(57)【要約】  本開示は、Ｔ細胞の増殖および活性化に関する。一態様では、本開示は、導入遺伝子発現のために使用されてもよい、γδＴ細胞の増殖および活性化に関する。別の態様では、本開示は、α−および／またはβ−ＴＣＲ陽性細胞を枯渇させる一方で、γδＴ細胞を増殖および活性化させることに関する。増殖したγδＴ細胞と、枯渇または減少したα−および／またはβ−ＴＣＲ陽性細胞とを含むＴ細胞集団もまた、本開示によって提供される。本開示は、開示されたＴ細胞集団を使用する方法をさらに提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
γδＴ細胞をヒト対象の血液サンプルから単離するステップと、
アミノビスホスホネート、ヒト組換えインターロイキン２（ＩＬ−２）およびヒト組換えインターロイキン１５（ＩＬ−１５）の存在下において、前記単離されたγδＴ細胞を活性化させるステップと、
アミノビスホスホネートの非存在下、およびヒト組換えインターロイキン２（ＩＬ−２）およびヒト組換えインターロイキン１５（ＩＬ−１５）の存在下において、前記活性化されたγδＴ細胞を増殖させるステップと
を含んでなる、γδＴ細胞を活性化および増殖させるインビトロ法。
【請求項２】
前記γδＴ細胞が、白血球アフェレーシスヒトサンプルから単離される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノビスホスホネートが、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、その塩および／またはその水和物を含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記アミノビスホスホネートがゾレドロン酸である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
活性化させるステップが、ゾレドロン酸と、ＩＬ&#8722;２およびＩＬ&#8722;１５からなるサイトカイン組成物との存在下である、請求項１&#12316;４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記活性化させるステップが、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）リガンドの存在下である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
前記ＴＬＲ２リガンドが、アンホテリシンＢ、Ｌ−テアニン、タンニン、およびポリフェノールからなる群から選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記活性化させるステップが、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の存在下である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記活性化させるステップが、ＣＯＸ−２阻害剤の存在下である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＣＯＸ−２阻害剤がイブプロフェンである、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
活性化させるステップが、約１μＭ〜約１０μＭの濃度のゾレドロン酸の存在下である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
活性化させるステップが、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ−２の存在下で行われる、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
活性化させるステップが、約１μＭ〜約１００μＭの濃度のゾレドロン酸、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ濃度のＩＬ−２、および約１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１５の存在下で行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
増殖させるステップが、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ−２および／または約５０〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１５の存在下である、請求項１〜１０および１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記増殖したγδＴ細胞の密度が、少なくとも約１×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０８細胞／ｍｌ、または少なくとも約１×１０９細胞／ｍｌである、請求項１&#12316;１４のいずれか一項に記載の方法によって調製された、増殖したγδＴ細胞の集団。
【請求項１６】
請求項１５に記載の操作されたγδＴ細胞の有効量をそれを必要とする患者に投与するステップを含んでなる、がんを治療する方法。
【請求項１７】
前記がんが、肺がん、小細胞肺がん、黒色腫、肝臓がん、乳がん、子宮がん、メルケル細胞がん、膵臓がん、胆嚢がん、胆管がん、結腸直腸がん、尿膀胱がん、非小細胞肺がん、腎臓がん、白血病、卵巣がん、食道がん、脳がん、胃がん、および前立腺がんからなる群から選択される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記がんが黒色腫である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
γδＴ細胞をヒト対象の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離するステップを含んでなり、前記単離するステップが、
前記ＰＢＭＣを抗αおよび抗βＴ細胞受容体（ＴＣＲ）抗体に接触させるステップと、
α−および／またはβ−ＴＣＲ陽性細胞を前記ＰＢＭＣから枯渇させるステップと、
アミノビスホスホネート、ヒト組換えインターロイキン２（ＩＬ−２）およびヒト組換えインターロイキン１５（ＩＬ−１５）の存在下において、前記単離されたγδＴ細胞を活性化させるステップと、
アミノビスホスホネートの非存在下、およびヒト組換えインターロイキン２（ＩＬ−２）およびヒト組換えインターロイキン１５（ＩＬ−１５）の存在下において、前記活性化されたγδＴ細胞を増殖させるステップと
を含んでなる、γδＴ細胞を活性化および増殖させるインビトロ法。
【請求項２０】
前記活性化されたγδＴ細胞を組換えウイルスベクターで形質導入するステップをさらに含んでなる、請求項１&#12316;１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ウイルスベクターが、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、またはトランスポゾンである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記ウイルスベクターが、レンチウイルスベクターである、請求項２０または２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ウイルスベクターが、エンベロープタンパク質をコード化する配列番号１と少なくとも９５％の同一性を有するＲＤ１１４ＴＲ遺伝子を含んでなる、請求項２０〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記ウイルスベクターが、ＣＤ８および／またはαβ−ＴＣＲをコードする、請求項２０〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記形質導入するステップが、形質導入エンハンサーの存在下である、請求項２０〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記形質導入エンハンサーが、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）またはＶｅｃｔｏｆｕｓｉｎ−１（登録商標）である、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
請求項１４〜２０のいずれか一項に記載の方法によって調製された、操作されたγδＴ細胞。
【請求項２８】
請求項１&#12316;１４および請求項１９&#12316;２６のいずれか一項に記載の方法によって調製された、増殖および活性化されたγδＴ細胞の集団。
【請求項２９】
（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブト−２−エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）、イソプレノイドピロリン酸（ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からなる群から選択されるホスホ抗原をさらに含んでなる、請求項１〜１４および１９〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は特許協力条約に基づく国際出願であり、その内容全体が参照により援用される、２０１７年１１月２７日に提出された米国仮出願第６２／５９１，０４１号明細書、２０１７年１１月２７日に出願された独国特許出願第１０２０１７１２７９８４．９号明細書の優先権を主張する。
【０００２】
本開示は、Ｔ細胞の増殖および活性化に関する。一態様では、本開示は、導入遺伝子発現のために使用されてもよい、γδＴ細胞の増殖および活性化に関する。別の態様では、本開示は、α−および／またはβ−ＴＣＲ陽性細胞を枯渇させる一方で、γδＴ細胞を増殖および活性化させることに関する。増殖したγδＴ細胞と、枯渇または減少したα−および／またはβ−ＴＣＲ陽性細胞とを含むＴ細胞集団もまた、本開示によって提供される。本開示は、開示されたＴ細胞集団を使用する方法をさらに提供する。
【背景技術】
【０００３】
γδＴ細胞は、αβＴＣＲの代わりにγδＴＣＲを発現するＴ細胞のサブセットに相当する。γδＴ細胞は、組織結合型Ｖδ２陰性細胞と、末梢循環型Ｖδ２陽性細胞、より具体的にはＶγ９δ２という、２つの主要なサブセットに分類され得る。どちらのサブセットも、抗ウイルス活性および抗腫瘍活性を有することが示されている。従来のαβＴＣＲ発現細胞とは異なり、γδＴＣＲ発現細胞は、古典的なＭＨＣＩおよびＩＩとは無関係にそれらの標的を認識する。ナチュラルキラー（ＮＫ）Ｔ細胞と同様に、γδＴ細胞は、ストレスを受けた細胞および／または腫瘍細胞上に存在する非古典的ＭＨＣ分子、すなわちＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ａ（ＭＩＣＡ）およびＭＨＣクラスＩポリペプチド関連配列Ｂ（ＭＩＣＢ）に結合する、ＮＫＧ２Ｄを発現する。γδＴＣＲは、例えば、ストレスおよび／または腫瘍関連ホスホ抗原などの様々なリガンドを認識する。γδＴ細胞は、複数の機序、すなわち、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、パーフォリン、およびグランザイム分泌を介して、それらの標的の直接的な細胞溶解を媒介する。さらに、ＣＤ１６を発現するγδＴ細胞は、抗体依存性細胞媒介性細胞毒性（ＡＤＣＣ）を増強する。
【０００４】
末梢血液中に一般にわずか１〜５％の量で存在することもあるγδΤの問題は、特に少量の血液を採取して、次に、そこからの細胞を活性化および／または増殖させる場合に、医学的処置に十分なγδΤ細胞の純度と数が確保され得ないことである。医学的処置に十分なγδΤ細胞の純度と数を確保するために、患者からの採血量を増やすことにはまた、患者の負担が大きいという問題がある。
【０００５】
これまでのところ、自己Ｖγ９δ２Ｔ細胞を用いた臨床試験では、ビスホスホネート（すなわち、ゾレドロネートおよびパミドロネート）および１００Ｕ／ｍｌのＩＬ−２によるＰＢＭＣの１４日間の治療である、Ｖγ９δ２Ｔ細胞増殖プロトコルが使用されてもよい。最良でも、この治療は、１４日以内に総Ｖγ９δ２Ｔ細胞に１００倍の増加をもたらしてもよく；その後、増殖率は低下して細胞死の増加に一致する。そのため、従来のＶγ９δ２Ｔ増殖プロトコルは、商業的に実現可能な同種異系製品として認定されるのに十分な数の細胞をもたらさないこともある。
【０００６】
米国特許第７，７４９，７６０号明細書は、ビスホスホネート、インターロイキン２（ＩＬ−２）、およびインターロイキン１８（ＩＬ−１８）を含有する、Ｖγ９Ｖδ２Ｔ細胞増殖因子を記載する。
【０００７】
米国特許第８，９６２，３１３号明細書は、単離された末梢血に疾患抗原を添加することによって、疾患抗原特異的細胞毒性Τリンパ球（ＣＴＬ）とγδΤ細胞を同時増殖させる方法；および得られた組み合わせをインターロイキンを含有する培養液中で培養する方法を記載する。
【０００８】
国際公開第２０１４／０７２４４６号パンフレットは、感染症、がん、自己免疫ならびにその他疾患の治療法で使用するための、γδＴ細胞活性化因子とＩＬ−３３の組み合わせを使用して、γδＴ細胞のＩＬ−２を含まない増殖を誘発する方法を記載する。
【０００９】
国際公開第２０１６／１６６５４４号パンフレットは、γδＴ細胞が、ホスホ抗原であるイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）の存在下で増殖されてもよく、培養ステップでサイトカインが提供されて、γδＴ細胞の増殖が促進され、末梢血単核細胞の細胞表現型が維持されてもよいことを記載する。
【００１０】
米国特許第２０１１／０１５８９５４号明細書は、（ａ）フィブロネクチン、フィブロネクチン断片またはその混合物、および（ｂ）γδＴ細胞の活性化因子の存在下において、γδＴ細胞を含有する細胞集団を培養するステップを含む、γδＴ細胞集団を調製する方法を記載する。
【００１１】
米国特許第２０１６／０１７５３５８号明細書は、収集されたγδＴ細胞上で発現される細胞表面マーカーの陽性および／または陰性選択を用いて、例えば、末梢血サンプル、臍帯血サンプル、腫瘍、腫瘍生検、組織、リンパ液から、または対象の上皮サンプルなどの様々な起源から、γδＴ細胞が直接単離され得ることを記載する。γδＴ細胞は、ＣＤ４、ＣＤ８、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲδ、およびその他の適切な細胞表面マーカーの陽性または陰性発現に基づいて、複合サンプルから単離され得る。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
商業的に実現可能な治療製品として十分な数のγδＴ細胞を調製し得る方法の必要性が、依然として存在する。この技術的問題の解決策は、特許請求の範囲で特徴付けられる実施形態によって提供される。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
一態様では、本開示は、γδＴ細胞をヒト対象の血液サンプルから単離するステップと、単離されたγδＴ細胞をアミノビスホスホネートおよびサイトカイン化合物または組成物の存在下において、活性化させるステップと、活性化されたγδＴ細胞をアミノビスホスホネートの非存在下、およびサイトカイン化合物または組成物の存在下において、増殖させるステップとを含む、γδＴ細胞を活性化および／または増殖させる方法を提供する。
【００１４】
一態様では、本出願は、γδＴ細胞をヒト対象の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離するステップを含む、γδＴ細胞を増殖および活性化させる方法に関し、単離するステップは、例えば、ビオチン共役または磁気ビーズ共役抗αβＴＣＲ抗体などの抗αおよび抗βＴ細胞受容体（ＴＣＲ）抗体と、ＰＢＭＣを接触させるステップと、例えば、ストレプトアビジンマイクロビーズまたは磁石を使用することによって、α−および／またはβ−ＴＣＲ陽性細胞をＰＢＭＣから枯渇させるステップと、アミノビスホスホネートおよび／またはホスホ抗原を含有する少なくとも１つの化合物、および例えば、ＩＬ−２単独、ＩＬ−１５単独、またはＩＬ−２およびＩＬ−１５の組み合わせなどのヒト組換えインターロイキン２（ＩＬ−２）、および／またはヒト組換えインターロイキン１５（ＩＬ−１５）を含んでなる少なくとも１つのサイトカインの存在下において、単離されたγδＴ細胞を活性化させるステップと、少なくとも１つの化合物の非存在下、および少なくとも１つのサイトカインの存在下において、活性化されたγδＴ細胞を増殖させるステップとを含む。
【００１５】
別の態様では、本開示は、ヒト対象の白血球アフェレーシスからγδＴ細胞を単離するステップを含む、γδＴ細胞を増殖および活性化させる方法に関し、単離するステップは、例えば、ビオチン共役または磁気ビーズ共役抗αβＴＣＲ抗体などの抗αおよび抗βＴ細胞受容体（ＴＣＲ）抗体と、白血球アフェレーシス産物を接触させるステップと、例えば、ストレプトアビジンマイクロビーズまたは磁石を使用することによって、α−および／またはβ−ＴＣＲ陽性細胞をＰＢＭＣから枯渇させるステップと、アミノビスホスホネートおよび／またはホスホ抗原；およびＩＬ−２、および／またはＩＬ−１５を含んでなる少なくとも１つのサイトカインを含有する少なくとも１つの化合物の存在下において、単離されたγδＴ細胞を活性化させるステップと、少なくとも１つの化合物の非存在下、および少なくとも１つのサイトカインの存在下において、活性化されたγδＴ細胞を増殖させるステップとを含む。
【００１６】
なおも別の態様では、本開示は、γδＴ細胞をヒト対象の血液サンプルから単離するステップと、アミノビスホスホネート、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）リガンド、ならびにＩＬ−２およびＩＬ−１５から本質的になるサイトカイン組成物の存在下において、単離されたγδＴ細胞を活性化させるステップと、アミノビスホスホネートの非存在下、前記サイトカイン組成物の存在下において、活性化されたγδＴ細胞を増殖させるステップとを含む、γδＴ細胞を活性化および増殖させる方法を提供する。
【００１７】
一態様では、本開示は、本明細書に記載の方法論を利用することによって、Ｔ細胞を活性化させる方法を提供する。別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法論を利用することによって、Ｔ細胞を増殖させる方法を提供する。なおも別の態様では、本開示は、本明細書に記載の方法論を利用することによって、Ｔ細胞を活性化および増殖させる方法を提供する。
【００１８】
一態様では、単離されたγδＴ細胞の活性化は、ゾレドロン酸、ＴＬＲ２リガンド、ならびにＩＬ−２およびＩＬ−１５からなるサイトカイン組成物の存在下で行われる。別の態様では、サイトカイン組成物は、ＩＬ−２またはＩＬ−１５からなる。一態様では、本明細書に記載の方法はインビトロ法である。
【００１９】
一態様では、γδＴ細胞は、例えば、ヒト対象などの対象のＬｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）などの白血球アフェレーシス産物から単離される。別の態様では、γδＴ細胞は、臍帯血などの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されない。一態様では、血液サンプルは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および／または白血球アフェレーシス産物を含んでなる。
【００２０】
別の態様では、α−および／またはβ−ＴＣＲ陽性細胞としては、αβＴ細胞およびナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞が挙げられる。
【００２１】
なおも別の態様では、アミノビスホスホネートは、ゾレドロネート、パミドロネート、アレンドロネート、リセドロネート、イバンドロネート、インカドロネート、クロドロネート、エチドロネート、またはネリドロネート、その塩および／またはその水和物であってもよい。なおも別の態様では、本明細書に記載の方法で利用される唯一のアミノビスホスホネートは、ゾレドロネートである。
【００２２】
別の態様では、ホスホ抗原は、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブト−２−エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）、イソプレノイドピロリン酸（ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、またはジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）であってもよい。
【００２３】
本開示は、アミノビスホスホネート、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５の存在下において、γδＴ細胞を活性化させることをさらに提供する。なおも別の態様では、活性化は、アミノビスホスホネートとＩＬ−２、またはアミノビスホスホネートとＩＬ−１５の存在下で行われる。
【００２４】
一態様では、活性化は、ホスホ抗原、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５の存在下；またはホスホ抗原およびＩＬ−１５の存在下で行われる。
【００２５】
別の態様では、アミノビスホスホネートはゾレドロン酸である。
【００２６】
別の態様では、ホスホ抗原はＩＰＰである。
【００２７】
別の態様では、アミノビスホスホネートは、約０．１μＭ〜約５００μＭ、約０．１μＭ〜約４００μＭ、約０．１μＭ〜約３００μＭ、約０．１μＭ〜約２００μＭ、約０．１μＭ〜約１００μＭ、約０．５μＭ〜約１００μＭ、約１μＭ〜約５００μＭ、約１μＭ〜約４００μＭ、約１μＭ〜約３００μＭ、約１μＭ〜約２００μＭ、約１μＭ〜約１００μＭ、約１μＭ〜約９０μＭ、約１μＭ〜約８０μＭ、約１μＭ〜約７０μＭ、約１μＭ〜約６０μＭ、約１μＭ〜約５０μＭ、約１μＭ〜約４０μＭ、約１μＭ〜約３０μＭ、約１μＭ〜約２０μＭ、約１μＭ〜約１５μＭ、約１μＭ〜約１０μＭ、約１μＭ〜約９μＭ、約１μＭ〜約８μＭ、約１μＭ〜約７μＭ、約１μＭ〜約６μＭ、約１μＭ〜約５μＭ、約２μＭ〜約５μＭ、約３μＭ〜約５μＭ、約２μＭ〜約５μＭ、約２μＭ〜約１０μＭ、約３μＭ〜約８μＭ、または約４μＭ〜約６μＭの濃度であってもよい。
【００２８】
別の態様では、アミノビスホスホネートは、約０．１μＭ〜約１００μＭまたは約１μＭ〜約１００μＭの濃度であってもよい。別の態様では、アミノビスホスホネートは、約５μＭの濃度であってもよい。
【００２９】
なおも別の態様では、活性化中の単離されたγδＴ細胞の播種密度は、約０．０１×１０６細胞／ｃｍ２〜約１×１０７細胞／ｃｍ２、約０．１×１０６細胞／ｃｍ２〜約５×１０６細胞／ｃｍ２、約０．２５×１０６細胞／ｃｍ２〜約５×１０６細胞／ｃｍ２、約０．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約５×１０６細胞／ｃｍ２、約０．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約４×１０６細胞／ｃｍ２、約０．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約３×１０６細胞／ｃｍ２約０．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約２．５×１０６細胞／ｃｍ２、約０．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、約０．６×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、約０．７×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、約０．８×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、約０．９×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、約１×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、または約１．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２である。
【００３０】
別の態様では、活性化中の単離されたγδＴ細胞の播種密度は、約０．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約３×１０６細胞／ｃｍ２である。
【００３１】
一態様では、活性化および／または増殖中のＩＬ−２の濃度は、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約１０００ＩＵ／ｍｌ、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約５００ＩＵ／ｍｌ、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約４００ＩＵ／ｍｌ、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約３００ＩＵ／ｍｌ、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌ、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約１５０ＩＵ／ｍｌ、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌ、約２０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌ、約３０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌ、約４０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌ、約５０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌ、約７５ＩＵ／ｍｌ〜約１２５ＩＵ／ｍｌ、約２０ＩＵ／ｍｌ〜約８０ＩＵ／ｍｌ、約２５ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌ、または約５０ＩＵ／ｍｌ〜約１５０ＩＵ／ｍｌである。
【００３２】
別の態様では、活性化および／または増殖中のＩＬ−２の濃度は、約５０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌである。別の態様では、活性化および／または増殖中のＩＬ−１５の濃度は、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１μｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約５００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約４００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約３００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約２００ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１５０ｎｇ／ｍｌ、約１０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約４０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約６０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌ、約２０ｎｇ／ｍｌ〜約８０ｎｇ／ｍｌ、約３０ｎｇ／ｍｌ〜約６０ｎｇ／ｍｌ、または約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１２０ｎｇ／ｍｌである。
【００３３】
別の態様では、活性化および／または増殖中のＩＬ−１５の濃度は、約５０ｎｇ／ｍｌ〜約１００ｎｇ／ｍｌである。
【００３４】
本開示は、活性化が、約１μＭ〜約１００μＭの濃度のゾレドロン酸、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約２００ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ−２、および約１０〜５００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１５の存在下で行われる態様をさらに提供する。なおも別の態様では、増殖は、約１０ＩＵ／ｍｌ〜約１００ＩＵ／ｍｌの濃度のＩＬ−２および／または約５０〜２００ｎｇ／ｍｌの濃度のＩＬ−１５の存在下で行われる。
【００３５】
別の態様では、サイトカインは、ＩＬ−７、ＩＬ−１８、および／またはＩＬ−２１を含んでもよい。一態様では、本明細書に記載の方法は、増殖中または活性化中に、または増殖中と活性化中の双方で、ＩＬ−１２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−３３、ＩＬ−４、ＩＬ−９、および／またはＩＬ−２３の１つまたは複数を除外する。
【００３６】
なおも別の態様では、少なくとも１つの化合物は、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）リガンドをさらに含む。
【００３７】
一態様では、ＴＬＲ２リガンドは、アンホテリシンＢ、Ｌ−テアニン、タンニン、およびポリフェノールからなる群から選択される。
【００３８】
別の態様では、ＴＬＲ２リガンドはアンホテリシンＢである。
【００３９】
なおも別の態様では、少なくとも１つの化合物は、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）および／またはグルタミン／グルタマックスをさらに含む。
【００４０】
一態様では、ＮＡＣの濃度は、約１ｍＭ〜約１０ｍＭ、約２ｍＭ〜約８ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約５ｍＭ、または約０．５ｍＭ〜約２．５ｍＭである。
【００４１】
別の態様では、少なくとも１つの化合物は、ＣＯＸ−２阻害剤をさらに含む。
【００４２】
なおも別の態様では、ＣＯＸ−２阻害剤はイブプロフェンである。
【００４３】
一態様では、増殖は、さらにＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）および／またはグルタミン／グルタマックスの存在下で行われる。
【００４４】
一態様では、ＮＡＣの濃度は約１ｍＭ〜約１０ｍＭである。
【００４５】
一態様では、活性化の持続時間は、約７日間、約１０日間、約１２日間、約１４日間、約１６日間、または約２０日間以下である。
【００４６】
一態様では、活性化の持続時間は、１日間〜約１０日間、１日間〜約９日間、１日間〜約８日間、１日間〜約７日間、１日間〜約６日間、１日間〜約５日間、１日間〜約４日間、約２日間〜約１０日間、約２日間〜約８日間、約２日間〜約７日間、約３日間〜約７日間、または約４日間〜約６日間である。
【００４７】
別の態様では、活性化の持続時間は、約１日間〜約７日間である。
【００４８】
一態様では、増殖の持続時間は、約７日間、約１０日間、約１２日間、約１４日間、約１６日間、約２０日間、約２２日間、約２４日間、約２６日、約２８日、または約３０日以上を超える。一態様では、増殖の持続時間は、約７日〜約３０日、約７日〜約２５日間、または約１０日間〜約２０日間である。
【００４９】
一態様では、増殖中のγδＴ細胞の細胞密度は、約０．１×１０６細胞／ｃｍ２〜約５×１０６細胞／ｃｍ２、約０．２５×１０６細胞／ｃｍ２〜約５×１０６細胞／ｃｍ２、約０．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約５×１０６細胞／ｃｍ２、約０．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約４×１０６細胞／ｃｍ２、約０．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約３×１０６細胞／ｃｍ２、約０．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約２．５×１０６細胞／ｃｍ２、約０．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、約０．６×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、約０．７×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、約０．８×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、約０．９×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、約１×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２、または約１．５×１０６細胞／ｃｍ２〜約２×１０６細胞／ｃｍ２である。
【００５０】
別の態様では、増殖に使用されるサイトカインは、ＩＬ−１８、ＩＬ−２１、およびＩＬ−７をさらに含んでもよい。
【００５１】
一態様では、本出願は、本明細書に記載のいずれか１つの態様の方法によって調製された、増殖および活性化されたγδＴ細胞の集団に関する。
【００５２】
別の態様では、本出願は、組換えウイルスベクターを用いて、１〜１６番目の態様のいずれか１つの方法によって調製された増殖および活性化されたγδＴ細胞を形質導入することをはじめとする、γδＴ細胞におけるウイルス形質導入効率を高める方法に関する。
【００５３】
別の態様では、ウイルスベクターは、レトロウイルスベクターである。
【００５４】
別の態様では、ウイルスベクターは、γレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターである。
【００５５】
なおも別の態様では、ウイルスベクターは、ＣＤ８およびαβ−ＴＣＲを発現する。
【００５６】
一態様では、本出願は、本開示の方法によって調製された、操作されたγδＴ細胞に関する。
【００５７】
一態様では、本出願は、その中で増殖したγδＴ細胞の濃度が、少なくとも約１×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも約１×１０８細胞／ｍｌ、または少なくとも約１×１０９細胞／ｍｌである、本開示の方法によって調製された、増殖したγδＴ細胞の集団に関する。
【００５８】
一態様では、本出願は、本開示の方法によって調製された、操作されたγδＴ細胞の有効量をそれを必要とする患者に投与することを含んでなる、がんを治療する方法に関する。
【００５９】
一態様では、がんは、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、神経芽腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、小脳星細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫などの脳腫瘍、乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明がん、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頸がん、小児期がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫、胚芽細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞がん腫、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん、非小細胞および小細胞肺がんなどの肺がん、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん、多発性内分泌腺腫症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭のがん腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、経口がん、中咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、メルケル細胞皮膚がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、絨毛性腫瘍（妊娠性）、原発不明がん、尿道がん、子宮の肉腫、膣がん、外陰がん、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍からなる群から選択される。
【００６０】
一態様では、がんは黒色腫である。
【図面の簡単な説明】
【００６１】
【図１Ａ】本開示の一実施形態によるＰＢＭＣからのαβＴ細胞の枯渇を示す。ＰＢＭＣは、ビオチン共役αβＴＣＲ抗体と共にインキュベートされ、製造業者のプロトコルに従ったストレプトアビジンマイクロビーズとのインキュベートがそれに続いた。次にサンプルをＬＳカラムに通過させ、αβＴＣＲ発現細胞が富化された。カラム通過物は、αβＴＣＲ枯渇画分に相当する。一晩の培養後、αβＴＣＲ富化画分およびαβＴＣＲ枯渇画分は、蛍光色素共役αβＴＣＲ抗体対Ｖγ９抗体で染色され、フローサイトメトリー分析がそれに続いた。
【図１Ｂ】本開示の一実施形態によるＶγ９δ２Ｔ細胞産物中の最小残留αβＴ細胞を示す。市販のビオチン化抗αβＴＣＲ抗体／ストレプトアビジンマイクロビーズを使用して、正常ドナー（ドナーＡ、ドナーＢ、およびドナーＣ）（図１Ｂ）および（ドナー１２およびドナー１３）（図１Ｃ）のＰＢＭＣからαβＴ細胞を枯渇させた。αβＴ細胞枯渇ＰＢＭＣは、ゾレドロネート／ＩＬ−２／ＩＬ−１５と共に１４日間培養され、例えば、抗αβＴＣＲ抗体および抗γδＴＣＲ抗体などのそれぞれの蛍光色素共役抗体による細胞表面染色がそれに続き、ＣＤ３上のサブゲーティングによって、残留αβＴ細胞および富化γδＴ細胞が評価された。
【図１Ｃ】同上
【図１Ｄ】本開示の一実施形態によるＶγ９δ２Ｔ細胞のサイトカインプロファイリングを示す。Ｖγ９δ２細胞は、細胞収穫の６時間前にゴルジストップ／プラグ（すなわち、タンパク質輸送阻害剤）で処理された。細胞は表面Ｖδ２について染色され、固定化および透過処理がそれに続いた。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７ａ、およびＩＦＮ−γに対する蛍光色素共役抗体を使用して、細胞内ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７ａ、およびＩＦＮ−γの染色が実施された。
【図１Ｅ】本開示の別の実施形態による、例えば、Ｌｅｕｋｏｐａｋ（登録商標）などの白血球アフェレーシス産物からのαβＴ細胞の枯渇を示す。白血球アフェレーシス産物からの樹状細胞および前駆細胞を含む白血球は、ビオチン共役αβＴＣＲ抗体と共にインキュベートされ、ストレプトアビジンマイクロビーズとのインキュベートがそれに続いてもよい。次にサンプルをＬＳカラムに通過させ、αβＴＣＲ発現細胞が富化された。カラム通過物は、αβＴＣＲ枯渇画分に相当する。一晩の培養後、αβＴＣＲ枯渇画分は、蛍光色素共役αβＴＣＲ抗体対γδＴＣＲ抗体で染色され、フローサイトメトリー分析がそれに続いた。
【図２】本開示の一実施形態によるＶγ９δ２Ｔ細胞の活性化に対する、分子の効果を示す。活性化ステップ中に、例えば、ゾレドロネート（ＺＡ）などのアミノビスホスホネート、または例えば、ＩＰＰなどのホスホ抗原、および例えば、ＩＬ−２および／またはＩＬ−１５などのサイトカインが存在してもよい。
【図３】本開示の一実施形態によるＶγ９δ２Ｔ細胞の増殖に対する、分子の効果を示す。増殖ステップ中に、アミノビスホスホネートまたはホスホ抗原であるＩＰＰなしで、サイトカインが存在し続けてもよい。
【図４Ａ】本開示の一実施形態による増殖中の、Ｔ細胞マーカーに対する細胞密度の効果を示す。ゾレドロネート、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５の存在下における１４日間の活性化後、Ｖγ９δ２Ｔ細胞は、高密度（例えば、２×１０６細胞／ｍｌ）および低密度（例えば、０．５×１０６細胞／ｍｌ）で、ゾレドロネートの非存在下において、例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１５などの恒常的サイトカインによって増殖された。例えば、ＣＤ１２２、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、およびＣＤ９５ＬなどのＴ細胞マーカーが分析された。
【図４Ｂ】本開示の一実施形態による増殖中の、細胞死に対する細胞密度の効果を示す。ゾレドロネート、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５の存在下における１４日間の活性化後、Ｔ細胞は、高密度（例えば、２×１０６細胞／ｍｌ）および低密度（例えば、０．５×１０６細胞／ｍｌ）で、ゾレドロネートの非存在下において、例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１５などの恒常的サイトカインによって増殖された。細胞死が測定された。
【図５】本開示の一実施形態によるＩＬ−２Ｒαを発現するＶδ２Ｔ細胞に対する、アンホテリシンＢの効果を示す。αβ枯渇ＰＢＭＣは、０日目にゾレドロネート、ＩＬ−２、ＩＬ−１５を補給した活性化培地中で培養された。４８時間後に、アンホテリシンＢが添加され、４８時間後に、ＣＤ３＋／Ｖδ２Ｔ細胞上のＣＤ２５（またはＩＬ−２Ｒα）表面発現のフローサイトメトリーに基づく分析のために、細胞が収穫された。
【図６】本開示の一実施形態による細胞増殖に対する、ゾレドロネート（ゾメタ）効果を示す。γδＴ細胞は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびアンホテリシンＢを含有する規定培地中で、ゾレドロネート（ゾメタ）を使用して増殖された。
【図７】本開示の一実施形態によるＶγ９δ２Ｔ細胞へのウイルス形質導入のための予定表を示す。１日目に新鮮なＰＢＭＣからαβＴ細胞が枯渇され、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の存在下でゾレドロネートによって活性化され；２４時間後（２日目）に１．５のＭＯＩの各ウイルス上清を使用して、細胞が形質導入され；ＧＦＰ導入遺伝子の発現は、フローサイトメトリーによって、７日目（すなわち、形質導入後５日目）に形質導入効率ついて；１２日目（すなわち、形質導入後１０日目）に、持続的な導入遺伝子発現について評価された。
【図８Ａ】本開示の一実施形態によるγレトロウイルスベクターを使用した、ウイルス導入遺伝子のＶγ９δ２Ｔ細胞における発現を示す。形質導入後５日目および１０日目に、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現γレトロウイルス（例えば、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）偽型（例えば、配列番号４）、ＲＤ１１４ＴＲ偽型（配列番号１）、およびＧＦＰ発現レンチウイルス（例えばＶＳＶ−Ｇ偽型（例えば、配列番号３））などの異なるエンベロープタンパク質発現ウイルスが、Ｖγ９δ２Ｔ細胞へのそれらの形質導入効率について試験された。
【図８Ｂ】本開示の一実施形態による、ＲＤ１１４ＴＲまたはＶＳＶ&#8722;Ｇ偽型化レンチウイルスベクターによって形質導入されたＶγ９δ２Ｔ細胞における、例えば、ＣＤ８αなどのウイルス導入遺伝子の発現を示す。
【図９Ａ】形質導入プロセス中の、異なる形質導入エンハンサー（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎｎ（登録商標）対Ｖｅｃｔｏｆｕｓｉｎ−１（登録商標））を使用した、ＣＤ８αβによるγδＴ細胞の形質導入を示す。３人のドナー（ドナー１、ドナー２、およびドナー３）から入手されたγδＴ細胞は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（プレート上に被覆されたフィブロネクチン断片）またはＶｅｃｔｏｆｕｓｉｎ−１（登録商標）（可溶性カチオンペプチド）の存在下において、ＣＤ８αβをコード化するレトロウイルスで形質導入された後、ＣＤ８αβ＋細胞の％を判定するフローサイトメトリーがそれに続いた。
【図９Ｂ】本開示の一実施形態による操作されたウイルスによる、Ｖγ９δ２Ｔ細胞の形質導入効率を示す。Ｖγ９δ２Ｔ細胞は、ウイルスなし（模擬）で形質導入され、またはαβ−ＴＣＲウイルス単独で、ＣＤ８ウイルス単独で、またはαβ−ＴＣＲウイルス＋ＣＤ８ウイルスで形質導入された。形質導入された細胞は、ＴＡＡ／ＭＨＣ−ＰＥデキストラーマー、抗ＣＤ８抗体、またはＮＹＥＳＯ−ＰＥデキストラーマー（陰性対照）と共にインキュベートされ、フローサイトメトリー分析がそれに続いた。
【図１０】本開示の一実施形態による操作されたウイルスで形質導入された、Ｖγ９δ２Ｔ細胞の増殖倍数を示す。Ｖγ９δ２Ｔ細胞（ＧＤ）またはαβＴ細胞（ＡＢ）は、ウイルスなし（模擬）、αβ−ＴＣＲウイルス（ＴＣＲ）、ＣＤ８ウイルス（ＣＤ８）、またはＣＤ８＋ＴＣＲで形質導入され、導入後７〜２１日目の倍数増殖の測定がそれに続いた。
【図１１Ａ】本開示の一実施形態による、操作されたＶγ９δ２Ｔ細胞を示す。ウイルスなし（模擬）で、またはαβ−ＴＣＲレトロウイルスとＣＤ８αβレトロウイルス（αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＶγ９δ２Ｔ細胞は、ＴＡＡ／ＭＨＣ複合体と共にインキュベートされ、フローサイトメトリー分析がそれに続き、ＴＡＡ／ＭＨＣ複合体に結合したＶγ９δ２Ｔ細胞が検出された。
【図１１Ｂ】本開示の一実施形態による、操作されたＶｇ９δ２Ｔ細胞の機能評価を示す。ウイルスなし（模擬）で、またはαβ−ＴＣＲレトロウイルスとＣＤ８αβレトロウイルス（αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＶγ９δ２Ｔ細胞は、ＴＡＡ／ＭＨＣ複合体と共にインキュベートされ、フローサイトメトリー分析がそれに続き、アポトーシスマーカーであるＣＤ１０７ａが検出された。
【図１１Ｃ】本開示の別の実施形態による、操作されたＶｇ９δ２Ｔ細胞の機能評価を示す。ウイルスなし（模擬）で、またはαβ−ＴＣＲレトロウイルスとＣＤ８αβレトロウイルス（αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ２）で形質導入されたＶγ９δ２Ｔ細胞は、ＴＡＡ／ＭＨＣ複合体と共にインキュベートされ、フローサイトメトリー分析がそれに続き、ＩＦＮ−γ放出が検出された。
【図１１Ｄ】本開示の一実施形態による、操作されたＶｇ９δ２Ｔ細胞の細胞溶解活性を示す。ウイルスなし（模擬）で、またはαβ−ＴＣＲレトロウイルスとＣＤ８αβレトロウイルス（αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ２）で形質導入されたＶγ９δ２Ｔ細胞は、ＴＡＡ／ＭＨＣ複合体と共にインキュベートされ、フローサイトメトリー分析がそれに続き、アポトーシス細胞が検出された。
【図１１Ｅ】本開示の一実施形態による、γδＴ細胞の細胞溶解活性の延長を示す。細胞溶解活性は、８４時間の共培養アッセイ中にリアルタイムで評価された。標的陽性Ａ３７５−ＲＦＰ腫瘍細胞は、Ｔ細胞なし（腫瘍細胞）で、または非導入細胞（αβＴ細胞およびγδＴ細胞）と共に、αβ−ＴＣＲウイルスとＣＤ８αβウイルスで形質導入されたαβＴ細胞（αβＴＣＲ＋αβＴ細胞）と共に、またはαβ−ＴＣＲウイルスとＣＤ８αβウイルスで導入されたγδＴ細胞（αβＴＣＲ＋γδＴ細胞）と共にインキュベートされ、ＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析がそれに続き、標的細胞増殖が測定された。
【図１２】図１２Ａ：本開示の一実施形態による、操作されたウイルスの概略図を示す。ＣＤ８／ＣＤ４キメラ受容体−Ｔ２Ａ短縮型ＣＳＦ１Ｒは、ＣＤ４膜貫通ドメインと細胞内ドメインとに連結された、ＣＤ８α細胞外ドメインを含有する。図１２Ｂ：本開示の一実施形態による、操作されたウイルスの概略図を示す。ＣＤ８／ＣＤ４キメラ受容体−Ｔ２Ａ−ＣＳＦ１Ｒ／４１ＢＢキメラ受容体は、キメラＣＤ８／ＣＤ４タンパク質の下流で連結された、ＣＳＦ１Ｒ細胞外ドメインを含有する。
【図１３】本開示の一実施形態による、同種異系Ｔ細胞療法を示す。同種異系Ｔ細胞療法は、γδＴ細胞を健常ドナーから採取するステップと、外因性ＴＣＲなどの関心のある外因性遺伝子のウイルス形質導入によってγδＴ細胞を操作するステップと、それに続く細胞増殖、増殖した操作されたγδＴ細胞の収穫を含んでもよく、γδＴ細胞は、患者に輸液する前に「既製」Ｔ細胞製品として凍結保存されもよい。
【図１４】本開示の一実施形態による、γδＴ細胞製造を示す。γδＴ細胞製造は、例えば、白血球アフェレーシス産物などの白血球またはＰＢＭＣを採取または入手するステップと、ＰＢＭＣまたは白血球アフェレーシス産物からαβＴ細胞を枯渇させるステップと、それに続くγδＴ細胞の活性化、形質導入、および増殖を含んでもよい。
【発明を実施するための形態】
【００６２】
同種異系Ｔ細胞療法は、同種異系γδＴ細胞を遺伝子操作して、外因性ＴＣＲを発現させることに基づいてもよい。異所性ＴＣＲを介した特異的な腫瘍認識に加えて、γδＴ細胞は、本明細書に記載されるような多数の腫瘍タイプに対する活性を有してもよい。
【００６３】
一態様では、本開示は、Ｔ細胞の増殖および／または活性化に関する。別の態様では、本開示は、γδＴＣＲに対する抗体などのγδＴＣＲに特異的なエピトープに結合する薬剤の非存在下における、γδＴ細胞の増殖および／または活性化に関する。一態様では、本開示は、導入遺伝子発現のために使用されてもよい、γδＴ細胞の増殖および／または活性化に関する。
【００６４】
本開示は、α−および／またはβ−ＴＣＲ陽性細胞を枯渇させている間における、γδＴ細胞の増殖および活性化にさらに関する。増殖したγδＴ細胞と、枯渇または減少したα−および／またはβ−ＴＣＲ陽性細胞とを含むＴ細胞集団もまた、本開示によって提供される。本開示は、開示されたＴ細胞集団を使用する方法をさらに提供する。
【００６５】
一態様では、大規模優良製造規範（ＧＭＰ）グレードのＴＣＲ操作されたＶγ９δ２Ｔ細胞を製造するための方法が、本明細書で提供される。
【００６６】
支持細胞の非存在下では、精製されたγδＴ細胞へのＩＬ−１８の添加は、ＩＬ−２に対する表面高親和性受容体（ＣＤ２５またはＩＬ−２Ｒａ）の量の顕著な増加を伴う、γδＴ細胞の増殖を促進する。さらに、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）リガンドであるアンホテリシンＢは、γδＴ細胞、ＣＤ８＋Ｔ細胞、およびＮＫ細胞を活性化し、高親和性ＩＬ−２ＲαであるＣＤ２５の表面発現の検出を増強し得る。これらの結果は集合的に、Ｖγ９δ２Ｔ細胞のゾレドロネート媒介性活性化と増殖における、ＩＬ−２シグナル伝達の重要な役割を強調する。したがって、ＩＬ−２シグナル伝達を介したγδＴ細胞増殖のためのＩＬ−２の利用可能性を最大化するために（または多数のαβＴ細胞によるＩＬ−２の隔離を最小化するために）、本開示の方法は、市販のＧＭＰ試薬である抗αβＴＣＲを使用して、正常なＰＢＭＣからαβＴ細胞を枯渇させることを含んでもよい。組換えＩＬ−１８は、商業的なＧＭＰ試薬として現在入手できないことから、本開示の方法は、低用量のアンホテリシンＢを培養に補給し、ＣＤ２５表面発現を増加させ、ＩＬ−２結合およびシグナル伝達を増強してもよく、それは次に、活性化／増殖中のＩＬ−２応答性を増強してもよい。さらに、ＩＬ−１５は、ＩＰＰで処理されたＶγ９δ２Ｔ細胞の増殖および生存を増加させることが示されているので、ＩＬ−１５が添加されてもよい。
【００６７】
図１３は、腫瘍中で関心のある標的を発現する特定のがんを有する適格患者の迅速な治療のために、γδＴ細胞産物などの「既製」Ｔ細胞製品を送達し得る、同種異系Ｔ細胞療法のためのアプローチを示す。このアプローチは、γδＴ細胞を健常ドナーから採取するステップと、外因性ＴＣＲなどの関心のある外因性遺伝子のウイルス形質導入によってγδＴ細胞を操作するステップと、それに続く細胞増殖、増殖した操作されたγδＴ細胞の収穫を含んでもよく、γδＴ細胞は、患者に輸液する前に「既製」Ｔ細胞製品として凍結保存されもよい。したがって、このアプローチは、個別化Ｔ細胞製造の必要性を排除してもよい。
【００６８】
γδＴ細胞を単離するために、一態様では、γδＴ細胞は、対象から、または対象の複合サンプルから単離されてもよい。一態様では、複合サンプルは、末梢血サンプル、臍帯血サンプル、腫瘍、幹細胞前駆体、腫瘍生検、組織、リンパであっても、または外部環境と直接接触する対象の上皮部位からのもの、または幹前駆体細胞に由来するものであってもよい。γδＴ細胞は、例えば、１つまたは複数の細胞表面マーカーを発現するγδＴ細胞をフローサイトメトリー技術を用いて選別することによって、対象の複合サンプルから直接単離されてもよい。野生型γδＴ細胞は、γδＴ細胞に関連し得る、多数の抗原認識、抗原提示、共刺激、および接着分子を示してもよい。特定のγδＴＣＲ、抗原認識、抗原提示、リガンド、接着分子、または共刺激分子などの１つまたは複数の細胞表面マーカーを使用して、複合サンプルから野生型γδＴ細胞が単離されてもよい。γδＴ細胞に関連する、またはγδＴ細胞によって発現される様々な分子を使用して、複合サンプルからγδＴ細胞が単離されてもよい。別の態様では、本開示は、Ｖδ１＋、Ｖδ２＋、Ｖδ３＋細胞またはそれらの任意の組み合わせを混合集団から単離する方法を提供する。
【００６９】
例えば、末梢血単核細胞は、例えば、Ｆｉｃｏｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）ＰＬＵＳ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）システムをはじめとする、アフェレーシス療法装置、または別の適切な装置／システムを用いて、対象から採取され得る。γδＴ細胞またはγδＴ細胞の所望の亜集団は、採取されたサンプルから、例えば、フローサイトメトリー技術を用いて精製され得る。臍帯血細胞は、対象の出産時に臍帯血からも入手され得る。
【００７０】
採取されたγδＴ細胞上で発現される細胞表面マーカーの陽性および／または陰性選択を使用して、末梢血サンプル、臍帯血サンプル、腫瘍、腫瘍生検、組織、リンパから、または対象の上皮サンプルから、類似した細胞表面マーカーを発現するγδＴ細胞またはγδＴ細胞集団が直接単離され得る。例えば、γδＴ細胞は、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２４、ＣＤ２５、ＣＤ４４、Ｋｉｔ、ＴＣＲα、ＴＣＲβ、ＴＣＲα、ＴＣＲδ、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ７０、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ１６、ＣＤ３３７（ＮＫｐ３０）、ＣＤ３３６（ＮＫｐ４６）、ＯＸ４０、ＣＤ４６、ＣＣＲ７、およびその他の適切な細胞表面マーカーの陽性または陰性発現に基づいて、複合サンプルから単離され得る。
【００７１】
一態様では、γδＴ細胞は、生体外で培養された複合サンプルから単離されてもよい。別の態様では、ＰＢＭＣ集団全体は、単球、αβＴ細胞、Ｂ細胞、およびＮＫ細胞などの特定の細胞集団の事前の枯渇なしに、活性化および増殖され得る。別の態様では、富化されたγδＴ細胞集団は、それらの特定の活性化および増殖に先立って作製され得る。別の態様では、γδＴ細胞の活性化および増殖は、ナイーブまたは操作されたＡＰＣの存在なしに実施されてもよい。その他の態様では、腫瘍標本からのγδＴ細胞の単離および増殖は、γδＴＣＲに特異的な抗体をはじめとする固定化γδＴ細胞マイトジェン、およびレクチンをはじめとするその他のγδＴＣＲ活性化剤を使用して実施され得る。別の態様では、腫瘍標本からのγδＴ細胞の単離および増殖は、γδＴＣＲに特異的な抗体をはじめとする固定化γδＴ細胞マイトジェン、およびレクチンをはじめとするその他のγδＴＣＲ活性化剤の非存在下で実施され得る。
【００７２】
一態様では、γδＴ細胞は、例えば、ヒト対象などの対象の白血球アフェレーシスから単離される。別の態様では、γδＴ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離されない。
【００７３】
図１４は、本開示の一実施形態による、γδＴ細胞製造を示す。このプロセスは、白血球またはＰＢＭＣを白血球アフェレーシス産物から採取または入手することを含んでもよい。白血球アフェレーシスは、ドナーから全血を採取し、アフェレーシス療法装置を使用して成分を分離することを含んでもよい。フェレーシス療法装置は、所望の血液成分を分離し、残りはドナーの循環に戻される。例えば、白色血液細胞、血漿、および血小板が、アフェレーシス療法装置を使用して採取され得て、赤血球と好中球はドナーの循環に戻される。このプロセスでは、市販の白血球アフェレーシス産物が使用されてもよい。白血球を入手するための別の方法は、それらをバフィーコートから入手することである。バフィーコートを単離するために、抗凝固全血がドナーから得られ遠心分離される。遠心分離後に、血液は、血漿、赤血球、およびバフィーコートに分離される。バフィーコートは、血漿層と赤血球層の間に位置する層である。白血球アフェレーシスの採取は、バフィーコートの採取によって達成されるものよりも、より高い純度と、単核細胞含有量の大幅な増加をもたらしてもよい。白血球アフェレーシスによって可能な単核細胞含有量は、典型的には、バフィーコートから得られるものの２０倍であってもよい。単核細胞を富化するために、さらなる分離のためのＦｉｃｏｌｌ勾配の使用が必要なこともある。
【００７４】
ＰＢＭＣからαβＴ細胞を枯渇させるために、例えば、抗αβＴＣＲ抗体で被覆されたＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）磁気ビーズを使用した磁気分離によって、αβＴＣＲ発現細胞がＰＢＭＣから分離されてもよく、αβＴＣＲ−Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣの凍結保存がそれに続く。「既製」Ｔ細胞製品を製造するために、凍結保存αβＴＣＲ−Ｔ細胞枯渇ＰＢＭＣは、例えば、２〜６日間など１〜１０日間にわたり、アミノビスホスホネートおよび／またはイソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）および／または例えば、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インターロイキン１５（ＩＬ−１５）、および／またはインターロイキン１８（ＩＬ−１８）などのサイトカイン、および／または例えば、Ｔｏｌｌ様受容体２（ＴＬＲ２）リガンドなどのその他の活性化剤の存在下において、例えば、２４から４〜６ウェルプレートまたはＴ７５／Ｔ１７５フラスコなどの小／中規模で、または例えば、５０ｍｌ〜１００リットルのバッグなどの大規模で解凍され活性化されてもよい。
【００７５】
一態様では、単離されたγδＴ細胞は、１つまたは複数の抗原との接触に応答して急速に増殖し得る。Ｖγ９Ｖδ２＋Ｔ細胞などのいくつかのγδＴ細胞は、組織培養中に、プレニルピロリン酸塩、アルキルアミン、および代謝産物または微生物抽出物のようないくつかの抗原との接触に応答して生体外で急速に増殖し得る。刺激されたγδＴ細胞は、複合サンプルからのγδＴ細胞の単離を容易にし得る、多数の抗原提示、刺共激、および接着分子を示し得る。複合サンプル内のγδＴ細胞は、１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、または別の適当な期間にわたり、少なくとも１つの抗原によって生体外で刺激され得る。適切な抗原によるγδＴ細胞の刺激は、生体外でγδＴ細胞集団を増殖させ得る。
【００７６】
生体外における複合体試料からのγδＴ細胞の増殖を刺激するために使用されてもよい抗原の非限定的な例としては、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、アルキルアミン、ヒト微生物病原体の代謝産物、常在細菌の代謝産物、メチル−３−ブテニル−１−ピロリン酸（２Ｍ３Ｂ１ＰＰ）、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブト−２−エニルピロリン酸（ＨＭＢ−ＰＰ）、エチルピロリン酸（ＥＰＰ）、ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）、ジメチルアリルリン酸塩（ＤＭＡＰ）、ピロリン酸ジメチルアリル（ＤＭＡＰＰ）、エチル−アデノシン三リン酸（ＥＰＰＰＡ）、ピロリン酸ゲラニル（ＧＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、イソペンテニル−アデノシン三リン酸（ＩＰＰＰＡ）、モノエチルリン酸（ＭＥＰ）、モノエチルピロリン酸（ＭＥＰＰ）、３−ホルミル−１−ブチル−ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ１）、Ｘ−ピロリン酸（ＴＵＢＡｇ２）、３−ホルミル−１−ブチル−ウリジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ３）、３−ホルミル−１−ブチル−デオキシチミジン三リン酸（ＴＵＢＡｇ４）、モノエチルアルキルアミン、アリルピロリン酸、クロトイルピロリン酸、ジメチルアリル−γ−ウリジン三リン酸、クロトイル−γ−ウリジン三リン酸、アリル−γ−ウリジン三リン酸、エチルアミン、イソブチルアミン、ｓｅｃ−ブチルアミン、イソ−アミルアミン、および窒素含有ビスホスホネートなどのプレニルピロリン酸塩が挙げられてもよい。
【００７７】
γδＴ細胞の活性化および増殖は、本明細書に記載の活性化剤および共刺激剤を使用して実施され、特定のγδＴ細胞増殖および持続集団を始動し得る。一態様では、異なる培養からのγδＴ細胞の活性化および増殖は、異なるクローナル集団サブセットまたは混合ポリクローナル集団サブセットを達成し得る。別の態様では、異なる作動薬を使用して、特定のγδ活性化シグナルを提供する作用物質が同定され得る。別の態様では、特定のγδ活性化シグナルを提供する作用物質は、γδＴＣＲに対する異なるモノクローナル抗体（ＭＡｂ）であり得る。別の態様では、細胞エネルギーおよびアポトーシスの誘導なしに、特定のγδＴ細胞増殖を始動させるのを助ける、コンパニオン共刺激剤が使用され得る。これらの共刺激剤としては、ＮＫＧ２Ｄ、ＣＤ１６１、ＣＤ７０、ＪＡＭＬ、ＤＮＡＸ副分子−１（ＤＮＡＭ−１）、ＩＣＯＳ、ＣＤ２７、ＣＤ１３７、ＣＤ３０、ＨＶＥＭ、ＳＬＡＭ、ＣＤ１２２、ＤＡＰ、およびＣＤ２８などのγδ細胞上で発現される受容体に結合するリガンドが挙げら得る。別の態様では、共刺激剤は、ＣＤ２およびＣＤ３分子上の独特のエピトープに特異的な抗体であり得る。ＣＤ２およびＣＤ３は、αβまたはγδＴ細胞上で発現されたときに、異なる立体構造を有し得る。別の態様では、ＣＤ３およびＣＤ２に対する特異的抗体は、γδＴ細胞の明瞭な活性化をもたらし得る。
【００７８】
γδＴ細胞の操作に先立って、γδＴ細胞の集団を生体外で増殖させてもよい。生体外におけるγδＴ細胞集団の増殖を促進するのに使用され得る試薬の非限定的例としては、抗ＣＤ３または抗ＣＤ２、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０、抗ＯＸ４０抗体、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−９、ＩＬ−３３、ＩＬ−１８、またはＩＬ−２１、ＣＤ７０（ＣＤ２７リガンド）、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）、アメリカヤマゴボウ（ＰＷＭ）、タンパク質落花生凝集素（ＰＮＡ）、大豆凝集素（ＳＢＡ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）凝集素（ＬＣＡ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）凝集素（ＰＳＡ）、リンゴマイマイ（Ｈｅｌｉｘ  ｐｏｍａｔｉａ）凝集素（ＨＰＡ）、ビシア・グラミネア（Ｖｉｃｉａ  ｇｒａｍｉｎｅａ）レクチン（ＶＧＡ）、またはＴ細胞増殖を刺激できる別の適切なマイトジェンが挙げられてもよい。
【００７９】
広域スペクトルの抗原を認識するγδＴ細胞の能力は、γδＴ細胞の遺伝子操作によって増強され得る。一態様では、γδＴ細胞は操作され、生体内で選択された抗原を認識する普遍的な同種異系療法が提供され得る。γδＴ細胞の遺伝子操作は、抗原結合機能とＴ細胞活性化機能の双方を単一の受容体に組み合わせる、αβＴＣＲ、γδＴＣＲ、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）などの腫瘍認識部分発現コンストラクト、その抗原結合断片、またはリンパ球活性化ドメインを、単離されたγδＴ細胞のゲノム、サイトカイン（ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＩＬ−１９、ＩＬ−３３、ＩＬ−４、ＩＬ−９、ＩＬ−２３、ＩＬ１β）に安定的に組み込むことを含んで、生体外および生体内におけるＴ細胞の増殖、生存、および機能を増強してもよい。単離されたγδＴ細胞の遺伝子操作はまた、例えば、ＭＨＣ遺伝子座などの単離されたγδＴ細胞のゲノム中の１つまたは複数の内因性遺伝子からの遺伝子発現を欠失させ、または破壊することを含んでもよい。
【００８０】
一態様では、ウイルスとは、天然に存在するウイルスならびに人工ウイルスを指す。本開示のいくつかの実施形態によるウイルスは、エンベロープウイルスまたは非エンベロープウイルスのどちらであってもよい。パルボウイルス（ＡＡＶなど）は、非エンベロープウイルスの例である。好ましい実施形態では、ウイルスは、エンベロープウイルスであってもよい。好ましい実施形態では、ウイルスは、レトロウイルス、特にレンチウイルスであってもよい。真核細胞のウイルス感染を促進し得るウイルス外被タンパク質は、水疱性口内炎ウイルス（ＶＳＶ−Ｇ）、改変ネコ内在性レトロウイルス（ＲＤ１１４ＴＲ）、および改変テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶＴＲ）からのエンベロープ糖タンパク質（ＧＰ）で偽型化されたＨＩＶ−１由来レンチウイルスベクター（ＬＶ）を含んでもよい。これらのエンベロープタンパク質は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をはじめとするパルボウイルスなどのその他のウイルスの侵入を効率的に促進し得て、それによってそれらの広範な効率を実証する。例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）４０７０  ｅｎｖ（参照により本明細書に援用される、Ｍｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４−８４０，２００５に記載されるような）、ＲＤ１１４  ｅｎｖ（配列番号２）、キメラエンベロープタンパク質ＲＤ１１４ｐｒｏまたはＲＤｐｒｏ（参照により本明細書に援用される、Ｂｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１０；２３５：１２６９−１２７６に記載されるような、ＲＤ１１４のＲペプチド切断配列をＨＩＶ−１マトリックス／カプシド（ＭＡ／ＣＡ）切断配列で置き換えることによって構築されたＲＤ１１４−ＨＩＶキメラ）、バキュロウイルスＧＰ６４  ｅｎｖ（参照により本明細書に援用される、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８１：１０８６９−１０８７８，２００７に記載されるような）、またはＧＡＬＶ  ｅｎｖ（参照により本明細書に援用される、Ｍｅｒｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７９：８３４−８４０，２００５に記載されるような）、またはその誘導体をはじめとする、その他のウイルスエンベロープタンパク質が使用されてもよい。
【００８１】
ＲＤ１１４ＴＲ
ＲＤ１１４ＴＲは、ネコ白血病ウイルスＲＤ１１４の細胞外および膜貫通ドメインと、両種性マウス白血病ウイルスエンベロープの細胞質尾部（ＴＲ）とから構成される、キメラエンベロープ糖タンパク質である。ＲＤ１１４ＴＲ偽型化ベクターは、ヒト造血前駆細胞およびＮＯＤ／ＳＣＩＤ再増殖細胞への効率的な遺伝子移入を媒介し得る。その内容全体が参照により援用される、Ｄｉ  Ｎｕｎｚｉｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ：８１１−８２０（２００７））。ＲＤ１１４偽型化ベクターはまた、大型動物モデルにおける効率的な遺伝子移入も媒介し得て（Ｎｅｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｌ．Ｔｈｅｒ．２：１５７−１５９（２００４）；Ｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍａｌ．Ｔｈｅｒ：６１１−６１７（２００３）；およびＫｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  Ｃｅｌｌｓ，Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，＆  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  ３０：１３２−１４３（２００３））、これらの各参考文献の内容は、それらの全体が参照により援用される。
【００８２】
本開示は、配列番号１または配列番号５のアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有するＲＤ１１４ＴＲ変異型を含んでもよい。例えば、ＲＤ１１４ＴＲ（配列番号１）との約９６％の配列同一性を有するＲＤ１１４ＴＲ変異型（ＲＤ１１４ＴＲｖ１（配列番号５））が使用されてもよい。一態様では、本開示は、修飾アミノ酸残基を有するＲＤ１１４ＴＲ変異型を提供する。修飾アミノ酸残基は、アミノ酸の挿入、欠失、または置換から選択されてもよい。一態様では、本明細書に記載の置換は、保存的アミノ酸置換である。すなわち、ＲＤ１１４ＴＲのアミノ酸は、類似特性を有するその他のアミノ酸で置換されてもよい（類似した、疎水性、親水性、抗原性、αらせん構造またはβシート構造を形成または破壊する傾向などの保存的変化）。保存的置換の非限定的例は、例えば、その内容全体が参照により援用される、Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ（１９８４）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙにある。
【００８３】
別の態様では、本開示は、配列番号１、２、３、４、または５のアミノ酸配列と、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％の配列同一性を有する変異型を含んでもよい。
【００８４】
一態様では、保存的置換としては、その内容全体が参照により援用される、Ｄａｙｈｏｆｆによって”Ｔｈｅ  Ａｔｌａｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ．Ｖｏｌ．５”，Ｎａｔｌ．Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈに記載されるものが挙げられてもよい。例えば、一態様では、以下のグループの１つに属するアミノ酸は、互いに交換され得て、したがって、保守的な交換を構成する：グループ１：アラニン（Ａ）、プロリン（Ｐ）、グリシン（Ｇ）、アスパラギン（Ｎ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）；グループ２：システイン（Ｃ）、セリン（Ｓ）、チロシン（Ｙ）、スレオニン（Ｔ）；グループ３：バリン（Ｖ）、イソロイシン（Ｉ）、ロイシン（Ｌ）、メチオニン（Ｍ）、アラニン（Ａ）、フェニルアラニン（Ｆ）；グループ４：リジン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）、ヒスチジン（Ｈ）；グループ５：フェニルアラニン（Ｆ）、チロシン（Ｙ）、トリプトファン（Ｗ）、ヒスチジン（Ｈ）；およびグループ６：アスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）。
【００８５】
一態様では、保存的アミノ酸置換は、例えば、（１）非極性：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｒｏ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ；（２）非荷電極性：Ｇｌｙ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｃｙｓ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；および（４）塩基性：Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓなどの同一クラスの別のものによるアミノ酸の置換を含んでもよい。（１）芳香族：Ｐｈｅ、Ｔｙｒ、Ｈｉｓ；（２）プロトン供与体：Ａｓｎ、Ｇｌｎ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉｓ、Ｔｒｐ；および（３）プロトン受容体：Ｇｌｕ、Ａｓｐ、Ｔｈｒ、Ｓｅｒ、Ｔｙｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎなどの保存的な別のアミノ酸置換がなされてもよい（米国特許第１０１０６８０５号明細書を参照されたい）。
【００８６】
別の態様では、表Ａに従って保存的置換が行なわれてもよい。タンパク質修飾に対する耐性を予測する方法は、例えば、その内容全体が参照により援用される、Ｇｕｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ，１０１（２５）：９２０５−９２１０（２００４）にある。
【００８７】
【表Ａ】
2021503959.tif 000002
【００８８】
一態様では、形質導入後約１０日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクターの導入遺伝子発現は、約２０％&#12316;約６０％、約３０％&#12316;約５０％、または約３５％&#12316;約４５％である。一態様では、同一条件下における形質導入後１０日目のＶＳＶ−Ｇ偽型化ベクターの導入遺伝子発現である約５％〜約２５％、約２％〜約２０％、約３％〜約１５％、または約５％〜約１２％と比較して、形質導入後１０日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクターの導入遺伝子発現は、約２０％〜約６０％、約３０％〜約５０％、または約３５％〜約４５％である。なおも別の態様では、形質導入後１０日目のＶＳＶ−Ｇ偽型化ベクター導入遺伝子発現である約３．６％と比較して、形質導入後１０日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクターの導入遺伝子発現は、約４０％である。
【００８９】
なおも別の態様では、形質導入後約５日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクターの導入遺伝子発現は、約２０％&#12316;約５０％、約１５％&#12316;約３０％、または約２０％&#12316;約３０％である。一態様では、同一条件下における形質導入後５日目のＶＳＶ−Ｇ偽型化ベクターの導入遺伝子発現である約１０％〜約２０％、約１５％〜約２５％、または約１７．５％〜約２０％と比較して、形質導入後５日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクターの導入遺伝子発現は、約２０％〜約５０％約１５％〜約３０％、または約２０％〜約３０％である。なおも別の態様では、形質導入後５日目のＶＳＶ−Ｇ偽型化ベクター導入遺伝子発現である約１９％と比較して、形質導入後５日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクターの導入遺伝子発現は、約２４％である。
【００９０】
別の態様では、形質導入後１０日目のＶＳＶ−Ｇ偽型化ベクターの導入遺伝子発現と比較して、形質導入後１０日目のＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクターの導入遺伝子発現は、約２倍、約３倍、約４倍、約５倍、または約１０倍、約１１倍、または約１２倍以上である。
【００９１】
一態様では、本開示は、ＲＤ１１４ＴＲ偽型（例えば、配列番号１）を有するレトロウイルスを使用して、Ｔ細胞を形質導入する方法を提供する。別の態様では、Ｔ細胞は、ＶＳＶ−Ｇ偽型（例えば、配列番号３）を有するレトロウイルスと比較して、ＲＤ１１４ＴＲ偽型（例えば、配列番号１）を有するレトロウイルスによって、より効率的に形質導入される。別の態様では、ＲＤ１１４ＴＲエンベロープを利用してレンチベクターが偽型化され、次にこれを使用してＴ細胞が優れた効率で形質導入される。
【００９２】
操作されたγδＴ細胞は、様々な方法によって作製されてもよい。例えば、腫瘍認識部分、または別のタイプの認識部分を含んでなる、発現カセットをコードするポリヌクレオチドは、トランスポゾン／トランスポザーゼシステム；またはレンチウイルスまたはレトロウイルスシステムなどのウイルスベースの遺伝子移入システム；または形質移入、電気穿孔、形質導入、リポフェクション、リン酸カルシウム（ＣａＰＯ４）、オルモシルなどのナノ工学物質などの別の適切な方法；アデノウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルスをはじめとするウイルス送達方法、または別の適切な方法によって、γδＴ細胞に安定に導入され得る。ヒト遺伝子治療には、その全体が本明細書に援用される、国際公開第１９９３０２０２２１号パンフレットに記載される方法などのいくつかのウイルス法が用いられている。γδＴ細胞を操作するために用られ得るウイルス法の非限定的例としては、γレトロウイルス法、アデノウイルス法、レンチウイルス法、単純ヘルペスウイルス法、ワクシニアウイルス法、ポックスウイルス法、またはアデノウイルス関連ウイルス法が挙げられてもよい。
【００９３】
図１４は、特定のがん抗原およびＣＤ８に対するαβＴＣＲなどの関心のある外因性遺伝子を発現する、ＲＤ１１４ＴＲγレトロウイルスベクターおよびＲＤ１１４ＴＲレンチウイルスベクターなどのウイルスベクターで、単離されたγδＴ細胞を形質導入することによって、活性化Ｔ細胞が操作されてもよいことを示す。ウイルスベクターはまた、ウッドチャックＰＲＥ（ＷＰＲＥ）などの転写後調節エレメント（ＰＲＥ）を含有して、核および細胞質双方のｍＲＮＡレベルを増加させることによって、導入遺伝子の発現を増強させてもよい。マウスＲＮＡ輸送エレメント（ＲＴＥ）、サルレトロウイルス１型（ＳＲＶ−１）の構成的輸送エレメント（ＣＴＥ）、およびヒト熱ショックタンパク質７０の５’未翻訳領域（Ｈｓｐ７０５’ＵＴＲ）をはじめとする、１つまたは複数の調節要素もまた使用され、および／またはＷＰＲＥと組み合わされて、導入遺伝子発現を増加させてもよい。形質導入は、例えば、１日間などの１／２&#12316;５日間にわたり、例えば、２４から４&#12316;６ウェルプレートなどの小規模で、または中／大規模で、１回または複数回実行され、安定した導入遺伝子発現が達成されてもよい。
【００９４】
ＲＤ１１４ＴＲは、マウス白血病ウイルスの細胞質尾部（ＴＲ）に融合した、ネコ内因性ウイルス（ＲＤ１１４）の細胞外および膜貫通ドメインを含有するキメラ糖タンパク質である。一態様では、形質導入後約１０日目におけるＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクターの導入遺伝子発現は、ＶＳＶ−Ｇ偽型化ベクターと比較してより高い。
【００９５】
ＶＳＶ−Ｇ  ｅｎｖ、ＭＬＶ４０７０  ｅｎｖ、ＲＤ１１４  ｅｎｖ、キメラエンベロープタンパク質ＲＤ１１４ｐｒｏ、バキュロウイルスＧＰ６４  ｅｎｖ、またはＧＡＬＶ  ｅｎｖなどのその他のウイルスエンベロープタンパク質、またはその誘導体もまた使用されてもよい。
【００９６】
一態様では、操作された（または形質導入された）γδＴ細胞は、抗原提示細胞またはアミノビスホスホネートによる刺激なしに、生体外で増殖され得る。本開示の抗原反応性の操作されたＴ細胞は、生体外および生体内で増殖されてもよい。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の活性集団は、抗原提示細胞、抗原性ペプチド、非ペプチド分子、または小分子化合物などのアミノビスホスホネートによる抗原刺激なしで、特定の抗体、サイトカイン、マイトジェン、またはＩＬ−１７Ｆｃ融合タンパク質、ＭＩＣＡＦｃ融合タンパク質、およびＣＤ７０Ｆｃ融合タンパク質などの融合タンパク質を使用して、生体外で増殖されてもよい。γδＴ細胞集団の増殖に使用され得る抗体の例としては、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２７、抗ＣＤ３０、抗ＣＤ７０、抗ＯＸ４０、抗ＮＫＧ２Ｄ、または抗ＣＤ２抗体が挙げられてもよく、サイトカインの例としては、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１、ＩＬ−１８、ＩＬ−９、ＩＬ−７、および／またはＩＬ−３３が挙げられてもよく、マイトジェンの例としては、ヒトＣＤ２７に対するリガンドであるＣＤ７０、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）、コンカバリンＡ（ＣｏｎＡ）、アメリカヤマゴボウマイトジェン（ＰＷＭ）、タンパク質落花生凝集素（ＰＮＡ）、大豆凝集素（ＳＢＡ）、レンズマメ（Ｌｅｎｓ  ｃｕｌｉｎａｒｉｓ）凝集素（ＬＣＡ）、エンドウマメ（Ｐｉｓｕｍ  ｓａｔｉｖｕｍ）凝集素（ＰＳＡ），リンゴマイマイ（Ｈ．ｐｏｍａｔｉａ）凝集素（ＨＰＡ）、ビシア・グラミネア（Ｖｉｃｉａ  ｇｒａｍｉｎｅａ）レクチン（ＶＧＡ）またはＴ細胞増殖を刺激できる別の適切なマイトジェンが挙げられてもよい。別の態様では、操作されたγδＴ細胞の集団は、６０日間未満、４８日間未満、３６日間未満、２４日間未満、１２日間未満、または６日間未満増殖され得る。
【００９７】
別の態様では、本開示は、養子免疫伝達療法のために、操作されたγδＴ細胞集団を生体外で増殖させる方法を提供する。本開示の操作されたγδＴ細胞は、生体外で増殖されてもよい。本開示の操作されたγδＴ細胞は、ＡＰＣによる活性化なしで、またはＡＰＣおよびアミノリン酸塩との共培養なしで、生体外で増殖され得る。
【００９８】
別の態様では、γδＴ細胞集団は、３６日間未満、３５日間未満、３４日間未満、３３日間未満、３２日間未満、３１日間未満、３０日間未満、２９日間未満、２８日間未満、２７日間未満、２６日間未満、２５日間未満、２４日間未満、２３日間未満、２２日間未満、２１日間未満、２０日間未満、１９日間未満、１８日間未満、１７日間未満、１６日間未満、１５日間未満、１４日間未満、１３日間未満、１２日間未満、１１日間未満、１０日間未満、９日間未満、８日間未満、７日間未満、６日間未満、５日間未満、４日間未満、または３日間未満生体外で増殖させ得る。
【００９９】
図１４は、形質導入または操作されたγδＴ細胞の増殖が、例えば、１４〜２８日間などの７〜３５日間にわたり、例えば、フラスコ／Ｇ−Ｒｅｘなどの小／中規模で、または例えば、５０ｍｌ〜１００リットルバッグなどの大規模で、例えば、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１８などのサイトカインの存在下において、実行されてもよいことを示す。増殖した形質導入されたＴ細胞産物は、次に、患者への輸液用の「既製」Ｔ細胞製品として凍結保存されてもよい。
【０１００】
治療方法
本明細書に記載の操作されたγδＴ細胞を含有する組成物は、予防的および／または治療的治療のために投与されてもよい。治療用途では、医薬組成物は、疾患または病状の症状を治癒しまたは少なくとも部分的に阻止するのに十分な量で、疾患または病状に既に苦しんでいる対象に投与され得る。操作されたγδＴ細胞は、発症、罹患、または病状の悪化の可能性を軽減するためにも投与され得る。治療的使用のための操作されたγδＴ細胞の集団の有効量は、疾患または病状の重症度および経過、以前の治療、対象の健康状態、体重、および／または薬物に対する応答、および／または治療医の判断に基づいて変動し得る。
【０１０１】
本明細書の操作されたγδＴ細胞を使用して、例えば、本明細書に記載のがんなどの病状に対する治療を必要とする対象が、治療され得る。
【０１０２】
対象における病状（例えば、病気）をγδＴ細胞で治療する方法は、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞を対象に投与することを含んでもよい。本開示のγδＴ細胞は、様々なレジメン（例えば、タイミング、濃度、投与量、治療間隔、および／または製剤）で投与されてもよい。対象はまた、本開示の操作されたγδＴ細胞を与られる前に、例えば、化学療法、放射線、または双方の組み合わせで、事前調節され得る。また、操作されたγδＴ細胞の集団は、対象に投与する前に冷凍または凍結保存されてもよい。操作されたγδＴ細胞の集団は、同じ腫瘍認識部分、異なる腫瘍認識部分、または同じ腫瘍認識部分と異なる腫瘍認識部分との組み合わせを発現する、２種以上の細胞を含み得る。例えば、操作されたγδＴ細胞の集団は、異なる抗原を認識し、または同じ抗原の異なるエピトープを認識するように設計された、いくつかの異なる操作されたγδＴ細胞を含み得る。
【０１０３】
本開示のγδＴ細胞を使用して、様々な病状が治療されてもよい。一態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、固形腫瘍および血液学的悪性疾患をはじめとする、がんが治療されてもよい。がんの非限定的例としては、急性リンパ芽球性白血病、急性骨髄性白血病、副腎皮質がん、ＡＩＤＳ関連がん、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、肛門がん、虫垂がん、星状細胞腫、神経芽腫、基底細胞がん、胆管がん、膀胱がん、骨がん、小脳星細胞腫、脳星状細胞腫／悪性神経膠腫、上衣腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路および視床下部神経膠腫などの脳腫瘍、乳がん、気管支腺腫、バーキットリンパ腫、原発不明がん、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫、子宮頸がん、小児期がん、慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸がん、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜がん、上衣腫、食道がん、ユーイング肉腫、胚芽細胞腫瘍、胆嚢がん、胃がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部がん、心臓がん、肝細胞（肝臓）がん、ホジキンリンパ腫、下咽頭がん、眼球内黒色腫、膵島細胞がん腫、カポジ肉腫、腎臓がん、喉頭がん、口唇および口腔がん、脂肪肉腫、肝臓がん、非小細胞および小細胞肺がんなどの肺がん、リンパ腫、白血病、マクログロブリン血症、骨の悪性線維性組織球腫／骨肉腫、髄芽腫、黒色腫、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮頸部がん、口腔がん、多発性内分泌腺腫症候群、骨髄異形成症候群、骨髄性白血病、鼻腔および副鼻腔がん、鼻咽頭のがん腫、神経芽腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺がん、経口がん、中咽頭がん、骨肉腫／骨の悪性線維性組織球腫、卵巣がん、卵巣上皮がん、卵巣胚細胞腫瘍、膵臓がん、膵臓がん膵島細胞、副鼻腔および鼻腔がん、副甲状腺がん、陰茎がん、咽頭がん、褐色細胞腫、松果体星状細胞腫、松果体胚細胞腫、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、形質細胞新生物、原発性中枢神経系リンパ腫、前立腺がん、直腸がん、腎細胞がん、腎盂および尿管移行細胞がん、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、唾液腺がん、肉腫、皮膚がん、メルケル細胞皮膚がん、小腸がん、軟部組織肉腫、扁平上皮がん、胃がん、Ｔ細胞リンパ腫、咽喉がん、胸腺腫、胸腺がん、甲状腺がん、絨毛性腫瘍（妊娠性）、原発不明がん、尿道がん、子宮の肉腫、膣がん、外陰がん、ヴァルデンストレームマクログロブリン血症、およびウィルムス腫瘍が挙げられる。
【０１０４】
一態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、感染性疾患が治療されてもよい。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、感染性疾患が治療されてもよく、感染性疾患はウイルスによって引き起こされてもよい。なおも別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、自己免疫疾患などの免疫疾患が治療されてもよい。
【０１０５】
本開示のγδＴ細胞による治療は、病状の臨床的発症前、発症中、および発症後に、対象に提供されてもよい。治療は、臨床的発症の１日後、１週間後、６ヶ月後、１２ヶ月後、または２年後に、対象に提供されてもよい。治療は、疾患の臨床的発症後、１日間、１週間、１ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、２年間、３年間、４年間、５年間、６年間、７年間、８年間、９年間、１０年間以上を超えて、対象に提供されてもよい。治療は、疾患の臨床的発症後、１日間、１週間、１ヶ月間、６ヶ月間、１２ヶ月間、または２年間未満にわたり対象に提供されてもよい。治療は、臨床試験においてヒトを治療することもまた含んでもよい。こ治療は、本開示の操作されたγδＴ細胞を含んでなる医薬組成物を対象に投与することを含み得る。
【０１０６】
別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、対象の体内の内因性リンパ球の活性を調節してもよい。別の態様では、操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、内因性Ｔ細胞に抗原を提供してもよく、免疫応答を高めてもよい。別の態様では、記憶Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞であってもよい。別の態様では、記憶Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、別の免疫細胞の細胞毒性を活性化してもよい。別の態様では、別の免疫細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞であってもよい。別の態様では、別の免疫細胞は、ナチュラルキラーＴ細胞であってもよい。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の対象への投与は、調節Ｔ細胞を抑制してもよい。別の態様では、調節性Ｔ細胞は、ＦＯＸ３＋Ｔｒｅｇ細胞であってもよい。別の態様では、調節性Ｔ細胞は、ＦＯＸ３−Ｔｒｅｇ細胞であってもよい。本開示の操作されたγδＴ細胞によってその活性が調節され得る細胞の非限定的例としては、造血幹細胞；Ｂ細胞；ＣＤ４；ＣＤ８；赤血球；白色血液細胞；樹状抗原提示細胞をはじめとする樹状細胞；白血球；マクロファージ；記憶Ｂ細胞；記憶Ｔ細胞；単球；ナチュラルキラー細胞；好中球顆粒球；Ｔヘルパー細胞；およびＴキラー細胞が挙げられてもよい。
【０１０７】
ほとんどの骨髄移植中に、シクロホスファミドと全身照射の組み合わせが慣習的に用いられて、対象の免疫系による移植中の造血幹細胞（ＨＳＣ）の拒絶が予防されてもよい。一態様では、ドナー骨髄とインターロイキン−２（ＩＬ−２）との生体外インキュベーションが実施されて、ドナー骨髄中のキラーリンパ球の作製が増強されてもよい。インターロイキン−２（ＩＬ−２）は、野生型リンパ球の成長、増殖、分化に必要であってもよいサイトカインである。γδＴ細胞のヒトへの養子免疫伝達に関する現在の研究では、γδＴ細胞とインターロイキン−２との同時投与が必要であってもよい。しかし、低用量および高用量のＩＬ−２は、どちらも高度に毒性の副作用を有し得る。ＩＬ−２毒性は、複数の臓器／システム、最も顕著には心臓、肺、腎臓、および中枢神経系で顕在化し得る。別の態様では、本開示は、ナイーブサイトカイン、またはＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−１２、ＩＬ−２１などのその改変バージョンの同時投与なしに、操作されたγδＴ細胞を対象に投与する方法を提供する。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、ＩＬ−２との同時投与なしに、対象に投与され得る。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、ＩＬ−２との同時投与なしに、骨髄移植などの処置中に対象に投与されてもよい。
【０１０８】
投与方法
１つまたは複数の操作されたγδＴ細胞集団は、任意の順序でまたは同時に、対象に投与されてもよい。同時である場合、複数の操作されたγδＴ細胞は、静脈内注射などの単一の一体化形態で、または、例えば、複数の静脈内輸液、皮下注射、注射または丸薬として、複数の形態で提供され得る。操作されたγδＴ細胞は、単一のパッケージで、または複数のパッケージで、一緒にまたは別々に包装され得る。操作されたγδＴ細胞の１つまたは全ては、複数回用量で投与され得る。同時ではない場合、複数回用量のタイミングは、約１週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、または約１年間程度変動してもよい。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、対象への投与後に、対象の体内で、生体内増殖させ得る。操作されたγδＴ細胞は凍結されて、同一の細胞調製物での複数の治療のための細胞が提供され得る。本開示の操作されたγδＴ細胞、および該細胞を含んでなる医薬組成物は、キットとして包装され得る。キットは、操作されたγδＴ細胞、および該細胞を含んでなる医薬組成物の使用に関する指示（例えば、書面による指示）を含んでもよい。
【０１０９】
別の態様では、がんを治療する方法は、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞を被験者に投与することを含んでなり、投与はがんを治療する。別の実施形態では、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも約１０秒間、３０秒間、１分間、１０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、１週間、２週間、３週間、１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、または１年間にわたり投与されてもよい。別の態様では、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも１週間にわたり投与されてもよい。別の態様では、治療的に有効な量の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも２週間にわたり投与されてもよい。
【０１１０】
本明細書に記載の操作されたγδＴ細胞は、疾患または病状の発生前、発生中、または発生後に投与され得て、操作されたγδＴ細胞を含有する医薬組成物を投与するタイミングは変動し得る。例えば、操作されたγδＴ細胞は予防的に使用され得て、疾患または病状の発生の可能性を軽減するために、病状または疾患の傾向を有する対象に連続的に投与され得る。操作されたγδＴ細胞は、症状の発生中にまたは発生後にできる限り速やかに、対象に投与され得る。操作されたγδＴ細胞の投与は、症状の発生後即座に、症状の発生から最初の３時間以内に、症状の発生から最初の６時間以内に、症状の発生から最初の２４時間以内に、症状の発生から４８時間以内に、または症状の発生から任意の期間内に開始され得る。最初の投与は、本明細書に記載の任意の製剤を使用して、本明細書に記載の任意の経路などの実用的な任意の経路を介し得る。別の態様では、本開示の操作されたγδＴ細胞の投与は、静脈内投与であってもよい。１つまたは複数用量の操作されたγδＴ細胞は、がん、感染性疾患、免疫疾患、敗血症の発症後、可能な限り直ぐに、または骨髄移植と共に、例えば、約２４時間〜約４８時間、約４８時間〜約１週間、約１週間〜約２週間、約２週間〜約１ヶ月間、約１ヶ月間〜約３ヶ月間などの免疫疾患の治療に必要な期間にわたり投与され得る。がんの治療のために、操作されたγδＴ細胞の１つまたは複数用量は、がんの発症から数年後に、その他の治療の前または後に、投与され得る。別の態様では、操作されたγδＴ細胞は、少なくとも約１０分間、３０分間、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、１２時間、２４時間、少なくとも４８時間、少なくとも７２時間、少なくとも９６時間、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも４週間、少なくとも１ヶ月間、少なくとも２ヶ月間、少なくとも３ヶ月間、少なくとも４ヶ月間、少なくとも５ヶ月間、少なくとも６ヶ月間、少なくとも７ヶ月間、少なくとも８ヶ月間、少なくとも９ヶ月間、少なくとも１０ヶ月間、少なくとも１１ヶ月間、少なくとも１２ヶ月間、少なくとも１年間、少なくとも２年間、少なくとも３年間、少なくとも４年間、または少なくとも５年間にわたり投与され得る。治療期間は、対象によって変動し得る。
【０１１１】
保存
一態様では、γδＴ細胞は凍結媒体中で調合され、少なくとも約１ヶ月間、２ヶ月間、３ヶ月間、４ヶ月間、５ヶ月間、６ヶ月間、１年間、２年間、３年間、または少なくとも５年間にわたる長期保存のために、液体窒素冷凍庫（−１９６℃）または極低温冷凍庫（−６５℃、−８０℃、−１２０℃、または−１５０℃）などの極低温保存ユニットに入れられてもよい。凍結媒体は、ｐＨを約６．０&#12316;約６．５、約６．５&#12316;約７．０、約７．０&#12316;約７．５、約７．５&#12316;約８．０、または約６．５&#12316;約７．５の間に維持するための生理学的ｐＨ緩衝剤を有する、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、および／または塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）、および／またはデキストロース、および／または硫酸デキストランおよび／またはヒドロキシエチルデンプン（ＨＥＳ）を含有し得る。凍結保存γδＴ細胞は解凍され、本明細書に記載されるような、抗体、タンパク質、ペプチド、および／またはサイトカインでの刺激によって、さらに処理され得る。凍結保存されたγδＴ細胞は解凍され、本明細書に記載されるような、ウイルスベクター（レトロウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＡＶ）、およびレンチウイルスベクターをはじめとする）または非ウイルス手段（ＲＮＡ、例えばトランスポゾンなどのＤＮＡ、およびタンパク質をはじめとする）で、遺伝子改変され得る。改変されたγδＴ細胞はさらに凍結保存され、凍結媒体１ｍＬ当たり少なくとも約１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、または少なくとも約１０１０個の細胞で、少なくとも約１、５、１００、１００、１５０、２００、５００本のバイアルの細胞バンクが作製され得る。凍結保存細胞バンクは、それらの機能を保持していてもよく、解凍されさらに刺激されて増殖され得る。別の態様では、解凍された細胞は、細胞培養バッグおよび／またはバイオリアクターなどの適切な閉鎖容器内で刺激および増殖され、同種異系細胞産物として一定量の細胞が作製され得る。凍結保存γδＴ細胞は、極低温保存条件下において、少なくとも約６ヶ月間、７ヶ月間、８ヶ月間、９ヶ月間、１０ヶ月間、１１ヶ月間、１２ヶ月間、１３ヶ月間、１５ヶ月間、１８ヶ月間、２０ヶ月間、２４ヶ月間、３０ヶ月間、３６ヶ月間、４０ヶ月間、５０ヶ月間、または少なくとも約６０ヶ月間にわたり、それらの生物学的機能を保持し得る。別の態様では、製剤中に保存料を使用することはできない。凍結保存γδＴ細胞は解凍され、同種異系の既製細胞製品として複数の患者に輸液され得る。
【０１１２】
一態様では、本明細書に記載の操作されたγδＴ細胞は、少なくとも１×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０３細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０４細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０５細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０６細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０７細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも２×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも３×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも４×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも５×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも６×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも７×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも８×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも９×１０８細胞／ｍｌ、少なくとも１×１０９細胞／ｍｌ、以上の、約１×１０３細胞／ｍｌ〜約少なくとも１×１０８細胞／ｍｌ、約１×１０５細胞／ｍｌ〜約少なくとも１×１０８細胞／ｍｌ、または約１×１０６細胞／ｍｌ〜約少なくとも１×１０８細胞／ｍｌの量で組成物中に存在してもよい。
【０１１３】
例えば、キメラＣＤ８α−ＣＤ４ｔｍ／細胞内タンパク質（図１２Ａおよび１２Ｂ）などの腫瘍抗原特異的ＴＣＲを発現するように操作され得る、生存可能な同種異系Ｔ細胞産物を開発するために、本開示の実施形態は、最終的な同種異系産物中の残留αβＴ細胞の存在を最小化しながら、γδＴ細胞の収量を最大化し得る方法を含んでもよい。例えば、本開示の実施形態は、αβＴ細胞を枯渇させることによってγδＴ細胞を増殖および活性化させ、アンホテリシンＢ、Ｎ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）（または高用量グルタミン／グルタマックス）、ＩＬ−２、および／またはＩＬ−１５などの分子で成長培養を補足する方法を含んでもよい。
【０１１４】
一態様では、本明細書に記載の方法を使用して、本開示の態様による自己由来または同種異系産物が生成されてもよい。
【０１１５】
本発明は、特許請求の範囲を限定することは意図されない、以下の実施例を参照してより良く理解されてもよい。
【実施例】
【０１１６】
実施例１
白血球アフェレーシス産物を処理する
例えば、ＬｅｕｋｏＰａｋ（登録商標）などの白血球アフェレーシス産物は、次のように処理してもよい：ＬｅｕｋｏＰａｋ（登録商標）バッグの一端をアルコール綿棒で拭き、かみそりの刃で切ってフラスコ内に排出してもよい。ハンクス溶液で容積をおよそ５００ｍｌの間に希釈し、チューブ当たり３０ｍｌで、容量５０ｍｌのチューブ１６〜２９本に分注してもよい。チューブは、ブレーキなし、加速なしで、４００ｇで３０分間遠心沈殿させてもよい。白色の液体を吸引してもよく、新しい５０ｍｌのチューブを半分充填して、２５ｍｌのＰＢＳで満たしてもよい。合計３回の洗浄のために、この手順をさらに２回繰り返してもよい。最後の洗浄前に、血球計を使用して細胞を数えてもよい。収量は、１×１０８細胞／チューブの３０〜６０本のチューブであってもよい。
【０１１７】
実施例２
αβＴ細胞を枯渇させる
図１Ａは、ＰＢＭＣからのαβＴ細胞の枯渇を示すｆ。フィコール処理後のＰＢＭＣをビオチン共役αβＴＣＲ抗体と共にインキュベートし、製造業者のプロトコルに従ったストレプトアビジンマイクロビーズとのインキュベートがそれに続いた。次にサンプルをＬＳカラムに通過させ、αβＴＣＲ発現細胞を富化させた。カラム通過物は、αβＴＣＲ枯渇画分に相当する。一晩の培養後、αβＴＣＲ富化画分およびαβＴＣＲ枯渇画分を蛍光色素共役αβＴＣＲ抗体対Ｖγ９抗体で染色し、フローサイトメトリー分析がそれに続いた。データは、Ｖγ９δ２細胞がαβＴＣＲ富化された画分中にほぼ皆無である（０％）一方で、ほぼ全てのＶγ９δ２細胞がαβＴＣＲ枯渇画分中に富化されている（４５％）ことを示す。
【０１１８】
同様に、白血球アフェレーシス産物からの細胞をビオチン共役αβＴＣＲ抗体と共にインキュベートしてもよく、製造業者のプロトコルに従ったストレプトアビジンマイクロビーズがそれに続く。次にサンプルをＬＳカラムに通過させ、αβＴＣＲ発現細胞を富化させた。カラム通過物は、αβＴＣＲ枯渇画分に相当する。一晩の培養後、αβＴＣＲ枯渇画分を蛍光色素共役αβＴＣＲ抗体対γδＴＣＲ抗体で染色し、フローサイトメトリー分析がそれに続いた。図１Ｅは、白血球アフェレーシス産物の出発細胞が最小限の（４．１４％）Ｖγ９δ２細胞を含む一方で、ほぼ全てのＶγ９δ２細胞がαβＴＣＲ枯渇画分中で富化されている（９５．５％）ことを示す。一態様では、前述の方法を使用して、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約５５％、約６０％、約６５％、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％を超えて、Ｖγ９δ２細胞を富化させてもよい。
【０１１９】
図１Ｂおよび１Ｃは、Ｖγ９δ２Ｔ細胞産物中の最小限の残留αβＴ細胞を示す。ビオチン化抗αβＴＣＲ抗体／ストレプトアビジンマイクロビーズを使用して、正常なドナー（ドナーＡ、ドナーＢ、ドナーＣ、ドナー１２、およびドナー１３）のＰＢＭＣからαβＴ細胞を枯渇させた。αβＴ細胞枯渇ＰＢＭＣをゾレドロネート／ＩＬ−２／ＩＬ−１５と共に１４日間培養し、例えば、抗αβＴＣＲ抗体および抗γδＴＣＲ抗体などのそれぞれの蛍光色素共役抗体による細胞表面染色がそれに続き、ＣＤ３上のサブゲーティングによって、残留αβＴ細胞および富化γδＴ細胞を評価した。これらの結果は、αβＴ細胞枯渇γδＴ細胞が富化され、すなわち、９０．１％（ドナーＡ）、７８．６％（ドナーＢ）、２８．９％（ドナーＣ）、８９％（ドナー１２）、７４％（ドナー１３）となったことを示す。さらに、αβＴ細胞枯渇γδＴ細胞は、最小限の残留αβＴ細胞、すなわち、０．０２％（ドナーＡ）、０．０５％（ドナーＢ）、０．２％（ドナーＣ）、０．４％（ドナー１２）、および１％（ドナー１３）を含有する。例えば、ハプロタイプ一致造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）において、０．２〜０．６％の範囲の残留αβＴ細胞は慢性移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）をもたらさず、したがって、これらのαβＴ細胞枯渇γδＴ細胞は安全な同種異系製品になることから、最小限の残留αβＴ細胞が重要である。
【０１２０】
図１Ｄは、Ｖγ９δ２細胞のサイトカインプロファイリングを示す。αβゾレドロネート／ＩＬ−２／ＩＬ−１５と共に培養されたαβＴ細胞枯渇ＰＢＭＣは、細胞収穫の６時間前にゴルジストップ／プラグ（すなわち、タンパク質輸送阻害剤）で処理した。細胞を表面Ｖδ２について染色し、固定化および透過処理がそれに続いた。ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７ａ、およびＩＦＮ−γに対する蛍光色素共役抗体を使用して、細胞内ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７ａ、およびＩＦＮ−γの染色を実施した。これらの結果は、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１７ａ、およびＩＦＮ−γが、Ｖγ９δ２細胞の１２％、０．２％、４％でそれぞれ発現したことを示す。ＩＬ−１５が媒介するＩＬ−１７コミットメントの阻害は、例えば、０．２％などの少量のＩＬ−１７産生Ｖγ９δ２によって示される。
【０１２１】
実施例３
αβＴ細胞枯渇ＰＢＭＣの活性化および増殖
アネルギーへのコミットメントなしの最大のＴ細胞活性化、増殖、および生存には、ＴＣＲを介して誘発されるシグナル１、共刺激分子を介して誘発されるシグナル２、および成長因子シグナル伝達を介して誘発されるシグナル３の３つのシグナルが必要であってもよい。
【０１２２】
図２および図３は、本開示の一実施形態による活性化ステップおよび増殖ステップをそれぞれ示す。活性化ステップおよび増殖ステップは、２つの連続的なステップであってもよい。例えば、活性化ステップ（図２）中に、例えばゾレドロネート（ＺＡ）などのアミノビスホスホネート、または例えばＩＰＰなどのホスホ抗原、および例えばＩＬ−２および／またはＩＬ−１５などのサイトカインが存在してもよい。一方で、増殖ステップ（図３）中に、アミノビスホスホネートまたは例えばＩＰＰなどのホスホ抗原なしで、サイトカインが存在し続けてもよい。活性化ステップ（図２）は、アミノビスホスホネートまたは例えばＩＰＰなどのホスホ抗原が添加され洗い流されていない、最初の１４日間中に起こってもよい。１４日目の終わりに、アミノビスホスホネートまたは例えばＩＰＰなどのホスホ抗原を含有する全ての培地を除去し、アミノビスホスホネートまたは例えばＩＰＰなどのホスホ抗原の非存在下において、サイトカインを有する培地で交換することによって、活性化細胞を採取してもよいことから、増殖ステップ（図３）は１５日目以降であってもよい。対照的に、Ｖγ９δ２ゾレドロネート媒介性産生のための従来法のプロトコルでは、このような条件下で細胞を１４日目を超えて生存させられなかったことから、活性化／増殖として１〜１４日目を指すことが多い。本開示では、例えばゾレドロネートなどのアミノビスホスホネート、または例えばＩＰＰなどのホスホ抗原が存在することから、１&#12316;１４日目は活性化ステップと称され、従来の１４日間のプロセスを超えて細胞を生存させ増殖させられることから、１５日目以降は増殖ステップと称される。
【０１２３】
図２は、パミドロン酸、アレンドロン酸、ゾレドロン酸、リセドロン酸、イバンドロン酸、インカドロン酸、その塩および／またはその水和物をはじめとする、アミノビスホスホネート；または例えば、（Ｅ）−４−ヒドロキシ−３−メチル−ブト−２−エニルピロリン酸（ＨＭＢＰＰ）、イソプレノイドピロリン酸（ピロリン酸ファルネシル（ＦＰＰ）、ゲラニルゲラニルピロリン酸（ＧＧＰＰ）、イソペンテニルピロリン酸（ＩＰＰ）、およびジメチルアリル二リン酸（ＤＭＡＰＰ）などのホスホ抗原によって誘発されるγδＴＣＲ／ＩＰＰ相互作用を介して誘発され、増殖のためにＶγ９δ２Ｔ細胞を活性化してもよい、シグナル１を示す。例えば、ゾレドロネート（ゾレドロン酸（ＺＡ）またはゾメタ）は、単球（Ｍｏ）中でメバロン酸経路を阻害してＩＰＰなどのホスホ抗原の蓄積をもたらし、単球（ＺＡ−Ｍｏ）上に提示されてγ９δ２ＴＣＲ／ＣＤ３を活性化し、ＰＫＣシグナル伝達を介して増殖を誘導し、それによってシグナル１として機能する。ＩＰＰ自体もまた、γ９δ２ＴＣＲに結合することによって、γδＴ細胞に直接作用し得て、それによって単球の必要がなくなる。
【０１２４】
図２はまた、アンホテリシンＢ（ＦＤＡ承認されたアムビゾーム）、すなわち、ＴＬＲ２リガンドなどの共刺激分子を介して誘発されたシグナル２も示す。例えば、アンホテリシンＢは、２つの潜在的な機序を介してγδＴ細胞を刺激し得る。最初に、シグナル２として機能するアンホテリシンＢは、共刺激分子としてγδＴ細胞に作用し、γδＴ細胞の活性化、増殖、およびＩＦＮ−γ産生を共刺激し、αβＴ細胞に対するＶδ２Ｔ細胞の免疫抑制活性を低減し得る。アンホテリシンＢはまた、ＩＬ−２の高親和性受容体（ＩＬ−２Ｒα）であるＣＤ２５のエンハンサーとしても作用し得て、それによってＩＬ−２に対する応答性を高め、シグナル３を介した増殖を刺激する。次に、シグナル３として機能するアンホテリシンＢは、単球（ＺＡ−Ｍｏ）に作用して、ＣＤ２５発現を増強し中央記憶Ｔ細胞を支持し得る、ＩＬ−１８の分泌を促進し、エフェクターＶγ９δ２Ｔ細胞の産生を増強してＩＬ−１７コミットされた細胞をブロックし得る、ＩＬ−１５の分泌を促進し得る。アンホテリシンＢの適切な代替品としては、茶由来のＬ−テアニン、リンゴ由来のタンニン、クランベリーおよびシイタケ由来のポリフェノールなどの天然抽出物が挙げられてもよい。
【０１２５】
Ｖγ９δ２培養にＣＤ８６および４１ＢＢＬなどの共刺激分子を添加すると、それらの増殖が促進された。本開示の実施形態は、骨髄性細胞が優勢な細胞集団であってもよい、αβＴ細胞枯渇ＰＢＭＣまたはαβＴ細胞枯渇白血球アフェレーシス産物の使用を含んでもよい。骨髄性細胞は、メバロン酸経路を阻害するゾレドロネートを取り込んで、分泌型として発現されまたは骨髄性細胞上の膜結合型として提供されてもよい、ＩＰＰ蓄積をもたらす。骨髄性細胞はまた、優れた抗原提示細胞でもあり、分化の異なる段階で様々な共刺激分子を発現する。
【０１２６】
さらに、γδＴ細胞自体もまた、様々な共刺激分子を発現してもよい。このように、ゾレドロネート処理中に、αβ枯渇ＰＢＭＣまたはαβＴ細胞枯渇白血球アフェレーシス産物を高細胞密度で培養して、骨髄性細胞上に存在する共刺激分子の結合、ならびにγδＴ細胞の増殖を促進させてもよく、その結果、Ｖγ９δ２Ｔ細胞の活性化、増殖、および生存が増強される。例えば、外因性ＩＬ−２（１０&#12316;１０００Ｕ／ｍｌ、好ましくは２０&#12316;５００Ｕ／ｍｌ、より好ましくは５０&#12316;１００Ｕ／ｍｌ）をαβ枯渇ＰＢＭＣまたはαβＴ細胞枯渇白血球アフェレーシス産物に添加してもよく、その中でＣＤ４ヘルパーＴ細胞（ＩＬ−２を分泌する）は、αβＴ細胞枯渇細胞の間において、活性化および増殖中の生存および増殖を維持する。外因性ＩＬ−１５（１０〜１０００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２０〜５００ｎｇ／ｍｌ；より好ましくは５０〜１００ｎｇ／ｍｌ）を高細胞密度培養で使用して、図１Ｄ（中央パネル）に示されるようにＩＬ−１７産生Ｖγ９δ２Ｔ細胞の発達を阻害して、γδＴ細胞増殖を増強させ、ナイーブＶγ９δ２Ｔ細胞のエフェクター細胞への分化を促進させることによって、Ｖγ９δ２活性化を最大化させてもよい。したがって高密度培養は、γδＴ細胞上でＣＤ２８、ＣＤ８６、ＣＤ８３、ＣＤ８０を発現する、γδ−γδＴ細胞間の相互共刺激作用を利用する。例えば、ＣＤ８６および／またはＣＤ８０と相互作用するＣＤ２８共刺激分子は、γδＴ細胞の生存および増殖を増強し得る。
【０１２７】
Ｔ細胞の表現型および細胞死に対する細胞密度の影響を判定するために、ゾレドロネート、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５の存在下における１４日間にわたる活性化後に、Ｖγ９δ２Ｔ細胞をゾレドロネートの非存在下で、高密度（例えば、２×１０６細胞／ｍｌ）および低密度（例えば、０．５×１０６細胞／ｍｌ）で、例えば、ＩＬ−２およびＩＬ−１５などの恒常的サイトカインによって増殖させ、Ｔ細胞マーカー分析がそれに続いた。図４Ａは、高密度および低密度で培養されたＶγ９δ２Ｔ細胞におけるマーカー発現間に有意差がなかったことから、Ｖγ９δ２Ｔ細胞において、例えば、ＣＤ１２２、ＣＤ８０、ＣＤ８３、ＣＤ８６、ＣＤ９５、およびＣＤ９５Ｌなどの免疫表現型マーカーが、細胞密度による影響を受けなかったことを示す。しかし図４Ｂは、低密度での増殖（５１％）と比較した、高密度での増殖中の細胞死（２０％）の有意な減少を示す。これらの結果は、例えば、少なくとも１×１０６細胞／ｍｌなどの高密度のＶγ９δ２Ｔ細胞が、細胞死を減少させることによって細胞生存を促進してもよいことを示唆する。
【０１２８】
図５は、アンホテリシンＢの包含が、ＣＤ２５（またはＩＬ−２Ｒα）を発現するＶδ２（すなわち、Ｖγ９δ２）Ｔ細胞の％を増加させることを示す。簡潔に述べると、０日目にゾレドロネート、ＩＬ−２、ＩＬ−１５を補給した活性化培地中で、αβ枯渇ＰＢＭＣを培養した。４８時間後に、アンホテリシンＢを添加し、４８時間後に、ＣＤ３＋／Ｖδ２Ｔ細胞上におけるＣＤ２５（またはＩＬ−２Ｒα）表面発現のフローサイトメトリーベースの分析のために、細胞を収穫した。これらの結果は、ゾレドロネート、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５の処理が、未処理のαβ枯渇ＰＢＭＣ（０．５５％）と比較して、ＣＤ２５発現Ｖδ２Ｔ細胞の％を１６％に増加させることを示す。しかし、ゾレドロネート、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５へのアンホテリシンＢの添加は、Ｖδ２Ｔ細胞の％を１６％（アンホテリシンＢなし）から２９％（アンホテリシンＢあり）に増加させる。これらの結果は、アンホテリシンＢが、シグナル２および３を介して、ゾレドロネート、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５によって増殖および活性化されたＶδ２Ｔ細胞をさらに増殖させ得ることを示す。
【０１２９】
図６は、ＩＬ−２、ＩＬ−１５、およびアンホテリシンＢを含有する規定培地中のゾレドロネート（ゾメタ）を使用した、γδＴ細胞の増殖を示す。γδＴ細胞絶対数の増加倍数は、ドナー２０について、０日目〜１７日目、０日目〜２２日目、および０日目〜２９日目で、それぞれ３，３５０倍、１１，０６０倍、および３１，６６６倍である。同様に、γδＴ細胞絶対数の増加倍数は、ドナー２１について、０日目〜１７日目、０日目〜２２日目、および０日目〜２９日目で、それぞれ４，６３３倍、１２，３２０倍、および３２，８３３倍である。対照的に、上述したように、古典的なＶγ９δ２Ｔ細胞増殖プロトコルは、最良でも１４日間以内に総Ｖγ９δ２Ｔ細胞に１００倍のみの増殖をもたらし、その後、増殖率は低下し、これは細胞死の増加に起因してもよい。一態様では、前述の方法を用いて、増殖後の２９日目における０日目と比較したγδＴ細胞絶対数の増加倍数は、約１０００倍〜約４０，０００倍、約３０００倍〜約３５，０００倍、約５０００倍〜約３５，０００倍、約６０００倍〜約３５，０００倍、約７０００倍〜約３５，０００倍、約８０００倍ｔｏ３０，０００倍、約１０，０００倍〜約３５，０００倍、約１５，０００倍〜約３５，０００倍、約２０，０００倍〜約３５，０００倍、約２５，０００倍〜約３５，０００倍、約３０，０００倍〜約３５，０００倍、約１０，０００倍を超え、約１５，０００倍を超え、約２０，０００倍を超え、約２５，０００倍を超え、約３０，０００倍を超え、約４０，０００倍を超え、または約４０，０００倍を超えてもよい。
【０１３０】
好中球（血液中の最も豊富な白血球）は、γδＴ細胞の成長および生存を抑制し得る。したがって、好中球の除去または不活化は、γδＴ細胞の成長および生存を促進してもよい。これを達成するために、プロテイナーゼ３、エラスターゼ、およびカテプシンＧなどの好中球プロテアーゼを使用して、（１）好中球増殖、（２）サイトカイン産生、および（３）ＩＬ−２のタンパク質分解性切断およびブチロフィリン３Ａ１（ＣＤ２７７）の調節を介したγδＴ細胞の細胞毒性を阻害してもよい。さらに、多菌性敗血症マウスで観察されたように、グルタミンおよび／またはＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ）の投与は、好中球の数を低減し、γδＴ細胞の百分率を増加させる。さらに、ＬＰＳ誘発急性肺損傷ラットで観察されたように、グルタミン補給は、ある程度は、抗酸化物質グルタチオン（ＧＳＨ）の合成を促進してフリーラジカルの有害な影響、すなわちテロメアの侵食を減少させることによって、γδＴ細胞のアポトーシス率を低下させる。図２および図３に示されるようなこれらの観察結果に基づいて、本開示の実施形態は、高用量のグルタミン／グルタマックス（または例えば、１〜１０ｍＭ、好ましくは２．５〜７ｍＭの低用量のＮ−アセチルシステイン（ＮＡＣ））で培養を補足し、フリーラジカル媒介性損傷に抵抗し、γδＴ細胞複製可能性を維持し、それによって培養増殖を最大化することもまた含んでもよい。ＮＡＣまたは高用量のグルタミン／グルタマックスは、高いＧＳＨ細胞内レベルを維持し、培養中の単球および好中球からの高いフリーラジカル（活性酸素種（ＲＯＳ））産生を相殺し得る。さらに、図２に示されるように、イブプロフェン（シクロオキシゲナーゼ−２（ＣＯＸ−２）阻害剤）は、単球（ＺＡ−Ｍｏ）におけるＣＯＸ−２のアンホテリシンＢ媒介性活性化を抑制し、それによって単球との共培養中のプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）の蓄積を制限し得る。バルデコキシブ、ロフェコキシブ、セレコキシブなどのその他のＣＯＸ−２阻害剤もまた、使用してもよい。
【０１３１】
実施例４
ＲＤ１１４ＴＲ偽型化レトロウイルスベクターによるＶγ９δ２Ｔ細胞のＴＣＲ操作
図７は、Ｖγ９δ２Ｔ細胞へのウイルス形質導入の予定表を示す。新鮮な白血球からαβＴ細胞を枯渇させ、ＩＬ−２およびＩＬ−１５の存在下において、ゾレドロネートで最低１日間または最大７日間活性化させる。γδＴ細胞は、αβＴＣＲおよび／またはＣＤ８を発現するウイルス上清を使用して、活性化後２４&#12316;１６８時間の間に形質導入し得る。
【０１３２】
本開示の方法によって調製されたＶγ９δ２Ｔ細胞が、異なるエンベロープタンパク質を発現するウイルスによるウイルス形質移入に適するかどうかを判定するために、Ｖγ９δ２Ｔ細胞への形質導入効率について、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）発現γレトロウイルス（例えば、テナガザル白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）偽型（配列番号４）およびＲＤ１１４ＴＲ偽型（配列番号１））、およびＧＦＰ発現レンチウイルス（例えば、ＶＳＶ−Ｇ偽型（例えば、配列番号３））を試験した。さらに、Ｖγ９δ２Ｔ細胞への形質導入効率について、ＶＳＶ−ＧおよびＲＤ１１４ＴＲで偽型化されたＣＤ８α発現レンチウイルス（ＬＶ）を試験した。
【０１３３】
図８Ａは、形質導入後５日目のＧＦＰ発現が、ＧＡＬＶ偽型では１２％、ＲＤ１１４ＴＲ偽型では３４％、ＶＳＶ−Ｇ偽型では４６％であることを示す。しかし、形質導入後１０日目に、ＲＤ１１４ＴＲ偽型がＧＦＰ発現を４０％に維持したのに対して、ＧＡＬＶ偽型およびＶＳＶ−Ｇ偽型では、それぞれ７％および３．６％に低下した。これらの結果は、ＲＤ１１４ＴＲ偽型化γレトロウイルスが、ゾレドロネート、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５で増殖されたＶγ９δ２Ｔ細胞における安定した遺伝子発現のための、最適な遺伝子送達法であってもよいことを示唆する。
【０１３４】
図８Ｂは、ＲＤ１１４ＴＲで偽型化されたＬＶでＶγ９δ２Ｔ細胞を形質導入した場合、形質導入後４日目に、Ｖγ９δ２Ｔ細胞上のＣＤ８α発現が、６３．２％（２．１８μｌのＬＶを使用）〜９５．８％（３５μｌのＬＶを使用）の範囲であったことを示す。他方、ＶＳＶ−Ｇで偽型化されたＬＶでＶγ９δ２Ｔ細胞を形質導入した場合、Ｖγ９δ２Ｔ細胞上のＣＤ８α発現は、１７．９％（２．１８μｌのＬＶを使用）〜３１．２％（３５μｌのＬＶを使用）の範囲であった。ＶＳＶ−Ｇが最も頻繁に使用されるエンベロープであり、ＲＤ１１４ＴＲは一般に偽型化γレトロウイルスに使用されるが、これらの結果は、ＲＤ１１４ＴＲ偽型化レンチウイルスをＶγ９δ２Ｔ細胞の形質導入に使用し得るだけでなく、ＶＳＶ−Ｇ偽型化レンチウイルスよりも高いＶγ９δ２Ｔ細胞への形質導入効率を呈することを示す。
【０１３５】
実施例５
αβ−ＴＣＲおよびＣＤ８αβを発現するγδＴ細胞を操作する
本開示の操作されたγδＴ細胞を使用して、病状の治療を必要とする対象を治療してもよい。ＴＡＡ／ＭＨＣ複合体に特異的に結合するαβ−ＴＣＲを発現するγδＴ細胞を操作するために、αβ−ＴＣＲ−発現γレトロウイルス（αβ−ＴＣＲウイルス）を作製した。γδＴ細胞はＣＤ８を発現しないこともあるので、例えば、がんなどの標的細胞の細胞膜上のＴＡＡ／ＭＨＣ−Ｉ複合体認識するために、γδＴ細胞はαβ−ＴＣＲに加えてＣＤ８を必要とすることもある。これを受けて、ＣＤ８発現γレトロウイルス（ＣＤ８ウイルス）を作製した。
【０１３６】
操作されたγレトロウイルスによるＶγ９δ２Ｔ細胞の形質導入効率を判定するために、ＩＬ−２およびＩＬ−１５を補充した規定培地培地中において３のＭＯＩで、αβ−ＴＣＲウイルスおよび／またはＣＤ８ウイルスによって、ゾレドロネート活性化Ｖγ９δ２Ｔ細胞を形質導入した。形質導入効率は、形質導入後９６時間目に、ＴＡＡ／ＭＨＣ−ＰＥデキストラーマー（または陰性対照ＮＹＥＳＯ−ＰＥデキストラーマー）による染色と、それに続くＣＤ３、ＣＤ８α、およびＶδ２染色によって測定した。ＭａｃｓＱｕａｎｔ上での取得に、ＣＤ３集団の解析ゲーティングが続いた。
【０１３７】
形質導入は、形質導入エンハンサーの存在下で実施してもよく、負荷電細胞とビリオン間の静電反発を物理的に減少させることによって形質導入効率を増加させ、ひいては細胞とビリオンを間の相互作用を増加させる。この目的を達成するために、ＣＤ８αβをコード化するレトロウイルスによるγδＴ細胞形質導入中に、２つの形質導入エンハンサーを試験した。ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）（プレート上に被覆されたフィブロネクチン断片）およびＶｅｃｔｏＦｕｓｉｎ−１（登録商標）（可溶性カチオン性ペプチド）を試験した。図９Ａは、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（登録商標）がより高い形質導入効率（平均４９．７％）をもたらした一方で、ＶｅｃｔｏＦｕｓｉｎ−１（登録商標）もまた、２７．５％の平均形質導入効率でγδＴ細胞を形質導入できたことを示す。
【０１３８】
図９Ｂは、陰性対照ＮＹＥＳＯ−ＰＥデキストラーマー染色、すなわちαβ−ＴＣＲウイルス単独（１．６％）、およびαβ−ＴＣＲウイルスとＣＤ８ウイルスの双方（２％）による形質導入と比較して、ＴＡＡ／ＭＨＣ−ＰＥデキストラーマー染色によって同定された、Ｖγ９δ２Ｔ細胞の７１％がαβ−ＴＣＲウイルス単独で、Ｖγ９δ２Ｔ細胞の４９％がαβ−ＴＣＲウイルスとＣＤ８ウイルスの双方で、形質導入されたことを示す。これらの結果は、ＴＡＡ／ＭＨＣ複合体に特異的に結合するαβ−ＴＣＲが、αβ−ＴＣＲウイルスで形質導入されたＶγ９δ２Ｔ細胞の細胞表面上に容易に提示されたことを示す。さらに、模擬（ウイルスなし）（４％）およびαβ−ＴＣＲウイルス単独による形質導入（４．４％）と比較して、ＣＤ８ウイルス単独で形質導入されたＶγ９δ２Ｔ細胞の７．６％、およびαβ−ＴＣＲウイルスとＣＤ８ウイルスの双方で形質導入されたＶγ９δ２Ｔ細胞の６．８％が、ＣＤ８α染色によって同定された。これらのデータは、ゾレドロネート、ＩＬ−２、およびＩＬ−１５媒介性活性化および増殖によって調製されたＶγ９δ２Ｔ細を使用して、ウイルス形質導入によってＴＡＡ特異的ＴＣＲおよびＣＤ８が発現され得ることを示す。
【０１３９】
ウイルス形質導入後のＶγ９δ２Ｔ細胞の増殖倍数を判定するために、Ｖγ９δ２Ｔ細胞（ＧＤ）またはαβＴ細胞（ＡＢ）をαβ−ＴＣＲウイルス（ＴＣＲ）および／またはＣＤ８ウイルス（ＣＤ８）で形質導入し、形質導入後７日目〜２１日目の倍数増殖の測定がそれに続いた。図１０は、形質導入なしでは、Ｖγ９δ２Ｔ細胞（ＧＤ模擬）（１，０４０倍）が一般に、αβＴ細胞（ＡＢ模擬）（２８９倍）よりも高い倍数増殖を有することを示す。αβ−ＴＣＲ単独による形質導入後、Ｖγ９δ２Ｔ細胞（ＧＤ＋ＴＣＲ）は５１７倍を有し、これはαβＴ細胞（ＡＢ＋ＴＣＲ）の２１１倍よりも高い。ＣＤ８単独（ＧＤ＋ＣＤ８）またはＣＤ８＋αβ−ＴＣＲ（ＧＤ＋ＣＤ８＋ＴＣＲ）による形質導入後に、Ｖγ９δ２Ｔ細胞は、それぞれ、６２０倍および５４０倍の増殖を有する。これらの結果は、Ｖγ９δ２Ｔ細胞が、一般にαβＴ細胞よりも優れた細胞増殖能力、およびウイルス形質導入能力を有することを示す。
【０１４０】
Ｖγ９δ２Ｔ細胞をαγ−ＴＣＲレトロウイルスおよびＣＤ８αβレトロウイルスで形質導入することによって、その中でαβ−ＴＣＲがＴＡＡ／ＭＨＣ複合体に特異的に結合するαβ−ＴＣＲ発現Ｖγ９δ２Ｔ細胞を作製した。図１１Ａは、ウイルス形質導入なしのＶγ９δ２Ｔ細胞（模擬）と比較して、αβ−ＴＣＲレトロウイルスおよびＣＤ８αβレトロウイルスで形質導入されたＶγ９δ２Ｔ細胞（αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ８）の３４．９％が、ＴＡＡ／ＭＨＣ−デキストラーマー（ＴＡＡ／ＭＨＣ−ｄｅｘ）および抗ＣＤ８抗体（ＣＤ８）によって陽性に染色されたことを示し、細胞表面上にαβ−ＴＣＲとＣＤ８αβの双方を発現するＶγ９δ２Ｔ細胞（αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ８αβ操作Ｖｇ９ｄ２Ｔ細胞）の作製が示唆される。
【０１４１】
操作されたＶγ９δ２Ｔ細胞の細胞溶解活性を判定するために、例えば、細胞表面上に提示されるＴＡＡ／ＭＨＣ複合体を有するヒト悪性黒色腫細胞株であるＡ３７５細胞株などの標的細胞に、αβ−ＴＣＲＣＤ８αβで操作されたＶγ９δ２Ｔ細胞を曝露した。４つの機能アッセイ：（１）ＣＤ１０７ａ脱顆粒、（２）ＩＦＮ−γ放出、（３）６時間後のＡ３７５細胞のアポトーシス、および（４）長期共培養後のＡ３７５に対する操作されたγδＴ細胞の細胞毒性効果。
【０１４２】
ＣＤ１０７ａ脱顆粒アッセイの原理は、細胞毒性細胞の細胞質内にある事前形成された溶解性顆粒を利用する、顆粒依存性経路を介した標的細胞の殺滅に基づく。これらの顆粒を取り囲む脂質二重層は、ＣＤ１０７ａ（ＬＡＭＰ−１）をはじめとする、リソソーム関連膜糖タンパク質（ＬＡＭＰ）を含有する。Ｔ細胞受容体複合体を介して標的細胞が認識されるとすぐに、グランザイムおよびパーフォリンのようなアポトーシス誘導タンパク質が免疫シナプス内に放出され、これは脱顆粒と称されるプロセスである。それによって、膜貫通タンパク質ＣＤ１０７ａは細胞表面に曝露され、特異的なモノクローナル抗体によって染色し得る。図１１Ｂは、ウイルス形質導入なしのＶγ９δ２Ｔ細胞（模擬）と比較して、例えば、Ａ３７５細胞などの標的細胞と共にインキュベートされた、αβ−ＴＣＲレトロウイルスおよびＣＤ８αβレトロウイルス（αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＶγ９δ２Ｔ細胞の２３．１％が、抗ＣＤ１０７ａ抗体によって陽性に染色されたことを示し、αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ８αβで操作されたＶｇ９ｄ２Ｔ細胞は、Ａ３７５細胞に曝露されたときに、脱顆粒を行うことによって細胞溶解性になることが示唆される。
【０１４３】
ＩＦＮ−γ放出アッセイは、Ｔ細胞のＴＣＲが細胞表面上の抗原提示細胞のペプチド／ＭＨＣ複合体に特異的に結合したときに放出されるＩＦＮ−γのレベルを通じて、例えば、Ａ３７５細胞などの抗原提示細胞に対する細胞媒介応答を測定する。図１１Ｃは、ウイルス形質導入なしのＶγ９δ２Ｔ細胞（模擬）と比較して、αβ−ＴＣＲレトロウイルスおよびＣＤ８αβレトロウイルス（αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ８）で形質導入されたＶγ９δ２Ｔ細胞の１９．７％が、抗ＩＦＮ−γ抗体によって陽性に染色されたことを示し、αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ８αβで操作されたＶγ９δ２Ｔ細胞が、Ａ３７５細胞に曝露されたときにＩＦＮ−γを放出することによって細胞溶解性になることが示唆される。
【０１４４】
細胞溶解活性は、非ＣＤ３Ｔ細胞、すなわちＡ３７５細胞のアポトーシス上でゲーティングすることによって、Ａ３７５細胞への曝露後２４時間目に評価した。アポトーシスは、収穫した培養物を生／死の色素で染色することによって評価した。図１１Ｄは、ウイルス形質導入なしのＶγ９δ２Ｔ細胞（模擬）と比較して、αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ８αβで操作されたＶγ９δ２Ｔ細胞（αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ８αβ）は、Ａ３７５細胞の７０％でアポトーシスを誘導したことを示し、αβ−ＴＣＲ＋ＣＤ８αβで操作されたＶγ９δ２Ｔ細胞がＡ３７５細胞を殺滅することによって細胞溶解性になることが示唆される。
【０１４５】
８４時間の共培養アッセイ中に、細胞溶解活性をリアルタイムでも評価した。３：１のエフェクター対標的比で、標的陽性Ａ３７５−ＲＦＰ腫瘍細胞と、非形質導入およびαβＴＣＲ＋ＣＤ８αβ形質導入γδＴ細胞とを共培養した。標的陽性Ａ３７５−ＲＦＰ腫瘍細胞の溶解をＩｎｃｕＣｙｔｅ（登録商標）生細胞分析システム（Ｅｓｓｅｎ  ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅ）によって、リアルタイムで評価した。腫瘍細胞単独、および非形質導入およびαβＴＣＲ形質導入αβＴ細胞をそれぞれ陰性および陽性対照として使用した。図１１Ｅに示されるように、非形質導入γδＴ細胞が、γδＴ細胞の内因的抗腫瘍特性に起因する細胞毒性可能性を示した一方で、αβＴＣＲ＋ＣＤ８αβ形質導入γδＴ細胞は、αβＴＣＲ形質導入γδＴ細胞と比較して同様の細胞毒性可能性を示し、腫瘍細胞を標的化し殺傷するようにαβＴＣＲ＋ＣＤ８αβ形質導入γδＴ細胞を操作し得ることが示唆された。
【０１４６】
これらのデータは、本開示の方法によって生成された操作されたＶγ９δ２Ｔ細胞が機能的であり、ＴＡＡペプチドに特異的な様式で、例えば、がん細胞などの標的細胞を殺傷するために使用され得ることを示す。
【０１４７】
一態様では、本明細書に記載の方法および実施形態で使用できる、本明細書に記載のＴＡＡペプチドとしては、例えば、米国特許第２０１６０１８７３５１号明細書、米国特許第２０１７０１６５３３５号明細書、米国特許第２０１７００３５８０７号明細書、米国特許第２０１６０２８０７５９号明細書、米国特許第２０１６０２８７６８７号明細書、米国特許第２０１６０３４６３７１号明細書、米国特許第２０１６０３６８９６５号明細書、米国特許第２０１７００２２２５１号明細書、米国特許第２０１７０００２０５５号明細書、米国特許第２０１７００２９４８６号明細書、米国特許第２０１７００３７０８９号明細書、米国特許第２０１７０１３６１０８号明細書、米国特許第２０１７０１０１４７３号明細書、米国特許第２０１７００９６４６１号明細書、米国特許第２０１７０１６５３３７号明細書、米国特許第２０１７０１８９５０５号明細書、米国特許第２０１７０１７３１３２号明細書、米国特許第２０１７０２９６６４０号明細書、米国特許第２０１７０２５３６３３号明細書、および米国特許第２０１７０２６０２４９号明細書に記載されるＴＡＡペプチドが挙げられ、これらの各出版物の内容およびその中に記載されている配列リストは、それらの全体が参照により本明細書に援用される。
【０１４８】
実施例６
キメラ分子を発現するγδＴ細胞を操作する
γδＴ細胞は、ＮＫＧ２Ｄ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＣＤ２６、ＮＫＲＰ１、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ４６、ＣＤ２４４（２Ｂ４）、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０に由来するリガンド結合ドメイン；または抗Ｈｅｒ２ｎｅｕなどの抗腫瘍抗体；またはＣＤ３−ζ、Ｄａｐ１０、ＣＤ２８、４−ＩＢＢ、およびＣＤ４０Ｌから得られる抗ＥＧＦＲおよびシグナル伝達ドメインを含む、キメラ腫瘍認識部分を発現するように操作されてもよい。いくつかの例では、キメラ受容体は、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、Ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＥＧＦＲ、メソテリン、ＣＤ３８、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＰＳＡ、ＲＯＮ、ＣＤ３０、ＣＤ２２、ＣＤ３７、ＣＤ３８、ＣＤ５６、ＣＤ３３、ＣＤ３０、ＣＤ１３８、ＣＤ１２３、ＣＤ７９ｂ、ＣＤ７０、ＣＤ７５、ＣＡ６、ＧＤ２、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＥＡＣＡＭ５、ＣＡ−１２５、ＭＵＣ−１６、５Ｔ４、ＮａＰｉ２ｂ、ＲＯＲ１、ＲＯＲ２、５Ｔ４、ＰＬＩＦ、Ｈｅｒ２／Ｎｅｕ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＰＭＮＢ、ＬＩＶ−１、ｇｌｙｃｏｌｉｐｉｄＦ７７、線維芽細胞活性化タンパク質、ＰＳＭＡ、ＳＴＥＡＰ−１、ＳＴＥＡＰ−２、ｃ−ｍｅｔ、ＣＳＰＧ４、Ｎｅｃｔｉｎ−４、ＶＥＧＦＲ２、ＰＳＣＡ、葉酸結合タンパク質／受容体、ＳＬＣ４４Ａ４、Ｃｒｉｐｔｏ、ＣＴＡＧ１Ｂ、ＡＸＬ、ＩＬ−１３Ｒ、ＩＬ−３Ｒ、ＳＬＴＲＫ６、ｇｐ１００、ＭＡＲＴ１、チロシナーゼ、ＳＳＸ２、ＳＳＸ４、ＮＹＥＳＯ−１、上皮性腫瘍抗原（ＥＴＡ）、ＭＡＧＥＡファミリー遺伝子（ＭＡＧＥ３Ａ、ＭＡＧＥ４Ａなど）、ＫＫＬＣ１、変異ｒａｓ、βｒａｆ、ｐ５３、ＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ａ（ＭＩＣＡ）、またはＭＨＣクラスＩ鎖関連分子Ｂ（ＭＩＣＢ）、ＨＰＶ、またはＣＭＶに結合する。
【０１４９】
γδＴ細胞を形質導入するために使用されてもよいその他の操作されたウイルスは、αβＴＣＲおよびキメラＣＤ８／ＣＤ４を別々に発現させる２つのウイルスを含んでもよい。代案としては、ＴＡＡ特異的αβＴＣＲと、キメラＣＤ８／ＣＤ４（短縮型コロニー刺激因子１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）を有する）の双方が、単一ウイルスに含まれてもよい。
【０１５０】
図１２Ａは、例えば、ＣＤ８／ＣＤ４キメラ受容体−Ｔ２Ａ短縮型ＣＳＦ１Ｒを示し、その中で、ＣＤ８α細胞外ドメインは、ＣＤ４膜貫通ドメインおよび細胞内ドメインと連結されていてもよい。ＣＤ８αは、その中でＣＤ８βがパルミトイル化のために重要であるＭＨＣＩ分子のα３ドメインに結合するために、ひいてはＴＣＲ複合体との相互作用のために脂質ラフトへのＣＤ８の適切な動員を提供するために必要である。他方、ＣＤ４はモノマーとして機能し、脂質ラフトに局在し得て、ＣＤ８細胞内ドメインと同様に、ＣＤ４細胞内ドメインは、リンパ球特異的タンパク質チロシンキナーゼ（Ｌｃｋ）を動員し得て、これは、Ｔヘルパー細胞および細胞毒性Ｔ細胞上のＣＤ４およびＣＤ８共受容体の細胞質尾部とそれぞれ相互作用して、ＴＣＲ複合体からのシグナル伝達を補助し得る。したがって、ＣＤ８αとＣＤ８βの双方を発現させる代わりに、ＭＨＣＩ分子に結合して脂質ラフトに局在し得るキメラＣＤ８／ＣＤ４タンパク質を作製してもよい。キメラＣＤ８／ＣＤ４タンパク質の機能が不要になった場合にキルスイッチとして使用される、短縮型ＣＳＦ１受容体（ＣＳＦ１Ｒ）の細胞内触媒領域が、キメラＣＤ８／ＣＤ４タンパク質の下流に連結されていてもよい。ＣＳＦ１Ｒは、Ｔ細胞上では発現されず、骨髄性細胞中に最も豊富である。したがって、ＣＳＦ１Ｒ細胞内触媒領域媒介性シグナル伝達をオフにすることは、γδＴ細胞などのＴ細胞に対する最小限の効果を有するであろう。ＣＳＦ１Ｒシグナル伝達をオフにするために、Ｒ７１５５、ＣＹＣ１１６４５、Ｋｉ２０２２７、ＧＷ２５８０、ＢＬＺ９４５、ＰＬＸ５６２２、およびＰＬＸ３３９７などのいくつかのチロシンキナーゼ阻害剤が使用されてもよい。短縮型ＴＮＦＲ２、短縮型ＥＳＲ１、および／またはＥＳＲ１／Ｆａｓシグナル伝達をはじめとするが、これに限定されるものではない、その他の受容体が、キルスイッチとして使用されてもよく、それはエストロゲン受容体を活性化し、Ｔ細胞のＦａｓ媒介性死滅を誘導してもよい。
【０１５１】
ＣＳＦ１は、Ｍ１（古典的に活性化されたマクロファージ）からＭ２（代替的に活性化されたマクロファージ）への分極を促進し得る。腫瘍微小環境内では、ＣＳＦ１は、腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ）をＭ１型からＭ２型に分極させ得る。ＴＡＭのＭ１型は、ＴＡＭのＭ２型よりも高い腫瘍殺滅活性を有することから、これは望ましくないこともある。腫瘍微小環境におけるＣＳＦ１の存在を利用して、Ｔ細胞の機能／持続性を推進し、ＴＡＭを分極化するＣＳＦ１の可能性を低減するために、ＣＳＦ１に結合するＣＳＦ１Ｒ細胞外ドメインをキメラＣＤ８／ＣＤ４タンパク質に含めてもよい。
【０１５２】
図１２Ｂは、例えば、ＣＤ８／ＣＤ４キメラ受容体−Ｔ２Ａ−ＣＳＦ１Ｒ／４１ＢＢキメラ受容体を示し、その中で、ＣＳＦ１Ｒ細胞外ドメインは、ＣＳＦ１Ｒ細胞外ドメインが、マクロファージから離れたＣＳＦ１に結合しそれを隔離し得るように、キメラＣＤ８／ＣＤ４タンパク質の下流に連結され、したがって、Ｍ１からＭ２への分極を減少させる。例えば、４１ＢＢなどの共刺激分子を提供することによって、この融合タンパク質は、γδＴ細胞などのＴ細胞の生存および増殖を促進してもよい。
【０１５３】
本開示の利点としては、（１）メバロン酸依存性腫瘍に対する細胞毒性を引き出すためのγδＴ細胞の使用；（２）内因性γδＴＣＲの欠失の有無にかかわらず、腫瘍抗原特異的キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはαβ−ＴＣＲを発現するように操作された同種異系細胞としてのγδＴ細胞の使用；（３）免疫不全のがん患者を治療するための、様々な形態の抗体またはＴ細胞エンゲージャーの同時投与による、同種異系免疫細胞としてのγδＴ細胞の使用；（４）がんワクチンのための樹状細胞の成熟を高めるためのγδＴ細胞の使用；および（５）細胞毒性ＣＤ８Ｔ細胞の活性化を高めるための抗原提示細胞としてのγδＴ細胞の使用が挙げられてもよい。
【０１５４】
本明細書で言及される全ての参考文献は、各参考文献が参照により援用されることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書に援用される。あらゆる参考文献の引用は、出願日より前のその開示に対するものであり、本開示が、先行発明の性質上、そのような参照を先取りする権利を有していないことを認めるものとして、解釈されるべきではない。
【０１５５】
上述の要素のそれぞれ、または２つ以上を合わせて、上述の種類とは異なるその他の各種方法においても、有用な用途が見いだされてもよいことが理解されるであろう。さらなる分析なしに、前述のものは、本開示の要旨を完全に明らかにするので、その他の人々は、先行技術の観点から、添付の特許請求の範囲に記載される本開示の一般的なまたは特定の態様の本質的な特徴を公正に構成する特徴を省略することなく、現在の知識を適用することによって、様々な用途に容易に適応させ得るであろう。前述の実施形態は、例示のためだけに示され；本開示の範囲は、以下の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２】
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【図３】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１１Ｃ】
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【図１１Ｄ】
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【図１１Ｅ】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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