(57)【要約】本発明は、形質転換ヒト細胞およびその使用に関し、より具体的には、ガイドＲＮＡを使用する遺伝子発現抑制システムを使用することによりＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターおよびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターをコードする遺伝子が変形した細胞およびその使用に関する。かかる形質転換細胞は生体内でさえも細胞の治療効果を効果的に示すことができ、かつ生体内免疫応答により除去されない。したがって、有効成分として当該免疫細胞を含む組成物は癌、感染性疾患、変性疾患または免疫学的疾患の治療のために有効に使用され得ることが期待される。
2021503284.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
β２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号１、配列番号６、配列番号１７、および配列番号２６からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含むガイドＲＮＡ。
【請求項２】
ＨＬＡ−ＤＱをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号６４、配列番号６５、配列番号８７、および配列番号９０からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含むガイドＲＮＡ。
【請求項３】
ＨＬＡ−ＤＰをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号１２３または配列番号１２９の核酸配列を含むガイドＲＮＡ。
【請求項４】
ＨＬＡ−ＤＲをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号１８６、配列番号１８８、および配列番号２２５からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含むガイドＲＮＡ。
【請求項５】
有効成分として：
請求項１−４のいずれか一項に記載のガイドＲＮＡまたはガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列；および
ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼまたはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列、
を含む遺伝子発現を阻害するための組成物。
【請求項６】
ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼが、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、およびＣｓｆ４からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターおよびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターの発現が阻害されている、形質転換細胞。
【請求項８】
形質転換細胞が細胞膜表面でペプチド抗原を発現する、請求項７に記載の形質転換細胞。
【請求項９】
ペプチド抗原がＧ−ペプチドである、請求項８に記載の形質転換細胞。
【請求項１０】
Ｇ−ペプチドが改変ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターに結合している、請求項９に記載の形質転換細胞。
【請求項１１】
改変ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターがＨＬＡ−ＥおよびＢ２Ｍが結合している構造を有する、請求項１０に記載の形質転換細胞。
【請求項１２】
Ｂ２ＭのＣ末端が第一リンカーを介してＨＬＡ−Ｅのα１のＮ末端に結合し、Ｇ−ペプチドのＣ末端が第二リンカーを介して改変ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターにおけるＢ２ＭのＮ末端に結合している、請求項１１に記載の形質転換細胞。
【請求項１３】
Ｇ−ペプチドが配列番号２３６の配列を有する、請求項１２に記載の形質転換細胞。
【請求項１４】
ＨＬＡ−Ｅが配列番号２４０の配列を有する、請求項１２に記載の形質転換細胞。
【請求項１５】
Ｂ２Ｍが配列番号２３７の配列を有する、請求項１２に記載の形質転換細胞。
【請求項１６】
第一リンカーが配列番号２３８の配列を有する、請求項１２に記載の形質転換細胞。
【請求項１７】
第二リンカーが配列番号２４１の配列を有する、請求項１２に記載の形質転換細胞。
【請求項１８】
ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターをコードする遺伝子における改変が請求項１に記載のガイドＲＮＡを使用して実施される、請求項７に記載の形質転換細胞。
【請求項１９】
ＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターをコードするＤＱ、ＤＰ、およびＤＲ遺伝子における改変がそれぞれ請求項２、３、および４に記載のガイドＲＮＡを使用して実施される、請求項７に記載の形質転換細胞。
【請求項２０】
形質転換細胞が治療同種細胞である、請求項７に記載の形質転換細胞。
【請求項２１】
治療同種細胞が免疫細胞または幹細胞である、請求項２０に記載の形質転換細胞。
【請求項２２】
免疫細胞がＮＫ細胞またはＴ細胞である、請求項２１に記載の形質転換細胞。
【請求項２３】
有効成分として請求項７に記載の形質転換細胞を含む、癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための医薬組成物。
【請求項２４】
癌が、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫、血液癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、皮膚癌、メラノーマ、肉腫、前立腺癌、食道癌、肝細胞癌、星細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、髄芽腫からなる群から選択されるいずれか１つである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
感染性疾患が、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染、サイトメガロウイルス感染、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染、ウイルス性呼吸器疾患、およびインフルエンザからなる群から選択されるいずれか１つである、請求項２３に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
請求項２３−２５のいずれか一項に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための方法。
【請求項２７】
投与が静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、動脈内、心室内、病巣内、髄腔内、局所、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つの経路を介して行われる、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための形質転換細胞の使用であって、ここで、ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターおよびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターの発現が形質転換細胞において阻害されており、かつ形質転換細胞が、細胞膜表面で改変ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターに結合したペプチド抗原を発現する、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、形質転換ヒト細胞およびその使用に関し、より具体的にはガイドＲＮＡを介して形質転換されたヒト細胞およびその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
癌または感染性疾患の治療法として、患者の免疫機能を利用した免疫療法が注目されている。免疫療法は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞、樹状細胞等の免疫細胞の相互作用を介する疾患の治療方法を意味する。これらのうち、ある抗原に特異的なキメラ抗原受容体を発現する遺伝子組換えＴ細胞を用いる免疫療法が現れている。また、生体外で活性化されることにより高い細胞毒性を持たせたＮＫ細胞が白血病などの血液がんに対して優れた治療効果を示すことが報告されている（Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ＆Ｄｉｓｅａｓｅ，３３：ｐ２６１−２６６，２００４）。
【０００３】
一方、上述したように癌または感染性疾患の治療薬としての免疫細胞の可能性にもかかわらず、患者の体内に存在する免疫細胞は健康な人に比べて機能および数の観点からは顕著に少ない。したがって、自己免疫細胞を利用するよりも、同種免疫細胞の移植を利用する方がより効果的である。しかし、同種免疫細胞を移植される場合には、移植拒絶反応や生体内での非自己認識による免疫異物除去（ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ）など、いくつかの問題が生じる可能性がある。したがって、これらの欠点を克服するために、同種免疫細胞を自己として認識させつつ、同種免疫細胞を細胞バンク化する代替手段が求められている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の開示
技術的課題
上記課題を解決するために、本発明者らは、細胞においてＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターをコードする遺伝子およびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターをコードする遺伝子を標的化するガイドＲＮＡを合成した。さらに、本発明者らは、有効成分としてガイドＲＮＡおよびＮＡガイドエンドヌクレアーゼ（ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ  エンドヌクレアーゼ）を含む遺伝子発現を阻害するための組成物を使用してＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターおよびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターの発現が阻害されている細胞であって、ＨＬＡ−Ｅが前記細胞への生体内における免疫異物除去が防止されるようにそこに導入されてもよい細胞を調製した。
【０００５】
したがって、本発明の目的は、ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターをコードする遺伝子およびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターをコードする遺伝子を標的化するガイドＲＮＡを提供すること、および前記ガイドＲＮＡを使用して形質転換された細胞を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
課題を解決するための手段
上記目的を達成するために、本発明は、β２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号１、配列番号６、配列番号１７、および配列番号２６からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含むガイドＲＮＡ；ＨＬＡ−ＤＱをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号６４、配列番号６５、配列番号８７、および配列番号９０からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含むガイドＲＮＡ；ＨＬＡ−ＤＰをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号１２３または配列番号１２９の核酸配列を含むガイドＲＮＡ；およびＨＬＡ−ＤＲをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号１８６、配列番号１８８、および配列番号２２５からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含むガイドＲＮＡ、を提供する。
【０００７】
さらに、本発明は、有効成分としてガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列ならびにＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼもしくはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子発現を阻害するための組成物を提供する。
【０００８】
さらに、本発明は、ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターおよびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターの発現が阻害されている形質転換細胞を提供する。
【０００９】
さらに、本発明は、有効成分として形質転換細胞を含む癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための医薬組成物；および対象に前記組成物を投与することを含む癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための方法を提供する。
【００１０】
さらに、本発明は、癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための形質転換細胞の使用を提供し、ここで、形質転換細胞においてＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターおよびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターの発現が阻害されており、かつ形質転換細胞が細胞膜表面で改変ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターに結合したＧ−ペプチドなどのペプチド抗原を発現する。
【００１１】
本発明の有利な効果
本発明に従ったガイドＲＮＡを用いる遺伝子発現阻害システムを用いて、ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターをコードする遺伝子およびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターをコードする遺伝子が改変された細胞を調製することができる。また、Ｇ−ペプチド等のペプチド抗原が結合したＨＬＡ−Ｅを細胞に追加導入することができる。上記のように形質転換された細胞は、生体内でも治療効力を効果的に示すことができ、生体内での免疫応答によって排除されない。したがって、有効成分として前記細胞を含む組成物は、癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患の治療のために有用に使用され得ることが期待される。
【図面の簡単な説明】
【００１２】
【図１】図１はＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡを使用することにより調製した細胞においてＨＬＡ−ＡＢＣネガティブ細胞をフローサイトメトリーで解析することにより得られた結果を図示する。
【図２】図２はＨＬＡ−ＤＲＡ標的化ｇＲＮＡを使用することにより調製した細胞においてＨＬＡ−ＤＲネガティブ細胞をフローサイトメトリーで解析することにより得られた結果を図示する。
【図３】図３はＨＬＡ−ＤＱＡ標的化ｇＲＮＡを使用することにより調製した細胞においてＨＬＡ−ＤＱネガティブ細胞をフローサイトメトリーで解析することにより得られた結果を図示する。
【図４】図４はＨＬＡ−ＤＰＡ標的化ｇＲＮＡを使用することにより調製した細胞においてＨＬＡ−ＤＰネガティブ細胞をフローサイトメトリーで解析することにより得られた結果を図示する。
【図５】図５はＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡに依存するＨＬＡ−ＡＢＣネガティブ細胞系統の生産率を図示する。
【図６】図６はＤＲＡ標的化ｇＲＮＡに依存するＨＬＡ−ＤＲネガティブ細胞系統の生産率を図示する。
【図７】図７はＤＱＡ標的化ｇＲＮＡに依存するＨＬＡ−ＤＱネガティブ細胞系統の生産率を図示する。
【図８】図８はＤＰＡ標的化ｇＲＮＡに依存するＨＬＡ−ＤＰネガティブ細胞系統の生産率を図示する。
【図９】図９はＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡで調製した細胞系統におけるＢ２Ｍをコードする核酸における変異を図示する。
【図１０】図１０はＨＬＡ−ＤＲＡ標的化ｇＲＮＡで調製した細胞系統におけるＨＬＡ−ＤＲＡをコードする核酸における変異を図示する。
【図１１】図１１はＨＬＡ−ＤＱＡ標的化ｇＲＮＡで調製した細胞系統におけるＨＬＡ−ＤＱＡをコードする核酸における変異を図示する。
【図１２】図１２はＨＬＡ−ＤＰＡ標的化ｇＲＮＡで調製した細胞系統におけるＨＬＡ−ＤＰＡをコードする核酸における変異を図示する。
【図１３】図１３は細胞分離後のＨＬＡ−ＩポジティブＮＫ−９２ＭＩ細胞系統およびＨＬＡ−ＩネガティブＮＫ−９２ＭＩ細胞系統を図示する。
【図１４】図１４はＨＬＡ−ＩポジティブＮＫ−９２ＭＩ細胞系統およびＨＬＡ−ＩネガティブＮＫ−９２ＭＩ細胞系統の細胞殺滅（ｃｅｌｌ−ｋｉｌｌｉｎｇ）能力についての評価結果を図示する。
【図１５】図１５はｇＲＮＡを使用してＣＤ４  Ｔ細胞、ＣＤ８  Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を形質転換し、そしてフローサイトメトリーで解析を行うことにより得られた結果を図示する。
【図１６】図１６は単一ｇＲＮＡ−形質転換細胞および複数のｇＲＮＡ−形質転換細胞における標的についての欠失効率を図示する。
【図１７】図１７は、単一ｇＲＮＡ−形質転換細胞、複数のｇＲＮＡ−形質転換細胞、およびコントロール群細胞での細胞増殖率を比較する。
【図１８】図１８は、ＨＬＡ−ＩポジティブＴ細胞およびＨＬＡ−ＩネガティブＴ細胞間のサイトカイン産生能力を比較する。
【図１９】図１９は、ＨＬＡ−ＩポジティブＮＫ細胞およびＨＬＡ−ＩネガティブＮＫ細胞間のサイトカイン産生能力を比較する。
【図２０】図２０はＨＬＡ−ＩポジティブＲａｊｉ細胞系統およびＨＬＡ−ＩネガティブＲａｊｉ細胞系統へのＮＫ細胞の細胞殺滅能力についての評価結果を図示する。
【図２１】図２１はＧ−ペプチドを担持するＨＬＡ−Ｅの模式図およびそれを発現するためのタンパク質の構造を図示する。
【図２２】図２２は形質導入を介してＫ５６２細胞系統において発現したＨＬＡ−Ｅを解析することにより得られた結果を図示する。
【図２３】図２３はＨＬＡ−Ｅを発現するＫ５６２細胞系統（Ｋ５６２Ｇ−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｅ）およびコントロール群Ｋ５６２細胞系統（Ｋ５６２）に対するＮＫ細胞の細胞殺滅能力についての評価結果を図示する。
【発明を実施するための形態】
【００１３】
発明を実施するための最良の形態
本発明の一態様では、β２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号１、配列番号６、配列番号１７、および配列番号２６からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含むガイドＲＮＡが提供される。
【００１４】
本明細書中で使用される「Ｂ２Ｍ」という用語は、ＭＨＣ  Ｉの構成要素であるβ２−ミクログロブリンタンパク質を指す。Ｂ２Ｍは細胞表面のＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターの発現に必須であり；Ｂ２Ｍが除去されるか、または改変されると、細胞表面でのＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターの発現が起こりにくくなる。したがって、ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターの機能はＢ２Ｍの遺伝子を改変することにより除去されてもよい。
【００１５】
Ｂ２Ｍをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡは、配列番号１−５８からなる群から選択されるいずれか１つであってもよく、具体的には、配列番号１、配列番号６、配列番号１７、および配列番号２６からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
【００１６】
さらに、本発明の一態様では、ＨＬＡ−ＤＱをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号６４、配列番号６５、配列番号８７、および配列番号９０からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含むガイドＲＮＡが提供される。
【００１７】
本明細書中で使用される「ＨＬＡ」という用語はＭＨＣ遺伝子の産物であるヒト白血球抗原を指す。ＨＬＡはＨＬＡ  ＩおよびＨＬＡ  ＩＩから構成される。ＨＬＡ  Ｉは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃを含んでもよい；およびＨＬＡ  ＩＩは、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ、およびＨＬＡ−ＤＲを含んでもよい。
【００１８】
本明細書中で使用される「ＨＬＡ−ＤＱ」という用語は、ＭＨＣ  ＩＩを構成するαβヘテロダイマーを指す。ＤＱはＨＬＡ−ＤＱＡ１およびＨＬＡ−ＤＱＢ１からなる。αサブユニットはＨＬＡ−ＤＱＡ１遺伝子によりコードされ、βサブユニットはＨＬＡ−ＤＱＢ１遺伝子によりコードされる。ＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターの発現はＤＱの遺伝子を改変することにより阻害されてもよい。
【００１９】
ＤＱをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡは、配列番号５９−１１６からなる群から選択されるいずれか１つであってもよく、具体的には、配列番号６４、配列番号６５、配列番号８７、および配列番号９０からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
【００２０】
本発明の別の態様では、ＨＬＡ−ＤＰをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号１２３または配列番号１２９の核酸配列を含むガイドＲＮＡが提供される。
【００２１】
本明細書中で使用される「ＨＬＡ−ＤＰ」という用語は、ＤＰαサブユニットおよびＤＰβサブユニットからなるコードされたＭＨＣ  ＩＩ細胞表面レセプターを指す。ＤＰαはＨＬＡ−ＤＰＡ１によりコードされ、ＤＰβはＨＬＡ−ＤＰＢ１によりコードされる。ＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターの発現はＤＰの遺伝子を改変することにより阻害されてもよい。
【００２２】
ＤＰをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡは、配列番号１１７−１７５からなる群から選択されるいずれか１つであってもよく、具体的には配列番号１２３または配列番号１２９であってもよい。
【００２３】
さらに、本発明のさらに別の態様では、ＨＬＡ−ＤＲをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡであって、配列番号１８６、配列番号１８８、および配列番号２２５からなる群から選択されるいずれか１つの核酸配列を含むガイドＲＮＡが提供される。
【００２４】
本明細書中で使用される「ＨＬＡ−ＤＲ」という用語は、ＭＨＣ  ＩＩ細胞表面レセプター、具体的にはＭＨＣ  ＩＩ細胞表面レセプターを構成するαβヘテロダイマーを指す。ＨＬＡ−ＤＲの各サブユニットは２つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよび細胞質尾部を含有する。ＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターの発現はＤＲの遺伝子を改変することにより阻害されてもよい。
【００２５】
ＤＲをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡは、配列番号１７６−２３４からなる群から選択されるいずれか１つであってもよく、好ましくは配列番号１８６、配列番号１８８、および配列番号２２５からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
【００２６】
本明細書中で使用される「ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）」という用語は、標的ＤＮＡを特異的に認識しヌクレアーゼと複合体を形成し、それにより前記ヌクレアーゼを前記標的ＤＮＡに誘導するＲＮＡ分子を指す。
【００２７】
ガイドＲＮＡは原核生物のクラスター化され、規則的に間隔を空けられた、短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）システムに由来するガイドＲＮＡであってもよい。
【００２８】
ガイドＲＮＡは非天然に存在するキメラｃｒＲＮＡ配列を含有してもよく、ｃｒＲＮＡ配列は標的配列にハイブリダイズできる可変標的ドメインを含有してもよい。
【００２９】
さらに、ガイドＲＮＡはＢ２Ｍ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ、およびＨＬＡ−ＤＲ遺伝子のそれぞれについての相補配列を含有する。細胞に送達された後、ガイドＲＮＡは前記標的配列を認識でき、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼと複合体を形成できる。
【００３０】
本発明のさらに別の態様では、有効成分としてガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列ならびにＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼもしくはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む遺伝子発現を阻害するための組成物が提供される。
【００３１】
ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼはｍＲＮＡまたはタンパク質の形態で送達されてもよいし、またはそれをコードするＤＮＡを担持したベクターを使用して形質転換により標的細胞に送達されてもよい。タンパク質の形態でエンドヌクレアーゼが使用される場合、前記エンドヌクレアーゼはガイドＲＮＡと複合体を形成することにより得られるＲＮＰ複合体として機能してもよい。
【００３２】
本明細書中で使用される「ＲＮＰ複合体」という用語は、有効成分としてガイドＲＮＡおよびＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼを含む複合体を指し、ここで前記複合体は標的配列を認識し、結合でき、それにより選択的に前記標的配列にニックを入れ（ｎｉｃｋｉｎｇ）または開裂させる。ＲＮＡ複合体は例えば、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体であってもよいが、これに限られない。
【００３３】
本発明の実施形態では、ＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼは、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１０、Ｃａｓ１２ａ、Ｃａｓ１２ｂ、Ｃａｓ１２ｃ、Ｃａｓ１２ｄ、Ｃａｓ１２ｅ、Ｃａｓ１３ａ、Ｃａｓ１３ｂ、Ｃａｓ１３ｃ、Ｃａｓ１３ｄ、Ｃｐｆ１、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、およびＣｓｆ４からなる群から選択されるいずれか１つであってもよく、具体的にはＣａｓ９であってもよい。
【００３４】
本発明の一態様では、ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターおよびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターの発現が阻害されている形質転換細胞が提供される。
【００３５】
本明細書中で使用される「発現阻害」という用語は、標的遺伝子の機能における減少を引き起こすヌクレオチド配列上の改変を意味し、好ましくはかかる発現阻害により標的遺伝子の発現は検出不能となるか、または標的遺伝子が無意味なレベルに発現することを意味する。
【００３６】
本発明の実施形態では、形質転換細胞は細胞膜表面でペプチド抗原を発現してもよい。ペプチド抗原の例は、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃ、およびＨＬＡ−Ｇのシグナルペプチドを含むがこれらに限定されず、かつ前記ペプチド抗原は具体的にはＨＬＡ−Ｇのシグナルペプチド（Ｇ−ペプチド）である。前記ペプチド抗原は、改変ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターに結合していてもよい。
【００３７】
本発明の実施形態では、改変ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターはＨＬＡ−ＥおよびＢ２Ｍが結合している構造を有する。具体的には、改変ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターにおいて、Ｂ２ＭのＣ末端は第一リンカーを介してＨＬＡ−Ｅのα１のＮ末端に結合していてもよく、かつＧ−ペプチドのＣ末端は第二リンカーを介してＢ２ＭのＮ末端に結合していてもよい。改変ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターはＨＬＡ−ＧおよびＢ２Ｍが結合している構造を有していてもよい。
【００３８】
本発明の実施形態では、Ｇ−ペプチドは、配列番号２３６の配列を有していてもよい；ＨＬＡ−Ｅは、配列番号２４０の配列を有していてもよい；Ｂ２Ｍは、配列番号２３７の配列を有していてもよい；および第一リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎは１−５の整数である）であってもよく、ある実施形態では配列番号２３８の配列を有していてもよい。第二リンカーは、（Ｇ４Ｓ）ｎ（ｎは２−６の整数である）であってもよく、配列番号２４１の配列を有していてもよい。
【００３９】
本発明の実施形態では、ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターをコードする遺伝子の改変はＢ２Ｍをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡ（例えば、配列番号１、配列番号６、配列番号１７、または配列番号２６）を使用して実施されてもよい。具体的には、ＭＨＣ  Ｉの改変は、単一ガイドＲＮＡを使用して単一の欠失により実施されてもよい。
【００４０】
本発明の実施形態では、ＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターをコードするＤＱ、ＤＰ、およびＤＲ遺伝子の改変はＤＱをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡ（例えば、配列番号６４、配列番号６５、配列番号８７、または配列番号９０）、ＤＰをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡ（例えば、配列番号１２３または配列番号１２９）、およびＤＲをコードする核酸配列に相補的に結合するガイドＲＮＡ（例えば、配列番号１８６、配列番号１８８、または配列番号２２５）を使用して実施されてもよい。ＭＨＣ  ＩＩの改変はＭＨＣ  Ｉの改変と共に実施され、複数のガイドＲＮＡ（配列番号１、配列番号６４、配列番号１２９、および配列番号１８８のすべてを含有するなど）を使用して複数の欠失により行われてもよい。
【００４１】
本発明の実施形態では、形質転換細胞は、治療同種細胞であってもよい。本明細書中で使用される「治療同種細胞」という用語は、疾患の進行の抑制、治療、または症状の緩和を目的として対象に注入される非自己同種細胞を指し、その例は、免疫細胞および幹細胞を含むがこれらに限定されない。
【００４２】
本明細書中で使用される「免疫細胞」という用語は、人体の免疫応答に関与する細胞を指し、その例はＮＫ細胞、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、およびマクロファージを含む。
【００４３】
本発明の実施形態では、免疫細胞は、ＮＫ細胞またはＴ細胞であってもよい。
【００４４】
本明細書中で使用される「幹細胞」という用語は、様々な細胞に分化できる多能性細胞を指す。幹細胞の例は、ヒト胚性幹細胞、骨髄幹細胞、間葉系幹細胞、ヒト神経幹細胞、口腔粘膜細胞等を含んでもよい。具体的には、幹細胞は、間葉系幹細胞であってもよい。
【００４５】
さらに、本発明の一態様では、有効成分として形質転換細胞を含む癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための医薬組成物が提供される。
【００４６】
本発明の実施形態では、癌は、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、Ｂ細胞急性リンパ性白血病（Ｂ−ＡＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、リンパ腫、非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、多発性骨髄腫、血液癌、胃癌、肝臓癌、膵臓癌、大腸癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、皮膚癌、メラノーマ、肉腫、前立腺癌、食道癌、肝細胞癌、星細胞腫、中皮腫、頭頸部癌、髄芽腫からなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
【００４７】
本発明の実施形態では、感染性疾患は、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）感染、サイトメガロウイルス感染、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）感染、ウイルス性呼吸器疾患、およびインフルエンザからなる群から選択されるいずれか１つであってもよい。
【００４８】
本明細書中で使用される「変性疾患」という用語は、組織が当該組織の不可逆的な量的損失によりその本来の機能を失う病的状態を指す。変性疾患の例は、脳神経疾患、虚血性疾患、皮膚損傷、骨疾患、および変性関節炎を含むがこれらに限定されない。
【００４９】
本明細書中で使用される「遺伝性疾患」という用語は、遺伝子または染色体に有害な変異により起こる病的状態を指す。遺伝性疾患の例は、血友病、アルビニズム、ファブリー病、ハンター症候群、およびグリコーゲン蓄積症を含むがこれらに限定されない。
【００５０】
本明細書中で使用される「免疫疾患」という用語は、過剰または望ましくない免疫応答のために組織が損傷を受ける任意の病的状態を指す。したがって、「免疫疾患」という用語は、「高活性免疫疾患（ｈｙｐｅｒａｃｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｅ  ｄｉｓｅａｓｅ）」と同様の意味を有し、「免疫疾患を防止するまたは治療するための組成物」という用語は、「免疫抑制剤」と同様の意味を有する。
【００５１】
免疫疾患の例は、移植片対宿主病、移植片拒絶反応、慢性炎症性疾患、炎症性疼痛、神経因性疼痛、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、および自己免疫疾患を含むがこれらに限定されない。
【００５２】
「自己免疫疾患」という用語は、免疫細胞が自己と異物を区別できず、自己を攻撃するときに起こる病的状態を指す。自己免疫疾患の例は、リューマチ性関節炎、全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｉｓ）、橋本甲状腺炎、グレイブ病、多発性硬化症、強皮症、重症筋無力症、Ｉ型糖尿病、アレルギー性脳脊髄炎、糸球体腎炎、白斑、ベーチェット病、クローン病、強直性脊椎炎、血小板減少性紫斑病、尋常性天疱瘡、自己免疫性溶血性貧血、副腎皮質ジストロフィー（ＡＬＤ）、および全身性エリテマトーデス（ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｌｕｐｕｓ  ｅｒｙｔｈｅｍａｔｏｓｕｓ）（ＳＬＥ）を含んでもよいがこれらに限定されない。
【００５３】
本発明の一態様では、対象に医薬組成物を投与することを含む、癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための方法が提供される。
【００５４】
本発明の実施形態では、投与は、静脈内、筋肉内、皮内、皮下、腹腔内、動脈内、心室内、病巣内、髄腔内、局所、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されるいずれか１つの経路を介して行われてもよい。
【００５５】
本発明の別の態様では、癌、感染性疾患、変性疾患、遺伝性疾患、または免疫疾患を治療するための形質転換細胞の使用が提供され、ここでＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターおよびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターの発現が形質転換細胞において阻害されており、かつ形質転換細胞が、細胞膜表面で改変ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターに結合したＧ−ペプチドを発現する。
【００５６】
本発明のさらに別の態様では、ＭＨＣ  Ｉ細胞膜レセプターについての遺伝子およびＭＨＣ  ＩＩ細胞膜レセプターについての遺伝子を改変するためのキットであって、ガイドＲＮＡもしくはガイドＲＮＡをコードするヌクレオチド配列ならびにＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼもしくはＲＮＡガイドエンドヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むキットが提供される。
【００５７】
以下、本発明を以下の実施例によりさらに詳細に説明する。ただし、以下の実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲はこれに限定されるものではない。
【実施例】
【００５８】
実施例１．ＨＬＡを標的化するｇＲＮＡの合成および選択
実施例１．１．  ｇＲＮＡ配列の検索および合成
ｇＲＮＡ配列について検索するために、ＮＣＢＩ（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）により提供される遺伝子の完全なヌクレオチド配列を使用した。ｇＲＮＡの設計ツールとして、ウェブベースシステムＣＨＯＰＣＨＯＰ（ｈｔｔｐ：／／ｃｈｏｐｃｈｏｐ．ｃｂｕ．ｕｉｂ．ｎｏ／）、Ｅ−ＣＲＩＳＰ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅ−ｃｒｉｓｐ．ｏｒｇ／Ｅ−ＣＲＩＳＰ／ｄｅｓｉｇｎｃｒｉｓｐｒ．ｈｔｍｌ）、ＣＲＩＳＰＲ−ＥＲＡ（ｈｔｔｐ：／／ｃｒｉｓｐｒ−ｅｒａ．ｓｔａｎｆｏｒｄ．ｅｄｕ／）、ＲＧＥＮツール（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｒｇｅｎｏｍｅ．ｎｅｔ／ｃａｓ−ｄｅｓｉｇｎｅｒ／）を使用した。設計したｇＲＮＡのうち、遺伝子ノックアウトに最も適した約６０ｇＲＮＡを所望の標的ごとに得た。これらの配列をもとに、製造元の指示書に従いＧｅｎｅＡｒｔ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｇＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２９３７７）を使用してｇＲＮＡを合成した。
【００５９】
すなわち、各ｇＲＮＡをコードするＤＮＡテンプレートの合成に必要なフォワードオリゴヌクレオチドプライマーおよびリバースオリゴヌクレオチドプライマーを合成し、そして合成プライマーおよびＧｅｎｅＡｒｔ  Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ  ｇＲＮＡ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｋｉｔ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ａ２９３７７）に含まれるＴｒａｃｒフラグメント＋Ｔ７プライマーＭｉｘを使用してＰＣＲサーマルサイクラー（ＦｌｅｘＣｙｃｌｅｒ２、Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ）でＰＣＲを実施した。以下のＰＣＲパラメータを使用した：９８℃で１０秒間でプレ変性、その後９８℃で５秒間および５５℃で１５秒間の条件下で変性およびアニーリングの３２サイクル、その後７２℃、１分間で最終伸長。テンプレートとして得られたＰＣＲ産物を使用して、インビトロ転写反応を３７℃で４時間実施し；その後結果物を精製してｇＲＮＡを得た。
【００６０】
得られたｇＲＮＡが以下の表１から４に示される。具体的には、ＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｂ２Ｍ）についてのｇＲＮＡ配列が表１に示される；ＨＬＡ−ＤＱについてのｇＲＮＡ配列が表２に示される；ＨＬＡ−ＤＰについてのｇＲＮＡ配列が以下表３に示される；およびＨＬＡ−ＤＲについてのｇＲＮＡ配列が以下表４に示される。
表１
【表１−１】
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【表１−２】
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表２
【表２−１】
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【表２−２】
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表３
【表３−１】
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【表３−２】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【００６１】
実施例１．２．  Ｒａｊｉ細胞系統への遺伝子導入によるｇＲＮＡの選択
７．５μｇの得られたｇＲＮＡを６５℃、１０分間インキュベートし、一本鎖を形成させた。その後、７．５μｇのＣａｓ９タンパク質（Ｔｏｏｌｇｅｎ、ＴＧＥＮ＿ＣＰ３またはＣｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍ０６４６Ｔ）をそこに加え、インキュベーションを２５℃、１０分間実施し、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ複合体）を調製した。ＲＮＰ複合体をＳＧ細胞系統４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）  Ｘ  Ｋｉｔ  Ｓ（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＸＣ−３０３２）を使用して４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＴＭ）  Ｘ  Ｕｎｉｔ（Ｌｏｎｚａ、ＡＡＦ−１００２Ｘ）で４×１０５細胞のＲａｊｉ細胞系統に遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞を７日間インキュベートし、その後細胞表面のＨＬＡの発現レベルおよびゲノムＤＮＡにおける変異の存在を確認した。
【００６２】
実施例１．３．  フローサイトメーターを使用するＨＬＡの発現レベルの確認
ＲＮＰ複合体−遺伝子導入Ｒａｊｉ細胞系統およびコントロール群Ｒａｊｉ細胞系統のそれぞれの２×１０５細胞を１００μＬのＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳ／シース（ｓｈｅａｔｈ）バッファー）において懸濁し、５ｍＬチューブで調製した。前記細胞を抗体処理に供した。その後、光を３０分間遮断しインキュベーションを４℃で実施した。前記抗体として、ＰＥ抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−１０１−４４８）、ＰＥ抗ＨＬＡ−ＤＲ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３６１６０５）、ＰＥ抗ＨＬＡ−ＤＱ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１８１０６）、およびＰＥ抗ＨＬＡ−ＤＰ（Ｌｅｉｎｃｏ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｈ１３０）を使用した。その後、３ｍＬのＦＡＣＳバッファーをそこに加え、遠心分離を２，０００ｒｐｍ、３分、４℃で実施した。その後、上清を除去し試料を得、および前記試料をＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａにより解析した。合計６０のｇＲＮＡを各回２０ｇＲＮＡを使用して３回試験した。各ｇＲＮＡの「％ＨＬＡネガティブ」値からコントロール群の「％ＨＬＡネガティブ」値を引くことにより算出される値（正規化された％ＨＬＡネガティブ）についての結果は、図１−４に図示される。さらに、１０以上の値を有するｇＲＮＡ（ただしＢ２Ｍ標的化ｇＲＮＡについては１以上の値を有するｇＲＮＡ）について１度に再実験を行うことにより得られた結果は、図５−８に図示される。
【００６３】
図５−８における結果から、各ＨＬＡの発現を効率よく減少できる合計１３ｇＲＮＡを選択し、そのうち２−４ｇＲＮＡをそれぞれの標的（ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＱ、ＨＬＡ−ＤＰ、およびＨＬＡ−ＤＲ）について選択した。具体的には、Ｂ２Ｍ−０１、Ｂ２Ｍ−０７、Ｂ２Ｍ−１８、およびＢ２Ｍ−２７ｇＲＮＡをＨＬＡ−ＡＢＣについて選択した；ＤＱＡ−１４、ＤＱＡ−１５、ＤＱＡ−３７、およびＤＱＡ−４０をＨＬＡ−ＤＱについて選択した；ＤＰＡ−０７およびＤＰＡ−１３をＨＬＡ−ＤＰについて選択した；およびＤＲＡ−１８、ＤＲＡ−２０、およびＤＲＡ−５８をＨＬＡ−ＤＲについて選択した。
【００６４】
実施例１．４．  標的遺伝子のゲノムＤＮＡにおける変異の確認
フローサイトメトリーを使用して選択したＨＬＡ標的化ｇＲＮＡがゲノムＤＮＡにおける変異を引き起こすかどうかを確認するため、ゲノムＤＮＡを製造元の指示書に従いＧｕｉｄｅ−ｉｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６３１４４３）を使用して解析した。
【００６５】
すなわち、ＲＮＰ複合体−遺伝子導入Ｒａｊｉ細胞系統およびコントロール群Ｒａｊｉ細胞系統のそれぞれの５×１０５細胞を１，２００ｒｐｍ、５分遠心分離し、そして上清を除去した。その後、９０μＬのＧｕｉｄｅ−ｉｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６３１４４３）に含有する抽出バッファー１をそこに加え、インキュベーションを９５℃、１０分間実施した。その後、Ｇｕｉｄｅ−ｉｔ  Ｍｕｔａｔｉｏｎ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６３１４４３）に含有する１０μＬの抽出バッファー２をそこに加え、ピペッティングで得られたＤＮＡ溶解物をＰＣＲ用純水で１：８の割合で希釈した。ＰＣＲを希釈ＤＮＡ溶解物、および以下表５に示される選択したｇＲＮＡおよび標的ゲノムＤＮＡの解析ＰＣＲプライマーを使用してＰＣＲサーマルサイクラー（ＦｌｅｘＣｙｃｌｅｒ２、Ａｎａｌｙｔｉｋ  Ｊｅｎａ）で実施した。
【００６６】
以下のＰＣＲパラメータを使用してＰＣＴ産物を産生した：９８℃、２分間でプレ変性、その後９８℃で１０秒間、６０℃で１５秒間、および６８℃、１分間の条件下で変性およびアニーリングの３５サイクル、その後６８℃、５分間で伸長。得られたＰＣＲ産物を変性および再ハイブリダイズさせるために、５μＬのＰＣＲ用純水を１０μＬのＰＣＲ産物に加えた。その後、インキュベーションを９５℃、５分間実施し、そして９５℃から８５℃まで１秒当たり２℃減少し、かつ８５℃から２５℃まで１秒当たり０．１℃減少する条件下で温度を変化させた。最後に１μＬのＧｕｉｄｅ−ｉｔ  Ｒｅｓｏｌｖａｓｅをそこに加え、インキュベーションを３７℃、３０分間実施した。その後、電気泳動を１．５％アガロースゲルで実施した。結果は、図９−１２に図示される。
【００６７】
ＨＬＡ標的化ｇＲＮＡ−遺伝子導入細胞のＰＣＴ産物におけるＧｕｉｄｅ−ｉｔ  ｒｅｓｏｌｖａｓｅ開裂ＤＮＡフラグメントを電気泳動結果において確認した。これらの結果から、１３の選択したＨＬＡ標的化ｇＲＮＡがそれらの標的ゲノムＤＮＡで変異を誘発することがわかった。
【表５】
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【００６８】
そうして、Ｒａｊｉ細胞における遺伝子導入によりそれぞれのＨＬＡの発現を効率よく減少できるｇＲＮＡを選択した。実施例２および３では、選択されたｇＲＮＡを使用して、形質転換ＮＫ細胞を調製し、そしてその有効性を確認した。
【００６９】
実施例２．  ＨＬＡ−Ｉ−欠失細胞の調製および確認
実施例２．１．  ＮＫ−９２ＭＩ細胞系統におけるＨＬＡ−Ｉの欠失
３７．５μｇのＢ２Ｍ−０１  ｇＲＮＡを６５℃、１０分間インキュベートし、一本鎖を形成させた。その後、３７．５μｇのＣａｓ９タンパク質（Ｔｏｏｌｇｅｎ、ＴＧＥＮ＿ＣＰ３）をそこに加え、インキュベーションを２５℃、１０分間実施し、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ複合体）を調製した。ＲＮＰ複合体をＣｅｌｌ  Ｌｉｎｅ  ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  Ｋｉｔ  Ｒ（Ｌｏｎｚａ、ＶＣＡ−１００１）を使用してＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＴＭ）  ２ｂ（Ｌｏｎｚａ、ＡＡＢ−１００１）で２×１０６細胞のＮＫ−９２ＭＩ細胞系統に遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞を３日間インキュベートし、その後細胞分離を細胞セパレーターを使用して実施した。
【００７０】
実施例２．２．  ＨＬＡ  Ｉネガティブ細胞の分離
Ｂ２Ｍ−０１  ＲＮＰ複合体−遺伝子導入ＮＫ−９２ＭＩ細胞系統を５ｍＬチューブに移動させ、そしてＰＥ抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ，１３０−１０１−４４８）および７−ＡＡＤ（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．，Ａ０７７０４）で処理した。その後、光を３０分間遮断しインキュベーションを４℃で実施した。染色した細胞をフィルタートップＦＡＣＳチューブ（Ｆａｌｃｏｎ、３５２２３５）を使用してフィルターにかけ、そしてＨＬＡ−Ｉポジティブ細胞およびＨＬＡ−Ｉネガティブ細胞をＦＡＣＳ  Ａｒｉａ  ＩＩ（ＢＤ）を使用して分離した。結果は、図１３に図示される。ＨＬＡ−Ｉネガティブ細胞が９５．９％の純度を有し、ＨＬＡ−Ｉポジティブ細胞が９７．２％の純度を有することを確認した。
【００７１】
実施例２．３．  ＨＬＡ−Ｉ−欠失ＮＫ−９２ＭＩ細胞系統の細胞殺滅能力の評価
細胞分離後４日間インキュベートしたＨＬＡ−Ｉポジティブ細胞およびＨＬＡ−Ｉネガティブ細胞それぞれを使用して、Ｋ５６２細胞系統に対するそれらの細胞殺滅能力を比較した。Ｋ５６２細胞系統を製造元の指示書に従い３０μＭカルセイン−ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃ３０９９）で染色し、そしてＥ：Ｔ比１０：１、３：１、１：１、または０．３：１でＵ底プレートでＮＫ−９２ＭＩ細胞系統とインキュベートした。４時間後、各インキュベート物を１００μＬずつ取り、細胞死により分泌されたカルセイン−ＡＭの量をフルオロメーター（ＶｉｃｔｏｒＴＭＸ３、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定した。結果として、図１４に示されるように、ＨＬＡ−Ｉポジティブ細胞およびＨＬＡ−Ｉネガティブ細胞はＫ５６２細胞系統に対して同等の細胞殺滅能力を有することを確認した。これらの結果から、ＨＬＡ−Ｉの欠失が細胞殺滅能力に影響しないことがわかった。
【００７２】
実施例３．  ＨＬＡ−Ｉ−およびＨＬＡ−ＩＩ−欠失細胞の調製および確認
実施例３．１．  ＮＫ細胞の調製およびインキュベーション
冷凍保存末梢血単核細胞を３７℃のウォーターバスに急速溶解し、５０ｍＬコニカルチューブに移した。チューブを振盪しながら、融解培地（ＲＰＭＩ、１１８７５−０９３＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ  β−ＭＥ）をそこに滴下して混合した。その後、遠心分離を１，２００ｒｐｍ、１０分、４℃で実施し、上清を除去し、１０ｍＬのＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ（ＣｅｌｌＧＥＮＩＸ、２００１）培地で再懸濁した。その後、細胞数を定量した。前記細胞を培養培地（ＣｅｌｌＧｒｏ  ＳＣＧＭ＋１０ｎｇ／ｍＬ  ＯＫＴ３＋５００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２＋５％ヒト血漿）で１×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、培養バッグ（ＮＩＰＲＯ、８７−３５２）に入れた。インキュベーションを３７℃で２４時間ＣＯ２インキュベーターで実施し、その後、遺伝子導入を実施した。
【００７３】
実施例３．２．  Ｔ細胞の調製およびインキュベーション方法
冷凍保存末梢血単核細胞を３７℃のウォーターバスに急速溶解し、５０ｍＬコニカルチューブに移した。チューブを振盪しながら、融解培地（ＲＰＭＩ、１１８７５−０９３＋１０％ＦＢＳ＋５５μＭ  β−ＭＥ）をそこに滴下して混合した。その後、遠心分離を１，２００ｒｐｍ、１０分、４℃で実施し、上清を除去し、４０ｍＬのＭＡＣＳバッファー（ＰＢＳ＋０．５％ＦＢＳ＋２ｍＭ  ＥＤＴＡ）で再懸濁した。その後、細胞数を定量した。１０７細胞あたり２０μＬのＣＤ３マイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０５０−１０１）での処理を実施した。その後、光を１５分遮断し、４℃でインキュベートした。その後、遠心分離を１，３５０ｒｐｍ、８分、４℃で実施し、上清を除去し、結果物を５００μＬのＭＡＣＳバッファーで再懸濁した。その後、再懸濁物をＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレーター（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０９０−９７６）に取り付けたＬＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−０４２−４０１）にロードした。ＬＳカラムをＭＡＣＳバッファーで３回洗浄し、ＱｕａｄｒｏＭＡＣＳセパレーターから除去した。その後、除去したＬＳカラムをプランジャーで圧縮し、ＣＤ３ポジティブ細胞を得た。前記細胞をＴ細胞培養培地（Ｘ−ＶＩＶＯ１５（Ｌｏｎｚａ、ＢＥ０２−０６０Ｑ）＋４０μＬ／ｍＬ  ＤｙｎａｂｅａｄｓヒトＴ−アクチベーターＣＤ３／ＣＤ２８（Ｇｉｂｃｏ、１１１．３１Ｄ）＋２００ＩＵ／ｍＬ  ＩＬ−２＋５％ヒト血漿）で１×１０６細胞／ｍＬの濃度で再懸濁し、培養バッグ（ＮＩＰＲＯ、８７−３５２）に入れた。インキュベーションを３７℃で２４時間ＣＯ２インキュベーターで実施し、その後、遺伝子導入を実施した。
【００７４】
実施例３．３．  選択されたｇＲＮＡを使用するＨＬＡ−欠失ＮＫ細胞およびＴ細胞の調製
３７．５μｇの各ｇＲＮＡを６５℃、１０分間インキュベートし、一本鎖を形成させた。その後、３７．５μｇのＣａｓ９タンパク質（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、Ｍ０６４６Ｔ）をそこに加え、インキュベーションを２５℃、１０分間実施し、Ｃａｓ９−ｇＲＮＡ複合体（ＲＮＰ複合体）を調製した。複数の欠失の場合、それぞれのｇＲＮＡの量の合計を３７．５μｇに設定した。Ｐ３初代細胞４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商標）  Ｘ  Ｋｉｔ  Ｌ（Ｌｏｎｚａ、Ｖ４ＸＰ−３０２４）を使用して４Ｄ−Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（ＴＭ）  Ｘ  Ｕｎｉｔ（Ｌｏｎｚａ、ＡＡＦ−１００２Ｘ）で、ＲＮＰ複合体を２×１０６細胞に遺伝子導入した。遺伝子導入された細胞を３日間インキュベートし、その後サイトカインの産物を観察した。遺伝子導入された細胞を１４日間インキュベートし、その後ＨＬＡ発現が減少したかどうかをフローサイトメトリーにより確認した。
【００７５】
実施例３．４．  フローサイトメトリーを使用するＨＬＡの減少した発現の確認
ＲＮＰ複合体−遺伝子導入細胞およびコントロール群細胞のそれぞれについて、２×１０５細胞を１００μＬのＦＡＣＳバッファー（１％ＦＢＳ／シース（ｓｈｅａｔｈ）バッファー）において懸濁し、５ｍＬチューブで調製した。細胞染色を３回にわたり実施した。第一染色について、抗ＨＬＡ−ＤＰ（Ａｂｃａｍ、ａｂ２０８９７）を使用し；第二染色についてＰＥヤギ抗マウスＩｇＧ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、１２−４０１０−８２）を使用し；および第三染色について、Ｖ４５０抗ＣＤ４（ＢＤ、５６０３４５）、ＡＰＣ−Ｃｙ７抗ＣＤ８（ＢＤ、５５７８３４）、ＢＶ５１０抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１１４３６）、ＰＥ−Ｃｙ７抗ＨＬＡ−ＤＲ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２５−９９５２−４２）、Ａｌｅｘａ６４７抗ＨＬＡ−ＤＱ（ＢＤ、５６４８０６）を使用した。一方で、ＮＫ細胞の場合、ＢＶ４２１抗ＣＤ５６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１８３２８）をＶ４５０抗ＣＤ４の代わりに使用した。各回、抗体処理後、光を３０分間遮断しインキュベーションを４℃で実施した。その後、３ｍＬのＦＡＣＳバッファーをそこに加え、遠心分離を２，０００ｒｐｍ、３分、４℃で実施し、上清を除去した。全染色試料を得、ＬＳＲ  Ｆｏｒｔｅｓｓａで解析した。結果は、図１５−１７に図示される。
【００７６】
それぞれのＨＬＡを欠失するｇＲＮＡとして、Ｂ２Ｍ−０１、ＤＲＡ−２０、ＤＱＡ−１４、およびＤＰＡ−１３を使用した。図１５における結果から、単一ｇＲＮＡでの遺伝子導入に際し、標的ＨＬＡの欠失が少なくとも７０％、最大で９９％の高い効率で達成されることがわかった。図１６における結果から、複数の欠失の効率は単一欠失の効率と比較して顕著に減少しないことがわかった。複数の欠失の効率を単一欠失と比較する場合、前記効率は単一欠失の「％ネガティブ」値を複数の欠失の「％ネガティブ」値で割ることにより得られた値に、１００を乗じることにより示した。さらに、図１７における結果を参照すると、ＲＮＰ複合体−遺伝子導入細胞の１４日のインキュベーション率（ｒａｔｅ）はコントロール群細胞のものと同様であることがわかった。とりわけ、単一ｇＲＮＡ（ＤＰＡ−１３）−遺伝子導入細胞および複数のｇＲＮＡ−遺伝子導入細胞間でインキュベーション率（ｒａｔｅ）の観点で差異がないことを確認した。
【００７７】
実施例３．５．  ＨＬＡ−欠失Ｔ細胞およびＮＫ細胞の活性の解析
ＲＮＰ複合体−遺伝子導入細胞およびコントロール細胞のそれぞれについて、１×１０６細胞をＰＭＡ、イオノマイシン（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｃｏｃｋｔａｉｌ、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、００−４９７０−０３）、およびＡＰＣ抗ＣＤ１０７α（ＢＤ、５６０６６４）での処理に供し、その後インキュベーションするか、またはＡＰＣ抗ＣＤ１０７αおよび２×１０５Ｋ５６２細胞とインキュベートした。５時間後、ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５抗ＣＤ３（Ｔｏｎｂｏ、６５−００３８−Ｔ１００）、ＢＶ４２１抗ＣＤ５６（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１８３２８）、ＦＩＴＣ抗Ｂ２Ｍ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１６３０４）、ＡＰＣ−Ｃｙ７抗ＨＬＡ−ＡＢＣ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１１４２６）、およびＰＥ抗ＨＬＡ−ＤＲ／ＤＰ／ＤＱ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、１３０−１０４−８２７）での処理を実施した。その後、光を３０分間遮断しインキュベーションを４℃で実施し、表面染色を行った。
【００７８】
その後、３ｍＬのＦＡＣＳバッファーをそこに加え、遠心分離を２，０００ｒｐｍ、３分、４℃で実施し、上清を除去した。その後ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ（ＴＭ）バッファー（ＢＤ、５５４７２２）を使用して、固定および浸透を３０分実施した。洗浄を１ＸＰｅｒｍ／ウォッシュバッファー（ＢＤ、５５４７２３）で２回実施し、ＰＥ−Ｃｙ７抗ＴＮＦ−α（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２５−７３４９−８２）およびＶ５００抗ＩＦＮ−γ（ＢＤ、５５４７０１）での処理を実施した。光を３０分間遮断しインキュベーションを４℃で実施し、細胞内染色を行った。その後、３ｍＬのＦＡＣＳバッファーをそこに加え、遠心分離を２，０００ｒｐｍ、３分、４℃で実施し、上清を除去した。その後、洗浄を１ＸＰｅｒｍ／ウォッシュバッファーで２回実施し、Ｔ細胞およびＮＫ細胞におけるサイトカイン産物をフローサイトメトリーで解析した。結果は、図１８および１９に図示される。
【００７９】
図１８において、ＨＬＡが欠失されても、Ｔ細胞が活性化されると分泌されるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＣＤ１０７αの量がＨＬＡポジティブ細胞と異ならないことを確認した。また、図１９において、ＨＬＡが欠失されても、ＮＫ細胞が活性化されると分泌されるＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、およびＣＤ１０７αの量がＨＬＡポジティブ細胞と異ならないことを確認した。これらの結果から、ＮＫ細胞の活性はＨＬＡ−ＩおよびＨＬＡ−ＩＩが欠失されても維持されることがわかった。
【００８０】
実施例４．  ＨＬＡ−Ｅ−発現ベクターの合成および発現の確認
実施例４．１．  ＨＬＡ−Ｉ−欠失Ｒａｊｉ細胞系統に対するＮＫ細胞の細胞殺滅能力の評価
ＮＫ細胞の細胞殺滅能力がＨＬＡ−Ｉ−欠失細胞において増加しているかどうかを確認するために、Ｒａｊｉ細胞系統をＢ２Ｍ−０１  ＲＮＰ複合体で遺伝子導入し、ＨＬＡ−Ｉポジティブ細胞およびＨＬＡ−Ｉネガティブ細胞を細胞セパレーターを使用して分離した。それぞれの細胞を製造元の指示書に従いカルセイン−ＡＭで染色し、そして１×１０４細胞をＥ：Ｔ比１０：１、３：１、１：１、または０．３：１でＵ底プレートでＮＫ−９２ＭＩ細胞系統とインキュベートした。５時間後、細胞死により分泌されたカルセイン−ＡＭの量をフルオロメーターで測定した。図２０に示されるように、ＮＫ細胞の細胞殺滅能力がＨＬＡ−Ｉポジティブ細胞と比較してＨＬＡ−Ｉネガティブ細胞において増加することを確認した。
【００８１】
実施例４．２．  ＨＬＡ−Ｅベクターの合成
実施例４．１と同様にＨＬＡ−Ｉを欠失するためにＢ２Ｍ  ＲＮＰ複合体で細胞が遺伝子導入されると生じるＮＫ細胞により引き起こされる細胞殺滅現象を避けるために、ＨＬＡ−Ｅを前記細胞に導入するためのＨＬＡ−Ｅベクターを合成した。すなわち、Ｂ２Ｍ（配列番号２３７）が３つの第一Ｇ４Ｓリンカー（配列番号２３８）を介してＢ２Ｍシグナルペプチド（Ｂ２Ｍ  ＳＳ；配列番号２３５）に連結したＧ−ペプチド（配列番号２３６）に連結し、そしてＢ２Ｍが４つの第二Ｇ４Ｓリンカー（配列番号２４１）を介してＨＡタグ（配列番号２３９）と付着したＨＬＡ−Ｅ（配列番号２４０）に結合している形質転換ＨＬＡ−Ｅ（Ｇ−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｅ）を合成した。それぞれの配列が以下表６に示される。合成形質転換ＨＬＡ−ＥをｐＬＶＸ−ＥＦ１α−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、６３１９８８）への挿入によりクローニングし、その構造は図２１に示される。
【表６】
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【００８２】
実施例４．３．  Ｋ５６２細胞系統への形質導入によるＨＬＡ−Ｅの発現およびその確認
形質転換ＨＬＡ−Ｅ挿入ｐＬＶＸ−ＥＦ１α−ＩＲＥＳ−Ｐｕｒｏベクターを２９３Ｔ細胞系統をレンチウイルスパッケージングベクターと共に遺伝子導入した。３日後、レンチウイルス上清を０．４５μｍフィルターを通して得た。Ｋ５６２細胞系統をレンチウイルス上清処理に供し、遠心分離を３，０００ｒｐｍ、１時間、３２℃で実施した。３日後、１×１０６細胞を５ｍＬチューブに移し、細胞表面染色をＰＥ−Ｃｙ７抗ＨＬＡ−Ｅ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３４２６０８）およびＡＰＣ抗Ｂ２Ｍ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ、３１６３１２）で３０分実施した。ＦＡＣＳバッファーでの洗浄を実施し、そしてＨＬＡ−ＥおよびＢ２Ｍの発現をフローサイトメトリーで検査した。図２２にみられるように、ＨＬＡ−ＥおよびＢ２Ｍが、形質転換ＨＬＡ−Ｅを発現するＫ５６２細胞系統において高レベルで発現したことを確認した。
【００８３】
実施例４．４．  ＨＬＡ−Ｅ導入細胞における細胞殺滅能力の評価
形質転換ＨＬＡ−Ｅを発現する各Ｋ５６２細胞系統およびコントロール群Ｋ５６２細胞系統を製造元の指示書に従いカルセイン−ＡＭで染色し、そして１×１０４細胞をＥ：Ｔ比１０：１、３：１、１：１、または０．３：１でＵ底プレートでＮＫ細胞とインキュベートした。５時間後、１００μＬを各インキュベート物からとり、細胞死により分泌されたカルセイン−ＡＭの量をフルオロメーター（ＶｉｃｔｏｒＴＭＸ３、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）で測定した。
【００８４】
図２３にみられるように、コントロール群Ｋ５６２細胞系統（Ｋ５６２）と比較して形質転換ＨＬＡ−Ｅを発現するＫ５６２細胞系統（Ｋ５６２  Ｇ−Ｂ２Ｍ−ＨＬＡ−Ｅ）の場合では、ＮＫ細胞により引き起こされる細胞死現象は顕著に減少したことが確認された。これらの結果から、ＨＬＡ−Ｅの発現がＮＫ細胞により引き起こされる細胞死を防止できることがわかった。
【００８５】
実施例５．  ＨＬＡ−Ｉ−およびＨＬＡ−ＩＩ−欠失ＮＫ細胞へのＨＬＡ−Ｅの導入
実施例４．２と同様にして調製したＨＬＡ−Ｅベクターを使用して実施例３で調製したＨＬＡ−Ｉ−およびＨＬＡ−ＩＩ−欠失ＮＫ細胞にＧ−ペプチドが結合したＨＬＡ−Ｅを導入して形質転換ＮＫ細胞を調製した。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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