(57)【要約】  本発明は、増幅のための微生物またはウイルスの核酸を含み、エボラ出血熱などの高病原性ウイルスの存在を検出するために使用することができる試料を調製する迅速で安全かつ正確な方法に関する。この方法は、溶媒および界面活性剤を含む試薬の存在下で試料を加熱することを含む。試薬および組成物も提供される。
2021532770.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリメラーゼによる微生物またはウイルスの核酸の直接増幅のために、１つ以上の微生物またはウイルス粒子を含有し得る対象から得られた試料を調製する方法であって、
前記方法が、前記試料を、界面活性剤、溶媒、および１つ以上の核酸ポリメラーゼを含む試薬の存在下で、容器内で少なくとも７０℃の温度に加熱することを含む、方法。
【請求項２】
前記微生物またはウイルスの核酸が、抽出されず、任意に、前記微生物またはウイルスの核酸が、アルコールで沈殿されず、任意に、エタノールで沈殿されない、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記試料の前記温度が、周囲温度に対して低下せず、任意に、前記試料が凍結されない、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記試料が、
ａ）加熱前、および／または
ｂ）前記加熱の後に、遠心分離されない、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記試料または試薬のいかなる部分も、
ａ）前記加熱の前に、および／または
ｂ）前記加熱の後に、前記容器から取り出されず、
前記試料が、前記容器に添加されると、前記容器からいかなる材料も取り出されない、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記試料が、粗製試料であり、任意に、前記試料が、
ａ）血液、
ｂ）尿、
ｃ）血清、
ｄ）血漿、
ｅ）糞便、
ｆ）脳脊髄液、
ｇ）スワブ、任意に目、耳、鼻もしくは口からのスワブ、および／または
ｈ）スワブの洗浄液から採取された溶出物の試料である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記試料が、粒子状または細胞性物質を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、哺乳動物試料、任意に、ヒト、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ウシ（ｃｏｗ）、ヒツジ、ブタ（ｐｉｇ）、イヌ、ラクダ、ウマ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ネコ、ラットマウス、フェレット、モルモット、ミンク、その他のモデル生物試料であるか、または鳥類試料であるか、または魚類試料である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記１つ以上の微生物またはウイルス粒子が、
ａ）ウイルス、細菌、真菌からなる群、および／または
ｂ）クラス４もしくは３の病原体、および／または
病原体であって、
ｃ）エボラ出血熱、ラッサ熱、マールブルグウイルス病、リフトバレー熱、コンゴ熱、および黄熱からなる群から選択されるウイルス性出血熱、ならびに／または
ｄ）日本脳炎、デング熱、ジカ熱、チクングニア熱、
ｅ）ＰＰＲＶ、ＦＭＤＶ、ＢＴＶ、ニューカッスル病、ブタインフルエンザ、ＢＶＤＶが挙げられるが、これらに限定されない、ウイルス血症成分を有する獣医学的疾患、
ｆ）マラリア、ＨＩＶ、ウイルス性肝炎、土壌伝播蠕虫寄生虫感染からなる群から選択される疾患を引き起こす病原体、から選択され得る、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ウイルス粒子が、ＲＮＡゲノムを含むウイルス粒子である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記試料が、ＰＣＲを阻害する、物質を含むか、または物質を放出し、任意に、加熱するとＰＣＲを阻害する、物質を放出する、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記試薬が、前記１つ以上のポリメラーゼと適合性である、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記試薬が、前記１つ以上のポリメラーゼが供給される前記試薬と適合性である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記試薬が、ＲＮＡ分解を最小化し、任意に、マグネシウムカチオンによるＲＮＡの非特異的触媒作用を最小化する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試薬が、Ｔｒｉｓを含まない、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１６】
前記試薬が、ビシンを含み、任意に２０ｍＭ〜７０ｍＭのビシン、任意に２５ｍＭ〜６５ｍＭのビシン、任意に３０ｍＭ〜６０ｍＭのビシン、任意に３５ｍＭ〜５５ｍＭのビシン、任意に４０ｍＭ〜５０ｍＭのビシン、任意に５０ｍＭのビシンを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試薬が、トリシンを含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記試薬が、二価カチオンを緩衝する、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記溶媒がグリセロールであり、および／または前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ、任意にＴｗｅｅｎ２０である、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記試薬がＴｗｅｅｎ、任意に、Ｔｗｅｅｎ２０を、最大０．４％の濃度で含み、任意に、Ｔｗｅｅｎを、
ａ）少なくとも０．０２５％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、および／または
ｂ）０．４％、０．３５％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１５％、０．１％、０．０７５％、０．０５％、０．０２５％未満、および／または
ｃ）０．０２５％〜０．４％、０．０５％〜０．３５％、０．０７５％〜０．３％、０．１％〜０．２５％、０．１５％〜０．２％、の濃度で含み、
任意に、ｔｗｅｅｎの前記濃度が、０．１５％〜０．４％である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記試薬が最大１１％の濃度でグリセロールを含み、任意に、前記試薬が１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％以下のグリセロールを含み、任意に、グリセロールの濃度は約８％〜９％の間である、請求項１〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記試薬が、約７０℃〜１００℃、任意に７２℃〜９８℃、７４℃〜９６℃、７６℃〜９４℃、７８℃〜９２℃、８０℃〜９０℃、８２℃〜８８℃、または８４℃〜８６℃の温度で、約６．５〜７．５のｐＨであり、任意に、前記試薬が、７０ＣでｐＨ７．４５であり、および／または９５℃でｐＨ７．０である、請求項１〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記試薬が、少なくとも２つの異なるポリメラーゼ酵素を含む、請求項１〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ポリメラーゼが、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、任意に、Ｂｉｏｎｅｅｒ  Ｒｏｃｋｅｔｓｃｒｉｐｔである、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記ポリメラーゼが、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、任意に、ｔｔｈまたはｔｌｉ（Ｖｅｎｔ）ポリメラーゼである、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試薬が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する別個のポリメラーゼと、を含む、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記試薬が、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有するポリメラーゼを含み、任意に、前記ポリメラーゼが、
ａ）ＴＴＨポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）［配列番号３］
ｂ）Ｈａｗｋ  Ｚ０５（Ｒｏｃｈｅ）、［配列番号４］
ｃ）ＷＯ２０１４／０２３３１８に記載されているポリメラーゼ
ｄ）配列番号１、２、３、４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリメラーゼであって、任意に、前記ポリメラーゼは、以下の突然変異：配列番号１、２、３、または４に関するＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ、Ｍ７４７Ｋ、Ｌ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ、Ｅ７７３Ｇ、およびＬ７８９Ｆのうちの１、２、３、４、５、６、７、または８個を含む、ポリメラーゼ、
ｅ）Ｍ１／Ｍ７４７Ｋ酵素［配列番号２］に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリメラーゼ、からなる群から選択される、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性および前記ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方が同じ補因子を必要とし、任意に、両方が補因子としてマグネシウムカチオンを必要とする、請求項１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記ウイルスが、ＲＮＡウイルスであり、前記ポリメラーゼが、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、任意に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する、請求項１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記試料が、
ａ）約７０℃〜１００℃、任意に７２℃〜９８℃、７４℃〜９６℃、７６℃〜９４℃、７８℃〜９２℃、８０℃〜９０℃、８２℃〜８８℃、または８４℃〜８６℃に、および／または
ｂ）少なくとも７２℃、７４℃、７６℃、７８℃、８０℃、８２℃、８４℃、９６℃、８８℃、９０℃、９２℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃または１００℃以上に加熱される、請求項１〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記試料が、必要な温度に、
ａ）０．５秒〜５秒、１秒〜４．５秒、１．５秒〜４秒、２秒〜３．５秒、または２．５秒〜３秒、および／または
ｂ）少なくとも０．５秒、１秒、１．５秒、２秒、２．５秒、３秒、３．５秒、４秒、４．５秒、または少なくとも５秒、および／または
ｃ）５秒、４．５秒、４秒、３．５秒、３秒、２．５秒、２秒、１．５秒、１秒、０．５秒、０．２５秒未満、加熱される、請求項１〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が、
ａ）７４℃〜８４℃、任意に１秒間、または
ｂ）９０℃超で１秒間、加熱される、請求項１〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記試料が、前記試料と試薬との総量の少なくとも５％、任意に、少なくとも６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％以上を構成し、任意に、前記試料と試薬との総量の１３％を構成する、請求項１〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記方法が、現場ベースである、請求項１〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が、以前に処理されておらず、任意に、前記試料が、前記対象から直接採取され、前記容器に直接添加されている、請求項１〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記試薬が、血液凝固を助ける薬剤を含む、請求項１〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
対象から得られた試料中に存在する微生物またはウイルスの核酸を増幅する方法であって、前記試料が、請求項１〜３６のいずれか一項に従って調製され、続いて前記微生物またはウイルスの核酸の増幅が行われる、方法。
【請求項３８】
前記増幅が、ＰＣＲを使用して実施される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記増幅が、ＰＣＲの前に逆転写ステップ、任意に、逆転写ＰＣＲ、任意に、リアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を伴う、請求項３７または３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記増幅が、ＰＣＲの前に、２つ以上の逆転写ステップ、任意に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０または２０ステップを超える逆転写を伴う、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記逆転写を促進させる前記淳方向プライマーが、前記ＰＣＲを促進させる前記順方向プライマーと同じである、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記逆転写を促進させる前記順方向プライマーの前記融点が、ＰＣＲを促進させる前記順方向プライマーの前記融点とは異なり、その結果、前記反応の前記温度に応じて、ａ）逆転写が起こるか、ｂ）ＰＣＲが起こるか、またはｃ）逆転写とＰＣＲの両方が同時に起こり、任意に、前記プライマーの前記融点における前記差が、約５Ｃである、請求項３９〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
１つ以上のプライマーが、１つ以上のＬＮＡ、ＺＮＡおよび／またはＢＮＡ修飾を含み、任意に、前記逆方向プライマーが、１つ以上のＬＮＡ、ＺＮＡおよび／またはＢＮＡ修飾を含む、請求項３８〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記逆転写反応の前記温度が、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの前記融解温度よりも低い、請求項４０〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記増幅が、４０ｂｐ〜５００ｂｐ、任意に５０ｂｐ〜４５０ｂｐ、任意に６０ｂｐ〜４００ｂｐ、任意に７０ｂｐ〜３５０ｂｐ、任意に８０ｂｐ〜３００ｂｐ、任意に９０ｂｐ〜２５０ｂｐ、任意に１００ｂｐ〜２００ｂｐ、任意に約１５０ｂｐ、任意に６０ｂｐ〜１００ｂｐの長さのアンプリコンをもたらす、請求項４０〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記増幅が、請求項１〜３７のいずれか一項に従って前記試料が調製された前記容器と同じ容器内で行われる、請求項３８〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記試料および試薬が前記容器内に入ると、前記容器は密閉され、前記調製および増幅反応全体を通して再び開かれることはない、請求項３８〜４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４８】
前記試料および試薬が前記容器内に入ると、前記試料または試薬のどの部分も、
ａ）前記加熱の前に、および／または
ｂ）前記加熱の後に、
ｃ）ＲＴの前に、および／または
ｄ）ＰＣＲの前に、および／または
ｅ）ＲＴ中、および／または
ｆ）ＰＣＲ中、および／または
ｇ）ＲＴ後、および／または
ｈ）ＰＣＲ後に、前記容器から取り出されない、請求項３６〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
前記増幅が、フルオロフォア標識プライマーまたはプローブを使用して行われ、任意に、前記フルオロフォアが、３００ｎｍ〜８００ｎｍの間の波長で励起し、かつ３００ｎｍ〜８００ｎｍの間の波長で発光し、任意に、前記フルオロフォアが、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＣＹ５のうちの１つ以上から選択される、請求項３８〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
前記試料および試薬が、前記逆転写酵素ステップと前記ＰＣＲステップとの間で操作されず、任意に、ワンステップＲＴ−ＰＣＲである、請求項３８〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
対象から得られた試料中の微生物またはウイルス粒子の存在を検出する方法であって、前記試料が、請求項１〜３７のいずれか一項に従って調製されているか、または前記微生物またはウイルス粒子からの前記核酸が、請求項３８〜５０のいずれか一項に従って増幅され、続いて、前記増幅された核酸が検出される、方法。
【請求項５２】
前記増幅が、アンプリコンの量に対応する蛍光シグナルをもたらす、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記検出が、分光光度計を用いて行われる、請求項５１または５２に記載の方法。
【請求項５４】
請求項１〜３８のいずれか一項に記載の試料の前記調製、または請求項３９〜５０のいずれか一項に記載の前記増幅方法、または請求項５１〜５３のいずれか一項に記載の前記検出方法で使用するための試薬であって、前記試薬が、界面活性剤、溶媒および１つ以上の核酸ポリメラーゼを含む、試薬。
【請求項５５】
前記試薬が、ＲＮＡ分解を最小限に抑える、請求項５４に記載の試薬。
【請求項５６】
前記試薬が、Ｔｒｉｓを含まない、請求項５４または５５に記載の試薬。
【請求項５７】
前記試薬が、ビシンを含み、任意に２０ｍＭ〜７０ｍＭのビシン、任意に２５ｍＭ〜６５ｍＭのビシン、任意に３０ｍＭ〜６０ｍＭのビシン、任意に３５ｍＭ〜５５ｍＭのビシン、任意に４０ｍＭ〜５０ｍＭのビシン、任意に５０ｍＭのビシンを含む、請求項５４〜５６のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項５８】
前記試薬が、二価カチオンを緩衝する、請求項５４〜５７のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項５９】
前記溶媒がグリセロールであり、および／または前記界面活性剤がＴｗｅｅｎ、任意にＴｗｅｅｎ２０であり
任意に、Ｔｗｅｅｎ、例えば、最大０．４％の濃度のＴｗｅｅｎ２０を含み、および／または最大１１％の濃度のグリセロールを含み、任意に、前記試薬が、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％以下のグリセロールを含む、請求項５４〜５８のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項６０】
前記試薬が、少なくとも２つの異なるポリメラーゼ酵素を含む、請求項５４〜５９のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項６１】
前記ポリメラーゼが、ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有するか、または、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有し、任意に、前記ポリメラーゼが、
ａ）ＴＴＨポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）［配列番号］
ｂ）Ｈａｗｋ  Ｚ０５（Ｒｏｃｈｅ）、［配列番号４］
ｃ）ＷＯ２０１４／０２３３１８に記載されているポリメラーゼ
ｄ）配列番号１、２、３、４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリメラーゼであって、任意に、前記ポリメラーゼは、以下の突然変異：配列番号１、２、３、または４に関するＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ、Ｍ７４７Ｋ、Ｌ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ、Ｅ７７３Ｇ、およびＬ７８９Ｆのうちの１、２、３、４、５、６、７、または８個を含む、ポリメラーゼ、
ｅ）Ｍ１／Ｍ７４７Ｋ酵素［配列番号２］に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリメラーゼ、からなる群から選択される、請求項５４〜６０のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項６２】
前記試薬が、血液凝固を助ける薬剤を含む、請求項５４〜６１のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項６３】
前記試薬が、ＰＣＲおよび／またはＲＴ−ＰＣＲおよび／またはＲＴ−ｑＰＣＲに必要な成分を含み、任意に、
１つ以上のプライマー、任意に、１つ以上のフルオロフォア標識プライマー、および／または
１つ以上の蛍光染料、
塩化マグネシウム、
ＢＳＡ、
ｄＮＴＰ、
アルギニン、
ランダムＲＮＡ、例えば酵母ＲＮＡ、および／または
凍結乾燥中に酵素活性を維持するために必要な賦形剤を含む、請求項５４〜６２のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項６４】
前記試薬の前記成分のうちの１つ以上が、凍結乾燥形態であり、任意に、容器内での凍結乾燥形態であり、任意に、ポリメラーゼ、ＢＳＡ、プライマー（複数可）、プローブ（複数可）またはｄＮＴＰのうちの１つ以上が凍結乾燥され、任意に、一緒に凍結乾燥される、請求項５４〜６３のいずれか一項に記載の試薬。
【請求項６５】
ＲＴ−ＰＣＲを実施する方法であって、前記方法が、２つ以上の逆転写ステップ、任意に、ＰＣＲの前に、またはＰＣＲ中に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０を超える逆転写のステップを含む、方法。
【請求項６６】
前記逆転写を促進させる前記逆方向プライマーが、前記ＰＣＲを促進させる前記逆方向プライマーと同じである、請求項６５に記載の方法。
【請求項６７】
前記逆転写を促進させる前記順方向プライマーの前記融点が、ＰＣＲを促進させる前記順方向プライマーの前記融点とは異なり、その結果、前記反応の前記温度に応じて、ａ）逆転写が起こるか、ｂ）ＰＣＲが起こるか、またはｃ）逆転写とＰＣＲの両方が同時に起こり、任意に、前記プライマーの前記融点における前記差が、約５Ｃである、請求項６５または６６に記載の方法。
【請求項６８】
１つ以上のプライマーが、１つ以上のＬＮＡ、ＺＮＡおよび／またはＢＮＡ修飾を含み、任意に、前記逆方向プライマーが、１つ以上のＬＮＡ、ＺＮＡおよび／またはＢＮＡ修飾を含む、請求項６５〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記逆転写反応の前記温度が、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの前記融解温度を超える、請求項６５〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記増幅が、４０ｂｐ〜５００ｂｐ、任意に５０ｂｐ〜４５０ｂｐ、任意に６０ｂｐ〜４００ｂｐ、任意に７０ｂｐ〜３５０ｂｐ、任意に８０ｂｐ〜３００ｂｐ、任意に９０ｂｐ〜２５０ｂｐ、任意に１００ｂｐ〜２００ｂｐ、任意に約１５０ｂｐの長さのアンプリコンをもたらす、請求項６５〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
ウイルス核酸が増幅に利用可能になる温度を決定するための方法であって、
ａ）前記方法が、請求項１〜３８のいずれか一項に記載の前記方法に従って複数の試料を調製することを含み、前記複数の試料が、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲの前に、異なる温度範囲のうちの１つにそれぞれ個別に加熱され、任意に、個々の試料が調製され、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、または９０Ｃのうちの１つに加熱され、任意に、７６、７７、７８、７９、８０、８１Ｃに加熱され、その後、
ｂ）ウイルス核酸の増幅、任意に、請求項３９〜５０のいずれか一項に記載の増幅が続き、その後、
ｃ）アンプリコンの検出、任意に、請求項５１〜５３のいずれか一項に従って前記アンプリコンの検出が続く、方法。
【請求項７２】
微生物またはウイルス感染の存在または非存在を診断するための方法であって、対象から得られた試料が、請求項１〜３８のいずれか一項に従って調製され、その後、
ａ）前記ウイルス核酸の増幅、任意に、請求項３９〜５０のいずれか一項に記載の増幅が続き、および／またはその後、
ｂ）アンプリコンの検出、任意に、請求項５１〜５３のいずれか一項に従って前記アンプリコンの検出が続き、
前記アンプリコンの存在の前記検出が、前記対象が前記微生物またはウイルス感染を有することを示している、方法。
【請求項７３】
界面活性剤、溶媒、および１つ以上の核酸ポリメラーゼを含むキットであって、任意に、前記界面活性剤、溶媒、および／または核酸ポリメラーゼが、請求項１〜７２のいずれか一項に従って定義される、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、微生物およびウイルス粒子の検出、特に粗製試料中の微生物またはウイルス粒子の検出に関する。
【背景技術】
【０００２】
辺境地において必要な場所で使用するために、例えば微生物またはウイルス感染の診断のために、迅速で、単純化され、比較的低コストの分子診断試験が必要とされている。関連する最近の例は、２０１４年のコンゴ民主共和国でのエボラ出血熱の大流行およびこの地域での現在も続いている大流行であろう。これらの環境で重要なのは、真に感染した患者をマラリアなどの他の原因で発熱している患者から分離できるように、患者を迅速にトリアージする機能である。エボラ出血熱のようなウイルス性出血熱は感染性が高いため、野戦病院で患者を迅速に正しく階層化することが不可欠である。同様に重要なのは、この状況で分子検査に通常使用される感染した患者の血液への曝露を最小限に抑えることにより、オペレータの安全性を最大化するための絶対的な要件である。病原体の診断は通常、任意の標的病原体の核酸を精製するための試料の核酸抽出を実行した後に実行され、これが、実験室研究員の主なリスクポイントである。したがって、最小限の実験施設を使用し、熟練したオペレータを必要としない、単純でバイオセーフな方法が必要である。
【０００３】
典型的に、エボラ出血熱などの高封じ込めレベルの病原体の存在をスクリーニングするための分子的方法は、検査を実行するオペレータを保護するために、追加レベルの生物学的安全性を要求する。これらのウイルス性出血熱をスクリーニングする最初のステップは、患者から静脈血を採取することである。試料を採取する個人は、典型的には、複数の手袋、防護服、およびフェイスマスクを含む、完全な個人用保護具を着用する。血液試料を採取することに続いて、収集容器の外側は、核酸抽出が行われる前にウイルスを非感染性にするように、漂白剤中に、その後、抗ウイルス薬、例えばグアニジンチオシアン酸塩に浸すことによって殺菌される。これらの既知の方法は、複数ステップの手順を含み、したがって、訓練されたユーザー、および実験室へのアクセスを必要とする。
【０００４】
このような検査のための静脈吸引に使用される典型的容積は、３〜６ｍｌであり、複数の液体の伝送およびキャップの取り外しを行う必要があることを考慮すると、病原体にさらされるリスクは高い。少量の血液など、少量を直接処理できれば、このさらされるリスクを最小限に抑えることができる。
【０００５】
より少量の試料、例えば血液が処理されると、オペレータの安全性を最大化するために、その後、感度の要件に課される負担が増加する。ＷＨＯのＲ＆Ｄの青写真（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｗｈｏ．ｉｎｔ／ｂｌｕｅｐｒｉｎｔ／ｅｎ／）は、発展途上国の低コスト診断のための検出レベルに好適であるものとして、３，０００ビリオン（ｖｉｒｉｏｎｓ）／ｍｌの全血のレベルを定義する。これは、ＨＩＶおよびＣ型肝炎を含み、かつ上で記載のウイルス性出血熱（エボラ出血熱、ラッサ熱、マールブルグ、リフトバレー熱、クリミアコンゴ熱、ニパ、黄熱病、デング熱など）を含む、幅広い疾患の検出を可能にする。３，０００ビリオン／ｍｌは、マイクロリットルあたり３ウイルス目標であるため、３，０００ビリオン／ｍｌの数字は、検出の下限の要求を提供し、かつ反応に直接追加される必要がある血液の容積上の案内を与える。
【０００６】
現在の方法の改善は、最も致命的な病原体のいくつかの高い発生率に一致する、特定の第三世界諸国のように、特に安全機器へのアクセスが制限されている場合、病原体のより安全な検出を可能にするように、要求される。
【０００７】
血液は、容易にアクセス可能であり、診断で日常的に使用されている、潜在的な病原体の供給源に一般的に使用されている。
【０００８】
病原体は、ｒｔＰＣＲを含む、ＰＣＲベースの診断を介して日常的に検出されている。しかしながら、ＰＣＲは典型的に、酵素増幅プロセスと、ｒｔＰＣＲなどの、ＰＣＲのいくつかの形式でＰＣＲ産物の存在を検出するために使用される光学系との両方の観点から、全血の存在によって阻害される。全血は、ヘム、鉄、免疫グロブリンなど、およびＰＣＲの実行に必要なポリメラーゼ酵素、またはＲＮＡ目標からの増幅に必要な逆転写酵素を阻害する他のものなどの阻害剤を含有する。同様に、リアルタイム処理で使用される蛍光体は、血液中のヘムなどの物質によって消光され、血液自体は、独自の吸光度および放射スペクトル有し、最終的な結果として、リアルタイムＰＣＲは、高濃度の血液の存在では信頼できないと考えられる。感度の負担（特に低量の血液を使用する場合）は、血液が、必然的に、ＰＣＲの全反応容積の、より大きな割合を形成する必要があり、反応の不透明性によるリアルタイムにＰＣＲを実行することができなくなる、ポイントに到達することを意味する。
【０００９】
上記を考慮して、血液試料を使用するＰＣＲベースの診断は、例えば、血漿もしくは血清をＰＣＲ反応に取り入れることができるようにするため、赤血球を除去することにおいて、ＰＣＲが溶解物中に存在するいかなる阻害物質もない状態で実行できるようにするため、病原体の核酸を抽出することにおいて、および／または赤血球がない状態で検出が実行できるようにするため、得られたＰＣＲ産物を抽出することにおいて、典型的に複数のステップが必要である。これらの複数のステップは、臨床医および実験室スタッフが感染しないようにするための検査機器、生物学的安全環境、ならびに安全機器を要求し、つまり、検出は、単純ではなく、かつ病原体の現場ベースの迅速な検出には好適でない。
【００１０】
ＰＣＲが全血の存在によって阻害されることは、十分に確立された事実であり、処理が完全に光学的に阻害される前に、反応に追加されることができる血液の量が非常に少ないため、直接採血ＱＰＣＲについての査読論文はほとんどない。追加されることができる血液の量、および記載されている方法論の量が比較的少量（＜５０ｕｌ）であることは、血液からの病原体の直接検出が、非常にまれにしか記載されていないことを意味する。標準的なＱＰＣＲの場合、Ｍｉｎｏｇｕｅら（Ｍｉｎｏｇｕｅ，  Ｔｉｍｏｔｈｙ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．「Ｃｒｏｓｓ−ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｓ  ｏｆ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ＰＣＲ  ｒｅａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｄｉｒｅｃｔ  ｔｅｓｔｉｎｇ  ｏｆ  ａｅｒｏｓｏｌ  ａｎｄ  ｂｌｏｏｄ  ｓａｍｐｌｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｗａｒｆａｒｅ  ａｇｅｎｔ  ＤＮＡ」、Ａｐｐｌｉｅｄ  ａｎｄ  ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ  ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ｖｏｌ．８０，４（２０１４）：１３２２−９）は、胞子を全血に直接スパイクすることを記載したが、これは、最大４％のみであり、いずれの遠心分離ステップについても批判的に記載していない。血液の存在下における逆転写酵素の使用に関する文献は、さらに少ないため、血液からの直接逆転写ＱＰＣＲに関する文献は、さらに少なくなっている。存在するものは、多数のリボソームＲＮＡがＰＣＲ目標として使用されることができる、マラリアのような寄生虫を中心としており、例えば、寄生虫ごとに数万のリボソームＲＮＡ転写物が存在する場合（Ｔａｙｌｏｒ  ＢＪ，Ｌａｎｋｅ  Ｋ，Ｂａｎｍａｎ  ＳＬ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  Ｄｉｒｅｃｔ  ｆｒｏｍ  Ｂｌｏｏｄ  Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ  Ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  Ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ  Ｍａｌａｒｉａ  Ｐａｒａｓｉｔｅ  Ｔｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  Ｓｅｔｔｉｎｇｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．２０１７；９７（２）：５３３−５４３）、またはウイルス力価が全血１ｍｌあたり数百万に達する可能性がある、エボラ出血熱のようなウイルスが存在する場合（Ｋａｖｉｔ  Ｓｈａｈ，Ｅｍｍａ  Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ａｄａｍ  Ｔｙｌｅｒ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｅｄ  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｌｉｎｄａ  Ｅａｓｔｅｒｂｒｏｏｋ，Ｄｉａｎｅ  Ｌｅｅ，Ｃｌａｉｒｅ  Ｃｌｅａｖｅｒ，Ｌｏｕｉｓｅ  Ｕｓｈｅｒ，Ｊａｎｅ  Ｅ  Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊａｍｅｓ  Ｐｉｔｍａｎ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｂ  Ｂｒｕｃｅ，Ｄａｖｉｄ  Ｅｄｇｅ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｌｅｅ，Ｎｅｌｓｏｎ  Ｎａｚａｒｅｔｈ，Ｄａｖｉｄ  Ａ  Ｎｏｒｗｏｏｄ，Ｓｔｅｒｇｈｉｏｓ  Ａｔｈａｎａｓｉｏｓ  Ｍｏｓｃｈｏｓ．Ｆｉｅｌｄ−ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，Ｒａｐｉｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｂｏｌａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  Ｂｌｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１７；ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ７ＳＣ０３２８１Ａ）である。全血によるＰＣＲの阻害は、ヘム化合物、免疫グロブリンを含有する鉄の��在によって、および単にカルシウムなどの血液中の競合するカチオンの存在によって引き起こされる多因子であることが示されている（Ｓｉｄｓｔｅｄｔ，Ｍａｊａ  ｅｔ  ａｌ．「Ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ，ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ  Ｇ，ａｎｄ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｉｎ  ｄｉｇｉｔａｌ  ａｎｄ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ」Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ａｎｄ  ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｖｏｌ．４１０，１０（２０１８）：２５６９−２５８３）。
【００１１】
血液細胞などの、細胞を溶解する方法は、例えば、ＷＯ２０１１／１５７９８９から既知である。しかしながら、ＷＯ２０１１／１５７９８９の方法は、必要な凍結および解凍サイクルを可能にするように、大量のエネルギーを必要とする。このような方法は、電池式のＰＣＲマシンを使用する病原体の現場ベースの検出には好適でない。
【００１２】
ＷＯ２０１６／１３９４４３は、血液試料に直接ＰＣＲを実行するための方法を開示している。しかしながら、この方法は、各ＰＣＲ反応で比較的少量の血液を使用することに制限されており、つまり、感度が制限され、特定の励起波長および放射波長にも制限される。ＣＹ５−ＢＨＱ２、ＨｉＬｙｔｅ６４７−ＱＸＬ６０７などの、好適である蛍光体の組み合わせが存在し、多重化の可能性を制限しているが、これらの波長は、一般的に使用される蛍光体の大部分とは相関していない。
【００１３】
これを考慮して、特に血液試料からの、病原体検出の単一ステップ、閉チューブＰＣＲベースの方法は、安価、かつ単純であり、電気へのアクセスが制限されている、現場使用に好適であるため、利用できない。ＢｉｏＦｉｒｅもしくはＳｍａｒｔＣｙｃｌｅｒなどの、全血を処理できる機器、またはアッセイは、上流での処理が必要であり、その性質上、核酸抽出処理を自動化するための絶対的な要求の効力によって、検査ごとにより複雑であり、したがって高価である。
【００１４】
ＢＧ  Ｒｅｓｅａｒｃｈは以前、粗製試料から細胞およびウイルスを直接溶解する方法、ＷＯ２０１１／１５７９８９  Ｋａｖｉｔ  Ｓｈａｈ  ｅｔ  ａｌ．Ｆｉｅｌｄ−ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，Ｒａｐｉｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｂｏｌａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  Ｂｌｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１７；ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ７ＳＣ０３２８１Ａ）、および全血の存在下でマルチプレックスリアルタイムＰＣＲの実行を可能にする関連する光学システム、ＷＯ２０１６／１３９４４３を記載している。
【００１５】
ＷＯ２０１１／１５７９８９に記載されている方法では、氷晶の損傷（ウイルスの場合）、細胞が融解したときの浸透圧ショック（真菌の場合）をもたらし、および療法の結果として、より複雑な標的（胞子および細菌など）に対して、生物を検出可能にした。しかしながら、凍結のプロセスは方法に時間を追加し、野外ではこれらの機械はバッテリー電源で稼働するため、凍結／融解は電力の大幅な消耗になる。したがって、本発明は、エボラ出血熱のような疾患に感染した患者の野外での診断検出を可能にする試薬および方法を提供し、検出までの時間、オペレータの病原体への曝露時間を短縮し、訓練されたオペレータの必要性を取り除き、大流行区域に実験室を設立する。
【００１６】
その場合、本発明が、出現する疾患の大流行に対応して、粗製試料から直接病原体を直接検出するのに特に有用であることは明らかであろう。本発明は、広範囲の粗製試料型および病原体群に適用可能である。さらに、新たに出現する病気の大流行に対応するための要件を満たすために、方法論に対する新しいアッセイを迅速に開発することが可能であり、すなわち、特定の病原体の検出に合わせて方法および試薬を最適化することが可能である。この手法は実証済みのＲＴ−ＱＰＣＲプロセスに基づいているため、重要な最適化ステップは、前述の試薬と組み合わせて、新たに遭遇した病原体を溶解および増幅できる熱プロセスを決定することである。しかしながら、本明細書から、本発明の特定の実施形態は、最適化を必要としないことが期待され、新たな病原体の感染を検出するために記載されるように使用できることが明らかであろう。
【００１７】
本出願人らは、本明細書に記載の方法および試薬を使用することによって、粗製試料の量、例えば、反応に添加することができる、血液の量を大幅に増加させることが可能であることを発見した。全血の場合、この量は、３５％を超える。これは、診断感度を高めるという複合的な利点を有するが、反応の最終容積を最小限に抑えることもできるため、より迅速な熱サイクルが可能になり、ポイントオブケア現場の設定で重要な検出までの時間が短縮される。追加的に、総反応容積を減らし、それに比例して試薬のコストを削減することによって、検査あたりのコストを大幅に削減する。
【００１８】
多数の血液感染性ウイルス感染は、ラッサ、ＣＣＨＦ、エボラ出血熱などを含む、遠隔地のリソース不足の環境で発見され、検出までの最短時間、使いやすさ、および検査あたりのコストがすべて重要である。ＷＨＯのＲ＆Ｄの青写真は、発展途上国の簡略化された分子診断が、３０００ビリオン／ｍｌの感度、および抗体ベースのアプローチと同等の検査あたりのコストを有するべきであると述べている。本発明は、これを達成し、感度を１０００ビリオン／ｍｌ未満に増加させ、側方流動免疫診断のそれよりもコストを削減する。記載された方法を使用するアッセイは、反応あたりわずか１５ビリオンを検出する可能性が示されているため、１５ｕｌの血液が追加されたと仮定すると、これが１０００ビリオン／ｍｌの最終感度になる。
【００１９】
試料が血液試料である場合、本出願人らは、ｐＨおよび補助剤の存在などの変数に基づく、いくつかの試薬混合物が、血液に対してより変性する可能性があることを発見した。その結果は、ＷＯ２０１６１３９４４３に記載されている光学システム（全血の存在下における多重検出のための高出力レーザーをベースとした分光法ベースのアプローチを記載している）が、そのような状況において、その出願（Ｋａｖｉｔ  Ｓｈａｈ，Ｅｍｍａ  Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ａｄａｍ  Ｔｙｌｅｒ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｅｄ  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｌｉｎｄａ  Ｅａｓｔｅｒｂｒｏｏｋ，Ｄｉａｎｅ  Ｌｅｅ，Ｃｌａｉｒｅ  Ｃｌｅａｖｅｒ，Ｌｏｕｉｓｅ  Ｕｓｈｅｒ，Ｊａｎｅ  Ｅ  Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊａｍｅｓ  Ｐｉｔｍａｎ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｂ  Ｂｒｕｃｅ，Ｄａｖｉｄ  Ｅｄｇｅ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｌｅｅ，Ｎｅｌｓｏｎ  Ｎａｚａｒｅｔｈ，Ｄａｖｉｄ  Ａ  Ｎｏｒｗｏｏｄ，Ｓｔｅｒｇｈｉｏｓ  Ａｔｈａｎａｓｉｏｓ  Ｍｏｓｃｈｏｓ．  Ｆｉｅｌｄ−ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，Ｒａｐｉｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｂｏｌａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  Ｂｌｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１７；ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ７ＳＣ０３２８１Ａ）に記載されている最大１３％もの血中濃度のリアルタイムＰＣＲシグナルを検出できなくなっていることである。この低下したパフォーマンスの理由は、より変性した試薬において、血液が赤い液体から変性タンパク質の「褐色」コロイド懸濁液に変わり、液体の不透明度が増加するためである。血液の割合が高くなると、暗褐色のコロイド懸濁液が形成され、光学データの収集が完全に防止される。本出願人らは、全血が４０％もの存在下で逆転写定量ＰＣＲ（ＲＴ−ＱＰＣＲ）を実行することができる試薬を処方することができたが、光学データがもはや識別できないため、この処理は、実行不可能である。
【発明の概要】
【００２０】
本発明は、試料中の微生物およびウイルス粒子を処理ならびに検出するための改善された試薬および方法を提供する。本発明は、試料が全血などの粗製試料である場合に特に有利である。本発明の方法は、典型的には、ウイルスまたは微生物の核酸が、例えば、標準的なＲＴ−ＰＣＲ反応によって増幅可能にする処理ステップ、任意の標的核酸が増幅される後続の増幅ステップ、および増幅された核酸が検出される検出ステップを伴う。この方法は、任意の励起および検出波長を使用できるため、任意のフルオロフォアまたは適切なアンプリコン検出色素または当技術分野において既知のリアルタイムＰＣＲケミストリーで使用することができる。これにより、同時にスクリーニングできる標的核酸標的、この場合は全血からの病原体の数が改善される。本発明の方法はまた、いくつかの以前の方法のように核酸抽出ステップまたは遠心分離を必要とせず、これは、本方法がはるかに単純であり、必要な実験装置および試料の取り扱いが少なくて済むことを意味する。
【００２１】
いくつかの実施形態では、本方法はまた、逆転写（ＲＴ）の複数のラウンドも伴う。これは、反応の感度を大幅に向上させ、血液などの粗製試料から直接、非常に少量のウイルスの存在を検出できることが示されている。
【００２２】
この方法は、ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５１１５６の教示と組み合わせて、全血中のウイルス性病原体を直接検出し、閉チューブ内で血漿を効果的に生成し、そこに含有される病原体を溶解し、次いで、目的の標的病原体に対してＲＴ−ＱＰＣＲを直接実行するためのシステムとして使用することができ、遠心分離ステップ後に、任意の凍結融解サイクルを実行できるため（ＥＰ２５８５５８１）、広範囲の標的病原体を直接増幅可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１Ａ】Ａ）８５、８７、８９、９１、９３、９５Ｃで１秒間の加熱を示している。
【図１Ｂ】Ｂ）７１／７３／７４／７６／７８／８０Ｃで４５秒間の加熱を示している。
【図１Ｃ】Ｃ）７８／７９／８０／８１／８２Ｃで２０秒間の加熱である。
【図２Ａ】Ａ）血清（０％の血液）、および９％の血液と１５％の血液中の１００個のビリオンからの核酸の増幅を示している。
【図２Ｂ】Ｂ）感染した動物の病変から単離された細胞からのＰＰＲＶウイルスの直接検出である。
【図２Ｃ】Ｃ）ＰＰＲＶに感染した動物からのブタ鼻腔スワブの連続希釈である。
【図２Ｄ】Ｄ）脳脊髄液からのエボラシュードウイルスの直接検出である。
【図２Ｅ】Ｅ）ａ）ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、ｂ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのいずれかを１０００細菌／ｒｘｎでスパイクした全血である。
【図２Ｆ】Ｆ）ウイルス培養物からのＣＣＨＦの直接検出である。
【図２Ｇ】Ｇ）凍結した感染患者試料からのラッサ熱の直接検出である。
【図３Ａ】Ａ）界面活性剤を含まず、６％のグリセロール、０．１％のｔｗｅｅｎおよび６％のグリセロール、ならびに０．２％のｔｗｅｅｎおよび６％のグリセロールで構成された最小量の溶媒を含む反応を示す。
【図３Ｂ】Ｂ）Ｔｗｅｅｎを０．６％、０．９％、および１．０％を用いた反応を示す。
【図３Ｃ】Ｃ）０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０と６％のグリセロールとを含む反応、および０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０と０％のグリセロールとを含む反応を示す。
【図３Ｄ】Ｄ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを含む反応を示す。
【図４】データを示している。
【図５】本発明の試薬が、ＲＮＡ分解から保護することを示すデータである。
【図６】反応に対するグリセロールの効果である。
【図７】血液沈下に対するｔｗｅｅｎの効果である。
【図８Ａ】逆転写酵素に対する複数の短い保持時間の効果である。
【図８Ｂ】逆転写酵素に対する複数の短い保持時間の効果である。
【図８Ｃ】逆転写酵素に対する複数の短い保持時間の効果である。
【図９】標識を使用した血液からのＰＣＲである。
【図１０】配列アラインメントである。
【図１１Ａ】粗製試料からの直接検出のさらなる例である。
【図１１Ｂ】粗製試料からの直接検出のさらなる例である。
【図１１Ｃ】粗製試料からの直接検出のさらなる例である。
【図１１Ｄ】粗製試料からの直接検出のさらなる例である。
【図１２】本試薬および方法が、反応量の最大３５％の全血で確実に機能することを示しており、興味深いことに、１２〜１６％の範囲で感度が向上しているようである。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
一態様では、本発明は、試料中に存在し得る標的微生物またはウイルス核酸の直接増幅のために試料を調製する方法を提供する。本発明者らは、場合によっては試料を加熱することで、ＰＣＲ試薬にアクセス可能で、かつ増幅可能な核酸を得るのに十分であり得るが、加熱だけでは信頼性がなく、一般には異なる標的微生物またはウイルスに広く適用できないことを見出した。これは特に、試料が粗製試料である場合、例えば、血液試料などの対象から得られた粗製試料であり、それ自体がＰＣＲ反応を阻害する化合物を含み得ることが多い場合である。
【００２５】
したがって、一態様では、本発明は、ポリメラーゼによる微生物またはウイルス粒子核酸の直接増幅のための１つ以上の微生物またはウイルス粒子を含有し得る対象から得られた試料を調製する方法を提供し、本方法は、容器内の試料を、界面活性剤、溶媒および１つ以上の核酸ポリメラーゼを含む試薬の存在下で、少なくとも７０℃の温度に加熱することを含む。
【００２６】
病原体診断の現在の方法は、通常、任意の標的病原体核酸を精製するために、試料の核酸抽出、例えば、塩／アルコール抽出の後に実行される。これは一般に、専用の実験施設の使用および訓練を受けた分子生物学者を必要とし、そのため、特に精巧な実験装置へのアクセスが制限されている国または地域で、新たに出現する病原体の大流行に対応するのには適していない。核酸抽出は、２つの理由で実行され、１つは、標的核酸を放出するために病原体が破壊されることを保証するためであり、もう１つは、ＰＣＲ阻害物質として分子診断アッセイの性能に悪影響を与え得る試料中に存在する阻害物質を除去するためである。
【００２７】
したがって、直接診断を実行するには、単一の閉チューブプロセスでこの機能の二重性を実現する必要がある。病原体を溶解／核酸を検出可能にする必要があり、試薬は、診断検出を行うのに十分な粗製試料の存在下で増幅プロセスを実行できる必要がある。例えば、エボラ出血熱の場合、症状を示す個体は、１ｅ６ビリオン／ｍｌ血液を超えるウイルス量を有し、このウイルス量は疾患の重症度とそれに伴う死亡リスクに直接関係しており、これは、粗製全血の各マイクロリットルが１０００個のゲノム標的を含有し、診断的有用性を有するであろうことを意味している（Ｈａｒｔｌｅｙ  ＭＡ、Ｙｏｕｎｇ  Ａ、Ｔｒａｎ  ＡＭＯｋｏｎｉ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＨＨ、Ｓｕｍａ  Ｍｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  Ｅｂｏｌａ  Ｓｅｖｅｒｉｔｙ：Ａ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｐｒｉｏｒｉｔｉｚａｔｉｏｎ  Ｓｃｏｒｅ  ｆｏｒ  Ｅｂｏｌａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ．ＰＬＯＳ  Ｎｅｇｌｅｃｔｅｄ  Ｔｒｏｐｉｃａｌ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １１（２）：ｅ０００５２６５．）。ＷＨＯは、３０００ビリオン／ｍｌの感度レベルを、辺境の貧困地域で使用するための単純で低コストの検査に適していると定義している。一例として、これは、ウイルス量が１０，０００ビリオン／  ｍｌ未満になる可能性がある発展途上国の状況で、Ｃ型肝炎およびＨＩＶなどの重要な疾患を検出するのに十分であるだろう。その結果、これらの場合、各マイクロリットルには３つのゲノム標的の領域しか含有しないため、大量の粗製試料を処理する必要がある。この方法論の好ましい試料型は、ウイルス性病原体の存在を検出することが目標である場合は全血であり、通常、血清および血漿は分子生物学研究所で使用される試料型である。血漿および血清は、抽出プロセスを経て偽陰性の結果を生成する可能性のある阻害化合物を回避するため、一般的に使用されている。血清および血漿を使用することの不利な点は、使用する遠心分離が試料中のウイルス力価を低下させる可能性があることである（Ｋｌｕｎｇｔｈｏｎｇ  Ｃ，Ｇｉｂｂｏｎｓ  ＲＶ，Ｔｈａｉｓｏｍｂｏｏｎｓｕｋ  Ｂ，ｅｔ  ａｌ．Ｄｅｎｇｕｅ  ｖｉｒｕｓ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ｗｈｏｌｅ  ｂｌｏｏｄ  ｆｏｒ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ  ＰＣＲ  ａｎｄ  ｖｉｒｕｓ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ．Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７；４５（８）：２４８０−５．）。したがって、血液などの試料に存在する微生物またはウイルスの病原体を直接検出するための理想的なアプローチは、全血の量などの試料を封止された反応容器に直接添加して、バイオセーフティーおよび感度を最大化し、いかなる微生物またはウイルス中に存在する核酸も増幅可能になることを保証し、直接増幅を実行することである。増幅可能とは、微生物またはウイルスの内部にある核酸が、プライマーおよびポリメラーゼ（複数可）などのＰＣＲ成分にアクセスできるようになることの意味、および血管の環境に存在する核酸を増幅することができるように、例えば、ＰＣＲ、または逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）、またはリアルタイム（ｒｔ）ＰＣＲ（ｒｔＰＣＲ）もしくは定量的（ｑ）ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）、または逆転写定量的ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰ��Ｒ）によって増幅することができるように、いかなる増幅阻害物質の影響も十分に軽減されることの意味が含まれる。
【００２８】
「直接増幅」とは、試料を調製する方法に従って、増幅、例えば、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲをそのまま試料に対して実施することができる、すなわち、核酸のさらなる処理を必要とせず、および増幅に必要な成分のすべてがすでに存在するか、または試料に添加されており、増幅が起こり得るという意味が含まれる。直接増幅とは、処理後に成分を試料から除去する必要がないこと、すなわち、試料を遠心分離して、増幅阻害物質を含むと考えられ得るペレット状の物質または別の画分を除去する必要がないという意味も含まれる。１つの好ましい実施形態では、容器は、増幅に必要なすべての成分を含み、その結果、試料が容器に添加されると、増幅が進行することができる。試料が添加されると、容器が増幅および検出に必要なすべての成分を含むものなどのいくつかの実施形態では、容器を封止することができ、再び開く必要はない。この方法は、ウイルスまたは微生物の核酸を直接増幅するための試料を調製するため、本発明の方法は、高病原性の微生物およびウイルスの検出において特に有用である。このような状況では、臨床医／現場作業員の病原体への曝露を可能な限り減らすことが重要である。本発明は、試料が採取されて容器に添加された後、臨床医／現場作業員が病原性物質に曝露される必要がないことを提供する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、この方法は、試料を調製するための閉チューブ法である。当業者は、閉チューブ法が意味するものを理解するであろうが、典型的には、試料が、調製、または下流の増幅および検出ステップに必要な成分とともに、容器に添加されると、容器が閉じられ、例えば、キャップを閉じるか、容器の蓋を封止することによって、キャップまたは蓋が再び開かれることはない。例えば、閉チューブ法のいくつかの実施形態では、それ以上の材料は容器に添加されず、または容器からは除去されず、例えば、核酸は抽出されないか、またはいかなる方法でも精製されない。
【００３０】
したがって、一実施形態では、微生物またはウイルスの核酸は抽出されず、例えば、微生物またはウイルスの核酸は、アルコールで沈殿されず、例えば、エタノールで沈殿されない。当業者は、核酸抽出が何を意味するかを理解するであろうが、典型的には、その環境からの核酸の精製である。したがって、この実施形態では、核酸は、その元の環境から除去されず、すなわち、試料および試薬の他の成分から除去されない。この実施形態および他の実施形態では、核酸は精製されておらず、すなわち、細胞またはウイルスの他の成分から分離されていない。
【００３１】
同じ、もしくは異なる実施形態では、調製ステップのどの段階でも、試料または試薬のどの部分も容器から取り出されず、例えば、
ａ）該加熱の前に、および／または
ｂ）該加熱の後に、試料または試薬のどの部分も容器から取り出されない。
【００３２】
一実施形態では、試料が容器に添加されると、容器からいかなる材料も除去されない。さらなる実施形態では、調製、増幅、および検出中に、容器からいかなる材料も取り出されない。このような実施形態では、不可逆ロックを含む容器を使用することができ、その結果、試料が添加され、容器が封止されると、容器を再び開くことができない。このような容器は、ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５１１５６に記載されている。一実施形態において、容器は、生物学的安全容器であると考えられる。当業者は、生物学的安全という用語が何を意味するかを理解するであろう。一実施形態において、生物学的安全手段は、容器内に含有される病原体のいずれも容器から逃れることができず、したがって、容器を取り扱う人が内部に含有されるいかなる病原体にも曝されることができないことを意味する。一実施形態において、生物学的安全容器は、ロックする蓋、またはキャップを有する。好ましくは、生物学的安全容器は、炭素充填ポリマーなどの、耐破砕性の材料で作られている。別の実施形態において、生物学的安全容器はまた、密封において２つのセキュリティポイントを有する。
【００３３】
好ましい一実施形態において、本発明の容器は、増幅反応、例えば、ＰＣＲ反応における使用に好適であり、任意に、逆転写（ＲＴ）ＰＣＲにおける使用に好適であり、任意に、定量（ｑ）ＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲにおける使用に好適である。このような反応における使用に好適な容器は、典型的には、厚さがおよそ０．５〜０．８ｍｍの薄い壁を有し、炭素充填ポリマーで作られている。これは、１）熱の取得および損失をより速くすること、２）反応容器ホルダ／チューブ／液体内容物間の遅れを減少すること、の２つを行う。
【００３４】
増幅のために試料を調製するいくつかの既知の方法は、試料を繰り返し凍結融解することを伴う。このような方法は現在の方法での使用に適しているが、試料を凍結する必要はない。凍結融解はエネルギー集約的であるため、これは、このような方法に対する本発明の利点であり、例えば、サーマルサイクラーが電池式である主電源へのアクセスが不十分な国において、このような方法が現場での使用に最適ではないことを意味する。本発明は、この欠点に対処する。
【００３５】
したがって、一実施形態では、試料の温度は、周囲温度に対して低下せず、任意に、試料は凍結されない。
【００３６】
核酸増幅用の試料を調製する他の手段は、試料の遠心分離を伴い、遠心分離により、ａ）アンプリコンの検出を妨げる粒子状物質を破壊することができ、およびｂ）ＰＣＲ阻害物質を含む可能性のある物質を破壊することができる。しかしながら、凍結融解法と同様に、遠心分離には追加の実験装置およびエネルギーが必要である。上で論じたように、遠心分離はまた、いくつかのウイルスまたは微生物の物質を除去することができ、これは、増幅においてテンプレートとして作用するために利用可能な標的核酸がより少ないことを意味する。本発明は、より単純で、低エネルギーで、スキルを必要とせず、分光光度計の光路を妨害する粒子状物質および増幅阻害に関する問題に対処する。増幅の阻害は、例えば、血液、尿素、または唾液に存在する阻害物質に耐性のある酵素を選択するなど、適切なポリメラーゼ酵素（複数可）を選択することによってある程度軽減することができる。当業者は、特定の試料型に耐性のある酵素を認識し、所与の試料型で使用するのに最も適切な酵素を決定する方法も認識している。
【００３７】
したがって、一実施形態では、試料は、
ａ）加熱前、および／または
ｂ）該加熱後の遠心分離されない。
【００３８】
しかしながら、遠心分離が適切な場合もあり、例えば、試料と試薬とを容器に引き込むだけでは、例えば、容器のキャップに凝縮している可能性がある。例えば、試料は、単に凝縮物を容器に引き入れるために、例えば、１〜２０００ｇの速度で５秒〜１５秒の間、パルス遠心分離されてもよい。
【００３９】
好ましくは、試料は粗製試料である。粗製試料とは、いかなる成分も添加されていないか、もしくは最小限の成分が添加されている試料および／または試料の組成を変更する処理ステップが、対象から試料を得た後に適用されていない試料の意味が含まれる。例えば、粗製試料は、以下のような粗製生物学的試料であり得る。
ａ）血液、任意に全血、
ｂ）尿、
ｃ）血清、
ｄ）血漿、
ｅ）糞便、
ｆ）脳脊髄液、
ｇ）スワブ、任意に目、耳、鼻もしくは口からのスワブ、および／または
ｈ）スワブの洗浄液から採取された溶出物。
【００４０】
いくつかの例示的な実施形態では、ヒト、および動物、もしくは環境表面、または別の固体試料型から採取したスワブを、水中、例えば２００ｕｌの水に入れ、ボルテックスしてウイルスまたは微生物粒子を放出することができる。次いで、この水を反応量の最大２０％で容器に添加することができる。同様に、液体環境試料を容器に直接添加することもできる。
【００４１】
当業者は、粗製試料が何を意味するかを理解するであろう。一実施形態では、粗製試料は、その本来の環境から標的核酸を精製する、例えば、血球、尿試料、糞便試料、髄液またはスワブから精製する試みがなされていない試料である。スワブの洗浄液から採取した溶出液は、この段階での標的核酸が依然として細胞性物質またはウイルス粒子に関連している可能性が高いため、粗製試料と見なされる。
【００４２】
本発明は動物の疾患の検出にも適用できるために、スワブ、またはスワブ溶出液を試料として使用する能力が重要である。獣医学の分野で最も一般的に使用されている試料の種類はスワブであり、これらは、疑いのある疾患に応じて、目、鼻、または口のいずれかから採取される。牛疫およびＰＰＲＶなどの多くの猛毒性の動物病原体は、ウイルス血症成分を有するが、経済的に重要ないくつかの疾患では、ウイルス性病原体が血中に見つかる時間枠は非常に限られている。しかし、これらの病気が風土病である辺境の貧困環境で血液からの直接アプローチを使用することには多くの不利な点がある。第１に、動物から血液試料を採取するには、訓練を受けた獣医師の介入が必要であり、第２に、一般の人が採取できる試料にアクセスするために、ウイルスがより簡単に見出すことができることである。この適用例は、核酸抽出に頼ることなく、口、目、または鼻から採取した拭き取り試料から直接ウイルス動物病原体の直接検出を実施するための方法を網羅している。本出願人らはまた、これが他の重要な疾患、例えば、ヒトの呼吸器疾患にも適用できることを確認した。スワブは、患者または動物から簡単に採取され、２００ｕｌの水が入ったプラスチックチューブに入れられ、チューブが振盪され、スワブからウイルス粒子が放出される。次いで、この液体のごく一部が、血液または前述の他の液体試料型の代わりに反応容器に直接移される。
【００４３】
粗製生物学的試料は、有機体から直接採取された任意の試料であると考えられる。本発明は、病原性感染症の診断においてその主な有用性を有すると考えられるが、粗製試料はまた、粗製環境試料であってもよく、その場合、主張の「対象」は、環境試料の表面または起源に関連するよう採取することができる。粗製環境試料とは、食品試料、表面などの環境から採取したスワブ、および有機体から直接採取されない他の試料型（この場合、有機体から直接採取された粗製生物学的試料と考えられる）などの試料の意味が含まれる。
【００４４】
粗製試料はまた、直接の粗製環境試料、例えば、小川または湖からの水の直接試料、土壌または他の環境物質の直接試料であってもよい。試料は、植物試料であってもよい。
【００４５】
粗製試料はまた、例えば現場における獣医病原体を検出するために使用する場合など、例えばオペレータへの感染性が高くない、病原体のための、全血からの血漿および血清の調製、または綿棒の洗浄からの溶出物など、試料の取得に続いて最小限の処理ステップが適用された試料であり得る。粗製試料には、防腐剤などの追加の成分が添加されている場合もあるが、これらは試料からの核酸のいかなる精製ももたらすとは見なされず、換言すれば、試料内の元々の物質はすべて存在したままである。血液試料の場合、保存のためにＥＤＴＡを試料に追加する場合があるが、試料は依然として粗製試料と見なされる。スワブおよび試料は、本発明の方法に従って調製する前に凍結することができるが、好ましくは、方法は、少なくとも汚染および感染を最小限に抑えるために、直ちに、または対象から採取された試料に対してできるだけ速やかに実行される。
【００４６】
上述したように、処理された試料は、通常、標的核酸を増幅するための増幅反応で使用される。次いで、増幅された標的、またはアンプリコンは、増幅後または増幅中のいずれかに、例えば、ｑＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲを使用して検出される。当業者は、ｑＰＣＲおよびＲＴ−ｑＰＣＲが通常、染料およびプローブ化学を挿入または検出するフルオロフォアまたは他の適切な核酸の使用を必要とすることを理解するであろう。
【００４７】
当業者は、ｑＰＣＲが何を意味するかを理解するであろう。この場合、反応は、目標病原体がラッサなどの、高レベルの配列異質性を有する場合の、プライマーまたはプライマーのグループ、および目的の目標に特異的な配列であるプローブを含有する。これは、５´末端が蛍光体で標識され、３´が消光部分で標識されている加水分解プローブであることができ、増幅中にプローブは、酵素によって加水分解され、そのような蛍光は、サイクルごとに増加する。励起手段は、提供され、結果として生じる放射は、いくつかの実施形態において、キャップに位置している、容器の窓を通して捕捉される。
【００４８】
いくつかの好ましい実施形態では、フルオロフォアまたは染料は、例えば、フルオロフォアで標識されたプライマーまたはプローブの一部として、処理ステップ中に存在する。粗製試料は、典型的には、いくつかの実施形態では、蛍光体の励起および／または放射波長の捕捉を妨害すると考えられることができ、好適である蛍光体の選択を別の方法で妨害することができる、粒子状もしくは細胞性物質を含む。これらの問題を回避するための既知の方法は、遠心分離および／または試料によって吸収されない、例えば血液によって吸収されない波長、例えば遠赤色フルオロフォアで励起および発光する特定のフルオロフォアの組み合わせの使用を伴う。しかしながら、本方法で使用される試薬は、全血などの試料の凝集または凝固をもたらし、その結果、血管の基部に沈む大きな沈着物が形成されるため、これらの問題に対処する。本発明は、全血試料での使用に特に適しているが、提供される試薬は、タンパク質が豊富ないかなる試料中のタンパク質性物質も沈めるであろう。容器が実質的に攪乱または攪拌されたりしない限り、堆積物は容器の底部に残り、フルオロフォアの励起および発光に使用できる清澄化された最上層を残す。したがって、任意の波長で励起および発光するフルオロフォアまたは染料を、遠心分離ステップを必要とせずに、本発明で使用することができる。例えば、試料は、３００ｎｍ〜８００ｎｍの波長で励起され得、発光は、任意の波長、例えば、３００ｎｍ〜８００ｎｍで収集され得る。いくつかの実施形態では、ｑＰＣＲに関連する蛍光体を励起するように使用されている励起波長は、６３０ｎｍ〜６４５ｎｍであり、任意に６３３ｎｍ〜６４２ｎｍであり、および／または放射光は、６５０ｎｍ〜７５０ｎｍの波長で収集される。別の実施形態では、フルオロフォレは、およそ４７５ｎｍおよび／または６３５ｎｍの波長で励起されており、および／または放射光は、およそ５２０〜５０ｎｍおよび６６０〜７５０ｎｍの波長で収集されている。
【００４９】
一実施形態において、ＰＣＲは、４７５ｎｍおよび６３５ｎｍでのＬＥＤ励起、ならびに５２０〜５８０ｎｍおよび６６０〜７５０ｎｍの窓を有するデュアルバンドパスフィルタを使用する４００〜９００ｎｍでの放射の収集を伴う２色システムを使用する。
【００５０】
代表的なフルオロフォアとしては、ＦＡＭ、ＴＥＴ、ＪＯＥ、ＶＩＣ、ＨＥＸ、ＮＥＤ、ＰＥＴ、ＲＯＸ、ＴＡＭＲＡ、ＣＹ５が挙げられる。しかしながら、当業者は、本発明の方法では試料が励起または発光を妨害しないので、好適なフルオロフォアまたは染料の選択が、使用されるサーマルサイクラーの励起および収集能力によってのみ制限されることを理解するであろう。
【００５１】
本発明では必要とされないが、試料に対して遠心分離ステップを実行することが可能であり、これは場合によっては有益であり得る。例えば、遠心分離ステップを実行することによって、粗製試料、例えば、血液は、光路からより速く除去され得る。
【００５２】
試料が得られ、容器（ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５１１５６による容器であっても、またはそうでなくてもよい）に直接添加されるならば、安全の観点から好ましいと考えられる。当業者は、当然のことながら、試料を取得した後、試料が、反応容器に加える前に、例えば低温で、一定期間保存され得ることを理解するであろう。
【００５３】
上記のように、試料は典型的には、生物学的試料であり、例えば、哺乳動物、例えば、ヒト、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）、ブタ（ｓｗｉｎｅ）、ウシ（ｃｏｗ）、ヒツジ、ブタ（ｐｉｇ）、イヌ、ラクダ、ウマ、ラマ、ヤギ、ウサギ、ネコ、ラットマウス、フェレット、モルモット、ミンク、その他のモデル生物から採取された試料であり得る。他の実施形態では、試料は、鳥類から採取された試料である。他の実施形態では、試料は、魚類から採取された試料である。好ましくは、試料は、ヒト試料または乳牛からの試料である。
【００５４】
最終的に検出される微生物またはウイルス粒子は、任意の微生物またはウイルス粒子、例えば、ウイルス、細菌、原生動物または真菌のいずれかであり得る。好ましい実施形態では、微生物またはウイルスは、病原性微生物またはウイルス、例えば、Ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ａｇｅｎｔｓ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｆｏｒ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  ｔｈｅ  Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ，ＲＩＶＭ  Ｌｅｔｔｅｒ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２０５０８４００２によって分類されるクラス３または４の病原体である。
【表１】
2021532770.tif 000003
【００５５】
病原体は哺乳動物の病原体、例えば、ヒト病原体、ウシ（ｃａｔｔｌｅ）病原体、ブタ（ｓｗｉｎｅ）病原体、ウシ（ｃｏｗ）病原体、ヒツジ病原体、ブタ（ｐｉｇ）病原体、イヌ病原体、ラクダ病原体、ウマ病原体、ラマ病原体、ヤギ病原体、ウサギ病原体、ネコ病原体、ラット病原体、マウス病原体、フェレット病原体、モルモット病原体、ミンク病原体、または他のモデル生物病原体、もしくは鳥類病原体または魚類病原体である。
【００５６】
他の実施形態、または同じ実施形態では、病原体は鳥類の病原体である。したがって、一実施形態では、１つ以上の微生物またはウイルス粒子は、以下からなる群から選択され得る：
ａ）エボラ出血熱、ラッサ熱、マールブルグウイルス病、リフトバレー熱、コンゴ熱、および黄熱からなる群から選択されるウイルス性出血熱、ならびに／または
ｂ）日本脳炎、デング熱、ジカ熱、チクングニア熱、
ｃ）ＰＰＲＶ、ＦＭＤＶ、ＢＴＶ、ニューカッスル病、ブタインフルエンザ、ＢＶＤＶが挙げられるが、これらに限定されない、ウイルス血症成分を有する獣医学的疾患、
ｄ）マラリア、ＨＩＶ、ウイルス性肝炎、土壌伝播蠕虫寄生虫感染。
ウイルス血症とは、血液由来の成分を有するという意味が含まれる。
【００５７】
本発明は、ＲＮＡゲノムを有する微生物またはウイルスの調製、その後の増幅および検出において特定の有用性を有すると考えられる。
【００５８】
一実施形態では、ウイルス粒子は、ＲＮＡウイルス粒子である。いくつかの実施形態では、ＲＮＡウイルス粒子は、以下からなる群から選択されるか、または以下を含む：
アデノ随伴ウイルス、アイチウイルス、オーストラリアコウモリリッサウイルス、ＢＫポリオマウイルス、バンナウイルス、バルマ森林ウイルス、ブニヤムウェラウイルス、ブニヤウイルスラクロス、ブニヤウイルスカンジキウサギ、オナガザルヘルペスウイルス、チャンディプラウイルス、チクングニアウイルス、コサウイルスＡ、牛痘ウイルス、コクサッキーウイルス、クリミア−コンゴ出血熱ウイルス、デングウイルス、ドーリウイルス、ジュグベウイルス、デュベンヘイジウイルス、東部ウマ脳炎ウイルス、エボラウイルス、エコーウイルス、脳心筋炎ウイルス、エプスタイン−バーウイルス、欧州コウモリリッサウイルス、ＧＢウイルスＣ／Ｇ型肝炎ウイルス、ハンタンウイルス、ヘンドラウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、Ｅ型肝炎ウイルス、デルタ型肝炎ウイルス、ウマポックスウイルス、ヒトアデノウイルス、ヒトアストロウイルス、ヒトコロナウイルス、ヒトサイトメガロウイルス、ヒトエンテロウイルス６８、７０、ヒトヘルペスウイルス１、ヒトヘルペスウイルス２、ヒトヘルペスウイルス６、ヒトヘルペスウイルス７、ヒトヘルペスウイルス８、ヒト免疫不全ウイルス、ヒトパピローマウイルス１、ヒトパピローマウイルス２、ヒトパピローマウイルス１６、１８、ヒトパラインフルエンザ、ヒトパルボウイルスＢ１９、ヒト呼吸器合胞体ウイルス、ヒトライノウイルス、ヒトＳＡＲＳコロナウイルス、ヒトスプーマレトロウイルス、ヒトＴリンパ球向性ウイルス、ヒトトロウイルス、Ａ型インフルエンザウイルス、Ｂ型インフルエンザウイルス、Ｃ型インフルエンザウイルス、イスファハンウイルス、ＪＣポリオマウイルス、日本脳炎ウイルス、ジュニンアレナウイルス、ＫＩポリオマウイルス、クンジンウイルス、ラゴスコウモリウイルス、ビクトリア湖マールブルグウイルス、ランガットウイルス、ラッサウイルス、ローズデールウイルス、跳躍病ウイルス、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス、マチュポウイルス、マヤロウイルス、ＭＥＲＳコロナウイルス、麻疹ウイルス、メンゴ脳心筋炎ウイルス、メルケル細胞ポリオマウイルス、モコラウイルス、伝染性軟属腫ウイルス、サル痘ウイルス、ムンプスウイルス、マレー渓谷脳炎ウイルス、ニューヨークウイルス、ニパウイルス、ノーウォークウイルス、オニョンニョンウイルス、オルフウイルス、オロポーシェウイルス、ピチンデウイルス、ポリオウイルス、プンタトロフレボウイルス、プーマラウイルス、狂犬病ウイルス、リフトバレー熱ウイルス、ロサウイルスＡ、ロスリバーウイルス、ロタウイルスＡ、ロタウイルスＢ、ロタウイルスＣ、風疹ウイルス、サギヤマウイルス、サリウイルスＡ、ササシチョウバエ熱シチリアウイルス、サッポロウイルス、セムリキ森林ウイルス、ソウルウイルス、サル泡沫状ウイルス、シミアンウイルス５、シンドビスウイルス、サウサンプトンウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介ポワッサンウイルス、トルクテノウイルス、トスカーナウイルス、ウークニエミウイルス、ワクシニアウイルス、水痘帯状疱疹ウイルス、痘瘡ウイルス、ベネズエラウマ脳炎ウイルス、小胞口内炎ウイルス、西部ウマ脳炎ウイルス、ＷＵポリオマウイルス、西ナイルウイルス、ヤバサル腫瘍ウイルス、ヤバ様疾患ウイルス、黄熱病ウイルス、ジカウイルス。
【００５９】
本発明は、エンベロープウイルスおよび非エンベロープウイルスの両方の処理およびその後の増幅に適していると考えられる。
【００６０】
上記のように、試料は、界面活性剤、溶媒、および１つ以上の核酸ポリメラーゼを含む試薬の存在下で、容器内で少なくとも７０℃の温度に加熱される。好ましい実施形態では、試料のさらなる物理的操作は行われないか、または試料が添加されると容器にさらなる材料が添加されないので、界面活性剤および溶媒を含む試薬は、酵素が下流の増幅で機能することを可能にするために、１つ以上の核酸ポリメラーゼと適合性でなければならない。適合性とは、試薬が酵素の完全最大活性を実質的に維持する必要があることを意味する。例えば、酵素は少なくとも９８％、９６％、９４％、９２％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６５％、６０％の活性を保持する必要がある。当業者は、異なる試薬で使用された場合の、ポリメラーゼの最大活性およびポリメラーゼの活性の相対的変化を決定する方法を理解するであろう。例えば、裸のＲＮＡテンプレートを用いたリアルタイムＰＣＲ反応を実施することができ、例えば、酵素が供給される緩衝液を使用して、１００％の活性を提供すると見なすことができる。試薬の様々な成分の添加の効果は、例えば、ｔｗｅｅｎおよび／またはグリセロールを添加し、ポリメラーゼの性能を測定することによって決定することができる。いくつかの実施形態では、試薬の存在下でポリメラーゼを用いて増幅が起こる場合、すなわち任意の量の増幅が行われる場合、試薬はポリメラーゼと適合性がある。したがって、一実施形態では、試薬は１つ以上のポリメラーゼと適合性がある。実際には、特定の試薬成分の存在下での反応のＣｔが、試薬成分の非存在下での反応のＣｔの０．５以内であることが適切であると考えられる。
【００６１】
当業者は、試薬のどの成分が特定のポリメラーゼと適合性があるかを理解するであろう。
【００６２】
さらに、同じ、もしくは代替の実施形態では、試薬は、１つ以上のポリメラーゼが供給される試薬と適合性がある。当業者は、典型的には市販のポリメラーゼが液体の形で供給され、したがってすでに様々な成分に関連していることを理解するであろう。いくつかの状況では、ポリメラーゼが供給される試薬と、ポリメラーゼの活性を低下または阻害する可能性がある本発明の試薬との間に相互作用があり得ると考えられる。上記のように、当業者はこれを認識し、本発明の試薬が酵素の試薬と適合性であることを確実にするための措置を講じることができる。
他の実施形態では、ポリメラーゼは凍結乾燥されて供給され、その場合、ポリメラーゼはまだいずれの試薬とも結合しておらず、したがってこの適合性は問題ではない。好ましくは、ポリメラーゼは、試料が添加される容器内で凍結乾燥されて供給される。
【００６３】
当業者は、ポリメラーゼが純粋な酵素液相で、すなわち酵素がまだいずれの試薬にも含まれていない場合、または関連する貯蔵緩衝液なしで供給され得る場合にも供給され得ることに気付くであろう。
【００６４】
場合によっては、標的核酸がＲＮＡであるため、追加の問題は、放出されたＲＮＡ自体の熱安定性である。当業者は、ＲＮＡが、塩基性溶液中の二価カチオンの存在下で分解することに承知している（Ｖａｌｌｅｓ  ＳＭ，Ｓｔｒｏｎｇ  ＣＡ，Ｂｕｓｓ  ＥＡ，Ｏｉ  ＤＨ．Ｎｏｎ−ｅｎｚｙｍａｔｉｃ  ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＲＮＡ  ｉｎ  ｗｏｒｋｅｒｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ａｎｔ  Ｎｙｌａｎｄｅｒｉａ  ｐｕｂｅｎｓ．Ｊ  Ｉｎｓｅｃｔ  Ｓｃｉ．２０１２；１２：１４６．ｄｏｉ：１０．１６７３／０３１．０１２．１４６０１）。その結果、ここで説明する調製方法を、通常、Ｔｒｉｓおよび４ＭのＭｇＣｌ２に基づく標準的なＴａｑポリメラーゼ緩衝液で使用すると、放出されたＲＮＡは急速に分解され、標的ＲＮＡを増幅できなくさせる。したがって、当業者は、試薬が１つ以上の緩衝剤を含み得ることを理解するであろう。試薬は任意の緩衝剤を含み得、当業者はそのような薬剤を承知している。しかしながら、一実施形態では、試薬はＴｒｉｓを含まない。
【００６５】
本出願人らは、試料が加熱される温度、すなわち７０℃を超える温度で実質的に中性のｐＨであり、例えば、標的核酸がウイルス核酸であるキャプシドＴｍであり、それらの温度を超えると中性になる緩衝液を開発した。当業者は、緩衝液が所与の温度で中性のｐＨになるかどうかを示すのは緩衝液のＰＫＡであることを理解するであろう。例えば、ビシンのＰＫＡは、０．０１８ｐＨ／Ｃである。さらに、システムは、遊離濃度が最小化されるように二価カチオンを緩衝する。いくつかの実施形態では、試薬は、したがって、ビシンまたはトリシンに基づき、典型的な配合物は、５０ｍＭのビシン／トリシン、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１１５ｍＭの酢酸カリウムで、２５℃でｐＨ８．２に調整されたものであり得る。この試薬は、７０℃を超える温度、例えば、キャプシドＴｍ（キャプシド変性点）では本質的に中性であり、したがって、ＲＮＡを攻撃する過剰なヒドロキシルイオンはないが、それでもｐＨは５５Ｃ〜６５Ｃ、ｐＨ７．４〜７．６の範囲で行われる逆転写／増幅ステップでの酵素についての生理学的要件になるであろう。
【００６６】
したがって、一実施形態は、約７０℃〜１００℃、任意に７２℃〜９８℃、７４℃〜９６℃、７６℃〜９４℃、７８℃〜９２℃、８０℃〜９０℃、８２℃〜８８℃、または８４℃〜８６℃の温度で、約６．５〜７．５のｐＨを有する試薬を提供し、任意に、試薬は７０ＣでｐＨ７．４５であり、および／または９５℃でｐＨ７．０である。
【００６７】
したがって、好ましい実施形態では、試薬はＲＮＡの分解を最小限に抑え、好適な成分の例は、上記に提供されている。
【００６８】
二価カチオンは通常、ポリメラーゼ活性の補因子として必要とされるため、いくつかの実施形態では、試薬が二価カチオンを緩衝するかどうかが重要であると考えられる。適切な緩衝液には、ビシンおよびトリシンが含まれる。
【００６９】
別の実施形態では、ビシンベースの緩衝液が好ましい。ビシンの濃度は、任意の濃度とすることができる。したがって、一実施形態では、試薬はビシンを含む。別の実施形態では、試薬は、２０ｍＭ〜７０ｍＭのビシン、２５ｍＭ〜６５ｍＭのビシン、３０ｍＭ〜６０ｍＭのビシン、３５ｍＭ〜５５ｍＭのビシン、４０ｍＭ〜５０ｍＭのビシン、または約５０ｍＭのビシンの濃度で、ビシンを含む。別の、もしくは同じ実施形態では、試薬は、少なくとも２０ｍＭ、２５ｍＭ、３０ｍＭ、３５ｍＭ、４０ｍＭ、４５ｍＭ、５０ｍＭ、５５ｍＭ、６０ｍＭ、６５ｍＭ、７０ｍＭの濃度でビシンを含む。別の、もしくは同じ実施形態では、試薬は、７０ｍＭ、６５ｍＭ、６０ｍＭ、５５ｍＭ、５０ｍＭ、４５ｍＭ、４０ｍＭ、３５ｍＭ、３０ｍＭ、２５ｍＭ、または２０ｍＭ未満の濃度でビシンを含む。
【００７０】
別の実施形態では、試薬はトリシンを含み、例えば、上記の濃度のトリシンを含む。
【００７１】
上で論じたように、試薬は少なくとも１つの溶媒および少なくとも１つの界面活性剤を必要とする。一実施形態では、溶媒はグリセロールである。同じ、もしくは別の実施形態では、界面活性剤はＴｗｅｅｎであり、例えばＴｗｅｅｎ２０である。したがって、一実施形態では、溶媒はグリセロールであり、および／または界面活性剤はＴｗｅｅｎ、例えばＴｗｅｅｎ２０である。
【００７２】
一実施形態では、試薬は、Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート）、例えば最大０．４％の濃度のＴｗｅｅｎ２０、例えば
ａ）少なくとも０．０２５％、０．０５％、０．０７５％、０．１％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．３５％、０．４％、および／または
ｂ）０．４％、０．３５％、０．３％、０．２５％、０．２％、０．１５％、０．１％、０．０７５％、０．０５％、０．０２５％未満、および／または
ｃ）０．０２５％〜０．４％、０．０５％〜０．３５％、０．０７５％〜０．３％、０．１％〜０．２５％、０．１５％〜０．２％、の濃度で、Ｔｗｅｅｎ２０を含み、
例えば、ｔｗｅｅｎの濃度は、０．１５％〜０．３％である。
【００７３】
一実施形態では、試薬は、任意に、１１％、または１１％未満の濃度でグリセロールを含み、試薬は、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％未満、またはそれ以下のグリセロールを含む。同じ、もしくは代替の実施形態では、試薬は、０．５％〜１１％、１％〜１０％、２％〜９％、３％〜８％、４％〜７％、または５％〜６％の濃度でグリセロールを含む。同じ、もしくは代替の実施形態では、試薬は、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％を超える、または１１％を超える濃度でグリセロールを含む。
【００７４】
上記のように、試料は、１つ以上のポリメラーゼの存在下で少なくとも７０℃に加熱される。細菌などの微生物を加熱すると、細菌を破壊し、核酸がポリメラーゼおよびプライマーなどの増幅に必要な成分にアクセスできるようにすることが知られている。ウイルスを加熱すると、核酸が核酸染色にアクセスし（Ｔｒ）、ウイルスＴＭを中和するウイルスキャプシドのタンパク質配座を破壊することも知られている（Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２  Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ−ｔｈｅ  ＰａＳＴＲｙ  ａｐｐｒｏａｃｈ）。Ｗａｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ  ２０１２に記載されているＴｒは、Ｔｍよりも低い温度である。ウイルスの不活性化および核酸の核酸染色へのアクセス可能性の両方と相関するＴｒにもかかわらず、本発明の発明者らは、ウイルスをこのより低いＴｒ温度に加熱することは、ウイルス核酸を増幅可能にするのに十分ではないことを確認した。実際、ウイルスをＴｍまで加熱しても、ウイルスタンパク質が配座を変化させる温度（キャプシド変性温度）は、核酸を増幅させるのに十分ではない。本発明者らは、ウイルス核酸の増幅が、界面活性剤および溶媒（ｔｗｅｅｎおよびグリセロールなど）の存在下でウイルスがウイルスのＴｍまで加熱された後にのみ可能であることを示した。
【００７５】
７０Ｃを超える温度ではほとんどのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが変性するため、ポリメラーゼの存在下で試料を加熱することは一般的な手法ではないことが理解されよう。したがって、本発明は、耐熱性ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを必要とする（このような活性が必要とされる場合）。このような酵素の例が、本明細書に提供されている。
【００７６】
本発明者らは、これまでに試験されたすべてのウイルスについて、それぞれ個々のウイルスのＴｍ（キャプシド変性温度）が７６℃〜８１℃の範囲内にあることを発見した。しかしながら、一部のウイルスまたは微生物は、より高い温度を必要とする可能性がある。本発明の試薬は、任意のＤＮＡまたはＲＮＡに対して保護的であると考えられるので、特に、この方法でまだ使用されておらず、最適化が実行されていないウイルスまたは微生物を扱う場合、より高い温度を使用することが適切であると考えられる。しかしながら、当業者は、可能であれば、より低い温度を使用して、核酸およびポリメラーゼ活性の両方を保存するべきであることを理解するであろう。あるいは、より高い温度に加熱することは、より短い加熱の持続時間を使用できることを意味する。いくつかの実施形態では、たとえそれがより高い温度を使用することを意味するとしても、加熱の持続時間を短く保つことが好ましい。
【００７７】
試料を７０Ｃ以上に加熱すると、標的ウイルスまたは微生物の核酸の少なくとも一部が増幅可能になり、例えば、ポリメラーゼおよび他の増幅成分にアクセスできるようになると考えられるが、７０Ｃは最適ではない場合がある。当業者は、例えば、好適な範囲にわたるいくつかの異なる温度を使用して、本明細書で論じられる本発明の方法を複数回実行することによって、温度を最適化する方法を知っているであろう。しかしながら、１つの好ましい実施形態では、これはすべての試料に好適であり、最適化が必要とされないので、試料は９３〜９５Ｃに加熱される。とはいえ、当業者は、所与の試料型およびウイルス／微生物について、アクセス可能な核酸と核酸の分解との間の最適なバランスを提供する最適な温度および加熱持続時間があることを理解するであろう。
【００７８】
９５Ｃに加熱することはまた、より低い温度が核酸を増幅成分にアクセス可能にさせ得るが、場合によっては、核酸が増幅を妨げる二次構造を有するという利点を有する。約９５Ｃに加熱すると、核酸の二次構造が確実に除去される。
【００７９】
本出願人らは、ウイルスまたは微生物の核酸が増幅成分にアクセス可能される点であるＴｍ点が、増幅試薬混合物に溶媒／界面活性剤を添加することによって低下させることができることを観察した。多くの溶媒界面活性剤の組み合わせがウイルスの不活性化に商業的に使用されているが、これらは多くの増幅手法とはほとんど互換性がないことが判明した。適切な組み合わせは、８〜１１％のグリセロールと、０．１５〜１％のＴｗｅｅｎ２０（最適には８〜９％のグリセロールと０．１５〜０．３％のＴｗｅｅｎ）であることが判明した。Ｔｗｅｅｎの場合、パーセンテージの追加はＴＭ点をさらに低下させるが、本出願人らは、ＰＣＲプロセスなどの任意のプライマーおよびプローブのハイブリダイゼーション温度が、０．４％というＴｗｅｅｎの高濃度によって低下され、その結果、ＰＣＲ効率の低下が観察された。熱だけではウイルスＲＮＡを増幅可能にすることはできず、すなわち、Ｔｍ点に到達し、挿入染料がＲＮＡにアクセス可能にさせるが、このＲＮＡは増幅することができない。それには、正しい熱処理および正しい濃度の溶剤／界面活性剤混合物が必要である。これは、グリセロールとＴｗｅｅｎとの組み合わせがキャプシドタンパク質の変性を助け、脂質またはタンパク質が放出されたＲＮＡと結合したままにならず、したがってポリメラーゼによって増幅可能にすることを保証すると想定される。
【００８０】
反応条件の好ましいセットは以下の通りである：２５ＣでｐＨ８．２において、５０ｍＭのビシン、３．４ｍＭのＭｇＣｌ２、１１５ｍＭの酢酸カリウム、８％のグリセロール、０．２％のｔｗｅｅｎ。２．５〜４ｍＭのＭｇＣｌ２のＭｇＣｌ２濃度の範囲は、アンプリコンを生成するが、３．４ｍＭのＭｇＣｌ２が最適である。
【００８１】
一実施形態では、試料は以下に加熱される：
ａ）約７０℃〜１００℃、任意に７２℃〜９８℃、７４℃〜９６℃、７６℃〜９４℃、７８℃〜９２℃、８０℃〜９０℃、８２℃〜８８℃、または８４℃〜８６℃に、および／または
ｂ）少なくとも７２℃、７４℃、７６℃、７８℃、８０℃、８２℃、８４℃、９６℃、８８℃、９０℃、９２℃、９４℃、９５℃、９６℃、９７℃、９８℃、９９℃、１００℃または１００℃以上。
【００８２】
いくつかの実施形態では、試料は、特に試料中の標的核酸がウイルス核酸であり、試料がウイルス粒子を含むことが疑われる実施形態では、約７６℃〜８１℃で加熱される。例えば、少なくとも７６．０、７６．５、７７．０、７７．５、７８．０、７８．５、７９．０、７９．５、８０．５、８１．０または８１．５℃に加熱することができる。
【００８３】
他の実施形態では、例えば、特にウイルスのＴｍ（キャプシド変性）温度が決定されていない状況において、試料は、約９３〜９５℃に１〜５秒間加熱される。
【００８４】
いくつかの実施形態では、例えば、試料が細菌または真菌などの微生物である場合、試料は、９０〜９５Ｃに、例えば３０〜６０秒間加熱される。
【００８５】
当業者は、ＲＮＡ、例えばウイルスＲＮＡを含む試料を９５Ｃに加熱することが、ＲＮＡが従来技術の方法を使用して分解されるので、取るべき典型的なアプローチではないことを理解するであろう。同様に、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの存在下でＲＮＡを９５Ｃに加熱することは、ポリメラーゼが分解されるようになるため、日常的な手法ではない。
【００８６】
したがって、一実施形態では、試料は標的核酸を含むか、または含むと予想され、あるいは標的核酸はウイルスＲＮＡであり、ポリメラーゼはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、試料は９０Ｃ以上に加熱され、例えば、９５Ｃに１、２、３、４または５秒加熱される。
【００８７】
試料は、任意の時間、必要な温度に加熱することができる。しかしながら、また上記のように、当業者は、核酸を扱う場合、高温への曝露を最小限に抑えることが好ましいことを理解するであろう。したがって、一実施形態では、試料は、以下の必要な温度に加熱される：
ａ）０．５秒〜５秒、１秒〜４．５秒、１．５秒〜４秒、２秒〜３．５秒、または２．５秒〜３秒、および／または
ｂ）少なくとも０．５秒、１秒、１．５秒、２秒、２．５秒、３秒、３．５秒、４秒、４．５秒、または少なくとも５秒、および／または
ｃ）５秒、４．５秒、４秒、３．５秒、３秒、２．５秒、２秒、１．５秒、１秒、０．５秒、０．２５秒未満。
【００８８】
好ましい実施形態では、試料は、必要な温度に、約１秒間、例えば、０．５秒〜１．５秒間、加熱される。
【００８９】
特に好ましい実施形態では、例えば、標的核酸がウイルスＲＮＡである場合、試料は、約７４℃〜８４℃に、例えば、約１秒間、例えば、０．５秒〜１．５秒加熱されるか、または９５℃に約１秒間、例えば、０．５秒〜１．５秒加熱される。
【００９０】
追加の問題は、放出されたＲＮＡ自体の熱安定性であり、ＲＮＡは塩基性溶液中の二価カチオンの存在下で分解する（緩衝液とマグネシウムイオンとの複合触媒活性によって促進される非酵素的ＲＮＡ加水分解）。その結果、ここで説明するプロセスをＴｒｉｓおよび４ＭのＭｇＣｌ２に基づく標準のＴａｑポリメラーゼ緩衝液で使用すると、放出されたＲＮＡは急速に分解され、標的病原体ＲＮＡは増幅不能にされる。これを克服するために、本出願人は、キャプシドＴｍ温度で実質的に中性ｐＨであり、それらの温度を超えると中性になる緩衝液を開発し、さらにシステムは二価カチオンを緩衝し（Ｆｒｅｅ−ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｂｙ  “Ｇｏｏｄ‘ｓ”  ｂｕｆｆｅｒｓ，Ｒ  Ｎａｋｏｎ，ＣＲ  Ｋｒｉｓｈｎａｍｏｏｒｔｈｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９  Ａｕｇ  １９８３：Ｖｏｌ．２２１，Ｉｓｓｕｅ  ４６１２，ｐｐ．７４９−７５０）、これにより、ビシンおよびトリシンに基づいて、遊離濃度が最小化され−典型的な配合物は、５０ｍＭビシン／トリシン、３．４ｍＭのＭｇＣｌ２、１１５ｍＭの酢酸カリウムであり得、２５ＣでｐＨ８．２に調整すると、この緩衝液はＴｍ（キャプシド変性点）で本質的に中性になり、したがって、ＲＮＡを攻撃する過剰なヒドロキシルイオンはないが、ｐＨは、逆転写／増幅ステップ、ｐＨ７．４〜７．６において酵素の生理学的要件になる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、試薬は、約７０℃〜１００℃、７２℃〜９８℃、７４℃〜９６℃、７６℃〜９４℃、７８℃〜９２℃、８０℃〜９０℃、８２℃〜８８℃、または８４℃〜８６℃の温度で、中性のｐＨ、例えば、約６．５〜７．５で有利であり、例えば、試薬は、９５℃の温度でｐＨ７である。
【００９２】
いくつかの実施形態では、試薬はまた、１つ以上の二価カチオンを含む。ポリメラーゼは通常、活性のために金属イオンを必要とし、各酵素は異なる補因子を必要とする場合がある。例えば、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼは、通常Ｍｇカチオンを必要とするが、一部のポリメラーゼのＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、Ｍｎカチオンを必要とする。したがって、いくつかの実施形態では、試薬はまた、１つ以上の二価カチオンを含む。当業者は、使用されているポリメラーゼに対してどの補因子が必要であるかを決定するための十分な知識を身に付けている。
【００９３】
試薬の成分の一部またはすべてが凍結乾燥されて供給される場合、利点があり得ることが理解されよう。例えば、本発明は、冷蔵へのアクセスが不十分な高温地域での現場ベースの使用に特に適しているので、凍結乾燥された成分を供給することにより、分解または成分が減少する。したがって、いくつかの実施形態では、容器は、ポリメラーゼなどの凍結乾燥成分を含み得る。凍結乾燥された成分はまた、大量に供給され得る。同じ、もしくは他の実施形態では、凍結乾燥された成分は、凍結乾燥されて供給できない成分を含む「再懸濁」試薬に再懸濁され得る。好ましい実施形態では、凍結乾燥された成分は、再懸濁緩衝液に再懸濁され、試料が容器に添加される前に、容器に入れられる（凍結乾燥された成分がまだ容器に供給されていない場合）。次いで、蓋が密閉されて閉じられ、再び開く必要はない。増幅および検出が実行されると、試料および容器は安全に破壊される。
【００９４】
最終的に、再懸濁試薬中の凍結乾燥成分の再懸濁に続いて、ポリメラーゼを含む、増幅反応が後で起こるのに必要なすべての成分が存在する。次いで、試料を添加し、その後、飼料を少なくとも７０℃に加熱する。例えば、再懸濁緩衝液は、グリセロール、Ｔｗｅｅｎ２０および水、ならびに塩化マグネシウムなどのいくつかの塩からなり得るが、この再懸濁緩衝液に、アジ化ナトリウムなどの微生物増殖を防止する薬剤を添加することができるが、他の抗菌剤は、当該技術分野において既知である。
【００９５】
論じたように、ウイルスまたは微生物は、ＤＮＡまたはＲＮＡである標的核酸を含み得る。当業者は、例えばＰＣＲ反応でＤＮＡを増幅するために、単一のポリメラーゼ活性、すなわちＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼが必要であることを理解するであろう。当業者は、市販されている多くのＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ、例えば、Ｔａｑポリメラーゼ、Ｖｅｎｔポリメラーゼ、ＫＯＤ、Ｔｌｉがあることを理解している。
【００９６】
当業者はまた、テンプレート標的核酸がＲＮＡである場合、ＲＮＡを増幅するために、それが最初にＲＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用してｃＤＮＡに変換されなければならないことを理解している。既知のＲＮＡ依存性ポリメラーゼには、とりわけＢｉｏｎｅｅｒ  Ｒｏｃｋｅｔｓｃｒｉｐｔ、ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ、ＡＭＶ、ＭＭＵＬＶ、ＦＩＶが挙げられる。
【００９７】
ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる逆転写の後に、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼによる得られたｃＤＮＡの増幅が続く。したがって、場合によっては、試薬は２つ以上のポリメラーゼを含んでもよく、例えば、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを含み得る。上記のように、耐熱性ポリメラーゼは、試料の調製および下流の増幅プロセスに関連する高温に耐えるために必要である。
【００９８】
しかしながら、好ましくは、テンプレート標的核酸がＲＮＡである場合、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ機能およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ機能の両方を実行することができる単一のポリメラーゼが試薬中に存在する。
【００９９】
したがって、一実施形態では、試薬は、上記のように少なくとも２つの異なるポリメラーゼ酵素を含む。酵素の他の組み合わせも企図され、例えば、試薬は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼを含み得るが、試薬はまた、増幅中／増幅後に得られる蛍光収量を増加し得ると考えられるＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するさらなるポリメラーゼを含み得る。これらは、例えば、いずれかのポリメラーゼに有利な１：１、２：１、３：１の比で含まれ得る。好適なＤＮＡポリメラーゼとしては、ＫＯＤ、Ｔｌｉ、ｈｅｍｏＴａｑ、Ｋａｐａ  ｂｌｏｏｄ、Ｐｈｕｓｉｏｎ、ＴＴＨが挙げられる。
【０１００】
同じ、もしくは別の実施形態では、ポリメラーゼはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、かつＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有さず、例えば、このポリメラーゼは、Ｂｉｏｎｅｅｒ  Ｒｏｃｋｅｔｓｃｒｉｐｔである。
【０１０１】
ポリメラーゼは、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性および／またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性が、試料が、例えば、核酸、例えばウイルス拡散を、増幅成分にアクセス可能にさせる温度で加熱される温度での短時間の保持に耐えることができるポリメラーゼであるべきである。
【０１０２】
同じ、もしくは別の実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、かつＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有さない。
【０１０３】
さらに別の実施形態では、試薬は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有さないポリメラーゼを含み、また、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有さない別個のポリメラーゼを含む。
【０１０４】
好ましい実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有するか、または、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有し、任意に、ポリメラーゼは、以下からなる群から選択される：
ａ）ＴＴＨポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）［配列番号３］
ｂ）Ｈａｗｋ  Ｚ０５（Ｒｏｃｈｅ）、［配列番号４］
ｃ）ＷＯ２０１４／０２３３１８に記載されているポリメラーゼ
ｄ）配列番号１、２、３、４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリメラーゼであって、任意に、このポリメラーゼは、以下の突然変異：配列番号１、２、３、または４に関するＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ、Ｍ７４７Ｋ、Ｌ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ、Ｅ７７３Ｇ、およびＬ７８９Ｆのうちの１、２、３、４、５、６、７、または８個を含むもの、
ｅ）Ｍ１／Ｍ７４７Ｋ酵素［配列番号２］に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリメラーゼ。
【０１０５】
好ましい酵素は、配列番号１、２、３、４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、任意に、このポリメラーゼが、以下の突然変異：配列番号１、２、３、または４に関するＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ、Ｍ７４７Ｋ、Ｌ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ、Ｅ７７３Ｇ、およびＬ７８９Ｆのうちの１、２、３、４、５、６、７、または８個を含むものであるか、またはＭ１／Ｍ７４７Ｋ酵素［配列番号２］に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリメラーゼであり、これらの酵素のいくつかが、Ｈａｗｋｚ０５よりも増幅中の血液の存在に対してより耐性があり、ＴＴＨよりも逆転写に優れていると考えられているためである。このような酵素によって生成された増幅データが実施例に提供されている。
【０１０６】
ポリメラーゼ（複数可）が、血液などのいくつかの試料に見られる阻害物質に対して自然に耐性があるか、または耐性があるように操作されている場合も好ましい。例えば、酵素ＴＴＨは、血液中に存在する阻害物質に対して自然に耐性があると考えられている（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  Ｒｅｐｏｒｔｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ８，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：３４１０（２０１８））。配列番号１、２、３、４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する特定の酵素であって、任意に、このポリメラーゼが、以下の突然変異：配列番号１、２、３、または４に関するＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ、Ｍ７４７Ｋ、Ｌ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ、Ｅ７７３Ｇ、およびＬ７８９Ｆのうちの１、２、３、４、５、６、７、または８個を含む酵素、またはＭ１／Ｍ７４７Ｋ酵素［配列番号２］に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する酵素は、血液の中の阻害物質に対してり耐性があると考えられている。
【０１０７】
配列番号１は、好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ａｑｕａｔｉｃｕｓ）ポリメラーゼのアミノ酸配列を指す：
ＭＲＧＭＬＰＬＦＥＰＫＧＲＶＬＬＶＤＧＨＨＬＡＹＲＴＦＨＡＬＫＧＬＴＴＳＲＧＥＰＶＱＡＶＹＧＦＡＫＳＬＬＫＡＬＫＥＤＧＤＡＶＩＶＶＦＤＡＫＡＰＳＦＲＨＥＡＹＧＧＹＫＡＧＲＡＰＴＰＥＤＦＰＲＱＬＡＬＩＫＥＬＶＤＬＬＧＬＡＲＬＥＶＰＧＹＥＡＤＤＶＬＡＳＬＡＫＫＡＥＫＥＧＹＥＶＲＩＬＴＡＤＫＤＬＹＱＬＬＳＤＲＩＨＶＬＨＰＥＧＹＬＩＴＰＡＷＬＷＥＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹＲＡＬＴＧＤＥＳＤＮＬＰＧＶＫＧＩＧＥＫＴＡＲＫＬＬＥＥＷＧＳＬＥＡＬＬＫＮＬＤＲＬＫＰＡＩＲＥＫＩＬＡＨＭＤＤＬＫＬＳＷＤＬＡＫＶＲＴＤＬＰＬＥＶＤＦＡＫＲＲＥＰＤＲＥＲＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦＧＬＬＥＳＰＫＡＬＥＥＡＰＷＰＰＰＥＧＡＦＶＧＦＶＬＳＲＫＥＰＭＷＡＤＬＬＡＬＡＡＡＲＧＧＲＶＨＲＡＰＥＰＹＫＡＬＲＤＬＫＥＡＲＧＬＬＡＫＤＬＳＶＬＡＬＲＥＧＬＧＬＰＰＧＤＤＰＭＬＬＡＹＬＬＤＰＳＮＴＴＰＥＧＶＡＲＲＹＧＧＥＷＴＥＥＡＧＥＲＡＡＬＳＥＲＬＦＡＮＬＷＧＲＬＥＧＥＥＲＬＬＷＬＹＲＥＶＥＲＰＬＳＡＶＬＡＨＭＥＡＴＧＶＲＬＤＶＡＹＬＲＡＬＳＬＥＶＡＥＥＩＡＲＬＥＡＥＶＦＲＬＡＧＨＰＦＮＬＮＳＲＤＱＬＥＲＶＬＦＤＥＬＧＬＰＡＩＧＫＴＥＫＴＧＫＲＳＴＳＡＡＶＬＥＡＬＲＥＡＨＰＩＶＥＫＩＬＱＹＲＥＬＴＫＬＫＳＴＹＩＤＰＬＰＤＬＩＨＰＲＴＧＲＬＨＴＲＦＮＱＴＡＴＡＴＧＲＬＳＳＳＤＰＮＬＱＮＩＰＶＲＴＰＬＧＱＲＩＲＲＡＦＩＡＥＥＧＷＬＬＶＡＬＤＹＳＱＩＥＬＲＶＬＡＨＬＳＧＤＥＮＬＩＲＶＦＱＥＧＲＤＩＨＴＥＴＡＳＷＭＦＧＶＰＲＥＡＶＤＰＬＭＲＲＡＡＫＴＩＮＦＧＶＬＹＧＭＳＡＨＲＬＳＱＥＬＡＩＰＹＥＥＡＱＡＦＩＥＲＹＦＱＳＦＰＫＶＲＡＷＩＥＫＴＬＥＥＧＲＲＲＧＹＶＥＴＬＦＧＲＲＲＹＶＰＤＬＥＡＲＶＫＳＶＲＥＡＡＥＲＭＡＦＮＭＰＶＱＧＴＡＡＤＬＭＫＬＡＭＶＫＬＦＰＲＬＥＥＭＧＡＲＭＬＬＱＶＨＤＥＬＶＬＥＡＰＫＥＲＡＥＡＶＡＲＬＡＫＥＶＭＥＧＶＹＰＬＡＶＰＬＥＶＥＶＧＩＧＥＤＷＬＳＡＫＥ
配列番号２は、ＷＯ２０１４／０２３３１８に記載されているように、Ｍ７４７Ｋ置換を有するＭ１ポリメラーゼを指す：
ＭＲＧＭＬＰＬＦＥＰＫＧＲＶＬＬＶＤＧＨＨＬＡＹＲＴＦＨＡＬＫＧＬＴＴＳＲＧＥＰＶＱＡＶＹＧＦＡＫＳＬＬＫＡＬＫＥＤＧＤＡＶＩＶＶＦＤＡＫＡＰＳＦＲＨＥＡＹＧＧＹＫＡＧＲＡＰＴＰＥＤＦＰＲＱＬＡＬＩＫＥＬＶＤＬＬＧＬＡＲＬＥＶＰＧＹＥＡＤＤＶＬＡＳＬＡＫＫＡＥＫＥＧＹＥＶＲＩＬＴＡＤＫＤＬＹＱＬＬＳＤＲＩＨＶＬＨＰＥＧＹＬＩＴＰＡＷＬＷＥＫＹＧＬＲＰＤＱＷＡＤＹＲＡＬＴＧＤＥＳＤＮＬＰＧＶＫＧＩＧＥＫＴＡＲＫＬＬＥＥＷＧＳＬＥＡＬＬＫＮＬＤＲＬＫＰＡＩＲＥＫＩＬＡＨＭＤＤＬＫＬＳＷＤＬＡＫＶＲＴＤＬＰＬＥＶＤＦＡＫＲＲＥＰＤＲＥＲＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦＧＬＬＥＳＰＫＡＬＥＥＡＰＷＰＰＰＥＧＡＦＶＧＦＶＬＳＲＫＥＰＭＷＡＤＬＭＡＬＡＡＡＲＧＧＲＶＨＲＡＰＥＰＹＫＡＬＲＤＬＫＥＡＲＧＬＬＡＫＤＬＳＶＬＡＬＲＥＧＬＧＬＰＰＧＤＤＰＭＬＬＡＹＬＬＤＰＳＮＴＴＰＥＧＶＡＲＲＹＧＧＥＷＴＥＥＡＧＥＲＡＡＬＳＥＲＬＦＡＮＬＷＧＲＬＥＧＥＥＲＬＬＷＬＹＲＥＶＥＲＰＬＳＡＶＬＡＨＭＥＡＴＧＶＲＬＤＶＡＹＬＲＡＭＳＬＥＶＡＥＥＩＡＲＬＥＡＥＶＦＲＬＡＧＨＰＦＮＬＮＳＲＤＱＬＥＲＶＬＦＤＥＬＧＬＰＡＩＧＫＴＥＫＴＧＫＲＳＴＲＡＡＶＬＥＡＬＲＥＡＨＰＩＶＥＫＩＬＱＹＲＥＬＴＫＬＫＳＴＹＩＤＰＬＰＤＬＩＨＰＲＴＧＲＬＨＴＲＦＮＱＴＡＴＡＴＧＲＬＳＳＳＤＰＮＬＱＮＩＰＶＲＴＰＬＧＱＲＩＲＲＡＦＩＡＥＥＧＷＬＬＶＡＬＤＹＳＱＩＥＬＲＶＬＡＨＬＳＧＤＥＮＬＩＲＶＦＱＥＧＲＤＦＨＴＥＴＡＳＷＭＦＧＶＰＲＥＡＶＤＰＬＭＲＲＡＡＫＴＩＮＦＧＶＬＹＧＭＳＡＨＲＬＳＱＥＬＡＩＰＹＥＥＡＱＡＦＩＥＲＹＦＱＳＦＰＫＶＲＡＷＩＥＫＴＬＥＥＧＲＲＲＧＹＶＥＴＬＦＧＲＲＲＹＶＰＤＬＥＡＲＶＫＧＶＲＥＡＡＥＲＭＡＦＮＫＰＶＱＧＴＡＡＤＬＭＫＬＡＭＶＫＬＦＰＲＬＧＥＭＧＡＲＭＬＬＱＶＨＤＥＬＶＬＥＡＰＫＥＲＡＥＡＶＡＲＬＡＫＥＶＭＥＧＶＹＰＬＡＶＰＬＥＶＥＶＧＩＧＥＤＷＬＳＡＫＥ
配列番号３は、ＴＴＨポリメラーゼ配列を指す：
ＭＥＡＭＬＰＬＦＥＰＫＧＲＶＬＬＶＤＧＨＨＬＡＹＲＴＦＦＡＬＫＧＬＴＴＳＲＧＥＰＶＱＡＶＹＧＦＡＫＳＬＬＫＡＬＫＥＤＧＹＫＡＶＦＶＶＦＤＡＫＡＰＳＦＲＨＥＡＹＥＡＹＫＡＧＲＡＰＴＰＥＤＦＰＲＱＬＡＬＩＫＥＬＶＤＬＬＧＦＴＲＬＥＶＰＧＹＥＡＤＤＶＬＡＴＬＡＫＫＡＥＫＥＧＹＥＶＲＩＬＴＡＤＲＤＬＹＱＬＶＳＤＲＶＡＶＬＨＰＥＧＨＬＩＴＰＥＷＬＷＥＫＹＧＬＲＰＥＱＷＶＤＦＲＡＬＶＧＤＰＳＤＮＬＰＧＶＫＧＩＧＥＫＴＡＬＫＬＬＫＥＷＧＳＬＥＮＬＬＫＮＬＤＲＶＫＰＥＮＶＲＥＫＩＫＡＨＬＥＤＬＲＬＳＬＥＬＳＲＶＲＴＤＬＰＬＥＶＤＬＡＱＧＲＥＰＤＲＥＧＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦＧＬＬＥＡＰＡＰＬＥＥＡＰＷＰＰＰＥＧＡＦＶＧＦＶＬＳＲＰＥＰＭＷＡＥＬＫＡＬＡＡＣＲＤＧＲＶＨＲＡＡＤＰＬＡＧＬＫＤＬＫＥＶＲＧＬＬＡＫＤＬＡＶＬＡＳＲＥＧＬＤＬＶＰＧＤＤＰＭＬＬＡＹＬＬＤＰＳＮＴＴＰＥＧＶＡＲＲＹＧＧＥＷＴＥＤＡＡＨＲＡＬＬＳＥＲＬＨＲＮＬＬＫＲＬＥＧＥＥＫＬＬＷＬＹＨＥＶＥＫＰＬＳＲＶＬＡＨＭＥＡＴＧＶＲＬＤＶＡＹＬＱＡＬＳＬＥＬＡＥＥＩＲＲＬＥＥＥＶＦＲＬＡＧＨＰＦＮＬＮＳＲＤＱＬＥＲＶＬＦＤＥＬＲＬＰＡＬＧＫＴＱＫＴＧＫＲＳＴＳＡＡＶＬＥＡＬＲＥＡＨＰＩＶＥＫＩＬＱＨＲＥＬＴＫＬＫＮＴＹＶＤＰＬＰＳＬＶＨＰＲＴＧＲＬＨＴＲＦＮＱＴＡＴＡＴＧＲＬＳＳＳＤＰＮＬＱＮＩＰＶＲＴＰＬＧＱＲＩＲＲＡＦＶＡＥＡＧＷＡＬＶＡＬＤＹＳＱＩＥＬＲＶＬＡＨＬＳＧＤＥＮＬＩＲＶＦＱＥＧＫＤＩＨＴＱＴＡＳＷＭＦＧＶＰＰＥＡＶＤＰＬＭＲＲＡＡＫＴＶＮＦＧＶＬＹＧＭＳＡＨＲＬＳＱＥＬＡＩＰＹＥＥＡＶＡＦＩＥＲＹＦＱＳＦＰＫＶＲＡＷＩＥＫＴＬＥＥＧＲＫＲＧＹＶＥＴＬＦＧＲＲＲＹＶＰＤＬＮＡＲＶＫＳＶＲＥＡＡＥＲＭＡＦＮＭＰＶＱＧＴＡＡＤＬＭＫＬＡＭＶＫＬＦＰＲＬＲＥＭＧＡＲＭＬＬＱＶＨＤＥＬＬＬＥＡＰＱＡＲＡＥＥＶＡＡＬＡＫＥＡＭＥＫＡＹＰＬＡＶＰＬＥＶＥＶＧＭＧＥＤＷＬＳＡＫＧ
配列番号４は、ＨａｗｋＺ０５ポリメラーゼ配列を指す：
ＭＫＡＭＬＰＬＦＥＰＫＧＲＶＬＬＶＤＧＨＨＬＡＹＲＴＦＦＡＬＫＧＬＴＴＳＲＧＥＰＶＱＡＶＹＧＦＡＫＳＬＬＫＡＬＫＥＤＧＹ
ＫＡＶＦＶＶＦＤＡＫＡＰＳＦＲＨＥＡＹＥＡＹＫＡＧＲＡＰＴＰＥＤＦＰＲＱＬＡＬＩＫＥＬＶＤＬＬＧＦＴＲＬＥＶＰＧＦＥＡＤ
ＤＶＬＡＴＬＡＫＫＡＥＲＥＧＹＥＶＲＩＬＴＡＤＲＤＬＹＱＬＶＳＤＲＶＡＶＬＨＰＥＧＨＬＩＴＰＥＷＬＷＥＫＹＧＬＫＰＥＱＷ
ＶＤＦＲＡＬＶＧＤＰＳＤＮＬＰＧＶＫＧＩＧＥＫＴＡＬＫＬＬＫＥＷＧＳＬＥＮＩＬＫＮＬＤＲＶＫＰＥＳＶＲＥＲＩＫＡＨＬＥＤ
ＬＫＬＳＬＥＬＳＲＶＲＳＤＬＰＬＥＶＤＦＡＲＲＲＥＰＤＲＥＧＬＲＡＦＬＥＲＬＥＦＧＳＬＬＨＥＦＧＬＬＥＡＰＡＰＬＥＥＡＰ
ＷＰＰＰＥＧＡＦＶＧＦＶＬＳＲＰＥＰＭＷＡＥＬＫＡＬＡＡＣＫＥＧＲＶＨＲＡＫＤＰＬＡＧＬＫＤＬＫＥＶＲＧＬＬＡＫＤＬＡＶ
ＬＡＬＲＥＧＬＤＬＡＰＳＤＤＰＭＬＬＡＹＬＬＤＰＳＮＴＴＰＥＧＶＡＲＲＹＧＧＥＷＴＥＤＡＡＨＲＡＬＬＡＥＲＬＱＱＮＬＬＥ
ＲＬＫＧＥＥＫＬＬＷＬＹＱＥＶＥＫＰＬＳＲＶＬＡＨＭＥＡＴＧＶＲＬＤＶＡＹＬＫＡＬＳＬＥＬＡＥＥＩＲＲＬＥＥＥＶＦＲＬＡ
ＧＨＰＦＮＬＮＳＲＤＱＬＥＲＶＬＦＤＥＬＲＬＰＡＬＧＫＴＱＫＴＧＫＲＳＴＳＡＡＶＬＥＡＬＲＥＡＨＰＩＶＥＫＩＬＱＨＲＥＬ
ＴＫＬＫＮＴＹＶＤＰＬＰＧＬＶＨＰＲＴＧＲＬＨＴＲＦＮＱＴＡＴＡＴＧＲＬＳＳＳＤＰＮＬＱＮＩＰＩＲＴＰＬＧＱＲＩＲＲＡＦ
ＶＡＥＡＧＷＡＬＶＡＬＤＹＳＱＩＥＬＲＶＬＡＨＬＳＧＤＥＮＬＩＲＶＦＱＥＧＫＤＩＨＴＱＴＡＳＷＭＦＧＶＳＰＥＡＶＤＰＬＭ
ＲＲＡＡＫＴＶＮＦＧＶＬＹＧＭＳＡＨＲＬＳＱＥＬＡＩＰＹＥＥＡＶＡＦＩＥＲＹＦＱＳＦＰＫＶＲＡＷＩＥＫＴＬＥＥＧＲＫＲＧ
ＹＶＥＴＬＦＧＲＲＲＹＶＰＤＬＮＡＲＶＫＳＶＲＥＡＡＥＲＭＡＦＮＭＰＶＱＧＴＡＡＤＬＭＫＬＡＭＶＫＬＦＰＨＬＲＥＭＧＡＲ
ＭＬＬＱＶＨＤＥＬＬＬＥＡＰＱＡＲＡＥＥＶＡＡＬＡＫＥＡＭＥＫＡＹＰＬＡＶＰＬＥＶＥＶＧＩＧＥＤＷＬＳＡＫＧ
【０１０８】
試料を調製する方法、およびその後の生成物の増幅および検出が「閉チューブ」である場合、すなわち、一度増幅および検出に必要な試料および材料が容器内に置かれる状況において、容器は閉じられ、再び開かれず、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方が存在するようにポリメラーゼが存在する場合（少なくとも２つの異なるポリメラーゼが容器内に存在するため、１つがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有し、別のものがＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するか、または両方の活性を有する単一のポリメラーゼが存在する場合、または両方の活性を有する単一の酵素が存在し、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性もしくはＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する少なくとも１つのさらなる酵素が存在する場合のいずれか）、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害物質である補因子を必要とせず、および／またはＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の阻害物質である補因子を必要としない。
【０１０９】
好ましい実施形態では、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性は両方とも、補因子としてマグネシウムカチオンを必要とする。
標的核酸がＲＮＡである場合、例えば、ウイルスがＲＮＡウイルスである場合、ポリメラーゼがＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するか、または例えば、両方のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有することが好ましいことは当業者には明らかであろう。
【０１１０】
上記のように、試料は任意の試料型であり得るが、好ましくは粗製試料である。試料は、任意の量であり得、試料と試薬との総量に関して任意の相対量のものであり得る。しかしながら、本方法は、高相対量試料での使用に適していると考えられ、例えば、一実施形態では、試料は、試料と試薬との総量の少なくとも５％、例えば、少なくとも６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２１％、２２％、２３％、２４％、２５％、２６％、２７％、２８％、２９％、３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、または３５％以上を構成し、任意に、試料と試薬との総量の１３％を構成する。
【０１１１】
実施例に記載されているように、試料が血液または血清である場合、好ましい濃度は、約１２〜１６％の血液または血清である。理論に束縛されるものではないが、これらの濃度での分子クラウディングは、増幅反応の効率を高めると考えられている。
【０１１２】
このようにして、十分に大きな試料、例えば粗製試料、例えば全血を使用することが可能であるが、それでも少量で増幅および検出を実行する。例えば、いくつかの実施形態では、試料、例えば、粗製試料、例えば全血の量は、１００ｕｌ未満、例えば、９０ｕｌ、８０ｕｌ、７０ｕｌ、６０ｕｌ、５０ｕｌ、４０ｕｌ、３０ｕｌ、２０ｕｌ、１５ｕｌ、１２ｕｌ、１０ｕｌ、５ｕｌ、４ｕｌ、３ｕｌ、２ｕｌ、１ｕｌ、０．５ｕｌ未満である。少量の試料を使用すると、ウイルスまたは微生物にさらされるリスクが軽減される。例えば、試料量は、０．５ｕｌ〜１００ｕｌ、例えば、１ｕｌ〜９０ｕｌ、例えば、２ｕｌ〜８０ｕｌ、３ｕｌ〜７０ｕｌ、４ｕｌ〜６０ｕｌ、５ｕｌ〜５０ｕｌ、１０ｕｌ〜４０ｕｌ、１５ｕｌ〜３０ｕｌまたは２０ｕｌであり得る。いくつかの好ましい実施形態では、粗製試料は、５ｕｌ、１０ｕｌ、１２ｕｌ、１５ｕｌまたは２０ｕｌである。
【０１１３】
容器内の試料と試薬との総量は、１０ｕｌ〜５００ｕｌ、２０ｕｌ〜４５０ｕｌ、３０ｕｌ〜４００ｕｌ、４０ｕｌ〜３５０ｕｌ、５０ｕｌ〜３００ｕｌ、６０ｕｌ〜２５０ｕｌ、７０ｕｌ〜２００ｕｌ、８０ｕｌ〜１５０ｕｌ、９０ｕｌ〜１４０ｕｌ、１００ｕｌ〜１３０ｕｌ、１１０ｕｌ〜１２０ｕｌであり得る。例えば、総量は、５００ｕｌ、４００ｕｌ、３００ｕｌ、２００ｕｌ、１００ｕｌ、９０ｕｌ、８０ｕｌ、７０ｕｌ、６０ｕｌ、５０ｕｌ、４０ｕｌ、３０ｕｌ、２０ｕｌまたは１０ｕｌ未満であり得る。いくつかの好ましい実施形態では、総反応量は、５０ｕｌ、６０ｕｌ、７０ｕｌ、８０ｕｌ、９０ｕｌ、６２ｕｌ、７２ｕｌ、８２ｕｌ、９２ｕｌ、１０２ｕｌ、７５ｕｌ、８５ｕｌ、９５ｕｌ、１０５ｕｌ、１１０ｕｌである。
【０１１４】
したがって、いくつかの実施形態では：
ａ）容器内の試料の量は、
ｉ）１００ｕｌ未満、例えば９０ｕｌ、８０ｕｌ、７０ｕｌ、６０ｕｌ、５０ｕｌ、４０ｕｌ、３０ｕｌ、２０ｕｌ、１５ｕｌ、１０ｕｌ、５ｕｌ、４ｕｌ、３ｕｌ、２ｕｌ、１ｕｌ、０．５ｕｌ未満であり、および／または
ｉｉ）０．５ｕｌ〜１００ｕｌ、例えば、１ｕｌ〜９０ｕｌ、例えば、２ｕｌ〜８０ｕｌ、３ｕｌ〜７０ｕｌ、４ｕｌ〜６０ｕｌ、５ｕｌ〜５０ｕｌ、１０ｕｌ〜４０ｕｌ、１５ｕｌ〜３０ｕｌまたは２０ｕｌであり、および／または
ｂ）容器内の試料と試薬との総量は、
ｉ）１０ｕｌ〜５００ｕｌ、２０ｕｌ〜４５０ｕｌ、３０ｕｌ〜４００ｕｌ、４０ｕｌ〜３５０ｕｌ、５０ｕｌ〜３００ｕｌ、６０ｕｌ〜２５０ｕｌ、７０ｕｌ〜２００ｕｌ、８０ｕｌ〜１５０ｕｌ、９０ｕｌ〜１４０ｕｌ、１００ｕｌ〜１３０ｕｌ、１１０ｕｌ〜１２０ｕｌであり、および／または
ｉｉ）５００ｕｌ、４００ｕｌ、３００ｕｌ、２００ｕｌ、１００ｕｌ、９０ｕｌ、８０ｕｌ、７０ｕｌ、６０ｕｌ、５０ｕｌ、４０ｕｌ、３０ｕｌ、２０ｕｌまたは１０ｕｌ未満であり得る。
【０１１５】
いくつかの好ましい実施形態では、試料量は１０μｌであり、容器内の試料と試薬との総量は、６０ｕｌ、７０ｕｌ、８０ｕｌ、または９０ｕｌであるか、または試料量は、１２μｌであり、容器内の試料と試薬との総量は、６２ｕｌ、７２ｕｌ、８２ｕｌ、９２ｕｌ、１０２ｕｌであるか、または試料量は１５ｕｌであり、総量は、７５ｕｌ、８５ｕｌ、９５ｕｌ、または１０５ｕｌである。
【０１１６】
上記のように、いくつかの実施形態では、この方法は現場ベースであり、現場での使用に適している。現場使用とは、非標準実験室設定における使用の意味を含む。現場使用による一実施形態において、電気が制限されている、または電池のみで利用可能な環境における使用を意味する。同じ、もしくは異なる実施形態において、現場使用とは、臨床医、実験室の科学者、または容器を扱う他の人が、容器が使用される物質の性質に好適である安全装置を装備していない状況の意味を含む。例えば、いくつかの実施形態において、容器は、高病原性ウイルスおよび細菌を検出するために使用され、典型的には、対象からの試料、または環境試料を収容するために使用され、現場使用などの特定の状況において、容器を取り扱う人は、非常に基本的な安全装備のみが装備され得る。また、この方法の意味は、低コスト、簡便、バイオセーフであり、試料への最小限の曝露を必要とし、試料を容器に添加すると、容器が再び開くことはない。また、この方法は、電気などの最小限のエネルギーで実行でき、試料を凍結、遠心分離する必要がなく、増幅または試薬成分を必要とせず、必然的に冷蔵または凍結する必要がないという意味も含まれる。
【０１１７】
好ましい実施形態では、試料は対象から直接採取され、試薬とともに容器に直接入れられる。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、特に試料が血液を含むか、または全血を含む場合、試薬は、血液凝固で補助する薬剤を含む。上で論じたように、血液の存在は、ＰＣＲ阻害物質の存在により、増幅産物の蛍光検出を妨害し、増幅自体を阻害する両方の可能性がある。本発明者らは、血液が凝固した場合、例えば増幅反応の時間経過中に、血液が比較的急速に容器の底に沈むことを見出した。凝固した血液は、ウイルスまたは微生物の核酸を容器に供給するために利用可能であるが、増幅阻害物質を浸出させることができなくなる。
【０１１９】
上記から明らかなように、本発明は、存在する微生物またはウイルスの核酸を直接増幅するための試料を調製するための方法を提供する。
【０１２０】
したがって、本発明はまた、対象から得られた試料中に存在する微生物またはウイルスの核酸を増幅させる方法を提供し、試料は本発明の方法に従って調製されるということになる。試料を調製する方法の特徴に与えられた設定は、例えば増幅の方法に適用されるなど、明細書全体に適用される。例えば、上記の試料型、容量、試薬成分、温度、ポリメラーゼなどの設定は、増幅方法に適用される。
【０１２１】
一実施形態では、増幅は、ＰＣＲまたはｑ−ＰＣＲを使用して実施される。いくつかの実施形態では、増幅は、ＰＣＲの前の逆転写ステップ、例えば逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−−ＰＣＲ）、例えばリアルタイム逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）を伴う。
【０１２２】
本発明者らは、驚くべきことに、標的核酸がＲＮＡ、例えばウイルスＲＮＡである状況で逆転写酵素の２つ以上のサイクルを実行することが可能かつ有益であり、ＲＮＡの存在量が少ない場合に特に有益であることを発見した。例えば、逆転写の効率は通常１０〜２０％にすぎず（Ｍｉｒａｎｄａ  ＪＡ；Ｓｔｅｗａｒｄ  ＧＦ，Ｖａｒｉａｂｌｅｓ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ  ａｎｄ  ｉｎｔｅｒｐｒｅｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ＰＣＲ（ＲＴ−ｑＰＣＲ）：Ａｎ  ｅｍｐｉｒｉｃａｌ  ｓｔｕｄｙ  ｕｓｉｎｇ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｐｈａｇｅ  ＭＳ２．Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１７；２４１：１−１０）、そのため、ＲＮＡのコピー数が１反応あたり１００コピー未満であると予想される状況では、逆転写を複数回行うことが特に有益であると考えられる。
【０１２３】
このようにして、ＲＮＡからｃＤＮＡへの逆転写が繰り返され、試料を十分に高い温度に加熱して、例えば、９５Ｃに加熱して、得られたｃＤＮＡハイブリッドの鎖を分離する必要がある。当業者は、この実施形態が、９５Ｃへの加熱に耐えることができるポリメラーゼを必要とすることを理解するであろう。
【０１２４】
見かけの周期的ＲＴの他の方法が報告されている（例えば、Ｂｉｏｎｅｅｒ  ＷＯ２００８／１１５００２）が、それらの方法はｃＤＮＡの変性温度を到底達成しない。ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの融点が対応するＤＮＡの融点よりも高いことは十分に確立されており、その結果、アンプリコンの長さが８０ｂｐを超える場合、得られるハイブリッドを確実に変性させるために、いかなる反応も９４Ｃを超える温度に加熱する必要がある。これは、この公開に記載されている最高温度ではハイブリッドを変性させることができず、そのため、存在するＲＮＡ分子の数よりも多くのｃＤＮＡ分子を作成することは決してできないことを意味する。ＢｉｏＲａｄは、ＷＯ２０１４／１３８６８８で少なくとも２ラウンドの逆転写を実行する方法を記載しているが、これは、各試料が複数のナノリットル反応に分解され、これらのそれぞれが、理論的には反応当たり単一の標的である、区画化された反応戦略を記載している。これは、抽出された核酸を必要とし、この方法が機能するために粗製試料にナノリットルあたりの病原体が十分になく、明確に区画化された反応を主張するため、大きな違いである。本質的に、これは、本明細書で記載するように元々存在するＲＮＡの量よりも多くのｃＤＮＡ分子を生成するように設計された方法とは対照的に、各分割の単一の標的が正常に転写されることを保証する方法である。この前増幅は、反応に非常に少数の標的が存在すると予想される場合に感度を最大化するための鍵である。
【０１２５】
この方法は、逆転写の任意の数のサイクルを含み得る。逆転写のサイクルとは、好適な酵素のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性がＲＮＡをＤＮＡ鎖に逆転写できるようにするという意味が含まれる。２番目のサイクルでは、ＲＮＡ：ＤＮＡハイブリッドが解離し、ポリメラーゼがＲＮＡにアクセスできるようにする閾値温度まで試料を加熱する必要があるだろう。温度を伸長温度まで下げ、同じテンプレートＲＮＡ分子から２番目のＤＮＡ鎖が生成される。
【０１２６】
いくつかの実施形態では、増幅は、２つ以上の逆転写ステップを含み、すなわち、反復逆転写、例えば、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、また２０超のＰＣＲ前の逆転写のサイクルを伴う。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、逆転写を促進させる逆方向プライマーは、ＰＣＲを促進させる逆方向プライマーと同じである。
【０１２８】
本出願人らは、この場合、逆転写を促進させるプライマーの融点を操作して、ＲＴをＰＣＲから分離すること、または実際に両方の性能を最大化することが可能になるというさらなる改善を見出した。プライマーの５０％が目的の標的に結合する点である、逆転写を促進させるプライマーのＴｍがそのＴｍからＤＮＡに分離される場合、本出願人らは、反応を逆転写のみに偏らせること、すなわち、反応は、ｃＤＮＡのみが形成され、逆転写は、プライマーが反応中の任意のＤＮＡに結合するには高すぎる温度で実行されるため、ＰＣＲ反応が開始できないことが可能であることを示した。そのような変更の１つは、逆方向プライマー配列へのロックド核酸の組み込みであり、これは、（Ｌｏｃｋｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄｓ  ｉｎ  ＰＣＲ  ｐｒｉｍｅｒｓ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ．Ｇｅｎｏｍｉｃｓ，ＩＳＳＮ：１０８９−８６４６，Ｖｏｌ：９１，Ｉｓｓｕｅ：３，Ｐａｇｅ：３０１−５，２００８）のように、修飾されたＲＮＡ分子は、ＲＮＡテンプレートへのＴｍを不均衡に増加させ、そのため、反応をｃＤＮＡの生成に偏らせる。例えば、配列ＧＡＧＴＡＧＧＡＧ｛Ｔ｝｛Ｔ｝｛Ｔ｝ＧＴＧＡＡＡＧＴＧＴＣ（括弧はＬＮＡの修飾を表す）は、ＤＮＡに対するＴｍが６４Ｃであるが、ＲＮＡに対するＴｍは７８Ｃである。したがって、例えば７５Ｃで逆転写することが可能であるが、ＰＣＲ産物を生成しないため、反復逆転写は、対応するＤＮＡ標的に対するＴｍよりも最低９Ｃ高いＴｍを有し、ＴＭよりも６Ｃ以上で逆転写を実行する逆方向プライマーによって特徴付けられる。この時点で、プライマーの１％未満がＤＮＡ標的に結合する可能性があり、そのため、大部分に逆転写が行われ、したがって、これは、患者が１ｍｌ当たり３，０００個のビリオンで感染するとき、感染した血液が、血液１マイクロリットル当たり３つの標的しか含有しないこの手法で不可欠な前増幅ステップを表す。標準的なＲｔ−ＱＰＣＲでは、反応が開始する前に数十のコピーが存在する必要があるため、この前ステップは診断感度に対する必要な推進力を表す。
【０１２９】
反復逆転写およびＰＣＲを促進させるプライマーは、ａ）温度に基づいて逆転写をＰＣＲから分離するか、またはｂ）逆転写とＰＣＲを同時に可能にするように設計することができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、逆転写を促進させる逆方向プライマーの融点は、ＰＣＲを促進させる順方向プライマーの融点とは異なり、その結果、反応の温度に応じて、ａ）逆転写が起こるか、ｂ）ＰＣＲが起こるか、またはｃ）逆転写とＰＣＲの両方が同時に起こる。順方向プライマーのＤＮＡに対するＴｍが逆方向プライマーのＲＮＡに対するＴｍから６Ｃ以上離れているならば、このときは、ＰＣＲの発生を防ぎながら効率的な逆転写を行うことが可能である。
【０１３１】
好ましい実施形態では、プライマーの融点の差は、約５〜６Ｃである。
【０１３２】
当業者は、ＲＮＡまたはＤＮＡに対するプライマーのＴｍが主に配列のＧＣ含有量によって促進されることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、逆転写反応の温度は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの融解温度を超える。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、１つ以上のプライマーは、１つ以上のＬＮＡ、ＺＮＡおよび／またはＢＮＡ修飾を含み、例えば、いくつかの実施形態では、逆方向プライマーは、１つ以上のＬＮＡ、ＺＮＡおよび／またはＢＮＡ修飾を含む。１つ以上のプライマーはまた、またはその代わりに、１つ以上のＬＮＡ、ＺＮＡおよび／またはＢＮＡ修飾を含み得る。
【０１３４】
当業者は、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲなどの増幅を使用して、例えば２０ｂｐ〜５，０００ｂｐの広範囲の長さのアンプリコンを生成できることを理解するであろう。しかしながら、現在の目的、すなわち疾患診断のためには、より短いアンプリコンが必要であり、これは診断結果をより迅速に得ることができることを意味するので、より短いアンプリコンが好ましい。したがって、いくつかの実施形態では、増幅は、４０ｂｐ〜５００ｂｐ、例えば５０ｂｐ〜４５０ｂｐ、例えば６０ｂｐ〜４００ｂｐ、例えば７０ｂｐ〜３５０ｂｐ、例えば８０ｂｐ〜３００ｂｐ、例えば９０ｂｐ〜２５０ｂｐ、例えば１００ｂｐ〜２００ｂｐ、例えば約１５０ｂｐの長さのアンプリコンをもたらす。得られるアンプリコンのサイズは、６０ｂｐ〜１００ｂｐであることが好ましい。
【０１３５】
上で論じたように、試料が添加され、試料が調製されたのと同じ容器内で増幅反応を実行することに関連する利点があり、例えば、生物学的安全性の理由である。したがって、一実施形態では、増幅は、本発明による試料の調製方法に従って試料が調製された容器と同じ容器内で行われる。
【０１３６】
別の実施形態では、試料および試薬が容器内に入ると、容器は密閉され、増幅反応全体を通して再び開かれることはない。
【０１３７】
同じ、もしくは異なる実施形態では、試料および試薬が容器に入ると、以下の試料または試薬のどの部分も、
ａ）該加熱の前に、および／または
ｂ）該加熱の後に、
ｃ）ＲＴの前に、および／または
ｄ）ＰＣＲの前に、および／または
ｅ）ＲＴ中、および／または
ｆ）ＰＣＲ中、および／または
ｇ）ＲＴ後、および／または
ｈ）ＰＣＲの後に、容器から取り出されない。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、この方法は、核酸を増幅する閉チューブ法である。当業者は、閉チューブ法が意味するものを理解するであろうが、典型的には、試料が、調製、または下流の増幅および検出ステップに必要な成分とともに、容器に添加されると、容器が閉じられ、例えば、キャップを閉じるか、容器の蓋を封止することによって、キャップまたは蓋が再び開かれることはない。例えば、閉チューブ法のいくつかの実施形態では、それ以上の材料は容器に添加されず、または容器からは除去されず、例えば、核酸は抽出されないか、またはいかなる方法でも精製されない。
【０１３９】
当業者は、増幅、例えば、ＰＣＲが少なくとも順方向および逆方向プライマーを使用して実行されることを理解するであろう。ｑＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲなどの場合によっては、プライマーは、アンプリコンの検出を可能にする好適なフルオロフォアまたは他の染料で標識されてもよい。反応はまた、蛍光標識されたプローブなどのプローブを使用してもよい。
試料が血液であり、血液が光路から沈む場合、または血液以外の試料の場合、好適なフルオロフォアは、５００ｎｍでのＦＡＭから７５０ｎｍでのａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６８０までの収集波長にわたり、当技術分野において既知の任意のフルオロフォア、例えば、ＴＥＴ、ＨＥＸ、Ｃｙ５を包含する。沈下（または遠心分離）せずに、血液試料には、とりわけ、６３０〜７５０ｎｍで発光するＣｙ５、ａｌｅｘａ  ｆｌｕｏｒ  ６５７、６８０、５９４、ｐｕｌｓａｒ  ６５０、ｑｕａｓａｒ  ６７０、ＣＹ５．５、ｑｕａｓａｒ  ７０５を含む遠赤外染料が必要である。
【０１４０】
好ましい実施形態では、試料が容器に添加されると試料は攪乱されないので、いくつかの実施形態では、試料および試薬は、逆転写酵素ステップとＰＣＲステップとの間では操作されない。［１ステップＲＴ−ＰＣＲ］
【０１４１】
当業者は、増幅のための試料を調製する方法を提供し、増幅の方法を提供することに加えて、本発明はまた、対象から得られた試料中の微生物またはウイルス粒子の存在を検出する方法を提供し、試料が、本発明に従って調製され、および／または微生物またはウイルス粒子からの核酸が本発明に従って増幅され、続いて増幅された核酸が検出されることを理解するであろう。
【０１４２】
上記のように、いくつかの実施形態では、増幅は、アンプリコンの量に相応する蛍光シグナルをもたらす。例えば、蛍光標識されたプライマーがアンプリコンに組み込まれるようになるか、または蛍光標識されたプローブを使用して、作製されたアンプリコンの量、またはアンプリコンの存在を定量化することができる。当業者は、定量的ＰＣＲ（ｑＰＣＲ／ＲＴ−ｑＰＣＲ）、および反応を実行し、アンプリコンを検出するための利用可能な選択肢を認識している。
いくつかの実施形態では、アンプリコンは、例えば、蛍光標識された染料／プライマーが反応において使用された場合に、分光光度計で検出される。
【０１４３】
当業者は、分光光度計が、例えば３００〜９００ｎｍの間のすべての放射光を捕捉でき、次いで、特定の範囲、例えば、５１０〜５８０ｎｍおよび６５５〜７５０ｎｍの２つのウィンドウで見ることを可能にするフィルタを使用できることを理解するであろう。これは、これらの波長に該当する任意の染料を使用することができ、試料を較正するか、またはスペクトルの重なりもしくは通常の光学系に関するその他の問題のいずれかを計算する必要がないことを意味する。
【０１４４】
したがって、一実施形態では、アンプリコンは、増幅中に蛍光標識されたプライマーまたはプローブで標識され、得られた蛍光は、５１０〜５８０ｎｍおよび６５５〜７５０ｎｍの２つのウィンドウで３００〜９００ｎｍの間のすべての光を捕捉する分光光度計を使用して検出される。
【０１４５】
非病原性ウイルスもしくは微生物、または危険とは見なされない病原性ウイルスもしくは微生物の場合、本発明の閉チューブの実施形態はそれほど重要ではないと見なされ、したがって電気泳動などのアンプリコンを検出する他の手段を使用することができ、および／またはアンプリコンは疫学研究のために配列決定されてもよい。
【０１４６】
本発明はまた、本発明の方法のいずれかで使用するための、例えば、試料の調製で使用するための、および／または本発明の増幅方法で使用するための、および／または本発明による検出方法で使用するための試薬を提供し、試薬は、界面活性剤、溶媒、および１つ以上の核酸ポリメラーゼを含む。
【０１４７】
本発明のこの態様の特徴のための設定は、本明細書の他の箇所で定義されている通りであり、例えば、溶媒、界面活性剤、ポリメラーゼ、各成分の濃度、ｐＨなどの設定は、本明細書で定義されている通りである。
【０１４８】
上で論じたように、いくつかの実施形態では、試薬はＲＮＡ分解を最小限に抑える。
また、いくつかの実施形態では上で論じたように、試薬はＴｒｉｓを含まない。
【０１４９】
試薬は、ビシンを含むことができ、例えば、２０ｍＭ〜７０ｍＭのビシン、例えば２５ｍＭ〜６５ｍＭのビシン、例えば３０ｍＭ〜６０ｍＭのビシン、例えば３５ｍＭ〜５５ｍＭのビシン、例えば４０ｍＭ〜５０ｍＭのビシン、例えば５０ｍＭのビシンの濃度で、ビシンを含んでもよい。
【０１５０】
好ましい実施形態では、試薬は二価カチオンを緩衝する。
いくつかの実施形態では、溶媒はグリセロールであり、および／または界面活性剤はＴｗｅｅｎ、例えばＴｗｅｅｎ２０である。特定の実施形態では、試薬は、Ｔｗｅｅｎ、例えば、最大０．４％の濃度のＴｗｅｅｎ２０を含み、および／または最大１１％の濃度のグリセロールを含み、例えば、試薬は、１１％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％以下のグリセロールを含む。
【０１５１】
上記のように、試薬は１つ以上のポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、試薬は、少なくとも２つの異なるポリメラーゼ酵素を含む。
【０１５２】
例えば、一実施形態では、ポリメラーゼは、ＤＮＡ依存性のＤＮＡポリメラーゼ活性、ＲＮＡ依存性ポリメラーゼ活性を有するか、または、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性の両方を有し、任意に、ポリメラーゼは、以下からなる群から選択される：
ａ）ＴＴＨポリメラーゼ（Ｐｒｏｍｅｇａ）［配列番号３］
ｂ）Ｈａｗｋ  Ｚ０５（Ｒｏｃｈｅ）、［配列番号４］
ｃ）ＷＯ２０１４／０２３３１８に記載されているポリメラーゼ
ｄ）配列番号１、２、３、４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリメラーゼであって、任意に、このポリメラーゼは、以下の突然変異：配列番号１、２、３、または４に関するＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ、Ｍ７４７Ｋ、Ｌ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ、Ｅ７７３Ｇ、およびＬ７８９Ｆのうちの１、２、３、４、５、６、７、または８個を含むもの、
ｅ）Ｍ１／Ｍ７４７Ｋ酵素［配列番号２］に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリメラーゼ。
【０１５３】
好ましい酵素は、配列番号１、２、３、４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有し、任意に、このポリメラーゼが、以下の突然変異：配列番号１、２、３、または４に関するＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ、Ｍ７４７Ｋ、Ｌ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ、Ｅ７７３Ｇ、およびＬ７８９Ｆのうちの１、２、３、４、５、６、７、または８個を含むものであるか、またはＭ１／Ｍ７４７Ｋ酵素［配列番号２］に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有するポリメラーゼであり、これらの酵素のいくつかが、Ｈａｗｋｚ０５よりも増幅中の血液の存在に対してより耐性があり、ＴＴＨよりも逆転写に優れていると考えられているためである。このような酵素によって生成された増幅データが実施例に提供されている。
【０１５４】
ポリメラーゼ（複数可）が、血液などのいくつかの試料に見られる阻害物質に対して自然に耐性があるか、または耐性があるように操作されている場合も好ましい。例えば、酵素ＴＴＨは、血液中に存在する阻害物質に対して自然に耐性があると考えられている。配列番号１、２、３、４に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する特定の酵素であって、任意に、このポリメラーゼが、以下の突然変異：配列番号１、２、３、または４に関するＳ５１５Ｒ、Ｉ６３８Ｆ、Ｍ７４７Ｋ、Ｌ３２２Ｍ、Ｌ４５９Ｍ、Ｓ７３９Ｇ、Ｅ７７３Ｇ、およびＬ７８９Ｆのうちの１、２、３、４、５、６、７、または８個を含む酵素、またはＭ１／Ｍ７４７Ｋ酵素［配列番号２］に対して少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性を有する酵素は、血液の中の阻害物質に対してり耐性があると考えられている。
【０１５５】
試薬はまた、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する第１のポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する第２のポリメラーゼと、を含んでもよい。
【０１５６】
試薬はまた、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する第１のポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する第２のポリメラーゼと、を含んでもよい。
【０１５７】
いずれの場合も、試薬は、１：１〜５：１の第１のポリメラーゼ対第２のポリメラーゼの比を含み得、例えば、少なくとも１：１、１：２、１：３、１：４、または少なくとも１：５の第１のポリメラーゼ対第２のポリメラーゼの比を含んでもよい。
【０１５８】
試薬はまた、１：１〜５：１の第２のポリメラーゼ対第１のポリメラーゼの比を含み得、例えば、少なくとも１：１、１：２、１：３、１：４、または少なくとも１：５の第１のポリメラーゼ対第２のポリメラーゼの比を含んでもよい。
【０１５９】
例えば、試薬は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する第１のポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する第２のポリメラーゼを含むことができ、ここでは、第１のポリメラーゼ対第２のポリメラーゼの比が、１：１〜５：１であり、例えば、少なくとも１：１、１：２、１：３、１：４、または少なくとも１：５の第１のポリメラーゼ対第２のポリメラーゼの比を含んでもよく、または、第２のポリメラーゼ対第１のポリメラーゼの比が、１：１〜５：１であり、例えば、少なくとも１：１、１：２、１：３、１：４、または少なくとも１：５の第１のポリメラーゼ対第２のポリメラーゼの比を含んでもよい。
【０１６０】
別の例では、試薬は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する第１のポリメラーゼと、ＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有する第２のポリメラーゼを含むことができ、ここでは、第１のポリメラーゼ対第２のポリメラーゼの比が、１：１〜５：１であり、例えば、少なくとも１：１、１：２、１：３、１：４、または少なくとも１：５の第１のポリメラーゼ対第２のポリメラーゼの比を含んでもよく、または、第２のポリメラーゼ対第１のポリメラーゼの比が、１：１〜５：１であり、例えば、少なくとも１：１、１：２、１：３、１：４、または少なくとも１：５の第１のポリメラーゼ対第２のポリメラーゼの比を含んでもよい。
【０１６１】
試薬は、同じ、もしくは異なる活性を有する１、２、３、４、５またはそれ以上の異なるポリメラーゼ酵素を含み得る。
【０１６２】
さらに、いくつかの実施形態では、試薬は、血液凝固で補助する薬剤を含む。血液凝固で補助する薬剤の設定は、本明細書の他の箇所で記載されている通りである。
【０１６３】
いくつかの実施形態では、増幅反応は閉チューブバイオセーフ反応であるため、試薬は、増幅およびその後の検出に必要なすべての成分を含み、試料自体を除外するべきであることが理解されよう。したがって、一実施形態では、試薬は、ＰＣＲおよび／またはＲＴ−ＰＣＲおよび／またはＲＴ−ｑＰＣＲに必要な成分を含み、例えば、以下を含み得る：
１つ以上のプライマー、例えば、１つ以上のフルオロフォア標識プライマー、および／または
１つ以上の蛍光染料、
塩化マグネシウム、ＢＳＡ、ｄＮＴＰ、アルギニン、ランダムＲＮＡ、例えば、酵母ＲＮＡ、凍結乾燥中に酵素活性を維持するために必要な賦形剤。
【０１６４】
また、上記のように、試薬のいくつかの成分は凍結乾燥され得るが、これは、凍結乾燥された成分の冷蔵が通常必要とされないので、利点を有する。したがって、一実施形態では、試薬の成分のうちの１つ以上は、凍結乾燥形態であり、任意に、容器内での凍結乾燥形態である。一実施形態では、試薬の成分のうちの１つ以上は、凍結乾燥形態であり、任意に、容器内での凍結乾燥形態であり、任意に、ポリメラーゼ、ＢＳＡ、プライマー（複数可）、プローブ（複数可）またはｄＮＴＰのうちの１つ以上が凍結乾燥され、任意に、一緒に凍結乾燥される。
【０１６５】
上記のように、本発明者らは、複数回の逆転写を実行することが可能であり、有益であることを発見した。複数回の逆転写は、標的核酸の増幅および検出の感度を高め、これは、試料、特に試料中の任意のＲＮＡを分解から保護する本発明の試薬の使用によって主に可能になった。したがって、本発明は、ＲＴ−ＰＣＲを実施する方法も提供し、この方法は、２つ以上の逆転写ステップ、例えば、ＰＣＲの前に、またはＰＣＲ中に、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、または２０を超える逆転写のステップを含む。この方法は、本発明の他の方法から独立していると見なされるが、他の方法と共に使用することができる。逆転写および反復逆転写の設定は、本明細書の他の箇所に記載されている通りである。
【０１６６】
上記のように、反復ＲＴの方法において、いくつかの実施形態では、逆転写を促進させる逆方向プライマーは、ＰＣＲを促進させる逆方向プライマーと同じである。
【０１６７】
さらに、また上記のように、いくつかの実施形態では、逆転写を促進させる逆方向プライマーの融点は、ＰＣＲを促進させる順方向プライマーの融点とは異なり、その結果、反応の温度に応じて、ａ）逆転写が起こるか、ｂ）ＰＣＲが起こるか、またはｃ）逆転写とＰＣＲの両方が同時に起こる。例えば、プライマーの融点の差は約５Ｃ以上であり得、逆転写はＤＮＡへのＴＭよりも６Ｃ以上で起こり、これにより、ＲＴのみが起こり得る。
【０１６８】
プライマーは、１つ以上のＬＮＡ、ＺＮＡおよび／またはＢＮＺ修飾を含み、任意に、逆方向プライマーは、１つ以上のＬＮＡ、ＺＮＡおよび／またはＢＮＺ修飾を含む。
【０１６９】
いくつかの実施形態では、逆転写反応の温度は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッドの融解温度を超える。
【０１７０】
反復ＲＴを使用して、任意のサイズのアンプリコンを増幅することができるしかしながら、好ましい実施形態では、増幅は、４０ｂｐ〜５００ｂｐ、任意に５０ｂｐ〜４５０ｂｐ、任意に６０ｂｐ〜４００ｂｐ、任意に７０ｂｐ〜３５０ｂｐ、任意に８０ｂｐ〜３００ｂｐ、任意に９０ｂｐ〜２５０ｂｐ、任意に１００ｂｐ〜２００ｂｐ、任意に約１５０ｂｐの長さのアンプリコンをもたらす。アンプリコンは、６０〜１００ｂｐの範囲であることが好ましいであろう。
【０１７１】
本発明はまた、ウイルス核酸が増幅に利用可能になる温度を決定するための方法を提供し、
ａ）この方法は、本発明の方法に従って複数の試料を調製することを含み、複数の試料が、ＰＣＲまたはＲＴ−ＰＣＲの前に、異なる温度範囲の１つにそれぞれ個別に加熱され、例えば、個々の試料が調製され、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０℃、９１℃、９２℃、９３℃、９４℃、９５℃のうちの１つに加熱され、任意に、７６、７７、７８、７９、８０、８１℃に加熱され、その後、
ｂ）ウイルス核酸の増幅、例えば本発明の方法に従って増幅を行い、その後、
ｃ）アンプリコンの検出、任意に、本発明に従ってアンプリコンの検出を行う。
【０１７２】
本明細書に記載される方法が、試料中のウイルスまたは微生物の存在または非存在を判定するために使用できるため、診断方法に使用できることは明らかであろう。したがって、本発明は、微生物またはウイルス感染の存在または非存在を診断するための方法を提供し、対象から得られた試料が、本発明に従って調製され、その後、
ａ）ウイルス核酸の増幅、例えば、本発明の方法にしたがって増幅が続き、その後、
ｂ）アンプリコンの検出、例えば、本発明に従ってアンプリコンの検出が続き、
アンプリコンの存在の検出が、対象が微生物またはウイルス感染を有することを示している。
【０１７３】
本発明の様々な態様および実施形態がキットとして提供されるのに役立つことも当業者には明らかであろう。例えば、本発明は、界面活性剤、溶媒、および１つ以上の核酸ポリメラーゼを含むキットを提供する。界面活性剤、溶媒、およびポリメラーゼ（複数可）についての設定は、本明細書で定義されている通りである。いくつかの実施形態では、キットはまた、反応容器、例えば、不可逆ロックを含む容器３５を使用することができ、その結果、試料が添加され、容器が封止されると、容器を再び開くことができない。このような容器は、ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５１１５６に記載されている。
【０１７４】
キットの様々な構成成分は、液体形態または凍結乾燥形態であり得る。凍結乾燥成分についての設定は、本明細書に記載されている。
【０１７５】
本明細書で明らかに先に公表された文献のリストまたは議論は、その文献が最新技術の一部であるか、または共通の一般知識であることを認めるものと必ずしも解釈されるべきではない。
【０１７６】
本発明の所与の態様、特徴、またはパラメータのための選好および選択肢は、特に文脈に示されない限り、本発明の全ての他の態様、特徴、およびパラメータにおける任意のおよび全ての選好および選択肢と組み合わせて開示されているよう見なされるべきである。例えば、本発明は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼおよびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性を有するポリメラーゼと、０．３％のＴｗｅｅｎと、８％のグリセロールと、を含む試薬を提供する。本発明はまた、ウイルス核酸の増幅のためのウイルスを含み得る試料を調製する方法を提供し、この方法は、ＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼ活性およびＤＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼの両方を有するポリメラーゼの存在下で密閉容器内で試料を９５Ｃで１秒間加熱することを含む。本発明はまた、対象をエボラ出血熱に感染していると診断する方法を提供し、この方法は、増幅のために対象から採取した２ｕｌの血液の試料を調製することであって、調製が、試料を９５Ｃに１秒間加熱することを含む、調製することと、この試料でＲＴ−ＰＣＲまたはＲＴ−ｑＰＣＲを直接実施し、続いてアンプリコンの検出（存在する場合）を行うことと、を含む。
【０１７７】
（図面の説明）
［図１］
Ａ）８５、８７、８９、９１、９３、９５Ｃで１秒間の加熱を示している。Ｂ）７１／７３／７４／７６／７８／８０Ｃで４５秒間の加熱を示している。Ｃ）７８／７９／８０／８１／８２Ｃで２０秒間の加熱である。８１／８２はこのウイルスに最適であるが、すべての温度がウイルス核酸を増幅可能にし、同程度になる。使用したアッセイはＧＰ１４アッセイであった（Ｔｒｏｍｂｌｅｙ  ＡＲ，Ｗａｃｈｔｅｒ  Ｌ，Ｇａｒｒｉｓｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＴａｑＭａｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓｅｓ，ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ，ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  ｈａｎｔａｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．２０１０；８２（５）：９５４−９６０．ｄｏｉ：１０．４２６９／ａｊｔｍｈ．２０１０．０９−０６３６）。標的は、１００ビリオンのａｃｃｕｐｌｅｘ  ＺＥＢＯＶコントロール（Ｓｅｒａｃａｒｅ  ＬＬＣ、カタログ番号０５０５−００１）であった。５０ｕｌのｒｘｎ、８００ｎｍのＦおよびＲプライマー、２００ｎｍのＣｙ５標識プローブおよび記載されている試薬−５０ｍＭのビシンｐＨ８．２、３．４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、１１５ｍＭの酢酸カリウム、０．１ｕｇ／ｕｌのＢＳＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ。８．５％のグリセロール、５単位／ｒｘｎの酵素（配列番号２と＞９５％と同じ）。熱サイクルプロトコルは、８５／８７／８９／９１／９３／９５９５Ｃで１秒間（ウイルス溶解）、６３Ｃで９０秒間（ＲＴステップ）、９６Ｃで３秒間（ハイブリッド変性）、５７Ｃで４５秒間（ＰＣＲ）、９５Ｃで３数間の変性であって、４０回繰り返した。
［図２］本発明の方法は、様々な試料型での使用に適している。
Ａ）血清（０％の血液）、および９％の血液と１５％の血液中の１００個のビリオンからの核酸の増幅を示している。驚くべきことに、血液の好ましい量は１２〜１６％であり、血清の好ましい量は１２〜１６％である。
Ｂ）感染した動物の病変から単離された細胞からのＰＰＲＶウイルスの直接検出である。
Ｃ）ＰＰＲＶに感染した動物からのブタ鼻腔スワブの連続希釈である。
Ｄ）脳脊髄液からのエボラシュードウイルスの直接検出である。
Ｅ）ａ）ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、ｂ）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉのいずれかを１０００細菌／ｒｘｎでスパイクした全血である。これは、この方法が細菌の核酸を増幅可能にするので、血液中の細菌感染が核酸抽出を必要とせずに検出され得ることを実証している。
Ｆ）ウイルス培養物からのＣＣＨＦの直接検出である。
Ｇ）凍結した感染患者試料からのラッサ熱の直接検出である。
上記のすべての反応について、条件は以下の通りであった：５０ｕｌのｒｘｎ、４００〜８００ｎｍのＦおよびＲプライマー、１２０〜２００ｎｍのＣｙ５標識プローブおよび記載されている試薬−５０ｍＭのビシンｐＨ８．２、３．４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、１１５ｍＭの酢酸カリウム、０．１ｕｇ／ｕｌのＢＳＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ。８．５％のグリセロール、５単位／ｒｘｎの酵素（配列番号２と＞９５％と同じ）。熱サイクルプロトコルは、９５Ｃで１秒間（ウイルス溶解）、６３Ｃで９０秒間（ＲＴステップ）、９６Ｃで３秒間（ハイブリッド変性）、５７Ｃで４５秒間（ＰＣＲ）、９５Ｃで３数間の変性であって、４０回繰り返した。すべてのアッセイは、閉チューブフォーマットで完了し、試料を直接混合物に添加した。実験ＥおよびＡは、ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５１１５６の容器および方法で実施され、反応容器を密閉すると、そこに含有される赤血球を容器の基部に引き込み、ビリオンを直接検出することができる血漿を作製するために、遠心分離機で５００ｇに３０秒間さらした。適切なプライマーおよびプローブが使用され、エボラ出血熱の場合、これらはＧＰ１４アッセイであった（Ｔｒｏｍｂｌｅｙ  ＡＲ，Ｗａｃｈｔｅｒ  Ｌ，Ｇａｒｒｉｓｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＴａｑＭａｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓｅｓ，ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ，ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  ｈａｎｔａｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒｏｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．２０１０；８２（５）：９５４−９６０．ｄｏｉ：１０．４２６９／ａｊｔｍｈ．２０１０．０９−０６３６）。ＣＣＨＦの場合、これらは（Ｂａｒｒｙ  Ａｔｋｉｎｓｏｎ，Ｊｏｈｎ  Ｃｈａｍｂｅｒｌａｉｎ，Ｃｈｒｉｓｔｏｐｈｅｒ  Ｈ．Ｌｏｇｕｅ，Ｎｉｃｏｌａ  Ｃｏｏｋ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｂｒｕｃｅ，Ｓｔｕａｒｔ  Ｄ．Ｄｏｗａｌｌ，ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒ  Ｈｅｗｓｏｎ．Ｖｅｃｔｏｒ−Ｂｏｒｎｅ  ａｎｄ  Ｚｏｏｎｏｔｉｃ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ．Ｓｅｐ  ２０１２）からのものであり、ＰＰＲＶの場合、以下の出版物からのアッセイであり（Ａ  ｒｅａｌ  ｔｉｍｅ  ＲＴ−ＰＣＲ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｅ  ｄｅｓ  ｐｅｔｉｔｓ  ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｍｅｔｈｏｄｓ，ＩＳＳＮ：１８７９−０９８４，Ｖｏｌ：１７１，Ｉｓｓｕｅ：２，Ｐａｇｅ：４０１−４：２０１１）、Ｌａｓｓａの場合、アッセイ（Ｔｒｏｍｂｌｅｙ  ＡＲ，Ｗａｃｈｔｅｒ  Ｌ，Ｇａｒｒｉｓｏｎ  Ｊ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｐａｎｅｌ  ｏｆ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＴａｑＭａｎ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ｃｈａｉｎ  ｒｅａｃｔｉｏｎ  ａｓｓａｙｓ  ｆｏｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｂｓｏｌｕｔｅ  ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｆｉｌｏｖｉｒｕｓｅｓ，ａｒｅｎａｖｉｒｕｓｅｓ，ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｗｏｒｌｄ  ｈａｎｔａｖｉｒｕｓｅｓ．Ａｍ  Ｊ  Ｔｒ���ｐ  Ｍｅｄ  Ｈｙｇ．２０１０；８２（５）：９５４−９６０）からのものであり、最後にｅ．ｃｏｌｉおよびｓ．ｅｐｉｄｅｒｍｉｓの場合、以下のプライマーおよびプローブを使用した：
Ｅ．ＣｏｌｉＡ２＿Ｆ２  ＧＴＡＡＣＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＡＣＣ
Ｅ．ＣｏｌｉＡ２＿Ｒ２  ＴＧＴＧＧＧＣＡＴＴＣＡＧＴＣＴＧＧＡＴＣ
Ｅ．ＣｏｌｉＡ２＿Ｐ２  ＣＴＧＡＴＣＡＡＴＴＣＣＡＣＡＧＴＴＴＴＣＧＣＧ
Ｓｅｐ＿ａａｐ＿Ｐ０４−Ｆ  ＣＴＧＴＴＡＡＴＧＧＧＴＴＣＴＴＡＧＴＴＧＴＴＧＧ
Ｓｅｐ＿ａａｐ＿Ｐ０４ｂ−Ｒ  ＣＡＡＡＡＴＡＴＧＧＴＣＣＡＧＴＴＧＡＴＧＧＡＧＡ
Ｓｅｐ＿ａａｐ＿Ｐ０４−Ｐ  ＧＴＴＧＴＡＡＴＴＧＴＴＴＴＴＧＴＴＣＣＴＧＧＴＴＣＡＣＣＴ
［図３］Ｔｗｅｅｎ（ポリソルベート）は、増幅成分が核酸にアクセスして増幅をもたらすことを可能にするが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘはそうではない。
Ａ）界面活性剤を含まず、６％のグリセロール、０．１％のｔｗｅｅｎおよび６％のグリセロール、ならびに０．２％のｔｗｅｅｎおよび６％のグリセロールで構成された最小量の溶媒を含む反応を示す。
Ｂ）Ｔｗｅｅｎを０．６％、０．９％、および１．０％を用いた反応を示す。
Ｃ）０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０と６％のグリセロールとを含む反応、および０．２％のＴｗｅｅｎ  ２０と０％のグリセロールとを含む反応を示す。
Ｄ）Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘを含む反応を示す。
［図４］
Ａ）ＴＴＨ酵素のデータを示す−反応あたり１０００ビリオンを有する９％の血液。
Ｂ）Ｈａｗｋｚ３０５酵素のデータを示す−反応あたり１００コピーで６％の血液。
Ｃ）配列番号２の酵素のデータを示す。
５０ｕｌの反応、８００ｎｍのＦおよびＲプライマー、２００ｎｍのＣｙ５標識プローブおよび記載されている試薬−５０ｍＭのビシンｐＨ８．２、３．４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、１１５ｍＭの酢酸カリウム、０．１ｕｇ／ｕｌのＢＳＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ。８．５％のグリセロール、５単位／ｒｘｎの酵素（配列番号２と＞９５％と同じ）。熱サイクルプロトコルは、９５Ｃで１秒間（細菌溶解）、６３Ｃで９０秒間（ＲＴステップ）、９６Ｃで３秒間（ハイブリッド変性）、５７Ｃで４５秒間（ＰＣＲ）、９５Ｃで３数間の変性であって、４０回繰り返した。反応は、１５％の最終反応量でヒトの血液でスパイクされた。
［図５］
本発明の試薬が、ＲＮＡ分解から保護することを示すデータである。３、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０ｍＭの濃度のマグネシウムを用いて９５Ｃで１分間の温度保持で反応を行った。これはビシン緩衝液中で行った。
［図６］反応に対するグリセロールの効果である。
Ａ）６、７、８、９および１０％グリセロールｖ／ｖで実行された反応を示す。８〜９％が最良の妥協点であることがわった。
Ｂ）０．２％のｔｗｅｅｎ２０で０％および６％グリセロールを用いた反応を示す。
［図７］血液沈下に対するｔｗｅｅｎの効果である。
Ａ）エッペンドルフチューブ内の血液の沈下に対する０．１％、０．４％、および１．０％のｔｗｅｅｎの効果である。
Ｂ）様々な濃度のＰＣＲ反応チューブ内の血液の沈下に対するトゥイーンの効果である。ＰＣＲ画像の前後が示され、ｔｗｅｅｎの濃度が高いとＰＣＲ後に明白な透明な層が形成され、ｔｗｅｅｎの濃度が低いと、透明な層は存在しないか、または最小限の形成となる、ＰＣＲ前後の画像が示されている。
Ｃ）Ｂで設定された反応からの増幅データである。
［図８］逆転写酵素に対する複数の短い保持時間の効果である。
Ａ）単一の４分間の逆転写ステップは、ｉ）単一の保持時間（０回変性）として実行するか、またはｉｉ）多数のｃＤＮＡ変性ステップを含むが、合計保持時間が（ｉ）のものと同じである多数のより短い保持時間として実行するかのいずれかである。
Ｂ）それぞれ１６％のヒト全血を含有し、各反応に１０個のウイルスがスパイクされた１５個の同一の反応のセット−コピー数が非常に少ないが、開始時にＰＣＲを開始する複数の機会を有することによる高感度−これは、低コスト診断のためのＷＨＯによって要求される商業的に重要な３，０００ビリオン／ｍｌを満たす鍵である。
Ｃ）この方法の一般的な熱プロファイルであり−正しい温度を、各ステップを決定する必要がある。
［図９］
Ａ）Ｔｅｔ標識を使用した血液からのＰＣＲであり、Ｂ）ＣＹ５標識を使用した血液からのＰＣＲである。
反応は、ＴＥＴ染料またはＣｙ５のいずれかで標識されたプローブおよびクエンチャーがそれぞれＢＨＱ１またはＢＨＱ２であることを除いて、反応は同じであった。標的な、ａｃｃｕｐｌｅｘ  ｅｂｏｌａ標準物質であった。５０ｕｌのｒｘｎ、８００ｎｍのＦおよびＲプライマー、２００ｎｍのＣｙ５標識プローブおよび記載されている試薬−５０ｍＭのビシンｐＨ８．２、３．４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、１１５ｍＭの酢酸カリウム、０．１ｕｇ／ｕｌのＢＳＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ。８．５％のグリセロール、５単位／ｒｘｎの酵素（配列番号２と＞９５％と同じ）。熱サイクルプロトコルは、９５Ｃで１秒間（ウイルス溶解）、６３Ｃで９０秒間（ＲＴステップ）、９６Ｃで３秒間（ハイブリッド変性）、５７Ｃで４５秒間（ＰＣＲ）、９５Ｃで３数間の変性であって、４０回繰り返した。
［図１０］配列アラインメントである。
［図１１］粗製試料からの直接検出のさらなる例である：
ａ）最終反応量の６％で添加された凍結血液を使用した、感染したマウスモデルからのリフトバレー熱ウイルス（Ｒｉｆｔ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）の直接検出である。
ｂ）ウイルス培養培地からのクリミアコンゴ出血熱ウイルス（Ｃｒｉｍｅａｎ  Ｃｏｎｇｏ  Ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）の直接検出である。
ｃ）感染したブタの血液または鼻腔スワブからの小反芻獣疫ウイルス（Ｐｅｓｔ  ｄｅｓ  Ｐｅｔｉｔｓ  Ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ）の直接検出である。
ｄ）ＰＢＭＣ中のウイルス培養仏からの口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ  ａｎｄ  Ｍｏｕｔｈ  ｖｉｒｕｓ）の検出である。
５０ｕｌのｒｘｎ、８００ｎｍのＦおよびＲプライマー、２００ｎｍのＣｙ５標識プローブおよび記載されている試薬−５０ｍＭのビシンｐＨ８．２、３．４ｍＭのＭｇＣｌ２、０．４ｍＭのｄＮＴＰ、１１５ｍＭの酢酸カリウム、０．１ｕｇ／ｕｌのＢＳＡ、０．２％のＴｗｅｅｎ。８．５％のグリセロール、５単位／ｒｘｎの酵素（配列番号２と＞９５％と同じ）。熱サイクルプロトコルは、９５Ｃで１秒間（ウイルス溶解）、６３Ｃで９０秒間（ＲＴステップ）、９６Ｃで３秒間（ハイブリッド変性）、５７Ｃで４５秒間（ＰＣＲ）、９５Ｃで３数間の変性であって、４０回繰り返した。
プライマー配列は、以下の通りである：
ＣＣＨＦ  Ｓ１２２Ｆ  ＣＣＴＴＴＴＴＧＡＡＣＴＣＴＴＣＡＡＡＣＣ
ＣＣＨＦ  Ｓ１Ｒ  ＴＣＴＣＡＡＡＧＡＡＡＣＡＣＧＴＧＣＣ
ＣＣＨＦ  Ｐｒｏｂｅ  ＡＣＴＣＡＡＧＧＫＡＡＣＡＣＴＧＴＧＧＧＣＧＴＡＡＧ
ＲＶＦ  Ｗｅｉｄ  Ｆ  ＴＧＣＣＡＣＧＡＧＴＹＡＧＡＧＣＣＡ
ＲＶＦ  Ｗｅｉｄ  Ｒ  ＧＴＧＧＧＴＣＣＧＡＧＡＧＴＹＴＧＣ
ＲＶＦ  Ｗｅｉｄ  ＰＴＣＣＴＴＣＴＣＣＣＡＧＴＣＡＧＣＣＣＣＡＣ
ＰＰＲＶＦ  ＡＧＡＧＴＴＣＡＡＴＡＴＧＴＴＲＴＴＡＧＣＣＴＣＣＡＴ
ＰＰＲＶＲ  ＴＴＣＣＣＣＡＲＴＣＡＣＴＣＴＹＣＴＴＴＧＴ
ＰＰＲＶＰ  ＣＡＣＣＧＧＡＹＡＣＫＧＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＡＡ
【０１７８】
（実施例）
実施例１−標的核酸を増幅成分にアクセス可能にするために必要な温度
図１ａ、ｂおよびｃは、試料をより高い温度に短時間加熱することが、より低い温度に長時間加熱するよりも好ましいことを示している。
【０１７９】
７６Ｃを超える温度は、ウイルス核酸を増幅成分にアクセス可能にする。しかしながら、ＲＮＡは時間とともに分解するため、保持時間をより短くすることが好ましく、より短いクーラー保持が最も好ましい。好ましい実施形態は、試料を９３〜９５Ｃに１秒間加熱することである。
【０１８０】
実施例２−複数の試料型およびウイルス／微生物
本発明は、血液および血漿（図２Ａ）、感染動物の病変からの細胞（図２Ｂ）、ブタ鼻腔スワブ、脳脊髄液、ウイルス培養物、凍結感染患者血清試料を含む複数の試料型での使用に好適であり、少なくともラッサ熱、ＣＣＨＦ、ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｐｉｄｅｒｍｉｓ、Ｅ．ｃｏｌｉ、エボラシュードウイルス、およびＰＰＲＶを検出するために使用することができる。本発明を使用して、増幅可能な核酸を含むいかなるウイルスまたは微生物も検出することができないことを疑う理由はない。
【０１８１】
実施例３−Ｔｗｅｅｎおよびグリセロールの効果
ウイルスまたは微生物の核酸を増幅可能にするために、界面活性剤が必要である。したがって、７０Ｃ以上に加熱するだけでは、核酸の増幅をもたらすのに十分ではない。Ｔｗｅｅｎはウイルスまたは微生物の核酸を増幅可能にすることができるが、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘはそうではない。
【０１８２】
ポリソルベート８０はより親油性であり、ポリソルベート２０はより親水性であるため、すべての試験はｔｗｅｅｎ２０（ポリソルベート２０）で行われたが、他のｔｗｅｅｎの形態も機能しないと考える理由はない。酵素緩衝液が界面活性剤Ｂｒｉｊを含んでおり、ＢｒｉｊがＴｒｉｔｏｎと適合性がない可能性があるため、Ｔｒｉｔｏｎは機能しなかったと予想される。したがって、Ｔｗｅｅｎ以外の界面活性剤は、本発明の方法および本発明の試薬と共に使用するのに好適であると考えられるが、場合によっては、酵素混合物の成分との適合性を評価する必要があり得る。他の非イオン性界面活性剤はこのプロセスと適合性があり、当技術分野において既知であると想定されている。
【０１８３】
界面活性剤がないということは、例えば、キャプシド配座を変更するか、または核酸からタンパク質を除去するために界面活性剤が必要な場合があり、溶解および再現性のないデータにつながるため、標的核酸が増幅成分にアクセス可能ではないことを意味する。何よりも０．１％を超えるｔｗｅｅｎを添加すると、反応が再現可能になる。Ｔｗｅｅｎの濃度が高くなりすぎると、プライマー／プローブのｔｍが低下する。これにより、ＰＣＲの効率およびプロービングが低下し、ＰＣＲ自体に損傷を与える。実際には、この特定の反応では、この抑圧が始まるため、０．７％を超えて使用することはできない。
【０１８４】
Ｔｗｅｅｎは、試料が血液である試料を沈下させるのにも役立つ。図７は、様々な濃度のｔｗｅｅｎが血液の沈下および増幅に及ぼす効果を示している。０．１％のｔｗｅｅｎからずっと、チューブの上部に透明な層が形成され、透明な層のサイズはｔｗｅｅｎの濃度に依存する（０％のｔｗｅｅｎのチューブでは、上部に透明な層を全く示さない）。しかしながら、より高い濃度では、ｔｗｅｅｎはプライマーのＴｍを低下させ、かつＰＣＲ効率を低下させる。０．２〜０．３％のｔｗｅｅｎは、ＰＣＲ効率を低下させることなく透明な層を提供するため、最適であると考えられる。
【０１８５】
効率的かつ再現性のある溶解および増幅を行うには、溶媒および界面活性剤の両方が存在する必要がある。
【０１８６】
実施例４−本発明の方法は、ある範囲のポリメラーゼと共に使用するのに好適である。
図４Ａは、ＲＮＡ依存性およびＤＮＡ依存性の両方のポリメラーゼ活性を有するＴＴＨ酵素について得られたデータを示している。図４Ｂは、両方の活性を有するＨａｗｋｚ０５酵素についてのデータを示している。
【０１８７】
ＴＴＨおよびＨａｗｋｚ０５酵素は使用できるが、ＴＴＨは逆転写酵素としてうまく働かず、Ｈａｗｋｚ０５は血液の存在によってより阻害されるため、配列番号２と９０％または９５％の同一性を有する酵素ほど感度が高くない。
【０１８８】
実施例５−試薬によるＲＮＡ保護
ＴｒｉｓとＭｇとの組み合わせがニック（ｎｉｃｋ）の入ったＲＮＡをもたらすことは周知である（ＡｂｏｕＨａｉｄａｒ  ａｎｄ  Ｉｖａｎｏｖ，１９９９  Ｚ  Ｎａｔｕｒｆｏｒｓｃｈ  ５４：５４２−５４８）。
【０１８９】
本発明の方法および試薬は、ＲＮＡ分解を最小限に抑える。
【０１９０】
低ＲＮＡ分解の最も良い証拠は、マグネシウム濃度および保持時間の範囲全体で一貫した性能であることである。図５は、マグネシウムを３、３．２、３．４、３．６、３．８、４．０ｍＭで用いた９４Ｃで１分間の加熱ステップのデータを示している。これは高温で比較的長い時間であり、Ｍｇ２＋が高いが、Ｃｔは同じである。これは、ＭｇＣｌ２の２５％増加に対してＲＮＡ分解に差がないことを示している。考えられるメカニズム、したがってビシン／トリシンを選択する理由は、溶液中で遊離している利用可能な遊離金属イオンの量を緩衝できることが知られており、これに加えてｐＨを下げると、ＲＮＡのヒドロキシル攻撃を最小限にすることができるためである（Ｆｒｅｅ−ｍｅｔａｌ  ｉｏｎ  ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｂｙ  “Ｇｏｏｄ’ｓ”  ｂｕｆｆｅｒｓ  Ｒ  Ｎａｋｏｎ，ＣＲ  Ｋｒｉｓｈｎａｍｏｏｒｔｈｙ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９  Ａｕｇ  １９８３：Ｖｏｌ．２２１，Ｉｓｓｕｅ  ４６１２，ｐｐ．７４９−７５０  ＤＯＩ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．６８７９１７３）。
−これは、ＲＮＡが反応中に留まるため、必要に応じて逆転写の複数のサイクルに利用できることを意味する。
【０１９１】
本発明の緩衝液は、いくつかの実施形態では、試料がさらされる７０Ｃを超える温度でも中性のｐＨである。
【表２】
2021532770.tif 000004
【０１９２】
公表されたデータによると、ビシンは０．１８ｐＨ単位／Ｃ低下する。
【０１９３】
したがって、９５Ｃではビシン緩衝液のｐＨは７．０であり、過剰な水酸化物イオンが必要になるため、変性ステップ中にＲＮＡ攻撃が発生することはあり得ない。
【０１９４】
ビシン緩衝液は、３つすべての酵素（ＴＴＨ、Ｈａｗｋ３０５、および配列番号２の酵素）が機能することが示された唯一の緩衝液であるため、特に好ましいと考えられ、ＴｔｈはＴｒｉｓ緩衝液中でＰＣＲを行うが、ビシン中ではＲＴのみを行う。Ｈａｗｋ３０５は、ビシンまたはトリシンで機能するため、ビシンの代わりにトリシンを使用できる可能性がある。ビシン緩衝液は、高温およびＭｇＣｌ２濃度に影響を受けにくいため、ＲＮＡの生存を助けることも示された。
【０１９５】
実施例６−反復逆転写酵素
本発明の発明者らは、同等の時間の単一のより長い保持ではなく、ｃＤＮＡ変性ステップを含む一連のより短い保持として逆転写酵素をうまく働かせることが可能、かつ有益であることを見出した。
【０１９６】
図８は、単一の長い保持として実行される単一の４分間の逆転写ステップ、またはｃＤＮＡ変性ステップによって分割された一連の短い保持についてのデータを示している。各反応は、同じ全体の時間の長さで実行される。
【０１９７】
同じ一定時間内により多くのＲＴサイクルを実行した場合の最終蛍光が高いことに留意されたい−これは、より多くのＲＮＡがＣＤＮＡに変換されたことを示している。
【０１９８】
反応には２５０のビリオンと９％のヒト全血が含有していた。
【０１９９】
５回の変性で最も早いＣｔ−が生成されたため、１〜４分のＲＴステップと同じ時間で６ｘ４１秒のＲＴステップを実行すると、ＲＮＡが存続し、各サイクルで新しいｃＤＮＡが作成されるため、データが改善された。
【０２００】
ＲＮＡからＤＮＡへの結合はＤＮＡ／ＤＮＡ結合よりもエネルギー的に強力であり、実際の例として、プライマー配列ＧＡＴＡＣＡＣＴＧＧＧＡＴＧＡＣＴＣＴＴＴＧＣＣＧＡＡＣは、７１ＣのＤＮＡへのＴｍを有するが、７６Ｃの標的ＲＮＡへのＴｍを有する。
【０２０１】
これは、７６Ｃで逆転写を実行するとＲＴ反応は成功するが、複数のサイクルを実行した場合、プライマーの１．７４％のみがＴｍより約５Ｃ高いアニーリング温度でＤＮＡに結合できるため、ＰＣＲ産物はほとんど生成されないことを意味する。
【０２０２】
したがって、複数の高温ＲＴステップを実行することにより、同じＲＮＡ鎖から複数のｃＤＮＡ分子を作成し、この前増幅ステップを行うことで感度を高めることができる。記載されている試薬は、ＲＮＡ分子が高温で十分長く生き残ることを保証し、複数のサイクルを達成できるようにする。
【０２０３】
別の戦略は、ロックド核酸（ＬＮＡ）を使用することにより、ＲＮＡおよびＤＮＡへのＴｍが互いに非常に近いプライマーを設計することである。ＬＮＡはＲＮＡ種であり、その配座は３’−ｅｎｄｏ配座に固定されており、鎖内結合を安定化させる効果がある。その結果、ＬＮＡ部分がＲＮＡ標的に対するＴｍを上昇させる間、ＤＮＡへの順方向および逆方向のＴｍを互いに近づけることができる。次いで、ＲＴおよびＰＣＲを同じ温度で効率的に実行できるアッセイを設計することが可能であり−ＰＣＲは、単純なシングルコピー転写または逆転写とは対照的に、初期標的コピー数の２倍に基づく増幅化学である。したがって、両方が同じ温度で効率的に実行できる場合、感度は最大になり−効率的なＰＣＲが同時に開始されるため、ＲＴ機能はまだ初期の低コピー数のＲＮＡ標的をｃＤＮＡに変換する最初の機会を提供し、その後、増幅して検出することができる。
【０２０４】
試薬はＲＮＡの分解を最小限に抑えるため、これは、ウイルスＲＮＡなどの標的核酸が溶液中に留まり、各サイクルが、ＲＮＡがｃＤＮＡに変換されるさらなる機会をさらに与えることを意味する。
【０２０５】
図８Ｂは、それぞれが１６％のヒト全血を含有し、各反応に１０個のウイルスがスパイクされた１５個の同一の反応のセットを示している。高感度は、コピー数が非常に少ないが、開始時にＰＣＲを開始する複数の機会を有することにより−これは、低コスト診断のためのＷＨＯによって要求される商業的に重要な３，０００ビリオン／ｍｌを満たす鍵である。この場合、プライマーはＲＴとＰＣＲの両方が同時に発生することを可能にするように設計されている。このような手法が、最も感度が高いことが見出された。
【０２０６】
ＲＴおよびＰＣＲを実行できる酵素を使用することの欠点は、２つの機能を分離することが非常に難しいことである。反復ＲＴの最適温度を決定するには、温度範囲全体で検出感度の比較を実行する必要がある（図８Ｃを参照）。温度が高く、保持時間が長いほど、血液などの阻害物質が試料から放出される可能性が高くなるため、温度および保持時間をできるだけ最小限に抑える必要があり、これにより、検出までの時間が短縮される。
【０２０７】
実施例７−この方法は、任意の波長で発光および励起する任意のフルオロフォアで機能する。
エボラゲノム（Ａｃｃｕｐｌｅｘ  Ｓｅｒａｃａｒｅ）を発現するシンドビスウイルスからのウイルス核酸を血液試料から増幅し、Ｔｅｔ標識（図９ａ）またはＣＹ５標識（図９ｂ）で標識した。Ｔｅｔ標識は、約５２１ｎｍで励起し、約５３６ｎｍで発光し、一方、ＣＹ５標識は約６２５ｎｍまたは６５０ｎｍで励起し、約６７０ｎｍで発光する。したがって、本方法および試薬は、スペクトルの両端にある赤および緑の両方のフルオロフォアで標識されたアンプリコンの検出に好適であるため、本発明は、任意のフルオロフォアでの使用に好適であると考えられる。
【０２０８】
実施例８−好ましい実施形態
試料型／ウイルス／微生物の広い範囲に適用可能な最適な反応条件は、５０ｍＭのビシン、３．４ｍＭのＭｇＣｌ２、１１５ｍＭの酢酸カリウム、８％のグリセロール、０．４％のｔｗｅｅｎ、２５ＣでｐＨ８．２であることが見出された。３〜４ｍＭのＭｇＣｌ２のＭｇＣｌ２濃度の範囲は、アンプリコンを生成するが、３．４ｍＭのＭｇＣｌ２が最適であることが証明された。好ましくは、酵素Ｍ１／Ｍ７４７Ｋが使用される（配列番号２）。
【０２０９】
閉チューブアッセイで粗製試料から直接ウイルス性病原体を検出するプロセスは、次の通りであり得る。
【０２１０】
粗製試料を、２５ＣでｐＨ８．２において、５０ｍＭのビシン、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１１５ｍＭの酢酸カリウム、８％グリセロール、０．４％のｔｗｅｅｎ、および酵素、好ましくはＭ１／Ｍ７４７Ｋまたは配列番号２と少なくとも９０％、もしくは少なくとも９５％の同一性を有する酵素、目的の標的（複数可）に特異的なプライマー、および配列特異的な蛍光プローブを含有する反応容器に添加する。
【０２１１】
反応容器の温度を、９５Ｃに１秒間上昇させる。（ウイルス／微生物の核酸を増幅成分にアクセス可能にする）
目的の標的に特異的なプライマー配列によって決定されるように、温度を逆転写ステップに最適な温度に降下させる。
標的を９６Ｃで３秒間変性させる。
任意に、複数回の反復逆転写を実行する。
得られたｃＤＮＡからＱＰＣＲ増幅を行い、得られたアンプリコンを検出する。この好ましい熱サイクルプロトコルを、図８Ｃに示す。
【表３】
2021532770.tif 000005
【表４】
2021532770.tif 000006
【表５】
2021532770.tif 000007
【０２１２】
実施例９
この明細書は、病原体核酸の直接増幅を可能にする試薬および方法を記載しており、特に、感染が疑われる全血試料から直接のＲＮＡウイルスに関係している。この方法は、細菌性および真菌性病原体、ならびに血清、血漿、尿、脳脊髄液、糞便、および目、鼻、口から採取したスワブを含む幅広い投入試料からも適用できる。
【０２１３】
さらに、標的病原体がウイルスである場合に反応を複数回の逆転写に供することによって最大感度を確立することを可能にする方法、および個々のウイルス性病原体が溶解して検出される点を決定する方法論が記載されている。
【０２１４】
本明細書は、核酸抽出の実行に頼ることなく、単一の閉チューブプロセスにおいて粗製全血試料からウイルス性病原体の直接増幅を実行するのに必要な方法を含み、迅速で低コストの現場内診断を可能にする。
【０２１５】
ＵＶ、溶媒／界面活性剤、熱を含む、ウイルス性病原体の不活性化に好適な方法がいくつか示されている。熱処理は通常、血液および血液製剤などの生物学的に活性な基質中のウイルス性病原体の不活性化に使用され、６０Ｃの領域に穏やかに加熱すると、ＨＩＶおよびＨｅｐＣなどの病原体が感染性を失うことが実証されている。ＰａＳＴＲｙ技術と呼ばれる最近の研究（Ｆｒｙ  ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｐｌａｔｅ−ｂａｓｅｄ  ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｖｉｒｕｓ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｖａｃｃｉｎｅ  ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｖｏｌｕｍｅ  １８５，Ｉｓｓｕｅ  １，２０１２，Ｐａｇｅｓ  １６６−１７０）は、この熱不活性化が、２段階のプロセスであり、低温（Ｔｒ）でウイルスゲノムがキャプシドから放出され、高温（Ｔｍ）でキャプシド自体が分解されることを示唆している。ウイルスは、これらのプロセスのいずれかによって非感染性になる。著者らは、ワクチンの製造のためにこのプロセスを発明しし、任意のウイルスについて、ゲノム放出がいつ発生するかを判定することは可能であるが、キャプシド自体はまだ無傷であるため、弱毒化ワクチンをより確実なものにすることができる。この明細書の著者らは、Ｔｍ点が増幅可能なウイルス核酸が解放される点と一致することを発見し、Ｔｒ点では、タンパク質性成分、おそらく核タンパク質がウイルスゲノムと共存しているため、等温増幅またはＰＣＲなど分子生物学的方法による増幅が不可能である。通常、時間のかかる抽出プロセスが必要であり、その間、熟練した専門家が必要であり、専門家が致命的な病原体に曝露される可能性があるため、ウイルス性病原体を粗製試料から直接増幅可能にする方法を有することが有利である。
【０２１６】
この明細書の著者らは、ウイルス性病原体を含有することが疑われる粗製試料を反応容器に添加し、ウイルスのＴｍ点まで温度を上昇させることが可能であれば、その中で放出されたウイルスゲノムを直接増幅できる可能性があると提案した。出願人ら（ＢＧ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）は、病原体を閉チューブで溶解して増幅可能な核酸を放出する方法について以前記載したが（ＥＰ２５８５５８１）、本明細書の手法では、凍結する必要がなく、さらに凍結の複数のサイクルよりも迅速であるため、エネルギー要件が少ないという利点を有する。
【０２１７】
本出願人らは、デング熱を含む多くの病原体に対してＰａＳＴＲｙ手法を実行し、これまでに試験されたすべての重要な病原体のＴｍが７４〜８４Ｃの範囲にあることを発見した。したがって、７４〜８４Ｃの範囲の核酸増幅プロセスに単一の短い保持時間が追加された場合、含有されたウイルス性病原体の直接増幅が可能である可能性があると理論付けられた。エボラ出血熱、ラッサ熱、ＳＡＲＳなどの重要な致命的な病原体の大部分はプラス鎖ＲＮＡゲノムを有しているため、病原体を成功裏に増幅させるには逆転写ステップが重要であることに留意するべきである。ＭＭＵＬＶおよびより最近の修飾酵素などの文献にあるネイティブ逆転写酵素の大部分は、Ｔｍ点でウイルスキャプシドを変性させるために必要なこれらの高温によって変性される。したがって、本明細書で記載されているプロセスは、これらの温度への短時間のエクスカーションに耐えることができるＢｉｏｎｅｅｒ  Ｒｏｃｋｅｔｓｃｒｉｐｔなどの熱安定性酵素を使用する必要がある。
【０２１８】
追加の問題は、放出されたＲＮＡ自体の熱安定性であり、ＲＮＡは塩基性溶液中の二価カチオンの存在下で分解する（緩衝液とマグネシウムイオンとの複合触媒活性によって促進される非酵素的ＲＮＡ加水分解）。その結果、ここで説明するプロセスをＴｒｉｓおよび４ＭのＭｇＣｌ２に基づく標準のＴａｑポリメラーゼ緩衝液で使用すると、放出されたＲＮＡは急速に分解され、標的病原体ＲＮＡは増幅不能にされる。これを克服するために、本出願人らは、キャプシドＴｍ温度で実質的に中性ｐＨであり、それらの温度を超えると中性になり、二価カチオンを緩衝し、これにより、ビシンおよびトリシンに基づいて、遊離濃度が最小化さる緩衝液を開発し−典型的な配合物は、５０ｍＭビシン／トリシン、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１１５ｍＭの酢酸カリウムであり得、２５ＣでｐＨ８．２に調整すると、この緩衝液はＴｍ（キャプシド変性点）で本質的に中性になり、したがって、ＲＮＡを攻撃する過剰なヒドロキシルイオンはないが、ｐＨは、逆転写／増幅ステップ、７．４〜７．６において酵素の生理学的要件になる。
【０２１９】
本出願人らは、増幅試薬混合物に溶媒／界面活性剤を添加することによってＴｍ点を下げることができることを観察し、多くの溶媒界面活性剤の組み合わせがウイルス不活性化のために商業的に使用されているが、これらは多くの増幅手法とほとんど適合しないことが見出されている。適切な組み合わせは、８％のグリセロールと０．１〜０．４％のＴｗｅｅｎ２０であることがわかった。Ｔｗｅｅｎの場合、パーセンテージの追加はＴＭ点をさらに低下させるが、本出願人らは、ＰＣＲプロセスなどの任意のプライマーおよびプローブのハイブリダイゼーション温度が、０．４％というＴｗｅｅｎの高濃度によって低下されることも観察した。
【０２２０】
最適な反応条件は、２５ＣでｐＨ８．２において、５０ｍＭのビシン、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２、１１５ｍＭの酢酸カリウム、８％のグリセロール、０．４％のｔｗｅｅｎであることが分かった。
【０２２１】
粗製試料から直接ウイルス性病原体を検出するプロセスは、以下の通りである。
【０２２２】
粗製試料を、２５ＣにおいてｐＨ８．２で、５０ｍＭのビシン、３．５ｍＭのＭｇＣｌ２」、１１５ｍＭの酢酸カリウム、８％のグリセロール、０．４％のｔｗｅｅｎ、１１５ｍＭ酢酸カリウム、８％グリセロール、および逆転写およびｃＤＮＡ増幅／検出の実行に好適な酵素を含有する反応容器に添加する。
【０２２３】
反応容器の温度を、７６〜８１Ｃに１５〜６０秒間上昇させる。（ウイルス溶解ステップ）
逆転写ステップに最適な温度に加工させる。
得られたｃＤＮＡから増幅を行う。
【０２２４】
７６〜８１Ｃは、これまでにテストされたすべてのウイルスのＴｍ（キャプシド変性）に正しい範囲であることが証明されており、これを超える温度では、ＲＮＡが急速に分解され、したがって感度が低下する。
【０２２５】
獣医学的検出方法
獣医学の分野で最も一般的に使用されている試料の種類はスワブであり、これらは、疑いのある疾患に応じて、目、鼻、または口のいずれかから採取される。牛疫およびＰＰＲＶなどの多くの猛毒性の動物病原体は、ウイルス血症成分を有するが、経済的に重要ないくつかの疾患では、ウイルス性病原体が血中に見つかる時間枠は非常に限られている。本出願人らは、全血の直接検出のための方法を説明しており、これは、口蹄疫およびＰＰＲＶなどの疾患の急性ウイルス血症の検出に好適であることが示されている（Ｋａｖｉｔ  Ｓｈａｈ，Ｅｍｍａ  Ｂｅｎｔｌｅｙ，Ａｄａｍ  Ｔｙｌｅｒ，Ｋｅｖｉｎ  Ｓ  Ｒｉｃｈａｒｄｓ，Ｅｄ  Ｗｒｉｇｈｔ，Ｌｉｎｄａ  Ｅａｓｔｅｒｂｒｏｏｋ，Ｄｉａｎｅ  Ｌｅｅ，Ｃｌａｉｒｅ  Ｃｌｅａｖｅｒ，Ｌｏｕｉｓｅ  Ｕｓｈｅｒ，Ｊａｎｅ  Ｅ  Ｂｕｒｔｏｎ，Ｊａｍｅｓ  Ｐｉｔｍａｎ，Ｃｈｒｉｓｔｉｎｅ  Ｂ  Ｂｒｕｃｅ，Ｄａｖｉｄ  Ｅｄｇｅ，Ｍａｒｔｉｎ  Ｌｅｅ，Ｎｅｌｓｏｎ  Ｎａｚａｒｅｔｈ，Ｄａｖｉｄ  Ａ  Ｎｏｒｗｏｏｄ，Ｓｔｅｒｇｈｉｏｓ  Ａｔｈａｎａｓｉｏｓ  Ｍｏｓｃｈｏｓ．Ｆｉｅｌｄ−ｄｅｐｌｏｙａｂｌｅ，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ，Ｒａｐｉｄ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｃｔｉｖｅ  Ｅｂｏｌａ  Ｖｉｒｕｓ  Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ｉｎ  Ｕｎｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  Ｂｌｏｏｄ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１７；ＤＯＩ：１０．１０３９／Ｃ７ＳＣ０３２８１Ａ）−しかし、これらの疾患が風土病である辺境の資源の乏しい環境で血液からの直接的手法を使用することには多くの不利な点がある。第１に、動物から血液試料を採取するには、訓練を受けた獣医師の介入が必要であり、第２に、一般の人が採取できる試料にアクセスするために、ウイルスがより簡単に見出すことができることである。この適用例は、核酸抽出に頼ることなく、口、目、または鼻から採取した拭き取り試料から直接ウイルス動物病原体の直接検出を実施するための方法を網羅している。
【０２２６】
実施例１０
実世界の粗製試料のウイルス性病原体を検出する方法の有用性のさらなる実証は、一連の重要なウイルス性病原体を検出する能力である。図１１（Ａ）は、感染したマウスからのリフトバレー熱ウイルス（Ｒｉｆｔ  Ｖａｌｌｅｙ  Ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）の直接検出を示し、（Ｂ）ウイルス培養物からのクリミアコンゴ出血熱ウイルス（Ｃｒｉｍｅａｎ  Ｃｏｎｇｏ  Ｈａｅｍｏｒｒｈａｇｉｃ  ｆｅｖｅｒ  ｖｉｒｕｓ）の検出を示し、および（Ｃ）血液または鼻腔スワブ試料のいずれかからの直接の小反芻獣疫ウイルス（Ｐｅｓｔｅ  ｄｅｓ  Ｐｅｔｉｔｓ  Ｒｕｍｉｎａｎｔｓ  ｖｉｒｕｓ）の検出を示している。これは、動物およびヒトに影響を与える新興感染症の迅速で低コストの診断を行うための手法の有用性を実証している。スワブから作業できるということは、呼吸器疾患を簡単に特定できることを意味し、この技法は、ウイルス性病原体のＷＨＯのトップ１０リストを検出する機能を備えており、エボラ出血熱、ラッサ熱、デング熱、リフトバレー熱、マールブルグ（Ｍａｒｂｕｒｇ）、クリミアコンゴ熱、ならびに口蹄疫（Ｄ）およびＰＰＲＶなどの重要な獣医学的疾患の概念証明データの生成にすでに使用されており、重要な獣医学的疾患は、開発途上国に多大な経済的影響を与える一方で、ペンサイドで、そして決定的には港で動物をスクリーニングするために世界的に商業的有用性を有している。
【０２２７】
実施例１１
ＰＣＴ／ＧＢ２０１９／０５１１５６の容器および教示と併せると、反応あたり最大３％の最終量で全血中のウイルス性病原体を検出することが可能であり、非常に高い感度を提供し、血液検出から直接の技術目標を達成し、これは、３，０００ビリオン／ｍｌというＷＨＯ  Ｒ＆Ｄの青写真の目標を満たしている。図８Ｂは、１０４２ビリオン／ｍｌでの１５個の同一の反応を示しており、感度要件を容易に満たし、手法の有用性を示している。図１２ＡおよびＢは、本試薬および方法が、反応量の最大３５％の全血で確実に機能することを示しており、興味深いことに、１２〜１６％の範囲で感度が向上しているようである。これは、分子クラウディングの結果であると考えられ（Ｓａｓａｋｉ，Ｙ．，Ｍｉｙｏｓｈｉ，Ｄ．，＆Ｓｕｇｉｍｏｔｏ，Ｎ．（２００６）．Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｃｒｏｗｄｉｎｇ  ｏｎ  ＤＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｊｏｕｒｎａｌ，１（４），４４０−４４６．）、血液成分による阻害を最小限に抑えながら分子クラウディングの最大の利点が達成されるポイントは、この１２〜１６％の範囲に対応する必要がある。実際には、これは、１５ｕｌの全血を含有する９５ｕｌの反応物が約１６％であり、図８Ｂが１０コピー／ｒｘｎであるため、感度が１０４２ビリオン／ｍｌであることを意味する。
【図１Ａ】
2021532770.tif 000008
【図１Ｂ】
2021532770.tif 000009
【図１Ｃ】
2021532770.tif 000010
【図２Ａ】
2021532770.tif 000011
【図２Ｂ】
2021532770.tif 000012
【図２Ｃ】
2021532770.tif 000013
【図２Ｄ】
2021532770.tif 000014
【図２Ｅ】
2021532770.tif 000015
【図２Ｆ】
2021532770.tif 000016
【図２Ｇ】
2021532770.tif 000017
【図３Ａ】
2021532770.tif 000018
【図３Ｂ】
2021532770.tif 000019
【図３Ｃ】
2021532770.tif 000020
【図３Ｄ】
2021532770.tif 000021
【図４】
2021532770.tif 000022
【図５】
2021532770.tif 000023
【図６】
2021532770.tif 000024
【図７】
2021532770.tif 000025
【図８Ａ】
2021532770.tif 000026
【図８Ｂ】
2021532770.tif 000027
【図８Ｃ】
2021532770.tif 000028
【図９】
2021532770.tif 000029
【図１０】
2021532770.tif 000030
【図１１Ａ】
2021532770.tif 000031
【図１１Ｂ】
2021532770.tif 000032
【図１１Ｃ】
2021532770.tif 000033
【図１１Ｄ】
2021532770.tif 000034
【図１２】
2021532770.tif 000035
【配列表】
2021532770000001.app
【国際調査報告】
2021532770.tif 000036
2021532770.tif 000037
2021532770.tif 000038
2021532770.tif 000039
2021532770.tif 000040