(57)【要約】  本明細書では、抗ＰＤ１抗体、またはこの断片／変異体と、ＴＧＦ−βトラップとを含む融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を含む組成物が提示される。本明細書では、抗ＰＤ１抗体、またはこの断片／変異体と、ＡＤＡ２ポリペプチドとを含む融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を含む組成物が提示される。本明細書ではまた、組成物を、がんの処置において使用する方法も提示される。
2021531754.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ．プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に結合する抗体、または前記抗体の断片、もしくは前記抗体の変異体；および
ｂ．トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）サイトカイントラップ
を含む、融合タンパク質であり、
前記融合タンパク質の、１または複数のポリペプチドが、リンカーにより接続されている、
前記融合タンパク質。
【請求項２】
前記リンカーが、（Ｇ４Ｓ）ｎ［式中、ｎは、２、３、４、５、または６である］を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項３】
前記リンカーが、（Ｇｌｙ）ｎ［式中、ｎは、６、７、または８である］を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項４】
前記リンカーが、（ＥＡＡＡＫ）ｎ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６である］を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項５】
前記リンカーが、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａを含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項６】
前記リンカーが、配列番号１７〜３４のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項１に記載の融合タンパク質。
【請求項７】
前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップが、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦβＲ）、またはその機能的な断片、抗ＴＧＦ−β抗体、またはその抗原結合性断片、ＴＧＦ−β１阻害性ペプチド、またはその変異体を含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８】
前記ＴＧＦβＲが、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、または前記その機能的な断片である、請求項７に記載の融合タンパク質。
【請求項９】
ＴＧＦβＲＩＩの前記機能的断片が、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）である、請求項８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１０】
前記ＥＣＤが、ＴＧＦ−β１に結合する、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１１】
前記ＥＣＤが、ＴＧＦ−β３に結合する、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１２】
前記ＥＣＤが、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に結合する、請求項９に記載の融合タンパク質。
【請求項１３】
前記ＥＣＤが、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に結合するが、ＴＧＦ−β２に結合しない、請求項１２に記載の融合タンパク質。
【請求項１４】
前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップが、配列番号１４、配列番号１４１、または配列番号１４２に示される配列と、少なくとも８０％同一な配列を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１５】
前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップが、配列番号１４、配列番号１４１、または配列番号１４２に示される配列を含む、請求項１から１３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１６】
前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップが、配列番号１４に示される配列を含む、請求項１から１５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１７】
前記抗体（抗ＰＤ１）が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１８】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項１７に記載の融合タンパク質。
【請求項１９】
前記ＩｇＧ４が、配列番号１４６または配列番号２９２の１０８位において、突然変異を含む、請求項１８に記載の融合タンパク質。
【請求項２０】
前記突然変異が、Ｓ１０８Ｐ突然変異である、請求項１９に記載の融合タンパク質。
【請求項２１】
前記ＩｇＧ４が、前記リンカーにより、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップへと接続された、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２２】
前記抗体の前記断片が、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、（Ｆｖ）２、またはｓｃＦｖである、請求項１から２１のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２３】
前記抗体が、前記抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）と、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項１から２２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２４】
前記リンカーが、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）を、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップへと接続する、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２５】
前記リンカーが、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）を、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップへと接続する、請求項２３に記載の融合タンパク質。
【請求項２６】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、前記融合タンパク質内で、第２のリンカーにより、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）へと接続された、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２７】
前記第２のリンカーが、配列番号１７〜３４のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項２６に記載の融合タンパク質。
【請求項２８】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、配列番号１〜７および１４９〜１６４のうちのいずれか１つに示される配列と、少なくとも８０％同一である、請求項２３から２７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項２９】
軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）が、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される配列と、少なくとも８０％同一である、請求項２３から２８のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３０】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、配列番号１〜７および１４９〜１６４のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３１】
軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）が、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項２３から３０のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３２】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、配列番号６に示される配列と、少なくとも９０％同一であり、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）が、配列番号１２に示される配列と、少なくとも９０％同一である、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３３】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、配列番号６に示される配列を含み、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）が、配列番号１２に示される配列を含む、請求項３２に記載の融合タンパク質。
【請求項３４】
前記融合タンパク質が、配列番号１５に示される配列と、配列番号１６に示される配列とを含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３５】
前記融合タンパク質が、配列番号１５に示される配列と、配列番号１４３に示される配列とを含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３６】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、配列番号７に示される配列と、少なくとも９０％同一であり、軽鎖の前記可変領域が、配列番号１３に示される配列と、少なくとも９０％同一である、請求項２３から２９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３７】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、配列番号７に示される配列を含み、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）が、配列番号１３に示される配列を含む、請求項３６に記載の融合タンパク質。
【請求項３８】
前記融合タンパク質が、配列番号２９６に示される配列と、配列番号１４５に示される配列とを含む、請求項１から３１および請求項３６から３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項３９】
前記融合タンパク質が、配列番号２９６に示される配列と、配列番号１４４に示される配列とを含む、請求項１から３１および請求項３６から３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４０】
前記抗体が、断片結晶化可能領域（Ｆｃ）をさらに含む、請求項１から３９のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４１】
前記Ｆｃが、ヒトＦｃ１、Ｆｃ２、Ｆｃ３、Ｆｃ４、またはそれらの断片である、請求項４０に記載の融合タンパク質。
【請求項４２】
前記Ｆｃが、１または複数の突然変異をさらに含む、請求項４０に記載の融合タンパク質。
【請求項４３】
前記抗体が、前記ｓｃＦｖおよび前記Ｆｃ断片を含む、請求項２２から４２のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４４】
前記ＴＧＦβサイトカイントラップが、前記抗ＴＧＦβ抗体、または前記その抗原結合性断片を含む、請求項７から４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４５】
前記抗ＴＧＦβ抗体が、配列番号１６６、１６８、１６９、１７１、１７３、１７５、または１７７によりコードされるＶＨと、配列番号１６５、１６７、１７０、１７２、１７４、１７６、または１７８によりコードされるＶＬとを含む、請求項４４に記載の融合タンパク質。
【請求項４６】
前記ＴＧＦβサイトカイントラップが、前記ＴＧＦβ阻害性ペプチド、または前記その変異体を含む、請求項７から４３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項４７】
前記ＴＧＦβ阻害性ペプチドが、配列番号１９３〜２２７のうちのいずれか１つに明示された配列を含む、請求項４６に記載の融合タンパク質。
【請求項４８】
請求項１から４７および１１７から１２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
【請求項４９】
請求項１から４７および１１７から１２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結された、発現ベクター。
【請求項５０】
前記プロモーターが、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである、請求項４９に記載の発現ベクター。
【請求項５１】
前記誘導性プロモーターが、低分子リガンド誘導性の、２ポリペプチドエクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチである、請求項５０に記載の発現ベクター。
【請求項５２】
前記ベクターが、アデノウイルスベクターである、請求項４９から５１のいずれか一項に記載の発現ベクター。
【請求項５３】
（ａ）請求項１から４７および１１７から１２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質；
（ｂ）請求項１から４７および１１７から１２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｃ）請求項４９から５２のいずれか一項に記載の発現ベクター；および
（ｄ）薬学的に許容される賦形剤
を含む医薬組成物。
【請求項５４】
がんを処置する方法であって、細胞を、
（ａ）請求項１から４７および１１７から１２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質；
（ｂ）請求項１から４７および１１７から１２０のいずれか一項に記載の融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；または
（ｃ）請求項４９から５２のいずれか一項に記載の発現ベクター
と接触させるステップを含む方法。
【請求項５５】
前記細胞が、がん細胞である、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記細胞が、哺乳動物細胞である、請求項５４から５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
がんを伴う対象を処置する方法であって、
（ａ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に結合する抗体または前記抗体の断片もしくは変異体；および
（ｂ）トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦβＲ）、またはその機能的な断片、抗ＴＧＦ−β抗体、またはその抗原結合性断片、ＴＧＦ−β１阻害性ペプチド、またはその変異体
を含む融合タンパク質を含む組成物を投与するステップ
を含み、
前記融合タンパク質の、１または複数のポリペプチドが、リンカーにより接続されている、
方法。
【請求項５８】
前記リンカーが、（Ｇ４Ｓ）ｎ［式中、ｎは、２、３、４、５、または６である］を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記リンカーが、（Ｇｌｙ）ｎ［式中、ｎは、６、７、または８である］を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６０】
前記リンカーが、（ＥＡＡＡＫ）ｎ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６である］を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６１】
前記リンカーが、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａを含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６２】
前記リンカーが、配列番号１７〜３４のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項６３】
前記トランスフォーミング増殖因子受容体タンパク質が、ＴＧＦβＲＩＩである、請求項５７から６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記ＴＧＦβＲＩＩの前記機能的断片が、ＴＧＦβＲＩＩ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）である、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップが、配列番号１４、配列番号１４１、または配列番号１４２に示される配列と、少なくとも８０％同一な配列を含む、請求項５７から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップが、配列番号１４、配列番号１４１、または配列番号１４２に示される配列を含む、請求項５７から６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記抗体が、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体である、請求項５７から６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記ＩｇＧが、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である、請求項５７から６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記ＩｇＧ４が、配列番号１４６または配列番号２９２の１０８位において、突然変異を含む、請求項６８に記載の方法。
【請求項７０】
前記突然変異が、Ｓ１０８Ｐ突然変異である、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
前記抗体の前記断片が、前記抗体の、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、（Ｆｖ）２、またはｓｃＦｖである、請求項５７に記載の方法。
【請求項７２】
前記抗体、または前記抗体の断片、もしくは前記抗体の変異体が、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む、請求項５７から７１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記リンカーが、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）を、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップへと接続する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
前記リンカーが、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）を、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップへと接続する、請求項７２に記載の方法。
【請求項７５】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、第２のリンカーにより、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）へと接続されている、請求項７２から７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、配列番号１〜７および１４９〜１６４のうちのいずれか１つに示される配列と、少なくとも８０％同一である、請求項７２から７５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）が、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される配列と、少なくとも８０％同一である、請求項７２から７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、配列番号１〜７および１４９〜１６４のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項７２から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）が、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される配列を含む、請求項７２から７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、配列番号６に示される配列と、少なくとも９０％同一であり、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）が、配列番号１２に示される配列と、少なくとも９０％同一である、請求項７２から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、配列番号６に示される配列を含み、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）が、配列番号１２に示される配列を含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
前記融合タンパク質が、配列番号１５に示される配列と、配列番号１６に示される配列とを含む、請求項５７から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記融合タンパク質が、配列番号１５に示される配列（ＶＬ５  Ｉｇｇ４）と、配列番号１４３に示される配列とを含む、請求項５７から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
重鎖の前記可変領域（ＶＨ）が、配列番号７に示される配列と、少なくとも９０％同一であり、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）が、配列番号１３に示される配列と、少なくとも９０％同一である、請求項７２から７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８５】
重鎖の前記可変領域が、配列番号７に示される配列を含み、軽鎖の前記可変領域が、配列番号１３に示される配列を含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記融合タンパク質が、配列番号２９６に示される配列と、配列番号１４５に示される配列とを含む、請求項５７から７９および請求項８４から８５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８７】
前記融合タンパク質が、配列番号２９６に示される配列と、配列番号１４４に示される配列とを含む、請求項５７から７９および請求項８４から８５のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項８８】
前記抗体が、断片結晶化可能領域（Ｆｃ）をさらに含む、請求項５７から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
前記Ｆｃが、ヒトＦｃ１、Ｆｃ２、Ｆｃ３、Ｆｃ４、またはこれらの断片である、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記Ｆｃが、１または複数の突然変異をさらに含む、請求項８８に記載の方法。
【請求項９１】
前記抗体が、前記ｓｃＦｖおよび前記Ｆｃ断片を含む、請求項７１から９０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記がんが、不応性がんである、請求項５７から９１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
前記対象が、ＰＤ−１抗体またはＣＴＬＡ−４抗体による処置に対して、非応答性である、請求項５７から９２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９４】
１または複数の、さらなる抗がん剤を投与するステップをさらに含む、請求項５７から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記さらなる抗がん剤が、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤である、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記ＰＤ−１阻害剤が、抗ＰＤ−１抗体、またはその断片もしくは変異体である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９７】
前記ＣＴＬＡ−４阻害剤が、抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはその断片もしくは変異体である、請求項９５に記載の方法。
【請求項９８】
１または複数のサイトカインを投与するステップをさらに含む、請求項５７から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記対象が、哺乳動物対象である、請求項５７から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記対象が、ヒトである、請求項５７から９９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記がんが、中皮腫、神経膠芽腫、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胃がん、子宮頸がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、乳がん、胃がん、膀胱がん、肝がん、ホジキンリンパ腫、肺がん、皮膚がん、腎がん、または頭頸部がんである、請求項５７から１００のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
皮膚がんが、皮膚扁平上皮癌、黒色腫、または基底細胞がんである、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
肺がんが、非小細胞肺がん（ＮＳＬＣ）または小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０４】
乳がんが、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０５】
外因性受容体を発現するように操作された、有効量のＴ細胞を投与するステップをさらに含む、請求項５７から１０４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０６】
前記外因性受容体が、キメラ抗原受容体である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記キメラ抗原受容体が、操作Ｔ細胞受容体である、請求項１０６に記載の方法。
【請求項１０８】
前記キメラ抗原受容体が、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、葉酸受容体α、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−４、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、またはＶＥＧＦ−Ｒ２におけるエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む、請求項１０６から１０７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記抗原結合性ドメインが、配列番号３７〜５６から選択される配列を含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記抗原結合性ドメインが、配列番号３５〜３６から選択される配列を含む、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１１】
操作Ｔ細胞の有効量が、１ｋｇ当たり少なくとも１０２細胞である、請求項１０７から１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
操作Ｔ細胞の有効量が、１ｋｇ当たり少なくとも１０４細胞である、請求項１０７から１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
操作Ｔ細胞の有効量が、１ｋｇ当たり少なくとも１０５細胞である、請求項１０７から１１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記操作Ｔ細胞が、サイトカインをさらに発現する、請求項１０７から１１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記サイトカインが、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαを含む融合タンパク質である、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
それを必要とする対象における、がんを処置する方法であって、
（ａ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に結合する抗体、または前記抗体の断片、もしくは前記抗体の変異体；およびトランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦβＲ）タンパク質またはその機能的な断片を含む融合タンパク質を含む組成物を投与するステップであって、前記融合タンパク質の、１または複数のポリペプチドが、リンカーにより接続されている、ステップ；および
（ｂ）前記対象へと、有効量の操作Ｔ細胞の、１または複数の用量を投与するステップであって、前記操作Ｔ細胞が、キメラ受容体および膜結合型ＩＬ−１５を含む、ステップ
を含む方法。
【請求項１１７】
前記融合タンパク質が、配列番号１５に示される配列と、配列番号２９４に示される配列とを含む、請求項１から３３のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１８】
前記融合タンパク質が、配列番号２９６に示される配列と、配列番号２９５に示される配列とを含む、請求項１から３１および請求項３６から３７のいずれか一項に記載の融合タンパク質。
【請求項１１９】
前記融合タンパク質が、配列番号１５に示される配列と、配列番号２９４に示される配列とを含む、請求項５７から８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記融合タンパク質が、配列番号１３に示される配列と、配列番号２９５に示される配列とを含む、請求項５７から７９および請求項８４から８５のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、２０１８年７月９日に出願された米国特許仮出願第６２／６９５，６２３号明細書、２０１８年７月９日に出願された米国特許仮出願第６２／６９５，６２７号明細書、２０１９年６月１９日に出願された米国特許仮出願第６２／８６３，７１０号明細書、２０１９年６月２０日に出願された米国特許仮出願第６２／８６４，３６７号明細書および２０１９年６月２５日に出願された米国特許仮出願第６２／８６６，４２０号明細書の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
近年、獲得免疫系へと伝えられる抑制シグナルの中断に基づく、モノクローナル抗体ベースのがん免疫療法が、臨床における有望性を示した。ＣＴＬＡ−４抗体による阻害剤（例えば、イピリムマブ）、およびＰＤ−１阻害剤（例えば、ペムブロリズマブ、ニボルマブ）のＦＤＡ承認により、今日では、肺がん、腎細胞がん、および卵巣がんを含む、充実性腫瘍を処置するための、より多くの処置選択肢が利用可能である。しかし、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１、およびＴＧＦ−βが共発現される適応の大半（例えば、卵巣、胃、および結腸直腸）では、免疫チェックポイント阻害剤に対する応答が、ほとんど乃至全く観察されていない。したがって、当技術分野では、がんのための、より安全かつより有効な処置を得ることが必要とされ続けている。
【０００３】
参照による組込み
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、および特許出願は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照により具体的かつ個別に組み込まれることが指し示された場合と同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書では、（ａ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に結合する抗体、または前記抗体の断片、もしくは前記抗体の変異体；および（ｂ）トランスフォーミング増殖因子ベータ（ＴＧＦ−β）サイトカイントラップを含み、融合タンパク質の、１または複数のポリペプチドが、リンカーにより接続された（connected）、融合タンパク質が提示される。
【０００５】
一実施形態では、前記リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ［式中、ｎは、２、３、４、５、または６である］を含む。一実施形態では、前記リンカーは、（Ｇｌｙ）ｎ［式中、ｎは、６、７、または８である］を含む。一実施形態では、前記リンカーは、（ＥＡＡＡＫ）ｎ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６である］を含む。一実施形態では、前記リンカーは、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａを含む。一実施形態では、前記リンカーは、配列番号１７〜３４のうちのいずれか１つに示される配列を含む。一実施形態では、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップは、トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦβＲ）、またはこの機能的な断片、抗ＴＧＦ−β抗体、またはこの抗原結合性断片、ＴＧＦ−β１阻害性ペプチド、またはこの変異体を含む。
【０００６】
一実施形態では、前記ＴＧＦβＲは、トランスフォーミング増殖因子ベータ受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）、または前記この機能的な断片である。一実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩの前記機能的断片は、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）である。一実施形態では、前記ＥＣＤは、ＴＧＦ−β１に結合する。一実施形態では、前記ＥＣＤは、ＴＧＦ−β３に結合する。一実施形態では、前記ＥＣＤは、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に結合する。一実施形態では、前記ＥＣＤが、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に結合するが、ＴＧＦ−β２に結合しない。一実施形態では、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップは、配列番号１４、配列番号１４１、または配列番号１４２に示される配列と、少なくとも８０％同一な配列を含む。一実施形態では、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップは、配列番号１４、配列番号１４１、または配列番号１４２に示される配列を含む。
【０００７】
一実施形態では、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップは、配列番号１４に示される配列を含む。一実施形態では、前記抗体（抗ＰＤ１）は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体である。一実施形態では、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。一実施形態では、前記ＩｇＧ４は、配列番号１４６または配列番号２９２の１０８位において、突然変異を含む。一実施形態では、前記突然変異は、Ｓ１０８Ｐ突然変異である。一実施形態では、前記ＩｇＧ４は、前記リンカーにより、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップへと接続されている。一実施形態では、前記抗体の前記断片は、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、（Ｆｖ）２、またはｓｃＦｖである。
【０００８】
一実施形態では、前記抗体は、前記抗体の重鎖の可変領域（ＶＨ）と、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一実施形態では、前記リンカーは、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）を、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップへと接続する。一実施形態では、前記リンカーは、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）を、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップへと接続する。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、前記融合タンパク質内で、第２のリンカーにより、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）へと接続されている。一実施形態では、前記第２のリンカーは、配列番号１７〜３４のうちのいずれか１つに示される配列を含む。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、配列番号１〜７および１４９〜１６４のうちのいずれか１つに示される配列と、少なくとも８０％同一である。
【０００９】
一実施形態では、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される配列と、少なくとも８０％同一である。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、配列番号１〜７および１４９〜１６４のうちのいずれか１つに示される配列を含む。一実施形態では、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される配列を含む。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、配列番号６に示される配列と、少なくとも９０％同一であり、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号１２に示される配列と、少なくとも９０％同一である。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、配列番号６に示される配列を含み、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号１２に示される配列を含む。
【００１０】
一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、配列番号１６に示される配列とを含む。一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、配列番号１４３に示される配列とを含む。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、配列番号７に示される配列と、少なくとも９０％同一であり、軽鎖の前記可変領域は、配列番号１３に示される配列と、少なくとも９０％同一である。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、配列番号７に示される配列を含み、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号１３に示される配列を含む。
【００１１】
一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号２９６に示される配列と、配列番号１４５に示される配列とを含む。一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号２９６に示される配列と、配列番号１４４に示される配列とを含む。一実施形態では、前記抗体は、断片結晶化可能領域（fragment crystallizable）（Ｆｃ）をさらに含む。一実施形態では、前記Ｆｃは、ヒトＦｃ１、ヒトＦｃ２、ヒトＦｃ３、ヒトＦｃ４、またはこれらの断片である。一実施形態では、前記Ｆｃは、１または複数の突然変異をさらに含む。一実施形態では、前記抗体は、前記ｓｃＦｖおよび前記Ｆｃ断片を含む。一実施形態では、前記ＴＧＦβサイトカイントラップは、前記抗ＴＧＦβ抗体、または前記この抗原結合性断片を含む。一実施形態では、抗ＴＧＦβ抗体は、配列番号１６６、１６８、１６９、１７１、１７３、１７５、または１７７によりコードされるＶＨと、配列番号１６５、１６７、１７０、１７２、１７４、１７６、または１７８によりコードされるＶＬとを含む。
【００１２】
一実施形態では、前記ＴＧＦβサイトカイントラップは、前記ＴＧＦβ阻害性ペプチド、または前記この変異体を含む。一実施形態では、ＴＧＦβ阻害性ペプチドは、配列番号１９３〜２２７のうちのいずれか１つに明示された配列を含む。
【００１３】
本明細書では、本明細書で開示される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提示される。
【００１４】
本明細書では、本明細書で開示される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、前記ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結された、発現ベクターが提示される。一実施形態では、前記プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである。一実施形態では、前記誘導性プロモーターは、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチである。一実施形態では、前記ベクターは、アデノウイルスベクターである。
【００１５】
本明細書では、（ａ）本明細書で開示される融合タンパク質、（ｂ）本明細書で開示される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または（ｃ）本明細書で開示される発現ベクター、および（ｄ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物が提示される。
【００１６】
本明細書では、がんを処置する方法であって、細胞を、（ａ）本明細書で開示される融合タンパク質、（ｂ）本明細書で開示される融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または（ｃ）本明細書で開示される発現ベクターと接触させるステップを含む方法が提示される。一実施形態では、前記細胞は、がん細胞である。一実施形態では、前記細胞は、哺乳動物細胞である。
【００１７】
本明細書では、がんを伴う対象を処置する方法であって、（ａ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に結合する抗体または前記抗体の断片もしくは変異体、および（ｂ）トランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦβＲ）、またはこの機能的な断片、抗ＴＧＦ−β抗体、またはこの抗原結合性断片、ＴＧＦ−β１阻害性ペプチド、またはこの変異体を含む融合タンパク質を含む組成物を投与するステップを含み、融合タンパク質の、１または複数のポリペプチドが、リンカーにより接続されている、方法が提示される。
【００１８】
一実施形態では、前記リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ［式中、ｎは、２、３、４、５、または６である］を含む。一実施形態では、前記リンカーは、（Ｇｌｙ）ｎ［式中、ｎは、６、７、または８である］を含む。一実施形態では、前記リンカーは、（ＥＡＡＡＫ）ｎ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６である］を含む。一実施形態では、前記リンカーは、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａを含む。一実施形態では、前記リンカーは、配列番号１７〜３４のうちのいずれか１つに示される配列を含む。一実施形態では、前記トランスフォーミング増殖因子受容体タンパク質は、ＴＧＦβＲＩＩである。一実施形態では、前記ＴＧＦβＲＩＩの前記機能的断片は、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）である。一実施形態では、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップは、配列番号１４、配列番号１４１、または配列番号１４２に示される配列と、少なくとも８０％同一な配列を含む。一実施形態では、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップは、配列番号１４、配列番号１４１、または配列番号１４２に示される配列を含む。
【００１９】
一実施形態では、前記抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体である。一実施形態では、前記ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。一実施形態では、前記ＩｇＧ４は、配列番号１４６または配列番号２９２の１０８位において、突然変異を含む。一実施形態では、前記突然変異は、Ｓ１０８Ｐ突然変異である。一実施形態では、前記抗体の前記断片は、前記抗体の、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、（Ｆｖ）２、またはｓｃＦｖである。一実施形態では、前記抗体、または前記抗体の断片、もしくは前記抗体の変異体は、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一実施形態では、前記リンカーは、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）を、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップへと接続する。一実施形態では、前記リンカーは、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）を、前記ＴＧＦ−βサイトカイントラップへと接続する。
【００２０】
一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、第２のリンカーにより、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）へと接続されている。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、配列番号１〜７および１４９〜１６４のうちのいずれか１つに示される配列と、少なくとも８０％同一である。一実施形態では、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される配列と、少なくとも８０％同一である。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、配列番号１〜７および１４９〜１６４のうちのいずれか１つを含む。
【００２１】
一実施形態では、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される配列を含む。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、配列番号６に示される配列と、少なくとも９０％同一であり、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号１２に示される配列と、少なくとも９０％同一である。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、配列番号６に示される配列を含み、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号１２に示される配列を含む。一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、配列番号１６に示される配列とを含む。
【００２２】
一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列（ＶＬ５  Ｉｇｇ４）と、配列番号１４３に示される配列とを含む。一実施形態では、重鎖の前記可変領域（ＶＨ）は、配列番号７に示される配列と、少なくとも９０％同一であり、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号１３に示される配列と、少なくとも９０％同一である。一実施形態では、重鎖の前記可変領域は、配列番号７に示される配列を含み、軽鎖の前記可変領域は、配列番号１３に示される配列を含む。一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号２９６に示される配列と、配列番号１４５に示される配列とを含む。一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号２９６に示される配列と、配列番号１４４に示される配列とを含む。
【００２３】
一実施形態では、前記抗体は、断片結晶化可能領域（Ｆｃ）をさらに含む。一実施形態では、前記Ｆｃは、ヒトＦｃ１、ヒトＦｃ２、ヒトＦｃ３、ヒトＦｃ４、またはこれらの断片である。一実施形態では、前記Ｆｃは、１または複数の突然変異をさらに含む。一実施形態では、前記抗体は、前記ｓｃＦｖおよび前記Ｆｃ断片を含む。一実施形態では、前記がんは、不応性がんである。一実施形態では、前記対象は、ＰＤ−１抗体またはＣＴＬＡ−４抗体による処置に対して、非応答性である。一実施形態では、方法は、１または複数の、さらなる抗がん剤を投与するステップをさらに含む。一実施形態では、前記さらなる抗がん剤は、ＰＤ−１阻害剤、ＰＤ−Ｌ１阻害剤、またはＣＴＬＡ−４阻害剤である。一実施形態では、前記ＰＤ−１阻害剤は、抗ＰＤ−１抗体、またはこの断片もしくは変異体である。
【００２４】
一実施形態では、前記ＣＴＬＡ−４阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体、またはこの断片もしくは変異体である。一実施形態では、方法は、１または複数のサイトカインを投与するステップをさらに含む。一実施形態では、前記対象は、哺乳動物対象である。一実施形態では、前記対象は、ヒトである。一実施形態では、前記がんは、中皮腫、神経膠芽腫、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胃がん、子宮頸がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、乳がん、胃がん、膀胱がん、肝がん、ホジキンリンパ腫、肺がん、皮膚がん、腎がん、または頭頸部がんである。
【００２５】
一実施形態では、皮膚がんは、皮膚扁平上皮癌、黒色腫、または基底細胞がんである。一実施形態では、肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＬＣ）または小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）である。一実施形態では、乳がんは、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である。一実施形態では、方法は、外因性受容体を発現するように操作された、有効量のＴ細胞を投与するステップをさらに含む。一実施形態では、外因性受容体は、キメラ抗原受容体である。一実施形態では、キメラ抗原受容体は、操作Ｔ細胞受容体である。
【００２６】
一実施形態では、キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、葉酸受容体α、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−４、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、またはＶＥＧＦ−Ｒ２におけるエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、抗原結合性ドメインは、配列番号３７〜５６から選択される配列を含む。一実施形態では、抗原結合性ドメインは、配列番号３５〜３６から選択される配列を含む。
【００２７】
一実施形態では、操作Ｔ細胞の有効量は、１ｋｇ当たりの細胞少なくとも１０２個である。一実施形態では、操作Ｔ細胞の有効量は、１ｋｇ当たりの細胞少なくとも１０４個である。一実施形態では、操作Ｔ細胞の有効量は、１ｋｇ当たりの細胞少なくとも１０５個である。一実施形態では、操作Ｔ細胞は、サイトカインをさらに発現する。一実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαを含む融合タンパク質である。
【００２８】
本明細書では、それを必要とする対象における、がんを処置する方法であって、（ａ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に結合する抗体、または前記抗体の断片、もしくは前記抗体の変異体；およびトランスフォーミング増殖因子受容体（ＴＧＦβＲ）タンパク質またはこの機能的な断片を含む融合タンパク質を含む組成物を投与するステップであって、融合タンパク質の、１または複数のポリペプチドが、リンカーにより接続されている、ステップ；および（ｂ）対象へと、有効量の操作Ｔ細胞の、１または複数の用量を投与するステップであって、操作Ｔ細胞が、キメラ受容体および膜結合型ＩＬ−１５を含む、ステップを含む方法が提示される。
【００２９】
一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、配列番号２９４に示される配列とを含む。一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号２９６に示される配列と、配列番号２９５に示される配列とを含む。一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、配列番号２９４に示される配列とを含む。一実施形態では、前記融合タンパク質は、配列番号１３に示される配列と、配列番号２９５に示される配列とを含む。
【００３０】
本明細書では、とりわけ、（ａ）プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に結合する抗体、または前記抗体の断片、もしくは前記抗体の変異体；および（ｂ）アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）タンパク質、またはこの機能的な断片を含み、融合タンパク質の、１または複数のポリペプチドが、リンカーにより接続された、融合タンパク質が提示される。一実施形態では、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ［式中、ｎは、２、３、４、５、または６である］を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ）ｎ［式中、ｎは、６、７、または８である］を含む。別の実施形態では、リンカーは、（ＥＡＡＡＫ）ｎ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６である］を含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａを含む。ある特定の実施形態では、リンカーは、配列番号１７〜３４のうちのいずれか１つに示される配列を含む。
【００３１】
一実施形態では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡ２）またはこの突然変異体、もしくはこの変異体である。別の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）タンパク質は、ＡＤＡ２突然変異体１（配列番号２７３）、ＡＤＡ２突然変異体２（配列番号２７４）、ＡＤＡ２突然変異体３（配列番号２７５）、ＡＤＡ２突然変異体４（配列番号２７６）、ＡＤＡ２突然変異体５（配列番号２７７）、もしくはＡＤＡ２突然変異体６（配列番号２７８）、ＡＤＡ２突然変異体７（配列番号２７９）、または野生型ＡＤＡ２（配列番号２８４）のうちのいずれか１つを含む。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）タンパク質は、配列番号２８４または２７３〜２７９のうちのいずれか１つに示される配列と、少なくとも８０％同一な配列を含む。ある特定の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）タンパク質は、配列番号２８４または２７３〜２７９のうちのいずれか１つに示される配列を含む。
【００３２】
一実施形態では、抗体は、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）抗体である。ある特定の実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。一実施形態では、ＩｇＧ４は、配列番号１４６または２９２の１０８位において、突然変異を含む。一部の実施形態では、突然変異は、Ｓ１０８Ｐ突然変異である。一部の例では、抗体の断片は、抗体の、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、（Ｆｖ）２、またはｓｃＦｖである。一実施形態では、抗体、または抗体の断片もしくは抗体の変異体は、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一実施形態では、リンカーは、重鎖の可変領域（ＶＨ）を、アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡ２）またはこの突然変異体、もしくはこの変異体へと接続する。別の実施形態では、リンカーは、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を、アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡ２）またはこの突然変異体、もしくはこの変異体へと接続する。
【００３３】
一例では、重鎖可変領域（ＶＨ）は、第２のリンカーにより、軽鎖可変領域（ＶＬ）へと接続されている。一実施形態では、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号１〜７および１４９〜１６４のうちのいずれか１つに示される配列と、少なくとも８０％同一である。別の例では、軽鎖の可変領域（ＶＬ）は、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される配列と、少なくとも８０％同一である。さらなる実施形態では、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号１〜７および１４９〜１６４のうちのいずれか１つに示される配列を含む。さらなる実施形態では、軽鎖の可変領域（ＶＬ）は、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される配列を含む。一実施形態では、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号６に示される配列（ＶＨ６）と、少なくとも９０％同一であり、軽鎖の可変領域（ＶＬ）は、配列番号１２に示される配列（ＶＬ５）と、少なくとも９０％同一である。ある実施形態では、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号６に示される配列を含み、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号１２に示される配列を含む。
【００３４】
一例では、融合タンパク質は、配列番号１２に示される配列（ＶＬ５）および配列番号２８０に示される配列（ＶＨ６  ＩｇＧ４（ｍｕｔ）−ＡＤＡ２  ｗｔ）を含む。別の例では、融合タンパク質は、配列番号１２に示される配列（ＶＬ５）、および配列番号２８１に示される配列（ＶＨ６  ｉｇＧ４（ｍｕｔ）ＡＤＡ２  ｍｕｔ  ７）を含む。一例では、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号７に示される配列（ＶＨ７）と、少なくとも９０％同一であり、軽鎖の前記可変領域（ＶＬ）は、配列番号１３に示される配列（ＶＬ６）と、少なくとも９０％同一である。一例では、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号７に示される配列（ＶＨ７）を含み、軽鎖の可変領域（ＶＬ）は、配列番号１３に示される配列（ＶＬ６）を含む。別の例では、融合タンパク質は、配列番号１３に示される配列（ＶＬ６）、および配列番号２８２に示される配列（ＶＨ７  ｉｇＧ４（ｍｕｔ）ＡＤＡ２  ｗｔ）を含む。一例では、融合タンパク質は、配列番号１３に示される配列（ＶＬ６）、および配列番号２８３に示される配列（ＶＨ７  ｉｇＧ４（ｍｕｔ）ＡＤＡ２  ｍｕｔ  ７）を含む。
【００３５】
本明細書では、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドが提示される。本明細書ではさらに、上記の態様のうちのいずれか１つによる融合タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含み、ポリヌクレオチドが、プロモーターに作動可能に連結された、発現ベクターが提示される。一部の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチである。一部の実施形態では、ベクターは、アデノウイルスベクターである。
【００３６】
本明細書では、がんを処置する方法であって、細胞を、融合タンパク質、融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド、または発現ベクターと接触させるステップを含む方法が提示される。一部の実施形態では、細胞は、がん細胞である。一部の実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞である。
【００３７】
本明細書ではさらに、融合タンパク質；または融合タンパク質をコードするポリヌクレオチド；または発現ベクターと、薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提示される。
【００３８】
本明細書では、がんを伴う対象を処置する方法であって、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に結合する抗体、または前記抗体の断片、もしくは前記抗体の変異体；およびアデノシンデアミナーゼタンパク質、またはこの機能的な断片を含む融合タンパク質を含む組成物を投与するステップを含み、融合タンパク質の、１または複数のポリペプチドが、リンカーにより接続されている、方法が提示される。ある特定の場合には、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡ２）である。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）タンパク質は、ＡＤＡ２突然変異体１（配列番号２７３）、ＡＤＡ２突然変異体２（配列番号２７４）、ＡＤＡ２突然変異体３（配列番号２７５）、ＡＤＡ２突然変異体４（配列番号２７６）、ＡＤＡ２突然変異体５（配列番号２７７）、もしくはＡＤＡ２突然変異体６（配列番号２７８）、ＡＤＡ２突然変異体７（配列番号２７９）、または野生型ＡＤＡ２（配列番号２８４）のうちのいずれか１つを含む。
【００３９】
ある特定の場合には、リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ［式中、ｎは、２、３、４、５、または６である］を含む。一部の実施形態では、リンカーは、（Ｇｌｙ）ｎ［式中、ｎは、６、７、または８である］である。一部の実施形態では、リンカーは、（ＥＡＡＡＫ）ｎ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、または６である］を含む。一部の実施形態では、リンカーは、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａを含む。場合によって、リンカーは、配列番号１７〜３４のうちのいずれか１つに示される配列を含む。
【００４０】
本明細書では、がんを伴う対象を処置する方法が提示される。ある特定の場合には、がんは、中皮腫、神経膠芽腫、子宮内膜がん、結腸直腸がん、胃がん、子宮頸がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、乳がん、胃がん、膀胱がん、肝がん、ホジキンリンパ腫、肺がん、皮膚がん、腎がん、または頭頸部がんである。ある特定の場合には、皮膚がんは、皮膚扁平上皮癌、黒色腫、または基底細胞がんである。他の場合には、肺がんは、非小細胞肺がん（ＮＳＬＣ）または小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）である。場合によって、乳がんは、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である。
【００４１】
別の実施形態では、がんを伴う対象を処置する方法であって、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に結合する抗体、または前記抗体の断片、もしくは前記抗体の変異体；およびアデノシンデアミナーゼタンパク質、またはこの機能的な断片を含む融合タンパク質を含む組成物を投与するステップを含み、融合タンパク質の、１または複数のポリペプチドが、リンカーにより接続されている、方法が提供される。さらなる実施形態では、がんを伴う対象を処置する方法は、外因性受容体を発現するように操作された、有効量のＴ細胞を投与するステップをさらに含む。
【００４２】
場合によって、外因性受容体は、キメラ抗原受容体である。他の場合には、キメラ抗原受容体は、操作Ｔ細胞受容体である。１つの場合には、キメラ抗原受容体は、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、葉酸受容体α、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−４、ＭＵＣ−１６、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、またはＶＥＧＦ−Ｒ２におけるエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、配列番号３７〜５６から選択される配列を含み、他の実施形態では、抗原結合性ドメインは、配列番号３５〜３６から選択される配列を含む。
【００４３】
一実施形態では、操作Ｔ細胞の有効量は、１ｋｇ当たりの細胞少なくとも１０２個である。別の実施形態では、操作Ｔ細胞の有効量は、１ｋｇ当たりの細胞少なくとも１０４個である。さらなる実施形態では、操作Ｔ細胞の有効量は、１ｋｇ当たりの細胞少なくとも１０５個である。
【００４４】
さらなる実施形態では、操作Ｔ細胞は、サイトカインをさらに発現する。別の実施形態では、サイトカインは、ＩＬ−１５およびＩＬ−１５Ｒαを含む融合タンパク質である。
【００４５】
本明細書では、それを必要とする対象における、がんを処置する方法であって、プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１）に結合する抗体、または前記抗体の断片、もしくは前記抗体の変異体；およびアデノシンデアミナーゼタンパク質、またはこの機能的な断片を含む融合タンパク質を含む組成物を投与するステップであって、融合タンパク質の、１または複数のポリペプチドが、リンカーにより接続されている、ステップ；および対象へと、有効量の操作Ｔ細胞の、１または複数の用量を投与するステップであって、操作Ｔ細胞が、キメラ受容体および膜結合型ＩＬ−１５を含む、ステップを含む方法が提示される。
【００４６】
本開示の特徴は、特に、付属の特許請求の範囲において明示されている。本開示の特徴および利点についてのよりよい理解は、本開示の原理が用いられる、例示的な実施形態を明示する、以下の詳細な記載および付属の図面を参照することにより得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】免疫抑制における、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の概略を示す図である。
【図２】免疫抑制における、ＴＧＦ−βの概略を示す図である。
【図３】卵巣がん患者のサブセットにおける、転移性疾患および予後不良と相関する、ＴＧＦ−β関連遺伝子のクラスター（病期ＩＩＩ／ＩＶにおいてエンリッチされる）を示す図である。
【図４】図４Ａ、４Ｂ、および４Ｃは、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質についての概略的デザインを示す図である。他の例示的な実施形態では、ＡＤＡ２は、抗ＰＤ１へと融合されうる。
【図５】抗ＰＤ１（ＶＨ６−ＶＬ５）ＩｇＧ１−ＴＧＦβＲＩＩ、および抗ＰＤ１（ＶＨ６−ＶＬ５）ＩｇＧ４−ＴＧＦβＲＩＩによる、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１間相互作用の遮断を示すグラフである。
【図６】抗ＰＤ１（ＶＨ６−ＶＬ５）ＩｇＧ１−ＴＧＦβＲＩＩ、および抗ＰＤ１（ＶＨ６−ＶＬ５）ＩｇＧ４−ＴＧＦβＲＩＩによる、ＴＧＦ−β１アイソフォームシグナル伝達の中和を示すグラフである。
【図７】抗ＰＤ１（ＶＨ６−ＶＬ５）ＩｇＧ１−ＴＧＦβＲＩＩ、および抗ＰＤ１（ＶＨ６−ＶＬ５）ＩｇＧ４−ＴＧＦβＲＩＩによる、ＴＧＦ−β２アイソフォームの中和を示すグラフである。
【図８】抗ＰＤ１（ＶＨ６−ＶＬ５）ＩｇＧ１−ＴＧＦβＲＩＩ、および抗ＰＤ１（ＶＨ６−ＶＬ５）ＩｇＧ４−ＴＧＦβＲＩＩによる、ＴＧＦ−β３アイソフォームシグナル伝達の中和を示すグラフである。
【図９−１】図９Ａ、図９Ｂ、および図９Ｃは、抗ＰＤ１抗体または対照抗体と比較した、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在下で刺激されたＰＢＭＣによる、増殖およびＩＦＮ−γ産生の増強を、用量依存的に示すグラフである。
【図９−２】同上。
【図９−３】同上。
【図９−４】図９Ｄおよび図９Ｅは、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質を、ＰＢＭＣと、結腸直腸がん（結腸直腸腺癌）細胞系との共培養物へと添加した場合における、ＣＤ８＋Ｔ細胞上の、ＰＤ１受容体の占有、およびＩＦＮ−γの産生のそれぞれを示すグラフである。
【図９−５】図９Ｆおよび図９Ｇは、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質を、ＰＢＭＣと、頭頸部がん（喉頭癌）細胞系との共培養物へと添加した場合における、ＣＤ８＋  Ｔ細胞上の、ＰＤ１受容体の占有、およびＩＦＮ−γの産生のそれぞれを示すグラフである。
【図９−６】図９Ｈおよび図９Ｉは、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在下における、ＰＢＭＣと、結腸直腸がん（結腸直腸腺癌）細胞との共培養物の上清中の、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２のそれぞれの濃度を描示するグラフである。
【図９−７】図９Ｊおよび図９Ｋは、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在下における、ＰＢＣＭと、頭頸部がん（喉頭癌）細胞との共培養物の上清中の、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２のそれぞれの濃度を描示するグラフである。
【図９−８】図９Ｌおよび９Ｍは、抗ＰＤ１単独と比較した、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在下における、結腸直腸がん（結腸直腸腺癌）細胞、または頭頸部がん（喉頭癌）細胞と、ＰＢＭＣとの、それぞれの３Ｄスフェロイド培養物中の、ＩＦＮ−γの産生を描示するグラフである。
【図１０】図１０Ａ〜１０Ｄは、組換えＴＧＦ−β１の存在下における、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質処置の、Ｔ細胞の増殖および活性化に対する効果を示す図である。
【図１１−１】図１１Ａ〜１１Ｆは、組換えＴＧＦ−β１の存在下、および抗ＰＤ１、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質、または対照抗体の存在下における、ＰＢＭＣによる、多様なサイトカインの発現を示す図である。
【図１１−２】同上。
【図１１−３】同上。
【図１２−１】図１２Ａは、結腸直腸がんについてのヒト化マウスモデルにおける、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、腫瘍増殖に対する、抗ＰＤ１単独と比較した効果を示す図である。
【図１２−２】図１２Ｂは、結腸直腸がんについてのヒト化マウスモデルにおいて、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質による処置が、腫瘍内の、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、Ｔｒｅｇに対する比を、有意に増大させることを示す図である。
【図１２−３】図１２Ｃは、結腸直腸がんについてのヒト化マウスモデルにおける、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質処置の、パーフォリン発現レベルに対する、抗ＰＤ１処置と比較した効果を示す図である。図１２Ｄおよび図１２Ｅは、結腸直腸がんについてのヒト化マウスモデルにおける、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質処置の、ＴＧＦ−β１濃度およびＴＧＦ−β２濃度のそれぞれに対する、抗ＰＤ１処置と比較した効果を示す図である。
【図１３−１】図１３Ａは、頭頸部がんについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質による処置が、ＩＦＮγの産生を、抗ＰＤ１処置と比較して、有意に改善したことを示す図である。図１３Ｂ〜１３Ｇは、多様な経路遺伝子についての発現解析により証拠立てられる通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質による処置が、Ｔ細胞機能を、有意に増大させることを示す図である。
【図１３−２】同上。
【図１３−３】同上。
【図１３−４】同上。
【図１４−１】図１４Ａは、頭頸部がんについてのヒト化マウスモデルにおける、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、腫瘍増殖に対する、抗ＰＤ１単独と比較した効果を示す図である。
【図１４−２】図１４Ｂは、頭頸部がんについてのヒト化マウスモデルで、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質による処置を、抗ＰＤ１単独またはアイソタイプ対照による処置と対比した場合における、腫瘍を保有するマウスの生存を示す図である。図１４Ｃは、頭頸部がんについてのヒト化マウスモデルにおける、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質で処置されたマウスの腫瘍内の、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、調節性Ｔ細胞に対する比を示す図である。
【図１４−３】図１４Ｄおよび１４Ｅ頭頸部がんについてのヒト化マウスモデルにおける、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、ＴＧＦ−β１濃度およびＴＧＦ−β２濃度に対する、抗ＰＤ１単独と比較した効果を示す図である。図１４Ｆは、頭頸部がんについてのヒト化マウスモデルにおける、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、ＩＦＮ−γの産生に対する効果を示す図である。
【図１５−１】図１５Ａ〜１５Ｂは、原発性結腸直腸がん患者試料における、抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、ＩＦＮ−γ産生およびＴＧＦ−β１濃度に対する効果を示す図である。
【図１５−２】図１５Ｃは、抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質と共に共培養された、原発性結腸直腸がん患者試料についての、遺伝子発現解析を示す図である。
【図１６】抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質についての、抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質と比較した、細胞傷害アッセイの結果を描示するグラフを示す図である。
【図１７】キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）Ｔ細胞と組み合わせた、抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質と、ＣＡＲ  Ｔ細胞と組み合わせた抗ＰＤ１と、ＣＡＲ  Ｔ細胞単独とを対比した、細胞傷害アッセイの結果を描示するグラフである。
【図１８】図１８Ａおよび１８Ｂは、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔと組み合わせた、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質についての細胞傷害アッセイ、およびＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔと組み合わせた、抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質についての細胞傷害アッセイの、それぞれの結果を描示するグラフである。
【図１９】図１９Ａおよび１９Ｂは、ＮＫ細胞と共培養した場合に、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質、および抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質のそれぞれを使用する、腫瘍細胞溶解を描示するグラフである。
【図２０】異なるリンカーを使用する、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質による、ＴＧＦ−ｂ１およびＰＤ１への、同時的な結合についてのＢｉａｃｏｒｅ解析を描示するグラフである。
【図２１】抗ＰＤ１  ＩｇＧ４−ＡＤＡ２による、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１間相互作用の遮断を示すグラフである。
【図２２】抗ＰＤ１  ｈＩｇＧ１−ＡＤＡ２、および抗ＰＤ１  ｈＩｇＧ４−ＡＤＡ２について測定された、ＡＤＡ２の酵素活性を示すグラフである。
【図２３−１】図２３Ａ〜２３Ｃは、抗ＰＤ１および抗ＰＤ１−ＡＤＡ２融合タンパク質の、多様な変異体の、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１間相互作用に対する効果を示すグラフを示す図である。
【図２３−２】同上。
【図２３−３】同上。
【図２４−１】図２４Ａ〜２４Ｆは、ＡＤＡの酵素活性により測定される、抗ＰＤ１−ＡＤＡ２融合タンパク質の、多様な変異体の酵素活性を示すグラフを示す図である。
【図２４−２】同上。
【図２４−３】同上。
【図２４−４】同上。
【図２５】ＡＤＡの酵素活性により測定される、抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２と対比した、抗ＰＤ１−ｍｕｔＡＤＡ２の酵素活性を示すグラフである。
【図２６−１】図２６Ａ〜２６Ｄは、抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２の変異体の、Ｔ細胞増殖に対する効果を描示するグラフを示す図である。
【図２６−２】同上。
【図２６−３】図２６Ｅは、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照と比較した、抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２による、ＩＦＮγの産生を描示するグラフである。
【図２７−１】図２７Ａ〜２７Ｂは、Ｔ細胞増殖の、アデノシン媒介性抑制を反転させる、ｗｔＡＤＡ２およびｍｕｔＡＤＡ２の有効性を描示するグラフを示す図である。
【図２７−２】同上。
【図２８】抗ＰＤ１−ＡＤＡ２融合タンパク質の変異体の、ＰＤ１−ＰＤＬ１間相互作用の遮断に対する効果を描示するグラフである。
【図２９】ＡＤＡの酵素活性により測定される、抗ＰＤ１−ＡＤＡ２−ｓｃＦｖ−Ｆｃの酵素活性を示すグラフである。
【図３０】ＡＤＡの酵素活性により測定される、抗ＰＤ１−ＡＤＡ２の変異体の酵素活性を示す棒グラフである。
【図３１】図３１Ａ〜３１Ｂは、抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２の、原発性ＣＲＣ患者の腫瘍内の、ＩＦＮ−γの産生、および腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の増殖に対する効果を描示するグラフを示す図である。
【図３２】抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２と対比した、抗ＰＤ１の、肺がんの腫瘍体積についてのヒト化マウスモデルに対する効果を描示するグラフである。
【図３３】図３３Ａ〜３３Ｃは、抗ＰＤ１−アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡ２）：抗ＰＤ１−ＡＤＡ２についての概略デザインを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００４８】
発明の詳細な説明
以下の記載および例は、本開示の実施形態について、詳細に例示する。
【００４９】
本開示は、本明細書で記載される特定の実施形態に限定されず、そのようなものとして、変動しうることを理解されたい。当業者は、本開示には、変動および改変がなされ、これらは、その範囲内に包含されることを認識するであろう。
【００５０】
全ての用語は、それらが、当業者により理解される通りに理解されることを意図する。そうでないことが規定されない限りにおいて、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同じ意味を有する。
【００５１】
本明細書で使用される節の小見出しは、構成上の目的だけのものであり、記載される主題を限定するものとみなすべきではない。
【００５２】
本開示の多様な特色は、単一の実施形態の文脈で記載しうるが、特色はまた、個別に提示される場合もあり、任意の適切な組合せで提示される場合もある。逆に、本明細書では、明確さのために、本開示を、個別の実施形態の文脈で記載しうるが、本開示はまた、単一の実施形態でも、実施することができる。
【００５３】
以下の定義は、当技術分野における定義を補完し、本出願へと方向付けられ、いかなる関連または非関連の案件、例えば、共同所有される、いかなる特許または出願にも帰属しない。本明細書で記載される方法および材料と、同様または同等である、任意の方法および材料を、本開示の試験の実施において使用しうるが、本明細書では、好ましい材料および方法について記載する。したがって、本明細書で使用される用語法は、特定の実施形態について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることを意図するものではない。
【００５４】
定義
本出願では、そうでないことが別段に言明されない限りにおいて、単数形の使用は、複数形を含む。本明細書で使用される通り、そうでないことが文脈により明確に指示されない限りにおいて、単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、および「その」は、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。
【００５５】
本出願では、そうでないことが言明されない限りにおいて、「または」の使用は、「および／または」を意味する。本明細書で使用される、「および／または」および「これらの任意の組合せ」という用語、ならびにそれらの文法的同等物は、互換的に使用することができる。これらの用語は、任意の組合せが、具体的に想定されることを伝達しうる。例示だけを目的として述べると、以下の、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはこれらの任意の組合せ」という語句は、「個別のＡ；個別のＢ；個別のＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；ＡおよびＣ；ならびにＡ、Ｂ、およびＣ」を意味しうる。文脈により、選言的使用が言及されない限りにおいて、「または」という用語は、接続的に使用することもでき、選言的に使用することもできる。
【００５６】
さらに、「〜を含むこと」という用語のほか、「〜を含む」、「〜を含む」、および「含まれた」など、他の形態の使用も、非限定的である。
【００５７】
本明細書における、「一部の実施形態」、「ある実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」への言及は、実施形態との関連で記載される、特定の特色、構造、または特徴が、本開示の、少なくとも一部の実施形態には含まれるが、全ての実施形態には、必ずしも含まれないことを意味する。
【００５８】
本明細書および特許請求の範囲で使用される「〜を含むこと（comprising）」（「〜を含む（comprise）」および「〜を含む（comprises）」など、「〜を含むこと（comprising）」の任意の形態）、「〜を有すること」（「〜を有する（have）」および「〜を有する（has）」など、「〜を有すること」の任意の形態）、「〜を含むこと（including）」（「〜を含む（include）」および「〜を含む（includes）」など、「〜を含むこと（including）」の任意の形態）、または「〜を含有すること」（「〜を含有する（contain）」および「〜を含有する（contains）」など、「〜を含有すること」の任意の形態）という語は、包含的またはオープンエンドであり、さらなる、列挙されていない要素または方法ステップを除外しない。本明細書で論じられる任意の実施形態は、本開示の任意の方法または組成物に関して実施することが可能であり、この逆も成り立つことが想定される。さらに、本開示の組成物を使用して、本開示の方法を達成することができる。
【００５９】
基準数値に関して、本明細書で使用される、「約」という用語、およびその文法的同等物は、数値自体、およびこの数値から±１０％の範囲の値を含みうる。
【００６０】
「約」または「およそ」という用語は、当業者により決定される、特定の値についての、許容可能な誤差範囲内であって、部分的に、値がどのようにして測定または決定されるのか、すなわち、測定系の限界に依存する誤差範囲内を意味する。例えば、「約」は、当技術分野における慣行に従い、１標準偏差または１標準偏差を超える範囲内を意味しうる。代替的に、「約」は、所与の値の、最大で２０％、例えば、最大で１０％、最大で５％、または最大で１％の範囲も意味しうる。別の例では、「約１０」の量は、１０および９〜１１の任意の量を含む。さらに別の例では、基準数値との関係における「約」という用語はまた、値±この値から１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲も含む。代替的に、特に、生物学的系または生物学的過程に関して、「約」という用語は、値の桁数内、好ましくは、５倍以内、より好ましくは２倍以内も意味しうる。特定の値を、本出願および特許請求の範囲において記載する場合、そうでないことが言明されない限りにおいて、特定の値について、許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語を仮定すべきである。
【００６１】
本明細書で使用される「ポリヌクレオチド」または「オリゴヌクレオチド」とは、リボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドである、任意の長さのヌクレオチドまたは核酸のポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造だけを指す。したがって、この用語は、二本鎖ＤＮＡおよび一本鎖ＤＮＡ、三重鎖ＤＮＡのほか、二本鎖ＲＮＡおよび一本鎖ＲＮＡも含む。この用語はまた、例えば、ポリヌクレオチドのメチル化および／またはキャッピングによる修飾形態、ならびにポリヌクレオチドの非修飾形態も含みうる。用語はまた、天然のものではないヌクレオチドまたは合成ヌクレオチドのほか、ヌクレオチド類似体を含む分子を含むことも意図する。
【００６２】
本明細書で使用される、「トランスフェクション」、「形質転換」、または「形質導入」とは、物理的方法または化学的方法を使用することによる、１または複数の外因性ポリヌクレオチドの、宿主細胞への導入を指す。本明細書で開示または想定される、ポリヌクレオチド配列およびベクターは、例えば、トランスフェクション、形質転換、または形質導入により、細胞へと導入されうる。当技術分野では、多くのトランスフェクション法が公知であり、例えば、リン酸カルシウムＤＮＡ共沈殿法（例えば、Murray E. J. (ed.), Methods in Molecular Biology, Vol. 7, Gene Transfer and Expression Protocols, Humana Press (1991)を参照されたい）；ＤＥＡＥ−デキストラン法；電気穿孔法；カチオン性リポソーム媒介性トランスフェクション法；タングステン粒子促進型遺伝子銃法（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)）;およびリン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈殿法（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）を含む。ファージベクターまたはウイルスベクターは、それらの多くが市販されている、適切なパッケージング細胞内で、感染性粒子を増殖させた後で、宿主細胞へと導入することができる。
【００６３】
本明細書で使用される、「ポリペプチド」、「ペプチド」、およびこれらの文法的同等物は、アミノ酸残基のポリマーを指す。ポリペプチドは、任意選択で、グリコシル化、または所与の細胞内環境内の、所与のタンパク質に典型的な、他の修飾を含みうる。本明細書で開示されるポリペプチドおよびタンパク質（これらの機能的部分および機能的変異体を含む）は、１または複数の、天然に存在するアミノ酸の代わりに、合成アミノ酸を含みうる。当技術分野では、このような合成アミノ酸が公知であり、例えば、アミノシクロヘキサンカルボン酸、ノルロイシン、α−アミノ−ｎ−デカン酸、ホモセリン、Ｓ−アセチルアミノメチルシステイン、ｔｒａｎｓ−３−ヒドロキシプロリンおよびｔｒａｎｓ−４−ヒドロキシプロリン、４−アミノフェニルアラニン、４−ニトロフェニルアラニン、４−クロロフェニルアラニン、４−カルボキシフェニルアラニン、β−フェニルセリン、β−ヒドロキシフェニルアラニン、フェニルグリシン、α−ナフチルアラニン、シクロヘキシルアラニン、シクロヘキシルグリシン、インドリン−２−カルボン酸、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、アミノマロン酸、アミノマロン酸モノアミド、Ｎ’−ベンジル−Ｎ’−メチルリシン、Ｎ’，Ｎ’−ジベンジルリシン、６−ヒドロキシリシン、オルニチン、α−アミノシクロペンタンカルボン酸、α−アミノシクロヘキサンカルボン酸、α−アミノシクロヘプタンカルボン酸、α−（２−アミノ−２−ノルボルナン）カルボン酸、α，γ−ジアミノ酪酸、α，β−ジアミノプロピオン酸、ホモフェニルアラニン、およびα−ｔｅｒｔ−ブチルグリシンを含む。本開示は、操作細胞内の、本明細書で記載されるポリペプチドまたはタンパク質の発現が、ポリペプチドまたはタンパク質の、１または複数のアミノ酸の翻訳後修飾と関連しうることをさらに想定する。翻訳後修飾の非限定例は、リン酸化、アセチル化およびホルミル化を含むアシル化、グリコシル化（Ｎ連結型およびＯ連結型を含む）、アミド化、ヒドロキシル化、メチル化およびエチル化を含むアルキル化、ユビキチン化、ピロリドンカルボン酸の付加、ジスルフィド架橋の形成、硫酸化、ミリストイル化、パルミトイル化、イソプレニル化、ファルネシル化、ゲラニル化、グリピオン化、リポイル化、およびヨード化を含む。
【００６４】
ポリペプチドの、２つの核酸配列またはアミノ酸配列の文脈において、本明細書で使用される、「同一」または「配列同一性」という用語およびその文法的同等物は、指定された比較域にわたり、最大の照応関係についてアライメントされた場合に同じである、２つの配列内の残基を指す。本明細書で使用される「比較域」とは、少なくとも約２０、通例、約５０〜約２００、より通例では、約１００〜約１５０の連続する位置によるセグメントであって、２つの配列を、最適にアライメントした後で、その中の配列を、同じ数の、連続する位置による基準配列と比較しうるセグメントを指す。当技術分野では、比較のための配列アライメント法が周知である。比較のための最適な配列アライメントは、Smith and Waterman, Adv. Appl. Math., 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズム；Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol., 48:443 (1970)のアライメントアルゴリズム；Pearson and Lipman, Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A., 85:2444 (1988)の類似性検索法；これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔｉｃｓ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ  Ｃａｌｉｆ．によるＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム内のＣＬＵＳＴＡＬ、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ（ＧＣＧ）、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．、Ｕ．Ｓ．Ａ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡを含むがこれらに限定されない）により行うことができ、ＣＬＵＳＴＡＬプログラムについては、Higgins and Sharp, Gene, 73:237-244 (1988)およびHiggins and Sharp, CABIOS, 5:151-153 (1989)、Corpet et al., Nucleic Acids Res., 16:10881-10890 (1988)、Huang et al., Computer Applications in the Biosciences, 8:155-165 (1992)、およびPearson et al., Methods in Molecular Biology, 24:307-331 (1994)により十分に記載されている。アライメントはまた、目視および手作業のアライメントにより実施されることも多い。実施形態の１つのクラスでは、本明細書のポリペプチドは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＰ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準ポリペプチドまたはこの断片と少なくとも８０％、８５％、９０％、９８％の９９％、または１００％同一である。同様に、核酸はまた、出発核酸に照らして記載することもでき、例えば、それらは、例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＮ（もしくはＣＬＵＳＴＡＬ、または他の任意の利用可能なアライメントソフトウェア）により測定される通り、基準核酸またはこの断片と５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９８％、９９％、または１００％同一でありうる。１つの分子が、大型の分子に対して、ある特定の百分率の配列同一性を有するという場合、これは、２つの分子が最適にアライメントされれば、小型の分子内の、百分率の残基は、２つの分子が最適にアライメントされた順序に従い、大型の分子内にマッチ残基を見出すことを意味する。
【００６５】
核酸配列またはアミノ酸配列に対して適用される「実質的に同一な」という用語およびその文法的同等物は、核酸配列またはアミノ酸配列が、上記で記載したプログラム、例えば、標準的なパラメータを使用するＢＬＡＳＴを使用する基準配列と比較して、少なくとも９０％の配列同一性、またはこれを超える配列同一性、少なくとも９５％、少なくとも９８％、および少なくとも９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。例えば、ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列のための）は、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ＝５、Ｎ＝−４、および両方の鎖の比較を使用する。アミノ酸配列のために、ＢＬＡＳＴＰプログラムは、デフォルトとして、３のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用する（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1992)を参照されたい）。配列同一性百分率は、２つの最適にアライメントされた配列を、比較域にわたり比較することにより決定し、比較域内のポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適なアライメントのために、基準配列（付加または欠失を含まない）と比較して、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含みうる。百分率は、同一な核酸塩基またはアミノ酸残基が、両方の配列内で生じる位置の数を決定して、マッチさせた位置の数を求め、マッチさせた位置の数を、比較域内の位置の総数で除し、結果に、１００を乗じて、配列同一性百分率を求めることにより計算する。一部の実施形態では、実質的な同一性は、少なくとも約５０残基の長さの配列の領域にわたり、少なくとも約１００残基の領域にわたり存在し、一部の実施形態では、配列は、少なくとも約１５０残基にわたり、実質的に同一である。一部の実施形態では、配列は、コード領域の全長にわたり、実質的に同一である。
【００６６】
「相同性」は一般に、２つまたはこれを超える核酸またはタンパク質（またはこれらの配列）の間の配列同一性から推定される。相同性を確立するのに有用な配列の間の同一性の、正確な百分率は、問題の核酸およびタンパク質と共に変動するが、少なくとも２５％の配列同一性を使用して、相同性を確立する。高レベルの配列同一性、例えば、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、もしくは９９％、またはこれを超える配列同一性もまた、相同性を確立するのに使用することができる。本明細書では、配列同一性百分率を決定するための方法（例えば、デフォルトパラメータを使用する、ＢＬＡＳＴＰおよびＢＬＡＳＴＮ）について記載するが、これらは、一般に利用可能である。核酸および／または核酸配列は、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、「相同」である。タンパク質および／またはタンパク質配列は、それらのコードＤＮＡが、天然または人工で、共通の先祖核酸または先祖核酸配列に由来する場合、「相同」である。相同な分子は、「相同体」と称されうる。例えば、任意の、天然に存在するタンパク質は、任意の、利用可能な突然変異誘発法により修飾されうる。発現させると、この突然変異核酸は、元の核酸によりコードされるタンパク質と相同なポリペプチドをコードする。
【００６７】
本明細書で使用される「単離」という用語およびその文法的同等物は、その天然環境からの核酸の摘出を意味する。本明細書で使用される「精製」という用語およびその文法的同等物は、分子または組成物が、天然から摘出されたもの（ゲノムＤＮＡおよびｍＲＮＡを含む）であれ、合成されたもの（ｃＤＮＡを含む）であれ、かつ／または検査室条件下で増幅されたのであれ、純度が増大しており、この場合、「純度」とは、相対的用語であり、「絶対純度」ではないことを意味する。一方、核酸およびタンパク質は、希釈剤またはアジュバントと共に製剤化される場合があるが、実際的な目的では、単離されているものとしうることを理解されたい。例えば、核酸は、細胞への導入のために使用する場合、許容可能な担体または希釈剤と混合することが典型的である。本明細書で使用される「実質的に精製された」という用語およびその文法的同等物は、核酸、ポリペプチド、タンパク質、または他の化合物が、天然では会合する、ポリヌクレオチド、タンパク質、ポリペプチド、および他の分子を本質的に含まない、すなわち、約５０％を超えて含まない、約７０％を超えて含まない、約９０％を超えて含まない、核酸配列、ポリペプチド、タンパク質または他の化合物を指す。
【００６８】
「発現ベクター」または「ベクター」とは、細胞内のポリヌクレオチドの複製の自律的単位として挙動する（すなわち、それ自身の制御下における複製が可能である）か、または宿主細胞の染色体への挿入により複製が可能となる、任意の遺伝子エレメント、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、トランスポゾンであって、接合させたセグメントの複製および／または発現をもたらすように、それへと、別のポリヌクレオチドセグメントを接合させた遺伝子エレメントである。適切なベクターは、プラスミド、トランスポゾン、バクテリオファージ、およびコスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターは、所望の宿主細胞中へのベクターのライゲーションまたは挿入を実施し、接合させたセグメントの発現を実施するのに必要なポリヌクレオチド配列を含有しうる。このような配列は、宿主生物に応じて異なり、転写を実施するプロモーター配列、転写を増加させるエンハンサー配列、リボソーム結合性部位の配列、および転写翻訳終結配列を含む。代替的に、発現ベクターは、ベクターの、宿主細胞のＤＮＡ配列へのライゲーションまたは組込みを伴わずに、その中でコードされる核酸配列の産物を、直接発現させることが可能でありうる。一部の実施形態では、ベクターは、宿主細胞内で複製することが可能であり、適切な選択的圧の存在下で、宿主細胞内のＤＮＡの染色体外セグメントとして存続する、「エピソーム発現ベクター」または「エピソーム」である（例えば、Conese et al., Gene Therapy, 11:1735-1742 (2004)を参照されたい）。代表的な、市販のエピソーム発現ベクターは、エプスタイン−バー核抗原１（ＥＢＮＡ１）およびエプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）複製起点（ｏｒｉＰ）を用いるエピソームプラスミドを含むがこれらに限定されない。ベクターである、ｐＲＥＰ４、ｐＣＥＰ４、ｐＲＥＰ７、ならびにＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｃａｒｌｓｂａｄ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐｃＤＮＡ３．１およびＳｔｒａｔａｇｅｎｅ（ＬａＪｏｌｌａ、Ｃａｌｉｆ．）製のｐＢＫ−ＣＭＶは、ＥＢＮＡ１およびｏｒｉＰの代わりに、Ｔ抗原およびＳＶ４０の複製起点を使用する、エピソームベクターの非限定的な例を表す。ベクターはまた、選択用マーカー遺伝子も含みうる。
【００６９】
本明細書で使用される「選択用マーカー遺伝子」という用語は、核酸配列を発現させる細胞を、対応する選択用薬剤の存在下で、これと順方向または逆方向に、特異的に選択することを可能とする核酸配列を指す。当技術分野では、適切な選択用マーカー遺伝子が公知であり、例えば、国際特許出願公開第１９９２／０８７９６号パンフレットおよび同第１９９４／２８１４３号パンフレット、Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 3567 (1980)、O’Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 1527 (1981)、Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78: 2072 (1981)、Colberre-Garapin et al., J. Mol. Biol., 150:1 (1981)、Santerre et al., Gene, 30: 147 (1984)、Kent et al., Science, 237: 901-903 (1987)、Wigler et al., Cell, 11: 223 (1977)、Szybalska & Szybalski, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 48: 2026 (1962)、Lowy et al., Cell, 22: 817 (1980)、ならびに米国特許第５，１２２，４６４号明細書および同第５，７７０，３５９号明細書において記載されている。
【００７０】
本明細書で使用される「コード配列」とは、タンパク質またはポリペプチドをコードするポリヌクレオチドのセグメントを指す。領域または配列には、５’末端の近傍では、開始コドンが結合し、３’末端の近傍では、終止コドンが結合する。コード配列はまた、オープンリーディングフレームと称することもできる。
【００７１】
本明細書で使用される「作動可能に連結された」とは、ＤＮＡセグメントの、別のＤＮＡセグメントへの、物理的な連結および／または機能的な連結であって、セグメントが、それらの意図される方式で機能することを可能とするような連結を指す。遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列は、それが、例えば、プロモーター、エンハンサー、および／またはサイレンサーなどの調節配列に、ＤＮＡ配列の転写のモジュレーションを、直接的または間接的に可能とする方式で連結されている場合に、調節配列に作動可能に連結されている。例えば、ＤＮＡ配列は、それが、プロモーターの転写開始部位に対して、下流において、転写開始部位に対して、適正なリーディングフレーム内で、プロモーターへとライゲーションされており、ＤＮＡ配列を通して、転写の伸長が進行することを可能とする場合に、プロモーターに作動可能に連結されている。エンハンサーまたはサイレンサーは、それが、それぞれ、ＤＮＡ配列の転写を増加または減少させるように、ＤＮＡ配列へとライゲーションされている場合に、遺伝子産物をコードするＤＮＡ配列に作動可能に連結されている。エンハンサーおよびサイレンサーは、ＤＮＡ配列のコード領域の上流に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もあり、この中に埋め込まれている場合もある。シグナル配列が、ポリペプチドの分泌に参与するプレタンパク質として発現する場合、シグナル配列のＤＮＡは、ポリペプチドをコードするＤＮＡに作動可能に連結されている。ＤＮＡ配列の、調節配列への連結は、典型的に、適切な制限部位におけるライゲーションにより、または当業者に公知の制限エンドヌクレアーゼを使用して、配列内に挿入された、アダプターまたはリンカーを介して達せられる。
【００７２】
本明細書で使用される「〜を誘導する」、「誘導」という用語、およびその文法的同等物は、転写調節因子によりもたらされる、核酸配列の転写、プロモーターの活性、および／またはプロモーターの発現の、何らかの基礎転写レベルと比べた上昇を指す。
【００７３】
「転写調節因子」という用語は、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を防止もしくは阻害するように作用する生化学的エレメント（例えば、リプレッサータンパク質または核阻害性タンパク質）、または、ある特定の環境条件下で、プロモーター駆動性ＤＮＡ配列の転写を可能とするか、もしくは刺激するように作用する生化学的エレメント（例えば、インデューサーまたはエンハンサー）を指す。
【００７４】
本明細書で使用される「エンハンサー」という用語は、例えば、それが作動可能に連結された核酸配列の転写を増大させるＤＮＡ配列を指す。エンハンサーは、核酸配列のコード領域から、何キロベースも離れて位置することが可能であり、調節因子の結合、ＤＮＡのメチル化パターン、またはＤＮＡ構造の変化を媒介しうる。当技術分野では、様々な異なる供給源に由来する、多数のエンハンサーが周知であり、クローニングされたポリヌクレオチドとして、またはクローニングされたポリヌクレオチド内で利用可能である（例えば、ＡＴＣＣなどの寄託先のほか、他の商業的供給源または個人的供給源から）。プロモーター（一般に使用されるＣＭＶプロモーターなど）を含む、多数のポリヌクレオチドはまた、エンハンサー配列も含む。エンハンサーは、コード配列の上流に位置する場合もあり、この中に位置する場合もあり、この下流に位置する場合もある。「Ｉｇエンハンサー」という用語は、免疫グロブリン（Ｉｇ）遺伝子座内にマップされるエンハンサー領域に由来するエンハンサーエレメント（このようなエンハンサーは、例えば、重鎖（ミュー）５’側エンハンサー、軽鎖（カッパ）５’側エンハンサー、カッパイントロンエンハンサーおよびミューイントロンエンハンサー、ならびに３’側エンハンサーを含む）を指す（一般に、Paul W. E. (ed), Fundamental Immunology, 3rd Edition, Raven Press, New York (1993), pages 353-363、および米国特許第５，８８５，８２７号明細書を参照されたい）。
【００７５】
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す。プロモーターは、ＤＮＡの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、上流に（センス鎖の５’側領域に向かって）位置する。あるプロモーターが、細胞内の全ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。本明細書で使用される「プロモーター活性」という用語およびその文法的同等物は、その活性が測定されるプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるＲＮＡ転写物の量を決定することにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接的に測定することもできる。
【００７６】
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結した遺伝子の発現が、生物または特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。誘導性プロモーターの非限定例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターを含む。誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの一部または遺伝子スイッチでありうる。
【００７７】
本明細書で使用される「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」とは、細胞媒介性免疫において、中心的な役割を果たす、リンパ球の種類である。「Ｔ細胞」または「Ｔリンパ球」は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）など、他のリンパ球と区別されうる。
【００７８】
本明細書で使用される、免疫グロブリン（Ｉｇ）としてもまた公知の、「抗体」という用語は、モノクローナル抗体の場合もあり、ポリクローナル抗体の場合もある。本明細書で使用される「モノクローナル抗体」という用語は、Ｂ細胞の単一のクローンにより産生され、同じエピトープに結合する抗体を指す。これに対し、「ポリクローナル抗体」とは、異なるＢ細胞により産生され、同じ抗原の、異なるエピトープに結合する抗体の集団を指す。抗体は、任意の動物由来でありうる。抗体は、ＩｇＧ（ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含む）、ＩｇＡ（ＩｇＡｌおよびＩｇＡ２を含む）、ＩｇＤ、ＩｇＥ、またはＩｇＭ、およびＩｇＹでありうる。一部の実施形態では、抗体は、単鎖全抗体を含む、全抗体でありうる。一部の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ（ＶＨおよびＣＨ１からなる）、Ｆｖ断片（ＶＨおよびＶＬからなる）、単鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、単鎖抗体、ジスルフィド連結された可変断片（ｄｓＦｖ）、およびＶＬドメインまたはＶＨドメインを含む断片を含みうるがこれらに限定されない、抗体の断片でありうる。全抗体は、典型的に、４つのポリペプチド：重（Ｈ）鎖ポリペプチドの２つの同一なコピー、および軽（Ｌ）鎖ポリペプチドの２つの同一なコピーからなる。重鎖の各々は、１つのＮ末端の可変（ＶＨ）領域と、３つのＣ末端の定常（ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３）領域とを含有し、各軽鎖は、１つのＮ末端の可変（ＶＬ）領域と、１つのＣ末端の定常（ＣＬ）領域とを含有する。軽鎖および重鎖の各対の可変領域は、抗体の抗原結合性部位を形成する。ＶＨ領域と、ＶＬ領域とは、各領域が、それらの配列が比較的保存されている、４つのフレームワーク領域を含む、共通の一般的な構造を有する。フレームワーク領域は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）により接続されている。ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３として公知である、３つのＣＤＲは、抗原への結合の一因となる、抗体の「超可変領域」を形成する。これらの特定の領域については、それらの全てが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977)およびKabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), by Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)、ならびにMacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)により記載されており、この場合、定義は、互いに対して比較された場合、重複するアミノ酸残基、またはアミノ酸残基のサブセットを含む。好ましくは、「ＣＤＲ」という用語は、配列の比較に基づき、Kabatにより規定されるＣＤＲである。ＣＤＲＨ１、ＣＤＲＨ２、およびＣＤＲＨ３は、重鎖ＣＤＲを表示し、ＣＤＲＬ１、ＣＤＲＬ２、およびＣＤＲＬ３は、軽鎖ＣＤＲを表示する。
【００７９】
本明細書では、「抗体の断片」、「抗体断片」、「抗体の断片」、「抗原結合性部分」という用語、またはこれらの文法的同等物を、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の、１または複数の断片または部分を意味するように、互換的に使用する（一般に、Holliger et al., Nat. Biotech., 23(9):1126-1129 (2005)を参照されたい）。抗体断片は、例えば、１もしくは複数のＣＤＲ、可変領域（またはこの部分）、定常領域（またはこの部分）、またはこれらの組合せを含むことが所望される。抗体断片の非限定例は、（１）ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、ＣＬドメイン、およびＣＨ１ドメインからなる一価断片である、Ｆａｂ断片；（２）ストーク領域におけるジスルフィド架橋により連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片である、Ｆ（ａｂ’）２断片；（３）抗体の単一のアームのＶＬドメインおよびＶＨドメインからなる、Ｆｖ断片；（４）２つのドメインを、単一のポリペプチド鎖として合成することを可能とするリンカーにより接合された、Ｆｖ断片の２つのドメイン（すなわち、ＶＬおよびＶＨ）からなる一価分子である、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）（例えば、Bird et al., Science, 242: 423-426 (1988); Huston et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 5879-5883 (1988); and Osbourn et al., Nat. Biotechnol., 16: 778 (1998)を参照されたい）；ならびに（５）各ポリペプチド鎖が、同じポリペプチド鎖上のＶＨとＶＬとの間の対合を可能とするには短すぎるペプチドリンカーにより、ＶＬへと接続されたＶＨを含み、これにより、２つの機能的な抗原結合性部位を有する二量体分子を作出するように、異なるＶＨ−ＶＬポリペプチド鎖上の相補的ドメインの間の対合を駆動する、ポリペプチド鎖の二量体である、ダイアボディーを含む。当技術分野では、抗体断片が公知であり、例えば、米国特許第８，６０３，９５０号明細書において、より詳細に記載されている。
【００８０】
「抗原認識部分」、「抗原認識ドメイン」、「抗原結合性ドメイン」、または「抗原結合性領域」とは、抗原に特異的に結合する分子または分子の部分を指す。一実施形態では、抗原認識部分は、抗体、抗体様分子、またはこれらの断片である。
【００８１】
「保存的アミノ酸置換」または「保存的突然変異」という用語は、１つのアミノ酸の、共通の特性を伴う、別のアミノ酸による置換えを指す。個別のアミノ酸の間の共通の特性を規定する、機能的な方式は、相同な生物の、対応するタンパク質の間の、アミノ酸変化の標準化頻度を解析することである（Schulz, G. E. and Schirmer, R. H., Principles of Protein Structure, Springer-Verlag, New York (1979)）。このような解析に従い、群内のアミノ酸が、互いと優先的に交換され、したがって、全体的なタンパク質構造に対するそれらの影響において、最も互いと相似する、アミノ酸群を規定することができる（Schulz, G. E. and Schirmer, R. H.、前出）。保存的突然変異の例は、上記の亜群内のアミノ酸のアミノ酸置換、例えば、正の電荷を維持しうるような、リシンによる、アルギニンの置換、およびこの逆の置換；負の電荷を維持しうるような、グルタミン酸による、アスパラギン酸の置換、およびこの逆の置換；遊離−ＯＨを維持しうるような、セリンによる、トレオニンの置換；ならびに遊離−ＮＨ２を維持しうるような、グルタミンによる、アスパラギンの置換を含む。代替的に、または加えて、機能的変異体は、少なくとも１つの非保存的アミノ酸置換を伴う、基準タンパク質のアミノ酸配列を含みうる。
【００８２】
「非保存的突然変異」という用語は、異なる群の間のアミノ酸置換、例えば、リシンによるトリプトファンの置換、またはフェニルアラニンによるセリンの置換などを伴う。この場合、非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性に干渉したり、これを阻害したりしないことが好ましい。非保存的アミノ酸置換は、機能的変異体の生物学的活性が、親タンパク質と比較して増大するように、機能的変異体の生物学的活性を増強しうる。
【００８３】
本明細書で言及される「増殖性疾患」とは、細胞の過剰な増殖および／または細胞マトリックスの過剰な代謝回転が、がんを含む疾患の発症機序に著明に寄与する、という統一的概念を指す。一部の実施形態では、増殖性疾患は、がんである。
【００８４】
本明細書で使用される「患者」または「対象」とは、がんなどの増殖性障害を伴うと診断されるか、またはこれを有するかもしくは発症することが疑われる哺乳動物対象を指す。一部の実施形態では、「患者」という用語は、がんなどの増殖性障害を発症する可能性が平均より高い哺乳動物対象を指す。例示的な患者は、ヒト、類人猿、イヌ、ブタ、ウシ、ネコ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、齧歯動物、および本明細書で開示される療法から利益を得うる、他の哺乳動物でありうる。例示的なヒト患者は、男性および／または女性でありうる。本明細書では、「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」を、例えば、がんであるが、これらに制約されない、疾患または障害を伴うと診断されているか、またはこれを有することか疑われる患者とみなす。
【００８５】
本明細書では、「〜を投与すること」は、本明細書で記載される、１または複数の組成物を、患者または対象に施すこととみなす。例を目的として、限定せずに述べると、組成物の投与、例えば、注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋内（ｉ．ｍ．）注射により実施することができる。１または複数のこのような経路を利用することができる。非経口投与は、例えば、ボーラス注射による場合もあり、時間経過にわたる、漸次的な灌流による場合もある。代替的に、または共時的に、投与は、経口経路による投与でありうる。加えて、投与はまた、ボーラスまたは細胞ペレットのデポ手術による場合もあり、医療用デバイスの設置による場合もある。ある実施形態では、本開示の組成物は、本明細書で記載される核酸配列を発現する操作細胞もしくは宿主細胞、または本明細書で記載される、少なくとも１つの核酸配列を含むベクターを、増殖性障害を処置または防止するのに有効な量で含みうる。医薬組成物は、本明細書で記載される標的細胞集団を、１または複数の、薬学的または生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて含みうる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩液、リン酸緩衝生理食塩液などの緩衝液；グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトールなどの炭水化物；タンパク質；ポリペプチドまたはグリシンなどのアミノ酸；抗酸化剤；ＥＤＴＡまたはグルタチオンなどのキレート剤；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含みうる。
【００８６】
本明細書で使用される「処置」、「〜を処置すること」という用語、またはそれらの文法的同等物は、所望の薬理学的効果および／または生理学的効果を得ることを指す。複数の実施形態では、効果は、治療的である、すなわち、効果は、疾患および／または疾患に帰せられうる有害症状を、部分的または完全に治癒させる。一部の実施形態では、「〜を処置すること」という用語は、疾患または状態「を防止すること」を含みうる。
【００８７】
本明細書で使用された、「処置間隔」とは、処置サイクル、例えば、規則的なスケジュールで繰り返されうる、例えば、治療剤の投与コースを指す。複数の実施形態では、投与量レジメンは、処置間隔の間に、治療剤の投与がない、１または複数の期間を有しうる。例えば、処置間隔は、第２の治療剤、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞の投与と組み合わせて（投与の前に、投与と共時的に、または投与の後で）投与される、融合タンパク質の、１回の投与を含みうる。
【００８８】
本明細書で使用される、「組み合わせて投与された」または「共投与」または「〜を共投与すること」または「〜を共に施すこと」という用語は、２つの（またはこれを超える）、異なる処置が、対象へと、対象の障害の罹患の経過中に送達されること、例えば、対象が、障害を伴うと診断された後で、障害が治癒もしくは消失するか、または処置が、他の理由で中止される前に、２つまたはこれを超える処置が送達されることを意味する。一部の実施形態では、投与に関して、重複がなされるように、第２の処置の送達が開始されてもなお、１つの処置の送達がなされる。本明細書では、場合によって、これは、「同時的送達」または「共時的送達」と称される。他の実施形態では、他の処置の送達が始まる前に、１つの処置の送達が終わる。いずれかの場合についての、一部の実施形態では、組合せ投与のために、処置は、より有効である。例えば、第２の処置は、より有効である、例えば、より低量の第２の処置で、同等の効果が見られるか、もしくは第２の処置は、第１の処置の非存在下で、第２の処置が投与された場合に見られるより、大きな程度で、症状を低減するか、または第１の処置についても、類似の状況が見られる。一部の実施形態では、送達は、症状の低減、または障害と関連する、他のパラメータの低減が、他の処置の非存在下で送達された、１つの処置により観察される低減より大きくなるようになされる。２つの処置の効果は、部分的に相加的な場合もあり、完全に相加的な場合もあり、相加的であることを超える場合もある。送達は、第２の処置が送達される時点で、第１の処置の効果が、なおも検出可能であるように送達されうる。
【００８９】
一部の実施形態では、第１の処置と、第２の処置とは、同じまたは個別の組成物により、同時に（例えば、同じ時点において）投与される場合もあり、逐次的に投与される場合もある。逐次的投与とは、さらなる処置、例えば、二次処置の投与の前（例えば、５、１０、１５、３０、４５、６０分間未満である、直前に；１、２、３、４、６、８、１０、１２、１６、２０、２４、４８、７２、９６時間、またはこれを超える期間；４、５、６、７、８、９日間、またはこれを超える期間；１、２、３、４、５、６、７、８週間、またはこれを超える期間の前に）における、１つの処置の投与を指す。第１の処置の投与および二次処置の投与の順序はまた、逆転される場合もある。
【００９０】
「治療有効量」、「治療的量」、「免疫学的有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍阻害有効量」という用語、またはそれらの文法的同等物は、所望の治療結果を達成するのに必要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。治療有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに１つまたは複数の対象において所望の応答を誘発する、本明細書で記載される組成物の能力などの因子に従い変動しうる。投与される、本開示の組成物の正確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍サイズ、感染または転移の程度、および状態の個別差を考慮して、医師により決定されうる。
【００９１】
代替的に、本明細書で記載される、１または複数の組成物の、患者または対象への投与の、薬理学的効果および／または生理学的効果は、「予防的」な場合もある、すなわち、効果は、疾患またはその症状を、完全に、または部分的に予防する場合もある。「予防有効量」とは、所望の予防結果（例えば、疾患の発症の防止）を達成するのに必要な投与量において、必要な期間にわたり有効な量を指す。
プログラム細胞死タンパク質、および他のチェックポイント阻害剤
【００９２】
ＰＤ−１またはＣＤ２７９（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ２７９）としてもまた公知の、プログラム細胞死タンパク質１は、免疫チェックポイントタンパク質である。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸は、腫瘍媒介性免疫回避を促進しうる。場合によって、ＰＤＬ−１は、腫瘍細胞、腫瘍微小環境内の、骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）、抗原提示細胞（ＡＰＣ）などのアクセサリー細胞により、過剰発現されうる。場合によって、ＰＤ−１は、「消耗」Ｔ細胞により上方調節される場合があり、そのリガンド（ＰＤＬ−１、ＰＤＬ２、およびＣＤ８０）に結合すると、エフェクターＴ細胞機能を抑制するように、シグナル伝達しうる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１による遮断は、消耗Ｔ細胞の機能を回復させ、腫瘍細胞の殺滅を促進しうる（図１）。
【００９３】
一部の実施形態では、ＰＤ−１阻害剤と、ＴＧＦ−βトラップとを含む融合タンパク質は、全長の、ニボルマブ（抗ＰＤ−１）、ＭＫ−３９４５（抗ＰＤ−１）、ペムブロリズマブ（抗ＰＤ−１）、ピジリズマブ（抗ＰＤ−１）、ＲＥＧＮ２８１０（抗ＰＤ−１）、ＡＭＰ−２２４（抗ＰＤ−１）、ＭＥＤＩ０６８０（抗ＰＤ−１）、ＰＤＲ００１（抗ＰＤ−１）、ＣＴ−００１（抗ＰＤ−１）、またはこれらの機能的断片もしくは変異体を含みうるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ニボルマブである。一部の実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ペムブロリズマブである。
【００９４】
融合タンパク質
一部の実施形態では、本明細書で提示される融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、リンカーを介して、サイトカイントラップへと融合されたＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−１抗体を含む。
【００９５】
一部の実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ＰＤ−１をターゲティングする抗体、または抗体の断片もしくは抗体の変異体でありうる。一部の実施形態では、ペムブロリズマブを含む融合タンパク質は、サイトカイントラップ（例えば、ＴＧＦ−βトラップ）へと融合されうる。一部の実施形態では、ニボルマブを含む融合タンパク質は、サイトカイントラップ（例えば、ＴＧＦ−βトラップ）へと融合されうる。
【００９６】
一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、上記で記載されたサイトカイントラップと、免疫チェックポイント遺伝子をターゲティングする、抗体、抗体の断片または変異体とを含む。一部の実施形態では、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、およびプログラム細胞死リガンド１（ＰＤＬ１）など、免疫チェックポイントをターゲティングする抗体、または抗体の断片もしくは抗体の変異体は、リンカーを介して、ＴＧＦ−βトラップ分子へと融合されうる。一部の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１阻害剤は、アテゾリズマブである。
【００９７】
一部の実施形態では、本明細書で提示される融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、本明細書で記載されるアデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）、またはこの機能的な変異体もしくは誘導体へと融合されたＰＤ１阻害剤またはＰＤ１抗体を含む。
【００９８】
サイトカイントラップ
サイトカインは、多くの生物学的過程に対して、影響を及ぼす。サイトカインの阻害は、例えば、がんにおいて、臨床的利益を有しうる。いくつかのサイトカインは、様々な疾患において、原因作用物質であることが示されている。このようなサイトカインは、ＩＬ−１、ＩＬ−４、Ｉｌ−６、ＴＮＦ−α、ＴＧＦ−ベータ、およびこれらの、多様なアイソフォームを含むがこれらに限定されない。本明細書で使用される「サイトカイントラップ」という用語は、サイトカイン作用の、遮断剤または中和剤を指す。このようなサイトカイントラップの例は、サイトカイン受容体の細胞外ドメイン、サイトカインに結合する抗体、およびサイトカインに結合するペプチド（例えば、阻害性ペプチド）を含みうるがこれらに限定されない。一実施形態では、サイトカインは、ＴＧＦ−βである。一実施形態では、サイトカインは、ＴＧＦ−β１である。一実施形態では、サイトカインは、ＴＧＦ−β３である。一実施形態では、サイトカインは、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３である。さらなる実施形態では、ＴＧＦ−βをターゲティングするサイトカイントラップ（例えば、ＴＧＦ−βトラップ）は、ＴＧＦ−βＲＩＩの細胞外ドメイン、またはこの変異体（例えば、配列番号１４１および１４２）、抗ＴＧＦ−β抗体、ならびにＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、および／またはＴＧＦ−β３の阻害性ペプチドを含みうる。
【００９９】
トランスフォーミング増殖因子
トランスフォーミング増殖因子β（ＴＧＦ−β）は、多くの細胞型における、増殖、分化、および他の機能を制御しうる、多機能なペプチドセットである。ＴＧＦ−βは、形質転換の誘導において、ＴＧＦ−αと共に、相乗作用的に作用しうる。ＴＧＦ−βはまた、負の自己分泌性増殖因子としても作用しうる。ＴＧＦ−βの活性化およびシグナル伝達の調節異常は、アポトーシスを結果としてもたらしうる。多くの細胞は、ＴＧＦ−βを合成することが可能であり、これらのうちのほとんど全ては、このペプチドに対する特異的受容体を有する。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３は全て、同じ受容体のシグナル伝達系を介して機能しうる。ＴＧＦ−β１は、免疫系の制御において、重要な役割を果たす場合があり、異なる種類の細胞上、または異なる発生段階にある細胞上で、異なる活性を示しうる。大半の免疫細胞（または白血球）は、ＴＧＦ−β１を分泌しうる。ＴＧＦ−β１は、前駆体タンパク質のＣ末端から、タンパク質分解性切断により導出される１１２アミノ酸残基のペプチドである。小型の分泌型ポリペプチドである、ＴＧＦ−βは、Ｉ型の二量体受容体（ＴＧＦβＲＩ）を動員し、リン酸化させうる、ＩＩ型のセリン／トレオニンキナーゼ二量体受容体（ＴＧＦβＲＩＩ）を介して、シグナル伝達しうる。ＴＧＦβＲＩは、細胞の増殖（ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ）、分化、アポトーシス、および増殖（ｇｒｏｗｔｈ）に関与する遺伝子を調節する転写因子でありうるＳＭＡＤをリン酸化し活性化させうる。多くの進行期がんは、ＴＧＦ−βおよびＴＧＦβＲの両方を、過剰発現し、浸潤性の腫瘍形成を促進することが公知である。ＴＧＦＢシグナル伝達経路の阻害は、がんの処置において、鍵となる治療戦略でありうる。
【０１００】
一部のＴ細胞（例えば、調節性Ｔ細胞）は、ＴＧＦ−β１を放出して、他のＴ細胞の作用を阻害しうる。活性化Ｔ細胞の、ＩＬ−１／ＩＬ−２依存性増殖、および休眠ヘルパーＴ細胞および細胞傷害性Ｔ細胞の活性化は、ＴＧＦ−β１の活性により防止されうる。同様に、ＴＧＦ−β１は、インターフェロン−γ、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦ−α）、および多様なインターロイキンを含むがこれらに限定されない、他の多くのサイトカインの分泌および活性を阻害しうる。ＴＧＦ−β１はまた、ＩＬ−２受容体など、サイトカイン受容体の発現レベルを低下させて、免疫細胞の活性を下方調節しうる。しかし、ＴＧＦ−β１はまた、Ｔ細胞内の、ある特定のサイトカインの発現を増大させる場合もあり、特に、細胞が、未成熟である場合、それらの増殖を促進しうる（図２）。
【０１０１】
ＴＧＦ−β１は、Ｂ細胞に対しても、同様の影響を及ぼす場合があり、これは、細胞の分化状態に従い変動しうる。ＴＧＦ−β１は、Ｂ細胞の増殖を阻害する場合があり、アポトーシスを刺激する場合があり、未成熟Ｂ細胞上および成熟Ｂ細胞上の、抗体、トランスフェリン、およびＭＨＣクラスＩＩタンパク質の発現の制御において、役割を果たしうる。
【０１０２】
ＴＧＦ−β１の、マクロファージおよび単球に対する効果は、主に、抑制性である場合があり、このサイトカインは、これらの細胞の増殖を阻害し、これらによる、反応性酸素（例えば、スーパーオキシド（Ｏ２−））中間体、および窒素（例えば、一酸化窒素（ＮＯ））中間体の産生を防止しうる。しかし、他の細胞型の場合と同様に、ＴＧＦ−β１はまた、骨髄由来の細胞に対して、逆の影響も及ぼしうる。例えば、ＴＧＦ−β１は、化学誘引物質として作用し、免疫応答を、一部の病原体へと方向付けることが可能であり；マクロファージおよび単球は、低レベルのＴＧＦ−β１に対して、走化的に応答しうる。さらに、単球性サイトカイン（ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、およびＴＮＦ−αを含む）の発現、およびマクロファージによる食細胞性殺滅も、ＴＧＦ−β１の作用により増大しうる（図２）。
【０１０３】
サイトカインファミリーのサブセットである、トランスフォーミング増殖因子−ベータＩＩＩ（ＴＧＦ−β３）は、細胞の増殖、胚形成、免疫系の調節、および分化を含む、多岐にわたる機能の一因となる。
【０１０４】
トランスフォーミング増殖因子β受容体ＩＩ（ＴＧＦβＲＩＩ）
ＴＧＦ−β受容体（ＴＧＦβＲ）とは、１回膜貫通型セリン／トレオニンキナーゼ受容体である。ＴＧＦβＲは、ホモ二量体の場合もあり、ヘテロ二量体の場合もある、いくつかの異なるアイソフォームで存在しうる。ＴＧＦ−βスーパーファミリー内で特徴づけられたリガンドの数が、公知の受容体の数を、はるかに超えることは、リガンドと受容体との相互作用がプロミスキャスであること（promiscuity）を示唆する。ＴＧＦ−βに特異的な、３つのＴＧＦ−βスーパーファミリー受容体（ＴＧＦβＲ）は、それらの構造および機能的特性により識別されうる。ＴＧＦβＲＩ（ＡＬＫ５）と、ＴＧＦβＲＩＩとは、同様なリガンド結合アフィニティーを有し、ペプチドマッピングだけによって、互いと識別される場合がある。ＴＧＦβＲＩおよびＴＧＦβＲＩＩのいずれも、ＴＧＦ−β１に対する高アフィニティーおよびＴＧＦ−β２に対する低アフィニティーを有しうる。ＴＧＦβＲＩＩＩ（β−グリカン）は、ホモ二量体であるＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２の両方に対して、高アフィニティーを有し、加えて、ヘテロ二量体であるＴＧＦ−β１，２に対しても、高アフィニティーを有する場合がある。ＴＧＦβ受容体はまた、ＴＧＦ−β３にも結合しうる。「ＴＧＦβＲＩＩ」または「ＴＧＦβ受容体ＩＩ」とは、野生型ヒト２型ＴＧＦβ受容体アイソフォームＡ配列を有するポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ参照配列（ＲｅｆＳｅｑ）受託番号：ＮＰ＿００１０２００１８（配列番号２８９）のアミノ酸配列、もしくは野生型ヒト２型ＴＧＦβ受容体アイソフォームＢ配列を有するポリペプチド（例えば、ＮＣＢＩ  ＲｅｆＳｅｑ受託番号：ＮＰ＿００３２３３（配列番号２９０）のアミノ酸配列、または配列番号２８９もしくは配列番号２９０のアミノ酸配列と、実質的に同一な配列を有する配列を意味する。ＴＧＦβＲＩＩは、野生型配列のＴＧＦβ結合活性のうちの、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２５％、３５％、５０％、７５％、９０％、９５％、または９９％を保持しうる。発現されたＴＧＦβＲＩＩのポリペプチドは、シグナル配列を欠く。
【０１０５】
ＴＧＦ−β１は、星細胞内および樹状細胞内の、ＭＨＣ  ＩＩの効能を低減する場合があり、これは、適切なヘルパーＴ細胞集団の活性化を低下させうる。ＴＧＦ−β１は、がんが進行するのに応じて、腫瘍増殖を促進する場合があり、一部の実施形態では、炎症性細胞応答を抑制しないが、調節性Ｔ細胞機能を促進しうる。ＴＧＦ−β１は、腫瘍細胞、腫瘍関連線維芽細胞、調節性Ｔ細胞、および未成熟骨髄細胞により産生されうる。ＴＧＦ−β１は、Ｔ細胞のプライミングを阻害し、消耗表現型を促進しうる。ＴＧＦ−β１は、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、および樹状細胞を含む、自然免疫細胞集団の抗腫瘍活性を抑制しうる。ＴＧＦ−β受容体ＩＩは、腫瘍関連骨髄細胞により上方調節される場合があり、転移を促進しうる。
【０１０６】
ＴＧＦ−βトラップ融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体
本明細書では、ＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−１抗体などの免疫チェックポイント阻害剤と、サイトカイン（例えば、ＴＧＦ−β）を中和しうるサイトカイントラップとを含む融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体が提示される。ある特定の場合には、サイトカイントラップは、配列番号１４２を含む、ＴＧＦ−βトラップ（また、ＴＧＦ−βＲＩＩ、またはこの断片もしくは変異体とも称される）でありうる。ＴＧＦ−βトラップの例は、受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、またはこの機能的な変異体もしくは誘導体、ＴＧＦ−β阻害性ペプチド（例えば、配列番号１９３〜２２７）、または抗ＴＧＦ−β抗体を含みうるがこれらに限定されない。一部の実施形態では、抗ＴＧＦ−β抗体は、配列番号１６６、１６８、１６９、１７１、１７３、１７５、または１７７のうちのいずれか１つから選択される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、抗ＴＧＦ−β抗体は、配列番号１６５、１６７、１７０、１７２、１７４、１７６、または１７８のうちのいずれか１つから選択される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。ある特定の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップは、ＴＧＦ−β１またはＴＧＦ−β２またはＴＧＦ−β３に特異的に結合するか、またはこれに対する高アフィニティーを有しうる。他の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップは、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３に特異的に結合するか、またはこれに対する高アフィニティーを有しうる。他の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップは、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に特異的に結合するか、またはこれに対する高アフィニティーを有しうる。さらなる実施形態では、ＴＧＦ−βトラップは、ＴＧＦ−β２に対するアフィニティーが低度であるか、またはこれに結合しない場合がある。
【０１０７】
本明細書で提示される融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体（例えば、ＴＧＦ−βトラップなどのサイトカイントラップへと融合させたＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−１抗体）は、例えば、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１と、免疫細胞上のＰＤ−１との間の相互作用の、同時的な遮断と、例えば、腫瘍微小環境内の、ＴＧＦ−βの中和とに起因する、相乗的抗腫瘍効果を誘発しうる。理論に束縛されずに述べると、この効果は、単一の分子実体による、２つの、主要な免疫逃避機構の、同時的な遮断と、腫瘍微小環境内の、ＴＧＦ−βの、ターゲティングされた枯渇とから得られる。この枯渇は、以下：（１）抗ＰＤ−１による、腫瘍細胞のターゲティング；（２）ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦｂＲＩＩ）による、腫瘍微小環境内のＴＧＦ−βへの結合；および／または（３）ＰＤ−Ｌ１受容体媒介性エンドサイトーシスを介する、ＴＧＦ−βの結合の破壊のうちの１または複数により達成されうる。本明細書で提示される融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体（例えば、ＴＧＦ−βトラップなどのサイトカイントラップへと融合させたＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−１抗体）はまた、ナチュラルキラー細胞媒介性の、腫瘍細胞の殺滅も促進しうる。
【０１０８】
（ｉ）ＴＧＦβＲＩＩトラップ融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体
一部の実施形態では、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体はまた、サイトカイントラップ、およびＰＤ−１阻害剤もしくは抗ＰＤ−１抗体、またはこれらの断片もしくは変異体も含む。一部の実施形態では、サイトカイントラップ（例えば、ＴＧＦ−βトラップ）を含む融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、任意選択で、切断可能リンカーまたは非切断可能リンカーを介して、ＰＤ−１阻害剤へと融合されている。一部の実施形態では、サイトカイントラップ（例えば、ＴＧＦ−βトラップ）は、サイトカイン受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）である。一部の実施形態では、本明細書で記載される融合タンパク質内の、サイトカイン受容体の配列は、受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、またはこの機能的な変異体もしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号１４に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体における、サイトカイン受容体配列は、配列番号１４のポリペプチド配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される融合タンパク質内の、サイトカイン受容体の配列は、受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、またはこの機能的な変異体もしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号１４１に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体における、サイトカイン受容体配列は、配列番号１４１のポリペプチド配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される融合タンパク質内の、サイトカイン受容体の配列は、受容体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、またはこの機能的な変異体もしくは誘導体を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦβＲＩＩの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）は、配列番号１４２に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体における、サイトカイン受容体配列は、配列番号１４２のポリペプチド配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体における、サイトカイン受容体配列は、ＴＧＦ−β１および／またはＴＧＦ−β３に結合するが、ＴＧＦ−β２に結合しない。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体における、サイトカイン受容体配列は、ＴＧＦ−β１だけに結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体における、サイトカイン受容体配列は、ＴＧＦ−β３だけに結合する。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体における、サイトカイン受容体配列は、ＴＧＦ−β１および／またはＴＧＦ−β３だけに結合し、ＴＧＦ−β２に対するアフィニティーが低度であるか、またはこれに対するアフィニティーを有さない。
【０１０９】
一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体は、ＴＧＦβＲＩＩまたはこれらの断片（例えば、ＴＧＦβＲＩＩのＥＣＤ）へと融合されている。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体部分は、リンカーを介して、ＴＧＦβＲＩＩまたはこれらの断片（例えば、ＴＧＦβＲＩＩのＥＣＤ）へと融合されている。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体部分は、ＴＧＦβＲＩＩの、少なくとも１つの細胞外ドメインへと融合されている。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体部分は、リンカーを介して、ＴＧＦβＲＩＩの、少なくとも１つの細胞外ドメインへと融合されている。
【０１１０】
一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体断片または変異体は、ＰＤ−１抗体の、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、（Ｆｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆｃ、ダイアボディー、トリアボディー、またはミニボディーである。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体断片は、ＰＤ−１抗体の、単一ドメイン抗体である。一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ＰＤ−１抗体の、ＶＮＡＲ断片またはＶＨＨ断片である。
【０１１１】
非限定的な、例示的融合タンパク質は、図４Ａ〜４Ｃに例示される。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップへと融合させた抗ＰＤ−１抗体、またはこの断片もしくは変異体を含む融合タンパク質は、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１と、免疫細胞上のＰＤ−１との間の相互作用の、同時的な遮断と、腫瘍微小環境内の、ＴＧＦ−βの中和とに起因する、相乗的抗腫瘍効果を誘発しうる。理論に束縛されずに述べると、この効果は、単一の分子実体による、２つの、主要な免疫逃避機構の、同時的な遮断と、腫瘍微小環境内の、ＴＧＦ−βの、ターゲティングされた枯渇とから得られる。この枯渇は、（１）ＰＤ−１による、腫瘍細胞のターゲティング；（２）ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）による、腫瘍微小環境内のＴＧＦ−βへの結合；および（３）ＰＤ−Ｌ１受容体媒介性エンドサイトーシスを介する、ＴＧＦ−βの結合の破壊により達成される。
【０１１２】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＨ）へと融合されている。他の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップは、ＰＤ−１抗体のＩｇＧ（例えば、図４Ａ）へと融合されている。ある特定の態様では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。ある実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ４である。別の実施形態では、ＩｇＧ４は、配列番号１４６（野生型）、配列番号２９１、配列番号２９２、または配列番号１４７（Ｓ１０８Ｐ）である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＨ）へと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ＶＨの定常領域へと融合されている。ＰＤ−１抗体、またはこの断片もしくは変異体の、ＶＨ配列の例は、配列番号１〜７および１４９〜１６４を含むがこれらに限定されない。ＰＤ−１抗体、またはこの断片もしくは変異体の、ＶＬ配列の例は、配列番号８〜１３および１４８を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、軽鎖の可変領域（ＶＬ）へと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ＶＬの定常領域へと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、軽鎖の可変領域（ＶＬ）へと融合されている。一態様では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＶＬ鎖もしくはＶＨ鎖、またはこれらの断片／変異体の、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０１１３】
「抗ＰＤ１（ＶＬ／ＶＨ）−ＴＧＦβＲＩＩ」または「抗ＰＤ１（ＶＨ／ＶＬ）−ＴＧＦβＲＩＩ」という用語は、互換的に使用され、融合タンパク質内で使用される、特異的なＶＬまたはＶＨを表示する。一実施形態では、「抗ＰＤ１（ＶＬ／ＶＨ）−ＴＧＦβＲＩＩ」または「抗ＰＤ１（ＶＨ／ＶＬ）−ＴＧＦβＲＩＩ」という用語は、抗ＰＤ１の重鎖の定常領域へと融合されたＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）を指すか、または、代替的に、抗ＰＤ１の軽鎖の定常領域へと融合されたＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）を指す。
【０１１４】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦａｂへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦａｂへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦａｂ２へと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦａｂ２へと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の（Ｆａｂ’）２へと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の（Ｆａｂ’）２へと融合されている。一態様では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）２の、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０１１５】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦｖへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦｖへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の（Ｆｖ）２へと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の（Ｆｖ）２へと融合されている。一態様では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｆｖまたは（Ｆｖ）２の、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０１１６】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のｓｃＦｖへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のｓｃＦｖへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のｓｃＦｖ−Ｆｃへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のｓｃＦｖ−Ｆｃへと融合されている。一態様では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−Ｆｃの、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０１１７】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦｃへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦｃへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｃ末端のＦｃへと連結されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｃ末端のＦｃへと連結されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｎ末端のＦｃへと連結されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｎ末端のＦｃへと連結されている。
【０１１８】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のダイアボディーへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のダイアボディーへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のトリアボディーへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のトリアボディーへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のミニボディーへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のミニボディーへと融合されている。一態様では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ミニボディーの、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０１１９】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＶＮＡＲへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＶＮＡＲへと融合されている。記載される、全ての実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ＶＮＡＲの、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０１２０】
一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＶＨＨへと融合されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＶＨＨへと融合されている。記載される、全ての実施形態では、ＴＧＦ−βトラップ（例えば、ＴＧＦβＲＩＩ）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ＶＨＨの、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０１２１】
一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体部分は、ＴＧＦβＲＩＩ、またはこの断片もしくは変異体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩのＥＣＤ）へと融合されている。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体部分は、リンカーを介して、ＴＧＦβＲＩＩ、またはこの断片もしくは変異体（例えば、ＴＧＦβＲＩＩのＥＣＤ）へと融合されている。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体部分は、ＴＧＦβＲＩＩの、少なくとも１つの細胞外ドメインへと融合されている。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体部分は、リンカーを介して、ＴＧＦβＲＩＩの、少なくとも１つの細胞外ドメインへと融合されている。非限定的な、例示的融合タンパク質は、図４Ａ〜４Ｃに例示される。
【０１２２】
一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体断片は、ＰＤ−１抗体の、Ｆａｂ、Ｆａｂ２、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、（Ｆｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆｃ、ダイアボディー、トリアボディー、またはミニボディーである。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体断片は、ＰＤ−１抗体の、単一ドメイン抗体である。一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ＰＤ−１抗体の、ＶＮＡＲ断片またはＶＨＨ断片である。
【０１２３】
一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号１〜７のうちのいずれか１つに示される、１または複数のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号１〜７および１４９〜１６４のうちのいずれか１つに示されるポリペプチド配列のうちのいずれか１つとの、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有する、１または複数のポリペプチド配列を含む。
【０１２４】
一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＬ）は、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される、１または複数のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＬ）は、配列番号８〜１３および１４８に示されるポリペプチド配列のうちのいずれか１つとの、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有する、１または複数のポリペプチド配列を含む。
【０１２５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１２６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号１６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０１２７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、配列番号１６に示される配列とを含む。
【０１２８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号１４３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０１２９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、配列番号１４３に示される配列とを含む。
【０１３０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号２９４に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０１３１】
ある実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、配列番号２９４に示される配列とを含む。
【０１３２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号１３に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号１３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１３３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２９６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号１４５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０１３４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２９６に示される配列と、配列番号１４５に示される配列とを含む。
【０１３５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２９６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号１４４に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０１３６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２９６に示される配列と、配列番号１４４に示される配列とを含む。
【０１３７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２９６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号２９５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０１３８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２９６に示される配列と、配列番号２９５に示される配列とを含む。
【０１３９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号１６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０１４０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号１４３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０１４１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号１４５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４５に示される配列を含む。
【０１４２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、リンカーと、配列番号１６に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号１５に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、リンカーと、配列番号１６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号１５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１４３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１４４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１４５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１４６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１４７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１４８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１４９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１５０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１５１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１５２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１５３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０１５４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１５５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１５６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１５７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１５８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１５９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１６０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１６１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５０に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５０に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１６２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５１に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５１に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１６３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５２に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１６４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５３に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１６５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５４に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５４に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１６６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５５に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１６７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５６に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１６８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１６９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１７０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５９に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５９に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１７１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６０に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６０に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１７２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６１に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６１に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１７３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６２に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１７４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６３に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１７５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６４に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６４に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０１７６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１７７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１７８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１０に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１０に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１７９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１８０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１８１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１８２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１８３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０１８４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０１８５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４３に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０１８６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４４に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４４に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０１８７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４５に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０１８８】
（ｉｉ）抗ＴＧＦβ抗体融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体
他の実施形態では、サイトカイントラップは、ＴＧＦ−βに対する抗体、抗体断片または抗体変異体である。このような実施形態では、このような抗体は、抗ＴＧＦβ汎中和抗体、または受容体の、ＴＧＦβ１、２、および／もしくは３への結合を遮断する、抗受容体抗体を含みうる。ある特定の実施形態では、抗体の断片または変異体は、ＴＧＦβ抗体の、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、（Ｆｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆｃ、ダイアボディー、トリアボディー、またはミニボディーである。一実施形態では、抗ＴＧＦ−β抗体、またはこの断片もしくは変異体は、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦ−β抗体、またはこの断片もしくは変異体は、ＴＧＦ−β１に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦ−β抗体、またはこの断片もしくは変異体は、ＴＧＦ−β３に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦ−β抗体、またはこの断片もしくは変異体は、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β２に結合する。ある特定の実施形態では、抗ＴＧＦ−β抗体、またはこの断片もしくは変異体は、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に結合する。ＴＧＦ−β抗体、またはこの断片もしくは変異体のＶＨ配列の例は、配列番号１６６、１６８、１６９、１７１、１７３、１７５、および１７７を含むがこれらに限定されない。ＴＧＦ−β抗体、またはこの断片もしくは変異体のＶＬ配列の例は、配列番号１６５、１６７、１７０、１７２、１７４、１７６、および１７８を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、抗ＴＧＦ−β抗体は、配列番号１６６、１６８、１６９、１７１、１７３、１７５、または１７７のうちのいずれか１つから選択される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、抗ＴＧＦ−β抗体は、配列番号１６５、１６７、１７０、１７２、１７４、１７６、または１７８のうちのいずれか１つから選択される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０１８９】
（ｉｉｉ）ＴＧＦ−βアンタゴニスト性ペプチド融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体
ある特定の実施形態では、サイトカイントラップは、ＴＧＦ−βアンタゴニスト性ペプチド、またはＴＧＦ−β阻害性ペプチドを含みうる。このようなペプチドは、ファージディスプレイを使用して、デノボで作出されうる。一実施形態では、このようなペプチドは、ＴＧＦ−βのアイソフォーム（複数可）またはＴＧＦ−β受容体（複数可）のセグメントに由来する場合があり、ＴＧＦ−βアンタゴニスト性ペプチドの例は、配列番号１９３〜２２７を含みうるがこれらに限定されない。ＴＧＦ−β阻害性ペプチドの例は、配列番号１９３〜２２７を含みうるがこれらに限定されない。一実施形態では、ペプチドは、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＶＨおよび／またはＶＬへと融合されうる。別の実施形態では、１つのペプチドは、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体へと融合されうる。さらなる実施形態では、１つを超えるペプチドは、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体へと融合されうる。１つを超えるペプチドが、利用される場合、ペプチドは、コンカタマーを形成するように、リンカーを伴って融合されている場合もあり、リンカーを伴わずに融合されている場合もある。１つを超えるペプチドが、利用される場合、コンカタマーを形成するのに、同じペプチドが使用されうる。代替的に、コンカタマーを形成するのに、２つまたはこれを超える、異なるペプチド組合せが使用されうる。
【０１９０】
アデノシン：
アデノシンは、腫瘍微小環境内で鍵となる免疫調節剤である。細胞外アデノシンは、大半の免疫細胞内で、主に発現される亜型である、Ａ２Ａアデノシン受容体（Ａ２ＡＲ）に結合すると、炎症性応答を抑制する。いくつかの腫瘍は、それぞれ、ＡＴＰおよびＡＤＰを、ＡＭＰへと転換し、ＡＭＰを、アデノシンへと、転換する一因となる、エクトヌクレオチダーゼであるＣＤ３９およびＣＤ７３を、高レベルで発現する。したがって、アデノシンは、Ｆｏｘｐ３、ＣＤ３９、およびＣＤ７３の発現を誘導することにより、調節性Ｔ細胞の抑制活性を促進する。加えて、低酸素状態も、ＣＤ３９およびＣＤ７３の誘導を介して、腫瘍微小環境内の、細胞外アデノシンの蓄積を誘導する。加えて、腫瘍微小環境内の、高レベルの細胞外アデノシンは、それぞれ、ヌクレオチド輸送体であるＥＮＴ−１の、低酸素状態誘導性因子（ＨＩＦ）依存性阻害、およびアデノシンの、細胞内腔内の再配置を防止し、ＡＭＰの形成を防止する、アデノシンキナーゼの阻害により維持される。したがって、腫瘍微小環境内の、細胞外アデノシンの低減をターゲティングすることは、免疫細胞機能を増強し、腫瘍細胞の殺滅を促進することであると理解される。
【０１９１】
本明細書の、ある実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）を含む融合タンパク質であって、腫瘍微小環境内の、細胞外アデノシンの低減をターゲティングする、融合タンパク質が提示される。
【０１９２】
アデノシンデアミナーゼ
アデノシンデアミナーゼ（また、アデノシンアミノヒドロラーゼまたはＡＤＡとしても公知である）ＡＤＡは、アデノシンを、不可逆的に脱アミノ化し、アミノ基の、ケトン基による置換を介して、これを、類縁のヌクレオシドである、イノシンへと転換する。次いで、イノシンは、これを、ヒポキサンチンへと転換するプリンヌクレオシドホスホリラーゼ（ＰＮＰ）と呼ばれる別の酵素により脱リボシル化される（リボースから除去される）。ＡＤＡは、食物からのアデノシンの分解、および組織内の核酸の代謝回転に必要とされる。ヒトにおける、その主要な機能は、免疫系の発生および維持である。しかし、ＡＤＡの、上皮細胞の分化、神経伝達、および妊娠の維持との関連もまた、観察されている。ＡＤＡの、２つのアイソフォーム：ＡＤＡ１およびＡＤＡ２が存在する。
【０１９３】
ＡＤＡ１は、大半の体細胞内、特に、リンパ球内およびマクロファージ内で見出され、ここで、ＡＤＡ１は、細胞質ゾルおよび核内に存在するだけでなく、また、ジペプチジルペプチダーゼ４（ＣＤ２６としても公知である）へと接合された、細胞膜上の細胞外形態としても存在する。ＡＤＡ１は、大部分、細胞内活性に関与し、小型形態（単量体）および大型形態（二量体）の両方で存在する。小型形態から、大型形態への相互転換は、肺内の「転換因子」により調節される。
【０１９４】
ＡＤＡ２は、ヒト脾臓内で、最初に同定された。その後、ＡＤＡ２は、マクロファージを含む、他の組織内でも見出され、ここで、ＡＤＡ２は、ＡＤＡ１と共存する。２つのアイソフォームは、アデノシンの、デオキシアデノシンに対する比を調節する。ＡＤＡ２は、主に、ヒトの血漿中および血清中で見出され、主に、ホモ二量体として存在する。ＡＤＡ２は、ヒト血漿中に存在する、主要形態であり、多くの疾患、特に、免疫系と関連する疾患：例えば、関節リウマチ、乾癬、およびサルコイドーシスにおいて増大しる。血漿中のＡＤＡ２アイソフォームはまた、大半のがんにおいても増大する。ＡＤＡ２は、遍在性ではなく、単球−マクロファージ内で、ＡＤＡ１と共に共存する。
【０１９５】
ＡＤＡ２融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体
本明細書では、ＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−１抗体などの免疫チェックポイント阻害剤と、アデノシンを中和しうる、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）とを含む融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体が提示される。本明細書で提示される融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体（例えば、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）へと融合させたＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−１抗体は、例えば、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１と、免疫細胞上のＰＤ−１との間の相互作用の、同時的な遮断と、例えば、腫瘍微小環境内の、アデノシンの中和とに起因する、相乗的抗腫瘍効果を誘発しうる。理論に束縛されずに述べると、この効果は、単一の分子実体による、２つの、主要な免疫逃避機構の、同時的な遮断、および腫瘍微小環境内の、アデノシンの、ターゲティングされた枯渇から得られる。この枯渇は、以下：（１）抗ＰＤ−１による、腫瘍細胞のターゲティング；（２）アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）による、腫瘍微小環境内のアデノシンへの結合；および（３）ＰＤ−Ｌ１受容体媒介性エンドサイトーシスを介する、アデノシンの結合の破壊のうちの１または複数により達成されうる。
【０１９６】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、また、ＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−１抗体、またはこの断片もしくは変異体も含む融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の一部である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）を含む融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、任意選択で、切断可能リンカーまたは非切断可能リンカーを介して、ＰＤ−１阻害剤へと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡ２）である。一部の実施形態では、本明細書で記載される融合タンパク質は、本明細書で記載される、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）、またはこの機能的な変異体もしくは誘導体を含む。ＡＤＡ２および変異体の例については、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、ＷＯ２０１６０６１２８６において記載されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βサイトカイントラップは、ＡＤＡ２突然変異体１、ＡＤＡ２突然変異体２、ＡＤＡ２突然変異体３、ＡＤＡ２突然変異体４、ＡＤＡ２突然変異体５、ＡＤＡ２突然変異体６、またはＡＤＡ２突然変異体７のうちのいずれか１つを含む。一部の実施形態では、本明細書で提示される融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、リンカーを介して、ＡＤＡタンパク質、またはこの機能的な断片へと融合されたＰＤ−１阻害剤またはＰＤ−１抗体を含む。一部の実施形態では、ＰＤ−１阻害剤は、ＰＤ−１をターゲティングする抗体、または抗体の断片もしくは変異体でありうる。
【０１９７】
一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、配列番号２８４のポリペプチド配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、配列番号２７３のポリペプチド配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、配列番号２７４のポリペプチド配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、配列番号３７２７５のポリペプチド配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、配列番号２７６のポリペプチド配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、配列番号２７７のポリペプチド配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、配列番号２７８のポリペプチド配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、配列番号２７９のポリペプチド配列との、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有するポリペプチド配列を含む。
【０１９８】
一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、上記で記載された、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）と、免疫チェックポイント遺伝子をターゲティングする、抗体、抗体の断片または変異体を含む。一部の実施形態では、細胞傷害性Ｔリンパ球関連タンパク質４（ＣＴＬＡ−４）、およびプログラム細胞死１（ＰＤ−１）などの免疫チェックポイントをターゲティングする、抗体、または抗体の断片もしくは変異体は、リンカーを介して、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）分子へと融合されうる。
【０１９９】
一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体部分は、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）、またはこの断片へと融合されている。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体部分は、リンカーを介して、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）へと融合されている。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体部分は、ＡＤＡ２の、少なくとも１つのドメインへと融合されている。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体部分は、リンカーを介して、ＡＤＡ２の、少なくとも１つのドメインへと融合されている。
【０２００】
一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体断片または変異体は、ＰＤ−１抗体の、Ｆａｂ、（Ｆａｂ）２、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、（Ｆｖ）２、ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ−Ｆｃ、Ｆｃ、ダイアボディー、トリアボディー、またはミニボディーである。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体断片は、ＰＤ−１抗体の、単一ドメイン抗体である。一部の実施形態では、単一ドメイン抗体は、ＰＤ−１抗体の、ＶＮＡＲ断片またはＶＨＨ断片である。
【０２０１】
非限定的な、例示的融合タンパク質は、図３３Ａ〜３３Ｃに例示される。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）へと融合させた抗ＰＤ−１抗体、またはこの断片もしくは変異体を含む融合タンパク質は、腫瘍細胞上のＰＤ−Ｌ１と、免疫細胞上のＰＤ−１との間の相互作用の、同時的な遮断と、腫瘍微小環境内の、細胞外アデノシンの低減のターゲティングとに起因する相乗的抗腫瘍効果を誘発しうる。
【０２０２】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＨ）へと融合されている。他の実施形態では、アデノシンデアミナーゼは、ＰＤ−１抗体のＩｇＧ（例えば、図４ａ）へと融合されている。ある特定の態様では、ＩｇＧは、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４である。ある実施形態では、ＩｇＧは、ＩｇＧ４である。別の実施形態では、ＩｇＧ４は、配列番号１４６（野生型）、配列番号２９１、配列番号２９２、または配列番号１４７（Ｓ１０８Ｐ）である。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＨ）へと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ＶＨの定常領域へと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、軽鎖の可変領域（ＶＬ）へと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、軽鎖の可変領域（ＶＬ）へと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ＶＬの定常領域へと融合されている。一態様では、アデノシンデアミナーゼは、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ＶＨまたはＶＬの、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０２０３】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦａｂへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦａｂへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の（Ｆａｂ）２へと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の（Ｆａｂ）２へと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の（Ｆａｂ’）２へと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の（Ｆａｂ’）２へと融合されている。一態様では、アデノシンデアミナーゼは、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ）２の、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０２０４】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦｖへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦｖへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の（Ｆｖ）２へと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の（Ｆｖ）２へと融合されている。一態様では、アデノシンデアミナーゼは、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｆｖまたは（Ｆｖ）２の、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０２０５】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のｓｃＦｖへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のｓｃＦｖへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のｓｃＦｖ−Ｆｃへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のｓｃＦｖ−Ｆｃへと融合されている。一態様では、アデノシンデアミナーゼは、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ｓｃＦｖまたはｓｃＦｖ−Ｆｃの、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０２０６】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦｃへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＦｃへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｃ末端のＦｃへと連結されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｃ末端のＦｃへと連結されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｎ末端のＦｃへと連結されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、Ｎ末端のＦｃへと連結されている。
【０２０７】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のダイアボディーへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のダイアボディーへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のトリアボディーへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のトリアボディーへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のミニボディーへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のミニボディーへと融合されている。
【０２０８】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＶＮＡＲへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＶＮＡＲへと融合されている。一態様では、アデノシンデアミナーゼは、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ＶＮＡＲの、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０２０９】
一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＶＨＨへと融合されている。一部の実施形態では、アデノシンデアミナーゼ（例えば、ＡＤＡ２）は、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体のＶＨＨへと融合されている。一態様では、アデノシンデアミナーゼは、リンカーを介して、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、ＶＨＨの、Ｎ末端またはＣ末端へと融合されている。
【０２１０】
一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号１〜７のうちのいずれか１つに示される、１または複数のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＨ）は、配列番号１〜７および１４９〜１６４に示されるポリペプチド配列のうちのいずれか１つとの、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有する、１または複数のポリペプチド配列を含む。
【０２１１】
一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＬ）は、配列番号８〜１３および１４８のうちのいずれか１つに示される、１または複数のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、ＰＤ−１抗体、またはこの断片／変異体の、重鎖の可変領域（ＶＬ）は、ポリペプチド配列番号８〜１３、および１４８に示される配列のうちのいずれか１つとの、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％の同一性を有する、１または複数のポリペプチド配列を含む。
【０２１２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号１２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０２１３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号２８０に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０２１４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２に示される配列と、配列番号２８０に示される配列とを含む。
【０２１５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号２８１に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０２１６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２に示される配列と、配列番号２８１に示される配列とを含む。
【０２１７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号１３に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号１３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０２１８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号２８２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０２１９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３に示される配列と、配列番号２８２に示される配列とを含む。
【０２２０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列と、配列番号２８３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である配列とを含む。
【０２２１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３に示される配列と、配列番号２８３に示される配列とを含む。
【０２２２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２２３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２２４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２２５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号４に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２２６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２２７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２２８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号７に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２２９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２３０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５０に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５０に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２３１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５１に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５１に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２３２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５２に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２３３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５３に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２３４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５４に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５４に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２３５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５５に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２３６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５６に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５６に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２３７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２３８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２３９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５９に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５９に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２４０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６０に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６０に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２４１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６１に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６１に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２４２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６２に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２４３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６３に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２４４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６４に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１６４に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２４５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２４６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号９に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２４７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１０に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１０に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２４８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１１に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２４９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２５０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２５１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２５２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０２５３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８０に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８０に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０２５４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８１に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８１に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０２５５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８２に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８２に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０２５６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８３に示されるポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号２８３に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一であるポリペプチド配列を含む。
【０２５７】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０２５８】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０２５９】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０２６０】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）と、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）とを含む。
【０２６１】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号５に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２６２】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１４９に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２６３】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５７に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２６４】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２６５】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示されるポリペプチド配列を含む、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号１５８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、重鎖の可変領域（ＶＨ）を含む。
【０２６６】
一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８に示されるポリペプチド配列を含む、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質は、配列番号８に示される配列と、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、または１００％同一である、軽鎖の可変領域（ＶＬ）を含む。
【０２６７】
リンカー
一部の実施形態では、リンカーは、配列番号１７〜３４のうちのいずれか１つに示される、１または複数のポリペプチド配列を含む。一部の実施形態では、リンカーは、可撓性リンカーでありうる。可撓性リンカーは、接合されるドメインが、ある程度の移動または相互作用を必要とする場合に適用することができる。可撓性リンカーは、小型、非極性（例えば、Ｇｌｙ）、または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）のアミノ酸から構成されうる。可撓性リンカーは、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基の連なりから主になる配列（「ＧＳ」リンカー）を有しうる。可撓性リンカーの、非限定例は、（Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）ｎ［ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０でありうる］の配列を有しうる。コピー数である「ｎ」を調整することにより、機能的ドメインの適切な分離を達成するように、この例示的ＧＳリンカーの長さが最適化される場合もあり、必要なドメイン間相互作用を維持するように、この例示的ＧＳリンカーの長さが最適化される場合もある。ＧＳリンカーのほかに、他の可撓性リンカーも、組換え融合タンパク質に利用されうる。一部の実施形態では、可撓性リンカーは、（Ｇｌｙ）ｎ［ｎは、６、７、または８でありうる］の配列を有しうる。場合によって、可撓性リンカーはまた、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合もあるが、可撓性を維持するように、ＴｈｒおよびＡｌａなど、さらなるアミノ酸を含有する場合もある。場合によって、本明細書で記載されるリンカーは、非可撓性リンカーでありうる。非可撓性リンカーは、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体のドメイン間で、一定の距離を維持するのに利用されうる。非可撓性リンカーの例は、少数を挙げれば、アルファヘリックス形成リンカー、Ｐｒｏに富む配列、（ＸＰ）ｎ、Ｘ−Ｐｒｏ骨格、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１〜６）でありうる。非可撓性リンカーは、場合によって、αヘリックス構造を取ることにより、または複数のＰｒｏ残基を含有することにより、比較的剛直な構造を呈しうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体における、ＰＤ−１阻害剤などの免疫チェックポイント阻害剤と、サイトカイン（例えば、ＴＧＦ−β）を中和しうる、サイトカイントラップ（例えば、ＴＧＦ−βトラップ）とは、介在するリンカーポリペプチドをコードする、介在配列により隔てられうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体における、ＰＤ−１阻害剤などの免疫チェックポイント阻害剤と、ＡＤＡ２（またはこの突然変異体）とは、介在するリンカーポリペプチドをコードする、介在配列により隔てられうる。ある特定の実施形態では、リンカーポリペプチドは、下記の表：
【０２６８】
【表１】
2021531754.tif 000003
に開示された、リンカーポリペプチドを含む。
【０２６９】
一部の実施形態では、リンカーは、可撓性リンカー、非可撓性リンカー、ｉｎ  ｖｉｖｏ切断可能リンカー、またはこれらの任意の組合せでありうる。場合によって、リンカーは、機能的ドメインを、併せて連結する（可撓性リンカーおよび非可撓性リンカーの場合のように）場合もあり、ｉｎ  ｖｉｖｏ切断可能リンカーの場合のように、機能的ドメインを、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて放離する場合もある。一部の実施形態では、リンカーは、生物学的活性を改善し、発現収率を増大させることが可能であり、所望の薬物動態を達成しうる。一部の実施形態では、リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエーテルも含みうる。
【０２７０】
場合によって、本明細書で記載されるリンカー配列は、可撓性リンカーを含みうる。可撓性リンカーは、接合されるドメインが、ある程度の移動または相互作用を要求する場合に適用されうる。可撓性リンカーは、小型、非極性（例えば、Ｇｌｙ）、または極性（例えば、ＳｅｒまたはＴｈｒ）のアミノ酸から構成されうる。可撓性リンカーは、Ｇｌｙ残基およびＳｅｒ残基の連なりから主になる配列（「ＧＳ」リンカー）を有しうる。可撓性リンカーの例は、（Ｇ４Ｓ）ｎ［式中、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である］の配列を有しうる。一部の実施形態では、可撓性リンカーは、（Ｇｌｙ）ｎ［ｎは、６、７、または８でありうる］の配列を有しうる。場合によって、可撓性リンカーはまた、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合もあるが、可撓性を維持するように、ＴｈｒおよびＡｌａなど、さらなるアミノ酸を含有する場合もある。他の場合には、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性アミノ酸が、可溶性を改善するのに使用されうる。コピー数である「ｎ」を調整することにより、機能的ドメインの適切な分離を達成するように、これらの、非限定な、例示的リンカーの長さが最適化される場合もあり、必要なドメイン間相互作用を維持するように、これらの、非限定な、例示的リンカーの長さが最適化される場合もある。ＧＳリンカーのほかに、他の可撓性リンカーも、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体に利用されうる。場合によって、可撓性リンカーはまた、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合もあるが、可撓性を維持するように、ＴｈｒおよびＡｌａなど、さらなるアミノ酸を含有する場合もある。他の場合には、ＬｙｓおよびＧｌｕなどの極性アミノ酸を使用して、可溶性を改善することができる。
【０２７１】
本明細書で記載されるリンカー配列内に組み入れられる可撓性リンカーは、良好な可撓性および可溶性をもたらすように、ＧｌｙおよびＳｅｒなど、小型アミノ酸または極性アミノ酸に富む場合がある。可撓性リンカーは、ある特定の移動または相互作用が、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体のドメインに所望される場合に、適切な選択でありうる。加えて、可撓性リンカーは、非可撓性構造を有さないが、機能的ドメイン間の距離を保持する、受動的リンカーとして用いられる場合もある。可撓性リンカーの長さは、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の、適正なフォールディングを可能とするように調整される場合もあり、最適な生物学的活性を可能とするように調整される場合もある。
【０２７２】
本明細書で記載されるリンカーは、場合によって、非可撓性リンカーをさらに含みうる。非可撓性リンカーは、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体のドメイン間で、一定の距離を維持するのに利用されうる。非可撓性リンカーの例は、少数を挙げれば、アルファヘリックス形成リンカー、Ｐｒｏに富む配列、（ＸＰ）ｎ、Ｘ−Ｐｒｏ骨格、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１〜６）でありうる。非可撓性リンカーは、場合によって、αヘリックス構造を取ることにより、または複数のＰｒｏ残基を含有することにより、比較的剛直な構造を呈しうる。
【０２７３】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるリンカーは、切断可能リンカーでありうる。他の場合に、リンカーは、切断可能ではない。切断可能でないリンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏ過程またはｅｘ  ｖｉｖｏ過程を通して、１つの分子として作用するように、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の機能的ドメインを、共有結合的に、一体に接合しうる。リンカーはまた、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいても切断可能でありうる。切断可能リンカーは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、遊離の機能的ドメインを放出させるように導入することができる。切断可能リンカーは、少数を挙げれば、還元試薬、プロテアーゼの存在により切断することができる。例えば、ジスルフィド結合の還元を用いて、切断可能リンカーを作製することができる。ジスルフィドリンカーの場合、グルタチオンなど、チオールとのジスルフィド交換を介する切断イベントが、切断をもたらしうるであろう。他の場合には、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける、組換え融合タンパク質内のリンカーの切断はまた、ｉｎ  ｖｉｖｏの、病理学的状態（例えば、がんまたは炎症）下、特異的な細胞内または組織内で発現する場合もあり、ある特定の細胞区画内に拘束される場合もある、プロテアーゼによっても実行されうる。場合によって、切断可能リンカーは、切断のターゲティングを可能としうる。例えば、多くのプロテアーゼの特異性は、拘束区画内のリンカーの緩徐な切断をもたらしうる。切断可能リンカーはまた、ヒドラゾン、ペプチド、ジスルフィド、またはチオエーテル（thioesther）も含みうる。例えば、ヒドラゾンは、血清中の安定性を付与しうる。他の場合には、ヒドラゾンは、酸性区画内の切断を可能としうる。酸性区画は、最大で７のｐＨを有しうる。リンカーはまた、チオエーテルも含みうる。チオエーテルは、非還元性でありうる。チオエーテルは、細胞内タンパク質分解のためにデザインすることができる。
【０２７４】
場合によって、リンカーは、操作リンカーでありうる。例えば、リンカーは、疎水性などの化学的特徴を含むようにデザインされうる。場合によって、少なくとも２つの、異なる、リンカーポリペプチド配列は、同じポリペプチドリンカー配列をコードしうる。リンカーをデザインする方法は、コンピュータ計算による方法でありうる。場合によって、コンピュータ計算による方法は、グラフ法を含みうる。コンピュータ計算法を使用して、データベースから導出された三次元ペプチド構造のライブラリーから、適切なペプチドを検索することができる。例えば、Ｂｒｏｏｋｈａｖｅｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｄａｔａ  Ｂａｎｋ（ＰＤＢ）を使用して、リンカーの選択されたアミノ酸の間の間隔の距離を測ることができる。場合によって、ポリペプチドリンカーはまた、１または複数のＧＳリンカー配列、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＧＳ）ｎ、（ＳＧ）ｎ、（ＧＳＧ）ｎ、および（ＳＧＳＧ）ｎ［ｎは、０〜１５の、任意の数でありうる］も含みうる。
【０２７５】
がんを処置する方法
本明細書ではまた、ＰＤ−１阻害剤などの免疫チェックポイント阻害剤と、サイトカイン（例えば、ＴＧＦ−β）を中和しうる、サイトカイントラップ（例えば、ＴＧＦ−βトラップ）とを含む融合タンパク質により、がんを処置する方法も提示される。本明細書ではまた、ＰＤ−１阻害剤などの免疫チェックポイント阻害剤と、アデノシンデアミナーゼタンパク質とを含む融合タンパク質により、がんを処置する方法も提示される。ＰＤ１およびＰＤ−Ｌ１／２によるシグナル伝達経路、ならびにＣＴＬＡ−４およびＣＤ８０／８６によるシグナル伝達経路など、免疫チェックポイント経路の遮断をターゲティングするモノクローナル抗体の開発は、がん処置を革新し、黒色腫、非小細胞肺がん、腎細胞癌、膀胱がん、頭頸部扁平上皮がん、高頻度ＭＳＩ結腸直腸癌、メルケル細胞癌腫、およびホジキンリンパ腫を含むがこれらに限定されない、いくつかのがん適応において、持久性の臨床活性を裏付けている。持久性の応答にもかかわらず、応答率は、極めて低度にとどまり、いくつかの患者は、疾患の進行をもたらす耐性を発症している。さらに、卵巣、胃食道、前立腺、膵臓、および他の多くのがんなど、いくつかの適応では、チェックポイント阻害剤は、いかなる、実質的な臨床応答を示すことにも失敗している。
【０２７６】
チェックポイント遮断の失敗は、腫瘍微小環境内に存在する、免疫抑制因子の複雑性に帰せられうる。これらの因子は、骨髄由来抑制細胞、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）などの抑制細胞；抑制性サイトカイン、およびＴＧＦ−βなどの増殖因子、およびインターロイキン１０（ＩＬ−１０）；ならびにアデノシンおよびインドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ（ＩＤＯ）の副産物などの代謝誘導体を含みうるがこれらに限定されない。本明細書で提示される、抗ＰＤ１−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質は、腫瘍微小環境内の、２つの、負の抑制性経路をターゲティングしうる治療の例である。これらの経路は、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１間相互作用が、主要な役割を果たしうる、腫瘍細胞により媒介される、免疫との、細胞内在性相互作用と、ＴＧＦ−βが、卓越したメンバーでありうる、免疫抑制性サイトカインにより媒介される、細胞外在性相互作用とを含みうる。
【０２７７】
一部の実施形態では、がんは、神経膠芽腫、結腸直腸がん、胃がん、子宮頸がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、乳がん、および腎がんであるが、これらに限定されない。加えて、本明細書で記載される融合タンパク質は、チェックポイント遮断の応答率が、低度であり、ＴＧＦ−βが、高度に発現される、非小細胞がん（ＮＳＣＬ）および黒色腫などにおける適応に適しうる。
【０２７８】
がんは、Ｂ細胞がん、例えば、多発性骨髄腫、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、例えば、アルファ鎖病、ガンマ鎖病、およびミュー鎖病などの重鎖病、良性単クローン性免疫グロブリン血症、ならびに免疫細胞性アミロイドーシス、黒色腫、乳がん、肺がん、気管支がん、結腸直腸がん、前立腺がん（例えば、転移性前立腺がん、ホルモン不応性前立腺がん）、膵がん、胃がん、卵巣がん、膀胱がん、脳または中枢神経系がん、末梢神経系がん、食道がん、子宮頸がん、子宮がんまたは子宮内膜がん、口腔がんまたは咽頭がん、肝がん、腎がん、精巣がん、胆管がん、小腸がんまたは虫垂がん、唾液腺がん、甲状腺がん、副腎がん、骨肉腫、軟骨肉腫、造血組織がんなどを含むがこれらに限定されない。本開示により包含される方法に適用可能ながんの種類についての、他の非限定例は、ヒト肉腫およびヒト癌腫、例えば、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨原性肉腫、軟骨腫、血管肉腫、内皮肉腫、リンパ管肉腫、リンパ管内皮肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌、結腸直腸がん、膵がん、乳がん、トリプルネガティブ乳がん、卵巣がん、扁平細胞がん、基底細胞癌、腺がん、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌、嚢胞腺癌、髄様癌、気管支癌、腎細胞癌、肝がん、胆管癌、肝がん、肝細胞癌（ＨＣＣ）、絨毛癌、精上皮腫、胚性癌、ウィルムス腫瘍、子宮頸がん、骨がん、脳腫瘍、精巣がん、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神経膠腫、星状細胞腫、髄芽腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽細胞腫、聴神経腫瘍、希突起神経膠腫、髄膜腫、黒色腫、神経芽細胞腫、網膜芽細胞腫；白血病、例えば、急性リンパ性白血病および急性骨髄性白血病（骨髄芽球性白血病、前骨髄性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、および赤白血病）；慢性白血病（慢性骨髄性（顆粒球性）白血病および慢性リンパ性白血病）；ならびに真性多血症、リンパ腫（ホジキン病および非ホジキン病）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトロームマクログロブリン血症、および重鎖病を含む。一部の実施形態では、その表現型が、本開示の方法により決定されるがんは、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、婦人科がん、腎がん、喉頭がん、肺がん、経口がん、頭頸部がん、卵巣がん、膵がん、前立腺がん、または皮膚がんなどであるがこれらに限定されない上皮がんである。他の実施形態では、がんは、乳がん、前立腺がん、肺がん、または結腸がんである。さらに他の実施形態では、上皮がんは、非小細胞肺がん、非乳頭状腎細胞癌、子宮頸癌、卵巣癌（例えば、漿液性卵巣癌）、または乳癌である。上皮がんは、漿液性がん、内膜がん、粘液性がん、明細胞がん、ブレンナーがん、または性状不明がんを含むがこれらに限定されない、他の多様な形でも特徴づけられうる。一部の実施形態では、本開示は、マントル細胞リンパ腫を含むがこれらに限定されない、リンパ腫またはこの亜型の、処置、診断、および／または予後診断において使用される。
【０２７９】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示される、抗ＰＤ１−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質は、標準治療（化学療法、および最新の臨床試験治療を含むがこれらに限定されない）に対して、約０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％の平均応答率を有するがんを処置するのに使用されうる治療の例である。ある特定の実施形態では、本明細書で提示される、抗ＰＤ１−ＡＤＡ２融合タンパク質は、標準治療（化学療法、および最新の臨床試験治療を含むがこれらに限定されない）に対して、約０、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、または９５％の平均応答率を有するがんを処置するのに使用されうる治療の例である。このようながんは、ホジキンリンパ腫、黒色腫、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）、高頻度マイクロサテライト不安定性（ＭＳＩ）またはミスマッチ修復（ＭＭＲ）欠損充実性腫瘍、ＣＳＣＣ、ＲＣＣ、ＣＲＣ、黒色腫、メルケル細胞がん、膀胱がん、ＲＣＣ、肝細胞癌（ＨＣＣ）、頭頸部がん（Ｈ＆Ｎ）、子宮頸がん、胃がん、小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）、子宮内膜がん、中皮腫、卵巣がん、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）、乳がん、結腸直腸がん（ＣＲＣ）、膵がん、前立腺がんを含むがこれらに限定されない。
【０２８０】
組合せ療法
一部の実施形態では、融合タンパク質は、さらなる治療剤との組合せ療法として投与される。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、抗体などの生物学的分子を含む。例えば、処置は、融合タンパク質の、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ＥｒｂＢ２、および／またはＶＥＧＦに結合する抗体を含むがこれらに限定されない、腫瘍関連抗原に対する抗体との組合せ投与を伴いうる。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、がん幹細胞マーカーに特異的な抗体である。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、血管新生阻害剤（例えば、抗ＶＥＧＦ抗体またはＶＥＧＦ受容体抗体）である抗体である。ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、ベバシズマブ（ＡＶＡＳＴＩＮ）、ラムシルマブ、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ）、ペルツズマブ（ＯＭＮＩＴＡＲＧ）、パニツムマブ（ＶＥＣＴＩＢＩＸ）、ニモツズマブ、ザルツムマブ、またはセツキシマブ（ＥＲＢＩＴＵＸ）である。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、低分子などの薬剤を含む。例えば、処置は、本明細書で提示される融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２（ＥｒｂＢ２）、および／またはＶＥＧＦを含むがこれらに限定されない、腫瘍関連抗原に対する阻害剤として作用する低分子との組合せ投与を伴いうる。一部の実施形態では、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、ゲフィチニブ（ＩＲＥＳＳＡ）、エルロチニブ（ＴＡＲＣＥＶＡ）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ）、ラパチニブ（lapatanib）、バンデタニブ（ＺＡＣＴＩＭＡ）、ＡＥＥ７８８、ＣＩ−１０３３、セジラニブ（ＲＥＣＥＮＴＩＮ）、ソラフェニブ（ＮＥＸＡＶＡＲ）、およびパゾパニブ（ＧＷ７８６０３４Ｂ）からなる群から選択される、タンパク質キナーゼ阻害剤と組み合わせて投与される。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、ｍＴＯＲ阻害剤を含む。別の実施形態では、さらなる治療剤は、化学療法、またはＴＲＥＧ細胞の数を低減する、他の阻害剤である。ある特定の実施形態では、治療剤は、シクロホスファミドまたは抗ＣＴＬＡ４抗体である。別の実施形態では、さらなる治療剤は、骨髄由来サプレッサー細胞の存在を低減する。さらなる実施形態では、さらなる治療剤は、カルボタキソールである。さらなる実施形態では、さらなる治療剤は、イブルチニブである。
【０２８１】
一部の実施形態では、方法は、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体と組み合わせた、１または複数のチェックポイント阻害剤をさらに含みうる。一部の実施形態では、さらなるチェックポイント阻害剤は、抗ＣＴＬＡ−４抗体でありうる。抗ＣＴＬＡ−４抗体（例えば、イピリムマブ）は、進行性黒色腫を伴う参加者において、持久性の抗腫瘍活性、および生存の延長を示し、その結果として、２０１１年に、食品医薬品局（ＦＤＡ）による、その承認をもたらしている。Hodi et al., Improved survival with ipilimumab in patients with metastatic melanoma. N Engl J Med. (2010) Aug 19; 363(8):711-23を参照されたい。一部の実施形態では、１または複数のチェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体でありうる。一部の実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、全長アテゾリズマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）、アベルマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）、デュルバルマブ（抗ＰＤ−Ｌ１）、またはこれらの断片もしくは変異体でありうる。一部の実施形態では、１または複数のチェックポイント阻害剤は、ＣＤ２７阻害剤、ＣＤ２８阻害剤、ＣＤ４０阻害剤、ＣＤ１２２阻害剤、ＣＤ１３７阻害剤、ＯＸ４０（ＣＤ１３４としても公知である）阻害剤、ＧＩＴＲ阻害剤、ＩＣＯＳ阻害剤、またはこれらの任意の組合せのうちのいずれか１または複数でありうる。一部の実施形態では、１または複数のチェックポイント阻害剤は、Ａ２ＡＲ阻害剤、Ｂ７−Ｈ３（ＣＤ２７６としても公知である）阻害剤、Ｂ７−Ｈ４（ＶＴＣＮ１としても公知である）阻害剤、ＢＴＬＡ阻害剤、ＩＤＯ阻害剤、ＫＩＲ阻害剤、ＬＡＧ３阻害剤、ＴＩＭ−３阻害剤、ＶＩＳＴＡ阻害剤、またはこれらの任意の組合せのうちのいずれか１または複数でありうる。
【０２８２】
ある特定の実施形態では、さらなる治療剤は、第２の免疫療法剤を含む。一部の実施形態では、さらなる免疫療法剤は、コロニー刺激因子、インターロイキン、免疫抑制機能を遮断する抗体（例えば、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＣＤ３抗体、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体）、免疫細胞機能を増強する抗体（例えば、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＯＸ−４０抗体、抗ＣＤ４０抗体、または抗４−１ＢＢ抗体）、ｔｏｌｌ様受容体（例えば、ＴＬＲ４、ＴＬＲ７、ＴＬＲ９）、可溶型リガンド（例えば、ＧＩＴＲＬ、ＧＩＴＲＬ−Ｆｃ、ＯＸ−４０Ｌ、ＯＸ−４０Ｌ−Ｆｃ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ−Ｆｃ、４−１ＢＢリガンド、または４−１ＢＢリガンド−Ｆｃ）、またはＢ７ファミリーのメンバー（例えば、ＣＤ８０、ＣＤ８６）を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、さらなる免疫療法剤は、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ２８、ＣＤ３、ＰＤ−Ｌ１、ＴＩＧＩＴ、ＧＩＴＲ、ＯＸ−４０、ＣＤ−４０、または４−１ＢＢをターゲティングする。
【０２８３】
一部の実施形態では、さらなる治療剤は、さらなる免疫チェックポイント阻害剤である。一部の実施形態では、さらなる免疫チェックポイント阻害剤は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＣＤ２８抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗４−１ＢＢ抗体、または抗ＯＸ−４０抗体である。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、抗ＴＩＧＩＴ抗体である。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、ＢＭＳ９３５５５９（ＭＤＸ−１１０５）、アテゾリズマブ（atexolizumab）（ＭＰＤＬ３２８０Ａ）、デュルバルマブ（ＭＥＤＩ４７３６）、およびアベルマブ（ＭＳＢ００１０７１８Ｃ）からなる群から選択される、抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）およびトレメリムマブからなる群から選択される、抗ＣＴＬＡ−４抗体である。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、ＢＭＳ−９８６０１６およびＬＡＧ５２５からなる群から選択される、抗ＬＡＧ−３抗体である。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、ＭＥＤＩ６４６９、ＭＥＤＩ０５６２、およびＭＯＸＲ０９１６からなる群から選択される、抗ＯＸ−４０抗体である。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、ＰＦ−０５０８２５６６からなる群から選択される、抗４−１ＢＢ抗体である。一部の実施形態では、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、サイトカイン、アドレノメジュリン（ＡＭ）、アンジオポエチン（Ａｎｇ）、ＢＭＰ、ＢＤＮＦ、ＥＧＦ、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、ＦＧＦ、ＧＤＮＦ、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ−ＣＳＦ）、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＧＤＦ９、ＨＧＦ、ＨＤＧＦ、ＩＧＦ、遊走刺激因子、ミオスタチン（ＧＤＦ−８）、ＮＧＦ、ニューロトロフィン、ＰＤＧＦ、トロンボポエチン、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＮＦ−α、ＶＥＧＦ、ＰｌＧＦ、ガンマ−ＩＦＮ、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、およびＩＬ−１８からなる群から選択される生体分子と組み合わせて投与されうる。
【０２８４】
サイトカイン
場合によって、サイトカインは、少なくとも１つのケモカイン、インターフェロン、インターロイキン、リンホカイン、腫瘍壊死因子、もしくは変異体、またはこれらの組合せを含む。場合によって、サイトカインは、インターロイキンである。場合によって、インターロイキンは、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１４、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−２０、ＩＬ−２１、ＩＬ−２２、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−２５、ＩＬ−２６、ＩＬ−２７、ＩＬ−２８、ＩＬ−２９、ＩＬ−３０、ＩＬ−３１、ＩＬ−３２、ＩＬ−３３、ならびに機能的な変異体および断片のうちの少なくとも１つである。一部の実施形態では、サイトカインは、膜結合型の場合もあり、分泌型の場合もある。複数の実施形態では、サイトカインは、可溶型ＩＬ−１５、可溶型ＩＬ−１５／ＩＬ−１５Ｒα複合体（例えば、ＡＬＴ−８０３）である。ある特定の場合には、インターロイキンは、膜結合型ＩＬ−１５（ｍｂＩＬ−１５）、またはＩＬ−１５と、ＩＬ−１５Ｒαとの融合体を含みうる。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、本明細書で記載される、改変免疫エフェクター細胞と共発現されうる、膜結合型キメラＩＬ−１５である。一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、全長ＩＬ−１５Ｒα、またはこの断片、変異体と、インフレームで融合させた全長ＩＬ−１５（例えば、天然ＩＬ−１５ポリペプチド）、またはこの断片もしくは変異体を含む。場合によって、ＩＬ−１５は、リンカーを介して、ＩＬ−１５Ｒαへと、間接的に連結されている。一部の場合には、ｍｂＩＬ−１５は、Hurton et al., “Tethered IL-15 augments antitumor activity and promotes a stem-cell memory subset in tumor-specific T cells,” PNAS 2016において記載されている通りである。場合によって、サイトカインは、ＣＡＲと、同じ免疫エフェクター細胞内で発現される。
【０２８５】
一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、本明細書で記載される、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ−１ｔ−１、ＣＤ２０ｔ−１、またはＣＤ２０などの細胞タグと共に発現される。ｍｂＩＬ−１５は、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ−１ｔ−１、ＣＤ２０ｔ−１、またはＣＤ２０と、インフレームで発現されうる。
【０２８６】
一部の実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、遺伝子転写のための、誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの、リガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
【０２８７】
別の態様では、インターロイキンは、ＩＬ−１２を含みうる。一部の実施形態では、ＩＬ−１２は、単鎖ＩＬ−１２（ｓｃＩＬ−１２）、プロテアーゼ感受性ＩＬ−１２、不安定化ＩＬ−１２、膜結合型ＩＬ−１２、挿入型ＩＬ−１２である。一部の場合には、ＩＬ−１２変異体は、それらの全てが、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、国際公開第２０１５／０９５２４９号パンフレット、国際公開第２０１６／０４８９０３号パンフレット、国際公開第２０１７／０６２９５３号パンフレットにおいて記載されている通りである。一部の実施形態では、上記で記載されたサイトカインは、遺伝子転写のための、誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの、リガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
【０２８８】
一部の実施形態では、本明細書で記載される融合タンパク質は、遺伝子転写のための、誘導性プロモーターの制御下にありうる。一態様では、誘導性プロモーターは、遺伝子スイッチの、リガンド誘導性プロモーターでありうる。場合によって、誘導性プロモーターは、ＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。
【０２８９】
遺伝子スイッチ
本明細書では、遺伝子スイッチポリペプチド、リガンド誘導性遺伝子スイッチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、ならびにこれらのポリペプチドおよび／またはポリヌクレオチドを組み込む方法および系が提示される。「遺伝子スイッチ」という用語は、プロモーターが付随する応答エレメントの組合せを指し、例えば、１または複数のリガンドの存在下で、応答エレメントおよびプロモーターが組み込まれた遺伝子の発現をモジュレートする、エクジソン受容体（ＥｃＲ）ベースの系を指す。緊密に調節された誘導性遺伝子発現系または遺伝子スイッチは、遺伝子治療、細胞内の、大スケールのタンパク質の作製、細胞ベースのハイスループットのスクリーニングアッセイ、機能的ゲノミクス、ならびにトランスジェニック植物およびトランスジェニック動物における形質の調節など、多様な適用に有用である。このような誘導性遺伝子発現系は、リガンド誘導性異種遺伝子発現系を含みうる。
【０２９０】
ＥｃＲベースの遺伝子スイッチの初期形は、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster））ＥｃＲ（ＤｍＥｃＲ）ポリペプチドおよびマウス（Mus musculus）ＲＸＲ（ＭｍＲＸＲ）ポリペプチドを使用し、これらの受容体が、ステロイドであるポナステロンＡの存在下の、哺乳動物細胞系およびトランスジェニックマウスにおいて、レポーター遺伝子をトランス活性化させることを示した（Christopherson et al., 1992；No et al., 1996）。その後、Suhr et al., 1998は、非ステロイド系のエクジソンアゴニストである、テブフェノジドが、外因性ヘテロ二量体パートナーの非存在下で、カイコ（Bombyx mori）ＥｃＲ（ＢｍＥｃＲ）を介して、哺乳動物細胞内のレポーター遺伝子の、高レベルのトランス活性化を誘導することを示した。
【０２９１】
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書（国際公開第９７／３８１１７号パンフレット）およびＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９９／０８３８１号明細書（国際公開第９９／５８１５５号パンフレット）は、外因性遺伝子の発現をモジュレートするための方法であって、外因性遺伝子およびエクジソン応答エレメントを含むＤＮＡ構築物が、それに対するリガンドの存在下で、かつ、任意選択で、サイレントパートナーとして作用することが可能な受容体の存在下で、エクジソン応答エレメントに結合して、遺伝子発現を誘導するエクジソン受容体を含む、第２のＤＮＡ構築物により活性化する方法について開示している。この例では、エクジソン受容体を、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）から単離した。典型的に、このような系は、最適の活性化をもたらすために、サイレントパートナー、好ましくはレチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）の存在を必要とする。哺乳動物細胞内では、昆虫エクジソン受容体（ＥｃＲ）は、哺乳動物レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）と、ヘテロ二量体化し、これにより、標的遺伝子または異種遺伝子の発現を、リガンド依存的に調節するのに使用することが可能である。ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書（国際公開第９９／０２６８３号パンフレット）は、カイコガであるカイコ（Bombyx mori）から単離されたエクジソン受容体が、外因性の二量体パートナーを必要とせずに、哺乳動物系内で機能的であることについて開示している。
【０２９２】
米国特許第６，２６５，１７３号明細書は、受容体のステロイド／甲状腺スーパーファミリーの多様なメンバーを、遺伝子発現系における使用のための、ＵＳＰの、少なくとも二量体化ドメインを含むキイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）ウルトラスピラクル受容体（ＵＳＰ）またはこの断片と組み合わせうることについて開示している。米国特許第５，８８０，３３３号明細書は、植物において使用された、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）のＥｃＲおよびウルトラスピラクル（ＵＳＰ）によるヘテロ二量体系であって、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメインが、２つの異なるハイブリッドタンパク質上に位置する、ヘテロ二量体系について開示している。これらの場合の各々では、トランス活性化ドメインおよびＤＮＡ結合性ドメイン（ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９８／１４２１５号明細書における通りに、天然のＥｃＲとして、またはＰＣＴ国際特許出願／米国出願第９７／０５３３０号明細書における通りに、修飾ＥｃＲとして）を、単一の分子へと組み込み、ＵＳＰまたはＲＸＲである、他のヘテロ二量体パートナーを、それらの天然状態において使用した。
【０２９３】
ＰＣＴ国際特許出願／米国出願第０１／０９０５号明細書は、トランス活性化ドメインと、ＤＮＡ結合ドメインとを２つの異なるタンパク質上に置くことにより互いから隔てた、エクジソン受容体ベースの誘導性遺伝子発現系が、リガンドの非存在下で、バックグラウンド活性の大幅な低減を結果としてもたらし、リガンドの存在下で、バックグラウンドを上回る活性の著明な増大を結果としてもたらすことについて開示している。この２ハイブリッド系は、ＰＣＴ／米国出願第９７／０５３３０号明細書およびＰＣＴ／米国出願第９８／１４２１５号明細書において開示されている、２つの系と比較して、著明に改善された誘導性遺伝子発現モジュレーション系である。２ハイブリッド系は、ＤＮＡ結合性ドメインが、遺伝子上のＤＮＡ結合性部位に結合すると、トランス活性化ドメインが、プロモーターを、より効果的に活性化させるように、相互作用タンパク質の対が、転写活性化ドメインを、ＤＮＡ結合性ドメインに対して、より好適な位置に置く能力を利用すると考えられる（例えば、米国特許第５，２８３，１７３号明細書を参照されたい）。２ハイブリッド遺伝子発現系は、核内受容体ポリペプチドへと融合させたＤＮＡ結合性ドメインをコードする、第１の遺伝子発現カセット、および異なる核内受容体ポリペプチドへと融合させたトランス活性化ドメインをコードする、第２の遺伝子発現カセットである、２つの遺伝子発現カセットを含む。リガンドの存在下では、抗体の、ＴＧＦ−βサイトカイントラップとの相互作用を促進するコンフォメーション変化が誘導され、これにより、ＤＮＡ結合性ドメインと、トランス活性化ドメインとの二量体化が結果としてもたらされると考えられる。ＤＮＡ結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは、２つの異なる分子上に存在するので、リガンドの非存在下では、バックグラウンド活性が、大幅に低減される。
【０２９４】
２ハイブリッド系のある特定の改変はまた、ステロイド性リガンド、例えば、ポナステロンＡ（「ＰｏｎＡ」）またはムリステロンＡ（「ＭｕｒＡ」）と比較した場合に、非ステロイド性リガンド、例えば、ジアシルヒドラジンに対する感受性の改善ももたらしうる。すなわち、ステロイドと比較した場合、非ステロイド性リガンドは、低リガンド濃度で、より大きな遺伝子転写活性をもたらした。さらに、２ハイブリッド系は、非修飾ＲＸＲを切り替えパートナーとして使用する場合に生じうる、ＲＸＲの過剰発現に起因する一部の副作用も回避する。好ましい２ハイブリッド系では、ＥｃＲまたはＲＸＲの、天然のＤＮＡ結合性ドメインおよびトランス活性化ドメインは除去され、結果として、これらのハイブリッド分子は、細胞内に存在する、他のステロイドホルモン受容体との相互作用の可能性を低下させ、これにより、副作用の低減を結果としてもたらす。
【０２９５】
エクジソン受容体（ＥｃＲ）とは、核内受容体スーパーファミリーのメンバーであり、サブファミリー１、群Ｈ（本明細書では、「群Ｈ核内受容体」と称する）へと分類される。各群のメンバーは、Ｅ（リガンド結合）ドメイン内で、４０〜６０％のアミノ酸同一性を共有する（Laudet et al., A Unified Nomenclature System for the Nuclear Receptor Subfamily, 1999; Cell 97: 161-163）。エクジソン受容体に加えて、この核内受容体サブファミリー１、群Ｈの他のメンバーは、ユビキタス受容体（ＵＲ）、オーファン受容体１（ＯＲ−１）、ステロイドホルモン核内受容体１（ＮＥＲ−１）、ＲＸＲ相互作用性タンパク質１５（ＲＩＰ−１５）、肝臓ｘ受容体β（ＬＸＲβ）、ステロイドホルモン受容体様タンパク質（ＲＬＤ−１）、肝臓ｘ受容体（ＬＸＲ）、肝臓ｘ受容体α（ＬＸＲα）、ファルネソイドｘ受容体（ＦＸＲ）、受容体相互作用性タンパク質１４（ＲＩＰ−１４）、およびファルネソール受容体（ＨＲＲ−１）を含む。
【０２９６】
場合によって、誘導性プロモーター（「ＩＰ」）は、Ｉｎｔｒｅｘｏｎ  ＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎのＲＨＥＯＳＷＩＴＣＨ（登録商標）遺伝子スイッチなど、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチでありうる。場合によって、遺伝子スイッチは、それらの各々が、参照によりその全体において組み込まれる、ＰＣＴ／米国出願第２００１／００９０５０号明細書（国際公開第２００１／０７０８１６号パンフレット）；米国特許第７，０９１，０３８号明細書；同第７，７７６，５８７号明細書；同第７，８０７，４１７号明細書；同第８，２０２，７１８号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００１／０３０６０８号明細書（国際公開第２００２／０２９０７５号パンフレット）；米国特許第８，１０５，８２５号明細書；同第８，１６８，４２６号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３５号明細書（国際公開第２００２／０６６６１３号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，２００号明細書（米国公開第２０１２０１６７２３９号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５７０６号明細書（国際公開第２００２／０６６６１４号パンフレット）；米国特許第７，５３１，３２６号明細書；同第８，２３６，５５６号明細書；同第８，５９８，４０９号明細書；ＰＣＴ／米国出願第５２００２／００５０９０号明細書（国際公開第２００２／０６６６１２号パンフレット）；米国特許第８，７１５，９５９号明細書（米国公開第２００６０１００４１６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５２３４号明細書（国際公開第２００３／０２７２６６号パンフレット）；米国特許第７，６０１，５０８号明細書；同第７，８２９，６７６号明細書；同第７，９１９，２６９号明細書；同第８，０３０，０６７号明細書；ＰＣＴ／米国出願第５２００２／００５７０８号明細書（国際公開第２００２／０６６６１５号パンフレット）；米国特許出願公開第１０／４６８，１９２号明細書（米国公開第２０１１０２１２５２８号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００２／００５０２６号明細書（国際公開第２００３／０２７２８９号パンフレット）；米国特許第７，５６３，８７９号明細書；同第８，０２１，８７８号明細書；同第８，４９７，０９３号明細書；ＰＣＴ／米国出願第２００５／０１５０８９号明細書（国際公開第２００５／１０８６１７号パンフレット）；米国特許第７，９３５，５１０号明細書；同第８，０７６，４５４号明細書；ＰＣＴ／米国出願第５２００８／０１１２７０号明細書（国際公開第２００９／０４５３７０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４１，０１８号明細書（米国公開第２００９０１３６４６５号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００８／０１１５６３号明細書（国際公開第２００９／０４８５６０号パンフレット）；米国特許出願公開第１２／２４７，７３８号明細書（米国公開第２００９０１２３４４１号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２００９／００５５１０号明細書（国際公開第２０１０／０４２１８９号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／１２３，１２９号明細書（米国公開第２０１１０２６８７６６号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１１／０２９６８２���明細書（国際公開第２０１１／１１９７７３号パンフレット）；米国特許出願公開第１３／６３６，４７３号明細書（米国公開第２０１３０１９５８００号明細書）；ＰＣＴ／米国出願第２０１２／０２７５１５号明細書（国際公開第２０１２／１２２０２５号パンフレット）；国際公開第２０１８／１３２４９４号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２０１８／０１３１９６号明細書）および米国特許第９，４０２，９１９号明細書において記載されている系のうちのいずれかの、エクジソンベースの受容体による構成要素から選択されうるが、これらに限定されない。
【０２９７】
リガンド活性化型エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチへと適用される場合に、本明細書で使用される、「リガンド」という用語は、遺伝子スイッチを活性化させて、遺伝子発現を刺激する能力を有する、様々な可溶性の低分子（ジアシルヒドラジン化合物など）（すなわち、この活性化において、ポリヌクレオチド（例えば、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）および／またはポリペプチドの、リガンド誘導性発現をもたらす）である。このようなリガンドの例は、それらの各々が、参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、国際公開第２００４／０７２２５４号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２００４／００３７７５号明細書）；国際公開第２００４／００５４７８号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２００３／０２１１４９号明細書）；国際公開第２００５／０１７１２６号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２００４／００５１４９号明細書）；国際公開第２００４／０７８９２４号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２００４／００５９１２号明細書）；国際公開第２００８／１５３８０１号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２００８／００６７５７号明細書）；国際公開第２００９／１１４２０１号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２００９／００１６３９号明細書）；国際公開第２０１３／０３６７５８号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２０１２／０５４１４１号明細書）；国際公開第２０１４／１４４３８０号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２０１４／０２８７６８号明細書）；および国際公開第２０１６／０４４３９０号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２０１５／０５０３７５号明細書）において記載されているリガンドを含むがこれらに限定されない。
【０２９８】
リガンドの例はまた、限定せずに述べると、エクジソン、２０−ヒドロキシエクジソン、ポナステロンＡ、ムリステロンＡなどのｅｃｄｙステロイド、９−ｃｉｓ−レチノイン酸、レチノイン酸の合成類似体、それらの各々が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，２５８，６０３号明細書；米国特許第６，０１３，８３６号明細書；同第５，１１７，０５７号明細書；同第５，５３０，０２８号明細書；および同第５，３７８，７２６号明細書；同第７，３０４，１６１号明細書；同第７，８５１，２２０号明細書；同第８，７４８，１２５号明細書；同第９，２７２，９８６号明細書；同第７，４５６，３１５号明細書；同第７，５６３，９２８号明細書；同第８，５２４，９４８号明細書；同第９，１０２，６４８号明細書；同第９，１６９，２１０号明細書；同第９，２５５，２７３号明細書；および同第９，３５９，２８９号明細書において開示されているＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジンなどのＮ，Ｎ’−ジアシルヒドラジン；米国特許第８，６６９，０７２号明細書；および同第８，８９５，３０６号明細書において記載されているオキサゾリン；欧州出願第２，４６１，８０９号明細書において開示されているジベンゾイルアルキルシアノヒドラジンなどのジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン；米国特許第５，２２５，４４３号明細書において開示されているＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジンなどのＮ−アルキル−Ｎ，Ｎ’−ジアロイルヒドラジン；欧州出願第２３４，９９４号明細書において開示されているＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジンなどのＮ−アシル−Ｎ−アルキルカルボニルヒドラジン；米国特許第４，９８５，４６１号明細書において記載されているＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジンなどのＮ−アロイル−Ｎ−アルキル−Ｎ’−アロイルヒドラジン；米国特許第７，３７５，０９３号明細書；同第８，１２９，３５５号明細書；および同第９，８０２，９３６号明細書において記載されているアミドケトンなどのアミドケトン；ならびに３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパジド、オキシステロール、２２（Ｒ）ヒドロキシコレステロール、２４（Ｓ）ヒドロキシコレステロール、２５−エポキシコレステロール、Ｔ０９０１３１７、５−アルファ−６−アルファ−エポキシコレステロール−３−スルフェート（sulfate）（ＥＣＨＳ）、７−ケトコレステロール−３−スルフェート（sulfate）、ファルネソール（famesol）、胆汁酸、１，１−ビホスホネート（biphosphonate）エステル、若年性ホルモンＩＩＩなども含む。本発明において有用なジアシルヒドラジンリガンドの例は、ＲＧ−１１５８１９（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−エチル−２，２−ジメチル−プロピル）−Ｎ’−（２−メチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、ＲＧ−１１５９３２（（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド）、およびＲＧ−１１５８３０（３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベ��ゾイル）−ヒドラジド）を含む。例えば、それらのいずれもが参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、国際公開第２００８／１５３８０１号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２００８／００６７５７号明細書）；および国際公開第２０１３／０３６７５８号パンフレット（ＰＣＴ／米国出願第２０１２／０５４１４１号明細書）を参照されたい。
【０２９９】
例えば、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチのためのリガンドは、任意の適切なリガンドから選択されうる。天然に存在するエクジソンまたはエクジソン類似体（例えば、２０−ヒドロキシエクジソン、ムリステロンＡ、ポナステロンＡ、ポナステロンＢ、ポナステロンＣ、２６−ヨードポナステロンＡ、イノコステロンまたは２６−メシルイノコステロン）、および非ステロイド系誘導剤の両方が、本発明の遺伝子スイッチのためのリガンドとして使用されうる。米国特許第６，３７９，９４５号明細書は、ニセアメリカタバコガ（Heliothis virescens）から単離された昆虫ステロイド受容体（「ＨＥｃＲ」）であって、ステロイド、およびある特定の非ステロイド系誘導剤の両方に対して応答性の遺伝子スイッチとして作用することが可能なＨＥｃＲについて記載している。非ステロイド系誘導剤は、例えば、低廉な製造費用、代謝的安定性、昆虫、植物、または哺乳動物に存在しないこと、および環境上の許容可能性を含む、いくつかの理由で、この系、ならびに、ステロイドおよび非ステロイド誘導剤の両方に応答性である、多くの他の系において、ステロイドを凌駕する、明瞭な利点を有する。米国特許第６，３７９，９４５号明細書は、２つのジベンゾイルヒドラジンである、１，２−ジベンゾイル−１−ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドラジン、およびテブフェノジド（Ｎ−（４−エチルベンゾイル）−Ｎ’−（３，５−ジメチルベンゾイル）−Ｎ’−ｔｅｒｔ−ブチル−ヒドラジン）の、エクジソンベースの遺伝子スイッチのためのリガンドとしての有用性について記載している。本発明ではまた、リガンドとして、米国特許第５，１１７，０５７号明細書において開示されているジベンゾイルヒドラジンなど、他のジベンゾイルヒドラジンも含まれる。テブフェノジドの、キイロショウジョウバエ（Drosophila melanogaster）に由来するエクジソン受容体のための、化学的リガンドとしての使用もまた、米国特許第６，１４７，２８２号明細書において開示されている。エクジソンリガンドの、さらなる非限定例は、３，５−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル−４−ヒドロキシ−Ｎ−イソブチル−ベンズアミド、８−Ｏ−アセチルハルパジド、１，２−ジアシルヒドラジン、Ｎ’−置換−Ｎ，Ｎ’−二置換ヒドラジン、ジベンゾイルアルキルシアノヒドラジン、Ｎ−置換−Ｎ−アルキル−Ｎ，Ｎ−ジアロイルヒドラジン、Ｎ−置換−Ｎ−アシル−Ｎ−アルキル、カルボニルヒドラジン、またはＮ−アロイル−Ｎ‘−アルキルＮ’−アロイルヒドラジンである（米国特許第６，７２３，５３１号明細書を参照されたい）。
【０３００】
一実施形態では、エクジソンベースの遺伝子スイッチ系のためのリガンドは、ジアシルヒドラジンリガンド、またはキラル性ジアシルヒドラジンリガンドである。遺伝子スイッチ系において使用されるリガンドは、式Ｉ：
【０３０１】
【化１】
2021531754.tif 000004
［式中、Ａは、アルコキシ、アリールアルキルオキシ、またはアリールオキシであり；Ｂは、任意選択で、置換アリール、または、任意選択で、置換ヘテロアリールであり；Ｒ１およびＲ２は、独立に、任意選択で、置換アルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、任意選択で、置換シクロアルキル、任意選択で、置換アルケニル、任意選択で、置換アルキニル、任意選択で、置換ヘテロシクロ、任意選択で、置換アリール、もしくは、任意選択で、置換ヘテロアリール；またはこれらの、薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態、もしくは非結晶形態である］
の化合物でありうる。
【０３０２】
別の実施形態では、リガンドは、式ＩＩ：
【０３０３】
【化２】
2021531754.tif 000005
［式中、Ａは、アルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、任意選択で、置換アリール、または、任意選択で、置換ヘテロアリールであり；Ｂは、任意選択で、置換アリール、または、任意選択で、置換ヘテロアリールであり；Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１が、Ｒ２と同一ではなく；不斉炭素原子を保有する、Ｒ１およびＲ２における絶対立体配置が、主に、Ｓであることを条件として、独立に、任意選択で、置換アルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、任意選択で、置換シクロアルキル、任意選択で、置換アルケニル、任意選択で、置換アルキニル、任意選択で、置換ヘテロシクロ、任意選択で、置換アリール、もしくは、任意選択で、置換ヘテロアリールであるか；またはこれらの、薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態、もしくは非結晶形態である］
の、光学異性体が濃縮された化合物でありうる。
【０３０４】
ある特定の実施形態では、リガンドは、式ＩＩＩ：
【０３０５】
【化３】
2021531754.tif 000006
［式中、Ａは、アルコキシ、アリールアルキルオキシ、アリールオキシ、アリールアルキル、任意選択で、置換アリール、または、任意選択で、置換ヘテロアリールであり；Ｂは、任意選択で、置換アリール、または、任意選択で、置換ヘテロアリールであり；Ｒ１およびＲ２は、Ｒ１が、Ｒ２と同一ではなく；不斉炭素原子を保有する、Ｒ１およびＲ２における絶対立体配置が、主に、Ｒであることを条件として、独立に、任意選択で、置換アルキル、アリールアルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、任意選択で、置換シクロアルキル、任意選択で、置換アルケニル、任意選択で、置換アルキニル、任意選択で、置換ヘテロシクロ、任意選択で、置換アリール、もしくは、任意選択で、置換ヘテロアリールであるか；またはこれらの、薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態、もしくは非結晶形態である］
の、光学異性体が濃縮された化合物でありうる。
【０３０６】
一実施形態では、リガンドは、少なくとも９５％の光学異性過剰を有する、（Ｒ）−３，５−ジメチル−安息香酸Ｎ−（１−ｔｅｒｔ−ブチル−ブチル）−Ｎ’−（２−エチル−３−メトキシ−ベンゾイル）−ヒドラジド、または、これらの、薬学的に許容される塩、水和物、結晶形態、もしくは非結晶形態でありうる。
【０３０７】
式Ｉのジアシルヒドラジンリガンドと、式ＩＩまたはＩＩＩの、キラル性ジアシルヒドラジンリガンドとは、エクジソンベースの遺伝子スイッチ系と共に使用されると、本発明の、治療用ポリペプチドまたは治療用ポリヌクレオチドの発現の、外部性の一過性調節のための手段をもたらす。それらの各々が、参照によりそれらの全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第８，０７６，５１７号明細書；同第８，８８４，０６０号明細書；および同第９，５９８，３５５号明細書を参照されたい。
【０３０８】
本発明において使用されるリガンドは、塩を形成しうる。本明細書で使用される「塩（複数可）」という用語は、無機酸および無機塩基ならびに／または有機酸および有機塩基により形成される、酸性塩および／または塩基性塩を表す。加えて、式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物が、塩基性部分および酸性部分の両方を含有する場合、双性イオン（「内部塩」）が形成される場合があり、本明細書で使用される「塩（複数可）」という用語の中に含まれる。例えば、調製時に利用されうる、単離ステップまたは精製ステップでは、他の塩もまた有用であるが、薬学的に許容される塩（すなわち、非毒性の塩、生理学的に許容される塩）が使用される。式Ｉ、ＩＩ、またはＩＩＩの化合物の塩は、例えば、化合物を、塩が沈殿する培地などの培地中、または水性培地中で、等量など、ある量の酸または塩基と反応させるのに続き、凍結乾燥にかけることにより形成されうる。
【０３０９】
塩基性部分を含有するリガンドは、様々な有機酸および無機酸と共に、塩を形成しうる。例示的な酸付加塩は、酢酸塩（酢酸またはトリハロ酢酸、例えば、トリフロロ酢酸と共に形成される酢酸塩など）、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、二硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、クエン酸塩、樟脳、カンファースルホン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、ググルコヘプタン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプタン酸塩、ヘキサン酸塩、塩酸塩（塩酸により形成される）、臭化水素酸塩（臭化水素により形成される）、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩（マレイン酸により形成される）、メタンスルホン酸塩（メタンスルホン酸により形成される）、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、シュウ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、サリチル酸塩、コハク酸塩、硫酸塩（硫酸により形成される硫酸塩など）、スルホン酸塩（本明細書で言及されるスルホン酸塩など）、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トシル酸塩などのトルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩などを含む。
【０３１０】
酸性部分を含有するリガンドは、様々な有機塩基および無機塩基と共に、塩を形成しうる。例示的な塩基性塩は、アンモニウム塩、ナトリウム塩、リチウム塩、およびカリウム塩などのアルカリ金属塩、カルシウム塩およびマグネシウム塩などのアルカリ土類金属塩、ベンザチン、ジシクロヘキシルアミン、ヒドラバミン（Ｎ，Ｎ−ビス（デヒドロアビエチル）エチレンジアミンにより形成される）、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミン、Ｎ−メチル−Ｄ−グルカミド、ｔ−ブチルアミンなど、有機塩基（例えば、有機アミン）を伴う塩、ならびにアルギニン、リシンなどのアミノ酸を伴う塩などを含む。
【０３１１】
誘導性遺伝子発現系のための、非限定的なリガンドの例はまた、ＦＫ５０６、シクロスポリンＡ、またはラパマイシンである、ＦＫ５０６結合性ドメインを利用するリガンドも含む。ＦＫ５０６、ラパマイシン、およびこれらの類似体については、米国特許第６，６４９，５９５号明細書；同第６，１８７，７５７号明細書；同第７，２７６，４９８号明細書；および同第７，２７３，８７４号明細書において開示されている。
【０３１２】
一部の実施形態では、誘導性遺伝子の発現のためのジアシルヒドラジンリガンドは、１日当たりの単位用量を、約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、または１２０ｍｇとして投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、１日当たりの単位用量を、約５ｍｇとして投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、１日当たりの単位用量を、約１０ｍｇとして投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、１日当たりの単位用量を、約１５ｍｇとして投与される。一部の実施形態では、ジアシルヒドラジンリガンドは、１日当たりの単位用量を、約２０ｍｇとして、毎日投与される。
【０３１３】
一部の実施形態では、２つまたはこれを超える治療剤との組合せ療法は、異なる作用機構により作用する薬剤を使用しうるが、これが要求されるわけではない。作用機構が異なる薬剤を使用する組合せ療法は、相加効果または相乗効果を結果としてもたらしうる。組合せ療法は、各薬剤について、単剤療法で使用されるより低用量を可能とし、これにより、毒性の副作用を低減し、かつ／または薬剤の治療指数（複数可）を増大させる。組合せ療法は、耐性のがん細胞が発生する可能性を低下させうる。一部の実施形態では、組合せ療法は、免疫応答に影響を及ぼす（例えば、応答を増強するか、または活性化させる）治療剤、および腫瘍／がん細胞に影響を及ぼす（例えば、腫瘍／がん細胞を阻害するか、または死滅させる）治療剤を含む。
【０３１４】
ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を投与することに加えて、方法または処置は、少なくとも１つの、さらなる治療剤を投与するステップをさらに含む。さらなる治療剤は、薬剤の投与の前に、これと共時的に、かつ／またはこれに後続して投与されうる。一部の実施形態では、少なくとも１つの、さらなる治療剤は、１、２、３、またはこれを超える、さらなる治療剤を含む。
【０３１５】
本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体と組み合わせて投与されうる治療剤は、化学療法剤を含む。したがって、一部の実施形態では、方法または処置は、化学療法剤と組み合わせるか、または化学療法剤のカクテルと組み合わせた、本明細書で記載される薬剤の投与を伴う。一部の実施形態では、方法は、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体と組み合わせた、シスプラチン、カペシタビン、または５−フルオロウラシルなど、１または複数の抗新生物剤をさらに含みうる。薬剤による処置は、化学療法の投与の前に、これと共時的に、またはこれに後続して生じうる。組合せ投与は、単一の医薬製剤中の共投与、もしくは個別の製剤を使用する共投与、または、一般に、全ての活性薬剤が、それらの生物学的活性を、同時に及ぼしうるような時間内における逐次投与を含みうる。このような化学療法のための調製物および投与スケジュールは、製造元の指示書に従い、または、当業者により、経験的に決定される通りに使用されうる。このような化学療法のための調製物および投与スケジュールについてはまた、The Chemotherapy Source Book, 4th Edition, 2008, M. C. Perry, Editor, Lippincott, Williams & Wilkins, Philadelphia, PAにおいても記載されている。
【０３１６】
有用な化学療法剤のクラスは、例えば、抗チューブリン剤、アウリスチン、ＤＮＡ副溝結合剤、ＤＮＡ複製阻害剤、アルキル化剤（例えば、シスプラチン、モノ（白金）、ビス（白金）、および三核白金錯体などの白金錯体、ならびにカルボプラチン）、アントラサイクリン、抗生剤、抗葉酸剤、代謝拮抗剤、化学療法増感剤、デュオカルマイシン、エトポシド、フッ素化ピリミジン、イオノフォア、レキシトロプシン、ニトロソウレア、プラチノール、プリン系代謝拮抗剤、ピューロマイシン、放射線増感剤、ステロイド、タキサン、トポイソメラーゼ阻害剤、ビンカアルカロイドなどを含む。ある特定の実施形態では、第２の治療剤は、アルキル化剤、代謝拮抗剤、抗有糸分裂剤、トポイソメラーゼ阻害剤、または血管新生阻害剤である。
【０３１７】
本明細書で提示される融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、単独で使用される場合もあり、手術、照射、化学療法、および／または骨髄移植（自家、同系、同種、または非近縁）など、従来の治療レジメンと組み合わせて使用される場合もある。腫瘍抗原のセットは、例えば、大半のがん患者において有用でありうる。
【０３１８】
キメラ受容体と組み合わせた、融合タンパク質
一部の実施形態では、融合タンパク質は、さらなる治療剤との組合せ療法として投与される。一部の実施形態では、さらなる治療剤は、キメラ抗原受容体または操作Ｔ細胞受容体などのキメラ受容体を含む。例えば、処置は、融合タンパク質の、キメラ受容体との同時的投与を伴いうる。一実施形態では、処置は、融合タンパク質と、キメラ受容体を含む、改変エフェクター細胞との共投与を伴いうる。一実施形態では、処置は、融合タンパク質の投与を後続させる、キメラ受容体を含む、改変エフェクター細胞の逐次的投与を伴いうる。別の実施形態では、処置は、キメラ受容体を含む、改変エフェクター細胞の投与を後続させる、融合タンパク質の逐次的投与を伴いうる。一態様では、投与の間に、少なくとも０．５、１、２、３、４、５、６、８、１０、１２、１５、１８、２０、または２４時間の時差が存在しうる。別の態様では、投与の間に、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、７５、９０日間、またはこれを超える日数が存在しうる。
【０３１９】
一部の実施形態では、改変エフェクター細胞は、Ｔ細胞および／またはナチュラルキラー細胞を含む、改変免疫細胞である。Ｔ細胞またはＴリンパ球は、細胞媒介性免疫に関与する白血球の亜型である。例示的なＴ細胞は、ヘルパーＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞、ＴＨ１７細胞、ステムセルメモリーＴ細胞（ＴＳＣＭ）、ナイーブＴ細胞、メモリーＴ細胞、エフェクターＴ細胞、調節性Ｔ細胞、またはナチュラルキラーＴ細胞を含む。ある特定の態様では、本明細書で記載される実施形態は、改変免疫エフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｔｒｅｇ、ＮＫ細胞またはＮＫ  Ｔ細胞）の作製および／または拡大増殖であって、細胞に、キメラ受容体をコードするＤＮＡ（またはＲＮＡ）構築物を含有する発現ベクターをトランスフェクトするステップを含む、作製および／または拡大増殖を含む。
【０３２０】
本明細書の一部の実施形態では、細胞表面上で発現されるキメラ受容体を含む、改変エフェクター細胞について記載される。一部の場合には、キメラ受容体は、腫瘍抗原、例えば、腫瘍関連抗原または腫瘍特異的抗原の認識、およびこれへの結合を可能とする抗原結合性領域を含む。一部の場合には、抗原結合性領域は、抗体または結合性断片、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ’）３、ｓｃＦｖ、ｓｃ（Ｆｖ）２、ｄｓＦｖ、ダイアボディー、ミニボディー、およびナノボディー、またはこれらの結合性断片を含む。場合によって、抗原結合性領域は、ｓｃＦｖを含む。場合によって、キメラ受容体は、ｓｃＦｖ（例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ））を含む。一部の場合には、キメラ抗原受容体は、パターン認識受容体を含む。他の場合には、キメラ受容体は、操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。
【０３２１】
本明細書ではさらに、殺滅スイッチ、選択マーカー、バイオマーカー、またはこれらの組合せとしての使用のための細胞タグを含む、免疫エフェクター細胞が提示される。一部の実施形態では、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔ、ＨＥＲ１ｔ−１、ＣＤ２０ｔ−１、またはＣＤ２０を含む。場合によって、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔを含み、前記ＨＥＲ１ｔは、配列番号６８のポリペプチド配列を含む。一部の場合には、細胞タグは、ＨＥＲ１ｔ−１を含み、前記ＨＥＲ１ｔ−１は、配列番号６９のポリペプチド配列を含む。
【０３２２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）とは、外因性の特異性を、免疫エフェクター細胞へとグラフトする、操作受容体である。一部の場合には、ＣＡＲは、抗原結合性ドメインを含む細胞外ドメイン（エクトドメイン）、ストーク領域、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメイン（エンドドメイン）を含む。一部の場合には、細胞内ドメインは、１または複数の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、Ｔ細胞活性化のための、抗原結合性ドメイン、ストーク領域、膜貫通ドメイン、１または複数の共刺激ドメイン、およびシグナル伝達ドメインを含む。
【０３２３】
抗原結合性ドメインは、モノクローナル抗体の相補性決定領域、モノクローナル抗体の可変領域、および／またはこれらの抗原結合性断片を含みうる。相補性決定領域（ＣＤＲ）とは、抗原と相補的であり、したがって、受容体に、この特定の抗原に対するその特異性をもたらす、抗原受容体（例えば、免疫グロブリンおよびＴ細胞受容体）タンパク質の可変ドメイン内に見出される、短いアミノ酸配列である。抗原受容体の各ポリペプチド鎖は、３つのＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３）を含有しうる。一部の場合には、抗原結合性ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖを含む。場合によって、抗原結合性ドメインは、ｓｃＦｖである。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆａｂである。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆａｂ’である。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆ（ａｂ’）２である。場合によって、抗原結合性ドメインは、Ｆｖである。
【０３２４】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９、ＢＣＭＡ、ＣＤ４４、α−葉酸受容体、ＣＡＩＸ、ＣＤ３０、ＲＯＲ１、ＣＥＡ、ＥＧＰ−２、ＥＧＰ−４０、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、葉酸結合性タンパク質、ＧＤ２、ＧＤ３、ＩＬ−１３Ｒ−ａ２、ＫＤＲ、ＥＤＢ−Ｆ、メソテリン、ＣＤ２２、ＥＧＦＲ、葉酸受容体α、ＭＵＣ−１、ＭＵＣ−４、もしくはＭＵＣ−１６などのムチン、ＭＡＧＥ−Ａ１、ｈ５Ｔ４、ＰＳＭＡ、ＴＡＧ−７２、ＥＧＦＲ、ＣＤ２０、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ１２３、またはＶＥＧＦ−Ｒ２におけるエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。一実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＭＵＣ１６上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９上またはＣＤ３３上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ１９上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。場合によって、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ３３上のエピトープに結合する抗原結合性ドメインを含む。さらなる実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＨＬＡ−Ａ２、ミエリン希突起膠細胞糖タンパク質（ＭＯＧ）、第ＶＩＩＩ因子（ＦＶＩＩＩ）、ＭＡｄＣＡＭ１、ＳＤＦ１、またはＩＩ型コラーゲンにおけるエピトープに結合する、自己抗原結合性領域または抗原結合性領域を含む。
【０３２５】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲおよび方法は、がんなどの過剰増殖性疾患、自己免疫疾患の処置、またはウイルス感染、細菌感染、または寄生虫感染など、感染の処置のために使用されうる。一部の態様では、ＣＡＲは、がん細胞内、自己免疫細胞内、またはウイルス、細菌、もしくは寄生虫に感染した細胞内で増大する抗原をターゲティングする。ターゲティングされうる病原体は、限定せずに述べると、マラリア原虫属（Plasmodium）、トリパノソーム、アスペルギルス属（Aspergillus）、カンジダ属（Candida）、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、ＨＳＶ、ＨＰＶ、ＲＳＶ、ＥＢＶ、ＣＭＶ、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、またはエボラ病原体を含む。自己免疫疾患は、移植片対宿主病、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、セリアック病、クローン病、シェーグレン症候群、リウマチ性多発筋痛症、多発性硬化症、視神経脊髄炎、強直性脊椎炎、１型糖尿病、円形脱毛症、血管炎、側頭動脈炎、水疱性類天疱瘡、乾癬、尋常性天疱瘡、または自己免疫性ブドウ膜炎を含みうる。
【０３２６】
ＣＡＲにより本質的に認識される病原体は、本質的に任意の種類の病原体でありうるが、一部の実施形態では、病原体は、真菌、細菌、またはウイルスである。例示的なウイルス性病原体は、アデノウイルス科（Adenoviridae）、エプスタイン−バーウイルス（ＥＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、ＲＳ（Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ  Ｓｙｎｃｙｔｉａｌ）ウイルス、ＪＣウイルス、ＢＫウイルス、ＨＰＶ、ＨＳＶ、ＨＨＶファミリーのウイルス、肝炎ファミリーのウイルス、ピコルナウイルス科（Picornaviridae）、ヘルペスウイルス科（Herpesviridae）、ヘパドナウイルス科（Hepadnaviridae）、フラビウイルス科（Flaviviridae）、レトロウイルス科（Retroviridae）、オルトミクソウイルス科（Orthomyxoviridae）、パラミクソウイルス科（Paramyxoviridae）、パポバウイルス科（Papovaviridae）、ポリオーマウイルス属（Polyomavirus）、ラブドウイルス科（Rhabdoviridae）、およびトガウイルス科（Togaviridae）の病原体を含む。例示的な病原性ウイルスは、天然痘、インフルエンザ、耳下腺炎、麻疹、水痘、エボラ、および風疹を引き起こす。例示的な病原性真菌は、カンジダ属（Candida）、アスペルギルス属（Aspergillus）、クリプトコッカス属（Cryptococcus）、ヒストプラズマ属（Histoplasma）、ニューモシスチス属（Pneumocystis）、およびスタキボトリス属（Stachybotrys）を含む。例示的な病原性細菌は、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、シュードモナス属（Pseudomonas）、赤痢菌属（Shigella）、カンピロバクター属（Campylobacter）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、ヘリコバクター属（Helicobacter）、大腸菌（E. coli）、リケッチア属（Rickettsia）、バチルス属（Bacillus）、ボルデテラ属（Bordetella）、クラミジア属（Chlamydia）、スピロヘータ門（Spirochetes）、およびサルモネラ属（Salmonella）を含む。一部の実施形態では、病原体受容体であるデクチン１は、アスペルギルス属（Aspergillus）など、真菌の細胞壁上の炭水化物構造を認識するＣＡＲを作出するのに使用されうる。別の実施形態では、ウイルス決定基（例えば、ＣＭＶおよびエボラに由来する糖タンパク質）を認識する抗体に基づき、ウイルス感染およびウイルス病態を阻止するＣＡＲが作られうる。
【０３２７】
一部の実施形態では、「ストーク領域」、「スペーサー」、または「ヒンジ」領域は、抗原結合性ドメインを、膜貫通ドメインと連結するのに使用される。一部の場合には、「ストークドメイン」または「ストーク領域」は、ポリペプチド鎖内で、膜貫通ドメインを、細胞外ドメインまたは細胞質ドメインへと連結するように機能する、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリペプチドを含む。一部の実施形態では、「ストークドメイン」または「ストーク領域」は、抗原結合性ドメインが、抗原認識を容易とするように、異なる方向を向くことを可能とするのに十分な程度に可撓性である。場合によって、ストーク領域は、ＩｇＧ１に由来するヒンジ領域を含む。代替的な場合に、ストーク領域は、免疫グロブリンのＣＨ２ＣＨ３領域と、任意選択で、ＣＤ３の一部とを含む。場合によって、ストーク領域は、国際公開第２０１６／０７３７５５号パンフレットにおいて記載されている、ＣＤ８αヒンジ領域、ＩｇＧ４−Ｆｃの１２アミノ酸のヒンジ領域（ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ）、またはＩｇＧ４ヒンジ領域を含む。
【０３２８】
膜貫通ドメインは、天然供給源に由来する場合もあり、合成供給源に由来する場合もある。供給源が天然である場合、ドメインは、任意の膜結合性タンパク質または膜貫通タンパク質に由来しうる。適切な膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体の、アルファ鎖、ベータ鎖、またはゼータ鎖の膜貫通領域を含む場合もあり、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ζ、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８アルファ、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、またはＣＤ１５４に由来する膜貫通領域を含む場合もある。代替的に、膜貫通ドメインは、合成の場合もあり、ロイシンおよびバリンなどの疎水性残基を含みうる。一部の実施形態では、合成膜貫通ドメインの、一方または両方の末端では、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが見出される。任意選択で、一部の実施形態では、２〜１０アミノ酸の間の長さである、短いオリゴヌクレオチドリンカーまたはポリペプチドリンカーは、ＣＡＲの膜貫通ドメインと、細胞質シグナル伝達ドメインとの間の連結を形成しうる。一部の実施形態では、リンカーは、グリシン−セリンリンカーである。
【０３２９】
一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。一部の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。他の実施形態では、膜貫通ドメインは、ＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。
【０３３０】
細胞内ドメインは、１または複数の共刺激ドメインを含みうる。例示的な共刺激ドメインは、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せを含むがこれらに限定されない。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ８、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される共刺激ドメインのうちの１もしくは複数、または２つもしくはこれを超えるものを含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである、ＣＤ２８および４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこれらのそれぞれの断片を含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである、ＣＤ２８およびＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらのそれぞれの断片を含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである、ＣＤ８およびＣＤ２８、またはこれらのそれぞれの断片を含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである、ＣＤ２８、またはこの断片を含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、またはこの断片を含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこの断片を含む。一部の場合には、本明細書で記載されるＣＡＲは、共刺激ドメインである、ＣＤ８、またはこの断片を含む。
【０３３１】
一部の実施形態では、細胞内ドメインは、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインをさらに含む。一部の場合には、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲゼータ、ＦｃＲガンマ、ＦｃＲベータ、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、またはＣＤ６６ｄに由来するドメインを含む。一部の場合には、Ｔ細胞活性化のためのシグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来するドメインを含む。
【０３３２】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、本明細書で記載されるサイトカインを含むがこれらに限定されない、１または複数のさらなる治療剤と共に、対象へと投与される。さらなる実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲを発現する免疫エフェクター細胞は、膜結合型ＩＬ−１５（「ｍＩＬ−１５またはｍｂＩＬ−１５」）を発現する。本発明の態様では、ｍｂＩＬ−１５は、ＩＬ−１５と、ＩＬ−１５Ｒαとの融合タンパク質を含む。さらなる実施形態では、ｍｂＩＬ−１５は、配列番号６９のアミノ酸配列と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。ある特定の場合には、ＣＡＲと、サイトカインとは、個別のベクター内で発現される。具体的場合には、ベクターは、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、またはＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンでありうる。
【０３３３】
ＣＤ１９特異的ＣＡＲ
ＣＤ１９とは、免疫グロブリンスーパーファミリーの細胞表面糖タンパク質であり、主に、悪性Ｂ細胞系統内で見出される。一部の場合には、ＣＤ１９はまた、膵がん、肝がん、および前立腺がんなど、充実性腫瘍内で検出されている。
【０３３４】
本明細書の一部の実施形態では、抗原結合性ドメインが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖを含む、ＣＤ１９特異的ＣＡＲについて記載される。一部の場合には、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＦＭＣ６３によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の実施形態では、ｓｃＦｖドメインおよび／またはＶＨ／ＶＬドメインは、ＦＭＣ６３に由来する。ＦＭＣ６３とは、一般に、ヒト由来のＣＤ１９を発現するＮａｌｍ−ｌ細胞およびＮａｌｍ−１６細胞に対して惹起されるマウスＩｇＧｌモノクローナル抗体（Ling, N. R., el al. (1987). Leucocyte typing III. 302）を指す。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３３５】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１５、ＪＣＡＲ０１７、または１９−２８ｚ  ＣＡＲ（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。本明細書の一部の実施形態では、抗原結合性ドメインが、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１５、ＪＣＡＲ０１７、または１９−２８ｚ  ＣＡＲ（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３３６】
本明細書の一部の実施形態では、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインが、ＪＣＡＲ０１４、ＪＣＡＲ０１５、ＪＣＡＲ０１７、または１９−２８ｚ  ＣＡＲ（Ｊｕｎｏ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３３７】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、米国特許出願公開第２０１６０１５２７２３号明細書において記載されている抗ＣＤ１９抗体を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、国際特許公開第２０１５／１２３６４２号パンフレットにおいて記載されている抗ＣＤ１９抗体を含む。一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、クローンである、ＦＭＣ６３に由来する、抗ＣＤ１９ｓｃＦｖ（Nicholson et al. Construction and characterisation of a functional CD19 specific single chain Fv fragment for immunotherapy of B lineage leukaemia and lymphoma. Mol. Immunol., 34:1157-1165, 1997）を含む。
【０３３８】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＫＴＥ−Ｃ１９（Ｋｉｔｅ  Ｐｈａｒｍａ，Ｉｎｃ．）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。本明細書の一部の実施形態では、抗原結合性ドメインが、ＫＴＥ−Ｃ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３３９】
本明細書の一部の実施形態では、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインが、ＫＴＥ−Ｃ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３４０】
一部の実施形態では、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、国際公開第２０１５１８７５２８号パンフレットにおいて記載されている抗ＣＤ１９抗体、またはこの断片もしくは誘導体を含む。
【０３４１】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＣＴＬ０１９（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。本明細書の一部の実施形態では、抗原結合性ドメインが、ＣＴＬ０１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３４２】
本明細書の一部の実施形態では、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインが、ＣＴＬ０１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３４３】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＵＣＡＲＴ１９（Ｃｅｌｌｅｃｔｉｓ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。本明細書の一部の実施形態では、抗原結合性ドメインが、ＵＣＡＲＴ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３４４】
本明細書の一部の実施形態では、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインが、ＵＣＡＲＴ１９によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３４５】
一部の実施形態では、抗原結合性ドメインは、ＢＰＸ−４０１（Ｂｅｌｌｉｃｕｍ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。本明細書の一部の実施形態では、抗原結合性ドメインが、ＢＰＸ−４０１によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３４６】
本明細書の一部の実施形態では、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインが、ＢＰＸ−４０１によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について記載される。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３４７】
場合によって、抗原結合性ドメインは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブ・ラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ−５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブ・マホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（またはＤＩ−Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブ・パプトックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ  ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ−１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）、またはＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲは、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３４８】
本明細書の一部の実施形態では、抗原結合性ドメインが、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ、またはｓｃＦｖを含む、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞について記載される。一部の場合には、抗原結合性ドメインは、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。場合によって、抗原結合性ドメインは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブ・ラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ−５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブ・マホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（またはＤＩ−Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブ・パプトックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ  ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ−１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）、またはＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３４９】
場合によって、本明細書で記載されるＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｓｃＦｖの抗原結合性ドメインを含み、抗原結合性ドメインは、ブリナツモマブ（Ａｍｇｅｎ）、コルツキシマブ・ラブタンシン（ＩｍｍｕｎｏＧｅｎ  Ｉｎｃ．／Ｓａｎｏｆｉ−ａｖｅｎｔｉｓ）、ＭＯＲ２０８（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ  ＡＧ／Ｘｅｎｃｏｒ  Ｉｎｃ．）、ＭＥＤＩ−５５１（Ｍｅｄｉｍｍｕｎｅ）、デニンツズマブ・マホドチン（Ｓｅａｔｔｌｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、Ｂ４（またはＤＩ−Ｂ４）（Ｍｅｒｃｋ  Ｓｅｒｏｎｏ）、タプリツモマブ・パプトックス（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）、ＸｍＡｂ  ５８７１（Ａｍｇｅｎ／Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．）、ＭＤＸ−１３４２（Ｍｅｄａｒｅｘ）、またはＡＦＭ１１（Ａｆｆｉｍｅｄ）によってもまた認識される、ＣＤ１９上のエピトープを認識する。一部の場合には、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ８アルファ膜貫通ドメインまたはＣＤ３ζ膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメイン；ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＤＡＰ１０、ＤＡＰ１２、ＯＸ４０（ＣＤ１３４）、またはこれらの断片もしくは組合せから選択される、１または複数の共刺激ドメイン；およびＣＤ３ζに由来するシグナル伝達ドメインをさらに含む。
【０３５０】
ＣＤ３３特異的ＣＡＲ
「ＣＤ３３」とは、６７ｋＤａの、１回膜貫通型糖タンパク質であり、シアル酸結合性免疫グロブリン様レクチン（Ｓｉｇｌｅｃ）スーパーファミリーのメンバーである。ＣＤ３３は、その細胞外ドメイン内の、シアル酸の結合の一因となる、ＶセットのＩｇ様ドメインと、Ｃ２のセットＩｇ様ドメインとにより特徴づけられる。ＣＤ３３ｍ  ＲＮＡの、代替的なスプライシングは、ＶセットのＩｇ様ドメイン、ならびにＶセットのＩｇ様ドメインと、Ｃ２−セットＩｇ様ドメインとを連結する、ジスルフィド結合を欠く、短いアイソフォーム（ＣＤ３３ｍ）をもたらす。健常対象では、ＣＤ３３は、正常の複能性骨髄前駆体上、単能性コロニー形成細胞上、単球上、および成熟顆粒球上で見出される、骨髄分化抗原として、主に発現される。ＣＤ３３は、８０％を超える骨髄性白血病細胞上で発現されるが、正常造血幹細胞上または成熟顆粒球上では発現されない（Andrews, R. et al., The L4F3 antigen is expressed by unipotent and multipotent colony-forming cells but not by their precursors, Blood, 68(5):1030-5 (1986)）。ＣＤ３３は、悪性骨髄細胞上、活性化Ｔ細胞上、および活性化ＮＫ細胞上で発現されることが報告されており、ＡＭＬ患者の大半における、芽細胞の、少なくともサブセット上において見出される（Pollard, J. et al., Correlation of CD33 expression level with disease characteristics and response to gemtuzumab ozogamicin containing chemotherapy in childhood AML, Blood, 119(16):3705-11 (2012)）。ＡＭＬ性芽細胞上の、広範な発現に加えて、ＣＤ３３は、ＡＭＬの基底をなす、幹細胞上でも発現されうる。
【０３５１】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＣＤ３３に特異的（ＣＤ３３  ＣＡＲ）である。ＣＤ３３特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現されると、Ｔ細胞の特異性を、ヒトＣＤ３３へとリダイレクトする。複数の実施形態では、抗原結合性ドメインは、標的抗原特異的な、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体の、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、グリシン−セリンリンカーまたはホイットローリンカーなどの可撓性リンカーにより接続されたＶＬおよびＶＨを含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、Ｍ１９５、ｍ２Ｈ１２、ＤＲＢ２、および／またはＭｙ９−６である。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ｓｃＦｖ、例えば、ｈＭ１９５である。一部の実施形態では、抗原結合性部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨと、方向性をもって連結されたＶＨおよびＶＬを含みうる。
【０３５２】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３５のアミノ酸配列（ｈＭ１９５  ＶＬ）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３５３】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３６のアミノ酸配列（ｈＭ１９５  ＶＨ）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３５４】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３７のアミノ酸配列（Ｍ２Ｈ１２  ＶＨ）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３５５】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３８のアミノ酸配列（Ｍ２Ｈ１２  ＶＬ）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３５６】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号３９のアミノ酸配列（ＤＲＢ２  ＶＨ）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３５７】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４０のアミノ酸配列（ＤＲＢ２  ＶＬ）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３５８】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４１のアミノ酸配列（Ｍｙ９−６  ＶＨ）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３５９】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４２のアミノ酸配列（Ｍｙ９−６  ＶＬ）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３６０】
ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ
ＭＵＣ１６は、ＣＡ−１２５としてもまた公知である、大型の炭水化物抗原である。ＭＵＣ１６は、ヒト第１９染色体上に位置するＭＵＣ１６遺伝子によりコードされる。ＭＵＣ１６は、３つのドメインを含み、高度にグリコシル化された、マルチドメインのＩ型膜貫通型タンパク質である。Ｃ末端ドメインは、自己タンパク質溶解活性を有する、複数の細胞外ＳＥＡ（ウニ精子タンパク質、エンテロキナーゼ、およびアグリン）モジュールを含有する。ＳＥＡは、膜貫通型（ＴＭ）ドメインに対して近位である、２つのタンパク質分解性部位を保有する。ＣＡ−１２５と称する、大型の切断型ドメインは、酸性のｐＨで、循環へと放出される。ＣＡ−１２５は、一般に、卵巣がんについての、疾患バイオマーカーとして使用される。高度に保存的な、トランケート型で、細胞外の、膜にテザリングされたタンパク質ドメインは、ＭＵＣ１６細胞外ドメインと呼ばれる。腫瘍細胞表面上に保持された、ＭＵＣ１６の細胞外ドメインに特異的に結合したＭＵＣ１６抗体が同定された。目的の細胞（がん細胞など）による、「ＭＵＣ１６の過剰発現」とは、目的の細胞により発現される、対照細胞（非がん性細胞、正常細胞など）と比較して高レベルである、ＭＵＣ１６のタンパク質および／またはｍＲＮＡを指す。
【０３６１】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲの抗原結合性部分は、ＭＵＣ１６に特異的（ＭＵＣ１６  ＣＡＲ）である。ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲは、細胞表面上で発現されると、Ｔ細胞の特異性を、ヒトＭＵＣ１６へとリダイレクトする。複数の実施形態では、抗原結合性ドメインは、標的抗原特異的な、抗ＭＵＣ１６モノクローナル抗体の、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）および重鎖可変ドメイン（ＶＨ）であって、グリシン−セリンリンカーまたはホイットローリンカーなどの可撓性リンカーにより接続されたＶＬおよびＶＨを含む単鎖抗体断片（ｓｃＦｖ）を含む。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ＭＵＣ１６−ｓｃＦｖ（配列番号４３〜４４）、ＭＵＣ１６−ｓｃＦｖ（配列番号４５〜４６）、ＭＵＣ１６−ｓｃＦｖ（配列番号４７〜４８）、ＭＵＣ１６−ｓｃＦｖ（配列番号４９〜５０）、ＭＵＣ１６−ｓｃＦｖ（配列番号５１〜５２）、ＭＵＣ１６−ｓｃＦｖ（配列番号５３〜５４）、またはＭＵＣ１６−ｓｃＦｖ（配列番号５５〜５６）である。複数の実施形態では、ｓｃＦｖは、ヒト化ｓｃＦｖである。
【０３６２】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４３のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−１）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３６３】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４４のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−１）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３６４】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４５のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−２）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３６５】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４６のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−２）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３６６】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４７のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−３）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３６７】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４８のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−３）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３６８】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号４９のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−４）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３６９】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５０のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−４）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３７０】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５１のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−５）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３７１】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５２のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−５）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３７２】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５３のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−５）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３７３】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５４のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−６）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３７４】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５５のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−７）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＬポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３７５】
複数の実施形態では、本明細書で記載されるＣＡＲは、配列番号５６のアミノ酸配列（ＭＵＣ１６−７）と、少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性を有する、ＶＨポリペプチドを含む抗原結合性部分を含む。
【０３７６】
一部の実施形態では、抗原結合性部分は、例えば、Ｎ末端からＣ末端へと、ＶＨ−リンカー−ＶＬまたはＶＬ−リンカー−ＶＨと、方向性をもって連結されたＶＨおよびＶＬを含みうる。
【０３７７】
操作Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）
一部の実施形態では、キメラ受容体は、操作Ｔ細胞受容体を含む。Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）は、Ｔ細胞の表面上で対合して、ヘテロ二量体の受容体を形成する、２つの鎖（αβまたはγδ）から構成される。一部の場合には、αβ  ＴＣＲは、体内の大半のＴ細胞上で発現され、特異的ＭＨＣ拘束抗原の認識に関与することが公知である。α鎖およびβ鎖の各々は、２つのドメイン：タンパク質を、細胞膜へとアンカリングし、ＣＤ３シグナル伝達装置の不変サブユニットと会合する定常ドメイン（Ｃ）と；相補性決定領域（ＣＤＲ）と称される、６回ループを介して、抗原認識を付与する可変ドメイン（Ｖ）とから構成される。一部の場合には、各Ｖドメインは、３つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ３を超可変領域とする、ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３を含む。これらのＣＤＲは、主要組織適合性複合体によりコードされるタンパク質に結合された抗原性ペプチドの間で形成される複合体（ｐｅｐＭＨＣ）（例えば、ＨＬＡ−Ａ複合体、ＨＬＡ−Ｂ複合体、ＨＬＡ−Ｃ複合体、ＨＬＡ−ＤＰＡ１複合体、ＨＬＡ−ＤＰＢ１複合体、ＨＬＡ−ＤＱＡ１複合体、ＨＬＡ−ＤＱＢ１複合体、ＨＬＡ−ＤＲＡ複合体、またはＨＬＡ−ＤＲＢ１複合体）と相互作用する。一部の場合には、定常ドメインは、定常ドメインを、可変ドメインへと接続する接合領域をさらに含む。場合によって、ベータ鎖は、接合領域の一部を構成する、短い多様性領域をさらに含む。
【０３７８】
場合によって、このようなＴＣＲは、特異的腫瘍抗原、例えば、ＮＹ−ＥＳＯ、Ｍａｇｅ  Ａ３、Ｔｉｔｉｎと反応性である。他の場合には、このようなＴＣＲは、患者の腫瘍内で発現される、特異的ネオ抗原（すなわち、腫瘍により発現される、患者特異的な、体細胞性の、非同義突然変異）と反応性である。場合によって、操作ＴＣＲは、アフィニティー増強されうる。
【０３７９】
一部の実施形態では、ＴＣＲは、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ（ＩＭＧＴ）によるＴＣＲ命名法を使用して記載され、ＩＭＧＴによる、ＴＣＲ配列についての公開データベースへとリンクする。例えば、それらのフレームワーク配列、ＣＤＲ１配列、ＣＤＲ２配列、およびＣＤＲ３配列により識別される、いくつかの種類のアルファ鎖可変（Ｖα）領域と、いくつかの種類のベータ鎖可変（Ｖβ）領域とが存在しうる。このようにして、Ｖαの種類は、ＩＭＧＴ命名法では、固有のＴＲＡＶ番号により言及されうる。例えば、「ＴＲＡＶ２１」は、固有のフレームワーク配列、ならびにＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列、ならびに、ＴＣＲから、ＴＣＲへと保存されるアミノ酸配列により、部分的に規定されるが、また、ＴＣＲから、ＴＣＲへと変動するアミノ酸配列も含む、ＣＤＲ３配列を有するＴＣＲＶα領域を規定する。同様に、「ＴＲＢＶ５−１」は、固有のフレームワーク配列、ならびにＣＤＲ１配列およびＣＤＲ２配列を有するが、ＣＤＲ３配列は、部分的に規定されているに過ぎない、ＴＣＲＶβ領域を規定する。
【０３８０】
場合によって、ベータ鎖多様性領域は、ＩＭＧＴ命名法では、ＴＲＢＤという略号で言及される。
【０３８１】
一部の場合には、ＩＭＧＴ命名法により規定される固有の配列は、広く公知であり、ＴＣＲの分野に携わる者に閲覧可能である。例えば、これらは、ＩＭＧＴによる公開データベースおよび“T cell Receptor Factsbook”, (2001) LeFranc and LeFranc, Academic Press, ISBN 0-12-441352-8において見出すことができる。
【０３８２】
一部の実施形態では、αβヘテロ二量体であるＴＣＲは、例えば、細胞質ドメインおよび膜貫通ドメインの両方を有する全長鎖としてトランスフェクトされる。場合によって、ＴＣＲは、例えば、国際公開第２００６／０００８３０号パンフレットにおいて記載されている、それぞれの定常ドメインの残基の間に導入されたジスルフィド結合を含有する。
【０３８３】
一部の場合には、本明細書で記載されるＴＣＲは、単鎖フォーマットである（例えば、国際公開第２００４／０３３６８５号パンフレットを参照されたい）。単鎖フォーマットは、Ｖα−Ｌ−Ｖβ型、Ｖβ−Ｌ−Ｖα型、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖβ型、Ｖα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβ型、Ｖα−Ｃα−Ｌ−Ｖβ−Ｃβ型のαβ  ＴＣＲポリペプチド［フォーマット中、ＶαおよびＶβは、それぞれ、ＴＣＲα可変領域およびＴＣＲβ可変領域であり、ＣαおよびＣβは、それぞれ、ＴＣＲα定常領域およびＴＣＲβ定常領域であり、Ｌは、リンカー配列である］を含む。ある特定の実施形態では、本発明の単鎖ＴＣＲは、国際公開第２００４／０３３６８５号パンフレットにおいて記載されている、それぞれの定常ドメインの残基の間に導入されたジスルフィド結合を有しうる。
【０３８４】
本明細書で記載されるＴＣＲには、検出用標識、治療剤、またはＰＫ修飾部分を付随させうる。
【０３８５】
診断を目的とする、例示的な検出用標識は、蛍光標識、放射性標識、酵素、核酸プローブ、および造影試薬を含むがこれらに限定されない。
【０３８６】
本明細書で記載されるＴＣＲに付随させうる治療剤は、免疫モジュレーター、放射性化合物、酵素（例えば、パーフォリン）、または化学療法剤を含む。毒性作用が、所望の場所で及ぼされることを確保するために、化合物が、制御された形で放出されるように、毒素は、ＴＣＲへと連結されたリポソームの内部に存在しうるであろう。場合によって、徐放は、体内の輸送時における損傷作用を最小化し、毒素が、対象とする抗原提示細胞へのＴＣＲの結合の後で、最大の作用を及ぼすことを確保する。
【０３８７】
一部の実施形態では、さらなる、適切な治療剤は、例えば、
ａ．低分子細胞傷害剤、例えば、哺乳動物細胞を死滅させる能力を伴う化合物であって、７００ダルトン未満の分子量を有する化合物。このような化合物はまた、細胞傷害作用を有することが可能な、毒性金属も含有しうるであろう。さらに、これらの低分子の細胞傷害剤はまた、プロドラッグ、すなわち、生理学的条件下で、崩壊するか、または転換されて、細胞傷害剤を放出する化合物も含むことが理解されるものとする。このような薬剤の例は、シスプラチン、メイタンシン誘導体、ラケルミシン、カリケアミシン、ドセタキセル、エトポシド、ゲムシタビン、イホスファミド、イリノテカン、メルファラン、ミトキサントロン、ソルフィマーナトリウムであるphotofrin II、テモゾロミド、トポテカン、グルクロン酸トリメトレキサート（trimetreate glucuronate）、アウリスチンＥ、ビンクリスチン、およびドキソルビシンを含む；
ｂ．ペプチド性細胞毒素、すなわち、哺乳動物細胞を死滅させる能力を伴う、タンパク質またはこれらの断片。例えば、リシン、ジフテリア毒素、シュードモナス属（pseudomonas）菌の外毒素Ａ、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼ；
ｃ．放射性核種、すなわち、元素の不安定的な同位体であって、α粒子もしくはβ粒子、またはγ線のうちの１または複数の、共時的な放射を伴って崩壊する同位体。例えば、ヨウ素１３１、レニウム１８６、インジウム１１１、イットリウム９０、ビスマス２１０および２１３、アクチニウム２２５、ならびにアスタチン２１３であり；キレート化剤が、これらの放射性核種の、高アフィニティーＴＣＲ、またはこれらの多量体への会合を容易とするのに使用されうる；
ｄ．免疫刺激剤、すなわち、免疫応答を刺激する、免疫エフェクター分子。例えば、ＩＬ−２およびＩＦＮ−γなどのサイトカイン；
ｅ．スーパー抗原およびこれらの突然変異体；
ｆ．ＴＣＲ−ＨＬＡ融合；
ｇ．ＩＬ−８、結晶板因子４、黒色腫増殖刺激性タンパク質などのケモカイン；
ｈ．抗Ｔ細胞決定基抗体またはＮＫ細胞決定基抗体（例えば、抗ＣＤ３抗体、抗ＣＤ２８抗体、または抗ＣＤ１６抗体）を含む、抗体またはこれらの断片；
ｉ．抗体様結合特徴を伴う、代替的なタンパク質足場；
ｊ．補体活性化因子；ならびに
ｋ．異種タンパク質ドメイン、同種タンパク質ドメイン、ウイルス性／細菌性タンパク質ドメイン、ウイルス性／細菌性ペプチドを含む。
【０３８８】
用量
使用される、融合タンパク質および改変免疫エフェクター細胞の適切な用量は、対象の年齢および体重、および使用される、特定の薬物に依存するであろう。融合タンパク質および改変免疫エフェクター細胞の、用量および治療レジメンは、当業者により決定されうる。
【０３８９】
ある特定の実施形態では、融合タンパク質は、１ｋｇ当たり約１〜３０ｍｇ、例えば、１ｋｇ当たり約５〜２５ｍｇ、１ｋｇ当たり約１０〜２０ｍｇ、１ｋｇ当たり約１〜５ｍｇ、または１ｋｇ当たり約３ｍｇの用量における、注射（例えば、皮下注射または静脈内注射）により投与される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１ｋｇ当たり約１ｍｇ、１ｋｇ当たり約３ｍｇ、１ｋｇ当たり約５ｍｇ、１ｋｇ当たり約１０ｍｇ、１ｋｇ当たり約２０ｍｇ、１ｋｇ当たり約３０ｍｇ、または１ｋｇ当たり約４０ｍｇの用量で投与される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１ｋｇ当たり約１〜３ｍｇ、または１ｋｇ当たり約３〜１０ｍｇの用量で投与される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、１ｋｇ当たり約０．５〜２、２〜４、２〜５、５〜１５、または５〜２０ｍｇの用量で投与される。投与スケジュールは、例えば、毎週１回〜２、３、４週間ごとに１回で変動しうる。一実施形態では、融合タンパク質は、隔週、１ｋｇ当たり約１０〜２０ｍｇの用量で投与される。別の実施形態では、融合タンパク質は、２週間ごとに１回、１ｋｇ当たり約１ｍｇ、２週間ごとに１回、１ｋｇ当たり約３ｍｇ、２週間ごとに１回、１ｋｇ当たり１０ｍｇ、４週間ごとに１回、１ｋｇ当たり３ｍｇ、または４週間ごとに１回、１ｋｇ当たり５ｍｇの用量で投与される。
【０３９０】
他の実施形態では、融合タンパク質は、約２００ｍｇ〜５００ｍｇ、例えば、約２５０ｍｇ〜４５０ｍｇ、約３００ｍｇ〜４００ｍｇ、約２５０ｍｇ〜３５０ｍｇ、約３５０ｍｇ〜４５０ｍｇ、または約３００ｍｇ、または約４００ｍｇの用量（例えば、フラット用量）における、注射（例えば、皮下注射または静脈内注射）により投与される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、約２００ｍｇ、約２５０ｍｇ、約３００ｍｇ、約３５０ｍｇ、約４００ｍｇ、約４５０ｍｇ、または約５００ｍｇの用量で投与される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、２００または３００ｍｇの用量で投与される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、約２５０〜４５０ｍｇ、または約３００〜４００ｍｇの用量で投与される。一部の実施形態では、融合タンパク質は、約２００〜３００ｍｇ、２５０〜３５０ｍｇ、３００〜４００ｍｇ、３５０〜４５０ｍｇ、または４００〜５００ｍｇの用量で投与される。投与スケジュールは、例えば、毎週１回〜２、３、４、５、または６週間ごとに１回で変動しうる。一実施形態では、融合タンパク質は、３または４週間ごとに１回、約３００ｍｇ〜４００ｍｇの用量で投与される。一実施形態では、融合タンパク質は、３週間ごとに１回、約３００ｍｇの用量で投与される。一実施形態では、融合タンパク質は、４週間ごとに１回、約４００ｍｇの用量で投与される。一実施形態では、融合タンパク質は、４週間ごとに１回、約３００ｍｇの用量で投与される。一実施形態では、融合タンパク質は、３週間ごとに１回、約４００ｍｇの用量で投与される。融合タンパク質は、１回または複数回にわたり、例えば、１、２、３、４、５、６、７回、またはこれを超える回数にわたり投与されうる。一実施形態では、融合タンパク質は、６回にわたり投与される。融合タンパク質は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＭＵＣ１６、ＣＤ３３、ＣＤ１９またはＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ発現細胞の投与後少なくとも５日後、例えば、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、２０、２５、３０、３５、または４０日後、に投与されうる。一部の実施形態では、融合タンパク質は、ＣＡＲ発現細胞、例えば、ＭＵＣ１６特異的ＣＡＲ発現細胞、またはＣＤ３３特異的ＣＡＲ発現細胞の投与後約８日または約１５日後に投与されうる。
【０３９１】
融合タンパク質は、当技術分野で公知の、様々な方法により投与されうるが、多くの治療適用では、好ましい投与経路／方式は、静脈内注射または静脈内注入である。例えば、融合タンパク質は、１ｍ２当たり約３５〜４４０ｍｇ、典型的に、１ｍ２当たり約７０〜３１０ｍｇであり、より典型的に、１ｍ２当たり約１１０〜１３０ｍｇの用量に到達するように、２０ｍｇ／分を超え、例えば、２０〜４０ｍｇ／分であり、典型的に、４０ｍｇ／分以上の速度における静脈内注入により投与されうる。複数の実施形態では、融合タンパク質は、１ｍ２当たり約１〜１００ｍｇ、好ましくは、１ｍ２当たり約５〜５０ｍｇ、１ｍ２当たり約７〜２５ｍｇであり、より好ましくは、１ｍ２当たり約１０ｍｇの用量に到達するように、１０ｍｇ／分未満、好ましくは、５ｍｇ／分以下の速度における静脈内注入により投与されうる。
【０３９２】
融合タンパク質は、１ｍ２当たり約３５〜４４０ｍｇ、典型的に、１ｍ２当たり約７０〜３１０ｍｇであり、より典型的に、１ｍ２当たり約１１０〜１３０ｍｇの用量に到達するように、２０ｍｇ／分を超え、例えば、２０〜４０ｍｇ／分であり、典型的に、４０ｍｇ／分以上の速度における静脈内注入により投与されうる。複数の実施形態では、１ｍ２当たり約１１０〜１３０ｍｇの注入率は、１ｋｇ当たり約３ｍｇのレベルを達成する。他の実施形態では、融合タンパク質は、１ｍ２当たり約１〜１００ｍｇ、例えば、１ｍ２当たり約５〜５０ｍｇ、１ｍ２当たり約７〜２５ｍｇ、または、１ｍ２当たり約１０ｍｇの用量に到達するように、１０ｍｇ／分未満、例えば、５ｍｇ／分以下の速度における静脈内注入により投与されうる。一部の実施形態では、抗体は、約３０分間にわたり注入される。
【０３９３】
改変エフェクター細胞の用量
一部の実施形態では、ある量の改変エフェクター細胞が、それを必要とする対象へと投与されるが、量は、サイトカインと関連する毒性を誘導する有効性および潜在的可能性に基づき決定される。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０８〜約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０９個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０８個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０７個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０６個を含む。場合によって、改変エフェクター細胞の量は、１ｋｇ当たりの改変エフェクター細胞約１０５個を含む。
【０３９４】
一部の実施形態では、改変エフェクター細胞は、改変Ｔ細胞である。一部の場合には、改変Ｔ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞である。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８〜約１０９個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０９個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６個を含む。一部の場合には、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５個を含む。
【０３９５】
一部の実施形態では、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞である。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８〜約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０９個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０８個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０７個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０６個を含む。場合によって、ＣＤ１９特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＣＡＲ−Ｔ細胞約１０５個を含む。
【０３９６】
一部の実施形態では、改変Ｔ細胞は、操作ＴＣＲ  Ｔ−細胞である。場合によって、操作ＴＣＲ  Ｔ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０８個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０７個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６〜約１０８個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０７〜約１０９個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５〜約１０６個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６〜約１０７個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０７〜約１０８個を含む。場合によって、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０８〜約１０９個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０９個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０８個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０７個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０６個を含む。一部の場合には、操作ＴＣＲ細胞の量は、１ｋｇ当たりのＴＣＲ細胞約１０５個を含む。
【０３９７】
投与量の値は、緩和される状態の種類および重症度と共に変動しうることに注意されたい。任意の特定の対象について、特異的投与レジメンは、個々の必要、および組成物の投与者または組成物の投与の監督者の職業的判断に従い、時間経過にわたり調整されるべきであり、本明細書で明示される投与量範囲は、例示的なものであるに過ぎず、特許請求される組成物の範囲または施薬を限定するように意図されるものではないないことも、さらに理解されたい。
【０３９８】
融合タンパク質の発現系および精製系
本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、１もしくは複数の融合タンパク質、またはこれらの断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターで形質転換された宿主細胞を、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の発現を可能とするのに十分な条件下で、十分な長さの時間にわたり培養することにより、細胞から産生されうる。例えば、大腸菌（E. coli）内で発現されるポリペプチドは、封入体からリフォールディングされうる（例えば、Hou et al. (1998) Cytokine 10:319-30を参照されたい）。当技術分野では、これらを使用するための細菌発現系および方法が周知である（Current Protocols in Molecular Biology, Wiley & Sons, and Molecular Cloning - A Laboratory Manual - 3rd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2001)を参照されたい）。コドン、適切な発現ベクター、および適切な宿主細胞の選出は、多数の因子に応じて変動する場合があり、必要に応じて、容易に最適化されうる。本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、哺乳動物細胞内、または酵母、バキュロウイルス、およびｉｎ  ｖｉｔｒｏ発現系を含むがこれらに限定されない、他の発現系で発現されうる（例えば、Kaszubska et al. (2000) Protein Expression and Purification 18:213-220を参照されたい）。
【０３９９】
発現の後、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、精製または単離されうる。本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体のうちのいずれかに適用される場合の、「精製された」または「単離された」という用語は、天然で、これに随伴する成分（例えば、タンパク質、または他の天然に存在する生物学的分子もしくは有機分子）、例えば、タンパク質を発現する原核生物における、他のタンパク質、脂質、および核酸から、分離または精製されたポリペプチドまたはタンパク質を指す場合がある。典型的に、ポリペプチドは、それが、試料中の全タンパク質の重量で、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．５％、少なくとも９９．９％を構成する場合に、精製されている。
【０４００】
本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、他のどのような成分が、試料中に存在するのかに応じて、様々な形で、単離または精製されうる。標準的精製法は、電気泳動法、分子法、免疫法、ならびにイオン交換クロマトグラフィー、疎水性クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、および逆相ＨＰＬＣクロマトグラフィーを含む、クロマトグラフィー法を含む。例えば、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、標準的な、抗融合タンパク質抗体アフィニティーカラムを使用して精製されうる。タンパク質の濃縮を伴う、限外濾過法および透析法もまた、有用である。例えば、Scopes (1994) “Protein Purification, 3rd edition,” Springer-Verlag, New York City, N.Yを参照されたい。必要な精製度は、所望の使用に応じて変動しうる。一部の場合には、発現された、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の精製は、必要ではない。
【０４０１】
精製された、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の収率または純度を決定するための方法は、例えば、ブラッドフォードアッセイ、ＵＶ分光法、ビウレットタンパク質アッセイ、ローリータンパク質アッセイ、アミドブラックタンパク質アッセイ、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）、質量分析（ＭＳ）、およびゲル電気泳動法（例えば、クーマシーブルーまたは銀コロイド染料などのタンパク質染料を使用する）を含みうる。発現、精製されたら、または発現後に精製した後で、本明細書で記載されるｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイのうちの任意のものなどの、ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイまたはｉｎ  ｖｉｖｏアッセイを使用して、本明細書で記載される融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、列挙された、所望の特性のうちのいずれか１つについてアッセイされうる。例えば、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、例えば、ＰＤ−１を阻害し、ＴＧＦ−βを捕捉するその能力についてアッセイされうる。
【０４０２】
本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、様々な技法を使用して産生されうる。例えば、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドは、例えば、プロモーター配列、リボソーム結合性部位、転写開始配列および転写終結配列、翻訳開始配列および翻訳終結配列、転写ターミネーターシグナル、ポリアデニル化シグナル、ならびにエンハンサー配列または活性化因子配列を含みうる、転写調節配列および翻訳調節配列を含有する発現ベクターへと挿入されうる。一部の実施形態では、調節配列は、プロモーター配列、ならびに転写開始配列および転写終結配列を含みうる。加えて、発現ベクターは、それが、２つの異なる生物内、例えば、発現のための哺乳動物内または昆虫細胞内、ならびにクローニングおよび増幅のための原核生物宿主で維持されうるように、１つを超える複製系を含みうる。
【０４０３】
哺乳動物細胞（例えば、宿主細胞）内の核酸からの、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の発現のために、いくつかの可能なベクター系が利用可能である。例えば、ベクターの、１つのクラスは、所望の遺伝子配列の、宿主細胞ゲノムへの組込みに依拠する。ＤＮＡを安定的に組み込んだ細胞は、大腸菌（E. coli）ｇｐｔ（Mulligan and Berg (1981) Proc Natl Acad Sci USA 78:2072）、またはＴｎ５  ｎｅｏ（Southern and Berg (1982) Mol Appl Genet 1:327）などの薬物耐性遺伝子を、同時に導入することにより選択されうる。選択用マーカー遺伝子は、発現されるＤＮＡ遺伝子配列へと連結される場合もあり、共トランスフェクションにより、同じ細胞へと導入される場合もある（Wigler et al. (1979) Cell 16:77）。別のクラスのベクターは、自律的な複製能を、染色体外プラスミドへと付与する、ＤＮＡエレメントを利用する。これらのベクターは、ウシパピローマウイルス（Sarver et al. (1982) Proc Natl Acad Sci USA, 79:7147）、ポリオーマウイルス（Deans et al. (1984) Proc Natl Acad Sci USA 81:1292）、またはＳＶ４０ウイルス（Lusky and Botchan (1981) Nature 293:79）などの動物ウイルスに由来しうる。発現ベクターは、後続の、核酸の発現に適する形で、細胞（例えば、宿主細胞）へと導入されうる。導入法は、大部分、下記で論じられる、標的細胞型により指定される。非限定的で例示的な方法は、ＣａＰＯ４沈殿、リポソーム融合、リポフェクチン、電気穿孔、ウイルス感染、デキストラン媒介性トランスフェクション、ポリブレン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、および直接的マイクロインジェクションを含みうる。
【０４０４】
融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の発現に適切な宿主細胞は、酵母細胞、細菌細胞、昆虫細胞、植物細胞と、上記で記載された通り、哺乳動物細胞とを含みうるがこれらに限定されない。目的の細胞は、大腸菌（E. coli）などの細菌、出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）およびメタノール資化酵母（Pichia pastoris）などの真菌、ＳＦ９などの昆虫細胞、哺乳動物細胞系（例えば、ヒト細胞系）のほか、初代細胞系（例えば、初代哺乳動物細胞）である。一部の実施形態では、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞内、または(ＮＳ０)など、適切な骨髄腫細胞系で発現される。適切な細胞系はまた、例えば、ＢＨＫ−２１（ベビーハムスター腎臓）細胞；２９３（ヒト胎児腎）細胞；ＨＭＥｐＣ（ヒト乳腺上皮細胞；３Ｔ３（マウス胚性線維芽）細胞も含む。
【０４０５】
本明細書で記載される方法は、細菌細胞内、哺乳動物細胞内、昆虫細胞内、酵母細胞内、およびクラミドモナス属（chlamydomonas）細胞内のタンパク質産生など、多様な細胞ベースの発現系内の、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の発現および精製をもたらす。タンパク質の発現は、構成的な場合もあり、硫酸銅、ガラクトース、メタノールなどの糖、メチルアミン、チアミン、テトラサイクリン、またはＩＰＴＧなどの誘導剤により、誘導的な場合もある。融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体が、宿主細胞内で発現された後で、宿主細胞は、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を、精製のために放離するように、溶解される。多様な宿主細胞を溶解させる方法については、“Sample Preparation-Tools for Protein Research” EMD Bioscience and in the Current Protocols in Protein Sciences (CPPS)において特色づけられている。非限定的で、例示的な精製法は、例えば、ヒスチジンでタグ付けされた融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体のための、ニッケル、コバルト、または亜鉛によるアフィニティー樹脂を使用する、イオン金属アフィニティークロマトグラフィーなどのアフィニティークロマトグラフィーである。ヒスチジンでタグ付けされたタンパク質を精製する方法については、自社製のＴａｌｏｎｘコバルト樹脂を使用する、Ｃｌｏｎｔｅｃｈにより記載されており、Ｎｏｖａｇｅｎにより、自社製のｐＥＴシステムのマニュアルの１０版において記載されている。別の、非限定的で、例示的な精製戦略は、免疫アフィニティークロマトグラフィーによる精製戦略であり、例えば、抗ｍｙｃ抗体をコンジュゲートされた樹脂が、例えば、ｍｙｃでタグ付けされた融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体をアフィニティー精製するのに使用されうる。トロンビンおよびエンテロキナーゼなど、セリンプロテアーゼによる酵素消化は、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を、ヒスチジンタグまたはｍｙｃタグから切断し、これらから放出し、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を、アフィニティー樹脂から放出しながら、ヒスチジンタグおよびｍｙｃタグを、アフィニティー樹脂へと接合させたままにする。
【０４０６】
当技術分野では、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドを、細胞（例えば、宿主細胞）へと導入し、これらを発現させる方法が公知である。発現ベクターの文脈では、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターは、当技術分野における、任意の方法により、宿主細胞、例えば、哺乳動物、細菌細胞、酵母細胞、または昆虫細胞へと、たやすく導入されうる。例えば、発現ベクターは、物理的手段、化学的手段、または生物学的手段により、宿主細胞へと導入されうる。
【０４０７】
ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、遺伝子銃法、マイクロインジェクション法、電気穿孔法などを含む。当技術分野では、ベクターおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製するための方法が周知である。例えば、Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (2001))を参照されたい。複数の実施形態では、ポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための方法は、リン酸カルシウムトランスフェクションまたはポリエチレンイミン（ＰＥＩ）トランスフェクションである。
【０４０８】
融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体をコードするポリヌクレオチドを、宿主細胞へと導入するための、生物学的方法は、ＤＮＡベクターおよびＲＮＡベクターの使用を含みうる。ウイルスベクターと、とりわけ、レトロウイルスベクターとは、遺伝子を、哺乳動物細胞、例えば、ヒト細胞へと挿入するための、最も広く使用される方法となっている。他のウイルスベクターは、レンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどに由来しうる。例えば、米国特許第５，３５０，６７４号明細書および同第５，５８５，３６２号明細書を参照されたい。
【０４０９】
一部の実施形態では、発現ベクターは、そのそれぞれの宿主細胞内に、プロモーター配列、リボソーム認識／結合性ＴＡＴＡボックス、ならびに効率的な遺伝子の転写および翻訳のための３’ＵＴＲである、ＡＡＵＡＡＡ転写終結配列など、５’側上流および３’側下流の、必要な調節エレメントを有しうる。発現ベクターは、６×ヒスチジン、Ｖ５、チオレドキシン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、ｃ−Ｍｙｃ、ＶＳＶ−Ｇ、ＨＳＶ、ＦＬＡＧ、マルトース結合性ペプチド、金属結合性ペプチド、ＨＡ、および「分泌」シグナル（ミツバチメリチン、α因子、ＰＨＯ、Ｂｉｐ）など、発現される融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体へと組み込まれた、さらなる配列を有しうる。加えて、それらが必要とされなくなった後における、それらの酵素による除去を容易とするように、これらの配列の後に、酵素消化部位も組み込まれうる。これらのさらなる配列は、融合タンパク質発現の検出、アフィニティークロマトグラフィーによるタンパク質精製、宿主の細胞質ゾル内の、組換えタンパク質の可溶性の増強、および／または融合タンパク質の、培養培地、原核細菌のペリプラズム、もしく酵母細胞のスフェロプラストへの分泌に有用である。融合タンパク質の発現は、宿主細胞において構成的な場合もあり、例えば硫酸銅、ガラクトース、メタノールなどの糖、メチルアミン、チアミン、テトラサイクリン、バキュロウイルスによる感染、およびラクトースの、安定的な合成類似体である、ＩＰＴＧ（イソプロピル−ベータ−Ｄ−チオガラクトピラノシド）などの誘導剤により誘導される場合もある。
【０４１０】
発現ベクターおよび宿主細胞の非限定例は、ＢＬ２１、ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳおよびＡＤ４９４（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ、Ｒｏｓｅｔｔａ（ＤＥ３）、ならびにＯｒｉｇａｍｉ（ＤＥ３）（Ｎｏｖａｇｅｎ）など、大腸菌（E. coli）宿主細胞内のタンパク質発現のための、ｐＥＴベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ）、ｐＧＥＸベクター（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、およびｐＭＡＬベクター（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ｌａｂｓ．Ｉｎｃ．）；ＣＨＯ、ＣＯＳ、ＨＥＫ−２９３、Ｊｕｒｋａｔ、およびＭＣＦ−７などの哺乳動物細胞系内の発現のための、強力ＣＭＶプロモーターベースのｐｃＤＮＡ３．１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）およびｐＣＩｎｅｏベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）；複製不能アデノウイルスベクターである、ｐＡｄｅｎｏＸベクター、ｐＡｄ５Ｆ３５ベクター、ｐＬＰ−Ａｄｅｎｏ−Ｘ−ＣＭＶベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、ｐＡｄ／ＣＭＶ／Ｖ５−ＤＥＳＴベクター、哺乳動物細胞内の、アデノウイルス媒介性の、遺伝子の導入および発現のためのｐＡｄ−ＤＥＳＴベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；哺乳動物細胞内の、レトロウイルス媒介性の、遺伝子の導入および発現のための、Ｃｌｏｎｔｅｃｈ製のＲｅｔｒｏ−Ｘ（商標）系を伴う使用のためのレトロウイルスベクターである、ｐＬＮＣＸ２、ｐＬＸＳＮ、およびｐＬＡＰＳＮ；哺乳動物細胞内の、レンチウイルス媒介性の、遺伝子の導入および発現のための、ｐＬｅｎｔｉ４Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、ｐＬｅｎｔｉ６／Ｖ５−ＤＥＳＴ（商標）、およびｐＬｅｎｔｉ６．２／Ｖ５−ＧＷ／ｌａｃＺ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；哺乳動物細胞内の、アデノ随伴ウイルス媒介性の、遺伝子の導入および発現のための、ｐＡＡＶ−ＭＣＳ、ｐＡＡＶ−ＩＲＥＳ−ｈｒＧＦＰ、およびｐＡＡＶ−ＲＣベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などの、アデノ随伴ウイルス発現ベクター；ツマジロクサヨトウ（Spodopera frugiperda）９（Ｓ９）昆虫細胞系内、およびＳｆｌ１昆虫細胞系内の発現のための、ＢＡＣ  ｐａｋ６バキュロウイルス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）およびｐＦａｓｔＢａｃ（商標）−ＨＴ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；ショウジョウバエ属（Drosophila）Ｓｃｈｎｅｉｄｅｒ  Ｓ２細胞内の発現のためのｐＭＴ／ＢｉＰ／Ｖ５−Ｈｉｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；メタノール資化酵母（Pichia pastoris）内の発現のためのピキア属（Pichia）発現ベクターである、ｐＰＩＣＺα、ｐＰＩＣＺ、ｐＦＬＤα、およびｐＦＬＤ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、ならびにメチロトローフ酵母（P. methanolica）内の発現のための、ベクターである、ｐＭＥＴαおよびｐＭＥＴ；酵母である出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）内の発現のための、ｐＹＥＳ２／ＧＳベクターおよびｐＹＤ１ベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含みうる。コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）における、大スケールの異種タンパク質の発現における、近年の進展については、Griesbeck C. et. al. 2006 Mol. Biotechnol. 34:213-33およびFuhrmann M. 2004, Methods Mol Med. 94:191-5により記載されている。
【０４１１】
細胞ベースの発現系のほかに、無細胞発現系もまた、想定される。無細胞発現系は、従来の細胞ベースの発現法を凌駕する、いくつかの利点であって、タンパク質のフォールディングに好適となるような、反応状態の容易な修飾、生成物の毒性に対する感受性の低下、および迅速な発現スクリーニング、または反応容量の低減および処理時間の短縮に起因する、大量のタンパク質の産生など、ハイスループット戦略に対する適性を含む利点をもたらす。無細胞発現系は、プラスミドを使用する場合もあり、直鎖状ＤＮＡを使用する場合もある。さらに、翻訳効率の改善は、反応ミックス１ミリリットル当たりのタンパク質１ミリグラムを超える収量を結果としてもたらした。
【０４１２】
一実施形態では、連続無細胞翻訳系は、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を作製するのに使用されうる。タンパク質を、高収率で作製することが可能な、連続無細胞翻訳系については、Spirin A S. et. al., Science 242:1162 (1988)により記載されている。方法は、アミノ酸、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）、およびグアノシン三リン酸（ＧＴＰ）を含有する、フィーディング緩衝液による、反応混合物の全体にわたる連続流デザイン、および翻訳されたポリペプチド産物の連続除去を使用する。系は、大腸菌（E. coli）溶解物を使用して、無細胞の連続フィーディング緩衝液をもたらす。この連続流系は、原核生物発現ベクターおよび真核生物発現ベクターのいずれにも適合性である。大スケールの、無細胞作製については、Chang G. el. al., Science 310:1950-3 (2005)により記載されている。
【０４１３】
他の市販の無細胞発現系は、大腸菌（E. coli）ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を、効率的な、カップリングされた転写反応および翻訳反応のために利用して、試験管反応フォーマットにおいて、最大で、ミリグラム単位量の活性組換えタンパク質を作製するＥｘｐｒｅｓｓｗａｙ（商標）Ｃｅｌｌ−Ｆｒｅｅ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）；これもまた、大腸菌（Ｅ．  ｃｏｌｉ）ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用するＲａｐｉｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＲＴＳ）（Ｒｏｃｈｅ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）；およびウサギ網状赤血球ベースのｉｎ  ｖｉｔｒｏ系を使用するＴＮＴ  Ｃｏｕｐｌｅｄ  Ｒｅｔｉｃｕｌｏｃｙｔｅ  Ｌｙｓａｔｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を含む。
【０４１４】
他の例示的な作製法では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、化学的方法を、全体的に、または部分的に使用して、デノボで合成されうる。例えば、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の構成要素であるアミノ酸配列は、固相法により合成され、樹脂から切断され、調製用高速液体クロマトグラフィーにより精製されるのに続き、所望のポリペプチドを形成するように、化学結合を施される。合成ペプチドの組成は、アミノ酸解析またはシーケンシングにより確認されうる。
【０４１５】
試料中に存在する（精製の前および後の両方において）内毒素の量を、検出および／または測定するための方法は、利用可能な市販のキットに基づきうる。例えば、タンパク質試料中の、内毒素の濃度は、ＱＣＬ−１０００  Ｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃキット（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）、Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ｏｆ  Ｃａｐｅ  Ｃｏｄ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから入手可能な、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）キット、Ｐｙｒｏｔｅｌｌ（登録商標）−Ｔキット、Ｐｙｒｏｃｈｒｏｍｅ（登録商標）キット、Ｃｈｒｏｍｏ−ＬＡＬキット、およびＣＳＥキットなど、ＬＡＬ（ｌｉｍｕｌｕｓ  ａｍｅｂｏｃｙｔｅ  ｌｙｓａｔｅ）ベースのキットを使用して決定されうる。一部の実施形態では、内毒素は、限定せずに述べると、ＰｒｏｔｅｏＳｐｉｎ（商標）Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌキット（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、Ｄｅｔｏｘｉ−Ｇｅｌ  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌ  Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；Ｐｉｅｒｃｅ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、ＭｉｒａＣＬＥＡＮ（登録商標）  Ｅｎｄｏｔｏｘｉｎ  Ｒｅｍｏｖａｌキット（Ｍｉｒｕｓ）、またはＡｃｒｏｄｉｓｃ（商標）−Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｅ膜（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を含む、様々な市販の試薬を使用して、融合タンパク質調製物から除去されうる。
【０４１６】
一部の実施形態では、発現および精製の後、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、修飾されうる。修飾は、共有結合的修飾の場合もあり、非共有結合的修飾の場合もある。このような修飾は、例えば、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の、標的アミノ酸残基を、選択された、側鎖残基または末端残基と反応させることが可能な、有機誘導体化剤と反応させることにより、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体へと導入されうる。修飾に適する部位は、例えば、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体についての、構造解析またはアミノ酸配列解析を含む、様々な基準のうちのいずれかを使用して選び出されうる。
【０４１７】
一部の、例示的な作製法では、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、異種部分へとコンジュゲートされうる。一部の実施形態では、異種部分は、例えば、異種ポリペプチド、治療剤（例えば、毒素または薬物）、または放射性標識、酵素標識、蛍光標識、または発光標識などであるがこれらに限定されない、検出用標識でありうる。適切な異種ポリペプチドは、例えば、抗体、またはこの断片もしくは変異体の精製における使用のための、抗原性タグ（例えば、ＦＬＡＧ、ポリヒスチジン、ヘマグルチニン（ＨＡ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、またはマルトース結合性タンパク質（ＭＢＰ））を含みうる。異種ポリペプチドはまた、診断用マーカーまたは検出用マーカーとして有用なポリペプチド、例えば、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、またはクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）も含みうる。異種部分が、ポリペプチドである場合、部分は、本明細書で記載される融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体へと組み込まれる結果として、異種部分を含む融合タンパク質をもたらしうる。
【０４１８】
プロモーター
「プロモーター」とは、コード配列の転写を誘発する、ポリヌクレオチドの領域を指す。プロモーターは、ＤＮＡの、同じ鎖上の、遺伝子の転写開始部位の近傍であり、かつ、上流に（センス鎖の５’側領域に向かって）位置する。あるプロモーターが、細胞内の全ての状況において活性であるので、構成的であるのに対し、他のプロモーター、例えば、誘導性プロモーターは、特異的刺激に応答して調節され、活性となる。さらに他のプロモーターは、Ｔ細胞特異的プロモーターを含むがこれらに限定されない、組織特異的プロモーターまたは活性化プロモーターである。
【０４１９】
本明細書で使用される「プロモーター活性」という用語およびこの文法的同等物は、その活性が測定されるプロモーターに作動可能に連結されたヌクレオチド配列の発現の程度を指す。プロモーター活性は、例えば、ノーザンブロット解析により、産生されるＲＮＡ転写物の量を決定することにより、直接的に測定することもでき、プロモーターに連結されたレポーター核酸配列など、連結された核酸配列によりコードされる産物の量を決定することにより、間接的に測定することもできる。
【０４２０】
本明細書で使用される「誘導性プロモーター」とは、転写調節因子、例えば、生物因子または非生物因子の存在または非存在により、活性へと誘導されるプロモーターを指す。誘導性プロモーターは、それらに作動可能に連結された遺伝子の発現が、生物、または、特に、組織の発生の、ある特定の段階において、オンまたはオフにされうるため、有用である。誘導性プロモーターの例は、アルコール調節性プロモーター、テトラサイクリン調節性プロモーター、ステロイド調節性プロモーター、金属調節性プロモーター、発症機序調節性プロモーター、温度調節性プロモーター、および光調節性プロモーターである。
【０４２１】
適切なプロモーターの１つの例は、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）即初期プロモーター配列である。このプロモーター配列は、それへと作動的に連結された、任意のポリヌクレオチド配列の、高レベルの発現を駆動することが可能である、強力な構成的プロモーター配列である。しかし、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ＬＴＲ（ｌｏｎｇ  ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｐｅａｔ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン−バーウイルス即初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーターのほか、アクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘモグロビンプロモーター、およびクレアチンキナーゼプロモーターなどであるがこれらに限定されない、ヒト遺伝子プロモーターを含むがこれらに限定されない、他の構成的プロモーター配列もまた、使用することができる。さらに、本開示は、構成的プロモーターの使用に限定されないものとする。誘導性プロモーターもまた、本開示の一部として想定される。誘導性プロモーターの使用は、このような発現が所望される場合に、それが作動的に連結されたポリヌクレオチド配列の発現をオンにするか、または発現が所望されない場合に、発現をオフにすることが可能な分子スイッチをもたらす。誘導性プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター（metallothionine promoter）、グルココルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーター、およびテトラサイクリンプロモーターを含むがこれらに限定されない。
【０４２２】
一部の実施形態では、プロモーターは、構成的プロモーター、組織特異的プロモーター、または誘導性プロモーターである。一部の実施形態では、誘導性プロモーターは、低分子リガンド誘導性の、２つのポリペプチドによる、エクジソン受容体ベースの遺伝子スイッチである。
【０４２３】
さらなるプロモーターエレメント、例えば、エンハンサーは、転写開始の頻度を調節しうる。典型的に、プロモーターエレメントは、開始部位の３０〜１１０ｂｐ上流の領域内に位置するが、多数のプロモーターは、開始部位の下流にも、機能的なエレメントを含有することが近年示されている。エレメントが、互いに対して逆位であるか、または移動している場合にも、プロモーター機能が保存されるように、プロモーターエレメントの間のスペーシングは、柔軟であることが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターでは、活性が減衰し始める前に、プロモーターエレメントの間のスペーシングが、５０ｂｐの距離まで増大する場合がある。個別のエレメントは、転写を活性化させるように、プロモーターに応じて、共作動的に機能する場合もあり、独立に機能する場合もあると考えられる。
【０４２４】
レポーター
レポーター遺伝子は、トランスフェクトされた可能性がある細胞を同定し、調節配列の機能性について査定するために使用されうる。一般に、レポーター遺伝子は、宿主細胞内に存在しないか、またはこれらにより発現されず、その発現が、何らかの、容易に検出可能な特性、例えば、酵素活性により顕在化されるポリペプチドをコードする、遺伝子である。融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体をコードするポリペプチドが、宿主細胞へと導入された後の適切な時点において、レポーター遺伝子の発現についてアッセイされる。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、ベータ−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光タンパク質遺伝子（例えば、Ui-Tei et al., FEBS Letters 479: 79-82 (2000)）を含みうるがこれらに限定されない。適切な発現系が周知であり、公知の技法を使用して調製される場合もあり、市販品が購入される場合もある。一般に、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、最小の５’側フランキング領域を伴うポリヌクレオチド構築物は、プロモーターとして同定される。このようなプロモーター領域は、レポーター遺伝子へと連結される場合があり、薬剤を、プロモーター駆動型転写をモジュレートする能力について査定するのに使用されうる。
【０４２５】
変異体
「断片」または「変異体」という用語は、１または複数の、例えば、ＰＤ−１および／またはＴＧＦ−βに対する結合性部分を含有する、本明細書で記載される融合タンパク質の、変異体および誘導体を指す。ある特定の実施形態では、融合タンパク質の、アミノ酸配列変異体が想定される。例えば、一部の実施形態では、本明細書で記載される融合タンパク質のアミノ酸配列変異体は、融合タンパク質の、結合アフィニティーおよび／または他の生物学的特性を改善することが想定される。アミノ酸変異体を調製するための例示的方法は、適切な修飾を、融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列へと導入する方法、またはペプチド合成による方法を含むがこれらに限定されない。このような修飾は、例えば、融合タンパク質のアミノ酸配列からの欠失、および／またはこれへの挿入、および／またはこの中の残基の置換を含む。
【０４２６】
最終的な融合タンパク質を得るために、最終的な融合タンパク質が所望の特徴、例えば、ＰＤ−１の阻害、およびＴＧＦ−βのトラップを保有することを条件として、欠失、挿入、および置換の、任意の組合せが、多様なドメインに対して行われうる。一部の実施形態では、１または複数のアミノ酸置換を有する、融合タンパク質変異体が提供される。一部の実施形態では、置換突然変異誘発のための、目的の部位は、ＣＤＲ領域およびフレームワーク領域を含みうる。一部の実施形態では、目的の、標的結合性タンパク質の可変ドメインへと、アミノ酸置換が導入される場合があり、生成物は、所望の活性、例えば、抗原への結合の保持／改善、免疫原性の減少、または抗体依存性細胞媒介性細胞傷害作用（ＡＤＣＣ）もしくは補体依存性細胞傷害作用（ＣＤＣ）の改善についてスクリーニングされる。抗体変異体（例えば、ＰＤ−１抗体変異体）を調製するために、保存的アミノ酸置換および非保存的アミノ酸置換の両方が想定されうる。
【０４２７】
変異体融合タンパク質を創出する置換についての別の例は、親抗体内の、１または複数の超可変領域残基の置換でありうる。一般に、次いで、変異体は、親抗体と比較した、所望の特性の改善、例えば、アフィニティーの増大、アフィニティーの低減、免疫原性の低減、結合のｐＨ依存性の増大に基づき選択される。例えば、アフィニティー成熟変異体抗体は、例えば、本明細書で記載され、当技術分野で公知である、ファージディスプレイベースのアフィニティー成熟法など、ファージディスプレイベースのアフィニティー成熟法を使用して作出されうる。置換は、変異体を作出するように、親抗体の超可変領域（ＨＶＲ）内でなされる場合があり、次いで、変異体は、結合アフィニティーに基づき、すなわち、アフィニティー成熟により選択される。アフィニティー成熟についての、一部の実施形態では、多様性は、様々な方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、またはオリゴヌクレオチド指向突然変異誘発）のうちのいずれかにより、成熟のために選び出された可変遺伝子へと導入されうる。次いで、二次ライブラリーが創出されうる。次いで、所望のアフィニティーを伴う、任意の抗体変異体を同定するように、ライブラリーがスクリーニングされうる。多様性を導入する、別の方法は、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に、４つ〜６つの残基）がランダム化されうる、ＨＶＲ指向法を伴いうる。抗原結合性に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニン走査突然変異誘発またはモデル化を使用して、特異的に同定されうる。置換は、親抗体配列内の、１つ、２つ、３つ、４つ、またはこれを超える部位における置換でありうる。
【０４２８】
一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質の断片または変異体は、それぞれ、天然に存在するＶＬドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を伴うが、「ヒト化された」、すなわち、天然に存在するＶＬドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列内の（特に、インフレームワーク配列内の）、１または複数のアミノ酸残基を、ヒトに由来する、従来の４鎖抗体に由来するＶＬドメイン内またはＶＨドメイン内の、対応する位置（複数可）において生じるアミノ酸残基のうちの１または複数で置き換えることにより「ヒト化された」ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含みうる。これは、当業者に明らかでありうる、当技術分野で公知の方式で、例えば、本明細書における、さらなる記載に基づき実施されうる。このような、ヒト化融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、それ自体が公知の、任意の適切な形で得られるので、出発物質として、天然に存在するＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに、厳密に限定されるわけではないことに注意されたい。
【０４２９】
一部の実施形態では、本明細書で記載される、融合タンパク質の断片または変異体は、それぞれ、天然に存在するＶＬドメインまたはＶＨドメインのアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を伴うが、「ラクダ化された」、すなわち、従来の４鎖抗体に由来する、天然に存在するＶＬドメインまたはＶＨドメインの、アミノ酸配列内の、１または複数のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＬドメイン内またはＶＨドメイン内の、対応する位置（複数可）において生じるアミノ酸残基のうちの１または複数で置き換えることにより「ラクダ化された」、ＶＬドメインおよびＶＨドメインを含む。このような「ラクダ化」は、好ましくは、ＶＨ−ＶＬ界面を形成し、かつ／もしくはＶＨ−ＶＬ界面に存在するアミノ酸位置、および／またはいわゆるラクダ科（Camelidae）ホールマーク残基（例えば、国際公開第９４／０４６７８号パンフレット；およびDavies and Riechmann (1994 and 1996)を参照されたい）に挿入されうる。一部の実施形態では、ラクダ化単一ドメインを、作出またはデザインするための出発物質または出発点として使用されるＶＨ配列は、ＶＨ３配列など、哺乳動物、例えば、ヒトに由来するＶＨ配列でありうる。ある特定の実施形態では、このような、ラクダ化融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、当技術分野で公知の、任意の適切な形で得られうるので、出発物質として、天然に存在するＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインを含むポリペプチドを使用して得られたポリペプチドに、厳密に限定されるわけではないことに注意されたい。
【０４３０】
例えば、「ヒト化」および「ラクダ化」のいずれも、それぞれ、天然に存在するＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列を用意し、次いで、ヌクレオチド配列内の、１または複数のコドンを、新たなポリヌクレオチド配列が、それぞれ、「ヒト化」または「ラクダ化」された融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体をコードするような形で変化させることによって実施されうる。次いで、このポリヌクレオチドは、所望の結合能（例えば、ＰＤ−１）をもたらすように発現されうる。代替的に、他の実施形態では、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、公知のペプチド合成法を使用して、ＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインを含む、天然に存在する抗体のアミノ酸配列から、デノボで合成された「ヒト化」抗体または「ラクダ化」抗体を含む。一部の実施形態では、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、公知のペプチド合成法を使用して、それぞれ、ＶＬドメインおよび／またはＶＨドメインを含む、天然に存在する抗体のアミノ酸配列またはヌクレオチド配列から、デノボで合成された「ヒト化」抗体または「ラクダ化」抗体を含み、それぞれ、本開示の、所望のヒト化抗体またはラクダ化抗体をコードするヌクレオチド配列がデザインされ、次いで、核酸合成のための、公知の技法を使用して、デノボで合成され、この後、このようにして得られた核酸が、所望の抗体をもたらすように、公知の発現法を使用して発現される。
【０４３１】
ＶＬドメインまたはＶＨドメインのための、天然に存在する配列から出発して、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を得るのに適する、他の方法および技法は、例えば、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体をもたらすように、適切な形で、ヘテロ二量体の形成を、ホモ二量体の形成より優先するアミノ酸置換を含む、１または複数の、天然に存在するＶＬ配列またはＶＨ配列の、１または複数の部分（１または複数のフレームワーク（ＦＲ）配列、および／または相補性決定領域（ＣＤＲ）配列など）、および／または１または複数の合成配列または半合成配列、および／またはＣＨ２ドメインのための、天然に存在する配列、ならびにＣＨ３ドメインのための、天然に存在する配列を組み合わせるステップを含む。
【０４３２】
抗体の操作
一部の実施形態では、以下の通りに、最終的な抗体（例えば、ＰＤ−１抗体）の、より大きな化学的安定性をもたらすために、露出された側鎖を含有する、ある特定のアミノ酸を、別のアミノ酸残基へと変化させることが所望でありうる。アスパラギンの脱アミド化は、Ｎ−Ｇ配列上、またはＤ−Ｇ配列上で生じる場合があり、ポリペプチド鎖へと、ねじれを導入し、その安定性を減少させる（イソアスパラギン酸効果）、イソアスパラギン酸残基の創出を、結果としてもたらしうる。一部の実施形態では、本開示の融合タンパク質の抗体は、アスパラギン異性部位を含有しない。
【０４３３】
例えば、アスパラギン（Ａｓｎ）残基は、特に、ＣＤＲ内の、任意のＡｓｎ−Ｇｌｙ配列における、イソアスパラギン酸の形成の潜在的可能性を低減するように、ＧｌｎまたはＡｌａへと変化させられうる。同様の問題は、Ａｓｐ−Ｇｌｙ配列においても生じうる（Reissner and Aswad (2003) Cell. Mol. Life Sci. 60:1281）。イソアスパラギン酸の形成は、抗体の、その標的抗原への結合を弱めるか、または完全に失効化させうる。Presta (2005) J. Allergy Clin. Immunol. 116:731 at 734を参照されたい。一実施形態では、アスパラギンは、グルタミン（Ｇｌｎ）へと変化させられうる。アスパラギン（Ａｓｎ）残基またはグルタミン（Ｇｌｎ）残基に隣接するアミノ酸を変更して、小型のアミノ酸が、アスパラギンまたはグルタミンに隣接して生じる場合に、大きな速度で生じる、脱アミド化の可能性を低減することもまた所望されうる。Bischoff & Kolbe (1994) J. Chromatog. 662:261を参照されたい。加えて、メチオニンの硫黄が、酸化する可能性であって、抗原結合アフィニティーを低減する場合があり、また、最終的な抗体調製物中の、分子的異質性にも寄与しうる可能性を低減するために、ＣＤＲ内の、任意のメチオニン残基（典型的に、溶媒に曝露されたＭｅｔ）は、Ｌｙｓ、Ｌｅｕ、Ａｌａ、またはＰｈｅへと変化させられうる（同上）。一実施形態では、メチオニンは、アラニン（Ａｌａ）へと変化させられうる。加えて、切断可能なＡｓｎ−Ｐｒｏペプチド結合の潜在的可能性を防止するか、または最小化するために、ＣＤＲ内に見出される、任意のＡｓｎ−Ｐｒｏの組合せを、Ｇｌｎ−Ｐｒｏ、Ａｌａ−Ｐｒｏ、またはＡｓｎ−Ａｌａへと変更することが所望でありうる。その後、このような置換を伴う抗体は、置換が、抗体の、ヒトＰＤ−Ｌ１に対するアフィニティーもしくは特異性、または他の所望の生物学的活性を、許容不可能なレベルまで低下させないことを確保するようにスクリーニングされうる。
【０４３４】
本明細書で開示される融合タンパク質の抗体はまた、放射性核種または他の検出可能な標識などの化学的部分へもコンジュゲートされうる。放射性核種は、９９Ｔｃ、９０Ｙ、１１１Ｉｎ、３２Ｐ、１４Ｃ、１２５Ｉ、３Ｈ、１３１Ｉ、１１Ｃ、１５Ｏ、１３Ｎ、１８Ｆ、３５Ｓ、５１Ｃｒ、５７Ｔｏ、２２６Ｒａ、６０Ｃｏ、５９Ｆｅ、５７Ｓｅ、１５２Ｅｕ、６７Ｃｕ、２１７Ｃｉ、２１１Ａｔ、２１２Ｐｂ、４７Ｓｃ、１０９Ｐｄ、２３４Ｔｈ、ならびに４０Ｋ、１５７Ｇｄ、５５Ｍｎ、５２Ｔｒ、および５６Ｆｅを含む。蛍光標識または化学発光標識は、希土類キレート剤、フルオレセインおよびこの誘導体、ローダミンおよびこの誘導体、イソチオシアン酸、フィコエリトリン、フィコシアニン、アロフィコシアニン、ｏ−フタルアルデヒド、フルオレサミン、１５２Ｅｕ、ダンシル、ウンベリフェロン、ルシフェリンなどのフルオロフォア、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュウ酸エステル標識、エクオリン標識、２，３−ジヒドロフタラジンジオン、ビオチン／アビジン、スピン標識、および安定的なフリーラジカルを含みうる。
【０４３５】
抗体分子を、多様な部分へとコンジュゲートするための、当技術分野で公知の、任意の方法であって、Hunter, et al., (1962) Nature 144:945；David, et al., (1974) Biochemistry 13:1014；Pain, et al., (1981) J. Immunol. Meth. 40:219；およびNygren, J., (1982) Histochem. and Cytochem. 30:407により記載されている方法を含む方法が利用されうる。抗体をコンジュゲートするための方法は、常套的な方法であり、当技術分野で、十分に周知である。
【０４３６】
医薬組成物
本開示は、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体と、このための担体（例えば、薬学的に許容される担体）とを含む組成物を提示する。組成物は、担体、好ましくは、生理学的に（例えば、薬学的に）許容可能な担体と、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体とを含む、生理学的に許容される（例えば、薬学的に許容される）組成物であることが所望される。本開示の文脈内では、任意の適切な担体の使用が可能であり、当技術分野では、このような担体が周知である。担体の選出しは、部分的に、組成物の特定の使用（例えば、動物への投与）、および組成物を投与するのに使用される、特定の方法により決定されるであろう。理想的には、複製欠損型アデノウイルスベクターの文脈では、医薬組成物は、好ましくは、複製コンピテント型のアデノウイルスを含まない。医薬組成物は、任意選択で、滅菌でありうる。
【０４３７】
適切な組成物は、抗酸化剤、緩衝剤、および静菌剤を含有しうる、水性および非水性の、等張性滅菌溶液、ならびに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、および保存剤を含みうる、水性および非水性の滅菌懸濁液を含む。組成物は、アンプルおよびバイアルなど、単位用量または複数回投与用量の密封容器により提示しうるが、使用の直前における、滅菌液体担体、例えば、水の添加だけを必要とする、凍結乾燥（freeze-dried（lyophilized））状態で保管することもできる。即席溶液および即席懸濁液は、滅菌粉末、滅菌顆粒、および滅菌錠剤から調製することができる。好ましくは、担体は、緩衝生理食塩液である。場合によって、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体は、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を、投与の前の損傷から保護するように製剤化された、組成物の部分である。例えば、組成物は、ガラス容器、シリンジ、または注射針など、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を、調製、保管、または投与するのに使用されるデバイス上における、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の喪失を低減するように製剤化されうる。組成物は、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の、光感受性および／または温度感受性を低下させるように製剤化されうる。この目的で、組成物は、好ましくは、例えば、上記で記載された液体担体など、薬学的に許容される液体担体、ならびにポリソルベート８０、Ｌ−アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、およびこれらの組合せからなる群から選択される安定化剤を含む。このような組成物の使用は、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の保管寿命を延長し、その投与を容易とするであろう。融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を含有する組成物の製剤化については、例えば、米国特許第６，２２５，２８９号明細書、米国特許第６，５１４，９４３号明細書、および国際公開第２０００／０３４４４４号パンフレットにおいて、さらに記載されている。
【０４３８】
組成物はまた、形質導入効率を増強するようにも製剤化されうる。加えて、当業者は、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体が、他の治療剤または生物学的活性薬剤と共に、組成物中に存在しうることも理解するであろう。例えば、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体の、ｉｎ  ｖｉｖｏにおける投与と関連する、腫脹および炎症を低減するように、イブプロフェンまたはステロイドなど、炎症を制御する因子も、組成物の一部でありうる。既存の感染を処置し、かつ／または投与手順と関連する感染など、将来の感染の危険性を低減するように、抗生剤、すなわち、殺微生物剤および殺真菌剤も存在しうる。
【０４３９】
一部の場合には、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体を含む医薬組成物は、活性化合物の、薬学的に使用されうる調製物への加工を容易とする、賦形剤および補助剤を含む、１または複数の生理学的に許容される担体を使用する、常套的な形で製剤化される。適正な製剤は、選択される投与経路に依存する。本明細書で記載される医薬組成物の概要については、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995); Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975; Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980; and Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)において見出される。
【０４４０】
医薬組成物は、任意選択で、例だけを目的として述べると、従来の混合工程、溶解工程、顆粒化工程、糖衣錠化工程、研和工程、乳化工程、カプセル化工程、封入工程、または圧縮工程など、従来の方式で製造される。
【０４４１】
ある特定の実施形態では、組成物はまた、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸、および塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、およびトリス−ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基を含む、１または複数のｐＨ調整剤または緩衝剤；ならびにクエン酸塩／デキストロース、炭酸水素ナトリウム、および塩化アンモニウムなどの緩衝液も含みうる。このような酸、塩基、および緩衝剤は、組成物のｐＨを、許容可能な範囲で維持するのに必要とされる量で組み入れられる。
【０４４２】
他の実施形態では、組成物はまた、組成物のオスモル濃度を、許容可能な範囲に収めるのに必要とされる量の、１または複数の塩も含みうる。このような塩は、ナトリウムカチオン、カリウムカチオン、またはアンモニウムカチオンと、塩化物アニオン、クエン酸アニオン、アスコルビン酸アニオン、ホウ酸アニオン、リン酸アニオン、重炭酸アニオン、硫酸アニオン、チオ硫酸アニオン、または亜硫酸水素アニオンとを有する塩を含み、適切な塩は、塩化ナトリウム塩、塩化カリウム塩、チオ硫酸ナトリウム塩、亜硫酸水素ナトリウム塩、および硫酸アンモニウム塩を含む。
【０４４３】
本明細書で記載される医薬組成物は、経口投与経路、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）投与経路、鼻腔内投与経路、口腔内投与経路、舌下投与経路、または直腸内投与経路を含むがこれらに限定されない、任意の適切な投与経路により投与される。一部の場合には、医薬組成物を、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）投与のために製剤化する。
【０４４４】
本明細書で記載される医薬組成物を、処置される個体による経口の服用のための、水性経口分散液、液体、ゲル、シロップ、エリキシル、スラリー、懸濁液など、固体経口剤形、エアゾール剤、制御放出製剤、即時融解製剤、発泡製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、粉剤、丸剤、糖衣錠剤、カプセル剤、遅延放出製剤、持続放出製剤、パルス放出製剤、多粒子製剤、即時放出製剤と制御放出製剤との混合剤を含むがこれらに限定されない、任意の適切な剤形へと製剤化する。一部の実施形態では、医薬組成物を、カプセル剤へと製剤化する。一部の実施形態では、医薬組成物を、溶液（例えば、静脈内投与のための）へと製剤化する。場合によって、医薬組成物を、輸注液として製剤化する。場合によって、医薬組成物を、注射液として製剤化する。
【０４４５】
本明細書で記載される、固体の医薬剤形は、任意選択で、本明細書で記載される、融合タンパク質、またはこの断片もしくは変異体と、適合性の担体、結合剤、充填剤、懸濁剤、芳香剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、保湿剤、可塑化剤、安定化剤、浸透増強剤、湿潤剤、消泡剤、抗酸化剤、保存剤、またはこれらの１もしくは複数の組合せなど、１または複数の薬学的に許容される添加剤とを含む。
【０４４６】
さらなる他の態様では、Remington's Pharmaceutical Sciences, 20th Edition (2000)において記載されている手順など、標準的なコーティング手順を使用して、組成物の周囲に、薄膜コーティングを施すことができる。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化し、粒子の一部または全部をコーティングすることができる。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化し、粒子の一部または全部をマイクロカプセル化することができる。一部の実施形態では、組成物を、粒子（例えば、カプセルによる投与のための）へと製剤化することができ、粒子の一部または全部をマイクロカプセル化せず、アンコーティングする。
【０４４７】
ある特定の実施形態では、本明細書で提示される組成物はまた、微生物活性を阻害する、１または複数の保存剤も含みうる。適切な保存剤は、メルフェンおよびチオメルサールなどの水銀含有物質；安定化二酸化塩素；ならびに塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウム、および塩化セチルピリジニウムなどの四級アンモニウム化合物を含む。
【０４４８】
「消泡剤」は、加工時における発泡であって、水性分散液の凝固、薄膜完成品中の気泡を結果としてもたらすか、または、一般に、加工を損なう発泡を低減する。例示的な抗発泡剤は、シリコンエマルジョン（silicon emulsion）またはセスキオレイン酸ソルビタン（sorbitan sesquoleate）を含む。
【０４４９】
「抗酸化剤」は、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、およびトコフェロールを含む。ある特定の実施形態では、抗酸化剤は、必要とされる場合、化学的安定性を増強する。
【０４５０】
本明細書で記載される製剤は、抗酸化剤、金属キレート化剤、チオールを含有する化合物、および他の一般的な安定化剤から利益を得る場合がある。このような安定化剤の例は、（ａ）約０．５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０．１％〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％〜約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）０．００３％〜約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％〜約０．０５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）硫酸デキストラン、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ポリ硫酸ペントサン、および他のヘパリノイド、（ｍ）マグネシウムおよび亜鉛などの二価カチオン、または（ｎ）これらの組合せを含むがこれらに限定されない。
【０４５１】
「結合剤」は、凝集性の性質を付与し、例えば、アルギン酸およびその塩；カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標））、エチルセルロース（例えば、Ｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、および結晶セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））などのセルロース誘導体；微晶質デキストロース；アミロース；ケイ酸マグネシウムアルミニウム；多糖酸；ベントナイト；ゼラチン；ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー；クロスポビドン；ポビドン；デンプン；アルファデンプン；トラガント、デキストリン、スクロース（例えば、Ｄｉｐａｃ（登録商標））、グルコース、デキストロース、糖蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール（例えば、Ｘｙｌｉｔａｂ（登録商標））、およびラクトースなどの糖；アカシア、トラガント、ガッティガム、イサポールハスクの粘液、ポリビニルピロリドン（例えば、Ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ（登録商標）ＣＬ、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＣＬ、Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）ＸＬ−１０）、カラマツ由来のアラビノガラクタン（arabogalactan）、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）、ポリエチレングリコール、蝋、アルギン酸ナトリウムなどの天然ガムまたは合成ガムを含む。
【０４５２】
「担体」または「担体材料」は、医薬中で一般に使用される任意の賦形剤を含み、イブルチニブおよび抗がん剤の化合物など、本明細書で開示される化合物との適合性、ならびに所望の剤形の放出プロファイル特性に基づき選択されるものとする。例示的な担体材料は、例えば、結合剤、懸濁剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、保湿剤、希釈剤などを含む。
【０４５３】
「薬学的に適合性の担体材料」は、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、カルシウム乳酸、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、ダイズレシチン、タウロコール酸、ホスファチジルコリン、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖、ステアロイル乳酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファデンプンなどを含みうるがこれらに限定されない。例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Nineteenth Ed (Easton, Pa.: Mack Publishing Company, 1995)、Hoover, John E., Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pennsylvania 1975、Liberman, H.A. and Lachman, L., Eds., Pharmaceutical Dosage Forms, Marcel Decker, New York, N.Y., 1980、およびPharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, Seventh Ed. (Lippincott Williams & Wilkins 1999)を参照されたい。
【０４５４】
「分散剤」および／または「粘性モジュレーティング剤」は、液体培地または顆粒化法またブレンド法を介して、薬物の拡散および均質性を制御する材料を含む。一部の実施形態では、これらの薬剤はまた、コーティングマトリックスまたはエローディングマトリックスの有効性も促進する。例示的な拡散促進剤／分散剤は、例えば、親水性ポリマー、電解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０またはＴｗｅｅｎ（登録商標）８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；市販品では、Ｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）として公知である）、ａｎｄ例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、およびＨＰＣ−Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ  Ｋ１００、ＨＰＭＣ  Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ  Ｋ１５Ｍ、およびＨＰＭＣ  Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム（carboxymethylcellulose sodium）、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣＡＳ）、非晶質セルロースなど、炭水化物ベースの分散剤、ケイ酸マグネシウムアルミニウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、酸化エチレンおよびホルムアルデヒドを伴う、４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノールポリマー（チロキサポールとしてもまた公知である）、ポロキサマー（例えば、酸化エチレンと、酸化プロピレンとのブロックコポリマーである、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ６８（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ８８（登録商標）、およびＰｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ１０８（登録商標））；およびポロキサミン（例えば、酸化プロピレンおよび酸化エチレンの、エチレンジアミンへの逐次的付加から導出される四官能性ブロックコポリマーである、Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８（登録商標）（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．）としてもまた公知のＴｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８（登録商標））、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ−６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギン酸塩、キトサン、およびこれらの組合せを含む。セルロースまたはトリエチルセルロースな��の可塑化剤もまた、分散剤として使用することができる。特に、リポソーム分散液中および自己乳化分散液中で有用な分散剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルコリン、鶏卵に由来する天然ホスファチジルグリセロール、コレステロール、およびイソプロピルミリスチン酸である。
【０４５５】
１または複数のエロージョン促進剤の、１または複数の拡散促進剤との組合せもまた、本組成物中で使用することができる。
【０４５６】
「希釈剤」という用語は、送達の前に、目的の化合物を希釈するのに使用される化合物を指す。希釈剤はまた、より安定的な環境をもたらしうるため、化合物を安定化させるのにも使用することができる。当技術分野では、緩衝液中に溶解させた塩（これはまた、ｐＨの制御または維持ももたらしうる）を、リン酸緩衝生理食塩液溶液を含むがこれらに限定されない希釈剤として用いる。ある特定の実施形態では、希釈剤は、組成物のバルクを増大させて、圧縮を容易とするか、またはカプセルの充填のための均質なブレンドに十分なバルクを創出する。このような化合物は、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの結晶セルロース；二塩基性リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；アルファデンプン、Ｄｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロースベースの希釈剤、粉砂糖；一塩基性硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストレート（dextrate）；加水分解シリアル固形、アミロース；粉末セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどを含む。
【０４５７】
「充填剤」は、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、二塩基性リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、結晶セルロース、セルロース  粉末、デキストロース、デキストレート（dextrate）、デキストラン、デンプン、アルファデンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの化合物を含む。
【０４５８】
「滑沢剤」および「流動促進剤」とは、材料の接着または摩擦を防止、低減、または阻害する化合物である。例示的な滑沢剤は、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、滑石、フマル酸ステアリルナトリウム、鉱物油などの炭化水素、または水素化ダイズ油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの水素化植物油、高脂肪酸、ならびにアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛など、それらのアルカリ金属塩およびアルカリ土類金属塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、滑石、蝋、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、ナトリウム酢酸、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００）、またはＣａｒｂｏｗａｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、ナトリウムオレイン酸、安息香酸ナトリウム、ベヘン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムまたはラウリル硫酸ナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などを含む。
【０４５９】
「可塑化剤」とは、マイクロカプセル化材料を軟化させるのに使用される化合物、またはマイクロカプセル化材料の脆性を低下させるフィルムコーティングである。適切な可塑化剤は、例えば、ＰＥＧ  ３００、ＰＥＧ  ４００、ＰＥＧ  ６００、ＰＥＧ  １４５０、ＰＥＧ  ３３５０、およびＰＥＧ  ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロース、およびトリアセチンを含む。一部の実施形態では、可塑化剤はまた、分散剤または保湿剤としても機能しうる。
【０４６０】
「可溶化剤」は、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００〜６００、グリコフロール、トランスクトール、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物を含む。
【０４６１】
「安定化剤」は、任意の抗酸化薬剤、緩衝液、酸、保存剤などの化合物を含む。
【０４６２】
「懸濁剤」は、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有しうる）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシメチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガントガムおよびアカシアガム、グアルガムなどのガム、キサンタンガムを含むキサンタン、糖、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロースなどのセルロース誘導体、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、モノラウリン酸ポリエトキシル化ソルビタン、ポビドンなどの化合物を含む。
【０４６３】
「界面活性剤」は、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（docusate）、Ｔｗｅｅｎ  ６０またはＴｗｅｅｎ  ８０、トリアセチン、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、モノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート（ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）、ポロキサマー、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリン、酸化エチレンと酸化プロピレンとのコポリマー、例えば、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物を含む。他の一部の界面活性剤は、ポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステルおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素化ヒマシ油；ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０を含む。一部の実施形態では、界面活性剤は、物理的安定性を増強するか、または他の目的で、組み入れることができる。
【０４６４】
「粘性増強剤」は、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸酢酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、フタル酸ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギン酸塩、アカシア、キトサン、およびこれらの組合せを含む。
【０４６５】
「保湿剤」は、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、ソルビタンモノオレイン酸、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムドクセート（docusate）、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクセート（doccusate）、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物を含む。
【０４６６】
キット／製品
本明細書の、ある特定の実施形態では、本明細書で記載される、１または複数の方法による使用のためのキットおよび製品が開示される。このようなキットは、バイアル、試験管など、１または複数の容器であって、容器の各々が、本明細書で記載される方法において使用される個別のエレメントのうち１つを含む容器を受容するように区画化されたキャリングケース、パッケージ、または容器を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、および試験管を含む。一実施形態では、容器は、ガラスまたはプラスチックなど、様々な材料から形成されている。
【０４６７】
本明細書で提示される製品は、パッケージング材料を含有する。医薬パッケージング材料の例は、ブリスターパック、ボトル、試験管、バッグ、容器、ボトル、ならびに選択される製剤と、意図される投与方式および処置方式とに適する、任意のパッケージング材料を含むがこれらに限定されない。
【０４６８】
キットは、典型的に、内容物を列挙する表示、および／または使用のための指示書、ならびに使用のための指示書を伴う添付文書を含む。典型的に、指示書のセットもまた、組み入れられると予想される。
【０４６９】
一部の実施形態では、表示は、容器上に貼付されているか、または容器に付随する。一実施形態では、表示を形成する文字、数、または他の記号が、容器自体へと接着されているか、鋳造されているか、またはエッチングされている場合、表示は容器上に貼付されており、表示はまた、容器を保持する、レセプタクルまたはキャリングケース内に、例えば、パッケージ添付文書として存在する場合、容器に付随する。一実施形態では、表示は、内容物が、具体的な治療適用に使用されるものであることを指し示すのに使用される。表示はまた、内容物の、本明細書で記載される方法などにおける使用のための指示も指し示す。
【実施例】
【０４７０】
これらの例は、例示的な目的だけで提示されるものであり、本明細書で提示される特許請求の範囲を限定しようとするものではない。
【０４７１】
[実施例１]
抗ＰＤ１−ＴＧＦ−βトラップの融合タンパク質
抗ＰＤ１  ＶＨおよび抗ＰＤ１  ＶＬは、リンカーである、（Ｇ４Ｓ）２により、ＴＧＦβＲＩＩを、Ｃ末端において融合させたＩｇＧ構成、ｓｃＦｖ−Ｆｃ構成、またはｓｃＦｖ構成で、合成および形成した。抗ＰＤ１−トラップ融合タンパク質は、製造元のプロトコールに従い、Ｅｘｐｉ２９３細胞内で、一過性に発現させた。融合タンパク質を精製するために、トランスフェクトされた上清を、ＡＫＴＡ  ＡＶＡＮＴを使用する、プロテインＬカラムへとロードした。タンパク質を、ＩｇＧ溶出緩衝液（Ｐｉｅｒｃｅ）で溶離させる前に、カラムを、ＰＢＳで洗浄した。次いで、ＰＤ−１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、溶離されたタンパク質を、ＰＢＳへと緩衝液交換した。
【０４７２】
表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、ＣＭ５チップ、アミンカップリングキット、１０倍濃度のＨＢＳ−Ｐランニング緩衝液、および再生用のグリシン（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して実施した。抗ＰＤ１反応速度アッセイのために、所定のリガンド固定化プログラムを使用して、精製されたＰＤ−１  Ｆｃ融合タンパク質を、ＣＭ５チップ上に固定化させた。精製された抗ＰＤ１−トラップ融合タンパク質を、ＨＢＳ−Ｐランニング緩衝液中で、ある範囲の最終濃度へと希釈し、注入した。解離を進行させるのに続き、チップ表面の再生のために、１０ｍＭのグリシン（ｐＨ１．５）によるパルスにかけた。
【０４７３】
抗ＰＤ１−トラップ融合タンパク質が、ＰＤ１およびＴＧＦβＲＩＩに、同時に結合しうるのかどうかについて探索するために、１００ｎＭの、抗ＰＤ１トラップ融合タンパク質を、ＰＤ１固定化ＣＭ５チップへと、３分間にわたり注入するのに続き、３分間にわたる解離にかけた。その後、ＴＧＦ−βの、異なるアイソフォームを注入して、ＴＧＦ−βの、ＰＤ１に結合した抗ＰＤ１−トラップ融合タンパク質への結合について検討した。
【０４７４】
抗ＰＤ１−ＴＧＦβＲＩＩの、ＴＧＦ−βのアイソフォームに対する結合アフィニティーについて解析するために、抗ＰＤ１−ＴＧＦβＲＩＩを、ＣＭ５チップ上に固定化させ、次いで、ＴＧＦ−βタンパク質を、ＨＢＳ−Ｐランニング緩衝液中で、ある範囲の最終濃度へと希釈し注入して、ＴＧＦ−βの、固定化抗ＰＤ１−ＴＧＦβＲＩＩに対する結合アフィニティーを測定した。抗ＰＤ１（ＶＨ６−ＶＬ５またはＶＨ７−ＶＬ６）−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質の、固定化ＰＤ−１に対するアフィニティーを、表２（図６〜８）に示す。ＴＧＦ−βのアイソフォームの、固定化抗ＰＤ−１ＩｇＧ４抗体（ＶＨ６−ＶＬ５）−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質に対するアフィニティーを、表３に示す。観察される通り、融合タンパク質は、ＴＧＦ−β１およびＴＧＦ−β３に、高アフィニティーで結合し、ＴＧＦ−β２に、低アフィニティーで結合した。
【０４７５】
【表２】
2021531754.tif 000007
【０４７６】
【表３】
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【０４７７】
ＴＧＦβＲＩＩへと融合させた、多様な抗ＰＤ−１変異体の結合アフィニティーは、Ｂｉａｃｏｒｅ  ３０００を使用する、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）アッセイにより評価した。ヒトＦｃ領域へと融合させたＰＤ−１を、センサーチップである、ＣＭ５上に固定化させた。異なる濃度の、多様な融合タンパク質を、溶液相中に注入し、融合タンパク質のＫＤを計算するのに、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎを使用して、データを解析した。抗ＰＤ１（ＶＨ６−ＶＬ５）−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質、および抗ＰＤ１（ＶＨ７−ＶＬ６）−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質などの変異体は、ＰＤ１に対して、それぞれの抗ＰＤ１単独と比較して、同様の結合アフィニティーを有することが見出された。
【０４７８】
【表４】
2021531754.tif 000009
【０４７９】
ＰＤ−１／ＰＤＬ−１遮断アッセイ
抗ＰＤ１−ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１間相互作用を遮断することにより、抗ＰＤ１抗体として機能しうるのかどうかについて探索するために、Ｐｒｏｍｅｇａ製の、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイキットを利用した。略述すると、ＰＤ−Ｌ１  ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を、アッセイの開始の１日前に融解させ、３７℃、５％ＣＯ２で、１６〜２０時間にわたり、一晩にわたる回収を可能とした。用量反応曲線を作成するために、抗ＰＤ１  ＴＧＦβＲＩＩタンパク質の、１００ｎＭ〜０．０９８ｎＭの範囲の系列希釈液を調製した。次いで、プレートを、インキュベーターから取り出し、細胞培地を廃棄した。次いで、目的の抗体を、ＰＤ−Ｌ１  ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を含有するプレートへと、直接添加した。次いで、このステップに続き、ＰＤ−１エフェクター細胞を、融解させ、９６ウェルプレートへと添加した。プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で、６時間にわたりインキュベートした。Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼ基質試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を、各ウェルへと添加し、相対ルシフェラーゼ単位（ＲＬＵ）を、Ｇｌｏｍａｘ  ９６マイクロプレートルミノメーター上で測定した。抗ＰＤ１  ＴＧＦβＲＩＩタンパク質のＩＣ５０は、ＲＬＵ濃度データを、４パラメータのロジスティック方程式へと当てはめることにより決定した。これらの値を、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断効力の尺度として使用した（図５）。
【０４８０】
ＨＥＫ−ＢｌｕｅＴＧＦ−βアッセイ
抗ＰＤ１ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質が、ＴＧＦ−βの機能を中和する有効性について検討するために、誘導性レポーター遺伝子を伴う、安定的な細胞系（ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＢ−βレポーター細胞系、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を利用した。この安定的な細胞系は、定量されうる、分泌型胎盤性アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）の産生をもたらす、ＴＧＦ−β／ＳＭＡＤ経路の活性化を介して、生体活性ＴＧＦ−βの検出を可能とする。略述すると、ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３を、あらかじめ決定されたＥＣ５０濃度へと希釈し、平底９６ウェルプレートへと添加した。次いで、用量反応曲線を作成するために、抗ＰＤ１  ＴＧＦβＲＩＩタンパク質の系列希釈液を、ＴＧＦ−βの、異なるアイソフォームを含有するプレートへと添加した。プレートを、３７℃で、３０分間にわたりインキュベートした。次いで、ＨＥＫ−Ｂｌｕｅ（商標）ＴＧＦ−β細胞を、プレートへと、１ｍＬ当たりの細胞０．７×１０６個の最終濃度で添加した。次いで、プレートを、３７℃、５％ＣＯ２で、のべ２０時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、上清のアリコートを取り出し、分泌型ＳＥＡＰを定量するのに使用される、ＱＵＡＮＴＩ−Ｂｌｕｅ（商標）基質（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含有するプレートへと添加した。プレートを、３７℃で、１時間にわたりインキュベートした。次いで、プレートを、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  Ｐｌｕｓプレートリーダー上、６２０〜６５５ｎｍで読み取った。ＩＣ５０は、吸光度−濃度データを、４パラメータロジスティック方程式へと当てはめること（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ）により決定した。多様な抗ＰＤ１  ＴＧＦβＲＩＩ融合タンパク質の、対照と比較した効能についての結果を、図５〜８に描示する。
【０４８１】
表６および７は、多様な被験融合タンパク質構築物、および報告された、ＴＧＦ−β１誘導性の遺伝子活性の阻害を、さらに一覧する。
【０４８２】
【表５】
2021531754.tif 000010
【０４８３】
【表６】
2021531754.tif 000011
【０４８４】
多様な抗ＰＤ１  ＩｇＧ４−ＴＧＦｂＲＩＩ融合構築物の、ＰＤ１への結合
ＰＤ１−Ｆｃ抗原および参照抗原を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５表面上に固定化させた。６〜１２連の系列希釈濃度の、多様な抗ＰＤ１  ＩｇＧ４−ＴＧＦｂＲＩＩ（表８）を、ＰＤ１−Ｆｃ抗原上および参照表面上に、系列注入した。反応速度データを、１：１モデル：物質移動を伴うラングミュアモデルについて査定した。表７に観察される通り、抗ＰＤ１  ＩｇＧ４−ＴＧＦｂＲＩＩの、ＰＤ１−Ｆｃ抗原との結合アフィニティー（ＫＤ）は、１０１２〜１０１０の間の範囲であった。
【０４８５】
【表７】
2021531754.tif 000012
【０４８６】
多様な抗ＰＤ１  ＩｇＧ４−ＴＧＦβＲＩＩ融合構築物の、ＰＤ１およびＴＧＦ−β１への、同時的な結合
異なるリンカーを伴う抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質（表９）が、ＰＤ１およびＴＧＦ−β１に、同時に結合するのかどうかについて探索するために、以下の構築物を作り、Ｂｉａｃｏｒｅ実験で調べた。ＰＤ１−Ｆｃ抗原を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５チップ表面上に固定化させた。抗ＰＤ１（ＶＬ５−ＶＨ６）．ＩｇＧ４−リンカー−ＴＧＦｂＲＩＩを、センサー表面上に注入するのに続き、ＴＧＦβ１を、センサー表面上に注入した。図２０に示される通り、全ての抗ＰＤ１（ＶＬ５−ＶＨ６）．ＩｇＧ４−リンカー−ＴＧＦＲＩＩ構築物は、ＰＤ１−Ｆｃ抗原およびＴＧＦβ１の両方に、同時に結合した。
【０４８７】
【表８】
2021531754.tif 000013
【０４８８】
[実施例２]
抗ＰＤ１−ＴＧＦ−βトラップは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ培養物中の、Ｔ細胞活性化を促進する
抗ＰＤ１−ＴＧＦ−βトラップが、Ｔ細胞機能を促進する能力について評価するために、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅを使用して、白血球除去産物（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  Ｂｏａｒｄ（ＩＲＢ）により承認されたプロトコール下で、正常な健常ドナーから得られた）から精製された、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて使用した。ＰＢＭＣを、細胞増殖色素である、ＣｅｌｌＴｒａｃｅバイオレットで標識し、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で刺激した。インキュベーションの終了時に、培養物上清を回収し、ＩＦＮ−γ放出アッセイのために使用されるまで保管した。細胞を、蛍光コンジュゲート抗体で標識して、Ｔ細胞増殖について評価した。
【０４８９】
抗ＰＤ１−ＴＧＦ−βトラップの存在下で刺激されたＰＢＭＣが、増殖およびＩＦＮ−γ産生の、抗ＰＤ１対照抗体または抗ＲＳＶ対照抗体と比較した、用量依存的な増強を示したことは、融合分子が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路およびＴＧＦ−β経路の両方をターゲティングする能力を示唆する（図９Ａ〜９Ｃ）。データはまた、融合分子の効果の、抗ＰＤ１単独と比較した、相加的増強も裏付ける。
【０４９０】
結腸直腸がんについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、抗ＰＤ１−ＴＧＦ−ＲＩＩは、抗ＰＤ１単独と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する
抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の有効性を、結腸直腸がんについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて査定した。健常ドナーから精製されたＰＢＭＣを、がん細胞系である、ＨＴ−２９と共に、５日間にわたり共培養した。細胞を、アイソタイプ対照、抗ＰＤ１、または抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在下で、抗ＣＤ３により刺激した。培養物上清を回収し、製造元のプロトコールに従い、ＩＦＮ−γレベルを、ＭＳＤにより定量した。細胞を回収し、Ｔ細胞上の、標的の占有について、フローサイトメトリーにより解析した。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３の、細胞培養物上清中レベルは、製造元のプロトコールに従い、Ｌｕｍｉｎｅｘにより定量した。
【０４９１】
図９Ｄは、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩが、抗ＰＤ１の場合と同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞表面上のＰＤ１に結合することを示す。図９Ｅに示される通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質は、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照と比較して、高レベルのＩＦＮ−γ産生を促進した。図９Ｈ：ＨＴ−２９  ＰＢＭＣ共培養系中で産生されるＴＧＦ−β１は、被験最低用量であってもなお、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ処置時に、完全に中和される。図９Ｉ：ＨＴ−２９  ＰＢＭＣ共培養系中で産生されるＴＧＦ−β２は、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ処置時に、部分的に中和される。全体として、このｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルからの結果は、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、抗ＰＤ１抗体と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する。
【０４９２】
頭頸部がんについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩは、抗ＰＤ１単独と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する
抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の有効性を、頭頸部がんについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて査定した。健常ドナーから精製されたＰＢＭＣを、がん細胞系である、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２と共に、５日間にわたり共培養した。細胞を、アイソタイプ対照、抗ＰＤ１、または抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在下で、抗ＣＤ３により刺激した。培養物上清を回収し、製造元のプロトコールに従い、ＩＦＮ−γレベルを、ＭＳＤにより定量した。細胞を回収し、Ｔ細胞上の、標的の占有について、フローサイトメトリーにより解析した。ＴＧＦ−β１、ＴＧＦ−β２、およびＴＧＦ−β３の、細胞培養物上清中レベルは、製造元のプロトコールに従い、Ｌｕｍｉｎｅｘにより定量した。
【０４９３】
図９Ｆは、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩが、抗ＰＤ１の場合と同様に、ＣＤ８＋Ｔ細胞表面上のＰＤ１に結合することを示す。図９Ｇに示される通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質は、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照と比較して、高レベルのＩＦＮ−γ産生を促進した。図９Ｊ：Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２  ＰＢＭＣ共培養系中で産生されるＴＧＦ−β１は、被験最低用量であってもなお、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ処置時に、完全に中和される。図９Ｋ：Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２  ＰＢＭＣ共培養系中で産生されるＴＧＦ−β２は、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ処置時に、部分的に中和される。全体として、このｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルからの結果は、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、抗ＰＤ１抗体と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する。
【０４９４】
結腸直腸がんについての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルにおいて、抗ＰＤ１−ＴＧＦ−ＲＩＩは、抗ＰＤ１単独と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する
抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の有効性を、結腸直腸がんについての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルにおいて査定した。３Ｄ腫瘍スフェロイドは、結腸直腸がん細胞系である、ＨＴ−２９細胞系と、線維芽細胞系とを共培養することにより作出した。次いで、健常ドナーから精製されたＰＢＭＣを、スフェロイド培養物へと添加した。細胞を、アイソタイプ対照、抗ＰＤ１、または抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在下で、抗ＣＤ３により、５日間にわたり刺激した。培養物上清を回収し、製造元のプロトコールに従い、ＩＦＮ−γレベルを、ＭＳＤにより定量した。
【０４９５】
図９Ｌに示される通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質は、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照と比較して、高レベルのＩＦＮ−γ産生を促進した。全体として、この３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルからの結果は、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、抗ＰＤ１抗体と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する。
【０４９６】
頭頸部がんについての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルにおいて、抗ＰＤ１−ＴＧＦ−ＲＩＩは、抗ＰＤ１単独と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する
抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の有効性を、結腸直腸がんについての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルにおいて査定した。３Ｄ腫瘍スフェロイドは、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２細胞系と、線維芽細胞系とを共培養することにより作出した。次いで、健常ドナーから精製されたＰＢＭＣを、スフェロイド培養物へと添加した。細胞を、アイソタイプ対照、抗ＰＤ１、または抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在下で、抗ＣＤ３により、５日間にわたり刺激した。培養物上清を回収し、製造元のプロトコールに従い、ＩＦＮ−γレベルを、ＭＳＤにより定量した。
【０４９７】
図９Ｍに示される通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質は、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照と比較して、高レベルのＩＦＮ−γ産生を促進した。全体として、この３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルからの結果は、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、抗ＰＤ１抗体と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する。
【０４９８】
[実施例３]
ｉｎ  ｖｉｔｒｏの、組換えＴＧＦ−β１の存在下で、抗ＰＤ１−ＴＧＦ−βトラップは、抗ＰＤ１と比較して、優れた活性を有する
抗ＰＤ１−ＴＧＦ−βトラップが、高レベルのＴＧＦ−βを伴う環境内で、Ｔ細胞機能を促進する能力について評価するために、ＰＢＭＣを、上記の通り、組換えＴＧＦ−β１の存在下で刺激した。インキュベーションの終了時に、培養物上清を回収し、サイトカイン解析のために使用されるまで保管した。細胞を、蛍光コンジュゲート抗体で標識して、活性化についてのリードアウトとして、Ｔ細胞増殖、およびＩＬ−２受容体アルファまたはＣＤ２５の上方調節について評価した。
【０４９９】
組換えＴＧＦ−β１は、Ｔ細胞の活性化、増殖、ならびにサイトカインおよびケモカインの産生を抑制した（図１０および図１１）。この抑制は、抗ＰＤ１−ＴＧＦ−β１トラップにより、用量依存的に、抗ＰＤ１と比較して、有意に反転された。データは、融合タンパク質が、高量の外因性ＴＧＦ−β１を中和し、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路を破壊する結果として、Ｔ細胞免疫応答の増強をもたらす能力を示唆する。したがって、融合分子による、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１の遮断、およびＴＧＦ−βの中和は、チェックポイント阻害剤による処置が失敗したがん適応において、強力な抗腫瘍応答を誘発するための、魅力的な免疫療法でありうる。
【０５００】
[実施例４]
結腸直腸がんについてのヒト化マウスモデルにおいて、抗ＰＤ１−ＴＧＦ−ＲＩＩは、抗ＰＤ１単独と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する
抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質が、結腸直腸がんによる腫瘍を阻害する能力を、ヒト化マウスモデルにおいて査定した。ヒト化ＮＯＧマウスに、ＨＴ−２９がん細胞を投与した。腫瘍を保有するマウスを無作為化し、毎週２回、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質、抗ＰＤ１抗体単独、またはアイソタイプ対照を投与した。図１２Ａに見られる通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質は、腫瘍増殖を、抗ＰＤ１およびアイソタイプ対照と比較して、有意に阻害した。研究の終了時における、腫瘍についての解析は、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質処置マウスが、高頻度の腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を有することを示した。抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ処置マウスに由来する腫瘍についての解析はまた、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）に対する比の増大も示した。
【０５０１】
[実施例５]
頭頸部がんについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩは、抗ＰＤ１単独と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する
抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の有効性を、頭頸部がんについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて査定した。健常ドナーから精製されたＰＢＭＣを、がん細胞系である、Ｄｅｔｒｏｉｔ  ５６２と共に、４８時間にわたり共培養した。細胞を、アイソタイプ対照、抗ＰＤ１、または抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在下で、抗ＣＤ３により刺激した。培養物上清を回収し、製造元のプロトコールに従い、ＩＦＮ−γレベルを、ＭＳＤにより定量した。培養時間の終了時において、細胞ペレットを、共培養物から、遠心分離により採取し、製造元のプロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏキットを使用して、ＲＮＡを精製した。精製されたＲＮＡを、製造元の指示書に従い、ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇを使用する、遺伝子発現解析のために使用した。遺伝子発現は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒソフトウェアを使用して解析した。
【０５０２】
図１３Ａに示される通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質は、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照と比較して、高レベルのＩＦＮ−γ産生を促進した。抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質処置は、インターフェロン経路遺伝子（図１３Ｂ）、ならびに細胞傷害性遺伝子（図１３Ｃ）の、抗ＰＤ１処置と比較した、有意の上方調節を結果としてもたらし、腫瘍の存在下における、細胞傷害機能の、抗ＰＤ１抗体と比較した改善を強調する。さらに、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質処置は、腫瘍の転移および血管新生経路に関与する遺伝子の、有意の下方調節を結果としてもたらした（図１３Ｄ）。全体として、このｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルからの結果は、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、抗ＰＤ１抗体と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する。
【０５０３】
[実施例６]
頭頸部がんについてのヒト化マウスモデルにおいて、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩは、抗ＰＤ１単独と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する
抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質が、頭頸部がんによる腫瘍を阻害する能力を、ヒト化マウスモデルにおいて査定した。ヒト化ＮＳＧマウスに、Ｄ５６２細胞系を投与した。腫瘍を保有するマウスを無作為化し、毎週２回、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質、抗ＰＤ１抗体単独、またはアイソタイプ対照を投与した。図１４に見られる通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質は、抗ＰＤ１およびアイソタイプ対照と比較して、有意に、腫瘍の増殖を阻害し（図１４Ａ）、腫瘍を保有するマウスの生存を改善し（図１４Ｂ）、ＩＦＮγレベルを上昇させた（図１４Ｆ）。抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質による処置は、腫瘍内の、ＣＤ８＋Ｔ細胞の、Ｔｒｅｇに対する比を、有意に改善した（図１４Ｃ）。
【０５０４】
[実施例７]
原発性結腸直腸がん（ＣＲＣ）患者試料中において、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩは、抗ＰＤ１単独と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する
抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の有効性を、原発性結腸直腸がん患者試料中で査定した。ＣＲＣ患者に由来するＰＢＭＣを、解離腫瘍細胞と共に共培養した。細胞を、アイソタイプ対照、抗ＰＤ１、または抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在下で刺激した。培養物上清を回収し、製造元のプロトコールに従い、ＩＦＮ−γレベルを、ＭＳＤにより定量した。ＴＧＦ−βレベルは、製造元のプロトコールに従い、Ｌｕｍｉｎｅｘにより評価した。培養時間の終了時において、細胞ペレットを、共培養物から、遠心分離により採取し、製造元のプロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏキットを使用して、ＲＮＡを精製した。精製されたＲＮＡを、製造元の指示書に従い、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇを使用する、遺伝子発現解析のために使用した。遺伝子発現は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒソフトウェアを使用して解析した。
【０５０５】
図１５Ａに示される通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質は、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照と比較して、高レベルのＩＦＮ−γ産生を促進した。抗ＰＤ−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質は、患者ＰＢＭＣおよび解離腫瘍細胞により産生されるＴＧＦ−β１を、完全に中和した（図１５Ｂ）。抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質処置は、細胞傷害性遺伝子（図１５Ｃ）の、抗ＰＤ１処置と比較した、有意の上方調節を結果としてもたらし、腫瘍の存在下における、細胞傷害機能の、抗ＰＤ１抗体と比較した改善を強調する。さらに、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質処置は、腫瘍の転移および血管新生経路に関与する遺伝子の、有意の下方調節を結果としてもたらした（図１５Ｃ）。予期される通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質処置群内では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、有意に下方調節される。全体として、この患者由来試料からの結果は、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、抗ＰＤ１抗体と比較して、優れた抗腫瘍応答を呈する。
【０５０６】
[実施例８]
卵巣がんについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩは、抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＧＦＲＩＩと比較して、細胞傷害作用の増大を呈する
抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩの有効性を、卵巣がんについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて、抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＧＦＲＩＩと比較した。健常ドナーから精製されたＰＢＭＣを、がん細胞系である、ＳＫ−ＯＶ−３と共に共培養した。免疫細胞を、アイソタイプ対照、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質、または抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在下で刺激した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞解析システムを使用して、腫瘍細胞の殺滅を、培養時間にわたり評価した。
【０５０７】
図１６に示される通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の存在は、抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質と比較した場合に、腫瘍細胞の殺滅の増大を呈した。全体として、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩは、抗ＰＤ−Ｌ１−ＴＧＦＲＩＩと比較した場合に、細胞傷害作用の改善を呈する。
【０５０８】
[実施例９]
抗ＰＤ１−ＴＧＦ−ＲＩＩの、ＣＡＲ−Ｔとの組合せは、抗ＰＤ１との組合せ、またはＣＡＲ−Ｔ単独と比較した場合に、３Ｄ腫瘍スフェロイド殺滅を、有意に増強した
抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せを、卵巣がんについての、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ３Ｄ腫瘍スフェロイドモデルにおいて査定した。本実施例では、ＣＡＲ−Ｔ細胞とは、ＭＵＣ１６  ＣＡＲを発現するように操作されたＴ細胞を指すことに留意されたい。３Ｄ腫瘍スフェロイドは、卵巣がん細胞系である、ＳＫ−ＯＶ−３と、線維芽細胞系とを共培養することにより作出した。次いで、ＣＡＲ−Ｔ細胞を、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質または抗ＰＤ１の存在下で、３Ｄ腫瘍スフェロイド培養物へと添加した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞解析システムを使用して、３Ｄ腫瘍スフェロイドの、標的特異的殺滅を、培養時間にわたり評価した。
【０５０９】
図１７に示される通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せは、抗ＰＤ１と、ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せ、またはＣＡＲ−Ｔ細胞単独と比較した場合の、３Ｄ腫瘍スフェロイドの殺滅の増大を示した。全体として、この殺滅アッセイからの結果は、抗ＰＤ−１−ＴＧＦ−ＲＩＩの、ＣＡＲ−Ｔ細胞への添加が、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍応答を増強することを示唆する。
【０５１０】
[実施例１０]
抗ＰＤ１−ＴＧＦ−ＲＩＩの、ＣＤ３３特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せ
ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、細胞傷害アッセイにおいて、ＭＯＬＭ−１３  ＡＭＬ腫瘍細胞系と共に共培養し、培養物を、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３生細胞解析測定器内でインキュベートした。抗ＰＤ１または抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩを、表示の培養物へと、等モル濃度で添加した。培養の開始時に、Ｓｙｔｏｘ  Ｇｒｅｅｎを、直接添加して、培養物中の死細胞の同定および計数を可能とした。解析は、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｓ３ソフトウェアを使用して実施した。示されるグラフに提示されたデータは、三連ウェルからの平均値±ＳＤであり、ウェル１つ当たりの走査回数５回で採取した。図１８Ａに示される通り、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、ＣＤ３３  ＣＡＲ  Ｔ細胞との組合せは、ＣＡＲ  Ｔ細胞と、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）との組合せ、またはＣＡＲ  Ｔ細胞単独と比較した、殺滅の増大を示した。
【０５１１】
図１８Ｂに示される通り、抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、ＣＤ３３  ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せは、ＣＡＲ−Ｔ細胞と、抗ＰＤ１との組合せまたはＣＡＲ−Ｔ細胞単独と比較した、殺滅の増大を示した。全体として、これらの細胞傷害アッセイからの結果は、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質、および抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質が、ＣＡＲ−Ｔ細胞の抗腫瘍免疫応答を増強することを裏付ける。
【０５１２】
[実施例１１]
抗ＰＤ１−ＴＧＦ−ＲＩＩの、ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せは、腫瘍細胞の殺滅を増強する
ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質または抗ＰＤ１の存在下において、細胞表面上でＣＤ１９抗原を発現する腫瘍細胞と共に共培養する。抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、ＣＤ１９  ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せは、抗ＰＤ１と、ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せ、またはＣＡＲ−Ｔ細胞単独と比較した場合の、腫瘍細胞の殺滅の増大を示す。
【０５１３】
[実施例１２]
抗ＰＤ１−ＴＧＦ−ＲＩＩの、ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔとの組合せは、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害可能性を改善する
ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質または抗ＰＤ１の存在下または非存在下において、ＢＣＭＡ抗原を発現する腫瘍細胞系と共に共培養する。抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せは、抗ＰＤ１と、ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せ、またはＣＡＲ−Ｔ細胞単独と比較した、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害可能性を改善する。
【０５１４】
[実施例１３]
抗ＰＤ１−ＴＧＦ−ＲＩＩの、ＰＳＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔとの組合せは、ＣＡＲ−Ｔ細胞による腫瘍細胞の殺滅を増強する
ＰＳＭＡ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞を、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質または抗ＰＤ１の存在下または非存在下において、ＰＳＭＡ抗原を発現する腫瘍細胞系と共に共培養する。抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩ融合タンパク質の、ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せは、抗ＰＤ１と、ＣＡＲ−Ｔ細胞との組合せ、またはＣＡＲ−Ｔ細胞単独と比較した場合の、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞傷害作用を改善する。
【０５１５】
[実施例１４]
ＮＫ細胞による標的細胞の溶解は、抗ＰＤ１−ＴＧＦＲＩＩにより改善された
抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ＴＧＦＲＩＩ、および抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ＴＧＦＲＩＩが、ナチュラルキラー細胞媒介性の、腫瘍細胞の殺滅を促進する能力を、卵巣がんについてのｉｎ  ｖｉｔｒｏモデルにおいて評価した。エフェクターＮＫ細胞を、健常ドナーから精製し、抗ＲＳＶ−ＴＦＧＢＲＩＩ（対照）、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）、および抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）、抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ＴＧＦＲＩＩ、ならびに抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ＴＧＦＲＩＩの存在下において、異なるＥ：Ｔ細胞比で、一晩にわたり、ＳＫ−ＯＶ−３標的細胞系と共に共培養した。プロピジウムヨウ素（propidium iodine）を、培養物へと添加して、死細胞を同定し、Ｎｅｘｃｅｌｏｍ  Ｃｅｌｉｇｏを使用して、細胞死についてアッセイした。図１９Ａおよび図１９Ｂにおいて観察される通り、抗ＰＤ１−ＴＧＦＢＲＩＩ融合タンパク質は、抗ＰＤ１またはＴＧＦＢＲＩＩ単独（抗ＲＳＶ−ＴＧＦＢＲＩＩ）と比較して、高度の腫瘍細胞殺滅を促進した。
【０５１６】
[実施例１５]
抗ＰＤ１−ＡＤＡ２の融合タンパク質
抗ＰＤ１  ＶＨおよび抗ＰＤ１  ＶＬは、リンカーである、（Ｇ４Ｓ）２により、アデノシンデアミナーゼ２（ＡＤＡ２）を、Ｃ末端において融合させた、ＩｇＧ構成、ｓｃＦｖ−Ｆｃ構成、またはｓｃＦｖ構成で、合成および形成した。抗ＰＤ１−アデノシンデアミナーゼ融合タンパク質は、製造元のプロトコールに従い、Ｅｘｐｉ２９３細胞内で、一過性に発現させ、ＡＫＴＡ  ＡＶＡＮＴ系を使用して精製した。
【０５１７】
表面プラズモン共鳴
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）解析は、Ｂｉａｃｏｒｅ３０００、ＣＭ５チップ、アミンカップリングキット、１０倍濃度のＨＢＳ−Ｐランニング緩衝液、および用のグリシンを使用して実施した。抗ＰＤ１反応速度アッセイのために、所定のリガンド固定化プログラムを使用して、組換えＰＤ−１  Ｆｃタンパク質を、チップ上に固定化させた。精製された、抗ＰＤ１−アデノシンデアミナーゼ融合タンパク質を、ランニング緩衝液中、最終濃度の範囲へと希釈し、注入した。解離の進行を可能とするのに続き、チップ表面を再生した。
【０５１８】
【表９】
2021531754.tif 000014
【０５１９】
ＰＤ−１／ＰＤＬ−１遮断アッセイ
抗ＰＤ１−ＡＤＡ２融合タンパク質が、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１間相互作用を遮断することにより、抗ＰＤ１抗体として機能しうるのかどうかについて探索するために、実施例１に描示した通りに、Ｐｒｏｍｅｇａ製の、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイキットを使用した。これらの値を、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断効力の尺度として使用した（図２１）。
【０５２０】
ＡＤＡ酵素活性アッセイ
抗ＰＤ１  ＡＤＡ２融合タンパク質酵素活性を決定するために、製造元の推奨に従い、アデノシンデアミナーゼ（ＡＤＡ）活性比色キット（Ａｂｃａｍ）を利用した。ＡＤＡの酵素活性を、時間経過にわたり計算するために、２分後および３０分後の時点を選択した。図２２に示される通り、抗ＰＤ１−ＡＤＡ２融合タンパク質は、時間経過にわたり、酵素活性を呈した。
【０５２１】
[実施例１６]
抗ＰＤ１  ＩｇＧ４  Ｓ１０８Ｐ−ｗｔＡＤＡ２および抗ＰＤ１  ＩｇＧ４  Ｓ１０８Ｐ−ｍｕｔＡＤＡ２についてのＰＤ１結合アフィニティー解析
ＰＤ１−Ｆｃ抗原および参照抗原を、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＣＭ５表面上に固定化させ、次いで、６〜１２連の系列希釈濃度の、抗ＰＤ１  ＩｇＧ４  Ｓ１０８Ｐ−ｗｔＡＤＡ２および抗ＰＤ１  ＩｇＧ４  Ｓ１０８Ｐ−ｍｕｔＡＤＡ２を、ＰＤ１−Ｆｃ抗原上および参照表面上に、系列注入した。反応速度データを、１：１モデル：物質移動を伴うラングミュアモデルについて査定した。結果は、表１１に描示される通りである。
【０５２２】
【表１０】
2021531754.tif 000015
【０５２３】
[実施例１７]
抗ＰＤ１−ＡＤＡ２融合タンパク質は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ１シグナル伝達を、効果的に遮断した
抗ＰＤ１−ＡＤＡ２融合タンパク質が、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１間相互作用を遮断する能力を、実施例１２で言及された、レポーターバイオアッセイを使用して査定した。
【０５２４】
図２３Ａ〜２３Ｂに示される通り、抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ｗｔＡＤＡ２および抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ｍｕｔ７ＡＤＡ２、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ｗｔＡＤＡ２および抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ｍｕｔ７ＡＤＡ２は、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１間相互作用を、同様の効力で遮断した。
【０５２５】
[実施例１８]
ＡＤＡ２の酵素活性
抗ＰＤ１−ＡＤＡ２融合タンパク質が、アデノシンを酵素的に分解する能力を、実施例１２で言及された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＡ酵素活性アッセイにおいて査定した。
【０５２６】
図２４Ａ〜２４Ｆに示される通り、低濃度のアデノシンでは、ｍｕｔ７ＡＤＡ２は、ｗｔＡＤＡ２と比較して、高度の酵素活性を有する。
【０５２７】
[実施例１９]
抗ＰＤ１−ｍｕｔ７−ＡＤＡ２は、抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２より高度の酵素活性を有する
蛍光ＡＤＡ２酵素アッセイキットを使用して、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ｗｔＡＤＡ２および抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ｍｕｔ７ＡＤＡ２のミカエリスメンテン定数（Ｋｍ）を測定した。図２５に示される通り、抗ＰＤ１−ｍｕｔ７ＡＤＡ２は、抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２と比較して、高度のＫｍを有する。
【０５２８】
[実施例２０]
抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２は、Ｔ細胞増殖の、アデノシン媒介性抑制を反転させる
抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２が、Ｔ細胞増殖を促進する能力を、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、正常ドナーＰＢＭＣを使用して評価した。１ｍＭのアデノシンを含有する培地中で共培養された、ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ標識化ＰＢＭＣを、濃度を増大させる、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ｗｔＡＤＡ２および抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）の存在下で刺激した。サイトカイン解析のために、上清を回収した。フローサイトメトリーにより、細胞を、Ｔ細胞増殖についてアッセイした。データは、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ｗｔＡＤＡ２が、ＣＤ４＋Ｔ細胞（図２６Ａ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞（図２６Ｂ）の、アデノシン媒介性抑制を、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）、またはアイソタイプ対照と比較して有意に反転させることを示した。図２６Ｃおよび２６Ｄに示される通り、抗ＰＤ１および抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２のいずれも、ＣＤ４＋Ｔ細胞上（図２６Ｃ）およびＣＤ８＋Ｔ細胞上（図２６Ｄ）のＰＤ１受容体を、同様に占有した。
【０５２９】
抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ｗｔＡＤＡ２が、Ｔ細胞機能を促進する能力を、濃度を増大させる、抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）、抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ｗｔＡＤＡ２、またはアイソタイプ対照の存在下、アデノシンを含有する培地中で、ＰＢＭＣを刺激することによりさらに評価した。培養物上清を回収し、ＩＦＮγの産生についてアッセイした。図２６Ｅは、抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）−ｗｔＡＤＡ２処置が、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照と比較して、有意に多くのＩＦＮ−γを誘導したことを示す。
【０５３０】
[実施例２１]
ｗｔＡＤＡ２およびｍｕｔＡＤＡ２は、Ｔ細胞増殖の、同等なアデノシン媒介性抑制の反転を示した
Ｔ細胞増殖の、アデノシン媒介性抑制を反転させる、ｗｔＡＤＡ２およびｍｕｔＡＤＡ２の有効性を、濃度を増大させる、抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２、抗ＰＤ１−ｍｕｔＡＤＡ２、抗ＲＳＶ−ｗｔＡＤＡ２、抗ＲＳＶ−ｍｕｔＡＤＡ２の存在下、アデノシンを含有する培地中で、標識付けされたＰＢＭＣを刺激することにより評価した。細胞を染色し、次いで、フローサイトメトリーにより、増殖について解析した。ｗｔＡＤＡ２融合タンパク質およびｍｕｔＡＤＡ融合タンパク質のいずれも、ＣＤ４  Ｔ細胞（図２７Ａ）およびＣＤ８  Ｔ細胞（図２７Ｂ）のアデノシン媒介性抑制の反転において、同等に有効であった、
【０５３１】
[実施例２２]
抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ＡＤＡ２による、ＰＤ１−ＰＤＬ１間相互作用の遮断
多様な形態の、抗ＰＤ１−ＡＤＡ２融合タンパク質が、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１間相互作用を遮断する能力を、実施例１２で言及された、レポーターバイオアッセイを使用して査定した。
【０５３２】
図２８に示される通り、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＡＤＡ２、ｈＩｇＧ１−ＡＤＡ２、およびｓｃＦｖ−ＡＤＡ２は、全て、ＰＤ１／ＰＤ−Ｌ１遮断バイオアッセイにより測定される、機能的活性を示した。
【０５３３】
[実施例２３]
抗ＰＤ１−ＡＤＡ２−ｓｃＦｖ−ＦｃのＡＤＡ酵素活性
多様な形態の、抗ＰＤ１−ＡＤＡ２融合タンパク質が、アデノシンを酵素的に分解する能力を、実施例１２で言及された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＡＤＡ酵素活性アッセイにおいて査定した。
【０５３４】
図２９に示される通り、抗ＰＤ１（ＶＨ７／ＶＬ６）ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＡＤＡ２と、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）ｓｃＦｖ−Ｆｃ−ＡＤＡ２とは、対照と同等な、同様のＡＤＡ２の酵素活性を有する。
【０５３５】
[実施例２４]
多様な抗ＰＤ１−ＡＤＡ２構築物および抗ＰＤ１−ｍｕｔＡＤＡ２構築物のＡＤＡ酵素活性
ＡＤＡの酵素活性アッセイは、上記で記載された通りに行った。図３０に示される通り、アデノシンを１０ｎＭとするとき、ｍｕｔＡＤＡ２は、ｗｔＡＤＡ２と比較して、高度の酵素活性を有する。
【０５３６】
[実施例２５]
抗ＰＤ１−ＡＤＡ２は、原発性ＣＲＣ患者の腫瘍内の、ＩＦＮ−γの産生、および腫瘍浸潤性リンパ球（ＴＩＬ）の増殖の促進した
ＣＲＣ患者から精製されたＰＢＭＣを、マッチさせた解離腫瘍細胞と共に共培養した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識付けされた細胞を、アイソタイプ対照、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）、または抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ｗｔＡＤＡ２融合タンパク質の存在下で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により刺激した。培養物上清を回収し、ＩＦＮ−γレベルを、製造元のプロトコールに従い、ＭＳＤにより定量し、細胞を、Ｔ細胞の増殖について評価した。遺伝子発現解析のために、細胞ペレットを、遠心分離により採取し、製造元のプロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏキットを使用して、ＲＮＡを精製した。精製されたＲＮＡを、製造元の指示書に従い、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇを使用する、遺伝子発現解析のために使用した。遺伝子発現は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒソフトウェアを使用して解析した。
【０５３７】
図３１Ａに示される通り、抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２融合タンパク質は、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照と比較して、高レベルのＩＦＮ−γ産生およびＴ細胞増殖（図３１Ｂ）を促進した。抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２融合タンパク質処置は、ＩＦＮ−γシグナル伝達遺伝子、およびケモカインシグナル伝達遺伝子、ならびに細胞傷害性遺伝子（図３１Ｃ）の、抗ＰＤ１処置と比較した、有意の上方調節を結果としてもたらし、腫瘍の存在下における、Ｔ細胞の細胞傷害機能の、抗ＰＤ１抗体と比較した改善を強調する。
【０５３８】
[実施例２６]
肺がんについてのヒト化マウスモデルにおける、抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２融合タンパク質の効果
末梢血単核細胞でヒト化したＮＳＧマウスに、膵がん細胞系である、Ｐａｎｃ．０８．ｆＬｕｃ．ｅＧＦＰを、膵臓内接種（同所（ortotopic）注射）した。マウス体重を、毎週測定し、腫瘍重量を、３８日目の研究終了時に測定した。マウスを、処置群へと無作為化し、毎週２回、ＨＢＳＳ（媒体対照）、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）、および抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ｗｔＡＤＡ２で処置した。図３２に見られる通り、抗ＰＤ−ｗｔＡＤＡ２で処置されたマウスは、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照で処置されたマウスと比較して、有意に小型の腫瘍を有した。
【０５３９】
図３２に見られる通り、抗ＰＤ−ｗｔＡＤＡ２で処置されたマウスは、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照で処置されたマウスと比較して、有意に小型の腫瘍を有した。
【０５４０】
[実施例２７]
抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ｗｔＡＤＡ２による処置は、アデノシン経路、血管新生を下方調節し、細胞傷害作用およびサイトカイン遺伝子を上方調節した
ＣＲＣ患者から精製されたＰＢＭＣを、マッチさせた解離腫瘍細胞と共に共培養した。ＣｅｌｌＴｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔで標識付けされた細胞を、アイソタイプ対照、抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）、または抗ＰＤ１（ＶＨ６／ＶＬ５）−ｗｔＡＤＡ２融合タンパク質の存在下で、抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８により刺激した。培養物上清を回収し、ＩＦＮ−γレベルを、製造元のプロトコールに従い、ＭＳＤにより定量し、細胞を、Ｔ細胞増殖について評価する。遺伝子発現解析のために、培養物を複製し、細胞ペレットを、遠心分離により採取し、製造元のプロトコールに従い、Ｑｉａｇｅｎ  ＲＮＡｅａｓｙ  ｍｉｃｒｏキットを使用して、ＲＮＡを精製した。精製されたＲＮＡを、製造元の指示書に従い、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇを使用する、遺伝子発現解析のために使用した。遺伝子発現は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇ  ｎＣｏｕｎｔｅｒソフトウェアを使用して解析した。
【０５４１】
抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２融合タンパク質は、抗ＰＤ１またはアイソタイプ対照と比較して、高レベルのＩＦＮ−γ産生およびＴ細胞増殖を促進した。抗ＰＤ１−ｗｔＡＤＡ２融合タンパク質による処置はまた、ＩＦＮ−γシグナル伝達遺伝子、およびケモカインシグナル伝達遺伝子、ならびに細胞傷害性遺伝子（データは示さない）の、抗ＰＤ１処置と比較した、有意の上方調節も結果としてもたらし、腫瘍の存在下における、Ｔ細胞の細胞傷害機能の、抗ＰＤ１抗体と比較した改善を強調する。
【０５４２】
配列
本明細書では、本明細書で提示される実施形態に含まれた、ある特定の配列についての、代表的なリストが提示される。
【０５４３】
【表１１−１】
2021531754.tif 000016
【０５４４】
【表１１−２】
2021531754.tif 000017
【０５４５】
【表１１−３】
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【０５４６】
【表１１−４】
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【０５４７】
【表１１−５】
2021531754.tif 000020
【０５４８】
【表１１−６】
2021531754.tif 000021
【０５４９】
【表１１−７】
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【０５５０】
【表１１−８】
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【０５５１】
【表１１−９】
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【０５５２】
【表１１−１０】
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【０５５３】
【表１１−１１】
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【０５５４】
【表１１−１２】
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【０５５５】
【表１１−１３】
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【０５５６】
【表１１−１４】
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【０５５７】
【表１１−１５】
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【０５５８】
【表１１−１６】
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【０５５９】
【表１１−１７】
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【０５６０】
【表１１−１８】
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【０５６１】
【表１１−１９】
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【０５６２】
【表１１−２０】
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【０５６３】
【表１１−２１】
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【０５６４】
【表１１−２２】
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【０５６５】
【表１１−２３】
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【０５６６】
【表１１−２４】
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【０５６７】
【表１１−２５】
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【０５６８】
【表１１−２６】
2021531754.tif 000041
【０５６９】
【表１１−２７】
2021531754.tif 000042
【０５７０】
【表１２−１】
2021531754.tif 000043
【０５７１】
【表１２−２】
2021531754.tif 000044
【０５７２】
【表１２−３】
2021531754.tif 000045
【０５７３】
【表１２−４】
2021531754.tif 000046
【０５７４】
【表１２−５】
2021531754.tif 000047
【０５７５】
【表１３】
2021531754.tif 000048
【０５７６】
【表１４−１】
2021531754.tif 000049
【０５７７】
【表１４−２】
2021531754.tif 000050
【０５７８】
【表１４−３】
2021531754.tif 000051
【０５７９】
【表１４−４】
2021531754.tif 000052
【０５８０】
【表１４−５】
2021531754.tif 000053
【０５８１】
【表１４−６】
2021531754.tif 000054
【０５８２】
【表１４−７】
2021531754.tif 000055
【０５８３】
【表１４−８】
2021531754.tif 000056
【０５８４】
【表１４−９】
2021531754.tif 000057
【０５８５】
【表１４−１０】
2021531754.tif 000058
【０５８６】
【表１５】
2021531754.tif 000059
【０５８７】
【表１６】
2021531754.tif 000060
【０５８８】
【表１７】
2021531754.tif 000061
【図１】
2021531754.tif 000062
【図２】
2021531754.tif 000063
【図３】
2021531754.tif 000064
【図４】
2021531754.tif 000065
【図５】
2021531754.tif 000066
【図６】
2021531754.tif 000067
【図７】
2021531754.tif 000068
【図８】
2021531754.tif 000069
【図９−１】
2021531754.tif 000070
【図９−２】
2021531754.tif 000071
【図９−３】
2021531754.tif 000072
【図９−４】
2021531754.tif 000073
【図９−５】
2021531754.tif 000074
【図９−６】
2021531754.tif 000075
【図９−７】
2021531754.tif 000076
【図９−８】
2021531754.tif 000077
【図１０】
2021531754.tif 000078
【図１１−１】
2021531754.tif 000079
【図１１−２】
2021531754.tif 000080
【図１１−３】
2021531754.tif 000081
【図１２−１】
2021531754.tif 000082
【図１２−２】
2021531754.tif 000083
【図１２−３】
2021531754.tif 000084
【図１３−１】
2021531754.tif 000085
【図１３−２】
2021531754.tif 000086
【図１３−３】
2021531754.tif 000087
【図１３−４】
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【図１４−１】
2021531754.tif 000089
【図１４−２】
2021531754.tif 000090
【図１４−３】
2021531754.tif 000091
【図１５−１】
2021531754.tif 000092
【図１５−２】
2021531754.tif 000093
【図１６】
2021531754.tif 000094
【図１７】
2021531754.tif 000095
【図１８】
2021531754.tif 000096
【図１９】
2021531754.tif 000097
【図２０】
2021531754.tif 000098
【図２１】
2021531754.tif 000099
【図２２】
2021531754.tif 000100
【図２３−１】
2021531754.tif 000101
【図２３−２】
2021531754.tif 000102
【図２３−３】
2021531754.tif 000103
【図２４−１】
2021531754.tif 000104
【図２４−２】
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【図２４−３】
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【図２４−４】
2021531754.tif 000107
【図２５】
2021531754.tif 000108
【図２６−１】
2021531754.tif 000109
【図２６−２】
2021531754.tif 000110
【図２６−３】
2021531754.tif 000111
【図２７−１】
2021531754.tif 000112
【図２７−２】
2021531754.tif 000113
【図２８】
2021531754.tif 000114
【図２９】
2021531754.tif 000115
【図３０】
2021531754.tif 000116
【図３１】
2021531754.tif 000117
【図３２】
2021531754.tif 000118
【図３３】
2021531754.tif 000119
【配列表】
2021531754000001.app
【国際調査報告】
2021531754.tif 000120
2021531754.tif 000121
2021531754.tif 000122
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