(57)【要約】本発明は、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む薬物送達システムを提供するための、特に、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断するための方法、上記方法によって得られ得る薬物送達システムおよび新規ＶＬＰに関する。上記方法は、ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする、およびＶＬＰへと再アセンブルする工程を包含する。これらの工程は、２回繰り返され得、それによって改善された有効性を提供し得る。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む薬物送達システムを提供するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）  ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
ｂ）  該ａ）の組成物の該ＶＰ１タンパク質を、該ＶＰ１を誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルする工程、
ｃ）  該ｂ）の組成物の該ＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｄ）  該（ｃ）の組成物の該ペンタマーを、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへと再アセンブルする工程
ｅ）  該ｄ）の組成物の該ＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件へと曝す工程、
ｆ）  該ｅ）の組成物の該ペンタマーを、カーゴおよび該ペンタマーを誘導する条件に曝して、該カーゴと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程、
を包含する方法。
【請求項２】
工程ｄ）の前に、前記ｃ）の組成物の前記ペンタマーは、該ペンタマーの凝集を誘導する条件へと曝される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凝集は、沈殿剤、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルコール、塩またはこれらの組み合わせからなる群より選択される沈殿剤によって、最も好ましくは塩によって誘導される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記塩は、シトレート（Ｃ６Ｈ５Ｏ７３−）、ホスフェート（ＰＯ４３−）、スルフェート（ＳＯ４２−）、リン酸水素（ＨＰＯ４２−）、リン酸二水素（Ｈ２ＰＯ４−）、ヨウ素酸（ＩＯ３−）、ヒドロキシド（ＯＨ−）、フルオリド（Ｆ−）、臭素酸（ＢｒＯ３−）またはアセテート（ＣＨ３ＣＯＯ−）、四級アンモニウム化合物（ＮＲ４＋）であって、Ｒは、アルキル基もしくはアリール基であるもの、好ましくはテトラメチルアンモニウム（（ＣＨ３）４Ｎ＋）またはジメチルアンモニウム（（ＣＨ３）２Ｎ２＋）、アンモニウム（ＮＨ４＋）、カリウム（Ｋ＋）、セシウム（Ｃｓ＋）、ルビジウム（Ｒｂ＋）またはリチウム（Ｌｉ＋）からなる群より選択される、アニオンおよびカチオンを含み、好ましくはＳＯ４２−および／またはＮＨ４＋を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記塩は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４およびＮａ２ＨＰＯ４からなる群より選択され、好ましくは（ＮＨ４）２ＳＯ４である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｄ）は、ｄ）の組成物のペンタマーを、該ペンタマーの凝集を誘導する条件から分離することを包含する、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記分離は、塩および緩衝液、ならびに６〜８．５の、好ましくは６．５〜８．５の、より好ましくは７〜８の、最も好ましくは７．２〜７．５の、特に７．５のｐＨを含む組成物に対する透析によって達成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程ｄ）の組成物は、
ａ）０．３未満、好ましくは０．２未満、好ましくは０．１未満の多分散指数（ＰＤＩ）、より好ましくは０．０１〜０．０９の間の範囲の多分散指数、および／または
ｂ）ＶＬＰのうちの少なくとも７０％が２０ｎｍ〜７０ｎｍの、好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍの、より好ましくは３５ｎｍ〜６５ｎｍの、より好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有する、
によって特徴づけられる、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
約−８０℃〜約４℃の温度において少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、好ましくは少なくとも２４時間にわたって、より好ましくは約−８０℃の温度において少なくとも２４時間にわたって、前記工程ｄ）の組成物からのＶＬＰを貯蔵する工程を包含する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
貯蔵する工程は、凍結防止添加剤、好ましくはポリオール、糖、無機塩、有機塩、アミノ酸、ポリマー、エクストリモライト、またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む群から選択される凍結防止添加剤を含む組成物の中で起こる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記無機塩は、スルフェートアニオンを含み、好ましくは硫酸アンモニウムであり、そして／または前記アミノ酸は、グリシン、グルタミン、プロリン、アラニンであり、そして／または前記アミノ酸誘導体は、ベタインである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程ｂ）のＶＬＰ、前記工程ｃ）のペンタマーおよび／または前記工程ｄ）のＶＬＰは精製に供される、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ＶＰ１は、配列番号１に従うアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有する、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列である、前述の請求項のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
以下のパラメーターのうちの１またはこれより多くによって特徴づけられる、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物：
ａ）０．３未満、好ましくは０．２未満、好ましくは０．１未満、より好ましくは０．０１〜０．０９の間の範囲の多分散指数（ＰＤＩ）、
ｂ）ＶＬＰのうちの少なくとも７０％が、２０ｎｍ〜７０ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍの、より好ましくは３５ｎｍ〜６５ｎｍの、より好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有する、
ｃ）前記組成物内のＶＬＰ含有量が、少なくとも８０％（ｖ／ｖ）。好ましくは少なくとも８５％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９５％（ｖ／ｖ）。
【請求項１６】
前述の請求項のいずれかに記載の方法によって得られ得る、薬物送達システム。
【請求項１７】
必要性のある被験体における治療および／または診断の方法における使用のための、好ましくは神経学的障害の、特にＣＮＳ疾患の処置のための、請求項１６に記載の薬物送達システム。
【請求項１８】
請求項１の工程ａ）〜ｅ）および前記ｅ）の組成物の前記ペンタマーを、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルするというさらなる工程を包含する方法によって得られ得る、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１９】
前記ＶＬＰは血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する、請求項１６もしくは１７に記載の薬物送達システム、または請求項１８に記載のＶＬＰ。
【請求項２０】
ＶＬＰは、前記薬物送達システムの投与後に、好ましくはｉ．ｖ．投与後に、１０日間以内にＣＮＳにおいて検出可能である、請求項  １９に記載の薬物送達システムまたはＶＬＰ。
【請求項２１】
前記ＶＬＰは、生理学的に無傷のＢＢＢを横断する、請求項１９または２０に記載の薬物送達システムまたはＶＬＰ。
【請求項２２】
前記横断は、前記ＢＢＢの完全性の喪失または透過性の増大を要求しない、請求項２０に記載の薬物送達システムまたはＶＬＰ。
【請求項２３】
前記被験体は、彼のＢＢＢの透過性を増大させるか、またはその混乱を誘導するという処置を受けたことがない、請求項１７に記載の薬物送達システム。
【請求項２４】
塩および緩衝液を含み、そしてｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．５の、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物であって、該組成物は、好ましくは：
ａ）１２０ｍＭ〜１７０ｍＭ  ＮａＣｌ、好ましくは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、
ｂ）１〜５ｍＭ  ＣａＣｌ２、好ましくは２ｍＭ  ＣａＣｌ２、および
ｃ）５〜３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、好ましくは１０〜２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、より好ましくは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
を含む、組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明は、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む、薬物送達システム（ＤＤＳ）を提供するための、特に血液脳関門（ＢＢＢ）を横断するための方法、薬物送達システムならびに上記方法によって得られる新規なＶＬＰおよびＶＬＰ含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
血液脳関門（ＢＢＢ）は、血液と脳との間にある高度に選択的かつ透過性の膜である。その関門は、循環血液を、中枢神経系（ＣＮＳ）における脳細胞外液（ＢＥＣＦ）から分離するように機能する。ＢＢＢは、本来は高度に選択的であり、受動拡散によって、脂溶性分子、水およびある種のガスの通過のみを可能にする。その関門はまた、分子（例えば、グルコースおよびアミノ酸）を選択的に輸送し、これら分子は、神経機能に必須である。さらに、ＢＢＢは、親油性の潜在的な神経毒が脳に入ることを妨げる。
【０００３】
生理学的条件下では、ＢＢＢは、不要な物質がＣＮＳに入ることを実質的に防止するように有効に機能する。大きなナノ治療剤および低分子の大多数（低分子のうちの９８％と概算）は、ＢＢＢが原因で、脳に入ることが制限される。生理学的（健康な）条件下では、ＢＢＢの機能は、従って、貴重である。しかし、ＣＮＳ疾患または薬学的生成物でのＣＮＳの処置を要する任意の他の障害の事象において、ＢＢＢは、有効な処置に対する大きなハードルとなる。
【０００４】
ＢＢＢを横断して、その薬学的生成物（薬物、カーゴ）を成功裡に輸送するという問題に加えて、ＣＮＳ送達の間に遭遇し得るそれら問題に注意を払わなければならない。たとえその薬学的生成物がＢＢＢを横断するとしても、治療上関連する濃度において存在しないことがある。さらに、脳組織中のある種の酵素は、その薬学的生成物を不活性化し、その製品を無効にするかまたはあまり有効でなくすることがある。従って、その薬学的生成物は、ＢＢＢを横断し得るが、これが脳内部に一旦入った後に、分解され得る。
【０００５】
ＢＢＢを横断して薬学的生成物を輸送することに影響を与えるためのいくつかのストラテジーが公知である。薬学的生成物が実際に脳へと透過し得る程度は、一方のストラテジーから他方のストラテジーまで変動する。一方のストラテジーは、ＢＢＢの透過性を増大させることである。これを用いると、ＢＢＢを横断する薬学的生成物の量が増大され得るのみならず、その薬学的生成物の遊離形態および結合形態の両方が、その関門を横断するように作製され得る。
【０００６】
ＢＢＢの透過性を増大させるための手段としては、浸透圧による開放（ｏｓｍｏｔｉｃ  ｏｐｅｎｉｎｇ）または化学的開放が挙げられる。浸透圧による開放は、高張液（ｈｙｐｅｒｔｏｎｉｃｓ）で可能であり得、これは、ＢＢＢの表面に直接適用される場合に、ＢＢＢを混乱させる（ｄｉｓｒｕｐｔ）能力を有する。化学的開放は、ＢＢＢの透過性を増大させるというより選択的かつ制御可能なアプローチである。通常の毛細管は、血管作用性ロイコトリエン処置を使用してそれらの透過性を増大させる場合には、影響を与えられないようである。脳腫瘍の毛細管は、これらの処置により感受性が高い。研究から、ブラジキニンは、通常の脳における毛細管に影響を与えることなく、脳腫瘍の毛細管を開くことが明らかになった。
【０００７】
脳血管拡張または集中超音波照射（ｆｏｃｕｓｅｄ  ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ  ｒａｄｉａｔｉｏｎ）は、ＢＢＢの透過性を増大させるための他方のアプローチを表す。脳血管拡張は、血管を拡げて脳血流を増大させるというプロセスに言及する。集中超音波照射、すなわち、低周波数（例えば、２６０ｋＨｚ）、ＭＲＩガイド下超音波は、その関門の局所のかつ可逆的な混乱を誘導し得る。
【０００８】
薬学的生成物をＣＮＳへと輸送する別のアプローチは、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）に基づく薬物送達システムの使用である。そのＶＬＰは、薬物（「カーゴ」）に装填される。このような薬物送達システムは、国際公開第２０１３／１３１６４４号  Ａ１で開示される。静脈内投与後に、そのＶＬＰがその事前の操作なしにＢＢＢを横断し得、これを用いると、生理学的に無傷のＢＢＢを超えてそのＶＬＰと一緒にその薬物を輸送し得ることが記載される。ＪＣＶに由来するＶＬＰを含む薬物送達システムの生成のための方法は、国際公開第２０１３／０１７２７２号  Ａ１の主題である。
国際公開第２０１３／１３１６４４号  Ａ１の開示は、ＪＣＶに由来するＶＬＰがインビボでその生理学的に無傷のＢＢＢを超えて横断するという最初の実験による証拠を提供した。よって、薬学的生成物に装填されたＪＣＶに由来するＶＬＰは、ＣＮＳに入るための有望な薬物送達システムである。しかし、このシステムの有効性をさらに改善することが依然として必要である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００９】
【特許文献１】国際公開第２０１３／１３１６４４号  Ａ１
【特許文献２】国際公開第２０１３／０１７２７２号  Ａ１
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１０】
発明の要旨
従って、本発明の目的は、改善された有効性を有する、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するＶＬＰに基づく、特に薬学的生成物をＣＮＳへと送達するための、薬物送達システムを提供することである。改善された有効性は、特に、より多くのカーゴがＣＮＳに達することを意味する。その改善された有効性は、相互作用し得る多数の理由があり得る。より高い有効性は、例えば、より多量のＶＬＰおよび／またはカーゴがＣＮＳに入るように、ＶＬＰによるＢＢＢのより有効な横断に起因し得る。それは、ＣＮＳに達した後に、そのＶＬＰからのカーゴの改善された放出に等しく起因し得る、さらに、そのより高い有効性の理由は、各個々のＶＬＰがより多量のカーゴに装填され得るか、または装填されるＶＬＰの量全体が増大され得るという事実であり得る。
【００１１】
驚くべきことに、改善された有効性を有するＪＣＶに由来するＶＬＰを含む薬物送達システムは、上記薬物送達システムを生成するための方法が上記ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする工程および上記ペンタマーをＶＬＰへと再アセンブルする工程を２回包含する場合に提供され得ることは、本発明者らによって見出された。上記方法は、以下の工程を包含する：
ａ）ＪＣＶのＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
ｂ）上記工程ａ）の組成物のＶＰ１タンパク質を、上記ＶＰ１を誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルする工程、
ｃ）上記ｂ）の組成物のＶＬＰを、上記ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｄ）上記ｃ）の組成物のペンタマーを、上記ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへと再アセンブルする工程、
ｅ）上記ｄ）の組成物のＶＬＰを、上記ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｆ）上記ｅ）の組成物のペンタマーを、カーゴ、および上記ペンタマーを誘導する条件に曝して、上記カーゴと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程。
【００１２】
本発明に従う方法によって得られ得る薬物送達システムの改善された有効性は、上記薬物送達システムのカーゴが上記ルシフェラーゼ発現プラスミドＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）（以下の実施例１、図１）である場合に、ルシフェラーゼの増大した発現によって示される。それとともに、さらに、本発明の薬物送達システムがカーゴとしての核酸の送達に適していることが示される。
【００１３】
実施例１はさらに、上記工程ｆ）で得られるＶＬＰが、ＢＢＢを効率的に横断するという証拠を与える（以下の実施例１、図２および図３）。それとともに、上記ＶＬＰが薬物をＣＮＳへと輸送するための薬物送達システムとして使用され得るという証拠が提供される。
【００１４】
さらに、上記工程ｄ）で得られるＶＬＰは、貯蔵に特に適していることが見出された。それらは、−８０℃の貯蔵条件に、２４時間を超える期間にわたって耐える（ｗｉｔｈｈｏｌｄ）。貯蔵後、上記ＶＬＰは、上記薬物送達システムを提供するためにさらに処理され得る。よって、それらは、カーゴと会合したＶＬＰを含む薬物送達システムの製造の間に適切な貯蔵可能な中間生成物を表す。
【００１５】
１つの特定の局面において、従って、本発明は、貯蔵の適切性が増大したＶＬＰを提供するための方法に関する。このようなＶＬＰは、現実的な理由から、上記薬物送達システムの生成を実質的に促進する。それは、ＶＬＰの大規模製造、および次いで、カーゴなしのそれらの中間貯蔵を可能にする。貯蔵後に、個々の顧客の需要に際して、その貯蔵されたＶＬＰは、さらに処理され得、所望のカーゴに装填される。従って、上記工程ｄ）で提供されるＶＬＰの中間貯蔵は、ＶＬＰに基づいて、薬物送達システムの製造プロセスにおいてさらなる融通性を可能にする。
【００１６】
さらに、本発明に従うＶＬＰが安定していることが見出された。それらの安定性は、ＶＰ１生成および直接的なその後のアセンブリ（すなわち、脱アセンブル／再アセンブル工程なし）からの結果であるＶＬＰと等しく匹敵し得る（図６）。このことから、本発明に従う２回の脱アセンブル工程および再アセンブル工程は、驚くべきことに、上記ＶＬＰの安定性に対する負の影響を有しないということになる。
【００１７】
なお別の局面において、本発明は、薬物送達システムまたはＶＬＰを含む組成物に関する。
【００１８】
驚くべきことに、上記ＶＬＰを含む組成物の均質性が、上記工程ｄ）のペンタマーを２工程で再アセンブルすることによって改善され得ることがさらに見出されたのに対して、上記第１の工程は、上記工程ｃ）のペンタマーの凝集を誘導する工程を包含し、上記第２の工程は、上記ペンタマーを、上記ペンタマーの凝集を誘導する条件から分離する工程を包含する（以下の実施例３、図７および図８）。
【００１９】
ＶＬＰを含む組成物の均質のサイズ分布は、規定された品質基準を満たすために重要である上記薬物送達システムとしての使用のためのＶＬＰの規定された集団を生成することを可能にするので、有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１。本発明に従って調製されたＶＬＰ（２ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブル）または１回だけ脱アセンブルおよび再アセンブルされているＶＬＰ（先行技術）のいずれかでトランスフェクトされた膠芽腫細胞において測定されるルシフェラーゼ活性。
【００２１】
【図２】図２。単一培養物としてのＢＢＢモデルの設定（Ａ）および本発明に従って調製されたＶＬＰの透過性（Ｂ）。
【００２２】
【図３】図３。共培養物としてのＢＢＢモデルの設定（Ａ）および本発明に従って調製されたＶＬＰの透過性（Ｂ）。
【００２３】
【図４】図４。先行技術のＶＬＰ（１ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブル後）に対する本発明に従うＶＬＰ（２ラウンドの脱アセンブル／再アセンブル後）の、および中間貯蔵を伴うＴＥＭ画像。
【００２４】
【図５】図５。ＶＬＰの中間貯蔵を伴う本発明に従うＶＬＰ（２ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブル後）（Ａ）、１ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルとペンタマーの中間貯蔵とを伴うＶＬＰ（Ｂ）、ならびに新鮮に調製したＶＬＰ（Ｃ）のＦＦＦ−ＭＡＬＳ分析。
【００２５】
【図６】図６。新鮮に調製したＶＬＰおよび中間貯蔵を伴う本発明に従うＶＬＰ（２ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブル）のｎＤＳＦ分析。
【００２６】
【図７】図７。貯蔵前にペンタマーの凝集を誘導することありまたはなしでの本発明の工程ｄ）に従うＶＬＰのＰＤＩを示すＤＬＳ分析。
【００２７】
【図８】図８。貯蔵前および貯蔵後にペンタマーの凝集を誘導することありまたはなしでの本発明の工程ｄ）に従うＶＬＰの平均直径を示すＤＬＳ分析。
【００２８】
【図９】図９。種々の凍結防止添加剤とともに貯蔵したＶＬＰのｎＤＳ分析（Ａ）およびルシフェラーゼ活性（Ｂ）。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明の第１の局面において、本発明は、以下の工程を包含する、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む薬物送達システムを提供するための方法に関する：
ａ）  ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
ｂ）  工程ａ）の組成物のＶＰ１タンパク質を、そのＶＰ１を誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルする工程、
ｃ）  ｂ）の組成物のＶＬＰを、そのＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｄ）  ｃ）の組成物のペンタマーを、そのペンタマーを誘導する条件に曝してＶＬＰへと再アセンブルする工程、
ｅ）  ｄ）の組成物のＶＬＰを、そのＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｆ）  ｅ）の組成物のペンタマーを、カーゴおよびそのペンタマーを誘導する条件に曝して、そのカーゴと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程。
【００３０】
本発明の状況において、および説明しやすさのために、工程ｂ）から生じるＶＬＰは、「ｐＶＬＰ」（一次ＶＬＰ）ともいわれ得る。工程ｄ）から得られるＶＬＰは、「ｒＶＬＰ」（再アセンブルＶＬＰ）ともいわれ得る。工程ｆ）の結果としてのＶＬＰは、「ｃＶＬＰ」（カーゴＶＬＰ）ともいわれ得る。
【００３１】
本発明の第２の局面において、本発明は、以下のパラメーターのうちの１またはこれより多くによって特徴づけられるＪｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物に関する：
ａ．  ０．３未満、好ましくは０．２未満、好ましくは０．１未満、より好ましくは０．０１〜０．０９の間の範囲の多分散指数（ＰＤＩ）
ｂ．  ＶＬＰのうちの少なくとも７０％が２０ｎｍ〜７０ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍ、より好ましくは３５ｎｍ〜６５ｎｍ、より好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有する、
ｃ．  その組成物内のＶＬＰ含有量が、少なくとも８０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも８５％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９５％（ｖ／ｖ）。
【００３２】
第３の局面において、本発明は、本発明に従う方法によって得られ得る薬物送達システムに関する。その薬物送達システムは、治療および／もしくは診断の方法において、好ましくは神経学的障害の処置のために使用され得る。よって、本発明はまた、障害、特にＣＮＳ疾患を、本発明に従う薬物送達システムで処置するための方法に関する。その処置方法は、好ましくは、その薬物送達システムを、その必要性のある被験体に投与する工程を包含する。
【００３３】
その薬物送達システムは、好ましくは改善された有効性を有する。そのＶＬＰは、ＢＢＢの透過性の事前の増大なしに、ＢＢＢを横断し得る。よって、本発明の薬物送達システムは、ＣＮＳ疾患を処置するための方法において使用され得、ここでその方法は、処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる工程を包含しない。本発明の薬物送達システムは、好ましくは、ＢＢＢを損なうかまたは混乱させるためのいかなる化学的または物理的処置をも受けたことがない患者に投与される。
【００３４】
本発明の第４の局面において、本発明は、本発明の方法の工程ａ）〜ｅ）およびｅ）の組成物のペンタマーを、そのペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルするさらなる工程を包含する方法によって得られ得るＪｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。これらのＶＬＰは、カーゴ非含有である。それらは特に、ワクチンとして有用である。
【００３５】
本発明の第５の局面において、塩および緩衝液を含み、７．０〜８．０の間、好ましくはおよそ７．５のｐＨを有する、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物が、提供される。上記組成物は、好ましくは、
ａ．  １２０ｍＭ〜１７０ｍＭ  ＮａＣｌ、好ましくは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、
ｂ．  １〜５ｍＭ  ＣａＣｌ２、好ましくは２ｍＭ  ＣａＣｌ２、および
ｃ．  ５〜３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、好ましくは１０〜２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、より好ましくは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
を含む。
【００３６】
この組成物は、生理学的条件下でのＶＬＰの取り扱いを可能にする。これらの条件下では、そのＶＬＰは、本質的に無傷のままであり、好ましくはそれらは、それらのキャプシド構造を本質的に維持する。カーゴに装填される場合、それらは本質的に、そのカーゴと会合したままである。それは、被験体への、特にヒトへの、そのＶＬＰの静脈内投与のための薬学的組成物として特に適している。
【００３７】
本発明のなおさらなる局面において、以下の特徴（「標的パラメーター（ｔａｒｇｅｔ  ｐａｒａｍｅｔｅｒ）」）のうちの少なくとも１つ、好ましくは全てを有するＶＬＰを含む組成物が、提供される：
【表１】
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本発明の状況において、用語「薬物送達システム（ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）」とは、薬学的生成物をその必要性のある被験体に、特にヒトまたは動物に投与するための組成物をいう。薬物送達システムは、有利なことには、その中に含まれるかまたはそこに付着される薬学的生成物の、好ましくはヒトまたは動物において、目的の部位への送達を可能にする。好ましくは、その送達は、その標的に対して選択的である。すなわち、その薬学的生成物のうちの多くは、身体または器官の他の部位ではなくその標的に送達される。
【００３８】
「ＣＮＳの薬物送達システム（ｄｒｕｇ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ＣＮＳ）」とは、その薬物送達システムがＣＮＳを選択的に標的化することを意味する。ＣＮＳとは、脊髄および脳を、特に脳をいう。用語「脳（ｂｒａｉｎ）」とは、その解剖学的部分（例えば、前頭葉、頭頂葉、側頭葉、後頭葉、および小脳）を含む。
【００３９】
本発明の薬物送達システムは、種々の経路（経口、皮膚、鼻または肺の経路または注射を含む）を介して投与され得る。特に好ましいのは、その薬学的生成物の全身的効果を可能にする投与形態である。具体的実施形態において、本発明の薬物送達システムは、経口的にまたは非経口的に、特に静脈内に投与される。
【００４０】
本発明の薬物送達システムは、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む。その「ＪＣウイルス（ＪＣ  ｖｉｒｕｓ）」またはＪｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ；  ＮＣＢＩ  Ｔａｘｏｎｏｍｙ  １０６３２）は、ヒトポリオーマウイルスである。ＪＣＶは、正二十面体対称であり、直径約４５ｎｍを有し、７２のＶＰ１ペンタマーからなる。少数の構造タンパク質ＶＰ２およびＶＰ３もまた存在する。
【００４１】
「ウイルス様粒子（ｖｉｒｕｓ−ｌｉｋｅ  ｐａｒｔｉｃｌｅ）」（ＶＬＰ）とは、本発明の状況において、ウイルス構造タンパク質または改変されたウイルス構造タンパク質またはウイルス構造タンパク質に由来するタンパク質から構成される殻（キャプシドともいわれる）を有する複製欠損粒子として定義される。本発明に従うＶＬＰは、ＪＣＶに由来する。すなわち、その殻は、ウイルス構造タンパク質または改変されたウイルス構造タンパク質またはＪＣＶに由来するウイルス構造タンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に由来する、特にＶＰ１に由来するタンパク質から構成される。
【００４２】
本発明の特に好ましい実施形態において、その殻における唯一のウイルス構造タンパク質は、ＶＰ１タンパク質である。最も好ましい実施形態において、そのＶＬＰの殻は、ＶＰ１タンパク質からなる。すなわち、その殻は、いかなる他のタンパク質をも含まない。
【００４３】
そのウイルス構造タンパク質、特にそのＶＰ１は、ペンタマー構造（ペンタマー）へとアセンブルする。本発明によれば、そのＶＬＰ殻は、好ましくは、いくつかのＶＰ１タンパク質、特にいくつかのＶＰ１ペンタマー、特に、７２のＶＰ１ペンタマーから構成される。
【００４４】
「ペンタマー（ｐｅｎｔａｍｅｒ）」とは、本発明の状況において、５個のポリペプチド、例えば、ＶＰ１タンパク質がアセンブルする場合に形成される構造である。ペンタマーへのアセンブリは、そのポリペプチド間の共有結合または非共有結合の形成に起因し得る。そのポリペプチドは、代表的には、五角形対称を有する環形状の構造を形成する。ペンタマーでは、各ポリペプチドサブユニットは、好ましくは２個の隣接するサブユニットと相互作用する。
【００４５】
本発明に従う「ペプチド（ｐｅｐｔｉｄｅ）」は、任意の数の任意のタイプのアミノ酸、好ましくは天然に存在するアミノ酸から構成され得、これらは好ましくは、ペプチド結合によって連結される。特に、ペプチドは、少なくとも３個のアミノ酸、好ましくは少なくとも５個、少なくとも７個、少なくとも９個、少なくとも１２個または少なくとも１５個のアミノ酸を含む。ペプチドの長さに上限はない。しかし、好ましくは、本発明に従うペプチドは、５００個のアミノ酸、好ましくは４００個、３００個、２５０個、２００個、１５０個、または１２０個のアミノ酸の長さを超えない。約１０個のアミノ酸を超えるペプチドは、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」といわれ得る。
【００４６】
そのＶＬＰの構造タンパク質、特にそのＶＰ１は、ＪＣＶの天然の構造タンパク質と同一であるかまたはその構造タンパク質に由来する。「改変されたまたは由来する（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｄ）」とは、ＶＰ１の機能を保持してキャプシドへとアセンブルすると同時に、１またはこれより多くのアミノ酸の挿入、欠失または置換を包含する。
【００４７】
一実施形態において、その天然の（ＪＣＶ）構造タンパク質は、その生成、その細胞標的化プロフィールおよび特異性またはその細胞内標的化プロフィールもしくは特異性に関して、そのＶＬＰを最適化するために改変され得る。改変または誘導体化は、タンパク質翻訳を増強するために、その構造タンパク質、特にそのＶＰ１をコードするヌクレオチド配列のコドン最適化を含み得る。
【００４８】
本発明に従う用語「ＶＰ１」または「ウイルスタンパク質１（ｖｉｒｕｓ  ｐｒｏｔｅｉｎ  １）」とは、ＪＣＶの天然のＶＰ１に同一であるかまたはこれに由来し、そしてキャプシドへとアセンブリし得るタンパク質をいう。
【００４９】
本発明に従う用語「ＶＰ１」は、配列番号１に従うアミノ酸配列と、この配列にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％または少なくとも９９％のアミノ酸配列同一性を有するタンパク質を包含する。本発明の最も好ましい実施形態において、そのＶＰ１は、配列番号１に従うアミノ酸配列を有する。
【００５０】
本発明に従う用語「ＶＰ１」はまた、その天然のＶＰ１の画分を包含する。好ましくは，上記ＶＰ１の画分は、配列番号１に従うアミノ酸配列の少なくともアミノ酸３２〜３１６、または配列番号１のアミノ酸３２位〜３１６位に由来するアミノ酸配列と、この配列にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９７％、より好ましくは少なくとも９８％もしくは少なくとも９９％の同一性を有するその誘導体を含む。
【００５１】
本発明の好ましい実施形態において、そのＶＰ１は、配列番号１に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。本発明の最も好ましい実施形態において、そのＶＰ１は、配列番号１に従うアミノ酸配列と同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５２】
本発明の別の実施形態において、そのＶＰ１は、配列番号３に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、より好ましくは少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を有する。一実施形態において、ＶＰ１のアミノ酸配列は、配列番号３のアミノ酸配列と同一である。
【００５３】
一実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列である。
【００５４】
本発明の別の実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一である。一実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド配列と同一である。
【００５５】
その配列は、表２に示される。
【表２−１】
2021502951.tif 000003
【表２−２】
2021502951.tif 000004
【表２−３】
2021502951.tif 000005
【表２−４】
2021502951.tif 000006
【００５６】
本発明の好ましい実施形態において、そのＶＰ１は、配列番号１に従うアミノ酸配列とその全長にわたって少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を有する。
【００５７】
本発明の好ましい実施形態において、そのＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列とその全長にわたって少なくとも８０％同一である。
【００５８】
ＪＣＶの構造タンパク質、好ましくはＶＰ１は、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたは昆虫細胞において発現され得る。本発明の好ましい実施形態によれば、その構造タンパク質、好ましくはＶＰ１は、昆虫細胞において発現される。これは、昆虫細胞における発現がＥ．ｃｏｌｉにおける発現ではなくＪＣＶに由来する野生型タンパク質と比較してより少ない改変（例えば、翻訳後修飾）をもたらすことから、有利である。
【００５９】
本発明に従うＶＬＰは、キャプシド中に、１または数個のさらなる異種タンパク質（すなわち、ＪＣＶタンパク質に同一でないかまたはそのタンパク質に由来しないタンパク質）をさらに含み得る。例えば、異種タンパク質は、そのキャプシドの中に繋留され得る、すなわち、このタンパク質のうちの少なくとも一部は、好ましくは外側からアクセス可能である。原則的に、任意のタンパク質は、そのような異種タンパク質がキャプシドの中に組み込まれ得、そのＶＬＰのアセンブリに実質的に干渉しない限りにおいて、異種タンパク質として適している。
【００６０】
本発明に従う薬物送達システムにおいて使用されるＶＬＰは、カーゴと会合される。これは、そのカーゴがそのＶＬＰに可逆的に結合されることを意味する。これは、例えば、そのカーゴの任意の一部との物理化学的相互作用もしくは付着に起因するか、またはそのキャプシドへのそのカーゴの組み込みによるかのいずれかであり得る。その組み込みは、完全または不完全であり得る。本発明の特に好ましい実施形態において、そのカーゴの総量の大部分は、そのキャプシドへと完全に組み込まれる。最も好ましいのは、そのカーゴがそのＶＬＰのキャプシドの中に完全に被包されることである。
【００６１】
本発明の状況では、「ＶＬＰがカーゴを含む（ＶＬＰ  ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ  ｔｈｅ  ｃａｒｇｏ）」という表現は、そのＶＬＰが「そのカーゴと会合される（ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｔｈｅ  ｃａｒｇｏ）」という表現と同義に使用される。そのＶＬＰとそのカーゴとの会合は、ＶＬＰをそのカーゴに「装填（ｌｏａｄｉｎｇ）」または「パッキング」した結果であり得る。
【００６２】
「装填」とは、ＶＬＰとカーゴとの会合を、例えば、浸透圧ショックによってまたはＶＰ１もしくはＶＰ１ペンタマーをＶＬＰへとそのカーゴと一緒にアセンブルすることによってもたらす任意のプロセスを意味する。「装填されたＶＬＰ（ｌｏａｄｅｄ  ＶＬＰ）」は、このプロセスから生じるＶＬＰである。用語「パッキング（ｐａｃｋｉｎｇ）」とは、ＶＰ１またはＶＰ１ペンタマーをＶＬＰへとそのカーゴと一緒にアセンブルすることを介して、そのＶＬＰを装填するプロセスに関する。これから生じるＶＬＰは、「パックされた（ｐａｃｋｅｄ）」ＶＬＰといわれる。
【００６３】
用語「カーゴ（ｃａｒｇｏ）」とは、本発明の状況において、そのＶＬＰと会合される任意の薬学的生成物のために使用される。用語、薬学的生成物は、本発明の状況において、用語「薬物（ｄｒｕｇ）」と交換可能に使用される。
【００６４】
その薬学的生成物は、治療または診断の物質である。その薬学的組成物は、これがそのＶＬＰと会合する限りにおいて、任意の化学的性質のものであり得る。好ましくはその薬学的生成物は、活性な薬学的成分（ＡＰＩ）、特に「低分子（ｓｍａｌｌ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ）」（好ましくは≦１０００ダルトンの有機化合物）、生物製剤（ａ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ）または細胞増殖抑制剤である。好ましい実施形態において、その生物製剤は、タンパク質、ペプチドまたは核酸からなる群より選択され、特に所望のタンパク質をコードする核酸（例えば、ｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、プラスミドもしくはベクター）、阻害性核酸（例えば、ｓｉＲＮＡもしくはｍｉＲＮＡ）および触媒活性を有する核酸（例えば、リボザイム）からなる群より選択される。
【００６５】
さらなる実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、モノクローナル抗体、抗精神病薬、鎮痛薬、血栓溶解薬、抗鬱薬、免疫モジュレーター、免疫抑制薬、アセチルコリンエステラーゼインヒビター、グルタミン酸レセプターアンタゴニストもしくはモジュレーター（例えば、ＮＭＤＡレセプターアンタゴニスト）、精神刺激薬、抗認知症薬、抗不安薬、ヌートロピック薬（ｎｏｏｔｒｏｐｉｃ  ｄｒｕｇ）、代謝増強薬（ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  ｅｎｈａｎｃｅｒ）、代謝モジュレーター、神経保護薬、抗てんかん薬（ａｎｔｉｃｏｎｓｕｌｖａｎｔ）、細胞増殖抑制薬、およびサイトカインからなる群より選択されるカーゴに装填される。
【００６６】
特に好ましい実施形態において、そのカーゴは、核酸（特にＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）または遺伝子療法に適した核酸）、抗体、細胞増殖抑制薬またはサイトカインであり、より好ましくはそのカーゴは、核酸（例えば、プラスミド）または抗体である。最も好ましい実施形態において、そのカーゴは、核酸（例えば、プラスミド）である。用語「抗体（ａｎｔｉｂｏｄｙ）」とは、抗体またはそのフラグメント、ならびに抗体−薬物結合体（ＡＤＣ）を含む。
【００６７】
好ましくは，そのカーゴはプラスミドである。
【００６８】
一実施形態において、その核酸、好ましくはプラスミドは、遺伝子を含む。必要である場合、そのカーゴは、遺伝子を含み、ＣＮＳ標的細胞におけるその発現は、好ましくは一過性である。よって、本発明の最も好ましい実施形態によれば、その薬物送達システムは、遺伝子を含むプラスミドと会合したＶＬＰを含むのに対して、ＣＮＳ疾患の処置は、処置されるべき被験体の標的細胞における上記遺伝子の一過性の発現によってもたらされる。
【００６９】
本発明によれば、表現、何か（例えば、ＶＰ１、ペンタマー、ＶＬＰ）を何かをもたらす（例えば、アセンブリを誘導する）ための条件に「曝す（ｅｘｐｏｓｉｎｇ）」とは、考慮中の物質（例えば、ＶＰ１、ペンタマー、ＶＬＰ）を、このある種の効果を引き起こし得る（例えば、アセンブリを誘導する）条件にもたらすことをいう。このような曝露は、その物質のための条件を変化させることによって、例えば、その物質に種々の緩衝液、塩またはｐＨなどとの接触をもたらすことによって行われ得る。これは、何かを、その物質を含む組成物に添加する（逆も同様）か、またはその物質をその組成物から分離し、そして次いで、その物質を異なる組成物に添加するかのいずれかによって、可能である。
【００７０】
条件の変更はまた、温度、照射などを変動させることによって達成され得る。当然のことながら、条件の変更のためのこのような手段は、組み合わされ得るおよび／または反復され得る。その所望の効果（例えば、そのＶＰ１もしくはペンタマーの、ＶＬＰへのアセンブリおよび／またはそのＶＬＰの凝集を誘導する）を誘導する他の適切な条件はまた、当業者に周知である。その同じことが、そのそれぞれの条件への曝露の適切な継続期間にも当てはまる；これは、当業者の通常の手段によって見出され得る。
【００７１】
表現「何かを、何かをもたらすための条件に曝す（ｅｘｐｏｓｉｎｇ  ｓｏｍｅｔｈｉｎｇ  ｔｏ  ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｆｏｒ  ａｆｆｅｃｔｉｎｇ  ｓｏｍｅｔｈｉｎｇ）」は、企図されるべき効果を要求しない、すなわち、その物質の全てが考慮中の効果を達成しなければならないわけではない。例えば、「そのペンタマーが凝集するように誘導する条件（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ  ｉｎｄｕｃｉｎｇ  ｔｈｅ  ｐｅｎｔａｍｅｒｓ  ｔｏ  ａｇｇｒｅｇａｔｅ）」は本質的に、その条件が凝集を誘導するために適していることを意味する。それは、実際に全てのペンタマーが凝集することを要求しない。
【００７２】
本明細書で使用される場合、用語「アセンブリ（ａｓｓｅｍｂｌｙ）」または「ＶＬＰへとアセンブルする（ａｓｓｅｍｂｌｅ  ｉｎｔｏ  ＶＬＰ）」とは、考慮中の構造（ＶＰ１タンパク質またはペンタマーのいずれか）が会合してＶＬＰのキャプシドを確立することを意味する。ＶＰ１が出発物質として使用される場合、ＶＬＰへのアセンブリは、ペンタマーの事前の形成を含み得る。これは、そのＶＰ１タンパク質が先ず、ペンタマーを形成し得、次いで、ＶＬＰを形成し得るか、またはそれらはＶＬＰへと直接アセンブリし得ることを意味する。ＶＬＰのアセンブリは、可逆的である。
【００７３】
用語「脱アセンブル（ｄｉｓａｓｓｅｍｂｌｙ）」とは、翻って、そのＶＬＰのキャプシドがペンタマー構造および／または構造タンパク質へと少なくとも部分的に崩壊する場合のプロセスをいう。その脱アセンブルは、温度を上昇させることによって、プロテアーゼを添加することによって、および／またはＶＬＰを形成するために使用される分子間相互作用（例えば、分子間ジスルフィド架橋）を減少させることによって（例えば、還元剤を添加するかもしくはキレート化剤を添加することによって）誘導され得る。このような条件はまた、条件への段階的曝露を包含し得る。例えば、その組成物は、その温度が上昇する前に、還元剤と接触され得る。
【００７４】
そのＶＰ１および／またはペンタマーを誘導して、ＶＬＰへとアセンブルするための方法は一般に、当業者に公知である（Ｇｏｌｄｍａｎｎら（Ｊ．  Ｖｉｒｏｌ．  １９９９；  ７３（５）：  ４４６５−６９）；  ＤＥ  １９５  ４３  ５５３  Ａ１）。その同じことが、ペンタマーへのＶＬＰの脱アセンブルに当てはまる。当業者は、よって、ＶＬＰのアセンブリおよび脱アセンブルの制御のための方法を認識する。
【００７５】
本発明の一実施形態において、そのＶＰ１またはペンタマーを含む組成物中のＣａ２＋イオンの濃度は、そのＶＬＰのアセンブリ／脱アセンブルの制御のために使用される。例えば、そのアセンブリを誘導するために、遊離Ｃａ２＋イオンの濃度が増大され得る。その脱アセンブルが望ましい場合、遊離Ｃａ２＋イオンの濃度は、キレート化剤をその組成物に添加することによって低下させられ得る。
【００７６】
そのアセンブリを誘導するためのさらなる選択肢は、ＶＬＰへのアセンブリを、例えば、そのペンタマーを含む組成物中の溶媒を低減することによって促進するために、ＶＰ１ペンタマーの濃度を増大させることである。これは、アルカリ土類金属（例えば、Ｃａ２＋またはＭｇ２＋）の濃度の適合を要求し得る。
【００７７】
よって、本発明の好ましい実施形態によれば、脱アセンブルは、そのＶＬＰを分子間ジスルフィド架橋が例えば、そのＶＬＰを還元条件に曝すことによって還元される条件に曝すことによって誘導され得る。好ましい実施形態において、この工程は、キレート化剤のさらなる存在下で達成される。より好ましくは、その脱アセンブルは、そのＶＬＰを、キレート化剤の存在下で、および必要に応じて高温で還元条件に曝すことによって誘導される。
【００７８】
本発明の特定の実施形態において、そのＶＬＰは、ＤＴＴならびにＥＤＴＡおよび／またはＥＧＴＡを含む組成物に、好ましくは１５℃〜３０℃、好ましくは２０℃〜２５℃の温度で、最も好ましくは約２３℃の温度で曝される。
【００７９】
本発明の好ましい実施形態によれば、ｃ）の組成物のペンタマーは、その凝集を誘導する条件に曝される。この工程は、工程ｄ）の前に行われる場合に最も適切である。好ましい実施形態において、その物質（例えば、そのペンタマー）のうちの少なくとも２０％（好ましくは少なくとも３０％、より好ましくは少なくとも４０％）が凝集する。
【００８０】
驚くべきことに、この工程はそのＶＬＰのより均質のサイズ分布をもたらし得ることが見出された（図７および図８）。これは、よりよい品質管理および標準化を可能にし、これは、そのＶＬＰが薬物送達システムにおいて使用される場合に最も重要である。よって、このさらなる手順は、好ましくは、薬物送達システムの品質制御要件の一部である。
【００８１】
用語「凝集物（ａｇｇｒｅｇａｔｅ）」とは、任意の粒状構造を意味する。「凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）」とは、凝集物をもたらすプロセスを意味する。このプロセスは、可逆的である。
【００８２】
そのペンタマーまたはＶＬＰの凝集は、コントロールと比較して、その組成物中のＶＬＰの増大した平均粒度によって決定され得る。そのより大きな粒度は、標準的方法（例えば、動的光散乱法（ＤＬＳ））によって決定され得る。
【００８３】
本発明の特定の実施形態によれば、そのペンタマーまたはＶＰ１の凝集は、タンパク質の沈殿を促進することが当該分野で公知である１またはこれより多くの薬剤（沈殿剤）によって誘導され得る。従って、最も好ましいのは、本発明によれば、沈殿剤の使用である。
【００８４】
「沈殿剤（ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ  ａｇｅｎｔ）」とは、ＶＰ１またはペンタマーの凝集を促進する薬剤をいう。沈殿剤の概念は一般に、当業者に公知である。沈殿剤は代表的には、タンパク質の濃縮および精製を促進するために使用される。沈殿は、より具体的には、そのタンパク質の溶解性を低下させることによって、溶媒の溶媒和能力の質を変化させる結果であり得る。その溶解性は、その組成物のｐＨをタンパク質の等電点へと調節することによっても低下され得る。さらに、その組成物の温度を低下させることは、タンパク質の溶解性をも低減し得る。
【００８５】
考えられる沈殿剤は、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、またはアルコール（例えば、エタノール）、および塩である。後者は、「塩析するための薬剤（ａｇｅｎｔｓ  ｆｏｒ  ｓａｌｔｉｎｇ  ｏｕｔ）」として当業者に公知である。
【００８６】
好ましくは、本発明によれば、その沈殿剤は塩である。最も好ましいのは、「ホフマイスターシリーズ（Ｈｏｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｓｅｒｉｅｓ）」として公知のイオンを含む塩である。そのホフマイスターシリーズは、溶液中の具体的タンパク質の溶解性に影響を及ぼす能力に関して、そのタンパク質に対するそれらの疎水性効果に関するイオンの組織化を説明する。タンパク質に対して疎水性効果を発揮するイオンは、特に好ましい。本明細書で、このようなイオンは、コスモトロピックイオンといわれる。
【００８７】
少なくとも１種のコスモトロピックアニオンまたはカチオンを含む沈殿剤が好ましい。好ましいアニオンは、シトレート（Ｃ６Ｈ５Ｏ７３−）、ホスフェート（ＰＯ４３−）、スルフェート（ＳＯ４２−）、リン酸水素（ＨＰＯ４２−）、リン酸二水素（Ｈ２ＰＯ４−）、ヨウ素酸（ＩＯ３−）、ヒドロキシド（ＯＨ−）、フルオリド（Ｆ−）、臭素酸（ＢｒＯ３−）またはアセテート（ＣＨ３ＣＯＯ−）またはこれらの組み合わせからなる群より選択され、より好ましいアニオンは、シトレート、ホスフェートまたはスルフェートであり、最も好ましいアニオンはスルフェートである。
【００８８】
好ましいカチオンは、アンモニウムまたは四級アンモニウム化合物（ＮＲ４＋であってＲは、アルキル基もしくはアリール基であるもの（例えば、テトラメチルアンモニウム（（ＣＨ３）４Ｎ＋）もしくはジメチルアンモニウム（（ＣＨ３）２Ｎ２＋））である。さらに好ましいカチオンは、カリウム（Ｋ＋）、セシウム（Ｃｓ＋）、ルビジウム（Ｒｂ＋）もしくはリチウム（Ｌｉ＋）またはこれらの組み合わせを含むリストから選択され、特に好ましいのは、四級アンモニウム化合物またはアンモニウムであり、最も好ましいのはアンモニウムである。
【００８９】
従って、その塩は、好ましくは、シトレート（Ｃ６Ｈ５Ｏ７３−）、ホスフェート（ＰＯ４３−）、スルフェート（ＳＯ４２−）、リン酸水素（ＨＰＯ４２−）、リン酸二水素（Ｈ２ＰＯ４−）、ヨウ素酸（ＩＯ３−）、ヒドロキシド（ＯＨ−）、フルオリド（Ｆ−）、臭素酸（ＢｒＯ３−）またはアセテート（ＣＨ３ＣＯＯ−）、四級アンモニウム化合物（ＮＲ４＋であって、Ｒはアルキル基もしくはアリール基であるもの）（好ましくはテトラメチルアンモニウム（（ＣＨ３）４Ｎ＋）もしくはジメチルアンモニウム（（ＣＨ３）２Ｎ２＋））、アンモニウム（ＮＨ４＋）、カリウム（Ｋ＋）、セシウム（Ｃｓ＋）、ルビジウム（Ｒｂ＋）またはリチウム（Ｌｉ＋）からなる、好ましくは、ＳＯ４２−および／もしくはＮＨ４＋またはこれらの組み合わせを含む群より選択アレルアニオンおよびカチオンを含む。
【００９０】
好ましい実施形態によれば、その塩は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４およびＮａ２ＨＰＯ４からなる群より選択される。最も好ましい塩は、硫酸アンモニウム（（ＮＨ４）２ＳＯ４）である。
【００９１】
本発明によれば、そのペンタマーの凝集は、そのペンタマーをその沈殿剤と接触した状態にするための任意の手段によって、例えば、その沈殿剤を、そのペンタマーを含む組成物に（または逆もまた同様（すなわち、そのペンタマーを含む組成物を、沈殿剤に））添加することによって、誘導され得る。他の手段（例えば、透析、その結果、その沈殿剤が拡散によってペンタマーに達する）も可能である。
【００９２】
本発明の１つの好ましい実施形態によれば、そのペンタマーの凝集は、その沈殿剤を含む組成物、例えば、硫酸アンモニウムを含む組成物に対する組成物に対する透析によって誘導される。
【００９３】
本発明の特に好ましい実施形態によれば、凝集のためのペンタマーを含む組成物は、０．３〜５Ｍの間の、好ましくは４Ｍまでの硫酸アンモニウム濃度を有し、さらにより好ましいのは、１．８〜２．２Ｍの間の濃度である。最も好ましいのは、およそ２Ｍである。
【００９４】
そのペンタマーの凝集を誘導する工程は、好ましくは少なくとも１時間、より好ましくは少なくとも５時間、さらにより好ましくは少なくとも１２時間、最もより好ましくは少なくとも１６時間の継続期間を有する。その工程が、２４時間未満の継続時間を有することは好ましい。好ましい実施形態において、この工程の継続時間は、１４〜１９時間の間である。最も好ましい実施形態において、この工程の継続時間は、１６〜１８時間の間である。この時間の間に、そのペンタマーは、凝集を誘導するための条件に曝され、特にそれらは、硫酸アンモニウムとの接触状態にある。
【００９５】
そのペンタマーの凝集を誘導する工程の後に、そのペンタマーを、その凝集を誘導するために使用された条件から分離する工程を本発明のプロセスに含めることは、有利である。このような工程に適用可能な方法は、特に限定されない；当業者に公知の、そのペンタマーを、凝集を誘導する条件から分離することを可能にする任意の方法が、適用可能である。
【００９６】
本発明の好ましい実施形態において、そのペンタマーは、透析によって、それらの凝集を誘導する条件から分離される。そのペンタマーの凝集が沈殿剤を使用することによって誘導される場合に、透析が使用され得る。透析の原理はまた、都合がよいことには、そのペンタマーを沈殿剤との接触にもたらすために適用される。最も好ましいのは、本発明に従う方法が少なくとも２つの透析工程：工程ｃ）の組成物の、沈殿剤を含む組成物に対する第１の透析、および凝集の誘導後の、その沈殿剤を本質的に含まない組成物に対する第２の透析、を包含する場合である。
【００９７】
そのペンタマーをその沈殿剤から分離するための透析は、好ましくは、生理学的条件に少なくとも類似である組成物に対するものである。このような組成物は、好ましくは塩を含み、６〜８．５の、好ましくは６．５〜８．５の、より好ましくは７〜８の、最も好ましくは７．２〜７．５の、特に７．５のｐＨを有する。その組成物の容積モル浸透圧は、好ましくは２８０〜３１０ｍｏｓｍｏｌ／ｌの間、最も好ましくは３０８ｍｏｓｍｏｌ／ｌである。その組成物は、例えば、０．８〜０．９２％（ｗ／ｖ）の、好ましくは０．９％（ｗ／ｖ）の濃度の生理食塩水（塩化ナトリウム）濃度を有し得る。
【００９８】
そのペンタマーを、その凝集を誘導するために使用された条件から分離する工程は、好ましくは少なくとも１時間にわたって、より好ましくは少なくとも５時間、１２時間にわたって、より好ましくは少なくとも１８時間にわたって、より好ましくは約２４時間もしくはこれより長い間、行われる。より長い期間はまた、特に、凝集するように誘導されたペンタマーの濃度、そのペンタマーを含む組成物、ならびにその沈殿剤の性質および濃度に依存して、可能である。好ましい実施形態において、その凝集したペンタマーを含む組成物は、生理学的条件に類似の組成物に対して、約２４時間にわたって透析される。
【００９９】
その組成物は、好ましくは、緩衝液をさらに含む。適切な緩衝系は、当業者に公知である。本発明の好ましい実施形態において、その組成物は、ＴＲＩＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、ホスフェート緩衝液または炭酸水素緩衝系を含む。最も好ましいのは、ＴＲＩＳ緩衝液である。
【０１００】
最も好ましい実施形態において、その組成物は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌおよび１５０ｍＭ  ＮａＣｌを含み、ｐＨ７．５を有する。
【０１０１】
そのペンタマーをＶＬＰへとアセンブルすることを促進するために、その組成物は、二価イオン（例えば、Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｂａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｆｅ２＋、Ｚｎ２＋またはこれらの組み合わせ）をさらに含み得る。最も好ましいのは、Ｃａ２＋、例えば、ＣａＣｌ２である。好ましい実施形態において、その組成物は、１〜３ｍＭ  ＣａＣｌ２、好ましくは２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含む。
【０１０２】
本発明の非常に好ましい実施形態において、生理学的条件に少なくとも類似のその組成物は、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび２ｍＭ  ＣａＣｌ２を含み、ｐＨ７．５を有する。
【０１０３】
本発明のなお別の局面において、驚くべきことに、ＶＬＰ（ｒＶＬＰ）の貯蔵は、ペンタマーの貯蔵と比較して有利であることが見出された（図４および図５）。ペンタマーが貯蔵され、その後、融解および再アセンブルされる場合、主に、「非常に小さい（ｔｉｎｙ）」粒子が凝集物と同様に形成する。これらのＶＬＰが、薬物送達システムの生成に適切ではない。しかし、貯蔵後に解離および再アセンブルしたＶＬＰは、適切なサイズにされたＶＬＰの特に均質の集団を形成する。従って、本発明の一実施形態において、組成物は、２０ｎｍ〜７０ｎｍの、好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍの、より好ましくは３５ｎｍ〜６５ｎｍの、より好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有する粒子とともに提供される。均質のサイズ分布は、品質制御要件を満たすために重要である。
【０１０４】
好ましい実施形態において、本発明に従う方法は、工程ｄ）の組成物からのＶＬＰを貯蔵する工程を包含する。約−８０℃〜約４℃の温度においてそのＶＬＰを貯蔵する工程は、少なくとも１０時間、１５時間、２０時間の貯蔵期間にわたって、好ましくは少なくとも２４時間にわたって可能である。さらに３日間より長い貯蔵は、可能である。
【０１０５】
好ましい実施形態において、そのＶＬＰは、０℃未満の温度において貯蔵される（凍結する工程）。凍結する工程は、種々の冷却速度を使用して行われ得る。例えば、「ゆっくりとした（ｓｌｏｗ）」凍結は、約−１℃／分の冷却速度を適用することによって起こり得る一方で、速い凍結は、そのサンプル（すなわち、その組成物を含む容器）と液体窒素とを接触させるか、またはそのサンプルを−８０℃の冷凍庫の中に配置することによって、行われ得る。
【０１０６】
好ましい実施形態において、貯蔵する工程は、凍結防止添加剤、好ましくはポリオール、糖、無機塩、有機塩、アミノ酸、ポリマー、エクストリモライトまたはこれらの誘導体もしくは組み合わせからなる群より選択される凍結防止添加剤を含む組成物の中で起こる。
【０１０７】
好ましい実施形態において、その無機塩は、スルフェートアニオンを含む。スルフェートアニオンを含む好ましい塩は、硫酸カリウム、硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、硫酸マグネシウムおよび硫酸アンモニウムである。好ましくは、その無機塩は硫酸アンモニウムである。
【０１０８】
そのアミノ酸は、好ましくはグリシン、グルタミン、プロリンまたはアラニンである。好ましいアミノ酸誘導体は、ベタインである。さらに可能な凍結防止添加剤は、グリセロール、スクロース、ＤＭＳＯ、エクトインまたはヒドロキシエクトインである。
【０１０９】
凍結防止添加剤の添加、特に無機塩（例えば、スルフェートアニオンを含む塩、特に硫酸アンモニウム）および／またはアミノ酸誘導体（例えば、ベタイン）の添加は、そのＶＬＰの安定性および機能性または有効性に関して有利であることが見出された（図９）。前出で述べたように、増強された安定性および／または機能性もしくは有効性は、ＶＬＰを薬物送達システムとして使用する場合に特に望ましい。凍結防止添加剤を、工程ｄ）の組成物に添加することは、安定性および機能性または有効性に関して、工程ｆ）のパックされたＶＬＰに影響を有することは、驚くべきことであった。
【０１１０】
凍結防止添加剤は、生物学的組織を、凍結損傷（すなわち、氷の形成に起因）から保護する目的を果たす。その凍結防止添加剤は通常、細胞における溶質濃度を増大させることによって機能する。しかし、生物学的使用に適切であるために、それらは容易に透過しなければならず、細胞に対して毒性であってはならない。従って、このような添加剤は、そのペンタマーおよび／またはＶＬＰにとってより温和な貯蔵条件を提供するために適している。凍結防止添加剤は、貯蔵のために凍結されるべきペンタマーおよび／またはＶＬＰを含む組成物に補充され得る。
【０１１１】
本発明の特定の好ましい実施形態によれば、その凍結防止添加剤は、ＶＬＰ、好ましくはｒＶＬＰが２つの透析工程を使用してアセンブリされた（２工程再アセンブル）後のその後の凍結のために、ＶＬＰを含む組成物に添加される。
【０１１２】
ポリオールベースの凍結防止添加剤を除く凍結防止添加剤の適切なモル濃度は、０．５Ｍ、０．６Ｍ、０．７Ｍ、０．８Ｍ、０．９Ｍ、１Ｍ、１．１Ｍ、１．２Ｍ、１．３Ｍ、１．４Ｍ、１．５Ｍ、２Ｍ、３Ｍ、４Ｍ、５Ｍであり得る。優先的には、これらの凍結防止添加剤は、約１Ｍのモル濃度で、好ましくは１Ｍのモル濃度で使用される。
【０１１３】
そのポリオールベースの凍結防止添加剤は、少なくとも０．３Ｍ、少なくとも０．４Ｍ、少なくとも０．５Ｍ、少なくとも０．６Ｍ、少なくとも０．７Ｍ、少なくとも０．８Ｍ、少なくとも０．９Ｍ、少なくとも１Ｍ、少なくとも２Ｍまたは少なくとも３Ｍのモル濃度で使用され得る。好ましくは、そのポリオールベースの凍結防止添加剤、好ましくはグリセロール  ５％は、約０．６Ｍ〜０．７Ｍの濃度で、より好ましくは０．６８Ｍの濃度で使用され得る。
【０１１４】
あるいは、そのポリオールベースの凍結防止添加剤は、ペンタマーおよび／またはＶＬＰを含む組成物の容積％に基づいて添加され得る。適切な容積％は、３％（ｖ／ｖ）、４％（ｖ／ｖ）、５％（ｖ／ｖ）、６％（ｖ／ｖ）、７％（ｖ／ｖ）、８％（ｖ／ｖ）、９％（ｖ／ｖ）または１０％（ｖ／ｖ）を含む。優先的には、そのポリオールベースの凍結防止添加剤は、５％（ｖ／ｖ）において添加される。
【０１１５】
本発明の好ましい実施形態において、工程ｃ）のペンタマーおよび／または工程ｄ）のＶＬＰは、精製に供される。用語「精製（ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」とは、本発明の状況において、そのＶＰ１、ペンタマーまたはＶＬＰを、複雑な組成物から単離または分離することをいう。考えられる方法は、沈殿、クロスフロー濾過、クロマトグラフィー、例えば、分取クロマトグラフィー、好ましくはサイズ排除クロマトグラフィー、および／または動的光散乱法（ＤＬＳ）を含む。
【０１１６】
用語「クロマトグラフィー（ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ）」とは、固定相と移動相との間でその個々の構成要素を分布させることによって、物質の混合物の分離を可能にする方法をいう。特に、クロマトグラフィーとは、その目的の物質を定常相に先ず結合および富化し、その後第２の工程でそれを溶離する（クロマトグラフィーの結合および溶離モード）ことによって、または不純物をその定常相に結合させてその目的の分子の純度をフロースルーの中で増大させる（フロースルーモード）ことによって、物質を精製するための方法をいう。
【０１１７】
クロマトグラフィーは、移動相の中に含まれる分析物と固定相との相互作用に基づくことに従ってグループに分けられ得る。本発明に従うクロマトグラフィーの好ましいタイプは、「逆相（ｒｅｖｅｒｓｅｄ  ｐｈａｓｅ）」クロマトグラフィー、「イオン交換（ｉｏｎ−ｅｘｃｈａｎｇｅ）」クロマトグラフィー、「アフィニティー（ａｆｆｉｎｉｔｙ）」クロマトグラフィー、またはサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）を包含する。イオン交換クロマトグラフィーの中でも、その精製方法は、固定相の中に存在する電荷に基づいて、カチオン交換クロマトグラフィー（ＣＥＸ）（ここでその固定相は負電荷を有し、従って、正に荷電した分子を保持する）、およびアニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）（ここでその固定相は、正電荷を有し、従って、負に荷電した分子を保持する）へとさらに分けられ得る。
【０１１８】
特に、クロマトグラフィーは、中間生成物として、本発明に従う方法によって得られるｒＶＬＰを精製するために使用され得る。特にＡＥＸは、ｒＶＬＰを精製するために使用され得る。
【０１１９】
ＡＥＸにおいて使用される固定相は、固定相に存在する交換物質によって提供されるイオン性相互作用の強度に基づいて、「強アニオン交換体（ｓｔｒｏｎｇ  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）」および「弱アニオン交換体（ｗｅａｋ  ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）」へとさらに記載され得る。表現「アニオン交換体（ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅｒ）」または「アニオン交換マトリクス（ａｎｉｏｎ  ｅｘｃｈａｎｇｅ  ｍａｔｒｉｘ）」は類義語であり、ともに、アニオンに結合し得、アニオンに対してこれらを周りの媒体から交換し得る天然または人工の物質をいう。アニオン交換体は、陽イオンを有し、負に荷電した対イオンを交換する。
【０１２０】
本発明のＶＬＰは、ヌクレアーゼでさらに処理され得、そして／または滅菌濾過に供され得る。ヌクレアーゼ処理は、好ましくは、核酸がカーゴとして使用される場合に行われる。種々のヌクレアーゼが当業者に公知であり、例えば、ベンゾナーゼを含む。滅菌濾過の方法としては、特に、不純物の除去のために適したフィルタを使用するダイアフィルトレーションまたは超遠心分離が挙げられる。
【０１２１】
本発明のなお別の局面において、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物が提供され、これは、以下のパラメーターのうちの１またはこれより多くによって特徴づけられる：
ａ．  ０．３未満、好ましくは０．２未満、好ましくは０．１未満、より好ましくは０．０１〜０．０９の間の範囲の多分散指数（ＰＤＩ）、
ｂ．  ＶＬＰのうちの少なくとも７０％が、２０ｎｍ〜７０ｎｍの、好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍの、より好ましくは３５ｎｍ〜６５ｎｍの、より好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有する、
ｃ．  その組成物内のＶＬＰ含有量が、少なくとも８０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも８５％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９５％（ｖ／ｖ）。
【０１２２】
粒度分布は、「多分散指数（Ｐｏｌｙ  Ｄｉｓｐｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｄｅｘ）」（ＰＤＩ）として評価され得る。そのＰＤＩは、組成物中の粒度分布を示し、従って、粒子の均質性を記載する。ＰＤＩ値は、種々の方法（ゲル浸透クロマトグラフィー／サイズ排除クロマトグラフィー、レオロジー、溶液粘性、膜透過または光散乱法が挙げられる）を使用して得られ得る。
【０１２３】
そのＰＤＩは、好ましくは動的光散乱法（ＤＬＳ）によって決定される。ＤＬＳでは、本来の分布は、どの程度の光を種々の「スライス（ｓｌｉｃｅ）」から散乱するかを示す強度分布である。ＤＬＳは、分布の統計から、平均サイズおよびこの平均サイズからの標準偏差の決定を可能にする。相対的多分散性は、その標準偏差を平均で除算することによって決定される。分布の相対的多分散性から、多分散指数（ＰＤＩ）は、その平方として導出され得る。ＤＬＳによって得られるＰＤＩ値は、単分散性の（ＰＤＩ＜０．１）組成物および多分散性の（ＰＤＩ＞０．１）組成物へとグループに分けられ得、それによって、その多分散性の群内ではまた、より小さな値は、その組成物内でのより均質な分布を示す。
【０１２４】
本発明によれば、０．１〜０．４のＰＤＩ値は好ましい。より好ましくは，そのＰＤＩ値は、０．１〜０．３であり、さらにより好ましくは０．１〜０．２である。
【０１２５】
ＶＬＰを含む組成物の平均直径は、視覚的方法（例えば、顕微鏡法（好ましくは平均直径を決定するためにソフトウェアが装備される））によって測定され得るが、分析的光散乱法（例えば、ＤＬＳ）またはナノトラッキング法（例えば、ＮＴＡ）によっても測定され得る。
【０１２６】
その組成物内のＶＬＰ含有量は、例えば、ＦＦＦ−ＭＡＬＳおよび／またはＤＬＳによって測定され得る。両方の方法は、適切なサイズにされたＶＬＰおよび凝集物、「非常に小さいもの」（小粒子）と他の不純物（例えば、塩、デブリまたはペンタマー）との間を区別し得る。
【０１２７】
このような組成物は、特に、薬物送達システムに通常課される要件を満たす。明らかに、このような組成物は、均質でありかつ高純度を有する。
【０１２８】
別の局面において、本発明は、本発明に従う方法によって得られ得る薬物送達システムに関する。このような薬物送達システムは、上記で述べられるとおりの利点を有する。特に、このような薬物送達システムは、治療および／または診断の方法において、好ましくは神経学的障害（すなわち、ＣＮＳ疾患）の処置のために使用され得る。
【０１２９】
よって、本発明はまた、障害（特にＣＮＳ疾患）を本発明に従う薬物送達システムで処置するための方法に関する。処置する方法は、好ましくは、必要性のある被験体にその薬物送達を投与する工程を包含する。
【０１３０】
本発明はまた、神経学的障害、すなわち、ＣＮＳ疾患の処置のための医薬の製造のための薬物送達システムの使用に関する。処置方法は、好ましくは、その処置されるべき被験体のＢＢＢの透過性を増大させる工程を包含しない。本発明の薬物送達システムは、好ましくは、ＢＢＢを損なうかまたは混乱させるためのいかなる化学的または物理的処置をも受けたことのない患者に投与される。
【０１３１】
用語「ＣＮＳ疾患（ＣＮＳ  ｄｉｓｅａｓｅ）」（または「神経学的障害（ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）」）とは、個体の神経系の、好ましくは中枢神経系の任意の障害をいう。それは、神経変性障害、精神的障害または神経血管障害を包含する。
【０１３２】
本発明の一実施形態において、その神経学的障害は、脳卒中（ｓｔｒｏｋｅ）、アルコール嗜癖、アルツハイマー病、不安、関節炎、無力症、注意欠陥多動性障害、双極性障害、がん疼痛、脳虚血、脳神経保護（ｃｅｒｅｂｒａｌ  ｎｅｕｒｏｐｒｏｔｅｃｔａｎｔ）、痙性斜頚、ハンチントン病と関連する舞踏病、慢性疼痛、慢性の重篤な疼痛、認知障害、皮質性ミオクローヌス、神経変性疾患、うつ病、糖尿病性神経障害疼痛、糖尿病性ニューロパチー、情動不安定、癲癇、ナルコレプシーと関連する過剰な眠気、線維筋痛症、脆弱Ｘ症候群、フリードライヒ運動失調症、不眠症、レノックスガスター症候群、大うつ病性不安障害（ｍａｊｏｒ  ｄｅｐｒｅｓｓｉｖｅ  ａｎｄ  ａｎｘｉｅｔｙ  ｄｉｓｏｒｄｅｒ）、双極性障害と関連する躁病エピソード、記憶障害、片頭痛、軽度認知機能障害、中程度から重篤な疼痛、運動ニューロン疾患、多発性硬化症、筋骨格疼痛、ナルコレプシー、神経痛、神経因性疼痛、ニコチン依存症、強迫性障害、オピオイド誘導性有害効果、オピオイド誘導性便秘、変形性関節症疼痛、過活動膀胱、疼痛、パーキンソン病、小児の流涎症（ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｄｒｏｏｌｉｎｇ）、糖尿病性末梢神経障害、術後疼痛、ヘルペス後神経痛、月経前不快気分障害、精神病、難治性複雑部分発作（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｐａｒｔｉａｌ  ｓｅｉｚｕｒｅ）、下肢静止不能症候群（ＲＬＳ）、統合失調症、てんかん発作（ｓｅｉｚｕｒｅ）、重篤な慢性疼痛、睡眠障害、禁煙、痙縮、脊髄損傷、脳卒中、トランスサイレチン型家族性アミロイドポリニューロパチー、外傷性脳損傷、回転性めまい（ｖｅｒｔｉｇｏ）、悪液質、筋萎縮性側索硬化症、脊髄小脳失調症Ｉ型、錐体外路障害および運動障害、一過性脳虚血性発作（ＴＩＡ）、進行性多巣性白質脳症（ＰＭＬ）、ＨＩＶ感染、認知症（例えば、アルツハイマー病、血管性認知症、前頭側頭型認知症、意味性認知症およびレビー小体を伴う認知症）からなる群より選択され、好ましくは、アルツハイマー病、パーキンソン病および多発性硬化症を含むかまたはこれらからなる群より選択される。
【０１３３】
本発明のさらなる局面において、本発明は、本発明の方法の工程ａ）〜ｅ）およびｅ）の組成物のペンタマーを、そのペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルするというさらなる工程を含む方法によって得られ得る、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）に関する。カーゴは、最終のアセンブリ工程において添加されない。このようなＶＬＰは、ワクチンとして特に有用であり得る。
【０１３４】
一実施形態において、本発明に従うＶＬＰは、血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する。従って、本発明の一実施形態において、その薬物送達システムは、ＢＢＢを横断して薬物を送達するために使用され得る。本発明によれば、薬物送達システムおよび／またはＶＬＰおよび／またはそのＶＬＰにパックされた薬物は、ＢＢＢを横断し得る。
【０１３５】
重要なことには、その薬物送達システムによるＢＢＢの横断は、その薬物送達システムが、脳内の特定の細胞集団を標的化するという機能を示すことを、すなわち、カーゴを標的化された細胞に送達することを可能にする。本発明の状況において、上記薬物送達システムは、標的化された細胞へのおよび／またはその中への送達を含む。
【０１３６】
好ましい実施形態において、本発明のＶＬＰおよび／またはそのカーゴは、処置されるべき被験体、特にヒトへの投与後に、投与後に１０日間未満で、好ましくは５日間未満で、より好ましくは３日間未満で、ＣＮＳにおいて検出され得る。その薬物送達システムは、好ましくは、被験体に静脈内投与される。これは、そのＶＬＰを信頼性の高い薬物送達システムとして使用する場合に特に有利である。
【０１３７】
好ましくは、その方法は、ＢＢＢの完全性の喪失または増大した透過性を要しない。
【０１３８】
インビトロでのＢＢＢの完全性は、公知の方法によって、例えば、相対的な経内皮電気抵抗測定（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ）（ＴＥＥＲ）（Ｒｅｍｐｅら，  Ｂｉｏｃｈｅｍ  Ｂｉｏｐｈ  Ｒｅｓ  Ｃｏｍｍ  ２０１１，  ４０６  （１）：  ６４−６９）によって、測定され得る。ＢＢＢの多くのインビトロモデルは、確立される（種々の共培養物中での初代のウシまたはヒト脳内皮細胞（例えば、ヒト脳内皮細胞株ＨＢＥＣ−５ｉ）を含む。インビボでは、画像化法（例えば、ＣＴスキャンまたはＭＲＩ）は、ＢＢＢ透過性を可視化するために造影剤と一緒に使用され得る。機能的画像化（例えば、ＰＥＴまたはＳＰＥＣＴ）も使用され得る。
【０１３９】
本発明によれば、その薬物送達システムを投与する前またはその間に、ＢＢＢの透過性を損なうことは必要とされない。従って、ＢＢＢは、好ましくは生理学的に無傷であり、これは、その完全性が低下されないおよび／またはその透過性が健康的な天然の状態と比較して増大されないことを意味する。本発明のＶＬＰは、好ましくは生理学的に無傷のＢＢＢを横断する。
【０１４０】
その薬物送達システムを含む組成物は、好ましくは、ＢＢＢの完全性を混乱させ得る添加剤を要しない。よって、本発明の最も好ましい実施形態において、その薬物送達システムは、ＢＢＢの透過性に影響を及ぼし得るいかなる添加剤をも含まない。
【０１４１】
材料および方法
ＶＬＰ製造
ウイルス様粒子（ＶＬＰ）を、ヨトウムシ（ｆａｌｌ  ａｒｍｙｗｏｒｍ）（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）に由来するＳｆ９昆虫細胞株（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用するタンパク質発現によって製造した。ＶＬＰを、その細胞にＪｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス  ＶＰ１タンパク質発現カセットを含む組換えバキュロウイルスを感染させることによって生成した。その組換えバキュロウイルスを、Ｂａｃ−ｔｏ−Ｂａｃ（登録商標）  Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ発現系（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用することによって調製した。ＶＬＰを、３．４Ｌ  バイオリアクター（ＩＮＦＯＲＳ  ＨＴ  Ｍｉｎｉｆｏｒｓ）中での７〜１０日後に、ｐＨ６．３において生成した。空気流および温度（２６℃）をその時間にわたって制御した。細胞および細胞デブリを除去するために、懸濁物を、４℃、５．０００ｇで遠心分離し、そのＶＬＰを含む上清を採取した。
【０１４２】
そのＶＬＰを、２つの異なる濃縮法：７．５％  ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）での沈殿またはAＫＴＡｃｒｏｓｓ  ｆｌｏｗＴＭシステム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でのクロスフロー、を使用して濃縮した。ＰＥＧ沈殿に関して、その清澄にされた上清を、ＰＥＧと混合して７．５％（ｖ／ｖ）を達成し、４℃において２時間にわたってインキュベートし、その後、その沈殿物を、４℃、１０．０００ｇでの遠心分離によって分離し、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．５中で懸濁した。クロスフローを、３００ｋＤａカットオフ膜（Ｈｙｄｒｏｓａｒｔ（登録商標）  ３００ｋＤａ  ＥＣＯ，  Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を備えたAＫＴＡｃｒｏｓｓ  ｆｌｏｗＴＭシステムで行った。そのフロー限外濾過を１．５バールの一定圧および８倍（８Ｌの緩衝液に対して１Ｌの上清）で行った。
【０１４３】
ＶＬＰを、室温において７０分間、５ｍＭ  ＤＴＴおよび１０ｍＭ  ＥＤＴＡを使用することによってペンタマーへとさらに解離し、そのペンタマーを、１５０ｍＭから１Ｍ  ＮａＣｌへのＮａＣｌ段階的勾配でＨｉＳｃａｌｅ  ＣａｐｔｏＱカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、アニオン交換クロマトグラフィー（ＡＥＸ）によって精製した。ペンタマーを、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ工程で溶離した。溶離後、そのペンタマーを以下のとおり処理した：
ａ）  カーゴと混合し、再アセンブルした（「カーゴでの新鮮なまたは貯蔵したペンタマーのパッケージング」を参照のこと）；
ｂ）  ペンタマーの貯蔵のために５％  グリセロールとともに−８０℃で凍結した（これをその後、カーゴと混合および再アセンブルされ得る。「カーゴでの新鮮なまたは貯蔵したペンタマーのパッケージング」を参照のこと）または
ｃ）  ２０ｋＤａカットオフを有する透析カセット（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ＬｙｚｅｒＴＭ  Ｇ２  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）へと直ぐに配置し、透析（２工程透析）による２工程再アセンブルによって再アセンブルした。第１に、ペンタマーを、２Ｍ  硫酸アンモニウム緩衝液（「ＡＳ」、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２Ｍ  （ＮＨ４）２ＳＯ４、ｐＨ７．５）に対して２４時間にわたって透析し、次いで、次の２４時間にわたって１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５（標準的再会合緩衝液、「ＳＴ」）に移した（ＡＳ＞ＳＴ）。あるいは、その２工程透析を、ＳＴ緩衝液で、両方の工程において行った（ＳＴ＞ＳＴ）。両方の場合に、アセンブリされていない物質および凝集物をそのＶＬＰから分離するために、そのＶＬＰを含む組成物を、ＨｉＰｒｅｐＴＭ  Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（登録商標）Ｓ−５００  ＨＲカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  ＺＳ  Ｎａｎｏ（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｃ．）を使用する動的光散乱法（ＤＬＳ）において画分の多分散指数（ＰＤＩ）の制御下で、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって精製した。標的化したサイズを有するＶＬＰ画分を選択およびプールし、次いで、適用可能である場合に５ｋＤａ  カットオフ膜を有するＶｉｖａｓｐｉｎ（登録商標）濃縮器（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）中で濃縮し、続いて、−８０℃で貯蔵した。
【０１４４】
カーゴでの再アセンブルしたＶＬＰのパッケージング
再アセンブルしたＶＬＰのＶＬＰパッケージングのために、上記の工程ｃ）の貯蔵したＶＬＰを−８０℃から取り出し、サーマルシェイカー（２３℃、３５０ｒｐｍ）を使用して融解した。その後、融解したＶＬＰサンプルの解離を、解離緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＤＴＴ、および１０ｍＭ  ＥＤＴＡ）の存在下で、２３℃および４５ｒｐｍにおいて１５分間そのサンプルをインキュベートすることによって行った。解離したＶＬＰを、カーゴ（例えば、核酸）の存在下で再アセンブルした。簡潔には、その解離したＶＬＰを、適切な濃度のカーゴと徹底的に混合し、続いて、その混合物を、２０ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析チャンバ（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ＬｙｚｅｒＴＭ  ＭＩＮＩ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して標準的な再会合緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して透析した。４〜６時間後、透析緩衝液を、新鮮な透析緩衝液に交換し、サンプルをさらに１６〜１８時間インキュベートした。核酸をカーゴとして使用する場合、パックされていない核酸を、２５μｇ  ＶＬＰおよび２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２につき、３７℃において１時間、４０  ｕ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）とインキュベートすることによって消化した。サンプルを、透析する前に濾過した（Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）  Ｃｏｓｔａｒ（登録商標）  Ｓｐｉｎ−Ｘ（登録商標）遠心分離チューブフィルタ；孔サイズ０．２２μｍ）。ＶＬＰを、その後直接分析し、そして／または−８０℃で貯蔵した。
【０１４５】
カーゴでの新鮮なまたは貯蔵したペンタマーのパッケージング
ペンタマーパッケージングのために、新鮮なまたは−８０℃で貯蔵したペンタマーを直接混合し、カーゴで再アセンブルしたか、またはサーマルシェイカー（２３℃、３５０ｒｐｍ）を使用して融解し、次いで、カーゴ（例えば、核酸）の存在下で再アセンブルした。簡潔には、そのペンタマーを、適切な濃度のカーゴと徹底的に混合し、続いて、その混合物を、２０ｋＤａ  ＭＷＣＯ透析チャンバ（Ｓｌｉｄｅ−Ａ−ＬｙｚｅｒＴＭ  ＭＩＮＩ  Ｄｉａｌｙｓｉｓ  Ｄｅｖｉｃｅ，  Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して標準的な再会合緩衝液（１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ７．５）に対して透析した。核酸をカーゴとして使用する場合、パックされていない核酸を、２５μｇ  再アセンブルＶＬＰおよび２．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２につき、３７℃において１時間、４０  ｕ  Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ（登録商標）  Ｎｕｃｌｅａｓｅ（Ｍｅｒｃｋ）とインキュベートすることによって消化した。再アセンブルしたペンタマーを、その後直接分析した。
【０１４６】
ＶＬＰの機能性試験／ルシフェラーゼアッセイ
核酸に装填したＶＬＰの場合（新鮮なまたは貯蔵したペンタマーから；または再アセンブルおよび精製したＶＬＰから製造）、ルシフェラーゼ  ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）プラスミドを、カーゴとして使用した。膠芽腫細胞を、予め、１０％  ＦＣＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）および１％  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を補充した９００μｌ  ＤＭＥＭ培地、高グルコース、ＧｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中に、３×１０４の密度で２４時間播種した。そのサンプルを添加する前に、その相当する量の培地を、各ウェル中の一定量の培地を維持するために除去した。サンプルをその細胞に添加し、３７℃および５％  ＣＯ２において４８時間インキュベートした。その後、細胞培地を排除し、細胞をＰＢＳで洗浄した。ルシフェラーゼ活性を、製造業者の説明書に従って決定した（ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ））。Ｇｌｏｍａｘ（登録商標）マルチ検出システム（Ｐｒｏｍｅｇａ）において、白色９６ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  ｂｉｏ−ｏｎｅ）中でルミネッセンスを測定した。
【０１４７】
ＶＬＰ特徴付け
サンプル解離を堅守するために、サンプルの再アセンブルおよび安定性、動的光散乱法（ＤＬＳ）および多分散指数（ＰＤＩ）を、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏ  ＺＳ（Ｍａｌｖｅｒｎ．）を使用して測定した。そのＶＬＰサイズおよびＰＤＩを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（バージョン７．１１，  Ｍａｌｖｅｒｎ）で記録した。さらに、各サンプルの屈折温度を、Ｔｙｃｈｏ  ＮＴ．６（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を使用してｎＤＳＦによって評価した。
【０１４８】
サンプル組成を分析するために、非対称フローフィールドフローフラクショネーション（ＡＦ４，  Ｗｙａｔｔ  Ｉｎｃ．）を行った。サンプルを、多角度光散乱法（ＭＡＬＳ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）およびＵＶ検出器を使用することによって分析した。
【０１４９】
透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）分析を、８０ｋＶの電圧で作動するＺｅｉｓｓ  ＥＭ９００電子顕微鏡の助けを借りて、種々の実験工程においてそのサンプルを直接可視化するために行った。このアプローチのために、サンプルを、予め２％  酢酸ウラニル（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して、炭素被覆銅グリッド（Ｐｌａｎｏ  ＧｍｂＨ）の上で染色した。
【０１５０】
血液脳関門（ＢＢＢ）透過を検証するための人工ＢＢＢモデル
ＶＬＰのＢＢＢ透過を、２区画人工ＢＢＢモデルにおいて、単一培養物（透過性にした蛍光標識物質の直接定量）または共培養物（標的細胞における透過した物質によって引き起こされるタンパク質発現）のいずれかを使用することによって評価した。
【０１５１】
両方の場合に、２４ウェル透過可能支持体（挿入物、０．４μｍ、Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｓｔａｒ）を、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中の１：２０  フィブロネクチン（ＢｉｏＲｅａｇｅｎｔ）および１：７５  Ｉ型コラーゲン（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の混合物で、３７℃において９０分間、予め被覆した。過剰な被覆を注意深く除去した後、被覆した挿入物を、９００μｌ  培地（ＥｎｄｏＧＲＯ，  ＳＣＭＥ００４，  Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を満たした新たな２４ウェルプレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−Ｏｎｅ）へと移した。７．５×１０４  ＢＢＢ細胞（ＨＢＥＣ−５ｉ，  脳毛細血管内皮細胞）を２００μｌ  培地とともにその挿入物へと播種した。細胞を、９６時間〜１２０時間にわたって、そのウェル中の培地を２日ごとに交換しながらインキュベートした。
【０１５２】
単一培養物実験（蛍光標識カーゴの透過）
その調製した挿入物を、１ウェルあたり９００μｌのフェノール非含有培地（ＤＭＥＭ／Ｆ−１２、ＨＥＰＥＳ、フェノールレッドなし、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を満たした新たな２４ウェルプレートに注意深く移した。サンプルをその挿入物に添加する前に、各挿入物において２００μｌ  培地の一定量を維持するために、その相当する量の培地を除去した。インキュベーター中で、３７℃において１２０分間のインキュベーション後に、各ウェルの３×１００μｌを、黒色９６ウェルプレートに移し、そのサンプルの蛍光を、プレートリーダー（Ｔｅｃａｎ  Ｉｎｆｉｎｉｔｅ  Ｍ２００，  Ｔｅｃａｎ）を使用して決定した。
【０１５３】
ＢＢＢ形成を確認するために、そのＢＢＢを、ＥＤＴＡをその挿入物に添加することによって混乱させた。その挿入物を、新鮮なフェノール非含有培地を含む２４ウェルプレートに移した。ＥＤＴＡ（ｃＥｎｄ＝５ｍＭ、およそ５μｌ）を、その挿入物に添加し、９０分間、３７℃においてインキュベートした。その後、蛍光を上記で記載されるように決定した。
【０１５４】
透過を、ＢＢＢ細胞を有するその挿入物の蛍光シグナルを、ＢＢＢ細胞なしの適切な挿入物に対して正規化することによって計算した。その同じ様式で、そのＢＢＢの完全性を、ＥＤＴＡの添加後に検証した。
【０１５５】
共培養物実験（透過した物質の活性）
挿入物を、標的細胞（膠芽腫細胞）を含む、１０％  ＦＣＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）および１％  Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ（ＰＡＮ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）を補充した９００μｌ  ＤＭＥＭ、高グルコース、ＧｕｔａＭＡＸＴＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）中、３×１０４の密度で予め２４時間播種した新たな２４ウェルプレートに移した。そのサンプル（ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）プラスミドでパックされたＶＬＰ）をその挿入物に添加する前に、各挿入物において２００μｌ  培地の一定量を維持するために、その相当する量の培地を除去した。２４時間後に、その挿入物を、その２４ウェルプレートから除去し、ＰＢＳで洗浄した。応じて、その膜（ＢＢＢ細胞を有する）を外科用メスを使用して切断し、１．５ｍｌ  反応バイアルに移した。ルシフェラーゼ活性を、その製造業者の説明書に従って決定した（ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ））。
【０１５６】
そのウェル（その標的細胞を含む）を、さらに２４時間、ルシフェラーゼアッセイをその製造業者の説明書に従って行う前に、インキュベートした（ＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ））。
【０１５７】
低温保護を伴う貯蔵
各凍結防止添加剤であるグリセロール（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ）、スクロース（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ）、硫酸アンモニウム（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ）、ＤＭＳＯ（Ｃａｒｌ  Ｒｏｔｈ）およびベタイン（Ｍｅｒｃｋ）を、０．６８Ｍに相当する５％（ｖ／ｖ）でのグリセロールを除いて、最終添加剤濃度１Ｍを生じるように、ＶＬＰに添加した。さらに、１つのアリコートは、添加剤物質を含まなかった（ｗ／ｏ）。そのサンプルを分割し、２つの凍結速度を適用することによって凍結した：  各サンプルの１／２を、およそ−１℃／分の冷却速度で凍結した（遅い凍結）一方で、その２／２を、その容器を液体窒素へと漬けることによって迅速に凍結した（迅速凍結）。全てのサンプルを−８０℃において１〜１０日間の貯蔵期間で貯蔵した。２３℃での融解および３５０ｒｐｍでの振盪後に、そのサンプルを、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、２ｍＭ  ＣａＣｌ２、ｐＨ  ７．５に対して、室温において２時間透析して、添加剤濃度および分析結果に対するそれらの影響を低減させた。粒子直径およびＰＤＩを、Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ  Ｎａｎｏｓｅｒｉｅｓ（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって決定した。屈折温度を、Ｔｙｃｈｏ  ＮＴ．６（Ｎａｎｏｔｅｍｐｅｒ）を使用して測定した。貯蔵後のＶＬＰ機能性を、ＮａｎｏＬｕｃ（登録商標）プラスミドパッケージングおよびその後のＮａｎｏＧｌｏ（登録商標）  Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ａｓｓａｙ（Ｐｒｏｍｅｇａ）の助けを借りて証明した。
【実施例】
【０１５８】
実施例１：機能分析
ＶＬＰの有効性を送達するカーゴ（これを、種々の方法を使用して調製した）を比較した（図１）。この目的のために、２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルまたは１ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル（両方の方法において、ルシフェラーゼプラスミドの存在下で最後の再アセンブル）を受けたＶＬＰを生成した。顕著なことには、２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルを受けたＶＬＰのルシフェラーゼ活性は、１ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルを受けたＶＬＰと比較して、および「プラスミドのみ」および「細胞のみ」のコントロールと比較して、有意に増大した。
【０１５９】
次に、本発明に従って調製されたＶＬＰが血液脳関門（ＢＢＢ）を透過する能力を分析した（図２）。図２Ａは、単一培養物設定においてＶＬＰもしくはプラスミド（丸）によってＢＢＢ透過を試験する人工血液脳関門（ＢＢＢ）モデルの設定を示す。ヒト脳内皮細胞（ＢＢＢ細胞、ＨＢＥＣ−５ｉ）を、透過可能な支持体上にプレートした。図２Ｂは、「プラスミドのみ」のコントロールと比較して、２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル（蛍光標識プラスミドの存在下での第２の再アセンブル）を受けたＶＬＰの透過性を示す。黒い棒は、無傷のＢＢＢでの実験を表す。白い棒は、人工的に混乱させたＢＢＢ（ＥＤＴＡの添加によって）での実験を表す。顕著なことには、本発明に従って調製されたＶＬＰは、裸のプラスミドより有意に大きな比でＢＢＢを横断する能力があった。ＢＢＢ層の完全性の混乱は、この差異を破壊し、本発明に従って調製されたＶＬＰの選択的で効率的な透過能力を示す。
【０１６０】
本発明に従って生成されたＶＬＰの有効性の、標的細胞への送達を評価するために、共培養ＢＢＢモデルを使用した（図３）。図３Ａは、ＶＬＰまたはプラスミド（丸）によるＢＢＢ透過および共培養設定において標的細胞の中に透過した物質によって引き起こされるその後のタンパク質発現を試験するために、人工ＢＢＢモデルの設定を示す。図３Ｂは、挿入物に存在するＢＢＢ細胞において（ＨＢＥＣ−５ｉ細胞において）測定されたルシフェラーゼ活性および透過後の標的細胞におけるルシフェラーゼ活性を示す。人工ＢＢＢ（「被覆＋ＢＢＢ細胞」）およびＢＢＢ細胞なしの被覆（「被覆のみ」）を試験した。その挿入物の細胞のルシフェラーゼ活性は、細胞が存在する場合に（従って、「被覆のみ」サンプルが予測されるようにいかなるルシフェラーゼ活性をも示さなかった）およびルシフェラーゼプラスミドが本発明に従って調製されたＶＬＰへとパックされた場合に（プラスミドのみと比較して）のみ測定された。その標的細胞のルシフェラーゼ活性はまた、ＢＢＢ細胞層が存在するかまたは被覆のみかに関係なく、本発明の方法に従って調製されたＶＬＰを有するサンプル中でのみ（プラスミドのみと比較して）測定された。
【０１６１】
従って、本発明に従って調製されたＶＬＰは、高感染性およびカーゴ送達能力を保持すると同時に、ＢＢＢを効率的に通過する能力がある。サンプル（パックされた）は、２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル（ルシフェラーゼプラスミドの存在下での第２の再アセンブル）を受けたＶＬＰを意味する。
【０１６２】
実施例２：  ペンタマーの貯蔵  対  ＶＬＰの貯蔵
種々の貯蔵手順を受けた標識ＶＬＰを含む組成物の均質性および均質性を調査するために、透過型電子顕微鏡法（ＴＥＭ）を行った。１ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルで生成されたＶＬＰ（凍結されたペンタマー、左）を、２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブルで生成されたＶＬＰ（凍結されたＶＬＰ、右）と比較した（図４）。後者の場合に生成されたＶＬＰは、顕著により均質な分布を示した。なぜならそれらは、そのペンタマーが製造の間に凍結されたＶＬＰと比較した場合に、いかなる目に見える欠損性ウイルス粒子をも欠いたからである。
【０１６３】
図４におけるように生成された装填ＶＬＰの均質性をさらに調査するために、ＦＦＦ−ＭＡＬＳ分析を行った（図５）。両方のサンプルを、参照として働く新鮮に調製したＶＬＰ（カーゴなし、従って、脱アセンブル／再アセンブルなし）と比較した。顕著なことには、参照（図５Ｃ）と比較すると、ＶＬＰの中間凍結を伴う２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル後に生成されたＶＬＰ（図５Ａ）は、その組成物中に存在するＶＬＰ凝集物の量を顕著に低減した。さらに、ＶＬＰの分布は、さらにより均質であった。そのＶＬＰのサイズならびに「非常に小さいもの」および「塩、デブリ、ペンタマー」の存在は、匹敵していた。
【０１６４】
顕著なことには、ＶＬＰが１ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル（凍結されたペンタマー）後に生成された場合、構造的に無傷のＶＬＰはほとんど同定できなかった（図５Ｂ）。従って、本発明の方法は、再アセンブルされたＶＬＰとしてのＶＬＰの中間貯蔵およびほとんど凝集物のない装填ＶＬＰの非常に均質な集団の生成を可能にする。パーセンテージを、凝集物を除いて示す。
【０１６５】
ＶＬＰの中間凍結（「サンプル（パックされた）」、実線）を、新鮮に調製したＶＬＰ（カーゴなし、従って、脱アセンブル／再アセンブルなし「サンプル（ｗｔ）」、破線）と比較して２ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル後に生成されたＶＬＰの安定性をさらに特徴づけるために、ｎＤＳＦ分析を、融解温度（屈折温度）を明らかにするために行った（図６）。顕著なことには、両方のＶＬＰサンプルの融解曲線は、ほぼ区別可能でなく、本発明の方法に従って調製されたＶＬＰが新鮮に調製したＶＬＰと等しく安定であることを示す。
【０１６６】
実施例３：再アセンブル前に凝集を誘導する
次に、ペンタマーをＶＬＰへと再アセンブルする間に凝集を誘導する効果を測定した。ＤＬＳによって均質性を分析した（図７および図８）。図７は、凝集の誘導あり（白い棒）および凝集の誘導なし（黒い棒）の透析後に得られたＶＬＰのＰＤＩを示す。第１の凝集の誘導によって再アセンブルされたＶＬＰは、凝集の誘導なしで再アセンブルされたＶＬＰと比較して、強く低減したＰＤＩを示した。従って、再アセンブルの間の凝集の誘導は、遙かにより均質なサイズ分布をもたらした。両方のサンプルを、凍結する前に採取した（従って、それらは１ラウンドの脱アセンブルおよび再アセンブルを受けた）。
【０１６７】
図８は、図７におけるように調製されたサンプル（図８、左）およびその後の凍結工程を除いて同じ再アセンブル条件を受けたサンプル（図８、右）のＤＬＳによって決定した平均サイズ分布を示す。凝集の誘導ありで再アセンブルした両方のサンプル（実線）は、非常に均質なサイズ分布を示す一方で、凝集工程を受けなかったサンプル（破線）は、少なくとも２つのＶＬＰ集団を示す。さらには、その凍結工程は、後者のサンプルにとって明らかに有害であった。なぜなら凝集の誘導なしで再アセンブルされたＶＬＰを含む組成物は、凍結後にかなりより不均質になったからである。しかし、凝集の誘導ありで再アセンブルされたＶＬＰは、そのサンプルの均質性に何ら影響なく凍結できた。
【０１６８】
実施例４：凍結防止添加剤の効果
ＶＬＰに対するサンプル貯蔵の効果をさらに綿密に調べるために、種々の凍結防止添加剤を、１ラウンドの脱アセンブルおよびその後の再アセンブル、ならびにＡＳ緩衝液を含む２回の透析工程（再アセンブルの間の凝集の誘導のため）後に凍結したＶＬＰを含む組成物に添加した（図９）。図９Ａは、ｎＤＳＦによって分析した場合に示されるように貯蔵された装填ＶＬＰの安定性を示す。顕著なことには、硫酸アンモニウムを含む緩衝液中に貯蔵されたＶＬＰは、他の凍結防止添加剤と比較して、かなりより安定した（すなわち、より高い屈折温度を示す）。興味深いことには、この効果は、そのＶＬＰが迅速に凍結されたか（黒い棒）またはゆっくりと凍結されたか（点付きの棒）に関わらず無関係であった。
【０１６９】
次の工程において、これらのサンプルを、ルシフェラーゼアッセイにおいて使用した（図９Ｂ）。予測外なことには、そのルシフェラーゼ活性は、硫酸アンモニウムを含む組成物中に貯蔵されたＶＬＰによって強力に増大された。ベタインはまた、凍結防止添加剤なしのサンプルおよび他の試験した凍結防止添加剤と比較した場合に有利であった。従って、凍結防止添加剤、特に硫酸アンモニウムの使用は、ＶＬＰの安定性をかなり増大させ、その装填ＶＬＰの感染性およびカーゴ送達有効性を増大させた。繰り返すと、この効果は、そのＶＬＰが迅速に凍結されたか（黒い棒）またはゆっくりと凍結されたか（白い棒）に関わらず無関係であった。
【図１】
2021502951.tif 000007
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年3月13日(2020.3.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む薬物送達システムを提供するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）  ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
ｂ）  該ａ）の組成物の該ＶＰ１タンパク質を、該ＶＰ１を誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルする工程、
ｃ）  該ｂ）の組成物の該ＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｄ）  該（ｃ）の組成物の該ペンタマーを、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへと再アセンブルする工程
ｅ）  該ｄ）の組成物の該ＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件へと曝す工程、
ｆ）  該ｅ）の組成物の該ペンタマーを、カーゴおよび該ペンタマーを誘導する条件に曝して、該カーゴと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程、
を包含する方法。
【請求項２】
工程ｄ）の前に、前記ｃ）の組成物の前記ペンタマーは、該ペンタマーの凝集を誘導する条件へと曝される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記凝集は、沈殿剤、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルコール、塩またはこれらの組み合わせからなる群より選択される沈殿剤によって、最も好ましくは塩によって誘導される、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記塩は、シトレート（Ｃ６Ｈ５Ｏ７３−）、ホスフェート（ＰＯ４３−）、スルフェート（ＳＯ４２−）、リン酸水素（ＨＰＯ４２−）、リン酸二水素（Ｈ２ＰＯ４−）、ヨウ素酸（ＩＯ３−）、ヒドロキシド（ＯＨ−）、フルオリド（Ｆ−）、臭素酸（ＢｒＯ３−）またはアセテート（ＣＨ３ＣＯＯ−）、四級アンモニウム化合物（ＮＲ４＋）であって、Ｒは、アルキル基もしくはアリール基であるもの、好ましくはテトラメチルアンモニウム（（ＣＨ３）４Ｎ＋）またはジメチルアンモニウム（（ＣＨ３）２Ｎ２＋）、アンモニウム（ＮＨ４＋）、カリウム（Ｋ＋）、セシウム（Ｃｓ＋）、ルビジウム（Ｒｂ＋）またはリチウム（Ｌｉ＋）からなる群より選択される、アニオンおよびカチオンを含み、好ましくはＳＯ４２−および／またはＮＨ４＋を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記塩は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４およびＮａ２ＨＰＯ４からなる群より選択され、好ましくは（ＮＨ４）２ＳＯ４である、請求項３または４に記載の方法。
【請求項６】
工程ｄ）は、ｄ）の組成物のペンタマーを、該ペンタマーの凝集を誘導する条件から分離することを包含する、請求項２〜５のいずれかに記載の方法。
【請求項７】
前記分離は、塩および緩衝液、ならびに６〜８．５の、好ましくは６．５〜８．５の、より好ましくは７〜８の、最も好ましくは７．２〜７．５の、特に７．５のｐＨを含む組成物に対する透析によって達成される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記工程ｄ）の組成物は、
ａ）０．３未満、好ましくは０．２未満、好ましくは０．１未満の多分散指数（ＰＤＩ）、より好ましくは０．０１〜０．０９の間の範囲の多分散指数、および／または
ｂ）ＶＬＰのうちの少なくとも７０％が２０ｎｍ〜７０ｎｍの、好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍの、より好ましくは３５ｎｍ〜６５ｎｍの、より好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有する、
によって特徴づけられる、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
約−８０℃〜約４℃の温度において少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、好ましくは少なくとも２４時間にわたって、より好ましくは約−８０℃の温度において少なくとも２４時間にわたって、前記工程ｄ）の組成物からのＶＬＰを貯蔵する工程を包含する、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
貯蔵する工程は、凍結防止添加剤、好ましくはポリオール、糖、無機塩、有機塩、アミノ酸、ポリマー、エクストリモライト、またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む群から選択される凍結防止添加剤を含む組成物の中で起こる、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記無機塩は、スルフェートアニオンを含み、好ましくは硫酸アンモニウムであり、そして／または前記アミノ酸は、グリシン、グルタミン、プロリン、アラニンであり、そして／または前記アミノ酸誘導体は、ベタインである、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記工程ｂ）のＶＬＰ、前記工程ｃ）のペンタマーおよび／または前記工程ｄ）のＶＬＰは精製に供される、請求項１〜１１のいずれかに記載の方法。
【請求項１３】
前記ＶＰ１は、配列番号１に従うアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有する、請求項１〜１２のいずれかに記載の方法。
【請求項１４】
前記ＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列である、請求項１〜１３のいずれかに記載の方法。
【請求項１５】
以下のパラメーターのうちの１またはこれより多くによって特徴づけられる、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物：
ａ）０．３未満、好ましくは０．２未満、好ましくは０．１未満、より好ましくは０．０１〜０．０９の間の範囲の多分散指数（ＰＤＩ）、
ｂ）前記ＶＬＰのうちの少なくとも７０％が、２０ｎｍ〜７０ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍの、より好ましくは３５ｎｍ〜６５ｎｍの、より好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有する、
ｃ）ＶＬＰ含有量が、少なくとも８０％（ｖ／ｖ）。好ましくは少なくとも８５％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９５％（ｖ／ｖ）。
【請求項１６】
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の方法によって得られ得る、薬物送達システム。
【請求項１７】
必要性のある被験体における治療および／または診断の方法における使用のための、好ましくは神経学的障害の、特にＣＮＳ疾患の処置のための、請求項１６に記載の薬物送達システム。
【請求項１８】
請求項１の工程ａ）〜ｅ）および前記ｅ）の組成物の前記ペンタマーを、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルするというさらなる工程を包含する方法によって得られ得る、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
【請求項１９】
前記ＶＬＰは血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する、請求項１６もしくは１７に記載の薬物送達システム、または請求項１８に記載のＶＬＰ。
【請求項２０】
前記ＶＬＰは、前記薬物送達システムの投与後に、好ましくはｉ．ｖ．投与後に、１０日間以内にＣＮＳにおいて検出可能である、請求項１９に記載の薬物送達システムまたはＶＬＰ。
【請求項２１】
前記ＶＬＰは、生理学的に無傷のＢＢＢを横断する、請求項１９または２０に記載の薬物送達システムまたはＶＬＰ。
【請求項２２】
前記横断は、前記ＢＢＢの完全性の喪失または透過性の増大を要求しない、請求項２０に記載の薬物送達システムまたはＶＬＰ。
【請求項２３】
前記被験体は、彼のＢＢＢの透過性を増大させるか、またはその混乱を誘導するという処置を受けたことがない、請求項１７に記載の薬物送達システム。
【請求項２４】
塩および緩衝液を含み、そしてｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．５の、請求項１５に記載の組成物であって、該組成物は、好ましくは：
ａ）１２０ｍＭ〜１７０ｍＭ  ＮａＣｌ、好ましくは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、
ｂ）１〜５ｍＭ  ＣａＣｌ２、好ましくは２ｍＭ  ＣａＣｌ２、および
ｃ）５〜３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、好ましくは１０〜２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、より好ましくは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
を含む、組成物。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１６９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１６９】
次の工程において、これらのサンプルを、ルシフェラーゼアッセイにおいて使用した（図９Ｂ）。予測外なことには、そのルシフェラーゼ活性は、硫酸アンモニウムを含む組成物中に貯蔵されたＶＬＰによって強力に増大された。ベタインはまた、凍結防止添加剤なしのサンプルおよび他の試験した凍結防止添加剤と比較した場合に有利であった。従って、凍結防止添加剤、特に硫酸アンモニウムの使用は、ＶＬＰの安定性をかなり増大させ、その装填ＶＬＰの感染性およびカーゴ送達有効性を増大させた。繰り返すと、この効果は、そのＶＬＰが迅速に凍結されたか（黒い棒）またはゆっくりと凍結されたか（白い棒）に関わらず無関係であった。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む薬物送達システムを提供するための方法であって、該方法は、以下の工程：
ａ）  ＶＰ１タンパク質を含む組成物を提供する工程、
ｂ）  該ａ）の組成物の該ＶＰ１タンパク質を、該ＶＰ１を誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルする工程、
ｃ）  該ｂ）の組成物の該ＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件に曝す工程、
ｄ）  該（ｃ）の組成物の該ペンタマーを、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへと再アセンブルする工程
ｅ）  該ｄ）の組成物の該ＶＬＰを、該ＶＬＰをペンタマーへと脱アセンブルする条件へと曝す工程、
ｆ）  該ｅ）の組成物の該ペンタマーを、カーゴおよび該ペンタマーを誘導する条件に曝して、該カーゴと会合したＶＬＰへとアセンブルする工程、
を包含する方法。
(項目２)
工程ｄ）の前に、前記ｃ）の組成物の前記ペンタマーは、該ペンタマーの凝集を誘導する条件へと曝される、項目１に記載の方法。
(項目３)
前記凝集は、沈殿剤、好ましくは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、アルコール、塩またはこれらの組み合わせからなる群より選択される沈殿剤によって、最も好ましくは塩によって誘導される、項目２に記載の方法。
(項目４)
前記塩は、シトレート（Ｃ６Ｈ５Ｏ７３−）、ホスフェート（ＰＯ４３−）、スルフェート（ＳＯ４２−）、リン酸水素（ＨＰＯ４２−）、リン酸二水素（Ｈ２ＰＯ４−）、ヨウ素酸（ＩＯ３−）、ヒドロキシド（ＯＨ−）、フルオリド（Ｆ−）、臭素酸（ＢｒＯ３−）またはアセテート（ＣＨ３ＣＯＯ−）、四級アンモニウム化合物（ＮＲ４＋）であって、Ｒは、アルキル基もしくはアリール基であるもの、好ましくはテトラメチルアンモニウム（（ＣＨ３）４Ｎ＋）またはジメチルアンモニウム（（ＣＨ３）２Ｎ２＋）、アンモニウム（ＮＨ４＋）、カリウム（Ｋ＋）、セシウム（Ｃｓ＋）、ルビジウム（Ｒｂ＋）またはリチウム（Ｌｉ＋）からなる群より選択される、アニオンおよびカチオンを含み、好ましくはＳＯ４２−および／またはＮＨ４＋を含む、項目３に記載の方法。
(項目５)
前記塩は、（ＮＨ４）２ＳＯ４、Ｋ２ＳＯ４、Ｎａ２ＳＯ４、（ＮＨ４）２ＨＰＯ４、Ｋ２ＨＰＯ４およびＮａ２ＨＰＯ４からなる群より選択され、好ましくは（ＮＨ４）２ＳＯ４である、項目３または４に記載の方法。
(項目６)
工程ｄ）は、ｄ）の組成物のペンタマーを、該ペンタマーの凝集を誘導する条件から分離することを包含する、項目２〜５のいずれかに記載の方法。
(項目７)
前記分離は、塩および緩衝液、ならびに６〜８．５の、好ましくは６．５〜８．５の、より好ましくは７〜８の、最も好ましくは７．２〜７．５の、特に７．５のｐＨを含む組成物に対する透析によって達成される、項目６に記載の方法。
(項目８)
前記工程ｄ）の組成物は、
ａ）０．３未満、好ましくは０．２未満、好ましくは０．１未満の多分散指数（ＰＤＩ）、より好ましくは０．０１〜０．０９の間の範囲の多分散指数、および／または
ｂ）ＶＬＰのうちの少なくとも７０％が２０ｎｍ〜７０ｎｍの、好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍの、より好ましくは３５ｎｍ〜６５ｎｍの、より好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有する、
によって特徴づけられる、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目９)
約−８０℃〜約４℃の温度において少なくとも１０時間、１５時間、２０時間、好ましくは少なくとも２４時間にわたって、より好ましくは約−８０℃の温度において少なくとも２４時間にわたって、前記工程ｄ）の組成物からのＶＬＰを貯蔵する工程を包含する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目１０)
貯蔵する工程は、凍結防止添加剤、好ましくはポリオール、糖、無機塩、有機塩、アミノ酸、ポリマー、エクストリモライト、またはこれらの誘導体もしくは組み合わせを含む群から選択される凍結防止添加剤を含む組成物の中で起こる、項目９に記載の方法。
(項目１１)
前記無機塩は、スルフェートアニオンを含み、好ましくは硫酸アンモニウムであり、そして／または前記アミノ酸は、グリシン、グルタミン、プロリン、アラニンであり、そして／または前記アミノ酸誘導体は、ベタインである、項目１０に記載の方法。
(項目１２)
前記工程ｂ）のＶＬＰ、前記工程ｃ）のペンタマーおよび／または前記工程ｄ）のＶＬＰは精製に供される、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目１３)
前記ＶＰ１は、配列番号１に従うアミノ酸配列と、その全長にわたって少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含み、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を有する、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目１４)
前記ＶＰ１タンパク質のヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列と、その全長にわたって少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％同一であり、好ましくは配列番号２のヌクレオチド配列である、前述の項目のいずれかに記載の方法。
(項目１５)
以下のパラメーターのうちの１またはこれより多くによって特徴づけられる、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物：
ａ）０．３未満、好ましくは０．２未満、好ましくは０．１未満、より好ましくは０．０１〜０．０９の間の範囲の多分散指数（ＰＤＩ）、
ｂ）ＶＬＰのうちの少なくとも７０％が、２０ｎｍ〜７０ｎｍ、好ましくは３０ｎｍ〜７０ｎｍの、より好ましくは３５ｎｍ〜６５ｎｍの、より好ましくは４０〜６０ｎｍの平均直径を有する、
ｃ）前記組成物内のＶＬＰ含有量が、少なくとも８０％（ｖ／ｖ）。好ましくは少なくとも８５％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９０％（ｖ／ｖ）、好ましくは少なくとも９５％（ｖ／ｖ）。
(項目１６)
前述の項目のいずれかに記載の方法によって得られ得る、薬物送達システム。
(項目１７)
必要性のある被験体における治療および／または診断の方法における使用のための、好ましくは神経学的障害の、特にＣＮＳ疾患の処置のための、項目１６に記載の薬物送達システム。
(項目１８)
項目１の工程ａ）〜ｅ）および前記ｅ）の組成物の前記ペンタマーを、該ペンタマーを誘導する条件に曝して、ＶＬＰへとアセンブルするというさらなる工程を包含する方法によって得られ得る、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）。
(項目１９)
前記ＶＬＰは血液脳関門（ＢＢＢ）を横断する、項目１６もしくは１７に記載の薬物送達システム、または項目１８に記載のＶＬＰ。
(項目２０)
ＶＬＰは、前記薬物送達システムの投与後に、好ましくはｉ．ｖ．投与後に、１０日間以内にＣＮＳにおいて検出可能である、項目  １９に記載の薬物送達システムまたはＶＬＰ。
(項目２１)
前記ＶＬＰは、生理学的に無傷のＢＢＢを横断する、項目１９または２０に記載の薬物送達システムまたはＶＬＰ。
(項目２２)
前記横断は、前記ＢＢＢの完全性の喪失または透過性の増大を要求しない、項目２０に記載の薬物送達システムまたはＶＬＰ。
(項目２３)
前記被験体は、彼のＢＢＢの透過性を増大させるか、またはその混乱を誘導するという処置を受けたことがない、項目１７に記載の薬物送達システム。
(項目２４)
塩および緩衝液を含み、そしてｐＨ７．０〜８．０、好ましくは７．５の、Ｊｏｈｎ  Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍウイルス（ＪＣＶ）に由来するウイルス様粒子（ＶＬＰ）を含む組成物であって、該組成物は、好ましくは：
ａ）１２０ｍＭ〜１７０ｍＭ  ＮａＣｌ、好ましくは１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、
ｂ）１〜５ｍＭ  ＣａＣｌ２、好ましくは２ｍＭ  ＣａＣｌ２、および
ｃ）５〜３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、好ましくは１０〜２５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、より好ましくは１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、
を含む、組成物。
【国際調査報告】
2021502951.tif 000016
2021502951.tif 000017
2021502951.tif 000018