(57)【要約】  本発明は、核酸結合ドメインを有する組換えタンパク質に関する。特に、本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインおよびセツキシマブ抗体を含む組換えタンパク質、ｄｓＲＮＡをさらに含む複合体、核酸配列、ならびに本発明の組換えタンパク質または複合体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。さらに、本発明は、癌の治療に使用するための本発明の組換えタンパク質、複合体、または薬学的組成物に関し、前記癌は、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインおよびセツキシマブ抗体を含む組換えタンパク質。
【請求項２】
前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）が前記セツキシマブ抗体の軽鎖のＮ末端に結合されているか、または前記ｄｓＲＢＤが前記セツキシマブ抗体の重鎖のＣ末端に結合されている、請求項１に記載の組換えタンパク質。
【請求項３】
前記ｄｓＲＢＤおよび前記セツキシマブ抗体がスペーサーペプチドを介して共有結合されており、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含み、式中、好ましくはｎは、１、２、３または４であり、さらに好ましくはｎは、３である、請求項１または２に記載の組換えタンパク質。
【請求項４】
前記ｄｓＲＢＤが、前記スペーサーペプチドを介して前記セツキシマブ抗体の前記軽鎖のＮ末端に結合され、前記スペーサーペプチドが配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、前記ｄｓＲＢＤが、前記スペーサーペプチドを介して前記セツキシマブ抗体の前記重鎖のＣ末端に結合され、前記スペーサーペプチドが配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する、請求項３に記載の組換えタンパク質。
【請求項５】
前記１つ以上のｄｓＲＢｍが、ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、ＴＲＢＰ、ＰＡＣＴ、スタウフェン（Ｓｔａｕｆｅｎ）、ＮＦＡＲ１、ＮＦＡＲＺ、ＳＰＮＲ、ＲＨＡおよびＮＲＥＢＰのｄｓＲＢｍからなる群から選択される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項６】
前記１つ以上のｄｓＲＢｍの少なくとも１つが、ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、好ましくはヒトＰＫＲ（ｈＰＫＲ）のアミノ酸配列である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項７】
前記ｄｓＲＢＤが、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、アミノ酸残基Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されており、好ましくは前記非システインアミノ酸は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択され、より好ましくは、前記非システインアミノ酸は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される、請求項１〜６のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項８】
前記ｄｓＲＢＤが２つの二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ（ｄｓＲＢｍ）を含み、一方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ１）が、ｈＰＫＲの残基６〜７９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、かつ他方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ２）が、ｈＰＫＲの残基９６〜１６９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１およびＫ６４は、ｄｓＲＢｍ１の前記ホモログに保存されており、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４は、ｄｓＲＢｍ２の前記ホモログに保存されており、前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されており、好ましくは、前記非システインアミノ酸は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択され、より好ましくは、前記非システインアミノ酸は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される、請求項１〜７のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項９】
前記ｄｓＲＢＤが、配列番号８の配列を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載の組換えタンパク質。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質およびｄｓＲＮＡを含む複合体。
【請求項１１】
前記ｄｓＲＮＡが、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１２】
前記ｄｓＲＮＡが、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）である、請求項１０に記載の複合体。
【請求項１３】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載の組換えタンパク質または複合体および薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
【請求項１４】
癌の治療に使用するための、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の組換えタンパク質、複合体、または薬学的組成物であって、前記癌は、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする、組換えタンパク質、複合体、または薬学的組成物。
【請求項１５】
請求項１〜９のいずれか一項に記載の組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸結合ドメインを有する組換えタンパク質の分野に関する。特に、本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインおよびセツキシマブ抗体を含む組換えタンパク質またはキメラタンパク質、ｄｓＲＮＡをさらに含む複合体、核酸配列、ならびに本発明の組換えタンパク質または複合体を含む薬学的組成物に関する。さらに、本発明は、癌の治療に使用するための本発明の組換えタンパク質、複合体または薬学的組成物に関し、前記癌は、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする。
【０００２】
関連技術
結腸直腸癌または肺癌などの癌は、長年にわたって研究者を困惑させてきた深刻な病気である。ＥＧＦＲ（ｅｒｂＢ−１）とその同族リガンドのレベルの上昇は、多くの種類の癌の共通の構成要素として確認されている。Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎらによる研究では、頭頸部癌、卵巣癌、子宮頸癌、膀胱癌、食道、胃癌、乳房癌、子宮内膜癌、結腸直腸癌、および非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）が、正常な組織と比較して、高いレベルのＥＧＦＲを発現し、ＥＧＦＲと患者の予後との間の関連に関して適切な判断ができるように十分な深さで研究されている（Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，“ＥＧＦＲ  ａｎｄ  ｃａｎｃｅｒ  ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ”，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，ｖｏｌ．３７，ｐｐ．９−１５，２００１）。
【０００３】
ｅｒｂＢ受容体とそれらのシグナル伝達経路をブロックすることを目的としたいくつかの戦略は、現在、前臨床および臨床調査を受けている。これらの中には、ｅｒｂＢ受容体またはそのリガンドに結合するモノクローナル抗体および二重特異性抗体、癌細胞を選択的に標的とする抗体／免疫毒素複合体、ｅｒｂＢ受容体のリン酸化をブロックするチロシンキナーゼ阻害剤による小分子療法、ｅｒｂＢ受容体遺伝子の転写を減少させるアンチセンスオリゴヌクレオチド、ｅｒｂＢ  ｍＲＮＡを分解するリボザイム、およびユビキチン経路を介してｅｒｂＢファミリーの特定のメンバーの分解を促進するアンサマイシン類似体、による免疫療法がある。ヒト化ＭＡｂであるトラスツズマブ、キメラＭＡｂであるセツキシマブ（Ｃ２２５）、ヒト化二重特異性抗体であるＭＤＸＨ２１０、および二重特異性抗体であるＭＤＸ４４７を含め、いくつかのＭＡｂ薬が臨床調査中である（Ｓｌｉｃｈｅｎｍｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｔｈｅ  ＥｒｂＢ  Ｆａｍｉｌｙ  ｏｆ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔｙｒｏｓｉｎｅ  Ｋｉｎａｓｅｓ，Ｓｅｍｉｎａｒｓ  ｉｎ  Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ．２８（５），Ｓｕｐｐｌ  １６，ｐｐ．６７−７９，２００１）。
【０００４】
セツキシマブ（ＩＭＣ−Ｃ２２５、Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））は、正常細胞と腫瘍細胞の両方の上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＨＥＲ１、ｃ−ＥｒｂＢ−１）に特異的に結合し、上皮成長因子（ＥＧＦ）と、トランスフォーミング増殖因子アルファなどの他のリガンドとの結合を競合的に阻害する、組換え型の、ヒト／マウスキメラＩｇＧ１モノクローナル抗体である。ＥＧＦＲへのセツキシマブの結合は、受容体関連キナーゼのリン酸化と活性化をブロックし、細胞増殖の阻害、アポトーシスの誘導、およびマトリックスメタロプロテイナーゼと血管内皮増殖因子の産生の減少をもたらす。ＥＧＦＲは、皮膚や毛包を含む多くの正常な上皮組織で構成的に発現される。ＥＧＦＲの過剰発現は、結腸および直腸癌を含む多くのヒトの癌でも検出される（ＮＩＨ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  ｆｏｒ  Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ，Ｊｕｌｙ  ２，２０１３）。
【０００５】
セツキシマブは、ＥＧＦＲ発現、転移性または再発性の結腸直腸癌、局所または局所進行性頭頸部扁平上皮癌（ＳＣＣＨＮ）の治療での使用、およびＫ−ｒａｓ変異陰性（野生型）、ＥＧＦＲ発現転移性結腸直腸癌（ｍＣＲＣ）患者の第１選択治療のためのＦＯＬＦＩＲＩ（イリノテカン、５−フルオロウラシル、ロイコボリン）との併用が承認されている（ＮＩＨ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＦＤＡ  Ａｐｐｒｏｖａｌ  ｆｏｒ  Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ，Ｊｕｌｙ  ２，２０１３）。
【０００６】
過去数年間に観察された治療法の印象的な改善にもかかわらず、転移性結腸直腸癌患者の予後は依然として不良である。セツキシマブとパニツムマブは、異なる治療ライン間のいくつかの第ＩＩＩ相臨床試験において観察された、無増悪生存期間、全生存期間、奏効率、および生活の質の点で有効である。しかしながら、それらは患者の一部でのみ有効であることが示されており、反応者でさえ最終的に二次耐性を発生することにより耐性になる。抗ＥＧＦＲ薬に対する一次耐性と獲得耐性の両方の根底にある、提案される分子メカニズムがいくつかある。最も頻繁な耐性メカニズムは、ＥＧＦＲシグナル伝達経路の下流エフェクター（ＫＲＡＳ、ＮＲＡＳ、ＢＲＡＦ、ＰＩＫ３ＣＡなど）のゲノム変化の結果である（Ｓｆｏｒｚａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｔｏ ａｎｔｉ−ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｉｎ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ，Ｗｏｒｌｄ  Ｊ  Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２０１６，ｖｏｌ．２２（２８），ｐｐ．６３４５−６３６１）。
【０００７】
ウイルスの二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）模倣体は、抗腫瘍免疫応答を促進するために癌免疫療法で探索されている。ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）とポリアデニル酸−ポリウリジル酸（ポリＡＵ）は、ウイルスｄｓＲＮＡの合成類似体であり、Ｉ型インターフェロン（ＩＦＮ−Ｉ）の強力な誘導物質である。癌細胞に対する合成ｄｓＲＮＡの直接的な影響は、ＩＦＮ−Ｉ産生の誘導に基づいて実証されており、自己分泌シグナル伝達ループを介して順に癌細胞のアポトーシスを促進する（Ｇａｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｒｅｃｔ  ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｄｓＲＮＡ  ｍｉｍｅｔｉｃｓ  ｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅｓ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ＩＦＮ−β  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｃａｐａｂｌｅ  ｏｆ  ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ  ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ  ｃｅｌｌ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ，Ｅｕｒ．  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３，ｖｏｌ．４３，ｐｐ．１８４９−１８６１）。
【０００８】
ポリＩＣ複合体は、ヒトにおける有効なＩＦＮ誘導物質であるが、その毒性が癌患者での使用を制限する（Ｋｒｏｗｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｈａｓｅ  Ｉ  ｔｒｉａｌｓ  ｏｆ  ｐｏｌｙ（Ｉ，Ｃ）ｃｏｍｐｌｅｘｅｓ  ｉｎ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｃａｎｃｅｒ  Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｒｅｓｐｏｎｓｅ  Ｍｏｄ．１９８５，ｖｏｌ．４（６），ｐｐ．６４０−６４９）。ＥＧＦＲ過剰発現細胞にポリＩＣを特異的に導入するために、ポリエチレンイミン（２５ｋＤａ）、ポリエチレングリコールおよびマウスＥＧＦの複合体が利用されている（Ｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＧＦ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ  ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄｅｄ  ＲＮＡ  ｅｌｉｍｉｎａｔｅｓ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ，  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ，ａｎｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｍｉｃｅ，ＰＬｏＳ  Ｍｅｄ．２００６，ｖｏｌ．３（１），ｐ．ｅ６）。
【０００９】
しかしながら、ＲＮＡを腫瘍細胞に選択的に送達することができる、効率的で忍容性の高い癌治療薬および担体に対する必要性は依然として高い。
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインおよびセツキシマブ抗体を含む組換えタンパク質に関する。
【００１１】
第２の態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質およびｄｓＲＮＡを含む複合体に関する。
【００１２】
さらなる態様において、本発明は、本発明の組換えタンパク質または複合体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。
【００１３】
さらなる態様では、本発明は、癌の治療に使用するための本発明の組換えタンパク質、複合体または薬学的組成物に関し、前記癌は、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする。
【００１４】
さらなる態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸配列に関する。
【００１５】
本発明者らは、二本鎖ＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）に結合したセツキシマブ抗体を含む組換えタンパク質を開発した。本発明の組換えタンパク質は、セツキシマブ抗体を介してＥＧＦＲに結合することができ、したがって、Ｆｃ媒介効果などの抗体依存性細胞効果を媒介する。セツキシマブ抗体は細胞外ドメインに結合するため、ＥＧＦＲ下流のシグナル伝達を阻害し、受容体の内在化とダウンレギュレーションを誘導し、抗体依存性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を媒介する。しかしながら、これは、本発明の組換えタンパク質におけるセツキシマブの唯一の効果ではない。
【００１６】
本発明の組換えタンパク質は、ＥＧＦＲを過剰発現する腫瘍細胞にポリＩＣなどのｄｓＲＮＡを選択的に送達することができ、したがって、細胞毒性、アポトーシスおよび免疫細胞の動員などのｄｓＲＮＡを介する抗癌作用を誘導するだけでなく、いわゆる「バイスタンダー効果（ｂｙｓｔａｎｄｅｒ  ｅｆｆｅｃｔ）」、すなわち、ＥＧＦＲを発現しない近くの癌細胞が、標的ｄｓＲＮＡの効果によって殺傷される。
【００１７】
組換えタンパク質に含まれるセツキシマブ抗体はＥＧＦＲを標的とするため、癌細胞におけるＥＧＦＲの過剰発現を利用して、細胞傷害性ｄｓＲＮＡ分子を癌細胞に選択的に送達し、これらの細胞へのｄｓＲＮＡの選択的取り込みを誘導する。これにより、副作用が軽減され、免疫応答が癌細胞に選択的に誘導される。
【００１８】
さらに、セツキシマブ抗体に対する応答は、ＴＬＲ３を活性化するポリＩＣなどのｄｓＲＮＡによって強化される。したがって、ポリＩＣなどのｄｓＲＮＡは、セツキシマブ抗体ベースの抗癌レジメンの効力を相乗的に改善するための効果的な手段を提供する。
【００１９】
さらに、本発明の組換えタンパク質は、正確に定義されており、低コストで簡単に製造できるため、化学的ベクター（ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｖｅｃｔｏｒ）よりも有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１Ａ】（Ａ）セツキシマブ、（Ｂ）セツキシマブ−ＬＣ−ＤＳＲＢＤ（セツキシマブの軽鎖（ＬＣ）のＮ末端に付着したＤＳＲＢＤ）、（Ｃ）セツキシマブ−ＨＣ−ＤＳＲＢＤ（セツキシマブの重鎖（ＨＣ）のＣ末端に付着したＤＳＲＢＤ）の概略図
【図１Ｂ】（Ａ）セツキシマブ、（Ｂ）セツキシマブ−ＬＣ−ＤＳＲＢＤ（セツキシマブの軽鎖（ＬＣ）のＮ末端に付着したＤＳＲＢＤ）、（Ｃ）セツキシマブ−ＨＣ−ＤＳＲＢＤ（セツキシマブの重鎖（ＨＣ）のＣ末端に付着したＤＳＲＢＤ）の概略図
【図１Ｃ】（Ａ）セツキシマブ、（Ｂ）セツキシマブ−ＬＣ−ＤＳＲＢＤ（セツキシマブの軽鎖（ＬＣ）のＮ末端に付着したＤＳＲＢＤ）、（Ｃ）セツキシマブ−ＨＣ−ＤＳＲＢＤ（セツキシマブの重鎖（ＨＣ）のＣ末端に付着したＤＳＲＢＤ）の概略図
【図２】セツキシマブ抗体の重鎖と軽鎖をコードする遺伝子と、スクリーニング可能なマーカーとして使用される赤い蛍光タンパク質であるＤＳＲＥＤを発現する遺伝子とを含むセツキシマブ−ＤＳＲＥＤ  ＰＵＣ５７ベクターの設計。これらの遺伝子は、タバコに対してコドン最適化された。重鎖と軽鎖はそれぞれＲＵＢＩＳＣＯの小さなサブユニットプロモーターとターミネーターに隣接し、それぞれが植物細胞原形質膜の外側の空間であるアポプラストにそれらを導くシグナルペプチドを含んでいる。ＤＳＲＥＤ遺伝子は、ＣＡＭＶ３５Ｓプロモーターとターミネーターに隣接している。各発現ユニットを取り囲んでいるのが、マトリックス付着領域（ＭＡＲ）であり、図中、標識化ＣＨＮ  Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６、およびＲＢ７で、これらは、遺伝子発現を増強することが示されている。
【図３】ゴールデンゲートアセンブリに成功した後のセツキシマブ重鎖および軽鎖とスクリーニング可能なマーカーＤＳＲＥＤをコードする中間ベクターＰＵＣ５７。
【図４Ａ】ＰＵＣ５７のセツキシマブ−軽鎖−ＤＳＲＢＤ−ＤＳＲＥＤ（Ａ）、ＰＵＣ５７のセツキシマブ−重鎖−ＤＳＲＢＤ−ＤＳＲＥＤ（Ｂ）。
【図４Ｂ】ＰＵＣ５７のセツキシマブ−軽鎖−ＤＳＲＢＤ−ＤＳＲＥＤ（Ａ）、ＰＵＣ５７のセツキシマブ−重鎖−ＤＳＲＢＤ−ＤＳＲＥＤ（Ｂ）。
【図５】植物形質転換のためのバイナリーアグロバクテリウム発現ベクターＰＢＩＮＰＬＵＳのマップ。
【図６】抗ヒトＩＧＧ  ＨＲＰ抗体を使用する、選択したセツキシマブ発現タバコのウエスタンブロット。約５０ＫＤＡと約２５ＫＤＡのバンドは、それぞれ重鎖と軽鎖を表す。比較のために、１００ＮＧの市販のセツキシマブを実行した。野生型（ＷＴ）植物のサンプルを対照として使用した。発明の詳細な説明
【図７Ａ】抗ヒトＩＧＧ  ＨＲＰ抗体（Ａ）とマウス抗ヒトＰＫＲ、続いて抗マウスＩＧＧ抗体（Ｂ）を使用する、選択したセツキシマブ−ＬＣ−ＤＳＲＢＤ発現タバコのウエスタンブロット。約５０ＫＤＡおよび約４５ＫＤＡのバンドは、それぞれ重鎖および軽鎖のＤＳＲＢＤを表す。
【図７Ｂ】抗ヒトＩＧＧ  ＨＲＰ抗体（Ａ）とマウス抗ヒトＰＫＲ、続いて抗マウスＩＧＧ抗体（Ｂ）を使用する、選択したセツキシマブ−ＬＣ−ＤＳＲＢＤ発現タバコのウエスタンブロット。約５０ＫＤＡおよび約４５ＫＤＡのバンドは、それぞれ重鎖および軽鎖のＤＳＲＢＤを表す。
【図８Ａ】抗ヒトＩＧＧ  ＨＲＰ抗体（Ａ）とマウス抗ヒトＰＫＲ、続いて抗マウスＩＧＧ抗体（Ｂ）を使用する、選択したセツキシマブ−ＨＣＤＳＲＢＤ発現タバコのウエスタンブロット。約７５ＫＤＡおよび約２５ＫＤＡのバンドは、それぞれ重鎖−ＤＳＲＢＤおよび軽鎖を表す。
【図８Ｂ】抗ヒトＩＧＧ  ＨＲＰ抗体（Ａ）とマウス抗ヒトＰＫＲ、続いて抗マウスＩＧＧ抗体（Ｂ）を使用する、選択したセツキシマブ−ＨＣＤＳＲＢＤ発現タバコのウエスタンブロット。約７５ＫＤＡおよび約２５ＫＤＡのバンドは、それぞれ重鎖−ＤＳＲＢＤおよび軽鎖を表す。
【図９】プロテインＡビーズ精製のウエスタンブロットの結果。セツキシマブ（Ａ）、セツキシマブ−ＬＣ−ＤＳＲＢＤ（Ｂ）、およびセツキシマブ−ＨＣ−ＤＳＲＢＤ（Ｃ）の各精製試行に対して、精製前のライセート、非結合タンパク質、結合タンパク質（溶出前のビーズ）および溶出したタンパク質から実行させた。抗ヒトＩＧＧ−ＨＲＰ抗体を使用してブロットを検出した。セツキシマブ−ＤＳＲＢＤキメラに対しては、マウス抗ＰＫＲ、続いて抗マウスＨＲＰ抗体も検出に使用された（ＢおよびＣの右側の区画）。
【図１０Ａ】植物由来のセツキシマブのプロテインＡ精製クロマトグラフィー。溶出ピークは８７〜９０ＭＬ（Ｘ軸）に観察された（Ａ）。選択した画分試料のクーマシー染色、タンパク質は画分６〜１１（Ｂ）に見られる。抗ヒトＩＧＧ−ＨＲＰ抗体を使用するウエスタンブロット分析では、ライセート（精製前）と溶出画分にセツキシマブ重鎖と軽鎖が示されるが、非結合または洗浄画分には示されない（Ｃ）。
【図１０Ｂ】植物由来のセツキシマブのプロテインＡ精製クロマトグラフィー。溶出ピークは８７〜９０ＭＬ（Ｘ軸）に観察された（Ａ）。選択した画分試料のクーマシー染色、タンパク質は画分６〜１１（Ｂ）に見られる。抗ヒトＩＧＧ−ＨＲＰ抗体を使用するウエスタンブロット分析では、ライセート（精製前）と溶出画分にセツキシマブ重鎖と軽鎖が示されるが、非結合または洗浄画分には示されない（Ｃ）。
【図１０Ｃ】植物由来のセツキシマブのプロテインＡ精製クロマトグラフィー。溶出ピークは８７〜９０ＭＬ（Ｘ軸）に観察された（Ａ）。選択した画分試料のクーマシー染色、タンパク質は画分６〜１１（Ｂ）に見られる。抗ヒトＩＧＧ−ＨＲＰ抗体を使用するウエスタンブロット分析では、ライセート（精製前）と溶出画分にセツキシマブ重鎖と軽鎖が示されるが、非結合または洗浄画分には示されない（Ｃ）。
【図１１Ａ】植物由来のセツキシマブ−ＬＣ−ＤＳＲＢＤのプロテインＡ精製クロマトグラフィー。溶出ピークは８２〜９０ＭＬ（Ｘ軸）で観察された（Ａ）。抗ヒトＩＧＧ−ＨＲＰ抗体を使用するウエスタンブロット分析では、セツキシマブ重鎖の溶出、およびＬＣ−ＤＳＲＢＤではなく元の軽鎖であり得る約２５ＫＤＡのバンドを示す（Ｂ）。
【図１１Ｂ】植物由来のセツキシマブ−ＬＣ−ＤＳＲＢＤのプロテインＡ精製クロマトグラフィー。溶出ピークは８２〜９０ＭＬ（Ｘ軸）で観察された（Ａ）。抗ヒトＩＧＧ−ＨＲＰ抗体を使用するウエスタンブロット分析では、セツキシマブ重鎖の溶出、およびＬＣ−ＤＳＲＢＤではなく元の軽鎖であり得る約２５ＫＤＡのバンドを示す（Ｂ）。
【図１２】市販のセツキシマブ、タバコで発現させたセツキシマブおよびセツキシマブ−ＬＣ−ＤＳＲＢＤの、ＥＧＦＲへの特異的結合。
【００２１】
2021516056.tif 000002
2021516056.tif 000003
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本明細書およびそれに続く特許請求の範囲を通して、文脈が他の意味に解する場合を除いて、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」という単語または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」という単語、ならびに「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）／含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）／含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などの変形は、要素、述べられた整数、ステップ、またはそれらのグループの包含を意味するが、任意の他の要素、述べられた整数、ステップ、またはそれらのグループの除外を意味しないと理解されるべきである。
【００２３】
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明白に他のことを指示しない限り、複数の指示対象を含む。
【００２４】
数値に関連して使用される場合、「約」という用語は、示された数値よりも０〜１０％小さい下限を有し、示された数値よりも０〜１０％大きい上限を有する範囲内の数値を包含することを意味する。
【００２５】
第１の態様では、本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）結合ドメインと、セツキシマブ抗体とを含む組換えタンパク質に関する。
【００２６】
セツキシマブ（Ｅｒｂｉｔｕｘ（登録商標））は、上皮成長因子受容体結合Ｆａｂ（フラグメント、抗原結合）領域を有する。セツキシマブは、ヒトＥＧＦＲのＮ末端部分に特異的な２２５マウスＥＧＦＲモノクローナル抗体のＦｖ（可変、抗原結合）領域と、ヒトＩｇＧ１重鎖およびカッパ軽鎖定常（フレームワーク）領域で構成されている。
【００２７】
セツキシマブ完全抗体には、２つの重鎖と２つの軽鎖とが含まれる。セツキシマブ重鎖および軽鎖配列は、当技術分野で知られている。例えば、セツキシマブ重鎖または軽鎖は、（１）Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｂａｓｉｓ  ｆｏｒ  ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｅｐｉｄｅｒｍａｌ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｙ  Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ，Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  ２００５，ｖｏｌ．  ７，ｐｐ．３０１−３１１、（２）Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｉｃ  Ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｆｏｒｍ  ｏｆ  ａ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｕｍ，Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ  ２００８；ｖｏｌ．８０：ｐｐ．１７３７−１７４５、（３）Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ａｔ  ＨＶＩＧＴ  ｄａｔａｂａｓｅ，ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｖａｉｌａｂｌｅ  ｏｎｌｉｎｅ  ａｔ  ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝７９０６、（４）Ａｙｏｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｒｒｅｃｔ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ  ａｎｄ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｇｌｙｃｏ−ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ｂｙ  ａ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｉｎｔａｃｔ，ｍｉｄｄｌｅ−ｕｐ，ｍｉｄｄｌｅ−ｄｏｗｎ  ａｎｄ  ｂｏｔｔｏｍ−ｕｐ  ＥＳＩ  ａｎｄ  ＭＡＬＤＩ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓｍ，Ａｂｓ  ２０１３，ｖｏｌ．５（５），ｐｐ．６９９−７１０（補足資料を含む）、または（５）Ｃｅｔｕｘｉｍａｂ  ａｔ  ＤｒｕｇＢａｎｋ  （ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ００００２）のいずれかに開示されたセツキシマブ重鎖配列またはセツキシマブ軽鎖配列を有することができ、これらのそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００２８】
最も好ましくは、セツキシマブ重鎖（ＣＴＸ−ＨＣ）は、配列番号１の以下の配列を有する：
ＱＶＱＬＫＱＳＧＰＧＬＶＱＰＳＱＳＬＳＩＴＣＴＶＳＧＦＳＬＴＮＹＧＶＨＷＶＲＱＳＰＧＫＧＬＥＷＬＧＶＩＷＳＧＧＮＴＤＹＮＴＰＦＴＳＲＬＳＩＮＫＤＮＳＫＳＱＶＦＦＫＭＮＳＬＱＳＮＤＴＡＩＹＹＣＡＲＡＬＴＹＹＤＹＥＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡＡＳＴＫＧＰＳＶＦＰＬＡＰＳＳＫＳＴＳＧＧＴＡＡＬＧＣＬＶＫＤＹＦＰＥＰＶＴＶＳＷＮＳＧＡＬＴＳＧＶＨＴＦＰＡＶＬＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＴＶＰＳＳＳＬＧＴＱＴＹＩＣＮＶＮＨＫＰＳＮＴＫＶＤＫＫＶＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
【００２９】
最も好ましくは、セツキシマブ軽鎖（ＣＴＸ−ＬＣ）は、配列番号２の以下の配列を有する：
ＤＩＬＬＴＱＳＰＶＩＬＳＶＳＰＧＥＲＶＳＦＳＣＲＡＳＱＳＩＧＴＮＩＨＷＹＱＱＲＴＮＧＳＰＲＬＬＩＫＹＡＳＥＳＩＳＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＳＩＮＳＶＥＳＥＤＩＡＤＹＹＣＱＱＮＮＮＷＰＴＴＦＧＡＧＴＫＬＥＬＫＲＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
【００３０】
本明細書で使用される場合、「セツキシマブ抗体」という用語は、ＥＧＦＲを認識して特異的に結合し、セツキシマブの配列、好ましくは配列番号１または配列番号２と、少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有する重鎖ドメインおよび軽鎖可変ドメインを有する、セツキシマブおよび任意の抗体または抗体フラグメントを包含する。本明細書で使用される場合、「セツキシマブ抗体」またはセツキシマブという用語はまた、ＥＧＦＲを認識して特異的に結合し、セツキシマブの配列、好ましくは配列番号１または配列番号２とそれぞれ、少なくとも８０％の同一性（例えば、少なくとも８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の同一性）を有する重鎖ドメインまたは軽鎖ドメインを有する任意の抗体または抗体フラグメントも包含する。
【００３１】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、従来技術で定義されているセツキシマブである。好ましくは、セツキシマブ抗体は、（１）前掲文献Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００５中に（２）前掲文献Ｄｕｂｏｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００８中に、（３）ＨＶＩＧＴデータベース、ｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ／３Ｄｓｔｒｕｃｔｕｒｅ−ＤＢ／ｃｇｉ／ｄｅｔａｉｌｓ．ｃｇｉ？ｐｄｂｃｏｄｅ＝７９０６のセツキシマブに、（４）前掲文献Ａｙｏｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３中に、または（５）ＤｒｕｇＢａｎｋのセツキシマブ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ００００２）に定義されるセツキシマブである。
【００３２】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブ重鎖またはセツキシマブ軽鎖を含む抗体を指す。別の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブ重鎖およびセツキシマブ軽鎖を含む抗体を指す。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する重鎖を含む。
【００３３】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号２の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の同一性を有する軽鎖を含む。
【００３４】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖を含む。別の実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖を含む。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖を含み、かつセツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖を含む。
【００３５】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する２つの重鎖および配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する２つの軽鎖を含む。
【００３６】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖からなる。別の実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する重鎖および配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも８０％の同一性を有する２つの重鎖および配列番号２と少なくとも８０％の同一性を有する２つの軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖を含む。別の実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖を含む。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖を含み、かつセツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖を含む。
【００３７】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する２つの重鎖および配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する２つの軽鎖を含む。
【００３８】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖からなる。別の実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する重鎖および配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９０％の同一性を有する２つの重鎖および配列番号２と少なくとも９０％の同一性を有する２つの軽鎖からなる。
【００３９】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖を含む。別の実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖を含む。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖を含み、かつセツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖を含む。
【００４０】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する２つの重鎖および配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有する２つの軽鎖を含む。
【００４１】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖からなる。別の実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する重鎖および配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有する軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有する２つの重鎖および配列番号２と少なくとも９５％の同一性を有する２つの軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖を含む。別の実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖を含む。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖を含み、かつセツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖を含む。
【００４２】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９９％の同一性を有する２つの重鎖および配列番号２と少なくとも９９％の同一性を有する２つの軽鎖を含む。
【００４３】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖からなる。別の実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９９％の同一性を有する重鎖および配列番号２と少なくとも９９％の同一性を有する軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも９９％の同一性を有する２つの重鎖および配列番号２と少なくとも９９％の同一性を有する２つの軽鎖からなる。
【００４４】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖を含む。別の実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖を含む。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖を含み、かつセツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖を含む。
【００４５】
より好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、両方とも配列番号１の２つの重鎖、および両方とも配列番号２の２つの軽鎖を含む。
【００４６】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖からなる。別の実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号２と少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖および配列番号２と少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖からなる。より好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、両方とも配列番号１の２つの重鎖、および両方とも配列番号２の２つの軽鎖からなる。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブ完全抗体またはセツキシマブ抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ”、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖまたは単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）である。高レベルのＦｃ媒介効果をもたらすため、セツキシマブ完全抗体がより好ましい。
【００４７】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、単一特異性抗体または二重特異性抗体などの多特異性抗体である。より好ましくは、セツキシマブ抗体は単一特異性抗体である。
【００４８】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、少なくとも１つの軽鎖および少なくとも１つの重鎖を含む。好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、２つの軽鎖および２つの重鎖を含む。
【００４９】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、（ｉ）両方とも配列番号１の２つの重鎖、および両方とも配列番号２の２つの軽鎖、または（ｉｉ）配列番号１の１つの重鎖、および配列番号２の１つの軽鎖を含む。より好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、両方とも配列番号１の２つの重鎖、および両方とも配列番号２の２つの軽鎖を含む。
【００５０】
好ましい実施形態では、本発明の組換えタンパク質のｄｓＲＢＤは、セツキシマブ抗体の軽鎖のＮ末端に結合される（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）か、またはｄｓＲＢＤは、セツキシマブ抗体の重鎖のＣ末端に結合される（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）。特定の好ましい実施形態では、本発明の組換えタンパク質のｄｓＲＢＤは、セツキシマブ抗体の軽鎖のＮ末端に結合される（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）。別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、セツキシマブ抗体の重鎖のＣ末端に結合される（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）。
【００５１】
本明細書で使用される「軽鎖のＮ末端」という用語は、好ましくは、軽鎖のＮ末端のアミノ酸１〜２４を指す。好ましくは、軽鎖のＮ末端は、軽鎖の最初のＮ末端アミノ酸を指す。より好ましくは、軽鎖のＮ末端は、軽鎖の最初のＮ末端アミノ酸のアミン基を指す。最も好ましくは、軽鎖のＮ末端は、軽鎖の最初のＮ末端アミノ酸のアルファ炭素原子に連結されたアミン基を指す。
【００５２】
本明細書で使用される場合、「重鎖のＣ末端」という用語は、重鎖のアミノ酸位置４１６から最後のアミノ酸までの範囲のアミノ酸を指す。好ましくは、軽鎖のＮ末端は、重鎖の最後のＣ末端アミノ酸を指す。より好ましくは、重鎖のＣ末端は、重鎖の最後のＣ末端アミノ酸のカルボキシル基を指す。さらにより好ましくは、重鎖のＣ末端は、重鎖の最後のＣ末端アミノ酸のアルファ炭素原子に連結されたカルボキシル基を指す。
【００５３】
これらの付着部位により、本発明の組換えタンパク質に含まれるｄｓＲＢＤは、セツキシマブ抗体のプロテインＡ結合を妨害せず、したがって組換えタンパク質の効率的な精製プロセスを可能にする（実施例を参照）。
【００５４】
これらの特定の付着部位に関するデータに基づいて、ｄｓＲＢＤも組換えタンパク質のＥＧＦＲへの結合を妨害せず、インビボでＦｃ媒介免疫応答が誘導されることが示すことができた。
【００５５】
ＥＬＩＳＡ（実施例を参照）により、セツキシマブ抗体の軽鎖のＮ末端に結合したｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）を含む本発明の組換えタンパク質が、その受容体ＥＧＦＲに結合することができ、したがって生物学的に活性であるという証拠を提供できる。セツキシマブ抗体のコンフォメーションとフォールディングは、融合したｄｓＲＢＤによって損なわれない。
【００５６】
本発明の組換えタンパク質のｄｓＲＢＤがセツキシマブ抗体の軽鎖のＮ末端に結合している（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）状態では、セツキシマブのＦｃ領域はプロテインＡでの精製だけでなく、治療によって引き起こされる抗腫瘍免疫応答の重要な要素である、抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）に利用可能である。
【００５７】
特定の好ましい実施形態では、本発明の組換えタンパク質のｄｓＲＢＤは、セツキシマブ抗体の軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖および配列番号２と少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖からなる。
【００５８】
特定の好ましい実施形態では、本発明の組換えタンパク質のｄｓＲＢＤは、セツキシマブ抗体の重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖および配列番号２と少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖からなる。
【００５９】
好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤおよびセツキシマブ抗体は共有結合される。
【００６０】
さらに好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤおよびセツキシマブ抗体は、スペーサーペプチドを介して共有結合される。好ましくは、前記スペーサーペプチドは、フレキシブルなスペーサーペプチドである。好ましい実施形態では、前記スペーサーペプチドは、少なくとも１５アミノ酸のオリゴペプチドであり、前記少なくとも１５アミノ酸は、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＬｙｓおよびＧｌｕからなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、前記スペーサーペプチドは、Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＬｙｓおよびＧｌｕからなる群から選択されるアミノ酸を含む少なくとも１５アミノ酸のオリゴペプチドである。
【００６１】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）および前記セツキシマブ抗体は、グリシン−セリンスペーサーペプチドを介して共有結合される。好ましくは、前記グリシン−セリンスペーサーペプチドは、ペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎを含む。好ましい実施形態では、前記ｎは、好ましくは１、２、３または４である。より好ましくは、前記ｎは３であり、すなわち、前記スペーサーペプチドはペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含む。前記スペーサーは、ａ）ＥＧＦＲへのセツキシマブ抗体の結合も、ｂ）ｄｓＲＮＡまたはポリＩＣへのｄｓＲＢＤの結合も妨害しない。
【００６２】
別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の軽鎖に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の重鎖に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の軽鎖に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の重鎖に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する。
【００６３】
別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する。さらに好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する。
【００６４】
別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖および配列番号２と少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖からなる。
【００６５】
別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、セツキシマブ抗体は、配列番号１と少なくとも１００％の同一性を有する重鎖および配列番号２と少なくとも１００％の同一性を有する軽鎖からなる。
【００６６】
別の好ましい実施形態では、組換えタンパク質の前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、１つ以上の二本鎖ＲＮＡ結合モチーフ（ｄｓＲＢｍ）を含む。好ましくは、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、２つのｄｓＲＢｍを含む。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、両方がα−β−β−β−αフォールドを有する２つのタンデム連結されたｄｓＲＮＡ結合モチーフ（ｄｓＲＢｍ）を含む。
【００６７】
好ましくは、ｄｓＲＢＤはヒトｄｓＲＢＤであり、すなわち、それはヒトタンパク質に由来する。したがって、例えば、免疫原性は最小化される。
【００６８】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、約３０ｂｐ〜約８０ｂｐの長さを有するｄｓＲＮＡに結合することができる。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、配列非依存性の様式でｄｓＲＮＡに結合する。
【００６９】
別の好ましい実施形態では、前記１つ以上のｄｓＲＢｍは、ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、ＴＲＢＰ、ＰＡＣＴ、スタウフェン（Ｓｔａｕｆｅｎ）、ＮＦＡＲ１、ＮＦＡＲＺ、ＳＰＮＲ、ＲＨＡおよびＮＲＥＢＰのｄｓＲＢｍから選択される。別の好ましい実施形態では、前記１つ以上のｄｓＲＢｍのうちの少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、好ましくはヒトＰＫＲ（ｈＰＫＲ）のアミノ酸配列である。別の好ましい実施形態では、前記１つ以上のｄｓＲＢｍのうちの少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、好ましくはヒトＰＫＲ（ｈＰＫＲ）のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、前記１つ以上のｄｓＲＢｍのうちの少なくとも１つは、ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）、好ましくはヒトＰＫＲ（ｈＰＫＲ）のｄｓＲＢｍである。
【００７０】
本明細書で使用する場合、ｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＲ）という用語（ｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ、プロテインキナーゼＲ（ＰＫＲ）、インターフェロン誘導ｄｓＲＮＡ活性化プロテインキナーゼ、または真核生物翻訳開始因子２−アルファキナーゼ２（ＥＩＦ２ＡＫ２）とも呼ばれる）は、Ｅｉｆ２ａｋ２遺伝子によってコードされる酵素を指す。本明細書で使用する場合、ヒトｄｓＲＮＡ依存性プロテインキナーゼ（ｈＰＫＲ）という用語は、遺伝子またはタンパク質データベース（例えばＮＣＢＩ遺伝子ＩＤ：５６１０、ＵｎｉＰｒｏｔ  Ｐ１９５２５）で言及されているアイソフォームをコードする転写変異体を含む、ヒトＥｉｆ２ａｋ２遺伝子によってコードされる酵素を指す。
【００７１】
別の好ましい実施形態では、前記１つ以上のｄｓＲＢｍのそれぞれは、ＰＫＲ、好ましくはヒトＰＫＲ（ｈＰＫＲ）のアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、前記１つ以上のｄｓＲＢｍのそれぞれは、ＰＫＲ、好ましくはヒトＰＫＲ（ｈＰＫＲ）のアミノ酸配列である。別の好ましい実施形態では、前記１つ以上のｄｓＲＢｍのそれぞれは、ＰＫＲ、好ましくはヒトＰＫＲ（ｈＰＫＲ）のｄｓＲＢｍである。
【００７２】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、少なくとも１つのｄｓＲＢｍは、ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲのアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、２つのｄｓＲＢｍを含み、少なくとも１つのｄｓＲＢｍは、ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲのアミノ酸配列である。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、２つのｄｓＲＢｍを含み、少なくとも１つのｄｓＲＢｍは、ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲのｄｓＲＢｍである。
【００７３】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、２つのｄｓＲＢｍを含み、両方のｄｓＲＢｍは、ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲのアミノ酸配列を含む。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、２つのｄｓＲＢｍを含み、両方のｄｓＲＢｍは、ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲのアミノ酸配列である。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、２つのｄｓＲＢｍを含み、両方のｄｓＲＢｍは、ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲのｄｓＲＢｍである。
【００７４】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤおよび前記セツキシマブ抗体は、スペーサーペプチドを介して共有結合され、前記スペーサーペプチドは、ペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）を含み、式中、ｎは、１、２、３または４、好ましくは３であり、前記ｄｓＲＢＤは、２つのｄｓＲＢｍを含み、両方のｄｓＲＢｍは、ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲのｄｓＲＢｍである。別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ抗体の重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、かつ前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、両方のｄｓＲＢｍはＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲのｄｓＲＢｍである。
【００７５】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲのアミノ酸残基６〜１６９を含む。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲのアミノ酸残基６〜１６９からなる。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、全長ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲを含む。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、全長ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲからなる。
【００７６】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、ｈＰＫＲのアミノ酸残基６〜１６９を含み、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、ＰＫＲのアミノ酸残基６〜１６９からなり、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、全長ｈＰＫＲを含み、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、全長ｈＰＫＲからなり、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。
【００７７】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１９７または１〜１６９を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１９７または１〜１６９からなる。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６９を含む。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６９からなる。
【００７８】
特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１９７または１〜１６９を含み、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸に交換されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１９７または１〜１６９からなり、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６９を含み、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６９からなり、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。
【００７９】
非常に好ましい特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８からなり、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。非常に好ましい特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸に交換されている。
【００８０】
非常に好ましい特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、前記アミノ酸残基の少なくとも８０％が保存されており、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログには、前記アミノ酸残基の少なくとも８０％が保存されており、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０、およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。
【００８１】
非常に好ましい特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログのアミノ酸残基１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログのアミノ酸残基１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。
【００８２】
非常に好ましい特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、前記アミノ酸残基の少なくとも８０％が保存されており、前記ホモログには、前記アミノ酸残基の少なくとも８０％が保存されており、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログには、前記アミノ酸残基の少なくとも８０％が保存されており、前記ホモログには、前記アミノ酸残基の少なくとも８０％が保存されており、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。
【００８３】
好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。
【００８４】
好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。
【００８５】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ１）は、ｈＰＫＲの残基６〜７９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、かつ他方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ２）は、ｈＰＫＲの残基９６〜１６９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１およびＫ６４は、ｄｓＲＢｍ１のホモログに保存されており、かつＦ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４は、ｄｓＲＢｍ２のホモログに保存されている。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ１）は、ｈＰＫＲの残基６〜７９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、かつ他方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ２）は、ｈＰＫＲの残基９６〜１６８のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１およびＫ６４は、ｄｓＲＢｍ１のホモログに保存されており、かつＦ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４は、ｄｓＲＢｍ２のホモログで保存されており、かつ１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸に交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。
【００８６】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ１）は、ｈＰＫＲの残基６〜７９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、かつ他方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ２）は、ｈＰＫＲの残基９６〜１６９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１およびＫ６４は、ｄｓＲＢｍ１のホモログに保存されており、かつＹ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４はｄｓＲＢｍ２のホモログに保存されている。
【００８７】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ１）は、ｈＰＫＲの残基６〜７９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、かつ他方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ２）は、ｈＰＫＲの残基９６〜１６９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１およびＫ６４は、ｄｓＲＢｍ１のホモログに保存されており、かつＹ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４は、ｄｓＲＢｍ２のホモログに保存されており、かつ１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸に交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニンまたはバリンである。
【００８８】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ１）は、ｈＰＫＲの残基６〜７９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、かつ他方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ２）は、ｈＰＫＲの残基９６〜１６９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、アミノ酸残基１〜２４、３９〜５０および５８〜６９は、ｄｓＲＢｍ１のホモログに保存されており、かつＹ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４は、ｄｓＲＢｍ２のホモログに保存されている。
【００８９】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ１）は、ｈＰＫＲの残基６〜７９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、かつ他方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ２）は、ｈＰＫＲの残基９６〜１６９のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、アミノ酸残基１〜２４、３９〜５０および５８〜６９は、ｄｓＲＢｍ１のホモログに保存されており、かつＹ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４は、ｄｓＲＢｍ２のホモログに保存されており、かつ１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニンまたはバリンである。
【００９０】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍはｈＰＫＲの残基６〜７９のアミノ酸配列からなり、かつ他方のｄｓＲＢｍはｈＰＫＲの残基９６〜１６９のアミノ酸配列からなる。
【００９１】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍはｈＰＫＲの残基６〜７９のアミノ酸配列からなり、かつ他方のｄｓＲＢｍはｈＰＫＲの残基９６〜１６９のアミノ酸配列からなり、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニンまたはバリンである。
【００９２】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ１）は、配列番号５のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、かつ他方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ２）は、配列番号６のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１およびＫ６４は、ｄｓＲＢｍ１のホモログに保存されており、かつＦ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４は、ｄｓＲＢｍ２のホモログで保存されている。
【００９３】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ１）は、配列番号５のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、かつ他方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ２）は、配列番号６のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１およびＫ６４は、ｄｓＲＢｍ１のホモログに保存されており、かつＹ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０、Ｋ１５４は、ｄｓＲＢｍ２のホモログに保存されている。
【００９４】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ１）は、配列番号５のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、かつ他方のｄｓＲＢｍ（ｄｓＲＢｍ２）は、配列番号６のアミノ酸配列またはそのホモログからなり、アミノ酸残基１〜２４、３９〜５０および５８〜６９は、ｄｓＲＢｍ１のホモログに保存されており、かつＹ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４は、ｄｓＲＢｍ２のホモログに保存されている。
【００９５】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは２つのｄｓＲＢｍを含み、一方のｄｓＲＢｍは配列番号５のアミノ酸配列からなり、かつ他方のｄｓＲＢｍは配列番号６のアミノ酸配列からなる。
【００９６】
配列番号５は、ＬＳＡＧＦ−ＦＭＥＥＬＮＴＹＲＱ−ＫＱＧＶＶＬＫＹＱＥ−ＬＰＮＳＧＰＰＨＤＲ−ＲＦＴＦＱＶＩＩＤＧ−ＲＥＦＰＥＧＥＧＲＳ−ＫＫＥＡＫＮＡＡＡＫ−ＬＡＶＥＩＬＮＫＥの配列を有する。
【００９７】
配列番号６は、ＬＳＭＧ−ＮＹＩＧＬＩＮＲＩＡ−ＱＫＫＲＬＴＶＮＹＥ−ＱＶＡＳＧＶＨＧＰＥ−ＧＦＨＹＫＶＫＭＧＱ−ＫＥＹＳＩＧＴＧＳＴ−ＫＱＥＡＫＱＬＡＡＫ−ＬＡＹＬＱＩＬＳＥの配列を有する。
【００９８】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、２つのｄｓＲＢｍを含み、前記ｄｓＲＢｍは、１５〜２５、好ましくは１６〜２０アミノ酸からなるリンカーを介して連結される。別の好ましい実施形態では、前記リンカーは、ＰＫＲ、好ましくはｈＰＫＲの残基８０〜９５からなる。別の好ましい実施形態では、前記リンカーは、配列番号７のアミノ酸配列からなる。配列番号７は、ＫＫＡＶＳＰＬＬＬＴＴＴＮＳＳＥＧの配列を有する。
【００９９】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、配列番号８の配列を有する。配列番号８は、ＭＭＡＧＤＬＳＡＧＦＦＭＥＥＬＮＴＹＲＱＫＱＧＶＶ  ＬＫＹＱＥＬＰＮＳＧＰＰＨＤＲＲＦＴＦＱＶＩＩＤＧＲＥＦＰＥＧＥＧＲＳＫＫＥＡＫＮＡＡＡＫＬＡＶＥＩＬＮＫＥＫＫＡＶＳＰＬＬＬＴＴＴＮＳＳＥＧＬＳＭＧＮＹＩＧＬＩＮＲＩＡＱＫＫＲＬＴＶＮＹＥＱＶＡＳＧＶＨＧＰＥＧＦＨＹＫＶＫＭＧＱＫＥＹＳＩＧＴＧＳＴＫＱＥＡＫＱＬＡＡＫＬＡＹＬＱＩＬＳＥの配列を有する。
【０１００】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤおよび前記セツキシマブはスペーサーペプチドを介して共有結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、ペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８からなり、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブ（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）の重鎖のＣ末端に結合されており、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸に交換されている。
【０１０１】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤおよび前記セツキシマブはスペーサーペプチドを介して共有結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸に交換されている。好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。
【０１０２】
別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、またはｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４は保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。
【０１０３】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤおよび前記セツキシマブはスペーサーペプチドを介して共有結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログの１−２４、３９−５０および５８−６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、スペーサーペプチドを介してセツキシマの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、ペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログの１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されている。特定の実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログの１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。
【０１０４】
別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログの１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換される。好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。
【０１０５】
好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。
【０１０６】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤおよび前記セツキシマブはスペーサーペプチドを介して共有結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＢＤが配列番号８の配列を有する。
【０１０７】
別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、かつ前記ｄｓＲＢＤが配列番号８の配列を有する。
【０１０８】
別の好ましい実施形態では、本発明の組換えタンパク質は、細胞溶解性ペプチドをさらに含む。好ましくは、前記細胞溶解性ペプチドは、メリチンまたはカンジダリジン（Ｃａｎｄｉｄａｌｙｓｉｎ）である。別の好ましい実施形態では、前記細胞溶解性ペプチドは、スペーサーペプチド内または組換えタンパク質のＮ末端に配置される。
【０１０９】
別の好ましい実施形態では、組換えタンパク質は、精製目的で、Ｈｉｓ６タグなどの精製タグをさらに含み得る。好ましくは、組換えタンパク質は、組換えタンパク質の製造プロセスから残っている汚染ｄｓＲＮＡを含まない。
【０１１０】
別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介して、配列番号１を有するセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介して、配列番号２を有するセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、前記ｄｓＲＢＤは、配列番号８の配列を有する。
【０１１１】
別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介して、配列番号１を有するセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する。別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介して、配列番号２を有するセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、前記ｄｓＲＢＤは配列番号８の配列を有する。
【０１１２】
本発明の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して、（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。本発明の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して、（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ重鎖のＣ末端に結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。さらに好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８からなり、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。
【０１１３】
本発明の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０、およびＫ１５４は保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。
【０１１４】
本発明の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログの１〜２４、３９〜５０および５８−６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して前記セツキシマブ重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０、およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。さらに好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログでは、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸に交換されている。本発明の好ましい実施形態において、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して前記セツキシマブ重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログの１〜２４、３９〜５０および５８−６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸に交換されている。さらに好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログ１〜２４、３９〜５０および５８〜６９では、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。
【０１１６】
本発明の別の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＢＤを含み、ｄｓＲＢＤは、配列番号８のものであり、かつスペーサーペプチドを介して（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合され、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する。本発明の別の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１のセツキシマブ重鎖および配列番号２のセツキシマブ軽鎖ならびにｄｓＲＢＤを含み、ｄｓＲＢＤは配列番号８のものであり、かつスペーサーペプチドを介して（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合され、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する。
【０１１７】
本発明の別の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＢＤを含み、ｄｓＲＢＤは、配列番号８のものであり、かつスペーサーペプチドを介して（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ重鎖のＣ末端に結合され、前記スペーサーペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を有する。本発明の別の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１のセツキシマブ重鎖および配列番号２のセツキシマブ軽鎖ならびにｄｓＲＢＤを含み、ｄｓＲＢＤは配列番号８のものであり、かつスペーサーペプチドを介して（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ重鎖のＣ末端に結合され、前記スペーサーペプチドが、配列番号４のアミノ酸配列を有する。
【０１１８】
別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、スペーサーペプチドを介して配列番号１を有するセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、アポプラストシグナルペプチドは、このｄｓＲＢＤのＮ末端に結合されているか、または、ｄｓＲＢＤは、スペーサーペプチドを介して配列番号２を有するセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、前記ｄｓＲＢＤは配列番号８の配列を有し、アポプラストシグナルペプチドはセツキシマブの重鎖のＮ末端に結合されている。
【０１１９】
別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介して、配列番号１を有するセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、アポプラストシグナルペプチドは、ｄｓＲＢＤのＮ末端に結合されている。別の好ましい実施形態では、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介して、配列番号２を有するセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、前記ｄｓＲＢＤは配列番号８の配列を有し、アポプラストシグナルペプチドはセツキシマブの重鎖のＮ末端に結合されている。
【０１２０】
本発明の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して、（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸によって交換されており、かつ第１のアポプラストシグナルペプチドがｄｓＲＢＤのＮ末端に結合され、第２のアポプラストペプチドがセツキシマブ重鎖のＮ末端に結合されている。本発明の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して、（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ重鎖のＣ末端に結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸によって交換されており、かつ第１のアポプラストシグナルペプチドがｄｓＲＢＤのＮ末端に結合されかつ第２のアポプラストペプチドがセツキシマブ重鎖のＮ末端に結合されている。好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは互いに異なる。より好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは異なるエンドグルカナーゼである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは、異なる種からの異なるエンドグルカナーゼである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは、異なるエンドグルカナーゼであり、第１はワタ由来であり、第２はタバコ由来である。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは、異なるエンドグルカナーゼであり、第１は配列番号１６のものであり、第２は配列番号１７のものである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは、異なるエンドグルカナーゼであり、第１は重鎖に付着した配列番号１６のものであり、第２は軽鎖に付着した配列番号１７のものである。
【０１２１】
本発明の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖、ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）、ならびに第１および第２のアポプラストシグナルペプチドを含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されており、前記第１のアポプラストシグナルペプチドがｄｓＲＢＤのＮ末端に結合されておりかつ第２のアポプラストペプチドがセツキシマブ重鎖のＮ末端に結合されている。本発明の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖、ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）、および第１のアポプラストシグナルペプチドを含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ重鎖のＣ末端に結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログ含み、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４は保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されており、前記第１のアポプラストシグナルペプチドがｄｓＲＢＤのＮ末端に結合されておりかつ前記第２のアポプラストペプチドがセツキシマブ重鎖のＮ末端に結合されている。好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは互いに異なる。より好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは異なるエンドグルカナーゼである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは、異なる種からの異なるエンドグルカナーゼである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは異なるエンドグルカナーゼであり、第１はワタ由来であり、第２はタバコ由来である。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは異なるエンドグルカナーゼであり、第１は配列番号１６のものであり、第２は配列番号１７のものである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは異なるエンドグルカナーゼであり、第１は重鎖に付着した配列番号１６のものであり、第２は軽鎖に付着した配列番号１７のものである。本発明の別の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＢＤを含み、ｄｓＲＢＤは配列番号８のものであり、かつスペーサーペプチドを介して（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合しており、前記スペーサーペプチドが配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、かつ第１のアポプラストシグナルペプチドがｄｓＲＢＤのＮ末端に結合されておりかつ第２のアポプラストペプチドがセツキシマブ重鎖のＮ末端に結合されている。本発明の別の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１のセツキシマブ重鎖および配列番号２のセツキシマブ軽鎖ならびにｄｓＲＢＤを含み、ｄｓＲＢＤは配列番号８のものであり、かつスペーサーペプチドを介して、（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）のセツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合されており、前記スペーサーペプチドが配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、かつ第１のアポプラストシグナルペプチドがｄｓＲＢＤのＮ末端に結合されておりかつ第２のアポプラストペプチドが、セツキシマブ重鎖のＮ末端に結合されている。本発明の別の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１のセツキシマブ重鎖および配列番号２のセツキシマブ軽鎖ならびにｄｓＲＢＤを含み、ｄｓＲＢＤは配列番号８のものであり、かつスペーサーペプチドを介して、（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ重鎖のＣ末端に結合されており、前記スペーサーペプチドが配列番号４のアミノ酸配列を有し、かつ第１のアポプラストシグナルペプチドが重鎖のＮ末端に結合されておりかつ第２のアポプラストシグナルペプチドが軽鎖のＮ末端に結合されている。好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは互いに異なる。
【０１２２】
本発明の別の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＢＤを含み、ｄｓＲＢＤは配列番号８のものであり、かつスペーサーペプチドを介して、（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ重鎖のＣ末端に結合されており、前記スペーサーペプチドが配列番号４のアミノ酸配列を有し、かつ第１のアポプラストシグナルペプチドが重鎖のＮ末端に結合されておりかつ第２のアポプラストシグナルペプチドが軽鎖のＮ末端に結合されている。本発明の別の好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体は、配列番号１のセツキシマブ重鎖および配列番号２のセツキシマブ軽鎖ならびにｄｓＲＢＤを含み、ｄｓＲＢＤは配列番号８のものであり、かつスペーサーペプチドを介して、（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）の前記セツキシマブ重鎖のＣ末端に結合されており、前記スペーサーペプチドは配列番号４のアミノ酸配列を有し、かつ第１のアポプラストシグナルペプチドが重鎖のＮ末端に結合されておりかつ第２のアポプラストシグナルペプチドが軽鎖のＮ末端に結合されている。好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは互いに異なる。より好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは、異なるエンドグルカナーゼである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは、異なる種からの異なるエンドグルカナーゼである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは、異なるエンドグルカナーゼであり、第１はワタ由来であり、第２はタバコ由来である。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは、異なるエンドグルカナーゼであり、第１は配列番号１６のものであり、第２は配列番号１７のものである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは、異なるエンドグルカナーゼであり、第１は重鎖に付着した配列番号１６のものであり、第２は軽鎖に付着した配列番号１７のものである。
【０１２３】
好ましくは、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８からなり、１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸に交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。
【０１２４】
好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは互いに異なる。より好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドの一方はタバコのものであり、他方はワタアポプラストペプチドである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドの一方は配列番号１６のものであり、他方は配列番号１７のものである。
【０１２５】
さらなる態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質およびｄｓＲＮＡを含む複合体に関する。
【０１２６】
好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡは、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含む。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡは、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）、ポリ−Ｌ−リジンおよびカルボキシメチルセルロースを有するポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ，Ｃ）−ＬＣ）、およびポリ−Ｌ−リジンを有するポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリ（Ｉ，Ｃ）−Ｌ）からなる群から選択される。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡは、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）である。
【０１２７】
別の好ましい実施形態では、前記ポリＩＣは、各鎖に少なくとも２２個のリボヌクレオチドを含む。好ましくは、前記ポリＩＣは、各鎖に８５〜３００個のリボヌクレオチドを含む。
【０１２８】
別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡは、ポリＩＣ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、および低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）から選択される。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡは、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）に由来する。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡは、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）である。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡは、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）である。
【０１２９】
別の好ましい実施形態では、本発明の前記複合体の前記ｄｓＲＮＡは、発癌前（ｐｒｏ−ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ）核酸に対して向けられた少なくとも１つのｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡを含む。特定の実施形態では、複合体のｄｓＲＮＡは、Ｂｃｌ−ｘｌ、Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、Ｓｔａｔ３、Ｐｋｂ／Ａｋｔなどであるがこれらに限定されない発癌前ｍＲＮＡに対して向けられた少なくとも１つのｓｉＲＮＡ配列を含む。
【０１３０】
別の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡは、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含み、前記ｄｓＲＢＤおよび前記セツキシマブは、スペーサーペプチドを介して共有結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、ペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡは、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含み、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８からなり、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡはポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含み、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸に交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。
【０１３１】
別の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡは、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含み、前記ｄｓＲＢＤおよび前記セツキシマブはスペーサーペプチドを介して共有結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡはポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含み、かつｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡはポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含み、かつｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログには、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡは、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含み、前記ｄｓＲＢＤおよび前記セツキシマブはスペーサーペプチドを介して共有結合され、前記スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログの１−２４、３９−５０および５８−６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤは、スペーサーペプチドを介してセツキシマの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、ペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログの１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されている。別の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡはポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含み、かつｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログの１〜２４、３９−５０および５８−６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸に交換されている。別の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡはポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含み、かつｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログの１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。
【０１３２】
好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。
【０１３３】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡは、ポリイノシン酸−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含むか、好ましくはそのものであり、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸によって交換されている。さらに好ましい実施形態では、ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８からなり、１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。
【０１３４】
本発明の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡは、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含むか、好ましくはそのものであり、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、スペーサーペプチドを介して前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、スペーサーペプチドがペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、かつ前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインはヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログではＦ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインは、ヒトＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログからなり、前記ホモログでは、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４は保存されており、前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。本発明の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡは、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含むか、好ましくはそのものであり、セツキシマブ抗体は、セツキシマブの重鎖および軽鎖ならびにｄｓＲＢＤを含み、ｄｓＲＢＤは配列番号８のものであり、かつスペーサーペプチドを介しての前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する。本発明の好ましい実施形態では、本発明の複合体のｄｓＲＮＡは、ポリイノシン−ポリシチジル酸（ポリＩＣ）を含むか、好ましくはそのものであり、セツキシマブ抗体は、配列番号１のセツキシマブ重鎖および配列番号２のセツキシマブ軽鎖ならびにｄｓＲＢＤを含み、ｄｓＲＢＤは配列番号８のものであり、かつスペーサーペプチドを介しての前記セツキシマブ軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有する。
【０１３５】
別の好ましい実施形態では、本発明の複合体における前記ｄｓＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインと非共有結合的に会合している。別の好ましい実施形態では、本発明の複合体の前記ポリＩＣは、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインと非共有結合的に会合している。別の好ましい実施形態では、本発明の複合体の前記ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡまたはｓｈＲＮＡは、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメインと非共有結合的に会合している。
【０１３６】
別の好ましい実施形態では、本発明の複合体の前記ｄｓＲＢＤおよび前記セツキシマブは、スペーサーペプチドを介して共有結合され、前記スペーサーペプチドが、ペプチド（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３を含み、前記ｄｓＲＢＤは、配列番号８の配列を有し、かつｄｓＲＮＡはポリＩＣである。
【０１３７】
別の好ましい実施形態では、本発明の複合体におけるｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが、配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは前記スペーサーペプチドを介してセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、前記ｄｓＲＢＤは配列番号８の配列を有し、かつ前記ｄｓＲＮＡはポリＩＣである。
【０１３８】
別の好ましい実施形態では、本発明の複合体におけるｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介して配列番号１を有するセツキシマブの軽鎖のＮ末端に結合され（ＣＴＸ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが配列番号３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有するか、または、ｄｓＲＢＤは、前記スペーサーペプチドを介して配列番号２を有するセツキシマブの重鎖のＣ末端に結合され（ＣＴＸ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ）、前記スペーサーペプチドが配列番号４（ＧＰＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を有し、前記ｄｓＲＢＤは配列番号８の配列を有し、かつ前記ｄｓＲＮＡはポリＩＣである。
【０１３９】
さらなる態様において、本発明は、本発明の組換えタンパク質または複合体および薬学的に許容される担体を含む薬学的組成物に関する。薬学的組成物は、任意の既知の方法による投与のために処方することができる。本発明の薬学的組成物は、静脈内、脳内（ｉｎｔｒａ−ｂｒａｉｎ）（脳内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒａｌ））、経口、皮内、筋肉内、皮下、経皮、経粘膜的、鼻腔内または眼内投与用に製剤化することができる。
【０１４０】
さらなる態様では、本発明は、癌の治療に使用するための本発明の組換えタンパク質、複合体または薬学的組成物に関し、前記癌は、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする。別の態様では、本発明は、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌の治療方法に関し、前記方法は、本発明の組換えタンパク質、複合体または薬学的組成物を患者に全身投与することを含む。
【０１４１】
特定の実施形態では、ＥＧＦＲ過剰発現細胞を特徴とする癌は、非小細胞肺癌、乳癌、神経膠芽腫、頭頸部扁平上皮癌、胃癌、食道癌、結腸直腸癌、腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、子宮内膜癌、膀胱癌または前立腺癌、およびそれらの転移から選択される。
【０１４２】
特定の実施形態では、治療は、腫瘍浸潤性Ｔ細胞（Ｔ−ＴＩＬ）、腫瘍特異的操作Ｔ細胞（ｔｕｍｏｒ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ−ｃｅｌｌ）、または末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）などの免疫細胞を投与することをさらに含む。
【０１４３】
さらなる態様では、本発明は、本発明の組換えタンパク質をコードする核酸配列を含むベクターに関する。
【０１４４】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、本明細書で定義されるセツキシマブ抗体の軽鎖および本明細書で定義されるセツキシマブ抗体の重鎖をコードする核酸配列、ならびに本明細書で定義されるｄｓＲＢＤをコードする核酸配列を含む。
【０１４５】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号９、１０および１１を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１０、１１および２２を含む。
【０１４６】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１０、２２と、１４または１５のうちの１つを含む。好ましい実施形態において、前記ベクターは、配列番号１０、２２、１２、１３と、１４または１５のうちの１つを含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１０、２２、１２、１３と、１４または１５のうちの１つ、ならびに１８、１９または２０のうちの少なくとも１つを含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１０、２１、１２、１３、１８、１９および２０を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１０、２１、１２、１３、１８、１９および２０と、１４または１５のうちの１つを含む。
【０１４７】
好ましい実施形態において、前記ベクターは、配列番号１１、２２、１２、１３と、１４または１５のうちの１つを含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１１、２２、１２、１３と、１４または１５のうちの１つ、ならびに１８、１９または２０のうちの少なくとも１つを含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１１、２２、１２、１３、１８、１９および２０を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１１、２２、１２、１３、１８、１９および２０と、１４または１５のうちの１つを含む。
【０１４８】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１０、１１、２２、１２、１３、１４および１５を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１０、１１、２２、１２、１３、１４および１５と、１８、１９または２０の少なくとも１つを含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１０、１１、２２、１２、１３、１８、１９および２０を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１０、２２、２１、１２、１３、１８、１９、２０、１４および１５を含む。
【０１４９】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２３および２４を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２４および２６を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２５および２６と、２３または２４のいずれかを含む。
【０１５０】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２３および１０を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２４および１１を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１０および１１と、２３または２４のいずれかを含む。
【０１５１】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２２、２３および２５を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２２、２４および２６を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２２、２５および２６と、２３または２４のいずれかを含む。
【０１５２】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２２、２３および１０を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２２、２４および１１を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２２、１０および１１と、２３または２４のいずれかを含む。
【０１５３】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２７を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２８を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２７を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２８および２６を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号２５および２７を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１８、１９、２０、２８および２６を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１８、１９、２０、２５および２７を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１２、１３、１８、１９、２０、２８および２６を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１２、１３、１８、１９、２０、２５および２７を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１２、１３、２８および２６を含む。好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１２、１３、２５および２７を含む。
【０１５４】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、調節エレメントとして、（ｉ）リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット由来の植物プロモーター、および（ｉｉ）リブロース−１，５−ビスリン酸カルボキシラーゼ（ｒｕｂｉｓｃｏ）小サブユニット由来の植物ターミネーターを含み、前記調節エレメントは、セツキシマブ抗体の軽鎖、好ましくは配列番号１１をコードする核酸配列と、セツキシマブ抗体の重鎖、好ましくは配列番号１０をコードする核酸配列と、ｄｓＲＢＤ、好ましくは配列番号９をコードする核酸配列と、作動可能に連結される。好ましい実施形態では、前記植物プロモーターおよび前記植物ターミネーターは、Ｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｕｍ  ｍｏｒｉｆｏｌｉｕｍ  Ｒａｍａｔのｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットに由来する。
【０１５５】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１２および１３の核酸配列のｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットからの植物プロモーターを調節エレメントとして含む。
【０１５６】
配列番号１２（ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットからの植物プロモーターの核酸配列）：
ＡＡＴＴＣＧＡＴＡＴＣＡＣＧＣＴＴＡＧＡＣＡＡＡＣＡＣＣＣＣＴＴＧＴＴＡＴＡＣＡＡＡＧＡＡＴＴＴＣＧＣＴＴＴＡＣＡＡＡＡＴＣＡＡＡＴＴＣＧＡＧＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＡＴＧＣＡＣＴＡＡＡＴＡＡＧＡＴＣＡＴＴＣＣＧＡＴＣＣＡＡＴＣＴＡＡＣＣＡＡＴＴＡＣＧＡＴＡＣＧＣＴＴＴＧＧＧＴＡＣＡＣＴＴＧＡＴＴＴＴＴＧＴＴＴＣＡＧＴＡＧＴＴＡＣＡＴＡＴＡＴＣＴＴＧＴＴＴＴＡＴＡＴＧＣＴＡＴＣＴＴＴＡＡＧＧＡＴＣＴＴＣＡＣＴＣＡＡＡＧＡＣＴＡＴＴＴＧＴＴＧＡＴＧＴＴＣＴＴＧＡＴＧＧＧＧＣＴＣＧＧＡＡＧＡＴＴＴＧＡＴＡＴＧＡＴＡＣＡＣＴＣＴＡＡＴＣＴＴＴＡＧＧＡＧＡＴＡＣＣＡＧＣＣＡＧＧＡＴＴＡＴＡＴＴＣＡＧＴＡＡＧＡＣＡＡＴＣＡＡＡＴＴＴＴＡＣＧＴＧＴＴＣＡＡＡＣＴＣＧＴＴＡＴＣＴＴＴＴＣＡＴＴＴＡＡＴＧＧＡＴＧＡＧＣＣＡＧＡＡＴＣＴＣＴＡＴＡＧＡＡＴＧＡＴＴＧＣＡＡＴＣＧＡＧＡＡＴＡＴＧＴＴＣＧＧＣＣＧＡＴＡＴＣＣＣＴＴＴＧＴＴＧＧＣＴＴＣＡＡＴＡＴＴＣＴＡＣＡＴＡＴＣＡＣＡＣＡＡＧＡＡＴＣＧＡＣＣＧＴＡＴＴＧＴＡＣＣＣＴＣＴＴＴＣＣＡＴＡＡＡＧＧＡＡＣＡＣＡＣＡＧＴＡＴＧＣＡＧＡＴＧＣＴＴＴＴＴＴＣＣＣＡＣＡＴＧＣＡＧＴＡＡＣＡＴＡＧＧＴＡＴＴＣＡＡＡＡＡＴＧＧＣＴＡＡＡＡＧＡＡＧＴＴＧＧＡＴＡＡＣＡＡＡＴＴＧＡＣＡＡＣＴＡＴＴＴＣＣＡＴＴＴＣＴＧＴＴＡＴＡＴＡＡＡＴＴＴＣＡＣＡＡＣＡＣＡＣＡＡＡＡＧＣＣＣＧＴＡＡＴＣＡＡＧＡＧＴＣＴＧＣＣＣＡＴＧＴＡＣＧＡＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＴＡＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＧＧＣＣＴＡＡＧＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＡＧＴＡＣＧＴＧＧＧＧＧＴＡＣＣＡＣＡＴＡＴＡＧＧＡＡＧＧＴＡＡＣＡＡＡＡＴＡＣＴＧＣＡＡＧＡＴＡＧＣＣＣＣＡＴＡＡＣＧＴＡＣＣＡＧＣＣＴＣＴＣＣＴＴＡＣＣＡＣＧＡＡＧＡＧＡＴＡＡＧＡＴＡＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＣＣＴＧＣＣＡＣＧＴＧＴＣＡＣＡＴＣＧＴＣＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＡＴＧＡＴＡＡＧＧＧＡＴＴＡＣＡＴＣＣＴＴＣＴＡＴＧＴＴＴＧＴＧＧＡＣＡＴＧＡＴＧＣＡＴＧＴＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＧＣＣＡＣＡＴＧＡＴＣＣＡＡＴＧＧＣＣＡＣＡＧＧＡＡＣＧＴＡＡＧＡＡＴＧＴＡＧＡＴＡＧＡＴＴＴＧＡＴＴＴＴＧＴＣＣＧＴＴＡＧＡＴＡＧＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＧＴＡＴＣＡＡＴＡＣＧＡＡＣＴＡＡＴＴＣＡＣＴＣＡＴＴＧＧＡＴＴＣＡＴＡＧＡＡＧＴＣＣＡＴＴＣＣＴＣＣＴＡＡＧＴＡＴＣＴＡＡＡＣ
【０１５７】
配列番号１３（ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットからの植物ターミネーターの核酸配列）：
ＧＧＣＣＧＣＡＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＴＡＴＴＴＡＣＣＡＡＧＡＣＴＴＴＴＧＡＡＴＡＴＴＡＡＣＣＴＴＣＴＴＧＴＡＡＣＧＡＧＴＣＧＧＴＴＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＡＧＧＧＴＴＴＴＧＴＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＣＴＴＴＴＡＡＴＴＣＡＴＣＡＣＴＴＴＡＡＴＴＣＣＣＴＡＡＴＴＧＴＣＴＧＴＴＣＡＴＴＴＣＧＴＴＧＴＴＴＧＴＴＴＣＣＧＧＡＴＣＧＡＴＡＡＴＧＡＡＡＴＧＴＡＡＧＡＧＡＴＡＴＣＡＴＡＴＡＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＡＴＴＧＴＣＧＴＴＴＣＡＴＡＴＴＴＧＣＡＡＴＣＴＴＴＴＴＴＴＡＣＡＡＡＣＣＴＴＴＡＡＴＴＡＡＴＴＧＴＡＴＧＴＡＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＴＴＣＴＴＧＴＴＡＴＡＴＴＡＧＧＧＧＧＡＡＡＴＡＡＴＧＴＴＡＡＡＴＡＡＡＡＧＴＡＣＡＡＡＡＴＡＡＡＣＴＡＣＡＧＴＡＣＡＴＣＧＴＡＣＴＧＡＡＴＡＡＡＴＴＡＣＣＴＡＧＣＣＡＡＡＡＡＧＴＡＣＡＣＣＴＴＴＣＣＡＴＡＴＡＣＴＴＣＣＴＡＣＡＴＧＡＡＧＧＣＡＴＴＴＴＣＡＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＡＴＡＡＧＧＡＡＴＧＣＴＡＣＡＡＣＣＧＣＡＴＡＡＴＡＡＣＡＴＣＣＡＣＡＡＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＴＡＡＣＡＴＧＴＣＡＧＡＣＡＧＴＧＡＴＴＧＡＡＡＧＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＡＧＴＴＴＣＧＴＴＡＴＣＴＴＣＴＴＴＴＣＴＣＡＴＴＡＡＧＣＧＡＡＴＣＡＣＴＡＣＣＴＡＡＣＡＣＧＴＣＡＴＴＴＴＧＴＧＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＧＡＡＴＧＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＧＴＴＧＴＡＧＣＡＴＴＣＣＴＣＴＴＴＴＣＡＡＡＴＴＡＧＧＧＴＴＴＧＴＴＴＧＡＧＡＴＡＧＣＡＴＴＴＣＡＧＣＣＧＧＴＴＣＡＴＡＣＡＡＣＴＴＡＡＡＡＧＣＡＴＡＣＴＣＴＡＡＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＡＡＧＡＣＴＡＡＡＡＡＡＴＣＴＴＧＴＡＡＧＴＴＡＧＣＧＣＡＧＡＡＴＡＴＴＧＡＣＣＣＡＡＡＴＴＡＴＡＴＡＣＡＣＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＡＴＡＴＡＧＡＧＡＣＴＡＡＴＴＡＣＡＣＴＴＴＴＡＡＣＣＡＣＴＡＡＴＡＡＴＴＡＴＴＡＣＴＧＴＡＴＴＡＴＡＡＣＡＴＣＴＡＣＴＡＡＴＴＡＡＡＣＴＴＧＴＧＡＧＴＴＴＴＴＧＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＴＡＴＣＡＴＡＴＡＴＡＣＴＡＡＡＡＧＧＣＡＧＧＡＡＣＧＣＡＡＡＣＡＴＴＧＣＣＣＣＧＧＴＡＣＴＧＴＡＧＣＡＡＣＴＡＣＧＧＴＡＧＡＣＧＣＡＴＴＡＡＴＴＧＴＣＴＡＴＡＧＴＧＧＡＣＧＣＡＴＴＡＡＴＴＡＡＣＣＡＡＡＡＣＣＧＣＣＴＣＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＣＴＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧＣＴＣＧ
【０１５８】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、シグナルペプチドをコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列（シグナルヌクレオチド配列）をさらに含み、前記シグナルペプチドは、前記細胞コンパートメントが小胞体（ＥＲ）でない場合に、発現されたセツキシマブ抗体鎖を細胞コンパートメントに向けて標的化する。好ましい実施形態では、前記シグナルペプチドはＮ末端シグナルペプチドである。好ましい実施形態では、前記シグナルヌクレオチド配列は、セツキシマブ抗体の重鎖および軽鎖のコード配列の５’末端に位置する。
【０１５９】
さらに好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤが３’で重鎖に付着した状態で、前記シグナルヌクレオチド配列は、重鎖のコード配列の５’末端に位置し、かつ前記シグナルヌクレオチド配列は、軽鎖のコード配列の５’末端に位置する。
【０１６０】
より好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＢＤが５’で軽鎖に付着した状態で、前記シグナルヌクレオチド配列は、重鎖のコード配列の５’末端に位置し、かつ前記シグナルヌクレオチド配列は、ｄｓＲＢＤのコード配列の５’末端に位置する。
【０１６１】
好ましい実施形態では、ベクターに含まれる前記少なくとも１つのシグナルヌクレオチド配列は、互いに異なる２つ以上のシグナルヌクレオチド配列である。好ましい実施形態では、ベクターに含まれる前記少なくとも１つのシグナルヌクレオチド配列は、ワタシグナルペプチド配列およびタバコシグナルペプチド配列である。これは、正確な反復を避け、ベクター内の相同組換えと再構成を最小限に抑える効果がある。
【０１６２】
より好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは異なるエンドグルカナーゼである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは、異なる種からの異なるエンドグルカナーゼである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは異なるエンドグルカナーゼであり、第１はワタ由来であり、第２はタバコ由来である。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは異なるエンドグルカナーゼであり、第１は配列番号１６のものであり、第２は配列番号１７のものである。さらにより好ましくは、前記第１および第２のアポプラストペプチドは異なるエンドグルカナーゼであり、第１は重鎖に付着した配列番号１６のものであり、第２は軽鎖に付着した配列番号１７のものである。
【０１６３】
好ましい実施形態では、前記シグナルペプチドは、発現されたセツキシマブ抗体配列を、細胞質、アポプラストおよび液胞からなる群から選択される細胞コンパートメントに向けて標的化する。より好ましい実施形態では、前記シグナルペプチドは、発現されたセツキシマブ抗体配列をアポプラストに向けて標的化し、すなわち、前記シグナルペプチドはアポプラストシグナルペプチドである。アポプラストは、好ましくは、植物細胞の原形質膜の外側の空間として定義される。好ましい実施形態では、前記少なくとも１つのシグナルペプチドのそれぞれは、アポプラストシグナルペプチドである。
【０１６４】
好ましい実施形態では、前記アポプラストシグナルペプチドは、ヒトまたは植物アポプラストシグナルペプチドである。別の好ましい実施形態では、前記アポプラストシグナルペプチドは植物アポプラストペプチドである。別の好ましい実施形態では、前記アポプラストシグナルペプチドは、ヒト、ＧｏｓｓｙｐｉｕｍおよびＮｉｃｏｔｉａｎａ由来のアポプラストシグナルペプチドからなる群から選択される。好ましくは、前記アポプラストシグナルペプチドは、ＧｏｓｓｙｐｉｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ由来、より好ましくはＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｃｏ由来である。
【０１６５】
好ましい実施形態では、前記アポプラストシグナルペプチドはエンドグルカナーゼである。
【０１６６】
別の好ましい実施形態では、シグナルペプチドをコードする前記少なくとも１つのヌクレオチド配列は、配列番号１４または１５のヌクレオチド配列を有する。さらに好ましい実施形態では、前記ベクターは、配列番号１４によってコードされる１つのヌクレオチド配列および配列番号１５によってコードされる１つのヌクレオチド配列を含む。
【０１６７】
配列番号１４（ワタアポプラストシグナルペプチドをコードする核酸配列）：
ＡＴＧＧＣＴＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＴＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＧＡＴＣＣＴＴＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＴＧＣＴＧＧＣＣＡＣＧＡＴＴＡＣＡＧＧＧＡＴＧＣＴＣＴＣＣＧＴＡＡＡＴＣＴＴＣＣＡＴＧＧＣＴ
配列番号１６（ワタアポプラストシグナルペプチドをコードするアミノ酸配列）：
ＭＡＲＫＳＬＩＦＰＶＩＬＬＡＶＬＬＦＳＰＰＩＹＳＡＧＨＤＹＲＤＡＬＲＫＳＳＭＡ
配列番号１５（タバコアポプラストシグナルペプチドの核酸配列）：
ＡＴＧＧＣＣＧＣＴＡＧＧＡＡＧＴＣＣＣＴＴＡＴＴＴＴＣＣＣＡＧＴＧＡＴＴＣＴＣＣＴＣＧＣＣＧＴＧＣＴＣＣＴＴＴＴＴＴＣＴＣＣＡＣＣＡＡＴＣＴＡＣＴＣＣ
配列番号１７（タバコアポプラストシグナルペプチドのアミノ酸配列）：
ＭＡＡＲＫＳＬＩＦＰＶＩＬＬＡＶＬＬＦＳＰＰＩＹＳ
【０１６８】
好ましい実施形態では、本発明の前記ベクターは、少なくとも１つのマトリックス付着領域（ＭＡＲ）をさらに含む。前記ＭＡＲは、好ましくは、ＣＨＮ５０Ｓ／ＭＩ、ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６およびＲｂ７からなる群から選択される。
【０１６９】
好ましい実施形態では、本発明の前記ベクターは、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つが互いに異なる２つ以上のマトリックス付着領域（ＭＡＲ）を含む。さらに好ましい実施形態では、本発明の前記ベクターは、ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６およびＲｂ７を含む。別の好ましい実施形態では、本発明の前記ベクターは、ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  ＩＩの２つのＭＡＲ、１つのＴＭ６および１つのＲｂ７を含む。
【０１７０】
別の好ましい実施形態では、前記ＭＡＲは、配列番号１８、１９および２０の配列からなる群から選択される。
【０１７１】
配列番号１８（ＣＨＮ  ５０  Ｓ／Ｍ  ＩＩの核酸配列）：
ＡＧＧＴＡＣＡＧＡＡＣＧＴＧＧＧＡＡＴＣＴＡＡＧＴＴＴＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＣＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＣＴＡＡＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＴＣＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＡＴＴＧＴＧＴＡＡＴＴＣＣＴＴＡＧＴＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＴＡＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＡＣＣＴＡＡＴＴＡＴＡＡＣＴＴＴＣＴＡＧＣＴＡＡＡＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＣＡＴＣＧＴＡＡＧＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧＴＣＧＡＡＡＴＡＴＴＧＴＡＣＴＡＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＡＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡＧＡＣＧＣＣＧＧＧＴＧＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＴＣＡＡＡＣＴＴＴＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＧＴＡＧＡＴＡＴＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＡＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＣＴＣＧＣＴＴＧＧＧＣＧＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＡＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＡＧＴＡＧＡＡＴＧＣＧＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＡＡＴＴＣＧＡＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＴＴＣＴＡＣＡＴＡＧＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＧＴＡＡＣＴＡＧＡＴＣＴＡＣＡＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＴＧＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＡＡＧＡＡＴＴＧＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＡＡＡＡＡＧＴＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＣＴＴＴＴＣＧＴＣＧＧＧＴＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＧＣＣＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＣＴＣＴＡＡＣＣＴＡＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＡＧＣＴＣＴＴＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＣＡＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＡＣＴＣＴＡＡＡＣＣＡＡＴＧＴＣＧＡＴ
配列番号１９（ＴＭ６の核酸配列）：
ＴＡＡＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＴＴＴＡＡＴＴＡＡＣＡＴＡＡＣＣＡＡＧＧＡＴＴＴＴＴＡＴＡＴＣＧＧＴＡＡＴＡＡＣＴＣＴＡＡＴＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＡＡＴＣＡＧＴＣＴＡＧＡＡＣＴＣＴＣＴＴＡＣＣＴＣＴＡＡＴＡＡＧＴＡＡＡＡＧＴＡＣＴＴＣＴＡＡＴＡＡＡＴＴＣＡＴＡＴＡＣＴＴＴＴＴＣＴＣＴＣＴＴＣＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＣＴＴＴＧＣＴＣＴＴＣＴＴＴＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＴＣＴＡＡＴＡＧＣＣＴＴＴＴＡＴＧＡＧＡＡＧＴＡＡＡＣＴＴＴＴＡＧＧＧＴＴＧＧＣＣＣＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＣＡＣＡＡＴＴＡＴＡＴＡＧＴＴＴＣＴＴＡＣＴＣＡＧＴＴＧＴＴＧＧＡＡＴＡＴＡＡＴＴＣＡＡＡＴＴＣＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＡＣＧＧＴＧＡＣＡＴＴＧＡＧＴＴＴＴＡＣＴＴＴＧＴＧＧＡＡＧＡＧＡＡＴＴＡＧＡＴＴＣＴＣＧＴＧＴＴＡＧＴＡＡＡＡＴＣＧＧＴＴＡＧＴＡＡＴＴＧＡＴＧＡＴＧＣＡＴＴＡＴＴＴＴＴＡＣＴＣＴＡＴＡＡＴＡＧＡＧＡＴＧＣＡＡＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＧＣＡＴＴＴＴＧＧＧＡＴＣＡＡＡＴＴＧＴＡＡＴＧＣＡＧＴＣＡＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＴＣＡＴＡＡＡＴＧＴＴＴＧＧＧＡＴＡＴＴＧＴＴＧＧＴＴＡＴＴＴＡＡＣＴＡＧＡＡＡＴＡＧＡＣＴＴＣＴＴＡＴＴＴＣＡＴＡＴＴＴＡＴＴＧＴＴＡＡＡＡＴＣＣＴＴＴＡＴＴＧＧＡＧＡＴＧＡＡＴＴＡＴＴＴＧＴＴＣＡＣＣＧＡＴＴＡＧＡＡＧＴＴＧＡＴＡＧＴＣＧＣＴＴＴＴＧＴＴＴＴＡＧＡＡＧＡＡＡＴＴＴＴＡＣＣＧＴＡＧＡＣＣＡＡＧＴＴＡＡＧＧＡＧＴＴＴＴＡＧＡＡＧＣＡＣＴＴＴＧＣＡＴＧＧＧＡＧＣＡＴＴＡＧＴＧＴＡＴＧＴＴＡＴＧＧＣＴＴＴＡＴＣＡＡＡＴＡＴＡＧＧＴＴＴＴＧＡＡＧＡＴＴＣＡＧＡＧＡＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＧＣＴＡＧＡＡＣＣＣＡＡＧＡＡＣＴＡＧＧＡＡＧＴＴＡＧＡＧＴＡＡＴＴＣＡＣＡＡＴＡＣＣＡＴＡＡＣＧＴＧＡＴＡＴＡＡＡＡＣＴＴＴＴＴＡＴＴＧＴＡＡＣＴＣＡＡＡＴＣＧＧＴＡＡＴＡＴＴＴＴＴＴＧＣＴＴＴＡＧＴＣＴＴＡＡＴＣＧＡＴＡＡＡＴＴＡＴＴＴＴＴＴＴＡＴＡＴＴＧＡＴＴＡＧＴＴＡＴＡＧＧＡＧＧＣＴＣＡＣＡＡＡＧＴＴＧＧＧＡＡＴＡＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＣＡＴＡＴＴＴＴＧＴＡＴＴＴＧＡＡＣＡＡＴＴＴＡＴＧＡＡＡＴＡＧＴＡＡＴＴＧＧＴＡＡＡＡＡＡＴＣＡＣＴＴＴＡＡＡＴＴＴＴＴＡＴＣＣＴＡＴＡＴＣＣＡＧＡＡＧＧＡＴＴＡＴＧＧＴＧＴＣＴＧＧＣＡＴＡＧＴＴＧＴＴＴＧＧＡＡＧＡＴＴＴＧＡＡＴＣＡＧＧＧＴＡＡＡＡＧＴＡＴＧＴＴＧＴＡＡＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＧＴＴＡＴＡＧＧＣＡＴＴＴＴＴＴＧＴＧＣＴＴＧＡＴＴＧＴＴＴＴＧＴＴＧＴＣＡＴＴＡＴＡＴＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＧＧＡＡＧＴＧＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＡＴＴＡＡＡＡＴＡＴＡＧＡＴＡＡＴＣＡＡＴＴＴＴＡＴＡＡＧＡＡＡＴＴＴＧＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＡＣＡＡＧＧＡＴＡＡＡＧＴＣＴＡＣＡＡＴＡＴＧＣＧＡＧＴＡＡＡＡＴＴＴＧＡＴＴＧＡＡＣＣＴＡＧＧＡＴＧＴＣ
配列番号２０（Ｒｂ７の核酸配列）：
ＴＣＧＡＴＴＡＡＡＡＡＴＣＣＣＡＡＴＴＡＴＡＴＴＴＧＧＴＣＴＡＡＴＴＴＡＧＴＴＴＧＧＴＡＴＴＧＡＧＴＡＡＡＡＣＡＡＡＴＴＣＧＡＡＣＣＡＡＡＣＣＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＴＡＴＡＴＡＧＴＴＴＴＴＡＴＡＴＡＴＡＴＧＣＣＴＴＴＡＡＧＡＣＴＴＴＴＴＡＴＡＧＡＡＴＴＴＴＣＴＴＴＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＴＡＧＡＡＡＴＡＴＴＴＧＣＧＡＣＴＣＴＴＣＴＧＧＣＡＴＧＴＡＡＴＡＴＴＴＣＧＴＴＡＡＡＴＡＴＧＡＡＧＴＧＣＴＣＣＡＴＴＴＴＴＡＴＴＡＡＣＴＴＴＡＡＡＴＡＡＴＴＧＧＴＴＧＴＡＣＧＡＴＣＡＣＴＴＴＣＴＴＡＴＣＡＡＧＴＧＴＴＡＣＴＡＡＡＡＴＧＣＧＴＣＡＡＴＣＴＣＴＴＴＧＴＴＣＴＴＣＣＡＴＡＴＴＣＡＴＡＴＧＴＣＡＡＡＡＴＣＴＡＴＣＡＡＡＡＴＴＣＴＴＡＴＡＴＡＴＣＴＴＴＴＴＣＧＡＡＴＴＴＧＡＡＧＴＧＡＡＡＴＴＴＣＧＡＴＡＡＴＴＴＡＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＧＡＡＣＡＴＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＧＧＴＡＴＣＡＴＡＴＴＧＡＴＴＴＴＴＡＴＡＣＴＴＡＡＴＴＡＣＴＡＡＡＴＴＴＧＧＴＴＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＧＴＧＴＡＣＡＴＣＡＡＣＧＡＡＡＡＡＴＴＡＧＴＣＡＡＡＣＧＡＣＴＡＡＡＡＴＡＡＡＴＡＡＡＴＡＴＣＡＴＧＴＧＴＴＡＴＴＡＡＧＡＡＡＡＴＴＣＴＣＣＴＡＴＡＡＧＡＡＴＡＴＴＴＴＡＡＴＡＧＡＴＣＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＡＡＡＡＡＡＡＡＴＴＡＡＴＴＴＴＴＡＣＴＡＡＣＡＣＡＴＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＡＴＣＡＡＡＡＡＴＴＴＧＡＣＡＡＡＧＴＡＡＧＡＴＴＡＡＡＡＴＡＡＴＡＴＴＣＡＴＣＴＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＣＣＡＧＡＡＡＡＴＧＣＴＧＡＡＡＡＣＣＣＧＧＣＡＡＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡＡＴＣＣＡＡＡＣＣＧＡＴＡＴＡＧＴＴＧＧＴＴＴＧＧＴＴＴＧＡＴＴＴＴＧＡＴＡＴＡＡＡＣＣＧＡＡＣＣＡＡＣＴＣＧＧＴＣＣＡＴＴＴＧＣＡＣＣＣＣＴＡＡＴＣＡＴＡＡＴＡＧＣＴＴＴＡＡＴＡＴＴＴＣＡＡＧＡＴＡＴＴＡＴＴＡＡＧＴＴＡＡＣＧＴＴＧＴＣＡＡＴＡＴＣＣＴＧＧＡＡＡＴＴＴＴＧＣＡＡＡＡＴＧＡＡＴＣＡＡＧＣＣＴＡＴＡＴＧＧＣＴＧＴＡＡＴＡＴＧＡＡＴＴＴＡＡＡＡＧＣＡＧＣＴＣＧＡＴＧＴＧＧＴＧＧＴＡＡＴＡＴＧＴＡＡＴＴＴＡＣＴＴＧＡＴＴＣＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＴＣＣＣＡＡＧＴＡＴＴＡＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＣＴＡＧＧＡＡＧＡＡＧＧＴＴＡＧＣＴＡＣＧＡＴＴＴＡＣＡＧＣＡＡＡＧＣＣＡＧＡＡＴＡＣＡＡＡＧＡＡＣＣＡＴＡＡＡＧＴＧＡＴＴＧＡＡＧＣＴＣＧＡＡＡＴＡＴＡＣＧＡＡＧＧＡＡＣＡＡＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＡＡＡＡＡＴＡＣＧＣＡＡＴＧＡＣＴＴＧＧＡＡＣＡＡＡＡＧＡＡＡＧＴＧＡＴＡＴＡＴＴＴＴＴＴＧＴＴＣＴＴＡＡＡＣＡＡＧＣＡＴＣＣＣＣＴＣＴＡＡＡＧＡＡＴＧＧＣＡＧＴＴＴＴＣＣＴＴＴＧＣＡＴＧＴＡＡＣＴＡＴＴＡＴＧＣＴＣＣＣＴＴＣＧＴＴＡＣＡＡＡＡＡＴＴＴＴＧＧＡＣＴＡＣＴＡＴＴＧＧＧＡＡＣＴＴＣＴＴＣＴＧＡＡＡＡＴＡＧＴ
【０１７２】
好ましい実施形態では、セツキシマブ抗体の重鎖および軽鎖をコードするベクターの前記核酸配列は、調節エレメントとして、両方ともｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットからの、プロモーターおよびターミネーターにそれぞれ作動可能に接続されており、前記プロモーターは上流でＭＡＲが隣接し、前記ターミネーターは下流でＭＡＲが隣接し、前記ＭＡＲは、好ましくは、ＣＨＮ５０Ｓ／ＭＩ、ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６およびＲｂ７からなる群から選択される。
【０１７３】
好ましい実施形態では、本発明の前記ベクターは、５’から３’へ：
（１）ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  Ｉ、ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６およびＲｂ７からなる群から選択されるＭＡＲと、
（２）第１の調節エレメントであって、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットプロモーターである、前記調節エレメントと、
（３）アポプラストシグナルペプチド、好ましくは  ＧｏｓｓｙｐｉｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ由来のもの、をコードするヌクレオチド配列と、
（４）セツキシマブ抗体の第１の重鎖または軽鎖をコードする核酸配列およびｄｓＲＢＤをコードする核酸配列であって、前記第１の鎖は、（４．１）その３’末端（下流）でｄｓＲＢＤをコードする配列に連結された重鎖、または（４．２）その５’末端（上流）でｄｓＲＢＤと連結された軽鎖である、核酸配列、ならびにセツキシマブ抗体の第２の鎖をコードする核酸配列であって、前記第２の鎖はセツキシマブ抗体の重鎖または軽鎖のうちの他方である核酸配列と、
（５）前記少なくとも１つの調節エレメントのうちの第２のものであって、前記調節エレメントは、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットターミネーターであるものと、
（６）ＣＨＮ５０Ｓ／ＭＩ、ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６およびＲｂ７からなる群から選択される前記少なくとも１つのＭＡＲの第２のものと、を含む。
【０１７４】
好ましい実施形態において、本発明のベクターは、５’から３’へ（すなわち、下流方向へ）：（１）第１のＭＡＲであって、前記第１のＭＡＲは、好ましくは、ＣＨＮ  ５０  Ｓ／ＭＩ、ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６およびＲｂ７からなる群から選択されるものと、（２）第１のプロモーターとして定義される調節エレメントであって、前記第１のプロモーターが好ましくはｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットプロモーターであるものと、（３）アポプラストシグナルペプチド、好ましくはＧｏｓｓｙｐｉｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａのシグナルペプチドをコードするシグナル配列と、（４）セツキシマブ抗体の重鎖または軽鎖をコードする配列のうちの１つであって、前記重鎖はその３’末端（下流）でｄｓＲＢＤをコードする配列と連結され、軽鎖はその５’末端（上流）でｄｓＲＢＤと連結されるものと、（５）第１のターミネーターとして定義されるさらなる調節エレメントであって、前記第１のターミネーターは、好ましくは、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットターミネーターであるものと、（６）第２のＭＡＲであって、前記第２のＭＡＲは好ましくはＴＭ６またはＲｂ７であるものと、（７）第２のプロモーターとして定義されるさらなる調節エレメントであって、前記第２のプロモーターは、好ましくはｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットプロモーターであるものと、（８）アポプラストシグナルペプチド、好ましくはＧｏｓｓｙｐｉｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａのシグナルペプチドをコードするシグナル配列と、（９）（（４）と比較して）セツキシマブ抗体の重鎖または軽鎖のいずれかをコードする配列の他方と、（１０）第２のターミネーターとして定義されるさらなる調節エレメントであって、前記第２のターミネーターは、好ましくは、ｒｕｂｉｓｃｏ小サブユニットターミネーターであるものと、（１１）第３のＭＡＲであって、前記第３のＭＡＲは、好ましくは、ＣＨＮ５０Ｓ／ＭＩ、ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６およびＲｂ７からなる群から選択されるものと、を含む。
【０１７５】
好ましい実施形態において、前記ベクターは、マーカー遺伝子および植物細胞における発現のための少なくとも１つの調節エレメントを含む少なくとも１つのマーカーカセットをさらに含み、前記少なくとも１つの調節エレメントは、前記マーカー遺伝子に作動可能に連結される。好ましい実施形態では、前記マーカー遺伝子は、緑色蛍光タンパク質を除く蛍光タンパク質、または抗生物質耐性遺伝子である。好ましくは、植物細胞における発現のための前記少なくとも１つの調節エレメントは、植物プロモーターおよび植物ターミネーターである。好ましい態様において、マーカーカセットの前記植物プロモーターは、ＣａＭＶ  ３５ＳプロモーターおよびＮＯＳターミネーターである。好ましいマーカーカセットは、ＤｓＲｅｄ遺伝子などの赤色蛍光マーカー遺伝子、好ましくはＭＡＲが隣接するＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーター、および好ましくはＭＡＲが隣接するＮＯＳターミネーターを含み、前記ＭＡＲは、好ましくはＣＨＮ  ５０  Ｓ／Ｍ  Ｉ、ＣＨＮ  ５０  Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６およびＲｂ７からなる群から選択される。マーカーカセットから発現された前記マーカー遺伝子は、形質転換細胞をスクリーニングするための選択マーカーとして有用である。
【０１７６】
好ましい実施形態では、前記ベクターは、ＤＳＲｅｄなどの蛍光タンパク質を含む第１のマーカーカセット、およびカナマイシン耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子を含む第２のマーカーカセットをさらに含み、各マーカーカセットは、植物細胞における発現のための少なくとも１つの調節エレメントを含み、前記少なくとも１つの調節エレメントのそれぞれは、そのマーカーカセットのマーカー遺伝子に作動可能に連結されている。好ましくは、植物細胞における発現のための前記少なくとも１つの調節エレメントは、ＭＡＲが上流に隣接する植物プロモーターおよびＭＡＲが下流に隣接する植物ターミネーターであり、前記ＭＡＲは、好ましくはＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  Ｉ、ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６およびＲｂ７からなる群から選択される。
【０１７７】
好ましい実施形態では、前記マーカーカセットは、以下の配列番号２１の配列を含む：
ＴＧＡＧＡＣＴＴＴＴＣＡＡＣＡＡＡＧＧＧＴＡＡＴＡＴＣＧＧＧＡＡＡＣＣＴＣＣＴＣＧＧＡＴＴＣＣＡＴＴＧＣＣＣＡＧＣＴＡＴＣＴＧＴＣＡＣＴＴＣＡＴＣＡＡＡＡＧＧＡＣＡＧＴＡＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＧＴＧＧＣＡＣＣＴＡＣＡＡＡＴＧＣＣＡＴＣＡＴＴＧＣＧＡＴＡＡＡＧＧＡＡＡＧＧＣＴＡＴＣＧＴＴＣＡＡＧＡＴＧＣＣＴＣＴＧＣＣＧＡＣＡＧＴＧＧＴＣＣＣＡＡＡＧＡＴＧＧＡＣＣＣＣＣＡＣＣＣＡＣＧＡＧＧＡＧＣＡＴＣＧＴＧＧＡＡＡＡＡＧＡＡＧＡＣＧＴＴＣＣＡＡＣＣＡＣＧＴＣＴＴＣＡＡＡＧＣＡＡＧＴＧＧＡＴＴＧＡＴＧＴＧＡＴＡＴＣＴＣＣＡＣＴＧＡＣＧＴＡＡＧＧＧＡＴＧＡＣＧＣＡＣＡＡＴＣＣＣＡＣＴＡＴＣＣＴＴＣＧＣＡＡＧＡＣＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＴＡＴＡＡＧＧＡＡＧＴＴＣＡＴＴＴＣＡＴＴＴＧＧＡＧＡＧＧＡＣＴＣＣＧＧＴＡＴＴＴＴＴＡＣＡＡＣＡＡＴＴＡＣＣＡＣＡＡＣＡＡＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＡＡＣＡＡＣＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＡＣＴＡＴＴＣＴＡＧＴＣＧＡＡＡＴＧＧＣＣＴＣＣＴＣＣＧＡＧＡＡＣＧＴＧＡＴＣＡＣＴＧＡＧＴＴＣＡＴＧＡＧＧＴＴＣＡＡＧＧＴＧＡＧＧＡＴＧＧＡＡＧＧＴＡＣＴＧＴＧＡＡＣＧＧＡＣＡＣＧＡＧＴＴＣＧＡＧＡＴＣＧＡＡＧＧＴＧＡＡＧＧＴＧＡＧＧＧＴＡＧＡＣＣＡＴＡＣＧＡＧＧＧＡＣＡＣＡＡＣＡＣＴＧＴＧＡＡＧＣＴＣＡＡＧＧＴＧＡＣＡＡＡＡＧＧＴＧＧＣＣＣＡＣＴＴＣＣＡＴＴＣＧＣＴＴＧＧＧＡＴＡＴＣＣＴＴＴＣＡＣＣＡＣＡＧＴＴＣＣＡＧＴＡＣＧＧＣＴＣＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣＧＴＴＡＡＧＣＡＣＣＣＡＧＣＴＧＡＴＡＴＣＣＣＣＧＡＣＴＡＣＡＡＧＡＡＧＴＴＧＴＣＴＴＴＣＣＣＡＧＡＧＧＧＡＴＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＣＧＴＧＴＧＡＴＧＡＡＴＴＴＣＧＡＧＧＡＴＧＧＴＧＧＴＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＴＧＡＣＣＣＡＧＧＡＴＴＣＴＴＣＡＣＴＴＣＡＧＧＡＴＧＧＣＴＧＣＴＴＣＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＴＣＧＧＧＧＴＧＡＡＣＴＴＣＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＧＣＣＣＡＧＴＧＡＴＧＣＡＧＡＡＡＡＡＧＡＣＴＡＴＧＧＧＡＴＧＧＧＡＡＧＣＣＴＣＣＡＣＴＧＡＧＡＧＧＣＴＴＴＡＴＣＣＡＡＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＧＣＴＣＡＡＧＧＧＣＧＡＧＡＣＴＣＡＣＡＡＧＧＣＴＣＴＴＡＡＧＣＴＣＡＡＡＧＡＴＧＧＴＧＧＣＣＡＣＴＡＣＣＴＣＧＴＣＧＡＧＴＴＣＡＡＧＴＣＴＡＴＣＴＡＣＡＴＧＧＣＣＡＡＧＡＡＧＣＣＡＧＴＴＣＡＧＣＴＣＣＣＣＧＧＴＴＡＣＴＡＣＴＡＣＧＴＴＧＡＣＧＣＴＡＡＧＣＴＣＧＡＣＡＴＣＡＣＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＡＧＧＡＴＴＡＣＡＣＴＡＴＣＧＴＣＧＡＧＣＡＧＴＡＣＧＡＧＡＧＧＡＣＴＧＡＡＧＧＴＡＧＧＣＡＴＣＡＣＴＴＧＴＴＣＣＴＣＴＧＡＧＣＴＴＧＧＡＡＴＧＧＡＴＣＴＴＣＧＡＴＣＣＣＧＡＴＣＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＴＴＧＧＣＡＡＴＡＡＡＧＴＴＴＣＴＴＡＡＧＡＴＴＧＡＡＴＣＣＴＧＴＴＧＣＣＧＧＴＣＴＴＧＣＧＡＣＧＡＴＴＡＴＣＡＴＡＴＡＡＴＴＴＣＴＧＴＴＧＡＡＴＴＡＣＧＴＴＡＡＧＣＡＴＧＴＡＡＴＡＡＴＴＡＡＣＡＴＧＴＡＡＴＧＣＡＴＧＡＣＧＴＴＡＴＴＴＡＴＧＡＧＡＴＧＧＧＴＴＴＴＴＡＴＧＡＴＴＡＧＡＧＴＣＣＣＧＣＡＡＴＴＡＴＡＣＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＣＧＡＴＡＧＡＡＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＡＧＣＧＣＧＣＡＡＡＣＴＡＧＧＡＴＡＡＡＴＴＡＴＣＧＣＧＣＧＣＧＧＴＧＴＣＡＴＣＴＡＴＧＴＴＡＣＴＡＧＡＴＣＧＧＧＡＡＴＴＧＣＣＡＡＧＣＴＡＡＴＴＣＴＴＧＡＡＧＡＣＧＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＴＧＡＴＡＣＧＣＣＴＡＴＴＴＴＴＡＴＡＧＧＴＴＡＡＴＧＴＣＡＴＧＡＴＡＡＴＡＡＴＧＧＴＴＴＣＴＴＡＧＡＣＧＴＧＡＧＧＴＧＧＣＡＣＴＴＴＴＣＧＧＧＧＡＡＡＴＧＴＧＣＧＣＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＴＴＴＧＴＴＴＡＴＴＴＴＴＣＴＡＡＡＴＡＣＡＧＡＡＴＴＧＴＣＧＡＣＴＴＧＴＧＴＣＧＡＣＡＧＧＴＡＣＡＧＡＡＣＧＴＧＧＧＡＡＴＣＴＡＡＧＴＴＴＣＴＧＡＣＴＣＴＡＣＡＴＴＴＣＴＡＣＡＴＡＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＣＴＡＡＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＴＣＴＴＡＴＴＡＴＡＣＴＡＡＡＴＴＧＴＧＴＡＡＴＴＣＣＴＴＡＧＴＡＡＴＡＴＧＴＡＡＡＴＴＴＡＣＴＴＧＡＡＣＴＴＣＴＴＣＣＡＧＡＡＣＣＡＣＴＣＣＣＣＣＡＡＣＣＴＡＡＴＴＡＴＡＡＣＴＴＴＣＴＡＧＣＴＡＡＡＣＴＣＡＧＣＧＡＴＴＴＴＴＴＴＧＧＴＴＣＡＴＣＧＴＡＡＧＡＣＡＴＴＧＴＣＡＧＴＣＧＡＡＡＴＡＴＴＧＴＡＣＴＡＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＧＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＴＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＣＣＴＡＡＣＴＣＡＣＴＣＡＡＧＡＧＡＣＧＣＣＧＧＧＴＧＴＡＡＣＣＡＧＧＣＴＣＴＧＴＴＴＴＴＴＣＧＣＣＡＡＡＡＣＡＡＡＡＡＡＡＣＴＧＧＧＡＡＴＣＡＡＡＣＴＴＴＣＧＴＧＣＴＧＣＡＣＧＴＡＧＡＴＡＴＴＣＧＣＣＡＴＣＴＴＴＡＡＧＡＴＴＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＣＣＴＴＣＴＣＣＴＴＴＴＴＴＡＴＧＡＡＡＴＴＣＧＴＡＣＴＴＡＡＡＴＴＴＴＡＡＡＡＡＣＴＣＧＣＴＴＧＧＧＣＧＴＣＡＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＡＡＴＴＣＴＴＴＣＴＴＣＣＴＣＴＧＡＣＴＡＡＡＴＴＡＣＡＡＴＴＴＴＴＴＴＣＴＡＡＧＴＡＧＡＡＴＧＣＧＴＧＴＴＣＡＡＡＣＡＴＣＡＡＴＴＣＧＡＡＣＴＣＡＡＡＡＡＡＴＴＡＣＴＴＴＴＣＴＡＣＡＴＡＧＴＴＴＡＡＧＡＡＴＴＴＣＴＴＣＡＧＴＴＣＡＡＧＴＡＡＣＴＡＧＡＴＣＴＡＣＡＴＣＣＡＡＡＣＡＣＴＣＡＣＣＡＡＧＴＧＧＧＣＧＣＴＴＧＧＣＴＡＴＡＡＧＡＡＴＴＧＣＡＡＧＡＴＣＣＣＣＡＡＡＡＡＧＴＡＡＴＡＧＡＡＡＣＴＣＴＴＴＴＣＧＴＣＧＧＧＴＡＡＴＧＡＴＡＴＴＴＡＧＡＡＡＣＴＡＧＡＡＴＴＡＴＧＣＣＴＣＧＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＴＴＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＴＴＴＡＡＴＣＧＴＴＴＧＴＣＴＣＴＡＡＣＣＴＡＡＡＣＧＡＡＡＡＣＴＴＴＧＡＡＡＡＧＴＡＧＣＴＣＴＴＴＧＧＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡＡＡＴＴＴＴＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＣＡＡＡＡＴＡＣＡＴＴＴＴＣＡＡＧＴＡＧＡＡＧＴＴＡＡＡＡＡＴＡＣＴＣＴＡＡＡＣＣＡＡＴＧＴＣＧＡＴ
【０１７８】
好ましくは、配列番号２１は、ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  Ｉ、ＣＨＮ５０Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６およびＲｂ７からなる群から選択されるＭＡＲが下流および上流に隣接している。
【０１７９】
さらなる態様では、本発明は、本発明のベクターを含む植物細胞に関し、前記植物細胞は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属に由来する。より好ましい実施形態では、前記植物細胞は、Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ由来である。最も好ましくは、前記植物細胞はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍに由来する。さらにより好ましい実施形態では、前記植物細胞はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ由来のものである。
【０１８０】
さらなる態様では、本発明は、以下のステップ：
−本発明のベクターのセツキシマブ抗体の（重鎖および／または軽鎖）をコードする少なくとも１つの核酸配列を植物細胞で発現させるステップと、
−任意選択的に、セツキシマブ抗体の鎖を発現する植物細胞についてスクリーニングするステップと、
−植物細胞からセツキシマブ抗体の発現された鎖を抽出および精製するステップと、を含む、セツキシマブ抗体を製造する方法に関する。
【０１８１】
好ましい実施形態では、前記植物細胞はＮｉｃｏｔｉａｎａ属に由来する。別の好ましい実施形態では、前記植物細胞は、  Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ由来である。より好ましくは、前記植物細胞はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍに由来する。さらにより好ましい実施形態では、前記植物細胞はＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ由来のものである。
【０１８２】
植物細胞では、セツキシマブ抗体はセツキシマブ重鎖および軽鎖の存在下で構築される。Ｎｉｃｏｔｉａｎａ属由来、特にＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍまたはＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｂｅｎｔｈａｍｉａｎａ由来の植物細胞が構築に好ましい。
【０１８３】
本発明の方法の好ましい実施形態では、前記植物細胞は、発現ステップの前に本発明のベクターで形質転換される。好ましい実施形態では、前記ベクターは、例えば、エレクトロポレーションまたは塩化カルシウムベースの方法により、前記植物細胞に形質転換される。
【０１８４】
好ましい実施形態において、前記ベクターは、細菌、好ましくはアグロバクテリウム、より好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ、さらに好ましくはＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＧＶ３１０１とのインキュベーションにより、前記植物細胞、好ましくはＮｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍに形質転換される。
好ましい実施形態において、植物細胞は、発現されたセツキシマブ抗体鎖についてスクリーニングされる。組換えタンパク質発現の存在をスクリーニングするために、葉試料などの細胞試料をウエスタンブロットで分析した。
【０１８５】
さらに好ましい実施形態において、発現されたセツキシマブ抗体を精製するステップが、発現されたセツキシマブ抗体を精製するステップが、プロテインＡカラムタンパク質精製、続いてカラムゲルろ過を使用すること、またはプロテインＡ−セルロース−結合ドメイン（Ｐｒｏｔｅｉｎ−Ａ−Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−Ｂｉｎｄｉｎｇ−Ｄｏｍａｉｎ）を使用すること、を含む。
【０１８６】
プロテインＡカラムでタンパク質を精製した後、溶出したタンパク質を濃縮し、ゲル濾過カラムにロードして、形成された可能性のあるタンパク質凝集体を除去できる。
【０１８７】
さらなる態様では、本発明は、ｈＰＫＲの少なくともアミノ酸残基６〜７９もしくは９６〜１６８またはそのホモログを含むｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）に関し、前記ホモログのアミノ酸残基には、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０、およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。
【０１８８】
好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲの少なくともアミノ酸残基６〜７９および／または９６〜１６８を含み、ｈＰＫＲの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記非システインアミノ酸はアラニン誘導体である。好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、２−アミノ酪酸、ノルバリン、ノルロイシン、イソロイシンおよびアロイソロイシンからなる群から選択される。より好ましくは、前記アラニン誘導体は、アラニン、グリシン、ロイシン、バリン、およびイソロイシンからなる群から選択される。さらにより好ましくは、前記アラニン誘導体はアラニンまたはバリンである。
【０１８９】
好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲの少なくともアミノ酸残基６〜７９および９６〜１６８またはそのホモログを含むｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ホモログのアミノ酸残基には、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基６〜７９もしくは９６〜１６９、またはそのホモログを含み、前記ホモログのアミノ酸残基にはＦ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基６〜７９および９６〜１６９、またはそのホモログを含み、前記ホモログのアミノ酸残基には、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６９またはそのホモログを含み、前記ホモログのアミノ酸残基にはＦ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログのアミノ酸残基には、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基１〜１９７またはそのホモログを含み、前記ホモログのアミノ酸残基には、Ｆ１０、Ｆ４３、Ｖ４５、Ｉ４７、Ａ７１、Ｖ７２、Ｒ３９、Ｆ４１、Ｓ５９、Ｋ６０、Ｋ６１、Ｋ６４、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインが非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。
【０１９０】
好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基６〜７９または９６〜１６９を含み、ｈＰＫＲの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基６〜７９および９６〜１６９を含み、ｈＰＫＲの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６９を含み、ｈＰＫＲの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８を含み、ｈＰＫＲの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基１〜１９７を含み、ｈＰＫＲの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。
【０１９１】
好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲの少なくともアミノ酸残基６〜７９および９６〜１６８またはそのホモログを含むｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）を含み、前記ホモログのアミノ酸残基１−２４、３９−５０および５８−６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基６〜７９もしくは９６〜１６９、またはそのホモログを含み、前記ホモログのアミノ酸残基１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基６〜７９および９６〜１６９、またはそのホモログを含み、前記ホモログアミノ酸残基１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１および１３５位のシステインは非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６９またはそのホモログを含み、前記ホモログのアミノ酸残基１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基１〜１６８またはそのホモログを含み、前記ホモログのアミノ酸残基１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましい実施形態では、前記ｄｓＲＮＡ結合ドメイン（ｄｓＲＢＤ）は、ｈＰＫＲのアミノ酸残基１〜１９７またはそのホモログを含み、前記ホモログのアミノ酸残基１〜２４、３９〜５０および５８〜６９には、Ｙ１０１、Ｙ１３３、Ｃ１３５、Ｍ１３７、Ａ１６１、Ｆ１３１、Ｋ１５０およびＫ１５４が保存されており、かつ前記ｄｓＲＢＤの１２１位および１３５位のシステインは、非システインアミノ酸によって交換されている。好ましくは、前記ホモログには、アミノ酸残基の少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、さらにより好ましくは少なくとも９９％が保存されている。
【０１９２】
本発明は、以下の非限定的な実施例によって例示される。
【実施例】
【０１９３】
実施例１−設計およびクローニング
構築物は、抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ、ならびに２つのセツキシマブ−ｄｓＲＢＤキメラの発現のために設計され、１つはＮ末端で抗体の軽鎖に結合したｄｓＲＢＤ（配列番号５および６または８）（セツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ、配列番号２）を有するものであり、もう１つはＣ末端で重鎖に結合したｄｓＲＢＤ（配列番号５および６または８）（セツキシマブ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ、配列番号１）を有するものであるｄｓＲＢＤは、短い（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３ペプチドを介して抗体に結合されている（セツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤと配列番号３のリンカー、セツキシマブ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤと配列番号４のリンカー）（図１）。
【０１９４】
セツキシマブ−ＤｓＲｅｄ：セツキシマブ−ＤｓＲｅｄ  ｐＵＣ５７ベクターには、セツキシマブ抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子と、スクリーニングのマーカーとして使用される赤い蛍光タンパク質であるＤｓＲｅｄを発現する遺伝子が含まれている。これらの遺伝子は、タバコに対してコドン最適化された。重鎖と軽鎖はそれぞれｒｕｂｉｓｃｏの小さなサブユニットプロモーターとターミネーターに隣接し、それらを植物細胞原形質膜の外側の空間であるアポプラストに導く、アポプラストシグナルペプチド（タバコまたはコットンのいずれか）に融合した。ＤｓＲｅｄ、サンゴ礁（Ｄｉｓｃｏｓｏｍａ種）からの赤い蛍光タンパク質は、マーカー遺伝子として使用され、ＣａＭＶ  ３５Ｓプロモーターとターミネーターに隣接している。各発現ユニットを取り囲むのは、４つのマトリックス付着領域（ＭＡＲ）、ＣＨＮ  Ｓ／Ｍ  ＩＩ、ＴＭ６およびＲｂ７であり（図２）、これらは遺伝子発現を増強することが示されている。
【０１９５】
組換え抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブおよびキメラ抗体セツキシマブ−ｄｓＲＢＤは、Ｇｅｎｏｍｅ  Ｃｏｍｐｉｌｅｒを使用して設計され、米国ノースカロライナ州のＧｅｎｅｒａｌ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｉｎｃ．から注文され、この会社は、タバコの配列のコドン最適化も提供した。セツキシマブの重鎖および軽鎖をコードする配列は、ＤｒｕｇＢａｎｋ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｄｒｕｇｂａｎｋ．ｃａ／ｄｒｕｇｓ／ＤＢ００００２）から取得した。
【０１９６】
ゴールデンゲートアセンブリーメソッド：セツキシマブ−ＤｓＲｅｄ  ｐＵＣ５７ベクターは、ゴールデンゲートアセンブリーメソッドを使用して組み立てられた、これにより、単一タイプのＩＩＳ制限酵素とＴ４  ＤＮＡリガーゼを使用して、ワンポット反応でベクターバックボーンに複数のインサートを組み立てることができる。タイプＩＩＳ制限酵素は認識部位の外側を切断し、４ヌクレオチドのオーバーハングを残す。インサートは、必要な順序でのみ組み立てることができるオーバーハングを用いて設計できる。
【０１９７】
配列は１〜３Ｋｂｐの範囲で７つの部分に順序づけられ、ｐＵＣ５７プラスミドで提供された（図３）。各パーツには、ＩＩＳ型制限酵素ＢｓａＩの認識部位と４ヌクレオチドのオーバーハングが隣接し、ＮＥＢ  ゴールデンゲートアセンブリツール（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｏｌｄｅｎｇａｔｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｅｄｉｔｏｒ）を使用して正しい順序で組み立てることができる。図３は、ゴールデンゲートアセンブリが成功した後のｐＵＣ５７のセツキシマブ−ＤｓＲｅｄのベクターマップを示し、これは、ＤＮＡ塩基配列決定で検証された。７つの配列部分のそれぞれに制限部位を含有させ、ゴールデンゲートの組み立てが成功しなかった場合に備えて、７つの部分の従来のライゲーションを可能にした。
【０１９８】
ゴールデンゲートアセンブリのデスティネーションベクター（ｄｅｓｔｉｎａｔｉｏｎ  ｖｅｃｔｏｒ）は、２つのＢｓａＩ制限部位を含む短い配列をｐＵＣ５７ベクターに挿入することで作成された。ＢｓａＩ制限部位の外側にある４つのヌクレオチド塩基対配列は、７つの配列部分の最初と最後に相補的であった。ゴールデンゲートアセンブリ反応は、１５μｌの最終容量で、１００ｎｇのデスティネーションベクター、２：１のインサート：ベクターモル比での７つの部分のそれぞれ、１．５μｌの１０ｘＮＥＢ  Ｔ４バッファー、１．５μｌの１０ｘＢＳＡ、１μｌのＮＥＢ  Ｔ４リガーゼ（２，０００，０００ユニット／ｍｌ）、１μｌのＢｓａＩ（１０，０００ユニット／ｍｌ）で構成された。アセンブリ反応は、サーモサイクラーで次のように実行された：（３７°で３分、１６°で４分）ｘ２４回、５０°で５分、８０°で５分、１６°で保持。反応液５μｌをコンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＤＨ５αに形質転換した。
【０１９９】
セツキシマブ−ｄｓＲＢＤキメラ：得られたゴールデンゲートアセンブリ生成物であるセツキシマブ−ＤｓＲｅｄ  ｐＵＣ５７ベクターをさらに改変して、セツキシマブ−ｄｓＲＢＤキメラを作成した。ベクターを（ＡｐａＩおよびＸｈｏＩで）切断して重鎖終止コドンを削除し、次にフレキシブルタンパク質リンカー（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）３およびｄｓＲＢＤ、をコードするフラグメントとライゲーションして、セツキシマブ−重鎖−ｄｓＲＢＤ−ＤｓＲｅｄを作製した（図４Ｂ）。同様に、ベクターを（ＡｇｅＩおよびＳｐｅＩで）切断して軽鎖を除去し、次にｄｓＲＢＤ、リンカー、および軽鎖、をコードするフラグメントとライゲーションして、セツキシマブ−ｄｓＲＢＤ−軽鎖−ＤｓＲｅｄを作製した（図４Ａ）。
【０２００】
配列確認後、インサート（セツキシマブ−ＤｓＲｅｄ、セツキシマブ−重鎖−ｄｓＲＢＤ−ＤｓＲｅｄおよびセツキシマブ−ｄｓＲＢＤ−軽鎖−ＤｓＲｅｄ）はそれぞれ、ｐＵＣ５７からＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで切り出され、ｐＢＩＮＰＬＵＳバイナリ発現ベクターのマルチクローニングサイト（ＭＣＳ）に導入された（図５）。
【０２０１】
セツキシマブ、セツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ、およびセツキシマブ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤの発現ユニットをそれぞれ別々にｐＵＣ５７に組み込んだ後、各ユニットをｐＵＣ５７ベクターから切り出し、別々にｐＢＩＮＰＬＵＳベクターに挿入した。
【０２０２】
また、ｐＢＩＮＰＬＵＳのＴ−ＤＮＡ領域には、選択マーカーとして使用されたカナマイシン耐性も左側の境界近くに含まれていた。ＭＣＳは、Ｔ−ＤＮＡ内（左側と右側のＴ−ＤＮＡ境界の間）のプラスミド上に位置され、これはアグロバクテリウムを介した形質転換によってタバコに導入されたＤＮＡの領域であった。
【０２０３】
実施例２−アグロバクテリウムエレクトロポレーション
次いで、セツキシマブ、セツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤおよびセツキシマブ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤをコードするｐＢＩＮＰＬＵＳベクターを、エレクトロポレーションを使用してＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株ＧＶ３１０１に形質転換した。アグロバクテリウムにおけるＤＮＡ単離の効率が悪いため、成功した形質転換を検証するために、ＤＮＡをアグロバクテリウムから単離し、その後、Ｅ．ｃｏｌｉに再形質転換された。次に、再形質転換されたＥ．ｃｏｌｉからＤＮＡを単離し、配列決定した。次に、検証されたプラスミド配列を有するアグロバクテリウムクローンをタバコの形質転換に使用した。
【０２０４】
実施例３−植物の形質転換
Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ植物を、アグロバクテリウムを介したタバコ形質転換を介して形質転換した。無菌で生育されたタバコの葉片を組換えアグロバクテリウムとインキュベートし、カナマイシンを含むＭＳ培地プレートで約３〜５週間生育させた。発芽した苗条は発根培地で育てられ、発根したら苗を温室に移した。葉は温室に移された直後、形質転換後約８〜１０週間で試料採取された。
【０２０５】
詳細には、無菌Ｎｉｃｏｔｉａｎａ  ｔａｂａｃｕｍ  ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ植物は６−８週間育てられた。３つの操作されたアグロバクテリウム株のそれぞれを、５０μｇ／ｍｌカナマイシンを含む５０ｍｌのＬＢ中で、シェーカー上２８°で約４８時間生育させた。細菌培養物を室温で５０００ＲＰＭで１０分間遠心分離した。上清を除去し、各ペレットを５０ｍｌのＭＳ培地（ビタミン（Ｄｕｃｈｅｆａ  ｃａｔ＃Ｍ０２２２．００５０）および３０ｇ／Ｌスクロースを含む、４．４ｇ／Ｌ  Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ＆Ｓｋｏｏｇ培地（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ  ｃａｔ＃４０７２−０５）ｐＨ＝５．８）で再懸濁した。タバコの葉を１ｃｍ２の小片に切り、アグロバクテリウムと５分間インキュベートした。次に、葉片を、固体ＭＳ培地（０．８ｍｌ／Ｌインドール−３−酢酸（ＩＡＡ）と２ｍｌ／Ｌキネチンを含有する、７  ｇ／ｌ  ｐｌａｎｔ  ａｇａｒ  （Ｄｕｃｈｅｆａ  （ｃａｔ＃  Ｐ１００１．１０００））を含む液体ＭＳ培地）を含むペトリ皿にプレーティングした。プレートを暗所で２５°で４８時間インキュベートした後、外植片を選択的ＭＳ培地（０．８ｍｌ／Ｌ  ＩＡＡ、２ｍｌ／Ｌキネチン、４００ｍｇ／Ｌカルベニシリン、１００ｍｇ／Ｌカナマイシン）を含む新しいペトリ皿に移した。
【０２０６】
プレートを光の中で２５°でインキュベートし、３〜４週間、１０日ごとに新しい選択培地に移した。カルスが発達して芽が形成された後、根が成長するまで芽を発根培地（１００ｍｇ／Ｌカナマイシンおよび４００ｍｇ／Ｌカルベニシリンを含むＭＳ培地）に移した（３〜４週間）。次に、芽を温室の土壌ポットに移し、点滴灌漑システムに接続して、成熟した植物に成長させた。
【０２０７】
組換え植物（以下）の同定後、ホモ接合体を得るために、植物を繰り返し（最大１０回）自家受精させた。
【０２０８】
実施例４−ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析
植物系統のスクリーニング：組換えタンパク質発現の存在をスクリーニングするために、葉試料を抗ヒトＩｇＧ抗体を使用するウエスタンブロットで分析した。セツキシマブを発現する植物では、セツキシマブの重鎖および軽鎖に対応するバンドが約５０および約２５ｋＤａで検出された（図６）。約１７ｋＤａの小さなバンドもすべての試料に存在しており、それは軽鎖の発現レベルが重鎖の発現レベルよりも高い場合に起こることが知られているように、軽鎖の分解産物であると考えられていた。これは後に抗カッパ軽鎖抗体を使用して確認された。
【０２０９】
セツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ発現植物では、ＰＫＲ  ｄｓＲＮＡ結合ドメインの追加により、軽鎖は２０ｋＤａ大きくなった。抗ＩｇＧ抗体を使用するウエスタンブロットでは、重鎖では約５０ｋＤａのバンド、軽鎖−ｄｓＲＢＤキメラでは分子量の約４５ｋＤａの微弱なバンドが見られた。ｄｓＲＢＤを検出する抗ＰＫＲ抗体を使用すると、約４５ｋＤａのバンドがより顕著であった。これらの２つのバンドに加えて、抗ＩｇＧ抗体を使用したときに、ｄｓＲＢＤを含まない軽鎖の分子量である約２５ｋＤａのバンドを含むいくつかの小さなバンドが検出された。これらのバンドはすべて抗カッパ抗体を使用したときに検出され、ＬＣ−ｄｓＲＢＤが部分的に分解されたことを示唆している。しかし、ＬＣ−ｄｓＲＢＤの正しい分子量にバンドがあるため、発現したタンパク質の一部が目的のキメラであることが確認されている（図７）。
【０２１０】
同様に、セツキシマブ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ発現植物では、重鎖は２０ｋＤａ大きくなった。抗ヒトＩｇＧ抗体を使用した場合、バンドは約５０および約２５ｋＤａで検出され、元の重鎖および軽鎖を表すが、キメラ重鎖−ｄｓＲＢＤは検出されなかった（図８）。ｄｓＲＢＤが追加されているため、抗ＩｇＧ抗体はキメラ重鎖−ｄｓＲＢＤとの結合から遮られる。抗ＰＫＲ抗体を使用した場合、予想される分子量約７５ｋＤａに加え、より小さな約６５ｋＤａのバンドが検出された。ＰＫＲのｄｓＲＢＤは２つの二本鎖ＲＮＡ結合ドメインで構成されているため、小さい方のバンドは、１つのｄｓＲＮＡ結合ドメインのみを持つキメラ重鎖−ｄｓＲＢＤを表す。したがって、所望のキメラも存在する。
【０２１１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびウエスタンブロット分析用の植物試料の準備：詳細には、事前に計量したマイクロチューブ（ｍｉｃｒｏｆｕｇｅ  ｔｕｂｅ）を、１００μｌの粉砕バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭメタ重亜硫酸カリウム（ＰＭＢＳ）、１×Ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｐｒｏｔｅａｓｅ  Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  Ｔａｂｌｅｔ）を用いて調製した。形質転換後約１０週間、各植物からの４つの葉のディスク（約８０ｍｇ）をマイクロチューブの蓋でチューブに留め、氷上に置いて計量した。オーバーヘッドスターラーに取り付けたプラスチック製のマイクロ乳棒で、試料を３０秒間粉砕した。試料を４°、４０００ＲＰＭの速度で３０分間遠心分離し、上清を分析のため新しいチューブに移した。
【０２１２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥとウエスタンブロット分析：調製した植物試料を１２％ＳＤＳゲルで泳動させ、ニトロセルロース膜に移した。膜をＴＢＳＴ中の５％スキムミルクで室温で１時間ブロックし、次いで抗ヒトＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、ＨＲＰコンジュゲート抗体（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、１：１０，０００）と室温で２時間インキュベートした。膜をＴＢＳＴで３回５分間洗浄した後、ＥＣＬ（強化化学発光）試薬を添加し、ＥＣＬドキュメンテーションシステムを使用してシグナルを捕捉した。ｄｓＲＢＤの検出のために、マウス由来の抗ＰＫＲ一次抗体を膜と一晩４°でインキュベートし、膜をＴＢＳＴで３回５分間洗浄した後、二次抗マウスＨＲＰコンジュゲート抗体と１時間インキュベートした。
【０２１３】
実施例５−ＥＬＩＳＡおよびタンパク質精製のための植物試料の調製
２〜３か月齢植物の上部、下部、および中部の葉を採取した（１植物あたり５〜２０グラム）。植物組織１グラムあたり、１０ｍｌの粉砕バッファー（１００ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ８、２５ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、１ｍＭ  ＰＭＢＳ、１ｘ抗プロテアーゼカクテル（２０ｍＭ  ＡＥＢＳＦ、１６ｍＭアプロチニン、１３０ｍＭベンズアミジン、２ｍＭロイペプチン、５０μＭダイズトリプシンインヒビター））を添加し、Ｗａｒｉｎｇ実験用ブレンダーで３０秒間ブレンドした。試料を４°、９０００  ＲＰＭで３０分間遠心分離し、上清を新しいチューブに移し、遠心分離を繰り返した。試料は−２０°で凍結した。
【０２１４】
実施例６−ＥＬＩＳＡ
機能性を決定し、たばこ植物で発現したタンパク質の量を定量化するために、ＥＧＦＲコーティングプレートを使用してサンドイッチＥＬＩＳＡを実施した。発現したセツキシマブならびにセツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤで陽性反応が観察された。セツキシマブＨＣ−ｄｓＲＢＤでもより低い強度で陽性反応が観察された。この低い反応性は、検出試薬である抗セツキシマブ抗体がキメラＨＣ−ｄｓＲＢＤと結合することが困難なためと考えられる。ＥＬＩＳＡを使用して、ウエスタンブロットの結果に基づいて、各構築物のうちの４つの最も高く発現している植物の発現レベルを評価した。これにより、セツキシマブおよびセツキシマブ−ｄｓＲＢＤ発現植物の継続的な成長のために自家受粉した最高の発現レベルの植物の選択、ならびにホモ接合種子バンクの最終的な生成が可能になった。最も発現量の多いセツキシマブ（ＣＴＸ）、セツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ、およびセツキシマブ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤ植物の濃度は、それぞれ５７、４５、および１４ｍｇ／ｋｇであった。セツキシマブＬＣ−ｄｓＲＢＤ試料のすべてのタンパク質がｄｓＲＢＤを含んでいるわけではないこと、および検出試薬がすべてのセツキシマブＨＣ−ｄｓＲＢＤに結合できなかった可能性があることを考慮する必要がある。
【０２１５】
セツキシマブＥＬＩＳＡキットはＳｏｍｒｕＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅから購入した。調製した植物試料をアッセイバッファーで１：１００に希釈し（最終希釈は１：１０００）、各試料の１００μｌをＥＧＦＲコーティングウェルに加えた。標準曲線は、０．１５６〜１０ｎｇ／ウェルの範囲のセツキシマブの濃度で作成された。プレートをプレートシェーカー上で２３°で１時間３００ＲＭＰでインキュベートした。プレートの内容物を廃棄し、プレートを２５０μｌの洗浄バッファーで３回３分洗浄した。１００μｌの検出試薬を添加し、プレートをプレートシェーカー上で２３°で１時間、３００ＲＭＰでインキュベートした。２５０μｌの洗浄バッファーでさらに３回洗浄した後、１００μｌのＴＭＢをウェルに加え、プレートを７分間インキュベートし、光から保護した。１００μｌのＴＭＢ停止液を添加し、プレートリーダーで４５０ｎｍ、バックグラウンドを６２０ｎｍで結果を読み取った。検量線は、４パラメータロジスティック回帰（４ＰＬ）モデルを使用して計算された。
【０２１６】
本発明の組換えタンパク質、例えばセツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ、およびセツキシマブ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤの結合能力を特徴付けるために特別に設計されたＥＬＩＳＡアッセイでは、ｍａｘｉｓｏｒｐ  ９６ウェルプレートを、０．１Ｍ炭酸バッファー，ｐＨ９．６中の１μｇ／ｍｌのＲ−Ｈｕｍ−ｈＥＧＦＲ（細胞外ドメイン活性ＥＧＦＲ  ＡＡ  １−６４５、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  Ｏｎｌｉｎｅの製品番号ＡＢＩＮ２００１８４３）で４℃で一晩コーティングした。次にプレートをＰＢＳ，ｐＨ７．４、０．１％ｖ／ｖ  Ｔｗｅｅｎ−２０で４回洗浄し、２％スキムミルクを含む同じ洗浄バッファーで３７℃で２時間ブロックした。洗浄後、ｄｓＲＢＤ−ＬＣを１：１の段階希釈で加えた。０．１μｇ／ｍｌ〜０．００２μｇ／ｍｌの範囲のセツキシマブの検量線が含まれている。プレートを３７℃で４５分間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、ＰＢＳ０．１％ｔｗｅｅｎ−２０  ２％スキムミルクで１／２０００００に希釈したペルオキシダーゼ標識抗ヒトＩｇＧと３７℃で３０分間インキュベートした。プレートを上記のように洗浄し、１００μｌのＴＭＢ溶液を各ウェルに加えた。プレートを暗所で室温で２分間インキュベートし、５０μｌの１Ｍ硫酸を各ウェルに添加して反応を停止した。吸光度は４５０ｎｍで記録され、バックグラウンドは６２０ｎｍで補正された。市販のセツキシマブならびにタバコで発現されたＣＴＸの用量依存的な結合は、プロテインＡでの精製と、ｄｓＲＢＤ−ＬＣキメラのＥＧＦＲへの粗製ライセートによって示された（図１２を参照）。
【０２１７】
これらのデータは、タバコＣＴＸおよびｄｓＲＢＤ−ＬＣセツキシマブキメラが特定の方法でＥＧＦＲに結合できることを証明している。結合の特異性を確認するためにＥＧＦとの競合実験が行われる。
【０２１８】
実施例７−プロテインＡビーズタンパク質精製
植物由来のセツキシマブおよびセツキシマブ−ｄｓＲＢＤキメラをプロテインＡカラムを使用して精製する前に、プロテインＡアガロースビーズを使用して小規模精製を行い、プロテインＡ結合を検証した。結果は、セツキシマブとセツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤがｐＨ７．２でプロテインＡビーズに結合し、ｐＨ３で溶出したことを示した（図９）。さらに、精製前にライセートに現れる１７ｋＤａの軽鎖フラグメントは、溶出液には存在しない。
【０２１９】
しかしながら、おそらく重鎖へのｄｓＲＢＤの付加がプロテインＡ−Ｆｃ結合を遮るため、セツキシマブ−ＨＣ−ｄｓＲＢＤはプロテインＡビーズに結合できなかったようである。従って、プロテインＡカラム精製は、セツキシマブおよびセツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤのみで行われた。
【０２２０】
詳細には、４０μｌのＰｉｅｒｃｅプロテインＡアガロースビーズを各ドルフィンマイクロチューブに加え、５００μｌのＤＤＷで洗浄した後、スイングバケット遠心分離機で、２５００ｇで２分間遠心分離した。５００μｌのＩＰバッファー（２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ，ｐＨ７．２）で２回洗浄を繰り返した。９００μｌの調製済み植物試料をビーズに加え、回転させながら室温で２時間インキュベートした。試料を２５００ｇで２分間遠心分離し、上清を廃棄した。ビーズを５００μｌのＩＰバッファーで３回洗浄した。５０μｌの溶出バッファー（１００ｍＭクエン酸）をビーズと５分間インキュベートした後、２５００ｇで２分間遠心分離し、上清を収集した。溶出ステップを繰り返し、上澄みを合わせた。３７μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ，ｐＨ８．５を加えて溶出し、生理的ｐＨに戻した。
【０２２１】
実施例８−プロテインＡカラムタンパク質精製
高発現植物からのセツキシマブおよびセツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ植物ライセートを、ＡＫＴＡ設計クロマトグラフィーシステムを使用してプロテインＡカラムで精製した。溶出を酸性条件下で行い、画分を収集した。溶出ピークからの画分を、クーマシー染色およびウエスタンブロット分析のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで実行した。セツキシマブ精製では、重鎖と軽鎖がそれぞれ溶出画分に約５０ｋＤａと約２５ｋＤａで検出された（図１０）。
【０２２２】
セツキシマブ精製よりも少量の植物組織が使用されたため、セツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤ精製では、はるかに小さいピークがあった（図１１）。しかしながら、溶出画分のウエスタンブロット分析では、重鎖を表す約５０ｋＤａの明確なバンドと、ｄｓＲＢＤなしの軽鎖を表す約２５ｋＤａのバンドが示されているが、ＬＣ−ｄｓＲＢＤを表すバンドはない。ＬＣ−ｄｓＲＢＤをより適切に検出するために抗ＰＫＲ抗体を使用しても、バンドは検出されなかった（結果は示さない）。溶出したタンパク質の一部がＬＣ−ｄｓＲＢＤを含むように、より多くの植物組織が必要になる可能性があるか、または、処理プロセスのステップがＬＣ−ｄｓＲＢＤの劣化につながった可能性もある。現在、この問題を調査し、セツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤの精製に取り組んでいる。
【０２２３】
プロテインＡカラム精製に続いて、形成された可能性のあるタンパク質凝集体を除去するために、溶出されたタンパク質を濃縮し、ゲル濾過カラムにロードした。所望のバッファーでタンパク質画分を収集した後、タンパク質を再度濃縮し、−８０℃で凍結した。タンパク質濃度はＮａｎｏＤｒｏｐで測定した。精製されたセツキシマブの濃度は約１０ｍｇ／ｋｇで、精製されたセツキシマブ−ＬＣ−ｄｓＲＢＤの濃度は約１ｍｇ／ｋｇであった。
【０２２４】
詳細には、調製した植物抽出物を０．２μｍフィルターでろ過し、ＡＫＴＡクロマトグラフィーシステムを使用してＨｉＴｒａｐプロテインＡ高性能１ｍｌカラムに通した。リン酸ナトリウム緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム，ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ）を使用してカラムを洗浄した。溶出は、１００ｍＭクエン酸，ｐＨ３で行った。最終的なｐＨが７．４に達するのに必要な容量で中和バッファー（Ｔｒｉｓ，ｐＨ９．５）を含むチューブに分画を集め、ＳＤＳ  ＰＡＧＥで分析した。タンパク質を含む画分を合わせ、濃縮し、ゲルろ過カラムを使用して精製した。タンパク質を含む画分を再び合わせ、濃縮し、−８０°で凍結した。ＮａｎｏＤｒｏｐを使用してタンパク質濃度を測定した。
【０２２５】
実施例９−大規模精製
より大規模な精製では、キメラタンパク質であるプロテインＡセルロース結合ドメイン（ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤ）が使用される（Ｅ．Ｓｈｐｉｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  ｆｕｓｅｄ  ｔｏ  ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｄｏｍａｉｎ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０００，ｖｏｌ．３１（３），ｐ．１９７）。このキメラタンパク質では、ＩｇＧ分子のＦｃに特異的に結合するプロテインＡ（ＰｒｏｔＡ）がセルロース結合ドメインに融合している。セルロースは非常に低価格で多くの形態で市販されているため、アフィニティ精製の魅力的なマトリックスである。タバコ植物は、組換えセツキシマブまたはセツキシマブ−ｄｓＲＢＤを高収量で、ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤを発現するタバコ植物と異種交配される。したがって、これらの交雑植物では、発現した組換え抗体はＦｃを介してＰｒｏｔＡ−ＣＢＤに結合する。タンパク質抽出後、ニトロセルロースをタンパク質抽出物に加え、０．２ミクロンのホロファイバー（ｈｏｌｏｆｉｂｅｒ）でろ過する。ＰｒｏｔＡ−ＣＢＤ−抗体化合物はニトロセルロースに結合し、ホロファイバーを通過できないが、他の不要なタンパク質は通過して廃棄される。一連のｐＨ変化と洗浄により、組換えタンパク質がＰｒｏｔＡ−ＣＢＤから放出されて溶出し、次の実験ですぐに使用できる。
【０２２６】
実施例１０−キメラタンパク質の重鎖および軽鎖の構築
キメラタンパク質の重鎖および軽鎖の構築は、使用された発現系の細胞、例えばタバコ植物の細胞で行われた。
【０２２７】
軽鎖と重鎖は別々に発現され、ＳＳ結合（各重鎖と軽鎖内、および重鎖と軽鎖の間の両方）を形成し、２つの重鎖と２つの軽鎖で構成される最終構造に折りたたまれる。これは、細胞機構を使用して細胞内で発生するプロセスである（Ｆｅｉｇｅ  ａｎｄ  Ｂｕｃｈｎｅｒ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｌｄｉｎｇ  ａｎｄ  ａｓｓｅｍｂｌｙ，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｃａ  ｅｔ  Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａ  Ａｃｔａ（ＢＢＡ）  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，２０１４，ｖｏｌ．１８４４（１１），ｐｐ．２０２４−２０３１、Ｍａ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｓｓｅｍｂｌｙ  ｏｆ  ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ｗｉｔｈ  ＩｇＧ１  ａｎｄ  ＩｇＡ  ｈｅａｖｙ  ｃｈａｉｎ  ｄｏｍａｉｎｓ  ｉｎ  ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ  ｔｏｂａｃｃｏ  ｐｌａｎｔｓ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９４．２４：１３１−１３８）。
【０２２８】
実施例１１−セツキシマブキメラのポリＩＣ結合
セツキシマブキメラがポリＩＣに結合する能力を評価するために、電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）テストが実行される。異なる量の精製されたキメラをｄｓＲＮＡ（すなわち、Ｃｙ３標識ポリＩＣまたは定義された長さのｄｓＲＮＡ）とインキュベートし、アガロースゲルで電気泳動する。ゲルの可視化後、キメラとインキュベートしたｄｓＲＮＡの移動を、キメラなしのｄｓＲＮＡと比較する。移動の遅延は、キメラがｄｓＲＮＡに結合する能力を示している。
【０２２９】
実施例１２−セツキシマブキメラの生物活性
軽鎖のＮ末端にｄｓＲＢＤが付着したセツキシマブキメラは、ＥＧＦＲに結合することができる。ＥＧＦＲに結合するキメラの能力は、ＥＧＦＲでコーティングされたプレート上で行われるＥＬＩＳＡによって示された。プレートに付着したＥＧＦＲの後にセツキシマブまたはｄｓＲＢＤ−セツキシマブキメラ、続いてペルオキシダーゼコンジュゲート抗ヒトＩｇＧが続いた。ＥＧＦＲへのポリＩＣあり、ポリＩＣなしのセツキシマブ−ｄｓＲＢＤキメラの結合は、市販のセツキシマブの結合に匹敵した。
【０２３０】
結合がＥＧＦＲに特異的であることを確認するために、遊離ＥＧＦを用量を増やしながら追加する。ＥＧＦＲへの結合についてＥＧＦがキメラと競合するかどうかが試験され、それによりＥＬＩＳＡにおいてペルオキシダーゼ結合抗ＩｇＧで得られるシグナルが減少する。キメラの細胞毒性は以下のアッセイで示される。
【０２３１】
生存アッセイ：ＥＧＦＲ過剰発現細胞を９６ウェルプレートに播種する（ウェルあたり５０００細胞）。翌日、培地を交換し、細胞を、ポリＩＣ、セツキシマブ、セツキシマブ−ｄｓＲＢＤキメラ（「ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤ」）、またはセツキシマブ−ｄｓＲＢＤキメラでプレインキュベートしたポリＩＣ（「ポリＩＣ／ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤ」）で、所定の比率で処理する。細胞生存率は、処理の７２時間後にメチレンブルー比色アッセイで測定される。
【０２３２】
ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤは、ポリＩＣがない場合、セツキシマブと同じくらい効果的である（細胞株に応じて、２０〜８０％の生存率になる）。しかし、ポリＩＣ／ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤは、セツキシマブの影響をほとんど受けない細胞、例えばＭＤＡ−ＭＢ−４６８の生存率を大幅に低下させる。
【０２３３】
細胞周期分析：ＥＧＦＲ過剰発現細胞を６ウェルプレートに播種する（ウェルあたり５００，０００細胞）。翌日、培地を交換し、細胞を異なる濃度のポリＩＣ、セツキシマブ、ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤ、またはポリＩＣ／ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤで４８時間処理する。細胞をトリプシンで解離させ、５００ｇで１０分間遠心分離する。細胞ペレットをＰＢＳで２回洗浄し、液体窒素中で凍結融解サイクルを繰り返すことにより細胞膜を損傷させる。あるいは、細胞を固定し、エタノールで透過処理することができる。細胞を０．２ｍｌのリボヌクレアーゼＡ（１ｍｇ／ｍｌ）と共にインキュベートし、０．２ｍｌのヨウ化プロピジウム溶液（１００μｇ／ｍｌ）で染色する。細胞の蛍光は、フローサイトメトリー、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して分析される。細胞周期の分布は、適切なソフトウェアを使用して計算される。手順を簡素化するために、ＢｉｏＶｉｓｉｏｎのＥＺ  Ｃｅｌｌ  Ｃｙｃｌｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓキットなど、さまざまなキットを利用できる。
【０２３４】
ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤは、ポリＩＣがない場合、セツキシマブと同様にＧ１で細胞を停止する。我々は、ポリＩＣ／ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤがほとんどの細胞をアポトーシスに駆動し、残りの細胞がＧ１で停止する可能性があることを予測している。
【０２３５】
アポトーシスアッセイ：ＥＧＦＲ過剰発現細胞を２４ウェルプレートに播種する（ウェルあたり１００，０００細胞）。翌日、培地を交換し、細胞を、ポリＩＣ、セツキシマブ、ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤ、またはポリＩＣ／ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤで所定の比率で８時間処理する。アネキシンＶ／ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色は、製造元のガイドラインに従ってＭＢＬ  ＭＥＢＣＹＴＯアポトーシスキットを使用して行われ、フローサイトメトリー、ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＡＲＩＡＩＩＩ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＵＳＡ）を使用して分析される。
【０２３６】
ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤは、ポリＩＣがない場合、低レベルのアポトーシス（＜２０％）を引き起こすが、ポリＩＣ／ＣＴＸ−ｄｓＲＢＤはほとんどの細胞をアポトーシスに導く。
【０２３７】
ウエスタンブロット分析：ＥＧＦＲ過剰発現細胞を６ウェルプレートに播種する（ウェルあたり５００，０００細胞）。翌日、培地を交換し、細胞を、ポリＩＣ、セツキシマブ−ｄｓＲＢＤ、またはセツキシマブ−ｄｓＲＢＤとプレインキュベートしたポリＩＣで異なる濃度で処理する。さまざまな時点で、沸騰Ｌａｅｍｍｌｉサンプルバッファー（１０％グリセロール、５０ｍｍｏｌ／Ｌ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ６．８、３％ＳＤＳ、および５％  ２−メルカプトエタノール）で細胞を溶解する。ライセートは、以下の、ＥＧＦＲ、ホスホ−ＥＧＦＲ、ＥＲＫ、ホスホ−ＥＲＫ、ＣＤＫ２、ホスホ−ｐ１３０、ホスホ−Ｒｂ、ｐ２７、ＢＣＬ２およびＢａｘ、カスパーゼ３、カスパーゼ９およびＰＡＲＰ、に対する抗体を用いるウエスタンブロット分析に供される。
【０２３８】
ＥＬＩＳＡ：ＥＧＦＲ過剰発現細胞を９６ウェルプレートに播種する（ウェルあたり５０００細胞）。翌日、培地を交換し、細胞をポリＩＣ、セツキシマブ−ｄｓＲＢＤ、またはセツキシマブ−ｄｓＲＢＤとプレインキュベートしたポリＩＣで、所定の比率で処理する。培地は２４時間後に収集され、インターフェロンガンマ誘発タンパク質１０（ＩＰ１０）、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）リガンド５（ＣＣＬ５）および腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）タンパク質が、ＡＢＴＳ  ＥＬＩＳＡ開発キット（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ）を使用して、製造元のプロトコルに従って定量される。インターフェロンベータ（ＩＦＮ−β）タンパク質は、生物発光ＥＬＩＳＡキット（ＬｕｍｉＫｉｎｅ）を使用して、製造元のプロトコルに従って定量される。
【０２３９】
ＰＭＢＣバイスタンダー効果：ＥＧＦＲ過剰発現細胞を６ウェルプレートに播種する（ウェルあたり５００，０００細胞）。翌日、培地を交換し、所定の比率でセツキシマブ−ｄｓＲＢＤとプレインキュベートしたポリＩＣで細胞を処理する。処理の４８時間後、２４ウェルプレートに２４時間早く播種し、０．５ｍｌの培地で増殖させた５００，０００個のＰＢＭＣに、トランスフェクト細胞からの０．５ｍｌの培地（「馴化培地」）を加える。次いで、馴化ＰＢＭＣからの０．１ｍｌの培地を、２４時間前に９６ウェルプレートに播種した追加の未処理のＥＧＦＲ過剰発現細胞（「指標細胞」）からの０．１ｍｌの培地と交換する。これらの細胞の生存は、ＰＢＭＣからの培地を添加してから４８時間後のメチレンブルーアッセイによって決定される。
【０２４０】
直接バイスタンダー効果：以前のアッセイと並行して、直接バイスタンダー効果を示すために、０．１ｍｌの馴化培地を使用して、９６ウェルプレートに２４時間早く播種し、０．２ｍｌ培地で増殖させた非トランスフェクトインジケーター細胞からの０．１ｍｌ培地を置き換える。これらの細胞の生存は、馴化培地を添加してから４８時間後にメチレンブルーを使用して測定される。
【０２４１】
活性化されたＰＢＭＣによるインビトロでの癌細胞の殺傷：ＥＧＦＲ過剰発現細胞２０，０００個を２４ウェルプレートに播種し、１０％ＦＣＳと抗生物質を補充した１ｍｌのＲＰＭＩ培地で一晩増殖させる。次に、細胞を、所定の濃度でセツキシマブ−ｄｓＲＢＤとプレインキュベートしたポリＩＣで処理する。２４時間後、５００，０００ＰＢＭＣ／ウェルを癌細胞に加え、さらに２４時間共培養する。アポトーシス細胞は、アネキシン−Ｖ−ビオチンキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｉｎｃ．）を使用して視覚化される。腫瘍細胞とＰＢＭＣを区別するために、腫瘍細胞はＦＩＴＣコンジュゲートＥＧＦＲ抗体（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、Ｉｎｃ．、緑色蛍光）で標識されている。細胞を蛍光顕微鏡で可視化し、デジタルカメラを使用して写真を撮る。あるいは、ＰＢＭＣを無視するゲーティングを使用して、ＦＡＣＳでアポトーシスを分析することもできる。
【０２４２】
結果：ＥＧＦＲ過剰発現細胞株をセツキシマブ−ｄｓＲＢＤ−ポリＩＣで処理すると、細胞増殖が阻害され、アポトーシス、Ｇ１集団、ｐ２７およびＢａｘが増加するが、ＣＤＫ２、ホスホ−ｐ１３０、ホスホ−Ｒｂ、ホスホ−ＥＧＦＲ、ホスホ−ＥＲＫ、およびＢＣＬ２が減少する。セツキシマブ−ｄｓＲＢＤ−ポリＩＣで治療すると、サイトカインとケモカインのレベルが上昇し、ＰＢＭＣを介したバイスタンダー効果だけでなく、直接的な効果が発生する。セツキシマブと組み合わせたポリＩＣの相乗効果により、セツキシマブ−ｄｓＲＢＤ−ポリＩＣによる治療によって誘発される効果は、セツキシマブの単剤療法によって引き起こされる効果を超える。
【図１Ａ】
2021516056.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
2021516056.tif 000011
【図６】
2021516056.tif 000012
【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
2021516056.tif 000017
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１０Ｃ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２】
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【配列表】
2021516056000001.app
【国際調査報告】
2021516056.tif 000024
2021516056.tif 000025
2021516056.tif 000026
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