(57)【要約】  本発明は、１７〜３０ヌクレオチドを含む第１オリゴヌクレオチド鎖及び１７〜３０ヌクレオチドを含む第２オリゴヌクレオチド鎖で構成され、前記２本のオリゴヌクレオチド鎖のうち長さが少なくとも１５ヌクレオチドの配列同士が相補し、末端が対合しないヌクレオチドが突出を形成し、前記第１オリゴヌクレオチド鎖又は第２オリゴヌクレオチド鎖は、標的遺伝子プロモーターにおける長さが１６〜３５ヌクレオチドである連続的フラグメントのいずれと７５％以上の相同性又は相補性を有し、前記第２オリゴヌクレオチド鎖に、１〜４ヌクレオチドからなる３’末端突出が存在する小分子活性化ＲＮＡを提供する。本発明の小分子活性化ＲＮＡによれば、標的遺伝子の発現を効果よく促進するとともにオフターゲット効果を低下することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
１７〜３０ヌクレオチドを含む第１オリゴヌクレオチド鎖及び１７〜３０ヌクレオチドを含む第２オリゴヌクレオチド鎖で構成され、
前記第１オリゴヌクレオチド鎖のうち長さが少なくとも１５ヌクレオチドの配列が前記第２オリゴヌクレオチド鎖に対して相補的であり、
前記第１オリゴヌクレオチド鎖又は第２オリゴヌクレオチド鎖は、標的遺伝子プロモーターにおける長さが１５〜３０ヌクレオチドである連続的フラグメントのいずれと７５％以上の相同性又は相補性を有し、
前記第１オリゴヌクレオチド鎖及び第２オリゴヌクレオチド鎖で形成される二本鎖体の一方の末端が平滑末端であり、他方の末端が第１オリゴヌクレオチド鎖又は第２オリゴヌクレオチド鎖の末端に１〜４ヌクレオチドの突出を有する、小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項２】
前記第１オリゴヌクレオチド鎖及び第２オリゴヌクレオチド鎖で形成された二本鎖体の一方の末端は平滑末端であり、他方の末端が前記第１オリゴヌクレオチド鎖又は前記第２オリゴヌクレオチド鎖の末端に２〜３ヌクレオチドの突出を有する、請求項１に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項３】
前記ヌクレオチドの突出が、チミン、ウラシル又は天然ヌクレオチドから選択される、請求項１又は２に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項４】
前記突出が、ｄＴｄＴｄＴ、ｄＴｄＴ、ＵＵＵ、ＵＵ又は連続する２個又は３個の天然ヌクレオチドである、請求項３に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項５】
前記第１オリゴヌクレオチド鎖又は第２オリゴヌクレオチド鎖の５’末端が、二本鎖体の平滑末端に存在し、
前記第１オリゴヌクレオチド鎖又は第２オリゴヌクレオチド鎖の５’末端から１番目〜３番目のヌクレオチドの１〜３ヌクレオチドがあり、他方の鎖における対応する位置にあるヌクレオチドとミスペアリングされている、請求項１〜４のいずれか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項６】
前記ミスペアリングした塩基がシトシンである、請求項５に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項７】
前記第１オリゴヌクレオチド鎖及び第２オリゴヌクレオチド鎖で形成された、突出を含まない二本鎖体の長さが、１７〜２４ヌクレオチドである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項８】
前記第１オリゴヌクレオチド鎖及び第２オリゴヌクレオチド鎖で形成された、突出を含まない二本鎖体の長さが、１８〜２０ヌクレオチドであることを特徴とする請求項７に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項９】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡの、細胞における標的遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせるための製剤の製造における使用。
【請求項１０】
前記小分子活性化ＲＮＡは前記細胞に直接導入される、請求項９に記載の使用。
【請求項１１】
前記細胞が哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒト細胞である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記細胞が人体に存在する、請求項１１に記載の使用。
【請求項１３】
前記人体が、標的遺伝子の発現の欠陥及び/又は不足による疾病を患っており、
前記小分子活性化分子が、疾病を治療できるように有効量で投与される、請求項１２に記載の使用。
【請求項１４】
前記標的遺伝子が、ヒトｐ２１、ＫＬＦ４、ＮＫＸ３-１、ＶＥＧＦＡからなる群から選択される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項１５】
前記小分子活性化ＲＮＡは、ｐ２１遺伝子の発現を少なくとも１０％活性化又はアップレギュレーションさせる、請求項１４に記載の小分子活性化ＲＮＡ。
【請求項１６】
請求項１４又は１５に記載の小分子活性化ＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含む組成物。
【請求項１７】
前記薬学的に許容される担体が、リポソーム、高分子ポリマー又はポリペプチドである、請求項１６に記載の組成物。
【請求項１８】
請求項１４又は１５に記載の小分子活性化ＲＮＡ又は請求項１６又は１７に記載の組成物の、標的遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる製剤の製造における使用、好ましくは腫瘍又は良性増殖性病変を治療するための製剤の製造における使用、より好ましくは、前記腫瘍が膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、結腸直腸癌である、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子生物学の分野に関し、具体的には、標的遺伝子プロモーター配列を利用する二本鎖小分子ＲＮＡによる遺伝子発現のアップレギュレートに関する。
【背景技術】
【０００２】
二本鎖小核酸分子は、化学合成されたオリゴリボヌクレオチド（例えば、小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ））と天然に存在するオリゴリボヌクレオチド（例えば、マイクロリボヌクレオチド（ｍｉＲＮＡ））とを含み、タンパク質コード遺伝子の調節配列（例えば、プロモーター配列）を配列特異的にターゲッティングすることにより、転写及びエピジェネリックレベルで遺伝子の発現レベルをアップレギュレート可能であることが証明され、このような現象は、ＲＮＡの活性化と言われている（ＲＮＡａ）(Li,Okino et al. (2006) Proc Natl Acad Sci USA 103:17337-17342; Janowski,Younger et al.(2007) Nat Chem Biol 3:166-173; Place,Li et al.(2008) Proc Natl Acad Sci USA 105:1608-1613; Huang,Place et al.(2012) Nucleic Acids Res 40:1695-1707; Li (2017) Adv Exp Med Biol 983:1-20)。研究によれば、ＲＮＡの活性化は、カエノラブディティス・エレガンスからヒトへの進化的保存の内因性分子メカニズムである(Huang,Qin et al.(2010) PloS One 5:e8848; Seth,Shirayama et al.(2013) Dev Cell 27:656-663;Turner,Jiao et al.(2014) Cell Cycle 13:772-781)。
【０００３】
どのようにヒト細胞の内因性遺伝子又はタンパク質の発現を安全かつ選択的に増強するかは、依然として遺伝子治療の分野の大きな課題である。従来のウィルス型遺伝子治療システムは、その固有の欠陥を有しており、宿主ゲノムを変化させたり、免疫反応を起こせたりするなどの副作用がある。ＲＮＡ活性化は、ゲノムを変化せずに内因性遺伝子の発現を活性化させることができるという利点を有し、一種の代表的な内因性遺伝子の発現を活性化させる新しい策略であり、疾病治療において巨大な応用価値を有する。
【０００４】
ｐ２１WAF1/CIP1（ＣＤＫＮ１Ａとも言われ、以下、ｐ２１という）遺伝子は、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤であり、重要な腫瘍抑制遺伝子である(Harper,Adami et al.(1993)Cell 75:805-816;Fang,Igarashi et al. (1999) Oncogene 18:2789-2797)。研究によれば、異所性ベクターによるp２１の過剰発現又は内因性ｐ２１の活性化による転写は、腫瘍細胞や体内腫瘍の成長を効率よく抑制できる(Harper,Adami et al. (1993) Cell 75:805-816; Eastham,Hall et al. (1995) Cancer Res 55:5151-5155; Wu,Bellas et al. (1998) J Exp Med 187:1671-1679; Harrington,Spitzweg et al. (2001) J Urol 166:1220-1233)。そのため、ｐ２１遺伝子を標的として活性化させる方法は、例えば癌などの多くの疾病の治療に幅広く応用される可能性がある。
【発明の概要】
【０００５】
本発明は、細胞内に遺伝子発現を標的として増加させることができるオリゴヌクレオチド分子及びその方法を提供する。この方法は、標的遺伝子プロモーター配列を標的とするオリゴヌクレオチド分子を細胞に導入することによって、目標遺伝子の発現を効果的に増加させ、効果的な生物学的作用を生成することができるものである。本発明に記載のオリゴヌクレオチドは、構造的に最適化された二本鎖リボヌクレオチド分子であり、このような分子は、小分子活性化ＲＮＡ（ｓａＲＮＡ）とも呼ばれる。
【０００６】
本発明は、１７〜３０ヌクレオチドを含む第１オリゴヌクレオチド鎖及び１７〜３０ヌクレオチドを含む第２オリゴヌクレオチド鎖で構成され、前記第１オリゴヌクレオチド鎖のうち長さが少なくとも１５ヌクレオチドの配列と前記第２オリゴヌクレオチド鎖とは相補的塩基対を形成し、前記第１オリゴヌクレオチド鎖又は第２オリゴヌクレオチド鎖は、標的遺伝子プロモーターにおける長さが１５〜３０ヌクレオチドである連続的フラグメントのいずれと７５％以上、例えば８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上、１００％の配列相同性又は相補性を有し、第１オリゴヌクレオチド鎖及び第２オリゴヌクレオチド鎖で形成される二本鎖体は、その一端が平滑末端である（すなわち、突出構造ではない）とともに、他端が第１オリゴヌクレオチド鎖又は第２オリゴヌクレオチド鎖の末端に１〜４ヌクレオチドの突出、例えば１ヌクレオチド、２ヌクレオチド、３ヌクレオチド、４ヌクレオチドの突出を形成可能である小分子活性化ＲＮＡを提供する。１つの具体的な実施例では、上記小分子活性化ＲＮＡにおける第１オリゴヌクレオチド鎖及び第２オリゴヌクレオチド鎖で形成された二本鎖体は、その一端が平滑末端であるとともに、他端が第１オリゴヌクレオチド鎖又は第２オリゴヌクレオチド鎖の末端に２〜３ヌクレオチドの突出を形成可能である。
【０００７】
上記小分子活性化ＲＮＡは、その突出のヌクレオチドが、Ｔ（チミン）、Ｕ（ウラシル）又は天然ヌクレオチド突出から選択され、例えば、突出がｄＴｄＴｄＴ、ｄＴｄＴ、ＵＵＵ、ＵＵ又は連続する２又は３個の天然ヌクレオチド（例えば、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ）であってもよい。本発明に記載の天然ヌクレオチド突出とは、第１オリゴヌクレオチド鎖又は第２オリゴヌクレオチド鎖の末端に突出しているヌクレオチドが、それと対応する標的配列のヌクレオチドと同一又は相補的なものであることを意味する。
【０００８】
上記小分子活性化ＲＮＡでは、前記第１オリゴヌクレオチド鎖又は第２オリゴヌクレオチド鎖の５’末端が、二本鎖体の平滑末端に存在し、前記第１オリゴヌクレオチド鎖又は第２オリゴヌクレオチド鎖のうちの一方の鎖における５’末端からの１番目〜３番目のヌクレオチドと、他方の鎖における対応する位置にあるヌクレオチドとは、１〜３個の塩基がミスマッチした。好ましくは、ミスマッチは、シトシンミスマッチである。本明細書に記載のシトシンミスマッチは、少なくとも２種類の方式があり、そのうちの１種の方式として、１本の鎖におけるヌクレオチド自体がシトシンヌクレオチド（Ｃ）であるが、２番目の鎖を合成する際には、シトシンとＷａｔｓｏｎ-Ｃｒｉｃｋによって対合するグアニンヌクレオチド（Ｇ）を、例えばアデニンヌクレオチド（Ａ）、チミンヌクレオチド（Ｔ）又はウラシルヌクレオチド（Ｕ）などの非グアニンヌクレオチドに置き換えることである。他種の方式として、１本の鎖におけるヌクレオチド自体が例えばアデニンヌクレオチド（Ａ）、ウラシルヌクレオチド（Ｕ）又はチミンヌクレオチド（Ｔ）などの非グアニンヌクレオチドであるが、他本の鎖においてもともとＡ、Ｕ又はＴとＷａｔｓｏｎ-Ｃｒｉｃｋによって対合するヌクレオチドをチミンヌクレオチド（Ｃ）に置き換えることである。
【０００９】
本発明が提供する小分子活性化ＲＮＡでは、第１オリゴヌクレオチド鎖及び第２オリゴヌクレオチド鎖で形成された二本鎖体のうち、突出を含まない長さが１７〜２４ヌクレオチド、例えば１７ヌクレオチド、１８ヌクレオチド、１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチドである。好ましくは、第１オリゴヌクレオチド鎖及び第２オリゴヌクレオチド鎖で形成された二本鎖体のうち、突出を含まない長さが１８〜２０ヌクレオチドである。
【００１０】
本発明は、上記の小分子活性化ＲＮＡの、細胞における標的遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせるための製剤、例えば薬物の製造における使用をさらに提供する。前記小分子活性化ＲＮＡは、前記細胞に直接導入されてもよい。前記細胞が哺乳動物の細胞であり、好ましくはヒト細胞である。前記細胞が人体に存在してもよいし、例えば分離した細胞株、細胞系統又は初代細胞などの生体外のものであってもよい。
また、前記人体は、標的遺伝子の発現の欠陥及び/又は不足による疾病を患っており、前記小分子活性化核酸分子が、疾病を治療できるように有効量で投与される。
【００１１】
ある１種の場合では、前記小分子活性化ＲＮＡの標的遺伝子は、ヒトｐ２１遺伝子である。ほかの場合では、遺伝子発現の欠陥又は不足によって疾病を起こす他の原因遺伝子、例えばＫＬＦ４遺伝子、ＮＫＸ３-１遺伝子、ＶＥＧＦＡ遺伝子であってもよい。
【００１２】
標的遺伝子がｐ２１遺伝子又はほかの遺伝子であると、前記小分子活性化ＲＮＡは、標的遺伝子の発現を少なくとも１０％、例えば１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％以上、６０％以上、７０％以上、８０％以上、９０％以上、１００％以上活性化又はアップレギュレーションさせることができる。
【００１３】
本発明は、上記の小分子活性化ＲＮＡ及び薬学的に許容される担体を含む組成物をさらに提供する。そのうち、薬学的に許容される担体が、リポソーム、高分子ポリマー又はポリペプチドである。
【００１４】
本発明は、上記の小分子活性化ＲＮＡ又は組成物の、標的遺伝子の発現を活性化又はアップレギュレーションさせる製剤の製造における使用をさらに提供する。また、好ましくは、抗腫瘍又は良性増殖性病変の製剤の製造における使用、より好ましくは、前記腫瘍が膀胱癌、前立腺癌、肝臓癌、結腸直腸癌である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】図１は、ｐ２１遺伝子プロモーター配列の、転写開始部位（ＴＳＳ）上流-１０００ｂｐからＴＳＳ下流３ｂｐまでを示すものである。ＴＳＳは、湾曲した矢印で示される。
【図２】図２は、ｐ２１遺伝子プロモーターにおける小分子活性化ＲＮＡのホットスポット領域の選別を示すものである。図１に示すｐ２１プロモーター配列に対して、４３９個の小分子活性化ＲＮＡを設計して化学合成して、ＰＣ３ヒト前立腺癌細胞に１個ずつトランスフェクションした。７２時間後、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０方法でｐ２１遺伝子ｍＲＮＡレベルを分析した。そのうち、（Ａ）は、４３９個のｓａＲＮＡ（X軸）のそれぞれによる対照処理に対するｐ２１  ｍＲＮＡレベルの倍数変化（Ｙ軸）を示すものである。X軸における小分子活性化ＲＮＡは、ｐ２１遺伝子の転写開始部位（ＴＳＳ）に対する位置（最上流のＲＡＧ-８９８から最下流のＲＡＧ１-１７７）に従ってソートする。図中に、８個のホットスポット（ｈｏｔｓｐｏｔ）領域（薄い灰色の長方形枠）を示した。（Ｂ）は、（Ａ）のデータを小分子活性化ＲＮＡの誘導によるｐ２１  ｍＲＮＡの発現の倍数変化の大きさに従って低いものから高いものまでソートするものである。（Ａ）及び（B）における破線は、２倍誘導の位置を示す。
【図３】図３は、ホットスポット領域１〜８におけるｐ２１遺伝子に対する小分子活性化ＲＮＡの活性化作用を示すものである。
【図４】図４は、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０の実験結果を検証するためにＲＴ-ｑＰＣＲ法によってｐ２１遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析することを示すものである。そのうち、（Ａ）は、４３９個の小分子活性化ＲＮＡをそれらのｐ２１  ｍＲＮＡ発現の誘導活性にしたがって４つの群（ｂｉｎ）に分け、毎群から５個の小分子活性化ＲＮＡをランダムに選択して、それぞれ１０ ｎＭの濃度でＰＣ３細胞にトランスフェクションした。７２時間後、ｍＲＮＡを抽出して逆転写した後、ＲＴ-ｑＰＣＲ法を用いてｐ２１遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析したことを示すものである。（Ｂ）は、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０（X軸）及びＲT-ｑＰＣＲ（Ｙ軸）方法によって、小分子活性化ＲＮＡで誘導されたｐ２１遺伝子のｍＲＮＡ相対レベルの相関性を検出することを示すものである。
【図５】図５は、小分子活性化ＲＮＡによるｐ２１  ｍＲＮＡ発現の誘導作用及びＫＵ-７-Ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞の増殖の抑制作用を示すものである。図示された３個の小分子活性化ＲＮＡは、それぞれ１０ｎＭでＫＵ-７-Ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞を７２時間トランスフェクションした。そのうち、（Ａ）は、ＲT-ｑＰＣＲによるｐ２１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの分析を示すものである。（Ｂ）は、ＣＣＫ-８方法による細胞活力の評価を示すものである。ｓａＲＮＡ処理群の細胞活力は、対照処理群（Ｍｏｃｋ）の細胞活力に対する百分率で示される。（Ｃ）は、トランスフェクション終了時の代表的な細胞画像（１００×）を示すものである。
【図６】図６は、小分子活性化ＲＮＡによるｐ２１  ｍＲＮＡの発現の誘導作用及びＨＣＴ１１６細胞の増殖の抑制作用を示すものである。図示された３個の小分子活性化ＲＮＡは、それぞれ１０ｎＭでＨＣＴ１１６細胞を７２時間トランスフェクションした。（Ａ）は、ＲＴ-ｑＰＣＲによるｐ２１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの分析を示すものである。（Ｂ）は、ＣＣＫ-８方法による細胞活力の評価を示し、ｓａＲＮＡ処理群の細胞活力は、対照処理群（Ｍｏｃｋ）の細胞活力に対する百分率で示される。（Ｃ）は、トランスフェクション終了時の代表的な細胞画像（１００×）を示すものである。
【図７】図７は、小分子活性化ＲＮＡによるｐ２１  ｍＲＮＡの発現の誘導作用及びＨｅｐＧ２細胞の増殖の抑制作用を示すものである。図示された３個の小分子活性化ＲＮＡは、それぞれ１０  ｎＭでＨｅｐＧ２細胞を７２時間トランスフェクションした。（Ａ）は、ＲＴ-ｑＰＣＲによるｐ２１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの分析を示すものである。（Ｂ）は、ＣＣＫ-８方法による細胞活力の評価を示し、ｓａＲＮＡ処理群の細胞活力は、対照処理群（Ｍｏｃｋ）の細胞活力に対する百分率で示される。（Ｃ）は、トランスフェクション終了時の代表的な細胞画像（１００×）を示すものである。
【図８】図８は、ｐ２１プロモーター領域及びそのうちの小分子活性化ＲＮＡの標的とする部分の配列を示す図である。転写開始部位（ＴＳＳ）-３３２〜-２９２に対するｐ２１プロモーターの４０ｂｐ領域を標的配列として、この領域を標的とする一連の小分子活性化ＲＮＡを設計し、図中には標的配列に対応する相同性の小分子活性化ＲＮＡ配列を示した。このプロモーター領域は、単一ヌクレオチドがシフトして形成された１７個のオーバーラップした標的部位を含み、それらの間が１つのポリヌクレオチド繰り返し配列（下線付き）のみによって仕切られている。
【図９】図９は、ｐ２１プロモーターを標的とする小分子活性化ＲＮＡの遺伝子誘導活性を示す図である。前記各小分子活性化ＲＮＡは、それぞれ１０ｎＭでＫＵ-７-Ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞を７２時間トランスフェクションした。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルをブランク対照とする。非特異的二本鎖体（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクションサンプルを陰性対照とする。ＲＴ-ｑＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨの発現レベルを内部参照として、ｐ２１の相対発現レベル（平均値±標準偏差）を決定した。統計学的有意差は、一元配置分散分析及びＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較検証により決定される（ブランク対照に対して、***Ｐ＜０．００１となる）。
【図１０】図１０は、Ｒａｇ１-０〜Ｒａｇ１-２０の二本鎖体の小分子活性化ＲＮＡ配列及びシーケンスアラインメントの二本鎖構造を示す図である。ミスマッチ塩基は、コロンで標識される。粗体は、Ｒａｇ１-０を基とするヌクレオチドの変化を表す。
【図１１】図１１は、Ｒａｇ１変異体（Ｒａｇ１-０〜Ｒａｇ１-２０）がヒト癌細胞株においてｐ２１の発現を誘導する活性を示すものである。（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれＫＵ-７-Ｌｕｃ２-ＧＦＰ、ＰＣ３及びＢｅｌ-７４０２細胞をそれぞれ前記各小分子活性化ＲＮＡによって１０ｎＭで７２時間トランスフェクションしたことを示すものである。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルをブランク対照とする。非特異的ｓａＲＮＡ（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクションサンプルを陰性対照とする。ＲＴ-ｑＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨの発現レベルを内部参照として、ｐ２１の相対発現レベル（平均値±標準偏差）を決定した。統計学的有意差は、一元配置分散分析及びＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較検証により決定される（ブランク対照に対して、***Ｐ＜０．００１となる）。
【図１２】図１２は、小分子活性化ＲＮＡ（Ｒａｇ１-０〜Ｒａｇ１-２０）によるヒト癌細胞株の増殖の抑制作用を示す図である。（Ａ）〜（Ｃ）はそれぞれＫＵ-７-Ｌｕｃ２-ＧＦＰ、ＰＣ３、Ｂｅｌ-７４０２細胞をそれぞれ前記各小分子活性化ＲＮＡによって１０  ｎＭで７２時間トランスフェクションしたことを示す。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルをブランク対照とする。非特異的二本鎖体（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクションサンプルを陰性対照とする。ＣＣＫ-８方法を用いて細胞活力を定量的に検出する。統計学的有意差は、一元配置分散分析とＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較検証により決定される（ブランク対照に対して、*Ｐ＜０．５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１となる）。
【図１３】図１３は、Ｒａｇ１-２１〜Ｒａｇ１-４４の二本鎖体のシーケンスアラインメントを示す図である。ミスマッチ塩基は、コロンで標識され、粗体は、ヌクレオチド又は構造の変化を表す。
【図１４】図１４は、小分子活性化ＲＮＡ（Ｒａｇ１-２１〜Ｒａｇ１-２８）がヒト癌細胞株においてｐ２１発現を誘導する活性を示す図である。（Ａ）〜（Ｅ）はそれぞれＫｕ-７-Ｌｕｃ２-ＧＦＰ、ＵＭ-ＵＣ-３、T２４、J８２、Ｂｅｌ-７４０２細胞をそれぞれ前記各二本鎖体によって１０ｎＭで７２時間トランスフェクションしたことを示すものである。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルをブランク対照とする。非特異的二本鎖体（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクションサンプルを陰性対照とする。ＲＴ-ｑＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨの発現レベルを内部参照として、ｐ２１の相対発現レベル（平均値±標準偏差）を決定した。統計学的有意差は、一元配置分散分析とＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較検証により決定される（ブランク対照に対して、*Ｐ＜０．５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１となる）。
【図１５】図１５は、小分子活性化ＲＮＡ（Ｒａｇ１-２１〜Ｒａｇ１-２８）によるヒト癌細胞株の増殖の抑制作用を示す図である。（Ａ）〜（Ｅ）はそれぞれＫＵ-７-Ｌｕｃ２-ＧＦＰ、ＵＭ-ＵＣ-３、T２４、J８２、及びＢｅｌ-７４０２細胞をそれぞれ前記各小分子活性化ＲＮＡによって１０ｎＭで７２時間トランスフェクションしたことを示すものである。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルをブランク対照とする。非特異的二本鎖体（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクションサンプルを陰性対照とする。ＣＣＫ-８方法を用いて細胞活力を定量的に検出する。統計学的有意差は、一元配置分散分析とＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較検証により決定される（ブランク対照に対して、*Ｐ＜０．５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１となる）。
【図１６】図１６は、小分子活性化ＲＮＡ（Ｒａｇ１-２９〜Ｒａｇ１-４４）がヒト癌細胞株においてｐ２１発現を誘導する活性を示す図である。（Ａ）〜（Ｅ）はそれぞれＫＵ-７-Ｌｕｃ２-ＧＦＰ、ＵＭ-ＵＣ-３、T２４、J８２及びＰＣ３細胞をそれぞれ前記各二本鎖体によって１０ｎＭで７２時間トランスフェクションしたことを示すものである。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルをブランク対照とする。非特異的二本鎖体（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクションサンプルを陰性対照とする。ＲＴ-ｑＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨの発現レベルを内部参照として、ｐ２１の相対発現レベル（平均値±標準偏差）を決定した。統計学的有意差は、一元配置分散分析とＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較検証により決定される（ブランク対照に対して、*Ｐ＜０．５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１となる）。
【図１７】図１７は、小分子活性化ＲＮＡ（Ｒａｇ１-２９〜Ｒａｇ１-４４）によるヒト癌細胞株の増殖の抑制作用を示す図である。（Ａ）〜（Ｅ）はそれぞれＫＵ-７-Ｌｕｃ２-ＧＦＰ、ＵＭ-ＵＣ-３、T２４、J８２及びＰＣ３細胞をそれぞれ前記各二本鎖体によって１０ｎＭで７２時間トランスフェクションしたことを示すものである。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルをブランク対照とする。非特異的二本鎖体（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクションサンプルを陰性対照とする。ＣＣＫ-８方法を用いて細胞活力を定量的に検出する。統計学的有意差は、一元配置分散分析とＴｕｋｅｙ’ｓ多重比較検証により決定される（ブランク対照に対して、*Ｐ＜０．５；**Ｐ＜０．０１；***Ｐ＜０．００１となる）。
【図１８】図１８は、ｐ２１遺伝子ｓａＲＮＡ二本鎖体のシーケンスアラインメントを示す図である。ミスマッチ塩基は、コロンで標識され、粗体は、ヌクレオチド又は構造の変化を表す。
【図１９】図１９は、ｐ２１プロモーターを標的とする小分子活性化ＲＮＡの遺伝子誘導活性を示す図である。前記各小分子活性化ＲＮＡは、それぞれ１０ｎＭでＫＵ-７-Ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞を７２時間トランスフェクションした。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルをブランク対照（Ｍｏｃｋ）とし、非特異的二本鎖体（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクションサンプルを陰性対照とする。ＲＴ-ｑＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨの発現レベルを内部参照として、ｐ２１遺伝子のｍＲＮＡの相対発現レベルを決定した（２回の実験の平均値±標準偏差）。
【図２０】図２０は、ＫＬＦ４、ＮＫＸ３-１及びＶＥＧＦＡ遺伝子ｓａＲＮＡ二本鎖体のシーケンスアラインメントを示す図である。ミスマッチ塩基は、コロンで標識され、粗体は、ヌクレオチド又は構造の変化を表す。
【図２１】図２１は、ＫＬＦ４プロモーターを標的とする小分子活性化ＲＮＡの遺伝子誘導活性を示す図である。前記各小分子活性化ＲＮＡは、それぞれＰＣ３（Ａ）、ＫＵ-７-Ｌｕｃ２-ＧＦＰ（Ｂ）及びＢｅｌ-７４０２（Ｃ）細胞を１０ｎＭで７２時間トランスフェクションした。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルをブランク対照（Ｍｏｃｋ）とし、非特異的二本鎖体（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクションサンプルを陰性対照とする。ＲＴ-ｑＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨの発現レベルを内部参照として、ＫＬＦ４  ｍＲＮＡの相対発現レベルを決定した（少なくとも２回の実験の平均値±標準偏差）。
【図２２】図２２は、ＮＫＸ３-１プロモーターを標的とする小分子活性化ＲＮＡの遺伝子誘導活性を示す図である。前記各小分子活性化ＲＮＡは、それぞれＰＣ３（Ａ）とＢｅｌ-７４０２（Ｂ）細胞を１０ｎＭで７２時間トランスフェクションした。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルをブランク対照（Ｍｏｃｋ）とし、非特異的二本鎖体（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクションサンプルを陰性対照とする。ＲＴ-ｑＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨの発現レベルを内部参照として、ＮＫＸ３-１  ｍＲＮＡの相対発現レベルを決定した（少なくとも２回の実験の平均値±標準偏差）。
【図２３】図２３は、ＶＥＧＦＡプロモーターを標的とする小分子活性化ＲＮＡの遺伝子誘導活性を示す図である。前記各小分子活性化ＲＮＡは、それぞれ図示した濃度でＨｅＬａ（Ａ）、ＣＯＳ-１（Ｂ）及びＡＲＰＥ-１９（Ｃ）細胞を７２時間トランスフェクションした。オリゴヌクレオチドを含まないトランスフェクションサンプルをブランク対照（Ｍｏｃｋ）とし、非特異的二本鎖体（ｄｓＣｏｎ）トランスフェクションサンプルを陰性対照とする。ＲＴ-ｑＰＣＲにより、ＧＡＰＤＨの発現レベルを内部参照として、ＶＥＧＦＡ  ｍＲＮＡの相対発現レベルを決定した（少なくとも２回の実験の平均値±標準偏差）。
【図２４】図２４は、ｐ２１  ｓａＲＮＡ  Ｒａｇ１-４０による腫瘍成長の抑制を示す図である。図示した小分子活性化ＲＮＡは、１ｍｇ/ｋｇの用量で腫瘍内注射され、投与期間の移植癌の体積変化を記録した。矢印は、投与時点を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
以下、具体的な説明によって本発明をさらに説明する。
【００１７】
なお、特に断らない限り、本明細書において用いられる全ての技術及び科学用語は、本発明が属する技術分野における一般的な技術者が通常理解できる意味と同じ意味を有する。
本願において、単数形となる「１個（ａ）」、「この（this）」は、特に明記しない限り、その複数形も含む。
定義
【００１８】
本明細書で使用される「相補」という用語は、２本のオリゴヌクレオチド鎖が互いに塩基対を形成する能力を意味する。塩基対は、通常、逆方向に平行となるオリゴヌクレオチド鎖におけるヌクレオチドユニット同士の水素結合により形成される。相補的オリゴヌクレオチド鎖は、Ｗａｔｓｏｎ-Ｃｒｉｃｋ方式で塩基対合してもよく（例えば、Ａ-Ｔ、Ａ-Ｕ、Ｃ-Ｇ）、又は、二本鎖体の形成を許可するいずれの方式（例えば、Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型又は逆Ｈｏｏｇｓｔｅｅｎ型塩基対合）で塩基対合してもよい。「１００％対合」とは、１００％の相補性を有し、すなわち、二本鎖のヌクレオチドユニットが全て水素結合で互いに接合していることを意味する。
【００１９】
完全相補性又は１００％相補性は、二本鎖オリゴヌクレオチド分子の二本鎖領域における第１オリゴヌクレオチド鎖からの各ヌクレオチドユニットが第２オリゴヌクレオチド鎖と「ミスマッチ」無しに水素結合を形成できることを意味する。不完全相補とは、二本鎖のヌクレオチドユニットが全て水素結合で互いに接合することができないことを意味する。例えば、二本鎖領域の長さが２０ヌクレオチドである２本のオリゴヌクレオチド鎖に対しては、各鎖における２つの塩基対のみが互いに水素結合で接合することが可能であると、オリゴヌクレオチド鎖は１０％の相補性を有する。同じ実施例では、各鎖における１８個の塩基対が互いに水素結合で接合することが可能であると、オリゴヌクレオチド鎖は９０％の相補性を有する。基本的相補性とは、約７９％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％以上の相補性を意味する。
【００２０】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語とは、ヌクレオチドのポリマーをいい、ＤＮＡ、ＲＮＡ又はＤＮＡ/ＲＮＡハイブリッドの一本鎖又は二本鎖分子、規則的や不規則的に交互するデオキシリボヌクレオチド部分及びリボヌクレオチド部分を含むオリゴヌクレオチド鎖、ならびにこれらの種類のオリゴヌクレオチドの修飾及び天然又は非天然に存在する骨格を含むが、これらに限定されるものではない。本発明に記載の標的遺伝子転写を活性化させるためのオリゴヌクレオチドは、小分子活性化ＲＮＡである。
【００２１】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド」という用語は、２個以上の修飾され又は修飾されていないリボヌクレオチド及び/又はその類似体を含むオリゴヌクレオチドを意味する。
【００２２】
本明細書で使用される「オリゴヌクレオチド鎖」及び「オリゴヌクレオチド配列」という用語は、互いに置き換えることが可能であり、３０個以下の塩基を有する短鎖のヌクレオチドの総称である（デオキシリボ核酸ＤＮＡ又はリボ核酸ＲＮＡを含む）。本発明において、オリゴヌクレオチド鎖の長さは、１７〜３０ヌクレオチドのいずれかの長さであってもよい。
【００２３】
本明細書で使用される「遺伝子」という用語は、１本のポリペプチド鎖のコード又は１本の機能性ＲＮＡの転写に必要な全てのヌクレオチド配列を意味する。「遺伝子」は、宿主細胞に対して内因性、あるいは完全又は部分的に組換えられた遺伝子であってもよい（例えば、コーディングプロモーターを導入した外因性オリゴヌクレオチド及びコード配列、又は内因性コード配列に隣接する異種プロモーターを宿主細胞に導入したもの）。例えば、「遺伝子」は、エクソン及びイントロンで構成される核酸配列を含む。タンパク質をコードする配列は、例えば、開始コドンと終止コドンとの間のオープンリーディングフレームにおけるエクソンに含まれる配列であり、本発明では、「遺伝子」は、他の遺伝子がコード配列又は非コード配列を含むか否かを問わず、例えばプロモーター、エンハンサー等のような遺伝子制御配列及び本分野で知られている他の遺伝子の転写、発現又は活性を制御する他の全ての配列を含むことができる。１つの場合、例えば、「遺伝子」は、例えばプロモーターやエンハンサー等の制御配列を含む機能性核酸の説明に用いることができる。組換え遺伝子の発現は、一種又は多種の異種制御配列により制御することができる。
【００２４】
本明細書で用いられる「標的遺伝子」は、生体内に天然に存在する核酸配列、組換え遺伝子、ウイルス又は細菌配列、染色体又は染色体外及び/又は細胞及び/又はその染色質を一時的又は安定的にトランスフェクション又は混入したものである。標的遺伝子は、タンパク質コード遺伝子であってもよいし、非タンパク質コード遺伝子であってもよい（例えば、マイクロＲＮＡ遺伝子、長鎖非コードＲＮＡ遺伝子）。標的遺伝子は、通常、プロモーター配列を含み、プロモーター配列と同一性（相同性とも言われる）を有する小分子活性化ＲＮＡを設計することにより、標的遺伝子に対するアップレギュレートを実現することができ、標的遺伝子の発現のアップレギュレーションとして表現される。「標的遺伝子プロモーター配列」とは、標的遺伝子の非コード配列を意味し、本発明において「標的遺伝子プロモーター配列と相補する」における標的遺伝子プロモーター配列とは、当該配列のコード鎖（非鋳型鎖とも言われる）、すなわち、当該遺伝子コード配列と同一の核酸配列である。「標的配列」は、標的遺伝子プロモーター配列のうち小分子活性化ＲＮＡのセンスオリゴヌクレオチド鎖又はアンチセンスオリゴヌクレオチドと相同又は相補的な配列フラグメントを意味する。
【００２５】
本明細書において、「第１オリゴヌクレオチド鎖」は、センス鎖であってもよく、アンチセンス鎖であってもよい。小分子活性化ＲＮＡのセンス鎖は、小分子活性化ＲＮＡの二本鎖体のうち標的遺伝子のプロモーターＤＮＡ配列のコード鎖と同一性を有する核酸鎖を意味し、アンチセンス鎖は、小分子活性化ＲＮＡの二本鎖体のうちセンス鎖と相補的な核酸鎖を意味する。
【００２６】
本明細書に使用される「第２オリゴヌクレオチド鎖」は、センス鎖又はアンチセンス鎖であってもよい。第１オリゴヌクレオチド鎖がセンス鎖である場合、第２オリゴヌクレオチド鎖はアンチセンス鎖である。一方、第１オリゴヌクレオチド鎖がアンチセンス鎖である場合、第２オリゴヌクレオチド鎖はセンス鎖である。
【００２７】
本明細書で使用される「コード鎖」は、標的遺伝子における転写が不可能な１本のＤＮＡ鎖を指し、該鎖のヌクレオチド配列は、転写により生成されたＲＮＡの配列と一致する（ＲＮＡではＵでＤＮＡにおけるTを置換した）。本発明に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖ＤＮＡ配列のコード鎖は、標的遺伝子ＤＮＡコード鎖と同一のＤＮＡ鎖に存在するプロモーター配列を意味する。
【００２８】
本明細書で使用される「鋳型鎖」とは、標的遺伝子の二本鎖ＤＮＡのうちコード鎖に相補的な他本の鎖であって、鋳型としてＲＮＡに転写可能な鎖を意味し、当該鎖は、転写したＲＮＡ塩基と相補的なものである（Ａ−Ｕ，Ｇ-Ｃ）。転写過程において、ＲＮＡポリメラーゼは、鋳型鎖に結合し、鋳型鎖の３’−＞５’方向に沿って移動し、５’−＞３’方向に従ってＲＮＡの合成を触媒する。本発明に記載の標的遺伝子プロモーターの二本鎖ＤＮＡ配列の鋳型鎖は、標的遺伝子ＤＮＡ鋳型鎖と同一のＤＮＡ鎖に存在するプロモーター配列を意味する。
【００２９】
本明細書で使用される「プロモーター」という用語は、タンパク質をコードしない核酸配列を意味し、タンパク質コード又はＲＮＡコード核酸配列と位置的に関連付けることによりそれらの転写に対して調節作用を果たす。通常、真核プロモーターは、１００〜５，０００個の塩基対を含むが、この長さの範囲は、本明細書で使用される「プロモーター」を限定する趣旨ではない。プロモータ配列は、一般的にタンパク質コード又はＲＮＡコード配列の５’末端に位置するが、エキソン及びイントロン配列にも存在する。
【００３０】
本明細書で使用される「転写開始部位」という用語は、遺伝子の鋳型鎖に転写開始を標識するためのヌクレオチドを意味する。転写開始部位は、プロモータ領域の鋳型鎖に出現することができる。１つの遺伝子は、１つ以上の転写開始部位を有することができる。
【００３１】
本明細書で使用される「同一性」又は「相同性」という用語は、小分子活性化ＲＮＡのうちの１本のオリゴヌクレオチド鎖（センス鎖又はアンチセンス鎖）が標的遺伝子のプロモータ配列のある領域のコード鎖又は鋳型鎖と少なくとも８０％の類似性を有することを意味する。
【００３２】
本明細書で使用される「突出」、「ｏｖｅｒｈａｎｇ」、「垂下」は、互いに置き換えることができ、オリゴヌクレオチド鎖の末端（５’又は３’）における塩基対合しないヌクレオチドであり、二本鎖オリゴヌクレオチドのうちの１本の鎖からはみ出した他の鎖で産生されるものである。二本鎖体の３’及び/又は５’末端からはみ出した一本鎖領域は、「突出」と称される。標的配列において３’又は５’方向に向かって延伸した突出は、「天然突出」と称される。
【００３３】
本明細書で使用される「天然突出」、「天然ヌクレオチド突出」は、互いに置き換えることが可能であり、小分子活性化ＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖における５’末端又は３’末端で標的配列に由来する突出を意味する。
【００３４】
本明細書で使用される「遺伝子活性化」又は「活性化遺伝子」は、互いに置き換えることが可能であり、遺伝子転写レベル、ｍＲＮＡレベル、タンパク質レベル、酵素活性、メチル化状態、染色質状態又は形態、翻訳レベル、又はそれらの細胞又は生物システムにおける活性又は状態を測定することにより、ある核酸の転写、翻訳又は発現、あるいは活性の増加を測定することを意味する。これらの活動又は状態は、直接的又は間接的に測定することができる。また、「遺伝子活性化」、「活性化遺伝子」は、このような活性化のメカニズムによらず、核酸配列に相関する活性が増加したことを意味し、例えば、調節配列として調節作用を発揮したり、ＲＮＡに転写されたり、タンパク質に翻訳されてタンパク質の発現を増加したりする。
【００３５】
本明細書で使用される「小分子活性化ＲＮＡ」と「ｓａＲＮＡ」は、互いに置き換えることが可能であり、遺伝子発現を促進できるリボ核酸分子であり、標的遺伝子の非コード核酸配列（例えばプロモーター、エンハンサー等）と配列同一性を有するリボヌクレオチド配列を含む核酸鎖とこの鎖と相補的なヌクレオチド配列を含む核酸鎖とを組み合わせることにより、二本鎖体を形成することができる。小分子活性化ＲＮＡは、合成され又はベクターで発現されるとともに二本鎖領域のヘアピン構造を形成できる一本鎖ＲＮＡ分子で構成されてもよい。そのうち、第１領域は、遺伝子のプロモーター標的配列と配列同一性を有するリボヌクレオチド配列を含み、第２領域に含まれるリボヌクレオチド配列は、第１領域と相補的なものである。小分子活性化ＲＮＡ分子の二本鎖体領域の長さは、通常は約１０個〜約５０個の塩基対、約１２個〜約４８個の塩基対、約１４個〜約４６個の塩基対、約１６個〜約４４個の塩基対、約１８個〜約４２個の塩基対、約２０個〜約４０個の塩基対、約２２個及び約３８個の塩基対、約２４個及び約３６個の塩基対、約２６個及び約３４個の塩基対、約２８個及び約３２個の塩基対であり、通常、約１０個、約１５個、約２０個、約２５個、約３０個、約３５個、約４０個、約４５個、約５０個の塩基対である。また、「ｓａＲＮＡ」及び「小分子活性化ＲＮＡ」には、リボヌクレオチド部分以外の核酸も含まれ、修飾されたヌクレオチド又はその類似物が含まれるが、これに限定されるものではない。
【００３６】
本明細書で使用される「ホットスポット」は、機能を有する遺伝子プロモーター領域を意味する。ホットスポット領域では、ホットスポット領域配列を標的とする機能性小分子活性化ＲＮＡの凝集が現われ、これらのホットスポット領域内に少なくとも１０個の小分子活性化ＲＮＡを発生することができ、そのうち、少なくとも６０％の小分子活性化ＲＮＡは、遺伝子ｍＲＮＡ発現が１．５倍以上になるまで誘導することができる。
【００３７】
本明細書において、「合成」とは、オリゴヌクレオチドの合成方式を意味し、例えば化学合成、生体外転写、ベクター表現などのＲＮＡを合成可能な任意の方式が含まれる。
【００３８】
本明細書において、「ｐ２１」は、ｐ２１WAF1/CIP1遺伝子を意味し、ＣＤＫＮ１Ａ遺伝子とも呼ばれ、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫ）阻害剤であり、一種の重要な腫瘍抑制遺伝子でもある。ｐ２１を過剰発現し、又は内因性ｐ２１の転写を活性化することにより、腫瘍細胞及び生体内腫瘍の成長を効果的に抑制することができる。
【００３９】
材料及び方法
細胞培養及びトランスフェクション
【００４０】
細胞株ＲＴ４、ＫＵ-７、Ｔ２４及びＨＴ-１１９７は改良されたＭｃＣｏｙ’ｓ  ５Ａ培地（Ｇｉｂｃｏ）に、Ｊ８２、ＴＣＣＳＵＰ及びＵＭ-ＵＣ-３細胞株はＭＥＭ培地（Ｇｉｂｃｏ）に、５６３７、ＰＣ３及びＢｅｌ-７４０２はＲＰＭＩ１６４０培地（Ｇｉｂｃｏ）にそれぞれ培養された。全ての培地は、１０％の子ウシ血清（Ｓｉｇｍａ-Ａｌｄｒｉｃｈ）及び１％のペニシリン/ストレプトマイシン（Ｇｉｂｃｏ）を含有する。細胞を５％ ＣＯ2、３７℃の条件下で培養した。メーカーの説明に従い、ＲＮＡｉMａｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ）を用いて１０  ｎＭ（特に断らない限り）濃度で小分子活性化ＲＮＡをトランスフェクションし、全ての小分子活性化ＲＮＡの配列を表１に示す。
【００４１】
表１  鎖配列及び二本鎖体の組成
【表１】
2021520221.tif 000002
2021520221.tif 000003
2021520221.tif 000004
2021520221.tif 000005
【００４２】
ＲＮＡ分離及び逆転写ポリメラーゼ連鎖反応
細胞を２-３×１０5個の細胞/ウェルで６ウェルプレートに播種し、オリゴヌクレオチド二本鎖体をリバーストランスフェクションした。ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌｕｓ  Ｍｉｎｉキット（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて、その説明書に従って細胞総ＲＮＡを抽出した。ｇＤＮＡ  Ｅｒａｓｅｒ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｌｇａ，Ｊａｐａｎ）を含むＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴキットを用いてＲＮＡ（１μｇ）をｃＤＮＡに逆転写した。ｑＰＣＲは、ＡＢＩ  ７５００  Ｆａｓｔ  Ｒｅａｌ-ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）及びＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ  ＩＩ（Ｔａｋａｒａ，Ｓｈｌｇａ，Ｊａｐａｎ）試薬を用い、９５℃で３秒間、６０℃で３０秒間である反応条件で４０サイクル増幅した。ＧＡＰＤＨを内部参照とする。全てのプライマー配列を表２に示す。
【００４３】
表２．ｑＲＴ-ＰＣＲ分析のプライマー配列
【表２】
2021520221.tif 000006
【００４４】
細胞増殖測定
細胞を２-４×１０3個の細胞/ウェルで９６ウェルプレートに敷き、一晩培養して、オリゴヌクレオチド二本鎖体をトランスフェクションした。３日間トランスフェクションした後、ＣＣＫ-８（Ｄｏｊｉｎｄｏ）を用い、その説明書に従って細胞増殖の検出を行った。実験手順を簡単に説明すると、１０μL  ＣＣＫ８溶液を各ウェルに入れ、３７℃で１時間インキュベートした後、マイクロプレートリーダーを用いて４５０ｎｍ箇所での吸光度を測定した。
【００４５】
ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０分析
細胞を９６ウェルプレートに敷いてオリゴヌクレオチド二本鎖体をトランスフェクションし、７２時間トランスフェクションした後、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０キット（ＡｆｆｙＭｅｔｒｉｘ）を用いて目標遺伝子ｍＲＮＡレベルを定量的に検出した。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０キットは、交雑技術に基づく方法であり、遺伝子特異的プローブを用いてｍＲＮＡレベルを直接定量するものである。実験手順を簡単に説明すると、分解液を添加してトランスフェクション後の細胞を分解させ、細胞分解物をＣＤＫＮ１Ａ（ｐ２１）及びＨＰＲＴ１（ハウスキーピング遺伝子）プローブを内包する捕捉ウェルプレートに入れ、５５℃で一晩交雑した。交雑信号を増強するために、１００  μL相当の緩衝液（ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０キットから提供）に２．０  ＰＲeＡＭＰ、２．０  ＡＭＰ及び２．０ Ｌａｂｌｅ  Ｐｒｏｂｅと順番に交雑した。全ての交雑はいずれも５０〜５５℃で１時間振盪する。最後に、洗浄した後、２．０ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅを加えて室温で５分間インキュベートした。その後、Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  ２００  ＰＲOプレートリーダー（Ｔｅｃａｎ、スイス）を用いて光信号を検出した。
【００４６】
統計分析
結果は、平均値±標準偏差として表される。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍソフトウェア（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて一元配置分散分析を行い、その後Ｔｕｋｅｙ’ｓ ｔ検定を行って統計分析を行った。統計学的有意性の基準は、*Ｐ＜０．０５、**Ｐ＜０．０１、及び***Ｐ＜０．００１と設定した。
【実施例】
【００４７】
以下、実施例によって本発明をさらに説明する。また、実施例は単に本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲又は内容を何ら制限するものではないと解釈されるべきである。
説明の便宜上、以下の式を用いて、小分子活性化ＲＮＡ（以下、単に「ｓａＲＮＡ」という）の構造を説明する。
オリゴヌクレオチド一本鎖についての説明：
[５ＯＨn] ＋ Ｎn ＋ [３ＯＨn] （式１）
【００４８】
５ＯＨn又は３ＯＨnは、それぞれ５’又は３’末端突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）であり、天然ヌクレオチド（ｎａｔｕｒａｌ ｏｖｅｒｈａｎｇ，ＮＯ）、デオキシチミジル酸（Ｔ）又はウラシルヌクレオチド（Ｕ）突出等とすることができ、ｎは突出したヌクレオチドの個数である。Ｎnは、他本のオリゴヌクレオチド鎖が二本鎖構造を形成可能な領域であり、ここで、ＮはＳ（センス鎖）又はＡＳ（アンチセンス鎖）とすることができ、ｎは他本の相補鎖と二本鎖構造を形成するヌクレオチドの長さである（突出を含まない）。例えば、５ＮＯ1＋ＡＳ19＋３Ｔ2は、他本の相補鎖と長さが１９ヌクレオチドの二本鎖領域を形成できるアンチセンス鎖であることを表し、その５’末端に１つの天然ヌクレオチド突出があり、３’末端に２つのデオキシチミジル酸突出があり、全長が２２個（すなわち、１＋１９＋２）のヌクレオチドである。角括弧は、オプションを示す。
二本鎖オリゴヌクレオチドについての説明：
[Ｂ5]＋[Ｂ3]＋[ＭＭ(N'nZ: X,Y)]＋[ＯＨN5']       （式２）
【００４９】
Ｂ５及びＢ３は、それぞれ二本鎖体、すなわちセンス鎖に対して５’末端が平滑末端（５’-ｂｌｕｎｔ）、又は３’末端が平滑末端（３’-ｂｌｕｎｔ）であることを示す。また、ＭＭは、二本鎖同士のミスマッチであり、（Ｎ’ｎZ：Ｘ，Ｙ）におけるＮ’は、二本鎖体の５’又は３’末端からカウントし、ｎは、二本鎖体におけるミスマッチしたヌクレオチドのカウント位置を表し、Ｘは、突然変異前に標的配列と一致し又は相補的なヌクレオチドであり、Ｙは、突然変異後のヌクレオチドであり、Ｚは、突然変異したヌクレオチドが存在する鎖であり、センスはＳであり、アンチセンスはＡＳである。例えば、「３’１Ｓ：Ａ，Ｃ」は、二本鎖体の３’末端からの１位に対応するセンス鎖の「Ａ」（アデニンヌクレオチド）が「Ｃ」（シトシンヌクレオチド）に突然変異したことを表し、ＯＨN5'は、一般的でない５’突出を表し、Ｎは、Ｓ（センス鎖）又はＡＳ（アンチセンス鎖）である。例えば、ＯＨAS5'は、ＡＳ鎖に５’突出が存在していることを示す。対称的な３’突出を含む二本鎖体は、一般的な構造とみなされるので、別途説明しない。角括弧は、オプションを示す。
【００５０】
実施例１：ｐ２１遺伝子プロモーター領域を標的とする機能性小分子活性化ＲＮＡの選別
ｐ２１遺伝子の発現を活性化できる機能性小分子活性化ＲＮＡを選別するために、ｐ２１遺伝子の１ｋｂプロモーター配列のコード鎖をＵＣＳＣ  Ｇenomeデータベースから検索して得た（図１）。転写開始部位（ＴＳＳ）の上流の-１ｋｂ箇所からサイズが１９ｂｐの標的部位を選定し、１ｂｐずつ移動するようにＴＳＳ部位へ移動して、合計９８２個の標的配列を得た。標的配列に対して、ＧＣ含有量が６５％超え又は３５％未満であり、かつ、５個以上の連続する同一のヌクレオチドを含む標的配列を排除するようにフィルタ処理を行った。フィルタリング後、残りの４３９個の標的配列は候補として選別プロセスに入る。サイズが１９ヌクレオチドの候補標的配列に基づいて、それと配列同一性を有するサイズが１９ヌクレオチドのＲＮＡ配列を化学合成し、その３’末端にｄＴｄＴを加えてセンス鎖を得た。構造式は、Ｓ19＋[３T2]である。これと同時に、同一の標的配列と逆相補的なサイズが１９ヌクレオチドのＲＮＡ配列を合成し、その３’末端にｄＴｄＴを加えてアンチセンス鎖を得た。構造式は、ＡＳ19＋[３T2]である。センス鎖とアンチセンス鎖を同じモル数で混合してアニール処理し、二本鎖ｓａＲＮＡを得た。
【００５１】
前記二本鎖ｓａＲＮＡを１０ｎＭの最終濃度でＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞にトランスフェクションし、７２時間後、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０キットを用いてｐ２１遺伝子ｍＲＮＡレベルを検出した。ブランク対照処理されたｐ２１  ｍＲＮＡレベルに対する各ｓａＲＮＡの倍数変化を算出して図２に示す。該研究において、全てのｓａＲＮＡによるｐ２１遺伝子ｍＲＮＡの倍数変化は、０．６６（抑制）から８．１２（誘導）までの範囲を含む（図２（Ｂ））。そのうち、３６１個（８２．２％）のｓａＲＮＡは、ｐ２１の発現を１．０１〜８．１２倍誘導し、７４個（１６．９％）のｓａＲＮＡは、抑制作用（０．９９〜０．６６倍）を示し、４個（０．９％）のｓａＲＮＡは、ｐ２１遺伝子ｍＲＮＡレベルに対して影響を与えない（１．０倍）。
【００５２】
選別された４３９個のｓａＲＮＡのうち、１３２個（３０．１％）は、ｐ２１  ｍＲＮＡを少なくとも２倍誘導することができ、２２９個（５２．４％）のｓａＲＮＡは、ｐ２１  ｍＲＮＡを少なくとも１．５倍誘導することができる。これらの機能を有するｓａＲＮＡは、ｐ２１プロモーター領域全体にわたって分散される。しかし、８個の遊離した領域には、機能性小分子活性化ＲＮＡの凝集が見られ、これらの領域は「ホットスポット」と呼ばれる。ホットスポット領域の定義は、１つの領域内に少なくとも１０個の小分子活性化ＲＮＡが含まれ、そのうち、少なくとも６０％の小分子活性化ＲＮＡは、ｐ２１  ｍＲＮＡ発現を１．５倍以上に達するように誘導することができる（図２（Ａ）及び図３）。ホットスポット１〜８の標的配列及び対応する小分子活性化ＲＮＡ配列をそれぞれ表３及び表４に示す。
【００５３】
表３  ｐ２１プロモーターのホットスポット領域の標的配列
【表３】
2021520221.tif 000007
【００５４】
表４  ｐ２１プロモーターのホットスポット領域にある機能性小分子活性化ＲＮＡ
【表４】
2021520221.tif 000008
2021520221.tif 000009
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【００５５】
これらのホットスポットでは、ホットスポット領域１と対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の-８９３ｂｐ〜-８０１ｂｐであり、その配列が、配列番号９３に示すものであり、この領域には４４個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され（表４及び図３（Ａ））、それぞれは、ＲＡＧ-８３４、ＲＡＧ-８４５、ＲＡＧ-８９２、ＲＡＧ-８４６、ＲＡＧ-８２１、ＲＡＧ-８８４、ＲＡＧ-８６４、ＲＡＧ-８４３、ＲＡＧ-８５４、ＲＡＧ-８４４、ＲＡＧ-８８７、ＲＡＧ-８３８、ＲＡＧ-８５８、ＲＡＧ-８３５、ＲＡＧ-８７６、ＲＡＧ-８７０、ＲＡＧ-８５３、ＲＡＧ-８８１、ＲＡＧ-８２８、ＲＡＧ-８７２、ＲＡＧ-８４１、ＲＡＧ-８３１、ＲＡＧ-８２９、ＲＡＧ-８２０、ＲＡＧ-８２２、ＲＡＧ-８６８、ＲＡＧ-８４９、ＲＡＧ-８６２、ＲＡＧ-８６５、ＲＡＧ-８９３、ＲＡＧ-８４８、ＲＡＧ-８２４、ＲＡＧ-８６６、ＲＡＧ-８４０、ＲＡＧ-８７５、ＲＡＧ-８８０、ＲＡＧ-８７１、ＲＡＧ-８８８、ＲＡＧ-８８５、ＲＡＧ-８９４、ＲＡＧ-８３３、ＲＡＧ-８２５、ＲＡＧ-８８９、ＲＡＧ-８２３である。
【００５６】
ホットスポット領域２（表４、図３（Ｂ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の-７１７〜-６３２ｂｐであり、その配列が、配列番号９４に示すものであり、この領域には３１個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-６９３、ＲＡＧ-６９２、ＲＡＧ-６８８、ＲＡＧ-６９６、ＲＡＧ-６９４、ＲＡＧ-６８７、ＲＡＧ-６９１、ＲＡＧ-６９０、ＲＡＧ-６８９、ＲＡＧ-６８２、ＲＡＧ-６８６、ＲＡＧ-６６２、ＲＡＧ-６９５、ＲＡＧ-６５４、ＲＡＧ-６５８、ＲＡＧ-６８５、ＲＡＧ-７０４、ＲＡＧ-７１４、ＲＡＧ-７０５、ＲＡＧ-６６１、ＲＡＧ-６５６、ＲＡＧ-６９８、ＲＡＧ-６９７、ＲＡＧ-６５７、ＲＡＧ-７１５、ＲＡＧ-６５２、ＲＡＧ-６５１、ＲＡＧ-６５０、ＲＡＧ-７１６、ＲＡＧ-７１７、ＲＡＧ-７１１である。
【００５７】
ホットスポット３（表４、図３（Ｃ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の-５８５ｂｐ〜-５５１ｂｐであり、その配列が、配列番号９５に示すものであり、この領域には、９個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-５８０、ＲＡＧ-５７７、ＲＡＧ-５６９、ＲＡＧ-５７６、ＲＡＧ-５７０、ＲＡＧ-５７４、ＲＡＧ-５８５、ＲＡＧ-５７９、ＲＡＧ-５８４である。
【００５８】
ホットスポット４（表４、図３（Ｄ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の-５５４ｂｐ〜-５０５ｂｐであり、その配列が、配列番号９６に示すものであり、この領域には、１７個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-５２４、ＲＡＧ-５５３、ＲＡＧ-５３７、ＲＡＧ-５２６、ＲＡＧ-５５４、ＲＡＧ-５２３、ＲＡＧ-５３４、ＲＡＧ-５４３、ＲＡＧ-５２５、ＲＡＧ-５３５、ＲＡＧ-５４６、ＲＡＧ-５４５、ＲＡＧ-５４２、ＲＡＧ-５３１、ＲＡＧ-５２２、ＲＡＧ-５２９、ＲＡＧ-５５２である。
【００５９】
ホットスポット５（表４、図３（Ｅ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の-５１４ｂｐ〜-４８５ｂｐであり、その配列が、配列番号９７に示すものであり、この領域には、９個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-５０３、ＲＡＧ-５０４、ＲＡＧ-５０５、ＲＡＧ-５０６、ＲＡＧ-５０７、ＲＡＧ-５０８、ＲＡＧ-５０９、ＲＡＧ-５１０、ＲＡＧ-５１１、ＲＡＧ-５１２、ＲＡＧ-５１３、ＲＡＧ-５１４である。
【００６０】
ホットスポット６（表４、図３（Ｆ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の-４４２ｂｐ〜-４０５ｂｐであり、その配列が、配列番号９８に示すものであり、この領域には、１２個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-４２７、ＲＡＧ-４３０、ＲＡＧ-４３１、ＲＡＧ-４２３、ＲＡＧ-４２５、ＲＡＧ-４３３、ＲＡＧ-４３５、ＲＡＧ-４３４、ＲＡＧ-４３９、ＲＡＧ-４２６、ＲＡＧ-４２８、ＲＡＧ-４４２である。
【００６１】
ホットスポット７（表４、図３（Ｇ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の-３５２ｂｐ〜-３１３ｂｐであり、その配列が、配列番号９９に示すものであり、この領域には、１３個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-３３５、ＲＡＧ-３５１、ＲＡＧ-３５２、ＲＡＧ-３３１、ＲＡＧ-３４４、ＲＡＧ-３４２、ＲＡＧ-３４１、ＲＡＧ-３３３、ＲＡＧ-３４５、ＲＡＧ-３４６、ＲＡＧ-３３６、ＲＡＧ-３３２、ＲＡＧ-３４３である。
【００６２】
ホットスポット８（表４、図３（Ｈ））に対応する標的配列は、ｐ２１プロモーター配列の-３２５ｂｐ〜-２６０ｂｐであり、その配列が、配列番号１００に示すものであり、この領域には、１８個の機能を有するｓａＲＮＡが確認され、それぞれは、ＲＡＧ-２９４、ＲＡＧ-２８５、ＲＡＧ-２８６、ＲＡＧ-２９２、ＲＡＧ-２９１、ＲＡＧ-２８４、ＲＡＧ-２７９、ＲＡＧ-２８０、ＲＡＧ-３２５、ＲＡＧ-２９３、ＲＡＧ-３２２、ＲＡＧ-３２１、ＲＡＧ-２８１、ＲＡＧ-２８９、ＲＡＧ-２７８、ＲＡＧ-２８３、ＲＡＧ-２８２、ＲＡＧ-２９５である。
【００６３】
ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０の検出結果を検証するために、４３９個の小分子活性化ＲＮＡを、そのｐ２１  ｍＲＮＡ発現の活性化活性に基づいて４つの群（ｂｉｎ）に分け、各群から５つのｓａＲＮＡをランダムに選び、それぞれをＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞に１０ ｎＭの濃度でトランスフェクションした。７２時間後、ｍＲＮＡを抽出して逆転写した後、ＲＴ-ｑＰＣＲ法を用いてｐ２１遺伝子のｍＲＮＡレベルを分析した。２種類の方法で得られたｐ２１遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルは、顕著な相関性を示す（Ｒ2=０．８２）（図４）。ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０法で得られた全ての機能性ｓａＲＮＡは、いずれもＲT-ｑＰＣＲ方法により真の機能性ｓａＲＮＡであると検証され、そのうちのいくつかの機能性ｓａＲＮＡは、ＲT-ｑＰＣＲ分析においてより強いｐ２１  ｍＲＮＡの誘導能力を示す（表５）。
表５．  ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０方法に対する検証
【表５】
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【００６４】
以上のように、上記データからは、ｐ２１プロモーター領域における多数の特定部位は、ｓａＲＮＡ標的配列としてｐ２１発現を誘導することができ、そのうちの一部の領域はより高い感受性を持ち、それと対応するｓａＲＮＡがｐ２１発現を活性化させる可能性がより大きいことが示された。
【００６５】
実施例２：ｓａＲＮＡによるｐ２１遺伝子ｍＲＮＡの発現の誘導及び癌細胞の増殖の抑制
ｓａＲＮＡによるｐ２１遺伝子ｍＲＮＡ発現の誘導作用及び癌細胞増殖の抑制作用をさらに評価するために、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ  ２．０によって選別したｓａＲＮＡ（ＲＡＧ１-４３１、ＲＡＧ１-５５３、ＲＡＧ１-６８８）をがん細胞株Ｋｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ（膀胱癌）、ＨＣＴ１１６（結腸癌）及びＨｅｐＧ２（肝細胞癌）にトランスフェクションした。その結果、上記の全ての細胞株において、ｓａＲＮＡは、いずれもｐ２１遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを少なくとも２倍に誘導するとともに細胞増殖を抑制することができ、ｓａＲＮＡを介するｐ２１の誘導による効果が示された。具体的には、ＲＡＧ-４３１、ＲＡＧ-５５３、ＲＡＧ-６８８をそれぞれＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞にトランスフェクションし、それぞれがｐ２１  ｍＲＮＡ発現を１４．０倍、３６．９倍、３１．９倍誘導し、ブランク処理に対する活着率が７１．７％、６０．７％、６７．４％であった（図５）。ＲＡＧ-４３１、ＲＡＧ-５５３、ＲＡＧ-６８８をそれぞれＨＣＴ１１６細胞にトランスフェクションし、それぞれがｐ２１  ｍＲＮＡ発現を２．３倍、３．５倍及び２．４倍誘導し、ブランク処理に対する活着率が４５．３％、２２．５％、３８．５％であった（図６）。ＲＡＧ-４３１、ＲＡＧ-５５３、ＲＡＧ-６８８をそれぞれＨｅｐＧ２細胞にトランスフェクションし、それぞれがｐ２１  ｍＲＮＡ発現を２．２倍、３．３倍、及び２．０倍を誘導し、相対ブランク処理による生存率が７６．７％、６４．９％、７９．９％であった（図７）。
【００６６】
実施例３：ホットスポット領域のｓａＲＮＡの更なる選別及び最適化
ｐ２１発現を活性化させたオリゴヌクレオチドを選別及び検証するために、ホットスポット７（それと対応する標的配列がｐ２１プロモーター配列の-３５２ｂｐ〜-３１３ｂｐ）を更なる選別対象とし、ｐ２１プロモーターの転写開始部位（ＴＳＳ）-３３２から-２９２までの４０ｂｐ領域を標的配列として、この領域を標的とする一連のオリゴヌクレオチド二本鎖体を合成した（各鎖の長さが２１ヌクレオチドである）。該プロモーター領域は、単一のヌクレオチドがシフトして形成された１７個の重なり合う標的部位を含み、それらの間の一部のポリアデノシン繰り返し配列が排除される（図８）。各二本鎖体は、ｐ２１プロモーターにおける相同配列と同様な１９ヌクレオチドの配列を有し、２本の鎖にダブルｄＴ突出末端を有し、この二本鎖ＲＮＡは、ｐ２１転写開始部位に対する標的位置に基づいて、Ｐ２１-２９７、Ｐ２１-２９８、Ｐ２１-２９９、Ｐ２１-３２５等と名前付けられた。全ての二本鎖配列を表１に示す。各二本鎖体をＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ（膀胱尿道上皮癌）細胞にトランスフェクションし、７２時間後にｐ２１遺伝子ｍＲＮＡ発現レベルを検出した。図９に示すように、複数の二本鎖体（Ｐ２１-３２１、Ｐ２１-３２２、Ｐ２１-３３１）は、ｐ２１の強活性化剤であり、その発現レベルを約４〜６倍向上させたが、他の二本鎖体はｐ２１発現を顕著にアップレギュレーションしなかった。このデータから、ｓａＲＮＡによる遺伝子の活性化程度は、標的部位及び/又はその配列に依存し、標的部位に微細な変化（例えば、モノヌクレオチドのシフト）が発生すると機能性のｓａＲＮＡが完全に不活性となる可能性があることが分かった。
【００６７】
実施例４：３’末端が天然又は２個のウラシルヌクレオチド突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）の構造となる二本鎖ｓａＲＮＡ
また、特定の標的配列に対して、ｓａＲＮＡ構造を最適化することによっても、より良好な活性化効果が生じることができる。具体的なデータは、以下のとおりである。
【００６８】
Ｐ２１-３２２（以下、「Ｒａｇ１-０」という）を選択して、改善された薬物属性を有する新規な配列をさらに開発するために用いられる。まず、ｓａＲＮＡ二本鎖体の突出の組成の変化をテストし、そのうち、各鎖におけるダブルｄＴヌクレオチド突出を、天然ヌクレオチド突出（すなわち、標的遺伝子プロモーター配列に由来するもの）又は２つのウラシルヌクレオチドに置き換え、新たなｓａＲＮＡ変異体（それぞれを「Ｒａｇ１-１」及び「Ｒａｇ１-２」という）を２つ得た（図１０）。各二本鎖ｓａＲＮＡをそれぞれＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ、ＰＣ３（前立腺癌）及びＢｅｌ-７４０２（肝細胞癌）細胞を含む３種類の異なる細胞株にトランスフェクションした。７２時間後にｐ２１遺伝子ｍＲＮＡの発現レベルを評価した。図１１（Ａ）-（Ｃ）に示すように、Ｋｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞において、Ｒａｇ１-０と比べて、Ｒａｇ１-１及びＲａｇ１-２によるｐ２１の誘導がやや増加した。ＰＣ３及びＢｅｌ-７４０２細胞において、Ｒａｇ１-０と比べて、Ｒａｇ１-２によるｐ２１発現の誘導作用がより強くなった。ＣＣＫ-８法によって測定した細胞活力のデータからは、Ｒａｇ１-０と比べて、Ｒａｇ１-１及びＲａｇ１-２はいずれもＢｅｌ-７４０２細胞の増殖に対する抑制作用を改善したことが分かった（図１２）。このデータからは、天然ヌクレオチド突出（すなわち、標的遺伝子プロモーター配列に由来する）又は２つのウラシルヌクレオチドなどの異なるヌクレオチド突出構造を有する場合、機能的にはＲＡＧ１-０と比べて劣らなく、そして、ある種類の腫瘍に対して、Ｒａｇ１-０よりもｐ２１発現に対する誘導及び細胞増殖に対する抑制の点で改善効果がある可能性もあることが分かった。これからも、ある種類のがんに対して、天然ヌクレオチド突出又は２つのウラシルヌクレオチド突出の構造によって、ｓａＲＮＡによる遺伝子誘導及び成長抑制の活性を改善することができることを証明した。天然突出末端を含む二本鎖体は、標的配列と１００％相補的なものであり、その配列の全長がその標的部位に由来する（ダブルｄＴ及びウラシル突出と異なる）。このような設計によって、非天然又はミスマッチした突出を含むｓａＲＮＡよりも良い標的特異性及び相補性を提供することができる。
【００６９】
実施例５：二本鎖ｓａＲＮＡの長さによるｐ２１に対する誘導活性への影響
本出願人は、二本鎖体の長さがｐ２１に対する誘導活性に影響を及ぼすか否かを確定するために、Ｒａｇ１-０二本鎖体の（センス鎖に対する）３’末端に相同配列の１つのヌクレオチドを１つずつ増加する方式で５つの新たな二本鎖体を設計合成し、それぞれをＲａｇ１-３、Ｒａｇ１-４、Ｒａｇ１-５、Ｒａｇ１-６及びＲａｇ１-７と名前付け、それらの長さがそれぞれ２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド、２６ヌクレオチドである。これらの二本鎖体は、ダブルｄＴ突出を保留する（図１０）。図示したように、図１１（Ａ）-（Ｃ）では、長さが２２ヌクレオチドであるＲａｇ１-３は、Ｒａｇ１-０と比べて、Ｋｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞において遺伝子発現の誘導と細胞増殖の抑制とがより良好となった（図１２）。二本鎖体の活性は、長さが２２個より多いヌクレオチドであるとなくなり、これは、２１〜２２ヌクレオチドを有する二本鎖体の長さは、遺伝子の誘導に対してより好適であることを意味する。
【００７０】
さらに、出願人は、Ｐ２１-３２３（「Ｒａｇ１-８」ともいう）から、天然ヌクレオチド突出構造を有する変異体（Ｒａｇ１-９）と、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、２５ヌクレオチド又は２６ヌクレオチドまで延伸した変異体（それぞれがＲａｇ１-１０、Ｒａｇ１-１１、Ｒａｇ１-１２、Ｒａｇ１-１３、Ｒａｇ１-１４ともいわれ、それらの突出構造が依然としてダブルｄＴである）を合成した（図１０）。その結果、天然突出構造を有するとともに２１ヌクレオチドを有するＲａｇ１-９は、遺伝子誘導の活性を顕著に改善しなく、長さが２２ヌクレオチドを有するＲａｇ１-１０は、全ての細胞株において他の二本鎖体よりも良くなり、強いｐ２１活性化剤であることが示された（図１１（Ａ）-（Ｃ））。また、長さが２３ヌクレオチドであるＲａｇ１-１１の、Ｋｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ及びＰＣ３細胞における誘導作用はＲａｇ１-１０にほぼ同じであるが、Ｂｅｌ-７４０２細胞においてｐ２１遺伝子発現を顕著に誘導しなかった（図１１（Ａ）-（Ｃ））。したがって、ｓａＲＮＡ配列の長さを長くすることにより、活性のないｓａＲＮＡを強い遺伝子活性化剤に変換することができる。
【００７１】
実施例６：ミスマッチを含有する二本鎖ｓａＲＮＡ
出願人は、Ｒａｇ１-０の変異体を設計合成した。具体的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖の５’末端の１位のヌクレオシドに対応するセンスオリゴヌクレオチド鎖におけるアデノシンを、アンチセンスオリゴヌクレオチド鎖を変化せずにウラシル又はシトシンに突然変異させることにより、それぞれ二本鎖ｓａＲＮＡの３’末端に１個の塩基のミスマッチがあるｓａＲＮＡ変異体Ｒａｇ１-１５及びＲａｇ１-１６を得た。また、アンチセンス鎖の５’末端の１位及び２位のヌクレオシドに対応するセンス鎖におけるヌクレオシドをアデノシン及びウラシルに突然変異させることにより、二本鎖の３’末端に２個の塩基のミスマッチを含むｓａＲＮＡ変異体Ｒａｇ１-１７を得た（図１０）。これらのｓａＲＮＡをＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ、ＰＣ３又はＢｅｌ-７４０２細胞にトランスフェクションし、３種類のｓａＲＮＡ変異体のそれぞれによるｐ２１発現の誘導は少なくともＲａｇ１-０とほぼ同じであり、又はそれよりも良くなるが、シトシンミスマッチを含むＲａｇ１-１６二本鎖体は、全ての３種類の細胞株のいずれにおいても強活性化剤である（図１１（Ａ）-（Ｃ））。
【００７２】
実施例７：非対称構造となる二本鎖ｓａＲＮＡ
本発明者らは、非対称構造となる二本鎖体を合成し、Ｒａｇ１-１８（センス鎖の３’末端に突出がなく、３’平滑末端となる二本鎖体）、Ｒａｇ１-２０（センス鎖における５’末端の１位のヌクレオシドを除去することによりアンチセンス鎖における３’末端に３個のヌクレオチド突出を発生させた）、及びＲａｇ１-１９（Ｒａｇ１-１８とＲａｇ１-２０の２種類の構造修飾の組み合わせを含み、すなわち、センス鎖における５’末端の１位のヌクレオシドと３’末端のダブルｄＴ突出が除去され、５’末端に３個のヌクレオシド突出を有するとともに３’末端が平滑末端である非対称二本鎖構造が形成された）（図１０）。図１１（Ａ）-（Ｃ）に示すように、Ｒａｇ１-１８は、全ての３種類の細胞株のいずれにおいてｐ２１を活性化させることができなかったが、Ｒａｇ１-２０は、全ての３種類の細胞株のいずれにおいてもｐ２１への誘導能力がＲａｇ１-０とほぼ同じである。Ｒａｇ１-１８と比べて、Ｒａｇ１-１９における２種類の構造修飾の組み合わせは、その遺伝子誘導活性を回復した。この２種類の構造の最適化は、いずれもｓａＲＮＡの遺伝子誘導活性を保留するとともにセンス鎖のオフターゲット効果を減少させることができ、そして、少ない核酸を用いてオリゴヌクレオチドを合成するので、コストを節約できるという利点もある。
【００７３】
実施例８：構造特徴の組み合わせの最適化
１．図１３に示すように、Ｒａｇ１-２１、Ｒａｇ１-２２、Ｒａｇ１-２３及びＲａｇ１-２４は、Ｒａｇ１-１０の誘導体である。
（１）Ｒａｇ１-２１は、２つのウラシル突出を含み、その構造式として、センス鎖が（Ｓ20＋３Ｕ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ20＋３Ｕ2）となる。
【００７４】
（２）Ｒａｇ１-２２は、２つの天然ヌクレオチド突出を含み、その構造式として、センス鎖が（Ｓ20＋３ＮＯ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ20＋３ＮＯ2）となる。
【００７５】
（３）Ｒａｇ１-２３は，Ｒａｇ１-２１の変異体であり、その二本鎖体の３’末端の１位の塩基がミスマッチし、このミスマッチは、センス鎖におけるアデノシンをシトシンに突然変異させて形成されたものである。その構造式として、センス鎖が（Ｓ20＋３Ｕ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ20＋３Ｕ2）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００７６】
（４）Ｒａｇ１-２４は、Ｒａｇ１-２３の変異体であり、そのうち、センス鎖の５’末端の１位のヌクレオチドが欠失しているので、アンチセンス鎖の突出長を延長させた。その構造式として、センス鎖が（Ｓ19＋３Ｕ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ20＋３Ｕ2ＮＯ2）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００７７】
２．Ｒａｇ１-２５及びＲａｇ１-２６は、Ｒａｇ１-１６の変異体であり、そのうち、センス鎖及びアンチセンス鎖の突出がそれぞれ２つのウラシルヌクレオチド又は天然突出で置換され、センス鎖が３’シトシンのミスマッチを含む。
【００７８】
（１）Ｒａｇ１-２５の構造式として、センス鎖が（Ｓ19＋３Ｕ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３Ｕ2）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００７９】
（２）Ｒａｇ１-２６の構造式として、センス鎖が（Ｓ19＋３ＮＯ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００８０】
３．Ｒａｇ１-２７及びＲａｇ１-２８は、Ｒａｇ１-２０の変異体であり、両者のセンス鎖に３’シトシンミスマッチを含むとともに５’末端が欠失しているので、アンチセンス鎖の突出長さを延長させ、センス鎖及びアンチセンス鎖のそれぞれが２０及び２１ヌクレオチドである。
【００８１】
（１）Ｒａｇ１-２７の突出は、２つのウラシルヌクレオチドである。その構造式として、センス鎖が（Ｓ18＋３Ｕ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３Ｕ2）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００８２】
（２）Ｒａｇ１-２８の突出は、２つの天然ヌクレオチド突出である。その構造式として、センス鎖が（Ｓ18＋３ＮＯ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００８３】
これらのｓａＲＮＡ変異体（Ｒａｇ１-２１〜Ｒａｇ１-２８）をＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ、ＵＭ-ＵＣ-３（膀胱移行細胞癌）、Ｔ２４（膀胱癌）、Ｊ８２（膀胱移行細胞癌）又はＢｅｌ-７４０２細胞株にトランスフェクションし、７２時間後に遺伝子発現を評価した。図１４（Ａ）〜（Ｅ）に示すように、全ての二本鎖体はいずれも異なる程度でｐ２１発現を誘導することができ、そのうち、Ｒａｇ１-２１、Ｒａｇ１-２３及びＲａｇ１-２６が他の変異体よりも優れている。同時に、トランスフェクションされた細胞の細胞増殖能をＣＣＫ-８検出法で分析したところ、各ｓａＲＮＡ変異体はいずれも全ての細胞に対して異なる成長抑制作用を有することがわかった。そのうち、Ｒａｇ１-２６がＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ、ＵＭ-ＵＣ-３及びＴ２４細胞において最も優れている（図１５（Ａ）-（Ｅ））。これらのデータから、センス鎖の３’末端におけるシトシンミスマッチ及び天然突出構造の利点を示した。
【００８４】
３．本発明者は、Ｒａｇ１-２６に基づいて新たなＲａｇ１-２９〜Ｒａｇ１-４４の変異体（表１、図１３）を設計し、これらの変異体は、以下の配列及び構造変化の異なる組み合わせを含む。
一本鎖の長さの変化：
長さ１７〜２２ヌクレオチドのセンス鎖；
長さ２０〜２２ヌクレオチドのアンチセンス鎖；
二本鎖体の構造の変化：
二本鎖体５’平滑末端；
二本鎖体３’平滑末端；
二本鎖体ミスマッチ；
突出特徴の変化：
アンチセンス鎖の３’末端における１〜３ヌクレオチドの突出；
アンチセンス鎖の５’末端における１〜２ヌクレオチドの突出；
センス鎖の３’末端における２ヌクレオチド（天然ヌクレオチド又はウラシルヌクレオチド）の突出。
【００８５】
（１）Ｒａｇ１-２９は、アンチセンス鎖における突出を除去することにより二本鎖体の５’平滑末端に非対称構造を実現することにより、アンチセンス鎖における突出（ｏｖｅｒｈａｎｇ）がｐ２１遺伝子の誘導に必要なものであるか否かを確定するものであり、その構造式として、センス鎖が（Ｓ20+３ＮＯ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ20）、二本鎖体が（Ｂ5＋ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００８６】
（２）Ｒａｇ１-３０は、３’末端に２つのウラシルヌクレオチド突出を有しつつ裁断されたセンス鎖であり、そのうち、５’末端のヌクレオチドが除去されるので、アンチセンス鎖に天然ヌクレオチドからなる３ヌクレオチド突出を発生させた。その構造式として、センス鎖が（Ｓ18＋３Ｕ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ18＋３ＮＯ3）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００８７】
（３）Ｒａｇ１-３１は、Ｒａｇ１-３０と類似するが、センス鎖における突出を除去することで平滑末端の非対称構造を形成した。その構造式として、センス鎖が（Ｓ18）、アンチセンス鎖が（ＡＳ18＋３ＮＯ3）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００８８】
（４）Ｒａｇ１-３２は、Ｒａｇ１-２９と類似するが、アンチセンス鎖の３’末端において天然突出を２つのウラシルヌクレオチド突出に置換させたものである。その構造式として、センス鎖が（Ｓ20＋３ＮＯ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ20＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００８９】
（５）Ｒａｇ１-３３は、Ｒａｇ１-３２と類似するが、センス鎖において、ミスマッチしたシトシンヌクレオチドをアグアニル酸に置き換えてゆらぎ（ｗｏｂｂｌｅ）塩基対合による活性への影響をテストするものである。その構造式として、センス鎖が（Ｓ20＋３ＮＯ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ20＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００９０】
（６）Ｒａｇ１-３４は、Ｒａｇ１-３２と類似するが、センス鎖における５’末端のヌクレオチドが欠失したものである。その構造式として、センス鎖が（Ｓ19＋３ＮＯ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３ＮＯ3）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００９１】
（７）Ｒａｇ１-３５は、Ｒａｇ１-３２の平滑末端の誘導体であり、そのうち、センス鎖における突出が除去された。その構造式として、センス鎖が（Ｓ20）、アンチセンス鎖が（ＡＳ20＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（Ｂ３＋ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００９２】
（８）Ｒａｇ１-３６は、Ｒａｇ１-３５と類似し、センス鎖の５’末端における１個のヌクレオチドを削除して平滑末端非対称構造を形成したものである。その構造式として、センス鎖が（Ｓ19）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３ＮＯ3）、二本鎖体が（Ｂ３＋ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００９３】
（９）Ｒａｇ１-３７は、Ｒａｇ１-３６と類似し、ミスマッチしたシトシンヌクレオチドがセンス鎖から欠失し、アンチセンス鎖の５’末端にモノヌクレオチドの突出末端を発生させたものである。その構造式として、センス鎖が（Ｓ18）、アンチセンス鎖が（５ＮＯ1＋ＡＳ18＋３ＮＯ3）、二本鎖体が（ＯＨAS5'）となる。
【００９４】
（１０）Ｒａｇ１-３８は、Ｒａｇ１-２７の一般的でない誘導体であり、アンチセンス鎖の５’末端に、センス鎖の３’突出とマッチングするためにジヌクレオチドを含むミスマッチが延伸するとともに、アンチセンス鎖にモノヌクレオチドの３’突出が存在する。その構造式として、センス鎖が（Ｓ18＋３Ｕ2）、アンチセンス鎖が（５Ｕ2＋ＡＳ18＋３ＮＯ1）、二本鎖体が（ＯＨAS5'＋ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００９５】
（１１）Ｒａｇ１-３９は、Ｒａｇ１-３３の誘導体であり、そのうち、アンチセンス鎖におけるミスマッチしたシトシンがグアノシンで置換され、二本鎖体の長さが１個の塩基対分短くなった。その構造式として、センス鎖が（Ｓ18＋３ＮＯ2）、アンチセンス鎖が（ＡＳ18＋３ＮＯ3）、二本鎖体が（ＭＭ(3'1S:A,G)）となる。
【００９６】
（１２）Ｒａｇ１-４０は、Ｒａｇ１-２６の誘導体であり、センス鎖における突出を除去することにより、平滑末端が非対称にさせた。その構造式として、センス鎖が（Ｓ19）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（Ｂ３＋ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【００９７】
（１３）Ｒａｇ１-４１は、Ｒａｇ１-４０と類似し、そのうち、センス鎖におけるミスマッチしたシトシンがグアノシンで置換された。その構造式として、センス鎖が（Ｓ19）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（Ｂ３＋ＭＭ(3'1S:A,G)）となる。
【００９８】
（１４）Ｒａｇ１-４２もＲａｇ１-４０と類似し、ミスマッチしたヌクレオチドのみがセンス鎖から欠失することにより、アンチセンス鎖の５’末端にモノヌクレオチドの突出末端を発生させたものである。その構造式として、センス鎖が（Ｓ18）、アンチセンス鎖が（５ＮＯ1＋ＡＳ18＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（ＯＨAS5'）となる。
【００９９】
（１５）Ｒａｇ１-４３もＲａｇ１-４０と類似し、二本鎖体の長さが１つの塩基対分短くなったものである。その構造式として、センス鎖が（Ｓ18）、アンチセンス鎖が（ＡＳ18＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（Ｂ３＋ＭＭ(3'1S:A,C)）となる。
【０１００】
（１６）Ｒａｇ１-４４はＲａｇ１-３７と類似し、二本鎖体の長さが１つの塩基対分短くなったものである。その構造式として、センス鎖が（Ｓ17）、アンチセンス鎖が（５ＮＯ1＋ＡＳ18＋３ＮＯ3）、二本鎖体が（ＯＨAS5'）となる。
【０１０１】
上記二本鎖体ｓａＲＮＡ（Ｒａｇ１-２９〜Ｒａｇ１-４４）をそれぞれＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ、ＵＭ-ＵＣ-３、T２４、J８２又はＰＣ３細胞株にトランスフェクションし、７２時間後に遺伝子発現を評価した。図１６（Ａ）〜（Ｅ）に示すように、Ｒａｇ１-２９及びＲａｇ１-３８は、全ての細胞株においてｐ２１発現を誘導する能力をほとんど喪失していた。この２つの二本鎖体のアンチセンス鎖に少なくとも２ヌクレオチドの突出末端を有しないため、この特徴はｐ２１遺伝子の誘導活性に対して不可欠なものである。逆に、センス鎖における３’突出末端は全く無くてもよい。これは、Ｒａｇ１-３１、Ｒａｇ１-３５、Ｒａｇ１-３６、Ｒａｇ１-４０、Ｒａｇ１-４１及びＲａｇ１-４３は、いずれも強い活性を保っているからである。また、二本鎖体の３’末端のヌクレオチドミスマッチの存在は、活性を最大化することに対して重要である。なぜならば、他の強い活性ｓａＲＮＡに比べて、センス鎖の３’末端におけるミスマッチしたヌクレオチドが除去されるので、Ｒａｇ１-３７、Ｒａｇ１-４２及びＲａｇ１-４４のｐ２１活性化能力が低下したからである。アンチセンス鎖においてシチジンの代わりにグアノシンを用いて、アンチセンス鎖におけるグアノシンとＧ-Ｕミスマッチを形成する場合（例えば、Ｒａｇ１-３９及びＲａｇ１-４１）は、ｓａＲＮＡの活性に対して悪影響をもたらす可能性もあるが、Ｒａｇ１-３３においてこのような悪影響がない。これは、Ｒａｇ１-３３の二本鎖体の二本鎖領域の長さ（２０個のヌクレオチドを有するが、Ｒａｇ１-３９及びＲａｇ１-４０はそれぞれ１８個と１９個のヌクレオチドを有する）による正影響によりＧ-Ｕミスマッチによる悪影響が相殺されるかと推定される。これにもかかわらず、シトシンミスマッチを他のヌクレオチドに含ませることにより遺伝子誘導活性を最適化する好みをさらにサポートする。
【０１０２】
ＣＣＫ-８法を用いて各細胞株の細胞活力を検出し（図１７（Ａ）-（Ｅ））、遺伝子誘導活性（図１６（Ａ）-（Ｅ））と結合して総合的に分析したところ、二本鎖体Ｒａｇ１-３０、Ｒａｇ１-３２、Ｒａｇ１-３５及びＲａｇ１-４０はいずれも最大の遺伝子誘導活性とがん細胞増殖に対する強い抑制作用を有することがわかった。ちなみに、Ｒａｇ１-３５及びＲａｇ１-４０はそれぞれＲａｇ１-２３及びＲａｇ１-２６の変異体であるが、いずれも平滑末端の非対称構造、シトシンミスマッチ及び天然クレオチド突出を有するので、後者は二本鎖体のアンチセンス鎖の全長を予期の標的部位と１００％相補的なものにしたため、顕著に改善された遺伝子誘導と腫瘍細胞増殖の抑制活性を示していた。
【０１０３】
Ｒａｇ１-３６二本鎖体は、ｐ２１発現の強力な活性化剤であるが、全てのテストした細胞株では一部又は全部の細胞増殖抑制活性が失われていた。これは、全てのテストされた小分子活性化ＲＮＡ変異体における唯一の遺伝子誘導活性と細胞増殖抑制活性が一致しない二本鎖体である。このような独特の特性は、Ｒａｇ１-３６の配列及び/又は構造特徴に関連する可能性があり、このような特徴は、目標遺伝子の発現の誘導のみが必要であり、細胞成長を過剰に抑制する必要がない場合に用いられる可能性がある。
実施例９：構造特徴の組み合わせの最適化の検証
【０１０４】
出願人は、ｐ２１遺伝子プロモーターを標的とする通常構造ｓａＲＮＡ  ＲＡＧ-４３１-０、ＲＡＧ-５５３-０、ＲＡＧ-６８８-０及びＲＡＧ-６９３-０及びそれらのそれぞれの３種の変異体を設計合成し、その構造式は以下のとおりである（図１８）。
ＲＡＧ-４３１-１：センス鎖（Ｓ19）、アンチセンス鎖（ＡＳ19+３ＮＯ2）、二本鎖体（Ｂ３＋ＭＭ(3'1S:U,C)）
ＲＡＧ-４３１-３：センス鎖（Ｓ19+３Ｔ2）、アンチセンス鎖（ＡＳ19）、二本鎖体（Ｂ５＋ＭＭ(5'1AS:U,C)）
ＲＡＧ-５５３-１：センス鎖（Ｓ19）、アンチセンス鎖（ＡＳ19+３ＮＯ2）、二本鎖体（Ｂ３+ＭＭ(3'1S:G,C)）
ＲＡＧ-５５３-３：センス鎖（Ｓ19+３Ｔ2）、アンチセンス鎖（ＡＳ19）、二本鎖体（Ｂ５+ＭＭ(5'1AS:U,C)）
ＲＡＧ-６８８-１：センス鎖（Ｓ19）、アンチセンス鎖（ＡＳ19+３ＮＯ2）、二本鎖体（Ｂ３+ＭＭ(3'1S:A,C)）
ＲＡＧ-６８８-３：センス鎖（Ｓ19+３Ｔ2）、アンチセンス鎖（ＡＳ19）、二本鎖体（Ｂ５+ＭＭ(5'1AS:U,C)）
ＲＡＧ-６９３-１：センス鎖（Ｓ19）、アンチセンス鎖（ＡＳ19+３ＮＯ2）、二本鎖体（Ｂ３+ＭＭ(3'1S:U,C)）
ＲＡＧ-６９３-３：センス鎖（Ｓ19+３Ｔ2）、アンチセンス鎖（ＡＳ19）、二本鎖体（Ｂ５+ＭＭ(5'1AS:U,C)）
【０１０５】
ＲＡＧ-４３１-０及びその変異体をＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞にトランスフェクションし、ＲＡＧ-４３１-０は、ｐ２１の発現を９．３７倍誘導し、その変異体であるＲＡＧ-４３１-１及びＲＡＧ-４３１-３はそれぞれｐ２１の発現を１８．３５倍及び１２．２６倍誘導した（図１９）。
【０１０６】
ＲＡＧ-５５３-０及びその変異体をＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞にトランスフェクションし、ＲＡＧ-５５３-０はｐ２１の発現を１０．６２倍誘導し、その変異体であるＲＡＧ-５５３-１及びＲＡＧ-５５３-３はそれぞれｐ２１の発現を１５．１０倍及び１５．６１倍誘導した（図１９）。
【０１０７】
ＲＡＧ-６８８-０及びその変異体をＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞にトランスフェクションし、ＲＡＧ-６８８-０はｐ２１の発現を１４．０３倍誘導し、その変異体であるＲＡＧ-６８８-１及びＲＡＧ-６８８-３はそれぞれｐ２１の発現を１８．２８倍及び６．３６倍誘導した（図１９）。
【０１０８】
ＲＡＧ-６９３-０及びその変異体をＫｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ細胞にトランスフェクションし、ＲＡＧ-６９３-０はｐ２１の発現を７．０４倍誘導し、その変異体であるＲＡＧ-６９３-１及びＲＡＧ-６９３-３はそれぞれｐ２１の発現を１０．５４倍及び６．８５倍誘導した（図１９）。
【０１０９】
本出願人は、ＫＬＦ４遺伝子プロモーターを標的とするｓａＲＮＡ  ＫＬＦ４-０及びその変異体であるＫＬＦ４-１をさらに設計合成し、その構造がＲａｇ１-４０と類似し、構造式として、センス鎖が（Ｓ19）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（Ｂ３＋ＭＭ(3'1S:A,C)）である（図２０）。これらのｓａＲＮＡをＰＣ３、Ｋｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ及びＢｅｌ-７４０２細胞にトランスフェクションし、ＫＬＦ４-０は、ＫＬＦ４の発現をそれぞれ２．６４倍、１．５７倍及び１．３１倍誘導したが、ＫＬＦ４-１変体によるＫＬＦ４の発現の誘導活性がいずれもＫＬＦ４-０よりも優れ、ＰＣ３、Ｋｕ-７-ｌｕｃ２-ＧＦＰ及びＢｅｌ-７４０２細胞ではそれぞれ３．４２倍、１．７７倍及び１．４３倍であった（図２１（Ａ）-（Ｃ））。
【０１１０】
本出願人は、ＮＫＸ３-１遺伝子プロモーターを標的とするｓａＲＮＡ  ＮＫＸ３-１-０及びその変異体であるＮＫＸ３-１-１、ＮＫＸ３-１-２、ＮＫＸ３-１-３を設計合成し、これらの変異体の構造がＲａｇ１-４０と類似する。ＮＫＸ３-１-１の構造式は、センス鎖が（Ｓ19）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（Ｂ３＋ＭＭ(3'1S:A,C)）である。ＮＫＸ３-１-２の構造式は、センス鎖が（Ｓ19）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（Ｂ３＋ＭＭ(3'1S:A,G)）である。ＮＫＸ３-１-３の構造式は、センス鎖が（Ｓ19）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（Ｂ３＋ＭＭ(3'1S:A,U)）である。これらのｓａＲＮＡをＰＣ３及びＢｅｌ-７４０２細胞にトランスフェクションし、ＮＫＸ３-１-０は、ＮＫＸ３-１の発現をそれぞれ２．７倍及び１．６７倍誘導し、その変異体であるＮＫＸ３-１-１、ＮＫＸ３-１-２、ＮＫＸ３-１-３によるＮＫＸ３-１の発現の誘導活性はいずれもＮＫＸ３-１-０よりも優れる（図２２（Ａ）-（Ｂ））。
【０１１１】
本出願人は、ＶＥＧＦＡ遺伝子プロモーターを標識とするｓａＲＮＡ  ＶＥＧＦ-０及びその変異体であるＶＥＧＦ-１をさらに設計合成し、その構造がＲａｇ１-４０と類似し、構造式として、センス鎖が（Ｓ19）、アンチセンス鎖が（ＡＳ19＋３ＮＯ2）、二本鎖体が（Ｂ３＋ＭＭ(3'1S:A,C)）である（図２０）。これらのｓａＲＮＡをＨｅＬａ、ＣＯＳ-１又はＡＲＰＥ-１９細胞にトランスフェクションし、ＶＥＧＦ-０はＶＥＧＦＡの発現をそれぞれ１．２２倍、１．１１倍及び１．５１倍誘導した。ＶＥＧＦ-０の変異体であるＶＥＧＦ-１によるＶＥＧＦＲの発現の誘導活性はＶＥＧＦ-０よりも優れる（図２３（Ａ）-（Ｃ））。
【０１１２】
上記の分析結果から、ｓａＲＮＡをＲａｇ１-４０と類似する構造と設計した場合、特定の配列を問わず、遺伝子の活性化の活性という点でいずれも一般的なｓａＲＮＡよりも優れている。具体的には、アンチセンス鎖の３’突出は、天然ヌクレオチド突出（例えば、ＲＡＧ-４３１-１、ＲＡＧ-５５３-１、ＲＡＧ-６８８-１、ＲＡＧ-６９３-１、ＮＫＸ３-１-１、ＮＫＸ３-１-２及びＮＫＸ３-１-３）であってもよいし、ＵＵ突出（例えばＫＬＦ４-１及びＶＥＧＦ-１）であってもよい。突然変異したヌクレオチドは、Ｃ（例えば、ＲＡＧ-４３１-１、ＲＡＧ-４３１-３、ＲＡＧ-６８８-１、ＲＡＧ-６８８-３、ＲＡＧ-６９３-１、ＮＫＸ３-１-１、ＫＬＦ４-１、ＶＥＧＦ-１）、Ａ（ＲＡＧ-５５３-１及びＲＡＧ-５５３-３）、Ｇ（ＮＫＸ３-１-２）及びＵ（例えば、ＮＫＸ３-１-３）であってもよい。
【０１１３】
実施例１０  ｐ２１  ｓａＲＮＡ  Ｒａｇ１-４０によるマウス体内でのヒト皮下移植腫瘍の成長に対する抑制
ｓａＲＮＡ製剤の調製：ｓａＲＮＡ送達システムは、ｉｎ  ｖｉｖｏ-ｊｅｔＰＥＩ（２０１-１０Ｇ，Ｐｏｌｙｐｌｕｓ-ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ，フランス）を用い、メーカーから提供した調製方法に従って製剤を調製した。その過程を簡単に説明すると、まず、ｓａＲＮＡを１０％グルコース溶液に希釈して溶液Ａを得た。次に、必要な量のｉｎ  ｖｉｖｏ-ｊｅｔＰＥＩを１０％グルコース溶液に希釈して溶液Ｂを得た。その後、溶液Ａと溶液Ｂを等体積で混合し（Ｎ/Ｐ比が８であり、グルコースの最終濃度が５％である）、均一に混合した後、室温で１５分間静置する。
【０１１４】
対数増殖期のヒト肝細胞癌の細胞株ＨｅｐＧ２細胞を採取し、計数した後、細胞懸濁液を３．５×１０7個/ｍＬに調整し、ＢＡＬＢ/ｃヌードマウスの右腋皮下に０．２ｍＬ/匹で接種した。腫瘍が約１００ｍｍ3に成長して、担癌ヌードマウスを７匹/組でＶｅｈｉｃｌｅ（５％グルコース）群、ＲＡＧ１-４０投与群にランダムに分け、１、４、７日目に、ｓａＲＮＡを１ｍｇ・ｋｇ-１で腫瘍内注射した。１回目の投与（１日目）から、２日ごとにノギスで腫瘍の長径と短径を測定し、Ｖ=（Ｌ×Ｗ2）/２という式で腫瘍体積を算出した。ここで、Ｌは腫瘍塊の最長径、Ｗは腫瘍塊の表面と平行となるとともに長径に垂直となる直径をそれぞれ示す。投与中の腫瘍成長曲線及び解剖後の腫瘍の大きさ及び形態を記録した。
【０１１５】
図２４に示すように、異なる検出時点では、投与群の腫瘍成長が緩慢であり、投与後の７日目から、腫瘍が縮小する傾向にあり、体積は対照であるＶｅｈｉｃｌｅ群の腫瘍体積よりも著しく小さくなる。投与後の１０日目に投与群の腫瘍体積と治療開始時の体積と比べて１２．８％増加したが、Ｖｅｈｉｃｌｅ群の腫瘍体積は１１９．８％増加し、両群の腫瘍体積の変化にきわめて明らかな差異があり（Ｐ＜０．００１）、ｐ２１遺伝子発現を活性化できるｓａＲＮＡは体内腫瘍の成長に対して顕著な抑制作用を有することを証明した。
【０１１６】
関連参照
本明細書に引用された各特許文献及び科学文献の全ての開示内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０１１７】
等価
本発明は、その基本的な特徴から逸脱することなく他の具体的な形態で実施することができる。したがって、上記の実施例は、例示的なものであって、本発明を限定するものではないと考えられるべきである。本発明の範囲は上記の明細書ではなく特許請求の範囲によって示され、特許請求の範囲と均等の意味及び範囲内での全ての変更が含まれることが意図される。
【図１】
2021520221.tif 000019
【図２】
2021520221.tif 000020
【図３Ａ−Ｄ】
2021520221.tif 000021
【図３Ｅ−Ｈ】
2021520221.tif 000022
【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
2021520221.tif 000026
【図８】
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【図９】
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【図１０】
2021520221.tif 000029
【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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