(57)【要約】プロモーターに機能的に連結された、C-Cケモカイン受容体タイプ7（CCR7）をコードする核酸を含む、改変されたNK-92細胞が、本明細書において提供される。任意で、該細胞は、C-Cモチーフリガンド21（CCL21）をコードする核酸、C-Cモチーフリガンド19（CCL19）をコードする核酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む。該改変されたNK-92細胞を含む、組成物およびキットもまた提供される。該改変された細胞を作製する方法、および該細胞を用いてがんを処置する方法が、提供される。2021531808.tif 000013
2021531808.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターに機能的に連結された、C-Cケモカイン受容体タイプ7（CCR7）をコードする核酸を含む、改変されたNK-92細胞。
【請求項２】
CCR7をコードする核酸が、SEQ ID NO:1と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する、請求項1に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項３】
CCR7が、改変されたNK-92細胞の細胞表面上に発現する、請求項1または2に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項４】
プロモーターに機能的に連結された、C-Cモチーフリガンド21（CCL21）をコードする核酸をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項５】
CCL21をコードする核酸が、SEQ ID NO:2と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する、請求項4に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項６】
C-Cモチーフリガンド19（CCL19）をコードする核酸をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項７】
CCL19をコードする核酸が、2Aペプチドリンカーによって、CCL21をコードする核酸に連結され、かつ同一のプロモーターが、CCL19およびCCL21の発現を駆動する、請求項6に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項８】
プロモーターが、1つまたは複数のNFAT結合エレメントと、最小プロモーターとを含む、請求項4〜7のいずれか一項に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項９】
プロモーターが、SEQ ID NO:6と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する、請求項4〜8のいずれか一項に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか一項に記載のNK-92細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
【請求項１１】
請求項1〜9のいずれか一項に記載のNK-92細胞と、使用のための指示書とを含む、キット。
【請求項１２】
対象においてがんの転移を減少させる方法であって、請求項10に記載の組成物を対象に投与する段階を含み、それにより、対象においてがんの転移を減少させる、方法。
【請求項１３】
対象においてがんを処置する方法であって、以下の段階を含む、方法：
(a)  がんを有する対象を選択する段階；
(b)  その細胞表面上にCCR7を発現する改変されたNK-92細胞の治療的有効量を対象に投与する段階であって、投与が対象においてがんを処置する、段階。
【請求項１４】
細胞がCCL21をさらに発現する、請求項13に記載の方法。
【請求項１５】
1 m2あたり1 x 103〜1 x 1010個のNK-92細胞が、対象に投与される、請求項13または14に記載の方法。
【請求項１６】
NK-92細胞が非経口投与される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
NK-92細胞が静脈内投与される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
NK-92細胞が腫瘍周辺に投与される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
NK-92細胞が、ある期間にわたり、注入によって対象に投与される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
期間が5分〜130分である、請求項19に記載の方法。
【請求項２１】
NK-92細胞が、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、またはそれより多い日数にわたり、1日に1回対象に投与される、請求項13〜20のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
追加の治療剤を対象に投与する段階をさらに含む、請求項13〜21のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
背景
養子移植された腫瘍特異的な細胞傷害性リンパ球に基づくがん免疫療法は、悪性腫瘍を有する患者の処置に有望である。ある種のがんにおける、この初期の成功にもかかわらず、腫瘍の処置は、腫瘍微小環境の免疫を抑制する性質に主として起因して、依然として難題であり続けている。改変されたT細胞に加えて、NK細胞に基づく免疫療法が探求されている。NK-92は細胞溶解性のがん細胞株であり、これは非ホジキンリンパ腫に罹患している対象の血液中で発見され、そしてその後、エクスビボで不死化された。NK-92細胞はNK細胞に由来するが、正常なNK細胞によって示される主な抑制性受容体を欠き、一方で活性化受容体の大部分を保持する。しかしながら、NK-92細胞は正常な細胞を攻撃せず、また、ヒトにおいて容認できない免疫拒絶反応を誘発することもない。
【０００２】
リンパ節転移を通常駆動するものは、低酸素で駆動されるCCR7上方制御であり、CCR7は、ナイーブT細胞および樹状細胞において主として見いだされるケモカイン受容体である。血中NK細胞における受容体CCR7の上方制御は、NK細胞のリンパ節へのホーミングを改善することが以前に証明されており、これは、NK細胞が、転移拡大の一般的な経路であるリンパ節コンパートメントへの道筋と同じ道筋をたどることを可能にする。しかし、このことは、臨床上意義のある細胞株においてはいまだに証明されていない。
【発明の概要】
【０００３】
概要
本明細書において、プロモーターに機能的に連結された、C-Cケモカイン受容体タイプ7（CCR7）をコードする核酸を含む、改変されたNK-92細胞が提供される。任意で、細胞は、C-Cモチーフリガンド21（CCL21）をコードする核酸、C-Cモチーフリガンド19（CCL19）をコードする核酸、またはそれらの組み合わせをさらに含む。また、改変されたNK-92細胞を含む、組成物およびキットも提供される。改変された細胞を作製する方法、および該細胞を用いてがんを処置する方法が、提供される。
【０００４】
1つまたは複数の態様の詳細が、添付の図面および以下の説明に記載される。他の特徴、目的、および利点は、該説明および図面から、ならびに請求の範囲から、明らかである。
【図面の簡単な説明】
【０００５】
【図１】NK-92細胞においてAAVS1遺伝子座に挿入するための、受容体CCR7を含むプラスミドpNKAT-CCR7-LP3を示す概略図である。
【図２】プラスミドpCRENFAT-CCL21を示す概略図であり、これは、図1のプラスミドの第一の挿入物から、ピューロマイシン選択カセットを置き換えることによる、NFAT応答性CCL21遺伝子のNK-92細胞への連続的な組み込みのために、使用され得る。
【図３】野生型NK-92細胞における、およびCCR7を発現する改変されたNK-92細胞における、NK-92細胞に関連する表現型マーカーの発現を示すグラフである（レーン1: aNK（野生型）; レーン2: 改変されたNK-92細胞（MA3）; レーン3: 改変されたNK-92細胞（MB4）; レーン4: 改変されたNK-92細胞（MB6）; レーン5: 改変されたNK-92細胞（ME6）; レーン6: 改変されたNK-92細胞（MH3）; A: アイソタイプ（APC）; B: CD54（ICAM-1）; C: NKp30; D: NKG2D）。
【図４】CCR7を発現する改変されたNK-92細胞の、K562細胞に対する細胞傷害活性を示すグラフである。
【図５】CCR7を発現する改変されたNK-92細胞の、HL-60細胞に対する細胞傷害活性を示すグラフである。
【図６Ａ】K562およびSup-B15（細胞が、CD19-CARのmRNAでエレクトロポレーションされた場合）に対する標的結合という状況において実証される、NFATの活性化を示すグラフである。
【図６Ｂ】K562およびSup-B15（細胞が、CD19-CARのmRNAでエレクトロポレーションされた場合）に対する標的結合という状況において実証される、NFATの活性化を示すグラフである。
【図７】CCR7を発現する改変されたNK-92細胞が、ケモカインであるCCL19およびCCL21に向かって遊走することを示すグラフである。
【図８】CCR7を発現する細胞が、CCL19を発現するK-19細胞に向かって遊走することを示すグラフである。
【図９Ａ】CCR7遊走のインビボ分析を示すグラフである。CCR7を発現するNK-92細胞を投与してから3時間後の、CCL19を有する腫瘍へのホーミングの有意な改善を示す。
【図９Ｂ】CCR7遊走のインビボ分析を示すグラフである。24時間の時点での、4匹のマウス中の3匹における、CCL19を分泌する腫瘍への、CCR7を発現するNK-92細胞の動員が、増加したことを示す。
【図１０】CCR7を発現するように改変されたNK-92細胞（2段目）、CCR7およびCD16を発現するように改変されたNK-92細胞（3段目）、またはCCR7、CD16、およびCD19を発現するように改変されたNK-92細胞（4段目）における、CCR7、CD16、またはCD19の検出を示すグラフである。野生型NK-92細胞は、1段目にある対照である。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
詳細な説明
本明細書においては、それを発現させた場合にリンパ球をリンパ節へと向けることが知られているあるケモカイン受容体（CCR7）を組み込むことによって、活性化された細胞傷害性ナチュラルキラー細胞株（NK-92）を、リンパ節へのホーミングおよびリンパ節での挙動を改善するための基盤として用いる、操作された細胞が、提供される。操作された細胞はまた、任意で、転写因子NFATの活性化に基づく応答エレメントをも含んでおり、これは次に、受容体CCR7に対するリガンドであるCCL21および／またはCCL19を分泌する。いかなる理論にも拘束されるものではないが、これらの2つの増強の組み合わせは、存在するCCL21および／またはCCL19勾配を使用して、改変された細胞上のCCR7が、患者の体内においてリンパ節を標的とすることを可能にする、と考えられる。転移がリンパ節に到達し、そして、転移巣が消失して改変された細胞によるCCL21および／またはCCL19の分泌が停止するまで続くフィードバックループを形成する場合に、CCL21および／またはCCL19の勾配は、転写因子NFATの活性化、ならびに改変された細胞によるCCL21および／またはCCL19の発現ならびに分泌によって、増幅される。
【０００７】
本明細書において記載されるように、CCR7発現カセットを、選択可能なマーカーを含む除去可能な選択カセットとともに含む、線状の遺伝子構築物のエレクトロポレーションの後で、伸長因子1a（EF1a）プロモーターによって駆動される、リンパ節ホーミング受容体であるCCR7を、安定に長期間発現するように、改変されたNK-92細胞は作製されている。ピューロマイシン選択の1週間後に連続希釈クローニングが続き、高レベルのCCR7発現を保持するモノクローナルな細胞株が確立された。これらのCCR7過剰発現NK細胞は、遊走／浸潤アッセイにおいて、リンパ節に関連するケモカインであるCCL21およびCCL19への機能的応答を有する。
【０００８】
感受性細胞株の標的エンゲージメントは、転写因子NFATの活性化およびその核移行によって、NK-92細胞において認識されることが示される。CD16またはCD3経路が関与する標的結合（ADCC、またはCARが媒介する標的認識を含む）は、NK-92細胞においてNFATの活性化を誘導するのに十分である。これは、ストップ領域に隣接する3つのNFAT結合ドメインと、ホタルルシフェラーゼを駆動する最小プロモーターとを含むレポーターカセットを挿入することによって、証明された。このレポーター細胞株へのCD19 CAR mRNAのエレクトロポレーションを介する、受容体CD3によるNFATの活性化と、それに続くSup-B15（CD19+であるが、非特異的な細胞傷害性に対して耐性）との共培養は、ルシフェラーゼの発現をもたらした。条件付きCCL21および／またはCCL19発現ベクターは、同じNFAT結合ドメインを、標的の認識の際にCCL21および／またはCCL19の発現を駆動するための最小プロモーターと組み合わせて用いることによって、構築され得る。
【０００９】
NK-92細胞株は、ヒトの、IL-2依存性NK細胞株であり、該株は、非ホジキンリンパ腫を有すると診断された50歳の男性の末梢血単核細胞（PBMC）から確立された（Gong, et al., Leukemia. 8:652-8 (1994)）。NK-92細胞は、CD3、CD8、およびCD16の非存在下でのCD56brightおよびCD2の発現によって特徴付けされる。CD56bright/CD16neg/lowという表現型は、末梢血中のNK細胞のある小サブセットに典型的であり、これは、サイトカイン産生細胞として免疫調節機能を有する。正常なNK細胞とは異なり、NK-92は、キラー細胞抑制性受容体（KIR）のほとんどを発現しない（Maki, et al., J Hematother Stem Cell Res. 10:369-83 (2001)）。活性化機能および潜在的な抑制能力を有し、すべてのNK細胞によって発現される、受容体KIRの1つであるKIR2DL4のみが、NK-92の表面上に検出された。KIR2DL4は、HLA対立遺伝子Gへの結合を介して抑制効果をもたらすと考えられている（Suck, Cancer Immunol. Immunother. 65(4):485-92 (2015)）。NK-92細胞による細胞傷害性の殺傷において主力となる経路は、パーフォリン／エステラーゼ経路を介する；NK-92は、高レベルのパーフォリンおよびグランザイムBを発現する（Maki, et al., J Hematother Stem Cell Res. 10:369-83 (2001)）。
【００１０】
NK-92細胞は、非常に広い範囲の細胞傷害性を有しており、かつ血液悪性疾患および固形腫瘍に由来する細胞株に対して活性である（Klingemann, Blood, 87(11):4913-4 (1996); Swift, Haematologica. 97(7):1020-8 (2012); Yan, et al., Clin Cancer Res. 4:2859-68 (1998)）。重症複合免疫不全（SCID）マウスにおける安全性評価は、NK-92処置に関連する影響、たとえば急性毒性または長期のがん原性といった影響が無かったことを示した（Tam, et al., J Hematother. 8:281-90 (1999), Yan, et al., Clin Cancer Res. 4:2859-68 (1998)）。ヒト白血病細胞を接種されたマウスへの、またはヒト黒色腫のマウスモデルへの、NK-92細胞の投与は、いくつかのマウス腫瘍における完全寛解を含む、生存性の改善および腫瘍増殖の抑制をもたらした（Tam, et al., J Hematother. 8:281-90 (1999), Yan, et al., Clin Cancer Res. 4:2859-68 (1998)）。第I相臨床試験により、その安全性プロファイルが確認されている。NK-92細胞株の特徴付けは、国際公開公報第1998/49268号および米国特許出願公開第2002-0068044号に開示されており、それらの全体が、参照により本明細書に組み入れられる。
【００１１】
任意で、改変されたNK-92細胞は、Fc受容体CD16も発現する。本明細書において使用される場合、「Fc受容体」なる用語は、Fc領域として知られる抗体の一部への結合によって免疫細胞の保護機能に寄与する、ある種の細胞（たとえばナチュラルキラー細胞）の表面上に見いだされるタンパク質を指す。抗体のFc領域の、細胞のFc受容体（FcR）への結合は、抗体媒介性ファゴサイトーシスまたは抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ADCC）を介して細胞のファゴサイトーシス活性または細胞傷害活性を刺激する。FcRは、それらが認識する抗体のタイプによって分類される。たとえば、Fc-ガンマ受容体（FCγR）はIgGクラスの抗体に結合する。FCγRIII-A（CD16とも称される）は、IgG抗体に結合する低親和性Fc受容体であり、かつADCCを活性化する。FCγRIII-Aは典型的にはNK細胞上に見いだされる。CD16をコードする代表的なアミノ酸配列はSEQ ID NO:12に示される。CD16をコードする代表的なポリヌクレオチド配列はSEQ ID NO:13に示される。CD16の完全な配列は、エントリーP08637としてSwissProtデータベース中に見いだされ得る。
【００１２】
任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:13と70%、80%、90%、または95%の同一性を有する核酸配列を含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:13と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する核酸配列を含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:12と70%、80%、90%、または95%の同一性を有するポリペプチドを含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:12と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチドを含む。
【００１３】
NK-92細胞の細胞傷害は、サイトカイン（たとえばインターロイキン-2（IL-2））の存在に依存する。したがって、任意で、改変されたNK-92細胞は、少なくとも1つのサイトカインを発現するようさらに改変される。任意で、少なくとも1つのサイトカインは、IL-2、IL-12、IL-15、IL-18、IL-21、またはそれらのバリアントである。任意で、少なくとも1つのサイトカインは、IL-2、IL-15、またはそれらの組み合わせである。任意で、IL-2は、IL-2を小胞体へ向けるシグナル配列とともに発現される。IL-2を小胞体に向けることで、実質的な量のIL-2を細胞外に放出することのない、オートクリンの活性化に十分なレベルでのIL-2の発現が可能になる。Konstantinidis et al “Targeting IL-2 to the endoplasmic reticulum confines autocrine growth stimulation to NK-92 cells” Exp Hematol. 2005 Feb;33(2):159-64参照。IL-2をコードする代表的な核酸はSEQ ID NO:14に示され、IL-2の代表的なポリペプチドはSEQ ID NO:15に示される。
【００１４】
任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:14と70%、80%、90%、または95%の同一性を有する核酸配列を含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:14と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%または99%の同一性を有する核酸配列を含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:15と70%、80%、90%、または95%の同一性を有するポリペプチドを含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、SEQ ID NO:15と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するポリペプチドを含む。提供される改変されたNK-92細胞は、有利なことに、臨床的な有害作用を引き起こす量のIL-2を分泌することなく、IL-2の非存在下で維持されることができる。
【００１５】
任意で、改変されたNK-92細胞は、細胞表面上にキメラ抗原受容体（CAR）を発現するように、さらに操作される。任意で、CARは、腫瘍特異的抗原に対して特異的である。腫瘍特異的抗原は、非限定的な例として、US 2013/0189268；WO 1999024566 A1；US 7098008；およびWO 2000020460 A1に記載されており、それらのそれぞれは、その全体が、参照により本明細書に組み入れられる。腫瘍特異的抗原は、限定するものではないが、NKG2D、CS1、GD2、CD138、EpCAM、EBNA3C、GPA7、CD244、CA-125、ETA、MAGE、CAGE、BAGE、HAGE、LAGE、PAGE、NY-SEO-1、GAGE、CEA、CD52、CD30、MUC5AC、c-Met、EGFR、FAB、WT-1、PSMA、NY-ESO1、AFP、CEA、CTAG1B、CD19、およびCD33を含む。CARは、たとえば、以下の番号の特許公報である、WO 2014039523；US 20140242701；US 20140274909；US 20130280285；およびWO 2014099671に記載されるように操作され得、該公報のそれぞれは、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。任意で、CARは、CD19 CAR、CD33 CAR、またはCSPG-4 CARである。
【００１６】
本明細書において、プロモーターに機能的に連結された、C-Cケモカイン受容体タイプ7（CCR7）をコードする核酸を含む、改変されたNK-92細胞が提供される。任意で、CCR7をコードする核酸は、SEQ ID NO:1と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する。任意で、CCR7は、改変されたNK-92細胞の細胞表面上に発現する。任意で、改変されたNK-92細胞は、プロモーターに機能的に連結された、C-Cモチーフリガンド21（CCL21）をコードする核酸を、さらに含む。任意で、CCL21をコードする核酸は、SEQ ID NO:2と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する。任意で、改変されたNK-92細胞は、プロモーターに機能的に連結された、C-Cモチーフリガンド19（CCL19）をコードする核酸を、さらに含む。任意で、CCL19をコードする核酸は、SEQ ID NO:16と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する。任意で、プロモーターは、1つまたは複数のNFAT結合エレメントと、最小プロモーターとを含む。任意で、プロモーターは、SEQ ID NO:6と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する。任意で、改変された細胞は、CCL19およびCCL21をコードする核酸を含む。任意で、CCL21をコードする核酸は、2Aペプチドリンカーによって、CCL19をコードする核酸に連結される。任意で、2Aペプチドリンカーは、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18を含む。任意で、改変されたNK-92細胞は、CARをさらに含む。任意で、CARは、CD19である。任意で、改変されたNK-92細胞は、Fc受容体をさらに含む。任意で、Fc受容体は、CD16である。任意で、改変されたNK-92細胞は、サイトカインをさらに含む。任意で、サイトカインは、IL-2である。
【００１７】
本明細書において、CCR7をコードする核酸を含む、発現ベクターが、提供される。任意で、発現ベクターは、CCL21をコードする核酸をさらに含む。任意で、発現ベクターは、CCL19をコードする核酸をさらに含む。任意で、発現ベクターは、CCR7と、CCL21と、CCL19とをコードする核酸を含み、任意で、これらのそれぞれは、同じプロモーターに、または異なるプロモーターに、機能的に連結されている。任意で、CCR7とCCL21とをコードする核酸は、プロモーターに機能的に連結される。任意で、該核酸は、同じプロモーターに機能的に連結される。任意で、CCR7をコードする核酸は、第一のプロモーターに機能的に連結され、かつCCL21をコードする核酸は、第二のプロモーターに機能的に連結される。任意で、第二のプロモーターは、CCL21およびCCL19の発現を駆動する。任意で、CCL21およびCCL19をコードする核酸は、2Aペプチドリンカーによって連結される。例示的なプロモーターは、限定されるものではないが、CMVプロモーター、ユビキチンプロモーター、PGKプロモーター、およびEF1 alsoプロモーターを含む。任意で、本明細書において、SEQ ID NO:1を有する核酸か、またはSEQ ID NO:1と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有する核酸を含む発現ベクターが、提供される。任意で、核酸は、プロモーターに機能的に連結される。任意で、プロモーターは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、もしくはSEQ ID NO:11からなる群より選択されるか、またはプロモーターは、SEQ ID NO:3と、SEQ ID NO:9と、SEQ ID NO:10と、もしくはSEQ ID NO:11と、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有する。また、SEQ ID NO:2を有する核酸か、またはSEQ ID NO:2と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有する核酸を含む発現ベクターも、提供される。任意で、核酸は、プロモーターに機能的に連結される。任意で、プロモーターは、SEQ ID NO:4および／またはSEQ ID NO:5を含む。任意で、プロモーターは、SEQ ID NO:6を含むか、またはSEQ ID NO:6と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有する核酸を含む。任意で、提供される発現ベクターは、SEQ ID NO:1か、またはSEQ ID NO:1と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有する核酸、およびSEQ ID NO:2か、またはSEQ ID NO:2と90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、もしくは99%の同一性を有する核酸の、両方を含む。適した発現ベクターは公知であって、かつ使用され得る。任意で、発現ベクターは、プラスミドである。
【００１８】
本明細書において、CCR7を含み、ならびに任意でCCL21および／またはCCL19をも含む改変されたNK-92細胞を作製する方法が、提供される。方法は、NK-92細胞を、発現ベクターで形質転換する段階を含み、該発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結された、CCR7をコードする核酸を含む。任意で、方法は、CCR7を含む改変されたNK-92細胞を、第二の発現ベクターで形質転換する段階をさらに含み、該第二の発現ベクターは、プロモーターに機能的に連結された、CCL21をコードする核酸を含む。第二の発現ベクターは、CCL21と同じプロモーターに、またはCCL21とは異なるプロモーターに機能的に連結された、CCL19をコードする核酸を、さらに含み得る。任意で、方法は、CCR7およびCCL21を含む改変されたNK-92細胞を、第三の発現ベクターでさらに形質転換する段階を含み、該第三の発現ベクターは、CCL19をコードする核酸を含む。任意で、方法は、NK-92細胞を、CCR7をコードする核酸、CCL21をコードする核酸、CCL19をコードする核酸、またはそれらの任意の組み合わせを含む発現ベクターで形質転換する段階を含む。発現ベクターは、CCR7をコードする核酸に機能的に連結されるプロモーターを、さらに含み得、該プロモーターは、CCL21および／もしくはCCL19を発現させるために使用されてよく、またはあるいは、発現ベクターは、CCL21および／もしくはCCL19に機能的に連結された、異なるプロモーターを、さらに含んでもよい。任意で、CCL21および／またはCCL19に機能的に連結されるプロモーターは、転写因子NFATの活性化に、応答性である。
【００１９】
本明細書において使用される場合、プロモーターなる用語、プロモーターエレメントなる用語、および制御配列なる用語は、該プロモーターに機能的に連結された、選択されたポリヌクレオチド配列の発現を制御し、かつ細胞において該選択されたポリヌクレオチド配列の発現に影響を及ぼすポリヌクレオチドを、指す。スラウストキトリウム（Thraustochytrium）プロモーターなる用語は、本明細書において使用される場合、スラウストキトリウム細胞において機能するプロモーターを指す。いくつかの態様において、プロモーターエレメントは、コード配列の5’側の位置における非翻訳領域（UTR）であるか、またはそれを含む。5’ UTRは、mRNA転写物の一部を形成しており、かつそのため、真核生物におけるタンパク質発現の不可欠な要素である。転写されると、5’UTRは、転写レベルおよび翻訳レベルの両方において、タンパク質発現を制御することができる。哺乳類宿主細胞において、ベクターからの転写を制御するプロモーターは、さまざまな供給源から得ることができ、該供給源は、たとえば、ポリオーマウイルス、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、レトロウイルス、B型肝炎ウイルス、およびサイトメガロウイルス（たとえばSEQ ID NO:11）などの、ウイルスのゲノムであるか、または異種性の哺乳類プロモーター、これはたとえば、ベータアクチンプロモーター、真核生物の翻訳伸長因子1アルファ1（EF1α）プロモーター（たとえばSEQ ID NO:3）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（PGK）プロモーター（たとえばSEQ ID NO:10）、およびユビキチンプロモーター（たとえばSEQ ID NO:9）である。本明細書において、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、またはSEQ ID NO:11と、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有するプロモーターが提供される。
【００２０】
選択可能なマーカーなる表現は、本明細書において使用される場合、たとえば、選択を可能にする産物（ポリペプチド）をコードする遺伝子のようなヌクレオチド配列、または遺伝子産物（たとえばポリペプチド）それ自体、のいずれかを指す。選択可能なマーカーなる用語は、本明細書において、当技術分野において一般的に理解されているように使用され、かつ、細胞または生物内におけるその存在が、ある定義される培養条件（選択的な条件）下で、該細胞または生物に、増殖上または生存上有意に有利なもしくは不利な点を付与するマーカーを指す。選択剤なる表現は、本明細書において使用される場合、細胞に、または細胞の集団に、選択可能なマーカーを有する該細胞または細胞の集団にとって有利または不利のいずれかである選択圧を導入する、作用物質を指す。たとえば、選択剤は抗生物質であり、かつ選択可能なマーカーは抗生物質耐性遺伝子である。哺乳類細胞に適する、選択可能なマーカーの例は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（DHFR）、チミジンキナーゼ、ネオマイシン、ネオマイシンアナログG418、ハイグロマイシン（hydromycin）、およびピューロマイシンである。
【００２１】
核酸とは、本明細書において使用される場合、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチド、ならびにそれらの重合体および相補体を指す。この語は、単鎖型もしくは二重鎖型のいずれかの、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを含む。この語は、合成、天然、および非天然であり、参照の核酸に類似した結合特性を有し、かつ参照のヌクレオチドに類似した様式で代謝される、公知のヌクレオチドアナログまたは改変された主鎖残基もしくは結合を含む核酸を包含する。そのようなアナログの例は、限定するものではないが、ホスホロチオエート、ホスホロアミダート、メチルホスホナート、キラル-メチルホスホナート、2-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸（PNA）を含む。他に指示されない限り、核酸配列の保存的に改変された変異体（たとえば縮重コドン置換）、および相補配列は、本明細書において記載される特定の核酸配列の代わりに使用され得る。具体的には、縮重コドン置換は、1つもしくは複数の選択された（またはすべての）コドンの第3位が混合塩基および／またはデオキシイノシン残基で置換された配列を作製することによって達成され得る（Batzer et al., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka et al., J. Biol. Chem. 260:2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8:91-98 (1994)）。核酸なる用語は、遺伝子、cDNA、mRNA、オリゴヌクレオチド、およびポリヌクレオチドと、互換性をもって使用される。
【００２２】
核酸は、それが別の核酸配列と機能的関係に置かれる場合に、機能的に連結される。たとえば、プレ配列もしくは分泌リーダーをコードするDNAは、それがポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現される場合、ポリペプチドをコードするDNAに機能的に連結されている；プロモーターもしくはエンハンサーは、それが配列の転写に影響を及ぼす場合、コード配列に機能的に連結されている；または、リボソーム結合部位は、それが翻訳を促進するように配置される場合、コード配列に機能的に連結されている。一般的に、機能的に連結されるとは、連結されたDNA配列が互いに近くにあり、分泌リーダーの場合には、連続的であってかつ読み取り相（reading phase）中にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは連続的でなくてもよい。たとえば、第2の核酸配列と機能的に連結される核酸配列は、任意の有効な3次元的会合が許容されるが、そのような第2の配列と、直接的または間接的のいずれかで共有結合される。単一の核酸配列は、複数の他の配列に、機能的に連結され得る。たとえば、単一のプロモーターが複数のRNA種の転写に作用し得る。連結は、都合の良い制限部位でのライゲーションによって達成され得る。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプターまたはリンカーが、従来の慣行にしたがって使用される。
【００２３】
同一、またはパーセント同一性なる用語は、2以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈では、以下に記載されるデフォルトのパラメーターでBLASTもしくはBLAST 2.0配列比較アルゴリズムを用いて測定された場合に、または手作業でのアラインメントおよび目視検査によって測定された場合に（たとえばNCBIのウェブサイト等を参照）、同じであるか、もしくは同じアミノ酸残基もしくはヌクレオチドの特定のパーセンテージ（すなわち、比較ウィンドウもしくは指定された領域にわたって最大限一致するよう比較されそしてアラインされた場合の、特定の領域にわたる約60%の同一性、好ましくは65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%の、もしくはより高い同一性）を有する、2以上の配列またはサブ配列を指す。そのような配列は、したがって、実質的に同一である、と言われる。この定義はまた、試験配列の相補体を指すか、またはこれに適用されてよい。該定義はまた、置換を有する配列とともに、欠失および／または付加を有する配列をも含む。以下に記載されるように、好ましいアルゴリズムは、ギャップ等を明らかにすることができる。好ましくは同一性は、少なくとも約25アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さの領域にわたって、またはより好ましくは50〜100アミノ酸もしくはヌクレオチドの長さの領域にわたって存在する。
【００２４】
配列比較のためには、典型的には1つの配列が、それに対して試験配列が比較される参照配列の役割をはたす。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験配列および参照配列がコンピューターに入力され；必要であればサブ配列の座標が指定され；そして配列アルゴリズムのプログラムパラメーターが指定される。好ましくは、デフォルトのプログラムパラメーターが使用され得、または代替のパラメーターが指定され得る。配列比較アルゴリズムはその後、プログラムパラメーターに基づき、参照配列に対する試験配列のパーセント配列同一性を算定する。
【００２５】
比較ウィンドウとは、本明細書において使用される場合、20〜600、通常約50〜約200、より通常には約100〜約150からなる群より選択されるいずれか1つの数の、連続的な位置のセグメントへの言及を含み、ここで配列は、同じ数の連続的な位置の参照配列と、該2つの配列が最適にアラインされた後で比較されてよい。比較のための配列のアラインメントの方法は、当技術分野において周知である。比較のための、配列の最適なアラインメントは、たとえばSmith & Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)の局所相同性アルゴリズムによって；Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)の相同性アラインメントアルゴリズムによって；Pearson & Lipman, Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444 (1988)の類似性検索の方法によって；これらのアルゴリズムのコンピューター化された遂行によって（the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIにおけるGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）；または手作業でのアラインメントおよび目視検査によって、実施され得る（たとえばCurrent Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 1995 supplement)参照）。
【００２６】
パーセント配列同一性および配列類似性を決定するために適切なアルゴリズムの好ましい例はBLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらはそれぞれ、Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)、およびAltschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)に記載されている。BLASTおよびBLAST 2.0は、本明細書において記載されるパラメーターを用いて、核酸またはタンパク質のパーセント配列同一性を決定するために使用される。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、当技術分野において公知であるように、the National Center for Biotechnology Informationを通じて公に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインされた場合に何らかの正の値の閾値スコアTとマッチするかまたはこれを充足するかいずれかの、クエリー配列中の選択された長さ（W）の短いワードを同定することによって、高スコアリング配列ペア（high scoring sequence pair）（HSP）を同定することを、最初に含む。Tは、隣接ワードスコア閾値（neighborhood word score threshold）と称される（Altschulら、前記）。これらの、最初の隣接ワードヒット（neighborhood word hit）は、それらを含む、より長いHSPを発見するための検索を開始するための種（seed）として働く。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り、各配列に沿って両方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列に関しては、パラメーターM（マッチする残基のペアのリワードスコア（reward score）；常に ＞0）およびN（ミスマッチの残基のペナルティスコア（penalty score）；常に ＜0）を用いて算定される。アミノ酸配列に関しては、累積スコアを算定するためにスコアリングマトリックス（scoring matrix）が使用される。各方向におけるワードヒットの拡張は、累積アラインメントスコアがその最大の達成値からXの量が減少した時に；累積スコアが、1つもしくは複数の負のスコアリング残基アラインメントの蓄積のために、ゼロもしくはそれ以下となった時に；またはいずれかの配列の末端に到達した時に、停止される。BLASTアルゴリズムのパラメーター、W、T、およびXは、アラインメントの鋭敏性および速度を決定する。期待値（E）は、データベース検索において偶然に生じると予想されるものと同等またはそれより良いスコアを有する、異なるアラインメントの数を表す。BLASTNプログラム（ヌクレオチド配列用）は、デフォルトとして、11のワード長（W）、10の期待値（E）、M = 5、N = -4、および両鎖の比較を使用する。アミノ酸配列用のBLASTPプログラムは、デフォルトとして、3のワード長、10の期待値（E）、およびBLOSUM62のスコアリングマトリックス（Henikoff & Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915 (1989)参照）、50のアラインメント（B）、10の期待値（E）、M = 5、N = -4、および両鎖の比較を使用する。
【００２７】
形質転換なる用語は、本明細書において使用される場合、それによって外来のまたは異種性の核酸分子（たとえばベクターもしくは組み換え核酸分子）がレシピエント細胞に導入されるプロセスを指す。外来のもしくは異種性の核酸分子は、宿主細胞のゲノムを構成する染色体DNA中に組み込まれて（すなわち、これと共有結合して）もよく、または組み込まれなくてもよい。たとえば、外来のまたは異種性のポリヌクレオチドは、プラスミドなどのエピソーム性のエレメント上で維持されてよい。あるいは、または加えて、外来のもしくは異種性のポリヌクレオチドは、それが染色体複製を通じて娘細胞に継承されるように、染色体に組み込まれてよい。形質転換のための方法は、限定するものではないが、リン酸カルシウム沈殿；組み換え核酸を含む細菌プロトプラストとのレシピエント細胞の融合；組み換え核酸を含むリポソームでのレシピエント細胞の処理；DEAEデキストラン；ポリエチレングリコール（PEG）を用いる融合；エレクトロポレーション；マグネトポレーション（magnetoporation）；バイオリスティック送達；レトロウイルス感染；リポフェクション；および細胞への直接的なDNAのマイクロインジェクションを含む。
【００２８】
形質転換された、なる用語は、細胞に関して使用される場合、細胞が外来のまたは異種性の遺伝的物質（たとえば組み換え核酸）を所持するように、本明細書において記載されるように形質転換を受けた細胞を指す。形質転換された、なる用語はまた、またはあるいは、外来のもしくは異種性の遺伝的物質を含む細胞、細胞型、組織、生物等を指すために使用され得る。
【００２９】
導入する、なる用語は、本明細書において、細胞へのまたは生物への核酸の導入に関して使用される場合、その最も広い意味を有すること、ならびに、たとえば、形質転換法（たとえば、塩化カルシウムを用いる形質転換、エレクトロポレーション、パーティクルボンバードメント）による導入、およびさらに、形質導入、接合、および交配を含む他の方法による導入をも包含することが、意図される。任意で、核酸を細胞中または生物中に導入するために、構築物が利用される。
【００３０】
改変された、なる用語、および組み換えなる用語は、細胞、核酸、ポリペプチド、ベクター等に関して使用される場合、細胞、核酸、ポリペプチド、ベクター等が、実験室的方法によって改変されているかまたは実験室的方法の成果であり、かつ非天然であることを示す。したがって、たとえば、改変された細胞とは、実験室的な手法、たとえば細胞に核酸を導入するための形質転換方法によって産生または改変された細胞を含む。改変された細胞は、天然（非組み換え）型の細胞中には見いだされない核酸配列を含み得るか、または変更された核酸配列、たとえば非天然のプロモーターに結合された核酸配列を含み得る。
【００３１】
本明細書において使用される場合、外来なる用語は、核酸（たとえば、制御配列および／もしくは遺伝子を含む、核酸）またはポリペプチドなどの物質であって、細胞もしくは生物へ人工的に導入される、および／もしくはそれが存在する細胞中で天然には生じない、物質を指す。言い換えると、核酸またはポリペプチドなどの物質は、それが導入される細胞または生物以外の起源を有する。外来の核酸は、細胞中に天然に存在する核酸のヌクレオチド配列と同一のヌクレオチド配列を有し得る。たとえば、NK-92細胞は、NK-92の配列、たとえばヘパラナーゼを有する核酸を含むように操作され得る。任意で、内在性のNK-92ヘパラナーゼ配列は、天然の条件下では関連することのない制御配列を有する遺伝子に、機能的に連結される。NK-92ヘパラナーゼ配列は、宿主細胞において天然に生じ得るが、導入された核酸は、本開示によれば、外来である。外来の核酸は、細胞中に天然に存在する任意の核酸のヌクレオチド配列とは異なるヌクレオチド配列を、有し得る。たとえば、外来の核酸は、異種性の核酸、すなわち異なる種または生物からの核酸であり得る。したがって、外来の核酸は、供給源の生物において天然に見いだされる核酸の配列と同一であるが、該外来の核酸が導入される細胞のものとは異なる核酸配列を、有し得る。本明細書において使用される場合、内在性なる用語は、細胞にもともと備わっている核酸配列を指す。本明細書において使用される場合、異種性なる用語は、細胞にもともと備わっているわけではない核酸配列、すなわち該細胞とは異なる生物からの核酸配列を指す。外来なる用語、および内在性なる用語、または異種性なる用語は、相互排他的ではない。したがって、核酸配列は、外来であってかつ内在性であり得、これは、核酸配列がある細胞に導入され得るが、該核酸配列は、該細胞中に天然に存在する核酸の配列と同じであるかまたは類似する配列を有することを意味する。同様に、核酸配列は、外来であってかつ異種性であり得、これは、核酸配列がある細胞に導入され得るが、該核酸配列は、該細胞にもともと備わっているわけではない配列、たとえば異なる生物からの配列を有することを意味する。
【００３２】
本明細書において記載されるように、対照または標準対照とは、試験試料、試験測定値、もしくは試験値との比較のための参照、通常は既知の参照として働く、試料、測定値、または値を指す。たとえば、試験細胞、たとえばFc受容体の遺伝子をコードする核酸配列で形質転換された細胞は、既知の正常な（野生型）細胞（たとえば標準対照細胞）と比較され得る。標準対照はまた、Fc受容体を発現しないか、またはFc受容体活性を有さないかもしくは最少のレベルのFc受容体活性を有する細胞の集団（たとえば標準対照細胞）から得られる、平均的測定値または平均値を表し得る。当業者は、標準対照が、任意の数のパラメーター（たとえばRNAレベル、ポリペプチドレベル、特定の細胞タイプ等）の評価のために設計され得ることを理解するであろう。
【００３３】
本明細書において使用される場合、「がん」なる用語は、哺乳類において見いだされるすべての種類のがん、新生物、または悪性腫瘍を指し、白血病、癌腫、および肉腫を含む。例示的ながんは、脳のがん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、頭頚部がん、肝臓がん、腎臓がん、肺がん、非小細胞肺がん、黒色腫、中皮腫、卵巣がん、肉腫、胃がん、子宮がん、および髄芽腫を含む。追加の例は、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、多発性骨髄腫、神経芽腫、卵巣がん、横紋筋肉腫、原発性血小板血症、原発性マクログロブリン血症、原発性脳腫瘍、がん、悪性膵臓インスリノーマ、悪性カルチノイド、膀胱がん、前がん性皮膚病変、精巣がん、リンパ腫、甲状腺がん、神経芽腫、食道がん、尿生殖路のがん、悪性高カルシウム血症、子宮内膜がん、副腎皮質がん、膵臓内分泌のおよび膵臓外分泌の新生物、ならびに前立腺がんを含む。
【００３４】
本明細書において使用される場合、「転移」なる用語、「転移性」なる用語、および「転移したがん」なる用語は、互換性をもって使用されることができ、かつ、1つの器官からの、または近接していない別の器官もしくは体の一部からの、増殖性の疾患または障害、たとえばがんの、拡大を指す。がんは、起源の部位において生じ、該部位は原発性腫瘍と称される、たとえば起源の部位が乳房であれば、該部位は、たとえば原発性乳がんと称される。原発性腫瘍における、または起源の部位における、いくつかのがん細胞は、局所領域において周辺の正常な組織に侵入および浸潤する能力、ならびに／または全身を循環するリンパ系もしくは血管系の壁に侵入して体内の他の部位および組織に至る能力を、獲得する。原発性腫瘍のがん細胞から形成された、臨床的に検出可能な第二の腫瘍は、転移性腫瘍または二次性腫瘍と称される。がん細胞が転移した場合、転移性腫瘍およびその細胞は、元の腫瘍のそれらと類似していると推定される。したがって、肺がんが乳房に転移した場合、乳房の部位における二次性腫瘍は、異常な肺細胞と、異常ではない乳房細胞とからなる。乳房における二次性腫瘍は、転移した肺がんと称される。したがって、転移性がんなる表現は、対象が、原発性腫瘍を有しているかまたは過去に原発性腫瘍を有しており、かつ1つまたは複数の二次性腫瘍を有している、という疾患を指す。非転移性がんなる表現、または転移性でないがんを有する対象、なる表現は、対象が、原発性腫瘍を有しているが、1つまたは複数の二次性腫瘍を有さない、という疾患を指す。たとえば、転移した肺がん、とは、原発性肺腫瘍を有しているかまたは原発性肺腫瘍の既往歴を有しており、かつ第二の位置かまたは複数の位置において、たとえば乳房において、1つまたは複数の二次性腫瘍を有している対象における、疾患を指す。
【００３５】
本明細書において使用される場合、異常、疾患、もしくは障害を「処置する」か、もしくはそれらの「処置」とは、または異常、疾患、または障害に関連する症状を「処置する」か、もしくはそれらの「処置」とは、有益なまたは望ましい結果を得るためのアプローチを指し、該結果とは、臨床結果を含む。有益な、または望ましい臨床結果とは、限定されるものではないが、1つもしくは複数の症状もしくは異常の、軽減または改善、異常、障害、または疾患の、程度の低減、異常、障害、または疾患の、状態の安定、異常、障害、または疾患の、進展の防止、異常、障害、または疾患の、拡大の防止、異常、障害、もしくは疾患の、進行の遅延または緩徐化、異常、障害、もしくは疾患の、発症の遅延または緩徐化、異常、障害、もしくは疾患の、状態の改善または緩和、および部分的なものまたは全体的なものいずれかの寛解を、含み得る。「処置する」とはまた、処置の非存在下で予想されるものを超えて、対象の生存を延長することをも意味し得る。「処置する」とはまた、異常、障害、または疾患の進行を阻害することや、異常、障害、または疾患の進行を一時的に緩徐化することをも意味し得るが、いくつかの例において、それは、異常、障害、または疾患の進行を永続的に停止することに関連する。本明細書において使用される場合、処置（treatment）なる用語、処置する（treat）なる用語、または処置する（treating）なる用語は、プロテアーゼの発現によって特徴付けされる疾患もしくは異常の1つもしくは複数の症状の影響を減少させる、またはプロテアーゼの発現によって特徴付けされる疾患もしくは異常の症状を減少させる、方法を指す。したがって、開示される方法において、処置とは、既存の疾患の重篤性、異常の重篤性、または疾患もしくは異常の症状の重篤性を、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、または100%減少させることを指し得る。たとえば、疾患を処置するための方法とは、対照と比較して、対象において疾患の1つまたは複数の症状が10%減少する場合の、処置であると考えられる。したがって、減少とは、天然のまたは対照のレベルと比較して、10%の、20%の、30%の、40%の、50%の、60%の、70%の、80%の、90%の、100%の、または10%〜100%の間における任意のパーセントの減少であり得る。処置とは、疾患の、異常の、または疾患もしくは異常の症状の治癒または完全な除去を必ずしも指すわけではないことが、理解される。さらに、本明細書において使用される場合、低下させる、減少させる、または阻害することへの言及は、対照のレベルと比較して、10%の、20%の、30%の、40%の、50%の、60%の、70%の、80%の、90%の、またはより大きい変化を含み、かつそのような用語は、完全な消失を含み得るが、完全な消失を必ず含むわけではない。
【００３６】
対象なる用語、患者なる用語、個体なる用語等は、限定することを意図したものではなく、かつ概して互換性を有し得る。すなわち、患者として記載される個体は、必ずしも所定の疾患を有しているわけではなく、単に診察を受けようとしているだけの可能性がある。明細書全体において使用されるように、対象は、脊椎動物であり得、より具体的には、哺乳類（たとえば、ヒト、ウマ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、マウス、ウサギ、ラット、およびモルモット）、鳥類、爬虫類、両生類、魚類、ならびに任意の他の動物であり得る。該用語は、特定の年齢や性別を意味するものではない。したがって、成体の対象も生まれたばかりの対象も、雄であっても雌であっても、包含されることが意図される。本明細書において使用される場合、患者、個体、および対象は、互換性をもって使用され得、かつこれらの用語は、限定することを意図したものではない。すなわち、患者として記載される個体は、必ずしも所定の疾患を有しているわけではなく、単に診察を受けようとしているだけの可能性がある。患者なる用語または対象なる用語は、ヒト対象および獣医学上の対象を含む。
【００３７】
「投与」または「投与する」とは、本明細書において使用される場合、望ましい効果を達成するために適した任意の経路によって、1種類の化合物もしくは複数種類の化合物を、提供すること、接触させること、および／または送達することを指す。投与は、限定するものではないが、経口投与、舌下投与、非経口投与（たとえば、静脈内注入、皮下注入、皮内注入、筋肉内注入、関節内注入、動脈内注入、滑膜内注入、胸骨内注入、髄腔内注入、病巣内注入、または頭蓋内注入）、経皮投与、局所投与、頬側投与、直腸投与、膣投与、鼻投与、眼投与、吸入による投与、およびインプラントを含み得る。任意で、NK-92細胞は、非経口投与される。任意で、NK-92細胞は、静脈内投与される。任意で、NK-92細胞は、腫瘍周辺に投与される。
【００３８】
したがって、本明細書において、対象においてがんの転移を減少させる方法が提供され、該方法は、その細胞表面上にCCR7を発現する改変されたNK-92細胞の治療的有効量を、対象に投与する段階であって、それにより、対象においてがんの転移を減少させる段階を含む。また、対象においてがんを処置する方法も提供され、該方法は、がんを有する対象を選択する段階、およびその細胞表面上にCCR7を発現する改変されたNK-92細胞の治療的有効量を対象に投与する段階を含み、ここで投与は、対象においてがんを処置する。任意で、細胞は、CCL21をさらに発現する。任意で、方法は、追加の治療剤を対象に投与する段階をさらに含む。
【００３９】
NK-92細胞は、多様な経路によって対象に投与され得る。たとえば、NK-92細胞は、ある期間にわたり、注入（たとえば静脈内注入）によって対象に投与され得る。典型的には、NK-92細胞の一回量について、期間は5分〜130分である。任意で、期間は90分〜120分である。任意で、期間は15分〜30分である。
【００４０】
NK-92細胞、および任意で他の抗がん剤は、がんを有する患者に1回投与されることができるし、たとえば、治療の期間中、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、もしくは23時間ごとに1回、または1、2、3、4、5、6、もしくは7日ごとに1回、または1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週、もしくはより多い週ごとに1回、またはこれらの数の端点を含む任意の2つの間の任意の範囲ごとに1回、というように、複数回投与されることができる。したがって、たとえば、NK-92細胞は、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、またはそれより多い日数にわたり、1日に1回対象に投与され得る。任意で、NK-92細胞は、2日間にわたり1日に1回、というサイクルにおいて投与される。サイクルは、その後に、1時間もしくはそれより長い、1日もしくはそれより長い、または1週間もしくはそれより長い、NK-92細胞による処置のない期間が続く。本明細書において使用される場合、「サイクル」なる用語は、その間に休薬期間（たとえば、処置無しか、または他の作用物質による処置）を有する、規則的なスケジュールで繰り返される処置を指す。たとえば、1週間にわたって与えられる処置と、その後に続く2週間の休薬が、1回の処置サイクルである。処置のそのようなサイクルは、1回または複数回繰り返され得る。したがって、NK-92細胞は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20サイクル、またはそれより多いサイクルにおいて、投与され得る。
【００４１】
NK-92細胞は細胞の絶対数によって対象に投与され得る、たとえば該対象は、1回の注入につき約、少なくとも約、もしくは最大で約1 x 1010、1 x 109、1 x 108、1 x 107、5 x 107、1 x 106、5 x 106、1 x 105、5 x 105、1 x 104、5 x 104、1 x 103、5 x 103（等々）個のNK-92細胞、またはこれらの数の端点を含む任意の2つの間の任意の範囲などの、細胞約1000個／注入から細胞約100億個／注入までを投与され得る。任意で、1 x 108〜1 x 1010個の細胞が対象に投与される。任意で、細胞は、1週または複数週の間、週に1回または複数回投与される。任意で、細胞は、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10週、またはより多い週の間、週に1回もしくは2回投与される。
【００４２】
任意で、対象は、1回の注入につき約、少なくとも約、もしくは最大で約1 x 1010個／m2、1 x 109個／m2、1 x 108個／m2、1 x 107個／m2、5 x 107個／m2、1 x 106個／m2、5 x 106個／m2、1 x 105個／m2、5 x 105個／m2、1 x 104個／m2、5 x 104個／m2、1 x 103個／m2、5 x 103個／m2（等々）のNK-92細胞、またはこれらの数の端点を含む任意の2つの間の任意の範囲などの、細胞約1000個／注入／m2から細胞約100億個／注入／m2までを投与される。任意で、1 x 103個／m2〜1 x 1010個／m2のNK-92細胞が対象に投与される。任意で、2 x 109個／m2個のNK-92細胞が対象に投与される。
【００４３】
任意で、NK-92細胞は、細胞の相対数によってそのような個体に投与され得る、たとえば該個体は、個体1キログラムにつき約、少なくとも約、もしくは最大で約1 x 1010、1 x 109、1 x 108、1 x 107、5 x 107、1 x 106、5 x 106、1 x 105、5 x 105、1 x 104、5 x 104、1 x 103、5 x 103（等々）個のNK-92細胞、またはこれらの数の端点を含む任意の2つの間の任意の範囲などの、個体1キログラムにつき細胞約1000個から細胞約100億個までを投与され得る。
【００４４】
任意で、総用量は体表面積のm2によって算定されてよく、1 m2につき約1 x 1011、1 x 1010、1 x 109、1 x 108、1 x 107個を、またはこれらの数の端点を含む任意の2つの間の任意の範囲を含む。任意で、約10億〜約30億個のNK-92細胞が患者に投与される。任意で、1用量あたりの注入されるNK-92細胞の量は体表面積のm2によって算定されてよく、1 m2につき1 x 1011、1 x 1010、1 x 109、1 x 108、1 x 107、1 x 106、1 x 105、1 x 104、1 x 103個を含む。
【００４５】
任意で、NK-92細胞は、NK-92細胞と、ヒト血清またはその等価物などの媒体とを含む組成物において投与される。任意で、媒体はヒト血清アルブミンを含む。任意で、媒体はヒト血漿を含む。任意で、媒体は約1%〜約15%のヒト血清またはヒト血清等価物を含む。任意で、媒体は約1%〜約10%のヒト血清またはヒト血清等価物を含む。任意で、媒体は約1%〜約5%のヒト血清またはヒト血清等価物を含む。任意で、媒体は約2.5%ヒト血清またはヒト血清等価物を含む。任意で、血清はヒトAB血清である。任意で、ヒト治療剤における使用のために許容される血清代替品がヒト血清の代わりに使用される。そのような血清代替品は、当技術分野において公知のものであってよい。任意で、NK-92細胞は、NK-92細胞と、細胞生存能能力を持続させる等張な液体の溶液とを含む組成物中において投与される。任意で、NK-92細胞は、凍結保存された試料から再構成された組成物において投与される。
【００４６】
本明細書において提供される方法にしたがって、本明細書において提供される1つまたは複数の作用物質の有効量が対象に投与される。有効量なる用語および有効用量なる用語は互換性をもって使用される。有効量なる用語は、望ましい生理的応答（たとえば炎症の減少）を引き起こすのに必要な任意の量として定義される。作用物質の投与のための有効量およびスケジュールは当業者によって経験的に決定されてよい。投与のための用量の範囲は、疾患または障害の1つもしくは複数の症状に影響を及ぼす（たとえば減少させるまたは遅らせる）という望ましい効果を引き起こすのに十分大きいものである。用量は、望まれない交差反応、アナフィラキシー反応等といった、実質的な有害な副作用を引き起こすほどに大きくするべきではない。一般的に用量は、年齢、健康状態、性別、疾患のタイプ、疾患もしくは障害の程度、投与の経路、または他の薬剤がレジメン中に含まれるかどうかによって異なり、当業者によって決定され得る。用量は、何らかの禁忌がある場合には、個々の医師によって調整され得る。用量は変えることができ、かつ1種または複数種の用量の投与で、1日に1回、1日または数日の間投与されることができる。手引きは、所定のクラスの薬学的産物のための適切な用量に関する文献に見いだされ得る。たとえば、有効量は、所定のパラメーターについて少なくとも5%、10%、15%、20%、25%、40%、50%、60%、75%、80%、90%、もしくは少なくとも100%の増加または低下を示すであろう。有効性はまた、増加「倍率」または低下「倍率」として表現され得る。たとえば治療的有効量は、対照よりも少なくとも1.2倍、1.5倍、2倍、5倍、またはそれより多い効果を有し得る。厳密な用量および剤形は、処置の目的によって決まり、かつ公知の技術を用いて当業者が確認可能である（たとえば、Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (vols. 1-3, 1992)；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding (1999)；Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Gennaro, Editor (2012)、およびPickar, Dosage Calculations (1999)参照）。
【００４７】
薬学的に許容される組成物は、多様な担体および賦形剤を含み得る。多様な水性担体、たとえば緩衝生理的食塩水等が使用され得る。これらの溶液は滅菌され、かつ一般的に、望ましくない物質を含まない。適切な担体およびそれらの調合は、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 22nd Edition, Loyd V. Allen et al., editors, Pharmaceutical Press (2012)に記載されている。薬学的に許容される担体は、生物学的にも他の点でも有害でない材料を意味する。すなわち、該材料は、有害な生物学的影響を引き起こすことも、それが含まれる薬学的組成物の他の構成要素と有害な様式で相互作用することもなく、対象に投与される。対象に投与される場合、担体は任意で、有効成分の分解を最小限にするように、かつ対象における有害な副作用を最小限にするように、選択される。本明細書において使用される場合、薬学的に許容される、なる用語は、生理学的に許容される、および薬理学的に許容される、と同義語として使用される。薬学的組成物は、一般的に緩衝剤および保管中の保存剤を含み、かつ、投与の経路に応じて、適切な送達のための緩衝液および担体を含み得る。
【００４８】
組成物は、たとえば酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム塩化カルシウム、乳酸ナトリウム等の、pH調整および緩衝剤、毒性調整剤等といった、生理的条件に近づけるために必要とされる、許容される補助的な物質を含んでよい。これらの製剤中の細胞の濃度、および／または他の作用物質の濃度は変えることができ、かつ、選択された特定の投与方法、および対象の必要性にしたがって、主として流体の量、粘性、体重等に基づいて選択される。
【００４９】
任意で、NK-92細胞は、処置されるがんのための1つまたは複数の他の治療とともに対象に投与される。理論に拘束されるものではないが、NK-92細胞およびがんに対する別の療法での対象の共処置は、NK-92細胞およびこの別の療法が、内在性免疫系に、そのような内在性作用をこれまで圧倒していたがんを排除する機会をもたらすことを可能にすると考えられる。任意で、処置されるがんのための2以上の他の処置は、たとえば、抗体療法、放射線療法、化学療法、幹細胞移植療法、またはホルモン療法を含む。
【００５０】
任意で、抗体がNK-92細胞とともに患者に投与される。任意で、NK-92細胞および抗体は、対象に、たとえば同じ製剤中で、一緒に投与されるか；たとえば別々の製剤中で同時に、別々に投与されるか；またはたとえば異なる投与スケジュールでもしくは1日のうちの異なる時刻で、別々に投与され得る。別々に投与される場合、抗体は、静脈内投与または経口投与などの、任意の適した経路で投与され得る。
【００５１】
任意で、抗体は、がん性細胞またはがんに関連するマーカーを発現する細胞を標的とするために使用されてよい。多数の抗体が、がんの処置のみのために承認されている。
【００５２】
提供される方法は、他の腫瘍療法とさらに組み合わせられ得、該療法は、放射線療法、手術、ホルモン療法、および／または免疫療法などである。したがって、提供される方法は、1つまたは複数の追加の治療剤を対象に投与する段階をさらに含み得る。適した追加の治療剤は、限定されるものではないが、鎮痛剤、麻酔剤、中枢神経興奮剤、コルチコステロイド、抗コリン作用剤、抗コリンエステラーゼ剤、鎮痙剤、抗新生物剤、アロステリック阻害剤、アナボリックステロイド、抗リウマチ剤、精神治療剤、神経遮断剤、抗炎症剤、駆虫剤、抗生物質、抗凝固剤、抗真菌剤、抗ヒスタミン剤、抗ムスカリン様作用剤、抗マイコバクテリア剤、抗原虫剤、抗ウイルス剤、ドーパミン作用剤、血液系作用剤、免疫剤、ムスカリン様作用剤、プロテアーゼ阻害剤、ビタミン、増殖因子、およびホルモンを含む。治療剤の選択および投薬量は、処置される所定の疾患に基づいて、当業者によって容易に決定され得る。任意で、追加の治療剤は、酢酸オクトレオチド、インターフェロン、ペムブロリズマブ、グルコピラノシルリピドA、カルボプラチン、エトポシド、またはそれらの任意の組み合わせである。
【００５３】
任意で、追加の治療剤は、化学療法剤である。化学療法の処置レジメンは、対象への、1種類の化学療法剤の投与、または化学療法剤の組み合わせの投与を含み得る。化学療法剤は、限定されるものではないが、アルキル化剤、アントラサイクリン、タキサン、エポチロン、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤、トポイソメラーゼIの阻害剤、トポイソメラーゼIIの阻害剤、キナーゼ阻害剤、モノクローナル抗体、ヌクレオチドアナログおよび前駆体アナログ、ペプチド抗生物質、プラチナベースの化合物、レチノイド、ならびにビンカアルカロイドおよび誘導体を含む。任意で、化学療法剤は、カルボプラチンである。
【００５４】
作用物質もしくは組成物の組み合わせは、一緒に（たとえば混合物として）、別々だが同時に（たとえば別々の静脈経路を介して）、または連続的に（たとえば、1つの作用物質が先に投与され、それに第2の作用物質の投与が続く）のいずれかで投与され得る。したがって、組み合わせなる用語は、2つ以上の作用物質または組成物の、一緒の、同時の、または連続的な投与を指すために使用される。一連の処置は、対象の特定の特徴、および選択される処置のタイプに応じて、個々に最善に決定される。本明細書において開示されるものなどの処置は、対象に、1日に1回、1日に2回、2週間に1回、月に1回、または治療的に有効な任意の適切な基準で投与され得る。処置は、単独で、または本明細書において開示される、もしくは当技術分野において公知の、任意の他の処置との組み合わせで投与され得る。追加の処置は、第1の処置と同時に、異なる時間に、または完全に異なる治療スケジュールで（たとえば第1の処置は1日に1回であってよく、一方で追加の処置は1週間に1回である）投与され得る。
【００５５】
本明細書において、プロモーターに機能的に連結された、C-Cケモカイン受容体タイプ7（CCR7）をコードする核酸を含む、改変されたNK-92細胞を含むキットが提供される。任意で、CCR7をコードする核酸は、SEQ ID NO:1と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する。任意で、CCR7は、改変されたNK-92細胞の細胞表面上に発現する。任意で、改変されたNK-92細胞は、プロモーターに機能的に連結された、C-Cモチーフリガンド21（CCL21）をコードする核酸を、さらに含む。任意で、CCL21をコードする核酸は、SEQ ID NO:2と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する。任意で、改変されたNK-92細胞は、プロモーターに機能的に連結された、C-Cモチーフリガンド19（CCL19）をコードする核酸を、さらに含む。任意で、CCL19をコードする核酸は、SEQ ID NO:16と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する。任意で、プロモーターは、1つまたは複数のNFAT結合エレメントと、最小プロモーターとを含む。任意で、プロモーターは、SEQ ID NO:6と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する。任意で、プロモーターは、CCL21およびCCL19の両方の発現を駆動する。任意で、CCL19およびCCL21をコードする核酸は、2Aペプチドリンカーによって連結され、該リンカーは、たとえば、SEQ ID NO:17またはSEQ ID NO:18である。任意で、改変されたNK-92細胞は、薬学的に許容される賦形剤を含む組成物として、提供される。任意で、キットは、改変されたNK-92細胞の投与の前に、同時に、または後に投与されるべき、治療的に有効な化合物または薬剤などの追加の化合物を含んでよい。任意で、キットの使用のための指示書は、がんの処置における、キットの構成要素を使用するための指示を含む。指示書は、調製（たとえば、凍結乾燥されたタンパク質の場合には希釈または再構成）を、抗体ならびにNK-92細胞（たとえば解凍および／または培養）についてどのように行うかに関する情報を、さらに含んでよい。指示書は、投与の用量および頻度に関する手引きをさらに含んでよい。
【００５６】
開示される方法および組成物のために使用され得る、それらとともに使用され得る、それらの調製のために使用され得る、またはそれらの産物である、材料、組成物、および構成要素が開示される。これらおよび他の材料が本明細書において開示される、そして、これらの材料の組み合わせ、サブセット、相互作用、群等が開示されていて、これら化合物のさまざまな個々のおよび集合的な組み合わせのならびに変更のそれぞれへの具体的な言及が明示的に開示されていないかもしれない場合にも、それぞれは具体的に意図され、本明細書において記載されることが理解される。たとえば、ある方法が開示および考察されており、かつ該方法を含むいくつかの分子に対してなされ得るいくつかの改変が考察される場合、該方法の、それぞれのおよびすべての組み合わせならびに変更、ならびに可能な改変が、そうでないことが具体的に指示されない限り、具体的に意図される。同様に、これらの任意のサブセットまたは組み合わせもまた、具体的に意図されかつ開示される。この概念は、限定するものではないが、開示される組成物を用いる方法における工程を含む、本開示のすべての局面に適用される。したがって、実施され得る多様な追加の工程が存在する場合、これら追加の工程のそれぞれは、開示される方法の、任意の特定の方法の工程でまたは方法の工程の組み合わせで実施され得ること、およびそのような組み合わせまたは組み合わせのサブセットのそれぞれが、具体的に意図され、かつ開示されているとみなされるべきであることが、理解される。
【００５７】
本明細書において引用される刊行物、および引用される資料は、本明細書によって明確に、それらの全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００５８】
以下の実施例は、本明細書において記載される方法および組成物のある局面をさらに説明することを意図したものであり、請求の範囲を限定することを意図したものではない。
【実施例】
【００５９】
実施例1.  CCR7を発現する、改変されたNK細胞株
PflFI酵素を用いてプラスミドpNKAT-CCR7-LP3（図1）を線状化し、続いて線状のプラスミドをゲル精製し、そしてその後、線状のプラスミドを、NEONトランスフェクションシステム（Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）を用いてNK-92細胞にエレクトロポレーションすることによって、改変されたNK-92細胞を作製した。ピューロマイシン選択の1週間後、得られたポリクローナルな集団を、CCR7の発現に関して試験し、そして5% ヒト血清およびIL-2を添加されたX-Vivo（商標）培地（Lonza, Basel, Switzerland）中での連続希釈によって、モノクローナルな細胞株を得た。25% 条件培地（ポリクローナルな集団からの、フィルター滅菌された上清）の追加により、改善された選択が観察された。改変されたNK-92細胞は、EF1αプロモーターと、ポリAテールを有するCCR7遺伝子と、ユビキチンプロモーターによって駆動される、LoxPに挟まれたピューロマイシン耐性遺伝子とを含んでおり、これらのすべては、AAVS1遺伝子座を標的とするホモロジーアームに囲まれている（SEQ ID NO:7）。実施例において使用され、かつ明細書全体において論じられる配列は、表1に示される。
【００６０】
CCR7の発現がNK-92細胞に影響を及ぼさないことを実証するため、NK-92細胞マーカーの2つの発現を決定した。結果は図3に示される。図3におけるすべてのデータは、Intellicyt iQue screener plusを用いて生成された。細胞を、記載される表現型マーカーに対するAPCコンジュゲート抗体か、または陰性対照として適切なアイソタイプのいずれかとともに、4℃で30分間インキュベートした。細胞をその後、PBS + 1% BSA中ですすぎ、ペレット化し、30 uLのPBS + 1% BSA中に再懸濁した。リードアウトを、左上の四半分に示されるように、リーディングから細胞デブリを消失させるためにゲーティングし、そして右上の四半分に示される蛍光閾値を超える細胞のパーセンテージを、2つの別々のヒートマップとして表示した。該ヒートマップは、「陽性」の閾値を超えるパーセンテージ、および「強陽性」の閾値を超えるパーセンテージを、それぞれ、左下および右下の四半分において示す。図3は、CCR7の発現を駆動させても、本発明者らの細胞株に関連する主要な表現型マーカーには有意な影響を及ぼさないことを示す。具体的には、CCR7の発現は、NKp30の発現にもNKG2Dの発現にも影響を及ぼさないようであり、ICAM-1の発現をわずかに増加させ得る。
【００６１】
改変されたNK-92細胞の細胞傷害性を決定するため、エフェクター細胞（Nk-92細胞、および改変されたNK-92細胞クローン）を、96ウェルV底プレート（横向き）の左のウェル中に播種し、そしてその後、最高濃度のウェル中に100000個のエフェクターを残して2倍希釈を7回行うように、8列のプレートにわたって連続的に希釈した。次いで、染色された標的細胞（K562（図4）、HL-60（図5）を、バックグラウンド細胞死を測定するための標的のみの対照ウェルとともに、エフェクター細胞の入ったすべてのウェルに、10000個／ウェルで播種した。プレートを短時間スピンダウンし、そして37℃かつ5% CO2で4時間にわたりインキュベートした。プレートをスピンダウンし、上清を吸引除去し、そして細胞を、細胞死を測定するため、ヨウ化プロピジウムを含むPBS中に再懸濁した。細胞をその後、Intellicyt iQue screener plusに供し、そしてそれらもまたPI染色に対して陽性である標的細胞（染色により、エフェクターとは区別される）の割合を測定した。この時点での「真の」エフェクター対標的比もまた、算定した。これは、iQueによって計数されたエフェクター細胞および標的細胞の数を表す。死細胞のパーセンテージを、対照ウェルにおいて自然に死滅した細胞の数と比較し、エフェクターによって特異的に殺傷された細胞のパーセンテージを算定した。結果は図4および5に示される。図4は、K562細胞に対し、CCR7が上方制御されているクローンにおける細胞傷害性が、親細胞株と比較して同程度であることを示し、図5は、HL-60細胞に対し、CCR7が上方制御されているクローンにおける細胞傷害性が、親細胞株と比較して同程度であることを示す。
【００６２】
インビトロ試験は、ボイデンチャンバーアッセイ、および遊走をブロックするマトリゲル層を用いることからなっていた。CCR7を発現する改変された細胞は、これらのアッセイにおいて、CCL21およびCCL19（CCR7の別のリガンド）に向かう遊走を示した。細胞を、上部ウェルに入れ、8 uM ポア上にコートされたマトリゲル（ECM様基質）の薄い層によって、下部チャンバーから隔てた。細胞（25000個／ウェル）を、低血清培地（X-Vivo 10 + 1% ヒト血清 + 500 U/mL IL-2）中において上部チャンバーに入れ、そして同じ低血清培地を、それ単独か、または対象となるケモカインを含むかのいずれかで、下部チャンバーにおいて使用した。この試験では、CCL21は15 ng/mLで使用され、CCL19は15 ng/mLで使用され、SDF-1aは20 ng/mLで使用された。試験をそれぞれ、Nk-92細胞、またはCCR7を発現する改変されたNK-92細胞のいずれかに関して、3連で行った。続いてプレートを、18時間の浸潤アッセイのため、インキュベーター内に一晩置き、その後上部チャンバーを除去し、十分な混合およびMacsQuant FACS解析機器における読み取りの後で、150 μL（全量750 μLのうちの）を下部ウェルからサンプリングした。下部チャンバー中の生細胞を計数し、細胞の数を、ケモカインを含まないウェルと比較し、浸潤指数を生成した。これらの数値を平均し、統計学的適切性を、両側t検定を用いて算定した。下部膜から細胞を脱離させることなく下部ウェルをサンプリングしたので、ECMの下部部分に結合したままのそれらの細胞がこれらの数値に反映されていない可能性があり、これが、CCL19とCCL21との間の差異をもたらしているようである。結果は図7に示される。具体的には、図7は、CCR7を発現する改変されたNK-92細胞の、CCR7に対するケモカインであるCCL19への浸潤性が、統計学的に有意に増加したことを示す。それはまた、骨髄転移に関与するケモカインであるSDF-1aへの浸潤性の低下をも示し、これは、受容体CCR7の上方制御に対する応答のようである。CCL21への統計学的に有意な応答の欠如は、実施されたアッセイの性質に起因する可能性がある。アッセイは、浸潤およびそれに続くECMからの脱離の両方を測定し、この挙動は、CCL19勾配における遊走と一致する。CCL21は、遊走を誘導する一方で、マトリックスからの脱離は誘導せず、統計学的に有意な浸潤の潜在性を証明するためには追加の段階を必要とする。
【００６３】
CCR7を発現するさまざまな改変されたNK-92細胞クローン（図8においてaNKと称される、NK-92野生型対照とともに）の、ヒトケモカインであるCCL19を発現するように操作された細胞（K-19細胞）に向かって遊走する能力を、評価した。同じタイプの野生型細胞（K562）への細胞動員もまた、決定した。浸潤アッセイを、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（CFSE）で染色されたエフェクターで、Corning Biocoat Transwellアッセイを用いて実施した。Transwellの下部のウェルを、野生型K562、またはCCL19を発現するように操作されたK562のバリアントであるK-19、のいずれかとインキュベートし、K-19のウェル中の浸潤細胞の数を、フローサイトメトリーによって、K562のウェル中の浸潤細胞の数と比較した。結果は図8に示される。CCR7を発現するNK-92細胞は、K-19細胞に向かって遊走する。
【００６４】
NSGマウスにおいて対側性の腫瘍を、片方の脇腹にK562、および他方の脇腹にK-19（CCL19を発現するように操作されたK562）として生じさせることによって、CCR7分布のインビボ研究を行った。エフェクター細胞をCFSEで染色し、そしてその後、尾静脈への注入によって投与した。腫瘍をさまざまな時点で採取し、そして、腫瘍細胞の単細胞懸濁液を作製し、そしてその後フローサイトメーターに供することによって、CFSE染色された浸潤しているエフェクターの数を計数した。図9Aは、注入の3時間後の時点での、すべてのコホートにおいて集積している細胞の数を示し、これは、受容体CCR7を備えたエフェクターが投与された場合に、CCL19供給源を有するように発生させた腫瘍へのホーミングが有意に改善されることを証明する。図9Bは、24時間の時点での4匹のマウス中の3匹において、CCL19を分泌する腫瘍への、CCR7+コホートからの動員が、増加したことを示す。
【００６５】
CCR7を発現するNK-92細胞はまた、Fc受容体およびCARを発現することもできる。受容体CCR7を有する3つのバリアントとともに、野生型NK-92細胞の染色を実施した。結果は図10に示される。図10の1段目は、CCR7、CD16、およびCD19 CARについての野生型細胞の染色を示し、これらはすべて陰性のベースラインである。2段目は、CCR7のみを発現する細胞を示す。3段目は、CCR7およびCD16を発現する細胞を示す（これはまた、ヒト血清に由来するIgGに起因して、プロテインL染色によっていくらかの陽性を示す）。4段目は、CCR7、CD16、およびCD19 CARを発現する細胞を示す（プロテインL染色に陽性である）。
【００６６】
実施例2.  CCL21の制御された発現のための、NFAT応答性構築物の作製
NFAT応答性エレメントを同定するため、NFATベースのルシフェラーゼ発現カセットを安定に発現する細胞株（NR2.2）を、線状の構築物をNk-92細胞にエレクトロポレーションすることによって、作製した。該構築物は、ストップ領域、それに続く3つのNFAT応答エレメント（SEQ ID NO:4）、および最小プロモーター（SEQ ID NO:5）を含み、該プロモーターは、活性化されたNFATの存在下で、それによりホタルルシフェラーゼの産生を駆動し得る。これらの細胞のサブセットには、抗CD19 CAR（CD19はSup-B15細胞に存在する抗原であり、該CARが無ければ、Sup-B15細胞はNK-92細胞による殺傷に対して耐性）を含むmRNAもまた、その後エレクトロポレーションした。これらの細胞は、左のグラフにおいてENR2.2として表される。続いて細胞を、標的細胞の非存在下または存在下において、3連でプレーティングし、そして2.5時間〜24時間の範囲の期間にわたりインキュベートした。インキュベーション期間の終了時に、Promega DualGlo systemのStep 1試薬を、ルシフェラーゼを活性化するために（その基質であるルシフェリンを与えることによって）、ウェルに追加した。結果を、SpectraMax i3xプレートリーダーにおいて読み取り、Microsoft Excelにおいて算定された標準偏差をともなう平均として表した。結果は図6Aおよび6Bに示される。NFATの活性化は、時間依存性の様式での、K562に対する標的結合、およびCD19-CARのmRNAがエレクトロポレーションされた場合のみSup-B15に対する標的結合、という状況において証明された。
【００６７】
実施例3.  CCR7およびCCL21を発現する、改変されたNK細胞株
プラスミドpCRENFAT-CCL21は、リコンビナーゼ媒介カセット交換において、pNKAT-CCR7-LP3構築物中に埋め込まれたLoxP部位を用いて、CCR7を含むNK-92細胞中に組み込まれる。環状プラスミド（pCRENFAT-CCL21）のエレクトロポレーションに続き、Creリコンビナーゼを一過性に発現させ、古い選択カセットの、LoxPに挟まれた新しいカセットとの交換を、媒介する。新しいカセットの組み込みを容易にするためにブラストサイジンでの選択を使用し、選択された集団から、CCR7およびCCL21を発現する改変されたNK-92細胞を得るために、先に実施例1において記載されたものと同じ様式で、モノクローナルな細胞株をサブクローニングする。
【００６８】
CCR7およびCCL21を発現する、改変されたNK-92細胞を評価するため、ボイデンチャンバーの下部ウェルにおいて、未染色の改変されたNK-92細胞を、NFATの活性化を引き起こすことが既知である細胞（K562、または他の細胞株）と共培養し、染色された改変NK-92細胞を上部チャンバーに入れる。感受性細胞株との共培養によって遊走が誘導されると証明される場合、このシステムは有効である。
【００６９】
追加のインビボアッセイとして、マトリゲルプラグに埋め込まれた、CCL21を分泌する標的細胞を用いることによって、遊走部分を試験する。シンジェニックマウスモデルまたはNSGマウスモデルにおいて小さな腫瘍を形成させるために、標的細胞を使用し、続いて、操作されたエフェクター細胞を、異なる経路によって（たとえば、皮下 対 尾静脈によって）マウスに与える。細胞が、適切な走化性リガンドを分泌する細胞に向かって優先的に遊走する場合、これは、改変された細胞が、がん細胞を標的としていることを証明する。
【００７０】
（表１）配列
2021531808.tif 000003
2021531808.tif 000004
2021531808.tif 000005
2021531808.tif 000006
2021531808.tif 000007
2021531808.tif 000008
2021531808.tif 000009
2021531808.tif 000010
2021531808.tif 000011
2021531808.tif 000012
【図１】
2021531808.tif 000014
【図２】
2021531808.tif 000015
【図３】
2021531808.tif 000016
【図４】
2021531808.tif 000017
【図５】
2021531808.tif 000018
【図６Ａ】
2021531808.tif 000019
【図６Ｂ】
2021531808.tif 000020
【図７】
2021531808.tif 000021
【図８】
2021531808.tif 000022
【図９Ａ】
2021531808.tif 000023
【図９Ｂ】
2021531808.tif 000024
【図１０】
2021531808.tif 000025
【配列表】
2021531808000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年3月23日(2021.3.23)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロモーターに機能的に連結された、C-Cケモカイン受容体タイプ7（CCR7）をコードする核酸を含む、改変されたNK-92細胞。
【請求項２】
CCR7をコードする核酸が、SEQ ID NO:1と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する、請求項1に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項３】
CCR7が、改変されたNK-92細胞の細胞表面上に発現する、請求項1または2に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項４】
プロモーターに機能的に連結された、C-Cモチーフリガンド21（CCL21）をコードする核酸をさらに含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項５】
CCL21をコードする核酸が、SEQ ID NO:2と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する、請求項4に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項６】
C-Cモチーフリガンド19（CCL19）をコードする核酸をさらに含む、請求項1〜5のいずれか一項に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項７】
CCL19をコードする核酸が、2Aペプチドリンカーによって、CCL21をコードする核酸に連結され、かつ同一のプロモーターが、CCL19およびCCL21の発現を駆動する、請求項6に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項８】
プロモーターが、1つまたは複数のNFAT結合エレメントと、最小プロモーターとを含む、請求項4〜7のいずれか一項に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項９】
プロモーターが、SEQ ID NO:6と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する、請求項4〜8のいずれか一項に記載の改変されたNK-92細胞。
【請求項１０】
請求項1〜9のいずれか一項に記載のNK-92細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
【請求項１１】
請求項1〜9のいずれか一項に記載のNK-92細胞と、使用のための指示書とを含む、キット。
【請求項１２】
請求項1〜9のいずれか一項に記載のNK-92細胞を含む、対象においてがんの転移を減少させるための薬学的組成物。
【請求項１３】
その細胞表面上にCCR7を発現する改変されたNK-92細胞の治療的有効量を含む、対象においてがんを処置するための薬学的組成物。
【請求項１４】
細胞がCCL21をさらに発現する、請求項13に記載の薬学的組成物。
【請求項１５】
1 m2あたり1 x 103〜1 x 1010個のNK-92細胞を含む、請求項13または14に記載の薬学的組成物。
【請求項１６】
非経口投与される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１７】
静脈内投与される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１８】
腫瘍周辺に投与される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項１９】
ある期間にわたり、注入によって対象に投与される、請求項13〜15のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２０】
期間が5分〜130分である、請求項19に記載の薬学的組成物。
【請求項２１】
1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、またはそれより多い日数にわたり、1日に1回対象に投与される、請求項13〜20のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
追加の治療剤とともに投与される、請求項13〜21のいずれか一項に記載の薬学的組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００４】
1つまたは複数の態様の詳細が、添付の図面および以下の説明に記載される。他の特徴、目的、および利点は、該説明および図面から、ならびに請求の範囲から、明らかである。
[本発明1001]
プロモーターに機能的に連結された、C-Cケモカイン受容体タイプ7（CCR7）をコードする核酸を含む、改変されたNK-92細胞。
[本発明1002]
CCR7をコードする核酸が、SEQ ID NO:1と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する、本発明1001の改変されたNK-92細胞。
[本発明1003]
CCR7が、改変されたNK-92細胞の細胞表面上に発現する、本発明1001または1002の改変されたNK-92細胞。
[本発明1004]
プロモーターに機能的に連結された、C-Cモチーフリガンド21（CCL21）をコードする核酸をさらに含む、本発明1001〜1003のいずれかの改変されたNK-92細胞。
[本発明1005]
CCL21をコードする核酸が、SEQ ID NO:2と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する、本発明1004の改変されたNK-92細胞。
[本発明1006]
C-Cモチーフリガンド19（CCL19）をコードする核酸をさらに含む、本発明1001〜1005のいずれかの改変されたNK-92細胞。
[本発明1007]
CCL19をコードする核酸が、2Aペプチドリンカーによって、CCL21をコードする核酸に連結され、かつ同一のプロモーターが、CCL19およびCCL21の発現を駆動する、本発明1006の改変されたNK-92細胞。
[本発明1008]
プロモーターが、1つまたは複数のNFAT結合エレメントと、最小プロモーターとを含む、本発明1004〜1007のいずれかの改変されたNK-92細胞。
[本発明1009]
プロモーターが、SEQ ID NO:6と少なくとも90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、または99%の同一性を有する、本発明1004〜1008のいずれかの改変されたNK-92細胞。
[本発明1010]
本発明1001〜1009のいずれかのNK-92細胞と、薬学的に許容される賦形剤とを含む、組成物。
[本発明1011]
本発明1001〜1009のいずれかのNK-92細胞と、使用のための指示書とを含む、キット。
[本発明1012]
対象においてがんの転移を減少させる方法であって、本発明1010の組成物を対象に投与する段階を含み、それにより、対象においてがんの転移を減少させる、方法。
[本発明1013]
対象においてがんを処置する方法であって、以下の段階を含む、方法：
(a)  がんを有する対象を選択する段階；
(b)  その細胞表面上にCCR7を発現する改変されたNK-92細胞の治療的有効量を対象に投与する段階であって、投与が対象においてがんを処置する、段階。
[本発明1014]
細胞がCCL21をさらに発現する、本発明1013の方法。
[本発明1015]
1 m2あたり1 x 103〜1 x 1010個のNK-92細胞が、対象に投与される、本発明1013または1014の方法。
[本発明1016]
NK-92細胞が非経口投与される、本発明1013〜1015のいずれかの方法。
[本発明1017]
NK-92細胞が静脈内投与される、本発明1013〜1015のいずれかの方法。
[本発明1018]
NK-92細胞が腫瘍周辺に投与される、本発明1013〜1015のいずれかの方法。
[本発明1019]
NK-92細胞が、ある期間にわたり、注入によって対象に投与される、本発明1013〜1015のいずれかの方法。
[本発明1020]
期間が5分〜130分である、本発明1019の方法。
[本発明1021]
NK-92細胞が、1日間、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、8日間、9日間、10日間、11日間、12日間、13日間、14日間、15日間、16日間、17日間、18日間、19日間、20日間、またはそれより多い日数にわたり、1日に1回対象に投与される、本発明1013〜1020のいずれかの方法。
[本発明1022]
追加の治療剤を対象に投与する段階をさらに含む、本発明1013〜1021のいずれかの方法。
【国際調査報告】
2021531808.tif 000026
2021531808.tif 000027
2021531808.tif 000028
2021531808.tif 000029
2021531808.tif 000030