(57)【要約】  ケイ素置換ローダミン化合物が本明細書に開示される。また、ＳｉＲ色素のＳｉ原子（１０位）に結合している少なくとも１つのビニル基を含むＳｉＲ色素も本明細書に記載される。ＳｉＲ化合物の誘導体、官能化されたバージョン、コンジュゲート、キット、関連する合成方法、および使用もまた提供される。ケイ素−ローダミン（ＳｉＲ）色素は、遠赤色波長で明るい蛍光を提供し、良好な光安定性を提示することができる。本明細書に記載される化合物は、生物学的試料の蛍光標識化および検出に有用であり得る。【選択図】図２Ｃ
2021536500.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
式（Ｉ）の化合物であって、
【化１】
2021536500.tif 000062
式中、
Ｒ1が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ2が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
または、Ｒ1およびＲ2が、それらが結合しているケイ素と一緒に環を形成し、
各Ｌ1が、独立して、リンカーであり、
各ＲAが、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
各ＲB1が、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
Ｒ3が、−ＣＯＯＨ、ＳＯ3-、Ｈ、Ｒ3a、−Ｌ1−ＲA、または−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ3aが、
【化２】
2021536500.tif 000063
または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲN3）（ＲN4）であり、
ＲN3が、Ｈ、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＣＨ2−Ａであり（Ａが、少なくとも１つの極性基または荷電基で置換されたアリールまたはヘテロアリールである）、
ＲN4が、−Ｌ1−ＲA、または−Ｌ1−ＲB1、または−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＲBであり（ｑが、２、３、４、５、または６である）、
Ｒ3bが、−ＯＨまたは−Ｎ（ＲN5）−Ｌ3a−ＲBであり、
各Ｌ3aが、独立して、リンカーであり、
ＲBが、反応性リガンドまたは標的結合部分であり、
ＲN5が、Ｈ、メチル、またはＣ2-6アルキルであり、
Ｒ4が、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
Ｅが、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
Ｒ5が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ6が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ7が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ8が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ9が、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
各ＲN1が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ5もしくはＲ7と一緒に環を形成し、
各ＲN2が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ6もしくはＲ8と一緒に環を形成し、
Ｒ10が、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ3または−Ｏ−ＣＨ2−Ａ1であり（Ａ1が、少なくとも１つのＲ11で任意に置換されたアリールまたはヘテロアリールである）、
Ｒ11が、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＯＲ12であり、
Ｒ12が、Ｈ、メチル、アセチル（Ａｃ）、アセトキシメチル（ＡＭ）、−ＰＯ32-、−ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、
Ｒ13が、
【化３】
2021536500.tif 000064
であり（Ｒ15が、オリゴペプチドまたは−ＯＲ’であり（Ｒ’が、アセチル、ＡＭ、ＰＯ32-、ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、ＡＭが、アセトキシメチルである））、
さらに、（ｉ）Ｒ1がメチルもしくはＣ2-6アルキルである場合、Ｒ2は、メチルもしくはＣ2-6アルキルではなく、または（ｉｉ）Ｒ3が、Ｒ3aもしくは−Ｌ1−ＲB1である、化合物、
またはそのスピロラクトン形態および／もしくは塩。
【請求項２】
式（Ｐ２）の化合物を調製する方法であって、
【化４】
2021536500.tif 000065
式Ｐ１ａ
【化５】
2021536500.tif 000066
およびＰ１ｂ
【化６】
2021536500.tif 000067
の化合物をオルガノリチウム塩基、次いでＳｉＣｌ2Ｒ1Ｒ2と反応させることを含み、式中、
Ｒ1が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ2が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換されたビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
または、Ｒ1およびＲ2が、それらが結合しているケイ素と一緒に環を形成し、
各Ｌ1が、独立して、リンカーであり、
各ＲAが、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
各ＲB1が、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
Ｒ5が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ6が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ7が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ8が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
各ＲN1が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ5もしくはＲ7と一緒に環を形成し、
各ＲN2が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ6もしくはＲ8と一緒に環を形成し、
Ｒ10が、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ3または−Ｏ−ＣＨ2−Ａ1であり（Ａ1が、少なくとも１つのＲ11で任意に置換されたアリールまたはヘテロアリールである）、
Ｒ11が、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＯＲ12であり、
Ｒ12が、Ｈ、メチル、アセチル（Ａｃ）、アセトキシメチル（ＡＭ）、−ＰＯ32-、−ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、
Ｒ13が、
【化７】
2021536500.tif 000068
であり（Ｒ15が、オリゴペプチドまたは−ＯＲ’であり（Ｒ’が、アセチル、ＡＭ、ＰＯ32-、ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、ＡＭが、アセトキシメチルである））、
それにより、前記式（Ｐ２）の化合物を生成する、方法。
【請求項３】
式（Ｉ）の化合物を調製する方法であって、
【化８】
2021536500.tif 000069
式（Ｐ２）の化合物を、
【化９】
2021536500.tif 000070
式（Ｐ２ａ）の化合物と、
【化１０】
2021536500.tif 000071
１００℃を超える温度で、ＣｕＢｒ2の存在下で反応させることを含み、式中、
Ｒ1が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ2が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
または、Ｒ1およびＲ2が、それらが結合しているケイ素と一緒に環を形成し、
各Ｌ1が、独立して、リンカーであり、
各ＲAが、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
各ＲB1が、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
Ｒ3が、−ＣＯＯＨ、ＳＯ3-、Ｈ、Ｒ3a、−Ｌ1−ＲA、または−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ3aが、
【化１１】
2021536500.tif 000072
または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲN3）（ＲN4）であり、
ＲN3が、Ｈ、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＣＨ2−Ａであり（Ａが、少なくとも１つの極性基または荷電基で置換されたアリールまたはヘテロアリールである）、
ＲN4が、−Ｌ1−ＲA、または−Ｌ1−ＲB1、または−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＲBであり（ｑが、２、３、４、５、または６である）、
Ｒ3bが、−ＯＨまたは−Ｎ（ＲN5）−Ｌ3a−ＲBであり、
各Ｌ3aが、独立して、リンカーであり、
ＲBが、反応性リガンドまたは標的結合部分であり、
ＲN5が、Ｈ、メチル、またはＣ2-6アルキルであり、
Ｒ4が、ＳＯ3、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
Ｅが、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
Ｒ5が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ6が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ7が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ8が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ9が、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
各ＲN1が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ5もしくはＲ7と一緒に環を形成し、
各ＲN2が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ6もしくはＲ8と一緒に環を形成し、
Ｒ10が、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ3または−Ｏ−ＣＨ2−Ａ1であり（Ａ1が、少なくとも１つのＲ11で任意に置換されたアリールまたはヘテロアリールである）、
Ｒ11が、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＯＲ12であり、
Ｒ12が、Ｈ、メチル、アセチル（Ａｃ）、アセトキシメチル（ＡＭ）、−ＰＯ32-、−ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、
Ｒ13が、
【化１２】
2021536500.tif 000073
であり（Ｒ15が、オリゴペプチドまたは−ＯＲ’であり（Ｒ’が、アセチル、ＡＭ、ＰＯ32-、ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、ＡＭが、アセトキシメチルである））、
さらに、（ｉ）Ｒ1がメチルもしくはＣ2-6アルキルである場合、Ｒ2は、メチルもしくはＣ2-6アルキルではなく、または（ｉｉ）Ｒ3が、Ｒ3aもしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
それにより、前記式（Ｉ）の化合物を生成する、方法。
【請求項４】
Ｒ1またはＲ2が、ビニルまたは置換ビニルである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項５】
Ｒ1またはＲ2が、ビニルである、請求項１〜４のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項６】
Ｒ1またはＲ2が、メチルまたはＣ2-6アルキルで置換されたビニルである、請求項１〜５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７】
Ｒ1およびＲ2が、それらが結合しているケイ素と一緒に環を形成する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項８】
前記環が、飽和環である、請求項７に記載の化合物または方法。
【請求項９】
前記環が、５員、６員、または７員環である、請求項７または８に記載の化合物または方法。
【請求項１０】
前記環が、置換されていない、請求項７〜９のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１１】
Ｒ1またはＲ2が、−Ｌ1−ＲAである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１２】
ＲAが、−ＣＯＯＨである、請求項１１に記載の化合物または方法。
【請求項１３】
ＲAが、
【化１３】
2021536500.tif 000074
ＮＨＳエステルまたはスクシンイミジルエステル（ＳＥ）、カルボキシル、カルボキシレスター（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒ）、マレイミド、アミド、スルホジクロロフェニル（ＳＤＰ）エステル、スルホテトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）エステル、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、アセトキシメチル（ＡＭ）エステル、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、アミノデキストラン、およびシクロオクチン−アミンである、請求項１１に記載の化合物または方法。
【請求項１４】
ＲAが、可溶化官能基である、請求項１１に記載の化合物または方法。
【請求項１５】
前記可溶化官能基が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のエチレンオキシド単位を含む、請求項１４に記載の化合物または方法。
【請求項１６】
ＲAが、ホスホラミダイトを含む、請求項１１に記載の化合物または方法。
【請求項１７】
Ｒ1またはＲ2が、−Ｌ1−ＲB1である、請求項１〜６または１１〜１６のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１８】
ＲB1が、核酸結合部分を含む、請求項１７に記載の化合物または方法。
【請求項１９】
ＲB1が、細胞骨格結合部分を含む、請求項１７に記載の化合物または方法。
【請求項２０】
ＲB1が、
【化１４】
2021536500.tif 000075
を含み、波線が、任意にリンカーを介した前記ＳｉＲ部分への接続を示す、請求項１７に記載の化合物または方法。
【請求項２１】
ＲB1が、抗体を含む、請求項１７に記載の化合物または方法。
【請求項２２】
各Ｌ1が、独立して、−（ＣＨ2）s−Ｘ−Ｌ3a−であり、式中、ｓが、独立して、２、３、４、５、または６であり、各Ｘが、独立して、ＣＨ2、Ｓ、Ｓ（Ｏ）、またはＳ（Ｏ）2であり、各Ｌ3aが、独立して、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、０、１、２、３、４、５、または６である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項２３】
Ｓが、２である、請求項２２に記載の化合物または方法。
【請求項２４】
Ｘが、Ｓである、請求項２２または２３に記載の化合物または方法。
【請求項２５】
Ｘが、Ｓ（Ｏ）である、請求項２２または２３に記載の化合物または方法。
【請求項２６】
各Ｌ3aが、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、２である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項２７】
各Ｌ3aが、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、３である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項２８】
各Ｌ3aが、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、４、５、または６である、請求項２２〜２５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項２９】
Ｒ3が、−ＣＯＯＨである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項３０】
Ｒ3が、ＳＯ3-である、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項３１】
Ｒ3が、Ｈである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項３２】
Ｒ3が、Ｒ3aである、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項３３】
Ｒ3aが、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲN3）（ＲN4）である、請求項３２に記載の化合物または方法。
【請求項３４】
ＲN3が、メチルである、請求項３３に記載の化合物または方法。
【請求項３５】
ＲN3が、−ＣＨ2−Ａであり、Ａが、少なくとも２つの極性基または荷電基で置換されたアリールまたはヘテロアリールである、請求項３３に記載の化合物または方法。
【請求項３６】
ＲN3が、−ＣＨ2−Ａであり、Ａが、少なくとも１つの−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＮＯ2、または−ＳＯ3-で置換されたアリールまたはヘテロアリールである、請求項３３または３５に記載の化合物または方法。
【請求項３７】
ＲN3が、−ＣＨ2−Ａであり、Ａが、独立して−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＮＯ2、または−ＳＯ3-である少なくとも２つの基で置換されたアリールまたはヘテロアリールである、請求項３３、３５、または３６に記載の化合物または方法。
【請求項３８】
ＲN3が、−ＣＨ2−Ａであり、Ａが、少なくとも２つの−ＳＯ3-で置換されたアリールまたはヘテロアリールである、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項３９】
Ａが、置換アリールである、請求項３３または３５〜３８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項４０】
ＲN4が、−（ＣＨ2）3−ＲBであり、ＲN4の前記ＲBが、−ＣＯＯＨである、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項４１】
ＲN4が、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＲBであり、ｑが、２である、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項４２】
ＲN4が、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＲBであり、ｑが、３である、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項４３】
ＲN4が、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＲBであり、ｑが、４、５、または６である、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項４４】
Ｒ3aが、
【化１５】
2021536500.tif 000076
である、請求項３２に記載の化合物または方法。
【請求項４５】
Ｒ3bが、Ｎ（ＲN5）−Ｌ3a−ＲBである、請求項４４に記載の化合物または方法。
【請求項４６】
ＲN5が、Ｈである、請求項４５に記載の化合物または方法。
【請求項４７】
ＲN5が、メチルである、請求項４５に記載の化合物または方法。
【請求項４８】
Ｒ3bが、−ＯＨである、請求項４４〜４７のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項４９】
Ｒ3aが、
【化１６】
2021536500.tif 000077
である、請求項３２に記載の化合物または方法。
【請求項５０】
各Ｌ3aが、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、２である、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項５１】
各Ｌ3aが、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、３である、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項５２】
各Ｌ3aが、独立して、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、４、５、または６である、請求項４５〜４９のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項５３】
ＲBが、反応性リガンドを含み、任意に、前記反応性リガンドが、カルボキシル、アミン、または活性エステルであり、さらに任意に、前記活性エステルが、ＮＨＳエステルまたはスクシンイミジルエステル（ＳＥ）、カルボキシレスター、スルホジクロロフェニル（ＳＤＰ）エステル、スルホテトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）エステル、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、およびアセトキシメチル（ＡＭ）エステルである、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項５４】
ＲBが、ホスホラミダイトを含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項５５】
ＲBが、核酸結合部分を含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項５６】
ＲBが、細胞骨格結合部分を含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項５７】
ＲBが、
【化１７】
2021536500.tif 000078
を含み、波線が、任意にリンカーを介した前記ＳｉＲ部分への接続を示す、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項５８】
ＲBが、抗体を含む、請求項１〜５２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項５９】
Ｒ4が、ＳＯ3-である、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項６０】
Ｒ4が、Ｈである、請求項１〜５８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項６１】
ＥおよびＲ9が、各々、クロロである、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項６２】
Ｅが、Ｈである、請求項１〜６０のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項６３】
Ｒ5が、Ｈである、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項６４】
Ｒ5が、メチルである、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項６５】
Ｒ5が、ＲN1と一緒に環を形成する、請求項１〜６２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項６６】
Ｒ6が、Ｈである、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項６７】
Ｒ6が、メチルである、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項６８】
Ｒ6が、ＲN2と一緒に５員または６員環を形成する、請求項１〜６５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項６９】
Ｒ7が、Ｈである、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７０】
Ｒ7が、メチルである、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７１】
Ｒ7が、ＲN1と一緒に５員または６員環を形成する、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７２】
Ｒ8が、Ｈである、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７３】
Ｒ8が、メチルである、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７４】
Ｒ8が、ＲN2と一緒に５員または６員環を形成する、請求項１〜７１のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７５】
１つまたは各ＲN1が、Ｈである、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７６】
１つまたは各ＲN1が、メチルである、請求項１〜７５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７７】
１つまたは各ＲN1が、Ｃ（Ｏ）ＯＲ10である、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７８】
ＲN1が、Ｒ5と一緒に５員または６員環を形成する、請求項１〜６２または６５〜７７のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項７９】
ＲN1が、Ｒ7と一緒に５員または６員環を形成する、請求項１〜６８または７１〜７８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項８０】
１つまたは各ＲN2が、Ｈである、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項８１】
１つまたは各ＲN2が、メチルである、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項８２】
１つまたは各ＲN2が、Ｃ2-4アルキルである、請求項１〜８１のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項８３】
１つまたは各ＲN2が、Ｃ（Ｏ）ＯＲ10である、請求項１〜８２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項８４】
ＲN2が、Ｒ6と一緒に５員または６員環を形成する、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項８５】
ＲN2が、Ｒ8と一緒に５員または６員環を形成する、請求項１〜６５または６８〜８４のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項８６】
Ｒ10が、−ＣＨ2−Ａ1であり、Ａ1が、少なくとも１つのＲ11で任意に置換されたアリールである、請求項１〜７２または７５〜８５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項８７】
Ｒ11が、メチルである、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項８８】
Ｒ11が、−ＯＲ12である、請求項１〜８６のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項８９】
Ｒ12が、Ｈである、請求項１〜８６または８８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項９０】
Ｒ12が、メチルである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項９１】
Ｒ12が、アセチル（Ａｃ）である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項９２】
Ｒ12が、アセトキシメチル（ＡＭ）である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項９３】
Ｒ12が、−ＰＯ32−である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項９４】
Ｒ12が、−ＰＯ3（ＡＭ）2である、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項９５】
Ｒ12が、グリコシドである、請求項１〜８８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項９６】
ＲN1またはＲN2が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であり、任意に、ＲN1またはＲN2のうちの１つのみが、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13である、請求項１〜９５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項９７】
Ｒ15が、プロテアーゼによって認識されるオリゴペプチドであり、任意に、前記プロテアーゼが、カスパーゼである、請求項１〜９６のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項９８】
Ｒ15が、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクトペプチド、またはノナペプチドである、請求項１〜９７のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項９９】
Ｒ15が、アミノ酸配列ＤＶＥＤを含む、請求項１〜９８のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１００】
Ｒ15が、アミノ酸配列ＤＶＥＤＨＮを含む、請求項１〜９９のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１０１】
Ｒ15が、Ｃ末端を介してＲ13の環に連結されたオリゴペプチドである、請求項１〜１００のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１０２】
Ｒ1またはＲ2が、メチルまたはＣ2-6アルキルである、請求項１〜１０１のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１０３】
ａ．Ｒ5およびＲ6が、同一である、
ｂ．ＲN1が、ＲN2と同一である、または
ｃ．Ｒ7およびＲ8が、同一である、のうちの１つ、２つ、または３つが、真である、請求項１〜１０２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１０４】
各ＲN1が、ＲN2と同一である、請求項１〜１０３のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１０５】
前記化合物が、任意に、Ｒ1およびＲ2が必ずしも同一ではないことを除き、ケイ素およびＲ4を通過する鏡映面を有する、請求項１〜１０４のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１０６】
構造
【化１８】
2021536500.tif 000079
またはその開放形態、塩、もしくは遊離酸を有する、請求項１〜１０５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１０７】
前記化合物が、以下の式を有する標識ヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
ＮＵＣ−ＤＹＥ
式中、
ＮＵＣが、ヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
ＤＹＥが、前記化合物のＳｉＲ部分であり、ＮＵＣおよびＤＹＥが、リンカーによって接続されており、
前記リンカーが、式（Ｉ）のＲ1位またはＲ2位のうちの１つでＤＹＥに結合し、任意に、ＮＵＣがプリン塩基を含む場合、前記リンカーが、前記プリンの８位に結合し、ＮＵＣが７−デアザプリン塩基を含む場合、前記リンカーが、前記７−デアザプリンの７位に結合し、ＮＵＣがピリミジン塩基を含む場合、前記リンカーが、前記ピリミジンの５位に結合する、請求項１〜１０６のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１０８】
ＮＵＣが、ヌクレオチド三リン酸、プライマー、プライマー伸長生成物、またはプローブを含む、請求項１０７に記載の化合物または方法。
【請求項１０９】
前記化合物の前記ＳｉＲ部分とエネルギー伝達関係にあるクエンチャーまたはフルオロフォアをさらに含む、請求項１０７または１０８に記載の化合物または方法。
【請求項１１０】
ＮＵＣが、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択される塩基を含む、請求項１０７〜１０９のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１１１】
前記化合物が、式（Ｌ１）のホスホラミダイト化合物であり、
【化１９】
2021536500.tif 000080
式中、
ＸおよびＹが、一緒にリンカーを形成し、
Ｂ1が、リン酸エステル保護基であり、
別々に取られるＢ2およびＢ3が、最大１０個の炭素原子を含有する低級アルキル、低級アルケン、アリール、およびシクロアルキルであり、
Ｄが、前記化合物の前記ＳｉＲ部分であり、
Ｙが、式（Ｉ）のＲ1位またはＲ2位のうちの１つでＤに結合する、請求項１〜１０５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１１２】
前記化合物が、式（Ｌ２）のホスホラミダイト化合物であり、
【化２０】
2021536500.tif 000081
式中、
Ｂ1が、リン酸エステル保護基であり、
Ｂ2およびＢ3が、別々で、最大１０個の炭素原子を含有する低級アルキル、低級アルケン、アリール、またはシクロアルキルであり、
Ｂ5が、水素または酸切断性ヒドロキシル保護基であり、
Ｂが、ヌクレオシド／ヌクレオチド塩基であり、
Ｄが、前記化合物の前記ＳｉＲ部分であり、
Ｂが、式（Ｉ）のＲ1位またはＲ2位のうちの１つにリンカーを介して結合し、
任意に、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分が、前記プリンまたは７−デアザプリンのＮ9位で結合し、Ｂがピリミジンである場合、糖部分が、前記ピリミジンのＮ1位で結合し、
任意に、Ｂがプリンである場合、前記リンカーが、前記プリンの８位に結合し、Ｂが７−デアザプリンである場合、前記リンカーが、前記７−デアザプリンの７位に結合し、Ｂがピリミジンである場合、前記リンカーが、前記ピリミジンの５位に結合する、請求項１〜１０５のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１１３】
以下の化合物のうちのいずれか１つである前記化合物
【化２１】
2021536500.tif 000082
2021536500.tif 000083
2021536500.tif 000084
2021536500.tif 000085
2021536500.tif 000086
2021536500.tif 000087
2021536500.tif 000088
2021536500.tif 000089
2021536500.tif 000090
2021536500.tif 000091
2021536500.tif 000092
2021536500.tif 000093
2021536500.tif 000094
2021536500.tif 000095
2021536500.tif 000096
またはその開環形態もしくはスピロラクトン形態、および／または塩もしくは遊離酸であり、式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ15、およびＲN1が、請求項１に定義される通りである、請求項１〜１１２のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１１４】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ15、およびＲN1が、請求項１に定義される通りである、以下の化合物のうちのいずれか１つである第１の化合物を、
【化２２】
2021536500.tif 000097
2021536500.tif 000098
2021536500.tif 000099
2021536500.tif 000100
2021536500.tif 000101
2021536500.tif 000102
2021536500.tif 000103
2021536500.tif 000104
2021536500.tif 000105
2021536500.tif 000106
2021536500.tif 000107
2021536500.tif 000108
2021536500.tif 000109
2021536500.tif 000110
標的結合部分、ヌクレオシド／ヌクレオチド、もしくはポリヌクレオチドと反応させることによって形成される化合物であって、任意に、前記第１の化合物が、その部分を、前記標的結合部分と反応する反応性リガンドに変換することによって最初に活性化される、化合物、またはその開環形態もしくはスピロラクトン形態、および／または塩もしくは遊離酸。
【請求項１１５】
前記標的結合部分が、抗体、核酸結合部分、または細胞骨格結合部分である、請求項１１４に記載の化合物。
【請求項１１６】
標的ポリヌクレオチドを検出する方法であって、前記標的ポリヌクレオチドを含むか、または含む疑いのある試料を、前記標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる、請求項１または４〜１１４のいずれか一項に記載の化合物と接触させることと、前記標的ポリヌクレオチドと前記化合物とを含む複合体が形成されたかどうかを決定することと、を含む、方法。
【請求項１１７】
前記標的ポリヌクレオチドと前記化合物とを含む複合体が形成されたかどうかを決定することが、前記複合体からの蛍光を検出すること、または複合体形成から生じる蛍光の変化を検出することを含み、任意に、前記複合体形成から生じる蛍光の変化が、切断または立体構造の変化に起因するクエンチャーによるクエンチングの低減である、請求項１１６に記載の化合物または方法。
【請求項１１８】
ポリヌクレオチドを配列決定する方法であって、配列決定反応中に、前記ポリヌクレオチドを請求項１、４〜１０５、または１０７〜１１４のいずれか一項に記載の化合物と接触させることと、配列決定生成物を形成することと、前記配列決定生成物からの蛍光を検出することと、を含み、前記化合物が、プライマーまたはヌクレオチド三リン酸を含む、方法。
【請求項１１９】
前記化合物が、前記配列決定生成物の合成を終了する標識ターミネーターヌクレオチドまたはジヌクレオチドであり、任意に、前記標識ターミネーターヌクレオチドが、標識ジデオキシヌクレオチド、または可逆的ターミネーターヌクレオチドもしくはジヌクレオチドである、請求項１１８に記載の化合物または方法。
【請求項１２０】
前記化合物が、プライマーであり、前記配列決定生成物が、プライマー伸長によって形成される、請求項１１８に記載の化合物または方法。
【請求項１２１】
前記方法が、蛍光を検出する前に、前記配列決定生成物を他の配列決定生成物から分離することを含み、任意に、前記分離することが、電気泳動によるものであり、さらに任意に、前記電気泳動が、キャピラリー電気泳動である、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１２２】
前記方法が、前記配列決定生成物をインサイチュで検出することを含む、請求項１１８〜１２０のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１２３】
第１の反応性リガンドを含むヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを標識化する方法であって、前記ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、前記第１の反応性リガンドとの反応時に結合を形成することができる第２の反応性リガンドを含む、請求項１または４〜１０５または１０７〜１１４のいずれか一項に記載の化合物と反応させることを含む、方法。
【請求項１２４】
前記第２の反応性リガンドが、ホスホラミダイトである、請求項１２３に記載の化合物または方法。
【請求項１２５】
前記第２の反応性リガンドが、活性エステルであり、任意に、前記活性エステルが、ＮＨＳエステルである、請求項１２３に記載の化合物または方法。
【請求項１２６】
ポリヌクレオチドを染色する方法であって、前記ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド結合部分を含む、請求項１、４〜１０５、または１０７〜１１４のいずれか一項に記載の化合物と接触させることを含む、方法。
【請求項１２７】
ポリヌクレオチドと非共有的に関連付けられたポリヌクレオチド結合部分を含む、請求項１、４〜１０５、または１０７〜１１４のいずれか一項に記載の化合物を含む、蛍光複合体。
【請求項１２８】
前記ポリヌクレオチドが、約８〜約１５ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチド、約３０〜約５０ヌクレオチド、約５０〜約２００ヌクレオチド、約２００〜約１０００ヌクレオチド、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５Ｍｂ、または約５Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、または約５０Ｍｂ〜約５００Ｍｂの長さを有する、請求項１２６に記載の方法または請求項１２７に記載の蛍光複合体。
【請求項１２９】
前記核酸が、プラスミド、コスミド、ＰＣＲ生成物、制限断片、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または天然もしくは合成オリゴヌクレオチドである、請求項１１６〜１２８のいずれか１つに記載の方法または蛍光複合体。
【請求項１３０】
前記ポリヌクレオチドが、電気泳動ゲル、細胞、器官、ウイルス、ウイロイド、もしくは生物学的流体中にあるか、または水試料、土壌試料、食品、発酵プロセス、もしくは表面洗浄中にあるか、またはそれから得られた、請求項１１６〜１２８のいずれか１つに記載の方法または蛍光複合体。
【請求項１３１】
細胞膜の完全性を決定する方法であって、ａ）１つ以上の細胞を含有する試料を、少なくとも１つの荷電基を含む請求項１、４〜１０６、または１１３〜１１５のいずれか一項に記載の化合物と、前記化合物が損傷した細胞膜を有する細胞に入るのに十分な時間インキュベートすることと、
ｂ）１つ以上の細胞からの検出可能な蛍光信号の存在に基づいて１つ以上の細胞の細胞膜の完全性を決定することであって、前記検出可能な蛍光信号の存在が、細胞膜の完全性が損なわれていることを示し、前記検出可能な蛍光信号の非存在が、細胞膜の完全性が無傷であることを示す、決定することと、を含む、方法。
【請求項１３２】
標的を検出する方法であって、前記標的抗原を含むか、または含む疑いのある試料を、前記標的に特異的に結合する標的結合部分を含む、請求項１、４〜１０６、または１１３〜１１５のいずれか一項に記載の化合物と接触させることと、前記標的と前記化合物とを含む複合体からの蛍光を検出することと、を含む、方法。
【請求項１３３】
前記試料が、細胞を含む、請求項１３２に記載の化合物および方法。
【請求項１３４】
前記試料が、生物学的抽出物を含む、請求項１３２に記載の化合物または方法。
【請求項１３５】
蛍光を検出することが、蛍光顕微鏡、プレートリーダー、蛍光スキャナ、蛍光計、またはフローサイトメータを使用して行われる、請求項１３１〜１３４のいずれか一項に記載の化合物または方法。
【請求項１３６】
標的を検出するためのキットであって、前記標的に特異的に結合するように構成される標的結合部分を含む、請求項１または４〜１１５のいずれか一項に記載の化合物を含む、キット。
【請求項１３７】
前記標的が、アクチンまたは微小管であり、前記標的結合部分が、アクチン結合部分または微小管結合部分である、請求項１３６に記載のキット。
【請求項１３８】
前記標的結合部分が、前記標的に特異的な抗体である、請求項１３６に記載のキット。
【請求項１３９】
前記標的が、一次抗体であり、前記標的結合部分が、前記一次抗体に特異的な二次抗体である、請求項１３６に記載のキット。
【請求項１４０】
前記標的が、ポリペプチド、多糖類、脂質、またはポリヌクレオチドである、請求項１３６〜１３８のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４１】
請求項１または４〜１１５のいずれか一項に記載の化合物を含む、試料を染色するためのキット。
【請求項１４２】
式（Ｉ）の化合物を、標的結合部分、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドにコンジュゲートするためのキットであって、少なくとも１つの反応性リガンドを含む、請求項１〜１１５のいずれか一項に記載の化合物を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、蛍光色素およびそのコンジュゲートの分野に関する。
【背景技術】
【０００２】
序論および要約
多くの分野において、蛍光色素を使用して生物学的材料を検出または定量化することは有用または必要である。核酸、ポリペプチド、細胞、および膜などの生物学的材料は、例えば、生物医学的、遺伝的、発酵、水産養殖、農業的、法医学的、および環境的用途において、様々な試料型で検出され得る。特定の用途に対する所望の特性を有する色素を提供するために、しばしば、所与の細胞内位置、細胞内成分（例えば、細胞骨格成分もしくは核酸）、またはエピトープなどの特定の成分に対して色素を標的とする部分に色素を官能化またはコンジュゲートすることが有用または必要である。
【０００３】
ケイ素−ローダミン（ＳｉＲ）色素は、遠赤色波長で明るい蛍光を提供し、良好な光安定性を提示することができるため、そのような色素を官能化またはコンジュゲートする試みは、様々な用途のためになされてきた。そのような試みは、概して、色素のキサンテン部分を修飾することに焦点を当ててきたが、そのような修飾は、吸収および発光波長、量子収率、ならびに光安定性などの、色素の光物理的特性の著しい変化をもたらした。したがって、吸収および発光波長、量子収率、ならびに光安定性などの色素のうちの１つ以上の光物理的特性を改善するために修飾されているか、または修飾することができるＳｉＲ色素が必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書に記載されるのは、ＳｉＲ色素のＳｉ原子（１０位）に結合している少なくとも１つのビニル基を含むＳｉＲ色素、ならびにその誘導体、官能化バージョン、コンジュゲート、および使用である。関連する合成方法もまた提供される。ビニル基は、例えば、チオール−エン反応を使用して誘導体化されて、官能化またはコンジュゲートされたＳｉＲ色素を提供することができる。ビニル含有および誘導体化された色素は、遊離ＳｉＲと同様の光物理的特性を有し得、および／または上記のような生物学的に関連する標的に対する改善された特性もしくは特徴（例えば、特異的結合親和性）を有する、他の利益を提供するか、または少なくとも公衆に有用な選択を提供し得る。
【０００５】
したがって、以下は、本明細書に提供される実施形態の一部である。実施形態１は、式（Ｉ）の化合物であり、
【化１】
2021536500.tif 000003
式中、
Ｒ1が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ2が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
または、Ｒ1およびＲ2が、それらが結合しているケイ素と一緒に環を形成し、
各Ｌ1が、独立して、リンカーであり、
各ＲAが、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
各ＲB1が、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
Ｒ3が、−ＣＯＯＨ、ＳＯ3-、Ｈ、Ｒ3a、−Ｌ1−ＲA、または−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ3aが、
【化２】
2021536500.tif 000004
または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲN3）（ＲN4）であり、
ＲN3が、Ｈ、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＣＨ2−Ａであり（Ａが、少なくとも１つの極性基または荷電基で置換されたアリールまたはヘテロアリールである）、
ＲN4が、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1、または−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＲBであり（ｑが、２、３、４、５、または６である）、
Ｒ3bが、−ＯＨまたは−Ｎ（ＲN5）−Ｌ3a−ＲBであり、
各Ｌ3aが、独立して、リンカーであり、
ＲBが、反応性リガンドまたは標的結合部分であり、
ＲN5が、Ｈ、メチル、またはＣ2-6アルキルであり、
Ｒ4が、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
Ｅが、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
Ｒ5が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ6が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ7が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ8が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ9が、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
各ＲN1が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ5および／もしくはＲ7と一緒に環を形成し、
各ＲN2が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ6および／もしくはＲ8と一緒に環を形成し、
Ｒ10が、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ3または−Ｏ−ＣＨ2−Ａ1であり（Ａ1が、少なくとも１つのＲ11で任意に置換されたアリールまたはヘテロアリールである）、
Ｒ11が、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＯＲ12であり、
Ｒ12が、Ｈ、メチル、アセチル（Ａｃ）、アセトキシメチル（ＡＭ）、−ＰＯ32-、−ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、
Ｒ13が、
【化３】
2021536500.tif 000005
であり（Ｒ15が、オリゴペプチドまたは−ＯＲ’であり（Ｒ’が、アセチル、ＡＭ、ＰＯ32-、ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、ＡＭが、アセトキシメチルである））、
さらに、（ｉ）Ｒ1がメチルもしくはＣ2-6アルキルである場合、Ｒ2は、メチルもしくはＣ2-6アルキルではなく、または（ｉｉ）Ｒ3が、Ｒ3aもしくは−Ｌ1−ＲB1である、化合物、
またはそのスピロラクトン形態および／もしくは塩である。
【０００６】
実施形態２は、式（Ｐ２）の化合物を調製する方法であり、
【化４】
2021536500.tif 000006
その方法が、式（Ｐ１ａ）
【化５】
2021536500.tif 000007
および式（Ｐ１ｂ）
【化６】
2021536500.tif 000008
の化合物をオルガノリチウム塩基、次いでＳｉＣｌ2Ｒ1Ｒ2と反応させることを含み、式中、
Ｒ1が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ2が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
または、Ｒ1およびＲ2が、それらが結合しているケイ素と一緒に環を形成し、
各Ｌ1が、独立して、リンカーであり、
各ＲAが、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
各ＲB1が、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
Ｒ5が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ6が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ7が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ8が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
各ＲN1が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ5および／もしくはＲ7と一緒に環を形成し、
各ＲN2が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ6および／もしくはＲ8と一緒に環を形成し、
Ｒ10が、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ3または−Ｏ−ＣＨ2−Ａ1であり、Ａ1が、少なくとも１つのＲ11で任意に置換されたアリールまたはヘテロアリールであり、
Ｒ11が、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＯＲ12であり、
Ｒ12が、Ｈ、メチル、アセチル（Ａｃ）、アセトキシメチル（ＡＭ）、−ＰＯ32-、−ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、
Ｒ13が、
【化７】
2021536500.tif 000009
であり（Ｒ15が、オリゴペプチドまたは−ＯＲ’であり（Ｒ’が、アセチル、ＡＭ、ＰＯ32-、ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、ＡＭが、アセトキシメチルである））、
それにより、式（Ｐ２）の化合物を生成する。
【０００７】
実施形態３は、式（Ｉ）の化合物を調製する方法であって、その方法が、
【化８】
2021536500.tif 000010
式（Ｐ２）の化合物を、
【化９】
2021536500.tif 000011
式（Ｐ２ａ）の化合物と、
【化１０】
2021536500.tif 000012
１００℃を超える温度で、ＣｕＢｒ2の存在下で反応させることを含み、式中、
Ｒ1が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ2が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
または、Ｒ1およびＲ2が、それらが結合しているケイ素と一緒に環を形成し、
各Ｌ1が、独立して、リンカーであり、
各ＲAが、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
各ＲB1が、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
Ｒ3が、−ＣＯＯＨ、ＳＯ3-、Ｈ、Ｒ3a、−Ｌ1−ＲA、または−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ3aが、
【化１１】
2021536500.tif 000013
または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲN3）（ＲN4）であり、
ＲN3が、Ｈ、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＣＨ2−Ａであり（Ａが、少なくとも１つの極性もしくは荷電基で置換されたアリールまたはヘテロアリールである）、
ＲN4が、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1、または−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＲBであり（ｑが、２、３、４、５、または６である）、
Ｒ3bが、−ＯＨまたは−Ｎ（ＲN5）−Ｌ3a−ＲBであり、
各Ｌ3aが、独立して、リンカーであり、
ＲBが、反応性リガンドまたは標的結合部分であり、
ＲN5が、Ｈ、メチル、またはＣ2-6アルキルであり、
Ｒ4が、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
Ｅが、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
Ｒ5が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ6が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ7が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ8が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ9が、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
各ＲN1が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ5および／もしくはＲ7と一緒に環を形成し、
各ＲN2が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ6および／もしくはＲ8と一緒に環を形成し、
Ｒ10が、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ3または−Ｏ−ＣＨ2−Ａ1であり（Ａ1が、少なくとも１つのＲ11で任意に置換されたアリールまたはヘテロアリールである）、
Ｒ11が、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＯＲ12であり、
Ｒ12が、Ｈ、メチル、アセチル（Ａｃ）、アセトキシメチル（ＡＭ）、−ＰＯ32-、−ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、
Ｒ13が、
【化１２】
2021536500.tif 000014
であり（Ｒ15が、オリゴペプチドまたは−ＯＲ’であり（Ｒ’が、アセチル、ＡＭ、ＰＯ32-、ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、ＡＭが、アセトキシメチルである））、
さらに、（ｉ）Ｒ1がメチルもしくはＣ2-6アルキルである場合、Ｒ2は、メチルもしくはＣ2-6アルキルではなく、または（ｉｉ）Ｒ3が、Ｒ3aもしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
それにより、式（Ｉ）の化合物を生成する。
【０００８】
実施形態４は、Ｒ1またはＲ2が、ビニルまたは置換ビニルである、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０００９】
実施形態５は、Ｒ1またはＲ2が、ビニルである、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００１０】
実施形態６は、Ｒ1またはＲ2が、メチルまたはＣ2~6アルキルで置換ビニルである、実施形態１〜５のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００１１】
実施形態７は、Ｒ1およびＲ2が、それらが結合しているケイ素と一緒に環を形成する、実施形態１〜３のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００１２】
実施形態８は、環が、飽和環である、実施形態７に記載の化合物または方法である。
【００１３】
実施形態９は、環が、５員、６員、または７員環である、実施形態７または８に記載の化合物または方法である。
【００１４】
実施形態１０は、環が、置換されていない、実施形態７〜９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００１５】
実施形態１１は、Ｒ1またはＲ2が、−Ｌ1−ＲAである、実施形態１〜６のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００１６】
実施形態１２は、ＲAが、−ＣＯＯＨである、実施形態１１に記載の化合物または方法である。
【００１７】
実施形態１３は、ＲAが、
【化１３】
2021536500.tif 000015
（例えば、ＮＨＳエステルまたはスクシンイミジルエステル（ＳＥ））、カルボキシル、カルボキシレスター、マレイミド、アミド、スルホジクロロフェニル（ＳＤＰ）エステル、スルホテトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）エステル、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、アセトキシメチル（ＡＭ）エステル、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、アミノデキストラン、およびシクロオクチン−アミンである、実施形態１１に記載の化合物または方法である。
【００１８】
実施形態１４は、ＲAが、可溶化官能基である、実施形態１１に記載の化合物または方法である。
【００１９】
実施形態１５は、可溶化官能基が、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個のエチレンオキシド単位を含む、実施形態１４に記載の化合物または方法である。
【００２０】
実施形態１６は、ＲAが、ホスホラミダイトを含む、実施形態１１に記載の化合物または方法である。
【００２１】
実施形態１７は、Ｒ1またはＲ2が、−Ｌ1−ＲB1である、実施形態１〜６または１１〜１６のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００２２】
実施形態１８は、ＲB1が、核酸結合部分を含む、実施形態１７に記載の化合物または方法である。
【００２３】
実施形態１９は、ＲB1が、細胞骨格結合部分を含む、実施形態１７に記載の化合物または方法である。
【００２４】
実施形態２０は、ＲB1が、
【化１４】
2021536500.tif 000016
を含み、波線が、任意にリンカーを介したＳｉＲ部分への接続を示す、実施形態１７に記載の化合物または方法である。
【００２５】
実施形態２１は、ＲB1が、抗体を含む、実施形態１７に記載の化合物または方法である。
【００２６】
実施形態２２は、各Ｌ1が、独立して−（ＣH2）s−Ｘ−Ｌ3a−であり、式中、ｓが、独立して、２、３、４、５、または６であり、各Ｘが、独立して、ＣＨ2、Ｓ（Ｏ）、またはＳ（Ｏ）2であり、各Ｌ3aが、独立して、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、０、１、２、３、４、５、または６である、実施形態１〜２１のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００２７】
実施形態２３は、ｓが、２である、実施形態２２に記載の化合物または方法である。
【００２８】
実施形態２４は、Ｘが、Ｓである、実施形態２２または２３に記載の化合物または方法である。
【００２９】
実施形態２５は、Ｘが、Ｓ（Ｏ）である、実施形態２２または２３に記載の化合物または方法である。
【００３０】
実施形態２６は、各Ｌ3aが、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、２である、実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００３１】
実施形態２７は、各Ｌ3aが、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、３である、実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００３２】
実施形態２８は、各Ｌ3aが、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、４、５、または６である、実施形態２２〜２５のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００３３】
実施形態２９は、Ｒ3が、−ＣＯＯＨである、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００３４】
実施形態３０は、Ｒ3が、ＳＯ3-である、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００３５】
実施形態３１は、Ｒ3が、Ｈである、実施形態１〜２８のいずれか一項に記載の化合物または方法である。
【００３６】
実施形態３２は、Ｒ3が、Ｒ3aである、実施形態１〜２８のいずれか一項に記載の化合物または方法である。
【００３７】
実施形態３３は、Ｒ3aが、−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲN3）（ＲN4）である、実施形態３２に記載の化合物または方法である。
【００３８】
実施形態３４は、ＲN3が、メチルである、実施形態３３に記載の化合物または方法である。
【００３９】
実施形態３５は、ＲN3が、−ＣＨ2−Ａであり、Ａが、少なくとも２つの極性基または荷電基で置換されたアリールまたはヘテロアリールである、実施形態３３に記載の化合物または方法である。
【００４０】
実施形態３６は、ＲN3が、−ＣＨ2−Ａであり、Ａが、少なくとも１つの−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＮＯ2、または−ＳＯ3-で置換されたアリールまたはヘテロアリールである、実施形態３３または３５に記載の化合物または方法である。
【００４１】
実施形態３７は、ＲN3が、−ＣＨ2−Ａであり、Ａが、独立して−ＯＨ、−ＮＨ2、−ＣＯＯＨ、−ＮＯ2、または−ＳＯ3-である少なくとも２つの基で置換されたアリールまたはヘテロアリールである、実施形態３３、３５、または３６に記載の化合物または方法である。
【００４２】
実施形態３８は、ＲN3が、−ＣＨ2−Ａであり、Ａが、少なくとも２つの−ＳＯ3-基で置換されたアリールまたはヘテロアリールである、実施形態３５〜３７のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００４３】
実施形態３９は、Ａが、置換アリールである、実施形態３３または３５〜３８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００４４】
実施形態４０は、ＲN4が、−（ＣＨ2）3−ＲBであり、任意に、ＲN4のＲBが、−ＣＯＯＨである、実施形態３３〜３９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００４５】
実施形態４１は、ＲN4が、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＲBであり、ｑが、２である、実施形態３３〜３９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００４６】
実施形態４２は、ＲN4が、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＲBであり、ｑが、３である、実施形態３３〜３９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００４７】
実施形態４３は、ＲN4が、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＲBであり、ｑが、４、５、または６である、実施形態３３〜３９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００４８】
実施形態４４は、Ｒ3aが、
【化１５】
2021536500.tif 000017
である、実施形態３２に記載の化合物または方法である。
【００４９】
実施形態４５は、Ｒ3bが、Ｎ（ＲN5）−Ｌ3a−ＲBである、実施形態４４に記載の化合物または方法である。
【００５０】
実施形態４６は、ＲN5が、Ｈである、実施形態４５に記載の化合物または方法である。
【００５１】
実施形態４７は、ＲN5が、メチルである、実施形態４５に記載の化合物または方法である。
【００５２】
実施形態４８は、Ｒ3bが、−ＯＨである、実施形態４４〜４７のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００５３】
実施形態４９は、Ｒ3aが、
【化１６】
2021536500.tif 000018
である、実施形態３２に記載の化合物または方法である。
【００５４】
実施形態５０は、各Ｌ3aが、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、２である、実施形態４５〜４９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００５５】
実施形態５１は、各Ｌ3aが、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、３である、実施形態４５〜４９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００５６】
実施形態５２は、各Ｌ3aが、独立して、−（ＣＨ2）p−であり、ｐが、４、５、または６である、実施形態４５〜４９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００５７】
実施形態５３は、ＲBが、反応性リガンドを含み、任意に、反応性リガンドが、カルボキシル、アミン、マレイミド、または活性エステルであり、さらに任意に、活性エステルが、ＮＨＳエステルもしくはスクシンイミジルエステル（ＳＥ）、スルホジクロロフェニル（ＳＤＰ）エステル、スルホテトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）エステル、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、またはペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステルである、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００５８】
実施形態５６は、ＲBが、ホスホラミダイトを含む、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００５９】
実施形態５５は、ＲBが、核酸結合部分を含む、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００６０】
実施形態５６は、ＲBが、細胞骨格結合部分を含む、実施形態１〜５２のいずれか一項に記載の化合物または方法である。
【００６１】
実施形態５７は、ＲBが、
【化１７】
2021536500.tif 000019
を含み、波線が、任意にリンカーを介したＳｉＲ部分への接続を示す、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００６２】
実施形態５８は、ＲBが、抗体を含む、実施形態１〜５２のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００６３】
実施形態５９は、Ｒ4が、ＳＯ3-である、実施形態５９〜１９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００６４】
実施形態６０は、Ｒ4が、Ｈである、実施形態１〜５８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００６５】
実施形態６１は、ＥおよびＲ9が、各々、クロロである、実施形態１〜６０のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００６６】
実施形態６２は、ＥおよびＲ9が、各々、Ｈである、実施形態１〜６０のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００６７】
実施形態６３は、Ｒ5が、Ｈである、実施形態１〜６２のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００６８】
実施形態６４は、Ｒ5が、メチルである、実施形態１〜６２のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００６９】
実施形態６５は、Ｒ5が、ＲN1と一緒に５員または６員環を形成する、実施形態１〜６２のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００７０】
実施形態６６は、Ｒ6が、Ｈである、実施形態１〜６５のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００７１】
実施形態６７は、Ｒ6が、メチルである、実施形態１〜６５のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００７２】
実施形態６８は、Ｒ6が、ＲN2と一緒に５員または６員環を形成する、実施形態１〜６５のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００７３】
実施形態６９は、Ｒ7が、Ｈである、実施形態１〜６８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００７４】
実施形態７０は、Ｒ7が、メチルである、実施形態１〜６８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００７５】
実施形態７１は、Ｒ7が、ＲN1と一緒に５員または６員環を形成する、実施形態１〜６８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００７６】
実施形態７２は、Ｒ8が、Ｈである、実施形態１〜７１のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００７７】
実施形態７３は、Ｒ8が、メチルである、実施形態１〜７１のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００７８】
実施形態７４は、Ｒ8が、ＲN2と一緒に５員または６員環を形成する、実施形態１〜７１のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００７９】
実施形態７５は、１つまたは各ＲN1が、Ｈである、実施形態１〜７４のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００８０】
実施形態７６は、１つまたは各ＲN1が、メチルまたはＣ2-4アルキルである、実施形態１〜７５のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００８１】
実施形態７７は、１つまたは各ＲN1が、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ10である、実施形態１〜７６のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００８２】
実施形態７８は、ＲN1が、Ｒ5と一緒に５員または６員環を形成する、実施形態１〜６２または６５〜６７のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００８３】
実施形態７９は、ＲN1が、Ｒ7と一緒に５員または６員環を形成する、実施形態１〜６８または７１〜７８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００８４】
実施形態８０は、１つまたは各ＲN2が、Ｈである、実施形態１〜７９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００８５】
実施形態８１は、１つまたは各ＲN2が、メチルである、実施形態１〜８０のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００８６】
実施形態８２は、１つまたは各ＲN2が、Ｃ2-4アルキルである、実施形態１〜８１のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００８７】
実施形態８３は、１つまたは各ＲN2が、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ10である、実施形態１〜８２のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００８８】
実施形態８４は、ＲN2が、Ｒ6と一緒に５員または６員環を形成する、実施形態１〜８３のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００８９】
実施形態８５は、ＲN2が、Ｒ8と一緒に５員または６員環を形成する、実施形態１〜６５または６８〜８４のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００９０】
実施形態８６は、Ｒ10が、−ＣＨ2−Ａ1であり、Ａ1が、少なくとも１つのＲ11で任意に置換されたアリールである、実施形態１〜７２または７５〜８５のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００９１】
実施形態８７は、Ｒ11が、メチルである、実施形態１〜８６のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００９２】
実施形態８８は、Ｒ11が、−ＯＲ12である、実施形態１〜８６のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００９３】
実施形態８９は、Ｒ12が、Ｈである、実施形態１〜８６または８８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００９４】
実施形態９０は、Ｒ12が、メチルである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００９５】
実施形態９１は、Ｒ12が、アセチル（Ａｃ）である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００９６】
実施形態９２は、Ｒ12が、アセトキシメチル（ＡＭ）である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００９７】
実施形態９３は、Ｒ12が、−ＰＯ32−である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００９８】
実施形態９４は、Ｒ12が、−ＰＯ3（ＡＭ）2である、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【００９９】
実施形態９５は、Ｒ12が、グリコシドである、実施形態１〜８８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１００】
実施形態９６は、ＲN１またはＲN2が、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１3であり、任意に、ＲN1またはＲN2のうちの１つのみが、−Ｃ（Ｏ）Ｒ１3である、実施形態１〜９５のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１０１】
実施形態９７は、Ｒ15が、プロテアーゼによって認識されるオリゴペプチドであり、任意に、プロテアーゼが、カスパーゼである、実施形態１〜９６のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１０２】
実施形態９８は、Ｒ15が、テトラペプチド、ペンタペプチド、ヘキサペプチド、ヘプタペプチド、オクトペプチド、またはノナペプチドである、実施形態１〜９７のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１０３】
実施形態９９は、Ｒ15が、アミノ酸配列ＤＶＥＤを含む、実施形態１〜９８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１０４】
実施形態１００は、Ｒ15が、アミノ酸配列ＤＶＥＤＨＮを含む、実施形態１〜９９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１０５】
実施形態１０１は、Ｒ15が、Ｃ末端を介してＲ13の環に連結されたオリゴペプチドである、実施形態１〜１００いずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１０６】
実施形態１０２は、Ｒ1またはＲ2が、メチルまたはＣ2~6アルキルである、実施形態１〜１０１のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１０７】
実施形態１０３は、実施形態１〜１０２のいずれか１つに記載の化合物または方法であり、
【０１０８】
実施形態１０４は、Ｒ５およびＲ6が、同一である、
【０１０９】
実施形態１０５は、ＲN1が、ＲN2と同一である、または
【０１１０】
実施形態１０６は、Ｒ7およびＲ8が、同一である、のうちの１つ、２つ、または３つが真である。
【０１１１】
実施形態１０７は、各ＲN1が、ＲN2と同一である、実施形態１〜１０６のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１１２】
実施形態１０８は、化合物が、任意に、Ｒ1およびＲ2が必ずしも同一ではないことを除いて、ケイ素およびＲ4を通過する鏡映面を有する、実施形態１〜１０７のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１１３】
実施形態１０９は、構造
【化１８】
2021536500.tif 000020
またはその開環形態、塩、もしくは遊離酸を有する、実施形態１〜１０８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１１４】
実施形態１１０は、化合物が、式を有する標識ヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
ＮＵＣ−ＤＹＥ
式中、
ＮＵＣが、ヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
ＤＹＥが、化合物のＳｉＲ部分であり、ＮＵＣおよびＤＹＥが、リンカーによって接続されており、
リンカーが、式（Ｉ）のＲ1位またはＲ2位のうちの１つでＤＹＥに結合し、任意に、ＮＵＣがプリン塩基を含む場合、リンカーが、プリンの８位に結合し、ＮＵＣが７−デアザプリン塩基を含む場合、リンカーが、７−デアザプリンの７位に結合し、ＮＵＣがピリミジン塩基を含む場合、リンカーが、ピリミジンの５位に結合する、実施形態１〜１０９のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１１５】
実施形態１１１は、ＮＵＣが、ヌクレオチド三リン酸、プライマー、プライマー伸長生成物、またはプローブを含む、実施形態１１０に記載の化合物または方法である。
【０１１６】
実施形態１１２は、化合物のＳｉＲ部分とエネルギー伝達関係にあるクエンチャーまたはフルオロフォアをさらに含む、実施形態１１０または１１１に記載の化合物または方法である。
【０１１７】
実施形態１１３は、ＮＵＣが、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、およびデアザグアノシンからなる群から選択される塩基を含む、実施形態１１０〜１１２のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１１８】
実施形態１１４は、化合物が、式（Ｌ１）のホスホラミダイト化合物であり、
【化１９】
2021536500.tif 000021
式中、
ＸおよびＹが、一緒にリンカーを形成し、
Ｂ1が、リン酸エステル保護基であり、
別々に取られるＢ2およびＢ3が、最大１０個の炭素原子を含有する低級アルキル、低級アルケン、アリール、およびシクロアルキルであり、
Ｄが、化合物のＳｉＲ部分であり、
Ｙが、式（Ｉ）のＲ1またはＲ2位のうちの１つでＤに結合する、実施形態１〜１０８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１１９】
実施形態１１５は、化合物が、式（Ｌ２）のホスホラミダイト化合物であり、
【化２０】
2021536500.tif 000022
式中、
Ｂ1が、リン酸エステル保護基であり、
別々に取られるＢ2およびＢ3が、最大１０個の炭素原子を含有する低級アルキル、低級アルケン、アリール、またはシクロアルキルであり、
Ｂ5が、水素または酸切断性ヒドロキシル保護基であり、
Ｂが、ヌクレオシド／ヌクレオチド塩基であり、
Ｄが、化合物のＳｉＲ部分であり、
Ｂが、式（Ｉ）のＲ1またはＲ2位のうちの１つにリンカーを介して結合し、
任意に、Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分が、プリンまたは７−デアザプリンのＮ9位で結合し、Ｂがピリミジンである場合、糖部分が、ピリミジンのＮ1位で結合し、
任意に、Ｂがプリンである場合、リンカーが、プリンの８位に結合し、Ｂが７−デアザプリンである場合、リンカーが、７−デアザプリンの７位に結合し、Ｂがピリミジンである場合、リンカーが、ピリミジンの５位に結合する、実施形態１〜１０８のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１２０】
実施形態１１６は、化合物１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、２Ａ、３、４Ａ、５、６、７、７Ａ、７Ｂ、８、９、１０Ａ、１０Ｂ、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３５、３６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５６、５７、５８、および５９のうちのいずれか１つである化合物、またはその開環形態もしくはスピロラクトン形態、および／または塩もしくは遊離酸である、実施形態１〜１１１５のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１２１】
実施形態１１７は、化合物１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、２Ａ、３、４Ａ、５、６、７、７Ａ、７Ｂ、８、９、１０Ａ、１０Ｂ、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および５９のうちのいずれか１つである第１の化合物を、標的結合部分、ヌクレオシド／チド、またはポリヌクレオチドと反応させることによって形成される化合物であり、第１の化合物が、その部分を、標的結合部分と反応する反応性リガンドに変換することによって最初に活性化される、化合物、またはその開環形態もしくはスピロラクトン形態、および／または塩もしくは遊離酸である。
【０１２２】
実施形態１１８は、標的結合部分が、抗体、核酸結合部分、または細胞骨格結合部分である、実施形態１１７に記載の化合物である。
【０１２３】
実施形態１１９は、標的ポリヌクレオチドを検出する方法であり、その方法が、標的ポリヌクレオチドを含むか、またはその疑いのある試料を、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる実施形態１または４〜１１７のいずれか１つに記載の化合物と接触させることと、標的ポリヌクレオチドと化合物とを含む複合体が形成されたかどうかを決定することと、を含む。
【０１２４】
実施形態１２０は、標的ポリヌクレオチドと化合物とを含む複合体が形成されたかどうかを決定することが、複合体からの蛍光を検出すること、または複合体形成から生じる蛍光の変化を検出することを含み、任意に、複合体形成から生じる蛍光の変化が、切断または立体構造変化に起因するクエンチャーによるクエンチングの低減である、実施形態１１９に記載の化合物または方法である。
【０１２５】
実施形態１２１は、ポリヌクレオチドを配列決定する方法であり、その方法が、配列決定反応中に、ポリヌクレオチドを実施形態１、４〜１０８、または１１０〜１１７のいずれか１つに記載の化合物と接触させることと、配列決定生成物を形成することと、配列決定生成物からの蛍光を検出することと、を含み、化合物が、プライマーまたはヌクレオチド三リン酸を含む。
【０１２６】
実施形態１２２は、化合物が、配列決定生成物の合成を終了する標識ターミネーターヌクレオチドまたはジヌクレオチドであり、任意に、標識ターミネーターヌクレオチドが、標識ジデオキシヌクレオチド、または可逆ターミネーターヌクレオチドもしくはジヌクレオチドである、実施形態１２１に記載の化合物または方法である。
【０１２７】
実施形態１２３は、化合物が、プライマーであり、配列決定生成物が、プライマー伸長によって形成される、実施形態１２１に記載の化合物または方法である。
【０１２８】
実施形態１２４は、方法が、蛍光を検出する前に、配列決定生成物を他の配列決定生成物から分離することを含み、任意に、分離することが、電気泳動によるものであり、さらに任意に、電気泳動が、キャピラリー電気泳動である、実施形態１２１〜１２３のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１２９】
実施形態１２５は、方法が、配列決定生成物をインサイチュで検出することを含む、実施形態１２１〜１２３のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１３０】
実施形態１２６は、第１の反応性リガンドを含むヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを標識化する方法であって、その方法が、ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを、第１の反応性リガンドとの反応時に結合を形成することができる第２の反応性リガンドを含む実施形態１、４〜１０８、または１１０〜１１７のいずれか１つに記載の化合物と反応させることを含む。
【０１３１】
実施形態１２７は、第２の反応性リガンドが、ホスホラミダイトである、実施形態１２６に記載の化合物または方法である。
【０１３２】
実施形態１２８は、第２の反応性リガンドが、活性エステルであり、任意に活性エステルが、ＮＨＳエステルである、実施形態１２６に記載の化合物または方法である。
【０１３３】
実施形態１２９は、ポリヌクレオチドを染色する方法であって、その方法が、ポリヌクレオチドを、ポリヌクレオチド結合部分を含む実施形態１、４〜１０８、または１１０〜１１７のいずれか１つに記載の化合物と接触させることを含む。
【０１３４】
実施形態１３０は、蛍光複合体であり、それが、ポリヌクレオチドと非共有結合したポリヌクレオチド結合部分を含む、実施形態１、４〜１０８または１１０〜１１７のいずれか１つに記載の化合物を含む。
【０１３５】
実施形態１３１は、ポリヌクレオチドが、約８〜約１５ヌクレオチド、約１５〜約３０ヌクレオチド、約３０〜約５０ヌクレオチド、約５０〜約２００ヌクレオチド、約２００〜約１０００ヌクレオチド、約１ｋｂ〜約５ｋｂ、約５ｋｂ〜約１０ｋｂ、約１０ｋｂ〜約５０ｋｂ、約５０ｋｂ〜約５００ｋｂ、約５００ｋｂ〜約５Ｍｂ、約５Ｍｂ〜約５０Ｍｂ、または約５０Ｍｂ〜約５００Ｍｂの長さを有する、実施形態１２９に記載の方法または実施形態１３０に記載の蛍光複合体である。
【０１３６】
実施形態１３２は、核酸が、プラスミド、コスミド、ＰＣＲ生成物、制限断片、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、または天然もしくは合成オリゴヌクレオチドである、実施形態１１９〜１３１のいずれか１つに記載の方法または蛍光複合体である。
【０１３７】
実施形態１３３は、ポリヌクレオチドが、電気泳動ゲル、細胞、器官、ウイルス、ビロイド、または生物学的流体中にあるか、または水試料、土壌試料、食料、発酵プロセス、または表面洗浄液中にあるか、またはそれから得られた、実施形態１１９〜１３２のいずれか１つに記載の方法または蛍光複合体である。
【０１３８】
実施形態１３４は、細胞膜の完全性を決定する方法であり、その方法が、
ａ）１つ以上の細胞を含有する試料を、実施形態１、４〜１０９、または１１６〜１１８のいずれか１つに記載の化合物と、化合物が損傷した細胞膜を有する細胞に入るのに十分な時間インキュベートすることと、
ｂ）１つ以上の細胞からの検出可能な蛍光信号の存在に基づいて１つ以上の細胞の細胞膜の完全性を決定することであって、検出可能な蛍光信号の存在が、細胞膜の完全性が損なわれていることを示し、検出可能な蛍光信号の非存在が、細胞膜の完全性が無傷であることを示す、決定することと、を含む。
【０１３９】
実施形態１３５は、標的を検出する方法であり、その方法が、標的を含むか、またはその疑いのある試料を、標的に特異的に結合する標的結合部分を含む実施形態１、４〜１０９、または１１６〜１１８のいずれか１つに記載の化合物と接触させることと、標的と化合物とを含む複合体からの蛍光を検出することと、を含む。
【０１４０】
実施形態１３６は、試料が、細胞を含む、実施形態１３５に記載の化合物または方法である。
【０１４１】
実施形態１３７は、試料が、生体抽出物を含む、実施形態１３５に記載の化合物または方法である。
【０１４２】
実施形態１３８は、蛍光を検出することが、蛍光顕微鏡、プレートリーダー、蛍光スキャナ、蛍光計、またはフローサイトメータを使用して行われる、実施形態１３４〜１３７のいずれか１つに記載の化合物または方法である。
【０１４３】
実施形態１３９は、標的を検出するためのキットであり、そのキットが、標的に特異的に結合するように構成される標的結合部分を含む、実施形態１または４〜１１７のいずれか１つに記載の化合物を含む。
【０１４４】
実施形態１４０は、標的が、アクチンまたは微小管であり、標的結合部分が、アクチン結合部分または微小管結合部分である、実施形態１３９に記載のキットである。
【０１４５】
実施形態１４１は、標的結合部分が標的に特異的な抗体である、実施形態１３９に記載のキットである。
【０１４６】
実施形態１４２は、標的が、一次抗体であり、標的結合部分が、一次抗体に特異的な二次抗体である、実施形態１３９に記載のキットである。
【０１４７】
実施形態１４３は、標的が、ポリペプチド、多糖類、脂質、またはポリヌクレオチドである、実施形態１３９〜１４１のいずれか１つに記載のキットである。
【０１４８】
実施形態１４４は、試料を染色するためのキットであり、そのキットが、実施形態１または４〜１１８のいずれか１つに記載の化合物を含む。
【０１４９】
実施形態１４５は、式（Ｉ）の化合物を、標的結合部分、ヌクレオチド、またはポリヌクレオチドにコンジュゲートするためのキットであって、そのキットが、少なくとも１つの反応性リガンドを含む、実施形態１または４〜１１８のいずれか１つに記載の化合物を含む。
【図面の簡単な説明】
【０１５０】
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｒは本明細書に提供される例示的なＳｉ−ローダミン（ＳｉＲ）化合物の構造を示す。図１Ａは、化合物１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、および２Ａの構造を示す。
【図１Ｂ】図１Ｂは、化合物３、４、および４Ａの構造を示す。
【図１Ｃ】図１Ｃは、化合物５および６の構造を示す。
【図１Ｄ】図１Ｄは、化合物７、７Ａ、および７Ｂの構造を示す。
【図１Ｅ】図１Ｅは、化合物８、９、および１０Ａの構造を示す。
【図１Ｆ】図１Ｆは、化合物１０Ｂ、１１、および１２の構造を示す。
【図１Ｇ】図１Ｇは、化合物１３、１４、および１５の構造を示す。
【図１Ｈ】図１Ｈは、化合物１６、１７、１８、１９、２０、および２１の構造を示す。
【図１Ｉ】図１Ｉは、化合物２２、２３、２４、２５、２６、および２７の構造を示す。
【図１Ｊ】図１Ｊは、化合物２８、２９、３０、３１、３２、および３３の構造を示す。
【図１Ｋ】図１Ｋは、化合物３４、３５、３６、３７、３８、および３９の構造を示す。
【図１Ｌ】図１Ｌは、化合物４３の構造を示す。
【図１Ｍ】図１Ｍは、化合物４５および４６の構造を示す。
【図１Ｎ】図１Ｎは、化合物４７、４８、４９、および５０の構造を示す。
【図１Ｏ】図１Ｏは、化合物５１および５２の構造を示す。
【図１Ｐ】図１Ｐは、化合物５３、５４、５５、および５６の構造を示す。
【図１Ｑ】図１Ｑは、化合物５７、５８、および５９の構造を示す。
【図１Ｒ】図１Ｒは、左側に、一般的なＳｉＲ化合物の蛍光双性イオン開環形態、および右側に、同じ一般的なＳｉＲ化合物の非蛍光スピロ閉鎖形態を示す。
【図２Ａ】図２Ａ〜２Ｅは様々なＳｉＲ化合物の調製を示す。図２Ａは、既知の方法によるＳｉＲ化合物への合成経路を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本明細書に提供される実施形態による化合物１〜３の例示的な合成スキームを示し、それは、本明細書に提供されるある特定の実施形態による様々なリガンドへのコンジュゲーション反応において使用することができる（化合物３は、既知の方法を使用して化合物２の酸化によって生成することができる）。
【図２Ｃ】図２Ｃは、化合物２からの化合物２Ａの例示的な調製を示し、それは、本明細書に提供されるある特定の実施形態に従って示されるようなコンジュゲーション反応において使用することができる。
【図２Ｄ】図２Ｄは、本明細書に提供されるある特定の実施形態に従って化合物２から（例えば、化合物２Ａを介して）調製することができる、生細胞（化合物４）、チューブリンプローブ（化合物５）、およびアクチンプローブ（化合物６）のための核色素の構造を示す。
【図２Ｅ】図２Ｅは、本明細書に提供されるある特定の実施形態による化合物７Ａを介した化合物７Ｂの例示的な合成スキームを示す。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｅは、２つの異なる濃度でのＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｅ、スイス）または化合物４の生細胞染色および平均核信号強度の比較を示す。陽性染色細胞は、黒い背景上で灰色から白色の物体として現れる。化合物４では、染色が顕著に明るかった。図３Ａは、１μＭのＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔで染色した細胞を示す。
【図３Ｂ】図３Ｂは、２μＭのＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔで染色した細胞を示す。
【図３Ｃ】図３Ｃは、１μＭの化合物４で染色した細胞を示す。
【図３Ｄ】図３Ｄは、２μＭの化合物４で染色した細胞を示す。
【図３Ｅ】図３Ｅは、ＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔおよび化合物４で染色した細胞の観察された核信号強度を比較する棒グラフを示す。核信号強度は、試験した各染色および濃度について核内の蛍光強度を平均化することによって決定した。
【図４】図４Ａ〜４Ｄは、ドセタキセル（タキソール）を標的化リガンドとして使用してチューブリンプローブで染色した細胞の比較を示す。各色素について２つのフィールドを示す。細胞を、０．５μＭの化合物５またはＳＩＲ−タキソール（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｅ、スイス）で染色し、画像化を行った。図４Ａ〜Ｂは、化合物５で染色した細胞を示す。図４Ｃ〜Ｄは、ＳｉＲ−タキソールで染色した細胞を示す。
【図５】図５Ａ〜５Ｄは、化合物７およびＴＯ−ＰＲＯ−３の蛍光強度および光安定性の比較を示す。固定Ａ４５９細胞を、１μＭの化合物７またはＴＯ−ＰＲＯ−３で染色し、蛍光顕微鏡のＣｙ５チャネルを使用して画像を収集した。陽性染色の細胞は、黒い背景上で淡い灰色の物体として現れる。図５Ａは、１μＭのＴＯ−ＰＲＯ−３による染色を示す。図５Ｃは、１μＭの化合物７による染色を示す。図５Ｂは、Ｃｙ５チャネルからの励起光に１分間曝露した後のＴＯ−ＰＲＯ−３蛍光を示す（蛍光はほとんどまたは全く観察できなかった）。図５Ｄは、Ｃｙ５チャネルからの励起光に１分間曝露した後の化合物７の蛍光を示す。
【図６】図６Ａ〜６Ｅは、化合物７および７ＢのＤＡＰＩチャネルからの蛍光強度およびブリードスルーの比較を示す。図６Ａ〜６Ｄは、Ｃｙ５チャネルにおいて撮像すると、化合物７Ｂが化合物７よりも明るいことを示し（それぞれ、図６Ａおよび６Ｃ）、ＤＡＰＩチャネルへのブリードスルーが少ないことを示す（それぞれ、図６Ｂおよび６Ｄ）。図６Ｅは、化合物７と比較すると、化合物７Ｂの信号がＣｙ５チャネルにおいて１２％増加し（それぞれ、図６Ｅ、＃３および＃１を参照されたい）、化合物７と比較して、ＤＡＰＩチャネルにおいて驚くべき５０％減少した（それぞれ、図６Ｅ、＃４および＃２を参照されたい）ことを実証する棒グラフを示す。
【図７】図７Ａ〜７Ｂは、ＰＲＯＬＯＮＧ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄド（「ＰＬＤ」、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）またはＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（商標）封入剤（「ＶＳＨ」、Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）でスライドを調製した後、化合物１０Ｂの光安定性を、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）６４７色素（「ＡＦ６４７」、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）と比較する。ＨｅＬａ細胞をスライド上に配置し、５０μＭの化合物１０ＢまたはＡＦ６４７で染色した。図７Ａは、ＡＦ６４７または化合物１０Ｂで染色され、ＰＲＯＬＯＮＧ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ（ＰＬＤ）またはＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（商標）で取り付けられた検体中に残っている蛍光の割合を比較する。ＡＦ６４７＋ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤは、完全に光漂白した（データ示さず）。図７Ｂは、６３３ｎｍのレーザーを使用して検体を共焦点顕微鏡でどのように撮像したかの概略図を示す。３つの視野内の各対象領域を５０回スキャンした。
【図８】本明細書に提供されるある特定の実施形態による、ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドを標識化するために使用することができる化合物５４−ＦＡＭプライマー標識の生成のために化合物５４−ホスホラミダイトおよびＦＡＭ−ホスホラミダイトを使用することを例示する。プライマーは、６５０ｎｍを超える発光をする。
【図９】ＮＨＳエステルを介して、ＦＡＭおよび化合物５９に由来するＳｉＲ部分にコンジュゲートされたプライマーオリゴヌクレオチドの生成を例示する。プライマーオリゴヌクレオチドは、本明細書に提供されるある特定の実施形態に従って、化合物５９−ＦＡＭプライマー標識によって標識化される。
【図１０Ａ】図１０Ａ〜１０Ｂは、固定細胞または標識抗体の染色などの実験手順に有用な例示的な化合物の構造を示す。図１０Ａは、本明細書に提供されるある特定の実施形態による、リガンドにコンジュゲートしたＳｉＲ色素によって本明細書に表される、固定細胞染色として有用な化合物の調製を例示する。
【図１０Ｂ】図１０Ｂは、本明細書に提供されるある特定の実施形態による、水溶性ＳｉＲ  ＮＨＳエステルの調製、続いて抗体へのそのコンジュゲーションを例示する。
【図１１Ａ】図１１Ａ〜１１Ｂは、様々な化合物の吸光度および発光スペクトルを、ＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）６４７色素（「ＡＦ６４７」、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）と比較する。図１１Ａは、化合物８、１０Ａ、および１２の吸光度スペクトルをＡＦ６４７と比較する。
【図１１Ｂ】図１１Ｂは、化合物１０Ａおよび１２の発光スペクトルをＡＦ６４７と比較する。
【図１２Ａ】図１２Ａ〜１２Ｃは、抗チューブリン抗体およびＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）６４７色素（「ＡＦ６４７」、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）または１５の標識化度（「ＤＯＬ」）で二次抗体にコンジュゲートされた化合物１０Ａで染色した細胞の例を示す。チューブリンの陽性染色の細胞は、黒い背景上で灰色から白色に見える。核をＤＡＰＩで染色した。図１２Ａは、ＡＦ６４７で染色した細胞を示す。
【図１２Ｂ】図１２Ｂは、化合物１０Ａによる細胞の染色を示す（ＤＯＬ＝１５）。
【図１２Ｃ】図１２Ｃは、ＡＦ６４７、化合物１０Ａ（ＤＯＬ＝１０）、および化合物１０Ａ（ＤＯＬ＝１５）の蛍光と、使用された各標識二次試薬の濃度とを比較する。化合物１０Ａの結果では、ＡＦ６４７よりも明るさは低いが、オフターゲットまたはバックグラウンド蛍光は認められず、化合物１０Ａは、ＡＦ６４７よりも良好な光安定性を示した。
【図１３】光漂白に抵抗する能力における化合物１３、化合物１４、またはＡＦ６４７の抗体コンジュゲートの比較を示す。化合物１３および１４の両方は、７００秒を超える曝露に対して実質的に光漂白に耐性を有したが、ＡＦ６４７は耐性を有しなかった。ＤＯＬは、標識化度（例えば、１抗体当たりのＳｉＲ色素部分）を示す。
【図１４】細胞型Ａ５４９およびＨｅＬａについて、化合物４Ｂ（下部のＰＤＴ）および化合物４Ｃ（上部のＰＤＴ）で染色した細胞の核信号強度を示す。
【図１５】Ｃｙ５およびＤＡＰＩチャネル上のＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔならびに化合物４Ｂおよび４Ｃで染色した細胞の核信号強度を比較する棒グラフを示す。
【図１６】ジアステロマーと市販のＳｉＲ−タキソール化合物との混合物と比較した、化合物５についてのジアステロマーＡおよびＢの信号強度を比較する棒グラフを示す。
【図１７Ａ】異なる種類のリンカーで調製した化合物６アクチンプローブの平均信号強度を比較する棒グラフを示す。
【図１７Ｂ】異なる種類のリンカーで調製した化合物６アクチンプローブの信号対バックグラウンド（Ｓ／Ｂ）比を比較する棒グラフを示す。
【図１８Ａ】平均信号強度、化合物６Ａ、化合物６Ｂ、単離された化合物６Ａおよび６Ｂの混合物（異性体分離前）、化合物６の２つの分離された異性体の組み合わせ（Ａ／Ｂ）、ならびにＳｉＲ−アクチン（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｅ）で標識化された細胞を比較する棒グラフを示す。
【図１８Ｂ】図１８Ａで試験した化合物の各々について、信号対バックグラウンド比を比較する棒グラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【０１５１】
ここで、本開示のある特定の実施形態を詳細に参照し、それらの例は、添付の図面に例示される。一般的な説明および詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なのみであり、教示を制限するものではないことを理解されたい。本開示は例示される実施形態と併せて説明されるが、それらは、それらの実施形態に本開示を限定することを意図するものではないことが理解されよう。逆に、本開示は、添付の特許請求の範囲によって定義されるように、本開示内に含まれ得るすべての代替、修正、および等価物を網羅することが意図される。
【０１５２】
本教示を詳細に説明する前に、本開示は、特定の組成物またはプロセスステップに限定されないことを理解されたく、それは、そのようなものが変化し得るためである。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈に別段の指示がない限り、複数の参照を含むことに留意されたい。したがって、例えば、「１つの色素」への言及は、複数の色素を含み、「１つの細胞」への言及は、複数の細胞を含む、などである。「または」という用語は、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、包括的な意味で、すなわち、「および／または」と同等に使用される。
【０１５３】
本明細書および添付の特許請求の範囲の目的で、別途示されない限り、数量、割合、または比率を表すすべての数、ならびに明細書および特許請求の範囲に使用される他の数値は、すべての場合において、それらが既にそのように修正されていない程度まで「約」という用語によって修正されているものとして理解されるべきである。「約」は、記載された主題の特性に実質的に影響を与えない、例えば、１０％、５％、２％、または１％以内の変動の程度を示す。したがって、反対が示されない限り、以下の明細書および添付の特許請求の範囲に記載される数値パラメータは、得ようとする所望の特性によって変化し得る近似値である。最低でも、特許請求の範囲に対する均等論の適用を限定することを企図しないように、各数値パラメータは、少なくとも、報告された有効数字の桁数を考慮し、かつ通常の四捨五入の技術を適用することによって解釈されるべきである。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定することを意図するものではない。
【０１５４】
上記の明細書に特に記載されていない限り、様々な構成要素を「含む」を列挙する明細書中の実施形態はまた、列挙された構成要素「からなる」または「から本質的になる」と企図され、様々な構成要素「からなる」を列挙する明細書中の実施形態はまた、列挙された構成要素を「含む」または「からなる」と企図され、様々な構成要素「から本質的になる」を列挙する明細書中の実施形態はまた、列挙された構成要素を「からなる」または「含む」と企図される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には適用されない）。
【０１５５】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成的な目的のみのためであり、決して所望の主題を限定すると解釈されるべきではない。参照により組み込まれる任意の文献が、本明細書で定義される任意の用語と矛盾する場合、本明細書が制御する。本教示は、様々な実施形態と併せて説明されるが、本教示がそのような実施形態に限定されることは意図されない。逆に、本教示は、当業者によって理解されるように、様々な代替、修正、および等価物を包含する。
【０１５６】
定義
別段の定めがない限り、以下の用語およびフレーズは、本明細書で使用される場合、以下の意味を有することを意図している。
【０１５７】
「またはそれらの組み合わせ」という用語は、本明細書で使用される場合、この用語の前に列挙される用語のすべての置換および組み合わせを指す。例えば、「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、ＡＢ、ＡＣ、ＢＣ、またはＡＢＣ、および特定の文脈で順序が重要な場合は、ＢＡ、ＣＡ、ＣＢ、ＡＣＢ、ＣＢＡ、ＢＣＡ、ＢＡＣ、またはＣＡＢ、のうちの少なくとも１つ含むことを意図している。この実施例に引き続き、ＢＢ、ＡＡＡ、ＡＡＢ、ＢＢＣ、ＡＡＡＢＣＣＣＣ、ＣＢＢＡＡＡ、ＣＡＢＡＢＢなどの１つ以上の項目または用語の反復を含有する組み合わせが明示的に含まれる。当業者は、文脈から別段明らかでない限り、典型的には、任意の組み合わせの項目または用語の数に制限がないことを理解するであろう。
【０１５８】
本明細書で使用される場合、「キット」という用語は、１つ以上の化合物または組成物、ならびに溶媒、溶液、緩衝液、説明書、または乾燥剤などの１つ以上の関連材料などの関連する構成要素のパッケージ化されたセットを指す。
【０１５９】
本明細書で使用される場合、「置換された」は、１つ以上の水素原子が１つ以上の非水素原子、官能基、または部分で置き換えられる分子を指す。例えば、非置換窒素は、−ＮＨ2であり、置換窒素は、−ＮＨＣＨ3である。例示的な置換基としては、ハロゲン、例えば、フッ素および塩素、（Ｃ1〜Ｃ8）アルキル、硫酸、スルホン酸、スルホン、アミノ、アンモニウム、アミド、ニトリル、ニトロ、低級アルコキシ、フェノキシ、芳香族、フェニル、多環式芳香族、複素環、水溶化基、連結、および連結部分が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、置換基は、
−Ｘ、−Ｒ、−ＯＨ、−ＯＲ、−ＳＲ、−ＳＨ、−ＮＨ2、−ＮＨＲ、−ＮＲ2、−+ＮＲ3、−Ｎ＝ＮＲ2、−ＣＸ3、−ＣＮ、−ＯＣＮ、
−ＳＣＮ、−ＮＣＯ、−ＮＣＳ、−ＮＯ、−ＮＯ2、−Ｎ2+、−Ｎ3、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ2、
−Ｓ（Ｏ）2Ｏ-、−Ｓ（Ｏ）2Ｒ、−ＯＳ（Ｏ）2ＯＲ、−Ｓ（Ｏ）2ＮＲ、−Ｓ（Ｏ）Ｒ、−ＯＰ（Ｏ）（ＯＲ）2、−Ｐ（Ｏ）（ＯＲ）2、
−Ｐ（Ｏ）（Ｏ-）2、−Ｐ（Ｏ）（ＯＨ）2、−Ｃ（Ｏ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）Ｘ、−Ｃ（Ｓ）Ｒ、−Ｃ（Ｏ）ＯＲ、−ＣＯ2-、
−Ｃ（Ｓ）ＯＲ、−Ｃ（Ｏ）ＳＲ、−Ｃ（Ｓ）ＳＲ、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ2、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ2、−Ｃ（ＮＲ）ＮＲ2を含むが、これらに限定されず、式中、各Ｘが、独立して、ハロゲンであり、各Ｒが、独立して、−Ｈ、Ｃ1〜Ｃ6アルキル、Ｃ5〜Ｃ14アリール、複素環、または連結基である。
【０１６０】
別途示されない限り、本明細書で明示的に定義されていない置換基の命名は、官能基の末端部分に続いて、結合点に向かって隣接する官能基を命名することによって達成される。例えば、置換基「アリールアルキルオキシカルボニル」は、（アリール）−（アルキル）−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−の基を指す。
【０１６１】
本明細書で定義されるすべての置換基において、それ自体にとってのさらなる置換基を有する置換基（例えば、置換アリール基によってさらに置換される、置換アリール基でそれ自体が置換されている置換基として置換アリール基を有する置換アリール）を定義することによって達成されるポリマーは、本明細書に含まれることを意図していないことが理解される。そのような場合、そのような置換の最大数は、３である。例えば、２つの他の置換アリール基での置換アリール基の連続置換は、−置換アリール−（置換アリール）−置換アリールに限定される。
【０１６２】
同様に、本明細書に提供される定義は、許容されない置換パターン（例えば、５つのフルオロ基で置換されたメチル）を含むことを意図していないことが理解される。そのような許容されない置換パターンは、当業者に知られている。
【０１６３】
本明細書に開示される化合物は、非溶媒和形態、ならびに水和形態を含む溶媒和形態で存在し得る。これらの化合物は、複数の結晶形態または非晶質形態で存在し得る。一般に、すべての物理的形態は、本明細書に記載される使用に対して同等であり、本開示の範囲内であることが意図される。本明細書に開示される化合物は、非対称炭素原子（すなわち、キラル中心）または二重結合を有してもよく、本明細書に記載される化合物のラセミ体、ジアステレオマー、幾何異性体、および個々の異性体は、本開示の範囲内である。本明細書に記載される化合物は、単一異性体として、または異性体の混合物として調製され得る。
【０１６４】
置換基がそれらの従来の化学式によって指定され、左から右に書かれる場合、それらは、構造を右から左に書くことから生じるであろう化学的に同一の置換基を同等に包含し、例えば、−ＣＨ2Ｏ−もまた、−ＯＣＨ2−を列挙することを意図している。
【０１６５】
本明細書で開示される化合物を定義するために使用される化学構造は、各々、各所与の構造が表され得る可能な共鳴構造のうちの１つの表現であることが理解されよう。さらに、定義によって、共鳴構造は、電子の非局在化を表すために当業者によって使用される単なるグラフィック表現であり、本開示は、任意の所与の構造について１つの特定の共鳴構造を示すことによって、いかなる方法でも限定されないことが理解されよう。
【０１６６】
開示される化合物がコンジュゲートされた環系を含む場合、共鳴安定化は、形式電子電荷が分子全体に分布されることを可能にし得る。特定の電荷は、特定の環系または特定のヘテロ原子上に局在化されるように描写され得るが、電荷が化合物の代替部分上に正式に局在化され得る同等の共鳴構造が描画され得ることが一般に理解される。
【０１６７】
「アルキル」とは、親アルカン、アルケン、またはアルキンの単一炭素原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される飽和もしくは不飽和、分枝、直鎖、または環状炭化水素ラジカルを意味する。典型的なアルキル基は、メチル、エチル、プロピル、ブチルなどを含むがこれらに限定されない、１〜１２個の飽和および／または不飽和炭素からなる。いくつかの実施形態では、アルキルは、１〜１０個の炭素原子、例えば、１〜６つの炭素原子、例えば、１、２、３、４、５、または６つの炭素原子を有する一価飽和脂肪族ヒドロカルビル基である。「アルキル」には、例として、線状および分枝ヒドロカルビル基、例えば、メチル（ＣＨ3−）、エチル（ＣＨ3ＣＨ2−）、ｎ−プロピル（ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2−）、イソプロピル（（ＣＨ3）2ＣＨ−）、ｎ−ブチル（ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−）、イソブチル（（ＣＨ3）2ＣＨＣＨ2−）、ｓｅｃ−ブチル（（ＣＨ3）（ＣＨ3ＣＨ2）ＣＨ−）、ｔ−ブチル（（ＣＨ3）3Ｃ−）、ｎ−ペンチル（ＣＨ3ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2ＣＨ2−）、およびネオペンチル（（ＣＨ3）3ＣＣＨ2−）が含まれる。
【０１６８】
「置換アルキル」は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルアルキル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、−ＳＯ3Ｈ、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオ−ル、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群から選択される１〜５つ、例えば、１〜３つ、または１〜２つの置換基を有するアルキル基を指し、該置換基が、本明細書で定義される。特定の置換アルキル基は、担体分子または固体支持体に直接または間接的に結合するための反応基、例えば、これらに限定されないが、カルボキシルまたはカルボキシルエステル（例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルなどの活性化エステル）で置換されたアルキル、ならびにアミノカルボニル−ＣＯＮＨＲで置換されたアルキルであり、式中、Ｒが、用語「アミノカルボニル」に関して以下に定義される有機部分であるアルキル、例えば、カルボキシル、カルボキシレスター、マレイミド、スクシンイミジルエステル（ＳＥ）、スルホジクロロフェニル（ＳＤＰ）エステル、スルホテトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）エステル、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ニトリルトリアセチン酸（ＮＴＡ）、アミノデキストラン、およびシクロクチンアミンを含むがこれらに限定されない反応基（Ｒx）によって末端が置換されたＣ1〜Ｃ10（例えば、Ｃ1〜Ｃ6）アルキルを含む。
【０１６９】
「アルキルスルホネート」は、−（ＣＨ2）n−ＳＯ3Ｈであり、ｎが、１〜６の整数である。
【０１７０】
「アルコキシ」は、−Ｏ−アルキルの基を指し、アルキルが、本明細書で定義される。アルコキシには、例として、メトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｔ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、およびｎ−ペントキシが含まれる。いくつかの実施形態では、アルコキシは、−ＯＲであり、Ｒが、Ｃ1〜Ｃ6アルキルである。
【０１７１】
「置換アルコキシ」は、−Ｏ−（置換アルキル）の基を指し、置換アルキルが、本明細書で定義される。
【０１７２】
「アルキルジイル」とは、親アルカン、アルケン、またはアルキンの同じまたは２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去することによって誘導される２つの一価ラジカル中心を有する、１〜２０個の炭素原子の飽和もしくは不飽和、分枝、直鎖、または環状炭化水素ラジカルを意味する。典型的なアルキルジイルラジカルは、１，２−エチルジイル、１，３−プロピルジイル、１，４−ブチルジイルなどを含むが、これらに限定されない。
【０１７３】
「アリール」または「Ａｒ」は、親芳香族環系の単一炭素原子から１つの水素原子を除去することによって誘導される６〜２０個の炭素原子の一価の芳香族炭化水素ラジカルを意味する。典型的なアリール基は、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどから誘導されるラジカルを含むが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、アリールは、単環（例えば、フェニル）または複数の縮合環（例えば、ナフチルまたはアントリル）を有する６〜１４個の炭素原子の一価の芳香族カルボン酸基であり、縮合環は、芳香族（例えば、２−ベンゾキサゾリノン、２Ｈ−１，４−ベンゾキサジン−３（４Ｈ）−オン−７−イルなど）であっても、なくてもよく、ただし、結合の点が芳香族炭素原子にあることが条件である。好ましいアリール基としては、フェニルおよびナフチルが挙げられる。
【０１７４】
「置換アリール」は、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルケニル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、−ＳＯ3Ｈ、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群から選択される１〜５つ、例えば１〜３つ、または１〜２つの置換基で置換されるアリール基を指し、該置換基が、本明細書で定義される。
【０１７５】
「アリレノ」とは、化合物の２つの連続するアリール炭素と縮合した芳香族環、すなわち、親芳香族環系の２つの隣接炭素原子の各々から１つの水素原子を除去することによって誘導される２つの隣接する一価ラジカル中心を有する二価の架橋ラジカルを意味する。アリーノ架橋ラジカル、例えば、ベンゼノを親芳香族環系に結合させると、縮合芳香族環系、例えば、ナフタレンがもたらされる。典型的なアリレノ基には、［１，２］ベンゼノ、［１，２］ナフタレノ、および［２，３］ナフタレノが含まれるが、これらに限定されない。
【０１７６】
「アリールジイル」とは、コンジュゲートされた共鳴電子系、および親アリール化合物の２つの異なる炭素原子から２つの水素原子を除去することによって誘導される少なくとも２つの一価のラジカル中心を有する、６〜２０個の炭素原子の不飽和環式または多環式炭化水素ラジカルを意味する。
【０１７７】
「ヘテロアリール」は、１〜１０個の炭素原子、および環内の酸素、窒素、および硫黄からなる群から選択される１〜４つのヘテロ原子の芳香族基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単一の環（例えば、ピリジニルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有してもよく、縮合環は、芳香族であっても、なくてもよく、および／またはヘテロ原子を含有しても、していなくてもよく、ただし、結合の点が芳香族ヘテロアリール基の原子を介していることが条件である。一実施形態では、ヘテロアリール基の窒素および／または硫黄環原子（複数可）は、任意に酸化されて、Ｎ−オキシド（Ｎ→Ｏ）、スルフィニル、またはスルホニル部分を提供する。好ましいヘテロアリールとしては、ピリジニル、ピロリル、インドリル、チオフェニル、およびフラニルが挙げられる。
【０１７８】
「置換ヘテロアリール」は、置換アリールについて定義される置換基の同じ群からなる群から選択される１〜５つ、例えば、１〜３つ、または１〜２つの置換基で置換されるヘテロアリール基を指す。
【０１７９】
「ヘテロアリールオキシ」は、−Ｏ−ヘテロアリールを指す。
【０１８０】
「置換ヘテロアリールオキシ」は、−Ｏ−（置換ヘテロアリール）の基を指す。
【０１８１】
「アルケニル」は、２〜６つの炭素原子、例えば、２〜４つの炭素原子を有し、少なくとも１つ、例えば、１〜２つのアルケニル不飽和部位を有するアルケニル基を指す。そのような基は、例えば、ビニル、アリル、ブタ−３−エン−１−イル、およびプロペニルによって例示される。
【０１８２】
「置換アルケニル」は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、−ＳＯ3Ｈ、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群から選択される、１〜３つの置換基、例えば、１〜２つの置換基を有するアルケニル基を指し、該置換基が、本明細書で定義され、ただし、任意のヒドロキシ置換がビニル（不飽和）炭素原子に結合していないことを条件とする。
【０１８３】
「アシル」は、Ｈ−Ｃ（Ｏ）−、アルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）−、アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルケニル−Ｃ（Ｏ）−、アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、置換アルキニル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）−、シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−、置換シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）−、アリール−Ｃ（Ｏ）−、置換アリール−Ｃ（Ｏ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）−、複素環式−Ｃ（Ｏ）−、および置換複素環式−Ｃ（Ｏ）−の基を指し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。アシルは、「アセチル」基ＣＨ3Ｃ（Ｏ）−を含む。
【０１８４】
「アシルアミノ」は、−ＮＲＣ（Ｏ）アルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換アルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）シクロアルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換シクロアルキル、−ＮＲＣ（Ｏ）シクロアルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換シクロアルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）アルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換アルケニル、−ＮＲＣ（Ｏ）アルキニル、−ＮＲＣ（Ｏ）置換アルキニル、−ＮＲＣ（Ｏ）アリール、−ＮＲＣ（Ｏ）置換アリール、−ＮＲＣ（Ｏ）ヘテロアリール、−ＮＲＣ（Ｏ）置換ヘテロアリール、−ＮＲＣ（Ｏ）複素環式、および−ＮＲＣ（Ｏ）置換複素環式の基を指し、Ｒが、水素またはアルキルであり、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式は、本明細書に定義される。
【０１８５】
「アシルオキシ」は、アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換アルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アルケニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換アルケニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アルキニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換アルキニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、アリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換アリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換シクロアルケニル−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、複素環式Ｃ（Ｏ）Ｏ−、および置換複素環式Ｃ（Ｏ）Ｏ−の基を指し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０１８６】
「アミノ」は、−ＮＨ2の基を指す。
【０１８７】
「置換アミノ」は、−ＮＲ’Ｒ”の基を指し、Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、置換複素環式、−ＳＯ2−アルキル、−ＳＯ2−置換アルキル、−ＳＯ2−アルケニル、−ＳＯ2−置換アルケニル、−ＳＯ2−シクロアルキル、−ＳＯ2−置換シルコアルキル、−ＳＯ2−シクロアルケニル、−ＳＯ２−置換シルコアルケニル、−ＳＯ2−アリール、−ＳＯ2−置換アリール、−ＳＯ2−ヘテロアリール、−ＳＯ2−置換ヘテロアリール、−ＳＯ2−複素環式、および−ＳＯ2−置換複素環式であり、Ｒ′およびＲ″が、それらに結合した窒素と任意に接合されて、複素環式または置換複素環式基を形成し、ただし、Ｒ′およびＲ″が、両方とも水素ではないことが条件であり、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。Ｒ′が水素であり、Ｒ″がアルキルである場合、置換アミノ基は、本明細書ではアルキルアミノと称されることがある。Ｒ′およびＲ″がアルキルである場合、置換アミノ基は、本明細書ではジアルキルアミノと称されることがある。単置換アミノを指す場合、それは、Ｒ′またはＲ″の両方ではなくいずれかが、水素であることを意味する。二置換アミノを指す場合、それは、Ｒ′もＲ″も、水素ではないことを意味する。
【０１８８】
「アミノカルボニル」は、−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”の基を指し、Ｒ′およびＲ″が、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”は、それらに結合した窒素と任意に接合されて、複素環式または置換複素環式基を形成し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０１８９】
「アミノチオカルボニル」は、−Ｃ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ”の基を指し、Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”が、それらに結合した窒素と任意に接合されて、複素環式または置換複素環式基を形成し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０１９０】
「アミノカルボニルアミノ」は、−ＮＲＣ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”の基を指し、Ｒが、水素またはアルキルであり、Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”が、それらに結合した窒素と任意に接合されて、複素環式または置換複素環式基を形成し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０１９１】
「アミノチオカルボニルアミノ」は、−ＮＲＣ（Ｓ）ＮＲ’Ｒ”の基を指し、Ｒが、水素またはアルキルであり、Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”が、それらに結合した窒素と任意に接合されて、複素環式または置換複素環式基を形成し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、置換複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０１９２】
「アミノカルボニルオキシ」は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）ＮＲ’Ｒ”の基を指し、Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”が、それらに結合した窒素と任意に接合されて、複素環式または置換複素環式基を形成し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０１９３】
「アミノスルホニル」は、−ＳＯ2ＮＲ’Ｒ”の基を指し、Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”が、それらに結合した窒素と任意に接合されて、複素環式または置換複素環式基を形成し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０１９４】
「アミノスルホニルオキシ」は、Ｏ−ＳＯ2ＮＲ’Ｒ”の基を指し、Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”が、それらに結合した窒素と任意に接合されて、複素環式または置換複素環式基を形成し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０１９５】
「アミノスルホニルアミノ」は、−ＮＲＳＯ2ＮＲ’Ｒ”の基を指し、Ｒが、水素またはアルキルであり、Ｒ’およびＲ”が、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルキエニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”が、それらに結合した窒素と任意に接合されて、複素環式または置換複素環式基を形成し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０１９６】
「アミジノ」は、−Ｃ（＝ＮＲ’’’）Ｒ’Ｒ”の基を指し、Ｒ’、Ｒ”、およびＲ’’’が、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アリール、置換アリール、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群から選択され、Ｒ’およびＲ”が、それらに結合した窒素と任意に接合されて、複素環式または置換複素環式基を形成し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０１９７】
「アリールオキシ」は、−Ｏ−アリールの基を指し、アリールは、本明細書で定義される通りであり、例として、フェノキシおよびナフトキシを含む。
【０１９８】
「置換アリールオキシ」は、−Ｏ−（置換アリール）の基を指し、置換アリールは、本明細書で定義される通りである。
【０１９９】
「アリールチオ」は、−Ｓ−アリールの基を指し、アリールは、本明細書で定義される通りである。
【０２００】
「置換アリールチオ」は、−Ｓ−（置換アリール）の基を指し、置換アリールは、本明細書で定義される通りである。
【０２０１】
「アルキニル」は、２〜６つの炭素原子および例えば２〜３つの炭素原子を有し、少なくとも１つ、例えば１〜２つのアルキニル不飽和部位を有するアルキニル基を指す。
【０２０２】
「置換アルキニル」は、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、−ＳＯ3Ｈ、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群から選択される、１〜３つの置換基、例えば、１〜２つの置換基を有するアルキニル基を指し、該置換基が、本明細書で定義され、ただし、任意のヒドロキシ置換が、アセチレン炭素原子に結合していないことを条件とする。
【０２０３】
「カルボニル」は、−Ｃ（＝Ｏ）−と等しい、−Ｃ（Ｏ）−の二価の基を指す。
【０２０４】
「カルボキシル」または「カルボキシ」は、−ＣＯＯＨまたはその塩を指す。
【０２０５】
「カルボキシルアルキル」または「カルボキシアルキル」は、−（ＣＨ2）NＣＯＯＨの基を指し、ｎが、１〜６である。
【０２０６】
「カルボキシルエステル」または「カルボキシエステル」は、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルケニル、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−複素環式、および−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換複素環式の基を指し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される通りである。
【０２０７】
「（カルボキシルエステル）アミノ」は、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルケニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルケニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アリール、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルキル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルケニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルケニル、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−複素環式、および−ＮＲ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換複素環式の基を指し、Ｒが、アルキルまたは水素であり、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０２０８】
「（カルボキシルエステル）オキシ」は、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アルキニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アルキニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−アリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換アリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルキル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−シクロアルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換シクロアルケニル、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ヘテロアリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換ヘテロアリール、−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−複素環式、および−Ｏ−Ｃ（Ｏ）Ｏ−置換複素環式の基を指し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０２０９】
「シアノ」は−ＣＮの基を指す。
【０２１０】
「シクロアルキル」は、縮合環系、架橋環系、およびスピロ環系を含む単一または複数の環式環を有する、３〜１０個の炭素原子の環式アルキル基を指す。好適なシクロアルキル基の例としては、例えば、アダマンチル、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、およびシクロオクチルが挙げられる。
【０２１１】
「シクロアルケニル」は、単一または複数の環式環を有し、少なくとも１つの＞Ｃ＝Ｃ＜環不飽和、例えば、＞Ｃ＝Ｃ＜１〜２つの環不飽和部位を有する、３〜１０個の炭素原子の非芳香族環状アルキル基を指す。
【０２１２】
「置換シクロアルキル」および「置換シクロアルケニル」は、オキソ、チオン、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、アルコキシ、置換アルコキシ、アシル、アシルアミノ、アシルオキシ、アミノ、置換アミノ、アミノカルボニル、アミノチオカルボニル、アミノカルボニルアミノ、アミノチオカルボニルアミノ、アミノカルボニルオキシ、アミノスルホニル、アミノスルホニルオキシ、アミノスルホニルアミノ、アミジノ、アリール、置換アリール、アリールオキシ、置換アリールオキシ、アリールチオ、置換アリールチオ、カルボキシル、カルボキシルエステル、（カルボキシルエステル）アミノ、（カルボキシルエステル）オキシ、シアノ、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルキルオキシ、置換シクロアルキルオキシ、シクロアルキルチオ、置換シクロアルキルチオ、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、シクロアルケニルオキシ、置換シクロアルケニルオキシ、シクロアルケニルチオ、置換シクロアルケニルチオ、グアニジノ、置換グアニジノ、ハロ、ヒドロキシ、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、ヘテロアリールオキシ、置換ヘテロアリールオキシ、ヘテロアリールチオ、置換ヘテロアリールチオ、複素環式、置換複素環式、ヘテロシクリルオキシ、置換ヘテロシクリルオキシ、ヘテロシクリルチオ、置換ヘテロシクリルチオ、ニトロ、−ＳＯ3Ｈ、置換スルホニル、スルホニルオキシ、チオアシル、チオール、アルキルチオ、および置換アルキルチオからなる群から選択される１〜５つ、例えば、１〜３つの置換基を有するシクロアルキルまたはシクロアルケニル基を指し、該置換基が、本明細書で定義される。
【０２１３】
「シクロアルキルオキシ」は、−Ｏ−シクロアルキルを指す。
【０２１４】
「置換シクロアルキルオキシ」は、−Ｏ−（置換シクロアルキル）を指す。
【０２１５】
「シクロアルキルチオ」は、−Ｓ−シクロアルキルを指す。
【０２１６】
「置換シクロアルキルチオは、−Ｓ−（置換シクロアルキル）を指す。
【０２１７】
「シクロアルケニルオキシ」は、−Ｏ−シクロアルケニルを指す。
【０２１８】
「置換シクロアルケニルオキシ」は、−Ｏ−（置換シクロアルケニル）を指す。
【０２１９】
「シクロアルケニルチオ」は、−Ｓ−シクロアルケニルを指す。
【０２２０】
「置換シクロアルケニルチオ」は、−Ｓ−（置換シクロアルケニル）を指す。
【０２２１】
「グアニジノ」は、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ2の基を指す。
【０２２２】
「置換グアニジノ」は、−ＮＲＣ（＝ＮＲ）Ｎ（Ｒ）2を指し、各Ｒが、独立して、水素、アルキル、置換アルキル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式からなる群から選択され、共通のグアニジノ窒素原子に結合した２つのＲ基が、それらに結合した窒素と共に任意に連結されて、複素環式または置換複素環式基を形成し、ただし、少なくとも１つのＲが、水素ではないことを条件とし、該置換基が、本明細書で定義される通りである。
【０２２３】
「Ｈ」は、水素を示す。
【０２２４】
「ハロ」または「ハロゲン」は、フルオロ、クロロ、ブロモ、およびヨードを指す。
【０２２５】
「ヒドロキシ」または「ヒドロキシル」は、−ＯＨの基を指す。
【０２２６】
「ヘテロアリール」は、１〜１０個の炭素原子、および環内の酸素、窒素、および硫黄からなる群から選択される１〜４つのヘテロ原子の芳香族基を指す。そのようなヘテロアリール基は、単一の環（例えば、ピリジニルまたはフリル）または複数の縮合環（例えば、インドリジニルまたはベンゾチエニル）を有してもよく、縮合環は、芳香族であっても、なくてもよく、および／またはヘテロ原子を含有しても、していなくてもよく、ただし、結合の点が芳香族ヘテロアリール基の原子を介していることが条件である。一実施形態では、ヘテロアリール基の窒素および／または硫黄環原子（複数可）は、任意に酸化されて、Ｎ−オキシド（Ｎ→Ｏ）、スルフィニル、またはスルホニル部分を提供する。好ましいヘテロアリールとしては、ピリジニル、ピロリル、インドリル、チオフェニル、およびフラニルが挙げられる。
【０２２７】
「置換ヘテロアリール」は、置換アリールについて定義される置換基の同じ群からなる群から選択される１〜５つ、例えば、１〜３つまたは１〜２つの置換基で置換されるヘテロアリール基を指す。
【０２２８】
「ヘテロアリールオキシ」は、−Ｏ−ヘテロアリールを指す。
【０２２９】
「置換ヘテロアリールオキシ」は、−Ｏ−（置換ヘテロアリール）の基を指す。
【０２３０】
「ヘテロアリールチオ」は、−Ｓ−ヘテロアリールの基を指す。
【０２３１】
「置換ヘテロアリールチオ」は、−Ｓ−（置換ヘテロアリール）の基を指す。
【０２３２】
「複素環」または「複素環式」または「ヘテロシクロアルキル」または「ヘテロシクリル」とは、環内に少なくとも１つの非炭素原子、例えば、窒素、酸素、および硫黄を有する任意の環系を意味する。いくつかの実施形態では、複素環は、１〜１０個の炭素原子、および環内の窒素、硫黄、または酸素からなる群から選択される１〜４つのヘテロ原子の、縮合、架橋、およびスピロ環系を含む、単一の環または複数の縮合環を有する飽和または不飽和基であり、縮合環系において、１つ以上の環が、シクロアルキル、アリール、またはヘテロアリールであり得、ただし、結合の点が、非芳香族環を通ることを条件とする。一実施形態では、複素環基の窒素および／または硫黄原子（複数可）は、任意に酸化されて、Ｎ−オキシド、スルフィニル、スルホニル部分を提供する。複素環としては、ピロール、インドール、フラン、ベンゾフラン、チオフェン、ベンゾチオフェン、２−ピリジル、３−ピリジル、４−ピリジル、２−キノリル、３−キノリル、４−キノリル、２−イミダゾール、４−イミダゾール、３−ピラゾール、４−ピラゾール、ピリダジン、ピリミジン、ピラジン、シノリン、プタラジン、キナゾリン、キノキサリン、３−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−（１，２，４−Ｎ）−トリアゾリル、５−テトラゾリル、４−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、５−（１−Ｏ，３−Ｎ）−オキサゾール、４−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、５−（１−Ｓ，３−Ｎ）−チアゾール、２−ベンゾオキサゾール、２−ベンゾチアゾール、４−（１，２，３−Ｎ）−ベンゾトリアゾール、およびベンズイミダゾールが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３３】
「置換複素環式」または「置換ヘテロシクロアルキル」または「置換ヘテロシクリル」は、置換シクロアルキルについて定義されるものと同じ置換基の１〜５つ、例えば、１〜３つで置換されるヘテロシクリル基を指す。
【０２３４】
複素環およびヘテロアリールの例としては、アゼチジン、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、ジヒドロインドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、フタリミド、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン、４，５，６，７−テトラヒドロベンゾ［ｂ］チオフェン、チアゾール、チアゾリジン、チオフェン、ベンゾ［ｂ］チオフェン、モルホリニル、チオモルホリニル（チオロホリニルとも称される）、１，１−ジオキソチオモルホリニル、ピペリジニル、プロリジン、およびテトラヒドロフラニルが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２３５】
「ヘテロシクリルオキシ」は、−Ｏ−ヘテロシクリルの基を指す。
【０２３６】
「置換ヘテロシクリルオキシ」は、−Ｏ−（置換ヘテロシクリル）の基を指す。
【０２３７】
「ヘテロシクリルチオ」は、−Ｓ−ヘテロシクリルの基を指す。
【０２３８】
「置換ヘテロシクリルチオ」は、−Ｓ−（置換ヘテロシクリル）の基を指す。
【０２３９】
「ヒドラジニル」は、−ＮＨＮＨ2−の基または＝ＮＮＨ−の基を指す。
【０２４０】
「置換ヒドラジニル」は、ヒドラジニル基を指し、アルキル基などの非水素原子が、ヒドラジニルアミン基のうちの一方または両方に付加される。置換ヒドラジニルの一例は、−Ｎ（アルキル）−ＮＨ2または＝Ｎ+(アルキル）−ＮＨ2である。
【０２４１】
「ニトロ」は、−ＮＯ2の基を指す。
【０２４２】
「オキソ」は、（＝Ｏ）の原子または（−Ｏ-）の原子を指す。
【０２４３】
「スピロシクリル」は、以下の構造によって例示されるように、スピロ結合（環の唯一の共通メンバーである単一原子によって形成される結合）を有するシクロアルキルまたはヘテロシクリル環を有する３〜１０個の炭素原子の二価の飽和環状基を指す。
【化２１】
2021536500.tif 000023
【０２４４】
「スルホニル」は、−Ｓ（Ｏ）2−の二価の基を指す。
【０２４５】
「置換スルホニル」は、−ＳＯ2−アルキル、−ＳＯ2−置換アルキル、−ＳＯ2−アルケニル、−ＳＯ2−置換アルケニル、−ＳＯ2−シクロアルキル、−ＳＯ2−置換シルコアルキル、−ＳＯ2−シクロアルケニル、−ＳＯ2−置換シルコアルケニル、−ＳＯ2−アリール、−ＳＯ2−置換アリール、−ＳＯ2−ヘテロアリール、−ＳＯ2−置換ヘテロアリール、−ＳＯ2−複素環式、−ＳＯ2−置換複素環式の基を指し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。置換スルホニルとしては、メチル−ＳＯ2−、フェニル−ＳＯ2−、および４−メチルフェニル−ＳＯ2−などの基が挙げられる。
【０２４６】
「スルホニルオキシ」は、−ＯＳＯ2−アルキル、−ＯＳＯ2−置換アルキル、−ＯＳＯ2−アルケニル、−ＯＳＯ2−置換アルケニル、−ＯＳＯ2−シクロアルキル、−ＯＳＯ2−置換シルコアルキル、−ＯＳＯ2−シクロアルケニル、−ＯＳＯ2−置換シルコアルケニル、−ＯＳＯ2−アリール、−ＯＳＯ2−置換アリール、−ＯＳＯ2−ヘテロアリール、−ＯＳＯ2−置換ヘテロアリール、−ＯＳＯ2−複素環式、−ＯＳＯ2−置換複素環式の基を指し、アルキル、置換アルキル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０２４７】
「チオアシル」は、Ｈ−Ｃ（Ｓ）−、アルキル−Ｃ（Ｓ）−、置換アルキル−Ｃ（Ｓ）−、アルケニル−Ｃ（Ｓ）−、置換アルケニル−Ｃ（Ｓ）−、アルキニル−Ｃ（Ｓ）−、置換アルキニル−Ｃ（Ｓ）−、シクロアルキル−Ｃ（Ｓ）−、置換シクロアルキル−Ｃ（Ｓ）−、シクロアルケニル−Ｃ（Ｓ）−、置換シクロアルケニル−Ｃ（Ｓ）−、アリール−Ｃ（Ｓ）−、置換アリール−Ｃ（Ｓ）−、ヘテロアリール−Ｃ（Ｓ）−、置換ヘテロアリール−Ｃ（Ｓ）−、複素環式−Ｃ（Ｓ）−、および置換複素環式−Ｃ（Ｓ）−の基を指し、アルキル、置換アルキニル、アルケニル、置換アルケニル、アルキニル、置換アルキニル、シクロアルキル、置換シクロアルキル、シクロアルケニル、置換シクロアルケニル、アリール、置換アリール、ヘテロアリール、置換ヘテロアリール、複素環式、および置換複素環式が、本明細書で定義される。
【０２４８】
「チオール」は、−ＳＨの基を指す。
【０２４９】
「チオカルボニル」は、−Ｃ（＝Ｓ）−と等しい、−Ｃ（Ｓ）−の二価の基を指す。
【０２５０】
「チオン」は、（＝Ｓ）の原子を指す。
【０２５１】
「アルキルチオ」は、−Ｓ−アルキルの基を指し、アルキルが、本明細書で定義される通りである。
【０２５２】
「置換アルキルチオ」は、−Ｓ−（置換アルキル）の基を指し、置換アルキルが、本明細書で定義される通りである。
【０２５３】
「検出可能な応答」という用語は、本明細書で使用される場合、観察または計装のいずれかによって直接的または間接的に検出可能な信号の発生または変化を指す。いくつかの実施形態では、検出可能な応答は、波長分布パターンまたは吸光度もしくは蛍光の強度の変化、または光の散乱、蛍光寿命、蛍光偏光、もしくは上記のパラメータの組み合わせの変化をもたらす光応答である。
【０２５４】
「色素」という用語は、本明細書で使用される場合、光を放射して、観察可能で検出可能な信号を生成する化合物を指す。
【０２５５】
本明細書で使用される場合、「蛍光発生」という用語とは、対象の生物学的化合物または分析物への結合時および／または酵素による切断時に蛍光の変化を実証する化合物または組成物を指す。
【０２５６】
本明細書で使用される場合、「フルオロフォア」という用語は、励起時に光を発光することができる部分または化合物を指し、対象の生物学的化合物または分析物への結合時および／または酵素による切断時に蛍光を提示する蛍光発生フルオロフォアを含む。本開示のフルオロフォアは、フルオロフォアの溶解度、スペクトル特性、または物理的特性を改変するために置換され得る。
【０２５７】
本明細書で使用する場合、「薬学的に許容される塩」または「生物学的に互換性のある塩」は、使用時に有毒ではなく、生体分子に実質的に有害な影響を及ぼさない対イオンである。そのような塩の例としては、とりわけ、Ｋ+、Ｎａ+、Ｃｓ+、Ｌｉ+、Ｃａ2+、Ｍｇ2+、Ｃｌ-、ＡｃＯ-、およびアルキルアンモニウムまたはアルコキシアンモニウム塩が挙げられる。
【０２５８】
「リンカー」または「Ｌ」という用語は、本明細書で使用される場合、単一の共有結合、または一連の安定な共有結合を含む部分を指し、その部分はしばしば、化学反応基などの別の部分または生物学的および非生物学的成分へと蛍光発生または蛍光化合物に共有結合させる、Ｃ、Ｎ、Ｏ、Ｓ、およびＰからなる群から選択される１〜４０個の複数価の原子を組み込む。リンカー中の複数価の原子の数は、例えば、０、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、２５、３０、または最大４０以上のより大きな数であってもよい。リンカーは、直鎖であっても非直鎖であってもよく、いくつかのリンカーは、ペンダント側鎖もしくはペンダント官能基、またはその両方を有する。そのようなペンダント部分の例は、親水性修飾剤、例えば、スルホ（−ＳＯ3Ｈまたは−ＳＯ3-)のような可溶化基である。ある特定の実施形態では、Ｌは、単結合、二重結合、三重結合、または芳香炭素−炭素結合、炭素−窒素結合、窒素−窒素結合、炭素−酸素結合、および炭素−硫黄結合の任意の組み合わせから構成される。例示的な連結メンバーとしては、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−、などを含む部分が挙げられる。リンカーは、例として、アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−ＮＨ−、−Ｓ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ（Ｏ）n−から選択される部分の組み合わせからなり得、ｎが、０、１、もしくは２、−Ｏ−、５員または６員の単環式環、ならびに任意のペンダント官能基、例えば、スルホ、ヒドロキシ、およびカルボキシである。反応基または反応性リンカー（Ｒx）に結合したリンカーによって形成された部分は、−Ｌ−Ｒxと称され得る。反応基は、その中で反応性のある物質と反応してもよく、それにより、リンカーは、コンジュゲートされた物質（Ｓc）に結合し、−Ｌ−Ｓcと称され得るか、または場合によっては、リンカーは、反応基（例えば、エステルのカルボニル基）の残基を含有してもよく、「−ＬR」と称され得る。「切断可能なリンカー」は、反応または状態の結果によって切断され得る１つ以上の切断可能な基を有するリンカーである。「切断可能な基」という用語は、開放された部分をコンジュゲートの残りの部分に連結する結合を切断することによって、コンジュゲートの一部、例えば、蛍光発生または蛍光性部分を、コンジュゲートの残りの部分から開放させる部分を指す。そのような切断は、本質的に化学的であるか、または酵素的に媒介されるかのいずれかである。例示的な酵素学的に切断可能な基としては、天然アミノ酸、または天然アミノ酸で終わるペプチド配列が挙げられる。
【０２５９】
「反応性リガンド」（または「Ｒx」）とも本明細書で称される「反応基」という用語は、本明細書で使用される場合、別の化学基と反応して、共有結合を形成することができる、すなわち、好適な反応条件下で共有結合的に反応し、一般的に、別の物質に対する結合の点を表す基である。反応基は、異なる化合物の官能基と化学的に反応して、共有連結を形成することができる、本開示の化合物上の部分、例えば、カルボン酸またはスクシンイミジルエステルである。反応基は、一般的に、求核性、求電子性、および光活性化が可能な基を含む。
【０２６０】
例示的な反応基としては、オレフィン、アセチレン、アルコール、フェノール、エーテル、酸化物、ハロゲン化物、アルデヒド、ケトン、カルボン酸、エステル、アミド、シアネート、イソシアネート、チオシアネート、イソチオシアネート、アミン、ヒドラジン、ヒドラゾン、ヒドラジド、ジアゾ、ジアゾニウム、ニトロ、ニトリル、メルカプタン、スルフィド、ジスルフィド、スルホキシド、スルホン、スルホン酸、スルフィン酸、アセタール、ケタール、無水物、硫酸、スルフェン酸イソニトリル、アミジン、イミド、イミダート、ニトロン、ヒドロキシルアミン、オキシム、ヒドロキサム酸、チオヒドロキサム酸、アレン、オルトエステル、亜硫酸、エナミン、イナミン、尿素、イソ尿素、セミカルバジド、カルボジイミド、カルバメート、イミン、アジド、アゾ化合物、アゾキシ化合物、およびニトロソ化合物が挙げられるが、これらに限定されない。反応性官能基としては、バイオコンジュゲート、例えば、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル（またはスクシンイミジルエステル（ＳＥ））、マレイミド、スルホジクロロフェニル（ＳＤＰ）エステル、スルホテトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）エステル、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、ニトリロ三酢酸（ＮＴＡ）、アミノデキストラン、シクロオクチン−アミンなどを調製するために使用されるものも挙げられる。これらの官能基の各々を調製するための方法は、当技術分野で周知であり、特定の目的へのそれらの適用または修正は、当業者の能力の範囲内である（例えば、Ｓａｎｄｌｅｒ  ａｎｄ  Ｋａｒｏ，ｅｄｓ  ．，Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  Ｇｒｏｕｐ  Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，１９８９を参照されたい）。例示的な反応基または反応性リガンドとしては、ＮＨＳエステル、ホスホラミダイト、および以下の表１に列挙される他の部分が挙げられる。ヌクレオチド、ヌクレオシド、および糖類（例えば、リボシルおよびデオキシリボシル）は、少なくとも、酵素触媒作用を介してホスホジエステル結合を形成するそれらの能力のため、反応性リガンドとも見なされる。疑義を避けるために、飽和アルキル基は、反応性リガンドとは見なされない。
【０２６１】
「担体分子」という用語は、本明細書で使用される場合、本明細書で開示される細胞トラッカー化合物に共有結合しているか、または共有結合する生物学的または非生物学的成分を指す。そのような成分としては、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、プソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質アセンブリ、合成ポリマー、高分子微粒子、生物学的細胞、ウイルス、およびそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。担体分子が、少なくとも４つの複数価の原子、しばしば１０個を超える複数価の原子（すなわち、水素およびハロ以外の原子）、例えば、少なくとも１５個のそのような原子を有する有機部分を、少なくとも２０個のそのような原子を有する部分の場合のように含む一実施形態が含まれる。
【０２６２】
「コンジュゲートされた物質」または「ＳC」という用語は、担体分子または固体支持体を指す。
【０２６３】
本明細書で使用される場合、「標的結合部分」は、特異的結合活性および蛍光または蛍光発生特性の両方を有する化合物を提供するために、フルオロフォアに結合しているか、または結合することができる部分を指す。例示的な標的結合部分としては、タキソールまたはアクチン結合ペプチドなどの細胞骨格結合部分、Ｈｏｅｃｈｓｔまたはニトロ−ＨｅｃｈｓｔなどのＤＮＡ結合部分、（相補的な配列にハイブリダイズすることができる）ポリヌクレオチド、ならびに抗体およびその抗原結合断片が挙げられる。
【０２６４】
「固体支持体」という用語は、本明細書で使用される場合、液体相に実質的に不溶性であり、対象の分子または粒子に結合することができるマトリックスまたは培地を指す。本明細書での使用に好適な固体支持体には、半固体支持体が含まれ、特定の種類の支持体に限定されない。有用な固体支持体としては、固体および半固体マトリックス、例えば、エアロゲルおよびヒドロゲル、樹脂、ビーズ、バイオチップ（薄膜被覆バイオチップを含む）、マイクロ流体チップ、ケイ素チップ、マルチウェルプレート（マイクロタイトルプレートまたはマイクロプレートとも称される）、膜、導電性金属および非導電性金属、ガラス（顕微鏡スライドを含む）、ならびに磁気支持体が挙げられる。有用な固体支持体のより具体的な例としては、シリカゲル、高分子膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖類、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、ＦＩＣＯＬＬ（登録商標）（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）を含む）、ナイロン、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンなどが挙げられる。
【０２６５】
本明細書で使用される場合、「染色」という用語は、顕微鏡画像中のコントラストを増強するために顕微鏡法で使用される技術である。染色および色素は、生物学的組織および細胞内の構造を強調するために頻繁に使用される。染色はまた、色素を基質に添加して、タンパク質、核酸、脂質、または炭水化物などの特定の化合物の存在を定量化または定性化することも伴う。フローサイトメトリー中の細胞をマーキングし、ゲル電気泳動中のタンパク質または核酸にフラグを立てるためにも、生物学的染色が使用される。染色は、生物学的材料に限定されず、半結晶性ポリマーおよびブロックコポリマーなどの他の材料の形態を研究するために使用することができる。
【０２６６】
「低級アルキル」は、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｔｅｒｔ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ネオペンチル、ｔｅｒｔ−ペンチルなどの、１〜８個の炭素原子を含有する直鎖および分枝炭化水素部分を示す。「低級ハロアルキル」は、１つ以上のハロゲン原子置換基、通常はフッ素、クロロ、ブロモ、またはヨードを有する低級置換アルキルを示す。
【０２６７】
「低級アルケン」は、１〜８個の炭素原子を含有する炭化水素を示し、炭素−炭素結合のうちの１つ以上が、二重結合である。
【０２６８】
「低級アルキン」は、１〜８個の炭素原子を含有する炭化水素を示し、炭素のうちの１つ以上が、トリプル結合で結合される。
【０２６９】
「ヌクレオシド」は、１’位でペントースに連結したプリン、デアザプリン、またはピリミジンヌクレオシド塩基、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、ウラシル、チミン、デアザアデニン、デアザグアノシンなどからなる化合物を指す。ヌクレオシド塩基がプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分が、プリンまたはデアザプリンのＮ9位で結合し、ヌクレオシド塩基がピリミジンである場合、糖部分が、ピリミジンのＮ1位で結合している、例えば、Ｋｏｒｎｂｅｒｇ  ａｎｄ  Ｂａｋｅｒ，ＤＮＡ  Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，２ｎｄ  Ｅｄ．（Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，１９９２）。
【０２７０】
「ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ヌクレオシドのホスフェートエステル、例えば、トリホスフェートエステルを指し、エステル化の最も一般的な部位は、ペントースのＣ−５位に結合したヒドロキシル基である。「ヌクレオシド／ヌクレオチド」という用語は、本明細書で使用される場合、ヌクレオシドおよびヌクレオチドの両方、ならびにそれらの類似体を含む化合物のセットを指す。ヌクレオシド／ヌクレオチドに関する「類似体」には、修飾塩基部分、修飾糖部分、および／または修飾リン酸部分を有する合成類似体が含まれ、例えば、概してＳｃｈｅｉｔのＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ａｎａｌｏｇｓ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８０）によって説明される。リン酸類似体は、リン酸の類似体を含み、リン原子が、＋５の酸化状態にあり、酸素原子のうちの１つ以上が、非酸素部分で置き換えられ、例示的な類似体には、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロセレノエート、ホスホロジセレノエート、ホスホロアニロチオエート、ホスホラニレート、ホスホラミデート、ホウ素リン酸などが含まれ、関連する対イオン、例えば、Ｈ+、ＮＨ4+、ＮＡ+などをそのような対イオンが存在する場合に含む。例示的な塩基類似体としては、２，６−ジアミノプリン、ヒポキサンチン、シュードウリジン、Ｃ−５−プロピン、イソシトシン、イソグアニン、２−チオピリミジン、および他のそのような類似体が挙げられるが、これらに限定されない。例示的な糖類似体としては、２’位置が、水素、ヒドロキシ、アルコキシ、例えば、メトキシ、エトキシ、アリルオキシ、イソプロポキシ、ブトキシ、イソブトキシおよびフェノキシ、アミノまたはアルキルアミノ、フルオロ、クロロ、ならびにブロモである、２’修飾が挙げられるが、これらに限定されない。「標識ヌクレオシド／ヌクレオチド」という用語は、任意にリンカーを介して式（Ｉ）の色素化合物に共有結合されるヌクレオシド／ヌクレオチドを指す。
【０２７１】
「ポリヌクレオチド」（「オリゴヌクレオチド」を含む）とは、二本鎖および一本鎖デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、そのα−アノマー形態などを含む、天然ヌクレオチドモノマーまたはその類似体の直鎖ポリマーを意味する。通常、ヌクレオシドモノマーは、ホスホジエステル連結によって連結され、本明細書で使用される場合、「ホスホジエステル連結」という用語は、ホスホジエステル結合またはそのホスフェート類似体を含む結合を指し、関連する対イオン、例えば、Ｈ+、ＮＨ4+、ＮＡ+などをそのような対イオンが存在する場合に含む。ポリヌクレオチドのサイズは、典型的には、いくつかのモノマー単位、例えば、８〜４０、から数千個のモノマー単位の範囲である。ポリヌクレオチドが一連の文字によって表されるときは、特に断りのない限り、ヌクレオチドは、左から右に５’→３’の順序であり、「Ａ」は、デオキシアデノシンを表し、「Ｃ」は、デオキシシチジンを表し、「Ｇ」は、デオキシグアノシンを表し、「Ｔ」は、チミジンを表すことが理解されよう。
【０２７２】
「水溶性基」とは、本発明の化合物の水溶液中の溶解性を増加させる置換基を意味する。例示的な水溶化基としては、第４級アミン、硫酸、スルホン酸、カルボン酸、ホスホン酸、リン酸、ポリエーテル、ポリヒドロキシル、ボロン酸、ポリエチレングリコール、およびエチレンオキシド（−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）−）の反復単位が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７３】
例示的な化合物、組成物、方法、使用、およびキット
本明細書に提供されるのは、ケイ素−ローダミン（ＳｉＲ）色素およびそのコンジュゲート、そのような色素を含むキットおよび組成物、ならびに生物学的材料を検出および定量化するためのそのような色素を使用する方法、そのような色素を作製および／または官能化またはコンジュゲートする方法である。
【０２７４】
１．色素およびコンジュゲート
式（Ｉ）の化合物であって、
【化２２】
2021536500.tif 000024
式中、
Ｒ1が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ2が、メチル、Ｃ2-6アルキル、ビニル、置換ビニル、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1であり、
または、Ｒ1およびＲ2が、それらが結合しているケイ素と一緒に環を形成し、
各Ｌ1が、独立して、リンカーであり、
各ＲAが、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
各ＲB1が、独立して、反応性リガンド、可溶化官能基、標的結合部分、またはヌクレオシド／ヌクレオチド部分であり、
Ｒ3が、−ＣＯＯＨ、ＳＯ3-、Ｈ、Ｒ3a、−Ｌ1−ＲA、または−Ｌ1−ＲB1であり、
Ｒ3aが、
【化２３】
2021536500.tif 000025
または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（ＲN3）（ＲN4）であり、
ＲN3が、Ｈ、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＣＨ2−Ａであり（Ａが、少なくとも１つの極性基または荷電基で置換されたアリールまたはヘテロアリールである）、
ＲN4が、−Ｌ1−ＲA、もしくは−Ｌ1−ＲB1、または−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）q−Ｃ（Ｏ）Ｏ−ＲBであり（ｑが、２、３、４、５、または６である）、
Ｒ3bが、−ＯＨまたは−Ｎ（ＲN5）−Ｌ3a−ＲBであり、
各Ｌ3aが、独立して、リンカーであり、
ＲBが、反応性リガンドまたは標的結合部分であり、
ＲN5が、Ｈ、メチル、またはＣ2-6アルキルであり、
Ｒ4が、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
Ｅが、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
Ｒ5が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ6が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ7が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN1と一緒に環を形成し、
Ｒ8が、Ｈ、メチル、もしくはＣ2-6アルキルであるか、またはＲN2と一緒に環を形成し、
Ｒ9が、ＳＯ3-、メチル、クロロ、Ｃ2-6アルキル、またはＨであり、
各ＲN1が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ5もしくはＲ7と一緒に環を形成し、
各ＲN2が、独立して、Ｈ、メチル、Ｃ2-4アルキル、−Ｃ（Ｏ）Ｒ10、−Ｃ（Ｏ）Ｒ13であるか、またはＲ6もしくはＲ8と一緒に環を形成し、
Ｒ10が、−Ｃ（Ｏ）−ＣＦ3または−Ｏ−ＣＨ2−Ａ1であり（Ａ1が、少なくとも１つのＲ11で任意に置換されたアリールまたはヘテロアリールである）、
Ｒ11が、メチル、Ｃ2-6アルキル、または−ＯＲ12であり、
Ｒ12が、Ｈ、メチル、アセチル（Ａｃ）、アセトキシメチル（ＡＭ）、−ＰＯ32-、−ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、
Ｒ13が、
【化２４】
2021536500.tif 000026
であり（Ｒ15が、オリゴペプチドまたは−ＯＲ’であり（Ｒ’が、アセチル、ＡＭ、ＰＯ32-、ＰＯ3（ＡＭ）2、またはグリコシドであり、ＡＭが、アセトキシメチルである））、
さらに、（ｉ）Ｒ1がメチルもしくはＣ2-6アルキルである場合、Ｒ2は、メチルもしくはＣ2-6アルキルではなく、または（ｉｉ）Ｒ3が、Ｒ3aもしくは−Ｌ1−ＲB1である、化合物、
またはそのスピロラクトン形態および／もしくは塩が、上記の実施形態１に開示される。
【０２７５】
また、図１Ａ〜１Ｑに示される化合物１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、２Ａ、３、４Ａ、５、６、７、７Ａ、７Ｂ、８、９、１０Ａ、１０Ｂ、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５６、５７、５８、および５９も開示される。トリエチルアミンなどの対イオンは、化合物１０Ａ〜１３などの特定の化合物で示されるが、そのような化合物への言及は、明示的に示されない限り、特定の対イオンを含まない。したがって、例えば、「化合物１０Ａ」は、他のカチオンとの塩、ならびに対応する遊離スルホン酸（水酸化スルホニル）を含む。同様に、いくつかの場合では、前駆体、副産物、試薬などが、例えば、化合物４５で例示されており、これらは、情報目的のみのためであり、化合物自体の構造を制限しない。Ｒ1、Ｒ2などの置換基は、上記に記載された実施形態のいずれか１つおよび特許請求の範囲に記載された値、例えば、実施形態１の式（Ｉ）に記載された値を有することができる。
【０２７６】
Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｅ、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、ＲN1、またはＲN2が、上記に記載された実施形態のいずれか１つおよび特許請求の範囲に記載された値を有する化合物も開示される。
【０２７７】
化合物１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、２Ａ、３、４Ａ、５、６、７、７Ａ、７Ｂ、８、９、１０Ａ、１０Ｂ、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および５９として上記に列挙される選択された化合物は、本開示の色素の排他的なリストであることを意図するものではない。本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、置換基および化合物構造における多数の修正、置換、および変更が可能である。例えば、本明細書に記載されるように、本明細書に記載される化合物のコンジュゲートも提供される。
【０２７８】
フェニル環上に２’−カルボキシル基を含む本開示のＳｉＲ化合物（すなわち、式（Ｉ）のＲ3位）は、スピロラクトン（非蛍光であり得る）と蛍光形態（例えば、双性イオン）との間で平衡に存在することができる。図１Ｒを参照されたい。スピロラクトン形態への異性化は、ＳｉＲ化合物を細胞透過性にすることができる。したがって、本明細書に開示されるＳｉＲ化合物のスピロラクトン形態、例えば、本明細書に開示されるフェニル環上に２’−カルボキシル基を含むＳｉＲ化合物のスピロラクトン形態も本明細書に提供される。スピロラクトン化は、色素が結合していないときに好ましい（おそらく、任意の特定の理論に束縛されることを望まずに、遊離色素分子の疎水性凝集のために）場合がある一方で、蛍光双性イオン状態は、標的と関連付けられるとき、好ましい場合がある。したがって、色素は、非蛍光スピロラクトン形態が標的結合時に蛍光双性イオンに変換するという点で、標的結合依存性の蛍光性を提示することができる。
【０２７９】
あるいは、２’−カルボキシル基以外のＲ3置換基が、スピロラクトン化を防止し、色素が蛍光状態から異性化することができないようにし、および／または本開示のＳｉＲ色素を生細胞不透過性にすることが可能である。そのような色素は、生／死細胞識別に有用であり得る。そのような色素は、さらに、本明細書の他の箇所に記載されるように標的結合部分にコンジュゲートすることができ、これは、生／死細胞識別実験において、透過性および／もしくは死細胞内のそれらの滞留時間、ならびに／または蛍光差を増加させることができる。
【０２８０】
いくつかの実施形態では、近赤外線蛍光を提示する化合物が提供される。本開示のＳｉＲ化合物の蛍光は、ＳｉＲの縮合環系に追加の環を含むことによって赤色にシフトし得る。例えば、ＲN１およびＲ5が、一緒に環を形成することができ、Ｒ6およびＲN2が、一緒に環を形成することができる。ＲN１およびＲ5ならびにＲ6ならびにＲN2によって形成される環は、各々、少なくとも１つの追加の環にさらに縮合され得る。あるいは、または加えて、ＲN１およびＲ7が、一緒に環を形成することができ、Ｒ8およびＲN2が、一緒に環を形成することができる。いくつかの実施形態では、化合物は、少なくとも５つの環を含む縮合環系を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、少なくとも７つの環を含む縮合環系を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、少なくとも９つの環を含む縮合環系を含む。いくつかの実施形態では、前述の縮合環系のうちのいずれか１つは、５員環および６員環からなる。いくつかの実施形態では、前述の縮合環系のうちのいずれか１つは、６員環からなる。５つ以上の環の縮合環系を含む例示的な化合物は、化合物１８〜３７および４５〜５９である。いくつかの実施形態では、前述の化合物のうちのいずれか１つの縮合環系は、式（Ｉ）について定義されるか、または本明細書に開示される任意の実施形態に記載されるように、別のＳｉＲ化合物のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4、または任意の番号付けされた実施形態もしくは請求項で定義されるＲ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4を含む、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、およびＲ4と組み合わされる。
【０２８１】
いくつかの実施形態では、化合物は、任意に、Ｒ1およびＲ2が必ずしも同一ではないことを除き、式（Ｉ）のケイ素およびＲ4を通過する鏡映面を有する。ＲN1に結合した窒素またはＲN2に結合した窒素に対する形式電荷、ならびに分子軌道またはコンジュゲートされたｐｉ系において共鳴を介して再配置または非局在化することができる二重結合の形式位置は、対称性を破壊するものとは見なされない。加えて、Ｒ3およびＥは、概して、それらが結合している環とケイ素を含む環系との間の結合の回転を通じて対称面を占有することができる範囲で対称性を破壊しない。したがって、例えば、化合物１Ａは、式（Ｉ）のケイ素およびＲ4を通過する鏡映面を有し、化合物１は、Ｒ1およびＲ2が同一でないことを除いて、式（Ｉ）のケイ素およびＲ4を通過する鏡映面を有する。
【０２８２】
当業者は、化合物が、互変異性、配座異性体、幾何異性体、および／または立体異性体の現象を提示し得ることを理解するであろう。本明細書および特許請求の範囲内の式図面は、必ずしもすべての可能な互変異性体、配座異性体、鏡像異性体、または幾何異性体形態を表すものではないため、本開示は、本明細書に記載される有用性のうちの１つ以上を有する化合物の任意の互変異性体、配座異性体、鏡像異性体、および／または幾何異性体形態を包含することが理解されるべきである。
【０２８３】
さらに、化合物が、とりわけ、それらの環境のｐＨに依存して、多くの異なるプロトン化状態で存在し得ることもまた明らかであろう。本明細書に提供される構造式は、いくつかの可能なプロトン化状態のうちの１つのみで化合物を描写するが、これらの構造は、例示のみであり、本開示は、任意の特定のプロトン化状態に限定されないことが理解されよう。ＳｉＲ化合物の任意のおよびすべてのプロトン化形態は、本開示の範囲内に入ることが意図される。
【０２８４】
さらに、本開示の化合物は、複数の正電荷または負電荷を持つことができる。酵素基質と関連する対イオンは、典型的には、化合物が得られる合成および／または単離方法によって決まる。典型的な対イオンとしては、アンモニウム、ナトリウム、カリウム、リチウム、ハロゲン化物、酢酸、トリフルオロ酢酸など、およびそれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。任意の関連する対イオンの同一性は、本開示の重要な特徴ではなく、本開示は、特に明記しない限り、任意の種類の対イオンと関連する化合物を包含することが理解されよう。
【０２８５】
本開示のある特定の実施形態では、組成物が提供され、その組成物は、本明細書に提供される化合物のいずれかと、少なくとも１つの溶媒と、を含む。ある特定の実施形態では、溶媒は、水もしくはＤＭＳＯ、またはそれらの組み合わせを含む。ある特定の実施形態では、組成物は、培地をさらに含む。
【０２８６】
ある特定の実施形態では、組成物が提供され、その組成物は、ａ）本明細書に提供される化合物のうちの１つ以上と、ｂ）担体と、を含む。
【０２８７】
ある特定の実施形態では、組成物が提供され、組成物は、ａ）本明細書に提供される化合物のうちの１つ以上と、ｂ）分析物と、を含む。
【０２８８】
２．反応基、担体分子、および固体支持体
例示的な実施形態では、本明細書に提供されるＳｉＲ化合物は、アクリルアミド、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、無水物、アニリン、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロネート、カルボン酸、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン、ヒドラジド、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホルアミダイト、反応性プラチナ複合体、ハロゲン化スルホニル、チオール基、および光活性化が可能な基から選択されるメンバーである反応基または反応性リガンドを含む。いくつかの実施形態では、化合物は、別の分子へのコンジュゲーションに有用な反応基または反応リガンドを含む。例示的な反応基および／またはリガンドとしては、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステル、カルボキシル、カルボキシレスター、マレイミド、アミド、スルホジクロロフェニル（ＳＤＰ）エステル、スルホテトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）エステル、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、アセトキシメチル（ＡＭ）エステル、ニトリル三酢酸（ＮＴＡ）、アミノデキストラン、およびシクロオクチン−アミンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２８９】
これらの反応基は、反応基含有ＳｉＲ化合物を提供するために、本明細書に提供されるＳｉＲ化合物の合成中または合成後のいずれかに共有結合することができる。このようにして、反応基含有ＳｉＲ化合物は、好適な反応性を有する官能基を含有するか、または含有するように修飾される様々な担体分子または固体支持体に共有結合され、成分の化学結合をもたらすことができる。例示的な実施形態では、本明細書に開示されるＳｉＲ化合物の反応基および固体支持体の担体分子の官能性基は、それらの間の共有連結を生成することができる求電子性および求核性を含む。あるいは、反応基は、光活性化が可能な基を含み、それは、適切な波長の光での照射後にのみ化学的に反応性になる。典型的には、反応基と担体分子または固体支持体との間のコンジュゲーション反応により、ＳｉＲ化合物を担体分子または固体支持体に結合させる新氏連結に組み込まれる反応基の１つ以上の原子がもたらされる。
【０２９０】
例えば、ＮＨＳエステルをリンカーまたは分子に求核基（例えば、アミノ基またはスルフヒドリル）でコンジュゲートするための一般的なプロトコルは、アセトニトリル水溶液（アセトニトリルの割合は、溶解性を得るための色素の疎水性によって決定される）中のＮＨＳエステルを、水中（またはリンカーが疎水性である場合は、アセトニトリル水溶液）のリンカーで溶解させることを伴う。水性炭酸水素ナトリウム緩衝液（１Ｍ）を溶液に添加して、ボルテックスまたは振盪中に、０．１Ｍの緩衝液濃度を達成する。混合物を室温で１０分間〜３０分間振盪する。反応混合物中の粗コンジュゲートは、逆相ＨＰＬＣによって精製することができる。
【０２９１】
官能基および連結の選択された例を下の表１に示し、求電子基と求核基との反応は、共有連結をもたらす。当業者は、コンジュゲートされる化合物の同一性、それらの化合物中の他の部分の反応性（例えば、望ましくない副生成物を避けるため）、および共有連結に望ましい特性に応じて、基の適切な対を選択することができる。したがって、いくつかの実施形態では、反応性リガンドは、表１に列挙される求電子基または求核基から選択される。いくつかの実施形態では、化合物の反応基または反応性リガンドは、表１に列挙される求電子基から選択される。いくつかの実施形態では、化合物の反応基または反応性リガンドは、表１に列挙される求核基から選択される。
【０２９２】
【表１】
2021536500.tif 000027
2021536500.tif 000028
【０２９３】
コンジュゲートされる物質に本開示のＳｉＲ化合物を結合させるために使用される反応基の選択は、典型的には、コンジュゲートさせる物質上の反応基または官能基、および所望の共有連結の種類または長さに依存する。有機または無機の物質（生体分子または非生体分子）上に典型的に存在する官能基の種類には、アミン、アミド、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド、ケトン、ホスホネート、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二置換アミン、ハロゲン化物、エポキシド、ハロゲン化シリル、カルボン酸エステル、スルホン酸エステル、プリン、ピリミジン、カルボン酸、オレフィン結合、またはこれらに基の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。単一の種類の反応部位が、物質上で利用可能であり得る（多糖またはシリカに典型的である）か、またはタンパク質に典型的であるように、様々な部位が生じ得る（例えば、アミン、チオール、アルコール、フェノール）。
【０２９４】
典型的には、反応基は、アミン、チオール、アルコール、アルデヒド、ケトンと、またはシリカと反応するであろう。好ましくは、反応基は、アミンもしくはチオール官能基と、またはシリカと反応する。一実施形態では、反応基は、アクリルアミド、カルボン酸の活性化エステル、アシルアジド、アシルニトリル、アルデヒド、ハロゲン化アルキル、ハロゲン化シリル、無水物、アニリン、ハロゲン化アリール、アジド、アジリジン、ボロネート、ジアゾアルカン、ハロアセトアミド、ハロトリアジン、ヒドラジン（ヒドラジドを含む）、イミドエステル、イソシアネート、イソチオシアネート、マレイミド、ホスホルアミダイト、反応性白金複合体、ハロゲン化スルホニル、またはチオール基である。「反応性白金複合体」とは、特に、米国特許第５，７１４，３２７号に記載されるような化学反応性白金複合体を意味する。
【０２９５】
反応基が、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、ハロゲン化スルホニル、テトラフルオロフェニルエステル、またはイソチオシアネートなどのカルボン酸の活性化エステルである場合、得られる化合物は、タンパク質、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはハプテンなどの担体分子のコンジュゲートを調製するために特に有用である。反応基が、マレイミド、ハロアルキル、またはハロアセトアミド（米国特許第５，３６２，６２８号、同第５，３５２，８０３号、および同第５，５７３，９０４号に開示される任意の反応基を含む）である場合、得られる化合物は、チオール含有物質へのコンジュゲーションに特に有用である。反応基がヒドラジドである場合、得られる化合物は、過ヨウ素酸塩酸化炭水化物および糖タンパク質へのコンジュゲーションに特に有用であり、加えて、細胞マイクロインジェクションのためのアルデヒドで固定可能な極性トレーサーである。反応基がハロゲン化シリルである場合、得られる化合物は、シリカ表面へのコンジュゲーションに特に有用であり、特にシリカ表面が、その後遠隔イオン検出または定量化のために使用される光ファイバープローブに組み込まれる場合に有用である。
【０２９６】
特定の態様では、反応基は、光活性化が可能な基であり、その結果、その基は、適切な波長での照射後にのみ反応種に変換される。適切な波長は、概して、４００ｎｍ未満のＵＶ波長である。この方法は、溶液中にあるか、または固体もしくは半固体マトリックス上に固定化されているかのいずれかで、標的分子のみに特異的な結合を提供する。このようにして、光活性化が可能な反応基を含む本明細書で提供されるＳｉＲ化合物は、アニオン性タンパク質と関連付けられ、タンパク質に共有結合的にコンジュゲートされ得る。光活性化が可能な反応基としては、ベンゾフェノン、アリールアジド、およびジアジリンが挙げられるが、これらに限定されない。
【０２９７】
ある実施形態では、反応基は、光活性化が可能な基、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、ハロアセトアミド、ハロアルキル、ヒドラジン、イソチオシアネート、マレイミド基、脂肪族アミン、ハロゲン化シリル、カダベリン、またはソラレンである。ある特定の実施形態では、反応基は、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、マレイミド、ヨードアセトアミド、またはハロゲン化シリルである。特定の実施形態では、反応基は、カルボン酸のスクシンイミジルエステル、スルホニルハロゲン化物、テトラフルオロフェニルエステル、ヨーソチオシアネート（ｉｏｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅｓ）、またはマレイミドである。
【０２９８】
レポーター分子を担体分子または固体支持体に結合させる共有連結の選択は、典型的には、コンジュゲートさせる成分上の化学反応基に依存する。直前のセクションにおける反応基に関する議論もここで関連している。ヒドラジニル付属器に加えて、生物学的または非生物学的成分上に典型的に存在する例示的な反応基には、アミン、チオール、アルコール、フェノール、アルデヒド、ケトン、ホスフェート、イミダゾール、ヒドラジン、ヒドロキシルアミン、二置換アミン、ハロゲン化物、エポキシド、スルホン酸エステル、プリン、ピリミジン、カルボン酸、またはこれらの基の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。単一の種類の反応部位が、成分上で利用可能であり得る（多糖に典型的である）か、またはタンパク質に典型的であるように、様々な部位が生じ得る（例えば、アミン、チオール、アルコール、フェノール）。担体分子または個体支持体は、同じかまたは異なり得る２つ以上のレポーター分子、またはハプテンによって追加的に修飾される物質にコンジュゲートされ得る。いくらかの選択性が反応条件を慎重に制御することによって得ることができるが、標識化の選択性は、適切な反応性化合物の選択によって得られることが最善である。
【０２９９】
式（Ｉ）のＳｉＲ化合物のコンジュゲートが形成される場合、生成物は、依然として式（Ｉ）の化合物と見なされ、新たにコンジュゲートされた材料は、式（Ｉ）の懸垂基、例えば、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｅ、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、ＲN1、またはＲN2のうちの１つを介してＳｉＲ部分に結合していると見なされる。
【０３００】
担体分子：
別の例示的な実施形態では、本説明のＳｉＲ化合物は、担体分子に共有結合している。化合物が反応基（または反応性リガンド）を有する場合、担体分子は、代替的に、反応基を介して化合物に連結することができる。反応基は、反応性官能性部分およびリンカーの両方、または反応性官能性部分のみを含有し得る。
【０３０１】
様々な担体分子が本開示において有用である。例示的な担体分子としては、抗原、ステロイド、ビタミン、薬物、ハプテン、代謝産物、毒素、環境汚染物質、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、核酸、核酸ポリマー、炭水化物、脂質、およびポリマーが挙げられる。
【０３０２】
例示的な実施形態では、担体分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、プソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質アセンブリ、合成ポリマー、高分子微粒子、生物学的細胞、ウイルス、およびそれらの組み合わせを含む。別の例示的な実施形態では、担体分子は、ハプテン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマー、タンパク質、ペプチド、または多糖から選択される。別の例示的な実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｅ、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、ＲN1、またはＲN2から選択される少なくとも１つのメンバーが、担体分子を含む。別の例示的な実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｅ、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、ＲN1、またはＲN2のうちの１つが、置換アルキル基または反応基、例えばアルキル−スクシンイミジル基を介して結合した担体基を含む。
【０３０３】
例示的な実施形態では、担体分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、プソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質アセンブリ、合成ポリマー、高分子微粒子、生物学的細胞、ウイルス、およびそれらの組み合わせを含む。別の例示的な実施形態では、担体分子は、ハプテン、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸ポリマー、タンパク質、ペプチド、または多糖から選択される。好ましい実施形態では、担体分子は、アミノ酸、ペプチド、タンパク質、多糖、ヌクレオシド、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、核酸、ハプテン、プソラレン、薬物、ホルモン、脂質、脂質アセンブリ、チラミン、合成ポリマー、高分子微粒子、生体細胞、細胞成分、イオンキレート部分、酵素基質、またはウイルスである。別の好ましい実施形態では、担体分子は、抗体またはその断片、抗原、アビジンまたはストレプトアビジン、ビオチン、デキストラン、抗体結合タンパク質、蛍光タンパク質、アガロース、および非生物学的微粒子である。典型的には、担体分子は、抗体、抗体断片、抗体結合タンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、レクチン、または成長因子である。好ましいハプテンとしては、ビオチン、ジゴキシゲニン、および蛍光タンパク質が挙げられる。
【０３０４】
抗体結合タンパク質としては、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、可溶性Ｆｃ受容体、タンパク質Ｌ、レクチン、抗ＩｇＧ、抗ＩｇＡ、抗ＩｇＭ、抗ＩｇＤ、抗ＩｇＥ、またはそれらの断片が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３０５】
例示的な実施形態では、酵素基質は、アミノ酸、ペプチド、糖、アルコール、アルカン酸、４−グアニジノベンゾン酸、核酸、脂質、硫酸、リン酸、−ＣＨ2ＯＣＯアルキル、およびそれらの組み合わせから選択される。したがって、酵素基質は、ペプチダーゼ、ホスファターゼ、グリコシダーゼ、デアルキラーゼ、エステラーゼ、グアニジノベンゾターゼ、スルファターゼ、リパーゼ、ペルオキシダーゼ、ヒストンデアセチラーゼ、エンドグリコセルアミダーゼ、エキソヌクレアーゼ、レダクターゼ、およびエンドヌクレアーゼからなる群から選択される酵素によって切断され得る。
【０３０６】
別の例示的な実施形態では、担体分子は、アミノ酸（リン酸、炭水化物、またはＣ1〜Ｃ22カルボン酸によって保護または置換されるものを含む）、またはペプチドもしくはタンパク質などのアミノ酸のポリマーである。関連する実施形態では、担体分子は、少なくとも５つのアミノ酸、より好ましくは５〜３６個のアミノ酸を含有する。例示的なペプチドとしては、ニューロペプチド、サイトカイン、毒素、プロテアーゼ基質、およびタンパク質キナーゼ基質が挙げられるが、これらに限定されない。他の例示的なペプチドは、臓器局在化ペプチド、すなわち、細胞輸送機構による特定の細胞下部構造内の局在化のためにコンジュゲートされた化合物を標的にする役割を果たすペプチドとして機能し得る。好ましいタンパク質担体分子としては、酵素、抗体、レクチン、糖タンパク質、ヒストン、アルブミン、リポタンパク質、アビジン、ストレプトアビジン、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇ、フィコビリタンパク質、ならびに他の蛍光タンパク質、ホルモン、毒素、および成長因子が挙げられる。典型的には、タンパク質担体分子は、抗体、抗体断片、アビジン、ストレプトアビジン、毒素、レクチン、または成長因子である。
【０３０７】
別の例示的な実施形態では、担体分子は、任意に、フルオロフォアまたは他のリガンドの結合、例えば、アルキニル連結（米国特許第５，０４７，５１９号）、アミノアリル連結（米国特許第４，７１１，９５５号）、もしくは他の連結のための追加のリンカーまたはスペーサーを含有する、核酸塩基、ヌクレオシド、ヌクレオチド、または核酸ポリマーを含む。別の例示的な実施形態では、ヌクレオチド担体分子は、ヌクレオシドまたはデオキシヌクレオシドまたはジデオキシヌクレオシドである。
【０３０８】
例示的な核酸ポリマー担体分子は、一本鎖もしくは多重鎖の、天然もしくは合成ＤＮＡもしくはＲＮＡオリゴヌクレオチド、またはＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドであるか、あるいは珍しいリンカー、例えば、モルホリン誘導体化ホスフェート（ＡｎｔｉＶｉｒａｌｓ，ＩｎＣ．、オレゴン州コーバリス）、またはペプチド核酸、例えば、Ｎ−（２−アミノエチル）グリシン単位を組み込み、その核酸は、５０ヌクレオチド未満、より典型的には２５ヌクレオチド未満を含有する。
【０３０９】
別の例示的な実施形態では、担体分子は、典型的には、デキストラン、ＦＩＣＯＬＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、コネチカット州フェアフィールド）、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、デンプン、アガロース、およびセルロースなどの多糖であるか、またはポリ（エチレングリコール）などのポリマーである炭水化物またはポリオールを含む。関連する実施形態では、多糖担体分子は、デキストラン、アガロース、またはＦＩＣＯＬＬを含む。
【０３１０】
別の例示的な実施形態では、担体分子は、糖脂質、リン脂質、およびスフィンゴ脂質を含む脂質（典型的には、６〜２５個の炭素を有する）を含む。あるいは、担体分子は、リポソームなどの脂質小胞を含むか、またはリポタンパク質である（以下を参照されたい）。いくつかの親油性置換基は、コンジュゲートされた色素化合物の細胞または細胞器官への輸送を促進するのに有用である。
【０３１１】
あるいは、担体分子は、細胞、細胞系、細胞断片、またはサブ細胞粒子である。この種類のコンジュゲートされた材料の例としては、ウイルス粒子、細菌粒子、ウイルス成分、生物学的細胞（動物細胞、植物細胞、細菌、または酵母など）、または細胞成分が挙げられる。標識化することができる、またはその構成分子を標識化することができる細胞成分の例としては、リソソーム、エンドソーム、細胞質、核、ヒストン、ミトコンドリア、ゴルジ装置、エンドプラズマ網、および液胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【０３１２】
別の実施形態では、担体分子は、金属キレート部分である。対象の金属イオンに結合し、その蛍光特性の変化をもたらす任意のキレート剤は、好適なコンジュゲートであるが、好ましい金属キレート部分は、クラウンエーテルであり、Ｋｕｈｎら（１９９５）の米国特許第５，４０５，９７５号に記載されるようなジアリールジアザクラウンエーテル、Ｋｕｈｎら（１９９５）の米国特許第５，４５３，５１７号（参照により組み込まれる）およびＴｓｉｅｎら（１９９１）の米国特許第５，０４９，６７３号に記載されるような１，２−ビス−（２−アミノフェノキシエタン）−Ｎ，Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’，Ｎ’−四酢酸（ＢＡＰＴＡ）の誘導体、Ｒａｊｕら（１９９５）のＡｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２５６：Ｃ５４０（１９８９）に記載されるような２−カルボキシメトキシ−アニリン−Ｎ，Ｎ−二酢酸（ＡＰＴＲＡ）の誘導体、ならびにＫｕｈｎら（１９９７）の米国特許第５６４８，２７０号に記載されているようなピリジルベースおよびフェナントロリン金属イオンキレート剤を含む。
【０３１３】
別の例示的な実施形態では、担体分子は、有機または無機材料と非共有結合的に関連付けられる。親油性置換基を有する担体分子の例示的な実施形態を使用して、例えば、膜構造のためのプローブとしての使用のため、またはリポソーム、リポタンパク質、フィルム、プラスチック、親油性微粒子、または同様の材料への組み込みのために、膜内での色素化合物の非共有組み込みよって、生物学的膜またはリポソームなどの脂質アセンブリを標的とすることができる。
【０３１４】
例示的な実施形態では、担体分子は、特異的結合対メンバーを含み、本化合物は、特異的結合対メンバーにコンジュゲートされ、試料中の分析物を検出するために使用される。あるいは、標識化された特異的結合対メンバーの存在は、その特異的結合対の相補的メンバーの位置を示し、各特異的結合対メンバーは、他方の特定の空間および極性組織に特異的に結合し、かつ相補的である表面上または空洞内の領域を有する。例示的な結合対を表２に示す。
【０３１５】
【表２】
2021536500.tif 000029
【０３１６】
個体支持体：
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるＳｉＲ化合物は、固体支持体に共有結合している。固体支持体は、フルオロフォアを介して、または存在する場合、反応基を介して、または存在する場合、担体分子を介してのいずれかでＳｉＲ化合物に結合し得る。
【０３１７】
本明細書での使用に好適な固体支持体は、典型的には、液体相で実質的に不溶性である。本明細書で使用するための固体支持体は、特定の種類の支持体に限定されない。むしろ、多数の支持体が利用可能であり、当業者に既知である。したがって、有用な固体支持体としては、固体および半固体マトリックス、例えば、エアロゲルおよびヒドロゲル、樹脂、ビーズ、バイオチップ（薄膜被覆バイオチップを含む）、マイクロ流体チップ、ケイ素チップ、マルチウェルプレート（マイクロタイトルプレートまたはマイクロプレートとも称される）、膜、導電性金属および非導電性金属、ガラス（顕微鏡スライドを含む）、ならびに磁気支持体が挙げられる。有用な固体支持体のより具体的な例としては、シリカゲル、高分子膜、粒子、誘導体化プラスチックフィルム、ガラスビーズ、綿、プラスチックビーズ、アルミナゲル、多糖類、例えば、ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、コネチカット州フェアフィールド）、ポリ（アクリレート）、ポリスチレン、ポリ（アクリルアミド）、ポリオール、アガロース、寒天、セルロース、デキストラン、デンプン、ＦＩＣＯＬＬ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）、ヘパリン、グリコーゲン、アミロペクチン、マンナン、イヌリン、ニトロセルロース、ジアゾセルロース、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、ポリエチレン（ポリ（エチレングリコール）を含む）、ナイロン、ラテックスビーズ、磁気ビーズ、常磁性ビーズ、超常磁性ビーズ、デンプンなどが挙げられる。
【０３１８】
ある特定の実施形態では、固体支持体は、本明細書に開示される色素化合物を結合させるための、固体支持体反応性官能基を含んでもよく、ヒドロキシル、カルボキシル、アミノ、チオール、アルデヒド、ハロゲン、ニトロ、シアノ、アミド、尿素、炭酸、カルバメート、イソシアネート、スルホン、スルホン酸、スルホンアミド、スルホキシドなどを含むが、これらに限定されない。有用な反応基が上に開示され、本明細書の固体支持体反応性官能基に同様に適用可能である。
【０３１９】
好適な固相支持体は、所望の最終使用および種々の合成プロトコルへの適性に基づいて選択され得る。例えば、アミド結合形成が、本明細書に開示されるＳｉＲ化合物を固体支持体に結合させるのに望ましい場合、一般にペプチド合成に有用な樹脂、例えば、ポリスチレン（例えば、Ｂａｃｈｅｍ  Ｉｎｃ．、Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓなどから入手したＰＡＭ−樹脂）、ＰＯＬＹＨＩＰＥ樹脂（カナダのＡｍｉｎｏｔｅｃｈから入手）、ポリアミド樹脂（Ｐｅｎｉｎｓｕｌａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手）、ポリエチレングリコールでグラフトしたポリスチレン樹脂（ＴＥＮＴＡＧＥＬ、Ｒａｐｐ  Ｐｏｌｙｍｅｒｅ、ドイツ、テュービンゲン）、ポリジメチル−アクリルアミド樹脂（カリフォルニアのＭｉｌｌｉｇｅｎ／Ｂｉｏｓｅａｒｃｈから入手可能）、またはＰＥＧＡビーズ（Ｐｏｌｙｍｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手可能）が用いられてもよい。
【０３２０】
３．標的結合部分へのコンジュゲート
一般に、ＳｉＲ部分およびコンジュゲート部分（例えば、標的結合部分、ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ホスホラミダイトなど）を含む本明細書に記載される化合物に関して、ＳｉＲ部分は、式（Ｉ）の構造を有し、その置換基（例えば、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｅ、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、ＲN1、またはＲN2）は、コンジュゲート部分を含み、それはは、任意に、リンカーを介してＳｉＲ部分に接続される。いくつかの実施形態では、Ｒ1またはＲ2が、コンジュゲートされた部分を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ3またはＲ4が、コンジュゲートされた部分を含む。
【０３２１】
いくつかの実施形態では、ＳｉＲ部分が、抗体、細胞骨格結合部分、または核酸結合部分などの標的結合部分に結合しているコンジュゲートが提供される。標的結合部分を含むＳｉＲ化合物を使用して、例えば、本明細書の他の箇所に記載される蛍光顕微鏡法および超解像顕微鏡法の適用のために、標的結合部分によって結合した標的を蛍光染色することができる。
【０３２２】
例えば、そのようなコンジュゲートを調製するために、標的結合部分の反応基（例えば、抗体上のアミン）を、式（Ｉ）の化合物上のＮＨＳエステルなどの反応基と反応させて、本開示によるコンジュゲートを提供することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される化合物は、まずその部分を、標的結合部分と反応する反応性リガンドに変換することによって活性化される。そのようなコンジュゲーション反応の生成物も、本明細書に開示される化合物と見なされる。
【０３２３】
したがって、いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物は、標的結合部分を含む。いくつかの実施形態では、標的結合部分は、式（Ｉ）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4の一部である。標的結合部分は、例えば、前述の位置のうちの１つで、例えば、適切な誘導体化手順を使用して、例えば、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4が、反応性リガンド、例えば、Ｒ1もしくはＲ2でのビニル（または例えば、本明細書の他の箇所で考察されるチオール−エン反応を使用して提供され得る、カルボキシルもしくはアミンなどの異なる反応基；Ｒ1での誘導体化に必要な変更を加えて適用することができる、Ｒ2での誘導体化を伴う例示的な合成経路については図２Ｂ〜２Ｄを参照されたい）、またはＲ3もしくはＲ4でのカルボキシルなどの反応性リガンドを含む、式（Ｉ）の化合物から開始して、ＳｉＲ部分にコンジュゲートされ得る。Ｒ4での誘導体化に必要な変更を加えて適用することができる、Ｒ3での誘導体化を伴う例示的な合成経路については図２Ｅを参照されたい。
【０３２４】
いくつかの実施形態では、標的結合部分は、細胞骨格結合部分である。
【０３２５】
いくつかの実施形態では、細胞骨格結合部分は、ドセタキセルなどの微小管結合部分である。コンジュゲートされたドセタキセルの例示的な構造は、
【化２５】
2021536500.tif 000030
であり、波線が、例えば、リンカーを介したＳｉＲ部分への接続を示す。例えば、化合物５を参照されたい。
【０３２６】
いくつかの実施形態では、細胞骨格結合部分は、アクチン結合ペプチドである。コンジュゲートされたアクチン結合ペプチドの例示的な構造は、
【化２６】
2021536500.tif 000031
であり、波線が、例えば、リンカーを介したすＳｉＲ部分への接続を示す。例えば、化合物６を参照されたい。
【０３２７】
いくつかの実施形態では、標的結合部分は、アクチン結合部分、例えばファロイジンである。例示的なファロイジンコンジュゲートは、化合物７Ａなどのケイ素ローダミンを使用して調製することができる。
【０３２８】
いくつかの実施形態では、標的結合部分は、核酸結合部分、例えば、ＤＮＡ結合部分である。例示的な核酸結合部分は、Ｈｏｅｃｈｓｔ部分またはニトロ−Ｈｏｅｃｈｓｔ部分である。コンジュゲートされたＨｏｅｃｈｓｔ部分の例示的な構造は、
【化２７】
2021536500.tif 000032
であり、波線が、例えば、リンカーを介したＳｉＲ部分への接続を示す。例えば、化合物４および７を参照されたい。コンジュゲートされたニトロ−Ｈｏｅｃｈｓｔ部分の例示的な構造は、
【化２８】
2021536500.tif 000033
であり、波線が、例えば、リンカーを介したＳｉＲ部分への接続を示す。例えば、化合物７Ｂを参照されたい。Ｈｏｅｃｈｓｔのものと重複する蛍光スペクトルを有する別の色素を伴い得る用途では、蛍光ブリードスルーを低減したニトロ−Ｈｏｅｃｈｓｔ部分を使用することが望ましい場合がある（実施例４を参照されたい）。
【０３２９】
Ｒ3位での誘導体化を伴う固定細胞を染色するためのコンジュゲートの調製の一般的な図については、図１０Ａを参照されたい。
【０３３０】
４．ホスホラミダイト、ならびに標識ヌクレオシド、ヌクレオチド、およびポリヌクレオチド
ホスホラミダイトを含む式（Ｉ）による化合物も本明細書で提供される。ホスホラミダイトは、式（Ｉ）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4基の一部であり得る。
【０３３１】
いくつかの実施形態では、化合物は、式（Ｌ１）を有するホスホラミダイト化合物であり、
【化２９】
2021536500.tif 000034
式中、ＸおよびＹが、一緒にリンカーを形成し、Ｂ１が、リン酸エステル保護基であり、別々に取られるＢ2およびＢ3が、最大１０個の炭素原子を含有する低級アルキル、低級アルケン、アリール、およびシクロアルキルであり、Ｄが、ＳｉＲ含有色素部分である。そのような化合物は、ヌクレオチドの糖分布を介した固体支持合成を使用して、化学的に合成されたポリヌクレオチドまたは化学的に自動合成可能なポリヌクレオチドの５’末端を標識化するのに好適である。Ｙは、式（Ｉ）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4のうちの位置の１つを介してＤに結合することができる。ＸおよびＹは、様々な形態をとってもよいが、構造Ｘ−Ｙは、（ｉ）ＤＮＡ合成条件に対して安定でなければならず、（ｉｉ）ポリヌクレオチド−標的ハイブリダイゼーションを実質的に妨げてはならなず、および（ｉｉｉ）それが結合する色素の蛍光をクエンチしてはならなく、例えば、米国特許第５，２３１，１９１号、同第５，２５８，５３８号、および同第４，７５７，１４１号、および同第５，２１２，３０４号。いくつかの実施形態では、Ｘは、直鎖状または環状の低級アルキル、直鎖状もしくは環状の置換低級アルキル、ポリエチレンオキシド、１〜８つの炭素原子を有する低級アリール、ペプチド、またはポリエーテルである。いくつかの実施形態では、Ｙは、アミド、スルホンアミド、尿素、ウレタン、またはチオ尿素である。例えば、Ｙは、アミドであり得、Ｘは、−（ＣＨ2）nであり得、ｎが、２〜３０、例えば、２〜６などの２〜１０の範囲である。別の例では、Ｙは、アミドであり得、Ｘは、−（ＣＨ2ＣＨ2Ｏ）n−（すなわち、直鎖ポリエチレンオキシド）であり得、ｎが、２〜３０、例えば、２〜６などの２〜１０の範囲である。
【０３３２】
ホスホラミダイト化合物は、様々な既知の方法によって合成され得る。一般に、合成は、以下のように進む。Ｄのフェノールヒドロキシルは、存在する場合、ＤＮＡ合成脱保護剤、例えば、アンモニア、エタノールアミン、メチルアミン／水酸化アンモニウム混合物、およびｔ−ブチルアミン／水／メタノール（１：２：１）の混合物で除去することができる色素保護基で保護され、例えば、米国特許第５，２３１，１９１号を参照されたい。そのように保護された色素は、本明細書では、色素の「保護された誘導体」と称される。いくつかの実施形態では、保護基は、安息香酸またはピバリン酸のエステルである。次に、保護された色素、例えば、カルボン酸の反応性リガンドが、例えば、カルボジイミドで活性化され、Ｎ、Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、または別の同様の非プロトン性溶媒中のアルコールリンカー誘導体、例えば、アミノアルコール、例えば、エタノールアミン、ヘキサノールアミンなどと反応させて、遊離アルコール官能基、例えば、アルコール−アミド誘導体を有する保護された色素を得る。次いで、遊離アルコールは、標準手順を使用して、例えば、触媒量のテトラゾールジイソプロピルアミンを含有するアセトニトリル中のホスフィチル化剤、例えば、ジ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルアミノ）メトキシホスフィンと反応させて、ホスホラミダイト、例えば、米国特許第５，２３１，１９１号を得る。
【０３３３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるＳｉＲ部分で標識化されたポリヌクレオチドが提供される。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、式（Ｌ１）の化合物とのヌクレオチドの糖の部分を介した固体支持体合成を使用して、化学的に合成された、または化学的に自動合成可能なポリヌクレオチドの５’末端を標識化することによって生成することができる。あるいは、第１の反応性リガンド（例えば、一次アミンなどの求核反応性リガンド）を含むポリヌクレオチドは、第１の反応性リガンドと適合性のある第２の反応性リガンド（例えば、活性エステル、例えば、ＮＨＳエステルなどの求電子反応性リガンド）を含む式（Ｉ）の化合物とそれを反応させることによって標識化することができる。
【０３３４】
いくつかの実施形態では、式（Ｌ２）を有するホスホラミダイト化合物が提供され、
【化３０】
2021536500.tif 000035
可変置換基が、以下のように定義される。Ｂ１が、リン酸エステル保護基であり、別々に取られるＢ2およびＢ3が、最大１０個の炭素原子を含有する低級アルキル、低級アルケン、アリール、またはシクロアルキルであり、Ｂ5が、水素または酸切断可能なヒドロキシル保護基であり、Ｂが、ヌクレオシド／ヌクレオチド塩基であり、Ｄが、ＳｉＲ含有色素部分である。Ｂがプリンまたは７−デアザプリンである場合、糖部分は、プリンまたは７−デアザプリンのＮ9位で結合し、Ｂがピリミジンである場合、糖部分は、ピリミジンのＮ1位で結合する。ＢおよびＤは、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4位のうちの１つでＤに結合したリンカーを介して連結される。Ｂがプリンである場合、リンカーは、プリンの８位に結合し、Ｂが７−デアザプリンである場合、リンカーは、７−デアザプリンの７位に結合し、Ｂがピリミジンである場合、リンカーは、ピリミジンの５位に結合する。
【０３３５】
いくつかの実施形態では、Ｂ5は、トリフェニルメチルラジカルまたはその電子供与置換誘導体であり、本明細書で使用される場合、「電子供与」という用語は、それが一部である分子中の隣接原子に価電子を開放する置換基の傾向、すなわち、それが隣接原子に関して電気陽性であることを示す。いくつかの実施形態では、電子供与置換基としては、アミノ、低級アルキル、１〜８個の炭素原子を有する低級アリール、低級アルコキシなどが挙げられる。より好ましくは、電子供与置換基は、メトキシである。例示的なトリチルとしては、４，４’−ジメトキシトリチル、すなわち、ビス（ｐ−アニシル）フェニルメチル、モノメトキシトリチル、α−ナフチルジフェニルメチル、トリ（ｐ−メトキシフェニル）メチルなどが挙げられる。これらおよび他のトリチルの結合および切断条件は、ＧｒｅｅｎｅおよびＷｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１）に見出すことができる。
【０３３６】
一般に、式（Ｌ２）のヌクレオチドホスホラミダイトは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第９，７８３，５６０号に記載されるように合成され得る。
【０３３７】
式（Ｌ２）の化合物は、化学的に合成されたポリヌクレオチドの内部標識化に好適である。したがって、本明細書で開示されるＳｉＲ部分で標識化された塩基を含むポリヌクレオチドも本明細書で提供され、例えば、塩基が、式（Ｉ）のＲ1、Ｒ2、Ｒ3、またはＲ4を介してＳｉＲ部分に結合される。そのような標識ポリヌクレオチドは、ＤＮＡ配列決定プライマー、ＰＣＲプライマー、ポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ、ポリヌクレオチドライゲーションプローブなどとしてを含む、いくつかの重要な文脈において有用である。いくつかの実施形態では、標識化されたポリヌクレオチドは、蛍光エネルギー伝達がドナー色素とアクセプター色素またはクエンチャーとの間で行われるように位置する第２の色素またはクエンチャーをさらに含む。そのような多色素または色素／クエンチャーのエネルギー伝達ポリヌクレオチドは、例えば、Ｊｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９２：４３４７−４３５１（１９９５）のスペクトル調整が可能な配列決定プライマーとして、および例えば、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２１：３７６１−３７６６（１９９３）、米国特許第５，７２３，５９１号（ＴａｑＭａｎプローブ）、米国特許第８，２１１，６４４号（分子ビーコンプローブ）のハイブリダイゼーションプローブとしての用途を見出す。
【０３３８】
本明細書では、構造を有する標識ヌクレオシド／ヌクレオチドも提供され、
ＮＵＣ−ＤＹＥ
式中、ＮＵＣが、ヌクレオシド／ヌクレオチドまたはヌクレオシド／ヌクレオチド類似体であり、ＤＹＥが、本明細書に記載されるＳｉＲ含有色素部分である。ＮＵＣおよびＤＹＥは、リンカーによって接続することができ、そのリンカーは、式（Ｉ）のＲ1位またはＲ2位のうちの１つを介してＤＹＥに結合する。ＮＵＣがプリン塩基を含む場合、リンカーは、プリンの８位に結合することができ、ＮＵＣが７−デアザプリン塩基を含む場合、リンカーは、７−デアザプリンの７位に結合することができ、ＮＵＣがピリミジン塩基を含む場合、リンカーは、ピリミジンの５位に結合することができる。
【０３３９】
ヌクレオシド標識は、既知のリンカー、連結基、および関連する相補的官能基を用いる多数の既知のヌクレオシド／ヌクレオチド標識化技術のうちのいずれか１つを使用して達成され得る。一般に、ＳｉＲ化合物とヌクレオシドとを連結するリンカーは、（ｉ）ポリヌクレオチド合成条件に対して安定するべきであり、（ｉｉ）ポリヌクレオチド標的ハイブリダイゼーションを妨げるべきではなく、（ｉｉｉ）関連酵素、例えば、ポリメラーゼ、リガーゼなどと適合性であるべきであり、かつ（ｉｖ）色素の蛍光特性に悪影響を及ぼすべきではない。使用に好適な例示的な塩基標識化手順には、以下が含まれる。Ｇｉｂｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：６４５５−６４６７（１９８７）、Ｇｅｂｅｙｅｈｕ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４５１３−４５３５（１９８７）、Ｈａｒａｌａｍｂｉｄｉｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１５：４８５６−４８７６（１９８７）、Ｎｅｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，５（３）：２３３−２４１（１９８６）、Ｂｅｒｇｓｔｒｏｍ，  ｅｔ  ａｌ．，ＪＡＣＳ，１１１：３７４−３７５（１９８９）、米国特許第４，８５５，２２５号、同第５，２３１，１９１号、および同第５，４４９，７６７号。
【０３４０】
いくつかの実施形態では、リンカーは、アセチレンアミドまたはアルケニルアミド基を含み、色素とヌクレオシド／ヌクレオチド塩基との間のリンカーは、色素の活性化Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）エステルをヌクレオシド／ヌクレオチドのアルキニルアミノまたはアルケニルアミノ誘導体化塩基と反応させることによって形成される。さらなる実施形態では、得られるリンカーは、３−（カルボキシ）アミノ−１−プロピン−１−イルである。他の実施形態では、リンカーは、構造−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2ＯＣＨ2ＣＨ2ＮＲN6Ｘ−（式中、Ｘが、−Ｃ（Ｏ）−（ＣＨ2）n−Ｎ（ＲN7）−（式中、ｎが、１〜５の範囲であり）、−Ｃ（Ｏ）−Ａｒ−（ＣＨ2）n−Ｎ（ＲN7）−（式中、ｎが、１〜５の範囲であり）、または−Ｃ（Ｏ）−Ｃ≡Ｃ−ＣＨ2−Ｎ（ＲN7）−であり、ＲN7が、Ｈ、低級アルキル、または保護基であり、ＲN6が、Ｈまたは低級アルキルである。）を有する置換プロパルギルエトキシアミド基を含む。参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７７０，７１６号を参照されたい。
【０３４１】
いくつかの実施形態では、標識ヌクレオシド／ヌクレオチドは、式（Ｌ３）の化合物であり、
【化３１】
2021536500.tif 000036
式中、Ｂが、ヌクレオチド塩基、例えば、ウラシル、シトシン、デアザアデニン、またはデアザグアノシンであり、Ｗ1およびＷ2が、ＯＨ、またはポリメラーゼ媒介性テンプレート指向性重合を遮断することができる基、例えば、Ｈ、フッ素などであり、Ｗ3が、ＯＨ、または一リン酸、二リン酸、もしくは三リン酸もしくはリン酸アナログであり、Ｄが、本明細書に記載されるＳｉＲ部分であり、例えば、Ｂが、式（Ｉ）のR１、Ｒ２、Ｒ3、またはＲ4を介してＳｉＲ部分に結合している。例えば、化合物は、Ｗ3が、三リン酸であり、Ｗ2およびＷ1が、Ｈであるジデオキシヌクレオチ三リン酸であり得る。標識ジデオキシヌクレオチドは、例えば、蛍光検出を利用するサンガー型ＤＮＡ配列決定方法において、鎖終結剤として特定の用途を見出す。別の例として、化合物は、Ｗ3が、三リン酸であり、Ｗ2およびＷ1が、それぞれＯＨおよびＨであるデオキシヌクレオチド三リン酸であり得る。そのような標識デオキシヌクレオチドは、例えば、ＰＣＲまたはニック翻訳などの増幅反応における標識ポリメラーゼ伸長生成物における特定の用途を見出す。
【０３４２】
本開示によるホスホラミダイト化合物を使用した例示的な二重標識プライマーの調製を図８に示す。本開示によるＮＨＳエステル化合物を使用した例示的な二重標識プライマーの調製を図９に示す。
【０３４３】
有用な試薬および反応条件を含む、ホスホラミダイト化合物、ヌクレオシド、およびヌクレオチド調製に一般に関連するさらなる考察については、参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，０８，３７９号および同第９，７８３，５６０号を参照されたい。
【０３４４】
５．水溶性を増加させる部位
本明細書で提供されるＳｉＲ化合物の水溶性を増加させることは、例えば、水性環境においてより高い濃度でのＳｉＲ化合物の使用を可能にするため、および／または生細胞の無傷の細胞膜にＳｉＲ化合物を不透過性にするために望ましい場合がある。したがって、いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｅ、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、ＲN1、およびＲN2のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上が、極性基または荷電（例えば、アニオン性、カチオン性、または双性イオン性）基である１つ以上の可溶化官能基を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｅ、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、ＲN1、およびＲN2のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上が、酸素含有基、窒素含有基、もしくは塩素含有基、および／または水素結合ドナーもしくはアクセプターなどの１つ以上の極性基を含む。いくつかの実施形態では、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｅ、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、ＲN1、およびＲN2のうちの少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、またはそれ以上が、酸素含有基、窒素含有基、または塩素含有基などの１つ以上の極性基を含む。例示的な可溶化官能基としては、カルボキシル、アミン、アルコール、ニトロ、クロロ、カルボニル、エステル、硫酸、スルホネート、リン酸、ホスホネート、エーテル（例えば、ポリエチレンオキシド）、アミド、カーボネート、カルバメートなどが挙げられる。
【０３４５】
いくつかの実施形態では、可溶化官能基は、リンカーの一部として提供され得る。例えば、ポリエチレンオキシドリンカー、−（ＣＨ2ＣH2Ｏ）n−が提供され得、例えば、式中、ｎが、少なくとも３など、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれ以上である。いくつかの実施形態では、そのようなリンカーは、さらなる誘導体化に有用な反応性リガンド、例えば、ＮＨＳエステル、カルボキシル、カルボキシレスター（ｃａｒｂｏｘｙｌｅｓｔｅｒ）、マレイミド、アミド、スルホジクロロフェニル（ＳＤＰ）エステル、スルホテトラフルオロフェニル（ＳＴＰ）エステル、テトラフルオロフェニル（ＴＦＰ）エステル、ペンタフルオロフェニル（ＰＦＰ）エステル、アセトキシメチル（ＡＭ）エステル、または本明細書に記載される他の反応性リガンドを１つの末端に含むことができる。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、可溶化官能基は、アリールまたはヘテロアリール上の置換基として提供され得る。いくつかの実施形態では、化合物は、同じでも異なっていてもよい（例えば、スルホネート）、少なくとも１、２、または３つの可溶化官能基で置換されたアリールまたはヘテロアリール（例えば、フェニル）を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、互いにメタ方向の２つのスルホン酸などの少なくとも１つ、例えば少なくとも２つのスルホン酸で置換されたアリールまたはヘテロアリール（例えば、フェニル）を含む。
【０３４７】
例示的な可溶化置換基は、ポリエチレンオキシドリンカー、反応性リガンド、および２つのスルホネートで置換されたフェニルを含むもの、例えば、
【化３２】
2021536500.tif 000037
であり、波線が、ＳｉＲ部分への接続を示す。例えば、化合物１０Ａ〜１４を参照されたい。図１０Ｂも参照されたい。そのような化合物のアミンは、例えば、カルボキシルの活性化によって生成される酸塩化物または他の求電子剤などの反応性リガンドに結合することができる。いくつかの実施形態では、上記で考察したもののうちのいずれかなどの可溶化置換基は、式（Ｉ）のＲ3位に結合している。いくつかの実施形態では、上記で考察したもののうちのいずれかなどの可溶化置換基は、式（Ｉ）のＲ4位に結合している。
【０３４８】
６．使用；染色および検出方法
本明細書に提供されるＳｉＲ化合物およびコンジュゲートは、様々な生物学的用途において使用することができる。ＳｉＲ化合物およびコンジュゲートは、他の特徴を犠牲にすることなく、明るさおよび光安定性の増加を含む、予期しない特性を有することが見出されている。驚くべきことに、Ｒ１またはＲ２位でのＳｉＲ化合物のコンジュゲーションは、化合物の光化学特性に悪影響を及ぼさず、むしろ明るさおよび光安定性が増加していることが見られた（例えば、化合物４、５、および６を参照されたい）。
【０３４９】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供されるＳｉＲ化合物を使用して、細胞、細胞構造、器官、標的分子などを標識化または染色することができる。いくつかの実施形態では、細胞または細胞構造を染色または標識化する方法が提供され、その方法は、ａ）１つ以上の細胞または細胞構造を含有する試料を式（Ｉ）のＳｉＲ化合物と接触させて、接触試料を形成することと、ｂ）接触試料を適切な時間インキュベートして、インキュベート試料を形成することと、ｃ）試料を適切な波長で照明して、照明試料を形成することと、ｄ）照明試料からの蛍光発光を検出することと、を含む。
【０３５０】
いくつかの実施形態では、標的分子を検出する方法が提供され、その方法は、ａ）標的分子を含有するかまたは含有すると考えられる試料を式（Ｉ）のＳｉＲ化合物と接触させて、接触試料を形成することと、ｂ）接触試料を適切な時間インキュベートして、インキュベート試料を形成することと、ｃ）試料を適切な波長で照射して、照明試料を形成することと、ｄ）照明試料から蛍光発光を検出することと、を含み、蛍光発光が、標的分子を検出するために使用される。
【０３５１】
いくつかの実施形態では、生物学的構造を検出するための方法が提供され、その方法は、ａ）特定の生物学的構造を含有するか、または含有すると考えられる試料を、式（Ｉ）のＳｉＲ化合物と組み合わせることであって、該生物学的構造が、核酸を含有する、組み合わせることと、ｂ）組み合わされた試料およびＳｉＲ化合物を、ＳｉＲ化合物が生物学的構造中の核酸と組み合わされるのに十分な時間インキュベートして、生物学的構造に対応する検出可能な蛍光信号を有するＳｉＲ核酸複合体のパターンを形成することと、ｃ）生物学的構造に対応する蛍光信号を検出することと、を含む。
【０３５２】
いくつかの実施形態では、本明細書に提供される方法で使用される化合物は、１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、２Ａ、３、４Ａ、５、６、７、７Ａ、７Ｂ、８、９、１０Ａ、１０Ｂ、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および５９から、またはそれらの開環形態もしくはスピロラクトン形態、および／または塩もしくは遊離酸から選択される。
【０３５３】
標識抗体。いくつかの実施形態では、本明細書に提供されるＳｉＲ部分は、本明細書に記載される抗体にコンジュゲートして、抗体を含む式（Ｉ）の化合物を提供することができる。したがって、抗原、または抗原を含む細胞、細胞成分、組織などを染色または検出するための方法が提供され、その方法は、抗原を含むと疑われる試料を、抗原に特異的な抗体を含む式（Ｉ）の化合物と接触させることを含む。また、抗原、または抗原を含む細胞、細胞成分、組織などを染色または検出するための方法も本明細書で提供され、その方法は、抗原を含むと疑われる試料を、抗原に特異的な一次抗体と接触させることと、一次抗体を、一次抗体に特異的な抗体（すなわち、本明細書に開示されるＳｉＲ部分で標識化された二次抗体）を含む式（Ｉ）の化合物と接触させることとを含む。対象の抗原、または抗原を含む細胞、細胞成分、組織などを染色または検出するための一次抗体または二次抗体としてのそのような式（Ｉ）の化合物の対応する使用も提供される。そのような方法および使用は、免疫蛍光、免疫組織化学、フローサイトメトリー（例えば、ＦＡＣＳ）、ウエスタンブロッティング、蛍光ＥＬＩＳＡ、および蛍光標識抗体を使用することができる任意の他のアプローチを包含する。
【０３５４】
細胞骨格染色。いくつかの実施形態では、本開示のＳｉＲ部分を本明細書に記載される細胞骨格結合部分にコンジュゲートして、細胞骨格結合部分を含む式（Ｉ）の化合物を提供することができる。したがって、細胞骨格成分（例えば、アクチンまたは微小管）を染色または検出するための方法が提供され、その方法は、細胞試料（例えば、透過細胞および／または固定細胞を含む）を、細胞骨格結合部分（例えば、本明細書に記載されるものうちのいずれかなどのアクチンまたは微小管結合部分）を含む式（Ｉ）の化合物と接触させることを含む。
【０３５５】
核酸染色および検出。いくつかの実施形態では、本開示のＳｉＲ部分を本明細書に記載される核酸結合部分にコンジュゲートして、核酸結合部分を含む式（Ｉ）の化合物を提供することができる。いくつかの実施形態では、本開示のＳｉＲ部分は、ポリヌクレオチドに結合することができるか、またはポリヌクレオチドに組み込まれるヌクレオチドに結合することができ、それらは、次いで標識プライマーまたはプローブとして機能することができる。そのような化合物は、核酸ポリマーを含有するか、または含有すると考えられる試料と組み合わせることができ、次いで、化合物と試料との混合物は、化合物が試料中の核酸ポリマーと組み合わされるのに十分な時間インキュベートされて、検出可能な蛍光信号を有する１つ以上の化合物核酸複合体を形成する。核酸は、ＤＮＡ、例えばｄｓＤＮＡまたはｓｓＤＮＡであり得る。核酸はまた、ＲＮＡまたはＲＮＡ−ＤＮＡハイブリッドであり得る。化合物を使用して、水溶液、ＰＣＲなどの配列決定または増幅反応、細胞試料（例えば、ＦＩＳＨまたは一般的な核もしくは染色体染色のための）、および電気泳動ゲル中などの様々な試料中の核酸を標識化または検出することができる。当業者は、一般的な核酸またはＤＮＡ結合部分を含む化合物をいつ使用するか、および特定の配列を標的とするプローブまたはプライマーをいつ使用するかを認識するであろう。
【０３５６】
いくつかの実施形態では、核酸を染色する方法が提供され、その方法は、核酸を含有するか、または含有すると考えられる試料を、式（Ｉ）の化合物と組み合わせることと、試料および化合物を、化合物が試料中の核酸と組み合わされるのに十分な時間インキュベートさせて、検出可能な蛍光信号を与える１つ以上の化合物核酸複合体を形成することと、を含む。いくつかの実施形態では、化合物は、１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、２Ａ、３、４Ａ、５、６、７、７Ａ、７Ｂ、８、９、１０Ａ、１０Ｂ、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および５９、またはその開環形態もしくはスピロラクトン形態、および／もしくは遊離酸から選択される。
【０３５７】
標的ポリヌクレオチドは、例えば、標的ポリヌクレオチドに特異的に結合することができる本明細書に記載されるＳｉＲ化合物を使用して、かつ例えば、複合体からの蛍光を検出することによって、または複合体形成から生じる蛍光の変化を検出することによって、標的ポリヌクレオチドとＳｉＲ化合物とを含む複合体が形成されたかどうかを決定して、特異的に検出することができ、任意に、複合体形成から生じる蛍光の変化は、切断または立体構造変化に起因するクエンチャーによるクエンチングの低減である。
【０３５８】
蛍光信号の存在、位置、強度、励起および発光スペクトル、蛍光偏光、蛍光寿命、ならびに他の物理的特性を含むＳｉＲ化合物−核酸複合体の特徴を使用して、試料の態様または部分を検出、区別、選別、定量化、および／または分析することができる。本開示の化合物は、異なるスペクトル特性を有する同一クラスの化合物を含む、１つ以上の追加の試薬（例えば、検出可能に異なる蛍光試薬）と組み合わせて任意に使用される（例えば、本明細書の他の箇所における発光および近赤外線色素のシフトの考察を参照されたい）。
【０３５９】
本明細書に開示されるＳｉＲ化合物を使用してポリヌクレオチドを配列決定する方法も提供される。当業者は、例えば、プライマー上の標識、ジデオキシヌクレオチドなどの鎖末端ヌクレオチド、または可逆的ターミネーターヌクレオチドもしくはジヌクレオチドとして、蛍光部分が配列決定方法に用いられ得る様々な方法を認識するであろう（可逆的ターミネーターヌクレオチドおよびジヌクレオチドの一般的な考察については、例えば、米国特許第８，０１７，３３８号、ＰＣＴ公開第ＷＯ２０８／０３７５６８号、および米国特許第７，４７６，５０４号を参照されたい）。検出前に、例えば、キャピラリー電気泳動などの電気泳動によって配列決定反応生成物が分離される配列決定方法を使用することができる。あるいは、生成物がインサイチュで検出される配列決定方法を使用することができる（例えば、上述の文書を参照されたい）。
【０３６０】
生／死細胞アッセイ。ある特定の実施形態は、例えば、フローサイトメトリーおよび蛍光顕微鏡法との使用に適合する、細胞を染色するおよび／または細胞生存率を評価するための方法、使用、または組成物を提供する。そのような方法および使用は、細胞または細胞混合物を、本明細書に開示されるＳｉＲ化合物とインキュベートすることと、細胞または細胞混合物に刺激を提供して、蛍光信号を誘発することと、蛍光信号を測定することと、を含むことができる。方法および使用は、例えば、蛍光の程度が所定の閾値（生存不可能を示す）を超えるかどうかを決定することによって、または結果を生集団および死集団（死細胞集団は、それらの損なわれた膜の完全性を考慮して、より大きな程度の染色を示す）にグループ化することによって、生細胞および／または死細胞の量を定量化することをさらに含むことができる。
【０３６１】
いくつかの実施形態では、本開示のＳｉＲ化合物は、生存不可能な真核細胞、例えばヒト細胞などの哺乳動物細胞に送達または通過される。細胞が光源で照射されると、蛍光発光が収集、検出、分析、または測定され得る。アッセイ中の細胞は、細胞死を誘導する物質または試薬、例えば、カンプトテシンまたはスタウロスポリンで処理され得る。データは、プレートリーダー、蛍光顕微鏡、またはフローサイトメータなどの任意の適切な蛍光検出装置を使用して取得され得る。
【０３６２】
いくつかの実施形態では、細胞または細胞の混合物は、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの追加の蛍光分子とインキュベートされ、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの追加の蛍光分子は、本開示による化合物からスペクトル的に区別可能であり、蛍光信号は、少なくとも１つ、２つ、３つ、または４つの追加の蛍光分子から測定される測定している。２つの供給源からの蛍光は、発光最大値が少なくとも３０ｎｍ離れている場合、または光学フィルタ、例えば、分子のうちの少なくとも１つからの蛍光がフィルタのうちの少なくとも１つによって差異的に低減される一対のフィルタの使用を通じて、供給源からの蛍光を区別することができる場合、スペクトル的に区別可能であると見なされる。
【０３６３】
別の実施形態では、アッセイ方法は、細胞が複数の容器に含有される場合に実行され得る。任意の容器において、細胞は、１つの型または異なる型の細胞であり得る。細胞は、例えば、異なる培地の存在下で、異なる条件下で成長した同じ型であってもよい。細胞のうちのいくつかは、アポトーシス誘導剤またはカスパーゼ阻害剤で処理されてもよい。複数の容器、アレイは、例えば、走査光源などの光源によって照射され得る。細胞は、同じまたは異なる生物のものであってもよい。
【０３６４】
超解像イメージングおよび顕微鏡法；単一分子の局在化。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、超解像または顕微鏡法で使用される。超解像撮像および顕微鏡法のレビューについては、Ｈｕａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．２００９；７８：９９３−１０１６、Ｌｅｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ  ２０１１；６５：９６７−９８０、およびＳｃｈｅｒｍｅｌｌｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．２０１０；１９０：１６５−１７５を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される化合物は、単一分子局在化顕微鏡法（例えば、生細胞内）で使用される。単一分子局在化顕微鏡法の詳細な考察については、Ｐａｔｔｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．２０１０；６１：３４５−３６７、Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００４；１０１：１１２９８−１１３０３、およびＳｈｔｅｎｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ２００９；１０６：３１２５−３１３０を参照されたい。任意のそのような方法または使用において、試料は、試料またはその対象の成分を化合物で染色するのを許容する条件下で、本明細書に記載される化合物（例えば、標的結合部分を含む）と接触することができる。次いで、超解像もしくは単一分子局在化撮像または顕微鏡技術に従って染色試料を撮像することができる。
【０３６５】
染色液。いくつかの実施形態では、本開示のＳｉＲ化合物は、ＳｉＲ化合物を染色溶液、例えば、試料および意図した用途と適合する水溶液または水混和性溶液に溶解させることによって使用のために調製される。細胞形態または生理学の最小限の摂動が望まれる生物学的試料については、染色溶液が適切に選択される。溶液アッセイについては、いくつかの実施形態では、染色溶液は、評価を受ける標的材料の天然立体構造に摂動を与えない。高濃度の有機溶媒、カチオン、および酸化剤も、一般に、０．０１％以上の濃度のイオン性洗剤ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）と同様に、蛍光を低下させる。しかしながら、いくつかの染色溶液添加剤は、化合物−核酸複合体の蛍光を干渉しない（例えば、最大８Ｍの尿素、最大１ｇ／ｍＬのＣｓＣｌ、溶液の最大５０％のホルムアミド、および最大４０％のスクロース）。本明細書で提供されるＳｉＲ化合物は、一般に、水単独よりも緩衝溶液中でより高い安定性を有し、β−メルカプトエタノールなどの遊離酸素ラジカルのレベルを低下させる薬剤は、化合物の安定性に寄与する。
【０３６６】
染色溶液は、本開示のＳｉＲ化合物を、水などの水性溶媒、緩衝生理食塩水などの緩衝溶液（いくつかの実施形態では、いくつかの生存率識別用途のための非リン酸）、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン（ＴＲＩＳ）緩衝液（例えば、ＥＤＴＡを含有する）、またはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、もしくはメタノールもしくはエタノールなどの低級アルコールなどの水混和性有機溶媒中に直接溶解させることによって作製することができる。ＳｉＲ化合物は、染色溶液で使用された約１００倍以上の濃度で有機溶媒（いくつかの実施形態では１００％のＤＭＳＯ）に予め溶解させ、次いで水または緩衝液などの水性溶媒で１回以上希釈して、その結果、ＳｉＲ化合物が有効量で存在することができる。
【０３６７】
本開示のＳｉＲ化合物の有効量は、標的材料と組み合わせて検出可能な蛍光応答を与えるのに十分な量である。溶液中のＳｉＲ化合物濃度は、試料中の標的材料に接触し、検出可能な信号を与えるのに十分でなければならないが、過剰な化合物は、バックグラウンド蛍光の問題を引き起こし得る。染色溶液の最適な濃度および組成は、試料の性質（物理的、生物学的、生化学的、および生理学的特性を含む）、ＳｉＲ化合物−試料相互作用の性質（核酸の部位への化合物の輸送速度を含む）、および行われる分析の性質によって決定され、以下の実施例に記載されるものなどの標準手順に従って決定することができる。
【０３６８】
試料型。ＳｉＲ化合物は、対象の生物学的材料、例えば、細胞（特定の種類のものであり得る）、抗原、細胞成分、または核酸を含有するか、または含有すると考えられる試料と組み合わされる。
【０３６９】
試料は、任意に、生物学的構造（すなわち、生物または生物の別個の単位）、または溶液（生物学的構造を含有する溶液を含む）、または固体もしくは半固体材料である。したがって、本開示を実践するために使用される試料材料は、任意に、溶液中に遊離しているか、固体もしくは半固体材料中もしくはその上に固定化されているか、生物学的構造から抽出されているか（例えば、溶解細胞、組織、生物、または器官から）、または生物学的構造内に封入されたままである。標的材料はまた、細胞の細胞質、細胞の細胞質中で見ることができるか、または細胞外にあり得る。標的がＳｉＲ化合物に結合するために、核酸が生物学的構造に封入されていなくても、標的を水性環境中で提供して、ＳｉＲ化合物に接触させることができる。
【０３７０】
試料は、天然または合成であってもよく、様々な供給源から得ることができる。試料中の標的材料の存在は、天然の生物学的プロセス、または合成もしくは実験方法論の成功もしくは失敗の結果、望ましくない汚染、または疾患状態に起因し得る。標的材料は、感染、トランスフェクション、または治療的処置によってなど、天然源に対して内因性であるか、または異物として導入され得る。標的材料は、試料のすべてまたは一部のみに存在し得、標的材料の存在を使用して、個々の試料を区別するか、または単一の試料内の一部または領域を区別するか、または試料または試料の特徴を識別することができる。
【０３７１】
いくつかの実施形態では、標的材料を含有する試料は、細胞であるか、または液体源から直接得られるか、もしくは固体材料（有機または無機）、もしくは細胞が培養のために導入された成長培地からの洗浄液として得られる水溶液もしくは水性混和溶液であるか、または、標的材料が評価のために配置された緩衝液である。標的材料が細胞内にある場合、細胞は、任意に、微生物を含む単一の細胞、または多細胞生物、胚、組織、生検試料、フィラメント、バイオフィルムなどを含む、二次元または三次元層での他の細胞と関連付けられた複数の細胞である。あるいは、試料は、固体であり、任意に、スミアもしくはスクレイプ、または濾過によって液体もしくは蒸気から除去された残留物である。本開示の一態様では、試料は、尿、脳脊髄液、血液、リンパ液、組織ホモジネート、間質性流体、細胞抽出物、粘液、唾液、痰、便、生理学的分泌物、または他の同様の流体などの分離された、または濾過されていない生物学的流体を含む、生物学的流体から得られる。あるいは、試料は、土壌、水、もしくは空気などの環境源から、または廃棄物の流れ、水源、供給ライン、もしくは生産ロットから取られるなどの産業資源から得られる。産業資源はまた、生物学的反応器、もしくは醸造などの食品発酵プロセスからの発酵培地、または、肉、ゲイン、農産物、もしくは乳製品などの食品も含む。
【０３７２】
標的材料が溶液中に存在する場合、試料溶液は、精製もしくは合成された標的材料のうちの１つから、細胞抽出物もしくはホモジネートもしくは他の生物学的流体などの粗混合物、または生物学的、工業的、もしくは環境的供給源からの希釈溶液まで変化し得る。場合によっては、化合物と組み合わせる前に、標的材料を溶液中の他の生体分子または流体の混合物から分離することが望ましい。核酸、ポリペプチド、代謝産物、オリゴおよび多糖類、脂質、ならびに他の生物学的分子との一般的に粗混合物からのそれらの組み合わせなど、様々な標的材料の分離および精製のための多くの技術が存在する。これらには、様々な支持体もしくは溶液を使用するか、または流れる流れの中で、クロマトグラフィー技術および電気泳動技術のような手段が含まれる。あるいは、生体分子の混合物は、非標的材料が分解され、より容易に除去することができるように、適切な分解酵素（例えば、ＲＮａｓｅ、ＤＮａｓｅ、および／またはプロテアーゼ）で処理され得る。
【０３７３】
試料の供給源および種類、ならびにＳｉＲ化合物の使用は、どの化合物の特徴、したがってどのＳｉＲ化合物が特定の試料を染色するのに最も有用であるかを決定するであろう。持続的な高強度照明（例えば、顕微鏡法）を利用して化合物の蛍光が検出される場合、一般的に使用される化合物（例えば、フルオレセイン）よりも光漂白速度が低いＳｉＲ化合物が好ましく、特に、生細胞での使用に好ましい。生体系に対する化合物の比較的低い毒性は、概して、化合物自体によって引き起こされる摂動がほとんどまたは全くない生物学的試料中の核酸の検査を可能にする。化合物が細胞膜またはゲルに浸透しなければならない場合、より永続的なＳｉＲ化合物が好ましいが、いくつかの細胞は、細胞膜にわたる受動的拡散以外の手段、例えば、食作用または他の種類の摂取によって、他の細胞に対して不浸透であることが示されている化合物を容易に取り込む。細胞を速やかにかつ容易に浸透する化合物は、必ずしもゲルに速やかに浸透するものではない。核酸がゲル上で染色される用途では、ＳｉＲ化合物はまた、高い結合親和性（例えば、Ｋd≧１０−6Ｍ）を有するように選択されるが、ゲルまたはキャピラリー電気泳動などの分離ステップを受ける前に、核酸が予め染色される用途では、より高い結合親和性（例えば、Ｋd≧１０−8Ｍ）が好ましく、良好な分離を保証する。溶液中の核酸を染色する際、高い結合親和性は、少量の核酸に対するより高い感度に転換されるが、中程度の結合親和性（例えば、１０−6Ｍ≦Ｋd≦１０−8Ｍ）を有する化合物は、より大きなダイナミックレンジにわたってより効果的である。ＳｉＲ化合物の光安定性、毒性、結合親和性、量子収率、および蛍光増強は、当該技術分野において既知の標準方法に従って決定される。
【０３７４】
追加の試薬。本開示のＳｉＲ化合物は、別個に検出可能な１つ以上の追加の試薬と併せて使用することができる。追加の試薬は、別々に使用される場合、例えば、同じ試料の異なるアリコートを染色するために使用される場合、または追加の試薬の信号が化合物−核酸複合体の蛍光信号と検出可能に異なるかどうかにかかわらず、試料の異なる部分または成分を染色する場合、別々に検出可能であり得る。あるいは、本開示のＳｉＲ化合物は、ＳｉＲ化合物と組み合わせて使用されることが所望される他の試薬とは異なる検出可能な応答を与えるように選択される。いくつかの実施形態では、追加の１つまたは複数の試薬は、蛍光性であり、化合物−核酸複合体とは異なるスペクトル特性を有する。例えば、本明細書に記載されるＳｉＲ化合物は、フルオレセインイソチオシアネートまたはフィコエリトリンで標識化されたものなどの一般的に使用される蛍光抗体と組み合わせて使用することができる。感度のレベルが異なる化合物間のスペクトル特性の差異を検出するために、任意の蛍光検出システム（目視検査を含む）を使用することができる。そのような差異としては、励起最大値の差、発光最大値の差、蛍光寿命の差、同じ励起波長または異なる波長での蛍光発光強度の差、吸光性の差、蛍光偏光の差、標的材料との組み合わせによる蛍光増強の差、またはそれらの組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。検出可能に異なる化合物は、任意に、異なるスペクトル特性および異なる選択性を有する本開示のＳｉＲ化合物のうちの１つである。本開示の一態様では、化合物−核酸複合体および追加の検出試薬は、同じまたは重複する励起スペクトルを有するが、例えば、≧１０ｎｍ、≧２０ｎｍ、または≧５０ｎｍで分離された発光最大値を有する、明らかに異なる発光スペクトルを有する。すべての蛍光試薬の同時励起は、各試薬に対して個々に準最適であるが、試薬の組み合わせに最適である波長で試料の励起を必要とし得る。あるいは、追加の試薬（複数可）は、主題の化合物−核酸複合体を励起するために使用される波長とは異なる波長で同時にまたは連続的に励起され得る。
【０３７５】
追加の化合物は、任意に、サイズ、形状、代謝状態、生理学的状態、遺伝子型、または他の生物学的パラメータもしくはそれらの組み合わせに従って、例えば、細胞またはその成分を含有する生物学的試料を分化するために使用される。追加の試薬は、任意に、同じ特徴に対して非選択的試薬の併用のために試料の特定の特性に対して選択的であるか、または試料の別の特徴に対して選択的である試薬との併用のために試料の１つの特徴に対して選択的である。本開示の一態様では、追加の１つまたは複数の化合物が細胞内で代謝されて、他の細胞内ではなく、ある特定の細胞内で蛍光生成物を得、その結果、本開示のシアニン化合物の蛍光応答が、そのような代謝プロセスが行われていない場合にのみ優勢となる。あるいは、追加の１つまたは複数の化合物は、細胞表面タンパク質または受容体、例えば、蛍光レクチンまたは抗体などの細胞のいくつかの外部成分に特異的である。本開示のさらに別の態様では、追加の１つまたは複数の化合物は、細胞膜を能動的または受動的に横切り、細胞膜の完全性または機能を示すために使用される（例えば、カルセインＡＭまたはＢＣＥＣＦ  ＡＭ）。別の態様では、追加の試薬は、ＡＴリッチ核酸に選択的に結合し、染色体バンディングを示すために使用される。本開示の別の態様では、追加の試薬は、器官染色、すなわち、特定の器官に対して選択的である染色であり、例えば、追加の試薬（複数可）は、ミトコンドリアへの潜在的な感受性取り込み（例えば、ローダミン１２３またはテトラメチルロサミン）のために、または生細胞の器官におけるｐＨ勾配に起因する取り込みのために選択され得る（例えば、Ｄｉｗｕ，ｅｔ  ａｌ．，ＣＹＴＯＭＥＴＲＹ  ｓｕｐｐ．７，ｐ７７，Ａｂｓｔｒａｃｔ  ４２６Ｂ（１９９４））。
【０３７６】
追加の化合物は、当該技術分野で一般的に知られている標準手順によって決定される化合物の最適濃度での有効量で存在するように分析される試料に添加される。各化合物は、意図される使用に応じて、任意に、別個の溶液中で調製されるか、または１つの溶液中で組み合わされる。上記のように、好適な波長で染色細胞を照射した後、細胞は、照射に対するそれらの蛍光応答に従って分析される。さらに、差次蛍光応答は、さらなる分析または実験のために、細胞または核酸を選別するための基礎として使用することができる。例えば、ある特定の手順を「生き残る」すべての細胞が選別されるか、または試料中のある特定の型のすべての細胞が選別される。細胞は、当該技術分野で、例えば、Ｍａｎｓｏｕｒらの米国特許第４，６６５，０２４号（１９８７）で既知の手順に従って、手動で、またはフローサイトメトリーなどの自動化された技術を使用して選別することができる。
【０３７７】
７．キット
別の態様では、本明細書に開示されるＳｉＲ化合物（本明細書に開示されるコンジュゲートであり得るが、必ずしもそうではない）および１つ以上の他の試薬を含むキットが提供される。本明細書に記載されるＳｉＲ化合物の任意の実施形態は、キットで提供することができる。いくつかの実施形態では、上述の少なくとも１つの追加の試薬が、本開示による化合物を有するキットに含まれる。ある特定の実施形態では、キットは、緩衝剤、精製媒体、または試料を含むバイアルのうちの１つ以上をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、細胞毒性薬、アポトーシス誘導剤、細胞、溶媒、または乾燥剤をさらに含む。キットはまた、本開示の方法、例えば、コンジュゲーション方法、アッセイ方法、または合成方法を実施するのに有用な試薬を含み得る。後者の例として、ビニル基を含む化合物には、置換基で化合物を誘導体化するためにチオール−エン反応を行うための試薬が提供され得るか、または反応性リガンド、例えば、本明細書に記載されるＮＨＳエステルもしくは他の反応性リガンドを含む化合物には、置換基で化合物を誘導体化するために求核置換反応を行うための試薬が提供され得る。いくつかの実施形態では、キットは、有機溶媒および乾燥剤のうちの少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ＤＭＳＯ。いくつかの実施形態では、キットは、溶媒、緩衝剤、安定剤、ｐＨ調整剤などの少なくとも１つの追加の物質をさらに含む。いくつかの実施形態では、キットは、アンチフェード試薬をさらに含む。
【０３７８】
キットはまた、真核細胞を含み得る。いくつかの実施形態では、キットは、フローサイトメトリーとの使用に適合している。いくつかの実施形態では、キットは、蛍光顕微鏡法との使用に適合している。いくつかの実施形態では、キットは、化合物を抗体にコンジュゲートするための試薬を含む。
【０３７９】
いくつかの実施形態では、キット中のＳｉＲ化合物は、例えば、二次抗体としての使用に好適であり得る抗体（例えば、ヒト、マウス、またはウサギなどの第２の種の抗体に特異的な、ウサギまたはヤギなどの第１の種由来の抗体であって、第２の種が第１の種と異なる抗体）にコンジュゲートされる。
【０３８０】
いくつかの実施形態では、キットは、核酸合成反応、例えばＰＣＲ、ｑＰＣＲ、もしくはｒｔＰＣＲ、またはＤＮＡ配列決定などの増幅反応との使用に適合している。そのようなキットは、ＮＴＰまたはｄＮＴＰ、ポリメラーゼ、および１つ以上のプライマーを含むことができる。ＮＴＰ／ｄＮＴＰまたはプライマーのうちの少なくとも１つが、本明細書に開示される化合物で標識化され得、またはキットは、本明細書に開示される化合物で標識化されたプローブをさらに含むことができる。いくつかの実施形態では、そのような標識プローブは、例えば、プローブを、ＴａｑＭａｎアッセイまたは分子ビーコンプローブを使用するアッセイなど、ＳｉＲ部分による蛍光を変化させる（例えば、増加させる）プローブの分解、切断、または立体構造変化を伴うアッセイで使用するのに好適にすることができる、ケイ素−ローダミン部分のクエンチャーまたはエネルギー伝達パートナーをさらに含む。
【０３８１】
ある特定の実施形態では、本明細書に開示されるキットは、本明細書に記載される化合物のうちの１つ以上と、１つ以上の化合物を保存する１つ以上の容器と、を含む。このキットは、１つ以上の化合物を調製する方法、または１つ以上のＳｉＲ化合物を含有する組成物を調製する方法、および化合物または化合物を含有する組成物を投与する方法についての説明書を任意に含有する。ある特定の実施形態では、キットは、本明細書に開示される方法を行うための説明書を含む。ある特定の実施形態では、その方法は、インビトロ法である。キットは、ＳｉＲ化合物を送達するための１つ以上の機器、またはシリンジ、ピペット、ピペットバルブ、スパチュラ、バイアル、シリンジニードル、およびそれらの様々な組み合わせを含むが、これらに限定されない化合物を含有する組成物をさらに含んでもよい。
【０３８２】
８．ＳｉＲ化合物および関連中間体の調製方法
本明細書に記載される化合物１、１Ａ、１Ｂ、１Ｃ、２、２Ａ、３、４Ａ、５、６、７、７Ａ、７Ｂ、８、９、１０Ａ、１０Ｂ、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４３、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、および５９を含む、式（Ｉ）の化合物を調製する方法が提供される。式（Ｉ）の化合物を調製するのに有用な合成中間体を調製する方法も提供される。
【０３８３】
多くの官能化ＳｉＲ色素は、異なる生物学的用途のため、特に超解像イメージングおよび細胞内標的化のためにキサンテン部分を修飾することによって合成されている。しかしながら、キサンテン部分の修飾は、通常、吸収および発光波長、量子収率、および光安定性などの色素の光物理特性の著しい変化をもたらす。このため、１０位のケイ素でＳｉＲ色素化合物に官能基または反応基（複数可）を導入するための新しい合成戦略が本明細書に提供される。具体的には、１つ以上のビニル基が１０位に導入されて、モノビニルおよびビスビニルＳｉＲ色素を形成し、これらは、官能基または反応基（複数可）を導入するためにチオール−エン反応によってさらに誘導体化することができる。本明細書に提供される合成方法では、Ｓｉ−キサントン中間体は、関与しない（図２Ｂおよび２Ｅを参照されたい）。
【０３８４】
さらに、ＳｉＲ誘導体を作製するための現在の合成手順のほとんどは、非常に危険な試薬（例えば、ｔｅｒｔ−ブチルリチウム、ｓｅｃ−ブチリチウム、塩化チオニル、および６ＮＨＣｌ）を使用するとともに、長く骨の折れる合成ステップを必要とする。対照的に、本明細書に提供される合成アプローチは、重要なＳｉＲコア構造を作製するための２つのステップ、続いて、本明細書では「エチルスルフプロピオン酸リンカー」または「ＥＳＰリンカー」と称される、標的臓器について様々なリガンドとカップリングすることができるリンカーを提供する最終的なチオール−エン反応だけを必要とする（図２Ｂ〜２Ｅを参照されたい）。このＥＳＰリンカーを含む本開示のＳｉＲ化合物は、明るさおよび光安定性の増加を含む、予想外の特性を有する。
【０３８５】
さらに、メチルビニル−ＳｉＲ（化合物１）とのチオール−エン反応は、４〜１２個の原子の範囲の異なる長さのリンカーを提供することができる。フルオロフォアが標的リガンドに近接することは、ＳｉＲ生細胞蛍光プローブを設計する上で重要である。
【０３８６】
式（Ｉ）の化合物を調製するために有用な前駆体または合成中間体を表す式Ｐ１ａ、Ｐ１ｂ、Ｐ２、およびＰ２ａを以下に示す。この経路による例示的な化合物およびステップを図２Ｂ〜Ｅに示す。
【０３８７】
簡潔に述べると、最後から最初まで記載される第１の合成経路では、式（Ｉ）の化合物は、式（Ｐ２）の化合物および式（Ｐ２ａ）の化合物から調製することができる。式（Ｐ２ａ）の化合物は、既知の方法によって調製することができる。式（Ｐ２）の化合物は、式（Ｐ１ａ）および（Ｐ１ｂ）の化合物（同じであっても異なっていてもよい）、ならびにＳｉＣＬ2Ｒ1Ｒ2から調製することができる。式（Ｐ１ａ）および（Ｐ１ｂ）の化合物ならびにＳｉＣＬ2Ｒ1Ｒ2のすべては、既知の方法によって調製することができる。
【０３８８】
いくつかの実施形態では、式（Ｉ）の化合物を調製する方法が提供され、その方法は、式（Ｐ２）の化合物を、
【化３３】
2021536500.tif 000038
式（Ｐ２ａ）の化合物と、
【化３４】
2021536500.tif 000039
１００℃を超える温度で、ＣｕＢｒ2の存在下で反応させることを含み、式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4、Ｅ、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、Ｒ9、ＲN1、およびＲN2が、本明細書に記載される値を有し、それにより、式（Ｉ）の化合物を生成する。
【０３８９】
いくつかの実施形態では、式（Ｐ２）の化合物を調製する方法が提供され、
【化３５】
2021536500.tif 000040
その方法は、式（Ｐ１ａ）
【化３６】
2021536500.tif 000041
および式（Ｐ１ｂ）
【化３７】
2021536500.tif 000042
の化合物を、ブチルリチウムなどの有機リチウム塩基と、次いでＳｉＣＬ2Ｒ1Ｒ2と反応させることを含み、式中、Ｒ1、Ｒ2、Ｒ5、Ｒ6、Ｒ7、Ｒ8、ＲN1、およびＲN2が、本明細書に記載される値を有する。式（Ｐ２）の化合物を使用する方法はまた、上述の式（Ｐ２）の化合物を調製することを含み得る。
【０３９０】
式（Ｉ）のある特定の化合物の合成経路は、例えば、所望の置換基が式（Ｉ）の初期化合物をもたらすステップとあまり適合性がない、追加のステップをさらに含む。
【０３９１】
例えば、Ｒ1および／またはＲ2は、式（Ｉ）の初期化合物中のビニルであり得、次いで、チオール−エン反応および任意に追加のステップを介して誘導体化されて、本明細書に記載されるＲ1および／またはＲ2の他の値を提供することができる。チオール−エン反応は、チオール、例えば、Ｚが反応基、例えば、カルボキシルまたはアミンなどの本明細書に記載される反応基であるＨＳ−リンカー−Ｚを、Ｒ1および／またはＲ2がビニルである式（Ｉ）の化合物と反応させて、Ｒ1および／またはＲ2が反応基Ｚに連結される式（Ｉ）の化合物を提供することを含み得る。Ｚを使用して化合物をさらに誘導体化して、例えば、標的結合部分、例えば、核酸結合部分、細胞骨格結合部分などの本明細書に記載される標的結合部分へのコンジュゲートを提供することができる。例えば、とりわけ、化合物４〜６を参照されたい。
【０３９２】
あるいは、または加えて、Ｒ3またはＲ4は、式（Ｉ）の初期化合物中のカルボキシルであり得、次いで、さらに誘導体化されて、例えば、リンカーおよび反応性リガンドまたは標的結合部分を提供することができる。例えば、カルボキシルは、ＰＯＣＬ3を有するアシルクロリドに変換され、次いで、既知の化学（例えば、塩化物の求核置換を含む）を使用してさらに置換されて、化合物７および７Ｂなどの化合物に到達することができる（図２Ｅを参照されたい）。
【０３９３】
式（Ｉ）の様々な化合物を提供するのに有用な追加の詳細および任意のステップは、本明細書の他の箇所、例えば、図、実施例、ならびに上記の溶解性を増加させるためのコンジュゲート、反応性リガンド、ホスホロアミダイト、ヌクレオチドおよびヌクレオシド、ならびに部分の説明に記載される。
【実施例】
【０３９４】
以下の実施例は、特定の開示された実施形態を説明するために提供されており、決して本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。
実施例１．化合物の調製
【化３８】
2021536500.tif 000043
【０３９５】
十分に乾燥した１Ｌの三口丸底フラスコに、３−ブロモ−Ｎ，Ｎ−ジメチルアラニリン（２５ｇ、１２５．０ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＨＦ（３００ｍＬ）をフラスコに移した。反応混合物を−７８℃に冷却し、温度を３０分間維持した。ｎ−ＢｕＬｉ（５９．８ｍＬのヘキサン中の２．３Ｍのｎ−ＢｕＬｉ、１３７ｍｍｏｌ）を追加の漏斗に添加し、４５分間にわたって反応混合物に滴下した。同じ温度で１時間撹拌した後、メチルビニルジクロロシラン（１０．６１ｍＬ、８１．２ｍｍｏｌ）を反応混合物に−７８℃で添加した。ドライアイスバスを除去して、温度を室温（ＲＴ）に上昇させ、ＲＴで９０分間さらに攪拌した。反応混合物を、水でクエンチし、ロータリーエバポレーターを使用してＴＨＦの大部分を除去した。粗製物をＥｔＯＡＣ（１５０ｍＬ）で希釈し、水層をＥｔＯＡＣ（２×１５０ｍＬ）でさらに抽出した。合わせた有機層をブラインで洗浄し、Ｎａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物を、シリカゲル（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡＣ＝９：１）上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、３，３’−（メチル（ビニル）シランジイル）ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアラニリン）（１２．６ｇ、６５％）を得た。
【化３９】
2021536500.tif 000044
【０３９６】
７５ｍＬの圧力容器に、３，３’−（メチル（ビニル）シランジイル）ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアラニリン）（３．８ｇ、１２．２４ｍｍｏｌ）、２−カルボキシベンズアルデヒド（３．６７ｇ、２４．４８ｍｍｏｌ）、およびＣｕＢｒ2（２７３ｍｇ、１．２２ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、１２０℃で３時間撹拌した。室温まで冷却した後、深い青色の粗製物をＣＨＣｌ3（１５０ｍＬ）および水（１５０ｍＬ）に希釈した。水層をＣＨＣｌ3（１００ｍＬ×２）でさらに抽出し、合わせた有機層を分離漏斗に移した。有機層を、ＮＡ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。粗製物を、シリカゲル（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡＣ＝９：１）上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物１（８９０ｍｇ、１７％）を得た。
【化４０】
2021536500.tif 000045
【０３９７】
化合物１（４００ｍｇ、０．９１ｍｍｏｌ）を含有する２５０ｍＬの石英フラスコに、３−メルプトプロピオン酸（１５４ｍｇ、１．４５ｍｍｏｌ）、ＤＭＰＡ（５８ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）、およびＴＨＦ（２０ｍＬ）を添加した。フラスコをアルゴンバルーンに接続した。反応を室温で２時間、長い波長ＵＶ光で照射した。光分解反応混合物を、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。粗製物を、シリカゲル（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物２（３５０ｍｇ、７１％）および化合物３（４６ｍｇ、９％）を得た。
【化４１】
2021536500.tif 000046
【０３９８】
化合物２（３３０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ）を含有するフラスコに、ＤＭＦ（１０ｍＬ）、トリエチルアミン（２５２μＬ、１．８１ｍｍｏｌ）、およびＴＳＴＵ（３６３ｍｇ、１．２１ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物をＲＴで１．５時間撹拌した。回転蒸発を介して高真空ポンプを使用して溶媒を除去した。粗製物を、シリカゲル（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物２Ａ（２４３ｍｇ、６２％）を得た。
【化４２】
2021536500.tif 000047
【０３９９】
ＤＭＦ（２ｍＬ）中の２’−（４−ヒドロキシフェニル）−５−（４−メチル−１−ピペラジニル）−２，５’−ｂｉ（１Ｈ−ベンジイミダゾール）（２８ｍｇ、６６．０μｍｏｌ）の溶液に、Ｋ2ＣＯ3（２５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）および４−（ＢｏＣ−アミノ）ブチルブロミド（２１．６ｍｇ、８５．７ｍｍｏｌ）を添加し、反応混合物を６０℃で２４時間加熱した。溶媒を、回転蒸発を介して高真空ポンプを使用して除去した。粗製物を、シリカゲル（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝３：１）上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、中間体（１５ｍｇ、３８％）を得た。
【０４００】
ＤＣＭ（１．０ｍＬ）中の２０％のＴＦＡを中間体（１４ｍｇ、２３．５μｍｏｌ）に添加し、室温で１５分間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去して、Ｂｏｃで保護された中間体を得た。ＤＭＦ（２．０ｍＬ）中の化合物２Ａ（１２ｍｇ、１８．６μｍｏｌ）の溶液に、ＤＩＥＡ（１２ｍｇ、９３．２μｍｏｌ）およびＤＭＦ中のＢｏｃで保護された中間体（１．０ｍＬ）を添加して、反応物を室温で２時間撹拌した。回転蒸発を介して高真空ポンプを使用して溶媒を除去した。粗製物を、Ｃ−１８カラム（ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ、０％〜９５％勾配）上のＢｉｏｔａｇｅによって精製して、化合物４（１０．５ｍｇ、４４％）を得た。
【０４０１】
化合物４は、ケイ素原子上のステレオ中心およびスピロ−ラクト化により、２つのジアステレオマーの混合物として存在し得る。Ｂｉｏｔａｇｅ  Ｃ−１８精製中に、２つのジアステロマー（化合物４Ｂおよび化合物４Ｃ）を単離した。１つのジアステレオマーは、化合物４ＣよりもＴＬＣ上で実行がより遅かったため、このジアステロマーは、図中で「下部」と称され、化合物４Ｃは、「上部」と称される。しかしながら、出願人は、２つのジアステレオマーの構成がまだ割り当てられていないため、この指定は任意であることに留意する。
【化４３】
2021536500.tif 000048
【０４０２】
ＤＭＳＯ（８ｍＬ）中の化合物２Ａ（２００ｍｇ、０．３１ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ溶液（１：１、８ｍＬ）中の６−アミノヘキサン酸（６１ｍｇ、０．４７ｍｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（１２０ｍｇ、０．９３ｍｍｏｌ）の溶液を添加し、室温で２時間撹拌した。粗製物を、Ｃ−１８カラム（ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ、０％〜９５％勾配）上のＢｉｏｔａｇｅによって精製して、中間体（８０ｍｇ）を得た。
【０４０３】
ドセタキセル（１１７ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）をギ酸（３．０ｍＬ）中に溶解し、２０分間撹拌し、溶媒を除去して、３’−アミノドセタキセルを得た。中間体（８０ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（７３ｍｇ、０．６１ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（４ｍＬ）中のＰｙＡＯＰ（９５ｍｇ、０．１８ｍｍｏｌ）の溶液に、上記のＤＭＦ中（２ｍＬ）の３’−アミノドセタキセルを添加した。回転蒸発を介して高真空ポンプを使用して溶媒を除去した。粗製物を、シリカゲル（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝９：１）上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、化合物５（６５ｍｇ、１５％）を得た。
【０４０４】
化合物５の各ジアステロマーを、最終カラムクロマトグラフィー精製中に単離した。化合物５Ｂは、化合物５ＣよりもＴＬＣ上で実行がより遅かったため、このジアステロマーは、図中で「下部」と称され、化合物５Ｃは「上部」と称される。しかしながら、２つのジアステレオマーの正しい構成は、まだ割り当てられていない。
【化４４】
2021536500.tif 000049
【０４０５】
（４Ｒ，７Ｒ，１０Ｓ，１３Ｓ，１９Ｓ，Ｅ）−７−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−１０−（４−アミノブチル）−４−（４−ヒドロキシフェニル）−８，１３，１５，１９−テトラメチル−１−オキサ−５，８，１１−トリアザシクロノナデク−１５−エン−２，６，９，１２−テトラオン２，２，２−トリフルオロ酢酸1（２．０ｍｇ、２．５μｍｏｌ）を、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル−Ｎ−エチルアミン（３．３ｍｇ、０．０２５ｍｍｏｌ）を含有する０．３ｍＬの乾燥ＤＭＦ中に溶解した。化合物２Ａ（２．５ｍｇ、３．８μｍｏＬ）を０．１ｍＬのクロロホルムに溶解し、ペプチドの溶液に添加した。溶液を室温で１時間保持し、次いで蒸発乾固させた。残渣を、ＣＨＣｌ3／ＭｅＯＨ（１０：１）混合物を使用して分析用のアルミニウムで裏打ちされたＴＬＣプレート上で精製した。生成物の曲げをＴＬＣプレートから切断し、ＣＨＣｌ３−ＭｅＯＨ混合物で複数回抽出した。合わせた抽出物を濾過し、溶媒を蒸発させて、化合物６（２．０ｍｇ、６６％）を得た。
【０４０６】
Ｍｉｌｒｏｙ，Ｌｅｃｈ−Ｇｕｓｔａｖ  ｅｔ  ａｌ．，“Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  Ｓｔａｔｉｃ  Ａｃｔｉｎ  ｉｎ  Ｌｉｖｅ  Ｃｅｌｌｓ”Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，ｖｏｌ．１３４，Ａｐｒ．４，２０１２，ｐｐ８４８０−８４８６．
【０４０７】
化合物６Ａを、以下に示す反応スキームに従って合成した。
【化４５】
2021536500.tif 000050
【０４０８】
ＤＭＦ（１．５ｍＬ）中の２Ａ（１００ｍｇ、０．１５５ｍｍｏｌ）の溶液に、ＤＩ−水（０．５ｍＬ）中のアミノ−ＰＥＧ4酸（４３ｍｇ、０．１７ｍｏｌ）、およびＤＩＥＡ（６０ｍｇ、０．４７ｍｏｌ）の溶液を添加した。反応混合物を３０分間撹拌し、溶媒を除去した。粗製物を、Ｃ−１８カラム（ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ、０％〜８０％勾配）上のＢｉｏｔａｇｅによって精製して、中間体（５０ｍｇ、４０％）を得た。
【０４０９】
中間体（６１ｍｇ、７６．２０μｍｍｏｌ）、ＤＩＥＡ（４１ｍｇ、０．３２ｍｍｏｌ）、およびＤＭＦ（２ｍＬ）中のＰｙＡＯＰ（５０ｍｇ、０．０９５ｍｍｏｌ）の溶液に、（４Ｒ，７Ｒ，１０Ｓ，１３Ｓ，１９Ｓ，Ｅ）−７−（（１Ｈ−インドール−３−イル）メチル）−１０−（４−アミノブチル）−４−（４−ヒドロキシフェニル）−８，１３，１５，１９−テトラメチル−１−オキサ−５，８，１１１−トリアザシクロノナデク−１５−エン−２，６，９，１２−テトラオン２，２，２−トリフルオロ酢酸（５０ｍｇ、６３．５μｍｏｌ）を添加した。反応混合物を室温で３０分間撹拌し、溶媒を、回転蒸発を介して高真空ポンプを使用して除去した。粗製物を、Ｃ−１８カラム（ＭｅＯＨ／Ｈ2Ｏ、０％〜９０％勾配）上のＢｉｏｔａｇｅによって精製して、化合物６Ａ（５１ｍｇ、５５％）を得た。
【０４１０】
化合物６Ａの各ジアステロマーを、最終カラムクロマトグラフィー精製中に単離した。化合物６Ａ−Ａは、化合物６Ａ〜ＢよりもＴＬＣ上で実行が遅かったため、このジアステロマーは、図中で「ＥＳＰ−ＰＥＧ４−Ａ」と称され、化合物６Ａ−Ｂは「ＥＳＰ−ＰＥＧ４−Ｂ」と称される。しかしながら、２つのジアステレオマーの正しい構成は、まだ割り当てられていない。ＰＥＧ12リンカーを含有する化合物６Ｂを、上記の手順に従って調製した。
【化４６】
2021536500.tif 000051
【０４１１】
化合物６Ｃの合成を以下に示す。
【化４７】
2021536500.tif 000052
【０４１２】
Ｃ６リンカーを含有する化合物６Ｃを、上記の化合物６を作製する手順に従って調製した。
【化４８】
2021536500.tif 000053
【０４１３】
十分に乾燥した５００ｍＬの三口丸底フラスコに、３−ブロモ−Ｎ、Ｎ−ジメチルアラニリン（６．０１ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、およびＴＨＦ（６０ｍＬ）を添加した。反応混合物を−７８℃に冷却し、温度を３０分間維持した。ｎ−ＢｕＬｉ（１２．０ｍＬの、ヘキサン中の２．５Ｍのｎ−ＢｕＬｉ、３０．０ｍｍｏｌ）を、−７８℃で５分間にわたってシリンジを使用して反応混合物に滴加した。同じ温度で３０分間撹拌した後、ジメチルジクロロシラン（１．５１ｍＬ、１２．５ｍｍｏｌ）を−７８℃で反応混合物に添加した。ドライアイス浴を除去して、温度を室温まで上昇させ、さらに室温で９０分間撹拌した。反応混合物を、飽和ＮＨ4Ｃｌ溶液でクエンチし、ＤＩ−水（６０ｍＬ）で希釈した。水層をＥｔＯＡＣ（３×６０ｍＬ）で抽出した。合わせた有機層をブライン（１００ｍＬ）で洗浄し、ＮＡ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、濃縮した。粗製物を、シリカゲル（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡＣ＝９：１）上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、３，３’−（ジメチルシランジイル）ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアラニリン）（２．９２ｇ、６５％）を得た。
【化４９】
2021536500.tif 000054
【０４１４】
７５ｍＬの圧力容器に、３，３’−（メチル（ビニル）シランジイル）ビス（Ｎ，Ｎ−ジメチルアラニリン）（２．８ｇ、９．３８ｍｍｏｌ）、２−カルボキシベンズアルデヒド（４．２３ｇ、２８．１４ｍｍｏｌ）、およびＣｕＢｒ2（２１０ｍｇ、０．９４ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を、１２０℃で３時間撹拌した。室温まで冷却した後、深い青色の粗製物をＣＨＣｌ3（１００ｍＬ）中に溶解し、２ＮのＮａＯＨ（１２０ｍＬ）で洗浄した。水層をＣＨＣｌ3（６０ｍＬ×２）でさらに抽出し、合わせた有機層を分離漏斗に移した。有機層をＮａ2ＳＯ4上で乾燥させ、濾過し、ロータリーエバポレーターを使用して濃縮した。粗物を、シリカゲル（Ｈｅｘ：ＥｔＯＡＣ＝９：１）上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）安息香酸（８２８ｍｇ、２１％）を得た。
【化５０】
2021536500.tif 000055
【０４１５】
１，２−ジクロロエタン（４ｍＬ）中の２−（７−（ジメチルアミノ）−３−（ジメチルイミノ）−５，５−ジメチル−３，５−ジヒドロジベンゾ［ｂ，ｅ］シリン−１０−イル）安息香酸（３００ｍｇ、０．７０ｍｍｏｌ）の溶液に、ＰＯＣｌ3（１．９６ｍＬ、２１．０ｍｍｏｌ）を添加した。反応混合物を４時間撹拌した。揮発性材料を、ハウス真空下でロータリーエバポレーター上で除去して、アシル化粗製物を得た。
【０４１６】
ｔｅｒｔ−ブチルピペリジン−４−カルボン酸（１８６ｍｇ、０．８４ｍｍｏｌ）およびＤＣＭ／ＭｅＣＮ（１：１、１４ｍＬ）を、上記のアシル化粗製物を含有するフラスコに添加した。この溶液に、トリエチルアミン（１．９５ｍＬ、１４．０ｍｍｏｌ）を０℃で添加し、さらに室温で１５時間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去した。粗製物を、Ｃ−１８カラム（脱イオン水（０．１％のＴＦＡ）／アセトニトリル（０．１％のＴＦＡ）、０〜９５％勾配）上のＢｉｏｔａｇｅによって精製して、エステル化合物（２８７ｍｇ）を得た。
【０４１７】
ＤＣＭ中の５０％のＴＦＡをエステル化合物に添加し、２時間撹拌した。揮発性材料をロータリーエバポレーターによって除去し、粗製物をＣ−１８カラム（脱イオン水（０．１％のＴＦＡ）／アセトニトリル（０．１％のＴＦＡ）、０〜９５％勾配）上のＢｉｏｔａｇｅによって精製して、化合物７Ａ（１８８ｍｇ、３ステップにわたって４１％）を得た。
【化５１】
2021536500.tif 000056
【０４１８】
４−［６−（４−メチル−１−ピペラジニル）−１Ｈ−ベンジイミダゾール−２−イル］−２−ベンゼンジアミン（５０ｍｇ、０．１６ｍｍｏｌ）およびＡｃＯＨ（５．０ｍＬ）中の４−ヒドロキシ−３−ニトロベンザルデヒド（３９ｍｇ、０．２３ｍｍｏｌ）の溶液を１３０℃で３時間加熱した。溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去した。粗製物を、シリカゲル（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝３：１）上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、中間体１（２２ｍｇ、１８％）を得た。
【０４１９】
中間体１（２０ｍｇ、４２．６μｍｏｌ）、４−（ＢｏＣ−アミノ）ブチルブロミド（１４ｍｇ、５５．４μｍｏｌ）、およびＫ2ＣＯ3（１５．９ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に溶解した。反応混合物を５時間撹拌した。回転蒸発を介して高真空ポンプを使用して溶媒を除去した。粗製物を、シリカゲル（ＣＨＣｌ3：ＭｅＯＨ＝４：１）上でカラムクロマトグラフィーによって精製して、を得て、中間体２（８ｍｇ、２９％）を得た。
【０４２０】
ＤＣＭ（１ｍＬ）中の３０％のＴＦＡ中の中間体２（４．４ｍｇ、６．８７μｍｏｌ）の溶液を１０分間撹拌した。溶媒をロータリーエバポレーターを使用して除去した。ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の化合物７Ａ（５．０ｍｇ、８．７μｍｏｌ）の溶液に、ＰｙＡＯＰ（５．４ｍｇ、１０．３μｍｏｌ）およびＤＩＥＡ（４．４ｍｇ．３４．３μｍｏｌ）を添加した。室温で５分間撹拌した後、ＤＭＦ（１．０ｍＬ）中の脱保護中間体を上記の溶液に添加した。反応混合物を室温で２時間撹拌した。回転蒸発を介して高真空ポンプを使用して溶媒を除去した。粗製物を、Ｃ−１８カラム（脱イオン水（０．１％のＴＦＡ）／アセコニトリル（０．１％のＴＦＡ）、０〜９５％勾配）上のＢｉｏｔａｇｅによって精製して、化合物７Ｂ（５．５ｍｇ、５３％）を得た。
【０４２１】
実施例２．核染色
化合物２ベースの蛍光材料の適用性を実証するために、ＥＳＰ−色素リンカー部位でＨｏｅｃｈｓｔ部分を組み込むことによって、生細胞核色素を合成した。意外なことに、化合物２ベースのプローブは、他の所望の特性を犠牲にすることなく、フルオロフォアの明るさを大幅に改善した。
【０４２２】
蛍光顕微鏡法を使用して、化合物４の蛍光強度をＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｅ、スイス）と比較した。生ＨｅＬａ細胞を、ＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔまたは化合物４により、１μＭまたは２μＭで、３７℃で３０分間染色した。ＬＣＩＳ緩衝液で洗浄して、過剰な色素を除去した後、蛍光顕微鏡のＣｙ５チャネルを使用して、５つの複製物から画像を収集し、ＨＣＳ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して分析した。細胞の代表的な画像を図３Ａ〜３Ｂ（ＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔで染色）および図３Ｃ〜３Ｄ（化合物４で染色）に示す。図３Ｅは、ＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔおよび化合物４で染色した細胞の核信号強度を比較する棒グラフを示す。化合物４で染色した細胞における平均核信号強度は、１μＭおよび２μＭでの蛍光強度の比の平均に基づいて、ＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔで染色した細胞よりも４８％高かった。
【０４２３】
実施例３．細胞骨格染色
化合物２ベースの蛍光材料の適用性をさらに実証するために、標的化リガンドであるドセタキセルを使用してチューブリンプローブも作製した。意外なことに、化合物２ベースのプローブは、他の所望の特性を犠牲にすることなく、フルオロフォアの明るさを大幅に改善した。化合物５（ドセタキセルを標的結合部分として使用するチューブリンプローブ）の蛍光強度をＳｉＲ−タキソール（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｏｍｅｒ、スイス）と比較した。生ＨｅＬａ細胞を、０．５μＭの化合物５またはＳｉＲ−タキソールにより、３７℃で３０分間染色し、撮像するために調製した。画像を図４Ａ〜４Ｂ（化合物５で染色）、および図４Ｃ〜４Ｄ（ＳｉＲ−タキソールで染色）に示す。化合物５で染色した細胞は、ＳｉＲ−タキソールで染色した細胞よりも明るい信号を示した。
【０４２４】
実施例４．生細胞および固定細胞における核染色、ならびに化合物７の光安定性
ＳｉＲ誘導体は、非蛍光スピロラクトンと蛍光双性イオンとの間のフェニル環上の２’−カルボキシル基を介して平衡に存在する。スピロラクトン形態は、ＳｉＲ細胞透過性を可能にする優勢な形態である。細胞不浸透性ＳｉＲ色素を作製するために、ピペリジンなどのかさばる二次アミンを２’−カルボキシル基上に組み込み、それにより、スピロラクトン化を防止し、ＳｉＲ色素を常に蛍光または「オン」にする。化合物７Ａを合成し、Ｈｏｅｃｈｓｔとカップリングして、化合物７を作製するか、またはニトロＨｏｅｃｈｓｔとカップリングして、化合物７Ｂを作製した（図２Ｅ）。
【０４２５】
化合物７の蛍光強度および光安定性を、遠赤色蛍光を有する固定細胞核酸染色であるＴＯ−ＰＲＯ−３と比較した。固定ＨｅＬａ細胞を、室温で１μＭの化合物７またはＴＯ−ＰＲＯ−３で３０分間染色し、蛍光顕微鏡のＣｙ５チャネルを使用して撮像するために調製した。図５Ｃに示されるように、化合物７の染色は、意外なことに、図５Ａに示されるＴＯ−ＰＲＯ−３染色よりも明るかった。化合物７は、図５Ｄに示されるように、励起光に１分間曝露した後も、実質的な蛍光を保持したが、図５Ｂに示されるように、ＴＯ−ＰＲＯ−３染色は、より減少した。
【０４２６】
Ｈｏｅｃｈｓｔ色素は、青色チャネルで蛍光性であるため、ＨｏｅｃｈｓｔコンジュゲートＳｉＲ色素の青色チャネルへのブリードスルーの可能性がある。ニトロ基をＨｏｅｓｃｈｔ部分に添加して、化合物７Ｂをもたらしたところ、驚いたことに、ブリードスルーは、ＤＡＰＩチャネルにおいて約５０％減少した。加えて、Ｃｙ５チャネルにおける信号は、驚くことに、約１２％増加した。
【０４２７】
ＨｅＬａ細胞を５ｋ／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ2インキュベーター内に一晩（ｏ／ｎ）放置した。次いで、細胞をホルムアルデヒド固定し、洗剤で透過させた。次いで、細胞を０．５μＭの最終濃度の化合物７または化合物７Ｂのいずれかで染色した。次いで、細胞を洗浄し、ＣｅｌｌＩｎｓｉｇｈｔ  ＣＸ５ハイコンテント撮像機器上で撮像した。図６Ａ〜６Ｄは、化合物７ＢがＣｙ５チャネルにおいて撮像されるとき、化合物７よりも明るく（それぞれ、図６Ａおよび６Ｃ）、ＤＡＰＩチャネルへのブリードスルーが少ないことを示す（それぞれ、図６Ｂおよび６Ｄ）。図６Ｅは、化合物７と比較して、化合物７Ｂの蛍光信号がＣｙ５チャネルにおいて１２％増加したことを示し（それぞれ、図６Ｅ、＃３および＃１を参照されたい）、化合物７Ｂの蛍光信号が、驚くことに、化合物７と比較して、ＤＡＰＩチャネルにおいて５０％減少したことを示す（それぞれ、図６Ｅ、＃４および＃２を参照されたい）。
【０４２８】
実施例５．化合物１０Ｂの光安定性
水溶性リンカーを本開示のＳｉＲ化合物に結合させることは、、それらの水溶性を増加させ、それは、抗体標識化および他の用途に有用である。本開示の水溶性ＳｉＲ色素およびそれらのコンジュゲートは、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ６４７コンジュゲートと比較して極めて光安定性であった。
【０４２９】
Ｈｅｌａ細胞をスライド上に配置し、５０μＭの化合物１０ＢまたはＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）６４７色素（「ＡＦ６４７」、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）で、２５℃で６０分間染色した。スライドを、光漂白を低減するために、ＰＲＯＬＯＮＧ（商標）Ｄｉａｍｏｎｄ（「ＰＬＤ」、ＴｈｅｒｍＯＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、マサチューセッツ州ウォルサム）またはＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（商標）（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、カリフォルニア州バーリンゲーム）で取り付け、カバースリップをした。図７Ｂは、各検体がどのように撮像されたか、および各検体について、３つの視野内の関心領域がスキャンのためにどのように選択されたかを示す。各領域を６３３ｎｍのレーザーを使用して共焦点顕微鏡で５０回スキャンし、次いで撮像した。ＡＦ６４７＋ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤは、完全に光漂白した（データ示さず）。図７Ａに示されるように、化合物１０Ｂで染色した検体における５０回のスキャン後に残った蛍光の割合は、使用された封入剤に関係なく、ＡＦ６４７で染色した検体中よりも大きかった。
【０４３０】
実施例６．開示されたＳｉＲ化合物の蛍光特徴
水に溶解した様々な開示された化合物およびＡＬＥＸＡ  ＦＬＵＯＲ（商標）６４７色素（ＡＦ６４７）（色素のみ）またはリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解したヤギ抗マウス（ＧＡＭ）ＩｇＧコンジュゲートとしての蛍光特徴を決定した。励起および発光最大値ならびに量子収率を決定するために、３つの反復を行った。色素のみの試料について量子収率を測定した。データを表３に示す（ＮＤ＝未定）。
【表３】
2021536500.tif 000057
【０４３１】
ある特定の化合物は、溶媒に溶解したときに試験した。励起および発光最大値を決定するために、３つの反復を行った。データを表４に示す。
【表４】
2021536500.tif 000058
【０４３２】
実施例７．近赤外線発光ＳｉＲホスホラミダイトおよび標識ポリヌクレオチド
シリル置換は、一般に、ローダミン色素に赤色に向かう７５ｎｍのスペクトルシフトを与える。６５０ｎｍを超えて発光する標識ヌクレオチドおよびポリヌクレオチド（例えばプライマーおよびプローブ）の合成のために、シリル置換をジクロロ−ローダミンホスホラミダイトに組み込んで、化合物５１〜５４を作成する。計算された発光最大値を下の表５に示す。
【表５】
2021536500.tif 000059
【０４３３】
化合物５４−ホスホラミダイトおよびＦＡＭホスホラミダイトを使用したＦＡＭおよびＳｉＲ標識プライマーの生成を図８に例示する。化合物５４（および同様の化合物）を使用して、ＦＲＥＴアッセイで使用するためのマルチクロモフォア構造の合成を自動化することができる。化合物５９のＮＨＳエステルからのＦＡＭおよびＳｉＲ部分で標識化されたプライマーの生成を図９に例示する。
【０４３４】
実施例８．固定細胞染色；抗体コンジュゲーション
ＳｉＲ化合物は、本明細書の他の箇所に記載されているように、双性イオン（開環）形態とスピロ（閉環）形態との間に平衡に存在する。標的結合部分のプローブへの標的結合部分の、固定細胞または抗体などのリガンドの標的への結合は、より蛍光性の開環形態に有利であり得るが、遊離の非結合ＳｉＲプローブは、主に閉環形態、例えば、可逆的疎水性凝集によって安定化された形態で存在し得る。
【０４３５】
異なる用途に使用することができるＳｉＲ化合物を与える経路を、図１０Ａ〜１０Ｂに示す。固定細胞を染色することができるＳｉＲ化合物の調製を図１０Ａに示す。
【０４３６】
いくつかのＳｉＲ色素は、可溶化官能基なしでは、いくつかの使用に対して十分に水溶性ではない場合があるため、水溶性リンカーをＳｉＲに結合させて、抗体標識化などのコンジュゲーションを容易にすることができる。例示的な可溶化置換基は、ポリエチレンオキシドリンカー、反応性リガンド、および２つのスルホネートで置換されたフェニルを含むもの、例えば、
【化５２】
2021536500.tif 000060
であり、波線が、ＳｉＲ部分への接続を示す。例えば、化合物１０Ａ〜１４を参照されたい。抗体標識化のための水溶性ＳｉＲの例示的な合成経路を、図１０Ｂに示す。
【０４３７】
本明細書に提供されるＳｉＲ化合物の水溶性はまた、１つ以上のスルホネート基の添加によっても増加することができる。例えば、化合物８を参照されたい。
【０４３８】
実施例９．ＳｉＲ化合物の蛍光特徴に対する置換およびコンジュゲーションの効果
化合物１０Ａ、１１、１２、および１３を使用して、吸収最大値に対する異なるＳｉＲ置換パターンの効果を調べるために実験を行った。化合物１１のビニル基のうちの１つまたは両方を、化合物１０Ａおよび１２のそれぞれの中のメチルで置き換える。化合物１３において、２つの環外アミンの各々上の１つのメチル基を、化合物１２と比較して排除した。各ビニル基がメチルに変化したとき、吸収最大値が約５ｎｍ、青色にシフトしたことが見出された。２つの環外アミンの各々上の１つのメチル基が排除されたとき、３０ｎｍのシフトが観察された（表６）。したがって、Ｓｉを介してＳｉＲ部分に連結した基を使用したＳｉＲ色素の修飾は、メチル基の除去よりも効果が小さい。
【表６】
2021536500.tif 000061
【０４３９】
吸光度（図１１Ａに示す）および発光（図１１Ｂに示す）最大値に対する、ＳｉＲ（この実施例では化合物８、１０Ａ、および１２）のＩｇＧへのコンジュゲーションの効果をＩｇＧ−ＡＦ６４７と比較した。ＳｉＲ−コンジュゲートの吸収および発光最大値（６６５ｎｍ／６９０ｎｍ）は、ＡＦ６４７コンジュゲートと比較して、約２０ｎｍ、赤色にシフトする。最大発光は、赤色に１５ｎｍ、シフトした。このシフトは、Ｃｙ５フィルタを使用する場合、ＡＦ６４７よりも少ない信号を生じた。
【０４４０】
ＨｅＬａ細胞を７．５ｋ／ウェルの密度で９６ウェルプレートに播種し、ＣＯ2インキュベーター内に一晩放置した。細胞を５０μＭでのエトポシドで処理した。次いで、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、細胞を４％ホルムアルデヒド中で１５分間固定した。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いでＰＢＳ中の０．２５％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で１５分間透過させた。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いでＰＢＳ中の１％のＢＳＡ中で１時間ブロックした。細胞をＰＢＳで１回洗浄し、次いで１〜１０００に希釈した一次抗体（Ｅｎｚｏ、ＡＤＩ−ＫＡＭ−ＣＣ２５５−Ｆ）とインキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、次いで５μｇ／ｍＬでコンジュゲートしたＡＦ６４７（ＤＯＬ４．９）または化合物１０Ａ（ＤＯＬ５．４）を有する二次抗体標識と１時間インキュベートした。細胞をＰＢＳで３回洗浄し、ＤＡＰＩで対染色した。Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｃｅｌｌｏｍｉｃｓ  ＡｒｒａｙＳｃａｎ  ＶＴＩ機器で撮像した。データ分析／グラフ化をＰｒｉｓｍで実施した。
【０４４１】
ＤＯＬが標識化度である、ＳｉＲコンジュゲート、化合物１０Ａ（ＤＯＬ＝１５）、および化合物１０Ａ（ＤＯＬ＝１０）の蛍光強度を、蛍光顕微鏡法を用いてＡＦ６４７コンジュゲートと比較した。生マウス細胞を、ＡＦ６４７にコンジュゲートしたマウス抗チューブリン（図１２Ａに示す）、または化合物１０Ａとコンジュゲートしたマウス抗チューブリン（図１２Ｂに示されるＤＯＬ＝１５）で、２５℃で６０分間、増加濃度で染色した。ＰＢＳ緩衝液で洗浄して、過剰な色素を除去した後、蛍光顕微鏡のＣｙ５チャネルを使用して、画像を収集し、統合ソフトウェアを使用して分析した。細胞の画像を図１２Ａ〜１２Ｂに示す。図１２Ｃは、蛍光対標識二次試薬の濃度を比較するグラフを示す。ＳｉＲ色素は、Ｃｙ５チャネルにおけるＡＦ６４７より６〜８倍暗い画像を与え、上述のシフトした最大値と一致した。ＳｉＲ色素−コンジュゲートは、良好な標的特異性を示し、オフターゲットまたはバックグラウンド蛍光は、観察されなかった。撮像中に、光漂白は、ほとんど、または全く観察されなかった。
【０４４２】
化合物１３および１４（図１Ｇに示される構造）から作製されたＳｉＲ−ヤギ抗マウス（ＧＡＭ）コンジュゲートの蛍光強度および光安定性を、ＡＦ６４７と比較した。
【０４４３】
Ａ５４９細胞を１ウェルあたり５，０００個の細胞の密度でＧｒａｉｎｅｒ９６ウェルプレート上に播種し、一晩接着させた。翌日、それらを５０μＭのエトポシドで、３７℃で２時間処理して、抗体プローブのためにｐＨ２ＡＸのリン酸化を誘導し、次いで、ＰＢＳ中で調製した４％のＰＦＡ中で、室温で２０分間固定した。固定後、細胞をＰＢＳ中で３回すすぎ、ＰＢＳ中で調製した０．１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００で２０分間透過させた。Ｔｒｉｔｏｎ処理後、細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、ＰＢＳ中の３％のＢＳＡで作製したブロック溶液中に入れた。各プレートを、５μｇ／ｍＬでのブロック溶液中で調製した一次抗体で処理し、室温で１時間、４℃でのいずれかで処理した。一次抗体とのインキュベーション後、細胞をＰＢＳ中で３回洗浄し、遮断溶液中に貯蔵した後、二次抗体でプローブした。化合物１３（ＤＯＬ４．７）、化合物１４（ＤＯＬ４．０）、またはＡＦ６４７（ＤＯＬ４．９）で標識化された二次抗体を、ブロック溶液中で５μｇ／ｍＬから調製し、細胞を室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ中で３回洗浄し、信号の定量化のためにプレートをＣＸ−５  Ｃｅｌｌｉｎｓｉｔｅｔに移動させた。蛍光信号データを７００秒超の期間にわたって毎秒収集した。データ分析／グラフ化をＰｒｉｓｍで実施した。
【０４４４】
蛍光強度を、励起光への約１２分間の曝露の期間にわたって、フェード防止封入剤なしで取り付けられた試料中で監視した。図１３に示されるように、化合物１３および１４の両方は、ＡＦ６４７と比較して、時間の経過を通して光漂白に対してはるかに耐性があった。
【０４４５】
実施例１０．近赤外線蛍光ＳｉＲ色素
化合物１８、２０、２２、２４、および２６（図１Ｉに示される）、化合物２８、２９、３０、３１、および３２（図１Ｊに示される）、化合物４５および４６（図１Ｍに示される）、ならびに化合物４７、４８、４９、および５０（図１Ｎに示される）を含む近赤外線蛍光ＳｉＲ色素を合成し、発光最大値について試験する。発光最大値は、化合物１などの化合物と比較して、赤色の波長に向かってシフトすることが見出される。
【０４４６】
実施例１１．核酸分析
化合物５１〜５４などのＳｉＲ−ホスホラミダイト化合物をポリヌクレオチド合成反応に使用して、蛍光標識化されたプライマーおよびプローブを提供する。プライマーおよびプローブは、反応生成物の標識化および／または検出を提供するために、増幅および配列決定反応に使用する。
【０４４７】
化合物５１〜５４は、蛍光標識化されたプライマーおよびプローブを提供するために、固体支持体合成を使用して、ポリヌクレオチドの化学的に自動化が可能な合成において使用することができる。
【０４４８】
配列決定反応生成物は、キャピラリー電気泳動によって分解し、検出することができる。
【０４４９】
増幅反応生成物は、ハイブリダイゼーションに依存する切断または立体配座変化を通じて生成物に依存する蛍光をもたらす二重標識プローブ（例えば、エネルギー伝達パートナー、例えば、ＴａｑＭａＮ（商標）または分子ビーコンプローブなどのクエンチャーを含む）を使用して、リアルタイムで検出することができる。
【０４５０】
実施例１２．ＥＳｐ−ＳｉＲ異性体による核染色
化合物２（エチルスルホプロピル−ケイ素ローダミン、ＥＳＰ−ＳｉＲ）ベースの蛍光材料の異なるジアステロマーの適用性を実証するために、生細胞核色素を、ＥＳＰ−ＳｉＲ色素リンカー部位でＨｏｅｃｈｓｔ部分を組み込むことによって合成した。意外なことに、２つの異性体（化合物４Ｂ）のうちの１つを使用して調製されたプローブは、他の所望の特性を犠牲にすることなく、フルオロフォアの明るさを大幅に改善した。
【０４５１】
蛍光顕微鏡法を用いて、化合物４（化合物４Ｂおよび化合物４Ｃ）の各異性体の蛍光強度を比較した。ＤＭＳＯ原液（１ｍＭ）を使用して、各異性体のプロベネシドを含有するＰＢＳ中の終濃度５、２．５、１．２５、および０．６μＭに溶液を調製した。
【０４５２】
生ＨｅＬａまたはＡ５４９細胞を、各濃度の異性体により、３７℃で３０分間染色した。ＬＣＩＳ緩衝液で洗浄して、過剰な染料を除去した後、蛍光顕微鏡のＣｙ５チャネルを使用して、５つの複製物から画像を収集し、ＨＣＳ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して分析した。図１４は、化合物４Ｂおよび４Ｃで染色した細胞の核信号強度を示す。平均核信号強度は、試験した各濃度で、化合物４Ｂで染色した両方の細胞型において、化合物４Ｃで染色した細胞よりもほぼ２倍高かった。
【０４５３】
蛍光顕微鏡法を使用して、化合物４Ｂおよび４Ｃの蛍光強度をＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔ（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｃｈｏｍｅ、スイス）と比較した。生ＨｅＬａ細胞を、ＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔまたは化合物４Ｂもしくは４Ｃにより、１μＭで３０分間、３７℃で染色した。ＬＣＩＳ緩衝液で洗浄して、過剰な色素を除去した後、蛍光顕微鏡のＣｙ５およびＤＡＰＩチャネルを使用して、５つの複製物から画像を収集し、ＨＣＳ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して分析した。図１５は、ＳｉＲ−Ｈｏｅｃｈｓｔならびに化合物４Ｂおよび４Ｃで染色した細胞の核信号強度を比較する棒グラフを示す。化合物４Ｂは、Ｃｙ５チャネル上のスピロクロム（スイス）由来のＳｉＲ色素と比較して、より高い信号強度を提示したが、３つすべての化合物についてＤＡＰＩチャネル上では、信号は、ほとんど観察されなかった。
【０４５４】
実施例１３．ＥＳＰ−ＳｉＲ異性体によるチューブリン染色
化合物２ベースの蛍光材料の適用性をさらに実証するために、標的化リガンドであるドセタキセルを使用してチューブリンプローブ（化合物５）も作製した。意外なことに、化合物２のジアステレオマーのうちの１つを使用して調製されたプローブ（化合物５Ａ）は、他の所望の特性を犠牲にすることなく、フルオロフォアの明るさを大幅に改善した。化合物５の２つのジアステロマーおよび２つの異性体の混合物の蛍光強度を、ＳｉＲ−タキソール（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｏｍｅｒ、スイス）と比較した。生ＨｅＬａ細胞を、０．５μＭの各化合物により、３７℃で３０分間染色し、撮像するために調製した。図１６は、試験した各化合物およびジアステロマーの混合物の信号強度を比較する棒グラフを示す。化合物５Ａ（タキソール−レッド（Ｂ）、ＴＬＣ上の下部スポット）は、化合物５Ｂ（タキソール−レッド（Ａ）、ＴＬＣ上の上部スポット）、ＡとＢとの混合物、ならびにスピロクロム由来のＳｉＲ−タキソール化合物と比較して、チューブリンへのよりはるかに良好な結合を有する。
【０４５５】
実施例１４．ＥＳＰ−ＳｉＲ異性体の細胞染色に対するリンカーの効果
化合物２ベースの蛍光材料の性能をさらに実証するために、環状ペプチドを標的結合部分として使用して、アクチンプローブを合成した。意外なことに、化合物２ベースのプローブ（化合物６）は、他の所望の特性を犠牲にすることなく、フルオロフォアの明るさを大幅に改善した。化合物６の蛍光強度をＳｉＲ−アクチン（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｅ，スイス）と比較した。
【０４５６】
化合物６の誘導体を試験して、細胞染色有効性に対するリンカー型の効果を比較した。ＰＥＧ4またはＰＥＧ12リンカーを含む誘導体を、Ｃ6リンカー（Ｘ−リンカー）を含む化合物６、リンカーを有しないアクチンプローブコンジュゲート、およびＳｉＲ−アクチン（Ｓｐｉｒｏｃｈｒｏｍｏｍｅ、スイス）と比較した。生ＨｅＬａ細胞を、１μＭの各化合物により３７℃で３０分間染色し、本明細書に記載されるように撮像するために調製した。生ＨｅＬａ細胞を、各濃度の異性体により、３７℃で３０分間染色した。ＬＣＩＳ緩衝液で洗浄して、過剰な色素を除去した後、蛍光顕微鏡のＣｙ５チャネルを使用して、５つの複製物から画像を収集し、ＨＣＳ  Ｓｔｕｄｉｏソフトウェアを使用して分析した。図１７Ａおよび図１７Ｂは、それぞれ、試験した各化合物の平均信号強度および信号強度をバックグラウンド（Ｓ／Ｂ）と比較する棒グラフを示す。全体的に、ＰＥＧ4リンカーを有する化合物６の誘導体は、生細胞および固定細胞の両方において最も低いバックグラウンド（最も高いＳ／Ｂ）および最も均一な染色を提示したが、ＰＥＧ12は、明らかに高いバックグラウンドおよび不均一な染色を示した。
【０４５７】
アクチン染色に対する化合物６−ＰＥＧ4の異なる異性体の効果も試験した。生ＨｅＬａ細胞を、１μＭの各化合物により３７℃で３０分間染色し、上述のように撮像するために調製した。図１８Ａは、平均信号強度化合物６Ａ−Ａ（ＥＳＰ−ＰＥＧ４−Ａ）、化合物６Ａ−Ｂ（ＥＳＰ−ＰＥＧ４−Ｂ）、単離された化合物６Ａ−Ａおよび６Ａ−Ｂの混合物（異性体分離前）、ならびに化合物６Ａ−Ａおよび６Ａ−Ｂの２つの単離された異性体の組み合わせを比較する棒グラフを示す。信号強度を、ＳｉＲ−アクチン（スピロクロム）で標識化された細胞と比較した。図１８Ｂは、試験した化合物の各々について、信号対バックグラウンド比を比較する棒グラフを示す。化合物６Ａ−Ａは、化合物６Ａ−Ｂの約３倍の明るさであるが、両方とも同じ局在化特異性を共有する。
【図１Ａ】
2021536500.tif 000111
【図１Ｂ】
2021536500.tif 000112
【図１Ｃ】
2021536500.tif 000113
【図１Ｄ】
2021536500.tif 000114
【図１Ｅ】
2021536500.tif 000115
【図１Ｆ】
2021536500.tif 000116
【図１Ｇ】
2021536500.tif 000117
【図１Ｈ】
2021536500.tif 000118
【図１Ｉ】
2021536500.tif 000119
【図１Ｊ】
2021536500.tif 000120
【図１Ｋ】
2021536500.tif 000121
【図１Ｌ】
2021536500.tif 000122
【図１Ｍ】
2021536500.tif 000123
【図１Ｎ】
2021536500.tif 000124
【図１Ｏ】
2021536500.tif 000125
【図１Ｐ】
2021536500.tif 000126
【図１Ｑ】
2021536500.tif 000127
【図１Ｒ】
2021536500.tif 000128
【図２Ａ】
2021536500.tif 000129
【図２Ｂ】
2021536500.tif 000130
【図２Ｃ】
2021536500.tif 000131
【図２Ｄ】
2021536500.tif 000132
【図２Ｅ】
2021536500.tif 000133
【図３Ａ】
2021536500.tif 000134
【図３Ｂ】
2021536500.tif 000135
【図３Ｃ】
2021536500.tif 000136
【図３Ｄ】
2021536500.tif 000137
【図３Ｅ】
2021536500.tif 000138
【図４Ａ】
2021536500.tif 000139
【図４Ｂ】
2021536500.tif 000140
【図４Ｃ】
2021536500.tif 000141
【図４Ｄ】
2021536500.tif 000142
【図５Ａ】
2021536500.tif 000143
【図５Ｂ】
2021536500.tif 000144
【図５Ｃ】
2021536500.tif 000145
【図５Ｄ】
2021536500.tif 000146
【図６Ａ】
2021536500.tif 000147
【図６Ｂ】
2021536500.tif 000148
【図６Ｃ】
2021536500.tif 000149
【図６Ｄ】
2021536500.tif 000150
【図６Ｅ】
2021536500.tif 000151
【図７Ａ】
2021536500.tif 000152
【図７Ｂ】
2021536500.tif 000153
【図８】
2021536500.tif 000154
【図９】
2021536500.tif 000155
【図１０Ａ】
2021536500.tif 000156
【図１０Ｂ】
2021536500.tif 000157
【図１１Ａ】
2021536500.tif 000158
【図１１Ｂ】
2021536500.tif 000159
【図１２Ａ】
2021536500.tif 000160
【図１２Ｂ】
2021536500.tif 000161
【図１２Ｃ】
2021536500.tif 000162
【図１３】
2021536500.tif 000163
【図１４】
2021536500.tif 000164
【図１５Ａ】
2021536500.tif 000165
【図１５Ｂ】
2021536500.tif 000166
【図１６】
2021536500.tif 000167
【図１７Ａ】
2021536500.tif 000168
【図１７Ｂ】
2021536500.tif 000169
【図１８Ａ】
2021536500.tif 000170
【図１８Ｂ】
2021536500.tif 000171
【国際調査報告】
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2021536500.tif 000173
2021536500.tif 000174
2021536500.tif 000175
2021536500.tif 000176
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