒素容器４１２の外部にあるため、出口４１６およびポンプ４１４は、液体窒素容器４１４内の温度ほど低い温度に曝されず、これにより、凝縮器の内部空間４１０とポンプ４１４との間の通路の密封が簡素化される。真空を閉じるための弁を出口４１６に設けることができる。
【００７０】
代替の実施形態では、チューブは真空ポンプから試料を保持する容器まで延在することができ、チューブはループ状になり、液体窒素はまたは他の冷却流体を通ってチャンバを冷却することができる。プラスチック製のチューブ内に金属球を配置させることができる。したがって、冷却されたチューブは凝縮器として機能する。これにより、デバイス全体のサイズを縮小させる。
【００７１】
代替の実施形態では、凝縮器および生体試料を含有する容器（第１の容器）を液体窒素容器に挿入する代わりに、冷却コイルが凝縮器４１６の周りに巻き付けられている。次いで、冷却コイルに結合された冷却ユニットを作動させることにより、凝縮器４１６は外部から冷却され、これにより、凝縮器の壁の熱伝導に依存して、凝縮器内の第２の内部空間４１０も冷却する。このような実施形態では、受動冷却に依存する図４の実施形態とは異なり、これは能動冷却に依存し、冷却コイルを冷却するためにエネルギーの投資を必要とする。
【００７２】
図２のデバイス２００のタイプのデバイスであって、試料保持容器が凝縮器に直接的に連結するデバイスは、図４の実施形態のように、液体窒素（または他の極低温流体）によっても冷却できることを理解されたい。図５は、このような冷却の例を示している。図２に示されるタイプの凍結乾燥デバイス５００は、試料を支持／保管する第１の容器５０２と、凝縮器５０４とを有する。デバイス５００は、液体窒素容器５０６に挿入される。参照番号５０８は、デバイス５００が液体窒素中に浸されていないことを示すために、容器５０６内の液体窒素レベルを描写している。デバイス４００と同様に、デバイス５００も、容器５０６内の液体窒素の固有の低温によって受動的に冷却される。デバイス５００では、出口５１０は、容器５０２の上壁にあり、弁５１２を含む。連結要素１１８は、ポンプ１１４と同様の真空ポンプ（図示せず）を出口５１０に連結（接続）して、容器５０２の内部空間および凝縮器５０４の内部空間によって画定される閉じた内部空間に真空を適用する。
【００７３】
デバイス５００を液体窒素レベル５０８の上に位置付けるために、昇降要素５１４が設けられている。昇降要素５１４は、凝縮器５０４を液体窒素容器５０６の底部から分離する（空間を空ける）ための支柱を含む。昇降要素の別の実施形態が図６に示されており、参照番号６００で表記されている。この昇降要素６００は、図５のデバイス５００または他のデバイスを支持および昇降させて、凝縮器および試料保持容器が低温流体と直接接触しないようにするために利用することができる。
【００７４】
昇降要素６００は、外部部材６０２、らせん体またはねじ６０６を有する内部部材６０４、およびピストン６０８を含む。ピストン６０８は、内部部材６０４が外部部材６０２の内部ねじ山とねじ６０６の外部ねじ山との係合を介して外部部材６０２に入るときに、内部部材６０４の露出長を短くすることによって、内部部材６０４を上昇または下降させるために回転させることができる。内部部材の入れ子式配置を提供する他の構造も、昇降要素の高さ調整を達成するために企図されている。
【００７５】
昇降要素６００は、１つ以上の生体試料を凍結乾燥するためのデバイスを支持するように構成されている。したがって、これは、凝縮器、例えば、上記の凝縮器１０６、２０４、５０４、または他の凝縮器の下に配置されるように設計され、液体窒素容器内の凝縮器の高度を変化させて、これにより、いくつかの実施形態では、凝縮器を極低温流体のレベルより上に上昇させ、流体と接触しないようにすることができる。昇降要素６００は、追加の支持のために、受容部分、例えば、スロット、または凝縮器の他の構造と係合可能な支持要素６１０を任意に有することができる。昇降要素５１４および６００、ならびに昇降要素の代替変更バージョンは、固定された高さのものであり得るか、または極低温流体を含有する容器内の極低温流体の様々なレベルに調整し、および／もしくは流体面より上の異なる距離に調整するために高さを変化させる支持に調整可能であり得る。他の形態の昇降要素も企図される。例えば、図３に示されるスタンド３１４は、極低温流体ラインの上方に（そこから離間して）容器を取り付けるための昇降要素として提供され得る。高度レベルの調整、したがって液体窒素からの距離の調整により、凝縮器および試料の温度を調整／変更できる。
【００７６】
デバイス５００を液体窒素容器または別の極低温流体を含有する容器に挿入する代わりに、それを冷却コイルで包むことで、液体窒素または他の極低温流体によって受動的に冷却する代わりにデバイスを能動的に冷却することも企図される。
【００７７】
１つ以上の生体試料からの水の効率的な昇華を可能にする速度で昇華を促進するために、様々な形態のエネルギーを利用することができる。図４および５の実施形態では、試料を含有する容器５０４および５０２の上部は外気に曝され、その温度は、液体窒素容器内の液体窒素レベルを超える温度よりもかなり高いと予想される。しかしながら、より高い温度を達成するための他の方法も考えられ、昇華のために、容器への熱の能動的な適用が提供され得る。例えば、図７の実施形態では、生体試料を凍結乾燥するためのデバイスは、試料を保持するための第１の容器７０４および凝縮器７０６（上部が示されている）を含む。リングまたは他の構造の形態の加熱要素は、容器を囲むように外側に配置することができ、温度は、熱電対によって測定され、温度コントローラによって制御される。加熱要素が作用すると、昇華に必要なエネルギーが提供される。加熱要素は、容器に隣接するか、または接触して、全周にわたって円周方向に延びることができるか、あるいは、完全周よりも短く延びることができる。他の構成を含む他の形態の加熱要素も企図されることを理解されたい。シリコーンＯリングの形態のシール７０２は、容器を真空のために密封するために、容器７０４のスロットまたは空洞内に示されている。
【００７８】
図７における昇華を可能にするために、１つ以上の生体試料は、凝縮器の内部空間と連通して、閉じた空間またはチャンバを一緒に形成する、容器７０４の第１の内部空間７０８の内部環境に曝されるべきである。すなわち、閉じた空間内で温度が低下すると、試料は低温に曝されるはずであり、閉じた空間内で圧力が低下すると、試料は低圧に曝されるはずである、などである。したがって、試料は内部環境に曝され、遮られていない第１の内部空間に留まるべきである。したがって、図７では、トレイ７１０は複数の空洞７１２を有する。各試料は、遮られていない空洞７１２に直接配置でき、つまり、試料はそれぞれ内部空間内の環境に曝されていることを意味する。本明細書で論じられるように、試料は、空洞に配置されたバイアルに保管することができ、バイアルは、容器の第１の内部空間の内部環境に曝され、凝縮器の内部空間と連通するか、あるいは試料は、空洞に直接配置される（バイアルなし）ことを理解されたい。
【００７９】
図７および８の実施形態のデバイスなどのいくつかの実施形態では、デバイスは使い捨て可能な材料で構成されているため、使い捨てである。試料は、使い捨てであり、例えば、照射または他の方法によって上部から加熱することができるホルダーに配置される。図１、２、１０Ｃ、および１０Ｄの実施形態などの他の実施形態では、デバイスは使い捨てではないが、滅菌可能であり、試料を含有するバイアルは、容器の壁と接触し、壁が加熱されると加熱される金属ホルダーに配置される。
【００８０】
図８は、試料を保管するための代替の容器（第１の容器）の一実施形態を図示している。容器８００は、それぞれが複数の空洞を有する２つの積み重ねられたトレイ８０２、８０４を有する。より具体的には、上部トレイは、円周方向に配置された一連の空洞８０５を有し、下部トレイ８０４は、円周方向に配置された一連の空洞８０７を有する。明確にするために、各トレイ８０４、８０２の空洞のうちの１つだけが図面にラベル付けされている。連結要素８０６は、容器から真空ポンプへの連通を提供し、弁を含むことができる。他の実施形態では、３つ以上のトレイまたは１つだけのトレイがあってもよく、トレイは他の構成であり得ることを理解されたい。本明細書に開示される他の容器はまた、複数の生体試料を保管するための多数の空洞を備えた、多数のトレイ、例えば、互いの上に積み重ねられたトレイを有し得ることに留意されたい。試料は、本明細書に記載されるようにバイアルに配置されるか、またはトレイ上に直接配置され得る。
【００８１】
図９Ａおよび９Ｂの代替の実施形態では、デバイス８００のように容器内に１つ以上のトレイを保持する代わりに、容器９００の底壁９０２が生体試料を保持するためのトレイとして機能する。示されるように、底壁９０２は、試料を保持するための複数の空洞９０４を有する。本明細書に記載されているように、試料を空洞内に直接配置することができる。（他の実施形態では、試料はバイアルに配置することができ、バイアルは図７および１０Ｃの実施形態のようにホルダーに配置することができることに留意されたい）。出口９０５は、容器の底壁９０２から延在して示され、連結要素（例えば、チューブ）９０６を介してポンプに接続され、容器９００の内部空間および凝縮器（図示されず）によって形成された閉じた内部空間に真空を適用する。
【００８２】
図１０Ａは、試料を保持するための容器の代替の実施形態を図示している。容器１０００は、その上に配置されたカバー１００２を有し、カバーの縁部は、矢印１００４によって表されるように、容器の壁の縁部に溶接されている。出口は参照番号１００６で表記され、出口１００６から延びるチューブ１００８は、真空ポンプと連通する第２の連結要素（上記の連結要素１１８と同様の）として機能する。試料を乾燥させた後、かつ連結チューブ１００８に接続されている真空ポンプの接続を切る前に、乾燥した試料を含有する容器１０００を密封するために、矢印１００４で示すように、チューブ１００８を溶接することができる。チューブ１００８もまた、好ましくは図８のチューブ８０６のような狭い領域で密封される。理解できるように、本明細書に開示される他の容器に含有される試料は、乾燥後に同様の方法で、例えば、カバーおよびチューブを密封することによって、または閉じた環境を維持するための他の密封方法によって密封することができる。
【００８３】
図１０Ｂは、参照番号１０５０で表記される、本発明の凍結乾燥デバイスの代替の実施形態を図示している。デバイス１０５０は、凍結乾燥前に滅菌することができ、ステンレス鋼から作製することができる。デバイス１０５０は、液体窒素（または他の極低温流体）によって冷却され、温度コントローラ、圧力または温度モニター／ゲージ１０５４、真空用バルブ付きチューブ１０５２、およびデバイス１０５０の内部チャンバまたは閉じた空間内に生体試料を密封するためのトップカバー１０５６を有する。
【００８４】
図１０Ｃおよび１０Ｄの実施形態では、デバイス１０６０は、真空ポンプ入口１０６６、生体試料用の温度調節棚１０６４、および管状部材の形態の凝縮器１０６２を有する。デバイス１０６０は、液体窒素１０７０を含有するＬＮデュワー１０６８内に配置され、真空が適用されると、本明細書に記載されるように、閉じたチャンバ内の温度を低下させる。
【００８５】
図７〜１０Ｄの実施形態の容器は、本明細書に開示される他のデバイス、例えば、図１のデバイス１００のタイプのデバイスおよび図２のデバイス２００のタイプのデバイスで使用され得ることに留意されたい。
【００８６】
試料を保管するための容器は、様々な形状／構成のものとすることができ、例として、図８〜１０Ｄにおいて円形ディスク形状として示されていることを理解されたい。
【００８７】
上記で説明したように、１つ以上の試料を凍結乾燥するためのデバイスは、閉じた内部空間を備える。第１の容器および凝縮器は、閉じた内部空間と外部環境との間の粒子の交換を防ぐように構成され、したがって、閉じた内部空間は、真空ポンプの作動時に不完全真空に変わる。しかしながら、低圧発生を促進することに加えて、粒子の交換を防止することで、滅菌も容易になり、閉じた内部空間内からの粒子（１つ以上の試料が汚染されている場合）は超えて低温環境に到達できないが、一方低温環境からの汚染性粒子は、閉じた内部空間を越えて入ることはできない。
【００８８】
さらに、試料を保持するための容器および／もしくは凝縮器、ならびに／または容器と凝縮器を接続する連結要素（連結要素が容器と凝縮器を連結するために提供される実施形態において）は、とりわけポリマーおよび／または金属などの様々な材料から作製することができ、低圧下での曲がりを防ぎ、したがって生体試料を機械的損傷のリスクを受けることを回避するために、構造的に低圧に耐える材料が利用される。
【００８９】
本明細書に記載の実施形態では、凝縮器は、例えば、液体窒素（または他の極低温流体）容器によって受動的に、または例えば、冷却要素によって能動的に冷却される。これにより、凝縮器のすぐ外側の環境は「低温環境」を構成し、ここでは、凝縮器が極低温流体容器内にあるが、極低温流体自体内にないとき、または凝縮器が流体に浸されている場合で凝縮器が極低温流体自体内にあるとき、もしくは冷却コイルなどで現在置かれた周囲環境が冷却されているとき、低温環境は凝縮器を冷却する極低温流体の蒸気とすることができる。
【００９０】
デバイスは、サイズ／容積が十分に小さいため、閉じたチャンバ内の真空圧力に非常に短時間で到達できる。例えば、いくつかの実施形態では、容積が、２リットルほど小さく、または１．５リットルまたはそれ以上小さく、好ましくは１リットルほど小さく、またはさらには０．５リットルほど小さいため、圧力は、短時間で、例えば、１０分未満、またはより短い数分で、場合によっては数秒で、１ｔｏｒｒ未満、さらには０．５ｔｏｒｒ未満、またはさらには０．５Ｔｏｒｒ未満に達することが可能である。したがって、圧力が１ｔｏｒｒまたは０．５ｔｏｒｒに下がると昇華が始まり、試料に悪影響を与える可能性のある氷の結晶を取り除くか、または泳源させる。すなわち、内部空間、すなわち、真空ポンプを介して圧力が低減される空間の小さな容積は、所望の圧力が迅速に達成されることを可能にする。これにより、昇華をより迅速に開始できる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、凝縮器と試料ホルダーとを同じチャンバに配置することにより、チャンバの小容積を達成することができる。
【００９２】
さらに、容積が小さく、かつ冷却および昇華が迅速であるため、試料と凝縮器とを同じチャンバ内で比較的互いに接近させることができる。例えば、いくつかの実施形態では、試料から凝縮器（冷却要素）までの距離は、１０ｃｍほど短く、または好ましくは２ｃｍほど短くすることができるが、より短い距離およびより長い距離も企図される。この短い距離により、試料が昇華のために加熱された場合でも、望ましい凍結乾燥をなお可能にする。
【００９３】
本明細書で述べたように、デバイスは、いくつかの実施形態では、滅菌のためにオートクレーブに配置できるようにするベンチトップサイズであり得る。これらの実施形態では、金属のみで構成されているので、このような滅菌は、内部構成要素を損傷することなく実行することができる。さらに、いくつかの実施形態では、冷却ユニットを利用するのではなく、デバイスを液体窒素に配置して温度を低下させることができるので、容器内の管材などの非金属構成要素を避けて、容器内で滅菌を行うことができる。
【００９４】
デバイスは、携帯性を促進するために十分に小さいサイズであり得、これは、液体窒素の浸漬および／または滅菌に有益であり得ることに留意されたい。
【００９５】
上述の理由で達成できるデバイスのサイズが小さいため、いくつかの実施形態では、液体窒素の同じ容器に多数のデバイスを挿入できることが企図される。各デバイスには、多数のデバイスに対して同じ真空ポンプにすることができる真空ポンプと連通するための圧力モニターおよびコネクタと、デバイス内のチャンバへの真空適用のオンとオフを切り替えるバルブと、を有する。したがって、ＬＮ容器（または他の極低温流体の容器）内に多数のデバイスが配置されている場合、各デバイスのチャンバへの真空適用を個別に制御できると同時に、すべてのデバイスで真空を作動させる必要はない。したがって、すべてのデバイスに同じ真空ポンプを使用できるが、特定のデバイスに真空が必要ない場合、所望のデバイスのバルブを閉じると同時に、デバイスに真空を適用する必要はない。
【００９６】
各デバイスに１つ以上の試料を保持できること、例えば、デバイスは４つのバイアル、または６つのバイアル、または別の個数のバイアルを保持できることに留意されたい。
【００９７】
試料の凍結乾燥のための方法
ここで、哺乳動物の細胞または組織の生体試料である、生体試料を凍結乾燥する方法について説明する。
【００９８】
食品保存技術など、様々な用途での乾燥の利点は知られている。食品産業（例えば、インスタントコーヒー、粉乳、卵粉、乾燥酵母など）に加えて、医薬品、細菌、ウイルス、真菌、および酵母の調製に乾燥が使用されている。乾燥プロセスは次のように説明できる。自然界では、乾燥は、無水生活（ａｎｈｙｄｒｏｂｉｏｓｉｓ）または水なし生活としても知られているプロセスである。無水生活は、生物が検出可能な代謝を示さないが、再水和後に復活する能力を保持している非常に脱水された状態である。乾燥状態での保存は、植物（種子）および多くの原核生物で非常に一般的であるが、ワムシ、クマムシ、線虫、甲殻類、昆虫などの一部の真核生物でも見ることができる。それらすべてを統一することは、それらが比較的小さく、それらの体からの水の損失をほとんどまたはまったく制御できないこと、かつこれらが一般的に湿った生息地の短命な生息動物であることである。これらは様々な発育段階で乾燥する。水のない状態では生化学反応は起こらず、代謝は検出可能なレベルを超えて低下し、水が凍ったり、または沸騰したりすることはなく、能動的な細胞プロセスが破壊されないため、様々な環境の極限に耐えることができる。無水生活は、動物が水なしで長期間生存できるようにし、効果的に寿命を延ばし、最も適切な条件での生殖または発達を促進する。水の損失は段階的でゆっくりであり、多くの膜、タンパク質、および核保護剤をそれらの乾燥重量の５０％まで蓄積することを可能にする。これらの保護剤には、二糖類、主にトレハロース、胚発生後期（ＬＥＡ）タンパク質、アンヒドリン、熱ショックタンパク質などが挙げられる。
【００９９】
本発明は、精子細胞、卵母細胞、胚、ならびに卵巣組織、子宮組織および精巣組織などの生殖組織の凍結乾燥による乾燥を提供する。本発明はまた、幹細胞、造血幹細胞、間葉系幹細胞、胚性幹細胞、ヒト由来もしくは動物由来の人工多能性幹細胞の凍結乾燥による乾燥を提供する。本発明のこのような凍結乾燥はまた、赤血球または細胞株にも使用することができる。生体試料は、特別な凍結乾燥溶液に浸漬され、次いで、図１〜１０Ｄおよび１２〜１３に関連して本明細書に記載される装置を使用して凍結および乾燥される。凍結乾燥後のその後の再水和の結果は、体外受精（ＩＶＦ）、細胞質内精子注入（ＩＣＳＩ）、着床前遺伝子スクリーニング（ＰＧＳ）を含む遺伝子スクリーニング、着床前遺伝子診断（ＰＧＤ）を含む遺伝子診断テスト、およびその他などの生殖補助医療技術に使用することができるようなものである。
【０１００】
本発明の配偶子および生殖組織の首尾よい凍結乾燥のための全体的な方法をここで説明する。これには、このような目的で使用される溶液と、上述されたデバイス、ならびに図１〜１０Ｄおよび１２〜１３に図示されているデバイスなどの凍結乾燥デバイスが含まれる。本発明は、凍結プロセスおよび乾燥プロセスを提供する。本発明は、凍結乾燥プロセス後の再水和プロセスも提供する。配偶子および生殖組織は、凍結保存、受精能保護、ＩＶＦ、ＩＣＳＩ、ＰＧＤ、ＰＧＳなどが含まれるが、これらに限定されないＡＲＴに使用することができる。この技術は、安全な条件下で細胞および組織を長期間保管する効果的な方法を提供する。
【０１０１】
したがって、本発明は、スクロース、ソルビトール、グルコース、デキストラン、トレハロースなどの糖類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）などの凍結保護剤（ＣＰ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＬＥＡタンパク質などの巨大分子ならびにタンパク質、およびアスタキサンチン、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、アスコルビン酸などの抗酸化剤に基づいた、凍結乾燥溶液（凍結乾燥（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｉｎｇ）（ＬＹＯ）溶液）を含む、精子、卵母細胞、胚、卵巣組織、子宮組織、精巣組織などの生体試料を凍結するための組成物を提供する。ＬＹＯ溶液は、ＤＭＳＯおよびＨＳＡと、ＴＣＭ  １９９、トリス、ＰＢＳまたはヘペスＴａｌｐ、ＲＰＭＩ−１６４０、ダルベッコ変法イーグル培地、または当該分野において既知である任意の他のものなどの緩衝液溶液とを組み合わせて使用することができる。ＬＹＯ溶液は、例えば、ＤＭＳＯおよび炭水化物、またはＤＭＳＯおよびタンパク質から構成され得る。
【０１０２】
ＤＭＳＯは、タンパク質と一緒に使用すると、１９℃で結晶化するときに昇華するため、優れた凍結乾燥溶液を提供することが判明している。結晶化すると、昇華を行うことができる。昇華すると、得られる材料には、典型的には、ＤＭＳＯは含まないが、残留ＤＭＳＯが残っている場合でさえも（水の昇華のために）、摂氏１９度未満に保った場合、これは固体のままであり、従って試料、例えば、細胞に影響を与えない。ＤＭＳＯが１００％のＤＭＳＯの場合、ＤＭＳＯは１９℃で結晶化するが、本発明で使用できるように、ＤＭＳＯの割合が低い、たとえば５％または１０％の溶液では、凍結することによって、これは分離し、次いで昇華すると、残っているものはＤＭＳＯであり、それでこれは結晶化するであろう。
【０１０３】
細胞および組織は、様々な方法で採取することができる。例として、精子細胞は、射精、電気誘導射精、精巣精子吸引（ＴＥＳＡ）、生検、精原細胞の体外成熟が挙げられるが、これらに限定されない、当該分野において既知の任意の方法によって採取することができる。例として、卵母細胞は、卵子ピックアップ、生検、卵胞の体外成熟によって回収することができる。例として、胚は、ＩＶＦ手段によって得ることができるか、またはインビボで生成された胚を子宮から採取することができる。卵巣組織は、例えば、生検、経膣生検、腹腔鏡検査、開腹術および卵巣切除後に得ることができる。例として、子宮組織は、生検、経膣生検、腹腔鏡検査、開腹術および子宮摘出術後に得ることができる。精巣組織は、例えば、生検により得ることができる。上記は、生体試料、すなわち細胞および組織を採取する他の方法も企図されるため、例として提供されることに留意されたい。
【０１０４】
生体物質（試料）を取得後、その起源に基づいて評価される。例えば、精子細胞は通常、それらの形態、生存率および運動性についてカウントされて評価され、卵母細胞および胚は通常、それらの形態によってカウントされて評価され、組織は生／死染色のために採取されるか、または形態によってのみ評価され得る。細胞および組織を評価するためのいずれの方法が利用される場合でも、次に、生体試料は、本明細書に記載されるように、凍結乾燥溶液（ＬＹＯ溶液）に浸漬される。したがって、本方法は、以下により詳細に記載されるように、ＬＹＯ溶液中にあった後に細胞および組織を凍結することを提供する。
【０１０５】
要約すると、本プロセスには、試料を凍結すること、圧力を低下させること、および昇華によって氷を除去することを伴う、低温脱水プロセスを提供する。
【０１０６】
最初に、精子の凍結について図１２を参照して説明し、続いて胚および卵母細胞の凍結について説明し、次いで幹細胞の凍結について説明して、本発明のプロセスの例を提供する。
【０１０７】
精子の凍結
凍結パラメータは、図１２に図示されており、これには、参照番号１で表記された、少量の凍結乾燥（ＬＹＯ）溶液に浸漬され、凍結乾燥デバイス７の予冷された金属表面２に堆積させた精子の試料を含む。図１２では、金属表面２はデバイス７の一部であるが、他の実施形態では、精子試料（複数可）は、デバイスの外側の冷却された表面上に堆積され、次いで試料がデバイス内に配置された状態で、冷却された表面に堆積され得る。液滴は、ピペット３を使用してピペッティングすることにより、または金属表面上に配置するための所望の体積、好ましくは２００μｌ未満の体積をもたらす任意の他の方法により作り出すことができる。精子数が少ない場合は、カバーガラスなどの表面またはＣｒｙｏｔｏｐ（Ｋｉｔａｚａｔｏ、Ｊａｐａｎ）などのプラスチック表面にマーカー４でマークし、凍結乾燥プロセス後の再水和後の精子の位置を特定しやすくすることができる。液滴は、凍結する前にガラスまたはプラスチック表面などの小さな表面に配置することができるか、または金属表面で直接凍結することができ、凍結後は同じ温度に維持されているガラスバイアルに採取することができる。冷却速度は、表面温度および液滴の体積によって決定される。精子についての一例では、氷点下の高い温度（−２０℃〜−５０℃）に維持された表面で冷却された小さな液滴（例えば、１０〜２０μｌ）を使用するか、または−５０℃とＬＮもしくは液体空気温度との間の温度に冷却された、より大きな体積、例えば（２０〜２００μｌ）を使用することによって、急速な冷却速度が用いられる。
【０１０８】
卵母細胞および胚の凍結乾燥／ガラス化および乾燥
卵母細胞および胚の凍結は、図１３Ａと、図１３Ｂのフローチャートとに示されている。卵母細胞または胚は、その内容全体を参照により本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ  ＷＯ／２０１７／０６４７１５Ａ１に記載されるように、特別なポッド（カプセルとも呼ばれる）１２を有するストローに配置することができる。ストロー内の細胞を、ＤＭＳＯ、ＥＧ、またはＰＧなどの凍結保護剤と、ＴＣＭ培地中のＨＳＡなどのタンパク質と、を含有するＬＹＯ溶液に徐々に曝すことによって、冷凍は達成される。このようなＬＹＯ溶液の例は、ＴＣＭ培地中の１０％（ｖ／ｖ）のＤＭＳＯ、１０％（ｗ／ｖ）のＨＳＡから構成される溶液であり得る。このような溶液は、１００％ＬＹＯ溶液と称されてもよい。図１３Ａに示されるように、別々の容器に保持された徐々に増加するＬＹＯ溶液の溶液への漸進的な浸漬のいくつかの段階的な工程、例えば２〜６工程によって、曝露が行われる。例えば、第１の工程は、２５％のＬＹＯ溶液である溶液を含有する容器またはホルダー１５への配置であり得る。指定された時間の後、生体試料（卵母細胞または胚）を含有するストローまたは他の試料ホルダー１３を、次いで容器１５から除去し、５０％ＬＹＯ溶液である溶液を含有する容器またはホルダー１６に配置する。次いで、ストロー１３を除去し、７５％ＬＹＯ溶液である溶液を含有する容器またはホルダー１７に配置し、最後に容器１７から除去し、１００％ＬＹＯ溶液である溶液を含有するホルダーまたは容器１８に配置する。各溶液の曝露時間は、室温（ＲＴ）で１〜３分であり得るが、他の時間および／または温度もまた企図される。他のパーセンテージを利用できるので、上で列記されたＬＹＯ溶液のパーセントは、例として提供されていることを理解されたい。さらに、様々なＬＹＯ溶液を備えた少数または多数の容器も利用できるため、４つの容器が例として示されている。これは、図１３Ｂのフローチャートに表されており、ここでは、試料が、溶液１、溶液２…溶液ｎに浸漬されており、ｎは、一連の容器１〜ｎのＬＹＯ溶液の最後の容器を表している。容器１８から引き出された後、ホルダー（ストロー）１３は、ＬＮデュワー１９に含有される無菌液体空気２０に投入されるか、あるいは、液体窒素（ＬＮ）容器（図１３Ａには示さず、図１３Ｂのフローチャートに表されている）に急速に投入される。無菌空気は、米国特許第９，８９０，９９５号に記載されている方法に従って製造することができる（ＣｌａｉｒデバイスとしてＦｅｒｔｉｌｅＳａｆｅ，Ｉｓｒａｅｌにより製造されている）。続いて、ホルダー１３を、ＬＮデュワー１９から除去し、図１〜１０Ｄを参照して上述したタイプの凍結乾燥デバイスであるデバイス２１に配置する。この工程は、図１３Ｂのフローチャートに描写されている。デバイス２１は、溶液のガラス転移温度（Ｔｇ）よりも低い棚温度、例えば９０℃を有し、これは、ＬＮ容器２４中に配置されている前述のデバイス、例えば、デバイス１００、２００などで行われるようにデバイス２１のより低い温度に設定されたヒーター２２および凝縮器２３によって制御される。図１３Ａに示すように、また上記のように、ストロー１２内の試料１３は、容器２４内の液体窒素���ベルより高いことが好ましいことに留意されたい。コネクタ２５は、真空ポンプをデバイス２１の内部空間と連結して、囲まれた内部空間（チャンバ）の圧力を低下させる。ヒーター２２または他の加熱源、例えば、照射、例えば、赤外線ランプであり得る、熱エネルギー源が、ストロー１２内の試料に提供される。
【０１０９】
ガラス化および乾燥を用いることで、より高濃度のＤＭＳＯの溶液、例えば、３０＄の溶液を利用することができる。
【０１１０】
卵巣、子宮、精巣スライスの凍結
凍結のために、卵巣、子宮または精巣組織は、例えば１ｍｍ×１０ｍｍ×１０ｍｍの小さいサイズ、または、例えば、１ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍなどのより小さいサイズに切断される。次に、組織切片を、卵母細胞について記載したように（徐々に増加するＬＹＯ溶液への連続浸漬）、保持緩衝液培地中のＣＰと糖とから構成されるＬＹＯ溶液に曝露させるが、より長い曝露時間、例えば、５分、１０分、またはそれ以上を使用する。ＬＹＯ溶液への曝露に続いて、スライスを、Ｃｒｙｏｔｏｐ（Ｋｉｔａｚａｔｏ，Ｊａｐａｎ）などの担体上に配置するか、またはＰＣＴ  ＷＯ／２０１７／０６４７１５Ａ１に記載されるような特別なポッド（カプセルとも呼ばれる）を有するストロー内に配置し、卵母細胞については上記のように冷却される。
【０１１１】
凍結後の試料の一次乾燥
乾燥手順を図１２に示し、図１５のフローチャートに描写している。乾燥プロセスは、図１２に精子の試料と併せて示されているが、本明細書に記載の他の生体試料でも利用される。表面上またはバイアル中の細胞は、温度コントローラ６に接続されたデバイス７の棚５に配置されている。金属冷却表面は、デバイス７の一部であり得るが、あるいは、デバイスの外側にあり、その後デバイス内に配置された試料と一緒になる冷却表面であってもよい。デバイス７は、図１〜１０Ｄに示されるタイプのデバイスであり得る。デバイス７は、試料が内部に収容されると閉じ、閉じた内部空間を作り出し、チューブ７ａを介して閉じた内部空間と連通している真空ポンプ９がオンになり、閉じた内部空間に真空を作り出して、圧力を低下させる。閉鎖された閉じた内部空間と連通している真空モニター１０は、閉じた空間（本明細書では閉じたチャンバとも称される）内の圧力を監視するために、例えば、１０ｍＴｏｒｒ〜１００ｍＴｏｒｒの圧力を示す。デバイス７内の凝縮器１１は、棚温度よりも低い温度に設定され、電気または他の能動的冷却機構であり得る冷却システム８に接続される。あるいは、冷却のために、デバイスは、図５の実施形態におけるものなどの、上で説明されたように液体窒素容器内にあり、受動冷却を提供することができる。真空ポンプ９、真空モニター１０、冷却システム８および温度コントローラ６は、それぞれの機能を達成するために従来のポンプ、コントローラおよびモニターを利用できるので、概略的に示されていることに留意されたい。
【０１１２】
一次乾燥と称される比較的高い氷点下温度での乾燥は、棚の温度を、使用されるＬＹＯ溶液のＴｇ’（ガラス転移温度）よりも少し低く維持することによって行うことができ、いくつかの実施形態では、−１０℃、−３０℃、−５０℃以下であり得る。いくつかの実施形態では、真空は、１００ｍＴｏｒｒ、８０ｍＴｏｒｒ、５０ｍＴｏｒｒ、またはいくつかの実施形態では１０ｍＴｏｒｒ程度に低く設定される。いくつかの実施形態における凝縮器温度は、棚温度よりも低い温度（例えば、−１００℃〜−１９６℃の間）に設定することができる。
【０１１３】
一次乾燥後の二次乾燥
一次乾燥の完了後の二次乾燥は任意であり、段階的な方法で棚の温度を上げることによって、例えば、ＬＮからＲＴまでであり得る所望の保管温度に達するまで、棚の温度を１時間ごとに１０℃ずつ上昇させることによって行われる。一次および／または二次乾燥プロセスの最後に、バイアル（またはデバイス）を真空下で密閉するか、またはチャンバ内に窒素ガスを挿入して不活性ガスで密閉することができる。乾燥中は試料がガラス転移温度未満に保たれるため、溶融は発生しないことに留意されたい。熱電対は温度が上昇するにつれて温度を測定でき、コントローラを使用してこのような温度上昇を制御できることに留意されたい。（ガラス化では、水は氷の結晶から移動しないことに留意されたい）。
【０１１４】
乾燥後の再水和プロセス
再水和プロセスを図１４に示している。再水和される凍結試料は、例えば、ストローで凍結された卵母細胞もしくは胚の試料、またはペレットとして凍結され、真空密封バイアルに保管された精子細胞、もしくはストローまたは凍結乾燥プロセスにおいて上記のような真空密封用のバイアルに配置された担体のいずれかにあり得る組織スライスの試料であり得る。まず、卵母細胞もしくは胚２５を含有するストロー２６、または精子もしくは組織スライス２７を含有する液滴を含むバイアルまたは担体２８を、窒素蒸気下で、または非常に迅速な方法で（それらが保管された場所から）取り出し、ストロー２６／担体２８を容器２９の温かい溶液に浸漬させる。ストロー２６または担体２８は、例えば、１ｍｌの体積を有する温かい溶液中に浸漬され得る。担体上またはバイアル内のペレットを再水和する場合、そのときは、温かい溶液は、最初の体積の液滴を有することが好ましく、例えば、１０μｌのペレット／液滴は、１０μｌの加温溶液で再水和され、１超の液滴／ペレットを再水和する場合、体積を一緒に添加する必要がある（ペレット／液滴の合わせた体積を合計するため）。温かい溶液は、凍結および乾燥に使用されるＬＹＯ溶液の１つであり得る。次に、細胞／組織を５０％の第１の溶液の容器３０に移動させ、容器３０から除去して、２５％の第１の溶液の容器３１に入れ、次いで除去して洗浄液の容器３３に浸漬させ、例えば、精子は、ＩＣＳＩ培地中で希釈し、次いで、卵母細胞に注入することができる。（洗浄液の前に、異なる割合の第１の溶液を含有する追加の容器３２を利用することもできる）。
【０１１５】
試料を凍結乾燥および再水和する方法を図１５のフローチャートに示しており、ここでは、試料を含有する担体を、徐々に増加するＬＹＯ溶液の一連の溶液に順次挿入し、次いで担体を凍結乾燥のために液体窒素内に配置し、次いで、担体を除去し、密閉チャンバの温度および圧力が低下するデバイスに配置して、試料を加熱する。次いで、二次乾燥のために温度を徐々に上昇させて、次いで、試料を含有するバイアルを密封する。次いで、試料を、徐々に減少する一連のＬＹＯ溶液に順次挿入し、洗浄溶液中に浸漬させる。
【０１１６】
材料および方法
実施例１
精子採取
精子試料を、ｎ＝３のＳａｒｄａ品種の雄羊から採取し、単一の試料として分析するために一緒にプールした。濃度および運動性を、ＣＡＳＡ（Ｉｖｏｓ，Ｈａｍｉｌｔｏｎ  Ｔｈｏｒｎｅ，Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して評価した。８５％以上の運動性を示した精子のみを、実験用と考えられた。精子試料をトリス培地中で５０００万個の精子／ｍｌの濃度に希釈し、０．２５Ｍのトレハロースおよび０．４Ｍのソルビトールを含有するＬｙｏ  Ａ溶液、または０．１６Ｍのトレハロースおよび０．２６Ｍのソルビトールを含有するＬｙｏ  Ｂ溶液と共に２０％の卵黄を添加した。次に、精子を１℃／分の速度で４℃まで冷却し、ＣＡＳＡを使用して運動性を再評価した。
【０１１７】
凍結
実験では、様々な温度（−１０、−２５、または−３５℃）に予冷して１時間放置したカバーガラス上に、精子を１０μｌの液滴でピペッティングすることにより、凍結を行った。次いで、カバーガラスを取り除き、温かいプレート（３８℃）の上に置いて温めた。
【０１１８】
凍結乾燥
本発明者らは、新しいデバイスを使用した（ＦｅｒｔｉｌｅＳａｆｅ，Ｎｅｓ−Ｚｉｏｎａ，Ｉｓｒａｅｌ製のＤａｒｙａと称されるもの）。（デバイスは、図１〜１０Ｄと関連して本明細書に記載されるタイプのデバイスであり、閉じたチャンバ内の圧力を低減させ、温度を低下させたことに留意されたい）。これにより、真空圧を１０ｍＴｏｒｒまで非常に急速に減少させることができる。これは、２つのコンパートメントを有する、１リットルの容積の小さな金属シリンダー（図１のように）を備え、凝縮器が１つのコンパートメントのＬＮ２のレベルに配置され、試料は、ヒーターで制御され、真空ポンプに接続された別のコンパートメントに入れられる。本発明者らは、実験群に応じて、真空を８０ｍＴｏｒｒに、試料ヒーターを様々な温度に設定した。凍結した試料を、（各温度で）５分間凍結した後、凍結乾燥機に配置した。凍結は、開いていて試料を受け取る準備ができているＤａｒｙａ凍結乾燥機にごく近接して行われたため、これは非常に速く（１〜２秒で）行われた。すべての乾燥サイクルで、３〜５枚のスライドをＤａｒｙａデバイスに配置した。
【０１１９】
１時間後、解凍が非常に速かったため、カバーガラスを暖かいプレート（３８℃）に数秒間配置することによって、試料を解凍した。
【０１２０】
体積および重量の測定
−１０℃（１０分）および−２５℃（１時間）の温度で保持された試料の乾燥の前後に、目盛り付きのピペットおよび高精度分析スケール（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＥＤ２２４Ｓ）を使用することによって、液滴の体積および重量を測定した。
【０１２１】
クライオ顕微鏡法および低温ＳＥＭ
クライオ顕微鏡分析を、クライオステージＢＣＳ１９６（Ｌｉｎｋａｍ，Ｗａｔｅｒｆｅｅｌｄ，ＵＫ）を備えた光学顕微鏡を介して行った。５μｌの精子をＬｙｏ  ＡおよびＬｙｏ  Ｂ（溶液は同じ組成であったが、ソルビトールの濃度が異なった）中で−１０℃または−２５℃まで冷却し、これらの温度で１０または６０分間保持した。（他の試料は、Ｄａｒｙａにおいて様々な温度で１０分間凍結乾燥し、クライオ顕微鏡に配置した）。
【０１２２】
画像およびビデオの記録を取得し、次の式に従って、未凍結領域／全体の領域の比率を計算した。
％Ｕ＝（Ａｔ−Ａｃ）／Ａｔ＊１００
式中、Ｕは未凍結画分でであり、Ａｔは総表面積であり、Ａｃは結晶の表面積である。
【０１２３】
真空チャンバを備えた走査型電子顕微鏡（ＳＥＭ、Ｚｅｉｓｓ，Ｏｂｅｒｋｏｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、より低温の分析を行い、これにより、結露を回避し、試料の液滴を環境から注意深く隔離した。Ｌｙｏ  Ｂ中の精子５μｌを−１０℃のデバイスチャンバに配置し、この温度および大気圧で２０分間保持した。同様に、温度および時間の同じ条件を、２番目の実験で適用されたが、圧力設定のみが異なった（１０パスカル＝７５ｍＴｏｒｒ）。
【０１２４】
統計分析
群間の精子運動性の差異を、スチューデントのｔ検定を使用して分析した。有意性を、Ｐ＜０．０５に設定した。データは、平均値±標準偏差として表される。
【０１２５】
結果
凍結解凍および部分凍結乾燥後の解凍後運動性
精子の採取およびＣＡＳＡ分析の後に、これらをＬｙｏ  Ａ溶液に曝露すると、精子の運動性が低減することが判明した。運動性は８６％から３０％に減少したが、一時的なものに過ぎなかった。実際、２分後には６０％に達した。精子を４℃までゆっくり冷却した後、運動性は変化しなかった（６１％）。Ｌｙｏ  Ｂ溶液に曝露された精子は、関連する変化を示さず、６７％の冷却後運動性を示した。
【０１２６】
−１０℃、−２５℃、−３５℃の様々な高い氷点下温度に凍結した後、Ｌｙｏ  Ａに曝露された精液の解凍後運動性（ＰＴＭ）は、それぞれ３５％、３６％、および３８％であった（表１）。
【表１】
2021511080.tif 000003
【０１２７】
表１に示すように、Ｌｙｏ  Ｂ溶液に曝露された精液は、−１０℃および−２５℃に凍結し、解凍後にＬｙｏ  Ａに暴露されたものよりも良好であった（６４．５％、６４％）が、−３５℃では減少した（３１％）。
【０１２８】
高い氷点下温度で曝露し、１時間維持した場合に、精液に生じた変化を記録した。
【０１２９】
凍結した精子を両方の溶液中で−１０℃または−２５℃の氷点下の温度で１時間維持した場合、ＰＴＭは非常に低かった（＜１０％）。−３５℃では、運動性は記録されなかった。（表２）。
【０１３０】
最後に、−１０℃の温度で１時間凍結乾燥しても、精液には効果がなく、実際、ＰＴＭは両方の溶液で１０％未満であった（表２）。
【０１３１】
しかしながら、凍結乾燥を−２５℃、１０ｍＴｏｒｒのＬｙｏ  Ａ溶液で行った場合、ＰＴＭは３５％であったが、Ｌｙｏ  Ｂ溶液では４６．６％とやや良好であった（表２）。
【表２】
2021511080.tif 000004
【０１３２】
ＰＦＤは、−３５℃では実行されなかった。
【０１３３】
部分凍結乾燥前後の体積および重量
Ｌｙｏ  Ａを用いた−１０℃での凍結乾燥後の体積および重量の減少は次のとおりであった：８０μｌの初期体積は７６μｌに減少し、最初は９２ｍｇであった重量は８６ｍｇに減少した。
【０１３４】
Ｌｙｏ  Ａを用いた−２５℃での凍結乾燥後の体積および重量の減少は次のとおりであった：８０μｌの初期体積は７０μｌに減少し、最初は９２ｍｇであった重量は８０ｍｇに減少した。
【０１３５】
Ｌｙｏ  Ｂを用いた−１０℃での凍結乾燥後の体積および重量の減少は次のとおりであった：８０μｌの初期体積は７５μｌに減少し、最初は９２ｍｇであった重量は８４ｍｇに減少した。
【０１３６】
Ｌｙｏ  Ｂを用いた−２５℃での凍結乾燥後の体積および重量の減少は次のとおりであった：８０μｌの初期体積は６５μｌに減少し、最初は９２ｍｇであった重量は７１ｍｇに減少した。
【０１３７】
低温クライオ顕微鏡法
未凍結画分（Ｕ）の量と、−１０℃で１０分間保持された雄羊の精液試料から収集されたクライオ顕微鏡法データに示された氷の結晶サイズには、前の凍結乾燥の有無にかかわらず明確な違いがあった。凍結乾燥後のＬｙｏ  ＡのＵ率（Ｕ＝２８％、図１８−ｄ）は、凍結乾燥していない試料（１９％、図１８−ｂ）と比較してほぼ２倍であった。
【０１３８】
より明白な違いは、凍結乾燥していない試料（Ｕ＝１３％、図１８−ａ）と比較して、凍結乾燥溶液は非常に大きなＵ（３０％、図１８−ｃ）を明示した、Ｌｙｏ  Ｂ試料で示された。さらに、凍結乾燥した試料（図１８−ｃ、１８−ｄ）では、凍結乾燥していない試料（図１８−ａ、１８−ｂ）よりもはるかに小さい氷の結晶が見つかった。
【０１３９】
低温走査型電子顕微鏡法（ＳＥＭ）
真空圧（７５ｍＴｏｒｒ）で昇華プロセスに曝され、−１０℃で２０分間保持されたＬｙｏ  Ｂ試料のＳＥＭ分析では、大気圧で冷却された試料に見られる大きな結晶（図１９−ａ）と比べて、より小さな氷の結晶（図１９−ｂ）が示された。
【０１４０】
実施例２
表題：凍結乾燥したヒトの精子は、ＵＶ照射後、凍結した精子と比較して高いＤＮＡの完全性を示した。
【０１４１】
研究的疑問：ＵＶ照射後の、ａ）凍結したヒトの精子と、ｂ）凍結／乾燥した（凍結乾燥した）ヒトの精子とのＤＮＡ完全性の比較。
【０１４２】
要約的回答：凍結乾燥した人間の精子は、凍結した精子と比較して高いＤＮＡの完全性を維持する。
【０１４３】
すでに知られていること：最近、宇宙ステーションにおいて乾燥状態で９ヶ月間保存され、宇宙線に曝されたマウスの精子が、わずかなＤＮＡ損傷のみを示し、卵母細胞の細胞質によって修復され、正常な子孫をもたらすことが示された。
【０１４４】
研究デザイン、サイズ、期間：ヒトの精子を採取し、凍結して凍結乾燥させた。Ｈａｌｌｏｓｐｅｒｍを使用したＤＮＡの完全性は、１で測定された。新鮮な対照、２．凍結乾燥および再水和したもの、３．凍結乾燥、照射および再水和したもの、４．凍結照射および解凍したもの。
【０１４５】
参加者／材料、設定、方法：
研究に提供された新鮮なヒト精子試料（ｎ＝３）を、最初に凍結乾燥溶液（ＬｙｏＳ：α−ＭＥＭ  Ｅａｇｌｅ−０．２５Ｍのスクロース、０．２５ＭのトレハロースおよびαーＭＥＭ  Ｅａｇｌｅ培地中０．６％（ｗ／ｖ）ＨＡＳ）中に１：１（ｖ／ｖ）に希釈し、その後、滅菌液体空気（Ｃｌａｉｒ，Ｆｅｒｔｉｌｅｓａｆｅ，Ｉｓｒａｅｌ）に直接浸漬して凍結保存した。凍結乾燥したペレットを４℃でバイアルに保存し、凍結したペレットを液体窒素でガラスバイアルに保存した。４つの群を使用した：１．新鮮な対照。２．凍結乾燥し、再水和したもの。３．凍結乾燥し、再水和前に照射したもの  ４．解凍前に凍結および照射したもの。凍結乾燥は、凍結滅菌乾燥デバイス（Ｄａｒｙａ、Ｆｅｒｔｉｌｅｓａｆｅ，Ｉｓｒａｅｌ）を使用して行われた。続いて、凍結ペレットまたは乾燥ペレットを、ＵＶを使用して３０分間照射した。乾燥精子を（３７℃に温めた０．２ｍＬのＬｙｏＳ）を使用して再水和し、凍結ペレットを温めた（３７℃）顕微鏡スライド上で解凍した。ＤＮＡの完全性を、Ｈａｌｌｏｓｐｅｒｍキットを使用して評価した。
【０１４６】
主な結果およびチャンスの役割：
新鮮な人間の精子は、８５％のＤＮＡ完全性を示した（８４／９８）。再水和されたヒトの精子は、有意な細胞損失を示さず、ＤＮＡの完全性を減少させなかった。新鮮な精子の濃度は、１０・１０６細胞／ｍｌであって、運動性は５０％以上であって、ＤＮＡの完全性は８１．０６％±９．２％であった。解凍後の運動性（乾燥なし）は、新鮮な（正規化された）同じ試料の６５〜８０％であった。乾燥および再水和後の、ＬｙｏＳで再水和した群の濃度は、５．３７５・１０６細胞／ｍｌであった。照射された凍結乾燥ヒト精子は、８４％±８．１％のＤＮＡ完全性および５・１０６細胞／ｍｌの濃度を示した。照射された凍結精子のＤＮＡ完全性は有意に低く（Ｐ＜０．０５）、９％±１５％のみが完全型ＤＮＡを有したが、濃度はわずかに低くなった（４．５・１０６細胞／ｍｌ）。照射された凍結精子の形態学的観察は、照射された乾燥精子とは大きく異なっており、凍結状態での照射後、尾と膜は失われ、ＤＮＡはより大きな中空を示した。図１６は、照射された凍結精子（左）と照射された凍結乾燥精子（右）の中空精子染色を示している。
【０１４７】
これらの結果は、乾燥プロセスおよび乾燥状態での照射による細胞の損失ならびにＤＮＡの完全性への追加の損傷がなかったことを示している。乾燥した精子を使った以前の動物試験から、ＤＮＡに損傷がなければ、このときは、精子を受精に使用して、生きた正常な子孫をもたらすことができる。人間の精子の凍結乾燥は、ＵＶ照射から保護された室温で精子を長期間保存できる画期的な技術である。
【０１４８】
制限、注意の理由：
この研究は少数の試料で行われたものであり、ＩＣＳＩ後の正常な胚発生の検証が必要である。
【０１４９】
実施例３（卵巣組織を用いた）
マウスの卵巣を切開し、１×１０×５ｍｍに切断した。卵巣スライスを、ＰＢＳ中に１０％のＤＭＳＯ、１０％のＨＳＡを含有するＬｙｏ溶液に暴露した。ＬＹＯ溶液への曝露後、ＰＣＴ  ＷＯ／２０１７／０６４７１５Ａ１に記載されているように、スライスを特別なポッド（カプセルとも呼ばれる）を備えたストロー内に置き、Ｄａｒｙａデバイスを使用して１Ｃ／分の速度で冷却した。
【０１５０】
乾燥手順を、図１２および１３Ａに図示している。表面またはバイアル中の細胞を棚に配置した。真空モニターは１０ｍＴｏｒｒの圧力を示し、凝縮器は−１１５℃の温度に設定される。比較的高い氷点下の温度での乾燥、つまり一次乾燥を、棚の温度を−３０℃のＴｇ’よりも少し低く維持することによって行った。Ｄａｒｙａを使用した二次乾燥を、ｌＮからＲＴまでの所望の保管温度に到達するまで、棚の温度を１時間ごとに１０℃ずつ上昇させることによっておこなった。一次および／または二次乾燥プロセスの終わりに、バイアルを再水和するまで真空下で密封した。組織を３７℃の温Ｌｙｏ溶液で再水和し、次いで２％のホルムアルデヒドで固定した。
【０１５１】
結果は、再水和およびヘマトキシリンエオシンでの染色後、新鮮な対照組織と凍結乾燥組織との間の組織学的構造に違いは見られなかったことを示した（図１７を参照）。
【０１５２】
幹細胞を凍結乾燥するための方法
精子、卵母細胞の胚、生殖組織などを凍結乾燥するための方法については、上述している。上述の凍結乾燥方法は、再水和プロセスと共に、本発明による幹細胞に利用することもできる。
【０１５３】
幹細胞は、実験室で操作すると、幹細胞の起源に応じて様々な種類の細胞に分化することができる、未分化細胞である。これらは長年にわたって臨床現場で使用されてきた。造血幹細胞は、血液疾患と非血液疾患との両方の治療に使用されているが、最近では、骨髄由来の間葉系幹細胞（ＭＳＣ）が、再生医療の分野において実験室と初期の臨床試験との両方の対象となっている。胚性幹細胞（ＥＳＣ）は多能性細胞であり、３つの胚葉すべてから細胞に分化する能力を保持する安定した細胞株を形成することができる。このことが、それらを再生医学と毒物学との両方で特別な意味のあるものにしている。人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞もまた、それらを取り巻くいくつかの混乱させる倫理的問題なしに、胚性幹細胞と同様の応用を提供する。幹細胞の商業的および臨床的応用に不可欠な前提条件は、長期保管に適した凍結保存プロトコルである。
【０１５４】
現在、すべての幹細胞の凍結保存は、細胞を冷却し、液体窒素または窒素蒸気中で細胞を保管することによって行われている。凍結保存は、主に造血幹細胞および間葉系幹細胞に使用されるゆっくりとした凍結（比較的低い凍結保護剤濃度および遅い冷却速度を採用）によって、または主にＥＳＣおよびｉＰＳに使用される、ほとんどが高い凍結保存剤濃度および高い冷却速度を使用することによって行われる、ガラス化（氷の結晶を生成せずに試料を固化させるプロセス）によって行うことができる。ただし、これらの保存方法は高い代償を伴う。そのような保存方法の欠点は、精子胚、卵母細胞、生殖組織に関して上で説明されており、このような欠点は、幹細胞に対するこのような方法の使用に完全に適用できる。したがって、ＬＮ下の保管での凍結保存された幹細胞の維持は維持費が高く、専用の専門施設および訓練を受けたスタッフが必要であり、配送は煩雑で非常に高価であり、保証され、かつ継続的なＬＮ供給が必要であり、タンクの誤作動のリスクがある。さらに、汚染された試料が原因で、試料間で病原体が伝染するリスクがある。また、ＬＮの工業生産ならびに流通、および専用の貯蔵施設のエネルギー需要は、深刻な環境への影響があり、大量の二酸化炭素排出量を残す。これらすべての理由から、本発明による幹細胞の保存は非常に有益である。
【０１５５】
無水生活（ａｎｈｙｄｒｏｂｉｏｓｉｓ）または水なし生活としても知られている、凍結のための乾燥のプロセスは、上記で議論されており、簡潔にするために、本明細書では繰り返さない。
【０１５６】
以下に、造血幹細胞、ＭＳＣ、ＥＳＣおよびｉＰＳが挙げられるが、これらに限定されない幹細胞の凍結乾燥による乾燥のための方法を記載する。細胞は、特別な凍結乾燥溶液に浸漬され、次いで、図１〜１０Ｄおよび１２〜１３に関連して記載されるタイプの装置を使用して凍結および乾燥される。再水和時の結果は、培養中のこのような細胞の成長を可能にし、それらの分化する能力を維持するようなものである。
【０１５７】
本発明による幹細胞の首尾よい凍結乾燥のための全体的な方法をここで説明する。これには、そのような目的で使用される溶液および凍結乾燥デバイスが含まれる。本発明は、凍結プロセス、乾燥プロセスおよび再水和プロセスを提供する。幹細胞は、研究または臨床使用および再生医療に使用することができる。
【０１５８】
したがって、本発明は、スクロース、ソルビトール、グルコース、デキストラン、トレハロースなどの糖類、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコール（ＥＧ）、プロピレングリコール（ＰＧ）などの凍結保護剤（ＣＰ）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ＬＥＡタンパク質などの巨大分子ならびにタンパク質、およびアスタキサンチン、エピガロカテキンガレート（ＥＧＣＧ）、アスコルビン酸などの抗酸化剤に基づいた、上記のような凍結乾燥溶液（ＬＹＯ溶液）のための組成物を提供する。ＬＹＯ溶液は、ＤＭＳＯおよびＨＳＡと、ＴＣＭ  １９９、ＰＢＳ、ＲＰＭＩ−１６４０、またはヘペスＴａｌｐもしくは当該分野において既知の任意の他のものなどの緩衝液溶液とを組み合わせて使用することができる。
【０１５９】
実験室での培養で通常増殖する細胞は、正確な細胞型およびその後の培養システムに依存する実験室プロトコルに従って採取される。次いで、生体物質を、その濃度、すなわち、１ｍｌあたりの細胞数について評価する。これらは、生存能力を評価するために染色されてもよく、または染色されなくてもよい。したがって、本発明は、以降に記載するように、ＬＹＯ溶液中にあった後に細胞を凍結またはガラス化する方法を提供する。
【０１６０】
細胞の凍結
図１２および１３Ａのデバイスは、本発明による幹細胞のために利用される。したがって、凍結／ガラス化パラメータ／プロセスは、上記の実施形態で記載したように、デバイス７の予冷された金属表面２上で少量のＬＹＯ溶液１中に浸漬された細胞の試料を示す図１２に戻って参照することによって理解することができる（最初に、試料を、デバイスの外側の冷却された金属表面に配置するか、またはすでにデバイス内の冷却された金属表面上に配置する）。液滴は、ピペット３または２００μｌ未満の体積をもたらす他の方法で作製することができる。液滴は、凍結する前にガラスまたはプラスチック表面などの小さな表面に配置することができるか、または金属表面で直接凍結することができ、凍結後は同じ温度に維持されているガラスバイアルに採取することができる。冷却速度は、表面温度と液滴の容積によって決定され、例えば、氷点下の高い温度（−２０℃〜−５０℃）に維持された表面で冷却された小さな液滴（１０〜２０μｌ）を使用するか、または−５０℃とＬＮもしくは液体空気温度との間の温度に冷却された、より大きな体積、例えば（２０〜２００μｌ）を使用することによって、急速冷却速度を用いて決定される。
【０１６１】
幹細胞については、いくつかの実施形態では、遅い凍結速度が利用されることに留意されたい。例えば、−７℃の播種温度から、１〜１０℃／分で４０℃まで適用し、次いで真空を適用する。
【０１６２】
細胞のガラス化
ガラス化が成功するかどうかは、試料の体積、試料の粘度、および冷却速度の３つの主な要因に依存する。３つのパラメータは、次の方程式に従って相互作用する。
ガラス化の確率＝（粘度×冷却または昇温速度）／容積
したがって、試料の粘度および冷却速度が高くなるほど、かつ、容積が小さくなるほど、ガラス化が発生する確率は高くなる。
【０１６３】
凍結乾燥を目的のために、金属板に載せる前に細胞をガラス化することができる。
【０１６４】
ＥＳＣのガラス化は、通常、凍結保護剤濃度が増加する２つのガラス化溶液で、その一般的な構成成分がＤＭＳＯおよびＥＧである、溶液へのＥＳＣコロニーフラグメントの段階的な曝露を必要とする。本明細書に記載されるのは、使用することができるこのようなプロトコルの一例であり、これは例として非限定的な方法で記載されることを理解されたい。すなわち、ガラス化のための代替方法を利用することができる。ＥＳＣのガラス化プロトコルについての一例は次のとおりであり、２つのＬＹＯ溶液（ＬＳ）を使用し、両方とも、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ）で補充されたＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するＤＭＥＭが含まれる保持培地に基づいている。第１のＬＳ（ＬＳ１）は、１０％のＤＭＳＯと１０％の（ＥＧ）から構成されている。第２のガラス化溶液（ＬＳ２）には、２０％のＤＭＳＯ、２０％のＥＧ、および０．５Ｍのスクロースが含まれている。ＥＳ細胞の４〜６個の集塊を最初にＬＳ１中で１分間インキュベートし、その後ＬＳ２中で２５秒間インキュベートする。次いで、試料を２０μｌのＬＳ２の液滴で洗浄し、１〜２μｌのＶＳ２の液滴内に配置する。集塊を、Ｃｒｙｏｔｏｐ担体などの担体の端部に装填させる。担体は、上述したように、米国特許第９，８９０，９９５号のＣｌａｉｒデバイスを使用して、ＬＮまたは無菌液体空気に直接浸すことができる。ＰＣＴ  ＷＯ／２０１７／０６４７１５Ａ１（１２）に記載されているように、細胞をＬＳ１と共に特別なポッド（カプセルとも呼ばれる）を備えたストローに１分間装填し、キムワイプなどの吸収紙を使用して、余分な溶液を取り除き、次いで、ストローをＬＳ２に２５秒間挿入した後、溶液を吸収し、Ｃｌａｉｒデバイスを使用してＬＮまたは無菌液体空気にすぐに浸すことによって、代替の担体を使用することができる。
【０１６５】
ストローをＬＮまたはＬＮデュワー１９によって生成された無菌液体空気２０に迅速に投入後、これらを、ＬＮ容器２４内に配置されたときに、より低い温度に設定されたヒーター２２および凝縮器２３によって制御される、溶液のＴｇよりも低い棚温度、例えば、−９０℃を有するデバイス２１（例えば、図１３Ａを参照）に配置する（失透による損傷を避けるため）。
【０１６６】
一次乾燥
デバイス２１の幹細胞に利用される乾燥手順は、図１２および１３Ａと同じである。表面上またはバイアル中の細胞は、温度コントローラ６に接続された棚５に配置されている。デバイス７が閉じられ、真空ポンプ９が作動し始める。真空モニター１０は、例えば１０ｍＴｏｒｒから１００ｍＴｏｒｒの圧力を示す。凝縮器１１は、棚温度よりも低い温度に設定され、電気冷却などの能動的冷却または代替的に液体窒素の容器２４などの受動的冷却であり得る冷却システム８に接続される。一次乾燥は、使用されるＬＹＯ溶液のＴｇ’（例えば、−１０℃、−３０℃、−５０℃、−７０℃、−９０℃以下）よりも少し低い棚温度を維持することによって行われる。真空は、１００ｍＴｏｒｒ、８０ｍＴｏｒｒ、５０ｍＴｏｒｒ、または１０ｍＴｏｒｒ以下に設定されている。凝縮器温度は、棚温度よりも低い温度（例えば、−１００℃〜−１９６℃の間）に設定することができる。
【０１６７】
二次乾燥は任意であり、デバイス７を用いて、（一次乾燥が完了後に）段階的な方法で棚の温度を上げることによって、例えば、ＬＮから室温（ＲＴ）までであり得る所望の保管温度に達するまで、棚の温度を１時間ごとに１℃〜１０℃ずつ上昇させることによって行われる。一次および／または二次乾燥プロセス／プロセス（複数）の最後に、バイアル（またはデバイス）を真空下で密閉するか、またはチャンバ内に窒素ガスを挿入して不活性ガスで密閉することができる。
【０１６８】
再水和プロセス
幹細胞の再水和は、他の生体試料に関して上述された図１４（および図１５のフローチャート）の方法で実行された。再水和される凍結試料は、ストローまたは担体で凍結され、真空密封用のバイアルに配置される。まず、幹細胞２５を含有するストロー（複数可）２６、または幹細胞２７を含有する担体（複数可）２８を、窒素蒸気下で、または非常に迅速な方法で（それらが保管された場所から）取り出し、ストロー／担体を容器２９の温かい溶液に浸漬させる。ストロー２６は、１ｍｌの体積を有する温かい溶液中に浸漬され得る担体上またはバイアル内のペレットを再水和する場合、そのときは、温かい溶液は、初期体積の試料を有することが好ましく、例えば、１０μｌのペレット／液滴は、１０μｌの加温溶液で再水和され、１超の液滴／ペレットを再水和する場合、そのときは、体積を一緒に添加する必要がある（ペレット／液滴の合計体積に相当する）。温かい溶液は、凍結および乾燥に使用されるＬＹＯ溶液の１つであり得る。次いで、細胞を容器３０の第１の溶液の５０％に、次いで容器３１の第１の溶液の２５％に（上記と同じ方法で）移動させ、続いて容器３２の最終溶液に移動させることができ、例えば、細胞を、培地で希釈することができ、次いで患者に注入するか、または培養を続けることができる。
【０１６９】
したがって、理解できるように、卵母細胞、胚および精子の凍結乾燥および再水和のために本明細書で詳細に記載される方法、デバイスおよびシステムは、幹細胞の凍結乾燥および再水和に適用可能である。
【０１７０】
ヒトＵＢＣに由来する単核細胞の凍結乾燥−２ｎｄ＆３ｅｄ実験
目的：
これらの実験の目的は、（図１０Ｄの）ＦｅｒｔｉｌｅＳａｆｅ  Ｄａｒｙａデバイスを使用して、ヒト臍帯血（ＵＣＢ）に由来する単核細胞（ＭＮＣ）を凍結乾燥する（凍結乾燥する（Ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅ））ことであった。ＭＮＣが４つの異なる溶液（ＰＢＳまたはＲＰＭＩに基づくＩＭＴ−２およびＩＭＴ−３）で凍結乾燥された予備試験では、Ｄａｒｙａデバイスを使用してＩＭＴ−２（ＲＰＭＩ）溶液で最良の結果が得られた。これらの結果は、細胞数とトレパンブルー染料に基づいていた。
【０１７１】
次の実験では、本発明者らは、生存率の決定ならびにアネキシンＶ−ＦＩＴＣおよびＰＩ蛍光染色を使用するアポトーシス細胞の割合の評価において、より高い精度を有する生細胞／死細胞蛍光染色（ＦＩＴＣ／ＰＩ）を使用して、細胞の生存率をより良く評価したかった。両方のアッセイ（生存率およびアポトーシス）は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）デバイスを使用して評価した。
【０１７２】
これらの実験では、ＩＭＴ−２（ＲＰＭＩ）溶液を使用してＭＮＣを凍結乾燥し、試料を−８０℃またはドライシッパーで保管し、ＦＡＣＳ評価のためにエルサレムの外部ラボＨａｄａｓｓａｈメディカルセンターに配送した。
【０１７３】
実験の説明：
０６／０８／１８の０３４５にシバメディカルセンターで採取されたＵＣＢは、同じ日にＦｅｒｔｉｌｅｓａｆｅのラボに受け取られた（Ｅｘｐ．２）。別のＵＣＢユニットは、０８／０８／１８の２１００にシバメディカルセンターで採取され、翌日０９／０８／１８にＦｅｒｔｉｌｅｓａｆｅのラボに受け取られた（Ｅｘｐ．３）。すべてのユニットは、採取からこれらが処理されるまで、室温（ＲＴ）で保管した。
【０１７４】
１５ｍｌのチューブに３ｍｌのＦｉｃｏｌｌを配置し、その上に３ｍｌのＵＣＢを配置することにより、血液をＦｉｃｏｌｌ  Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ−１０７７勾配で分離した。１０００ｇで３０分間遠心したところ、破壊はなかった。
【０１７５】
次に、ＭＮＣ層を取り、別の１５ｍｌのチューブに配置した。３つのＭＮＣ層を１つの１５ｍｌのチューブに集め、約８ｍｌのＰＢＳ（ＣａおよびＭｇを含まない）を添加した。合計４本のチューブを、同じ方法で行った。チューブを３００ｇでさらに１０分間遠心分離した。上清を除去し、さらに１０ｍｌのＰＢＳ（ＣａおよびＭｇを含まない）を添加し、細胞を吸引し、３００ｇで１０分間さらに遠心分離した。次いで、上清を除去し、各ペレットを０．９４５ｍｇ／ｍｌのＥＧＣＧ、ＲＰＭＩ中の０．１Ｍのトレハロースから構成されたＩＭＴ−２（ＲＰＭＩ）溶液で再懸濁した。
【０１７６】
第２の実験から、０．５ｍｌの各細胞懸濁液を含有する２つのバイアルを凍結乾燥し、第３の実験では、０．５ｍｌの細胞懸濁液を含有する４つのバイアルをそれぞれ凍結乾燥した。
【０１７７】
凍結は、試料を−２０℃の冷凍庫の金属ブロック内に約１５分間配置することによって行い、試料が−２．５℃に達したときに、ＬＮ内に配置された予冷した針を使用して播種を行った。試料が凍結された後（−１０℃〜−１５℃に達したことで示される）、試料を、−３５℃の棚温度および２００ｍＴｏｒｒの真空圧のＤａｒｙａデバイスに移し、凝縮器を−１００℃で７２時間作動させた。第３の実験では、７２時間後に、細胞をＤａｒｙａデバイス内に−６９℃の棚温度でさらに２４時間放置した。
【０１７８】
７２時間後（Ｅｘｐ．２）、Ｄａｒｙａデバイスを開き、バイアルを真空密封し、２つのバイアルを−８０℃で４日間置いた後、ドライシッパー（約−１５５℃）に入れて、エルサレムのラボに送った。Ｄａｒｙａデバイス（Ｅｘｐ．３）で９６時間後、バイアルを除去して次のように処理した：２つのバイアルを真空密封してドライシッパーに入れ、１つのバイアルを３７℃に加熱した蒸留水４５０μｌで再水和し、トリパンブルーと細胞数の評価のために採取され、残りは密封されたバイアルに入れ、氷中に配置した。最後のバイアルを真空密封し、氷上に配置した。
【０１７９】
６つの試料すべてを、エルサレムに配送した。３７℃に温めた蒸留水４５０μｌを各バイアルに添加することで、まだ乾燥している５つのバイアルを再水和した。６つのバイアルすべては、死細胞のマーカーとしてヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を使用する生存率について、および膜が損傷した細胞のアネキシンＶ−ＦＩＴＣ結合マーカー（露出したホスファチジルセリン部位に付着する）および死細胞を標識するためのＰＩを使用するアポトーシスについてのＦＡＣＳ評価を受けた。
【０１８０】
細胞濃度を血球計算盤を使用してカウントし、再水和の前後の生存率を決定するためにトリパンブルーで染色した。
【０１８１】
細胞生存率を、次のように計算した＝（生細胞／全細胞）×１００
再水和後の生細胞を、次のように計算した
＝（再水和後の生細胞／凍結乾燥前の生細胞）×１００
【表３】
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【表４】
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【表５】
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【０１８２】
考察：
上記の実験では、ＦＡＣＳによると、生存率は試料間で約５５％から約８２％の生細胞の範囲であることがわかる。ＴＢを使用してＦｅｒｔｉｌｅｓａｆｅで染色した試料（試料＃１）は、８１％の生存率を示したが、ＦＡＣＳの結果は約６４％を示した。この違いは主に、ＴＢ染色に起因する偽陽性の特徴によるものであるが、ＰＩは損傷細胞のみの核に入る蛍光標識であるため、ＴＢ染色よりもはるかに正確である。
【０１８３】
それにもかかわらず、それは凍結乾燥後に細胞の大部分が生存可能であることを示している。結果の主な違いは、実験間で（Ｅｘｐ．２とＥｘｐ．３との間で）見られる。実験２では、両方の試料（試料＃４および５）で同様で高い生存率（ＦＡＣＳ結果によると）が約８２％であったが、Ｅｘｐ．２では生存率は５５．７％〜６７％であった。本発明者らは、再水和後の生存率のこれらの違いは、受け取った新鮮なユニットの違いに起因すると考えている。以前の研究で、新鮮な細胞はすべて生きているが、採取時間と凍結乾燥時間との間の時間が経過するにつれて劣化することがわかっている。第３の実験では、ＵＣＢユニットは配送の翌日に受け取られ、また、分離後の細胞数が少ないことも分かっており、以前の我々の研究において分離プロトコル後に受け取って使用したものよりも多い、１ｍｌ当たりあたり２２０万個の細胞（Ｅｘｐ．２）と比較して、７１万３０００個の細胞であった。
【０１８４】
さらに、アネキシンＶ  ＦＡＣＳデータに関しては、これは新鮮な対照なしで行われたため、結果を解釈できない。ＦＡＣＳ画像を見ると、細胞のどの割合がアポトーシスを起こしていて、どれが生きているかは理解できない。壊死細胞集団とは何であるかは明らかであるが、対照が欠如しているため、何も推測できず、ＦＡＣＳに選択した「ゲート」が正しい「ゲート」であるかどうかさえ推論できない。
【０１８５】
これらの研究業が進行する場合、再水和後の結果をよりよく理解および評価するために、新鮮なユニットも評価する必要がある。
【０１８６】
行われた保管の評価については、−８０℃で４日間保管し、ドライシッパーで輸送しても、Ｅｘｐ．２の試料４および５の高い生存率（８２％）が示すように、試料に損傷を与えなかったことがわかる。
【０１８７】
第３の実験では、ラボで再水和されて４℃で輸送された試料（＃１）の生存率は６３．９％であり、乾燥状態で保管されてドライシッパーで輸送された試料（＃３および６）は、それぞれ５５．７％および６７％であった。４℃で乾燥状態で輸送された試料＃２は、再水和後の５５％の生存率を有した。この実験では、輸送または保管条件が細胞に損傷を与えたことは分からない。上述のように、これらの実験におけるより低い生存率は、それらが受けたプロセスを受容したＵＣＢユニット間の違いの結果であると考えている。
【０１８８】
凍結乾燥動員幹細胞に関する報告
Ｓｈｉｂａ病院（ＩＲＢ下）からの細胞は、白血球除去法によって採取され、６００Ｍ細胞を２ｍｌで検出した。細胞を凍結溶液で１０Ｍ／ＭＬの濃度に、または２つの異なる凍結乾燥溶液で希釈した。２つのセッション（Ｆ１およびＦ２）で、ＲＰＭＩ培地（対照）中の１０％のＤＭＳＯで凍結を行った。すべての手順は、上記の方法に従う凍結および乾燥の手順で行った。
【０１８９】
２つの凍結乾燥溶液を試験し、Ｄｒｙ２は、ＲＰＭＩ培地中の０．１Ｍのトレハロースと１ｍｇ／ｍｌのＥＧＣＧとを含み、一方ＤＤＭＳＯは、ＲＰＭＩ培地中の５％のＤＭＳＯと１０％のＨＳＡである。
【０１９０】
結果は、ＤＤＭＳＯの生存率が、７２時間の培養後に同じ数の細胞と生細胞であり、１週間後に少数のコロニー（ＣＦＵ）であることを示す。
【０１９１】
さらに、Ｄｒｙ２は１週間の培養後のＣＤ３−ＣＤ８およびＣＤ３−ＣＤ４を提示している
【表６】
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【０１９２】
本発明の装置および方法を好ましい実施形態に関して説明してきたが、当業者は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神および範囲から逸脱することなく、変更および修正を加えることができることを容易に理解するであろう。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１０Ｄ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【国際調査報告】
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