(57)【要約】細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの弱毒化および／または感染性を評価するための方法および組成物が、提供される。いくつかの態様では、試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の弱毒化または感染性を評価するための方法が、提供される。このような方法は、例えば、（ａ）分化したＴＨＰ−１細胞を試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に感染させることであって、ＴＨＰ−１細胞が試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に感染する前にマクロファージに分化している、感染させることと、（ｂ）ＴＨＰ−１細胞を溶解し、寒天上で溶解物を播種することと、（ｃ）寒天上での成長によりＴＨＰ−１細胞内で増殖したＬｉｓｔｅｒｉａを計数することと、を含むことができる。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の弱毒化または感染性を評価する方法であって、
（ａ）分化したＴＨＰ−１細胞を前記試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に感染させることであって、前記ＴＨＰ−１細胞が前記試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に感染する前にマクロファージに分化している、感染させることと、
（ｂ）前記ＴＨＰ−１細胞を溶解し、寒天上で前記溶解物を播種することと、
（ｃ）前記寒天上での成長により前記ＴＨＰ−１細胞内で増殖した前記Ｌｉｓｔｅｒｉａを計数することと、を含む、方法。
【請求項２】
ステップ（ａ）の前に、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を使用して、前記ＴＨＰ−１細胞をマクロファージに分化させることをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ステップ（ａ）が、１：１の感染多重度（ＭＯＩ）で前記分化したＴＨＰ−１細胞を感染させることを含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
ステップ（ａ）と（ｂ）の間で、前記ＴＨＰ−１細胞によって取り込まれなかったＬｉｓｔｅｒｉａを死滅させることをさらに含む、請求項１〜３のいずれかに記載の方法。
【請求項５】
抗生物質を使用して、前記死滅が行われ、任意に、前記抗生物質がゲンタマイシンである、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
ステップ（ｂ）が、感染後０時間で行われる、請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
ステップ（ｂ）が、感染後３時間で行われる、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の取り込みおよび細胞内成長を野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ株および／または参照試料と比較することをさらに含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、前記融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）またはその断片であり、前記疾患関連抗原ペプチドが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質Ｅ７またはその断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡの欠失または不活性化変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、請求項１０または１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔの欠失または不活性化変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、前記核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、前記ＰＥＳＴ含有ペプチドが、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）のＮ末端断片である、請求項１０に記載の方法。
【請求項１４】
試験細菌株の弱毒化または感染性を評価する方法であって、
（ａ）ＴＨＰ−１細胞を分化することと、
（ｂ）前記分化したＴＨＰ−１細胞を前記試験細菌株に感染させることであって、前記感染が、
（ｉ）前記分化したＴＨＰ−１細胞を前記試験細菌株に接種することと、
（ｉｉ）前記試験細菌株を前記分化したＴＨＰ−１細胞で１〜５時間インキュベートして、感染したＴＨＰ１細胞を形成することと、
（ｉｉｉ）前記感染したＴＨＰ−１細胞から細胞外細菌を除去することと、
（ｉｖ）前記感染したＴＨＰ−１細胞を成長培地中で０〜１０時間インキュベートすることと、を含む、感染させることと、
（ｃ）前記感染したＴＨＰ−１細胞を溶解して、溶解物を形成することと、
（ｄ）前記溶解物または前記溶解物の希釈物を、前記細菌の成長を支持することができる培地を含むプレート上で藩種することと、
（ｅ）前記プレート上の前記細菌のコロニー形成単位を計数することと、を含む、方法。
【請求項１５】
前記分化したＴＨＰ−１細胞を感染させるステップが、１：１の感染多重度（ＭＯＩ）である、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
細胞外細菌を除去するステップが、前記細菌に対して有効な抗生物質を添加することを含み、任意に、前記抗生物質がゲンタマイシンである、請求項１４または１５に記載の方法。
【請求項１７】
前記感染したＴＨＰ−１細胞が、成長培地中で０、１、３、または５時間インキュベートされる、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記試験細菌株がＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、請求項１４〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、２０１８年３月９日に出願された米国出願第６２／６４０，８５５号の利益を主張し、これはすべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＥＦＳ−Ｗｅｂを介したテキストファイルとして提出された
配列表への参照
ファイル５２８０９２＿ＳｅｑＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５．ｔｘｔに記述された配列表は、８９キロバイトで、２０１９年２月２５日に作成され、参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）は、ヒトにおけるリステリア症の原因となるグラム陽性で芽胞を形成しない細菌である。癌免疫療法などのＬｍに基づく免疫療法を使用するために、これらの細菌は、弱毒化されるようにバイオ操作され、そのため、腫瘍特異的抗原を送達し、抗原特異的免疫応答を生成するがリステリア症を引き起こさないように使用することができる。初代マクロファージは、Ｌｍに基づく免疫療法がサイトゾルに感染して複製する能力を評価する（ａｓｓｅｓｓ）ために使用することができる。しかしながら、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の弱毒化および感染性を評価するために、より良い方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株、例えばＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの弱毒化および／または感染性を評価するための方法および組成物が、提供される。いくつかの態様では、試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の弱毒化または感染性を評価するための方法が、提供される。このような方法は、例えば、（ａ）分化したＴＨＰ−１細胞を試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に感染させることであって、ＴＨＰ−１細胞が試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に感染する前にマクロファージに分化している、感染させることと、（ｂ）ＴＨＰ−１細胞を溶解し、寒天上で溶解物を播種することと、（ｃ）寒天上での成長によりＴＨＰ−１細胞内で増殖したＬｉｓｔｅｒｉａを計数することと、を含むことができる。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１Ａ】適格性評価アッセイ３における時間対生存細胞数（ＶＣＣ）としてプロットした参照基準および野生型対照に対する細菌成長率および倍加時間を示すグラフ。
【図１Ｂ】適格性評価アッセイ４における時間対生存細胞数（ＶＣＣ）としてプロットした参照基準および野生型対照に対する細菌成長率および倍加時間を示すグラフ。
【図１Ｃ】適格性評価アッセイ５における時間対生存細胞数（ＶＣＣ）としてプロットした参照基準および野生型対照に対する細菌成長率および倍加時間を示すグラフ。
【図２Ａ】アッセイ間の比較を示す時間対生存細胞数（ＶＣＣ）としてプロットした野生型に対する細菌成長率および倍加時間を示すグラフ。
【図２Ｂ】アッセイ間の比較を示す時間対生存細胞数（ＶＣＣ）としてプロットした参照標準ＡＤＸＳ１１−００１に対する細菌成長率および倍加時間を示すグラフ。
【図３】ｐ−２、ｐ０、ｐ１、ｐ３、およびｐ５の時点で観察された生の計数情報を示すグラフ。
【図４】ｐ−２での計数とｐ０で見られた計数との比率を示すグラフ。
【図５】野生型に対する比率として、ｐ−２での計数とｐ０で見られた計数との比率を示すグラフ。
【図６】ｐ３およびｐ％での計数とｐ０で見られた計数との比率を示すグラフ。
【図７】野生型に対するｐ３およびｐ％での計数とｐ０で見られた計数との比率を示すグラフ。
【図８】データ実行による、野生型に対するｐ３およびｐ％での計数とｐ０で見られた計数との比率を示すグラフ。
【図９】野生型に対する、ｐ−２からｐ０への計数の比例的減少における継代数の影響を示すグラフ。
【図１０】回帰分析を示すグラフは、継代数の影響を評価する（ｅｖａｌｕａｔｅ）ために使用された。
【図１１】図３の各曲線における２つの結果として生じた変数間の関係を示すグラフ。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
定義
本明細書で互換的に使用される、「タンパク質」、「ポリペプチド」、および「ペプチド」という用語は、コード化および非コード化アミノ酸ならびに化学的または生化学的に修飾または誘導体化したアミノ酸を含む、任意の長さのアミノ酸のポリマー形態を指す。これらの用語には、修飾されたペプチド骨格を有するポリペプチドなどの修飾されたポリマーが含まれる。
【０００７】
タンパク質は、「Ｎ末端」および「Ｃ末端」を有すると言われている。「Ｎ末端」という用語は、遊離アミン基（−ＮＨ２）を有するアミノ酸によって終端されたタンパク質またはポリペプチドの開始部に関する。「Ｃ末端」という用語は、遊離カルボキシル基（−ＣＯＯＨ）によって終端されたアミノ酸鎖（タンパク質またはポリペプチド）の末端部に関する。
【０００８】
「融合タンパク質」という用語は、ペプチド結合または他の化学結合によって一緒に連結されている２つ以上のペプチドを含むタンパク質を指す。ペプチドは、ペプチドまたは他の化学結合によって直接一緒に連結し得る。例えば、キメラ分子は、一本鎖融合タンパク質として組換え発現され得る。あるいは、ペプチドは、２つ以上のペプチド間の１つ以上のアミノ酸などの「リンカー」または別の適切なリンカーによって一緒に連結し得る。
【０００９】
本明細書で互換的に使用される、「核酸」および「ポリヌクレオチド」という用語は、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、またはそれらの類似体もしくは修飾バージョンを含む、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。これらには、一本鎖、二本鎖、および多重鎖ＤＮＡまたはＲＮＡ、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド、およびプリン塩基、ピリミジン塩基、または他の天然、化学修飾、生化学修飾、非天然、もしくは誘導体化されたヌクレオチド塩基を含むポリマーが含まれる。
【００１０】
１つのモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がホスホジエステル結合を介して一方向で、その隣の３’酸素に結合する手法でオリゴヌクレオチドを作製するように、モノヌクレオチドが反応するため、核酸は、「５’末端」および「３’末端」を有すると言われている。オリゴヌクレオチドの末端は、モノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩がモノヌクレオチドペントース環の３’酸素に連結されていない場合、「５’末端」と呼ばれる。オリゴヌクレオチドの末端は、その３’酸素が別のモノヌクレオチドペントース環の５’リン酸塩に連結されていない場合、「３’末端」と呼ばれる。核酸配列は、より大きなオリゴヌクレオチドの内部に存在するとしても、５’および３’末端を有するとも言われ得る。線状または環状ＤＮＡ分子のいずれかにおいて、別個の要素は、「上流」または「下流」の５’もしくは３’要素であると呼ばれる。
【００１１】
「コドン最適化」とは、天然アミノ酸配列を維持しながら、天然配列の少なくとも１つのコドンを、宿主細胞の遺伝子においてより頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンで置き換えることによって、特定の宿主細胞における発現の増強のために核酸配列を修飾するプロセスを含む。例えば、融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを、天然に存在する核酸配列と比較すると、所与のＬｉｓｔｅｒｉａ細胞または任意の他の宿主細胞においてより高い使用頻度を有するコドンを置換するように修飾することができる。コドン使用頻度表は、例えば、「Ｃｏｄｏｎ  Ｕｓａｇｅ  Ｄａｔａｂａｓｅ」で容易に入手可能である。各アミノ酸についてＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓが利用する最適なコドンは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００７／０２０７１７０に示されている。これらの表は、様々な方法で適用することができる。すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＮａｋａｍｕｒａ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ２８：２９２を参照されたい。特定の宿主における発現のための特定の配列のコドン最適化のためのコンピュータアルゴリズム（例えば、Ｇｅｎｅ  Ｆｏｒｇｅを参照のこと）もまた利用可能である。
【００１２】
「プラスミド」または「ベクター」という用語には、細菌送達ベクター、ウイルスベクター送達ベクター、ペプチド免疫療法送達ベクター、ＤＮＡ免疫療法送達ベクター、エピソームプラスミド、組み込み型プラスミド、またはファージベクターを含む、任意の既知の送達ベクターが含まれる。「ベクター」という用語は、１つ以上の融合ポリペプチドを送達し、かつ任意に、それを宿主細胞において発現することができる構築物を指す。
【００１３】
「エピソームプラスミド」または「染色体外プラスミド」という用語は、染色体ＤＮＡとは物理的に離れていて（すなわち、エピソームまたは染色体外で、宿主細胞のゲノムに組み込まれない）、染色体ＤＮＡとは独立して複製する核酸ベクターを指す。プラスミドは、線状または環状であってよく、一本鎖または二本鎖であってよい。エピソームプラスミドは、任意に、宿主細胞の細胞質（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）で多数のコピーで存在し、エピソームプラスミド内で目的の任意の遺伝子の増幅をもたらし得る。
【００１４】
「ゲノムに組み込まれた」という用語は、ヌクレオチド配列が細胞のゲノムに組み込まれ、その後代によって引き継ぐことができるように、細胞に導入されている核酸を指す。細胞のゲノムへの核酸の安定した組み込みのために、任意のプロトコルを使用してよい。
【００１５】
「安定的に維持される」という用語は、選択（例えば、抗生物質選択）の非存在下で、検出可能な喪失を伴わずに少なくとも１０世代にわたる核酸分子またはプラスミドの維持を指す。例えば、その期間は、少なくとも１５世代、２０世代、少なくとも２５世代、少なくとも３０世代、少なくとも４０世代、少なくとも５０世代、少なくとも６０世代、少なくとも８０世代、少なくとも１００世代、少なくとも１５０世代、少なくとも２００世代、少なくとも３００世代、または少なくとも５００世代であり得る。安定的に維持されるとは、核酸分子またはプラスミドがインビトロ（例えば、培養中）で細胞において安定的に維持されること、インビボで安定的に維持されること、またはその両方を指す。
【００１６】
「オープンリーディングフレーム」または「ＯＲＦ」は、タンパク質を潜在的にコードし得る塩基の配列を含有するＤＮＡの部分である。例として、ＯＲＦは、遺伝子の開始コード配列（開始コドン）と停止コドン配列（終止コドン）との間に位置し得る。
【００１７】
「プロモーター」は、ＲＮＡポリメラーゼＩＩが特定のポリヌクレオチド配列のための適切な転写開始部位でＲＮＡ合成を開始することを指示することができるＴＡＴＡボックスを通常含むＤＮＡの調節領域である。プロモーターは、転写開始速度に影響を及ぼす他の領域をさらに含み得る。本明細書に開示されるプロモーター配列は、作動可能に連結されたポリヌクレオチドの転写を調節する。プロモーターは、本明細書に開示される１つ以上の細胞型（例えば、真核細胞、非ヒト哺乳動物細胞、ヒト細胞、げっ歯類細胞、多能性細胞、一細胞期胚、分化した細胞、またはそれらの組み合わせ）において活性であり得る。プロモーターは、例えば、構成的に活性なプロモーター、条件付きプロモーター、誘導性プロモーター、時間的に制限されたプロモーター（例えば、発生的に調節されたプロモーター）、または空間的に制限されたプロモーター（例えば、細胞特異的または組織特異的プロモーター）であり得る。プロモーターの例は、例えば、ＷＯ２０１３／１７６７７２において見出すことができ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００１８】
「作動可能な連結」または「作動可能に連結されている」とは、その両方の成分が正常に機能し、かつ成分の少なくとも１つが他の成分のうちの少なくとも１つに及ぶ機能を媒介し得る可能性を許すような、２つ以上の成分（例えば、プロモーターおよび別の配列要素）の並列を指す。例えば、プロモーターが、１つ以上の転写調節因子の存在または非存在に応じてコード配列の転写のレベルを制御する場合、そのプロモーターは、コード配列に作動可能に連結され得る。作動可能な連結は、そのような配列が相互に近接していること、またはトランスに作用する（例えば、制御配列が、コード配列の転写を制御するために離れて作用し得る）ことを含み得る。
【００１９】
２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の文脈における「配列同一性」または「同一性」は、特定の比較ウィンドウで最大の一致のためにアラインさせる場合、同じである２つの配列の残基について言及する。タンパク質に関して、配列同一性のパーセンテージを使用する場合、同一ではない残基位置は多くの場合に、保存的アミノ酸置換によって異なることが認められ、その保存的アミノ酸置換では、アミノ酸残基は同様の化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する他のアミノ酸残基で置換されており、したがって、分子の機能特性を変化させない。配列が保存的置換で異なる場合、配列同一性パーセントを、置換の保存的性質について補正するために、上方に調整してもよい。そのような保存的置換によって異なる配列は、「配列類似性」または「類似性」を有すると言われている。この調整を行う手段は、周知である。典型的には、これは、保存的置換を完全なミスマッチではなく部分的なミスマッチとしてスコアリングして、それによって、配列同一性パーセンテージを増加させることを含む。したがって、例えば、同一のアミノ酸が１のスコアを与えられ、非保存的置換がゼロのスコアを与えられる場合に、保存的置換は、ゼロから１の間のスコアを与えられる。保存的置換のスコアリングは、例えば、プログラムＰＣ／ＧＥＮＥ（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で実行されるように計算される。
【００２０】
「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適にアラインされた配列（完全にマッチする残基の数が最大）を比較することによって決定される値を指し、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのための（付加また欠失を含まない）参照配列と比較した場合に、付加または欠失（すなわち、ギャップ）を含んでもよい。パーセンテージは、同一の核酸塩基またはアミノ酸残基が両方の配列中に発生する位置の数を決定して一致した位置の数を得ること、一致した位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割ること、および結果に１００を掛けて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算される。特に明記しない限り（例えば、短い方の配列が、連結された非相同配列を含む）、比較ウィンドウは、比較される２つの配列のうちの短い方の全長である。
【００２１】
特に明記しない限り、配列同一性／類似性の値は、パラメーター：５０のＧＡＰ重量および３の長さ重量、およびｎｗｓｇａｐｄｎａ．ｃｍｐスコアリングマトリックスを使用するヌクレオチド配列の同一性％および類似性％；８のＧＡＰ重量および２の長さ重量、およびＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用するアミノ酸配列の同一性％および類似性％；またはその任意の同等のプログラムを使用し、ＧＡＰバージョン１０を使用して得られた値を指す。「同等のプログラム」は、問題の任意の２つの配列について、ＧＡＰバージョン１０によって生成された対応するアラインメントと比較した場合、同一のヌクレオチドまたはアミノ酸残基の一致および同一のパーセント配列同一性を有するアラインメントを生成する任意の配列比較プログラムを含む。
【００２２】
「保存的アミノ酸置換」という用語は、配列中に通常存在するアミノ酸の、類似のサイズ、電荷、または極性の、異なるアミノ酸との置換を指す。保存的置換の例には、イソロイシン、バリン、またはロイシンなどの非極性（疎水性）残基の、別の非極性残基との置換が含まれる。同様に、保存的置換の例には、アルギニンとリジンの間、グルタミンとアスパラギンの間、またはグリシンとセリンの間などの、１つの極性（親水性）残基の別のものとの置換が含まれる。加えて、リシン、アルギニン、もしくはヒスチジンなどの塩基性残基から別のものへの置換、またはアスパラギン酸もしくはグルタミン酸などのある酸性残基から別の酸性残基への置換は、保存的置換の追加の例である。非保存的置換の例には、非極性（疎水性）アミノ酸残基、例えば、イソロイシン、バリン、ロイシン、アラニン、またはメチオニンから極性（親水性）残基、例えば、システイン、グルタミン、グルタミン酸、またはリシンへの、および／または極性残基から非極性残基への置換が含まれる。典型的なアミノ酸の分類を以要約する。
【表１】
2021516972.tif 000003
【００２３】
「相同」配列（例えば、核酸配列）は、例えば、既知の参照配列と少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるような、既知の参照配列と同一か、または実質的に同様である配列を指す。
【００２４】
「野生型」という用語は、（変異型、病変した、改変したなどとは対照的に）正常な状態または文脈に見られるような構造および／または活性を有する実体を指す。野生型遺伝子およびポリペプチドは、多くの場合、複数の異なる形態（例えば、対立遺伝子）で存在する。
【００２５】
タンパク質および核酸に関する「単離された」という用語は、原位置で通常存在し得る他の細菌、ウイルス、または細胞構成要素に関して、タンパク質およびポリヌクレオチドの実質的に純粋な調製物にまで、およびそれを含めて、比較的精製されているタンパク質および核酸を指す。「単離された」という用語はまた、天然に存在する対応物を有さず、化学的に合成され、それにより他のタンパク質もしくは核酸で実質的にコンタミネーションされていないか、またはそれらに天然に付随するほとんどの他の細胞構成要素（例えば、他の細胞タンパク質、ポリヌクレオチド、または細胞構成要素）から分離もしくは精製されているタンパク質および核酸も含む。
【００２６】
「外因性」または「非相同」分子または配列は、細胞で通常発現されないか、またはその形態の細胞には通常存在しない分子または配列である。通常の存在には、細胞の特定の発生段階および環境条件に関する存在が含まれる。外因性または非相同分子または配列には、例えば、細胞内の対応する内因性配列の変異バージョンが含まれ得るか、または細胞内であるが、異なる形態の（すなわち、染色体内ではない）内因性配列に対応する配列が含まれ得る。特定の細胞における外因性または非相同分子または配列はまた、細胞の参照種とは異なる種に、または同じ種内の異なる生物に由来する分子または配列であり得る。例えば、非相同ポリペプチドを発現するＬｉｓｔｅｒｉａ株の場合、その非相同ポリペプチドは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に天然または内因性ではない、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株によって通常は発現されない、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株以外の源から、同じ種内の異なる生物に由来するポリペプチドであり得る。
【００２７】
対照的に、「内因性」分子もしくは配列または「天然」分子もしくは配列は、その形態で、特定の細胞において、特定の発生段階で、特定の環境条件下で通常存在する分子または配列である。
【００２８】
「バリアント」という用語は、大部分の集団とは異なるが、共通様式に対してまだ十分に相似していて、それらのうちの１つ（例えば、スプライスバリアント）であると考えられるアミノ酸または核酸配列（または生物または組織）を指す。
【００２９】
「アイソフォーム」という用語は、（例えば、同じタンパク質の）別のアイソフォーム、またはバージョンと比較してわずかな違いしかない分子（例えば、タンパク質）の１つのバージョンを指す。例えば、タンパク質アイソフォームは、異なるが、関連する遺伝子から生成され得、それらは、選択的スプライシングによって同じ遺伝子から生じ得るか、またはそれらは、単一ヌクレオチド多型から生じ得る。
【００３０】
「断片」という用語は、タンパク質に言及する場合、全長タンパク質よりも短いか、または少ないアミノ酸を有するタンパク質を意味する。「断片」という用語は、核酸に言及する場合、全長の核酸よりも短いか、または少ないヌクレオチドを有する核酸を意味する。断片は、例えば、Ｎ末端断片（すなわち、タンパク質のＣ末端の一部の除去）、Ｃ末端断片（すなわち、タンパク質のＮ末端の一部の除去）、または内部断片であり得る。断片はまた、例えば、機能的断片または免疫原性断片であり得る。
【００３１】
「類似体」という用語は、タンパク質に言及する場合、保存的アミノ酸相違によって、アミノ酸配列に影響を及ぼさない修飾によって、またはそれら両方によって、天然に存在するタンパク質とは異なるタンパク質を意味する。
【００３２】
「機能性」という用語は、生物学的活性または機能を示すタンパク質または核酸（またはその断片、アイソフォーム、もしくはバリアント）の生来の能力を指す。そのような生物学的活性または機能には、例えば、対象に投与した場合に免疫応答を誘発する能力が含まれ得る。そのような生物学的活性または機能にはまた、例えば、相互作用パートナーへの結合が含まれ得る。機能性断片、アイソフォーム、またはバリアントの場合、これらの生物学的機能は、実際は、変化してもよいが（例えば、それらの特異性または選択性に関して）、基本的な生物学的機能は維持される。
【００３３】
「免疫原性」または「免疫原性の」という用語は、対象に投与した場合に、対象において免疫応答を誘発する分子（例えば、タンパク質、核酸、抗原、または生物）の生来の能力を指す。例えば、その分子に対する比較的多数の抗体、その分子に対する抗体の比較的大きな多様性、その分子について特異的な比較的多数のＴ細胞、その分子に対する比較的大きな細胞傷害性またはヘルパーＴ細胞応答などによって、免疫原性を測定することができる。
【００３４】
「抗原」という用語は、本明細書において、対象または生物と接触させた場合に（例えば、対象または生物中に存在する場合に、またはそれによって検出された場合に）、対象または生物から検出可能な免疫応答が生じる物質を指すために本明細書で使用される。抗原は、例えば、脂質、タンパク質、炭水化物、核酸、またはそれらの組み合わせおよび変形であってよい。例えば、「抗原ペプチド」は、対象または生物に存在するかまたはそれによって検出された場合に、対象または生物において免疫応答の実行をもたらすペプチドを指す。例えば、そのような「抗原ペプチド」は、宿主細胞の表面上のＭＨＣクラスＩおよび／またはクラスＩＩ分子上に負荷され、そこで提示され、宿主の免疫細胞によって認識または検出され得、それによって、そのタンパク質に対する免疫応答の実行をもたらすタンパク質を包含し得る。そのような免疫応答は、同じタンパク質を発現する宿主内の他の細胞、例えば、罹患細胞（例えば、腫瘍または癌細胞）にも広がり得る。
【００３５】
「エピトープ」という用語は、免疫系によって認識される抗原上の部位（例えば、そこに抗体が結合する）を指す。エピトープは、１つ以上のタンパク質の三次フォールディングによって並置された隣接アミノ酸または非隣接アミノ酸から形成することができる。隣接アミノ酸から形成されるエピトープ（線形エピトープとしても公知）は典型的には、変性溶媒に対する曝露で保持されるが、三次フォールディングによって形成されたエピトープ（配座異性エピトープとしても公知）は典型的には、変性溶媒での処置で失われる。エピトープは典型的には、少なくとも３、さらに通常は、少なくとも５または８〜１０のアミノ酸を特有の空間配座で含む。エピトープの空間配座を決定する方法には、例えば、Ｘ線結晶学および２次元核磁気共鳴が含まれる。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＥｐｉｔｏｐｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．６６，Ｇｌｅｎｎ  Ｅ．Ｍｏｒｒｉｓ，Ｅｄ．（１９９６）を参照されたい。
【００３６】
「変異」という用語は、遺伝子またはタンパク質の構造のいずれかの変化を指す。例えば、変異は、染色体またはタンパク質の欠失、挿入、置換、または再編成から生じ得る。「挿入」は、１つ以上の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を付加することにより、遺伝子におけるヌクレオチドの数またはタンパク質におけるアミノ酸の数を変える。「欠失」は、１つ以上の追加のヌクレオチドまたはアミノ酸を減少させることによって、遺伝子におけるヌクレオチドの数またはタンパク質におけるアミノ酸の数を変える。
【００３７】
ヌクレオチドの付加または喪失が遺伝子リーディングフレームを変える場合に、ＤＮＡにおける「フレームシフト」変異は生じる。リーディングフレームは、１つのアミノ酸をそれぞれコードする３塩基の群からなる。フレームシフト変異は、これらの塩基の組み分けをシフトさせて、アミノ酸のためのコードを変化させる。得られたタンパク質は通常、非機能性である。挿入および欠失はそれぞれ、フレームシフト変異であり得る。
【００３８】
「ミスセンス」変異または置換は、コードされるアミノ酸の変化をもたらす、タンパク質の１つのアミノ酸の変化または単一ヌクレオチドにおける点変異を指す。１つのアミノ酸において変化をもたらす単一ヌクレオチドにおける点変異は、ＤＮＡ配列における「非同義」置換である。非同義置換はまた、コドンが未成熟停止コドンに変化して、結果として生じるタンパク質の短縮をもたらす「ナンセンス」変異をもたらし得る。対照的に、ＤＮＡにおける「同義」変異は、（コドンの縮退によって）タンパク質のアミノ酸配列を変化させないものである。
【００３９】
「体細胞変異」という用語は、生殖細胞（例えば、精子または卵子）以外の細胞によって獲得される遺伝的変化を含む。そのような変異は、細胞分裂の過程で変異細胞の後代に伝えられ得るが、遺伝性ではない。対照的に、生殖細胞変異は、生殖細胞系で生じ、次の世代の子孫に伝えられ得る。
【００４０】
「インビトロ」という用語は、人工環境、および人工環境（例えば、試験管）内で生じるプロセスまたは反応を指す。
【００４１】
「インビボ」という用語は、天然環境（例えば、細胞または生物または身体）、および天然環境内で生じるプロセスまたは反応を指す。
【００４２】
１つ以上の列挙された要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に列挙されていない他の要素を含み得る。例えば、タンパク質を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」組成物は、タンパク質を単独で、または他の成分との組み合わせで含有し得る。
【００４３】
値の範囲の指定は、その範囲内の、またはその範囲を定義するすべての整数、およびその範囲内の整数によって定義されるすべての部分範囲を含む。
【００４４】
文脈から別段に明確ではない限り、「約」という用語は、規定の値の測定の標準誤差（例えば、ＳＥＭ）内、または指定の値から±０．５％、１％、５％、または１０％の変化内の値を包含する。
【００４５】
冠詞「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」の単数形は、文脈が別段に明確に規定していない限り、複数形の言及を含む。例えば、「抗原」または「少なくとも１つの抗原」という用語は、それらの混合物を含む、複数の抗原を含み得る。
【００４６】
統計的に有意な、は、ｐ≦０．０５を意味する。
【００４７】
Ｉ．概要
Ｌｉｓｔｅｒｉａに基づく免疫療法の細胞内成長を分析するために分化したＴＨＰ−１細胞を使用する細胞に基づくアッセイが、本明細書に開示される。そのようなアッセイは、例えば、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａと比較した組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の弱毒化を評価するため、または組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の効力もしくは感染力を評価するために使用することができる。
【００４８】
具体的な一例として、ＡＤＸＳ１１−００１は、ゲノム内のｐｒｆＡの不可逆的な欠失、さらには変異ｐｒｆＡ遺伝子（Ｄ１３３Ｖ）との相補性のために弱毒化された組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）株である。ｐｒｆＡ遺伝子は、Ｌｍのインビボでの細胞内成長および生存に必要である、ｈｌｙ（リステリオリシンＯまたはＬＬＯ）、ａｃｔＡ（アクチン核形成Ａ）、ｐｌｃＡ（ホスホリパーゼＡ）、およびｐｌｃＢ（ホスホリパーゼＢ）などのいくつかの病原性遺伝子の転写を調節する。ＡＤＸＳ１１−００１の変異ｐｒｆＡとの相補性により、病原性遺伝子の発現が減少する。ＡＤＸＳ１１−００１免疫療法のプラスミドはまた、ｈｌｙプロモーターの制御下で、短縮化リステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）に融合したヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７も含む。ＡＤＸＳ１１−００１の弱毒化を評価するために、感染および複製は、対照として野生型Ｌｍを使用するマクロファージ細胞感染アッセイで評価される。
【００４９】
ＡＤＸＳ１１−００１の生物学的活性は、Ｅ７に特異的な細胞傷害性Ｔ細胞応答を刺激するために、マクロファージおよび樹状細胞などの抗原提示細胞（ＡＰＣ）によるＡＤＸＳ１１−００１の取り込み、ファゴリソソームからの脱出、ＡＰＣのサイトゾルにおける細胞内複製、ｔＬＬＯ−Ｅ７の発現、処理、およびＡＰＣの表面上のｔＬＬＯ−Ｅ７の提示に依存する。分化したＴＨＰ−１細胞の使用は、ＡＤＸＳ１１−００１がマクロファージのサイトゾルに感染して複製する能力をモニタリングするために、初代マクロファージを使用するより優れた代替手段である。この方法はまた、定量的であるという点でも有利である。
【００５０】
ＩＩ．Ｌｉｓｔｅｒｉａの弱毒化および感染性を評価するための方法
細菌の弱毒化および／または感染力を評価するための方法および組成物が、提供される。いくつかの実施形態では、細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株である。いくつかの実施形態では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である。いくつかの実施形態では、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株は、変異、組換え、または弱毒化Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である。そのような方法で使用することができる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株の例は、本明細書の他の箇所でより詳細に提供されている。そのような方法は、マクロファージ表現型を有するマクロファージ細胞株またはマクロファージ様細胞株を利用する。そのような細胞は、不死化細胞であり得る。例えば、細胞株は、ＴＨＰ−１細胞などのヒト単球細胞株であり得る。ＴＨＰ−１は、急性単球性白血病（Ｍ５サブタイプ）の小児症例の末梢血に由来する、自然に不死化した単球様細胞株を示す。ＴＨＰ−１細胞は、例えば、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（一般的にＰＭＡまたはＴＰＡとして知られている）を使用して、マクロファージ様細胞に分化させることができる。
【００５１】
いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）分化したＴＨＰ−１細胞を試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に感染させることであって、ＴＨＰ−１細胞が試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に感染する前にマクロファージに分化している、感染させることと、（ｂ）ＴＨＰ−１細胞を溶解し、寒天上で溶解物を播種することと、（ｃ）寒天上での成長によりＴＨＰ−１細胞内で増殖したＬｉｓｔｅｒｉａを計数することと、を含む。分化したＴＨＰ−１細胞は、付着細胞として成長し得る。他のマクロファージ様細胞も、使用することができる。他のマクロファージ様不死化細胞および／または細胞株も、使用することができる。
【００５２】
いくつかの実施形態では、方法は、ＴＨＰ−１細胞をマクロファージに分化させることをさらに含む。例えば、そのような分化は、本明細書の他の箇所で開示されるように、ステップ（ａ）の前にホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を使用して達成することができる。いくつかの実施形態では、分化前のＴＨＰ−１細胞の継代数は、３２未満である。
【００５３】
いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）は、１：１の感染多重度（ＭＯＩ）で分化したＴＨＰ−１細胞を感染させることを含む。しかしながら、任意の好適な感染多重度を使用することができる。
【００５４】
任意に、そのような方法は、ステップ（ａ）と（ｂ）の間で、ＴＨＰ−１細胞によって取り込まれなかったすべてのＬｉｓｔｅｒｉａを死滅させることをさらに含み得る。例えば、死滅は、ゲンタマイシンなどの抗生物質を使用して行うことができる。
【００５５】
任意に、溶解ステップ（ｂ）は、感染後３時間で行われる。しかし、溶解ステップは、感染後１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０時間など、他の時点でも実行することができる。
【００５６】
いくつかの実施形態では、分化したＴＨＰ−１細胞を細菌株に感染させることは、細菌を分化したＴＨＰ−１細胞で１〜５時間、２〜３時間、１時間、２時間、３時間、２時間±６０分間、２時間±５０分、２時間±４０分、２時間±３０分、２時間±２５分、２時間±２０分、２時間±１５分、２時間±１０分、２時間±５分、または２時間±３分インキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、細菌は、Ｌｉｓｔｅｒｉａである。いくつかの実施形態では、Ｌｉｓｔｅｒｉａは、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓである。いくつかの実施形態では、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、野生型Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓと比較して弱毒化されている。いくつかの実施形態では、細菌を含む接種培地を、分化したＴＨＰ−１細胞に添加する。
【００５７】
いくつかの実施形態では、感染ステップは、１つ以上の洗浄ステップおよび／または死滅ステップをさらに含む。洗浄ステップは、ＴＨＰ−１細胞から細菌含有培地を除去すること、および任意に、ＴＨＰ−１細胞をすすぎ、それによりＴＨＰ−１細胞に感染していない細菌を除去することを含むことができる。洗浄ステップは、使用する場合、ＴＨＰ−１細胞との細菌のインキュベーション後、および溶解ステップの前に実行することができる。死滅ステップは、細菌に対して有効な抗生物質をＴＨＰ−１細胞に添加し、それによりＴＨＰ−１細胞によって取り込まれなかった細菌（すなわち、細胞外細菌）を死滅させることを含むことができる。抗生物質は、細菌を死滅させるのに有効な濃度で添加することができる。死滅ステップは、使用する場合、ＴＨＰ−１細胞との細菌のインキュベーション後、および溶解ステップの前に実行することができる。死滅ステップは、洗浄ステップの後または前、または２つの洗浄ステップの間に実行することができる。いくつかの実施形態では、抗生物質を、ＴＨＰ−１細胞に添加し、１５〜７５分間、２０〜６０分間、３０〜５０分間、または約４２〜４５分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、抗生物質は、ゲンタマイシンである。
【００５８】
いくつかの実施形態では、溶解ステップ（ｂ）は、感染ステップ直後（感染後０時間）、感染後０〜１０時間、感染後１時間、感染後２時間、感染後３時間、感染後４時間、感染後５時間、感染後６時間、感染後７時間、感染後８時間、感染後９時間、または感染後１０時間実行される。いくつかの実施形態では、溶解ステップは、感染ステップ直後（ｐ０）、感染後１時間（ｐ１）、感染後３時間（ｐ３）、または感染後５時間（ｐ５）実行される。感染ステップ直後に溶解が実行されない場合、ＴＨＰ−１細胞は、溶解するまで成長培地で培養され得る。細菌の細胞内成長は、感染後のインキュベーション中に生じ得る。溶解ステップは、ＴＨＰ−１細胞を溶解することができるが細菌は溶解することができない水または類似の溶媒中にＴＨＰ−１細胞を収集して、溶解物を形成することと、細菌の成長を支持することができる培地上で溶解物を藩種することと、コロニー形成単位（ＣＦＵ）の数を計数することと、を含むことができる。いくつかの実施形態では、溶解物を希釈することができる。いくつかの実施形態では、溶解物の１つ以上の異なる希釈物を、培地上で藩種することができる。
【００５９】
いくつかの実施形態では、計数ステップは、溶解物からのＣＦＵの数を決定することを含み得る。いくつかの実施形態では、接種培地中のＣＦＵの数が、決定される。いくつかの実施形態では、ＣＦＵの数は、異なる感染後溶解期間または細菌株の後で決定される。いくつかの実施形態では、細菌株のＣＦＵは、感染ステップ直後、および１回以上の感染後に、接種培地について決定される。いくつかの実施形態では、細菌株のＣＦＵは、感染ステップ直後および感染後３時間で決定される。いくつかの実施形態では、ある時点で決定され、ＣＦＵと比較したＣＦＵは、別の感染後の時点で決定された。いくつかの実施形態では、取り込み率または感染率は、接種培地のＣＦＵを、感染後０時間でのＣＦＵと比較することによって計算される。いくつかの実施形態では、細胞内成長率は、感染後１〜１０時間でのＣＦＵを、感染後０時間でのＣＦＵと比較することによって計算される。いくつかの実施形態では、細胞内成長率は、感染後１時間、３時間、または５時間でのＣＦＵを、感染後０時間で決定されたＣＦＵと比較することによって計算される。
【００６０】
そのような方法は、変異体、組換え、または弱毒化Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株などの試験細菌株の取り込みおよび／または細胞内増殖を、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ株および／または参照試料などの対照と比較することをさらに含むことができる。
【００６１】
追加の実施形態が、実施例に開示される。
【００６２】
ＩＩＩ．組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株
本明細書に開示される方法は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株などの細菌株の弱毒化および感染性を評価する。そのような細菌株は、組換え細菌株であり得る。そのような組換え細菌株は、本明細書に開示される組換え融合ポリペプチド、または本明細書の他の箇所で開示される組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含むことができる。好ましくは、細菌株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）株である。Ｌｍは、ワクチンベクターとして、いくつかの固有の利点を有する。この細菌は、特別な要件なしで非常に効率的にインビトロで成長し、グラム陰性菌、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａにおいて主要な毒性因子であるＬＰＳが欠如している。抗生物質で容易に除去され得、重篤な有害作用の場合、一部のウイルス性ベクターと異なり、宿主ゲノムへの遺伝物質の組み込みが起こらないため、遺伝子操作で弱毒化されたＬｍベクターも追加の安全性を示す。
【００６３】
組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、任意のＬｉｓｔｅｒｉａ株であり得る。好適なＬｉｓｔｅｒｉａ株の例には、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｇｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｉｖａｎｏｖｉｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｕｒｒａｙｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｗｅｌｓｈｉｍｅｒｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）、または任意の他の既知のＬｉｓｔｅｒｉａ種が含まれる。好ましくは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ種の株である。Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株の例には、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ野生型（例えば、Ｂｉｓｈｏｐ  ａｎｄ  Ｈｉｎｒｉｃｈｓ（１９８７）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １３９：２００５−２００９、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６を参照のこと）、ファージキュアリングされたＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０５６（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６を参照のこと）、ファージキュアリングされ、ｈｌｙ遺伝子の欠失を有するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２７（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−  ４１８６、Ｊｏｎｅｓ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ（１９９４）Ｉｎｆｅｃｔ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ６５：５６０８−５６１３を参照のこと）、ファージキュアリングされ、ａｃｔＡ遺伝子の欠失を有するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９（例えば、Ｌａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔ  １８４：４１７７−４１８６、Ｓｋｏｂｌｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０００）Ｊ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ  １５０：５２７−５３８を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０４２（デルタＰＥＳＴ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および補足情報を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０９７（ＬＬＯ−Ｓ４４Ａ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および補足情報を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４３６４（デルタｌｐｌＡ；リポ酸タンパク質リガーゼ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および補足情報を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４４０５（デルタｉｎ１Ａ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および補足情報を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４４０６（デルタｉｎｌＢ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および補足情報を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−ＬＯＯＯ１（デルタ���ｃｔＡ；デルタｉｎｌＢ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および補足情報を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−Ｌ０００２（デルタａｃｔＡ；デルタｌｐｌＡ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および補足情報を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＣＳ−Ｌ０００３（ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ；デルタｌｐｌＡ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および補足情報を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０３８（デルタａｃｔＡ；ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および補足情報を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４３８４（ＬＬＯ  Ｓ４４Ａ；ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔ）（例えば、Ｂｒｏｃｋｓｔｅｄｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０１：１３８３２−１３８３７および補足情報を参照のこと）、ｌｐｌＡ１欠失（リポ酸タンパク質リガーゼＬｐｌＡ１をコードする）を有するＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株（例えば、Ｏ’Ｒｉｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３０２：４６２−４６４を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０１７（ＬＬＯ  Ｌ４６１Ｔを含む１０４０３Ｓ）（例えば、ＵＳ７，６９１，３９３を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＥＧＤ（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＬ５９１８２４を参照のこと）が含まれる。別の実施形態では、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＥＧＤ−ｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３２１０、ＡＴＣＣアクセッション番号ＢＡＡ−６７９を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＤＰ−Ｌ４０２９（ａｃｔＡ欠失、任意にｕｖｒＡＢ欠失との組み合わせ（ＤＰ−Ｌ４０２９ｕｖｒＡＢ）（例えば、ＵＳ７，６９１，３９３を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ａｃｔＡ−／ｉｎｌＢ−二重変異体（例えば、ＡＴＣＣアクセッション番号ＰＴＡ−５５６２を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｌｐｌＡ変異体またはｈｌｙ変異体（例えば、ＵＳ２００４／００１３６９０を参照のこと）、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ｄａｌ／ｄａｔ二重変異体（例えば、ＵＳ２００５／００４８０８１を参照のこと）である。他のＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株には、以下の遺伝子のうちの１つまたはそれらの任意の組み合わせをコードする核酸：ｈｌｙ（ＬＬＯ；リステリオリシン）、ｉａｐ（ｐ６０）、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｄａｌ（アラニンラセマーゼ）、ｄａｔ（Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ）、ｐｌｃＡ、ｐｌｃＢ、ａｃｔＡ、または成長、広がり、単壁ベシクルの分解、二重壁ベシクルの分解、宿主細胞への結合���もしくは宿主細胞による取り込みを媒介する任意の核酸を含有するように、（例えば、プラスミドによって、および／またはゲノム組み込みによって）修飾されているものが含まれる。上記の参照文献のそれぞれは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００６４】
組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａは、野生型の病原性を有し得るか、弱毒化された病原性を有し得るか、または非病原性であり得る。例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、ファゴソームまたはファゴリソソームを免れて、サイトゾルに進入するために十分に病原性であり得る。そのようなＬｉｓｔｅｒｉａ株はまた、本明細書の他の箇所で開示されるように、少なくとも１つの弱毒化変異、欠失、または不活性化を含む、生弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株であり得る。好ましくは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａは、弱毒化栄養素要求性株である。栄養素要求性株は、その成長に必要とされる特定の有機化合物を合成することができないものである。そのような株の例は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，１１４，４１４に記載されている。
【００６５】
好ましくは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子が欠如している。例えば、そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子をコードしないプラスミドを含み得る。しかしながら、本明細書に提供されるいくつかの組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、抗生物質耐性遺伝子をコードする核酸を含むプラスミドを含む。抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製で一般に使用される従来の選択およびクローニングプロセスで使用してもよい。例示的な抗生物質耐性遺伝子には、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびゲンタマイシンに対する耐性を付与する遺伝子産物が含まれる。
【００６６】
Ａ．組換え融合ポリペプチドまたは組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株
本明細書に開示される組換え細菌株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ株）は、本明細書に開示される組換え融合ポリペプチド、または本明細書の他の箇所で開示される組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含む。
【００６７】
組換え融合タンパク質をコードする核酸を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株では、核酸をコドン最適化することができる。各アミノ酸のためにＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって利用される最適なコドンの例は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２００７／０２０７１７０に示されている。核酸中の少なくとも１つのコドンが、本来の配列中のコドンよりも、そのアミノ酸についてＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによってより頻繁に使用されるコドンで置き換えられている場合、核酸は、コドン最適化されている。
【００６８】
核酸は、細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株内のエピソームプラスミド中に存在し得る、および／または核酸は、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株にゲノム的に組み込まれ得る。いくつかの組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、本明細書に開示される２つの組換え融合ポリペプチドをコードする２つの別々の核酸：エピソームプラスミド中に１つの核酸、および細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株にゲノム的に組み込まれた１つの核酸を含む。
【００６９】
エピソームプラスミドは、インビトロ（細胞培養で）、インビボ（宿主で）、またはインビトロおよびインビボの両方で安定的に維持されるものであり得る。エピソームプラスミドにおいての場合、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、プラスミド中のプロモーター／制御配列に作動可能に連結することができる。細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株にゲノム的に組み込まれる場合、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームは、外因性プロモーター／制御配列または内因性プロモーター／制御節配列に作動可能に連結することができる。遺伝子の構成的発現を駆動するために有用なプロモーター／制御配列の例は周知であり、これには、例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａのｈｌｙ、ｈｌｙＡ、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｐ６０プロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｂａｃプロモーター、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｇｒｉｓｅｕｓ  ｓｇｉＡプロモーター、およびＢ．ｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ  ｐｈａＺプロモーターが含まれる。場合によっては、目的の挿入遺伝子は、中断されないか、ゲノムＤＮＡへの組み込みから多くの場合に起こる制御拘束を受けず、場合によっては、挿入された非相同遺伝子の存在は、細胞自体の重要な領域の再編成または中断をもたらさない。
【００７０】
そのような組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株または本明細書の他の箇所で記載される弱毒化細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株を、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含むプラスミドまたはベクターで形質転換することによって作製することができる。プラスミドは、宿主染色体に組み込まれないエピソームプラスミドであり得る。あるいは、プラスミドは、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の染色体に組み込まれる組み込みプラスミドであり得る。本明細書で使用されるプラスミドは、マルチコピープラスミドであり得る。細菌を形質転換するための方法は周知であり、それには、塩化カルシウムコンピテント細胞に基づく方法、電気穿孔法、バクテリオファージ媒介形質導入、化学的転換技法、および物理的形質転換技法が含まれる。例えば、ｄｅ  Ｂｏｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｃｅｌｌ  ５６：６４１−６４９、Ｍｉｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９５）ＦＡＳＥＢＪ．９：１９０−１９９、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９７）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｇｅｒｈａｒｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  Ｇｅｎｅｒａｌ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｆｏｒ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．、およびＭｉｌｌｅｒ，１９９２，Ａ  Ｓｈｏｒｔ  Ｃｏｕｒｓｅ  ｉｎ  Ｂａｃｔｅｒｉａｌ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．を参照されたく、これらのそれぞれは、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７１】
ゲノム的に組み込まれた非相同核酸を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、部位特異的組み込みベクターを使用することによって作製することができ、それによって、相同組換えを使用して、組み込み遺伝子を含む細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａが作製される。組み込みベクターは、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に感染することができる任意の部位特異的組み込みベクターであり得る。そのような組み込みベクターは、例えば、ＰＳＡ  ａｔｔＰＰ’部位、ＰＳＡインテグラーゼをコードする遺伝子、Ｕ１５３  ａｔｔＰＰ’部位、Ｕ１５３インテグラーゼをコードする遺伝子、Ａ１１８  ａｔｔＰＰ’部位、Ａ１１８インテグラーゼをコードする遺伝子、または任意の他の既知のａｔｔＰＰ’部位または任意の他ファージインテグラーゼを含み得る。
【００７２】
非相同核酸を細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ染色体に組み込むための任意の他の公知の方法を使用して、組み込み遺伝子を含むそのような細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を作製することもできる。相同組換えのための技法は周知であり、例えば、Ｂａｌｏｇｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｖｅｔ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  １０９（１−２）：１１−１７）、Ｊｉａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００５）Ａｃｔａ  Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｓｉｎ（Ｓｈａｎｇｈａｉ）３７（１）：１９−２４）、およびＵＳ６，８５５，３２０に記載されており、これらのそれぞれは、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７３】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ染色体への組み込みはまた、トランスポゾン挿入を使用して達成することができる。トランスポゾン挿入のための技法は周知であり、例えば、ＤＰ−Ｌ９６７の構築について、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｕｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｉｔｙ  ５８：３７７０−３７７８によって記載されている。トランスポゾン変異誘発は、安定なゲノム挿入を達成することができるが、非相同核酸が挿入されているゲノム中の位置は分かっていない。
【００７４】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ染色体への組み込みはまた、ファージ組み込み部位を使用して達成することができる（例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＬａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４（１５）：４１７７−４１８６を参照のこと）。例えば、非相同遺伝子を、ゲノム内の任意の適切な部位であってよい対応する結合部位（例えば、ａｒｇ  ｔＲＮＡ遺伝子のｃｏｍＫまたは３’末端）に挿入するために、バクテリオファージ（例えば、Ｕ１５３またはＰＳＡリステリオファージ）のインテグラーゼ遺伝子および結合部位を使用することができる。非相同核酸の組み込み前に、内因性プロファージを、利用される結合部位からキュアリングすることができる。そのような方法は、例えば、単一のコピー組み込み体をもたらし得る。「ファージキュアリングステップ」を回避するために、ＰＳＡファージに基づくファージ組み込み系を使用することができる（例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＬａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｊ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ  １８４：４１７７−４１８６を参照のこと）。組み込まれた遺伝子の維持は、例えば、抗生物質による継続的な選択を必要とし得る。あるいは、抗生物質での選択を必要としないファージに基づく染色体組み込み系を確立することができる。代わりに、栄養素要求宿主株を相補することができる。例えば、臨床応用のための、ファージに基づく染色体組み込み系を使用することができ、その際、例えば、Ｄ−アラニンラセマーゼを含む必須酵素について栄養素要求性である宿主株を使用する（例えば、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−））。
【００７５】
遺伝物質および／またはプラスミドを細菌に導入するために、コンジュゲーションも使用することができる。コンジュゲーションのための方法は周知であり、例えば、Ｎｉｋｏｄｉｎｏｖｉｃ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｐｌａｓｍｉｄ  ５６（３）：２２３−２２７およびＡｕｃｈｔｕｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  １０２（３５）：１２５５４−１２５５９に記載されており、これらのそれぞれは、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００７６】
具体的な一例では、組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性ａｃｔＡ配列（ＡｃｔＡタンパク質をコードする）または内因性ｈｌｙ配列（ＬＬＯタンパク質をコードする）を含むオープンリーディングフレームとして、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａゲノムにゲノム的に組み込まれた組換え融合ポリペプチドをコードする核酸を含み得る。例えば、融合ポリペプチドの発現および分泌は、内因性ａｃｔＡプロモーターおよびＡｃｔＡシグナル配列の制御下にあり得るか、または内因性ｈｌｙプロモーターおよびＬＬＯシグナル配列の制御下にあり得る。別の例として、組換え融合ポリペプチドをコードする核酸は、ＡｃｔＡタンパク質をコードするａｃｔＡ配列またはＬＬＯタンパク質をコードするｈｌｙ配列を置き換えることができる。
【００７７】
組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の選択は、任意の手段によって達成することができる。例えば、抗生物質選択を使用することができる。抗生物質耐性遺伝子は、分子生物学およびワクチン調製で一般に使用される従来の選択およびクローニングプロセスで使用してもよい。例示的な抗生物質耐性遺伝子には、アンピシリン、ペニシリン、メチシリン、ストレプトマイシン、エリスロマイシン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール（ＣＡＴ）、ネオマイシン、ハイグロマイシン、およびゲンタマイシンに対する耐性を付与する遺伝子産物が含まれる。あるいは、抗生物質耐性遺伝子の代わりに、またはそれに加えて、選択のために、栄養素要求株を使用することができ、外因性代謝遺伝子を使用することができる。例として、本明細書で提供される代謝酵素または相補的遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養素要求細菌を選択するために、形質転換された栄養素要求細菌を、代謝酵素（例えば、アミノ酸代謝遺伝子）をコードする遺伝子または相補的遺伝子の発現を選択する培地において成長させることができる。あるいは、組換え体を選択するために、温度不安定なプラスミドを、または組換え体を選択するために、任意の他の公知の手段を使用することができる。
【００７８】
Ｂ．細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の弱毒化
本明細書に開示される組換え細菌株（例えば、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株）を、弱毒化することができる。「弱毒化」という用語は、宿主動物において疾患をもたらす細菌の能力の減退を包含する。例えば、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の病原特性は、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａと比較して低下していてもよいが、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａを、培養において成長および維持することができる。例として、弱毒化ＬｉｓｔｅｒｉａでのＢＡＬＢ／ｃマウスの静脈内接種を用いると、いくつかの実施形態では、接種動物の５０％が生き残る致死量（ＬＤ５０）が、野生型ＬｉｓｔｅｒｉａのＬＤ５０を超えて、少なくとも約１０倍、少なくとも約１００倍、少なくとも約１，０００倍、少なくとも約１０，０００倍、または少なくとも約１００，０００倍増加する。したがって、Ｌｉｓｔｅｒｉａの弱毒化株は、投与される動物を死滅させないものであるか、または投与される細菌の数が同じ動物を死滅させるために必要であろう野生型非弱毒化細菌の数よりもかなり多い場合にのみ、動物を死滅させるものである。弱毒化細菌はまた、その成長に必要とされる栄養素がそこに存在しないため、一般の環境では複製することができないものを意味すると解釈されるべきである。したがって、細菌は、必要な栄養素が供給される制御された環境での複製に限定される。弱毒化株は、制御されていない複製ができないという点において、環境的に安全である。
【００７９】
（１）細菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株を弱毒化する方法
弱毒化を、任意の公知の手段によって達成することができる。例えば、そのような弱毒化株は、１つ以上の内因性病原性遺伝子または１つ以上の内因性代謝遺伝子を欠損し得る。そのような遺伝子の例は、本明細書に開示されており、弱毒化を、本明細書に開示されている遺伝子のうちのいずれか１つまたは任意の組み合わせの不活性化によって達成することができる。不活性化は、例えば、欠失によって、または変異（例えば、不活性化変異）によって達成することができる。「変異」という用語は、配列（核酸またはアミノ酸配列）に対する任意の種類の変異または修飾を含み、欠失、切断、挿入、置換、分裂、または転座を包含し得る。例えば、変異には、フレームシフト変異、タンパク質の未成熟終止をもたらす変異、または遺伝子発現に影響を及ぼす制御配列の変異が含まれ得る。組換えＤＮＡ技法を使用するか、または変異原性化学物質または放射線を使用し、その後に変異体を選択する従来の変異誘発技術を使用して、変異誘発を達成することができる。復帰変異の低い確率を伴うため、欠失変異が好ましいことがある。「代謝遺伝子」という用語は、宿主細菌によって利用されるか、または必要とされる栄養素の合成に関係するか、またはそのために必要とされる酵素をコードする遺伝子を指す。例えば、酵素は、宿主細菌の持続的増殖に必要とされる栄養素の合成に関係し得るか、またはそれに必要とされ得る。「病原性」遺伝子という用語は、生物のゲノムにおけるその存在または活性が生物の病原性（例えば、生物が宿主においてニッチのコロニー形成を達成することができること（細胞への結合を含む））、免疫回避（宿主の免疫応答の回避）、免疫抑制（宿主の免疫応答の阻害）、細胞への侵入およびそこからの脱出、または宿主からの栄養取得）に寄与する遺伝子を含む。
【００８０】
そのような弱毒株の具体的な例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）である。そのような弱毒化株の別の例は、Ｌｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ）である。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１１／０１４２７９１を参照されたい。ＬｍｄｄＡは、内因性病原性遺伝子ａｃｔＡの欠失によって弱毒化されているＬｉｓｔｅｒｉａ株に基づく。そのような株は、ｄａｌ遺伝子の相補によってインビボおよびインビトロでの抗原発現のためのプラスミドを保持し得る。あるいは、ＬｍｄｄＡは、内因性のｄａｌ、ｄａｔ、およびａｃｔＡ遺伝子に変異を有するｄａｌ／ｄａｔ／ａｃｔＡ  Ｌｉｓｔｅｒｉａであり得る。そのような変異は、例えば、欠失または他の不活性化変異であり得る。
【００８１】
弱毒化株の別の具体的な例は、Ｌｍ  ｐｒｆＡ（−）、またはｐｒｆＡ遺伝子に部分的欠失または不活性化変異を有する株である。ＰｒｆＡタンパク質は、その脊椎動物宿主でコロニー形成するためにＬｍが必要とする必須病原性遺伝子を含むレギュロンの発現を制御する。したがって、ＰｒｆＡ変異は、ＰｒｆＡ依存性病原性遺伝子の発現を活性化させるＰｒｆＡの能力を著しく損なう。
【００８２】
弱毒化株のまた別の具体的な例は、細菌の天然菌力に重要な２つの遺伝子、すなわち、インターナリンＢおよびａｃｔ  Ａが欠失しているＬｍ  ｉｎｌＢ（−）ａｃｔＡ（−）である。
【００８３】
弱毒化細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の他の例には、１つ以上の内因性病原性遺伝子が欠損している細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株が含まれる。そのような遺伝子の例には、Ｌｉｓｔｅｒｉａでは、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、ｐｌｃＢ、ｐｌｃＡ、ｉｎｌＡ、ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、ｉｎｌＪ、およびｂｓｈが含まれる。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はまた、上記の株のうちのいずれかの二重変異体または三重変異体であり得る。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、遺伝子のそれぞれ１つの変異または欠失を含み得るか、または例えば、本明細書で提供される遺伝子（例えば、ａｃｔＡ、ｐｒｆＡ、およびｄａｌ／ｄａｔ遺伝子を含む）のうちのいずれか最大１０個の変異または欠失を含み得る。例えば、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性インターナリンＣ（ｉｎｌＣ）遺伝子の変異もしくは欠失および／または内因性ａｃｔＡ遺伝子の変異もしくは欠失を含み得る。あるいは、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性インターナリンＢ（ｉｎｌＢ）遺伝子の変異もしくは欠失および／または内因性ａｃｔＡ遺伝子の変異もしくは欠失を含み得る。あるいは、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性ｉｎｌＢ、ｉｎｌＣ、およびａｃｔＡ遺伝子の変異または欠失を含み得る。隣接細胞へのＬｉｓｔｅｒｉａの移行は、プロセスに関係する内因性ａｃｔＡ遺伝子および／または内因性ｉｎｌＣ遺伝子または内因性ｉｎｌＢ遺伝子の欠失によって阻害され、それによって、株骨格（ｓｔｒａｉｎ  ｂａｃｋｂｏｎｅ）として免疫原性および有用性の上昇を伴う、高レベルの弱毒化が生じる。弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株はまた、ｐｌｃＡおよびｐｌｃＢの両方の変異または欠失を含む二重変異体であり得る。場合によっては、株は、ＥＧＤ  Ｌｉｓｔｅｒｉａ骨格から構築することができる。
【００８４】
細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株はまた、代謝遺伝子に変異を有する栄養素要求株であり得る。一例として、株は、１つ以上の内因性アミノ酸代謝遺伝子を欠損し得る。例えば、Ｄ−アラニンを欠損しているＬｉｓｔｅｒｉａの栄養素要求株の生成は、例えば、欠失変異、挿入変異、フレームシフト変異、タンパク質の未成熟終止をもたらす変異、または遺伝子発現に影響を及ぼす制御配列の変異を含む、周知の多くの方法で達成され得る。栄養素要求表現型の復帰変異の低い確率を伴うため、欠失変異が好ましいことがある。例として、本明細書で提示するプロトコルに従って生成されるＤ−アラニンの変異を、単純な実験室培養アッセイにおいて、Ｄ−アラニンの非存在下で成長する能力について試験してもよい。この化合物の非存在下で成長し得ないそれらの変異体を選択することができる。
【００８５】
内因性アミノ酸代謝遺伝子の例には、ビタミン合成遺伝子、パントテン酸シンターゼをコードする遺伝子、Ｄ−グルタミン酸シンターゼ遺伝子、Ｄ−アラニンアミノトランスフェラーゼ（ｄａｔ）遺伝子、Ｄ−アラニンラセマーゼ（ｄａｌ）遺伝子、ｄｇａ、ジアミノピメリン酸（ＤＡＰ）の合成に関係する遺伝子、システインシンターゼＡ（ｃｙｓＫ）、ビタミン−Ｂ１２非依存性メチオニンシンターゼの合成に関係する遺伝子、ｔｒｐＡ、ｔｒｐＢ、ｔｒｐＥ、ａｓｎＢ、ｇｌｔＤ、ｇｌｔＢ、ｌｅｕＡ、ａｒｇＧ、およびｔｈｒＣが含まれる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、２つ以上のそのような遺伝子（例えば、ｄａｔおよびｄａｌ）を欠損し得る。Ｄ−グルタミン酸の合成は、部分的に、アルファ−ケトグルタラート＋Ｄ−ａｌａへのＤ−ｇｌｕ＋ｐｙｒの変換、および逆反応に関係するｄａｌ遺伝子によって制御される。
【００８６】
別の例として、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性シンターゼ遺伝子、例えば、アミノ酸合成遺伝子を欠損し得る。そのような遺伝子の例には、ｆｏｌＰ、ジヒドロウリジンシンターゼファミリータンパク質をコードする遺伝子、ｉｓｐＤ、ｉｓｐＦ、ホスホエノールピルビン酸シンターゼをコードする遺伝子、ｈｉｓＦ、ｈｉｓＨ、ｆｌｉＩ、リボソームラージサブユニットプソイドウリジンシンターゼをコードする遺伝子、ｉｓｐＤ、二官能性ＧＭＰシンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼタンパク質をコードする遺伝子、ｃｏｂＳ、ｃｏｂＢ、ｃｂｉＤ、ウロポルフィリン−ＩＩＩ  Ｃ−メチルトランスフェラーゼ／ウロポルフィリノーゲン−ＩＩＩシンターゼをコードする遺伝子、ｃｏｂＱ、ｕｐｐＳ、ｔｒｕＢ、ｄｘｓ、ｍｖａＳ、ｄａｐＡ、ｉｓｐＧ、ｆｏｌＣ、クエン酸シンターゼをコードする遺伝子、ａｒｇＪ、３−デオキシ−７−ホスホヘプツロン酸シンターゼをコードする遺伝子、インドール−３−グリセロール−リン酸シンターゼをコードする遺伝子、アントラニル酸シンターゼ／グルタミンアミドトランスフェラーゼ成分をコードする遺伝子、ｍｅｎＢ、メナキノン特異的イソコリスミン酸シンターゼをコードする遺伝子、ホスホリボシルホルミルグリシナミジンシンターゼＩまたはＩＩをコードする遺伝子、ホスホリボシルアミノイミダゾール−スクシノカルボキサミドシンターゼをコードする遺伝子、ｃａｒＢ、ｃａｒＡ、ｔｈｙＡ、ｍｇｓＡ、ａｒｏＢ、ｈｅｐＢ、ｒｌｕＢ、ｉｌｖＢ、ｉｌｖＮ、ａｌｓＳ、ｆａｂＦ、ｆａｂＨ、プソイドウリジンシンターゼをコードする遺伝子、ｐｙｒＧ、ｔｒｕＡ、ｐａｂＢ、およびａｔｐシンターゼ遺伝子（例えば、ａｔｐＣ、ａｔｐＤ−２、ａｐｔＧ、ａｔｐＡ−２など）が含まれる。
【００８７】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性のｐｈｏＰ、ａｒｏＡ、ａｒｏＣ、ａｒｏＤ、またはｐｌｃＢを欠損し得る。また別の例として、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、内因性ペプチドトランスポーターを欠損し得る。例には、ＡＢＣトランスポーター／ＡＴＰ結合／ペルメアーゼタンパク質、オリゴペプチドＡＢＣトランスポーター／オリゴペプチド結合タンパク質、オリゴペプチドＡＢＣトランスポーター／ペルメアーゼタンパク質、亜鉛ＡＢＣトランスポーター／亜鉛結合タンパク質、糖ＡＢＣトランスポーター、リン酸トランスポーター、ＺＩＰ亜鉛トランスポーター、ＥｍｒＢ／ＱａｃＡファミリーの薬剤耐性トランスポーター、硫酸トランスポーター、プロトン依存性オリゴペプチドトランスポーター、マグネシウムトランスポーター、ギ酸／亜硝酸トランスポーター、スペルミジン／プトレシンＡＢＣトランスポーター、Ｎａ／Ｐｉ−コトランスポーター、糖リン酸トランスポーター、グルタミンＡＢＣトランスポーター、主要なファシリテーターファミリートランスポーター、グリシンベタイン／Ｌ−プロリンＡＢＣトランスポーター、モリブデンＡＢＣトランスポーター、テコ酸（ｔｅｃｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）ＡＢＣトランスポーター、コバルトＡＢＣトランスポーター、アンモニウムトランスポーター、アミノ酸ＡＢＣトランスポーター、細胞分裂ＡＢＣトランスポーター、マンガンＡＢＣトランスポーター、鉄化合物ＡＢＣトランスポーター、マルトース／マルトデキストリンＡＢＣトランスポーター、Ｂｃｒ／ＣｆｌＡファミリーの薬剤耐性トランスポーター、および上記のタンパク質のうちの１つのサブユニットをコードする遺伝子が含まれる。
【００８８】
他の弱毒化細菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株は、細菌の成長プロセス、複製プロセス、細胞壁の合成、タンパク質の合成、脂肪酸の代謝に、または任意の他の成長もしくは複製プロセスに使用されるアミノ酸を代謝する内因性代謝酵素を欠損し得る。同様に、弱毒株は、細胞壁の合成で使用されるアミノ酸の形成を触媒し得るか、細胞壁の合成で使用されるアミノ酸の合成を触媒し得るか、または細胞壁の合成で使用されるアミノ酸の合成に関係し得る内因性代謝酵素を欠損し得る。あるいは、アミノ酸が、細胞壁の生合成で使用され得る。あるいは、代謝酵素は、細胞壁成分であるＤ−グルタミン酸のための合成酵素である。
【００８９】
他の弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、Ｄ−グルタミン酸合成遺伝子、ｄｇａ、ａｌｒ（アラニンラセマーゼ）遺伝子によってコードされる代謝酵素、またはアラニン合成に関係する任意の他の酵素を欠損し得る。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が欠損し得る代謝酵素のさらに他の例には、ｓｅｒＣ（ホスホセリンアミノトランスフェラーゼ）、ａｓｄ（アスパラギン酸ベータセミアルデヒドデヒドロゲナーゼ、細胞壁成分のジアミノピメリン酸の合成に関係する）、ｇｓａＢ−グルタメート−１−セミアルデヒドアミノトランスフェラーゼをコードする遺伝子（（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノエートからの５−アミノレブリネートの形成を触媒する）、ｈｅｍＬ（（Ｓ）−４−アミノ−５−オキソペンタノエートからの５−アミノレブリネートの形成を触媒する）、ａｓｐＢ（Ｌ−アスパルテートおよび２−オキソグルタラートからのオキサロアセタート（ｏｘａｌｏｚｃｅｔａｔｅ）およびＬ−グルタメートの形成を触媒するアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ）、ａｒｇＦ−１（アルギニン生合成に関係する）、ａｒｏＥ（アミノ酸生合成に関係する）、ａｒｏＢ（３−デヒドロキナート生合成に関係する）、ａｒｏＤ（アミノ酸生合成に関係する）、ａｒｏＣ（アミノ酸生合成に関係する）、ｈｉｓＢ（ヒスチジン生合成に関係する）、ｈｉｓＤ（ヒスチジン生合成に関係する）、ｈｉｓＧ（ヒスチジン生合成に関係する）、ｍｅｔＸ（メチオニン生合成に関係する）、ｐｒｏＢ（プロリン生合成に関係する）、ａｒｇＲ（アルギニン生合成に関係する）、ａｒｇＪ（アルギニン生合成に関係する）、ｔｈｉｌ（チアミン生合成に関係する）、ＬＭＯｆ２３６５＿１６５２（トリプトファン生合成に関係する）、ａｒｏＡ（トリプトファン生合成に関係する）、ｉｌｖＤ（バリンおよびイソロイシン生合成に関係する）、ｉｌｖＣ（バリンおよびイソロイシン生合成に関係する）、ｌｅｕＡ（ロイシン生合成に関係する）、ｄａｐＦ（リシン生合成に関係する）、およびｔｈｒＢ（スレオニン生合成に関係する）（すべてＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２９７３）によってコードされる酵素が含まれる。
【００９０】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、他の代謝酵素、例えば、ｔＲＮＡシンセターゼの変異によって生成され得る。例えば、代謝酵素は、トリプトファニルｔＲＮＡシンセターゼをコードするｔｒｐＳ遺伝子によってコードされ得る。例えば、宿主株細菌は、Δ（ｔｒｐＳ  ａｒｏＡ）であり得、両方のマーカーが、組み込みベクターに含まれ得る。
【００９１】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するために変異させることができる代謝酵素の他の例には、ｍｕｒＥ（ジアミノピメリン酸の合成に関係する；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００３４８５）、ＬＭＯｆ２３６５＿２４９４（テイコ酸生合成に関係する）、ＷｅｃＥ（リポ多糖生合成タンパク質ｒｆｆＡ；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＥ０１４０７５．１）、またはａｍｉＡ（Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）によってコードされる酵素が含まれる。代謝酵素のさらに他の例には、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ、ヒスチジノール−リン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４６６３４７）、または細胞壁テイコ酸グリコシル化タンパク質ＧｔｃＡが含まれる。
【００９２】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するために変異させることができる代謝酵素の他の例には、ペプチドグリカン成分または前駆体のための合成酵素が含まれる。成分は、例えば、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルムラミルペンタペプチド、ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン、ＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリル−ウンデカプレノール、ＧｌｃＮＡｃ−ｐ−（１，４）−ＭｕｒＮＡｃ−（ペンタペプチド）−ピロホスホリルウンデカプレノール、または任意の他のペプチドグリカン成分または前駆体であり得る。
【００９３】
弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を生成するために変異させることができる代謝酵素のさらに他の例には、ｍｕｒＧ、ｍｕｒＤ、ｍｕｒＡ−１、またはｍｕｒＡ−２（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＣ＿００２９７３にすべて記載されている）によってコードされる代謝酵素が含まれる。あるいは、代謝酵素は、ペプチドグリカン成分または前駆体のための任意の他の合成酵素であり得る。代謝酵素はまた、トランス−グリコシラーゼ、トランス−ペプチダーゼ、カルボキシ−ペプチダーゼ、任意の他のクラスの代謝酵素、または任意の他の代謝酵素であり得る。例えば、代謝酵素は、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ代謝酵素または任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ代謝酵素であり得る。
【００９４】
他の細菌株は、Ｌｉｓｔｅｒｉａについて上記したとおり、他の細菌株における対応するオルソロガスな遺伝子を変異させることによって弱毒化させることができる。
【００９５】
（２）弱毒化細菌およびＬｉｓｔｅｒｉａ株を相補する方法
本明細書に開示される弱毒化細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、弱毒化変異を相補する（例えば、栄養素要求Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の栄養素要求を相補する）相補的遺伝子を含む、または代謝酵素をコードする核酸をさらに含み得る。例えば、本明細書に開示される融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを有する核酸は、相補的遺伝子を含むか、または相補的代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームをさらに含み得る。あるいは、第１の核酸は、融合ポリペプチドをコードし得、別の第２の核酸は、相補的遺伝子を含むか、または相補的代謝酵素をコードし得る。
【００９６】
相補的遺伝子は、染色体外であり得るか、または、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａゲノムに組み込まれ得る。例えば、栄養素要求Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝酵素をコードする核酸を含むエピソームプラスミドを含み得る。そのようなプラスミドは、エピソームまたは染色体外の様式でＬｉｓｔｅｒｉａに含まれるであろう。あるいは、栄養素要求Ｌｉｓｔｅｒｉａ株は、代謝酵素をコードする核酸を含む組込みプラスミド（すなわち、組み込みベクター）を含み得る。そのような組み込みプラスミドを、Ｌｉｓｔｅｒｉａ染色体に組み込むために使用することができる。好ましくは、エピソームプラスミドまたは組み込みプラスミドは、抗生物質耐性マーカーを欠如している。
【００９７】
抗生物質耐性遺伝子の代わりに、またはそれに加えて、代謝遺伝子の選択のために使用することができる。例として、本明細書で提供される代謝酵素または相補的遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養素要求細菌を選択するために、形質転換された栄養素要求細菌を、代謝酵素（例えば、アミノ酸代謝遺伝子）または相補的遺伝子をコードする遺伝子の発現を選択する培地中で成長させることができる。例えば、Ｄ−グルタミン酸合成について栄養素要求である細菌を、Ｄ−グルタミン酸合成のための遺伝子を含むプラスミドで形質転換することができ、その栄養素要求細菌は、Ｄ−グルタミン酸の非存在下で成長するが、プラスミドで形質転換されていないか、またはＤ−グルタミン酸合成のためのタンパク質をコードするプラスミドを発現していない栄養素要求細菌は成長しない。同様に、Ｄ−アラニン合成のためのアミノ酸代謝酵素をコードする核酸を含むプラスミドで形質転換され、それを発現する場合、Ｄ−アラニン合成について栄養素要求性である細菌は、Ｄ−アラニンの非存在下で成長する。必須の成長因子、サプリメント、アミノ酸、ビタミン、抗生物質などを含むか、または含まない適切な培地を作製するためのそのような方法は、周知であり、商業的に利用可能である。
【００９８】
本明細書で提供される代謝酵素または相補的遺伝子をコードするプラスミドを含む栄養素要求細菌が適切な培地で選択されたら、その細菌を選択的圧力の存在下で成長させることができる。そのような成長は、栄養素要求因子を含まない培地中で細菌を成長させることを含み得る。栄養素要求細菌における代謝酵素または相補的遺伝子を発現するプラスミドの存在は、プラスミドが細菌とともに複製し、したがって、プラスミドを持つ細菌を継続的に選択することを保証する。プラスミドを含む栄養素要求細菌が成長している培地の容積を調整することによって、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株の生成を、容易に規模拡大することができる。
【００９９】
具体的な一例では、弱毒化株は、ｄａｌおよびｄａｔの欠失またはそこに不活性化変異を有する株（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）（Ｌｍｄｄ）またはＬｍ  ｄａｌ（−）ｄａｔ（−）ΔａｃｔＡ（ＬｍｄｄＡ））であり、相補的遺伝子は、アラニンラセマーゼ酵素（例えば、ｄａｌ遺伝子によってコードされる）またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素（例えば、ｄａｔ遺伝子によってコードされる）をコードする。例示的なアラニンラセマーゼタンパク質は、配列番号７６に記載される配列（配列番号７８によってコードされる；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３８４３８）を有し得るか、または配列番号７６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、またはアイソフォームの断片であり得る。アラニンラセマーゼタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａアラニンラセマーゼタンパク質であり得る。あるいは、アラニンラセマーゼタンパク質は、任意の他のグラム陽性アラニンラセマーゼタンパク質または任意の他のアラニンラセマーゼタンパク質であり得る。例示的なＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質は、配列番号７７に記載される配列（配列番号７９によってコードされる；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＦ０３８４３９）を有し得るか、または配列番号７７のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、またはアイソフォームの断片であり得る。Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質であり得る。あるいは、Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質は、任意の他のグラム陽性Ｄ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質または任意の他のＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼタンパク質であり得る。
【０１００】
別の具体的な例では、弱毒化株は、ｐｒｆＡの欠失またはそこにおける不活性化変異を有する株（例えば、Ｌｍ  ｐｒｆＡ（−））であり、相補的遺伝子は、ＰｒｆＡタンパク質をコードする。例えば、相補的遺伝子は、部分的なＰｒｆＡ機能を再生する変異体ＰｒｆＡ（Ｄ１３３Ｖ）タンパク質をコードし得る。野生型ＰｒｆＡタンパク質の例は、配列番号８０に記載されており（配列番号８１に記載される核酸によってコードされる）、Ｄ１３３Ｖ変異体ＰｒｆＡタンパク質の例は、配列番号８２に記載されている（配列番号８３に記載される核酸によってコードされる）。相補的ＰｒｆＡタンパク質は、配列番号８０または８２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、またはアイソフォームの断片であり得る。ＰｒｆＡタンパク質はまた、任意の他のＬｉｓｔｅｒｉａ  ＰｒｆＡタンパク質であり得る。あるいは、ＰｒｆＡタンパク質は、任意の他のグラム陽性ＰｒｆＡタンパク質または任意の他のＰｒｆＡタンパク質であり得る。
【０１０１】
別の例では、細菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株は、ａｃｔＡ遺伝子の欠失またはそこに不活性化変異を含み得、相補的遺伝子は、変異を相補し、かつＬｉｓｔｅｒｉａ株の機能を再生するａｃｔＡ遺伝子を含み得る。
【０１０２】
他の栄養素要求株および相補系を、本明細書で提供される方法および組成物とともに使用するために採用することもできる。
【０１０３】
ＩＶ．組換え融合ポリペプチド
本明細書に開示される組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株における組換え融合ポリペプチドは、任意の形態であり得る。いくつかのそのような融合ポリペプチドは、１つ以上の疾患関連抗原ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含むことができる。他のそのような組換え融合ポリペプチドは、１つ以上の疾患関連抗原ペプチドを含むことができ、融合ポリペプチドは、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含まない。
【０１０４】
組換え融合ポリペプチドの別の例には、Ｎ末端からＣ末端まで、細菌分泌配列、ユビキチン（Ｕｂ）タンパク質、および１つ以上の疾患関連抗原ペプチド（すなわち、Ｕｂ−ペプチド１−ペプチド２などのタンデム）が含まれる。あるいは、２つ以上の疾患関連抗原ペプチドが使用される場合、各抗原ペプチドがそれ自身の分泌配列およびＵｂタンパク質（例えば、Ｕｂ１−ペプチド１、Ｕｂ２−ペプチド２）に融合される別々の融合ポリペプチドの組み合わせが使用され得る。
【０１０５】
そのような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸（ミニ遺伝子構築物と称される）も開示される。そのようなミニ遺伝子核酸構築物は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン−ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つ以上のオープンリーディングフレームをさらに含み得る。例えば、ミニ遺伝子核酸構築物は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン−ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームをさらに含み得る。各オープンリーディングフレームは、異なるポリペプチドをコードすることができまる。いくつかの核酸構築物では、タンパク質合成の終了を保証するために、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンには、２つの停止コドンが続き得る。
【０１０６】
細菌シグナル配列は、ＨｌｙまたはＡｃｔＡシグナル配列などのＬｉｓｔｅｒｉａシグナル配列、または任意の他の既知のシグナル配列であり得る。別の場合では、シグナル配列は、ＬＬＯシグナル配列であり得る。例示的なＬＬＯシグナル配列は、配列番号９７に記載されている。シグナル配列は、細菌であり得るか、宿主細菌（例えば、ｓｅｃＡ１シグナルペプチドなどのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）に対して天然であり得るか、または宿主細菌に対して外来であり得る。シグナルペプチドの具体的な例には、Ｌａｃｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｌａｃｔｉｓからのＵｓｐ４５シグナルペプチド、Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｎｔｈｒａｃｉｓからの保護抗原シグナルペプチド、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓからのｐ６０シグナルペプチドなどのｓｅｃＡ２シグナルペプチド、およびＢ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ  Ｔａｔシグナルペプチド（例えばＰｈｏＤ）などのＴａｔシグナルペプチドが含まれる。具体的な例では、分泌シグナル配列は、ＡｃｔＡ３００分泌シグナルまたはＡｃｔＡ１００分泌シグナルなどのＬｉｓｔｅｒｉａタンパク質からのものである。例示的なＡｃｔＡシグナル配列は、配列番号９８に記載されている。
【０１０７】
ユビキチンは、例えば、全長タンパク質であり得る。本明細書で提供される核酸構築物から発現されるユビキチンは、宿主細胞のサイトゾルに侵入すると、加水分解酵素の作用によって、カルボキシ末端で、核酸構築物から発現される組換え融合ポリペプチドの残りの部分から切断され得る。これにより、融合ポリペプチドのアミノ末端が遊離して、宿主細胞のサイトゾルにおいてペプチドを生じる。
【０１０８】
融合ポリペプチド内の抗原ペプチドの選択、変更、および配置は、本明細書の他の箇所で詳細に論じられ、疾患関連抗原ペプチドの例は、本明細書の他の箇所でより詳細に論じられる。
【０１０９】
組換え融合ポリペプチドは、１つ以上のタグを含み得る。例えば、組換え融合ポリペプチドは、１つ以上の抗原ペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に１つ以上のペプチドタグを含み得る。タグを、抗原ペプチドに直接融合させ得るか、またはリンカー（その例を本明細書の他の箇所で開示される）によって抗原ペプチドに連結し得る。タグの例には、ＦＬＡＧタグ、２ｘＦＬＡＧタグ、３ｘＦＬＡＧタグ、Ｈｉｓタグ、６ｘＨｉｓタグ、およびＳＩＩＮＦＥＫＬタグが含まれる。例示的なＳＩＩＮＦＥＫＬタグは、配列番号１６に記載されている（配列番号１〜１５に記載されている核酸のうちのいずれか１つによってコードされる）。例示的な３ｘＦＬＡＧタグは、配列番号３２に記載されている（配列番号１７〜３１に記載されている核酸のうちのいずれか１つによってコードされる）。例示的なバリアント３ｘＦＬＡＧタグは、配列番号９９に記載されている。２つ以上のタグ、例えば、２ｘＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、３ｘＦＬＡＧタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグ、または６ｘＨｉｓタグおよびＳＩＩＮＦＥＫＬタグを一緒に使用することができる。２つ以上のタグを使用する場合、それらは、組換え融合ポリペプチドのどこにも、および任意の順序で位置し得る。例えば、２つのタグは、組換え融合ポリペプチドのＣ末端にあり得るか、２つのタグは、組換え融合ポリペプチドのＮ末端にあり得るか、２つのタグは、組換え融合ポリペプチド内で内部に位置させ得るか、１つのタグが組換え融合ポリペプチドのＣ末端に、およびもう１つのタグがＮ末端にあり得るか、１つのタグが組換え融合ポリペプチドのＣ末端に、およびもう１つが内部にあり得るか、または１つのタグが組換え融合ポリペプチドのＮ末端に、およびもう１つが内部にあり得る。他のタグには、キチン結合タンパク質（ＣＢＰ）、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、およびポリ（ＮＡＮＰ）が含まれる。特定の組換え融合ポリペプチドは、Ｃ末端のＳＩＩＮＦＥＫＬタグを含む。そのようなタグは、組換え融合タンパク質の容易な検出、組換え融合タンパク質の分泌の確認、またはこれらの「タグ」配列ペプチドに対する免疫応答を追跡することによる分泌された融合ポリペプチドの免疫原性の追跡を可能にし得る。例えば、これらのタグに特異的なモノクローナル抗体およびＤＮＡまたはＲＮＡプローブを含むいくつかの試薬を使用して、そのような免疫応答をモニタリングすることができる。
【０１１０】
本明細書に開示される組換え融合ポリペプチドは、組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株によって発現され得るか、またはタンパク質の発現および単離に使用される他のベクターおよび細胞系から発現および単離され得る。そのような抗原ペプチドを発現することを含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株は、例えば、そのような組換えＬｉｓｔｅｒｉａを含む免疫原性組成物において、ならびに組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株およびアジュバントを含むワクチンにおいて使用することができる。Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の宿主細胞系およびＬｉｓｔｅｒｉａ以外の宿主細胞系でのＬＬＯ、ＡｃｔＡ、またはＰＥＳＴ様配列の非溶血性短縮型を有する融合ポリペプチドとしての１つ以上の抗原ペプチドの発現は、抗原ペプチドの免疫原性の増強をもたらし得る。
【０１１１】
そのような組換え融合ポリペプチドをコードする核酸も開示される。核酸は、任意の形態であり得る。核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得るか、またはそれらからなり得、一本鎖または二本鎖であり得る。核酸は、プラスミド、例えば、エピソームプラスミド、マルチコピーエピソームプラスミド、または組み込みプラスミドの形態であり得る。あるいは、核酸は、ウイルスベクター、ファージベクターの形態で、または細菌人工染色体であり得る。そのような核酸は、１つのオープンリーディングフレームを有し得るか、または２つ以上のオープンリーディングフレーム（例えば、組換え融合ポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームおよび代謝酵素をコードする第２のオープンリーディングフレーム）を有し得る。一例では、そのような核酸は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン−ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２つ以上のオープンリーディングフレームを含み得る。例えば、核酸は、各オープンリーディングフレーム間のシャイン−ダルガーノリボソーム結合部位核酸配列によって連結された２〜４つのオープンリーディングフレームを含み得る。各オープンリーディングフレームは、異なるポリペプチドをコードし得る。いくつかの核酸では、タンパク質合成の終了を保証するために、融合ポリペプチドのカルボキシ末端をコードするコドンには、２つの停止コドンが続き得る。
【０１１２】
Ａ．抗原ペプチド
疾患関連ペプチドには、特定の疾患で発現するタンパク質由来のペプチドが含まれる。例えば、そのようなペプチドは、疾患組織で発現されるが、対応する正常組織では発現されない、または疾患組織で異常に高いレベルで発現されるタンパク質に由来し得る。本明細書で使用される「疾患」という用語は、「障害」および「状態」（医学的状態など）と一般的に同義であることを意図し、互換的に使用され、それらはすべて、ヒトもしくは動物の体の異常な状態、または正常な機能を害するその一部のうちの１つの異常な状態を反映し、該用語は、典型的に、兆候および症状を区別することに明らかになり、ヒトまたは動物に生命の存続時間または生活の質の低下を引き起こす。疾患関連抗原ペプチドの例には、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）Ｅ７またはＥ６、前立腺特異抗原（ＰＳＡ）、キメラＨｅｒ２抗原、Ｈｅｒ２／ｎｅｕキメラ抗原が含まれ得る。ヒトパピローマウイルスは、ＨＰＶ１６またはＨＰＶ１８であり得る。抗原ペプチドはまた、タンデムに作動可能に連結されたＨＰＶ１６  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１６  Ｅ７抗原、ＨＰＶ１８  Ｅ６抗原、ＨＰＶ１８  Ｅ７抗原、またはＨＰＶ抗原ペプチドにタンデムに作動可能に連結されたＨＰＶ１６抗原ペプチドを含み得る。
【０１１３】
融合ポリペプチドは、単一の抗原ペプチドを含み得るか、または２つ以上の抗原ペプチドを含み得る。各抗原ペプチドは、免疫応答を誘導するために十分な任意の長さであり得、各抗原ペプチドは、同じ長さであり得るか、または抗原ペプチドは、異なる長さを有し得る。例えば、本明細書に開示される抗原ペプチドは、５〜１００、１５〜５０、または２１〜２７アミノ酸長、または１５〜１００、１５〜９５、１５〜９０、１５〜８５、１５〜８０、１５〜７５、１５〜７０、１５〜６５、１５〜６０、１５〜５５、１５〜５０、１５〜４５、１５〜４０、１５〜３５、１５〜３０、２０〜１００、２０〜９５、２０〜９０、２０〜８５、２０〜８０、２０〜７５、２０〜７０、２０〜６５、２０〜６０、２０〜５５、２０〜５０、２０〜４５、２０〜４０、２０〜３５、２０〜３０、１１〜２１、１５〜２１、２１〜３１、３１〜４１、４１〜５１、５１〜６１、６１〜７１、７１〜８１、８１〜９１、９１〜１０１、１０１〜１２１、１２１〜１４１、１４１〜１６１、１６１〜１８１、１８１〜２０１、８〜２７、１０〜３０、１０〜４０、１５〜３０、１５〜４０、１５〜２５、１〜１０、１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、１〜１００、５〜７５、５〜５０、５〜４０、５〜３０、５〜２０、５〜１５、５〜１０、１〜７５、１〜５０、１〜４０、１〜３０、１〜２０、１〜１５、１〜１０、８〜１１、または１１〜１６アミノ酸長であり得る。例えば、抗原ペプチドは、少なくとも１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸長であり得る。抗原ペプチドのいくつかの具体的な例は、２１または２７アミノ酸長である。他の抗原ペプチドは、全長タンパク質またはその断片であり得る。
【０１１４】
一例として、抗原ペプチドは、ネオエピトープを含み得る。これらのネオエピトープは、例えば、患者特異的（すなわち、対象特異的）な癌変異であり得る。ネオエピトープを含む抗原ペプチドは、正常または健康なサンプルと比較して癌サンプルに存在する体細胞変異または配列の差を特定するために、対象からの癌サンプルから抽出された核酸を正常または健康な参照サンプルから抽出された核酸と比較することを含む、個別化免疫療法を作製するためのプロセスにおいて生成され得る。例えば、これらの変異または配列の差は、体細胞、非同義ミスセンス変異、または体細胞フレームシフト変異であり得、発現されたアミノ酸配列をコードし得る。そのような体細胞変異または配列の差を発現するペプチドは、「ネオエピトープ」と称され得る。癌特異的ネオエピトープは、（正常な非癌性または生殖細胞または組織などの）参照サンプルには存在しないが、癌サンプルには見られるエピトープを指し得る。これには、例えば、正常な非癌性細胞または生殖細胞では、対応するエピトープが見つかるが、癌細胞では、１つ以上の変異により、エピトープの配列は変化し、ネオエピトープが生じる。ネオエピトープは、変異したエピトープを含み得、変異のいずれかの側または両側に非変異配列を含み得る。
【０１１５】
別の例として、抗原ペプチドは、再発性癌変異を含み得る。例えば、本明細書に開示される組換え融合ポリペプチドは、２つ以上の抗原ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチド（すなわち、タンデムで、例えば、ＰＥＳＴ−ペプチド１−ペプチド２）を含み得るか、またはＰＥＳＴ含有ペプチドに融合されていない２つ以上の抗原ペプチドを含み得、各抗原ペプチドは、単一の再発性癌変異（すなわち、タンパク質のアミノ酸配列の単一の再発性変化、または遺伝子の単一の異なる非同義性再発性癌変異によってコードされる配列）を含み、抗原ペプチドのうちの少なくとも２つは、異なる再発性癌変異を含み、同じ癌関連タンパク質の断片である。あるいは、抗原ペプチドの各々は、異なる癌関連タンパク質からの異なる再発性癌変異を含み得る。あるいは、各抗原ペプチドがそれ自身のＰＥＳＴ含有ペプチド（例えば、ＰＥＳＴ１−ペプチド１；ＰＥＳＴ２−ペプチド２）に融合されている（または融合されていない）別々の融合ポリペプチドの組み合わせが使用され得る。任意に、断片の一部またはすべては、同じ癌関連タンパク質の非連続断片である。非連続断片は、タンパク質配列で連続して発生しない断片である（例えば、第１の断片は、１０〜３０残基で構成され、第２の断片は、１００〜１２０残基で構成されるか、または第１の断片は、１０〜３０残基で構成され、第２の断片は、残基２０〜４０で構成される）。任意に、抗原ペプチドのそれぞれは、単一のタイプの癌とは異なる再発性癌変異を含む。
【０１１６】
再発性癌変異は、癌関連タンパク質からのものであり得る。「癌関連タンパク質」という用語は、複数のタイプの癌で発生する、特定のタイプの癌を有する複数の対象で発生する、または１つ以上のタイプの癌の発生もしくは進行と相関する変異を有するタンパク質を含む。例えば、癌関連タンパク質は、発癌性タンパク質（すなわち、細胞成長を調節するタンパク質などの、癌の進行に寄与し得る活性を有するタンパク質）であり得るか、または腫瘍抑制タンパク質（すなわち、通常、細胞周期の負の調節によってまたはアポトーシスの促進などによって、癌形成の可能性を軽減するように作用するタンパク質）であり得る。好ましくは、癌関連タンパク質は、「変異ホットスポット」を有する。変異ホットスポットは、タンパク質コード遺伝子のアミノ酸の位置であり、選択がない場合に予想されるよりも頻繁に（好ましくは、転座、増幅、および欠失などの他の体細胞の異常ではなく、体細胞の置換によって）変異する。そのようなホットスポット変異は、複数のタイプの癌にわたって発生し得、および／または複数の癌患者間で共有され得る。変異ホットスポットは、腫瘍サンプルの集団全体にわたる選択圧を示す。腫瘍ゲノムには、変化時に腫瘍細胞に選択的成長の利点をもたらす遺伝子（すなわち、腫瘍ドライバー遺伝子）に影響を与えることによって腫瘍形成を「促進する」再発性癌変異が含まれる。そのような腫瘍ドライバー遺伝子は、例えば、バックグラウンド変異率（すなわち、再発）から予想されるよりも頻繁に変異する遺伝子を特定することによって、腫瘍サンプル全体にわたる正の選択の他のシグナル（例えば、サイレント変異と比較して高率の非サイレント変異、または機能的変異の蓄積へのバイアス）を示す遺伝子を特定することによって、不活性化変異がタンパク質の配列に沿って分布しているのに対し、機能獲得型変異は特定の残基またはドメインで特異的に発生する傾向があるという知識に基づいて、タンパク質配列の特定の領域で変異を維持する傾向を利用することによって、またはリン酸化部位などの特定の機能的残基の変異の過剰発現を利用することによって特定することができる。これらの変異の多くは、生物学的に活性なタンパク質（例えば、キナーゼドメインもしくは結合ドメイン）の機能領域で頻繁に発生するか、または活性部位（例えば、リン酸化部位）を妨害して、機能喪失型または機能獲得型変異を引き起こすか、またはそれらが、タンパク質の３次元構造および／または電荷バランスが正常な機能を妨げるほど十分に摂動されるような方法で発生し得る。多数の腫瘍のゲノム分析は、限られた数のアミノ酸位置で変異が発生することが多いことを示す。したがって、一般的な変異の大部分は、比較的少数の潜在的な腫瘍関連抗原またはＴ細胞エピトープによって表され得る。
【０１１７】
「再発性癌変異」は、複数のタイプの癌で、および／または特定のタイプの癌を有する複数の対象で発生するタンパク質のアミノ酸配列の変化である。癌に関連するそのような変異は、対応する健康な組織に通常は存在しない腫瘍関連抗原をもたらし得る。
【０１１８】
複数の癌にわたって、または複数の癌患者の間で発生する共通の変異を有する腫瘍ドライバー遺伝子および癌関連タンパク質が周知であり、複数の腫瘍サンプルおよび複数の腫瘍タイプにわたる配列データが存在する。例えば、Ｃｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ３４（２）：１５５−１６３、Ｔａｍｂｏｒｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｓｃｉ  Ｒｅｐ  ３：２６５０を参照されたく、これらのそれぞれは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１９】
各抗原ペプチドはまた、親水性であり得るか、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓもしくは目的の別の細菌における分泌可能性を予測し得る特定のハイドロパシー閾値までの、またはそれ未満のスコアを示し得る。例えば、抗原ペプチドは、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数によって２１アミノ酸ウィンドウでスコアリングすることができ、カットオフ（約１．６）を超えるすべてのスコアリングは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌される可能性が低いため、排除することができる。同様に、抗原ペプチドまたは融合ポリペプチドの組み合わせは、親水性であり得るか、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓもしくは目的の別の細菌における分泌可能性を予測し得る特定のハイドロパシー閾値までの、またはそれ未満のスコアを示し得る。
【０１２０】
抗原ペプチドを、任意の手法で一緒に連結させることができる。例えば、抗原ペプチドは、介在配列を用いずに相互に直接融合させることができる。あるいは、抗原ペプチドを、ペプチドリンカーなどの１つ以上のリンカーを介して間接的に相互に連結させることができる。場合によっては、隣接する抗原ペプチドのいくつかの対を相互に直接融合させることができ、抗原ペプチドの他の対を１つ以上のリンカーを介して間接的に相互に連結させることができる。同じリンカーを、隣接する抗原ペプチドの各対の間で使用することができるか、または任意の数の異なるリンカーを、隣接する抗原ペプチドの異なる対の間で使用することができる。加えて、１つのリンカーを、隣接する抗原ペプチドの対の間で使用することができるか、または多数のリンカーを、隣接する抗原ペプチドの対の間で使用することができる。
【０１２１】
任意の適切な配列を、ペプチドリンカーのために使用することができる。例として、リンカー配列は、例えば、１〜約５０アミノ酸長であってよい。一部のリンカーは、親水性であってよい。リンカーは、様々な目的に役立ち得る。例えば、リンカーは、細菌分泌を増加させるために、抗原プロセシングを促進するために、融合ポリペプチドの柔軟性を増加させるために、融合ポリペプチドの剛性を上昇させるために、または任意の他の目的のために役立ち得る。場合によっては、繰り返しを最小限にするために、異なるアミノ酸リンカー配列を、抗原ペプチドの間に分布させるか、または同じアミノ酸リンカー配列をコードする異なる核酸を、抗原ペプチドの間に分布させる（例えば、配列番号８４〜９４）。これはまた、二次構造を縮小させて、それによって、Ｌｍ組換えベクター株集団内で融合ポリペプチドをコードする核酸（例えば、プラスミド）の効率的な転写、翻訳、分泌、維持、または安定化を可能にするために役立ち得る。他の適切なペプチドリンカー配列を、例えば、因子：（１）柔軟な延長配座を取るそれらの能力、（２）抗原ペプチド上の機能性エピトープと相互作用し得る二次構造を取るそれらの能力、および（３）機能性エピトープと反応し得る疎水性または荷電残基の欠如、のうちの１つ以上に基づいて選択してもよい。例えば、ペプチドリンカー配列は、Ｇｌｙ、Ａｓｎ、およびＳｅｒ残基を含有してもよい。他の中性付近のアミノ酸、例えば、ＴｈｒおよびＡｌａも、リンカー配列において使用してもよい。リンカーとして通常使用され得るアミノ酸配列には、Ｍａｒａｔｅａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｇｅｎｅ  ４０：３９−４６、Ｍｕｒｐｈｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ８３：８２５８−８２６２、ＵＳ４，９３５，２３３、およびＵＳ４，７５１，１８０に開示されているものが含まれ、これらのそれぞれは、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。リンカーの具体的な例には、表２のリンカーが含まれるが（これらのそれぞれは、そのままリンカーとして、配列の繰り返しを含むリンカーで、または表内の他の配列のうちの１つ以上をさらに含むリンカーで使用することができる）、他のものも、考えられ得る（例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｅｄｄｙ  Ｃｈｉｃｈｉｌｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１３）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２２：１５３−１６７を参照のこと）。指定がない限り、「ｎ」は、挙げられているリンカーにおける繰り返しの未定数を表す。
【表２】
2021516972.tif 000004
【０１２２】
Ｂ．ＰＥＳＴ含有ペプチド
本明細書に開示される組換え融合タンパク質は、ＰＥＳＴ含有ペプチドを含む。ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドのアミノ末端（Ｎ末端）末端（すなわち、抗原ペプチドに対してＮ末端）にあってもよいか、融合ポリペプチドのカルボキシ末端（Ｃ末端）末端（すなわち、抗原ペプチドに対してＣ末端）にあってもよいか、または抗原ペプチド内に埋め込まれていてもよい。一部の組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株および方法では、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、融合ポリペプチドの一部ではなく、それから離れている。ＬＬＯペプチドなどのＰＥＳＴ様配列への抗原ペプチドの融合は、抗原ペプチドの免疫原性を増強することができ、細胞媒介性および抗腫瘍免疫応答を増加させることができる（すなわち、細胞媒介性および抗腫瘍免疫を増加させる）。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＳｉｎｇｈ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７５（６）：３６６３−３６７３を参照のこと。
【０１２３】
ＰＥＳＴ含有ペプチドは、ＰＥＳＴ配列またはＰＥＳＴ様配列を含むものである。真核タンパク質におけるＰＥＳＴ配列は、以前から特定されている。例えば、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）（ＰＥＳＴ）がリッチなアミノ酸配列を含有し、一般に、常にではないが、いくつかの正電荷アミノ酸を含有するクラスターの横に配置されているタンパク質は、急速な細胞内半減期を有する（すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４：３６４−３６９）。さらに、これらの配列は、タンパク質を、分解のためのユビキチン−プロテアソーム経路へと向けることが報告されている（すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１）。この経路はまた、ＭＨＣクラスＩに結合する免疫原性ペプチドを生成するために、真核細胞によって使用され、ＰＥＳＴ配列は、免疫原性ペプチドをもたらす真核タンパク質において豊富であると仮定されている（すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＲｅａｌｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９４）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．３４８：１０９−１１３）。原核タンパク質は、この酵素経路を有さないため、ＰＥＳＴ配列を通常含有しない。しかしながら、アミノ酸プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）がリッチなＰＥＳＴ様配列は、ＬＬＯのアミノ末端で報告されており、かつＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ病原性に必須であると報告されている（すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＤｅｃａｔｕｒ  ａｎｄ  Ｐｏｒｔｎｏｙ  （２０００）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２９０：９９２−９９５）。ＬＬＯにおけるこのＰＥＳＴ様配列の存在は、タンパク質が、宿主細胞のタンパク質分解機構による分解のための標的となるため、ＬＬＯがその機能を果たし、ファゴソームまたはファゴリソソーム小胞からのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの脱出を促進すると、細胞を損傷し得る前に、これは破壊される。
【０１２４】
ＰＥＳＴおよびＰＥＳＴ様配列の同定は周知であり、例えば、Ｒｏｇｅｒｓ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３４（４７７４）：３６４−３７８およびＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒ  ａｎｄ  Ｒｏｇｅｒｓ（１９９６）Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．２１：２６７−２７１に記載されており、これらのそれぞれは、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。ＰＥＳＴまたはＰＥＳＴ様配列は、ＰＥＳＴファインドプログラムを使用して特定され得る。例えば、ＰＥＳＴ様配列は、プロリン（Ｐ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、およびスレオニン（Ｔ）残基のリッチな領域であり得る。任意に、ＰＥＳＴ様配列は、いくつかの正電荷アミノ酸を含有する１つ以上のクラスターの横に配置され得る。例えば、ＰＥＳＴ様配列は、プロリン（Ｐ）、アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）、セリン（Ｓ）、および／またはスレオニン（Ｔ）残基の高い局所濃度を有する少なくとも１２のアミノ酸長の親水性区間として定義され得る。場合によっては、ＰＥＳＴ様配列は、正電荷アミノ酸、すなわち、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）、およびリジン（Ｋ）を含有しない。一部のＰＥＳＴ様配列は、１つ以上の内部リン酸化部位を含有し得、これらの部位でのリン酸化がタンパク質分解の前に起こる。
【０１２５】
一例では、ＰＥＳＴ様配列は、Ｒｏｇｅｒｓらに開示されているアルゴリズムと適合する。別の例では、ＰＥＳＴ様配列は、ＲｅｃｈｓｔｅｉｎｅｒおよびＲｏｇｅｒｓに開示されているアルゴリズムと適合する。ＰＥＳＴ様配列はまた、指定されたタンパク質配列内の正電荷アミノ酸Ｒ、Ｈ、およびＫの初期スキャンによって特定することができる。正電荷隣接部の間のすべてのアミノ酸を計数し、いくつかのウィンドウサイズパラメーターに等しいか、またはそれ以上のアミノ酸の数を含有するモチーフのみをさらに検討する。任意に、ＰＥＳＴ様配列は、少なくとも１つのＰ、少なくとも１つのＤまたはＥ、および少なくとも１つのＳまたはＴを含有する必要がある。
【０１２６】
ＰＥＳＴモチーフの品質を、重要なアミノ酸の局所富化、さらには疎水性のモチーフに基づくスコアリングパラメーターによって精密化することができる。Ｄ、Ｅ、Ｐ、Ｓ、およびＴの富化は、重量パーセント（ｗ／ｗ）で表され、１当量のＤまたはＥ、１当量のＰ、および１当量のＳまたはＴについて補正される。疎水性の計算はまた、原則として、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５の方法に従うことができる。簡略化された計算では、本来はアルギニンでの−４．５からイソロイシンでの＋４．５の範囲であるＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数を、アルギニンでの０から、イソロイシンでの９０までの値をもたらす次の線型変換を使用して正の整数に変換する：ハイドロパシー指数＝１０＊Ｋｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数＋４５。
【０１２７】
潜在的なＰＥＳＴモチーフの疎水性はまた、各アミノ酸種でのモルパーセントおよび疎水性指数の積の合計として計算することもできる。所望のＰＥＳＴスコアは、次の式：ＰＥＳＴスコア＝０．５５＊ＤＥＰＳＴ−０．５＊疎水性指数によって表される、局所富化の項および疎水性の項の組み合わせとして得られる。
【０１２８】
したがって、ＰＥＳＴ含有ペプチドは、上記のアルゴリズムを使用して少なくとも＋５のスコアを有するペプチドを指し得る。あるいは、それは、少なくとも６、少なくとも７、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも３２、少なくとも３５、少なくとも３８、少なくとも４０、または少なくとも４５のスコアを有するペプチドを指し得る。
【０１２９】
任意の他の既知の利用可能な方法またはアルゴリズムを使用して、ＰＥＳＴ様配列を特定することもできる。例えば、ＣａＳＰｒｅｄｉｃｔｏｒ（すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＧａｒａｙ−Ｍａｌｐａｒｔｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ２１  Ｓｕｐｐｌ  １：ｉ１６９−７６）を参照のこと。使用することができる別の方法は、次である：ＰＥＳＴ指数は、１の値をアミノ酸Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｐｒｏ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ａｓｎ、またはＧｌｎに割り当てることによって、適切な長さの各区間（例えば、３０〜３５アミノ酸区間）について計算される。ＰＥＳＴ残基のそれぞれでの係数値（ＣＶ）は１であり、他の各ＡＡ（非ＰＥＳＴ）のそれぞれでのＣＶはゼロである。
【０１３０】
ＰＥＳＴ様アミノ酸配列の例は、配列番号４３〜５１に記載されているものである。ＰＥＳＴ様配列の一例は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫＴＰＩＥＫＫＨＡＤＥＩＤＫ（配列番号４３）である。ＰＥＳＴ様配列の別の例は、ＫＥＮＳＩＳＳＭＡＰＰＡＳＰＰＡＳＰＫ（配列番号４４）である。しかしながら、任意のＰＥＳＴまたはＰＥＳＴ様アミノ酸配列を使用することができる。ＰＥＳＴ配列ペプチドは既知であり、例えば、ＵＳ７，６３５，４７９、ＵＳ７，６６５，２３８、およびＵＳ２０１４／０１８６３８７に記載されており、これらのそれぞれは、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１３１】
ＰＥＳＴ様配列は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓなどのＬｉｓｔｅｒｉａ種に由来し得る。例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ＡｃｔＡタンパク質は、少なくとも４つのそのような配列（配列番号４５〜４８）を含有し、そのいずれも、本明細書に開示される組成物および方法で使用するために適している。他の同様のＰＥＳＴ様配列には、配列番号５２〜５４が含まれる。Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｓｐ．由来のストレプトリジンＯタンパク質も、ＰＥＳＴ配列を含有する。例えば、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓストレプトリジンＯは、アミノ酸３５〜５１にＰＥＳＴ配列ＫＱＮＴＡＳＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号４９）を含み、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉｓｉｍｉｌｉｓストレプトリジンＯは、アミノ酸３８〜５４にＰＥＳＴ様配列ＫＱＮＴＡＮＴＥＴＴＴＴＮＥＱＰＫ（配列番号５０）を含む。ＰＥＳＴ様配列の別の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｓｅｅｌｉｇｅｒｉ  ｃｙｔｏｌｙｓｉｎ細胞溶解素に由来し、Ｉｓｏ遺伝子：ＲＳＥＶＴＩＳＰＡＥＴＰＥＳＰＰＡＴＰ（例えば、配列番号５１）によってコードされる。
【０１３２】
あるいは、ＰＥＳＴ様配列は、他の原核生物に由来し得る。ＰＥＳＴ様アミノ酸配列が予想される他の原核生物には、例えば、他のＬｉｓｔｅｒｉａ種が含まれる。
【０１３３】
（１）リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）
本明細書に開示される組成物および方法で利用することができるＰＥＳＴ含有ペプチドの一例は、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）ペプチドである。ＬＬＯタンパク質の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１３１２８（配列番号５５；核酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ１５１２７に記載されている）に割り当てられているタンパク質である。配列番号５５は、シグナル配列を含むプロタンパク質である。プロタンパク質の最初の２５アミノ酸は、シグナル配列であり、細菌によって分泌されるとＬＬＯから切断され、それによって、シグナル配列を含まない５０４アミノ酸の全長活性ＬＬＯタンパク質が生じる。本明細書に開示されるＬＬＯペプチドは、シグナル配列を含み得るか、またはシグナル配列を含まないペプチドを含み得る。使用することができる例示的なＬＬＯタンパク質は、配列番号５５に記載される配列、または配列番号５５のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、およびアイソフォームの断片を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＬＬＯタンパク質の断片またはＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、ホモログの断片、バリアントの断片、または類似体の断片をコードする任意の配列を使用することができる。相同ＬＬＯタンパク質は、例えば、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超える参照ＬＬＯタンパク質との配列同一性を有し得る。
【０１３４】
ＬＬＯタンパク質の別の例は、配列番号５６に記載されている。使用することができるＬＬＯタンパク質は、配列番号５６に記載される配列、または配列番号５６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、およびアイソフォームの断片を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、またはそれからなり得る。
【０１３５】
ＬＬＯタンパク質の別の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＺＰ＿０１９４２３３０またはＥＢＡ２１８３３に記載されている、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＺ＿ＡＡＲＺ０１００００１５またはＡＡＲＺ０１００００１５．１に記載されている核酸配列によってコードされる、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  １０４０３Ｓ株からのＬＬＯタンパク質である。ＬＬＯタンパク質の別の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ  ４ｂ  Ｆ２３６５株（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＹＰ＿０１２８２３を参照）、ＥＧＤ−ｅ株（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿４６３７３３を参照）、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの他の株からのＬＬＯタンパク質である。ＬＬＯタンパク質のさらに別の例は、ＦｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａｌｅｓバクテリアＨＴＣＣ２１７０（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＺＰ＿０１１０６７４７またはＥＡＲ０１４３３を参照、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＺ＿ＡＡＯＣ０１０００００３によってコードされる）からのＬＬＯタンパク質である。使用することができるＬＬＯタンパク質は、上記のＬＬＯタンパク質、または上記のＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、およびアイソフォームの断片を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、またはそれからなり得る。
【０１３６】
ＬＬＯ、またはそのホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、およびアイソフォームの断片に相同なタンパク質も使用することができる。そのような一例は、例えば、Ｐａｅｎｉｂａｃｉｌｌｕｓ  ａｌｖｅｉにおいて見い出され得るアルベオリジン（例えば、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ２３５６４またはＡＡＡ２２２２４を参照、またはＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｍ６２７０９によってコードされる）である。他のそのような相同タンパク質が公知である。
【０１３７】
ＬＬＯペプチドは、全長ＬＬＯタンパク質または短縮化ＬＬＯタンパク質またはＬＬＯ断片であり得る。同様に、ＬＬＯペプチドは、天然ＬＬＯタンパク質の１つ以上の機能性を維持しているか、または天然ＬＬＯタンパク質の１つ以上の機能性が欠如しているものであり得る。例えば、維持されるＬＬＯ機能性は、細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ）がファゴソームまたはファゴリソソームから脱出することを可能にし得るか、または融合するペプチドの免疫原性を増強し得る。維持される機能性はまた、溶血機能または抗原機能であり得る。あるいは、ＬＬＯペプチドは、非溶血性ＬＬＯであり得る。ＬＬＯの他の機能は公知であり、ＬＬＯ機能性を評価するための方法およびアッセイも公知である。
【０１３８】
ＬＬＯ断片は、ＰＥＳＴ様配列であり得るか、またはＰＥＳＴ様配列を含み得る。ＬＬＯ断片は、内部欠失、Ｃ末端からの短縮化、およびＮ末端からの短縮化のうちの１つ以上を含み得る。場合によっては、ＬＬＯ断片は、１つを超える内部欠失を含み得る。他のＬＬＯペプチドは、１つ以上の変異を含む全長ＬＬＯタンパク質であり得る。
【０１３９】
一部のＬＬＯタンパク質または断片は、野生型ＬＬＯに対して溶血活性を有するか、または非溶血性断片である。例えば、ＬＬＯタンパク質は、カルボキシ末端での活性化ドメインの欠失もしくは変異によって、システイン４８４の欠失もしくは変異によって、または別の位置での欠失もしくは変異によって非溶血性になり得る。
【０１４０】
他のＬＬＯタンパク質は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ８，７７１，７０２に詳述されているように、コレステロール結合ドメイン（ＣＢＤ）の欠失または変異によって非溶血性になり得る。変異は、例えば、置換または欠失を含み得る。ＣＢＤ全体が変異し得る、ＣＢＤの一部が変異し得るか、またはＣＢＤ内の特定の残基が変異し得る。例えば、ＬＬＯタンパク質は、配列番号５５の残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２のうちの１つ以上（例えば、Ｃ４８４、Ｗ４９１、Ｗ４９２、Ｃ４８４およびＷ４９１、Ｃ４８４およびＷ４９２、Ｗ４９１およびＷ４９２、または３つの残基すべて）または配列番号５５と最適にアラインさせた場合の対応する残基（例えば、対応するシステインまたはトリプトファン残基）の変異を含み得る。例として、ＬＬＯの残基Ｃ４８４、Ｗ４９１、およびＷ４９２がアラニン残基で置換されていて、そのことが、野生型ＬＬＯに対して溶血活性をかなり低下させるであろう変異ＬＬＯタンパク質を作製することができる。Ｃ４８４Ａ、Ｗ４９１Ａ、およびＷ４９２Ａ変異を含む変異ＬＬＯタンパク質は、「ｍｕｔＬＬＯ」と称される。
【０１４１】
別の例として、変異ＬＬＯタンパク質を、コレステロール結合ドメインを含む内部欠失で作製することができる。配列番号５５のコレステロール結合ドメインの配列は、配列番号７４に記載されている。例えば、内部欠失は、１〜１１アミノ酸欠失、１１〜５０アミノ酸欠失であり得るか、またはそれより長くあり得る。同様に、変異領域は、１〜１１アミノ酸、１１〜５０アミノ酸、またはそれより長くあり得る（例えば、１〜５０、１〜１１、２〜１１、３〜１１、４〜１１、５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、１０〜１１、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、１２〜５０、１１〜１５、１１〜２０、１１〜２５、１１〜３０、１１〜３５、１１〜４０、１１〜５０、１１〜６０、１１〜７０、１１〜８０、１１〜９０、１１〜１００、１１〜１５０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、１５〜７０、１５〜８０、１５〜９０、１５〜１００、１５〜１５０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜１５０、３０〜３５、３０〜４０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜１００、または３０〜１５０アミノ酸）。例えば、配列番号５５の残基４７０〜５００、４７０〜５１０、または４８０〜５００からなる変異領域は、ＣＢＤ（配列番号５５の残基４８３〜４９３）を含む欠失配列をもたらす。しかしながら、変異領域はまた、ＣＢＤの断片であり得るか、またはＣＢＤの一部と重複し得る。例えば、変異領域は、配列番号５５の残基４７０〜４９０、４８０〜４８８、４８５〜４９０、４８６〜４８８、４９０〜５００、または４８６〜５１０からなり得る。例えば、ＣＢＤ（残基４８４〜４９２）の断片は、野生型ＬＬＯに対して溶血活性をかなり低下させるであろう非相同配列で置き換えられ得る。例えば、ＣＢＤ（ＥＣＴＧＬＡＷＥＷＷＲ；配列番号７４）は、ＮＹ−ＥＳＯ−１からのＨＬＡ−Ａ２制限エピトープ１５７〜１６５を含有する抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１（ＥＳＬＬＭＷＩＴＱＣＲ；配列番号７５）からのＣＴＬエピトープで置き換えられ得る。得られるＬＬＯは、「ｃｔＬＬＯ」と称される。
【０１４２】
一部の変異ＬＬＯタンパク質では、変異領域は、非相同配列によって置き換えられ得る。例えば、変異領域は、同数の非相同アミノ酸、より少ない数の非相同アミノ酸、またはより多い数のアミノ酸によって置き換えられ得る（例えば、１〜５０、１〜１１、２〜１１、３〜１１、４〜１１、５〜１１、６〜１１、７〜１１、８〜１１、９〜１１、１０〜１１、１〜２、１〜３、１〜４、１〜５、１〜６、１〜７、１〜８、１〜９、１〜１０、２〜３、２〜４、２〜５、２〜６、２〜７、２〜８、２〜９、２〜１０、３〜４、３〜５、３〜６、３〜７、３〜８、３〜９、３〜１０、１２〜５０、１１〜１５、１１〜２０、１１〜２５、１１〜３０、１１〜３５、１１〜４０、１１〜５０、１１〜６０、１１〜７０、１１〜８０、１１〜９０、１１〜１００、１１〜１５０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜５０、１５〜６０、１５〜７０、１５〜８０、１５〜９０、１５〜１００、１５〜１５０、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜５０、２０〜６０、２０〜７０、２０〜８０、２０〜９０、２０〜１００、２０〜１５０、３０〜３５、３０〜４０、３０〜６０、３０〜７０、３０〜８０、３０〜９０、３０〜１００、または３０〜１５０アミノ酸）。他の変異ＬＬＯタンパク質は、１つ以上の点変異（例えば、１残基、２残基、３残基、またはそれ以上の点変異）を有する。変異残基は、連続し得るか、または連続し得ない。
【０１４３】
１つの例示的な実施形態では、ＬＬＯペプチドは、シグナル配列において欠失を、およびＣＢＤにおいて変異または置換を有してもよい。
【０１４４】
一部のＬＬＯペプチドは、Ｎ末端ＬＬＯ断片（Ｃ末端が欠失しているＬＬＯタンパク質）である。一部のＬＬＯペプチドは、少なくとも４９４、４８９、４９２、４９３、５００、５０５、５１０、５１５、５２０、または５２５アミノ酸長、または４９２〜５２８アミノ酸長である。例えば、ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質のおよそ最初の４４０または４４１アミノ酸からなり得る（例えば、配列番号５５または５６の最初の４４１アミノ酸、または配列番号５５または５６と最適にアラインさせた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）。他のＮ末端ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４２０アミノ酸からなり得る（例えば、配列番号５５または５６の最初の４２０アミノ酸、または配列番号５５または５６と最適にアラインさせた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）。他のＮ末端断片は、ＬＬＯタンパク質のほぼアミノ酸２０〜４４２からなり得る（例えば、配列番号５５または５６のアミノ酸２０〜４４２、または配列番号５５または５６と最適にアラインさせた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）。他のＮ末端ＬＬＯ断片は、システイン４８４を含む活性化ドメインを含まない、特にシステイン４８４を含まない任意のΔＬＬＯを含む。例えば、Ｎ末端ＬＬＯ断片は、ＬＬＯタンパク質の最初の４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、または２５アミノ酸（例えば、配列番号５５もしくは５６の最初の４２５、４００、３７５、３５０、３２５、３００、２７５、２５０、２２５、２００、１７５、１５０、１２５、１００、７５、５０、もしくは２５アミノ酸、または配列番号５５もしくは５６と最適にアラインさせた場合の別のＬＬＯタンパク質の対応する断片）に対応し得る。好ましくは、断片は、１つ以上のＰＥＳＴ様配列を含む。ＬＬＯ断片および短縮化ＬＬＯタンパク質は、上記の具体的なアミノ酸範囲のいずれか１つに対応する相同ＬＬＯタンパク質の残基を含有し得る。残基数は、上記で挙げた残基数と正確に対応する必要はない（例えば、相同ＬＬＯタンパク質が、本明細書に開示される具体的なＬＬＯタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合）。Ｎ末端ＬＬＯ断片の例には、配列番号５７、５８、および５９が含まれる。使用することができるＬＬＯタンパク質は、配列番号５７、５８、もしくは５９に記載される配列、または配列番号５７、５８、もしくは５９のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、およびアイソフォームの断片を含む、本質的にそれからなる、またはそれからなる。一部の組成物および方法では、配列番号５９に記載されるＮ末端ＬＬＯ断片を使用する。配列番号５９に記載されるＮ末端ＬＬＯ断片をコードする核酸の例は、配列番号６０である。
【０１４５】
（２）ＡｃｔＡ
本明細書に開示される組成物および方法で利用することができるＰＥＳＴ含有ペプチドの別の例は、ＡｃｔＡペプチドである。ＡｃｔＡは、表面関連タンパク質であり、細胞質全体にＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを推進するために、感染宿主細胞においてスキャフォールドとして作用して、宿主アクチンポリマーの重合、構築、および活性化を促進する。哺乳動物細胞のサイトゾルへの侵入後すぐに、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、宿主アクチンフィラメントの重合を誘導し、アクチン重合によって生じる力を使用して、初めは細胞内に、次いで細胞から細胞へと移動する。ＡｃｔＡは、アクチン核形成およびアクチンをベースとする運動性の媒介を担う。ＡｃｔＡタンパク質は、多数の結合部位を宿主細胞骨格成分に提供し、それによって、細胞のアクチン重合機構を構築するためのスキャフォールドとして作用する。ＡｃｔＡのＮ末端は、モノマーのアクチンに結合し、固有のアクチン核形成活性を刺激することによって、構成的活性型核形成促進因子として作用する。ａｃｔＡおよびｈｌｙ遺伝子は両方とも、転写活性化因子ＰｒｆＡによって調節される１０ｋｂ遺伝子クラスターのメンバーであり、ａｃｔＡは、哺乳動物サイトゾルにおいて約２２６倍に上方制御される。ＡｃｔＡタンパク質またはＡｃｔＡタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、ホモログの断片、バリアントの断片、または類似体の断片をコードする任意の配列を使用することができる。相同ＡｃｔＡタンパク質は、例えば、７０％、７２％、７５％、７８％、８０％、８２％、８３％、８５％、８７％、８８％、９０％、９２％、９３％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％超の参照ＡｃｔＡタンパク質との配列同一性を有し得る。
【０１４６】
ＡｃｔＡタンパク質の一例は、配列番号６１に記載される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＡｃｔＡタンパク質の別の例は、配列番号６２に記載される配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。これらの配列のいずれかに対応するプロタンパク質の最初の２９アミノ酸はシグナル配列であり、細菌によって分泌されるときに、ＡｃｔＡタンパク質から切断される。ＡｃｔＡペプチドは、シグナル配列（例えば、配列番号６１または６２のアミノ酸１〜２９）を含み得るか、またはシグナル配列を含まないペプチドを含み得る。ＡｃｔＡタンパク質の他の例は、配列番号６１または６２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、アイソフォームの断片、または類似体の断片を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【０１４７】
ＡｃｔＡタンパク質の別の例は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ１０４０３Ｓ株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＤＱ０５４５８５）、ＮＩＣＰＢＰ５４００２株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ３９４９５９）、Ｓ３株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ３９４９６０）、ＮＣＴＣ５３４８株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ３９４９６１）、ＮＩＣＰＢＰ５４００６株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ３９４９６２）、Ｍ７株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ３９４９６３）、Ｓ１９株（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ３９４９６４）、またはＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの任意の他の株からのＡｃｔＡタンパク質である。使用することができるＬＬＯタンパク質は、上記のＬＬＯタンパク質、または上記のＬＬＯタンパク質のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、断片、ホモログの断片、バリアントの断片、類似体の断片、およびアイソフォームの断片を含み得るか、本質的にそれからなり得るか、またはそれからなり得る。
【０１４８】
ＡｃｔＡペプチドは、全長ＡｃｔＡタンパク質または短縮化ＡｃｔＡタンパク質またはＡｃｔＡ断片（例えば、Ｃ末端部分が除去されているＮ末端ＡｃｔＡ断片）であり得る。好ましくは、短縮化ＡｃｔＡタンパク質は、少なくとも１つのＰＥＳＴ配列（例えば、１つを超えるＰＥＳＴ配列）を含む。加えて、短縮化ＡｃｔＡタンパク質は、任意で、ＡｃｔＡシグナルペプチドを含み得る。短縮化ＡｃｔＡタンパク質に含まれるＰＥＳＴ様配列の例には、配列番号４５〜４８が含まれる。一部のそのような短縮化ＡｃｔＡタンパク質は、配列番号４５〜４８に記載されるＰＥＳＴ様配列またはそのホモログのうちの少なくとも２つ、配列番号４５〜４８に記載されるＰＥＳＴ様配列またはホモログのうちの少なくとも３つ、または配列番号４５〜４８に記載されるＰＥＳＴ様配列またはそのホモログの４つすべてを含む。短縮化ＡｃｔＡタンパク質の例には、全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）のおよそ残基３０〜１２２、およそ残基３０〜２２９、およそ残基３０〜３３２、およそ残基３０〜２００、またはおよそ残基３０〜３９９を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるものが含まれる。短縮化ＡｃｔＡタンパク質の他の例には、全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）のほぼ最初の５０、１００、１５０、２００、２３３、２５０、３００、３９０、４００、または４１８残基を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるものが含まれる。短縮化ＡｃｔＡタンパク質の他の例には、全長ＡｃｔＡタンパク質配列（例えば、配列番号６２）のほぼ残基２００〜３００または残基３００〜４００を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるものが含まれる。例えば、短縮化ＡｃｔＡは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ７，６５５，２３８に記載されているように、野生型ＡｃｔＡタンパク質の最初の３９０アミノ酸からなる。別の例として、短縮化ＡｃｔＡは、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＵＳ２０１４／０１８６３８７に記載されるように、ＰＥＳＴモチーフが欠失していて、非保存的ＱＤＮＫＲ（配列番号７３）置換を含有するＡｃｔＡ−Ｎ１００またはその修飾バージョン（ＡｃｔＡ−Ｎ１００＊と称される）であり得る。あるいは、短縮化ＡｃｔＡタンパク質は、上記のアミノ酸範囲または本明細書に開示されるＡｃｔＡペプチドのいずれかのアミノ酸範囲の１つに対応する相同ＡｃｔＡタンパク質の残基を含有し得る。残基数は、上記で挙げた残基数と正確に対応する必要はない（例えば、相同ＡｃｔＡタンパク質が、本明細書で利用するＡｃｔＡタンパク質に対して挿入または欠失を有する場合）。
【０１４９】
短縮化ＡｃｔＡタンパク質の例には、例えば、配列番号６３、６４、６５、もしくは６６に記載される配列、または配列番号６３、６４、６５、もしくは６６のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、バリアントの断片、アイソフォームの断片、もしくは類似体の断片を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質が含まれる。配列番号６３は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ１と称され、配列番号６２に記載される全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜１２２からなる。配列番号６４は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ２またはＬＡ２２９と称され、配列番号６２に記載される全長ＡｃｔＡ配列に記載される全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜２２９からなる。配列番号６５は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ３と称され、配列番号６２に記載される全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜３３２からなる。配列番号６６は、ＡｃｔＡ／ＰＥＳＴ４と称され、配列番号６２に記載される全長ＡｃｔＡ配列のアミノ酸３０〜３９９からなる。具体的な例として、配列番号６４に記載される配列からなる短縮化ＡｃｔＡタンパク質を使用することができる。
【０１５０】
短縮化ＡｃｔＡタンパク質の例には、例えば、配列番号６７、６９、７０、もしくは７２に記載される配列または配列番号６７、６９、７０、もしくは７２のホモログ、バリアント、アイソフォーム、類似体、バリアントの断片、アイソフォームの断片、または類似体の断片を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなるタンパク質が含まれる。具体的な例として、配列番号６７に記載される配列からなる短縮化ＡｃｔＡタンパク質（配列番号６８に記載される核酸によってコードされる）を使用することができる。別の具体的な例として、配列番号７０に記載される配列からなる短縮化ＡｃｔＡタンパク質（配列番号７１に記載される核酸によってコードされる）を使用することができる。配列番号７１は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ１０４０３Ｓ株においてＡｃｔＡをコードする最初の１１７０ヌクレオチドである。場合によっては、ＡｃｔＡ断片を、非相同シグナルペプチドに融合させることができる。例えば、配列番号７２は、Ｈｌｙシグナルペプチドに融合しているＡｃｔＡ断片を記載している。
【０１５１】
Ｃ．組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物の生成
本明細書に開示される組換え融合ポリペプチドをコードする免疫療法構築物またはそれを含む組成物を生成するための方法も本明細書で提供する。例えば、そのような方法は、免疫療法構築物に含める抗原ペプチドを選択および設計すること（ならびに、例えば、各抗原ペプチドのハイドロパシーを試験すること、および選択されたハイドロパシー指数の閾値を超えるスコアを示す場合、抗原ペプチドを修飾または除外すること）、選択された抗原ペプチドのそれぞれを含む１つ以上の融合ポリペプチドを設計すること、ならびに融合ポリペプチドをコードする核酸構築物を生成することを含み得る。
【０１５２】
抗原ペプチドを、疎水性または親水性についてスクリーニングすることができる。抗原ペプチドを、例えば、それらが親水性である場合、またはそれらが、目的の特定の細菌（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）における分泌可能性を予期させ得る特定のハイドロパシー閾値までの、またはそれ未満のスコアを示す場合、選択することができる。例えば、抗原ペプチドは、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数によって２１アミノ酸のウィンドウでスコアリングすることができ、カットオフ（約１．６）を超えるすべてのスコアリングは、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓによって分泌される可能性が低いため、排除する。例えば、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれるＫｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８２）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １５７（１）：１０５−１３２を参照のこと。あるいは、選択されたカットオフについてのスコアリングする抗原ペプチドを変化させることができる（例えば、抗原ペプチドの長さを変化させる）。使用することができる他のスライディングウィンドウサイズは、例えば、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７またはそれ以上のアミノ酸を含む。例えば、スライディングウィンドウサイズは、９〜１１アミノ酸、１１〜１３アミノ酸、１３〜１５アミノ酸、１５〜１７アミノ酸、１７〜１９アミノ酸、１９〜２１アミノ酸、２１〜２３アミノ酸、２３〜２５アミノ酸、または２５〜２７アミノ酸であり得る。使用することができる他のカットオフには、例えば、以下の範囲１．２〜１．４、１．４〜１．６、１．６〜１．８、１．８〜２．０、２．０〜２．２２．２〜２．５、２．５〜３．０、３．０〜３．５、３．５〜４．０、または４．０〜４．５が含まれるか、またはカットオフは、１．４、１．５、１．７、１．８、１．９、２．０、２．１、２．２、２．３、２．３、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、または４．５であり得る。カットオフは、例えば、融合ポリペプチドを送達するために使用される細菌の属または種に応じて異なり得る。
【０１５３】
他の適切なハイドロパシープロットまたは他の適切なスケールには、例えば、Ｒｏｓｅ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｍｏｌ  Ｓｔｒｕｃｔ  ２２：３８１−４１５、Ｂｉｓｗａｓ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ  Ａ  １０００：６３７−６５５、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８４）Ａｎｎ  Ｒｅｖ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ５３：５９５−６２３、Ａｂｒａｈａｍ  ａｎｄ  Ｌｅｏ（１９８７）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ，Ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ２：１３０−１５２、Ｓｗｅｅｔ  ａｎｄ  Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ（１９８３）Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７１：４７９−４８８、Ｂｕｌｌ  ａｎｄ  Ｂｒｅｅｓｅ（１９７４）Ａｒｃｈ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  １６１：６６５−６７０、Ｇｕｙ（１９８５）Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ｊ  ４７：６１−７０、Ｍｉｙａｚａｗａ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  １８：５３４−５５２、Ｒｏｓｅｍａｎ（１９８８）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２００：５１３−５２２、Ｗｏｌｆｅｎｄｅｎ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２０：８４９−８５５、Ｗｉｌｓｏｎ（１９８１）Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｊ  １９９：３１−４１、Ｃｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ（１９９０）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０、Ａｂｏｄｅｒｉｎ（１９７１）Ｉｎｔ  Ｊ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  ２：５３７−５４４、Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８４）Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  １７９：１２５−１４２、Ｈｏｐｐ  ａｎｄ  Ｗｏｏｄｓ（１９８１）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ７８：３８２４−３８２８、Ｍａｎａｖａｌａｎ  ａｎｄ  Ｐｏｎｎｕｓｗａｍｙ（１９７８）Ｎａｔｕｒｅ  ２７５：６７３−６７４、Ｂｌａｃｋ  ａｎｄ  Ｍｏｕｌｄ（１９９１）Ａｎａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ  １９３：７２−８２、Ｆａｕｃｈｅｒｅ  ａｎｄ  Ｐｌｉｓｋａ（１９８３）Ｅｕｒ  Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ  １８：３６９−３７５、Ｊａｎｉｎ（１９７９）Ｎａｔｕｒｅ  ２７７：４９１−４９２、Ｒａｏ  ａｎｄ  Ａｒｇｏｓ（１９８６）Ｂｉｏｃｈｉｍ  Ｂｉｏｐｈｙｓ  Ａｃｔａ  ８６９：１９７−２１４、Ｔａｎｆｏｒｄ（１９６２）Ａｍ  Ｃｈｅｍ  Ｓｏｃ  ８４：４２４０−４２７４、Ｗｅｌｌｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．（１９８５）ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ  １８８：２１５−２１８、Ｐａｒｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５：５４２５−５４３１、およびＣｏｗａｎ  ａｎｄ  Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ（１９９０）Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３：７５−８０に報告されているものが含まれ、これらのそれぞれは、すべての目的のためにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０１５４】
任意に、抗原ペプチドは、対象のヒト白血球抗原（ＨＬＡ）型に結合するそれらの能力についてスコアリングし（例えば、ｎｅｔＭＨＣｐａｎ、ＡＮＮ、ＳＭＭＰＭＢＥＣ．ＳＭＭ、ＣｏｍｂＬｉｂ＿Ｓｉｄｎｅｙ２００８、ＰｉｃｋＰｏｃｋｅｔ、およびｎｅｔＭＨＣｃｏｎｓを含む、ｗｗｗ．ｉｅｄｂ．ｏｒｇで利用可能な免疫エピトープデータベース（ＩＥＤ）を使用することによって）、各抗原ペプチドからの最良のＭＨＣ結合スコアによって順位付けすることができる。他の情報源には、ＴＥｐｒｅｄｉｃｔ（ｔｅｐｒｅｄｉｃｔ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔ／ｈｅｌｐ．ｈｔｍｌ）または他の利用可能なＭＨＣ結合測定スケールが含まれる。カットオフは、異なる発現ベクター、例えば、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａでは異なってもよい。
【０１５５】
任意に、抗原ペプチドを除外するか、または免疫抑制の影響を回避するために、抗原ペプチドを、免疫抑制エピトープ（例えば、Ｔ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導Ｔヘルパーエピトープなど）についてスクリーニングすることができる。
【０１５６】
任意に、抗原ペプチドをスクリーニングするために、エピトープの免疫原性についての予測アルゴリズムを使用することができる。しかしながら、これらのアルゴリズムは、どのペプチドがＴ細胞応答をもたらすかの予測において、最良でも２０％の正確性である。あるいは、スクリーニング／予測アルゴリズムを使用しない。あるいは、抗原ペプチドを、免疫原性についてスクリーニングすることができる。例えば、これは、１つ以上のＴ細胞を抗原ペプチドと接触させることと、免疫原性Ｔ細胞応答について分析することと、を含み得、免疫原性Ｔ細胞応答は、免疫原性ペプチドとしてペプチドを特定する。これはまた、１つ以上のＴ細胞をペプチドと接触させた場合の、ＣＤ２５、ＣＤ４４、またはＣＤ６９のうちの少なくとも１つの分泌を測定するか、またはＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１、およびＩＬ−２を含む群から選択されるサイトカインの分泌を測定するために免疫原性アッセイを使用することも含み得、分泌の増加は、ペプチドが１つ以上のＴ細胞エピトープを含むものとして特定する。
【０１５７】
選択された抗原ペプチドを、潜在的な融合ポリペプチドのための１つ以上の順序候補に配置することができる。単一プラスミドに収め得るよりも、より有効な抗原ペプチドが存在する場合、異なる抗原ペプチドに、必要／所望に応じて優先順位を割り当てることができるか、および／またはそれらを異なる融合ポリペプチドに分割することができる（例えば、異なる組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株に含ませるために）。優先順位を、相対サイズ、転写の優先、および／または翻訳されるポリペプチドの全体疎水性などの因子によって決定することができる。本明細書の他の箇所でより詳細に開示されるように、リンカーなしで直接一緒に、または任意の数の抗原ペプチド対の間にあるリンカーの任意の組み合わせで結合しているように、抗原ペプチドを配置することができる。変異負荷に対して必要とされる構築物の数、単一プラスミドからの多数のエピトープの翻訳および分泌の効率、ならびにプラスミドを含む各細菌またはＬｍに必要なＭＯＩの検討に基づき、含まれる線状抗原ペプチドの数を決定することができる。
【０１５８】
抗原ペプチドの組み合わせまたは全融合ポリペプチド（すなわち、抗原ペプチドおよびＰＥＳＴ含有ペプチドおよび任意のタグを含む）も、疎水性についてスコアリングすることができる。例えば、融合された抗原ペプチドの全体または全融合ポリペプチドを、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅハイドロパシー指数によってスライディング２１アミノ酸ウィンドウでハイドロパシーについてスコアリングすることができる。いずれかの領域がカットオフ（例えば、約１．６）を超えるスコアを示す場合、抗原ペプチドの許容される順序（すなわち、カットオフを超える領域がスコアを示す領域がないもの）が見出されるまで、抗原ペプチドを再整理するか、または融合ポリペプチド内でシャッフルすることができる。あるいは、いずれかの問題のある抗原ペプチドを除去するか、または異なるサイズに再設計することができる。あるいは、または加えて、本明細書の他の箇所で開示されるような抗原ペプチド間にある１つ以上のリンカーを、付加するか、または修飾して、疎水性を変えることができる。個々の抗原ペプチドのハイドロパシー試験の場合と同様に、他のウィンドウサイズを使用してもよいか、または他のカットオフを使用してもよい（例えば、融合ポリペプチドを送達するために使用される細菌の属または種に応じて）。加えて、他の適切なハイドロパシープロットまたは他の適切なスケールを使用してもよい。
【０１５９】
任意に、抗原ペプチドを除外するか、または免疫抑制の影響を回避するために、抗原ペプチドの組み合わせまたは全融合ポリペプチドを、免疫抑制エピトープ（例えば、Ｔ−ｒｅｇエピトープ、ＩＬ−１０誘導Ｔヘルパーエピトープなど）についてさらにスクリーニングすることができる。
【０１６０】
次いで、抗原ペプチドまたは融合ポリペプチドの候補の組み合わせをコードする核酸を、設計および最適化することができる。例えば、配列を、翻訳レベル、発現期間、分泌レベル、転写レベル、およびそれらの任意の組み合わせを増加させるために最適化することができる。例えば、増加は、対照の非最適化配列に対して２倍〜１０００倍、２倍〜５００倍、２倍〜１００倍、２倍〜５０倍、２倍〜２０倍、２倍〜１０倍、または３倍〜５倍であり得る。
【０１６１】
例えば、融合ポリペプチドまたは融合ポリペプチドをコードする核酸は、オリゴヌクレオチド配列で形成され得る二次構造のレベルを低下させるために最適化され得るか、あるいは配列を修飾し得る任意の酵素の結合を防ぐために最適化され得る。細菌細胞における発現は、例えば、転写サイレンシング、短いｍＲＮＡ半減期、二次構造形成、オリゴヌクレオチド結合分子、例えば、リプレッサーおよび阻害剤の結合部位、ならびにレアｔＲＮＡプールの利用可能性によって妨害され得る。細菌発現における多くの問題の原因は、元の配列内で見出される。ＲＮＡの最適化には、シス作用エレメントの修飾、そのＧＣ含有率の適合、細菌細胞の非限定的ｔＲＮＡプールに関するコドンバイアスの変更、および内部相同領域の回避を含み得る。したがって、配列を最適化することは、例えば、非常に高い（＞８０％）または非常に低い（＜３０％）ＧＣ含有率の領域を調節することを伴い得る。配列を最適化することはまた、例えば、次のシス作用配列モチーフのうちの１つ以上を回避することを伴い得る：内部ＴＡＴＡボックス、ｃｈｉ部位、およびリボソーム侵入部位；ＡＴリッチまたはＧＣリッチ配列区間；繰り返し配列およびＲＮＡ二次構造；（潜在）スプライスドナーおよびアクセプター部位；分岐点；またはそれらの組み合わせ。発現を最適化することはまた、配列要素を遺伝子の隣接領域に、および／またはプラスミド内の他の箇所に付加することを伴い得る。
【０１６２】
発現を最適化することはまた、例えば、コドン使用頻度を宿主遺伝子（例えば、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ遺伝子）のコドンバイアスに適合させることを伴い得る。例えば、下のコドンを、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓでは使用することができる。
【表３】
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【０１６３】
融合ポリペプチドをコードする核酸を生成し、送達ビヒクル、例えば、細菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に導入することができる。ワクシニアウイルスまたはウイルス様粒子などの他の送達ビヒクルは、ＤＮＡ免疫療法またはペプチド免疫療法に適し得る。融合ポリペプチドをコードするプラスミドを生成し、細菌株またはＬｉｓｔｅｒｉａ株に導入したら、細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を培養し、抗原ペプチドを含む融合ポリペプチドの発現および分泌を確認するために特徴付けることができる。
【０１６４】
Ｖ．キット
本明細書に開示される方法のうちのいずれかを行う際に利用される１つ以上の試薬を含むキット、または本明細書に開示される組成物、ツール、もしくは装置のうちのいずれかを含むキットも提供される。
【０１６５】
例えば、そのようなキットは、ＴＨＰ−１細胞、および任意に、ＴＨＰ−１細胞を分化させるための１つ以上の試薬または教材を含むことができる。そのようなキットはまた、本明細書に開示される組換え細菌またはＬｉｓｔｅｒｉａ株を含み得る。加えて、そのようなキットは、本明細書に開示される方法を実施するためのＴＨＰ−１細胞および／または組換え細菌もしくはＬｉｓｔｅｒｉａ株の使用を説明する教材をさらに含むことができる。モデルキットを以下に説明するが、他の有用なキットの内容は、本開示を考慮して明白であるであろう。
【０１６６】
上記または下記で引用されているすべての特許出願、ウェブサイト、他の刊行物、アクセッション番号などは、各項目が、参照により組み込まれることが具体的にかつ個別に示されたのと同じ程度に、すべての目的に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。配列の異なるバージョンが違う時間にアクセッション番号に関連付けられている場合、本出願の有効な出願日においてアクセッション番号に関連付けられるバージョンを意味する。有効な出願日とは、該当する場合、アクセッション番号に関する実際の出願日以前または優先出願の出願日を意味する。同様に、刊行物、ウェブサイトなどの異なるバージョンが違う時間に公開されている場合、別段の指定のない限り、本出願の有効な出願日の直近に公開されたバージョンを意味する。別段に他の指示がない限り、本発明の任意の特徴、ステップ、要素、実施形態、または態様を、任意の他のものと組み合わせて使用することができる。本発明は、明瞭さおよび理解の目的に対し図表および例を介していくつかの詳細が記載されているが、添付の特許請求の範囲内で、ある特定の変化および改変を実施することができることが明らかになろう。
【０１６７】
実施形態の列挙
本明細書に開示される主題には、以下の実施形態が含まれるが、これらに限定されない。
【０１６８】
１．試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の弱毒化または感染性を評価する方法であって、
（ａ）分化したＴＨＰ−１細胞を試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に感染させることであって、ＴＨＰ−１細胞が試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に感染する前にマクロファージに分化している、感染させることと、
（ｂ）ＴＨＰ−１細胞を溶解し、寒天上で溶解物を播種することと、
（ｃ）寒天上での成長によりＴＨＰ−１細胞内で増殖したＬｉｓｔｅｒｉａを計数することと、を含む、方法。
【０１６９】
２．ステップ（ａ）の前に、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）を使用して、ＴＨＰ−１細胞をマクロファージに分化させることをさらに含む、実施形態１に記載の方法。
【０１７０】
３．分化したＴＨＰ−１細胞を試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に感染させることは、分化したＴＨＰ−１細胞を試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株に接種することと、試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株を分化したＴＨＰ−１細胞で１〜５時間インキュベートして、感染したＴＨＰ１細胞を形成することと、を含む、実施形態１または２に記載の方法。
【０１７１】
４．ステップ（ａ）が、１：１の感染多重度（ＭＯＩ）で分化したＴＨＰ−１細胞を感染させることを含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の方法。
【０１７２】
５．ステップ（ａ）と（ｂ）の間で、ＴＨＰ−１細胞によって取り込まれなかったＬｉｓｔｅｒｉａを死滅させることをさらに含む、実施形態１〜４のいずれかに記載の方法。
【０１７３】
６．抗生物質を使用して、死滅が行われ、任意に、抗生物質がゲンタマイシンである、実施形態５に記載の方法。
【０１７４】
７．ステップ（ｂ）の前に、細胞外Ｌｉｓｔｅｒｉａが、感染したＴＨＰ−１細胞から除去される、実施形態１〜４のいずれか１つに記載の方法。
【０１７５】
８．細胞外Ｌｉｓｔｅｒｉａを除去することが、Ｌｉｓｔｅｒｉａに対して有効な抗生物質を添加することを含み、任意に、抗生物質がゲンタマイシンである、実施形態７に記載の方法。
【０１７６】
９．感染したＴＨＰ−１細胞が、細胞外Ｌｉｓｔｅｒｉａを除去した後かつステップ（ｂ）の前に、成長培地中で０〜１０時間インキュベートされる、実施形態７または８に記載の方法。
【０１７７】
１０．ステップ（ｂ）が、感染後０時間で行われる、実施形態１〜９のいずれかに記載の方法。
【０１７８】
１１．ステップ（ｂ）が、感染後０時間、感染後１時間、感染後３時間、および／または感染後５時間で行われる、実施形態１〜１０のいずれかに記載の方法。
【０１７９】
１２．寒天が、Ｌｉｓｔｅｒｉａの成長を支持することができる培地を含有する、実施形態１〜１１のいずれかに記載の方法。
【０１８０】
１３．試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株の取り込みおよび細胞内成長を野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ株および／または参照試料と比較することをさらに含む、実施形態１〜１２のいずれかに記載の方法。
【０１８１】
１４．試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、実施形態１〜１３のいずれかに記載の方法。
【０１８２】
１５．試験Ｌｉｓｔｅｒｉａ株が、融合ポリペプチドをコードする第１のオープンリーディングフレームを含む核酸を含む組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株であり、当該融合ポリペプチドが、疾患関連抗原ペプチドに融合したＰＥＳＴ含有ペプチドを含む、実施形態１〜１４のいずれかに記載の方法。
【０１８３】
１６．ＰＥＳＴ含有ペプチドが、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）またはその断片であり、疾患関連抗原ペプチドが、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質Ｅ７またはその断片である、実施形態１５に記載の方法。
【０１８４】
１７．組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ｐｒｆＡの欠失または不活性化変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、核酸が、エピソームプラスミドにあり、Ｄ１３３Ｖ  ＰｒｆＡ変異タンパク質をコードする第２のオープンリーディングフレームを含む、実施形態１５または１６に記載の方法。
【０１８５】
１８．組換えＬｉｓｔｅｒｉａ株が、ａｃｔＡ、ｄａｌ、およびｄａｔの欠失または不活性化変異を含む弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株であり、核酸が、エピソームプラスミドにあり、アラニンラセマーゼ酵素またはＤ−アミノ酸アミノトランスフェラーゼ酵素をコードする第２のオープンリーディングフレームを含み、ＰＥＳＴ含有ペプチドが、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）のＮ末端断片である、実施形態１５に記載の方法。
【０１８６】
１９．試験細菌株の弱毒化または感染性を評価する方法であって、
（ａ）ＴＨＰ−１細胞を分化することと、
（ｂ）分化したＴＨＰ−１細胞を試験細菌株に感染させることであって、感染が、
（ｉ）分化したＴＨＰ−１細胞を試験細菌株に接種することと、
（ｉｉ）試験細菌株を分化したＴＨＰ−１細胞で１〜５時間インキュベートして、感染したＴＨＰ１細胞を形成することと、
（ｉｉｉ）感染したＴＨＰ−１細胞から細胞外細菌を除去することと、
（ｉｖ）感染したＴＨＰ−１細胞を成長培地中で０〜１０時間インキュベートすることと、を含む、感染させることと、
（ｃ）感染したＴＨＰ−１細胞を溶解して、溶解物を形成することと、
（ｄ）溶解物または溶解物の希釈物を、細菌の成長を支持することができる培地を含むプレート上で藩種することと、
（ｅ）プレート上の細菌のコロニー形成単位を計数することと、を含む、方法。
【０１８７】
２０．分化したＴＨＰ−１細胞を感染させるステップが、１：１の感染多重度（ＭＯＩ）である、実施形態１９に記載の方法。
【０１８８】
２１．細胞外細菌を除去するステップが、細菌に対して有効な抗生物質を添加することを含み、任意に、抗生物質がゲンタマイシンである、実施形態１９または２０に記載の方法。
【０１８９】
２２．感染したＴＨＰ−１細胞が、成長培地中で０、１、３、または５時間インキュベートされる、実施形態１９〜２１のいずれか１つの方法。
【０１９０】
２３．試験細菌株がＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ株である、実施形態１９〜２２のいずれか１つの方法。
【０１９１】
配列の簡単な説明
添付の配列表に列記されているヌクレオチドおよびアミノ酸配列は、ヌクレオチド塩基のための標準的な文字略語、およびアミノ酸のための三文字表記を使用して示されている。ヌクレオチド配列は、配列の５’末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進み３’末端に至る標準規則に従っている。各ヌクレオチド配列の１本の鎖のみが示されているが、相補鎖は、示されている鎖を任意に参照することによって含まれると理解される。アミノ酸配列は、配列のアミノ末端から始まって先へ（すなわち、各行で左から右へ）進みカルボキシ末端に至る標準規則に従っている。
【表４−１】
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【表４−２】
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【表４−３】
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【実施例】
【０１９２】
実施例１．Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの細胞内成長を定量化するためのＴＨＰ−１に基づくアッセイ
この実施例は、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓおよび弱毒化された組換えＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの感染率および／または細胞内成長を定量化するための方法を提供する。分化したＴＨＰ−１細胞を使用する細胞に基づくアッセイは、Ｌｉｓｔｅｒｉａに基づく免疫療法の細胞内成長を分析するために使用され、ブレインハートインフュージョン寒天上での成長による感染後の細菌を定量化する。いくつかの実施形態では、記載された手順は、ＡＤＸＳ１１−００１または他のＬｉｓｔｅｒｉａ株のサンプルに適用される。
【０１９３】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ヒトにおけるリステリア症の原因となるグラム陽性で芽胞を形成しない細菌である。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ヒトマクロファージ内のファゴソームからの脱出によってインビボで生存する。脱出すると、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、その宿主のサイトゾル内で細胞内に複製することができる。免疫療法株Ｌｍ−ＬＬＯＥ７（例えば、弱毒化生株であるＡＤＸＳ１１−００１  Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ）は、目的の組換えタンパク質（すなわち、短縮化リステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）に融合したヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７）の発現のためのプラスミドを含有する。Ｌｍ−ＬＬＯＥ７免疫療法で使用される細菌株は、必須の病原性遺伝子ｐｒｆＡを欠いている変異株ＸＦＬ−７である。ｐｒｆＡ遺伝子は、ａｃｔＡおよびｈｌｙ（ＬＬＯをコードする遺伝子）などのすべての病原性遺伝子を含む多くの遺伝子に作用する転写因子であるが、Ｌｉｓｔｅｒｉａのインビトロ培養に必要である。ＸＦＬ−７は、非病原性であり、マクロファージにより取り込まれ得るが、ファゴソームから脱出して、マクロファージのサイトゾルで増殖することはできない。Ｌｍ−ＬＬＯＥ７の弱毒化を評価するために、感染および複製は、野生型Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓと並行して、マクロファージ細胞感染アッセイで評価される。
【０１９４】
組換えタンパク質は、ｈｌｙプロモーターの制御下にある不活性ＬＬＯおよびＨＰＶ  Ｅ７コード配列の融合を含むプラスミドｐＧＧ５５から発現され、ｐｒｆＡのプラスミドのコピーの発現も駆動する。これらの遺伝子は、グラム陽性菌／グラム陰性細菌シャトルプラスミドｐＡＭ４０１に導入され、遺伝子操作はグラム陽性細菌では容易に実行することができないため、Ｅ．ｃｏｉｌでもＬｉｓｔｅｒｉａでも増幅され得る。したがって、プラスミド遺伝子には、グラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の複製因子、ならびにグラム陽性細菌およびグラム陰性細菌の抗生物質選択マーカー（クロラムフェニコール）が含まれる。プラスミドは、クロラムフェニコールに対する耐性を付与し、クロラムフェニコールの存在下での培養によりインビトロで維持される。インビボでは、ＸＦＬ−７で不活性化された病原性因子ＰｒｆＡのトランス相補性によってプラスミドが保持される。
【０１９５】
Ｌｉｓｔｅｒｉａに基づく免疫療法の細胞内成長を分析するために、分化したＴＨＰ−１細胞を使用する細胞に基づくアッセイが、本明細書に記載される。ＴＨＰ−１細胞は、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で刺激することによって、マクロファージに分化させることができるヒト単球細胞である。細菌は、ＴＨＰ−１細胞を溶解し、ブレインハートインフュージョン寒天上に細菌希釈液を播種することによって、特定の時点での感染前および感染後に定量化される。コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、マクロファージの細胞内環境で生存している生菌を表す。
【０１９６】
ＡＤＸＳ１１−０００１を使用した例示的な手順を、以下に説明する。しかしながら、これらの手順および他の実施例で説明されている手順は、いかなるＬｉｓｔｅｒｉａ株も使用することができる。サンプル（複数可）および参照標準は、感染前に、解凍、ペレット化、再懸濁され、標的細胞数に希釈される。
【表５】
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【表６】
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【０１９７】
化学薬品／試薬
このアッセイで使用する前に、ＢＨＩプレートを目視検査して、巨視的なコンタミネーションがないこと、および寒天が広がっていることを確認することができる。プレートは、野生型１０４０３ＳおよびＡＤＸＳ１１−００１でストリーキングし、３７℃で２４時間インキュベートすることによって、成長の適合性を確認することができる。コロニーは、野生型およびＡＤＸＳ１１−００１の両方で可視的であり得る。
【表７】
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【０１９８】
試薬の調製すべての試薬の調製は、必要とされる必要量を満たすように調整することができる。
完全なＲＰＭＩ（ｃ−ＲＰＭＩ）
１．４４５ｍＬのＲＰＭＩに、（１）５０ｍＬのＦＢＳ−照射済み、（２）５ｍＬのＬ−グルタミン（２００ｍＭ）を添加する。
２．ラベルを貼って、５±３℃で保存する。有効期限は、調製日から１カ月である。
１．６ｍＭのＰＭＡ（ホルボール−１２−ミリステート１３−アセテート）
１．最終濃度が１．６ｍＭのＰＭＡになるように、１ｍＬのＤＭＳＯに１ｍｇのＰＭＡを再構成する。
２．枯渇するまでマイクロ遠心チューブに１０μＬを分注する。
３．ラベルを貼って、−２０±１０℃で保存する。有効期限は、調製日から６カ月である。
２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール
１．最終濃度が２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールになるように、２０ｍＬの１００％エタノールに０．５ｇのクロラムフェニコールを再構成する。
２．ラベルを貼って、−２０±１０℃で保存する。有効期限は、調製日から１カ月である。
１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン
１．最終濃度が１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンになるように、４０ｍＬの滅菌水に４ｇのストレプトマイシンを再構成する。０．２ミクロンフィルターを使用して滅菌する。枯渇するまで１．５ｍＬのチューブに１ｍＬを分注する。
２．ラベルを貼って、−２０±１０℃で保存する。有効期限は、調製日から１カ月である。
ブレインハートインフュージョン寒天＋２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール
１．開始する前に、ＢＨＩプレートに製造上の欠陥（コンタミネーション、プレートの破損、不均一な寒天など）がないことを確認する。
２．１８０μＬの滅菌ＰＢＳおよび２０μＬのクロラムフェニコール（２５ｍｇ／ｍＬ）を、ブレインハートインフュージョン寒天プレートに加え、滅菌スプレッダーを使用してプレートの表面全体を覆うように広げる。すべての液体が寒天プレートによって吸収されるまで広げる。
３．１つを超えるプレートを調製する場合、クロラムフェニコールの作業材料を調製することができ（ＰＢＳの場合は１８０μＬ×プレート数、クロラムフェニコールの場合は２０μＬ×プレート数）、各プレートに２００μＬを加え、滅菌スプレッダーを使用して広げる。
４．ＢＨＩ＋２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールプレートの有効期限は、製造業者によるプレートの有効期限、またはクロラムフェニコール材料の有効期限のいずれか早い方になる。
ブレインハートインフュージョン寒天＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン
１．開始する前に、ＢＨＩプレートに製造上の欠陥（コンタミネーション、プレートの破損、不均一な寒天など）がないことを確認する。
２．１８０μＬの滅菌ＰＢＳおよび２０μＬのストレプトマイシン（１００ｍｇ／ｍＬ）を、ブレインハートインフュージョン寒天プレートに加え、滅菌スプレッダーを使用してプレートの表面全体を覆うように広げる。すべての液体が寒天プレートによって吸収されるまで広げる。
３．１つを超えるプレートを調製する場合、ストレプトマイシンの作業材料を調製することができ（ＰＢＳの場合は１８０μＬ×プレート数、ストレプトマイシンの場合は２０μＬ×プレート数）、各プレートに２００μＬを加え、滅菌スプレッダーを使用して広げる。
４．ＢＨＩ＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンプレートの有効期限は、製造業者によるプレートの有効期限、またはストレプトマイシン材料の有効期限のいずれか早い方になる。
【０１９９】
対照
陰性／滅菌対照
１．未接種：各３枚のプレート、ＢＨＩ寒天＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよびＢＨＩ寒天＋２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール。
２．接種：各３枚のプレート、ＢＨＩ寒天＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシンおよびＢＨＩ寒天＋２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール、それぞれ１００μＬのＰＢＳを接種
陽性対照
１．野生型：ＢＨＩ寒天＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン上でＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＰＨＥ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ  １０４０３Ｓ）でストリークされた２つのプレート。
２．ＡＤＸＳ１１−００１：ＡＤＸＳ１１−００１参照標準でストリークされた２つのプレートは、ＢＨＩ寒天＋２５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコール上で陽性対照として機能する
【０２００】
ＴＨＰ−１細胞の調製
１．手順ステップ３の必要に応じて、ＴＨＰ−１細胞の十分なバイアルを解凍する。
２．解凍後少なくとも２回の副次継代。いくつかの実施形態では、ＴＨＰ−１細胞は、継代数３２未満である。
３．すでに培養中のＴＨＰ−１細胞は、適切な細胞培養の参照を用いたアッセイに使用することができる。
４．ｃ−ＲＰＭＩ中に１．０×１０６細胞／ｍＬの濃度で４０ｍＬの細胞を調製する。細胞計数を決定する。
５．２４ウェルプレートの２つの各ウェルに、１ｍＬの細胞懸濁液を添加する（一例については、別表２の表９のプレートマップを参照）。ウェルに「ＰＭＡなし」のラベルを貼る。残りの細胞懸濁液（約３４ｍＬ）に、１６μＭのＰＭＡ（３４μＬ）を加え、最終濃度が約１６ｎＭのＰＭＡになる。よく混ぜる。
６．ウェルあたり１ｍＬを、合計１０ウェルに分配する（例えば、別表２の表９のプレートマップを参照）。
７．３６±１℃、５±１％ＣＯ２で一晩（１６〜２０時間）インキュベートする。
【０２０１】
感染。以下のステップ１〜１３は、陽性対照の野生型細菌に対して実行され、参照標準およびサンプルの細菌に対して繰り返す。
１．必要に応じて、陽性対照の野生型Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓまたは参照標準またはサンプルＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの１つのバイアルを取得する。
２．バイアルを完全に解凍するために、３６±２℃で１分間インキュベートした後、室温で５分間までインキュベートする。
３．総体積を、それぞれラベル付けされた１．５ｍＬの遠心チューブにシリンジおよび針で移す。
４．１．０ｍＬを、それぞれラベル付けされた１．５ｍＬの遠心チューブに移す。残留物を廃棄する。
５．マイクロ遠心分離機を２分間使用して、１．０ｍＬの細胞を１６，１００×ｇでペレット化する。上清を廃棄し、１．０ｍＬの室温のｃ−ＲＰＭＩで細胞を再懸濁する。ｃ−ＲＰＭＩを使用して、最終濃度が１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬになるように細菌の希釈液を調製する。この濃度での最終容量は、約１５ｍＬである。
６．ＴＨＰ−１細胞を含む２４ウェルプレートを得る。ウェルに、必要に応じて、野生型としてまたはサンプル番号を有するラベルを貼る。
７．顕微鏡下で細胞を観察し、ＰＭＡで処理した細胞と未処理の細胞の違いを確認する。未処理の細胞は、軽く振ると流動性を示す。処理した細胞は、軽く振ると付着したままになる。
８．ピペットを使用して、ＰＭＡ処理細胞を含むすべてのウェルから培地を吸引する（真空補助装置を使用することができる）。
９．１．０ｍＬの調製した細菌（ステップ６；１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ）を、プレートのウェルに移す。
１０．顕微鏡でプレートを観察し、ＴＨＰ−１細胞がまだウェルの表面に付着していることを確認する。
１１．プレートを、３６±２℃、５±１％ＣＯ２でインキュベートする。インキュベーション開始時間を記録する。プレートを、次の操作の前に２時間インキュベートする。
１２．細菌の１×１０６ＣＦＵ／ｍＬ希釈液の生存率テストを実行する（ｐ−２と示される）。別表１に概説されている手順を利用する。別表１で概説されている希釈スキームを利用する。別表１に概説されている陽性および陰性対照を調製する。
１３．試験Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓサンプル（ＡＤＸＳ１１−００１など）を使用して、ステップ１〜１２を繰り返す。
【０２０２】
感染停止。次のステップ１〜１０は、最初に陽性対照の野生型細菌に対して実行され、サンプルの細菌に対して繰り返す。
１．２０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含むｃ−ＲＰＭＩを調製する。
２．２時間後、野生型またはサンプルを含むプレートを、３６±２℃、５±１％ＣＯ２のインキュベーション条件から除去する。
３．ピペットを使用して、各ウェルからＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含有する培地を除去する（真空補助装置を使用することができる）。
４．２０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する調製したｃ−ＲＰＭＩをウェルあたり１ｍＬを慎重に分注し、破壊を避けるためにウェルの側面にゆっくりと加える。
５．プレートを４２〜４５分間のインキュベーション条件（３６±２℃、５±１％ＣＯ２）に戻す。
６．プレートをインキュベーション条件から除去する。
７．ピペットを使用して、各ウェルから２０μｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するｃ−ＲＰＭＩを除去する（真空補助装置を使用することができる）。
８．ウェルごとにゲンタマイシンを含まない１ｍＬのｃ−ＲＰＭＩを添加し、破壊を避けるようにウェルの側面に対してゆっくりと添加することによって、細胞を慎重に洗浄する。
９．ピペットを使用して、各ウェルからｃ−ＲＰＭＩを除去する（真空補助装置を使用することができる）。
１０．（ゲンタマイシンを含まない）１ｍＬのｃ−ＲＰＭＩを、破壊を避けるようにウェルの側面に対してゆっくりと添加することによって、各ウェルに慎重に分注し、プレートを３６±２℃、５±１％ＣＯ２で５〜１５分間のインキュベーション条件に戻す。
１１．参照標準を含むプレートを使用して、ステップ１〜１０を繰り返し、サンプル（例えば、ＡＤＸＳ１１−００１）を含むプレートを使用して、繰り返す。
【０２０３】
細胞内Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ成長の検出のための収集手順
１．プレートをインキュベーション条件から除去し、時間を記録する。最初の時点は、ｐ０である。その後の時点は、ｐ３（３時間）および任意にｐ５（５時間）で得られる。
２．ウェルを顕微鏡下で観察する。各ウェル中のＰＭＡ処理ＴＨＰ−１細胞の層が一貫し、前の吸引ステップおよび分注ステップで細胞が最小限からまったく除去されていないことを確認する。任意のウェルにＴＨＰ−１細胞の有意な消失があることが観察された場合、ウェルに「Ｘ」で印を付け、それを使用しないようにする。
３．時点「ｐ０」の収集に使用するために、ウェルを１つ選択する。
４．ピペットを用いて吸引することによって、選択したウェルからｃ−ＲＰＭＩを除去する（真空補助装置を使用することができる）。
５．ウェルに１ｍＬの滅菌水を分注し、マイクロピペットを使用して、上下にピペッティングすることによって、ウェルの表面からＴＨＰ−１細胞を取り除く。
６．内容物全体を１．５ｍＬの遠心チューブに移す。
７．細胞が正常に除去されたことを確認するために、ウェルを顕微鏡下で観察する。ＴＨＰ−１細胞のかなりの部分が残っている場合、１．５ｍＬのチューブにあらかじめ移した滅菌水の一部を利用して、上下にピペッティングすることによって、細胞を取り除く。内容物を１．５ｍＬのチューブに戻し、ＴＨＰ−１細胞が除去されたことを、顕微鏡を介して確認する。
８．次の時点の収集の準備ができるまで、プレートをインキュベーション条件（３６±２℃、５±１％ＣＯ２）に戻す。
９．チューブを少なくとも１分間ボルテックスする。
１０．生存率試験を実行する。別表１に概説されている手順を利用する。別表１の表８で概説されている希釈スキームを利用する。
１１．参照標準を含むプレートを使用して、ステップ１〜１０を繰り返し、サンプル（例えば、ＡＤＸＳ１１−００１）を含むプレートを使用して、繰り返す。
【０２０４】
計算
１．野生型に対するサンプルの比率としての取り込み（ｐ−２／ｐ０）。
２．野生型に対するサンプルの比率としての細胞内成長（ｐ３／ｐ０）。
【０２０５】
別表１−生存率試験の手順
１．生存率試験を開始する前に、すべての寒天プレートが十分に乾燥していることを確認する。
２．以下の陰性対照を調製する：（１）適切な寒天タイプの３つの非接種プレート、および（２）１００μＬのＰＢＳを接種し、滅菌スプレッダーで広げた適切な寒天タイプの３つのプレート。
３．最大速度で６０秒間、ＴＨＰ−１細胞の１．０ｍＬのアリコートをボルテックスする。代わりに、ｐ−２時点の生存率は、ＰＢＳで調製した１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬの希釈液を利用する。
４．連続希釈は、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの細胞型（野生型またはサンプル）および試験した時点に基づいて調製される。表８を参照のこと。連続希釈は、１００μＬのボルテックスした１．０ｍＬのアリコートを、９００μＬのＰＢＳに移すことによって調製した。このプロセスは、必要とされるすべての希釈が得られるまで繰り返す。
５．各希釈液の接種材料は、滅菌スプレッダーを用いて適切な寒天タイプに３重に広げる。
６．以下の陽性対照を調製する。適切な陽性対照を、適切な寒天上に、１０μＬの接種ループを用いて２重接種する。
７．各プレートは、液体を吸収し、蓋をして少なくとも１５分間乾燥させてから、裏返し、３５〜３８℃のインキュベーターに入れる。
８．１６〜２４時間後、プレートをインキュベーション条件から除去する。各時点でのすべてのＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞種（野生型およびサンプル）が同じ期間インキュベートされることを確認する。
９．コロニー形成単位（ＣＦＵ）の総数は、手動で計数され、各希釈液の各プレートについて記録する。
【表８】
2021516972.tif 000012
【０２０６】
別表２−２４ウェルプレートの調製。２４ウェルプレートの調製を以下に示す。Ｌｍ野生型に対してこのプレート設定を行い、参照標準およびサンプル（例えば、ＡＤＸＳ１１−００１）について繰り返す。プレートウェル設定は、播種時に計数されたＴＨＰ−１細胞の数および試験される時点に基づいて調整することができる。
【表９】
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【０２０７】
実施例２．Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの細胞内成長を定量化するためのＴＨＰ−１に基づくアッセイの検証。
この適格性研究は、実施例１に記載される方法が、野生型Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（Ｌｍ）と比較したＡＤＸＳ１１−００１製剤の弱毒化を定量化するために使用され得ることを実証するために行われた。この方法では、ヒトＴＨＰ−１細胞を利用し、ＴＨＰ−１細胞におけるＡＤＸＳ１１−００１製剤または野生型Ｌｍの取り込みおよび細胞内成長を評価した。この実施例は、適格性実験から生成されたデータを要約する。
【表１０】
2021516972.tif 000014
【０２０８】
Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、抗原提示細胞（ＡＰＣ）で独特のライフサイクルを示す、グラム陽性で芽胞を形成しない細菌である。ＡＰＣファゴソームによるＬｍの最初の取り込み後、サイトリシン、リステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）の発現がトリガーされ、ファゴソームからのＬｍの脱出を媒介する。脱出すると、Ｌｍは、その宿主のサイトゾル内で細胞内で複製することができる。細胞に基づくアッセイは、分化したＴＨＰ−１細胞を使用して、Ｌｉｓｔｅｒｉａに基づくワクチンの取り込みおよび細胞内成長を分析するために使用された。ＴＨＰ−１細胞は、単球として培養物中に維持されるが、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で刺激することによって、マクロファージに容易に分化させることができるヒト単球細胞である。細菌は、ＴＨＰ−１細胞を溶解し、ブレインハートインフュージョン寒天に細菌希釈液を播種することによって、特定の時点での感染前および感染後に定量化される。コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、マクロファージの細胞内環境で生存している生存可能なＬｍを表す。
【０２０９】
株ＡＤＸＳ１１−００１は、目的のタンパク質（すなわち、短縮化リステリオリシンＯ（ｔＬＬＯ）に融合したヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ７）の発現のためのプラスミドを含有する。ＴＨＰ−１感染アッセイを使用して、野生型親株１０４０３Ｓに関してＡＤＸＳ１１−００１の弱毒化を実証した。このアッセイでは、ＴＨＰ１細胞を、１：１の感染の多重度で１０４０３ＳまたはＡＤＸＳ１１−００１に感染させ、感染後１時間、３時間、および５時間などの異なる時点で細菌ＣＦＵのインビトロ成長を分析した。弱毒化の結果として、１０４０３Ｓと比較して、ＡＤＸＳ１１−００１の取り込みおよび細胞内成長の大幅な減少が観察された。
【０２１０】
対照の調製。野生型Ｌｍ  １０４０３ＳおよびＡＤＸＳ１１−００１  ＤＰを、実施例１に記載のように調製した。簡単に言えば、サンプルを、３６±２℃で解凍し、遠心分離し、完全なＲＰＭＩを使用して、濃度を１．０×１０６細胞／ｍＬに調整した。
【０２１１】
ＴＨＰ−１細胞の調製。ＴＨＰ−１細胞バンク、継代数Ｐ３３を、１×１０６生存細胞／ｍＬの密度で凍結した。ＴＨＰ−１細胞、Ｐ３３を、実施例１に記載のように調製した。簡単に言うと、ＴＨＰ−１細胞は、１６ｎＭのＰＭＡを含む完全なＲＰＭＩの２４ウェルプレートに、１．０×１０６細胞／ｍＬ／ウェルの濃度で藩種した。
【０２１２】
サンプルの調製。実施例１と同様に、ＰＭＡ分化したＴＨＰ−１細胞を、野生型Ｌｍ  １０４０３ＳおよびＡＤＸＳ１１−００１  ＤＰに感染させた。細菌コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、ＴＨＰ−１細胞を溶解し、寒天プレート上に細菌希釈液を藩種することによって、特定の時点での感染前および感染後に定量化した。
【０２１３】
結果。結果は、３つの独立した実験から生成された。各希釈液から生成されたＣＦＵ、ならびに対照およびサンプルからの各時点を分析して、必要とされるすべての計算を取得し、適格性パラメーターを評価した。平均、標準偏差、変動係数、および生データ出力の計算は、アッセイ間およびアッセイ内の精度について決定され、特異性は、各実行について評価した。
【０２１４】
計数された細胞数として表される生存率は、このアッセイの生データ出力として機能する。生存率の決定には、以下の基準を使用した。アッセイからのデータは、陰性対照（非接種およびＰＢＳ接種プレート）がコロニーの成長を示さなかった場合にのみ許容できると見なされた。４０未満のコロニー形成単位（ＣＦＵ）は、数が少なすぎる（ＴＦＴＣ）と見なされ、６００超のＣＦＵは、数が多すぎる（ＴＮＴＣ）と見なされた。これらの制限内の値のみが定量化された。
【０２１５】
精度（アッセイ内の再現性）
複製対照およびサンプルの値の相対標準偏差（ＲＳＤ）の割合（％）は、アッセイ内の精度で計算された。各時点での３つのアッセイのそれぞれにおける３重のウェルのＲＳＤ（％）は、野生型では１１％〜２０％、ＡＤＸＳ１１−００１参照標準サンプルでは９％〜２１％の範囲であった。野生型およびＡＤＸＳ１１−００１参照標準の両方のすべての時点でＲＳＤ（％）によって測定されたアッセイ内の最大変動は、２１％であり、ｐ１時点で観察された。しかしながら、ｐ１値は、報告可能な結果の計算には使用されなかった。アッセイ内歳差は、ＲＳＤが２１％のアッセイの報告可能な値を計算する際に範囲内であると予想される。
【０２１６】
アッセイの報告可能な値を計算する際に使用される、ｐ０の値は、野生型では２０％の最大ＲＳＤ、参照標準では９％の最大ＲＳＤであった。細胞内成長出力、ｐ３およびｐ５は、それぞれ、野生型では最大１１％および１７％の最大ＲＳＤ％、ＡＤＸＳ１１−００１参照標準では１０％および１９％の最大ＲＳＤ％を示した。ｐ３値は、ｐ５値よりも高いアッセイ間の精度を示した。アッセイ内の精度のＲＳＤ値を表１１で要約する。加えて、時間対生存細胞数（ＶＣＣ）としてプロットされた図１の曲線に示されるような成長速度は、すべての曲線が同じ一般的な形状および傾向を示すため、ウェル間に見かけ上の差を示さなかった。
【表１１】
2021516972.tif 000015
【０２１７】
中間精度。
２人の分析者が複数日にわたって実施した３つの独立したアッセイで得られた値を使用して、中間精度を評価した。３つのＴＨＰ−１細胞の継代数ならびに感染および滴定を利用した３つのアッセイを行った。各独立したアッセイの調製からの感染後の各時点でのサンプルの３つの複製測定の平均間の一致を含む変動係数として表される個々の試験結果間の一致の程度を評価した。評価には、各独立したアッセイの調製からの感染後の各時点での野生型対照の３つの複製測定の平均間の一致も含まれた。
【０２１８】
（Ａ）生データ、各時点でのＶＣＣ。各時点で希釈に対して正規化されたＶＣＣ値は、３つのアッセイすべてについて計算した。野生型で観察された最高のＲＳＤ％は、４７％であり、ＡＤＸＳ１１−００１参照標準では２３％であった。結果を表１２で要約する。報告可能な結果の場合、これらの値はさらに比率に変換されるため、生データのＲＳＤ％は、それほど重要ではないことに注意しなければならない。
【０２１９】
加えて、時間対生存細胞数（ＶＣＣ）としてプロットされた図２の曲線に示されるような成長速度は、すべての曲線が同じ一般的な形状および傾向を示すため、アッセイ間に見かけ上の差を示さなかった。
【０２２０】
【表１２】
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【０２２１】
（Ｂ）アッセイ比（報告可能な値）。各実験について、報告可能な値は、以下のように計算した。
【数１】
2021516972.tif 000017
【０２２２】
３つすべてのアッセイにおいて、比は、サンプルの取り込みでは１０を超え、細胞内成長では２を超えた。報告された比の値である、サンプルの取り込みにおける３つすべてのアッセイ間の最大のＲＳＤ％は３９％であり、細胞内成長では最大２９％であった。結果を表１３に示す。加えて、時間対生存細胞数（ＶＣＣ）としてプロットされた図１の曲線に示されるような成長速度は、すべての曲線が同じ一般的な形状および傾向を示すため、アッセイ間に見かけ上の差を示さなかった。
【表１３】
2021516972.tif 000018
【０２２３】
（Ｃ）分析者。アッセイ３および４のアッセイの感染部分は、アッセイ５において、分析者１および分析者２によって行われた。アッセイ３および４のアッセイの滴定部分は、アッセイ５において、分析者２および分析者１によって行われた。データは、分析者間で野生型の生データ値に違いの可能性があり得ることを示唆しており、これは、ｐ−２／ｐ０比に反映される。報告可能な値、ｐ３／ｐ０およびｐ５／ｐ０は、分析者の影響を示さない。分析者に依存しないアッセイ比は、取り込みでは１２以上であり、細胞内成長では３以上であり、これは、野生型株とＡＤＸＳ１１−００１参照標準またはサンプルを区別するのに十分な倍数差である。表１３を参照のこと。
【０２２４】
（Ｄ）日。異なる日に実施されたアッセイの報告可能な値については、有意な影響は観察されなかった。アッセイの滴定および感染部分が同じ分析者によって実施されたアッセイ３およびアッセイ４の報告可能な値は、取り込み（ｐ−２／ｐ０）では３ユニット以内、細胞内成長では２ユニット以内であった。すべての値は、取り込みでは１２以上であり、細胞内成長では２以上であり、これは、野生型株とＡＤＸＳ１１−００１参照標準およびサンプルを区別するのに十分な有意な倍数差である。表１３を参照のこと。
【０２２５】
（Ｅ）ＴＨＰ−１細胞の継代数。細胞の継代数は、アッセイの報告可能な値に有意な影響を示さなかった。この適格では、ＴＨＰ１細胞継代Ｐ３２、Ｐ３７、およびＰ３９を使用した。各継代数は、取り込みでは１２以上であり、細胞内成長では２を超える報告可能な値を与え、これは、野生型株とＡＤＸＳ１１−００１参照標準およびサンプルを区別するのに十分な有意な倍数差であった。表１３を参照のこと。
【０２２６】
特異性
ＴＨＰ−１マトリックスの未接種およびＰＢＳ接種したブランクサンプルを干渉および選択性について試験した。これは、各アッセイに含まれており、すべてのアッセイでブランクでの成長（ＣＦＵ）は観察されなかった。これらの陰性対照はまた、偽陰性または偽陽性の結果がないことを示すコンタミネーションがないことも示す。
【０２２７】
サンプルおよび野生型対照の両方で溶解したＴＨＰ−１マトリックスから検出可能なＣＦＵが、各アッセイで生成された。参照標準サンプル（ＡＤＸＳ１１−００１）および対照（野生型）の同じＴＨＰ−１マトリックスの存在下で、各アッセイからＣＦＵが検出されたため、許容できる特異性が示された。
【０２２８】
加えて、細胞内成長は、組換えＬｍワクチン株が細胞に侵入して増殖し、それ故に、選択性を支持することができることを示す指標である。細胞内成長は、野生型株とＡＤＸＳ１１−００１参照標準およびサンプルとの間の倍数差を示すのに十分な３つのアッセイのそれぞれについて観察され、計算された。
【０２２９】
結果。実施例１に記載されるプロトコルは、ＡＤＸＳ１１−００１についての分化したＴＨＰ−１細胞におけるＬｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ感染および複製の分析に適している。この方法は、野生型とＡＤＸＳ１１−００１の間の取り込みおよび細胞内成長の倍数差を検出するという点で、特異的であることが実証された。この方法は、正確かつ再現性があることも示され、報告可能なアッセイ結果は、分析者、アッセイを実施した日数、またはＴＨＰ−１細胞継代数と同様に独立していた。
【０２３０】
実施例３．Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの細胞内成長を定量化するためのＴＨＰ−１に基づくアッセイの最適化。
データは、実施例１に記載されている方法を使用して、合計１３回の代表的な試験実行から得た。このデータは、主要な品質属性を維持しながらメソッド効率の改善を模索するために評価され、これには、応答の開発のためのより短い時間枠が妥当かどうか（３時間対５時間）を判定することと、ＴＨＰ−１細胞の継代数の上限を見出すことと、ｐ−２からｐ０への応答のベースライン変化の下限を見出すことと、ｐ１時点の有用性を決定することと、が含まれる。
【０２３１】
対象となる方法は、細胞に基づくマクロファージ細胞感染アッセイであり、ＡＤＸＳ１１−００１の弱毒化の評価の一部として感染および複製を評価する。これは、野生型（ＷＴ）Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞、１０４０３Ｓ、および特定のＡＤＸＳ１１−００１サンプルの両方を並行して使用して実施される。これは、細胞に基づくアッセイであり、ＴＨＰ−１細胞を溶解し、寒天に細菌希釈液を播種することによって、特定の時点で感染前および感染後に定量される細菌を使用する。コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、マクロファージの細胞内環境で生存している生菌の計数を表す。異なる時点で定量化されたＣＦＵとそれ自体およびＷＴの比率は、結果を定量化する機会を示す。
【０２３２】
この方法の感染ステップの一部として、２４ウェルプレートを使用して、サンプルおよびＷＴの両方に対して異なる応答を発生させ、次いでこれらをサンプリングしてインキュベートし、生存細胞計数を得る。この生存細胞計数は、感染の開始と２時間のインキュベーション時間に先行するため、ｐ−２と称され、その後、サンプルおよびＷＴに対する測定が再度行われる。この２時間のインキュベーション後の測定値は、ｐ０と称される。その後の生存細胞計数の測定はまた、１時間（ｐ１）、３時間（ｐ３）、および５時間（ｐ５）のインキュベーション時間後にも行われる。メソッドは、（ａ）サンプル対ＷＴの比としてサンプル（ｐ−２／ｐ０）の更新、および（ｂ）ＷＴ対サンプルの比として細胞内成長（ｐ３／ｐ０）を報告する。データソースを表１４に示す。
【表１４】
2021516972.tif 000019
【０２３３】
結果は、期待への適合性についてスクリーニングされた。図３は、本発明の方法における時点のすべて（ｐ−２、ｐ０、ｐ１、ｐ３、およびｐ５）で観測された生の計数情報を示す。表１２に示されている各実行は、個別のサブプロットにあり、キーの各バッチに対して得られる曲線は、試験結果を表す。このデータは、初めの２時間の期間（ｐ−２からｐ０）で予想される下降変化、続いてｐ０からｐ５への増加を示す。
【０２３４】
応答は予想どおりであり、最初の接種後のサンプルは、野生型生物よりも著しく低い計数を有し、ｐ０時点以降も同様の増加率であった。
【０２３５】
図４および図５は、野生型（ＷＴ）と比較したサンプル成長の取り込みに関するデータのグラフ描写を示す。図４は、ｐ−２での計数とｐ０で見られる計数との比率としての生データを示す。ｐ−２からｐ０への変化量は、サンプルごとに著しく異なる。図５は同じものを示すが、サンプルの結果を野生型に対する比率として変換する。
【０２３６】
図５は、サンプルのｐ−２／ｐ０応答の変化と、実行ごとの野生型の変化の比率を示す。変化は、通常、野生型と比較してサンプルの５倍以上の差である。これは、図５では赤い破線として示される。野生型に対するサンプルの相対的応答は、ＴＨＰ−１細胞の継代数に関連している（以下を表示）。
【０２３７】
図６および図７は、野生型と比較した比率を得る前の細胞内成長（ｐ３／ｐ０）および（ｐ５／ｐ０）に関するデータのグラフ描写を示す。図６は、野生型と比較した比率を得る前のサンプルの比率を示す。比率を得る前のｐ３およびｐ５の結果には顕著な違いがある。図７は、本方法に従ってデータを調整し、野生型に対する応答の変化を示す。これは、ｐ３、ｐ５応答での相対的応答が実質的に異ならないことを示す。同様の変動性は、サンプルの種類内（実行ごと）およびサンプル間で観察される。
【０２３８】
図８は、図７に示したのと同じ結果をプロットするが、実行ごとにデータも分割する。この結果の所見は、ｐ３およびｐ５での成長率の差が、サンプル内で実行ごとに見られるものよりも小さいことを示す。このデータは、この基準において、ｐ３対野生型での比例成長の使用を支持している。
【０２３９】
継代数の影響を評価するために、（野生型に対して）ｐ−２からｐ０への計数の比例的減少を、その実行での生物の継代数に対する各サンプルについてプロットした。図９は、明確な関係を示す。
【０２４０】
このグラフに基づいて、回帰分析を使用して、継代数の影響を定量的に評価した。結果を図１０に示す。回帰方程式は、近似線形応答を示し、第３２継代で、個々の結果の９５％予測区間が１０の相対的応答（１桁分の差）であることを示す。この分析に基づいて、相対的応答（ｐ−２に対するｐ０結果の比例差）が１０を超えたままであることを保証するために、３２の最大継代数を使用することを推奨する。
【０２４１】
ｐ１時点の有用性を確立するために、図３の個々の曲線のそれぞれに対して次のステップを行った：（１）すべての計数をＬｏｇ１０スケールに変換した、（２）ｐ０、ｐ１、およびｐ３での応答を使用して、勾配を計算し、これは、３つすべての時点を使用した場合の１時間あたりの計数の変化度を表し、これをｘ軸に示す、（３）ｐ３およびｐ０での応答の差を計算し、１時間ごとの変化を表すために３で割り、これをｙ軸に示す。
【０２４２】
各曲線における２つの結果として生じた変数間の関係を図１１にプロットする。単純な差を使用しても、３つすべての時点を使用して勾配を計算しても、Ｌｏｇ１０（計数）の１時間ごとの変化に対して本質的に同じ値が見られることを示す。ｐ１時点は、計算で使用するために必須ではない。
【０２４３】
データの評価に基づいて、以下が支持される。ｐ５対ｐ０の代わりにｐ３対ｐ０を使用して、サンプル対野生型の相対的応答を評価することができる。試験は、ｐ３で終了することができる。継代の影響は、大きくなる可能性があり、ＴＨＰ−１の継代数に上限３２を適用することを推奨し得る。この上限を継代数に適用すると、ｐ−２からｐ０（野生型からサンプル）への応答のベースラインの変化が少なくとも１０倍にとどまるという信頼が得られ、これは下限として推奨される。ｐ１で得られた結果は、サンプルまたは野生型の変化の程度の計算に必須ではない。
【０２４４】
実施例４．Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対するＴＨＰ−１に基づく感染性アッセイ。
ＡＤＸＳ１１−００１は、リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）およびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）タンパク質Ｅ７の融合タンパク質を発現するように遺伝子改変された、弱毒化Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの生菌株である癌免疫療法製品であり、腫瘍抗原は、主に子宮頸部だけでなく、外陰部癌、膣癌、陰茎癌、肛門癌、ならびにヒトパピローマウイルス１６および１８、さらには３１および４５に直接関連する口腔咽頭癌の細胞に見られる。
【０２４５】
病原体として、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓは、ファゴソームに取り込まれた後、細胞質に脱出ることによって非食細胞および食細胞に感染する細胞内病原体である。これは、ファゴソームをリソソームと融合して、ファゴリソソームを形成する前に、液胞膜の破壊に寄与するタンパク質リステリオリシンＯ（ＬＬＯ）の発現によって達成される。これにより、細菌は細胞質に脱出することができ、そこで増殖し、細胞から細胞へと直接広がる。ＴＨＰ−１細胞は、単球として培養物中に維持されるが、ホルボール１２−ミリステート１３−アセテート（ＰＭＡ）で刺激することによって、マクロファージに容易に分化させることができるヒト単球細胞株である。
【０２４６】
この実施例で説明する方法は、Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ製剤（例えば、ＡＤＸＳ１１−００１）の侵入を測定し、分化したＴＨＰ−１細胞の感染後の個別の時点で細胞質に脱出するためのものである。ＰＭＡで分化したＴＨＰ−１細胞に、野生型対照と製剤ＡＤＸＳ１１−００１をそれぞれ１：１の感染多重度（Ｍ０１）で接種する。次いで、感染したＴＨＰ−１細胞をゲンタマイシンで処理して、細胞外細菌を死滅させる。細菌は、ＴＨＰ−１細胞を溶解し、ブレインハートインフュージョン（ＢＨＩ）寒天プレート上に細菌希釈液を播種することによって、特定の時点での感染前および感染後に定量化される。コロニー形成単位（ＣＦＵ）は、リソソームからの脱出により、マクロファージの細胞内環境で生存している生菌を表す。
【０２４７】
例示的なアッセイを、以下に説明する。しかしながら、このアッセイは、いかなるＬｉｓｔｅｒｉａ株に対しても使用することができる。各アッセイ時期は、参照標準とともに、対照に対して最大２つの製剤サンプルを評価することができる。
【表１５】
2021516972.tif 000020
【０２４８】
装置、試薬、および消耗品
各アッセイ時期は、参照標準とともに、対照に対して最大２つの製剤サンプルを評価することができる。
【表１６】
2021516972.tif 000021
【表１７】
2021516972.tif 000022
【０２４９】
試薬の調製手順
注記：容積／量は、必要に応じて拡大または縮小することができる。
【０２５０】
通常の継代培養（ｃ−ＲＰＭＩ）のための完全なＲＰＭＩ（５００ｍＬ）：４４５ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０、５０ｍＬのＦＢＳ、５ｍＬのＬ−グルタミン（２００ｍＭ）。２〜８℃で最長１カ月間貯蔵。
【０２５１】
解凍用の完全なＲＲＭＩ（ｃ−ＲＰＭＩ−ｔｈａｗ）５０５ｍＬ：４００ｍＬのＲＰＭＩ  １６４０、１００ｍＬのＦＢＳ、５ｍＬのＬ−グルタミン（２００ｍＭ）、２〜８℃で最長１カ月間貯蔵。
【０２５２】
凍結溶液５００ｍＬ：４５０ｍＬの加熱不活性化ＦＢＳ、５０ｍＬのグリセロール、新たに調製。
【０２５３】
１．６ｍＭのＰＭＡ：１．０ｍｇのＰＭＡ（Ｍｗ：６１６．８３）、１．０ｍＬのＤＭＳＯ、−２０℃で最長６カ月間貯蔵。２ｍＬの滅菌マイクロ遠心チューブ中に１０μＬのアリコートを調製。各アリコートは、使い捨てである。
【０２５４】
１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン：１ｇのストレプトマイシン、０．２μｍフィルターを使用して滅菌した１０ｍＬの滅菌水、−２０℃で最長１カ月間貯蔵。２ｍＬの滅菌マイクロ遠心チューブ中に１ｍＬのアリコートを調製。各アリコートは、使い捨てである。
【０２５５】
ブレインハートインフュージョン寒天＋１００μｇ／ｍＬのストレプトマイシン。開始する前に、ＢＨＩプレートに製造上の欠陥（コンタミネーション、プレートの破損、不均一な寒天など）がないことを確認するために検査した。各寒天プレートの体積は、約２２．８ｍＬである。１７７．２μＬ×寒天プレートＰＢＳの数、２２．８μＬ×寒天プレートの数１００ｍｇ／ｍＬのストレプトマイシン１００ｍｇ／ｍＬ。２００μＬの希釈ストレプトマイシンを、各寒天プレートに添加した。滅菌スプレッダーを使用してプレートの表面全体を覆うように広げる。すべての液体が寒天プレートによって吸収されるまで広げる。プレートは、寒天プレートまたはストレプトマイシンのいずれか早い方の有効期限まで、２〜８℃で貯蔵される。
【０２５６】
ＴＨＰ−１細胞株の培養
ＴＨＰ−１細胞の解凍。生物学的安全キャビネット中の無菌条件下で手順を実行する。滅菌であると認定され、無菌で調製された材料のみを使用する。
１．３７℃に設定された水浴中でｃ−ＲＰＭＩ解凍培地を事前に温める。
２．３ｍＬの事前に温めたｃ−ＲＰＭＩ解凍培地を、滅菌の５０ｍＬの遠心チューブに入れる。
３．ＴＨＰ−１バイアルを極低温記憶装置から取り出し、内容物がほぼ解凍されるまで３７℃に設定された水浴中で解凍するが、少量の氷の結晶がチューブ内に残る。
４．消毒剤でバイアルを徹底的に洗浄する。
５．３ｍＬのｃ−ＲＰＭＩ解凍培地を含む５０ｍＬの遠心チューブに、解凍した細胞を１滴ずつ添加する。
６．さらに１ｍＬのｃ−ＲＰＭＩ解凍培地でクライオバイアルを洗浄し、細胞が入った５０ｍＬのチューブに移す。
７．計数のために約１００μＬの細胞懸濁液を取る。
注記：血球計を使用して計数するには、細胞懸濁液のアリコートを０．４％トリパンブルーで１：２に希釈する。穏やかなピペッティングによって懸濁液が十分に混合されていることを確認する。計数にはＣチップを使用する。２つの独立した計数を実行する。細胞生存率（≧８５％）および密度を決定する。
８．細胞懸濁液を１５０×ｇで５分間、室温で遠心分離する
９．上清を廃棄し、事前に温めておいたｃ−ＲＰＭＩ解凍培地に細胞を再懸濁して、１〜３×１０５生細胞／ｍＬの細胞密度を得る。
１０．チューブの内容物を細胞培養フラスコ（例えばＴ７５）に移し、３７℃、５％ＣＯ２の絶対湿度でインキュベートする。
１１．細胞が指数関数的成長期（ｅｘｐｏｎｅｎｔｉａｌ  ｐｈａｓｅ  ｏｆ  ｇｒｏｗｔｈ）に達するまで、フラスコを垂直位置に保つ。
１２．細胞は、通常２〜３日ごとに計数する。
注記：培養が確立されると（通常、解凍後６日）、ｃ−ＲＰＭＩ培地を使用して血清濃度を１０％に低下させる。
【０２５７】
通常のＴＨＰ−１細胞培養。手順は、生物学的安全キャビネット中の無菌条件下で、滅菌であると認定され、無菌で調製された材料を使用して実行される。
【０２５８】
いくつかの実施形態では、通常の細胞培養およびＴＨＰ−１アッセイでは、細胞継代数は、Ｐ３２に制限される。細胞を新しい培養容器に移すたびに継代と見なされる。同じ培養容器に培地を添加して、指数成長を確実にしても、継代数は変わらない。
【０２５９】
指数成長中の細胞を保つために、培養物を、３〜８×１０５生細胞／ｍＬの間に維持する。
１．顕微鏡下で細胞の形態およびコンタミネーションを検査する。
細胞の大部分が培養容器の表面に付着している場合は、継続しない。そのような場合は、培養物を廃棄し、作業中の細胞バンクの別のバイアルを解凍する。
２．総細胞数および生存率のために、約１ｍＬの細胞懸濁液をバイアルに移す。
３．指数関数的成長期の細胞を保つために、細胞懸濁液の体積が最大許容体積に達するまで、細胞に３×１０５細胞／ｍＬの密度まで新たにｃ−ＲＰＭＩ培地を補充し、次いで細胞懸濁液を、３×１０５細胞／ｍＬの播種密度で事前にラベル付けされたフラスコに継代する。
異なるサイズのフラスコの最小および最大容量範囲を、最適なＣＯ２浸透のために、以下に示す：７７５フラスコ：１５〜３７．５ｍＬ；Ｔ１５０フラスコ：３０〜７５ｍＬ
４．３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで培養物をインキュベートする。
５．細胞は、通常２〜３日ごとに計数する。
【０２６０】
ＴＨＰ−１細胞の凍結保存。手順は、生物学的安全キャビネット中の無菌条件下で、滅菌であると認定され、無菌で調製された材料を使用して実行される。
１．「通常のＴＨＰ−１細胞培養」のステップ１〜２に従う。
２．１０（ｖ／ｖ）％グリセロールを補充した熱不活性化ＦＢＳからなる凍結培地を調製する。
３．細胞を１５０×ｇで５分間、室温で遠心分離する。
４．上清を廃棄し、塊が見えなくなるまでチューブを軽くたたくことによって細胞を再懸濁する。ゆっくりと滴下し、２倍の最終凍結密度（最終凍結密度は２×１０６細胞／ｍＬである）を得るためにチューブを回転させることによって、凍結培地を添加する。
５．細胞を含むチューブに、第２の等量の凍結培地をゆっくりと添加する。完全な混合を可能にするために、添加中にチューブを静かに回転させる。
６．血清ピペットを使用して、１ｍＬの細胞懸濁液を事前にラベル付けされた２ｍＬのクライオバイアルに分注する。
７．クライオバイアルを、２−プロパノールを含む印まで満たされた室温のＣｏｏｌＣｅｌｌまたはＭｒ  Ｆｒｏｓｔｙ容器に入れる。
８．冷凍容器を−７０℃の冷凍庫に２４〜７２時間移す。
９．クライオバイアルを気相窒素貯蔵に移す。
１０．凍結細胞バッチの場所および詳細を記録する。
【０２６１】
ＴＨＰ−１細胞の調製および細胞分化（１日目）注記：試験項目（対照、参照、またはサンプル）ごとに１×ＴＨＰ−１  ２４ウェルプレートを調製する。各プレートには、最低７つのＰＭＡ処理ウェルおよび２つの未処理ウェルが必要である。以下に示すようなプレートレイアウトの例。
【表１８】
2021516972.tif 000023
１．３７℃に設定された水浴中で完全ＲＰＭＩ（ｃ−ＲＰＭＩ）培地を事前に温める。
２．インキュベーターから細胞を取り出し、コンタミネーションの兆候がないか目視検査し、顕微鏡下で細胞を確認する。
コンタミネーションがある場合は、継続しない。細胞の大部分が培養容器の表面に付着している場合は、継続しない。そのような場合は、培養物を廃棄し、作業中の細胞バンクの別のバイアルを解凍する。
３．細胞懸濁液を数回上下にピペッティングして、細胞を混合し、細胞を計数するために少量の細胞を取り出す。
４．０．４％トリパンブルー中で２倍希釈の細胞懸濁液を調製する。ピペットで穏やかに混合することによって、希釈した細胞懸濁液の適切な混合を確保する。
５．合計２つの独立した細胞計数のＣチップを調製し、細胞密度および生存率を決定する。細胞生存率が少なくとも８５％である場合にのみ継続する。
６．１×１０６生細胞／ｍＬで細胞懸濁液を調製する：適切な体積の細胞懸濁液を１５０×ｇで、室温で５分間遠心分離し、上清を廃棄し、細胞ペレットをｃ−ＲＰＭＩに再懸濁する。よく混ぜる。ウェルあたり最低１ｍＬの細胞懸濁液を調製する。
７．２４ウェルプレートの「ＰＭＡなし」とラベル付けされた２つのウェルのそれぞれに１ｍＬの細胞懸濁液を添加する（プレートレイアウトを参照）。
８．残りの細胞懸濁液に、１６ｐＭ（１．６ｍＭのストックから１００倍希釈）ＰＭＡを添加し、最終濃度を約１６ｎＭのＰＭＡにする。よく混ぜる。
９．ウェルごとに１ｍＬのＰＭＡ処理細胞懸濁液を、各プレート上の最低７つのウェルに添加する（プレートレイアウトを参照）。
１０．細胞を、３７±１℃、５±１％ＣＯ２で１６〜２４時間インキュベートする。
【０２６２】
ＴＨＰ−１細胞の感染および時間的経過（２日目）
サンプルおよび対照の調製。ＰＭＡで処理したＴＨＰ−１細胞を含むウェルの操作はすべて、注意して取り扱わなければならない。培地は、プレートを約４５度の角度で傾けることによって吸引または分注しなければならない。ピペットチップは、吸引または分注のステップ中にウェルの表面をこすってはならない。
１．野生型Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ／参照標準または製剤サンプルのうちの１つのバイアルを取り出す。
２．バイアルを室温で最大１０分間解凍し、サンプルが完全に解凍されていることを確認する。
３．ボルテックスし、細胞懸濁液をそれぞれラベル付けされた２ｍＬのマイクロ遠心チューブ（１ｍＬ）に移す。移した正確な体積を記録する。
４．細胞を１４５００×ｇで２分間、室温で遠心分離する
５．上清を慎重に廃棄し、ペレットを室温のｃ−ＲＰＭＩで再懸濁する。培地の体積は、ステップ３で最初に移された試験項目の体積と同じでなければならない。
６．ｃ−ＲＰＭＩを使用して、細菌の希釈液を１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬの最終濃度になるように調製する。この濃度での最終体積は、約１５ｍＬでなければならない。
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓがｃ−ＲＰＭＩで成長する可能性があるため、すぐに次のセクションに進む。
【０２６３】
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むＴＨＰ−１細胞の感染。
１．インキュベーターから１枚の２４ウェルプレートを取り出す。
２．顕微鏡下でＴＨＰ−１細胞の付着を観察し、ＰＭＡで処理した細胞と未処理の細胞の違いを確認する（軽く振動するときの流動性を示す）。
３．ＰＭＡで処理した細胞を含むウェルから培地を吸引し、「サンプルおよび対照の調製」のステップ７で調製した１ｍＬの細菌を添加する。
４．顕微鏡でプレートを観察し、ＴＨＰ−１細胞がまだウェルの表面に付着していることを確認する。
５．３７±１℃、５±１％ＣＯ２でプレートを２時間±３分間インキュベートする。
６．「生存率試験の手順−ｐ−２時点」に従って、「サンプルおよび対照の調製」で調製された試験項目の生存率試験を実行する。
【０２６４】
生存率試験の手順−ｐ−２時点。生存率試験を開始する前に、すべての寒天プレートが十分に乾燥していることを確認する。
１．（ＴＨＰ  １細胞の感染および時間的経過（２日目））に説明されているように、１．０×１０６ＣＦＵ／ｍＬに希釈した試験項目を使用する
２．表に従って細菌懸濁液を連続的に希釈する。
【表Ａ】
2021516972.tif 000024
３．１００μＬの各希釈液を適切なＢＨＩ寒天プレートに広げる。各希釈に３つの寒天プレートを作製する（すなわち、ｐ−２の時点で、試験項目ごとに合計９つの寒天プレートが生成する）。
野生型Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ対照には寒天ＢＨＩプレートを使用する
ＡＤＸＳ１１−００１試験項目には寒天ＢＭ＋クロラムフェニコールを使用する
４．各プレートは、液体を吸収し、蓋をして少なくとも１５分間乾燥させてから、裏返し、ＣＯ２を使用せずに３５〜３８℃のインキュベーターに１６〜２４時間入れる。
【０２６５】
感染の停止。
１．２０ｐｇ／ｍＬのゲンタマイシンが入ったｃ−ＲＰＭＩを調製する。
２．２時間後、野生型またはサンプルが入ったプレートを、インキュベーターから除去する。
３．ピペットを使用して、各ウェルからＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含有する培地を除去する。
４．２０ｐｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有する調製したｃ−ＲＰＭＩをウェルあたり１ｍＬを慎重に分注し、破壊を避けるためにウェルの側面にゆっくりと加える。
５．プレートを、インキュベーターに３７±１℃、５±１％ＣＯ２で４５分間戻す。
６．ピペットを使用して、各ウェルから２０ｐｇ／ｍＬのゲンタマイシンを含有するｃ−ＲＰＭＩを除去する。
７．ウェルごとにゲンタマイシンを含まない１ｍＬのｃ−ＲＰＭＩを添加する（単分子層の破壊を避けるようにウェルの側面に対してゆっくりと添加する）ことによって、細胞を慎重に洗浄する。
８．ピペットを使用して、各ウェルからｃ−ＲＭＰＩを除去する。
９．１ｍＬのｃ−ＲＰＭＩ（ゲンタマイシンを含まない）を、破壊を避けるようにウェルの側面に対してゆっくりと添加することによって、各ウェルに慎重に分注し、プレートを３７±１℃、５±１％ＣＯ２に設定されたインキュベーターに少なくとも５分間戻す。インキュベーションの終了は、ｐ０と表される。
【０２６６】
細胞内Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ成長の検出−ｐ０。
１．時点「ｐ０」の収集に使用するために、ウェルを１つ選択する。
各ウェル中のＰＭＡ処理ＴＨＰ−１細胞の層が一貫し、前の吸引ステップおよび分注ステップで細胞が最小限からまったく除去されていないことを保証する。任意のウェルにＴＨＰ−１細胞の有意な消失があることが観察された場合、ウェルに印を付け、それを使用しないようにする。
２．ピペットを用いて吸引することによって、選択したウェルからｃ−ＲＰＭＩを除去する。
３．ウェルに１ｍＬの滅菌水を分注する。上下にピペッティングすることによって、ウェルの表面からＴＨＰ−１細胞を取り除く。内容物全体を２ｍＬの遠心チューブに移す。
細胞が正常に除去されたことを確認するために、顕微鏡下で観察する。ＴＨＰ−１細胞のかなりの部分が残っている場合、２ｍＬのチューブにあらかじめ移した水の一部を利用して、上下にピペッティングすることによって、細胞を取り除く。内容物を２ｍＬのチューブに戻し、ＴＨＰ−１細胞が除去されたことを顕微鏡下で確認する。
４．次の時点の収集の準備ができるまで、プレートを３７±１℃、５±１％ＣＯ２のインキュベーターに戻す。
５．細胞溶解物を少なくとも１分間ボルテックスして細胞内細菌を放出し、「生存率試験手順−ｐ０／ｐ３時点」に従って生存率試験を実施する。
【０２６７】
細胞内Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ成長の検出−ｐ３。
１．ｐ０で表わされる時間から３時間後にインキュベーターからプレートを除去する（「感染の停止」、ステップ９）。
２．時点「ｐ３」の収集に使用するために、ウェルを１つ選択する。
各ウェル中のＰＭＡ処理ＴＨＰ−１細胞の層が一貫し、前の吸引ステップおよび分注ステップで細胞が最小限からまったく除去されていないことを保証する。任意のウェルにＴＨＰ−１細胞の有意な消失があることが観察された場合、ウェルに印を付け、それを使用しないようにする。
３．ピペットを用いて吸引することによって、選択したウェルからｃ−ＲＰＭＩを除去する。
４．ウェルに１ｍＬの滅菌水を分注する。上下にピペッティングすることによって、ウェルの表面からＴＨＰ−１細胞を取り除く。内容物全体を２ｍＬの遠心チューブに移す。呼び出しが正常に除去されたことを確認するために、ウェルを顕微鏡下で観察する。ＴＨＰ−１細胞のかなりの部分が残っている場合、２ｍＬのチューブにあらかじめ移した水の一部を利用して、上下にピペッティングすることによって、細胞を取り除く。内容物を２ｍＬのチューブに戻し、ＴＨＰ−１細胞が除去されたことを顕微鏡下で確認する。
５．細胞溶解物を少なくとも１分間ボルテックスして細胞内細菌を放出し、「生存率試験手順−ｐ０／ｐ３時点」に従って生存率試験を実施する。
【０２６８】
生存率試験の手順−ｐ０／ｐ３時点。
１．
ｐ０の場合：「細胞内Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ成長の検出−ｐ０、ステップ５
ｐ３の場合：「細胞内Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ成長の検出−ｐ３、ステップ５、において生成された試験項目の溶解物の使用
２．表に従って細菌懸濁液を連続的に希釈する。
【表Ｂ】
2021516972.tif 000025
３．１００μＬの各希釈液を適切なＢＨＩ寒天プレートに広げる。各希釈に３つの寒天プレートを作製する（すなわち、ｐ−２の時点で、試験項目ごとに合計９つの寒天プレートが生成する）。
野生型Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ対照には寒天ＢＨＩプレートを使用する。
ＡＤＸＳ１１−００１試験項目には寒天ＢＨＩ＋クロラムフェニコールを使用する。
４．各プレートは、液体を吸収し、蓋をして少なくとも１５分間乾燥させてから、裏返し、ＣＯ２を使用せずに３５〜３８℃のインキュベーターに１６〜２４時間入れる。
【０２６９】
対照プレート。
１．各アッセイ時期のために、以下の陰性対照寒天プレートに従って調製する：
未接種：
３×ＢＨＩ寒天＋１００ｐｇ／ｍＬのストレプトマイシン
３×ＢＨＩ寒天＋２５ｐｇ／ｍＬのクロラムフェニコール
接種：
３×ＢＨＩ寒天＋１００μＬのＰＢＳを接種した１００ｐｇ／ｍＬのストレプトマイシン
３×ＢＨＩ寒天＋１００μＬのＰＢＳを接種した２５ｐｇ／ｍＬのクロラムフェニコール
２．各アッセイ時期のために、以下の陽性対照寒天プレートを調製する：
２×ＢＨＩ寒天＋１×１０６ＣＦＵ／ｍＬで１０μＬの野生型Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを接種した１００ｐｇ／ｍＬのストレプトマイシン。
２×ＢＨＩ寒天＋１×１０６ＣＦＵ／ｍＬで１０μＬの参照標準を接種した２５ｐｇ／ｍＬのクロラムフェニコール。
３．プレートは、アッセイ寒天プレートと一緒に、ＣＯ２を含まない３５〜３８℃で１６〜２４時間インキュベートする。
コロニー計数（３日目）
１．１６〜２４時間後、プレートをインキュベーターから除去する
注記：各時点でのすべてのＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細胞種（野生型、参照、およびサンプル）が同じ期間インキュベートされることを確認する）。
２．コロニー形成単位の総数は、手動で計数され、ワークシート中の各希釈液の各プレートについて記録する。
計算
１．その後の計算には、４０〜６００の値を有するコロニー計数のみを使用する。必要な計算を実行するには、希釈ごとの最小２コロニー数が範囲内でなければならない。２つを超えるプレートに４０〜６００の範囲外のコロニー計数がある場合は、ｐ０および／またはｐ３の時点で調整された希釈を使用してアッセイ全体を繰り返す（「生存率試験の手順−ｐ０／ｐ３の時点」、ステップ２）。
２．各時点で、ＣＦＵ／ｍＬ値を計算する。
【数２】
2021516972.tif 000026
３．計算されたすべてのＣＦＵ／ｍＬ値のｌｏｇ１０変換を実行する。
４．ｙ軸にｌｏｇ１０ＣＦＵ／ｍＬ、ｘ軸に時間を使用してデータをプロットする。
アッセイの受け入れ基準
１．すべての陰性対照寒天プレート上での細菌成長の証拠はない。
２．コロニーは、すべての陽性対照寒天プレート上に存在していなければならない。
３．ｐ−２で計算された対照の平均ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）は、６±０．５以内である
４．３重の寒天プレートの有効なコロニー計数値間のＣＶ（％）＊３０以下。
＊ＣＶ＝［（標準偏差／平均）×１００］
５．以下の式に従って、細胞株のパフォーマンス（ＣＬＰ）パラメーターを計算する。
【数３】
2021516972.tif 000027
すべての有効なアッセイで、ＣＬＰを３以上実行する。ＣＬＰ値は、トラッキングに供される。Ｐ−２、ｐ０は、それぞれ、時点ｐ−２およびｐ０における平均ＣＦＵ／ｍＬ値である。
６．以下の式を使用して、対照に対する参照応答を計算する。
【数４】
2021516972.tif 000028
すべての有効なアッセイで、ＲＲＳを２．０以上で実行する。ＲＲＳ値は、トラッキングに供される。Ｐ３、ｐ０は、それぞれ、時点ｐ３およびｐ０における平均ＣＦＵ／ｍＬ値である。
報告可能な結果
１．各サンプルについて、次の式を使用して報告可能な結果を計算する。
【数５】
2021516972.tif 000029
小数第１位（ｄ．ｐ．）まで報告する。
２．仕様に対して結果を評価する。
【０２７０】
実施例５．Ｌｉｓｔｅｒｉａ  ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに対するＴＨＰ−１に基づく感染性アッセイの検証。
この方法の一般的な概要を実施例４に示す。
【表１９】
2021516972.tif 000030
【０２７１】
方法論
アッセイの完了には３日かかる。１日目に、ＴＨＰ−１細胞を、２４ウェル組織培養プレートに１×１０６生細胞／ｍＬで藩種した（試験項目ごとに１つのプレート−上記を参照（ＴＨＰ  １細胞の感染および時間経過（２日目）））。８５％超の生存率を有する細胞のみを使用し、培養の継代数は、Ｐ３２に制限した。次いで、ＴＨＰ−１細胞を、ＰＭＡ溶液で処理して、一晩のインキュベーション中にマクロファージへの分化を刺激した。
【０２７２】
翌日、光学顕微鏡を使用して、視覚的に分化を確認した。分化した細胞は、ウェル表面に付着し、懸濁液中に残っている未分化の丸みを帯びた細胞とは形態学的に異なる。
【０２７３】
各試験項目の濃度は、（公称濃度に基づいて）１×１０６ＣＦＵ／ｍＬに調整し、さらに１０−１、１０−２、および１０−３に連続希釈した。１００μＬの各希釈液を、ＢＨＩ寒天プレートに播種し、１６〜２４時間インキュベートして、コロニーを成長させた。各希釈に対して３枚のプレートを用意した。次いで、コロニーを手動で計数して、ｐ−２  ＣＦＵ／ｍＬ値を生成した。この時点で、感染前の固定量のＣＦＵ／ｍＬは、６±０．５  ｌｏｇ１０  ＣＦＵ／ｍＬを生成すると予想された。これにより、同じ量の試験項目を使用して、ＴＨＰ−１細胞を感染することが保証された。
【０２７４】
１×１０６ＣＦＵ／ｍＬに調整された試験項目も、分化したＴＨＰ−１細胞に２時間±３分間添加した。この間、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ細菌は、ＴＨＰ−１細胞に侵入した。次いで、培養培地に残っているすべての細菌は、ゲンタマイシンを４５分間添加することによって死滅させた。ゲンタマイシンは、ＴＨＰ−１細胞の細胞膜に浸透することができないため、このステップでは細胞外細菌のみを除去した。Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓを含むＴＨＰ−１細胞を溶解した。溶解物を、１０−１、１０−２、および１０−３に連続的に希釈した。１００μＬの各希釈液を、ＢＨＩ寒天プレートに播種し、１６〜２４時間インキュベートして、コロニーを成長させた。各希釈に対して３枚のプレートを用意した。次いで、コロニーを手動で計数して、ｐ０  ＣＦＵ／ｍＬ値を生成した。この時点で、感染細菌細胞の数は、各試験項目について決定された。
【０２７５】
Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓに感染したＴＨＰ−１細胞を含むいくつかのウェルを、ゲンタマイシンによる処理の完了後３時間、インキュベーターに残した。インキュベーション時間の終了時に、細胞を溶解した。溶解物を、１０−１、１０−２、および１０−３に連続的に希釈した。１００μＬの各希釈液を、ＢＨＩ寒天プレートに播種し、１６〜２４時間インキュベートして、コロニーを成長させた。各希釈に対して３枚のプレートを用意した。次いで、コロニーを手動で計数して、ｐ３  ＣＦＵ／ｍＬ値を生成した。この時点で、感染の進行は、各試験項目について決定された。
【０２７６】
対照プレートはまた、抗生物質耐性プロファイルを介して無菌技術および試験項目の同一性を評価するためにも調製した。対照プレートを、ｐ−２、ｐ０、およびｐ３  ＢＨＩ寒天プレートと一緒にインキュベートした。
【０２７７】
データ分析
各ＢＨＩ寒天プレートを手動で計数した。各コロニーは１  ＣＦＵに相当する。各調製物／溶解物希釈物（すなわち、１０−１、１０−２、および１０−３）により、３つのコロニー計数値（すなわち、ＣＦＵ）を得た。少なくとも１つの希釈で、コロニー計数が４０〜６００コロニー／ＢＨＩ寒天プレート内でコロニー計数を生成し、３０％未満のＣＶ（％）を有すると予想された。ＣＦＵ／ｍＬ値は、以下の方程式に基づいて、ｐ−２、ｐ０、およびｐ３の時点で各試験項目について計算した。
【数６】
2021516972.tif 000031
【０２７８】
対照におけるｐ−２でのＬｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）は、すべての有効なアッセイ実行に対して６±０．５以内であると予想された。
【０２７９】
各試験項目の細胞内成長を評価するために、報告可能な結果は、以下の方程式を使用して計算した。
【数７】
2021516972.tif 000032
式中、ｐ３、ｐ０は、それぞれ、時点ｐ３およびｐ０における平均ＣＦＵ／ｍＬである。
報告可能な結果は、１ｄ．ｐと計算される。
参照標準材料における報告可能な結果は、≧２．０であると予想される。
加えて、分化したＴＨＰ−１細胞の感染に対する許容度は、細胞ライナーのパフォーマンスパラメーターを計算することによって測定される。
【数８】
2021516972.tif 000033
式中、ｐ−２、ｐ０は、それぞれ、時点ｐ−２およびｐ０における平均ＣＦＵ／ｍＬである。
細胞株のパフォーマンスパラメーターは、０ｄ．ｐと計算された。
細胞株パラメーターは、すべての有効なアッセイ実行に対して≧３であると予想された。
【０２８０】
メソッド性能パラメーターの評価のための方法論
【表２０】
2021516972.tif 000034
アッセイ内の精度アッセイ内の精度について、データは、３重に試験した参照材料（ｎ＝３）および１つの対照（ｎ＝１）からなる１つのアッセイ時期（Ａ１）から収集された。データは、同じ分析条件下での変動性を反映する。参照材料（ｎ＝３）の調製物を調製し、同じアッセイ時期の間に独立して処理した。
【０２８１】
計算：参照標準の平均／ＳＤ報告可能な結果（アッセイＡ１〜Ａ７の試験項目２）＋ＣＶ（％）；ｎ＝７。
【０２８２】
特異性。アッセイの特異性は、対照の成長パターンを参照材料／サンプルから区別する試験システムの能力として定義された。
【０２８３】
ＣＦＵ／ｍＬに対する時間と項目の影響を考慮するために、固定係数として項目、時間、およびそれらの相互作用を使用して、二元配置分散分析（ＡＮＯＶＡ）を実行し、ランダム効果として複製を含めた。相互作用効果は、各項目内の時間経過の差を表す。データは、分析前に対数的（１０進法）に変換された。
【０２８４】
上記のＡＮＯＶＡに続いて、各項目の同等性は、２つの片側検定法（ＴＯＳＴ）を使用して対照と比較された。各比較について、対照平均と項目平均の差の信頼区間が決定された。平均間の差の（−０．５、０．５）の同値区間を考慮して、２つの平均間の差の９０％信頼区間が決定された。両方の信頼限界が同値区間内にある場合、２つの平均は、同等性であると認定された。
【０２８５】
計算は、ＳＡＳソフトウェア（Ｐｒｏｃ  ＧＬＭを使用したバージョン９．１．３）を使用して、ＥＮＶＩＧＯ統計部門によって実行された。
【０２８６】
堅牢性の確認。事前検証研究からの結果に基づいて、ＴＨＰ−１細胞の感染時間は、２時間＋／−３分と定義された。この範囲が報告可能な結果に影響を与えないことを示すために、感染時間の下限および上限を使用して、２つのアッセイ（Ａ６およびＡ７）を実行した。アッセイＡ１（ｎ＝３）からの平均報告可能な結果を、アッセイＡ６（ｎ＝３）およびＡ７（ｎ＝３）の平均報告可能な結果と比較した。Ａ１、Ａ６、およびＡ７のＣＶ（％）は、２５以下であると予想される。
【表２１】
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結果
【表２２】
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【表２３】
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【表２４】
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【表２５】
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【表２６】
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【表２７】
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【表２８】
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【表２９】
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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