(57)【要約】  本明細書に開示されるのは、試料中の１つ以上の種類の微生物の多様な集団から遺伝物質を抽出する方法である。微生物は、原核生物または真核生物であり得、細菌、古細菌、真菌、原生動物、蠕虫、寄生虫、ウイルス、ファージ、および他のものを含み得る。抽出は、単一の試料からであってもよく、その後の同定は、ｑＰＣＲ、ＰＣＲ、ＲＦＬＰ、ＳＳＣＰ、対立遺伝子特異的ＰＣＲ、標的化されたシークエンシング、プルダウンシークエンシング、全ショットガンシークエンシング、または他の方法等の分子法を介してもよい。また、真菌（すなわち、サッカロマイセス属の種）、動物細胞（ウシ）、植物（例えば、オオムギ）等の様々な生物から、ヒト対象の腸から、核酸分子を抽出すること、そこからメタゲノミクス解析を実行すること、およびメタゲノミクス解析に基づいて対象のプロバイオティクス治療または食事指針を決定することを含む方法も提供される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）試料を液体窒素溶液と混合することと、
ｂ）第１の溶解液を添加することであって、前記第１の溶解液が、界面活性剤およびキレート剤を含む、前記添加することと、
ｃ）第２の溶解液を添加することであって、前記第２の溶解液が、カオトロピック剤を含む、前記添加することと
を含む、方法。
【請求項２】
前記試料と液体窒素溶液との前記混合が、前記試料と前記液体窒素との混合物を粉砕することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記第１の溶解液が、１つ以上の緩衝液、１つ以上のマイルドな界面活性剤、および／または１つ以上のプロテアーゼをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記第１の溶解液の前記界面活性剤が、ＳＤＳを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記ＳＤＳの濃度が、約１０％である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記カオトロピック剤が、酢酸リチウムを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
試料、液体窒素、前記第１の溶解液、および前記第２の溶解液の混合物が、熱ショック処理にさらに供される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記試料が、前記第１の溶解液で処理する前に前処理ステップに供され、前記前処理ステップが、前記試料中に存在する任意の細菌胞子および／または真菌胞子の発芽を誘発する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
前記前処理ステップが、前記試料をＴｗｅｅｎ−８０と混合することを含む、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
物理的溶解を引き起こす機械的処理ステップをさらに含み、前記機械的処理ステップが、超音波処理、ビーズ混合、ビーズミル均質化、加圧、顕微溶液化、またはこれらの組み合わせを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
任意の抽出された遺伝物質をメタゲノミクス解析に供することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、対象の腸から得られる、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
前記メタゲノミクス解析が、前記対象が摂取した１つ以上の食物を同定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記メタゲノミクス解析が、前記対象が摂取した１つ以上の主要栄養素を同定する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記メタゲノミクス解析に基づいて前記対象のプロバイオティクス治療を決定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１６】
前記メタゲノミクス解析に基づいて前記対象の食事指針を決定することをさらに含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１７】
対象の摂食量を決定する方法であって、
ａ）前記対象から得られた大便試料から遺伝物質を抽出することであって、前記遺伝物質が請求項１にしたがって抽出される、前記抽出することと、
ｂ）前記対象の前記摂食量を決定するために、前記第１の試料から抽出された前記遺伝物質をメタゲノミクス解析に供することと
を含む、前記方法。
【請求項１８】
前記対象を、前記摂食量の解析に基づいてプロバイオティクスまたは食物で治療することをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
生物のゲノムデータを有するデータベースであって、そのような生物の同定に有用なデータベースの使用を、メタゲノム解析が含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記データベースが、全ゲノムとして、より高いオーダーに共通でありかつ特定のものに固有の様々な長さのｋ−ｍｅｒとして、またはゲノムをバーコード化してそれらをシークエンシング結果に一致させる他の手段として処理され得る、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
メタゲノム解析が、
重複を除去すること、アダプタシークエンシングを除去すること、ベースコールのクオリティを向上させるために５’または３’シークエンシングを除去して特定のクオリティ（すなわち、Ｑ２０以上）のベースコールのみを含むこと、ヒトリードをフィルタリングすること、ペアードリードを作成またはそれらを分離すること、リードのオーバーラップを制限すること
から選択されるシークエンシング情報の前処理を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
シークエンシング情報が、特定の長さのｋ−ｍｅｒに分割されてもよく、完全な断片として使用されてもよく、大規模レファレンスゲノムに対してスキャフォールディングおよびアライメントされてもよい、ソフトウェアまたはシステム
の使用により、前記シークエンシング情報を前記データベースにアライメントさせること、または、
同定された生物、同定された生物の相対的存在量、ゲノムサイズ、アライメントされた総計の断片、株か、種か、属か、科か、目か、綱か、門か、界か、もしくはドメインかにアライメントされた固有の断片、のレポートを作成するための、他の方法
を、メタゲノム解析が含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２３】
マイクロバイオームプロファイルが、ディスバイオシスを示す疾患、障害、または特異的なシグネチャの同定を可能にし、前記マイクロバイオームを調節して前記根底にあるプロファイルを改善するために、プロバイオティクスおよび／または栄養補助治療を適用することができる、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
グループが、人口統計学的情報、表現型情報、または診断情報に基づいて作成され、およびそのプロファイルグループにバーコードが割り当てられる、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
統計解析が、個々のマイクロバイオームプロファイルがデータベース内の既知のグループとどの程度密接に関連しているかを決定するために使用される、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
対象のプロバイオティクス治療をモニタリングする方法であって、
ａ）前記対象から得られた第１の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出することであって、前記遺伝物質が請求項１にしたがって抽出される、前記抽出することと、
ｂ）前記第１の試料から抽出された前記遺伝物質をメタゲノミクス解析に供することと、
ｃ）前記対象をプロバイオティクスで治療し、次いで、前記第１の試料からの前記遺伝物質の抽出と同様に前記対象から得られた第２の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出することと、
ｄ）前記第２の試料から抽出された前記遺伝物質に対してメタゲノミクス解析を実行することと、
ｅ）前記第１の試料の前記メタゲノミクス解析の結果を、前記第２の試料の前記メタゲノミクス解析の結果と比較することと
を含む、前記方法。
【請求項２７】
前記対象内で所望の微生物集団を得るために、前記プロバイオティクス治療を改変することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
適切なプロバイオティクス治療を決定するために、メタボロ−ムマーカーの解析をさらに含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
プロバイオティクス治療が、抗生物質、化学療法、医薬品の使用、環境変化、旅行、汚染物質消化、腸管もしくは腸の梗塞、ストレス、または前記微生物集団の破壊が生じ得る他の作用の後に行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項３０】
マイクロバイオームの調節が、個体を、前記個体が健康であることが分かっていたときの以前の微生物集団に戻すことである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３１】
プロバイオティクスおよび／またはプレバイオティクスによるマイクロバイオームの調節が、データベースによって内部的にまたは公開データベースによって外部的に定義された正常な腸にマイクロバイオームプロファイルを復元することである、請求項２７に記載の方法。
【請求項３２】
糞便移植に使用されるが、ディスバイオシスを回復させるためのプロバイオティクス／プレバイオティクスとして使用される、糞便物質リポジトリ試料のマイクロバイオームプロファイルに類似するものとして、正常が定義される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
メモリと、前記メモリに結合された１つ以上のプロセッサとを含むコンピューティングシステムであって、前記１つ以上のプロセッサが、請求項１７に記載の方法を実行するための操作を実行するように構成される、前記コンピューティングシステム。
【請求項３４】
メモリと、前記メモリに結合された１つ以上のプロセッサとを含むコンピューティングシステムであって、前記１つ以上のプロセッサが、請求項２６に記載の方法を実行するための操作を実行するように構成される、前記コンピューティングシステム。
【請求項３５】
請求項１に記載の方法を実行するための自動プラットフォーム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月２日に出願された米国特許出願第６２／６５１，６２０号に対する米国特許法第１１９条に基づく利益を主張する。先行出願の開示は、本出願の一部とみなされ、参照により本出願の開示に組み込まれる。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、ゲノム解析に関し、より具体的には、生体試料中の微生物の多様な集団から食物に関連する核酸分子を抽出および解析する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
人体の約１０兆個のヒト細胞をはるかに上回る数で、約１００兆個の微生物が、人体の内外に生息している。これらの通常は無害なウイルス、細菌および真菌は、共生または相利共生生物と称される。共生または相利共生生物は、様々な方法で私たちの身体を健康に保つのに役立つ。共生または相利共生、および病原性的に体の内外に生息する全ての微生物はまとめて、マイクロバイオームと称され、それらの平衡状態および関連するメタボロームは、個体の健康状態と密接に関連し、逆もまた同様である。
【０００４】
核酸シークエンシングの進歩は、腸および皮下組織に生息するマイクロバイオームを迅速かつ正確に同定しおよびプロファイルする機会を生み出した。最適なフローラはまた、相乗的な方法で宿主の免疫系と相互作用し、その健康上の利益をさらに増殖させる。個体の関連するメタボロームは、質量分析法に基づくシステムによって、またはゲノミクスに基づくメタボロームモデリングおよびフラックスバランス解析を使用してプロファイル化することもでき、健全なメタボロームプロファイルを作製するために使用することもできる。これらの方法論はすべて、微生物集団の複雑さを分析するために使用することができる。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、生物学的、環境的、栄養補助的、または他の生態学的微生物の異種集団試料中の多様な微生物集団から核酸分子を抽出する方法、ならびに個体へのプロバイオティクスのカスタマイゼーションを決定するための処理ステップおよび解析を介して核酸または抽出物を使用する方法を対象とする。本発明に特有の処理ステップとしては、ＲＮＡまたはＤＮＡクリーンアップ、断片化、分離、または消化；ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、デジタルＰＣＲ、またはシークエンシング等の下流適用のためのライブラリまたは核酸調製；バイオインフォマティクスＱＣ、フィルタリング、アライメント、またはデータ分離のための前処理；微生物種分類学的割り当てのためのメタゲノミクスまたはヒトゲノムバイオインフォマティクスパイプライン；ならびに他の生物アライメント、同定、および変異体解釈が挙げられる。
【０００６】
本発明はまた、ＤＮＡ抽出ならびに、肉、植物、果物、野菜、および／またはこれらの生物と共に含まれる微生物のデータベースからの食物ＤＮＡ配列に基づく摂食量の決定、のために試料を使用するための万能な方法も記載する。本明細書に開示されるのは、試料中の１つ以上の種類の細胞または細胞成分の多様な集団から遺伝物質を抽出し、健康の改善および疾患の予防のために摂取された食物および栄養素の内訳を決定する方法である。
【０００７】
したがって、一態様では、本発明は、解析のための試料の調製方法を提供する。方法は、ａ）試料を界面活性剤、例えばＳＤＳ、およびキレート剤、例えばＥＤＴＡを含む第１の溶解液と混合することと、ｂ）ステップａ）の混合物にリゾチームを有する第２の溶解液を添加することと、ｃ）ステップｂ）の混合物に、カオトロピック剤、例えば尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジン等を含む第３の溶解液を添加することと、を含む。前処理ステップは、核酸収率をさらに最適化するために使用され得る物理的溶解を含み得る。機械的溶解の例としては、超音波処理、ビーズ混合、およびビーズミル均質化が挙げられる。
【０００８】
同様の態様では、本方法は、ａ）大便試料等の試料を液体窒素溶液と混合することと、ｂ）第１の溶解液を添加することであって、第１の溶解液が、界面活性剤およびキレート剤、例えばＳＤＳ、ならびにキレート剤、例えばＥＤＴＡを含む、添加することと、ｃ）第２の溶解液を添加することであって、第２の溶解液が、カオトロピック剤、例えば、尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジンを含む、添加することと、を含む。前処理ステップは、核酸収率をさらに最適化するために使用され得る物理的溶解を含み得る。機械的溶解の例としては、超音波処理、ビーズ混合、およびビーズミル均質化が挙げられる。
【０００９】
別の態様では、本発明は、対象の摂食量を決定する方法を提供する。本方法は、ａ）対象から得られた大便試料から遺伝物質を抽出することであって、当該遺伝物質が本開示の方法に従って抽出された、抽出することと、ｂ）対象の摂食量を決定するために、第１の試料から抽出された遺伝物質をメタゲノミクス解析に供することと、を含む。実施形態では、方法は、摂食量の解析に基づいてプロバイオティクスまたは食物で対象を治療することをさらに含む。
【００１０】
別の態様では、本発明は、対象のプロバイオティクス治療をモニタリングする方法を提供する。方法は、ａ）対象から得られた第１の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出することであって、当該遺伝物質が、本開示の方法に従って抽出された、抽出することと、ｂ）第１の試料から抽出された遺伝物質をメタゲノミクス解析に供することと、ｃ）対象をプロバイオティクスで治療し、次いで、第１の試料からの遺伝物質の抽出と同様に対象から得られた第２の試料中に存在する任意の微生物から遺伝物質を抽出することと、ｄ）第２の試料から抽出された遺伝物質に対してメタゲノミクス解析を行うことと、ｅ）第１の試料のメタゲノミクス解析の結果を第２の試料のメタゲノミクス解析と比較することと、を含む。
【００１１】
さらに別の態様では、本発明は、追加の化学検査または遺伝子検査の有無にかかわらず、腸内で検出されたプロバイオティクス生物からプロバイオティクススコアを計算することを含む方法を提供する。
【００１２】
さらに別の態様では、本発明は、マイクロバイオームのスコアを計算することを含み、このスコアは、マイクロバイオームがディスバイオシス、ニュートラル、または安定状態にあるかどうかを評価するために使用される方法を提供する。
【００１３】
本発明はさらに、メモリと、メモリに結合された１つ以上のプロセッサとを含むコンピューティングシステムを提供し、１つ以上のプロセッサは、本発明の方法を実行するための操作を実行するように構成される。
【００１４】
本発明はまた、本発明の方法を実行するための自動プラットフォームを提供する。
【００１５】
本発明は、生物学的、環境的、食事補助的、または他の生態学的微生物の異種集団試料からの微生物の多様なフローラから核酸を抽出するためのオールインワン方法を提供する。
【００１６】
実施形態では、本発明は、プロバイオティクスおよび環境的試料中の微生物のそれぞれの核酸を解析することを介して、微生物の組成および相対的存在量を決定する際に使用することができる。ＤＮＡは精製されて、核酸解析のために下流で使用される（特に、２つ以上の種／亜種のゲノムが同定されるメタゲノミクス解析）。
【００１７】
前述の一般的な説明および以下の詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものに過ぎず、特許請求される本発明のさらなる説明を提供することが意図される。本発明のさらなる理解を提供するために任意の添付の図面が含まれ、本明細書に組み込まれ、その一部を構成し、本発明のいくつかの実施形態を例示し、説明と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】ヒト（高タンパク質食、＞５０歳、補助食品使用者）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（ｐｒｅｖａｌｅｎｃｅ  ｏｒｇａｎｉｓｍ）の存在を例示する概略図である。
【図２Ａ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（細菌）の存在を例示する概略図である。
【図２Ｂ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（ウイルスおよびファージ）の存在を例示する概略図である。
【図２Ｃ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（古細菌）の存在を例示する概略図である。
【図２Ｄ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（真菌および他の真核生物）の存在を例示する概略図である。
【図３Ａ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、非ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（細菌）の存在を例示する概略図である。
【図３Ｂ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、非ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（ウイルスおよびファージ）の存在を例示する概略図である。
【図３Ｃ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、非ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（古細菌）の存在を例示する概略図である。
【図３Ｄ】ヒト（高炭水化物食、１８〜５０歳、非ベジタリアン食）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（真菌および他の真核生物）の存在を例示する概略図である。
【図４Ａ】ヒト（高乳タンパク質食、０〜２歳、ベジタリアン授乳なし）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（細菌）の存在を例示する概略図である。
【図４Ｂ】ヒト（高乳タンパク質食、０〜２歳、ベジタリアン授乳なし）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（ウイルスおよびファージ）の存在を例示する概略図である。
【図４Ｃ】ヒト（高乳タンパク質食、０〜２歳、ベジタリアン授乳なし）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（古細菌）の存在を例示する概略図である。
【図４Ｄ】ヒト（高乳タンパク質食、０〜２歳、ベジタリアン授乳なし）のマイクロバイオームシグネチャの高保有率の生物（真菌および他の真核生物）の存在を例示する概略図である。
【図５】ヒトのマイクロバイオームシグネチャのより低い保有率生物の存在および日和見病原体の同定を示す概略図である。
【図６】ヒトのマイクロバイオームシグネチャにおいて検出された典型的なプロバイオティクスを示す概略図である。
【図７】ヒトのマイクロバイオームシグネチャにおいて検出された典型的なプロバイオティクスを示す概略図である。
【図８】正常集団についての個々の相対的存在量とデータベース平均との比較を示す概略的グラフ図である。
【図９】食事補助食品混合培養物から本発明の方法を介して同定された生物を示す表である。
【図１０】本発明のデータベースに格納された種々の微生物の固有な種の分類を記載した表である。
【図１１】本発明の一実施形態での個体からの例示的な人口統計学的情報を示す。
【図１２】本発明の一実施形態での魚介類に関連して検出された例示的な生物を示す。
【図１３】本発明の一実施形態における哺乳動物肉に関連して検出された例示的な生物を示す。
【図１４】本発明の一実施形態における穀物に関連して検出された例示的な生物を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
発明の詳細な説明
本発明は、試料中の１つ以上の種類の微生物の多様な集団から核酸分子を抽出するための万能な方法を提供する。微生物の種類には、グラム陽性細菌、グラム陽性細菌胞子、グラム陰性細菌、古細菌、原生動物、寄生蠕虫、藻類、真菌、真菌胞子、ウイルス、ウイロイド、バクテリオファージ、およびワムシが含まれる。いくつかの実施形態では、多様な集団は、同じ種類の複数の異なる微生物、例えばグラム陽性細菌である。いくつかの実施形態では、多様な集団は、複数の異なる種類の微生物、例えば細菌（グラム陽性細菌、グラム陽性細菌胞子および／またはグラム陰性）、真菌、ウイルス、およびバクテリオファージである。
【００２０】
異なる種類の微生物は、自身の遺伝物質を保護するために異なる組成物および機構を有するため、同一の生体試料中の別の種類の微生物の遺伝物質も抽出する能力を損なうことなく、ある種類の微生物から遺伝物質を抽出することは、多くの場合困難である。しかしながら、本発明は、ある種類の微生物から得ることができる遺伝物質の量を、同じ試料中の別の種類の微生物の遺伝物質を抽出することによって犠牲にすることなく、試料中の異なる種類の微生物から遺伝物質を抽出することを可能にする。本発明によれば、微生物を含む試料は、生体試料、環境試料、人工的に作製された試料（例えば、実験室試験または対照試料、プロバイオティクス組成物または補助食品の試料等）であってもよい。生体試料の例としては、組織試料、血液試料、血漿試料、脳脊髄液試料、尿試料、糞便試料、消化管から得られた物質の試料、生物学的分泌物（例えば、精液、膣分泌物、母乳、涙液、唾液等）等が挙げられる。固体試料を液化または溶液と混合してもよく、次いで、混合物から得られた液化試料、混合物、または溶液中に存在する微生物の遺伝物質を本発明に従って抽出してもよい。抽出された遺伝物質は、精製、増幅、およびシークエンシング等のさらなる処理および解析に供され得る。
【００２１】
いくつかの実施形態では、例えば、遺伝物質が抽出された試料中の１つ以上の種類の微生物を同定するために、抽出された遺伝物質をメタゲノミクス解析に供する。追加の実施形態では、全ゲノムショットガンシークエンシングは、ヒト糞便試料から調製された抽出核酸物質に対して実行することができる。調製には、有機溶媒、不純物、塩、フェノール、および他のプロセス阻害汚染物質を除去するための核酸クリーンアップ反応が含まれる。追加の調製としては、各試料由来の核酸ライブラリ調製が挙げられ、ｇＤＮＡは、合成、ナノポア、ロングリード、および／またはＣＭＯＳ電子的シークエンシングによる大規模並列シークエンシング等のシークエンシングプラットフォーム上で配列決定するために試料を調製するための修飾および／または増幅を受ける。
【００２２】
本明細書に開示されるように、本発明の方法は、微生物を特定の順序で３つの異なる組成物に供することによって、同じ試料中に存在する１つ以上の異なる種類の微生物から遺伝物質を成功裏に抽出することを可能にする。本発明による方法は、第１に、試料中に存在する任意のグラム陰性細菌を溶解し、続いて、試料中に存在する任意の酵母および細菌の細胞壁の多糖成分を消化し、次いで、第２のステップ後に無傷である任意の細胞壁をカオトロピック剤で破壊することを含む。
【００２３】
簡潔に述べると、一実施形態では、第１のステップは、試料を、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））およびキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））を含む第１の溶解液と混合して、試料中に存在する任意のグラム陰性細菌を溶解させることを含む。第１の溶解液は、１つ以上の緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ）、１つ以上のマイルドな界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００）、および／または１つ以上のプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）をさらに含み得る。
【００２４】
第１のステップ後、試料をリゾチームを含む第２の溶解液と混合して、混合物中に存在する酵母および細菌の細胞壁の多糖成分を消化する。リゾチームは、第１の溶解液の活性を阻害し得るため、試料と第２の溶解液との接触は、第１の溶解液で試料を処理した後に起こることが重要である。
【００２５】
第２の溶解液での処理後、カオトロピック剤（例えば、尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジン等）を含む第３の溶解液を混合物に添加して、第２の溶解液によって消化されない任意の細胞壁を破壊する。第３の溶解液は、ＳＤＳ等の界面活性剤を含み得る。
【００２６】
いくつかの実施形態では、第１の溶解液および第３の溶解液の両方が、１〜１０％ｗ／ｖの作用濃度でＳＤＳを含む。いくつかの実施形態では、第３の溶解液で処理した後、混合物はさらに、カオトロピック剤（例えば、尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジン等）およびプロテイナーゼＫを含む第４の溶解液で処理される。第３の溶解液のカオトロピック剤が酢酸リチウムであるいくつかの実施形態において、混合物は次いで熱ショック処理に供され、次いで第４の溶解液で処理され得る。
【００２７】
ある特定の態様では、以下の開示は、ＤＮＡ抽出、ならびに、肉、植物、果物、野菜、および／またはこれらの生物と共に含まれる微生物のデータベースからの食物ＤＮＡ配列に基づく摂食量の決定、のために大便試料を使用するための万能な方法を説明する。本明細書に開示されるのは、試料中の１つ以上の種類の細胞または細胞成分の多様な集団から遺伝物質を抽出し、健康の改善および疾患の予防のために、摂取された食物および栄養素の内訳を決定する方法である。
【００２８】
いくつかの実施形態では、生物学的分泌物（例えば、精液、膣分泌物、母乳、涙、唾液、血液、尿等）は、消化管等から得られる。固体試料は、液化または溶液と混合され得、次いで、液化試料、混合物、または混合物から得られた溶液中の、例えば植物性（実生、葉、子葉、種子、胚乳、組織培養カルス、根等）、動物性、真菌類性、または原型生物性食物等の、遺伝物質を含む任意の食物の遺伝物質は、本発明または当該技術分野で既知の他の標準的な核酸抽出プロトコルに従って抽出することができる。いくつかの実施形態では、抽出された遺伝物質は、精製、増幅、およびシークエンシング等のさらなる処理および解析に供され得る。いくつかの実施形態では、例えば、遺伝物質が抽出された試料中の１つ以上の種類の生物を同定するために、抽出された遺伝物質をメタゲノミクス解析に供する。
【００２９】
いくつかの実施形態では、メタゲノム解析が利用するデータベースは、ヒトまたは他の動物によって摂取される生物または生物の成分の相対的存在量を有する核酸を同定して適切な系統内に分類学的に割り当てる、特定の目的のためにカスタマイズされている。いくつかの実施形態では、追加のデータテーブルまたはデータベースは、それらの食事を表すものとして、生物の腸試料の主要栄養素含有量を決定するために、生物の相対的存在量のルックアップとして使用され得る。いくつかの実施形態では、この主要栄養素の内訳には、脂肪、炭水化物、タンパク質、ビタミン  ミネラル、および任意の主要栄養素の副成分が含まれ得る。
【００３０】
本明細書に開示されるように、本発明の方法は、単離、精製、または核酸を捕捉するための他の方法に試料を供することによって、同じ試料中に存在する１つ以上の異なる種類の生物、生物の１つ以上の細胞、または細胞マトリックスもしくはオルガネラから遺伝物質を成功裏に抽出することを可能にする。本発明による方法は、限定されないが、任意の細胞壁および細胞膜を含む試料中の任意の食物細胞を溶解または破壊すること、試料中に存在する任意の真菌、植物、哺乳動物、または原生動物細胞の任意の細胞壁または膜の多糖またはリグニン成分を消化すること、ならびに消化ステップ後に無傷である任意の細胞壁をカオトロピック剤で破壊することを含む。
【００３１】
本発明は、化学的溶解の前に細胞壁を崩壊させ、かつ有害な細胞酵素を不活性化したままにするために、液体窒素瞬間冷凍および即時の機械的破壊または粉砕によって、食物細胞の細胞壁または膜を物理的に破壊するステップを含む。本発明は、試料を、界面活性剤（例えば、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ））およびキレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ））を含む第１の溶解液と混合して、試料中に存在する任意の動物細胞を溶解させることを含むステップを含む。第１の溶解液は、１つ以上の緩衝液（例えば、Ｔｒｉｓ）、１つ以上のマイルドな界面活性剤（例えば、Ｔｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、臭化セチルトリメチルアンモニウム）、および／または１つ以上のプロテアーゼ（例えば、プロテイナーゼＫ）をさらに含み得る。特定の実施形態では、第１の溶解液は、１〜１０％ｗ／ｖの作用濃度でＳＤＳを含む。本発明は、試料を、カオトロピック剤（例えば、尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジン等）を含む第２の溶解液と混合することを含むステップを含む。第２の溶解液は、ＳＤＳ等の界面活性剤を含み得る。特定の例示的な実施形態では、第１および第２の溶解液は、任意の特定の順序で添加され得る。
【００３２】
いくつかの実施形態では、本発明は、試料をリゾチームを含む第３の溶解液と混合して、混合物中に存在する任意の真菌または細菌細胞壁の多糖成分を消化することを含むステップを含み得る。いくつかの実施形態では、混合物は、カオトロピック剤（例えば尿素、酢酸リチウム、塩酸グアニジン等）およびプロテイナーゼＫを含む第４の溶解液でさらに処理されてもよい。第４の溶解液のカオトロピック剤が酢酸リチウムであるいくつかの実施形態では、混合物は次いで熱ショック処理に供され得、次いで第４の溶解液で処理され得る。特定の例示的な実施形態では、第３および／または第４の溶液が、任意の時点で混合物に添加されて、任意の先行する溶解液によって消化されていない任意の細胞壁を破壊し得る。
【００３３】
いくつかの実施形態では、試料が細菌胞子および／または真菌胞子を有するか、または有する疑いがある場合、試料は、第１の溶解液と接触する前に胞子の細胞壁の発芽を誘導する前処理ステップに供され得る。前処理ステップは、試料をマイルドな界面活性剤、例えば、Ｔｗｅｅｎ−８０等の化学物質と混合して発芽を誘発すること、または発芽を誘発する条件下（例えば、温度）で試料を培養することを含み得る。発芽が化学物質で誘導されるいくつかの実施形態では、化学物質は好ましくは、第１、第２、および第３の溶解液の活性または有効性を阻害、低減、または改変しないものである。
【００３４】
いくつかの実施形態では、本発明による方法は、超音波処理、ビーズ混合、ビーズミル均質化、加圧、顕微溶液化等を含む機械的方法によって物理的溶解を引き起こす１つ以上の機械的処理ステップをさらに含み得る。いくつかの実施形態では、機械的処理ステップは、試料を第１の溶解液に供する前に実行される。
【００３５】
実施形態では、本発明による方法は、酵母（すなわち、サッカロマイセス属の種（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｓｐｐ．））、グラム陰性細菌（例えば、アシネトバクター属の種（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｓｐｐ．））、グラム陽性細菌（例えば、ビフィドバクテリウム属の種（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｓｐｐ．）、ウイルス（例えば、スクレロティニア属の種（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｐｐ．））、胞子（バチルス属の種（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｐｐ．））、蠕虫（サナダムシ  エキノコックス属の種（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐｐ．））、原生動物（肉質虫類（Ｓａｒｃｏｄｉｎａ）−アメーバ、例えばエントアメーバ属（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ））およびファージ（例えばラクトバチルス属（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）ファージ）を含む様々な微生物から核酸分子を抽出することができる。
【００３６】
実施形態では、本発明による方法は、真菌（すなわち、サッカロマイセス属の種）、動物細胞（ウシ（Ｂｏｓ  ｔａｕｒｕｓ））、植物（例えば、オオムギ（Ｈｏｒｄｅｕｍ  ｖｕｌｇａｒｅ））を含む様々な生物から核酸分子を抽出することができる。
【００３７】
以下の実施例は、本発明を例示することを意図するが、限定するものではない。
【実施例】
【００３８】
抽出方法Ａ
１０ｍｇ〜５０００ｍｇの試料を滅菌２ミリリットル（ｍＬ）マイクロ遠心チューブに添加した。ビーズビーティングを、４００マイクロリットル（μＬ）のビーズ純粋混合物を添加し、８０００ｒｐｍで約３０秒間ボルテックスすることによって、任意選択的に実行してもよい。しかしながら、高分子量核酸、例えばゲノムＤＮＡを得ることが望ましい場合、ビーズビーティングは好ましくは回避される。
【００３９】
第１の溶解液処理ステップ
試料中の任意のグラム陰性細菌を溶解するために、試料に約４００μＬの消化緩衝液（１％ｗ／ｖＳＤＳ、２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、ｐＨ８）および約２０μＬのプロテイナーゼＫを添加することによって、試料を第１の溶解液に供し、穏やかに混合した。次いで、混合物を５５℃で約３０分間インキュベートした。
【００４０】
第２の溶解液処理ステップ
試料中の任意のグラム陽性細菌を溶解するために、グルコシドヒドラーゼ（「リゾチーム」）を含む第２の溶解液を第１の溶解液処理ステップから得られた混合物に添加して、最終リゾチーム濃度１ｍｇ／ｍＬおよびｐＨ約８．０を得た。好適なグルコシドヒドロラーゼは、様々な動物の卵白、涙、または粘液もしくは唾液を含む様々な供給源から得ることができる。次いで、混合物を３７℃で約１〜２４時間インキュベートした。
【００４１】
第３の溶解液処理ステップ
試料中に存在する任意の真菌細胞および／または酵母細胞を溶解するために、蒸留滅菌Ｈ２Ｏ中１Ｍの酢酸リチウムおよび５％ｗ／ｖのＳＤＳを含む第３の溶解液を添加して、第２の溶解液処理ステップから生じる混合物の約１：５の希釈液を得た。処理された混合物を７０℃で１５分間インキュベートし、続いて９５℃で１分間ヒートショックにかけ、次いで２２℃の水浴に入れることによって室温にした。
【００４２】
第２および第３の溶解液処理ステップは、バクテリオファージおよびウイルスの外皮を溶解するのに十分であるため、試料中に存在し得るバクテリオファージおよびウイルスから遺伝物質を抽出するための追加のステップは必要ない。
【００４３】
抽出方法Ｂ
溶解前処理ステップ
１００〜２００ｍｇの試料を滅菌２ミリリットル（ｍＬ）マイクロ遠心チューブに添加した。液体窒素５００ｍＬを加え、試料を３０秒間凍結させる。次に、ペレットペッスルまたはのこぎり波発生器（ｓａｗ−ｔｏｏｔｈ  ｇｅｎｅｒａｔｏｒ）プローブを使用して、次のステップに進む前に試料を完全に粉砕する。
【００４４】
第１の溶解液処理ステップ
試料中の任意の動物、真菌、および原生動物食物細胞膜を溶解するために、試料に約４００μＬの消化緩衝液（１％ｗ／ｖＳＤＳ、２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、２．５ｍＭのＥＤＴＡ、１％のＴｒｉｔｏｎ（商標）Ｘ−１００、１．２ＭのＮａＣｌ  ｐＨ８）および約２０μＬのプロテイナーゼＫを添加することによって、試料を第１の溶解液に供し、穏やかに混合した。次いで、混合物を５５℃で約３０分間インキュベートした。
【００４５】
第２の溶解液処理ステップ
試料中に存在する任意の真菌細胞および／または酵母細胞を溶解するために、蒸留滅菌Ｈ２Ｏ中の１Ｍ酢酸リチウムおよび５％ｗ／ｖのＳＤＳを含む第２の溶解液を添加して、第１の溶解液処理ステップから生じる混合物の約１：５の希釈液を得た。処理された混合物を７０℃で１５分間インキュベートし、続いて９５℃で１分間ヒートショックにかけ、次いで２２℃の水浴に入れることによって室温にした。
【００４６】
核酸精製
一実施形態では、溶解微生物から抽出された遺伝物質、すなわち、第１、第２、および第３の溶解液処理ステップに供された後に混合物中に存在する核酸分子は、次に混合物を２つのマイクロ遠心チューブに分割することによってＤＮＡおよびＲＮＡ精製物に精製した。約２０μＬのＲＮＡｓｅ  Ａを添加し、室温で５分間インキュベートすることによって、ＤＮＡを１つのチューブから抽出した。混合物を生体高分子組織ホモジナイザカラムに通した。ビーズビーティングを前もって実行した場合、混合物を組織ホモジナイザカラムにかけることは、回避することが好ましい。
【００４７】
次いで、溶出液を１０００ｇで５分間遠心分離した。上清を約４００μＬのＤＮＡ溶解液（グアニジンＨＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ、および７０％ＥｔＯＨ）および約２０μＬのプロテイナーゼＫで処理し、混合し、次いで５５℃で１０分間インキュベートした。次に、−２２℃でＥｔＯＨを添加し、反転させて混合物を混合した。混合物は、当該技術分野で既知の１つ以上の追加のＤＮＡ抽出および精製方法に供され得る。
【００４８】
ＲＮＡを、生体高分子組織ホモジナイザカラムに混合物を通すことによって、第２のマイクロ遠心チューブから抽出した。再度、ビーズビーティングを前もって実行した場合、混合物を組織ホモジナイザカラムにかけることは、回避することが好ましい。次いで、溶出液を１０００ｇで５分間遠心分離した。上清を２５ｍＭのＭｇＣｌ２溶液中の約４０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（１Ｕ）で処理し、次いで３７度で約１５分間インキュベートした。次いで、混合物を酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出に供した。混合物は、当該技術分野で既知の１つ以上の追加のＲＮＡ抽出および精製方法に供され得る。
【００４９】
一実施形態では、溶解微生物から抽出された遺伝物質、すなわち、第１、第２、および前溶解処理ステップに供された後に混合物中に存在する核酸分子は、次いで混合物を２つのマイクロ遠心チューブに分割することによってＤＮＡおよびＲＮＡ精製した。約２０？ＬのＲＮＡｓｅ  Ａを添加し、室温で５分間インキュベートすることによって、ＤＮＡを１つのチューブから抽出した。
【００５０】
次いで、溶出液を１０００ｇで５分間遠心分離した。上清を約４００μＬのＤＮＡ溶解液（グアニジンＨＣｌ、Ｔｒｉｓ−ＥＤＴＡ、および７０％ＥｔＯＨ）および約２０μＬのプロテイナーゼＫで処理し、混合し、次いで５５℃で１０分間インキュベートした。次に、−２２℃でＥｔＯＨを添加し、反転させて混合物を混合した。混合物は、当該技術分野で既知の１つ以上の追加のＤＮＡ抽出および精製方法に供され得る。
【００５１】
ＲＮＡを第２のマイクロ遠心チューブから抽出した。次いで、溶出液を１０００ｇで５分間遠心分離した。上清を２５ｍＭのＭｇＣｌ２溶液中の約４０μＬのＤＮａｓｅ  Ｉ（１Ｕ）で処理し、次いで３７度で約１５分間インキュベートした。次いで、混合物を酸グアニジニウムチオシアネート−フェノール−クロロホルム抽出に供した。混合物は、当該技術分野で既知の１つ以上の追加のＲＮＡ抽出および精製方法に供され得る。
【００５２】
ＲＮＡ分子の定量的発現が所望されるいくつかの実施形態では、ＲＮＡ核酸分子の放出および限定された分解を確実にするため、ＲＮＡ安定化緩衝液およびビーズビーティングの使用が好ましい。
【００５３】
高分子量核酸分子の抽出が所望されるいくつかの実施形態では、ビーズビーティングおよび組織ホモジナイズカラムが回避され、シリカカラムベースの抽出の代わりにフェノール−クロロホルム−アルコール抽出が実行される。いくつかの実施形態において、磁気ビーズベースの核酸精製を実行してもよい。核酸の選択的分子量を除去し、試料を精製するために、アガロースゲルベースの精製および濃縮を実行してもよい。
【００５４】
メタゲノミクス解析
一実施形態では、抽出および精製された遺伝物質をＩｌｌｕｍｉｎａインデックスアダプタを使用してシークエンシングのために調製し、サイズおよび量をチェックした。低サイクルＰＣＲは、５０ｎｇ未満のＤＮＡの任意の投入に対して１〜２０サイクルで実行され、それ以外の場合は、５０ｎｇ以上の核酸に対して、ＰＣＲフリーのライブラリ調製方法を利用することができる。ゲル精製は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて実行した。クリーンＰＣＲ産物を、Ｑｕｂｉｔ（商標）２．０フルオロメータ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて定量化した。試料を等モル量で組み合わせた。ライブラリプールを、Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）ＣＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｍｅｓ  ＩＡ）を使用してサイズ検証し、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｄｓＤＮＡキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して定量化した。希釈後、１％〜１０％のＰｈｉＸ（商標）Ｖ３ライブラリ対照（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）のスパイク、プールを０．１Ｎ  ＮａＯＨの等しい体積で５分間変性させ、次いでＩｌｌｕｍｉｎａのＨＴ１緩衝液中でさらに希釈した。変性およびＰｈｉＸ（商標）スパイクしたプールをＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプライマーを有するＩｌｌｕｍｉｎａ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ（商標）シーケンサにロードし、５０〜５５０塩基、ペアードエンドまたはシングルリードに設定した。
【００５５】
この方法には、短いインサートの方法のための、１０００以上の範囲のシークエンシングリードを使用することができる。Ｐａｃ  Ｂｉｏ（商標）、Ｎａｎｏｐｏｒｅ（商標）、または他の次の遺伝子シークエンシング方法等の大型のインサートの方法は、１０００未満のシークエンシングリードを使用することができる。分類の割り当ての前にバイオインフォマティクスのクオリティフィルタリングを実行した。生のシークエンシングファイルのクオリティトリミングは、シークエンシングアダプタまたはインデックスの除去；クオリティスコア（Ｑ２０＞）、末端の塩基対、またはシグナル強度に基づいてリードの３’または５’末端をトリミングすること；クオリティスコア、ＧＣ含有量、またはアライメントされていない塩基対に基づいてリードを除去すること；設定された数の塩基対で重複リードを除去することを含み得る。処理されたシークエンシングファイルのアライメントは、ｒｅｆｓｅｑ（商標）、Ｇｒｅｅｎｇｅｅｎｓ（商標）、ＨＭＰ（商標）、ＮＣＢＩ（商標）、ＰＡＴＲＩＣ（商標）、または他の公開／私有データリポジトリもしくは社内データセットからの配列からなるカスタム微生物ゲノムデータベースを使用して行った。このデータベースは、完全なゲノムアライメント足場、ｋ−ｍｅｒ断片アライメント、またはメタゲノミクスおよびバイオインフォマティクスの技術分野で実践されている他のスキームとして使用され得る。データベースゲノムに一致するシークエンシングリード／断片の数に基づいて、生物に共通または固有の分類学的同一性を割り当てる。この識別子は、マッチングシークエンシングリードを分類群内の生物または株に関連付ける、バーコード、ヌクレオチド配列、またはいくつかの他の計算タグであってもよい。いくつかの識別子は、より高いオーダーであり、生物のドメイン、界、門、綱、目、科、または属を識別する。
【００５６】
本発明は、種内の株の最も低いオーダーで生物を識別することができる。
【００５７】
実施形態では、本発明は、当社のデータベース内に含まれる１つ以上の細菌の同定および／または解析を含む（図１０）。いくつかの選択された例は、バチルス・クラウジイ（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｃｌａｕｓｉｉ）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ａｎｉｍａｌｉｓ）、ペディオコッカス・アシディラクティシ（Ｐｅｄｉｏｃｏｃｃｕｓ  ａｃｉｄｉｌａｃｔｉｃｉ）、アシネトバクター・インディカス（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｉｎｄｉｃｕｓ）、ラクトバチルス・サリヴァリウス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓａｌｉｖａｒｉｕｓ）、アシネトバクター属、バチルス・アミロリケファシエンス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｍｙｌｏｌｉｑｕｅｆａｃｉｅｎｓ）、ラクトバチルス・ヘルヴェティクス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｈｅｌｖｅｔｉｃｕｓ）、バチルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、ラクトバチルス・プランタルム（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｐｌａｎｔａｒｕｍ）、ビフィドバクテリウム・ロングム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｌｏｎｇｕｍ）亜種インファンティス（ｉｎｆａｎｔｉｓ）、エンテロコッカス・ヒラエ（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｈｉｒａｅ）、ラクトバチルス・デルブリッキー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｄｅｌｂｒｕｅｃｋｉｉ）亜種ブルガリクス（ｂｕｌｇａｒｉｃｕｓ）、エンテロコッカス属、ラクトバチルス・ラムノサス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｈａｍｎｏｓｕｓ）、ラクトコッカス・ラクチス（Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓ）、シュードモナス・スタッツェリ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｓｔｕｔｚｅｒｉ）、ラクトバチルス・アシドフィルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｓ）、クレブシエラ属（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ）およびエンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ  ｃｌｏａｃａｅ）株である。
【００５８】
実施形態では、本発明は、当社のデータベース内に含まれる１つ以上の酵母の同定および／または解析を含む（図１０）。いくつかの選択された例は、サッカロマイセス属の種ブラウディ（Ｂｏｕｌａｒｄｉｉ）、サッカロマイセス・クドリアヴゼヴィイ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｋｕｄｒｉａｖｚｅｖｉｉ）、サッカロマイセス・パストリアヌス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｐａｓｔｏｒｉａｎｕｓ）およびサッカロマイセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ  ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）である。
【００５９】
実施形態では、本発明は、当社のデータベース内に含まれる１つ以上のファージまたはウイルスの同定および／または解析を含む（図１０）。いくつかの選択された例は、バチルスファージｐｈｉ２９、腸内細菌（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａ）ファージＨＫ０２２、ラクトバチルスファージＡ２、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）ファージＨＫ６３９、ファージｃｄｔＩ、スクレロティニア・スクレロティオルム（Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ  ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ）パルティティウイルス（ｐａｒｔｉｔｉｖｉｒｕｓ）Ｓセグメント２、バークホルデリア属（Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ）ファージＢｃｅｐＭｕ、ラクトコッカス属プロファージｂＩＬ３１１、エンテロコッカスファージｐｈｉＦＬ４ＡおよびストレプトコッカスファージＳＭ１である。
【００６０】
今後のデータベースの改善により、この方法で検出できる生物が増加または洗練する。
【００６１】
一実施形態では、抽出および精製された遺伝物質をＩｌｌｕｍｉｎａインデックスアダプタを使用してシークエンシングのために調製し、サイズおよび量をチェックした。低サイクルＰＣＲを実行でき、または標準的なＰＣＲフリー方法で実行することもできる。ゲル精製は、Ｑｉａｇｅｎ  Ｇｅｌ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（商標）（Ｑｉａｇｅｎ，Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）を用いて実行した。クリーンＰＣＲ産物を、Ｑｕｂｉｔ（商標）２．０フルオロメータ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて定量化した。試料を等モル量で組み合わせた。ライブラリプールを、Ｆｒａｇｍｅｎｔ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（商標）ＣＥ（Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ  Ｉｎｃ．，Ａｍｅｓ  ＩＡ）を使用してサイズ検証し、Ｑｕｂｉｔ（商標）Ｈｉｇｈ  Ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ  ｄｓＤＮＡキット（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を使用して定量化した。希釈後、１０％ＰｈｉＸ（商標）Ｖ３ライブラリ対照（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ  ＣＡ）のスパイク、プールを０．１Ｎ  ＮａＯＨの等しい体積で５分間変性させ、次いでＩｌｌｕｍｉｎａのＨＴ１緩衝液中でさらに希釈した。変性およびＰｈｉＸ（商標）スパイクしたプールをＩｌｌｕｍｉｎａシークエンシングプライマーを有するＩｌｌｕｍｉｎａ（商標）次世代シーケンサにロードし、１５０塩基のペアードエンドリードに設定した。分類の割り当ての前にバイオインフォマティクスのクオリティフィルタリングを実行した。
【００６２】
表１を使用して、個体が以下を摂取したと判断する：
【００６３】
（表１）
2021520191.tif 000003
【００６４】
主要栄養素摂取量のモニタリングと食事指導
いくつかの実施形態では、本発明は対象における食物により摂取する栄養、量、および質をモニターするために使用され得る。例えば、プロバイオティクスでの治療の前に、対象の消化管から得られた試料が取得され、本明細書に開示されるようにその中の食物生物の遺伝物質が抽出され、メタゲノミクス解析に供され得る。全体の、部分的な、または不完全な参照ゲノム、ＲＮＡ、または核酸成分または断片で構成されるカスタマイズされた食物固有のデータベースは、シークエンシングから核酸情報を同定、定量化、および分類学的に割り当てるために、バイオインフォマティクスツールによって利用される。その出力は、以下の表２に例示され、腸内にいた生物の種または生物の細胞の同定を含む。
【００６５】
（表２）
2021520191.tif 000004
【００６６】
次いで、所与のプロバイオティクスによる治療中および／または治療後に、第２の試料が、対象の消化管から取得され、第２の試料中の微生物の遺伝物質が抽出され、メタゲノミクス解析に供され得、その結果は、第１の試料のメタゲノミクス解析の結果と比較される。次に、比較結果に基づいて、食物生物の結果をマイクロバイオーム生物の結果と比較して、食物に関連する微生物を理解し、全体的な食物品質評価を行うことができる。いくつかの実施形態では、これは、個体がその食物源を通して摂取している生物の種についての情報、および、選択または直接の改変のいずれかによる、その種に対する任意の遺伝子改変、突然変異、または不規則性についての情報を提供し得る。
【００６７】
いくつかの実施形態では、マイクロバイオーム解析の第２の試料は、食物生物に共通する微生物の検出を可能にし、かつ食物生物の健康に関する情報を提供する。いくつかの実施形態では、ヒトが消費する食物は、その種が特定され、それらに特異的な微生物と一致する、一般的な食物源、例えばニワトリ、ウシ、ブタ、またはさらには植物、および原生生物等の一部であってもよい。特定の例示的な実施形態では、ニワトリ肉腫ウイルスを有し得るニワトリ種は、解析された第２の腸内マイクロバイオーム試料中に検出され得る。いくつかの実施形態では、摂取される食物生物の健康は、宿主生物の健康に悪影響を及ぼす微生物の存在または不在によって決定され得る。特定の例示的な実施形態では、ウマにおける呼吸器疾患であるウマヘルペスウィルス２型等の疾患が、宿主生物の健康に影響を及ぼし得ることが検出され得る。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本発明は、所与の対象の腸内マイクロバイオームをスクリーニングし、次いで、栄養バランス、改善された微生物腸プロファイル、および栄養素の吸収の側面について健康の質を改善させることを可能にする食物または食事レジメンを対象に合わせて調整する（ｃｕｓｔｏｍ  ｔａｉｌｏｒ）ために使用され得る。
【００６９】
プロバイオティクス治療のモニタリング
いくつかの実施形態では、本発明は対象におけるプロバイオティクス治療をモニターするために使用され得る。例えば、プロバイオティクスでの治療の前に、対象の消化管から得られた試料を取得し、本明細書に開示されるように、その中の微生物の遺伝物質を抽出し、メタゲノミクス解析に供することができる。次いで、所与のプロバイオティクスでの治療中および／または治療後、第２の試料が対象の消化管から得られおよび第２の試料中の微生物の遺伝物質が本明細書に開示されるように抽出され、メタゲノミクス解析に供され得、その結果が、第１の試料のメタゲノミクス解析の結果と比較される。次いで、比較結果に基づいて、対象のプロバイオティクス治療を改変して、対象の腸内に所望の微生物集団を得ることができる。例えば、その量が対象の腸内で増加するそのことが所望される微生物を含むプロバイオティクスを対象に投与してもよい。
【００７０】
いくつかの実施形態では、糞便試料は微生物糞便群のメタボロ−ムの判定のために混合または培養され得る。次いで、メタボロームプロファイルを使用して、個体に利益をもたらすプロバイオティクス株を決定することができる。メタボロームプロファイルの例としては、エネルギー代謝、栄養素利用、インスリン抵抗性、脂肪性、脂質異常症、炎症、短鎖脂肪酸、有機酸、サイトカイン、神経伝達物質化学物質または表現型に影響を与えるものが挙げられ、他のメタボロームマーカーを含み得る。
【００７１】
マイクロバイオームスクリーニングとプロバイオティクスの選択
本発明は、様々な市販のプロバイオティクスの微生物含有量を決定するために成功裏に使用された。さらに、本発明の方法を使用して、様々なプロバイオティクスの微生物含有量および対象の腸内のマイクロバイオーム含有量を決定する。一実施形態では、対象の腸内のマイクロバイオーム含有量およびそれに対する任意の所望の変化に基づいて、対象のマイクロバイオームの健康において増加および／または維持されることが所望される微生物を含有する１つ以上のプロバイオティクスを選択できる。一実施形態では、対象の腸内のマイクロバイオーム含有量およびそれに対する任意の所望の変更に基づいて、個体からの直接的調査情報によって、または本発明による腸内生物核酸解析によって記録される、それらの食物源から得られる主要栄養素含有量に関連して、対象の腸内バランスにおいて増加および／または維持されることが所望される微生物を含有する１つ以上のプロバイオティクスを選択することができる。
【００７２】
ここで、マイクロバイオームは、細菌、真菌、ウイルス、ファージ、および寄生生物等の微生物叢とそれらに含まれる生物の全体像を表す。例えば、本明細書に記載の方法を使用して、対象の腸内マイクロバイオームが２５％のＡおよび７５％のＢを含有することが決定され、プロバイオティクス１が７５％のＡおよび２５％のＢを含有することが決定され、プロバイオティクス２が２５％のＡおよび７５％のＢを含有することが決定される。対象の腸内マイクロバイオームが維持されることが望ましい場合、対象に投与するためにプロバイオティクス２を選択するであろう。しかしながら、対象の腸内のＡおよびＢの量が５０／５０であることが所望される場合、対象に投与するプロバイオティクス１および２の両方を選択できる。あるいは、対象の腸内のＡおよびＢの量が５０／５０に達するまで、対象に投与するプロバイオティクス１を選択してもよい。いくつかの実施形態では、対象への投与のために、例えば、等量、変動量、または多様な量のＡおよびＢまたは他のプロバイオティクス株を含有するプロバイオティクス製剤をその対象に合わせて調整してもよい。個体の腸に存在する微生物の相対的存在量を利用した計算モデルは、プロボティックに含まれる微生物の種類、用量、およびカクテルを決定するのに役立つ。例えば、生物Ａが一般集団または以前のマイクロバイオーム解析と比較して低減または欠如していると判断された場合、生物Ａの濃度を増加させるプロバイオティクスまたはプレバイオティクスを提供する。このプレバイオティクスまたはプロバイオティクスは、まさにその生物Ａまたは生物Ａの成長をサポートする別の生物であり得る。与えられる用量は、個体における生物の相対的存在量、成長速度、適合性、受容体もしくは受容体密度、遺伝子、もしくは発現パターン等のプレバイオティクス／プロバイオティクスの性能特徴、またはメタボローム産物を考慮するであろう。
【００７３】
対象に合わせて調整したプロバイオティクスは、等量ではなくてもよいが、個々の腸／糞便試料から検出された相対的存在量に基づいて製剤化される。これらの製剤は、マイクロバイオームを健康な状態に調節するように作られている。マイクロバイオームの健康状態は、ｍｅｔａＨＩＴ（商標）、Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（商標）、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｕｔ  Ｐｒｏｊｅｃｔ（商標）等の既存の集約私的および公的データベースの使用によって決定される。健康状態は、血液バイオマーカー検査の観点から、既知の問題がなく、健康状態である人の場合に個別に決定されてもよく、その後、それらの完全なマイクロバイオームプロファイルが完了する。１つまたはいくつかのマイクロバイオームシグネチャが完了した後、発見された微生物のうちのいくつか／すべての平均をその個体について理解することができ、その平均からの分散にアクセスして、それらがディスバイオシスにあるかどうかを判断することができる。マイクロバイオームプロファイルはグループに集約することができ、これらのグループは次いで、迅速なバイオインフォマティクス割り当てのためにバーコードを割り当てられる。グループは、試料が収集された個体に関連する単一または複数の表現型、診断、または人口統計学的情報によって作成することができる。固有グループは、線形距離計算、多様性値、Ｃ４．５決定木などの分類子、または主要成分解析等の統計モデルを使用して、Ｈｕｍａｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｍｅ  ＰｒｏｊｅｃｔまたはＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｇｕｔ  Ｐｒｏｊｅｃｔによって定義される「正常」などの集約された既知の集団と比較することによって、別のグループから決定することができる。
【００７４】
したがって、いくつかの実施形態では、本発明は、所与の対象の腸内マイクロバイオームをスクリーニングし、次いで、対象の腸内マイクロバイオームに基づいてプロバイオティクスレジメンを所与の対象に合わせて調整するのに使用され得る。
【００７５】
ディスバイオシスの治療
いくつかの実施形態では、本発明は、対象の微生物叢がバランスの取れたマイクロバイオームから、負の副作用、障害、および／または疾患を引き起こしているか、または引き起こし得るものに移行した事象の後に、対象の腸内フローラおよび／またはファウナを恒常性に回復させるために使用され得る。健康状態としては、ニキビおよびアレルギーから、胃腸疾患、肥満および癌まで、様々な状態が挙げられるが、これらに限定されない。そのようなディスバイオシスの一例は、肥満の発症の場合である。対象の腸内のいくつかの微生物株は、対象がおかれている肥満または体重管理の問題と関連することが示されている。例えば、Ｌｅｙ，ｅｔ  ａｌ．（２００５）ＰＮＡＳ  ＵＳＡ  １０２：１１０７０−１１０７５を参照されたい。例えば、肥満動物およびヒト対象において、バクテロイデス（Ｂａｃｔｅｒｉｄｅｓ）対ファーミキューテス（Ｆｉｒｍｉｃｕｔｅｓ）門微生物の比は、代謝性能において重要な役割を果たす。例えば、Ｔｕｒｎｂａｕｇｈ，ｅｔ  ａｌ．（２０１２）ＰＬＯＳ  ＯＮＥ  ７：ｅ４１０７９を参照されたい。肥満および体重管理の問題に関連することが知られているいくつかの腸内微生物には、バクテロイデス・ユニフォルミス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｕｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バクテロイデス・ペクチノフィラス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ  ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｉｌｕｓ）、ロゼブリア・イヌリニボランス（Ｒｏｓｅｂｕｒｉａ  ｉｎｕｌｉｎｉｖｏｒａｎｓ）、メタノブレビバクター・スミジイ（Ｍｅｔｈａｎｏｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒ  ｓｍｉｔｈｉｉ）およびビフィドバクテリウム・アニマリスが含まれる。
【００７６】
したがって、いくつかの実施形態では、対象の腸内の第１の所与の微生物対第２の所与の微生物の比は、本明細書に記載の方法を使用して決定され、次いで、その比が望ましくないまたは異常である場合、対象は、その比を所望の比になるよう修正するための治療を施される。いくつかの実施形態では、対象の腸内の全微生物の総量に対する、対象の腸内の第１の所与の微生物の量は、本明細書に記載の方法を使用して決定され、次いで、第１の所与の微生物の相対量が望ましくないまたは異常である場合、対象は、その量を所望の量になるように修正するための治療を施される。腸内マイクロバイオームの再検査は、それらが主要栄養素と食物指導をよく守っているかどうかを判断するために使用されるかもしれない。かかる治療には、以下を対象に投与することを含む：対象の腸内でその量を増やすことが所望される１つ以上の微生物を含有するプロバイオティクス、対象の腸内でその量を減少させることが所望される微生物または微生物類を殺すかまたはその成長を遅らせるための抗菌剤、例えば抗生物質、抗真菌剤、抗ウイルス剤等、健康な腸内マイクロバイオームの成長または維持を支持する食事および／または栄養補助食品、例えば、プレバイオティクス、マグネシウム、魚油、Ｌ−グルタミン、ビタミンＤ等、等々。例えば、Ｍｉｌｌｉｏｎ，ｅｔ  ａｌ．（（２００５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｂｅｓ．３６：８１７−８２５）は、肥満対象の腸内微生物叢がラクトバチルス・ロイテリ（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｒｅｕｔｅｒｉ）が豊富で、ビフィドバクテリウム・アニマリスおよびメタノブレビバクター・スミジイが枯渇していることを示す。したがって、本明細書に記載の方法を使用して、対象の腸内のラクトバチルス・ロイテリ、ビフィドバクテリウム・アニマリス、およびメタノブレビバクター・スミジイの量を決定し、その量が肥満関連腸内微生物叢の典型または指標であることを発見した後、対象に、ビフィドバクテリウム・アニマリスおよびメタノブレビバクター・スミジイを含有し、ラクトバチルス・ロイテリを比較的少量〜全く含有しないプロバイオティクスを投与することができる。実施形態では、肥満対象の腸内微生物叢は、フラボノイド、ポリフェノール、および短鎖脂肪酸を有する食物から利益を得るであろう。
【００７７】
マイクロバイオームのスコア付け
全体的なマイクロバイオームシグネチャのスコア付けは、表３に表されるように、類似の決定木、アルゴリズム、人工知能、スクリプト、または論理木を使用する。このシステムは、ユーザが自分の腸内マイクロバイオームがどれほど健康であるか、そして見出されたいくつかまたは多くの課題に対処する必要があるかを理解するのに役立つスコアを可能にする。課題には、限定されないが、既知の病原性生物の同定、日和見病原体の数および同定、機会が与えられたときに病原性影響を引き起こすことが知られている潜在的生物、良好な微生物環境に対する支持が欠如しているがそれらの組成または主要株の欠如、全体的な多様性、およびトップ１０に見出される独自の生物の数、ならびにまたは０．１％を超える保有率を有する生物、が含まれ得る。
【００７８】
試料解析の集計から多様性カットオフ（ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｃｕｔ  ｏｆｆ）を決定し、カットオフをｘ相対的存在量で決定した。たとえば、ｘ＝０．１％の場合、３５２個の固有生物が平均的な健康なプロファイルを構成する。次に、この数値の周りに標準偏差を適用し、曲線分析の下にガウス分布とパーセンタイルを使用して、データベースの平均から平均多様性数にどれくらい近いかをスコア化できる。多様性数が少なく、平均から離れているほど、マイクロバイオームのスコアは低くなる。数値が大きければおよび多様性が大きいほど、マイクロバイオームのスコアが高くなる。プロバイオティクススコアを伴うこのタイプスコア付けのカテゴリーは、マイクロバイオームがどれほど健康であるかを理解するため、カスタマイズのための数と視覚的に計測されたスコアを決定する。グラフィックビジュアライゼーションの一例を以下に挙げる。低はマイクロバイオームの品質が低いことを意味し、高はマイクロバイオームの品質とスコアが高いことを意味する。低−＞１００のうち３０、中＞１００のうち６５、高＝１００のうち６５以上。
【００７９】
スコア付けおよびプロバイオティクス式のアルゴリズムの一例は、以下の表３に含まれる。表３は、決定木、アルゴリズム、人工知能、スクリプト、または論理木として表すことができる。かかる決定木、アルゴリズム、人工知能、スクリプト、または論理木の機能は、検出されたプロバイオティクスに関連する個々のマイクロバイオームのウェルネスのスコアを出力し、プロバイオティクス使用のための式および投薬推奨事項を提供する。
【００８０】
微生物がグループ化され得る可能性のあるカテゴリーの例示的なリストを、以下の表４に記載する。
【００８１】
（表３）プロバイオティクスのスコア付けおよび式の決定表の例。プロバイオティクス株データベース、メタゲノム解析データベース、および文献キュレーションデータベースの利用が含まれる。
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【００８２】
（表４）グループを作成する可能性のあるカテゴリー
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【００８３】
本出願で使用されるすべての科学的および技術的用語は、特に明記しない限り、当該技術分野で一般的に使用される意味を有する。
【００８４】
本明細書で使用される場合、「対象」という用語は、ヒトおよび非ヒト動物を含む。「非ヒト動物」という用語は、全ての脊椎動物、例えば、哺乳動物および非ヒト霊長類、ウマ、ヒツジ、イヌ、ウシ、ブタ、ニワトリ、ならびに他の獣医学的対象および試験動物等の非哺乳動物を含む。
【００８５】
単数形の使用は、特に明記しない限り、複数形を含むことができる。本明細書および添付の特許請求の範囲で使用される場合、単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈により明らかにそうではないと指示されない限り、複数の指示対象を含むことができる。「または」の使用は、特に明記しない限り、「および／または」を意味し得る。本明細書で使用される場合、「および／または」は、「および」または「または」を意味する。例えば、「Ａおよび／またはＢ」は、「Ａ、Ｂ、またはＡおよびＢの両方」を意味し、「Ａ、Ｂ、Ｃ、および／またはＤ」は、「Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、またはそれらの組み合わせ」を意味し、当該「それらの組み合わせ」は、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤの任意のサブセット、例えば、単一のメンバーサブセット（例えば、ＡもしくはＢもしくはＣもしくはＤ）、２メンバーサブセット（例えば、ＡおよびＢ、ＡおよびＣ等）、または３メンバーサブセット（例えば、Ａ、Ｂ、およびＣ、またはＡ、Ｂ、およびＤ等）、または４メンバー全て（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤ）を意味する。
【００８６】
本明細書で使用される場合、用語「試料」および「生体試料」は、本発明によって提供される方法に好適な任意の試料を指す。細胞の試料は、例えば、非侵襲的または対象の生検等の侵襲的技法によって得られる腸試料または糞便試料を含む、任意の試料であり得る。一実施形態では、「試料」という用語は、対象の糞便または腸組織に由来する任意の調製物を指す。例えば、本明細書に記載の非侵襲的方法を使用して得られた細胞の試料を使用して、本発明の方法のための核酸分子またはタンパク質を単離することができる。
【００８７】
実施形態では、解析は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ｍｔＤＮＡ、一本鎖または二本鎖を含む任意の核酸のものであり得る。この核酸は、約５ｂｐのオリゴのように短いものからメガ塩基のように長いもの、またはそれ以上の長さのものまで、任意の長さであり得る。本明細書で使用される場合、「核酸分子」という用語は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、一本鎖、二本鎖または三本鎖、ならびにこれらの任意の化学修飾を意味する。事実上核酸の任意の修飾が企図される。「核酸分子」は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１５，０００、２０，０００、３０，０００、４０，０００、５０，０００、７５，０００、１００，０００、１５０，０００、２００，０００、５００，０００、１，０００，０００、１，５００，０００、２，０００，０００、５，０００，０００、またはそれ以上の長さの塩基あってもよく、全長染色体ＤＮＡ分子まで、ほとんど任意の長さであり得る。遺伝子の発現を解析する方法については、試料から単離された核酸は通常ＲＮＡである。
【００８８】
一本鎖核酸分子は、グアニン（Ｇ）がシトシン（Ｃ）と塩基対合しておよびアデニン（Ａ）がチミン（Ｔ）またはウリジン（Ｕ）と塩基対合する能力に基づいて、他の核酸分子の全てまたは一部と塩基対合（ハイブリダイズ）して二重らせん（二本鎖核酸分子）を形成することができる場合、別の一本鎖核酸分子に「相補的」である。例えば、ヌクレオチド配列５’−ＴＡＴＡＣ−３’は、ヌクレオチド配列５’−ＧＴＡＴＡ−３’に相補的である。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「ハイブリダイゼーション」とは、核酸鎖が塩基対合を介して相補鎖と結合するプロセスを指す。ハイブリダイゼーション反応は感受性かつ選択的であるため、対象となる特定の配列は、それが低濃度で存在する試料においても同定できる。インビトロ状況では、好適にストリンジェントな条件を、例えば、プレハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーション溶液中の塩またはホルムアミドの濃度によって、またはハイブリダイゼーション温度によって定義することができ、当該技術分野で周知である。特に、塩の濃度を減少させること、ホルムアミドの濃度を増加させること、またはハイブリダイゼーション温度を上昇させることによって、ストリンジェンシーを増加させることができる。例えば、高ストリンジェンシー条件下でのハイブリダイゼーションは、約３７℃〜４２℃で約５０％のホルムアミド中で起こり得る。ハイブリダイゼーションは、約３０℃〜３５℃で約３５％〜２５％のホルムアミド中で低減されたストリンジェンシー条件下で起こり得る。特に、ハイブリダイゼーションは、５０％ホルムアミド、５倍ＳＳＰＥ、０．３％ＳＤＳ、ならびに２００ｍｇ／ｍｌの剪断および変性サーモン精子ＤＮＡ中の４２℃の高ストリンジェンシー条件下で起こり得る。ハイブリダイゼーションは、上述のように低減されたストリンジェンシー条件下で起こり得るが、３５℃の下げられた温度で３５％ホルムアミド中で起こり得る。特定のストリンジェンシーレベルに対応する温度範囲は、対象となる核酸のプリン対ピリミジン比を計算し、それに応じて温度を調整することによってさらに狭めることができる。上記の範囲および条件に関する変形は、当該技術分野において周知である。
【００９０】
本明細書で使用される場合、「マイクロバイオーム」という用語は、対象の腸に生息する細菌、ウイルス、および真菌、古細菌、原生動物、アメーバ、または蠕虫を含む微生物を指す。
【００９１】
本明細書で使用される場合、微生物（ｍｉｃｒｏｂｉａｌ）、微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）、または微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）という用語は、原核生物または真核生物、胞子、細菌、古細菌、真菌、ウイルス、または原生動物、単細胞または多細胞を含む任意の微生物を指す。
【００９２】
本発明は、機能的構成要素および様々な処理ステップの観点から部分的に説明される。そのような機能的構成要素および処理ステップは、指定された機能を実行し、様々な結果を達成するように構成された任意の数の構成要素、動作、および技法によって実現され得る。例えば、本発明は、様々な生体試料、バイオマーカー、要素、材料、コンピュータ、データ源、記憶システムおよび媒体、情報収集技術およびプロセス、データ処理基準、統計解析、回帰解析等を用いることができ、これらは様々な機能を実行し得る。加えて、本発明は医学的診断の文脈で説明されているが、本発明は、任意の数のアプリケーション、環境、およびデータ解析と併せて実施されてもよく、本明細書に記載されるシステムは、本発明のための単なる例示的なアプリケーションである。
【００９３】
本発明の様々な態様によるデータ解析のための方法は、例えば、コンピュータシステム上で動作するコンピュータプログラムを使用して、任意の好適な方法で実装され得る。本発明の様々な態様に従った例示的な解析システムは、コンピュータシステム、例えば、プロセッサおよびランダムアクセスメモリ、例えば遠隔アクセス可能なアプリケーションサーバ、ネットワークサーバ、パーソナルコンピュータまたはワークステーション等を含む従来のコンピュータシステムと併せて実装され得る。コンピュータシステムはまた、追加のメモリデバイスまたは情報記憶システム、例えば、大量記憶システムおよびユーザインタフェース、例えば、従来のモニタ、キーボード、および追跡デバイスを好適に含む。しかしながら、コンピュータシステムは、任意の好適なコンピュータシステムおよび関連機器を含み得、任意の好適な様式で構成され得る。一実施形態では、コンピュータシステムはスタンドアロンシステムを含む。別の実施形態では、コンピュータシステムは、サーバおよびデータベースを含むコンピュータのネットワークの一部である。
【００９４】
遺伝子情報の受信、処理、および解析に必要なソフトウェアは、単一のデバイスに実装され得るか、または複数のデバイスに実装され得る。ソフトウェアは、情報の記憶および処理がユーザに関して遠隔で行われるように、ネットワークを介してアクセス可能であり得る。本発明の様々な態様による解析システムおよびその様々な要素は、データ収集、処理、解析、レポートおよび／または診断等のマイクロバイオーム解析を容易にするための機能および動作を提供する。本解析システムは、マイクロバイオームおよび試料に関する情報を維持し、解析および／または診断を容易にする。例えば、本実施形態では、コンピュータシステムは、マイクロバイオームに関する情報を受信、格納、検索、解析、およびレポートし得るコンピュータプログラムを実行する。コンピュータプログラムは、様々な機能または動作を実行する複数のモジュール、例えば、生データを処理し、補足データを生成するための処理モジュール、ならびに生データおよび補足データを解析してモデルおよび／または予測を生成するための解析モジュールを含んでもよい。
【００９５】
解析システムはまた、様々な追加のモジュールおよび／または個々の機能を提供し得る。例えば、解析システムはまた、例えば、処理および解析機能に関連する情報を提供するためのレポート機能を含んでもよい。解析システムはまた、アクセスを制御し、他の管理機能を実行する等の様々な管理機能および操作機能を提供してもよい。
【００９６】
本発明の開示を理解または完了するために必要な範囲において、本明細書に言及される全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれが個別にそのように組み込まれた場合と同程度に、参照により明示的に組み込まれる。
【００９７】
本発明は上記の例を参照して記載されているが、変更および変形は本発明の精神および範囲内に包含されることが理解されるであろう。したがって、本発明は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図２Ｄ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図３Ｄ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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