(57)【要約】  本発明は、炎症性障害の処置または防止での使用のための赤血球に対する抗体、および炎症性障害を処置または防止する方法であって、赤血球に対する治療有効量の抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
炎症状態を防止または処置する方法での使用のための赤血球（ＲＢＣ）に対する抗体であって、該炎症状態は、ＩＴＰではない自己免疫状態である前記抗体。
【請求項２】
炎症状態は、神経学的自己免疫状態である、請求項１に記載の方法での使用のための抗体。
【請求項３】
炎症状態は、健康な対象と比較してＩｌ−１０が上昇した自己免疫状態である、請求項１に記載の方法での使用のための抗体。
【請求項４】
抗体は、１つまたはそれ以上の他の血液細胞および／または血管系に関連する細胞よりもＲＢＣ上に高密度で見出されるＲＢＣ分子に結合する、請求項１に記載の使用のための抗体。
【請求項５】
抗体は、モノクローナルおよびヒトまたはヒト化抗体である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項６】
抗体は、ＩｇＧ型、好ましくはＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型のものである、請求項５に記載の使用のための抗体。
【請求項７】
抗体は、Ｆｃ領域を含み、好ましくはＦｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）のようなＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項８】
自己免疫状態は、自己抗体媒介自己免疫状態である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項９】
状態は、
（ｉ）慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症（ＭＳ）および視神経脊髄炎（ＮＭＯ）から選択される、
（ｉｉ）関節リウマチおよびＴＲＡＬＩから選択される、
請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１０】
ＲＢＣ抗体は、ペプチドエピトープに結合する、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１１】
ＲＢＣ抗体は、ＲｈＤタンパク質、グリコホリンＡ（ＧＰＡ）タンパク質、ＴＥＲ−１１９抗原（Ｌｙ７６）のヒト相同分子種、およびＢａｎｄ３から選択されるＲＢＣ分子に結合する、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１２】
ＲＢＣ抗体は、細胞あたり１０２〜１０５コピーの密度で見出されるＲＢＣ分子に結合する、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１３】
抗体は、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、脳内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、肺内、鼻腔内、皮内局所投与によって、または吸入によって、好ましくは静脈内または皮下投与によって投与される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１４】
抗体は、１つまたはそれ以上の他の治療剤、好ましくは少なくとも１つの他の抗炎症剤、または炎症状態を処置するため、またはそれらの症状を軽減するために使用される薬剤と組み合わせて投与され、場合により該１つまたはそれ以上の他の治療剤が抗炎症剤、免疫抑制剤、および／または鎮痛剤から選択される、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１５】
ａ．抗体の投与は、抗原のもしくは抗原に対する寛容をもたらさず、場合により該抗原は、自己免疫状態に関与するまたは自己免疫状態を起こす抗体と投与されるタンパク質またはペプチドである、および／または
ｂ．該抗体は、任意の非免疫グロブリン配列を含有せず、好ましくはここで該抗体は、免疫グロブリン配列からなり、さらなる（例えばＮまたはＣ末端に融合した）配列が存在しない、および／または
ｃ．該抗体は、任意のさらなるタンパク質またはペプチドを有する融合タンパク質ではない、
請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【請求項１６】
抗体は、組成物として対象に投与され、場合により該組成物が任意の細胞を含まないおよび／または細胞が該組成物と共投与されない、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のための抗体。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、炎症性障害の処置または防止での使用のための赤血球に対する抗体、および炎症性障害を処置または防止する方法であって、赤血球に対する治療有効量の抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
炎症性障害は、炎症によって特徴付けられる多くの疾患および状態を含む。例としては、特に、アレルギー、喘息、自己免疫疾患、セリアック病、糸球体腎炎、肝炎および炎症性腸疾患が挙げられる。
【０００３】
炎症性障害の現在の処置は、疾患自体と同様に広範囲にわたるが、１つの手法はこれらの疾患を処置する静脈内免疫グロブリン（ＩＶＩｇ）の使用である。一般に健康な個体の血漿から得られる多特異性ＩｇＧを集めた治療製剤であるＩＶＩｇ調製物は、１９８０年代初期から利用可能であり、原発性または続発性免疫不全症の処置のために使用されてきた。その多様な抗炎症性および免疫調節性特性により、ＩＶＩｇは広範な自己免疫状態および炎症状態において成功裏に使用される。承認された自己免疫兆候としては、突発性血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、川崎病、ギランバレー症候群、および他の自己免疫神経症、重症筋無力症、皮膚筋炎、およびいくつかの奇病があげられる（非特許文献１）。
【０００４】
他の処置も、抗体を含む。例えば、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）も、炎症性疾患の処置に使用される。これらのｍＡｂの多くは、関節リウマチ、クローン病、潰瘍性大腸炎、脊椎関節症、若年性関節炎、乾癬、乾癬性関節炎、およびその他を含むいくつかの炎症性疾患および免疫疾患の治療のために認可された、炎症に役割を有する分子、例えば抗腫瘍ネクローシス因子（抗ＴＮＦ）、抗インターロイキン−１（抗ＩＬ−１）受容体、抗ＩＬ−６受容体、抗α４インテグリンサブユニット、および抗ＣＤ２０剤を標的化する。
【０００５】
赤血球（ＲＢＣ）に結合する抗体は、免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）を有する患者、およびＲｈ陰性である母親のＲｈ同種免疫のための第一選択治療として、２つの目的だけのために治療的に使用される。
【０００６】
ＩＴＰがいくつかの血小板表面抗原に対して検出可能な抗体を有する自己免疫疾患であり、ＩＴＰの典型的特徴の１つは血小板数の低下であるため、初めは、抗ＲＢＣ抗体、例えば「抗Ｄ」（ヒト血漿から精製された抗Ｄ免疫グロブリンの混合物）の、単核食細胞系（ＭＰＳ、以前は網膜内皮系（ＲＥＳ）として公知）における食細胞によるオプソニン化された血小板のクリアランスを競合的に阻害する能力に基づいて、ＩＴＰの処置での使用は実行された。血小板数の低下は、少なくとも部分的には、ＩｇＧ自己抗体による血小板のコーティングの結果として生じ、これが次に、それらを脾臓マクロファージならびに肝臓のクッパー細胞によるオプソニン化および食作用に対して感受性にする。これらの抗体を導入することによって、ＲＢＣは抗体によってコートされ、続いて単核食細胞系（ＭＰＳ、以前はＲＥＳとして公知）によってクリアランスされるため、ＩＴＰ処置は有効であると提案されている。このクリアランスは、同じ経路によって生じるオプソニン化された血小板のクリアランスと競合し、自己抗体−オプソニン化された血小板のクリアランスの低減をもたらす。
【０００７】
この理論は、ＩＴＰ患者が脾臓除去後、抗Ｄに最小の応答を示すまたは応答しないという観察によって支持される。抗Ｄオプソニン化ＲＢＣは、オプソニン化された血小板のインビトロでの食作用も防止し得る。
【０００８】
いくつかの異なるマウスＲＢＣ分子（例えば、ＣＤ２４およびＴＥＲ−１１９抗原）に対するモノクローナル抗体は、マウスモデルにおいて血小板減少症を成功裏に改善することが示された（特許文献２）。マウスにおいて、ＣＤ２４はＲＢＣによって発現されるようであるが、ヒトＲＢＣで発現されるとは考えられていない。さらなる研究では、ＲｈＤを発現しないがＲｈｃを発現するＩＴＰ患者は、抗Ｒｈｃによって成功裏に処置された（特許文献３）。
【０００９】
しかしながら、驚くべきことに、ＴＥＲ−１１９抗原に対する抗体によるＩＴＰの改善は急速に、および（ＲＢＣクリアランスによって誘導された）貧血症の測定可能な発症前に生じることが、本発明者らによって観察された。この観察に基づき、以前に提案された簡単なＭＰＳ遮断メカニズムは、抗体の効果を説明するのに不十分なようであり、広範な抗炎症活性が関与していることをさらに示す。これは、古典的なＭＰＳ機能が関与しない炎症性疾患、特に炎症性関節炎および輸血関連急性肺傷害（ＴＲＡＬＩ）をＴＥＲ−１１９抗原に対する抗体が改善できるというマウスモデルにおける本発明者らの実証によって確かめられた。試験した抗ＴＥＲ−１１９抗原抗体は、マウスにおいて関節炎の誘発を防止し、また確立された疾患も改善できる。さらに、それは、ＴＲＡＬＩのマウスモデルにおける低体温症を防止し、肺浮腫を低減することができた。これに基づき、抗ＲＢＣ抗体は炎症性障害に著しい治療能力を有する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｈａｒｔｕｎｇ  ＨＰら、Ｃｌｉｎ  Ｅｘｐ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００９；１５８（補遺１）：２３〜３３頁
【非特許文献２】Ｓｏｎｇ  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（９）：３７０８〜３７１３頁
【非特許文献３】Ｏｋｓｅｎｈｅｎｄｌｅｒ  Ｅら、Ｂｌｏｏｄ．１９８８；７１：１４９９〜１５０２頁
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
したがって、本発明は、炎症状態を処置または防止する方法での使用のための赤血球に対する抗体を提供する。
【００１２】
赤血球に対する治療有効量の抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む、対象において炎症状態を処置または防止する方法も提供される。
【００１３】
炎症状態を処置または防止する医薬の製造のための赤血球に対する抗体の使用も提供される。
【００１４】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣに対する抗体は、ＲＢＣ分子、好ましくはＲＢＣ膜貫通分子に特異的に結合する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣに対する抗体は、ポリクローナルまたはモノクローナル抗体である。抗体は、単一特異性または多特異性（例えば単一特異性）であってよい。いくつかの実施形態では、抗体は、単離された、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性、単一特異性、マウス、ヒト、完全ヒト、ヒト化、霊長類化またはキメラ抗体である。特定の一実施形態では、ＲＢＣ抗原に対する抗体は、モノクローナルヒトまたはヒト化抗体またはミニボディ（Ｆａｂ部分の定常領域を欠損している抗体断片）である。いくつかの実施形態では、ＲＢＣに対する抗体はＦａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）およびジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディから選択され；好ましくはそのような断片はＦｃを含む部分に結合または融合される。
【００１６】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣに対する抗体は、ＩｇＧまたはＩｇＭ型のものであり、特に、任意の型のラット、マウス、ヒトまたはヒト化ＩｇＧもしくはＩｇＭであってよく、好ましくは、ヒトまたはヒト化ＩｇＧもしくはＩｇＭであってよい。ヒトまたはヒト化ＩｇＧは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４型のものであってよい。ラットまたはマウスＩｇＧ（例えば、ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂもしくはＩｇＧ２ｃ、またはマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４）も使用される。ＲＢＣ抗原に対する抗体は、好ましくはＦｃ領域を含み、好ましくはＦｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）のようなＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、炎症状態は自己免疫状態、例えば自己抗体媒介自己免疫状態である。自己免疫状態は、上昇したＩＬ−１０が存在する（例えば健康な対象と比較して）状態であってよい。自己免疫状態は、いくつかの実施形態ではＩＴＰではない神経学的状態であってよい。自己免疫状態は、（ｉ）慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症（ＭＳ）および視神経脊髄炎（ＮＭＯ）から選択される、または（ｉｉ）関節リウマチおよびＴＲＡＬＩから選択される。
【００１８】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣ抗体はペプチドエピトープに結合する。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ抗体は、ＲｈＤタンパク質、ＧＰＡ、ＴＥＲ−１１９抗原（Ｌｙ７６）のヒト相同分子種、およびＢａｎｄ３から選択されるＲＢＣ分子に結合する。いくつかの実施形態では、ＲＢＣ抗体は、ＲＢＣあたり１０２〜１０５コピーの密度で見出されるＲＢＣ分子に結合する。抗体は任意の経路、例えば非経口または非−非経口（ｎｏｎ−ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ）によって投与される。好ましい非−非経口経路としては、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、局所投与または吸入が挙げられる。典型的には、ＲＢＣに対する抗体は、静脈内または皮下投与によって投与される。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣに対する抗体は、対象の体重の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの量の抗体が、所与の時間スケール、例えば１日、または１週間、２週間または１ヵ月で投与されるように投与される。ある特定の実施形態では、そのような重量ベースの投与量は、１日または１週間、２週間または１ヵ月あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、１日または１週間、２週間または１ヵ月あたり約０．３ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、１日または１週間、２週間または１ヵ月あたり約３ｍｇ／ｋｇ体重、および１日または１週間、２週間または１ヵ月あたり約１０ｍｇ／ｋｇ体重から選択される。
【００２０】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣに対する抗体は、固定投与量で投与される。特定の実施形態では、ＲＢＣに対する抗体は、約５０μｇ〜約２０００ｍｇの固定投与量の抗体の量が所与の時間スケール、例えば１日、１週間、２週間または１ヵ月で投与されるように投与される。
【００２１】
投与レジメンは、したがって、所与の時間スケールで対象に投与される抗体の量に関して規定される。その時間スケールの間に投与される頻度は、各時間に投与される抗体の量を決定する。例えば、投与量が１０ｍｇ／ｋｇ／週である場合、これは単回１０ｍｇ／ｋｇ投与または適切に低減した量の抗体により複数回投与として投与される（例えば、１週間で２５ｍｇ／ｋｇ用量）。いくつかの実施形態では、ＲＢＣに対する抗体は、単回投与として（例えば、毎日、毎週、２週間毎に１回、毎月１回）、または投与される度に抗体の量が少ない場合、より頻繁に複数回投与として投与される。皮下経路による一般的な投与では、静脈内投与（例えば２週間毎に１回または月１回）よりもより頻繁に（例えば１日１回）実行される。
【００２２】
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、治療有効量の１つまたはそれ以上の他の治療剤、好ましくは少なくとも１つの他の抗炎症剤、または炎症状態を処置するため、またはそれらの症状を軽減するために使用される薬剤、例えば抗炎症剤、免疫抑制剤または鎮痛剤を対象にさらに投与する工程を含む。
【００２３】
いくつかの実施形態では、抗体は、好ましくはＲＢＣに結合する。例えば、ＲＢＣ抗体が結合するＲＢＣ分子は、１つまたはそれ以上の他の血液細胞および／または血管系と関連する細胞よりもＲＢＣ上に高密度で見出される。
【００２４】
いくつかの実施形態では、抗体はヒト、または好適なインビボの動物モデルにおいてＭＰＳ遮断を起こし、またはインビボ、例えば動物モデルにおいてもしくはヒトにおいて溶血を起こし、またはインビトロアッセイでオプソニン化した血小板の食作用を阻害する。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
【図１】抗体クローニング戦略を示す図である。ベクターおよび断片は、示した酵素を使用して消化され、Ｔ４  ＤＮＡライゲースによってクローニングされた。組換えクローンは、ＩｎＴａｇアダプターに位置するクロラムフェニコール耐性マーカー（ＣｍＲ）を使用して選択された。ｐＣＭＶ：ＣＭＶプロモーター、ｐＡ：ＢＧＨポリＡ、Ｓ：ＥＲシグナル配列。
【図２−１】マウスＩＴＰの改善が、検出可能な貧血症の前に生じ得ることを示す図である。Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、ラットＩｇＧ  ４５μｇの（Ａ、Ｂ）またはＴＥＲ−１１９抗体４５μｇ（Ｃ、Ｄ）によって前処置され、血小板ならびに赤血球は、Ｘ軸に示した期間に数えられた。ＩＴＰは、Ｘ軸に示した時点で抗血小板抗体（ＭＷＲｅｇ３０）２μｇによって誘導された。血小板は、ＭＷＲｅｇ３０注射の１時間後に数えられた。左のｙ軸は血小板数を表し（白い四角）、右のｙ軸はＲＢＣ数を表す（黒い三角）。データは、５回の別々の実験、全部で９０匹のマウスの平均±ＳＥＭとして表される。血小板減少症では、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊Ｐ＜０．０００１。
【図２−２】図２−１の続き。
【図３】モノクローナルＲＢＣ特異的抗体ＴＥＲ−１１９が炎症性関節炎および輸血関連急性肺障害を阻害することを示す図である。０日目、Ｃ５７Ｂ１／６マウスは基底の関節炎測定のためにアセスメントされた（Ａ、Ｂ）。マウスの１つの群はＴＥＲ−１１９抗体４５μｇを受け（白い丸）、他の群は何も受けなかった（白い四角）。２時間後、全てのマウスはＫ／Ｂ×Ｎ血清の注射を受けた。足首測定（Ａ）および臨床スコア（Ｂ）は、Ｍｏｔｔ  ＰＪら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（６）：ｅ６５８０５にしたがって１０日間毎日とられた。データは５回の別々の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。ｎ＝１６（Ｋ／Ｂ×Ｎ血清のみ）；ｎ＝１３（ＴＥＲ−１１９）。＊Ｐ＜０．００５；＊＊Ｐ＜０．０００１。  独立した実験では、マウスは、前処置無しでＫ／Ｂ×Ｎ血清の注射を受ける。５日目に、関節炎のマウスは、処置（矢印）無し（白い丸）、３０Ｆ１抗体５０μｇ（白い三角）またはＴＥＲ−１１９抗体４５μｇ（白い丸）によって処置された。足首測定（Ｃ）および臨床スコア（Ｄ）は、Ｍｏｔｔ  ＰＪら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（６）：ｅ６５８０５にしたがって０、１、２および５〜９日目に測定された。データは４回の別々の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。ｎ＝５（Ｋ／Ｂ×Ｎ血清のみ）；ｎ＝６（ＴＥＲ−１１９）；ｎ＝７（３０−Ｆ１）。＊Ｐ＜０．０１；＊＊Ｐ＜０．０００１。  ＴＲＡＬＩ実験のため、ＳＣＩＤマウスは、２４時間、ＴＥＲ−１１９抗体４０μｇを注射される（白い丸、白い三角）、または未処置のままであった（白い四角）。マウスは、次いで３４−１−２ｓ  ５０μｇを注射される（白い三角、白い四角）、または何も注射されなかった（白い丸）。直腸温度は、２時間の間３０分毎に測定された（Ｅ）。マウスは続いて２時間で犠牲にされ、肺浮腫がアセスメントされた（Ｆ）。データは４回の別々の実験の平均±Ｓ．Ｅ．Ｍとして表される。ｎ＝４（ＴＥＲ−１１９）；ｎ＝５（３４−１−２Ｓ）；ｎ＝１４（ＴＥＲ−１１９＋３４−１−２Ｓ）。＊Ｐ＝０．００６；＊＊Ｐ＝０．００１。
【図４−１】コラーゲンＡｂ誘導関節炎（ＣＡｂＩＡ）へのＴＥＲ−１１９の治療効果を示す図である。（Ａ）ＣＡｂＩＡが確立されたマウスは、ＴＥＲ−１１９  ２ｍｇ／ｋｇまたはアイソタイプ対照ｍＡｂ（ラットＩｇＧ２ｂ）の単回ｉ．ｖ．注射によって５日目に処置された。臨床スコアは、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＩＫら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；１９２：５０３１〜５０３８頁にしたがってアセスメントされた。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝９）である。（Ｂ）実験の１２日目のマウスの全組織学的スコア。点は、個々のマウスを表す；バーは平均±ＳＥＭを示す。＊＊＊Ｐ＜０．００１、アイソタイプ対照と比較、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（両側）。（Ｃ）および（Ｄ）は、コラーゲンＡｂ誘導関節炎（ＣＡｂＩＡ）における臨床スコアへの異なる用量のＴＥＲ−１１９の効果を示す。（Ｅ）関節での浸潤細胞の数をアセスメントするため、各マウスからの膝蓋骨が回収され、消化され、視覚的に数えられた浸潤する白血球を示す。（Ｆ）１ｍｇ／ｋｇ用量でのＴＥＲ−１１９は、１．５および２ｍｇ／ｋｇ用量と比較してＲＢＣの表面での著しく低い結合抗体を生じ、これは臨床スコアと相関する。（Ｇ）全ての用量のＴＥＲ−１１９抗体は、関節炎マウスの関節でＣ１ｑ、Ｃ３およびＣ５ａレベルを低減する。補体成分Ｃ１ｑ（Ａ）、Ｃ３（Ｂ）およびＣ５ａ（Ｃ）は、ＥＬＩＳＡによって滑液からアセスメントれた。データは、対照群に対するｏｎｅ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡ検定とＨｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ多重比較検定によって分析された。＊Ｐ＜０．０５；＊＊Ｐ＜０．０１；＊＊＊Ｐ＜０．００１；＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。（Ｈ）ＣＡｂＩＡが確立されたマウスは、ＴＥＲ−１１９、アイソタイプ対照ｍＡｂ、脱グリコシル化ＴＥＲ−１１９またはＭ１／６９によって６日目に処置された。臨床スコアおよび足幅がアセスメントされた。統計的な比較は、Ｔｗｏ−ｗａｙ  ＡＮＯＶＡとＤｕｎｎｅｔｔ多重比較検定を使用して算出された（アイソタイプ対照に対する全ての群）。（Ｉ）フローサイトメトリーによってアセスメントされた、Ｃ５７ＢＬ／６マウス由来の赤血球と抗体（一次抗体０〜５１２ｎｇ）の結合を示す。
【図４−２】図４−１の続き。
【図４−３】図４−２の続き。
【図４−４】図４−３の続き。
【図４−５】図４−４の続き。
【図４−６】図４−５の続き。
【図５】ＴＥＲ−１１９オプソニン化ＲＢＣの用量依存的食作用係数を示す図である。赤血球はＣ５７Ｂ／６マウスから得られ、様々な濃度のＴＥＲ−１１９によって非オプソニン化（対照）またはオプソニン化され、次いで３０分間ＲＡＷ２６４．７マクロファージとインキュベートされた。食作用係数は、摂取されたＲＢＣの総数を計数し、これをフィールド内のマクロファージの総数によって割り、１００倍することによって算出された（群あたりｎ＝５）。＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１。
【図６】ＴＥＲ−１１９オプソニン化赤血球とインキュベートした血小板の食作用係数を示す図である。ＲＡＷ２６４．７細胞は終夜培養され、次いでＣＭＦＤＡによって標識され、Ｍｗｒｅｇ３０によってオプソニン化された血小板は、３７℃で３０分間、ＴＥＲ−１１９オプソニン化ＲＢＣ有りまたは無しのいずれかでＲＡＷ細胞に添加された。血小板食作用係数が算出された。＊＊＊Ｐ＜０．０５。（群あたりｎ＝５）。
【図７】抗赤血球抗体コートしたＲＢＣの、血小板食作用を阻害する能力を示す図である。赤血球は、非オプソニン化または１時間、抗体ＴＥＲ−１１９、脱グリコシル化ＴＥＲ−１１９、３４−３Ｃ（５または４０μｇ）およびＭ１／６９によってオプソニン化され、次いで、３０分間ＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＷＲｅｇ３０オプソニン化ＣＦＭＤＡ標識された血小板とインキュベートされた。細胞は、共焦点顕微鏡によって可視化され、内部移行した血小板はＩｍａｒｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．０．２によって数えられた。（Ｐ＜０．０５）。（群あたりｎ＝４〜６）。
【図８】マウスＩｇＧスイッチバリアントとして発現された６つのＴＥＲ−１１９が、受動抗体伝達非依存的にコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）の慢性モデルを処置し得ることを示す図である。ＩＩ型コラーゲンに対して免疫されたＤＢＡ−１マウスは、関節炎を発症させられ、次いでＰＢＳ（塗りつぶした丸、ｎ＝７マウス）、マウスＩｇＧ１サブタイプとして発現された（四角、ｎ＝６マウス）、またはマウスＩｇＧ２ａサブタイプとして発現された（三角、ｎ＝６マウス）ＴＥＲ−１１９  ２ｍｇ／ｋｇによって処置され（矢印によって示したタイミング）、関節炎の臨床スコアは実験の経過にわたって評価された。
【図９】コラーゲンＡｂ誘導関節炎（ＣＡｂＩＡ）への３４−３Ｃ（抗Ｂａｎｄ３抗体）の治療効果を示す図である。（Ａ）ＣＡｂＩＡが確立されたマウスは、抗Ｂａｎｄ  ３ｍＡｂ（クローン３４−３Ｃ、マウスＩｇＧ２ａ）２ｍｇ／ｋｇまたはＰＢＳの単回ｉ．ｖ．注射によって５日目に処置された。臨床スコアは、Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＩＫら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；１９２：５０３１〜５０３８頁にしたがってアセスメントされた。データは平均±ＳＥＭ（ｎ＝４／５）である。（Ｂ）実験の６日目と１２日目の間のマウスの臨床スコアの平均を示す図である。点は、個々のマウスを表す；バーは平均±ＳＥＭを示す。データは、Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定（両側）によって分析された。＊Ｐ＜０．０５。
【発明を実施するための形態】
【００２６】
本発明は、炎症状態の処置におけるＲＢＣに対する抗体の使用に関し、ＲＢＣ  ＴＥＲ−１１９抗原に対する抗体が、この抗体の溶血作用の前に生じる炎症状態免疫性血小板減少症（ＩＴＰ）への作用を有するという、本発明者らの驚くべき発見に基づく。この抗体および他のＲＢＣ枯渇性抗体のＩＴＰへの作用は、同じ経路によって血小板の枯渇を競合的に阻害する単核食細胞系（ＭＰＳ）によるオプソニン化ＲＢＣクリアランスの結果として生じることが以前から考えられてきた。しかしながら、ＲＢＣへの作用とＩＴＰの改善との間のタイミングのこの違いは、血小板の数によってアセスメントされるように、抗ＲＢＣ抗体が広範な抗炎症活性を有し、したがってそのような抗体にはＩＴＰ治療を超えて炎症を含む他の疾患に広がる効用があるという結論を支持する。
【００２７】
この広範な抗炎症活性のこの存在は、抗ＲＢＣ抗体の古典的なＭＰＳ機能が関与しない３つの別々の炎症性疾患を改善する能力によって支持される。第１に、抗ＲＢＣ抗体は、関節リウマチの周知のおよび特徴がはっきりしたＫ／Ｂ×Ｎマウスモデルにおいて関節リウマチの誘導を防止することができ、ここで関節炎の誘導はＫ／Ｂ×Ｎマウスから血清を移した後に生じる。これは、Ｋ／Ｂ×Ｎ血清による疾患の誘導前に、マウスを抗ＲＢＣ抗体によって予防的に処置することによって示された。抗ＲＢＣ抗体によって予防的に処置されたマウスにおいて、そうしなかったマウスと比較して、このマウスモデルのＲＡをアセスメントする２つの標準パラメーター、臨床関節炎スコアおよび足首幅に明らかな低減があった（Ｍｏｔｔ  ＰＪ、Ｌａｚａｒｕｓ  ＡＨ（２０１３）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  ８（６）：ｅ６５８０５）。これに加え、臨床関節炎スコアおよび足首幅のパラメーターに再び基づき、抗ＲＢＣ抗体は、確立された関節炎疾患も改善することができた。Ｋ／Ｂ×Ｎ血清による疾患誘導の５日後の抗ＲＢＣ抗体による処置は、臨床スコアおよび足首幅を３日後に正常レベルに戻した。
【００２８】
抗ＲＢＣ抗体は、マウスの周知のおよび特徴がはっきりしたコラーゲン抗体誘導関節炎（ＣＡｂＩＡ）モデル（最も一般的に研究された関節リウマチの自己免疫モデル）においても炎症性関節炎を改善することができた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＩＫら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４；１９２：５０３１〜５０３８頁。Ｃａｍｐｂｅｌｌ  Ｉ  Ｋら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６；１９７：４３９２〜４４０２頁）。ＣＡｂＩＡモデルにおける疾患発生は、ＦｃγＲ結合と補体系の活性化の両方に依存する（Ｋａｇａｒｉ  ＴＤら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０３；１７０（８）：４３１８〜４３２４頁。Ｎａｎｄａｋｕｍａｒ  ＫＳら、Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ  Ｒｅｓ  Ｔｈｅｒ．２００６；８（６）：２２３頁）。関節炎の誘導は、抗コラーゲンｍＡｂカクテルの注射およびＬＰＳのよる注射後に生じる。これは、疾患の誘導後に、マウスを抗ＲＢＣ抗体よって処置することによって示された。処置群間で明らかな違いがあった；処置されたマウスは注射の２４時間以内は関節炎から完全に保護され、抗ＲＢＣ抗体によって処置されたマウスにおいて、処置しなかったマウスと比較して、組織学的スコアの低減が観察された。
【００２９】
炎症性疾患のさらなるマウスモデルでは、抗ＲＢＣ抗体は、ＭＨＣクラスＩ抗体（３４−１−２Ｓ）のＳＣＩＤマウスへの輸注後に観察される低体温症の誘導を防止し、ならびに肺浮腫を改善することができた。これは、ヒト輸血関連急性肺傷害（ＴＲＡＬＩ）のマウスモデルであり、これは輸血の最も深刻な合併症の１つである。抗ＲＢＣ抗体の、低体温症の誘導の防止によって決定される全身性ショックを防止する、ならびにＩＴＰおよび関節炎におけるものと異なる症状を有するこの炎症性疾患における肺浮腫を改善する能力は、抗ＲＢＣ抗体の広範な抗炎症作用をさらに支持する。
【００３０】
ＩＶＩＧは３０年にわたりＩＴＰの処置に使用され、ポリクローナル抗Ｄは、Ｄ抗原（例えば、この処置のためのＲｈｏｐｈｙｌａｃ（登録商標）として販売されている）を発現するＩＴＰを有する患者における血小板減少症を回復することができるが、抗ＲＢＣ抗体の広範な抗炎症作用は、以前は認識されていなかった。ＩＴＰの処置で使用されるＲＢＣに対するモノクローナル抗体を同定するために研究が行われ、上記の抗ＴＥＲ−１１９のようなある特定の抗ＲＢＣモノクローナル抗体およびさらなる抗ＣＤ２４抗体がマウスモデルにおいて有効であることが示されたが（Ｓｏｎｇ  Ｓら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（９）：３７０８〜３７１３頁）、モノクローナル抗Ｄ抗体がＩＴＰを有するヒトで試験された小さな研究は成功しなかった（Ｇｏｄｅａｕ，Ｂ．ら、（１９９６）Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ；３６（４）：３２８〜３３０頁）。
【００３１】
ＩＴＰの処置のための抗体の先の研究の多くは、したがって、そのような抗体のＲＢＣをオプソニン化し、特にＭＰＳ経路との競合を提供することにより、血小板破壊を防止する能力に注目した。本発明者らによるこの新しい研究は、しかしながら、より一般的に炎症の処置におけるＲＢＣに対する抗体の新しい治療領域を広げる。本発明者らは、これらの見識がＲＢＣに結合する抗体を使用し、炎症の低減、治癒率の増加、炎症性障害における生存および／または無増悪生存期間の延長を目的とする治療介入の新規の機会を提供することを認識する。
【００３２】
本発明は、したがって、対象における炎症状態を防止および処置する方法での使用のためのＲＢＣに対する抗体、ならびに炎症状態を防止または処置する方法であって、それを必要とする対象にＲＢＣに対する治療有効量の抗体を投与する工程を含む方法を提供する。同様の作用は、インビトロで抗Ｄ抗体によって感作され、次いで患者に導入された赤血球によって達成されることが示され（Ａｍｂｒｉｚ−Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ，Ｒ．ら（２００２）「Ｆｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｂｌｏｃｋａｄｅ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｆｒａｃｔｏｒｙ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｉｍｍｕｎｅ  ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｏｐｅｎｉｃ  ｐｕｒｐｕｒａ  ｗｉｔｈ  ａｎｔｉ−Ｄ  ＩｇＧ」Ａｒｃｈ  Ｍｅｄ  Ｒｅｓ  ３３（６）：５３６〜５４０頁）；したがって、本発明は、対象における炎症状態を防止および処置する方法での使用のためのＲＢＣに対する抗体によって感作されたＲＢＣの投与、ならびに炎症状態を防止または処置する方法も提供する。
【００３３】
炎症状態
本発明は、炎症状態の処置および／または防止に関する。「炎症状態」により、再発性または慢性であってよく、正常な組織修復と関連しない破壊的な炎症によって特徴付けられる任意の状態を意味する。炎症は慢性炎症であってよい。慢性炎症状態では、好中球および他の白血球がサイトカインおよびケモカインによって恒常的に動員され、組織損傷をもたらす。
【００３４】
炎症状態の例は、自己免疫状態、すなわち免疫系が体の自身の組織を攻撃する疾患である。そのような疾患は、特に体の免疫系が炎症を起こす「自己炎症性疾患」を含む。そのような状態は、抗体媒介、および／またはＴ細胞媒介、および／または体の先天的な免疫系によって媒介される。一実施形態では、本発明の抗体は、自己抗体媒介自己免疫状態を処置するために使用される。
【００３５】
炎症状態は、補体媒介であってもよい（例えば、再灌流傷害、または脊髄傷害における補体媒介炎症）。
【００３６】
炎症状態は、上昇したＩＬ−１０が存在し、関節炎、特に関節リウマチ、川崎病、Ｉ型糖尿病、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）から選択される状態のような自己免疫状態であってよい。
【００３７】
代わりに、炎症状態は、上昇したＩＬ−１０が存在せず、例えば正常レベルのＩＬ−１０がある、またはＩＬ−１０が低減された自己免疫状態であってよい。ＩＴＰ患者および自己免疫性甲状腺炎患者は対照よりも低レベルのＩＬ−１０を有する。
【００３８】
疾患は、例えば、温度の変化と関連する炎症、自己免疫性血球減少症（例えば、自己免疫性溶血性貧血（ＡＩＨＡ）、自己免疫性好中球減少症（ＡＩＮ）、自己免疫性血小板減少症（ＩＴＰ））、原発性抗リン脂質症候群、関節炎（例えば、関節リウマチ、若年性関節炎）、腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎、クローン病、セリアック病）、川崎病、ＳＬＥ、免疫性血小板減少性紫斑病、虚血／再灌流傷害、Ｉ型糖尿病、炎症性皮膚障害（例えば、ざ瘡、乾癬、扁平苔癬、天疱瘡、類天疱瘡）、自己免疫性甲状腺疾患（例えば、グレーブス病、橋本甲状腺炎）、シェーグレン症候群、肺炎症（例えば、喘息、慢性閉塞性肺疾患（ＣＯＰＤ）、肺サルコイドーシス、リンパ球性肺胞炎）、移植拒絶、脊髄傷害、脳傷害（例えば、脳卒中、外傷性脳傷害）、神経変性疾患（例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、レビー小体病）、他の神経学的状態（進行性多巣性白質脳症、ＡＬＳ、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、炎症性ニューロパチー、ギランバレー症候群（ＧＢＳ）、運動ニューロン疾患（ＭＮＤ）、多発性硬化症、重症筋無力症、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、他の自己免疫チャネル病）、歯肉炎、遺伝子治療誘導性炎症、血管新生の疾患、炎症性腎疾患（例えば、ＩｇＡ腎症、膜性増殖性糸球体腎炎、急速進行性糸球体腎炎）、スティーブンス・ジョンソン症候群、自己免疫性てんかん、筋肉の炎症（例えば、皮膚筋炎および多発性筋炎）、強皮症、およびアテローム性動脈硬化であり得る。
【００３９】
特に関心があるのは、肺傷害（例えば、急性肺障害、輸血関連急性肺傷害（ＴＲＡＬＩ））、自己免疫性血球減少症、突発性血小板減少性紫斑病／免疫性血球減少症（ＩＴＰ）、関節リウマチ、全身性エリテマトーデス、喘息、川崎病、ギランバレー症候群、スティーブンス・ジョンソン症候群、クローン病、大腸炎、糖尿病（例えば、１型または２型糖尿病）、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、炎症性ニューロパチー、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、他の自己免疫チャネル病、自己免疫性てんかん、重症筋無力症、皮膚筋炎、多発性筋炎、強皮症、血管炎、ブドウ膜炎、天疱瘡、類天疱瘡、脊髄傷害またはアルツハイマー病である。
【００４０】
いくつかの実施形態では、炎症状態は、神経学的状態、例えば神経学的自己免疫疾患である。そのような状態の例としては、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症（ＭＳ）、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）、または自己免疫性てんかんが挙げられる。
【００４１】
いくつかの実施形態では、炎症状態は、関節炎（例えば関節リウマチ）およびＴＲＡＬＩから選択される。
【００４２】
いくつかの実施形態では、炎症状態は、ＩＴＰではなく、またはＩＴＰもしくは自己免疫性甲状腺炎ではない。他の実施形態では、炎症状態は、ＩＬ−１０が減少した疾患ではなく、または正常レベルのＩＬ−１０がある疾患ではない。
【００４３】
ＩＬ−１０レベルは、当技術分野で公知の標準的な免疫アッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）キットを使用して測定される。レベルは、任意の適切なサンプル、例えば血液、血清、血漿、尿、脳脊髄液で測定され、したがって、本明細書においてＩＬ−１０のレベルが言及される場合、関連するサンプルでのレベルである。比較は正常、例えば健康な対象と行われる。
【００４４】
処置の生物学的読み出し／効果
いずれの特定の理論にも拘束されないが、本発明者らは、本発明に記載の抗ＲＢＣ抗体の使用が以下に有用であると考える：（ｉ）炎症状態の炎症を低減する、（ｉｉ）状態の臨床症状を低減および／または遅延する（炎症状態の炎症の作用であってよい）、（ｉｉｉ）炎症状態を有する対象の生存を延長する、（ｉｖ）そのような状態に苦しむ患者の生活の質を高める、（ｖ）患者の治療の利便性を高める、および／または（ｖｉ）炎症状態を処置するために使用される他の薬物の効能を高める。
【００４５】
炎症状態を処置する方法であって、ＲＢＣに対する有効量の抗体を対象に投与する工程を含む方法が提供される。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、炎症状態において炎症を低減する方法、状態の臨床症状（例えば炎症状態の炎症の作用）を低減および／または遅延する方法、炎症状態を有する対象の生存を延長する方法、そのような状態に苦しむ患者の生活の質を高める方法、患者の治療の利便性を高める方法、および／または炎症状態を処置するために使用される１つまたはそれ以上の他の薬物の効能を高める方法であって、それぞれの場合に、ＲＢＣに対する有効量の抗体をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法が記載される。
【００４６】
本発明の方法は、炎症状態の１つまたはそれ以上の症状を処置または防止する、場合により炎症状態の１つまたはそれ以上の症状を処置する方法であって、ＲＢＣに対する有効量の抗体をそれを必要とする対象に投与する工程を含む方法としても記載される。
【００４７】
同様に、そのような方法を実行するための医薬の製造におけるＲＢＣに対する抗体の使用として、これらの方法での使用のためのＲＢＣに対する抗体が提供される。
【００４８】
（ｉ）炎症状態における炎症の低減
本発明の方法は、炎症状態において炎症を低減する方法として記載される。いくつかの実施形態では、炎症、および炎症状態におけるその作用は当技術分野で公知の標準的な臨床試験によってアセスメントされる。
【００４９】
例えば、炎症状態の疾患マーカーが公知である。疾患の状態をアセスメントするために使用される１つまたは複数のマーカーは、関連疾患（本明細書では「疾患マーカー」と呼ばれる）に特異的なマーカーもしくはマーカーの群であってよく、または炎症（ここで「炎症マーカー」と呼ばれる）のマーカーであってよい。アセスメントの好適なサンプルの例としては、組織、血液および尿が挙げられる。
【００５０】
１つまたはそれ以上の炎症マーカーのレベルが対象においてアセスメントされ、炎症性疾患の状態についておよび疾患への任意の処置の効果についての情報が提供される。炎症マーカーの低減は、一般に、炎症の低減の指標である。生物学的サンプルは、様々な時点で対象から採取され（例えば、処置が開始される前および本発明の抗体の投与後の好適な時点で）、１つまたはそれ以上の炎症マーカーのレベルがアセスメントされ、対象における炎症への処置の効果が決定される。そのような目的のために周知の炎症マーカーの例としては、ＣＲＰ、ＩＬ−６およびＴＮＦ−αが挙げられる。一実施形態では、１つまたはそれ以上の炎症マーカーは、本発明の抗体の投与前のマーカーのレベルと比較して、本発明の抗体の投与後に対象において低減される。本発明の別の実施形態では、方法は、対象において１つまたはそれ以上の炎症マーカーのレベルを決定する工程をさらに含み、これは処置の前および／または後であってよい。
【００５１】
任意の低減は、好ましくは統計的に有意である。１つまたはそれ以上の上記のマーカーの低減は、処置前のレベルと比較して少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％であってよい。
【００５２】
（ｉｉ）炎症状態の臨床症状（例えば、炎症状態の炎症の作用）を低減および／または遅延する
本発明の方法は、炎症状態の臨床症状（例えば、炎症状態の炎症の作用）の低減の方法として記載される。いくつかの実施形態では、１つまたはそれ以上の疾患マーカーのレベルが対象においてアセスメントされ、疾患の状態についておよび疾患への任意の処置の効果についての情報が提供される。多くの状態では、疾患の臨床症状は、炎症および関連組織の損傷の結果として生じるが、他のメカニズムも公知である。
【００５３】
ある特定の疾患マーカーが公知であり、炎症状態を診断およびモニターするために医師により使用される。一般に、疾患マーカーのレベルの低減は疾患の重症度の低減の指標であり得る（ある特定の状況では、１つまたはそれ以上の疾患マーカーの増加は疾患の重症度の低減の指標であり得るが）。生物学的サンプルは、様々な時点で対象から採取され（例えば、処置が開始される前および本発明の抗体の投与後の好適な時点で）、１つまたはそれ以上の疾患マーカーのレベルがアセスメントされ、対象における炎症への処置の効果が決定される。そのような目的のために公知の疾患マーカーの例は、以下の表１に記載される。一実施形態では、１つまたはそれ以上の疾患マーカーは、本発明の抗体の投与前のマーカーのレベルと比較して、本発明の抗体の投与後に対象において低減される（または増加される）。ある特定の実施形態では、低減（例えば、炎症性サイトカインまたはケモカイン）または増加（例えば、抗炎症性サイトカインまたは抗炎症性ケモカイン）は疾患の重症度の低下と関連する。本発明の別の実施形態では、方法は、対象において１つまたはそれ以上の疾患マーカーのレベルを決定する工程をさらに含み、これは処置の前および後であってよい。
【００５４】
【表１】
2021502958.tif 000002
【００５５】
そのようなマーカーの任意の低減または増加は、好ましくは統計的に有意である。１つまたはそれ以上の上記のマーカーの低減または増加は、例えば処置前のレベルと比較して少なくとも５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０％であってよい。
【００５６】
炎症の作用は当技術分野で公知の標準的な臨床試験によってもアセスメントされる。臨床試験は、処置される疾患または障害の臨床症状に基づいて行われるスコアリングを含み得る。一実施形態における処置は、本発明の抗体の投与前の疾患の臨床スコアと比較して疾患の臨床スコアの改善をもたらす。これは、本発明の抗体による処置後の実施例３および４のＫ／Ｂ×Ｎマウスで観察される臨床スコアの改善および足首の大きさの低減のような適切な動物モデルで見られる改善、実施例６の３４−１−２Ｓ誘導性低体温症の防止、ならびに実施例５のＣＡｂＩＡマウスで観察される臨床および組織学的スコアの改善と類似している。
【００５７】
処置が疾患進行の時間経過に影響するため、改善は、臨床症状または炎症状態の重症度の低減、または炎症状態の臨床症状の遅延で明らかにされる。
【００５８】
（ｉｉｉ）炎症状態を有する対象の生存を延長する
本発明の方法は、炎症状態を有する対象の生存を延長する方法として記載される。多くの炎症状態、特に自己免疫状態は治癒することはなく、そのような状態を有さない対照と比較した場合、対象の余命の減少をもたらす。したがって、処置は、例えば、少なくとも１、２、５、１０ヵ月または数年まで炎症状態を有する対象の生存を延長することができる。
【００５９】
（ｉｖ）炎症状態を処置するために使用される他の薬物の効能を増強する。
本発明の方法は、炎症状態を処置するために使用される１つまたはそれ以上の他の薬物効能を増強する方法として記載される。炎症状態を処置する公知の方法は、３つの一般的な手法、免疫抑制、抗炎症、または緩和的処置を含む。抗炎症剤の例としては、抗炎症鎮痛剤（ＮＳＡＩＤ、例えばアスピリン、イブプロフェン）が挙げられる。コルチコステロイド（例えばプレドニゾンおよびプレドニゾロン）、アミノサリチル酸、免疫抑制剤、例えばアザチオプリン、メルカプトプリン、およびメトトレキサートも使用される。サイトカイン、Ｂ細胞、および共刺激分子を含む標的による生物学的治療が現在使用されている。サイトカイン標的としては、腫瘍ネクローシス因子（ＴＮＦ）−アルファ（例えば、インフリキシマブ、アダリムマブ、およびゴリムマブ）、インターロイキン（ＩＬ）−１、抗ＩＬ−６分子が挙げられる。Ｂ細胞の枯渇は、抗ＣＤ２０抗体（例えば、リツキシマブ）の使用およびＢリンパ球刺激因子（ＢＬｙＳ）（ベリムマブ）によるＢ細胞受容体（ＢＣＲ）調節を含む。
【００６０】
したがって、本発明の抗体は、他の抗炎症剤の効能を増強するために１つまたはそれ以上の他の抗炎症剤と組み合わせて使用される。同様に、他の抗炎症剤は、本発明の抗体の効能を増強し得る。
【００６１】
赤血球抗体
赤血球（ＲＢＣ）抗体はＲＢＣに結合する。ＲＢＣ抗体が結合する分子は、本明細書においてＲＢＣ分子と呼ばれる。したがって、これは、ＲＢＣに対する抗体が無傷のＲＢＣに結合するため、ＲＢＣ表面分子、すなわちＲＢＣの外表面に見出されるまたはＲＢＣの外表面と関連する分子である。赤血球膜画分で同定されたタンパク質のリストが以下に示される；本発明での使用に好適なＲＢＣ分子はこのリストから選択される（表２）。
【００６２】
【表２】
2021502958.tif 000003
【表３】
2021502958.tif 000004
【００６３】
ＲＢＣ分子は、直接的または間接的にＲＢＣ膜に結合される。ＲＢＣ膜への分子の直接的な結合は、膜貫通タンパク質もしくは膜貫通糖タンパク質である分子、または膜の脂質への直接的な結合の結果として起こり得る。ＲＢＣへの分子の間接的な結合は、それ自体膜に直接的に結合される分子に結合するまたは会合する分子の結果として起こり得る（例えば、膜タンパク質もしくは糖タンパク質または膜の１つまたはそれ以上の脂質に結合されるタンパク質もしくは糖鎖）。
【００６４】
ＲＢＣ抗体は、したがってタンパク質（例えば、糖タンパク質）または糖鎖であってよいが、典型的にはタンパク質（例えば、糖タンパク質）であるＲＢＣ分子、すなわちＲＢＣ表面分子に結合する。いくつかの例では、ＲＢＣ分子はグリコシル化されない。
【００６５】
ＲＢＣ表面分子はＲＢＣ抗原としても記載されるが、ＲＢＣ抗体は、異なる血液型を生じるＲＢＣ分子の異なるアイソフォームのようなＲＢＣ分子の異なるアイソフォーム間を区別する必要がない。言い換えると、ＲＢＣ抗体は、いくつかの実施形態では、例えば、ＲＢＣ分子が異なる血液型と関連する複数のアイソフォームを有する場合、ＲＢＣ分子の２つ以上のアイソフォームに結合してよい（例えば、２つ以上、３つ以上、４つ以上のアイソフォーム）。そのような場合、抗体は、ＲＢＣ分子の多型の結果として生じる異なる血液型間を区別しない。代わりに、ＲＢＣ抗体は、ＲＢＣ分子の多型の結果として生じる異なる血液型間を区別できるようにＲＢＣ分子の１つのアイソフォームにのみ結合し得る。
【００６６】
ある特定のＲＢＣ分子は、異なる個体で異なる型を取ってよく、これらの違いは異なる血液型と関連する。例えば、タンパク質または糖タンパク質分子は複数の可能なアイソフォームを有してよく、異なるアイソフォームは異なる血液型と関連する。異なるタンパク質抗原に基づく血液型の例はＲｈｅｓｕｓ式である。Ｒｈｅｓｕｓ  Ｄタンパク質は、存在または非存在のいずれかであり、そのため生じる個体はＲｈＤ陽性または陰性であるが、関連するＲｈｅｓｕｓ  ＣＥタンパク質は、５つのアミノ酸位置のみでのアミノ酸多型の結果として生じるいくつかの型で存在し得る。Ｒｈｅｓｕｓ  ＣＥタンパク質の異なる型は、異なるＲｈｅｓｕｓ血液型と関連し、異なる抗原であると言われる。したがって、Ｒｈｅｓｕｓ  ＣＥタンパク質のようなＲＢＣ分子の場合、タンパク質の異なるアイソフォームが存在し、ＲＢＣ抗体はタンパク質の全てのアイソフォームに結合し得るか、またはある特定のアイソフォームにのみ結合し得る。
【００６７】
同様に、異なる糖鎖ベースの血液型抗原が存在する。「ＡＢＯ」抗原は、ＲＢＣ膜にある多くの異なるタンパク質および脂質に結合される糖鎖である。ＡＢＯ遺伝子座は、３つの主な対立形質：Ａ、Ｂ、およびＯを有する。各ＡおよびＢ対立遺伝子は、それぞれＡおよびＢ抗原の合成の最終工程を触媒するグリコシルトランスフェラーゼをコードする。Ａ／Ｂ多型は、ＡＢＯ遺伝子のいくつかのＳＮＰから生じ、４つのアミノ酸が異なるＡおよびＢトランスフェラーゼをもたらす。Ｏ対立遺伝子は、ＡＢＯ抗原前駆体（Ｈ抗原）を未修飾のままにする不活性なグリコシルトランスフェラーゼをコードするが、ＡおよびＢ抗原は糖鎖構造が異なる。ＡＢＯ抗原は、複数のＲＢＣ分子に存在し得る。糖鎖の異なる型は異なる血液型と関連し、異なる抗原と呼ばれる。したがって、ＡＢＣ抗原を含有するＲＢＣ分子の場合、異なる糖鎖構造が異なる血液型と関連し、ＲＢＣ抗体はある特定の糖鎖構造にのみ結合し得るか、または全ての型のＲＢＣ分子に結合し得る（例えば、ＲＢＣ分子のタンパク質部分に結合することによって）。
【００６８】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣ分子は分子ではなく、その存在もしくは非存在またはその異なるアイソフォームの存在は血液型を生じる（例えば、ＲＢＣ抗体はＡまたはＢ抗原に結合しない）。他の実施形態では、ＲＢＣ分子は分子であり、その存在もしくは不在またはその異なるアイソフォームの存在は血液型を生じる。そのような場合、ＲＢＣ抗体が結合するエピトープは、典型的には血液型を生じるアイソフォームによって影響されない、すなわち抗体は血液型とは無関係に結合する。
【００６９】
抗体が結合する分子の部分は、エピトープである。分子が糖タンパク質である場合、エピトープは糖鎖部分または糖タンパク質のタンパク質部分にあってよいが、好ましくはタンパク質部分にある、すなわちペプチドエピトープである。抗体が結合するエピトープは、糖鎖またはペプチドエピトープであってよいが、好ましくはペプチドエピトープであり、好ましくは糖鎖エピトープではない。ペプチドエピトープは、直鎖状または構造エピトープであってよい。
【００７０】
ＲＢＣ分子は、輸送に関与するタンパク質または糖タンパク質であってよい。輸送に関与するＲＢＣ分子は、例えばＢａｎｄ３アニオン輸送体（Ｄｉｅｇｏ血液型を規定する異なるアイソフォームを有する）、アクアポリン１水輸送体（Ｃｏｌｔｏｎ血液型を規定する）、アクアポリン３、Ｇｌｕｔ１、Ｋｉｄｄ抗原タンパク質、Ｒｈｅｓｕｓ関連糖タンパク質（ＲｈＡＧ、ＣＤ２４１）、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、Ｃａ２＋−ＡＴＰａｓｅ、Ｎａ＋Ｋ＋２Ｃｌ−共輸送体、Ｎａ＋−Ｃｌ−共輸送体、Ｎａ−Ｈ交換体、Ｋ−Ｃｌ共輸送体、Ｇａｒｄｏｓチャネルであってよい。糖タンパク質であるＲＢＣ輸送タンパク質としては、限定はされないが以下が挙げられる：Ｂａｎｄ３アニオン輸送体、アクアポリン１、アクアポリン３、Ｇｌｕｔ１、Ｋｉｄｄ抗原タンパク質、ＲｈＡＧ（ＣＤ２４１）、Ｎａ＋／Ｋ＋−ＡＴＰａｓｅ、Ｎａ−Ｈ交換体。
【００７１】
ＲＢＣ分子は細胞接着に関与する分子、例えばＩＣＡＭ−４またはＢＣＡＭ（ＣＤ２３９）であってよい。ＩＣＡＭ−４およびＢＣＡＭは両方とも糖タンパク質である。
【００７２】
ＲＢＣ分子はＲＢＣにおいて構造的な役割を有すると考えられる分子であってよい。構造的な役割を有するＲＢＣ分子は骨格タンパク質との連結を確立し、脂質二重膜と膜骨格との間の結合の制御に重要な役割を果たし、赤血球が膜の崩壊（小胞化）を防止することによってその好ましい膜表面領域を維持することを可能にするようである。そのような分子は、それらが赤血球の表面上にある場合、本発明にしたがって有用であり得る。構造的な役割を有する細胞表面分子としては、Ｂａｎｄ３（これは様々な糖分解酵素、推定のＣＯ２輸送体、および炭酸脱水酵素を集合させて、赤血球代謝ならびにイオンおよびガス輸送機能の制御に重要な役割を果たし得る「メタボロン」と呼ばれる巨大分子複合体にする）、ＲｈＡＧ（ＣＤ２４１）、ｒｈｔタンパク質４．１１Ｒベースの巨大分子複合体の膜であるタンパク質（例えば、グリコホリンＣ（ＣＤ２３６）およびＤ（Ｇｅｒｂｉｃｈ血液型を規定する）、ＸＫ、ＲｈＤ（ＣＤ２４０Ｄ）／ＲｈＣＥ（ＣＤ２４０Ｅ）、Ｄｕｆｆｙタンパク質（ＣＤ２３４））、ならびにグリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）およびＢ（ＣＤ２３５ｂ）のような他のグリコホリンが挙げられる。
【００７３】
糖タンパク質であるＲＢＣ構造タンパク質としては、限定はされないが、以下が挙げられる：Ｂａｎｄ３、ＲｈＡＧ、グリコホリンＡ〜Ｄ、ＸＫ、ＲｈＤ／ＲｈＣＥ、Ｄｕｆｆｙタンパク質。
【００７４】
他のＲＢＣ分子としては、ＣＲ１、ＣＤ９９、ＣＤ１４７、ＥＲＭＡＰ、ＣＤ２３８、ＣＤ２０、ＣＤ１５１、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、ＡＣｈＥ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ（ＣＤ２９７、ＡＲＴ４）、ＣＤ１０８（ＪＭＨ）、ＥｍｍおよびマウスＴＥＲ−１１９抗原（Ｌｙ７６、グリコホリンＡ関連タンパク質）に対するヒト相同分子種。
【００７５】
ＲＢＣ分子はタンパク質であってよく、糖タンパク質であってよく、または糖鎖であってよいが、好ましくはタンパク質（例えば、糖タンパク質）である。抗体が結合するエピトープは、糖鎖またはペプチドエピトープであってよいが、好ましくはペプチドエピトープであり、好ましくは糖鎖エピトープではない。
【００７６】
ＲＢＣ分子はその構造に基づいて、すなわちＩ型一回貫通タンパク質、ＩＩ型一回貫通タンパク質、ＩＩＩ型一回貫通タンパク質、複数回貫通タンパク質、ＧＰＩ結合タンパク質、またはこれらの組合せであるとして規定される。
【００７７】
Ｉ型一回貫通ＲＢＣ分子の例としては、グリコホリンＡ（ＣＤ２３５ａ）、グリコホリンＢ（ＣＤ２３５ｂ）、グリコホリンＣ（ＣＤ２３６）、グリコホリンＤ、ＣＲ１、ＢＣＡＭ（ＣＤ２３９）、ＩＣＡＭ−４（ＣＤ２４２）、ＣＤ９９、ＣＤ１４７およびＥＲＭＡＰが挙げられる。
【００７８】
ＩＩ型一回貫通タンパク質の例としては、ＣＤ２３８、ＸＫ、Ｂａｎｄ３、アクアポリン１、Ｋｉｄｄ、アクアポリン３、ＣＤ１５１が挙げられる。
【００７９】
ＲＢＣ  ＧＰＩ結合タンパク質の例は、ＤＡＦ（ＣＤ５５）、ＡＣｈＥ、Ｄｏｍｂｒｏｃｋ（ＣＤ２９７、ＡＲＴ４）、ＣＤ１０８（ＪＭＨ）、Ｅｍｍである。
【００８０】
ＲＢＣタンパク質および／または脂質に結合される糖鎖抗原の例としては、Ｐ１、Ｐｋ、Ｐ、ＡＢＯｓ、Ｈｈ、ＬｅｗｉｓまたはＩ抗原が挙げられる。
【００８１】
ＲｈＤ抗原
好ましいＲＢＣ分子はＲｈＤ分子（例えばヒトＲｈＤ分子）である。これは、欧州のコーカサス人のおよそ８５％に見出されるタンパク質であり、「Ｒｈｅｓｕｓ血液型系」に関与する。Ｒｈｅｓｕｓ因子の頻度は、他の集団でより高いこともある。
【００８２】
ＲｈｅｓｕｓＤ分子は高度に免疫原性であり、Ｒｈｅｓｕｓ不適合妊娠中およびＲｈｅｓｕｓ不適合血液の輸血後に抗ＲｈｅｓｕｓＤ抗体を誘発する。モデル研究は、ＲｈｅｓｕｓＤ分子が、細胞膜の外側に伸びたまたは細胞質に突き出た非常に短い接続領域のみを有する１２回膜貫通ドメインを有することを示す。ＲｈｅｓｕｓＤ分子を発現するこれらの個体は、Ｒｈｅｓｕｓ陽性であると言われる。Ｄ分子を欠損する個体は、Ｒｈｅｓｕｓ陰性と呼ばれる。Ｒｈｅｓｕｓ系に関与する他の遺伝子は、ＲＨＣＥ遺伝子であり、Ｃ、Ｅ、ｃおよびｅ抗原ならびに変異体を含有するＲｈＣＥタンパク質をコードする。
【００８３】
Ｄ分子上に複数のエピトープがあることが公知であり、「部分的Ｄ表現型」、赤血球にＤ抗原を有するが、血清に同種抗Ｄを有する人々を説明する。少なくとも９つの異なるエピトープ（ｅｐＤ１〜ｅｐＤ９）により、Ｄ変異体の人々の中には、ある特定のエピトープを欠損することが可能であり、抗体は欠損するＤエピトープに対して生じる。部分的Ｄ抗原に対する抗体を生じるＲｈｅｓｕｓ陽性個体は、それぞれＤ抗原に異なる異常を有する６つの主な異なるカテゴリー（Ｄ”〜ＤＶＩ  Ｉ）に分類された。これらのＤカテゴリーは、ヒトモノクローナル抗Ｄ抗体のパネルに対して試験した場合、反応の異なるパターンを与えることが示された（Ｔｉｐｐｅｔｔ，Ｐら、Ｖｏｘ  Ｓａｎｇｕｉｎｉｓ．７０（３）：１２３；１９９６）。異なる反応パターンは９つのエピトープを同定し、異なる部分Ｄカテゴリーを規定した。Ｄ抗原上に存在するエピトープの数は、部分的Ｄカテゴリー毎に異なり、ＤＶＩカテゴリーは、最少のｅｐＤ３、４および９を発現する。
【００８４】
一実施形態では、ＲＢＣ分子はＲｈｅｓｕｓＤ分子である。さらなる実施形態では、ＲＢＣ分子は、９つのエピトープｅｐＤ１〜ｅｐＤ９の少なくとも３つ、例えばｅｐＤ１〜ｅｐＤ９エピトープの少なくとも４、５、６、７、８または９つ全てを有するＲｈｅｓｕｓＤ分子である。一実施形態では、ＲＢＣ分子はＵｎｉＰｒｏｔエントリーＱ０２１６１の配列を有するＲｈｅｓｕｓＤ分子である。
【００８５】
別のＲｈ抗原は、Ｃ、Ｅ、ｃおよびｅ抗原（および変異体）を有するＲｈＣＥ（ＵｎｉＰｒｏｔエントリーＰ１８５７７）である。
【００８６】
マウスＴＥＲ−１１９抗原（Ｌｙ−７６）に対するヒト相同分子種
好ましい実施形態では、ＲＢＣ分子はＴＥＲ−１１９抗原（Ｌｙ７６）のヒト相同分子種である。ＴＥＲ−１１９抗原に対する抗体が使用され、以下に記載のように、３つの炎症状態の処置の実施例において有効であることが見出された。ＴＥＲ−１１９に対するラットモノクローナル抗体がＩＴＰのマウスモデルで使用され（Ｓｏｎｇ  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（９）：３７０８〜３７１３頁）、ＩＴＰを軽減することが示された。ＴＥＲ−１１９抗原は５２ｋＤグリコホリンＡ関連タンパク質であり、Ｌｙ７６としても公知である。それは、細胞表面グリコホリンＡと関連する分子である。
【００８７】
グリコホリンＡ（ＧＰＡ、ＣＤ１３５ａ）およびＢ（ＧＰＢ、ＣＤ２３５ｂ）およびグリコホリンＣおよびＤ
一実施形態では、ＲＢＣ分子はグリホリンＡ（ＧＰＡ）である。グリコホリンＡおよびＢは、ＭＮおよびＳｓ血液型の抗原決定基を持つヒト赤血球膜の主要なシアロ糖タンパク質である。約４０の変異体表現型が同定され、ＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ０２７３０（ＧＰＡ）およびＰ０６０２８（ＧＰＢ）である。
【００８８】
Ｂａｎｄ３（ＣＤ２３３）
一実施形態では、ＲＢＣ分子はＢａｎｄ３アニオン輸送体タンパク質である。アニオン交換体１（ＡＥ１）またはｂａｎｄ３または溶質キャリアファミリー４メンバー１（ＳＬＣ４Ａ１）としても公知のＢａｎｄ３アニオン輸送体タンパク質は、ヒトのＳＬＣ４Ａ１遺伝子によってコードされるタンパク質である；ＵｎｉＰｒｏｔエントリーはＰ０２７３０である。それは複数回貫通膜タンパク質である。ＣＤ２３３は、形質膜をわたる重炭酸塩の塩化物の電気的中性のアニオン交換を媒介の要因である系統学的に保存された輸送タンパク質である。それは、赤血球膜の主要な内在性膜糖タンパク質であり、赤血球膜の正常な可動性および安定性ならびにその細胞質ドメインの細胞骨格タンパク質、解糖酵素、およびヘモグロビンとの相互作用を介する正常な赤血球形に必要である。
【００８９】
集団におけるＲＢＣ分子の頻度
全てのＲＢＣ分子が全ての個体に見出されるわけではない。実際、異なる個体のＲＢＣ上で見出される分子間の違いは個体の血液型の要因であることは周知である。例として、ＡＢＯ血液型系では、Ａ型の個体は彼または彼女のＲＢＣ上に存在するＡ抗原、およびその血液中にＢ抗原に対する抗体を有する。Ｂ型の個体は彼または彼女のＲＢＣ上に存在するＢ抗原、およびその血液中にＡ抗原に対する抗体を有する。ＡＢ型の個体は彼または彼女のＲＢＣ上に存在するＡおよびＢ抗原を有し、その血液中に、ＡまたはＢ抗原に対する抗体はない。Ｏ型の個体はＯ抗原（Ｈ抗原）を有し、したがって彼または彼女のＲＢＣ上にＡまたはＢ抗原は存在しないが、その血液中にはＡおよびＢ抗原の両方に対する抗体がある。このことから、本発明の方法で抗Ａ抗体（すなわちＡ糖鎖抗原に結合する抗体）を使用することは、Ａ型またはＡＢ型である患者においてのみ有効であり、本発明の方法で抗Ｂ抗体（すなわちＢ糖鎖抗原に結合する抗体）を使用することは、Ｂ型またはＡＢ型の患者においてのみ有効であることが分かる。したがって、全ての対象において、または対象の所与の集団、例えばヒトの所与の集団において高レベルで見出されるＲＢＣ分子に対する抗体を使用することには利点が伴う。
【００９０】
したがって、分子、またはエピトープはヒトの少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％もしくは９９．５％で、または目的のヒト集団の少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、９９％または９９．５％で見出される。
【００９１】
例として、ＲｈＤ分子はヒトのおよそ８０％で見出されるが、集団によって変わり得る。
【００９２】
分子密度
ＲＢＣ分子またはエピトープは、好ましくは細胞あたり１０２〜１０６コピー、例えば細胞あたり１０２〜１０５、１０２〜１０４、１０２〜１０３、１０３〜１０４、１０３〜１０５、１０４〜１０５コピーの密度で見出される。ＲＢＣ上に好適な密度の分子を選択することは有利であり、それにより過度の溶血、および対象においてこれが有するであろう有害事象、例えば貧血症を起こすことが避けられる。例えば、ＡおよびＢ血液型抗原はＲＢＣ上に非常に高い密度であるが（細胞あたり１０６コピーの領域で）、ＲｈＤ分子はおよそ１０３〜１０４コピーで見出され、ＴＥＲ−１１９抗原はおよそ１０５コピーであり、したがって、分子またはエピトープの密度は、好ましくはＲＢＣあたり１０２〜１０５、１０２〜１０４、１０２〜１０３、１０３〜１０４、１０３〜１０５、１０４〜１０５コピーである。
【００９３】
いくつかの場合、分子は好ましくはＲｈＤ分子またはＧＰＡまたはＴＥＲ−１１９抗原（ＧＰＡ関連タンパク質、Ｌｙ−７６）のヒト相同分子種またはＢａｎｄ３である。
【００９４】
ある特定の他の場合では、抗原は好ましくはＲｈＤ分子、ＴＥＲ−１１９抗原のヒト相同分子種もしくはＴＥＲ−１１９抗原（Ｌｙ−７６）もしくはＣＤ２４ではない、または好ましくはＲｈＤ分子もしくはＴＥＲ−１１９抗原（Ｌｙ−７６）もしくはＴＥＲ−１１９抗原のヒト相同分子種ではない。代わりに、抗原は、好ましくはＲｈＤ分子、ＴＥＲ−１１９抗原（Ｌｙ−７６）、ＴＥＲ−１１９抗原のヒト相同分子種、ＣＤ２４もしくはＲｈＣＥ分子ではない、または好ましくはＲｈＤ分子もしくはＴＥＲ−１１９抗原（Ｌｙ−７６）もしくはＴＥＲ−１１９抗原のヒト相同分子種もしくはＲｈＣＥ分子ではない。
【００９５】
エピトープは、いくつかの実施形態では、糖鎖エピトープでもない。いくつかの実施形態では、それはＡＢＯエピトープでもなく、Ｐ１、Ｐｋ、Ｐ、ＡＢＯ、Ｈｈ、ＬｅｗｉｓまたはＩエピトープでもない。
【００９６】
体内のＲＢＣ分子の分布
ＲＢＣ分子は、好ましくはＲＢＣ上に選択的に発現され、それは抗体が好ましくはＲＢＣに結合することを意味するため有利であり、それによりオフターゲット効果が避けられる。例えば、分子は、１つまたはそれ以上の他の細胞上よりもＲＢＣ上に高い密度（細胞あたりの分子のコピー数として表される）、例えば１つまたはそれ以上の他の細胞よりも少なくとも２、３、４、５、１０、２０または５０倍高い密度で見出される。これらの他の細胞は、血液細胞（例えば、白血球（リンパ球、単核球、および顆粒球）または血小板）であってよい。これらの他の細胞は、血管系と関連する細胞（例えば内皮細胞または線維芽細胞）であってもよい。分子は白血球、血小板、および／または血管系と関連する細胞上に発現されない、例えば１つまたはそれ以上の白血球、血小板、および血管系と関連する細胞上に発現されないことが好ましい。ある特定の実施形態では、分子は、任意の他の細胞型上よりも少なくとも２、３、４、５、１０、２０または５０倍高い密度、例えば上記で言及した１つまたはそれ以上の細胞型上で少なくとも２、３、４、５、１０、２０または５０倍高く発現される。
【００９７】
結果として、抗体は、好ましくはＲＢＣに結合する。したがって、抗体は、１つまたはそれ以上の他の細胞、例えば血液細胞（例えば白血球（リンパ球、単核球、および顆粒球）または血小板）および／または血管系と関連する細胞（例えば内皮細胞または線維芽細胞）と比較して、好ましくはＲＢＣに結合する。抗体は、白血球、血小板、および／または血管系と関連する細胞に結合しないことが好ましい。ある特定の実施形態では、抗体は、任意の他の細胞型に結合せず、例えば１つまたはそれ以上の白血球、血小板、および血管系と関連する細胞に結合しない。抗体結合の検出は、当技術分野で公知の標準的な手順を使用して実行される（例えば、抗体を細胞とインキュベートし、適切に標識された二次抗体を使用して結合した抗体を検出することによるなど、例えばフローサイトメトリーによる、細胞に結合する抗体を検出する免疫アッセイ）。
【００９８】
代わりに、またはさらに、分子はＲＢＣ上および他の細胞型上で発現されるが、そのような場合、これらの他の細胞型は体または抗体が接近できない体の領域においてより低頻度で見出される。これは、抗体が好ましくはＲＢＣに結合することを意味し、そのような細胞に統計的により遭遇しやすいため有利であり、それによりオフターゲット効果が避けられる。例えば、分子は、ＲＢＣよりも体内または血管系により低頻度で見出される細胞上で見出される（例えば、ＲＢＣよりも体内または血管系のこれらの細胞の少なくとも２、３、４、５、１０、２０または５０分の１である）。さらにまたはかわりに、これらの他の細胞型は、例えば脳において見出される。
【００９９】
異なる細胞型上での分子の発現は、当技術分野で公知の標準的なインビトロでの方法によってアセスメントされ（例えば、免疫アッセイおよびＰＣＲベースの方法のようなタンパク質またはコードする核酸レベルに基づく）、異なる細胞型に結合する抗体の能力はインビトロで免疫アッセイを使用して同様にアッセイされる。異なる細胞型の数も、当技術分野で公知の標準的な方法によってアッセイされる。
【０１００】
抗体
使用される抗体はＲＢＣ分子に対する抗体である。いくつかの実施形態では、それはＲＢＣ分子に特異的である。これは、抗体とＲＢＣ分子との間の結合が特異的結合であることを意味する。本明細書で使用する場合、用語「特異的結合」は、本発明の抗体とＲＢＣ分子との間の結合反応を指し、ここで解離定数（ＫＤ）は１０−７Ｍ以下、特に１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、または１０−１０Ｍ以下である。用語「ＫＤ」は、本明細書で使用する場合、解離定数を指すことを意図し、これは会合速度（Ｋａ）に対する解離速度（Ｋｄ）の比率から得られ、モル濃度（Ｍ）として表される。ＫＤ値は当技術分野で十分に確立された方法を使用して決定される。抗体の会合および解離動力学を決定する１つの方法は、表面プラズモン共鳴を使用することにより、例えばＢｉａｃｏｒｅ（商標）システムのようなバイオセンサーシステムを使用することによる。
【０１０１】
一般に、より小さいＫＤ値が好まれる。これは分子へのより高い親和性に相当する。
【０１０２】
本発明の抗体は、典型的には高抗親和性のＲＢＣ分子に結合する。本明細書で使用する場合、用語「高親和性」は、ＫＤが１０−７Ｍ以下、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、または１０−１０Ｍ以下のＲＢＣ分子に結合する抗体を指す。しかしながら、「高親和性」結合は、異なる抗体で変わり得る。例えば、ＩｇＧ抗体の「高親和性」結合は、１０−８Ｍ以下、１０−９Ｍ以下、または１０−１０Ｍ以下のＫＤを指すが、ＩｇＭ抗体の高親和性結合は、１０−７Ｍ以下、または１０−８Ｍ以下のＫＤを有する抗体を指す。いくつかの実施形態では、抗体は高親和性ＩｇＧ抗体である。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、本発明の方法での使用のための抗体は、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（例えばＢｉａｃｏｒｅ）によって決定される１０−７Ｍ〜１０−１１Ｍの範囲のＫＤ値のそのＲＢＣ分子に結合する。
【０１０４】
親和性は他の技術（例えば平衡結合アッセイ）を使用しても算出される。抗ＲＢＣ抗体の親和性および濃度は、ＲＢＣへのどのくらいの結合が達成されるか規定する。結合は、特に多価ＩｇＭ抗体を使用する場合、抗体の結合力によっても駆動される。「結合力」は、非共有結合相互作用の多様な親和性の蓄積された強度を指す。
【０１０５】
ＩｇＧ１フォーマット（ＭＤＪ８）の抗ＲｈＤ抗体のクローンＬＤ１／２−６−３は、ナノモル範囲でのＲＢＣに対する親和性を示す（ＫＤ＝３ｎＭ、細胞あたり１４’０６９結合部位の算出により）（Ｍｉｅｓｃｈｅｒ  Ｓら、Ｂｒ．Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００；１１１（１）：１５７〜１６６頁）。ＴＥＲ−１１９（ラットＩｇＧ２ｂ）は、約３０ｎＭの親和性を示す（ＦＡＣＳ飽和実験から算出）。
【０１０６】
抗体の機能定義
いくつかの実施形態では、本発明の抗体はインビトロおよびインビボでＲＢＣに結合する（例えば、ヒトＲＢＣに）。これは、例えば免疫ベースの技術を使用してＲＢＣに対する抗体の結合を検出することによってインビトロでアセスメントされる。これは、当技術分野で公知の標準的な手順を使用して実行される（例えば抗体をＲＢＣとインキュベートし、適切に標識された二次抗体を使用して結合した抗体を検出することによるなど、例えばフローサイトメトリーによる、および例えば実施例７に記載のように、ＲＢＣに結合する抗体を検出すること）。インビボでの抗体結合も、例えば、対象からのサンプルにおいて、適切に標識した二次抗体を使用して（例えばフローサイトメトリーにより）、対象に抗体を投与し、ＲＢＣに結合する抗体を検出することによって検出される。
【０１０７】
本発明の抗体は、さらにまたはかわりにヒトにおいてまたは好適な動物（例えばマウス）モデルにおいてインビボでＭＰＳ（ＲＥＳとも記載される）遮断を起こし得る。マウスモデルにおけるＭＰＳ遮断は、例えば（Ｓｏｎｇ  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（９）：３７０８〜３７１３）に記載の、当技術分野で公知のアッセイを使用してアセスメントされる。簡単に述べると、好適なマウスモデル（例えばＳＣＩＤ）から採取されたＲＢＣは、インビトロで本発明の抗体とインキュベートされ、オプソニン化を起こし、オプソニン化されたＲＢＣは好適なマーカーによって標識され、好適なマウスに注射される。注射後に時間間隔で採取されたサンプルは、ＲＢＣおよび標識されたＲＢＣ数を評価される。導入後の経時的な循環する標識されたＲＢＣの数の低減は、ＭＰＳ遮断の指標である。低減は、例えば、アセスメントされた最初の時点での数と比較して循環する標識されたＲＢＣの３０〜８０％、４０〜７５％、または５０〜６５％であってよい。ヒトにおけるＭＰＳ遮断は、食作用アッセイに基づくＭＰＳ機能を測定するサロゲートアッセイによってアセスメントされる。臨床的に認められたアッセイは、単核球単層アッセイ（ＭＭＡ）として当技術分野で公知である（Ｔｏｎｇ  ＴＮ＆Ｂｒａｎｃｈ  ＤＲ  Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１７；１１９：５５０３９ページ。Ｔｏｎｇ  ＴＮら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２０１６；５６（１１）：２６８０〜２６９０頁）。
【０１０８】
抗体は、さらにまたは代わりにインビボで、例えば動物モデルまたはヒト対象で溶血を起こし得る。これは、例えば、抗体の投与後のＲＢＣ数の低減によって測定される。これは、標準的な技術、例えば抗体投与後の血液サンプル中のＲＢＣ数を得ること、または血液サンプル中の溶血の１つまたはそれ以上のマーカー（例えば遊離ヘモグロビン）を測定することによって決定される。抗体の導入後の経時的なＲＢＣの数の低減は、インビボでの溶血の指標である。
【０１０９】
この方法でＲＢＣ数の低減が評価される場合、抗体の投与前にみられたＲＢＣ数の９９、９８、９７、９６、９５、９４、９３、９２、９１、９０、８０、７０、６０、５０％未満までＲＢＣ数の低減があり得る。
【０１１０】
抗体は、さらに、例えば動物モデルまたはヒト対象において、インビボでの血小板数または血小板濃度の低減を起こし得る。これは、例えば抗体の投与後の対象数から採取したサンプルにおける血小板数または濃度を決定することにより測定される。これは、標準的な技術によって決定される。
【０１１１】
抗体は、さらにまたは代わりに、例えば実施例２に記載のように、マウスＩＴＰモデルにおいてマウスＩＴＰを改善し得る。抗体の投与の結果として、そのようなマウスモデルにおけるマウスＩＴＰの改善は、例えば処置前のレベルと比較して処置されたマウスにおける血小板数を比較することによって決定される。処置されたマウスにおける１．５時間後の少なくとも１．２５、１．５、１．７５、２、２．５、３の血小板数の増加は、処置前のレベルと比較して、そのようなマウスモデルにおけるマウスＩＴＰの改善の指標であり得る。
【０１１２】
抗体は、さらにまたは代わりに、例えば実施例３に記載のように、関節リウマチのマウスモデルにおける炎症性関節炎を改善し得る。Ｋ／Ｂ×Ｎ血清による注射の２時間前の本発明の抗体による前処置は、いくつかの実施形態では、Ｍｏｔｔら（Ｍｏｔｔ  ＰＪら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３：８（６）：ｅ６５８０５）に記載の標準的な手順にしたがってアセスメントされたように、Ｋ／Ｂ×Ｎ血清を注射された非前処置マウスと比較して、Ｋ／Ｂ×Ｎ血清を注射されたマウスにおける関節炎スコアを低減し、および／または足首幅を低減し得る。効果は、例えば処置の７日後に観察される。足首幅および／または臨床スコアは、いくつかの実施形態では、処置なしでの足首幅および／または臨床スコアと比較して少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０％低減される。臨床スコアはいくつかの例では０に低減される。
【０１１３】
同様に、抗体は、さらにまたは代わりに、例えば実施例４に記載のように、関節リウマチのマウスモデルにおいて確立された炎症性関節炎を回復する。Ｋ／Ｂ×Ｎ血清の注射の５日後の抗体の投与は、処置後、例えば処置の３日後の臨床スコアおよび／または足首幅を低減し得る。足首幅および／または臨床スコアは、いくつかの実施形態では、処置前の足首幅および／または臨床スコアと比較して少なくとも５、１０、１５、２０、３０、４０、５０％低減される。臨床スコアは、いくつかの例では０まで低減される。
【０１１４】
抗体は、さらにまたは代わりに、例えば実施例５に記載のように、ＣＡｂＩＡモデルにおいて炎症性関節炎を改善し得る。抗コラーゲンｍＡｂカクテル（０日目）およびＬＰＳ（３日目）による投与後、５日目の本発明に抗体による処置は、いくつかの実施形態では、実施例５に記載の手順にしたがってアセスメントされたように、例えば、コラーゲンｍＡｂカクテル（０日目）およびＬＰＳ（３日目）を注射されたが本発明の抗体によって処置されなかったマウスと比較して低減された臨床および組織学的関節炎スコアによって測定され、関節炎から保護される。効果は、例えば処置後１日目に観察される。組織学的および／もしくは臨床スコアは、いくつかの実施形態では０まで低減される、または処置なしでの組織学的および／もしくは臨床スコアと比較して少なくとも５０、６０、７０、８０％低減される。
【０１１５】
抗体は、さらにまたは代わりに、ＴＲＡＬＩのマウスモデルにおける３４−１−２Ｓ誘導性の低体温症を防止または低減し得る。本発明の抗体によるＳＣＩＤマウスの注射は、直腸温度測定によってアセスメントされるように（例えば実施例６のように）、抗ＭＨＣ  Ｉ抗体３４−１−２Ｓの１時間後の注射によって誘導される低体温症を低減し得る（Ｆｕｎｇ  ＹＬら、Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１６（１６）：３０７３〜３０７９頁）。本発明の抗体および抗ＭＨＣ  Ｉ抗体３４−１−２ｓによって処置されたマウスにおける直腸温度測定値は、抗ＭＨＣ  Ｉ抗体３４−１−２ｓ単独で処置されたマウスにおける直腸温度測定値よりも処置の２時間後少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９または１０℃高い。
【０１１６】
抗体は、さらにまたは代わりに、ＴＲＡＬＩのマウスモデルにおける３４−１−２Ｓ誘導性の肺浮腫を低減または防止し得る。本発明の抗体によるＳＣＩＤマウスの注射は、処置の２時間後のマウスの犠牲後、湿／乾（Ｗ／Ｄ）肺重量比の検死によってアセスメントされるように、抗ＭＨＣ  Ｉ抗体３４−１−２Ｓの１時間後の注射によって誘導される肺浮腫を低減し得る。抗体による前処置後に３４−１−２Ｓを受けるマウスは、３４−１−２Ｓを注射されたマウスよりも著しく低い肺Ｗ／Ｄ比を示し得る。
【０１１７】
抗体は、さらにまたは代わりに、インビトロアッセイにおいてオプソニン化された血小板の食作用を阻害し得る。インビトロアッセイでの、オプソニン化された血小板の食作用を阻害する抗体の能力は、例えば実施例７の方法を使用して、例えばＲＢＣの存在下での血小板食作用の量を本発明の抗体によってオプソニン化されたＲＢＣの存在下での血小板食作用の量と比較することによってアセスメントされる。本発明の抗体によってオプソニン化されていないＲＢＣの存在下での血小板食作用の量と比較した本発明の抗体によってオプソニン化されたＲＢＣの存在下での血小板食作用の量の低減は、例えば少なくとも２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００％の血小板食作用係数の低減として表される。
【０１１８】
ヒトおよびマウスＲＢＣ分子がそれらの一次配列に違いを有し、そのため試験される抗体への異なる結合特性を有し得るという事実を説明するため、上記のアッセイは、可能な場合、ヒトＲＢＣを使用して実行される（インビトロアッセイのため）。任意のマウスモデルが使用される場合、マウスモデルは、適切なヒトＲＢＣ分子が発現されるように改変される（例えば、遺伝的に操作される）。
【０１１９】
いくつかの実施形態では、抗体の投与は、抗原、例えば自己免疫状態に関与するまたは自己免疫状態を起こす抗原のまたは抗原に対する寛容（例えば、免疫寛容）、例えば抗体と投与されるタンパク質またはペプチドであってよい抗原のまたは抗原に対する寛容をもたらさない。いくつかの実施形態では、抗体は別のタンパク質と投与されない（例えば、タンパク質またはペプチド抗原）。
【０１２０】
構造抗体定義
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、典型的には抗体およびそれらの抗原結合性断片の両方を指す。天然に存在する「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む糖タンパク質である。各重鎖は、重鎖可変領域（本明細書ではＶＨと省略される）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２、およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書ではＶＬと省略される）と軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つのドメイン、ＣＬを含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域によって散在する超可変の領域にさらに細分される。各ＶＨおよびＶＬは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成される。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。抗体の定常領域は、免疫系の様々な細胞（例えばエフェクター細胞）および古典的補体系の第１の補体（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。
【０１２１】
好ましくは、抗体は、上記の特定の領域／ドメインからなる分子である。抗体は、ジスルフィド結合によって相互接続された２つの抗体重鎖および２つの抗体軽鎖のみを含み、例えば、各抗体重鎖は抗体重鎖可変領域および３つの定常領域ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３）からなり、各抗体軽鎖は抗体軽鎖可変領域および軽鎖定常領域からなる。
【０１２２】
好ましくは、抗体は、非免疫グロブリン配列を含有せず、例えばそれは、免疫グロブリン配列からなり、さらなる（例えば、ＮまたはＣ末端に融合した）配列が存在しない。この免疫グロブリン配列は、抗体、または免疫グロブリン、特にＩｇＧに存在する配列であるまたは配列に相当する配列であってよい。当業者は、例えば免疫グロブリンホールドの保存された性質に基づくそのような配列を容易に同定できる。
【０１２３】
好ましくは、抗体は、任意のさらなるタンパク質またはペプチドとの融合タンパク質ではなく、例えば、抗体は、例えば抗原のような任意の非抗体タンパク質またはペプチドに結合または融合しない。「結合または融合する」は、直接または間接的な結合を含むが、化学結合、例えば抗体とさらなるタンパク質またはペプチドとの間のペプチド結合である結合であってよく、例えば分子融合であってよい。間接的な結合は、例えば抗体に結合される粒子を介してよい（例えば、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、ポリマーソーム、またはミセル）。さらなるタンパク質またはペプチドは、例えば寛容性因子抗原であってよい（例えば、その抗原に寛容を生成するために投与される抗原）。
【０１２４】
抗体としては、限定はされないが、単離された、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性、単一特異性、マウス、ヒト、完全ヒト、ヒト化、霊長類化またはキメラ抗体が挙げられる。一実施形態では、抗体は単離されている。典型的には、本発明の抗体は、キメラ、完全ヒト、ヒトまたはヒト化抗体である。さらなる実施形態では、抗体は、ヒトまたはヒト化モノクローナル抗体である。用語、抗体は、以下により詳細に記載するように抗原結合性断片を含む。代わりに、ＲＢＣ抗体は、ポリクローナル調整物、例えばポリクローナル抗ＲｈＤ調整物であってよい。
【０１２５】
本明細書で使用する場合、「単離された抗体」は、他の細胞性物質および／もしくは化学物質を実質的に含まない抗体、ならびに／または異なる抗原特異性を有する（例えば、他の抗原に結合する）他の抗体を実質的に含まない抗体を指す。本明細書の他のところで議論したように、組成物は特に、単離された抗体を含んでよく、例えば単離された抗体（例えば単離された抗体調整物）および以下により詳細に規定される薬学的に許容される担体または希釈剤からなってよい。用語「単離された」は、さらに、例えば、ポリクローナル抗体調整物が他の細胞性物質および／もしくは化学物質を実質的に含まないポリクローナル調整物、ならびに／または異なる抗原特異性を有する（例えば、他の抗原に結合する）他の抗体を実質的に含まない抗体に適用される。
【０１２６】
本明細書で使用する場合、「モノクローナル抗体」または「モノクローナル抗体組成物」は、単一分子組成物の抗体分子の調製物である。モノクローナル抗体組成物は、単一の結合特異性および特定のエピトープへの親和性を示す。
【０１２７】
「ヒト抗体」は、フレームワーク、ＣＤＲ領域および定常領域（存在する場合）がヒト起源の配列、例えば、ヒト生殖系列配列またはヒト生殖系列配列の変異バージョンに由来する可変領域を有する抗体を含むことを意図する。ヒト抗体は、したがって、ヒト配列によってコードされないアミノ酸残基を含み得る（例えば、インビトロでの無作為もしくは部位特異的変異導入またはインビボでの体細胞変異によって導入される変異）。
【０１２８】
用語「ヒトモノクローナル抗体」は、フレームワークおよびＣＤＲ領域の両方がヒト配列に由来する可変領域を有する単一結合特異性を示す抗体を指す。そのようなヒトモノクローナル抗体は、不死化細胞に融合されたヒト重鎖導入遺伝子および軽鎖導入遺伝子を含むゲノムを有するトランスジェニック非ヒト動物、例えばトランスジェニックマウスから得られたＢ細胞を含むハイブリドーマによって産生される。完全ヒト配列由来の抗体は、マウスまたは他の非ヒト配列を持たず、２つの供給源：ファージディスプレイ技術およびトランスジェニックマウスによって大量生産される。
【０１２９】
「ヒト化抗体」は、任意の必要なフレームワーク逆突然変異と一緒にヒト配列由来可変領域に移植されたマウスまたは他の非ヒト配列由来ＣＤＲ領域を含有する。
【０１３０】
抗原結合性断片、変異体および誘導体も使用され、限定はされないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、またはミニ抗体（Ｆａｂ部分に定常領域を欠損する抗体断片）が挙げられる。ＳｃＦｖ分子は当技術分野で公知であり、例えば、米国特許第５，８９２，０１９号に記載される。いくつかの実施形態では、抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＭからなる群から選択される。他の実施形態では、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆ（ａｂ）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、ＳｃＦｖ、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、およびミニボディのような断片が使用される。使用される断片は、好ましくは適切なＦｃ含有部分に融合または結合される。抗体は、好ましくはｓｃＦｖではなく、または好ましくはｓｃＦｖを含まない。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、抗体はＩｇＧまたはＩｇＭ型のものである。特に、抗体は、任意の型のＩｇＧであってよい。特に、それは、任意の型のラット、マウス、ヒトまたはヒト化ＩｇＧまたはＩｇＭ、好ましくはヒトまたはヒト化ＩｇＧまたはＩｇＭであってよい。ヒトまたはヒト化ＩｇＧは、例えばＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４型のものであってよい。ラットまたはマウスＩｇＧも使用される（例えば、ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、もしくはＩｇＧ２ｃ、またはマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３もしくはＩｇＧ４）。
【０１３２】
抗体は、好ましくはＦｃドメインまたはその部分を含む。非限定的な例としては、好適なＦｃドメインはＩｇＧのような免疫グロブリンサブクラスに由来し得る。いくつかの実施形態では、好適なＦｃドメインまたはその部分は、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４（例えばヒト）に由来する、またはラットもしくはマウスＩｇＧ（例えば、ラットＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、もしくはＩｇＧ２ｃ、またはマウスＩｇＧ２ａ、ＩｇＧ２ｂ、ＩｇＧ２ｃ、ＩｇＧ３、もしくはＩｇＧ４）に由来する。特に好適なＦｃドメインは、ヒトまたはヒト化抗体に由来するものを含む。
【０１３３】
抗体は、好ましくはＦｃ受容体に結合する。これは、Ｆｃγ受容体（例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ））であってよい。Ｆｃ受容体に結合する能力は、いくつかの場合では、Ｆｃドメインのグリコシル化に依存してよく、そのようなものとしてのＦｃドメインまたはその部分は好ましくはグリコシル化される（または好ましくは脱グリコシル化されない）。
【０１３４】
抗体は、好ましくは低い補体活性化活性を有する。「低い補体活性化活性」により、抗体が表面結合または免疫複合体の場合、表面結合または免疫複合体ヒトＩｇＧ３よりも低く補体を活性化することを意味する。抗体は、好ましくはヒトＩｇＧ３よりも９０％低く、好ましくはヒトＩｇＧ３よりも８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％低く、より好ましくはヒトＩｇＧ３よりも３０％、２５％、または２０％低く、さらにより好ましくはヒトＩｇＧ３よりも１５％低くまたはさらに１０％低く補体を活性化する。
【０１３５】
抗体は、補体活性化活性を低減するためにＦｃ領域で改変される。好ましくは、補体活性化活性は、未改変の抗体と比較して少なくとも１０％、２０％、３０％、または４０％低減され；未改変の抗体と比較して、より好ましくは、補体活性化活性は、少なくとも５０％、６０％、または７０％低減され、さらにより好ましくは、補体活性化活性は、少なくとも８０％または９０％さえも低減される。
【０１３６】
補体活性化は、表面結合または免疫複合体抗体の補体源とのインキュベーション中に可溶性末端複合体（ｓＣ５ｂ−Ｃ９）の生成をモニターすることによって決定され；末端複合体は標準的なＥＬＩＳＡによって測定される。
【０１３７】
ある特定のＲＢＣ分子に対する抗体の生成および特徴付けの方法は、当技術分野で公知であり、以前に記載されている。例えば、ＷＯ９７４９８０９は、抗Ｒｈｅｓｕｓ  Ｄ抗体を記載し、ＴＥＲ−１１９抗体（Ｋｉｎａ  Ｔら、Ｂｒ  Ｊ  Ｈａｅｍａｔｏｌ．２０００；１０９：２８０〜２８７頁）はマウスモデルで広く使用され、抗ＣＤ２４（マウスＲＢＣ分子である）もマウスモデルで試験された（Ｓｏｎｇ  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（９）：３７０８〜３７１３頁）。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣ抗体は、抗Ｄのポリクローナル調整物である。そのような抗Ｄポリクローナル調整物は市販で入手できる（例えば、Ｒｈｏｐｈｙｌａｃ（登録商標））；代わりに、いくつかのモノクローナル抗Ｄ抗体のカクテルが使用される。いくつかの実施形態では、本発明の方法での使用のための抗体は組換えによって産生される。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣ抗体は、例において言及されたようにＴＥＲ−１１９抗体に見出される１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（例えば、これらのＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ、または少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ）。ＲＢＣ抗体は、例において言及されたようにＴＥＲ−１１９抗体に見出される軽および／または重鎖の配列を有し得る。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣ抗体は、例において言及されたように抗ヒトＲｈＤ抗体に見出される１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（例えば、これらのＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ、または少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ）。ＲＢＣ抗体は、例において言及されたように抗ヒトＲｈＤ抗体に見出される軽および／または重鎖の配列を有し得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣ抗体は、例において言及されたように抗ヒトＧＰＡ抗体に見出される１つまたはそれ以上の相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む（例えば、これらのＣＤＲの１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ、または少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つもしくは６つ）。ＲＢＣ抗体は、例において言及されたように抗ヒトＧＰＡ抗体に見出される軽および／または重鎖の配列を有し得る。
【０１４２】
処置の方法
本発明は、炎症状態を処置または防止する方法での使用のためのＲＢＣに対する抗体および対象において炎症状態を処置または防止する方法であって、ＲＢＣに対する治療有効量の抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法を提供する。
【０１４３】
本発明は、対象において炎症状態を処置または防止する方法であって、ＲＢＣに対する抗体によって感作された、治療有効量の対象自身のまたは（代わりにまたはさらに）提供されたヒト赤血球を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法も提供する。
【０１４４】
本明細書で使用する場合、用語「対象」または「個体」または「患者」は、治療を必要とする誰かを指す。本明細書で使用する場合、用語「対象」は、任意のヒトまたは非ヒト動物を含む。用語「非ヒト動物」は、全ての脊椎動物、例えば哺乳動物およびマウス、ラット、非ヒト霊長類、ヒツジ、イヌ、ネコ、ウマおよびウシのような非哺乳動物を含む。典型的には、しかしながら、用語「対象」はヒトを指す。
【０１４５】
用語「有効量」または「に有効な量」または「治療有効量」は、所望の結果、特に、疾患進行の防止および／または対象が処置される疾患と関連する症状の改善を得るのに十分な治療剤の投与量への言及を含む。
【０１４６】
本明細書で使用する場合、用語「処置する」、「処置すること」または「処置」は、目的が、炎症のような、既存の望まない生理学的変化または障害を低減または減速する（和らげる）ことである治療手段を指す。有益または所望の臨床結果としては、限定はされないが、症状の軽減、疾患の程度の縮減（炎症の程度を含む）、疾患の安定化（すなわち悪化しない）状態、疾患進行の遅延または減速、疾患状態の改善または緩和、および寛解（部分的かまたは全体的か）が挙げられる。「処置」は、処置を受けなかった場合に予測される生存と比較して生存を延長することも意味し得る。処置を必要とする対象は、典型的には、処置が提供される疾患、状態、または障害をすでに患っている対象を指すが、処置が提供される疾患、状態、または障害を患うリスクのある対象を含み得る。いくつかの実施形態では、処置される対象は、１つまたはそれ以上の自己免疫疾患の症状を有する。
【０１４７】
慢性炎症に関する疾患状態の文脈において、用語「処置すること」は、炎症促進性の免疫細胞の複製もしくは刺激の阻害、調節不全の免疫系の慢性炎症状態の阻害もしくは減少、または自己免疫状態または疾患を有する対象によって経験される発赤の頻度および／もしくは強度の減少のいずれかまたは全てを含む。
【０１４８】
本明細書で使用する場合、「防止」は、疾患状態がすでに確立されておらず、したがって本発明の方法が疾患状態の確立を防止し、炎症のような望ましくない生理学的変化または障害を低減または減速（和らげる）し得ることを意味するために使用される。防止の文脈では、処置は、疾患状態が既に確立される前に開始し得る。
【０１４９】
抗体は、好ましくは、本明細書の他の場所に規定された組成物として対象に投与される。ある特定の好ましい実施形態では、組成物は任意の細胞を含まず、および／または細胞が組成物と共投与されない。他の好ましい実施形態では、抗体は、組成物中のタンパク質性の活性成分のみであり、および／またはタンパク質性の活性成分は組成物と共投与されない。活性成分は、例えば、対象に効果を発揮することが意図されるおよび／または対象に効果を発揮する組成物中の成分であってよい。「活性成分」は、したがって、例えば担体および／または賦形剤を除外し得る。
【０１５０】
ある特定の好ましい実施形態では、抗体は組成物中に存在し、投与される前記組成物中の抗体は任意の抗原に結合されない（例えば、抗体ＣＤＲを介して任意の抗原に結合されない）。代わりに述べると、抗体は対象に投与された後、例えば抗体の投与後のみ、対象において抗原に結合し、例えば抗体の投与後の対象の血液中で、例えば抗体−ＲＢＣ複合体が形成され、および／または対象に存在する任意の抗体／ＲＢＣ複合体が対象への抗体の投与後に形成される。
【０１５１】
ある特定の好ましい実施形態では、抗体は組成物に存在し、投与される前記組成物中の前記抗体のＣＤＲは抗原への結合に利用される。
【０１５２】
配合
いくつかの実施形態では、本発明の抗体は、１つまたはそれ以上の治療剤と組み合わせて投与される。例えば、併用療法は、少なくとも１つの他の抗炎症剤、または炎症状態を処置するまたはそれらの症状を軽減するために使用される薬剤と組み合わせた本発明の抗体を含み得る。例えば、特定の実施形態では、炎症状態を処置または防止する方法は、抗炎症剤、免疫抑制剤、および／または鎮痛剤から選択される１つまたはそれ以上の治療剤と組み合わせてＲＢＣに対する有効量の抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む。例としては、ＮＳＡＩＤ（例えばアスピリン、イブプロフェンなど）、コルチコステロイド（例えばプレドニゾンおよびプレドニゾロン）、アミノサリチル酸、アザチオプリン、メルカプトプリン、メトトレキサート、および生物学的療法（例えば他の抗体）が挙げられる。
【０１５３】
複数の薬剤は、同時または連続使用のために製剤化される。
【０１５４】
投与レジメン
投与レジメンは、典型的には、最適な所望の応答（例えば治療応答）を提供するように調整される。例えば、抗体の単回ボーラスが投与される。他の実施形態では、いくつかの分割用量が経時的に投与される、または用量は、治療状況の必要性によって示されるように比例的に低減または増加される。抗体は任意の経路、例えば、非経口的または経腸的に投与される、またはＤＮＡワクチン技術を使用してインビボで生成される。好ましい非経口経路としては、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、脳内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、肺内（例えば噴霧）、鼻腔内、皮内、局所投与または吸入が挙げられる。２以上の記載した経路の組合せが使用される。特定の実施形態では、ＲＢＣに対する抗体は静脈内または皮下投与によって投与される。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、抗体は静脈内（ＩＶ）、例えば静脈内輸注としてまたは静脈内ボーラスとして投与される。用語「静脈内輸注」は、薬物、例えばおよそ５分より長い時間、例えば、およそ３０〜９０分の間に、動物またはヒト患者の静脈への抗体の導入を指すが、本開示にしたがって、静脈内輸注は、代わりに１０時間以下、例えば５時間以下、または２時間以下で投与される。特定の一実施形態では、輸注の期間は少なくとも６０分である。用語「静脈内ボーラス」または「静注」は、例えば、およそ１５分以下、例えば５分以下で体が薬物を受けるように、動物またはヒトの静脈への抗体の薬物投与を指す。例として、本発明の抗体は、１週間〜４週間の間隔で１ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内に投与される。
【０１５６】
他の実施形態では、本発明の抗体は、皮下に投与される。用語「皮下投与」は、比較的遅い、薬物の容器からの持続送達による、対象の皮膚下、例えば、皮膚と下層組織との間のポケット内への抗体の導入を指す。ポケットは、皮膚を上に、および下層組織から離して挟むまたは引っ張ることによって生じさせる。いくつかの実施形態では、抗体を含む組成物は、皮下針による患者の皮膚の表面下に導入される。
【０１５７】
いくつかの実施形態では、抗体は、対象の体重依存的な投与量で投与され、例えば抗体は、対象の体重の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの量の抗体が所与の時間尺度、例えば１日、または１週間、２週間または１ヵ月投与されるように投与される。ある特定の実施形態では、そのような体重ベースの投与量は、１日または１週間、２週間または１ヵ月あたり約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重、１日または１週間、２週間または１ヵ月あたり約０．３１ｍｇ／ｋｇ体重、約１ｍｇ／ｋｇ体重、１日または１週間、２週間または１ヵ月あたり約３ｍｇ／ｋｇ、および１日または１週間、２週間または１ヵ月あたり約１０ｍｇ／ｋｇ体重から選択される。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、抗体は固定投与量で投与される。特定の実施形態では、抗体は、約５０μｇ〜約２０００ｍｇの固定投与量の抗体の量が所与の時間尺度、例えば１日、１週間、２週間または１ヵ月投与されるように投与される。
【０１５９】
投与レジメンは、したがって、所与の時間尺度で対象に投与される抗体の量の文脈で規定される。その時間尺度の間の投与の頻度は、各回に投与される抗体の量を決定する。例えば、投与量が１０ｍｇ／ｋｇ／週の場合、これは単回１０ｍｇ／ｋｇ用量として、または抗体の適切に低減された量の複数回用量（例えば１週間で２５ｍｇ／ｋｇ用量）として投与される。いくつかの実施形態では、抗体は単回用量（例えば、毎日、毎週、２週間毎に１回、または毎月１回）として、または投与される各回で抗体の量がより少ない場合より頻繁に複数回用量として投与される。一般的に、皮下経路による投与は、静脈内投与（例えば２週間毎に１回または１ヵ月に１回）よりもより頻繁に（例えば１日１回）実行される。いくつかの実施形態では、ＲＢＣに対する抗体は、単回用量として；１週間あたり１またはそれ以上の用量で、１週間あたり１回、２以上の用量で；２週間毎に１回；３週間毎に１回；４週間毎に１回；１ヵ月に１回；３ヵ月に１回；または６ヵ月毎に１回投与される。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、ＲＢＣに対する抗体は、１日から６ヵ月の間隔で投与される。特定の実施形態では、ＲＢＣに対する抗体は１週間；２週間；３週間；４週間；１ヵ月；２ヵ月；３ヵ月；４ヵ月；５ヵ月；または６ヵ月の間隔で投与される。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、抗体は単一用量として投与され、または１週間あたり１回、２週間毎に１回、３週間毎に１回、４週間毎に１回、１ヵ月に１回、３ヵ月毎に１回、６ヵ月毎に１回、または様々な間隔で２以上の用量で投与される。
【０１６２】
いくつかの実施形態では、患者自身の赤血球または提供されたヒト赤血球のいずれかの赤血球が、インビトロで抗体と組み合わされ、次いでこれらの「感作された」赤血球、すなわち抗体によってコーティングされた赤血球が患者に投与される。
【０１６３】
医薬組成物
本発明は、本発明の抗体、例えば単離された抗体を含む組成物、例えば医薬組成物も提供する。そのような組成物は、本発明の１つまたは組合せの（例えば２以上の異なる）抗体を含み得る。例えば、本発明の医薬組成物は、異なるＲＢＣ分子、抗原、または異なる抗原または異なるエピトープに結合する、またはそうでなければ相補的な活性を有する２つの抗体を含み得る。本明細書で議論する組成物は本発明の方法で使用される。本明細書において言及される抗体は、好ましくは本明細書で言及される組成物として投与される。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本開示は、本発明の１つまたはそれ以上の抗体を含む医薬組成物および薬学的に許容される担体を提供する。用語「薬学的に許容される担体」は、生理学的に適合性の任意のおよび全ての溶媒、緩衝液、分散培地、コーティング剤、抗菌剤、および抗真菌剤、等張剤、および吸収遅延剤などを含む。好ましくは、担体は、静脈内、筋肉内、皮下、非経口、脊髄または上皮投与（例えば注射または輸注による）に好適である。例えば、いくつかの実施形態では、静脈内投与のための組成物は、典型的には無菌等張緩衝液中の溶液である。
【０１６５】
ある特定の好ましい実施形態では、例えば、本発明の方法での使用のための組成物は単離された抗体を含む。組成物は、本発明の方法で使用され、ここで、活性成分は単離された抗体である（例えばタンパク質性の活性成分（例えばタンパク質またはペプチド）が単離された抗体である、または活性成分のみが単離された抗体である）。ある特定の実施形態では、組成物は、単離された抗体および薬学的に許容される担体からなってよい。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、抗体は、任意の細胞、例えば赤血球のような任意の血液細胞を含まない、特に抗体に結合した任意の赤血球を含まない組成物中に存在する。抗体は、したがって、細胞、例えば赤血球のような任意の血液細胞を実質的に含まない、および特に抗体に結合した赤血球を含有しない組成物に存在し得る。
【０１６７】
ある特定の好ましい実施形態では、抗体はカプセル化されない、例えば細胞にカプセル化されない、例えばＲＢＣのような血液細胞にカプセル化されない。
【０１６８】
そのような医薬担体および賦形剤ならびに好適な医薬製剤の調製物は、当技術分野で周知である（例えば、「Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ」、Ｆｒｏｋｊａｅｒら，Ｔａｙｌｏｒ  ＆  Ｆｒａｎｃｉｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｋｉｂｂｅら、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ、２０００参照）。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの添加剤、例えば充填剤、緩衝剤、または安定剤を含み得る。標準的な医薬製剤技術は、当業者に周知である（例えば、２００５  Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’  Ｄｅｓｋ  Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ（登録商標）、Ｔｈｏｍｓｏｎ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ：Ｍｏｎｖａｌｅ、ＮＪ，２００４；Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｇｅｎｎａｒｏら編、Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ：Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ、ＰＡ、２０００参照）。好適な医薬添加剤としては、例えばマンニトール、ソルビトール、ラクトース、スクロース、トレハロース、またはその他のような糖、ヒスチジン、アルギニン、リジン、グリシン、アラニン、ロイシン、セリン、スレオニン、グルタミン酸、アスパラギン酸、グルタミン、アスパラギン、フェニルアラニン、プロリン、またはその他のようなアミノ酸、塩化ナトリウムまたはその他の塩のような等張状態を達成する添加剤、ポリソルベート８０、ポリソルベート２０、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、塩化カルシウムまたはその他のような安定剤、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）のような生理学的ｐＨ緩衝剤等が挙げられる。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、ｐＨ緩衝試薬および湿潤剤または乳化剤を含有し得る。さらなる実施形態では、組成物は保存剤または安定剤を含有し得る。
【０１６９】
投与の経路に依存して、本発明に記載の抗体は、化合物を不活性化し得る酸および他の自然条件の作用から化合物を保護するために物質でコーティングされる。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、本発明の医薬組成物は、注射可能な製剤の形態で抗体を含む。他の実施形態では、本発明の医薬組成物は、非経口投与のために製剤化され、例えば静脈内、皮下、または筋肉内投与のために製剤化される抗体またはそれらの抗原結合性断片を含む。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体は、滅菌水溶液または分散液および滅菌注射可能溶液または分散液の即時調製のための滅菌粉末を含む。ある特定の実施形態では、本開示は、例えばバイアルのような容器内の、滅菌注射可能溶液の調製のための本発明の抗体の滅菌粉末を提供する。
【０１７２】
一般
用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」ならびに「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）」を包含し、例えばＸを「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」組成物は、Ｘのみからなってよく、またはさらに追加の、例えばＸ＋Ｙを含んでよい。
【０１７３】
数値Ｘに関連する用語「約」は、例えばｘ±１０％を意味する。本発明は例示のみのために記載され、本発明の範囲および趣旨内にある限り修正が行われることが理解されるであろう。
【０１７４】
本発明の記載
１．炎症状態を処置または防止する方法での使用のための赤血球（ＲＢＣ）に対する抗体。
２．対象において炎症状態を処置または防止する方法であって、赤血球（ＲＢＣ）に対する治療有効量の抗体を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
３．炎症状態を処置または防止する医薬の製造のための赤血球（ＲＢＣ）に対する抗体の使用。
４．抗体は、ＲＢＣ分子に特異的に結合する、項１の使用のための抗体、または項２の方法、または項３の使用。
５．抗体は、単離された、ポリクローナル、モノクローナル、多特異性、単一特異性、マウス、ヒト、完全ヒト、ヒト化、霊長類化またはキメラ抗体である、項１もしくは４の使用のための抗体、項２もしくは４の方法、または項４の使用。
６．抗体は、モノクローナルおよびヒトまたはヒト化抗体であり、および場合により単離されている、項１もしくは４もしくは５のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４もしくは５のいずれか１項の方法、または項３〜５のいずれか１項の使用。
７．抗体は、ＩｇＧ型である、項６の使用のための抗体、または項６の方法、または項６の使用。
８．抗体は、ＩｇＧ１型のものである、項６もしくは７の使用のための抗体、または項６もしくは７の方法、または項６もしくは７の使用。
９．抗体は、ＩｇＧ２型のものである、項６もしくは７の使用のための抗体、または項６もしくは７の方法、または項６もしくは７の使用。
１０．抗体は、ＩｇＧ３型のものである、項６もしくは７の使用のための抗体、または項６もしくは７の方法、または項６もしくは７の使用。
１１．抗体、ＩｇＧ４型のものである、項６もしくは７の使用のための抗体、または項６もしくは７の方法、または項６または７の使用。
１２．抗体は、Ｆｃ領域を含み、好ましくはＦｃ受容体、例えば、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩＡ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＢ（ＣＤ３２）、ＦｃγＲＩＩＩＡ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩＩＩＢ（ＣＤ１６ｂ）のようなＦｃγ受容体（ＦｃγＲ）に結合する、項１もしくは４〜１１のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜１１のいずれか１項の方法、または項３〜１１のいずれか１項の使用。
１３．抗体は、低い補体活性化活性を有する、項１もしくは４〜１１のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜１１のいずれか１項の方法、または項３〜１１のいずれか１項の使用。
１４．Ｆｃ領域は、補体活性化を低減するように改変された、項１３の使用のための抗体、方法、または使用。
１５．炎症状態は、自己免疫状態である、項１もしくは４〜１４のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜１４のいずれか１項の方法、または項４〜１４のいずれか１項の使用。
１６．自己免疫状態は、自己抗体媒介自己免疫状態である、項１もしくは４〜１５のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜１５のいずれか１項の方法、または項３〜１５のいずれか１項の使用。
１７．自己免疫状態は、上昇したＩＬ−１０が存在する状態である、項１もしくは４〜１６のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜１６のいずれか１項の方法、または項４〜１６のいずれかの使用。
１８．自己免疫状態は、神経学的状態である、項１もしくは４〜１７のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜１７のいずれか１項の方法、または項４〜１７のいずれかの使用。
１９．自己免疫状態は、ＩＴＰではない、項１もしくは４〜１８のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜１８のいずれか１項の方法、または項４〜１８のいずれかの使用。
２０．状態は：
（ｉ）慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）、重症筋無力症（ＭＧ）、多発性硬化症（ＭＳ）および視神経脊髄炎（ＮＭＯ）から選択される、または
（ｉｉ）関節リウマチおよびＴＲＡＬＩから選択される、
項１もしくは４〜１９のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜１９のいずれか１項の方法、または項３〜１９のいずれか１項の使用。
２１．状態は、慢性炎症性脱髄性多発ニューロパチー（ＣＩＤＰ）である、項１もしくは４〜２０のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２０のいずれか１項の方法、または項３〜２０のいずれか１項の使用。
２２．状態は、重症筋無力症（ＭＧ）である、項１もしくは４〜２０のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２０のいずれか１項の方法、または項３〜２０のいずれか１項の使用。
２３．状態は、多発性硬化症（ＭＳ）である、項１もしくは４〜２０のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２０のいずれか１項の方法、または項３〜２０のいずれか１項の使用。
２４．状態は、視神経脊髄炎（ＮＭＯ）である、項１もしくは４〜２０のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２０のいずれか１項の方法、または項３〜２０のいずれか１項の使用。
２５．状態は、関節リウマチである、項１もしくは４〜２０のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２０のいずれか１項の方法、または項３〜２０のいずれか１項の使用。
２６．状態は、ＴＲＡＬＩである、項１もしくは４〜２０のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２０のいずれか１項の方法、または項３〜２０のいずれか１項の使用。
２７．ＲＢＣ抗体は、ペプチドエピトープに結合する、項１もしくは４〜２６のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２６のいずれか１項の方法、または項３〜２６のいずれか１項の使用。
２８．ＲＢＣ抗体は、ＲｈＤタンパク質、ＧＰＡ、ＴＥＲ−１１９抗原（Ｌｙ７６）のヒト相同分子種、およびＢａｎｄ３から選択されるＲＢＣ分子に結合する、項１もしくは４〜２７のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２７のいずれか１項の方法、または項３〜２７のいずれか１項の使用。
２９．ＲＢＣ抗体は、ＲＢＣあたり１０２〜１０５コピーの密度で見出されるＲＢＣ分子に結合する、項１もしくは４〜２８のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２８のいずれか１項の方法、または項３〜２８のいずれか１項の使用。
３０．抗体は、静脈内、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、脳内、皮下、関節内、関節滑液嚢内、髄腔内、肺内、鼻腔内、皮内局所投与によって、または吸入によって、好ましくは静脈内または皮下投与によって投与される、項１もしくは４〜２９のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２９のいずれか１項の方法、または項３〜２９のいずれか１項の使用。
３１．抗体は、対象の体重の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの量の抗体が週あたり投与されるように投与される、項１もしくは４〜２９のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２９のいずれか１項の方法、または項３〜２９のいずれか１項の使用。
３２．抗体は、対象の体重の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの量の抗体が２週間毎に投与されるように投与される、項１もしくは４〜２９のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２９のいずれか１項の方法、または項３〜２９のいずれか１項の使用。
３３．抗体は、対象の体重の約０．００１ｍｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇの量の抗体が１ヵ月あたりに投与されるように投与される、項１もしくは４〜２９のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２９のいずれか１項の方法、または項３〜２９のいずれか１項の使用。
３４．抗体は、約５０μｇ〜約２０００ｍｇの固定投与量が週あたりに投与されるように投与される、項１もしくは４〜２９のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２９のいずれか１項の方法、または項３〜２９のいずれか１項の使用。
３５．抗体は、約５０μｇ〜約２０００ｍｇの固定投与量が２週間あたりに投与されるように投与される、項１もしくは４〜２９のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２９のいずれか１項の方法、または項３〜２９のいずれか１項の使用。
３６．抗体は、約５０μｇ〜約２０００ｍｇの固定投与量が１ヵ月あたりに投与されるように投与される、項１もしくは４〜２９のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜２９のいずれか１項の方法、または項３〜２９のいずれか１項の使用。
３７．抗体は、１つまたはそれ以上の他の治療剤、好ましくは少なくとも１つの他の抗炎症剤、または炎症状態を処置するため、またはそれらの症状を軽減するために使用される薬剤と組み合わせて投与される、項１もしくは４〜３６のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜３６のいずれか１項の方法、または項３〜３６のいずれか１項の使用。
３８．１つまたはそれ以上の他の治療剤は、抗炎症剤を含む、項３７の使用のための抗体、項３７の方法、または項３７の使用。
３９．１つまたはそれ以上の他の治療剤は、免疫抑制剤を含む、項３７または３８の使用のための抗体、方法、または使用。
４０．１つまたはそれ以上の他の治療剤は、鎮痛剤を含む、項３５〜３９のいずれか１項の使用のための抗体、方法、または使用。
４１．抗体は、好ましくはＲＢＣに結合する、項１もしくは４〜４０のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜４０のいずれか１項の方法、または項３〜４０のいずれか１項の使用。
４２．ＲＢＣ抗体が結合するＲＢＣ分子は、１つまたはそれ以上の他の血液細胞および／または血管系に関連する細胞よりもＲＢＣ上に高密度で見出される、項１もしくは４〜４１のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜４１のいずれか１項の方法、または項３〜４１のいずれか１項の使用。
４３．ＲＢＣ抗体が結合するＲＢＣ分子は、血小板、白血球、および／または血管系に関連する細胞よりもＲＢＣ上に高密度で見出される、項１もしくは４〜４２のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜４２のいずれか１項の方法、または項３〜４２のいずれか１項の使用。
４４．ＲＢＣ抗体が結合するＲＢＣ分子は、血小板上で見出されない、項１もしくは４〜４３のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜４３のいずれか１項の方法、または項３〜４３のいずれか１項の使用。
４５．抗体は、ヒト、または好適な動物モデルにおいてインビボでＭＰＳ遮断を起こす、項１もしくは４〜４４のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４から４４のいずれか１項の方法、または項３〜４４のいずれか１項の使用。
４６．抗体は、インビボ、例えば動物モデルにおいてまたはヒトにおいて溶血を起こす、項１もしくは４〜４５のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜４５のいずれか１項の方法、または項３〜４５のいずれか１項の使用。
４７．抗体は、インビトロアッセイでオプソニン化した血小板の食作用を阻害する、項１もしくは４〜４６のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜４６のいずれか１項の方法、または項３〜４６のいずれか１項の使用。
４８．抗体の投与は、抗原のまたは抗原に対する寛容をもたらさない、項１もしくは４〜４７のいずれかの使用のための抗体、または項２もしくは４〜４７のいずれかの方法、または項３〜４７のいずれか１項の使用。
４９．抗原は、自己免疫状態に関与するまたは自己免疫状態を起こす抗体と投与されるタンパク質またはペプチドである、項４８の使用のための抗体、方法、または使用。
５０．抗体は、任意の非免疫グロブリン配列を含有せず、好ましくは、抗体は、免疫グロブリン配列からなり、さらなる（例えばＮまたはＣ末端に融合した）配列が存在しない、項１もしくは４〜４９のいずれか１項の使用のための抗体、または項２もしくは４〜４９のいずれかの方法、または項３〜４９のいずれか１項の使用。
５１．抗体は、任意のさらなるタンパク質またはペプチドを有する融合タンパク質ではない、項１もしくは４〜５０のいずれかの使用のための抗体、または項２もしくは４〜５０のいずれかの方法、または項３〜５０のいずれか１項の使用。
５２．抗体は、組成物として対象に投与され、場合により組成物が任意の細胞を含まないおよび／または細胞が組成物と共投与されない、項１もしくは４〜５１のいずれかの使用のための抗体、または項２もしくは４〜５１のいずれかの方法、または項３〜５１のいずれか１項の使用。
５３．対象において炎症状態を処置または防止する方法であって、赤血球（ＲＢＣ）に対する抗体によって感作された、治療有効量のヒト赤血球を、それを必要とする対象に投与する工程を含む方法。
【実施例】
【０１７５】
方法
試薬
Ｃ５７ＢＬ／６マウスおよびＳＣＩＤマウスは、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，ＮＹ，ＵＳＡ）から入手した。ＭＷＲｅｇ３０は、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、Ｏｎｔ．、Ｃａｎａｄａ）から入手した。３０−Ｆ１は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ、ＵＳＡ）から入手した。３０−１−２ＳおよびＴＥＲ−１１９は、Ｂｉｏ  Ｘ  Ｃｅｌｌ（Ｗｅｓｔ  Ｌｅｂａｎｏｎ、ＮＨ、ＵＳＡ）から入手した。
【０１７６】
ＩＴＰ／貧血症
記載したように、ＩＴＰが誘導され、血小板が数えられた（Ｃｒｏｗ  ＡＲら、Ｂｌｏｏｄ．２０１１；１１７（３）：９７１〜９７４頁）。記載したように、貧血症が誘導され、ＲＢＣが数えられた（Ｃｈｅｎ  Ｘら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２０１４；５４（３）：６５５〜６６４頁）。マウスは、対照ラットＩｇＧ  ４５μｇ、またはＴＥＲ−１１９  ４５μｇを特定の時点で注射され、それらのＲＢＣが数えられ、その後各群はＭＷＲｅｇ３０  ２μｇを受けた。ＭＷＲｅｇ３０注射の１時間後、マウスは血小板計数のために採血された。
【０１７７】
Ｋ／Ｂ×Ｎ関節炎モデル
記載したように、Ｋ／Ｂ×Ｎ関節炎が誘導され、スコア化された（Ｍｏｔｔ  ＰＪら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３：８（６）：ｅ６５８０５）。マウスは、Ｋ／Ｂ×Ｎ血清の注射前に、なし、またはＴＥＲ−１１９  ４５μｇによって前処置された。マウスは、関節炎の進行を毎日モニターされた。別個の実験では、マウスは関節炎にされ、５日目にＴＥＲ−１１９  ４５μｇまたは３０−Ｆ１  ５０μｇで処置された。
【０１７８】
ＴＲＡＬＩ
記載したように、ＴＲＡＬＩが誘導された（Ｋａｐｕｒ  Ｒら、Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２６（２５）：２７４７〜２７５１頁）。簡単に述べると、ＳＣＩＤマウスは、３４−１−２Ｓ  ５０μｇの注射の２４時間前に、ＴＥＲ−１１９  ４０μｇを注射された。直腸温度が、２時間の間３０分毎に記録され、次いでマウスは犠牲にされ、湿／間（Ｗ／Ｄ）肺重量比が決定された。
【実施例１】
【０１７９】
赤血球標的化抗体の生成（ＴＥＲ−１１９、ＩＣ３、ＬＤ１／２−６−３）
ｐＣＧＣベクターと呼ばれる一連の発現ベクターは、様々な抗体アイソタイプの重鎖の定常領域（ＣＨ）を、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ＥＲベクターに（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ  ＭＡ、ＵＳＡ）導入することによって生成された。抗ＴＥＲ−１１９（ＷＯ２０１３１２１２９６Ａ１）、抗グリコホリンＡ抗体ＩＣ３（ＷＯ９３２４６３０Ａ１）、および抗Ｄ抗体ＬＤ１／２−６−３（ＷＯ９７４９８０９Ａ１）の可変領域（ＶＬおよびＶＨ）をコードするＤＮＡ断片は、ＣＨＯ発現のためにコドン最適化され、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（ＭＡ、ＵＳＡ）によって合成された。次いで、ＶＬおよびＶＨ断は、図１に示すように、ＩｎＴａｇポジティブセレクション法（Ｃｈｅｎら、２０１４  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ４２（４）：ｅ２６）を使用して関連するｐＣＧＣベクターに適切なＩｎＴａｇアダプターと共にクローニングされた。最終発現ベクターは、軽鎖の発現が第１のＣＭＶプロモーターによって駆動され、重鎖の発現が第２のＣＭＶプロモーターによって駆動される二重発現ベクターである。
【０１８０】
【表４】
2021502958.tif 000005
【０１８１】
アミノ酸配列
ＬＤ１／２−６−３  ＶＬ（抗ヒトＲｈＤ）
ＶＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＳＩＩＲＹＬＮＷＹＱＨＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＨＴＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＶＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＳＹＴＴＰＹＴＦＧＱＧＴＫＬＱＩＫＲ（配列番号１）
ＬＤ１／２−６−３  ＶＨ（抗ヒトＲｈＤ）
ＱＶＫＬＬＥＳＧＧＧＶＶＱＰＧＧＳＬＲＶＡＣＶＡＳＧＦＴＦＲＮＦＧＭＨＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＡＦＩＷＦＤＡＳＮＫＧＹＧＤＳＶＫＧＲＦＴＶＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＧＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＥＫＡＶＲＧＩＳＲＹＮＹＹＭＤＶＷＧＫＧＴＴＶＴＶＳＳ（配列番号２）
ＩＣ３  ＶＬ（抗ヒトＧＰＡ）
ＤＩＶＭＳＱＳＰＳＳＬＡＶＳＶＧＥＫＶＳＭＳＣＫＳＳＱＳＬＦＮＳＲＴＲＫＮＹＬＴＷＹＱＱＫＰＧＱＳＰＫＰＬＩＹＷＡＳＴＲＥＳＧＶＰＤＲＦＴＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＶＱＡＥＤＬＡＤＹＹＣＫＱＳＹＮＬＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号３）
ＩＣ３  ＶＨ（抗ヒトＧＰＡ）
ＥＶＲＬＬＥＳＧＧＧＰＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＡＡＳＧＦＤＦＳＲＹＷＭＮＷＶＲＲＡＰＧＫＧＬＥＷＩＧＥＩＮＱＱＳＳＴＩＮＹＳＰＰＬＫＤＫＦＩＩＳＲＤＮＡＫＳＴＬＹＬＱＭＮＫＶＲＳＥＤＴＡＬＹＹＣＡＲＬＳＬＴＡＡＧＦＡＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＡ（配列番号４）
抗ＴＥＲ−１１９  ＶＬ（抗マウスＧＰＡ関連タンパク質、抗Ｌｙ７６）
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＶＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＬＮＣＫＡＳＱＮＩＮＫＹＬＮＷＹＱＱＫＬＧＥＡＰＫＶＬＩＹＮＴＮＮＬＱＴＧＩＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＦＣＦＱＨＹＴＷＰＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫＲ（配列番号５）
抗ＴＥＲ−１１９  ＶＨ（抗マウスＧＰＡ関連タンパク質、抗Ｌｙ７６）
ＥＶＫＬＱＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＫＬＳＣＶＡＳＧＦＴＦＲＤＨＷＭＮＷＶＲＱＡＰＧＫＴＭＥＷＩＧＤＩＲＰＤＧＳＤＴＮＹＡＰＳＶＲＮＲＦＴＩＳＲＤＮＡＲＳＩＬＹＬＱＭＳＮＭＲＳＤＹＴＡＴＹＹＣＶＲＤＳＰＴＲＡＧＬＭＤＡＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ（配列番号６）
【０１８２】
ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）細胞における一過性ｍＡｂ発現
ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現システム（Ｇｉｂｃｏ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ  ＣＡ、ＵＳＡ）のＭａｘ  Ｔｉｔｅｒプロトコールを使用する一過性トランスフェクションは、製造業者の説明書にしたがって実施された。プラスミドＤＮＡ（１２０μｇ）は、８ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭ中で希釈され、優しく混合された。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ試薬（６４０μＬ）は、７．４ｍＬのＯｐｔｉＰｒｏ（商標）ＳＦＭ中で希釈され、優しく混合され、希釈したＤＮＡとすぐに合わされ、優しく混合され、室温で２分間インキュベートされ、ＤＮＡ−ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ複合体を形成させた。ＤＮＡ−Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）ＣＨＯ複合体は、次いで、ＥｘｐｉＣＨＯ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（商標）培地中にＥｘｐｉＣＨＯ−Ｓ（商標）細胞（１．２×１０９個の細胞）２００ｍＬを含有する１ＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに添加された。細胞は、およそ２０時間、１４０ｒｐｍで振盪しながら８％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターでインキュベートされた。ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｅｎｈａｎｃｅｒ  １２００μＬおよびＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄ  ３２ｍＬからなるマスターミックスが調製され、各フラスコに添加された。細胞は、１４０ｒｐｍで振盪しながら５％ＣＯ２を含む３２℃のインキュベーターでさらに４日間インキュベートされた。さらなるＥｘｐｉＣＨＯ（商標）Ｆｅｅｄ  ３２ｍＬが添加され、細胞はさらに９日間インキュベートされた。タンパク質は、２０分間４℃で４０００ｒｐｍでの上澄み液の遠心分離から採取され、ＨＰＬＣ定量および精製の前に０．４５μＭフィルターを使用してきれいな容器に濾過された。
【０１８３】
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞における一過性ｍＡｂ発現
Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）発現システム（Ｌｉｆｅ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＣＡ，ＵＳＡ）を使用する一過性トランスフェクションは、製造業者の説明書にしたがって実施された。プラスミドＤＮＡ（１ｍｇ）は、５０ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ（商標）Ｉ培地中で希釈され、優しく混合された。Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクション試薬（２．７ｍＬ）は、５０ｍＬのＯｐｔｉ−ＭＥＭ（商標）Ｉ培地中で希釈され、優しく混合され、室温で５分間インキュベートされた。希釈したＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクション試薬は、次いで、希釈したＤＮＡに添加され、優しく混合され、室温で２０〜３０分間インキュベートされ、ＤＮＡ−Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクション試薬複合体を形成させた。ＤＮＡ−Ｅｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３トランスフェクション試薬複合体は、次いで、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ（商標）細胞（２．５×１０９個の細胞）８１７ｍＬを含有する３ＬのＥｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに添加された。細胞は、およそ１９時間、１２０ｒｐｍで振盪しながら８％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターでインキュベートされた。５ｍＬのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ１（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）、５０ｍＬのＥｘｐｉｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）２９３  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｅｎｈａｎｃｅｒ２（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，ＣＡ，ＵＳＡ）および２５ｍＬのＬｕｐｉｎ  Ｐｅｐｔｏｎｅ（Ｓｏｌａｂｉａ  Ｓ．Ａ．Ｓ、Ｆｒａｎｃｅ）からなるマスターミックスが調製され、各Ｅｒｌｅｎｍｅｙｅｒフラスコに添加された。細胞は、１２０ｒｐｍで振盪しながら８％ＣＯ２を含む３７℃のインキュベーターでさらに５日間インキュベートされた。タンパク質は、２０分間４０００ｒｐｍでの上澄み液の遠心分離から採取され、ＨＰＬＣ定量および精製の前に０．４５μＭフィルターを使用して清潔なチューブに濾過された。
【実施例２】
【０１８４】
治療抗体ＴＥＲ−１１９によるタイムコース実験
ＩＴＰモデルにおけるＴＥＲ−１１９によるタイムコース実験が実施された。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは、ラットのＩｇＧ  ４５μｇ（図１Ａ、Ｂ）またはＴＥＲ−１１９  ４５μｇ（図２Ｃ、Ｄ）によって前処置され、図２のｘ軸に示す期間、血小板ならびに赤血球が数えられた。ＩＴＰは、ｘ軸に示した時間に、抗血小板抗体（ＭＷＲｅｇ３０）２μｇによって誘導された。血小板は、ＭＷＲｅｇ３０注射の１時間後に数えられた。
【０１８５】
対照ラットＩｇＧによって注射されたマウスは、ラットＩｇＧへの短期（図２Ａ）または長期（図２Ｂ）の暴露後に貧血症または抗血小板抗体誘導ＩＴＰの改善を示さない。対照的に、ＴＥＲ−１１９によって前処置されたマウスは、投与の３時間後に始まる測定できるほどの貧血症を実証した（図２Ｃ）。驚くべきことに、ＩＴＰの改善は測定できるほどの貧血症の発症前に見られた（図２Ｃ、０．５時間および１．５時間）。反対に、本発明者らは、最大の貧血症に達した場合、ＩＴＰの顕著な改善を観察しなかった（図２Ｄ、９６時間）。これらのデータは、貧血症が、ＴＥＲ−１１９によるＩＴＰの改善に必須ではないことを示す。これは、ＩＴＰにおけるＴＥＲ−１１９の治療活性が、単にＭＰＳ機能の競合阻害によらないことを推測させる。
【実施例３】
【０１８６】
ＴＥＲ−１１９は、Ｋ／Ｂ×Ｎモデルにおいて炎症性関節炎を改善できる。
関節リウマチは滑膜関節の炎症を含む一般的な自己免疫障害である（Ｃｏｌｍｅｇｎａ  Ｉ、Ｏｈａｔａ  ＢＲ、Ｍｅｎａｒｄ  ＨＡ．Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１２；９１（４）：６０７〜６２０頁）。Ｋ／Ｂ×Ｎ関節炎モデルは、ヒト関節リウマチの多くの免疫学的メカニズムをとり（Ｋｏｕｓｋｏｆｆ  Ｖら、Ｃｅｌｌ．１９９６年；８７（５）：８１１〜８２２頁）、脾臓摘出マウスは正常マウスと同等に疾患に感受性であるため、脾臓血球貯留を必要とする炎症性疾患として公知ではない（Ｍｉｓｈａｒｉｎ  ＡＶら、Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１４；９（２）：５９１〜６０４頁）。したがって、本発明者らは、ＴＥＲ−１１９の広範な抗炎症活性能を試験するためこのモデルを使用した。
【０１８７】
０日目、Ｃ５７ＢＬ／６マウスは基底の関節炎測定をアセスメントされた（図３ＡおよびＢ）。マウスの１つの群はＴＥＲ−１１９  ４５μｇを受け（白い丸）、他の群（白い四角）は何も受けなかった。２時間後、全てのマウスがＫ／Ｂ×Ｎ血清の注射を受けた。Ｍｏｔｔ  ＰＪら、ＰＬｏＳ  Ｏｎｅ．２０１３；８（６）：ｅ６５８０５にしたがって、足首測定（Ａ）および臨床スコア（Ｂ）が１０日間毎日取られた。
【０１８８】
Ｋ／Ｂ×Ｎ血清を注射されたマウスは、それらの臨床関節炎スコアに基づき、注射後２日目までに（図２Ｂ、白い丸）、およびそれらの足首幅に基づき３日目までに（図３Ａ、白い四角）炎症性関節炎を発症した。疾患重症度は時間と共に増加し、７日（臨床スコア）および８日（足首幅）で最大に達した。比較すると、ＴＥＲ−１１９によって予防的に処置されたマウスは、著しく低減した関節炎スコア（図３Ａ、白い丸）および（図３Ｂ、白い丸）を実証した。これらのデータは、ＲＢＣに対するモノクローナル抗体が炎症性関節炎を改善できることを実証し、ＴＥＲ−１１９がＩＴＰの処置を超えて広範な抗炎症活性を発揮することを示している。
【実施例４】
【０１８９】
ＴＥＲ−１１９は、Ｋ／Ｂ×Ｎモデルにおいて確立された関節炎を回復できる。
本発明者らは、確立された関節炎疾患を改善するＴＥＲ−１１９の能力も試験した。独立した実験において、マウスは、前処置なしでＫ／Ｂ×Ｎ血清の注射を受けた。５日目に、関節炎マウスは、何もなし（図３Ｃ、白い四角）、３０Ｆ１  ５０μｇ（例えば、Ｓｏｎｇ  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（９）：３７０８〜３７１３頁で使用された、非治療抗ＣＤ２４抗体、白い三角）またはＴＥＲ−１１９  ４５μｇ（白い丸）によって処置された（図３Ｃ／Ｄ、矢印）。足首測定（Ｃ）および臨床スコア（Ｄ）は０、１、２、および５〜９日目に測定された。
【０１９０】
この一連の実験において、マウスは、それらの足首幅（図３Ｃ）および臨床スコア（図３Ｄ）に基づいて５日目に最大の関節炎を発症した。５日目にＴＥＲ−１１９によって処置されたマウスは、処置の１日後に関節炎炎症の明らかな低減を示し、足首幅および臨床スコアは処置の３日後に正常に戻った。足首幅の減少は、処置の１日後では顕著ではなかったが（６日目、Ｐ＝０．０６）、腫れの実質的な低減があった。ＲＢＣ抗体３０−Ｆ１（Ｆｃ受容体に結合せず、マウスＩＴＰを改善しないラットＩｇＧ２ｃ抗体（Ｓｏｎｇ  Ｓら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（９）：３７０８〜３７１３頁））を受けるマウスは、未処置のマウスと同様に、炎症の改善を示さなかった。これらのデータは、ＴＥＲ−１１９が確立された関節炎を回復でき、活性化するＦｃ受容体に結合できるＩｇＧサブタイプが選択されなければならないことを実証する。これは、脱グリコシル化ＴＥＲ−１１９、Ｆｃ受容体結合活性を大きく減らすことが公知のプロセスによっても確認され、脱グリコシル化ＴＥＲ−１１９は、Ｋ／Ｂ×Ｎ関節炎またはＩＴＰを著しく改善しなかったことを示す（データは示さない）。
【実施例５】
【０１９１】
ＴＥＲ−１１９は、コラーゲン抗体誘導関節炎ＣＡｂＩＡモデルにおいて炎症性関節炎を改善できる
実験概要
赤血球標的化抗体は、マウスのコラーゲンＡｂ誘導関節炎（ＣＡｂＩＡ）モデルにおける治療効能を調べられた（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＩＫら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１４、１９２：５０３１〜５０３８頁。Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＩＫら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１６、１９７：４３９２〜４４０２頁）。
【０１９２】
試薬
・抗ＩＩ型コラーゲンｍＡｂカクテル（ＣＡｂ）、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  カタログ番号５３１００、１０ｍｇ／ｍｌ（ｌｏｔ番号１５０２１１）。
・ＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０１１１：Ｂ４）、Ｃｈｏｎｄｒｅｘ  カタログ番号５３１００、０．５ｍｇ／ｍｌ（ｌｏｔ番号１４０２４３）。
・ラットＩｇＧ２ｂ（アイソタイプ対照）、２．７５ｍｇ／ｍｌ、４．５．１７、ＷＥＨＩ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ。
・ＴＥＲ−１１９、２．００ｍｇ／ｍｌ，４．５．１７、ＷＥＨＩ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ。
【０１９３】
マウス
３０匹の雄のＣ５７ＢＬ／６マウス（７〜８週齢）は、Ｂｉｏ２１  Ａｎｉｍａｌ  Ｆａｃｉｌｉｔｙ，Ｍｅｌｂｏｕｒｎｅ、Ａｕｓｔｒａｌｉａから得られた。マウスは、実験が開始される前に１週間、Ｂｉｏ２１のＣＳＬマウス室で順応させた。
【０１９４】
手順
０日目に、全てのマウスは、抗コラーゲンｍＡｂカクテル（１０ｍｇ／ｍｌ）０．２ｍｌをｉ．ｐ．注射された。３日目に、全てのマウスは、ＬＰＳ（０．５ｍｇ／ｍｌ）０．１ｍｌをｉ．ｐ．注射された。５日目に、関節炎マウスは無作為に処置群に分けられ（表４）、示した試薬の単回ｉ．ｖ．注射を投与された。実験は１２日で終了された。
【０１９５】
関節炎関節の組織学
１２日目に、マウスは屠殺され、足の背面が１０％中性緩衝ホルマリン中で固定され、脱灰され、パラフィン中に包埋された。矢状組織切片は、Ｈ＆Ｅによって染色され、処置群を盲検によりスコア化した。足首関節は、３つの特徴に関して（滲出液−関節腔内の炎症細胞の存在；滑膜炎−滑膜肥厚および炎症細胞浸潤の程度；組織破壊−軟骨および骨びらんおよび侵食）、それぞれ５つ（０−正常、１−最小、２−軽度、３−中等度、４−重度、５−重症）の中から全体的にスコア化し、これらを総計して、１５の中から総スコアを得た。
【０１９６】
【表５】
2021502958.tif 000006
【０１９７】
結果
ＴＥＲ−１１９処置マウスは、注射の２４時間以内に関節炎から完全に保護され、これは１２日目の実験の終わりまで持続された（図４ａ）。
【０１９８】
１２日目のマウスの右足首関節の背面の盲検組織学的スコアリング（アイソタイプ対照、ｎ＝９；ＴＥＲ−１１９、ｎ＝６）は、２つの処置群間で明らかな違いを示した（図４ｂ）。ＴＥＲ−１１９処置した関節は、アイソタイプ対照ｍＡｂ処置した関節炎マウスで見られた炎症および関節組織の破壊の兆候なく見かけでは正常であった。なお、ＴＥＲ−１１９処置群の３匹のマウスは、過度の体重減少により研究の完了前に安楽死させた。
【０１９９】
異なる用量のＴＥＲ−１１９の効果
臨床スコア（図４ＣおよびＤ）および関節での細胞の蓄積（図４Ｅ）への異なる用量のＴＥＲ−１１９（１、１．５、および２ｍｇ／ｋｇ）の効果がアセスメントされた。関節での浸潤細胞の数をアセスメントするため、各マウス由来の膝蓋骨が採取され、消化され、浸潤する白血球が視覚的に数えられた。
【０２００】
１．５および２ｍｇ／ｋｇのＴＥＲ−１１９は、臨床スコアの低減に有効である。全ての用量が、関節の浸潤細胞数を著しく低減した。１ｍｇ／ｋｇの用量のＴＥＲ−１１９は、１．５および２ｍｇ／ｋｇの用量と比較して、ＲＢＣの表面上の著しく少ない結合抗体をもたらし、臨床スコアと相関する（図４Ｆ）。
【０２０１】
ＣＡｂＩＡは、関節においてＣ３およびＣ５ａの増加をもたらし（Ｓｐｉｒｉｇ  Ｒら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１８、２００：２５４２〜２５５３頁）、これらの補体成分ならびにＣ１ｑは、血漿におけるこれらの補体成分で観察される差がなく（図示せず）、関節においてＴＥＲ−１１９によって減少された（図４Ｇ）。
【０２０２】
異なる抗体の効果
コラーゲン抗体カクテル（０日目）およびＬＰＳ（３日目）を注射されたＣ５７ＢＬ／６マウスは、関節炎を発症させ、次いで２ｍｇ／ｋｇのＴＥＲ−１１９、脱グリコシル化ＴＥＲ−１１９（Ｆｃグリカンのない変異体、したがってＦｃ受容体および補体結合を損なう）、Ｍ１／６９またはＩｇＧ２ｂアイソタイプ対照抗体のいずれかを注射され（６日目；処置）、臨床スコアおよび足幅が毎日評価された（図４Ｈ）。２匹のマウスのみがＭ１／６９によって試験された。
【０２０３】
ＴＥＲ−１１９は、赤血球上のグリコホリンＡ複合体に特異的であるが、Ｍ１／６９は、熱安定抗原（ＨＳＡ）、Ｌｙ−５２、またはネクタドリンとしても公知のマウスＣＤ２４と反応し、ホスファチジルイノシトール結合を介して細胞膜にアンカーされた約３５〜４５ｋＤａの糖タンパク質であり、赤血球ならびにリンパ球、顆粒球、胸腺細胞、上皮細胞、神経細胞、および樹状細胞上に発現される抗原である。
【０２０４】
ＴＥＲ−１１９およびＭ１／６９は両方とも、ＩＴＰのマウスモデルで血小板数を増加し得る（Ｓｏｎｇ  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（９）：３７０８〜３７１３頁）。これらの抗体のマウス赤血球との結合を確かめるため、抗体（０〜５１２ｎｇの一次抗体）をＣ５７ＢＬ／６マウス由来の赤血球、続いて二次抗ラットＩｇフィコエリトリンコンジュゲートと反応させ、フローサイトメトリーによってアセスメントした（図４Ｉ参照）。ＴＥＲ−１１９、脱グリコシル化ＴＥＲ−１１９、およびＭ１／６９は、アイソタイプ対照との比較で全ての用量の研究において赤血球に比較的結合した。
【０２０５】
全ての関節炎モデルの臨床スコアは、以下のように割り当てた：０、正常；０．５、指幅に限られた腫れ；１、軽度の足の腫れ；２、明らかな足の腫れ；３、重症の足の腫れおよび／または硬直。
【０２０６】
結論
静脈内のＴＥＲ−１１９は、臨床的および組織学的にアセスメントした場合、確立されたＣＡｂＩＡの遮断に治療的に有効であった。
【実施例６】
【０２０７】
ＴＥＲ−１１９処置は、３４−１−２Ｓ誘導低体温症を著しく防止し得る。
輸血関連急性肺傷害（ＴＲＡＬＩ）は、輸血の最も深刻な合併症の１つである（Ｃｈａｐｍａｎ  ＣＥら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ．２００９；４９（３）：４４０〜４５２頁）。ＳＣＩＤマウスへのＭＨＣクラスＩ抗体（３４−１−２Ｓ）（Ｌｏｏｎｅｙ  ＭＲら、Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．２００６；１１６（６）：１６１５〜１６２３頁）の輸注は、ほぼヒトのＴＲＡＬＩの症状、ＩＴＰおよび関節炎で観察されるものとは異なる症状を示す炎症性疾患を誘導する（Ｆｕｎｇ  ＹＬら、Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１６（１６）：３０７３〜３０７９頁）。本発明者らが近年見出したように、炎症はマウスＴＲＡＬＩのリスクがあり（Ｋａｐｕｒ  Ｒら、Ｂｌｏｏｄ．２０１５；１２６（２５）：２７４７〜２７５１頁）、本発明者らは次に、これらの疾患の誘導を阻害するＴＥＲ−１１９の能力を調べた。
【０２０８】
ＳＣＩＤマウスは、ＴＥＲ−１１９  ４０μｇを注射され（図３Ｅ／Ｆ、白い丸、白い三角）、または２４時間未処置のままにされた（白い丸）。マウスは、次いで３４−１−２Ｓ  ５０μｇを注射され（白い三角、白い四角）または何も注射されなかった（白い丸）。直腸温度は２時間の間３０分毎に測定され（図３Ｅ）、マウスはその後２時間で犠牲にし、肺浮腫をアセスメントした（図３Ｆ）。マウスの直腸温度がモニターされ、３４−１−２Ｓによって誘導される全身性ショックを評価された（Ｆｕｎｇ  ＹＬら、Ｂｌｏｏｄ．２０１０；１１６（１６）：３０７３〜３０７９頁）。ＴＥＲ−１１９のみを注射されたマウスと比較して、３４−１−２Ｓを受けたマウスは、注射後３０分で直腸温度の低下を示し（図３Ｅ）、９０分まで低下し、１２０分の終了点まで安定に維持された。対照的に、３４−１−２Ｓ注射の前にＴＥＲ−１１９の前処置を受けたマウスは、３０分で体温のあまりはっきりしない低下を示し、６０分、９０分、および１２０分で顕著になった（対３４−１−２Ｓのみ）。これらのデータは、ＴＥＲ−１１９処置が３４−１−２Ｓ誘導低体温症を著しく防止し得ることを実証する。
【０２０９】
肺浮腫の検死は、湿／乾（Ｗ／Ｄ）肺重量比によって測定された。ＴＥＲ−１１９による前処置後に３４−１−２Ｓを受けたマウスは、ＴＥＲ−１１９単独で処置されたものと類似の肺Ｗ／Ｄ比を示すが、３４−１−２Ｓのみを注射されたマウスより著しく低く、それらの増加したＷ／Ｄ重量比に基づくＴＲＡＬＩを経験した。したがって、ＴＥＲ−１１９は３４−１−２Ｓ誘導全身性ショックを防止し、肺浮腫を改善し得る。感作されたＲＢＣは、肺（または関節）に移行することが公知ではないため、これは抗ＲＢＣ抗体の抗炎症作用が局所的ではないことを示している。
【実施例７】
【０２１０】
ＴＥＲ−１１９はインビトロ（マウスシステム）での食作用を阻害し得る
ＴＥＲ−１１９はＲＢＣに結合し、ＴＥＲ−１１９オプソニン化ＲＢＣは濃度依存的な様式で貪食される。
【０２１１】
材料および方法
ＲＡＷ２６４．７細胞の調製
Ｒａｗ細胞は、１０％の熱不活性化ＦＢＳを補充した新しいＲＰＭＩ−１６４０中にはがし取ることによって採取され、細胞は、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ  Ｖｉ−Ｃｅｌｌ  ＸＲ、Ｃｅｌｌ  ｖｉａｂｉｌｉｔｙ  Ａｎａｌｙｚｅｒ（シリアル番号ＡＴ０８０６６）を使用して数えられ、５×１０５個の細胞／ｍＬに合わせられた。細胞は、ウェル当たり１ｍＬの細胞調製物を使用してカバースリップのある１２ウェルプレートで培養された。細胞は、３７℃で終夜インキュベートされた。
【０２１２】
血小板および赤血球計数
全血５〜８００μＬが、心臓穿刺を使用して各マウスから得られた。血液はすぐに、１：１（抗凝結緩衝液：ＢＳＧＣ緩衝液）２００μＬと混合され、ＢＳＣＧ緩衝液を使用して最終容積１．５ｍＬに希釈された。各希釈された血液サンプルは、室温で３分間３００ｇで遠心分離され、多血小板血漿（ＰＲＰ）が回収された。残りのサンプルは、ＢＳＧＣ（１．５ｍＬ）中に再懸濁され、再び遠心分離された。ＰＲＰが再び回収され、先のＰＲＰサンプルに添加され、このＰＲＰ混合物は次いで１０分間１２００ｇで遠心分離された。血小板ペレットは、ＢＳＧＣ  １ｍＬに再懸濁され、ＰＲＰ  ５μＬは、ＢＳＧＣ緩衝液で１：２００に希釈され、次いで血小板は、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）フローサイトメーターで計数され、調整物中の血小板の濃度が決定された。
【０２１３】
ＲＢＣは、次いで、ＰＢＳ（１ｍＬ）中に再懸濁され、各サンプルはＰＢＳ中で１：３０００に希釈され、次いでフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  ｆｌｏｗ  ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ  ｓｙｓｔｅｍ）によって分析され血液中の赤血球の濃度が決定された。
【０２１４】
ＣＭＦＤＡ  Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｋｅｒ  Ｇｒｅｅｎによる血小板の標識
血小板は、ＰＲＰ  ５μＬを採取し、ＢＳＧＣ緩衝液（９９５μＬ）中で希釈することによって、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ  ａｎａｌｙｚｅｒ  １０（ＭＡＣＳ  Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）フローサイトメーターを使用して計数された。血小板は、５×１０８個の血小板／ｍＬに合わせられた。ＣＭＦＤＡは、１０μｇ／ｍＬの濃度に調製された。次いで等容積の血小板とＣＭＦＤＡ（例えば血小板１ｍＬとＣＭＦＤＡ  １ｍＬ）とは、最終ＣＭＦＤＡ濃度が５μｇ／ｍＬになるように一緒に混合された。混合物は、暗所で優しく混合しながら３７℃で３０分間インキュベートされた。
【０２１５】
抗ＣＤ４１（Ｍｗｒｅｇ３０）抗体による血小板、および抗ＲＢＣ抗体によるＲＢＣのオプソニン化
ＣＭＦＤＡとのインキュベーション後、血小板は１０分間１２００ｇで遠心分離され、ペレットはＨＢＳＳ（１ｍＬ）中で再懸濁された。Ｍｗｒｅｇ３０抗体は、１０μｇ／ｍＬの濃度で血小板サンプルに添加された。混合物は、優しく混合しながら室温で３０分間インキュベートされた。
【０２１６】
ＲＢＣは、Ｇｕａｖａ  Ｅａｓｙ  Ｃｙｔｅ  Ｍｉｎｉ（シリアル番号２８０００６０１７０）を使用して計数され、５×１０８個のＲＢＣ／ｍＬに合わせられた。選択濃度の抗ＲＢＣ抗体は、ＲＢＣ  １ｍＬに添加された。混合物は、優しく混合しながら室温で１時間インキュベートされた。
【０２１７】
ＲＡＷ２６４．７細胞とのインキュベーション
抗体との１時間のインキュベーション後、ＲＢＣはＰＢＳで洗浄され、８分間３００ｇで遠心分離された。ＲＢＣは再び計数され、１０％熱不活性化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ１６４０を使用して０．４×１０８個のＲＢＣ／ｍＬに合わせられた。血小板はＨＢＳＳによって洗浄され、１０分間１２００ｇで遠心分離された。血小板は再び計数され、１０％熱不活性化ＦＢＳを補充したＲＰＭＩ−１６４０中で３〜５×１０８個の血小板／ｍＬに合わせられた。ＲＢＣおよび血小板を添加するため、上澄み液がＲＡＷ２６４．７細胞から除去され、ウェルあたり血小板調整物１００μｌが添加され（３〜５×１０７個の血小板；比１マクロファージ：１００血小板）、ＲＢＣ調整物２５０μｌが添加された（１０×１０６個のＲＢＣ；比約１マクロファージ：２０血小板）。細胞は、３０分間３７℃でインキュベートされた。
【０２１８】
食作用後調整
食作用は、細胞を氷上に置くことによって停止された。ＲＡＷ２６４．７細胞は、ウェルあたりＨＢＳＳ  ５００μｌ（１μｇ／ｍＬのカルバサイクリン）によって１回洗浄された。残りのＲＢＣは、１．５分間ウェルあたりｄＨ２Ｏ  ０．９ｍＬを添加することによって溶解され、次いで０．１ｍＬのＰＢＳ  １０×が添加され溶解プロセスが停止された。細胞は、ＨＢＳＳ  ５００μｌによってさらに２回洗浄された。最終的に、ＰＢＳ／０．５ｍＭ  ＥＤＴＡ／０．０５％トリプシンの溶液５００μＬが３７℃で５分間ウェルに添加され、あらゆる残りの結合した血小板が除去された。トリプシン／ＥＤＴＡ溶液が除去され、細胞はＨＥＰＥＳ緩衝液を含有するＲＰＭＩ１６４０（５００μＬ）中に置かれた。
【０２１９】
共焦点画像化および食作用係数の算出
ＬＳＭ  ７００  Ｚｅｉｓｓ  Ｃｏｎｆｏｃａｌ顕微鏡を使用して写真が撮られた。ウェルあたり５枚の写真が撮られた（上、下、中央、左、および右）。内部移行した血小板は、ＩＭＡＲＩＳ８．０を使用して計数された。これらの実験での内部移行した血小板の基準は以下である：４．２μＭの最小容積、緑色蛍光、およびｘ、ｙ、およびｚ平面でのマクロファージによる血小板の内部移行。マクロファージは、Ｆｉｊｉ（Ｆｉｊｉはただの画像）細胞計数プログラムを使用して計数された。食作用係数（ＰＩ）は、以下の式を使用して算出された：
ＰＩ＝（移植された血小板の総数／計数されたマクロファージの総数）×１００
【０２２０】
オプソニン化赤血球の免疫蛍光検出
全血５〜８００μＬが、心臓穿刺を使用して各マウスから得られ、血液はすぐに、１：１（抗凝結緩衝液：ＢＳＧＣ緩衝液）２００μＬで希釈され、さらにＢＳＣＧ緩衝液を使用して総容積１．５ｍＬに希釈された。各希釈された血液サンプルは、室温で３分間３００ｇで遠心分離され、多血小板血漿（ＰＲＰ）が除去された。ＲＢＣは、次いでＰＢＳ（１ｍＬ）中に再懸濁され、各サンプルはＰＢＳ中で１：３０００に希釈された。ＲＢＣは、Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅ  Ｍｉｎｉ（シリアル番号２８０００６０１７０）を使用して計数され、５×１０８個のＲＢＣ／ｍＬに合わせられた。抗体あたりＲＢＣ  １ｍＬが使用された。抗体は、示した濃度でＲＢＣ懸濁液に添加された。混合物は、優しく混合しながら３７℃で１時間インキュベートされた。インキュベーション後、ＲＢＣは洗浄され、１０８個のＲＢＣ／ｍＬに再調整され、サンプル１００μＬが５ｍＬのフローサイトメトリーチューブに添加され、室温で３０分間適切な種特異的Ｒ−ＰＥコンジュゲート二次抗体（１：２００）の調製物（１００μＬ）中でインキュベートされた。最終洗浄が実施され、未結合の抗体が除去された。サンプルは、次いでフローサイトメトリー（Ｇｕａｖａ  ＥａｓｙＣｙｔｅフローサイトメトリーシステム）によって分析され、抗体−オプソニン化赤血球の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が決定された。
【０２２１】
結果
マウスＲＢＣは、室温で４５分間、様々な濃度のＴＥＲ−１１９抗体とインキュベートされ、洗浄され、次いで３７℃および５％  ＣＯ２で３０分間、ＲＡＷマクロファージに添加された。インキュベーション後、残りのＲＢＣは、２分間Ｈ２Ｏによって溶解され、ＲＡＷ細胞は、位相差顕微鏡で可視化される前に４％ＰＦＡによって固定された。マクロファージおよび内部移行したＲＢＣが計数され、食作用係数が算出された。ＴＥＲ−１１９は、１．２５μｇ／ｍＬと同じくらい低い濃度での食作用のためＲＢＣをオプソニン化できた（図５）。最大ＲＢＣ食作用（すなわちプラトー）は、≧５μｇ／ｍＬで達成された（図５）。
【０２２２】
さらに、共焦点顕微鏡手法を使用して、ＴＥＲ−１１９オプソニン化ＲＢＣがインビトロで血小板食作用を防止することが実証された（データは示さない）。ＴＥＲ−１１９によってオプソニン化されたＲＢＣは、ＲＡＷ２６４．７細胞によるＣＭＦＤＡ標識された血小板の取込みを著しく阻害したが、対照ＲＢＣは取込みに影響しなかった（データは示さない）。食作用係数の算出は、ＴＥＲ−１１９オプソニン化ＲＢＣがおよそ７５％まで血小板食作用を低減できたことを確認した（図６）。
【０２２３】
異なる抗体は、食作用の阻害に異なる能力を有する。正常なマウスからの赤血球は、非オプソニン化または１時間、抗体ＴＥＲ−１１９、脱グリコシル化ＴＥＲ−１１９、３４−３Ｃ（５または４０μｇ）、またはＭ１／６９によるオプソニン化のいずれかであり、次いで３０分間ＲＡＷ２６４．７細胞およびＭＷＲｅｇ３０オプソニン化ＣＭＦＤＡ標識血小板とインキュベートされた。試験した抗体の反応性は、表５、以下、および図７に示す。細胞は、共焦点顕微鏡によって可視化され、内部移行した血小板はＩｍａｒｉｓ  ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖｅｒｓｉｏｎ  ８．０．２によって計数された。ＴＥＲ−１１９、３４−３Ｃ、およびＭ１／６９のみが、インビトロでの血小板食作用を著しく阻害できた（Ｐ＜０．０５）。（群あたりｎ＝４〜６）。
【０２２４】
血小板食作用を阻害する抗赤血球抗体コートＲＢＣの能力。
【０２２５】
【表６】
2021502958.tif 000007
【実施例８】
【０２２６】
赤血球標的化抗体のＭＧを改善する能力の試験
マウス（Ｃ５７Ｂｌ／６、８〜１０週齢）は、０、２８、および５６日目に完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）でのゴマフシビレエイ（ｔｏｒｐｅｄｏ  ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ）（Ｔ−ＡＣｈＲ）から抽出および精製されたアセチルコリン受容体２０〜４０μｇによって免疫された。ＣＦＡ対照群も含まれた。免疫は、４つの部位で皮下に実施された。最初の注射は、２つの背面の足蹠および肩甲骨で実施され、続いて、肩甲骨および太腿に注射された（Ｗｕ  Ｂら、Ｃｕｒｒ  Ｐｒｏｔｏｃ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００１；Ｃｈａｐｔｅｒ  １５：ｕｎｉｔ  ８）。
【０２２７】
マウスは、握力（筋力低下の客観測定として）または逆懸垂中の時間を測定することによって全身筋力低下の発症をスクリーニングされた。筋力低下は、運動後にも測定された。この目的のため、マウスは平らなプラットフォーム上に置かれ、筋力低下が観察された。次いで、しっぽの付け根を持って吊り下げながら、マウスを、繰り返しケージ上部の格子を横切って優しく引っ張り、その間、格子をつかもうとさせることによって運動させた（２０〜３０分）。それらは、２分間平らなプラットフォーム上に置かれ、筋力低下の兆候が再び観察された。臨床的な筋力低下は以下のように段階分けされる：段階０、正常な姿勢のマウス；段階１、休止時には正常であるが、筋力低下が背むし様の姿勢、運動性の制限、および運動後頭を上げる困難によって特徴的に示される；段階２、観察期間中、運動せずに段階１の症状；段階３、段階２の低下をともなう脱水および瀕死の状態。
【０２２８】
多くのマウスが段階１〜３の低下を実証する場合、Ｔ−ＡＣｈＲに特異的な抗体（ＩｇＧ２ｂ）が決定された。
【０２２９】
段階１〜３の低下を実証するマウスおよび著しく陽性のＴ−ＡＣｈＲ特異的ＩｇＧ２ｂ抗体は以下の群に無作為化された：
１．アイソタイプ対照による処置
２．抗ＴＥＲ−１１９抗体による処置
３．抗グリコホリンＡ抗体による処置
【０２３０】
マウスは、単一用量のＡｂ、例えば２ｍｇ／ｋｇ、ｉｖのいずれかを注射された。用量は、０．１ｍｇ／ｋｇ〜２ｍｇ／ｋｇの間であってもよい。抗体は、腹腔内または皮下に投与されてもよい。
【０２３１】
臨床スコアおよび筋力低下は、抗体の投与後１ヵ月の全期間、週に２回決定された。実験の終了時の血清、筋肉（すなわち三頭筋）および胴体は、個々のマウスから凍結された。Ｔ−ＡＣｈＲ特異的ＩｇＧ２ｂ抗体の力価は、血清中で決定され、組織は補体沈着（Ｃ３およびＣ５ｂ−Ｃ９）の免疫組織学によって分析された。
【実施例９】
【０２３２】
ＮＭＯにおける赤血球標的化抗体の試験
体重が一致した雌のＳｐｒａｇｕｅ  Ｄａｗｌｅｙラット（２５０〜３００ｇ、９〜１２週齢）は、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）を使用して麻酔され、次いで定位固定のフレーム上にのせた。頭皮正中切開後、十字縫合の０．５ｍｍ前方および３．５ｍｍ側方に直径１ｍｍの穿頭孔を生じさせた。直径４０μｍのガラス針が５ｍｍの深さまで挿入され、加圧注入によって１０分間にわたり総容積３〜６μＬで３０または４０μｇの組換え抗ＡＱＰ４−ＩｇＧを脳内に輸注した。同じ日に、ラットは０．１〜２ｍｇ／ｋｇ、ｉ．ｐ．の単回用量の１）抗ＴＥＲ−１１９抗体または２）アイソタイプ対照で処置された。５日目に、ラットは深く麻酔され、ヘパリン添加したＰＢＳ  ２００ｍｌ、次いで１００ｍｌのＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）によって左室を通って経心臓的に灌流された。脳は、４％ＰＦＡ中で固定され、３０％スクロース中、４℃で終夜置かれ、ＯＣＴに包埋された。固定された脳は凍結され、切片にされ（厚さ１０μｍ）、ＡＱＰ４（１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、ＧＦＡＰ（１：１００、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）（１：２００、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、イオン化カルシウム結合アダプター分子−１（Ｉｂａ１；１：１０００；Ｗａｋｏ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、ＶＡ）、Ｃ５ｂ−９（１：５０、Ｈｙｃｕｌｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｕｄｅｎ、Ｔｈｅ  Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ）またはＣＤ４５（１：１０、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）に対する一次抗体との終夜のインキュベーション（４℃）、続く適切な蛍光二次抗体（１：２００、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）の前に遮断溶液（ＰＢＳ、１％ウシ血清アルブミン、０．２％  ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）中で１時間インキュベートされた。切片は、Ｌｅｉｃａ蛍光顕微鏡で可視化するためＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Ｖｅｃｔｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ、ＣＡ）によってマウントされた。ＮＭＯ病理学は、ＡＱＰ４およびミエリン欠損および補体沈着によってアセスメントされた。
【実施例１０】
【０２３３】
インビトロヒトシステムにおけるＦｃγＲ機能を阻害する赤血球標的化抗体の能力を試験する
ＦｃγＲ機能は、例えば免疫グロブリン被覆粒子のＦｃγＲ媒介取込みを含む。抗ＲＢＣ抗体および赤血球の免疫複合体は、抗体単独よりもＦｃγ受容体の遮断により有効であると考えられ、抗炎症／免疫抑制の一般的な状態をもたらすと考えられる。この効果は、おそらくＲＢＣ表面上の抗原の密度および試験した抗体のアイソタイプに依存する。異なる抗ＲＢＣ抗体の効果を調べるため、ＦｃγＲ発現細胞様ＴＨＰ１細胞またはヒト単核球／マクロファージはＲＢＣ−抗ＲＢＣ抗体複合体とインキュベートされ、続いてＦｃγＲ発現細胞のＩｇＧ被覆粒子または細菌を食作用する能力が測定された。ＲＢＣ抗体複合体が細胞の表面上のＦｃγＲを遮断する場合、ＦｃγＲ媒介取込みは低減された。（実験は、Ｔｒｉｄａｎｄａｐａｎｉら、Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ．２００２；２７７（７）：５０８２〜９頁；Ｎａｇｅｌｋｅｒｋｅ  ＳＱ  ら、Ｂｌｏｏｄ．２０１４；１２４（２５）：３７０９〜１８頁；Ｃｏｏｐａｍａｈ  ＭＤら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０２（８）：２８６２〜７頁から適用された）。
【０２３４】
抗ＲＢＣ抗体と赤血球の免疫複合体は、それら自身による食作用を誘導した（マウスシステムと類似）が、このメカニズムによる他の粒子および細菌の食作用も阻害した。
【実施例１１】
【０２３５】
ヒトシステムのインビトロでのＦｃγＲ表面発現を阻害する赤血球標的化抗体の能力を試験する
ＦｃγＲへ結合する、およびそれによりＦｃγＲ機能、例えば、ＦｃγＲ媒介食作用を遮断する抗ＲＢＣ抗体と赤血球の免疫複合体の上記のメカニズムに則して、ＦｃγＲ発現自体も影響されると考えられる。細胞表面上でのＦｃγＲ発現へのＲＢＣ−抗ＲＢＣ抗体複合体の効果を調べるため、ＴＨＰ１細胞またはヒト単核球／マクロファージは複合体とインキュベートされ、ＦｃγＲ発現がＦＡＣＳによって経時的にアセスメントされた。ＣＤ６４、ＣＤ３２ａおよびＣＤ１６を含む活性化ＦｃγＲは、下方制御されると考えられたが、阻害受容体ＣＤ３２ｂはむしろ上方制御された（実験は、Ｓｏｎｇ  Ｓ．ら、Ｂｌｏｏｄ．２００３；１０１（９）：３７０８〜３７１３頁から適用された。）。
【実施例１２】
【０２３６】
マウスＩｇＧ変異体に変換されたＴＥＲ−１１９抗体は、コラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を改善した
抗体または血清を含む疾患の輸注によらないＢ細胞およびＴ細胞依存性慢性疾患モデルにおける疾患改善活性を調べるため、ＣＩＡにおける治療応答がアセスメントされた。さらに、ＴＥＲ−１１９のマウスバージョンをアセスメントするため、ラットＩｇＧ２ｂ定常領域がマウスＩｇＧ１およびＩｇＧ２ａと置き換えられた。２ｍｇ／ｋｇのこれらの抗体のそれぞれが、上記のように２８日間ＩＩ型コラーゲンによって事前免疫されたＤＢＡ／１マウスの異なる群に注射された（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＩＫら、Ｊ  Ｌｅｕｋ  Ｂｉｏｌ  ２０００；６８：１４４〜５０頁）。簡単に述べると、ＤＢＡ−１マウスは、２１日間隔で完全フロイントアジュバント中のトリコラーゲンを注射され、７日後、ｉ．ｖ．経路によって２ｍｇ／ｋｇのアイソタイプ変換（マウスＩｇＧ１、マウスＩｇＧ２ａ）ＴＥＲ−１１９により処置され、臨床スコアがアセスメントされた。
【０２３７】
両マウスＩｇＧサブタイプは、注射の１日以内に関節炎マウスの臨床スコアを減少でき、改善効果は丸１週間持続し、その後関節炎に戻った（図８）。したがって、疾患の改善は単なる抗体誘導関節炎モデルを超えて広がる。ＣＩＡモデルは記載したように実施された（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＩＫら、Ｊ  Ｌｅｕｋ  Ｂｉｏｌ  ２０００；６８：１４４〜５０頁）。
【実施例１３】
【０２３８】
３４−３Ｃは、コラーゲン抗体誘導関節炎ＣＡｂＩＡモデルにおける炎症性関節炎を改善できる
本発明者らは、赤血球上のＢａｎｄ３抗原を標的とする３４−３Ｃ  ｍＡｂの、マウスのＣＡｂＩＡモデルで確立された関節炎疾患を改善する能力も試験した。０日目、全てのマウスは、抗コラーゲンｍＡｂカクテル０．２ｍｌ（１０ｍｇ／ｍｌ）をｉ．ｐ．注射された。３日目、全てのマウスは、ＬＰＳ  ０．１ｍＬ（０．５ｍｇ／ｍｌ）をｉ．ｐ．注射された。５日目、関節炎マウスは、処置群に無作為に分配され、２ｍｇ／ｋｇ  ３４−３Ｃ（図９、黒い四角）または陰性対照としてＰＢＳ（黒い丸）を単回ｉ．ｖ．注射された。実験は１２日目に終了された。対照としてＰＢＳによって処置されたマウスは、時間と共に疾患の重症度を増加し、８日目に最大に達した（臨床スコア）。比較すると、ＲＢＣ抗体３４−３Ｃ（マウスＩｇＧ２ａ、Ｌｅｄｄｙ  ＪＰ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１９９３；９１：１６７２〜１６８０頁）を受けるマウスは、臨床スコアの著しい低減を示した。これらのデータは、３４−３Ｃ  ｍＡｂが確立された関節炎を回復し得ることを実証した。
【図１】
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【図２−１】
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【図２−２】
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【図３】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図４−６】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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