(57)【要約】ＲＮＡライブラリー構築方法及びその特化されたキットを提供する。ＲＮＡライブラリーを調製するための方法は、以下のステップ：ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；３’末端に尾部を付加するステップ；５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップを含む。本発明は、ポリＡ尾部付加及び５’末端ライゲーションを組み合わせている。システムのＲＮＡ含量は、ポリＡ尾部付加によって急速に増加し、それにより、続く精製による損失を避けることができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、前記ＤＮＡプローブ混合物が、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法。
【請求項２】
前記断片化が、加熱処理によって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
３’末端に尾部を付加する前記ステップが、以下の様式：５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変し、次いで尾部を付加することによって実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
「５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変する」前記ステップが、以下の方法：Ｔ４  ＰＮＫによって処理することによって実行される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去する前記ステップが、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、前記ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法。
【請求項７】
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去する前記ステップが、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法。
【請求項９】
ＲＮＡライブラリーを調製するための方法であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法。
【請求項１０】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｂが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｃが、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成されるＤＮＡプローブ混合物であり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項１１】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｇが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項１２】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｈが、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｂが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｃが、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成されるＤＮＡプローブ混合物であり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項１３】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
構成要素Ａが、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｈが、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｇが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項１４】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ｉ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
構成要素Ｉが、ＲＮＡ分子の３’末端を尾部付加及び改変するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｂが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｃが、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成されるＤＮＡプローブ混合物であり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項１５】
ＲＮＡライブラリーを調製するためのキットであって、構成要素Ｉ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含み、
構成要素Ｉが、ＲＮＡ分子の３’末端を尾部付加及び改変するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｇが、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｄが、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｅが、逆転写のための試薬又は試薬の組合せであり；
構成要素Ｆが、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである、キット。
【請求項１６】
シークエンシングにおける、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法の使用。
【請求項１７】
シークエンシングにおける、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載のキットの使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、ＲＮＡライブラリーの構築のための方法及びキットに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＮＩＰＴ（非侵襲的出生前検査）を含む、非侵襲的検査は、非常に古典的な技術であるだけでなく、新興分野でもある。血漿又は血清酵素検査及びＮＩＰＴは、身体的健康又は妊娠を予測するために、それぞれタンパク質及びＤＮＡのレベルで血漿／血清を解析する。しかしながら、血漿／血清ＲＮＡの適用はまだ始まったばかりであり、これは主に、ＲＮＡが不安定であり、血漿／血清ＲＮＡがほとんど小さな断片であり、その濃度が非常に低く、したがって、そのような低品質及び低濃度のＲＮＡのライブラリーの構築のための非常に優れた戦略がないためである。ＲＮＡライブラリーの構築の現在の技術は、長鎖ＲＮＡ又は短鎖ＲＮＡのみに向けられ、長鎖ＲＮＡ及び短鎖ＲＮＡ同時のライブラリーの構築のための好適な技術はなく、そのため、長鎖ＲＮＡと短鎖ＲＮＡの両方の同時研究は、それらの別々のライブラリーの構築を必要とする。
【０００３】
ＲＮａｓｅＨ法は、長鎖ＲＮＡのライブラリーの構築のための古典的な方法である。基本ステップは：ｒＲＮＡと逆相補性であるＤＮＡオリゴを試料とアニールするステップ、ＲＮａｓｅＨによってｒＲＮＡを除去するステップ、次いでＤＮａｓｅによってＤＮＡオリゴを除去するステップ；逆転写（一本鎖ｃＤＮＡ合成）、二本鎖合成；ギャップ充填、ｄＡの付加、アダプターライゲーション、ＰＣＲを含む。以下の問題がある；プロセスが、実行するのに非常に扱いにくく、遅く、困難であること；ＲＮＡの最初の量が高い必要があること；ＲＮＡの長い断片のみが検出できること。
【０００４】
Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡのライブラリー構築は、以下の基本ステップ：３’アダプターをライゲートするステップ、次いで５’アダプターをライゲートするステップ、逆転写、ＰＣＲを含む。以下の問題がある：操作が困難であり、遅く、コストがかかること；ＲＮＡの最初の量が、高い必要があること；ＲＮＡの短い断片のみが検出できること；ライブラリーの構築中に深刻なバイアスが誘導されること。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ＲＮＡライブラリー構築方法及びその特化されたキットを提供する。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための第１の方法（方法１）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
３’末端に尾部（ｔａｉｌｉｎｇ、テーリング）を付加するステップ
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法を提供する。
【０００７】
方法１は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
（４）ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
（５）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
【０００８】
断片化は、加熱処理によって実行される。断片化の目的は、４００ｎｔ以下のＲＮＡ断片を得ることである。ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有する。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有する。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有する。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有する。
【０００９】
３’末端に尾部を付加するステップは、以下の様式：５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変し、次いで尾部を付加することによって実行される。「５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変する」ステップは、以下の方法：Ｔ４  ＰＮＫによって処理することによって実行される。
【００１０】
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
【００１１】
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップは、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される。
【００１２】
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
【００１３】
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
【００１４】
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための方法（方法２）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も保護しようとする。
【００１５】
方法２は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブ混合物とハイブリダイズし、該ＤＮＡプローブ混合物が除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される、ステップ；
（４）ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップ；
（５）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
【００１６】
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
【００１７】
ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するステップは、以下の方法：ＲＮａｓｅＨ消化及びＤＮａｓｅ消化を連続して実施することによって実行される。
【００１８】
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
【００１９】
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
【００２０】
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための方法（方法３）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も提供する。
【００２１】
方法３は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出し、断片化を実施するステップ
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
（４）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
【００２２】
断片化は、加熱処理によって実行される。断片化の目的は、４００ｎｔ以下のＲＮＡ断片を得ることである。ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有する。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有する。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有する。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有する。
【００２３】
３’末端に尾部を付加するステップは、以下の様式：５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変し、次いで尾部を尾部することによって実行される。「５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変する」ステップは、以下の方法：Ｔ４  ＰＮＫによって処理することによって実行される。
【００２４】
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
【００２５】
標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップは、限定はされないが、チップ捕捉、複合ＰＣＲ、又は縮重ＰＣＲを含む方法によって実行される。
【００２６】
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
【００２７】
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
【００２８】
本発明は、ＲＮＡライブラリーを調製するための方法（方法４）であって、以下のステップ：
ＲＮＡを抽出するステップ；
３’末端に尾部を付加するステップ；
５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
逆転写及びＰＣＲ増幅を実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む方法も保護しようとする。
【００２９】
方法４は、好ましくは以下のステップ：
（１）ＲＮＡを抽出するステップ；
（２）３’末端に尾部を付加するステップ；
（３）５’末端にアダプターをライゲートし、標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップ；
（４）逆転写及びＰＣＲ増幅を順に実施して、ライブラリー溶液を得るステップ
を含む。
【００３０】
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
【００３１】
標的ＲＮＡ断片を濃縮するステップは、限定はされないが、チップ捕捉、複合ＰＣＲ、又は縮重ＰＣＲを含む方法によって実行される。
【００３２】
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
【００３３】
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
【００３４】
前述のハイブリッドのいずれか１つは、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドである。
【００３５】
前述のＲＮＡのいずれか１つは、ヒトＲＮＡである。
【００３６】
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡ及びＹ  ＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５〜配列番号２０８に連続して示されるように、２０４種類のプローブから構成される。
【００３７】
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５〜配列番号１９９に連続して示されるように、１９５種類のプローブから構成される。
【００３８】
前述のアダプターのいずれか１つは、配列表の配列番号１に示される。
【００３９】
前述の逆転写のいずれか１つは、配列表の配列番号２に示されるように逆転写プライマーを使用する。
【００４０】
前述のＰＣＲのいずれか１つは、２つのプライマーを使用し、１つは配列表の配列番号３に示され、もう一方は配列表の配列番号４に示される。
【００４１】
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット１）も保護しようとする。
【００４２】
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット２）も保護しようとする。
【００４３】
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット３）も保護しようとする。
【００４４】
本発明は、構成要素Ａ、構成要素Ｈ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット４）も保護しようとする。
【００４５】
本発明は、構成要素Ｉ、構成要素Ｂ、構成要素Ｃ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット５）も保護しようとする。
【００４６】
本発明は、構成要素Ｉ、構成要素Ｇ、構成要素Ｄ、構成要素Ｅ、及び構成要素Ｆを含む、ＲＮＡライブラリーを調製するためのキット（キット６）も保護しようとする。
【００４７】
構成要素Ａは、ＲＮＡ分子の３’末端に尾部を付加するための試薬又は試薬の組合せである。
【００４８】
構成要素Ｂは、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートするための試薬又は試薬の組合せである。
【００４９】
構成要素Ｃは、ＤＮＡプローブ混合物である。ＤＮＡプローブ混合物は、除去されると予想されるＲＮＡと逆相補性であるいくつかのＤＮＡプローブから構成される。
【００５０】
構成要素Ｄは、ハイブリッドからＲＮＡを除去し、ＤＮＡを除去するための試薬又は試薬の組合せである。
【００５１】
構成要素Ｅは、逆転写のための試薬又は試薬の組合せである。
【００５２】
構成要素Ｆは、ＰＣＲのための試薬又は試薬の組合せである。
【００５３】
構成要素Ｇは、ＲＮＡ分子の５’末端にアダプターをライゲートし、ＤＮＡプローブとハイブリダイズするための試薬又は試薬の組合せである。
【００５４】
構成要素Ｈは、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を有するようにＲＮＡ断片を改変するための試薬又は試薬の組合せである。
【００５５】
構成要素Ｉは、ＲＮＡ分子の３’末端を尾部付加及び改変するための試薬又は試薬の組合せである。
【００５６】
前述のキットのいずれか１つは、構成要素Ｊをさらに含む；構成要素Ｊは、ＲＮＡを抽出するための試薬又は試薬の組合せである。
【００５７】
構成要素Ａは、ポリＡポリメラーゼ及びＡＴＰである。構成要素Ａは、ＲＮａｓｅＨ緩衝液、ＡＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤及びポリＡポリメラーゼである。
【００５８】
構成要素Ｂは、アダプター及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ１である。
【００５９】
構成要素Ｄは、ＲＮａｓｅＨ及びＤＮａｓｅである。構成要素Ｄは、ＲＮａｓｅＨ、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ及びＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩである。構成要素Ｄは、ＲＮａｓｅＨ、Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ、ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ、ＣａＣｌ２及びＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液である。
【００６０】
構成要素Ｅは、逆転写プライマー及びＨｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴである。構成要素Ｅは、逆転写プライマー、ｄＮＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤、ＨｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ緩衝液及びＨｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴである。
【００６１】
構成要素Ｆは、増幅プライマー対である。構成要素Ｆは、増幅プライマー対及びＨｉＦｉ  ＰＣＲ  Ｍｉｘである。
【００６２】
構成要素Ｇは、アダプター、ＤＮＡプローブ混合物及びＴ４  ＲＮＡリガーゼ１である。構成要素Ｇは、アダプター、ＤＮＡプローブ混合物、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液、ＡＴＰ、ＰＥＧ８０００、ＲＮａｓｅ阻害剤、アルカリホスファターゼ及びＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液である。
【００６３】
構成要素Ｈは、Ｔ４  ＰＮＫである。
【００６４】
構成要素Ｉは、ポリＡポリメラーゼ、ＡＴＰ及びＴ４ＰＮＫである。構成要素Ｉは、ＲＮａｓｅ  Ｈ緩衝液、ＡＴＰ、ＲＮａｓｅ阻害剤、Ｔ４  ＰＮＫ及びポリＡポリメラーゼである。
【００６５】
尾部を付加するステップは、ポリ（Ａ）尾部又はポリ（Ｕ）尾部を付加するステップを指す。
【００６６】
ＲＮＡを抽出するステップは、ＣｆＲＮＡを抽出するステップ又は全ＲＮＡを抽出するステップを指す。
【００６７】
ＲＮＡを抽出するステップで使用される試料は、限定はされないが、血漿、組織又は細胞を含む。
【００６８】
前述のハイブリッドのいずれか１つは、ＤＮＡとＲＮＡのハイブリッドである。
【００６９】
前述のＲＮＡのいずれか１つは、ヒトＲＮＡである。
【００７０】
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡ及びＹ  ＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５〜配列番号２０８に連続して示されるように、２０４種類のプローブから構成される。
【００７１】
上記のように除去されると予想されるＲＮＡは、ｒＲＮＡである。前述のＤＮＡプローブ混合物のいずれか１つは、配列表の配列番号５〜配列番号１９９に連続して示されるように、１９５種類のプローブから構成される。
【００７２】
前述のアダプターのいずれか１つは、配列表の配列番号１に示される。
【００７３】
前述の逆転写プライマーのいずれか１つは、配列表の配列番号２に示される。
【００７４】
前述の増幅プライマー対のいずれか１つについては、１つは配列表の配列番号３に示され、もう一方は配列表の配列番号４に示される。
【００７５】
本発明は、シークエンシングの前述の方法のいずれか１つの使用も保護しようとする。シークエンシングはハイスループットシークエンシングである。
【００７６】
本発明は、シークエンシングの前述のキットのいずれか１つの使用も保護しようとする。シークエンシングはハイスループットシークエンシングである。
【００７７】
本発明は、ポリＡ尾部付加及び５’末端ライゲーションを組み合わせている。システムのＲＮＡ含量は、ポリＡ尾部付加によって急速に増加し、それにより、続く精製による損失を避けることができる。特定の配列を除去することは都合がよい。断片化及び改変（Ｔ４  ＰＮＫ処理）により、全ての型のＲＮＡが同様の化学的状態に入り、同時にライブラリーへと構築され得る。
【図面の簡単な説明】
【００７８】
【図１】図１は、本発明によって提供される方法の概略的なフローチャートを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００７９】
以下の実施例は、本発明のより良い理解を容易にするが、本発明を限定はしない。以下の実施例の実験方法は、他に特定しない限り、従来の方法である。以下の実施例で使用する試験材料は、他に特定しない限り、従来の生化学試薬店から全て購入される。以下の実施例の定量的検査は全て、３回の反復実験を設定し、結果は平均される。
【００８０】
１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液、ＲＮａｓｅＨ：ＮＥＢ  Ｍ０２９７Ｌ。ＲＮａｓｅ阻害剤：Ｔｈｅｒｍｏ  ＥＯ０３８２。Ｔ４  ＰＮＫ：ＮＥＢ  Ｍ０２０１。ポリＡポリメラーゼ：ＮＥＢ  Ｍ０２７６。１０×Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ緩衝液、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ１：ＮＥＢ  Ｍ０２０４。実施例で使用したアルカリホスファターゼは、ＦａｓｔＡＰアルカリホスファターゼであった：Ｔｈｅｒｍｏ  ＥＦ０６５１。Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ：Ｔｈｅｒｍｏ  ＡＭ２２３８。ＲＮａｓｅフリーＤＮａｓｅＩ：ＮＥＢ  Ｍ０３０３。ＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  Ｂｅａｄｓ：Ｖａｚｙｍｅ  Ｎ４１１。ＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  Ｂｅａｄｓ：Ｖａｚｙｍｅ  Ｎ４１２。ＨｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴ、５×ＨｉＳｃｒｉｐｔ  ＩＩ緩衝液：Ｖａｚｙｍｅ  Ｒ２０１。２×ＨｉＦｉ  ＰＣＲ  Ｍｉｘ：ＫＡＰＡ  ＫＫ２６０２。Ｑｕｂｉｔ  ＨＳ：Ｔｈｅｒｍｏ  Ｑ３２８５４。
【００８１】
小さなＲＮＡ断片は、１８ｎｔ〜３００ｎｔのサイズを有するＲＮＡ分子を指す（１８ｎｔと３００ｎｔを含む）。一般的な小さなＲＮＡ断片は、限定はされないが、マイクロＲＮＡ、短鎖非コードＲＮＡ（ｓｃＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を含む。
【００８２】
大きなＲＮＡ断片は、３００ｎｔよりも大きなサイズを有するＲＮＡ分子を指す。一般的な大きなＲＮＡ断片は、限定はされないが、ｍＲＮＡ及びＬｎｃＲＮＡ（長鎖非コードＲＮＡ）を含む。
【００８３】
配列表の配列番号５〜配列番号２０８では、ＲはＡ又はＧを表す。
【実施例】
【００８４】
実施例１：試料としてＣｆＲＮＡを使用してＲＮＡライブラリー（小さなＲＮＡ断片の情報を含有する）を構築する
Ｉ．ＲＮＡ抽出
ＣｆＲＮＡを、３００μＬの血漿から抽出した（ＲＮＡの量は約１２ｎｇであった）。
【００８５】
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．ポリＡ付加。
ステップＩで得たＣｆＲＮＡを取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、次いで氷上に置き、次いで表１に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
【表１】
2021536255.tif 000002
【００８６】
２．ｒＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション及びアダプターのライゲーション
ステップ１の完了後、システムに１μＬのＤｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  Ｍｉｘ及び０．５μＬの２０μＭ  アダプターを添加し、反応させ（反応条件：９５℃で５分、次いで０．１℃／秒の速さで２２℃に冷却、次いで２２℃で５分間維持）、次いで氷上に置き、次いで表２に記載の試薬を添加し、２５℃で１時間反応させ、次いで２μＬの１Ｕ／μＬ  アルカリホスファターゼ及び１３μＬのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）を添加し、次いで３７℃で１０分間反応させた。
【００８７】
アダプター（配列表の配列番号１）：
5'-GAACGACAUGGCUACGAUCCGACUUNNNN-3'
アダプターでは、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵを表す。アダプターの５’末端と３’末端の両方がヒドロキシル基を有する。
【表２】
2021536255.tif 000003
【００８８】
Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  Ｍｉｘはプローブ混合溶液であった（プローブ混合物は、配列表の配列番号５〜配列番号２０８に連続して示されるように、２０４種類のプローブから構成された；Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  Ｍｉｘでは、各プローブの濃度は０．５μＭであった）。プライマー混合物の各プローブは、除去されると予想されるＲＮＡ（ｒＲＮＡ及びＹ  ＲＮＡ）と逆相補性であり、アニールしてＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成する。
【００８９】
３．除去されると予想されるＤＮＡ及びＲＮＡの除去
（１）ステップ２の完了後、システムに１μＬの５Ｕ／μＬ  ＲＮａｓｅＨ及び４μＬのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで表３に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置いた。
【表３】
2021536255.tif 000004
【００９０】
（２）ステップ（１）の完了後、システムに精製のため７０μＬのＲＮＡ  Ｃｌｅａｎ  Ｂｅａｄｓ（１×）を添加し、精製産物を１５μＬのＤＥＰＣ水で回収し、１２．５μＬの上澄み液を新しいヌクレアーゼフリー遠心チューブに注意深くピペットした。
【００９１】
４．逆転写及びＰＣＲ
（１）ステップ３（２）の遠心チューブを取り、１μＬの５μＭ  Ａｄ１５３Ｒ−２５ｄＴ−ＶＮを添加し、６５℃で５分間反応させ、次いで氷上に２分間置き、次いで表４に記載の試薬を添加し、次いで逆転写にかけ（逆転写プログラム：５０℃、４０分）、次いで２５μＬの３ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液を添加し、十分に混合し、８５℃で１５分間反応させた。
【表４】
2021536255.tif 000005
【００９２】
Ａｄ１５３Ｒ−２５ｄＴ−ＶＮ（配列表の配列番号２）：
5'-GACCGCTTGGCCTCCGACTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'
Ａｄ１５３Ｒ−２５ｄＴ−ＶＮでは、ＶはＡ、Ｇ又はＣを表し、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＴを表す。
【００９３】
（２）ステップ（１）の完了後、２１μＬの産物を取り、表５に記載の試薬を添加し、次いでＰＣＲ増幅にかけ（ＰＣＲ増幅反応プログラム：９４℃で３分；９４℃で２０秒、６０℃で２０秒、７２℃で３０秒、２０サイクル；７２℃で５分；１６℃で保存）。
【表５】
2021536255.tif 000006
【００９４】
Ａｄ１５３−ＲＴ−Ｂａｒｃｏｄｅ−Ｎ（配列表の配列番号３）：
5'-TGTGAGCCAAGGAGTTGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTT-3'
Ａｄ１５３−ＲＴ−Ｂａｒｃｏｄｅ−Ｎでは、文字枠でマークした１０個の「Ｎ」は、試料バーコードであり、各試料はユニークな試料バーコードを有した。
【００９５】
Ｐｉ−Ａｄ１５３Ｆ−ＦＬ（配列表の配列番号４）：
5'-GAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3'
【００９６】
（３）ステップ（２）の完了後、システムに精製のため９０μＬのＤＮＡ  Ｃｌｅａｎ  Ｂｅａｄｓ（１．８×）を添加し、精製産物を２０μＬの１×ＴＥ溶液で回収し、それがライブラリー溶液であった。
【００９７】
５．ライブラリーの品質管理
ライブラリー溶液の定量は、Ｑｕｂｉｔ  ＨＳで実行し、ライブラリー濃度は２ｎｇ／μＬより高いべきである。
【００９８】
ＩＩＩ．ハイスループットシークエンシング
複数試料のライブラリー溶液を混合し、次いでハイスループットシークエンシングにかけた。
【００９９】
使用した装置は、ＢＧＩ−ＳＥＱ５００ＲＳであった。
【０１００】
パラメーター設定は：ＳＥ３５；４プール１；他の設定はＢＧＩ−ＳＥＱ５００ＲＳ標準プロトコールであった。
【０１０１】
低品質のリードは除去された；リードの５’末端の４塩基及び３’末端の複数の「Ａ」（最初の塩基がＡではなくなるまで）は除去された；少なくとも１５個の連続する「Ａ」を含有するリードは除去された；１７塩基を超えないリードは除去された；ｒＲＮＡアライメント及び除去が実施された；
マイクロＲＮＡ及びｐｉＲＮＡアライメントを実施し、総リード数と比較した各遺伝子のリード数を計算した。
【０１０２】
実施例２：効果の比較
血漿試料は３０人のヒト血漿試料であった。
【０１０３】
ＲＮＡライブラリーは、実施例１に記載の方法に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は５８．７２％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は３９．５９％であった。
【０１０４】
ライブラリーは、ＲＮａｓｅＨ法（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｚｙｍｅ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／１１ｂｆ８７１ｄ−ｃ６６ｃ−４０ｃｃ−ａｄｂｅ−３１７ａ７８ａｆ２１７０．ｐｄｆ）に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は６２．４４％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は２６．９９％であった（ここでアライメント率は、ミトコンドリアｒＲＮＡによる人工物であり、実際のアライメント率は約３％であった）。
【０１０５】
ライブラリーは、Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｖａｚｙｍｅ．ｃｏｍ／ｄｏｗｎｌｏａｄＲｅｐｏｓｉｔｏｒｙ／３２ａｂ９ｂ８９−８０７９−４９６１−ｂ５７１−ｄａｆ９６４ｃ０２ａ４６．ｐｄｆ）に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は４．３８％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は１．７７％であった。
【０１０６】
ライブラリーは、ＳＭＡＲＴｅｒ（ＳＭＡＲＴｅｒ（登録商標）Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ−Ｓｅｑ  Ｋｉｔ−Ｐｉｃｏ  Ｉｎｐｕｔ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ）に従って構築し、平均ゲノムアライメント率は３５．１０％であり、平均トランスクリプトームアライメント率は３７．２３％であった。
【０１０７】
実施例３：試料としてＣｆＲＮＡを使用して、ＲＮＡライブラリーを構築する（大きなＲＮＡ断片の情報と小さなＲＮＡ断片の情報の両方を含有する）
Ｉ．ＲＮＡ抽出
ＣｆＲＮＡを３００μＬの血漿から抽出した（ＲＮＡの量は約１２ｎｇであった）。
【０１０８】
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．断片化、改変、及びポリＡ付加。
断片化は加熱処理によって実行した。
【０１０９】
改変の目的は、断片化によって得られたＲＮＡ断片に、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を形成させることであった。
【０１１０】
ステップＩで得られたＣｆＲＮＡを取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、加熱処理にかけ（ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有した。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有した。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有した。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有した）、次いで氷上に置き、次いで表６に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
【表６】
2021536255.tif 000007
【０１１１】
ステップ２〜５は、実施例１のステップＩＩのステップ２〜５と同じであった。
【０１１２】
３．ハイスループットシークエンシング
実施例１のステップＩＩＩと同じ。
【０１１３】
実施例４．試料として全ＲＮＡを使用してＲＮＡライブラリーを構築する
Ｉ．ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡは、組織又は細胞から抽出した。
【０１１４】
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．断片化、改変、及びポリＡ付加。
断片化は加熱処理によって実行した。
【０１１５】
改変の目的は、断片化によって得られたＲＮＡ断片に、５’末端にリン酸基を、３’末端にヒドロキシル基を形成させることであった。
【０１１６】
ステップＩで得られた全ＲＮＡ（約１２ｎｇ）を取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、加熱処理にかけ（ＲＩＮ＞８の場合、加熱処理は、９４℃、１０分のパラメーターを有した。５≦ＲＩＮ≦８の場合、加熱処理は、９０℃、５分のパラメーターを有した。３≦ＲＩＮ≦５の場合、加熱処理は、８０℃、５分のパラメーターを有した。ＲＩＮ＜３の場合、加熱処理は、６５℃、５分のパラメーターを有した）、次いで氷上に置き、次いで表６に記載の試薬を添加し、次いで３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
【０１１７】
２．ｒＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション及びアダプターのライゲーション。
【０１１８】
ステップ１の完了後、システムに１μＬのＤｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  Ｍｉｘ及び０．５μＬの２０μＭ  アダプターを添加し、反応させ（反応条件：９５℃で５分、次いで０．１℃／秒の速さで２２℃に冷却、次いで２２℃で５分間維持）、次いで氷上に置き、次いで表２に記載の試薬を添加し、２５℃で１時間反応させ、次いで２μＬの１Ｕ／μＬ  アルカリホスファターゼ及び１３μＬのＴｒｉｓ−Ｃｌ緩衝液（ｐＨ７．５、１０ｍＭ）を添加し、次いで３７℃で１０分間反応させた。
【０１１９】
アダプター（配列表の配列番号１）：
5'-GAACGACAUGGCUACGAUCCGACUUNNNN-3'
アダプターでは、ＮはＡ、Ｇ、Ｃ又はＵを表す。アダプターの５’末端と３’末端の両方がヒドロキシル基を有する。
【０１２０】
Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  Ｍｉｘはプローブ混合溶液であった（プローブ混合物は、配列表の配列番号５〜配列番号１９９に連続して示されるように、１９５種類のプローブから構成された；Ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  Ｐｒｏｂｅ  Ｓｅｔ  Ｍｉｘでは、各プローブの濃度は０．５μＭであった）。プライマー混合物の各プローブは、除去されると予想されるＲＮＡ（ｒＲＮＡ）と逆相補性であり、アニールしてＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッドを形成した。
【０１２１】
ステップ３〜５は、実施例１のステップＩＩのステップ３〜５と同じであった。
【０１２２】
ＩＩＩ．ハイスループットシークエンシング
複数試料のライブラリー溶液を混合し、次いでハイスループットシークエンシングにかけた。
【０１２３】
使用した装置は、ＢＧＩ−ＳＥＱ５００ＲＳであった。
【０１２４】
パラメーター設定は：ＳＥ５０；４プール１；他の設定はＢＧＩ−ＳＥＱ５００ＲＳ標準プロトコールであった。
【０１２５】
低品質のリードは除去された；リードの５’末端の４塩基及び３’末端の複数の「Ａ」（最初の塩基がＡではなくなるまで）は除去された；少なくとも１５個の連続する「Ａ」を含有するリードは除去された；１７塩基を超えないリードは除去された；ｒＲＮＡアライメント及び除去が実施された；
マイクロＲＮＡ及びｐｉＲＮＡアライメントを実施し、総リード数と比較した各遺伝子のリード数を計算した。
【０１２６】
ＲＮＡ−ＲｅｆＳｅｑアライメントを実施し、短鎖非コードＲＮＡ、ｍＲＮＡ及びＬｏｎｇ  Ｎｏｎｃｏｒｄｉｎｇのアライメントを別々に実施し、ＲＰＫＭを計算した。
【０１２７】
実施例５：試料として全ＲＮＡを使用して、ＲＮＡライブラリーを構築する
Ｉ．ＲＮＡ抽出
全ＲＮＡを、組織又は細胞から抽出した。
【０１２８】
ＩＩ．ＲＮＡライブラリー構築
１．ポリＡ付加。
ステップＩで得た全ＲＮＡ（約１２ｎｇ）を取り、１４．５μＬの容積に達するまでＤＥＰＣ  Ｈ２Ｏを添加し、次いで２μＬの１０×ＲＮａｓｅＨ緩衝液を添加し、次いで氷上に置き、次いで表１に記載の試薬を添加し、３７℃で３０分間反応させ、次いで氷上に置き、次いで２μＬの４０ｍＭ  ＥＤＴＡ水溶液を添加して反応を停止させた。
【０１２９】
２．ｒＲＮＡプローブとのハイブリダイゼーション及びアダプターのライゲーション
実施例４のステップＩＩのステップ２と同じ。
【０１３０】
ステップ３〜５は、実施例１のステップＩＩのステップ３〜５と同じであった。
【０１３１】
ＩＩＩ．ハイスループットシークエンシング
実施例４のステップＩＩＩと同じ
実施例６：効果の比較
試料は、胎盤組織試料及びヒト不死化白血球（ＥＢウイルス法による）試料であった。
【０１３２】
ＲＮＡライブラリーは、実施例４に記載の方法に従って構築し、胎盤組織試料のゲノムアライメント率は６６．３２％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は０．３２％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は２７．７６％であった。
【０１３３】
ＲＮＡライブラリーは、実施例５に記載の方法に従って構築し、胎盤組織試料のゲノムアライメント率は７９．１８％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は２１．５４％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は９．５０％であった。
【０１３４】
ＲＮＡライブラリーは、実施例４に記載の方法に従って構築し、ヒト不死化白血球試料のゲノムアライメント率は７３．０７％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は０．２２％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は２８．５２％であった。
【０１３５】
ＲＮＡライブラリーは、実施例５に記載の方法に従って構築し、ヒト不死化白血球試料のゲノムアライメント率は８６．８５％であり、マイクロＲＮＡアライメント率は２．４１％であり、ｍＲＮＡ＋ｌｎｃＲＮＡアライメント率は２０．４０％であった。
【産業上の利用可能性】
【０１３６】
本発明は、以下の利点を有する：ライブラリー構築が高効率と高感度である；プロセスは簡略化され、大幅に加速される；非常に低コストであり、１つの反応材料は３０元以下である；操作が簡単である；カスタマイズが容易であり、モジュールは異なるニーズに合うように調整され得る；高品質のシークエンシングをもたらす；長鎖ＲＮＡ断片及び短鎖ＲＮＡ断片を同時に検出することができる。
【図１】
2021536255.tif 000008
【配列表】
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【国際調査報告】
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