(57)【要約】  本発明は、骨関節炎の処置において、生理活性潤滑剤としての脊索細胞マトリックス溶液の使用、より特には、関節内補充療法における生理活性潤滑剤としての使用、に関する。該脊索細胞マトリックス溶液は、関節炎の関節における痛みを低減することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
骨関節炎（ＯＡ）の処置において使用する為の、脊索細胞マトリックス（ＮＣＭ）溶液。
【請求項２】
前記ＮＣＭ溶液が、ＯＡを患う患者の関節炎の関節における痛みを処置する為に使用される、請求項１に記載の、ＮＣＭ溶液の使用。
【請求項３】
前記ＮＣＭ溶液が、潤滑剤として使用される、請求項１又は２に記載の、ＮＣＭ溶液の使用。
【請求項４】
前記ＮＣＭ溶液が、関節内補充療法における生理活性潤滑剤として使用される、請求項１又は２に記載の、ＮＣＭ溶液の使用。
【請求項５】
前記溶液が、水性溶液である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の、ＮＣＭ溶液の使用。
【請求項６】
請求項１〜５のいずれか１項に記載の、ＮＣＭ溶液の使用であって、該ＮＣＭ溶液が、
動物ドナーの椎間板から脊索細胞（ＮＣ：notochordal  cell）に富んだ脊索髄性（ＮＰ：nucleus  pulposus）組織を採取すること；
該ＮＣに富んだＮＰ組織を凍結乾燥して該組織内の細胞を破壊し、それによって、乾燥した且つもろいマトリックスを得ること；
該乾燥した且つもろいマトリックスを粉砕して、乾燥した且つもろいＮＣマトリックス粉末を得ること；及び
該ＮＣマトリックス粉末を水性溶液中に溶解して、ＮＣＭ溶液を得ること
の工程を含む方法によって得られうる、前記使用。
【請求項７】
請求項１〜６のいずれか１項に記載の、ＮＣＭ溶液の使用であって、該ＮＣＭ溶液が、
動物ドナーの椎間板から脊索細胞（ＮＣ）に富んだ脊索髄性（ＮＰ）組織を採取すること；
該ＮＣに富んだＮＰ組織を凍結乾燥して組織内の細胞を破壊し、それによって、乾燥した且つもろい第１のマトリックスを得ること；
該乾燥した且つもろいマトリックスを溶媒で戻し、そして、該戻されたマトリックスを脱細胞して細胞及び核酸残存物を取り除くこと；
該脱細胞されたマトリックスを凍結乾燥して、乾燥した且つもろい第２のマトリックスを得ること；
該乾燥した且つもろい第２のマトリックスを粉砕して、乾燥した且つもろいＮＣマトリックス粉末を得ること；及び
該ＮＣマトリックス粉末を水性溶液に溶解して、ＮＣＭ溶液を得ること
の工程を含む方法によって得られうる、前記使用。
【請求項８】
前記ＮＣＭ溶液が、ブタの椎間板から得られる、請求項１〜７のいずれか１項に記載のＮＣＭ溶液の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、骨関節炎の処置における、生理活性潤滑剤としての脊索細胞マトリックスの方法及び使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
椎間板（ＩＶＤ：intervertebral  disc）再生の分野において、脊索細胞（ＮＣ：notochordal  cell）は、かなりの注目を浴びてきている。それらは、髄核細胞（ＮＰＣ：nucleus  pulposus  cell）マトリックスの生成及び増殖１２〜１５、並びに骨髄由来幹細胞（ＢＭＳＣ：bone  marrow-derived  stem  cell）の軟骨形成性の表現型への分化１６、１７を刺激する能力を有する可溶性因子を産生する。ＮＣ分泌因子に対する代替は、凍結乾燥及び粉砕されたブタＮＣマトリックス（ＮＣＭ：NC  matrix）の直接使用である。この物質は、ウシＮＰＣのイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）培養で適用されたが（de  Vries,  Stefan;  van  D,  MeijBjorn;  Tryfonidou,  Marianna;  Ito,  Keita.  Notochordal  Cell  Matrix  As  a  Therapeutic  Agent  for  Intervertebral  Disc  Regeneration.  Tissue  Engineering  Part  A.  June  2018:ten.tea.2018.0026.）、ここで、それは、ＮＣ分泌可溶性因子と比較してはるかに強力な同化作用を発揮した。その上、イヌのイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）試験においてＮＣＭの椎間板内注射は、同化作用及び抗炎症作用を有し、且つＩＶＤの水分供給を増加した（Bach  FC,  Tellegen  AR,  Beukers  M,  et  al.  Biologic  canine  and  human  Intervertebral  Disc  repair  by  notochordal  cell-derived  matrix:  from  bench  towards  bedside.  Oncotarget.  2018;9(41):26507-26526）。ＮＰＣは関節軟骨細胞に酷似するので、ＮＣＭはまた、これらの細胞を刺激する潜在能力を有しうる。その上、水性媒体中に低濃度で溶解された場合に、ＮＣＭは、ＨＡと類似した潤滑特性を有しうる粘稠な流体を形成する。
【０００３】
脊索細胞マトリックス（ＮＣＭ：Notochordal  cell  matrix）は、イン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）において、椎間板の髄核細胞において再生する能力を有する。ＮＣはヒト軟骨細胞において同化能力及び抗炎症能力を有する因子を分泌することがまた実証されている。その上、低濃度で溶解される場合に、ＮＣＭが、潤滑特性を有しうる粘稠な流体を形成する。それ故に、本発明は、骨関節炎（ＯＡ：osteoarthritic）の関節に施与する為の再生潤滑剤としてＮＣＭを使用する為の新規なアプローチを記載する。ＮＣＭの再生能力を試験する為に、ウシ軟骨細胞が播種されたアルギン酸ビーズが、ＮＣＭが補充された媒体中で培養された。加えて、炎症性の環境におけるＮＣＭの効果を調査する為に、アルギン酸ビーズがまたＩＬ−１βで刺激されたＮＣＭ中で培養された。最後に、ヒアルロン酸（ＨＡ：hyaluronic  acid）に対して且つヒアルロン酸と組み合わせてＮＣＭの潤滑特性を試験する為に、ガラス上の軟骨のレシプロ式のスライディング摩擦試験（reciprocating  sliding  friction  test）が実施された。ＮＣＭは、ＧＡＧの沈着及び細胞増殖、並びにＤＮＡに対するＧＡＧの比及びヒドロキシプロリン含有量を増加させた。これらの効果は、ＩＬ−１βの存在下で維持された。ＮＣＭはまた、ＩＬ−１β誘発性のＩＬ−６、ＩＬ−８、ＡＤＡＭＴＳ−５及びＭＭＰ−１３の発現も緩和した。その上、ＮＣＭは、６の試験スピード並びに６０ｍｍ／ｓで、ＨＡと類似して、摩擦係数（ＣｏＦ：coefficient  of  friction）の用量依存性の低下を誘発した。本発明に由来する結果は、ＮＣＭが、軟骨細胞に対して同化作用及び抗炎症効果を有すること、並びに好ましい潤滑特性を有することを示す。それ故に、関節内ＮＣＭ注射は、ＯＡ関節内の罹患した軟骨組織を修復しながら、痛みを最小限に抑える処置としての可能性を有しうるが、また更なる調査を請け負う。
【０００４】
関節軟骨（ＡＣ：articular  cartilage）は、流体で満たされた滑膜関節内で骨の関節面を覆う、平滑な含水組織の層である。滑液と共に、それは、運動中のこれらの関節において低摩擦を実現する。変性関節疾患である骨関節炎（ＯＡ：osteoarthritis）は、ＡＣ並びに滑膜及び軟骨下骨組織に影響を及ぼし、痛みを伴う関節運動障害を引き起こす。膝のＯＡは、全世界における痛み及び能力障害に対する主原因の１つであり、推計は米国内だけでも９３０万人の罹患者を示唆する１。
【０００５】
ＯＡは、運動及び痛み薬物療法を用いて当初保守的に処置される。後期段階において、非ステロイド系抗炎症薬又は関節内ステロイド注射が処方される（２）。別の処置選択肢は、関節内補充療法（３）、すなわち滑液中に天然に見られる大きな多糖類であるヒアルロン酸（ＨＡ：hyaluronic  acid）の関節内注射、である（４）。ＨＡは、粘弾性の提供に加えて、滑液の粘度（５）を増加させ、それによって関節の流体潤滑に寄与する（６、７）。その上、軟骨表面でおの分子相互作用に起因して、それは境界潤滑にもやはり寄与する（８）。ＯＡにより、ＨＡは分解し、その結果、濃度の低下及び低分子量断片を引き起こすが、それは滑液の潤滑特性に影響を及ぼす（９）。ＨＡの関節への注射は、滑液粘度を増加させ、そして痛みを最小限に抑えて、人工膝関節全置換を遅延させることを目的とする。メタ分析は、ＨＡ関節内補充療法の有効性に関して矛盾する結果を提供するが（１０）、それは痛みを伴う膝ＯＡに対する安全且つ有効な処置であると一般的に考えられている（１１）。ＨＡのプラスの効果にもかかわらず、それは症状緩和を提供のみを提供し、罹患した軟骨を健康な状態まで修復しない。それ故に、他の選択肢が検討されるべきである。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
関節内補充療法において使用されることができる潤滑特性を用いた解決策、すなわちＯＡに患う患者の関節炎の関節において滑液の潤滑特性を増加させる為の処置を提供すること、が本発明の目的である。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
ＮＣＭ溶液はＨＡ溶液と同様の潤滑特性を有し、且つ摩擦係数（ＣｏＦ）を低下させることが判った。ＣｏＦの低下は関節内の痛み低下に寄与し、従って痛みを最低限に抑え且つＯＡに患う患者に救済をもたらす。
【０００８】
従って、本発明は、骨関節炎（ＯＡ）の処置におけるＮＣＭ溶液の使用、より特にはＯＡの処置における関節内補充療法の使用、を提供する。本発明の目的の為の関節内補充療法は、関節内に潤滑剤を直接関節内注射することによるＯＡの処置であると理解される。好ましくは、本発明は、ＯＡに患う患者の骨関節炎の関節における痛みの処置におけるＮＣＭ溶液の使用を提供する。より好ましくは、該ＮＣＭ溶液は、ＯＡの処置における、より具体的にはＯＡを患う患者の関節炎の関節における痛みの処置における、潤滑剤として使用される。該ＮＣＭ溶液は、ＯＡの処置における生理活性な関節内補充療法において、潤滑剤として使用されることができる。
【０００９】
ＮＰ組織は潤滑機能を有さないので、ＮＰマトリックスコンポーネントから単に構成されるＮＣＭは、境界又は流体潤滑剤として作用することは予想されなかった。更に、関節軟骨の関節面に結合した重要な糖タンパク質であるラブリシン（lubricin）（ＰＲＧ４）は、ＮＣに富んだ媒体のタンパク質含有物中には存在しなかったので、潤滑特性が、ＰＲＧ４の存在に寄与できなかった。それ故に、ＮＣＭ溶液が境界及び流体潤滑を生み出すことができたことは、さらに驚くことであった。
【００１０】
本発明は、骨関節炎（ＯＡ）を処置する方法、好ましくはＯＡに冒された関節内の痛みを処置する方法、においてＮＣＭ溶液の使用を提供する。該ＮＣＭ溶液は、上記関節内の痛みを低下させる為に、ＯＡに患う対象の関節内に潤滑剤として投与される。該ＮＣＭ溶液は好ましくは、関節内注射により関節中に直接投与される。該ＮＣＭ溶液は、未処置の関節炎の関節内のＣｏＦと比較して、罹患した関節炎の関節内の軟骨摩擦係数（ＣｏＦ）について、その低下を実現する為に、有効量で投与される。ＣｏＦを低下させることにより、罹患した関節炎の関節内の痛みは低下し、従ってＯＡに患う患者において、痛みの緩和を実現する。該ＮＣＭ溶液の有効量は、ＮＣＭの濃度、並びに他の因子、例えば疾患の状態、患者の年齢及び重量、に従って変化しうる。
【００１１】
潤滑剤としての使用に好適なＮＣＭ溶液は、当技術分野において共通する一般的な調製方法、例えば国際公開第２０１７／１２１７３６号パンフレット、ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ、Ｓｔｅｆａｎ等（２０１８年６月）、前出；Ｂａｃｈ  ＦＣ等（２０１８年）、前出；Vries  SAH,  Doeselaar  M,  Kaper  HJ,  Sharma  PK,  Ito  K.  Notochordal  cell  matrix  as  a  bioactive  lubricant  for  the  osteoarthritic  joint.  Sci  Rep.  2018;8(1):1-11.;  Notochordal  cell  matrix:  An  inhibitor  of  neurite  and  blood  vessel  growth?  J  Orthop  Res.  2018;36(12):3188-3195、に記載されている方法、を使用して得ることができる。該ＮＣＭ溶液を調製する好適な方法は、下記の工程を含む：
動物ドナーの椎間板から脊索細胞（ＮＣ）に富んだ髄核（ＮＰ）組織を採取すること；
該ＮＣに富んだＮＰ組織を凍結乾燥して組織内の細胞を破壊し、それによって、乾燥した且つもろいＮＣマトリックスを得ること；
該乾燥した且つもろいマトリックスを粉砕して、乾燥した且つもろいＮＣマトリックス粉末を得ること；及び
該ＮＣマトリックス粉末を溶媒中に溶解して、ＮＣＭ溶液を得ること。
【００１２】
本発明に従う動物ドナーは、その脊索細胞（ＮＣ：notochordal  cell）を保持し、それ故に変性椎間板症を発症しない任意の動物であることができる。それ故に、これらの動物は、それらの成体期全体を通じてさえも、長年にわたり椎間板のＮＰ組織内にそれらの脊索細胞を維持する。本発明に従う好適な動物ドナーは、非軟骨形成異常性のイヌ、ネコ、ブタ等である。好ましくは、該動物ドナーはブタ種であり、且つ椎間板はブタ椎間板である。
【００１３】
凍結乾燥は、当技術分野において公知の標準方法、例えばRemington:  The  Science  and  Practice  of  Pharmacy,  21st  Edition.  Ed  David  B  Troy.  Lippincott  Williams  &  Wilkins,  Baltimore,  2006において記載されている方法、を使用して行われることができる。凍結乾燥は、ＮＰ組織内の細胞を破壊し且つ断片化する為に行われる。乾燥し且つもろいマトリックスが得られ、次にそれは、粉砕されて、乾燥した且つもろいＮＣマトリックス粉末を形成する。
【００１４】
乾燥した且つもろいＮＣマトリックスの粉砕は、当技術分野において公知の標準方法を使用し、且つ当技術分野において周知の標準的な機器を使用して行われることができる。生物材料の粉砕の為の好適な方法及び機器は例えば、ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ、Ｓｔｅｆａｎ等（２０１８年６月）、前出、に記載されている。
【００１５】
乾燥した且つもろいＮＣマトリックス粉末を溶媒に溶解して、本発明のＮＣＭ溶液が得られる。好ましくは、該溶媒は、水性溶媒、より好ましくは緩衝化された水性溶媒、である。好適な水性溶媒は、薬学的に許容される水性担体溶媒、例えば水、ＰＢＳバッファー溶液、通常の生理食塩溶液等、として周知である任意の標準的な水性溶液であることができる。
【００１６】
凍結乾燥工程及び粉砕工程に加えて、該組織は脱細胞工程に付されて、細胞及び核酸の残存物を除去しうる。椎間板を提供する動物は、それらのゲノム内に、ヒト細胞に感染するおそれのある内因性のウィルス、例えばレトロウィルス、を宿しうる。該ＮＣマトリックスを脱細胞工程に付して核酸含有物を除去することによって、ウィルス核酸による感染症が予防されることができる。ＮＣマトリックスの脱細胞は、当技術分野において周知である標準的な脱細胞法を使用して行われることができる。好適な脱細胞法は例えば、国際公開第２０１５／０４８３１７号パンフレット及び国際公開第第２０１７／１２１７３６号パンフレットに記載されている。脱細胞の前に、凍結乾燥工程で得られた乾燥した且つもろいＮＣマトリックスが、溶媒、好ましくは生理学的水性溶液、例えば通常の生理食塩溶液、ＰＢＳ溶液等で戻される。好ましくは、脱細胞は、ヌクレアーゼ若しくは界面活性剤で又は両者の組み合わせで、該戻されたＮＣマトリックス組織を処理することによって行われる。そのような処理は、脱細胞されていないＮＣマトリックスと比較して、できる限り多くのタンパク質含有物を維持しながら、ＮＣマトリックスからの核酸含有物の実質的な除去を結果として生じる。ヌクレアーゼ若しくは界面活性剤で又は両者の組み合わせでの処理は、処理されていないＮＰ組織と比較して、ＮＣマトリックス組織から、核酸の少なくとも８０％の除去を結果として生じる。従って、核酸の残留含有量は、処理されていないマトリックスと比較して、処理されたＮＣマトリックスにおいて２０％未満である。
【００１７】
好適なヌクレアーゼは、ＤＮＡｓｅ、ＲＮＡｓｅ、Ｂｅｎｓｏｎａｓｅ（登録商標）等である。好適な界面活性剤は、トリトン（Triton）−Ｘ（登録商標）界面活性剤、例えばトリトン（Triton）−Ｘ（登録商標）１００等、である。好ましくは、脱細胞は、Ｂｅｎｓｏｎａｓｅでの、より好ましくはＢｅｎｓｏｎａｓｅ（登録商標）とトリトン−Ｘ（登録商標）−１００との組み合わせでの、処理によって行われる。ヌクレアーゼ及び界面活性剤は、用量に依存した様式で核酸を除去する。ヌクレアーゼ及び界面活性剤での処理は周知である技術であり、且つ当業者は、ルーチン技能及び当業者の一般的な知識を使用して必要とされる投薬量及び時間を決定することができる。投薬量及び反応時間に依存して、８０％〜９９％の任意のレベルの核酸除去が達成されることができる。ヌクレアーゼ及び／又は界面活性剤での処理後、脱細胞されたＮＣマトリックス組織が、幾つかの洗浄工程に付されて核酸残存物が除去される。次に、脱細胞されたＮＣマトリックス組織は、再度凍結乾燥されて乾燥した且つもろいＮＣマトリックス粉末を得て、それは粉砕され、溶解されて、本発明に従うＮＣＭ溶液を得ることができる。
【００１８】
従って、特別な観点において、本発明のＮＣＭ溶液が、下記の工程を含む方法によって調製されうる：
動物ドナーの椎間板から脊索細胞（ＮＣ：notochordal  cell）に富んだ脊索髄性（ＮＰ：nucleus  pulposus）組織を採取すること；
該ＮＣに富んだＮＰ組織を凍結乾燥して組織内の細胞を破壊し、それによって、乾燥した且つもろい第１のマトリックスを得ること；
該乾燥した且つもろいマトリックスを溶媒で戻し、そして、該戻されたマトリックスを脱細胞して細胞及び核酸残存物を取り除くこと；
該脱細胞されたマトリックスを凍結乾燥して、乾燥した且つもろい第２のマトリックスを得ること；
該乾燥した且つもろい第２のマトリックスを粉砕して、乾燥した且つもろいＮＣマトリックス粉末を得ること；及び
該ＮＣマトリックス粉末を水性溶液に溶解して、ＮＣＭ溶液を得ること。
【００１９】
動物ドナーは、上述されている通り任意の動物であることができる。凍結乾燥工程、粉砕工程、及び脱細胞工程、及び溶解工程は、上述されている通りに行われる。
【００２０】
該ＮＣＭ溶液は、追加の成分、例えば抗生物質、ＢＳＡ、ヒアルロン酸（ＨＡ）、又は持続放出型ヒドロゲルさえも含みうる。
【００２１】
本発明のＮＣＭ溶液は好ましくは、１〜２００ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜１００ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは１〜５０ｍｇ／ｍｌ、のＮＣマトリックス粉末の濃度を有する。
【００２２】
該ＮＣＭ溶液は、関節炎の関節における痛みを最小限に抑える為に、ＯＡの処置、好ましくはＯＡに患う患者を対象に、関節炎の関節における痛みの処置、より好ましくは関節内補充療法によるＯＡの処置、における生理活性潤滑剤として使用されることができる。処置されることができる関節は、膝、肘、足関節、指、股関節部の関節、及びＯＡに罹患している可能性のある他の全ての滑膜関節である。
【００２３】
更なる観点において、該ＮＣＭ溶液は、
脊索細胞を含有するブタ髄核組織を凍結乾燥して、組織内の細胞を破壊し、乾燥した且つもろい組織を作製すること；
乾燥した且つもろい組織を処理して、細胞及び核酸残存物を除去すること、ここで、該処理が、ブタ髄核組織内のブタのタンパク質含有物を実質的に維持しながら、ブタ髄核組織からブタ核酸の少なくとも８０％除去を結果として生じる；
該処理された材料を更に凍結乾燥し、処理された材料を脊索細胞マトリックス粉末に粉砕すること；及び
該脊索細胞マトリックス粉末を溶液又はゲルに溶解することによって、該脊索細胞マトリックス粉末を可溶化すること
の工程を含む方法
を含む、骨関節炎の関節用の生理活性潤滑剤として脊索細胞マトリックスを作製する方法
によって得ることができる。
【００２４】
更なる観点において、本発明は、生理活性潤滑剤として使用する為のＮＣＭ溶液を提供する。好ましくは、該ＮＣＭ溶液を含む生理活性潤滑剤が、本明細書に記載されている方法のいずれかで得られる。より好ましくは、該ＮＣＭ溶液を含む生理活性潤滑剤が、本明細書に記載されている方法のいずれかを使用してブタ椎間板から得られる。
【００２５】
１つの観点において、本発明は、ＯＡの処置において使用する為の生理活性潤滑剤を提供し、ここで、該潤滑剤は、可溶化された脊索細胞マトリックス粉末を含む。好ましくは、該脊索細胞マトリックス粉末は、脊索細胞を含有する凍結乾燥され処理されたブタ髄核組織に由来し、ここで、該粉末は２０％未満のブタ核酸を含有し、該粉末は、その起源とするブタ髄核組織と比較して、実質的に不変量のブタタンパク質含有物を含有し、且つ該可溶化された脊索細胞マトリックス粉末は、担体溶媒中に溶解されるか、又はゲルとして形成される。
【００２６】
本発明は、下記の実施例により更に説明されるが、該実施例に又はそれによって限定されることはない。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】図１は、ブタのＮＣに富んだＮＰマトリックス（ＮＣＭ）が、ウシ軟骨細胞の同化応答を誘発したことを示す。ウシ軟骨細胞が播種された１アルギン酸ビーズ当たりの（ａ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及び（ｂ）ＤＮＡ含有量、（ｃ）ＤＮＡ当たりのＧＡＧ、及び（ｄ）１ビーズ当たりのヒドロキシプロリン含有量。数値は平均値＋標準偏差を表し、１群当たりｎ＝５である。＊は、他の全ての群と比較してｐ＜０．０５を示す、＃は、基本媒体（ＢＭ：base  medium）と比較してｐ＜０．０５を示す。（ｅ）アルシアンブルー染色は、ＢＭと比較して、ＮＣＭ及び１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１（ＴＧＦ）が補充されたＢＭで、増加されたＧＡＧ沈着を確認する。コラーゲン免疫組織化学は、ビーズの端部でのＩＩ型コラーゲンの増加、且つＴＧＦでのより拡散性のＩＩ型コラーゲンの沈着を示す。Ｉ型コラーゲン染色強度は、ＮＣＭで増加されるように見える。
【図２】図２は、ＮＣに富んだ髄核マトリックス（ＮＣＭ）が、軟骨細胞が播種されたアルギン酸ビーズにおいて、顕著な同化作用を有することを示す。ＡＣＡＮ：アグリカン；ＣＯＬ−２：ＩＩ型コラーゲンα１；ＣＯＬ−１：Ｉ型コラーゲンα１。発現レベルは、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＰＬ１３）に比例する。数値は平均値＋標準偏差であり、１群当たりｎ＝５である。＊は、同時点での他の全ての群と比較してｐ＜０．０５を示す。＃は、基本媒体（ＢＭ）と比較してｐ＜０．０５を示す。
【図３】図３は、炎症性の刺激を追加が、ＮＣＭの再生能力に影響を及ぼさなかったことを示す。ウシ軟骨細胞が播種された１アルギン酸ビーズ当たりの（ａ）グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）及び（ｂ）ＤＮＡ含有物、（ｃ）単位ＤＮＡ当たりのＧＡＧ、及び（ｄ）１ビーズ当たりのヒドロキシプロリン含有物。数値は、平均値＋標準偏差を表し、１群当たりｎ＝５である。＃は両基本媒体（ＢＭ）群からｐ＜０．０５を示す。（ｅ）アルシアンブルー染色は、両ＢＭ群と比較して、両ＮＣＭ群についてＧＡＧ沈降の増加を確認する。ＩＩ型コラーゲン染色は、ＢＭ単独と比較して、ＢＭにＩＬ−１βを添加した場合、強度はより低かったが、それはＮＣＭにＩＬ−１βを添加したときも、程度はより低いもののやはり認められる。Ｉ型コラーゲンの沈着は、ＢＭにＩＬ−１βを添加すると増加するように見えたが、しかしながらＮＣＭにＩＬ−１βを添加してもこれは認められない。
【図４】図４は、ＮＣに富んだ髄核マトリックス（ＮＣＭ）が、抗炎症能力及び抗異化能力を有しうることを示す。ＩＬ−１β／６／８：インターロイキン−１β／６／８；ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α；ＡＤＡＭＴＳ−５：トロンボスポンジンモチーフ５を有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ；ＭＭＰ−１３：マトリックスメタロプロテイナーゼ１３；ＡＣＡＮ：アグリカン；ＣＯＬ−２：ＩＩ型コラーゲンα１。ＣＯＬ−１：Ｉ型コラーゲンα１。発現レベルは、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３（ＲＰＬ１３）に対する。数値は平均値＋標準偏差であり、１群当たりｎ＝４〜５である。＊は、同時点に由来する他の全ての群と比較してｐ＜０．０５を示す、＄は、基本媒体（ＢＭ）と比較してｐ＜０．０５を示し、＃は、ＢＭ＋ＩＬ−１βと比較してｐ＜０．０５を示す。
【図５】図５は、ＮＣに富んだ髄核マトリックス（ＮＣＭ）が、軟骨潤滑において潜在能力を有することを示す。ＰＢＳ単独における２０サイクル目のＣＯＦに標準化された、異なる潤滑剤における２０サイクル目の摩擦係数（ＣＯＦ）であって、（ａ）６ｍｍ／秒ｓ及び（ｂ）６０ｍｍ／ｓ秒における摩擦係数（ＣＯＦ）。ＢＳＡ：５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン、ＨＡ：４ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸、ＮＣＭｌ：４ｍｇ／ｍｌのＮＣＭ、ＮＣＭｈ：１０ｍｇ／ｍｌのＮＣＭ。数値は平均値＋標準誤差であり、６ｍｍ／秒ｓ測定につきｎ＝５、６０ｍｍ／ｓ測定の場合ｎ＝３である。＊は、ＢＳＡと比較してｐ＜０．０５を示し、＃は、ＢＳＡ＋ＨＡと比較してｐ＜０．０５を示し、＄は、ＢＳＡ＋ＮＣＭｌと比較してｐ＜０．０５を示す。
【図６】図６は、ＰＢＳ中で軟骨をガラスに対してレシプロ式でスライディングさせるラウンドを反復しても、摩擦係数（ＣｏＦ）に影響を及ぼさないことを示す。（ａ）６ｍｍ／秒ｓ及び（ｂ）６０ｍｍ／秒ｓにおいて軟骨をガラス上でスライディングさせる４回連続したラウンド（ＰＢＳ１〜ＰＢＳ４、ｎ＝４）の各サイクルについてのＣｏＦ。個々の測定について、試験スピードのいずれかでスライディングさせる複数のラウンド間で、有意差が観察された。
【発明を実施するための形態】
【実施例】
【００２８】
当試験の目的は、潤滑特性を有し、同時に軟骨細胞を刺激して、ＯＡ関節内の罹患した軟骨を修復することができるバイオマテリアルとしてＮＣＭを使用することに実現性があるか調査することであった。第１に、ウシ軟骨細胞上でのＮＣＭの再生能力がイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）でのアルギン酸ビーズ培養において調査された。第２に、ＮＣＭは、炎症性刺激の存在下で軟骨細胞を刺激することも可能であるか調査した。最後に、ヒアルロン酸（ＨＡ）に対して、及びヒアルロン酸（ＨＡ）との組み合わせに対してＮＣＭの潤滑特性を試験する為に、ガラス摩擦試験において軟骨のレシプロ式のスライディングが実施された。
【００２９】
材料及び方法
ブタＮＣＭの製造
ＮＣに富んだＮＰ組織が、ブタドナーのＩＶＤから採取された（ｎ＝５、生後約３カ月）。該組織は、一晩、凍結乾燥され（Ｌａｂｃｏｎｃｏ社、Ｋａｎｓａｓ  Ｃｉｔｙ、ＭＯ、米国）、乾燥した且つもろいマトリックスを結果として生じ、引き続き、それはマイクロディスメンブレーター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社、Ｇｏｅｔｉｎｇｅｎ、ドイツ）を使用して粉砕された。該ＮＣＭ粉末は、一定分量に小分けされ、そして更なる使用まで−８０℃で保管された。
【００３０】
軟骨細胞の単離及びアルギン酸ビーズの製造
関節軟骨のフルデプススライス（Full-depth  slices）が、ウシドナー（ｎ＝５、約３歳）の中手指節関節から収集され、そして１５％ペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）を含むリン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ：phosphate-buffered  saline）中に集められた。引き続き、軟骨フレークが、０．１％アンホテリシンＢの存在下、３７℃及び５％のＣＯ２において２０分間インキュベートされた。その後、ＰＢＳ−Ｐ／Ｓ−アンホテリシン混合物が吸引され、そして軟骨フレークは、消化媒体（１０％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％Ｐ／Ｓ、０．１％アンホテリシンＢ、及び０．５％コラゲナーゼＩＩ型が補充されたｈｇＤＭＥＭ）中、３７℃及び５％ＣＯ２において一晩で消化された。翌日、細胞懸濁物は７０μｍセルストレーナーを使用して濾し分けられ、そして軟骨細胞が新鮮なｈｇＤＭＥＭ中で２回洗浄された。該軟骨細胞は、１．２％アルギネート（Ｓｉｇｍａ社、１８０９４７、Ｚｗｉｊｎｄｒｅｃｈｔ、オランダ）中、細胞１０百万個／ｍｌで再懸濁され、そしてアルギン酸ビーズがこれまでのプロトコールに従い製造された（Ｇｕｏ等、１９８９年）。要するに、細胞１０百万個が、１８Ｇ混合針を使用して１ｍｌのアルギネートと混合され、その後、該懸濁物はシリンジ内に吸引された。アルギン酸ビーズは、１０２ｍＭの塩化カルシウム（Ｍｅｒｃｋ社、１０２３７８）溶液中に細胞懸濁物を滴下することによって製造された。引き続き、ビーズが０．９％塩化ナトリウム（Ｍｅｒｃｋ社、１０６４０４）溶液を用いて３回洗浄された後、培養培地に移された。
【００３１】
アルギン酸ビーズ培養
ＮＣＭの同化効果を試験する為に、軟骨細胞が播種されたアルギン酸ビーズが、基本媒体（ＢＭ：１％のＰ／Ｓ、１％のＩＴＳ−１＋（Ｃｏｒｎｉｎｇ社、３５４３５２、Ｌａｓｎｅ、ベルギー）、５０ｍｇ／ｍｌのアスコルビン酸−２−リン酸塩（Ｓｉｇｍａ社、Ａ８９６０）、１．２５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（Ｒｏｃｈｅ社、１０７３５０７８００１）、及び４０ｍｇ／ｍｌのＬ−プロリン（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ５６０７）が補充されたｈｇＤＭＥＭ）、ＮＣＭ（２ｍｇ／ｍｌのＮＣＭがＢＭに添加された）又は陽性対照としての１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１が添加されたＢＭ中で培養された。更に、ＮＣＭが炎症性の環境において再生効果を有するか試験する為に、アルギン酸ビーズがまた５ｎｇ／ｍｌのＩＬ−１βの存在下、ＢＭ及びＮＣＭ中で培養された。アルギン酸ビーズは、１週間に２回、媒体を交換しながら、３７℃及び５％ＣＯ２において３週間培養された。媒体を交換する毎に、ＮＣＭ、ＴＧＦ−β１及びＩＬ−１βが添加された。培養後、アルギン酸ビーズは、生化学アッセイ（０日目及び２１日目）若しくは遺伝子発現分析（３日目及び２１日目）用として−８０℃で保管され、又は（免疫）組織化学的染色（２８日目）用としてパラフィン中に包埋された。
【００３２】
生化学的含有量及び（免疫）組織化学的染色
生化学的含有量を決定する為に、アルギン酸ビーズが、６０℃で、パパイン消化バッファー（１００ｍＭのリン酸バッファー（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ５２４４）、５ｍＭのＬ−システイン（Ｓｉｇｍａ社、２００−１５７−７）、５ｍＭのエチレンジアミン四酢酸（Ｓｉｇｍａ社、０３６２０）、及び１４０ｍｇ／ｍＬのパパイン（Ｓｉｇｍａ社、Ｐ４７６２））中、一晩、消化された。該消化されたサンプルから、ＧＡＧ含有量が、サメ軟骨コンドロイチン硫酸（Ｓｉｇｍａ社、Ｃ４３８４）が参照物質として使用された従前のプロトコール１８から改変が施されたジメチルメチレンブルー（ＤＭＭＢ：dimethyl-methylene  blue）アッセイ法を用いて決定された。ヒドロキシプロリン含有量が、トランス−４−ヒドロキシプロリン（Ｓｉｇｍａ社、Ｈ５４４０９）参照物質を用いたＣｈｌｏｒａｍｉｎ−Ｔアッセイ１９を使用して測定された。ＤＮＡ含有量が、Ｑｕｂｉｔ定量プラットフォーム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を使用して測定された。
【００３３】
パラフィン包埋アルギン酸ビーズが切片化され、そしてプロテオグリカンの沈着及び細胞核を可視化する為にアルシアンブルー及びヘマトキシリンで染色された。コラーゲン免疫染色について、最初に、切片が、エタノール濃度を一連で減少させたキシレンを使用して脱ワックスされた。切片は、ＰＢＳ中で５分間洗浄され、そしてＩ型コラーゲン染色について、クエン酸バッファーを用いて９６℃で２０分間、及びＩＩ型コラーゲンについて、１０ｍＭのＨＣｌに溶解された０．０５％ペプシンを用いて３７℃で５分間、抗原回復が実施された。サンプルが、再度０．１％ツイーンを含むＰＢＳを用いて２回洗浄され、その後１０％のヤギ正常血清で３０分間ブロックされた。次に、サンプルは、１％のＮＧＳを含むＰＢＳ（Ｉ型コラーゲン用としてＡｂｃａｍ社、Ａｂ３４７１０、１：２００希釈、及びＩＩ型コラーゲン用としてＡｂｃａｍ社、Ａｂ１８０６９７、１：２００希釈）中で、一次抗体と共に４℃、一晩、インキュベーションされた。翌日、サンプルは、０．１％ツイーン（tween）を含むＰＢＳ中で５分間、２回洗浄され、その後二次抗体（Ｉ型コラーゲン用として分子プローブ抗ウサギＩｇＧ、Ａ２１４２８、１：２００希釈、及びＩＩ型コラーゲン用として分子プローブ抗マウスＩｇＧ２ａ、Ａ２１１３７、１：３００希釈）及びＤＡＰＩ（ＰＢＳ中１：５００）と共にインキュベーションされた。その後、サンプルは、再度０．１％ツイーンを含むＰＢＳ中で２回洗浄され、そしてｍｏｗｉｏｌを使用して包埋された。画像が、蛍光顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏｖｅｒｔ  ２００Ｍ、Ｚｅｉｓｓ社、Ｓｌｉｅｄｒｅｃｈｔ、オランダ）を使用して取得された。陽性対照サンプル（Ｉ型コラーゲン用としてウシ腱、及びＩＩ型コラーゲン用として関節軟骨）、並びに各サンプルに対する陰性対照（すなわち、一次抗体の省略）が含まれた。陰性対照は、非特異的陽性染色を示さなかった。
【００３４】
遺伝子発現
遺伝子発現分析が、１群毎にプールされた３つのアルギン酸ビーズにおいて実施された。アルギン酸ビーズは、クエン酸ナトリウムバッファー（ＲＮＡｓｅを含まない水に溶解された５５ｍＭのクエン酸三ナトリウム二水和物（Ｍｅｒｃｋ社、１０６４４８０５００）、０．１５Ｍの塩化ナトリウム、２５ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ社、Ｈ３３７５）、７．４にｐＨ調整）中に、室温で５分間、溶解された。遠心分離後、細胞ペレットが、１％のβ−メルカプトエタノールを含む３００μｌのＲＬＴバッファー（Ｑｉａｇｅｎ社、７４１０４、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）中に溶解された。ＲＮＡが抽出され、そしてオンカラムＤＮＡｓｅ消化工程を含むＱｉａｇｅｎミニキット（Ｑｉａｇｅｎ社、７４１０４）を使用して精製された。分光光度計（ＮＤ−１０００、Ｉｓｏｇｅｎ、ｄｅ  Ｍｅｅｒｎ、オランダ）が、単離されたＲＮＡの量及び純度を試験するのに使用された。ゲノムＤＮＡが存在しないことが、マイナス−ＲＴ反応（ｉＣｙｃｌｅｒ；Ｂｉｏ−Ｒａｄ社、Ｖｅｅｎｅｎｄａａｌ、オランダ）を用いて検証された。ｃＤＮＡが、ＶＩＬＯ−ｋｉｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、１１７５４０５０）を使用して合成された。試験された遺伝子及びその対応するプライマー対が表１に掲載されている。リボソームタンパク質Ｌ−１３（ＲＰＬ−１３）が、その発現が全ての培養条件全体を通じて最も安定であったので参照遺伝子として選択された。遺伝子発現がリアルタイムｑＰＣＲ（ＣＦＸ３８４、Ｂｉｏ−Ｒａｄ社）を使用して調査され、そして発現が、２−Ｃｔ法に従って報告される。統計比較が可能となるように、シグナルが得られなかったサンプルについてＣｔ数値は４０に設定された。
【００３５】
【表１】
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表１：ＲＴ−ｑＰＣＲアッセイで使用された標的遺伝子及び参照遺伝子についてのプライマー配列。ＲＰＬ１３：６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ１３；ＩＬ−１β／６／８：インターロイキン−１β／６／８；ＴＮＦα：腫瘍壊死因子α；ＡＤＡＭＴＳ−５：トロンボスポンジンモチーフ５を有するディスインテグリン及びメタロプロテイナーゼ；ＭＭＰ−１３：マトリックスメタロプロテイナーゼ１３；ＡＣＡＮ：アグリカン；ＣＯＬ２Ａ１：ＩＩ型コラーゲンα１。全てのプライマー対のアニーリング温度は６０℃であった。
【００３６】
ウシ骨軟骨プラグの調製
ウシ後膝関節（ｎ＝４、２歳、オス）が、Ｋｒｏｏｎ  Ｖｌｅｅｓ  ｂ．ｖ．，Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ，オランダから得られた。過剰の皮膚が除去され、且つ関節が軟骨表面に損傷を与えないように慎重に開放された。直径１２ｍｍの骨軟骨プラグ合計１４個が、中空のドリルビットを使用して大腿顆から穿孔された。穿孔期間中、軟骨は、サンプルの過熱を防止する為に、ＰＢＳを用いて継続的に保湿された。関節から骨軟骨プラグを除去した後、それらは、摩擦学試験（tribological  tests）で使用されるまで氷上のＰＢＳ中に２時間を超えずに保管された。
【００３７】
摩擦学試験
摩擦学試験が、ＵＭＴ−３（ユニバーサル・メカニカル・テスター、Ｂｒｕｋｅｒ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、米国）を使用してレシプロ式スライディング法で実施された。ガラス表面は、加温した水盤（３３℃、膝関節の温度）中に固定され、液体／潤滑剤のフィルムが表面を被覆するに任せた。骨軟骨プラグがロードセル上に取り付けられ、そしてレシプロ式の構成でガラス表面に対してスライドさせた。この試験では、骨軟骨プラグは、３群に分割された。第１群（ｎ＝５）の場合、ガラス表面は、最初ＰＢＳ中に浸漬され、その後プラグは、正常負荷である４Ｎが測定されるまでガラスに押し付けられたが、それは最近の試験２０で使用されたように、＜０．２５ＭＰａの低い接触圧をもたらす。次にレシプロ式のスライディングが、一定した通常負荷の下、６ｍｍ／秒において２０サイクル（５５ｍｍ一方向）実施され、その直後に６０ｍｍ／秒において２０サイクルが続いた。その後、該プラグは、負荷解除され、そしてＰＢＳが吸引され、及び５ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＰＢＳ＋ＢＳＡ）により置換され、試験が反復された。その後、この手順は、４ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸を含むＰＢＳ＋ＢＳＡ（ＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＨＡ）を用いて、及び４ｍｇ／ｍｌのＮＣＭを含むＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＨＡ（ＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＨＡ＋ＮＣＭ）を用いてやはり反復された。第２群（ｎ＝５）の場合、同一の試験が、異なる媒体群：ＰＢＳ、ＰＢＳ＋ＢＳＡ、４ｍｇ／ｍｌのＮＣＭを含むＰＢＳ＋ＢＳＡ（ＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＮＣＭｌ）、及び１０ｍｇ／ｍｌのＮＣＭを含むＰＢＳ＋ＢＳＡ（ＰＢＳ＋ＢＳＡ＋ＮＣＭｈ）を用いて実施された。試験期間中に、通常の力及び摩擦力がモニタリングされ、そしてデータをフィルターにかけて、試験スピードが設定スピードに近いデータポイントのみを取り込み（１０％の誤差は許容された）、及び摩擦係数（ＣｏＦ）を計算する為に、特注のＭａｔｌａｂスクリプトが使用された。測定毎に２０回目のサイクルにおいて取得されたＣｏＦが、接触面積の差異について補正する為に、ＰＢＳ単独でのその各測定に対して標準化された。第３群（ｎ＝４）の骨軟骨プラグの場合、２つのスピードにおいて反復されたスライディングが、軟骨表面、従って測定されたＣｏＦ値に影響を及ぼさなかったことを検証する為に、同一の手順が、但し各ラウンド新鮮なＰＢＳ中で実施された。
【００３８】
統計学
社会科学用の統計パッケージを用いて統計解析が実施された（ＳＰＳＳ、バージョン２２；ＩＢＭ社、Ａｒｍｏｎｋ、ＮＹ）。正規性がシャピロウィルク検定を使用して検定された。生化学データ及び遺伝子発現データでは、一元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）が実施され、そしてボンフェローニ補正を含め事後検定を行う独立したｔ検定が後続した。遺伝子発現データでは、時間的要因ではなく媒体群間の差異のみが興味の対象であったので、各時点において二元配置分散分析よりはむしろ一元配置分散分析が実施された。摩擦学的なデータの場合、異なる潤滑剤群に由来する標準化されたＣｏＦ値が、ボンフェローニ補正を含む事後的な方式で、対応のあるt検定（プラグ内比較の場合）又は独立ｔ検定（プラグ間比較の場合）を用いて比較された。ＰＢＳ対照測定の場合、反復測定分散分析が、それぞれ６及び６０ｍｍ／秒において２０サイクルからなる４つの連続的な試験から得られたＣｏＦ値を比較する為に使用された。
【００３９】
結果
ＮＣＭの再生能力
ＮＣＭ及びＴＧＦの両方の添加は、ＢＭと比較してＧＡＧ含有量の増加を結果として生じた（図１ａ）。その上、ＮＣＭを用いた場合のＧＡＧ含有量は、ＴＧＦと比較してそれより有意に高かった。類似したパターンがＤＮＡ含有量について認められ、ＢＭと比較してＴＧＦでは増加したが、しかしながらＮＣＭを用いた場合よりも更に増加した（図１ｂ）。これらのデータは、ＢＭと比較して、ＮＣＭ及びＴＧＦにおいて、ＤＮＡに対するＧＡＧの比について類似した増加に帰結する（図１ｃ）。また、コラーゲン含有量に対する尺度としてのヒドロキシプロリンは、ＢＭと比較してＮＣＭ及びＴＧＦの両方について増加した（図１ｄ）。アルシアンブルー染色は、ＮＣＭ及びＴＧＦについてＧＡＧ含有量の増加を確認した（図１ｅ）。コラーゲン免疫染色から、ＩＩ型コラーゲンの沈着は、ＢＭと比較して、主にビーズの端部においてＮＣＭによって、しかしながら特にＴＧＦによって刺激を受けているようである。Ｉ型コラーゲンの沈着は、ＴＧＦによって影響を受けないように見えたが、ＮＣＭ内で培養されたビーズはより強く染色された。
【００４０】
遺伝子レベルでＮＣＭの同化作用を決定する為に、ＡＣＡＮ、ＣＯＬ−２及びＣＯＬ−１の遺伝子発現分析が実施された（図２）。３日目において、ＡＣＡＮ発現の差異は培養群間で認められなかった。しかしながら、２１日目においては、ＡＣＡＮの発現が、ＢＭと比較してＮＣＭ及びＴＧＦの両方、及びＮＣＭと比較してＴＧＦについて増加した。ＣＯＬ−２の発現は、３日目及び２１日目において、ＢＭと比較してＮＣＭについて有意に異ならなかったが、しかしながら３日目においてＮＣＭと比較して、及び２１日目においてＢＭ及びＮＣＭと比較してそれらよりも、ＴＧＦについて有意に高かった。３日目において、ＣＯＬ−１発現における有意差は培養群間で認められなかったが、しかしながらＣＯＬ−１発現は、２１日目では、ＢＭ及びＴＧＦと比較してそれらよりもＮＣＭにおいて有意に高かった。
【００４１】
炎症性の環境におけるＮＣＭの潜在能力
ＮＣＭもまた、炎症性刺激の存在下で再生能力を有するか決定する為に、軟骨細胞が播種されたアルギン酸ビーズが、ＩＬ−１βの添加有り及び添加無しで、ＢＭ及びＮＣＭにおいて培養された。しかしながら、ＢＭ及びＮＣＭにＩＬ−１βを添加しても、ＩＬ−１βを含まないそのカウンターパートと比較して、ＧＡＧ、ＤＮＡ、ＤＮＡに対するＧＡＧ、及びヒドロキシプロリン含有量に影響を及ぼさなかった（図３ａ〜図３ｄ）。アルシアンブルー染色は、ＩＬ−１βを含む、及び含まないＢＭと比較して、ＩＬ−１βを含む、及び含まないＮＣＭについて、ＧＡＧ含有量の増加を確認した（図３ｅ）。興味深いことに、免疫染色は、ＩＬ−１βをＢＭに添加すると、ＩＩ型コラーゲンが減少することを示唆したが、一方、ＩＬ−１βをＮＣＭに添加した場合には、これは明確に観測されなかった。更に、ＩＬ−１βを添加すると、ＢＭにおいてＩ型コラーゲンの生成が増加するように思われたが、しかしながらＮＣＭには当てはまらない。
【００４２】
３日目において、培養群間で、ＩＬ−１βの発現に差異は認められなかった一方、２１日目においては、両ＢＭ群と比較して両ＮＣＭ群において、ＩＬ−１β発現は有意に低かった（図４）。更に、ＩＬ−１βを添加しても、その未処置の対照と比較して、ＢＭ又はＮＣＭのいずれにおいてもＩＬ−１β発現を増加させなかった。ＩＬ−６の発現は、３日目において他の全ての群と比較してそれよりも、ＩＬ−１βを含むＮＣＭにおいて有意に高かった。しかしながら、２１日目において、その発現は、ＢＭ単独及び両ＮＣＭ群と比較してそれよりも、ＩＬ−１βを含むＢＭにおいて有意に高かった。３日目において、ＩＬ−８の発現に差異は認められなかったが、その発現は、他の全ての培養群と比較してそれよりも、ＩＬ−１βを含むＢＭにおいて有意に高かった。培養群間の有意差は、ＴＮＦαについて、３日目又は２１日目のいずれにおいても認められなかった。３日目において、ＭＭＰ−１３の発現に有意差は認められなかったが、しかしながら２１日目におけるその発現は、ＢＭ単独及びＮＣＭ群と比較してそれよりも、ＩＬ−１βを含むＢＭでは有意に高かった。３日目におけるＡＤＡＭＴＳ−５発現は、両ＢＭ群と比較してそれよりも、ＩＬ−１βを含む及び含まないＮＣＭにおいて有意に高かった。しかしながら、２１日目において、その発現は、他の群と比較してそれよりも、ＩＬ−１βを含むＢＭにおいて有意に高かった。３日目において、ＡＣＡＮ発現に差異は認められなかった。しかしながら、２１日目において、ＮＣＭ内のＡＣＡＮ発現は、ＢＭ単独と比較してそれよりも有意に高かったが、またＩＬ−１βを含むＮＣＭでは、両ＢＭ群と比較してそれよりも有意に高かった。３日目において、ＩＬ−１βを添加すると、ＣＯＬ−２の発現がＢＭ単独と比較して有意に減少したが、２１日目において有意差は認められなかった。３日目において、ＣＯＬ−１発現について差異は認められなかったが、しかしながら２１日目において、ＩＬ−１βを含むＮＣＭにおけるその発現は、他の全ての培養群と比較してそれよりも有意に高かった。
【００４３】
ＮＣＭ潤滑
６ｍｍ／秒及び６０ｍｍ／秒の両方において（図５ａ及び図５ｂ）、ＢＳＡのＰＢＳへの添加は、相違をもたらさなかった、又はＣｏＦに若干の増加をもたらした。６ｍｍ／秒では、ＨＡ及びより少量のＮＣＭ（ＮＣＭｌ）の添加は、２０サイクルスライディングした後、ＢＳＡを含むＰＢＳと比較して、ＣｏＦにおいて有意な減少（約２７％）を結果として生じた（図５ａ）。ＮＣＭｌとＨＡとの組み合わせの添加は、ＣｏＦにおいてより強い低下（４５％）を結果として生じ、それはＢＳＡ単独と及びＨＡを含むＢＳＡと比較して有意に低かったが、しかしながらＮＣＭｌを含むＢＳＡと比較した場合には有意に低くなかった。ＣｏＦにおける最強の低下（５３％）がＮＣＭｈの添加で観察されたが、その場合ＣｏＦは、ＢＳＡと、並びにＨＡを含むＢＳＡとＮＣＭｌを含むＢＳＡとの両方と比較して有意に低かった。
【００４４】
６０ｍｍ／秒では、ＨＡの添加は、２０サイクルのスライディングの後、ＣｏＦについて、ＢＳＡを含むＰＢＳと比較してそれよりも９２％の減少を結果として生じ、ＨＡ及びＮＣＭｌの添加がまた類似した減少を示した。ＮＣＭｌ及びＮＣＭｈの添加は、ＢＳＡを含むＰＢＳと比較して、それぞれ５５及び７０％の有意な減少を結果として生じた（図５ｂ）。同一のプラグを反復してスライディングさせても、ＣｏＦ測定に影響を及ぼさなかったことを検証する為に、２０サイクルからなる４ラウンド、但し各ラウンド新鮮なＰＢＳ中において、骨軟骨プラグがガラス表面に対してスライディングさせる工程に付された。ＣｏＦは、６ｍｍ／秒（図６ａ）又は６０ｍｍ／秒（図６ｂ）のいずれにおいても、複数ラウンドのスライディングの結果として有意に変化しなかった。それ故に、図５ａ及び図５ｂに提示されているデータに補正は適用されなかった。
【００４５】
考察
馴化培地の形態で適用されるＮＣ分泌型因子は、ＮＰＣ及びＢＭＳＣに対して同化作用性、増殖性、及び軟骨形成性の潜在能力を示した（１２〜１７）。ＮＰＣと軟骨細胞との間の類似性に起因して、ＮＣ分泌型因子のＩＶＤ用途から軟骨細胞／軟骨の分野への置き換えは論理的と思われる。実際、ＮＣ馴化培地は、最近ヒトＯＡ軟骨細胞に対する同化作用及び抗炎症効果も示した。ＮＣＭの直接適用は、ＮＰＣに対して、ＮＣ馴化培地と比較してそれよりも強い同化作用さえも有したので（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ、投稿済み）、ＮＣＭは軟骨細胞に対しても刺激性の効果をやはり有することは妥当と思われた。従って、本試験は、ＯＡ関節内に注射する際の関節痛みを最小限に抑えると同時に、常在性軟骨細胞に再生刺激を提供する、生理活性関節内補充療法用の潤滑剤としての新規ＮＣＭアプローチのフィージビリティーについて試験した。
【００４６】
ＮＣＭは、ウシ軟骨細胞に対して強力な同化作用を発揮する
ＢＭと比較して、ＮＣＭの場合、ＧＡＧ、ＤＮＡ、単位ＤＮＡ当たりのＧＡＧ、及びヒドロキシプロリン含有量の増加によって示されるように、ＮＣＭはウシ軟骨細胞に対して強力な同化作用を発揮したので、ＮＣ馴化培地及びＮＣＭに関するこれまでの知見は最新の結果と整合している。ＮＣＭは、１０ｎｇ／ｍｌのＴＧＦ−β１の添加と比較して、単位ビーズ含有量当たりいっそうより高いＧＡＧ及びＤＮＡを結果として生じた。しかしながら、コラーゲン免疫組織化学は、ＢＭ及びＴＧＦと比較して、ＮＣＭについてＩ型コラーゲンの沈着の増加を明らかにしたが、それは２１日目におけるＮＣＭでのＣＯＬ−１の発現増加と整合する。培養群間のＩＩ型コラーゲン沈着における相違は、それほど識別可能ではなかったが、ＩＩ型コラーゲンは主にＮＣＭを含むビーズの端部に一貫して存在した一方、ＴＧＦ−β１を添加すると、ビーズ全体を通じて沈着した。これは、ＴＧＦ−β１は、ＮＣＭの１以上の活性成分よりも小さく、ビーズ中により容易に拡散することができることを示しうる。従って、ＴＧＦ−β１は、その効果をより多数の細胞に対して発揮するものであり、ＮＣＭと比較してＴＧＦ−β１において、ＡＣＡＮ及びＣＯＬ−２遺伝子についてより高い発現レベルが観測されることを説明する。これと整合して、ＮＣＭの再生能力が、ＮＰＣが播種されたアルギン酸ビーズにおいて試験されたこれまでの試験成績において、ＮＣＭは、アルギン酸ビーズ全体を通じて、Ｉ型コラーゲンよりはむしろＩＩ型コラーゲンの沈着を増強するように思われた（Ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ、Ｓｔｅｆａｎ等（２０１８年６月）、前出）。当該試験では、細胞３百万個／ｍｌの密度でＮＰＣが播種されたが、本試験では軟骨細胞は細胞１０百万個／ｍｌで播種され、ＮＣＭの生理活性因子の限定された拡散が、本試験においてより大きな役割を演じうることを示している。代替的には、ＮＰＣ及び軟骨細胞は、その類似性にもかかわらず、コラーゲンの沈着に関してＮＣＭ刺激に対して異なる応答を示す可能性、又はこれまでの試験で使用されたＮＰＣは、本試験における軟骨細胞と比較してそれよりも健康な状態にある可能性がある。それにもかかわらず、ＮＣＭの刺激はＩＩ型コラーゲンではなくＩ型コラーゲンの刺激であるにもかかわらず、強いマトリックス同化作用を示し、そして疾患状態下でのそれらの効果について、より踏み込んだ特徴づけを行う為に、更なる試験が必要とされる。
【００４７】
ＮＣＭは炎症性刺激の存在下で再生能力を有する
炎症性サイトカインは、次に異化作用性の因子、例えばＭＭＰ及びＡＤＡＭＴＳ、の放出を刺激し、ＯＡの発現及び進行において中心的役割を演ずる。それ故に、この試験は、ＮＣＭは炎症性刺激の存在下で軟骨細胞の再生応答も誘発することができるか試験した。遺伝子発現結果は、主に２１日目において、ＩＬ−６及びＩＬ−８発現レベルの増加によって明らかにされるように、ＢＭにＩＬ−１βを添加することで、実際、炎症性の環境を結果として生じたことを示唆する。その上、ＩＬ−１βは、ＢＭにおいて２１日目にＭＭＰ−１３及びＡＤＡＭＴＳ−５発現レベルが増加したことによって明らかにされるように、遺伝子レベルで異化作用を誘発した。しかしながら、ＩＬ−１βを用いてＮＣＭ群を処置しても、ＢＭ又はＮＣＭ単独と比較してこれらの遺伝子の発現レベルの増加を引き起こさず、ＮＰＣ上でＮＣＭの効果について試験している、これまでのイン・ビトロ（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）及びイン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）での試験においても認められたように、ＮＣＭは抗炎症能力及び抗異化作用能力を有することを示唆する（ｄｅ  Ｖｒｉｅｓ、Ｓｔｅｆａｎ等（２０１８年６月）、前出；Ｂａｃｈ  ＦＣ等（２０１８年）、前出）。興味深いことに、ＩＬ−１βをＢＭ又はＮＣＭに添加しても、ＩＬ−１β及びＴＮＦαはそれに応答しなかったが、それはこれまでの知見と整合しない（２１）。これまでの実験は、炎症性刺激に対してより敏感である可能性がある比較的高齢のヒトドナーから得られた軟骨細胞を使用したので、これは、種及び／又は年齢の差異に起因しうる。それにもかかわらず、ＩＬ−１β遺伝子発現は、両ＢＭ群と比較して両方ＮＣＭ群において有意に低く、それはＮＣＭの抗炎症能力を際立たせる。
【００４８】
培養中に適用される炎症性刺激は、ＧＡＧ、ＤＮＡ、及びヒドロキシプロリン含有量に有意に影響を及ぼさず、それはＮＣＭの同化作用及び増殖効果は、炎症性の環境において維持されることを示す。これはまた、ＮＣＭ単独と比較して、ＩＬ−１βで処置されたＮＣＭにおいて有意に異ならなかったＡＣＡＮ遺伝子発現レベルによって検証される。しかしながら、ＩＬ−１βと組み合わせたＮＣＭは、ＩＬ−１βを用いて処置されたＮＣＭについて、３日目でのＩＩ型コラーゲン染色強度及びＣＯＬ−２遺伝子発現の減少、並びに２１日目でのＣＯＬ−１遺伝子発現の増加によって観察されるように、不都合なコラーゲン生成を更に誘発すると思われる。しかしながら、２１日目において、ＣＯＬ−２発現レベルにおいて有意差は認められず、ＩＬ−１βが継続して存在したにもかかわらず、ＩＩ型コラーゲンの生成は培養時間全体にわたり回復したことを示唆する。その上、ＩＬ−１βの超生理学的濃度が適用され、炎症性の環境におけるＮＣＭの潜在能力がさらに、より生理学的な状況、例えば、イン・ビボ（ｉｎ  ｖｉｖｏ）、で調査されるべきである。
【００４９】
ＮＣＭは軟骨潤滑特性を有する
軟骨細胞に対するその再生効果に加えて、本試験は、低濃度（４及び１０ｍｇ／ｍｌ）のＮＣＭ溶液は、軟骨ＣｏＦを低下させることができることを示す。従って、ＮＣＭは、ＨＡを有し又は有しないで、ＯＡ関節潤滑剤として適用されうる。
【００５０】
摩擦学的対照測定（すなわち、毎回新鮮なＰＢＳ中で、同一の骨軟骨プラグをレシプロ式でスライディングさせる、４回の反復したラウンド）は、測定間で有意差は認められないことを実証し、従って他の実験に対して補正は適用されなかった。軟骨特性において関節間で生物学的に変動することから接触面積も異なるが、これを回避する際に、同一のプラグを反復して使用することのこの戦略が、従って功を奏する。
【００５１】
６ｍｍ／秒及び６０ｍｍ／秒の両方において、ＢＳＡのＰＢＳへの添加は、いずれにおいても、差異は生じない又はＣｏＦの若干の増加をもたらした。これは、予期されないことではなかった。ＢＳＡは、グリコシル化されていない球形のタンパク質であり、且つ境界潤滑又は流体潤滑のいずれも提供しないと予想された。その上、アルブミンは、ラブリシン（ＰＲＧ４）が天然の軟骨（２２）及びバイオマテリアル（２３）表面に吸着するのを妨げることに関与していた。ＢＳＡは豊富な滑液タンパク質であり、従ってその効果は、本測定においてモニターする必要があった（ＰＢＳ対照を除き、全ての潤滑剤溶液は、５ｍｇ／ｍｌのＢＳＡを含有した）。
【００５２】
低スピード、例えば６ｍｍ／秒、では、軟骨潤滑の流体力学的機構（６、７）及び摩擦水和機構２０のいずれも適用されないと予想される。天然の軟骨においてこのスピードのとき、軟骨表面上の吸着された分子は境界潤滑を提供する。ラブリシン（ＰＲＧ４）は、ＡＣの関節面、すなわち輝板、に結合された重要な糖タンパク質である。ラブリシンは、ループ化した方式又は一方の端部が解放された方式で係留され、境界潤滑を提供する。ＰＲＧ４に加えて、界面活性のリン脂質（ＳＡＰＬ：surface  active  phospholipids）は最も研究されている境界潤滑剤に属する（２４〜２６）。ＮＰ組織は潤滑機能を有しないので、ＮＰマトリックスコンポーネントから単に構成されているＮＣＭは、境界潤滑剤として作用するとは予想されなかった。ブタＮＣ馴化培地のプロテオミック含有量を調査するこれまでの試験では、ＰＲＧ４の存在は明らかにされていなかった（２７）。また、脊索細胞の液胞も脂質を含有するものと推測される（２８）が、しかしながら、その界面活性は、これまでに報告されていない。最後に、ＮＣマトリックス中に存在するムコ多糖がまたやはり界面活性であり得、且つ境界潤滑を誘発しうる。しかしながら、過去の試験成績は、１００ｍｇ／ｍｌという高濃度のコンドロイチン硫酸が、摩擦係数を減少させるのに必要であったことを報告し（２９）、一方、本試験では、使用されたＮＣＭの濃度は、１．５ｍｇ／ｍｌ及び４ｍｇ／ｍｌのＧＡＧを結果として生じたにすぎない。従って、境界潤滑は、ＮＣＭのより強力な作用機序であったこと、すなわちより速いスピードであること以上に、ＰＲＧ４以外のいくつかの成分が、このようなより低いスピードにおいて、軟骨に対して境界潤滑を提供するであろうことは、驚くべきことであった。ＮＣＭの添加がＣｏＦの用量依存性の減少を誘発したという事実は、その境界潤滑剤の機構と整合する。４ｍｇ／ｍｌでは、この効果は、関節内補充療法の為に臨床的に使用された濃度と類似した濃度のＨＡと類似した。最後に、ＨＡに添加された場合に、ＮＣＭはＣｏＦを更に減少させたが、それは、ＨＡとＮＣＭとの間に何らかの拮抗性の相互作用は存在しないこと、及びおそらく異なる作用機序を示す。
【００５３】
より速いスピード、例えば６０ｍｍ／秒、では、向かい合う軟骨表面が相互にスライドする場合に（６、７、３０）、流体のウェッジ（wedge）が形成される流体潤滑が役割を演ずることとなり、更には、摩擦水和（２０）が活性となる。この種の潤滑は、とりわけ、トラップされた流体の粘度に依存する。ＮＣＭはムコ多糖中に豊富に存在するので（２７）、このような様式で若干の潤滑効果を有すると期待されうる。しかしながら、実験中に、４ｍｇ／ｍｌのＨＡ溶液は、ＮＣＭｌ（４ｍｇ／ｍｌ）と比較して、及びＮＣＭｈ（１０ｍｇ／ｍｌ）溶液と比較したときでさえもそれよりも粘稠性であることが目視的に観測され、ＮＣＭが有効であろうことは疑わしかった。それにもかかわらず、ＮＣＭは、ＰＢＳ＋ＢＳＡと比較して、ＣｏＦを４ｍｇ／ｍｌにおいて約５５％、及び１０ｍｇ／ｍｌにおいて約７０％低下させた（たとえ、ＨＡを用いたときの減少よりもＣｏＦの減少は少なかったとしても）ので、ＮＣＭはこの試験スピードにおいて潤滑効果を有した。これは、より高スピードにおけるＮＣＭの潤滑機構が、純粋にその粘性によるだけでなく、他の不明な効果にも起因しうることを示唆する可能性がある。再び、このスピードで、ＮＣＭｌのＨＡとの組み合わせは、ＨＡ単独に対して類似したＣｏＦの低下を誘発し、それは、拮抗作用が存在しないこと、及びこの組み合わせは、ＮＣＭの再生能力からなおも利益を得つつ、最終的には、潤滑特性を最大化する為に臨床的に適用されうることを示す。
【００５４】
結論
結論として、この試験は、ＮＣＭがウシ軟骨細胞に対して再生効果を発揮し、且つ関節軟骨に対して強い潤滑特性を有することを実証する。それ故に、ＮＣＭはＯＡに対する療法として有望であり、ここで、ＮＣＭは、痛みを最小限に抑える為に、関節中に注射する際に直接適用されうる一方、同時に、常在性軟骨細胞に対して再生刺激（罹患した軟骨組織を健康な状態に向けて修復しうる）を誘発する。更なる試験が、より生理学的モデルにおけるＮＣＭの再生効果、及びＮＣＭを臨床的に応用する為の処置法に重点が置かれるべきである。
【００５５】
参考文献
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【国際調査報告】
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