(57)【要約】  本開示は、試料中の核酸標的の多重増幅および検出のための装置および方法を説明する。本開示の実施形態は、チップの装填、垂直配置、およびクランプを提供するように構成された機械システムと、チップの異なる温度を維持するように構成された熱制御システムと、光学蛍光イメージングシステムと、を含む。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の核酸標的の多重増幅および検出のための装置であって、
チップの装填、垂直配置、およびクランプを提供するように構成された、機械システムと、
前記チップの第１の温度および前記チップの第２の温度を維持するように構成された、熱制御システムであって、前記第１の温度が、前記第２の温度とは異なる、熱制御システムと、
少なくとも４０ピクセル×４０ピクセルのアレイ内の空間情報を収集するように構成された、光学蛍光イメージングシステムと、
前記機械システム、前記熱制御システム、および前記光学蛍光イメージングシステムに電気エネルギーを提供するように構成された、電力システムと、
前記機械システム、前記熱制御システム、前記電力システム、および前記光学イメージングシステムの動作を制御するように構成された、コントローラと、
ユーザがユーザインターフェースソフトウェアを介して前記制御システムを操作できるように構成された、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）と
を含む、装置。
【請求項２】
前記チップが、１０ｍｍ〜３２０ｍｍの高さ、１０ｍｍ〜３２０ｍｍの幅、および０．５ｍｍ〜１０ｍｍの厚さを有する、請求項１または２に記載の装置。
【請求項３】
前記ＧＵＩが、タッチスクリーンインターフェースである、前記請求項のいずれか一項に記載の装置。
【請求項４】
前記タッチスクリーンインターフェースが、スマートフォンに組み込まれている、請求項３に記載の装置。
【請求項５】
前記機械システムが、チップホルダ、フレーム、摺動構成要素、および支持構成要素を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の装置。
【請求項６】
前記チップホルダが、挿入スロット、位置決めスロット、およびモーション制御セットを含む、請求項５に記載の装置。
【請求項７】
前記フレームが、ベース、主構造キャリア、プレスバーロケータ、プレスバー、およびモーション制御セットを含む、請求項５に記載の装置。
【請求項８】
前記モーション制御セットが、電動可動構成要素およびそのホルダを含む、請求項７に記載の装置。
【請求項９】
前記電動可動構成要素が、リニアアクチュエータまたはステップモータを含む、請求項８に記載の装置。
【請求項１０】
前記摺動構成要素が、摺動プラットフォームおよび摺動バーを含む、請求項５に記載の装置。
【請求項１１】
前記支持構成要素が、レールスタンドを含む、請求項５に記載の装置。
【請求項１２】
前記熱制御システムが、複数の温度センサ、複数の熱ブロック、および熱源を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の装置。
【請求項１３】
前記複数の温度センサが、抵抗温度検出器（ＲＴＤ）、サーミスタ、熱電対、またはＩＲセンサを含む、請求項１２に記載の装置。
【請求項１４】
前記複数の温度センサのうちの1つの温度センサが、加熱ブロックに埋め込まれている、請求項１２に記載の装置。
【請求項１５】
前記複数の温度センサのうちの1つの温度センサが、前記複数の加熱ブロックのうちの1つの加熱ブロックの表面に結合されている、請求項１２に記載の装置。
【請求項１６】
前記複数の加熱ブロックが、アルミニウム、ステンレス鋼、または真鍮を含む、請求項１２に記載の装置。
【請求項１７】
前記複数の加熱ブロックが、集合的に、チャンバの総表面積の少なくとも５０パーセントに接触する、請求項１２に記載の装置。
【請求項１８】
前記熱源が、接着性の可撓性ヒータ、加熱プローブ、または加熱ワイヤを含む、請求項１２に記載の装置。
【請求項１９】
前記蛍光イメージングシステムが、光源、光学モジュール、および少なくとも４０×４０ピクセルを有する検出器を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２０】
前記検出器が、カメラである、請求項１９に記載の装置。
【請求項２１】
前記カメラが、科学的カメラまたはスマートフォンカメラを含む、請求項２０に記載の装置。
【請求項２２】
前記光源が、アークランプ、蒸気ランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、またはレーザを含む、請求項１９に記載の装置。
【請求項２３】
前記光学モジュールが、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、ビームスプリッタ、発光フィルタ、フラットミラー、対物レンズ、および／または光学レンズを含む、請求項１９に記載の装置。
【請求項２４】
前記機械システムが、１つ以上のプラスチックを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２５】
前記機械システムが、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、アセトニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、またはセラミックを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２６】
前記電力システムが、ＡＣ／ＤＣ電源、ＭＯＳＦＥＴ、スイッチ、増幅器、ダイオード、トランジスタ、および抵抗器を含む、前記請求項のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２７】
前記コントローラが、マイクロコントローラおよび／またはＰＩＤコントローラを含む、前記請求項のいずれか一項に記載の装置。
【請求項２８】
前記マイクロコントローラが、ラズベリーパイ、アルドゥイーノ、またはジェヌイーノを含む、請求項２７に記載の装置。
【請求項２９】
請求項１に記載の前記装置を使用してチップ内の試料を分析するための方法であって、
前記装置にチップを装填することと、
前記機械システムを操作して、第１の加熱ブロックと第２の加熱ブロックとの間に前記チップをクランプすることと、
前記第１の加熱ブロックを第１の温度に加熱することと、
前記第２の加熱ブロックを第２の温度に加熱することであって、前記第２の温度が、前記第１の温度とは異なる、加熱することと、
光源からの励起光を前記チップの表面に向けることと、
前記チップからの放出光を検出することと、
前記チップからの前記放出光を分析することと
を含む、方法。
【請求項３０】
前記チップから放出された前記光の分析を文書化するデータレポートを生成することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記第１の加熱ブロックと前記第２の加熱ブロックとの間から前記チップをクランプ解除することをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３２】
前記装置から前記チップをアンロードすることをさらに含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３３】
前記チップを装填することが、直線移動のためにモータを操作することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３４】
前記チップを装填することが、前記チップを前記装置に引き込むように構成された機構を操作することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３５】
前記チップをクランプすることが、セルフロックモータ、カムフォロアの組み合わせ、またはバネを備えた機構を操作することを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３６】
動作中、前記第１の温度が、７５℃〜１０５℃に維持される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３７】
動作中、前記第２の温度が、３０℃〜７５℃に維持される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１および第２の温度が、温度センサからのフィードバックに基づいて熱源電力を変更するマイクロコントローラプログラムによって制御される、請求項２９に記載の方法。
【請求項３９】
前記第１および第２の温度が、比例積分微分（ＰＩＤ）コントローラによって制御される、請求項２９に記載の方法。
【請求項４０】
第１の温度センサが、前記第１の熱ブロックに埋め込まれている、請求項２９に記載の方法。
【請求項４１】
第２の温度センサが、前記第２の熱ブロックに埋め込まれている、請求項２９に記載の方法。
【請求項４２】
前記第１の温度センサが、前記第１の熱ブロックの表面に結合されている、請求項２９に記載の方法。
【請求項４３】
前記第２の温度センサが、前記第２の熱ブロックの表面に結合されている、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記励起光源が、前記チップの表面に対して３０°〜９０°の角度を形成する、請求項２９に記載の方法。
【請求項４５】
前記チップからの放出光を検出することが、カメラを操作して、２分ごとに１画像以上の頻度で連続的に画像を取得することを含む、請求項２９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月１４日に出願された米国特許出願仮第６２／７３１，４９５号の優先権を主張し、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
背景
本発明は、米国国立衛生研究所および国立癌研究所によって授与された助成金番号Ｒ０１ＣＡ２０３９６４の下で政府の支援を受けてなされた。米国政府は本発明において一定の権利を有する。
【０００３】
Ａ．分野
本開示は、対流加熱および無標識マイクロアレイを用いたＤＮＡの多重増幅および検出のための装置および方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
Ｂ．関連技術
政府機関、病院、診療所、および民間の消費者において、迅速かつ多重化されたＤＮＡ診断に対する強い市場需要がある。現在の市販のｑＰＣＲシステムは大型で高価なものであり、さらに、４〜６個の対象のＤＮＡマーカー（４〜６プレックス）の同時検出に限定されている。単一のＤＮＡ試料のクローズドチューブ２０プレックス分析を可能にする市販のｑＰＣＲシステムの例として、ＬｕｍｉｎｅｘのｘＴａｇおよびＢｉｏｆｉｒｅのＦｉｌｍＡｒｒａｙの２つがある。どちらのシステムも、大型で（＞２０ｋｇ）高価な（＞＄５０，０００）機器を必要とするものであり、ポイントオブケアアプリケーションには適していない。Ａｌｅｒｅ  ｉ  Ｉｎｆｌｕｅｎｚａアッセイなどの等温ＤＮＡ増幅法は、大型または複雑な機器を必要としないが、３プレックスに制限されている。また、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）は、非常に高度なＤＮＡのマルチプレックス分析を可能にするが、多大な労力を要するライブラリ調製ワークフロー（１２時間以上）および長時間のシーケンシング実行（２４時間以上）を必要とする。これらの労力と時間を要するという特性から、ＮＧＳは、ポイントオブケアアプリケーションとして実用的ではない。これらの多重化能力および機器の価格／携帯性に基づく様々なプラットフォームの比較を図１に示す。本発明に関連する実施形態（以下でより詳細に論じられる「ドーナツ式ＰＣＲ」プラットフォームとして説明される）は、低価格で携帯可能な機器を用いて高度に多重化されたＤＮＡ試験を独自に可能にするものである。
【０００５】
国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２４５３号（特許文献１）およびＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０１７／１７２７６０号（‘７６０号公開）（特許文献２）は、係属中の出願の発明者によって開発されたシステムおよび方法を開示しており、ポイントオブケア設定において高度に多重化されたＤＮＡ分析を可能にするものである。‘７６０号公開に開示されたシステムは、実施形態の円形の性質に関連して、本明細書では「ドーナツ式ＰＣＲシステム」（または同様の用語）と称される。‘７６０号公開は、ドーナツ式ＰＣＲ消耗チップ、流体反応チャンバの内面へのプローブの共有結合の方法、増幅プライマーを含むＰＣＲ試薬、および検出プローブの設計を開示している。‘７６０号公開では、ＰＣＲ増幅、マイクロアレイ蛍光イメージング、画像分析、およびデータ解釈を実行するために、一部の異なる機器が使用された。さらに、アッセイの実行には、多数の手動介入ステップが必要であった。ここでは、全ての機械的、熱的、光学的、およびユーザインターフェース構成要素を組み込んだ単一の統合機器が開示され、ＤＮＡサンプルインアンサーアウト型のプラットフォームを可能としている。
【０００６】
ドーナツ式ＰＣＲシステムの高度に多重化された携帯性により、これまで非充足であったニーズが独自に充足された分野として、少なくとも３つのアプリケーション分野があると考えられる。すなわち、（１）家庭および薬局における感染症の検出とサブタイピング、（２）病院のベッドサイドでの院内感染の分析、および（３）フィールドでの農業および獣医の遺伝子プロファイリングおよび疾病検出アプリケーションである。
【０００７】
前述のように、‘７６０号公開は、ドーナツ式ＰＣＲアッセイおよび消耗品チップを開示している。本明細書で使用される場合、「チップ」という用語は、‘７６０号公開に記載されているような対流流体デバイスを含む。機器のうちの一部の必要な構成要素が説明されているが、‘７６０号公開には、チップの初期装填を過ぎても手動の介入が不要な、完全に統合されたドーナツ式ＰＣＲ機器については記載されていない。特に、ドーナツ式ＰＣＲチップを装填し、チップをヒータに自動クランプして良好な熱接触を形成するために必要な機械的構成要素について記載されていない。さらに、‘７６０号公開は、蛍光顕微鏡を使用することについて説明するものであり、スタンドアロンの読み出しデバイスに必要な光学構成要素（フィルタ、レンズ、ミラー）については記載されていない。結果として、本発明は、‘７６０号公開に対して新規性および進歩性を有する。
【０００８】
多数の定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）機器がＡｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社、Ｂｉｏ−Ｒａｄ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、Ｑｉａｇｅｎ社、Ｃｅｐｈｅｉｄ社、Ｒｏｃｈｅ社などの企業によって発明および商品化されている。これらのｑＰＣＲ機器は全て、アクティブな冷却機構を備えており、電力を大量に消費する。さらに、これらのｑＰＣＲ機器はいずれも、高プレックスの読み出しを実現するために必要な蛍光スポットの画像取得に、ピクセル解像度１００μｍ未満のカメラを利用していない。結果として、本発明は、過去のｑＰＣＲ機器に対して新規性および進歩性を有する。
【０００９】
対流式ＰＣＲは、２００２年に学術文献で報告されており、２つのヒータを異なる温度で利用している。ただし、報告された対流式ＰＣＲ機器は、高プレックスＤＮＡ分析用のマイクロアレイを統合していないため、対流式ＰＣＲ機器において、高プレックス読み出しに必要な蛍光スポットの画像取得にピクセル解像度１００μｍ以下のカメラを使用しているものは報告されていない。結果として、本発明は、過去の対流式ＰＣＲ機器に対して新規性および進歩性を有する。
【００１０】
マイクロアレイは、特定のプローブの空間的分離を使用して、ＤＮＡ分析のための高プレックス読み出しを実現する。ただし、市販のマイクロアレイは、アクティブな流体装置（ポンプなど）および／または手動洗浄を使用して、非結合標識試薬またはアンプリコンを除去するため、汚染されやすいオープンなシステムとなっている。対照的に、本発明では、ドーナツ式ＰＣＲチップに埋め込まれたマイクロアレイは、垂直に取り付けられ、２つの別個のヒータを使用して９５℃および６０℃に示差的に加熱される。結果として、本発明は、過去のマイクロアレイ技術に対して新規性および進歩性を有する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１１】
【特許文献１】国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０２４５３号
【特許文献２】ＰＣＴ特許出願公開ＷＯ２０１７／１７２７６０号
【発明の概要】
【００１２】
概要
簡潔に言えば、本開示は、生体試料中の核酸標的の多重増幅および検出のための装置および方法を提供する。本開示の実施形態は、チップの装填、垂直配置、およびクランプを提供するように構成された機械システムと、チップの異なる温度を維持するように構成された熱制御システムと、光学蛍光イメージングシステムと、を含む。
【００１３】
特定の実施形態は、試料中の核酸標的の多重増幅および検出のための装置を含み、装置は、チップの装填、垂直配置、およびクランプを提供するように構成された機械システムと、チップの第１の温度およびチップの第２の温度を維持するように構成された熱制御システムであって、第１の温度が、第２の温度とは異なる、熱制御システムと、少なくとも４０ピクセル×４０ピクセルのアレイ内の空間情報を収集するように構成された光学蛍光イメージングシステムと、機械システム、熱制御システム、および光学蛍光イメージングシステムに電気エネルギーを提供するように構成された電力システムと、機械システム、熱制御システム、電力システム、および光学イメージングシステムの動作を制御するように構成されたコントローラと、ユーザがユーザインターフェースソフトウェアを介して制御システムを操作できるように構成されたグラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）と、を含む。
【００１４】
特定の実施形態では、チップは、１０ｍｍ〜３２０ｍｍの高さ、１０ｍｍ〜３２０ｍｍの幅、および０．５ｍｍ〜１０ｍｍの厚さを有する。一部の実施形態では、ＧＵＩはタッチスクリーンインターフェースである。特定の実施形態では、タッチスクリーンインターフェースはスマートフォンに組み込まれている。特定の実施形態では、機械システムは、チップホルダ、フレーム、摺動構成要素、および支持構成要素を含む。特定の実施形態では、チップホルダは、挿入スロット、位置決めスロット、およびモーション制御セットを含む。一部の実施形態では、フレームは、ベース、主構造キャリア、プレスバーロケータ、プレスバー、およびモーション制御セットを含む。特定の実施形態では、モーション制御セットは、電動可動構成要素およびそのホルダを含む。
【００１５】
特定の実施形態では、電動可動構成要素は、リニアアクチュエータまたはステップモータを含む。特定の実施形態では、摺動構成要素は、摺動プラットフォームおよび摺動バーを含む。一部の実施形態では、支持構成要素は、レールスタンドを含む。特定の実施形態では、熱制御システムは、複数の温度センサ、複数の熱ブロック、および熱源を含む。特定の実施形態では、複数の温度センサは、抵抗温度検出器（ＲＴＤ）、サーミスタ、熱電対、またはＩＲセンサを含む。特定の実施形態では、複数の温度センサのうちの1つの温度センサは、加熱ブロックに埋め込まれている。一部の実施形態では、複数の温度センサのうちの1つの温度センサは、複数の加熱ブロックのうちの1つの加熱ブロックの表面に結合されている。特定の実施形態では、複数の加熱ブロックは、アルミニウム、ステンレス鋼、または真鍮を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、複数の加熱ブロックは、集合的に、チャンバの総表面積の少なくとも５０パーセントに接触する。特定の実施形態では、熱源は、接着性の可撓性ヒータ、加熱プローブ、または加熱ワイヤを含む。一部の実施形態では、蛍光イメージングシステムは、光源、光学モジュール、および少なくとも４０×４０ピクセルを有する検出器を含む。特定の実施形態では、検出器はカメラである。特定の実施形態では、カメラは、科学的カメラまたはスマートフォンカメラを含む。特定の実施形態では、光源は、アークランプ、蒸気ランプ、発光ダイオード（ＬＥＤ）、またはレーザを含む。一部の実施形態では、光学モジュールは、励起フィルタ、ダイクロイックミラー、ビームスプリッタ、発光フィルタ、フラットミラー、対物レンズ、および／または光学レンズを含む。特定の実施形態では、機械システムは、１つ以上のプラスチックを含む。特定の実施形態では、機械システムは、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、アセトニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）、またはセラミックを含む。特定の実施形態では、電力システムは、ＡＣ／ＤＣ電源、ＭＯＳＦＥＴ、スイッチ、増幅器、ダイオード、トランジスタ、および抵抗器を含む。一部の実施形態では、コントローラは、マイクロコントローラおよび／またはＰＩＤコントローラを含む。特定の実施形態では、マイクロコントローラは、ラズベリーパイ、アルドゥイーノ、またはジェヌイーノを含む。
【００１７】
特定の実施形態は、本明細書に記載の装置（例えば、請求項１に記載の装置を含む）を使用して、チップ内の試料を分析するための方法を含む。特定の実施形態では、本方法は、装置にチップを装填することと、機械システムを操作して、第１の加熱ブロックと第２の加熱ブロックとの間にチップをクランプすることと、第１の加熱ブロックを第１の温度に加熱することと、第２の加熱ブロックを第２の温度に加熱することであって、第２の温度が、第１の温度とは異なる、加熱することと、光源からの励起光をチップの表面に向けることと、チップからの放出光を検出することと、チップからの放出光を分析することと、を含む。
【００１８】
一部の実施形態は、チップからの放出光の分析を文書化するデータレポートを生成することをさらに含む。特定の実施形態は、第１の加熱ブロックと第２の加熱ブロックとの間からチップをクランプ解除することをさらに含む。特定の実施形態は、装置からチップをアンロードすることをさらに含む。特定の実施形態では、チップを装填することは、直線移動のためにモータを操作することを含む。一部の実施形態では、チップを装填することは、チップを装置に引き込むように構成された機構を操作することを含む。特定の実施形態では、チップをクランプすることは、セルフロックモータ、カムフォロアの組み合わせ、またはバネを備えた機構を操作することを含む。
【００１９】
特定の実施形態では、第１の温度は、動作中、７５℃〜１０５℃に維持される。特定の実施形態では、第２の温度は、動作中、３０℃〜７５℃に維持される。一部の実施形態では、第１および第２の温度は、温度センサからのフィードバックに基づいて熱源電力を変更するマイクロコントローラプログラムによって制御される。特定の実施形態では、第１および第２の温度は、比例積分微分（ＰＩＤ）コントローラによって制御される。特定の実施形態では、第１の温度センサは、第１の加熱ブロックに埋め込まれている。特定の実施形態では、第２の温度センサは、第２の熱ブロックに埋め込まれている。特定の実施形態では、第１の温度センサは、第１の加熱ブロックの表面に結合されている。一部の実施形態では、第２の温度センサは、第２の加熱ブロックの表面に結合されている。特定の実施形態では、励起光源は、チップの表面に対して３０°〜９０°の角度を形成する。特定の実施形態では、チップからの放出光を検出することは、カメラを操作して、２分ごとに１画像以上の頻度で画像を連続的に取得することを含む。
【００２０】
本発明の方法、組成物、キット、およびシステムのいずれかの任意の実施形態は、記載されたステップおよび／または特徴から構成されるか、または本質的にそれらから構成され（含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）／含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）／含有する／有する）てもよい。したがって、請求項のいずれにおいても、「から構成される」または「から本質的に構成される」という用語を、上述のオープンエンドリンク動詞のいずれかに置き換えて、オープンエンドリンク動詞を使用した場合とは異なる請求項の範囲を変更することができる。
【００２１】
特許請求の範囲における「または」という用語の使用は、代替物のみを指すように明示的に示されない限り、または代替物が相互に排他的である場合を除き、「および／または」を意味するために使用されるが、本開示は代替物ならびに「および／または」のみを参照する定義をサポートするものである。
【００２２】
本出願全体を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために使用されているデバイスまたは方法の誤差の標準偏差を含むことを示すために使用される。
【００２３】
長年の特許法に従い、クレームまたは明細書で「含む」という単語と組み合わせて使用される場合、「ａ」および「ａｎ」という単語は、特に明記しない限り、１つ以上を示す。
【００２４】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。ただし、本発明の精神と範囲内での様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるため、詳細な説明と具体的な実施例は、本発明の特定の実施形態を示す一方で、例示としてのみ与えられることを理解されたい。
【図面の簡単な説明】
【００２５】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の態様をさらに実証するために含まれている。本発明は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。特許または出願ファイルには、カラーで描かれた図面が少なくとも１つ含まれている場合がある。本特許または本特許出願公開のカラー図面付きコピーは、要求と必要な料金の支払いに応じて、特許庁から提供される。
【００２６】
【図１】多重化能力ならびに機器の価格および携帯性に関する様々なプラットフォームのグラフによる比較である。
【図２】本開示による毛細管内の対流およびチップ内の流れ、ならびに関連する製造原理および動作原理を示す。
【図３】本開示による装置の操作のためのワークフロー図を示す。
【図４】本開示による装置の部分分解図、ならびにプロトタイプ装置の写真およびプロトタイプからのイメージング結果を示す。
【図５】本開示による装置の概念的な機能フローチャートを示す。
【図６】本開示による装置のチップホルダおよびチップの斜視図および写真図を示す。
【図７】本開示による装置の代替のチップホルダ、装填機構、およびクランプ機構の概略図を示す。
【図８】本開示による装置の個々のサブフレームおよび組み立てフレームの斜視図を示す。
【図９】本開示による装置のプレスバーおよび組み立てフレームの斜視図を示す。
【図１０】クランプ解除位置およびクランプ位置における本開示による装置の機械システムを示す。
【図１１】本開示による、個別の状態、および装置の組み立てフレーム内の状態の加熱ブロックの正投影図および斜視図を示す。
【図１２】本開示による装置の熱制御システム構成要素の正投影図、透視図および写真図、ならびに加熱ブロック温度の応答曲線を示す。
【図１３】本開示による装置の蛍光イメージングシステムの概略図を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
発明の詳細な説明
本開示の例示的な実施形態は、３つの主要な構成要素、すなわち、（１）チップ（アクティブな冷却または流体装置を必要としない信頼性の高い対流式ＰＣＲのための環状反応チャンバ）と、（２）アッセイおよび読み出し（単一の蛍光チャネルを使用した５０以上のＤＮＡ標的の同時検出と分析クローズドチューブ方式のマイクロアレイ）と、（３）装置（多重増幅およびリアルタイム読み出しを実装するポータブルで低価格の機器）と、を含む。
【００２８】
対流式ＰＣＲの原理は、温度によって引き起こされる密度差（レイリーベナール対流）によって、水溶液を制御可能に循環させ得ることである。要するに、暖かい溶液は密度が低く、冷たい溶液は密度が高いので、重力により、示差的に加熱された溶液の循環を駆動することができる。アクティブな冷却または流体装置構成要素が必要ないため、対流式ＰＣＲ機器のサイズと重量は、ペルチェシステムを利用する従来のＰＣＲよりも大幅に軽量になる。
【００２９】
対流式ＰＣＲは、２００２年に最初に概念的に導入され、実験的に実証されたものであり、図２のセクションＡに示すように、反応チャンバとして垂直毛細管を使用する。ただし、この反応チャンバには循環速度の遅い「デッドゾーン」があり、非特異的なＤＮＡ増幅とプライマーダイマーの形成をもたらす。このように、毛細管チューブを用いた対流式ＰＣＲは、従来のＰＣＲに比べて相対的に不利であるため、商業的な導入が進んでいないのが現状である。対照的に、図２のセクションＢに示される操作中の環状反応チャンバにより、チップ内のデッドゾーンを排除し、９５℃および６０℃の温度ゾーンを介したチャンバ内でのＰＣＲ溶液の均一な循環が促進される。セクションＢに示されているドーナツ式ＰＣＲ流体チップ１００は、診断グレードのＤＮＡ分析のための対流式ＰＣＲを可能にするために、毛細管チューブよりも均一な温度制御を実現するように設計されている。ＰＣＲ溶液は、入口ポートを介して反応チャンバに注入され、もう一方のポートは空気のバイパスを可能にする。中央の内部円形インサート（「アイランド部」）は、ＰＣＲ混合物が制御されていない温度で長期間滞留する可能性のあるデッドスペースを防ぐ。ドーナツ式ＰＣＲチップ１００の製造および組み立てプロセスが図２のセクションＣに示されている。ドーナツ式ＰＣＲチップ１００と組み合わせて使用され得る無標識マイクロアレイ技術の概要が図２のセクションＤに示されている。アンプリコンおよびｄＮＴＰは標識されておらず、標識されていないアンプリコンによるクエンチャー標識オリゴヌクレオチドの置換によって、局所的な蛍光の増加が達成される。したがって、この技術により、オープンチューブ洗浄ステップが回避される。図２のセクションＥは、アンプリコン混合物へのハイブリダイゼーションの前（上部）および後（下部）の無標識マイクロアレイの蛍光画像を提供している。この画像は、Ｚｅｉｓｓ  Ａｘｉｏ  Ｏｂｓｅｒｖｅｒ蛍光顕微鏡を使用して撮影された。
【００３０】
従来の定量ＰＣＲ（ｑＰＣＲ）機器では、様々なスペクトル波長を使用して、様々なＤＮＡ標的の多重分析が実現されている。しかしながら、重複しない可視波長の蛍光物質の数は５〜６に制限されている。感染症および抗生物質耐性プロファイリングから農業遺伝子プロファイリングまで、多くのアプリケーションで、２０を超える異なる標的を検出する必要がある。例えば、それぞれ５つの標的を試験する４つの反応を介して、試料内の２０の異なるＤＮＡ標的をプロファイリングすることにより、試料の分割を実行できる。ただし、実際には、これは煩雑であり、試料が限られている場合は感度が犠牲になる。マイクロアレイにより、空間分離を使用して単一の蛍光波長を使用して高度の多重化を実現できるが、蛍光バックグラウンドの抑制に多大な労力を要するオープンチューブの洗浄ステップが必要である。このマイクロアレイのワークフローが複雑であるために、従来のマイクロアレイはインビトロ診断（ＩＶＤ）での使用に適していない。対照的に、環状ドーナツ式ＰＣＲチップの内面に印刷されたマイクロアレイは、無標識マイクロアレイであり、余分なアンプリコンまたは反応試薬を除去するために洗浄する必要はない。
【００３１】
ドーナツ式ＰＣＲチップで多くのＤＮＡ標的の多重増幅と検出を実行するには、温度の異なる２つのヒータにチップを軽く密着させて、熱的接触を形成する必要がある。過剰なバックグラウンド光を防ぐためには、ドーナツ式ＰＣＲチップを暗い場所に移動するか、チップ装填ドアを密閉する必要がある。また、ドーナツ式ＰＣＲチップは、適切に選択および配置されたフィルタおよび光学系を使用して、適切な波長、強度、およびフォーカスの光で照明する必要がある。カメラによってマイクロアレイの写真を定期的に撮影し、ソフトウェアを使用して画像を解釈し、輝点の有無を判断する。本開示の例示的な実施形態は、上記のプロセスのそれぞれを達成する統合装置を提供する。
【００３２】
ここで図３を参照すると、試料中の核酸標的の多重増幅および検出のための装置２００の概略図が、装置２００とともに使用するためのワークフロー図の概要とともに提供されている。図３に示すように、試料１１０は、１つ以上のＰＣＲ試薬と混合され、次いで、トランスファピペットを介してチップ１００に装填することができる。次に、チップ１００（試料１１０を含む）を密封し、分析のために装置２００に挿入することができる。ユーザは、グラフィカルユーザインターフェース（ＧＵＩ）２１０を介して装置２００の動作を制御することができる。特定の実施形態では、ＧＵＩ２１０は、装置２００に無線で結合することができ、特定の実施形態では、ＧＵＩ２１０は、モバイルデバイス２２０（例えば、スマートフォン、ラップトップコンピュータ、タブレットまたは他の適切なデバイスを含む）に組み込むことができる。ＧＵＩ２１０は、装置２００を介して試料１１０の分析を開始し、画像結果を表示するために使用することができる。デバイス２２０は、医師、看護師、または他の医療専門家に試験結果を送るために使用することができる。
【００３３】
ここで図４を参照すると、装置２００の概要が提供されている。図４のセクションＡは、（外部ハウジングを除く）組み立て後の構成要素の３Ｄ図を示している。図４のセクションＢは、装置２００のエンジニアリングプロトタイプの写真を提供している（ここでも、外部ハウジングを除く）。図４のセクションＣは、セクションＢに示される装置２００の実施形態によってイメージングされた、ドーナツ式ＰＣＲチップ１００内の１００スポットアレイの蛍光画像を示す。装置２００の特定の実施形態は、（例えばＵｌｔｉｍａｋｅｒ３などの適切なデバイスを使用して）３Ｄ印刷された構造的構成要素を含んでもよい。他の構成要素として、市販されている広く入手可能なモジュールが含まれてもよい。セクションＢに示される実施形態では、スマートフォンは、カメラ、画像処理ユニット、ユーザインターフェース、および無線データ送信機として機能する。図４に示す実施形態では、壁電源を使用しているが、内部にパワーバンクを備えており、最大６０分の動作を（例えば、１回の完全な試料分析に加えて、必要となる可能性のある余分な時間を考慮して）行うことができる。
【００３４】
図５は、装置２００によって実行される分析の概念図またはフローチャートを提供しており、これは、４つの主要なシステム、すなわち、蛍光イメージングシステム２１０、ユーザインターフェース２２０、機械システム２３０、および熱制御システム２４０で実行されるステップを含む。装置２００を操作するための一般的なプロセスの概要を、適切な試料、ｄＮＴＰ、ＤＮＡポリメラーゼ、およびバッファー試薬が装填されたドーナツ式ＰＣＲチップ１００と併せて以下に提供する。
【００３５】
ユーザは、最初に装置２００の電源を入れることができ、これにより、初期化の前に、システムチェック（例えば、コントローラが接続されていることの確認、カメラ機能および光源照明のチェック）が実行される。装置２００の初期化中に、熱制御システムがオンになり、次に、加熱ブロックを所定の温度に加熱し、それらを安定した温度に維持することできる。より詳細な温度制御方法の情報は、熱制御システムのセクションでさらに説明される。加熱ブロックプロセスに加えて、温度記録も同時に開始できる。熱制御システムは、実験が完了するまで連続的に動作し得る。また、システム初期化プロセスには、蛍光イメージングシステムの電源を起動し、光源のエネルギーパワーをチェックし、カメラのフォーカスを確認し、初期化画像を記録に残せる状態であることを確認することが含まれる。次に、システムは、可動機械部品の位置をリセットする。これには、例えば、加熱ブロックを保持しているフレームをクランプ解除位置に戻すことと、チップホルダをアンロード／排出位置に設定することと、チップを装填する準備をすることと、が含まれる。
【００３６】
装置２００は、装置が実験または分析の準備ができていることを示すディスプレイを含み得る。次に、ユーザは、装置２００に装填するためにチップを準備することができる。次に、ユーザはチップを挿入して装填し、チップが装填されて配置されていることを確認できる。装置２００は、加熱ブロックがチップをクランプするように構成することができる。次に、装置２００は、開始の準備ができていることを示し、実験／分析のためのカウントダウンを表示する。次に、装置２００は、カメラを使用して、所定の間隔（例えば、４５秒ごと）で１つの画像を撮影することにより、蛍光イメージングシステムタイマーを開始／リセットする。所定の各間隔の後、チップ内の蛍光物質を励起するために光源がオンになる。特定の実施形態では、励起フィルタを備えたレーザまたはＬＥＤ光を、潜在的な光源と見なすことができる。
【００３７】
次に、装置２００は、カメラを使用して、現在のチップの蛍光画像を捕捉して保存することができる。異なるタイプの蛍光物質と機器の設計には、異なる蛍光フィルタセットが必要になる。次に、光源の電源を切り、所定の間隔で次の画像が撮影され得る。これを実験／分析が完了するまで繰り返すことができる。実験が完了すると、熱制御システムと蛍光イメージングシステムがスイッチオフになる。分析終了後、チップは自動的に排出される。チップの温度が高いため、ユーザは注意する必要がある。次に、機械システムの加熱ブロックをクランプ解除して、チップを排出する。装置２００は、画像の分析を続け、データレポートを最終的に完成させることができる。その後、ユーザは次の実験に進むか、装置２００の電源を切ることができる。
【００３８】
ここで図６を参照すると、セクションＡは、１つ以上のチップ１００を保持するように構成されたチップホルダ２０５の３Ｄ図を示している。図６のセクションＢは、ホルダ２０５に装填した後のチップ１００の位置を示し、セクションＣは、非装填位置（左側）と装填位置（右側）のチップ１００を示している。図６のセクションＤは、チップ１００が装填されたチップホルダ２０５（この例では３Ｄ印刷により製造）の写真を提供している。
【００３９】
装置２００は、チップ装填および加熱ブロッククランプを含むが、これらに限定されない機能を実行する機械システム内の構成要素を含む。
【００４０】
装置２００におけるチップホルダ２０５の機能は、ドーナツ式ＰＣＲチップ１００を挿入し、チップを所定の位置に垂直に移動するように導くことである。チップホルダは、３つの主要な部品、すなわち挿入スロット２０６、位置決めスロット２０７、およびモーション制御セット２０８を含む。挿入スロット２０６は、チップ挿入のために機器表面から押し出される。チップ１００は、モーション制御セット２０８を導くとともに、チップ１００が垂直方向に上下に移動するのを支持する挿入スロット２０６に挿入される。チップ１００は、次に、位置決めスロット２０７に正確に配置される。
【００４１】
位置決めスロット２０７の横側にある２つの垂直バーは、ガイドレール２０９として機能し、チップ１００を垂直に上下に移動させるよう導くために使用される。モーション制御セット２０８は、２つの部品、すなわち可動構成要素２１１およびその固定具２１３を含む。特定の実施形態では、可動構成要素２１１は、直線モーションモータ、例えば、リニアアクチュエータまたはステップモータを利用する。モーション制御セット２０８の固定具２１３が固定のために使用され、チップ１００の移動中の可動構成要素２１１の安定化を確実にする。挿入スロット２０６、位置決めスロット２０７、ガイドレール２０９、および固定具２１３は、集合的に、統合チップホルダ２０５を形成する。例示的な実施形態では、モーション制御セット２０８の可動構成要素２１１は、チップホルダ２０５上に組み立てられる。チップホルダ２０５全体と可動構成要素２１１を組み立てた後、それらは装置２００内に固定される。チップ１００の垂直移動のプロセスは、モーション制御セット２０８によって導かれ、指示される。ここで、ドーナツ式ＰＣＲチップ１００は、垂直に移動されている物体である。
【００４２】
実験の前に、チップホルダ２０５は非装填位置にリセットされ、可動構成要素２１１（例えば、リニアアクチュエータ）は、図６のセクションＣの左側の図に示すように伸長する。チップ１００を挿入した後、チップ１００が位置決めスロット２０７に正確に配置されるまで、チップは短縮されたリニアアクチュエータとともに垂直に下に移動する。その際、図６のセクションＤおよびセクションＣの右図に示すように、チップ１００の上端と下端の両方が挿入スロット２０６（チップ１００の下端の一部）および位置決めスロット２０７に取り付けられ、垂直に留まる。実験後、可動構成要素２１１は、伸長し、チップ１００を上方に移動させて、チップ１００を排出するように指示する。
【００４３】
他の実施形態（図示せず）では、チップホルダは、異なる形状を含んでもよく、異なるタイプの機器を収容してもよい。特定の実施形態では、チップホルダは、チップ自体のみを移動させるのではなく、垂直に上下に移動させることができる。
【００４４】
チップホルダ２０５は、実験または分析が実行される前に、可動構成要素２１１によって駆動され、チップ挿入のために挿入スロット２０６を装置２００から押し出す。チップ１００を挿入した後、チップ１００は、位置決めスロット２０７の下部に直接接触し、チップの上端は、挿入スロット２０６と平行になる。次に、可動構成要素２１１は、チップホルダ２０５全体を駆動して下方に移動させ、次に挿入スロット２０６の一部を装置２００に引き戻し、チップ装填のプロセスを完了する。
【００４５】
実験後、可動構成要素２１１は、チップ１００を運ぶチップホルダ２０５とともに上方に移動して、挿入スロット２０６を機器２００の表面から押し出す。その後、チップ１００を取り外すことができる。
【００４６】
図７のセクションＡは、チップ１００を保持するように構成されたチップホルダ２０５の代替設計を示している。図７のセクションＢは、チップホルダ２０５を装填するように構成された装填機構２１５のための４つの異なる構成を提供している。各実施形態は、ヒータを含むが、チップホルダ２０５をヒータ間の位置に出し入れするための異なる構成要素も含む。第１の実施形態は、リードスクリューおよびリードナットを備えたステッピングモータを含む。第２の実施形態は、チップホルダに結合されたフォロアを上下させるために水平軸の周りを回転するカムを備えたステッピングモータを含む。第３の実施形態は、チップホルダに結合されたフォロアを上下させるために垂直軸の周りを回転するカムを備えたステッピングモータを含む。第４の実施形態は、チップホルダ２０５に係合して上昇および下降するように構成されたローラーギアおよびローラーに結合されたモータを含む。図７のセクションＣは、チップホルダおよびチップの各側のヒータをクランプするように構成されたクランプ機構２２５の３つの異なる実施形態を示している。各実施形態は、構成要素の移動を制御するように構成されたステッピングモータと、ヒータに接触するように構成されたクランプブロックと、を含む。第１の実施形態は、ステッピングモータに結合されたカムと、クランプブロックに結合されたフォロアとを含む。この実施形態はまた、ガイドレール上の複数のバネを含み、バネは、クランプブロックにヒータに向かって力を印加するように付勢されている（例えば、バネはクランプ位置に向かって付勢されている）。カムが回転すると、フォロアと係合し、バネ力を打ち消して、クランプブロックをヒータから（例えば、クランプ解除位置に）遠ざけることができる。
【００４７】
図７のセクションＣの第２の実施形態は、前述の実施形態と同様の構成を有するクランプ機構２２５を示している。しかしながら、この実施形態は、カムの代わりに、リードスクリューおよびリードナットの配置を利用して、クランプブロックをヒータに近づけたり、ヒータから遠ざけたりする。図７のセクションＣに示される第３の実施形態は、ヒンジ機構の周りを旋回するクランプブロックと係合するステッピングモータおよびカムを備えたクランプ機構２２５を示している。この実施形態はまた、旋回クランプブロックをヒータに向かって付勢するように構成されたねじりバネを含む。
【００４８】
ここで、図８および９を参照すると、個々のフレームおよび組み立てフレームの斜視図が示されている。フレームの主な機能は、加熱ブロックを垂直に固定することである。ここに示されているフレームには２つの部品が存在し、本明細書ではフレームアルファおよびフレームベータと称されることもある。
【００４９】
図８のセクションＡは、サブフレーム４１０（フレームアルファとも称される）の斜視図を提供し、一方、図８のセクションＢは、サブフレーム４２０（フレームベータとも称される）の斜視図を提供している。図８のセクションＣは、フレーム４５０を形成するためにサブフレーム４１０の近位に配置されたサブフレーム４２０を示している。両方のフレームは、ベース、主構造キャリア、およびプレスバーの３つの主要な構成要素を含む。ベースは、フレーム全体と摺動プラットフォーム間の接続および固定に使用される。図８のセクションＡは、ベース４１１および主構造キャリア４１２を備えたサブフレーム４１０を示し、図８のセクションＢは、ベース４２１および主構造キャリア４２２を備えたサブフレーム４２０を示している。図９のセクションＡは、サブフレーム４１０と組み合わせて使用するためのプレスバー４１３および４１４、ならびにサブフレーム４２０と組み合わせて使用するためのプレスバー４２３および４２４を示している。さらに、図９のセクションＡは、プレスバー４１３および４１４に結合された加熱ブロック４１５および４１６、ならびにプレスバー４２３および４２４に結合された加熱ブロック４２５および４２６を示している。図９のセクションＢは、サブ構成要素が組み立てられたフレーム４５０を示している。明確化のために、セクションＢで全ての個々の構成要素にラベル付けされているわけではない。
【００５０】
主構造キャリア４１２および４２２は、フレーム４５０において主な役割を果たし、それらの主な機能は、プレスバー４１３、４１４、４２３および４２４を爪部４１７および４２７（図８のセクションＡおよびＢにラベル付けされている）に固定することである。特定の実施形態では、製造用ベース４１１および４２１ならびに構造キャリア４１２および４２２は、それぞれ、単一の部品として作製することができる。各構成要素を硬質材料から製造して、その形状および形態を維持することができる。３Ｄ印刷のプロトタイプ作成には、ポリ乳酸（ＰＬＡ）材料およびアクリロニトリルブタジエンスチレン（ＡＢＳ）材料などが適した材料になり得る。
【００５１】
プレスバー４１３、４１４、４２３および４２４の機能は、加熱ブロック４１５、４１６、４２５および４２６を固定することである。図９に示すように、プレスバー４１３、４１４、４２３および４２４の形状は、扁平Ｕ字形である。プレスバーは高温でその形状を維持する必要があるため、耐熱材料が提案されている。特定の実施形態では、ポリカーボネート（ＰＣ）またはセラミック材料をプレスバーに使用することができる。
【００５２】
プレスバー４１３、４１４、４２３および４２４をフレーム４５０に（サブフレーム４１０および４２０を介して）結合した後、加熱ブロック４１５、４１６、４２５および４２６は、垂直に直立して配置される。サブフレーム４１０により、前部の２つの加熱ブロック４１５および４１６を組み立て、サブフレーム４２０により、後部の２つの加熱ブロック４２５および４２６を組み立てる。サブフレーム４１０および４２０（フレームアルファおよびフレームベータとも称される）の構成（例えば、形状および寸法）は異なっており、これにより、２つの完全に組み立てサブフレームの入れ子を容易にする。図８に示すように、リニアアクチュエータ４３０は、サブフレーム４１０とサブフレーム４２０との間に結合される。リニアアクチュエータ４３０が伸長すると、加熱ブロック４２５および４２６は、加熱ブロックがチップ１００に完全に係合またはクランプするまで、加熱ブロック４１５および４１６に近づく。リニアアクチュエータ４３０が短くなると、加熱ブロック４２５および４２６は、加熱ブロックがチップ１００を正常に係合解除またはクランプ解除するまで、加熱ブロック４１５および４１６から離れる方向に移動する。
【００５３】
図１０は、チップ１００の垂直装填およびクランプを提供するように構成された機械システム５００の概要を提供する。図１０のセクションＡは、クランプ解除位置にある機械システム５００の側面図を示している。この図では、リニアアクチュエータ４３０は後退位置にあり、サブフレーム４２０はリニアアクチュエータ４３０に向かって移動している。
【００５４】
図１０のセクションＢは、クランプ位置にある機械システム５００の側面図を示している。この図では、リニアアクチュエータ４３０は伸長位置にあり、サブフレーム４２０はリニアアクチュエータ４３０から離れてチップ１００に向かって移動している。
【００５５】
図１０のセクションＣは、クランプ位置にある機械システム５００の斜視図を提供し、セクションＤは、装填されたドーナツ式ＰＣＲチップ１００を備えた機械システム５００の写真を提供している。明確のために、図１０では全ての構成要素に参照番号をラベル付けしていない。
【００５６】
サブフレーム４１０および４２０は、フレームの前後への移動を容易にするために、摺動構成要素４６０で支持することができる。特定の実施形態では、（構成要素番号ＳＣ８ＵＵによって識別される）市販のリニアベアリングプラットフォームを摺動構成要素に使用することができる。特定の実施形態では、摺動構成要素は、摺動プラットフォーム、摺動バー、およびクランプスタンドを含むことができる。摺動式プラットフォームの表面は水平であり、フレームベース４１１および４２１に結合されている。摺動プラットフォームは、摺動バーに結合されており、摺動バーに沿って前後に移動し得る。
【００５７】
例示的な実施形態では、摺動プラットフォームの設計をカスタマイズして、摩擦を最小限に抑える機能を維持することができる。一実施形態では、摺動バーは、直径８ｍｍのステンレス鋼の表面ガラスシリンダである。特定の実施形態では、２つの摺動バーをプラットフォームに使用することができる。摺動バーは、多くの市販製品から選択でき、様々な寸法および材料のうちのいずれかであり得る。クランプスタンドは、摺動バーの固定および配置に使用される。特定の実施形態では、３セットのクランプスタンドを使用することができ、各セットは２つのクランプスタンドを含む。クランプスタンドのうちの１つのセットは、クランププロセス中にドーナツ式ＰＣＲチップ１００を破壊することを回避するために、過度の移動を防止する目的で、２つのセットの摺動プラットフォームの間に仕切りおよび緩衝物を形成する。
【００５８】
本発明の例示的な実施形態はまた、加熱ブロック４１５、４１６、４２５および４２６を介してチップ１００の２つの異なる温度を維持するように構成された熱制御システムを含む。ここで図１１のセクションＡを参照すると、加熱ブロック４１５および４１６について正面図および背面図が提供されている。図１１に示すように、加熱ブロック４１６は、ブロック４１６の一方の縁に近位の先細開口４１８を含む。以下でさらに説明するように、先細開口４１８により、蛍光イメージングが可能となる。先細開口４１８の中心は、加熱ブロック４１６がクランプ位置にあるときに、装填されたドーナツ式ＰＣＲチップ１００上の無標識マイクロアレイの位置に対応する。示される実施形態では、加熱ブロック４１５および４２５は、動作中に９５℃に設定され、加熱ブロック４１６および４２６は、動作中に６０℃に設定される。
【００５９】
図１２は、本発明による熱制御システムの例示的な実施形態の異なる態様を示している。セクションＡは、加熱ブロックに取り付けられた熱源４３１の３Ｄ図の概略斜視図を示し、セクションＢは、ヒータブロック（例えば、ブロック４２６）に結合された接着性の可撓性ヒータとして構成された熱源４３１の写真を提供している。図１２のセクションＣは、ドーナツ式ＰＣＲチップチャンバの下の加熱ブロック４２５および４２６に埋め込まれた温度センサ４３２の部分断面図を示している。図１２のセクションＤは、チップ１００の横側および加熱ブロック４２５および４２６の表面に取り付けられた温度センサ４３２を示している。図１２のセクションＥは、熱電対およびサーミスタとして構成された温度センサ４３２の写真を提供している。さらに、図１２のセクションＥは、表面接着ＲＴＤセンサを含む様々な温度センサを示している。図１２のセクションＦは、熱制御ボード６１０のプロトタイプを含む、熱制御システム６００の写真を提供している。図１２のセクションＧは、摂氏測定された加熱ブロック温度と秒単位の時間の応答曲線を示している。
【００６０】
特定の例示的な実施形態では、加熱ブロックは、表面がガラスで覆われた熱導電性ボードである。特定の実施形態では、加熱ブロックは、ドーナツ式ＰＣＲチップの少なくとも半分をカバーし得る幅および長さを有する。加熱ブロックの原理は、加熱された加熱ブロックのガラスで覆われた表面にチップをクランプすることにより、チップを所定の温度に加熱することである。図に示される特定の実施形態では、合計４つの個別の加熱ブロックが使用される。機器の動作中、２つの加熱ブロックは９５℃の温度を維持し、他の２つは６０℃の温度を維持する。
【００６１】
安定した温度制御に使用される加熱ブロックの総数は様々であり得る。例えば、図１１では、温度を維持するための良好なフィードバック制御ループを考慮すると、ヒータ４１５および４１６のみの使用で十分であり得る。図に示す実施形態では、温度の堅牢性と耐故障性のために４つの加熱ブロックを使用している。加熱ブロックに使用される材料は、アルミニウム、ステンレス鋼、真鍮、または熱伝導に適した他の材料であり得る。加熱ブロックの厚さは、所望の温度および熱源の特性に基づいて調整できる。図に示される例示的な実施形態では、３ミリメートルの厚さのアルミニウム板が加熱ブロックに使用される。
【００６２】
例示的な実施形態では、温度センサは、図１２のセクションＣおよびＤに示すように、加熱ブロックの表面上に組み立てられるか、または加熱ブロックに埋め込まれ得る。図示の実施形態では、温度センサは、ドーナツ式ＰＣＲチップ温度の最も正確な温度読み取りを達成するために、加熱ブロックがドーナツ式ＰＣＲチップに接触する位置で加熱ブロックに埋め込まれている（図１２のセクションＣを参照されたい）。例示的な実施形態では、温度センサは、２０℃〜１０５℃までの温度を、応答時間≦１秒、精度≦１．５℃で正確に測定できることが望ましい。図に示されている実施形態は、ＯＭＥＧＡ熱電対タイプＴを利用した。実験的に、他のタイプの熱電対でも同様の結果が得られることが観察されている。または、代わりに抵抗温度検出器（ＲＴＤ）またはサーミスタを使用することもできる。埋め込み温度センサ方式を適用する場合、加熱ブロックの形状は温度センサの形状に対応する必要があることに注意されたい。
【００６３】
本開示の例示的な実施形態はまた、加熱ブロックに熱を提供する熱源を含む。図示の実施形態は、カプトンポリイミド接着剤可撓性ヒータを含む。このヒータは加熱ブロックの表面に付着するが、ドーナツ式ＰＣＲチップには直接接触しない。ヒータは、熱源に供給される電力を変更することで温度を維持する。あるいは、加熱ワイヤを含む加熱プレートは、加熱ブロックまたはヒータを置き換えることができる。具体的には、熱源は、電気エネルギーの熱への変換を介して加熱ブロックの急速な加熱を提供することができるが、急速な冷却はできないことに留意されたい。
【００６４】
例示的な実施形態は、温度コントローラの中心的な態様として、温度センサのフィードバックループをさらに含む。温度コントローラは、温度センサから温度を読み取り、（１）目的の温度への加熱を迅速に実行し、（２）環境による潜在的変動があっても温度を正確に維持するように、加熱ブロックへの電力供給を導く。例示的な実施形態は、アルドゥイーノマイクロコントローラを使用して、増幅器モジュールを介して熱電対の温度を正確に読み取り、熱源の電力を制御することができる。あるいは、一般的なＰＩＤ（比例積分微分）コントローラにより、同じ機能を実現できる。
【００６５】
本発明の例示的な実施形態はまた、少なくとも４０ピクセル×４０ピクセルのアレイ内の空間情報を収集するように構成された光学蛍光イメージングシステムを含む。ここで図１３を参照すると、例示的な光学蛍光イメージングシステムの概要が示されている。図１３のセクションＡは、従来のまたは典型的な蛍光顕微鏡構成を含むシステム７００を示し、セクションＢは、プロトタイプ機器に使用される光学システム８００の概略図を示す。
【００６６】
ドーナツ式ＰＣＲチップ１００の蛍光イメージングには、光源７１０、光をチップ１００の適切な領域に誘導および集束するための光学モジュール７２０、他の波長のバックグラウンド信号を低減するための発光フィルタ７３０、ならびに光検出器アレイ７４０または画像取得用カメラが必要である。
【００６７】
図１３のセクションＡに示す実施形態では、システム７００はまた、より長い波長の光を通過させながら、より短い波長の光を反射するハイパスミラーであるダイクロイックミラー７５０を含む。これにより、励起光は試料に反射されて対物レンズを通過し、蛍光物質を励起する。放出された光子は約２０ｎｍ赤方偏移し、ダイクロイックミラー７５０を通過する。信号対雑音比を改善するために、発光フィルタ７３０を適用して、他の波長のバックグラウンド光を遮断する。最後に、放出光は、より良い倍率および集束のために接眼レンズ７６０を通過する。
【００６８】
上記は、蛍光顕微鏡で使用される蛍光イメージングの標準的な方法を説明している。図１３のセクションＢは、より携帯性が高く、スマートフォンカメラと互換性のあるシステム８００の単純化された代替設計を提示している。システム８００は、１つの発光フィルタ８３０および１つの緑色光レーザ（５３２ｎｍ）８１０のみを使用する。示される実施形態では、緑色レーザ８１０は、コヒーレント光源として機能し、チップ表面に対して４５℃の角度に向けられる。ＤＮＡマイクロアレイは、発光フィルタ８３０を通して明確に視覚化することができる。レーザの代わりに代替光源（例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）またはアークランプ）を使用することもできるが、追加の励起フィルタが必要になり、フォーカスを合わせる必要がある。
【００６９】
図１３のセクションＡを参照すると、光学レンズ７６０を使用して倍率が提供される。科学的カメラまたは携帯電話カメラのいずれかにより、専用ソフトウェアによるダウンストリーム画像処理用の鮮明なマイクロアレイ画像を生成できる。図２のセクションＥに示される画像は、標準のフィルタセットを備えた科学的カメラを使用して撮影された。図４のセクションＣの画像は、図１２のセクションＢに示されるセットアップを使用して、ｉＰｈｏｎｅ６ｓを使用して撮影された。あるいは、適切に配置された光検出器のアレイは、マイクロアレイのスポット輝度に関する関連情報を提供するように機能してもよい。
【００７０】
本明細書に開示および請求される全ての方法は、本開示に照らして過度の実験なしに作成および実行することができる。本発明の組成物および方法は、好ましい実施形態に関して説明されてきたが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載されている方法およびそのステップまたはステップの順序に変形例を適用できることが明らかであろう。より具体的には、化学的および生理学的に関連する特定の試薬が、同じまたは同様の結果が達成される一方で、本明細書に記載の試薬の代わりになり得ることが明らかであろう。当業者に明らかなかかる全ての同様の代替物および修正物は、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であると見なされる。
【００７１】
Ｖ．参考文献
以下の参考文献は、それらが本明細書に記載されたものを補足する例示的な手順または他の詳細を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
ＰＣＴ特許出願公開第ＷＯ２０１７／１７２７６０号
【図１】
2021536015.tif 000002
【図２ａ】
2021536015.tif 000003
【図２ｂ】
2021536015.tif 000004
【図２ｃ】
2021536015.tif 000005
【図２ｄ】
2021536015.tif 000006
【図２ｅ】
2021536015.tif 000007
【図３】
2021536015.tif 000008
【図４Ａ】
2021536015.tif 000009
【図４Ｂ】
2021536015.tif 000010
【図４Ｃ】
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【図５】
2021536015.tif 000012
【図６ａ】
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【図６ｂ】
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【図６ｃ】
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【図６ｄ】
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【図７ａ】
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【図７ｂ】
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【図７ｃ】
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【図８ａ】
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【図８ｂ】
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【図８ｃ】
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【図９】
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【図１０ａ】
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【図１０ｂ】
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【図１０ｃ】
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【図１０ｄ】
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【図１１】
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【図１２ａ】
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【図１２ｂ】
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【図１２ｃ】
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【図１２ｄ】
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【図１２ｅ】
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【図１２ｆ】
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【図１２ｇ】
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【図１３】
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【国際調査報告】
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