(57)【要約】本発明は、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片、および／またはＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドもしくはその生物学的に活性な断片をコードする核酸を使用して、ＣＤＨ１が減少または欠損した癌を治療するための組成物および方法を提供する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
減少したＣＤＨ１レベルを有する癌に罹患した対象を治療する方法であって、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片、からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤の治療的有効量を前記対象に投与することを含む、方法。
【請求項２】
前記癌がＣＤＨ１発現を喪失している、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記癌が上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こしつつあるか、または既に起こしている、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記癌が、びまん性胃癌（ＤＧＣ）、乳小葉癌、転移性乳癌、転移性肺癌、転移性非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、脳腫瘍および黒色腫からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記薬剤が、（ｉ）配列番号１、２、および３からなる群から選択されるポリペプチドとその全長にわたって少なくとも８０％同一であるＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片ならびに（ｉｉ）（ｉ）のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列、からなる群から選択され、前記核酸配列は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、および１１からなる群から選択される核酸配列、または前記生物学的に活性な断片をコードするその一部と、その全長にわたって少なくとも８０％同一である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記薬剤が、配列番号１、２、または３のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記薬剤が、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片であり、かつそれに融合した異種ポリペプチドをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記融合ポリペプチドが、対応する非融合ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片よりも長い半減期および／または細胞透過性を有する、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記異種ポリペプチドが、Ｆｃドメインおよび／または細胞透過性ペプチドである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
前記薬剤が、発現ベクターまたは細胞内に含まれる核酸である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記対象に免疫療法および／または癌療法を施すことをさらに含み、任意で、前記免疫療法および／または癌療法が前記薬剤の前、後、または同時に施される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記免疫療法が、細胞ベースである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記免疫療法が、癌ワクチンおよび／またはウイルスを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記免疫療法が、免疫チェックポイントを阻害する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ、４−ＩＢＢ、ＯＸ−４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、およびＡ２ａＲからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記癌療法が、放射線、放射線増感剤、および化学療法からなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
前記薬剤が、前記癌中の生存細胞または増殖細胞の数を減少させ、かつ／または前記癌細胞を含む腫瘍の体積またはサイズを減少させる、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記癌を治療するための少なくとも１つの追加の治療薬またはレジメンを前記対象に投与することをさらに含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
減少したＣＤＨ１レベルを有する癌細胞の生存率または増殖を減少させる方法であって、前記癌細胞を１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片、からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤と接触させることを含む、方法。
【請求項２０】
前記癌細胞がＣＤＨ１発現を喪失している、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記癌細胞が、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こしつつあるか、または既に起こしている、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記癌細胞が、びまん性胃癌（ＤＧＣ）、乳小葉癌、転移性乳癌、転移性肺癌、転移性非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、脳腫瘍、黒色腫からなる群から選択される癌を有する対象から得られる、請求項１９〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記薬剤が、（ｉ）配列番号１、２、および３からなる群から選択されるポリペプチドとその全長にわたって少なくとも８０％同一であるＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、ならびに（ｉｉ）（ｉ）のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列、からなる群から選択され、前記核酸配列は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、および１１からなる群から選択される核酸配列、または前記生物学的に活性な断片をコードするその一部と、その全長にわたって少なくとも８０％同一である、請求項１９〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記薬剤が、配列番号１、２、または３のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド配列を含む、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記薬剤が、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片であり、かつそれに融合した異種ポリペプチドをさらに含む、請求項１９〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記融合ポリペプチドが、対応する非融合ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片よりも長い半減期および／または細胞透過性を有する、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記異種ポリペプチドが、Ｆｃドメインおよび／または細胞透過性ペプチドである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記薬剤が、発現ベクターまたは細胞内に含まれる核酸である、請求項１９〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記癌細胞を免疫療法および／または癌療法と接触させることをさらに含み、任意で、前記免疫療法および／または癌療法が前記薬剤の前、後、または同時に施される、請求項１９〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記免疫療法が細胞ベースである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記免疫療法が癌ワクチンおよび／またはウイルスを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記免疫療法が免疫チェックポイントを阻害する、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記免疫チェックポイントが、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ、４−ＩＢＢ、ＯＸ−４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、およびＡ２ａＲからなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記癌療法が、放射線、放射線増感剤、および化学療法からなる群から選択される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
対象において減少したＣＤＨ１レベルを有する癌を治療するための請求項１に記載の薬剤の有効性を評価する方法であって、
ａ）最初の時点で、対象の試料における生存および／または増殖癌細胞の数を検出することと、
ｂ）前記薬剤の投与後の少なくとも１つの後続時点の間、工程ａ）を繰り返すことと、
ｃ）工程ａ）およびｂ）で検出された生存および／または増殖癌細胞の数を比較することと、を含み、前記最初の時点での前記試料中の量と比較した、後続試料中の生存および／または増殖癌細胞の不在、またはその数の顕著な減少は、前記薬剤が前記対象の癌を治療することを示す、方法。
【請求項３６】
前記最初の時点と前記後続時点との間で、前記対象が前記癌の治療を受けたか、治療を完了したか、かつ／または寛解にある、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記最初および／または少なくとも１つの後続試料が、エクスビボおよびインビボ試料からなる群から選択される、請求項３５または３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記最初および／または少なくとも１つの後続試料が、前記癌の動物モデルから得られる、請求項３５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記最初および／または少なくとも１つの後続試料が、前記対象から得られた単一試料またはプールされた試料の一部である、請求項３５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記試料が、前記対象から得られた細胞、血清、腫瘍周囲組織、および／または腫瘍内組織を含む、請求項３５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
臨床的有益率、死亡までの生存時間、病理学的完全奏効、病理学的奏効の半定量的測定、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存期間、無転移生存期間、無病生存期間、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー反応、およびＲＥＣＩＳＴ基準からなる群から選択される少なくとも１つの基準を測定することにより、前記薬剤に対する奏効性を決定することをさらに含む、請求項３５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記薬剤が薬学的に許容される製剤で投与される、請求項１〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記投与または接触の工程が、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで生じる、請求項１〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記対象が前記癌の動物モデルであり、任意に、前記動物モデルがマウスモデルである、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記対象が哺乳動物である、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記哺乳動物がマウスまたはヒトである、請求項４５に記載の方法。
【請求項４７】
前記哺乳動物がヒトである、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
減少したＣＤＨ１レベルを有する癌細胞の生存率または増殖を減少させる薬剤をスクリーニングするための細胞ベースのアッセイであって、
ａ）前記癌細胞を、１）ＲＨＯＡ変異体、またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡ変異体ポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、からなる群から選択される試験薬剤と接触させることと、
ｂ）対照と比較して癌細胞の減少した生存率または増殖を決定し、それにより癌細胞の生存率または増殖を減少させる前記試験薬剤を特定することと、を含む細胞ベースのアッセイ。
【請求項４９】
前記対照が前記試験薬剤と接触していない癌細胞である、請求項４８に記載の細胞ベースのアッセイ。
【請求項５０】
前記対照が抗癌剤と接触した癌細胞である、請求項４８に記載の細胞ベースのアッセイ。
【請求項５１】
前記癌細胞が、癌の動物モデル、または癌に罹患したヒト患者から単離される、請求項４８〜５０のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイ。
【請求項５２】
前記接触させる工程がインビボ、エクスビボ、またはインビトロで生じる、請求項４８〜５１のいずれか一項に記載の細胞ベースのアッセイ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１７年１１月８日に提出された米国仮出願第６２／５８３，１６６号の利益を主張し、前記出願の全内容は、本参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００２】
胃癌は、世界中で癌による死亡の３位の主要原因である（Ｓｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＷｏｒｌｄＪ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２：３８０−３８７；Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １６：９−１１；Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５１３：２０２−２０９）。胃癌は顕著な異質性を有するが、最も際立った２つのサブタイプは腸胃癌（ＩＧＣ）とびまん性胃癌（ＤＧＣ）である。ＤＧＣの名前の由来は、細胞接着の特徴的な欠如、間質全体への浸潤、および細胞分化の低下（多くの場合、印環細胞の形態）である。ＤＧＣの遺伝型を有する家族は、細胞接着タンパク質Ｅ−カドヘリンをコードするＣＤＨ１に変異を持っている（Ｇｕｉｌｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：４０２−４０５）。遺伝性ＤＧＣを超えて、非常に一般的な散発型のＤＧＣも、体細胞変異またはプロモーターの過剰メチル化を介して、Ｅ−カドヘリンの喪失とも関連している。ＤＧＣの開始は通常、腫瘍抑制因子ＣＤＨ１の喪失に続いて起こる。ＥＭＴ癌は、Ｅ−カドヘリン喪失びまん性胃癌と同様の特徴を有する。
【０００３】
ＲＨＯＡ変異はＤＧＣ内で繰り返し特定されており、これはＲＨＯＡがＤＧＣの新規候補ドライバーであることを示している。ＲｈｏＡは、細胞表面受容体と、異なる細胞内シグナル伝達タンパク質との間の媒介として作用する低分子量ＧＴＰａｓｅ−Ｒａｓ様タンパク質のＲｈｏファミリーのメンバーである。他のＧＴＰａｓｅと同様に、ＲｈｏＡは、アクチン細胞骨格、細胞遊走、細胞質分裂、細胞（分裂）周期の構造とダイナミクスに影響を与える、ＲＯＣＫなどの下流のエフェクターと相互作用する非活性ＧＤＰ結合コンフィギュレーションと活性ＧＴＰ結合コンフィギュレーションとの間を循環する。ＲｈｏＡの過剰発現は様々な癌で観察されており、ＲｈｏＡ活性は腫瘍形成と腫瘍細胞浸潤に関係している（Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１７９６：９１−９８）。しかし、ＲＨＯＡ変異が単に生理的なＲｈｏＡ活性を弱毒化させるだけなのか、あるいはこれらの変異が機能の獲得をもたらすのかについては明らかにされていない。
【０００４】
したがって、胃癌、ならびにＣＤＨ１発現の減少および／または欠損を特徴とする他の上皮／間葉転換（ＥＭＴ）癌は、早期の浸潤および転移を起こしやすく、効果的な分子標的療法を欠いている。したがって、当技術分野では、ＤＧＣのようなＥＭＴ癌の新しい治療標的を特定する大きな必要性が存在する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００５】
【非特許文献１】Ｓｕｔｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）ＷｏｒｌｄＪ．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ．１２：３８０−３８７
【非特許文献２】Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  １６：９−１１；Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｎｅｔｗｏｒｋ（２０１４）Ｎａｔｕｒｅ  ５１３：２０２−２０９
【非特許文献３】Ｇｕｉｌｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｎａｔｕｒｅ  ３９２：４０２−４０５
【非特許文献４】Ｋａｒｌｓｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．１７９６：９１−９８
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、低分子量ＧＴＰａｓｅ  ＲＨＯＡドミナントネガティブフォーム（例えば、ＲＨＯＡ  Ｔ１９Ｎ、ＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｅ、またはＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｖ）が、ＣＤＨ１−ｎｕｌｌ癌細胞など、減少および／または欠損したＣＤＨ１発現を有する癌細胞の過剰増殖を調節するが、ＣＤＨ１発現が損なわれていない癌細胞は温存するという発見に一部基づいている。
【０００７】
一態様では、減少したＣＤＨ１レベルを有する癌に罹患した対象を治療する方法が提供され、当該方法は、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片、からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤の治療的有効量を対象に投与することを含む。
【０００８】
本発明の任意の態様に適用することができ、および／または本明細書で説明する任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、一実施形態において、癌はＣＤＨ１発現を喪失している。別の実施形態では、癌は上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こしつつあるか、または既に起こしている。さらに別の実施形態では、癌は、びまん性胃癌（ＤＧＣ）、乳小葉癌、転移性乳癌、転移性肺癌、転移性非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、脳腫瘍および黒色腫からなる群より選択される。さらに別の実施形態において、薬剤は、（ｉ）配列番号１、２および３からなる群から選択されるポリペプチドとその全長にわたって少なくとも８０％同一であるＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、ならびに（ｉｉ）（ｉ）のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列、からなる群から選択され、核酸配列は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、および１１からなる群から選択される核酸配列、または生物学的に活性な断片をコードするその一部と、その全長にわたって、少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、薬剤は、配列番号１、２、または３のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド配列を含む。さらに別の実施形態では、薬剤はＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片であり、かつそれに融合した異種ポリペプチドをさらに含む。さらに別の実施形態では、融合ポリペプチドは、対応する非融合ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片よりも長い半減期および／または細胞透過性を有する。別の実施形態では、異種ポリペプチドは、Ｆｃドメインおよび／または細胞透過性ペプチドである。さらに別の実施形態では、薬剤は、発現ベクターまたは細胞内に含まれる核酸である。さらに別の実施形態において、本方法は、対象に免疫療法および／または癌療法を施すことをさらに含み、任意で、免疫療法および／または癌療法は、薬剤の前、後、または同時に施される。別の実施形態では、免疫療法は細胞ベースである。さらに別の実施形態では、免疫療法は癌ワクチンおよび／またはウイルスを含む。さらに別の実施形態では、免疫療法は免疫チェックポイントを阻害する。別の実施形態において、免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ、４−ＩＢＢ、ＯＸ−４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰアルファ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、およびＡ２ａＲからなる群から選択される。さらに別の実施形態では、癌療法は、放射線、放射線増感剤、および化学療法からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、薬剤は、癌中の生存細胞または増殖細胞の数を減少させ、かつ／または癌細胞を含む腫瘍の体積またはサイズを減少させる。別の実施形態において、本方法は、癌を治療するための少なくとも１つの追加の治療薬またはレジメンを対象に投与することをさらに含む。
【０００９】
別の態様では、減少したＣＤＨ１レベルを有する癌細胞の生存率または増殖を減少させる方法が提供され、当該方法は、癌細胞を１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片、からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤と接触させることを含む。
【００１０】
上述のように、本発明の任意の態様に適用することができ、および／または本明細書で説明する他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、一実施形態では、癌細胞はＣＤＨ１発現を喪失している。別の実施形態では、癌細胞は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こしつつあるか、または既に起こしている。さらに別の実施形態では、癌細胞は、びまん性胃癌（ＤＧＣ）、乳小葉癌、転移性乳癌、転移性肺癌、転移性非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、脳腫瘍、および黒色腫からなる群から選択される癌を有する対象から得られる。さらに別の実施形態において、薬剤は、（ｉ）配列番号１、２および３からなる群から選択されるポリペプチドとその全長にわたって少なくとも８０％同一であるＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、および（ｉｉ）（ｉ）のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸配列、からなる群から選択され、核酸配列は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、および１１からなる群から選択される核酸配列、または生物学的に活性な断片をコードするその一部と、その全長にわたって、少なくとも８０％同一である。別の実施形態では、薬剤は、配列番号１、２、または３のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド配列を含む。さらに別の実施形態では、薬剤はＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片であり、それに融合した異種ポリペプチドをさらに含む。さらに別の実施形態では、融合ポリペプチドは、対応する非融合ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片よりも長い半減期および／または細胞透過性を有する。別の実施形態では、異種ポリペプチドは、Ｆｃドメインおよび／または細胞透過性ペプチドである。さらに別の実施形態では、薬剤は、発現ベクターまたは細胞内に含まれる核酸である。さらに別の実施形態において、方法は、癌細胞を免疫療法および／または癌療法と接触させることをさらに含み、任意で、免疫療法および／または癌療法は薬剤の前、後、または同時に施される。別の実施形態では、免疫療法は癌ワクチンおよび／またはウイルスを含む。さらに別の実施形態では、免疫療法は免疫チェックポイントを阻害する。さらに別の実施形態では、免疫チェックポイントは、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＧＩＴＲ、４−ＩＢＢ、ＯＸ−４０、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰａｌｐｈａ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、ＨＨＬＡ２、ブチロフィリン、およびＡ２ａＲからなる群から選択される。別の実施形態において、癌療法は、放射線、放射線増感剤、および化学療法からなる群から選択される。
【００１１】
さらに別の態様では、減少したＣＤＨ１レベルを有する癌を治療するための請求項１に記載の薬剤の有効性を評価する方法が提供され、当該方法は、ａ）最初の時点で、対象の試料における生存および／または増殖している癌細胞の数を検出することと、ｂ）薬剤の投与後の少なくとも１つの後続時点の間、工程ａ）を繰り返すことと、ｃ）工程ａ）およびｂ）で検出された生存および／または増殖癌細胞の数を比較することと、を含み、最初の時点での試料中の量と比較した、後続試料中の生存および／または増殖癌細胞の数の不在、またはその数の顕著な減少は、薬剤が対象の癌を治療することを示す。
【００１２】
上述のように、本発明の任意の態様に適用することができ、および／または本明細書で説明する任意の他の実施形態と組み合わせることができる多数の実施形態がさらに提供される。例えば、一実施形態では、最初の時点と後続時点との間で、対象は癌の治療を受けたか、治療を完了したか、かつ／または寛解にある。別の実施形態では、最初および／または少なくとも１つの後続試料は、エクスビボおよびインビボ試料からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、最初および／または少なくとも１つの後続試料は、癌の動物モデルから得られる。さらに別の実施形態では、最初および／または少なくとも１つの後続試料は、対象から得られた単一の試料またはプールされた試料の一部である。別の実施形態では、試料は、対象から得られた細胞、血清、腫瘍周囲組織、および／または腫瘍内組織を含む。さらに別の実施形態では、本方法は、臨床的有益率、死亡までの生存、病理学的完全奏効、病理学的奏効の半定量的測定、臨床的完全寛解、臨床的部分寛解、臨床的安定疾患、無再発生存期間、無転移生存期間、無病生存期間、循環腫瘍細胞減少、循環マーカー反応、およびＲＥＣＩＳＴ基準からなる群から選択される少なくとも１つの基準を測定することにより、薬剤に対する奏効性を決定することをさらに含む。さらに別の実施形態では、薬剤は薬学的に許容される製剤で投与される。別の実施形態では、投与または接触の工程は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで生じる。さらに別の実施形態では、対象は癌の動物モデルであり、場合により動物モデルはマウスモデルである。さらに別の実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、哺乳動物はマウスまたはヒトである。さらに別の実施形態では、哺乳動物はヒトである。
【００１３】
さらに別の態様では、減少したＣＤＨ１レベルを有する癌細胞の生存率または増殖を減少させる薬剤をスクリーニングするための細胞ベースのアッセイが提供され、当該アッセイは、
ａ）癌細胞を、１）ＲＨＯＡ変異体、またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡ変異体ポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片、からなる群から選択される試験薬剤と接触させることと、ｂ）対照と比較して癌細胞の減少した生存率または増殖を決定し、それによって癌細胞の生存率または増殖を減少させる試験薬剤を特定することと、を含む。一実施形態では、対照は、試験薬剤と接触していない癌細胞である。別の実施形態では、対照は、抗癌剤と接触した癌細胞である。さらに別の実施形態では、癌細胞は、癌の動物モデル、または癌に罹患したヒト患者から単離される。さらに別の実施形態では、接触させる工程は、インビボ、エクスビボ、またはインビトロで生じる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】ＲＨＯＡ−Ｔ１９Ｎ異所性発現がＣＤＨ１−ｎｕｌｌ胃オルガノイドを特異的に死滅させることを示している。Ｍｉｓｔ１ＣｒｅＥＲ、Ｃｄｈ１Ｆ／Ｆオルガノイドにｐｌｘ３０７レンチ−ＥＧＦＰ／ＲＨＯＡ−ＷＴ／ＲＨＯ−Ｔ１９Ｎウイルスを感染させ、１週間ピューロ（ｐｕｒｏ）を添加することにより安定感染オルガノイドを選択した。次いで、細胞をタモキシフェンの有無にかかわらず処理して、Ｃｒｅを活性化し、Ｅ−カドヘリン喪失を誘導した。ＲＨＯＡ異所性発現とＥ−カドヘリン喪失は、ウエスタンブロットとＴｏｍａｔｏ／ＧＦＰカラースイッチ決定の両方で検証された。
【図２】ＲＨＯＡ−Ｔ１９Ｎ異所性発現がＣＤＨ１−ｎｕｌｌ乳房上皮ＭＣＦ１０Ａ細胞を特異的に死滅させることを示している。同質遺伝子的ＭＣＦ１０Ａ−ＣＤＨ１−無傷細胞に異なる構成的ＲＨＯＡ変異ウイルスを感染させ、１週間ピューロを添加することにより安定感染細胞を選択した。次いで、ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏアッセイを使用する分析のために、細胞を９６ウェルプレートに播いた。ＭＣＦ１０Ａ−ＣＤＨ１−ＫＯ細胞に異なるＤｏｘ誘導性ＲＨＯＡ変異ウイルスを感染させ、１週間ピューロを添加して安定感染細胞を選択した。次いで、ｃｅｌｌ  ｔｉｔｅｒ  ｇｌｏアッセイ分析のために細胞を、Ｄｏｘ誘導を伴う９６ウェルプレートに播いた。
【図３】ＲＨＯＡ−Ｔ１９ＮがＮＵＧＣ４腫瘍の成長を著しく阻害できることを示している。びまん性胃癌（ＤＧＣ）ＮＵＧＣ４細胞では、ウエスタンブロット分析により総Ｅ−カドヘリン喪失が確認された。次いで、細胞を、ピューロ選択を使用して、Ｄｏｘ誘導性レンチ−ＲＨＯＡウイルスに安定に感染させた。３００万個のＮＵＧＣ４細胞をヌードマウスの側腹部に注射した。２週間後、変異ＲＨＯＡ発現を誘導するために、通常の餌を、Ｄｏｘを含む餌に変更した。各群のマウスＮ＝３。Ｐ＜０．０００１：対照−対−Ｔ１９Ｎ。
【図４】ＲＨＯＡ−Ｔ１９ＮがＭＫＮ４５腫瘍の成長を著しく阻害できることを示している。びまん性腺癌ＭＫＮ４５細胞では、ウエスタンブロット分析により総Ｅ−カドヘリン喪失が確認された。次いで、細胞を、ピューロ選択を使用して、Ｄｏｘ誘導性レンチ−ＲＨＯＡウイルスに安定に感染させた。３００万個のＭＫＮ４５細胞をヌードマウスの側腹部に注射した。２週間後、変異ＲＨＯＡ発現を誘導するために、通常の餌を、Ｄｏｘを含む餌に変更した。各群のマウスＮ＝３。Ｐ＜０．０００１：対照−対−Ｔ１９Ｎ。  バーヒストグラムを示すいくつかの図については、示されるように、各表示の左から右へのバーは、凡例の上から下へのボックスに直接対応している。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
本発明は、低分子量ＧＴＰａｓｅ  ＲＨＯＡドミナントネガティブフォーム（例えば、ＲＨＯＡ  Ｔ１９Ｎ、ＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｅ、またはＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｖ）が、ＣＤＨ１−ｎｕｌｌ癌細胞など、減少および／または欠損したＣＤＨ１発現を有する癌細胞の過剰増殖を調節するが、ＣＤＨ１発現が損なわれていない癌細胞は温存するという発見に一部基づいている。例えば、ＲＨＯＡ  Ｔ１９Ｎドミナントネガティブフォームは、ＣＤＨ１−ｎｕｌｌ  ＭＣＦ１０Ａ細胞を特異的に死滅させるが、ＣＤＨ１−無傷ＭＣＦ１０Ａ細胞を温存する。同質遺伝子的胃オルガノイドモデルを使用して同様の結果が見出された。例えば、ＲＨＯＡ−Ｔ１９Ｎの異所性発現は、ＣＤＨ１−ｎｕｌｌ胃オルガノイドを特異的に死滅させる。さらに、ＲＨＯＡ−Ｔ１９ＮはＥ−カドヘリン喪失ＮＵＧＣ４およびＭＫＮ４５拡散胃細胞株の腫瘍成長を有意に抑制することができる。したがって、本発明は、部分的に、ドミナントネガティブＲＨＯＡを使用して減少したＣＤＨ１レベルを有する癌を治療するための方法および薬剤に関する。
【００１６】
Ｉ．定義
冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書において、冠詞の文法的対象の１つまたは２つ以上（すなわち、少なくとも１つ）を指すために使用される。例として、「要素」とは、１つの要素または２つ以上の要素を意味する。
【００１７】
本明細書で特に明記しない限り、用語「抗体」および「抗体類」は、抗体の天然に存在する形態（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ）および、単鎖抗体、キメラおよびヒト化抗体、および多特異性抗体などの組換え抗体、ならびに前述のすべての断片および誘導体であって、少なくとも抗原結合部位を有するこれらの断片および誘導体、を広く包含する。抗体誘導体は、抗体に結合したタンパク質または化学成分を含んでもよい。
【００１８】
本明細書で使用される「抗体」という用語には、抗体の「抗原結合部分」（または単に「抗体部分」）も含まれる。本明細書で使用される「抗原結合部分」という用語は、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、全長抗体の断片によって実行できることが示されている。抗体の「抗原結合部分」という用語に含まれる結合断片の例には、（ｉ）Ｆａｂ断片、ＶＬ、ＶＨ、ＣＬおよびＣＨ１ドメインからなる一価の断片と、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片、ヒンジ領域でジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価の断片と、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片と、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片と、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ  ３４１：５４４−５４６）と、（ｖｉ）分離された相補性決定領域（ＣＤＲ）と、が含まれる。さらに、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬとＶＨは別々の遺伝子によってコードされているが、それらは組換え法を使用して、ＶＬ領域とＶＨ領域が対になって一価のポリペプチドを形成する単一のタンパク質鎖（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られている、例えばＢｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４２：４２３−４２６、およびＨｕｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８５：５８７９−５８８３、およびＯｓｂｏｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １６：７７８を参照されたい）としてそれらを作成できるようにする合成リンカーによって結合することができる。そのような一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」という用語を包含することも意図されている。完全なＩｇＧポリペプチドまたは他のアイソタイプをコードする発現ベクターを生成するために、特定のｓｃＦｖの任意のＶＨおよびＶＬ配列をヒト免疫グロブリン定常領域ｃＤＮＡまたはゲノム配列に連結することができる。ＶＨおよびＶＬはまた、タンパク質化学または組換えＤＮＡ技術のいずれかを使用して、Ｆａｂ、Ｆｖ、または免疫グロブリンの他の断片の生成にも使用できる。ダイアボディなどの他の形態の一本鎖抗体も含まれる。ダイアボディは、ＶＨおよびＶＬドメインが一本鎖ポリペプチドで発現する二価の二重特異性抗体であるが、同じ鎖上の２つのドメイン間のペアリングを可能にするには短すぎるリンカーを使用し、それによりドメインを別の鎖の相補ドメインとペアリングさせ、２つの抗原結合部位の作成する（例えば、Ｈｏｌｌｉｇｅｒ，Ｐ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：６４４４−６４４８、Ｐｏｌｊａｋ，Ｒ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ２：１１２１−１１２３を参照されたい）。
【００１９】
さらに、抗体またはその抗原結合部分は、抗体または抗体部分と１つ以上の他のタンパク質またはペプチドとの共有結合性または非共有結合性会合により形成される、より大きな免疫接着性（ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｓｉｏｎ）ポリペプチドの一部であり得る。そのような免疫接着性ポリペプチドの例には、四量体ｓｃＦｖポリペプチドの作成のためのストレプトアビジンコア領域の使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ｈｕｍａｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ  ６：９３−１０１）および二価およびビオチン化ｓｃＦｖポリペプチドを作成するためのシステイン残基、マーカーペプチドおよびＣ末端ポリヒスチジンタグの使用（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ，Ｓ．Ｍ．，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１０４７−１０５８）が含まれる。ＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片などの抗体部分は、それぞれ抗体全体のパパインまたはペプシン消化などの従来の技術を使用して抗体全体から調製することができる。さらに、抗体、抗体部分、および免疫接着性ポリペプチドは、本明細書に記載の標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して取得することができる。
【００２０】
抗体はポリクローナルでもモノクローナルでも、異種、同種、または同一遺伝子のものでもまたはその修飾形態（例えば、ヒト化、キメラなど）であってもよい。抗体も完全にヒトのものであってよい。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」および「モノクローナル抗体組成物」という用語は、抗原の特定のエピトープと免疫反応することができる抗原結合部位の１つの種のみを含む抗体ポリペプチドの集団を指し、一方「ポリクローナル抗体」および「ポリクローナル抗体組成物」という用語は、特定の抗原と相互作用することができる抗原結合部位の複数の種を含む抗体ポリペプチドの集団を指す。モノクローナル抗体組成物は、通常、免疫反応する特定の抗原に対して単一の結合親和性を示す。
【００２１】
「アンチセンス」核酸ポリペプチドという用語は、タンパク質をコードする「センス」核酸に相補的な、例えば、二本鎖ｃＤＮＡポリペプチドのコード鎖に相補的な、ｍＲＮＡ配列に相補的な、または遺伝子のコード鎖に相補的な、ヌクレオチド配列を含む。したがって、アンチセンス核酸ポリペプチドは、センス核酸ポリペプチドに水素結合できる。
【００２２】
「体液」という用語は、体から排泄または分泌される体液と、通常は排泄または分泌されない体液（例、羊水、房水、胆汁、血液および血漿、脳脊髄液、耳垢および耳滓、カウパー氏腺液または尿道球腺液、乳び、キームス、便、女性射出液（ｆｅｍａｌｅ  ｅｊａｃｕｌａｔｅ）、間質液、細胞内液、リンパ、月経、母乳、粘液、胸水、腹水、膿、唾液、皮脂、精液、血清、汗、滑液、涙、尿、膣潤滑液、硝子体液、嘔吐）を指す。好ましい実施形態では、体液は、全血、血清、血漿などを含む血液関連液に制限される。
【００２３】
「癌」または「腫瘍」または「過剰増殖性障害」という用語は、制御されない増殖、不死、転移能、急速な成長および増殖速度、および特定の特徴的な形態的特徴など、発がん性細胞に典型的な特徴を有する細胞の存在を指す。癌は一般に、制御されない細胞成長、隣接組織へのそのような細胞の浸潤、および血管およびリンパ管メナスによる身体の他の器官へのそのような細胞の拡散に関連している。癌浸潤は、癌細胞が隣接組織の正常な境界に侵入してそれを越えるときに発生し、これは、癌細胞の遊走、癌細胞による基底膜の酵素的破壊などをアッセイすることで測定できる。いくつかの実施形態では、癌の特定の段階が関連しており、そのような段階には、血管新生、細胞浸潤、および／または転移の、前および／または後の期間が含まれ得る。癌細胞は、多くの場合、固形腫瘍の形態であるが、そのような細胞は動物内に単独で存在する場合もあれば、白血病細胞などの非腫瘍形成性癌細胞である場合もある。癌には、Ｂ細胞癌、例えば多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、例えばα鎖病、γ鎖病、およびｍｕ鎖病などの重鎖病、良性単クローン性ガンマグロブリン異常症、および免疫細胞性アミロイドーシス、黒色腫、乳癌、肺癌、気管支癌、結腸直腸癌、前立腺癌、膵臓癌、胃癌、卵巣癌、膀胱癌、脳または中枢神経系癌、末梢神経系癌、食道癌、子宮頸癌、子宮癌または子宮内膜癌、口腔癌または咽頭癌、肝臓癌、腎臓癌、精巣癌、胆道癌、小腸または虫垂癌、唾液腺癌、甲状腺癌、副腎癌、骨肉腫、軟骨肉腫、血液組織の癌などが含まれるが、これらに限定されない。本発明に包含される方法に適用可能な癌の他の非限定的な例には、ヒト肉腫および癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、脊索腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫（ｌｙｍｐｈａｎｇｉｏｅｎｄｏｔｈｅｌｉｏｓａｒｃｏｍａ）、滑膜腫、中皮腫、ユーイング肉腫、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸癌、膵臓癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、扁平上皮癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭状腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支原性癌、腎細胞癌、肝細胞腫、胆管癌、肝臓癌、絨毛癌、セミノーマ、胚性癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮頸癌、骨癌、脳腫瘍、精巣癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫瘍、乏突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫、白血病、例えば急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性および赤白血病）、慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）、および真性赤血球増加症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、および重鎖病、が含まれる、いくつかの実施形態において、表現型が本発明の方法によって決定される癌は、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、婦人科癌、腎癌、喉頭癌、肺癌、口腔癌、頭頸部癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、または皮膚癌などであるがこれらに限定されない上皮癌である。他の実施形態では、癌は乳癌、前立腺癌、肺癌、ま��は結腸癌である。さらに他の実施形態において、上皮癌は、非小細胞肺癌、非乳頭腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、または乳癌である。上皮性癌は、漿液性、類内膜性、粘液性、明細胞、ブレンナー、または未分化性を含むが、これらに限定されない様々な他の方法で特徴付けられてもよい。いくつかの実施形態では、本発明は、黒色腫およびそのサブタイプの治療、診断、および／または予後に使用される。
【００２４】
「分類する」という用語には、疾病状態を含む試料を「関連付ける」または「カテゴリー化する」ことが含まれる。特定の例では、「分類する」は統計的証拠、経験的証拠、またはその両方に基づいている。特定の実施形態では、分類する方法およびシステムは、既知の疾病状態を有する試料のいわゆるトレーニングセット（ｔｒａｉｎｉｎｇ  ｓｅｔ）を使用する。確立されると、トレーニングデータセットは、試料の未知の疾病状態を分類するために、未知の試料の特徴が比較される基礎、モデル、または鋳型として機能する。特定の例では、試料を分類することは、試料の疾病状態の診断に似ている。特定の他の例では、試料を分類することは、試料の疾病状態を別の疾病状態と区別することに似ている。
【００２５】
「コード領域」という用語は、アミノ酸残基に翻訳されるコドンを含むヌクレオチド配列の領域を指し、「非コード領域」という用語は、アミノ酸に翻訳されないヌクレオチド配列の領域を指す（例えば、５’および３’非翻訳領域）。
【００２６】
「相補的」という用語は、２つの核酸鎖の領域間または同じ核酸鎖の２つの領域間の配列相補性の広い概念を指す。第１の核酸領域のアデニン残基は、残基がチミンまたはウラシルである場合、第１の領域と逆平行である第２の核酸領域の残基と特異的な水素結合（「塩基対合」）を形成できることが知られている。同様に、第１の核酸鎖のシトシン残基は、残基がグアニンである場合、第１の鎖と逆平行である第２の核酸鎖の残基と塩基対合することができることが知られている。２つの領域が逆平行に配置されるときに、第１の領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基が、第２の領域の残基と塩基対合することができる場合、核酸の第１の領域は、同じまたは異なる核酸の第２の領域に相補的である。好ましくは、第１の領域は第１の部分を含み、第２の領域は第２の部分を含み、それにより、第１および第２の部分が逆平行に配置される場合、第１部分のヌクレオチド残基の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％は、第２部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。より好ましくは、第１の部分のすべてのヌクレオチド残基は、第２の部分のヌクレオチド残基と塩基対合することができる。
【００２７】
「対照」という用語は、試験試料中の発現産物との比較を提供するのに適した参照標準を指す。一実施形態では、対照は、そこから発現産物レベルが検出され、試験試料からの発現産物レベルと比較される「対照試料」を得ることを含む。そのような対照試料は、任意の適切な試料を含み得、それには、既知の結果を有する対照癌患者由来の試料（試料または以前の試料測定値を保存することができる）、正常患者または癌患者などの対象から単離された正常組織または細胞、正常対象または癌患者などの対象から単離された培養初代細胞／組織、癌患者の同じ臓器または体の位置から得られた隣接する正常細胞／組織、正常な対象から単離された組織または細胞試料、または預託機関から取得された初代細胞／組織が含まれるが、これらに限定されない。別の好ましい実施形態では、対照は、ハウスキーピング遺伝子を含むがこれに限定されない、任意の適切なソース由来の参照標準発現産物レベル、正常組織（または以前に分析された他の対照試料）由来の発現産物レベルの範囲、または特定の結果（例えば、１年、２年、３年、４年の生存など）を有する、もしくは特定の治療を受けている患者群、もしくは一連の患者由来の試験試料内で以前に決定された発現産物レベルの範囲、を含み得る。そのような対照試料および参照標準発現産物レベルは、本発明の方法における対照として組み合わせて使用できることが当業者に理解されるであろう。一実施形態では、対照は、正常または非癌性の細胞／組織試料を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、一連の癌患者などの一連の患者の、または特定の治療を受けている一連の癌患者の、またはある結果と別の結果を有する一連の患者の、発現レベルを含み得る。前者の場合、各患者の特定の発現産物レベルを、発現のパーセンタイルレベルに割り当てるか、または参照標準発現レベルの平均（ｍｅａｎ）または平均（ａｖｅｒａｇｅ）よりも高いか低いとして表現できる。別の好ましい実施形態では、対照は、正常細胞、併用化学療法で治療された患者由来の細胞、および良性癌を有する患者由来の細胞、を含み得る。別の実施形態では、対照は、測定値、例えば、その同じ集団のハウスキーピング遺伝子の発現レベルと比較したある集団の特定の遺伝子の平均発現レベルも含み得る。そのような集団は、正常な対象、任意の治療を受けていない（すなわち、治療を受けていない）癌患者、治療を受けている癌患者、または良性癌を有する患者、を含み得る。別の好ましい実施形態では、対照は、発現産物レベルの比率変換を含み、それには、試験試料中の２つの遺伝子の発現産物レベルの比を決定してそれを参照標準中の同じ２つの遺伝子の適切な比と比較すること、試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現産物レベルを決定して任意の適切な対照における発現産物レベルの差を決定すること、試験試料中の２つ以上の遺伝子の発現産物レベルを決定してそれらの発現を試験試料中のハウスキーピング遺伝子の発現に正規化し、任意の適切な対照と比較すること、が含まれるがこれらに限定されない。特に好ましい実施形態では、対照は、試験試料と同じ系統および／または種類である対照試料を含む。別の実施形態では、対照は、癌を有するすべての患者などの一連の患者試料内またはそれに基づくパーセンタイルとしてグループ化された発現産物レベルを含み得る。一実施形態では、例えば特定のパーセンタイルと比較して発現産物のより高いまたはより低いレベルが、結果を予測するための基礎として使用される、対照発現産物レベルが確立される。別の好ましい実施形態では、対照発現産物レベルは、既知の結果を有する癌対照患者由来の発現産物レベルを使用して確立され、試験試料からの発現産物レベルは、結果を予測するための基礎として対照発現産物レベルと比較される。以下のデータによって実証されるように、本発明の方法は、試験試料中の発現産物のレベルを対照と比較する際、特定のカットポイントの使用に限定されない。
【００２８】
本明細書で使用する場合、活性化免疫細胞に関して「同時刺激する」という用語は、同時刺激分子が増殖またはエフェクター機能を誘導する第２の非活性化受容体媒介シグナル（「同時刺激シグナル」）を提供する能力を含む。例えば、同時刺激シグナルは、例えば、Ｔ細胞受容体媒介シグナルを受け取ったＴ細胞におけるサイトカイン分泌をもたらし得る。例えば、活性化受容体を介して細胞受容体媒介シグナルを受け取った免疫細胞は、本明細書では「活性化免疫細胞」と呼ばれる。
【００２９】
「癌の診断」という用語は、個体における癌またはそのサブタイプの有無を決定するための本発明の方法、システム、およびコードの使用を含む。この用語には、個体における疾患活動性のレベルを評価するための方法、システム、およびコードも含まれる。診断は、治療的処置を提供する薬剤によって直接実施することができる。あるいは、治療薬を提供する人は、実行される診断アッセイを要求することができる。診断医および／または治療介入医は、診断アッセイの結果を解釈して治療戦略を決定することができる。同様に、そのような代替プロセスは、予後アッセイなどの他のアッセイにも適用できる。
【００３０】
分子が基質に関して共有結合または非共有結合している場合、分子のかなりの部分が基質から解離することなく、流体（例えば、標準食塩クエン酸緩衝液、ｐＨ７．４）ですすぐことができ、分子は基質に「固定」または「付着」されている。
【００３１】
本明細書で使用される「遺伝子発現データ」または「遺伝子発現レベル」という用語は、細胞または細胞群における遺伝子または遺伝子群の発現の相対的または絶対レベルに関する情報を指す。遺伝子発現レベルは、遺伝子によってコードされるｍＲＮＡなどのＲＮＡのレベルに基づいて決定され得る。あるいは、発現レベルは、遺伝子によりコードされるポリペプチドまたはその断片のレベルに基づいて決定され得る。遺伝子発現データは、個々の細胞、または腫瘍や生検試料などの細胞群について取得できる。遺伝子発現データおよび遺伝子発現レベルは、コンピューター読み取り可能な媒体、例えば、マイクロアレイまたはチップ読み取り装置と組み合わせて使用されるコンピューター読み取り可能な媒体に保存することができる。そのような遺伝子発現データを操作して、遺伝子発現シグネチャを生成することができる。
【００３２】
本明細書で使用される「遺伝子発現シグネチャ」または「シグネチャ」という用語は、協調的に発現される遺伝子群を指す。このシグネチャを構成する遺伝子は、特定の細胞系統、分化段階、または特定の生物学的応答中に発現し得る。遺伝子は、癌の原発部位の細胞、生検における非悪性細胞の性質、および癌の原因となる発癌メカニズムなど、それらが発現される腫瘍の生物学的側面を反映することができる。
【００３３】
本明細書で使用される「相同」または「相同性」という用語は、同じ核酸鎖の２つの領域間または２つの異なる核酸鎖の領域間のヌクレオチド配列の類似性を指す。両方の領域のヌクレオチド残基の位置が同じヌクレオチド残基で占められている場合、領域はその位置で相同である。各領域の少なくとも１つのヌクレオチド残基位置が同じ残基によって占められている場合、第１の領域は第２の領域と相同である。２つの領域間の相同性は、同じヌクレオチド残基が占める２つの領域のヌクレオチド残基位置の割合で表される。例として、ヌクレオチド配列５’−ＡＴＴＧＣＣ−３’を有する領域およびヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＧＧＣ−３’を有する領域は、５０％の相同性を共有する。好ましくは、第１領域は第１部分を含み、第２領域は第２部分を含み、それにより各部分のヌクレオチド残基位置の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５％、少なくとも約９０％、または少なくとも約９５％が、同じヌクレオチド残基によって占められている。より好ましくは、各部分のすべてのヌクレオチド残基位置は、同じヌクレオチド残基によって占められている。
【００３４】
「宿主細胞」という用語は、本発明の組換え発現ベクターなどの本発明の核酸が導入されている細胞を指すことを意図している。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書で互換的に使用される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことを理解されたい。変異または環境の影響のいずれかにより、後続の世代で特定の変更が発生する可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
【００３５】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、例えばヒト細胞によって作られる抗体により類似するように変更された可変および定常領域を有する非ヒト細胞によって作られる抗体を含むことを意図する。非ヒト抗体のアミノ酸配列を変更して、ヒト生殖系列免疫グロブリン配列に見られるアミノ酸を組み込む。ヒト化抗体には、例えばＣＤＲ中のヒトの生殖細胞系免疫グロブリン配列によってコードされていないアミノ酸残基（例えば、インビトロでのランダムまたは部位特異的変異によりまたはインビボでの体細胞変異により導入された変異）が含まれてもよい。
【００３６】
本明細書で使用される「ヒト化抗体」という用語は、マウスなどの別の哺乳動物種の生殖系列に由来するＣＤＲ配列がヒトフレームワーク配列に移植された抗体も含む。
【００３７】
本明細書で使用される「免疫細胞」という用語は、免疫応答に役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は造血系起源であり、Ｂ細胞およびＴ細胞、ナチュラルキラー細胞などのリンパ球や、単球、マクロファージ、好酸球、マスト細胞、好塩基球、顆粒球などの骨髄細胞が含まれる。
【００３８】
本明細書で使用される「免疫応答」という用語は、Ｔ細胞媒介性および／またはＢ細胞媒介性免疫応答を含む。例示的な免疫応答には、Ｔ細胞応答、例えばサイトカイン産生および細胞毒性が含まれる。さらに、免疫応答という用語には、Ｔ細胞の活性化、例えば抗体産生（体液性応答）およびサイトカイン応答性細胞、例えばマクロファージの活性化によって間接的に影響を受ける免疫応答が含まれる。
【００３９】
「免疫療法剤」という用語は、宿主の免疫系を刺激して対象の腫瘍または癌に対する免疫応答を生じさせることができる、任意の分子、ペプチド、抗体または他の薬剤を含むことができる。様々な免疫療法剤は、本明細書に記載の組成物および方法において有用である。免疫療法剤クラスの多数の抗癌剤が当技術分野で周知であり、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＰＤ−Ｌ２、ＣＴＬＡ４などの機能をブロックまたは阻害する抗体が含まれるが、これらに限定されない。
【００４０】
本明細書で使用される場合、「阻害する」という用語は、例えば特定のアクション、機能、または相互作用の減少、制限、または遮断を含む。例えば、過剰増殖性成長などの癌の少なくとも１つの症状が緩和、終結、減速、または予防される場合、癌は「阻害」される。本明細書で使用される場合、癌の再発または転移が減少、遅延、遅延、または予防される場合も、癌はまた「阻害」される。
【００４１】
本明細書で使用される「阻害シグナル」という用語は、免疫細胞上のポリペプチドの阻害受容体（例えばＣＴＬＡ−４またはＰＤ−１）を介して伝達されるシグナルを指す。そのようなシグナルは、活性化受容体を介して（例えば、ＴＣＲ、ＣＤ３、ＢＣＲ、またはＦｃポリペプチドを介して）シグナルに拮抗して、例えば、二次メッセンジャー生成の阻害、増殖の阻害、免疫細胞におけるエフェクター機能の阻害、例えば食作用の減少、抗体産生の減少、細胞毒性の減少、免疫細胞のメディエーター（サイトカイン（ＩＬ−２など）および／もしくはアレルギー反応のメディエーターなど）を産生することの不全、またはアネルギーの発達、をもたらし得る。
【００４２】
本明細書で使用する場合、「相互作用」という用語は、２つの分子間の相互作用を指す場合、分子と相互の物理的接触（例えば、結合）を指す。一般的に、そのような相互作用は、前記分子の一方または両方の活性（生物学的効果を生み出す）をもたらす。活性は、分子の一方または両方の直接的な活性であってもよい。あるいは、相互作用における一方または両方の分子は、それらのリガンドとの結合を妨げられる可能性があり、したがって、リガンド結合活性に関して不活性に保たれる（例えば、そのリガンドと結合し、免疫応答を誘発または阻害する）。そのような相互作用を阻害することにより、相互作用に関与する１つ以上の分子の活性が破壊される。そのような相互作用を強化することは、前記物理的接触の可能性を延長または増加させ、前記活性の可能性を延長または増加させることである。
【００４３】
本明細書で使用される「単離された抗体」は、異なる抗原特異性を有する他の抗体を実質的に含まない抗体を指すことを意図している。さらに、単離された抗体は、他の細胞物質および／または化学物質を実質的に含まないでよい。
【００４４】
本明細書で使用する「単離されたタンパク質」は、細胞から単離された場合、または組換えＤＮＡ技術により生成された場合、他のタンパク質、細胞材料、分離培地、および培地を実質的に含まないタンパク質、または化学合成された場合の化学前駆体または他の化学物質を含まないタンパク質を指す。「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質が由来する細胞または組織源からの細胞物質または他の混入タンパク質を実質的に含まないか、または化学的に合成された場合、化学前駆体もしくは他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言葉には、本発明の組成物が、それらが単離されまたは組換え生産される細胞の細胞成分から分離されている、調製物が含まれる。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という言葉には、細胞物質が約３０％、２０％、１０％、または５％（乾燥重量で）未満の調製物が含まれる。抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質またはそれらの断片、例えばそれらの生物学的に活性な断片が組換え生産される場合、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まない、すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の、約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満となる。
【００４５】
「キット」は、本発明のマーカーの発現を特異的に検出または調節するための少なくとも１つの試薬、例えばプローブを含む任意の製造物（例えば、パッケージまたは容器）である。キットは、本発明の方法を実施するためのユニットとして宣伝、配布、または販売することができる。
【００４６】
「びまん性胃癌」という用語は、「印環細胞胃癌」または「形成性胃組織炎」とも呼ばれる特定の種類の胃癌を指す。胃の１つの領域に留まるのではなく、胃の多くに影響を及ぼす傾向がある。固形腫瘍はない。代わりに、癌性（悪性）細胞が胃の裏層の下で増殖し、裏層を厚く硬くする。このタイプの癌の浸潤性により、これらの癌細胞は肝臓や近くの骨などの他の組織に広がる（転移する）可能性が高くなる。すべての胃癌の約２０％はびまん性胃癌であり、少数は遺伝性びまん性胃癌（ＨＤＧＣ）によるものである。ＨＤＧＣは遺伝性の遺伝子疾患である。ＨＤＧＣに最も一般的に関連する遺伝子はＣＤＨ１と呼ばれる。ＣＤＨ１遺伝子の変異（変化）は、人の胃癌やＨＤＧＣに関連する他の癌を発症するリスクを高める。ＣＴＮＮＡ１を含む他の遺伝子はＨＤＧＣと関連している可能性がある。
【００４７】
内視鏡検査とバリウムＸ線分析は、胃癌の診断に使用できる。ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、内視鏡超音波検査、および腹腔鏡による病期分類から選択された１つ以上の検査を使用して、胃腫瘍の病期を決定できる。びまん性胃癌は、上部内視鏡検査では癌が見えないため、診断が困難である。このため、びまん性胃癌のほとんどの症例は後期（ＩＩＩまたはＩＶ）に診断され、生存率の低下に関連している。びまん性胃癌の複数の症例がある家族、ならびに４０歳以前にびまん性胃癌と診断された患者は、ＣＤＨ１遺伝子変異の検査を推奨される。現在のスクリーニングの推奨事項は、毎年の生検による上部内視鏡検査である。特に病気が初期段階にある場合、手術（例、部分的胃切除術または胃全摘術）が最も一般的な治療アプローチである。より進行した胃癌の場合、化学療法、放射線療法、またはこれらのアプローチの組み合わせなど、手術に加えて治療が使用できる。
【００４８】
浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）とも呼ばれる「乳小葉癌」という用語は、小葉の壁を突き破り、乳房の組織に浸潤し始めた癌を指す。ＩＬＣは、浸潤性乳管癌（乳管（ｍｉｌｋ−ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｄｕｃｔ）で始まり、それを超えて広がる癌）に次いで２番目に多い乳癌である。米国癌協会によると、米国では１８万人以上の女性が毎年浸潤性乳癌に罹患していることが判明している。すべての浸潤性乳癌の約１０％は浸潤性小葉癌である。
【００４９】
ＩＬＣは、独特の分岐パターンで広がるため、他の形態の乳癌よりも診断が難しい場合がある。浸潤性小葉癌の診断には通常、乳房の物理的検査、マンモグラフィ、超音波、乳房ＭＲＩ、および生検（例えば、穿刺吸引生検、コア針生検、切開生検、切除生検など）を含む手順の組み合わせが含まれる。組織試料は顕微鏡下での検査のために病理学者に送られる。病理学者は、浸潤性小葉癌に典型的な細胞の外観と成長パターンを探す。病理学者は、Ｅ−カドヘリンタンパク質研究と呼ばれる特別な検査を注文することもできる。この変異について浸潤性小葉癌細胞を検査することは、インサイチュでそれを上皮内小葉癌、癌ではない小葉の異常細胞群と区別するのに役立つ。浸潤性小葉癌は、ステージＩ（最も初期の段階）からステージＩＶ（最も進行した段階）までのスケールで記述される。病期分類は、腫瘍の大きさ、リンパ節転移、および体の他の部位に拡がっているかどうかに関係している。数値が大きいほど、より進行した段階を表す。
【００５０】
浸潤性小葉癌の治療は、局所治療と全身治療の２つの広いカテゴリーに分類される。手術や放射線療法などの局所治療は、浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）自体と、胸部やリンパ節などの癌の影響を受ける可能性のある任意の周辺領域を治療するために行われる。可能な外科的手技には、乳腺腫瘤摘出術、乳房切除術、センチネルリンパ節郭清、および腋窩リンパ節郭清が含まれる。放射線療法を行う可能な方法には、体外照射、体内部分乳房照射、および体外部分乳房照射が含まれる。浸潤性小葉癌（ＩＬＣ）が発見された領域（または複数領域）に焦点を当てた局所治療とは異なり、全身治療は全身に関与する。化学療法、ホルモン療法、その他の標的療法などの治療は、原発性腫瘍から離れた可能性のある癌細胞を破壊し、ならびに浸潤性小葉癌が再発するリスクを減少させるために使用される。浸潤性小葉癌の治療に使用できる多くの化学療法のほんの一部の例には、アドリアマイシン、エレンス（Ｅｌｌｅｎｃｅ）、シトキサン、タキソテール、タキソール、ゼローダ、イグゼンプラ、メトトレキサート、およびフルオロウラシルが含まれる。ホルモン療法は、抗エストロゲン療法とも呼ばれ、体内のエストロゲンの量を減少させるか、エストロゲンが乳癌細胞にシグナルを送って増殖するのをブロックすることで機能する。最も頻繁に使用されるホルモン療法には以下の２つのタイプがある：選択的エストロゲン受容体モジュレーター（ＳＥＲＭ）およびアロマターゼ阻害剤。他の種類のホルモン療法には、エストロゲン受容体ダウンレギュレーター（ＥＲＤ）および卵巣の機能停止または除去が含まれる。浸潤性小葉癌がＨＥＲ２陽性の場合、ＨＥＲ２を標的とする治療法（ハーセプチンやタイケルブなど）を使用できる。ホルモン療法やＨＥＲ２標的療法と同様に、他の標的療法は、乳癌細胞の増殖と成長を可能にする特定のプロセスを妨げるように設計されている。ほんの一例は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）と呼ばれるタンパク質を標的とする薬剤であるアバスチン（化学名：ベバシズマブ）であり、新しい血管の形成と成長を刺激することを防ぐことができる。
【表１】
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【００５１】
「上皮間葉転換（ＥＭＴ）」という用語は、通常、基底表面を介して基底膜と相互作用する分極上皮細胞が、間葉細胞表現型を想定できる複数の生化学的変化を起こすことを可能にする生物学的プロセスを指し、これには、遊走能力の強化、侵襲性、アポトーシスに対する抵抗性の向上、およびＥＣＭ成分の生産の大幅な増加が含まれる。ＥＭＴの完了は、基底となる基底膜の分解と、それが発生した上皮層から離れて移動できる間葉系細胞の形成によって示される。ＥＭＴを開始し、完了に到達できるようにするために、多くの異なる分子プロセスが関与している。これらには、転写因子の活性化、特定の細胞表面タンパク質の発現、細胞骨格タンパク質の再編成と発現、ＥＣＭ分解酵素の産生、特定のマイクロＲＮＡの発現の変化が含まれる。多くの場合、関与する因子は、ＥＭＴを介して細胞が通過することを示すバイオマーカーとしても使用される。Ｅ−カドヘリンの喪失は、ＥＭＴの基本事象であると考えられている。ＥＭＴは、中胚葉形成や神経管形成など、多数の発達プロセスに不可欠である。ＥＭＴは、創傷治癒、臓器線維化、および癌進行の転移の開始でも発生することが示されている。転移の開始には浸潤が必要であり、これはＥＭＴによって可能になる。原発腫瘍の癌細胞は、Ｅ−カドヘリン抑制によって媒介される細胞間接着を失い、浸潤性が増加した基底膜を突き破り、血管内侵入によって血流に入る。「ＥＭＴ癌」という用語は、ＥＭＴプロセスを起こしつつあるか、または既に起こしているあらゆる種類の癌を指す。ＥＭＴ癌には、びまん性胃癌、乳小葉癌、転移性乳癌、転移性肺癌、転移性非小細胞肺癌、結腸癌、膵臓癌、前立腺癌、脳癌、黒色腫が含まれるが、これらに限定されない。
【００５２】
ＥＭＴでは、間葉状態に転換する上皮細胞は極性を失い、いくつかの転写因子の核発現を増加させ（表１を参照）、Ｅ−カドヘリン、シンデカン−１、および閉鎖帯１（ＺＯ−１）の発現を喪失し、細胞骨格タンパク質の合成を増加させ（下記を参照）、アクチンストレスファイバーの再配列、紡錘状になって、より移動性になる。これらのＥＭＴ様細胞は、アポトーシスや癌の化学療法にも耐性がある。
【００５３】
ＥＭＴを実証するために、様々なバイオマーカーが使用されており、その一部は獲得され、一部は転換中に弱毒化される（表１を参照）。Ｅ−カドヘリンの発現の変化は、ＥＭＴの原型上皮細胞マーカーであり、Ｅ−カドヘリン機能の喪失はＥＭＴを促進する。Ｅ−カドヘリンからＮ−カドヘリンへのカドヘリンの切り替えは、間葉系細胞、線維芽細胞、癌細胞、および神経組織で発現され、多くの場合、ＥＭＴの進行を監視するために使用されている。ＦＳＰ１は、Ｃａ２＋結合Ｓ１００タンパク質ファミリーのメンバーである。これは、癌および線維形成におけるＥＭＴを検出するためのプロトタイプの線維芽細胞マーカーである。カタツムリ転写因子は、ＥＭＴを調節する様々なシグナル伝達経路の一般的な下流標的の顕著な一例である。
【００５４】
「調節する」という用語には、アップレギュレーションおよびダウンレギュレーション、例えば、応答の増強または阻害が含まれる。
【００５５】
ＣＤＨ１、ＲＨＯＡなどのバイオマーカーの「正常」または「対照」発現レベルは、癌などの関心のある疾患に罹患していない例えばヒトの患者などの対象の細胞におけるバイオマーカーの発現レベルである。バイオマーカーの「過剰発現」または「有意に高い発現レベル」とは、発現を評価するために使用されるアッセイの標準誤差よりも大きい試験試料の発現レベルを指し、対照試料（例えば、関心のある疾患を有していない健康な対象からの試料）の発現活性またはバイオマーカーのレベルならびに好ましくは、いくつかの対照試料におけるバイオマーカーの平均発現レベルよりも好ましくは少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍以上高い。バイオマーカーの「有意に低い発現レベル」とは、対照試料（例えば、関心のある疾患のない健康な対象からの試料）の発現活性またはバイオマーカーのレベルならびに好ましくは、いくつかの対照試料におけるバイオマーカーの平均発現レベルよりも少なくとも１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１０．５、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０倍以上低い試験試料の発現レベルを指す。
【００５６】
本明細書に記載される「前悪性病変」という用語は、癌ではないが、癌になる可能性を有する病変を指す。「前悪性疾患」または「潜在的な悪性疾患」という用語も含まれる。特に、これは悪性形質転換について通常のリスクよりも大きい良性、形態学的および／または組織学的に変化した組織を指し、および局所組織の臨床的外観を必ずしも変化させないが、その組織における前癌病変または癌発生（白板症、紅板症、紅白板症扁平苔癬（苔癬様反応）および組織学的検査で異型の細胞または異形成が示された任意の病変または領域、について通常のリスクより大きな関連がある疾患または患者の習慣を指す。
【００５７】
「プローブ」という用語は、具体的に意図された標的分子、例えば、マーカーによってコードされるかまたはマーカーに対応するヌクレオチド転写物またはタンパク質に選択的に結合することができる任意の分子を指す。プローブは、当業者によって合成されるか、適切な生物学的調製物に由来するかのいずれかである。標的分子の検出の目的のために、プローブは、本明細書に記載されるように、標識されるように特に設計され得る。プローブとして利用できる分子の例には、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、抗体、および有機分子が含まれるが、これらに限定されない。
【００５８】
「予後」という用語には、癌の可能性のある経過および結果の予測、または疾患からの回復の可能性が含まれる。いくつかの実施形態において、統計的アルゴリズムの使用は、個体の予後の癌を提供する。例えば、予後は、手術、黒色腫の臨床的サブタイプの発症、１つ以上の臨床的要因の発症、腸癌の発症、または疾患からの回復であり得る。いくつかの実施形態では、用語「良好な予後」は、黒色腫の治療後の予想されるまたは可能性の高い結果が良好であることを示す。「予後不良」という用語は、黒色腫の治療後の予想されるまたは可能性の高い結果が良好でないことを示す。
【００５９】
「耐性」という用語は、癌試料もしくは哺乳動物の癌治療に対する後天的または自然な耐性（すなわち、治療的処置に対して非応答性である、または治療的処置に対する応答が減少または制限されている）を指し、例えば、治療的処置に対する応答が２５％、またはそれ以上、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれ以上から、２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍以上で、減少する。応答の減少は、耐性が獲得される前に同じ癌試料もしくは哺乳動物と比較するか、または治療的処置に対する耐性がないことが知られている別の癌試料もしくは哺乳動物と比較することによって測定できる。化学療法に対する典型的な獲得耐性は「多剤耐性」と呼ばれる。多剤耐性は、Ｐ糖タンパク質によって媒介されるか、他のメカニズムによって媒介されるか、または哺乳動物が多剤耐性微生物または微生物の組み合わせに感染したときに発生する可能性がある。治療的処置に対する耐性の決定は、当技術分野で日常的であり、通常の熟練した臨床医の技量の範囲内であり、例えば、本明細書で「感作されている」と記載される細胞増殖アッセイおよび細胞死アッセイにより測定することができる。いくつかの実施形態では、「耐性を逆転させる」という用語は、原発性癌療法（例えば、化学療法または放射線療法）単独では未治療の腫瘍の腫瘍体積と比較して腫瘍体積の統計的に有意な減少をもたらすことができない状況下で、未治療の腫瘍の腫瘍体積と比較した場合に、原発性癌療法（例えば、化学療法または放射線療法）と組み合わせた第２の薬剤を使用が、統計的有意性のレベル（例えば、ｐ＜０．０５）で腫瘍体積の有意な減少をもたらすことができることを意味する。これは一般に、未治療の腫瘍が対数で規則正しく成長しているときに行われた腫瘍体積測定に適用される。
【００６０】
「感作させる」という用語は、癌療法（例えば、化学療法または放射線療法）による関連する癌のより効果的な治療を可能にする方法で、癌細胞または腫瘍細胞を変えることを意味する。いくつかの実施形態では、正常細胞は、癌治療（例えば、化学療法または放射線療法）によって正常細胞が過度に損傷される程度には影響を受けない。治療的処置に対する感受性の増加または減少した感受性は、特定の治療についての当該技術分野で既知の方法および本明細書において以下に記載される方法に従って測定され、これらは限定されないが、細胞増殖アッセイ（Ｔａｎｉｇａｗａ  Ｎ，Ｋｅｒｎ  Ｄ  Ｈ，Ｋｉｋａｓａ  Ｙ，Ｍｏｒｔｏｎ  Ｄ  Ｌ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８２；４２：２１５９−２１６４）、細胞死アッセイ（Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ  Ｌ  Ｍ，Ｓｈｏｅｍａｋｅｒ  Ｒ  Ｈ，Ｍａｒｓｄｅｎ  Ｊ  Ａ，Ｄｉｌｌ  Ｐ  Ｌ，Ｂａｋｅｒ  Ｊ  Ａ，Ｍｏｒａｎ  Ｅ  Ｍ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  １９８４；９４：１６１−１７３、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ  Ｌ  Ｍ，Ｌｉｐｐｍａｎ  Ｍ  Ｅ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｐ  １９８５；６９：６１５−６３２、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ  Ｌ  Ｍ，Ｉｎ：Ｋａｓｐｅｒｓ  Ｇ  Ｊ  Ｌ，Ｐｉｅｔｅｒｓ  Ｒ，Ｔｗｅｎｔｙｍａｎ  Ｐ  Ｒ，Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ  Ｌ  Ｍ，Ｖｅｅｒｍａｎ  Ａ  Ｊ  Ｐ，ｅｄｓ．Ｄｒｕｇ  Ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  Ｌｅｕｋｅｍｉａ  ａｎｄ  Ｌｙｍｐｈｏｍａ．Ｌａｎｇｈｏｒｎｅ，Ｐ  Ａ：Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９３：４１５−４３２、Ｗｅｉｓｅｎｔｈａｌ  Ｌ  Ｍ，Ｃｏｎｔｒｉｂ  Ｇｙｎｅｃｏｌ  Ｏｂｓｔｅｔ  １９９４；１９：８２−９０）が含まれる。一定期間、例えば、ヒトでは６ヶ月、マウスでは４〜６週間にわたって腫瘍サイズの減少を測定することにより、動物の感受性または耐性を測定することもできる。組成物または方法は、そのような組成物または方法の非存在下での治療感受性または治療耐性と比較して、治療感受性の増加または耐性の減少が２５％、またはそれ以上、例えば３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれ以上、から２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍以上である場合、治療的処置に対する応答を感作させている。治療的処置に対する感受性または耐性の決定は、当技術分野で日常的であり、通常の熟練した臨床医の技量の範囲内である。癌療法の効力を増強するための本明細書に記載の任意の方法は、過剰増殖性またはそうでなければ癌性細胞（例えば、耐性細胞）を癌療法に対して感作させる方法に等しく適用できることを理解されたい。
【００６１】
「ＲＨＯＡ」という用語は、低分子量ＧＴＰａｓｅのＲｈｏファミリーのメンバーであるＲａｓホモログファミリーメンバーＡ（Ｒａｓ  Ｈｏｍｏｌｏｇ  Ｆａｍｉｌｙ  Ｍｅｍｂｅｒ  Ａ）を指し、不活性ＧＤＰ結合状態と活性ＧＴＰ結合状態の間を循環し、シグナル伝達カスケードの分子スイッチとして機能する。Ｒｈｏタンパク質は、アクチン細胞骨格の再編成を促進し、細胞の形状、付着、運動性を調節する。この遺伝子の過剰発現は、腫瘍細胞の増殖と転移に関連している。複数の選択的スプライスバリアントが特定されている。「ＲＨＯＡ」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、および誘導体を含むことを意図している。代表的なヒトＲＨＯＡ  ｃＤＮＡおよびヒトＲＨＯＡタンパク質配列は当技術分野で周知であり、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から公的に入手可能である。ヒトＲＨＯＡアイソフォームには、最長のアイソフォーム１（ＮＭ＿００１６６４．３およびＮＰ＿００１６５５．１）、短いアイソフォーム２（ＮＭ＿００１３１３９４１．１およびＮＰ＿００１３００８７０．１、バリアント１と比較して５’ＵＴＲが異なるが、同じタンパク質をコードする）、３（ＮＭ＿００１３１３９４３．１およびＮＰ＿００１３００８７２．１、代替の３’コーディングエキソンを含み、アイソフォーム１と比較して短く異なるＣ末端をもたらす）、４（ＮＭ＿００１３１３９４４．１およびＮＰ＿００１３００８７３．１、３’コーディング領域で２つの代替インフレームスプライス部位を使用し、アイソフォーム１と比較してより短いアイソフォームをもたらす）、５（ＮＭ＿００１３１３９４５．１およびＮＰ＿００１３００８７４．１、５’領域の代替スプライス部位を使用し、下流の開始コドンを使用して、アイソフォーム１と比較して短いＮ末端をもたらす）、６（ＮＭ＿００１３１３９４６．１およびＮＰ＿００１３００８７５．１、３’コーディング領域に２つの代替インフレームエキソンを欠きを欠き、アイソフォーム１と比較してより短いアイソフォームをもたらす）、および７（ＮＭ＿００１３１３９４７．１およびＮＰ＿００１３００８７６．１、５’コーディング領域に代替エクソンを欠き、フレームシフトが生じ、アイソフォーム１と比較して、異なるＣ末端を有する短いアイソフォームをもたらす）が含まれる。ヒト以外の生物のＲＨＯＡオーソログの核酸およびポリペプチド配列は周知であり、例えば、チンパンジーＲＨＯＡ（ＸＭ＿００１１６３８５１．５およびＸＰ＿００１１６３８５１．３）、イヌＲＨＯＡ（ＮＭ＿００１００３２７３．３およびＮＰ＿００１００３２７３．２）、ウシＲＨＯＡ（ＮＭ＿１７６６４５．３およびＮＰ＿７８８８１８．１）、マウスＲＨＯＡ（ＮＭ＿００１３１３９６１．１およびＮＰ＿００１３００８９０．１、ＮＭ＿００１３１３９６２．１およびＮＰ＿００１３００８９１．１、およびＮＭ＿０１６８０２．５およびＮＰ＿０５８０８２．２）、およびラットＲＨＯＡ（ＸＭ＿００６２４３６９９．１およびＸＰ＿００６２４３７６１．１、ＸＭ＿００６２４３７００．１およびＸＰ＿００６２４３７６２．１、およびＸＭ＿００６２４３７０１．１およびＸＰ＿００６２４��７６３．１）が含まれる。
【００６２】
「ドミナントネガティブＲＨＯＡ」という用語は、１つ以上の変異を保有し、そのためＧＴＰに結合できず、ドミナントネガティブな様式で作用して、ＲｈｏＡ  ＧＴＰローディングを阻害し、内在性ＲＨＯＡおよび他のＧＴＰａｓｅの減衰をもたらす、ＲＨＯＡ遺伝子またはタンパク質を指す。いくつかの実施形態において、それらは、他のＧＴＰａｓｅ活性化タンパク質およびグアニン交換因子を隔離することができる。これらの変異には、Ｔ１９Ｎ、Ｇ１７Ｖ、およびＧ１７Ｅが含まれるが、これらに限定されない。代表的な「ドミナントネガティブＲｈｏＡ」は、表２および表３に示されている配列で示されている。
【００６３】
「ＣＤＨ１」という用語は、カドヘリンスーパーファミリーの古典的なカドヘリンであるカドヘリン１を指す。この遺伝子は、１６番染色体上のカドヘリンファミリーの他のメンバーとともに遺伝子クラスターに存在する。選択的スプライシングは複数の転写バリアントをもたらし、そのうちの少なくとも１つはタンパク質分解処理されて成熟糖タンパク質を生成するプレプロタンパク質をコードする。このカルシウム依存性細胞間接着タンパク質は、５つの細胞外カドヘリンリピート、膜貫通領域、高度に保存された細胞質尾部で構成されている。タンパク質の構造と機能の関係は周知である。例えば、細胞内ドメインには、カテニン分子（ベータカテニンなど）の結合、したがってＥ−カドヘリン機能に不可欠な高度にリン酸化された領域が含まれている。この遺伝子の変異は、胃癌、乳癌、結腸直腸癌、甲状腺癌、卵巣癌と相関している。エクソン８または９のインフレームスキッピングとエクソン１０の欠失は、びまん型胃癌で実証されている。Ｅ−カドヘリンの細胞外ドメインに主に影響するエクソン７（浸潤性乳癌）、１２および１３（子宮内膜癌）、および１６（卵巣癌）の点変異も実証されている。おそらく、ＣＤＨ１の変異を示す最も知られている腫瘍は、浸潤性の乳房の小葉癌およびびまん性胃癌であり、これらの腫瘍の約５０％が影響を受けている。ＣＤＨ１の生殖細胞系変異は様々な家系で検出されており、その結果、印環細胞を伴う低分化びまん型腺癌が発生する。「遺伝性びまん性胃癌（ＨＤＧＣ）症候群」という用語は、罹患患者を説明するために作られている。ＣＤＨ１遺伝子の機能の喪失は、増殖、浸潤、および／または転移の増加により癌の進行に寄与する。このタンパク質の外部ドメインは、哺乳動物細胞への細菌の接着を媒介する可能性もあり、細胞質ドメインは内在化に必要である。
【００６４】
複数の選択的スプライスバリアントが特定されている。「ＣＤＨ１」という用語は、その断片、バリアント（例えば、対立遺伝子バリアント）、および誘導体を含むことを意図している。代表的なヒトＣＤＨ１  ｃＤＮＡおよびヒトＣＤＨ１タンパク質配列は当技術分野で周知であり、国立バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）から公的に入手可能である。ヒトＣＤＨ１アイソフォームには、最も長いアイソフォーム１（ＮＭ＿００４３６０．４およびＮＰ＿００４３５１．１）、より短いアイソフォーム２（ＮＭ＿００１３１７１８４．１およびＮＰ＿００１３０４１１３．１、バリアント１と比較して中央コーディング領域に代替エクソンを欠く）、３（ＮＭ＿００１３１７１８５．１およびＮＰ＿００１３０４１１４．１、その５’ＵＴＲのエクソンで代替スプライス部位を使用し、異なる５’ＵＴＲをもたらし、バリアント１と比較して下流の開始部位を使用する）および４（ＮＭ＿００１３１７１８６．１およびＮＰ＿００１３０４１１５．１、その５’ＵＴＲにエクソンを欠き、異なる５’ＵＴＲをもたらし、バリアント１と比較して下流の開始部位を使用する）が含まれる。ヒト以外の生物のＣＤＨ１オーソログの核酸およびポリペプチド配列は周知であり、例えば、チンパンジーＣＤＨ１（ＸＭ＿００１１６８１５０．４およびＸＰ＿００１１６８１５０．１、ＸＭ＿０１６９３００６４．１およびＸＰ＿０１６７８５５５３．１、ＸＭ＿０１６９３００６３．１およびＸＰ＿０１６７８５５５２．１）、サルＣＤＨ１（ＸＭ＿０１５１２６４８５．１およびＸＰ＿０１４９８１９７１．１、２．ＸＭ＿０１５１２６４８６．１およびＸＰ＿０１４９８１９７２．１）、犬ＣＤＨ１（ＮＭ＿００１２８７１２５．１およびＮＰ＿００１２７４０５４．１）、牛ＣＤＨ１（ＮＭ＿００１００２７６３．１およびＮＰ＿００１００２７６３．１）、マウスＣＤＨ１（ＮＭ＿００９８６４．３およびＮＰ＿０３３９９４．１）、およびラットＣＤＨ１（ＮＭ＿０３１３３４．１およびＮＰ＿１１２６２４．１）が含まれる。
【００６５】
「相乗効果」という用語は、２つ以上の抗癌剤または化学療法薬の併用効果が、抗癌剤または化学療法薬単独の個別の効果の合計よりも大きくできることを指す。
【００６６】
「対象」という用語は、健康な動物、哺乳動物またはヒト、または重大な疾患（例えば、癌）に罹患した動物、哺乳動物またはヒトを指す。「対象」という用語は「患者」と交換可能である。いくつかの実施形態では、対象は黒色腫以外の癌がない。他の実施形態では、対象は黒色腫を有するが、重大な１つ以上の他の癌がない。例えば、いくつかの実施形態では、対象は腎細胞癌、頭頸部癌、および／または肺癌がない。
【００６７】
「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言葉には、タンパク質の合成に関与する化学前駆体または他の化学物質からタンパク質が分離される抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物が含まれる。一実施形態では、「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言葉には、（乾燥重量で）約３０％未満の化学前駆体もしくは非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質、より好ましくは約２０％未満の化学前駆体もしくは非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質、さらにより好ましくは約１０％未満の化学前駆体もしくは非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質、および最も好ましくは、約５％未満の化学前駆体もしくは非抗体、ポリペプチド、ペプチドもしくは融合タンパク質化学物質、を有する抗体、ポリペプチド、ペプチドまたは融合タンパク質の調製物が含まれる。
【００６８】
「実質的に純粋な細胞集団」という用語は、全細胞集団を構成する細胞の、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約７５〜８０％、より好ましくは少なくとも約８５〜９０％、最も好ましくは、少なくとも約９５％である特定の細胞マーカー特性および分化能を有する細胞の集団を指す。したがって、「実質的に純粋な細胞集団」とは、指定されたアッセイ条件下で、特定のマーカー特性および分化能を示さない細胞の約５０％未満、好ましくは約２０〜２５％未満、より好ましくは約１０〜１５％未満、最も好ましくは約５％未満を含有する細胞集団を指す。
【００６９】
本明細書で使用される「生存」という用語には、以下のすべてが含まれる：全生存としても知られる、死亡までの生存（死亡は原因に関係ないかまたは腫瘍に関連するかのいずれかであってよい）、「無再発生存」（再発という用語には、局所再発と遠隔再発の両方が含まれる）、転移のない生存、無疾患生存（疾患という用語には、癌およびそれに関連する疾患が含まれる）。前記生存の長さは、定義された開始点（例えば、診断の時間または治療の開始）および終了点（例えば、死、再発または転移）を参照することにより計算され得る。さらに、治療の有効性の基準は、化学療法への応答、生存の可能性、所定の期間内の転移の可能性、および腫瘍の再発の可能性を含むように拡大することができる。
【００７０】
「転写されたポリヌクレオチド」または「ヌクレオチド転写物」は、本発明のマーカーの転写、およびもしあれば、ＲＮＡ転写物の通常の転写後プロセシング（例えば、スプライシング）、およびＲＮＡ転写物の逆転写、によって作製された成熟ｍＲＮＡのすべてまたは一部に対して相補的または相同である、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｈｎＲＮＡ、ｃＤＮＡ、成熟ｍｉＲＮＡ、ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ＊、ｐｉｗｉＲＮＡ、ａｎｔｉ−ｍｉＲＮＡ、またはｍｉＲＮＡ結合部位、またはそのバリアント、またはそのようなＲＮＡまたはｃＤＮＡの類似体）である。いくつかの態様において、転写されたポリヌクレオチドは、翻訳されたタンパク質を本来コードしない転写されたポリヌクレオチドとして定義される「長鎖ノンコーディングＲＮＡ」または「ｌｃＲＮＡ」である。ｌｃＲＮＡは一般に約１００ヌクレオチドよりも長い配列であり、長さの定義はｍｉｃｒｏＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉｗｉ関連ＲＮＡなどの従来の小さな核酸を区別するための便宜であるが、数十キロベースまでの長さがある。ｌｃＲＮＡは、タンパク質をコードする遺伝子（長鎖の遺伝子間ｎｃＲＮＡまたはｌｉｎｃＲＮＡ）とは別に配置され得るか、タンパク質をコードする遺伝子の近くまたは内部に存在し得る（Ｇｕｔｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｎａｔｕｒｅ  ４５８：２２３−２２７、Ｋａｔａｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０９：１５６４−１５６６、Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｎａｔｕｒｅ  ４６５：１８２−１８７、Ｄｅ  Ｓａｎｔａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）ＰＬｏＳ  Ｂｉｏｌ．８：ｅ１０００３８４）。
【００７１】
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」であり、これは、追加のＤＮＡセグメントを連結できる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらに作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において「組換え発現ベクター」または単に「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、多くの場合プラスミドの形態である。本明細書において、「プラスミド」および「ベクター」は、プラスミドが最も一般的に使用されるベクターの形態であるため、交換可能に使用され得る。しかし、本発明は同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態を含むことを意図している。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「不応答性」は、刺激、例えば、活性化受容体またはサイトカインを介した刺激に対する免疫細胞の屈折性（ｒｅｆｒａｃｔｉｖｉｔｙ）を含む。例えば、免疫抑制剤への曝露または高用量の抗原への曝露のために、不応答が生じる可能性がある。本明細書で使用される「アネルギー」または「寛容性」という用語には、受容体媒介刺激の活性化に対する屈折性が含まれる。そのような屈折性は一般に抗原特異的であり、寛容化抗原への曝露を中止した後も持続する。例えば、Ｔ細胞のアネルギー（非応答性とは対照的に）は、サイトカイン産生の欠如（ＩＬ−２など）によって特徴付けられる。Ｔ細胞アネルギーは、Ｔ細胞が抗原にさらされ、２番目のシグナル（共刺激シグナル）がない状態で１番目のシグナル（Ｔ細胞受容体またはＣＤ−３を介したシグナル）を受け取ると発生する。これらの条件下では、同じ抗原に対する細胞の再曝露は（共刺激ポリペプチドの存在下で再曝露が起こったとしても）、サイトカインを産生できず、したがって増殖できなくなる。しかし、サイトカイン（例えば、ＩＬ−２）とともに培養すると、アネルギーＴ細胞は増殖する。例えば、Ｔ細胞アネルギーは、ＥＬＩＳＡによりまたは指標細胞株を用いた増殖アッセイにより測定されるＴリンパ球によるＩＬ−２産生の欠如によっても観察される。あるいは、レポーター遺伝子構築物を使用することができる。例えば、アネルギーＴ細胞は、５’ＩＬ−２遺伝子エンハンサーの制御下にある異種プロモーターによってまたはエンハンサー内に見られるＡＰ１配列の多量体によって誘導されるＩＬ−２遺伝子転写を開始できない（Ｋａｎｇ  ｅｔ  ａｌ（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５７：１１３４）。
【００７３】
「単離されたポリペプチド」という用語は、特定の実施形態では、組換えＤＮＡまたはＲＮＡ、または合成起源、またはそれらのいくつかの組み合わせから調製され、（１）自然界で通常見られるタンパク質と関連しない、（２）通常発生する細胞から単離されている、（３）同じ細胞源から他のタンパク質を含まない状態で単離されている、（４）異なる種の細胞によって発現されている、または（５）自然界では発生しない、ポリペプチドを指す。
【００７４】
「標識」または「標識された」という用語は、ポリペプチドなどの分子への検出可能なマーカーの、任意に共有結合または非共有結合による組み込みまたは付着を指す。ポリペプチドを標識する様々な方法が当技術分野で知られており、使用することができる。ポリペプチドの標識の例には、以下が含まれるが、これらに限定されない：放射性同位体、蛍光標識、重原子、酵素標識またはレポーター遺伝子、化学発光基、ビオチン基、二次レポーターによって認識される所定のポリペプチドエピトープ（例えば、ロイシンジッパーペア配列、二次抗体の結合部位、金属結合ドメイン、エピトープタグ）。そのようなラベルの例と使用法については、以下で詳しく説明する。いくつかの実施形態において、ラベルは、潜在的な立体障害を減少させるために、様々な長さのスペーサーアームによって取り付けられている。
【００７５】
状態を「治療すること」という用語は、疾患の１つ以上の症状を鎮め、緩和または寛解させる、病気の程度を減少させる、病気の進行を遅延させるまたは緩徐させる、疾患の測定基準（統計）を改善および緩和または安定化させる、対象に障害および／またはその症状の低減、進行遅延、退行または寛解を経験させる、などの臨床結果を含む有益または望ましい結果を得るための措置を講じることを意味する。一実施形態では、障害および／またはその症状の再発が防止される。好ましい実施形態では、対象は障害および／またはその症状が治癒している。いくつかの実施形態では、「治療」または「治療すること」は、治療、防止、および予防を指すこともでき、予防（防止）のためまたは患者が罹患している場合の病気もしくは疾病もしくは状態もしくは事象の程度または発生の可能性を（可能ならば）治癒させる、もしくは減らすための、患者に対する薬の投与または医療処置の実施を特に指す。より詳細には、本発明に関連して、「治療」または「治療すること」は、患者への治療薬の適用または投与、または疾患、疾患の症状、または疾患の発症の素因を有する患者からの単離された組織または細胞株への治療薬の適用または投与として定義される。治療は、疾患、疾患の症状、または疾患に対する素因を、緩徐させ、治癒させ、直し、緩和させ、軽減させ、変化させ、鎮め、癒させ、寛解させ、改善し、または影響を及ぼさせ得る。
【００７６】
特定のタンパク質のアミノ酸配列と、そのタンパク質をコードできるヌクレオチド配列との間には、遺伝暗号（以下に示す）によって定義されているように、既知の明確な対応関係がある。同様に、特定の核酸のヌクレオチド配列と、その核酸によってコードされるアミノ酸配列との間には、遺伝暗号によって定義される既知の明確な対応がある。
遺伝暗号
【表Ａ】
2021502329.tif 000004
【００７７】
遺伝暗号の重要で周知である特徴はその冗長性であり、それにより、タンパク質を作るために使用されるアミノ酸のほとんどに、２個以上のコードヌクレオチドトリプレットを使用することができる（上に示す）。したがって、多くの異なるヌクレオチド配列が、特定のアミノ酸配列をコードできる。そのようなヌクレオチド配列は、すべての生物で同じアミノ酸配列が生成されるため、機能的に同等であると見なされる（ただし、特定の生物は、他の生物よりも効率的に一部の配列を翻訳する場合がある）。さらに、時々、プリンまたはピリミジンのメチル化バリアントが、特定のヌクレオチド配列で見つかる場合がある。そのようなメチル化は、トリヌクレオチドコドンと対応するアミノ酸との間のコード関係に影響を与えない。
【００７８】
上記を考慮して、本発明の融合タンパク質またはポリペプチド（またはその任意の部分）をコードするＤＮＡまたはＲＮＡのヌクレオチド配列を、ＤＮＡまたはＲＮＡをアミノ酸配列に翻訳する遺伝暗号を用いて、融合タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列を使用して誘導できる。同様に、融合タンパク質またはポリペプチドのアミノ酸配列については、融合タンパク質またはポリペプチドをコードできる対応するヌクレオチド配列を遺伝暗号から推定することができる（その冗長性のため、特定のアミノ酸配列に対して複数の核酸配列が生成される）。したがって、融合タンパク質またはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の本明細書における説明および／または開示は、ヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列の説明および／または開示も含むとみなされるべきである。同様に、本明細書の融合タンパク質またはポリペプチドアミノ酸配列の説明および／または開示は、アミノ酸配列をコードすることができるすべての可能なヌクレオチド配列の説明および／または開示も含むとみなされるべきである。
【００７９】
最後に、本発明の組成物および方法の範囲内に包含されるドミナントネガティブＲＨＯＡの例示的な核酸およびタンパク質配列を以下に示す。
表２：ＲＨＯＡドミナントネガティブフォームのアミノ酸配列
配列番号１  ヒトＲＨＯＡ  Ｔ１９Ｎアミノ酸配列
ＭＡＡＩＲＫＫＬＶＩＶＧＤＧＡＣＧＫＮＣＬＬＩＶＦＳＫＤＱＦＰＥＶＹＶＰＴＶＦＥＮＹＶＡＤＩＥＶＤＧＫＱＶＥＬＡＬＷＤＴＡＧＱＥＤＹＤＲＬＲＰＬＳＹＰＤＴＤＶＩＬＭＣＦＳＩＤＳＰＤＳＬＥＮＩＰＥＫＷＴＰＥＶＫＨＦＣＰＮＶＰＩＩＬＶＧＮＫＫＤＬＲＮＤＥＨＴＲＲＥＬＡＫＭＫＱＥＰＶＫＰＥＥＧＲＤＭＡＮＲＩＧＡＦＧＹＭＥＣＳＡＫＴＫＤＧＶＲＥＶＦＥＭＡＴＲＡＡＬＱＡＲＲＧＫＫＫＳＧＣＬＶＬ
配列番号２  ヒトＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｖのアミノ酸配列
ＭＡＡＩＲＫＫＬＶＩＶＧＤＧＡＣＶＫＴＣＬＬＩＶＦＳＫＤＱＦＰＥＶＹＶＰＴＶＦＥＮＹＶＡＤＩＥＶＤＧＫＱＶＥＬＡＬＷＤＴＡＧＱＥＤＹＤＲＬＲＰＬＳＹＰＤＴＤＶＩＬＭＣＦＳＩＤＳＰＤＳＬＥＮＩＰＥＫＷＴＰＥＶＫＨＦＣＰＮＶＰＩＩＬＶＧＮＫＫＤＬＲＮＤＥＨＴＲＲＥＬＡＫＭＫＱＥＰＶＫＰＥＥＧＲＤＭＡＮＲＩＧＡＦＧＹＭＥＣＳＡＫＴＫＤＧＶＲＥＶＦＥＭＡＴＲＡＡＬＱＡＲＲＧＫＫＫＳＧＣＬＶＬ
配列番号３  ヒトＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｅのアミノ酸配列
ＭＡＡＩＲＫＫＬＶＩＶＧＤＧＡＣＥＫＴＣＬＬＩＶＦＳＫＤＱＦＰＥＶＹＶＰＴＶＦＥＮＹＶＡＤＩＥＶＤＧＫＱＶＥＬＡＬＷＤＴＡＧＱＥＤＹＤＲＬＲＰＬＳＹＰＤＴＤＶＩＬＭＣＦＳＩＤＳＰＤＳＬＥＮＩＰＥＫＷＴＰＥＶＫＨＦＣＰＮＶＰＩＩＬＶＧＮＫＫＤＬＲＮＤＥＨＴＲＲＥＬＡＫＭＫＱＥＰＶＫＰＥＥＧＲＤＭＡＮＲＩＧＡＦＧＹＭＥＣＳＡＫＴＫＤＧＶＲＥＶＦＥＭＡＴＲＡＡＬＱＡＲＲＧＫＫＫＳＧＣＬＶＬ
表３：ＲＨＯＡドミナントネガティブフォームのｃＤＮＡ配列
配列番号４  ヒトＲＨＯＡ  Ｔ１９Ｎ  ｃＤＮＡ配列、バリアント１
ａｔｇｇｃｔｇｃｃａｔｃｃｇｇａａｇａａａｃｔｇｇｔｇａｔｔｇｔｔｇｇｔｇａｔｇｇａｇｃｃｔｇｔｇｇａａａｇＡＡＴｔｇｃｔｔｇｃｔｃａｔａｇｔｃｔｔｃａｇｃａａｇｇａｃｃａｇｔｔｃｃｃａｇａｇｇｔｇｔａｔｇｔｇｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｔｇａｇａａｃｔａｔｇｔｇｇｃａｇａｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇｇｔａｇａｇｔｔｇｇｃｔｔｔｇｔｇｇｇａｃａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｇｇａａｇａｔｔａｔｇａｔｃｇｃｃｔｇａｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃｔａｃｃｃａｇａｔａｃｃｇａｔｇｔｔａｔａｃｔｇａｔｇｔｇｔｔｔｔｔｃｃａｔｃｇａｃａｇｃｃｃｔｇａｔａｇｔｔｔａｇａａａａｃａｔｃｃｃａｇａａａａｇｔｇｇａｃｃｃｃａｇａａｇｔｃａａｇｃａｔｔｔｃｔｇｔｃｃｃａａｃｇｔｇｃｃｃａｔｃａｔｃｃｔｇｇｔｔｇｇｇａａｔａａｇａａｇｇａｔｃｔｔｃｇｇａａｔｇａｔｇａｇｃａｃａｃａａｇｇｃｇｇｇａｇｃｔａｇｃｃａａｇａｔｇａａｇｃａｇｇａｇｃｃｇｇｔｇａａａｃｃｔｇａａｇａａｇｇｃａｇａｇａｔａｔｇｇｃａａａｃａｇｇａｔｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｇｔａｃａｔｇｇａｇｔｇｔｔｃａｇｃａａａｇａｃｃａａａｇａｔｇｇａｇｔｇａｇａｇａｇｇｔｔｔｔｔｇａａａｔｇｇｃｔａｃｇａｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇｃａａｇｃｔａｇａｃｇｔｇｇｇａａｇａａａａａａｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃｔｔｇｔｃｔｔｇｔｇａ
配列番号５  ヒトＲＨＯＡ  Ｔ１９Ｎ  ｃＤＮＡ配列、バリアント２
ａｔｇｇｃｔｇｃｃａｔｃｃｇｇａａｇａａａｃｔｇｇｔｇａｔｔｇｔｔｇｇｔｇａｔｇｇａｇｃｃｔｇｔｇｇａａａｇＡＡＣｔｇｃｔｔｇｃｔｃａｔａｇｔｃｔｔｃａｇｃａａｇｇａｃｃａｇｔｔｃｃｃａｇａｇｇｔｇｔａｔｇｔｇｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｔｇａｇａａｃｔａｔｇｔｇｇｃａｇａｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇｇｔａｇａｇｔｔｇｇｃｔｔｔｇｔｇｇｇａｃａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｇｇａａｇａｔｔａｔｇａｔｃｇｃｃｔｇａｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃｔａｃｃｃａｇａｔａｃｃｇａｔｇｔｔａｔａｃｔｇａｔｇｔｇｔｔｔｔｔｃｃａｔｃｇａｃａｇｃｃｃｔｇａｔａｇｔｔｔａｇａａａａｃａｔｃｃｃａｇａａａａｇｔｇｇａｃｃｃｃａｇａａｇｔｃａａｇｃａｔｔｔｃｔｇｔｃｃｃａａｃｇｔｇｃｃｃａｔｃａｔｃｃｔｇｇｔｔｇｇｇａａｔａａｇａａｇｇａｔｃｔｔｃｇｇａａｔｇａｔｇａｇｃａｃａｃａａｇｇｃｇｇｇａｇｃｔａｇｃｃａａｇａｔｇａａｇｃａｇｇａｇｃｃｇｇｔｇａａａｃｃｔｇａａｇａａｇｇｃａｇａｇａｔａｔｇｇｃａａａｃａｇｇａｔｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｇｔａｃａｔｇｇａｇｔｇｔｔｃａｇｃａａａｇａｃｃａａａｇａｔｇｇａｇｔｇａｇａｇａｇｇｔｔｔｔｔｇａａａｔｇｇｃｔａｃｇａｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇｃａａｇｃｔａｇａｃｇｔｇｇｇａａｇａａａａａａｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃｔｔｇｔｃｔｔｇｔｇａ
配列番号６  ヒトＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｖ  ｃＤＮＡ配列、バリアント１
ａｔｇｇｃｔｇｃｃａｔｃｃｇｇａａｇａａａｃｔｇｇｔｇａｔｔｇｔｔｇｇｔｇａｔｇｇａｇｃｃｔｇｔＧＴＴａａｇａｃａｔｇｃｔｔｇｃｔｃａｔａｇｔｃｔｔｃａｇｃａａｇｇａｃｃａｇｔｔｃｃｃａｇａｇｇｔｇｔａｔｇｔｇｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｔｇａｇａａｃｔａｔｇｔｇｇｃａｇａｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇｇｔａｇａｇｔｔｇｇｃｔｔｔｇｔｇｇｇａｃａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｇｇａａｇａｔｔａｔｇａｔｃｇｃｃｔｇａｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃｔａｃｃｃａｇａｔａｃｃｇａｔｇｔｔａｔａｃｔｇａｔｇｔｇｔｔｔｔｔｃｃａｔｃｇａｃａｇｃｃｃｔｇａｔａｇｔｔｔａｇａａａａｃａｔｃｃｃａｇａａａａｇｔｇｇａｃｃｃｃａｇａａｇｔｃａａｇｃａｔｔｔｃｔｇｔｃｃｃａａｃｇｔｇｃｃｃａｔｃａｔｃｃｔｇｇｔｔｇｇｇａａｔａａｇａａｇｇａｔｃｔｔｃｇｇａａｔｇａｔｇａｇｃａｃａｃａａｇｇｃｇｇｇａｇｃｔａｇｃｃａａｇａｔｇａａｇｃａｇｇａｇｃｃｇｇｔｇａａａｃｃｔｇａａｇａａｇｇｃａｇａｇａｔａｔｇｇｃａａａｃａｇｇａｔｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｇｔａｃａｔｇｇａｇｔｇｔｔｃａｇｃａａａｇａｃｃａａａｇａｔｇｇａｇｔｇａｇａｇａｇｇｔｔｔｔｔｇａａａｔｇｇｃｔａｃｇａｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇｃａａｇｃｔａｇａｃｇｔｇｇｇａａｇａａａａａａｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃｔｔｇｔｃｔｔｇｔｇａ
配列番号８  ヒトＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｖ  ｃＤＮＡ配列、バリアント２
ａｔｇｇｃｔｇｃｃａｔｃｃｇｇａａｇａａａｃｔｇｇｔｇａｔｔｇｔｔｇｇｔｇａｔｇｇａｇｃｃｔｇｔＧＴＣａａｇａｃａｔｇｃｔｔｇｃｔｃａｔａｇｔｃｔｔｃａｇｃａａｇｇａｃｃａｇｔｔｃｃｃａｇａｇｇｔｇｔａｔｇｔｇｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｔｇａｇａａｃｔａｔｇｔｇｇｃａｇａｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇｇｔａｇａｇｔｔｇｇｃｔｔｔｇｔｇｇｇａｃａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｇｇａａｇａｔｔａｔｇａｔｃｇｃｃｔｇａｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃｔａｃｃｃａｇａｔａｃｃｇａｔｇｔｔａｔａｃｔｇａｔｇｔｇｔｔｔｔｔｃｃａｔｃｇａｃａｇｃｃｃｔｇａｔａｇｔｔｔａｇａａａａｃａｔｃｃｃａｇａａａａｇｔｇｇａｃｃｃｃａｇａａｇｔｃａａｇｃａｔｔｔｃｔｇｔｃｃｃａａｃｇｔｇｃｃｃａｔｃａｔｃｃｔｇｇｔｔｇｇｇａａｔａａｇａａｇｇａｔｃｔｔｃｇｇａａｔｇａｔｇａｇｃａｃａｃａａｇｇｃｇｇｇａｇｃｔａｇｃｃａａｇａｔｇａａｇｃａｇｇａｇｃｃｇｇｔｇａａａｃｃｔｇａａｇａａｇｇｃａｇａｇａｔａｔｇｇｃａａａｃａｇｇａｔｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｇｔａｃａｔｇｇａｇｔｇｔｔｃａｇｃａａａｇａｃｃａａａｇａｔｇｇａｇｔｇａｇａｇａｇｇｔｔｔｔｔｇａａａｔｇｇｃｔａｃｇａｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇｃａａｇｃｔａｇａｃｇｔｇｇｇａａｇａａａａａａｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃｔｔｇｔｃｔｔｇｔｇａ
配列番号８  ヒトＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｖ  ｃＤＮＡ配列、バリアント３
ａｔｇｇｃｔｇｃｃａｔｃｃｇｇａａｇａａａｃｔｇｇｔｇａｔｔｇｔｔｇｇｔｇａｔｇｇａｇｃｃｔｇｔＧＴＧａａｇａｃａｔｇｃｔｔｇｃｔｃａｔａｇｔｃｔｔｃａｇｃａａｇｇａｃｃａｇｔｔｃｃｃａｇａｇｇｔｇｔａｔｇｔｇｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｔｇａｇａａｃｔａｔｇｔｇｇｃａｇａｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇｇｔａｇａｇｔｔｇｇｃｔｔｔｇｔｇｇｇａｃａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｇｇａａｇａｔｔａｔｇａｔｃｇｃｃｔｇａｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃｔａｃｃｃａｇａｔａｃｃｇａｔｇｔｔａｔａｃｔｇａｔｇｔｇｔｔｔｔｔｃｃａｔｃｇａｃａｇｃｃｃｔｇａｔａｇｔｔｔａｇａａａａｃａｔｃｃｃａｇａａａａｇｔｇｇａｃｃｃｃａｇａａｇｔｃａａｇｃａｔｔｔｃｔｇｔｃｃｃａａｃｇｔｇｃｃｃａｔｃａｔｃｃｔｇｇｔｔｇｇｇａａｔａａｇａａｇｇａｔｃｔｔｃｇｇａａｔｇａｔｇａｇｃａｃａｃａａｇｇｃｇｇｇａｇｃｔａｇｃｃａａｇａｔｇａａｇｃａｇｇａｇｃｃｇｇｔｇａａａｃｃｔｇａａｇａａｇｇｃａｇａｇａｔａｔｇｇｃａａａｃａｇｇａｔｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｇｔａｃａｔｇｇａｇｔｇｔｔｃａｇｃａａａｇａｃｃａａａｇａｔｇｇａｇｔｇａｇａｇａｇｇｔｔｔｔｔｇａａａｔｇｇｃｔａｃｇａｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇｃａａｇｃｔａｇａｃｇｔｇｇｇａａｇａａａａａａｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃｔｔｇｔｃｔｔｇｔｇａ
配列番号９  ヒトＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｖ  ｃＤＮＡ配列、バリアント４
ａｔｇｇｃｔｇｃｃａｔｃｃｇｇａａｇａａａｃｔｇｇｔｇａｔｔｇｔｔｇｇｔｇａｔｇｇａｇｃｃｔｇｔＧＴＡａａｇａｃａｔｇｃｔｔｇｃｔｃａｔａｇｔｃｔｔｃａｇｃａａｇｇａｃｃａｇｔｔｃｃｃａｇａｇｇｔｇｔａｔｇｔｇｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｔｇａｇａａｃｔａｔｇｔｇｇｃａｇａｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇｇｔａｇａｇｔｔｇｇｃｔｔｔｇｔｇｇｇａｃａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｇｇａａｇａｔｔａｔｇａｔｃｇｃｃｔｇａｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃｔａｃｃｃａｇａｔａｃｃｇａｔｇｔｔａｔａｃｔｇａｔｇｔｇｔｔｔｔｔｃｃａｔｃｇａｃａｇｃｃｃｔｇａｔａｇｔｔｔａｇａａａａｃａｔｃｃｃａｇａａａａｇｔｇｇａｃｃｃｃａｇａａｇｔｃａａｇｃａｔｔｔｃｔｇｔｃｃｃａａｃｇｔｇｃｃｃａｔｃａｔｃｃｔｇｇｔｔｇｇｇａａｔａａｇａａｇｇａｔｃｔｔｃｇｇａａｔｇａｔｇａｇｃａｃａｃａａｇｇｃｇｇｇａｇｃｔａｇｃｃａａｇａｔｇａａｇｃａｇｇａｇｃｃｇｇｔｇａａａｃｃｔｇａａｇａａｇｇｃａｇａｇａｔａｔｇｇｃａａａｃａｇｇａｔｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｇｔａｃａｔｇｇａｇｔｇｔｔｃａｇｃａａａｇａｃｃａａａｇａｔｇｇａｇｔｇａｇａｇａｇｇｔｔｔｔｔｇａａａｔｇｇｃｔａｃｇａｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇｃａａｇｃｔａｇａｃｇｔｇｇｇａａｇａａａａａａｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃｔｔｇｔｃｔｔｇｔｇａ
配列番号１０  ヒトＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｅ  ｃＤＮＡ配列、バリアント１
ａｔｇｇｃｔｇｃｃａｔｃｃｇｇａａｇａａａｃｔｇｇｔｇａｔｔｇｔｔｇｇｔｇａｔｇｇａｇｃｃｔｇｔＧＡＡａａｇａｃａｔｇｃｔｔｇｃｔｃａｔａｇｔｃｔｔｃａｇｃａａｇｇａｃｃａｇｔｔｃｃｃａｇａｇｇｔｇｔａｔｇｔｇｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｔｇａｇａａｃｔａｔｇｔｇｇｃａｇａｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇｇｔａｇａｇｔｔｇｇｃｔｔｔｇｔｇｇｇａｃａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｇｇａａｇａｔｔａｔｇａｔｃｇｃｃｔｇａｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃｔａｃｃｃａｇａｔａｃｃｇａｔｇｔｔａｔａｃｔｇａｔｇｔｇｔｔｔｔｔｃｃａｔｃｇａｃａｇｃｃｃｔｇａｔａｇｔｔｔａｇａａａａｃａｔｃｃｃａｇａａａａｇｔｇｇａｃｃｃｃａｇａａｇｔｃａａｇｃａｔｔｔｃｔｇｔｃｃｃａａｃｇｔｇｃｃｃａｔｃａｔｃｃｔｇｇｔｔｇｇｇａａｔａａｇａａｇｇａｔｃｔｔｃｇｇａａｔｇａｔｇａｇｃａｃａｃａａｇｇｃｇｇｇａｇｃｔａｇｃｃａａｇａｔｇａａｇｃａｇｇａｇｃｃｇｇｔｇａａａｃｃｔｇａａｇａａｇｇｃａｇａｇａｔａｔｇｇｃａａａｃａｇｇａｔｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｇｔａｃａｔｇｇａｇｔｇｔｔｃａｇｃａａａｇａｃｃａａａｇａｔｇｇａｇｔｇａｇａｇａｇｇｔｔｔｔｔｇａａａｔｇｇｃｔａｃｇａｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇｃａａｇｃｔａｇａｃｇｔｇｇｇａａｇａａａａａａｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃｔｔｇｔｃｔｔｇｔｇａ
配列番号１１  ヒトＲＨＯＡ  Ｇ１７Ｅ  ｃＤＮＡ配列、バリアント２
ａｔｇｇｃｔｇｃｃａｔｃｃｇｇａａｇａａａｃｔｇｇｔｇａｔｔｇｔｔｇｇｔｇａｔｇｇａｇｃｃｔｇｔＧＡＧａａｇａｃａｔｇｃｔｔｇｃｔｃａｔａｇｔｃｔｔｃａｇｃａａｇｇａｃｃａｇｔｔｃｃｃａｇａｇｇｔｇｔａｔｇｔｇｃｃｃａｃａｇｔｇｔｔｔｇａｇａａｃｔａｔｇｔｇｇｃａｇａｔａｔｃｇａｇｇｔｇｇａｔｇｇａａａｇｃａｇｇｔａｇａｇｔｔｇｇｃｔｔｔｇｔｇｇｇａｃａｃａｇｃｔｇｇｇｃａｇｇａａｇａｔｔａｔｇａｔｃｇｃｃｔｇａｇｇｃｃｃｃｔｃｔｃｃｔａｃｃｃａｇａｔａｃｃｇａｔｇｔｔａｔａｃｔｇａｔｇｔｇｔｔｔｔｔｃｃａｔｃｇａｃａｇｃｃｃｔｇａｔａｇｔｔｔａｇａａａａｃａｔｃｃｃａｇａａａａｇｔｇｇａｃｃｃｃａｇａａｇｔｃａａｇｃａｔｔｔｃｔｇｔｃｃｃａａｃｇｔｇｃｃｃａｔｃａｔｃｃｔｇｇｔｔｇｇｇａａｔａａｇａａｇｇａｔｃｔｔｃｇｇａａｔｇａｔｇａｇｃａｃａｃａａｇｇｃｇｇｇａｇｃｔａｇｃｃａａｇａｔｇａａｇｃａｇｇａｇｃｃｇｇｔｇａａａｃｃｔｇａａｇａａｇｇｃａｇａｇａｔａｔｇｇｃａａａｃａｇｇａｔｔｇｇｃｇｃｔｔｔｔｇｇｇｔａｃａｔｇｇａｇｔｇｔｔｃａｇｃａａａｇａｃｃａａａｇａｔｇｇａｇｔｇａｇａｇａｇｇｔｔｔｔｔｇａａａｔｇｇｃｔａｃｇａｇａｇｃｔｇｃｔｃｔｇｃａａｇｃｔａｇａｃｇｔｇｇｇａａｇａａａａａａｔｃｔｇｇｇｔｇｃｃｔｔｇｔｃｔｔｇｔｇａ
＊表２に含まれるのは、表２にリストされた任意の配列番号のアミノ酸配列またはその一部と全長にわたって少なくとも８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，９９．５％、またはそれ以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド分子である。そのようなポリペプチドは、例えば癌中の生存細胞または増殖細胞の数を減少させる、および／または癌細胞を含む腫瘍の体積またはサイズを減少させるなど、本明細書でさらに説明する全長ポリペプチドの機能を有することができる。シグナルペプチドを含むまたは含まない、および／またはプロタンパク質を含むまたはプロタンパク質のみの、および／または成熟タンパク質を含むまたは成熟タンパク質のみの、ポリペプチドがさらに含まれる。
＊表３に含まれるのは、表３にリストされた任意の配列番号の核酸配列またはその一部とそれらの全長にわたって少なくとも８０％，８１％，８２％，８３％，８４％，８５％，８６％，８７％，８８％，８９％，９０％，９１％，９２％，９３％，９４％，９５％，９６％，９７％，９８％，９９％，９９．５％、またはそれ以上の同一性を有する核酸配列を含む、ＲＮＡ核酸分子（例えば、チミンをウレジンに置き換えたもの）、およびＤＮＡまたはＲＮＡ核酸配列である。そのような核酸分子は、例えば、癌中の生存細胞または増殖細胞の数を減少させ、および／または癌細胞を含む腫瘍の体積またはサイズを減少させるタンパク質をコードするなど、本明細書でさらに説明されるような全長核酸の機能を有することができる。シグナルペプチドを含むまたは含まない、および／またはプロタンパク質を含むまたはプロタンパク質のみの、および／または成熟タンパク質を含むまたは成熟タンパク質のみの、ポリペプチドをコードする核酸がさらに含まれる。
【００８０】
ＩＩ．薬剤と組成物
ａ．単離された核酸
本発明の一態様は、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子を利用する方法に関する。本明細書で使用される「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ分子（すなわち、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡ）およびＲＮＡ分子（すなわち、ｍＲＮＡ）、およびヌクレオチド類似体を使用して生成されたＤＮＡまたはＲＮＡの類似体を含むものとする。核酸分子は一本鎖でも二本鎖でもよいが、好ましくは二本鎖ＤＮＡである。「単離された」核酸分子は、核酸の天然源に存在する他の核酸分子から分離されたものである。好ましくは、「単離された」核酸は、核酸が由来する生物のゲノムＤＮＡ中の核酸に自然に隣接する配列（すなわち、核酸の５’および３’末端に位置する配列）を含まない。例えば、種々の実施形態では、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする単離された核酸分子は、核酸が由来する細胞（例えば、ＲＨＯＡドミナントネガティブ変異を有する癌細胞）のゲノムＤＮＡ中の核酸分子に自然に隣接する、ヌクレオチド配列の約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂまたは０．１ｋｂ未満を含み得る。さらに、ｃＤＮＡ分子などの「単離された」核酸分子は、他の細胞材料、または組換え技術によって産生される場合の培地、または化学合成される場合の化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。
【００８１】
本発明のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分をコードする核酸分子、例えば、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１のヌクレオチド配列を有する核酸分子、または配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１に示されるヌクレオチド配列またはその一部と、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、および最も好ましくは少なくとも約９５％、またはそれ以上（例えば、約９８％）相同であるヌクレオチド配列（すなわち、１００、２００、３００、４００、４５０、５００個の、またはそれ以上のヌクレオチド）は、標準的な分子生物学技術および本明細書で提供される配列情報を使用して単離することができる。例えば、ヒトＲＨＯＡドメインネガティブ変異体ｃＤＮＡは、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１のすべてまたは一部、またはその断片を使用して、ハイブリダイゼーションプローブおよび標準ハイブリダイゼーション技術（すなわち、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９に記載されている）として、ヒト癌細胞株から単離することができる。さらに、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１のすべてまたは一部を含む核酸分子、または、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１に示されるヌクレオチド配列、またはその断片と、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％またはそれ以上相同であるヌクレオチド配列は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１、またはその断片、の配列に基づいて設計されたオリゴヌクレオチドプライマーを使用するポリメラーゼ連鎖反応によって単離することができる。例えば、ｍＲＮＡは癌細胞から単離することができ（すなわち、Ｃｈｉｒｇｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １８：５２９４−５２９９のグアニジニウム−チオシアネート抽出手順によって）、ｃＤＮＡは逆転写酵素（すなわち、Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤから入手可能な、Ｍｏｌｏｎｅｙ  ＭＬＶ逆転写酵素、またはＳｅｉｋａｇａｋｕ  Ａｍｅｒｉｃａ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｐｅｔｅｒｓｂｕｒｇ，ＦＬから入手可能なＡＭＶ逆転写酵素）を使用して調製できる。ＰＣＲ増幅のための合成オリゴヌクレオチドプライマーは、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１に示されるヌクレオチド配列、またはその断片、またはそれらに相同なヌクレオチド配列に基づいて設計することができる。本発明の核酸は、標準的なＰＣＲ増幅技術に従って、鋳型として、ｃＤＮＡまたは代替としてゲノムＤＮＡおよび適切なオリゴヌクレオチドプライマー使用して増幅することができる。さらに、本発明の核酸は、鋳型としての野生型ＲＨＯＡのｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡおよび意図された変異を含む特定のオリゴヌクレオチドプライマーを使用する部位特異的変異誘発技術によって生成することができる。そのように増幅または生成された核酸は、適切なベクターにクローン化され、ＤＮＡ配列分析によって特徴付けられる。さらに、ＲＨＯＡドミナントネガティブ変異ヌクレオチド配列に対応するオリゴヌクレオチドは、標準的な合成技術により、すなわち自動化されたＤＮＡ合成装置を使用して調製することができる。
【００８２】
ＲＨＯＡドミナントネガティブ変異ヌクレオチド配列に基づくプローブを使用して、同じまたは相同タンパク質をコードする転写物またはゲノム配列を検出できる。好ましい実施形態では、プローブはそれに付着した標識基をさらに含む、すなわち、標識基は放射性同位体、蛍光化合物、酵素、または酵素補因子であり得る。そのようなプローブは、対象からの細胞試料中のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸のレベルを測定する、すなわち、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドのｍＲＮＡレベルを検出するなどして、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドを発現する細胞または組織を識別する診断テストキットの一部として使用できる。
【００８３】
他のＲＨＯＡドミナントネガティブ変異体をコードし、したがって配列番号４〜１１の配列またはその断片とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子が企図される。さらに、異なる種由来のＲＨＯＡドミナントネガティブ変異体をコードし、したがって配列番号４〜１１の配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子も、本発明の範囲内であることが意図されている。例えば、チンパンジーまたはサルＲＨＯＡドミナントネガティブ変異体ｃＤＮＡは、ヒトおよび／またはマウスＲＨＯＡドミナントネガティブ変異体のヌクレオチド配列に基づいて特定できる。
【００８４】
一実施形態では、本発明の核酸分子（複数可）は、配列番号１、２、または３のアミノ酸配列またはその断片と十分に相同なアミノ酸配列を含むタンパク質またはその一部をコードし、そのため、タンパク質またはその一部は、癌中の生存細胞または増殖細胞の数を減少させ、および／または癌細胞を含む腫瘍の体積またはサイズを減少させる。そのような各生物活性を測定するための方法およびアッセイは当技術分野で周知であり、代表的な非限定的な実施形態は以下の実施例および上記の定義に記載されている。
【００８５】
本明細書で使用される場合、「十分に相同」という言葉は、配列番号１、２、もしくは３のアミノ酸配列またはその断片に対して、最小数の同一または同等物（例えば、配列番号１、２、もしくは３のアミノ酸、またはその断片として、配列中のアミノ酸残基と同様の側鎖を有するアミノ酸残基）のアミノ酸残基を含むアミノ酸配列を有するタンパク質またはその部分を指し、その結果、そのタンパク質またはその部分が癌中の生存細胞または増殖細胞の数を減少させ、および／または癌細胞を含む腫瘍の体積またはサイズを減少させる。
【００８６】
別の実施形態では、タンパク質は、配列番号１、２、もしくは３のアミノ酸配列全体、またはその断片に対して、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同である。
【００８７】
本発明のＲＨＯＡドミナントネガティブ変異体核酸分子によりコードされるタンパク質の部分は、好ましくはＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの生物学的に活性な部分である。本明細書で使用される「ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの生物学的活性部分」という用語は、それぞれ全長ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの生物学的活性の１つ以上を有するＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの一部、例えばドメイン／モチーフを含むことを意図する。
【００８８】
全長ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの生物活性を維持する、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片の能力を決定するために、本明細書に記載の標準的な結合アッセイ、例えば免疫沈降および酵母ツーハイブリッドアッセイ、または機能アッセイ、例えばＲＮＡｉまたは過剰発現実験を実施できる。
【００８９】
本発明はさらに、遺伝暗号の縮重により配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１に示されるヌクレオチド配列またはその断片とは異なり、したがって配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１に示されるヌクレオチド配列またはその断片によりコードされるものと同じＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドをコードする、核酸分子を包含する。別の実施形態では、本発明の単離された核酸分子は、配列番号１、２、もしくは３に示されるアミノ酸配列、またはその断片を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、あるいは配列番号１、２、もしくは３のアミノ酸配列、またはその断片と、少なくとも約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列、または配列番号１、２、もしくは３と、少なくとも１、２、３、５、もしくは１０アミノ酸であるが３０、２０、１５アミノ酸以下で異なるアミノ酸配列を有するタンパク質をコードするヌクレオチド配列、を有する。別の実施形態では、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸は、１９５、１９０、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、または７０未満の長さのアミノ酸である関心のある全長ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド断片の一部をコードする核酸配列からなる。
【００９０】
ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドのアミノ酸配列の変化をもたらすＤＮＡ配列多型は、集団（例えば、哺乳動物集団、例えば、ヒト集団）内に存在し得ることが当業者に認識されるであろう。ドミナントネガティブＲＨＯＡ遺伝子のそのような遺伝子多型は、自然の対立遺伝子変異により、集団内の個体に存在する可能性がある。本明細書で使用される「遺伝子」および「組換え遺伝子」という用語は、ドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質、好ましくは哺乳動物、例えばヒトのドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質をコードするオープンリーディングフレームを含む核酸分子を指す。そのような天然の対立遺伝子変異は、通常、ドミナントネガティブＲＨＯＡ遺伝子のヌクレオチド配列に１〜５％の相違をもたらす可能性がある。天然の対立遺伝子変異の結果であり、ドミナントネガティブＲＨＯＡの機能的活性を変化させないドミナントネガティブＲＨＯＡでのそのようなすべてのヌクレオチド変異および結果として生じるアミノ酸多型は、本発明の範囲内であることが意図されている。さらに、他の種からのドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質をコードし、したがって配列番号４〜１１の配列とは異なるヌクレオチド配列を有する核酸分子は、本発明の範囲内であることが意図されている。本発明のヒトまたはマウスのドミナントネガティブＲＨＯＡ  ｃＤＮＡの天然の対立遺伝子バリアントおよび相同体に対応する核酸分子は、（本明細書に開示されるような）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下での標準的なハイブリダイゼーション技術によるハイブリダイゼーションプローブとしてヒトまたはマウスのｃＤＮＡまたはその一部を使用して、本明細書に開示されるヒトまたはマウスのドミナントネガティブＲＨＯＡ核酸配列との相同性に基づいて単離することができる。
【００９１】
集団に存在する可能性があるＲＨＯＡドミナントネガティブ変異体配列の天然に存在する対立遺伝子バリアントに加えて、当業者は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、または１１のヌクレオチド配列、またはその断片に、変異により変化を導入でき、それにより、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの機能的能力を変更することなくコード化されたＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドのアミノ酸配列に変化をもたらし得ることをさらに理解するであろう。例えば、「非必須」アミノ酸残基でのアミノ酸置換をもたらすヌクレオチド置換は、配列番号１、２、または３の配列、またはその断片で行うことができる。「非必須」アミノ酸残基は、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの配列（例えば、配列番号１、２、または３の配列、またはその断片）から、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの活性を大きく変えることなく変更できる残基であり、一方、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド活性には「必須」アミノ酸残基が必要である。しかし、他のアミノ酸残基（例えば、マウスとヒトの間で保存されていない、または半保存されているもの）は、活性に必須ではない可能性があり、したがって、ＲＨＯＡのドミナントネガティブポリペプチド活性を変更することなく、変更を受け入れやすい可能性がある。さらに、癌細胞の生存性および／または増殖に関連するＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド機能に必須であるが、他のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド機能に必須ではないアミノ酸残基は、変更を受けやすい可能性が高い。
【００９２】
したがって、本発明の別の態様は、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド活性に必須ではないアミノ酸残基の変化を含有するＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸分子に関する。そのようなＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、配列番号１、２、または３またはその断片とアミノ酸配列が異なるが、本明細書に記載のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド活性の少なくとも１つを保持する。一実施形態では、単離された核酸分子は、タンパク質が１つ以上のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドドメインを欠いている、タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む。定義セクションで述べたように、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの構造機能相関は既知であるため、当業者はＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの少なくとも１つの生物活性を保持しながら、変異またはその他の方法で変更される可能性のある領域を容易に理解できる。
【００９３】
本明細書で使用する「配列同一性または相同性」とは、２つのポリペプチド分子間または２つの核酸分子間の配列類似性を指す。２つの比較された配列の両方の位置が同じ塩基またはアミノ酸モノマーサブユニットによって占められている場合、例えば、２つのＤＮＡ分子のそれぞれの位置がアデニンによって占められている場合、分子はその位置で相同または配列同一である。２つの配列間の相同性または配列同一性のパーセントは、２つの配列で共有される一致または相同な同一の位置の数を、比較される位置の数で割った関数ｘ１００である。例えば、２つの配列の１０個のうち６個が同じ場合、２つの配列は６０％の相同性であるか、６０％の配列同一性を持つ。例として、ＤＮＡ配列ＡＴＴＧＣＣおよびＴＡＴＧＧＣは、５０％の相同性または配列同一性を共有する。一般に、２つの配列を整列させて最大の相同性を得るときに比較が行われる。特に指定のない限り、「ループアウト領域」、例えば、配列のうちの１つでの欠失または挿入から生じるものは、ミスマッチとしてカウントされる。
【００９４】
数学的アルゴリズムを使用して、２つの配列間の配列の比較とパーセント相同性の決定を行うことができる。好ましくは、アラインメントは、Ｃｌｕｓｔａｌ法を使用して実行することができる。マルチプルアライメントパラメータには、ギャップペナルティ＝１０、ギャップ長ペナルティ＝１０が含まれる。ＤＮＡアラインメントの場合、ペアワイズアラインメントパラメーターは、Ｈタプル（Ｈｔｕｐｌｅ）＝２、ギャップペナルティ＝５、ウインドウ＝４、およびダイアゴナルセーブド（Ｄｉａｇｏｎａｌ  ｓａｖｅｄ）＝４である。タンパク質アラインメントの場合、ペアワイズアラインメントパラメーターは、Ｋタプル＝１（Ｋｔｕｐｌｅ）、ギャップペナルティ＝３、ウインドウ＝５、およびダイアゴナルセーブド＝５である。
【００９５】
好ましい実施形態では、２つのアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｂｌｏｓｓｏｍ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み（ｇａｐ  ｗｅｉｇｈｔ）および１、２、３、４、５、または６の長さ重み（ｌｅｎｇｔｈ  ｗｅｉｇｈｔ）を使用して、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（オンラインで入手可能）のＧＡＰプログラムに組み込まれたＮｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））アルゴリズムを使用して決定される。さらに別の好ましい実施形態では、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックスおよび４０、５０、６０、７０、または８０のギャップ重み、または１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用する、ＧＣＧソフトウェアパッケージ（オンラインで入手可能）のＧＡＰプログラムを使用して決定される。別の実施形態では、２つのアミノ酸またはヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、ＰＡＭ１２０重み付き残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２、ギャップペナルティ４を使用する、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）（オンラインで入手可能）に組み込まれたＥ．Ｍｅｙｅｒｓ  ａｎｄ  Ｗ．Ｍｉｌｌｅｒ（ＣＡＢＩＯＳ，４：１１−１７（１９８９））のアルゴリズムを使用して、決定される。
【００９６】
配列番号１、２、または３またはその断片のタンパク質に相同なＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドをコードする単離された核酸分子は、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、または１１、またはその断片のヌクレオチド配列、または１つ以上のアミノ酸置換、付加、または欠失がコードされたタンパク質に導入されるような相同ヌクレオチド配列に、１つ以上のヌクレオチド置換、付加または欠失を導入することにより作成できる。変異は、部位特異的変異誘発およびＰＣＲ媒介変異誘発などの標準的な技術により、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１、またはその断片、または相同ヌクレオチド配列に導入することができる。好ましくは、保存的アミノ酸置換は、１つ以上の予測される非必須アミノ酸残基で行われる。「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸残基が同様の側鎖を有するアミノ酸残基で置換されるものである。同様の側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーは、当技術分野で定義されている。これらのファミリーには、塩基性側鎖（例えば、リジン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非荷電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、スレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、ベト２１７−４２０ランチト（ｂｅｔ２１７−４２０  ｒａｎｃｈｅｄ）側鎖（例えば、スレオニン、バリン、イソロイシン）および芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）、を有するアミノ酸が含まれる。したがって、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの予測される非必須アミノ酸残基は、好ましくは同じ側鎖ファミリーからの別のアミノ酸残基で置換される。あるいは、別の実施形態では、飽和変異誘発などによりＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドコード配列の全部または一部に沿ってランダムに変異を導入することができ、得られた変異体を本明細書に記載のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド活性についてスクリーニングして、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド活性を保持する変異体を特定することができる。配列番号４、５、６、７、８、９、１０、または１１またはその断片の変異誘発に続いて、コードされたタンパク質を組換えで発現させ（本明細書に記載のように）、タンパク質の活性を、例えば、本明細書に記載のアッセイを使用して決定することができる。
【００９７】
ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドレベルは、転写された分子またはタンパク質の発現を検出するための多種多様な周知の方法のいずれかによって評価され得る。そのような方法の非限定的な例には、タンパク質の検出のための免疫学的方法、タンパク質精製法、タンパク質機能または活性アッセイ、核酸ハイブリダイゼーション法、核酸逆転写法、および核酸増幅法が含まれる。
【００９８】
好ましい実施形態では、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドレベルは、遺伝子転写物（例えば、ｍＲＮＡ）を測定することにより、翻訳されたタンパク質の量の測定により、または遺伝子産物の活性の測定により確認される。発現レベルは、いずれも標準的な技術を使用して測定できるｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、またはタンパク質活性の検出によることを含めた様々な方法で監視できる。検出には、遺伝子発現レベルの定量化（例えば、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、または酵素活性）を含むことができ、あるいはまは、特に対照レベルと比較した、遺伝子発現レベルの定性的評価であってもよい。検出されているレベルのタイプは、文脈から明らかにであろう。
【００９９】
特定の実施形態では、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドｍＲＮＡ発現レベルは、当該分野で既知の方法を使用して、生体試料中のインサイチュおよびインビトロ形式の両方によって決定され得る。「生体試料」という用語は、対象から単離された組織、細胞、生体液およびその単離物、ならびに対象内に存在する組織、細胞および体液を含むことを意図している。多くの発現検出方法では、単離されたＲＮＡが使用される。インビトロの方法では、ｍＲＮＡの単離に対しては選択しない任意のＲＮＡ単離技術は、細胞からのＲＮＡの精製に利用できる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８７−１９９９を参照されたい）。さらに、多数の組織試料は、例えば、Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉの一段階ＲＮＡ単離プロセス（１９８９、米国特許第４，８４３，１５５号）など、当業者に周知の技術を使用して容易に処理できる。
【０１００】
単離されたｍＲＮＡは、サザン分析またはノーザン分析、ポリメラーゼ連鎖反応分析およびプローブアレイを含むがこれらに限定されないハイブリダイゼーションまたは増幅アッセイで使用できる。ｍＲＮＡレベルの検出のための１つの好ましい診断方法は、検出される遺伝子によりコードされるｍＲＮＡにハイブリダイズできる核酸分子（プローブ）と単離されたｍＲＮＡを接触させることを包含する。核酸プローブは、例えば、全長ｃＤＮＡ、またはその部分であって、少なくとも７、１５、３０、５０、１００、２５０または５００の長さのヌクレオチドのオリゴヌクレオチドなど、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドをコードするｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡに対するストリンジェントな条件下に特異的にハイブリダイズするのに十分なもの、であり得る。本発明の診断アッセイで使用するための他の適切なプローブは、本明細書に記載されている。ｍＲＮＡとプローブのハイブリダイゼーションは、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドが発現されていることを示す。
【０１０１】
１つの形式では、例えば単離されたｍＲＮＡをアガロースゲル上で泳動させ、ｍＲＮＡをゲルからニトロセルロースなどの膜に移すことにより、ｍＲＮＡを固体表面に固定し、プローブと接触させる。別の形式では、プローブ（複数可）は固体表面に固定され、ｍＲＮＡは、例えば、遺伝子チップアレイ、例えばＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ（商標）遺伝子チップアレイでプローブ（複数可）と接触される。当業者は、ＲＨＯＡドミナントネガティブｍＲＮＡ発現レベルのレベルを検出する際に使用するための既知のｍＲＮＡ検出方法を容易に適合させることができる。
【０１０２】
試料中のＲＨＯＡドミナントネガティブｍＲＮＡ発現レベルを決定する代替方法は、例えば、ｒｔＰＣＲ（Ｍｕｌｌｉｓ、１９８７、米国特許第４，６８３，２０２号に記載された実験的実施形態）、リガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８８：１８９−１９３）、自家持続配列複製法（Ｇｕａｔｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８７：１８７４−１８７８）、転写増幅システム（Ｋｗｏｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：１１７３−１１７７）、Ｑ−ベータレプリカーゼ（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ６：１１９７）、ローリングサークル複製（Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８５４，０３３号）、または他の任意の核酸増幅法、による核酸増幅のプロセス、それに続く当業者に周知の技術を使用する増幅分子の検出、を含む。これらの検出スキームは、核酸分子が非常に少ない数で存在する場合、核酸分子の検出に特に役立つ。本明細書で使用する増幅プライマーは、遺伝子の５’または３’領域（それぞれプラス鎖とマイナス鎖、またはその逆）にアニールし、間に短い領域を含むことができる一対の核酸分子として定義される。一般に、増幅プライマーは約１０〜３０の長さのヌクレオチドであり、約５０〜２００の長さのヌクレオチドの領域に隣接する。適切な条件下で、適切な試薬を使用して、そのようなプライマーは、プライマーが隣接するヌクレオチド配列を含む核酸分子の増幅を可能にする。
【０１０３】
インサイチュ法の場合、ｍＲＮＡは検出前に細胞から分離する必要は無い。そのような方法において、細胞または組織試料は、既知の組織学的方法を使用して調製／処理される。次に、試料を支持体、通常、スライドガラスに固定し、ＲＨＯＡドミナントネガティブｍＲＮＡにハイブリダイズできるプローブと接触させる。
【０１０４】
絶対的ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド発現レベルに基づいて決定を行う代わりに、決定は正規化されたＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド発現レベルに基づいてもよい。発現レベルは、その発現を非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド遺伝子、例えば構成的に発現されるハウスキーピング遺伝子の発現と比較することにより絶対的ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド発現レベルを補正することにより正規化される。正規化に適した遺伝子には、アクチン遺伝子などのハウスキーピング遺伝子、または上皮細胞特異的遺伝子が含まれる。この正規化により、ある試料（例えば、対象試料）の発現レベルを別の試料（例えば、正常な試料）で、または異なる出所の試料間で比較できる。
【０１０５】
ＲＨＯＡドミナントネガティブ変異体のレベルまたは活性は、発現されたポリペプチドを検出または定量化することにより検出および／または定量化することもできる。ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、当業者に周知の多数の手段のいずれかによって検出および定量化することができる。これらには、電気泳動、キャピラリー電気泳動、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）、超拡散クロマトグラフィーなどの分析生化学的方法、または流体またはゲル沈降反応、免疫拡散（単純または二重）、免疫電気泳動、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、免疫蛍光分析、ウエスタンブロット法などの免疫学的方法が含まれる。当業者は、細胞がＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドを発現するかどうかを決定する際に使用するための既知のタンパク質／抗体検出方法を容易に適合させることができる。
【０１０６】
ｂ．組換え発現ベクターと宿主細胞
本発明の別の態様は、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド（またはその一部）をコードする核酸を含むベクター、好ましくは発現ベクターの使用に関する。本明細書で使用される「ベクター」という用語は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターの１つのタイプは「プラスミド」で、追加のＤＮＡセグメントを連結できる環状の二本鎖ＤＮＡループを指す。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、追加のＤＮＡセグメントをウイルスゲノムに連結することができる。特定のベクターは、それらが導入される宿主細胞内で自律複製が可能である（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらに作動可能に連結されている遺伝子の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。一般に、組換えＤＮＡ技術で有用な発現ベクターは、多くの場合、プラスミドの形をしている。本明細書では、プラスミドがベクターの最も一般的に使用される形態であるため、「プラスミド」および「ベクター」を交換可能に使用することができる。しかし、本発明は、同等の機能を果たす、ウイルスベクター（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）などの発現ベクターの他の形態を含むことを意図している。一実施形態では、ドミナントネガティブＲＨＯＡ核酸分子を含むアデノウイルスベクターが使用される。
【０１０７】
本発明の組換え発現ベクターは、宿主細胞における核酸の発現に適した形態の本発明の核酸を含み、このことは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に作動可能に連結されている、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択される、１つ以上の調節配列を含むことを意味する。組換え発現ベクター内で、「作動可能に連結されている」とは、目的のヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で（例えば、インビトロ転写／翻訳システムにおいてまたは宿主細胞にベクターが導入された場合の宿主細胞内で）、調節配列（複数可）に連結されていることを意味することを意図する。「調節配列」という用語は、プロモーター、エンハンサー、および他の発現制御要素（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含むことを意図している。そのような調節配列は、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ；Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）に記載されている。調節配列には、多くのタイプの宿主細胞でヌクレオチド配列の構成的発現を指示するもの、および特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列の発現を指示するもの（例えば、組織特異的調節配列）が含まれる。発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細胞の選択、所望のタンパク質の発現レベルなどの要因に依存する可能性があることを当業者は理解するであろう。本発明の発現ベクターを宿主細胞に導入することにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる融合タンパク質またはペプチドを含むタンパク質またはペプチドを産生することができる。
【０１０８】
本発明の組換え発現ベクターは、原核細胞または真核細胞におけるドミナントネガティブＲＨＯＡの発現のために設計することができる。例えば、ドミナントネガティブＲＨＯＡは、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用して）酵母細胞、または哺乳動物細胞で発現できる。適切な宿主細胞については、Ｇｏｅｄｄｅｌ，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ（１９９０）でさらに説明されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列およびＴ７ポリメラーゼを使用して、インビトロで転写および翻訳され得る。
【０１０９】
原核生物におけるタンパク質の発現は、ほとんどの場合、融合タンパク質または非融合タンパク質の発現を指示する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌で行われる。融合ベクターは、そこにコードされるタンパク質、通常は組換えタンパク質のアミノ末端に多くのアミノ酸を追加する。そのような融合ベクターは、通常、次の３つの目的に役立つ。１）組換えタンパク質の発現を増加させる、２）組換えタンパク質の溶解度を高める、３）アフィニティー精製のリガンドとして作用することにより、組換えタンパク質の精製を支援する。多くの場合、融合発現ベクターでは、タンパク質分解切断部位が融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入され、融合タンパク質の精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離できるようにする。そのような酵素、およびそれらの同族認識配列には、Ｘａ因子、トロンビンおよびエンテロキナーゼが含まれる。典型的な融合発現ベクターには、融合するｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｂ．ａｎｄ  Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｋ．Ｓ．（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）が含まれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、またはプロテインＡを、それぞれ標的組換えタンパク質に結合する。一実施形態では、ドミナントネガティブＲＨＯＡのコード配列をｐＧＥＸ発現ベクターにクローニングして、Ｎ末端からＣ末端まで、および／またはＧＳＴトロンビン切断部位ドミナントネガティブＲＨＯＡを含む融合タンパク質をコードするベクターを作成する。融合タンパク質は、グルタチオン−アガロース樹脂を使用したアフィニティークロマトグラフィーで精製できる。ＧＳＴに融合されていない組換えＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、トロンビンによる融合タンパク質の切断によって回収することができる。
【０１１０】
適切な誘導性非融合大腸菌発現ベクターの例には、ｐＴｒｃ（Ａｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ  ６９：３０１−３１５）およびｐＥＴ  １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）６０−８９）が含まれる。ｐＴｒｃベクターからの標的遺伝子発現は、ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ融合プロモーターからの宿主ＲＮＡポリメラーゼ転写に依存している。ｐＥＴ  １１ｄベクターからの標的遺伝子発現は、共発現されたウイルスＲＮＡポリメラーゼ（Ｔ７  ｇｎ１）によって媒介されるＴ７  ｇｎ１０−ｌａｃ融合プロモーターからの転写に依存している。このウイルスポリメラーゼは、ｌａｃＵＶ  ５プロモーターの転写制御下にあるＴ７  ｇｎ１遺伝子を内在するλプロファージから宿主株ＢＬ２１（ＤＥ３）またはＨＭＳ１７４（ＤＥ３）によって供給される。
【０１１１】
大腸菌での組換えタンパク質の発現を最大にするための１つの戦略は、組換えタンパク質をタンパク質分解的に切断する能力が損なわれた宿主細菌でタンパク質を発現させることである（Ｇｏｔｔｅｓｍａｎ，Ｓ．，Ｇｅｎｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ：Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ  １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ（１９９０）１１９−１２８）。別の戦略は、各アミノ酸の個々のコドンが大腸菌で優先的に利用されるように、発現ベクターに挿入される核酸の核酸配列を変更することである（Ｗａｄａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２０：２１１１−２１１８）。本発明の核酸配列のそのような変更は、標準的なＤＮＡ合成技術により実施することができる。
【０１１２】
別の実施形態では、ドミナントネガティブＲＨＯＡ発現ベクターは酵母発現ベクターである。酵母Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓａｅでの発現用ベクターの例には、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｒｊａｎ  ａｎｄ  Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，（１９８２）Ｃｅｌｌ  ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅ  ５４：１１３−１２３）、およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）が含まれる。
【０１１３】
あるいは、バキュロウイルス発現ベクターを使用して、ドミナントネガティブＲＨＯＡを昆虫細胞で発現させることができる。培養昆虫細胞（Ｓｆ  ９細胞など）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）およびｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ  ａｎｄ  Ｓｕｍｍｅｒｓ（１９８９）Ｖｉｒｏｌｏｇｙ  １７０：３１−３９）が含まれる。
【０１１４】
さらに別の実施形態では、本発明の核酸は、哺乳動物発現ベクターを使用して哺乳動物細胞で発現される。哺乳動物発現ベクターの例には、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，Ｂ．（１９８７）Ｎａｔｕｒｅ  ３２９：８４０）およびｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯＪ．６：１８７−１９５）が含まれる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は多くの場合、ウイルスの調節要素によって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、およびシミアンウイルス４０に由来する。原核細胞および真核細胞の両方に適した他の発現システムについては、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｈ，Ｅ．Ｆ．，ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９の１６章と１７章を参照されたい。
【０１１５】
別の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型において優先的に核酸の発現を指示することができる（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現させる）。組織特異的な調節エレメントは、当技術分野で知られている。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例には、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ  ａｎｄ  Ｅａｔｏｎ（１９８８）Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特にＴ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８９）ＥＭＢＯＪ．８：７２９−７３３）および免疫グロブリン（Ｂａｎｅｒｊｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ニューロフィラメントプロモーター；Ｂｙｒｎｅ  ａｎｄ  Ｒｕｄｄｌｅ（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３０：９１２−９１６）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳漿乳清プロモーター；米国特許第４，８７３，３１６号およびヨーロッパ特許出願第２６４，１６６号）が含まれる。発達的に調節されたプロモーター、例えばマウスホックス（ｈｏｘ）プロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ  ａｎｄ  Ｇｒｕｓｓ（１９９０）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４９：３７４−３７９）およびα−フェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ  ａｎｄ  Ｔｉｌｇｈｍａｎ（１９８９）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含される。
【０１１６】
本発明の別の態様は、本発明の組換え発現ベクターまたは核酸が導入された宿主細胞に関する。用語「宿主細胞」および「組換え宿主細胞」は、本明細書で互換的に使用される。そのような用語は、特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の子孫または潜在的な子孫を指すことが理解される。変異または環境の影響のいずれかにより、後続の世代で特定の変更が発生する可能性があるため、そのような子孫は実際には親細胞と同一ではないかもしれないが、本明細書で使用される用語の範囲内に含まれる。
【０１１７】
宿主細胞は、任意の原核細胞または真核細胞であり得る。例えば、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、大腸菌などの細菌細胞、昆虫細胞、酵母または哺乳動物細胞（Ｆａｏ肝細胞癌細胞、初代肝細胞、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ）またはＣＯＳ細胞）で発現できる。他の適切な宿主細胞は、当業者に周知である。
【０１１８】
ベクターＤＮＡは、従来の形質転換またはトランスフェクション技術により原核細胞または真核細胞に導入できる。本明細書で使用する「形質転換」および「トランスフェクション」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウムの共沈、ＤＥＡＥ−デキストラン媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロポレーションを含む、外来核酸（例えば、ＤＮＡ）を宿主細胞に導入するための様々な技術的に認められた技術を指すことを意図する。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクトするための適切な方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ．２ｎｄ，ｅｄ．，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）および他の実験室マニュアルに記載されている。
【０１１９】
細胞培養には、宿主細胞、培地、その他の副産物が含まれる。細胞培養に適した培地は、当技術分野で周知である。ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその断片は、細胞およびポリペプチドを含む培地の混合物から分泌および単離され得る。あるいは、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその断片は、細胞質的に保持され、細胞が収集され、溶解され、タンパク質またはタンパク質複合体が単離され得る。ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその断片は、イオン交換クロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、限外ろ過、電気泳動、およびドミナントネガティブＲＨＯＡまたはその断片の特定のエピトープに特異的な抗体を用いる免疫親和性による精製を含む、タンパク質を精製するための当技術分野で既知の技術を使用して、細胞培養培地、宿主細胞、またはその両方から単離され得る。
【０１２０】
いくつかの実施形態において、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片は、異種ポリペプチドに融合され得る。特定の実施形態では、融合ポリペプチドは、対応する非融合ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片よりも長い半減期および／または細胞透過性を有する。例えば、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドを細胞透過性ペプチドに融合させて、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの無傷細胞への送達を容易にすることができる。タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）としても知られる細胞透過性ペプチドは、細胞膜を自由に通過できる小さなペプチドドメインを持つキャリアである。融合タンパク質がタンパク質形質導入として知られるプロセスで細胞膜を効率的に通過できるようにするいくつかのＰＴＤが特定されている。研究により、ＨＩＶ  ＴＡＴタンパク質に由来するＴＡＴペプチドは、ペプチドまたはタンパク質を様々な細胞に伝達する能力があることが実証されている。ＰＴＤは抗癌戦略で利用されており、例えば、細胞透過性Ｂｃｌ−２結合ペプチドｃｐｍ１２８５は、マウスのヒト骨髄性白血病の成長を遅らせる活性を示す。特定のＳＨ２ドメイン含有タンパク質の受容体結合部位を模倣するＦＧＦＲ７３０ｐＹなどの細胞透過性リンペプチドは、癌研究および細胞シグナル伝達機構研究の有望なツールである。他の実施形態では、異種タグは、当該分野で既知の標準方法に従って、精製目的に使用され得る（例えば、エピトープタグおよびＦＣ融合タグ）。
【０１２１】
したがって、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドのすべてまたは選択された部分をコードするヌクレオチド配列を使用して、微生物または真核生物の細胞プロセスを介してタンパク質の組換え形態を生成することができる。配列を発現ベクターなどのポリヌクレオチド構築物に連結し、真核生物（酵母、鳥類、昆虫または哺乳動物）または原核生物（細菌細胞）のいずれかの宿主に形質転換またはトランスフェクトすることが標準的な手順である。本発明による微生物手段または組織培養技術により、組換えＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその断片を調製するために、同様の手順またはその改変を使用することができる。
【０１２２】
別の変形では、タンパク質の産生は、インビトロ翻訳システムを使用して達成され得る。インビトロ翻訳システムは、一般に、ＲＮＡ分子のタンパク質への翻訳に必要な少なくとも最小限の要素を含む無細胞抽出物である翻訳システムである。インビトロ翻訳システムには、通常、少なくともリボソーム、ｔＲＮＡ、イニシエーターメチオニル−ｔＲＮＡＭｅｔ、翻訳に関与するタンパク質または複合体、例えば、ｅＩＦ２、ｅＩＦ３、キャップ結合タンパク質（ＣＢＰ）を含むキャップ結合（ＣＢ）複合体、および真核生物開始因子４Ｆ（ｅＩＦ４Ｆ）が含まれる。様々なインビトロ翻訳システムが当技術分野で周知であり、市販のキットが含まれる。インビトロ翻訳システムの例には、ウサギ網状赤血球溶解物、ウサギ卵母細胞溶解物、ヒト細胞溶解物、昆虫細胞溶解物および小麦胚芽抽出物などの真核生物溶解物が含まれる。溶解物は、Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ  Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ａｒｌｉｎｇｔｏｎ  Ｈｅｉｇｈｔｓ，Ｉｌｌ．、およびＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．などの製造者から市販されている。インビトロ翻訳システムは通常、酵素、翻訳、開始および伸長因子、化学試薬、およびリボソームなどの高分子を含んでいる。さらに、インビトロ転写システムを使用できる。そのようなシステムは、通常、少なくともＲＮＡポリメラーゼホロ酵素、リボヌクレオチド、および任意の必要な転写開始、伸長および終結因子を含む。インビトロ転写および翻訳は、ワンポット反応で結合されて、１つ以上の単離されたＤＮＡからタンパク質を産生し得る。
【０１２３】
特定の実施形態では、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその断片は、化学的に、無細胞系でリボソーム的に、または細胞内でリボソーム的に合成され得る。化学合成は、段階的な固相合成、ペプチド断片の立体配座支援再ライゲーション（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌｌｙ−ａｓｓｉｓｔｅｄ  ｒｅ−ｌｉｇａｔｉｏｎ）による半合成、クローン化または合成ペプチドセグメントの酵素的ライゲーション、化学的ライゲーションなど、様々な技術で認識されている方法を使用して実行できる。天然の化学的ライゲーションは、２つの非保護ペプチドセグメントの化学選択的反応を使用して、一過性のチオエステル連結中間体を産生する。次いで、一過性のチオエステル連結中間体は、自然に転位を受けて、ライゲーション部位に天然のペプチド結合を有する完全長のライゲーション産物を提供する。完全長のライゲーション産物は、無細胞合成で生成されたタンパク質と化学的に同一である。全長のライゲーション産物は、許容されるようにリフォールディングおよび／または酸化されて、天然型のジスルフィド含有タンパク質分子を形成し得る。（例えば、米国特許第６，１８４，３４４号および同第６，１７４，５３０号、を参照されたいおよびＴ．Ｗ．Ｍｕｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．（１９９３）：ｖｏｌ．４，ｐ４２０、Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）：ｖｏｌ．２４６，ｐ１１４９、Ａ．Ｗｌｏｄａｗｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９８９）：ｖｏｌ．２４５，ｐ６１６、Ｌ．Ｈ．Ｈｕａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）：ｖｏｌ．３０，ｐ７４０２、Ｍ．Ｓｃｌｍｏｌｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｐｅｐｔ．Ｐｒｏｔ．Ｒｅｓ．（１９９２）：ｖｏｌ．４０，ｐ１８０−１９３、Ｋ．Ｒａｊａｒａｔｈｎａｍ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９４）：ｖｏｌ．２６４，ｐ９０、Ｒ．Ｅ．Ｏｆｆｏｒｄ，“Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈｅｓ  ｔｏ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ”，ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄｅｓｉｇｎ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｎｅｗ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ，Ｊ．Ｂ．Ｈｏｏｋ，Ｇ．Ｐｏｓｔｅ，Ｅｄｓ．，（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９０）ｐｐ．２５３−２８２、Ｃ．Ｊ．Ａ．Ｗａｌｌａｃｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９２）：ｖｏｌ．２６７，ｐ３８５２、Ｌ．Ａｂｒａｈｍｓｅｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ（１９９１）：ｖｏｌ．３０，ｐ４１５１、Ｔ．Ｋ．Ｃｈａｎｇ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ（１９９４）９１：１２５４４−１２５４８、Ｍ．Ｓｃｈｎｌｚｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ（１９９２）：ｖｏｌ．，３２５６，ｐ２２１、およびＫ．Ａｋａｊｉ，ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｕｌｌ．（Ｔｏｋｙｏ）（１９８５）３３：１８４を参照されたい）。
【０１２４】
哺乳動物細胞の安定したトランスフェクションのために、使用される発現ベクターとトランスフェクション技術に応じて、細胞のごく一部のみが外来ＤＮＡをゲノムに組み込むことが知られている。これらの組込み体を特定および選択するために、選択可能なマーカー（例えば、抗生物質に対する耐性）をコードする遺伝子は、一般に関心のある遺伝子とともに宿主細胞に導入される。好ましい選択マーカーには、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、およびメトトレキサートなどの薬物に対する耐性を付与するマーカーが含まれる。選択マーカーをコードする核酸は、ドミナントネガティブＲＨＯＡをコードするものと同じベクター上の宿主細胞に導入するか、別のベクターに導入することができる。導入された核酸で安定的にトランスフェクトされた細胞は、薬物選択によって特定できる（例えば、選択マーカー遺伝子を組み込んだ細胞は生き残るが、他の細胞は死ぬ）。
【０１２５】
培養中の原核生物または真核生物宿主細胞などの本発明の宿主細胞を使用して、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドを産生（すなわち発現）することができる。したがって、本発明はさらに、本発明の宿主細胞を使用してＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドを産生する方法を提供する。一実施形態では、本方法は、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドが産生されるまで、本発明の宿主細胞（ドミナントネガティブＲＨＯＡをコードする組換え発現ベクターが導入されている）を適切な培地で培養することを含む。別の実施形態において、本方法は、培地または宿主細胞からＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドを単離することをさらに含む。
【０１２６】
本発明の宿主細胞はまた、例えば、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドを過剰発現するか、またはＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドを過剰分泌するヒトまたは非ヒトトランスジェニック動物および／または細胞を産生するために使用できる。非ヒトトランスジェニック動物は、びまん性胃癌（ＤＧＣ）、乳小葉癌、または他のタイプのＥＭＴ癌などの選択した障害の有害な症状を寛解させることができる薬剤または化合物などを特定するために設計されたスクリーニングアッセイで使用できる。例えば、一実施形態では、本発明の宿主細胞は、ドミナントネガティブＲＨＯＡコード配列またはその断片が導入されている受精卵母細胞または胚性幹細胞である。次いで、そのような宿主細胞を使用して、外因性ドミナントネガティブＲＨＯＡ配列がそのゲノムに導入された非ヒトトランスジェニック動物または内在性ＲＨＯＡ配列が変更された相同組換え動物を作成することができる。そのような動物は、ドミナントネガティブＲＨＯＡまたはその断片の機能および／または活性の研究、ならびにドミナントネガティブＲＨＯＡ活性のモジュレーターの特定および／または評価に有用である。本明細書で使用する「トランスジェニック動物」は、その動物の細胞の１つ以上が導入遺伝子を含む非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはラットまたはマウスなどのげっ歯類である。トランスジェニック動物の他の例には、非ヒト霊長類、羊、犬、牛、ヤギ、鶏、両生類などが含まれる。導入遺伝子は、トランスジェニック動物が発生する細胞のゲノムに組み込まれ、成熟動物のゲノムに残る外因性ＤＮＡであり、それにより、トランスジェニック動物の１つ以上の細胞型または組織におけるコードされた遺伝子産物の発現を指示する。本明細書で使用する「相同組換え動物」は、内在性ＲＨＯＡ遺伝子が、内在性遺伝子と動物の細胞、例えば動物の発生前の動物の胚細胞に導入された外因性ＤＮＡ分子との間の相同組換えによって変更されている、非ヒト動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはマウスである動物、である。
【０１２７】
本発明のトランスジェニック動物は、例えばマイクロインジェクション、レトロウイルス感染により受精卵母細胞の雄性前核にドミナントネガティブＲＨＯＡまたはその断片をコードする核酸を導入し、偽妊娠した雌の里親動物で卵母細胞を発達させることにより作製することができる。ヒトドミナントネガティブＲＨＯＡ  ｃＤＮＡ配列は、トランスジーンとして非ヒト動物のゲノムに導入できる。あるいは、ヒトドミナントネガティブＲＨＯＡ遺伝子の非ヒト相同体を導入遺伝子として使用することができる。イントロン配列およびポリアデニル化シグナルも導入遺伝子に含めて、導入遺伝子の発現効率を高めることができる。組織特異的調節配列（複数可）をドミナントネガティブＲＨＯＡトランスジーンに操作可能に連結させて、特定の細胞にＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの発現を指示することができる。胚操作およびマイクロインジェクションを介してトランスジェニック動物、特にマウスなどの動物を生成する方法は、当技術分野で慣行になっており、例えば、両方ともＬｅｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第４，７３６，８６６号および同第４，８７０，００９号に、およびＷａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第４，８７３，１９１号に、およびＨｏｇａｎ，Ｂ．，Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｍｏｕｓｅ  Ｅｍｂｒｙｏ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８６）に記載されている。他のトランスジェニック動物の生産にも同様の方法が使用される。トランスジェニックファウンダー動物は、そのゲノムにおけるドミナントネガティブＲＨＯＡトランスジーンの存在および／または動物の組織または細胞におけるドミナントネガティブＲＨＯＡ  ｍＲＮＡの発現に基づいて特定できる。次に、トランスジェニックファウンダー動物を使用して、導入遺伝子を保有する追加の動物を繁殖させることができる。さらに、ドミナントネガティブＲＨＯＡをコードする導入遺伝子を保有するトランスジェニック動物は、他の導入遺伝子を保有する他のトランスジェニック動物とさらに交配させることができる。
【０１２８】
相同組換え動物を作成するために、ドミナントネガティブＲＨＯＡ遺伝子の少なくとも一部を含むベクターが調製される。ドミナントネガティブＲＨＯＡ遺伝子は、ヒト遺伝子、またはヒトドミナントネガティブＲＨＯＡ遺伝子の非ヒト相同体であり得る。例えば、ヒトドミナントネガティブＲＨＯＡ遺伝子を使用して、マウスゲノム中の内在性ＲＨＯＡ遺伝子を改変するのに適した相同組換えベクターを構築することができる。相同組換えベクターでは、ドミナントネガティブＲＨＯＡ遺伝子のドミナントネガティブ変異は、その５’および３’末端に追加のＲＨＯＡ遺伝子の核酸が隣接しており、ベクターによって運ばれる外因性遺伝子と胚性幹細胞の内在性ＲＨＯＡ遺伝子の間に相同組換えが起こるようにする。追加の隣接ＲＨＯＡ核酸は、内在性遺伝子との相同組換えを成功させるのに十分な長さである。通常、数キロベースの隣接ＤＮＡ（５’および３’末端の両方）がベクターに含まれる（相同組換えベクターの説明については、例えば、Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．ａｎｄ  Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．（１９８７）Ｃｅｌｌ  ５１：５０３を参照されたい）。ベクターを（例えば、エレクトロポレーションにより）胚性幹細胞株に導入し、導入されたドミナントネガティブＲＨＯＡ遺伝子が内在性ＲＨＯＡ遺伝子と相同的に組換えられた細胞を選択する（例えば、Ｌｉ，Ｅ．ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｃｅｌｌ６９：９１５を参照されたい）。その後、選択した細胞を動物（マウスなど）の胚盤胞に注入して凝集キメラを形成する（例えば、Ｂｒａｄｌｅｙ，Ａ．ｉｎ  Ｔｅｒａｔｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ  ａｎｄ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｅ．Ｊ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ，ｅｄ．（ＩＲＬ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８７）ｐｐ．１１３−１５２を参照されたい）。次いで、キメラ胚を適切な偽妊娠の雌の里親動物に移植し、胚を出産させることができる。生殖細胞に相同的に組換えられたＤＮＡを持つ子孫は、動物のすべての細胞が導入遺伝子の生殖細胞系列伝達により相同的に組換えられたＤＮＡを含む動物を繁殖させるのに使用できる。相同組換えベクターおよび相同組換え動物を構築する方法は、Ｂｒａｄｌｅｙ（１９９１）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ２：８２３−８２９およびＬｅ  Ｍｏｕｅｌｌｅｃ  ｅｔ  ａｌ．によるＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９０／１１３５４、Ｓｍｉｔｈｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ９１／０１１４０、Ｚｉｊｌｓｔｒａ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ９２／０９６８、およびＢｅｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．によるＷＯ９３／０４１６９にさらに記載される。
【０１２９】
別の実施形態では、導入遺伝子の調節された発現を可能にする選択されたシステムを含むトランスジェニック非ヒト動物を作製することができる。そのようなシステムの一例は、バクテリオファージＰ１のｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムである。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムの説明については、例えば、Ｌａｋｓｏ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：６２３２−６２３６を参照されたい。リコンビナーゼシステムの別の例は、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰリコンビナーゼシステムである（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５１：１３５１−１３５５。ｃｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを使用して導入遺伝子の発現を調節する場合、Ｃｒｅリコンビナーゼと選択したタンパク質の両方をコードする導入遺伝子を含む動物が必要である。そのような動物は、例えば、一方は選択されたタンパク質をコードする導入遺伝子を含み、他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子を含む２つのトランスジェニック動物を交配させることによる、「二重」トランスジェニック動物の構築を通じて提供することができる。
【０１３０】
本明細書に記載の非ヒトトランスジェニック動物のクローンは、Ｗｉｌｍｕｔ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｎａｔｕｒｅ  ３８５：８１０−８１３およびＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９７／０７６６８およびＷＯ９７／０７６６９に記載の方法に従って作製することもできる。手短に言えば、トランスジェニック動物からの細胞、例えば体細胞を単離し、成長サイクルを終了してＧｏ期に入るように誘導することができる。次いで、静止細胞は、例えば、電気パルスの使用を介して、静止細胞が単離されるのと同じ種の動物からの除核卵母細胞に融合され得る。次に、再構成された卵母細胞は、桑実胚または胚盤胞に発達するように培養され、その後、偽妊娠の雌の里親動物に移される。この雌の里親動物から生まれた子孫は、細胞、例えば体細胞が単離される動物のクローンになる。
【０１３１】
ｃ．単離されたＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド
本発明はまた、本明細書に記載の方法に従って使用するための、可溶性、精製および／または単離されたＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその断片を提供する。
【０１３２】
一態様では、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、全長ドミナントネガティブＲＨＯＡアミノ酸配列または１〜約２０個の保存的アミノ酸置換を有する全長ドミナントネガティブＲＨＯＡアミノ酸配列を含み得る。本明細書に記載の任意のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドのアミノ酸配列は、本明細書に記載の当該分野で周知の目的のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド配列、またはその断片と、少なくとも５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または９９．５％同一であってもよい。加えて、本明細書に記載の任意のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその断片は、以下の生物学的活性：癌細胞生存、癌細胞増殖、および腫瘍サイズ／体積、の１つ以上を調節（例えば、減少）することができる。
【０１３３】
別の態様では、本発明は、単離されたＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドおよび約２５％、あるいは１５％、あるいは５％未満の混入生体高分子またはポリペプチドを含む組成物を企図する。
【０１３４】
本発明はさらに、核酸、ベクター、宿主細胞などのＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその断片の産生、検出、または特徴付けに関する組成物を提供する。そのような組成物は、アンチセンス核酸など、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの発現および／または活性を調節する化合物として役立ち得る。
【０１３５】
特定の実施形態において、本発明のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、その溶解性および生物学的利用能を増大させ、および／またはその精製、特定、検出、および／または構造的特徴付けを容易にするドメインを含む融合タンパク質であり得る。いくつかの実施形態では、融合パートナーが血漿中の融合タンパク質の安定性を高め、および／または全身の生物学的利用能を高めるＲＨＯＡドミナントネガティブ融合ポリペプチドを発現させることが有用であり得る。例示的なドメインには、例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、プロテインＡ、プロテインＧ、カルモジュリン結合ペプチド、チオレドキシン、マルトース結合タンパク質、ＨＡ、ｍｙｃ、ポリアルギニン、ポリＨｉｓ、ポリＨｉｓ−ＡｓｐまたはＦＬＡＧ融合タンパク質およびタグ、が含まれる。追加の例示的なドメインには、シグナルペプチド、タイプ２Ｉ分泌系ターゲティングペプチド、トランスサイトーシスドメイン、核局在化シグナルなど、インビボでタンパク質の局在化を変化させるドメインが含まれる。種々の実施形態では、本発明のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、１つ以上の異種融合を含み得る。ポリペプチドは、同じ融合ドメインの複数のコピーを含んでも、２つ以上の異なるドメインへの融合を含んでもよい。融合は、ポリペプチドのＮ末端、ポリペプチドのＣ末端、またはポリペプチドのＮ末端とＣ末端の両方で起こり得る。融合タンパク質の構築を容易にするため、または融合タンパク質のタンパク質発現または構造的制約を最適化するために、本発明のポリペプチドと融合ドメインとの間にリンカー配列を含めることも本発明の範囲内である。一実施形態では、リンカーは、本明細書に記載のリンカー、例えば、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０またはそれ以上のアミノ酸のリンカーである。リンカーは、例えば、非構造化組換えポリマー（ＵＲＰ）、例えば、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、２０の長さのアミノ酸であるＵＲＰであってよく、すなわち、リンカーは、二次構造、例えばＣｈｏｕ−Ｆａｓｍａｎアルゴリズム、を制限されているかまたは欠く。例示的なリンカーは、アミノ酸配列ＧＧＧＧＡＧＧＧＧを含む（例えば、アミノ酸配列ＧＧＧＧＡＧＧＧＧからなる）。別の実施形態では、タンパク質発現後またはその後にタグを除去するために、融合ポリペプチドと本発明のポリペプチドとの間にプロテアーゼ切断部位を含むようにポリペプチドを構築することができる。適切なエンドプロテアーゼの例には、例えば、第Ｘａ因子およびＴＥＶプロテアーゼが含まれる。
【０１３６】
いくつか実施形態では、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその断片は、抗体（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）断片（例えば、Ｆｃポリペプチド）に融合される。これらの融合タンパク質を調製するための技術は知られており、例えば、ＷＯ９９／３１２４１およびＣｏｓｍａｎ  ｅｔ．ａｌ．（２００１）Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  １４：１２３−１３３に記載されている。Ｆｃポリペプチドへの融合は、プロテインＡまたはプロテインＧカラムでのアフィニティークロマトグラフィーによる精製を容易にするという追加の利点を提供する。
【０１３７】
さらに別の実施形態では、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、それらの検出、精製、または構造的特徴付けを容易にするために蛍光標識で標識され得る。例示的な実施形態では、本発明のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、高感度（ｅｎｈａｎｃｅｄ）緑色蛍光タンパク質（ＥＧＦＰ）、Ｒｅｎｉｌｌａ  Ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ緑色蛍光タンパク質、ＧＦＰｍｕｔ２、ＧＦＰｕｖ４、高感度黄色蛍光タンパク質（ＥＹＦＰ）、高感度シアン蛍光タンパク質（ＥＣＦＰ）、高感度青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）、ｄｉｓｃｏｓｏｍａからのシトリンおよび赤色蛍光タンパク質（ｄｓＲＥＤ）を含む検出可能な蛍光シグナルを生成する異種ポリペプチド配列に融合され得る。
【０１３８】
「単離された」または「精製された」タンパク質またはその生物学的に活性な部分は、組換えＤＮＡ技術によって生成される場合、細胞物質を実質的に含まない、または化学合成される場合、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。「細胞物質を実質的に含まない」という言葉には、天然または組換えにより産生される細胞の細胞成分からポリペプチドが分離されているＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの調製物が含まれる。一実施形態では、「細胞物質を実質的に含まない」という言葉は、約３０％未満（乾燥重量で）の非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド（本明細書では「混入タンパク質」とも呼ばれる）、より好ましくは約２０％未満の非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、さらにより好ましくは約１０％未満の非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、最も好ましくは約５％未満の非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、を有する、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの調製物を含む。ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分が組換えにより産生される場合、それはまた、好ましくは培地を実質的に含まない、すなわち、培地は、タンパク質調製物の体積の約２０％未満、より好ましくは約１０％未満、最も好ましくは約５％未満に相当する。「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という言葉には、ポリペプチドが、そのポリペプチドの合成に関与する化学前駆体または他の化学物質から分離されているＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの調製物が含まれる。一実施形態では、「化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない」という用語には、約３０％未満（乾燥重量で）の非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド化学物質の化学前駆体、より好ましくは約２０％未満の非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド化学物質の化学前駆体、さらにより好ましくは約１０％未満の非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド化学物質の化学前駆体、最も好ましくは約５％未満の非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド化学物質の化学前駆体、を有するＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの調製物が含まれる。好ましい態様において、単離されたポリペプチドまたはその生物学的に活性な部分は、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドが由来する同じ動物からの混入ポリペプチドを欠く。通常、そのようなポリペプチドは、例えば非ヒト細胞におけるヒトＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの組換え発現により産生される。
【０１３９】
好ましい実施形態では、タンパク質またはその部分は、配列番号１、２、または３のアミノ酸配列またはその断片と十分に相同なアミノ酸配列を含み、その結果、タンパク質またはその部分は、以下の生物学的活性：癌細胞の生存、癌細胞の増殖、および腫瘍の大きさ／体積の１つ以上を、または複合して維持し、前記の生物学的活性の１つ以上を調節（例えば、減少）する。タンパク質の部分は、本明細書に記載の生物学的に活性な部分であることが好ましい。別の好ましい実施形態では、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、それぞれ配列番号１、２、もしくは３に示されるアミノ酸配列、またはその断片、または、配列番号１、２、もしくは３に示されるアミノ酸配列、またはその断片と、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上相同であるアミノ酸配列を有する。さらに別の好ましい実施形態では、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１のヌクレオチド配列、またはその断片にハイブリダイズする、例えばストリンジェントな条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列、または配列番号４、５、６、７、８、９、１０、もしくは１１に示されるヌクレオチド配列またはその断片と、少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約６０％、より好ましくは少なくとも約７０％、さらにより好ましくは少なくとも約８０％、さらにまた好ましくは少なくとも約９０％、最も好ましくは少なくとも約９５％、またはそれ以上相同であるヌクレオチド配列、によってコードされるアミノ酸配列を有する。本発明の好ましいＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドはまた、好ましくは、本明細書に記載のＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドの生物学的活性の少なくとも１つを有する。
【０１４０】
ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質の生物学的に活性な部分には、ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質のアミノ酸配列、例えば、配列番号１、２、もしくは３に示されるアミノ酸配列、またはその断片に由来する、または、ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質に相同なタンパク質のアミノ酸配列に由来するアミノ酸配列を含むペプチドが含まれ、全長ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質、またはＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質に相同な全長ポリペプチドよりも少ないアミノ酸を含み、ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質の少なくとも１つの活性を示す。通常、生物学的に活性な部分（ペプチド、例えば、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００またはそれ以上の長さのアミノ酸であるペプチド）は、ドメインまたはモチーフ（例えば、全長タンパク質マイナス、シグナルペプチド）を含む。好ましい実施形態では、本明細書に記載の１つ以上のドメイン／モチーフを含むタンパク質の生物学的に活性な部分は、１つ以上の以下の生物学的活性：癌細胞生存、癌細胞増殖、および腫瘍サイズ／体積、を調節（例えば、減少）することができる。さらに、タンパク質の他の領域が欠失している他の生物学的に活性な部分は、組換え技術により調製し、本明細書に記載の活性の１つ以上について評価することができる。好ましくは、ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質の生物学的に活性な部分は、生物学的活性を有する１つ以上の選択されたドメイン／モチーフまたはその部分を含む。一実施形態では、関心のあるドミナントネガティブＲＨＯＡ断片は、２４０、２３０、２２０、２１０、２００、１９５、１９０、１８５、１８０、１７５、１７０、１６５、１６０、１５５、１５０、１４５、１４０、１３５、１３０、１２５、１２０、１１５、１１０、１０５、１００、９５、９０、８５、８０、７５、または７０未満の長さのアミノ酸である全長ドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質の部分からなる。
【０１４１】
ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質は、組換えＤＮＡ技術によって産生できる。例えば、（上記のように）タンパク質をコードする核酸分子が発現ベクターにクローン化され、（上記のように）発現ベクターが宿主細胞に導入され、ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質が宿主細胞で発現される。ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質は、次に標準的なタンパク質精製技術を使用した適切な精製スキームによって細胞から単離できる。組換え発現の代わりに、ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質、ポリペプチド、またはペプチドは、標準的なペプチド合成技術を使用して化学的に合成できる。さらに、天然のＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質は、例えば抗ＲＨＯＡ抗体を使用して、細胞（例えば、ＲＨＯＡドミナントネガティブ変異を含む癌細胞）から単離できる。
【０１４２】
本発明はまた、ドミナントＲＨＯＡキメラまたは融合タンパク質を提供する。本明細書で使用される場合、ドミナントＲＨＯＡ「キメラタンパク質」または「融合タンパク質」は、非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドに作動可能に連結されているＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドを含む。「ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド」とは、ドミナントネガティブＲＨＯＡに対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指し、「非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド」とは、ドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質、例えば、ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質とは異なり、同じまたは異なる生物に由来するタンパク質と、実質的に相同でないタンパク質に対応するアミノ酸配列を有するポリペプチドを指す。融合タンパク質内で、「作動可能に連結されている」という用語は、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドと非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドが互いにインフレームで融合していることを示すことを意図している。非ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドは、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドのＮ末端またはＣ末端に融合させることができる。例えば、一実施形態では、融合タンパク質は、ドミナントネガティブＲＨＯＡ−ＧＳＴおよび／またはドミナントネガティブＲＨＯＡ−Ｆｃ融合タンパク質であり、ドミナントネガティブＲＨＯＡ配列は、それぞれＧＳＴまたはＦｃ配列のＮ末端に融合している。そのような融合タンパク質は、ドミナントネガティブＲＨＯＡポリペプチドを使用して作製することができる。そのような融合タンパク質はまた、組換えドミナントネガティブＲＨＯＡの精製、発現、および／または生物学的利用能を容易にすることができる。別の実施形態では、融合タンパク質は、そのＣ末端に異種シグナル配列を含むドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質である。特定の宿主細胞（例えば、哺乳動物宿主細胞）では、異種シグナル配列を使用することにより、ドミナントネガティブＲＨＯＡの発現および／または分泌を増加させることができる。
【０１４３】
好ましくは、本発明のドミナントネガティブＲＨＯＡキメラまたは融合タンパク質は、標準的な組換えＤＮＡ技術によって産生される。例えば、異なるポリペプチド配列をコードするＤＮＡ断片は、従来の技術に従って、例えば、ライゲーションのため平滑末端またはスタッガ末端（ｓｔａｇｇｅｒ−ｅｎｄｅｄ）終端、適切な終端を提供する制限酵素消化、必要に応じて粘着末端の充填、望ましくない結合を回避するためのアルカリホスファターゼ処理、および酵素的ライゲーション、を使用することによって、インフレームで一緒にライゲーションされる。別の実施形態において、融合遺伝子は、自動化ＤＮＡ合成装置を含む従来の技術により合成され得る。あるいは、遺伝子断片のＰＣＲ増幅はアンカープライマーを使用して実行でき、アンカープライマーは２つの連続した遺伝子断片の間に相補的なオーバーハングを生じさせ、その後、アニールしおよび再増幅してキメラ遺伝子配列を生成できる（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｅｄｓ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ：１９９２を参照されたい）。さらに、融合部分（例えば、ＧＳＴポリペプチド）をすでにコードしている多くの発現ベクターが市販されている。ドミナントネガティブＲＨＯＡをコードする核酸は、融合部分がインフレームでＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質に連結されるように、そのような発現ベクターにクローニングすることができる。
【０１４４】
本発明はまた、ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質の相同体に関する。ドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質の相同体は、変異誘発、例えば、それぞれドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質の個別の点変異またはトランケーションによって生成され得る。本明細書で使用される「相同体」という用語は、ドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質のバリアントを指す。一実施形態では、天然に存在する形態のタンパク質の生物学的活性のサブセットを有する相同体による対象の治療は、ドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質の天然に存在する形態による治療に比べて、対象における副作用が少ない。
【０１４５】
別の実施形態では、ドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質の相同体は、ドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質の変異体、例えばトランケーション変異体のコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることにより特定することができる。一実施形態では、ドミナントネガティブＲＨＯＡバリアントの多彩なライブラリーは、核酸レベルでのコンビナトリアル変異誘発により生成され、多彩な遺伝子ライブラリーによりコードされる。ドミナントネガティブＲＨＯＡバリアントの多彩なライブラリーは、例えば、合成オリゴヌクレオチドの混合物を遺伝子配列に酵素的に連結して、有望なドミナントネガティブＲＨＯＡ配列の縮重（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）セットが個々のポリペプチドとして発現できるようにすることにより、または代わりに、その中にドミナントネガティブＲＨＯＡ配列のセットを含有するより大きな融合タンパク質のセット（例えば、ファージディスプレイのための）として、作成することができる。縮重オリゴヌクレオチド配列から有望なドミナントネガティブＲＨＯＡ相同体のライブラリーを作成するために使用できる様々な方法がある。縮重遺伝子配列の化学合成は、自動ＤＮＡシンセサイザーで実行でき、合成遺伝子は適切な発現ベクターに連結される。遺伝子の縮重セットを使用すると、有望なドミナントネガティブＲＨＯＡ配列の望ましいセットをコード化するすべての配列を１つの混合物で提供できる。縮重オリゴヌクレオチドの合成方法は、当技術分野で知られている（例えば、Ｎａｒａｎｇ，Ｓ．Ａ．（１９８３）Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  ３９：３、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５３：３２３、Ｉｔａｋｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８：１０５６、Ｉｋｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄ  Ｒｅｓ．１１：４７７を参照されたい。
【０１４６】
さらに、ドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質コーディングの断片のライブラリーを使用して、ＲＨＯＡドミナントネガティブタンパク質の相同体のスクリーニングおよびその後の選択のために、ドミナントネガティブＲＨＯＡ断片の多彩な集団を生成できる。一実施形態では、コード化配列断片のライブラリーは、ドミナントネガティブＲＨＯＡコード化配列の二本鎖ＰＣＲ断片を、分子当たり約１回だけニッキングが発生する条件下、ヌクレアーゼで処理し、二本鎖ＤＮＡを変性させ、ＤＮＡを再生することにより生成できる異なるニック生成物からのセンス／アンチセンスペアを含むことができる二本鎖ＤＮＡを形成し、Ｓ１ヌクレアーゼで処理することにより改質二本鎖から一本鎖部分を除去し、得られた断片ライブラリーを発現ベクターに連結する。この方法により、様々なサイズのドミナントネガティブＲＨＯＡタンパク質のＮ末端、Ｃ末端、および内部断片をコードする発現ライブラリーを導き出すことができる。
【０１４７】
点変異またはトランケーションによって作成されたコンビナトリアルライブラリーの遺伝子産物をスクリーニングするための、および選択された特性を有する遺伝子産物についてｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのいくつかの技術が当技術分野で知られている。そのような技術は、ドミナントネガティブＲＨＯＡ相同体のコンビナトリアル変異誘発によって生成された遺伝子ライブラリーの迅速なスクリーニングに適応可能である。大規模な遺伝子ライブラリーをスクリーニングするための、ハイスループット分析に適した最も広く使用されている技術には、通常、遺伝子ライブラリーを複製可能な発現ベクターにクローニングし、得られたベクターのライブラリーで適切な細胞を形質転換し、所望の活性の検出によりその産生物が検出された遺伝子をコードするベクターの単離を容易にするという条件下で、コンビナトリアル遺伝子を発現させることが含まれる。ライブラリー中の機能的変異体の頻度を高める新しい技術である再帰的アンサンブル変異誘発（Ｒｅｃｕｒｓｉｖｅ  ｅｎｓｅｍｂｌｅ  ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）（ＲＥＭ）をスクリーニングアッセイと組み合わせて、ドミナントネガティブＲＨＯＡ相同体を特定することができる（Ａｒｋｉｎ  ａｎｄ  Ｙｏｕｖａｎ（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８９：７８１１−７８１５）。
【０１４８】
ＩＩＩ．薬剤と組成物の選択方法
本発明の別の態様は、減少したＣＤＨ１レベルを含む癌細胞の生存率または増殖を減少させる薬剤（例えば、ＲＨＯＡ変異体ポリペプチド）を選択する方法に関する。そのような方法は、細胞ベースおよび非細胞ベースのアッセイを含むスクリーニングアッセイを使用できる。
【０１４９】
一実施形態において、本発明は、減少したＣＤＨ１レベルを含む癌細胞の生存率または増殖を減少させる候補または試験化合物をスクリーニングするためのアッセイに関する。そのような化合物には、制限なしに、ＲＨＯＡ変異体ポリペプチドが含まれる。
【０１５０】
一実施形態では、アッセイは、減少したＣＤＨ１レベルを含む癌細胞の生存率または増殖を低下させる薬剤をスクリーニングするための細胞ベースのアッセイであって、ａ）癌細胞を、１）ＲＨＯＡ変異体、またはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡ変異体ポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される試験薬剤と接触させることと、ｂ）対照と比較して癌細胞の減少した生存率または増殖を決定し、それによって癌細胞の生存率または増殖を減少させる試験薬剤を特定することと、を含む。例えば、細胞増殖または浸潤は、本明細書でさらに説明されるように、細胞数カウント、細胞運動、マトリゲルアッセイ、増殖および／または浸潤関連遺伝子発現の誘導などを監視することにより決定できる。
【０１５１】
別の実施形態では、本発明のアッセイは、ＲＨＯＡ変異体ポリペプチド、またはその生物学的に活性な断片をＧＴＰと接触させ、試験ＲＨＯＡ変異体ポリペプチドがＧＴＰを組み込む能力を決定する無細胞アッセイである。試験ＲＨＯＡ変異体ポリペプチドへのＧＴＰの取り込みは、様々な方法で決定できる。例えば、蛍光ヌクレオチドアナログＮ−メチルアントラニロイル−ＧＴＰ（ｍａｎｔ−ＧＴＰ）のＲＨＯＡへの取り込みを、遊離のものとＲＨＯＡ結合ｍａｎｔ−ＧＴＰとの分光学的差異を測定することにより、分析する、ＲｈｏＧＥＦ交換アッセイキット（ｃｙｔｏｓｋｅｌｅｔｏｎ，Ｉｎｃ．）が使用できる。ＲＨＯＡの存在下でのｍａｎｔ−ＧＴＰ蛍光強度の増強は、ＧＴＰａｓｅによるヌクレオチドの取り込みを示している。
【０１５２】
別の態様では、本発明は、本明細書に記載のアッセイの２つ以上の組み合わせに関する。例えば、調節薬は、細胞ベースまたは無細胞アッセイを使用して特定でき、減少したＣＤＨ１レベルを含む癌細胞の生存率または増殖を減少させる薬剤の能力は、例えば、細胞形質転換および／または腫瘍形成の動物モデルなどの動物においてインビボで確認できる。
【０１５３】
本発明はさらに、上記のスクリーニングアッセイにより特定された新規薬剤に関する。したがって、本明細書に記載のように特定された薬剤を適切な動物モデルでさらに使用することは本発明の範囲内である。例えば、本明細書に記載されるように特定された薬剤は、そのような薬剤による治療の有効性、毒性、または副作用を決定するために動物モデルで使用することができる。あるいは、本明細書に記載のように特定された薬剤を動物モデルで使用して、そのような薬剤の作用メカニズムを決定することができる。さらに、本発明は、本明細書に記載の治療のための上記スクリーニングアッセイにより特定された新規薬剤の使用に関する。
【０１５４】
ＩＶ．対象
一実施形態では、減少したＣＤＨ１レベルを有する癌細胞の生存率または増殖を減少させる薬剤が投与される対象（例えば、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドをコードする核酸またはその生物学的に活性な断片および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤）、または減少したＣＤＨ１レベルを有する癌を治療するための薬剤の有効性の予測可能性がある対象は、哺乳動物（例えばマウス、ラット、霊長類、非ヒト哺乳動物、イヌ、ネコ、ウシ、ウマなどの家畜）であり、および好ましくはヒトである。別の実施形態では、対象は癌の動物モデルである。例えば、動物モデルは、ヒト由来の癌の同所性異種移植動物モデルであり得る。
【０１５５】
本発明の方法の別の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、および／または免疫療法などの治療を受けていない。さらに別の実施形態では、対象は、化学療法、放射線療法、標的療法、および／または免疫療法などの治療を受けている。
【０１５６】
特定の実施形態では、対象は、癌性または前癌性組織を除去する手術を受けている。他の実施形態では、癌性組織は除去されていず、例えば、癌性組織は、生命に不可欠な組織、または外科的処置が患者にかなりの危害を及ぼす可能性のある領域など、身体の手術不能領域に位置し得る。
【０１５７】
Ｖ．治療方法
本発明は、減少したＣＤＨ１レベルを有する癌のリスクがある（または癌にかかりやすい）対象を治療する予防的および治療的方法の両方を提供する。いくつかの実施形態では、癌はＣＤＨ１発現の喪失、例えばＣＤＨ１−ｎｕｌｌ癌を有する。いくつかの実施形態では、癌は、上皮間葉転換（ＥＭＴ）を起こしつつあるか、既に起こしている。特定の実施形態では、癌はびまん性胃癌（ＤＧＣ）または乳小葉癌である。
【０１５８】
１．予防方法
一態様では、本発明は、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片、からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤の治療有効量を対象に投与することによる、減少したＣＤＨ１レベルを有する癌に罹患した対象を予防する方法を提供する。予防薬の投与は、癌を予防するか、あるいは癌の進行を遅らせるように、減少したＣＤＨ１レベルを有する癌に特徴的な症状が現れる前に行うことができる。
【０１５９】
２．治療法
本発明の別の態様は、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片、からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤の治療有効量を対象に投与することによる、減少したＣＤＨ１レベルを有する癌に罹患した対象を治療する方法に関する。
【０１６０】
本発明の調節方法は、減少したＣＤＨ１レベルを有する癌細胞を、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片、からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤と接触させることを含む。
【０１６１】
これらの調節方法は、インビトロで（例えば、細胞を薬剤と接触させることにより）、あるいは、薬剤をインビボで細胞と接触させることにより（例えば、薬剤を対象に投与することにより）実施することができる。一実施形態では、本方法は、薬剤（例えば、本明細書に記載の薬剤、または本明細書に記載のスクリーニングアッセイにより特定された薬剤）、または１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片、からなる群から選択される薬剤の組み合わせを投与することを含む。
【０１６２】
さらに、これらの調節薬は、例えば、化学療法剤、ホルモン、抗血管新生剤、放射性標識、化合物との、または手術、凍結療法、および／または放射線療法との併用療法で投与することもできる。前述の治療方法は、他の形態の従来の治療（例えば、当業者に周知の癌の標準治療）と併用して、従来の治療の前後に連続して投与することができる。例えば、これらの調節薬は、治療有効量の化学療法剤とともに投与することができる。別の実施形態では、これらの調節薬は化学療法と併用して投与され、化学療法剤の活性および有効性を高める。Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（ＰＤＲ）は、様々な癌の治療に使用されてきた化学療法薬の投与量を開示している。治療的に有効なこれらの前述の化学療法薬のレジメンおよび投与量は、治療される特定の癌、疾患の程度、および当業者に周知である他の要因に依存し、医師によって決定され得る。    
【０１６３】
「標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用し、それによって癌を治療する薬剤の投与を指す。例えば、免疫チェックポイント阻害剤の阻害に関する標的療法は、本発明の方法と組み合わせて有用である。「免疫チェックポイント阻害剤」という用語は、抗腫瘍免疫応答を下方調節または阻害することにより免疫応答を微調整するＣＤ４＋および／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞表面上の分子群を意味する。免疫チェックポイントタンパク質は当技術分野で周知であり、ＣＴＬＡ−４、ＰＤ−１、ＶＩＳＴＡ、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、２Ｂ４、ＩＣＯＳ、ＨＶＥＭ、ＰＤ−Ｌ２、ＣＤ１６０、ｇｐ４９Ｂ、ＰＩＲ−Ｂ、ＫＩＲファミリー受容体、ＴＩＭ−１、ＴＩＭ−３、ＴＩＭ−４、ＬＡＧ−３、ＢＴＬＡ、ＳＩＲＰａｌｐｈａ（ＣＤ４７）、ＣＤ４８、２Ｂ４（ＣＤ２４４）、Ｂ７．１、Ｂ７．２、ＩＬＴ−２、ＩＬＴ−４、ＴＩＧＩＴ、およびＡ２ａＲ（例えば、ＷＯ２０１２／１７７６２４を参照）が含まれるがこれらに限定されない。１つ以上の免疫チェックポイント阻害剤の阻害は、阻害性シグナル伝達をブロックまたは中和して、免疫応答をアップレギュレートし、癌をより効果的に治療することができる。
【０１６４】
免疫療法は、例えば、癌ワクチンおよび／または感作抗原提示細胞の使用を含み得る標的療法の１つの形態である。例えば、腫瘍溶解性ウイルスは、正常な細胞を傷つけずに癌細胞に感染して溶解することができるウイルスであり、癌治療に有用な可能性がある。腫瘍溶解性ウイルスの複製は、腫瘍細胞の破壊を容易にするとともに、腫瘍部位での用量増幅を引き起こす。それらはまた、抗癌遺伝子のベクターとしても機能し、腫瘍部位に特異的に送達され得る。免疫療法は、癌抗原または疾患抗原に対する事前形成された抗体の投与によって達成される、宿主の短期保護のための受動免疫を含むことができる（例えば、腫瘍抗原に対する、化学療法剤または毒素に任意に連結されたモノクローナル抗体の投与）。例えば、抗ＶＥＧＦおよびｍＴＯＲ阻害剤は腎細胞癌の治療に有効であることが知られている。免疫療法は、癌細胞株の細胞傷害性リンパ球認識エピトープの使用にも焦点を当てることができる。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチド、リボザイム、ＲＮＡ干渉分子、三重らせんポリヌクレオチドなどを使用して、腫瘍または癌の開始、進行、および／または病理に関連する生体分子を選択的に調節することができる。
【０１６５】
「非標的療法」という用語は、選択された生体分子と選択的に相互作用しないが、癌を治療する薬剤の投与を指す。非標的療法の代表例には、化学療法、遺伝子療法、および放射線療法が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６６】
一実施形態では、化学療法が使用される。化学療法には、化学療法剤の投与が含まれる。そのような化学療法剤は、以下の化合物群から選択されるものであり得るが、これらに限定されない：白金化合物、細胞傷害性抗生物質、代謝拮抗剤、抗有糸分裂剤、アルキル化剤、ヒ素化合物、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤、タキサン、ヌクレオシド類似体、植物アルカロイド、および毒素、ならびにそれらの合成誘導体。例示的な化合物には、アルキル化剤：シスプラチン、トレオフルファン、およびトロホスファミド、植物アルカロイド：ビンブラスチン、パクリタキセル、ドセタキソール、ＤＮＡトポイソメラーゼ阻害剤：テニポシド、クリスナトール、およびマイトマイシン、葉酸拮抗剤：メトトレキサート、ミコフェノール酸、およびヒドロキシ尿素、ピリミジン類似体：５−フルオロウラシル、ドキシフルリジン、およびシトシンアラビノシド、プリン類似体：メルカプトプリンおよびチオグアニン、ＤＮＡ代謝拮抗剤：２’−デオキシ−５−フルオロウリジン、アフィジコリングリシナート、およびピラゾロイミダゾール、ならびに抗有糸分裂剤：ハリコンドリン、コルヒチン、およびリゾキシン、が含まれるが、これらに限定されない。１つ以上の化学療法剤を含む組成物（例えば、ＦＬＡＧ、ＣＨＯＰ）も使用され得る。ＦＬＡＧは、フルダラビン、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ）、およびＧ−ＣＳＦを含む。ＣＨＯＰは、シクロホスファミド、ビンクリスチン、ドキソルビシン、およびプレドニゾンを含む。別の実施形態では、ＰＡＲＰ（例えば、ＰＡＲＰ−１および／またはＰＡＲＰ−２）阻害剤が使用され、そのような阻害剤は当技術分野で周知である（例えば、オラパリブ、ＡＢＴ−８８８、ＢＳＩ−２０１、ＢＧＰ−１５（Ｎ−Ｇｅｎｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｉｎｃ．）、ＩＮＯ−１００１（Ｉｎｏｔｅｋ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ  Ｉｎｃ．）、ＰＪ３４（Ｓｏｒｉａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｃｉｒｃ．Ｒｅｓ．８９（８）：６８４−９１；Ｐａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｂｒ．Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．１３５（６）：１３４７−１３５０）、３−アミノベンズアミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、４−アミノ−１，８−ナフタルイミド（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、６（５Ｈ）−フェナントリジノン（Ｔｒｅｖｉｇｅｎ）、ベンズアミド（米国特許再発行（Ｕ．Ｓ．Ｐａｔ．Ｒｅ．）第３６，３９７号）、およびＮＵ１０２５（Ｂｏｗｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ  ８４（１）：１０６−１２）。作用メカニズムは、一般に、ＰＡＲＰ阻害剤がＰＡＲＰに結合してその活性を低下させる能力に関連している。ＰＡＲＰは、β−ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（ＮＡＤ＋）のニコチンアミドおよびポリＡＤＰリボース（ＰＡＲ）への変換を触媒する。ポリ（ＡＤＰリボース）とＰＡＲＰの両方は、転写、細胞増殖、ゲノム安定性、発癌の調節にリンクされている（Ｂｏｕｃｈａｒｄ  Ｖ．Ｊ．ｅｔ．ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ３１，Ｎｕｍｂｅｒ  ６，Ｊｕｎｅ  ２００３，ｐｐ．４４６−４５４（９）、Ｈｅｒｃｅｇ  Ｚ．；Ｗａｎｇ  Ｚ．−Ｑ．Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｒｅｓｅａ���ｃｈ／Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ｖｏｌｕｍｅ４７７，Ｎｕｍｂｅｒ  １，２  Ｊｕｎ．２００１，ｐｐ．９７−１１０（１４））ポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼ１（ＰＡＲＰ１）は、ＤＮＡ一本鎖切断（ＳＳＢ）の修復における重要な分子である（ｄｅ  Ｍｕｒｃｉａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９４：７３０３−７３０７、Ｓｃｈｒｅｉｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ７：５１７−５２８、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  １１：２３４７−２３５８）。ＰＡＲＰ１機能の阻害によるＳＳＢ修復のノックアウトは、ＤＮＡ二重鎖切断（ＤＳＢ）を誘発し、相同性指向のＤＳＢ修復に欠陥がある癌細胞で合成致死を引き起こす可能性がある（Ｂｒｙａｎｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ  ４３４：９１３−９１７、Ｆａｒｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｎａｔｕｒｅ４３４：９１７−９２１）。化学療法剤の前述の例は例示であり、限定することを意図していない。
【０１６７】
別の実施形態では、放射線療法が使用される。放射線療法で使用される放射線は電離放射線である。放射線療法は、ガンマ線、Ｘ線、陽子線でもある。放射線療法の例には、体外照射療法、放射性同位体（Ｉ−１２５、パラジウム、イリジウム）の組織内移植、ストロンチウム８９などの放射性同位体、胸部放射線療法、腹腔内Ｐ−３２放射線療法および／または全腹部および骨盤の放射線療法が含まれるが、これらに限定されない。放射線療法の一般的な概要については、Ｈｅｌｌｍａｎ，Ｃｈａｐｔｅｒ  １６：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ：Ｒａｄｉａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｙ，６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１，ＤｅＶｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｅｎｃｏｔｔ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ．を参照されたい。放射線療法は、放射線が遠隔ソースから向けられる体外照射療法または遠隔療法として施与することができる。放射線治療は、放射線源を癌細胞または腫瘍塊の近くの体内に配置する内科療法または密封小線源治療としても実施できる。また、ヘマトポルフィリンおよびその誘導体、ベルトポルフィン（Ｖｅｒｔｏｐｏｒｆｉｎ）（ＢＰＤ−ＭＡ）、フタロシアニン、光感受性物質Ｐｃ４、デメトキシヒポクレリンＡ（ｄｅｍｅｔｈｏｘｙ−ｈｙｐｏｃｒｅｌｌｉｎ  Ａ）および２ＢＡ−２−ＤＭＨＡなどの光感受性物質の投与を含む光線力学療法の使用も含まれる。
【０１６８】
別の実施形態では、ホルモン療法が使用される。ホルモン治療的処置は、例えば、ホルモンアゴニスト、ホルモンアンタゴニスト（例えば、フルタミド、ビカルタミド、タモキシフェン、ラロキシフェン、酢酸ロイプロリド（ＬＵＰＲＯＮ）、ＬＨ−ＲＨアンタゴニスト）、ホルモン生合成およびプロセシングの阻害剤、およびステロイド（例えば、デキサメタゾンレチノイド、デルトイド（ｄｅｌｔｏｉｄ）、ベタメタゾン、コルチゾル、コルチゾン、プレドニゾン、デヒドロテストステロン、グルココルチコイド、ミネラルコルチコイド、エストロゲン、テストステロン、プロゲスチン）、ビタミンＡ誘導体（例えば、全トランス型レチノイン酸（ＡＴＲＡ））、ビタミンＤ３類似体、抗ゲスターゲン（例、ミフェプリストン、オナプリストン）、または抗アンドロゲン（例えば、酢酸シプロテロン）を含み得る。
【０１６９】
別の実施形態では、体の組織が高温（１０６°Ｆまで）にさらされる手順である温熱療法が使用される。熱は、細胞に損傷を与えたり、細胞から生きるために必要な物質を奪ったりすることにより、腫瘍を縮小するのに役立つ。温熱療法は、外部および内部加熱デバイスを使用した局所、領域、全身温熱療法である。温熱療法は、ほとんどの場合、その効果の増強しようとするため他の治療法（放射線療法、化学療法、生物学的療法など）と一緒に使用される。局所温熱療法とは、腫瘍などの非常に小さな領域に加えられる熱のことである。体外のデバイスから腫瘍に向けられた高周波で、その領域を外部から加熱してよい。内部加熱を実現するには、いくつかのタイプの滅菌プローブのうちの１つが使用でき、細い加熱線または温水で満たされた中空管、埋め込みマイクロ波アンテナ、および高周波電極が含まれる。領域温熱療法では、臓器または四肢が加熱される。高エネルギーを生成する磁石とデバイスは、加熱される領域の上に配置される。灌流と呼ばれる別のアプローチでは、患者の血液の一部が取り出され、加熱され、内部で加熱される領域にポンプで送られる（灌流される）。全身加熱は、全身に広がった転移癌の治療に使用される。それは、温水毛布、ホットワックス、誘導コイル（電気ブランケットのようなもの）、または熱室（大型インキュベーターと同様）を使用して実現できる。温熱療法は、放射線の副作用や合併症の顕著な増加を引き起こさない。しかし、皮膚に直接熱を加えると、治療を受けた患者の約半数に不快感が生じたり、局所的な痛みが生じることがある。また、一般に急速に治癒する水疱を引き起こす可能性がある。
【０１７０】
さらに別の実施形態では、光線力学療法（ＰＤＴ、光線照射療法、光線療法、または光化学療法とも呼ばれる）は、いくつかのタイプの癌の治療に使用される。それは、単細胞生物が特定の種類の光にさらされる場合、光感作薬として知られる特定の化学物質がこの生物を死滅させることができるという発見に基づいている。ＰＤＴは、固定周波数のレーザー光を光感作薬と組み合わせて使用することにより、癌細胞を破壊する。ＰＤＴでは、光感作薬が血流に注入され、全身の細胞に吸収される。この薬剤は、正常細胞よりも長い時間癌細胞にとどまる。治療された癌細胞がレーザー光にさらされると、光感作薬は光を吸収し、処理された癌細胞を破壊する活性酸素を生成する。ほとんどの光感作薬が健康な細胞を離れたが、癌細胞にまだ存在しているときに起こるように、光の照射は慎重に時間を計る必要がある。ＰＤＴで使用されるレーザー光は、光ファイバー（非常に細いガラスストランド）を介して導くことができる。光ファイバーは、適切な量の光を送達するために癌の近くに配置される。光ファイバーは、肺癌の治療のために気管支鏡を介して肺に向けられ、食道癌の治療のために内視鏡を介して食道に向けられる。ＰＤＴの利点は、健康な組織への損傷を最小限に抑えることである。しかし、現在使用中のレーザー光は約３センチメートル以上の組織（１と１／８インチを少し超える）を通過できないため、ＰＤＴは主に、皮膚またはそのすぐ下または臓器の上皮の腫瘍の治療に使用される。光線力学療法は、治療後６週間以上、皮膚と目が光に敏感になる。患者は、直射日光と明るい屋内照明を少なくとも６週間避けることが勧められる。患者が屋外に出なければならない場合、サングラスを含む保護服を着用する必要がある。ＰＤＴの他の一時的な副作用は、特定の領域の治療に関連しており、咳、嚥下障害、腹痛、痛みを伴う呼吸または息切れが含まれ得る。１９９５年１２月、米国食品医薬品局（ＦＤＡ）は、閉塞を引き起こしている食道癌の症状を軽減し、レーザーだけでは十分に治療できない食道癌の症状を軽減するために、ポルフィマーナトリウムまたはＰｈｏｔｏｆｒｉｎ（登録商標）と呼ばれる光感作薬を承認した。１９９８年１月、ＦＤＡは、肺癌の通常の治療が適切ではない患者の早期非小細胞肺癌の治療のためにポルフィマーナトリウムを承認した。国立癌研究所およびその他の機関は、膀胱、脳、喉頭、口腔の癌を含むいくつかの種類の癌に対する光線力学療法の使用を評価するための臨床試験（調査研究）を支援している。
【０１７１】
さらに別の実施形態では、高強度の光を利用して癌細胞を破壊するためにレーザー療法が使用される。この技術は、特に他の治療では癌を治癒できない場合に、出血や閉塞などの癌の症状を軽減するためによく使用される。また、腫瘍を縮小または破壊することにより、癌を治療するために使用され得る。「レーザー」という用語は、誘導放出による光増幅を表す。電球などの通常の光は、多くの波長を持ち、あらゆる方向に広がる。一方、レーザー光は特定の波長を持ち、狭いビームに集束される。このタイプの高輝度ライトには、多くのエネルギーが含まれている。レーザーは非常に強力で、スチールを切断したり、ダイヤモンドを成形したりするために使用できる。レーザーは、眼の損傷した網膜の修復や組織の切断（メスの代わりに）など、非常に正確な外科手術にも使用できる。レーザーにはいくつかの異なる種類があるが、医学で広く使用されているのは３種類のみである。二酸化炭素（ＣＯ２）レーザー−このタイプのレーザーは、より深い層に浸透することなく、皮膚の表面から薄い層を除去できる。この技術は、皮膚や特定の前癌状態に深く広がっていない腫瘍の治療に特に有用である。従来のメス手術の代替として、ＣＯ２レーザーは皮膚を切断することもできる。このように皮膚癌を除去するのに、レーザーが使用される。ネオジム：イットリウム−アルミニウム−ガーネット（Ｎｄ：ＹＡＧ）レーザー−このレーザーからの光は、他のタイプのレーザーからの光よりも組織に深く浸透し、血液が急速に凝固する可能性がある。光ファイバーを介して身体のアクセスしにくい部分に運ぶことができる。このタイプのレーザーは、喉の癌の治療に時々使用される。アルゴンレーザー−このレーザーは組織の表層のみを通過できるため、皮膚科や眼科手術に役立つ。また、光線力学療法（ＰＤＴ）として知られる手順で腫瘍を治療するために、感光性色素とともに使用される。レーザーには、次のような標準的な外科用ツールに勝るいくつかの利点がある：レーザーはメスよりも正確である。周囲の皮膚または他の組織との接触がほとんどないため、切開の近くの組織は保護される。レーザーが発生する熱は手術部位を滅菌し、感染のリスクを減少させる。レーザーの精度が小さい切開を可能にするため、より短い手術時間が必要になり得る。レーザーは血管を熱で密封するので、出血、腫れ、または瘢痕が少ないため、治癒時間は、多くの場合、短縮される。レーザー手術はそれほど複雑ではない。例えば、光ファイバーを使用すると、大きく切開することなくレーザー光を体の一部に向けることができる。より多くの手順が外来患者ベースで行われる場合がある。レーザーは、癌を治療するために２つの方法で使用できる。熱で腫瘍を縮小または破壊することによる方法、または癌細胞を破壊する化学物質（光感作薬として知られる）を活性化することによる方法である。ＰＤＴでは、光感作薬は癌細胞に保持され、光によって刺激されて癌細胞を死滅させる反応を引き起こすことができる。ＣＯ２およびＮｄ：ＹＡＧレーザーは、腫瘍を縮小または破壊するために使用される。それらは内視鏡、医師が膀胱などの体の特定の領域を見ることができる管と一緒に使用できる。一部のレーザーからの光は、光ファイバーを備えた柔軟な内視鏡を介して伝達できる。これにより、医師は手術以外の方法では到達できなかった身体の部分を見て作業することができるため、レーザービームの非常に正確な照準が可能になる。レーザーは低倍率の顕微鏡でも使用でき、医者は治療中の部位をはっきりと見ることができる。レーザーシステムは、他の機器と併用すると、直径２００ミクロンの非常に細い糸の幅よりも小さい切断領域を生成できる。レーザーは、多くの種類の癌の治療に使用される。レーザー手術は、声門（声帯）、子宮頸部、皮膚、肺、膣、外陰部、陰茎癌の特定の段階の標準治療である。癌を破壊するために使用することに加えて、レーザー手術は、癌によって引き起こされる症状を軽減するためにも使用される（緩和ケア）。例えば、レーザーを使用して、患者の気管（気管）を塞いでいる腫瘍を縮小または破壊し、呼吸しやすくすることができる。また、大腸癌および肛門癌の緩和に使用されることもある。レーザー誘起間質温熱療法（Ｌａｓｅｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌ  ｔｈｅｒｍｏｔｈｅｒａｐｙ）（ＬＩＴＴ）は、レーザー療法の最新の開発の１つである。ＬＩＴＴは、温熱療法と呼ばれる癌治療と同じ考え方を使用しており、その熱は、細胞に損傷を与えたり、生きるために必要な物質を奪ったりすることにより、腫瘍を縮小するのに役立つ。この治療では、レーザーは体内の間質性領域（臓器間の領域）に向けられる。その後、レーザー光は腫瘍の温度を上昇させ、癌細胞を損傷または破壊する。
【０１７２】
本明細書に記載の調節薬を用いた治療の期間および／または用量は、特定のモジュレーターまたはその組み合わせに応じて変化し得る。特定の癌治療薬の適切な治療時間は、当業者には理解されるであろう。本発明は、各癌治療薬の最適な治療スケジュールの継続的な評価を企図し、本発明の方法により決定される対象の癌の表現型が最適な治療用量およびスケジュールを決定する際の要因である。
【０１７３】
ＶＩ．臨床効果
臨床的有効性は、当該分野で既知の任意の方法によって測定され得る。例えば、癌療法（例えば、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤）に対する応答は、療法に対する癌、例えば腫瘍、の任意の応答、好ましくはネオアジュバントまたはアジュバント化学療法の開始後の腫瘍の質量および／または体積の変化に関係している。腫瘍応答は、ネオアジュバントまたはアジュバント状況で評価することができ、全身治療介入後の腫瘍のサイズをＣＴ、ＰＥＴ、マンモグラム、超音波または触診によって測定される初期サイズおよび寸法と比較することができ、腫瘍の細胞充実性は組織学的に推定でき、治療開始前に採取した腫瘍生検の細胞充実性と比較することができる。生検または外科的切除後の腫瘍のキャリパー測定または病理学的検査によって、応答を評価することもできる。腫瘍体積や細胞充実性の変化率などの定量的な方法で、または半定量的スコアリングシステム、例えば残存癌負荷量（Ｓｙｍｍａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００７）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２５：４４１４−４４２２）を使用して、または「病理学的完全奏効」（ｐＣＲ）、「臨床的完全寛解」（ｃＣＲ）、「臨床的部分寛解」（ｃＰＲ）、「臨床的安定疾患」（ｃＳＤ）、「臨床進行性疾患」（ｃＰＤ）もしくはその他の定性的基準などの定性的な方法におけるミラーペイネスコア（Ｍｉｌｌｅｒ−Ｐａｙｎｅ  ｓｃｏｒｅ）（Ｏｇｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｒｅａｓｔ（Ｅｄｉｎｂｕｒｇｈ，Ｓｃｏｔｌａｎｄ）１２：３２０−３２７）を使用して、応答を記録することができる。腫瘍応答の評価は、ネオアジュバント療法またはアジュバント療法の開始後早期に、例えば、数時間後、数日後、数週間後、または好ましくは数ヶ月後に実施され得る。応答評価の典型的なエンドポイントは、ネオアジュバント化学療法の終了時、または残存腫瘍細胞および／または腫瘍床の外科的除去時である。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載の治療的処置の臨床的有効性は、臨床的有益率（ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｂｅｎｅｆｉｔ  ｒａｔｅ）（ＣＢＲ）を測定することにより決定され得る。臨床的有益率は、治療の終了から少なくとも６ヵ月後の時点で、完全寛解状態にある患者（ＣＲ）、部分寛解状態にある患者数（ＰＲ）、および安定疾患にある患者数（ＳＤ）の割合の合計を決定することにより測定される。この式の記号は、６か月間のＣＢＲ＝ＣＲ＋ＰＲ＋ＳＤである。いくつかの実施形態では、表１、２、および／または３の治療レジメンに列挙されたバイオマーカーの特定のモジュレーターのＣＢＲは、少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、またはそれ以上である。
【０１７５】
癌治療（例えば、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤）に対する応答を評価するための追加の基準は、「生存」に関連し、これには以下のすべてが含まれる：全生存としても知られる、死亡までの生存（原因に関係ないかまたは腫瘍に関連するかのいずれかであってよい）、「無再発生存」（再発という用語には、局在再発と遠隔再発の両方が含まれる）、転移のない生存、無疾患生存（疾患という用語には、癌およびそれに関連する疾患が含まれる）。前記生存の長さは、定義された開始点（例えば、診断の時間または治療の開始）および終了点（例えば、死、再発または転移）を参照することにより計算され得る。さらに、治療の有効性の基準は、化学療法への応答、生存の可能性、所定の期間内の転移の可能性、および腫瘍の再発の可能性を含むように拡大することができる。
【０１７６】
例えば、適切な閾値を決定するために、本発明に包含される特定の薬剤を対象の集団に投与することができ、結果は、癌治療（例えば、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤）の投与前に決定されたバイオマーカー測定値と相関させることができる。結果計測は、ネオアジュバント設定行われた療法に対する病理学的奏効であり得る。あるいは、全生存期間や無疾患生存期間などの結果尺度は、バイオマーカーの測定値がわかっている癌治療（例えば、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤）後の対象について、一定期間監視することができる。特定の実施形態では、同じ用量の薬剤が各対象に投与される。関連する実施形態では、投与される用量は、薬剤について当該技術分野で既知の標準用量である。対象を監視する期間は様々である。例えば、少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または６０か月間、対象を監視できる。癌治療（例えば、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤）の結果に相関するバイオマーカー測定閾値は、実施例セクションに記載されているような方法を使用して決定することができる。
【０１７７】
ＶＩＩ．医薬組成物
別の態様において、本発明は、１つ以上の薬学的に許容される担体（添加剤）および／または希釈剤および／または追加の有効成分とともに製剤化される、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される少なくとも１つの薬剤の治療有効量、を含む薬学的に許容される組成物を提供する。以下に詳細に説明するように、本発明の薬学的組成物は、以下に適合したものを含む固体または液体形態で投与するために特別に製剤化することができる：（１）経口投与、例えば、水薬（水性または非水性の溶液または懸濁液）、錠剤、ボーラス、粉末、顆粒、ペースト、（２）非経口投与、例えば、無菌溶液または懸濁液などの皮下、筋肉内または静脈内注射による、（３）局所塗布、例えば、皮膚に塗布するクリーム、軟膏またはスプレー、（４）膣内または直腸内、例えばペッサリー、クリームまたはフォームとして、または（５）エアゾール、例えば、水性エアゾール、リポソーム製剤、または化合物を含む固体粒子として。
【０１７８】
本明細書で使用される「治療有効量」という語句は、１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される薬剤の量、または１）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片をコードする核酸、および２）ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドまたはその生物学的に活性な断片からなる群から選択される薬剤を含む組成物の量であって、ある程度望ましい治療効果、例えば、合理的な利益／リスク比で、癌中の生存細胞または増殖細胞の数を減少させる、および／または癌細胞を含む腫瘍の体積またはサイズを減少させる、効果を生み出すのに有効である、薬剤または組成物の量を意味する。
【０１７９】
「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、合理的な利益／リスク比に見合った、過度に毒性、刺激、アレルギー反応、またはその他の問題や合併症のない、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのに適する、これらの薬剤、材料、組成物、および／または剤形を指すために本明細書で使用される。
【０１８０】
本明細書で使用される「薬学的に許容される担体」という語句は、１つの臓器、もしくは身体の一部、から別の臓器、もしくは身体の一部への本発明の化学物質の運搬または輸送に関与する、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒またはカプセル化材料などの薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクルを意味する、各担体は、製剤の他の成分と適合性があり、対象に有害でないという意味で「許容される」ものでなければならない。薬学的に許容される担体として機能できる材料のいくつかの例には：（１）糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース、（２）デンプン類、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン、（３）セルロース、およびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース、（４）トラガカント末、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）賦形剤、例えばカカオバターおよび坐剤ワックス、（９）油類、例えば落花生油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油、および大豆油、（１０）グリコール類、例えばプロピレングリコール、（１１）ポリオール類、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール、（１２）エステル類、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル、（１３）寒天、（１４）緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム（１５）アルギン酸、（１６）発熱物質を含まない水、（１７）等張食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）リン酸緩衝液、および（２１）薬学的製剤に使用される他の非毒性適合物質、が含まれる。
【０１８１】
「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明に包含される薬剤の比較的非毒性の無機および有機酸付加塩を指す。これらの塩は、治療薬の最終的な単離および精製中にインサイチュで、またはその遊離塩基形態の精製治療薬を適切な有機酸または無機酸と別々に反応させ、形成された塩を単離することにより調製できる。代表的な塩には、臭化水素酸塩、塩酸塩、硫酸塩、硫酸水素塩、リン酸塩、硝酸塩、酢酸塩、吉草酸塩、オレイン酸塩、パルミチン酸塩、ステアリン酸塩、ラウリン酸塩、安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシル酸塩、クエン酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩、ナフチル酸塩、メシル酸塩、グルコヘプトン酸塩、ラクトビオン酸塩、およびラウリルスルホン酸塩などが含まれる（例えば、Ｂｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１−１９を参照されたい）。
【０１８２】
他の事例では、本発明の方法に有用な薬剤は、１つ以上の酸性官能基を含んでもよく、したがって、薬学的に許容される塩基と薬学的に許容される塩を形成することができる。これらの場合の「薬学的に許容される塩」という用語は、本発明に包含される薬剤の比較的非毒性の無機および有機塩基付加塩を指す。同様に、これらの塩は、治療薬の最終単離および精製中にインサイチュで、またはその遊離酸形態の精製治療薬を、薬学的に許容される金属カチオンの水酸化物、炭酸塩もしくは重炭酸塩などの適切な塩基と、アンモニアと、または薬学的に許容される有機一級、二級、もしくは三級アミンと、別々に反応させることにより調製できる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類塩には、リチウム、ナトリウム、カリウム、カルシウム、マグネシウム、およびアルミニウム塩などが含まれる。塩基付加塩の形成に有用な代表的な有機アミンには、エチルアミン、ジエチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジンなどが含まれる（例えば、上記のＢｅｒｇｅ  ｅｔ  ａｌ．を参照）。
【０１８３】
湿潤剤、乳化剤および滑沢剤、例えばラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウム、ならびに着色剤、放出剤（ｒｅｌｅａｓｅ  ａｇｅｎｔ）、コーティング剤、甘味料、香味料および芳香剤、保存剤および抗酸化剤もまた、組成物中に存在し得る。
【０１８４】
薬学的に許容される抗酸化剤の例には：（１）水溶性抗酸化剤、例えばアスコルビン酸、塩酸システイン、硫酸水素ナトリウム、メタ亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウムなど、（２）油溶性抗酸化剤、例えばパルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、レシチン、没食子酸プロピル、α−トコフェロールなど、および（３）金属キレート剤、例えばクエン酸、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ソルビトール、酒石酸、リン酸など、が含まれる。
【０１８５】
本発明の方法において有用な製剤には、経口、経鼻、局所（頬側および舌下を含む）、直腸、膣、エアロゾルおよび／または非経口投与に適した製剤が含まれる。製剤は、単位投与形態で都合良く提供されてもよく、薬学の分野で周知の任意の方法によって調製されてもよい。単回投与形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、治療される宿主、特定の投与様式に応じて変化する。単回投与形態を生成するために担体材料と組み合わせることができる有効成分の量は、一般に、治療効果を生成する化合物の量になる。一般に、１００パーセントのうち、この量は、有効成分の約１パーセント〜約９９パーセント、好ましくは約５パーセント〜約７０パーセント、最も好ましくは約１０パーセント〜約３０パーセントの範囲である。
【０１８６】
これらの製剤または組成物を調製する方法は、本発明に包含される薬剤を、担体および任意で１つまたは複数の副成分と会合させるステップを含む。一般に、製剤は、治療薬を液体担体、または微粉化した固体担体、またはその両方と均一かつ密接に会合させ、次いで必要に応じて製品を成形することにより調製される。
【０１８７】
経口投与に適した製剤は、カプセル剤、カシェ剤、丸剤、錠剤、ロゼンジ（フレーバーベースを使用、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントを使用）、粉末、顆粒の形態で、または水性または非水性液体の溶液または懸濁液として、または水中油型または油中水型液体エマルジョンとして、またはエリキシル剤またはシロップ剤として、またはトローチ剤（ゼラチンおよびグリセリン、またはスクロースおよびアカシアなどの不活性基剤を使用）としておよび／または口腔洗浄剤などとして、それぞれが有効成分として所定量の治療薬を含んで、あってよい。化合物は、ボーラス、舐剤またはペーストとして投与することもできる。
【０１８８】
経口投与用の固体投与形態（カプセル、錠剤、丸薬、糖衣錠、粉末、顆粒など）では、有効成分は、１つ以上の薬学的に許容される担体、例えばクエン酸ナトリウムまたはリン酸二カルシウム、および／または以下のいずれか、（１）充填剤または増量剤、例えばデンプン、ラクトース、スクロース、グルコース、マンニトール、および／またはケイ酸、（２）結合剤、例えば、例としてカルボキシメチルセルロース、アルギン酸塩、ゼラチン、ポリビニルピロリドン、スクロースおよび／またはアカシア、（３）保湿剤、例えばグリセロール、（４）崩壊剤、例えば寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモまたはタピオカデンプン、アルギン酸、特定のケイ酸塩、および炭酸ナトリウム、（５）溶解妨害剤（ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｒｅｔａｒｄｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）、例えばパラフィン、（６）吸収促進剤、例えば四級アンモニウム化合物、（７）湿潤剤、例えば、例としてセチルアルコールおよびモノステアリン酸グリセロール、（８）吸着剤、例えばカオリンおよびベントナイト粘土、（９）滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固体ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム、およびそれらの混合物、および（１０）着色剤、と混合する。カプセル、錠剤および丸薬の場合、薬学的組成物は緩衝剤も含み得る。同様のタイプの固体組成物はまた、ラクトースまたは乳糖、ならびに高分子量ポリエチレングリコールなどのような賦形剤を使用して、軟および硬充填ゼラチンカプセルの充填剤として使用されてもよい。
【０１８９】
錠剤は、任意に１つ以上の副成分とともに、圧縮または成形することにより作成できる。圧縮錠剤は、結合剤（例えば、ゼラチンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース）、滑沢剤、不活性希釈剤、保存剤、崩壊剤（例えば、デンプングリコール酸ナトリウムまたは架橋カルボキシメチルセルロースナトリウム）、表面活性剤または分散剤を使用して調製できる。成形錠剤は、不活性液体希釈剤で湿らせた粉末ペプチドまたはペプチド模倣薬の混合物を適切な機械で成形することにより作製することができる。
【０１９０】
錠剤、および糖衣錠、カプセル、丸薬および顆粒などの他の固体投与形態は、任意に刻み目を付けるかまたは腸溶性コーティングおよび薬学的製剤技術分野で周知の他のコーティングなどのコーティングおよびシェルで調製することができる。それらはまた、例えば、所望の放出プロファイルを提供するために様々な割合でヒドロキシプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、リポソームおよび／またはミクロスフェアを使用して、その中の有効成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化され得る。それらは、例えば、細菌保持フィルターによるろ過により、または使用直前に滅菌水、または他の滅菌注射媒体に溶解できる滅菌固体組成物の形態の滅菌剤を組み込むことにより滅菌することができる。これらの組成物はまた、任意に不透明剤（ｏｐａｃｉｆｙｉｎｇ  ａｇｅｎｔ）を含有していてもよく、任意選択的に遅延様式で、胃腸管の特定の部分でのみ、または優先的に、有効成分（複数可）を放出する組成物であってもよい。使用できる包埋組成物の例には、ポリマー物質およびワックスが含まれる。有効成分は、適切な場合、上記の賦形剤の１つ以上を含むマイクロカプセル化形態であってもよい。
【０１９１】
経口投与用の液体投与形態には、薬学的に許容されるエマルジョン、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤が含まれる。有効成分に加えて、液体投与形態は、例えば水もしくは他の溶媒、可溶化剤および乳化剤、例えばエチルアルコール、イソプロピルアルコール、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコール、安息香酸ベンジル、プロピレングリコール、１，３−ブチレングリコール、油（特に綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリーブ油、ヒマシ油、ゴマ油）、グリセロール、テトラヒドロフリルアルコール、ポリエチレングリコールおよびソルビタンの脂肪酸エステル、およびそれらの混合物など、当技術分野で一般的に使用される不活性希釈剤を含有していてもよい。
【０１９２】
不活性希釈剤に加えて、経口組成物は、湿潤剤、乳化剤および懸濁化剤、甘味料、香味料、着色料、芳香剤および保存剤などのアジュバントも含むことができる。
【０１９３】
懸濁液は、活性薬剤に加えて、例えば、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビトールおよびソルビタンエステル、微結晶性セルロース、メタ水酸化アルミニウム、ベントナイト、寒天およびトラガカント、およびそれらの混合物などの懸濁化剤を含んでもよい。
【０１９４】
直腸または膣投与用の製剤は、１つ以上の治療薬を、例えばココアバター、ポリエチレングリコール、坐薬ワックスまたはサリチル酸塩、を含む１つ以上の適切な非刺激性賦形剤または担体と混合することにより調製できる坐剤として提供することができ、およびこれらは室温では固体であるが、体温では液体であるため、直腸または膣腔で融解して活性薬剤を放出する。
【０１９５】
膣内投与に適した製剤には、適切であることが当技術分野で知られているような担体を含有するペッサリー、タンポン、クリーム、ゲル、ペースト、フォームまたはスプレー製剤も含まれる。
【０１９６】
本発明に包含される薬剤の局所または経皮投与のための投与形態には、粉末、スプレー、軟膏、ペースト、クリーム、ローション、ゲル、溶液、パッチおよび吸入剤が含まれる。活性成分は、無菌条件下で、薬学的に許容される担体、および必要とされる可能性のある保存剤、緩衝液、または噴射剤と混合することができる。
【０１９７】
軟膏、ペースト、クリーム、およびゲルには、治療薬に加えて、動物性および植物性脂肪、油、ワックス、パラフィン、デンプン、トラガカント、セルロース誘導体、ポリエチレングリコール、シリコーン、ベントナイト、ケイ酸、タルクおよび酸化亜鉛、またはそれらの混合物などの賦形剤を含有してよい。
【０１９８】
粉末およびスプレーは、本発明に包含される薬剤に加えて、ラクトース、タルク、ケイ酸、水酸化アルミニウム、ケイ酸カルシウムおよびポリアミド粉末、またはこれらの物質の混合物などの賦形剤を含有することができる。スプレーは、クロロフルオロ炭化水素などの通常の噴射剤、およびブタンやプロパンなどの揮発性非置換炭化水素を追加で含有することができる。
【０１９９】
本発明に包含される薬剤は、代わりにエアロゾルによって投与することができる。これは、化合物を含有する水性エアロゾル、リポソーム製剤または固体粒子を調製することにより達成される。非水性（例えば、フルオロカーボン噴射剤）懸濁液を使用できる。音波ネブライザーは、化合物の分解を引き起こす可能性がある薬剤のせん断への暴露を最小限に抑えるため、好ましい。
【０２００】
通常、水性エアロゾルは、薬剤の水溶液または懸濁液を従来の薬学的に許容される担体および安定剤と一緒に製剤化することにより作成される。担体と安定剤は特定の化合物の要件によって異なるが、通常、非イオン性界面活性剤（Ｔｗｅｅｎ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、またはポリエチレングリコール）、血清アルブミンなどの無害なタンパク質、ソルビタンエステル、オレイン酸、レシチン、およびグリシンなどのアミノ酸、緩衝液、塩、糖または糖アルコールが含まれる。エアロゾルは一般に等張液から調製される。
【０２０１】
経皮パッチは、身体への治療薬の制御された送達を提供するという追加の利点を有する。そのような投与形態は、適切な媒体に薬剤を溶解または分散させることにより作成できる。吸収促進剤を使用して、皮膚を通るペプチド模倣薬の流れを増加させることもできる。そのような流れの速度は、速度制御膜を提供するか、またはペプチド模倣薬をポリマーマトリックスまたはゲルに分散させることにより制御することができる。
【０２０２】
眼科製剤、眼軟膏、粉末、溶液なども、本発明の範囲内にあると考えられる。
【０２０３】
非経口投与に適した本発明の薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容される滅菌等張水性もしくは非水性溶液、分散液、懸濁液もしくはエマルジョン、または使用直前に滅菌注射液もしくは分散液に再構成できる滅菌粉末と組み合わせた１つ以上の治療薬を含み、これらは抗酸化剤、緩衝液、静菌剤、製剤を対象レシピエントの血液と等張にする溶質、または懸濁化剤または増粘剤を含有していてもよい。
【０２０４】
本発明の薬学的組成物に使用できる適切な水性および非水性担体の例には、水、エタノール、ポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコールなど）、およびそれらの適切な混合物、オリーブ油などの植物油、ならびにオレイン酸エチルなどの注射可能な有機エステルなどが含まれる。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティング材料の使用、分散液の場合は必要な粒子サイズの維持、および界面活性剤の使用により維持できる。
【０２０５】
これらの組成物は、保存剤、湿潤剤、乳化剤、および分散剤などのアジュバントを含んでもよい。微生物の活動の防止は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノールソルビン酸などの様々な抗菌剤および抗真菌剤を含めることによって確実にできる。糖類、塩化ナトリウムなどの等張剤を組成物に含めることも望ましくあり得る。さらに、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンなどの吸収を遅延させる薬剤を含めることにより、注射可能な薬剤形態の長期吸収がもたらされ得る。
【０２０６】
場合によっては、薬物の効果を長引かせるために、皮下注射または筋肉内注射からの薬物の吸収を遅らせることが望ましい。これは、難水溶性である結晶性または非晶質の液体懸濁液を使用することにより実現できる。その場合、薬物の吸収速度は溶解速度に依存し、次いで溶解速度は結晶サイズと結晶形に依存する可能性がある。あるいは、非経口投与された薬物形態の遅延吸収は、薬物を油性ビヒクルに溶解または懸濁することにより達成される。
【０２０７】
注射可能なデポーの形態は、ポリラクチド−ポリグリコリドなどの生分解性ポリマーに、本発明に包含される薬剤のマイクロカプセル化マトリックスを形成することにより作成される。薬物とポリマーの比率、および使用する特定のポリマーの性質に応じて、薬物放出の速度を制御できる。他の生分解性ポリマーの例には、ポリ（オルトエステル）およびポリ（無水物）が含まれる。デポー注射製剤は、体組織に適合するリポソームまたはマイクロエマルジョンに薬物を包括させることによっても調製される。
【０２０８】
本発明の治療薬を医薬としてヒトおよび動物に投与する場合、それらはそれ自体で、または例えば０．１〜９９．５％（より好ましくは０．５〜９０％）の有効成分を薬学的に許容される担体と組み合わせて含有する薬学的組成物として投与することができる。
【０２０９】
本発明の薬学的組成物中の有効成分の実際の投与レベルは、特定の対象、組成物および投与様式で、対象に対して毒性なく、所望の治療応答を達成するのに有効な量の有効成分を得るために、本発明の方法により決定され得る。
【０２１０】
本発明の核酸分子をベクターに挿入し、遺伝子治療ベクターとして使用することができる。遺伝子治療ベクターは、例えば、静脈内注射、局所投与（米国特許第５，３２８，４７０号を参照）または定位的注射（例えば、Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ  Ｕ．Ｓ．Ａ．９１：３０５４  ３０５７を参照）によって対象に送達することができる。遺伝子治療ベクターの薬学的製剤は、許容可能な希釈剤中に遺伝子治療ベクターを含めることができ、または遺伝子送達ビヒクルが埋め込まれた徐放性マトリックスを含むことができる。あるいは、組換え細胞から完全な遺伝子送達ベクター、例えばレトロウイルスベクターを無傷で産生できる場合、薬学的製剤は、遺伝子送達システムを産生する１つ以上の細胞を含むことができる。
【０２１１】
ＶＩＩＩ．薬剤の投与
「投与する」という用語は、薬剤がその意図された機能を実行できるようにする投与経路を含むことを意図している。使用できる投与経路の例には、注射（皮下、静脈内、非経口、腹腔内、くも膜下腔内）、経口、吸入、および経皮が含まれる。注射は、ボーラス注射でも連続注入でもよい。投与経路に応じて、選択された材料で薬剤をコーティングまたは配置して、意図した機能を実行する能力に悪影響を及ぼす可能性がある自然条件から保護することができる。薬剤は、単独で、または薬学的に許容される担体と組み合わせて投与されてもよい。薬剤はプロドラッグとして投与することもでき、これは生体内でその活性型に変換される。薬剤はまた、１つ以上の追加の治療薬と組み合わせて（例えば、それの前、後、または同時に）投与されてもよい。
【０２１２】
個々の投与量は、主治医の判断における対象の要件、治療される状態の重症度、および使用される特定の化合物に応じて変化し得ることが理解されよう。治療上有効な量または用量を決定する際に、特定の治療薬の薬力学的特性およびその投与方法と投与経路、治療の望ましい時間経過、哺乳動物の種、その大きさ、年齢、および全体的な健康、関係する特定の病気、疾患の程度または関与または重症度、個々の対象の応答、投与される特定の化合物、投与方法、投与された製剤の生物学的利用能特性、選択された用法、並行治療の種類およびその他の関連する状況、を含むがこれらに限定されない、多くの追加要因が担当医によって考慮されてもよい。
【０２１３】
治療は、化合物の有効用量よりも少ない投与量で開始することができる。その後、一実施形態では、状況下で最適な効果に達するまで、投与量を少しずつ増加させる必要がある。便宜上、１日の総投与量を分割し、必要に応じて１日の間に分割して一部ずつ投与することができる。
【０２１４】
一般に、治療を開始する前に対象から最初の試料を取得し、治療中に１つ以上の試料を取得することが好ましい。そのような使用において、治療前に障害のある対象からの細胞の発現のベースラインが決定され、次いで、障害のある対象からの細胞の発現のベースライン状態の変化が治療過程中に監視される。あるいは、治療中に得られた２つ以上の連続試料を、治療前のベースライン試料を必要とせずに使用できる。そのような使用では、対象から得られた最初の試料が、障害のある対象からの細胞の発現が増加しているか減少しているかを決定するためのベースラインとして使用される。
【０２１５】
ポリヌクレオチドを哺乳動物、ヒトまたは非ヒト、またはその細胞に導入するための任意の手段は、本発明の様々な構築物を意図するレシピエントに送達するための本発明の実施に適合させることができる。本発明の一実施形態では、ＤＮＡ構築物は、トランスフェクションにより、すなわち「裸の」ＤＮＡの送達により、またはコロイド分散系との複合体で、細胞に送達される。コロイド系には、高分子複合体、ナノカプセル、ミクロスフェア、ビーズ、および水中油型エマルジョン、ミセル、混合ミセル、リポソームなどの脂質ベースの系が含まれる。本発明の好ましいコロイド系は、脂質複合化またはリポソーム製剤化されたＤＮＡである。前者のアプローチでは、脂質などのＤＮＡの製剤化の前に、目的のＤＮＡ構造を持つトランスジーンを含むプラスミドを最初に発現のため実験的に最適化することができる（例えば、５’非翻訳領域へのイントロンの包含と不必要な配列の除去（Ｆｅｌｇｎｅｒ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９５）Ａｎｎ  ＮＹ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  １２６−１３９））。次に、例えば様々な脂質またはリポソーム材料を用いたＤＮＡの製剤化が、既知の方法および材料を使用して達成され、レシピエント哺乳動物に送達され得る。例えば、Ｃａｎｏｎｉｃｏ  ｅｔ  ａｌ（１９９４）Ａｍ  Ｊ  Ｒｅｓｐｉｒ  Ｃｅｌｌ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ１０：２４−２９、Ｔｓａｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ２６８：Ｌ１０５２−１０５６、Ａｌｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔ  Ｇｅｎｅｔ．５：１３５−１４２、および米国特許第５，６７９，６４７号を参照されたい。
【０２１６】
リポソームのターゲティングは、解剖学的および機械的要因に基づいて分類できる。解剖学的分類は、選択性のレベル、例えば臓器特異性、細胞特異性、オルガネラ特異性に基づいている。機械的ターゲティングは、受動的か能動的かに基づいて区別できる。受動的ターゲティングでは、リポソームの自然な傾向を利用して、洞様毛細血管を含む器官の細網内皮系（ＲＥＳ）の細胞に分布する。一方、能動的ターゲティングには、リポソームをモノクローナル抗体、糖、糖脂質、タンパク質などの特定のリガンドに結合させることによるリポソームの変更、または自然発生する局在部位以外の臓器および細胞型へのターゲティングを達成するためにリポソームの組成またはサイズを変更することによるリポソームの変更、が含まれる。
【０２１７】
標的送達システムの表面は、様々な方法で修飾されてもよい。リポソーム標的送達システムの場合、脂質二重層と安定に会合するターゲティングリガンドを維持するために、脂質基をリポソームの脂質二重層に組み込むことができる。脂質鎖をターゲティングリガンドに結合するために、様々な連結基を使用できる。裸のＤＮＡまたは送達媒体、例えばリポソームに関連するＤＮＡを、対象のいくつかの部位に投与することができる（以下を参照されたい）。
【０２１８】
核酸は、任意のベクターで送達できる。これらには、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、プラスミドベクターなどの、ウイルスまたは非ウイルスベクターが含まれる。例示的な種類のウイルスには、ＨＳＶ（単純ヘルペスウイルス）、ＡＡＶ（アデノ随伴ウイルス）、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス）、ＢＩＶ（ウシ免疫不全ウイルス）、およびＭＬＶ（マウス白血病ウイルス）が含まれる。核酸は、ウイルス粒子、リポソーム、ナノ粒子、ポリマー複合体など、十分に効率的な送達レベルを提供する任意の望ましい形式で投与できる。
【０２１９】
関心のあるタンパク質または核酸をコードする核酸は、プラスミドまたはウイルスベクター、または当技術分野で知られている他のベクター内にあり得る。そのようなベクターは周知であり、特定の用途に合わせて任意のものを選択できる。本発明の一実施形態では、遺伝子送達ビヒクルは、プロモーターおよびデメチラーゼコード配列を含む。好ましいプロモーターは、組織特異的プロモーターおよび細胞増殖により活性化されるプロモーター、例えばチミジンキナーゼおよびチミジル酸シンターゼプロモーターである。他の好ましいプロモーターには、α−およびβ−インターフェロンプロモーターなどのウイルス感染により活性化可能なプロモーター、およびエストロゲンなどのホルモンにより活性化可能なプロモーターが含まれる。使用できる他のプロモーターには、モロニーウイルスＬＴＲ、ＣＭＶプロモーター、およびマウスアルブミンプロモーターが含まれる。プロモーターは構成的または誘導的であり得る。
【０２２０】
別の実施形態では、国際公開第９０／１１０９２号および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されているように、裸のポリヌクレオチド分子が遺伝子送達ビヒクルとして使用される。そのような遺伝子送達ビヒクルは、成長因子ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかであり得、特定の実施形態では、死滅したアデノウイルスに連結される（Ｃｕｒｉｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９２）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ．Ｔｈｅｒ．３：１４７−１５４）。任意に使用できる他のビヒクルには、ＤＮＡ−リガンド（Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１６９８５−１６９８７）、脂質−ＤＮＡの組み合わせ（Ｆｅｌｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８４：７４１３−７４１７）、リポソーム（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８７）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８４：７８５１−７８５５）およびマイクロプロジェクタイル（Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．８８：２７２６−２７３０）が含まれる。
【０２２１】
遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス複製起点またはパッケージングシグナルなどのウイルス配列を任意選択的に含むことができる。これらのウイルス配列は、アストロウイルス、コロナウイルス、オルソミクソウイルス、パポバウイルス、パラミクソウイルス、パルボウイルス、ピコルナウイルス、ポックスウイルス、レトロウイルス、トガウイルスまたはアデノウイルスなどのウイルスから選択することができる。好ましい実施形態では、成長因子遺伝子送達ビヒクルは組換えレトロウイルスベクターである。組換えレトロウイルスおよびその様々な使用は、例えば、Ｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ  ３３：１５３、Ｃａｎｅ  ａｎｄ  Ｍｕｌｌｉｇａｎ（１９８４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８１：６３４９、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １：５−１４、米国特許第４，４０５，７１２号、第４，８６１，７１９号、および第４，９８０，２８９号、ならびにＰＣＴ出願ＷＯ８９／０２，４６８号、ＷＯ８９／０５，３４９号、およびＷＯ９０／０２，８０６号を含む多くの参考文献に記載されている。本発明では、例えばＥＰ０，４１５，７３１、ＷＯ９０／０７９３６、ＷＯ９４／０３６２２、ＷＯ９３／２５６９８、ＷＯ９３／２５２３４、米国特許第５，２１９，７４０号、ＷＯ９３１１２３０、ＷＯ９３１０２１８、Ｖｉｌｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｔ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：３８６０−３８６４、Ｖｉｌｅ  ａｎｄ  Ｈａｒｔ（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：９６２−９６７、Ｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５３：８３−８８、高宮他（１９９２）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｒｅｓ．３３：４９３−５０３、Ｂａｂａ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７９：７２９−７３５（米国特許第４，７７７，１２７号、ＧＢ２，２００，６５１、ＥＰ０，３４５，２４２およびＷＯ９１／０２８０５）に記載されているものを含む、多数のレトロウイルス遺伝子送達ビヒクルを利用することができる。
【０２２２】
本発明のポリヌクレオチドを送達するために使用することができる他のウイルスベクター系は、ヘルペスウイルス、例えば単純ヘルペスウイルス（１９９７年５月２０日発行された、Ｗｏｏ  ｅｔ  ａｌ．による米国特許第５，６３１，２３６号、およびＮｅｕｒｏｖｅｘによるＷＯ００／０８１９１）、ワクシニアウイルス（Ｒｉｄｇｅｗａｙ（１９８８）“Ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒｓ，”Ｉｎ：Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ  Ｒ  Ｌ，Ｄｅｎｈａｒｄｔ  Ｄ  Ｔ，ｅｄ．Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ  ｓｕｒｖｅｙ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｌｏｎｉｎｇ  ｖｅｃｔｏｒｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅｓ．Ｓｔｏｎｅｈａｍ：Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ；Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ（１９８６）“Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ａｎｉｍａｌ  ＤＮＡ  ｖｉｒｕｓｅｓ：Ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ａｎｄ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｇｅｎｅｓ，”Ｉｎ：Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ  Ｒ，ｅｄ．Ｇｅｎｅ  ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ：Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８８）Ｇｅｎｅ，６８：１−１０）、およびいくつかのＲＮＡウイルス、に由来している。好ましいウイルスには、アルファウイルス、ポキシウイルス（ｐｏｘｉｖｉｒｕｓ）、アレナウイルス、ワクシニアウイルス、ポリオウイルスなどが含まれる。それらは、様々な哺乳動物細胞にいくつかの魅力的な特徴を提供する（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１２７５−１２８１、Ｒｉｄｇｅｗａｙ，１９８８上記参照、Ｂａｉｃｈｗａｌ  ａｎｄ  Ｓｕｇｄｅｎ，１９８６上記参照、Ｃｏｕｐａｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８上記参照、Ｈｏｒｗｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６４：６４２−６５０）。
【０２２３】
他の実施形態において、ゲノム中の標的ＤＮＡは、当該分野で周知の方法を使用して操作され得る。例えば、ゲノム内の標的ＤＮＡは、レトロウイルス挿入、人工染色体技術、遺伝子挿入、組織特異的プロモーターを用いたランダム挿入、遺伝子ターゲティング、転位因子、および／または外来ＤＮＡの導入するまたは修飾ＤＮＡ／修飾核ＤＮＡを産生するための他の方法により、欠失、挿入、および／または変異によって操作することができる。他の修飾技術には、ゲノムからのＤＮＡ配列の欠失および／または核ＤＮＡ配列の変更が含まれる。例えば、核ＤＮＡ配列は、部位特異的突然変異誘発により変更され得る。
【０２２４】
他の実施形態において、組換えＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチド、およびその断片は、対象に投与され得る。いくつかの実施形態では、増強された生物学的特性を有する融合タンパク質を構築および投与することができる（例えば、上述のＦｃ融合タンパク質）。加えて、ＲＨＯＡドミナントネガティブポリペプチドおよびその断片は、生物学的利用能の増強とタンパク質分解の低下などの望ましい生物学的活性をさらに高めるために、当該技術分野で周知の薬理学的方法（例えば、ペグ化、グリコシル化、オリゴマー化など）に従って修飾することができる。
【実施例】
【０２２５】
例示
本発明を、限定と解釈されるべきではない以下の実施例によりさらに説明する。
【０２２６】
実施例１：実施例２の材料および方法
ａ．マウスコロニー
Ｍｉｓｔ１−ＣｒｅＥＲＴ２、Ｃｄｈ１ｆｌｏｘ／ｆｌｏｘ、Ｔｏｍａｔｉｏｎ／ＧＦＰマウスは、Ｃｄｈ１のエクソン２−３に隣接するｌｏｘＰサイトを持つ条件付き対立遺伝子を持ち、コロンビア大学のＴｉｍｏｔｈｙ  Ｃ．Ｗａｎｇ氏から快く提供された。Ｃｒｅリコンビナーゼは、タモキシフェン（Ｓｉｇｍａ、Ｔ５６４８）ＴＡＭ（１〜５ｍｇ／０．２ｍｌコーン油、示されたとおり）の経口投与によって活性化された。すべての動物実験と手順は、ダナ−ファーバー癌研究所の倫理委員会によって承認された。
【０２２７】
ｂ．マウス胃オルガノイドの単離と培養
Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｎａｔ．Ｐｒｏｔ．８：２４７１−２４８２で先に説明されたプロトコルを次のように実行した。化学試薬を使用してマウスを安楽死させ、縦方向に胃を開き、ペーパータオルで内容物を大まかに取り除く。９０ｍｍペトリ皿にある氷冷ＰＢＳで組織をすすぎ、５０ｍｌの遠心管内で約２０ｍｌの氷冷ＰＢＳと激しく振とうして組織を洗浄する。洗浄後、組織を３５ｍｍペトリ皿に置き、皿を生物学的フード（ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｈｏｏｄ）に持って行き、細いハサミで組織を刻む。１，０００μｌのピペットを使用して１ｍｌのコラゲナーゼ溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１７１００−００１７、２ｍｇ／ｍｌ）を加え、組織断片を溶液に懸濁させ、細胞培養インキュベーターでペトリ皿をインキュベートし、１，０００μｌのピペットを使用して、組織混合物を５〜１０分ごとに勢いよくピペッティング（ｐｉｐｅｔｔｅ）する。ピペッティング後、位相差顕微鏡または解剖顕微鏡を使用して、個々の上皮ユニット（陰窩（ｃｒｙｐｔ）／窩（ｐｉｔ））が大きな組織片から分離されているかどうかを確認する。５０ｍｌの遠心管に７０μｍのセルストレーナーをセットし、１，０００μｌのピペットを使用してセルストレーナーを通して組織混合物をろ過する。ストレーナーを９ｍｌの洗浄培養液で洗浄し、ろ過した細胞懸濁液を１５ｍｌの遠心管に移し、次いで２０×ｇで５分間遠心分離する。５００μｌ〜１ｍｌの洗浄培養液を加えて、管内の細胞を再懸濁する。適切な量の懸濁液を１．５ｍｌ管に移し（管あたり１，０００−３，０００個の無傷の上皮ユニット）、２００×ｇで５分間遠心分離する。管を氷上に置き、マトリゲル（ＢＤ、３５６２３４、管あたり１５μｌ）に上皮ユニットを再懸濁する。管と２４ウェルプレートを氷上に置き、２０μｌピペットを使用して各ウェルの中心に１５μｌの細胞マトリゲル懸濁液を加え、ピペットチップでそれを慎重に広げる。細胞培養インキュベーターでプレートをインキュベートしてマトリゲルを重合させる。上皮ユニットがプレートの表面に付着しないように、プレートを上下逆さまにする。５００μｌの５０％馴化培地を各ウェルに加える。小腸と盲腸の場合、５００μｌの５０％馴化培地（組換えＷｎｔ３ａ（（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、５０３６−ＷＮ−０１０）（１００ｎｇ／ｍｌ）およびＲ−ｓｐｏｎｄｉｎ  １（（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、３４７４−ＲＳ−０５０）（５００ｎｇ／ｍｌ）を、１０μＭのＹ２７６３２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１２５４）および１０μＭのＳＢ４３１５４２（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、１６１４）を含むＡｄｖａｎｃｅｄ  ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１２６３４−０１０）に添加）を追加する。少なくとも２日ごとに培地を交換する。
【０２２８】
ｃ．オルガノイドのレンチウイルス感染
以下のプロトコルを使用した。２〜３日間、２４ウェルでオルガノイドを成長させ、ｐ１０００ピペットでマトリゲルを引っ掻いて培養液に懸濁させる。オルガノイド懸濁液を１５ｍｌ管に移し、アッセイの規模に応じて複数のウェルの懸濁液を組み合わせる。管を２００×ｇで５分間遠心分離し、約１００μｌを残して上清を吸引する。２００μｌのトリプシン−ＥＤＴＡでオルガノイドを再懸濁し、３７℃で５分間管をインキュベートする。１ｍｌの洗浄培養液を加え、激しいピペッティングによりオルガノイドを解離させる。管を２００ｇで５分間遠心分離してから、２５０μｌのレンチウイルス溶液（ＬｅｎｔｉＸ（商標）Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｏｒ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、カタログ番号６３１２３１）で、８μｇ／ｍｌポリブレン（Ｓｉｇｍａ、ＴＲ−１００３）、１０μＭのＹ２７６３２とともに濃縮された）で細胞を再懸濁させる。４８ウェルプレート上のウェルに懸濁液を移す。プレートをパラフィルムで密封し、プレートを６００×ｇ、３２℃で１時間遠心分離することによりスピンコレーション（ｓｐｉｎｃｏｌａｔｉｏｎ）を実行する。プレートを３７℃で６時間、インキュベートして形質導入させる。１ｍｌの馴化培地をウェルに加え、再懸濁し、懸濁液を１．５ｍｌ管に移す。管を２００×ｇで５分間遠心分離し、細胞を１５μｌのマトリゲルに再懸濁し、続いてオルガノイドの培養手順を行い、適切な抗生物質で選択する。
【０２２９】
ｄ．細胞生存率アッセイ
ＣｅｌｌＴｉｔｅｒ−Ｇｌｏ（登録商標）（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｇ７５７０）のプロトコルに従って、細胞生存率アッセイを実施した。
【０２３０】
ｅ．異種移植腫瘍の成長
４週齢のオスのヌードマウス（ＢＡＬＢ／ｃＡ−ｎｕ（ｎｕ／ｎｕ））の各側腹部に、ｄｏｘ誘導性対照またはＲＨＯＡ変異体ウイルスに感染した細胞を皮下注射した。すべての動物は、ダナ−ファーバー癌研究所の施設内動物管理使用委員会のガイドラインに従って維持および使用された。
【０２３１】
実施例２：ＲＨＯＡドミナントネガティブ変異体は、ＣＤＨ１−ｎｕｌｌ癌細胞を死滅させる。
びまん性胃癌（ＤＧＣ）は、胃癌の非常に致命的なバリアントであり、早期の浸潤および転移を起こしやすく、効果的な分子標的療法を欠く。ＤＧＣの開始は、通常、細胞接着タンパク質Ｅ−カドヘリンをコードする腫瘍抑制因子ＣＤＨ１の喪失に続いておこる。Ｅ−カドヘリン（ＣＤＨ１）の減少および／または喪失は浸潤性乳小葉癌の重要な特徴であり、ＣＤＨ１を標的とする機能喪失型変異は浸潤性小葉乳癌の５０％〜６０％に存在し、インサイチュでの小葉癌のマッチングで、多くの場合、観察される初期事象であると考えられている（ＭｃＣａｒｔ  Ｒｅｅｄ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．１７：１２）。本明細書では、Ｔ１９Ｎ、Ｇ１７Ｖ、Ｇ１７Ｅなどの低分子量ＧＴＰａｓｅ  ＲＨＯＡドミナントネガティブフォームの異所性発現が、ＣＤＨ１−ｎｕｌｌ細胞では増殖の有意な阻害と細胞死の誘導をもたらしたが、無傷のＣＤＨ１を有する細胞では起こらないことが実証された。これらの結果は、同質遺伝子的胃オルガノイドモデル（Ｅ−カドヘリンの有無にかかわらず）および同質遺伝子的乳房上皮細胞モデル（Ｅ−カドヘリンの有無にかかわらず）およびＥ−カドヘリン喪失ＮＵＧＣ４およびＭＫＮ４５びまん性胃細胞株を含む異種移植腫瘍成長モデルを使用して確認された。上皮間葉転換（ＥＭＴ）、びまん性胃癌、および乳小葉癌についての癌は、Ｅ−カドヘリンが喪失および／またはダウンレギュレートされるという点で類似している。これらの発見は、ＲＨＯＡドミナントネガティブフォームが、ＤＧＣおよび乳小葉癌、ならびにＥＭＴ表現型を伴う他の癌の効果的な治療法として使用できることを示している。
【０２３２】
参照による組み込み
本出願を通して引用されたすべての参考文献、特許出願、特許、および公開された特許出願、ならびに図および配列表の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０２３３】
均等物
当業者は、本明細書に記載される本発明の特定の実施形態に対する多くの均等物を認識し、または日常的な実験のみを使用して確認することができるであろう。そのような均等物は、添付の特許請求の範囲に含まれることが意図される。
【図１】
2021502329.tif 000005
【図２】
2021502329.tif 000006
【図３】
2021502329.tif 000007
【図４】
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【配列表】
2021502329000001.app
【国際調査報告】
2021502329.tif 000009
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