(57)【要約】  核酸シーケンシングのためのシステムおよび方法が、提供される。核酸は、二本鎖直線化伸長形態でテスト基板上に固定され、その後、基板上で一本鎖に変性されて、隣接する、核酸の固定された第一および第二の鎖を得る。鎖は、プローブが固定された第一または第二の鎖の対応する相補性部分とヘテロデュプレックスを形成できる条件下で、プローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露され、それにより光学活性の各インスタンス（ｉｎｓｔａｎｃｅ）を生じる。イメージャが、この光学活性の基板上の場所および期間を測定する。暴露および測定は、プローブのセットにおけるプローブについて反復され、それにより位置の複数のセットを得る。核酸配列は、セットにおける位置のコンパイルを通して位置の複数のセットから決定される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸をシーケンシングする方法であって、
（ａ）二本鎖直線化伸長形態で前記核酸をテスト基板上に固定しそれにより固定された伸長二本鎖核酸を形成させること；
（ｂ）前記固定された伸長二本鎖核酸を前記テスト基板上で一本鎖形態に変性させそれにより前記核酸の固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を得ることであって、前記固定された第二の鎖の各塩基が、前記固定された第一の鎖の対応する相補性塩基に隣接して位置する、変性させること；
（ｃ）前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖をオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露することであって、オリゴヌクレオチドプローブの前記セット中のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、所定の配列および長さであり、前記暴露すること（ｃ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを前記各オリゴヌクレオチドプローブに相補的な前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の部分と結合させかつ各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こりそれにより光学活性の各インスタンスを生じる、暴露すること；
（ｄ）二次元イメージャを用いて暴露すること（ｃ）の間に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスの前記テスト基板上の場所および期間を測定すること；
（ｅ）オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて暴露すること（ｃ）および測定すること（ｄ）を反復することであって、それにより前記テスト基板上の位置の複数のセットを得て、前記テスト基板上の位置のそれぞれの各セットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応する、反復すること；ならびに
（ｆ）前記テスト基板上の位置の前記複数のセットにより表される前記テスト基板上の前記位置をコンパイルすることにより前記テスト基板上の位置の前記複数のセットから前記核酸の少なくとも一部の配列を決定すること、
を含む、方法。
【請求項２】
前記暴露すること（ｃ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを前記個々のプローブに相補的な前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の部分と一過的かつ可逆的に結合させかつ前記各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こりそれにより光学活性のインスタンスを生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記暴露すること（ｃ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを前記個々のプローブに相補的な前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の部分と反復的に一過的かつ可逆的に結合させかつ前記各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こりそれにより光学活性の各インスタンスを反復的に生じる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、標識と結合される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記暴露することが、色素の形態の第一の標識の存在下であり、
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、第二の標識と結合され、かつ
前記第一の標識が、前記第一の標識と前記第二の標識が互いに接近している時に前記第二の標識を蛍光発光させる、
請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記暴露することが、インターカレーティング色素の存在下であり、
光学活性の前記各インスタンスが、前記オリゴヌクレオチドと前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の間の前記各ヘテロデュプレックス中にインターカレートする前記インターカレーティング色素の蛍光由来であり、光学活性の前記各インスタンスが、前記インターカレーティング色素が前記各ヘテロデュプレックスをインターカレートする前にその蛍光より大きい、
請求項１に記載の方法。
【請求項７】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つより多くのオリゴヌクレオチドプローブが、前記暴露すること（ｃ）の単一インスタンスの間に前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖に暴露される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
前記暴露すること（ｃ）の前記単一インスタンスの間に前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖に暴露されるオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける異なるオリゴヌクレオチドプローブが、異なる標識と会合される、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記暴露すること（ｃ）が、第一の温度でオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施されかつ前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を前記反復すること（ｅ）が、第二の温度で前記第一のオリゴヌクレオチドについて前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を実施することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記暴露すること（ｃ）が、第一の温度でオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施され、
前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を前記反復すること（ｅ）のインスタンスが、複数の異なる温度のそれぞれで前記第一のオリゴヌクレオチドについて前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を実施することを含み、かつ
前記第一の温度および前記複数の異なる温度でのそれぞれの温度について前記測定すること（ｄ）により記録された光学活性の前記測定された場所および期間を用いて前記第一のオリゴヌクレオチドプローブについて溶融曲線を構築することをさらに含む、
請求項１に記載の方法。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットが、前記オリゴヌクレオチドプローブの複数のサブセットを含みかつ前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）の前記反復すること（ｅ）が、オリゴヌクレオチドプローブの前記複数のサブセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの各サブセットについて実施される、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
前記テスト基板上の前記場所を測定することが、前記二次元イメージャにより得られたデータのフレームで光学活性の前記各インスタンスの中心を同定しかつ適合させるためにあてはめ関数で光学活性の前記各インスタンスを同定することかつ適合させることを含み、かつ
光学活性の前記各インスタンスの前記中心が、前記テスト基板上の光学活性の前記各インスタンスの前記位置であると見なされる、
請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
光学活性の前記各インスタンスが、前記二次元イメージャにより測定される複数のフレームにわたり持続し、
前記テスト基板上の前記場所を前記測定することが、前記複数のフレームにわたり光学活性の前記各インスタンスの中心を同定するために前記複数のフレームにわたりあてはめ関数で光学活性の前記各インスタンスを同定することかつ適合させることを含み、
光学活性の前記各インスタンスの前記中心が、前記複数のフレームにわたり前記テスト基板上の光学活性の前記各インスタンスの前記位置であると見なされる、
請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
テスト基板上の前記場所を前記測定することが、前記二次元イメージャにより測定されたデータのフレームをトレーニングされた畳み込みニューラルネットワークに入力することを含み、
データの前記フレームが、光学活性の複数のインスタンスの中の光学活性の前記各インスタンスを含み、
光学活性の前記複数のインスタンスにおける光学活性のそれぞれのインスタンスが、前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部に結合する個々のプローブに対応し、
前記入力に応答して、前記トレーニングされた畳み込みニューラルネットワークが、光学活性の前記複数のインスタンスにおける光学活性の１つまたは複数のインスタンスのそれぞれの前記テスト基板上の位置を同定する、
請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
前記測定することが、少なくとも２０ｎｍの位置特定精度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
光学活性の前記各インスタンスの前記テスト基板上の前記場所および前記期間を前記測定すること（ｄ）が、前記場所で５０００光子を超えて測定する、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
光学活性の前記各インスタンスが、前記テスト基板で観察されたバックグランドを上回る所定の数より大きな標準偏差である、請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
前記所定の数の標準偏差が、３より大きな標準偏差である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数のオリゴヌクレオチドプローブにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブが、ユニークなＮ量体配列を含み、Ｎが、セット｛１、２、３、４、５、６、７、８、９および１０｝中のある整数でありかつ長さＮの全てのユニークなＮ量体配列が、前記複数のオリゴヌクレオチドプローブにより表される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記ユニークなＮ量体配列が、１つまたは複数の縮重ヌクレオチド位置により占有される１つまたは複数のヌクレオチド位置を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記核酸が、少なくとも１４０塩基長でありかつ前記決定すること（ｆ）が、７０%を超える前記核酸配列の前記配列のカバー率を決定する、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記核酸が、少なくとも１０，０００塩基長である、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
核酸の前記長さが、約１，０００，０００塩基長のポアソン分布である、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記テスト基板が、前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を反復する前に洗浄され、それによりオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける別のオリゴヌクレオチドプローブに前記テスト基板を暴露する前に前記テスト基板から各オリゴヌクレオチドプローブを除去する、請求項１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記固定すること（ａ）が、分子コーミング（後退メニスカス（ｒｅｃｅｄｉｎｇ ｍｅｎｉｓｃｕｓ））、フローストレッチングナノコンファインメント、またはエレクトロストレッチングにより、前記核酸を前記テスト基板に塗布することを含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
光学活性のそれぞれの各インスタンスが、所定の閾値を充たす観察メトリックを有する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記観察メトリックが、期間、信号対ノイズ、光子計数、画素フットプリント、または強度を含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記所定の閾値が、
（ｉ）前記ユニークなＮ量体配列のそれぞれの残基が前記核酸の前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の中の相補性塩基に結合する結合の第一の形態と、
（ｉｉ）前記ユニークなＮ量体配列と前記各オリゴヌクレオチドプローブが結合して光学活性の前記各インスタンスを形成している前記核酸の前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の中の配列との間に少なくとも１つのミスマッチが存在する結合の第二の形態、
を区別する、請求項２６に記載の方法。
【請求項２９】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブが、それ自体の対応する所定の閾値を有する、請求項２６または２８に記載の方法。
【請求項３０】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについての前記所定の閾値が、トレーニングデータセットから誘導される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについての前記所定の閾値が、前記トレーニングデータセットから誘導され、かつ
前記トレーニングセットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについて、前記各オリゴヌクレオチドプローブの前記ユニークなＮ量体配列のそれぞれの残基が参照配列中の相補性塩基に結合するように前記参照配列に結合する際の前記各オリゴヌクレオチドプローブについて前記観察メトリックの尺度を含む、
請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記参照配列が、前記核酸と共に含まれるか前記テスト基板上に固定される、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブが、
前記固定された第一の鎖の相補性部分に結合することによる光学活性の第一のインスタンスと、
前記固定された第二の鎖の相補性部分に結合することによる光学活性の第二のインスタンス、
を生じる、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブが、
前記固定された第一の鎖の２つ以上の相補性部分に結合することによる光学活性の２つ以上の第一のインスタンスと、
前記固定された第二の鎖の２つ以上の相補性部分に結合することによる光学活性の２つ以上の第二のインスタンス、
を生じる、請求項１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記各オリゴヌクレオチドプローブが、前記暴露すること（ｃ）の間に３回以上各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部に結合しそれにより光学活性の３つ以上のインスタンスをもたらし、光学活性のそれぞれのインスタンスが、前記複数の結合事象における１つの結合事象を表す、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記暴露すること（ｃ）が、前記二次元イメージャの１つもしくは複数のフレームにわたり起こる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記暴露すること（ｃ）が、前記二次元イメージャの２つ以上のフレームにわたり起こる、請求項１〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、同じ長さである、請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、同じ長さＭであり、
Ｍが、２以上の正の整数であり、
前記テスト基板上の位置の前記複数のセットからの前記核酸の少なくとも一部の前記配列を前記決定すること（ｆ）が、位置の前記複数のセットにより表される前記オリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップ配列をさらに利用する、
請求項１〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記テスト基板上の位置の前記複数のセットからの前記核酸の少なくとも一部の前記配列を前記決定することが、前記固定された第一の鎖に対応する第一のタイリングパスと前記固定された第二の鎖に対応する第二のタイリングパスを決定することを含む、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記第一のタイリングパス中の断絶（ｂｒｅａｋ）が、前記第二のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記第一のタイリングパスまたは前記第二のタイリングパス中の断絶が、前記核酸の別のインスタンスから得られる第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
前記配列の配列割り当てにおける信頼度が、前記第一のタイリングパスおよび前記第二のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４４】
前記配列の配列割り当てにおける信頼度が、前記核酸の別のインスタンスから得られる第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４５】
前記テスト基板が、二次元表面である、請求項１〜４４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
前記テスト基板が、前記固定すること（ａ）の前に７−オクテニルトリクロロシランを含むビニルシランコーティングでコーティングされる、請求項１〜４５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
核酸をシーケンシングする方法であって、
（ａ）直線化伸長形態の前記核酸をテスト基板上に固定しそれにより固定された伸長核酸を形成させること；
（ｂ）前記固定された伸長核酸をオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露することであって、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、所定の配列および長さであり、前記暴露すること（ｂ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの前記各プールの個々のプローブを前記各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である前記固定された核酸の一部に対して一過的かつ可逆的に可能にする条件下で起こりそれにより光学活性の各インスタンスを生じる、暴露すること；
（ｃ）二次元イメージャを用いて前記暴露すること（ｂ）の間に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスの前記テスト基板上の場所および期間を測定すること；
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて前記暴露すること（ｂ）および前記測定すること（ｃ）を反復し、それにより前記テスト基板上の位置の複数のセットを得、前記テスト基板上の位置のそれぞれの各セットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応すること；ならびに
（ｅ）前記テスト基板上の位置の前記複数のセットにより表される前記テスト基板上の前記位置をコンパイルすることにより前記テスト基板上の位置の前記複数のセットから前記核酸の少なくとも一部の前記配列を決定すること、
を含む、方法。
【請求項４８】
核酸を解析する方法であって、
（ａ）二本鎖形態の前記核酸をテスト基板上に固定しそれにより固定された二本鎖核酸を形成させること、
（ｂ）前記固定された二本鎖核酸を前記テスト基板上で一本鎖形態に変性させそれにより前記核酸の固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を得ることであって、前記固定された第二の鎖が、前記固定された第一の鎖に相補的である、変性させること、ならびに
（ｃ）前記固定された第一の鎖および前記を暴露すること、
を含む、方法。
【請求項４９】
核酸をシーケンシングする方法であって、
（ａ）二本鎖直線化伸長形態の前記核酸をテスト基板上に固定しそれにより固定された伸長二本鎖核酸を形成させること；
（ｂ）前記固定された伸長二本鎖核酸を前記テスト基板上で一本鎖形態に変性させそれにより前記核酸の固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を得ることであって、そこで前記固定された第二の鎖の各塩基が、前記固定された第一の鎖の対応する相補性塩基に隣接して位置する、変性させること；
（ｃ）前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖をオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露することであって、オリゴヌクレオチドプローブの前記セット中のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、所定の配列および長さであり、前記暴露すること（ｃ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを前記各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部と結合させかつ各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こりそれにより光学活性の各インスタンスを生じる、暴露すること；
（ｄ）二次元イメージャを用いて暴露すること（ｃ）の間に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスの前記テスト基板上の場所および期間を測定すること；
（ｅ）オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて暴露すること（ｃ）および測定すること（ｄ）を反復し、それにより前記テスト基板上の位置の複数のセットを得、前記テスト基板上の位置のそれぞれの各セットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応すること；ならびに
（ｆ）前記テスト基板上の位置の前記複数のセットにより表される前記テスト基板上の前記位置をコンパイルすることにより前記テスト基板上の位置の前記複数のセットから前記核酸の少なくとも一部の配列を決定すること、
を含む、方法。
【請求項５０】
前記暴露すること（ｃ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを前記個々のプローブに相補的である前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部と一過的かつ可逆的に結合させかつ前記各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こりそれにより光学活性のインスタンスを生じる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
前記暴露（ｃ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを前記個々のプローブに相補的である前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部と反復的に一過的かつ可逆的に結合させかつ前記各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こりそれにより反復的に光学活性の各インスタンスを生じる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５２】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、標識と結合される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５３】
前記標識が、色素、蛍光ナノ粒子、または光散乱粒子である、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記暴露が、インターカレーティング色素の形態の第一の標識の存在下であり、
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、第二の標識と結合され、
前記第一の標識および前記第二の標識が、前記第一の標識と前記第二の標識が互いに接近している時に前記第一の標識および前記第二の標識の一方を蛍光発光させるオーバーラップするドナー発光スペクトルおよびアクセプター励起スペクトルを有し、かつ
光学活性の前記各インスタンスが、前記第二の標識に、前記オリゴヌクレオチドと前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖との間の前記各ヘテロデュプレックスをインターカレートする、前記インターカレーティング色素の付近に由来する、
請求項４９に記載の方法。
【請求項５５】
前記暴露することが、インターカレーティング色素の形態の第一の標識の存在下であり、
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、第二の標識と結合され、
前記第一の標識が、前記第一の標識および前記第二の標識が互いに接近している時に前記第二の標識を蛍光発光させ、
光学活性の前記各インスタンスが、前記第二の標識に、前記オリゴヌクレオチドと前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖との間の前記各ヘテロデュプレックスをインターカレートする、インターカレーティング色素の付近に由来する、
請求項４９に記載の方法。
【請求項５６】
前記暴露することが、インターカレーティング色素の形態の第一の標識の存在下であり、
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、第二の標識と結合され、
前記第二の標識が、前記第一の標識および前記第二の標識が互いに接近している時に前記第一の標識を蛍光発光させ、
光学活性の前記各インスタンスが、前記第二の標識に、前記オリゴヌクレオチドと前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖との間の前記各ヘテロデュプレックスをインターカレートする、インターカレーティング色素の付近に由来する、
請求項４９に記載の方法。
【請求項５７】
前記暴露することが、インターカレーティング色素の存在下であり、かつ
光学活性の前記各インスタンスが、前記オリゴヌクレオチドと前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖との間の前記各ヘテロデュプレックスにインターカレートする前記インターカレーティング色素の蛍光に由来し、光学活性の前記各インスタンスが、前記インターカレーティング色素が前記各ヘテロデュプレックスをインターカレートする前にその蛍光より大きい、
請求項４９に記載の方法。
【請求項５８】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つより多くのオリゴヌクレオチドプローブが、前記暴露すること（ｃ）の単一インスタンスの間に前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖に暴露され、かつ
前記暴露すること（ｃ）の前記単一インスタンスの間に前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖に暴露されるオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの異なるオリゴヌクレオチドプローブが、異なる標識と会合される、請求項４９に記載の方法。
【請求項５９】
第一のオリゴヌクレオチドプローブが第一の標識と会合されている、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のプールが、前記暴露すること（ｃ）の前記単一インスタンスの間に前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖に暴露され、
第二のオリゴヌクレオチドプローブが第二の標識と会合されている、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のプールが、前記暴露すること（ｃ）の前記単一インスタンスの間に前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖に暴露され、かつ
前記第一の標識と前記第二の標識が、異なる、
請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
第一のオリゴヌクレオチドプローブが第一の標識と会合されている、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブの第一のプールが、前記暴露すること（ｃ）の前記単一インスタンスの間に前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖に暴露され、
第二のオリゴヌクレオチドプローブが第二の標識と会合されている、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第二のオリゴヌクレオチドプローブの第二のプールが、前記暴露すること（ｃ）の前記単一インスタンスの間に前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖に暴露され、
第三のオリゴヌクレオチドプローブが第三の標識と会合されている、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第三のオリゴヌクレオチドプローブの第三のプールが、前記暴露すること（ｃ）の前記単一インスタンスの間に前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖に暴露され、かつ
前記第一の標識と、前記第二の標識と、前記第三の標識が、それぞれ異なる、
請求項５８に記載の方法。
【請求項６１】
前記反復（ｅ）すること、前記暴露すること（ｃ）、および前記測定すること（ｄ）が、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの単一オリゴヌクレオチドプローブについて実施される、請求項４９に記載の方法。
【請求項６２】
前記暴露すること（ｃ）が、第一の温度でオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施されかつ前記反復すること（ｅ）、前記暴露すること（ｃ）、および前記測定すること（ｄ）が、第二の温度で前記第一のオリゴヌクレオチドについて前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を実施することを含む、請求項４９に記載の方法。
【請求項６３】
前記暴露すること（ｃ）が、第一の温度でオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施され、
前記反復すること（ｅ）、前記暴露すること（ｃ）、および前記測定すること（ｄ）のインスタンスが、複数の異なる温度のそれぞれで前記第一のオリゴヌクレオチドについて前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を実施することを含み、かつ
前記第一の温度および前記複数の異なる温度におけるそれぞれの温度について前記測定すること（ｄ）により記録された光学活性の前記測定された場所および期間を用いて前記第一のオリゴヌクレオチドプローブについて溶融曲線を構築することをさらに含む、
請求項４９に記載の方法。
【請求項６４】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットが、前記オリゴヌクレオチドプローブの複数のサブセットを含み、前記暴露すること（ｃ）、および前記測定すること（ｄ）を前記反復すること（ｅ）が、オリゴヌクレオチドプローブの前記複数のサブセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの各サブセットについて実施される、請求項４９に記載の方法。
【請求項６５】
オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの各サブセットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットと異なる２つ以上のプローブを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの各サブセットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットと異なる４つ以上のプローブを含む、請求項６４に記載の方法。
【請求項６７】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットが、オリゴヌクレオチドプローブの４つのサブセットからなる、請求項６４に記載の方法。
【請求項６８】
各オリゴヌクレオチドプローブの計算されたまたは実験で誘導された溶融温度に基づきオリゴヌクレオチドプローブの前記セットをオリゴヌクレオチドプローブの前記複数のサブセットに分割することをさらに含み、類似の溶融温度を有するオリゴヌクレオチドプローブが、前記分割によりオリゴヌクレオチドプローブの同じサブセットに置かれかつ前記暴露すること（ｃ）のインスタンスの温度または期間が、オリゴヌクレオチドプローブの対応するサブセットにおける前記オリゴヌクレオチドプローブの平均溶融温度により決定される、請求項６４に記載の方法。
【請求項６９】
各オリゴヌクレオチドプローブの配列に基づきオリゴヌクレオチドプローブの前記セットをオリゴヌクレオチドプローブの前記複数のサブセットに分割することをさらに含み、オーバーラップする配列を有するオリゴヌクレオチドプローブが、異なるサブセットに置かれる、請求項６４に記載の方法。
【請求項７０】
前記テスト基板上の前記場所を前記測定することが、前記二次元イメージャにより得られたデータのフレーム中で光学活性の前記各インスタンスの中心を同定しかつ適合させるためにあてはめ関数で光学活性の前記各インスタンスを同定すること及び適合させることを含み、
光学活性の前記各インスタンスの前記中心が、前記テスト基板上の光学活性の前記各インスタンスの前記位置であると見なされる、
請求項４９に記載の方法。
【請求項７１】
前記あてはめ関数が、ガウス関数、第一モーメント関数（ｆｉｒｓｔ ｍｏｍｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、勾配に基づくアプローチ、またはフーリエ変換である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
光学活性の前記各インスタンスが、前記二次元イメージャにより測定される複数のフレームにわたり持続し、
前記テスト基板上の前記場所の前記測定が、前記複数のフレームにわたり光学活性の前記各インスタンスの中心を同定するために前記複数のフレームにわたりあてはめ関数で光学活性の前記各インスタンスを同定すること及び適合させることを含み、
光学活性の前記各インスタンスの前記中心が、前記複数のフレームにわたり前記テスト基板上の光学活性の前記各インスタンスの前記位置であると見なされる、
請求項４９に記載の方法。
【請求項７３】
前記あてはめ関数が、ガウス関数、第一モーメント関数、勾配に基づくアプローチ、またはフーリエ変換である、請求項７２に記載の方法。
【請求項７４】
テスト基板上の前記場所を前記測定することが、前記二次元イメージャにより測定されたデータのフレームをトレーニングされた畳み込みニューラルネットワークに入力することを含み、
データの前記フレームが、光学活性の複数のインスタンスの中の光学活性の前記各インスタンスを含み、
光学活性の前記複数のインスタンスにおける光学活性のそれぞれのインスタンスが、前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部に結合する個々のプローブに対応し、
前記入力に応答して、前記トレーニングされた畳み込みニューラルネットワークが、光学活性の前記複数のインスタンスにおける光学活性の１つまたは複数のインスタンスのそれぞれの前記テスト基板上の位置を同定する、
請求項４９に記載の方法。
【請求項７５】
前記測定することが、少なくとも２０ｎｍの位置特定精度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項７０〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７６】
前記測定することが、少なくとも２ｎｍの位置特定精度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項７０〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７７】
前記測定することが、少なくとも６０ｎｍの解像度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項７０〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７８】
前記測定することが、少なくとも６ｎｍの解像度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項７０〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７９】
前記測定することが、テスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像し、前記位置が、サブ回折限界位置である、請求項７０〜７４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８０】
光学活性の前記各インスタンスの前記テスト基板上の前記場所および前記期間を前記測定すること（ｄ）が、前記場所で５０００超の光子を測定する、請求項４９〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８１】
光学活性の前記各インスタンスの前記テスト基板上の前記場所および前記期間を前記測定すること（ｄ）が、前記場所で５０，０００超の光子を測定する、請求項４９〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８２】
光学活性の前記各インスタンスの前記テスト基板上の前記場所および前記期間を前記測定すること（ｄ）が、前記場所で２００，０００超の光子を測定する、請求項４９〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８３】
光学活性の前記各インスタンスが、前記テスト基板で観察されるバックグランドを上回る所定の数の標準偏差より大きい、請求項４９〜８２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８４】
前記所定の数の標準偏差が、３の標準偏差である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記所定の数の標準偏差が、６の標準偏差である、請求項８３に記載の方法。
【請求項８６】
前記複数のオリゴヌクレオチドプローブにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブが、ユニークなＮ量体配列を含み、Ｎが、セット｛１、２、３、４、５、６、７、８、および９｝中の整数でありかつ長さＮの全てのユニークなＮ量体配列が、前記複数のオリゴヌクレオチドプローブにより表される、請求項４９〜８５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８７】
前記ユニークなＮ量体配列が、１つまたは複数の縮重ヌクレオチドにより占有される１つまたは複数のヌクレオチド位置を含む、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記１つまたは複数のヌクレオチド位置におけるそれぞれの縮重ヌクレオチド位置が、ユニバーサル塩基により占有される、請求項８７に記載の方法。
【請求項８９】
前記ユニバーサル塩基が、２’−デオキシイノシンである、請求項８８に記載の方法。
【請求項９０】
前記ユニークなＮ量体配列が、単一の縮重ヌクレオチド位置により５’隣接されかつ単一の縮重ヌクレオチド位置により３’隣接される、請求項８６に記載の方法。
【請求項９１】
前記５’側の単一縮重ヌクレオチドおよび前記３’側の単一縮重ヌクレオチドが、それぞれ２’−デオキシイノシンである、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記核酸が、少なくとも１４０塩基長でありかつ前記決定すること（ｆ）が、７０%を超える前記核酸配列の前記配列のカバー率を決定する、請求項４９〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９３】
前記核酸が、少なくとも１４０塩基長でありかつ前記決定すること（ｆ）が、９０%を超える前記核酸配列の前記配列のカバー率を決定する、請求項４９〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９４】
前記核酸が、少なくとも１４０塩基長でありかつ前記決定すること（ｆ）が、９９%を超える前記核酸配列の前記配列のカバー率を決定する、請求項４９〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９５】
前記決定すること（ｆ）が、９９%を超える前記核酸配列の前記配列のカバー率を決定する、請求項４９〜９１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９６】
前記核酸が、少なくとも１０，０００塩基長である、請求項４９〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９７】
前記核酸が、少なくとも１，０００，０００塩基長である、請求項４９〜９５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９８】
前記テスト基板が、前記暴露すること（ｃ）および前記測定すること（ｄ）を反復することの前に洗浄され、それによりオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける別のオリゴヌクレオチドプローブに前記テスト基板を暴露する前に前記テスト基板から各オリゴヌクレオチドプローブを除去する、請求項４９〜９７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項９９】
前記固定すること（ａ）が、分子コーミング、フローストレッチングナノコンファインメント、またはエレクトロストレッチングにより前記テスト基板に前記核酸を塗布することを含む、請求項４９〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１００】
光学活性のそれぞれの各インスタンスが、所定の閾値を充たす観察メトリックを有する、請求項４９〜９８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１０１】
前記観察メトリックが、期間、信号対ノイズ、光子計数、または強度を含む、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記所定の閾値が、
（ｉ）前記ユニークなＮ量体配列のそれぞれの残基が前記核酸の前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の中の相補性塩基に結合する結合の第一の形態と、
（ｉｉ）前記ユニークなＮ量体配列と前記各オリゴヌクレオチドプローブが結合して光学活性の前記各インスタンスを形成する前記核酸の前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の中の配列との間に少なくとも１つのミスマッチがある結合の第二の形態、
を区別する、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０３】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブが、それ自体の対応する所定の閾値を有する、請求項１００または１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについての前記所定の閾値が、トレーニングデータセットから誘導される、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについての前記所定の閾値が、前記トレーニングデータセットから誘導され、かつ
前記トレーニングセットが、前記各オリゴヌクレオチドプローブの前記ユニークなＮ量体配列のそれぞれの残基が参照配列中の相補性塩基に結合するように前記参照配列に結合する際の前記各オリゴヌクレオチドプローブについて前記観察メトリックの尺度を、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについて、含む、
請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記参照配列が、参照基板上に固定される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０７】
前記参照配列が、前記核酸と共に含まれかつ前記テスト基板上に固定される、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０８】
前記参照配列が、ＰｈｉＸ１７４、 Ｍ１３、ラムダファージ、Ｔ７ファージ、大腸菌、出芽酵母、または分裂酵母のゲノムの全てまたは一部を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１０９】
前記参照配列が、既知の配列の合成構築物である、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１０】
前記参照配列が、ウサギグロビンＲＮＡの全てまたは一部を含む、請求項１０５に記載の方法。
【請求項１１１】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブが、
前記固定された第一の鎖の相補性部分に結合することによる光学活性の第一のインスタンスと、
前記固定された第二の鎖の相補性部分に結合することによる光学活性の第二のインスタンス、
を生じる、請求項４９〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１２】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブが、
前記固定された第一の鎖の２つ以上の相補性部分に結合することによる光学活性の２つ以上の第一のインスタンスと、
前記固定された第二の鎖の２つ以上の相補性部分に結合することによる光学活性の２つ以上の第二のインスタンス、
を生じる、請求項４９〜１１０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１３】
前記各オリゴヌクレオチドプローブが、前記暴露すること（ｃ）の間に３回以上各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部に結合しそれにより光学活性の３つ以上のインスタンスをもたらし、光学活性のそれぞれのインスタンスが、前記複数の結合事象における１つの結合事象を表す、請求項４９〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１４】
前記各オリゴヌクレオチドプローブが、前記暴露すること（ｃ）の間に５回以上前記各オリゴヌクレオチドプローブに相補的な前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部に結合しそれにより光学活性の５つ以上のインスタンスをもたらし、光学活性のそれぞれのインスタンスが、前記複数の結合事象における１つの結合事象を表す、請求項４９〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１５】
前記各オリゴヌクレオチドプローブが、前記暴露すること（ｃ）の間に１０回以上前記各オリゴヌクレオチドプローブに相補的な前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部に結合しそれにより光学活性の１０以上のインスタンスをもたらし、光学活性のそれぞれのインスタンスが、前記複数の結合事象における１つの結合事象を表す、請求項４９〜１１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記暴露すること（ｃ）が、５分以下の間起こる、請求項４９〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１７】
前記暴露すること（ｃ）が、２分以下の間起こる、請求項４９〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記暴露すること（ｃ）が、１分以下の間起こる、請求項４９〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記暴露すること（ｃ）が、前記二次元イメージャの１つもしくは複数のフレームにわたり起こる、請求項４９〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記暴露すること（ｃ）が、前記二次元イメージャの２つ以上のフレームにわたり起こる、請求項４９〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記暴露すること（ｃ）が、前記二次元イメージャの５００以上のフレームにわたり起こる、請求項４９〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記暴露すること（ｃ）が、前記二次元イメージャの５，０００以上のフレームにわたり起こる、請求項４９〜１１５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記暴露すること（ｃ）が、第一の期間の間にオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施され、
前記暴露すること（ｃ）、および前記測定（ｄ）を前記反復すること（ｅ）が、第二の期間の間に第二のオリゴヌクレオチドについて前記暴露すること（ｃ）を実施することを含み、かつ
前記第一の期間が、前記第二の期間より大きい、
請求項４９〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記暴露すること（ｃ）が、前記二次元イメージャの第一のフレーム数についてオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施され、
前記暴露すること（ｃ）、および前記測定すること（ｄ）を前記反復すること（ｅ）が、前記二次元イメージャの第二のフレーム数について第二のオリゴヌクレオチドについて前記暴露すること（ｃ）を実施することを含み、かつ
前記第一のフレーム数が、前記第二のフレーム数より大きい、
請求項４９〜１２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２５】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、同じ長さである、請求項４９〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２６】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、同じ長さＭであり、
Ｍが、２以上の正の整数であり、かつ
前記テスト基板上の位置の前記複数のセットからの前記核酸の少なくとも一部の前記配列を前記決定すること（ｆ）が、位置の前記複数のセットにより表される前記オリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップ配列をさらに利用する、
請求項４９〜１２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１２７】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける別のオリゴヌクレオチドプローブとＭ−１配列相同性を共有する、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記テスト基板上の位置の前記複数のセットからの前記核酸の少なくとも一部の前記配列の前記決定が、前記固定された第一の鎖に対応する第一のタイリングパスと前記固定された第二の鎖に対応する第二のタイリングパスとを決定すること含む、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２９】
前記第一のタイリングパス中の断絶が、前記第二のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３０】
前記第一のタイリングパスまたは前記第二のタイリングパス中の断絶が、参照配列を用いて解像される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３１】
前記第一のタイリングパスまたは前記第二のタイリングパス中の断絶が、前記核酸の別のインスタンスから得られる第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３２】
前記配列の配列割り当てにおける信頼度が、前記第一のタイリングパスおよび前記第二のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３３】
前記配列の配列割り当てにおける信頼度が、前記核酸の別のインスタンスから得られる第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される、請求項１２８に記載の方法。
【請求項１３４】
前記暴露すること（ｃ）のインスタンスの時間の長さが、前記暴露すること（ｃ）の前記インスタンスで用いられるオリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの推定溶融温度により決定される、請求項４９に記載の方法。
【請求項１３５】
（ｆ）前記固定された二本鎖または前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖を抗体、アフィマー、ナノモディ、アプタマー、またはメチル結合タンパク質に暴露してそれにより前記テスト基板上の位置の前記複数のセットからの前記核酸への修飾を決定することまたは前記核酸の一部の前記配列と相関させること、
をさらに含む、請求項４９〜１３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３６】
前記テスト基板が、二次元表面である、請求項４９〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記二次元表面が、ゲルまたはマトリックスでコーティングされる、請求項１３６に記載の方法。
【請求項１３８】
前記テスト基板が、細胞、三次元マトリックスまたはゲルである、請求項４９〜１３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記テスト基板が、前記固定すること（ａ）の前に配列特異性オリゴヌクレオチドプローブと結合されかつ前記固定すること（ａ）が、前記テスト基板に結合された配列特異性オリゴヌクレオチドプローブを用いて前記テスト基板上で前記核酸を捕捉することを含む、請求項４９〜１３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記核酸が、追加的な複数の細胞成分を含む溶液中にありかつ前記固定すること（ａ）または変性させること（ｂ）が、前記核酸が前記テスト基板上に固定された後でおよび前記暴露すること（ｃ）の前に前記テスト基板を洗浄しそれにより前記追加的な複数の細胞成分を前記核酸から離して精製することをさらに含む、請求項４９〜１３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４１】
前記テスト基板が、前記暴露すること（ｃ）の前にポリエチレングリコール、ウシ血清アルブミン−ビオチン−ストレプトアビジン、カゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１種もしくは複数の異なるｔＲＮＡ、１種もしくは複数の異なるデオキシリボヌクレオチド、１種もしくは複数の異なるリボヌクレオチド、サケ精子ＤＮＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７、Ｔｗｅｅｎ−２０、水素シルセスキオキサン（ＨＳＱ）、またはそれらの任意の組み合わせでパシベートされる（ｐａｓｓｉｖｉｚｅｄ）、請求項４９〜１４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４２】
前記テスト基板が、前記固定すること（ａ）の前に７−オクテニルトリクロロシランを含むビニルシランコーティングでコーティングされる、前記請求項による、請求項４９〜１４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４３】
固定された伸長二本鎖核酸を形成させるために二本鎖直線化伸長形態でテスト基板上に最初に固定されかつ固定された第二の鎖の各塩基が固定された第一の鎖の対応する相補性塩基に隣接して位置する前記核酸の固定された前記第一の鎖および固定された前記第二の鎖を得るために前記テスト基板上で一本鎖形態に次に変性される核酸をシーケンシングするためのコンピュータであって、前記コンピュータが、
少なくとも１つのプロセッサと；
メモリを含み、前記メモリが、前記少なくとも１つのプロセッサによる実行のための少なくとも１つのプログラムを記憶し、前記少なくとも１つのプログラムが、
（ａ）暴露の間に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスの前記基板上の各場所および各期間の測定を、二次元画像から、得ることであって、前記暴露の間に、前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖が、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露され、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、所定の配列および長さであり、前記暴露が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの前記各プールの個々のプローブを前記各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部と結合させかつ各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こりそれにより光学活性の各インスタンスを生じる、得ること；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて前記得ること（ａ）を反復し、それにより前記テスト基板上の位置の複数のセットを得、前記テスト基板上の位置のそれぞれの各セットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応する、反復すること；ならびに
（ｃ）前記テスト基板上の位置の前記複数のセットにより表される前記テスト基板上の前記位置をコンパイルすることにより前記テスト基板上の位置の前記複数のセットから前記核酸の少なくとも一部の配列を決定すること、
のための命令を含む、コンピュータ。
【請求項１４４】
前記テスト基板上の前記場所を前記測定することが、前記二次元イメージャにより得られたデータのフレームの中で光学活性の前記各インスタンスの中心を同定し適合させるためにあてはめ関数で光学活性の前記各インスタンスを同定すること及び適合させることを含み、
光学活性の前記各インスタンスの前記中心が、前記テスト基板上の光学活性の前記各インスタンスの前記位置であると見なされる、
請求項１４３に記載のコンピュータ。
【請求項１４５】
前記あてはめ関数が、ガウス関数、第一モーメント関数、勾配に基づくアプローチ、またはフーリエ変換である、請求項１４４に記載のコンピュータ。
【請求項１４６】
光学活性の前記各インスタンスが、前記二次元イメージャにより測定される複数のフレームにわたり持続し、
前記テスト基板上の前記場所の前記測定が、前記複数のフレームにわたり光学活性の前記各インスタンスの中心を同定するために前記複数のフレームにわたりあてはめ関数で光学活性の前記各インスタンスを同定すること及び適合させることを含み、かつ
光学活性の前記各インスタンスの前記中心が、前記複数のフレームにわたる前記テスト基板上の光学活性の前記各インスタンスの前記位置であると見なされる、
請求項１４３に記載のコンピュータ。
【請求項１４７】
前記あてはめ関数が、ガウス関数、第一モーメント関数、勾配に基づくアプローチ、またはフーリエ変換である、請求項１４６に記載のコンピュータ。
【請求項１４８】
テスト基板上の前記場所を前記測定することが、前記二次元イメージャにより測定されたデータのフレームをトレーニングされた畳み込みニューラルネットワークに入力することを含み、
データの前記フレームが、光学活性の複数のインスタンスの中の光学活性の前記各インスタンスを含み、
光学活性の前記複数のインスタンスにおける光学活性のそれぞれのインスタンスが、前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部に結合する個々のプローブに対応し、かつ
前記入力に応答して、前記トレーニングされた畳み込みニューラルネットワークが、光学活性の前記複数のインスタンスにおける光学活性の１つまたは複数のインスタンスのそれぞれの前記テスト基板上の位置を同定する、
請求項１４３に記載のコンピュータ。
【請求項１４９】
前記測定することが、少なくとも２０ｎｍの位置特定精度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項１４４〜１４８のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項１５０】
前記測定することが、少なくとも２ｎｍの位置特定精度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項１４４〜１４８のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項１５１】
前記測定することが、少なくとも６０ｎｍの解像度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項１４４〜１４８のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項１５２】
前記測定することが、少なくとも６ｎｍの解像度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項１４４〜１４８のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項１５３】
前記測定することが、テスト基板上の位置に光学活性の各インスタンスの中心を解像し、前記位置が、サブ回折限界位置である、請求項１４４〜１４８のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項１５４】
光学活性の前記各インスタンスの前記テスト基板上の前記場所および前記期間を前記測定することが、前記場所で５０００超の光子を測定する、請求項１４３〜１５３のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項１５５】
光学活性の前記各インスタンスの前記テスト基板上の前記場所および前記期間を前記測定することが、前記場所で５０，０００超の光子を測定する、請求項１４３〜１５３のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項１５６】
光学活性の前記各インスタンスの前記テスト基板上の前記場所および前記期間を前記測定することが、前記場所で２００，０００超の光子を測定する、請求項１４３〜１５３のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項１５７】
光学活性の前記各インスタンスが、前記テスト基板で観察されるバックグランドを上回る所定の数の標準偏差より大きい、請求項１４３〜１５６のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項１５８】
前記所定の数の標準偏差が、３の標準偏差である、請求項１５７に記載のコンピュータ。
【請求項１５９】
前記所定の数の標準偏差が、６の標準偏差である、請求項１５７に記載のコンピュータ。
【請求項１６０】
光学活性のそれぞれの各インスタンスが、所定の閾値を充たす観察メトリックを有する、請求項１４３〜１５９のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項１６１】
前記観察メトリックが、期間、信号対ノイズ、光子計数、画素フットプリント、または強度を含む、請求項１６０に記載のコンピュータ。
【請求項１６２】
前記所定の閾値が、
（ｉ）前記ユニークなＮ量体配列のそれぞれの残基が前記核酸の前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の中の相補性塩基に結合する結合の第一の形態と、
（ｉｉ）前記ユニークなＮ量体配列と前記各オリゴヌクレオチドプローブが結合して光学活性の前記各インスタンスを形成する前記核酸の前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の中の配列との間に少なくとも１つのミスマッチがある結合の第二の形態、
を区別する、請求項１６０に記載のコンピュータ。
【請求項１６３】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブが、それ自体の対応する所定の閾値を有する、請求項１６０または１６２に記載のコンピュータ。
【請求項１６４】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについて前記所定の閾値が、トレーニングデータセットから誘導される、請求項１６３に記載のコンピュータ。
【請求項１６５】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについて前記所定の閾値が、前記トレーニングデータセットから誘導され、
前記トレーニングセットが、前記各オリゴヌクレオチドプローブの前記ユニークなＮ量体配列のそれぞれの残基が参照配列中の相補性塩基に結合するように前記参照配列に結合する際の前記各オリゴヌクレオチドプローブについて前記観察メトリックの尺度を、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについて、含む、
請求項１６４に記載のコンピュータ。
【請求項１６６】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、同じ長さＭであり、
Ｍが、２以上の正の整数であり、かつ
前記テスト基板上の位置の前記複数のセットからの前記核酸の少なくとも一部の前記配列を前記決定すること（ｆ）が、位置の前記複数のセットにより表される前記オリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップ配列をさらに利用する、
請求項１４３〜１６５のいずれか１項に記載のコンピュータ。
【請求項１６７】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける別のオリゴヌクレオチドプローブとＭ−１配列相同性を共有する、請求項１６６に記載のコンピュータ。
【請求項１６８】
前記テスト基板上の位置の前記複数のセットからの前記核酸の少なくとも一部の前記配列を前記決定することが、前記固定された第一の鎖に対応する第一のタイリングパスと前記固定された第二の鎖に対応する第二のタイリングパスとを決定すること含む、請求項１６６に記載のコンピュータ。
【請求項１６９】
前記第一のタイリングパス中の断絶が、前記第二のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される、請求項１６８に記載のコンピュータ。
【請求項１７０】
前記第一のタイリングパスまたは前記第二のタイリングパス中の断絶が、参照配列を用いて解像される、請求項１６８に記載のコンピュータ。
【請求項１７１】
前記第一のタイリングパスまたは前記第二のタイリングパス中の断絶が、前記核酸の別のインスタンスから得られた第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される、請求項１６８に記載のコンピュータ。
【請求項１７２】
前記配列の配列割り当てにおける信頼度が、前記第一のタイリングパスおよび前記第二のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される、請求項１６８に記載のコンピュータ。
【請求項１７３】
前記配列の配列割り当てにおける信頼度が、前記核酸の別のインスタンスから得られた第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される、請求項１６８に記載のコンピュータ。
【請求項１７４】
固定された伸長二本鎖核酸を形成させるために二本鎖直線化伸長形態でテスト基板上に最初に固定されかつ固定された第二の鎖の各塩基が固定された第一の鎖の対応する相補性塩基に隣接して位置する前記核酸の固定された前記第一の鎖および固定された前記第二の鎖を形成させるために前記テスト基板上で一本鎖形態に次に変性される核酸をシーケンシングするための非一時的コンピュータ読み取り可能記憶媒体であって、
前記非一時的コンピュータ読み取り可能記憶媒体が、コンピュータデバイス上で記憶され、前記コンピュータデバイスが、１つまたは複数のプロセッサおよびメモリを含み、
前記メモリが、前記１つまたは複数のプロセッサによる実行のための１つまたは複数のプログラムを記憶し、
前記１つまたは複数のプログラムが、
（ａ）暴露の間に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスの前記基板上の各場所および各期間の測定を、二次元画像から、得ることであって、前記暴露の間に、前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖が、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露され、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、所定の配列および長さであり、前記暴露が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの前記各プールの個々のプローブを前記各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部と結合させかつ各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こりそれにより光学活性の各インスタンスを生じる、得ること；
（ｂ）オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて前記得ること（ａ）を反復し、それにより前記テスト基板上の位置の複数のセットを得、前記テスト基板上の位置のそれぞれの各セットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応する、反復すること；ならびに
（ｃ）前記テスト基板上の位置の前記複数のセットにより表される前記テスト基板上の前記位置をコンパイルすることにより前記テスト基板上の位置の前記複数のセットから前記核酸の少なくとも一部の配列を決定すること、
を含む方法を実行するための命令を単独でまたは集合的に含む、非一時的コンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１７５】
前記テスト基板上の前記場所を前記測定することが、前記二次元イメージャにより得られたデータのフレームの中で光学活性の前記各インスタンスの中心を同定し適合させるためにあてはめ関数で光学活性の前記各インスタンスを同定すること及び適合させることを含み、
光学活性の前記各インスタンスの前記中心が、前記テスト基板上の光学活性の前記各インスタンスの前記位置であると見なされる、
請求項１７４に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１７６】
前記あてはめ関数が、ガウス関数、第一モーメント関数、勾配に基づくアプローチ、またはフーリエ変換である、請求項１７５に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１７７】
光学活性の前記各インスタンスが、前記二次元イメージャにより測定される複数のフレームにわたり持続し、
前記テスト基板上の前記場所の前記測定が、前記複数のフレームにわたり光学活性の前記各インスタンスの中心を同定するために前記複数のフレームにわたりあてはめ関数で光学活性の前記各インスタンスを同定すること及び適合させることを含み、
光学活性の前記各インスタンスの前記中心が、前記複数のフレームにわたる前記テスト基板上の光学活性の前記各インスタンスの前記位置であると見なされる、
請求項１７４に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１７８】
前記あてはめ関数が、ガウス関数、第一モーメント関数、勾配に基づくアプローチ、またはフーリエ変換である、請求項１７７に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１７９】
テスト基板上の前記場所を前記測定することが、前記二次元イメージャにより測定されたデータのフレームをトレーニングされた畳み込みニューラルネットワークに入力することを含み、
データの前記フレームが、光学活性の複数のインスタンスの中の光学活性の前記各インスタンスを含み、
光学活性の前記複数のインスタンスにおける光学活性のそれぞれのインスタンスが、前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の一部に結合する個々のプローブに対応し、かつ
前記入力に応答して、前記トレーニングされた畳み込みニューラルネットワークが、光学活性の前記複数のインスタンスにおける光学活性の１つまたは複数のインスタンスのそれぞれの前記テスト基板上の位置を同定する、
請求項１７４に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１８０】
前記測定することが、少なくとも２０ｎｍの位置特定精度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項１７５〜１７９のいずれか１項に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１８１】
前記測定することが、少なくとも２ｎｍの位置特定精度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項１７５〜１７９のいずれか１項に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１８２】
前記測定することが、少なくとも６０ｎｍの解像度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項１７５〜１７９のいずれか１項に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１８３】
前記測定することが、少なくとも６ｎｍの解像度でテスト基板上の位置に光学活性の前記各インスタンスの前記中心を解像する、請求項１７５〜１７９のいずれか１項に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１８４】
前記測定することが、テスト基板上の位置に光学活性の各インスタンスの中心を解像し、前記位置が、サブ回折限界位置である、請求項１７５〜１７９のいずれか１項に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１８５】
光学活性の前記各インスタンスの前記テスト基板上の前記場所および前記期間を前記測定することが、前記場所で５０００超の光子を測定する、請求項１７４〜１８４のいずれか１項に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１８６】
光学活性の前記各インスタンスの前記テスト基板上の前記場所および前記期間を前記測定することが、前記場所で５０，０００超の光子を測定する、請求項１７４〜１８４のいずれか１項に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１８７】
光学活性の前記各インスタンスの前記テスト基板上の前記場所および前記期間を前記測定することが、前記場所で２００，０００超の光子を測定する、請求項１７４〜１８４のいずれか１項に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１８８】
光学活性の前記各インスタンスが、前記テスト基板で観察されるバックグランドを上回る所定の数の標準偏差より大きい、請求項１７４〜１８４のいずれか１項に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１８９】
前記所定の数の標準偏差が、３の標準偏差である、請求項１８８に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１９０】
前記所定の数の標準偏差が、６の標準偏差である、請求項１８８に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１９１】
光学活性のそれぞれの各インスタンスが、所定の閾値を充たす観察メトリックを有する、請求項１７４〜１９０のいずれか１項に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１９２】
前記観察メトリックが、期間、信号対ノイズ、光子計数、画素フットプリント、または強度を含む、請求項１９１に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１９３】
前記所定の閾値が、
（ｉ）前記ユニークＮな量体配列のそれぞれの残基が前記核酸の前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の中の相補性塩基に結合する結合の第一の形態と、
（ｉｉ）前記ユニークなＮ量体配列と前記各オリゴヌクレオチドプローブが結合して光学活性の前記各インスタンスを形成する前記核酸の前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖の中の配列との間に少なくとも１つのミスマッチがある結合の第二の形態、
を区別する、請求項１９１に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１９４】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブが、それ自体の対応する所定の閾値を有する、請求項１９１または１９３に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１９５】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについて前記所定の閾値が、トレーニングデータセットから誘導される、請求項１９４に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１９６】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについて前記所定の閾値が、前記トレーニングデータセットから誘導され、
前記トレーニングセットが、前記各オリゴヌクレオチドプローブの前記ユニークなＮ量体配列のそれぞれの残基が参照配列中の相補性塩基に結合するように前記参照配列に結合する際の前記各オリゴヌクレオチドプローブについて前記観察メトリックの尺度を、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについて、含む、
請求項１９５に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１９７】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、同じ長さＭであり、
Ｍが、２以上の正の整数であり、かつ
前記テスト基板上の位置の前記複数のセットからの前記核酸の少なくとも一部の前記配列を前記決定すること（ｆ）が、位置の前記複数のセットにより表される前記オリゴヌクレオチドプローブの前記オーバーラップ配列をさらに利用する、
請求項１７４〜１９６のいずれか１項に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１９８】
オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける別のオリゴヌクレオチドプローブとＭ−１配列相同性を共有する、請求項１９７に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項１９９】
前記テスト基板上の位置の前記複数のセットからの前記核酸の少なくとも一部の前記配列を前記決定することが、前記固定された第一の鎖に対応する第一のタイリングパスと前記固定された第二の鎖に対応する第二のタイリングパスとを決定すること含む、請求項１９７に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項２００】
前記第一のタイリングパスにおける断絶が、前記第二のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される、請求項１９９に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項２０１】
前記第一のタイリングパスまたは前記第二のタイリングパス中の断絶が、参照配列を用いて解像される、請求項１９９に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項２０２】
前記第一のタイリングパスまたは前記第二のタイリングパス中の断絶が、前記核酸の別のインスタンスから得られた第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される、請求項１９９に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項２０３】
前記配列の配列割り当てにおける信頼度が、前記第一のタイリングパスおよび前記第二のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される、請求項１９９に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項２０４】
前記配列の配列割り当てにおける信頼度が、前記核酸の別のインスタンスから得られた第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される、請求項１９９に記載のコンピュータ読み取り可能記憶媒体。
【請求項２０５】
核酸をシーケンシングする方法であって、
（ａ）直線化伸長形態での前記核酸をテスト基板上に固定しそれにより固定された伸長核酸を形成させること；
（ｂ）前記固定された伸長核酸をオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露することであって、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、所定の配列および長さであり、前記暴露すること（ｂ）が、前記各オリゴヌクレオチドプローブの前記各プールの個々のプローブを前記各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である前記固定された核酸の一部に対して一過的かつ可逆的に可能にする条件下で起こりそれにより光学活性の各インスタンスを生じる、暴露すること；
（ｃ）二次元イメージャを用いて前記暴露すること（ｂ）の間に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスの前記テスト基板上の場所および期間を測定すること；
（ｄ）前記オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて前記暴露すること（ｂ）および前記測定すること（ｃ）を反復し、それにより前記テスト基板上の位置の複数のセットを得、前記テスト基板上の位置のそれぞれの各セットが、オリゴヌクレオチドプローブの前記セットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応すること；ならびに
（ｅ）前記テスト基板上の位置の前記複数のセットにより表される前記テスト基板上の前記位置をコンパイルすることにより前記テスト基板上の位置の前記複数のセットから前記核酸の少なくとも一部の前記配列を決定すること、
を含む、方法。
【請求項２０６】
前記核酸が、二本鎖核酸でありかつ前記固定された二本鎖核酸を前記テスト基板上で一本鎖形態に変性させそれにより前記核酸の固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を得ることをさらに含み、前記固定された第二の鎖が、前記固定された第一の鎖に相補的である、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０７】
前記核酸が、一本鎖ＲＮＡである、請求項２０５に記載の方法。
【請求項２０８】
核酸を解析する方法であって、
（ａ）二本鎖形態の前記核酸をテスト基板上に固定しそれにより固定された二本鎖核酸を形成させること、
（ｂ）前記固定された二本鎖核酸を前記テスト基板上で一本鎖形態に変性させそれにより前記核酸の固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を得ることであって、前記固定された第二の鎖が、前記固定された第一の鎖に相補的である、変性させること、ならびに
（ｃ）前記固定された第一の鎖および前記固定された第二の鎖を１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブに暴露すること及び前記１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブが前記固定された第一の鎖または前記固定された第二の鎖に結合するかを決定すること、
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、参照により本明細書に組み入れられる、２０１７年１１月２９日出願の表題「Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ ｂｙ Ｅｍｅｒｇｅｎｃｅ」の米国特許出願第６２／５９１，８５０号の優先権を主張するものである。
【０００２】
本開示は一般に、１つまたは複数のポリヌクレオチドへのプローブの一時的結合を介して、核酸をシーケンシングするためのシステムおよび方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景
ＤＮＡシーケンシングは、最初ゲル電気泳動に基づく方法、つまりジデオキシ連鎖停止法（例えば、Ｓａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ.,  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ７４:５４６３−５４６７, １９７７）および化学分解法（例えば、Ｍａｘａｍ ｅｔ ａｌ.,  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ７４:５６０−５６４, １９７７）により現実のものとなった。ヌクレオチドをシーケンシングするこれらの方法は、両者とも時間がかかり高価であった。それにもかかわらず前者は、１０年を超える期間に数億ドルを費やしながら、初めてヒトゲノムのシーケンシングをもたらした。
【０００４】
個人向け医療という夢が実現に近づくにつれ、個々のヒトゲノムをシーケンシングするための安価で大規模な方法の要求が高まっている（Ｍｉｒ，  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｇｅｎｏｍｅｓ: Ｆｒｏｍ Ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌｓ ｔｏ Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ，  Ｂｒｉｅｆｉｎｇｓ ｉｎ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｏｍｉｃｓ，８: ３６７−３７８, ２００９）。ゲル電気泳動を回避する（そして次にはそれほど高価でない）複数のシーケンシング法が、「次世代シーケンシング」として開発された。可逆的ターミネータを用いる１つのそのようなシーケンシング法（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｃ．により実行）が、最も有力である。サンガーシーケンシングの最も発展した形態および現在、最も有力なＩｌｌｕｍｉｎａの技術で用いられる検出方法は、蛍光を含む。単一ヌクレオチド挿入を検出する他の可能な手段は、プロトン放出を利用する検出（例えば、電界効果トランジスタ、ナノポアを通るイオン電流および電子顕微鏡を介して）を含む。Ｉｌｌｕｍｉｎａの化学は、可逆的ターミネータを用いるヌクレオチドの環状付加を含み（Ｃａｎａｒｄ ｅｔ ａｌ., Ｍｅｔｚｋｅｒ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２:４２５９−４２６７, １９９４）、それは蛍光標識を担持する（Ｂｅｎｔｌｅｙ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ ４５６:５３−５９, ２００８）。Ｉｌｌｕｍｉｎａのシーケンシングは、単一ゲノム分子のクローン増幅で出発し、試料の実質的な前処理が、標的ゲノムをライブラリーに変換するために必要とされ、ライブラリーがその後クラスターとしてクローン増幅される。
【０００５】
しかしその後、シーケンシング前の増幅という要件を回避する２つの方法が、市場に届いた。新しい方法は両者とも、単一分子のＤＮＡでの合成による蛍光シーケンシング（ＳｂＳ）を実行する。ＨｅｌｉｃｏｓＢｉｏ（現在のＳｅｑＬＬ）による第一の方法は、可逆的終結を含み段階的ＳｂＳを実行する（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２０:１０６−９, ２００８）。第二の方法であるＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓのＳＭＲＴシーケンシングは、ヌクレオチドを取り込む反応の天然脱離基であるターミナルホスファート上の標識を利用し、これはシーケンシングが連続的に実行されることを可能にし、試薬を交換する必要がない。このアプローチの欠点の１つは、検出器を１つの視野に固定したままにする必要があるため処理能力が低いことである（例えば、Ｌｅｖｅｎｅ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９９:６８２−６８６, ２００３およびＥｉｄ Ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ，３２３:１３３−８, ２００９）。Ｐｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅのシーケンシングと若干類似したアプローチが、光学法によるというよりむしろナノポアを介してＳｂＳを検出することによる、Ｇｅｎｉａ（現在、Ｒｏｃｈｅに所属) により開発中の方法である。
【０００６】
最も一般に用いられるシーケンシング法は、リード長が限定されており、シーケンシングのコストと、得られたリードを組み立てる難易度の両方を上昇させる。サンガーシーケンシングにより得られるリード長は、１０００塩基の範囲である（例えば、Ｋｃｈｏｕｋ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｌ. Ｍｅｄ. ９:３９５, ２０１７）。 Ｒｏｃｈｅ ４５４シーケンシングおよびＩｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔは両者とも、数百塩基範囲のリード長を有する。約２５塩基のリードで最初に出発したＩｌｌｕｍｉｎａのシーケンシングは現在、典型的には１５０〜３００塩基対リードである。しかし、リード長のそれぞれの塩基に新鮮な試薬を供給する必要があるため、２５よりもむしろ２５０塩基のシーケンシングは、１０倍長い時間と１０倍高価な試薬を要求する。近年では、Ｉｌｌｕｍｉｎａの機器の標準的リード長は、おそらくリードが長くなるほどその技術がエラーを招くフェージング（クラスター内の分子が同期化から脱すること）を受けるために、およそ１５０塩基に減少された。
【０００７】
市販のシステムで可能な最長のリード長は、Ｏｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＯＮＴ）のナノポア鎖シーケンシングおよびＰａｃｉｆｉｃ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ（ＰａｃＢｉｏ）のシーケンシング（例えば、Ｋｃｈｏｕｋ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｌ. Ｍｅｄ. ９:３９５, ２０１７）により得られる。後者は、日常的に平均で約１０，０００塩基長のリードを有するが、前者は、非常にまれであるが、数百キロベース長のリードを得ることが可能である（例えば、Ｌａｖｅｒ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｍｏｌ. Ｄｅｔ. Ｑｕａｎｔ. ３:１−８, ２０１５）。これらの長いリード長は、アライメントに関して望ましいが、それらは正確性という代償を払っている。正確性が非常に低いことが多いため、ほとんどのヒトシーケンシングの用途では、これらの方法はＩｌｌｕｍｉｎａシーケンシングの補助として用いることができても、独立型シーケンシング技術として用いることはできない。その上、既存のロングリード技術の処理能力は、日常的なヒトゲノムスケールのシーケンシング用には低すぎる。
【０００８】
ＯＮＴおよびＰａｃＢｉｏシーケンシングの他に、それ自体はシーケンシング技術でないが、Ｉｌｌｕｍｉｎａショートリードシーケンシング技術を補助してロングリードを構築するための足場を提供する試料調製アプローチである、複数のアプローチが存在する。これらのうちの１つが、１０Ｘ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより開発されたドロップレットに基づく技術であり、それは、ドロップレット内の１００〜２００ｋｂ（例えば、抽出後の平均的な断片長範囲）の断片を単離し、それらをより短い長さの断片のライブラリーに処理し、断片のそれぞれが、それらが由来する１００〜２００ｋｂに特異的な配列同定タグを含有し、それは多数のドロップレットからのゲノムのシーケンシングの際に約５０〜２００ｋｂバケットにデコンボルブできる（Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔ. Ｒｅｖ. Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １７:３３３−３５１, ２０１６）。ニッキングエンドヌクレアーゼへの暴露によりＤＮＡを伸長してＤＮＡにニックを導入する別のアプローチが、Ｂｉｏｎａｎｏ Ｇｅｎｏｍｉｃｓにより開発された。その方法は、ニッキングポイントを蛍光的に検出して、分子のマップまたは足場を提供する。現在、この方法は、ゲノムの組み立てを支援するのに充分高い密度を有するように開発されていないが、それでもそれはゲノムの直接視覚化を提供し、大きな構造変異を検出し長い範囲のハプロタイプを決定することができる。
【０００９】
異なるシーケンシング法が開発され、シーケンシングコストを低減する一般的傾向にもかかわらず、ヒトゲノムのサイズは引き続き、患者にとって高いシーケンシングコストをもたらす。個々のヒトゲノムは、４６染色体に組織化され、そのうち最短は約５０メガベース、最長は２５０メガベースである。ＮＧＳシーケンシング法は、解析に要する時間を実質的に増加し得る参照ゲノムへの依存を含む、依然として性能に影響を及ぼす多くの課題を有する（例えば、Ｋｕｌｋａｒｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｏｍｐｕｔ  Ｓｔｒｕｃｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  J. １５:４７１−４７７, ２０１７で議論）。
【００１０】
上記の背景により、当該技術分野で必要とされるのは、試薬使用および時間において効率的であり、正確性を損なうことなく長いハプロタイプ分解リードを提供する、独立型シーケンシング技術を提供するためのデバイス、システムおよび方法である。
【００１１】
背景の節に開示された情報は、一般的背景の理解を進めるためだけのもので、この情報が当業者に既に知られた先行技術を形成するということの認知または何らかの示唆ととらえるべきではない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
概要
本開示は、改善された核酸シーケンシング技術を提供するためのデバイス、システムおよび方法への当該技術分野における要求に取り組む。１つの広範囲の態様において、本開示は、分子の１つまたは複数単位に分子プローブを結合させることにより、複数単位の分子の少なくとも１単位を同定する方法を含む。本開示は、１つまたは複数の種の分子プローブと分子の単一分子相互作用の検出に基づく。幾つかの実施形態において、プローブは、分子の少なくとも１単位に一過的に結合する。幾つかの実施形態において、プローブは、分子の少なくとも１単位に反復的に結合する。幾つかの実施形態において、分子の実体は、高分子、表面またはマトリックス上でナノメートルの正確度で位置特定される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様において、本明細書で開示されるのは、核酸をシーケンシングする方法である。方法は、（ａ）二本鎖直線化伸長形態の核酸をテスト基板上に固定し、それにより固定された伸長二本鎖核酸を形成すること、を含む。方法は、（ｂ）固定された伸長二本鎖核酸をテスト基板上で一本鎖形態に変性させ、それにより核酸の固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を得て、そこでは固定された第二の鎖の各塩基が、固定された第一の鎖の対応する相補性塩基に隣接して置かれることをさらに含む。方法は、（ｃ）固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露し、ここでオリゴヌクレオチドプローブのセット内のそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが、所定の配列および長さであること、に続く。暴露（ｃ）は、各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを、各オリゴヌクレオチドプローブに相補的な固定された第一の鎖または固定された第二の鎖のそれぞれの一部と結合させかつ各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こり、それにより光学活性の各インスタンス（ｉｎｓｔａｎｃｅ）を生じる。方法は、（ｄ）二次元イメージャを用いて暴露（ｃ）する間に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスのテスト基板上の場所および期間を測定すること、に続く。その後、方法は、（ｅ）オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて暴露（ｃ）および測定（ｄ）を反復し、それによりテスト基板上の位置の複数のセットを得ること、に進む。テスト基板上の位置のそれぞれの各セットは、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応する。方法は、（ｆ）位置の複数のセットにより表されるテスト基板上の位置をコンパイルすることにより、テスト基板上の位置の複数のセットから核酸の少なくとも一部の配列を決定すること、をさらに含む。
【００１４】
幾つかの実施形態において、暴露（ｃ）は、各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを、個々のプローブに相補的な固定された第一の鎖または固定された第二の鎖のそれぞれの一部と一過的かつ可逆的に結合させ各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こり、それにより光学活性のインスタンスを生じる。幾つかの実施形態において、暴露（ｃ）は、各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを反復的に、個々のプローブに相補的な固定された第一の鎖または固定された第二の鎖のそれぞれの一部と一過的かつ可逆的に結合させ各ヘテロデュプレックスを形成させる条件下で起こり、それにより反復的に光学活性の各インスタンスを生じる。幾つかのそのような実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、標識（例えば、色素、蛍光ナノ粒子、または光散乱粒子）と結合される。
【００１５】
幾つかの実施形態において、請求項１の方法である暴露は、インターカレーティング色素の形態の第一の標識の存在下であり、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、第二の標識と結合されており、第一の標識および第二の標識は、オーバーラップするドナー発光スペクトルおよびアクセプター励起スペクトルを有し、それは第一の標識と第二の標識が互いに接近している時には第一の標識および第二の標識の一方を蛍光発光させ、光学活性の各インスタンスは、第二の標識へ、オリゴヌクレオチドと固定された第一の鎖または固定された第二の鎖との間の各ヘテロデュプレックスをインターカレートする、インターカレーティング色素の付近に由来する。
【００１６】
幾つかの実施形態において、暴露は、インターカレーティング色素の形態の第一の標識の存在下であり、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、第二の標識と結合されており、第一の標識は、第一の標識と第二の標識が互いに接近している時には第二の標識を蛍光発光させ、光学活性の各インスタンスは、第二の標識へ、オリゴヌクレオチドと固定された第一の鎖または固定された第二の鎖との間の各ヘテロデュプレックスをインターカレートする、インターカレーティング色素の付近に由来する。
【００１７】
幾つかの実施形態において、暴露は、インターカレーティング色素の形態の第一の標識の存在下であり、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、第二の標識と結合されており、第二の標識は、第一の標識と第二の標識が互いに接近している時には第一の標識を蛍光発光させ、光学活性の各インスタンスは、第二の標識へ、オリゴヌクレオチドと固定された第一の鎖または固定された第二の鎖との間の各ヘテロデュプレックスをインターカレートする、インターカレーティング色素の付近に由来する。
【００１８】
幾つかの実施形態において、暴露は、インターカレーティング色素の存在下であり、光学活性の各インスタンスは、オリゴヌクレオチドと固定された第一の鎖または固定された第二の鎖との間の各ヘテロデュプレックスをインターカレートするインターカレーティング色素の蛍光に由来する。そのような実施形態において、光学活性の各インスタンスは、各ヘテロデュプレックスをインターカレートする前のインターカレーティング色素の蛍光よりも大きい。
【００１９】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける１つより多くのオリゴヌクレオチドプローブが、暴露（ｃ）の単一インスタンスの間に固定された第一の鎖および固定された第二の鎖に暴露され、暴露（ｃ）の単一インスタンスの間に固定された第一の鎖および固定された第二の鎖に暴露されるオリゴヌクレオチドプローブのセットのそれぞれ異なるオリゴヌクレオチドプローブは、異なる標識と会合される。幾つかのそのような実施形態において、第一のオリゴヌクレオチドプローブが第一の標識と会合される、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおいて第一のプールは、暴露（ｃ）の単一インスタンスの間に固定された第一の鎖および固定された第二の鎖に暴露され、第二のオリゴヌクレオチドプローブが第二の標識と会合される、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおいて第二のプールは、暴露（ｃ）の単一インスタンスの間に固定された第一の鎖および固定された第二の鎖に暴露され、第一の標識と第二の標識は、異なる。あるいは、第一のオリゴヌクレオチドプローブが第一の標識と会合される、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおいて第一のプールは、暴露（ｃ）の単一インスタンスの間に固定された第一の鎖および固定された第二の鎖に暴露され、第二のオリゴヌクレオチドプローブが第二の標識と会合される、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおいて第二のプールは、暴露（ｃ）の単一インスタンスの間に固定された第一の鎖および固定された第二の鎖に暴露され、第三のオリゴヌクレオチドプローブが第三の標識と会合される、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおいて第三のプールは、暴露（ｃ）の単一インスタンスの間に固定された第一の鎖および固定された第二の鎖に暴露され、第一の標識と第二の標識と第三の標識は、それぞれ異なる。
【００２０】
幾つかの実施形態において、反復（ｅ）、暴露（ｃ）および測定（ｄ）はそれぞれ、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれの単一オリゴヌクレオチドプローブについて実施される。
【００２１】
幾つかの実施形態において、暴露（ｃ）は、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブのために第一の温度で実施され、反復（ｅ）、暴露（ｃ）および測定（ｄ）は、第一のオリゴヌクレオチドのための暴露（ｃ）および測定（ｄ）を第二の温度で実施することを含む。
【００２２】
幾つかの実施形態において、暴露（ｃ）は、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブのために第一の温度で実施され、反復（ｅ）、暴露（ｃ）および測定（ｄ）のインスタンスは、第一のオリゴヌクレオチドのための暴露（ｃ）および測定（ｄ）を複数の異なる温度のそれぞれで実施することを含み、方法は、第一の温度および複数の異なる温度のそれぞれの温度のための測定（ｄ）により記録された光学活性の測定された場所および期間を用いて、第一のオリゴヌクレオチドプローブのための溶融曲線を構築することをさらに含む。
【００２３】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットは、オリゴヌクレオチドプローブの複数のサブセットを含み、反復（ｅ）、暴露（ｃ）および測定（ｄ）は、オリゴヌクレオチドプローブの複数のサブセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの各サブセットのために実施される。幾つかのそのような実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの各サブセットは、オリゴヌクレオチドプローブのセットと異なる２つ以上のプローブを含む。あるいはオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの各サブセットは、オリゴヌクレオチドプローブのセットと異なる４つ以上のプローブを含む。幾つかのそのような実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットは、オリゴヌクレオチドプローブの４つのサブセットからなる。幾つかの実施形態において、方法は、オリゴヌクレオチドプローブのセットを、計算されたまたは実験で誘導された各オリゴヌクレオチドプローブの溶融温度を基にして、オリゴヌクレオチドプローブの複数のサブセットに分割することをさらに含み、ここで類似の溶融温度を有するオリゴヌクレオチドプローブを、分割によりオリゴヌクレオチドプローブの同じサブセットに入れ、暴露（ｃ）のインスタンスの温度または期間を、オリゴヌクレオチドプローブの対応するサブセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの平均溶融温度により決定する。さらになお、幾つかの実施形態において、方法は、オリゴヌクレオチドプローブのセットを、各オリゴヌクレオチドプローブの配列に基づき、オリゴヌクレオチドプローブの複数のサブセットに分割することをさらに含み、ここでオーバーラップする配列を有するオリゴヌクレオチドプローブを、異なるサブセットに入れる。
【００２４】
幾つかの実施形態において、テスト基板上の場所の測定は、あてはめ関数で光学活性の各インスタンスを同定し適合させて、二次元イメージャにより得られたデータのフレーム中で光学活性の各インスタンスの中心を同定し適合させることを含み、光学活性の各インスタンスの中心は、テスト基板上の光学活性の各インスタンスの位置であると見なされる。幾つかのそのような実施形態において、あてはめ関数は、ガウス関数、第一モーメント関数（ｆｉｒｓｔ ｍｏｍｅｎｔ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）、勾配に基づくアプローチ、またはフーリエ変換である。
【００２５】
幾つかの実施形態において、光学活性の各インスタンスは、二次元イメージャにより測定される複数のフレームにわたり持続しており、テスト基板上の場所の測定は、複数のフレームにわたりあてはめ関数により光学活性の各インスタンスを同定し適合させて、複数のフレームにわたり光学活性の各インスタンスの中心を同定することを含み、光学活性の各インスタンスの中心は、複数のフレームにわたるテスト基板上の光学活性の各インスタンスの位置であると見なされる。幾つかのそのような実施形態において、あてはめ関数は、ガウス関数、第一モーメント関数、勾配に基づくアプローチ、またはフーリエ変換である。
【００２６】
幾つかの実施形態において、テスト基板上の場所の測定は、二次元イメージャにより測定されたデータのフレームをトレーニングされた畳み込みニューラルネットワークに入力することを含み、データのフレームは、光学活性の複数のインスタンスの中の光学活性の各インスタンスを含み、光学活性の複数のインスタンスにおける光学活性のそれぞれのインスタンスは、固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の一部に結合する個々のプローブに対応し、入力に応答して、トレーニングされた畳み込みニューラルネットワークは、光学活性の複数のインスタンスにおける光学活性の１つまたは複数のインスタンスのそれぞれのテスト基板上の位置を同定する。
【００２７】
幾つかの実施形態において、測定は、光学活性の各インスタンスの中心をテスト基板上の位置に、少なくとも２０ｎｍ、少なくとも２ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、または少なくとも６ｎｍの位置特定精度で解像する。
【００２８】
幾つかの実施形態において、測定は、光学活性の各インスタンスの中心をテスト基板上の位置に解像し、その位置は、サブ回折限界の位置である。
【００２９】
幾つかの実施形態において、光学活性の各インスタンスのテスト基板上の場所および期間の測定（ｄ）は、その場所で５０００光子を超えて、その場所で５００００光子を超えて、またはその場合で２００，０００光子を超えて測定する。
【００３０】
幾つかの実施形態において、光学活性の各インスタンスは、テスト基板で観察されたバックグランドを上回る、所定の数より大きな標準偏差（例えば、３、４、５、６、７、８、９、または１０より大きな標準偏差）である。
【００３１】
幾つかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドプローブにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブは、ユニークなＮ量体配列を含み、ここでＮは、セット｛１、２、３、４、５、６、７、８、および９｝中の整数であり、長さＮの全てのユニークなＮ量体配列は、複数のオリゴヌクレオチドプローブにより表される。幾つかのそのような実施形態において、ユニークなＮ量体配列は、１つまたは複数の縮重ヌクレオチドにより占有される１つまたは複数のヌクレオチド位置を含む。幾つかのそのような実施形態において、１つまたは複数のヌクレオチド位置におけるそれぞれの縮重ヌクレオチド位置は、ユニバーサル塩基（例えば、２’−デオキシイノシン）により占有される。幾つかのそのような実施形態において、ユニークなＮ量体配列は、単一の縮重ヌクレオチド位置が５’側に隣接し、単一の縮重ヌクレオチド位置が３’側に隣接する。あるいは５’側の単一縮重ヌクレオチドおよび３’側の単一縮重ヌクレオチドは、それぞれ２’−デオキシイノシンである。
【００３２】
幾つかの実施形態において、核酸は、少なくとも１４０塩基長であり、決定（ｆ）は、７０%を超える核酸配列の配列のカバー率を決定する。幾つかの実施形態において、核酸は、少なくとも１４０塩基長であり、決定（ｆ）は、９０%を超える核酸配列の配列のカバー率を決定する。幾つかの実施形態において、核酸は、少なくとも１４０塩基長であり、決定（ｆ）は、９９%を超える核酸配列の配列のカバー率を決定する。幾つかの実施形態において、決定（ｆ）は、９９%を超える核酸配列の配列のカバー率を決定する。
【００３３】
幾つかの実施形態において、核酸は、少なくとも１０，０００塩基長または少なくとも１，０００，０００塩基長である。
【００３４】
幾つかの実施形態において、テスト基板は、暴露（ｃ）および測定（ｄ）を反復する前に洗浄され、それによりオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける別のオリゴヌクレオチドプローブにテスト基板を暴露する前に、テスト基板から各オリゴヌクレオチドプローブを除去する。
【００３５】
幾つかの実施形態において、固定（ａ）は、分子コーミング（後退メニスカス（ｒｅｃｅｄｉｎｇ ｍｅｎｉｓｃｕｓ））、フローストレッチングナノコンファインメント、またはエレクトロストレッチングにより、核酸をテスト基板に塗布することを含む。
【００３６】
幾つかの実施形態において、光学活性のそれぞれの各インスタンスは、所定の閾値を充たす観察メトリックを有する。幾つかのそのような実施形態において、観察メトリックは、期間、信号対ノイズ、光子計数、または強度を含む。幾つかの実施形態において、所定の閾値は、（ｉ）ユニークなＮ量体配列のそれぞれの残基が核酸の固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の中の相補性塩基に結合する、結合の第一の形態と、（ｉｉ）ユニークなＮ量体配列と、各オリゴヌクレオチドプローブが結合して光学活性の各インスタンスを形成する核酸の固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の中の配列と、の間に少なくとも１つのミスマッチが存在する、結合の第二の形態、を区別する。
【００３７】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブは、それ自体の対応する所定の閾値を有する。幾つかのそのような実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブのための所定の閾値は、トレーニングデータセットから誘導される。例えば幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブのための所定の閾値は、トレーニングデータセットから誘導され、トレーニングセットは、各オリゴヌクレオチドプローブのユニークなＮ量体配列のそれぞれの残基が参照配列中の相補性塩基に結合するように、参照配列に結合した際の各オリゴヌクレオチドプローブについて観察メトリックの尺度を、オリゴヌクレオチドプローブのセット中のそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブについて、含む。幾つかのそのような実施形態において、参照配列は、参照基板上に固定される。あるいは参照配列は、核酸と共に含まれ、テスト基板上に固定される。幾つかの実施形態において、参照配列は、ＰｈｉＸ１７４、 Ｍ１３、ラムダファージ、Ｔ７ファージ、または大腸菌、出芽酵母、もしくは分裂酵母のゲノムの全てまたは一部を含む。幾つかの実施形態において、参照配列は、既知の配列の合成構築物である。幾つかの実施形態において、参照配列は、ウサギグロビンＲＮＡの全てまたは一部を含む。
【００３８】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブは、固定された第一の鎖の相補性部分に結合することによる光学活性の第一のインスタンスと、固定された第二の鎖の相補性部分に結合することによる光学活性の第二のインスタンス、を生じる。
【００３９】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブは、固定された第一の鎖の２つ以上の相補性部分に結合することによる光学活性の２つ以上の第一のインスタンスと、固定された第二の鎖の２つ以上の相補性部分に結合することによる光学活性の２つ以上の第二のインスタンス、を生じる。
【００４０】
幾つかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドプローブは、暴露（ｃ）の間に各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の一部に３回以上結合し、それにより光学活性の３つ以上のインスタンスが得られ、光学活性のそれぞれのインスタンスが、複数の結合事象における１つの結合事象を表す。
【００４１】
幾つかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドプローブは、暴露（ｃ）の間に各オリゴヌクレオチドプローブに相補的な固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の一部に５回以上結合し、それにより光学活性の５つ以上のインスタンスが得られ、光学活性のそれぞれのインスタンスが、複数の結合事象における１つの結合事象を表す。
【００４２】
幾つかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドプローブは、暴露（ｃ）の間に各オリゴヌクレオチドプローブに相補的な固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の一部に１０回以上結合し、それにより光学活性の１０以上のインスタンスが得られ、光学活性のそれぞれのインスタンスが、複数の結合事象における１つの結合事象を表す。
【００４３】
幾つかの実施形態において、暴露（ｃ）は、５分以下の間、２分以下の間、または１分以下の間起こる。
【００４４】
幾つかの実施形態において、暴露（ｃ）は、二次元イメージャの１つもしくは複数のフレーム、二次元イメージャの２つ以上のフレーム、二次元イメージャの５００以上のフレームにわたり、または二次元イメージャの５０００以上のフレームにわたり起こる。
【００４５】
幾つかの実施形態において、暴露（ｃ）は、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブのために第一の期間実施され、反復（ｅ）、暴露（ｃ）および測定（ｄ）は、第二のオリゴヌクレオチドのための暴露（ｃ）を第二の期間実施することを含み、第一の期間は、第二の期間より大きい。
【００４６】
幾つかの実施形態において、暴露（ｃ）は、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブのために二次元イメージャの第一のフレーム数について実施され、反復（ｅ）、暴露（ｃ）および測定（ｄ）は、二次元イメージャの第二のフレーム数について第二のオリゴヌクレオチドのために暴露（ｃ）を実施することを含み、第一のフレーム数は、第二のフレーム数より大きい。
【００４７】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、同じ長さである。
【００４８】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、同じ長さＭであり、Ｍは、２以上の正の整数であり（例えば、Ｍは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１０より大きい）、テスト基板上の位置の複数のセットからの核酸の少なくとも一部の配列の決定（ｆ）は、位置の複数のセットにより表されるオリゴヌクレオチドプローブのオーバーラップ配列をさらに利用する。幾つかのそのような実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける別のオリゴヌクレオチドプローブとＭ−１配列相同性を共有する。幾つかのそのような実施形態において、テスト基板上の位置の複数のセットからの核酸の少なくとも一部の配列を決定することは、固定された第一の鎖に対応する第一のタイリングパスと、固定された第二の鎖に対応する第二のタイリングパス、を決定すること含む。幾つかのそのような実施形態において、第一のタイリングパスの断絶（ｂｒｅａｋ）は、第二のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される。あるいは第一のタイリングパスまたは第二のタイリングパスの断絶は、参照配列を用いて解像される。あるいは第一のタイリングパスまたは第二のタイリングパスの断絶は、核酸の別のインスタンスから得られた第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される。幾つかのそのような実施形態において、配列の配列割り当てにおける信頼度は、第一のタイリングパスおよび第二のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される。あるいは配列の配列割り当てにおける信頼度は、核酸の別のインスタンスから得られた第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される。
【００４９】
幾つかの実施形態において、暴露（ｃ）のインスタンスの時間の長さは、暴露（ｃ）のインスタンスで用いられるオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの推定溶融温度により決定される。
【００５０】
幾つかの実施形態において、方法は、（ｆ）固定された二本鎖または固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を抗体、アフィマー、ナノモディ、アプタマー、またはメチル結合タンパク質に暴露し、それによりテスト基板上の位置の複数のセットからの核酸への修飾を決定すること、または核酸の一部の配列と相関させること、をさらに含む。
【００５１】
幾つかの実施形態において、テスト基板は、二次元表面である。幾つかのそのような実施形態において、二次元表面は、ゲルまたはマトリックスでコーティングされる。
【００５２】
幾つかの実施形態において、テスト基板は、細胞、三次元マトリックスまたはゲルである。
【００５３】
幾つかの実施形態において、テスト基板は、固定（ａ）の前に配列特異性オリゴヌクレオチドプローブと結合され、固定（ａ）は、テスト基板に結合された配列特異性オリゴヌクレオチドプローブを用いてテスト基板上で核酸を捕捉することを含む。
【００５４】
幾つかの実施形態において、核酸は、追加的な複数の細胞成分を含む溶液中にあり、固定（ａ）または変性（ｂ）は、核酸がテスト基板上に固定された後および暴露（ｃ）の前にテスト基板を洗浄すること、それにより追加的な複数の細胞成分を核酸から離して精製することをさらに含む。
【００５５】
幾つかの実施形態において、テスト基板は、暴露（ｃ）の前に、ポリエチレングリコール、ウシ血清アルブミン−ビオチン−ストレプトアビジン、カゼイン、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、１種もしくは複数の異なるｔＲＮＡ、１種もしくは複数の異なるデオキシリボヌクレオチド、１種もしくは複数の異なるリボヌクレオチド、サケ精子ＤＮＡ、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ Ｆ−１２７、Ｔｗｅｅｎ−２０、水素シルセスキオキサン（ＨＳＱ）、またはそれらの任意の組み合わせでパシベートされる（ｐａｓｓｉｖｉｚｅｄ）。
【００５６】
幾つかの実施形態において、テスト基板は、固定（ａ）の前に、７−オクテニルトリクロロシランを含むビニルシランコーティングでコーティングされる。
【００５７】
本開示の別の態様は、核酸をシーケンシングする方法であって、（ａ）直線化伸長形態で上記核酸をテスト基板上に固定し、それにより固定された伸長核酸を形成すること、（ｂ）固定された伸長核酸をオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露し、そこでオリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブが所定の配列および長さであり、暴露（ｂ）が、各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブを可能にする条件下で、各オリゴヌクレオチドプローブに相補的な固定された核酸のそれぞれの部分に対して一過的かつ可逆的に起こり、それにより光学活性の各インスタンスを生じること、（ｃ）二次元イメージャを用いて暴露（ｂ）の間に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスのテスト基板上の場所および期間を測定すること、（ｄ）オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて暴露（ｂ）および測定（ｃ）を反復し、それによりテスト基板上の位置の複数のセットを得て、テスト基板上の位置のそれぞれの各セットが、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応すること、ならびに（ｅ）位置の複数のセットにより表されるテスト基板上の位置をコンパイルすることにより、テスト基板上の位置の複数のセットから核酸の少なくとも一部の配列を決定すること、を含む、方法を提供する。幾つかのそのような実施形態において、核酸は、二本鎖核酸であり、方法は、固定された二本鎖核酸をテスト基板上で一本鎖形態に変性させ、それにより核酸の固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を得ることをさらに含み、ここで固定された第二の鎖は固定された第一の鎖に相補的である。幾つかの実施形態において、核酸は、一本鎖ＲＮＡである。
【００５８】
本開示の別の態様は、核酸を解析する方法であって、（ａ）テスト基板上で核酸を二本鎖形態で固定し、それにより固定された二本鎖核酸を形成すること、（ｂ）固定された二本鎖核酸をテスト基板上で一本鎖形態に変性させ、それにより核酸の固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を得、固定された第二の鎖が固定された第一の鎖に相補的であること、ならびに（ｃ）固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブに暴露して、１つまたは複数のオリゴヌクレオチドプローブが固定された第一の鎖に結合するか、または固定された第二の鎖に結合するかを決定すること、を含む、方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１Ａ】本開示の様々な実施形態により、結合事象に参加する複数のプローブを含むポリマーと、結合事象の位置特定および配列同定に関係する情報を回収および記憶し、その後さらに解析を実施してポリマー配列を決定するコンピュータ記憶媒体とを含む、例示的システムトポロジーを集合的に示す。
【図１Ｂ】本開示の様々な実施形態により、結合事象に参加する複数のプローブを含むポリマーと、結合事象の位置特定および配列同定に関係する情報を回収および記憶し、その後、さらに解析を実施してポリマー配列を決定するコンピュータ記憶媒体とを含む、例示的システムトポロジーを集合的に示す。
【図２Ａ】本開示の様々な実施形態により、標的ポリマーの配列および／または構造の特徴を決定するための方法の工程および特色のフローチャートを集合的に提供する。
【図２Ｂ】本開示の様々な実施形態により、標的ポリマーの配列および／または構造の特徴を決定するための方法の工程および特色のフローチャートを集合的に提供する。
【図３】本開示の様々な実施形態により、標的ポリマーの配列および／または構造の特徴を決定するための追加的方法の工程および特色のフローチャートを提供する。
【図４】本開示の様々な実施形態により、標的ポリマーの配列および／または構造の特徴を決定するための追加的方法の工程および特色のフローチャートを提供する。
【図５Ａ】本開示の様々な実施形態により、ポリヌクレオチドへのプローブの一過性結合の例を集合的に示す。
【図５Ｂ】本開示の様々な実施形態により、ポリヌクレオチドへのプローブの一過性結合の例を集合的に示す。
【図５Ｃ】本開示の様々な実施形態により、ポリヌクレオチドへのプローブの一過性結合の例を集合的に示す。
【図６Ａ】本開示の様々な実施形態により、標的ポリヌクレオチドに結合する長さの異なるｋ量体のプローブの例を集合的に示す。
【図６Ｂ】本開示の様々な実施形態により、標的ポリヌクレオチドに結合する長さの異なるｋ量体のプローブの例を集合的に示す。
【図７Ａ】本開示の様々な実施形態により、オリゴヌクレオチドセットの連続周期を有する参照オリゴを用いる例を集合的に示す。
【図７Ｂ】本開示の様々な実施形態により、オリゴヌクレオチドセットの連続周期を有する参照オリゴを用いる例を集合的に示す。
【図７Ｃ】本開示の様々な実施形態により、オリゴヌクレオチドセットの連続周期を有する参照オリゴを用いる例を集合的に示す。
【図８Ａ】本開示の様々な実施形態により、異なるプローブのセットを単一参照分子に当てはめる例を集合的に示す。
【図８Ｂ】本開示の様々な実施形態により、異なるプローブのセットを単一参照分子に当てはめる例を集合的に示す。
【図８Ｃ】本開示の様々な実施形態により、異なるプローブのセットを単一参照分子に当てはめる例を集合的に示す。
【図９Ａ】本開示の様々な実施形態により、複数のタイプのプローブが用いられる場合の一過的結合の例を集合的に示す。
【図９Ｂ】本開示の様々な実施形態により、複数のタイプのプローブが用いられる場合の一過的結合の例を集合的に示す。
【図９Ｃ】本開示の様々な実施形態により、複数のタイプのプローブが用いられる場合の一過的結合の例を集合的に示す。
【図１０Ａ】本開示の様々な実施形態により、収集された一過的結合事象の数が、実現され得るプローブの位置特定の度合いと相関する例を集合的に示す。
【図１０Ｂ】本開示の様々な実施形態により、収集された一過的結合事象の数が、実現され得るプローブの位置特定の度合いと相関する例を集合的に示す。
【図１１Ａ】本開示の様々な実施形態により、プローブをタイリングする例を集合的に示す。
【図１１Ｂ】本開示の様々な実施形態により、プローブをタイリングする例を集合的に示す。
【図１２Ａ】本開示の様々な実施形態により、直接標識されたプローブの一過的結合の例を集合的に示す。
【図１２Ｂ】本開示の様々な実施形態により、直接標識されたプローブの一過的結合の例を集合的に示す。
【図１２Ｃ】本開示の様々な実施形態により、直接標識されたプローブの一過的結合の例を集合的に示す。
【図１３Ａ】本開示の様々な実施形態により、インターカレーティング色素の存在下での一過的プローブ結合の例を集合的に示す。
【図１３Ｂ】本開示の様々な実施形態により、インターカレーティング色素の存在下での一過的プローブ結合の例を集合的に示す。
【図１３Ｃ】本開示の様々な実施形態により、インターカレーティング色素の存在下での一過的プローブ結合の例を集合的に示す。
【図１４Ａ】本開示の様々な実施形態により、異なるプローブ標識技術の例を集合的に示す。
【図１４Ｂ】本開示の様々な実施形態により、異なるプローブ標識技術の例を集合的に示す。
【図１４Ｃ】本開示の様々な実施形態により、異なるプローブ標識技術の例を集合的に示す。
【図１４Ｄ】本開示の様々な実施形態により、異なるプローブ標識技術の例を集合的に示す。
【図１４Ｅ】本開示の様々な実施形態により、異なるプローブ標識技術の例を集合的に示す。
【図１５】本開示の様々な実施形態により、変性され精査された二本鎖ＤＮＡ上のプローブの一過的結合の例を集合的に示す。
【図１６Ａ】本開示の様々な実施形態により、細胞溶解ならびに核酸の固定および伸長の例を集合的に示す。
【図１６Ｂ】本開示の様々な実施形態により、細胞溶解ならびに核酸の固定および伸長の例を集合的に示す。
【図１７】本開示の様々な実施形態により、単一細胞を捕捉し、場合により細胞からの核酸の抽出、延長およびシーケンシングを提供する、例示的マイクロ流体構造を示す。
【図１８】本開示の様々な実施形態により、異なるＩＤタグを個々の細胞に提供する例示的マイクロ流体構造を示す。
【図１９】本開示の様々な実施形態により、個々の細胞からのポリヌクレオチドをシーケンシングする例を示す。
【図２０Ａ】本開示の様々な実施形態により、一過的プローブ結合の撮像を実施するための例示的デバイスレイアウトを集合的に示す。
【図２０Ｂ】本開示の様々な実施形態により、一過的プローブ結合の撮像を実施するための例示的デバイスレイアウトを集合的に示す。
【図２１】本開示の様々な実施形態により、エアギャプにより分離された試薬を含有する例示的キャピラリーチュービングを示す。
【図２２Ａ】本開示の様々な実施形態により、蛍光の例を集合的に示す。
【図２２Ｂ】本開示の様々な実施形態により、蛍光の例を集合的に示す。
【図２２Ｃ】本開示の様々な実施形態により、蛍光の例を集合的に示す。
【図２２Ｄ】本開示の様々な実施形態により、蛍光の例を集合的に示す。
【図２２Ｅ】本開示の様々な実施形態により、蛍光の例を集合的に示す。
【図２３Ａ】本開示の様々な実施形態により、蛍光の例を集合的に示す。
【図２３Ｂ】本開示の様々な実施形態により、蛍光の例を集合的に示す。
【図２３Ｃ】本開示の様々な実施形態により、蛍光の例を集合的に示す。
【図２４】本開示の様々な実施形態により、合成された変性二本鎖ＤＮＡ上の一過的結合を示す。
【発明を実施するための形態】
【００６０】
詳細な記載
ここで、実施形態を詳細に参照するが、その実施例は、添付の図面に示されている。以下の詳細な記載において、本開示の徹底した理解をもたらすために、数多くの具体的詳細が示されている。しかし、本開示がこれらの具体的詳細を用いずに実践され得ることは、当業者に明白であろう。他の例において、周知の方法、手順、構成物、回路、およびネットワークは、実施形態の態様を無駄にあいまいにしないよう、詳細に記載されていない。
【００６１】
定義
本開示で用いられる用語法は、特定の実施形態を記載することのみを目的としており、本発明の限定を意図するものではない。明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる単数形の「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈で他に明確に示されない限り、複数形も含むものとする。本明細書で用いられる用語「および／または」が、関連して列挙された用語の１つまたは複数のあらゆる可能な組み合わせを指し、それを包含することも理解されよう。用語「包含する」および／または「含んでいる」は、本明細書で用いられる場合、述べられた特色、整数、ステップ、操作、要素および／または構成物の存在を明記するが、それらの１つまたは複数の他の特色、整数、ステップ、操作、要素、構成物、および／または群の存在または付加を排除しないことが、さらに理解されよう。
【００６２】
本明細書で用いられる用語「もし」は、文脈に応じて、「である場合」または「の際」または「決定に応答して」または「検出に応答して」を意味すると解釈されてもよい。同様に語句「決定されれば」または「［述べられた条件または事象が］検出されれば」は、文脈に応じて、「決定の際に」または「決定に応答して」または「［述べられた条件または事象の］検出の際に」または「［述べられた条件または事象の］検出に応答して」を意味すると解釈されてもよい。
【００６３】
用語「または」は、排他的な「または」というよりむしろ包括的な「または」を意味するものとする。即ち、他に明記されない限り、または文脈から明白な通り、語句「ＸはＡまたはＢを用いる」は、自然な包括的並べ替えのいずれかを意味するものとする。即ち語句「ＸはＡまたはＢを用いる」は、以下の例のいずれかに適合される：ＸはＡを用いる；ＸはＢを用いる；またはＸはＡとＢの両方を用いる。加えて、本出願および添付の特許請求の範囲で用いられる冠詞「ａ」および「ａｎ」は、一般に、他に明記されない限りまたは単数形に向けられる文脈から明白な通り、「１つまたは複数」を意味すると解釈されなければならない。
【００６４】
第一、第二などの用語は、様々な要素を記載するために本明細書で用いられ得るが、これらの要素が、これらの用語により限定されるべきでないこともまた、理解されよう。これらの用語は、１つの要素を他と区別するため用いられるに過ぎない。例えば、本開示の範囲を逸脱することなく、第一のフィルターは、第二のフィルターと称することができ、同様に第二のフィルターは、第一のフィルターと称することができる。第一のフィルターおよび第二のフィルターは、両者ともフィルターであるが、それらは同じフィルターではない。
【００６５】
本明細書で用いられる用語「約」または「およそ」は、当業者により決定される特有の値のための許容され得る誤差範囲を意味してよく、それは値がどのようにして測定または決定されるか、例えば測定システムの限界に部分的に依存し得る。例えば「約」は、当該技術分野での１実践あたり１以内または１を超える標準偏差を意味し得る。「約」は、所定の値の±２０％、±１０％、±５％、または±１％の範囲を意味し得る。用語「約」または「およそ」は、値の１０倍以内、５倍以内または２倍以内を意味し得る。特有の値が、本出願および特許請求の範囲で記載される場合、他に断りがなければ、特有の値のための許容され得る誤差範囲を意味する用語「約」が、推測されなければならない。用語「約」は、当業者により一般に理解される意味を有し得る。用語「約」は、±１０％を指し得る。用語「約」は、±５％を指し得る。
【００６６】
本明細書で用いられる用語「核酸」、「核酸分子」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に用いられる。これらの用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ、例えば相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）など）、リボ核酸（ＲＮＡ，例えばメッセンジャーＲＮＡ（ｍｅｓｓａｇｅ  ＲＮＡ）（ｍＲＮＡ）、低分子阻害ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、胎児または胎盤により高度に発現されるＲＮＡなど）、および／またはＤＮＡもしくはＲＮＡ類似体（例えば、塩基類似体、糖類似体および／または非ネイティブバックボーンなどを含有する）、ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド、ならびにポリアミド核酸（ＰＮＡ）などの任意の組成形態の核酸を指し、それらの全てが、一本鎖または二本鎖形態であり得る。他に限定されない限り、核酸は、天然ヌクレオチドの既知の類似体を含んでよく、その幾つかは、天然由来ヌクレオチドと類似の様式で機能し得る。核酸は、本明細書の工程を実行するのに有用な任意の形態（例えば、直鎖状、環状、スーパーコイル、一本鎖、二本鎖など）であり得る。幾つかの例において、核酸は、特定の実施形態においてインビトロでまたは宿主細胞、細胞、細胞核もしくは細胞の細胞質において複製し得るあるいは複製され得る、プラスミド、ファージ、自律複製配列（ＡＲＳ）、セントロメア、人工染色体、染色体、または他の核酸である、またはそれらに由来する。幾つかの実施形態における核酸は、単一染色体またはその断片に由来し得る（例えば、二倍体の生物体から得られた試料の一つの染色体由来の核酸試料）。核酸分子は、天然ポリヌクレオチド（例えば、長い非コード（ｌｎｃ）ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、染色体、ミトコンドリアＤＮＡまたはポリヌクレオチド断片）の全長を含み得る。ポリヌクレオチド断片は、少なくとも２００塩基長、好ましくは少なくとも数千ヌクレオチド長でなければならない。より好ましくはゲノムＤＮＡの場合、ポリヌクレオチド断片は、数百キロベース〜数メガベース長であろう。
【００６７】
特定の実施形態において、核酸は、ヌクレオソーム、ヌクレオソームの断片もしくは部分、またはヌクレオソーム様構造を含む。核酸は時には、タンパク質（例えば、ヒストン、ＤＮＡ結合タンパク質など）を含む。本明細書に記載された工程により解析された核酸は時には、実質的に単離され、タンパク質または他の分子と実質的に会合されない。核酸はまた、一本鎖（「センス」または「アンチセンス」、「プラス」鎖または「−」鎖、「フォワード」リーディングフレームまたは「リバース」リーディングフレーム）および二本鎖ポリヌクレオチドから合成、複製または増幅されたＲＮＡまたはＤＮＡの誘導体、変異体および類似体を包含する。デオキシヌクレオチドは、デオキシアデノシン、デオキシシチジン、デオキシグアノシンおよびデオキシチミジンを包含する。ＲＮＡの場合、塩基シトシンは、ウラシルに置き換えられ、糖の２’位は、ヒドロキシル部分を含む。幾つかの実施形態において、核酸は、対象から得られた核酸を鋳型として用いて調製される。
【００６８】
本明細書で用いられる用語「終末位置」または「末端位置」（または単に「末端」）は、無細胞ＤＮＡ分子、例えば血漿ＤＮＡ分子の、例えば先端で、最外側塩基のゲノム座標またはゲノム同一性またはヌクレオチド同一性を指してよい。末端位置は、ＤＮＡ分子のいずれかの末端に対応し得る。この様式では、ＤＮＡ分子の起点および終点に言及する場合、両方が、終末位置に対応し得る。幾つかの実施形態において、一方の末端位置は、解析法、例えば超並列シーケンシングもしくは次世代シーケンシング、一分子シーケンシング、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡシーケンシングライブラリ調整プロトコル、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、またはマイクロアレイにより検出または決定される無細胞ＤＮＡ分子の一方の先端での最外側塩基のゲノム座標またはヌクレオチド同一性である。幾つかの実施形態において、そのようなインビトロ技術は、無細胞ＤＮＡ分子の真のインビボ物理的末端（複数可）を改変する可能性がある。したがって各検出可能な末端は、生物学的に真の末端を表してよく、または末端は、分子の本来の末端から内側の１つもしくは複数のヌクレオチド、または末端から拡張された１つもしくは複数のヌクレオチド、例えばクレノウ断片による非ブラントエンドの二本鎖ＤＮＡ分子のオーバーハングの５’ブランティングおよび３’フィリングである。末端位置のゲノム同一性またはゲノム座標は、ヒト参照ゲノム、例えばｈｇ１９への配列リードのアライメントの結果から誘導され得る。それは、ヒトゲノムの本来の座標を表す指標またはコードのカタログから誘導され得る。それは、非限定的に標的特異性プローブ、ミニシーケンシング、ＤＮＡ増幅により読み取られる無細胞ＤＮＡ分子上の位置またはヌクレオチド同一性を指し得る。用語「ゲノム位置」は、ポリヌクレオチド（例えば、遺伝子、プラスミド、核酸断片、ウイルスＤＮＡ断片）中のヌクレオチド位置を指し得る。用語「ゲノム位置」は、ゲノム（例えば、配偶子もしくは微生物内の、または多細胞生物体の各細胞内の染色体のハプロイドセット）内のヌクレオチド位置に限定されない。
【００６９】
本明細書で用いられる「突然変異」、「単一ヌクレオチド変異体」、「単一ヌクレオチド多型」および「変異体」は、１つまたは複数の細胞の遺伝子材料中の検出可能な変化を指す。特有の例において、１つまたは複数の突然変異が、癌細胞で見出され得、癌細胞を同定し得る（例えば、ドライバーおよびパッセンジャー突然変異）。突然変異は、明白な細胞（ａｐｐａｒｅｎｔ  ｃｅｌｌ）から娘細胞に遺伝し得る。当業者は、親細胞での遺伝子突然変異（例えば、ドライバー突然変異）が娘細胞で追加の異なる突然変異（例えば、パッセンジャー突然変異）を誘導し得ることを、察知するであろう。突然変異または変異体は、一般に核酸中で起こる。特有の例において、突然変異は、１つまたは複数のデオキシリボ核酸またはその断片における検出可能な変化であり得る。突然変異は一般に、核酸中の新しい位置に付加、欠失、置換、反転、または転位されたヌクレオチドを指す。突然変異は、自然突然変異または実験で誘導された突然変異であり得る。特有の組織の配列における突然変異は、「組織特異性対立遺伝子」の一例である。例えば腫瘍は、正常細胞では起こらない、遺伝子座で対立遺伝子をもたらす突然変異を有し得る。「組織特異性対立遺伝子」の別の例は、胎児組織で起こるが母体組織では起こらない胎児特異性対立遺伝子である。用語「対立遺伝子」は、幾つかの例において突然変異と互換的に用いられ得る。
【００７０】
用語「一過的結合」は、結合する試薬またはプローブがポリヌクレオチド上の結合部位に可逆的に結合し、プローブは通常その結合部位に付着されたままでないことを意味する。これは、解析の過程で、結合部位の場所に関する有用な情報を提供する。典型的には１種の試薬またはプローブが、不動化されたポリマーに結合し、その後、若干の滞留時間の後にポリマーから剥離する。同じまたは別の試薬またはプローブがその後、別の部位でポリマーに結合する。幾つかの実施形態において、ポリマーに沿った複数の結合部位もまた、複数の試薬またはプローブに同時に結合される。幾つかの例において、異なるプローブは、オーバーラップした結合部位に結合する。ポリマーに可逆的に結合する試薬またはプローブのこの工程は、解析過程で多数回反復される。そのような結合事象の場所、頻度、滞留時間、光子発光は最終的に、ポリマーの化学構造のマップをもたらす。事実、これらの結合事象の一過的な性質は、多数のそのような結合事象の検出を可能にする。プローブが、長期間結合されたままであるなら、各プローブは、他のプローブの結合を阻害するであろう。
【００７１】
用語「反復結合」は、ポリマー中の同じ結合部位が解析の過程で同じ結合試薬もしくはプローブにより、または結合する試薬またはプローブの同じ化学種により、複数回結合されることを意味する。典型的には、ポリマーのマップが開発されるまで、１種の試薬がその部位に結合し、その後解離し、別の試薬が結合し、その後解離する、などである。この反復結合が、プローブから得られる情報の感度および正確度を向上させる。より多くの光子が蓄積され、複数の独立した結合事象が、実際のシグナルが検出される確率を上昇させる。感度は、一度しか検出されない場合にシグナルが低すぎてバックグランドノイズを超えてコールできない場合に、上昇する。そのような例では、シグナルは、持続的に認められれば、コール可能になる（例えば、シグナルが本物であるという確信は、同じシグナルが複数回認められる場合に上昇する）。結合部位のコールの正確度は、情報の複数の読み取りが１つの読み取りを別の読み取りで確認するため、上昇する。
【００７２】
本明細書で用いられる用語「プローブ」は、任意の光学蛍光標識が付着された、オリゴヌクレオチドを含み得る。幾つかの実施形態において、プローブは、蛍光色素または蛍光もしくは光散乱分子で場合により標識された、ペプチドまたはポリペプチドである。これらのプローブを用いて、核酸またはタンパク質のいずれかへの結合部位の位置特定を決定する。
【００７３】
本明細書で用いられる用語「オリゴヌクレオチド」および「オリゴ」は、短い核酸配列を意味する。幾つかの例において、オリゴは、定義されたサイズのものであり、例えば各オリゴは、ｋ個のヌクレオチド塩基（本明細書では「ｋ量体」とも称される）の長さである。典型的にはオリゴのサイズは、３量体、４量体、５量体、６量体などである。オリゴは、本明細書ではＮ量体とも称される。
【００７４】
本明細書で用いられる用語「標識」は、単一の検出可能な実体（例えば、波長を発する実体）または複数の検出可能な実体を包含する。幾つかの実施形態において、標識は、核酸に一過性に結合するか、またはプローブに結合される。異なるタイプの標識が、蛍光発光を明滅するか、光子発光を変動させるか、または光電スイッチをオフおよびオンにするであろう。異なる標識は、異なる撮像法に用いられる。詳細には幾つかの標識は、異なるタイプの蛍光顕微鏡法に独特に適合される。幾つかの実施形態において、蛍光標識は、異なる波長で蛍光発光し、異なる存続期間も有する。幾つかの実施形態において、バックグランド蛍光が、撮像視野に存在する。幾つかのそのような実施形態において、そのようなバックグランドは、散乱によって蛍光の早期時間窓を拒絶することにより、解析から除去される。標識が、プローブの一方の末端（例えば、オリゴプローブの３’末端）に存在する場合、位置特定の正確度は、プローブのその末端（例えば、プローブ配列の３’末端および標的配列の５’）に対応する。標識の明白な一過的で、変動するまたは明滅する挙動は、付着されたプローブが結合部位への結合のオンおよびオフであるか否かを識別することができる。
【００７５】
本明細書で用いられる用語「フラップ」は、第二の実体の結合のための受容体として作用する実体を指す。この２つの実体は、分子結合対を含み得る。そのような結合対は、核酸結合対を含み得る。幾つかの実施形態において、フラップは、標識されたオリゴヌクレオチドに結合するオリゴ−またはポリヌクレオチド配列の伸長を含む。フラップとオリゴヌクレオチドの間のそのような結合は、標的を結合するプローブの一部の一過的結合を撮像する工程の間実質的に安定でなければならない。
【００７６】
用語「延長された」、「拡張された」、「伸長された」、「直線化された」および「真っすぐにされた」は、互換的に用いられ得る。詳細には用語「延長されたポリヌクレオチド」（または「拡張されたポリヌクレオチド」など）は、何らかの手法で表面またはマトリックスに接着され、その後、直鎖形態に伸長された核酸分子を示す。一般にこれらの用語は、ポリヌクレオチドに沿った結合部位が、それらの間のヌクレオチド数と幾分か相関する物理的距離により分離されていることを意味する（例えば、ポリヌクレオチドは真っすぐである）。物理的距離が塩基数と一致する程度での幾らかの不正確さは、寛容され得る。                                                                                                                                          
【００７７】
本明細書で用いられる用語「撮像」は、二次元アレイまたは二次元走査検出装置の両方を包含する。ほとんどの例で、本明細書で用いられる撮像技術は、蛍光活性化物質（例えば、適当な波長のレーザ）および蛍光検出器を必ず包含するであろう。
【００７８】
本明細書で用いられる用語「配列ビット」は、配列の１塩基または数塩基（例えば、１〜９塩基長）を示す。詳細には幾つかの実施形態において、配列は、一過的結合に用いられるオリゴ（またはペプチド）の長さに対応する。したがってそのような実施形態において、配列は、標的ポリヌクレオチドの領域を指す。
【００７９】
本明細書で用いられる用語「ハプロタイプ」は、典型的には共に生来から持っている変異のセットを指す。これは、変異のセットがポリヌクレオチドまたは染色体上ですぐそばに存在するために起こる。幾つかの例において、ハプロタイプは、１つまたは複数の単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）を含む。幾つかの例において、ハプロタイプは、１つまたは複数の対立遺伝子を含む。
【００８０】
本明細書で用いられる用語「メチル結合タンパク質」は、メチル−ＣｐＧ結合ドメインを含有するタンパク質を指し、このドメインはおよそ７０ヌクレオチド残基を含む。そのようなドメインは、ＤＮＡの非メチル化領域に対し低親和性を有し、したがってメチル化されている核酸中の位置を同定するために用いられ得る。幾つかの共通するメチル結合タンパク質としては、ＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、およびＭＢＤ２が挙げられる。しかし、メチル−ＣｐＧ結合ドメインを含有する様々な異なるタンパク質が存在する（例えば、Ｒｏｌｏｆｆ ｅｔ ａｌ., ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４:１, ２００３に記載）。
【００８１】
本明細書で用いられる用語「ナノボディ」は、重鎖のみの抗体断片を含有する所有権のあるタンパク質セットを指す。これらは、高度に安定なタンパク質であり、種々のヒト抗体と類似の配列相同性を有するように設計でき、こうして細胞型または体内の領域の特異的標的化を可能にする。ナノボディの総説は、Ｂａｎｎａｓ ｅｔ ａｌ., Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ ｉｎ Ｉｍｍｕ. ８:１６０３, ２０１７に見出され得る。
【００８２】
本明細書で用いられる用語「アフィマー」は、非抗体結合タンパク質を指す。これらは、２つのペプチドループおよびＮ−末端配列を有し、幾つかの実施形態では所望のタンパク質ターゲットへの親和性および特異性を提供するように無作為化された、高度にカスタマイズされ得るタンパク質である。したがって幾つかの実施形態において、アフィマーは、タンパク質中の目的の配列または構造領域を同定するために用いられる。幾つかのそのような実施形態において、アフィマーは、多くの異なるタイプのタンパク質の発現、位置特定および相互作用を同定するために用いられる（例えば、Ｔｉｅｄｅ ｅｔ ａｌ., ＥＬｉｆｅ ６:Ｅ２４９０３, ２０１７に記載）。
【００８３】
本明細書で用いられる用語「アプタマー」は、高度に多目的性でカスタマイズされ得る結合分子の別のカテゴリーを指す。アプタマーは、ヌクレオチドおよび／またはペプチド領域を含む。可能なアプタマー配列のランダムセットを生成し、その後、目的の特異的な標的分子に結合する所望の配列を選択することが典型である。アプタマーは、それらの安定性および可撓性を超えた追加的特徴を有し、それがアプタマーを他のカテゴリーの結合タンパク質よりも望ましいものにする（例えば、Ｓｏｎｇ ｅｔ ａｌ., Ｓｅｎｓｏｒｓ １２:６１２−６３１, ２０１２およびＤｕｎｎ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔ. Ｒｅｖ. Ｃｈｅｍ. １:００７６, ２０１７に記載）。
【００８４】
複数の態様が、例証のために以下に例示的適用を参照して記載される。数多くの具体的詳細、関連性、および方法が、本明細書に記載された特色の完全な理解を提供するために示されていることが、理解されなければならない。しかし当業者は、本明細書に記載された特色が、具体的詳細または他の方法の１つまたは複数を用いずに実践され得ることを、察知されよう。一部の行為は、異なる順序で、そして／または他の行為もしくは事象と同時に行われ得るため、本明細書に記載された特色は、行為または事象の例示された順序に限定されない。さらに、例証された行為または事象の全てが、本明細書に記載された特色による方法論を実行するのに要求されるとは限らない。
【００８５】
例示的システムの実施形態
例示的システムの詳細が、ここに図１と併せて記載される。図１は、幾つかの実行によるシステム１００を示すブロック図である。幾つかの実行におけるデバイス１００は、１つまたは複数の処理装置（ＣＰＵ（複数可））１０２（プロセッサまたはプロセシングコアとも称される）と、１つまたは複数のネットワークインターフェース１０４と、ユーザーインターフェース１０６と、非持続型メモリ１１１と、持続型メモリ１１２と、これらの構成物を相互接続するための１つまたは複数の通信ブース１１４とを含む。１つまたは複数の通信ブース１１４は、システム構成物の間の通信を相互接続および制御する回路（時にはチップセットと呼ばれる）を場合により含む。非持続型メモリ１１１としては典型的には、ＤＲＡＭ、ＳＲＡＭ、ＤＤＲ ＲＡＭ、ＲＯＭ、ＥＥＰＲＯＭ、フラッシュメモリなどの高速ランダムアクセスメモリが挙げられるが、持続型メモリ１１２としては典型的には、ＣＤ−ＲＯＭ、デジタルバーサタイルディスク（ＤＶＤ）または他の光学記憶装置、磁気カセット、磁気テープ、磁気ディスク記憶装置もしくは他の磁気記憶デバイス、磁気ディスク記憶デバイス、光学ディスク記憶デバイス、フラッシュメモリデバイス、または他の不揮発性ソリッドステート記憶デバイスが挙げられる。持続型メモリ１１２は、ＣＰＵ（複数可）１０２から遠隔に配置される１つまたは複数の記憶デバイスを場合により包含する。持続型メモリ１１２、および非持続性メモリ１１２内の非揮発性メモリデバイス（複数可）は、非一時的コンピュータ読み取り可能記憶媒体を含む。幾つかの実行において、非持続型メモリ１１１、あるいは非一時的コンピュータ読み取り可能記憶媒体は、時には持続型メモリ１１２と協調的に、以下のプログラム、モジュールおよびデータ構造、またはそのサブセットを記憶する：
・  様々な基本的システムサービスを取り扱うため、およびハードウエア依存性タスクを実施するための手順を含む、任意選択によるオペレーティングシステム１１６；
・  システム１００を他のデバイスと接続するための、任意選択によるネットワーク通信モジュール（または他の命令）１１８、または通信ネットワーク；
・  各標的分子１３０についての情報を回収するための、光学活性検出モジュール１２０；
・  各標的分子１３０についての複数の結合部位におけるそれぞれの各結合部位１４０についての情報；
・  少なくとも（ｉ）期間１４４と（ｉｉ）発せられた光子の数１４６とを含むそれぞれの結合部位１４０についての複数の結合事象におけるそれぞれの各結合事象１４２についての情報；
・  それぞれの標的分子１３０の配列を決定するためのシーケンシングモジュール１５０；
・  少なくとも（ｉ）ベースコール１５２と（ｉｉ）確率１５４とを含むそれぞれの標的分子１３０についての複数の結合部位におけるそれぞれの各結合部位１４０についての情報；
・  それぞれの標的分子１３０についての参照ゲノム１６０に関する任意選択による情報；および
・  それぞれの標的分子１３０についての相補鎖１７０に関する任意選択による情報。
【００８６】
様々な実行において、先に同定された要素の１つまたは複数は、先に言及されたメモリデバイスの１つまたは複数に記憶され、上記の機能を実施するために命令のセットに対応する。先に同定されたモジュール、データ、またはプログラム（例えば、命令のセット）は、別のソフトウエアプログラム、手順、データセットまたはモジュールとして実行される必要はなく、したがってこれらのモジュールおよびデータの様々なサブセットが、様々な実行で組み合わせられても、または他の方法で再編成されてもよい。幾つかの実行において、非持続型メモリ１１１は場合により、上で同定されたモジュールおよびデータ構造のサブセットを記憶する。さらに幾つかの実施形態において、メモリは、上に記載されない追加的モジュールおよびデータ構造を記憶する。幾つかの実施形態において、上で同定された要素の１つまたは複数は、視覚化システム１００が必要な場合にそのようなデータの全てまたは一部を収集し得るように、視覚化システム１００によりアドレス可能な、視覚化システム１００以外の、コンピュータシステムに記憶される。
【００８７】
ネットワーク通信モジュール１１８の例としては、ワールドワイドウェブ（ＷＷＷ）、携帯電話ネットワークなどのイントラネットおよび／または無線ネットワーク、無線ローカルエリアネットワーク（ＬＡＮ）および／またはメトロポリタンエリアネットワーク（ＭＡＮ）、ならびに無線通信による他のデバイスが挙げられるが、これらに限定されない。無線通信は、複数の通信規格、プロトコルおよび技術のいずれかを場合により使用し、これは携帯通信用のグローバルシステム（ＧＳＭ）、拡張データＧＳＭ環境（ＥＤＧＥ）、高速ダウンリンクパケットアクセス（ＨＳＤＰＡ）、高速アップリンクパケットアクセス（ＨＳＵＰＡ）、Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ Ｄａｔａ−Ｏｎｌｙ（ＥＶ−ＤＯ）、ＨＳＰＡ、ＨＳＰＡ＋、Ｄｕａｌ−Ｃｅｌｌ ＨＳＰＡ（ＤＣ−ＨＳＰＤＡ）、ロングタームエボリューション（ＬＴＥ）、近距離通信（ＮＦＣ）、広帯域符号分割多重接続（Ｗ−ＣＤＭＡ）、符号分割多重接続（ＣＤＭＡ）、時分割多重接続（ＴＤＭＡ）、Ｂｌｕｅｔｏｏｔｈ、無線フィデリティ（Ｗｉ−Ｆｉ）（例えば、ＩＥＥＥ８０２．１１ａ、ＩＥＥＥ８０２．１１ａｃ、ＩＥＥＥ８０２．１１ａｘ、ＩＥＥＥ８０２．１１ｂ、ＩＥＥＥ８０２．１１ｇおよび／またはＩＥＥＥ８０２．１１ｎ）、ボイスオーバインターネットプロトコル（ＶｏＩＰ）、Ｗｉ−ＭＡＸ、電子メール用プロトコル（例えば、インターネットメッセージアクセスプロトコル（ＩＭＡＰ）および／またはポストオフィスプロトコル（ＰＯＰ））、インスタントメッセージング（例えば、拡張可能メッセージングおよびプレゼンスプロトコル（ＸＭＰＰ）、インスタントメッセージング用のセッションイニシエーションプロトコルおよびプレゼンスレバレッジング拡張（ＳＩＭＰＬＥ）、インスタントメッセージおよびプレゼンスサービス（ＩＭＰＳ））、および／もしくはショートメッセージサービス（ＳＭＳ）、または本開示の出願日にはまだ開発されていない通信プロトコルを含む任意の他の適切な通信プロトコルを含むが、これらに限定されない。
【００８８】
図１は、「システム１００」を表しているが、この図は、本明細書に記載された実行の構造的図式として以上に、コンピュータシステムに存在し得る様々な特色の機能的記載を意図する。実際に、および当業者に認識される通り、別々に図示されたアイテムを組み合わせることができ、幾つかのアイテムを分離することができる。その上、図１は、非持続型メモリ１１１中の特定のデータおよびモジュールを表すが、これらのデータおよびモジュールの幾つかまたは全てが、持続型メモリ１１２中にあってもよい。さらに幾つかの実施形態において、メモリ１１１および／または１１２は、上で記載されない追加的モジュールおよびデータ構造を記憶する。
【００８９】
本開示によるシステムを、図１を参照して開示したが、ここに本開示による方法を、図２Ａ、２Ｂ、３および４を参照して詳述する。
【００９０】
ブロック２０２  分子の化学構造を決定する方法が、提供される。本開示のゴールは、核酸の単一ヌクレオチド分解シーケンシングを可能にすることである。幾つかの実施形態において、１つまたは複数のプローブと分子の相互作用を特徴づける方法が、提供される。方法は、１つまたは複数のプローブ種を分子に一過的に結合させる条件下で、１つまたは複数のプローブ種を分子に添加することを含む。方法は、分子上の個々の結合事象を検出器により連続でモニタリングすること、および各結合事象を一定期間にわたり記録すること、により進行する。各結合事象からのデータは、解析されて、相互作用の１つまたは複数の特徴を決定する。
【００９１】
幾つかの実施形態において、ポリマーの同一性を決定する方法が、提供される。幾つかの実施形態において、細胞または組織の同一性を決定する方法が、提供される。幾つかの実施形態において、生物体の同一性を決定する方法が、提供される。幾つかの実施形態において、固体の同一性を決定する方法が、提供される。幾つかの実施形態において、方法は、単一細胞シーケンシングに適用される。
【００９２】
標的ポリマー
幾つかの実施形態において、分子は、核酸、好ましくはネイティブポリヌクレオチドである。様々な実施形態において、方法は、細胞、オルガネラ、染色体、ウイルス、エキソソーム、または体液からの単一標的ポリヌクレオチド分子をインタクト標的ポリヌクレオチドとして抽出することをさらに含む。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                 
【００９３】
幾つかの実施形態において、ポリマーは、短いポリヌクレオチドである（例えば、＜１キロベースまたは＜３００塩基）。幾つかの実施形態において、短いポリヌクレオチドは、尿および血液などの体液中の無細胞ＤＮＡで見出される通り、１００〜２００塩基、１５０〜２５０塩基、２００〜３５０塩基、または１００〜５００塩基の長さである。
【００９４】
幾つかの実施形態において、核酸は、少なくとも１０，０００塩基長である。幾つかの実施形態において、核酸は、少なくとも１，０００，０００塩基長である。
【００９５】
様々な実施形態において、単一標的ポリヌクレオチドは、染色体である。様々な実施形態において、単一標的ポリヌクレオチドは、約１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、または１０９塩基長である。
【００９６】
幾つかの実施形態において、方法は、標的タンパク質上のアミノ酸配列の解析を可能にする。幾つかの実施形態において、標的ポリペプチド上のアミノ酸配列を解析するための方法が、提供される。幾つかの実施形態において、標的ポリヌクレオチド上のアミノ酸配列に加え、ペプチド修飾を解析するための方法が、提供される。幾つかの実施形態において、分子の実体は、少なくとも５単位を含むポリマーである。そのような実施形態において、結合プローブは、オリゴヌクレオチド、抗体、アフィマー、ナノボディ、アプタマー結合タンパク質、または小分子などを含む分子プローブである。
【００９７】
そのような実施形態において、２０アミノ酸のそれぞれは、Ｎ−レコグニン、ナノボディ、抗体、アプタマーなどを含む対応する特異的プローブにより結合される。それぞれのプローブの結合は、ポリペプチド鎖内のそれぞれの対応するアミノ酸に特異的である。幾つかの実施形態において、ポリペプチド中のサブユニットの順序が、決定される。幾つかの実施形態において、結合は、結合部位の代替物に対してである。幾つかの実施形態において、代替物は、特定のアミノ酸またはペプチド配列で付着されたタグであり、一過的結合は、代替的タグに対してであろう。
【００９８】
幾つかの実施形態において、分子は、異種分子である。幾つかの実施形態において、異種分子は、超分子構造を含む。幾つかの実施形態において、方法は、異種ポリマーについて化学構造の単位を同定しおよび順序づけることを可能にする。そのような実施形態は、ポリマーを延長すること、および複数のプローブを結合させて、延長されたポリマーに沿った複数の部位で化学構造を同定すること、を含む。ヘテロポリマーの延長は、プローブ結合部位のサブ回折レベルの（例えば、ナノメートルでの）位置特定を可能にする。
【００９９】
幾つかの実施形態において、ポリマーのサブユニットを認識するプローブの結合によりポリマーをシーケンシングするための方法が、提供される。典型的には１つのプローブの結合は、ポリマーをシーケンシングするのに充分でない。例えば図１Ａは、ポリマー１３０のシーケンシングがプローブ１８２のレパートリーとの一過的相互作用（例えば、変性ポリヌクレオチドとオリゴヌクレオチドのレパートリーの相互作用、または変性ポリペプチドドとナノボディもしくはアフィマーのパネルの相互作用）を測定することに基づく実施形態である。
【０１００】
標的ポリマーの抽出および／または調製
幾つかの実施形態において、目的の細胞を、核酸抽出が実行される前には存在しない他の細胞から分離することが必要である。１つのそのような例において、循環する腫瘍細胞または循環する胎児細胞が、血液から単離される（例えば、アフィニティーキャプチャーのための細胞表面マーカーを用いることにより）。幾つかの実施形態において、関心事が、微生物細胞からポリヌクレオチドを検出および解析することであれば、微生物細胞をヒト細胞から分離することが必要である。幾つかの実施形態において、オプソニンを用いて、広範囲の微生物をアフィニティーキャプチャーし、それらを哺乳動物細胞から分離する。加えて幾つかの実施形態において、差異的溶解が、実施される。哺乳動物細胞が最初に、比較的穏やかな条件下で溶解される。微生物細胞は典型的には哺乳動物細胞よりも硬質であり、そのためそれらは、哺乳動物細胞の溶解の間無傷のままである。溶解された哺乳動物細胞断片は、洗い流される。その後、より厳しい条件を利用して、微生物細胞を溶解する。その後、標的微生物ポリヌクレオチドが、選択的にシーケンシングされる。
【０１０１】
幾つかの実施形態において、標的核酸は、シーケンシングの前に細胞から抽出される。代わりの実施形態において、シーケンシング（例えば、染色体ＤＮＡの）は、そこで染色体ＤＮＡが静止期に複雑な進路をたどる、細胞の内部で実行される。インサイチュでのオリゴの安定した結合は、Ｂｅｌｉｖｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ６:７１４７（２０１５）により実証されている。三次元空間におけるオリゴのそのようなインサイチュ結合およびそれらのナノメートル単位の位置特定は、細胞内での染色体分子の配列および構造的配置の決定を可能にする。
【０１０２】
標的ポリヌクレオチドは多くの場合、ネイティブの折り畳まれた状態で存在する。１つのそのような例において、ゲノムＤＮＡは染色体内で高度に縮合され、一方でＲＮＡは二次構造を形成する。幾つかの実施形態において、長さの長いポリヌクレオチドが、生体試料からの抽出の間に得られる（例えば、ポリヌクレオチドの実質的にネイティブの長さを保存することにより）。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、長さに沿った場所がほとんどまたは全く不明瞭にならずに追跡されるように、直線化される。理想的には、標的ポリヌクレオチドは、直線化の前または後に、真っすぐにされるか、伸長されるか、または延長される。
【０１０３】
方法は、非常に長いポリマー長をシーケンシングするのに特に適し、ここでネイティブの長さまたはその実質的割合は、保存される（例えば、ＤＮＡでは全染色体または約１メガベース画分）。しかし、一般的な分子生物学の方法は、ＤＮＡの意図しない断片化をもたらす。例えばピペッティングおよびボルテックス処理は、ＤＮＡ分子を破壊するせん断力を誘起する。ヌクレアーゼの汚染は、核酸を分解させる可能性がある。幾つかの実施形態において、ネイティブの長さ、またはネイティブの長さの実質的な高分子量（ＨＭＷ）断片は、不動化、伸長およびシーケンシングが始まる前に保存される。
【０１０４】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、シーケンシングを進行する前に、比較的均質な長い長さ（例えば、約１Ｍｂ長）に意図的に断片化される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、固定または延長の後またはその間に、比較的均質な長い長さに断片化される。幾つかの実施形態において、断片化は、酵素的に実行される。幾つかの実施形態において、断片化は、物理的に実行される。幾つかの実施形態において、物理的的断片化は、音波処理による。幾つかの実施形態において、物理的断片化は、イオン衝撃または放射線による。幾つかの実施形態において、物理的断片化は、電磁放射線による。幾つかの実施形態において、物理的断片化は、ＵＶ照射による。幾つかの実施形態において、ＵＶ照射の線量は、所与の長さへの断片化を実行するように制御される。幾つかの実施形態において、物理的断片化は、ＵＶ照射と色素（例えば、ＹＯＹＯ−１）での染色との組み合わせによる。幾つかの実施形態において、断片化工程は、物理的行為または試薬添加により停止される。幾つかの実施形態において、断片化工程での停止を実行する試薬は、ベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）などの還元剤である。
【０１０５】
放射線の線量による断片化およびシーケンシング
二次元センサーの視野により、ＤＮＡの完全なメガベース長をセンサーの一次元で観察することが可能な場合、１Ｍｂの長さのゲノムＤＮＡを生成することが効率的である。染色体長の断片のサイズを減少させることはまた、鎖のタングリングを最小限にして、伸長され充分に単離された形態で最大長のＤＮＡを得ることも、留意されなければならない。
【０１０６】
以下のステップを含む染色体の長いサブ断片をシーケンシングするための方法：
ｉ）  二本鎖の塩基対間でインターカレートする色素で染色体二本鎖ＤＮＡを染色するステップ；
ｉｉ）  染色された染色体ＤＮＡを所定の線量の電磁放射線に暴露して、所望のサイズ範囲内の染色体ＤＮＡのサブ断片を作製するステップ；
ｉｉｉ）  染色された染色体サブ断片ＤＮＡを表面上で延長および固定するステップ；
ｉｖ）  染色された染色体サブ断片を変性させて塩基対を破壊し、それによりインターカレーティング色素を放出させるステップ；
ｖ）  得られた退色延長固定一本鎖を所与の長さおよび配列のオリゴヌクレオチドのレパートリーに暴露するステップ；
ｖｉ）  レパートリー中のそれぞれのオリゴヌクレオチドの退色された延長一本鎖に沿った結合の場所を決定するステップ
ｖｉｉ）  レパートリー中の全てのオリゴの結合場所をコンパイルして、染色体サブ断片の全シーケンシングを得るステップ。
【０１０７】
先の幾つかの実施形態において、染色は、染色体が細胞内にある時に起こる。先の幾つかの実施形態において、より多くの染色剤が添加されデュブレックスが形成する時にデュプレックス内にインターカレートするため、標識されたオリゴヌクレオチドは、わずかしか標識されない。先の幾つかの実施形態において、場合により変性に加えて、染色を退色させることができる電磁放射線の線量が、適用される。先の幾つかの実施形態において、上記所定の線量は、暴露の強度および期間を操作すること、および化学的暴露で断片化を停止することにより実現され、上記化学的暴露は、ベータメルカプトエタノールなどの還元剤である。先の幾つかの実施形態において、線量は、断片の１Ｍｂ長前後のポアソン分布を作成するために予め決定される。
【０１０８】
固定および不動化の方法
ブロック２０４  核酸が、テスト基板上の二本鎖直線化伸長形態で固定され、それにより固定された伸長二本鎖核酸を形成する。場合により分子は、表面またはマトリックス上で不動化される。幾つかの実施形態において、断片化された、またはネイティブのポリマーが、固定される。幾つかの実施形態において、固定された二本鎖直線化核酸は、真っすぐでなく、むしろ曲線の、または曲がりくねった軌道をたどる。
【０１０９】
幾つかの実施形態において、固定は、分子コーミング（後退メニスカス）、流動伸長、ナノコンファインメント、またはエレクトロストレッチングにより、核酸をテスト基板に塗布することを含む。幾つかの実施形態において、基板への核酸の塗布は、核酸が基板に共有結合される、ＵＶ架橋ステップをさらに含む。幾つかの実施形態において、塗布は、核酸のＵＶ架橋を必要とせず、核酸は、他の手段（例えば、疎水性相互作用、水素結合など）を通して基板に結合される。
【０１１０】
一方の末端のみでのポリヌクレオチドの不動化（例えば、固定）は、ポリヌクレオチドを非協調的方法で伸長および収縮させる。したがってどのような延長の方法が用いられても、ポリマーの長さに沿った伸長の度合いを、標的中の任意の特有の位置に保証することができない。幾つかの実施形態において、ポリマーに沿った複数の場所の相対的位置が、変動を受けないことが必要である。そのような実施形態において、延長された分子は、表面での伸長が用いられ得るために（例えば、ＡＣＳ Ｎａｎｏ. ２０１５ Ｊａｎ ２７;９（１）:８０９−１６）、長さに沿った複数の接触点により表面に不動化または固定されなければならない（例えば、Ｍｉｃｈａｌｅｔ ｅｔ ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７:１５１８−１５２３, １９９７の分子コーミング技術で実施される通り; Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｏｍｂｉｎｇ ｏｆ ＤＮＡ: Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ, Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｓｅｌｆ−Ａｓｓｅｍｂｌｙ ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ（ＳＡＭＥ）１:１２５−１４８も参照）。
【０１１１】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドのアレイが、表面で不動化され、幾つかの実施形態において、アレイのポリヌクレオチドは、回折限界撮像により個別に解像されるのに充分、離れている。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、順序付けて表面で与えられ、それにより分子が所与の表面積内で最大限にパッキングされ、かつそれらがオーバーラップしないようにする。幾つかの実施形態において、これは、パターン化された表面を作製することにより実行される（例えば、ポリヌクレオチドの末端が結合するそのような場所での疎水性パッチまたはストリップの整列された配置）。幾つかの実施形態において、アレイのポリヌクレオチドは、回折限界撮像により個別に解像されるのに充分、離れておらず、超解像法により個別に解像される。
【０１１２】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、ＤＮＡカーテンにおいて組織化される（Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ., Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ. ４７２:２９３−３１５, ２０１０）。これは、長いポリヌクレオチドにとって特に有用である。そのような実施形態において、一方の末端に付着されたＤＮＡ鎖が、流動力もしくは電気泳動力により延長される間に、または鎖の両端が捕捉された後に、一過的結合が記録される。幾つかの実施形態において、同じ配列の多くのコピーが、ＤＮＡカーテンにおいて複数のポリヌクレオチドを形成する場合、配列は、１つのポリヌクレオチドからではなく複数のポリヌクレオチドから、集合体で結合パターンから組み立てられる。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドの両端は、パッド（例えば、表面の場所の他の区分よりも多くポリヌクレオチドに接着する表面の領域）に結合し、それぞれの端部が、異なるパッドに結合する。そのような実施形態において、ポリヌクレオチドの伸長配置を適所に保持し均等間隔の非オーバーラップまたは非相互作用のポリヌクレオチドの整列されたアレイが形成させることを可能にするために、単一の直鎖状ポリヌクレオチドが結合する２つのパッド。幾つかの実施形態において、１つのポリヌクレオチドのみが、個々のパッドを占有する。幾つかの実施形態において、パッドが、ポアソン工程を利用して定着される場合、一部のパッドは、ポリヌクレオチドにより占有されず、一部は、１つのポリヌクレオチド、一部は１つより多くのポリヌクレオチドにより占有される。
【０１１３】
幾つかの実施形態において、標的分子は、整列された超分子足場（例えば、ＤＮＡオリガミ構造）上に捕捉される。幾つかの実施形態において、足場構造は、溶液中で自由に開始して、標的分子を捕捉するための溶液相動力学を利用する。それらが、占有されると、足場が表面に定着し、または自己組織化し、表面に固定される。整列されたアレイは、分子の効率的なサブ回折パッキングを可能にし、視野あたりの分子を高密度（高密度アレイ）にさせる。単一分子の位置特定法は、高密度アレイ内のポリヌクレオチドを超解像させる（例えば、ポイント間距離を４０ｎｍ以下に）。
【０１１４】
幾つかの実施形態において、ヘアピンが、デュプレックス鋳型の末端にライゲートされる（場合により核酸の末端を滑らかにした後）。幾つかの実施形態において、ヘアピンは、核酸を表面に不動化するビオチンを含有する。代わりの実施形態において、ヘアピンは、デュプレックスの２つの鎖を共有結合でつなぐ働きがある。幾つかのそのような実施形態において、核酸の他の末端に、例えばオリゴ（ｏｌｉｏ）ｄ（Ｔ）が表面捕捉のために付加される。変性の後、核酸の両鎖は、オリゴとの相互作用に利用可能である。
【０１１５】
幾つかの実施形態において、整列されたアレイは、互いにつながって大きなＤＮＡ格子を形成する個別の足場の形態をとる（例えば、Ｗｏｏ ａｎｄ  Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ，  Ｎａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ, ５: ４８８９に記載）。幾つかのそのような実施形態において、個々の小さな足場が、塩基対合により互いを固定する。それらはその後、本開示のシーケンシングステップのために高次ナノ構造アレイを提供する。幾つかの実施形態において、捕捉部位が、整列された二次元格子中に１０ｎｍピッチで配列される。完全な占有により、そのような格子は、平方センチメートルあたりおよそ１兆分子を捕捉する能力を有する。
【０１１６】
幾つかの実施形態において、格子中の捕捉部位は、整列された二次元格子中に５ｎｍピッチ、１０ｎｍピッチ、１５ｎｍピッチ、３０ｎｍピッチ、または５０ｎｍピッチで配列される。幾つかの実施形態において、格子内の捕捉部位は、整列された二次元格子中に５ｎｍピッチ〜５０ｎｍピッチで配列される。
【０１１７】
幾つかの実施形態において、整列されたアレイは、ナノ流体工学を利用して作製される。１つのそのような例において、ナノトレンチまたはナノグルーブのアレイ（例えば、幅１００ｎｍおよび深さ１５０ｎｍ）は、表面が滑らかでなく、長いポリヌクレオチドを順序づける働きがある。そのような実施形態において、ナノトレンチまたはナノグルーブ中の一方のポリヌクレオチドの出現は、別のポリヌクレオチドの進入を排除する。別の実施形態において、ナノピットアレイが用いられ、そこでは長いポリヌクレオチドの分節が、ピットの中にあり、介入する長い分節が、ピットの間に広がっている。
【０１１８】
幾つかの実施形態において、高密度のポリヌクレオチドであっても、超解像での撮像および精密なシーケンシングを可能にする。例えば幾つかの実施形態は、ポリヌクレオチドのサブセットのみが、目的のものである（例えば、ターゲットシーケンシング）。そのような実施形態において、ターゲットシーケンシングが実行され、ポリヌクレオチドが通常よりも高密度で表面またはマトリックスに付着される場合、複雑な試料（例えば、全ゲノムまたはトランスクリプトーム）からのポリヌクレオチドのサブセットのみが、解析される必要がある。そのような実施形態において、回折限界空間内に複数のポリヌクレオチドが存在する場合でも、シグナルが検出される場合、それが標的遺伝子座の１つのみに由来し、この遺伝子座がプローブに同時に結合される別のそのような遺伝子座の回折限界距離内にない確率が高い。ターゲットシーケンシングを受けるそれぞれのポリヌクレオチド間の必要とされる距離は、標的とされるポリヌクレオチドの割合（％）に相関する。例えば、ポリヌクレオチドの５％未満が標的とされるならば、ポリヌクレオチドの密度は、ポリヌクレオチド配列全体が望ましい場合よりも２０倍大きい。ターゲットシーケンシングの幾つかの実施形態において、撮像時間は、全ゲノムが解析される場合よりも短い（例えば先の例では、ターゲットシーケンシング撮像は、全ゲノムシーケンシングよりも１０倍速くなり得る）。
【０１１９】
幾つかの実施形態において、テスト基板は、固定の前に配列特異性オリゴヌクレオチドプローブと結合され、固定は、テスト基板に結合された配列特異性オリゴヌクレオチドプローブを用いて、テスト基板上で核酸を捕捉することを含む。幾つかの実施形態において、核酸は、５’末端で結合される。幾つかの実施形態において、核酸は、３’末端で結合される。別の実施形態において、基板上に２つの別のプローブが存在する場合、１つのプローブが、核酸の第一の末端に結合し、別のプローブが、核酸の第二の末端に結合するであろう。２つのプローブが用いられる例では、核酸の長さに関する先行の情報を有することも必要である。幾つかの実施形態において、核酸は最初に、所定のエンドヌクレアーゼで切断される。
【０１２０】
様々な実施形態において、固定の前に、標的ポリヌクレオチドが、ゲルまたはマトリックス中に抽出または包埋される（例えば、Ｓｈａｇ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７:４６７−４７８, ２０１２に記載）。１つのそのような非限定的例において、ポリヌクレオチドは、液体−ゲル転移を受ける媒体を含有するフローチャネルで堆積される。ポリヌクレオチドは最初に液相で延長されかつ分配され、その後、固／ゲル相への相転移により固定される（例えば、加熱により、またはポリアクリルアミドゲルの場合には補因子添加もしくは時間により）。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、固／ゲル相で延長される。
【０１２１】
幾つかの代わりの実施形態において、プローブそのものが、表面またはマトリックス上で不動化される。そのような実施形態において、１つまたは複数の標的分子（例えば、ポリヌクレオチド）は、溶液に懸濁され、固定されたプローブに一過的に結合する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドの空間的にアドレス可能なアレイを用いて、ポリヌクレオチドを捕捉する。幾つかの実施形態において、適当な捕捉分子を用いて修飾または非修飾末端を捕捉することにより、無細胞ＤＮＡもしくはマイクロＲＮＡなどの短いポリヌクレオチド（例えば、３００ヌクレオチド未満）、またはｍＲＮＡなどの比較的短いポリヌクレオチド（例えば、１０，０００ヌクレオチド未満）が、表面で無作為に不動化される。幾つかの実施形態において、短い、または比較的短いポリヌクレオチドは、表面と複数の相互作用を行い、シーケンシングが、表面に平行な方向で実行される。これにより、スプライシングアイソフォームの組織化が解像される。例えば幾つかのアイソフォームにおいて、反復またはシャッフルされるエキソンの場所が、描かれる。
【０１２２】
幾つかの実施形態において、不動化されたプローブは、ポリヌクレオチドにアニーリングする共通配列を含有する。そのような実施形態は、標的ポリヌクレオチドが、好ましくは一方または両方の末端で、共通配列を有する場合に、特に有用である。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、一本鎖であり、ポリＡテールなどの共通配列を有する。１つのそのような例において、ポリＡテールを担持するネイティブｍＲＮＡは、表面のオリゴｄ（Ｔ）プローブのローンに捕捉される。幾つかの実施形態、特に短いＤＮＡが解析される実施形態において、ポリヌクレオチドの末端は、表面／マトリックス上の捕捉分子との相互作用に適合される。
【０１２３】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、制限酵素により作製された粘着末端で二本鎖を形成する。幾つかの非限定的例において、希少部位（例えば、Ｐｍｍｅ１またはＮＯＴ１）での制限酵素が、ポリヌクレオチドの長い断片を作製するために用いられ、各断片は、共通末端配列を含有する。幾つかの実施形態において、適合は、ターミナルトランスフェラーゼを用いて実施される。他の実施形態において、ライゲーションまたはタグメンテーションが、Ｉｌｌｕｍｉｎａシーケンシングのためのアダプターを導入するために用いられる。これは、ユーザーが確立されたＩｌｌｕｍｉｎａプロトコルを用いて試料を調製し、それらがその後、本明細書に記載された方法により捕捉およびシーケンシングされることを可能にする。そのような実施形態において、ポリヌクレオチドは好ましくは、エラーおよびバイアスを導入する傾向を有する増幅の前に捕捉される。
【０１２４】
延長の方法
ほとんどの実施形態において、ポリヌクレオチドまたは他の標的分子は、延長が起こるために表面またはマトリックスに付着されなければならない。幾つかの実施形態において、核酸の延長は、核酸を結晶学的長さ（例えば、１つの塩基から次の塩基の０．３４ｎｍの分離が既知である）と等しくするか、それより長くするか、またはそれより短くする。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、結晶学的長さを超えて伸長される。
【０１２５】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、分子コーミングにより伸長される（例えば、Ｍｉｃｈａｌｅｔ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７７:１５１８−１５２３, １９９７、およびＤｅｅｎ ｅｔ ａｌ., ＡＣＳ Ｎａｎｏ ９:８０９−８１６, ２０１５に記載）。これは、並行して数百万および数十億の分子の伸長および一方向アライメントを可能にする。幾つかの実施形態において、分子コーミングは、所望の核酸を含有する溶液を基板上に洗浄し、その後、溶液のメニスカスを引っ込めることにより実施される。メニスカスを引っ込める前に、核酸は、基板との共有結合的、または他の相互作用を形成する。溶液が後退すると、核酸がメニスカスと同方向に引っ張られる（例えば、表面貯留により）が、核酸と基板の間の相互作用の強度が、表面貯留力を克服するのに充分であれば、核酸は、メニスカスを後退させる方向で均一な様式で伸長される。幾つかの実施形態において、分子コーミングは、全体として参照により本明細書に取り込まれるＫａｙｋｏｖ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉ Ｒｅｐｏｒｔｓ. ６:１９６３６（２０１６）に記載される通り実施される。他の実施形態において、分子コーミングは、Ｐｅｔｉｔ ｅｔ ａｌ. Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３:１１４１−１１４６（２００３）に記載された方法またはその様々な改変法を用いて複数のチャネル（例えば、マイクロ流体デバイスの）で実施される。
【０１２６】
空気／水界面の形状は、分子コーミングにより伸長される延長ポリヌクレオチドの配向を決定する。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、空気／水界面に垂直に延長される。幾つかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドは、端部の一方または両方の修飾なしに表面に付着される。幾つかの実施形態において、二本鎖核酸の末端が、疎水性相互作用により捕捉される場合、後退するメニスカスでの伸長は、デュプレックスの一部を変性させ、表面との更なる疎水性相互作用を形成する。
【０１２７】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、分子糸通し（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｒｅａｄｉｎｇ）により伸長される（例えば、Ｐａｙｎｅ ｅｔ ａｌ., ＰＬｏＳ ＯＮＥ ８（７）:Ｅ６９０５８, ２０１３に記載）。幾つかの実施形態において、分子糸通しは、標的が一本鎖に変性された（例えば、化学的変性、温度および酵素による）後に実施される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、一方の末端でつながれ、その後、流動体の流れの中で伸長される（例えば、Ｇｒｅｅｎｅ ｅｔ ａｌ., Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，  ３２７: ２９３−３１５に示される）。
【０１２８】
様々な実施形態において、標的ポリヌクレオチド分子は、マイクロ流体チャネル内に存在する。１つのそのような例において、ポリヌクレオチドは、マイクロ流体チャネル内に流れるか、または１つもしくは複数の染色体、エキソソーム、核もしくは細胞からフローチャネル内に抽出される。幾つかの実施形態において、マイクロまたはナノ流体フローセルを介してポリヌクレオチドをナノチャネルに挿入するよりむしろ、ポリヌクレオチドは、チャネルの壁が形成される表面を電気的に偏向させるような方法でチャネルを構築することにより、オープントップチャネル内に挿入される（例えば、Ａｓａｎｏｖ ｅｔ ａｌ., Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ. １９９８ Ｍａｒ. １５;  ７０（６）:１１５６−６参照）。１つのそのような例において、正のバイアスが表面に適用され、それにより負電荷ポリヌクレオチドが、ナノチャネルに引き付けられる。同時に、チャネル壁のうねは偏向を含まず、それによりポリヌクレオチドは、それ自体がうねに堆積される可能性が低いであろう。
【０１２９】
幾つかの実施形態において、拡張は、流体力学的抗力による。１つのそのような例において、ポリヌクレオチドは、ナノスリット中の十字流により伸長される（Ｍａｒｉｅ ｅｔ ａｌ.,  Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０:４８９３−８，２０１３）。幾つかの実施形態において、核酸の拡張は、フローチャネル中のナノコンファインメントによる。フローストレッチングナノコンファインメントは、流量勾配により核酸を直鎖状コンフォメーションに伸長することを含み、それは一般にマイクロ流体デバイス内で実施される。この伸長法のナノコンファインメント部分は典型的には、マイクロ流体デバイスの狭い領域を指す。狭い領域またはチャネルの使用は、分子の独自性（例えば、伸長の間に複数のコンフォメーションを採用する個々の核酸または他のポリマーの傾向）の問題の克服を支援する。フローストレッチング法での１つの問題は、流れがいつも核酸分子に沿って均等に適用されるとは限らないことである。これは、広範囲の拡張の長さを呈する核酸をもたらし得る。幾つかの実施形態において、フローストレッチング法は、拡張流および／または流体力学的抗力を含む。ポリヌクレオチドがナノチャネル内に引き付けられる幾つかの実施形態において、１つまたは複数のポリヌクレオチドが、チャネル中でナノコンファインメントされ、それにより延長される。幾つかの実施形態において、ナノコンファインメントの後、ポリヌクレオチドは、偏向された表面に、または表面の最上部のコーティングもしくはマトリックスに堆積される。
【０１３０】
表面に正または負の偏向を加える方法が複数存在する。１つのそのような例において、表面は、非汚染性を有する材料で作製もしくはコーティングされるか、または脂質（例えば、脂質二重膜）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン、様々なＰＥＧ誘導体などでパシベートされる。パシベーションは、チャネルの任意の一部分におけるポリヌクレオチド封鎖を予防し、これにより延長を可能にする働きがある。幾つかの実施形態において、表面はまた、酸化インジウムスズ（ＩＴＯ）を含む。
【０１３１】
幾つかの実施形態において、ナノ流体チャネルの表面での脂質二重膜（ＬＢＬ）の作製のために、双性イオン性ＰＯＰＣ（１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン）脂質が、１％Ｌｉｓｓａｍｉｎｅ（商標）ローダミンＢ  １，２−ジヘキサデカノイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホエタノールアミンと共に表面にコーティングされる。トリエチルアンモニウム塩（ローダミン−ＤＨＰＥ）脂質の添加は、蛍光顕微鏡法でのＬＢＬ形成観察を可能にする。本開示の幾つかの実施形態で用いられる脂質二重膜パシベーションの方法は、Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ., Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ. １２:２２６０−２２６５, ２０１２に記載されている。
【０１３２】
幾つかの実施形態において、１つまたは複数のポリヌクレオチドの拡張は、電気泳動により実施される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、一方の末端でつながれ、その後、電場により伸長される（例えば、Ｇｉｅｓｅ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６: ３１７−３２５, ２００８に記載）。核酸のエレクトロストレッチングは、核酸が高度に負電荷の分子であるという事実から、予測される。例えばＲａｎｄａｌｌ ｅｔ ａｌ. ２００６, Ｌａｂ Ｃｈｉｐ. ６, ５１６−５２２により記載される、エレクトロストレッチングの方法は、核酸が電流によりマイクロチャネルを通して引き入れられること（そして核酸分子の配向を誘導すること）を含む。幾つかの実施形態において、エレクトロストレッチングは、ゲルの中で、またはゲルを用いずに実行される。ゲル使用の一利益は、核酸に利用可能な三次元空間を限定し、これにより分子独自性の克服を支援することである。ナノコンファインメントなどの圧力駆動型伸長法を超えるエレクトロストレッチングの一般的利点は、核酸分子を破壊するせん断力の欠如である。
【０１３３】
幾つかの実施形態において、複数のポリヌクレオチドが、１つの表面に存在する場合、ポリヌクレオチドは、同じ配向でアライメントされないか、または真っすぐでない（例えば、ポリヌクレオチドは、表面に付着するか、または曲線軌道でゲルを通り抜ける）。そのような実施形態において、複数のポリヌクレオチドの２つ以上がオーバーラップし、それぞれのポリヌクレオチドの長さに沿ってプローブの位置特定に関して混乱を招く見込みが高くなる。同じシーケンス情報が、真っすぐのうまくアライメントされた分子からのように曲がった配列から得られるが、曲がった配列からのシーケンシング情報を処理する画像処理タスクは、真っすぐの正しくアライメントされた分子から得られる情報よりも大きな計算力を要する。
【０１３４】
１つまたは複数のポリヌクレオチドが平坦な表面と平行な方向に延長する実施形態において、それらの長さが、ＣＭＯＳまたはＣＣＤカメラなどの二次元アレイ検出器において隣接する一連の画素で撮像される。幾つかの実施形態において、１つまたは複数のポリヌクレオチドは、表面と垂直な方向に延長される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、光シート顕微鏡法、シピニングディスク共焦点顕微鏡法、三次元超解像顕微鏡法、三次元一分子位置特定、またはレーザ走査ディスク共焦点顕微鏡法もしくはその変法により撮像される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表面に対して斜角で延長される。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、二次元検出器により撮像されてもよく、画像は、Ｓｉｎｇｌｅ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ Ｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎアルゴリズムソフトウエア（例えば、Ｏｖｅｓｎｙ ｅｔ ａｌ., ＢｉｏＩｎｆｏｒｍ. ３０:２３８９−２３９０, ２０１４に記載されたＦｉｊｉ／ ＩｍａｇｅＪ ｐｌｕｇ−ｉｎ ＴｈｕｎｄｅｒＳＴＯＲＭ）により処理されてもよい。
【０１３５】
固定および延長の前の単一細胞からのＤＮＡ抽出および単離
幾つかの実施形態において、単一細胞のためのトラップが、核酸内容物が放出されながら個々の細胞を１つの場所に保持するように、マイクロ流体構造内に設計される（例えば、ＷＯ／２０１２／０５６１９２またはＷＯ／２０１２／０５５４１５のデバイス設計を使用することによる）。幾つかの実施形態において、ナノチャネル中でポリヌクレオチドを抽出および伸長する代わりに、マイクロ／ナノ流体構造を密封するのに用いられるカバーガラスまたはホイルをポリビニルシランでコーティングして、分子コーミングを可能にする（例えば、Ｐｅｔｉｔ ｅｔ ａｌ., Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３:１１４１−１１４６. ２００３により記載された流体の移動による）。流体チップの内部の穏やかな条件は、抽出されたポリヌクレオチドが長く維持されることを可能にする。
【０１３６】
多くの異なるアプローチが、単一細胞または核から生体ポリマーを抽出するのに利用可能である（例えば、幾つかの適切な方法が、Ｋｉｍ ｅｔ ａｌ., Ｉｎｔｅｇｒ Ｂｉｏｌ １（１０）、 ５７４−８６, ２００９で総括される）。幾つかの非限定的例において、細胞は、ＫＣＬで処理されて、細胞膜を除去する。細胞は、低張溶液を添加することにより溶解される。幾つかの実施形態において、それぞれの細胞は、別々に単離され、それぞれの細胞のＤＮＡは、別々に抽出され、その後、ＤＮＡのそれぞれのセットが、マイクロ流体ベッセルまたはデバイスで別々にシーケンシングされる。幾つかの実施形態において、抽出は、１つまたは複数の細胞を界面活性剤および／またはプロテアーゼで処理することにより起こる。幾つかの実施形態において、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）が、溶解溶液中で提供されて、ヌクレアーゼにより必要とされる二価陽イオンを捕捉する（これによりヌクレアーゼ活性を低下させる）。
【０１３７】
幾つかの実施形態において、単一細胞の核および核外構成物が、以下の方法により別々に抽出される。１つまたは複数の細胞が、マイクロ流体デバイスの供給チャネルに提供される。１つまたは複数の細胞はその後、捕捉され、そこでそれぞれの細胞は、１つのトラッピング構造により捕捉される。第一の溶解緩衝液が、溶液に添加され、ここで第一の溶解緩衝液は、細胞膜を溶解するが、細胞核の完全性の維持を支援する。第一の溶解緩衝液の添加の際、１つまたは複数の細胞の核外構成物は、フローセル中に放出され、そこで放出されたＲＮＡが、不動化される。１つまたは複数の核はその後、第二の溶解緩衝液を供給することにより溶解される。第二の溶解緩衝液の添加は、１つまたは複数の核（例えば、ゲノムＤＮＡ）の構成物をフローセル中に放出させ、次にＤＮＡが不動化される。１つまたは複数の細胞の細胞外および細胞内成分は、同じフローセルの異なる場所でまたは同じデバイス内の異なるフローセルで不動化される。
【０１３８】
図１６Ａおよび１６Ｂの図式は、複数の単一細胞を捕捉および単離するマイクロ流体構造を示す。細胞１６０２は、フローセル２００４内の細胞トラップ１６０６により捕捉される。幾つかの実施形態において、細胞が捕捉された後、溶解試薬が流される。溶解の後、ポリヌクレオチドがその後、他の細胞から抽出されたポリヌクレオチドから単離されたまま、捕捉領域の付近に分配される。幾つかの実施形態において、図１６Ｂに示される通り、電気泳動での誘導が、核酸を操作するために実施される（例えば、電荷１６１０を利用）。溶解は、細胞１６０２および核１６０４から核酸１６０８を放出するであろう。核酸１６０８は、細胞１６０２がトラップされた時にそれらが存在する場所（例えば、細胞トラップ１６０６に対して）に残留する。トラップは、単一細胞の寸法である（例えば、２〜１０μＭ）。幾つかの実施形態において、マイクロドロップレットおよび細胞を結び付けるチャネルは、２μＭまたは１０μＭを超える。幾つかの実施形態において、二又のチャネルとトラップの間の距離は、１〜１０００ミクロンである。
【０１３９】
表面での高分子量ＤＮＡの抽出および延長
ＨＭＷポリヌクレオチドを伸長するための様々な方法が、異なる実施形態で用いられる（例えば、ＡＣＳ Ｎａｎｏ. ９（１）:８０９−１６, ２０１５）。１つのそのような例において、表面での延長は、フローセル中で実施される（例えば、Ｐｅｔｉｔ ａｎｄ  ＣａｒｂｅｃｋによりＮａｎｏ. Ｌｅｔｔ. ３: １１４１−１１４６, ２００３に記載されたアプローチを用いる）。流体アプローチに加えて、幾つかの実施形態においてポリヌクレオチドは、Ｇｉｅｓｓ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２６, ３１７−３２５（２００８）に開示された電場を利用して伸長される。複数のアプローチが、ポリヌクレオチドが表面に付着されない場合に、それらを延長するのに利用可能である（例えば、Ｆｒｉｅｔａｇ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，  ９（４）:０４４１１４（２０１５）；  Ｍａｒｉｅ ｅｔ ａｌ.,  Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １１０:４８９３−８, ２０１３）。
【０１４０】
ゲルプラグにおいてＤＮＡを使用する代わりとして、チップ上への装填に適した染色体が、Ｃｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓｃｉ．，  ２００２，  ２４，  ２７−３５により記載されたポリアミン法により調製され、デバイス中に直接ピペッティングされる。幾つかのそのような実施形態において、染色体中のＤＮＡに結合するタンパク質が、プロテアーゼを用いて消化されて、実質的に裸のＤＮＡを放出し、それはその後、先に記載された通り固定および延長される。
【０１４１】
リードの局地的保存のための試料処理
非常に長い領域またはポリマーがシーケンシングされる実施形態において、ポリマーの任意の分解は、全シーケンシングの正確度を顕著に低下させる可能性を有する。延長されたポリマー全体の保持を促進する方法を、以下に表す。
【０１４２】
ポリヌクレオチドは、抽出、貯蔵または調製の間に損傷されるようになる可能性を有する。ニックおよびアダクトが、ネイティブ二本鎖ゲノムＤＮＡ分子中に形成し得る。これは、試料のポリヌクレオチドがＦＦＰＥ材料に由来する場合に特にあてはまる。したがって幾つかの実施形態において、ＤＮＡ修復溶液が、ＤＮＡを不動化する前または後に導入される。幾つかの実施形態において、これは、ゲルプラグ中へのＤＮＡ抽出の後に実施される。幾つかの実施形態において、修復溶液は、ＤＮＡエンドヌクレアーゼ、キナーゼおよび他のＤＮＡ修飾酵素を含有する。幾つかの実施形態において、修復溶液は、ポリメラーゼおよびリガーゼを含む。幾つかの実施形態において、修復溶液は、Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ製のｐｒｅ−ＰＣＲキットである。幾つかの実施形態において、そのような方法は大部分が、Ｋａｒｉｍｉ−Ｂｕｓｈｅｒｉ ｅｔ ａｌ., Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ. Ｏｃｔ １;２６（１９）:４３９５−４００, １９９８およびＫｕｎｋｅｌ ｅｔ ａｌ.,  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ. ＵＳＡ，７８, ６７３４−６７３８, １９８１に記載された通り実施される。
【０１４３】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドが、延長された後、ゲルオーバーレイが、適用される。幾つかのそのような実施形態において、表面での延長および変性の後、ポリヌクレオチド（二本鎖または変性された）が、ゲル層で覆われる。あるいはポリヌクレオチドは、既にゲル環境内にありながら延長される（例えば、上記の通り）。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドが延長された後、それはゲル中に流し込まれる。例えば幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドが、一方の末端で表面に付着され、流動流れ（ｆｌｏｗ  ｓｔｒｅａｍ）の中で、または電気泳動での電流により伸長されると、周囲の媒体が、ゲル中に流れ込むようになる。幾つかの実施形態において、これは、アクリルアミド、過硫酸アンモニウムおよびＴＥＭＥＤを流動流れの中に含むことにより起こる。そのような化合物は、固まると、ポリアクリルアミドになる。代わりの実施形態において、熱に応答するゲルが、適用される。幾つかの実施形態において、ポリアクリルアミドの末端は、アクリルアミドと重合するＡｃｒｙｄｉｔｅで修飾される。幾つかのそのような実施形態において、ネイティブポリヌクレオチドの負のバックボーンを考慮すると、正電極に向かいポリヌクレオチドを延長する電場が加えられる。
【０１４４】
幾つかの実施形態において、核酸は、ゲルプラグまたはゲル層中で細胞から抽出されて、ＤＮＡの完全性を保持し、その後、ＡＣ電場が加えられて、ゲル内のＤＮＡを伸長するが、これがカバーガラスの最上部のゲル層で実施される場合、本発明の方法は、伸長されたＤＮＡに適用されて、一過的なオリゴ結合を検出できる。
【０１４５】
幾つかの実施形態において、試料は、その環境のマトリックスに架橋される。一例において、これは、細胞内部環境である。例えばシーケンシングが、細胞中でインサイチュに実行される場合、ポリヌクレオチドは、ヘテロ二官能基クロスリンカーを用いて細胞内マトリックスに架橋される。これは、シーケンシングがＦＩＳＳＥＱ（Ｌｅｅ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ ３４３:１３６０−１３６３, ２０１４）などの技術を用いて細胞内部に直接適用される場合に実行される。
【０１４６】
多くの破壊は、細胞および組織から生体分子を抽出し次に生体分子を、それが解析される前に取り扱う工程で起こる。ＤＮＡの例では、完全性の損失を導く取り扱いの態様としては、ピペッティング、ボルテックス処理、凍結解凍および過熱が挙げられる。幾つかの実施形態において、機械的応力は、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ，  １１:３４０−３４３（２０１０）に開示された手法などで最小限に抑えられる。加えて、高濃度の二価陽イオン、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡまたは没食子酸（ならびにその類似体および誘導体）が、ヌクレアーゼによる分解を阻害する。幾つかの実施形態において、二価陽イオン重量に対する試料の２：１比が、極度のヌクレアーゼが存在する糞便などの試料中であってもヌクレアーゼを阻害するのに充分である。
【０１４７】
核酸の完全性を維持するために（例えば、ＤＮＡの損傷またはより小さな断片への破壊を誘導しないように）、幾つかの実施形態において、染色体、ミトコンドリア、細胞、核、エキソソームなどの、その天然の保護環境にＤＮＡなどの生体高分子を保持することが望ましい。核酸が既に保護的環境の外部にある実施形態において、核酸をゲルまたはマイクロドロップレットなどの保護的環境内に入れることが、望ましい。幾つかの実施形態において、核酸は、シーケンシングされる場所（例えば、シーケンシングデータが獲得される流体システムまたはフローセルの一部）に物理的に接近させて、保護環境から放出される。したがって幾つかの実施形態において、生体高分子（例えば、核酸、タンパク質）は、保護性の実体の中で提供され、上記保護性実体は、生体高分子をそのネイティブに近い状態（例えば、ネイティブの長さ）に保持し、生体高分子を含む保護性実体を、それがシーケンシングされる場所の付近に持って行き、その後、生体高分子を、それがシーケンシングされるエリアまたはシーケンシングされるエリア付近に放出する。幾つかの実施形態において、本発明は、ゲノムＤＮＡを含むアガロースゲルを提供し、上記アガロースゲルがゲノムＤＮＡの実質的断片を２００Ｋｂ長より大きく保持し、ゲノムＤＮＡを含むアガロースを、ＤＮＡがシーケンシングされる環境（例えば、表面、ゲル、マトリックス）の付近に置き、ゲノムＤＮＡをアガロースから環境（またはさらなる輸送および取り扱いが最小限になるような環境の付近）に放出すること、およびシーケンシングを実行すること、を含む。シーケンシング環境への放出は、電場の適用によっても、またはアガロースでのゲルの消化によってもよい。
【０１４８】
ポリマー変性
ブロック２０６  固定された伸長二本鎖核酸は次に、テスト基板上で一本鎖形態に変性され、それにより核酸の固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を得る。固定された第二の鎖の各塩基は、固定された第一の鎖の対応する相補性塩基に隣接して存在する。幾つかの実施形態において、変性は、最初にポリヌクレオチドを延長または伸長し、その後、変性溶液を添加して、２つの鎖を分離することにより実施される。
【０１４９】
幾つかの実施形態において、変性は、１種または複数の試薬（例えば、０．５Ｍ  ＮａＯＨ、ＤＭＳＯ、ホルムアミド、尿素など）を含む化学的変性である。幾つかの実施形態において、変性は、加熱変性である（例えば、試料を８５℃以上に加熱することによる）。幾つかの実施形態において、変性は、ヘリカーゼまたはヘリカーゼ活性を有する他の酵素の使用によるなどの、酵素的変性による。幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドは、表面との相互作用により、または臨界長を超える伸長などの物理的工程により変性される。幾つかの実施形態において、変性は、全てまたは一部である。
【０１５０】
幾つかの実施形態において、ポリマー（例えば、ポリヌクレオチド中のヌクレオチドまたはポリペプチド上のリン酸化）の反復単位上の修飾へのプローブの結合は、任意選択による変性ステップの前に実行される。
【０１５１】
幾つかの実施形態において、二本鎖ポリヌクレオチドの任選択による変性は、全く実施されない。幾つかのそのような実施形態において、プローブは、デュプレックス構造にアニーリングできなければならない。例えば幾つかの実施形態において、プローブは、デュプレックスの過剰なブリージングを誘導することにより、ジンクフィンガー（ｚｉｎｇ−ｆｉｎｇｅｒ）タンパク質を通してデュブレックス中の配列を認識することにより、またはデュプレックスを溶解してガイドＲＮＡを結合させるＣａｓ９もしくは類似のタンパク質を用いることにより、鎖の侵入を通して（例えば、ＰＮＡプローブを用いる）デュブレックスの個々の鎖に結合する。幾つかの実施形態において、ガイドＲＮＡは、インターロゲーションプローブ配列を含み、レパートリーの核配列を含むｇＲＮＡが、提供される。
【０１５２】
幾つかの実施形態において、二本鎖ターゲットは、ニック（例えば、天然のニックまたはＤＮａｓｅ１処理により作製されるもの）を含有する。そのような実施形態において、反応条件下で、一方の鎖が、ほつれるもしくは他方から剥離する（例えば、一過的に変性する）か、または自然な塩基対ブリージングが、起こる。これは、プローブを、それがネイティブ鎖に取って代わられる前に、一過的に結合させる。
【０１５３】
幾つかの実施形態において、デュプレックスの鎖のそれぞれがオリゴによる結合に利用可能であるように、単一の二本鎖標的ポリヌクレオチドが変性される。幾つかの実施形態において、単一ポリヌクレオチドは、シーケンシング法における変性工程により、または別のステップで損傷され、かつ修復される（例えば、適切なＤＮＡポリメラーゼの添加による）。
【０１５４】
幾つかの好ましい実施形態において、二本鎖ゲノムＤＮＡの不動化および直線化（表面での一過性結合の準備中に）は、分子コーミング、表面へのＤＮＡのＵＶ架橋、任意選択による湿潤、化学変性剤（例えば、アルカリ溶液、ＤＭＳＯなど）への暴露を通した二本鎖ＤＮＡの変性、洗浄後の酸性溶液への任意選択による暴露、および任意選択によるプレコンディショニング緩衝液への暴露を含む。
【０１５５】
プローブのアニーリング
ブロック２０８  任意選択による変性ステップの後、方法は、固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露することに続き、ここでオリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、所定の配列および長さである。暴露は、各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブが結合し各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である固定された第一の鎖または固定された第二の鎖のそれぞれの一部（または複数の一部）と各ヘテロデュプレックスを形成することを可能にする条件下で起こり、それにより光学活性の各インスタンスを生じる。
【０１５６】
図５Ａ、５Ｂおよび５Ｃは、異なるプローブを１つのポリマー５０２に一過的に結合させる例を示す。それぞれのプローブ（例えば、５０４、５０６、および５０８）は、特異的インターロゲーション配列（例えば、ヌクレオチドまたはペプチド配列）を含む。プローブ５０４をポリヌクレオチド５０２に適用した後、プローブ５０４は、１つまたは複数の洗浄ステップでポリマー５０２から洗い流される。類似の洗浄ステップを利用して、次にプローブ５０６および５０８を除去する。
【０１５７】
プローブの設計および標的
幾つかの実施形態において、プローブが、溶液中の標的ポリヌクレオチドに提供される。溶液が、表面またはマトリックス上のポリヌクレオチドを沈めるのに充分な容量であれば、プローブは、拡散および分子衝突を通してポリヌクレオチドと接触できる。幾つかの実施形態において、溶液は、撹拌されて、プローブを１種または複数のポリヌクレオチドと接触させる。幾つかの実施形態において、プローブ含有溶液は、交換されて、新鮮なプローブを表面にもたらす。幾つかの実施形態において、電場が利用されて、プローブを表面に引き付け、例えば正に偏向された表面が、負電荷のオリゴを引き付ける。
【０１５８】
幾つかの実施形態において、標的は、ポリヌクレオチド配列を含み、プローブの結合部分は、例えば３量体、４量体、５量体、または６量体オリゴヌクレオチド配列インターロゲーション部分と、場合により１つまたは複数の縮重またはユニバーサルの位置と、場合によりヌクレオチドスペーサ（例えば、１つまたは複数のＴヌクレオチド）または塩基性もしくは非ヌクレオチド部分とを含む。図６Ａおよび６Ｂに示される通り、類似の結合が、用いられるオリゴプローブ（例えば、６０４および６１０）のサイズとは無関係に、ポリヌクレオチド６０２に沿って起こる。異なるｋ量体長のオリゴに本来備わる主な差異は、ｋ量体長が各プローブにより結合される結合部位の長さを設定することである（例えば、３量体プローブ６０４は主として、６０６などの３−ヌクレオチド長部位に結合し、５量体プローブ６１０は主として、６１０などの５−ヌクレオチド長部位に結合する）。
【０１５９】
図６Ａにおいて、３量体オリゴプローブは通常、短い。通常そのような短い配列は、非常に低い温度および長いインキュベーション時間が用いられる場合を除き、それらが安定に結合し得ないため、プローブとして用いられない。しかしそのようなプローブは、本明細書に記載される検出法により求められるように、標的ポリヌクレオチドへの一過的結合を形成する。さらにオリゴヌクレオチドプローブ配列が短いほど、レパートリーに存在するオリゴヌクレオチドは少ない。例えば、６４のオリゴヌクレオチド配列のみが３量体オリゴの完全なレパートリーに対し必要であるが、２５６のオリゴヌクレオチド配列が完全な４量体レパートリーに対し必要である。さらに、極端に短いプローブが修飾されて、幾つかの実施形態において溶融温度を上昇させ、及び幾つかの実施形態において縮重（例えば、Ｎ）ヌクレオチドを含める。例えば４つのＮヌクレオチドは、３量体オリゴの安定性を７量体の安定性に上昇させる。
【０１６０】
図６Ｂにおいて、この図式は、完全一致の位置（６１２−３）、一塩基ミスマッチ位置（６１２−２）および二塩基ミスマッチ位置（６１２−１）への５量体の結合を示す。
【０１６１】
任意の１つのプローブの結合は、ポリヌクレオチドをシーケンシングするのに充分でない。幾つかの実施形態において、プローブの完全なレパートリーが、ポリヌクレオチドの配列を再構成するのに必要とされる。オリゴ結合部位の場所に関する情報と、オーバーラップする結合部位へのプローブの時間的に分離した結合と、オリゴと標的ヌクレオチドの間のミスマッチの部分的結合と、結合の頻度と、結合期間の全てが、配列の推論に寄与する。延長または伸長されたポリヌクレオチドの場合、ポリヌクレオチドの長さに沿ったプローブ結合の場所は、堅固な配列の構築に寄与する。二本鎖ポリヌクレオチドの場合、信頼性のより大きな配列は、同時にデュプレックスの両方の鎖（例えば、両方の相補鎖）のシーケンシングから発生する。
【０１６２】
幾つかの実施形態において、共通の参照プローブ配列が、レパートリー中のオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれと一緒に添加される。例えば図７Ａ，７Ｂおよび７Ｃにおいて、共通参照プローブ７０４は、プローブセット（例えば、７０６、７１２および７１６）に含まれる追加のプローブと無関係に、標的ポリヌクレオチド７０２上の同じ結合部位７０８に結合する。参照プローブ７０４の存在は、各結合部位（例えば、７１０、７１４、７１８、７２０および７２２）への他のプローブの結合を阻害しない。
【０１６３】
図７Ｃに表される通り、結合部位７１８、７２０、および７２２は、どのように個々のプローブ（７１６−１、７１６−２および７１６−３）が可能な部位の全てを、それらの部位がオーバーラップしている場合でも、結合するのかを示す。図７Ａ、７Ｂ、および７Ｃにおいて、プローブ配列は、３量体により表される。しかし類似の方法が、４量体、５量体、６量体などのプローブを用いて等しく良好に実施され得る。
【０１６４】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットは、オリゴ（例えば、所与の長さの各オリゴ）の完全なレパートリーである。例えば、１０２４の個々の５量体の全セットが、コードされ、本開示の一実施形態による特有のレパートリーに含まれる。幾つかの実施形態において、複数の長さのレパートリーが、提供される。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットは、オリゴプローブのタイリングシリーズである。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットは、オリゴプローブのパネルである。合成生物学における特定の適用の場合（例えば、ＤＮＡデータ保存）、シーケンシングは、配列の特異的ブロックの順序を見出すことを含み、ここでそのブロックは所望のデータをコードするように設計される。
【０１６５】
図８Ａ、８Ｂおよび８Ｃにより示される通り、複数のプローブセット（例えば、８０４、８０６、および８０８）が、幾つかの実施形態において、任意の標的ポリマー８０２に適用される。それぞれのプローブタイプは、相補的な結合部位に優先的に結合するであろう。多くの実施形態において、それぞれのサイクル間での緩衝液による洗浄は、過去のセットにおけるプローブの除去を支援する。
【０１６６】
幾つかの実施形態において、核酸シーケンシングのためのプローブは、オリゴヌクレオチドであり、エピモディフィケーション（ｅｐｉ−ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ）のためのプローブは、修飾結合タンパク質もしくはペプチド（例えば、ＭＢＤ１などのメチル結合タンパク質）または抗修飾抗体（例えば、抗メチルＣ抗体）である。幾つかの実施形態において、オリゴプローブは、ゲノム中の特異的部位（例えば、既知の突然変異を有する部位）を標的とする。図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃに示される通り、オリゴヌクレオチド（例えば、８０４、８０６および８０８）とオルタネートプローブ（ａｌｔｅｒｎａｔｅ ｐｒｏｂｅｓ）（例えば、９０２）は両者とも、幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドまたはポリマー８０２に同時に（及び複数のサイクルにより）適用される。目的の標的部位を決定する方法は、参照により本明細書に組み入れられるＬｉｕ ｅｔ ａｌ., ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ９: ５０９（２００８）により提供される。
【０１６７】
幾つかの実施形態において、レパートリーのプローブのそれぞれ、またはレパートリーのプローブのサブセットは、一方が他方の後に適用される（例えば、１つまたはサブセットの結合が最初に検出され、その後、それが除去された後に、次のものが添加、検出および除去され、その後、次に進む、など）。幾つかの実施形態において、レパートリーの結合プローブの全てまたはサブセットが、同時に添加され、それぞれの結合プローブが、その同一性について完全にまたは部分的にコードする標識につながれ、結合プローブのそれぞれのコードが、検出により解読される。
【０１６８】
図１１Ａおよび１１Ｂにより示される通り、プローブのタイリングシリーズが、幾つかの実施形態において、複数のプローブの結合部位に関する情報を獲得するために用いられる。図１１Ａにおいて、第一のタイリングセット１１０４が、標的ポリヌクレオチド１１０２に適用される。第一のタイリングセット１１０８におけるプローブのサブセットのそれぞれのプローブは、１つの塩基１１０８を含有し、それにより標的ポリヌクレオチド１１０２中のその１つのヌクレオチドの５倍カバー率をもたらす。カバー率は、タイリングシリーズにおけるプローブのｋ量体長に比例するであろう（例えば、３量体オリゴのセットは、標的ポリヌクレオチド中の各塩基の３倍カバー率をもたらすであろう）。
【０１６９】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットが、標的ヌクレオチドに沿ってタイリングする場合、タイリングパス中に断絶が存在すれば問題が生じる可能性がある。例えば５量体のオリゴヌクレオチドセットを用いる場合、５塩基より長い標的分子中の配列の１つまたは複数の伸長に結合できるオリゴは存在しない。この場合、幾つかの実施形態において、１つまたは複数のアプローチがとられる。第一に、標的ポリヌクレオチドが二本鎖核酸を含むならば、１つまたは複数の塩基割り当ては、デュプレックスの相補鎖から得られた配列（複数可）に従う。第二に、標的分子の複数のコピーが利用可能である場合、１つまたは複数の塩基割り当ては、標的分子の他のコピー上の同じ配列の他のコピーに依存する。第三に、幾つかの実施形態において、参照配列が利用可能であれば、１つまたは複数の塩基割り当ては、参照配列に従い、かつ塩基は、それらが参照配列から人工的に植え込まれていることを示す注釈を付けられる。
【０１７０】
幾つかの実施形態において、特定のプローブが、様々な理由でレパートリーから省略される。例えばいくつかのプローブ配列は、自己相補性または回文配列などの、それ自体との、レパートリー中の他のプローブとの、またはポリヌクレオチドとの、問題のある相互作用を呈する（例えば、既知の確率論的な無差別な結合）。幾つかの実施形態において、情報性のあるプローブの最小数が、ポリヌクレオチドのそれぞれのタイプについて決定される。オリゴの完全なレパートリー内では、オリゴの半数が、オリゴの他の半数に対して完全に相補的である。幾つかの実施形態において、これらの相補対（および実質的な相補性による問題がある他のもの）はポリヌクレオチドに同時に添加されず、むしろ異なるプローブサブセットに割り当てられることが、保証されている。幾つかの実施形態において、センスとアンチセンスの両方の一本鎖ＤＮＡが存在する場合、シーケンシングは、それぞれのオリゴ相補対の１つのメンバーのみで実施される。センス鎖とアンチセンス鎖の両方から得られたシーケンシング情報が組み合わされて、全配列を作製する。しかしこの方法は、二本鎖ポリヌクレオチドの両方の鎖を同時にシーケンシングすることにより与えられる利点を失うため、好ましくない。
【０１７１】
幾つかの実施形態において、オリゴは、慣用的マイクロアレイ合成を利用して作製されたライブラリーを含む。幾つかの実施形態において、マイクロアレイライブラリーは、ゲノムの特異的標的部分に体系的に結合するオリゴを含む。幾つかの実施形態において、マイクロアレイライブラリーは、ポリヌクレオチド全体から特定の距離だけ離れた場所に体系的に結合するオリゴを含む。例えば１００万個のオリゴを含むライブラリーは、およそ３０００塩基ごとに結合するように設計されたオリゴを含み得る。同様に、一千万個のオリゴを含むライブラリーは、およそ３００塩基ごとに結合するように設計され得、三千万個のオリゴを含むライブラリーは、１００塩基ごとに結合するように設計され得る。幾つかの実施形態において、オリゴの配列は、参照ゲノム配列に基づいて計算的に設計される。
【０１７２】
幾つかの実施形態において、標的とされるゲノムの一部は、特異的遺伝子座である。他の実施形態において、標的とされるゲノムの一部は、ゲノムワイド関連解析の研究により同定された染色体間隔内の遺伝子座（例えば、癌につながる遺伝子）のパネルまたは遺伝子である。幾つかの実施形態において、標的とされる遺伝子座はまた、ゲノムのダークマター、典型的には反復性であるゲノムの異質染色体領域、ならびに反復領域の周辺にある複雑な遺伝子座である。そのような領域は、テロメア、セントロメア、末端動原体型染色体の短腕ならびに、ゲノムの他の複雑性の低い領域を含んだ。伝統的なシーケンシング法は、ゲノムの反復部分に対処できないが、ナノメートル精度が高ければ、方法は、これらの領域に包括的に対処する。
【０１７３】
幾つかの実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドプローブにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドは、ユニークなＮ量体配列を含み、この場合Ｎは、セット中の整数｛１、２、３、４、５、６、７、８および９｝であり、長さＮの全てのユニークなＮ量体配列は、複数のオリゴヌクレオチドプローブにより表される。
【０１７４】
プローブを作製するために用いられるオリゴの長さが長いほど、そのオリゴに対し影響を有する回文配列またはフォールドバック配列が効率的プローブとして機能する可能性が高い。幾つかの実施形態において、結合効率は、１つまたは複数の縮重塩基を除去してそのようなオリゴの長さを低減することにより、実質的に改善される。この理由から、より短いインターロゲーション配列（例えば、４量体）の使用は、有利である。しかし、より短いプローブ配列はまた、より安定性の低い結合（例えば、より低い結合温度）を呈する。幾つかの実施形態において、オリゴの結合安定性は、特異的な安定塩基修飾またはオリゴコンジュゲート（例えば、スチルベンキャップ）を用いて増強される。幾つかの実施形態において、完全に修飾された３量体または４量体（例えば、ロックされた核酸（ＬＮＡ））が、用いられる。
【０１７５】
幾つかの実施形態において、ユニークＮ量体配列は、１つまたは複数の縮重ヌクレオチドに占有された１つまたは複数のヌクレオチド位置を含む。幾つかの実施形態において、縮重位置は、４つのヌクレオチドの１つを含み、４つのヌクレオチドのそれぞれを有するバージョンが、反応ミックス中で提供される。幾つかの実施形態において、１つまたは複数のヌクレオチド位置でのそれぞれの縮重ヌクレオチド位置は、ユニバーサル塩基により占有される。幾つかの実施形態において、ユニバーサル塩基は、２’−デオキシイノシンである。幾つかの実施形態において、ユニークＮ量体配列は、５’末端で単一縮重ヌクレオチド位置に隣接され、３’末端で単一縮重ヌクレオチド位置に隣接される。幾つかの実施形態において、５’単一縮重ヌクレオチドおよび３’単一縮重ヌクレオチドは、それぞれ２’−デオキシイノシンである。
【０１７６】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、同じ長さＭである。幾つかの実施形態において、Ｍは、２以上の正の整数である。テスト基板上の位置の複数のセットから核酸の少なくとも一部の配列の決定（ｆ）は、位置の複数のセットにより表されるオリゴヌクレオチドプローブのオーバーラップ配列をさらに利用する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける別のオリゴヌクレオチドプローブとＭ−１配列相同性を共有する。
【０１７７】
プローブの標識
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、標識と結合される。図１４Ａ〜Ｅは、プローブを標識する異なる方法を示す。幾つかの実施形態において、標識は、色素、蛍光ナノ粒子、または光散乱粒子である。幾つかの実施形態において、プローブ１４０２は、標識１４０６に直接結合される。幾つかの実施形態において、プローブ１４０２は、オリゴ１４０８−Ａ上の配列に相補的な配列１４０８−Ｂを含むフラップ配列１４１０を介して間接的に標識される。
【０１７８】
好適な特徴を有する有機色素の多くのタイプが標識に利用可能であり、幾つかは、高い光安定性および／または高い量子効率および／または最小限の暗状態および／または高い溶解度および／または低い非特異的結合を有する。Ａｔｔｏ５４２は、複数の好適な品質を保有する好適な色素である。Ｃｙ３Ｂは非常に明るい色素であり、Ｃｙ３もまた効果的である。赤色色素Ａｔｔｏ６５５およびＡｔｔｏ６４７Ｎなどのいくつかの色素は、細胞または細胞内材料からの自己蛍光がよくみられる波長の回避を可能にする。多くのタイプのナノ粒子が、標識に利用可能である。蛍光標識されたラテックス粒子を超えて、本開示は、金または銀粒子、半導体ナノクリスタル、およびナノ粒子標識としてのナノダイアモンドを使用する。ナノダイアモンドは、幾つかの実施形態において、標識として特に好適である。ナノダイアモンドは、高い量子効率（ＱＥ）で光を発し、高い光安定性および長い蛍光寿命（例えば、およそ２０ｎｓであり、光散乱および／または自己蛍光から観察されるバックグランドを低減するのに用いられ得る）を有し、小さい（例えば、直径およそ４０ｎｍ）。ＤＮＡナノ構造およびナノボールは、有機色素をそれらの構造に組み込むことまたはインターカレーティング色素などの標識を拭い取ることにより、例外的に明るい標識であり得る。
【０１７９】
幾つかの実施形態において、それぞれの間接的標識は、塩基の同一性がプローブの配列インターロゲーション部分にコードされていることを明示する。幾つかの実施形態において、標識は、核酸インターカレーティング色素の１つまたは複数の分子を含む。幾つかの実施形態において、標識は、色素分子、蛍光ナノ粒子または光散乱粒子の１つまたは複数のタイプを含む。幾つかの実施形態において、より長い撮像時間を可能にするために、標識が急速に光退色しないことが、好ましい。
【０１８０】
図１２Ａ、１２Ｂおよび１２Ｃは、標的ポリヌクレオチド１２０６への、蛍光標識１２０２が付着されたオリゴヌクレオチド１２０４の一過性のオン−オフ結合を示す。標識１２０２は、プローブ１２０４が標的ポリヌクレオチド１２０６の結合部位に結合するか否かにかかわらず、蛍光を発する。同様に図１３Ａ、１３Ｂ、および１３Ｃは、非標識オリゴヌクレオチドプローブ１３０６の一過的オン−オフ結合を示す。結合事象は、溶液１３０２から一過的に形成するデュブレックス１３０４中への色素（例えば、ＹＯＹＯ−１）のインターカレーションにより検出される。インターカレーティング色素は、溶液中の自由な浮遊に比較して二本鎖核酸中に結合された場合に、蛍光の顕著な増加を呈する。
【０１８１】
幾つかの実施形態において、標的を結合するプローブは、直接標識されない。幾つかのそのような実施形態において、プローブは、フラップを含有する。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドを構築すること（例えば、それらをコードすること）は、オリゴヌクレオチドのセットにおけるそれぞれのｋ量体の一方の末端（例えば、フラップ配列）に特異的配列単位を連結することを含む。フラップのコード配列のそれぞれの単位は、異なる蛍光標識プローブのためのドッキング部位として作用する。５塩基のプローブ配列をコードするために、プローブ上のフラップは、５つの異なる結合場所を含有し、例えばそれぞれの場所は、次の場所に縦列につなげられた異なるＤＮＡ塩基配列である。例えばフラップ上の第一の位置は、プローブ配列（ポリヌクレオチドターゲットに結合する部分）に隣接し、第二の位置は、第一の位置に隣接する、などである。シーケンシングにプローブ−フラップを用いる利点において、種々のプローブ−フラップのそれぞれが、蛍光標識されたオリゴのセットに連結されて、プローブ配列のためのユニーク識別子タグを生成する。幾つかの実施形態において、これは、フラップ上のそれぞれの位置に相補的な４つの異なる標識のオリゴ配列（例えば、合計で１６の異なる標識）を使用することにより実行される。
【０１８２】
幾つかの実施形態において、Ａ、Ｃ、ＴおよびＧが画定されたプローブは、標識がオリゴヌクレオチド中の特異的位置でただ１つの画定されたヌクレオチドについて報告する（そして残りの位置が縮重している）様式で、コードされる。これは、ヌクレオチドごとに１つの色でちょうど４つのカラーコーディングを必要とする。
【０１８３】
幾つかの実施形態において、１つのフルオロフォアカラーのみが、工程全体で用いられる。そのような実施形態において、それぞれのサイクルは４つのサブサイクルに分割され、そのそれぞれにおいて、指定された位置（例えば、位置１）で４塩基の１つが個別に付加された後で、次のものが付加される。それぞれのサイクルにおいて、プローブは、同じ標識を担持する。この実行において、全レパートリーが、２０サイクルで使い尽くされ、大きな時間節約となる。
【０１８４】
幾つかの実施形態において、配列中の第一の塩基は、フラップ中の第一の単位によりコードされ、第二の塩基は第二の単位によりコードされる、などである。フラップ中の単位の順序は、オリゴ中の塩基配列の順序に対応する。異なる蛍光標識はその後、単位のそれぞれの上にドッキングされる（相補性塩基対合により）。第一の位置は、一例において、波長５００ｎｍ〜５３０ｎｍで発光し、第二は波長５５０ｎｍ〜５８０ｎｍで発光し、第三は６００ｎｍ〜６３０ｎｍ、第四は６５０ｎｍ〜６８０ｎｍ、そして第五は７００ｎｍ〜７３０ｎｍで発光する。それぞれの場所での塩基の同一性はその後、例えば蛍光寿命の標識によりコードされる。１つのそのような例において、Ａに対応する標識はより長い寿命Ｃを有し、Ｃは、Ｇより長い寿命を有し、Ｇは、Ｔより長い寿命を有する。先の例において、位置１の塩基Ａは、５００ｎｍ〜５３０ｎｍで発光し最も長い寿命を有し、位置３の塩基Ｇは、６００ｎｍ〜６３０ｎｍで発光し三番目に長い寿命を有する、などであろう。
【０１８５】
図１４Ｅに示される通り、プローブ１４０２は、配列１４０８−Ｂに対応する配列１４０８Ａを含むであろう。配列１４０８−Ｂは、フラップ領域１４１０に付着される。図１４Ｅの全構築物をもたらし得る可能な配列の例として、１４１０の４つの位置のそれぞれは、各々、配列ＡＡＡＡ（例えば、１４１２に相補的な位置）、ＣＣＣＣ（例えば、１４１４に相補的な位置）、ＧＧＧＧ（例えば、１４１６に相補的な位置）、およびＴＴＴＴ（例えば、１４１８に相補的な位置）により画定される。したがって全フラップ配列は、５’−ＡＡＡＡＣＣＣＣＧＧＧＧＴＴＴＴ−３’であろう。その後、それぞれの位置は、特異的発光波長によりコードされ、その位置にあり得る４つの異なる塩基は、４つの異なる蛍光寿命標識オリゴによりコードされ、ここで寿命／輝度比は、プローブ１４０２そのものの中の特有の位置および塩基コードに対応する。
【０１８６】
適切なコードの例は、以下の通りである：
・  位置１−Ａ  塩基コード−ＴＴＴＴ−発光ピーク５１０、寿命／輝度＃１
・  位置１−Ｃ  塩基コード−ＴＴＴＴ−発光ピーク５１０、寿命／輝度＃２
・  位置１−Ｇ  塩基コード−ＴＴＴＴ−発光ピーク５１０、寿命／輝度＃３
・  位置１−Ｔ  塩基コード−ＴＴＴＴ−発光ピーク５１０、寿命／輝度＃４
・  位置２−Ａ  塩基コード−ＧＧＧＧ−発光ピーク５６０、寿命／輝度＃１
・  位置２−Ｃ  塩基コード−ＧＧＧＧ−発光ピーク５６０、寿命／輝度＃２
・  位置２−Ｇ  塩基コード−ＧＧＧＧ−発光ピーク５６０、寿命／輝度＃３
・  位置２−Ｔ  塩基コード−ＧＧＧＧ−発光ピーク５６０、寿命／輝度＃４
・  位置３−Ａ  塩基コード−ＣＣＣＣ−発光ピーク６１０、寿命／輝度＃１
・  位置３−Ｃ  塩基コード−ＣＣＣＣ−発光ピーク６１０、寿命／輝度＃２
・  位置３−Ｇ  塩基コード−ＣＣＣＣ−発光ピーク６１０、寿命／輝度＃３
・  位置３−Ｔ  塩基コード−ＣＣＣＣ−発光ピーク６１０、寿命／輝度＃４
・  位置４−Ａ  塩基コード−ＡＡＡＡ−発光ピーク６６０、寿命／輝度＃１
・  位置４−Ｃ  塩基コード−ＧＧＧＧ−発光ピーク６６０、寿命／輝度＃２
・  位置４−Ｇ  塩基コード−ＧＧＧＧ−発光ピーク６６０、寿命／輝度＃３
・  位置４−Ｔ  塩基コード−ＧＧＧＧ−発光ピーク６６０、寿命／輝度＃４
【０１８７】
あるいは４つの位置は、蛍光寿命によりコードされ、塩基は、蛍光発光波長によりコードされる。幾つかの実施形態において、他の測定可能な物理的属性が、コーディングに代わりに用いられるか、または適合性があるならば、波長および寿命と組み合わせられてよい。例えば発光の偏光または輝度を測定して、フラップ中への含有に利用可能なコードのレパートリーを増加させることもできる。
【０１８８】
幾つかの実施形態において、トーホールドプローブ（例えば、Ｌｅｖｅｓｑｕｅ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｔｈｏｄｓ １０:８６５−８６７, ２０１３に記載）が、用いられる。これらのプローブは、部分的に二本鎖であり、ミスマッチングターゲットに結合された場合に、競合的に不安定化される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ５, ７８２−７８９, ２０１３に詳述される）。幾つかの実施形態において、トーホールドプローブは、単独で用いられる。幾つかの実施形態において、トーホールドプローブは、正しいハイブリダイゼーションを保証するために用いられる。幾つかの実施形態において、トーホールドプローブは、標的ポリヌクレオチドに結合された他のプローブのオフ反応を促進するために用いられる。
【０１８９】
共通の励起線（ｃｏｍｍｏｎ  ｅｘｃｉｔａｔｉｏｎ  ｌｉｎｅ）により励起される標識の例は、量子ドットである。この例による幾つかのそのような実施形態において、Ｑｄｏｔ ５２５、Ｑｄｏｔ ５６５、Ｑｄｏｔ ６０５、およびＱｄｏｔ ６５５が、４つの各ヌクレオチドであるように選択される。あるいは４つの異なるレーザ線を用いて、有機フルオロフォアを励起し、検出されたそれらの発光は、イメージスプリッタにより分割される。幾つかの他の実施形態において、発光波長は、有機色素の２つ以上に対し同じであるが、蛍光寿命は、異なる。当業者は、過度の労作および実験を行わずに、多数の異なるコーディングおよび検出スキームを想定し得るであろう。
【０１９０】
幾つかの実施形態において、レパートリー中の異なるオリゴは、個別に添加されず、むしろ一緒にコードおよびプールされる。一度に１つの色および１つのオリゴからの最も簡単なステップアップは、一度に２つの色および２つのオリゴである。５つのオリゴのそれぞれにつき１つの色素で、５つの識別可能な単一色素フレーバの直接的検出を利用して、一度に最大でおよそ５オリゴをプールすることを期待するのは合理的である。
【０１９１】
より複雑な例において、フレーバおよびコードの数が、増加する。例えば、３量体の完全なレパートリーにおけるそれぞれの塩基に対し個別にコードするために、６４の異なるコードが、要求される。また、例により、５量体の完全なレパートリーにおけるそれぞれの塩基に対し個別にコードするために、１０２４の異なるコードが、要求される。そのような多数のコードは、複数の色素フレーバで構成されたオリゴあたり１つのコードを有することにより実現される。幾つかの実施形態において、より小さいセットのコードを用いて、レパートリーのサブセット（サブレパートリー）をコードし、例えば幾つかの例において、６４のコードを用いて、５量体の完全な１０２４の配列レパートリーの１６のサブセットをコードする。
【０１９２】
幾つかの実施形態において、オリゴコードの大きなレパートリーが、多数の方法で得られる。例えば幾つかの実施形態において、ビーズが、コード特異性色素を装填されるか、またはＤＮＡナノ構造に基づくコードが、異なる蛍光波長を発する色素を最適な間隔で含む（例えば、Ｌｉｎ ｅｔ ａｌ., Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４: ８３２−８３９, ２０１２）。例えば図１４Ｃおよび１４Ｄは、蛍光標識１４１４を担持するビーズ１４１２の使用を示す。図１４Ｃにおいて、標識１４１４は、ビーズ１４１２上にコーティングされる。図１４Ｄにおいて、標識１４１４は、ビーズ１４１２中にカプセル化される。幾つかの実施形態において、それぞれの標識１４１４は、異なるタイプの蛍光分子である。幾つかの実施形態において、標識１４１４は全て、同じタイプの蛍光分子（例えば、Ｃｙ３）である。
【０１９３】
幾つかの実施形態において、コード化スキームが用いられ、そこでモジュラーコードを用いてオリゴ中の塩基の位置およびその同一性を記載する。幾つかの実施形態において、これは、プローブを同定する標識の組み合わせを含むプローブにコーティングアームを付加することにより、実行される。例えば、それぞれの可能な５量体オリゴヌクレオチドプローブのライブラリーがコードされるべき場合には、アームは、５つの部位を有し、それぞれの部位は、５量体中の５つのヌクレオベースのそれぞれに対応し、５つの部位のそれぞれは、５つの区別可能な種に結合される。１つのそのような例において、特異的ピークの発光波長を有するフルオロフォアは、位置のそれぞれに対応し（例えば、位置１に対し５００ｎｍ、位置２に対し５５０ｎｍ、位置３に対し６００ｎｍ、位置４に対し６５０ｎｍおよび位置５に対し７００ｎｍ）、同じ波長であるが異なる蛍光寿命を有する４つのフルオロフォアは、それぞれの位置で４つの塩基のそれぞれをコードする。
【０１９４】
幾つかの実施形態において、オリゴ上の異なる標識または他の結合試薬は、発光波長によりコードされる。幾つかの実施形態において、異なる標識は、蛍光寿命によりコードされる。幾つかの実施形態において、異なる標識は、蛍光偏光によりコードされる。幾つかの実施形態において、異なる標識は、波長と蛍光寿命の組み合わせによりコードされる。
【０１９５】
幾つかの実施形態において、異なる標識は、反復オン−オフハイブリダイゼーション速度によりコードされる。異なる結合−解離定数を有する異なる結合プローブが、用いられる。幾つかの実施形態において、プローブは、蛍光強度によりコードされる。幾つかの実施形態において、プローブは、異なる数の付着された非自己クエンチングフルオロフォアを有することによりコードされる蛍光強度である。個々のフルオロフォアは典型的には、クエンチしないように充分分離される必要がある。幾つかの実施形態において、これは、硬質のリンかーまたはＤＮＡナノ構造を利用して遂行されて、標識を互いからの適切な距離で所定の場所に保持する。
【０１９６】
蛍光強度によりコードするための代わりの一実施形態は、類似の発光スペクトルを有するが量子収率または他の測定可能な光学特性が異なる色素変異体を使用することである。例えば励起／発光５５８／５７２を有するＣｙ３Ｂは、励起／発光５５０／５７０および０．１５の量子収率を有するＣｙ３よりも実質的に明るい（例えば、量子収率０．６７）が、類似の吸収／発光スペクトルを有する。幾つかのそのような実施形態において、５３２ｎｍレーザを用いて、両方の色素を励起する。他の適切な色素としては、上方にシフトした励起および発光スペクトルを有するがそれにもかかわらず５３２ｎｍレーザにより励起されるＣｙ３．５（励起／発光５９１／６０４ｎｍ）が挙げられる。しかしその波長での励起は、Ｃｙ３．５にとって最適には届かず、色素の発光は、Ｃｙ３用のバンドパスフィルターではそれほど明るくないと思われる。励起／発光５３２／５５３を有するＡｔｔｏ５３２は、量子収率０．９を有し、５３２ｎｍレーザがこの色素にスイートスポットで当たるため、明るいと予測される。
【０１９７】
単一励起波長を用いて複数のコードを得る別のアプローチは、色素の発光寿命を測定することである。そのような実施形態による一例において、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５４６、Ｃｙ３Ｂ、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ５５５を含むセットが、用いられる。幾つかの例において、他の色素セットが、より有用である。幾つかの実施形態において、コードのレパートリーは、ＦＲＥＴ対を利用することにより、及び発光の偏光を測定することによっても拡大される。標識の数を増加させるための別の方法は、複数の色でコードすることによる。
【０１９８】
図１５は、ポリヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドプローブの一過的結合からの蛍光の例を示す。時系列からの選択されたフレーム（例えば、フレーム番号１、２０、４０、６０、８０、１００）は、オン−オフ結合の指標である、特異的部位でのシグナルの存在（例えば、黒いスポット）および不在（例えば、白い領域）を示す。それぞれの各フレームは、ポリヌクレオチドに沿った複数の結合されたプローブの蛍光を示す。集合体の画像は、過去のフレーム全ての蛍光の集合を示し、オリゴヌクレオチドプローブが結合した全ての部位を示す。
【０１９９】
標的ポリヌクレオチドへのプローブの一過的結合
プローブの結合は、力学的工程であり、結合されるプローブは常に、非結合になる確率を幾らか有する（例えば、温度および塩濃度を含む様々な因子により決定される）。こうして１つのプローブを他のものと置き換える好機は、常に存在する。例えば一実施形態において、プローブの相補鎖が用いられ、それは表面で伸長された標的ＤＮＡと溶液中の相補鎖へのアニーリングの間で連続的競合を引き起こす。別の実施形態において、プローブは３つの部分を有し、第一の部分は標的と相補性があり、第二の部分は標的に部分的に相補性がありかつ溶液中のオリゴに部分的に相補性があり、第三の部分は溶液中のオリゴに相補性がある。幾つかの実施形態において、化学構造の単位の精密な空間的場所に関する情報を集めることは、高分子の構造および／または配列を決定する一助となる。幾つかの実施形態において、プローブ結合部位の場所は、ナノメートルサイズまたはさらにサブナノメートルサイズの精度で決定される（例えば、単一分子位置特定アルゴリズムを用いることによる）。幾つかの実施形態において、物理的により接近した複数の観察される結合部位は、回折限界光学撮像法により解像可能であり、結合事象は時間的に分離されているため、解像される。核酸の配列は、それぞれの場所に結合するプローブの同一性に基づいて決定される。
【０２００】
暴露は、各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブが個々のプローブに相補的な固定された第一の鎖または固定された第二の鎖のそれぞれの一部と一過的かつ可逆的に結合しかつ各ヘテロデュプレックスを形成することを可能にする条件下で起こり、それにより光学活性のインスタンスを生じる。幾つかの実施形態において、滞留時間（例えば、特有のプローブによる結合の持続および／または維持）が、結合事象が完全なマッチ、ミスマッチ、またはスプリアスであるかを決定する際に用いられる。
【０２０１】
幾つかの実施形態において、暴露は、各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブが反復的に個々のプローブに相補的な固定された第一の鎖または固定された第二の鎖のそれぞれの一部と一過的かつ可逆的に結合しかつ各ヘテロデュプレックスを形成することを可能にする条件下で起こり、それにより反復的に光学活性の各インスタンスを生じる。
【０２０２】
幾つかの実施形態において、シーケンシングは、延長されたポリヌクレオチドを、次から次に提供されるプローブ（１つのプローブ配列を担う溶液が除去され、次のプローブ溶液を担う溶液が添加される）の完全な配列レパートリーのそれぞれからの一過性の相互作用に供することを含む。幾つかの実施形態において、それぞれのプローブの結合は、プローブを一過的に結合させる条件下で実行される。そのため例えば、結合は、１つのプローブに対して２５℃で、次のものに対して３０℃で実行される。またプローブは、セット中で結合され得、例えば一過的に結合するプローブの全てが、ほぼ同じような方法で、セットに集められて一緒に使用され得る。幾つかのそのような実施形態において、セットのそれぞれのプローブ配列は、差次的に標識または差次的にコードされる。
【０２０３】
幾つかの実施形態において、一過的結合は、少量の二価陽イオンを含むが一価陽イオンを含まない緩衝液中で実行される。幾つかの実施形態において、緩衝液は、５ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ  塩化マグネシウム、ｍｍ  ＥＤＴＡ、０．０５％  Ｔｗｅｅｎ−２０、およびｐＨ８を含む。幾つかの実施形態において、緩衝液は、１ｎＭ未満、５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、または１５ｎＭ未満の塩化マグネシウムを含む。
【０２０４】
幾つかの実施形態において、一過的結合を促進する複数の条件が、用いられる。幾つかの実施形態において、プローブ種の全レパートリー、例えば１０２４の可能な５量体のレパートリーからのそれぞれ５量体種に対して、ある条件が、そのＴｍに依存してあるプローブ種に用いられ、別の条件が、そのＴｍに依存して別のプローブに用いられる、などである。幾つかの実施形態において、５１２の非相補性５量体のみが、提供される（例えば、標的ポリヌクレオチド鎖の両方が、試料中に存在するため）。幾つかの実施形態において、それぞれのプローブ付加は、５つの特異的塩基と２つの縮重塩基（だから、7量体は１６）とを含むプローブの混合物を含み、全てが、インターロゲーション配列への能力に関して１つの５量体として機能する同じ標識で標識される。縮重塩基は、プローブセットの複雑性を増加させずに安定性を付加する。
【０２０５】
幾つかの実施形態において、同じ条件は、同じまたは類似のＴｍを共有する複数のプローブに提供される。幾つかのそのような実施形態において、レパートリー中のそれぞれのプローブは、異なるコード化標識（または同定されるものに応じた標識）を含む。そのような例において、温度は、複数のプローブ交換を通して保持された後、同じまたは類似のＴｍを共有する次のプローブシリーズのために上昇される。
【０２０６】
幾つかの実施形態において、プローブ結合期間の過程中に、温度は、１つより多くの温度でプローブの結合挙動が決定されるように、改変される。幾つかの実施形態において、類似の溶融曲線が実行され、ここで標的ポリマーへの結合挙動または結合パターンが、選択された範囲にわたる段階的な一連の温度（例えば、１０℃〜６５℃または１℃〜３５℃）と相関される。
【０２０７】
幾つかの実施形態において、Ｔｍは、例えば近傍法パラメータにより、計算される。他の実施形態において、Ｔｍは、経験的に導かれる。例えば最適な溶融温度範囲は、溶融曲線を実行することにより導かれる（例えば様々な温度にわたり、吸収により溶融の度合いを測定する）。幾つかの実施形態において、プローブセットの組成は、経験的テストにより検証された理論的に一致するそれらのＴｍに従って設計される。幾つかの実施形態において、結合は、実質的にＴｍ未満の温度（例えば、計算されたＴｍより最大で３３℃低い）で実施される。幾つかの実施形態において、それぞれのオリゴについて経験的に定義された最適温度が、シーケンシングにおけるそれぞれのオリゴの結合に用いられる。
【０２０８】
幾つかの実施形態において、異なるＴｍを有するオリゴヌクレオチドプローブのために温度を改変する代わりに、またはそれに加えて、プローブおよび／もしくは塩の濃度が改変され、かつ／またはｐＨが、改変される。幾つかの実施形態において、表面の電気的バイアスが、反復的に正と負で切り替えられて、プローブと１つまたは複数の標的分子の間の一過的結合を能動的に促す。
【０２０９】
幾つかの実施形態において、用いられるオリゴの濃度は、オリゴ配列のＡＴ対ＧＣ含量に従って調整される。幾つかの実施形態において、より高いオリゴ濃度が、よりＧＣ含量の高いオリゴに提供される。幾つかの実施形態において、塩基組成の影響を均等にする緩衝液（例えば、ＣＴＡＢ、ベタインまたはカオトロピック試薬、例えばテトラメチルアンモニウムクロリド（ＴＭＡＣｌ）を含有する緩衝液）が、２．５Ｍ〜４Ｍの濃度で用いられる。
【０２１０】
幾つかの実施形態において、プローブは、確率論的影響またはシーケンシングチャンバーの設計の態様のため（例えば、ナノチャネルのコーナーでまたはナノチャネルの壁に対してプローブをトラップするフローセル中の渦）、試料（例えば、フローチャンバー、スライド、ポリヌクレオチド（複数可）の長さおよび／またはポリヌクレオチドの整列したアレイ）にわたり不均一に分布される。プローブの局所的欠如は、プローブ溶液の効率的混合または撹拌が存在することを確保することにより対処される。幾つかの実施形態において、これは、溶液中に撹乱を生じる粒子を含めることにより、かつ／または乱流を生じるようなフローセル（例えば、１つまたは複数の表面のヘリンボンパターン）を組み立てることにより、音響波を用いて実施される。加えて、フローセルに存在する層流のせいで、典型的にはほとんど混合がなく、表面付近の溶液は、バルク溶液と極わずかしか混合しない。これは、表面付近に存在する試薬／結合プローブを除去する際に、及び新鮮な試薬／プローブを表面にもたらすことにおいて、問題を生じる。上記の撹乱を生じるアプローチを実行してこれに抵抗でき、かつ／または表面全体での大規模な流体流れ／交換を実行できる。幾つかの実施形態において、標的分子が並べられた後、非蛍光ビーズまたは球体が表面に付着され、表面のランドスケープ（ｌａｎｄｓｃａｐｅ）に粗い質感を与える。これは、表面付近の流体をより効果的に混合および／または交換するのに必要とされる渦および流れを作る。
【０２１１】
幾つかの実施形態において、全レパートリーまたはサブセットが、一緒に添加される。幾つかのそのような実施形態において、塩基組成の影響を均等にする緩衝液（例えば、ＴＭＡＣｌまたはチオシアン酸グアニジンなど、米国特許出願公開第２００４／００５８３４９号に記載）が、用いられる。幾つかの実施形態において、同じまたは類似のＴｍを有するプローブ種が、一緒に添加される。幾つかの実施形態において、一緒に添加されるプローブ種は、差次的に標識されていない。幾つかの実施形態において、一緒に添加されるプローブ種は、差次的に標識されている。幾つかの実施形態において、差次的標識は、異なる輝度、寿命もしくは波長、および／またはそのような物理的特性の組み合わせを有する、発光を有する標識である。
【０２１２】
幾つかの実施形態において、２つ以上のオリゴが一緒に用いられ、それらの結合場所は、異なるオリゴのシグナル間を区別する条件を用いずに決定される（例えば、オリゴは、同じ色で標識される）。両方のデュプレックス鎖が利用可能である場合、両鎖から結合部位のデータを得ることは、組み立てアルゴリズムの一部として２つ以上のオリゴヌクレオチドの間の識別を可能にする。幾つかの実施形態において、１つまたは複数の参照プローブが、レパートリーの各プローブと一緒に添加され、組み立てアルゴリズムがその後、そのような参照プローブの結合場所を使用して、配列組み立てに足場を作る、または配列組み立てを据え付けることができる。
【０２１３】
１つの代わりの実施形態において、プローブは、安定に結合するが、環境をオフモードに切り替える外部トリガーが、それらの一過性を制御する。非限定的実施形態において、トリガーは、プローブを解放する熱、ｐＨ、電場または試薬交換である。その後、環境が再びオンモードに切り替えられると、プローブが再度結合できるようになる。幾つかの実施形態において、結合が、結合の第一ラウンドで全ての部位を飽和しない場合、結合の第二周期のオリゴが、第一周期と異なる部位の異なるセットに結合する。幾つかの実施形態において、これらの周期が、制御可能な速度で複数回実行される。
【０２１４】
幾つかの実施形態において、一過性の結合は、１ミリ秒以下、５０ミリ秒以下、５００ミリ秒以下、１マイクロ秒以下、１０マイクロ秒以下、５０マイクロ秒以下、５００マイクロ秒以下、１秒以下で、２秒以下、５秒以下、または１０秒以下の間、持続する。
【０２１５】
新鮮なプローブの連続供給を確保する一過性の結合アプローチでは、フルオロフォアの光退色は大きな問題を引き起こさず、洗練された視野絞りまたはパウェルレンズは、発光を限定するのに必要とされない。それゆえ、フルオロフォアの選択（または退色防止剤、レドックスシステムの提供）は、重要でなく、幾つかのそのような実施形態において、比較的簡単な光学システムが、構築される（例えば、カメラの視野にない分子の照明を予防するｆ−ストップは、必要性が高くない）。
【０２１６】
幾つかの実施形態において、一過的結合の別の利点は、複数の測定がポリヌクレオチドに沿った各結合部位で実行され、これにより検出の正確度における信頼性が上昇し得ることである。例えば幾つかの例において、分子工程の典型的な確率論的性質のため、プローブは誤った場所に結合する。一過的に結合されたプローブでは、そのような外れて孤立した結合事象は、廃棄され得、複数の検出された相互作用により証明されたそれらの結合事象のみが、配列決定の目的のための検証された検出事象として許容される。
【０２１７】
一過的結合の検出および結合部位の位置特定
一過的結合は、位置特定のサブ回折レベルを可能にする不可欠な構成要素である。一過的に結合するプローブのセット中のそれぞれのプローブが、標的分子に結合される、または溶液中に存在する確率は、どんな時でも存在する。したがって、結合部位の全てが、どの時点においてもプローブに結合されるとは限らない。これは、光の回折限界よりも近い部位（例えば、標的分子上の１０ｎｍだけ離れた２つの部位）での結合事象の検出を可能にする。例えば、配列ＡＡＧＣＴＴが、６０塩基の後に反復されれば、それは、反復配列がおよそ２０ｎｍ離れていることを意味する（標的が延長されおよそ０．３４ｎｍのワトソンクリック塩基長へと真っすぐにされる場合）。２０ナノメートルは、通常は光学撮像により識別できない。しかしプローブが、撮像の間の異なる時間で２つの部位に結合する場合、それらは、個別に検出される。これは、結合事象の超解像イメージングを可能にする。ナノメートルサイズの精度は、反復を解像しそれらの数を決定するために特に重要である。
【０２１８】
幾つかの実施形態において、標的中の場所への複数の結合事象は、単一プローブ配列からのものではなく、レパートリーからのデータを解析すること、および部分的にオーバーラップした配列から生じる事象を考慮することにより、決定される。一例において、同じ（実際にはナノメートル以下で接近した）場所は、共通の５塩基配列を共有しかつ、そのそれぞれが他の配列を検証する、６量体であるプローブＡＴＴＡＡＧおよびＴＴＡＡＧＣにより結合され、及び５塩基のいずれかの側にある１塩基の配列を拡張する。幾つかの例において、５塩基配列のそれぞれの側にある塩基は、ミスマッチであり（末端でのミスマッチは典型的には、内部にあるミスマッチよりも耐容されると予測される）、結合事象の両方に存在する５塩基配列のみが、検証される。
【０２１９】
幾つかの代わりの実施形態において、一過性の単一分子結合が、非光学法により検出される。幾つかの実施形態において、非光学法は、電気的方法である。幾つかの実施形態において、一過性の単一分子結合は、非蛍光法により検出され、そこでは直接励起法はなく、むしろ生物発光または化学発光機構が用いられる。
【０２２０】
幾つかの実施形態において、標的核酸中のそれぞれの塩基は、配列がオーバーラップする複数のオリゴによりインターロゲートされる。各塩基のこの反復サンプリングは、標的ポリヌクレオチド中の希少な単一ヌクレオチド変異体または突然変異の検出を可能にする。
【０２２１】
本開示の幾つかの実施形態は、各オリゴヌクレオチドが解析下でポリヌクレオチドと有した結合相互作用（閾値結合期間を超える）のレパートリーを考慮する。幾つかの実施形態において、シーケンシングは、完全な一致からの配列をスティッチングまたは再構成することを含むだけでなく、各オリゴの結合傾向を最初に解析することにより配列を得る。幾つかの実施形態において、一過的結合は、検出の手段として記録されるが、位置特定を改善するのには用いられない。
【０２２２】
光学活性を検出し結合部位の位置特定を決定する撮像技術
ブロック２１４  二次元イメージャを用いて暴露の間に生じる光学活性のそれぞれの各インスタンスのテスト基板上の位置および期間が測定される。
【０２２３】
テスト基板上の場所の測定は、二次元イメージャにより測定されたデータのフレームをトレーニングされた畳み込みニューラルネットワークに入力することを含む。データのフレームは、光学活性の複数のインスタンス中の光学活性の各インスタンスを含む。光学活性の複数のインスタンスにおける光学活性のそれぞれのインスタンスは、固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の一部に結合する個々のプローブに対応する。入力に応答して、トレーニングされた畳み込みニューラルネットワークが、光学活性の複数のインスタンスにおける光学活性の１つまたは複数のインスタンスのそれぞれのテスト基板上の位置を同定する。
【０２２４】
幾つかの実施形態において、検出器は、２次元検出器であり、結合事象は、ナノメートルサイズの正確度まで位置特定される（例えば、単一分子位置特定アルゴリズムを使用することにより）。幾つかの実施形態において、相互作用の特徴は、各結合事象の期間を含み、それはプローブ（複数可）と分子の親和性に対応する。幾つかの実施形態において、特徴は、表面またはマトリックス上の場所であり、それは特有の分子のアレイ内の場所に対応する（例えば、特異的遺伝子配列に対応するポリヌクレオチド）。
【０２２５】
幾つかの実施形態において、光学活性のそれぞれの各インスタンスは、所定の閾値を満たす観察メトリックを有する。幾つかの実施形態において、観察メトリックは、期間、信号対ノイズ比、光子計数、または強度を含む。幾つかの実施形態において、所定の閾値は、光学活性の各インスタンスが１つのフレームで観察される場合、満たされる。幾つかの実施形態において、所定の閾値は、光学活性の各インスタンスが比較的低く、かつ光学活性の各インスタンスが１０分の１のフレームで観察される場合、満たされる。
【０２２６】
幾つかの実施形態において、所定の閾値は、（ｉ）ユニークなＮ量体配列のそれぞれの残基が核酸の固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の中の相補性塩基に結合する、結合の第一の形態と、（ｉｉ）ユニークなＮ量体配列と、各オリゴヌクレオチドプローブが結合して光学活性の各インスタンスを形成する核酸の固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の中の配列と、の間に少なくとも１つのミスマッチが存在する、結合の第二の形態、を区別する。
【０２２７】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブは、独自の対応する所定の閾値を有する。
【０２２８】
幾つかの実施形態において、所定の閾値は、ポリヌクレオチドに沿った特有の場所での１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、または６以上の結合事象を観察することに基づいて決定される。
【０２２９】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブの所定の閾値は、トレーニングデータセット（例えば、シーケンシングのラムダファージに方法を適用することにより得られる情報から導かれるデータセット）から導かれる。
【０２３０】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブの所定の閾値は、トレーニングデータセットから導かれる。トレーニングセットは、各オリゴヌクレオチドプローブのユニークなＮ量体配列のそれぞれの残基が参照配列中の相補的塩基に結合するように参照配列への結合の際の各オリゴヌクレオチドプローブについての観察メトリックの尺度を、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブ用に、含む。
【０２３１】
幾つかの実施形態において、参照配列は、参照基板上に固定される。幾つかの実施形態において、参照配列は、核酸と共に含まれ、テスト基板上に固定される。幾つかの実施形態において、参照配列は、ＰｈｉＸ１７４、 Ｍ１３、ラムダファージ、Ｔ７ファージ、大腸菌、出芽酵母、または分裂酵母のゲノムの全てまたは一部を含む。幾つかの実施形態において、参照配列は、既知の配列の合成構築物である。幾つかの実施形態において、参照配列は、ウサギグロビンＲＮＡの全てまたは一部を含む（例えば、核酸がＲＮＡを含む場合、またはポリヌクレオチドの一方の鎖のみがシーケンシングされる場合）。
【０２３２】
幾つかの実施形態において、暴露は、インターカレーティング色素の形態の第一の標識の存在下である。オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれの各オリゴヌクレオチドプローブは、第二の標識と結合される。第一の標識および第二の標識は、第一の標識と第二の標識が互いに接近している時に第一の標識および第二の標識の一方を蛍光発光させる、オーバーラップするドナー発光スペクトルおよびアクセプター励起スペクトルを有する。光学活性の各インスタンスは、第二の標識へ、オリゴヌクレオチドと固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の間の各ヘテロデュプレックスをインターカレートする、インターカレーティング色素の付近に由来する。幾つかの実施形態において、暴露および蛍光は、フェルスター共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）法を含む。そのような実施形態において、インターカレーティング色素は、ＦＲＥＴドナーを含み、第二の標識は、ＦＲＥＴアクセプターを含む。
【０２３３】
幾つかの実施形態において、シグナルは、プローブまたは標的配列上のインターカレーティング色素から標識へのＦＲＥＴにより検出される。幾つかの実施形態において、標的が不動化された後、全ての標的分子の末端は、例えばＦＲＥＴパートナーとして作用する蛍光標識ヌクレオチドを組み込んだターミナルトランスフェラーゼにより、標識される。幾つかのそのような実施形態において、プローブは、Ｃｙ３ＢまたはＡｔｔｏ ５４２標識により末端の一方で標識される。
【０２３４】
幾つかの実施形態において、ＦＲＥＴは、光活性化により置き換えられる。そのような実施形態において、ドナー（例えば、鋳型上の標識）は、光活性化剤を含み、アクセプター（例えば、オリゴヌクレオチド上の標識）は、不活性または暗色状態でフルオロフォアになる（例えば、Ｃｙ５は、蛍光撮像実験の前に、ｐＨ ７．５の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ、２ｍＭ  ＥＤＴＡ、および５０ｍＭ ＮａＣｌ中の１ｍｇ／ｍＬ  ＮａＢＨ４でケージングすることにより暗化され得る）。そのような実施形態において、暗化されたフルオロフォアの蛍光は、活性化剤の付近にある時にスイッチオンにされる。
【０２３５】
幾つかの実施形態において、暴露は、インターカレーティング色素（例えば、光活性化剤）の形態の第一の標識の存在下である。オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、第二の標識（例えば、暗化されたフルオロフォア）と結合される。第一の標識は、第一の標識と第二の標識が互いに接近している時に、第二の標識を蛍光発光させる。光学活性の各インスタンスは第二の標識へ、オリゴヌクレオチドと固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の間の各ヘテロデュプレックスをインターカレートする、インターカレーティング色素の付近に由来する。
【０２３６】
幾つかの実施形態において、暴露は、インターカレーティング色素（例えば、暗化されたフルオロフォア）の形態の第一の標識の存在下である。オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、第二の標識（例えば、光活性化剤）と結合される。第二の標識は、第一の標識と第二の標識が互いに接近している時に、第一の標識を蛍光発光させる。光学活性の各インスタンスは、第二の標識へ、オリゴヌクレオチドと固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の間の各ヘテロデュプレックスをインターカレートする、インターカレーティング色素の付近に由来する。
【０２３７】
幾つかの実施形態において、暴露は、インターカレーティング色素の存在下である。光学活性の各インスタンスはインターカレーティング色素の蛍光から、オリゴヌクレオチドと固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の間の各ヘテロデュプレックスをインターカレーティングし、ここで光学活性の各インスタンスは、インターカレーティング色素が各ヘテロデュプレックスをインターカレートする前に、その蛍光よりも大きい。デュプレックス中にインターカレートする１種または複数の色素の増強された蛍光（１００倍以上）は、単一分子位置特定アルゴリズムのための点光源様シグナルを提供し、結合部位の場所の精密な決定を可能にする。インターカレーティング色素は、デュプレックスにインターカレートし、確実に検出されかつ精密に位置特定される各結合部位のための顕著な数のヘテロデュプレックス結合事象を生じる。
【０２３８】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブは、固定された第一の鎖の相補的部分に結合することによる光学活性の第一のインスタンスと、固定された第二の鎖の相補的部分に結合することによる光学活性の第二のインスタンスとを生成する。幾つかの実施形態において、固定された第一の鎖の一部は、その相補性オリゴヌクレオチドプローブの結合による光学活性のインスタンスを生成し、固定された第一の鎖の一部に相補的な固定された第二の鎖の一部は、その相補性オリゴヌクレオチドプローブの結合による光学活性の別のインスタンスを生成する。
【０２３９】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブは、固定された第一の鎖の２つ以上の相補的部分に結合することによる光学活性の２つ以上の第一のインスタンスと、固定された第二の鎖の２つ以上の相補的部分に結合することによる光学活性の２つ以上の第二のインスタンスとを生成する。
【０２４０】
幾つかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドプローブは、暴露の間に各オリゴヌクレオチドプローブに相補的な固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の一部に３回以上結合し、それにより光学活性の３つ以上のインスタンスをもたらし、光学活性のそれぞれのインスタンスは、複数の結合事象における一結合事象を現す。
【０２４１】
幾つかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドプローブは、暴露の間に各オリゴヌクレオチドプローブに相補的な固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の一部に５回以上結合し、それにより光学活性の５つ以上のインスタンスをもたらす。光学活性のそれぞれのインスタンスは、複数の結合事象における一結合事象を現す。
【０２４２】
幾つかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドプローブは、暴露の間に各オリゴヌクレオチドプローブに相補的な固定された第一の鎖または固定された第二の鎖の一部に１０回以上結合し、それにより光学活性の１０以上のインスタンスをもたらし、光学活性のそれぞれのインスタンスは、複数の結合事象における一結合事象を現す。
【０２４３】
幾つかの実施形態において、暴露は、５分以下、４分以下、３分以下、２分以下、または１分以下の間、起こる。
【０２４４】
幾つかの実施形態において、暴露は、二次元イメージャの１つまたは複数のフレームにわたり起こる。幾つかの実施形態において、暴露は、二次元イメージャの２つ以上のフレームにわたり起こる。幾つかの実施形態において、暴露は、二次元イメージャの５００以上のフレームにわたり起こる。幾つかの実施形態において、暴露は、二次元イメージャの５，０００以上のフレームにわたり起こる。幾つかの実施形態において、光学活性が希薄な場合（例えば、プローブ結合のインスタンスがほとんど存在しない）、シグナルを位置特定するのに、一過的結合の１つのフレームで充分である。
【０２４５】
幾つかの実施形態において、暴露のインスタンスの時間長は、暴露のインスタンスに用いられるオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの推定溶融温度により決定される。
【０２４６】
幾つかの実施形態において、光学活性は、標識からの蛍光発光を含む。各標識が励起され、対応する発光波長が、フィルターホイール中の異なるフィルターを用いることにより別々に検出される。幾つかの実施形態において、発光寿命は、蛍光寿命撮像（ＦＬＩＭ）システムを用いて測定される。あるいは波長は、分割され、単一センサーの異なる量子、または４つの別のセンサーに発射される。プリズムを用いてＣＣＤの画素でのスペクトルを分割する方法が、Ｌｕｎｄｑｕｉｔ ｅｔ ａｌ., Ｏｐｔ Ｌｅｔｔ., ３３:１０２６−８, ２００８に記載された。幾つかの実施形態において、分光写真機も、用いられる。あるいは幾つかの実施形態において、発光波長を輝度レベルと組み合わせて、結合部位におけるプローブの滞留時間に関する情報を提供する。
【０２４７】
走査型プローブ顕微鏡法（高速原子間力顕微鏡法を含む）および電子顕微鏡法などの複数の検出方法は、ポリヌクレオチド分子が検出平面で延長される場合、ナノメートル距離を解像できる。しかしこれらの方法は、フルオロフォアの光学活性に関する情報を提供しない。超解像の精度で蛍光分子を検出するための光学撮像技術が複数存在する。これらは、誘導放出抑制顕微鏡法（ＳＴＥＤ）、確率論的な再構築光学顕微鏡（ＳＴＯＲＭ）、超解像ゆらぎイメージング（ＳＯＦＩ）、一分子位置特定顕微鏡法（ＳＭＬＭ）および全反射照明蛍光（ＴＩＲＦ）顕微鏡法 を含む。幾つかの実施形態において、ナノスケールトポグラフィーでの点集積（ＰＡＩＮＴ）に最も類似したＳＭＬＭアプローチが、好ましい。これらの方法は典型的には、フルオロフォアを励起するための１つまたは複数のレーザ、焦点検出／固定メカニズム、ＣＣＤカメラ、適当な対物レンズ、リレーレンズおよびミラーを必要とする。幾つかの実施形態において、検出ステップは、複数の画像フレーム（例えば、映画またはビデオ）を撮影して、プローブの結合オンおよびオフを記録することを含む。
【０２４８】
ＳＭＬＭ法は、高い光子計数に依存する。高い光子計数は、それによりガウスパターンで生成されたフルオロフォアの重心が決定される精度を改善するが、高い光子計数の要件はまた、長期の画像獲得、および明るく光安定性のあるフルオロフォアへの依存性にも関連する。プローブの高い溶液濃度は、クエンチされたプローブ分子ビーコンを用いること、または同じタイプの２つ以上の標識を、例えばオリゴの各側に１つずつ有することにより、有害なバックグランドを誘発せずに実行される。そのような実施形態において、これらの標識は、色素間相互作用を介して溶液中でクエンチされる。しかし、標識は、それらの標的に結合されると、分離するようになり、明るく蛍光発光して、標識をより容易に検出させることができる。
【０２４９】
幾つかの実施形態において、プローブのオンレートは、プローブ濃度を上昇させること、温度を上昇させること、または分子クラウディング（例えば、溶液にＰＥＧ４００、ＰＥＧ８００などを含めることにより）を上昇させることにより操作される（例えば、上昇される）。その化学成分を改変すること、不安定化する付加物を添加すること、またはオリゴヌクレオチドの場合にはそれらの長さを減少させること、によりプローブの熱安定性を低下させると、オフレートを上昇させることができる。幾つかの実施形態において、オフレートは、温度を上昇させること、塩濃度を低下させること（例えば、ストリンジェンシーを上昇させること）、またはｐＨを改変すること、によっても促進される。
【０２５０】
幾つかの実施形態において、用いられるプローブ濃度は、プローブを、それらが結合するまで、本質的に非蛍光性にすることにより上昇される。これを実行する１つの方法は、結合が光活性化事象を誘導することである。別の方法は、結合が起こるまで標識をクエンチすることである（例えば、分子ビーコン）。別の方法は、シグナルがエネルギー移動事象（例えば、ＦＲＥＴ、ＣＲＥＴ、ＢＲＥＴ）の結果として検出されることである。一実施形態において、表面上のバイオポリマーは、ドナーを担い、プローブは、アクセプターを担持する、またはその逆である。別の実施形態において、インターカレーティング色素が、溶液中で提供され、標識されたプローブの結合の際に、インターカレーティング色素とプローブの間のＦＲＥＴ相互作用が存在する。インターカレーティング色素の例は、ＹＯＹＯ−１であり、プローブ上の標識の例は、ＡＴＴＯ６５５である。別の実施形態において、インターカレーティング色素は、ＦＲＥＴ機構を用いずに使用され、表面の一本鎖標的配列およびプローブ配列の両方が、未標識であり、シグナルは、結合によりインターカレーティング色素がインターカレートする二本鎖を作製する場合のみ、検出される。インターカレーティング色素は、その同一性に応じて、それがＤＮＡにインターカレートせず溶液に不含であれば、１００倍または１０００倍低い明るさである。幾つかの実施形態において、ＴＩＲＦまたは薄層斜光照明（ＨＩＬＯ）（例えば、Ｍｅｒｔｚ ｅｔ ａｌ., Ｊ. ｏｆ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ｏｐｔｉｃｓ，１５（１）： ０１６０２７, ２０１０に記載）顕微鏡法を用いて、溶液中のインターカレーティング色素からの任意のバックグランドシグナルを排除する。
【０２５１】
しかし幾つかの実施形態において、高濃度の標識プローブは、表面のシグナルの検出を分かり難くする高いバックグランド蛍光を誘発する。幾つかの実施形態において、これは、表面で形成されたデュプレックスを標識するＤＮＡ染料またはインターカレーティング色素によって対処される。色素は、標的が一本鎖である、または一本鎖プローブを有する場合にはインターカレートしないが、色素は、デュプレックスがプローブと標的の間で形成された場合にはインターカレートするであろう。幾つかの実施形態において、プローブは、未標識であり、検出されるシグナルは、インターカレーティング色素のみによる。幾つかの実施形態において、プローブは、インターカレーティング色素またはＤＮＡ染料に対するＦＲＥＴパートナーとして作用する標識で標識される。幾つかの実施形態において、インターカレーティング色素は、ドナーであり、異なる波長のアクセプターと連結し、これによりプローブを複数のフルオロフォアでコードさせる。
【０２５２】
幾つかの実施形態において、検出ステップは、それぞれの相補性部位への複数の結合事象を検出することを含む。幾つかの実施形態において、複数の事象は、結合オンもしくはオフする同じプローブ分子に由来する、または同じ特異性の別の分子（例えば、それは同じ配列または分子構造に特異的である）により置き換えられ、これは複数回起こる。幾つかの実施形態において、結合オンまたはオフレートは、条件の改変による影響を受けない。例えば結合オンおよび結合オフは両者とも、同じ条件下（例えば、塩濃度、温度など）で起こり、プローブ−標的相互作用が弱いことによる。
【０２５３】
幾つかの実施形態において、シーケンシングは、より短い、同じ長さの、または１０倍以内のプローブ長である単一標的ポリヌクレオチド上の複数の場所で複数のオン−オフ結合事象を撮像することにより実行される。そのような実施形態において、より長い標的ポリヌクレオチドが断片化されるか、または断片のパネルが予め選択され、表面に配列され、それによりそれぞれのポリヌクレオチド分子が個別に解像され得る。これらの例において、特異的場所へのプローブ結合の頻度または期間を利用して、プローブが標的配列に対応するか否かを決定する。プロオーブ結合の頻度または期間は、プローブが標的配列（ミスマッチされた残りの塩基を含む）の全てに対応するか、または一部に対応するかを決定する。
【０２５４】
標的ポリヌクレオチド間のサイドバイサイド・オーバーラップの出現が、幾つかの実施形態において、ＤＮＡ染料からの蛍光増加により検出される。染料が用いられない幾つかの実施形態において、オーバーラップは、区分に沿った見かけの結合部位の頻度増加により検出される。例えば、回折限界分子が光学的にオーバーラップしているように見えるが実際には物理的にオーバーラップしていない幾つかの例において、それらは、本開示で他の箇所に記載される単一分子位置特定を利用して超解像される。エンドオンエンド・オーバーラップが生じる場合、幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドの末端をマーキングする標識を用いて、並列されたポリヌクレオチドを真の連続長と区別する。幾つかの実施形態において、そのような光学的キメラは、ゲノムの多くのコピーが予測され見かけのキメラの１つの出現のみが見出されれば、アーチファクトとして廃棄される。同じく、分子の末端（回折限界）が光学的にオーバーラップしているように見えるが、物理的にオーバーラップしていない実施形態において、それらは、本開示の方法により解像される。幾つかの実施形態において、場所の決定が非常に精密であるため、非常に接近したラベルから発出するシグナルが、分解される。
【０２５５】
幾つかの実施形態において、シーケンシングは、プローブより長い単一標的ポリヌクレオチド上の複数の場所で複数のオンオフ結合事象を撮像することにより実行される。幾つかの実施形態において、単一ポリヌクレオチドでのプローブ結合事象の場所が、決定される。幾つかの実施形態において、単一ポリヌクレオチドでのプローブ結合事象の場所は、標的ポリヌクレオチドを延長することにより決定され、それによりその長さに沿った異なる場所が、検出および解像される。
【０２５６】
幾つかの実施形態において、非結合プローブの光学活性を、標的分子に結合されたプローブと識別することは、結合されていないプローブからのシグナルの拒絶または除去を必要とする。幾つかのそのような実施形態において、これは、例えばエバネッセント場もしくは照明用の導波管を用いて、またはＦＲＥＴペア標識を利用することにより、または光活性化を利用することにより実行されて、特異的場所でプローブを検出する（例えば、Ｈｙｌｋｊｅ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｐｈｙｓ Ｊ. ２０１５;  １０８（４）: ９４９−９５６に記載）。
【０２５７】
幾つかの実施形態において、プローブは標識されていないが、標的との相互作用は、インターカレーティング色素１３０２などのＤＮＡ染料により検出され、色素は、デュプレックスにインターカレートし、結合が起こると、または起こったら、蛍光発光発光１３０４を開始する（例えば、図１３Ａ〜１３Ｃに示される）。幾つかの実施形態において、１種または複数のインターカレーティング色素が、どの時点でもデュプレックスにインターカレートする。幾つかの実施形態において、インターカレーティング色素がインターカレートされると、それにより発せられる蛍光は、インターカレーティング色素が溶液中で自由に浮遊することによる蛍光よりも大きい桁である。例えばインターカレートされたＹＯＹＯ−１色素からのシグナルは、溶液中で自由なＹＯＹＯ−１色素からのシグナルよりも約１００倍大きい。幾つかの実施形態において、明るく染色された（または部分的に光退色された）二本鎖ポリヌクレオチドが撮像される場合、観察されるポリヌクレオチドに沿った個別のシグナルは、単一インターカレーティング色素分子に対応する可能性がある。デュプレックス中のＹＯＹＯ−１色素の交換を容易にするため、及び明るいシグナルを得るために、メチルビオローゲンおよびアスコルビン酸を含むレドックス−酸化システム（ＲＯＸ）が、幾つかの実施形態において、結合緩衝液中で提供される。
【０２５８】
幾つかの実施形態において、単一色素分子で標識されたヌクレオチドの取り込みを検出することによる単一分子でのシーケンシング（例えば、ＨｅｌｉｃｏｓおよびＰａｃＢｉｏシーケンシングで実行される）は、色素が検出されない場合にはエラーを導入する。幾つかの例において、これは、色素が光退色したため、検出される累積シグナルが色素ブリンキング（ｄｙｅ  ｂｌｉｎｋｉｎｇ）により弱いため、色素の発光が弱すぎるため、または色素が長くて暗い光物理学的状態に進入するため、である。幾つかの実施形態において、これは、複数の代わりの方法により克服される。第一は、好適な光物理学的特性を有する堅固な個々の色素（例えば、Ｃｙ３Ｂ）と共に色素を標識することである。別のものは、光退色および暗い光物理学的状態を減少させる緩衝条件および添加剤を提供することである（例えば、ベータメルカプトエタノール、Ｔｒｏｌｏｘ、ビタミンＣおよびその誘導体、レドックスシステム）。別のものは、光への暴露を最小限に抑えること（例えば、より短い暴露を必要とするより高感度の検出器を有すること、またはストロボスコープの照明を提供すること）である。第二は、単一色素の代わりに、量子ドット（例えば、Ｑｄｏｔ６５５）、フルオロスフェア、ナノダイアモンド、プラズモン共鳴粒子、光散乱粒子などのナノ粒子で標識することである。別のものは、単一色素よりむしろヌクレオチドあたり多くの色素を有することである（例えば、図１４Ｃおよび１４Ｄに示される）。この場合、複数の色素１４１４は、自己クエンチング（例えば、かなり充分に間隔をあけたＤＮＡオリガミなどの剛直なナノ構造１４１２を用いる）を最小限に抑える方法で、または剛直なリンカーを介する直線上の間隔をあけて系統立てられる。
【０２５９】
幾つかの実施形態において、検出エラー率は、尿素、アスコルビン酸もしくはその塩、およびイソアスコルビン酸もしくはその塩、ベータメルカプトエタノール（ＢＭＥ）、ＤＴＴ、レドックスシステム、またはＴｒｏｌｏｘから選択される１種または複数の化合物（複数可）の溶液の存在下でさらに低下される（かつシグナルの有用期間が増加される）。
【０２６０】
幾つかの実施形態において、標的分子へのプローブの一過性結合のみが、色素の光物理学的性質によるエラーを減少させるのに充分である。撮像ステップの間に得られる情報は、異なる標識担持プローブの多くのオン／オフ相互作用の集合体である。したがって１つの標識が、光退色されるまたは暗い状態にあるとしても、分子上に到着した別の結合プローブ上の標識は、光退色されないか暗い状態になく、したがって幾つかの実施形態において、それらの結合部位の場所に関する情報を提供するであろう。
【０２６１】
幾つかの実施形態において、各一過的結合事象での標識からのシグナルは、光路（典型的には、倍率を提供する）を通して投影されて、２Ｄ検出器の１を超える画素に及ぶ。シグナルの点拡がり関数（ＰＳＦ）がプロットされ、ＰＳＦの重心が、シグナルの精密な場所として撮影される。幾つかの実施形態において、この位置特定は、サブ回折（例えば、超解像）およびさらにサブナノメートルの正確度まで実行される。位置特定の正確度は、収集された光子の数に反比例する。それゆえ、蛍光標識により１秒あたりに発光される光子が多いほど、またはより長く光子が収集されるほど、正確度が高い。
【０２６２】
一例において、図１０Ａおよび１０Ｂに示される通り、各結合部位での結合事象の数と収集される光子の数は両者とも、実行される位置特定の度合いと相関する。標的ポリマー１００２の場合、結合部位について記録される最小数の結合事象１００４−１および最小数の光子１００８−１は、それぞれ最も精度の低い位置特定１００６−１および１０１０−１と相関する。結合事象の数１００４−２、１００４−３、または記録された光子の数１００８−２、１００８−３のいずれかが、結合部位で増加すると、それぞれ位置特定の度合いが上昇する１００６−２、１００６−３および１０１０−２、１０１０−３。図１０Ａにおいて、ポリヌクレオチド１００２上への標識プローブの検出される確率論的結合事象の異なる数（例えば、１００４−１、１００４−２、１００４−４）は、プローブの位置特定の異なる度合い（１００６−１、１００６−２、１００６−３）をもたらし、ここでより多数の結合事象（例えば、１００４−２）は、より高度の位置特定（例えば、１００６−２）と相関し、より少数の結合事象（例えば、１００４−１）は、より低い度合いの位置特定（例えば、１００６−１）と相関する。図１０Ｂにおいて、検出される光子の異なる数（例えば、１００８−１、１００８−２および１００８−３）は同様に、位置特定の異なる度合い（それぞれ１０１０−１、１０１０−２および１０１０−３）をもたらす。
【０２６３】
代わりの実施形態において、それぞれの一過的結合事象における標識からのシグナルは、光学倍率路を通って投影されない。代わりに、基板（典型的にはその上に標的分子が存在する光学的に透明な表面）は、二次元検出アレイに直接連結される。検出アレイの画素が小さい場合（例えば、１平方ミクロン以下）、表面上の１対１シグナル投影は、結合シグナルが少なくとも１ミクロンの正確度で位置特定されることを可能にする。核酸が充分に伸長されている（例えば、ポリヌクレオチドの２キロベースが１ミクロン長に伸長されている）幾つかの実施形態において、ほんの２キロベース離れたシグナルが、分解される。例えば、シグナルが４０９６の塩基ごとまたは２ミクロンごとに起こると予測される６量体プローブの場合、この分解は、個々の結合部位を明解に位置特定するのに充分であろう。部分的に２つの画素間に入るシグナルは、中間の場所を提供する（例えば、シグナルが２つの画素間に入る場合、分解は、１平方ミクロンで５００ｎｍであり得る）。幾つかの実施形態において、基板は、二次元アレイ検出器に関して物理的に（例えば、１００ｎｍの増分で）換算されて（ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ）、より高い分解を提供する。そのような実施形態において、デバイスは、それがレンズを必要としないかレンズ間の空間を必要としないため、より小さい（またはより薄い）。幾つかの実施形態において、基板の換算はまた、既存のコンピュータおよびデータベースとより適合性がある電子リードアウトへの分子記憶リードアウトの直接的変換を提供する。
【０２６４】
幾つかの実施形態において、高速の一過的結合を捕捉するために、標準の顕微鏡技術よりも、捕捉フレーム率が上昇され、データ移行率が上昇される。幾つかの実施形態において、工程の速度は、高いフレーム検出を高濃度のプローブと連結することにより上昇される。しかし個々の暴露は、それぞれの暴露に関連する電子ノイズを低減するために最小の閾値暴露のままである。２００ミリ秒暴露の蓄積された電子ノイズは、２回の１０ミリ秒暴露未満であろう。
【０２６５】
より急速な撮像を可能にするより急速なＣＭＯＳカメラが、入手可能になっている。例えばＡｎｄｏｒ Ｚｙｌａ Ｐｌｕｓは、ＵＳＢ ３．０接続のみで５１２×１０２４平方画素にわたり１秒あたり最大３９８フレームを可能にし、制限された関心領域（ＲＯＩ）またはＣａｍｅｒａＬｉｎｋ接続よりもさらに速い。
【０２６６】
急速な撮像を得るための代わりのアプローチは、ガルボミラーまたはデジタルマイクロミラーを使用して時間的にインクリメントされた画像（ｔｅｍｐｏｒａｌ  ｉｎｃｒｅｍｅｎｔｅｄ  ｉｍａｇｅｓ）を異なるセンサーに送信することである。その後、ムービーのフレームの正しい順序が、獲得時間に従って異なるセンサーからのフレームをインターリーブすることにより再構成される。
【０２６７】
一過的結合工程は、塩濃度などの様々な生化学的パラメータを調整することにより、加速され得る。結合速度を適合させるために用いられ得る高いフレーム速度のカメラは複数存在し、多くの場合、視野が制限されて、画素のサブセットからのより急速なリードアウトを得る。１つの代わりのアプローチは、ガルバノメータミラーを使用して、連続シグナルを単一センサーの異なる領域に、または異なるセンターに時間的に分布することである。後者は、センサーの全視野の使用を可能にするが、分布されたシグナルがコンパイルされた時に全時間的解像能を上昇させる。
【０２６８】
複数の結合事象のデータセットの構築
ブロック２１８  オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについての暴露および測定を反復し、それによりテスト基板上の位置の複数のセットを得、テスト基板上の位置のそれぞれの各セットは、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応する。
【０２６９】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットは、オリゴヌクレオチドプローブの複数のサブセットを含み、暴露および測定の反復が、オリゴヌクレオチドプローブの複数のサブセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの各サブセットについて実施される。
【０２７０】
幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの各サブセットは、オリゴヌクレオチドプローブのセットからの２つ以上の異なるプローブを含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのそれぞれの各サブセットは、オリゴヌクレオチドプローブのセットからの４つ以上の異なるプローブを含む。幾つかの実施形態において、オリゴヌクレオチドプローブのセットは、オリゴヌクレオチドプローブの４つのサブセットからなる。
【０２７１】
幾つかの実施形態において、方法は、それぞれのオリゴヌクレオチドプローブの計算された、または実験的に得られた溶融温度に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブのセットを、オリゴヌクレオチドプローブの複数のサブセットに分割することをさらに含む。類似の溶融温度を有するオリゴヌクレオチドプローブは、分割により、オリゴヌクレオチドプローブの同じサブセットに入れられる。さらに、暴露のインスタンスの温度または期間は、オリゴヌクレオチドプローブの対応するサブセットにおけるオリゴヌクレオチドプローブの平均溶融温度により決定される。
【０２７２】
幾つかの実施形態において、方法は、各オリゴヌクレオチドプローブの配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブのセットをオリゴヌクレオチドプローブの複数のサブセットに分割することをさらに含み、ここでオーバーラップ配列を有するオリゴヌクレオチドプローブは、異なるサブセットに入れられる。
【０２７３】
幾つかの実施形態において、暴露および測定の反復は、オリゴヌクレオチドプローブセットにおけるそれぞれの単一オリゴヌクレオチドプローブについて実施される。
【０２７４】
幾つかの実施形態において、暴露は、第一の温度でオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施され、暴露および測定の反復は、第二の温度で第一のオリゴヌクレオチドについての暴露および測定を実施することを含む。
【０２７５】
幾つかの実施形態において、暴露は、第一の温度でオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施される。暴露および測定の反復のインスタンスは、複数の異なる温度のそれぞれで第一のオリゴヌクレオチドについて暴露および測定を実施することを含む。方法は、複数の異なる温度での第一の温度およびそれぞれの温度についての測定により記録された光学活性の測定された場所および期間を利用して、第一のオリゴヌクレオチドプローブについて溶融曲線を構築することをさらに含む。
【０２７６】
幾つかの実施形態において、テスト基板は、暴露および測定を反復する前に洗浄され、それによりオリゴヌクレオチドプローブの別のセットにテスト基板を暴露する前に１つまたは複数の各オリゴヌクレオチドプローブをテスト基板から除去する。場合により最初にプローブを、１つまたは複数の洗浄溶液と交換し、その後、プローブの次のセットを添加する。
【０２７７】
幾つかの実施形態において、テスト基板上の場所の測定は、あてはめ関数により光学活性の各インスタンスを同定し適合させて、二次元イメージャにより得られたデータのフレーム中で光学活性の各インスタンスの中心を同定し適合させることを含む。光学活性の各インスタンスの中心は、テスト基板上の光学活性の各インスタンスの位置であると見なされる。
【０２７８】
幾つかの実施形態において、あてはめ関数は、ガウス関数、第一モーメント関数、勾配に基づくアプローチ、またはフーリエ変換である。ガウスの適合は、顕微鏡のＰＳＦの近似に過ぎないが、幾つかの実施形態において、スプライン（例えば、三次スプライン）またはフーリエ変換アプローチの添加が、ＰＳＦの重心を決定する際の正確度を改善する働きがある（例えば、Ｂａｂｃｏｃｋ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉ Ｒｅｐ. ７:５５２, ２０１７ ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ., ４６:１８１９−１８２９, ２００７に記載）。
【０２７９】
データ処理の後、単一分子場所が、セット１〜５からのプローブのどれがポリヌクレオチド上の同じ位置特定フットプリントを有するか（例えば、どれが同じナノメートル場所に結合するか）を同定する（例えば、検出された色により）。一例において、ナノメートルサイズの場所は、１ｎｍ中心の精度（±０．５ｎｍ）で定義され、そのＰＳＦの重心が同じ１ｎｍ内に入るすべてのプローブが、こうして一緒にビニングされる。各単一の定義されたオリゴ種は、複数回結合して（例えば、発光および収集された光子の数に応じて）、ナノメートル（またはサブナノメートル）重心に対する正確な位置特定を可能にしなければならない。
【０２８０】
幾つかの実施形態において、ナノメートルまたはサブナノメートルサイズの位置特定は、例えば５’−ＣＧＡＣＴ−３’のオリゴ配列について、第一の塩基がＡであり、第二がＧであり、第三がＴであり、第四がＣであり、第五がＴであると決定する。そのようなパターンは、５’−ＣＧＡＣＴ−３’の標的配列を示唆する、したがって全ての単一塩基に定義された１０２４の５量体オリゴプローブは、ちょうど５周期で適用またはテストされ、ここでそれぞれの周期は、オリゴ付加および洗浄ステップの両方を含む。そのような実行において、セットにおけるそれぞれの特異的オリゴの濃度は、単独で用いられた場合よりも低い。この例において、データの獲得は、結合事象の閾値数に達するためにより長時間がかけられる。また、特異的オリゴよりも高濃度の縮重オリゴが、幾つかの実施形態において用いられる。幾つかの実施形態において、このコード化スキームは、プローブの直接的標識により、例えばオリゴの３’または５’で標識を合成またはコンジュゲートすることにより、実行される。しかし幾つかの代わりの実施形態において、これは、間接的標識により実行される（例えば、フラップ配列をそれぞれの標識オリゴに付着することによる）。
【０２８１】
幾つかの実施形態において、それぞれのオリゴの場所は、その場所について複数の事象のＰＳＦを決定することにより精密に定義され、その後、オフセット事象からの部分的配列オーバーラップ（及び入手可能であれば、デュプレックスの相補鎖からのデータ）により確証される。この実施形態は、１または数ナノメートルまでのプローブ結合の単一分子位置特定に強く依存する。
【０２８２】
幾つかの実施形態において、光学活性の各インスタンスは、二次元イメージャにより測定される複数のフレームにわたり持続する。テスト基板上の場所の測定は、複数のフレームにわたりあてはめ関数で光学活性の各インスタンスを同定し適合させて、複数のフレームにわたり光学活性の各インスタンスの中心を同定することを含む。光学活性の各インスタンスの中心は、複数のフレームにわたるテスト基板上の光学活性の各インスタンスの位置であると見なされる。幾つかの実施形態において、あてはめ関数は、複数のフレーム中のそれぞれのフレームの中心を個別に見出す。他の実施形態において、あてはめ関数は、あるいは複数のフレームにわたり集合的に、それぞれのフレームでの中心を見出す。
【０２８３】
幾つかの実施形態において、適合は、ある位置特定が次のフレーム中ですぐ隣接する（例えば、０．５画素以内の）トラッキングステップを含み、それらをまとめて平均し、それらの明るさの度合いにより加重し、それは、これが同じ結合事象であると仮定する。しかし、複数のフレームにより分離された（例えば、結合事象の間に少なくとも５フレームギャップで、少なくとも１０フレームギャップで、少なくとも２５フレームギャップで、少なくとも５０フレームギャップで、または少なくとも１００フレームギャップで）事象が存在する場合、あてはめ関数は、それらが異なる結合事象であると仮定する。異なる結合事象をトラッキングすることは、配列割り当てにおける信頼性向上を支援する。
【０２８４】
幾つかの実施形態において、測定は、光学活性の各インスタンスの中心を、少なくとも２０ｎｍの位置特定精度で、テスト基板上の位置に解像する。幾つかの実施形態において、測定は、光学活性の各インスタンスの中心を、少なくとも２ｎｍ、少なくとも６０ｎｍ、少なくとも６ｎｍの位置特定精度で、テスト基板上の位置に解像する。幾つかの実施形態において、測定は、光学活性の各インスタンスの中心を、２ｎｍ〜１００ｎｍの間の位置特定精度で、テスト基板上の位置に解像する。幾つかの実施形態において、測定は、光学活性の各インスタンスの中心をテスト基板上の位置に解像し、ここで位置は、サブ回折限界位置である。幾つかの実施形態において、解像は精度より限定的である。
【０２８５】
幾つかの実施形態において、テスト基板上の場所および光学活性の各インスタンスの期間の測定は、その場所で５０００光子より多く測定する。幾つかの実施形態において、テスト基板上の場所および光学活性の各インスタンスの期間の測定は、その場所で５０，０００光子より多くまたは場所で２００，０００光子より多く測定する。
【０２８６】
各色素は、それが光子を発生する最大速度（例えば、１ＫＨｚ〜１ＭＨｚ）を有する。例えば幾つかの色素の場合、１秒で２００，０００光子を測定することが唯一可能である。色素の典型的寿命は、１０ナノ秒である。幾つかの実施形態において、テスト基板上の場所および光学活性の各インスタンスの期間の測定は、その場所で１，０００，０００光子より多く測定する。
【０２８７】
幾つかの例において、特定の外れた配列（ｏｕｔｌｉｅｒ  ｓｅｑｅｎｃｅｓ）が、非ワトソンクリック様式で結合するか、または短いモチーフが、法外に高いオンレートまたは低いオフレートに導く。例えば、ＲＮＡとＤＮＡの間の幾つかのプリン−ポリピリミジン（ｐｏｌｙｐｒｙｒｉｍｉｄｉｎｅ）相互作用は、非常に強い（例えば、ＡＧＧなどのＲＮＡモチーフ）。これらは、より低いオフレートを有するだけでなく、より安定な核形成配列のためにより高いオンレートを有する。幾つかの例において、結合は、特定の既知の規則に必ずしも従わない外れ値から起こる。幾つかの実施形態において、アルゴリズムを用いて、そのような外れ値を同定するか、またはそのような外れ値の予測を考慮する。
【０２８８】
幾つかの実施形態において、光学活性の各インスタンスは、テスト基板で観察されるバックグランドを超える所定の数の標準偏差より大きい（例えば、３、４、５、６、７、８、９または１０より大きな標準偏差）。
【０２８９】
幾つかの実施形態において、暴露は、第一の期間にオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施される。幾つかのそのような実施形態において、暴露および測定の反復は、第二のオリゴヌクレオチドについての暴露を第二の期間に実施することを含む。第一の期間は、第二の期間より大きい。
【０２９０】
幾つかの実施形態において、暴露は、二次元イメージャの第一のフレーム数についてオリゴヌクレオチドプローブのセットにおける第一のオリゴヌクレオチドプローブについて実施される。幾つかのそのような実施形態において、暴露および測定の反復は、二次元イメージャの第二のフレーム数について第二のオリゴヌクレオチドについての暴露を実施することを含む。第一のフレーム数は、第二のフレーム数より大きい。
【０２９１】
幾つかの実施形態において、１つまたは複数のタイリングセットにおける相補性プローブを用いて、変性されたデュプレックスの鎖のそれぞれに結合する。図１１Ｂにより示される通り、固定された第一の鎖１１１０に対応する第一のタイリングパス１１１４と、固定された第二の鎖１１１２に対応する第二のタイリングパス１１１６とを決定することを含む、テスト基板上の位置の複数のセットから核酸の少なくとも一部の配列を決定することが可能である。
【０２９２】
幾つかの実施形態において、第一のタイリングパスの断絶は、第二のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される。幾つかの実施形態において、第一のタイリングパスまたは第二のタイリングパスの断絶は、参照配列を用いて解像される。幾つかの実施形態において、第一のタイリングパスまたは第二のタイリングパスの断絶は、核酸の別のインスタンスから得られる第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて解像される。
【０２９３】
幾つかの実施形態において、各結合部位の配列の配列割り当てにおける信頼度は、第一のタイリングパスおよび第二のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される。幾つかの実施形態において、その配列の配列割り当てにおける信頼度は、核酸の別のインスタンスから得られる第三のタイリングパスまたは第四のタイリングパスの対応する部分を用いて上昇される。
【０２９４】
配列のアライメントまたは組み立て
ブロック２２２  核酸の少なくとも一部の配列は、位置の複数のセットにより表されるテスト基板上の位置をコンパイルすることによりテスト基板上の位置の複数のセットから決定される。
【０２９５】
好ましくは隣接配列は、デノボ組み立てを介して得られる。しかし、幾つかの実施形態において、参照配列もまた、組み立てを容易にするのに用いられる。これは、デノボ組み立てが構築されることを可能にする。完全なゲノムシーケンシングが、ゲノムの同じ分節をつなぐ複数の分子（理想的には同じ親染色体から得られた分子）からの情報の合成を必要とする場合、アルゴリズムが、複数の分子から得られた情報を処理するために必要である。１つのアルゴリズムは、複数の分子間で共通する配列に基づき分子をアライメントする種類のものであり、そこで領域がカバーされるコアライメントされた分子からの帰属により、それぞれの分子中のギャップを埋める（例えば、１分子中のギャップが、別のコアライメントされた分子中のリードによりカバーされる）。
【０２９６】
幾つかの実施形態において、ショットガンアセンブリ法（例えば、Ｓｃｈｕｌｅｒ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７４:５４０−５４６, １９９６に記載）が、本明細書に記載された通り得られる配列割り当てを利用して組み立てを実行するように適合される。ショットガンシーケンシングを超える本発明の方法の利点は、複数のリードが、それらが全長のインタクト標的分子から収集されたので、予め組み立てられることである（例えば、それは、お互いに関するリードの場所が既知であり、かつリード間のギャップの長さが知られている）。様々な実施形態において、参照ゲノムを用いて、長い範囲のゲノム構造または短い範囲のポリヌクレオチド配列のいずれかまたは両方の組み立てを容易にする。幾つかの実施形態において、リードは、部分的にデノボ組み立てされ、その後、参照に対しアライメントされ、その後、参照で支援された組み立てが、さらにデノボ組み立てされる。幾つかの実施形態において、様々な参照組み立てを用いて、ゲノム組み立てのための幾つかのガイダンスを提供する。しかし典型的実施形態において、実際の分子から得られた情報は（特に、それが２個以上の分子により確証される場合）、参照配列からの任意の情報より大きく加重される。
【０２９７】
幾つかの実施形態において、配列ビットが得られる標的が、標的間の配列オーバーラップの分節に基づいてアライメントされ、より長いコンピュータ上のコンティグ、及び最終的には染色体全体の配列が、作成される。
【０２９８】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドの同一性は、その長さに沿ったプローブ結合のパターンにより決定される。幾つかの実施形態において、同一性は、ＲＮＡ種またはＲＮＡアイソフォームの同一性である。幾つかの実施形態において、同一性は、ポリヌクレオチドが対応する参照における場所である。
【０２９９】
幾つかの実施形態において、位置特定の正確度または精度は、配列ビットを一緒にスティッチングするのに充分でない。幾つかの実施形態において、あるプローブのサブセットが特異的位置関係内で結合すると見出されるが、しかし位置特定データから厳密にそれらの順序を、信頼性をもって決定するのは幾つかの実施形態において困難である。幾つかの実施形態において、解像は、回折限界である。幾つかの実施形態において、位置関係内の短い範囲の配列または回折限界スポットは、その位置関係またはスポット内にあるプローブの配列オーバーラップにより組み立てられる。したがって短い範囲の配列は、例えばオリゴのサブセットの個々の配列がどのようにオーバーラップするかに関する情報を利用することにより、組み立てられる。幾つかの実施形態において、この方法で構築された短い範囲の配列は、その後、ポリヌクレオチド上の順序に基づいて長い範囲の配列へと一緒にスティッチングされる。したがって長い範囲の配列は、隣接する、またはオーバーラップするスポットから得られた短い範囲の配列を結合させることにより得られる。
【０３００】
幾つかの実施形態において（例えば、自然に二本鎖である標的ポリヌクレオチドの場合）、相補鎖のために得られた参照配列および配列情報を利用して、配列割り当てを容易にする。
【０３０１】
幾つかの実施形態において、核酸は、少なくとも１４０塩基長であり、決定は、７０％より大きな核酸配列の配列のカバー率を決定する。幾つかの実施形態において、核酸は、少なくとも１４０塩基長であり、決定は、９０％より大きな核酸配列の配列のカバー率を決定する。幾つかの実施形態において、核酸は、少なくとも１４０塩基長であり、決定は、９９％より大きな核酸配列の配列のカバー率を決定する。幾つかの実施形態において、決定は、９９％より大きな核酸配列の配列のカバー率を決定する。
【０３０２】
非特異的なまたはミスマッチする結合事象
一般にシーケンシングは、標的ポリンヌクレオチドが、結合されるヌクレオチドに相補的なヌクレオチドを含有すると仮定する。しかしこれは、必ずしもあてはまらない。結合ミスマッチエラーは、この仮定が適用できない場合の一例である。それにもかかわらず、ミスマッチは、それが既知のルールまたは挙動に従って起こる場合、ターゲットの配列を決定する際に有用である。短いオリゴヌクレオチド（例えば、５量体）の使用は、１塩基が５量体長の２０％であるため、単一ミスマッチの影響が安定性に対し大きな影響を有することを意味する。このため適当な条件では、申し分のない特異性が、短いオリゴプローブにより得られる。それでも、ミスマッチは起こる可能性があり、分子相互作用の確率論的性質のため、それらの結合期間は、幾つかの例では、５塩基全てが特異的である結合と区別できない場合がある。しかし、塩基（または配列）のコーリングおよび組み立てを実施するために用いられるアルゴリズムは多くの場合、ミスマッチの出現を考慮する。多くのタイプのミスマッチは、予測可能であり、特定のルールに従う。これらのルールの幾つかは、理論的判断材料により誘導され、他は、実験的に誘導される（例えば、Ｍａｓｋｏｓ ａｎｄ  Ｓｏｕｔｈｅｒｎ，  Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２１（２０）: ４６６３−４６６９, ２０１３;  Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ., Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ２２:１３６５−１３６７, １９９４に記載）。
【０３０３】
表面への非特異的結合の影響はプローブのそのような非持続性により軽減され非特異的部位への結合は持続的でなく、１つのイメージャが非特異的な（例えば、相補性標的配列上にない）結合部位を占有するようになると、それは退色する可能性があるが、幾つかの例において、適所にとどまり、その場所へのさらなる結合を遮断する（例えば、Ｇ四重鎖形成による相互作用）。典型的には、標的ポリヌクレオチドに結合するイメージャの解像を妨害する非特異的結合部位の大部分は、撮像の早期内に占有され退色され、ポリヌクレオチド部位へのイメージャのオン／オフ結合を、その後、容易に観察されるようにする。こうして一実施形態において、高いレーザ力を利用して、最初に非特異的結合部位を占めるプローブを退色させ、場合により画像がこの時期に撮影されず、その後、レーザ力が場合により減少され、撮像を開始して、ポリヌクレオチドへのオン−オフ結合を捕捉する。初期非特異的結合の後で、さらなる非特異的結合は、あまり頻繁でなく（退色されたプローブは多くの場合、非特異的結合部位に粘着されたままであるため）、幾つかの実施形態において、例えばドッキング部位への特異的結合と見なされる、閾値を適用することにより、計算的にふるい落とされ、同じ場所への結合は、持続的でなければならず、例えば同じ部位で少なくとも５回以上、好ましくは１０回起こるべきである。典型的には、ドッキング部位へのおよそ２０の特異的結合事象が、検出される。
【０３０４】
非特異的である結合をふるい落とす別の手段は、フルオロフォアシグナルが、表面で伸長される標的分子の線状鎖の位置と相関しなければならない、ということである。幾つかの実施形態において、線状鎖を直接染色することにより、または線を持続的結合部位に挿入することにより、線状鎖の位置を決定できる。一般に、線に沿って落下（ｆａｌｌ）しないシグナルは、それらが持続性であるか否かにかかわらず、幾つかの実施形態において廃棄される。同様に、超分子格子が用いられる場合、既知の格子構造と相関しない結合事象は、幾つかの実施形態において廃棄される。
【０３０５】
複数の結合事象は、特異性も上昇させる。例えば単一の「コール」で検出される部分または配列の同一性を確立するよりむしろ、コンセンサスが、複数のコールから得られる。また、標的部分または配列への複数の結合事象は、実際の場所への結合を、非特異的結合事象と識別でき、ここでは結合（閾値期間の）が同じ場所で複数回起こる可能性は低い。また、経時的な複数の結合事象の測定が、退色される表面への非特異的結合事象の蓄積を可能にすることが観察され、その後、非特異的結合はほとんど再度検出されない。これは、非特異的結合からのシグナルが退色されても、非特異的結合部位が占有または遮断されたままであるためと考えられる。
【０３０６】
幾つかの実施形態において、シーケンシングは、ポリヌクレオチド上でのミスマッチおよび非特異的結合により複雑になる。非特異的結合または外れ値の事象の影響を回避するために、幾つかの実施形態において、方法では、場所および持続性に基づきシグナルを優先する。場所による優先性は、例えばプローブが伸長ポリマー上に共存するか、または格子構造内の場所を含む、超分子格子（例えば、ＤＮＡオリガミグリッド）上に共存するかに応じて予測される。結合の持続性による優先性は、結合の持続性および結合頻度に関係し、優先性リストを利用して、完全な一致、部分的一致または非特異的結合の見込みを決定する。パネルまたはレパートリーにおける各結合プローブについて確立される優先性を用いて、シグナルの適正さが決定される。
【０３０７】
幾つかの実施形態において、優先性を利用して、シグナルの持続期間が所定の閾値より大きいか、シグナルの反復または頻度が所定の閾値より大きいか、シグナルが標的分子の場所と相関するか、及び／または収集された光子の数が所定の閾値より大きいか、を決定することによりシグナルの検証および塩基コーリングを容易にする。幾つかの実施形態において、これらの決定のいずれかへの答えが真実であれば、シグナルは現実として（例えば、ミスマッチまたは非特異的結合事象でないとして）許容される。
【０３０８】
幾つかの実施形態において、ミスマッチは、その時間的結合パターンにより区別され、このため配列情報の二次層と見なされる。そのような実施形態において、結合シグナルが、時間的結合特性によりミスマッチと判定される場合、配列ビットは、生物情報学的に切り取られて推定ミスマッチング塩基を除去し、残りの配列ビットが、配列再構築に付加される。ミスマッチはハイブリダイズするオリゴの末端で起こる可能性が最も高いため、時間的結合特性により、１つまたは複数の塩基が、幾つかの実施形態において末端から切り取られる。どの塩基が切り取られるかに関する決定は、幾つかの実施形態において、同じ配列空間にわたる他のオリゴタイリングからの情報により知らされる。
【０３０９】
幾つかの実施形態において、可逆的と思われないシグナルは、それが非特異的シグナルに対応する機会または見込みを有するため（例えば、表面への蛍光混入物の付着により）、不利に加重される。
【０３１０】
ブロック３０２〜３０４  核酸を直線化伸長形態でテスト基板上に固定し、それにより固定された伸長核酸を形成させることを含む、核酸をシーケンシングする別の方法が、提供される。核酸は、上記方法のいずれか１つにより基板上に固定される。
【０３１１】
表面の単一細胞を単離しＤＮＡおよびＲＮＡの両方を抽出すること
ＲＮＡおよびＤＮＡのいずれかまたは両方を、単一細胞から単離しシーケンシングできる。幾つかの実施形態において、ゴールが、ＤＮＡをシーケンシングすることである場合、ＲＮＡｓｅを試料に加えた後、シーケンシングを開始する。幾つかの実施形態において、目的が、ＲＮＡをシーケンシングすることである場合、ＤＮＡｓｅを試料に加えた後、シーケンシングを開始する。幾つかの実施形態において、細胞質内核酸および核内核酸の両方が解析される場合、それらは、差次的または連続的に抽出される。幾つかの実施形態において、第一に細胞膜（角膜でない）を破壊して、細胞質内核酸を放出させ収集する。その後、角膜を破壊して、核内核酸を放出させる。幾つかの実施形態において、タンパク質およびポリペプチドが細胞質画分の一部として収集される。幾つかの実施形態において、ＲＮＡが、細胞質画分の一部として収集される。幾つかの実施形態において、ＤＮＡが、核画分の一部として収集される。幾つかの実施形態において、細胞質および核画分は、一緒に抽出される。幾つかの実施形態において、抽出後に、ｍＲＮＡおよびゲノムＤＮＡが、差次的に捕捉される。例えばｍＲＮＡは、表面に付着されたオリゴｄＴプローブにより捕捉される。これは、フローセルの第一の部分で起こり得、ＤＮＡは、その上でＤＮＡの末端が捕捉され得る（例えば、推定として疎水性相互作用により）疎水性ビニルシランコーティングを有する、フローセルの第二の部分で捕捉される。
【０３１２】
ポリ（Ｌ）リシン（ＰＬＬ）などの正電荷を有する表面（例えば、Ｍｉｃｒｏｓｕｒｆａｃｅｓ Ｉｎｃ．から入手または施設内でコーティング）は、細胞膜に結合し得ることが公知である。幾つかの実施形態において、細胞が表面と衝突する機会が増加するように、高さの低いフローチャネル（例えば、３０ミクロン未満）が、用いられる。衝突の数は、幾つかの実施形態において、フローセルシーリング中でヘリンボンパターンを利用して、乱流を導入することにより増加される。幾つかの実施形態において、細胞付着は、そのような実施形態において細胞が表面に低密度で分散されること（例えば、それぞれの個々の細胞から抽出されたＲＮＡおよびＤＮＡが空間的に分離されたままであるように、細胞間の充分な空間を確保すること）が望ましいため、効率的である必要はない。幾つかの実施形態において、細胞は、細胞および核膜の両方が破壊されるように（例えば、細胞の内容物が媒体に放出され、単離された細胞の付近の表面で捕捉されるように）、プロテアーゼ処理を利用して破裂される。不動化されると、ＤＮＡおよびＲＮＡは、幾つかの実施形態において、伸長される。幾つかの実施形態において、伸長緩衝液は、カバーガラス表面を一方向に流れる（例えば、ＤＮＡおよびＲＮＡポリヌクレオチドを流体の流れの方向に引き伸ばしアライメントさせる）。幾つかの実施形態において、ＲＮＡが抗体への結合に利用可能になるように、条件の調整（例えば、温度、伸長緩衝液の組成および流れの物理的力）が、ＲＮＡの二次／三次構造のほとんどを変性させる。ＲＮＡが変性形態で伸長されたら、変性緩衝液から結合緩衝液に切り替えることが可能である。
【０３１３】
あるいはＲＮＡは、最初に細胞膜を破壊し一方向の流れを誘導することにより、抽出および不動化される。核膜が、次にプロテアーゼを使用することにより破壊され、流れが反対方向に誘導される。幾つかの実施形態において、ＤＮＡは、放出の前または後に、例えばレアカッティング制限酵素（例えば、ＮＯＴ１、ＰＭＭＥ１）を用いることにより断片化される。この断片化は、ＤＮＡの解放を支援し、個々の鎖を単離してすき取ることを可能にする。不動化細胞が充分に離れ、各細胞から抽出されたＲＮＡおよびＤＮＡが混じり合わないようにシステムが設定されることが、確保される。幾つかの実施形態において、これは、細胞の破裂の前、後またはその間に、液体からゲルへの変移を誘導することにより支援される。
【０３１４】
幾つかの実施形態において、核酸は、二本鎖核酸である。そのような実施形態において、方法は、テスト基板上で固定された二本鎖核酸を一本鎖形態に変性させることをさらに含む。核酸は、シーケンシングが進行するために一本鎖形態でなければならない。固定された二本鎖核酸が変性されたら、核酸の固定された第一の鎖と固定された第二の鎖の両方が、得られる。固定された第二の鎖は、固定された第一の鎖に相補的である。
【０３１５】
幾つかの実施形態において、核酸は、一本鎖である（例えば、ｍＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）。核酸が一本鎖ＲＮＡである幾つかの実施形態において、変性は、シーケンシング方法が進行する前には必要でない。
【０３１６】
幾つかの実施形態において、試料は、付近にネイティブ相補鎖のない一本鎖ポリヌクレオチドを含む。ポリヌクレオチドに沿ったレパートリーのオリゴそれぞれについての結合場所がコンパイルされる幾つかの実施形態において、配列は、それらの場所に応じてシーケンシングビットの全てを集合させ、それらを一緒にスティッチングすることにより再構成される。
【０３１７】
ＲＮＡの伸長
帯電した表面上の核酸の伸長は、溶液の陽イオン濃度により影響を受ける。低塩濃度では、一本鎖であり、そのバックボーンに沿って負電荷を帯びたＲＮＡは、その長さに沿って無作為に表面に結合するであろう。
【０３１８】
ＲＮＡを変性させ直鎖形態に伸長する可能な方法が複数存在する。幾つかの実施形態において、ＲＮＡは最初、球状形態に入るように促される（例えば、高い塩濃度を利用することにより）。幾つかのそのような実施形態において、それぞれのＲＮＡ分子の末端（例えば、特にポリＡテール）は、より相互作用し易くなる。ＲＮＡが、球状形態で結合されたら、異なる緩衝液（例えば、変性緩衝液）が、幾つかの実施形態において、フローセル中に適用される。
【０３１９】
代わりの実施形態において、表面は、ｍＲＮＡのポリＡテールを捕捉するようにオリゴｄ（Ｔ）で予めコーティングされる（例えば、Ｏｚｓｏｌａｋ ｅｔ ａｌ., Ｃｅｌｌ １４３:１０１８−１０２９, ２０１０に記載）。ポリＡテールは典型的には、二次構造を相対的に含まないはずの領域である（例えば、それらがホモポリマーであるため)。ポリＡテールは、高等真核生物では相対的に長いので（２５０〜３０００ヌクレオチド）、幾つかの実施形態において、ハイブリダイゼーションが、ＲＮＡにおける分子内塩基対合のかなりの画分を溶融するのに充分な、相対的に高いストリンジェンシー（例えば、高温および／または高塩条件）で実施されるように、長いオリゴｄ（Ｔ）捕捉プローブが設計される。結合の後、幾つかの実施形態において、球形から直線状態へのＲＮＡ構造の残りの変化は、捕捉を無効にするには充分でないがＲＮＡにおける分子内塩基対合を破壊する変性条件を利用することにより、及び流体流れまたは電気泳動力により、実行される。
【０３２０】
ブロック３１０  幾つかの実施形態において、固定された伸長核酸は、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブの各プールに暴露される。オリゴヌクレオチドプローブのセットにおけるそれぞれのオリゴヌクレオチドプローブは、所定の配列および長さであり、暴露は、各オリゴヌクレオチドプローブの各プールの個々のプローブが各オリゴヌクレオチドプローブに相補的である固定された核酸のそれぞれの一部に対して一過性かつ可逆的に可能な条件下で起こり、それにより光学活性の各インスタンスを生じる。
【０３２１】
ブロック３１２  幾つかの実施形態において、二次元イメージャを用いて、暴露の際に起こる光学活性のそれぞれの各インスタンスのテスト基板上の場所および期間が、測定される。
【０３２２】
ブロック３１４  幾つかの実施形態において、暴露および測定が、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける各オリゴヌクレオチドプローブについて反復され、それによりテスト基板上の位置の複数のセットを得、テスト基板上の位置のそれぞれの各セットは、オリゴヌクレオチドプローブのセットにおける１つのオリゴヌクレオチドプローブに対応する。
【０３２３】
ブロック３１６  幾つかの実施形態において、核酸の少なくとも一部の配列は、位置の複数のセットにより表されるテスト基板上の位置をコンパイルすることにより、テスト基板上の位置の複数のセットから決定される。
【０３２４】
ＲＮＡシーケンシング
ＲＮＡの長さは典型的にはゲノムＤＮＡより短いが、現在の技術を利用してＲＮＡを一方の末端から他方までシーケンシングすることは困難である。それにもかかわらず、選択的スプライシングのため、ｍＲＮＡの全配列の組織化を決定することは、極めて重要である。幾つかの実施形態において、ｍＲＮＡは、不動化されたオリゴｄ（Ｔ）によるポリＡテールの結合により捕捉され、その二次構造は、適用される伸長力（例えば、＞４００ｐＮ）および変性条件（例えば、ホルムアミドまたは７Ｍもしくは８Ｍ尿素を含む）により除去され、それは表面で伸長されるようになる。その後、これは、結合試薬（例えば、エキソン特異的）が一過的に結合されることを可能にする。ＲＮＡの長さが短いため、本開示に記載される単一分子位置特定法を用いて、エキソンを解像および識別することは、有益である。幾つかの実施形態において、ＲＮＡに散在するわずかな結合事象が、特有のｍＲＮＡアイソフォームについてｍＲＮＡにおけるエキソンの順序および同一性を決定するのに充分である。
【０３２５】
二本鎖コンセンサス
試料分子から配列情報を得るための方法は、以下の通りである：
ｉ）第一のオリゴに第一の色標識を提供する。第二のオリゴに第二の色標識を提供し、ここで第二のオリゴは、第一のオリゴに相補的な配列である。
ｉｉ）基板上の二本鎖核酸分子を延長、固定し、かつ変性させる。
ｉｉｉ）第一および第二のオリゴの両方をｉｉの変性された核酸に暴露する。
ｉｖ）第一および第二のオリゴの結合場所を決定する。
ｖ）結合の位置が共存する場合、その場所は正しいと見なされる。
ｖｉ）延長された核酸に沿った複数の場所が、結合される。
【０３２６】
幾つかの実施形態において、オリゴは、一過的かつ可逆的に結合する。幾つかの実施形態において、第一および第二のオリゴは、所与の長さの第一および第二のオリゴの競合する（ｃｏｍｐｅｔｅ）レパートリーの一部であり、ステップｉｉ〜ｉｉｉは、レパートリーのそれぞれの第一および第二のオリゴ対について反復されて、核酸全体をシーケンシングする。
【０３２７】
幾つかの実施形態において、複数の修正を行って、２色が光学的に共存すべき時に共存することを、確実にする必要がある。これは、色収差について補正することを含む。幾つかのそのような実施形態において、対の２つのオリゴが一緒に添加されるが、それらが互いにアニーリングすることを予防ししたがってそれらの作用が中和されるために、修飾オリゴヌクレオチドの化学的性質が非自己対合類似塩基と共に用いられ、ここで修飾Ｇは、相補性オリゴヌクレオチド中の修飾Ｃと対合できないが標的核酸上の非修飾Ｃと対合でき、修飾Ａは、相補性オリゴヌクレオチド中の修飾Ｔと対合できないが非修飾Ｔと対合できる、などである。したがってそのような実施形態において、第一および第二のオリゴは、第一のオリゴが第二のオリゴと塩基対合を形成できないように、修飾される。
【０３２８】
幾つかの実施形態において、第一および第二のオリゴは、一緒に添加されず、一方が他方の後に添加される。
【０３２９】
一方のオリゴが、他方の後に添加されるそのような実施形態において、洗浄ステップが、それらの間で実施され、この場合、相補対の２つのオリゴは同じ色で標識され、色収差について補正する必要はない。また、２つのオリゴが互いに結合する可能性はない。
【０３３０】
幾つかの実施形態において、核酸は、オリゴの全レパートリーが使い尽くされるまで、さらに第一および第二のオリゴに暴露される。
【０３３１】
幾つかの実施形態において、第二のオリゴは、レパートリーの他のオリゴ対が添加される前に、第一のオリゴの後で次のオリゴとして添加される。幾つかの実施形態において、第二のオリゴは、レパートリーの他のオリゴ対が添加される前に、次のオリゴとして添加されない。
【０３３２】
そのような実施形態の例は、以下の、試料の分子からの配列情報を得るための方法を含む：
ｉ）基板上の二本鎖核酸分子を延長、固定し、かつ変性させる。
ｉｉ）第一の標識されたオリゴをｉ）の変性された核酸に暴露し、その結合の場所を検出および記録する。
ｉｉｉ）第一の標識されたオリゴを洗浄により除去する。
ｉｖ）第二の標識されたオリゴをｉ）の変性された核酸に暴露し、その結合の場所を検出および記録する。
ｖ）場合により、ｉｉ）とｉｖ）で記録の間にドリフトについて補正する。
ｖｉ）ｉｉ〜ｉｖで得られた結合の記録された位置が共存する場合、場所の配列についてのこのようにして得られた配列情報は、正しいと見なされる。
【０３３３】
幾つかの実施形態において、第一および第二のオリゴは、所与の長さの第一および第二のオリゴの競合するレパートリーの一部であり、ステップｉｉ〜ｉｉｉは、レパートリーのそれぞれの第一および第二のオリゴ対について反復されて、核酸全体をシーケンシングする。
【０３３４】
共存は、我々が同じ配列遺伝子座を見ていることを我々に告げる。さらに、センス鎖を標的とするプローブは、４つの差次的に標識されたオリゴを用いて中心塩基を識別すると期待でき、アンチセンス鎖を標的とするプローブは、センス鎖のプローブに対して相補的配列を有する４つの差次的標識のオリゴを用いて中心塩基を識別すると期待できる。中心的位置の検証された塩基コールを得るために、センス鎖についてのデータが、第二の鎖についてのデータを確証しなければならない。そのため、中央のＡ塩基を有するオリゴがセンス鎖に結合する場合、中央のＴ塩基を有するオリゴはアンチセンス鎖に結合しなければならない。
【０３３５】
センスおよびアンチセンス鎖についてそのような確証またはコンセンサスを得ることはまた、Ｇ：ＴまたはＧ：Ｕゆらぎ塩基対合による結合のための多義性の克服を支援する。これが、センス鎖上で起こる場合、Ｃ：Ａが塩基対を形成する可能性が低いため、アンチセンス鎖上でシグナルを生じそうにない。
【０３３６】
幾つかの実施形態において、修飾されたＧ塩基またはＴ／Ｕが、プローブ中で用いられて、ゆらぎ塩基対の形成を予防できる。幾つかの他の実施形態において、再構成のアルゴリズムは、特にＣ：Ｇ塩基対での確証が相補鎖上に存在せずかつ場所がＡ：Ｔ塩基対を形成する相補鎖へのオリゴ結合と相関する場合、ゆらぎ塩基対の形成の可能性を考慮する。幾つかの実施形態において、３つではなく２つだけの水素結合を形成する能力を有する７−デアザグアニジンが、Ｇ修飾として用いられて、それが形成する塩基対の安定性、ならびにＧ四重鎖およびそれ（そしてそのプロミスキャス結合）の出現率を低下させる。
【０３３７】
同時のデュプレックスコンセンサスの組み立て
幾つかの実施形態において、二重らせんの両方の鎖が存在し、接近している間に先に記載された通りオリゴヌクレオチドに暴露される。幾つかの実施形態において、各オリゴヌクレオチドセットにおけるそれぞれのオリゴが２つの相補鎖のどちらに結合しているかを、検出される一過的光学シグナルから、区別することはできない。例えば、ポリヌクレオチドに沿った各オリゴヌクレオチドセットのオリゴのそれぞれについてのそれぞれのポリヌクレオチドに沿った結合場所がコンパイルされる場合、異なる配列の２つのプローブが、同じ場所に結合したかのように見える場合がある。これらのオリゴは、配列が相補性でなければならず、困難は、結合された２つのオリゴのそれぞれがどの鎖に結合するかを決定することになり、それはポリヌクレオチドについて配列を正確にコンパイルするために前もって必要である。
【０３３８】
単一結合事象が一方の鎖か、または他方の鎖かを決定するために、得られた光学活性の完全なセットが、検討されなければならない。例えばオリゴの２つのタイリングシリーズが、問題の位置関係をカバーする場合、シグナルを作製するオリゴ配列がどちらのシリーズとオーバーラップするかに基づいて、シグナルが属する２つのタイリングシリーズのいずれかが、割り当てられる。幾つかの実施形態において、配列はその後、まず結合の場所および配列オーバーラップを利用して２つのタイリングシリーズのそれぞれを構築することにより、再構成される。その後、２つのタイリングシリーズは、逆相補鎖としてアライメントされ、各場所での塩基割り当ては、２つの鎖がそれらの場所でのそれぞれで完全な逆相補鎖である場合（例えば、これによりデュプレックスコンセンサス配列を提供する）のみ、許容される。
【０３３９】
幾つかの実施形態において、シーケンシングミスマッチは、多義的なベースコールであるとして止められ、ここで独立したミスマッチ結合事象からのものなどの、２つの可能性の一方が追加の情報層により確証される必要がある。幾つかの実施形態において、デュプレックスコンセンサスが得られたら、従来の（多分子の）コンセンサスが、ゲノムの同じ領域をカバーする他のポリヌクレオチドからのデータを比較することにより決定される（例えば、複数の細胞からの結合部位の情報が入手可能な場合）。そのようなアプローチによる１つの問題は、ハプロタイプの配列を含むポリヌクレオチドの可能性である。
【０３４０】
あるいは幾つかの実施形態において、個々の鎖のコンセンサスが、個々の鎖のコンセンサスのデュプレックスコンセンサスが得られる前に得られる。そのような実施形態において、デュプレックスの鎖それぞれの配列が、同時に得られる。これは、幾つかの実施形態において、追加的な試料調製ステップを必要とせずに実行され、現行のＮＧＳ法と異なり、そのようにデュプレックスの２つの鎖を分子バーコードで差次的にタグ付けする（例えば、Ｓａｌｋ ｅｔ ａｌ.,  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. １０９（３６），２０１２に記載）。
【０３４１】
センス鎖とアンチセンス鎖の両方の同時配列獲得は、ナノポアに利用可能な２Ｄまたは１Ｄ２コンセンサスシーケンシングと好適に比較される。これらの代替的方法は、第二の鎖の配列が得られる前に、デュプレックスの一方の鎖について得られる配列を必要とする。幾つかの実施形態において、デュプレックスコンセンサスシーケンシングは、１０６範囲での正確度、例えば１００万塩基に１つのエラーを提供する（他のＮＧＳアプローチの１０２〜１０３という十分でない正確度に比較して）。これにより、方法は、癌状態を示す（例えば、無細胞ＤＮＡ中に存在するものなど）または腫瘍細胞集団中に低頻度で存在する、希少な変異体を解像するための要件と高度に適合する。
【０３４２】
単一細胞解像シーケンシング
様々な実施形態において、方法は、単一細胞のゲノムをシーケンシングすることをさらに含む。幾つかの実施形態において、単一細胞は、他の細胞からの付着を含まない。幾つかの実施形態において、単一細胞は、クラスターまたは組織中で他の細胞に付着されている。幾つかの実施形態において、そのような細胞は、個々の非付着細胞に脱凝集される。
【０３４３】
幾つかの実施形態において、細胞は、ポリヌクレオチドが延長される構造（例えば、フローセルまたはマイクロウェル）の入口にそれらが流動的に移動する（例えば、ピペットを使用することによる）前に、脱凝集される。幾つかの実施形態において、脱凝集は、細胞をピペッティングすることにより、プロテアーゼ、音波処理または物理的撹拌を加えることにより、実行される。幾つかの実施形態において、細胞は、それらが延長する構造内に流動的に移動した後、脱凝集される。
【０３４４】
幾つかの実施形態において、単一細胞が単離され、ポリヌクレオチドが単一細胞から放出され、そのため、同じ細胞から発生するポリヌクレオチドは全て、互いに接近しかつ他の細胞の内容物が配置される場所と異なる場所に、配置されたままである。幾つかの実施形態において、Ｄｉ Ｃａｒｌｏ ｅｔ ａｌ., Ｌａｂ Ｃｈｉｐ ６:１４４５−１４４９, ２００６に記載されたトラップ構造が、用いられる。
【０３４５】
幾つかの実施形態において、複数の単一細胞を捕捉および単離するマイクロ流体構造（例えば、図１６Ａおよび１６Ｂに示されるように、トラップが分離している場合）、または複数の非単離細胞を捕捉する構造（例えば、トラップが連続している場合）のいずれかを使用できる。幾つかの実施形態において、トラップは、単一細胞の寸法である（例えば、２μＭ〜１０μＭ）。幾つかの実施形態において、フローセルは、長さ数百ミクロン〜数ミリメートルであり、深さ約３０ミクロンである。
【０３４６】
幾つかの実施形態において、例として図１７に示される通り、単一細胞は、送達チャネルに流れ１７０２、トラップされ１７０４、ヌクレオチドを放出し、その後延長する。幾つかの実施形態において、細胞１６０２は、溶解され１７０６、その後、細胞核が、第二の溶解ステップ１７０８を通して溶解され、こうして細胞外および細胞内ポリヌクレオチド１６０８を逐次放出する。場合により、核外および核内ポリヌクレオチドの両者は、単一溶解ステップを利用して放出される。放出後に、ポリヌクレオチド１６０８は、フローセル２００４の長さに沿って不動化され、延長される。幾つかの実施形態において、トラップは、単一細胞の寸法である（例えば、幅２μＭ〜１０μＭ）。一実施形態において、トラップの寸法は、底部が４．３μＭ幅、高さの中央では６μＭ、最上部が８μＭであり、深さ３３μｍであり、デバイスは、射出成形を利用して環状オレフィン（ＣＯＣ）から作製される。
【０３４７】
幾つかの実施形態において、単一細胞は、個々のチャネルに溶解され、それぞれの個々の細胞は、トランスポザーゼを介した統合によりユニークタグ配列と反応された後で、ポリヌクレオチドがひとまとめにされ同じ混合物中でシーケンシングされる。幾つかの実施形態において、トランスポザーゼ複合体は、細胞内にトランスフェクトされるか、または細胞を含むドロップレットに溶け込んだドロップレットの中にある。
【０３４８】
幾つかの実施形態において、凝集体は、細胞の小さなクラスターであり、幾つかの実施形態において、クラスター全体が、同じシーケンシングタグでタグ付けされる。幾つかの実施形態において、細胞は、凝集しておらず、循環する腫瘍細胞（ＣＴＣ）または循環する胎児細胞などの浮遊細胞はない。
【０３４９】
単一細胞シーケンシングでは、細胞溶解後の自然なシトシン脱アミノ化により誘発されるシトシン−チミジン単一ヌクレオチド変異体の問題がある。これは、試料をシーケンシングの前にウラシルＮ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）で前処理することにより克服される（例えば、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ., Ｍｏｌ Ｄｉａｇｎ Ｔｈｅｒ. １８（５）: ５８７−５９３, ２０１４に記載）。
【０３５０】
ハプロタイプの同定
様々な実施形態において、上記の方法は、ハプロタイプをシーケンシングするために用いられる。ハプロタイプのシーケンシングは、本明細書に記載された方法を利用してジプロイドゲノムのハプロタイプにまたがる第一の標的ポリヌクレオチドをシーケンシングすることを含む。ジプロイドゲノムの第二のハプロタイプ領域にまたがる第二の標的ポリヌクレオチドもまた、シーケンシングされなければならない。第一および第二の標的ポリヌクレオチドは、相同性染色体の異なるコピー由来であろう。第一および第二の標的ポリヌクレオチドの配列を比較し、それにより第一および第二の標的ポリヌクレオチド上のハプロタイプを決定する。
【０３５１】
こうして、実施形態から得られた単一分子のリードおよび組み立ては、ハプロタイプ特異性であると分類される。ハプロタイプ特異的情報が、長い範囲にわたり必ずしも容易に得られない唯一の例は、組み立てが断続的の場合である。そのような実施形態において、それでもリードの場所が、提供される。そのような状況であっても、ゲノムの同じ分節をカバーする複数のポリヌクレオチドが、解析されれば、ハプロタイプが、計算的に決定される。
【０３５２】
幾つかの実施形態において、相同性分子が、ハプロタイプまたは親染色体特異性に従って分離される。本開示の方法により実際に物理的または視覚的に得られた情報の視覚的性質は、特有のハプロタイプを示すことができる。幾つかの実施形態において、ハプロタイプの解像は、改善された遺伝的または祖先的研究の実施を可能にする。他の実施形態において、ハプロタイプの解像は、より良好な組織型判定の実行を可能にする。幾つかの実施形態において、ハプロタイプの解像または特有のハプロタイプの検出は、診断の実行を可能にする。
【０３５３】
複数の細胞からの同時のポリヌクレオチドのシーケンス
様々な実施形態において、先に記載された方法を用いて、それぞれのポリヌクレオチドが起源の細胞の情報を保持する、複数の細胞（または核）からのポリヌクレオチドを配列する。
【０３５４】
特定の実施形態において、トランスポゾンを介した配列挿入が、細胞の内部に介在し、各挿入は、起源の細胞に対する標識としてのユニークなＩＤ配列タグを含む。他の実施形態において、トランスポゾンを介した挿入は、単一細胞が単離されたコンテナの内部で起こり、そのようなコンテナは、アガロースビーズ、油−水ドロップレットなどを含む。ユニークなタグは、タグを担持するポリヌクレオチドの全てが同じ細胞から発生しなければならないことを示す。ゲノムＤＮＡおよび／またはＲＮＡの全てが、その後、抽出され、混合され、延長される。その後、本発明の実施形態によるシーケンシング（または任意の他のシーケンシング法）が、ポリヌクレオチド上で実施される場合、ＩＤ配列タグのリーディングが、ポリヌクレオチドがどの細胞から発生したかを示す。細胞を同定するタグを短く維持することが、好ましい。１０，０００細胞（例えば、腫瘍微生物学から）の場合、約６５，０００のユニークな配列が、８ヌクレオチド長の同定配列により提供され、１００万前後のユニークな配列が、１０ヌクレオチド長の同定配列により提供される。
【０３５５】
幾つかの実施形態において、個々の細胞は、同一性（ＩＤ）タグでタグ付けされる。図１９に示される通り、幾つかの実施形態において、同一性タグは、タグメンテーションによりポリヌクレオチドに統合され、それに対し試薬は、単一細胞に直接、または細胞１８０２に溶け込ませた、もしくは細胞１８０２を飲み込むマイクロドロップレットの中で、提供される。各細胞は、異なるＩＤタグを受け取る（大きなレパートリー、例えば１００万を超える可能なタグから）。マイクロドロップレットおよび細胞が、融合された後１８０４、ＩＤタグが、個々の細胞内のポリヌクレオチドに統合される。個々の細胞の内容物は、フローセル２００４内で混合される。シーケンシング（例えば、本明細書に開示された方法による）はその後、特有のポリヌクレオチドがどの細胞から発生したかを明らかにする。代わりの実施形態において、マイクロドロップレットは、細胞を飲み込み、タグ付けする試薬を細胞に送達する（例えば、細胞に拡散すること、または細胞の内容物をマイクロドロップレットの中に破裂させることによる）。
【０３５６】
この同じインデキシング原理は、目的が、試料を混合し、それらを一緒にシーケンシングすることであるが、各個別の試料に属する配列情報を回収することである場合、細胞以外の試料（例えば、異なる個体からの）に適用される。
【０３５７】
さらに、複数の細胞がシーケンシングされる場合、細胞集団におけるハプロタイプの多様性および頻度を決定できる。幾つかの実施形態において、集団内のゲノムの異質性が、単一細胞の内容物をまとめる必要なしに解析され、なぜなら、分子が充分に長ければ、細胞集団内に存在する異なる染色体、長い染色体分節またはハプロタイプが決定されるからである。これは、２つのハプロタイプが細胞中で一緒に存在することを示さないが、ゲノム構造タイプの多様性（またはハプロタイプ）およびそれらの頻度、かつどの異常な構造変異体が存在するか、を報告する。
【０３５８】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドがＲＮＡであり、ｃＤＮＡコピーがシーケンシングされる場合、タグの付加は、タグ配列を含むプライマーでのｃＤＮＡ合成を含む。ＲＮＡが直接シーケンシングされる場合、タグは、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼを用いる３’ＲＮＡターミナルへのタグのライゲーションにより添加される。代わりのタグ作製方法は、各個別のポリヌクレオチドがヌクレオチドテールのユニーク配列を確率論的に得るように、ＲＮＡまたはＤＮＡを４つのＡ、Ｃ、ＧおよびＴ塩基の１つを超えるヌクレオチドと共にターミナルトランスフェラーゼで伸長することである。
【０３５９】
幾つかの実施形態において、より多くの配列リードがポリヌクレオチド配列そのもののシーケンシングに充てられるように、配列の量がより短く保持されるために、タグ配列が、複数の部位に分布される。本明細書では、例えば３つの、複数の短い同一性配列が、それぞれの細胞またはコンテナの中に導入される。その後、ポリヌクレオチドの起源が、ポリヌクレオチドに沿って分布されたタグのビットから決定される。そのためこの場合、１つの場所からのタグリードのビットは、起源細胞を決定するのに充分でないが、複数のタグビットは、決定を行うのに充分である。
【０３６０】
構造変異体の検出
幾つかの実施形態において、検出された配列と参照ゲノムの間の差は、置換、挿入欠失および構造変異を含む。詳細には、参照配列が、本開示の方法により組み立てられていない場合、反復は圧縮され、再構成は展開するであろう。
【０３６１】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドに沿った一連の配列リードの方位が、反転事象が起こったか否かについて報告する。参照に対し比較された他のリードと逆方位での１つまたは複数のリードは、反転を示す。
【０３６２】
幾つかの実施形態において、付近にある他のリードの状況下で予測されない１つまたは複数のリードの存在は、参照に対し比較された転位またはトランスロケーションを示す。参照におけるリードの場所は、ゲノムのどの部分が別の部分にシフトしたかを示す。幾つかの例において、その新しい場所におけるリードは、トランスロケーションというよりもデュプリケーションである。
【０３６３】
幾つかの実施形態において、反復領域またはコピー数の変異を検出することもできる。リードまたは関係するリードを担うパラロガスな変異の反復的出現は、ゲノム中の複数の場所で起こる複数の、または非常に類似したリードとして観察される。これらの複数の場所は、幾つかの例において、一緒に接近してパッキングされるか（例えば、サテライトＤＮＡと同様に）、またはそれらは、他の場合にはゲノムにわたり分散される（例えば、擬似遺伝子でのように）。本開示の方法は、ショートタンデムリピート（ＳＴＲＳ）、可変数のタンデムリピート（ＶＮＴＲ）、トリヌクレオチドリピートなどに適用される。特異的リードの非存在または反復は、それぞれ欠失または増幅が起こったことを示す。幾つかの実施形態において、方法は、特にポリヌクレオチド中に複数のおよび／または複雑な転位が存在する場合に適用される。この方法は単一ポリヌクレオチドを解析することに基づくため、幾つかの実施形態において、先に記載された構造変異体は、少数の細胞、例えば集団からのほんの１％の細胞における希少な出現まで解像される。
【０３６４】
同様に幾つかの実施形態において、分節重複またはデュプリコンが、ゲノム中で正しく位置特定される。分節デュプリコンは典型的には、ほぼ同一の配列のＤＮＡ配列における長い領域である（例えば、１キロベース長より大きい）。これらの分節重複は、体細胞突然変異を含む、個々のゲノムにおける多数の構造変異を誘発する。分節デュプリコンは、ゲノムの遠位部分に存在する場合がある。現行の次世代シーケンシングでは、どの分節デュプリコンからリードが生じているかを決定することは困難である（つまり組み立てを複雑にする）。本開示の幾つかの実施形態において、配列リードが、長い分子（例えば、０．１〜１０メガベース長範囲）で得られ、通常、ゲノムのどの分節がデュプリコンに対応するゲノムの特有の分節に隣接するかを決定するためにリードを用いることにより、デュプリコンのゲノムの前後関係を決定することが可能である。
【０３６５】
構造変異体のブレークポイントが、本開示の幾つかの実施形態において精密に位置特定される。幾つかの実施形態において、ゲノムの２つの部分が融合していることを検出することは可能であり、そこでブレークポイントが起こった精密な個々のリードが、決定される。本明細書で記載された通り収集された配列リードは、２つの融合された領域のキメラを含み、ブレークポイントの一方の側の配列は全て、融合された分節の一方に対応し、他方の側は、融合された分節の他方である。このことは、構造がブレークポイント周辺で複雑である例でも、ブレークポイントを決定することに高い信頼性を与える。幾つかの実施形態において、精密な染色体ブレークポイント情報は、疾患のメカニズムを理解する際に、特異的トランスロケーションの出現を検出する際に、または疾患を診断する際に用いられる。
【０３６６】
エピジェノミックな修飾の位置特定
幾つかの実施形態において、方法は、固定された二本鎖または固定された第一の鎖および固定された第二の鎖を抗体、アフィマー、ナノボディ、アプタマー、またはメチル結合タンパク質に暴露し、それにより核酸への修飾を決定すること、またはテスト基板上の位置の複数のセットから核酸の一部の配列と相関させること、をさらに含む。幾つかの抗体は、二本鎖または一本鎖に結合する。メチル結合タンパク質は、二本鎖ポリヌクレオチドを結合すると予測されよう。
【０３６７】
幾つかの実施形態において、ネイティブポリヌクレオチドは、それらがシーケンシングのために提示される前に、プロセシングを必要としない。これは、ＤＮＡの化学修飾が適所にとどまるため、この方法がエピジェノミック情報を配列情報と統合することを可能にする。好ましくはポリヌクレオチドは、指向的に充分にアライメントされ、それにより撮像工程、ベースコールおよび組み立ての撮像が比較的容易であり、配列のエラー率が低く、カバー率が高い。本開示を実行するための複数の実施形態が記載されているが、それぞれは、試料の調製の負担が完全に、またはほぼ完全に排除されるように、実施される。
【０３６８】
これらの方法は、幾つかの実施形態において、増幅なしにゲノムＤＮＡ上で実施されるため、それらは、増幅のバイアスおよびエラーを被らず、エピジェノミックマーク（ｅｐｉｇｅｎｏｍｉｃ  ｍａｒｋ）が維持され、検出される（例えば、配列の獲得に対してオルソゴナルに）。幾つかの例において、核酸がメチル化される場合、配列特異的手法で決定することが有用である。例えば母方のＤＮＡから胎児を識別する一方法は、前者を目的の遺伝子座でメチル化することである。これは、非侵襲的出生前検査（ＮＩＰＴ）に有用である。
【０３６９】
炭素−５（Ｃ５）のアルキル化などの、複数のタイプのメチル化が可能であり、それは、哺乳動物において複数のシトシン変異体、Ｃ５−メチルシトシン（５−ｍＣ）、Ｃ５−ヒドロキシメチルシトシン（５−ｈｍＣ）、Ｃ５−ホルミルシトシンおよびＣ５−カルボキシルシトシンを生じる。真核および原核生物体もまた、アデニンをＮ６−メチルアデニン（６−ｍＡ）にメチル化する。原核生物において、Ｎ４−メチルシトシンもまた、多く存在する。
【０３７０】
抗体は、入手可能であるか、またはこれらの修飾のそれぞれ、および興味深いと解釈される任意の他の修飾に対して作製される。修飾を標的とするアフィマー、ナノボディまたはアプタマーは、より小さなフットプリントの可能性のため特に関連性がある。本発明における抗体への任意の参照は、アフィマー、ナノボディ、アプタマーおよび任意の類似試薬を含むと解釈されなければならない。加えて、他の天然由来ＤＮＡ結合タンパク質、例えばメチルタンパク質（ＭＢＤ１、ＭＢＤ２など）が、幾つかの実施形態で用いられる。
【０３７１】
メチル化分析は、幾つかの実施形態において、シーケンシングにオルソゴナルに実行される。幾つかの実施形態において、これは、シーケンシングの前に実施される。一例として、抗メチルＣ抗体またはメチル結合タンパク質（メチル結合ドメイン（ＭＢＤ）タンパク質ファミリーはＭｅＣＰ２、ＭＢＤ１、ＭＢＤ２およびＭＢＤ４を含む）またはペプチド（ＭＢＤ１に基づく）は、幾つかの実施形態においてポリヌクレオチドに結合され、それらの場所は、それらが除去される（例えば、高塩緩衝液、カオトロピック試薬、ＳＤＳ、プロテアーゼ、尿素および／またはヘパリンを添加することによる）前に、標識を介して検出される。好ましくは試薬は、オン−オフ結合を促進する一過的結合緩衝液の使用により一過的に結合するか、または試薬は、一過的に結合するように設計される。類似のアプローチが、ヒドロキシメチル化またはＤＮＡ損傷部位などの他のポリヌクレオチド修飾に用いられ、その場合抗体は、入手可能であるか、または作製される。修飾の場所が検出されて、修飾結合試薬が除去された後、シーケンシングを開始する。幾つかの実施形態において、標的ポリヌクレオチドが一本鎖になるように変性された後、抗メチルおよび抗ヒドロキシメチル抗体などが添加される。方法は、高感度であり、長いポリヌクレオチド上の１つの修飾を検出することが可能である。
【０３７２】
図１９は、単一細胞からのＤＮＡおよびＲＮＡの抽出および伸長、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡの差次的標識（例えば、それぞれｍＣおよびｍ６Ａへの抗体による）を示している。細胞１６０２は、表面に不動化され、その後、溶解される１９０２。溶解により核１６０４から放出された核酸１６０８は、不動化され、延長される１９０４。その後核酸は、付属のＤＮＡタグを含む抗体に暴露および結合される１９１０および１９１２。幾つかの実施形態において、タグは、ＤＮＡ  ＰＡＩＮＴに基づく単一分子位置特定のための蛍光色素またはオリゴヌクレオチドドッキング配列である。幾つかの実施形態において、タグおよびＤＮＡ  ＰＡＩＮＴを使用する代わりに、抗体または他の結合タンパク質は、単一蛍光標識または複数の蛍光標識で、直接蛍光標識される。抗体がコードされる例では、標識の一例は、図１４Ａ、１４Ｃおよび１４Ｄに示される通りである。ＤＮＡおよびＲＮＡの両方のエピモディフィケーション分析は、幾つかの実施形態において、本明細書に記載されたシーケンシング法を利用してそれらの配列と結び付けられる。
【０３７３】
幾つかの実施形態において、タンパク質を結合することによりメチル化を検出することに加え、結合部位におけるメチル化の存在は、修飾がない場合と比較した、修飾が標的核酸部位に存在する場合の差次的オリゴヌクレオチド結合挙動により検出される。
【０３７４】
幾つかの実施形態において、亜硫酸水素塩処理を利用して、メチル化を検出する。本明細書では、レパートリーに通した後、亜硫酸水素塩処理を利用して、非メチル化シトシンをウラシルに変換し、その後、再度レパートリーが適用される。亜硫酸水素塩処理の前にＣとして読み取られたヌクレオチド位置が、亜硫酸水素塩処理後にＵとして読み取られれば、それは、非メチル化されていると見なすことができる。
【０３７５】
メチル化などのＤＮＡ修飾のための参照エピゲノムは、存在しない。有用であるためには、既知のポリヌクレオチドのメチル化マップを、配列に基づくマップにリンクさせる必要がある。したがってエピマッピング法は、幾つかの実施形態において、エピマップへの関連性を提供するために、オリゴ結合により得られる配列ビットに相関される。配列リードに加えて、他の種類のメチル化情報もまた、幾つかの実施形態において結び付けられる。これは、非限定的例として、ニッキングエンドヌクレアーゼに基づくマップ、オリゴ結合に基づくマップ、ならびに変性および変性−再生マップを含む。幾つかの実施形態において、１つまたは複数のオリゴの一過的結合を用いて、ポリヌクレオチドをマッピングする。ゲノムへの機能的修飾に加え、同じアプローチが、幾つかの実施形態において、ＤＮＡ損傷部位およびタンパク質またはリガンド結合の部位などの、ゲノムへマッピングする他の特色に適用される。
【０３７６】
好ましい開示において、塩基シーケンシングまたはエピジェノミックシーケンシングのいずれかが、最初に実施される。幾つかの実施形態において、両方が、同時に実施される。例えば特異的エピモディフィケーションに対する抗体が、幾つかの実施形態において、オリゴから差次的にコードされる。そのような実施形態において、両方のタイプのプローブの一時的結合を容易にする条件が、利用される（例えば、低塩濃度）。
【０３７７】
幾つかの実施形態において、ポリヌクレオチドが染色体またはクロマチンを含む場合、抗体が染色体またはクロマチン上で用いられて、ＤＮＡへの修飾およびまたヒストンへの修飾（例えば、ヒストンアセチル化およびメチル化）を検出する。これらの修飾の場所は、染色体またはクロマチン上の場所への抗体の一過的結合により決定される。幾つかの実施形態において、抗体は、オリゴタグで標識され、一過的に結合せず、むしろそれらの結合部位に永久的または半永久的に固定される。そのような実施形態において、抗体は、オリゴタグを含み、これらの抗体結合部位の場所は、抗体タグ上のオリゴへの相補性オリゴの一過的結合を利用することにより、検出される。
【０３７８】
無細胞核酸の単離および解析
診断に最も利用し易いＤＮＡまたはＲＮＡの幾つかは、体液または糞便中の細胞の外部に見出される。そのような核酸は多くの場合、体内の細胞から脱落している。血中を循環する無細胞ＤＮＡは、トリソミー２１ならびに他の染色体およびゲノム疾患についての出生前検査に用いられる。それは、腫瘍由来ＤＮＡ、および特定の病的状態のためのマーカーである他のＤＮＡまたはＲＮＡを検出する手段でもある。しかし分子は典型的には、小分節中に存在する（例えば、血中で約２００塩基対長の範囲で、及び尿中ではより短い）。ゲノム領域のコピー数が、ゲノムの他の部分に比較して、参照の特有の領域にアライメントされたリード数への比較により決定される。
【０３７９】
幾つかの実施形態において、本開示の方法は、２つのアプローチにより無細胞ＤＮＡ配列の列挙または解析に適用される。第一は、変性の前または後に短い核酸を不動化することを含む。一過的結合試薬を利用して、核酸の同一性、そのコピー数、突然変異または特定のＳＮＰ対立遺伝子が存在するか否か、および検出された配列がメチル化されているか、または他の修飾（バイオマーカー）を担うかを決定するために、核酸をインターロゲートする。
【０３８０】
第二のアプローチは、小さな核酸断片を連結することを含む（例えば、無細胞核酸が、生体試料から単離された後で）。連結は、組み合わせた核酸の伸長を可能にする。連結は、ＤＮＡの末端をポリシングすること、およびブラントエンドのライゲーションを実施することにより実施される。あるいは血液または無細胞ＤＮＡが、２つのアリコットに分割され、一方のアリコットは、ポリＡでテーリングされ（ターミナルトランスフェラーゼを用いて）、他方のアリコットは、ポリＴによりテーリングされる。
【０３８１】
得られた連結物は、その後、シーケンシングに供される。得られた「超」配列リードは、その後、参照に対し比較されて、個々のリードを抽出する。個々のリードは、計算で抽出され、その後、他のショートリードと同じ手法で処理される。
【０３８２】
幾つかの実施形態において、生体試料は、核酸を分解する多数のエキソヌクレアーゼを含有する媒体である、糞便を含む。そのような実施形態において、機能するためにエキソヌクレアーゼにより必要とされる、高濃度の二価陽イオンのキレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）を用いて、ＤＮＡを充分に無傷で保持し、シーケンシングを可能にする。幾つかの実施形態において、無細胞核酸は、エキソソーム中の封入化を介して細胞から脱落する。エキソソームは、超遠心分離により、またはスピンカラム（Ｑｕｉａｇｅｎ）を用いることにより単離され、そこに含有されるＤＮＡまたはＲＮＡが収集され、シーケンシングされる。
【０３８３】
幾つかの実施形態において、メチル化情報は、先に記載された方法に従い、無細胞核酸から得られる。
【０３８４】
シーケンシング技術の組み合わせ
幾つかの実施形態において、本明細書に記載された方法は、他のシーケンシング技術と組み合わせられる。幾つかの実施形態において、一過的結合によるシーケンシングに続いて、第二の方法によるシーケンシングが、同じ分子で開始される。例えば、より長くより安定なオリゴヌクレオチドが結合されて、合成によるシーケンシングを開始する。幾つかの実施形態において、方法は、完全なゲノムのシーケンシングがなければ停止し、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のものなどのショートリードシーケンシングのための足場を提供するために用いられる。この場合、ＰＣＲ増幅ステップを除外することによりＩｌｌｕｍｉｎａライブラリー調製を実行して、より高いゲノムカバー率を得ることが、有利である。これらの実施形態の幾つかのうちの一利点である、必要とされるシーケンシングのカバー率は、例えば約４０倍から２０倍に半減する。幾つかの実施形態において、これは、この方法により実行されるシーケンシングの追加、およびこの方法が提供する場所の情報による。幾つかの実施形態において、場合により光学標識される、より長くより安定なオリゴは、シーケンシング工程の一部または全てでオリゴをショートシーケンシングする前、またはそれと同時に（好ましくは異なる標識で）、ゲノム中の目的の特異的領域（例えば、ＢＲＣＡ１遺伝子座）を印づけるために、標的に結合され得る。
【０３８５】
機械学習法
幾つかの実施形態において、人工知能または機械学習を利用して、既知の配列のポリマー（例えば、ポリヌクレオチド）に対してテストする場合、および／またはポリヌクレオチドの配列を別の方法から得られたデータと交差検証する場合に、レパートリーのメンバーの挙動を学習する。幾つかの実施形態において、学習アルゴリズムは、１つまたは複数の条件または前後関係において特有のプローブの結合部位を含む１つまたは複数のポリヌクレオチドターゲットに対するこのプローブの完全な挙動を考慮する。同じまたは異なる試料で実行されるシーケンシングが多いほど、機械学習からの知識がより確実になる。機械学習から学習されたものは、様々な他のアッセイ、特に一過的結合に基づく新興のシーケンシングに加えて、オリゴとオリゴ／ポリヌクレオチドとの相互作用を含むもの（例えば、ハイブリダイゼーションによるシーケンシング）に適用される。
【０３８６】
幾つかの実施形態において、人工知能または機械学習は、短いオリゴ（例えば、３量体、４量体、５量体または６量体）の完全なレパートリーを既知の配列の１つまたは複数のポリヌクレオチドに結合させるために実験的に得られた結合パターンのデータを提供することによりトレーニングされる。各オリゴのトレーニングデータは、結合場所、結合期間、および所与の期間にわたる結合事象の数を含む。このトレーニングの後、機械学習アルゴリズムが、決定される配列のポリヌクレオチドに適用され、その学習に基づき、ポリヌクレオチドの配列を組み立てることができる。幾つかの実施形態において、機械学習アルゴリズムはまた、参照配列を提供される。
【０３８７】
幾つかの実施形態において、配列組み立てアルゴリズムは、機械学習要素と非機械学習要素の両方を含む。
【０３８８】
幾つかの実施形態において、実験的に得られた結合パターンから学習するコンピュータアルゴリズムの代わりに、結合パターンが、シミュレーションを介して得られる。例えば幾つかの実施形態において、シミュレーションは、既知の配列のポリヌクレオチドへのレパートリーのオリゴの一過的結合で実施される。シミュレーションは、実験データまたは発表されたデータから得られたそれぞれのオリゴの挙動のモデルに基づく。例えば結合安定性の予測は、近傍法に従って入手される（例えば、ＳａｎｔａＬｕｃｉａ ｅｔ ａｌ., Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３５, ３５５５−３５６２（１９９６）およびＢｒｅｓｌａｕｅｒ ｅｔ ａｌ.,  Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ. Ａｃａｄ. Ｓｃｉ. ８３: ３７４６−３７５０, １９８６に記載）。幾つかの実施形態において、ミスマッチの挙動は、既知であるか（例えば、Ａに結合するＧのミスマッチは、Ａに結合するＴと同様またはより強い相互作用であり得る）または実験的に誘導される。さらに幾つかの実施形態において、オリゴの幾つかの短いサブ配列（例えば、ＧＧＡまたはＡＣＣ）の異常に高い結合強さが、知られている。幾つかの実施形態において、機械学習アルゴリズムは、シミュレートされたデータでトレーニングされ、その後、それが短いオリゴの完全なレパートリーによりインターロゲートされる場合に未知配列の配列を決定するために用いられる。
【０３８９】
幾つかの実施形態において、レパートリーまたはパネルのオリゴのデータ（場所、結合期間、シグナンル強度など）は、既知の配列の１つまたは複数、好ましくは（数十、数百、または数千）でトレーニングされた機械学習アルゴリズムに挿入される。その後、機械学習アルゴリズムは、問題の配列からデータセットを作成するために適用され、機械学習アルゴリズムは、問題の未知配列の配列を作成する。比較的小さいまたはそれほど複雑でないゲノムを有する生物体のシーケンシングのための（例えば、細菌、バクテリオファージなどのための）アルゴリズムのトレーニングは、そのタイプの生物体で実施されるべきである。より大きな、またはより複雑なゲノムを有する生物体（例えば、Ｓ．ポンベまたはヒト）、特に反復ＤＮＡ領域を有する生物体の場合、トレーニングは、そのタイプの生物体で実施されるべきである。全染色体長へのメガベース断片のロングレンジアセンブリの場合、ゲノムの特有の態様がトレーニングの間に表されるように、トレーニングは、幾つかの実施形態において類似の生物体で実施される。例えばヒトゲノムは、ジプロイドであり、分節重複を有する大きな配列領域を呈する。目的の他のゲノム、特に多くの農業的に重要な植物種は、高度に複雑なゲノムを有する。例えば小麦および他の穀物は、高度にポリプロイドのゲノムを有する。
【０３９０】
幾つかの実施形態において、機械学習に基づく配列再構築アプローチは、（ａ）１つまたは複数のトレーニングデータセットから収集されたレパートリー中のそれぞれのオリゴの結合挙動に関する情報を提供すること、ならびに（ｂ）配列が決定されるポリヌクレオチドへの、レパートリーのそれぞれのオリゴの物理的結合を提供すること、ならびに（ｃ）それぞれのオリゴについてそれぞれの場所での、結合場所および／または結合期間および／または結合が起こる回数（例えば、結合反復の持続）に関する情報を提供すること、を含む。
【０３９１】
幾つかの実施形態において、特有の実験の配列は第一に、非機械学習アルゴリズムにより処理される。その後、第一のアルゴリズムの出力配列を用いて機械学習アルゴリズムをトレーニングし、それによりトレーニングは、同じ厳密な分子の、実際の実験的に誘導された配列で起こる。幾つかの実施形態において、配列組み立てアルゴリズムは、ベイジアンアプローチを含む。幾つかの実施形態において、本開示の方法から誘導されたデータは、ＷＯ２０１００７５５７０に記載されたタイプのアルゴリズムに供給され、場合により他のタイプのゲノムまたはシーケンシングデータと組み合わせられる。
【０３９２】
幾つかの実施形態において、配列は、多数の方法でデータから抽出される。配列再構成法のスペクトラムの一方の末端では、モノマーの位置特定またはモノマーのストリングは非常に精密であるため（ナノメートルまたはサブナノメートルサイズ）、配列は、モノマーまたはストリングをただ並べることにより得られる。スペクトラムの他方の末端では、データは、配列についての様々な仮説を排するために使用される。例えば、１つの仮説は、配列が既知の個々のゲノム配列に対応するということである。アルゴリズムは、データがどこで個々のゲノムから分れるかを決定する。別の例では、仮説は、配列が「正常な」体細胞の既知のゲノム配列に対応するということである。アルゴリズムは、推定上の腫瘍細胞からのデータがどこで「正常な」体細胞の配列から分れるかを決定する。
【０３９３】
本開示の一実施形態において、１つまたは複数の既知の標的ポリヌクレオチド（複数可）（例えば、ラムダファージＤＮＡ、またはレパートリー中のそれぞれのオリゴへの相補鎖を含む超配列（ｓｕｐｅｒ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含む合成構築物）を含むトレーニングセットが、レパートリーからのそれぞれのオリゴヌクレオチドのテストされた反復結合に用いられる。機械学習アルゴリズムが、幾つかの実施形態において、オリゴプローブの結合およびミスマッチの特徴を決定するために用いられる。したがって直観に反して、ミスマッチ結合は、配列を組み立てるために、かつ／または配列に信頼性を加えるために用いられるさらなるデータを提供する方法として見られる。
【０３９４】
シーケンシングの機器類およびデバイス
シーケンシング法は、一般的な機器類の要件を有する。基本的に機器は、撮像および試薬交換が可能でなければならない。撮像の要件は、対物レンズ、リレーレンズ、ビームスプリッタ、ミラー、フィルター、およびカメラまたはポイントディテクターの群の１つまたは複数を含む。カメラは、ＣＣＤまたはアレイＣＭＯＳ検出器を含む。ポイントディテクターは、光電子増倍管（ＰＭＴ）またはアバランシェフォトダイオード（ＡＰＤ）を含む。幾つかの例において、高速カメラが用いられる。他の任意の態様が、方法の形式に応じて適合される。例えば光源（例えば、ランプ、ＬＥＤまたはレーザ）、基板（例えば、プリズム、格子、ゾル−ゲル、レンズ、移動可能な台または移動可能な対物レンズ）への照明の連結、イメージャに関して試料を移動させるためのメカニズム、試料混合／撹拌、温度制御および電気制御がそれぞれ独立して、本明細書に開示される異なる実施形態に適合される。
【０３９５】
単一分子での実行の場合、照明は好ましくは、エバネッセント波の生成を介する、例えば、適切な角度でレーザ光を基板の縁部にもたらすことにより生成される、プリズムに基づく全内反射、対物レンズに基づく全内反射、格子に基づく導波管、ヒドロゲルに基づく導波管、またはエバネッセントモード導波管を介する。幾つかの例において、導波管は、コア層と、第一の被覆層とを含む。あるいは照明は、ＨＩＬＯ照明または光シートを含む。幾つかの単一分子機器では、光散乱の影響は、パルス照明とタイムゲーティング検出の同期を利用することにより軽減され、本明細書では、光散乱が、ゲートアウトされる（ｇａｔｅｄ  ｏｕｔ）。幾つかの実施形態において、暗視野照明が、用いられる。幾つかの機器は、蛍光寿命測定用に設定される。
【０３９６】
幾つかの実施形態において、機器はまた、細胞、核、オルガネラ、染色体などからのポリヌクレオチドの抽出のための手段を含む。
【０３９７】
ほとんどの実施形態に適した機器は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ製のＧｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ ＩＩｘである。この機器は、プリズムに基づくＴＩＲ、２０倍乾燥対物レンズ、ライトスクランブラー、５３２ｎｍおよび６６０ｎｍレーザ、赤外レーザに基づく集束系、発光フィルターホイール、Ｐｈｏｔｏｍｅｔｒｉｘ ＣｏｏｌＳｎａｐ ＣＣＤカメラ、温度制御、および試薬交換のためのシリンジポンプに基づくシステムを含む。代わりのカメラの組み合わせによるこの機器の改良は、幾つかの実施形態において、より良好な一分子シーケンシングを可能にする。例えばセンサーは、好ましくは２ｅ未満の低電子ノイズを有する。またセンサーは、多数の画素を有する。シリンジポンプに基づく試薬交換システムは、幾つかの実施形態において、圧力で駆動される流れに基づくものに交換される。システムは、幾つかの実施形態において、機器の能動的または改変されたポンピングを取り付けるように適合された、互換性のあるＩｌｌｕｍｉｎａフローセルまたは慣用されるフローセルと共に用いられる。
【０３９８】
あるいは、レーザベッド（標識の選択に応じたレーザ）またはゲノムアナライザーからのレーザシステムおよびライトスクランブラーと連結されたモーター付きＮｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ顕微鏡と、ＥＭ  ＣＣＤカメラ（例えば、Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＩｍａｇｅＥＭ）またはサイエンティフィックＣＭＯＳ（例えば、Ｈａｍａｍａｔｓｕ Ｏｒｃａ ＦＬＡＳＨ）と、場合により温度制御とが用いられる。幾つかの実施形態において、科学的センサーよりむしろ消費者用センサーが、用いられる。これは、シーケンシングの経費を劇的に低減する能力を有する。これは、圧力駆動のまたはシリンジのポンプシステム、および特別に設計されたフローセルと連結される。幾つかの実施形態において、フローセルはガラスまたはプラスチックで製作され、それぞれが利点および欠点を有する。幾つかの実施形態において、フローセルは、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、例えばＴＯＰＡＳ、他のプラスチックもしくはＰＤＭＳを用いて、またはシリコンもしくはガラスで、マイクロファブリケーション法を利用して製作される。幾つかの実施形態において、熱可塑性樹脂の射出成形が、低コストルーターを工業規模の製造に提供する。幾つかの光学的構成において、熱可塑性樹脂は、良好な光学特性を最小限の内部蛍光と共に有する必要がある。芳香族系またはコンジュゲート化された系の含有を除いたポリマーは、それらが少なからぬ内部蛍光を有すると予測されるため、理想的には除外されるべきである。Ｚｅｏｎｏｒ １０６０Ｒ、Ｔｏｐａｓ ５０１３、およびＰＭＭＡ−ＶＳＵＶＴ（例えば、米国特許第８，０５７，８５２号に記載）は、緑色および赤色（例えば、Ｃｙ３およびＣｙ５の場合）の波長範囲で合理的光学特性を有し、Ｚｅｏｎａｒ  １０６０Ｒが最も好適な特性を有することが報告されている。幾つかの実施形態において、マイクロ流体デバイス中の大きなエリアにわたり熱可塑性樹脂を接着させることが可能である（例えば、Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ., Ｍｉｃｒｏｆｌｕｉｄｉｃｓ ａｎｄ  Ｎａｎｏｆｌｕｉｄｉｃｓ，  １９（４）, ９１３−９２２, ２０１５により報告される）。幾つかの実施形態において、バイオポリマーが付着されるガラス製のカバーガラスが、熱可塑性流動性構造に接着される。
【０３９９】
あるいは、手動操作されるフローセルが、顕微鏡の最上部で使用される。これは、幾つかの実施形態において、両面接着性シートを用いてフローセルを作製することにより構築され、適当な寸法のチャネルを有するようにレーザーカットされ、カバースリップとガラススライドの間に挟まれる。１つの試薬交換サイクルから別のサイクルへと、フローセルは、機器／顕微鏡上に留まり、フレーム間の位置決めをできる。幾つかの実施形態において、線型符号器を有するモーター付き台を用いて、大きなエリアの撮像の間にいつ台が移動するかを確実にする。同じ場所に、正しく立ち戻る。信用上の（ｆｉｄｕｃｉａｒｙ）マーカーを用いて、正しい位置決めを持続する。この例では、光学検出されるフローセル中のエッチングまたはフローセル内の表面に不動化されるビーズなどの、位置合わせマーキングを有することが、好ましい。ポリヌクレオチドバックボーンが染色されるならば（例えば、ＹＯＹＯ−１により）、それらの固定された既知の位置を利用して、１つのフレームから次のフレームへ画像をアライメントする。
【０４００】
１つの実施形態において、レーザまたはＬＥＤ照明を利用する照明メカニズム（例えば、米国特許第７，１７５，８１１号およびＲａｍａｃｈａｎｄｒａｎ ｅｔ ａｌ., Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｒｅｐｏｒｔｓ ３:２１３３, ２０１３に記載されるものなど）が、任意の加熱メカニズムおよび試薬交換システムと連結されて、本明細書に記載された方法を実行する。幾つかの実施形態において、スマートフォンに基づく撮像セットアップ（ＡＣＳ  Ｎａｎｏ７：９１４７）が、任意の温度制御モジュールおよび試薬交換システムと連結される。そのような実施形態において、それは主として、用いられる電話のカメラであるが、ｉｐｈｏｎｅまたは他のスマートフォンデバイスの照明および振動能力など他の態様を用いることもできる。
【０４０１】
図２０Ａおよび２０Ｂは、フローセル２００４および一体化された光学レイアウトを用いる、本明細書に記載された一過的プローブ結合の撮像を実施するための可能なデバイスを示す。試薬が、エアギャップ２０２２により分離された試薬／緩衝液２００８のパケットとして送達される。図２０Ａは、プリズム２０１６を通って伝達されるレーザ光２０１４を組み合わせることによりエバネッセント波２０１０が生成される、例示的レイアウトを示す（例えば、ＴＩＲＦセットアップ）。幾つかの実施形態において、反応の温度は、一体化された熱制御２０１２により制御される（例えば一例において、透明基板２０２４は、電気的に連結された酸化インジウムスズを含み、これにより基板２０２４全体の温度を変更する）。試薬は、試薬／緩衝液２００８の連続流として送達される。格子導波管２０２０または光子構造を用いてレーザ光２０１４を連結し、エバネッセント場２０１０を生成する。幾つかの実施形態において、熱制御は、空間を覆うブロック２０２６による。
【０４０２】
図２０Ａに記載されたレイアウトの態様は、図２０Ｂに記載されたレイアウトの態様と互換性がある。あるいは、例えば対物レンズスタイルのＴＩＲＦ、ライトガイド式のＴＩＲＦ、コンデンサー式ＴＩＲＦが、用いられ得る。連続式またはエアギャップ式試薬送達が、幾つかの実施形態において、シリンジポンプまたは圧力駆動の流れにより制御される。エアギャップ式方法は、試薬２００８の全てをキャピラリー／配管２１０２（例えば、図２１に示される）またはチャネルの中に予め装填させ、シリンジポンプまたは圧力制御システムから押すことまたは引くことにより送達させる。エアギャップ式方法は、試薬の全てをキャピラリー／配管またはチャネルの中に予め装填させ、シリンジポンプまたは圧力制御システムから押すことまたは引くことにより送達させる。エアギャップ２０２２は、空気または窒素などの気体または水性溶液と混ざらない液体を含む。エアギャップ２０２２を用いて、分子コーミングおよび試薬送達を実行することもできる。流体デバイス（例えば、流体ベッセル、カートリッジ、またはチップ）は、ポリヌクレオチド不動化及び場合により延長が実行されるフローセルエリアと、試薬貯蔵と、入口と、出口と、ポリヌクレオチド抽出ならびに、エバネッセント場を形作る任意選択による構造とを含む。幾つかの実施形態において、デバイスは、ガラス、プラスチック、またはガラスとプラスチックのハイブリッドで作製される。幾つかの実施形態において、熱および電気伝導性要素（例えば、金属）が、ガラスおよび／またはプラスチック成分に一体化される。幾つかの実施形態において、流体ベッセルは、ウェルである。幾つかの実施形態において、流体ベッセルは、フローセルである。幾つかの実施形態において、表面は、１つまたは複数の化学層、生化学層（例えば、ＢＳＡ−ビオチン、ストレプトアビジン）、液体層、ヒドロゲル、またはゲル層でコーティングされる。その後、２２×２２ｍｍカバーガラスが、ビニルシラン（ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４５:６４９−６５８, ２００８またはＧｅｎｏｍｉｃ Ｖｉｓｉｏｎから入手）でコーティングされるか、またはカバーガラスは、クロロベンゼン溶液中の１．５％Ｚｅｏｎｅｘでスピンコーティングされる。基板はまた、２％の３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）またはポリリシンでコーティングされてよく、伸長が、ＨＥＰＥＳ緩衝液中、ｐＨ７．５〜８で静電的相互作用により起こる。あるいはシラン化されたカバーガラスが、ビスアクリルアミドおよびＴＥＭＥＤを含有する１〜８％ポリアクリルアミド溶液中でスピンコーティングまたはディップコーティングされる。このために、及びビニルシランコーティングカバーガラスを用いて、カバーガラスを、アセトン中の１０％（ｖ／ｖ）３−メタクリルオキシプロピルトリメトキシシラン（Ｂｉｎｄ  Ｓｉｌａｎｅ；Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で１時間コーティングできる。ポリアクリルアミドコーティングはまた、記載された通り得ることができる（Ｌｉｕ Ｑ ｅｔ ａｌ. Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２０１２, １３（４），ｐｐ １０８６−１０９２）。用いられ得る複数のヒドロゲルコーティングは、Ｍａｔｅｅｓｃｕ ｅｔ ａｌ. Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ ２０１２, ２，４０−６９に記載および参照される。
【０４０３】
核酸はまた、交流（ＡＣ）電場を加えることにより、アガロースゲル中で延長され得る。ＤＮＡ分子は、ゲルに電気泳動することができ、またはＤＮＡは、溶融アガロースと混合され、その後、アガロースに組み込むことができる。その後、およそ１０Ｈｚの周波数を有するＡＣ場が適用され、２００〜４００Ｖ／ｃｍの電界強度が用いられる。伸長は、０．５〜３％のアガロースゲル濃度範囲で実行され得る。幾つかの例において、表面は、フローチャネルまたはウェル中でＢＳＡ−ビオチンでコーティングされ、その後、ストレプトアビジンまたはＮｅｕｔｒＡｖｉｄｉｎが添加される。このコーティングカバーガラスを用いて、最初にｐＨ７．５の緩衝液でＤＮＡを結合し、その後ｐＨ８．５の緩衝液中でＤＮＡを伸長させることにより、二本鎖ゲノムＤＮＡを伸長させることができる。幾つかの例において、ストレプトアビジンコーティングカバーガラスを用いて核酸鎖を捕捉および不動化するが、伸長は実行されない。こうして核酸は、一方の末端に付着され、他方の末端は、溶液中でぶら下がっている。
【０４０４】
幾つかの実施形態において、ＧＡＩＩｘなどの光学シーケンシングシステムの様々な顕微鏡のような構成成分を用いるよりむしろ、より一体化されたモノリシックなデバイスが、シーケンシングのために構築される。そのような実施形態において、ポリヌクレオチドが、センサーアレイに、またセンサーアレイに隣接するは基板に付着され、場合により直接伸長される。センサーアレイでの直接検出は、アレイへのＤＮＡハイブリダイゼーションについて実証された（例えば、Ｌａｍｔｕｒｅ ｅｔ ａｌ., Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ２２：２１２１−２１２５, １９９４に記載）。幾つかの実施形態において、センサーは、タイムゲーティングされて、蛍光色素からの発光に比較して短い寿命のレイリー散乱により、バックグランド蛍光を減少させる。
【０４０５】
一実施形態において、センサーは、ＣＭＯＳ検出器である。幾つかの実施形態において、複数の色が検出される（例えば、米国特許出願公開第２００９／０１９４７９９号に記載）。幾つかの実施形態において、検出器は、Ｆｏｖｅｏｎ検出器である（例えば、米国特許第６，７２７，５２１号に記載）。幾つかの実施形態において、センサーアレイは、トリプルジャンクションダイオードのアレイである（例えば、米国特許第９，１０５，５３７号に記載）。
【０４０６】
幾つかの実施形態において、試薬／緩衝液が、単一投与量でフローセルに送達される（例えば、ブリスターパックを介して）。パック中の各ブリスターは、オリゴヌクレオチドのレパートリーと異なるオリゴを含有する。オリゴ間の任意の混合または汚染なしに、第一のブリスターが穿孔され、核酸がその内容物に暴露される。幾つかの実施形態において、洗浄ステップが適用された後、その続きの次のブリスターに移動する。これは、オリゴヌクレオチドの異なるセットを物理的に分離する働きがあり、これにより過去のセットからのオリゴヌクレオチドが撮像の視界に残る、バックグランドノイズを低減する。
【０４０７】
幾つかの実施形態において、シーケンシングは、細胞が排出され、かつ／またはポリヌクレオチドが抽出された、同じデバイスまたはモノリシック構造で起こる。幾つかの実施形態において、方法を実行するのに必要とされる試薬は全て、分析が開始する前に、流体デバイスに予め装填される。幾つかの実施形態において、試薬（例えば、プローブ）は、デバイス中に乾燥状態で存在し、反応が進行する前に、湿潤および溶解される。
【０４０８】
実施例
実施例１：シーケンシングのための試料の調製
ステップ１：長さの長いゲノムＤＮＡの抽出
ＮＡ１２８７８またはＮＡ１８５０７細胞（Ｃｏｒｉｅｌｌ Ｂｉｏｒｅｐｏｓｉｔｏｒｙ）を培養で生育して、回収する。細胞を、６０℃に加熱された低融解温度のアガロースと混合する。混合物をゲル鋳型（例えば、Ｂｉｏ−Ｒａｄから購入）に注ぎ、ゲルプラグにセットして、およそ４×１０７細胞にする（この数は、ポリヌクレオチドの所望の密度に応じてより大きい、または小さい）。プロテイナーゼＫを含有する溶液にゲルプラグを浸すことにより、プラグ中の細胞を溶解する。ゲルプラグを、ＴＥ緩衝液で穏やかに洗浄する（例えば、混合を援助する小さな泡を残して洗浄緩衝液を充填された１５ｍＬ  Ｆａｌｃｏｎチューブ中で、試験管回転装置に乗せて）。プラグを、およそ１．６ｍＬ容量のくぼみに入れ、アガラーゼ酵素を用いてＤＮＡを消化して、ＤＮＡを抽出する。０．５Ｍ  ＭＥＳのｐＨ５．５溶液を、消化されたＤＮＡに適用する。ＦｉｂｅｒＰｒｅｐキット（Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｖｉｓｉｏｎ、フランス）および関連のプロトコルを用いてこのステップを実施して、平均長３００ｋｂの得られるＤＮＡ分子を与える。あるいはこれらの細胞株から抽出されたゲノムＤＮＡそのものを、Ｃｏｒｒｉｅｌから入手し、ワイドボアピペッを用いて０．５Ｍ  ＭＥＳのｐＨ５．５溶液に直接ピペッティングする（１．２ｍＬ中に約１０μＬで１μＭ未満の平均間隔をあたえる）。
【０４０９】
ステップ２：表面での分子伸長
ステップ１の最終部分は、抽出されたポリヌクレオチドを、０．５Ｍ  ＭＥＳのｐＨ５．５溶液を含むくぼみに与える。ビニルシランでコーティングされた基板のカバーガラス（例えば、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＶｉｓｉｏｎのＣｏｍｂｉＳｌｉｐｓ）をくぼみに浸漬して、１〜１０分間（必要とされるポリヌクレオチドの密度による）インキュベートする。その後、カバーガラスをつかむために取り付けられたクリップを含むシリンジポンプなどのメカニカルプラーを用いて、カバーガラスを緩やかに引き剥がす（あるいは、Ｇｅｎｏｍｉｃ ＶｉｓｉｏｎのＦｉｂｅｒＣｏｍｂを用いる）。カバーガラス上のＤＮＡを、クロスリンカー（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、米国）を用い、１０，０００マイクロジュールのエネルギーを利用して、表面に架橋させる。工程が、注意深く実行されれば、ポリヌクレオチド集団の中に存在する長さが１Ｍｂを超える、またはおよそ１０Ｍｂ長の分子の、表面で延長された平均長２００〜３００ｋｂである、高分子量（ＨＭＷ）ポリヌクレオチドをもたらす。より注意を注ぎ最適化することにより、平均長はメガベース範囲に移行する（上記のメガベース範囲のコーミングの節を参照）。
【０４１０】
代替法として、先に述べられた通り、予め抽出されたＤＮＡ（例えば、Ｎｏｖａｇｅｎ ｃａｔ. Ｎｏ. ７０５７２−３またはＰｒｏｍｅｇａ製のヒト男性ゲノムＤＮＡ）が用いられ、それは５０Ｋｂより大きなゲノム分子を良好な割合で含む。回折限界撮像を利用して高分子画分（ｈｉｇｈ  ｆｒａｃｔｉｏｎ）を個別に解像する場合、本明細書ではおよそ０．２〜０．５ｎｇ／μＬ濃度とおよそ５分間の浸漬が、分子密度を提供するのに充分である。
【０４１１】
ステップ３：フローセルの作製
カバースリップを、ガラススライドに既に付着された両面接着性３Ｍシートから作り上げたフローセルガスケットに押し付ける。ガスケット（両面接着性シート上に両側の保護層を有する）を、レーザカッターを用いて作り上げて、１つまたは複数のフローチャネルを生成する。フローチャネルの長さは、カバーガラスの長さよりも長く、そのため、カバーガラスをフローチャネルの中心に置くと、カバーガラスにより覆われていない各末端で１つずつのチャネルの一部が、流体をフローチャネルに、かつフローチャネルから分配するためのそれぞれ入口および出口として用いられる。流体は、ビニルシラン表面に接着される、延長ポリヌクレオチドの上を通過する。流体は、一方の末端の安全性スワブスティック（Ｊｏｈｎｓｏｎｓ、米国）を用いることによりチャネルを通って流れ、流体が他方の末端でピペッティングにより引き込まれると吸引を生じる。チャネルは、リン酸緩衝生理食塩水−Ｔｗｅｅｎおよびリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ洗浄液）で予め湿潤される。
【０４１２】
ステップ４：二本鎖ＤＮＡの変性
次のオリゴが添加され得る前に、前のオリゴが効率的に洗い流される必要があり；これは、緩衝液で最大４回交換すること、および場合によりＤＭＳＯまたはアルカリ溶液などの変性剤を用いて持続的結合を除去すること、により実行され得る。二本鎖ＤＮＡは、フローセルを通じてアルカリ（０．５Ｍ  ＮａＯＨ）でフラッシュすること、および室温でおよそ２０〜６０分間インキュベートすること、により変性される。これに続いて、ＰＢＳ／ＰＢＳＴ洗浄が行われる。あるいはインキュベーションは、１Ｍ  ＨＣｌで１時間、その後ＰＢＳ／ＰＢＳＴ洗浄によっても実行される。
【０４１３】
ステップ５：パシベーション
場合によりＢｌｏｃｋＡｉｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国）などのブロッキング緩衝液を流し込み、約５〜１５分間インキュベートする。これに続いて、ＰＢＳ／ＰＢＳＴ洗浄が行われる。
【０４１４】
実施例２：変性ポリヌクレオチドへのオリゴヌクレオチドの一過的結合によるシーケンシング
ステップ１：一過的結合条件下でのオリゴの添加
フローセルをＰＢＳＴと、場合により緩衝液Ａ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１００ｍＭ ＮａＣｌ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ７.５）で予めコンディショニングする。オリゴのそれぞれ約１〜１０ｎＭを、緩衝液Ｂ（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ８）または緩衝液Ｂ＋（５ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０、ｐＨ ８、１ｍＭ  ＰＣＡ、１ｍＭ  ＰＣＤ、１ｍＭ Ｔｒｏｌｏｘ）中の延長された変性ポリヌクレオチドに適用する。オリゴの長さは、典型的には５〜７ヌクレオチドの範囲であり、反応温度は、オリゴのＴｍに依存する。本発明者らが用いた１つのプローブタイプは、一般式５’−Ｃｙ３−ＮＸＸＸＸＸＮ−３’（Ｘは指定された塩基であり、Ｎは縮重位置である）のもので、１、２、４、６および７位にＬＮＡヌクレオチドを、３および５位にＤＮＡヌクレオチドを有し、Ｓｉｇｍａ Ｐｒｏｌｉｇｏから購入され、Ｐｉｈｌａｋらにより過去に用いられた通りである。結合の温度は、それぞれのオリゴ配列のＴｍに結び付けられた。
【０４１５】
Ａ＋およびＢ＋溶液で洗浄した後、オリゴヌクレオチドの一過的結合を、ＬＮＡ  ＤＮＡキメラオリゴ３００４  ＮＴｇＧｃＧＮ（大文字はＬＮＡ、小文字はＤＮＡのヌクレオチドである）について、Ｂ＋溶液中の０．５〜１００ｎＭの間（典型的には３ｎｍ〜１０ｎｍの間）のオリゴにより、室温で実行する。異なる温度および／または塩条件（および濃度）を、それらのＴｍおよび結合挙動に従って異なるオリゴ配列に用いる。ＦＲＥＴメカニズムを検出に用いる場合、最大１μＭのかなり高濃度のオリゴを用い得る。幾つかの実施形態において、ＦＲＥＴは、一過的に形成されたデュプレックスにインターカレートするインターカレーティング色素分子（適切に、ＹＯＹＯ−１、Ｓｙｔｏｘ Ｇｒｅｅｎ、Ｓｙｔｏｘ Ｏｒａｎｇｅ、Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄなど；Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからどのインターカレーティング色素が用いられるかにより１／１０００〜１／１０，０００の希釈形態）と、オリゴ上の標識の間である。幾つかの実施形態において、インターカレーティング色素を、ＦＲＥＴなしに、標識として直接用いる。この場合、オリゴは標識されない。安価であるだけでなく、非標識のオリゴは、ヘテロデュプレックス形成の際にインターカレーティング色素からのバックグランドが非インターカレーティング色素より１００〜１０００明るいため（例えば、どのインターカラントが用いられるかにより）、標識オリゴより高濃度で用いることができる。
【０４１６】
ステップ２：撮像  −  複数のフレームの撮影
フローチャネルを、Ｐｅｒｆｅｃｔ Ｆｏｃｕｓ、ＴＩＲＦアタッチメントおよびＴＩＲＦ対物レンズレーザ、ならびにＨａｍａｍａｔｓｕ ５１２ｘ５１２裏面入射型ＥＭＣＣＤカメラを具備した倒立顕微鏡（例えば、Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ）に設置する。プローブを緩衝液Ｂ＋に添加し、場合により撮像で補助する。
【０４１７】
表面に配設されたポリヌクレオチドに結合するプローブを、ＴＩＲＦアタッチメントを備えたＮｉｋｏｎ Ｔｉ−Ｅ上の１．４９ ＮＡ １００ｘ Ｎｉｋｏｎ油浸対物レンズを通して約１５００のＴＩＲＦ角度のファイバーオプティックスクランブラー（Ｐｏｉｎｔ  Ｓｏｕｒｃｅ）を介して調整された７５〜４００ｍＷレーザ光（例えば、５３２ｎｍの緑色光）の全内部反射により発生されるエバネッセント波により照明する。画像を、倍率が１．５倍のさらなる倍率を有する同じレンズを通して収集し、ダイクロイックミラーおよび発光フィルターを介してＨａｍａｍａｔｓｕ ＩｍａｇｅＥＭカメラに投影する。５０〜２００ミリ秒の５０００〜３０，０００のフレームを、Ｐｅｒｆｅｃｔ  Ｆｏｃｕｓを用いて１００〜１４０のＥＭゲインで撮影する。好ましくは高いレーザ力（例えば、４００ｍＷ）を早期に数秒間用いて初期の非特異的結合を退色させ、表面からのシグナルのほとんどのブランケットをより低密度に低下させ、個々の結合事象を解像する。その後、レーザ力を、場合により低下させる。
【０４１８】
図２２Ａ〜２２Ｅは、標的ポリヌクレオチドに一過的に結合するプローブの照明の例を示す。これらの図において、標的ポリヌクレオチドは、ヒトＤＮＡ由来である。暗いスポットは、プローブの蛍光領域を示し、より暗いスポットは、プローブによってより頻繁に結合されたより多くの領域を示す（例えば、より多くの光子が収集された）。図２２Ａ〜２２Ｅは、１つの標的ポリヌクレオチドのシーケンシングの際に捕捉された時系列からの画像（例えば、ビデオ）である。ポイント２２０２、２２０４、２２０６、２２０８は、経時的に幾分かの強度で結合された（例えば、オリゴヌクレオチドの異なるセットが、標的ポリヌクレオチドに暴露されたため）ポリヌクレオチド中の領域の例として時系列全体で示される。
【０４１９】
撮像緩衝液が、添加される。撮像緩衝液は、幾つかの実施形態において、ベータメルカプトエタノール、酵素的レドックス系、および／またはアスコルビン酸塩および没食子酸を含有する緩衝液により補充または交換される。フルオロフォアが、線に沿って検出され、結合が起こったことを示す。場合により、フローセルが１つより多くのチャネルで作製される場合、チャネルの１つが、ポリヌクレオチドの密度およびポリヌクレオチド延長の品質をチェックするためにＹＯＹＯ−１インターカレーティング色素で染色される（例えば、Ｉｎｔｅｎｓｉｌｉｇｈｔまたは４８８ｎｍレーザ照明を利用して）。
【０４２０】
ステップ３：撮像  −  他の場所への移動（任意選択によるステップ）
Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−ｅのスライドホルダー上に搭載された（フローセルの一部としてガラススライドに取り付けることにより）カバーガラスを、対物レンズ（つまりＣＣＤ）に関して移動させることで、別の場所を撮像する。撮像は、複数の他の場所で実施され、それにより異なる場所（第一の位置にあるＣＣＤの視野の外側）で与えられたポリヌクレオチドまたはポリヌクレオチドの一部に結合するプローブが、撮像される。各場所からの画像データを、コンピュータメモリに記憶させる。
【０４２１】
ステップ４：オリゴの次のセットの添加
オリゴの次のセットを添加し、ステップ１〜３を、ポリヌクレオチドの全体がシーケンシングされるまで繰り返す。
【０４２２】
ステップ５：結合の場所および同一性の決定
それぞれの蛍光ポイントシグナルの場所を検出し、結合された標識からの蛍光が投影される画素の場所を記録する。結合されたオリゴヌクレオチドの同一性は、どの標識オリゴヌクレオチドが結合されたかを、例えば光学フィルターによる波長選択を利用して、決定することにより決定され、フルオロフォアは、複数のフィルターで検出され、この場合、フィルターセットのそれぞれのフルオロフォアの発光シグネチャーを用いて、フルオロフォアの、及びこれによりオリゴヌクレオチドの同一性を決定する。場合によりフローセルが、１つより多いチャネルで作製される場合、チャネルの１つを、ポリヌクレオチドの密度およびポリヌクレオチド延長の品質をチェックするために、ＹＯＹＯ−１インターカレーティング色素で染色する（例えば、Ｉｎｔｅｎｓｉｌｉｇｈｔまたは４８８ｎｍレーザ照明を利用して）。１つまたは複数の画像またはムービーを、オリゴヌクレオチドを標識するために用いられる蛍光波長のそれぞれについて、撮影する。
【０４２３】
ステップ６：データ処理
デュプレックスの両方の鎖が表面に付着されたままである場合、オリゴの結合は、二本鎖の両方の鎖の相補的場所で同時に起こる。その後、全データセットを解析して、核酸上の特有の位置に密接に位置特定するシグナルを与えるオリゴのセットを見出し、それらの場所は、ポリヌクレオチド中の選択されたポイントに対応するオリゴ配列をオーバーラップすることにより確認され；これはその後、オリゴそれぞれの２つのオーバーラップするタイリングシリーズを明らかにする。位置関係での次のシグナルが適合するタイリングシリーズが、それが結合している鎖を示す。
【０４２４】
鎖は表面に固定されたままであるため、それぞれのオリゴについて記録された結合場所を、アルゴリズムを実行するソフトウエアスクリプトを利用してオーバーレイすることができる。これはシグナルをもたらし、オリゴ結合場所が、２つのオリゴヌクレオチド配列のタイリングパス、つまり変性されたデュプレックスのそれぞれの鎖についての別の（しかしそれは相補的でなければならない）パスのフレームワーク内に収まることを示す。各タイリングパスは、完全であるならば、その鎖の全長にわたる。その後、それぞれの鎖についてタイリングされた配列を比較して、二本鎖（２Ｄとしても知られる）コンセンサス配列を提供する。タイリングパスの１つの中にギャップが存在する場合、相補性タイリングパスの配列を取る。幾つかの実施形態において、配列を複数のコピーの同じ配列または参照と比較して、塩基割り当てを支援し、ギャップを閉じる。
【０４２５】
実施例３：ポリヌクレオチド上のエピマークの場所の検出
場合により、オリゴ結合工程の前に（または時にはその後またはその間に）、エピジェノミック結合試薬の一過的結合が、実行される。どの試薬が用いられるかに応じて、結合は、変性の前または後に実行される。抗メチルＣ抗体の場合、結合は変性ＤＮＡ上で実施され、メチル結合タンパク質の場合、結合は任意の変性ステップの前に二本鎖ＤＮＡ上で実施される。
【０４２６】
ステップ１  −  メチル結合試薬の一過的結合
変性の後に、フローセルをＰＢＳ洗浄液でフラッシュし、Ｃｙ３Ｂ標識抗メチル抗体３Ｄ３クローン（Ｄｉａｇｅｎｏｄｅ）をＰＢＳ中に添加する。
【０４２７】
あるいは変性の前に、フローセルをＰＢＳでフラッシュし、Ｃｙ３Ｂ標識ＭＢＤ１を添加する。
【０４２８】
撮像は、一過的オリゴ結合についての先の記載通りに実行する。
【０４２９】
ステップ２：メチル結合試薬の剥離
典型的には、エピ解析を、シーケンシングの前に実行する。それゆえ、場合によりメチル結合試薬を、シーケンシングが開始する前に、ポリヌクレオチドの前にフラッシュして落とす。これは、ＰＢＳ／ＰＢＳＴおよび／または高塩緩衝液およびＳＤＳを複数のサイクル流すこと、そしてその後、除去が起こったことを撮像によりチェックすること、により実行される。無視できる量より多くの結合試薬が残留することが明白である場合、カオトロピック塩であるＧｕＣｌなどのより過酷な処理を通して、残留する試薬を除去する。
【０４３０】
ステップ３：データ相関
シーケンシング後にエピジェノミクスデータが得られ、シーケンシング結合場所の結合場所間で相関を行い、エピ結合場所を相関させて、メチル化配列の前後関係を提供する。
【０４３１】
実施例４：ラムダファージＤＮＡにおける一過的結合から収集された蛍光
図２３Ａ、２３Ｂおよび２３Ｃは、一過的結合事象の例を示す。それらは、室温にて緩衝液Ｂ＋中１．５ｎＭ濃度でオリゴＩ．Ｄ．Ｌｉｎ２６２１、Ｃｙ３標識５’ＮＡｇＣｇＧＮ ３’の一過的結合を集合的に示す。標的ポリヌクレオチドは、ＭＥＳ  ｐＨ５．５緩衝液＋０．１Ｍ  ＮａＣｌ中でビニルシラン表面（Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｖｉｓｉｏｎ）上に手動でコームされたラムダファージゲノムである。点光源ファイバーオプティックスクランブラーを通した４００ｍＷのレーザ５２３ｎＭ。５３２ｎｍ励起バンド、１００倍ＴＩＲＦ対物レンズ、１．４９ＮＡおよび１．５倍の追加的倍率を含むＴＩＲＦアタッチメントおよびマルチクロイック（ｍｕｌｔｉ−ｃｈｒｏｉｃ）で、蛍光を収集した。振動絶縁は、実行しなかった。画像を、１００ＥＭゲイン設定を有するＨａｍａｍａｔｓｕ ＩｍａｇｅＥＭ ５１２ｘ５１２にＰｅｒｆｅｃｔ  Ｆｏｃｕｓで捕捉した。１００００フレームを１００ｍｓで収集した。オリゴヌクレオチドプローブセットにおけるＣｙ３の濃度は、およそ２５０ｎＭ〜３００ｎＭであった。図２３Ａは、ＴｈｕｎｄｅｒＳＴＯＲＭでの相互相関ドリフト補正の前に収集された蛍光を示す。図２３Ｂは、相互相関ドリフト補正の後に収集された蛍光をスケールバーと共に示す。図２３Ｃは、図２３Ｂの拡大領域中の蛍光を示す。図２３Ｃは、複数の場所へのＬｉｎ２６２１の持続的結合により探知された長いポリヌクレオチド鎖を示す。画像から、標的ポリヌクレオチド鎖が、Ｃｙ３発光の回折限界よりも近い距離で撮像表面に不動化および伸長されたことが、明らかである。
【０４３２】
実施例５：合成ＤＮＡにおける一過的結合から収集された蛍光
図２４は、３つの異なるポリヌクレオチド鎖から収集された蛍光データの例を示す。複数回のプロービングおよび洗浄ステップを、合成３キロベース変性二本鎖ＤＮＡで示す。合成ＤＮＡを、ビニルシラン表面でＭＥＳ  ｐＨ５．５中でコーミングして、変性させた。一連の結合および洗浄ステップを実行し、ビデオを記録し、ＴＨｕｎｄｅｒＳＴＯＲＭを用いてＩｍａｇｅＪで処理した。３つの例の鎖（１、２、３）を、緩衝液Ｂ＋中の１０ｎＭオリゴを用いて周囲温度で実行された以下の実験シリーズについての超解像画像から切り取った：オリゴ３００４結合、洗浄、オリゴ２８７９結合、洗浄、オリゴ３００６結合、洗浄、およびオリゴ３００４結合（再度）。これは、結合マップを一過的結合から誘導でき、結合パターンを洗浄により消去でき、その後、異なる結合パターンを合成ＤＮＡの同じ第一および第二の鎖上の異なるオリゴで得ること、を示している。このシリーズ最後でのオリゴ３００４への回帰、およびシリーズの最初に用いられた場合のパターンへのその類似性は、最適化での任意の試行を行わなくとも工程の頑強性を示している。
【０４３３】
実験的に決定された結合場所は、予測された、デュプレックス鎖１および３が示す４つの可能な完全一致結合部位のうちの３つ、ならびにデュプレックス鎖２が示す４つの結合場所全ておよび１つの顕著なミスマッチ場所に対応する。オリゴ３００４での第二のプロービングが、おそらく低いミスマッチのせいで、より明確なシグナルを示すように観察される。これは、レーザ光への長期暴露からの加熱により温度がわずかに上昇する可能性と一致する。
【０４３４】
この実験で用いられるオリゴ配列は、以下の通りである（大文字の塩基は、ロックド核酸（ＬＮＡ）である）：
オリゴ（Ｏｌｉｏ）３００４： ５’ｃｙ３ ＮＴｇＧｃＧＮ
オリゴ２８７９： ５’ ｃｙ３ ＮＧｇＣｇＡＮ
オリゴ３００６： ５’ ｃｙ３ ＮＴｇＧｇＣＮ： 
【０４３５】
３ｋｂｐ合成鋳型の配列のための配列表（文書の下）は、以下の通りである：
AAAAAAAAACCGGCCCAGCTTTCTTCATTAGGTTATACATCTACCGCTCGCCAGGGCGGCGACCTCGCGGGTTTTCGCTATTTATGAAAATTTTCCGGTTTAAGGCGTTTCCGTTCTTCTTCGTCATAACTTAATGTTTTTATTTAAAATACCCTCTGAAAAGATAGGATAGCACACGTGCTGAAAGCGAGGCTTTTTGGCCTCTGTCGTTTCCTTTCTCTGTTTTTGTCCGTGGAATGAACAATGGAAGTCAACAAAAAGCAGCTGGCTGACATTTTCGGTGCGAGTATCCGTACCATTCAGAACTGGCAGGAACAGGGAATGCCCGTTCTGCGAGGCGGTGGCAAGGGTAATGAGGTGCTTTATGACTCTGCCGCCGTCATAAAATGGTATGCCGAAAGGGATGCTGAAATTGAGAACGAAAAGCTGCGCCGGGAGGTTGAAGAACTGCGGTTCTTATACATCTAATAGTGATTATCTACATACATTATGAATCTACATTTTAGGTAAAGATTAATTGAGTACCAGGTTTCAGATTTGCTTCAATAAATTCTGACTGTAGCTGCTGAAACGTTGCGGTTGAACTATATTTCCTTATAACTTTTACGAAAGAGTTTCTTTGAGTAATCACTTCACTCAAGTGCTTCCCTGCCTCCAAACGATACCTGTTAGCAATATTTAATAGCTTGAAATGATGAAGAGCTCTGTGTTTGTCTTCCTGCCTCCAGTTCGCCGGGCATTCAACATAAAAACTGATAGCACCCGGAGTTCCGGAAACGAAATTTGCATATACCCATTGCTCACGAAAAAAAATGTCCTTGTCGATATAGGGATGAATCGCTTGGTGTACCTCATCTACTGCGAAAACTTGACCTTTCTCTCCCATATTGCAGTCGCGGCACGATGGAACTAAATTAATAGGCATCACCGAAAATTCAGGATAATGTGCAATAGGAAGAAAATGATCTATATTTTTTGTCTGTCCTATATCACCACAAAACCTGAAACTGGCGCGTGAGATGGGGCGACCGTCATCGTAATATGTTCTAGCGGGTTTGTTTTTATCTCGGAGATTATTTTCATAAAGCTTTTCTAATTTAACCTTTGTCAGGTTACCAACTACTAAGGTTGTAGGCTCAAGAGGGTGTGTCCTGTCGTAGGTAAATAACTGACCTGTCGAGCTTAATATTCTATATTGTTGTTCTTTCTGCAAAAAAGTGGGGAAGTGAGTAATGAAATTATTTCTAACATTTATCTGCATCATACCTTCCGAGCATTTATTAAGCATTTCGCTATAAGTTCTCGCTGGAAGAGGTAGTTTTTTCATTGTACTTTACCTTCATCTCTGTTCATTATCATCGCTTTTAAAACGGTTCGACCTTCTAATCCTATCTGACCATTATAATTTTTTAGAATGCGGCGTTTTCCGGAACTGGAAAACCGACATGTTGATTTCCTGAAACGGGATATCATCAAAGCCATGAACAAAGCAGCCGCGCTGGATGAACTGATACCGGGGTTGCTGAGTGAATATATCGAACAGTCAGGTTAACAGGCTGCGGCATTTTGTCCGCGCCGGGCTTCGCTCACTGTTCAGGCCGGAGCCACAGACCGCCGTTGAATGGGCGGATGCTAATTACTATCTCCCGAAAGAATCCGCATACCAGGAAGGGCGCTGGGAAACACTGCCCTTTCAGCGGGCCATCATGAATGCGATGGGCAGCGACTACATCCGTGAGGTGAATGTGGTGAAGTCTGCCCGTGTCGGTTATTCCAAAATGCTGCTGGGTGTTTATGCCTACTTTATAGAGCATAAGCAGCGCAACACCCTTATCTGGTTGCCGACGGATGGTGATGCCGAGAACTTTATGAAAACCCACGTTGAGCCGACTATTCGTGATATTCCGTCGCTGCTGTTAATTGAGTTTATAGTGATTTTATGAATCTATTTTGATGATATTATCTACATACGACTGGCGTGCCATGCTTGCCGGGATGTCAAATTTAATAAGGTGATAGTAAATAAAACAATTGCATGTCCAGAGCTCATTCGAAGCAGATATTTCTGGATATTGTCATAAAACAATTTAGTGAATTTATCATCGTCCACTTGAATCTGTGGTTCATTACGTCTTAACTCTTCATATTTAGAAATGAGGCTGATGAGTTCCATATTTGAAAAGTTTTCATCACTACTTAGTTTTTTGATAGCTTCAAGCCAGAGTTGTCTTTTTCTATCTACTCTCATACAACCAATAAATGCTGAAATGAATTCTAAGCGGAGATCGCCTAGTGATTTTAAACTATTGCTGGCAGCATTCTTGAGTCCAATATAAAAGTATTGTGTACCTTTTGCTGGGTCAGGTTGTTCTTTAGGAGGAGTAAAAGGATCAAATGCACTAAACGAAACTGAAACAAGCGATCGAAAATATCCCTTTGGGATTCTTGACTCGATAAGTCTATTATTTTCAGAGAAAAAATATTCATTGTTTTCTGGGTTGGTGATTGCACCAATCATTCCATTCAAAATTGTTGTTTTACCACACCCATTCCGCCCGATAAAAGCATGAATGTTCGTGCTGGGCATAGAATTAACCGTCACCTCAAAAGGTATAGTTAAATCACTGAATCCGGGAGCACTTTTTCTATTAAATGAAAAGTGGAAATCTGACAATTCTGGCAAACCATTTAACACACGTGCGAACTGTCCATGAATTTCTGAAAGAGTTACCCCTCTAAGTAATGAGGTGTTAAGGACGCTTTCATTTTCAATGTCGGCTAATCGATTTGGCCATACTACTAAATCCTGAATAGCTTTAAGAAGGTTATGTTTAAAACCATCGCTTAATTTGCTGAGATTAACATAGTAGTCAATGCTTTCACCTAAGGAAAAAAACATTTCAGGGAGTTGACTGAATTTTTTATCTATTAATGAATAAGTGCTTGACCTATTTCTTCATTACGCCATTATACATCTAGCCCACCGCTGCCAAAAAAAAA。
【０４３６】
実施例６：単一細胞の統合的単離、核酸抽出およびシーケンシング
ステップ１：マイクロ流体構造の設計および製作
マイクロチャネルを、典型的な径１５μｍでヒト癌細胞株由来の細胞を収容するように設計し、それによりマイクロ流体ネットワークは、３３μｍの最小の深さおよび幅を有する。デバイスは、細胞のための入口と、単一チャネルに合流して単一細胞のトラップに供給される緩衝液のための入口とを含む（図１７に示す）。細胞の入口と緩衝液の入口の間の交差点で、１つまたは複数のトラップが配置される供給チャネルの側壁に沿って、細胞が整列される。それぞれのトラップは、ヒト癌細胞株由来の細胞を捕捉するような寸法の簡単な圧縮（ｃｏｎｓｔｒｉｃｔｉｏｎ）である。細胞トラップのための圧縮は、台形断面を有し：それは底部が４．３μｍ幅、深さの中央部分が６μｍ幅、最上部が８μｍ幅であり、深さ３３μｍである。それぞれの細胞トラップは、供給チャネルを分岐点に接続し、その一方の側は廃棄チャネル（図１７に示されない）であり、他方がフローストレッチ区分（核酸延長およびシーケンスのため）を含むチャネルであり、それが各細胞に１つずつある。フローストレッチ区分は、２０μｍ（または最大２ｍｍ）幅、４５０μｍ長、１００ｎｍ（または最大２μｍの深さ）のチャネルからなる。幾つかの実施形態において、フローストレッチチャネルは、開始時はより狭く、述べられた寸法へと拡大する。
【０４３７】
ステップ２：デバイスの製作
デバイスは、ＴＯＰＡＳ ５０１３（ＴＯＰＡＳ）の射出成形を利用してニッケルシムを複製することにより製作される。手短に述べると、シリコンマスターをＵＶリソグラフィーおよび反応性イオンエッチングにより製造する。１００ｎｍ  ＮｉＶシーディング層を付着させ、ニッケルを最終的な厚さ３３０μｍまで電気めっきする。ＳｉマスターをＫＯＨ中で化学エッチングにより除去する。射出成形を、溶融温度２５０℃、金型温度１２０℃、２秒間の最大保持圧１，５００バール、および２０ｃｍ３／ｓ〜４５ｃｍ３／ｓの間で変動する射出速度を利用して実施する。最後に、カバーガラス（１．５）をデバイスに接着させるか、または１５０μｍ  ＴＯＰＡＳホイルを用いて、０．５１ＭＰａの最大圧下でＵＶと熱の処理の組み合わせにより、デバイスを密閉する。ホイルの表面粗度を、デバイスを密閉する前にシリコンウエハーから電気めっきされた２枚の平坦なニッケル板の間でホイルを１４０℃および５．１ＭＰａで２０分間圧迫することにより、低下させる。これは、デバイスの蓋が光学的に平坦であることを確実にし、高ＮＡ光学顕微鏡を可能にする。デバイスは、油浸ＴＩＲＦ対物レンズ（１００倍／ＮＡ  １．４９）およびＥＭＣＣＤカメラ（Ｈａｍａｍａｔｓｕ ＩｍａｇｅＥＭ ５１２）を具備した倒立蛍光顕微鏡（Ｎｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅ）に搭載される。流体を、圧力制御装置（ＭＦＣＳ、Ｆｌｕｉｇｅｎｔ）を用いて０〜１０ｍｂａｒ範囲の圧力で、デバイスを通して駆動する。デバイスにエタノールを注ぎ、その後、脱気し、ＦＡＣＳＦｌｏｗ Ｓｈｅａｔｈ Ｆｌｕｉｄ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を、フローストレッチデバイスに接続するマイクロチャネル以外の全てのマイクロチャネルに添加する。溶液が導入される供給チャネルの入口で陽圧を維持しながら、廃棄チャネルの出口で陰圧または吸引を施し、フローストレッチチャネルの出口で陽圧を施すことにより、選択的添加を実行する。単一分子の撮像および電気泳動に適した緩衝液（０．５×ＴＢＥ ＋ ０．５％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ ＋ １％ ｖ／ｖベータメルカプトエタノール：ＢＭＥ）を、フローストレッチデバイスのチャネルに添加する。この緩衝液は、フローストレッチ区分でのＤＮＡ粘着を予防し、フローストレッチ区分の高さが低い場合に、抽出されたＤＮＡの導入に逆らい得る電気浸透性の流れを抑制する。
【０４３８】
ステップ３：細胞調製
ＬＳ１７４Ｔ大腸癌細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ：Ａｕｔｏｇｅｎ−Ｂｉｏｃｌｅａｒ ＵＫ Ｌｔｄ.）および１％ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｌｏｎｚａ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ：Ｇｉｂｃｏ）で培養した後、ＦＢＳ中の１０％ＤＭＳＯ中で１．７  １０６細胞／ミリリットル濃度で凍結した。解凍した後、細胞懸濁液をＦＡＣＳＦｌｏｗ緩衝液と１：１で混合し、２８．８×ｇで５分間遠心分離して（Ａ−４−４４、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ）、ＦＡＣＳＦｌｏｗ緩衝液に再懸濁させる。最後に、細胞を１μＭ  Ｃａｌｃｅｉｎ  ＡＭ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、０．３５  １０６細胞／ミリリットルでチップ中に添加する。およそ５〜１０，０００細胞を添加し、各トラップにトラップされた最初の細胞を分析する。
【０４３９】
ステップ４：操作
細胞および緩衝液を同時に導入し、細胞を、トラップが配置されるマイクロチャネルの側壁に沿って整列させる。単一細胞を捕捉し、最大３０ｎＬ／分のトラップを通る緩衝液流れの間トラップ中で保持する。０．５×ＴＢＥ ＋ ０．５％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ ＋ ０．１μＭ ＹＯＹＯ−１（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で構成された溶解緩衝液を入口の一方に添加し、トラップ内に１０ｎＬ／分で１０分間注入する。その後、溶液を、全てのウェルでＹＯＹＯ−１を含まない緩衝液と交換して、染色を停止させる。次に、細胞核を１ｎＷ／（μｍ）２の線量で最大３００秒間、青色励起光に暴露し、ＤＮＡの部分的フォトニッキングを誘発する（ｗｗｗ.ｐｎａｓ.ｏｒｇ／ｃｇｉ／ｄｏｉ／１０．１０７３／ｐｎａｓ.１８０４１９４１１５のＳＩ Ａｐｐｅｎｄｉｘ参照）。その後、緩衝液を、ＢＭＥを含有する溶液（０．５×ＴＢＥ ＋ ０．５％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ ＋ １％ｖ／ｖ ＢＭＥ）に交換し、蛍光ランプの強度を、蛍光撮像が依然として可能な最小強度に低下させる。次に、温度を６０℃に上昇させ、タンパク質溶解溶液（プロテイナーゼＫ＞２００μｇ  ｍＬ−１（Ｑｕｉａｇｅｎ）、０．５×ＴＢＥ ＋ ０．５％ ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００ ＋ １％ｖ／ｖ ＢＭＥ ＋ ２００ｇ／ｍＬ）を導入し、溶解液をトラップを通じて押し出す。ＤＮＡは、隣接するフローストレッチ区分に移行し、油浸対物レンズ（１００倍、ＮＡ １．４９、１．５倍の追加的倍率で１２０ｎｍ画素サイズを与える）を、単一分子撮像のために適所に移動させる。ＤＮＡ断片を、フローストレッチ区分に５〜１０Ｖの電圧を加えることによる電気泳動を利用して、マイクロチャネルからフローストレッチデバイスに導入する。ＤＮＡ断片が、反対のマイクロチャネル中に両端を有する場合、電圧が切れる。１００〜１５０％で伸長された分子の４５０μｍ部分は、単一細胞からの１メガベース長を超える抽出ゲノムＤＮＡに対応する。幾つかの実施形態において、タンパク質溶解の後で、ＤＮＡ内容物を、捕捉緩衝液の代わりに０．５×ＴＢＥを用いることによりデバイスを通して押し出し、そのような実施形態において、フローストレッチ区分の寸法は場合により、より大きく、それにより数千メガベースの断片を同時に捕捉し（疎水性または静電的相互作用により）チャネル内部で伸長させることができる。これは、ｐＨ緩衝液８（例えば、ＨＥＰＥＳ）を用いること、及び接着されたカバーガラスがここでＡＰＴＥＳもしくはポリリシンなどの正電荷を帯びることにより、またはビニルシランカバーガラスを接着させｐＨ５．５〜５．７の０．５Ｍ  ＭＥＳ緩衝液を用いてＤＮＡ中に流し、これをその後、ＭＥＳ緩衝液を空気と共に用いてコーミングすることにより、実行される。ホイルがＺｅｏｎｅｘを含む場合、分子コーミングは、ｐＨ５．７にて０．６Ｍ  ＭＥＳ緩衝液で実行され得る。
【０４４０】
二本鎖核酸が、不動化されたら、変性溶液、０．５Ｍ  ＮａＯＨおよび／または６％ＤＭＳＯを流す。その後、単一細胞試料を本発明のシーケンシング法に供する準備ができ、ここでオリゴのレパートリーを流し、オリゴ結合を撮像する。
【０４４１】
幾つかの実施形態において、細胞溶解は、２段階であり、そのためＲＮＡは、混入せず、フローストレッチ区分で蛍光を誘発する。ここで、第一の溶解緩衝液（例えば、ＤＮＡインターカレーティングＹＯＹＯ−１色素が添加された、０．５％ｖ／ｖ Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００含有０．５×ＴＢＥ）を適用する。この緩衝液は、細胞膜を溶解し、サイトゾル内容物を、１０〜２０μｌヌクレアーゼ不含Ｈ２Ｏを充填したトラップ出口に放出し、核をトラップ中でＤＮＡと共に残す（例えば、ｖａｎ Ｓｔｒｉｊｐ ｅｔ ａｌ. Ｓｃｉ Ｒｅｐ. ７：１１０３０（２０１７）に記載）。それぞれの細胞のサイトゾル内容物を溶解し、廃棄出口に切り替えるか、またはデバイスを、ＤＮＡ用のフローストレッチ区分とは別のＲＮＡ用のフローストレッチ区分を有するように設計する。幾つかの実施形態において、ポリＡ  ＲＮＡを捕捉する、オリゴｄＴでコーティングされた別のフローストレッチ区分にＲＮＡを送る。幾つかの実施形態において、ＲＮＡ用のフローストレッチ区分は、ナノウェルまたはナノピットを含み（Ｍａｒｉｅ ｅｔ ａｌ，  Ｎａｎｏｓｃａｌｅ ＤＯＩ： １０．１０３９／ｃ７ｎｒ０６０１６ｅ）２０１７）、そこでＲＮＡをトラップし、例えばポリＡポリメラーゼを用いて、捕捉配列を添加するために酵素試薬を用いる。核の溶解は、第二の緩衝液（０．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００およびプロテイナーゼＫを含有する０．５×ＴＢＥ）で実施され、ＤＮＡは、ＤＮＡ用のフローストレッチ区分に切り替えられる。
【０４４２】
核酸の損失を最小限に抑えるために、トラップおよびフローストレッチ区分からの距離は短く、デバイスの壁を、脂質でのコーティングなどにより、充分にパシベートする（例えば、Ｐｅｒｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ，  Ｎａｎｏｌｅｔｔｅｒｓ １２ ：２２６０−５（２０１２）に記載）。
【０４４３】
引用された参考資料および代わりの実施形態
本明細書で引用された全ての参考資料は、それぞれ個々の発行物または特許または特許出願が、全ての目的で全体として参照により組み入れられることを具体的かつ個別に示すのと同程度に、全体として、そして全ての目的で、参照により本明細書に組み入れられる。
【０４４４】
全ての表題および副題は、簡便さのために本明細書で用いられているに過ぎず、本発明を限定するものと解釈されるべきではない。
【０４４５】
本明細書で提供されたあらゆる実施例または例示的言語（例えば、「など」）の使用は、単に本発明をよりよく示すことを意図しており、他に請求されない限り、範囲に関する限定をもたらすものではない。本明細書の言語は、任意の非特許請求要素を本発明の実践に不可欠のものとして示していると解釈されるべきではない。
【０４４６】
また、第一、第二などの用語は、様々な要素を記載するために本明細書で用いられ得るが、これらの要素が。これらの用語により限定されるべきでないことは、理解されよう。これらの用語は、１つの要素を別の要素と区別するためだけに用いられる。本開示の範囲を逸脱することなく、例えば、第一の対象は、第二の対象と称することができ、同様に第二の対象は、第一の対象と称することができる。第一の対象および第二の対象は、両者とも対象であるが、それらは同じ対象ではない。
【０４４７】
本開示で用いられる用語法は、特有の実施形態を記載することを目的とし、本発明の限定と意図するものではない。本明細書および添付の特許請求の範囲で用いられる通り、単数形「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈に他に明確に示されない限り、複数の形態を含むものとする。同じく本明細書で用いられる用語「および／または」は、関連の列挙された項目の１つまたは複数のあらゆる可能な組み合わせを指し、それらを包含することは、理解されよう。さらに、用語「含む」および／または「含んでいる」は、本明細書で用いられる場合、述べられた特色、整数、ステップ、操作、要素、および／または成分の存在を指定するが、１つまたは複数の他の特色、整数、ステップ、操作、要素、成分および／またはその群の存在または添加を排除しないことは、理解されよう。
【０４４８】
本明細書で用いられる用語「もし」は、文脈に応じて「である場合」または「の際」または「決定に応答して」または「検出に応答して」を意味するものと解釈されてもよい。同様に熟語「もし決定されれば」または「もし［述べられた条件または事象が］検出されれば」は、文脈に応じて、「決定する際」または「決定に応答して」または「（述べられた条件または事象を）検出する際」または「（述べられた条件または事象の）検出に応答して」を意味すると解釈されてもよい。
【０４４９】
本明細書の特許文献の引用および組み入れは、簡便さのためだけに実行されており、そのような特許文書の妥当性、特許性および／または実行可能性のいずれの見解も反映していない。
【０４５０】
本発明は、非一時的コンピュータ読み取り可能記憶媒体に埋め込まれたコンピュータプログラムのメカニズムを含むコンピュータメカニズム製品として実行され得る。例えばコンピュータプログラム製品は、図１の任意の組み合わせに示されるプログラムモジュールを含み得る。これらのプログラムモジュールは、ＣＤ−ＲＯＭ、ＤＶＤ、磁気ディスク記憶製品、ＵＳＢキー、または任意の他の非一時的コンピュータ読み取り可能データもしくはプログラム記憶製品で記憶され得る。
【０４５１】
本発明は、本明細書およびその中に引用された参考資料の教示に照らすことで最も徹底して理解される。当業者に明白な通り、本明細書の主旨および範囲を逸脱することなく、多くの改変および変更が可能である。本明細書に記載された具体的実施形態は、例を提示するに過ぎない。実施形態は、原理およびその実践的適用を最良に説明するために選択および記載され、それにより企図される特有の用途に適する様々な改変を含む本発明および様々な実施形態を当業者に最良に利用させる。本発明は、添付の特許請求の範囲の用語と、そのような特許請求の範囲が権利を与えられた均等物の全範囲によってのみ、限定されなければならない。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７Ａ】
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【図７Ｃ】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１３Ｃ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５】
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【図１６Ａ】
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【図１６Ｂ】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０Ａ】
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【図２０Ｂ】
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【図２１】
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【図２２Ａ】
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【図２２Ｂ】
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【図２２Ｃ】
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【図２２Ｄ】
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【図２２Ｅ】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２４】
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【国際調査報告】
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