(57)【要約】培養した胎盤、または、その一部から回収したエキソソームを、生成、単離、及び、特徴決定するための幾つかの手法を提供する。本明細書に記載した代替手法は、バイオテクノロジーのツール、及び、治療法として使用することができるエキソソームの生成、単離、及び、特徴決定を容易にする。本明細書では、胎盤器官培養物、または、当該胎盤の一部の培養物に由来するエキソソームの集団も提供する。エキソソームの集団を含む組成物、及び、対象の処置のためのそれらの使用方法も提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
胎盤、または、その一部からエキソソームを単離する方法であって、前記方法は：
ａ）胎盤、または、その一部、好ましくは、培養胎盤、または、その一部を、第１の培地と接触させること；及び
ｂ）前記胎盤、または、その一部からエキソソームの集団を含む第１の画分を得ること；
ｃ）任意に、前記胎盤、または、その一部を、第２の培地と接触させ、かつ、前記胎盤、または、その一部に由来するエキソソームの集団を含む第２の画分を得ること；
ｄ）任意に、前記胎盤、または、その一部を、第３の培地と接触させ、かつ、前記胎盤、または、その一部に由来するエキソソームの集団を含む第３の画分を得ること；及び
ｅ）任意に、前記第１、第２、及び／または、第３の画分に由来するエキソソームの集団を、好ましくは、連続遠心分離、及び／または、所望のエキソソームの集団に存在するマーカー、または、ペプチドに特異的な抗体、または、その結合部分を使用するアフィニティークロマトグラフィーで単離すること、を含み、前記抗体、または、その結合部分を、膜、樹脂、ビーズ、または、容器などの基質に固定している、前記方法。
【請求項２】
前記胎盤、または、その一部が、羊膜をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記胎盤、または、その一部が、ヒト胎盤、または、その一部である、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記第１、第２、及び／または、第３の培地を、胎盤、または、その一部と、４５分間、または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または、２４時間、または、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または、２０日間など、少なくとも４５分間かけて接触させ、時間の長さは、前記した時点のいずれか２つで定義した範囲内にある、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記第１、第２、及び／または、第３の培地を、胎盤、または、その一部と、少なくとも７、１４、２８、３５、または、４２日間、または、前記した時点のいずれか２つで定義した範囲内にある長さの時間をかけて接触させる、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６】
前記胎盤、または、その一部が、細分化、粉砕、または、酵素処理してある、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記胎盤、または、その一部は、実質的に平坦、または、シート状であり、及び、脱細胞化し、かつ、実質的に乾燥させており、及び、前記方法が、外因性細胞を含む体液を、前記脱細胞化胎盤、または、その一部と接触させて、前記脱細胞化胎盤、または、その一部に対して、前記外因性細胞を播種することをさらに含み、及び、前記細胞と、前記脱細胞化胎盤、または、その一部との接触は、脱細胞化胎盤、または、その一部を、第１の培地と接触させる前に行う、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項８】
前記外因性細胞を、前記胎盤、または、その一部のドナー対象とは異なる対象から得る、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記体液が、腹水、血液、または、血漿である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１０】
前記細胞が、臓器に由来する、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１１】
前記細胞が、肝臓、腎臓、肺、または、膵臓に由来する、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記細胞が、免疫細胞である、請求項７または８に記載の方法。
【請求項１３】
前記細胞が、Ｔ細胞またはＢ細胞である、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記第１の培地が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【請求項１５】
前記第１、第２、または第３の画分が、腹水、血液、または、血漿に由来するエキソソームを含む、請求項９に記載の方法。
【請求項１６】
前記第１、第２、または第３の画分が、臓器細胞に由来するエキソソームを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１７】
前記細胞が、肝臓、腎臓、肺、または、膵臓に由来する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１８】
前記第２の培地が、成長因子を含む、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
前記第３の培地が、キレート剤を含む、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
前記キレート剤が、ホスホネート、ＢＡＰＴＡ四ナトリウム塩、ＢＡＰＴＡ／ＡＭ、Ｄｉ−Ｎｏｔｒｏｐｈｅｎ（商標）試薬四ナトリウム塩、ＥＧＴＡ／ＡＭ、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラジン、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス−（２ピリジルメチル）エチレンジアミン、６−ブロモ−Ｎ’−（２−ヒドロキシベンジリデン）−２−メチルキノリン−４−カルボヒドラジド、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸テトラキス（アセトキシメチルエステル）、（エチレンジニトリロ）四酢酸、（ＥＤＴＡ）、エダタミル、エチレンジニトリロ四酢酸、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸、または、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸四ナトリウム塩（ＥＧＴＡ）、または、これらのあらゆる組み合わせである、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、または、ＥＧＴＡ、または、これらの組み合わせである、請求項１９または２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記キレート剤を、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭの濃度、または、前記した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度で第３の培地に提供する、請求項１９〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
前記第３の培地でのＥＤＴＡの濃度は、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭの濃度、または、前記した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度である、請求項１９〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
前記第３の培地が、プロテアーゼを含む、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
前記プロテアーゼが、トリプシン、コラゲナーゼ、キモトリプシン、または、カルボキシペプチダーゼ、または、これらのあらゆる組み合わせである、請求項２４に記載の方法。
【請求項２６】
前記プロテアーゼが、トリプシンである、請求項２５または２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記プロテアーゼを、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭの濃度、または、前記した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度で第３の培地に提供する、請求項２４に記載の方法。
【請求項２８】
前記方法が、前記胎盤、または、その一部を、さらなる複数の培地と接触させることをさらに含み、前記接触により、エキソソームを含む複数の画分が得られる、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
前記第１、第２、第３、または、さらなる培地が、グルコースを含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記第１、第２、第３、または、さらなる培地が、ＧＭ−ＣＳＦを含む、請求項２８または２９記載の方法。
【請求項３１】
前記第１、第２、第３、または、さらなる培地が、血清を含む、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１、第２、第３、または、さらなる培地が、ＤＭＥＭを含む、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１、第２、第３、または、さらなる培地が、ＡＨＲアンタゴニストを含む、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ＡＨＲアンタゴニストが、ＳＲ１である、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
前記ＳＲ１が、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、または、１ｍＭの濃度、または、前記した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にあるその他のあらゆる濃度である、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
前記第１の培地が、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃の温度、または、前記した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
前記第２の培地が、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃の温度、または、前記した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
前記第３の培地が、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃の温度、または、前記した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
前記複数のさらなる培地が、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃の温度、または、前記した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、請求項２８〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第１、第２または第３のかん流液、または、さらなる複数の培地が、抗生物質を含む、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
（ａ）前記第１、第２、及び／または、第３の画分、または、複数の画分を、組織フィルターに通すこと；
（ｂ）（ａ）で回収した濾過物に対して第１の遠心分離を行って、細胞ペレット、及び、第１の上清を生成すること；
（ｃ）前記第１の上清に関して第２の遠心分離を行って、第２の上清を生成すること；及び
（ｄ）前記第２の上清に関して第３の遠心分離を行って、エキソソームペレットを生成すること；及び、任意に、
（ｅ）前記エキソソームを溶液に再懸濁すること、
を含む方法で、前記エキソソームを、前記第１、第２、及び／または、第３の画分、または、複数の画分から単離する、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
前記エキソソームが、ＣＤ６３、ＣＤ６３−Ａ、パーフォリン、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ、または、グランザイムＢ、または、これらのあらゆる組み合わせを含む、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
前記エキソソームが、ＣＤ６３Ａを含む、請求項４２に記載の方法。
【請求項４４】
前記エキソソームが、シグナル伝達分子を含む、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４５】
前記エキソソームが、サイトカイン、ｍＲＮＡ、または、ｍｉＲＮＡを含む、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４６】
アフィニティークロマトグラフィーによってエキソソームを単離することをさらに含み、アフィニティークロマトグラフィーが、ウイルス抗原、ウイルスタンパク質、細菌抗原、細菌タンパク質、真菌抗原、または、真菌タンパク質を含むエキソソームの除去に関して選択的である、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
１つ以上のさらなるアフィニティークロマトグラフィーステップによってエキソソームを単離することをさらに含み、前記１つ以上のさらなるアフィニティークロマトグラフィーステップが、炎症マーカー、及び／または、腫瘍マーカーを含むエキソソームの除去に関して選択的である、前出請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４８】
ヒト胎盤由来のエキソソームを含む組成物であって、前記エキソソームが、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４ｌｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３−１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ２０９、ＣＤ３２６、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲＤＰＤＱ、ＭＣＳＰ、ＲＯＲ１、ＳＳＥＡ−４、または、これらの組み合わせに対して陽性である、前記組成物。
【請求項４９】
前記エキソソームが、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４ｌｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３−１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ２０９、ＣＤ３２６、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲＤＰＤＱ、ＭＣＳＰ、ＲＯＲ１、及び、ＳＳＥＡ−４に対して陽性である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５０】
前記エキソソームが、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４ｌｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３−１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ２０９、ＣＤ３２６、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲＤＰＤＱ、ＭＣＳＰ、ＲＯＲ１、及び、ＳＳＥＡ−４からなる群から選択した、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、または、それ以上のマーカーに対して陽性である、請求項４８に記載の組成物。
【請求項５１】
前記エキソソームが、ＣＤ３−、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３３−、ＣＤ１９２−、ＨＬＡ−Ａ−、ＨＬＡ−Ｂ−、ＨＬＡ−Ｃ−、ＨＬＡ−ＤＲ−、ＣＤ１１ｃ−、または、ＣＤ３４−である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５２】
前記エキソソームが、ＣＤ３−、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３３−、ＣＤ１９２−、ＨＬＡ−Ａ−、ＨＬＡ−Ｂ−、ＨＬＡ−Ｃ−、ＨＬＡ−ＤＲ−、ＣＤ１１ｃ−、及び、ＣＤ３４−である、請求項４８〜５０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５３】
前記エキソソームが、非コードＲＮＡ分子を含む、請求項４８〜５２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５４】
前記ＲＮＡ分子が、ミクロＲＮＡである、請求項５３に記載の組成物。
【請求項５５】
前記ミクロＲＮＡを、表７のミクロＲＮＡ、及び、それらの組み合わせからなる群から選択する、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５６】
前記ミクロＲＮＡを、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、及び、これらの組み合わせからなる群から選択する、請求項５４に記載の組成物。
【請求項５７】
前記エキソソームが、表３のサイトカイン、及び、それらの組み合わせからなる群から選択するサイトカインを含む、請求項４８〜５６のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５８】
前記エキソソームが、表４のサイトカイン受容体、及び、それらの組み合わせからなる群から選択するサイトカイン受容体を含む、請求項４８〜５７のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項５９】
前記エキソソームが、表６のタンパク質、及び、それらの組み合わせからなる群から選択するタンパク質を含む、請求項４８〜５８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６０】
前記エキソソームが、細胞質アコニット酸ヒドラターゼ、細胞表面糖タンパク質ＭＵＣ１８、タンパク質アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ１、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファ、カリン−５、カルシウム結合タンパク質３９、グルコシダーゼ２サブユニットベータ、塩化物細胞内チャネルタンパク質５、セマフォリン−３Ｂ、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２２、スプライセオソームＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ３９Ｂ、転写活性化タンパク質Ｐｕｒ−アルファ、プログラム細胞死タンパク質１０、ＢＲＯ１ドメイン含有タンパク質ＢＲＯＸ、キヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼ３、ラミニンサブユニットアルファ５、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＥメンバー１、シンタキシン結合タンパク質３、プロテアソームサブユニットベータタイプ７、及び、これらの組み合わせ、からなる群から選択したタンパク質を含む、請求項４８〜５８のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６１】
前記エキソソームが、間葉系幹細胞、臍帯血、または、胎盤かん流液に由来するエキソソームよりも少なくとも２倍高いレベルで、少なくとも１つのマーカー分子を含む、請求項４８〜６０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６２】
前記エキソソームが、間葉系幹細胞、臍帯血、及び、胎盤かん流液に由来するエキソソームよりも少なくとも２倍高いレベルで、少なくとも１つのマーカー分子を含む、請求項４８〜６０のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６３】
前記エキソソームを、全胎盤培養物の培地から単離する、請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６４】
前記エキソソームを、胎盤葉、または、胎盤の一部を含む全培養物の培地から単離する、請求項４８〜６２のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６５】
前記エキソソームを、請求項１〜４７のいずれか１項に記載の方法で生成する、請求項４８〜６４のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６６】
静脈内投与に適した形態である、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６７】
局所注射に適した形態である、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６８】
局所投与に適した形態である、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項６９】
超音波送達に適した形態である、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項７０】
免疫細胞の増殖を増加させる方法であって、前記細胞を、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項７１】
前記免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
前記免疫細胞が、ＮＫ細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記免疫細胞が、ＣＤ３４＋細胞である、請求項７０に記載の方法。
【請求項７４】
がん細胞の増殖を阻害する方法であって、前記細胞を、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む、前記方法。
【請求項７５】
前記対象での血管形成または血管新生の方法であって、前記対象に対して、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項７６】
前記対象の免疫系を調節する方法であって、前記対象に対して、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項７７】
対象の罹患組織または損傷組織を修復する方法であって、前記対象に対して、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項７８】
対象のがんを処置する方法であって、前記対象に対して、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項７９】
前記対象が、ヒトである、請求項７５〜７８のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１８年１１月１６日に出願した米国仮特許出願第６２／５８７，３３５号の利益を主張するものであり、その開示の全体を参照により本明細書に援用する。
【０００２】
１．発明の分野
培養した胎盤、または、その一部から、エキソソームを生成、単離、及び、特徴決定する方法を提供する。本明細書で説明する代替手法は、バイオテクノロジーのツール、及び、治療法として使用することができるエキソソームの生成、分離、特徴決定を容易にする。
【背景技術】
【０００３】
２．発明の背景
エキソソームは、生体細胞から分泌されるナノサイズの二脂質膜小胞であり、細胞間連絡において重要な機能を果たす。ヒトが妊娠している期間、胎盤は、生理的ホメオスタシスの調節と、胎児の発達の支援において中心的な役割を果たす。胎盤が分泌する細胞外小胞、及び、エキソソームは、胎盤と母体組織との間の連絡に寄与して、母体胎児耐性を維持することが知られている。エキソソームは、脂質、サイトカイン、ミクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び、ＤＮＡ、ならびに、タンパク質などの活性な生物製剤を含んでおり、これらを、当該エキソソームの表面に提示することができる。エキソソームは、免疫調節、血管形成の促進などの数多くの治療方法、及び、薬剤の送達に有用であると考えられている。大量のエキソソームの分離を可能にするさらなる手法が必要であることは、明らかである。
【発明の概要】
【０００４】
３．概要
本発明の態様は、培養した胎盤、または、その一部から、エキソソームを生成、単離、及び、特徴決定する方法に関する。本明細書で説明する手法は、バイオテクノロジーのツール、及び、治療法として使用することができるエキソソームの生成、分離、特徴決定を容易にする。好ましい代替手法は、以下の通りである：
【０００５】
１．胎盤、または、その一部からエキソソームを単離する方法であって、前記方法は：
ａ）胎盤、または、その一部、好ましくは、培養胎盤、または、その一部を、第１の培地と接触させること；及び
ｂ）前記胎盤、または、その一部からエキソソームの集団を含む第１の画分を得ること；
ｃ）任意に、前記胎盤、または、その一部を、第２の培地と接触させ、かつ、前記胎盤、または、その一部に由来するエキソソームの集団を含む第２の画分を得ること；
ｄ）任意に、前記胎盤、または、その一部を、第３の培地と接触させ、及び、前記胎盤、または、その一部に由来するエキソソームの集団を含む第３の画分を得ること；及び
ｅ）任意に、前記第１、第２、及び／または、第３の画分に由来するエキソソームの集団を、好ましくは、連続遠心分離、及び／または、所望のエキソソームの集団に存在するマーカー、または、ペプチドに特異的な抗体、または、その結合部分を使用するアフィニティークロマトグラフィーで単離すること、を含み、前記抗体、または、その結合部分を、膜、樹脂、ビーズ、または、容器などの基質に固定している、前記方法。
【０００６】
２．前記胎盤、または、その一部が、羊膜をさらに含む、代替手法１に記載の方法。
【０００７】
３．前記胎盤、または、その一部が、ヒト胎盤、または、その一部である、代替手法２に記載の方法。
【０００８】
４．前記第１、第２、及び／または、第３の培地を、胎盤、または、その一部と、４５分間、または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または、２４時間、または、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または、２０日間など、少なくとも４５分間かけて接触させ、時間の長さは、前記した時点のいずれか２つで定義した範囲内にある、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【０００９】
５．前記第１、第２、及び／または、第３の培地を、胎盤、または、その一部と、少なくとも７、１４、２８、３５、または、４２日間、または、前記した時点のいずれか２つで定義した範囲内にある長さの時間をかけて接触させる、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００１０】
６．前記胎盤、または、その一部が、細分化、粉砕、または、酵素処理してある、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００１１】
７．前記胎盤、または、その一部は、実質的に平坦、または、シート状であり、及び、脱細胞化し、かつ、実質的に乾燥させており、及び、前記方法が、外因性細胞を含む体液を、脱細胞化胎盤、または、その一部と接触させて、前記脱細胞化胎盤、または、その一部に対して、前記外因性細胞を播種することをさらに含み、及び、前記細胞と、前記脱細胞化胎盤、または、その一部との接触は、脱細胞化胎盤、または、その一部を、第１の培地と接触させる前に行う、代替手法１〜５のいずれか１つに記載の方法。
【００１２】
８．前記外因性細胞を、前記胎盤、または、その一部のドナー対象とは異なる対象から得る、代替手法７に記載の方法。
【００１３】
９．前記体液が、腹水、血液、または、血漿である、代替手法７または８に記載の方法。
【００１４】
１０．前記細胞が、臓器に由来する、代替手法７または８に記載の方法。
【００１５】
１１．前記細胞が、肝臓、腎臓、肺、または、膵臓に由来する、代替手法１０に記載の方法。
【００１６】
１２．前記細胞が、免疫細胞である、代替手法７または８に記載の方法。
【００１７】
１３．前記細胞が、Ｔ細胞またはＢ細胞である、代替手項１２に記載の方法。
【００１８】
１４．前記第１の培地が、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００１９】
１５．前記第１、第２、または第３の画分が、腹水、血液、または、血漿に由来するエキソソームを含む、代替手法９に記載の方法。
【００２０】
１６．前記第１、第２、または第３の画分が、臓器細胞に由来するエキソソームを含む、代替手法１０に記載の方法。
【００２１】
１７．前記細胞が、肝臓、腎臓、肺、または、膵臓に由来する、代替手法１１に記載の方法。
【００２２】
１８．前記第２の培地が、成長因子を含む、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００２３】
１９．前記第３の培地が、キレート剤を含む、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００２４】
２０．前記キレート剤が、ホスホネート、ＢＡＰＴＡ四ナトリウム塩、ＢＡＰＴＡ／ＡＭ、Ｄｉ−Ｎｏｔｒｏｐｈｅｎ（商標）試薬四ナトリウム塩、ＥＧＴＡ／ＡＭ、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラジン、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス−（２ピリジルメチル）エチレンジアミン、６−ブロモ−Ｎ’−（２−ヒドロキシベンジリデン）−２−メチルキノリン−４−カルボヒドラジド、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸テトラキス（アセトキシメチルエステル）、（エチレンジニトリロ）四酢酸、（ＥＤＴＡ）、エダタミル、エチレンジニトリロ四酢酸、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸、または、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸四ナトリウム塩（ＥＧＴＡ）、または、これらのあらゆる組み合わせである、代替手法１９に記載の方法。
【００２５】
２１．前記キレート剤が、ＥＤＴＡ、または、ＥＧＴＡ、または、これらの組み合わせである、代替手法１９または２０に記載の方法。
【００２６】
２２．前記キレート剤を、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭの濃度、または、前記した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度で第３の培地に提供する、代替手法１９〜２１のいずれか１つに記載の方法。
【００２７】
２３．前記第３の培地でのＥＤＴＡの濃度は、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭの濃度、または、前記した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度である、代替手法１９〜２２のいずれか１つに記載の方法。
【００２８】
２４．前記第３の培地が、プロテアーゼを含む、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００２９】
２５．前記プロテアーゼが、トリプシン、コラゲナーゼ、キモトリプシン、または、カルボキシペプチダーゼ、または、これらのあらゆる組み合わせである、代替手法２４に記載の方法。
【００３０】
２６．前記プロテアーゼが、トリプシンである、代替手法２５または２５に記載の方法。
【００３１】
２７．前記プロテアーゼを、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭの濃度、または、前記した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度で第３の培地に提供する、代替手法２４に記載の方法。
【００３２】
２８．前記方法が、前記胎盤、または、その一部を、さらなる複数の培地と接触させることをさらに含み、前記接触により、エキソソームを含む複数の画分が得られる、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００３３】
２９．前記第１、第２、第３、または、さらなる培地が、グルコースを含む、代替手法２８に記載の方法。
【００３４】
３０．前記第１、第２、第３、または、さらなる培地が、ＧＭ−ＣＳＦを含む、代替手法２８または２９記載の方法。
【００３５】
３１．前記第１、第２、第３、または、さらなる培地が、血清を含む、代替手法２８〜３０のいずれか１つに記載の方法。
【００３６】
３２．前記第１、第２、第３、または、さらなる培地が、ＤＭＥＭを含む、代替手法２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【００３７】
３３．前記第１、第２、第３、または、さらなる培地が、ＡＨＲアンタゴニストを含む、代替手法２８〜３２のいずれか１つに記載の方法。
【００３８】
３４．前記ＡＨＲアンタゴニストが、ＳＲ１である、代替手法３３に記載の方法。
【００３９】
３５．前記ＳＲ１が、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、または、１ｍＭの濃度、または、前記した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にあるその他のあらゆる濃度である、代替手法３４に記載の方法。
【００４０】
３６．前記第１の培地が、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃の温度、または、前記した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００４１】
３７．前記第２の培地が、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃の温度、または、前記した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００４２】
３８．前記第３の培地が、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃の温度、または、前記した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００４３】
３９．前記複数のさらなる培地が、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、４０℃の温度、または、前記した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、前記胎盤、または、その一部と接触している、代替手法２８〜３８のいずれか１つに記載の方法。
【００４４】
４０．前記第１、第２または第３のかん流液、または、さらなる複数の培地が、抗生物質を含む、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００４５】
４１．（ａ）前記第１、第２、及び／または、第３の画分、または、複数の画分を、組織フィルターに通すこと；
（ｂ）（ａ）で回収した濾過物に対して第１の遠心分離を行って、細胞ペレット、及び、第１の上清を生成すること；
（ｃ）前記第１の上清に関して第２の遠心分離を行って、第２の上清を生成すること；及び
（ｄ）前記第２の上清に関して第３の遠心分離を行って、エキソソームペレットを生成すること；及び、任意に、
（ｅ）前記エキソソームを溶液に再懸濁すること、
を含む方法で、前記エキソソームを、前記第１、第２、及び／または、第３の画分、または、複数の画分から単離する、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００４６】
４２．前記エキソソームが、ＣＤ６３、ＣＤ６３−Ａ、パーフォリン、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ、または、グランザイムＢ、または、これらのあらゆる組み合わせを含む、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００４７】
４３．前記エキソソームが、ＣＤ６３Ａを含む、代替手法４２記載の方法。
【００４８】
４４．前記エキソソームが、シグナル伝達分子を含む、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００４９】
４５．前記エキソソームが、サイトカイン、ｍＲＮＡ、または、ｍｉＲＮＡを含む、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００５０】
４６．アフィニティークロマトグラフィーによってエキソソームを単離することをさらに含み、アフィニティークロマトグラフィーが、ウイルス抗原、ウイルスタンパク質、細菌抗原、細菌タンパク質、真菌抗原、または、真菌タンパク質を含むエキソソームの除去に関して選択的である、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００５１】
４７．１つ以上のさらなるアフィニティークロマトグラフィーステップによってエキソソームを単離することをさらに含み、前記１つ以上のさらなるアフィニティークロマトグラフィーステップが、炎症マーカー、及び／または、腫瘍マーカーを含むエキソソームの除去に関して選択的である、前出代替手法のいずれか１つに記載の方法。
【００５２】
ヒト胎盤由来のエキソソームを含む組成物も提供しており、当該エキソソームは、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３−１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ２０９、ＣＤ３２６、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲＤＰＤＱ、ＭＣＳＰ、ＲＯＲ１、ＳＳＥＡ−４、または、それらの組み合わせに対して陽性である。
【００５３】
本明細書に記載したエキソソームは、特定のマーカーを含む。そのようなマーカーとして、例えば、エキソソームの同定において、及び、それらをその他のエキソソーム、例えば、胎盤に由来しないエキソソームと区別する上で有用になり得る。特定の実施形態では、そのようなエキソソームは、例えば、フローサイトメトリー、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）によって決定することができる1つ以上のマーカーに対して陽性である。加えて、本明細書で提供するエキソソームは、特定のマーカーの欠如に基づいて識別することができる。そのようなマーカーの有無の決定は、当該技術分野で公知の方法、例えば、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて行うことができる。
【００５４】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３−１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ２０９、ＣＤ３２６、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲＤＰＤＱ、ＭＣＳＰ、ＲＯＲ１、及び、ＳＳＥＡ−４に対して陽性である。一部の実施形態では、当該エキソソームは、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３１、ＣＤ４０、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ４９ｅ、ＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ６３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３−１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４６、ＣＤ２０９、ＣＤ３２６、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲＤＰＤＱ、ＭＣＳＰ、ＲＯＲ１、及び、ＳＳＥＡ−４からなる群から選択する２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、または、それ以上のマーカーに対して陽性である。
【００５５】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、ＣＤ３−、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３３−、ＣＤ１９２−、ＨＬＡ−Ａ−、ＨＬＡ−Ｂ−、ＨＬＡ−Ｃ−、ＨＬＡ−ＤＲ−、ＣＤ１１ｃ−、または、ＣＤ３４−である。一部の実施形態では、当該エキソソームは、ＣＤ３−、ＣＤ１１ｂ−、ＣＤ１４−、ＣＤ１９−、ＣＤ３３−、ＣＤ１９２−、ＨＬＡ−Ａ−、ＨＬＡ−Ｂ−、ＨＬＡ−Ｃ−、ＨＬＡ−ＤＲ−、ＣＤ１１ｃ−、及び、ＣＤ３４−である。
【００５６】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、非コードＲＮＡ分子を含む。一部の実施形態では、当該ＲＮＡ分子は、ミクロＲＮＡである。一部の実施形態では、当該ミクロＲＮＡを、表７のミクロＲＮＡ、及び、それらの組み合わせからなる群から選択する。一部の実施形態では、当該ミクロＲＮＡを、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−２６ａ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２６ａ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−３０ｄ、ｈｓａ−ｍｉＲ−３０ｄ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１００、ｈｓａ−ｍｉＲ−１００−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２１、ｈｓａ−ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−２２、ｈｓａ−ｍｉＲ−２２−３ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−９９ｂ、ｈｓａ−ｍｉＲ−９９ｂ−５ｐ、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−２、ｈｓａ−ｍｉｒ−１８１ａ−１、ｈｓａ−ｍｉＲ−１８１ａ−５ｐ、及び、それらの組み合わせからなる群から選択する。
【００５７】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、表３のサイトカイン、及び、それらの組み合わせからなる群から選択するサイトカインを含む。
【００５８】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、表４のサイトカイン受容体、及び、それらの組み合わせからなる群から選択するサイトカイン受容体を含む。
【００５９】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、表６のタンパク質、及び、それらの組み合わせからなる群から選択するタンパク質を含む。一部の実施形態では、当該エキソソームは、細胞質アコニット酸ヒドラターゼ、細胞表面糖タンパク質ＭＵＣ１８、タンパク質アルギニンＮ−メチルトランスフェラーゼ１、グアニンヌクレオチド結合タンパク質Ｇ（ｓ）サブユニットアルファ、カリン−５、カルシウム結合タンパク質３９、グルコシダーゼ２サブユニットベータ、塩化物細胞内チャネルタンパク質５、セマフォリン−３Ｂ、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２２、スプライセオソームＲＮＡヘリカーゼＤＤＸ３９Ｂ、転写活性化タンパク質Ｐｕｒ−アルファ、プログラム細胞死タンパク質１０、ＢＲＯ１ドメイン含有タンパク質ＢＲＯＸ、キヌレニン−オキソグルタル酸トランスアミナーゼ３、ラミニンサブユニットアルファ５、ＡＴＰ結合カセットサブファミリーＥメンバー１、シンタキシン結合タンパク質３、プロテアソームサブユニットベータタイプ７、及び、これらの組み合わせからなる群から選択したタンパク質を含む。
【００６０】
一部の実施形態では、当該エキソソームは、間葉系幹細胞、臍帯血、または、胎盤かん流液に由来するエキソソームよりも少なくとも２倍高いレベルで、少なくとも１つのマーカー分子を含む。一部の実施形態では、当該エキソソームは、間葉系幹細胞、臍帯血、及び、胎盤かん流液に由来するエキソソームよりも少なくとも２倍高いレベルで、少なくとも１つのマーカー分子を含む。
【００６１】
一部の実施形態では、当該エキソソームを、全胎盤培養物の培地から単離する。一部の実施形態では、当該エキソソームを、胎盤葉、または、胎盤を含む培地全体から単離する。
【００６２】
一部の実施形態では、当該エキソソームを、本発明の方法で生成する。一部の実施形態では、当該組成物は、静脈内投与に適した形態である。一部の実施形態では、当該組成物は、局所注射に適した形態である。一部の実施形態では、当該組成物は、局所投与に適した形態である。一部の実施形態では、当該組成物は、超音波送達に適した形態である。
【００６３】
免疫細胞の増殖を増加させる方法であって、当該細胞を、請求項４８〜６５のいずれか１項に記載の組成物と接触させることを含む方法も提供する。一部の実施形態では、当該免疫細胞は、Ｔ細胞である。一部の実施形態では、当該免疫細胞は、ＮＫ細胞である。一部の実施形態では、当該免疫細胞は、ＣＤ３４＋細胞である。
【００６４】
当該細胞を、本発明の組成物と接触させることを含む、がん細胞の増殖を阻害する方法も提供する。
【００６５】
本発明の組成物を、対象に対して投与することを含む、当該対象における血管形成または血管新生の方法も提供する。
【００６６】
本発明の組成物を、対象に対して投与することを含む、当該対象の免疫系を調節する方法も提供する。
【００６７】
本発明の組成物を、対象に対して投与することを含む、当該対象の罹患組織または損傷組織を修復する方法も提供する。
【００６８】
本発明の組成物を、対象に対して投与することを含む、当該対象のがんを処置する方法も提供する。
【００６９】
上記した方法の一部の実施形態では、当該対象は、ヒトである。
【００７０】
本明細書では、エキソソームを含む組成物も提供する。そのような組成物は、一般的には、エキソソームが由来する胎盤細胞を含まない。さらに、そのような組成物は、一般的に、エキソソームが由来する細胞培養物での細胞培養上清を含まない。
【００７１】
特定の実施形態では、精製したエキソソームを、それを必要とする対象への投与に適した医薬組成物へと製剤する。特定の実施形態では、当該対象は、ヒトである。本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、それを必要とする対象に対して、局所的、全身的皮下、非経口的、静脈内、筋肉内、局所的、経口的、皮内、経皮的、または、鼻腔内投与するように製剤できる。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、局所投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、全身皮下投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、非経口投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、筋肉内投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、局所投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、経口投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、皮内投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、経皮投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、鼻腔内投与用に製剤する。特定の実施形態では、本明細書で提供する胎盤由来のエキソソーム含有医薬組成物は、静脈内投与用に製剤する。
【００７２】
別の態様では、本明細書に記載したエキソソーム、及び／または、エキソソームを含む医薬組成物の使用を、本明細書で提供する。
【００７３】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソーム、及び／または、エキソソームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象の疾患、及び／または、病態を、処置、及び／または、予防するために使用する。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソーム、及び／または、エキソソームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象での血管形成、及び／または、血管新生を促すために使用する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソーム、及び／または、エキソソームを含む医薬組成物は、それを必要とする対象での免疫活性を調節する（例えば、免疫応答を増大する、または、免疫応答を抑制する）ために使用する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソーム、及び／または、エキソソームを含む医薬組成物は、それを必要とする対象での組織損傷、例えば、急性または慢性損傷が引き起こす組織損傷を修復するために使用する。
【００７４】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載した誘導エキソソーム、及び／または、エキソソームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象の疾患、及び／または、病態を、処置、及び／または、予防する方法に使用する。別の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象の疾患、及び／または、病態を処置する方法に使用する。別の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象の疾患、及び／または、病態を予防する方法に使用する。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象での血管形成、及び／または、血管新生を促すための方法に使用する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象において免疫活性を調節する（例えば、免疫応答を増大する、または、免疫応答を抑制する）方法に使用する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを含む医薬組成物を、それを必要とする対象での組織損傷、例えば、急性または慢性損傷が引き起こす組織損傷を修復する方法に使用する。
【００７５】
別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソーム、及び／または、エキソソームを含む医薬組成物を、細胞保護剤として使用する。別の態様では、本明細書に記載したエキソソーム、及び／または、エキソソームを含む医薬組成物を、医薬用途に適したキットの形態で提供する。
【図面の簡単な説明】
【００７６】
４．図面の簡単な説明
【図１】エキソソーム単離のための細胞培養の概略図である。
【００７７】
【図２Ａ】ＮａｎｏＳｉｇｈｔでのサイズ分布について分析をしたｐＥｘｏ分離株を示す。この作業は、ＳＢＩ  Ｉｎｃ．（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）が、受託サービスに従って、作業と報告にあたった（ｗｗｗ．ｓｙｓｔｅｍｂｉｏ．ｃｏｍ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｅｘｏｓｏｍｅ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／）。
【図２Ｂ】ＮａｎｏＳｉｇｈｔでのサイズ分布について分析をしたｐＥｘｏ分離株を示す。この作業は、ＳＢＩ  Ｉｎｃ．（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）が、受託サービスに従って、作業と報告にあたった（ｗｗｗ．ｓｙｓｔｅｍｂｉｏ．ｃｏｍ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｅｘｏｓｏｍｅ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／）。
【図２Ｃ】ＮａｎｏＳｉｇｈｔでのサイズ分布について分析をしたｐＥｘｏ分離株を示す。この作業は、ＳＢＩ  Ｉｎｃ．（Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．）が、受託サービスに従って、作業と報告にあたった（ｗｗｗ．ｓｙｓｔｅｍｂｉｏ．ｃｏｍ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ｅｘｏｓｏｍｅ−ｓｅｒｖｉｃｅｓ／）。
【００７８】
【図３Ａ】ＭＡＣＳＰｌｅｘキットを使用して、ｐＥｘｏ（Ｎ＝１２）に存在するタンパク質マーカーを示す。
【図３Ｂ】ＭＡＣＳＰｌｅｘキットを使用して、胎盤かん流液エキソソームに存在するタンパク質マーカーを示す。
【図３Ｃ】ＭＡＣＳＰｌｅｘキットを使用して、臍帯血由来エキソソームに存在するタンパク質マーカーを示す。
【００７９】
【図４】胎盤のエキソソーム集団で同定したタンパク質の機能経路を示す。
【００８０】
【図５】３つの胎盤エキソソーム試料で同定した共通するユニークなタンパク質を示す。
【００８１】
【図６】ｐＥｘｏが、トランスウェルシステムにおいてヒト皮膚線維芽細胞の移動を促すことを示す。
【００８２】
【図７】ｐＥｘｏが、ヒト臍帯血管内皮細胞の移動を促すことを示す。
【００８３】
【図８】ｐＥｘｏが、ＨＵＶＥＣの増殖を刺激することを示す。
【００８４】
【図９】ｐＥｘｏが、ヒトＣＤ３４＋細胞の増殖を刺激することを示す。
【００８５】
【図１０】ｐＥｘｏが、ヒトＣＤ３４＋細胞のコロニー形成を刺激することを示す。
【００８６】
【図１１】ｐＥｘｏが、ＳＫＯＶ３がん細胞の増殖を阻害することを示す。
【００８７】
【図１２】ｐＥｘｏが、Ａ５４９がん細胞の増殖を阻害することを示す。
【００８８】
【図１３】ｐＥｘｏが、ＭＤＡ３２１がん細胞の増殖を阻害することを示す。
【００８９】
【図１４】ｐＥｘｏが、培養中のＣＤ３＋Ｔ細胞の増殖に影響を及ぼさないことを示す。
【００９０】
【図１５】ｐＥｘｏが、ＵＢＣ  Ｔ  ＣＤ３＋細胞において、活性化マーカーＣＤ６９の発現を大きくすることを示す。
【００９１】
【図１６】ｐＥｘｏが、成人ＰＢＭＣ  Ｔ  ＣＤ３＋細胞において、活性化マーカーＣＤ６９の発現を大きくすることを示す。
【００９２】
【図１７】ｐＥｘｏが、ＰＢＭＣにおいて、ＣＤ５６＋  ＮＫ細胞を増やすことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００９３】
５．詳細な説明
５．１．胎盤由来のエキソソーム
本明細書に記載した胎盤由来のエキソソームは、後述するように、それらの形態、及び／または、分子マーカーで選択、及び、同定することができる。本明細書に記載した胎盤由来のエキソソームは、当該技術分野で公知のエキソソーム、例えば、絨毛膜絨毛間葉系幹細胞由来のエキソソーム、例えば、Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、ＰＬＯＳ  ＯＮＥ、８：７、ｅ６８４５１に記載されたものなど、とは異なる。したがって、本明細書で使用する用語「胎盤由来のエキソソーム」は、絨毛膜絨毛間葉系幹細胞から得た、または、それに由来したエキソソームを含むことを意味しない。
【００９４】
特定の実施形態では、本明細書に記載した胎盤由来エキソソームの集団は、細胞、例えば、有核細胞、例えば、胎盤細胞を含まない。
【００９５】
５．１．１．胎盤由来のエキソソームマーカー
本明細書に記載した胎盤由来のエキソソームは、当該エキソソームを、同定、及び／または、単離するために使用することができるマーカーを含む。これらのマーカーは、例えば、タンパク質、核酸、糖分子、グリコシル化タンパク質、脂質分子とし得るものであり、そして、モノマー、オリゴマー、及び／または、マルチマーの形態で存在し得る。特定の実施形態では、これらのマーカーは、エキソソームが由来する細胞が生産する。特定の実施形態では、当該マーカーは、エキソソームの由来となる細胞が提供するが、当該マーカーは、前記細胞が、高レベルで発現することはない。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームのマーカーは、対照マーカー分子と比較した場合に、起源の細胞と比較して、エキソソームの方がより多い。別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームのマーカーは、別の細胞型から得たエキソソームと比較して、当該エキソソームの方で豊富にあり（例えば、Ｓａｌｏｍｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３、ＰＬＯＳ  ＯＮＥ、８：７、ｅ６８４５ｌに記載の絨毛膜絨毛間葉系幹細胞、及び、前脂肪細胞間葉系幹細胞）、これらのエキソソームは、同一の方法で単離する。
【００９６】
エキソソームの三次元構造は、エキソソームの表面、及び／または、エキソソーム内に含まれるマーカーの保持を可能にする。同様に、マーカー分子は、一部をエキソソーム内に、一部をエキソソームの外表面に、及び／または、当該エキソソームのリン脂質二重層の前後に存在し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームに関連するマーカーは、タンパク質である。特定の実施形態では、これらのマーカーは、エキソソームリン脂質二重層内に固定した膜貫通タンパク質、または、タンパク質分子の一部が、エキソソーム内にある一方で、同じ分子の一部が、当該エキソソームの外表面に露出するように、エキソソームリン脂質二重層の前後に固定した膜貫通タンパク質である。特定の実施形態では、これらのマーカーは、当該エキソソーム内に完全に含まれる。別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームに関連するマーカーは、核酸である。特定の実施形態では、当該核酸は、非コードＲＮＡ分子、例えば、ミクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）である。
【００９７】
５．１．１．１．表面マーカー
本明細書に記載したエキソソームは、それらの同定を可能にし、かつ、それらの起源の細胞、ならびに、その他の細胞物質、及び、非細胞物質を含まない細胞エキソソームの実質的に純粋な集団を単離／得るために使用できる表面マーカーを含む。エキソソーム表面マーカー組成を決定する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、エキソソーム表面マーカーは、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）、または、ウエスタンブロッティングで検出することができる。
【００９８】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームは、例えば、ＦＡＣＳで決定することができるなど、当該技術分野で公知のエキソソームよりも多量の表面マーカーを含む。
【００９９】
５．１．１．２．収率
本明細書に記載したエキソソームは、本明細書に記載した方法に従って単離し得るものであり、そして、それらの収率を定量し得る。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを、約０．５〜５．０ｍｇ／リットルの培養培地（例えば、血清を含む、または、含まない培養培地）の濃度で単離する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを、約２〜３ｍｇ／リットルの培養培地（例えば、血清を含む培養培地）の濃度で単離する。別の特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームは、約０．５〜１．５ｍｇ／リットルの培養培地（例えば、血清を含まない培養培地）の濃度で単離する。
【０１００】
５．１．２．貯蔵及び保存
本明細書に記載したエキソソームは、保存することができ、すなわち、長期保存を可能にする条件下、または、エキソソームの分解を阻害する条件下に置くことができる。
【０１０１】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームは、適切な温度で、緩衝剤を含む組成物において、上記した方法に従って回収をした後に保存することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを、例えば、約−２０℃、または、約−８０℃で凍結保存する。
【０１０２】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームは、例えば、アンプルなどの小さな容器（例えば、２ｍＬのバイアル）で凍結保存することができる。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを、約０．１ｍｇ／ｍＬ〜約１０ｍｇ／ｍＬの濃度で凍結保存する。
【０１０３】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを、約−８０℃〜約−１８０℃の温度で凍結保存する。凍結保存したエキソソームは、使用のために解凍する前に、液体窒素に移すことができる。一部の実施形態では、例えば、一旦、アンプルが約−９０℃にまで達すると、それらを、液体窒素貯蔵領域に移す。凍結保存は、速度制御した冷凍庫を使用して解凍することもできる。凍結保存したエキソソームは、使用前に、約２５℃から約４０℃の温度で解凍することができる。
【０１０４】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームを、短期間（例えば、２週間未満）、約４℃〜約２０℃の温度で保存する。
【０１０５】
５．２．組成物
本明細書では、本明細書で提供するエキソソームを含む組成物、例えば、医薬組成物をさらに提供する。本明細書に記載した組成物は、エキソソームを用いた処置が有益である対象（例えば、ヒト対象）における特定の疾患、及び、障害の処置において有用である。
【０１０６】
特定の実施形態では、本明細書で提供したエキソソームを含むことに加えて、本明細書に記載した組成物（例えば、医薬組成物）は、医薬として許容可能な担体を含む。本明細書で使用する用語「医薬として許容可能な」は、連邦政府または州政府の規制機関から承認を受けたものであること、または、動物、特に、ヒトでの使用のために米国薬局方、あるいは、一般的に認められているその他の薬局方に収載されていることを意味する。医薬として許容可能な担体に関連して本明細書で使用する用語「担体」とは、医薬組成物と共に投与される希釈剤、アジュバント、賦形剤、または、ビヒクルのことを指す。とりわけ、生理食塩水、及び、デキストロース水溶液とグリセロール溶液も、注射可能な溶液用の液体担体として使用することができる。適切な賦形剤として、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、米穀、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどがある。適切な医薬担体の例は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」ＪＰ  Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ  ａｎｄ  ＡＲ  Ｇｅｎｎａｒｏ、１９９０、第１８版に記載されている。
【０１０７】
特定の実施形態では、本明細書に記載した組成物は、1つ以上の緩衝剤、例えば、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ダルベッコのＰＢＳ（ＤＰＢＳ）、及び／または、スクロースリン酸グルタミン酸緩衝剤をさらに含む。その他の実施形態では、本明細書に記載した組成物は、緩衝剤を含まない。特定の実施形態では、本明細書に記載した組成物は、血漿溶解物をさらに含む。
【０１０８】
特定の実施形態では、本明細書に記載した組成物は、1つ以上の塩、例えば、塩化ナトリウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、グルタミン酸ナトリウム、及び、アルミニウム塩（例えば、水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウム、ミョウバン（硫酸カリウムアルミニウム）、または、そのようなアルミニウム塩の混合物）をさらに含む。その他の実施形態では、本明細書に記載した組成物は、塩を含まない。
【０１０９】
本明細書に記載した組成物を、投与説明書と共に、容器、パック、または、ディスペンサーに入れておくことができる。
【０１１０】
本明細書に記載した組成物は、使用前に保存することができ、例えば、これらの組成物は、冷凍保存（例えば、約−２０℃または約−８０℃で）；冷蔵状態で保存（例えば、約４℃）；または、室温で保存することができる。
【０１１１】
５．２．１．製剤、及び、投与経路
疾患または病態の処置、及び／または、予防における治療的使用に有効である、本明細書に記載したエキソソームまたは組成物の量は、疾患の性質によって変化し、また、標準的な臨床技術によって決定することができる。対象に投与するエキソソーム、または、その組成物の正確な投与量も、投与経路、及び、処置する疾患または病態の重症度によって変化し、また、開業医の判断と、それぞれの対象の状況に応じて決定すべきである。例えば、有効な投与量は、投与手段、標的部位、患者の生理学的状態（年齢、体重、及び、健康状態など）、患者が人間であるか動物であるか、投与するその他の薬剤、及び、処置が予防的であるか否かによって、変化し得る。安全性と有効性を最適化するために、最適な治療用量に調整する。
【０１１２】
本明細書に記載したエキソソーム、または、その組成物の投与は、当該技術分野で公知の様々な経路を介して行うことができる。特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソーム、または、その組成物は、局部、全身、皮下、非経口、静脈内、筋肉内、局所、経口、皮内、経皮、または、鼻腔内投与で投与する。特定の実施形態では、当該投与は、静脈内注射による。特定の実施形態では、当該投与は、皮下注射を介する。特定の実施形態では、当該投与は、局所的である。別の特定の実施形態では、当該エキソソーム、または、その組成物は、細胞外マトリックスを含む製剤で投与する。別の特定の実施形態では、当該エキソソーム、または、その組成物は、1つ以上のさらなる送達デバイス、例えば、ステントと組み合わせて投与する。別の特定の実施形態では、当該エキソソーム、または、その組成物は、（例えば、虚血性疾患の処置での）低酸素組織または流入領域リンパ節など、当該エキソソーム、または、組成物で処置をする部位で、または、その周辺に対して局部的に投与する。
【０１１３】
５．３．使用の方法
５．３．１．血管形成が有効な疾患の処置
本明細書に記載したエキソソーム、及び、その組成物は、血管形成を促すものであり、したがって、血管形成が有効な疾患及び障害を処置するために使用することができる。したがって、本明細書に記載したエキソソーム、または、その組成物を使用して、それを必要とする対象における血管形成を促す方法を、本明細書で提供する。本明細書で使用する用語「処置する」は、対象における疾患、障害、または、病態、または、それらのあらゆるパラメータ、または、症状の治癒、緩和、改善、重症度の軽減、または、経時的抑制を含む。特定の実施形態では、本明細書で提供する方法に従って処置する対象は、哺乳動物、例えば、ヒトである。
【０１１４】
ある実施形態では、対象での血管形成または血管新生を誘導する方法を本明細書で提供しており、当該方法は、本明細書で提供するエキソソーム、または、その組成物を、対象に対して投与することを含む。したがって、本明細書で提供する方法を使用して、血管形成／血管新生の拡大が有効な対象の疾患及び障害を処置することができる。血管形成が有効で、それにより、本明細書に記載したエキソソーム、及び、組成物で処置することができる疾患／病態の例として、心筋梗塞、鬱血性心不全、末梢動脈疾患、重症下肢虚血、末梢血管疾患、左形成不全心臓症候群、糖尿病性足潰瘍、静脈潰瘍、または、動脈潰瘍があるが、これらに限定されない。
【０１１５】
ある実施形態では、例えば、末梢血管系にて血流が撹乱している対象を処置する方法を、本明細書で提供しており、当該方法は、本明細書で提供するエキソソーム、または、その組成物を、当該対象に対して投与することを含む。特定の実施形態では、本明細書で提供する方法は、虚血を有する対象を、本明細書で提供するエキソソーム、または、その組成物で処置することを含む。特定の実施形態では、当該虚血は、末梢動脈疾患（ＰＡＤ）、例えば、重大な四肢虚血（ＣＬＩ）である。特定のその他の実施形態では、当該虚血は、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、末梢動脈疾患、虚血性血管疾患、虚血性心疾患、または、虚血性腎疾患である。
【０１１６】
５．３．２．患者集団
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソームは、本明細書に記載した疾患または病態のいずれかを治療する必要がある対象に対して投与する。別の実施形態では、本明細書に記載した組成物は、本明細書に記載した疾患または病態のいずれかを治療する必要がある対象に対して投与する。特定の実施形態では、当該対象は、ヒトである。
【０１１７】
特定の実施形態では、本明細書に記載したエキソソーム、または、組成物は、血管形成、及び／または、血管新生を増やす治療を必要とする対象（例えば、ヒト）に対して投与する。
【０１１８】
５．４．キット
本明細書に記載した医薬組成物、すなわち、本明細書に記載したエキソソームを含む組成物の１つ以上の成分で満たした１つ以上の容器を含む医薬パックまたはキットを、本明細書で提供する。医薬品または生物学的製剤の製造、使用、または、販売を規制する政府機関が規定した形式の通知を、任意に、それら容器（複数可）に明記することができ、このものは、ヒトへの投与のための製造、使用、または、販売の規制機関の承認を示す。
【０１１９】
本明細書に記載したキットは、上記した方法で使用することができる。本明細書に記載した組成物は、個人に対して容易に投与できる形態で調製することができる。例えば、当該組成物は、医療用途に適した容器に入れることができる。このような容器として、例えば、滅菌プラスチックバッグ、フラスコ、ジャー、または、これらの組成物を容易に分配できるその他の容器とすることができる。例えば、当該容器は、レシピエントに対する液体の静脈内投与に適した、血液バッグ、または、その他のプラスチック製の医学的に許容されるバッグとすることができる。
【０１２０】
例示的な胎盤培養物
胎盤は、造血幹細胞（ＨＳＣ）、及び、非造血幹細胞などの幹細胞を含む細胞の貯蔵庫である。本明細書では、バイオリアクターで培養をする胎盤、または、その一部からエキソソームを単離する方法を記載している。培養を行っている間に、細胞からエキソソームは分泌され、そして、培地にエキソソームは分泌され、これにより、エキソソームのさらなる処理と分離が容易になる。エキソソームは、培養の異なる段階で、胎盤、または、その一部から分離することもできる（例えば、異なる時点で、かつ、それぞれの回復ステップで、異なるかん流液を使用し得る）。これらのエキソソームを、一旦、培地に取り込むと、例えば、遠心分離、（例えば、小さなＲａｂファミリーＧＴＰａｓｅ、アネキシン、フロチリン、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＥＳＣＲＴ複合体、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ６３Ａ、ＣＤ８１、ＣＤ８２）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）、パーフォリン、ＴＲＡＩＬ、グランザイムＢ、Ｆａｓに特異的な基質に結合した結合剤などの固定化結合剤；Ｆａｓリガンド、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＥＤＩＬ３、フィブロネクチン、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＣＡ３、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−１、ＴＧＦ−β１、ＭＡＧＥ  ３／６、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ９、ＣＤ１４７、ＣＡ−１２５、ＥｐＣａｍ、及び／または、ＣＤ２４などの１つ以上のがんマーカー；または、α−シヌクレイン、ＨＩＶ、または、ＨＣＶタンパク質、タウ、ベータ−アミロイド、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、フェチュイン−Ａ、及び／または、ＣＤ１３３など、これらに限定されない、ウイルス、真菌、または、細菌タンパク質、または、ペプチドなどの１つ以上の炎症マーカーまたは病原マーカーを利用する）市販のエキソソーム単離キット、レクチンアフィニティー、及び／または、アフィニティークロマトグラフィーを使用してさらに単離することができる。単離したエキソソームは、治療、診断、及び、バイオテクノロジーツールとして使用することができる。
【０１２１】
本明細書に記載した「エキソソーム」は、精嚢液、血液、尿、血清、及び、母乳など、数多くの、そして、おそらくはすべての真核生物の体液に存在する小胞である。それらは、細胞外小胞とも称し得る。エキソソームは、細胞間連絡における重要な機能を果たす生体細胞から分泌される二脂質膜小胞である。エキソソームは、幹細胞、上皮細胞などの細胞が生成し、かつ、マトリックス結合ナノ小胞（ＭＢＶ）として定義されるエキソソームのサブタイプが、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）生体足場（非体液）に存在すると報告されている。報告のあったエキソソームの直径は、３０〜１００ｎｍであり、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）よりも大きいが、例えば、赤血球よりもはるかに小さい。多胞体が原形質膜と融合するときに細胞からエキソソームを放出することができ、または、当該原形質膜から直接にエキソソームを放出することができる。
【０１２２】
エキソソームは、特殊な機能を持ち合わせており、また、凝固、細胞間シグナル伝達、廃棄物管理などのプロセスで重要な役割を果たすことが示されている。胎盤から分泌される細胞外小胞、及び、エキソソームは、胎盤と母体組織との間の連絡に寄与して、母体胎児耐性を維持することが知られている。ヒト胎盤外植片から単離したエキソソームは、免疫調節活性を有することが示されている。幹細胞由来のエキソソームは、アストロサイトとミクログリアの活性化を抑制して神経炎症を軽減し、そして、おそらくは、ＴＢＩの後の神経組織修復と機能回復の双方に寄与する神経原性ニッチを標的とすることで神経形成を促すことも示されている。（Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１７、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉｅｎｃｅを確認されたい）。ヒト胚性間葉系幹細胞に由来するエキソソームも、骨軟骨再生を促す（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１６、Ｏｓｔｅｏａｒｔｈｒｉｔｉｓ  ａｎｄ  Ｃａｒｔｉｌａｇｅ）。機能性ＦａｓリガンドとＴｒａｉｌ分子とを保有するヒト胎盤が分泌したエキソソームは、活性化した免疫細胞にアポトーシスを伝達することが示されており、このことは、胎児のエキソソームを介した胎児の免疫特権を示唆している。（Ａｎｎ−Ｃｈｒｉｓｔｉｎ  Ｓｔｅｎｑｖｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、２０１３、１９１：ｄｏｉ：１０．４０４９）。
【０１２３】
エキソソームは、脂質、サイトカイン、ミクロＲＮＡ、ｍＲＮＡ、及び、ＤＮＡなどの活性生物製剤を含む。それらは、遺伝物質、及び／または、タンパク質転移を介した細胞間連絡の伝達物質としても機能し得る。エキソソームは、細胞の機能的または生理学的状態を反映し得る細胞タイプに特異的な情報も含み得る。その結果、エキソソームの臨床的、及び、生物学的用途の開発に対する関心が高まっている。
【０１２４】
したがって、本明細書に記載した手法を使用して、任意に、（例えば、当該エキソソームに関する1つ以上のタンパク質、または、マーカーの有無を同定することで）特徴決定した当該エキソソームを含むヒト胎盤、または、その一部から単離したエキソソームを使用して、免疫調節、抗線維化環境、及び／または、再生促進効果を刺激することができる。したがって、本明細書に記載した手法を使用してヒト胎盤、または、その一部から単離したエキソソームを、（例えば、当該エキソソームに関するマーカーの有無に従って）選択し、精製し、凍結し、凍結乾燥し、梱包し、治療用品、及び／または、バイオテクノロジーのツールとして流通し得る。
【０１２５】
一部の代替手法では、腫瘍マーカーまたはペプチド、病原マーカーまたはペプチド、例えば、ウイルス、真菌、または、細菌のマーカー、または、ペプチド、及び／または、炎症ペプチドなどの炎症マーカーを有するエキソソームを同定して、そのようなエキソソームを、エキソソームの集団から効果的に除去（例えば、そのような腫瘍マーカーまたはペプチド、病原マーカーまたはペプチド、及び／または、炎症マーカーまたはペプチドに特異的な抗体、または、その結合部分などの結合分子を用いたアフィニティークロマトグラフィーで除去）し得る。したがって、一部の代替手法では、例えば、エキソソームの第１の集団を、本明細書に記載した方法によって、ヒト胎盤、または、その一部から単離し、そして、エキソソームの第１の集団を単離すると、このエキソソームの集団を、固定化抗体、または、その結合部分を有する基質（例えば、当該固定化抗体、または、その結合部分を有する膜、樹脂、ビーズ、または、容器）を使用して、さらに処理をしてエキソソームの１つ以上の亜集団を除去し、当該固定化抗体、または、その結合部分は、エキソソームの亜集団に存在するマーカーまたはペプチドに対して特異的であり、それらを、１つ以上の腫瘍マーカーまたはペプチド、病原マーカーまたはペプチド、例えば、ウイルス、真菌、または、細菌マーカー、または、ペプチド、及び／または、炎症マーカーなどまたは炎症ペプチドなどのさらなる単離のために選択する。一部の代替手法では、本明細書に記載した方法によって、ヒト胎盤、または、その一部から単離したエキソソームの第１の集団を、固定化抗体、または、その結合部分を有する基質（例えば、当該固定化抗体、または、その結合部分を有する膜、樹脂、ビーズ、または、容器）と接触させ、当該固定化抗体、または、その結合部分は、Ｆａｓリガンド、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＥＤＩＬ３、フィブロネクチン、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＣＡ３、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−１、ＴＧＦ−β１、ＭＡＧＥ  ３／６、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ９、ＣＤ１４７、ＣＡ−１２５、ＥｐＣａｍ、及び／または、ＣＤ２４などの１つ以上のがんマーカーに対して特異的であり、これにより、当該固定化抗体、または、その結合部分に対する親和性に基づいて、エキソソームの第１の集団から第２のエキソソームの集団を単離する。一部の代替手法では、本明細書に記載した方法によって、ヒト胎盤、または、その一部から単離したエキソソームの第１の集団を、固定化抗体、または、その結合部分を有する基質（例えば、当該固定化抗体、または、その結合部分を有する膜、樹脂、ビーズ、または、容器）と接触させ、当該固定化抗体、または、その結合部分は、α−シヌクレイン、ＨＩＶ、または、ＨＣＶタンパク質、タウ、ベータ−アミロイド、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、フェチュイン−Ａ、及び／または、ＣＤ１３３、または、これらの一部など、これらに限定されない、ウイルス、真菌、または、細菌タンパク質、または、ペプチドなどの１つ以上の炎症マーカーまたは病原マーカーに対して特異的であり、これにより、当該固定化抗体、または、その結合部分に対する親和性に基づいてエキソソームの第１の集団から第２のエキソソームの集団を単離する。
【０１２６】
一部の代替手法では、本明細書に記載した手法で単離、及び／または、選択したエキソソームの集団は、インビトロ及びインビボの双方で抗腫瘍活性を媒介することが示されているパーフォリン、及び／または、グランザイムＢ（Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１６；７（９）：１０８１−１０８７）、または、標的がん細胞に対して細胞傷害活性を発揮するエキソソームで知見されたＦａｓ（Ｔｈｅｒａｎｏｓｔｉｃｓ  ２０１７；７（１０）：２７３２−２７４５）など、治療に有用なマーカーまたはペプチドを有する。したがって、一部の代替手法では、本明細書に記載した方法によって、ヒト胎盤、または、その一部から単離したエキソソームの第１の集団を、固定化抗体、または、その結合部分を有する基質（例えば、当該固定化抗体、または、その結合部分を有する膜、樹脂、ビーズ、または、容器）と接触させ、当該固定化抗体、または、その結合部分は、パーフォリン、ＴＲＡＩＬ、及び／または、グランザイムＢ、及び／または、Ｆａｓに対して特異的であり、かつ、エキソソームの第１の集団に由来するエキソソームの第２の集団は、パーフォリン、ＴＲＡＩＬ、及び／または、グランザイムＢ、及び／または、Ｆａｓに対する当該固定化抗体、または、その結合部分の親和性に基づいて単離する。一部の代替手法では、ＣＤ６３  ＲＮＡ、及び／または、所望のミクロＲＮＡを含むエキソソームの集団を単離する。一部の代替手法では、エキソソームの集団を、アフィニティークロマトグラフィー、または、免疫学的技術を使用して、単離し、及び／または、特徴決定を行い、エキソソームの当該集団は、小さなＲａｂファミリーＧＴＰａｓｅ、アネキシン、フロチリン、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＥＳＣＲＴ複合体、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ６３Ａ、ＣＤ８１、ＣＤ８２）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０）、及び／または、上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）などのマーカー、または、ペプチドを含む。先に詳述したように、一部の代替手法では、本明細書に記載した方法で、ヒト胎盤、または、その一部から単離したエキソソームの第１の集団を、固定化抗体、または、その結合部分を有する基質（例えば、当該固定化抗体、または、その結合部分を有する膜、樹脂、ビーズ、または、容器）と接触させ、当該固定化抗体、または、その結合部分は、小さなＲａｂファミリーＧＴＰａｓｅ、アネキシン、フロチリン、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＥＳＣＲＴ複合体、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ６３Ａ、ＣＤ８１、ＣＤ８２）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０）、及び／または、上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）に対して特異的であり、かつ、エキソソームの第１の集団に由来するエキソソームの第２の集団は、小さなＲａｂファミリーＧＴＰａｓｅ、アネキシン、フロチリン、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＥＳＣＲＴ複合体、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ６３Ａ、ＣＤ８１、ＣＤ８２）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０）、及び／または、上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）に対する当該固定化抗体、または、その結合部分の親和性に基づいて単離する。その他の代替手法では、本明細書に記載した方法によって、ヒト胎盤、または、その一部から単離したエキソソームの集団を、���さなＲａｂファミリーＧＴＰａｓｅ、アネキシン、フロチリン、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＥＳＣＲＴ複合体、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ６３Ａ、ＣＤ８１、ＣＤ８２）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、及び／または、上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）の１つ以上に対して特異的な抗体、または、その結合部分と接触させ、そして、当該抗体、または、その結合部分の結合を、当該抗体、または、その結合部分に（例えば、ＥＬＩＳＡ、または、ブロッティング手順を利用して）結合し、それにより、単離したエキソソーム集団での当該小さなＲａｂファミリーＧＴＰａｓｅ、アネキシン、フロチリン、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＥＳＣＲＴ複合体、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ６３Ａ、ＣＤ８１、ＣＤ８２）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、及び／または、上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）の存在を確認する検出可能な試薬を有する二次結合剤で検出する。
【０１２７】
本明細書に記載した「単離」とは、エキソソームを、その他の物質から分離するための方法である。エキソソームの分離は、遠心分離機での強度の強い遠心力、市販キット（例えば、ＳｅｒａＭｉｒ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（ＳＢＩ  ｓｙｓｔｅｍ  ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、Ｉｎｔａｃｔ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ（ＣｏｍｂｉｎａｔｉｏｎＫｉｔ）Ｎｏｒｇｅｎ  ＢｉｏＴｅｋ  Ｃｏｒｐ．）の利用、及び、上記したマーカー、または、ペプチドなど（例えば、小さなＲａｂファミリーＧＴＰａｓｅ、アネキシン、フロチリン、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＥＳＣＲＴ複合体、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ６３Ａ、ＣＤ８１、ＣＤ８２）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）、パーフォリン、ＴＲＡＩＬ、グランザイムＢ、Ｆａｓ；Ｆａｓリガンド、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＥＤＩＬ３、フィブロネクチン、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＣＡ３、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−１、ＴＧＦ−β１、ＭＡＧＥ  ３／６、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ９、ＣＤ１４７、ＣＡ−１２５、ＥｐＣａｍ、及び／または、ＣＤ２４などの１つ以上のがんマーカー、または、α−シヌクレイン、ＨＩＶ、または、ＨＣＶタンパク質、タウ、ベータ−アミロイド、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、フェチュイン−Ａ、及び／または、ＣＤ１３３など、これらに限定されない、ウイルス、真菌、または、細菌タンパク質、または、ペプチドなどの１つ以上の炎症マーカーまたは病原マーカーに対して特異的な結合剤）、エキソソームに関するマーカーまたはペプチドに対して特異的な結合剤（例えば、抗体、または、その結合部分）を用いたレクチンアフィニティーまたはアフィニティークロマトグラフィーを使用して実行し得る。
【０１２８】
本明細書に記載した「胎盤」は、妊娠中の真獣類哺乳動物の子宮内の臓器であり、臍帯を通して胎児に栄養を与え、そして、維持をする。本明細書に記載したように、胎盤は、エキソソームを得るためのバイオリアクターとして使用し得る。一部の代替手法では、脱細胞化胎盤は、足場、及び、バイオリアクターとして使用し得るものであり、それは、外因性細胞集団（例えば、脱細胞化胎盤に播種し、そして、培養をした細胞集団）を保有しており、細胞特異的な当該細胞からエキソソームの集団を得る。したがって、一部の代替手法では、脱細胞化胎盤に、再生細胞集団（例えば、幹細胞、及び／または、内皮細胞、及び／または、前駆細胞を含む細胞の集団）を播種し、そして、当該再生細胞集団を、バイオリアクターにて、当該脱細胞化胎盤で培養し、そして、細胞特異的エキソソームを、遠心分離、市販のエキソソーム単離キット、レクチンアフィニティー、及び／または、上記したマーカー、または、ペプチドなど（例えば、小さなＲａｂファミリーＧＴＰａｓｅ、アネキシン、フロチリン、Ａｌｉｘ、Ｔｓｇ１０１、ＥＳＣＲＴ複合体、ＣＤ９、ＣＤ３７、ＣＤ５３、ＣＤ６３、ＣＤ６３Ａ、ＣＤ８１、ＣＤ８２）、Ｈｓｐ７０、Ｈｓｐ９０、上皮細胞接着分子（ＥｐＣａｍ）、パーフォリン、ＴＲＡＩＬ、グランザイムＢ、Ｆａｓ；Ｆａｓリガンド、ＣＤ２４、ＥｐＣＡＭ、ＥＤＩＬ３、フィブロネクチン、Ｓｕｒｖｉｖｉｎ、ＰＣＡ３、ＴＭＰＲＳＳ２：ＥＲＧ、Ｇｌｙｐｉｃａｎ−１、ＴＧＦ−β１、ＭＡＧＥ  ３／６、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＣＤ９、ＣＤ１４７、ＣＡ−１２５、ＥｐＣａｍ、及び／または、ＣＤ２４などの１つ以上のがんマーカー、または、α−シヌクレイン、ＨＩＶ、または、ＨＣＶタンパク質、タウ、ベータ−アミロイド、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、フェチュイン−Ａ、及び／または、ＣＤ１３３など、これらに限定されない、ウイルス、真菌、または、細菌タンパク質、または、ペプチドなどの１つ以上の炎症マーカーまたは病原マーカーに対して特異的な結合剤）を使用するアフィニティークロマトグラフィーを使用して、当該培養細胞から単離する。
【０１２９】
本明細書に記載した「腹水」とは、腹部と腹部臓器（腹腔）を覆う膜との間の空間にある過剰な体液のことである。腹水は、エキソソームの供給源となり得る。
【０１３０】
本明細書に記載した「血漿」とは、血液、及び、リンパ液の液体部分であり、血液の体積の約半分を構成する。血漿には細胞がなく、血清とは異なり、凝固しない。血漿は、抗体やその他のタンパク質を含む。血漿は、エキソソームの供給源となり得る。
【０１３１】
本明細書では、大量のエキソソームを生産するように細胞を培養するための幾つかの方法を提供する。エキソソームを回収または単離するために使用する培地に、1つ以上の栄養素、酵素、または、キレート剤を提供し得る。キレート剤は、培養細胞からのエキソソームの放出を促すために使用し得る。幾つかの方法で使用するキレート剤として、ホスホン酸塩、ＢＡＰＴＡ四ナトリウム塩、ＢＡＰＴＡ／ＡＭ、Ｄｉ−Ｎｏｔｒｏｐｈｅｎ（商標）試薬四ナトリウム塩、ＥＧＴＡ／ＡＭ、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラジン、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス−（２ピリジルメチル）エチレンジアミン、６−ブロモ−Ｎ’−（２−ヒドロキシベンジリデン）−２−メチルキノリン−４−カルボヒドラジド、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸テトラキス（アセトキシメチルエステル）、（エチレンジニトリロ）四酢酸、（ＥＤＴＡ）、エダタミル、エチレンジニトリロ四酢酸、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸、または、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸（ＥＧＴＡ）、または、これらのあらゆる組み合わせがあるが、これらに限定されない。当該キレート剤を、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭの濃度、または、前述した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度で当該培地に提供して、エキソソームを培養または単離するために使用し得る。本明細書で示したように、培地での1つ以上のキレート剤の存在は、バイオリアクターで培養した胎盤に由来するエキソソームの回収を予想外に高めた。当該エキソソームを、培養、及び／または、回収するために使用した培地は、プロテアーゼをも有し得るものであり、これは、エキソソームの放出をさらに促し得る。一部の代替手法では、当該培地に提供するプロテアーゼは、トリプシン、コラゲナーゼ、キモトリプシン、または、カルボキシペプチダーゼである。一部の代替手法では、当該プロテアーゼを、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭの濃度、または、前述した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度で当該培地に提供する。エキソソームを、培養、及び／または、回収するために使用する培地に、1つ以上の糖をも加え得る。一部の代替手法では、当該培地に添加する糖は、グルコースである。当該培地にグルコースが存在すると、エキソソームの放出が促されると考えられる。一部の代替手法では、当該グルコースを、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭの濃度、または、前述した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度で当該培地に提供する。また、当該培地は、成長因子、サイトカイン、���たは、１つ以上の薬物、例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、血清、及び／または、ＡＨＲアンタゴニストを含み得る。
【０１３２】
胎盤、または、その一部からエキソソームを回収する方法
胎盤からエキソソームを回収する例示的な方法を、図１に示す。エキソソーム生成のためのバイオリアクターとして胎盤を使用するのであれば、臍帯血：ＰＲＰ、胎盤かん流液（ＰＳ）、胎盤組織培養物（ＰＴＳ）、胎盤臓器培養物（ＰＯ）、または、胎盤、または、その一部に存在し得る外因性細胞胎盤を、エキソソーム単離の供給源とし得る。ある手法によって、胎盤、または、その一部を回収する（＃２０００１０３２３、２０１７年９月２５日に回収した）。胎盤を培地と接触させ、または、通常のＰＳＣ−１００  回収方法でかん流させて、ＰＳ−１（２０１７年９月２６日）として回収した。胎盤、または、その一部を、フード内で、少なくとも４時間インキュベートする。胎盤、または、その一部を、培地（ＲＰＭＩ培地）と接触させ、または、５００ｍＬのＲＰＭＩベース培地（１％抗生物質）でかん流させて、ＰＳ−２として回収した。次に、胎盤、または、その一部を、フード内で、一晩インキュベートし、そして、カバーをかける。胎盤、または、その一部を、７５０ｍＬの生理食塩水と接触させ、または、かん流させて、そして、ＰＳ−３として回収する。その後、これらの試料を、分析（Ｗａｒｒｅｎ）のために実験室に発送した。ＰＳ１、ＰＳ２、及び、ＰＳ３を、ＲＢＣ溶解した後に、同日に、ＦＡＣＳで分析した。
【０１３３】
分析に向けて、胎盤組織を、１×１×１ｃｍの大きさに切り、１００ｍLの溶液（すべて、１％Ｐ＆Ｓを含む）が入ったＴ７５フラスコ（それぞれに、胎盤の約１／８）に入れた。４つの溶液をアッセイした：Ａ：ＤＭＥＭ培地；Ｂ：ＰＢＳ；Ｃ：ＰＢＳ＋５ｍＭ  ＥＤＴＡ；Ｄ：ＰＢＳ＋０．０２５％トリプシン−ＥＤＴＡ。次に、これを、３７℃のインキュベーターで、一晩（Ｏ／Ｎ）、インキュベートした。
【０１３４】
次に、上清を回収し、組織フィルターを通過させ、そして、４００ｇで遠心して細胞（ペレット）を回収した。次に、最初の遠心分離をした後の上清を、エキソソーム単離のために遠心分離した（３０００ｇスピンスープ＞１０，０００スピンスープ：１００，０００ｇペレット）。
【０１３５】
回収した細胞を、ＦＡＣＳ分析にも使用した。これらの細胞試料は、幾つかの緩衝剤に入れてあった（Ａ＝ＰＴＳ１；Ｂ＝ＰＴＳ２；Ｃ＝ＰＴＳ−３、Ｄ＝ＰＴＳ４）。エキソソームを回収し、次いで、アッセイして、エキソソームマーカーの存在を同定し、この手順で、エキソソームが取得でき、かつ、単離されたことを確認した。
【０１３６】
ＥＬＩＳＡとタンパク質アッセイを使用した、胎盤バイオリアクターから単離したエキソソームの集団の同定
胎盤バイオリアクターの上清の画分を、上記した方法で回収し、そして、これらの画分を濾過した。その後、上清を、４００ｇ×１０分の遠心分離にかけて、細胞を回収した。最初の遠心分離の後に、２回目の遠心分離を、３０００ｇ×３０分で行って、細胞破片をペレット化した。３回目の遠心分離を、１０，０００ｇ×１時間で行って、微小胞をペレット化した。次に、４回目の遠心分離を、１００，０００ｇ×１．５時間で行って、エキソソームをペレット化した。次に、ペレット化したエキソソームを含む遠沈管を逆さにして紙の上に置いて、残留液体を排出した。次に、当該エキソソームペレットを、適切な容量（例えば、２．０ｍＬ）の滅菌ＰＢＳに溶解して、ペレットを溶解し、そして、当該エキソソームを含む溶液を、滅菌エッペンドルフチューブに等分し、次に、−２０℃／−８０℃の冷凍庫で凍結した。そして、エキソソームを、ＥＬＩＳＡ−６３Ａ、及び、タンパク質定量キットを使用して、エキソソーム特異的マーカーＣＤ６３Ａの存在についてアッセイした。
ここで示したように、ＰＲＰ、胎盤かん流液、及び、胎盤組織は、ＣＤ６３＋であり、かつ、超遠心によって効率的に単離できるエキソソームの集団を含む。当該エキソソームを単離するために、まず、培養上清を、組織フィルターで濾過し、そして、上記したようにして数度の遠心分離を行ってエキソソームを得て、それを、次に、凍結した。当該エキソソームをＥＬＩＳＡ検出するために、抗ＣＤ６３抗体を使用した。アッセイでは、試料を、エキソソーム結合緩衝剤（６０ｕＬ＋６０ｕＬ）で、１：１に希釈した。この手順によって、ＣＤ６３＋エキソソームを、効率的に単離した。
【０１３７】
エキソソームの特徴決定
エキソソームは、タンパク質、ペプチド、ＲＮＡ、ＤＮＡ、及び、サイトカインを含み得る。ｍｉＲＮＡ配列決定、表面タンパク質分析（ＭＡＣＳＰｌｅｘ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）、プロテオミクス分析、機能研究（インビトロでの酵素アッセイ創傷治癒アッセイ（スクラッチアッセイ）、エキソソーム誘発細胞増殖（ヒトケラチノサイト、または、線維芽細胞）（５つの公知の刺激物質との比較）、エキソソーム誘発コラーゲン生産（ヒトケラチノサイト、または、線維芽細胞）：ＴＧＦｂと比較して、血清及び非血清対照、プロコラーゲン１ＣペプチドのＥＬＩＳＡ、炎症性サイトカインのエキソソーム誘発阻害を含んでおり：応答細胞タイプは、ヒトケラチノサイト、または、ヒト線維芽細胞、及び、凍結乾燥した加熱殺菌細菌、または、ＬＰＳとの比較を含む）などの方法で実行し得る。
【０１３８】
一部の代替手法では、単離したエキソソームを、１００−Ｋｄａ  Ｖｉｖａｓｐｉｎフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）で濃縮し、ＰＢＳで１回洗浄し、そして、約４０μＬを回収した。エキソソームの当該濃縮集団を、１×プロテアーゼ阻害剤カクテル（Ｒｏｃｈｅ）を含む１０ｕＬの５×ＲＩＰＡ溶解緩衝剤と混合し、そして、ボルテックスした後に、ウォーターソニケーター（Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ  Ｃｌｅａｎｅｒ、ＪＳＰ）で、２０℃で、５分間、超音波処理した。超音波処理した後に、当該試験管を、断続的に混合しながら、２０分間、氷上で、インキュベートした。次に、この混合物を、４℃で、１０分間、１０，０００ｇで遠心分離した。単離した澄明な溶解物を、新たな試験管に移した。タンパク質量を、ＢＣＡキットで測定し、そして、ウエスタンブロッティングのために、レーンあたり１０ｕｇのタンパク質を投入し、次に、目的のタンパク質の決定のために抗体を使用した。
【０１３９】
別の代替手法では、細胞によるエキソソームの標識と取り込みを調べる（例えば、ＨＥＫ２９３Ｔ）。凍結溶出したエキソソームのアリコートを、１ｍＬのＰＢＳに再懸濁し、そして、ＰＫＨ２６蛍光細胞リンカーキット（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して標識付けをした。２×ＰＮＫ２６−色素溶液（１ｍＬの希釈液Ｃに４ｕＬの色素）を調製し、そして、１ｍＬのエキソソーム溶液と混合して、最終色素濃度を２×１０ｅ−６Ｍにした。直ちに、試料を５分間混合し、そして、１％ＢＳＡを添加して染色を停止して、ＰＫＨ２６色素を捕捉した。標識したエキソソームを、１００−Ｋｄａ  Ｖｉｖａｓｐｉｎフィルターに移し、次いで、４０００ｇで回転させた後に、ＰＢＳで２回洗浄し、そして、約５０ｕＬの試料を回収し、ＮＴＡを使用してエキソソーム濃度を分析した後に、−８０℃で保存した。標識反応のネガティブ対照として、ＰＢＳを使用した。取り込みについて研究するために、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、通常の培地を使用して、８ウェルチャンバースライド（１×１０ｅ４／ウェル）に接種した。２４時間後に、当該スライドを、ＰＢＳで２回洗浄し、そして、ＤＭＥＭ−エキソ不含ＦＢＳ（１０％）で、２４時間、インキュベートした。これに続いて、２×１０ｅ９エキソソームに対応する、１０％エキソ不含ＰＢＳ（２００ｕＬ）で、それぞれに標識を付けたエキソソーム試料を含む新鮮なＤＭＥＭ培地を、それぞれのウェルに加え、そして、細胞培養インキュベーターで、１．５時間インキュベートした。インキュベートした後に、当該スライドを、ＰＢＳ（５００ｕｌ）で２回洗浄し、そして、４％パラホルムアルデヒド溶液で、室温で、２０分間、固定した。これらのスライドを、ＰＢＳ（５００ｕＬ）で２回洗浄し、乾燥させ、そして、ＤＡＰＩを含むＰｒｏＬｏｎｇ  Ｇｏｌｄ  Ａｎｔｉｆａｄｅ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用して載置した。これらの細胞を、Ａｘｉｏｓｋｏｐ顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ）を使用して、視覚化した。
【０１４０】
培養した産後のヒト胎盤由来のエキソソームの高収率単離
ドナーの完全な同意の下、分娩後のヒト胎盤をかん流した。胎盤の残存血液を、大量の滅菌生理食塩水で洗い流し、次いで、抗生物質を補充した無血清培養培地を含む５−Ｌバイオリアクターで培養し、そして、３７℃インキュベーター（５％ＣＯ２）で培養し、次いで、冷蔵条件で、最長で４日間かけて回転させた。培養培地の上清を、３０００ｇ、及び、１０，０００ｇの連続遠心分離で処理して、組織、細胞、及び、微小胞をペレット化した。エキソソームを、１０，０００ｇ遠心分離で得た上清から、１００，０００ｇ超遠心分離によってペレット化し、そして、滅菌ＰＢＳで溶解した。エキソソームの収量を、ＢＣＡタンパク質アッセイで定量した。
【０１４１】
胎盤臓器培養物から得た上清を、エキソソームを単離する方法に記載したようにして処理をした。抗ＣＤ６３Ａ抗体を使用したＥＬＩＳＡアッセイは、単離したエキソソームが、エキソソームの特異的なタンパク質マーカーであるＣＤ６３Ａタンパク質を含む、ことを実証した。１リットルの培地で培養したある胎盤は、約４０ｍｇのエキソソーム、または、約１×１０１３のＣＤ６３Ａ陽性エキソソーム粒子を、２４時間で、生成したと推定する。ＣＤ９、ＣＤ８１、大きさ、及び、機能的活性の発現など、これらの胎盤臓器由来のエキソソームのさらなる特徴決定を行う。
【０１４２】
別の一連の実験では、ドナーの完全な同意の下、分娩後のヒト胎盤をかん流して、ＥＤＴＡの濃度が異なる培地でエキソソームを単離する。抗生物質と、様々な濃度のＥＤＴＡ（例えば、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または、１００ｍＭ、または、前述した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度）のＥＤＴＡを含む無血清培地を、一定速度の蠕動ポンプを介して、臍帯静脈を通じて胎盤にかん流させ、そして、制御した条件下で、さらに２４〜４８時間培養する。この培養の後に、ＥＤＴＡの使用量を含む７５０ｍＬの生理学的培地を、制御速度でかん流させる。次いで、すべてを上記した通りにして、エキソソームを、遠心分離と超遠心分離で連続的に単離し、ＣＤ６３Ａ  ＥＬＩＳＡアッセイで確認し、そして、ＢＣＡタンパク質アッセイで定量する。エキソソームを回収するために使用した培地でのＥＤＴＡの濃度は、バイオリアクターで培養した胎盤から回収したエキソソームの量に影響を与える、ことを示す。
【０１４３】
さらなる代替手法
一部の代替手法では、胎盤、または、その一部からエキソソームを単離する方法を提供する。この方法は、ａ）胎盤、または、その一部を、第１の培地と接触させること；ｂ）当該胎盤、または、その一部から、エキソソームを含む第１の画分を得ること；ｃ）当該胎盤、または、その一部を、第２の培地と接触させること；ｄ）当該胎盤、または、その一部から、エキソソームを含む第２の画分を得ること；ｅ）当該胎盤、または、その一部を、第３の培地と接触させること；ｆ）当該胎盤、または、その一部から、エキソソームを含む第３の画分を得ること、及び、任意に、当該第１、第２、及び／または、第３の画分からエキソソームを単離すること、を含む。一部の代替手法では、当該方法は、胎盤、または、その一部を、さらなる培地と接触させること；及び、当該胎盤、または、その一部から、エキソソームを含むさらなる画分を得る複数のステップをさらに含む。これらの２つのステップは、複数回反復し得る。好ましくは、当該胎盤、または、その一部を、バイオリアクターで、培養及び／または維持する。一部の代替手法では、当該胎盤、または、その一部は、羊膜を含む。一部の代替手法では、当該胎盤、または、その一部は、ヒトの胎盤、または、その一部である。一部の代替手法では、当該第１、第２、及び／または、第３の培地は、当該胎盤、または、その一部と、４５分間、または、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または、１２時間、または、前出した時点のいずれか２つで定義した範囲内にある長さの時間など、少なくとも４５分間かけて接触させる。一部の代替手法では、当該第１、第２、及び／または、第３の培地は、胎盤、または、その一部と、少なくとも７、１４、２８、３５、または、４２日間、または、前出した時点のいずれか２つで定義した範囲内にある長さの時間をかけて接触させる。一部の代替手法では、胎盤、または、その一部を、細分化、粉砕、または、コラゲナーゼ、及び／または、プロテアーゼなどの酵素で処理する。
【０１４４】
一部の代替手法では、胎盤、または、その一部を、脱細胞化し、任意に、実質的に乾燥した、実質的に平坦またはシート状の足場材料として提供する。当該脱細胞化胎盤、または、その一部を、足場として使用し、細胞培養または一次単離手順から得た均一な細胞集団などの外因性細胞（例えば、幹細胞、内皮細胞、及び／または、前駆細胞などの再生細胞）を有する。この方法は、脱細胞化胎盤、または、その一部に播種される細胞を含む継代液または体液をさらに含む。細胞を一旦確立すると、上記した手順を使用して、それら細胞から生成したエキソソームを回収し、そして、単離する。一部の代替手法では、脱細胞化胎盤、または、その一部に播種される細胞を含む体液は、腹水、血液、または、血漿である。一部の代替手法では、それらの細胞は、臓器に由来する。一部の代替手法では、当該細胞は、肝臓、腎臓、肺、または、膵臓に由来する。一部の代替手法では、当該細胞は、免疫細胞である。一部の代替手法では、当該細胞は、Ｔ細胞またはＢ細胞である。
【０１４５】
一部の代替手法では、当該第１の培地は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を含む。一部の代替手法では、当該第２の培地は、成長因子を含む。一部の代替手法では、当該第３の培地は、キレート剤を含む。一部の代替手法では、当該キレート剤は、ＥＤＴＡ、ＥＧＴＡ、ホスホン酸塩、ＢＡＰＴＡ四ナトリウム塩、ＢＡＰＴＡ／ＡＭ、Ｄｉ−Ｎｏｔｒｏｐｈｅｎ（商標）試薬四ナトリウム塩、ＥＧＴＡ／ＡＭ、ピリドキサールイソニコチノイルヒドラジン、Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−テトラキス−（２ピリジルメチル）エチレンジアミン、６−ブロモ−Ｎ’−（２−ヒドロキシベンジリデン）−２−メチルキノリン−４−カルボヒドラジド、１，２−ビス（２−アミノフェノキシ）エタン−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸酸テトラキス（アセトキシメチルエステル）、（エチレンジニトリロ）四酢酸、ＥＤＴＡ、エダサミル、エチレンジニトリロ四酢酸、エチレングリコール−ビス（２−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸、または、エチレングリコール−ビス（β−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ、Ｎ’、Ｎ’−四酢酸四ナトリウム塩、または、それらのあらゆる組み合わせである。一部の代替手法では、当該キレート剤は、ＥＤＴＡ、または、ＥＧＴＡ、または、それらの組み合わせである。一部の代替手法では、当該キレート剤を、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭ、または、前出した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度で、当該第３の培地に提供する。一部の代替手法では、当該第３の培地でのＥＤＴＡの濃度は、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭ、または、前出した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度である。
【０１４６】
一部の代替手法では、当該第３の培地は、プロテアーゼを含む。一部の代替手法では、当該プロテアーゼは、トリプシン、コラゲナーゼ、キモトリプシン、または、カルボキシペプチダーゼ、または、それらの混合物である。一部の代替手法では、当該プロテアーゼは、トリプシンである。一部の代替手法では、当該プロテアーゼを、１ｍＭ、２ｍＭ、３ｍＭ、４ｍＭ、５ｍＭ、６ｍＭ、７ｍＭ、８ｍＭ、９ｍＭ、１０ｍＭ、２０ｍＭ、３０ｍＭ、４０ｍＭ、５０ｍＭ、６０ｍＭ、７０ｍＭ、８０ｍＭ、９０ｍＭ、または、１００ｍＭ、または、前出した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にある濃度で、当該第３の培地に提供する。
【０１４７】
一部の代替手法では、当該方法は、胎盤、または、その一部を、さらなる複数の培地と接触させることをさらに含み、接触させることで、エキソソームを含む複数の画分を得る。一部の代替手法では、当該第１、第２、第３、または、さらなる培地は、グルコースを含む。一部の代替手法では、当該第１、第２、第３、または、さらなる培地は、ＧＭ−ＣＳＦを含む。一部の代替手法では、当該第１、第２、第３、または、さらなる培地は、血清を含む。一部の代替手法では、当該第１、第２、第３、または、さらなる培地は、ＤＭＥＭを含む。一部の代替手法では、当該第１、第２、第３、または、さらなる培地は、ＡＨＲアンタゴニストを含む。一部の代替手法では、当該ＡＨＲアンタゴニストは、ＳＲ１である。一部の代替手法では、当該ＳＲ１は、１ｎＭ、１０ｎＭ、１００ｎＭ、２００ｎＭ、３００ｎＭ、４００ｎＭ、５００ｎＭ、６００ｎＭ、７００ｎＭ、８００ｎＭ、９００ｎＭ、または、１ｍＭの濃度、または、前出した濃度のいずれか２つで定義した範囲内にあるその他の濃度である。
【０１４８】
一部の代替手法では、当該第１の培地は、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、または、４０℃、または、前出した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、胎盤、または、その一部と接触する。一部の代替手法では、当該第２の培地は、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、または、４０℃、または、前出した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、胎盤、または、その一部と接触する。一部の代替手法では、当該第３の培地は、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、または、４０℃、または、前出した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、胎盤、または、その一部と接触する。一部の代替手法では、当該さらなる複数の培地は、０℃、５℃、１０℃、１５℃、２０℃、２５℃、３０℃、３５℃、または、４０℃、または、前出した温度のいずれか２つで定義した範囲内にある温度を維持しながら、胎盤、または、その一部と接触する。
【０１４９】
一部の代替手法では、当該第１、第２、または、第３の培地、または、さらなる複数の培地は、抗生物質を含む。
【０１５０】
一部の代替手法では：
（ａ）当該第１、第２、及び／または、第３の画分、または、複数の画分を組織フィルターに通すこと；
（ｂ）（ａ）で回収した濾過物の第１の遠心分離を実行して、細胞ペレット、及び、第１の上清を生成すること；
（ｃ）当該第１の上清について第２の遠心分離を実行して、第２の上清を生成すること；及び
（ｄ）当該第２の上清について第３の遠心分離を実行して、エキソソームペレットを生成すること；及び、任意に、
（ｅ）当該エキソソームを溶液に再懸濁すること、を含む方法で、当該エキソソームを、当該第１、第２、及び／または、第３の画分、または、複数の画分から単離する。
【０１５１】
一部の代替手法では、単離したエキソソームの集団は、ＣＤ６３、ＣＤ６３−Ａ、パーフォリン、Ｆａｓ、ＴＲＡＩＬ、または、グランザイムＢ  Ｂ、または、これらの組み合わせを有するエキソソームを含む。一部の代替手法では、単離したエキソソームの集団は、シグナル伝達分子を含むエキソソームを含む。一部の代替手法では、単離したエキソソームの集団は、サイトカイン、ｍＲＮＡ、または、ｍｉＲＮＡを含むエキソソームを含む。
【０１５２】
一部の代替手法では、当該方法は、アフィニティークロマトグラフィーによってエキソソームを単離することをさらに含み、当該アフィニティークロマトグラフィーは、ウイルス抗原、ウイルスタンパク質、細菌抗原、または、細菌タンパク質真菌抗原、または、真菌タンパク質を含むエキソソームの除去について選択的である。
【０１５３】
一部の代替手法では、当該方法は、代替的、または、さらなるアフィニティークロマトグラフィーステップによってエキソソームを単離することをさらに含み、当該代替的、または、さらなるアフィニティークロマトグラフィーステップは、炎症タンパク質を含むエキソソームの除去について選択的である。一部の代替手法では、この方法は、抗炎症生体分子を含むエキソソームの集団を濃縮することをさらに含む。
【０１５４】
一部の代替手法では、本明細書の実施形態のいずれか１つによって生成したエキソソームを提供する。一部の代替手法では、当該エキソソームは、腹水、血液、または、血漿に由来する。一部の代替手法では、当該エキソソームは、臓器由来の細胞に由来する。一部の代替手法では、当該エキソソームは、免疫細胞に由来する。一部の代替手法では、当該エキソソームは、Ｔ細胞またはＢ細胞に由来する。
【０１５５】
一般的に、本明細書、とりわけ、添付した特許請求の範囲（例えば、添付した特許請求の範囲の本文）で使用した用語は、当業者であれば、一般的に、「オープン」用語を意図しているものと理解する（例えば、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」は、「があるが、それに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈し、用語「有する」は、「少なくとも有する」と解釈し、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」は、「があるが、それに限定されない（ｉｎｃｌｕｄｅｓ  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ｌｉｍｉｔｅｄ  ｔｏ）」と解釈するなど）。導入した請求項の要素に関して特定の数値を意図する場合に、そのような意図は、当該請求項に明示的に記載しているものであって、また、そのような記載が無ければ、そのような意図が存在しないことを、当業者は理解する。例えば、理解を助けるために、以下に添付した特許請求の範囲は、請求項の要素に添える導入句「少なくとも１つ」及び「１つ以上」の使用を含み得る。しかしながら、そのような句を使用しても、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」を導入した請求項の記載が、たとえ、同じ請求項が、導入句「１つ以上」または「少なくとも１つ」、及び、「ａ」または「ａｎ」などの不定冠詞（例えば、「ａ」及び／または「ａｎ」は、「少なくとも１つ」または「１つ以上」を意味するものと解釈する）を含んでいたとしても、そのような導入を行った請求項の要素を含む特定の請求項を、そのような要素を一つだけ含む実施形態にまで限定するものでなく；請求項の要素を導入する際に添えた定冠詞の使用についても同様である。加えて、導入した請求項の要素に関して特定の数値が明示的に記載されていても、そのような記載は、少なくとも記載した数値を意味するものと解釈する、ことを当業者は認識する（例えば、単なる「２つの要素」という記載は、その他の修飾語句が無くとも、少なくとも２つの要素、または、２つ以上の要素のこと意味する）。さらに、「Ａ、Ｂ、及び、Ｃなどの少なくとも１つ」に類似した慣例を使用する事例では、一般的に、このような構文は、当業者が慣例を理解する意味で意図している（例えば、「Ａ、Ｂ、及び、Ｃの少なくとも１つを有するシステム」として、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢを一緒に、ＡとＣを一緒に、ＢとＣを一緒に、及び／または、Ａ、Ｂ、及び、Ｃを一緒に、などを有するシステムがあるが、これらに限定されない。）。「Ａ、Ｂ、または、Ｃの少なくとも１つなど」に類似した慣例を使用する事例では、一般的に、このような構文は、当業者が慣例を理解する意味で意図している（例えば、「Ａ、Ｂ、または、Ｃの少なくとも１つを有するシステム」として、Ａのみ、Ｂのみ、Ｃのみ、ＡとＢを一緒に、ＡとＣを一緒に、ＢとＣを一緒に、及び／または、Ａ、Ｂ、及び、Ｃを一緒に、などを有するシステムがあるが、これらに限定されない。）。さらに、詳細な説明、特許請求の範囲、または、図面のいずれでも、２つ以上の代替的な用語を示す実質的に離接的な単語、及び／または、句は、当該用語の一方、当該用語のいずれか、または、当該用語の双方を含む可能性を企図している、ことを当業者は理解する。例えば、句「ＡまたはＢ」は、「Ａ」または「Ｂ」または��Ａ及びＢ」の可能性を含む、ことを理解する。
【実施例】
【０１５６】
６．実施例
６．１．実施例１：ヒト胎盤の培養
ヒト胎盤を受領し、そして、滅菌ＰＢＳ、または、生理食塩水で洗浄して血液を除去する。次いで、この胎盤を、抗生物質と２ｍＭ  ＥＤＴＡとを補充した５００ｍＬまたは１０００ｍＬのＤＭＥＭ培養液を入れた大きな容器で、臓器全体を容器内で培養する。別の方法では、当該胎盤を、様々な大きさに細分し、そして、培養容器に入れることができる。この培養は、３７ｏＣで、５％ＣＯ２を含む細胞培養インキュベーターで行う。培養時間は、４時間〜８時間であり、そして、培養液の上清を、エキソソームの単離のために使用する。新たな培地を、それぞれの回収時点で（例えば、８時間ごと、または、１２時間ごとに）加え、そして、当該胎盤臓器と組織とを、少なくとも５日間培養する。
【０１５７】
６．２．実施例２：胎盤エキソソームの単離と精製
培養の上清を、３，０００ｇで、３０分間、遠心して、細胞と、組織の破片とをペレット化する。次いで、当該上清を、１０，０００ｇで、１時間、遠心分離し、そして、ペレット（小細胞破片と細胞小器官）を廃棄する。次いで、当該上清を、１００，０００ｇで、２時間、遠心分離する。得られたペレットは、エキソソームである。このエキソソームペレットは、以下の方法でさらに精製できる：異なる量の滅菌ＰＢＳで再懸濁し、そして、１００，０００で、２時間遠心し、次いで、最終ペレットを、滅菌ＰＢＳで再懸濁する。この再懸濁したエキソソームを、シリンジフィルター（０．２ｕｍ）で濾過し、−８０℃で、３００ｕＬ〜１ｍＬまでの異なる量で分注する。
【０１５８】
胎盤のエキソソームは、大きさで特徴決定する。サイズ分布を、ナノ粒子追跡アッセイで分析する。ＮａｎｏＳｉｇｈｔを使用して、３つの代表的なｐＥｘｏの試料の大きさを測定した。それぞれの単離物の平均サイズは、それぞれ１１７、１０１、９６であり、報告されているエキソソームのサイズと一致する。結果を、図２Ａ〜図２Ｃに示す。
【０１５９】
６．３．実施例３：ＦＡＣＳ分析によるｐＥｘｏｓのマーカー
ｐＥｘｏのタンパク質マーカーを、ＭＡＣＳＰｌｅｘ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｋｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｔ＃１３０−１０８−８ｌ３）を用いて、このキットに備え付けのプロトコールに従って分析した。要するに、１２０μＬのｐＥｘｏ単離物を、１５μＬのエキソソーム捕捉ビーズと、室温で、一晩、インキュベートした。１ｍＬの洗浄液で１度洗浄した後に、当該エキソソームを、エキソソーム検出試薬ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１カクテルとインキュベートし、そして、さらに１時間インキュベートした。２回洗浄した後に、これらの試料を、ＦＡＣＳ（ＢＤ  Ｃａｎｔｏ  １０）で分析した。このキットは、ｍＩｇＧ１とＲＥＡ対照とを除いて、合計で３７個のタンパク質マーカーを備えている（表１）。
表１：ＭＡＣＳＰｌｅｘ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  ＫｉｔでｐＥｘｏを検出するために使用したタンパク質マーカーのリスト
【表１】
2021503301.tif 000002
【０１６０】
ｐＥｘｏ試料は、ＣＤ１ｃ、ＣＤ９、ＣＤ２０、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ２９、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３１、ＣＤ１０、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ４２ａ、ＣＤ４４、ＣＤ４５、ＣＤ１９ｃ、ＣＤ４、ＣＤ１５、ＣＤ１９ｃ、ＣＤ４、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ８３、ＣＤ６９、ＣＤ８１、ＣＤ８６、ＣＤ１０５、ＣＤ１３３−１、ＣＤ１４２、ＣＤ１４８、ＨＬＡ−ＡＢＣ、ＨＬＡ−ＤＲＤＰＤＱ、ＭＳＣＰ、ＲＯＲ１、ＳＳＥＡ−４のタンパク質マーカーに対して強い陽性を示すことが認められた。ｐＥｘｏは、ＣＤ２０９では、非常に低レベル（２．６％）である。培地と細胞培養インキュベーターで培養せずに、生理食塩水で胎盤の血管系をかん流させて得たヒト胎盤かん流液も使用してエキソソームを単離し、そして、マーカータンパク質発現のための同じ方法で分析した。かん流液由来のエキソソームも、ｐＥｘｏに認められる大部分のマーカーを高レベルで発現するが、ｐＥｘｏｓと比較して、ＣＤ１１ｃ（２．０％）、ＭＣＳＰ（３．４％）、及び、ＳＳＥＡ−４（３．５％）では、非常に抑制されている。また、ｐＥｘｏは、胎盤かん流液エキソソームと比較して、ＣＤ１４２、及び、ＣＤ８１のレベルが非常に高い。また、臍帯血を使用して、エキソソームも単離し、そして、マーカータンパク質発現と同じ方法で分析した。臍帯血由来のエキソソームも、大部分のタンパク質マーカーに対して陽性であるが、一般的には、これらのそれぞれのマーカータンパク質発現のレベルは低い。具体的には、ｐＥｘｏと比較して、臍帯血血清エキソソームは、ＣＤ５６（１．４％）、ＣＤ３（０．３％）、及び、ＣＤ２５（３．９％）と低レベルである。臍帯血血清でのＳＳＥＡ−４、及び、ＭＳＣＰタンパク質の発現は、ｐＥｘｏより非常に小さいが、胎盤かん流液エキソソームよりは大きい。臍帯血血清エキソソームも、ｐＥｘｏと比較して、ＭＳＣＰタンパク質のレベルが高い。これらのデータは、培養した胎盤組織が、培養していない胎盤及び臍帯血血清と比較して、独特のエキソソーム集団を生成することを示す。臍帯血血清由来のエキソソーム、及び、胎盤かん流液エキソソームと比較した、ｐＥｘｏ試料の結果を、図３Ａ〜図３Ｃ、及び、表２に示す。
表２
【表２】
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【０１６１】
６．４．実施例４：ｐＥｘｏ試料のサイトカイン、及び、成長因子
４１個の異なるサイトカインを備えたＭｉｌｔｉＰｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘキットを使用して、サイトカインの含有量について、ｐＥｘｏ試料を分析した。以下の表は、１５個の異なるｐＥｘｏ調製物で検出したサイトカインのデータを示す。このデータは、ｐＥｘｏが、ＦＧＦ２、Ｇ−ＣＳＦ、フラクタルカイン、ＧＤＧＦ−ＡＡ／ＢＢ、ＧＲＯ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−８、ＶＥＧＦ、及び、ＲＡＮＴＥＳなどのサイトカインを、有意なレベル（平均＞５０ｐｇ／ｍＬ）で含むことを示す。ｐＥｘｏは、ＥＧＦ、Ｆｌｔ−３Ｌ、ＩＦＮａ３、ＭＣＰ−３、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＩＬ−１５、ｓＣＤ４０Ｌ、ＩＬ６、ＩＰ−１０、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−アルファ、ＭＩＰ−１ベータ、及び、ＴＮＦ−アルファなどのその他のサイトカインも、検出可能なレベル（５ｐｇ／ｍＬ〜４９ｐｇ／ｍＬ）のサイトカインとして含む。
表３：ｐＥｘｏ製剤で検出したサイトカイン
【表３】
2021503301.tif 000005
【０１６２】
ｐＥｘｏ（１１個の試料）を、Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  Ｌｕｍｉｎｅｘ分析で、可溶性サイトカイン受容体の存在も分析した。そのデータを、以下の表に示す。このデータは、ｐＥｘｏが、ｓＥＦＧＲ、ｓｇｐ−１３０、ｓＩＬ−１Ｒ１、ｓＴＮＦＲ１、ｓＴＮＦＲＩＩ、ｓＶＥＧＲＲ１、ｓＶＥＧＦＲ１、ｓＶＥＧＦＲ３を、高レベル（＞１００ｐｇ／ｍＬ）で含み、かつ、ｓＣＤ３０、ｓＩＬ−２Ｒａ、ｓＩＬ−６Ｒ、ｓＲＡＧＥも、一部の試料で検出（＞１０ｎｇ／ｍＬ）することを示す。＜と表示したデータは、検出がされておらず、そして、陰性とみなした。
表４
【表４】
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【０１６３】
６．５．実施例５：胎盤エキソソームのプロテオーム分析
３つのｐＥｘｏ試料を、プロテオーム分析に供した。提出を受けた試料を、超音波プローブ（ＱＳｏｎｉｃａ）を使用して：振幅４０％、パルス１０×１秒オン、１秒オフに設定して溶解した。そのタンパク質濃度を、Ｑｕｂｉｔフルオロメトリーで測定した。１０ｕｇのそれぞれの試料を、ＳＤＳページで処理し、そして、精製したタンパク質を、トリプシン消化した。表５は、それぞれの試料で同定した総タンパク質を示す。これらの試料では、合計で１８１４のタンパク質を同定している。表６は、ｐＥｘｏ試料において同定頻度が大きかったタンパク質の識別子と遺伝子ＩＤを示す。さらなるデータを、図４及び図５に示す。
表５
【表５】
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表６
【表６】
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【０１６４】
６．６．実施例６：胎盤エキソソームのＲＮＡ分析
３つのｐＥｘｏ試料を、配列決定して、それらのＲＮＡプロファイルを分析した。要するに、ｐＥｘｏ試料由来のＲＮＡを抽出し、そして、ｃＤＮＡに変換し、そして、配列決定する。次いで、当該配列データを、データベースと比較して、それぞれの配列データのタイプと実体を同定する。表７に、ＲＮＡ配列決定結果の全体的なプロファイルを示す。ｐＥｘｏのＲＮＡは、ｔＲＮＡ、ミクロＲＮＡ、及び、その他の非コードＲＮＡのカテゴリを含む。ミクロＲＮＡは、ｐＥＸＯ試料の構成において２番目に豊富なＲＮＡである。これら３つのｐＥｘｏ試料では、合計で１５００の異なるミクロＲＮＡが同定されている。一部は、３つすべての試料に一般的に存在しており、また、一部は、１つ、または、２つの試料に特異的に認められている。最も高頻度のミクロＲＮＡの遺伝子識別子、及び、相対的頻度、及び、存在量を示す。ミクロＲＮＡは、細胞間連絡の機能において重要な役割を果たすことが知られている。
表７
【表７】
2021503301.tif 000017
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【０１６５】
６．７．実施例７：胎盤エキソソームは、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）の移動を促す
サイトカインプロファイルは、ｐＥｘｏが、走化性成長因子を含むことを示しており、このことは、ｐＥｘｏが、細胞移動を促す機能を備えていることを示唆している。このことを調べるために、トランスウェル移動アッセイを、次のように設定した：７５０ｕＬのＤＭＥＭ基本培地（無血清）を、トランスウェル（２４ウェル）プレートの下部チャンバーに置き、ｐＥｘｏを、５０ｕＬで加えた。ＰＢＳを、対照として、同量を加えた。１×１０ｅ５  ＨＤＦを、当該トランスウェルの上部チャンバー（８ｕｍ細孔）に播種した。６〜２４時間後に、当該トランスウェルの上部チャンバーの細胞を、綿棒を使って取り除いた。次いで、当該トランスウェルを、１％エタノールを含むＰＢＳを含んだ溶液で固定し、１％エタノール−ＰＢＳに溶解した１％クリスタルバイオレットで染色する。移動した細胞を、顕微鏡で可視化する。このデータは、ＨＤＦが当該トランスウェルの底面に向けて移動するのに対して、ＰＢＳ対照トランスウェルでは、ウェルを通って移動する細胞が大幅に少ない、という結果の例を示す。この研究は、ｐＥｘｏが、ヒト皮膚線維芽細胞の移動を促すことができる、ことを実証している。図６を参照されたい。
【０１６６】
６．８．実施例８：胎盤エキソソームは、ヒト臍帯血内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の移動を促す
トランスウェル移動アッセイも、次のように設定した：７５０ｕＬのＤＭＥＭ基本培地（無血清）を、トランスウェル（２４ウェル）プレートの下部チャンバーに置き、ｐＥｘｏを、５０ｕＬで加えた。ＰＢＳを、対照として、同量を加えた。２×１０ｅ５  ＨＵＶＥＣ発現ＧＦＰタンパク質を、当該トランスウェルの上部チャンバー（８ｕｍ細孔）に播種した。６〜２４時間後、移動したウェルを倒立蛍光顕微鏡（ＡＭＧ）で、直接に可視化する。この研究は、試験した３つすべてのｐＥｘｏ試料が、３連のすべてのウェルでＨＵＶＥＣの移動を促すことができる、ことを実証している。陽性対照として使用するＨＵＶＥＣの完全培地では、細胞移動が顕著であり、また、さらなる対照として使用するＰＢＳは、完全培地、または、ｐＥｘｏ試験済ウェルと比較して、細胞移動がわずかである。図７を参照されたい。
【０１６７】
６．９．実施例９：胎盤エキソソームは、ＨＵＶＥＣの増殖を刺激する
ｐＥｘｏのサイトカインプロファイルは、それが、ＨＵＶＥＣの増殖に関与することが公知である幾つかの増殖因子（ＰＧＤＦ−ＡＡ、ＢＢ、ＶＥＧＦ）を有することを示す。ＨＵＶＥＣの成長と増殖に関するｐＥｘｏの影響を調べるために、ＨＵＶＥＣ発現ＧＦＰを、１００ｕＬのＨＵＶＥＣ増殖完全培地が入った９６ウェルプレート（透明な底部と、不透明な壁）に、１×１０ｅ４細胞を播種した。２時間播種した後に、細胞を、ウェルの底に付着させた。次いで、これらのウェルに、２５ｕＬの異なるｐＥｘｏ試料（Ｎ＝６／試料）を加える。次いで、プレートリーダーを使用して、当該プレートを、播種をして０日後と２日後に、蛍光強度で評価する（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４、励起３９５ｎｍ／発光５０９ｎｍ）。図１３に示すように、完全培地は、０日目から２日目で、ＧＦＰシグナル（細胞数の指標）が強くなっていることが実証されている。完全培地を５０％希釈するＰＢＳ対照は、完全培地と比較して、わずかな増殖を示した。８つの異なるｐＥｘｏ試料は、すべて、２日目にＧＦＰの堅実な成長を示した。図８を参照されたい。
【０１６８】
６．１０．実施例１０：胎盤エキソソームは、ヒトＣＤ３４＋細胞の増殖とコロニー形成を刺激する
造血幹細胞の増殖に関するｐＥｘｏの効果を試験するために、ヒト臍帯血ＣＤ３４＋細胞（自社で調製した）を解凍し、そして、１×１０ｅ４／細胞／ｍｌ（Ｎ＝４）で、１０％  ＦＣＳ−ＩＭＤＭを含む、ＳＣＦ、Ｆｌｔ−３、ＫＬ（培地Ａ）のカクテルを含有する増殖培地で培養した。培養ウェルに、２５ｕＬのＰＢＳ、または、２５ｕＬのｐＥｘｏ試料（試験した２つのｐＥｘｏ試料）を加えた。１週間の培養後に、それぞれのウェルでの総細胞数を計数し、そして、当該培養物でのＣＤ３４＋細胞の割合を、抗ＣＤ３４抗体を使用したフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）で評価した。ＣＤ３４＋総細胞数を、培養物でのＣＤ３４＋細胞の％に対するウェル内の細胞総数として計算する。これらの結果は、ｐＥｘｏで処理した両方の培養物が、ＰＢＳ対照培養物と比較して、有意に多くのＣＤ３４＋細胞を有することを示した。また、ｐＥｘｏは、コロニー形成単位培養（ＣＦＵ）でのＣＤ３４＋細胞への影響についても試験した。ＣＦＵ培養は、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  Ｈ４４３４培地（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で確立されたものであり、そして、ｐＥｘｏまたはＰＢＳを、５０ｕＬ／ｍＬで添加した。２週間の培養後に、それぞれの３５ｍｍディッシュでの合計ＣＦＵ数を計数する（Ｎ＝３）。このデータは、ｐＥｘｏの存在下で、ＰＢＳ対照培養と比較して、有意に多くのＣＦＵが存在することを示した。図９及び図１０を参照されたい。
【０１６９】
６．１１．実施例１１：がん細胞増殖の阻害
ミクロＲＮＡデータ、及び、サイトカインデータは、ｐＥｘｏが、がん細胞増殖を阻害する活性を有することを示唆している。ｐＥｘｏ試料を使用して、９６ウェルプレートでのＳＫＯＶ３（ヒト卵巣癌細胞株）の増殖に関する影響を調べた。このＳＫＯＶ３細胞は、ルシフェラーゼを発現するように遺伝子操作しているので、ルシフェラーゼ活性の測定が、細胞増殖の指標となる。合計で８つの異なるｐＥｘｏ試料を使用した。２０００個のＳＫＯＶ３細胞を、１００ｕＬの増殖培地（ＤＭＥＭ−１０％ＦＣＳ）の入った９６ウェルプレートに加えた。２時間後に、４０ｕＬのｐＥｘｏを、ウェル（Ｎ＝６）に加え、そして、６０ｕＬの増殖培地を補充した。４０μＬのＰＢＳを、対照として使用した。完全培地の条件は、ウェルに対して１００μＬの培地を加えることである。インキュベーターで２日間培養した後に、ルシフェラーゼの活性を、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、細胞を溶解して測定し、そして、ルシフェラーゼ活性を、プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４）を用いてルミネセンス発光で測定した。このデータは、それぞれの細胞濃度で、ｐＥｘｏ処理した培養物が、ＰＢＳ対照と比較して、ルミネックス指標が有意に小さいことを示す。このデータは、ｐＥｘｏが、ＳＫＯＶ３細胞の増殖を阻害したことを示す。図１１を参照されたい。
【０１７０】
Ａ５４９がん細胞株（ヒト肺癌がん細胞株）を、９６ウェルプレート（Ｘｉｃｅｌｉｇｅｎｃｅ）に、１５００個の細胞／ウェルで播種した。播種して２４時間後に、ｐＥｘｏを、増殖培地（１００ｕＬ）に、３つの異なる用量（５ｕＬ、２５、及び、５０ｕＬ）で加える。同量のＰＢＳを、対照として加えた。細胞の成長は、ウェルへの細胞の付着を反映するソフトウェアを介して、播種してから１日目〜３日目までモニターすることができる。このデータは、ｐＥｘｏの存在が、正規化した細胞指標として示した細胞の成長を、ＰＢＳ対照と比較して、ｐＥｘｏの存在下で有意に抑制している、ことを示した。それぞれの成長曲線は、３つの独立したウェルの平均細胞指標である。図１２を参照されたい。
【０１７１】
ｐＥｘｏ試料を使用して、様々な用量の細胞を入れた９６ウェルプレートでのＭＤＡ２３１（ヒト乳癌細胞株）の成長に関する効果を調べた。このＭＤＡ２３１細胞は、ルシフェラーゼを発現するように遺伝子操作しているので、ルシフェラーゼ活性の測定は、細胞増殖の指標である。異なる細胞数のＭＤＡ２３１−ルシフェラーゼを、９６ウェルプレート（３連）に播種し、そして、２５ｕＬのｐＥｘｏ＃７８９を加えた。インキュベーターで２日間培養した後に、Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｋｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）で、細胞を溶解して測定し、そして、ルシフェラーゼ活性を、プレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ４）を用いて、ルミネセンス発光で測定した。このデータは、それぞれの細胞濃度で、ｐＥｘｏで処理した培養液が、ＰＢＳ対照と比較して、Ｌｕｍｉｎｅｘ指標が有意に小さい、ことを示している。このデータは、ｐＥｘｏが、ＭＤＡ２３１細胞の増殖を阻害した、ことを示している。図１３を参照されたい。
【０１７２】
６．１２．実施例１２：胎盤エキソソームは、免疫細胞の活性化及び分化を調節する
免疫細胞に関するｐＥｘｏの効果を調べるために、ヒト臍帯血Ｔ細胞を、ＰＫＨ蛍光色素で標識し、次いで、刺激となるｐＥｘｏまたはＰＨＡとインキュベートした。ＲＰＭＩ＋１０％ＦＣＳで５日間培養した後に、すべてのＴ細胞、ならびに、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ６９、ＣＤ２７などの様々なタイプのＴ細胞のサブタイプを区別できる抗体を利用するＦＡＣＳで、細胞を分析する。このデータは、ｐＥｘｏの存在下で、ＣＤ３＋細胞のＭＦＩが、対照培養と同様であることを示しており、このことは、ｐＥｘｏだけでは、Ｔ細胞に関する増殖活性に影響を与えないことを示す。ＰＨＡ刺激で、ＭＦＩは有意に減少しており、ＰＨＡとｐＥｘｏの両方の存在下で細胞が増殖したことを示しているが、当該ＭＦＩはＰＨＡ単独と同様であるので、細胞増殖が、ｐＥｘｏの存在による影響を受けないことを示す。ＣＤ６９＋細胞は、ｐＥｘｏで処理した細胞で有意に多く、ＣＤ６９＋細胞は、ＣＤ３＋細胞（Ｔ細胞）で有意に増加させており、このことは、Ｔ細胞の活性化を、ｐＥｘｏが高めたことを示す。この観察は、臍帯血Ｔ細胞と、ＰＢＭＣ細胞の両方で認められた。加えて、ｐＥｘｏが、ＰＢＭＣでのＣＤ５６＋細胞（ＮＫ）細胞の割合を高めることが認められた。図１４、図１５、図１６、及び、図１７を参照されたい。
【０１７３】
６．１３．実施例１３：培養した胎盤、胎盤かん流液、及び、ＰＲＰ（臍帯血血清）由来のエキソソームの収量
胎盤かん流液、及び、ＰＲＰ（臍帯血血清）を、培養したヒト胎盤組織と同じ方法で単離した。以下の表は、胎盤かん流液、及び、ＰＲＰに由来するエキソソームの収量が、培養した胎盤よりも有意に少ないことを示す。
表８
【表８】
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【０１７４】
考察
本発明の方法は、独特かつ有利な特性を有する大量のエキソソームを生成することができる。これらのエキソソームは、実証したエキソソームの機能によって生物活性であると考えられる数多くのタンパク質、及び、ＲＮＡを含むことが明らかになっている。これらのエキソソームは、数多くの細胞表面マーカーを発現しており、それらは、例えば、受容体またはリガンドなどの結合パートナーとして機能し得るものであり、それにより、この生物活性を、所望の細胞型に対する標的とすることができる。
【０１７５】
本明細書に提示したデータは、表９に記載したものなど、様々な適応症のためのエキソソームの有用性を示す。
表９
【表９】
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【０１７６】
均等物：
本開示は、本明細書に記載した特定の実施形態によって、範囲が限定されることはない。実際のところ、本明細書で提供する内容の様々な変更は、これまでに説明したものに加えて、前出の説明、及び、添付した図面から当業者に自明である。そのような変更が、添付した特許請求の範囲に属するものである、ことを意図している。
【０１７７】
様々な刊行物、特許、及び、特許出願を、本明細書で引用しており、それらの開示の全内容を参照により援用する。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図２Ｃ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【国際調査報告】
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