(57)【要約】  本発明は、ＳＲＥＢＰ１タンパク質の発現を阻害することができる、ＳＲＥＢＦ１プレｍＲＮＡイントロン及びエクソン配列に相補的なアンチセンスＬＮＡオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。ＳＲＥＢＦ１発現の阻害は、心血管疾患、２型糖尿病、脂肪肝、代謝性疾患、及びがんを含むさまざまな医学的障害に有益である。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
長さ１０−３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、長さ１０−３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列が、配列番号１４又は配列番号１５に少なくとも９０％相補的であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトＳＲＥＢＦ１を発現している細胞におけるヒトＳＲＥＢＰ１の発現を阻害することができる、アンチセンスオリゴヌクレオチド；又はその薬学的に許容される塩。
【請求項２】
連続ヌクレオチド配列が、配列番号１４又は配列番号１５に完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項３】
連続ヌクレオチド配列が、配列番号１６に完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項４】
連続ヌクレオチド配列が、配列番号１７又は配列番号１８に完全に相補的である、請求項１に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項５】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’［式中、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、１−８の糖修飾ヌクレオシドを含み、Ｇは、ＲＮａｓｅＨを動員することができる５と１６ヌクレオシド間の領域である］の連続ヌクレオチド配列を含むギャップマーオリゴヌクレオチドである、請求項１から４のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項６】
領域Ｆ及びＦ’の糖修飾ヌクレオシドが、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される、請求項５に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項７】
領域Ｇが５−１６の連続ＤＮＡヌクレオシドを含む、請求項５又は６に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項８】
アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである、請求項１から７のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項９】
ＬＮＡヌクレオシドが、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドである、請求項５から８のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１０】
連続ヌクレオチド配列間のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１から９のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１１】
オリゴヌクレオチドが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号７及び配列番号８からなる群より選択される連続ヌクレオチド配列を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１２】
オリゴヌクレオチドが、連続ヌクレオチド配列：
ＧＡＣｇｇｇｔａｃａｔＣＴＴ  （配列番号１）
ＧＧＡｃｇｇｇｔａｃａｔｃＴＴ  （配列番号２）
ＣＡｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡＧ  （配列番号３）
ＡＣａｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡＧ  （配列番号４）
ＡＡＣａｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡ  （配列番号７）
ＡＧＡＴｇｔｔｔａｔｔｔｔｃｃｔｔａＡＧ  （配列番号８）
を含むか又はそれからなり、
大文字がＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字がＤＮＡヌクレオシドを表す、請求項１から１１のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１３】
オリゴヌクレオチドが、連続ヌクレオチド配列：
ＧＡＣｇｇｇｔａｃａｔＣＴＴ  （配列番号１）
ＧＧＡｍｃｇｇｇｔａｃａｔｃＴＴ  （配列番号２）
ＣＡｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡＧ  （配列番号３）
ＡＣａｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡＧ  （配列番号４）
ＡＡＣａｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡ  （配列番号７）
ＡＧＡＴｇｔｔｔａｔｔｔｔｃｃｔｔａＡＧ  （配列番号８）
を含むか又はそれからなり、
大文字がベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字がＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンが５−メチル  シトシンであり、ｍｃが５−メチル  シトシン  ＤＮＡであり、ヌクレオシド間のヌクレオシド間結合が、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である、請求項１から１２のいずれか一項に記載のアンチセンスオリゴヌクレオチド。
【請求項１４】
請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、及び前記オリゴヌクレオチドに共有結合した少なくとも一つのコンジュゲート部分を含むコンジュゲート。
【請求項１５】
コンジュゲート部分が、三価のＧａｌＮＡｃコンジュゲート部分、例えば式
2021511029.tif 000009
［式中、波線は、オリゴヌクレオチドの５’末端への共有結合を表す］
のコンジュゲート部分である、請求項１４に記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
化合物が、
５’−ＧＮ２−Ｃ６ｏＣｏａｏＧｓＡｓＣｓｇｓｇｓｇｓｔｓａｓｃｓａｓｔｓＣｓＴｓＴ；
５’−ＧＮ２−Ｃ６ｏＣｏａｏＧｓＧｓＡｓｃｓｇｓｇｓｇｓｔｓａｓｃｓａｓｔｓｃｓＴｓＴ；
５’−ＧＮ２−Ｃ６ｏＣｏａｏＣｓＡｓｇｓｔｓｃｓａｓｔｓｔｓｇｓｃｓａｓｔｓｔｓＣｓＡｓＧ；及び
５’−ＧＮ２−Ｃｏ６ｏＣｏａＣｓＣｓｔｓａｓｇｓｔｓａｓａｓｇｓｃｓＣｓＡｓＣｓＧ；
からなる群より選択され、
大文字がベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字がＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンが５−メチル  シトシンであり、ｍｃが５−メチル  シトシン  ＤＮＡであり、下付きのｓがホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し、下付きのｏがホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し、ＧＮ２−Ｃ６が式：
2021511029.tif 000010
［式中、波線は、オリゴヌクレオチドの５’末端でのホスホジエステル結合への共有結合を表す］
の５’コンジュゲートである、
請求項１４又は１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
請求項１から１３に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１４から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート並びに薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントを含む薬学的組成物。
【請求項１８】
ＳＲＥＢＦ１を発現している標的細胞におけるＳＲＥＢＦ１発現を調節するためのｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法であって、前記方法が、請求項１から１３のいずかれか一項に記載のオリゴヌクレオチド、請求項１４から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート、又は請求項１７に記載の薬学的組成物を有効量で前記細胞に投与することを含む、方法。
【請求項１９】
治療的又は予防的有効量の、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１４から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項１７に記載の薬学的組成物を、疾患に罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、疾患を治療又は予防するための方法。
【請求項２０】
疾患が、心血管疾患、２型糖尿病、脂肪肝、代謝性疾患、及びがんからなる群より選択される、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
医薬における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１４から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項２２】
心血管疾患、２型糖尿病、脂肪肝、代謝性疾患、及びがんからなる群より選択される疾患の治療又は予防における使用のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１４から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項１７に記載の薬学的組成物。
【請求項２３】
心血管疾患、２型糖尿病、脂肪肝、代謝性疾患、及びがんからなる群より選択される疾患の治療又は予防のための医薬の調製のための、請求項１から１３のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド又は請求項１４から１６のいずれか一項に記載のコンジュゲート又は請求項１７に記載の薬学的組成物の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＲＥＢＰ１タンパク質の発現を阻害することができる、ＳＲＥＢＦ１プレｍＲＮＡイントロン及びエクソン配列に相補的なアンチセンスＬＮＡ  アンチセンスオリゴヌクレオチド（オリゴマー）に関する。ＳＲＥＢＦ１発現の阻害は、心血管疾患、２型糖尿病、脂肪肝、代謝性疾患、及びがんを含むさまざまな医学的障害に有益である。
【背景技術】
【０００２】
ＳＲＥＢＰ１、ステロール調節エレメント結合タンパク質−１は、転写因子のＳＲＥＢＰファミリーに属するタンパク質である。ＳＲＥＢＰファミリーには、二つの遺伝子：ＳＲＥＢＦ１及びＳＲＥＢＦ２によりコードされる三つの主なタンパク質、ＳＲＥＢＰ−１ａ、−１ｃ、及び２が含まれる。ＳＲＥＢＰ−１ａ及び−１ｃ（本明細書では合わせてＳＲＥＢ１と称する）は、異なるプロモーター及び選択的スプライシングの使用を通じて同じ遺伝子から生成される。
【０００３】
ＳＲＥＢＰタンパク質は、炭水化物、トリグリセリド、脂肪酸、及びコレステロール代謝に関与する酵素の主要な調節因子である。ＳＲＥＢＰの過剰発現は、２型糖尿病、非アルコール性脂肪性肝疾患、及び心血管疾患などの代謝性疾患の危険因子であると知られている。最近では、ＳＲＥＢＰ１の過剰発現はまた、脂質代謝ががん細胞で強く上方制御されているという観察と一致して、細胞増殖にも関与したため、転写因子活性はがんの原因として示唆された（Shao et al., Cell Metab. 2012 oct 3;16(4):414-9）。
【０００４】
ＳＲＥＢＰシグナル伝達による低分子介入は、メタボリックシンドロームの病態生理におけるＳＲＥＢＰの重要な役割を実証した（Ｓｏｌｙａｌ  ２０１５で概説）。レプチン欠乏（ｏｂ／ｏｂ）マウスは、高い肝ＳＲＥＢＰ１ｃを有し、このマウス株中のＳＲＥＢＰ１ノックアウトは、ｄｅ  ｎｏｖｏ脂質生成の減少及び脂肪肝の減少をもたらし、ｏｂ／ｏｂ／ＳＲＥＢＰ１＋／＋同腹子と比較して肥満やインスリン抵抗性に影響がない（Ｙａｇａｈｉ  ２００２）。４週間にわたってｏｂ／ｏｂマウスに毎日注射される、ＳＲＥＢＰ活性化の低分子阻害剤であるファトスタチンは、コントロールと比較して、肝臓脂肪、体重、及び血糖の減少をもたらし（Ｋａｍｉｓｕｋｉ  ２００９）、生体動物への介入は、ＳＲＥＢＰ１を出生からノックアウトすることとは異なる影響を及ぼしたことを示す。ファトスタチンは、すべてのＳＲＥＢＰの活性化を阻害し、ＳＲＥＢＰ１に特異的ではなく、望ましくない副作用のリスクが高まることに留意すること。ＳＲＥＢＰの成熟の別の低分子ブロッカーであるベツリンは、高脂血症及びインスリン耐性を改善し、疾患のマウスモデルで動脈硬化プラークを減少させることが報告された（Ｔａｎｇ  ２０１０）。
【０００５】
腫瘍成長のための高脂質供給を維持するためには高ＳＲＥＢＰ活性が必要であると見られ、腫瘍におけるＳＲＥＢＰシグナル伝達の正常化が抗がん療法の潜在的な標的であることを示す。全身性の制御から独立した高いＳＲＥＢＰ１シグナル伝達、及び結果として生じる高いｄｅ  ｎｏｖｏ脂質生成は、前立腺がん、子宮内膜がん、及び神経膠芽腫などのがんに見られる。ファトスタチンは、膵臓がん細胞の生存及び増殖を減少させ（Ｓｉｑｉｎｇａｏｗａ  ２０１７）、マウスの前立腺がん細胞異種移植片における腫瘍成長を低減させること（Ｌｉ  ２０１５）が実証された。
【０００６】
国際公開第２００８／０１１４６７号は、ＳＲＥＢＰ１のＲＮＡ干渉を媒介するとされる推定ｓｉＲＮＡについて言及している。米国特許公開第２００５／０２１５５０４号及び同第２００３／０２２４５１５１号は、ＭＯＥギャップマーアンチセンス化合物、及びｉｎ  ｖｉｔｒｏトランスフェクションアッセイにおいてヒト又はマウスＳＲＥＢＰ１を阻害するためのそれらの使用について言及している。ＳＲＥＢＰ１発現を少なくとも４０％阻害することができる化合物が好ましいとして同定された。
【０００７】
したがって、ＳＲＥＢＰ１を特異的に阻害することができる治療剤が必要である。
【０００８】
我々は、マウス及びヒトＳＲＥＢＰ１を標的とする２０７のＬＮＡギャップマーをスクリーニングし、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで（ヒト及びマウス細胞、ジムノシスを介する）及びｉｎ  ｖｉｖｏ（マウス）で、ＳＲＥＢＰ１アンチセンスを特異的に標的とするのに特に強力で効果的な配列及び化合物を同定した。試験した化合物は安全で、肝臓、腎臓及び脂肪ＳＲＥＢＰ発現は低下していた。我々は、肝臓、腎臓及び脂肪において、異なる化合物が異なるレベルの活性を有することを発見した。
【０００９】
発明の目的
発明者は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ又はｉｎ  ｖｉｖｏでのアンチセンス阻害に特に効果的な、ＳＲＥＢＰ１転写産物（ＳＲＥＢＦ１）の領域を同定した。そして、ＳＲＥＢＦ１プレｍＲＮＡ又は成熟ｍＲＮＡのこれらの領域を標的とする、ＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドを含むアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。本発明は、心血管疾患、２型糖尿病、脂肪肝、代謝性疾患、及びがんなどのさまざまな医学的障害の治療において有用な、ヒトＳＲＥＢＰ１を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを同定する。
【発明の概要】
【００１０】
本発明は、長さ１０−３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さ１０−３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１４又は配列番号１５に少なくとも９０％に相補的であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＳＲＥＢＰ１を発現している細胞におけるヒトＳＲＥＢＰ１の発現を阻害することができる。いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、前記ＳＲＥＢＰ１を発現している細胞においてＳＲＥＢＰ１ｃのようなＳＲＥＢＰ１の発現を阻害することができる。
【００１１】
本発明は、長さ１０−３０ヌクレオチドのアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、前記アンチセンスオリゴヌクレオチドは、長さ１０−３０ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含み、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１４又は配列番号１５に少なくとも９０％に相補的であり、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトＳＲＥＢＦ１転写産物を発現している細胞におけるヒトＳＲＥＢＰ１転写産物の発現を阻害することができる。
【００１２】
本書で言及されるか又は特許請求される本発明のオリゴヌクレオチドは、薬学的に許容される塩の形態であってもよい。
【００１３】
本発明は、本発明によるオリゴヌクレオチドを含むコンジュゲートを提供し、少なくとも一つのコンジュゲート部分は、前記オリゴヌクレオチドに共有結合している。
【００１４】
本発明は、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート並びに薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントを含む薬学的組成物を提供する。
【００１５】
本発明は、ＳＲＥＢＦ１を発現している標的細胞におけるＳＲＥＢＦ１を調節するためのｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を提供し、前記方法は、有効量の本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲート又は薬学的組成物を前記細胞に投与することを含む。
【００１６】
本発明は、治療的又は予防的有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は薬学的組成物を、疾患に罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、疾患を治療又は予防するための方法を提供する。
【００１７】
いくつかの実施態様では、疾患は、心血管疾患、２型糖尿病、脂肪肝、代謝性疾患、及びがんからなる群より選択される。
【００１８】
本発明は、薬剤における使用のための本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は薬学的組成物を提供する。
【００１９】
本発明は、心血管疾患、２型糖尿病、脂肪肝、代謝性疾患、及びがんからなる群より選択される疾患の治療又は予防における使用のための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は薬学的組成物を提供する。
【００２０】
本発明は、心血管疾患、２型糖尿病、脂肪肝、代謝性疾患、及びがんからなる群より選択される疾患の治療又は予防のための医薬の調製のための、本発明のオリゴヌクレオチド、コンジュゲート又は薬学的組成物の使用を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１】単一濃度でのＡ５４９、ＨｅＬａ及びＲＡＷ２６４．７細胞株中ヒト及びマウスＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡを標的とするさまざまなアンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性の試験。
【図２】単一濃度でのＡ５４９及びＨｅＬａ細胞株中ヒトＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性の比較は、良好な相関を示す。非常に効率的に標的とする２つのモチーフをハイライトしている。
【図３】Ａ５４９細胞株中の濃度依存性力価及び有効性についてのヒト（及びマウス）ＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡを標的とする選択されたオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験。
【図４】ＨｅＬａ細胞株中の濃度依存性力価及び有効性についてのヒト（及びマウス）ＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡを標的とする選択されたオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験。
【図５】ＲＡＷ２６４．７細胞株中の濃度依存性力価及び有効性についての（ヒト及び）マウスＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡを標的とする選択されたオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験。
【図６】ＲＡＷ２６４．７細胞株中の濃度依存性力価及び有効性についてのマウスＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡを標的とする選択されたオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏでの試験。
【図７】マウスｉｎ  ｖｉｖｏ有効性：治療、静脈内ＩＶ（尾静脈）の１６日後のマウス組織における、残存するＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡ転写産物。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
定義
本明細書において、用語「アルキル」は、単独で又は組み合わせて、１から８個の炭素原子を含む直鎖又は分枝鎖アルキル基、特に１から６個の炭素原子を含む直鎖又は分枝鎖アルキル基、具体的には１から４個の炭素原子を含む直鎖又は分枝鎖アルキル基を意味する。直鎖及び分枝鎖Ｃ１−Ｃ８アルキル基の例は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、異性体ペンチル、異性体ヘキシル、異性体ヘプチル及び異性体オクチル、特にメチル、エチル、プロピル、ブチル及びペンチルである。アルキルの特定の例は、メチル、エチル及びプロピルである。
【００２３】
用語「シクロアルキル」とは、単独で又は組み合わせて、３から８個の炭素原子を有するシクロアルキル環、特に３から６個の炭素原子を有するシクロアルキル環を意味する。シクロアルキルの例は、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロヘキシル、シクロヘプチル及びシクロオクチル、より具体的にはシクロプロピル及びシクロブチルである。「シクロアルキル」の特定の例は「シクロプロピル」である。
【００２４】
用語「アルコキシ」とは、単独で又は組み合わせて、用語「アルキル」がメトキシ、エトキシ、ｎ−プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、イソブトキシ、ｓｅｃ．ブトキシ及びｔｅｒｔ．ブトキシなどの先述の意味を有する、式アルキル−Ｏ−の基を意味する。特定の「アルコキシ」はメトキシ及びエトキシである。メトキシエトキシは、「アルコキシアルコキシ」の特定の例である。
【００２５】
用語「オキシ」とは、単独で又は組み合わせて、−Ｏ−基を意味する。
【００２６】
用語「アルケニル」とは、単独で又は組み合わせて、オレフィン結合と、８個まで、好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子とを含む、直鎖状又は分岐状の炭化水素残基を意味する。アルケニル基の例は、エテニル、１−プロペニル、２−プロペニル、イソプロペニル、１−ブテニル、２−ブテニル、３−ブテニル及びイソブテニルである。
【００２７】
用語「アルキニル」とは、単独で又は組み合わせて、三重結合と、８個まで、好ましくは６個まで、特に好ましくは４個までの炭素原子とを含む、直鎖状又は分岐状の炭化水素残基を意味する。
【００２８】
用語「ハロゲン」又は「ハロ」とは、単独で又は組み合わせて、フッ素、塩素、臭素又はヨウ素、特にフッ素、塩素又は臭素、より具体的にはフッ素を意味する。用語「ハロ」とは、別の基と組み合わせて、前記基の少なくとも一つのハロゲンでの置換、特に１から５のハロゲン、特に１から４のハロゲン、すなわち、１、２、３又は４のハロゲンでの置換を意味する。
【００２９】
用語「ハロアルキル」とは、単独で又は組み合わせて、少なくとも一つのハロゲン、特に１から５のハロゲン、特に１から３のハロゲンで置換されたアルキル基を意味する。ハロアルキルの例は、モノフルオロ−、ジフルオロ−又はトリフルオロ−メチル、−エチル又は−プロピル、例えば３，３，３−トリフルオロプロピル、２−フルオロエチル、２，２，２−トリフルオロエチル、フルオロメチル又はトリフルオロメチルを含む。フルオロメチル、ジフルオロメチル及びトリフルオロメチルが特定の「ハロアルキル」である。
【００３０】
用語「ハロシクロアルキル」とは、単独で又は組み合わせて、少なくとも一つのハロゲンで置換された、特に１から５のハロゲン、特に１から３のハロゲンで置換された、上で定義されたシクロアルキル基を意味する。「ハロシクロアルキル」の特定の例は、ハロシクロプロピル、特にフルオロシクロプロピル、ジフルオロシクロプロピル及びトリフルオロシクロプロピルである。
【００３１】
用語「ヒドロキシル」及び「ヒドロキシ」とは、単独で又は組み合わせて、−ＯＨ基を意味する。
【００３２】
用語「チオヒドロキシル」及び「チオヒドロキシ」とは、単独で又は組み合わせて、−ＳＨ基を意味する。
【００３３】
用語「カルボニル」とは、単独で又は組み合わせて、−Ｃ（Ｏ）−基を意味する。
【００３４】
用語「カルボキシ」又は「カルボキシル」とは、単独で又は組み合わせて、−ＣＯＯＨ基を意味する。
【００３５】
用語「アミノ」とは、単独で又は組み合わせて、第１級アミノ基（−ＮＨ２）、第２級アミノ基（−ＮＨ−）、又は第３級アミノ基（−Ｎ−）を意味する。
【００３６】
用語「アルキルアミノ」とは、単独で又は組み合わせて、上で定義された一又は二のアルキル基で置換された上で定義されたアミノ基を意味する。
【００３７】
用語「スルホニル」とは、単独で又は組み合わせて、−ＳＯ２基を意味する。
【００３８】
用語「スルフィニル」とは、単独で又は組み合わせて、−ＳＯ−基を意味する。
【００３９】
用語「スルファニル」とは、単独で又は組み合わせて、−Ｓ−基を意味する。
【００４０】
用語「シアノ」とは、単独で又は組み合わせて、−ＣＮ基を意味する。
【００４１】
用語「アジド」とは、単独で又は組み合わせて、−Ｎ３基を意味する。
【００４２】
用語「ニトロ」とは、単独で又は組み合わせて、ＮＯ２基を意味する。
【００４３】
用語「ホルミル」とは、単独で又は組み合わせて、−Ｃ（Ｏ）Ｈ基を意味する。
【００４４】
用語「カルバモイル」とは、単独で又は組み合わせて、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２基を意味する。
【００４５】
用語「カルバミド（ｃａｂａｍｉｄｏ）」とは、単独で又は組み合わせて、−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ２基を意味する。
【００４６】
用語「アリール」とは、単独で又は組み合わせて、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル及びホルミルから独立して選択される１から３の置換基で置換されていてもよい、６から１０個の炭素環原子を含む一価の芳香族炭素環式単環又は二環系を意味する。アリールの例は、フェニル及びナフチル、特にフェニルを含む。
【００４７】
用語「ヘテロアリール」とは、単独で又は組み合わせて、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル及びホルミルから独立して選択される１から３の置換基で置換されていてもよい、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、３又は４個のヘテロ原子を含み、残りの環原子が炭素である、５から１２の環原子の一価の芳香族複素環式単環又は二環系を意味する。ヘテロアリールの例は、ピロリル、フラニル、チエニル、イミダゾリル、オキサゾリル、チアゾリル、トリアゾリル、オキサジアゾリル、チアジアゾリル、テトラゾリル、ピリジニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、トリアジニル、アゼピニル、ジアゼピニル、イソオキサゾリル、ベンゾフラニル、イソチアゾリル、ベンゾチエニル、インドリル、イソインドリル、イソベンゾフラニル、ベンズイミダゾリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾイソオキサゾリル、ベンゾチアゾリル、ベンゾイソチアゾリル、ベンゾオキサジアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾトリアゾリル、プリニル、キノリニル、イソキノリニル、キナゾリニル、キノキサリニル、カルバゾリル又はアクリジニルを含む。
【００４８】
用語「ヘテロアリール」とは、単独で又は組み合わせて、ハロゲン、ヒドロキシ、アルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシ、アルコキシアルキル、アルケニルオキシ、カルボキシル、アルコキシカルボニル、アルキルカルボニル及びホルミルから独立して選択される１から３の置換基で置換されていてもよい、Ｎ、Ｏ及びＳから選択される１、２、３又は４個のヘテロ環原子を含み、残りの環原子が炭素である、４から１２、特に４から９の環原子の一価の飽和又は部分的に不飽和の単環又は二環系を意味する。単環式飽和ヘテロシクリルの例は、アゼチジニル、ピロリジニル、テトラヒドロフラニル、テトラヒドロ−チエニル、ピラゾリジニル、イミダゾリジニル、オキサゾリジニル、イソオキサゾリジニル、チアゾリジニル、ピペリジニル、テトラヒドロピラニル、テトラヒドロチオピラニル、ピペラジニル、モルホリニル、チオモルホリニル、１，１−ジオキソ−チオモルホリン−４−イル、アゼパニル、ジアゼパニル、ホモピペラジニル又はオキサゼパニルである。二環式飽和ヘテロシクロアルキルの例は、８−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、キヌクリジニル、８−オキサ−３−アザ−ビシクロ［３．２．１］オクチル、９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル、３−オキサ−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニル又は３−チア−９−アザ−ビシクロ［３．３．１］ノニルである。部分的に不飽和のヘテロシクロアルキルの例は、ジヒドロフリル、イミダゾリニル、ジヒドロ−オキサゾリル、テトラヒドロ−ピリジニル又はジヒドロピラニルである。
【００４９】
用語「薬学的に許容される塩」は、生物学的有効性と、遊離塩基又は遊離酸の特性とを保持する塩であって、生物学的にもその他の点でも望ましくないものではないものを指す。塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等の無機酸、特に塩酸、及び酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、Ｎ−アセチルシステイン等の有機酸により形成される。さらに、これらの塩は、遊離酸に無機塩基又は有機塩基を添加することにより調製され得る。無機塩基から誘導される塩は、ナトリウム塩、カリウム塩、リチウム塩、アンモニウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩を含むが、これらに限定されない。有機塩基から誘導される塩は、一級、二級、及び三級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、環状アミン、並びにイソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、リジン、アルギニンＮ−エチルピペリジン、ピペリジン、ポリアミン樹脂等の塩基性イオン交換樹脂の塩を含むが、これらに限定されない。式（Ｉ）の化合物は、両性イオンの形態で存在することもできる。式（Ｉ）の化合物の特に好ましい薬学的に許容される塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、メタンスルホン酸の塩である。
【００５０】
用語「保護基」とは、単独で又は組み合わせて、別の非保護反応部位において選択的に化学反応が行われ得るように、多官能化合物の反応部位を選択的にブロックする基を意味する。保護基は除去され得る。例示的保護基は、アミノ保護基、カルボキシ保護基又はヒドロキシ保護基である。
【００５１】
本発明の出発物質又は化合物の一つが、安定でない又は一又は複数の反応工程の反応条件下で反応性である一又は複数の官能基を含む場合、適切な保護基（例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ及びＰ．Ｇ．Ｍ．Ｗｕｔｓによる「Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ」、第３編、１９９９、Ｗｉｌｅｙ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋに記載されているもの）を、当技術分野で周知の方法を適用する重要な工程の前に導入することができる。このような保護基は、合成の後の段階で、前記文献に記載される標準的な方法を用いて除去することができる。保護基の例は、ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル（Ｂｏｃ）、９−フルオレニルメチル  カルバメート（Ｆｍｏｃ）、２−トリメチルシリルエチル  カルバメート（Ｔｅｏｃ）、カルボベンジルオキシ（Ｃｂｚ）及びｐ−メトキシベンジルオキシカルボニル（Ｍｏｚ）である。
【００５２】
本明細書に記載されている化合物は、いくつかの不斉中心を含有することができ、光学的に純粋なエナンチオマー、エナンチオマーの混合物、例えばラセミ体、ジアステレオ異性体の混合物、ジアステレオ異性ラセミ体又はジアステレオ異性ラセミ体の混合物の形態で存在することができる。
【００５３】
用語「不斉炭素原子」とは、四つの異なる置換基を有する炭素原子を意味する。カーン・インゴルド・プレローグ順位則によれば、不斉炭素原子は、「Ｒ」又は「Ｓ」構成であり得る。
【００５４】
オリゴヌクレオチド
本明細書で使用される用語「オリゴヌクレオチド」は、二つ以上の共有結合したヌクレオシドを含む分子として当業者に一般的に理解されるように定義される。そのような共有結合ヌクレオシドは、核酸分子又はオリゴマーと称されることもあり得る。オリゴヌクレオチドは、一般的に研究室で固相化学合成とそれに続く精製によって作製される。オリゴヌクレオチドの配列について言及するとき、共有結合したヌクレオチド又はヌクレオシドの核酸塩基部分の配列若しくは順序、又はそれらの修飾について言及される。本発明のオリゴヌクレオチドは人為的なものであり、化学的に合成され、典型的には精製又は単離される。本発明のオリゴヌクレオチドは、一又は複数の修飾されたヌクレオシド又はヌクレオチドを含み得る。
【００５５】
アンチセンスオリゴヌクレオチド
本明細書で使用される「アンチセンスオリゴヌクレオチド」は、標的核酸、特に標的核酸上の連続配列にハイブリダイズすることにより、標的遺伝子の発現を調節することができるオリゴヌクレオチドとして定義される。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、本質的に二本鎖ではなく、したがってｓｉＲＮＡ又はｓｈＲＮＡではない。好ましくは、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは一本鎖である。本発明の一本鎖オリゴヌクレオチドは、その内の又はその間の自己相補性の程度がオリゴヌクレオチドの全長の５０％未満である限り、ヘアピン又は分子間二重構造（同じオリゴヌクレオチドの二つの分子間で二重）を形成することができる。
【００５６】
連続ヌクレオチド配列
用語「連続ヌクレオチド配列」は、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチドの領域を指す。この用語は、本明細書では用語「連続核酸塩基配列」及び用語「オリゴヌクレオチドモチーフ配列」と区別せずに使用される。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドのすべてのヌクレオチドは、連続ヌクレオチド配列を構成する。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、Ｆ−Ｇ−Ｆ’ギャップマー領域などの連続ヌクレオチド配列を含み、さらなるヌクレオチド、例えば、官能基を連続ヌクレオチド配列に結合するのに使用され得るヌクレオチドリンカー領域を任意で含み得る。ヌクレオチドリンカー領域は、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。
【００５７】
ヌクレオチド
ヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド及びポリヌクレオチドの構成要素であり、本発明の目的上、天然に存在するヌクレオチドと天然に存在しないヌクレオチドとの両方を含む。本来は、ヌクレオチド、例えばＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオチドは、リボース糖部分、核酸塩基部分、及び一又は複数のリン酸基（ヌクレオシドにはない）を含む。ヌクレオシド及びヌクレオチドは、区別せずに「単位」又は「モノマー」と称され得る。
【００５８】
修飾ヌクレオシド
本明細書で使用される用語「修飾ヌクレオシド」又は「ヌクレオシド修飾」は、糖部分又は（核酸）塩基部分の一又は複数の修飾の導入により、同等のＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドと比較して修飾されたヌクレオシドを指す。好ましい実施態様では、修飾ヌクレオシドは、修飾糖部分を含む。用語「修飾ヌクレオシド」は、本明細書では用語「ヌクレオシド類似体」又は修飾「単位」又は修飾「モノマー」とも区別せずに使用され得る。非修飾ＤＮＡ糖部分を有するヌクレオシド又は非修飾ＲＮＡ糖部分を有するヌクレオシドは、本明細書ではＤＮＡヌクレオシド又はＲＮＡヌクレオシドと呼ばれる。ＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの塩基領域での修飾を有するヌクレオシドは、ワトソンクリック塩基対を可能にする場合、やはりＤＮＡ又はＲＮＡと呼ばれる。
【００５９】
修飾ヌクレオシド間結合
用語「修飾ヌクレオシド結合」は、二つのヌクレオシドを互いに共有結合させるホスホジエステル（ＰＯ）結合以外の結合として当業者により一般的に理解されるように定義される。したがって、本発明のオリゴヌクレオチドは、修飾ヌクレオシド間結合を含み得る。いくつかの実施態様では、修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合と比較して、オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を増加させる。天然に存在するオリゴヌクレオチドについて、ヌクレオシド間結合は、隣接するヌクレオシドとの間にホスホジエステルを作成するリン酸基を含む。修飾ヌクレオシド間結合は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のためにオリゴヌクレオチドを安定化するのに特に有用であり、本発明のオリゴヌクレオチドのＤＮＡ又はＲＮＡヌクレオシドの領域、例えば、ギャップマーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内、並びに修飾ヌクレオシドの領域、例えば領域Ｆ及びＦ’中でのヌクレアーゼ切断に対して保護するように機能し得る。
【００６０】
ある実施態様では、オリゴヌクレオチドは、例えば、ヌクレアーゼ攻撃に対してより耐性がある、一又は複数の修飾ヌクレオシド間結合などの、天然ホスホジエステルから修飾された一又は複数のヌクレオシド間結合を含む。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを血清中でインキュベートすることにより、又はヌクレアーゼ耐性アッセイ（例えば、ヘビ毒ホスホジエステラーゼ（ＳＶＰＤ））を使用することにより（どちらも当該技術分野でよく知られる）、決定され得る。オリゴヌクレオチドのヌクレアーゼ耐性を向上させることができるヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合と称される。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％は修飾され、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０又は例えば少なくとも９０％は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合のすべては、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では本発明のオリゴヌクレオチドを非ヌクレオチド官能基、例えばコンジュゲートに結合させるヌクレオシドは、ホスホジエステルであり得ることが認識される。
【００６１】
好ましい修飾ヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートである。
【００６２】
ホスホロチオエートヌクレオシド間結合は、ヌクレアーゼ耐性、有益な薬物動態及び製造の容易さにより、特に有用である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の少なくとも５０％はホスホロチオエートであり、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合の例えば少なくとも６０％、例えば少なくとも７０％、例えば少なくとも８０％又は例えば少なくとも９０％は、ホスホロチオエートである。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列中のヌクレオシド間結合のすべては、ホスホロチオエートである。
【００６３】
ホスホロチオエート結合などのヌクレアーゼ耐性結合は、ギャップマーの領域Ｇなど、標的核酸と二本鎖を形成するときにヌクレアーゼを動員することができるオリゴヌクレオチド領域において特に有用である。しかしながら、ホスホロチオエート結合は、非ヌクレアーゼ動員領域及び／又は親和性向上領域、例えばギャップマーのＦ及びＦ’領域においても有用であり得る。ギャップマーオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施態様では、領域Ｆ若しくはＦ’、又は領域ＦとＦ’の両方に一又は複数のホスホジエステル結合を含む場合があり、領域Ｇのヌクレオシド間結合は完全にホスホロチオエートであり得る。
【００６４】
有利には、オリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列中のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【００６５】
ＥＰ２７４２１３５で開示されるように、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、他のヌクレオシド間結合（ホスホジエステル及びホスホロチオエート以外）、例えばアルキル  ホスホネート／メチル  ホスホネートヌクレオシド間結合を含んでもよく、ＥＰ２７４２１３５によれば、例えば他のＤＮＡホスホロチオエートギャップ領域で許容され得る。
【００６６】
核酸塩基
核酸塩基という用語は、核酸ハイブリダイゼーションにおいて水素結合を形成するヌクレオシド及びヌクレオチドに存在するプリン（例えば、アデニン及びグアニン）及びピリミジン（例えば、ウラシル、チミン及びシトシン）部分を含む。本発明に関連して、核酸塩基という用語は、天然に存在する核酸塩基とは異なり得るが、核酸ハイブリダイゼーションの間に官能性である修飾核酸塩基も包含する。これに関連して、「核酸塩基」は、アデニン、グアニン、シトシン、チミジン、ウラシル、キサンチン及びヒポキサンチンなどの天然に存在する核酸塩基と、天然に存在しない変異体との両方を指す。そのような変異体は、例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1に記載されている。
【００６７】
いくつかの実施態様では、核酸塩基部分は、プリン又はピリミジンを、修飾プリン又はピリミジン、例えば置換プリン又は置換ピリミジン、例えばイソシトシン、プソイドイソシトシン、５−メチル  シトシン、５−チオゾロ−シトシン、５−プロピニル−シトシン、５−プロピニル−ウラシル、５−ブロモウラシル  ５−チアゾロ−ウラシル、２−チオ−ウラシル、２’チオ−チミン、イノシン、ジアミノプリン、６−アミノプリン、２−アミノプリン、２，６−ジアミノプリン及び２−クロロ−６−アミノプリンから選択される核酸塩基に変化させることにより、修飾される。
【００６８】
核酸塩基部分は、対応する各核酸塩基の文字コード、例えばＡ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、又はＵで示される場合があり、ここで各文字には、同等の機能の修飾核酸塩基が任意で含まれる場合がある。例えば、例示的なオリゴヌクレオチドでは、核酸塩基部分は、Ａ、Ｔ、Ｇ、Ｃ、及び５−メチル  シトシンから選択される。場合によっては、ＬＮＡギャップマーについて、５−メチル  シトシン  ＬＮＡヌクレオシドが使用され得る。
【００６９】
修飾オリゴヌクレオチド
修飾オリゴヌクレオチドという用語は、一又は複数の糖修飾ヌクレオシド及び／又は修飾ヌクレオシド間結合を含むオリゴヌクレオチドを説明する。キメラオリゴヌクレオチドという用語は、修飾ヌクレオシドを有するオリゴヌクレオチドを記載する文献において使用された用語である。
【００７０】
相補性
用語「相補性」は、ヌクレオシド／ヌクレオチドのワトソンクリック塩基対の能力を説明する。ワトソンクリック塩基対は、グアニン（Ｇ）−シトシン（Ｃ）及びアデニン（Ａ）−チミン（Ｔ）／ウラシル（Ｕ）である。オリゴヌクレオチドは、修飾核酸塩基を有するオリゴヌクレオチドを含んでもよく、例えば５−メチル  シトシンはシトシンの代わりに使用されることが多く、相補性という用語は、非修飾核酸塩基と修飾核酸塩基との間のワトソンクリック塩基対を包含することが理解される（例えば、Hirao et al (2012) Accounts of Chemical Research vol 45 page 2055及びBergstrom (2009) Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry Suppl. 37 1.4.1を参照）。
【００７１】
本明細書で使用される用語「％相補的」とは、別個の核酸分子（例えば、標的核酸）の所与の位置で、所与の位置で連続ヌクレオチド配列に相補的である（すなわち、それとワトソンクリック塩基対を形成する）核酸分子（例えば、オリゴヌクレオチド）における連続ヌクレオチド配列のパーセントでのヌクレオチド数を指す。百分率は、二つの配列（標的配列５’−３’及び３’−５’からのオリゴヌクレオチド配列）間の対を形成する整列塩基の数を数え、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの合計数で割り、１００を掛けることにより計算される。そのような比較において、整列しない（塩基対を形成する）核酸塩基／ヌクレオチドはミスマッチと呼ばれる。好ましくは、挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の％相補性の計算には許可されない。
【００７２】
用語「完全に相補的」とは、１００％の相補性を指す。
【００７３】
同一性
本明細書で使用される用語「同一性」とは、連続ヌクレオチド配列全体で参照配列（例えば配列モチーフ）と同一である核酸分子（例えばオリゴヌクレオチド）中の連続ヌクレオチド配列のヌクレオチドの割合（パーセントで表す）を指す。よって、同一性の百分率は、二つの配列間で（本発明の化合物の連続ヌクレオチド配列中及び参照配列中）同一である整列塩基の数（マッチ）を数え、オリゴヌクレオチド中のヌクレオチドの合計数で割り、１００を掛けることにより、計算される。したがって、同一性の百分率＝（マッチ×１００）／整列領域（例えば連続ヌクレオチド配列）の長さである。挿入及び欠失は、連続ヌクレオチド配列の同一性の百分率の計算には許可されない。同一性の決定において、ワトソンクリック塩基対を形成するための核酸塩基の機能的能力が保持される限り（例えば、５−メチル  シトシンは、％同一性を計算する目的でシトシンと同一であると考えられる）、核酸塩基の化学修飾は無視されることが理解される。
【００７４】
ハイブリダイゼーション
本明細書で使用される用語「ハイブリダイズすること」又は「ハイブリダイズする」とは、逆鎖の塩基対間の水素結合を形成し、それにより二本鎖を形成する二本の核酸鎖（例えばオリゴヌクレオチド及び標的核酸）として理解される。二本の核酸鎖間の結合親和性は、ハイブリダイゼーションの強度である。オリゴヌクレオチドの半分が標的核酸と二本鎖になる温度として定義される融解温度（Ｔｍ）に関して、記載されることが多い。生理的条件では、Ｔｍは親和性に厳密に比例しない（Mergny and Lacroix, 2003, Oligonucleotides 13:515-537）。標準状態のギブズ自由エネルギーΔＧ°は、結合親和性のより正確な表現であり、ΔＧ°＝−ＲＴｌｎ（Ｋｄ）（ここで、Ｒは気体定数であり、Ｔは絶対温度である）により反応の解離定数（Ｋｄ）に関する。したがって、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間の反応のΔＧ°が非常に低い場合、オリゴヌクレオチドと標的核酸との間のハイブリダイゼーションが強いことを反映している。ΔＧ°は、水性濃度が１Ｍ、ｐＨが７、温度が３７℃の反応に関連付けられるエネルギーである。オリゴヌクレオチドの標的核酸へのハイブリダイゼーションは自発反応であり、自発反応の場合、ΔＧ°はゼロ未満である。ΔＧ°は、例えば、Hansen et al., 1965, Chem. Comm. 36-38及びHoldgate et al., 2005, Drug Discov Todayに記載されるような等温滴定熱量（ＩＴＣ）法の使用により、実験的に測定することができる。当業者は、市販の機器がΔＧ°の測定に利用可能であることを認識する。ΔＧ°はまた、Sugimoto et al., 1995, Biochemistry 34:11211-11216 and McTigue et al., 2004, Biochemistry 43:5388-5405に記載の適切に誘導された熱力学パラメータを使用して、SantaLucia, 1998, Proc Natl Acad Sci USA. 95: 1460-1465に記載の隣接モデルを使用することにより、数値的に推定することができる。ハイブリダイゼーションにより意図された核酸標的を調節する可能性を有するために、本発明のオリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド長が１０−３０のオリゴヌクレオチドについて、推定ΔＧ°値−１０ｋｃａｌ未満で標的核酸にハイブリダイズする。いくつかの実施態様では、ハイブリダイゼーションの程度又は強度は、標準状態のギブズ自由エネルギーΔＧ°により測定される。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチド長が８−３０のオリゴヌクレオチドについて、推定ΔＧ°値−１０ｋｃａｌ未満、例えば−１５ｋｃａｌ未満、例えば−２０ｋｃａｌ未満、例えば−２５ｋｃａｌの範囲で標的核酸にハイブリダイズし得る。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、−１０から−６０ｋｃａｌ、例えば−１２から−４０、例えば−１５から−３０ｋｃａｌ又は−１６から−２７ｋｃａｌ、例えば−１８から−２５ｋｃａｌの推定ΔＧ°値で標的核酸にハイブリダイズする。
【００７５】
標的核酸
本発明によれば、標的核酸は、哺乳動物ＳＲＥＢＰ１をコードし、例えば、遺伝子、ＳＲＥＢＦ１  ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、プレｍＲＮＡ、成熟ｍＲＮＡ又はｃＤＮＡ配列であり得る核酸である。したがって、標的は、ＳＲＥＢＰ１標的核酸と称され得る。
【００７６】
適切には、標的核酸は、ＳＲＥＢＰ１タンパク質、特に哺乳動物ＳＲＥＢＰ１、例えばヒトＳＲＥＢＰ１ａ又はＳＲＥＢＰ１ｃ、例えば、配列番号１９、２０、２１又は２２として本明細書で提供されるプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ配列をコードするヒトＳＲＥＢＰ１をコードする。
【００７７】
いくつかの実施様態では、標的核酸は、配列番号１９若しくは２０又はその天然に存在する変異体（例えば哺乳動物ＳＲＥＢＰ１タンパク質をコードするＳＲＥＢＦ１配列）からなる群より選択される。
【００７８】
標的核酸の研究又は診断に本発明のオリゴヌクレオチドを用いる場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ由来の合成核酸であり得る。
【００７９】
ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏでの用途について、本発明のオリゴヌクレオチドは、典型的に、ＳＲＥＢＦ１標的核酸を発現している細胞におけるＳＲＥＢＦ１標的核酸の発現を阻害することができる。本発明のオリゴヌクレオチドの核酸塩基の連続配列は、場合によってはオリゴヌクレオチドを任意選択的な官能基、例えばコンジュゲート、又は他の非相補的な末端ヌクレオチド（例えば領域Ｄ’又はＤ’’）に連結し得るヌクレオチドベースのリンカー領域を除き、場合によっては一つ又は二つのミスマッチの例外を有し、オリゴヌクレオチドの長さにわたって測定して、典型的にはＳＲＥＢＦ１標的核酸に相補的である。標的核酸は、ヒトＳＲＥＢＰ１、例えば配列番号１９に開示されるようなヒトＳＲＥＢＦ１プレｍＲＮＡ配列、又は又は配列番号２０、２１若しくは２２に開示されるようなＳＲＥＢＦ１  成熟ｍＲＮＡ等の哺乳動物ＳＲＥＢＰ１タンパク質をコードする成熟ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ等のメッセンジャーＲＮＡである。配列番号１９−２２はＤＮＡ配列であり、標的ＲＮＡ配列は、チミジン塩基（Ｔ）の代わりにウラシル（Ｕ）塩基を有することが理解される。
2021511029.tif 000002
【００８０】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号１９を標的とする。
【００８１】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号２０を標的とする。
【００８２】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号２１を標的とする。
【００８３】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号２２を標的とする。
【００８４】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号１９、並びに配列番号２０、２１及び２２の少なくとも一つ、例えば二つ又は三つを標的とする。
【００８５】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号１９、２０、２１及び２２を標的とする。
【００８６】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号１９、２０及び２１を標的とする。
【００８７】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは配列番号１９、２０及び２２を標的とする。
【００８８】
標的配列
本明細書で使用される用語「標的配列」とは、本発明のオリゴヌクレオチドに相補的な核酸塩基配列を含む標的核酸に存在するヌクレオチドの配列を指す。いくつかの実施態様では、標的配列は、本発明のオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列に相補的な標的核酸上の領域からなる。いくつかの実施態様では、標的配列は、単一のオリゴヌクレオチドの相補的配列よりも長く、例えば本発明のいくつかのオリゴヌクレオチドによって標的とされ得る標的核酸の好ましい領域を表し得る。
【００８９】
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えば標的核酸のサブ配列、例えば本明細書に記載の標的配列に対して相補的であるか又はそれにハイブリダイズする連続ヌクレオチド領域を含む。
【００９０】
オリゴヌクレオチドは、標的核酸分子に存在する標的配列に相補的な連続ヌクレオチド配列を含む。連続ヌクレオチド配列（したがって標的配列）は、少なくとも１０の連続ヌクレオチド、例えば９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９又は３０の連続ヌクレオチド、例えば１２−２５、例えば１４−１８の連続ヌクレオチドを含む。
【００９１】
標的細胞
本明細書で使用される用語「標的細胞」とは、標的核酸を発現している細胞を指す。いくつかの実施態様では、標的細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏであり得る。いくつかの実施態様では、標的細胞は、哺乳動物細胞、例えば、げっ歯類、例えばマウス細胞若しくはラット細胞、又は霊長類細胞、例えばサル細胞若しくはヒト細胞である。
【００９２】
好ましい実施態様では、標的細胞は、ＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡ、例えばＳＲＥＢＦ１  プレｍＲＮＡ、例えば配列番号１９、又はＳＲＥＢＦ１  成熟ｍＲＮＡ（例えば配列番号２０、２１又は２２）を発現する。ＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡのポリＡテールは、典型的には、アンチセンスオリゴヌクレオチド標的化について無視される。
【００９３】
天然に存在する変異体
用語「天然に存在する変異体」とは、標的核酸と同じ遺伝子座に由来するＳＲＥＢＦ１遺伝子又は転写物の変異体ではあるが、例えば、遺伝情報の縮重によって同じアミノ酸をコードする多様なコドンを生じさせるのが原因で、あるいは、プレｍＲＮＡの選択的スプライシング、又は一塩基多型（ＳＮＰ）などの多型、及び対立遺伝子の変異体の存在が原因で、異なり得るものを指す。したがって、オリゴヌクレオチドに対して十分に相補的な配列の存在に基づき、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸及び天然に存在する変異体を標的とし得る。
【００９４】
ホモサピエンスＳＲＥＢＦ１遺伝子は、染色体１７、１７８１１３４９…１７８３７０１７、補体（ＮＣ＿００００１７．１１、Ｇｅｎｅ  ＩＤ  ６７２０）に位置する。
【００９５】
いくつかの実施態様では、天然に存在する変異体は、哺乳動物ＳＲＥＢＦ１標的核酸、例えば配列番号１９、２０、２１又は２２からなる群より選択される標的核酸に対して少なくとも９５％、例えば少なくとも９８％又は少なくとも９９％の相同性を有する。いくつかの実施態様では、天然に存在する変異体は、配列番号１９のヒトＳＲＥＢＦ１標的核酸に対して少なくとも９９％の相動性を有する。
【００９６】
発現の調節
本明細書で使用される用語「発現の調節」は、オリゴヌクレオチドの投与前のＳＲＥＢＰ１又はＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡの量と比較して、ＳＲＥＢＰ１タンパク質又はＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡの量を変化させるオリゴヌクレオチドの能力についての総称として理解すべきである。あるいは、発現の調節は、コントロール実験を参照することにより決定され得る。概して、コントロールは、生理食塩水組成物で処理された個体若しくは標的細胞、又は非標的化オリゴヌクレオチド（ｍｏｃｋ）で処理された個体若しくは標的細胞であることが理解される。
【００９７】
１つのタイプの調節は、オリゴヌクレオチドが例えばＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡの分解によってＳＲＥＢＰ１の発現を阻害、下方制御、減少、抑制、除去、中断、ブロック、防止、低減、低下、回避又は停止させる能力である。
【００９８】
高親和性修飾ヌクレオシド
オリゴヌクレオチド内に組み込まれた場合、例えば融解温度（Ｔｍ）で測定されるように、その相補的標的に対するオリゴヌクレオチドの親和性を増強させる修飾ヌクレオチドである。本発明の高親和性修飾ヌクレオシドは、融解温度を、好ましくは修飾ヌクレオシド当たり＋０．５から＋１２℃の間、より好ましくは＋１．５から＋１０℃の間、最も好ましくは＋３から＋８℃の間上昇させる。多数の高親和性修飾ヌクレオシドが当技術分野で知られており、たとえば、多くの２’置換ヌクレオシド及びロックド核酸（ＬＮＡ）が含まれる（例えば、Freier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213を参照）。
【００９９】
糖修飾
本発明のオリゴマーは、ＤＮＡ及びＲＮＡに見られるリボース糖残基と比較して、修飾糖部分、すなわち糖部分の修飾を有する一又は複数のヌクレオシドを含み得る。
【０１００】
主に親和性及び／又はヌクレアーゼ耐性などのオリゴヌクレオチドの特定の特性を改善することを目的に、リボース糖部分の修飾を有する多数のヌクレオシドが製造されてきた。
【０１０１】
そのような修飾としては、リボース環構造が修飾されているもの、例えばヘキソース環（ＨＮＡ）若しくは二環式環で置換したもの）、典型的には、リボース環（ＬＮＡ）上のＣ２炭素とＣ４炭素との間のビラジカル（ｂｉｒａｄｉｃｌｅ）架橋、又は典型的にはＣ２炭素とＣ３炭素との間の結合を欠く非結合リボース環（例えばＵＮＡ）を有するものが含まれる。他の糖修飾ヌクレオシドには、例えば、ビシクロヘキソース核酸（国際公開第２０１１／０１７５２１号）又は三環式核酸（国際公開第２０１３／１５４７９８号）が含まれる。修飾ヌクレオシドは、例えばペプチド核酸（ＰＮＡ）又はモルホリノ核酸の場合に糖部分が非糖部分で置き換えられるヌクレオシドも含む。
【０１０２】
糖修飾はまた、リボース環上の置換基を水素以外の基、又はＤＮＡ及びＲＮＡヌクレオシドにおいて天然に見出される２’−ＯＨ基に変更することを介してなされた修飾も含む。置換基は、例えば２’、３’、４’又は５’位に導入され得る。
【０１０３】
２’糖修飾ヌクレオシド
２’糖修飾ヌクレオシドは、２’位にＨ又は−ＯＨ以外の置換基を有する（２’置換ヌクレオシド）か又はリボース環で２’炭素と第２の炭素との間に架橋を形成することができる２’結合ビラジカル（ｂｉｒａｄｉｃｌｅ）を含むヌクレオシド、例えばＬＮＡ（２’−４’ビラジカル架橋）ヌクレオシドである。
【０１０４】
実際、２’置換ヌクレオシドの開発に多くの焦点が費やされており、オリゴヌクレオチドに組み込むと、多数の２’置換ヌクレオシドが有益な特性を有することがわかった。例えば、２’修飾糖は、結合親和性の向上及び／又はオリゴヌクレオチドに対するヌクレアーゼ耐性の増加を提供し得る。２’置換修飾ヌクレオシドの例は、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ  （ＭＯＥ）、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＲＮＡ、及び２’−Ｆ−ＡＮＡ  ヌクレオシドである。さらなる例については、例えばFreier & Altmann; Nucl. Acid Res., 1997, 25, 4429-4443、及びUhlmann; Curr. Opinion in Drug Development, 2000, 3(2), 293-213、及びDeleavey and Damha, Chemistry and Biology 2012, 19, 937を参照のこと。以下は、いくつかの２’置換修飾ヌクレオシドの説明である。
2021511029.tif 000003
【０１０５】
本発明に関して、２’置換は、ＬＮＡのような２’架橋分子を含まない。
【０１０６】
ロックド核酸（ＬＮＡ）
「ＬＮＡヌクレオシド」は、ヌクレオチドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’とのビラジカル結合（「２’−４’ブリッジ」とも呼ばれる）を含む２’修飾ヌクレオシドであり、これはリボース環の構造を制限又はロックする。これらのヌクレオシドは、文献中で架橋核酸又は二環式核酸（ＢＮＡ）とも称されている。リボースのコンフォメーションのロックは、ＬＮＡが相補的ＲＮＡ又はＤＮＡ分子のオリゴヌクレオチドに組み込まれる場合、ハイブリダイゼーションの親和性の強化（二重安定化）に関連している。これは、オリゴヌクレオチド／補体二重鎖の融解温度を測定することにより、日常的に決定することができる。
【０１０７】
非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、国際公開第９９／０１４２２６号、同第００／６６６０４号、同第９８／０３９３５２号、同第２００４／０４６１６０号、同第００／０４７５９９号、同第２００７／１３４１８１号、同第２０１０／０７７５７８号、同第２０１０／０３６６９８号、同第２００７／０９００７１号、同第２００９／００６４７８号、同第２０１１／１５６２０２号、同第２００８／１５４４０１号、同第２００９／０６７６４７号、同第２００８／１５０７２９号、Morita et al., Bioorganic & Med.Chem. Lett. 12, 73-76、Seth et al. J. Org. Chem. 2010, Vol 75(5) pp. 1569-81、及びMitsuoka et al., Nucleic Acids Research 2009, 37(4), 1225-1238、及びWan and Seth, J. Medical Chemistry 2016, 59, 9645-9667に開示されている。
【０１０８】
さらなる非限定的で例示的なＬＮＡヌクレオシドは、スキーム１で開示される。
【０１０９】
2021511029.tif 000004
特定のＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ、６’−メチル−ベータ−Ｄ−オキシ  ＬＮＡ、例えば（Ｓ）−６’−メチル−ベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ（ＳｃＥＴ）及びＥＮＡである。
【０１１０】
特定の有利なＬＮＡはベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡである。
【０１１１】
ＲＮａｓｅ  Ｈ活性及び動員
アンチセンスオリゴヌクレオチドのＲＮａｓｅ  Ｈ活性は、相補的ＲＮＡ分子を有する二本鎖における場合のＲＮａｓｅ  Ｈを動員する能力を指す。国際公開第０１／２３６１３号は、ＲＮａｓｅＨ活性を決定するためのｉｎ  ｖｉｔｒｏ法を提供し、これはＲＮａｓｅＨを動員する能力を決定するのに使用され得る。典型的には、オリゴヌクレオチドは、相補的標的核酸配列が提供された場合、ｐｍｏｌ／ｌ／ｍｉｎで測定して、試験されている修飾オリゴヌクレオチドと同じ塩基配列を有するが、オリゴヌクレオチド中のすべてのモノマー間にホスホロチオエート結合を有するＤＮＡモノマーのみを含有するオリゴヌクレオチドを使用し、国際公開第０１／２３６１３号の実施例９１−９５（参照により本明細書に援用）により提供される方法を使用するときに決定される初期速度の少なくとも５％、例えば、初期速度の少なくとも１０％又は２０％以上の初期速度を有する場合、ＲＮａｓｅ  Ｈを動員することができるとみなされる。ＲＨａｓｅ  Ｈ活性の決定における使用については、組み換えヒトＲＮａｓｅ  Ｈ１は、Ｌｕｂｉｏ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ＧｍｂＨ、Ｌｕｃｅｒｎｅ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄから入手可能である。
【０１１２】
ギャップマー
本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマーであり得る。アンチセンスギャップマーは、ＲＮａｓｅ  Ｈ媒介分解を介した分解により標的核酸を阻害するのに通常使用される。ギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドは、少なくとも三つの異なる構造領域５’−フランク、ギャップ及び３’−フランク、Ｆ−Ｇ−Ｆ’を「５→３」の配向で含む。「ギャップ」領域（Ｇ）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅ  Ｈを動員するのを可能にする連続ＤＮＡヌクレオチドのストレッチを含む。ギャップ領域は、一又は複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高い親和性糖修飾ヌクレオシドを含む５’フランク領域（Ｆ）により、及び一又は複数の糖修飾ヌクレオシド、有利には高親和性糖修飾ヌクレオシドを含む３’フランク領域（Ｆ’）により、フランクされる。領域Ｆ及びＦ’の一又は複数の糖修飾ヌクレオシドは、標的核酸に対するオリゴヌクレオチドの親和性を向上させる（すなわち、該糖修飾ヌクレオシドは、親和性向上糖修飾ヌクレオシドである）。いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の一又は複数の糖修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡ及び２’−ＭＯＥから独立して選択されるような高親和性２’糖修飾のような２’糖修飾ヌクレオシドである。
【０１１３】
ギャップマーデザインにおいて、ギャップ領域の５’及び３’モストヌクレオシドはＤＮＡヌクレオシドであり、それぞれ５’（Ｆ）又は３’（Ｆ’）領域の糖修飾ヌクレオシドに隣接して位置する。フランクは、ギャップ領域から最も離れた末端、すなわち５’フランクの５’末端及び３’フランクの３’末端に少なくとも一つの糖修飾ヌクレオシドを有することにより、さらに規定され得る。
【０１１４】
領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’は連続ヌクレオチド配列を形成する。本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド、又はその連続ヌクレオチド配列は、式Ｆ−Ｇ−Ｆ’のギャップマー領域を含み得る。
【０１１５】
ギャップマーデザインＦ−Ｇ−Ｆ’の全長は、例えば１２から３２ヌクレオシド、例えば１３から２４、例えば１４から２２ヌクレオシド、例えば１４から１７、例えば１６から１８ヌクレオシドであり得る。
【０１１６】
例として、本発明のギャップマーオリゴヌクレオチドは、以下の式で表すことができる：
Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’１−８、例えば
Ｆ１−８−Ｇ７−１６−Ｆ’２−８
ただし、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長が少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチドの長さであることを条件とする。
【０１１７】
領域Ｆ、Ｇ及びＦ’は、以下でさらに規定され、式Ｆ−Ｇ−Ｆ’に組み込むことができる。
【０１１８】
ギャップマー領域Ｇ
ギャップマーの領域Ｇ（ギャップ領域）は、オリゴヌクレオチドがＲＮａｓｅＨ、例えばヒトＲＮａｓｅ  Ｈ１、典型的にはＤＮＡヌクレオシドを動員することを可能にするヌクレオシドの領域である。ＲＮａｓｅＨは、ＤＮＡとＲＮＡとの間の二本鎖を認識し、ＲＮＡ分子を酵素的に切断する細胞酵素である。適切には、ギャップマーは、少なくとも５又は６の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば５−１６の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば６−１５の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば７−１４の連続ＤＮＡヌクレオシド、例えば８−１２の連続ＤＮＡヌクレオチド、例えば８−１２の連続ＤＮＡヌクレオチドの長さのギャップ領域（Ｇ）を有し得る。いくつかの実施態様では、ギャップ領域Ｇは、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６の連続ＤＮＡヌクレオシドからなり得る。いくつかの実施態様では、ギャップ領域中の一又は複数のシトシン（Ｃ）ＤＮＡは、メチル化されてもよく（例えば、ＤＮＡ  ｃの後にＤＮＡ  ｇが続くとき）、そのような残基は、５−メチル−シトシン（ｍｅＣ）と注釈付けられる。いくつかの実施態様では、ギャップ領域Ｇは、ＤＮＡヌクレオシドに結合した６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６の連続ホスホロチオエートからなり得る。いくつかの実施態様では、ギャップ中のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエート結合である。
【０１１９】
従来のギャップマーはＤＮＡギャップ領域を有するが、ギャップ領域内で使用されたときにＲＮａｓｅＨの動員を可能にする修飾ヌクレオシドの多くの例がある。ギャップ領域内に含まれるときにＲＮａｓｅＨを動員することができると報告された修飾ヌクレオシドは、例えば、アルファ−Ｌ−ＬＮＡ、Ｃ４’アルキル化ＤＮＡ（ＰＣＴ／ＥＰ２００９／０５０３４９及びVester et al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 18 (2008) 2296-2300に記載。どちらも参照により本明細書に援用される）、ＡＮＡのようなアラビノース由来のヌクレオシド及び２’Ｆ−ＡＮＡ（Mangos et al. 2003 J. AM. CHEM. Soc. 125, 654-661）、ＵＮＡ（非ロックド核酸）（参照により本明細書に援用されるFluiter et al., Mol. Biosyst., 2009, 10, 1039に記載）を含む。ＵＮＡは、非ロックド「糖」残基を形成する、典型的にはリボースのＣ２とＣ３との間の結合が除去された非ロックド核酸である。そのようなギャップマーに使用される修飾ヌクレオシドは、ギャップ領域に導入されるときに２’内部（ＤＮＡ様）構造を採用するヌクレオシドであり得る（すなわち、ＲＮａｓｅＨ動員を可能にする修飾）。いくつかの実施態様では、本明細書に記載のＤＮＡギャップ領域（Ｇ）は、場合によっては、ギャップ領域内に導入されるときに２’内部（ＤＮＡ様）構造を採用する１から３の糖修飾ヌクレオシドを含有してもよい。
【０１２０】
領域Ｇ「ギャップブレーカー」
あるいは、あるＲＮａｓｅＨ活性を保持しながらギャップマーのギャップ領域に３’エンドコンフォメーションをもたらす修飾ヌクレオシドの挿入の数多くの報告がなされている。一又は複数の３’エンド修飾ヌクレオシドを含むギャップ領域を有するそのようなギャップマーは、「ギャップブレーカー」又は「ギャップ破壊」ギャップマーと称される。例えば国際公開第２０１３／０２２９８４号を参照のこと。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドは、ギャップ領域内にＤＮＡヌクレオシドの十分な領域を保持し、ＲＮａｓｅＨの動員を可能にする。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドデザインのＲＮａｓｅＨを動員する能力は、典型的には、配列又は化合物固有である（Rukov et al. 2015 Nucl. Acids Res. Vol. 43 pp. 8476-8487を参照、この文献は、場合によっては標的ＲＮＡのより特異的な切断を提供するＲＮａｓｅＨを動員する「ギャップブレーカー」オリゴヌクレオチドを開示する）。ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドのギャップ領域内で使用される修飾ヌクレオシドは、例えば、３’エンドコンフォメーション（ｃｏｎｆｉｒｍａｔｉｏｎ）、例えば２’−Ｏ−メチル（ＯＭｅ）若しくは２’−Ｏ−ＭＯＥ（ＭＯＥ）ヌクレオシド、又はベータ−Ｄ  ＬＮＡ  ヌクレオシド（ヌクレオシドのリボース糖環のＣ２’とＣ４’との間の架橋はベータコンフォメーションである）、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ又はＳｃＥＴ  ヌクレオシドをもたらす修飾ヌクレオシドであってもよい。
【０１２１】
上記の領域Ｇを含有するギャップマーと同様に、ギャップブレーカー又はギャップ破壊ギャップマーのギャップ領域は、ギャップの５’末端（領域Ｆの３’ヌクレオシドに隣接）にＤＮＡヌクレオシドを、及びギャップの３’末端（領域Ｆ’の５’ヌクレオシドに隣接）にＤＮＡヌクレオシドを有する。破壊ギャップを含むギャップマーは、典型的には、ギャップ領域の５’末端又は３’末端のいずれかに少なくとも３又は４の連続ＤＮＡヌクレオシドの領域を保持する。
【０１２２】
ギャップブレーカーオリゴヌクレオチドの例示的なデザインは、
Ｆ１−８−［Ｄ３−４−Ｅ１−Ｄ３−４］−Ｆ’１−８
Ｆ１−８−［Ｄ１−４−Ｅ１−Ｄ３−４］−Ｆ’１−８
Ｆ１−８−［Ｄ３−４−Ｅ１−Ｄ１−４］−Ｆ’１−８
を含み、
ここで、領域Ｇは、ブラケット［Ｄｎ−Ｅｒ−Ｄｍ］内にあり、Ｄは、ＤＮＡヌクレオシドの連続配列であり、Ｅは、修飾ヌクレオシド（ギャップブレーカー又はギャップ破壊ヌレオシド）であり、Ｆ及びＦ’は、本明細書に規定されるフランク領域であり、ただし、ギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’の全長が少なくとも１２、例えば少なくとも１４ヌクレオチドの長さであることを条件とする。
【０１２３】
いくつかの実施態様では、ギャップ破壊ギャップマーの領域Ｇは、少なくとも、６のＤＮＡヌクレオシド、例えば６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５又は１６のＤＮＡヌクレオシドを含む。上に記載するように、ＤＮＡヌクレオシドは連続的であってもよく、場合によっては一又は複数の修飾ヌクレオシドが組み入れられていてもよいが、ギャップ領域ＧがＲＮａｓｅＨの動員を媒介することができることを条件とする。
【０１２４】
ギャップマーフランク領域、Ｆ及びＦ’
領域Ｆは、領域Ｇの５’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に位置する。領域Ｆの３’モストヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド又はＬＮＡヌクレオシドである。
【０１２５】
領域Ｆ’は、領域Ｇの３’ＤＮＡヌクレオシドのすぐ隣に位置する。領域Ｆ’の５’モストヌクレオシドは、糖修飾ヌクレオシド、例えば高親和性糖修飾ヌクレオシド、例えば２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシド又はＬＮＡヌクレオシドである。
【０１２６】
領域Ｆは、１−８の連続ヌクレオチドの長さ、例えば２−６、例えば３−４の連続ヌクレオチドの長さである。有利には、領域Ｆの５’モストヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆの二つの５’モストヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆの５’モストヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆの二つの５’モストヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆの二つの５’モストヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば二つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆの５’モストヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。
【０１２７】
領域Ｆ’は、２−８の連続ヌクレオチドの長さ、例えば３−６、例えば４−５の連続ヌクレオチドの長さである。有利には、領域Ｆ’の３’モストヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’の二つの３’モストヌクレオシドは糖修飾ヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’の二つの３’モストヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’の３’モストヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’の二つの３’モストヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシドヌクレオシド、例えば二つの３’ＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’の３’モストヌクレオシドは、２’置換ヌクレオシド、例えばＭＯＥヌクレオシドである。
【０１２８】
領域Ｆ又はＦ’の長さが一であるとき、有利にはＬＮＡヌクレオシドであることに留意すべきである。
【０１２９】
いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、糖修飾ヌクレオシドの連続配列からなるか、又はそれを含む。いくつかの実施態様では、領域Ｆの糖修飾ヌクレオシドは、独立して、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、ＬＮＡ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位から選択され得る。
【０１３０】
いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、ＬＮＡ及び２’置換修飾ヌクレオシド（混合ウィングデザイン）の両方を含む。
【０１３１】
いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’は、一タイプの糖修飾ヌクレオシドのみ、例えばＭＯＥのみ又はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡのみ又はＳｃＥＴのみからなる。そのようなデザインは、均一フランク又は均一ギャップマーデザインとも呼ばれる。
【０１３２】
いくつかの実施態様では、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’のヌクレオシドのすべては、ＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡ又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択される。いくつかの実施態様では、領域Ｆは、１−５、例えば２−４、例えば３−４、例えば１、２、３、４又は５の連続ＬＮＡヌクレオシドからなる。いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’のすべてのヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドである。
【０１３３】
いくつかの実施態様では、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’のヌクレオシドのすべては、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆは、１、２、３、４、５、６、７、又は８の連続ＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなる。いくつかの実施態様では、フランク領域の一つのみが、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなることができる。いくつかの実施態様では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなるのは５’（Ｆ）フランク領域であるが、３’（Ｆ’）フランク領域は、少なくとも一つのＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドを含む。いくつかの実施態様では、２’置換ヌクレオシド、例えばＯＭｅ又はＭＯＥヌクレオシドからなるのは３’（Ｆ’）フランク領域であるが、５’（Ｆ）フランク領域は、少なくとも一つのＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド又はｃＥＴヌクレオシドを含む。
【０１３４】
いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’のすべての修飾ヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えば、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡ、ＥＮＡ又はＳｃＥＴヌクレオシドから独立して選択され、ここで、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’は、場合によってはＤＮＡクレオシド（交互フランク、より詳細にはこれらの定義を参照）。いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’のすべての修飾ヌクレオシドはベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、ここで、領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦ及びＦ’は、場合によってはＤＮＡクレオシド（交互フランク、より詳細にはこれらの定義を参照）。
【０１３５】
いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の５’モスト及び３’モストヌクレオシドは、ＬＮＡヌクレオシド、例えばベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシド又はＳｃＥＴヌクレオシドである。
【０１３６】
いくつかの実施態様では、領域Ｆと領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’と領域Ｇとの間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。いくつかの実施態様では、領域Ｆ又はＦ’、Ｆ及びＦ’間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１３７】
ＬＮＡギャップマー
ＬＮＡギャップマーは、領域ＦとＦ’の一方又は両方がＬＮＡヌクレオシドを含むか又はそれからなるギャップマーである。ベータ−Ｄ−オキシギャップマーは、領域ＦとＦ’の一方又は両方がベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを含むか又はそれからなるギャップマーである。
【０１３８】
いくつかの実施態様では、ＬＮＡギャップマーは、式：［ＬＮＡ］１−５−［領域Ｇ］−［ＬＮＡ］１−５であり、式中、領域Ｇは、ギャップマー領域Ｇの定義で定義される通りである。
【０１３９】
ＭＯＥギャップマー
ＭＯＥギャップマーは、Ｆ及びＦ’がＭＯＥヌクレオシドからなるギャップマーである。いくつかの実施態様では、ＭＯＥギャップマーは、デザイン［ＭＯＥ］１−８−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］１−８、例えば［ＭＯＥ］２−７−［領域Ｇ］５−１６−［ＭＯＥ］２−７、例えば［ＭＯＥ］３−６−［領域Ｇ］−［ＭＯＥ］３−６であり、ここで領域Ｇは、ギャップマーの定義で定義される通りである。５−１０−５デザイン（ＭＯＥ−ＤＮＡ−ＭＯＥ）を有するＭＯＥギャップマーは、当該技術分野で広く使用されてきた。
【０１４０】
混合ウィングギャップマー
混合ウィングギャップマーは、領域ＦとＦ’の一方又は両方が２’置換ヌクレオシド、例えば２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ単位、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ単位、２’−フルオロ−ＤＮＡ単位、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、ＭＯＥ単位、アラビノ核酸（ＡＮＡ）単位及び２’−フルオロ−ＡＮＡ単位、例えばＭＯＥヌクレオシドからなる群より独立して選択される２’置換ヌクレオシドを含むＬＮＡギャップマーである。領域ＦとＦ’の少なくとも一方、又は領域ＦとＦ’の両方が、少なくとも一つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の残存するヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。領域ＦとＦ’の少なくとも一方、又は領域ＦとＦ’の両方が、少なくとも二つのＬＮＡヌクレオシドを含むいくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の残存するヌクレオシドは、ＭＯＥ及びＬＮＡからなる群より独立して選択される。いくつかの混合ウィングの実施態様では、領域ＦとＦ’の一方又は両方は、一又は複数のＤＮＡヌクレオシドをさらに含み得る。
【０１４１】
混合ウィングギャップマーは、国際公開第２００８／０４９０８５号及び同第２０１２／１０９３９５号に開示されており、この両方は参照により本明細書に援用される。
【０１４２】
交互フランクギャップマー
交互フランクを有するオリゴヌクレオチドは、フランク（Ｆ又はＦ’）の少なくとも一つが、ＬＮＡヌクレオシドに加えてＤＮＡを含むＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、領域Ｆ若しくはＦ’の少なくとも一方、又は領域ＦとＦ’の両方は、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様では、フランク領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦとＦ’の両方は、少なくとも三つのヌクレオシドを含み、ここでＦ及び／又はＦ’領域の５’及び３’モストヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドである。
【０１４３】
いくつかの実施態様では、領域Ｆ若しくはＦ’の少なくとも一方、又は領域ＦとＦ’の両方は、ＬＮＡヌクレオシドとＤＮＡヌクレオシドの両方を含む。そのような実施態様では、フランク領域Ｆ若しくはＦ’、又はＦとＦ’の両方は、少なくとも三つのヌクレオシドを含み、ここでＦ又はＦ’領域の５’及び３’モストヌクレオシドはＬＮＡヌクレオシドであり、領域Ｆ又はＦ’（又は領域ＦとＦ’の両方）の５’及び３’モストＬＮＡヌクレオシド間に位置する少なくとも一つのＤＮＡヌクレオシドが存在する。
【０１４４】
オリゴヌクレオチド中の領域Ｄ’又はＤ’’
本発明のオリゴヌクレオチドは、いくつかの実施態様では、標的核酸、例えばギャップマーＦ−Ｇ−Ｆ’、及びさらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドに相補的なオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含むか、又はそれからなる。さらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、標的核酸に相補的であっても相補的でなくてもよい。そのようなさらなる５’及び／又は３’ヌクレオシドは、本明細書では領域Ｄ’及びＤ’’と称され得る。
【０１４５】
領域Ｄ’又はＤ’’の添加は、連続ヌクレオチド配列、例えばギャップマーを、コンジュゲート部分又は別の官能基に結合する目的のために使用され得る。結合のために使用されるとき、コンジュゲート部分を有する連続ヌクレオチド配列は、生物切断性リンカーとして機能することができる。あるいは、それは、エキソヌクレアーゼ保護を提供するために、又は合成若しくは製造を容易にするために使用され得る。
【０１４６】
領域Ｄ’及びＤ’’は、それぞれ領域Ｆの５’末端又は領域Ｆ’の３’末端に接着して、以下の式Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’又はＤ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’のデザインを生成する。この例では、Ｆ−Ｇ−Ｆ’は、オリゴヌクレオチドのギャップマーの部分であり、領域Ｄ’又はＤ’’は、オリゴヌクレオチドの別個の部分からなる。
【０１４７】
領域Ｄ’又はＤ’’は、標的核酸に相補的又は非相補的であり得る１、２、３、４又は５の追加のヌクレオチドを独立して含むか、又はそれからなる。Ｆ又はＦ’領域に隣接するヌクレオチドは、糖修飾ヌクレオチド、例えばＤＮＡ又はＲＮＡ又はこれらの塩基修飾バージョンではない。Ｄ’又はＤ’領域は、ヌクレアーゼ感受性生物切断性リンカー（リンカーの定義を参照）として機能し得る。いくつかの実施態様では、追加の５’及び／又は３’末端ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合しており、ＤＮＡ又はＲＮＡである。領域Ｄ’又はＤ’’としての使用に適したヌクレオチドベースの生物切断性リンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号に開示されており、これは例としてホスホジエステル結合ＤＮＡジヌクレオチドを含む。ポリ−オリゴヌクレオチドコンストラクトにおける生物切断性リンカーの使用は、国際公開第２０１５／１１３９２２号に開示されており、生物切断性リンカーは、単一オリゴヌクレオチド内の多数のアンチセンスコンストラクト（例えばギャップマー領域）を結合するのに使用される。
【０１４８】
一実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、ギャップマーを構成する連続ヌクレオチド配列に加えて、領域Ｄ’及び／又はＤ’’を含む。
【０１４９】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、以下の式で表すことができる：
Ｆ−Ｇ−Ｆ’；特にＦ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’、特にＤ’１−３−Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８
Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＦ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８−Ｄ’’１−３
Ｄ’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−Ｄ’’、特にＤ’１−３−Ｆ１−８−Ｇ５−１６−Ｆ’２−８−Ｄ’’１−３。
【０１５０】
いくつかの実施態様では、領域Ｄ’と領域Ｆとの間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。いくつかの実施態様では、領域Ｆ’と領域Ｄ’’との間に位置するヌクレオシド間結合は、ホスホジエステル結合である。
【０１５１】
コンジュゲート
本明細書で使用されるコンジュゲートという用語は、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分又は領域Ｃ又は第３の領域）と共有結合しているオリゴヌクレオチドを指す。
【０１５２】
本発明のオリゴヌクレオチドの一又は複数の非ヌクレオチド部分へのコンジュゲーションは、例えば、オリゴヌクレオチドの活性、細胞分布、細胞取り込み又は安定性に影響を与えることによって、オリゴヌクレオチドの薬理を改善する。いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、オリゴヌクレオチドの細胞分布、バイオアベイラビリティ、代謝、排出、透過性及び／又は細胞取り込みを改善することにより、オリゴヌクレオチドの薬物動態特性を修正し又は向上させる。コンジュゲートは、オリゴヌクレオチドを特定の器官、組織又は細胞型に標的化し、それにより、オリゴヌクレオチドのその器官、組織又は細胞型における有効性を向上させる場合がある。同時に、コンジュゲートは、非標的細胞型、組織又は器官におけるオリゴヌクレオチドの活性、例えば、標的外活性又は非標的細胞型、組織若しくは器官の活性を低下させるのに役立つ場合がある。
【０１５３】
ある実施態様では、非ヌクレオチド部分（コンジュゲート部分）は、炭水化物、細胞表面受容体リガンド、原薬、ホルモン、親油性物質、ポリマー、タンパク質、ペプチド、毒素（例えば最近毒素）、ビタミン、ウイルスタンパク質（例えばカプシド）又はそれらの組み合わせからなる群より選択される。
【０１５４】
リンカー
結合又はリンカーは、一又は複数の共有結合を介して、対象の一つの化学基又はセグメントを対象の別の化学基又はセグメントに結合する二つの原子間の結合である。コンジュゲート部分は、直接又は結合部分（例えばリンカー又はテザー）を通じてオリゴヌクレオチドに接着することができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分（領域Ｃ）を、第１の領域、例えばオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列又はギャップマー領域Ｆ−Ｇ−Ｆ’（領域Ａ）に共有結合するのに役立つ。
【０１５５】
本発明のいくつかの実施態様では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、場合によっては、標的核酸に相補的なオリゴヌクレオチド又は連続ヌクレオチド配列（領域Ａ又は第１の領域）とコンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）との間に位置するリンカー領域（第２の領域又は領域Ｂ及び／又は領域Ｙ）を含み得る。
【０１５６】
領域Ｂは、通常遭遇するか又は哺乳動物の体内で遭遇するものに類似した条件下で切断可能な生理学的に不安定な結合を含むか又はそれからなる生物切断性リンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学変換（例えば切断）を受ける条件には、化学的条件、例えばｐＨ、温度、酸化若しくは還元条件又は薬剤、及び哺乳動物細胞で遭遇するものに見られる又は類似する塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施態様では、生物切断性リンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。ＤＮＡホスホジエステル含有生物切断性リンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号により詳細に記載されている（参照により本明細書に援用される）。本明細書の領域Ｄ’又はＤ’’も参照のこと。
【０１５７】
領域Ｙは、必ずしも生物切断性ではないが、コンジュゲート部分（領域Ｃ又は第３の領域）を、オリゴヌクレオチド（領域Ａ又は第１の領域）に共有結合するのに主に役立つリンカーを指す。領域Ｙリンカーは、鎖構造、又はエチレングリコール、アミノ酸単位又はアミノアルキル基などの繰り返し単位のオリゴマーを含み得る。本発明のオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、以下の領域要素Ａ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｃ、Ａ−Ｂ−Ｙ−Ｃ、Ａ−Ｙ−Ｂ−Ｃ又はＡ−Ｙ−Ｃから構成され得る。いくつかの実施態様では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６からＣ１２アミノアルキル基を含むＣ２−Ｃ３６アミノアルキル基等のアミノアルキルである。好ましい実施態様では、リンカー（領域Ｙ）はＣ６アミノアルキル基である。
【０１５８】
治療
本明細書で使用される用語「治療」は、既存の疾患（例えば本明細書で言及される疾患又は障害）、又は疾患の予防、すなわち予防法の両方を指す。したがって、本明細書でｆ言及される治療は、いくつかの実施態様では予防的であり得ることが認識される。
【０１５９】
発明の詳細な記載
本発明は、ＳＲＥＢＦ１発現を標的とする、オリゴヌクレオチド、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドに関する。
【０１６０】
ＳＲＥＢＦ１を標的とする本発明のオリゴヌクレオチドは、ＳＲＥＢＦ１標的核酸を発現している細胞におけるＳＲＥＢＦ１標的核酸の発現をハイブリダイズすること及び阻害することができる。
【０１６１】
ＳＲＥＢＦ１標的核酸は、哺乳動物ＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ、例えばヒトＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡ又はプレｍＲＮＡ、例えばＮＣＢＩ参照配列：ＮＧ＿０２９０２９．１（配列番号１９）により例示されるホモサピエンスステロール調節エレメント結合転写因子１（ＳＲＥＢＦ１）、染色体１７上のＲｅｆＳｅｑＧｅｎｅに由来するプレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡであり得る。
【０１６２】
ヒトＳＲＥＢＦ１  プレｍＲＮＡは、ホモサピエンス染色体１７、ＮＣ＿００００１７．１１（１７８１１３４９…．．１７８３７０１７、補体）．ＧＥＮＥ  ＩＤ＝６７２０（ＳＲＥＢＦ１）上にコードされる。
【０１６３】
成熟ヒトｍＲＮＡ標的配列は、ｃＤＮＡ配列配列番号２０、２１又は２２により本明細書で説明される。
【０１６４】
本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸、例えばＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡを発現している細胞におけるＳＲＥＢＦ１標的核酸、例えばＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡの発現を阻害することができる。
【０１６５】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、標的核酸を発現している細胞におけるＳＲＥＢＦ１標的核酸の発現を阻害することができ、細胞中のＳＲＥＢＦ１標的核酸（例えばｍＲＮＡ）の発現レベルと比較して、ＳＲＥＢＦ１標的核酸（例えばｍＲＮＡ）のレベルを少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、又は少なくとも９０％阻害のレベルを減少させることができる。適切には、細胞は、Ａ５４９、ＨｅＬａ及びＲＡＷ２６４．７細胞からなる群より選択される。実施例１は、本発明のオリゴヌクレオチドが標的核酸の発現を阻害する能力を評価するための適切なアッセイを提供する。適切には、標的核酸の発現を阻害する化合物能力の評価は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、例えば実施例１に記載のようなジムノティックジムノティック（ｇｙｍｎｏｔｉｃ）ｉｎ  ｖｉｔｒｏアッセイで実施される。
【０１６６】
本発明のある態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号１９又は配列番号２０と少なくとも９０％の相補性を有する、例えば完全に相補的な１０から３０ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列を含むＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーに関する。
【０１６７】
本発明のある態様は、アンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、配列番号２１又は配列番号２２と少なくとも９０％の相補性を有する、例えば完全に相補的な１０から３０ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列を含むＬＮＡアンチセンスオリゴヌクレオチドギャップマーに関する。
【０１６８】
いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、標的核酸又は標的配列の領域と少なくとも９０％相補的な、例えば少なくとも９１％、例えば少なくとも９２％、例えば少なくとも９３％、例えば少なくとも９４％、例えば少なくとも９５％、例えば少なくとも９６％、例えば少なくとも９７％、例えば少なくとも９８％、又は１００％相補的な１０−３０ヌクレオチドの連続配列を含む。
【０１６９】
発明者は、本発明のオリゴヌクレオチドにより標的化され得るＳＲＥＢＦ１標的核酸の特に効果的な配列を同定した。
【０１７０】
いくつかの実施態様では、標的配列は配列番号１４である。
【０１７１】
いくつかの実施態様では、標的配列は配列番号１５である。
【０１７２】
いくつかの実施態様では、標的配列は配列番号１６である。
【０１７３】
いくつかの実施態様では、標的配列は配列番号１７である。
【０１７４】
いくつかの実施態様では、標的配列は配列番号１８である。
【０１７５】
配列番号１４：    ｃｔｃｃａｔｔｇａａｇａｔｇｔａｃｃｃｇｔｃｃａｔｇｃｃｃｇ（１９、２０、２１、２２）
配列番号１５：    ｃｔｇａａｔｇｃａａｔｇａｃｔｇｔｔｔｔｔｔａｃｔｃｔｔａａｇｇａａａａｔａａａｃａｔｃｔ（１９、２０、２１）
配列番号１６：    ａａｇａｔｇｔａｃｃｃｇｔｃｃ（１９、２０、２２）
配列番号１７：    ｃｔｇａａｔｇｃａａｔｇａｃｔｇｔｔ（１９、２０、２１）
配列番号１８：    ｃｔｔａａｇｇａａａａｔａａａｃａｔｃｔ（１９、２０、２１）
（括弧中の数字は、標的配列がみられるＳＲＥＢＦ１  プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ転写産物の配列番号を指す）。
【０１７６】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１２−２４、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３の連続ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで連続ヌクレオチド配列は、配列番号１４に完全に相補的である。
【０１７７】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチドは、１２−２４、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２又は２３の連続ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで連続ヌクレオチド配列は、配列番号１５に完全に相補的である。
【０１７８】
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２−１５、例えば１３、又は１４、１５の連続ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで連続ヌクレオチド配列は、配列番号１６に完全に相補的である。
【０１７９】
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２−１８、例えば１３、１４、１５、１６、又は１７の連続ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで連続ヌクレオチド配列は、配列番号１７に完全に相補的である。
【０１８０】
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、１２−２０、例えば１３、１４、１５、１６、１７、１８、又は１９の連続ヌクレオチドの長さの連続ヌクレオチド配列を含み、ここで連続ヌクレオチド配列は、配列番号１８に完全に相補的である。
【０１８１】
いくつかの実施態様では、本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチド又はその連続ヌクレオチド配列は、ギャップマー、例えばＬＮＡギャップマー、混合ウィングギャップマー、又は交互フランクギャップマーである。
【０１８２】
いくつかの実施態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１４に完全に相補的な、少なくとも１０連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１２連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１３連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１４連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１５連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１８３】
いくつかの実施態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１５に完全に相補的な、少なくとも１０連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１２連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１３連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１４連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１５連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１８４】
いくつかの実施態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１６に完全に相補的な、少なくとも１０連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１２連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１３連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１４連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１５連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１８５】
いくつかの実施態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１７に完全に相補的な、少なくとも１０連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１２連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１３連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１４連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１５連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１８６】
いくつかの実施態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１８に完全に相補的な、少なくとも１０連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１２連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１３連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１４連続ヌクレオチド、例えば少なくとも１５連続ヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列を含む。
【０１８７】
いくつかの実施態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、長さ２０ヌクレオチド未満である。いくつかの実施態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、長さ１２−２４ヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、長さ１２−２２ヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、長さ１２−２０ヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、長さ１２−１８ヌクレオチドである。いくつかの実施態様では、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチドの連続ヌクレオチド配列は、長さ１２−１６ヌクレオチドである。
【０１８８】
いくつかの実施態様では、有利には、ヌクレオシドと連続ヌクレオチド配列との間のヌクレオシド間結合のすべては、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１８９】
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１４に完全に相補的である。
【０１９０】
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１５に完全に相補的である。
【０１９１】
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１６に完全に相補的である。
【０１９２】
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列は、配列番号１７又は配列番号１８に完全に相補的である。
【０１９３】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、式５’−Ｆ−Ｇ−Ｆ’−３’［式中、領域Ｆ及びＦ’は、独立して、１−８の糖修飾ヌクレオシドを含み、Ｇは、ＲＮａｓｅＨを動員することができる５と１６ヌクレオシド間の領域である］の連続ヌクレオチド配列を含むギャップマーオリゴヌクレオチドである。
【０１９４】
いくつかの実施態様では、領域Ｆ及びＦ’の糖修飾ヌクレオシドは、２’−Ｏ−アルキル−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メチル−ＲＮＡ、２’−アルコキシ−ＲＮＡ、２’−Ｏ−メトキシエチル−ＲＮＡ、２’−アミノ−ＤＮＡ、２’−フルオロ−ＤＮＡ、アラビノ核酸（ＡＮＡ）、２’−フルオロ−ＡＮＡ及びＬＮＡヌクレオシドからなる群より独立して選択される。
【０１９５】
いくつかの実施態様では、領域Ｇは、５−１６連続ＤＮＡヌクレオシドを含む。
【０１９６】
いくつかの実施態様では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ギャップマーオリゴヌクレオチド、例えばＬＮＡギャップマーオリゴヌクレオチドである。
【０１９７】
いくつかの実施態様では、ＬＮＡヌクレオシドは、ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドである。
【０１９８】
いくつかの実施態様では、連続ヌクレオチド配列間のヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０１９９】
本発明の配列モチーフ及び化合物
2021511029.tif 000005
【０２００】
化合物の欄において、大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドであり、ＬＮＡ  Ｃはすべての５−メチル  Ｃであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、小文字ｃの前の上付きのｍは５−メチル  シトシン  ＤＮＡヌクレオシドを表し、すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。
【０２０１】
本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば１２−２４、例えば１２−１８の長さ、ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号１又は２に存在する少なくとも１２、例えば少なくとも１４、例えば少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む連続ヌクレオチド配列を含む。
【０２０２】
本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば、１２−２４、例えば１２−１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号３又は４又は７に存在する少なくとも１２、例えば少なくとも１３、例えば少なくとも１４、例えば少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む連続ヌクレオチド配列を含む。
【０２０３】
本発明は、本発明によるアンチセンスオリゴヌクレオチド、例えば１２−２４、例えば１２−１８ヌクレオシド長のアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、配列番号８に存在する少なくとも１２、例えば少なくとも１３、例えば少なくとも１４、例えば少なくとも１５の連続ヌクレオチドを含む連続ヌクレオチド配列を含む。
【０２０４】
本発明は、配列番号１−１０から選択される連続ヌクレオチド配列を含むか又はそれからなる、本発明によるＬＮＡギャップマーを提供する。
【０２０５】
本発明は、以下：ＧＡＣｇｇｇｔａｃａｔＣＴＴ、ＧＧＡｃｇｇｇｔａｃａｔｃＴＴ、ＣＡｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡＧ、ＡＣａｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡＧ、ＣＡｃｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｔｔｇＡＴ、ＣＴｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｔｔｇＡＴ、ＡＡＣａｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡ、ＡＧＡＴｇｔｔｔａｔｔｔｔｃｃｔｔａＡＧ、ＡＡＧＡｃａｇｃａｇａｔｔｔａｔＴＣ、ＣＡｇｃａｇａｔｔｔａｔｔｃＡＧＣからなる群より選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し；ここで、大文字はＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、連続ヌクレオシド配列中のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。場合によっては、ＬＮＡシトシンは、５−メチル  シトシンであり得る。場合によっては、ＤＮＡシトシンは、５−メチル  シトシンであり得る。
【０２０６】
本発明は、以下：ＧＡＣｇｇｇｔａｃａｔＣＴＴ、ＧＧＡｃｇｇｇｔａｃａｔｃＴＴ、ＣＡｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡＧ、ＡＣａｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡＧ、ＣＡｃｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｔｔｇＡＴ、ＣＴｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｔｔｇＡＴ、ＡＡＣａｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡ、ＡＧＡＴｇｔｔｔａｔｔｔｔｃｃｔｔａＡＧ、ＡＡＧＡｃａｇｃａｇａｔｔｔａｔＴＣ、ＣＡｇｃａｇａｔｔｔａｔｔｃＡＧＣからなる群より選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し；ここで、大文字はベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡヌクレオシドであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドである。いくつかの実施態様では、連続ヌクレオシド配列中のすべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。場合によっては、ＬＮＡシトシンは、５−メチル  シトシンであり得る。場合によっては、ＤＮＡシトシンは、５−メチル  シトシンであり得る。
【０２０７】
本発明は、以下：ＧＡＣｇｇｇｔａｃａｔＣＴＴ、ＧＧＡｃｇｇｇｔａｃａｔｃＴＴ、ＣＡｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡＧ、ＡＣａｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡＧ、ＣＡｃｔｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｔｔｇＡＴ、ＣＴｇｔｃｔｔｇｇｔｔｇｔｔｇＡＴ、ＡＡＣａｇｔｃａｔｔｇｃａｔｔＣＡ、ＡＧＡＴｇｔｔｔａｔｔｔｔｃｃｔｔａＡＧ、ＡＡＧＡｃａｇｃａｇａｔｔｔａｔＴＣ、ＣＡｇｃａｇａｔｔｔａｔｔｃＡＧＣからなる群より選択されるアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供し；ここで、大文字はベータ−Ｄ−オキシ−ＬＮＡ  ヌクレオシドであり、すべてのＬＮＡシトシンは５−メチル  シトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドであり、連続ヌクレオシド配列中のすべてのヌクレオシド間結合はホスホロチオエートヌクレオシド間結合であり、場合によっては、ＤＮＡシトシンは５−メチル  シトシンであり得る。
【０２０８】
製造方法
さらなる態様では、本発明は、ヌクレオチド単位を反応させること、及びそれによりオリゴヌクレオチドに含まれる共有結合した連続ヌクレオチド単位を形成することを含む、本発明のオリゴヌクレオチドを製造するための方法を提供する。好ましくは、該方法は、ホスホルアミダイト化学を使用する（例えば、Caruthers et al, 1987, Methods in Enzymology vol. 154, pages 287-313を参照）。さらなる実施態様では、該方法は、連続ヌクレオチド配列をコンジュゲート部分（リガンド）と反応させて、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチドに共有結合させることをさらに含む。さらなる態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はコンジュゲートオリゴヌクレオチドを薬学的に許容される希釈剤、溶媒、担体、塩及び／又はアジュバントと混合することを含む、本発明の組成物を製造するための方法が提供される。
【０２０９】
ＧａｌＮＡｃコンジュゲート
いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、例えば、ガラクトース、ガラクトサミン、Ｎ−ホルミル−ガラクトサミン、Ｎアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニル−ガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブタノイル−ガラクトサミン、及びＮ−イソブタノイルガラクトス−アミンを含み得る、アシアログリコプロテイン受容体標的部分を含むか又はそれである。いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、ガラクトースクラスター、例えばＮ−アセチルガラクトサミントリマーを含む。いくつかの実施態様では、コンジュゲート部分は、ＧａｌＮＡｃ（Ｎ−アセチルガラクトサミン）、例えば一価、二価、三価又は四価ＧａｌＮＡｃを含む。三価のＧａｌＮＡｃコンジュゲートは、化合物を肝臓に標的化するのに使用され得る（例えば、米国特許第５，９９４５１７号、及びHangel and et al., Bioconjug Chem. 1995 Nov-Dec;6(6):695-701、国際公開第２００９／１２６９３３号、同第２０１２／０８９３５２号、同第２０１２／０８３０４６号、同第２０１４／１１８２６７号、同第２０１４／１７９６２０号、同第２０１４／１７９４４５号を参照）。図８の例も参照のこと。これらのＧａｌＮＡｃの参考文献及びそこで使用される特定のコンジュゲートは、参照により本明細書に援用される。
【０２１０】
いくつかの実施態様では、本発明のコンジュゲートは、図８に開示される三価のＧａｌＮＡｃコンジュゲートを含む。
【０２１１】
本発明の例示的なコンジュゲートは以下：
５’−ＧＮ２−Ｃ６ｏＣｏａｏＧｓＡｓＣｓｇｓｇｓｇｓｔｓａｓｃｓａｓｔｓＣｓＴｓＴ；
５’−ＧＮ２−Ｃ６ｏＣｏａｏＧｓＧｓＡｓｃｓｇｓｇｓｇｓｔｓａｓｃｓａｓｔｓｃｓＴｓＴ；
５’−ＧＮ２−Ｃ６ｏＣｏａｏＣｓＡｓｇｓｔｓｃｓａｓｔｓｔｓｇｓｃｓａｓｔｓｔｓＣｓＡｓＧ；及び
５’−ＧＮ２−Ｃ６ｏＣｏａｏＣｓＣｓｔｓａｓｇｓｔｓａｓａｓｇｓｃｓＣｓＡｓＣｓＧ；
を含み、ここで大文字はベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを表し、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、各ＬＮＡシトシンは５−メチル  シトシンであり、ｍｃは５−メチル  シトシンＤＮＡであり、下付きのｓはホスホロチオエートヌクレオシド間結合を表し、下付きのｏはホスホジエステルヌクレオシド間結合を表し、ＧＮ２−Ｃ６は、式：
2021511029.tif 000006
の５’コンジュゲートであり、ここで、波線は、オリゴヌクレオチドの５’末端でのホスホジエステル結合への共有結合を表す。
【０２１２】
コンジュゲートリンカー
結合又はリンカーは、一又は複数の共有結合を介して、対象の一つの化学基又はセグメントを対象の別の化学基又はセグメントに結合する二つの原子間の結合である。コンジュゲート部分は、直接又は結合部分（例えばリンカー又はテザー）を通じてオリゴヌクレオチドに接着することができる。リンカーは、第３の領域、例えばコンジュゲート部分を、オリゴヌクレオチド（例えば、領域Ａ又はＣの末端）に共有結合するのに役立つ。
【０２１３】
本発明のいくつかの実施態様では、本発明のコンジュゲート又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、場合によっては、オリゴヌクレオチドとコンジュゲート部分との間に位置するリンカー領域を含んでもよい。いくつかの実施態様では、コンジュゲートとオリゴヌクレオチドとの間のリンカーは生物切断性である。
【０２１４】
生物切断性リンカーは、通常遭遇するか又は哺乳動物の体内で遭遇するものに類似した条件下で切断可能な生理学的に不安定な結合を含むか又はそれからなる生物切断性リンカーを指す。生理学的に不安定なリンカーが化学変換（例えば切断）を受ける条件には、化学的条件、例えばｐＨ、温度、酸化若しくは還元条件又は薬剤、及び哺乳動物細胞で遭遇するものに見られる又は類似する塩濃度が含まれる。哺乳動物の細胞内条件には、タンパク質分解酵素又は加水分解酵素又はヌクレアーゼなどの哺乳動物細胞に通常存在する酵素活性の存在も含まれる。一実施態様では、生物切断性リンカーは、Ｓ１ヌクレアーゼ切断の影響を受けやすい。好ましい実施態様では、ヌクレアーゼ感受性リンカーは、少なくとも二つの連続ホスホジエステル結合、例えば少なくとも３又は４又は５の連続ホスホジエステル結合を含む、１から１０の間のヌクレオシド、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のヌクレオシド、より好ましくは２から６の間のヌクレオシド、最も好ましくは２から４の間の結合ヌクレオシドを含む。好ましくは、ヌクレオシドはＤＮＡ又はＲＮＡである。ホスホジエステル含有生物切断性リンカーは、国際公開第２０１４／０７６１９５号により詳細に記載されている（参照により本明細書に援用される）。
【０２１５】
コンジュゲートは、非生物切断性リンカーを介してオリゴヌクレオチドに結合してもよく、又はいくつかの実施態様では、コンジュゲートは、生物切断性リンカーに共有結合している非生物切断性リンカーを含んでもよい。リンカーは、必ずしも生物切断性ではないが、コンジュゲート部分をオリゴヌクレオチド又は生物切断性リンカーに共有結合するのに主に役立つ。そのようなリンカーは、鎖構造、又はエチレングリコール、アミノ酸単位又はアミノアルキル基などの繰り返し単位のオリゴマーを含み得る。いくつかの実施態様では、リンカー（領域Ｙ）は、例えばＣ６からＣ１２アミノアルキル基を含むＣ２−Ｃ３６アミノアルキル基のようなアミノアルキルである。いくつかの実施態様では、リンカー（領域Ｙ）はＣ６アミノアルキル基である。コンジュゲートリンカー基は、アミノ修飾オリゴヌクレオチド、及びコンジュゲート基上の活性化エステル基の使用を介して、オリゴヌクレオチドに常套的に結合され得る。
【０２１６】
薬学的組成物
さらなる態様では、本発明は、上記のオリゴヌクレオチド及び／又はオリゴヌクレオチドコンジュゲート又はその塩のいずれか、並びに薬学的に許容される希釈剤、担体、塩及び／又はアジュバントを含む薬学的組成物を提供する。薬学的に許容される希釈剤には、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が含まれ、薬学的に許容される塩には、限定されないが、ナトリウム塩及びカリウム塩が含まれる。いくつかの実施態様では、薬学的に許容される希釈剤は、滅菌リン酸緩衝食塩水である。いくつかの実施態様では、オリゴヌクレオチドは、５０−３００μＭ溶液の濃度で薬学的に許容される希釈剤に使用される。
【０２１７】
本発明による化合物は、それらの薬学的に許容される塩の形態で存在してもよい。用語「薬学的に許容される塩」は、本発明の化合物の生物学的有効性及び特性を保持しており、かつ好適な非毒性の有機酸若しくは無機酸又は有機塩基若しくは無機塩基から形成される一般的な酸付加塩又は塩基付加塩を指す。酸付加塩には、例えば、無機酸、例えば塩化水素酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硫酸、スルファミン酸、リン酸、及び硝酸から誘導されるもの、並びに有機酸、例えばｐ−トルエンスルホン酸、サリチル酸、メタンスルホン酸、シュウ酸、コハク酸、クエン酸、リンゴ酸、乳酸、フマル酸等から誘導されるものが含まれる。塩基付加塩には、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、及び第四級アンモニウム水酸化物、例えばテトラメチルアンモニウム水酸化物から誘導されるものが含まれる。薬学的化合物の塩への化学的修飾は、化合物の物理的及び化学的安定性、吸湿性、流動性及び溶解性の向上を得るための、薬化学者にとってよく知られた技術である。例えば、Bastin, Organic Process Research & Development 2000, 4, 427-435又はAnsel, In: Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems, 6th ed. (1995), pp. 196 and 1456-1457に記載されている。例えば、本明細書で提供される化合物の薬学的に許容される塩は、ナトリウム塩であり得る。
【０２１８】
本発明での使用に適した製剤は、RemingtonによるPharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Philadelphia, Pa., 17th ed., 1985にみられる。薬物送達のための方法の簡潔な概説については、例えばLanger (Science 249:1527-1533, 1990)を参照のこと。国際公開第２００７／０３１０９１号は、薬学的に許容される希釈剤、担体及びアジュバントのさらに適切で好ましい例を提供する（該特許文献は参照により本明細書に援用される）。適切な投与量、製剤化、投与経路、組成物、投与形態、他の治療剤との組み合わせ、プロドラッグ製剤も、国際公開第２００７／０３１０９１号で提供されている。
【０２１９】
本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、薬学的組成物又は製剤の調製のために、薬学的に許容される活性又は不活性な物質と混合され得る。薬学的組成物の製剤化のための組成物及び方法は、投与経路、疾患の程度、又は投与される用量を含むがこれらに限定されない数多くの基準に応じる。
【０２２０】
これらの組成物は、従来の滅菌技術によって滅菌され得るか、又は滅菌濾過され得る。得られた水溶液は、そのまま使用するために包装され得るか、又は凍結乾燥され得、凍結乾燥された調製物は、投与前に滅菌水性担体と組み合わされる。調製物のｐＨは、典型的には、３から１１の間、より好ましくは５から９の間、又は６から８の間、最も好ましくは７から８の間、例えば７から７．５であることになる。固体形態の得られた組成物は、錠剤又はカプセルの密封パッケージのように、それぞれが上記の薬剤の固定量を含有する複数の単回投与単位で包装され得る。固体形態の組成物はまた、局所塗布可能なクリーム又は軟膏用に設計された絞り出し可能なチューブのような柔軟な量の容器に包装することもできる。
【０２２１】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、プロドラッグである。特にオリゴヌクレオチドコンジュゲートに関して、プロドラッグが作用部位、例えば標的細胞に送達すると、オリゴヌクレオチドのコンジュゲート部分は切断される。
【０２２２】
適用
本発明のオリゴヌクレオチドは、例えば、診断、治療及び予防用の研究試薬として利用され得る。
【０２２３】
研究において、そのようなオリゴヌクレオチドは、細胞（例えばｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物）及び実験動物中のＳＲＥＢＰ１タンパク質の合成を特異的に調節するのに使用され得、それにより、標的の機能分析又は治療的介入の標的としてのその有用性の評価が促進される。典型的には、標的の調節は、タンパク質を産生するｍＲＮＡを分解若しくは阻害し、それによりタンパク質形成を防ぐことにより、又はタンパク質を産生する遺伝子又はｍＲＮＡのモジュレータを分解若しくは阻害することにより、達成される。
【０２２４】
標的核酸の研究又は診断に本発明のオリゴヌクレオチドを用いる場合、標的核酸は、ｃＤＮＡ又はＤＮＡ若しくはＲＮＡ由来の合成核酸であり得る。
【０２２５】
本発明は、ＳＲＥＢＦ１を発現している標的細胞におけるＳＲＥＢＦ１を調節するためのｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏの方法を提供し、前記方法は、有効量の本発明のオリゴヌクレオチドを前記細胞に投与することを含む。
【０２２６】
いくつかの実施態様では、標的細胞は、哺乳動物細胞、特にヒト細胞である。標的細胞は、哺乳動物の組織の一部を形成するｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞培養物又はｉｎ  ｖｉｖｏ細胞であり得る。
【０２２７】
診断において、オリゴヌクレオチドは、ノーザンブロット法、ｉｎ−ｓｉｔｕハイブリダイゼーション又は同様の技術により、細胞及び組織中のＲＥＢＦ１発現を検出及び定量化するのに使用され得る。
【０２２８】
治療については、疾患又は障害を有する疑いのある動物又はヒトは、ＳＲＥＢＦ１の発現を調節することにより治療され得る。
【０２２９】
本発明は、治療的又は予防的有効量の本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物を、疾患に罹患しているか又は罹患しやすい対象に投与することを含む、疾患を治療又は予防するための方法を提供する。
【０２３０】
本発明はまた、医薬としての使用のための本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、組成物又はコンジュゲートにも関する。
【０２３１】
本発明によるオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物は、典型的には、有効量で投与される。
【０２３２】
本発明はまた、本明細書で言及される障害の治療のための医薬の製造のための、又は本明細書で言及される障害の治療の方法のための、記載されるような本発明のオリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートの使用も提供する。
【０２３３】
本明細書で言及される疾患又は障害は、ＳＲＥＢＦ１の発現に関連する。いくつかの実施態様では、疾患又は障害は、ＳＲＥＢＦ１遺伝子における変異に関連し得る。したがって、いくつかの実施態様では、標的核酸は、ＳＲＥＢＦ１配列の変異形態である。
【０２３４】
本発明の方法は、好ましくは、ＳＲＥＢＦ１の異常なレベル及び／又は活性により引き起こされる疾患に対する治療又は予防に用いられる。
【０２３５】
本発明は、ＳＲＥＢＦ１の異常なレベル及び／又は活性の治療のための医薬の製造のための、本明細書に記載のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物にさらに関する。
【０２３６】
一実施態様では、本発明は、心血管疾患、２型糖尿病、脂肪肝、代謝性疾患、及びがんから選択される疾患又は障害の治療における使用のための、オリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物に関する。
【０２３７】
投与
本発明のオリゴヌクレオチド又は薬学的組成物は、局所又は経腸又は非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内又はくも膜下腔内）投与され得る。
【０２３８】
好ましい実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド又は薬学的組成物は、静脈内、動脈内、皮下、腹腔内若しくは筋肉内注射又は注入、くも膜下腔内又は頭蓋内、例えば脳内若しくは脳室内、硝子体内投与を含む非経口経路によって投与される。一実施態様では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、静脈内投与される。別の実施態様では、活性オリゴヌクレオチド又はオリゴヌクレオチドコンジュゲートは、皮下投与される。
【０２３９】
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物は、０．１−１５ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２−１０ｍｇ／ｋｇ、例えば０．２５−５ｍｇ／ｋｇの用量で投与される。投与は、一週に一回、二週毎、三週毎、又は一か月に一回であり得る。
【０２４０】
併用療法
いくつかの実施態様では、本発明のオリゴヌクレオチド、オリゴヌクレオチドコンジュゲート又は薬学的組成物は、別の治療剤との併用治療における使用のためのものである。治療剤は、例えば、上記の疾患又は障害の標準的な治療であり得る。
【０２４１】
本発明につながる研究は、「ＨＥＡＬＴＨ−Ｆ２−２０１３−６０２２２２」（Ａｔｈｅｒｏ−Ｆｌｕｘ）の合意下でＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｕｎｉｏｎ  Ｓｅｖｅｎｔｈ  Ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  Ｐｒｏｇｒａｍｍｅ［ＦＰ７−２００７−２０１３］から発見された。
【実施例】
【０２４２】
実施例１：単一濃度でのＡ５４９、ＨｅＬａ（及びＲＡＷ２６４．７）細胞株中ヒト（及びマウス）ＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡを標的とするアンチセンスオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏ有効性の試験。
Ａ５４９、ＨｅＬａ及びＲＡＷ２６４．７細胞株をＡＴＣＣから購入し、供給業者により推奨されるように、３７℃、５％  ＣＯ２で加湿したインキュベータで維持した。アッセイのために、３０００細胞／ウェル（Ａ５４９；ＨｅＬａ）又は２５００細胞／ウェル（ＲＡＷ２６４．７）を培地中の９６マルチウェルプレートに播種した。ＰＢＳに溶解したオリゴヌクレオチドの添加前に、細胞を２４時間インキュベートした。オリゴヌクレオチドの最終濃度：２５μＭ。オリゴヌクレオチドの添加の３日後、細胞を採取した。製造業者の指示に従ってＰｕｒｅＬｉｎｋ  Ｐｒｏ  ９６  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎキット（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＲＮＡを抽出し、５０μｌの水に溶出させた。続いてＲＮＡをＤＮａｓｅ／ＲＮａｓｅ  ｆｒｅｅ  Ｗａｔｅｒ（Ｇｉｂｃｏ）で１０回希釈し、１分間９０℃に加熱した。
【０２４３】
遺伝子発現分析について、ｑＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＸＬＴ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲ  ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ  ＲＯＸＴＭ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用してデュプレックスセットアップでＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイをｑＰＣＲに使用した：ＳＲＥＢＦ１、Ｈｓ０１０８８６７９＿ｇ１（Ｍｍ００５５０３３８＿ｍ１）［ＦＡＭ−ＭＧＢ］及び内在性コントロールＧＡＰＤＨ、Ｈｓ９９９９９９０５＿ｍ１（Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１）［ＶＩＣ−ＭＧＢ］。すべてのプライマーセットはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。表中の相対的なＮＦＫＢ１  ｍＲＮＡ発現レベルは、コントロール（ＰＢＳ処理細胞）のパーセントとして示される。
【０２４４】
我々は、ヒトＳＲＥＢＰ１転写産物（プレｍＲＮＡ又はｍＲＮＡ）を標的とする８４のＬＮＡギャップマーアンチセンスオリゴヌクレオチドを設計し、それを上記のアッセイで評価した。選択された化合物で処理された細胞からのＳＲＥＢＰ１  ｍＲＮＡレベルを図１及び図２に示し、ヒトＨｅＬａ及びＡ５４９細胞株で評価した。当初のライブラリスクリーンから、我々は、試験した細胞株で驚くほど効果的で強力な化合物を提供するＳＲＥＢＰ１ヒト転写産物上の２のモチーフ：モチーフＡ（配列番号１３）、及びモチーフＢ（配列番号１４）を同定した。
【０２４５】
使用した選択されたオリゴヌクレオチド：
2021511029.tif 000007
【０２４６】
化合物について：大文字はＬＮＡヌクレオシド（ベータ−Ｄ−オキシＬＮＡヌクレオシドを使用した）を表し、すべてのＬＮＡシトシンは５−メチル  シトシンであり、小文字はＤＮＡヌクレオシドを表し、上付きのｍがついたＤＮＡシトシンは５−メチル  Ｃ−ＤＮＡ  ヌクレオシドを表す。すべてのヌクレオシド間結合は、ホスホロチオエートヌクレオシド間結合である。化合物Ｍ１，１；Ｍ２，１及びＭ３，１は、マウスＳＲＥＢＰ１転写産物のみを標的とする。
【０２４７】
実施例２：濃度に応じたＡ５４９及びＨｅＬａ細胞株中ヒトＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡを標的とする選択されたオリゴヌクレオチドのｉｎ  ｖｉｔｒｏの力価及び有効性の試験。
【０２４８】
Ａ５４９細胞株及びＨｅＬａ細胞株を実施例１に記載した。実施例１に記載したようにして、アッセイを実施した。オリゴヌクレオチドの濃度：５０μＭから、ｈａｌｆ−ｌｏｇ希釈、８ポイント。オリゴヌクレオチドの添加の３日後、細胞を採取した。実施例１に記載したように、ＲＮＡの抽出及び二重Ｏｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。ＩＣ５０値の決定はＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ６で実施した。５０μＭのオリゴヌクレオチドでの処理時の相対的なＳＲＥＢＦ１  ｍＲＮＡレベルは、コントロールのパーセントとして表に示す（ＰＢＳ）。
2021511029.tif 000008
【０２４９】
Ａ５４９、ＨｅＬａ、ＲＡＷ２６４．７の濃度反応曲線はそれぞれ、図３、４及び５に示す。図６は、３つのマウスに特異的なＳｒｅｂｆ１標的化合物についてのＲＡＷ２６４．７細胞からの濃度反応曲線を示す。
【０２５０】
実施例３：マウスｉｎ  ｖｉｖｏ有効性及び許容試験、１６日間の治療、静脈内ＩＶ（尾静脈）。
動物
【０２５１】
メスのＣ５７ＢＬ／６ＪＢｏｍマウスで実験を実施した。生理食塩水コントロール群を含む研究の各群には、５匹の動物が含まれた。
【０２５２】
化合物及び投与手順
研究が第１６日に終了するまで、第０、３、７、１０、１４日に１５ｍｇ／ｋｇの化合物を動物に静脈内（尾静脈）投与した。
【０２５３】
安楽死
研究終了時（第１６日）に、肝臓、腎臓、脂肪組織の組織試料を解剖し、瞬間凍結する前に、すべてのマウスをＣＯ２で安楽死させた。
【０２５４】
Ｓｒｅｂｆ１  ＲＮＡ発現の定量化
ＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ＬＣ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｌｙｓｉｓ  Ｂｕｆｆｅｒ（製品番号０３６０４７２１００１、ロシュ）に溶解させるまで、組織試料を冷凍したままにし、使用者のマニュアルに従ってＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（ロシュ）でＭａｇＮＡ  Ｐｕｒｅ  ９６  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  ＲＮＡ  Ｌａｒｇｅ  Ｖｏｌｕｍｅ  Ｋｉｔ（製品番号０５４６７５３５００１、ロシュ）を使用してＲＮＡの抽出を継続し、ＲＮＡを水で５ｎｇ／μｌに希釈した。
【０２５５】
遺伝子発現分析について、ｑＳｃｒｉｐｔＴＭ  ＸＬＴ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲ  ＴｏｕｇｈＭｉｘ（登録商標）、Ｌｏｗ  ＲＯＸＴＭ（Ｑｕａｎｔａｂｉｏ）を使用してデュプレックスセットアップでＯｎｅ  Ｓｔｅｐ  ＲＴ−ｑＰＣＲを実施した。以下のＴａｑＭａｎプライマーアッセイをｑＰＣＲに使用した：Ｓｒｅｂｆ１、Ｍｍ００５５０３３８＿ｍ１（ＦＡＭ−ＭＧＢ）及び内在性コントロールＧａｐｄｈ、Ｍｍ９９９９９９１５＿ｇ１（ＶＩＣ−ＭＧＢ）。すべてのプライマーセットはＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから購入した。相対的なｍＲＮＡの発現レベルを生理食塩水で処理したコントロール群の％として示す（図７）。
【図１】
2021511029.tif 000011
【図２】
2021511029.tif 000012
【図３】
2021511029.tif 000013
【図４】
2021511029.tif 000014
【図５】
2021511029.tif 000015
【図６】
2021511029.tif 000016
【図７】
2021511029.tif 000017
【配列表】
2021511029000001.app
【国際調査報告】
2021511029.tif 000018
2021511029.tif 000019
2021511029.tif 000020
2021511029.tif 000021