(57)【要約】  本発明はＢＡＰまたはＢＡ細胞、得られたＢＡＰまたはＢＡ細胞集団、および医薬としてのそれらの使用に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の工程：
ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子を含む培地内で多能性細胞を培養して、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞を得る工程、
ｂ）該ｉＰＡＭ細胞を筋原性培地内で培養する工程、
ｃ）工程ｂ）の終了時に得られた細胞を、血清またはその同等物を含む、そして所望によりＦＧＦ２またはその同等物を更に含む培地内で、所望により更に培養する工程、
ｄ）工程ｂ）またはｃ）の終了時に得られた細胞を継代し、それらを培養皿内に播くことにより、ＢＡＰ細胞を選択する工程
を含む、ＢＡＰ細胞の製造方法。
【請求項２】
好ましくは請求項１記載の工程ａ）、工程ｂ）、所望により工程ｃ）、および工程ｄ）を含み、更に以下の工程：
ｅ）選択されたＢＡＰ細胞、好ましくは、工程ｄ）の終了時に得られうる細胞を、血清またはその同等物を含む脂肪生成培地内で培養して、ＢＡ細胞を得る工程
を含む、好ましくは請求項１記載の、ＢＡ細胞の製造方法。
【請求項３】
工程ａ）を、骨形成経路（ＢＭＰ）シグナル伝達経路のインヒビター、および所望によりＤＭＳＯを更に含む培地内で行う、請求項１または２記載の製造方法。
【請求項４】
ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路が正規Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路および／またはＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路である；
ｂ）ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターが、ノギン、コーディン、コーディン様１〜３、フォリスタチン、フォリスタチン様１〜５、Ｄａｎファミリーのメンバーならびにそれらの変異体および断片からなる群から選択される、請求項１〜３のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項５】
培地、血清またはその同等物、ＢＭＰ受容体のインヒビター、ｃ−ＭＥＴ受容体の活性化因子およびＩＧＦまたはインスリン受容体の活性化因子を含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる筋原性培地を使用して、工程ｂ）を行う、請求項１〜４のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項６】
培地、ＴＧＦベータ／アクチビン／ＮＯＤＡＬ経路のインヒビター（好ましくはＳＢ４３１５４２）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）受容体の活性化因子（好ましくはＥＧＦ）、アスコルビン酸、およびコルチコイド受容体の活性化因子（好ましくはヒドロコルチゾン）を含む、または実質的にそれらからなる脂肪生成培地を使用して、工程ｅ）を行う、請求項２〜５のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項７】
ＢＡ細胞がＵＣＰ１の発現により特徴づけられる、請求項２〜６のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項８】
ＢＡＰ細胞が、ＵＣＰ１を発現するＢＡ細胞に変換されるその能力により特徴づけられる、請求項１〜６のいずれか１項記載の製造方法。
【請求項９】
ＵＣＰ１を発現する細胞を、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の割合で含む、請求項２〜７のいずれか１項記載の製造方法により得られうるＢＡ細胞の集団。
【請求項１０】
請求項９記載のＢＡ細胞の集団へと変換されるＢＡＰ細胞集団の能力により特徴づけられる、請求項１、３、４、５、８のいずれか１項記載の製造方法により得られうるＢＡＰ細胞の集団。
【請求項１１】
医薬としての使用のための、請求項９または１０記載のＢＡＰまたはＢＡ細胞の集団。
【請求項１２】
請求項９〜１１のいずれか１項記載のＢＡＰまたはＢＡ細胞の集団を含む組成物であって、好ましくは該組成物が医薬組成物である、組成物。
【請求項１３】
医薬が、ＢＡまたはＢＡＰ細胞活性に関連した疾患または状態を治療するためのものであり、該疾患または状態が、好ましくは、肥満関連病態、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）、エネルギーバランス（摂取対消費）障害のような代謝性疾患または状態である、請求項１１記載のＢＡＰまたはＢＡ細胞の集団。
【請求項１４】
スクリーニング目的のための、請求項９または１０記載のＢＡＰまたはＢＡ細胞の集団の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明はＢＡＰ（褐色脂肪細胞前駆体）またはＢＡ（褐色脂肪細胞）細胞の製造方法、ＢＡＰまたはＢＡ細胞集団、および医薬としてのそれらの使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
哺乳類では、２つの主要なタイプの脂肪細胞、すなわち、褐色脂肪細胞（ＢＡ）および白色脂肪細胞（ＷＡ）が共存し、これらは全て、エネルギーバランスの調節に関与する一方で、逆の機能を有する。白色脂肪組織（ＷＡＴ）は全身に分散しており、主にエネルギー貯蔵に関与している。ＷＡＴとは対照的に、褐色脂肪組織（ＢＡＴ）はエネルギー消費に特化している。活性化されたＢＡＴは代謝基質を消費し、脂肪を燃焼させて、脱共役タンパク質（ＵＣＰ）−１を介して熱を生成させる。この組織は新生児および越年性種において大量に見出される。ヒトにおいては、ＢＡＴの量は経時的に減少し、成人では小さな沈着物として見出されうるに過ぎない。
【０００３】
ＢＡは重要な治療的潜在性を有する。脂肪を燃焼させて熱を生成させ、身体の恒温性を調節することにおいて、ＢＡは体重減少を促進させ、または血糖のような代謝パラメータを調節することが示されている。したがって、ＢＡＰおよび／またはＢＡの細胞供給源が臨床において緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
発明の概括
本発明はＢＡＰ細胞の製造方法に関する。該方法は、以下の工程：
ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子を含む培地内で多能性細胞を培養して、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞を得る工程、
ｂ）該ｉＰＡＭ細胞を筋原性培地内で培養する工程、
ｃ）工程ｂ）の終了時に得られた細胞を、血清またはその同等物を含む、そして所望によりＦＧＦ２またはその同等物を更に含む培地内で、所望により更に培養する工程、
ｄ）工程ｂ）またはｃ）の終了時に得られた細胞を継代し、それらを培養皿内に播くことにより、ＢＡＰ細胞を選択する工程
を含む。
【０００５】
本発明はまた、ＢＡ細胞の製造方法にも関する。該方法は、好ましくは、ＢＡＰ細胞の製造方法において定義される工程ａ）、ｂ）、所望により工程ｃ）、工程ｄ）を含み、それに続いて以下の工程：
ｅ）選択されたＢＡＰ細胞、好ましくは、工程ｄ）の終了時に得られうる細胞を、血清またはその同等物を含む脂肪生成培地内で培養して、ＢＡ細胞を得る工程を含む。
【０００６】
１つの実施形態においては、工程ａ）は、骨形成経路（ＢＭＰ）シグナル伝達経路のインヒビター、および所望によりＤＭＳＯを更に含む培地内で行われうる。
【０００７】
好ましい実施形態においては、
ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路は正規（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路および／またはＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路である；
ｂ）ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターは、ノギン、コーディン、コーディン様１〜３、フォリスタチン、フォリスタチン様１〜５、Ｄａｎファミリーのメンバーならびにそれらの変異体および断片からなる群から選択される。
【０００８】
もう１つの実施形態においては、工程ｂ）で使用される筋原性培地は培地、血清またはその同等物、ＢＭＰ受容体のインヒビター、ｃ−ＭＥＴ受容体の活性化因子およびＩＧＦまたはインスリン受容体の活性化因子を含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる。
【０００９】
１つの実施形態においては、工程ｅ）の脂肪生成培地が培地、ＴＧＦベータ／アクチビン／ＮＯＤＡＬ経路のインヒビター（好ましくはＳＢ４３１５４２）、ＥＧＦ受容体の活性化因子（好ましくはＥＧＦ（上皮増殖因子））、アスコルビン酸、およびコルチコイド受容体の活性化因子（好ましくはヒドロコルチゾン）を含む、または実質的にそれらからなる方法を行う。
【００１０】
もう１つの実施形態においては、ＢＡ細胞またはＢＡ細胞の集団はＵＣＰ１の発現により特徴づけられる。
【００１１】
本発明はまた、本明細書中に定義されている方法により得られうるＢＡ細胞の集団に関するものであり、該細胞集団は、ＵＣＰ１を発現する細胞を、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の割合で含む。
【００１２】
本発明はまた、本明細書中に定義されているＢＡ集団に変換される該集団の能力により特徴づけられる、本明細書中に定義されている方法により得られうるＢＡＰ細胞の集団に関する。
【００１３】
好ましくは、該ＢＡＰまたはＢＡ細胞集団は医薬としての使用のためのものである。より好ましくは、医薬は、ＢＡまたはＢＡＰ細胞活性に関連した疾患または状態を治療するためのものであり、これらは、好ましくは、肥満関連病態、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）、エネルギーバランス（摂取対消費）障害のような代謝性疾患または状態である。
【００１４】
本発明はまた、スクリーニング目的のための、本明細書中に定義されているＢＡＰまたはＢＡ細胞の集団の使用に関する。
【００１５】
発明の詳細な説明
ＢＡＰ細胞の製造方法
第１の態様においては、ＢＡＰ細胞の製造方法を提供し、該方法は、以下の工程：
ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子を含む培地内で多能性細胞を培養して、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞を得る工程、
ｂ）該ｉＰＡＭ細胞を筋原性培地内で培養する工程、
ｃ）工程ｂ）の終了時に得られた細胞を、血清またはその同等物を含む、そして所望によりＦＧＦ２またはその同等物を更に含む培地内で、所望により更に培養する工程、
ｄ）工程ｂ）またはｃ）の終了時に得られた細胞を継代し、それらを培養皿内に播くことにより、ＢＡＰ細胞を選択する工程
を含む。
【００１６】
第２の態様においては、ＢＡ細胞の製造方法を提供し、ここで、好ましい実施形態においては、前記で定義された方法（すなわち、工程ａ）、ｂ）、所望により工程ｃ）、工程ｄ））を使用してＢＡＰ細胞を製造し、該方法は更に、以下の工程：
ｅ）工程ｄ）の終了時に得られうる選択されたＢＡＰ細胞を、血清またはその同等物を含む脂肪生成培地内で培養して、ＢＡ細胞を得る工程を含む。
【００１７】
両方の方法の文脈において、ＢＡＰまたはＢＡ細胞の製造に言及される。ＢＡＰまたはＢＡ細胞の発現は、ＢＡＰ細胞またはＢＡ細胞を含む又はそれらからなる又は実質的にそれらからなる集団により置換されうる。ＢＡＰ細胞およびＢＡ細胞は本明細書中で後記で特定される。
【００１８】
特に示されていない限り、本発明の方法に言及されている場合、特に示されていない限り、ＢＡＰ細胞の製造方法またはＢＡ細胞の製造方法に言及されている。
【００１９】
工程ａ
本発明の方法の工程ａ）において培養される細胞は、好ましくは、多能性細胞である。本明細書中で用いる「多能性細胞」なる語は、種々の異なる細胞系譜を生成させうる哺乳類未分化細胞を意味する。典型的には、多能性細胞は、以下のマーカー、すなわち、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ３および４、ＴＲＡ１／８１を発現しうる。Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ  ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ，２００７を参照されたい。細胞における所与マーカーの発現または存在は、「本出願の場合に適用される定義」なる題名の全般的説明において開示されているとおりに評価されうる。１つの実施形態においては、多能性細胞は哺乳類多能性細胞である。好ましくは、該多能性細胞はヒト多能性細胞である。もう１つの実施形態においては、多能性細胞は非ヒト哺乳類多能性細胞である。１つの実施形態においては、多能性細胞は幹細胞である。好ましくは、該幹細胞は胚性幹細胞である。あるいは、該幹細胞は成体幹細胞である。成体幹細胞が使用される場合、それは、ＢＡＰまたはＢＡ細胞が器官限局性幹細胞または間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から生成されうることを意味する。もう１つの実施形態においては、多能性細胞はヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ細胞）である。もう１つの実施形態においては、多能性細胞は非ヒト哺乳類胚性幹細胞である。典型的には、例えば以下の表に記載されているもののようなｈＥＳ細胞系（Ｌｏｓｅｒら，２０１０）が本発明の方法に使用されうる。
【表１】
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【００２０】
１つの実施形態においては、多能性細胞は非ヒト胚性幹細胞、例えばマウス幹細胞、げっ歯類幹細胞または霊長類幹細胞である。１つの実施形態においては、多能性細胞は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は、ある遺伝子の「強制的」発現を誘導することにより非多能性細胞（典型的には成人体細胞）から人工的に誘導された多能性幹細胞の一種である。ｉＰＳＣは、２００６年にマウス細胞から（ＴａｋａｈａｓｈｉおよびＹａｍａｎａｋａ，２００６）、そして２００７年にヒト細胞から（Ｔａｋａｈａｓｈｉら，２００７；Ｙｕら，２００７）最初に産生された。
【００２１】
本明細書中で用いる「Ｗｎｔシグナル伝達経路」なる語は、「正規Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路」および「Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路」の２つの経路に分類されうるシグナル伝達経路を示す。本明細書中で用いる「正規Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路」または「Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路」なる語は、その一般的な意味において、胚発生および癌における役割に関して最もよく知られているだけでなく成体動物における正常生理的プロセスにも関与しているタンパク質および他の生物活性分子（脂質、イオン、糖など）のネットワークを示す。「正規Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路」はグリコーゲンシンターゼキナーゼ３β（ＧＳＫ−３β）のＷｎｔ依存性阻害により特徴づけられ、これは、β−カテニンの、後の安定化をもたらし、ついでこれは核に移動して転写因子として作用する。「Ｗｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路」はＧＳＫ−３βまたはβ−カテニンを含まず、幾つかのシグナル伝達分岐［カルシウム依存性シグナル伝達、平面内細胞極性（ＰＣＰ）分子、小さなＧＴＰアーゼおよびＣ−Ｊｕｎ  Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）シグナル伝達を含む］を含む。これらの経路はＣｌｅｖｅｒｓ，２００６；Ｍｏｎｔｃｏｕｑｕｉｏｌら，２００６；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒら，２００９のような多数の総説に詳細に記載されている。
【００２２】
１つの実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達経路は正規Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路である。もう１つの好ましい実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達経路はＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路である。もう１つの好ましい実施形態においては、Ｗｎｔシグナル伝達経路は正規Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路およびＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路である。
【００２３】
本明細書中で用いる「活性化因子」または「Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化因子」（特に示されていない限り）なる語は、Ｗｎｔシグナル伝達活性を増強または促進または活性化する物質を示す。例えば、正規Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の場合、この活性は、ＬＥＦ／ＴＣＦ結合部位レポーターの確立された多量体を使用してＷｎｔレポーター活性により、および／またはＧＳＫ−３βの阻害により、および／または正規Ｗｎｔ標的遺伝子、例えばＴ、Ｔｂｘ６、Ｍｓｇｎ１もしくはＡｘｉｎ２の活性化により測定されうる。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達活性の活性化は、前記のＭｓｇｎ１レポーター活性（Ｃｈａｌ  Ｊら，２０１５）のＷｎｔの増加として評価されうる。該増加は少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％以上の増加でありうる。
【００２４】
１つの実施形態においては、本発明による正規Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路またはＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路の活性化因子は、脊椎動物種に由来する又は修飾されたＲ−スポンジンファミリーのメンバーである。１つの実施形態においては、Ｒ−スポンジンファミリーのメンバーは哺乳類Ｒ−スポンジンファミリーのメンバーである。特定の実施形態においては、本発明によるＲ−スポンジンファミリーのメンバーは、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３およびＲ−スポンジン４からなる群から選択される。特定の実施形態においては、本発明によるＲ−スポンジンファミリーのメンバーはＲ−スポンジン３である。特定の実施形態においては、本発明によるＲ−スポンジンファミリーのメンバーはＲ−スポンジン２である。
【００２５】
脊椎動物組換えＲ−スポンジンは商業的に購入可能であり、あるいは馴化培地として製造可能である。これは、Ｒ−スポンジンタンパク質のコード配列を含有する構築物をＣＯＳ細胞のようなコンピテント細胞内で発現させることを含む。Ｒ−スポンジンタンパク質は培地内に分泌される。馴化培地は多能性細胞に直接適用可能であり、あるいは基礎培地中で前希釈されうる。
【００２６】
本明細書中で用いる「Ｒ−スポンジン３」または「Ｒ−スポンジン２」なる語は、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する、脊椎動物における分泌タンパク質のファミリーのメンバーを意味する。ヒトＲ−スポンジン３タンパク質の例示的な配列はアクセッション番号ＮＰ １１６１７３．２（配列番号１）としてデータベース内に寄託されている。マウスＲ−スポンジン３タンパク質の例示的な配列はアクセッション番号ＮＰ ０８２６２７．３（配列番号２）としてデータベース内に寄託されている。ヒトＲ−スポンジン２タンパク質の例示的な配列はアクセッション番号ＮＰ ８４８６６０．３（配列番号３）としてデータベース内に寄託されている。マウスＲ−スポンジン２タンパク質の例示的な配列はアクセッション番号ＮＰ ７６６４０３．１（配列番号４）としてデータベース内に登録されている。
【００２７】
本明細書中で用いる「Ｒ−スポンジン３」なる語はＲ−スポンジン３野生型（天然）タンパク質の任意の機能的変異体をも含む。ただし、そのような機能的変異体は本発明の目的のための分化因子の有利な特性を保有していなければならない。１つの実施形態においては、該機能的変異体は、最も密接に関連する公知天然Ｒ−スポンジン３ポリペプチド配列、例えば、それぞれ配列番号１または配列番号２のヒトまたはマウスポリペプチドＲ−スポンジン３に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する、Ｒ−スポンジン３の機能的ホモログであって、関連野生型タンパク質と実質的に同じＷｎｔ活性化活性を保有するものである。もう１つの実施形態においては、該機能的変異体は、例えば、野生型Ｒ−スポンジン３タンパク質の少なくとも５０、１００または２００個の連続的アミノ酸を含む、Ｒ−スポンジン３の断片であって、実質的に同じＷｎｔ活性化活性を保有するものである。もう１つの実施形態においては、そのような機能的変異体は、参照番号Ｑ９ＢＸＹ４−２およびＣＡＩ２０１４２．１（配列番号５）として記載されているヒトＲ−スポンジン３のアイソフォーム２のようなＲ−スポンジン３遺伝子産物アイソフォームからなりうる。この文脈においては、「実質的に」は、好ましくは、そのような機能的変異体の活性が、それが由来する野生型または天然分子の活性の少なくとも４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％であることを意味する。この文脈においては、それが由来する野生型または天然分子の活性は、好ましくは、Ｗｎｔシグナル伝達経路を活性化する活性を意味する。
【００２８】
本明細書中で用いる「Ｒ−スポンジン２」なる語は、Ｒ−スポンジン２野生型（天然）タンパク質の任意の機能的変異体をも含む。ただし、そのような機能的変異体は本発明の目的のための分化因子の有利な特性を保有していなければならない。１つの実施形態においては、該機能的変異体は、最も密接に関連する公知天然Ｒ−スポンジン２ポリペプチド配列、例えば、それぞれ配列番号３または配列番号４のヒトまたはマウスポリペプチドＲ−スポンジン２に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する、Ｒ−スポンジン２の機能的ホモログであって、関連野生型タンパク質と実質的に同じＷｎｔ活性化活性を保有するものである。もう１つの実施形態においては、該機能的変異体は、例えば、野生型Ｒ−スポンジン２タンパク質の少なくとも５０、１００または２００個の連続的アミノ酸を含む、Ｒ−スポンジン２の断片であって、実質的に同じＷｎｔ活性化活性を保有するものである。もう１つの実施形態においては、該機能的変異体は、例えばそれぞれ参照番号Ｑ６ＵＸＸ９−２（配列番号６）または参照番号Ｑ６ＵＸＸ９−３（配列番号７）として記載されているヒトＲ−スポンジン２のアイソフォーム２またはアイソフォーム３のようなＲ−スポンジン２遺伝子産物アイソフォームからなりうる。
【００２９】
１つの実施形態においては、本発明の方法の工程ａ）で使用される活性化因子はＲ−スポンジン３とＲ−スポンジン２との組合せである。１つの実施形態においては、本発明の方法の工程ａ）で使用される活性化因子は配列番号５のヒトＲ−スポンジン−３アイソフォーム２でありうる。１つの実施形態においては、本発明の方法の工程ａ）で使用される活性化因子は配列番号６の配列のヒトＲ−スポンジン−２アイソフォーム２、または配列番号７の配列のヒトＲ−スポンジン−２アイソフォーム３でありうる。
【００３０】
もう１つの実施形態においては、適量の薬理学的ＧＳＫ−３βインヒビター、例えば化合物ＣＨＩＲ９９０２１またはその同等物を細胞環境内に直接導入することが、単独で、またはＲ−スポンジンと組合せて、該系におけるＷｎｔシグナル伝達経路の活性を増強するための代替手段として行われる。ＣＨＩＲ９９２０１の同等物は、Ｈｕａｎｇら，２０１７年に記載されているＣＨＩＲ９８０１４である。本明細書中で用いる「グリコーゲンシンターゼキナーゼ３ベータ」の「ＧＳＫ−３β」なる語は、特定の細胞基質上の或るセリンおよびスレオニンアミノ酸上のホスファート分子の付加を媒介するセリン／スレオニンプロテインキナーゼを示す。ＧＳＫ−３βのインヒビターがＷｎｔシグナル伝達経路を活性化しうることは当技術分野でよく知られている。例えば、ＣｏｈｅｎおよびＧｏｅｄｅｒｔ，２００４；Ｓａｔｏら，２００４；Ｔａｅｌｍａｎら，２０１０；ＷｕおよびＰａｎ，２０１０を参照されたい。好ましい実施形態においては、ＧＳＫ−３βのインヒビターはＣＨＩＲ９９０２１またはその同等物である。
【００３１】
本明細書中で用いる「誘導性沿軸中胚葉前駆体」または「ｉＰＡＭ」は、任意の細胞型に由来する、沿軸中胚葉の前駆体細胞の特徴を示す細胞を意味する。１つの実施形態においては、ｉＰＡＭ細胞は以下の特性により特徴づけられる：
ａ）それらは、沿軸中胚葉前駆体細胞に特徴的なバイオマーカー、例えばＴｂｘ６、エフリン（Ｅｐｈｒｉｎ）Ａ１、エフリンＢ２、ＥＰＨＡ４、ＰＤＧＦＲアルファ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ３、Ｐａｐｃ（Ｐｃｄｈ８）、Ｌｆｎｇ、Ｈｅｓ７、リップリー（Ｒｉｐｐｌｙ）１、リップリー２、ブラキュリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）（Ｔ）、Ｃｄｘ２、Ｃｄｘ４、Ｅｖｘ１、Ｃｘｃｒ４、Ｉｌｌ７ｒｄ、Ｆｇｆ８、Ｆｇｆ１７、Ｇｂｘ２、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｒｓｐｏ３、ＳＰ５、ＳＰ８、Ｈａｓ２、Ｄｋｋ１、Ｄａｃｔ１、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２またはＭｓｇｎ１遺伝子を発現し、例えば、Ｍｓｇｎ１プロモーターを含む遺伝子レポーターアッセイ（Ｃｈａｌ  Ｊら，２０１５）で測定された場合にはＭｓｇｎ１遺伝子を優先的に発現する；および
ｂ）それらは、少なくとも骨格、真皮または筋細胞系譜に分化しうる多能性細胞である；
ｃ）所望により、それらは長期自己再生特性を有していてもよく、例えば、それらは培養内で６か月以上維持されうる。
【００３２】
前記の誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞の多能性は、例えばＷＯ  ２０１３／０３０２４３に定められているプロトコルを用いて、例えば骨格、真皮または筋細胞系譜へのインビトロ分化により、インビトロで試験されうる。本発明において、本発明者らは、これらのｉＰＡＭ細胞がＢＡＰ細胞およびＢＡ細胞に分化しうることを実証した。本明細書中で用いる「多能性」なる語は、環境および培養条件に応じて複数の細胞系譜に分化しうる細胞を意味する。あらゆるタイプの体細胞系譜に分化しうる多能性である誘導性胚性幹細胞とは対照的に、本発明の誘導性沿軸中胚葉前駆体細胞は、限局した分化能を有する。
【００３３】
１つの実施形態においては、工程ａ）で多能性細胞の培養に使用されるＲ−スポンジン３の濃度は０．１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌである。１つの実施形態においては、工程ａ）で多能性細胞の培養に使用されるＲ−スポンジン２の濃度は１ｎｇ／ｍｌ〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ〜３０ｎｇ／ｍｌである。１つの実施形態においては、Ｒ−スポンジン３またはＲ−スポンジン２の濃度は約１０ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌである。１０ｎｇ／ｍｌの濃度では、多能性細胞の５０％〜７０％が誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞において分化する。１つの実施形態においては、多能性細胞は、Ｒ−スポンジン３またはＲ−スポンジン２の存在下、１〜１５日間またはより短い期間にわたって培養される。特定の実施形態において、多能性細胞は、Ｒ−スポンジン３または／およびＲ−スポンジン２の存在下、１０ｎｇ／ｍｌの濃度で少なくとも１０日間培養される。１つの実施形態においては、ＣＨＩＲ９９０２１の濃度は１〜５μＭまたは２〜４μＭまたは３μＭである。
【００３４】
好ましい実施形態においては、工程ａ）の培地は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路のインヒビター、および所望によりＤＭＳＯを更に含む。
【００３５】
本明細書中で用いる「ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビター」（特に示されていない限り「インヒビター」とも称される）なる語は、ＢＭＰ  Ｉ型およびＩＩ型受容体から構成されるヘテロ複合体への二量体ＢＭＰタンパク質の結合（これは、Ｉｄ遺伝子のような標的遺伝子の活性化およびＳｍａｄ１／５／８のリン酸化につながるリン酸化カスケードをもたら）により特徴づけられるＢＭＰ（骨形成タンパク質）シグナル伝達経路の活性化の低下をもたらす任意の天然または合成化合物を示す。典型的には、ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターはタンパク質Ｓｍａｄ  １、５および８のリン酸化レベルの低下を誘発する（ＧａｚｚｅｒｏおよびＭｉｎｅｔｔｉ，２００７）。
【００３６】
与えられた化合物がＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターであるかどうかを評価するための方法は当業者に公知である。典型的には、ある化合物がＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターであるとみなされるのは、該化合物の存在下で細胞を培養した後、該化合物の非存在下で培養された細胞と比較してリン酸化Ｓｍａｄ  １、５または８のレベルが減少する場合である。リン酸化Ｓｍａｄタンパク質のレベルは、該Ｓｍａｄタンパク質のリン酸化形態に特異的な抗体を使用するウエスタンブロットにより測定されうる。該減少は少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または１００％以上の減少でありうる。
【００３７】
Ｉｄ遺伝子のような標的遺伝子の活性化は、典型的には、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）を介した直接Ｉｄ  １／２／３転写産物（ｍＲＮＡ）産生により測定可能であり、発現レベルが該化合物の非存在下の対照状況と比較されうる。
【００３８】
ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターはＢＭＰアンタゴニスト、ＢＭＰ  Ｉ型および／またはＩＩ型受容体活性を遮断する化合物（ＢＭＰ  Ｉ／ＩＩ型受容体インヒビター）、ＢＭＰ  Ｉ型および／またはＩＩ型遺伝子発現のインヒビター、あるいはＢＭＰシグナル伝達経路の任意の下流段階を阻害する分子でありうる。ＢＭＰシグナル伝達のインヒビターは天然または合成化合物でありうる。ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターがタンパク質である場合、それは精製タンパク質または組換えタンパク質または合成タンパク質でありうる。１つの実施形態においては、ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターはＢＭＰ  Ｉ型受容体インヒビターである。
【００３９】
組換えタンパク質の多数の製造方法が当技術分野で公知である。与えられたタンパク質の配列または該タンパク質をコードするヌクレオチド配列の知見から、当業者は、標準的な分子生物学および生化学技術を用いて、該タンパク質を容易に製造することが可能である。
【００４０】
本発明の１つの実施形態においては、ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターは、ノギン、コーディンおよび関連タンパク質（コーディン様１／２／３）、フォリスタチンおよび関連タンパク質（フォリスタチン様１／２／３／４／５）、Ｄａｎファミリーのタンパク質［ケルベロス（Ｃｅｒｂｅｒｕｓ）１、グレムリン（Ｇｒｅｍｌｉｎ）１および２、Ｃｅｒｌ−２（ココ（Ｃｏｃｏ））、ＳＯＳＴ（スクレロスチン（Ｓｃｌｅｒｏｓｔｉｎ））、ＳＯＳＴＤＣ１（ワイズ（Ｗｉｓｅ））を含む］ならびにＢＭＰシグナル伝達経路を阻害するそれらの変異体および断片からなる群から選択される。本発明のもう１つの実施形態においては、ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターは、ＢＭＰ−１／トロロイド（Ｔｏｌｌｏｉｄ）様タンパク質、ＴＷＳＧ１（ｔｗｉｓｔｅｄ  ｇａｓｔｒｕｌａｔｉｏｎ）、ＴＭＥＦＦ（トモレグリン（Ｔｏｍｏｒｅｇｕｌｉｎ））、バイグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）、ＴＳＫ（ツクシ（Ｔｓｕｋｕｓｈｉ））、ＢＭＰＥＲ（クロスベインレス（Ｃｒｏｓｓｖｅｉｎｌｅｓｓ）２）、オゴン（Ｏｇｏｎ）（シズルド（Ｓｉｚｚｌｅｄ））、ＡＭＮ（アムニオンレス（Ａｍｎｉｏｎｌｅｓｓ））、ＣＴＧＦ（結合組織増殖因子）およびＨＳＰＧ［グリピカン（Ｇｌｙｐｉｃａｎ）３およびシンデカン（Ｓｙｎｄｅｃａｎ）４を含む］からなる群から選択される。もう１つの実施形態においては、ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターはノギンである。ノギンは哺乳類ノギン、好ましくはマウスノギン（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＮＰ ０３２７３７、配列番号１０により例示されるマウスノギン）またはヒトノギン（ＧｅｎＰｅｐｔアクセッション番号ＥＡＷ９４５２８、配列番号１１により例示されるヒトノギン）でありうる。それは精製体または組換え体でありうる。それは単量体または二量体形態でありうる。１つの実施形態においては、ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターは、ＢＭＰシグナル伝達伝達カスケードを阻害する化合物である。１つの実施形態においては、ＢＭＰシグナル伝達カスケードを阻害する化合物は合成化合物または化学化合物である。
【００４１】
もう１つの実施形態においては、ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターはＢＭＰＩ型受容体のインヒビターである。本明細書中で用いる「骨形成タンパク質」の「ＢＭＰ  Ｉ型受容体」なる語は、特定の細胞基質上の或るセリンおよびスレオニンアミノ酸へのホスファート分子の付加をもたらすセリン／スレオニンタンパク質キナーゼ活性を有する膜貫通タンパク質を示す。ＢＭＰ  Ｉ型受容体のインヒビターがＢＭＰシグナル伝達経路を遮断しうることは当技術分野でよく知られている。例えば、Ｙｕ  ＢＰら，２００８を参照されたい。好ましい実施形態においては、ＢＭＰ  Ｉ型受容体のインヒビターはドルソモルフィン（Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ）なる化合物または構造活性研究により得られる任意の誘導体である［Ｃｕｎｙ  ＧＤら，２００８］。ドルソモルフィン（６−［４−（２−ピペリジン−１−イル−エトキシ）フェニル］−３−ピリジン−４−イル−ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン；化合物Ｃとも称される）はＢＭＰ  Ｉ型受容体（ＡＬＫ２、３および６）を特異的に阻害する［Ｙｕ  ＰＢら，２００８］。好ましいインヒビターまたはＢＭＰ受容体はＬＤＮ１９３１８９である。ＬＤＮ１９３１８９はＢＭＰ  Ｉ型受容体Ａｌｋ２およびＡｌｋ３のインヒビターである。組換えノギン（Ｎｏｇｇｉｎ）はＲ＆Ｄ  ＳｙｓｔｅｍｓまたはＰｅｐｒｏｔｅｃｈから購入可能であり、あるいは前記の標準的な技術を用いて製造可能である。
【００４２】
典型的には、ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターは、本発明の方法の工程ａ）の培地に、１〜１００００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは５〜５００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２００ｎｇ／ｍｌの範囲、より一層好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加される。典型的には、ノギンは、本発明の方法の工程ａ）の培地に、１〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは１０〜２００ｎｇ／ｍｌ、より一層好ましくは約２００ｎｇ／ｍｌまたは２００ｎｇ／ｍｌの濃度で添加される。典型的には、ドルソモルフィンは、本発明の方法の工程ａ）の培地に０．１〜２μＭの範囲の濃度、好ましくは１μＭで添加される。ＬＤＮ１９３１８９の濃度は３００〜６００ｎＭ、または４００〜５００ｎＭ、または約５００ｎＭ、または５００ｎＭでありうる。１つの実施形態においては、多能性細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターの存在下、１〜４日間培養される。
【００４３】
１つの実施形態においては、工程ａ）の培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、本発明によるＷｎｔ活性化因子およびＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターを含む。１つの実施形態における該方法においては、
ａ）Ｗｎｔシグナル伝達経路は正規（ｃａｎｏｎｉｃａｌ）Ｗｎｔ／ベータカテニンシグナル伝達経路および／またはＷｎｔ／ＰＣＰシグナル伝達経路である；
ｂ）ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターは、ノギン、コーディン、コーディン様１〜３、フォリスタチン、フォリスタチン様１〜５、Ｄａｎファミリーのメンバーならびにそれらの変異体および断片からなる群から選択される。
【００４４】
１つの実施形態においては、Ｗｎｔ活性化因子はＲ−スポンジン３であり、ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターはノギンである。
【００４５】
もう１つの実施形態においては、工程ａ）で使用される培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を更に改善するために、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）またはＤＭＳＯの同等物を更に含みうる。本明細書中で用いる「同等」なる語は、極性化合物と無極性化合物との両方を溶解する溶媒であるＤＭＳＯと同じ特性を示す物質を意味する。
【００４６】
１つの実施形態においては、工程ａ）で使用される培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン３、ノギンおよびＤＭＳＯを含む。もう１つの実施形態においては、工程ａ）で使用される培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン３およびＤＭＳＯを含む。もう１つの実施形態においては、工程ａ）で使用される培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン２、ノギンおよびＤＭＳＯを含む。もう１つの実施形態においては、工程ａ）で使用される培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン２およびＤＭＳＯを含む。もう１つの実施形態においては、工程ａ）で使用される培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン３、ドルソモルフィンおよびＤＭＳＯを含む。もう１つの実施形態においては、工程ａ）で使用される培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン２、ドルソモルフィンおよびＤＭＳＯを含む。更にもう１つの実施形態においては、工程ａ）で使用される培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン２、ノギンおよびＤＭＳＯを含む。更にもう１つの実施形態においては、工程ａ）で使用される培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン２およびＤＭＳＯを含む。
【００４７】
更にもう１つの実施形態においては、工程ａ）で使用される培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン２、ドルソモルフィンおよびＤＭＳＯを含む。
【００４８】
もう１つの好ましい実施形態においては、系内のＲ−スポンジン因子の活性を増強するために、以下の代替手段が用いられうる：
１．該Ｒ−スポンジン因子またはＲ−スポンジンの修飾形態をコードする遺伝子の内因性発現を増強する；
２．制御配列に機能的に連結されたＲ−スポンジン因子のコード配列を含む発現ベクターを、分化されるべき多能性細胞内に導入することにより、またはＲ−スポンジン因子のコードＲＮＡを該細胞内に導入することにより、該Ｒ−スポンジン因子の異所性発現を可能にする；
３．適量のＲ−スポンジン因子を、例えば、培養培地もしくは馴化培地内の組換えＲ−スポンジン因子（Ｒ−スポンジン１、２、３および４のファミリー）として、または基体コーティングとして、細胞環境内に直接的に導入する；
４．該標的細胞におけるＲ−スポンジン因子シグナル伝達に関与する遺伝子の内因性発現を活性化または阻害する；あるいは、
５．該標的細胞におけるＲ−スポンジン因子の発現レベル、成熟および全体的調節の制御に関与するタンパク質を過剰発現させる。
【００４９】
１つの実施形態においては、工程ａ）の培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、ＣＨＩＲ９９０２１、および本発明によるＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターであるドルソモルフィンを含む。１つの実施形態においては、工程ａ）の培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、ＣＨＩＲ９９０２１、ドルソモルフィンおよびＤＭＳＯを含む。１つの実施形態においては、工程ａ）の培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３およびＣＨＩＲ９９０２１の組合せであるＷｎｔ活性化因子と、ノギンおよびドルソモルフィンの組合せであるＢＭＰシグナリングのインヒビターとを含む。更にもう１つの実施形態においては、工程ａ）の培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン２、ＣＨＩＲ９９０２１、ドルソモルフィンおよびＤＭＳＯを含む。更にもう１つの実施形態においては、工程ａ）の培地は、誘導性沿軸中胚葉前駆体（ｉＰＡＭ）細胞への多能性細胞の分化を改善するために、Ｒ−スポンジン３、Ｒ−スポンジン２、ＣＨＩＲ９９０２１、ノギンおよびＤＭＳＯを含む。更にもう１つの実施形態においては、工程ａ）の培地は、ＣＨＩＲ９９０２１およびＬＤＮ−１９３１８９を含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる。更にもう１つの実施形態においては、工程ａ）の培地は、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＬＤＮ−１９３１８９（５００ｎＭ）を含む、またはそれらからなるか、または実質的にそれらからなる。好ましい実施形態においては、活性化因子はＲ−スポンジンファミリーのメンバーである。もう１つの実施形態においては、活性化因子は、Ｒ−スポンジン１、Ｒ−スポンジン２、Ｒ−スポンジン３およびＲ−スポンジン４からなる群から選択される。もう１つの好ましい実施形態においては、活性化因子はＲ−スポンジン２またはＲ−スポンジン３である。もう１つの好ましい実施形態においては、活性化因子はＧＳＫ−３βのインヒビター、例えばＣＨＩＲ９９０２１である。もう１つの実施形態においては、本発明によるインヒビターはＢＭＰ／ＴＧＦベータファミリーの分泌性アンタゴニストである。もう１つの実施形態においては、ＢＭＰシグナル伝達経路のインヒビターは、ノギン、コーディン、コーディン様１／２／３、フォリスタチン、フォリスタチン様１／２／３／４／５、ダン（Ｄａｎ）ファミリーのメンバー（ケルベロス１、グレムリン１／２を含む）からなる群から選択される。もう１つの好ましい実施形態においては、インヒビターはノギンまたはフォリスタチンである。もう１つの好ましい実施形態においては、インヒビターはＢＭＰシグナル伝達の化学的インヒビター、例えばドルソモルフィンである。
【００５０】
工程ａ）の持続時間は、適量のｉＰＡＭ細胞またはｉＰＡＭ細胞集団が得られる限り、決定的なものではない。該持続時間はＢＭＰインヒビターの存在およびＤＭＳＯの存在によっても変動しうる。通常、工程ａ）の持続時間は３〜１２日または４〜１１日または５〜１０日または６〜９日の範囲であることが可能であり、あるいは３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２日でありうる。１つの実施形態においては、多能性細胞、好ましくはｉＰＳ、より好ましくはｈｉＰＳ細胞は、トリプシンを使用して単細胞に解離され、３．１０４〜９．１０４  細胞／ｃｍ２の範囲の密度で播かれる。好ましい密度は５．５．１０４  細胞／ｃｍ２である。培養は、Ｒｏｃｋ（ロック）−１インヒビター（１０μＭ）で補足されたｍＴＥＳＲ−１培地内で、マトリゲルがコーティングされた皿において行われうる。１日後、培地は、Ｒｏｃｋ−１インヒビターを含有しない新鮮なｍＴＥＳＲ−１と交換されうる。培地（好ましくは、ＩＴＳ（１％）で補足されたＤＭＥＭ）は第３日からＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）で補足されうる。培地は第６日まで毎日交換されうる。
【００５１】
沿軸中胚葉前駆体の唯一の特異的マーカーはＭｓｇｎ１である（Ｙｏｏｎ  ＪＫら，２０１５）。Ｍｓｇｎ１の発現は、「本出願の場合に適用される定義」なる題名の部分において説明されているとおりに評価されうる。本明細書中で用いるＭｓｇｎ１遺伝子は、メソゲニン（Ｍｅｓｏｇｅｎｉｎ）１をコードする遺伝子を意味する。本発明の場合、Ｍｓｇｎ１遺伝子は、Ｍｓｇｎ１をコードする哺乳類遺伝子、好ましくはマウスまたはヒト遺伝子を意味する。マウスおよびヒトにおけるメソゲニン１をコードする遺伝子のヌクレオチド配列の例は、それぞれ配列番号８（ＮＭ ０１９５４４．１）および配列番号９（ＮＭ ００１１０５５６９．１）に記載されている。
【００５２】
１つの実施形態においては、Ｍｓｇｎ１が発現しているとみなされるのは、遺伝子発現に関する定量アッセイにおいて発現が検出可能である場合である。もう１つの実施形態においては、Ｍｓｇｎ１が発現しているとみなされるのは、元の多能性細胞において観察される発現レベル、またはマウス多能性細胞の場合にはＬＩＦ（白血病抑制因子）を含有しない若しくはヒト多能性細胞の場合にはＦＧＦ（線維芽細胞増殖因子）を含有しない基礎培地のような非特異的条件下で分化している細胞において観察される発現レベルよりも発現レベルが有意に高い場合である。対照細胞および試験細胞間の発現レベルは、ＧＡＰＤＨやベータアクチンのような構成的発現遺伝子を使用して正規化されうる。
【００５３】
沿軸中胚葉前駆体細胞に特徴的な他のバイオマーカーには、限定的なものではないが以下のタンパク質の１以上が含まれる：Ｔｂｘ６、エフリン（Ｅｐｈｒｉｎ）Ａ１、エフリンＢ２、ＥＰＨＡ４、ＰＤＧＦＲアルファ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ３、Ｐａｐｃ（Ｐｃｄｈ８）、Ｌｆｎｇ、Ｈｅｓ７、リップリー（Ｒｉｐｐｌｙ）１、リップリー２、ブラキュリ（Ｂｒａｃｈｙｕｒｙ）（Ｔ）、Ｃｄｘ２、Ｃｄｘ４、Ｅｖｘ１、Ｃｘｃｒ４、Ｉｌｌ７ｒｄ、Ｆｇｆ８、Ｆｇｆ１７、Ｇｂｘ２、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｒｓｐｏ３、ＳＰ５、ＳＰ８、Ｈａｓ２、Ｄｋｋ１、Ｄａｃｔ１、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２。
【００５４】
これらのｉＰＡＭ集団は、典型的には、ｉＰＡＭ細胞に加えて他の細胞型を含みうる。１つの実施形態においては、工程ａ）の終了時に得られる集団は、それらが、ｉＰＡＭ細胞に特徴的な少なくとも１つのバイオマーカー、例えばＭｓｇｎ１を発現する細胞を、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、好ましくは少なくとも９０％の割合で含むことにより特徴づけられる。該マーカーの存在または発現の評価は、好ましくは、「本出願の場合に適用される定義」なる題名の部分において説明されているとおりに行われうる。ｉＰＡＭ細胞を含む集団は適切な増殖条件下で無期限に培養されうる。ｉＰＡＭ細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を選択することにより、ｉＰＡＭ細胞を精製することが可能であり、あるいは集団におけるｉＰＡＭ細胞を富化させることが可能である。１つの実施形態においては、集団におけるｉＰＡＭ細胞の精製または富化のための、ｉＰＡＭ細胞に特異的なマーカーは、Ｍｓｇｎ１でありうる。精製またはｉＰＡＭ細胞富化は、細胞選別技術、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気ビーズ（ｉＰＡＭ細胞の該細胞表面マーカーの特異的結合体またはｉＰＡＭマーカーに対する蛍光レポーターを含むもの）を使用して達成されうる。したがって、精製または富化後、集団は、ｉＰＡＭ細胞に特徴的なバイオマーカー、例えばＭｓｇｎ１を発現する細胞を、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上の割合で含みうる。
【００５５】
工程ｂ
工程ａ）の終了時に得られたｉＰＡＭ細胞またはｉＰＡＭ細胞含有集団をついで、筋原性培地内で培養する。前記のとおり、工程ａ）の終了時に得られた細胞は、まず、ｉＰＡＭ細胞の存在に関して、更に富化または精製されていてもよい。
【００５６】
本明細書中で用いる筋原性培地は、筋細胞前駆体および／または筋細胞の産生を促進、刺激、誘導する培地である。筋細胞の前駆体のマーカーはＰａｘ７でありうる（Ｚａｍｍｉｔら，２００６）。初期段階の筋細胞のマーカーはデスミンまたはミオゲニンでありうる（Ｐａｕｌｉｎら，２００４；Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍら，２０１４）。成熟筋細胞のマーカーはアルファアクチニンでありうる（Ｂｅｇｇｓら，１９９２）。これらのマーカーのそれぞれの発現は、「本出願の場合に適用される定義」なる題名の部分において説明されているとおりに評価されうる。
【００５７】
筋原性培地は、培地、血清またはその同等物（好ましくはＫＳＲ）、ＢＭＰ受容体のインヒビター、ｃ−ＭＥＴ受容体の活性化因子およびＩＧＦまたはインスリン受容体の活性化因子を含むこと、またはそれらからなること、または実質的にそれらからなることが可能である。本出願の場合の培地は、哺乳類細胞を培養するのに適した培地である。適切な培地は当業者に公知であり、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＭＥＭ、ハム（Ｈａｍ）のＦ１２、ＩＭＤＭ、ライボビッツ（Ｌｅｉｂｏｖｉｔｚ）培地１９９を包含する。好ましい培地はＤＭＥＭである。血清はウシ血清でありうる。好ましいウシ血清はウシ胎児血清である。もう１つの好ましい実施形態においては、血清の同等物は、Ｃｈａｌら，２０１５に記載されているＫＳＲ（ノックアウト血清置換）である。好ましいインヒビターまたはＢＭＰ受容体はＬＤＮ１９３１８９である。ＬＤＮ１９３１８９はＢＭＰ  Ｉ型受容体Ａｌｋ２およびＡｌｋ３のインヒビターである。ｃ−ＭＥＴ受容体の好ましい活性化因子はＨＧＦ（肝細胞増殖因子）である。ＩＧＦまたはインスリン受容体の好ましい活性化因子はＩＧＦ−１（インスリン増殖因子−１）である。
【００５８】
第１の実施形態においては、筋原性培地は培地、血清またはその同等物（好ましくはＫＳＲ）、ＢＭＰ受容体のインヒビター（好ましくはＬＤＮ１９３１８９）、ｃ−ＭＥＴ受容体の活性化因子（好ましくはＨＧＦ）およびＩＧＦまたはインスリン受容体の活性化因子（好ましくはＩＧＦ１）を含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる。この第１の実施形態における好ましい筋原性培地は培地、ＫＳＲ、ＬＤＮ１９３１８９、ＨＧＦおよびＩＧＦ−１を含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる。
【００５９】
第２の実施形態においては、筋原性培地は培地、血清またはその同等物（好ましくはＫＳＲ）、ｃ−ＭＥＴ受容体の活性化因子（好ましくはＨＧＦ）およびＩＧＦまたはインスリン受容体の活性化因子（好ましくはＩＧＦ１）を含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる。この第２の実施形態における好ましい筋原性培地は培地、ＫＳＲ、ＨＧＦおよびＩＧＦ−１を含む。
【００６０】
第３の実施形態においては、筋原性培地は培地、血清またはその同等物（好ましくはＫＳＲ）およびＩＧＦまたはインスリン受容体の活性化因子（好ましくはＩＧＦ１）を含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる。この第３の実施形態における好ましい筋原性培地は培地、ＫＳＲおよびＩＧＦ−１を含む。
【００６１】
好ましい工程ｂ）においては、第１の実施形態の筋原性培地を最初に使用し、ついで第３の実施形態の筋原性培地を使用し、ついで第２の実施形態の筋原性培地を使用する。第１の実施形態の筋原性培地における培養は１〜３日または２日の持続期間を有しうる。第３の実施形態の筋原性培地における培養は３〜６日または４〜５日または４日の持続期間を有しうる。第２の実施形態の筋原性培地における培養は８〜１２日または９〜１１日または１０日の持続期間を有しうる。
【００６２】
好ましい方法においては、培地、ＫＳＲ、ＬＤＮ１９３１８９、ＨＧＦおよびＩＧＦ−１を含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる筋原性培地を使用して、工程ｂ）を行う。
【００６３】
好ましい濃度は以下のとおりである：ウシ血清または胎児ウシ血清５〜１０％、ＫＳＲ  ８〜２０％または１０〜１８％または１２〜１６％または１３〜１６％または１４〜１６％または１５％。ＬＤＮ１９３１８９の好ましい濃度は３００〜６００ｎＭまたは４００〜５００ｎＭまたは約５００ｎＭまたは５００ｎＭである。ＨＧＦの濃度は８〜１２ｎｇ／ｍｌまたは９〜１１ｎｇ／ｍｌまたは約１０ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌでありうる。ＩＧＦ−１の濃度は０．８〜４ｎｇ／ｍｌまたは１〜３ｎｇ／ｍｌまたは１．５〜２．５ｎｇ／ｍｌまたは約２ｎｇ／ｍｌまたは２ｎｇ／ｍｌでありうる。この第１の実施形態における好ましい筋原性培地は培地、ＫＳＲ（１５％）、ＬＤＮ１９３１８９（５００ｎＭ）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）を含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる。
【００６４】
工程ｂ）の持続時間は決定的なものではない。該持続時間は、工程ｂ）の開始時に使用されるｉＰＡＭ細胞の数および／または筋原性培地内に存在する成分の種類によっても変動しうる。通常、工程ｂ）の持続時間は２〜１８日、３〜１８日または４〜１７日または５〜１６日または６〜１６日の範囲でありうる。
【００６５】
工程ｃ）
この工程は所望により行われうる。この工程は、工程ｂ）の終了時に得られた細胞または細胞集団を、血清またはその同等物を含む、そして所望によりＦＧＦ２（線維芽細胞成長因子２）またはその同等物を更に含む培地内で培養することを含む。ＦＧＦ２（線維芽細胞増殖因子２）はｂＦＧＦ（塩基性線維芽細胞増殖因子）と同一である。この工程は、存在するＢＡＰ細胞の数を増加させること、またはＢＡＰ細胞の数を富化させることを意図としている。なぜなら、細胞が筋肉経路に向かって分化することを誘発する筋原性培地がもはや存在しないからである。血清はウシ血清、好ましくはウシ胎児血清でありうる。血清は５〜１０％、好ましくは１０％の割合で存在しうる。血清の同等物はＫＳＲである。所望により、工程ｃ）においては、ＦＧＦ２またはその同等物が存在しうる。それは、工程ｃ）がＦＧＦ２の非存在下で行われうることを意味する。ＦＧＦ２の濃度は３〜７ｎｇ／ｍｌまたは４〜６ｎｇ／ｍｌまたは約５ｎｇ／ｍｌまたは５ｎｇ／ｍｌでありうる。ＫＳＲの濃度は工程ｂ）と同じでありうる。工程ｃ）の持続時間は決定的なものではない。該持続時間は、工程ｃ）の開始時に使用される筋原性細胞の数および／または工程ｂ）の筋原性培地内に存在する成分の種類および／または工程ｂ）の持続時間によっても変動しうる。通常、工程ｃ）の持続時間は３〜１５日または４〜１５日または５〜１５日または６〜１５日または３〜１２日または４〜１１日または５〜１０日または３〜９日または４〜８日または５〜７日の範囲または６日でありうる。培地は２日ごとに交換されうる。
【００６６】
工程ｄ）
工程ｄ）においては、工程ｂ）またはｃ）の終了時に得られた細胞または細胞集団を継代し、それらを培養皿内に播くことにより、該細胞または細胞集団を更に培養する。細胞を播くために用いる密度は組織培養等級のプレート上で３．１０４〜９．１０４  細胞／ｃｍ２の範囲であることが可能であり、好ましくは、細胞密度は５．１０４  細胞／ｍ２である。工程ｂ）またはｃ）の終了時に得られた細胞または細胞集団は幾つかのＢＡＰ細胞を既に含んでいる可能性がある。工程ｄ）はそれらを更に富化し増殖させることを意図している。工程ｄ）の培地は特異的分化のいずれの促進因子をも含んでいなくてもよい。工程ｄ）の培地は、本明細書に既に挙げられているような培地を含むこと、またはそれからなること、または実質的にそれらからなることが可能である。ＤＭＥＭは、細胞の増殖を促進または増進するため、好ましい。例えば、筋原性または脂肪生成性分化を誘導する化合物は工程ｄ）の培地内に全く存在しないことが可能である。通常、この培地はＤＭＥＭ、グルコース、血清またはその同等物およびＦＧＦ２またはその同等物を含みうる。１つの実施形態においては、ウシ血清が該培地内に存在する。１つの実施形態においては、ウシ胎児血清が該培地内に存在する。１つの実施形態においては、血清の同等物としてＫＳＲが使用される。１つの実施形態においては、５〜１０％のウシ血清またはウシ胎児血清が該培地内に存在する。ＫＳＲの濃度は、工程ｂ）に関して定められているとおりでありうる。１つの実施形態においては、３〜８ｎｇ／ｍｌまたは４〜７または４〜６または５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ２が該培地内に存在する。１つの実施形態においては、グルコースは０．５〜６ｇ／Ｌ、または０．８〜５ｇ／Ｌ、または１〜４．５ｇ／Ｌで存在する。好ましくは、グルコースは１ｇ／Ｌで存在する。工程ｄ）におけるＢＡＰ細胞の富化および増殖は、得られた細胞集団の均質性を評価することによりモニターされうる。均質性は細胞の形態、細胞の増殖能および／または所与マーカーの発現に関して評価されうる。均質細胞集団の好ましい形態は、紡錘形を意味する線維芽細胞様形態である。該形態は顕微鏡下で観察可能であろう。また、好ましい実施形態においては、均質細胞集団は、２４〜７２時間以内に９０〜１００％のコンフルエンス（集密度）に達するまで高度に増殖性である。通常、コンフルエント（集密）な細胞またはコンフルエント直前の細胞（９０〜１００％  コンフルエント）を５０  ０００細胞／ｃｍ２の密度で培養皿内に播く。好ましい実施形態においては、細胞集団が均質であり高度に増殖性であると言えるのは、２４〜７２時間以内にコンフルエンスに達する場合である。
【００６７】
工程ｄ）の持続時間は決定的なものではない。該持続時間は、工程ｃ）の開始時に使用される細胞の数および／または筋原性培地内に存在する成分の種類によっても変動しうる。工程ｄ）中の継代数は２〜１０、３〜９または少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０継代、または最大３、４、５、６、７、８、９、１０継代の範囲でありうる。好ましい実施形態においては、継代数は４〜９、より好ましくは少なくとも４、または４である。通常、各継代は２〜３日の持続期間を有する。通常、工程ｄ）の持続期間は３〜２７日または４〜２６日または５〜２５日または８〜１２日の範囲でありうる。該持続期間は、播かれた初期細胞の数に応じた補正を要しうる。工程ｄ）は、工程ｂ）またはｃ）の終了時に得られた細胞を継代し培養皿内に播くことにより、ＢＡＰ細胞を増殖させ富化することを意図としている。ＢＡＰ細胞またはＢＡＰ細胞集団は本明細書中で後記において定義される。
【００６８】
もう１つの態様においては、本発明はまた、ＢＡ細胞の製造方法に関する。該方法は、好ましくは前記の工程ａ）、ｂ）、所望により実施される工程ｃ）および工程ｄ）を含み、それに続いて以下の工程、すなわち、
ｅ）選択されたＢＡＰ細胞、好ましくは、工程ｄ）の終了時に得られうる細胞を、血清またはその同等物を含む脂肪生成培地内で培養して、ＢＡ細胞を得る工程を含む。
【００６９】
工程ｅ）
好ましくは工程ｄ）の終了時に得られた若しくは得られうる細胞、または好ましくは工程ｄ）の終了時に得られた若しくは得られうる細胞集団を脂肪生成培地内で更に培養して、ＢＡまたはＢＡ細胞集団を得る。本明細書中で用いる脂肪生成培地は、ＢＡ細胞の産生を促進、刺激、誘導する培地である。ＢＡ細胞は脂肪細胞の特殊な亜集団に相当する。ＢＡ細胞ではない幾つかの脂肪細胞も工程ｅ）の終了時に存在しうる。ＢＡ細胞はＵＣＰ１の発現により特徴づけられる。脂肪細胞はＦＡＢＰ４の発現により特徴づけられる。ＵＣＰ１およびＦＡＢＰ４の発現は、「本出願の場合に適用される定義」なる題名の説明部分に記載されているとおりに評価されうる。
【００７０】
１つの実施形態においては、方法の実施において、工程ｅ）の脂肪生成培地は培地、ＴＧＦベータ／アクチビン／ＮＯＤＡＬ経路のインヒビター（好ましくはＳＢ４３１５４２）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）受容体の活性化因子（好ましくはＥＧＦ）、アスコルビン酸、およびコルチコイド受容体の活性化因子（好ましくはヒドロコルチゾン）を含む、または実質的にそれらからなる。本明細書に記載されている脂肪生成培地のいずれにもインドメタシンが添加されうる。これは、そのような培地において一般に使用される分子である。好ましい実施形態においては、方法の実施において、工程ｅ）の脂肪生成培地は培地、ＳＢ４３１５４２、ＥＧＦ、アスコルビン酸およびヒドロコルチゾンを含む、または実質的にそれらからなる。
【００７１】
第１の実施形態においては、脂肪生成培地は培地、ＴＧＦ−ベータ／アクチビン／ＮＯＤＡＬ経路のインヒビター（好ましくはＳＢ４３１５４２）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）受容体の活性化因子（好ましくはＥＧＦ）、ＰＰＡＲガンマ活性化因子（好ましくはロシグリタゾン）、インスリン、Ｔ３ホルモン、アスコルビン酸、コルチコイド受容体の活性化因子（すなわち、好ましくはヒドロコルチゾンおよびデキサメタゾン）、ならびに環状ＡＭＰおよび環状ＡＭＰホスホジエステラーゼの非特異的インヒビター（好ましくはＩＢＭＸ）を含むこと、または実質的にそれらからなることが可能である。第１の好ましい実施形態においては、脂肪生成培地は培地、ＳＢ４３１５４２、ＥＧＦ、ロシグリタゾン、インスリン、Ｔ３ホルモン、アスコルビン酸、ヒドロコルチゾン、デキサメタゾンおよびＩＢＭＸを含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる。
【００７２】
第２の実施形態においては、脂肪生成培地は培地、ＴＧＦ−ベータ／アクチビン／ＮＯＤＡＬ経路のインヒビター（好ましくはＳＢ４３１５４２）、ＥＧＦ（上皮増殖因子）受容体の活性化因子（好ましくはＥＧＦ）、ＰＰＡＲガンマ活性化因子（好ましくはロシグリタゾン）、インスリン、Ｔ３ホルモン、アスコルビン酸およびコルチコイド受容体の活性化因子（好ましくはグルココルチコイド、より好ましくはヒドロコルチゾン）を含むこと、それらからなること、または実質的にそれらからなることが可能である。第２の好ましい実施形態において、第２の実施形態の脂肪生成培地は培地、ＳＢ４３１５４２、ＥＧＦ、ロシグリタゾン、インスリン、Ｔ３ホルモン、アスコルビン酸およびヒドロコルチゾンを含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる。
【００７３】
本発明の場合、ＴＧＦ−ベータ／アクチビン／ＮＯＤＡＬ経路のインヒビターは、好ましくは、ＡＬＫ５、ＡＬＫ４、およびＡＬＫ７を阻害するが好ましくはＢＭＰ  Ｉ型受容体ＡＬＫ２、ＡＬＫ３およびＡＬＫ６を阻害しない化合物である。そのような好ましい化合物は製造業者Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＳＢ４３１５４２である。
【００７４】
本発明の場合、ＰＰＡＲガンマ活性化因子はチアゾリジンジオンクラスからの抗糖尿病薬であることが可能であり、好ましくはロシグリタゾン（製造者Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ）である。当業者に公知のとおり、チアゾリジンジオンクラスの化合物は、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、特にＰＰＡＲガンマの細胞内受容体クラスを活性化することにより作用する。
【００７５】
本発明の場合、コルチコイド受容体には、グルココルチコイド受容体およびミネラルコルチコイド受容体が含まれる。コルチコイド受容体の好ましい活性化因子には、グルココルチコイド、より好ましくはヒドロコルチゾンが含まれる。
【００７６】
ＥＧＦ受容体の好ましい活性化因子はＥＧＦ、より好ましくはヒトＥＧＦである。ヒトＥＧＦは配列番号１２により表される。１つの実施形態においては、ｈＥＧＲの機能的変異体が使用されうる。機能的変異体は、ヒトＥＧＦの配列番号１２に対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の同一性を有する、ヒトＥＧＦの機能的ホモログであって、関連野生型ヒトＥＧＦと実質的に同じＥＧＦ受容体活性化活性を保有するものである。この場合、実質的に同じ活性化活性は少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を意味しうる。
【００７７】
本発明の場合、第１の実施形態および第２の実施形態の脂肪生成培地は、ＤＭＥＭ（ダルベッコ改変イーグル培地、Ｇｉｂｃｏ）のような培地、および血清または血清の同等物を含む。好ましくは、存在する血清はウシ血清、より好ましくはウシ胎児血清であり、より一層好ましくは、５〜１０％のウシ血清、最も好ましくは１０％のウシ血清であり、より一層好ましくは、５〜１０％のウシ胎児血清、最も好ましくは１０％のウシ胎児血清である。１つの実施形態においては、血清が存在しない場合、その代わりにＫＳＲを使用することが可能である。ＫＳＲの好ましい濃度は本明細書に既に記載されている。工程ｅ）の好ましい実施形態においては、細胞を最初に第１の実施形態の脂肪生成培地内で培養し、ついで第２の実施形態の脂肪生成培地内で培養する。通常、最初の脂肪生成培地内での培養は２〜１５日または３〜１４日または４〜１３日または２〜１０日または２〜８日または３日の持続期間を有しうる。１つの実施形態においては、持続期間は２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日である。好ましい濃度は以下のとおりである：ＳＢ４３１５４２の場合は２〜８マイクロＭまたは３〜７マイクロＭまたは４〜６マイクロＭまたは約５マイクロＭまたは５マイクロＭ。アスコルビン酸の好ましい濃度は１０〜５０マイクログラム／ｍｌまたは１２．５〜４０マイクログラム／ｍｌまたは１５〜３０マイクログラム／ｍｌまたは約２５．５マイクログラム／ｍｌまたは２５．５マイクログラム／ｍｌである。ＥＧＦの濃度は８〜１２ｎｇ／ｍｌまたは９〜１１ｎｇ／ｍｌまたは約１０ｎｇ／ｍｌまたは１０ｎｇ／ｍｌでありうる。ヒドロコルチゾンの濃度は１〜７マイクログラム／ｍｌまたは２〜６マイクログラム／ｍｌまたは３〜５マイクログラム／ｍｌまたは約４マイクログラム／ｍｌまたは４マイクログラム／ｍｌでありうる。ロシグリタゾンの濃度は０．５マイクロＭ〜２マイクロＭまたは０．７５〜１．５マイクロＭまたは０．９〜１．２マイクロＭまたは１マイクロＭでありうる。インスリンの濃度は２〜１５マイクログラム／ｍｌまたは５〜１２．５マイクログラム／ｍｌまたは８〜１１マイクログラム／ｍｌまたは１０マイクログラム／ｍｌでありうる。Ｔ３ホルモンの濃度は１００〜３００ｐＭまたは１５０〜２５０ｐＭまたは２００ｐＭの範囲でありうる。デキサメタゾンの濃度は０．５マイクロＭ〜２マイクロＭまたは０．７５〜１．５マイクロＭまたは０．９〜１．２マイクロＭの範囲、または１マイクロＭモルでありうる。ＩＢＭＸの濃度は３００〜７００マイクロＭまたは４００〜６００マイクロＭの範囲、または５００マイクロでありうる。好ましくは、第１の好ましい実施形態の脂肪生成培地は培地、ＳＢ４３１５４２（５μＭ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ロシグリタゾン（１μＭ）、インスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、Ｔ３ホルモン（０．２ｎＭ）、アスコルビン酸（２５．５μｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１μＭ）およびＩＢＭＸ（５００μＭ）を含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる。好ましくは、第２の好ましい実施形態の脂肪生成培地は培地、ＳＢ４３１５４２（５μＭ）、ＥＧＦ���１０ｎｇ／ｍｌ）、ロシグリタゾン（１μＭ）、インスリン（１０ｍｇ／ｍｌ）、Ｔ３ホルモン（０．２ｎＭ）、アスコルビン酸（２５．５μｇ／ｍｌ）およびヒドロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）を含む、またはそれらからなる、または実質的にそれらからなる。これらの好ましい脂肪生成培地のそれぞれにおける培地、好ましくは、ＤＭＥＭである。また、これらの好ましい脂肪生成培地のそれぞれにおける培地は１０％  ＦＢＳおよび低グルコースで補足される。当技術分野においては、「低グルコース」または「ＤＭＥＭ低グルコース」は１ｇ／ｌであり、一方、「高グルコース」または「ＤＭＥＭ高グルコース」は４ｇ／ｌであることが当業者に公知である。細胞は、工程ｅ）の開始時に、３．１０４〜９．１０４  細胞／ｃｍ２の範囲の密度で、好ましくは５．１０４  細胞／ｃｍ２を使用して播かれうる。１つの実施形態においては、細胞は、誘導培地、すなわち、ＤＭＥＭから構成される培地において維持される。１つの実施形態においては、該培地には、ＦＢＳ（１０％）およびＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）で補足される。
【００７８】
工程ｅ）の持続時間は決定的なものではない。該持続時間は、工程ｂ）の開始時に使用されるｉＰＡＭ細胞の数、および／または筋原性培地内に存在する成分の種類、および／または工程ｃ）が実施されたかどうか、工程ｄ）の実施方法、例えば、工程ｄ）中の継代数によっても変動しうる。通常、工程ｅ）の持続時間は３〜１８日または４〜１７日または５〜１６日または６〜１６日の範囲でありうる。
【００７９】
１つの実施形態においては、本発明の方法において、得られたＢＡ細胞はＵＣＰ１の発現により特徴づけられる。ＢＡ細胞およびＵＣＰ１の発現は次節の説明において記載されている。好ましいヒトＵＣＰ１アミノ酸配列は本明細書においては配列番号１３として特定される。
【００８０】
当業者に明らかなとおり、本明細書に記載されている方法はエクスビボまたはインビトロ方法である。
【００８１】
また、ＢＡ細胞を得るための方法は、ＢＡＰ細胞を得るための方法の工程ａ）、ｂ）、所望により行われうる工程ｃ）および工程ｄ）を、それ自体が含む必要がないことも当業者には明らかである。当業者がＢＡＰ細胞を得ることが可能である限り、前記で定義されている工程ｅ）を適用することが可能であり、ＢＡ細胞が得られるであろう。
【００８２】
本発明の方法から得られうるＢＡＰ、ＢＡ細胞またはＢＡＰ、ＢＡ細胞集団
本発明は更に、好ましくは前記方法から得られうるＢＡＰ、ＢＡ細胞自体またはＢＡＰ、ＢＡ細胞集団自体に関する。本発明は、ＢＡＰまたはＢＡ細胞を含むＢＡＴ（褐色脂肪細胞組織）に関するものでもあることが、当業者に明らかである。本出願の全体を通して、ＢＡＰもしくはＢＡ細胞を含む組成物またはＢＡＰもしくはＢＡ細胞を含む集団に言及されている場合、そのような組成物またはそのような集団は、そのような細胞を含む組織とみなされうる。ＢＡＴは、ＢＡ細胞およびＢＡＰ細胞を含む組織である。１つの実施形態においては、ＢＡＰ細胞は哺乳類ＢＡＰ細胞、より好ましくはヒトＢＡＰ細胞である。１つの実施形態においては、ＢＡＰ細胞の集団はヒトＢＡＰ細胞の集団である。１つの実施形態においては、ＢＡ細胞は哺乳類ＢＡ細胞、より好ましくはヒトＢＡ細胞である。１つの実施形態においては、ＢＡ細胞の集団は、ヒトＢＡ細胞の集団である。
【００８３】
ＢＡ細胞またはＢＡ細胞集団は、典型的には、ＢＡ細胞に加えて他の細胞型を含みうる。１つの実施形態においては、本発明のＢＡ細胞の集団は、それらが、ＢＡ細胞に特徴的な少なくとも１つのバイオマーカー、例えばＵＣＰ１（脱共役タンパク質１）を発現する細胞を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、好ましくは少なくとも９０％の割合で含むことにより特徴づけられる。好ましくは、マーカーはＵＣＰ１である。ＵＣＰ１は、成熟ＢＡ段階を除外する唯一のマーカーであると推定される（Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄら，２００１；Ｃａｎｏｎら，２００４）。発現されうる他のマーカーとしては、ＰＧＣ１アルファ、ＦＡＢＰ４、ＣＩＤＥＡ、ＰＬＩＮ１、ＰＰＡＲガンマ、ＥＢＦ２、ＺＩＣ２、ＤＩＯ２、および脂質滴（すなわち、少なくとも１つの脂質滴）の付随的存在が挙げられる。ＵＣＰ１および／またはＰＧＣ１アルファおよび／または本明細書中に挙げられているいずれかの他のマーカーの発現の評価は、「本出願の場合に適用される定義」なる題名の部分に記載されているとおりに行われうる。脂質滴の検出は、中性脂質染色を用いて行われうる。
【００８４】
ＢＡ細胞に特異的なマーカーを発現する細胞を選択することにより、ＢＡ細胞を精製することが可能であり、または集団内のＢＡ細胞を富化することが可能である。１つの実施形態においては、ＢＡ細胞の集団の精製または富化のためのＢＡ細胞に特異的なマーカーは以下のマーカーの１以上から選択されうる：所望によりＰＧＣ１アルファ、ＦＡＢＰ４、ＣＩＤＥＡ、ＰＬＩＮ１、ＰＰＡＲガンマ、ＥＢＦ２、ＺＩＣ２および／またはＤＩＯ２のいずれかと組合されていてもよいＵＣＰ１。ＢＡ細胞は、前記の少なくとも１つの脂質滴の存在に関しても選択されうる。
【００８５】
ＢＡ細胞の精製または富化は、細胞選別技術、例えば蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）または磁気ビーズ（ＢＡ細胞の該細胞表面マーカーの特異的結合体またはＢＡマーカーに対する蛍光レポーターを含むもの）を使用して達成されうる。
【００８６】
したがって、精製または富化の後、該集団は、ＢＡ細胞に特徴的なバイオマーカー、例えば、所望によりＰＧＣ１アルファ、ＦＡＢＰ４、ＣＩＤＥＡ、ＰＬＩＮ１、ＰＰＡＲガンマ、ＥＢＦ２、ＺＩＣ２および／またはＤＩＯ２のいずれかと組合されていてもよいＵＣＰ１を発現する細胞を、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または９５％以上の割合で含みうる。ＢＡ細胞は前記の少なくとも１つの脂質滴を含みうる。得られたＢＡ細胞の機能を特徴づける別の方法は、脂肪分解の活性化因子、例えばフォルスコリンまたはイソプロテレノールでの処理に際して遊離グリセロールを放出するそれらの能力を評価することである。好ましくは、該処理はフォルスコリンでの処理である。より好ましくは、該処理は１０ｍＭのフォルスコリンで２４時間の処理である。放出される遊離グリセロールの増加は、未処理細胞と比較して、処理細胞では少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％または更には少なくとも６０％である。この遊離グリセロール放出は脂肪分解の増加の指標である。本発明の方法は、脂肪細胞、好ましくは機能的褐色脂肪細胞を高収率（少なくとも２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、７０％、８０％または更には８５％）で得ることを可能にする。
【００８７】
もう１つの好ましい実施形態においては、本発明は、前記方法により得られうるＢＡ細胞の集団を含む組成物に関する。１つの実施形態においては、ＢＡ細胞の集団はＢＡ細胞からなることが可能であり、またはＢＡ細胞から実質的になることが可能である。
【００８８】
もう１つの態様においては、本発明はまた、ＢＡＰ細胞に加えて他の細胞型を典型的に含みうるＢＡＰ細胞またはＢＡＰ細胞集団に関する。１つの実施形態においては、本発明のＢＡＰ細胞の集団は、該ＢＡＰ細胞集団が本発明の方法により得られうること、および該ＢＡＰ細胞集団が、本明細書中に定義されているＢＡ細胞の集団に変換される能力を有する細胞を少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の割合で含むことにより特徴づけられる。１つの実施形態においては、該変換は、工程ｅ）に従い血清またはその同等物を含む脂肪生成培地内でＢＡＰ細胞またはＢＡＰ細胞集団を培養した後に評価される。該ＢＡ細胞はＵＣＰ１を発現する。発現されうる他のマーカーとしては、ＰＧＣ１アルファ、ＦＡＢＰ４、ＣＩＤＥＡ、ＰＬＩＮ１、ＰＰＡＲガンマ、ＥＢＦ２、ＺＩＣ２、ＤＩＯ２が挙げられる。これらのＢＡ細胞は脂質滴（すなわち、少なくとも１つの脂質滴）の付随的存在によっても特徴づけられうる。ＵＣＰ１および本明細書中に挙げられているいずれかの他のマーカーの発現の評価は、「本出願の場合に適用される定義」なる題名の部分に記載されているとおりに行われうる。脂質滴の検出は、中性脂質染色を用いて行われうる。ＢＡＰ細胞の集団またはＢＡＰ細胞を含む集団は、当業者に公知の適切な増殖条件下（Ｗｄｚｉｅｋｏｎｓｋｉら，２０１０）、１〜２ヶ月間培養されうる。本発明の方法を適用することにより、ＢＡＰ細胞を精製することが可能であり、または集団内のＢＡＰ細胞を富化することが可能である。
【００８９】
もう１つの好ましい実施形態においては、本発明は、前記方法により得られうるＢＡＰ細胞の集団を含む組成物に関する。１つの実施形態においては、ＢＡＰ細胞の集団はＢＡＰ細胞からなることが可能であり、またはＢＡＰ細胞から実質的になることが可能である。
【００９０】
ＢＡＰもしくはＢＡ細胞またはＢＡＰもしくはＢＡ細胞集団の使用
ＢＡＰ細胞は分化条件下でインビトロで有利に培養されて、本明細書中に前記で定義されている褐色脂肪細胞（ＢＡ）を生成することが可能である。
【００９１】
もう１つの実施形態においては、本発明は、本発明の方法により得られうるＢＡＰまたはＢＡ細胞を含む組成物に関する。１つの実施形態においては、この組成物は医薬組成物である。ＢＡＰもしくはＢＡ細胞またはＢＡＰもしくはＢＡ細胞を含む集団またはこれらの細胞もしくは細胞集団を含む組成物は医薬として使用されうる。該医薬は、ＢＡＰまたはＢＡ細胞活性に関連した任意の疾患または状態を治療または予防するために使用されうる。そのような疾患または状態の例には、肥満関連病態、メタボリックシンドローム、糖尿病、高脂血症、ＮＡＳＨ（非アルコール性脂肪性肝炎）、エネルギーバランス（摂取対消費）障害のような代謝性疾患が含まれる。したがって、本発明はまた、本明細書中で挙げられている疾患に対する医薬の製造のための、ＢＡＰ細胞またはＢＡＰ細胞を含む集団またはこれらの細胞もしくは細胞集団を含む組成物の使用に関する。本発明のもう１つの態様は、本発明の集団としての、ＢＡＰまたはＢＡ細胞を含む集団の使用に関する。
【００９２】
本発明の集団は、種々の用途、特に研究または治療分野において使用されうる。１つの主要治療分野の用途は細胞療法または再生医療である。再生医療は、本明細書に記載されているとおりに得られたＢＡＰまたはＢＡ細胞を含む集団の移植により、損傷組織または細胞をインビボまたはインビトロまたはエクスビボで再生させることにより、組織または細胞（すなわち、ＢＡもしくはＢＡＰまたはそれらに関連したもの）の機能不全、損傷または障害から生じた任意の疾患を潜在的に治癒させるために使用されうる。
【００９３】
したがって、１つの態様においては、本発明は、哺乳動物、例えばヒト患者に移植するための細胞療法製品として使用のための、本発明の集団に関する。
【００９４】
１つの特定の実施形態においては、本発明は、本発明に従い得られたＢＡ細胞の集団を含む医薬組成物に関する。もう１つの好ましい実施形態においては、本発明は、例えば、ＵＣＰ１を発現する少なくとも１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８個または少なくとも１０９個の細胞を含むＢＡ細胞集団を含む医薬組成物に関する。もう１つの実施形態において、この組成物は、薬学的に許容しうるビヒクルを含む。
【００９５】
１つの実施形態においては、ＢＡＰ細胞を、ＢＡ系譜へのその分化を誘導するために培養し、または種々の細胞型と共に共培養する。もう１つの実施形態においては、ＢＡＰ細胞をレシピエント宿主に直接移植する。
【００９６】
もう１つの好ましい実施形態においては、本発明は、本発明の集団を含む組成物に関する。本発明の集団を含む組成物は細胞療法または再生医療において使用されうる。
【００９７】
もう１つの態様においては、ＢＡＰもしくはＢＡ細胞またはＢＡＰもしくはＢＡ細胞集団をスクリーニング目的に使用する。一例としては、ＢＡＰ細胞の増殖、生存および／またはＢＡ細胞への更なる分化を或る化合物が誘導する能力に関してスクリーニングするための、ＢＡＰ細胞またはＢＡＰ細胞集団の使用が挙げられる。もう１つの例としては、成熟ＢＡ細胞のエネルギー消費を誘導するためのその活性化を試験することが挙げられる。
【００９８】
本明細書およびその特許請求の範囲においては、「含む」なる動詞およびその活用形はその非限定的な意味で用いられ、その語に続く事項が含まれること、および具体的に挙げられていない事項が除外されないことを意味する。また、「からなる」なる動詞は「から実質的になる」により置換可能であり、これは、本明細書に記載されている方法または細胞集団または組成物が、それぞれ、具体的に特定されているもの以外の追加的工程および追加的成分を含みうることを意味し、ここで、該追加的工程および追加的成分は、それぞれ、本発明の特有の特徴を改変しない。また、「からなる」なる動詞は「から実質的になる」により置換可能であり、これは、本明細書に記載されている方法が、具体的に特定されているもの以外の追加的工程を含みうることを意味し、ここで、該追加的工程は本発明の特有の特徴を改変しない。また、単数形での要素に対する言及は、要素の１つのみが存在することを文脈が明確に要求しない限り、複数の要素が存在する可能性を除外しない。したがって、単数形表現は、通常、「少なくとも１つ」を意味する。「約」または「およそ」なる語は、数値に関連して用いられる場合（例えば、約１０）、好ましくは、その値が所与の値（１０）の約０．１％大きい又は小さいことが可能であることを意味する。本明細書中に引用されている全ての特許および参考文献の全体を参照により本明細書に組み入れることとする。
【００９９】
後記の実施例は例示を目的として記載されているに過ぎず、本発明の範囲を何ら限定するものではない。
【０１００】
本出願の場合に適用される定義
マーカー
本出願においては何度も、細胞または細胞集団はマーカーの発現により特徴づけられている。そのようなマーカーの例としては、Ｏｃｔ４、ＳＯＸ２、Ｎａｎｏｇ、ＳＳＥＡ  ３および４、ＴＲＡ  １／８１、Ｔｂｘ６、エフリンＡ１、エフリンＢ２、ＥＰＨＡ４、ＰＤＧＦＲアルファ、Ｓａｌｌ１、Ｓａｌｌ４、Ｄｌｌ１、Ｄｌｌ３、Ｐａｐｃ（Ｐｃｄｈ８）、Ｌｆｎｇ、Ｈｅｓ７、リップリー１、リップリー２、ブラキュリ（Ｔ）、Ｃｄｘ２、Ｃｄｘ４、Ｅｖｘ１、Ｃｘｃｒ４、Ｉｌｌ７ｒｄ、Ｆｇｆ８、Ｆｇｆ１７、Ｇｂｘ２、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ５ｂ、Ｒｓｐｏ３、ＳＰ５、ＳＰ８、Ｈａｓ２、Ｄｋｋ１、Ｄａｃｔ１、Ｐａｘ３、Ｐａｘ７、Ｍｅｓｐ１、Ｍｅｓｐ２、Ｍｓｇｎ１、ｐａｘ７、デスミン、ミオゲニン、アルファアクチニン、ＵＣＰ１、ＰＧＣ１アルファ、ＦＡＢＰ４、ＣＩＤＥＡ、ＰＬＩＮ１、ＰＰＡＲガンマ、ＥＢＦ２、ＺＩＣ２、ＤＩＯ２が挙げられる。該マーカーの発現が検出されうる場合、細胞または細胞集団が所与マーカーを発現すると言えるであろう。該マーカーの発現の検出は、遺伝子発現を測定するための当技術分野で公知の任意の方法、特に、リアルタイム定量的ＰＣＲもしくはマイクロアレイ、または遺伝子レポーター発現を用いる方法（該遺伝子レポーターは、ＷＯ２０１３／０３０２４３の実験の部に記載されているＭｓｇｎ１プロモーターを含む）のような定量的方法、あるいは細胞表面マーカーを含む特異的バイオマーカーを示す細胞を特定する細胞選別法または免疫染色法のような定性的方法を使用して行われうる。
【０１０１】
配列同一性
「配列同一性」は、本明細書においては、配列を比較することにより決定される、２以上の核酸（ヌクレオチド、ポリヌクレオチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ）配列間の関係として定義される。当技術分野においては、「同一性」はまた、場合に応じて、そのような一連の配列間のマッチ（一致）により決定される、核酸配列間の配列関連性の度合を意味する。「同一性」および「類似性」は、以下のものに記載されている方法（それらに限定されるものではない）を含む公知方法によって容易に計算されうる：Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｌｅｓｋ，Ａ．Ｍ．編，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８８；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ，Ｓｍｉｔｈ，Ｄ．Ｗ．編，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９３；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ，Ｐａｒｔ  Ｉ，Ｇｒｉｆｆｉｎ，Ａ．Ｍ．およびＧｒｉｆｆｉｎ，Ｈ．Ｇ．編，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｊｅｒｓｅｙ，１９９４；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７；ならびにＳｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．およびＤｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１；ならびにＣａｒｉｌｌｏ，Ｈ．およびＬｉｐｍａｎ，Ｄ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）。
【０１０２】
同一性を決定するための方法は、試験される配列間で最大マッチを与えるように設計される。同一性および類似性を決定するための方法は、公的に利用可能なコンピュータープログラムにおいてコード化される。２つの配列間の同一性および類似性を決定するための好ましいコンピュータープログラム法には、例えば、ＧＣＧプログラムパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７（１９８４））、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＢＬＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴＮおよびＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））が含まれる。ＢＬＡＳＴ  Ｘプログラムは、ＮＣＢＩおよび他のソースから公的に利用可能である（ＢＬＡＳＴ  Ｍａｎｕａｌ，Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，ＮＣＢＩ  ＮＬＭ  ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ  ２０８９４；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．ら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３−４１０（１９９０））。よく知られたスミス・ウォーターマン（Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）アルゴリズムも、同一性を決定するために使用されうる。核酸比較のためのパラメーターには以下のものが含まれる：アルゴリズム：ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３（１９７０）；比較マトリックス：マッチ＝＋１０、ミスマッチ＝０；ギャップペナルティ：５０；ギャップ長ペナルティ：３（Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓに位置するＧｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐからギャッププログラムとして入手可能）。
【０１０３】
本明細書中で用いる、２つのアミノ酸配列間の同一性（％）は、２つの配列の最適アラインメントのために導入される必要があるギャップの数および各ギャップの長さを考慮したうえでの、それらの配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、同一性（％）＝同一位置の数／位置の総数×１００）。２つの配列間の配列の比較および同一性（％）の決定は、後記のとおり、数学的アルゴリズムを使用して達成されうる。
【０１０４】
２つのアミノ酸配列間の同一性（％）は、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれているＥ．ＭｅｙｅｒｓおよびＷ．Ｍｉｌｌｅｒ（Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７，１９８８）のアルゴリズムを使用して、ＰＡＭ１２０重み残基表（ｗｅｉｇｈｔ  ｒｅｓｉｄｕｅ  ｔａｂｌｅ）、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を使用して決定されうる。
【０１０５】
所望により、アミノ酸類似性の度合を決定する際に、当業者に明らかなとおり、いわゆる「保存的」アミノ酸置換をも考慮することが可能である。保存的アミノ酸置換は、類似側鎖を有する残基の互換性を意味する。例えば、脂肪族側鎖を有するアミノ酸のグループはグリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンであり、脂肪族ヒドロキシル側鎖を有するアミノ酸のグループはセリンおよびスレオニンであり、アミド含有側鎖を有するアミノ酸のグループはアスパラギンおよびグルタミンであり、芳香族側鎖を有するアミノ酸のグループはフェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンであり、塩基性側鎖を有するアミノ酸のグループはリジン、アルギニンおよびヒスチジンであり、そして硫黄含有側鎖を有するアミノ酸のグループはシステインおよびメチオニンである。好ましい保存的アミノ酸置換群はバリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。本明細書に開示されているアミノ酸配列の置換変異体は、開示されている配列における少なくとも１つの残基が除去され、異なる残基がその位置に挿入されているものである。好ましくは、アミノ酸変化は保存的である。天然に存在するアミノ酸のそれぞれに関する好ましい保存的置換は以下のとおりである：Ａｌａからｓｅｒへ；Ａｒｇからｌｙｓへ；Ａｓｎからｇｌｎまたはｈｉｓへ；Ａｓｐからｇｌｕへ；Ｃｙｓからｓｅｒまたはａｌａへ；Ｇｌｎからａｓｎへ；Ｇｌｕからａｓｐへ；Ｇｌｙからｐｒｏへ；Ｈｉｓからａｓｎまたはｇｌｎへ；Ｉｌｅからｌｅｕまたはｖａｌへ；Ｌｅｕからｉｌｅまたはｖａｌへ；Ｌｙｓからａｒｇへ；ｇｌｎまたはｇｌｕへ；Ｍｅｔからｌｅｕまたはｉｌｅへ；Ｐｈｅからｍｅｔ、ｌｅｕまたはｔｙｒへ；Ｓｅｒからｔｈｒへ；Ｔｈｒからｓｅｒへ；Ｔｒｐからｔｙｒへ；Ｔｙｒからｔｒｐまたはｐｈｅへ；およびＶａｌからｉｌｅまたはｌｅｕへ。
【０１０６】
１つの実施形態においては、配列同一性は、与えられた２つの配列番号の全長またはその一部に基づいて計算される。その一部は、好ましくは、両方の配列番号の少なくとも５０％、６０％、７０％、８０％、９０％または１００％を意味する。
【０１０７】
活性化因子
本明細書中で用いる「特定の経路または分子の活性化物質」、例えば「Ｗｎｔシグナル伝達経路の活性化物質」（特に示されていない限り）は、該経路または分子に関連または付随する活性（Ｗｎｔシグナル伝達活性）を増強または促進または活性化またはアップレギュレーションまたは増加させる物質を意味する。例えば、正規Ｗｎｔ／β−カテニンシグナル伝達経路の場合、この活性は、ＬＥＦ／ＴＣＦ結合部位レポーターの、確立された多量体を使用して、Ｗｎｔレポーター活性により、および／またはＧＳＫ−３βの阻害により、および／または正規Ｗｎｔ標的遺伝子、例えばＴ、Ｔｂｘ６、Ｍｓｇｎ１もしくはアクシン（Ａｘｉｎ）２の活性化により測定されうる。したがって、Ｗｎｔシグナル伝達活性の活性化は、前記で特定されたＭｓｇｎ１レポーター活性のＷｎｔの増加として評価されうる（Ｃｈａｌ  Ｊら，２０１５）。経路または分子に応じて、該経路または分子の活性に特異的であり活性化因子の評価に使用されうるアッセイが当業者に公知である。該増加は、活性化因子の非存在下の対照条件と比較して少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％以上の増加でありうる。
【０１０８】
インヒビター
本明細書中で用いる「特定の経路または分子のインヒビター」は、該経路または分子に関連または付随する活性を阻害、ダウンレギュレーションまたは低減する物質を意味する。経路または分子に応じて、該経路または分子の活性に特異的でありインヒビターを評価するために使用されうるアッセイが当業者に公知である。該減少は、インヒビターの非存在下の対照条件と比較して少なくとも１％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、１００％以上の減少でありうる。
【図面の簡単な説明】
【０１０９】
【図１】ヒト褐色脂肪細胞前駆体（ｈＢＡＰ）を誘導し、ｈｉＰＳ細胞からヒト褐色脂肪細胞（ｈＢＡ）を生成させるための方法。誘導性沿軸中胚葉（ｉＰＡＭ）の生成の後、細胞は筋原性分化を受ける。ついで、これらの細胞からＢＡＰを誘導し、褐色脂肪細胞への分化を誘発させる。
【図２】ｈｉＰＳＣからヒト褐色脂肪細胞前駆体を誘導するための実験スキーム。第０日から第２２日まで、一連の分化培地は、マトリゲル被覆培養プレート上のｈｉＰＳ細胞からｉＰＡＭおよび筋原性細胞系譜を連続的に誘導することを可能にする。第１２日から第２２日まで、細胞をトリプシンの使用により解離させ、未被覆培養プレート上に播く。数回の継代の後、細胞集団におけるＢＡＰを富化させる。
【図３】ｈｉＰＳ細胞からのＢＡＰ誘導。ＢＡＰの誘導中の細胞集団の位相差光写真。細胞は連続的継代を通じて均質形態を獲得する（スケールバー＝１，０００μｍ）。
【図４】ＢＡＰの脂肪生成能。未分化ＢＡＰ（Ｕｎｄ．）から、または種々の継代（Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８およびＰ９）で１７日間の分化を受けたＢＡＰから、ｍＲＮＡを調製した。６つの脂肪生成マーカーをｑＰＣＲにより分析した。
【図５】褐色脂肪細胞の特徴づけ。ＢＡＰ分化を種々の継代（Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８およびＰ９）で１７日間誘導した。ＵＣＰ１、脂質滴および核が免疫染色により可視化されている（スケールバー＝５０μｍ）。
【図６】ヒト褐色脂肪細胞前駆体（ｈＢＡＰ）を導出し、ｈｉＰＳ細胞からヒト褐色脂肪細胞（ｈＢＡ）を生成させるための方法。誘導性沿軸中胚葉（ｉＰＡＭ）の生成の後、細胞は筋原性分化を受ける。ついで、これらの細胞からＢＡＰを誘導し、褐色脂肪細胞への分化を誘発させる。
【図７】ｈｉＰＳＣからヒト褐色脂肪細胞前駆体を誘導するための実験スキーム。第０日から第２２日まで、一連の分化培地は、マトリゲル被覆培養プレート上のｈｉＰＳ細胞からｉＰＡＭおよび筋原性細胞系譜を連続的に誘導することを可能にする。第１２日から第２２日まで、細胞をトリプシンの使用により解離させ、未被覆培養プレート上に播く。数回の継代の後、細胞集団におけるＢＡＰを富化させる。
【図８】ｈｉＰＳ細胞からのＢＡＰ誘導。第１６日におけるＢＡＰの誘導中の細胞集団の位相差光写真。細胞は連続的継代を通じて均質形態を獲得する（スケールバー＝１，０００μｍ）。
【図９】初期継代におけるＢＡＰの脂肪生成能。未分化ＢＡＰ（Ｕｎｄ．）から、または種々の継代（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５）で１７日間の分化を受けたＢＡＰから、ｍＲＮＡを調製した。６つの脂肪生成マーカーをｑＰＣＲにより分析した。
【図１０】初期継代における褐色脂肪細胞の特徴づけ。種々の継代（Ｐ１、Ｐ２、Ｐ３、Ｐ４およびＰ５）で第１６日に誘導されたＢＡＰに対して分化を１７日間誘導した。ＵＣＰ１、脂質滴および核が免疫染色により可視化されている。（Ｂ）ＵＣＰ１を発現し脂質滴を提示する細胞集団の定量。
【図１１】後期継代におけるＢＡＰの脂肪生成能。未分化ＢＡＰ（Ｕｎｄ．）から、または種々の継代（Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８およびＰ９）で１７日間の分化を受けたＢＡＰから、ｍＲＮＡを調製した。６つの脂肪生成マーカーをｑＰＣＲにより分析した。
【図１２】後期継代における褐色脂肪細胞の特徴づけ。ＢＡＰ分化を種々の継代（Ｐ５、Ｐ６、Ｐ７、Ｐ８およびＰ９）で１７日間誘導した。（Ａ）ＵＣＰ１、脂質滴および核が免疫染色により可視化されている。（Ｂ）ＵＣＰ１を発現し脂質滴を提示する細胞集団の定量。
【図１３】種々のエンドポイントにおいて誘導されたＢＡＰからの褐色脂肪細胞の特徴づけ。ＢＡＰを、血清含有培地内での培養工程の後、第１２日から第２２日まで誘導し、５回継代し、ＢＡＰは１７日間の脂肪細胞分化を受けた。（Ａ）ＵＣＰ１、脂質滴および核が免疫染色により可視化されている。（Ｂ）ＵＣＰ１を発現し脂質滴を提示する細胞集団の定量。（Ｃ）未分化ＢＡＰ（Ｕｎｄ．）から、または１７日間の分化を受けたＢＡＰ（分化）から、ｍＲＮＡを調製し、脂肪生成マーカーをｑＰＣＲにより分析した。（Ｄ）第１２日または第１６日から誘導されたＢＡＰを１７日間分化誘導し、ついで脂肪分解を１０μＭ  フォルスコリンで刺激する。
【図１４】血清含有培地内での培養工程の効果。（Ａ）血清含有培地内での培養工程の存在下（１）または非存在下（２）（すなわち、所望により行われうる工程ｃ））、ＢＡＰを第２０日から誘導し、ＢＡＰは１７日間の脂肪細胞分化を受けた。ＵＣＰ１、脂質滴および核が免疫染色により可視化されている。
【図１５】方法２との比較。方法２に従いｈｉＰＳ細胞を沿軸中胚葉系譜へと誘導した。第８日に、筋原性培地（ａ）または２つの脂肪生成培地（ｂおよびｃ）内で細胞を維持する。第２０日および第３０日からｍＲＮＡを調製した。また、方法１に従い、ＢＡＰおよびＢＡをｈｉＰＳ細胞から生成させる。方法１において記載されているとおりに、未分化ＢＡＰ（Ｕｎｄ．）から、または１７日間の分化を受けたＢＡＰ（Ｄｉｆｆ．）から、ｍＲＮＡを調製した。２つの脂肪生成マーカーをｑＰＣＲにより分析した。
【図１６】方法３．１との比較。沿軸中胚葉の誘導の後、方法３．１を用いて細胞を分化させる。第２０日および第３０日からｍＲＮＡを調製した。また、方法１に従い、ＢＡＰおよびＢＡをｈｉＰＳ細胞から生成させる。方法１において記載されているとおりに、未分化ＢＡＰ（Ｕｎｄ．）から、または１７日間の分化を受けたＢＡＰ（Ｄｉｆｆ．）から、ｍＲＮＡを調製した。２つの脂肪生成マーカーをｑＰＣＲにより分析した。
【図１７】方法３．２との比較。沿軸中胚葉の誘導の後、方法３．２を用いて細胞を分化させる。第８日に、２つの異なる脂肪生成培地（３．２  ａおよびｂ）内で細胞を維持する。また、方法１に従い、ＢＡＰおよびＢＡをｈｉＰＳ細胞から生成させる。方法１において記載されているとおりに、未分化ＢＡＰ（Ｕｎｄ．）から、または１７日間の分化を受けたＢＡＰ（Ｄｉｆｆ．）から、ｍＲＮＡを調製した。２つの脂肪生成マーカーをｑＰＣＲにより分析した。
【図１８】方法４との比較。方法４または方法１において記載されているとおりに、ＢＡＰをｈｉＰＳ細胞から生成させた。（Ａ）ＢＡＰ分化をＰ５で１７日間誘導した。ＵＣＰ１、脂質滴および核が免疫染色により可視化されている。（Ｂ）未分化ＢＡＰ（Ｕｎｄ．）から、またはＰ５で１７日間の分化を受けたＢＡＰ（Ｄｉｆｆ）から、ｍＲＮＡを調製した。２つの脂肪生成マーカーをｑＰＣＲにより分析した。
【図１９】方法５との比較。（Ａ）方法５において記載されているとおり、ｈｉＰＳ細胞の分化中の細胞集団の位相差光写真。また、方法１に従い、ＢＡＰおよびＢＡをｈｉＰＳ細胞から生成される。（Ｂ）方法１において記載されているとおりに、未分化ＢＡＰ（Ｕｎｄ．）から、または１７日間の分化を受けたＢＡＰ（Ｄｉｆｆ．）から、ｍＲＮＡを調製した。２つの脂肪生成マーカーをｑＰＣＲにより分析した。（Ｃ）１７日間の分化の後、ＵＣＰ１、脂質滴および核がＢＡ培養に対する免疫蛍光法により可視化されている。
【図２０】比較実験の概要。方法２、方法３．１、３．２および方法４を用いて、ｈｉＰＳ細胞を分化させる。また、試験される各方法に関して、方法１に従いＢＡＰ（Ｕｎｄ．）およびＢＡ（Ｄｉｆｆ．）をｈｉＰＳ細胞から生成させる。ｍＲＮＡを種々の条件から調製し、褐色脂肪生成性ＵＣＰ１の発現をｑＰＣＲにより分析した。
【表２】
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【０１１０】
実施例：
実施例１
方法
本明細書中で用いる全ての化合物の完全な名称および製造者は付録に記載されている。
【０１１１】
ｈｉＰＳ細胞からのヒト褐色脂肪細胞前駆体（ｈＢＡＰ）の一次分化および誘導
未分化ｈｉＰＳ細胞をトリプシンの使用により単細胞へ解離させ、それらを、ロック（Ｒｏｃｋ）−１インヒビター（１０μＭ）で補足されたｍＴＥＳＲ−１培地内で、マトリゲル被覆皿上に５．５．１０４細胞／ｃｍ２の密度で播く。１日後、培地を、ロック−１インヒビターを含有しない新鮮なｍＴＥＳＲ−１と交換する。細胞が、小さな凝集体を形成したら（この時点は分化の第０日と決定される）、それらを一連の分化培地と交換する。
【０１１２】
第０日に、培地を、ＩＴＳ（１％）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＬＤＮ−１９３１８９（５００ｎＭ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。第６日まで培地を毎日交換する。
【０１１３】
第６日に、培地を、ＫＳＲ（１５％）、ＬＤＮ−１９３１８９（５００ｎＭ）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。第８日まで培地を毎日交換する。
【０１１４】
第８日に、培地を、ＫＳＲ（１５％）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。第１２日まで培地を毎日交換する。
【０１１５】
第１２日から第２２日まで、培地を、ＫＳＲ（１５％）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。培地は２日ごとに交換する（図１および２）。
【０１１６】
ｈＢＡＰを誘導するための選択された日（第１２日〜第２２日）に、培地を、ＦＢＳ（１０％）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。培地は２日ごとに交換する。１週間後、トリプシンを使用して細胞を継代し、それらを組織培養等級プレート上に播く。これは固定継代数０である。ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）で補足された以前の培地内で細胞を維持する。
【０１１７】
細胞がコンフルエンスに達したら、それらを継代し、５．１０４細胞／ｃｍ２の密度で播く。
【０１１８】
均質形態を有する細胞集団が得られるまで、継代を繰り返す（通常４〜９回）（図２）。
【０１１９】
ヒト褐色脂肪細胞前駆体（ｈＢＡＰ）の分化：
ｈＢＡＰを高密度（すなわち、５．１０５細胞／ｃｍ２）でプレーティングし、誘導培地内で維持する。細胞がコンフルエンスに達したら、（この時点は分化の第０日と決定される）培地を、ＦＢＳ（１０％）、ロシグリタゾン（１μＭ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、Ｔ３（０．２ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（５μＭ）、アスコルビン酸（２５．５μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１μＭ）およびＩＢＭＸ（５００μＭ）で補足された低グルコース含有ＤＭＥＭから構成される分化培地と交換する。第３日の後、デキサメタゾンおよびＩＢＭＸは廃棄される（図３）。ついで分化培地を週２回交換する。
【０１２０】
結果
実験結果
ＢＡを得るためのワークフロー
このプロトコルは、ｈｉＰＳ細胞の初期バッチからＢＡを得るための連続的分化段階から構成される（図１）。ｉＰＡＭ細胞の誘導の後、ＢＡＰの推定亜集団は継代５から継代９までの連続的再プレーティングにより富化される。プロトコルの第２部分を開始する前に、第１２日から第２２日までの範囲の幾つかのエンドポイントにおいて、ＢＡＰを拾い上げた。ついで、主要脂肪生成因子を含有する培地内で、富化ＢＡＰ集団を２週間分化させる（図１および２）。
【０１２１】
ＢＡＰは継代によって富化されうる
１２〜２２日間の分化の後（第１６日が示されている）、細胞を継代し、血清＋ＦＧＦ２を含有する培地内でプレーティングして、ＢＡＰ集団を富化させた。Ｐ０からＰ４までの細胞の継代は凝集体および混入細胞を排除することが可能であった（図３）。位相差顕微鏡検査により示されるとおり、細胞は線維芽細胞様ＢＡＰの均質かつ１００％コンフルエントな集団となった。継代４の後、ＢＡＰの細胞形状はＰ９までは変化しなかった（データ非表示）。このことは、Ｐ５からＰ９までのいずれであるかに無関係に分化プロセスを行うことを可能にした。
【０１２２】
ＢＡＰ由来ＢＡは分化褐色脂肪細胞の関連マーカーを発現する
ＢＡＰまたはＢＡＰ由来ＢＡ（Ｐ５からＰ９まで）を、１０％ウシ胎児血清＋ロシグリタゾン（１μＭ）＋インスリン（１０μｇ／ｍｌ）＋Ｔ３ホルモン（２００ｐＭ）＋ＳＢ４３１５４２（５μｍ）＋アスコルビン酸（２５．５μｇ／ｍｌ）＋ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ヒドロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）＋デキサメタゾン（１μＭ）＋ＩＢＭＸ（５００μＭ）を含有するＤＭＥＭ内で分化させた。３日後、培地を、最後の２つの化合物を含有しない新しい培地と交換した。ＲＴ−ｑＰＣＲによる転写産物の発現レベルをＢＡおよびＢＡＰ細胞において評価した（図４）。汎（ｐａｎ−）脂肪細胞マーカーＦＡＢＰ４（脂肪酸結合タンパク質４）、ＰＬＩＮ１（ペリリピン１）、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）は、ＢＡＰ細胞と比較して、ＢＡ細胞内で増加した。このことは脂肪細胞経路への関与を反映している。一方、褐色脂肪細胞マーカーＵＣＰ１（脱共役タンパク質１）、ＣＩＤＥ−Ａ（細胞死誘導性ＤＦＦＡ様エフェクターＡ）およびＰＧＣ１−α（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ活性化補助因子アルファ）は、ＢＡにおいて、ＢＡＰの場合より多く発現された。この効果は継代５から９まで観察された（図４）。
【０１２３】
１７日間の成熟の後、ＢＡ培養物を次に、細胞内脂質滴を特定する中性脂質プローブを使用して、およびＵＣＰ１に対する抗体を使用して免疫蛍光法によって特徴づけした。示されているように、ＢＡはＵＣＰ１に関する強力かつ均質な染色を保持していた（図６）。ＵＣＰ１＋脂質滴を発現する細胞数の定量は３９，５％（Ｐ９細胞の場合）〜７９％（Ｐ６細胞の場合）の範囲の陽性細胞を示した。
【０１２４】
実施例１．ａ
方法
本明細書中で用いる全ての化合物の完全な名称および製造者は付録に記載されている。
【０１２５】
ｈｉＰＳ細胞からのヒト褐色脂肪細胞前駆体（ｈＢＡＰ）の一次分化および誘導（図６および７）
工程ａ）未分化ｈｉＰＳ細胞をトリプシンの使用により単細胞に解離させ、３．１０４〜９．１０４細胞／ｃｍ２の範囲の密度で播く。この実施例は、ロック（Ｒｏｃｋ）−１インヒビター（１０μＭ）で補足されたｍＴＥＳＲ−１培地内で、マトリゲル被覆皿上で５．５．１０４細胞／ｃｍ２で行った。１日後、培地を、ロック−１インヒビターを含有しない新鮮なｍＴＥＳＲ−１と交換する。細胞が、小さな凝集体を形成したら（この時点は分化の第０日と決定される）、それらを一連の分化培地と交換する。
【０１２６】
第０日に、培地を、ＩＴＳ（１％）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＬＤＮ−１９３１８９（５００ｎＭ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換し、第３日からは、ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）で補足された又は補足されていないものと交換する。第６日まで培地を毎日交換する。これは沿軸中胚葉系譜の誘導に対応する。
【０１２７】
工程ｂ）第６日に、培地を、ＫＳＲ（１５％）、ＬＤＮ−１９３１８９（５００ｎＭ）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足された、そしてＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）で補足された又は補足されていないＤＭＥＭから構成される培地と交換する。第８日まで培地を毎日交換する。
【０１２８】
第８日に、培地を、ＫＳＲ（１５％）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。第１２日まで培地を毎日交換する。
【０１２９】
第１２日から、選択された時点に達するまで（最も遅くて第２２日）、培地を、ＫＳＲ（１５％）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。培地は２日ごとに交換する。これはｈＢＡＰへの細胞の誘導の開始に対応する。
【０１３０】
工程ｃ）ｈＢＡＰを誘導するために選択された日［一次分化の第１２日〜第２２日、または工程ｃ）の開始の６〜１５日後］、培地を、ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）の存在下または非存在下のＦＢＳ（１０％）で補足された又は補足されていないＤＭＥＭから構成される培地と交換する。この実施例は、ＦＧＦ−２の非存在下で１０％  ＦＢＳで補足されたＤＭＥＭを使用して行った。培地は２日ごとに交換する。
【０１３１】
工程ｄ）７日後、細胞をトリプシンの使用により継代し、組織培養等級プレート上に播く。これは継代数０（Ｐ０）である。ＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭおよびＦＢＳ（１０％）から構成される培地内で細胞を維持する。
【０１３２】
細胞がコンフルエンスに達したら、それらを継代し、３．１０４〜９．１０４細胞／ｃｍ２の範囲の密度で組織培養等級プレート上に播く。この実験は、５．１０４細胞／ｃｍ２を使用して行った。
【０１３３】
当業者により判定される均質形態を有する細胞集団が得られるまで（図８）、継代を繰り返して（通常４〜９回）、ｈＢＡＰの集団を得る。
【０１３４】
ヒト褐色脂肪細胞（ｈＢＡ）へのヒト褐色脂肪細胞前駆体（ｈＢＡＰ）の二次分化：
工程ｅ）ｈＢＡＰを３．１０４〜９．１０４細胞／ｃｍ２の範囲の密度でプレーティングし、誘導培地、すなわち、ＦＢＳ（１０％）およびＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地内で維持する。この実験は、５．１０４細胞／ｃｍ２を使用して行った。細胞がコンフルエンスに達したら（この時点は二次分化の第０日と決定される）、培地を、ＦＢＳ（１０％）、ロシグリタゾン（１μＭ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、Ｔ３（０．２ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（５μＭ）、アスコルビン酸（２５．５μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１μＭ）およびＩＢＭＸ（５００μＭ）で補足された低グルコース（１ｇ／ｌ）含有ＤＭＥＭから構成される分化培地と交換する。デキサメタゾンおよびＩＢＭＸは第３日の後で廃棄される。ついで分化培地は８〜３０日（通常は約２週間）に週２回交換する。
【０１３５】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ：
核スピンＲＮＡプラスキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して全ＲＮＡを細胞培養から抽出した。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｇＤＮＡクリアー（ｃｌｅａｒ）ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ）、適切なプライマーを使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）において、５００ｎｇの全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＴＢＰを内部対照として使用した。
【０１３６】
免疫細胞化学：
細胞培養物をＰＦＡ  ４％で固定した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５％  ＮＧＳ、１％  ウシ胎児血清および０．２％  Ｔｒｉｔｏｎから構成されるブロッキング溶液と共に細胞を３０分間インキュベートした。一次抗体のインキュベーションを室温で１時間３０分行い、抗体の実施希釈度は以下のとおりであった。抗ＵＣＰ１（Ｒ＆Ｄ）は１：２５０であり、抗デスミン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）は１：８００であった。ＰＢＳ洗浄後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：１０００）と共に細胞を３０分間インキュベートし、Ｄａｐｉで対比染色した。標準的なプロトコルに従いＨＣＳ  Ｌｉｐｉｄｔｏｘ中性脂質染色を行った。
【０１３７】
脂肪分解：
ＢＡＰを１７日間分化させた。ついで、ＢＳＡ  ０．２％で補足されたＤＭＥＭ  １ｇ／ｌグルコース中で細胞を２４時間維持した。脂肪分解をフォルスコリン（１０μＭ）で２４時間刺激した。
【０１３８】
実験結果
本発明に記載されれているとおりにＢＡを得るためのワークフロー
このプロトコルは、ｈｉＰＳ細胞の初期バッチからＢＡを得るための連続的分化段階から構成される（図６）。ｉＰＡＭ細胞の誘導［工程ａ）］およびそれに続く筋原性培地への曝露［工程ｂ）］の後、第１２日から第２２日までの範囲の種々の時点でＢＡＰの推定亜集団を誘導して、連続的再プレーティング（通常４〜９継代）［工程ｃ）およびｄ）］により富化させる。ついで、この富化ＢＡＰ集団を、主要脂肪生成因子を含有する培地内で約２週間分化させる［工程ｅ）］（図６および７）。
【０１３９】
ＢＡＰの表現型特徴づけ
この実施例に記載されている方法に従う１２〜２２日間の分化の後（第１６日が示されている）、ＦＢＳ＋ＦＧＦ２を含有する培地内で細胞をプレーティングして、ＢＡＰ集団を富化させた。細胞の数回（通常は４回）の継代は凝集体および混入細胞の排除を可能にした（図８）。細胞集団は、位相差顕微鏡により示されるとおり、当業者にとって均質である、線維芽細胞様ＢＡＰの１００％コンフルエントな状態に達した。追加的な継代は、均質化が一旦得られたら、ＢＡＰの細胞形状を変化させなかった（データ非表示）。
【０１４０】
継代におけるＢＡＰ由来ＢＡの特徴づけ
ＦＢＳ（１０％）＋ロシグリタゾン（１μＭ）＋インスリン（１０μｇ／ｍｌ）＋Ｔ３ホルモン（２００ｐＭ）＋ＳＢ４３１５４２（５μｍ）＋アスコルビン酸（２５．５μｇ／ｍｌ）＋ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）＋ヒドロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）＋デキサメタゾン（１μＭ）＋ＩＢＭＸ（５００μＭ）を含有するＤＭＥＭ内で、ＢＡＰ（Ｐ１からＰ９まで）をＢＡへと分化させた。デキサメタゾンおよびＩＢＭＸは第３日の後で破棄された。脂肪細胞系譜に典型的な特定の転写産物の発現レベルをＢＡＰおよびＢＡの両方においてＲＴ−ｑＰＣＲにより評価した（図９および１１）。汎脂肪細胞マーカーＦＡＢＰ４（脂肪酸結合タンパク質４）、ＰＬＩＮ１（ペリリピン１）、ＰＰＡＲγ（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ）は、ＢＡ細胞においては、ＢＡＰと比較して著しく増加した（それぞれ最大１．１０５；３，５．１０４および８倍高い発現）。このことは脂肪細胞経路への関与を反映している。また、褐色脂肪細胞マーカー：ＵＣＰ１（脱共役タンパク質１）、ＣＩＤＥ−Ａ（細胞死誘導ＤＦＦＡ様エフェクターＡ）およびＰＧＣ１−α（ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体ガンマ活性化補助因子アルファ）は、ＢＡにおいては、ＢＡＰの場合より有意に多く発現された（それぞれ最大１，２．１０５；３００および１５０倍高い発現）。
【０１４１】
次に、分化の第１７日におけるＢＡ培養を、細胞内脂質滴を特定する中性脂質プローブを使用して、そしてＵＣＰ１に対する抗体を使用して免疫蛍光法により特徴づけした。ＢＡはＵＣＰ１に関する強力かつ均質な染色を保持していた（図１０および１２）。ＵＣＰ１＋脂質滴を発現する細胞の数の定量は、この実験においては、４０％（Ｐ２細胞の場合）〜７９％（Ｐ６細胞の場合）の範囲の陽性細胞を示した。本発明を使用して得られた分化の収率は、ＵＣＰ１を発現し脂質滴を提示する細胞に関して８５％に達した（図１９）。
【０１４２】
重要なことに、特徴づけを完了するために、第１２日または第１６日および５継代後に誘導されたＢＡＰを１７日間分化させ、ついでフォルスコリン（１０μＭ）で処理した。２４時間後、処理細胞においては、未処理細胞と比較して遊離グリセロールの放出の増加（約６０％の増加）が観察された（図１３．Ｄ）。ＢＡはフォルスコリンに応答して脂肪分解を増強することが可能であった。したがって、このことはこれらの細胞の機能性を示している。
【０１４３】
これらの結果は、本発明の方法が単に脂肪細胞を生成するというだけでなく、特に褐色脂肪前駆体および機能性脂肪細胞をも生成し、しかも前例のない非常に高い収率（最大８５％の純度）でそれらを生成して（実施例２を参照されたい）、工業用途に適した高純度のＢＡ集団を得ることを可能にすることを、疑いなく示している。
【０１４４】
ＢＡＰを誘導するための時間間隔
前記のとおり、連続継代によるＢＡＰの富化の前に、細胞を第６日から第２２日まで筋原性培地内で培養し、ついで血清含有培地内で維持する。
【０１４５】
種々の時点で誘導されたＢＡＰを（実施例１に記載されているとおりに）１７日間分化させた（５継代に関するデータが示されている）。ＢＡ培養は全て、多数の脂質滴と共にＵＣＰ１タンパク質を強く発現した（図１３、Ａ）。ＵＣＰ１を発現し脂質滴を提示する細胞の数の定量は４３％（第１４日に誘導されたＢＡＰの場合）から６９％（第１２日に誘導されたＢＡＰの場合）までの範囲を示した。ＵＣＰ１の発現はｑＰＣＲ分析により確認される（図１３、Ｂ）。ＦＡＢＰ４およびＵＣＰ１は共に、予想どおり、ＢＡにおいて、ＢＡＰの場合より多く発現された。これらのデータは、ＢＡＰが第１２日から第２２日までの任意の時点で誘導可能であり、満足しうる効率でＢＡの生成をもたらしうることを示している。更に、第１２日目および第１６日に誘導されたＢＡＰの分化の後で得られたＢＡにおいて、フォルスコリンでの刺激の後、脂肪分解の増加が観察された。これは以前の結果を証明するものである（図１３．Ｄ）。
【０１４６】
図１４においては、工程ｃ）無しで本発明の方法を行って、この工程の重要性を評価した。血清含有培地内で、培養工程の存在下（１）または非存在下（２）、第２０日にＢＡＰを誘導した。分化後、ＵＣＰ１陽性細胞の割合は、この追加的工程を行って誘導されたＢＡＰでは６０％であり、それ無しで誘導された場合には２３％である。これらの結果が示すところによると、工程ｃ）はＢＡ生成の収率を有意に増加させるが、その非存在はＢＡ集団の獲得を妨げず、したがって、工程ｃ）は、所望により行われうる工程である。
【０１４７】
これらの結果が示すところによると、ＢＡＰ誘導のために選択される時点が一次分化の１２〜２２日に含まれ、ついで２〜９回の連続継代が行われる限り、そのような選択される時点に無関係に、ｉＰＡＭ細胞の誘導の後、ＢＡＰおよびＢＡが高収率で生成されうる。これらの可能性のうち、好ましい条件は、ＢＡＰを第１６日に誘導し、それを分化前に５回継代することである。
【０１４８】
実施例２
この実施例においては、本出願に記載されている方法の優位性を確認するために、本発明の方法を、ＢＡＰおよび／またはＢＡを生成すると特許請求（または主張）しているものとして先行技術において特定される他の方法と比較した。各方法（２〜５）に関して、ＢＡＰおよびＢＡは、未分化ｈｉＰＳ細胞の同一バッチを同時に使用して、後記の本発明の方法（方法１）を用いて並行して生成された。
【０１４９】
方法
本明細書中で用いる全ての化合物の完全な名称および製造者は付録に記載されている。
【０１５０】
方法１：ｈｉＰＳ細胞からのｈＢＡＰの一次分化および誘導ならびにｈＢＡへのｈＢＡＰの分化
工程ａ）未分化ｈｉＰＳ細胞をトリプシンの使用により単細胞に解離させ、ロック（Ｒｏｃｋ）−１インヒビター（１０μＭ）で補足されたｍＴＥＳＲ−１培地内で、マトリゲル被覆皿上に５．５．１０４細胞／ｃｍ２の密度で播く。１日後、培地を、ロック−１インヒビターを含有しない新鮮なｍＴＥＳＲ−１と交換する。細胞が、小さな凝集体を形成したら（この時点は一次分化の第０日と決定される）、それらを一連の分化培地と交換する。
【０１５１】
第０日に、培地を、ＩＴＳ（１％）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＬＤＮ−１９３１８９（５００ｎＭ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。第６日まで培地を毎日交換する。
【０１５２】
工程ｂ）第６日に、培地を、ＫＳＲ（１５％）、ＬＤＮ−１９３１８９（５００ｎＭ）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。第８日まで培地を毎日交換する。
【０１５３】
第８日に、培地を、ＫＳＲ（１５％）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。第１２日まで培地を毎日交換する。
【０１５４】
第１２日から第１６日まで、培地を、ＫＳＲ（１５％）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。培地は２日ごとに交換する（図６および７）。
【０１５５】
工程ｃ）第１６日に、培地を、ＦＢＳ（１０％）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。培地は２日ごとに交換する。
【０１５６】
工程ｄ）７日後、細胞をトリプシンの使用により継代し、組織培養等級プレート上に播く（継代数０）。ＦＢＳ（１０％）およびＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される以前の培地内で細胞を維持する。
【０１５７】
細胞がコンフルエンスに達したら、それらを継代し、５．１０４細胞／ｃｍ２の密度で播く。
【０１５８】
均質形態を有する細胞集団が得られるまで、継代を５回繰り返す。
【０１５９】
工程ｅ）ｈＢＡＰを５．１０４細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングし、誘導培地、すなわち、ＦＢＳ（１０％）およびＦＧＦ−２（５ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭ内で維持する。細胞がコンフルエンスに達したら（この時点は二次分化の第０日と決定される）、培地を、ＦＢＳ（１０％）、ロシグリタゾン（１μＭ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、Ｔ３（０．２ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（５μＭ）、アスコルビン酸（２５．５μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１μＭ）およびＩＢＭＸ（５００μＭ）で補足された低グルコース（１ｇ／ｌ）含有ＤＭＥＭから構成される分化培地と交換する。デキサメタゾンおよびＩＢＭＸは第３日の後で廃棄される。ついで分化培地は二次分化の第１７日まで週２回交換する。
【０１６０】
方法２：ＷＯ２０１３／０３０２４３に記載されているプロトコル
ＷＯ２０１３／０３０２４３は、脂肪細胞へのｉＰＡＭ細胞の分化のための適切な条件下、すなわち、脂肪細胞分化を誘導することが公知である少なくとも１つの化合物の有効量の存在下、ｉＰＡＭ細胞の集団を培養することによる、脂肪細胞を含む集団の製造方法を特許請求している。ＷＯ２０１３／０３０２４３の方法を用いて方法１と同等のＢＡＰおよびＢＡが得られうるかどうかを判定するために、ｉＰＡＭ細胞を生成させ、ついで筋原性培地（２．ａ．）または脂肪生成培地（２．ｂ．および２．ｃ．）（ここで、脂肪生成培地は脂肪細胞の生成のための潜在的な「適切な条件」とみなされる）のいずれかにさらした。
【０１６１】
ｉＰＡＭ細胞の生成
未分化ｈｉＰＳ細胞をトリプシンの使用により単細胞に解離させ、ロック（Ｒｏｃｋ）−１インヒビター（１０μＭ）で補足されたｍＴＥＳＲ−１培地内で、マトリゲル被覆皿上に播く。１日後、培地を、ロック−１インヒビターを含有しない新鮮なｍＴＥＳＲ−１と交換する。細胞が、小さな凝集体を形成したら（この時点は一次分化の第０日と決定される）、それらを一連の分化培地と交換する。
【０１６２】
第０日に、培地を、ＩＴＳ（１％）、ＣＨＩＲ９９０２１（３μＭ）およびＬＤＮ−１９３１８９（５００ｎＭ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。
【０１６３】
３日後、以前の培地をＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）で補足する。第６日まで培地を毎日交換する。
【０１６４】
方法２．ａ：ｉＰＡＭ細胞の生成および筋原性培地内での培養工程：
第６日に、培地を、ＫＳＲ（１５％）、ＬＤＮ−１９３１８９（５００ｎＭ）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。第８日まで培地を毎日交換する。
【０１６５】
第８日に、培地を、ＫＳＲ（１５％）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。
【０１６６】
第１２日に、培地を、ＫＳＲ（１５％）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。培地は２〜３日ごとに交換する。
【０１６７】
方法２．ｂおよびｃ：ｉＰＡＭ細胞の生成および脂肪生成培地内での培養工程
ｉＰＡＭ細胞を前記のとおりに生成させる。
【０１６８】
第６日に、培地を、ＫＳＲ（１５％）、ＬＤＮ−１９３１８９（５００ｎＭ）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。第８日まで培地を毎日交換する。ついで第８日に、培地を２つの脂肪細胞分化培地の１つと交換する。
【０１６９】
ｂ．１５％  ＫＳＲを含有しデキサメタゾン（１μＭ）、ＩＢＭＸ（５００μＭ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、Ｔ３（０，２ｎＭ）およびロシグリタゾン（１μＭ）で補足されたＤＭＥＭベースの培地から構成される脂肪細胞分化培地。この培地は標準的な脂肪生成培地であると当業者にみなされるであろう。
【０１７０】
ｃ．本出願の工程ｅ）において記載されている脂肪細胞分化培地。該培地は、１５％  ＫＳＲ、デキサメタゾン（１μＭ）、ＩＢＭＸ（５００μＭ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、Ｔ３（０，２ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（５μＭ）、アスコルビン酸（２５，５μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびヒドロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭベースの培地から構成される。
【０１７１】
第１１日に、デキサメタゾンおよびＩＢＭＸを両方の脂肪生成培地から除去する。培地は２〜３日ごとに交換する。
【０１７２】
方法３：ＷＯ１７２２３４５７に記載されているプロトコル
ＷＯ１７２２３４５７は、ｉＰＡＭ細胞の集団を準備し、ついでこの集団を２つの異なるセットの条件（すなわち、「ＨＩＦＬ」または「ＰＲＡ−アディポミックス（Ａｄｉｐｏｍｉｘ）」）下で培養することにより、ＵＣＰ１を発現する誘導性褐色脂肪組織（ｉＢＡＴ）細胞を生成させるインビトロ法を特許請求している。方法３を用いて方法１と同等なＢＡＰおよびＢＡが得られうるかどうかを判定するために、ｉＰＡＭ細胞を生成させ、ついで、ＷＯ１７２２３４５７に記載されている方法のそれぞれにさらした。
【０１７３】
方法３．１．方法「ＨＩＦＬ」：
第０日から第６日まで：方法２において既に記載されている「ｉＰＡＭ細胞の生成」を参照されたい。
【０１７４】
第６日に、培地を、ＫＳＲ（１５％）、ＬＤＮ−１９３１８９（１００ｎＭ）、ＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ＦＧＦ−２（２０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−１（２ｎｇ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。第８日まで培地を毎日交換する。
【０１７５】
第８日に、培地をＨＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＧＦ−Ｉ（２ｎｇ／ｍｌ）のみで補足する。培地は２〜３日ごとに交換する。
【０１７６】
方法３．２．方法「ＰＲＡ−アディポミックス」：
第０日から第６日まで：方法２において既に記載されている「ｉＰＡＭ細胞の生成」を参照されたい。
【０１７７】
第６日に、培地を、ＰＤ１７３０７４［２５０ｎＭおよびレチノイン酸（１００ｎＭ］を含有するＤＭＥＭベースの培地と交換する。
【０１７８】
第８日に、培養物を以下の２つの脂肪細胞分化培地と交換する。
【０１７９】
ａ．ＷＯ１７２２３４５７に記載されているアディポミックス培地。該培地は、１５％  ＫＳＲ、１×インスリン−トランスフェリン−セレン（ＩＴＳ）、５００μＭ  ＩＢＭＸ、１２５ｎＭ  インドメタシン、１ｎＭ  Ｔ３、５μＭ  デキサメタゾンおよび１μＭ  ロシグリタゾンを含有するＤＭＥＭベースの培地から構成される。培地は２〜３日ごとに交換する。
【０１８０】
ｂ．本出願に記載されている脂肪細胞分化培地。該培地は、１５％  ＫＳＲ、デキサメタゾン（１μＭ）、ＩＢＭＸ（５００μＭ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、Ｔ３（０，２ｎＭ）、ロシグリタゾン（１μＭ）、ＳＢ４３１５４２（５μＭ）、アスコルビン酸（２５，５μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）およびヒドロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）を含有するＤＭＥＭベースの培地から構成される。第１１日に、デキサメタゾンおよびＩＢＭＸを除去する。培地は２〜３日ごとに交換する。
【０１８１】
方法４：「Ｈａｆｎｅｒら，２０１６」に記載されているプロトコル
Ｈａｆｎｅｒらは、胚様体（ＥＢ）を形成させ、ＤＭＥＭ、血清およびＦＧＦ−２を含有する培地内でそれを培養し、ついで連続継代し、工程ｅ）の脂肪生成培地内で培養することにより、ｈｉＰＳ細胞からＢＡＰ細胞およびＢＡ細胞を生成させるための方法を開示している。方法１および４は、ＢＡＰを誘導しそれをＢＡに分化させるための共通の工程を有するが、方法４に関する胚様体の形成を伴う多能性細胞の分化の第１工程、または方法１に関するｉＰＡＭ細胞の生成およびそれに続く筋原性培地への曝露の点で異なる。
【０１８２】
方法４を用いて方法１の場合と同等の収率でＢＡＰおよびＢＡが得られうるかどうかを判定するために、両方の方法を並行して行った。
【０１８３】
２０％  ノックアウト血清置換物で補足されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地内での浮遊培養によりＥＢを形成させた。ＥＢ形成の１０日後、ＥＢをゼラチン被覆培養プレート上でプレーティングし、２０％  ＫＳＲで補足されたＤＭＥＭ／Ｆ１２培地内で８日間維持する。第１８日に、培地を、１０％  ＦＢＳで補足されたＤＭＥＭから構成される培地と交換する。１週間後、細胞を継代し、組織培養等級のプレート上に播く。継代４または５の後、均質形態を有する細胞集団が得られるまで、継代を繰り返す。
【０１８４】
細胞を５．１０４細胞／ｃｍ２の密度でプレーティングし、誘導培地、すなわち、ＦＢＳ（１０％）およびＦＧＦ−２（５ｎｈ／ｍｌ）で補足されたＤＭＥＭ内で維持する。細胞がコンフルエンスに達したら（この時点は分化の０日目と決定される）、培地を、ＦＢＳ（１０％）、ロシグリタゾン（１μＭ）、インスリン（１０μｇ／ｍｌ）、Ｔ３（０．２ｎＭ）、ＳＢ４３１５４２（５μＭ）、アスコルビン酸（２５．５μｇ／ｍｌ）、ＥＧＦ（１０ｎｇ／ｍｌ）、ヒドロコルチゾン（４μｇ／ｍｌ）、デキサメタゾン（１μＭ）およびＩＢＭＸ（５００μＭ）で補足された低グルコース（１ｇ／ｌ）含有ＤＭＥＭから構成される分化培地と交換する。デキサメタゾンおよびＩＢＭＸは第３日の後で廃棄される。ついで分化培地を分化の第１７日まで週２回交換する。
【０１８５】
方法５：ＷＯ２０１２／１４７８５３に記載されているプロトコル
ＷＯ２０１２／１４７８５３は、ｈｉＰＳ細胞から褐色脂肪細胞を２工程プロセスで高効率（＞９０％）で製造するための方法を特許請求している。最初に、無血清環境中の造血サイトカインの存在下の多能性幹細胞からの浮遊培養により、細胞凝集体を生成させる。ついで、造血サイトカインの存在下の細胞凝集体の細胞接着により、ＢＡを生成させる。各方法により得られうるＢＡの分化の収率を比較するために、方法１および５を並行して行った。
【０１８６】
ＷＯ２０１２／１４７８５３によれば、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地（５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１容量％の合成脂質溶液、１容量％の１００×ＩＴＳ、４５０ｍＭ  ＭＴＧ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５容量％のＰＦＨＩＩ、５０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸、２０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ４、５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２．５ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ６および５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ２を含有する）内での浮遊培養による胚様体（ＥＢ）の形成により、ｈｉＰＳ細胞の分化を開始させる。培地は３日ごとに交換する。
【０１８７】
８日後、ＩＭＤＭ／Ｆ１２培地（５ｍｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１容量％の合成脂質溶液、１容量％の１００×ＩＴＳ、４５０ｍＭ  ＭＴＧ、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、５容量％のＰＦＨＩＩ、５０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸、１０ｎｇ／ｍＬのＢＭＰ７、５ｎｇ／ｍＬのＶＥＧＦ、２０ｎｇ／ｍＬのＳＣＦ、２．５ｎｇ／ｍＬのＦｌｔ３Ｌ、２．５ｎｇ／ｍＬのＩＬ６および５ｎｇ／ｍＬのＩＧＦ２を含有する）内で、ゼラチン被覆培養プレート上でＥＢをプレーティングする。培地は３日ごとに交換する。
【０１８８】
定量的ＲＴ−ＰＣＲ：
核スピンＲＮＡプラスキット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ）を使用して全ＲＮＡを細胞培養から抽出した。ｉＳｃｒｉｐｔ  ｇＤＮＡクリアー（ｃｌｅａｒ）ｃＤＮＡ合成キット（Ｂｉｏｒａｄ）、適切なプライマーを使用して、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ  ４８０ＩＩ（Ｒｏｃｈｅ）において、５００ｎｇの全ＲＮＡに対してＲＴ−ＰＣＲを行った。ＴＢＰを内部対照として使用した。
【０１８９】
免疫細胞化学：
細胞培養物をＰＦＡ  ４％で固定した。リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の５％  ＮＧＳ、１％  ウシ胎児血清および０．２％  Ｔｒｉｔｏｎから構成されるブロッキング溶液と共に細胞を３０分間インキュベートした。一次抗体のインキュベーションを室温で１時間３０分行い、抗体の実施希釈度は以下のとおりであった。抗ＵＣＰ１（Ｒ＆Ｄ）は１：２５０であり、抗デスミン（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ）は１：８００であった。ＰＢＳ洗浄後、ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８結合二次抗体（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）（１：１０００）と共に細胞を３０分間インキュベートし、Ｄａｐｉで対比染色した。標準的なプロトコルに従いＨＣＳリピドトックス（ｌｉｐｉｄｔｏｘ）中性脂質染色を行った。
【０１９０】
実験結果
方法１と方法２との比較：
本発明の方法において記載されている培養工程の適用の存在下または非存在下、褐色脂肪細胞をｉＰＡＭ細胞が生成する能力（図１５）を評価した。同時にｈｉＰＳ細胞の単一バッチから開始して、ｉＰＡＭ細胞を生成させた。ついで、細胞を筋原性培地内で維持し（方法２．ａ）、または脂肪生成培地内で培養し（方法２．ｂおよびｃ）、または方法１に従い分化させた。
【０１９１】
ｑＰＣＲにより分析された脂肪細胞マーカーの発現：  この比較のために、方法１のＢＡＰおよびＢＡに関する並びに第２０日、第３０日における遺伝子の発現を、第８日（すなわち、脂肪細胞系譜へのいずれかの関与の前）に採取されたサンプルに対して正規化した。２０または３０日間の分化の後、方法２．ａの細胞はＦＡＢＰ４（汎脂肪生成マーカー）を弱く発現したが、ＵＣＰ１（褐色脂肪細胞特異的マーカー）を発現しなかった。しかし、方法２．ｂおよび２．ｃの細胞においては、第２０日または第３０日において、ＵＣＰ１の発現は低レベルで検出された。方法１から生成された対照細胞においては、ＵＣＰ１の発現は９００倍高かった。
【０１９２】
これらのデータは、脂肪生成培地を使用する適切な誘導により、ｉＰＡＭ細胞が褐色脂肪細胞に分化しうることを示している。しかし、方法２．ｂまたは２．ｃで生成された細胞においては、方法１で生成された細胞の場合よりも、ＵＣＰ１の発現は有意に低かった。このことは、本発明において記載されている追加的工程の重要性を証明している。本発明を構成する培養工程の組合せは、先行技術において示唆されるそれらの工程の任意の他の組合せと比較して、驚くほど高い収率のＢＡの製造をもたらす。
【０１９３】
方法１と方法３との比較：
ＷＯ１７２２３４５７に従いＢＡ細胞を生成する能力を評価した。同時にｈｉＰＳ細胞の単一バッチから開始して、ｉＰＡＭ細胞を生成させた。ついで、細胞を方法１、３．１、３．２．ａおよび３．２．ｂの培養工程にさらした（方法の節に詳細に記載されている）。
【０１９４】
ｑＰＣＲにより分析された脂肪細胞マーカーの発現：
この比較のために、方法１のＢＡＰおよびＢＡに関する並びに第２０日、第３０日における遺伝子の発現を、第８日（すなわち、脂肪細胞系譜へのいずれかの関与の前）に採取されたサンプルに対して正規化した。
【０１９５】
２０または３０日間の分化の後、「ＨＩＦＬ」と称される方法３．１の細胞は脂肪細胞マーカーを全く発現しなかった（図１６）。このことは、該細胞が褐色脂肪細胞に分化しなかったことを示唆している。２０または３０日後、方法３．２の細胞は低レベルのＦＡＢＰ４およびＵＣＰ１マーカーを発現した（図１７）。ＵＣＰ１の発現は、方法１から生成された対照細胞においては、少なくとも１０００倍高かった。
【０１９６】
これらのデータは、適切な誘導により、ｉＰＡＭ細胞が褐色脂肪細胞に分化しうることを示している。しかし、ＵＣＰ１の発現は、方法３で生成された細胞においては、方法１と比較して有意に低かった。ＷＯ１７２２３４５７に記載されている方法はＢＡ細胞を低収率で生成させうるが、これらの結果は本発明の方法の優位性を明らかに示している。
【０１９７】
方法１と方法４との比較：
ＨａｆｎｅｒらによるＢＡ細胞の生成能力を評価した。方法１または方法４に従い褐色脂肪細胞を生成させるために、ｈｉＰＳ細胞を分化させた。二次分化前のＢＡＰ培養および脂肪生成培地内での１７日間の成熟の後のＢＡ培養を継代４（データ非表示）および５（図１８）においてｑＰＣＲおよび免疫蛍光により分析した。
【０１９８】
ｑＰＣＲにより分析された脂肪細胞マーカーの発現：  この比較のために、分化細胞における遺伝子の発現を未分化細胞における発現により正規化する。どちらの方法で得られたＢＡ細胞もＦＡＢＰ４およびＵＣＰ１の発現を示したが（図１８．Ｂ．）、方法１からの細胞はＵＣＰ１を１００倍高いレベルで発現した。
【０１９９】
ＩＦにより分析された脂肪細胞マーカーの発現：  ＵＣＰ１を発現し脂質滴を提示する細胞の集団は、方法１においては、方法４の場合よりも有意に高かった（方法１では約４７％、および方法４では２５％）（図１８．Ａ．）。
【０２００】
したがって、これらの結果は、驚くべきことに、方法１において記載されている、沿軸中胚葉系譜の誘導と継代によるＢＡＰの富化との組合せが、分化の収率を有意に改善することを示している。
【０２０１】
方法１と方法５との比較：
本発明者らは方法５の結果を再現することができなかった。数回の試みにもかかわらず、細胞凝集体の形成の最初の工程の後、２〜３日後に高い細胞死亡率が認められた（図１９）。細胞培養物は８日後に完全に喪失した。
【０２０２】
しかし、未分化ｈｉＰＳ細胞の同一バッチを使用して方法１に従い分化させた対照細胞は、ｑＰＣＲ（ＦＡＢＰ４およびＵＣＰ１マーカーは、ＢＡにおいて、ＢＡＰよりも多く発現された）または免疫蛍光法（１７日間の分化の後、ＵＣＰ１を発現し脂質滴を提示する細胞集団は８５％に達した）のいずれにおいても、予想された結果を示した。このことは、方法５の再現中に認められた細胞死亡率が、使用された未分化ｈｉＰＳ細胞によるものではなかったことを示唆している。
【０２０３】
これらの結果は、ＷＯ２０１２／１４７８５３の方法が再現性がない又は外部要因に大きく依存することを示唆しており、このことはこの方法を産業用途に不適なものにし、方法１の優位性を証明しており、方法５から理論的に得られうる細胞が、本発明の方法により得られる細胞と比較しうるものではないことを示唆している。
【０２０４】
比較の要約：
既存方法に対する本発明の技術的利点を実証するために、本発明を、以下の生成を特許請求（または主張）している先行技術において開示されている他の方法と比較した。
【０２０５】
・ｉＰＡＭ細胞からの脂肪細胞または褐色脂肪細胞の生成、あるいは
・ｈｉＰＳ細胞からの褐色脂肪細胞の生成。
【０２０６】
ｑＰＣＲによる分析（図２０）は、方法１で生成されたＢＡが、その他の方法のいずれよりも高いレベルで褐色脂肪細胞特異的マーカーＵＣＰ１を発現することを示しており（例えば、方法４より１００倍高い、そして方法３より最大１０００倍高い）、有意に高い分化収率を証明している。これらの結果は、本発明の方法が、ＢＡＰおよびＢＡの生成の収率および／または持続時間に関してだけでなく、ＥＢの非存在下のロバスト性に関しても、既存方法と比較して優れていることを明らかに示している。したがって、本出願はＢＡＰおよびＢＡの驚くべき新規製造方法を開示している。
【０２０７】
参考文献
本出願の全体にわたり、種々の参考文献が、本発明に関連した最新技術を記載している。これらの参考文献の開示を参照により本開示に組み入れることとする。
【０２０８】
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Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．ら，１９８４，“Ａ  ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ  ｓｅｔ  ｏｆ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｐｒｏｇｒａｍｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＶＡＸ”，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  １２（１）：３８７−３９５．
Ｇａｚｅｒｒｏ  Ｅ．およびＭｉｎｅｔｔｉ  Ｃ．（２００７）Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｄｒｕｇ  ｔａｒｇｅｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ｂｏｎｅ  ｍｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ．Ｃｕｒｒ  Ｏｐｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．：３２５−３３
Ｈｕａｎｇら，Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ｒｅｐｏｒｔｓ，２０１７．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ４０７１６
Ｌｏｓｅｒ，Ｐ．，Ｓｃｈｉｒｍ，Ｊ．，Ｇｕｈｒ，Ａ．，Ｗｏｂｕｓ，Ａ．Ｍ．ａｎｄ  Ｋｕｒｔｚ，Ａ．（２０１０）．Ｈｕｍａｎ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｕｓｅ  ｉｎ  ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ２８，２４０−６．
Ｍｅｙｅｒｓ  Ｅ．Ｘ．およびＭｉｌｌｅｒ  Ｗ．，Ｏｐｔｉｍａｌ  ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｌｉｎｅａｒ  ｓｐａｃｅ，（１９８８）Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．，４：１１−１７．
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ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ，１９７０，“Ａ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｍｅｔｈｏｄ  ａｐｐｌｉｃａｂｌｅ  ｔｏ  ｔｈｅ  ｓｅａｒｃｈ  ｆｏｒ  ｓｉｍｉｌａｒｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｔｗｏ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ”，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３．
Ｎｅｄｅｒｇａａｒｄら  ２００１，Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ．ＵＣＰ１：ｔｈｅ  ｏｎｌｙ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ａｂｌｅ  ｔｏ  ｍｅｄｉａｔｅ  ａｄａｐｔｉｖｅ  ｎｏｎ−ｓｈｉｖｅｒｉｎｇ  ｔｈｅｒｍｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｉｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
Ｐａｕｌｉｎら，Ｅｘｐ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｙｅｘｃｒ．２００４．０８．００４
Ｓａｔｏ，Ｎ．，Ｍｅｉｊｅｒ，Ｌ．，Ｓｋａｌｔｓｏｕｎｉｓ，Ｌ．，Ｇｒｅｅｎｇａｒｄ，Ｐ．およびＢｒｉｖａｎｌｏｕ，Ａ．Ｈ．（２００４）．Ｍａｉｎｔｅｎａｎｃｅ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ  ｉｎ  ｈｕｍａｎおよびｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｂｙ  ａ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  ＧＳＫ−３−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ．Ｎａｔ  Ｍｅｄ  １０，５５−６３．
Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｋ．，Ｈａｌｌ，Ａ．およびＴｏｌｗｉｎｓｋｉ，Ｎ．（２００９）．Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｍｅｅｔ  Ｒｈｏ  ＧＴＰａｓｅｓ．Ｇｅｎｅｓ  Ｄｅｖ  ２３，２６５−７７．
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｅ，Ｇ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８７
Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ，Ｇｒｉｂｓｋｏｖ，Ｍ．ａｎｄ  Ｄｅｖｅｒｅｕｘ，Ｊ．編，Ｍ  Ｓｔｏｃｋｔｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１
Ｔａｅｌｍａｎ，Ｖ．Ｆ．，Ｄｏｂｒｏｗｏｌｓｋｉ，Ｒ．，Ｐｌｏｕｈｉｎｅｃ，Ｊ．Ｌ．，Ｆｕｅｎｔｅａｌｂａ，Ｌ．Ｃ．，Ｖｏｒｗａｌｄ，Ｐ．Ｐ．，Ｇｕｍｐｅｒ，Ｉ．，Ｓａｂａｔｉｎｉ，Ｄ．Ｄ．およびＤｅ  Ｒｏｂｅｒｔｉｓ，Ｅ．Ｍ．（２０１０）．Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｒｅｑｕｉｒｅｓ  ｓｅｑｕｅｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｇｌｙｃｏｇｅｎ  ｓｙｎｔｈａｓｅ  ｋｉｎａｓｅ  ３  ｉｎｓｉｄｅ  ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｓｏｍｅｓ．Ｃｅｌｌ  １４３，１１３６−４８．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．，Ｔａｎａｂｅ，Ｋ．，Ｏｈｎｕｋｉ，Ｍ．，Ｎａｒｉｔａ，Ｍ．，Ｉｃｈｉｓａｋａ，Ｔ．，Ｔｏｍｏｄａ，Ｋ．ａｎｄ  Ｙａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００７）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ａｄｕｌｔ  ｈｕｍａｎ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １３１，８６１−７２．
Ｔａｋａｈａｓｈｉ，Ｋ．およびＹａｍａｎａｋａ，Ｓ．（２００６）．Ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ  ｆｒｏｍ  ｍｏｕｓｅ  ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｄ  ａｄｕｌｔ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｂｙ  ｄｅｆｉｎｅｄ  ｆａｃｔｏｒｓ．Ｃｅｌｌ  １２６，６６３−７６．
Ｗｕ，Ｄ．およびＰａｎ，Ｗ．（２０１０）．ＧＳＫ３：ａ  ｍｕｌｔｉｆａｃｅｔｅｄ  ｋｉｎａｓｅ  ｉｎ  Ｗｎｔ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ．Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｓｃｉ  ３５，１６１−８．
Ｙｏｏｎ  ＪＫら，（２０１５），Ｔｈｅ  ｂＨＬＨ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒ  ｐＭｅｓｏｇｅｎｉｎ１  ｉｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｓｅｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐａｒａｘｉａｌ  ｍｅｓｏｄｅｒｍ．Ｇｅｎｅｓ．Ｄｅｖ．，１４：３２０４−３２１４．
Ｙｕ，Ｊ．，Ｖｏｄｙａｎｉｋ，Ｍ．Ａ．，Ｓｍｕｇａ−Ｏｔｔｏ，Ｋ．，Ａｎｔｏｓｉｅｗｉｃｚ−Ｂｏｕｒｇｅｔ，Ｊ．，Ｆｒａｎｅ，Ｊ．Ｌ．，Ｔｉａｎ，Ｓ．，Ｎｉｅ，Ｊ．，Ｊｏｎｓｄｏｔｔｉｒ，Ｇ．Ａ．，Ｒｕｏｔｔｉ，Ｖ．，Ｓｔｅｗａｒｔ，Ｒ．ら（２００７）．Ｉｎｄｕｃｅｄ  ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌ  ｌｉｎｅｓ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｓｏｍａｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３１８，１９１７−２０．
Ｙｕ  ＰＢ，Ｈｏｎｇ  ＣＣ，Ｓａｃｈｉｄａｎａｎｄａｎ  Ｃ，Ｂａｂｉｔｔ  ＪＬ，Ｄｅｎｇ  ＤＹ，Ｈｏｙｎｇ  ＳＡ，Ｌｉｎ  ＨＹ，Ｂｌｏｃｈ  ＫＤ，Ｐｅｔｅｒｓｏｎ  ＲＴ．Ｄｏｒｓｏｍｏｒｐｈｉｎ  ｉｎｈｉｂｉｔｓ  ＢＭＰ  ｓｉｇｎａｌｓ  ｒｅｑｕｉｒｅｄ  ｆｏｒ  ｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ  ａｎｄ  ｉｒｏｎ  ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ．Ｎａｔ  Ｃｈｅｍ  Ｂｉｏｌ．２００８  Ｊａｎ；４（１）：３３−４１．Ｅｐｕｂ  ２００７  Ｎｏｖ  １８．
Ｚａｍｍｉｔら，Ｊ．Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００６．ｄｏｉ：１０．１２４２／ｊｃｓ．０２９０８。
【０２０９】
略語／分子一覧
アスコルビン酸（ビタミンＣとしても公知である）はヒトの食事における必須栄養素である。アスコルビン酸は強力な還元剤および抗酸化剤である。抗酸化活性に加えて、アスコルビン酸（ＡＳＣ）は、プロコラーゲンにおけるプロリンおよびリジン残基のヒドロキシル化酵素の補因子として作用する。製造業者：Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ。
【０２１０】
ＣＨＩＲ９９０２１は、ＧＳＫ３の非常に強力なインヒビターであるアミノピリミジン誘導体であり、ＷＮＴ活性化因子として作用する。製造業者：ａｘｏｎ  ｍｅｄｃｈｅｍ。
【０２１１】
デキサメタゾンは合成グルココルチコイドホルモンである。製造業者：Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ。
【０２１２】
ＤＭＥＭ：ダルベッコ変法イーグル培地（基礎培地）。製造業者：Ｇｉｂｃｏ。
【０２１３】
ＥＧＦ：上皮増殖因子（ＥＧＦ）は、その受容体であるＥＧＦＲに結合することにより、細胞の増殖および分化を刺激する。製造業者：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃｈ。
【０２１４】
ＦＢＳ：ウシ胎児血清。製造業者：ＰａｎＳｅｒａ；Ｄｕｔｓｃｈｅｒ。
【０２１５】
ＦＧＦ−２（別名ｂＦＧＦ）：線維芽細胞増殖因子−２。製造業者：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃｈ。
【０２１６】
ＨＧＦ：肝細胞増殖因子。製造業者：Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ。
【０２１７】
ヒドロコルチゾンは、副腎皮質から分泌されるグルココルチコイドである。製造業者：Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ。
【０２１８】
ＩＢＭＸ：（３−イソブチル−１−メチルキサンチン）は、サイクリックＡＭＰおよびサイクリックＧＭＰホスホジエステラーゼ（ＰＤＥ）の非特異的インヒビターである。ＰＤＥを阻害することにより、ＩＢＭＸは細胞ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルを増加させて、環状ヌクレオチドにより調節されるプロテインキナーゼを活性化する。製造業者：Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。
【０２１９】
ＩＧＦ−１：インスリン増殖因子１型。製造業者：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃｈ。
【０２２０】
ＩＴＳ：インスリン−トランスフェリン−セレン。それは細胞サプリメントである。インスリンはグルコースおよびアミノ酸の吸収、脂質生成、細胞内輸送、ならびにタンパク質および核酸の合成を促進する。トランスフェリンは、遊離鉄のレベルを制御する鉄結合性糖タンパク質である（また、酸素および過酸化物フリーラジカルのレベルを低下させるのを補助しうる）。セレンはグルタチオンペルオキシダーゼおよび他のタンパク質の補因子であり、培地における抗酸化剤として使用される。製造業者：Ｇｉｂｃｏ。
【０２２１】
ＫＳＲ：ノックアウト血清補充。それは、多能性幹細胞（ＰＳＣ）の成長を支持する、より明確なＦＢＳ非含有培地補足物である。製造業者：Ｇｉｂｃｏ。
【０２２２】
ＬＤＮ−１９３４８９：ＬＤＮ−１９３１８９は骨形成タンパク質（ＢＭＰ）Ｉ型受容体ＡＬＫ２およびＡＬＫ３の細胞透過性小分子インヒビターである。ＬＤＮ−１９３１８９はドルソモルフィンの構造活性相関研究から誘導されたものであり、主にＳｍａｄ１、Ｓｍａｄ５およびＳｍａｄ８のリン酸化の阻害を介して作用する。製造業者：Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ｂｉｏｔｅｃｈ。
【０２２３】
ｍＴＥＳＲ−１：ｈＥＳＣおよびｈｉＰＳＣのフィーダー非依存的維持のための標準化培地。製造業者：Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。
【０２２４】
Ｙ−２７６３２（通称：ロック（Ｒｏｃｋ）−１インヒビター）：Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）のインヒビター。製造業者：Ｔｏｃｒｉｓ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ。
【０２２５】
ロシグリタゾン：ロシグリタゾンはチアゾリジンジオンクラスの抗糖尿病薬である。他のチアゾリジンジオンと同様に、その作用メカニズムは、ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体（ＰＰＡＲ）、特にＰＰＡＲ−ガンマの細胞内受容体クラスの活性化によるものである。製造業者：Ｐｒｅｓｔｗｉｃｋ。
【０２２６】
ＳＢ４３１５４２はＴＧＦ−β／アクチビン／ＮＯＤＡＬ経路の小分子インヒビターであり、ＡＬＫ５、ＡＬＫ４およびＡＬＫ７を阻害するが、ＢＭＰ  Ｉ型受容体ＡＬＫ２、ＡＬＫ３およびＡＬＫ６を阻害しない。製造業者：Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ。
【０２２７】
Ｔ３：トリヨードチロニン。Ｔ３は、チロキシンの脱ヨウ素化により生じる甲状腺ホルモンである。製造業者：Ｓｉｇｍａ  ａｌｄｒｉｃｈ。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９−１】
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【図９−２】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１−１】
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【図１１−２】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１３Ｄ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８Ａ】
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【図１８Ｂ】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図１９Ｃ】
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【図２０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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