(57)【要約】  本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体並びにそれらの産生の方法及びそれらの使用に関する。
2021508472.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ａ）ＶＥＧＦへの抗体の結合が、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害することを伴わずに、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害し、
ｂ）抗体抗体が、２５℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合及び３７℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合する、
ＶＥＧＦに結合する抗体。
【請求項２】
ａ）（ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号０４のアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、ＶＨドメイン；並びに
ｂ）（ｉ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、ＶＬドメイン
を含む、ＶＥＧＦに結合する抗体。
【請求項３】
（ａ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号０４、配列番号１０、及び配列番号１２の群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含み、
（ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、請求項２に記載の抗体。
【請求項４】
配列番号０１のアミノ酸配列に対して少なくとも９５%の配列同一性を有するＶＨ配列；及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の抗体。
【請求項５】
（ａ）配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列、
（ｂ）配列番号０９のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列、
（ｃ）配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列、
（ｄ）配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列、
（ｅ）配列番号４２のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列、又は
（ｆ）配列番号４４のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列
を含む、請求項１〜４のいずれかに記載の抗体。
【請求項６】
Ｆａｂフラグメントである、請求項１〜５のいずれか一項記載の抗体。
【請求項７】
２５℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合する、請求項２〜６のいずれかに記載の抗体。
【請求項８】
配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する、先行する請求項のいずれかに記載の抗体。
【請求項９】
配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を有する抗体の親和性成熟変異体である、ＶＥＧＦに結合する抗体。
【請求項１０】
配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を有する抗体と同じエピトープに結合する、ＶＥＧＦに結合する抗体。
【請求項１１】
請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体をコードする、単離核酸。
【請求項１２】
請求項１１に記載の核酸を含む、宿主細胞。
【請求項１３】
請求項１３に記載の宿主細胞を、抗体の発現に適切な条件下で培養することを含む、ＶＥＧＦに結合する抗体を産生する方法。
【請求項１４】
請求項１〜１１のいずれかに記載の抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項１５】
追加の治療的薬剤を更に含む、請求項１４に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
医薬としての使用のための、請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体又は請求項１４〜１５のいずれか(any or claims 14 to 15)に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
ＶＥＧＦ関連疾患の処置において使用するための、請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体又は請求項１４〜１５のいずれか(any or claims 14 to 15)に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体又は請求項１４〜１５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項１９】
血管新生を阻害するための医薬の製造における、請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体又は請求項１４〜１５のいずれかに記載の医薬組成物の使用。
【請求項２０】
ＶＥＧＦ関連疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の請求項１〜１０のいずれか一項記載の抗体又は請求項１４〜１５のいずれかに記載の医薬組成物を、該個体に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
追加の治療的薬剤を、前記個体に投与することを更に含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
個体において血管新生を阻害する方法であって、血管新生を阻害するために有効な量の請求項１〜１０のいずれかに記載の抗体又は請求項１４〜１５のいずれかに記載の医薬組成物を、該個体に投与することを含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血管新生を阻害する抗体（より詳細には、抗ＶＥＧＦ抗体）及びそれを使用する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
本発明は、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合よりはむしろ、ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を優先的に阻害する抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。血管新生を阻害しながら、そのような抗体は、それらの特異的遮断特性に起因して、改善された安全性を有する。
【０００３】
血管新生は、既存の血管及び／又は循環内皮幹細胞からの新たな血管構造の発生である（非特許文献１〜３）。多くの生理学的過程において重要な役割を果たしながら、血管新生はまた、種々の障害（固形腫瘍、眼内血管新生症候群（例えば、増殖性網膜症又は加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ））、関節リウマチ、及び乾癬を含む）の病態形成において関係している（非特許文献４〜６）。
【０００４】
血管新生は、正常組織及び悪性組織において、標的組織中で及び離れた部位で産生される血管新生刺激及び血管新生阻害物質のバランスにより調節される（非特許文献７，８）。血管内皮成長因子Ａ（ＶＥＧＦ、血管透過性因子、ＶＰＦとしても公知である）は、血管新生の主要な刺激物質である。ヒトＶＥＧＦ（配列番号２９）は、例えば、非特許文献９において記載されている。ＶＥＧＦは、腫瘍及び眼内障害に関連付けられる正常及び異常な血管新生並びに新血管新生の調節に関与している（非特許文献１０〜１５）。ＶＥＧＦは、いくつかの供給源から単離されたホモ二量体糖タンパク質である。ＶＥＧＦは、内皮細胞について高度に特異的な分裂促進活性を示す。ＶＥＧＦは、胚の脈管形成の間での新たな血管の形成において、及び成人期の間での血管新生において、重要な調節機能を有する（非特許文献１６，１７；非特許文献１８において概説されている）。
【０００５】
複数の障害の病態形成における血管新生の重要な刺激としてのＶＥＧＦの同定によって、例えば、抗ＶＥＧＦ受容体抗体、可溶性受容体構築物、アンチセンスストラテジー、ＶＥＧＦに対するＲＮＡアプタマー、及び低分子量ＶＥＧＦ受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）阻害剤により、ＶＥＧＦ活性を遮断するための種々の試みがもたらされた（非特許文献１９）。抗ＶＥＧＦ抗体は、マウスにおける種々のヒト腫瘍細胞株の成長を抑制することが記載されている（非特許文献２０〜２３）。特許文献１〜４には、ＶＥＧＦに対する抗体が言及されている。ヒト化モノクローナル抗体ベバシズマブ（商品名アバスチン（登録商標）の下で販売されている）は、腫瘍治療特許文献５において使用されている抗ＶＥＧＦ抗体である。ラニビズマブ（商品名ルセンティス（登録商標））は、ベバシズマブ（アバスチン（登録商標））と同じ親マウス抗体に由来するモノクローナル抗体フラグメントである。それは、親分子よりもずっと小さく、ＶＥＧＦ−Ａへのより強い結合を提供するために親和性成熟されている（特許文献６）。それは、加齢性黄斑変性症の「ウェット」型（ｗＡＭＤ）（加齢性視力喪失の一般の形態）を処置するために承認されている抗血管新生化合物である。
【０００６】
アバスチン（登録商標）及びルセンティス（登録商標）などの臨床適用のために承認されている抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ−Ｒ１（ＦＬＴ−１、ｆｍｓ様チロシンキナーゼ）及びＶＥＧＦ−Ｒ２（ＫＤＲ／ＦＬＫ−１、胎児肝キナーゼ）の両方の受容体へのＶＥＧＦ結合を阻害する。ＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２は、密接に関連する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である。ＶＥＧＦ−Ｒ２は、主にＶＥＧＦ媒介性の血管新生について関与すると仮定されているが（非特許文献２４）、ＶＥＧＦ−Ｒ１は、例えば、破骨細胞分化において、血管新生に関連しない他の重要な生物学的役割を有することが公知である（非特許文献２５）。
【０００７】
ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を優先的に阻害するがＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害しないいくつかの抗ＶＥＧＦ抗体が報告されている（「２Ｃ３」と呼ばれる抗体を記載している特許文献７、「ｒ８４」と呼ばれる抗体を記載している特許文献８、「Ｌ３Ｈ６」と呼ばれる抗体を記載している特許文献９、並びに「ＨＦ２−１」、「ＨＦ２−５」、「ＨＦ２−９」、及び「ＨＦ２−１１」と呼ばれる抗体を記載している特許文献１０）。ＶＥＧＦ−Ｒ２（しかし、ＶＥＧＦ−Ｒ１ではない）へのＶＥＧＦ結合を遮断することにより、抗体は、改善された安全性プロファイルを有し、抗ＶＥＧＦ療法に関連する一般の毒性関連副作用を示さないと記載されている（非特許文献２６，２７）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００８】
【特許文献１】国際公開第９４／１０２０２号
【特許文献２】国際公開第９８／４５３３２号
【特許文献３】国際公開第２００５／００９００号
【特許文献４】国際公開第００／３５９５６号
【特許文献５】国際公開第９８／４５３３１号
【特許文献６】国際公開第９８／４５３３１号
【特許文献７】国際公開第２０００／６４９４６号
【特許文献８】国際公開第２００９／０６０１９８号
【特許文献９】国際公開第２０１２／０８９１７６号
【特許文献１０】欧州特許出願公開第３００６４６５号明細書
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】Asahara, M. et al., Science, 275(5302):964-967, 1997
【非特許文献２】Springer, et al., Mol. Cell, 2(5):549-558, 1998
【非特許文献３】Folkman and Shing, J. Biol. Chem., 267:10931-10934, 1992
【非特許文献４】Folkman, J., et al., J. Biol. Chem. 267 (1992) 10931-10934
【非特許文献５】Klagsbrun, M., et al., Annu. Rev. Physiol. 53 (1991) 217-239
【非特許文献６】Garner, A., Vascular diseases, in: Pathobiology of ocular disease, A dynamic approach, Garner, A., and Klintworth, G. K. (eds.), 2nd edition, Marcel Dekker, New York (1994), pp. 1625-1710
【非特許文献７】Fidler, et al., Cancer J. Sci. Am., 4 Suppl 1:S58-66, 1998
【非特許文献８】McNamara, et al., Br. J Surg., 85(8):1044-1055. 1998
【非特許文献９】Leung, D.W., et al., Science 246 (1989)
【非特許文献１０】Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25
【非特許文献１１】Berkman, R.A., et al., J. Clin. Invest. 91 (1993) 153-159
【非特許文献１２】Brown, L.F., et al., Human Pathol. 26 (1995) 86-91
【非特許文献１３】Brown, L.F., et al., Cancer Res. 53 (1993) 4727-4735
【非特許文献１４】Mattern, J., et al., Brit. J. Cancer. 73 (1996) 931-934
【非特許文献１５】Dvorak, H.F., et al., Am. J. Pathol. 146 (1995) 1029-1039
【非特許文献１６】Carmeliet, P., et al., Nature, 380 (1996) 435-439
【非特許文献１７】Ferrara, N., et al., Nature, 380 (1996) 439-442
【非特許文献１８】Ferrara, N., et al., Endocr. Rev. 18 (1997) 4-25
【非特許文献１９】Siemeister, et al. Cancer Metastasis Rev., 17(2):241-248., 1998
【非特許文献２０】Kim, K.J., et al., Nature 362 (1993) 841-844
【非特許文献２１】Warren, S.R., et al., J. Clin. Invest. 95 (1995) 1789-1797
【非特許文献２２】Borgstrom, P., et al., Cancer Res. 56 (1996) 4032-4039
【非特許文献２３】Melnyk, O., et al., Cancer Res. 56 (1996) 921-924
【非特許文献２４】Holash, J. et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Aug 20；99(17):11393-8
【非特許文献２５】Aldridge, S.E. et al., Biochem Biophys Res Commun. 2005 Sep 30；335(3):793-8
【非特許文献２６】Brekken, R. A., et al., Cancer Res. 2000 Sep 15；60(18):5117-24
【非特許文献２７】Sullivan, L.A., et al., PLoS One, 2010 Aug 6；5(8):e12031
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
この有利な挙動を提供し、同時に、臨床適用のために適切にするための、要求される特性及び十分な親和性を示す抗体の開発は、容易なアプローチではないため、改善されたＶＥＧＦ阻害剤についての必要性が依然としてある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
発明の概要
本発明は、抗ＶＥＧＦ抗体及びそれを使用する方法を提供する。
【００１２】
本発明の一局面は、ＶＥＧＦへの抗体の結合が、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害することを伴わずに、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害する、ＶＥＧＦに結合する抗体である。
【００１３】
本発明の別の局面は、ＶＥＧＦへの抗体の結合が、ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦの結合を選択的に阻害する、ＶＥＧＦに結合する抗体である。
【００１４】
本発明の別の局面は、ＶＥＧＦへの抗体の結合が、ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦの結合を完全に阻害し、かつ、ＶＥＧＦへの抗体の結合が、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦの結合を完全には阻害しない、ＶＥＧＦに結合する抗体である。
【００１５】
本発明の別の局面は、２５℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合し、かつ、３７℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、より高い又はほぼ同じ親和性でＶＥＧＦに結合する、ＶＥＧＦに結合する抗体である。
【００１６】
本発明の別の局面は、配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む抗体と同じエピトープに結合する、ＶＥＧＦに結合する抗体である。
【００１７】
本発明の別の局面は、
（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号０４、配列番号１０、及び配列番号１２の群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）
を含み、
（ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）
を含む、ＶＥＧＦに結合する抗体である。
【００１８】
一実施態様では、抗体は、配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号０９のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号４２のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号４４のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む。
【００１９】
本発明の別の局面は、配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体である。本発明の別の局面は、配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を有する抗体の親和性成熟変異体である抗体である。本発明の別の局面は、配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を有する抗体と同じエピトープに結合する、ＶＥＧＦに結合する抗体である。
【００２０】
本発明の別の局面は、配列番号０９のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体である。
【００２１】
本発明の別の局面は、配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体である。
【００２２】
本発明の別の局面は、配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体である。
【００２３】
本発明の別の局面は、配列番号４２のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体である。
【００２４】
本発明の別の局面は、配列番号４４のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体である。
【００２５】
本発明の別の局面は、本発明の抗体をコードする単離核酸である。
【００２６】
本発明の別の局面は、本発明の核酸を含む宿主細胞である。
【００２７】
本発明の別の局面は、ＶＥＧＦに結合する抗体を産生する方法であって、該抗体の発現のために適切な条件下で本発明の宿主細胞を培養することを含む、方法である。本発明の別の局面は、前記方法により産生された抗体である。
【００２８】
本発明の別の局面は、本発明の抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む医薬組成物である。
【００２９】
本発明の別の局面は、医薬としての使用のための本発明の抗体又は本発明の医薬組成物である。
【００３０】
本発明の別の局面は、ＶＥＧＦ関連疾患（例えば、癌又は眼疾患）の処置に使用するための本発明の抗体又は本発明の医薬組成物である。
【００３１】
本発明の別の局面は、医薬の製造における本発明の抗体又は本発明の医薬組成物の使用である。
【００３２】
本発明の別の局面は、血管新生を阻害するための医薬の製造における本発明の抗体又は本発明の医薬組成物の使用である。
【００３３】
本発明の別の局面は、ＶＥＧＦ関連疾患（例えば、癌又は眼疾患）を有する個体を処置する方法であって、有効量の本発明の抗体又は本発明の医薬組成物を該個体に投与することを含む、方法である。
【００３４】
本発明の別の局面は、個体において血管新生を阻害する方法であって、血管新生を阻害するために有効な量の本発明の抗体又は本発明の医薬組成物を該個体に投与することを含む、方法である。
【００３５】
本発明は、例えばＶＥＧＦ−Ｒ１を通じたＶＥＧＦシグナル伝達を遮断することにより起こされる副作用を回避することによって、高い親和性、高い安定性、及び改善された安全性プロファイルのような、特に価値のある特性を示す新規の抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。本発明により提供される抗体は、抗体フラグメントの治療的適用を可能にする高い親和性を示す。本発明の抗体は、ＶＥＧＦ関連疾患、例えば癌、血管疾患、又は眼疾患（例えば、加齢性黄斑変性症）などに罹患している患者のために利益を起こす価値ある特性を示す。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】ＶＥＧＦ−Ｒ１ドメイン２（赤）を伴う、並びにＶＥＧＦ−Ｒ２ドメイン２及び３（青）を伴う複合体中のＶＥＧＦ二量体（紫）の結晶構造。
【図２】実施例２において記載するとおりの、抗体Ｆａｂフラグメントの存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害（ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦ−Ｒ２／Ｒ１阻害ＥＬＩＳＡ）。
【図３】実施例４において記載するとおりの、ＥＬＩＳＡにより決定された抗ＶＥＧＦ抗体のＶＥＧＦ結合。
【図４Ａ】実施例６において記載するとおりの、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体ＶＥＧＦ−００８９、ＶＥＧＦ−０１１３、ＶＥＧＦ−０１１４並びにラニビズマブ及びＬ３Ｈ６  Ｆａｂ（０．４nM  ＶＥＧＦ）の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害。
【図４Ｂ】実施例６において記載するとおりの、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体ＶＥＧＦ−００８９並びに先行技術の抗体２Ｃ３、ｒ８４、及びＬ３Ｈ６（０．７nM  ＶＥＧＦ）の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害。
【図５】実施例６において記載するとおりの、抗ＶＥＧＦ抗体（０．７nM  ＶＥＧＦ）の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害。
【図６】実施例６において記載するとおりの、抗ＶＥＧＦ抗体（０．３４nM  ＶＥＧＦ）の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害。
【図７】実施例６において記載するとおりの、抗ＶＥＧＦ抗体（０．３４nM  ＶＥＧＦ）の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害。
【図８】実施例１１において記載するとおりの、抗ＶＥＧＦ抗体（０．３４nM  ＶＥＧＦ）の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害。
【図９】実施例１１において記載するとおりの、抗ＶＥＧＦ抗体（０．７nM  ＶＥＧＦ）の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害。
【図１０】実施例１１において記載するとおりの、抗ＶＥＧＦ抗体（０．３４nM  ＶＥＧＦ）の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害。
【図１１】実施例１１において記載するとおりの、抗ＶＥＧＦ抗体（０．７nM  ＶＥＧＦ）の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害。
【図１２】実施例１３に従ってＸ線結晶学により決定された、抗ＶＥＧＦ抗体ＶＥＧＦ−００８９を伴う複合体中のＶＥＧＦ二量体（紫）の結晶構造。
【図１３】実施例１３に従ってＸ線結晶学により決定された、ＶＥＧＦ−Ａ１２１（配列番号４５）の二量体中のＶＥＧＦ−００８９Ｆａｂフラグメントにより結合されたエピトープアミノ酸。５Aの距離内でＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂフラグメントと接触しているＶＥＧＦ−Ａ１２１分子の各々の１つにおいて含まれるアミノ酸位置を黒で強調している。
【００３７】
発明の詳細な説明
【００３８】
１．定義
【００３９】
本明細書における用語「抗体」は、最も広い意味において使用されており、それらが所望の抗原結合活性を示す限り、種々の抗体構造（モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、及び抗体フラグメントを含むが、これらに限定しない）を包含する。
【００４０】
「天然抗体」は、変動する構造を伴う天然免疫グロブリン分子を指す。例えば、天然ＩｇＧ抗体は、ジスルフィド結合している２つの同一の軽鎖及び２つの同一の重鎖で構成される、約１５０，０００ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。Ｎ末端からＣ末端まで、各々の重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）（可変重ドメイン又は重鎖可変領域とも呼ばれる）、それに続く３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、各々の軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）（可変軽ドメイン又は軽鎖可変領域とも呼ばれる）、それに続く定常軽（ＣＬ）ドメインを有する。
【００４１】
用語「全長抗体」、「インタクト抗体」、及び「全抗体」は、本明細書において互換的に使用し、天然抗体構造に実質的に類似している構造を有する、又は本明細書において定義するＦｃ領域を含む重鎖を有する抗体を指す。
【００４２】
「単離」抗体は、その自然環境の成分から分離されたものである。一部の実施態様では、抗体は、例えば、電気泳動（例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、等電点電気泳動（ＩＥＦ）、キャピラリー電気泳動）又はクロマトグラフィー（例えば、イオン交換又は逆相ＨＰＬＣ）方法により決定されるとおり、９５%又は９９%を上回る純度まで精製される。抗体純度の評価のための方法の概説については、例えば、Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)を参照のこと。
【００４３】
「ヒト抗体」は、ヒト又はヒト細胞により産生される、あるいはヒト抗体のレパートリー又は他のヒト抗体をコードする配列を利用した非ヒト供給源から由来する抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を保持するものである。ヒト抗体のこの定義では、具体的には、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体が除外される。
【００４４】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。
【００４５】
「フレームワーク」又は「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、４つのＦＲドメインからなる：ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３、及びＦＲ４。したがって、ＨＶＲ配列及びＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（又はＶＬ）中の以下の配列において現れる：ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。
【００４６】
本明細書において使用する用語「超可変領域」又は「ＨＶＲ」は、配列（「相補性決定領域」又は「ＣＤＲ」）において超可変である、及び／又は構造的に定義されたループ（「超可変ループ」）を形成する、及び／又は抗原接触残基（「抗原接触部」）を含む、抗体可変ドメインの領域の各々を指す。一般的に、抗体は６つのＨＶＲを含む：ＶＨ中の３つ（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、及びＶＬ中の３つ（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）。本明細書における例示的なＨＶＲは、以下を含む：
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）、及び９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)）；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）、及び９５−１０２（Ｈ３）で生じるＣＤＲ（Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)）；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）、及び９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触部（MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)）；並びに
（ｄ）ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）、及び９４−１０２（Ｈ３）を含む、（ａ）、（ｂ）、及び／又は（ｃ）の組み合わせ。
【００４７】
他に示さない場合、可変ドメイン中のＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）残基及び他の残基（例えば、ＦＲ残基）を、本明細書において、Kabat et al.（上記）に従ってナンバリングする。
【００４８】
抗体の「クラス」は、その重鎖により保持される定常ドメイン又は定常領域の型を指す。抗体の５つの主要なクラスがある（ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭ）、これらのいくつかをサブクラス（アイソタイプ）中に更に分けうる（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）。特定の実施態様では、抗体はＩｇＧ１アイソタイプである。特定の実施態様では、抗体は、Ｆｃ領域エフェクター機能を低下させるためのＰ３２９Ｇ、Ｌ２３４Ａ、及びＬ２３５Ａ変異を伴うＩｇＧ１アイソタイプである。他の実施態様では、抗体はＩｇＧ２アイソタイプである。特定の実施態様では、抗体は、ＩｇＧ４抗体の安定性を改善するためにヒンジ領域においてＳ２２８Ｐ変異を伴うＩｇＧ４アイソタイプである。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、２つの型（カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる）の１つに割り当てられうる。
【００４９】
本明細書における用語「Ｆｃ領域」は、定常領域の少なくとも一部を含む免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用する。この用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む。一実施態様では、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、又はＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで伸長する。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リジン（Ｌｙｓ４４７）は、存在しても、又はしなくてもよい。本明細書において他に指定しない場合、Ｆｃ領域又は定常領域中のアミノ酸残基のナンバリングは、ＥＵナンバリングシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従い、Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991において記載されるとおりである。
【００５０】
「エフェクター機能」は、抗体のＦｃ領域に起因しうるそれらの生物学的活性を指し、それは、抗体アイソタイプに伴って変動する。抗体エフェクター機能の例は以下を含む：Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）；Ｆｃ受容体結合；抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）；食作用；細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）の下方調節；及びＢ細胞活性化。
【００５１】
用語「ＶＥＧＦ」は、本明細書において使用するように、他に示さない場合、哺乳動物、例えば霊長類（例えば、ヒト）及び齧歯動物（例えば、マウス及びラット）などを含む、任意の脊椎動物の供給源からの任意の天然ＶＥＧＦを指す。この用語は、「全長」、未処理ＶＥＧＦ並びに細胞におけるプロセシングからもたらされる、ＶＥＧＦの任意の形態を包含する。この用語はまた、ＶＥＧＦの天然変異体（例えば、スプライス変異体又は対立遺伝子変異体）を包含する。例示的なヒトＶＥＧＦのアミノ酸配列を配列番号２９において示す。
【００５２】
用語「抗ＶＥＧＦ抗体」及び「ＶＥＧＦに結合する抗体」は、抗体が、ＶＥＧＦを標的とする際に、診断的及び／又は治療的薬剤として有用であるように、十分な親和性でＶＥＧＦに結合することが可能である抗体を指す。一実施態様では、無関係の、非ＶＥＧＦタンパク質への抗ＶＥＧＦ抗体の結合の程度は、例えば、表面共鳴プラズモン（ＳＰＲ）により測定されるように、ＶＥＧＦへの抗体の結合の約１０%未満である。特定の実施態様では、ＶＥＧＦに結合する抗体は、解離定数（Ｋｄ）≦１μM、≦１００nM、≦１０nM、≦１nM、≦０．１nM、≦０．０１nM、又は≦０．００１nM（例えば、１０−８M又はそれ以下、例えば、１０−８Mから１０−１３M、例えば、１０−９Mから１０−１３M）を有する。抗体は、抗体が１μM又はそれ以下のＫｄを有する場合、ＶＥＧＦに「特異的に結合」すると言う。
【００５３】
「親和性」は、分子（例えば、抗体）の単一結合部位及びその結合パートナー（例えば、抗原）の間での非共有結合的な相互作用の合計の強度を指す。他に示さない場合、本明細書において使用するように、「結合親和性」は、結合対のメンバー（例えば、抗体及び抗原）の間での１：１の相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。分子Ｘの、そのパートナーＹについての親和性は、一般的に、解離定数（Ｋｄ）により表わすことができる。親和性は、当技術分野において公知の一般の方法（本明細書において記載するものを含む）により測定することができる。結合親和性を測定するための特定の例証的及び例示的な実施態様を、以下において記載する。
【００５４】
本明細書における目的のための「アクセプターヒトフレームワーク」は、以下に定義するように、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークから由来する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワーク又は重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。
【００５５】
用語「可変領域」又は「可変ドメイン」は、抗原への抗体の結合において含まれる抗体重又は軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖及び軽鎖（それぞれＶＨ及びＶＬ）の可変ドメインは、一般的に、同様の構造を有し、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）及び３つの超可変領域（ＨＶＲ）を含む各々のドメインを伴う（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照のこと）。単一のＶＨ又はＶＬドメインは、抗原結合特異性を付与するのに十分でありうる。更に、特定の抗原に結合する抗体は、相補的ＶＬ又はＶＨドメインのライブラリーをそれぞれスクリーニングするために、抗原に結合する抗体からのＶＨ又はＶＬドメインを使用して単離されうる（例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)； Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照のこと）。
【００５６】
本明細書において使用する用語「モノクローナル抗体」は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、即ち、その集団を含む個々の抗体は、可能な変異体抗体（例えば、天然変異を含む、又はモノクローナル抗体調製物の産生の間に生じる）を除き、同一である、及び／又は同じエピトープに結合し、そのような変異体は、一般的に、少量で存在する。異なる決定基（エピトープ）に対して向けられた異なる抗体を典型的に含むポリクローナル抗体調製物とは対照的に、モノクローナル抗体調製物の各々のモノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対して向けられる。このように、修飾語「モノクローナル」は、実質的に均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を要求すると解釈すべきではない。例えば、本発明に従ったモノクローナル抗体は、種々の技術（ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ方法、及びヒト免疫グロブリン遺伝子座の全部又は部分を含むトランスジェニック動物を利用した方法を含むが、これらに限定しない）により作製されうるが、そのような方法及びモノクローナル抗体を作製するための他の例示的な方法を本明細書において記載する。
【００５７】
「抗体フラグメント」は、インタクトな抗体が結合する抗原に結合するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントの例は、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２；ダイアボディ；線形抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体フラグメントから形成された多重特異性抗体を含むが、これらに限定しない。
【００５８】
参照ポリペプチド配列に関する「パーセント（%）アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、ギャップを導入し（必要な場合）、最高パーセント配列同一性を達成した後（整列化の目的のために、任意の保存的置換を配列同一性の部分として考慮せず）、参照ポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義する。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のための整列化は、当技術分野内にある種々の方法において、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えばＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、Clustal W、Megalign（DNASTAR）ソフトウェア又はＦＡＳＴＡプログラムパッケージなどを使用して達成することができる。当業者は、配列を整列させるための適当なパラメーター（比較されている配列の全長にわたる最高の整列化を達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。本明細書における目的のために、アミノ酸配列同一性の値（%）を、ＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを伴うＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃ以降のggsearchプログラムを使用して生成する。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), “Improved Tools for Biological Sequence Analysis”, PNAS 85:2444-2448；W. R. Pearson (1996) “Effective protein sequence comparison” Meth. Enzymol. 266:227- 258；及びPearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36により作成されており、www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml又はwww.ebi.ac.uk/Tools/sss/fastaから公的に利用可能である。あるいは、fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgiでアクセス可能な公的サーバーを使用し、ggsearch（包括的タンパク質：タンパク質）プログラム及びデフォルトオプション（BLOSUM50；オープン：−１０；ｅｘｔ：−２；Ｋｔｕｐ＝２）を使用して配列を比較し、（ローカルよりはむしろ）包括的な整列化が実施されることを確実にすることができる。パーセントアミノ酸同一性は、出力整列化ヘッダーにおいて与えられる。
【００５９】
「親和性成熟」抗体は、１つ又は複数の超可変領域（ＨＶＲ）における１つ又は複数の変化（そのような変化を保持しない親抗体と比較して）を伴う抗体を指し、そのような変化は、抗原についての抗体の親和性における改善をもたらす。
【００６０】
用語「エピトープ」は、抗ＶＥＧＦ抗体が結合する、タンパク質性又は非タンパク質性のいずれかの抗原上の部位を意味する。エピトープは、近接アミノ酸ストレッチ（線状エピトープ）から形成されること、又は非近接アミノ酸（立体構造エピトープ）を含むこと（例えば、抗原の折り畳みに起因して、即ち、タンパク質性抗原の三次折り畳みにより空間的に接近する）の両方ができる。線形エピトープは、典型的には、変性薬剤へのタンパク質性抗原の曝露後、抗ＶＥＧＦ抗体により依然として結合されているのに対し、立体構造エピトープは、典型的には、変性薬剤を用いた処理時に破壊される。エピトープは、独特の空間的な立体構造において少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、少なくとも７、又は８〜１０のアミノ酸を含む。
【００６１】
特定のエピトープに結合する抗体（即ち、同じエピトープに結合する抗体）についてのスクリーニングは、当技術分野において慣用の方法、例えば、限定しないが、アラニンスキャニング、ペプチドブロット（Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463を参照のこと）、ペプチド切断分析、エピトープ切り出し、エピトープ抽出、抗原の化学修飾（Prot. Sci. 9 (2000) 487-496を参照のこと）、及び交差遮断（“Antibodies”, Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)を参照のこと）などを使用して行うことができる。
【００６２】
抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）は、修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）としても公知であり、多数から化学的又は酵素的に修飾された抗原表面までの抗体の各々の結合プロファイルに基づき、ＶＥＧＦに特異的に結合する多数のモノクローナル抗体にビンする（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号明細書を参照のこと）。各々のビンにおける抗体は、別のビンにより表されるエピトープとは明確に異なる、又は部分的に重複している独特のエピトープでありうる同じエピトープに結合する。
【００６３】
一部の実施態様では、２つの抗体は、１つの抗体の結合を低下又は排除する、抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異がまた、他の結合を低下又は排除する場合、同じエピトープに結合すると見なす。２つの抗体は、１つの抗体の結合を低下又は排除するアミノ酸変異のサブセットだけが、他の抗体の結合を低下又は排除する場合、「重複エピトープ」を有すると見なす。
【００６４】
「免疫複合体」は、１つ又は複数の異種分子（細胞傷害性薬剤を含むが、これに限定しない）に共役された抗体である。
【００６５】
用語「核酸」、「核酸分子」、又は「ポリヌクレオチド」は、ヌクレオチドの重合体を含む任意の化合物及び／又は物質を含む。各々のヌクレオチドは、塩基、具体的にはプリン塩基又はピリミジン塩基（即ち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）、又はウラシル（Ｕ））、糖（即ち、デオキシリボース又はリボース）、及びリン酸基で構成される。しばしば、核酸分子は、塩基の配列により記載され、それにより、前記塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’で表す。本明細書において、用語「核酸分子」は、例えば、相補的ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）及びゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡ又はＲＮＡの合成形態、及びこれらの分子の２つ又はそれ以上を含む混合多量体を含むデオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を包含する。核酸分子は線状又は環状でありうる。また、用語「核酸分子」は、センス鎖及びアンチセンス鎖の両方、並びに一本鎖及び二本鎖の形態を含む。更に、本明細書において記載する核酸分子は、天然又は非天然ヌクレオチドを含みうる。非天然ヌクレオチドの例は、誘導体化された糖又はリン酸骨格連結又は化学的に修飾された残基を伴う修飾ヌクレオチド塩基を含む。核酸分子はまた、インビトロ及び／又はインビボでの、例えば、宿主又は患者における本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適切であるＤＮＡ及びＲＮＡ分子を包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）又はＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、未修飾又は修飾であることができる。例えば、ｍＲＮＡを化学的に修飾し、ＲＮＡベクターの安定性及び／又はコードされる分子の発現を増強することができ、ｍＲＮＡを被験体中に注射し、インビボで抗体を生成することができる（例えば、Stadler ert al, Nature Medicine 2017、２０１７年６月１２日にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／nm．４３５６又は欧州特許第２１０１８２３号明細書を参照のこと）。
【００６６】
「単離」核酸は、その自然環境の成分から分離された核酸分子を指す。単離核酸は、核酸分子を通常含む細胞中に含まれる核酸分子を含むが、しかし、核酸分子は、染色体外に、又はその自然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００６７】
「抗ＶＥＧＦ抗体をコードする単離核酸」は、単一のベクター又は別々のプラスミド中にそのような核酸分子を含む、抗体の重鎖及び軽鎖（又はそのフラグメント）をコードする１つ又は複数の核酸分子を指し、そのような核酸分子は、宿主細胞中の１つ又は複数の位置に存在する。
【００６８】
用語「ベクター」は、本明細書において使用するように、それが連結されている別の核酸を伝播することが可能な核酸分子を指す。この用語は、自己複製核酸構造としてのベクター、並びにそれが導入された宿主細胞のゲノム中に組み入れられたベクターを含む。特定のベクターは、それらが操作的に連結された核酸の発現を方向付けることが可能である。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」として言及する。
【００６９】
用語「宿主細胞」、「宿主細胞株」、及び「宿主細胞培養物」は、互換的に使用され、外因性核酸が導入された細胞（そのような細胞の後代を含む）を指す。宿主細胞は、「形質転換体」及び「形質転換細胞」を含み、それらは、継代の数に関係なく、一次形質転換細胞及びそれから由来する後代を含む。後代は、核酸含量において親細胞と完全に同一ではないであろうが、しかし、変異を含みうる。本来形質転換されていた細胞においてスクリーニング又は選択されたものと同じ機能又は生物学的活性を有する変異体後代が、本明細書において含まれる。
【００７０】
用語「医薬組成物」又は「医薬製剤」は、その中に含まれる活性成分の生物学的活性が有効になることを許すような形態であり、医薬組成物が投与されうる被験体に非許容可能に有毒である追加成分を含まない調製物を指す。
【００７１】
薬剤（例えば、医薬組成物）の「有効量」は、所望の治療的又は予防的結果を達成するために必要な投与量で、及び期間にわたり有効な量を指す。
【００７２】
「個体」又は「被験体」は哺乳動物である。哺乳動物は、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌ、及びウマ）、霊長類（例えば、ヒト及び非ヒト霊長類、例えばサルなど）、ウサギ、及び齧歯類（例えば、マウス及びラット）を含むが、これらに限定しない。特定の実施態様では、個体又は被験体はヒトである。
【００７３】
「医薬的に許容可能な担体」は、被験体に非毒性である、活性成分以外の医薬組成物又は製剤中の成分を指す。医薬的に許容可能な担体は、緩衝剤、賦形剤、安定剤、又は保存剤を含むが、これらに限定しない。
【００７４】
用語「添付文書」を使用し、治療的産物の商業的パッケージにおいて習慣的に含まれる指示を指し、それには、そのような治療的産物の使用に関する適応症、使用法、投与量、投与、併用治療、禁忌、及び／又は警告についての情報が含まれる。
【００７５】
本明細書において使用するように、「処置」（及びその文法的変形、例えば「処置する」又は「処置すること」など）は、処置されている個体において疾患の自然経過を変化させる試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、又は臨床病理学の経過の間のいずれかで実施することができる。処置の望ましい効果は、疾患の発生又は再発を防止すること、症状の軽減、疾患の任意の直接的又は間接的な病理学的転帰の減弱、転移を防止すること、疾患進行の速度を減少させること、疾患状態の回復又は緩和、及び寛解又は改善された予後を含むが、これらに限定しない。一部の実施態様では、本発明の抗体を使用し、疾患の発生を遅延させる、又は疾患の進行を遅らせる。
【００７６】
２．発明の実施態様の詳細な説明
【００７７】
一局面では、本発明は、部分的には、抗ＶＥＧＦ抗体を使用した血管新生の阻害に基づく。特定の実施態様では、ＶＥＧＦに結合する抗体を提供する。本発明の抗体は、例えば、ＶＥＧＦ関連疾患、例えば癌又は眼疾患などの診断又は処置のために有用である。
【００７８】
Ａ．例示的な抗ＶＥＧＦ抗体
【００７９】
一局面では、本発明は、ＶＥＧＦに結合する抗体を提供する。一局面では、ＶＥＧＦに結合する単離抗体を提供する。一局面では、本発明は、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体を提供する。特定の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、
ａ）それにおいて、ＶＥＧＦへの抗体の結合は、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害することを伴わずに、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害する、及び／又は
ｂ）それにおいて、抗体は、２５℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合し、及び、それにおいて、抗体は、３７℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、より高い又はほぼ同じ親和性でＶＥＧＦに結合する。
【００８０】
一局面では、本発明は、（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３より選択される少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又は６つのＣＤＲを含む抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。ＣＤＲアミノ酸配列のこの組を含む１つの例示的な抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−００８９」として言及する抗体である。
【００８１】
一局面では、本発明は、（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全ての３つのＶＨ  ＣＤＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。別の実施態様では、抗体は、配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３及び配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。更なる実施態様では、抗体は、配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３、配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３、及びアミノ酸配列の配列番号０４を含むＣＤＲ−Ｈ２を含む。更なる実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む。
【００８２】
別の局面では、本発明は、（ａ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全ての３つのＶＬ  ＣＤＲ配列を含む抗体を提供する。一実施態様では、抗体は、（ａ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む。
【００８３】
別の局面では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３より選択されるＣＤＲ配列より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全ての３つのＶＨ  ＣＤＲ配列を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３より選択される少なくとも１つ、少なくとも２つ、又は全ての３つのＶＬ  ＣＤＲ配列を含むＶＬドメインを含む。
【００８４】
別の局面では、本発明の抗体は、（ａ）（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｃ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｄ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｅ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【００８５】
別の局面では、本発明は、（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。ＣＤＲアミノ酸配列のこの組を含む１つの例示的な抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−００８９」として言及する抗体である。
【００８６】
特定の実施態様では、上で提供する抗ＶＥＧＦ抗体の任意の１つ又は複数のアミノ酸は、ＣＤＲ  Ｈ２（配列番号０４）中の以下のＣＤＲ位置で変異している：位置４、６、７、及び８。
【００８７】
特定の実施態様では、置換は、本明細書において提供するように、保存的置換又は欠失である。特定の実施態様では、以下の置換又は欠失の任意の１つ又は複数を、任意の組み合わせにおいて作製してもよい：ＣＤＲ−Ｈ２（配列番号０４）中：位置Ｎ４Ｓ、Ｇ６Ｐ、位置７でのアミノ酸Ｇの欠失、及びＩ８Ｆ。
【００８８】
別の局面では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号０４のアミノ酸配列に対して少なくとも８０%の配列同一性を有するＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。
【００８９】
別の局面では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。本発明のこの局面に従った抗体において、ＣＤＲ−Ｈ２は、以下のコンセンサス配列である、配列番号３０のアミノ酸を含み：ＳＩＧＸ１ＧＸ２Ｘ３Ｘ４ＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３０）、それにおいて、Ｘ１、Ｘ２、及びＸ４は、任意の天然アミノ酸より互いに独立して選択され、及び、それにおいて、Ｘ３は、任意の天然アミノ酸又はギャップ（アミノ酸なし）より選択される。
【００９０】
別の局面では、本発明の抗体は、（ａ）（ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含むＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含むＶＬドメインを含む。本発明のこの局面に従った抗体において、ＣＤＲ−Ｈ２は、以下のコンセンサス配列である、配列番号３１のアミノ酸を含み：ＳＩＧＸ１ＧＸ２Ｘ３Ｘ４ＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号３１）、それにおいて、Ｘ１はＮ又はＳより選択され、Ｘ２はＧ又はＰより選択され、Ｘ３はギャップ（アミノ酸なし）又はＧのいずれかであり；及びＸ４はＩ又はＦより選択される。
【００９１】
別の局面では、本発明は、（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。ＣＤＲアミノ酸配列のこの組を含む例示的な抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−０１１３」及び「ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２０」として言及する抗体である。
【００９２】
別の局面では、本発明は、（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２；（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；（ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む抗体を提供する。ＣＤＲアミノ酸配列のこの組を含む例示的な抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−０１１４」及び「ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２１」として言及する抗体である。
【００９３】
一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、アクセプターヒトフレームワーク、例えば、ヒト免疫グロブリンフレームワーク又はヒトコンセンサスフレームワークを更に含む。
【００９４】
別の局面では、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号０１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに結合する能力を保持する。特定の実施態様では、合計１から１０のアミノ酸が、配列番号０１において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号０１中にＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、以下より選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲＣＤＲを含む：（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲＣＤＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３。
【００９５】
別の局面では、抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、それにおいて、抗体は、配列番号０２のアミノ酸配列に対して少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＬ配列は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに結合する能力を保持する。特定の実施態様では、合計１から１０のアミノ酸が、配列番号０２において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号０２中にＶＬ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＬは、（ａ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｂ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｃ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３より選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む。
【００９６】
別の局面では、抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、それにおいて、抗体は、上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列、及び上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、それぞれ配列番号０１及び配列番号０２中にＶＨ及びＶＬ配列（それらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号０１のＶＨドメイン及び配列番号０２のＶＬドメインを含む。前記ＶＨ及びＶＬドメインを含む１つの例示的な抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−００８９」として言及する抗体である。
【００９７】
別の局面では、抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、それにおいて、抗体は、上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列、及び上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、それぞれ配列番号３３及び配列番号０２中にＶＨ及びＶＬ配列（それらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号３３のＶＨドメイン及び配列番号０２のＶＬドメインを含む。前記ＶＨ及びＶＬドメインを含む１つの例示的な抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＤ８６７５」として言及する抗体である。
【００９８】
別の局面では、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号０９のアミノ酸配列に対して少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに結合する能力を保持する。特定の実施態様では、合計１から１０のアミノ酸が、配列番号０９において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号０９中にＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、以下より選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３。
【００９９】
別の局面では、抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、それにおいて、抗体は、上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列、及び上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、それぞれ配列番号０９及び配列番号０２中にＶＨ及びＶＬ配列（それらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号０９のＶＨドメイン及び配列番号０２のＶＬドメインを含む。前記ＶＨ及びＶＬドメインを含む１つの例示的な抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−０１１３」として言及する抗体である。
【０１００】
別の局面では、抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、それにおいて、抗体は、上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列、及び上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、それぞれ配列番号４３及び配列番号０２中にＶＨ及びＶＬ配列（それらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号４３のＶＨドメイン及び配列番号０２のＶＬドメインを含む。前記ＶＨ及びＶＬドメインを含む１つの例示的な抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２０」として言及する抗体である。別の局面では、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１１のアミノ酸配列に対して少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、９９%、又は１００%の配列同一性を有する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）配列を含む。特定の実施態様では、少なくとも９０%、９１%、９２%、９３%、９４%、９５%、９６%、９７%、９８%、又は９９%の同一性を有するＶＨ配列は、参照配列と比べて、置換（例えば、保存的置換）、挿入、又は欠失を含むが、しかし、その配列を含む抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦに結合する能力を保持する。特定の実施態様では、合計１から１０のアミノ酸が、配列番号１１において置換、挿入、及び／又は欠失されている。特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、ＣＤＲの外側の領域中（即ち、ＦＲ中）で生じる。場合により、抗ＶＥＧＦ抗体は、配列番号１１中にＶＨ配列（その配列の翻訳後修飾を含む）を含む。特定の実施態様では、ＶＨは、以下より選択される１つ、２つ、又は３つのＣＤＲを含む：（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、（ｂ）配列番号１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、及び（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３。
【０１０１】
別の局面では、抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、それにおいて、抗体は、上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列、及び上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、それぞれ配列番号１１及び配列番号０２中にＶＨ及びＶＬ配列（それらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号１１のＶＨドメイン及び配列番号０２のＶＬドメインを含む。前記ＶＨ及びＶＬドメインを含む１つの例示的な抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−０１１４」として言及する抗体である。
【０１０２】
別の局面では、抗ＶＥＧＦ抗体を提供し、それにおいて、抗体は、上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＨ配列、及び上に提供する実施態様のいずれかにおけるようなＶＬ配列を含む。一実施態様では、抗体は、それぞれ配列番号４５及び配列番号０２中にＶＨ及びＶＬ配列（それらの配列の翻訳後修飾を含む）を含む。一実施態様では、抗体は、配列番号４５のＶＨドメイン及び配列番号０２のＶＬドメインを含む。前記ＶＨ及びＶＬドメインを含む１つの例示的な抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２１」として言及する抗体である。
【０１０３】
全ての局面の一実施態様では、抗体は、配列番号０４、配列番号１０、及び配列番号１２の群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２を含む。
【０１０４】
全ての局面の一実施態様では、抗体は、配列番号４６及び配列番号４７の群より選択されるアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ３を含む。
【０１０５】
更なる局面では、本発明は、本明細書において提供する抗ＶＥＧＦ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。例えば、特定の実施態様では、配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む抗ＶＥＧＦ抗体と同じエピトープに結合する抗体を提供する。一実施態様では、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、Ｘ線結晶学により測定されるように、本明細書において記載する抗体ＶＥＧＦ−００８９と同じエピトープに結合する。一実施態様では、前記抗ＶＥＧＦ抗体は、実施例１３において記載するように、Ｘ線結晶学により測定されるように、本明細書において記載する抗体ＶＥＧＦ−００８９と同じエピトープに結合する。一実施態様では、ＶＥＧＦ−Ａ１２１の二量体上の立体構造エピトープに結合する抗体を提供し、それにおいて、ＶＥＧＦ−Ａ１２１は配列番号４５のアミノ酸配列を含み、それにおいて、エピトープは、ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子の１つにおいてアミノ酸Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｒ２３、Ｙ２５、Ｈ２７、Ｐ２８、Ｉ２９、Ｅ３０、Ｍ５５、Ｎ６２、Ｌ６６、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｃ１０２、Ｅ１０３、Ｃ１０４、Ｒ１０５、及びＰ１０６；並びに、ＶＥＧＦ二量体内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子の他の１つにおいてアミノ酸Ｅ３０、Ｋ４８、Ｍ８１、及びＱ８７を含む。ナンバリングは、配列番号４５において示すＶＥＧＦ−Ａ１２１のアミノ酸配列中のアミノ酸の位置に従っている（図１３も参照のこと）。一実施態様では、エピトープは、Ｘ線結晶学により測定する。
【０１０６】
本発明の更なる局面では、上の実施態様のいずれかに従った抗ＶＥＧＦ抗体は、モノクローナル抗体（ヒト抗体を含む）である。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、抗体フラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、ｓｃＦｖ、ダイアボディ、又はＦ（ａｂ’）２フラグメントである。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体はＦａｂフラグメントである。別の実施態様では、抗体は、全長抗体、例えば、インタクトなＩｇＧ１抗体又は本明細書において定義するような他の抗体クラスもしくはアイソタイプである。
【０１０７】
更なる局面では、上の実施態様のいずれかに従った抗ＶＥＧＦ抗体は、下のセクション１〜６において記載するような特色のいずれかを、単独で又は組み合わせにおいて組み入れてもよい。
【０１０８】
１．抗体親和性
【０１０９】
特定の実施態様では、本明細書において提供する抗体は、解離定数（Ｋｄ）≦１μM、≦１００nM、≦１０nM、又は≦１nM（例えば、１０−８M又はそれ以下、例えば、１０−８Mから１０−１３M、例えば、１０−９Mから１０−１３M）を有する。
【０１１０】
一実施態様では、本明細書において提供する抗体は、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合する（即ち、≦１５０pMの解離定数（Ｋｄ）を有する）。
【０１１１】
一実施態様では、本明細書において提供する抗体のＦａｂフラグメントは、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合する（即ち、≦１５０pMの解離定数（Ｋｄ）を有する）。一実施態様では、本明細書において提供する抗体は、２５℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合する。一実施態様では、本明細書において提供する抗体は、３７℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合する。一実施態様では、本明細書において提供する抗体は、２５℃及び３７℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合する。
【０１１２】
一実施態様では、本明細書において提供する抗体は、２５℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合し、抗体は、表面プラズモン共鳴により測定した場合、３７℃の温度でより高い又はほぼ同じ親和性でＶＥＧＦに結合する。「ほぼ同じ親和性」を伴いは、３７℃での抗体の親和性（即ち、Ｋｄ）が、２５℃での抗体の親和性（即ち、Ｋｄ）の＋／−５%の範囲内であることを意味する。
【０１１３】
一実施態様では、Ｋｄを、BIACORE（登録商標）表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定する。一実施態様では、Ｋｄは、実施例２において記載するように、表面プラズモン共鳴アッセイを使用して測定する。
【０１１４】
例えば、BIACORE（登録商標）-T-200 a BIACORE（登録商標）-8k（BIAcore, Inc.、ウプサラ）を使用したアッセイを、およそ１０応答単位（ＲＵ）で固定化抗原ＣＭ５チップを用いて２５℃で実施する。一実施態様では、カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（ＣＭ５、BIAcore Inc.）を、供給業者の指示に従い、Ｎ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）−カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）及びＮ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）を用いて活性化する。抗原を、流速５μL/分での注射前に１０mM酢酸ナトリウム（ｐＨ  ４．８）を用いて５μg/ml（およそ０．２μM）まで希釈し、約１０応答単位（ＲＵ）の共役タンパク質を達成する。抗原の注射に続き、１Ｍエタノールアミンを注射し、未反応基を遮断する。動態測定のために、Ｆａｂの２倍連続希釈物（０．７８nMから５００nM）を、０．０５%ポリソルベート２０（TWEEN-20（商標））界面活性剤（ＰＢＳＴ）を伴うＰＢＳ中で、２５℃で、流速約２５μL/分で注射する。会合速度（ｋｏｎ）及び解離速度（ｋｏｆｆ）を、単純な１対１のラングミュア結合モデル（BIAcore（登録商標）Evaluation Softwareバージョン３．２）を使用し、会合及び解離センサーグラムを同時に適合させることにより算出する。平衡解離定数（Ｋｄ）を比率ｋｏｆｆ／ｋｏｎとして算出する。例えば、Chen et al., J. Mol. Biol. 293: 865-881 (1999)を参照のこと。オン速度が、上の表面プラズモン共鳴アッセイにより１０６Ｍ−１  ｓ−１を超える場合、次に、オン速度を、２５℃で、ＰＢＳ（ｐＨ  ７．２）中の２０nMの抗抗原抗体（Ｆａｂ形態）の蛍光発光強度（励起＝２９５nm；発光＝３４０nm、１６nmバンドパス）における増加又は減少を測定する蛍光クエンチング技術を、分光計、例えばストップフロー装備分光光度計（Aviv Instruments）又は8000シリーズSLM-AMINCO（商標）分光光度計（ThermoSpectronic）などにおいて撹拌キュベットを用いて測定されるように、増加濃度の抗原の存在において使用することにより決定することができる。
【０１１５】
２．抗体フラグメント
【０１１６】
特定の実施態様では、本明細書において提供する抗体は、ヒト抗体である。用語「抗体フラグメント」は、抗原に特異的に結合する能力を保持するインタクトな抗体の一部を含むインタクトな抗体以外の分子を指す。抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆａｂ（ｓｃＦａｂ）；一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）及び単一ドメイン抗体（ｄＡｂｓ）を含むが、これらに限定しない。特定の抗体フラグメントの概説については、Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)を参照のこと。
【０１１７】
一実施態様では、抗体フラグメントは、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、又はＦ（ａｂ’）２フラグメント、特にＦａｂフラグメントである。インタクトな抗体のパパイン消化によって、２つの同一の抗原結合フラグメントが産生され、各々が重及び軽鎖可変ドメイン（それぞれＶＨ及びＶＬ）並びに、また、軽鎖の定常ドメイン（ＣＬ）及び重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」フラグメントと呼ぶ。用語「Ｆａｂフラグメント」は、このように、ＶＬドメイン及びＣＬドメインを含む軽鎖、並びにＶＨドメイン及びＣＨ１ドメインを含む重鎖フラグメントを含む抗体フラグメントを指す。Ｆａｂ’フラグメントは、抗体ヒンジ領域からの１つ又は複数のシステインを含むＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での残基の追加によりＦａｂフラグメントとは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が遊離チオール基を持つＦａｂ’フラグメントである。ペプシン処理によって、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂフラグメント）及びＦｃ領域の一部を有するＦ（ａｂ’）２フラグメントがもたらされる。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、増加したインビボ半減期を有するＦａｂ及びＦ（ａｂ’）２フラグメントの考察については、米国特許第５，８６９，０４６号明細書を参照のこと。
【０１１８】
別の実施態様では、抗体フラグメントは、ダイアボディ、トリアボディ、又はテトラボディである。ダイアボディは、２価又は二重特異性でありうる２つの抗原結合部位を伴う抗体フラグメントである。例えば、欧州特許出願公開第４０４，０９７号明細書；国際公開第１９９３／０１１６１号；Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)；及びHollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)を参照のこと。トリアボディ及びテトラボディはまた、Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)において記載されている。
【０１１９】
更なる実施態様では、抗体フラグメントは一本鎖Ｆａｂフラグメントである。「一本鎖Ｆａｂフラグメント」又は「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体重鎖定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、及びリンカーからなるポリペプチドであって、それにおいて、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端の方向における以下の順序の１つを有する：ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、又はｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ。特に、前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２及び５０アミノ酸の間のポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂフラグメントは、ＣＬドメイン及びＣＨ１ドメインの間の天然ジスルフィド結合を介して安定化される。また、これらの一本鎖Ｆａｂフラグメントは、システイン残基の挿入を介した鎖間ジスルフィド結合の生成により更に安定化されうる（例えば、Ｋａｂａｔナンバリングに従った可変重鎖における位置４４及び可変軽鎖における位置１００）。
【０１２０】
別の実施態様では、抗体フラグメントは一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）である。「一本鎖可変フラグメント」又は「ｓｃＦｖ」は、リンカーにより接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）の可変ドメインの融合タンパク質である。特に、リンカーは１０から２５アミノ酸の短いポリペプチドであり、通常は可動性のためのグリシン、並びに溶解性のためのセリン又はスレオニンに富み、ＶＨのＮ末端をＶＬのＣ末端に、又はその逆のいずれかで接続することができる。このタンパク質は、定常領域の除去及びリンカーの導入にもかかわらず、本来の抗体の特異性を保持する。ｓＦｖフラグメントの概説については、例えば、Pluuckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)を参照のこと；また、国際公開第９３／１６１８５号；並びに米国特許第５，５７１，８９４号明細書及び同第５，５８７，４５８号明細書を参照のこと。
【０１２１】
抗体フラグメントは、本明細書において記載するように、種々の技術（インタクトな抗体のタンパク質分解消化並びに組換え宿主細胞（例えば、大腸菌）による組換え産生を含むが、これらに限定しない）により作製することができる。
【０１２２】
３．ヒト抗体
【０１２３】
特定の実施態様では、本明細書において提供する抗体は、ヒト抗体である。ヒト抗体を、当技術分野において公知の種々の技術を使用して産生することができる。ヒト抗体は、一般的に、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001)及びLonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)において記載されている。
【０１２４】
４．多重特異性抗体
【０１２５】
特定の実施態様では、本明細書において提供する抗体は、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位（即ち、異なる抗原上の異なるエピトープ又は同じ抗原上の異なるエピトープ）について結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施態様では、多重特異性抗体は３つ又はそれ以上の結合特異性を有する。特定の実施態様では、結合特異性の１つは、ＶＥＧＦについてであり、他の（２つ又はそれ以上の）特異性は、任意の他の抗原についてである。特定の実施態様では、二重特異性抗体は、ＶＥＧＦの２つ（又はそれ以上）の異なるエピトープに結合しうる。多重特異性（例えば、二重特異性）抗体はまた、ＶＥＧＦを発現する細胞に細胞傷害薬剤又は細胞を局在化させるために使用されうる。多重特異性抗体は、全長抗体又は抗体フラグメントとして調製することができる。
【０１２６】
多重特異性抗体を作製するための技術は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組換え同時発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)を参照のこと）及び「ノブ・イン・ホール」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書、及びAtwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)を参照のこと）を含むが、これらに限定しない。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を作製するための静電ステアリング効果を操作すること（例えば、国際公開第２００９／０８９００４号を参照のこと）；２つ又はそれ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例えば、米国特許第４，６７６，９８０号明細書、及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照のこと）；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を産生すること（例えば、Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992)及び国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照のこと）；軽鎖の誤対合問題を回避するために一般の軽鎖技術を使用すること（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照のこと）；二重特異性抗体フラグメントを作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照のこと）；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと）；及び、例えば、Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)において記載されているように三重特異性抗体を調製することにより作製してもよい。
【０１２７】
例えば、「Ｏｃｔｏｐｕｓ抗体」、又はＤＶＤ−Ｉｇを含む、３つ又はそれ以上の抗原結合部位を伴う操作抗体がまた、本明細書において含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号及び国際公開第２００８／０２４７１５号を参照のこと）。３つ又はそれ以上の抗原結合部位を伴う多重特異性抗体の他の例を、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号、及び国際公開第２０１３／０２６８３１号において見出すことができる。
【０１２８】
多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つ又は複数の結合アームにおいてドメインクロスオーバーを伴う非対称形態において、即ち、ＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号及び国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照のこと）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５３号を参照のこと）又は完全なＦａｂアーム（例えば、国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照のこと、また、Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191、及びKlein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20を参照のこと）を交換することにより提供してもよい。一実施態様では、多重特異性抗体はクロスＦａｂフラグメントを含む。用語「クロスＦａｂフラグメント」又は「クロスオーバーＦａｂフラグメント」は、重鎖及び軽鎖の可変領域又は定常領域のいずれかが交換されているＦａｂフラグメントを指す。クロスＦａｂフラグメントは、軽鎖可変領域（ＶＬ）及び重鎖定常領域１（ＣＨ１）で構成されるポリペプチド鎖、並びに重鎖可変領域（ＶＨ）及び軽鎖定常領域（ＣＬ）で構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームはまた、荷電又は非荷電アミノ酸変異をドメイン界面中に導入し、正しいＦａｂ対合に向けることにより操作することができる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照のこと。
【０１２９】
多重特異性抗体についての種々の更なる分子フォーマットが当技術分野において公知であり、本明細書中に含まれる（例えば、Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106を参照のこと）。
【０１３０】
５．抗体変異体
【０１３１】
特定の実施態様では、本明細書において提供する抗体のアミノ酸配列変異体を熟慮する。例えば、抗体の結合親和性及び／又は他の生物学的特性を変えることが望まれうる。抗体のアミノ酸配列変異体を、抗体をコードするヌクレオチド配列中へ適当な修飾を導入することにより、又はペプチド合成により調製してもよい。そのような修飾は、例えば、抗体のアミノ酸配列内の残基からの欠失、及び／又はその中への挿入、及び／又はその置換を含む。欠失、挿入、及び置換の任意の組み合わせを作製し、最終的な構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合）を保持するという条件で、最終的な構築物に達することができる。
【０１３２】
ａ）置換、挿入、及び欠失変異体
【０１３３】
特定の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸置換を有する抗体変異体を提供する。置換変異誘発のための目的の部位は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）及びＦＲを含む。保存的置換を表Ｉにおいて「好ましい置換」の見出しの下に示す。より実質的な変化を、表Ｉにおいて「例示的な置換」の見出しの下に提供し、アミノ酸側鎖クラスを参照して下に更に記載するとおりである。アミノ酸置換を目的の抗体中に導入し、産物を、所望の活性（例えば、保持／改善された抗原結合、減少した免疫原性、又は改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣ）についてスクリーニングしてもよい。
【表１】
2021508472.tif 000003
アミノ酸は、一般の側鎖の特性に従ってグループ化されうる：
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；
（５）鎖の方向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０１３４】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを、別のクラスのメンバーについて交換することを伴いうる。
【０１３５】
置換変異体の１つの型は、親抗体（例えば、ヒト化又はヒト抗体）の１つ又は複数の超可変領域の残基を置換することを含む。一般的には、更なる試験のために選択された、結果として得られる変異体は、親抗体と比べて、特定の生物学的特性（例えば、増加した親和性、低下した免疫原性）における修飾（例えば、改善）を有するであろう、及び／又は、親抗体の特定の生物学的特性を実質的に保持するであろう。例示的な置換変異体は親和性成熟抗体であり、それは、例えば、ファージディスプレイベースの親和性成熟技術（例えば、本明細書において記載するものなど）を使用して便利に生成されうる。簡単には、１つ又は複数のＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）残基を変異させ、変異体抗体をファージ上に提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０１３６】
変化（例えば、置換）は、例えば、抗体の親和性を改善させるために、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）において作製してもよい。そのような変化は、ＨＶＲ「ホットスポット」、即ち、体細胞成熟プロセスの間に高頻度で変異を受けるコドンによりコードされる残基（例えば、Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)を参照のこと）、及び／又は抗原に接触する残基において作製してもよく、結果として得られる変異体ＶＨもしくはＶＬを結合親和性についてテストする。二次ライブラリーを構築し、それより再選択することによる親和性成熟が、例えば、Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37(O’Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001)）において記載されている。親和性成熟の一部の実施態様では、多様性を、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリング、又はオリゴヌクレオチド特異的変異誘発）のいずれかによる成熟のために選ばれた可変遺伝子中に導入する。二次ライブラリーを次に作る。ライブラリーを次にスクリーニングし、所望の親和性を伴う任意の抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）特異的アプローチを含み、それにおいて、いくつかのＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）を無作為化する。抗原結合において含まれるＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）残基を、例えば、アラニンスキャニング変異誘発又はモデリングを使用して特異的に同定しうる。ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３を特にしばしば標的にする。
【０１３７】
特定の実施態様では、置換、挿入、又は欠失は、そのような変化によって、抗原に結合する抗体の能力が実質的に低下しない限り、１つ又は複数のＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）内で生じうる。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変化（例えば、本明細書において提供する保存的置換）を、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）において作製しうる。そのような変化は、例えば、ＨＶＲ（例えば、ＣＤＲ）における抗原接触残基の外側でありうる。上に提供する、変異体ＶＨ及びＶＬ配列の特定の実施態様では、各々のＨＶＲを変化させない、あるいは、１つ、２つ、又は３つ未満のアミノ酸置換を含む。
【０１３８】
変異誘発のために標的にされうる抗体の残基又は領域の同定のための有用な方法は、「アラニンスキャニング変異誘発」と呼ばれ、Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085により記載されるとおりである。この方法において、標的残基の残基又は基（例えば、荷電残基、例えばａｒｇ、ａｓｐ、ｈｉｓ、ｌｙｓ、及びｇｌｕなど）を同定し、中性又は負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニン又はポリアラニン）により置換され、抗体と抗原との相互作用が影響されるか否かを決定する。更なる置換をアミノ酸位置に導入し、初期置換への機能的感受性を実証してもよい。あるいは、又は加えて、抗原−抗体複合体の結晶構造を使用して抗体及び抗原の間での接触点を同定してもよい。そのような接触残基及び隣接残基は、置換のための候補として標的にしてもよい又は排除してもよい。変異体をスクリーニングし、それらが所望の特性を含むか否かを決定してもよい。
【０１３９】
アミノ酸配列の挿入は、１つの残基から１００又はそれ以上の残基を含むポリペプチドまでの長さの範囲のアミノ及び／又はカルボキシ末端融合体、並びに単一の又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入を含む。末端挿入の例は、Ｎ末端メチオニル残基を伴う抗体を含む。抗体分子の他の挿入変異体は、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴについて（抗体特異的酵素プロドラッグ治療））又は抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドへの抗体のＮ又はＣ末端への融合体を含む。
【０１４０】
ｂ）グリコシル化変異体
【０１４１】
特定の実施態様では、本明細書において提供する抗体を変化させ、抗体がグリコシル化される程度を増加又は減少させる。抗体へのグリコシル化部位の付加又は欠失は、便利には、１つ又は複数のグリコシル化部位が作られる又は除去されるように、アミノ酸配列を変化させることにより達成してもよい。
【０１４２】
抗体がＦｃ領域を含む場合、それに付着されたオリゴ糖は変化されうる。哺乳動物細胞により産生される天然抗体は、典型的には、Ｎ連結により、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７に一般的に付着される分枝、二分岐オリゴ糖を含む。例えば、Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997)を参照のこと。オリゴ糖は、種々の糖質、例えば、マンノース、Ｎアセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、及びシアル酸、並びに二分岐オリゴ糖構造の「ステム」においてＧｌｃＮＡｃに付着されたフコースを含みうる。一部の実施態様では、本発明の抗体におけるオリゴ糖の修飾を、特定の改善された特性を伴う抗体変異体を作るために作製してもよい。
【０１４３】
一実施態様では、非フコシル化オリゴ糖、即ち、Ｆｃ領域に（直接的又は間接的に）付着されたフコースを欠くオリゴ質構造を有する抗体変異体を提供する。そのような非フコシル化オリゴ糖（「アフコシル化」オリゴ糖としても言及する）は、特に、二分岐オリゴ糖構造のステムにおいて第１のＧｌｃＮＡｃに付着されたフコース残基を欠くＮ連結オリゴ糖である。一実施態様では、天然又は親抗体と比較し、Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の増加した割合を有する抗体変異体を提供する。例えば、非フコシル化オリゴ糖の割合は、少なくとも約２０%、少なくとも約４０%、少なくとも約６０%、少なくとも約８０%、又は更に約１００%（即ち、フコシル化オリゴ糖は存在しない）でありうる。非フコシル化オリゴ糖のパーセンテージは、例えば、国際公開第２００６／０８２５１５号において記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法により測定されるように、Ａｓｎ  ２９７に付着された全てのオリゴ糖（例：複雑、ハイブリッド、及び高マンノース構造）の合計と比べた、フコース残基を欠くオリゴ糖の（平均）量である。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域におけるおよそ位置２９７（Ｆｃ領域残基のＥＵナンバリング）に位置付けられるアスパラギン残基を指す；しかし、Ａｓｎ２９７はまた、抗体における小さな配列変動に起因して、位置２９７の上流又は下流の約±３アミノ酸、即ち、位置２９４及び３００の間に位置付けられうる。Ｆｃ領域における非フコシル化オリゴ糖の増加した割合を有するそのような抗体は、改善されたＦｃγＲＩＩＩａ受容体結合及び／又は改善されたエフェクター機能、特に改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。例えば、米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書；米国特許出願公開第２００４／００９３６２１号明細書を参照のこと。
【０１４４】
低下したフコシル化を伴う抗体を産生することが可能である細胞株の例は、タンパク質フコシル化において欠損したＬｅｃ１３  ＣＨＯ細胞（Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986)；米国特許出願公開第２００３／０１５７１０８号明細書；及び国際公開第２００４／０５６３１２号、特に実施例１１で）、及びノックアウト細胞株、例えばアルファ−１，６−フコシルトランスフェラーゼ遺伝子、ＦＵＴ８ノックアウトＣＨＯ細胞など（例えば、Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004)；Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006)；及び国際公開第２００３／０８５１０７号を参照のこと）、又はＧＤＰ−フコース合成もしくはトランスポータータンパク質の低下もしくは消失した活性を伴う細胞（例えば、米国特許出願公開第２００４／２５９１５０号明細書、米国特許出願公開第２００５／０３１６１３号明細書、米国特許出願公開第２００４／１３２１４０号明細書、米国特許出願公開第２００４／１１０２８２号明細書を参照のこと）を含む。
【０１４５】
更なる実施態様では、二分されたオリゴ糖を伴う抗体変異体を提供し、例えば、それにおいて、抗体のＦｃ領域に付着した二分岐オリゴ糖は、ＧｌｃＮＡｃにより二分されている。そのような抗体変異体は、上に記載するように、低下したフコシル化及び／又は改善されたＡＤＣＣ機能を有しうる。そのような抗体変異体の例は、例えば、Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999)；Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006)；国際公開第９９／５４３４２号；国際公開第２００４／０６５５４０号、国際公開第２００３／０１１８７８号において記載されている。
【０１４６】
Ｆｃ領域に付着されたオリゴ糖中に少なくとも１つのガラクトース残基を伴う抗体変異体も提供する。そのような抗体変異体は、改善されたＣＤＣ機能を有しうる。そのような抗体変異体は、例えば、国際公開第１９９７／３００８７号；国際公開第１９９８／５８９６４号；及び国際公開第１９９９／２２７６４号において記載されている。
【０１４７】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
【０１４８】
特定の実施態様では、１つ又は複数のアミノ酸修飾を、本明細書において提供する抗体のＦｃ領域中に導入し、それにより、Ｆｃ領域変異体を生成してもよい。Ｆｃ領域変異体は、１つ又は複数のアミノ酸位置にアミノ酸修飾（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、又はＩｇＧ４  Ｆｃ領域）を含みうる。
【０１４９】
特定の実施態様では、本発明によって、一部（しかし、全てではない）のエフェクター機能を保持する抗体変異体が熟慮され、それによって、それは、インビボでの抗体の半減期が重要であるが、しかし、特定のエフェクター機能（例えば補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）及び抗体依存性細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）など）が不要又は有害である適用のための望ましい候補となる。インビトロ及び／又はインビボの細胞傷害性アッセイを行い、ＣＤＣ及び／又はＡＤＣＣ活性の低下／枯渇を確認することができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイを行い、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それ故に、ＡＤＣＣ活性を欠く可能性が高い）、しかし、ＦｃＲｎ結合能力は保持することを確実にすることができる。ＡＤＣＣを媒介するための初代細胞、ＮＫ細胞がＦｃγＲＩＩＩだけを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞上でのＦｃ発現が、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)の４６４頁の表３において要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例が、米国特許第５，５００，３６２号明細書（例えば、Hellstrom, I. et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)）及びHellstrom, I et al., Proc. Nat’l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985)；５，８２１，３３７（Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)を参照のこと）において記載されている。あるいは、非放射性アッセイ方法を用いてもよい（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（CellTechnology, Inc.、カリフォルニア州マウンテンビュー；及びCytoTox96（登録商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（Promega、ウィスコンシン州マジソン））を参照のこと）。そのようなアッセイのための有用なエフェクター細胞は、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を含む。あるいは、又は加えて、目的の分子のＡＤＣＣ活性を、インビボで、例えば、動物モデル、例えばClynes et al. Proc. Nat’l Acad. Sci. USA  95:652-656 (1998)において開示されているものなどにおいて評価しうる。Ｃ１ｑ結合アッセイも行い、抗体がＣ１ｑに結合することができず、それ故にＣＤＣ活性を欠くことを確認してもよい。例えば、国際公開第２００６／０２９８７９号及び国際公開第２００５／１００４０２号におけるＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照のこと。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを実施してもよい（例えば、Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996)；Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003)；及びCragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)を参照のこと）。ＦｃＲｎ結合及びインビボクリアランス／半減期の決定を、当技術分野において公知の方法を使用して実施することもできる（例えば、Petkova, S.B. et al., Int’l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006)；国際公開第２０１３／１２０９２９号を参照のこと）。
【０１５０】
低下したエフェクター機能を伴う抗体は、Ｆｃ領域残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、及び３２９の１つ又は複数の置換を伴う抗体を含む（米国特許第６，７３７，０５６号明細書）。そのようなＦｃ変異体は、アラニンへの残基２６５及び２９７の置換を伴う、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７、及び３２７の２つ又はそれ以上で置換を伴うＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号明細書）。
【０１５１】
ＦｃＲへの改善又は減弱された結合を伴う特定の抗体変異体が記載されている（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号明細書；国際公開第２００４／０５６３１２号、及びShields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)を参照のこと）。
【０１５２】
特定の実施態様では、抗体変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／又は３３４（残基のＥＵナンバリング）での置換を伴うＦｃ領域を含む。
【０１５３】
特定の実施態様では、抗体変異体は、ＦｃγＲ結合を減弱させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２３４及び／又は２３５（残基のＥＵナンバリング）での置換を伴うＦｃ領域を含む。一実施態様では、置換はＬ２３４Ａ及びＬ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）である。特定の実施態様では、抗体変異体は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域から由来するＦｃ領域におけるＤ２６５Ａ及び／又はＰ３２９Ｇを更に含む。一実施態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域から由来するＦｃ領域におけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＰ３２９Ｇ（ＬＡＬＡ−ＰＧ）である。（例えば、国際公開第２０１２／１３０８３１号を参照のこと）。別の実施態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域から由来するＦｃ領域におけるＬ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ、及びＤ２６５Ａ（ＬＡＬＡ−ＤＡ）である。
【０１５４】
一部の実施態様では、変化した（即ち、改善又は減弱された）Ｃ１ｑ結合及び／又は補体依存性細胞傷害性（ＣＤＣ）をもたらす変化をＦｃ領域において作製し、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号明細書、国際公開第９９／５１６４２号、及びIdusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)において記載されるとおりである。
【０１５５】
増加した半減期及び新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への改善した結合を伴う抗体は、それらは、胎児への母体ＩｇＧの移行に関与し（Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976)及びKim et al., J. Immunol. 24:249 (1994)）、米国特許出願公開第２００５／００１４９３４号明細書（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）において記載されている。それらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善させる１つ又は複数の置換をその中に伴うＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域残基：２３８、２５２、２５４、２５６、２６５、２７２、２８６、３０３、３０５、３０７、３１１、３１２、３１７、３４０、３５６、３６０、３６２、３７６、３７８、３８０、３８２、４１３、４２４、又は４３４の１つ又は複数での置換、例えば、Ｆｃ領域残基４３４の置換（例えば、米国特許第７，３７１，８２６号明細書；Dall’Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524を参照のこと）を伴うものを含む。
【０１５６】
マウスＦｃマウスＦｃＲｎ相互作用に決定的なＦｃ領域残基が、部位特異的変異誘発により同定されている（例えば、Dall’Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180を参照のこと）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、Ｈ４３３、Ｎ４３４、及びＨ４３５（Ｋａｂａｔに従ったＥＵナンバリング）が相互作用において含まれる（Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533；Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993；Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542）。残基Ｉ２５３、Ｈ３１０、及びＨ４３５が、ヒトＦｃとマウスＦｃＲｎとの相互作用のために決定的であることが見いだされた（Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819）。ヒトＦｃ−ヒトＦｃＲｎ複合体の試験では、残基Ｉ２５３、Ｓ２５４、Ｈ４３５、及びＹ４３６が、相互作用のために重大であることが示されている（Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993；Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604)。Yeung, Y.A., et al.(J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671）において、残基２４８から２５９及び３０１から３１７及び３７６から３８２及び４２４から４３７の種々の変異体が、報告及び検証されている。
【０１５７】
特定の実施態様では、抗体変異体は、ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２５３、及び／又は３１０、及び／又は４３５（残基のＥＵナンバリング）での置換を伴うＦｃ領域を含む。特定の実施態様では、抗体変異体は、位置２５３、３１０、及び４３５でのアミノ酸置換を伴うＦｃ領域を含む。一実施態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域から由来するＦｃ領域中のＩ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、及びＨ４３５Ａである。例えば、Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508を参照のこと。
【０１５８】
特定の実施態様では、抗体変異体は、ＦｃＲｎ結合を低下させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置３１０、及び／又は４３３、及び／又は４３６（残基のＥＵナンバリング）での置換を伴うＦｃ領域を含む。特定の実施態様では、抗体変異体は、位置３１０、４３３、及び４３６でのアミノ酸置換を伴うＦｃ領域を含む。一実施態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域から由来するＦｃ領域中のＨ３１０Ａ、Ｈ４３３Ａ、及びＹ４３６Ａである。（例えば、国際公開第２０１４／１７７４６０号を参照のこと）。
【０１５９】
特定の実施態様では、抗体変異体は、ＦｃＲｎ結合を増加させる１つ又は複数のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２５２、及び／又は２５４、及び／又は２５６（残基のＥＵナンバリング）での置換を伴うＦｃ領域を含む。特定の実施態様では、抗体変異体は、位置２５２、２５４、及び２５６でのアミノ酸置換を伴うＦｃ領域を含む。一実施態様では、置換は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域から由来するＦｃ領域中のＭ２５２Ｙ、Ｓ２５４Ｔ、及びＴ２５６Ｅである。
【０１６０】
Ｆｃ領域変異体の他の例に関する、Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988)；米国特許第５，６４８，２６０号明細書；米国特許第５，６２４，８２１号明細書；及び国際公開第９４／２９３５１号も参照のこと。
【０１６１】
ｄ）システイン操作抗体変異体
【０１６２】
特定の実施態様では、抗体の１つ又は複数の残基がシステイン残基を用いて置換されているシステイン操作抗体（例えば、ＴＨＩＯＭＡＢ（商標）抗体）を作ることが望ましいであろう。特定の実施態様では、置換残基は、抗体の接近可能な部位で生じる。それらの残基を、システインを用いて置換することにより、反応性チオール基は、それにより、抗体の接近可能な部位に位置付けられ、抗体を、他の部分、例えば薬物部分又はリンカー−薬物部分などに共役させるために使用し、本明細書において更に記載するように、免疫複合体を作ってもよい。システイン操作抗体は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号明細書、同第８，３０，９３０号明細書、同第７，８５５，２７５号明細書、同第９，０００，１３０号明細書、又は国際公開第２０１６／０４０８５６号において記載されているように生成してもよい。
【０１６３】
６．免疫複合体
【０１６４】
本発明はまた、１つ又は複数の治療的薬剤、例えば細胞傷害性薬剤、化学療法薬剤、薬物、成長阻害薬剤、毒素（例えば、タンパク質毒素、細菌、真菌、植物、もしくは動物起源の酵素活性毒素、又はそれらのフラグメント）、又は放射性同位体などに共役（化学結合）された本明細書における抗ＶＥＧＦ抗体を含む免疫複合体を提供する。
【０１６５】
一実施態様では、免疫複合体は、抗体が上で言及する治療的薬剤の１つ又は複数に共役されている抗体−薬物複合体（ＡＤＣ）である。抗体は、典型的には、リンカーを使用し、治療的薬剤の１つ又は複数に接続される。治療的薬剤及び薬物並びにリンカーの例を含むＡＤＣ技術の概要が、Pharmacol Review 68:3-19 (2016)において示されている。
【０１６６】
別の実施態様では、免疫複合体は、酵素的に活性な毒素又はそのフラグメント（ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合活性フラグメント、外毒素Ａ鎖（緑膿菌から）、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシンＡ鎖、アルファ−サルシン、シナアブラギリタンパク質、ジアチンタンパク質、フィトラカアメリカーナタンパク質（ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ、及びＰＡＰ−Ｓ）、モモルディカカランティア阻害剤、クルシン、クロチン、サパオナリアオフィシナリス阻害剤、ゲロニン、ミトジェリン、レストリクトシン、フェノマイシン、エノマイシン、及びトリコテセンを含むが、これらに限定しない）に共役された、本明細書において記載する抗体を含む。
【０１６７】
別の実施態様では、免疫複合体は、放射性原子に共役されて放射性複合体を形成する、本明細書において記載する抗体を含む。種々の放射性同位体を放射性複合体の産生のために利用可能である。例には、Ａｔ２１１、Ｉ１３１、Ｉ１２５、Ｙ９０、Ｒｅ１８６、Ｒｅ１８８、Ｓｍ１５３、Ｂｉ２１２、Ｐ３２、Ｐｂ２１２、及びＬｕの放射性同位体が含まれる。放射性複合体を検出のために使用する場合、それは、シンチグラフィー試験用の放射性原子、例えば、Ｔｔｃ−９９ｍもしくはＩ１２３、又は核磁気共鳴（ＮＭＲ）イメージング（磁気共鳴イメージング、ｍｒｉとしても公知である）用のスピンラベル、例えば再びヨウ素−１２３、ヨウ素−１３１、インジウム−１１１、フッ素−１９、炭素−１３、窒素−１５、酸素−１７、ガドリニウム、マンガン、又は鉄などを含みうる。
【０１６８】
抗体及び細胞傷害性薬剤の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング薬剤、例えばＮ−スクシンイミジル−３−（２−ピリジルジチオール）プロピオン酸（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）、イミノチオラン（ＩＴ）、イミドエステルの二官能性誘導体（例えばジメチルアジピミダートＨＣＬなど）、活性エステル類（例えばスベリン酸ジスクシンイミジルなど）、アルデヒド（例えばグルタルアルデヒドなど）、ビス−アジド化合物（例えばビス（ｐ−アジドベンゾイル）ヘキサンジアミンなど）、ビス−ジアゾニウム誘導体（例えばビス−（ｐ−ジアゾニウムベンゾイル）エチレンジアミンなど）、ジイソシアネート（例えばトルエン２，６−ジイソシアネートなど）、及びビス活性フッ素化合物（例えば１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベンゼンなど）を使用して作製しうる。例えば、リシン免疫毒素を、Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)において記載されているように調製することができる。炭素１４標識１−イソチオシアナートベンジル−３−メチルジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＭＸ−ＤＴＰＡ）は、抗体への放射性ヌクレオチドの共役のための例示的なキレート薬剤である。国際公開第９４／１１０２６号を参照のこと。リンカーは、細胞における細胞傷害性薬物の放出を促進する「切断可能なリンカー」でありうる。例えば、酸に不安定なリンカー、ペプチダーゼ感受性リンカー、感光性リンカー、ジメチルリンカー、又はジスルフィド含有リンカー（Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992)；米国特許第５，２０８，０２０号明細書）を使用してもよい。
【０１６９】
本明細書における免疫複合体又はＡＤＣは、限定しないが、架橋試薬を用いて調製されるそのような複合体（ＢＭＰＳ、ＥＭＣＳ、ＧＭＢＳ、ＨＢＶＳ、ＬＣ−ＳＭＣＣ、ＭＢＳ、ＭＰＢＨ、ＳＢＡＰ、ＳＩＡ、ＳＩＡＢ、ＳＭＣＣ、ＳＭＰＢ、ＳＭＰＨ、スルホＥＭＣＳ、スルホＧＭＢＳ、スルホＫＭＵＳ、スルホＭＢＳ、スルホＳＩＡＢ、スルホＳＭＣＣ、及びスルホＳＭＰＢ、並びにＳＶＳＢ（スクシンイミジル−（４−ビニルスルホン）安息香酸）を含むが、これらに限定しない。これらは商業的に利用可能である（例えば、Pierce Biotechnology、Inc.、米国イリノイ州ロックフォードから））を明示的に熟慮する。
【０１７０】
Ｂ．組み換え方法及び組成物
【０１７１】
抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号明細書において記載されるように、組換え方法及び組成物を使用して産生しうる。これらの方法のために、抗体をコードする１つ又は複数の単離核酸を提供する。
【０１７２】
天然抗体又は天然抗体フラグメントの場合では、２つの核酸が要求され、１つは軽鎖又はそのフラグメント用であり、１つは重鎖又はそのフラグメント用である。そのような核酸は、抗体のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又はＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の軽鎖及び／又は重鎖）をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上又は異なる発現ベクター上にあることができる。
【０１７３】
ヘテロ二量体重鎖を伴う二重特異性抗体の場合では、４つの核酸が要求され、１つは第１の軽鎖用であり、１つは第１のヘテロ単量体Ｆｃ領域ポリペプチドを含む第１の重鎖用であり、１つは第２の軽鎖用であり、及び１つは第２のヘテロ単量体Ｆｃ領域ポリペプチドを含む第２の重鎖用である。４つの核酸は、１つ又は複数の核酸分子又は発現ベクター中に含まれることができる。そのような核酸は、抗体の第１のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は第１のヘテロ単量体Ｆｃ領域を含む第１のＶＨを含むアミノ酸配列及び／又は第２のＶＬを含むアミノ酸配列及び／又は第２のヘテロ単量体Ｆｃ領域を含む第２のＶＨを含むアミノ酸配列（例えば、抗体の第１及び／又は第２の軽鎖並びに／あるいは第１及び／又は第２の重鎖）をコードする。これらの核酸は、同じ発現ベクター上又は異なる発現ベクター上にあることができ、通常、これらの核酸は２つ又は３つの発現ベクター上に位置付けられ、即ち、１つのベクターが１を上回るこれらの核酸を含むことができる。これらの二重特異性抗体の例は、ＣｒｏｓｓＭａｂである（例えば、Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191を参照のこと）。例えば、ヘテロ単量体重鎖の１つは、いわゆる「ノブ変異」（Ｔ３６６Ｗ及び、場合により、Ｓ３５４Ｃ又はＹ３４９Ｃの１つ）を含み、他は、いわゆる「ホール変異」（Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８Ａ、及びＹ４０７Ｖ並びに、場合により、Ｙ３４９Ｃ又はＳ３５４Ｃ）（Ｋａｂａｔ  ＥＵナンバリングに従う）（例えば、Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73を参照のこと）を含む。
【０１７４】
一実施態様では、本明細書中で報告する方法において使用される抗体をコードする単離核酸を提供する。
【０１７５】
一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体を作製する方法を提供し、それにおいて、方法は、上に提供するように、抗体をコードする核酸を含む宿主細胞を、抗体の発現のために適切な条件下で培養すること、及び、場合により、宿主細胞（又は宿主細胞培養培地）から抗体を回収することを含む。
【０１７６】
抗ＶＥＧＦ抗体の組換え産生のために、抗体をコードする核酸（例えば、上に記載する）を単離し、宿主細胞における更なるクローニング及び／又は発現のために、１つ又は複数のベクター中に挿入する。そのような核酸は、従来の手順（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）を使用して容易に単離及び配列決定されうる、又は組換え方法により産生されうる、又は化学合成により得られうる。
【０１７７】
抗体をコードするベクターのクローニング又は発現のための適切な宿主細胞は、本明細書において記載する原核細胞又は真核細胞を含む。例えば、抗体は、特に、グリコシル化及びＦｃエフェクター機能が必要とされない場合、細菌中で産生されうる。細菌における抗体フラグメント及びポリペプチドの発現については、例えば、米国特許第５，６４８，２３７号明細書、米国特許第５，７８９，１９９号明細書、及び米国特許第５，８４０，５２３号明細書を参照のこと（また、大腸菌における抗体フラグメントの発現を記載する、Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254を参考のこと）。発現後、抗体は、可溶性画分中の細菌細胞ペーストから単離してもよく、更に精製することができる。
【０１７８】
原核生物に加えて、真核微生物（例えば糸状菌又は酵母など）が、抗体をコードするベクターのために適切なクローニング又は発現宿主であり、グリコシル化経路が「ヒト化」されている真菌株及び酵母株を含み、部分的又は完全なヒトグリコシル化パターンを伴う抗体の産生をもたらす。Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414；及びLi, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215を参照のこと。
【０１７９】
（グリコシル化）抗体の発現のための適切な宿主細胞はまた、多細胞生物（無脊椎動物及び脊椎動物）から由来する。無脊椎動物細胞の例は、植物細胞及び昆虫細胞を含む。多数のバキュロウイルス株が同定されており、それらは、特にスポドプテラフルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）細胞のトランスフェクションのために昆虫細胞と併せて使用されうる。
【０１８０】
植物細胞培養物も宿主として利用することができる。例えば、米国特許第５，９５９，１７７号明細書、米国特許第６，０４０，４９８号明細書、米国特許第６，４２０，５４８号明細書、米国特許第７，１２５，９７８号明細書、及び米国特許第６，４１７，４２９号明細書（トランスジェニック植物において抗体を産生するためのPLANTIBODIES（商標）技術が記載されている）を参照のこと。
【０１８１】
脊椎動物細胞も宿主として使用してもよい。例えば、懸濁液中で成長するように適合されている哺乳動物細胞株が有用でありうる。有用な哺乳動物宿主細胞株の他の例は、ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７）；ヒト胚腎臓株（例えば、Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74において記載されている２９３又は２９３Ｔ細胞）；ベビーハムスター腎臓細胞（ＢＨＫ）；マウスセルトリ細胞（例えば、Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252において記載されているＴＭ４細胞）；サル腎臓細胞（ＣＶ１）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６）；ヒト子宮頸癌細胞（ＨＥＬＡ）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ）；バッファローラット肝臓細胞（ＢＲＬ  ３Ａ）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２）；ＴＲＩ細胞（例えば、Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68において記載されている）；ＭＲＣ５細胞；及びＦＳ４細胞である。他の有用な哺乳動物宿主細胞株は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（ＤＨＦＲ−ＣＨＯ細胞を含む）（Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220）；及び骨髄腫細胞株（例えばＹ０、ＮＳ０、及びＳＰ２／０など）を含む。抗体産生のために適切な特定の哺乳動物宿主細胞株の概説については、例えば、Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268を参照のこと。
【０１８２】
一実施態様では、宿主細胞は真核生物、例えば、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞又はリンパ系細胞（例えば、Ｙ０、ＮＳ０、Ｓｐ２０細胞）である。
【０１８３】
Ｃ．結合アッセイ
【０１８４】
本明細書において提供する抗ＶＥＧＦ抗体を、当技術分野において公知の種々のアッセイにより、それらの物理的／化学的特性及び／又は生物学的活性について同定しうる、スクリーニングしうる、又は特徴付けうる。
【０１８５】
一局面では、本発明の抗体は、例えば、公知の方法（例えばＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなど）により、その抗原結合活性について試験する。
【０１８６】
別の局面では、競合アッセイを使用し、ＶＥＧＦへの結合について、配列番号０１のＶＨドメイン及び配列番号０２のＶＬドメインを含む抗体と競合する抗体を同定しうる。
【０１８７】
例示的な競合アッセイでは、固定化ＶＥＧＦを、配列番号０１のＶＨドメイン及び配列番号０２のＶＬドメインを含む、ＶＥＧＦに結合する第１の標識抗体（例えば、抗ＶＥＧＦ−００８９）並びにＶＥＧＦへの結合について第１の抗体と競合するその能力についてテストされている第２の非標識抗体を含む溶液中でインキュベートする。第２の抗体はハイブリドーマ上清中に存在しうる。対照として、固定化ＶＥＧＦを、第１の標識抗体を含むが、しかし、第２の非標識抗体は含まない溶液中でインキュベートする。ＶＥＧＦへの第１の抗体の結合について許容的な条件下でのインキュベーション後、過剰な未結合抗体を除去し、固定化ＶＥＧＦに関連付けられる標識の量を測定する。固定化ＶＥＧＦに関連付けられる標識の量が、対照サンプルと比べて、テストサンプル中で実質的に低下している場合、次に、それは、第２の抗体がＶＥＧＦへの結合について第１の抗体と競合していることを示す。Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14(Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY)を参照のこと。
【０１８８】
Ｄ．医薬組成物
【０１８９】
更なる局面では、例えば、下の治療的方法のいずれかにおける使用のために、本明細書において提供する抗体のいずれかを含む医薬組成物を提供する。一局面では、医薬組成物は、本明細書において提供する抗体のいずれか及び医薬的に許容可能な担体を含む。別の局面では、医薬組成物は、例えば、下に記載するように、本明細書において提供する抗体のいずれか及び少なくとも１つの追加の治療的薬剤を含む。
【０１９０】
本明細書において記載する抗ＶＥＧＦ抗体の医薬組成物は、所望の程度の純度を有するそのような抗体を、１つ又は複数の任意の医薬的に許容可能な担体と混合することにより（Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)）、凍結乾燥組成物又は水溶液の形態において調製する。医薬的に許容可能な担体は、一般的に、用いられる投与量及び濃度でレシピエントに非毒性であり、緩衝剤、例えばヒスチジン、リン酸、クエン酸、酢酸、及び他の有機酸など；抗酸化剤（アスコルビン酸及びメチオニンを含む）；保存剤（例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチル又はプロピルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリジンなど；単糖類、二糖類、及び他の糖質（グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む）；キレート薬剤（例えばＥＤＴＡなど）；糖（例えばスクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなど）；塩形成対イオン（例えばナトリウムなど）；金属複合体（例えば、Ｚｎタンパク質複合体）；及び／又は非イオン性界面活性剤（例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）など）を含むが、これらに限定しない。例示的な医薬的に許容可能な担体は、本明細書において、侵入型薬物分散薬剤、例えば可溶性の中性活性ヒアルロニダーゼ糖タンパク質（ｓＨＡＳＥＧＰ）、例えば、ヒト可溶性ＰＨ−２０ヒアルロニダーゼ糖タンパク質、例えばｒＨｕＰＨ２０（HYLENEX（登録商標）、Halozyme, Inc.）などを更に含む。特定の例示的なｓＨＡＳＥＧＰ及び使用の方法（ｒＨｕＰＨ２０を含む）が、米国特許公開第２００５／０２６０１８６号明細書及び同第２００６／０１０４９６８号明細書において記載されている。一局面では、ｓＨＡＳＥＧＰは、１つ又は複数の追加のグリコサミノグリカナーゼ（例えばコンドロイチナーゼなど）と組み合わせる。
【０１９１】
例示的な凍結乾燥された抗体組成物が、米国特許第６，２６７，９５８号明細書において記載されている。水性抗体組成物は、米国特許第６，１７１，５８６号明細書及び国際公開第２００６／０４４９０８に号おいて記載されている組成物を含み、後者の組成物はヒスチジン−酢酸緩衝剤を含む。
【０１９２】
活性成分は、例えば、コアセルベーション技術により、又は界面重合により調製されたマイクロカプセル中に封入してもよく、例えば、コロイド薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルジョン、ナノ粒子、及びナノカプセル）中の又はマクロエマルジョン中のそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート（ｍｅｔｈｙｌｍｅｔｈａｃｙｌａｔｅ））マイクロカプセル）である。そのような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)において開示されている。
【０１９３】
徐放用の医薬組成物を調製しうる。徐放調製物の適切な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形品の形態（例えば、フィルム、又はマイクロカプセル）である。
【０１９４】
インビボ投与のために使用される医薬組成物は、一般的に無菌である。無菌性は、例えば、無菌濾過膜を通じた濾過により容易に達成されうる。
【０１９５】
Ｅ．治療的方法及び投与の経路
【０１９６】
本明細書において提供する抗ＶＥＧＦ抗体のいずれかを、治療的方法において使用してもよい。
【０１９７】
一局面では、医薬としての使用のための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。更なる局面では、ＶＥＧＦ関連疾患（例えば、癌又は眼疾患）の処置に使用するための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。特定の実施態様では、処置の方法における使用のための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、個体に有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む、ＶＥＧＦ関連疾患（例えば、癌又は眼疾患）を有する個体を処置する方法における使用のための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。１つのそのような実施態様において、方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療的薬剤（例えば、１、２、３、４、５、又は６つの追加の治療的薬剤）を個体に投与することを更に含む（例えば、下に記載するとおり）。更なる実施態様では、本発明は、血管新生の阻害に使用するための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。特定の実施態様では、本発明は、血管新生を阻害するための有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を個体に投与することを含む、個体において血管新生を阻害する方法における使用のための抗ＶＥＧＦ抗体を提供する。上の実施態様のいずれかに従った「個体」は、好ましくはヒトである。
【０１９８】
更なる局面では、本発明は、医薬の製造又は調製における抗ＶＥＧＦ抗体の使用を提供する。一実施態様では、医薬は、ＶＥＧＦ関連疾患（例えば、癌又は眼疾患）の処置のためである。更なる実施態様では、医薬は、ＶＥＧＦ関連疾患（例えば、癌又は眼疾患）を有する個体に有効量の医薬を投与することを含む、ＶＥＧＦ関連疾患（例えば、癌又は眼疾患）を処置する方法における使用のためである。１つのそのような実施態様では、方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療的薬剤を個体に投与することを更に含む（例えば、下に記載するとおり）。更なる実施態様では、医薬は、血管新生を阻害するためである。更なる実施態様では、医薬は、血管新生を阻害するために、個体に有効量の医薬を投与することを含む、個体において血管新生を阻害する方法における使用のためである。上の実施態様のいずれかに従った「個体」は、ヒトでありうる。
【０１９９】
更なる局面では、本発明は、ＶＥＧＦ関連疾患（例えば、癌又は眼疾患）を処置するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、そのようなＶＥＧＦ関連疾患（例えば、癌又は眼疾患）を有する個体に、有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を投与することを含む。１つのそのような実施態様では、方法は、有効量の少なくとも１つの追加の治療的薬剤を個体に投与することを更に含む（例えば、下に記載するとおり）。上の実施態様のいずれかに従った「個体」は、ヒトでありうる。
【０２００】
更なる局面では、本発明は、個体において血管新生を阻害するための方法を提供する。一実施態様では、方法は、血管新生を阻害するために、有効量の抗ＶＥＧＦ抗体を個体に投与することを含む。一実施態様では、「個体」はヒトである。
【０２０１】
更なる局面では、本発明は、例えば、上の治療的方法のいずれかにおける使用のための、本明細書において提供する抗ＶＥＧＦ抗体のいずれかを含む医薬組成物を提供する。一実施態様では、医薬組成物は、本明細書において提供する抗ＶＥＧＦ抗体のいずれか及び医薬的に許容可能な担体を含む。別の実施態様では、医薬組成物は、本明細書において提供する抗ＶＥＧＦ抗体のいずれか及び少なくとも１つの追加の治療的薬剤を含む（例えば、下に記載するとおり）。
【０２０２】
本発明の抗体は、治療において、単独で、又は他の薬剤との組み合わせにおいて使用することができる。例えば、本発明の抗体は、少なくとも１つの追加の治療的薬剤と同時投与してもよい。
【０２０３】
本発明の抗体（及び任意の追加の治療的薬剤）は、任意の適切な手段（非経口、肺内、及び鼻腔内、並びに、局所処置が望ましい場合、病巣内投与を含む）により投与することができる。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内、又は皮下投与を含む。投薬は、任意の適切な経路により、例えば、注射（例えば静脈内注射又は皮下注射など）によることができる（投与が短時間又は長時間であるかに部分的に依存する）。種々の投薬スケジュール（種々の時間点にわたる単一又は複数投与、ボーラス投与、及びパルス注入を含むが、これらに限定しない）を本明細書において熟慮する。
【０２０４】
本発明の抗体は、良好な医療行為と一致する様式において、製剤化、投薬、及び投与されうる。この文脈における考慮のための因子は、処置されている特定の障害、処置されている特定の哺乳動物、個々の患者の臨床状態、障害の原因、薬剤の送達部位、投与の方法、投与のスケジュール、及び医療従事者に公知の他の因子を含む。抗体は、問題の障害を防止又は処置するために現在使用される１つ又は複数の薬剤を用いて製剤化する必要はないが、しかし、場合により、製剤化される。そのような他の薬剤の有効量は、医薬組成物中に存在する抗体の量、障害又は処置の型、及び上で考察する他の因子に依存する。これらは、一般的に、本明細書において記載するのと同じ投与量で、及び投与経路を用いて、又は本明細書において記載する投与量の約１から９９%で、又は任意の投与量で、及び適当であると経験的／臨床的に決定される任意の経路により使用される。
【０２０５】
疾患の防止又は処置のために、本発明の抗体の適当な投与量（単独で、あるいは１つ又は複数の他の追加の治療的薬剤との組み合わせにおいて使用した場合）は、処置される疾患の型、抗体の型、疾患の重症度及び経過（抗体が予防的又は治療的な目的のために投与されるか否かにかかわらず）、過去の治療、患者の臨床歴及び抗体への応答、並びに主治医の判断に依存しうる。抗体は、１回で、又は一連の処置にわたり患者に適切に投与する。疾患の型及び重症度に依存して、抗体の約１μg/kgから１５mg/kg（例えば、０．１mg/kg〜１０mg/kg）は、例えば、１つ又は複数の別々の投与による、あるいは連続注入によるかにかかわらず、患者への投与のための初期候補投与量でありうる。１つの典型的な１日投与量は、上に言及する因子に依存して、約１μg/kgから１００mg/kg又はそれ以上の範囲でありうる。数日又はそれより長くにわたる反復投与のために、状態に依存し、処置は、一般的に、疾患症状の所望の抑制が生じるまで持続されうる。抗体の１つの例示的な投与量は、約０．０５mg/kgから約１０mg/kgの範囲にありうる。このように、約０．５mg/kg、２．０mg/kg、４．０mg/kg、又は１０mg/kg（又はそれらの任意の組み合わせ）の１つ又は複数の用量を患者に投与してもよい。そのような用量は、間欠的に、例えば、１週間毎又は３週間毎に投与してもよい（例えば、患者が、抗体の約２から約２０まで、又は、例えば、６用量を受けるようにする）。初回のより高い負荷用量、それに続く１つ又は複数のより低い用量を投与してもよい。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイにより簡単にモニターされる。
【０２０６】
Ｆ．製造品
【０２０７】
本発明の別の局面では、上に記載する障害の処置、防止、及び／又は診断のために有用な材料を含む製造品を提供する。製造品は、容器及び容器上の又はそれに関連付けられるラベル又は添付文書を含む。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、ＩＶ用溶液バッグなどを含む。容器は、種々の材料（例えばガラス又はプラスチックなど）から形成されうる。容器は、それ自体で、あるいは状態を処置、防止、及び／又は診断するために有効な別の組成物と組み合わせた組成物を保持し、無菌アクセスポートを有しうる（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針により貫通可能なストッパーを有するバイアルでありうる）。組成物中の少なくとも１つの活性薬剤は、本発明の抗体である。ラベル又は添付文書は、組成物が、選ばれた状態を処置するために使用されることを示す。更に、製造品は、（ａ）その中に含まれる組成物を伴う第１の容器（それにおいて、組成物は本発明の抗体を含む）；及び（ｂ）その中に含まれる組成物を伴う第２の容器（それにおいて、組成物は、更なる細胞傷害性薬剤又は他の治療的薬剤を含む）を含みうる。本発明のこの実施態様における製造品は、組成物を、特定の状態を処置するために使用することができることを示す添付文書を更に含みうる。あるいは、又は加えて、製造品は、医薬的に許容可能な緩衝液、例えば注射用の静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝生理食塩水、リンゲル液、及びデキストロース溶液などを含む第２（又は第３）の容器を更に含みうる。それは、商業的な及び使用者の観点から望ましい他の材料（他の緩衝液、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む）を更に含みうる。
【０２０８】
３．本発明の特定の実施態様
以下では、本発明の特定の実施態様を列挙する。
１．ＶＥＧＦへの抗体の結合が、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害することを伴わずに、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害する、ＶＥＧＦに結合する抗体。
２．表面プラズモン共鳴により測定した場合、２５℃の温度で≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合し、かつ、表面プラズモン共鳴により測定した場合、３７℃の温度でより高い又はほぼ同じ親和性でＶＥＧＦに結合する、ＶＥＧＦに結合する抗体。
３．ａ）ＶＥＧＦへの抗体の結合が、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害することを伴わずに、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害し；及び／又は
ｂ）表面プラズモン共鳴により測定した場合、２５℃の温度で≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合し、かつ、表面プラズモン共鳴により測定した場合、３７℃の温度でより高い又はほぼ同じ親和性でＶＥＧＦに結合する、
ＶＥＧＦに結合する抗体。
４．抗体のＦａｂフラグメントの結合が、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害することを伴わずに、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害する、実施態様１〜３の１つの抗体。
５．抗体抗体のＦａｂフラグメントが、２５℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合及び３７℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合する、実施態様１〜４の１つの抗体。
６．（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号０４、配列番号１０、及び配列番号１２の群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
（ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、
ＶＥＧＦに結合する抗体。
７．（ａ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１、
（ｂ）配列番号０４、配列番号１０、及び配列番号１２の群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２、並びに
（ｃ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３
を含む重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含み、
（ｄ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１、
（ｅ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２、及び
（ｆ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３
を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む、
実施態様１〜５の１つの抗体。
８．モノクローナル抗体である、実施態様１〜７のいずれかの抗体。
９．ヒト抗体である、実施態様１〜８のいずれか１つの抗体。
１０．ＶＥＧＦに結合する抗体フラグメントである、実施態様１〜９のいずれか１つの抗体。
１１．配列番号０１のアミノ酸配列と少なくとも９５%の配列同一性を有するＶＨ配列；及び配列番号０２のアミノ酸配列と少なくとも９５%の配列同一性を有するＶＬ配列を含む、実施態様１〜１０のいずれかの抗体。
１２．配列番号０１のアミノ酸配列と少なくとも９５%の配列同一性を有するＶＨ配列；及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、実施態様１〜１１のいずれかの抗体。
１３．配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、実施態様１〜１２のいずれかの抗体。
１４．配列番号０９のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、実施態様１〜１２のいずれかの抗体。
１５．配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、実施態様１〜１２のいずれかの抗体。
１６．配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、実施態様１〜１２のいずれかの抗体。
１７．配列番号４２のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、実施態様１〜１２のいずれかの抗体。
１８．配列番号４４のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、実施態様１〜１２のいずれかの抗体。
１９．配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体。
２０．配列番号０９のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体。
２１．配列番号１１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体。
２２．配列番号３３のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体。
２３．配列番号４２のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体。
２４．配列番号４４のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体。
２５．全長ＩｇＧ１抗体である、実施態様１〜２４のいずれかの抗体。
２６．Ｆａｂフラグメントである、実施態様１〜２４のいずれか１つの抗体。
２７．２５℃の温度で表面プラズモン共鳴により測定した場合、≦１５０pMの親和性でＶＥＧＦに結合する、実施態様１〜２６のいずれかの抗体。
２８．多重特異性抗体である、実施態様１〜２７のいずれかの抗体。
２９．（ａ）配列番号１３、配列番号１５、配列番号１６、配列番号３２、配列番号４１、及び配列番号４３の群より選択されるアミノ酸配列の重鎖；及び
（ｂ）配列番号１４の軽鎖
を含む、実施態様１〜２８のいずれかの抗体。
３０．配列番号１３の重鎖及び配列番号１４の軽鎖を含む、実施態様１〜２８のいずれかの抗体。
３１．配列番号１５の重鎖及び配列番号１４の軽鎖を含む、実施態様１〜２８のいずれかの抗体。
３２．配列番号１６の重鎖及び配列番号１４の軽鎖を含む、実施態様１〜２８のいずれかの抗体。
３３．配列番号３２の重鎖及び配列番号１４の軽鎖を含む、実施態様１〜２８のいずれかの抗体。
３４．（ａ）（ｉ）配列番号０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１；（ｉｉ）配列番号０４のアミノ酸配列と少なくとも８０%の配列同一性を有するＣＤＲ−Ｈ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３を含む、ＶＨドメイン；並びに（ｂ）（ｉ）配列番号０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１；（ｉｉ）配列番号０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２；及び（ｉｉｉ）配列番号０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３を含む、ＶＬドメインを含む、実施態様１〜２８のいずれかの抗体。
３５．配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を有する抗体の親和性成熟変異体である、ＶＥＧＦに結合する抗体。
３６．配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を有する抗体の変異体であり、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害することを伴わずに、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害する、ＶＥＧＦに結合する抗体。
３７．配列番号０１のＶＨ配列及び配列番号０２のＶＬ配列を有する抗体と同じエピトープに結合する、ＶＥＧＦに結合する抗体。
３８．配列番号０４、配列番号１０、及び配列番号１２の群より選択されるアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２を含む、先行する実施態様の１つの抗体。
３９．配列番号４６及び配列番号４７の群より選択されるアミノ酸配列を含むＨ−ＦＲ３を含む、先行する実施態様の１つの抗体。
４０．実施態様１〜３７のいずれかの抗体をコードする、単離核酸。
４１．実施態様３６の核酸を含む、宿主細胞。
４２．ＶＥＧＦに結合する抗体の発現のための適切な条件下で、実施態様３７の宿主細胞を培養することを含む、ＶＥＧＦに結合する抗体を産生する方法。
４３．宿主細胞から抗体を回収することを更に含む、実施態様３８の方法。
４４．実施態様３８又は３９の方法により産生された抗体。
４５．実施態様１〜３５のいずれかの抗体及び医薬的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
４６．医薬としての使用のための、実施態様１〜３５のいずれか１つの抗体又は実施態様４１の医薬組成物。
４７．ＶＥＧＦ関連疾患の処置に使用するための、実施態様１〜３５のいずれか１つの抗体又は実施態様４１のいずれかの医薬組成物。
４８．癌の処置に使用するための、実施態様１〜３５のいずれか１つの抗体又は実施態様４１のいずれかの医薬組成物。
４９．眼疾患の処置に使用するための、実施態様１〜３５のいずれか１つの抗体又は実施態様４１のいずれかの医薬組成物。
５０．ＶＥＧＦ関連疾患の処置のための医薬の製造における、実施態様１〜３５のいずれか１つの抗体又は実施態様４１の医薬組成物の使用。
５１．癌の処置のための医薬の製造における、実施態様１〜３５のいずれか１つの抗体又は実施態様４１の医薬組成物の使用。
５２．眼疾患の処置のための医薬の製造における、実施態様１〜３５のいずれか１つの抗体又は実施態様４１の医薬組成物の使用。
５３．血管新生を阻害するための医薬の製造における、実施態様１〜３５のいずれか１つの抗体又は実施態様４１の医薬組成物の使用。
５４．ＶＥＧＦ関連疾患を有する個体を処置する方法であって、有効量の実施態様１〜３５のいずれか１つの抗体又は実施態様４１の医薬組成物を、該個体に投与することを含む、方法。
５５．個体において血管新生を阻害する方法であって、血管新生を阻害するために有効な量の実施態様１〜３５のいずれかの抗体又は実施態様４１の医薬組成物を、該個体に投与することを含む、方法。
【表２】
2021508472.tif 000004
2021508472.tif 000005
2021508472.tif 000006
2021508472.tif 000007
【０２０９】
以下では、抗ＶＥＧＦ抗体ＶＥＧＦ−００８９、ＶＥＧＦ−０１１３、及びＶＥＧＦ−０１１４の印がつけられたＨＶＲ（太字の下線付き文字のＨＶＲ）を含むＶＨ及びＶＬドメインのアミノ酸配列を列挙する：
【０２１０】
・抗体ＶＥＧＦ−００８９：
ＶＨドメイン（配列番号０１）
【化１】
2021508472.tif 000008
ＶＬドメイン（配列番号０２）
【化２】
2021508472.tif 000009
【０２１１】
・抗体ＶＥＧＦ−０１１３：
ＶＨドメイン（配列番号０９）
【化３】
2021508472.tif 000010
ＶＬドメイン（配列番号０２）
【化４】
2021508472.tif 000011
【０２１２】
・抗体ＶＥＧＦ−０１１４：
ＶＨドメイン（配列番号１１）
【化５】
2021508472.tif 000012
ＶＬドメイン（配列番号０２）
【化６】
2021508472.tif 000013
【０２１３】
・抗体ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＤ８６７５：
ＶＨドメイン（配列番号３３）
【化７】
2021508472.tif 000014
ＶＬドメイン（配列番号０２）
【化８】
2021508472.tif 000015
【０２１４】
・抗体ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２０：
ＶＨドメイン（配列番号４２）
【化９】
2021508472.tif 000016
ＶＬドメイン（配列番号０２）
【化１０】
2021508472.tif 000017
【０２１５】
・抗体ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２１：
ＶＨドメイン（配列番号４４）
【化１１】
2021508472.tif 000018
ＶＬドメイン（配列番号０２）
【化１２】
2021508472.tif 000019
【実施例】
【０２１６】
以下は、本発明の方法及び組成物の例である。種々の他の実施態様を、上に提供する一般的な記載を仮定し、実行してもよいことが理解される。
【０２１７】
実施例１：
【０２１８】
ヒト抗ＶＥＧＦ抗体（抗体ＶＥＧＦ−００８９）の生成。
【０２１９】
ＶＥＧＦ−Ｒ１ドメイン２並びにＶＥＧＦ−Ｒ３ドメイン２及び３との複合体におけるヒトＶＥＧＦ二量体の結晶構造のオーバーレイを図１に描写する。この重ね合わせは、両方のＶＥＧＦ受容体がＶＥＧＦ二量体上の高度に類似する領域に結合すること、及び、従って、両方の受容体、ＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を同じ様式において阻害しない、ＶＥＧＦに結合する抗体を生成することが高度に困難であると思われることを例証する。これに沿って、当技術分野において公知の複数の抗ＶＥＧＦ抗体のうち、少数の抗体だけが、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合よりはむしろ、ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を選択的に遮断することが報告された。
【０２２０】
本明細書において記載する抗体ＶＥＧＦ−００８９は、ＶＥＧＦ由来抗原を用いた免疫化時に、ヒト化抗体レパートリーを発現する、Roche独自のトランスジェニックウサギから由来した。ヒト免疫グロブリン遺伝子座を含むトランスジェニックウサギが、国際公開第２０００／４６２５１号、国際公開第２００２／１２４３７号、国際公開第２００５／００７６９６号、国際公開第２００６／０４７３６７号、米国特許出願公開第２００７／００３３６６１号明細書、及び国際公開第２００８／０２７９８６号において報告されている。動物を、ＡＡＡＬＡＣ認定の動物施設において、付録Ａ「動物の収容及び飼育についてのガイドライン」に従って収容した。全ての動物の免疫化プロトコール及び実験を、オーバーバイエルン州政府により承認され（許可番号５５．２−１−５４−２５３２−９０−１４）、ドイツ動物福祉法並びに欧州議会及び理事会の指令２０１０／６３に従って実施した。
【０２２１】
トランスジェニックウサギの免疫化
【０２２２】
簡単には、ウサギ（ｎ＝３）（１２〜１６週齢）を、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に共役された組換えヒトＶＥＧＦ−１２１タンパク質（自社で産生）を用いて免疫化した。全ての動物を、０日目での、皮内適用による、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）を用いて乳化された４００μgタンパク質、それに続く筋肉内注射及び皮下注射を交互に繰り返すことによる、１、２、６、１１、及び１４週目での２００ｕgタンパク質エマルジョンを用いて免疫化した。血液を、４回目の免疫化以降から開始し、４、５、及び６日目に採取した。血清を、ＥＬＩＳＡによる免疫原特異的ウサギ及びヒト特異的免疫グロブリン力価決定のために調製し、末梢単核細胞を単離し、それを、Ｂ細胞クローニング過程において抗原特異的Ｂ細胞の供給源として使用した。
【０２２３】
トランスジェニックウサギからのＢ細胞クローニング
【０２２４】
ウサギ末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）の単離：免疫化ウサギの血液サンプルを採取した。ＥＤＴＡを含む全血を、製造業者の仕様に従って、リンパ液哺乳動物（Cedarlane Laboratories）を使用した密度遠心分離の前に、１×ＰＢＳ（ＰＡＡ）を用いて２倍希釈した。ＰＢＭＣを、１×ＰＢＳを用いて２回洗浄した。
【０２２５】
ＥＬ−４  Ｂ５培地：１０%ＦＣＳ（Pan Biotech）、２mMグルタミン、１%ペニシリン／ストレプトマイシン溶液（Gibco）、２mMピルビン酸ナトリウム、１０mM  ＨＥＰＥＳ（PAN Biotech）、及び  ０．０５mM  ｂ−メルカプトエタノール（Invitrogen）を用いて補充したＲＰＭＩ  １６４０（Pan Biotech）を使用した。
【０２２６】
プレートのコーティング：無菌細胞培養６ウェルプレートを、炭酸緩衝液（０．１M重炭酸ナトリウム、３４mM炭酸水素二ナトリウム、ｐＨ  ９，５５）中の２μg/ml  ＫＬＨを用いて４℃で一晩コーティングした。プレートを、使用前に、無菌ＰＢＳ中で３回洗浄した。
【０２２７】
マクロファージ／単球の又はヒトＦｃ結合剤の枯渇：ＰＢＭＣを無菌６ウェルプレート（細胞培養グレード）上に播種し、非特異的な接着を通じてマクロファージ及び単球を枯渇させた。各々のウェルを、最大で４mlの培地及び免疫化ウサギからの６×１０ｅ６個までのＰＢＭＣを用いて満たし、インキュベーター中で、３７℃で１時間にわたり結合させた。上清中の細胞（末梢血リンパ球（ＰＢＬ））を、抗原パニング工程のために使用した。
【０２２８】
免疫蛍光染色及びフローサイトメトリー：抗ＩｇＧ  ＦＩＴＣ（AbD Serotec）及び抗ｈｕＣｋ  ＰＥ（Dianova）抗体を単一細胞選別のために使用した。表面染色のために、枯渇及び濃縮工程からの細胞を、ＰＢＳ中の抗ＩｇＧ  ＦＩＴＣ及び抗ｈｕＣｋ  ＰＥ抗体を用いてインキュベートし、４℃の暗所において４５分間にわたりインキュベートした。染色後、ＰＢＭＣを、氷冷ＰＢＳを用いて２回洗浄した。最後に、ＰＢＭＣを氷冷ＰＢＳ中に再懸濁し、直ぐにＦＡＣＳ分析に供した。５μg/mlの濃度におけるヨウ化プロピジウム（BD Pharmingen）をＦＡＣＳ分析に先立ち加え、死細胞及び生細胞の間で区別した。コンピューター及びFACSDiva（商標）ソフトウェア（BD Biosciences）を備えたBecton Dickinson FACSAria（商標）を単一細胞選別のために使用した。
【０２２９】
Ｂ細胞培養：ウサギＢ細胞の培養を、Seeber et al.（S Seeber et al.  PLoS One 9 (2), e86184. 2014 Feb 04）により記載されている方法により実施した。簡単には、単一の選別されたウサギＢ細胞を、インキュベーター中で、３７℃で７日間にわたり、Pansorbin（登録商標）細胞（１：１０００００）（Calbiochem）、５%ウサギ胸腺細胞上清（MicroCoat）、及びガンマ線照射マウスＥＬ−４  Ｂ５胸腺腫細胞（５×１０ｅ５個細胞／ウェル）を含む２００μl／ウェルＥＬ−４  Ｂ５培地を伴う９６ウェルプレート中でインキュベートした。Ｂ細胞培養の上清をスクリーニングのために除去し、残りの細胞を直ぐに回収し、１００μlのＲＬＴ緩衝液（Qiagen）中で、−８０℃で凍結した。
【０２３０】
抗体のＶドメインをコードするＲＮＡを単離した。抗体の組換え発現のために、ＶＨ又はＶＬについてコードするＰＣＲ産物をｃＤＮＡとして発現ベクター中にクローニングし、ＨＥＫ−２９３細胞中に一過性に形質転換した。
【０２３１】
スクリーニングから、配列番号０１のＶＨドメイン及び配列番号０２のＶＬドメインを含む抗体を選択した。この抗体は、本明細書において、抗体「ＶＥＧＦ−００８９」としても言及する。その後の分析のために、抗体ＶＥＧＦ−００８９を、ヒトＶＨ及びＶＬドメイン並びに軽鎖（ＣＬカッパ）及び重鎖（ＣＨ１）のウサギ由来定常ドメインを有するＦａｂフラグメント（本明細書において「ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂフラグメント」又は単に「ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ」として言及する）として生成した。ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂフラグメントの重鎖のアミノ酸配列は、配列番号１３である。ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂフラグメントの軽鎖のアミノ酸配列は、配列番号１４である。
【０２３２】
実施例２：
【０２３３】
生成されたヒト抗ＶＥＧＦ抗体（抗体ＶＥＧＦ−００８９）の特徴付け
【０２３４】
抗体ＶＥＧＦ−００８９  ＦａｂフラグメントのＶＥＧＦ結合を、下に記載するように、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により評価した。
【０２３５】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による抗体結合親和性の決定
【０２３６】
抗Ｈｉｓ捕捉抗体（GE Healthcare 28995056）を、標準的なアミンカップリング化学を使用してSeries S Sensor Chip C1（GE Healthcare 29104990）に固定化し、５００〜１０００共鳴単位（ＲＵ）の表面密度をもたらした。泳動緩衝液及び希釈緩衝液として、ＨＢＳ−Ｐ＋（１０mM  ＨＥＰＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ  ｐＨ  ７．４、０．０５%Surfactant P20）を使用し、測定温度をそれぞれ２５℃及び３７℃に設定した。ｈＶＥＧＦ−Ａ１２１を表面に捕捉させ、結果として得られる５から３５ＲＵの範囲の捕捉レベルを伴った。抗ＶＥＧＦ抗体の希釈系列（０．３７〜３０nM）を１２０秒間にわたり注入し、解離を３０μl／分の流速で少なくとも６００秒間にわたりモニターした。表面を、１０mMグリシン（ｐＨ  １．５）を６０秒間にわたり注入することにより再生した。バルク屈折率差を、ブランク注入を差し引くことにより、及び捕捉ｈＶＥＧＦ−Ａ１２１を伴わない対照フローセルから得られた応答を差し引くことにより修正した。速度定数を、Biacore（登録商標）Evaluationソフトウェア内のラングミュア１：１結合モデルを使用して算出した。
【０２３７】
結果として、ＶＥＧＦ−００８９  ＦａｂフラグメントのＫＤは、１３４pM（２５℃の温度で）と決定した。
【０２３８】
抗体の更なる特徴付けのために、ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂフラグメントの存在におけるその受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害を、下に記載するように評価した：
【０２３９】
抗体Ｆａｂフラグメントの存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害（ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦ−Ｒ２／Ｒ１阻害ＥＬＩＳＡ）
【０２４０】
３８４ウェルストレプトアビジンプレート（Nunc／Microcoat＃１１９７４９９８００１）を、０．２５μg/mlビオチン化ＶＥＧＦ−Ｒ１又は０．５μg/mlビオチン化ＶＥＧＦ−Ｒ２（自社産生、ＤＰＢＳ（１×）（ＰＡＮ、＃Ｐ０４−３６５００）中の各々２５μl／ウェル）を用いてコーティングした。プレートを室温で１時間にわたりインキュベートした。並行して、０．７nMの濃度のＶＥＧＦ−１２１−Ｈｉｓ（自社産生）を、異なる希釈（１２×１：２希釈工程、５００nMの濃度から開始する）における抗体を用いてインキュベートした。このプレインキュベーション工程は、３８４ウェルＰＰプレート（Weidmannメディカルテクノロジー、＃２３４９０−１０１）において１×ＯＳＥＰ緩衝液（ビデスト水、１０×、Roche、＃１１  ６６６  ７８９  ００１  ＋  ０．５%ウシ血清アルブミン画分Ｖ、脂肪酸不含、Roche、＃１０  ７３５  ０８６  ００１  ＋  ０，０５%Tween  ２０）中で行った。プレートを室温で１時間にわたりインキュベートした。ＶＥＧＦ−Ｒ１／ＶＥＧＦ−Ｒ２コーティングされたストレプトアビジンプレートを、９０μl／ウェルのＰＢＳＴ緩衝液（ビデスト水、１０×ＰＢＳ  Roche＃１１６６６７８９００１  ＋  ０．１%Tween  ２０）を用いて３回洗浄した後、ＶＥＧＦ抗体プレインキュベーションプレートからの２５μlのサンプルを、コーティングされたストレプトアビジンプレートに移し、それを、その後、室温で１時間にわたりインキュベートした。９０μl／ウェルのＰＢＳＴ緩衝液を用いて３回洗浄した後、１×ＯＳＥＰ中の２５μl／ウェルの検出抗体（抗Ｈｉｓ  ＰＯＤ、Bethyl、＃Ａ１９０−１１４Ｐ、１：１２０００）を加えた。室温での１時間にわたるインキュベーション後、プレートを、９０μlのＰＢＳＴ緩衝液を用いて３回洗浄した。２５μlのＴＭＢ（Roche、＃１１  ８３５  ０３３  ００１）を全てのウェルに同時に加えた。室温で１０分間のインキュベーション後、シグナルを、Tecan Safire 2 Readerで、３７０nm／４９２nmで検出した。
【０２４１】
診療所において使用される先行技術の抗ＶＥＧＦ抗体についての対照及び代表として、ルセンティス（登録商標）（ラニビズマブ、配列番号２３の重鎖アミノ酸配列、配列番号２４の軽鎖アミノ酸配列）を同じ条件下で評価する。結果を図２中に示す。
【０２４２】
結果は、ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂフラグメントが、ＶＥＧＦ−ＶＥＧＦ−Ｒ２への結合を完全に遮断することが可能であることを示す。ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂフラグメントは、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を完全には遮断しなかった。結果的に、ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂフラグメントは、ＶＥＧＦ−Ｒ２を通じて（しかし、ＶＥＧＦ−Ｒ１を通じてではない）ＶＥＧＦシグナル伝達を選択的に遮断すると考えられる。図２中に示すように、先行技術の抗体ルセンティス（登録商標）は、両方の受容体、ＶＥＧＦ−Ｒ２及びＶＥＧＦ  Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を完全に遮断することが可能である。
【０２４３】
実施例３：
【０２４４】
ヒト抗ＶＥＧＦ抗体ＶＥＧＦ−００８９の改善
【０２４５】
抗体ＶＥＧＦ−００８９の抗体変異体を、抗体の特徴を更に改善するために作成した。
【０２４６】
種々の抗体候補から、２つの抗体を選択し、それにおいて、Ｈ−ＣＤＲ２ループ中では、Ｈ−ＣＤＲ２ループ内のトリグリシンストレッチの中間におけるグリシンが置換又は欠失された。
【０２４７】
ＶＥＧＦ−０１１３抗体
【０２４８】
ＶＥＧＦ−００８９抗体の第１の変異体は、配列番号０９の重鎖可変ドメイン及び配列番号０２の軽鎖可変ドメインを含む抗体である。この抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−０１１３」抗体として、並びに、ウサギ由来のＣＬカッパ及びＣＨ１ドメインを伴うＦａｂフラグメントとして提供される場合、「ＶＥＧＦ−０１１３  Ｆａｂフラグメント」又は単に「ＶＥＧＦ−０１１３  Ｆａｂ」として言及する。本明細書において使用するＶＥＧＦ−０１１３  Ｆａｂフラグメントは、配列番号１５の重鎖及び配列番号１４の軽鎖を含む。ＶＥＧＦ−０１１３抗体は、Ｈ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列においてだけ抗体ＶＥＧＦ−００８９とは異なり、なぜなら、ＶＥＧＦ−００８９抗体のＨ−ＣＤＲ２の位置６でのグリシン残基が、プロリン残基により置換されているためである：
ＶＥＧＦ−００８９のＨ−ＣＤＲ２
ＳＩＧＮＧＧＧＩＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号０４）
ＶＥＧＦ−０１１３のＨ−ＣＤＲ２
ＳＩＧＮＧＰＧＩＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１０）
【０２４９】
ＶＥＧＦ−０１１３のＨ−ＣＤＲ２において実現されるアミノ酸モチーフ「ＧＰＧ」によって、ＶＥＧＦ−００８９のＨ−ＣＤＲ２におけるトリグリシンストレッチ「ＧＧＧ」と比較した場合、Ｈ−ＣＤＲ２ループにずっと少ない立体構造の自由度が付与される。
【０２５０】
ＶＥＧＦ−０１１４抗体
【０２５１】
ＶＥＧＦ−００８９抗体の第２の変異体は、配列番号１１の重鎖可変ドメイン及び配列番号０２の軽鎖可変ドメインを含む抗体である。この抗体は、本明細書において「ＶＥＧＦ−０１１４」抗体として、並びに、ウサギ由来のＣＬカッパ及びＣＨ１ドメインを伴うＦａｂフラグメントとして提供される場合、「ＶＥＧＦ−０１１４  Ｆａｂフラグメント」又は単に「ＶＥＧＦ−０１１４  Ｆａｂ」として言及する。本明細書において使用するＶＥＧＦ−０１１４  Ｆａｂフラグメントは、配列番号１６の重鎖及び配列番号１４の軽鎖を含む。ＶＥＧＦ−０１１４抗体は、Ｈ−ＣＤＲ２のアミノ酸配列においてだけ抗体ＶＥＧＦ−００８９とは異なり、なぜなら、ＶＥＧＦ−００８９抗体のＨ−ＣＤＲ２の位置４でのアスパラギン残基が、セリン残基により置換されており、ＶＥＧＦ−００８９抗体のＨ−ＣＤＲ２の位置７でのグリシン残基が除去され、及び位置８でのイソロイシン残基がフェニルアラニン残基により置き換えられたためである：
ＶＥＧＦ−００８９のＨ−ＣＤＲ２
ＳＩＧＮＧＧＧＩＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号０４）
ＶＥＧＦ−０１１４のＨ−ＣＤＲ２
ＳＩＧＳＧＧ−ＦＹＴＹＹＡＤＳＶＫＧ（配列番号１２）
【０２５２】
抗体ＶＥＧＦ−０１１４を生成するために、ＶＥＧＦ−００８９のＨ−ＣＤＲ２におけるトリグリシンストレッチ「ＧＧＧ」中の第３のグリシン残基を除去した。また、フェニルアラニンを導入し、トリグリシンストレッチに続くイソリジン残基を置き換えた。
【０２５３】
実施例４：
【０２５４】
直接ＥＬＩＳＡにより評価される、抗ＶＥＧＦ抗体のＶＥＧＦ結合
【０２５５】
以下のように直接ＥＬＩＳＡを介して評価される、ＶＥＧＦへの先行技術の抗体２Ｃ３及びｒ８４の結合：
【０２５６】
ＶＥＧＦ結合ＥＬＩＳＡ
【０２５７】
Nunc（登録商標）MaxiSorp（商標）384ウェルμclearプレート（＃４６４７１８）を、１μg/ml  ＶＥＧＦ−１２１−Ｈｉｓ（自社産生）を用いてコーティングし、室温で１時間インキュベートした。９０μl／ウェルのＰＢＳＴ緩衝液（ビデスト水、１０×ＰＢＳ  Roche＃１１６６６７８９００１  ＋  ０．１%Tween（登録商標）２０）を用いて３回洗浄した後、遮断緩衝液（ビデスト水、１０×ＰＢＳ  Roche＃１１６６６７８９００１  ＋  ２％ウシ血清アルブミン画分Ｖ、脂肪酸不含、Roche、＃１０７３５０７８００１  ＋  ０．０５%Tween（登録商標）２０）を９０μl／ウェルで加え、室温で１時間にわたりインキュベートした。９０μl／ウェルのＰＢＳＴ緩衝液を用いて３回洗浄した後、濃度６０nMで開始する２５μlの抗体希釈系列（１６×１：２希釈工程）をＶＥＧＦコーティングウェルに加えた。室温での１時間にわたるインキュベーション後、プレートを再び９０μl／ウェルのＰＢＳＴ緩衝液を用いて３回洗浄した。２５μl／ウェルの検出抗体（抗ｃ−ｍｙｃ  ＰＯＤ（Bethyl、＃Ａ１９０−１０４Ｐ、１：１６０００）又は抗ｈｕラムダＬＣ（Bethyl、＃Ａ８０−１１６Ｐ、１：１５０００）又はＦ（ａｂ’）２フラグメントヤギ抗ｈｕ  ＩｇＧ  Ｆｃｙフラグメント特異的（ＪＩＲ、＃１０９−０３６−０９８、１：２０００）又はヤギ抗ｈｕ  ＩｇカッパＬＣ（Millipore、＃ＡＰ５０２Ｐ、１：２０００）（１×ＰＢＳ（１０×、Roche、＃１１  ６６６  ７８９  ００１）＋  ０．５%ウシ血清アルブミン画分Ｖ、脂肪酸不含、Roche、＃１０  ７３５  ０８６  ００１  ＋  ０，０５%Tween  ２０中）を加え、プレートを室温で１時間にわたりインキュベートした。９０μlのＰＢＳＴ緩衝液を用いて３回洗浄した後、２５μlのＴＭＢ（Roche、＃１１  ８３５  ０３３  ００１）を各々のウェルに加えた。ＲＴでの３分間のインキュベーション後、シグナルを、Tecan Safire 2リーダーで、３７０nm／４９２nmで検出した。
【０２５８】
本発明の抗体のＦａｂフラグメントをそれぞれテストした。以下の抗体をテストした（表１を参照のこと）：
【０２５９】
【表３】
2021508472.tif 000020
【０２６０】
先行技術の抗体を、実施例１において記載するのと同じ方法（ＨＥＫ−２９３細胞の一過性形質転換）を使用して生成した。以下の先行技術の抗体Ｆａｂフラグメントを並行して分析した：ラニビズマブ（ルセンティス（登録商標））、先行技術の抗体２Ｃ３（国際公開第２０００／６４９４６号において開示されている）、ｒ８４（国際公開第２００９／０６０１９８号において開示されている）、及びＬ３Ｈ６（国際公開第２０１２／０８９１７６号において開示されている）のＦａｂフラグメント。また、抗体２Ｃ３及びｒ８４を全長ＩｇＧ１抗体として分析した。
【０２６１】
使用した先行技術の抗体のアミノ酸配列を表２に列挙する。
【０２６２】
【表４】
2021508472.tif 000021
【０２６３】
結果を図３中に示す。ＶＥＧＦ結合は、抗体２Ｃ３について使用したアッセイ条件下では観察することはできなかったが、ＶＥＧＦ結合は、先行技術の抗体ｒ８４及びＬ３Ｈ６について確認された。抗体ｒ８４による抗原結合は、結合力の欠如に起因して、全長ＩｇＧ１よりはむしろ、Ｆａｂフラグメントとして使用した場合に顕著に低下することが実証されている。ＶＥＧＦ結合は、本発明の全てのテスト抗体について確認された。
【０２６４】
実施例５：
【０２６５】
本発明の抗体の結合親和性
【０２６６】
抗体の親和性を、実施例２において記載するのと同じ方法を使用してＳＰＲにより決定した。表１及び表２中に列挙する全てのＦａｂフラグメントをテストした。
【０２６７】
本発明の抗体並びに先行技術の抗体の親和性を、上に記載するように評価した。結果を表３中に示す。
【０２６８】
【表５】
2021508472.tif 000022
【０２６９】
実施例６：
【０２７０】
抗ＶＥＧＦ抗体の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害
【０２７１】
本発明の抗体Ｆａｂフラグメントの存在における、それぞれＶＥＧＦ−Ｒ２及びＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦの結合を、以下のようにテストした。
【０２７２】
抗体Ｆａｂフラグメントの存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ１及びＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害（ＶＥＧＦ：ＶＥＧＦ−Ｒ２／Ｒ１阻害ＥＬＩＳＡ）
【０２７３】
３８４ウェルストレプトアビジンプレート（Nunc／Microcoat＃１１９７４９９８００１）を、０．２５μg/mlビオチン化ＶＥＧＦ−Ｒ１又は０．５μg/mlビオチン化ＶＥＧＦ−Ｒ２（自社産生、ＤＰＢＳ（１×）（ＰＡＮ、＃Ｐ０４−３６５００）中で各々２５μl／ウェル）を用いてコーティングした。プレートを室温で１時間にわたりインキュベートした。並行して、濃度０．７nMでのＶＥＧＦ−１２１−Ｈｉｓ（自社産生）を、異なる希釈（１２×１：２希釈工程、濃度５００nMで開始する）における抗体を用いてインキュベートした。このプレインキュベーション工程は、３８４ウェルＰＰプレート（Weidmannメディカルテクノロジー、＃２３４９０−１０１）において、１×ＯＳＥＰ緩衝液（ビデスト水、１０×、Roche、＃１１  ６６６  ７８９  ００１  ＋  ０．５%ウシ血清アルブミン画分Ｖ、脂肪酸不含、Roche、＃１０  ７３５  ０８６  ００１  ＋  ０，０５%Tween  ２０）中で行った。プレートを室温で１時間にわたりインキュベートした。ＶＥＧＦ−Ｒ１／ＶＥＧＦ−Ｒ２コーティングされたストレプトアビジンプレートを、９０μl／ウェルのＰＢＳＴ緩衝液（二重蒸留水、１０×ＰＢＳ  Roche＃１１６６６７８９００１  ＋  ０．１%Tween（登録商標）２０）を用いて３回洗浄した後、ＶＥＧＦ抗体プレインキュベーションプレートからの２５μlのサンプルを、コーティングされたストレプトアビジンプレートに移し、それを、その後、室温で１時間にわたりインキュベートした。９０μl／ウェルのＰＢＳＴ緩衝液を用いて３回洗浄した後、２５μl／ウェルの検出抗体（抗Ｈｉｓ  ＰＯＤ、Bethyl、＃Ａ１９０−１１４Ｐ、１：１２０００）（１×ＯＳＥＰ中）を加えた。室温での１時間にわたるインキュベーション後、プレートを、９０μlのＰＢＳＴ緩衝液を用いて３回洗浄した。２５μl  ＴＭＢ（Roche、＃１１  ８３５  ０３３  ００１）を全てのウェルに同時に加えた。室温での１０分間のインキュベーション後、シグナルを、Tecan Safire 2リーダーで、３７０nm／４９２nmで検出した。
【０２７４】
第１の実験では、本発明の抗体ＶＥＧＦ−００８９、ＶＥＧＦ−０１１３、及びＶＥＧＦ−０１１４をテストし（表１を参照のこと）、先行技術の抗体Ｌ３Ｈ６  Ｆａｂ及びラニビズマブ（表２を参照のこと）を０．４nM  ＶＥＧＦの存在において分析した。陰性対照として、ラニビズマブをＶＥＧＦの非存在においても分析した（グラフ中で「ラニビズマブｗ／ｏ  ｈｉｓ  ＶＥＧＦ」として示す）。結果を図４Ａ中に示す。
【０２７５】
第２の実験では、表１及び表２中に列挙する全ての抗体を、０．７nMのＶＥＧＦの存在において、実施例２において記載するように分析した。結果を図４Ｂ中に示す。
【０２７６】
ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害は、テストした先行技術の抗体について使用した実験設定において評価しなかった。実験を、上に記載するのと同じ条件下で繰り返したが、しかし、０．７nMの代わりに０．３４nMのＶＥＧＦ−１２１−Ｈｉｓを使用した。結果を図７中に示す。
【０２７７】
この実験設定では、ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合の阻害が、高濃度での先行技術の抗体ｒ８４  ＩｇＧ１、ｒ８４  Ｆａｂ、及びＬ３Ｈ６  Ｆａｂについて観察された。本発明の抗体ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ、ＶＥＧＦ−０１１３  Ｆａｂ、及びＶＥＧＲ−０１１４  Ｆａｂは、全てのテストした濃度において、ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を阻害した。
【０２７８】
実施例７：
【０２７９】
抗ＶＥＧＦ抗体の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害
【０２８０】
本発明の抗体Ｆａｂフラグメントの存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦの結合を、実施例６において記載するようにテストした。表１及び表２中に列挙する全ての抗体をテストした。結果を図５中に示す。
【０２８１】
ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害は、テストした先行技術の抗体２Ｃ３、ｒ８４、及びＬ３Ｈ６について使用した実験設定において評価しなかった。
【０２８２】
実験を、上に記載するのと同じ条件下で繰り返したが、しかし、０．７nMの代わりに０．３４nMのＶＥＧＦ−１２１−Ｈｉｓを使用した。結果を図５中に示す。
【０２８３】
実施例８：
【０２８４】
レポーター遺伝子アッセイ（ＲＧＡ）を介した抗ＶＥＧＦ抗体のＩＣ５０の評価
【０２８５】
本発明の抗ＶＥＧＦ抗体（表１を参照のこと）を、２０nMから０．０２nMの範囲の９つの濃度においてテストした。先行技術の抗体ラニビズマブ（表２を参照のこと）を対照としてテストした。
【０２８６】
簡単には、白色の９６ウェルマルチタイタープレートのウェル当たり、３７，５μlの抗体溶液／ウェルを、３７，５μlのＶＥＧＦ−Ａ１２１：２５ｎg/ml／ウェルを用いて混合し、室温で３０分間にわたりインキュベートした。その後、４００００個細胞／ウェル当たり７５μl／ウェルのＨＥＫ２９３−ＮＦＡＴ−ＲＥ−Ｌｕｃ２Ｐ／ＫＤＲ＿Ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎを加え、３７℃、５%ＣＯ２で５時間にわたりインキュベートした。最後に、１００μl／ウェルのBio-Glo（商標）試薬を加え、発光を、Tecan infinite Readerを使用して決定した。結果を表４中に示す。
【０２８７】
【表６】
2021508472.tif 000023
【０２８８】
データによって、全てのテストした抗体によるＶＥＧＦへの拮抗的結合が確認される。
【０２８９】
実施例９：
【０２９０】
ヒト抗ＶＥＧＦ抗体ＶＥＧＦ−００８９の改善された変異体の提供
【０２９１】
抗体ＶＥＧＦ−００８９の追加の改善された抗体変異体を生成し、特に、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合よりはむしろ、ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を阻害する優先度を改善させた。種々の抗体候補から、表５中に列挙する３つの候補を選択した。表５中に列挙する抗体Ｆａｂフラグメントを、実施例１において記載するのと同じ方法（ＨＥＫ−２９３細胞の一過性形質転換）を使用して生成した。
【０２９２】
【表７】
2021508472.tif 000024
【０２９３】
実施例１０：
【０２９４】
本発明の抗体の結合親和性
【０２９５】
抗体の親和性を、実施例２において記載するのと同じ方法を使用してＳＰＲにより決定した。表１及び表５中に列挙する、本発明の抗体の全てのＦａｂフラグメントをテストした。また、追加の先行技術の抗体ＨＦ２−１、ＨＦ２−５、ＨＦ２−９、及びＨＦ２−１１（欧州特許出願公開第３００６４６５号明細書において開示されている）を、上に記載するように評価した。それらの追加の先行技術の抗体のアミノ酸配列を表６中に示す。
【０２９６】
【表８】
2021508472.tif 000025
【０２９７】
結果を表７中に示す。
【０２９８】
【表９】
2021508472.tif 000026
【０２９９】
実施例１１：
【０３００】
抗ＶＥＧＦ抗体の存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ２又はＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合の阻害
【０３０１】
本発明の抗体Ｆａｂフラグメントの存在におけるＶＥＧＦ−Ｒ２及びＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦの結合を、実施例２において記載するようにテストした。
【０３０２】
これらの実験では、本発明の抗体ＶＥＧＦ−００８９、ＶＥＧＦ−０１１３、ＶＥＧＦ−０１１４、ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＤ８６７５、ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２０、及びＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２１をテストし（表１及び表５を参照のこと）、先行技術の抗体ＨＦ２−１、ＨＦ２−５、ＨＦ２−９、及びＨＦ２−１１（表６を参照のこと）並びにラニビズマブ（表２を参照のこと）をＶＥＧＦの存在において分析した。結果を図８及び図１０（０．３４nM  ＶＥＧＦの存在における）並びに図９及び図１１（０．７nm  ＶＥＧＦの存在における）中に示す。
【０３０３】
テストした先行技術の抗体は、ＶＥＧＦ受容体ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合を有意に阻害しなかった。本発明の全てのテストした抗体は、ＶＥＧＦ−Ｒ１へのＶＥＧＦ結合よりはむしろ、ＶＥＧＦ−Ｒ２へのＶＥＧＦ結合を優先的に阻害した。
【０３０４】
実施例１２：
【０３０５】
本発明の例示的な抗体の化学的安定性
【０３０６】
本発明の例示的な抗体Ｆａｂフラグメントの化学的安定性を、以下のようにテストした：
【０３０７】
化学分解テスト：
【０３０８】
抗体サンプルを、２０mM  Ｈｉｓ／ＨｉｓＣｌ、１４０mM  ＮａＣｌ（ｐＨ  ６．０）中に製剤化し、３つの一定分量中に分けた：１つの一定分量をそれぞれＰＢＳ中に再緩衝化し、２つの一定分量を本来の製剤中に保った。ＰＢＳの一定分量及び１つのＨｉｓ／ＨｉｓＣｌ一定分量を、２週間（２ｗ）にわたり、４０℃（Ｈｉｓ／ＮａＣｌ）又は３７℃（ＰＢＳ）で１mg/mlにおいてインキュベートし、ＰＢＳサンプルを更に合計４週間（４ｗ）にわたりインキュベートした。第３の対照の一定分量サンプルを−８０℃で保存した。インキュベーションが終了した後、サンプルを、相対活性濃度（Biacore；各々の結合剤での両方のストレスを加えた一定分量の活性濃度を、ストレスを加えていない４℃の一定分量に対して標準化する）、凝集（ＳＥＣ）、及び断片化（キャピラリー電気泳動又はＳＤＳ−ＰＡＧＥ）について分析し、未処理の対照と比較した。
【０３０９】
サイズ排除ＵＨＰＬＣ（＝ＳＥＣ）について、タンパク質を、TSKgel UP-SW3000のようなクロマトグラフィーゲルを使用し、溶液中のそれらの分子サイズに依存して分離した。この方法を用いて、タンパク質溶液を、単量体、高分子種（例えば、凝集体、二量体、不純物）、及び低分子種（例えば、分解産物、不純物）のそれらの相対含量に関して分析した。０．２Mリン酸カリウム、０．２５M  ＫＣｌ（ｐＨ  ６．２）を移動相として使用した。タンパク質溶液を希釈し、約５０μのタンパク質を５μlの容量中で注入するようにし、２５℃で０．３ml/分の流量を用いて分析した。タンパク質の検出を２８０nmで行った。ピークの定義及びピーク積分を、製品固有の情報文書中の典型的なクロマトグラムにおいて実証されているように実施した。
【０３１０】
抗体ＶＥＧＦ−００８９、ＶＥＧＦ−０１１３、ＶＥＧＦ−０１１４、ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＤ８６７５、ＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２０、及びＶＥＧＦ−Ｐ１ＡＥ３５２１のＦａｂフラグメント（表１及び表５を参照のこと）を分析した。結果を表８及び表９中に示す。
【０３１１】
【表１０】
2021508472.tif 000027
【０３１２】
【表１１】
2021508472.tif 000028
【０３１３】
実施例１３：
【０３１４】
ＶＥＧＦ二量体との複合体における生成された抗体ＶＥＧＦ−００８９のＸ線結晶学及びエピトープ決定
【０３１５】
上に記載するようなＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂフラグメントの結晶構造を、当技術分野において公知の標準的な方法に従って分析した。
【０３１６】
ＶＥＧＦ−Ａ１２１との複合体におけるＶＥＧＦ−００８９  ＦａｂフラグメントのＸ線結晶学を、以下のように実施した：
【０３１７】
二量体複合体ＶＥＧＦ−Ａ１２１−ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂの複合体形成及び精製。複合体形成のために、ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂフラグメント及びヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１（Peprotech）を１．１：１のモル比において混合した。４℃で１６時間にわたる一晩のインキュベーション後、複合体を、２０mM  ＭＥＳ、１５０mM  ＮａＣｌ（ｐＨ６．５）中のSuperdex200（１６／６００）カラムでのゲル濾過クロマトグラフィーを介して精製した。二量体複合体を含む画分をプールし、１．４４mg/mlに濃縮した。
【０３１８】
二量体ＶＥＧＦ−Ａ１２１−ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂ複合体の結晶化。最初の結晶化試験を、２１℃で、１１．５mg/mlのタンパク質濃度での、シッティングドロップ蒸気拡散設定において実施した。結晶が、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ  ｐＨ  ８．５、０．２M  ＬｉＳＯ４、１．２６M（ＮＨ４）２ＳＯ４から１日以内に現れた。プレート状結晶が、１週間で１５０×１００×３０μmの最終サイズまで成長した。結晶を、スクリーニングプレートから直接回収したが、任意の更なる最適化工程を伴わなかった。
【０３１９】
データ収集及び構造決定。データ収集のために、結晶を、凍結防止剤として１５%のエチレングリコールの添加を伴う沈殿剤溶液中で、１００Ｋで瞬間冷却した。回折データを、Swiss Light Source（スイス、フィリゲン）のビームラインＸ１０ＳＡでPILATUS 6M検出器を使用し、１．００００Aの波長で収集した。データを、ＸＤＳ（Kabsch, W. Acta Cryst. D66, 133-144 (2010)）を用いて処理し、SADABS（BRUKER）を用いて縮尺している。結晶は、ａ＝２２７．６１A、ｂ＝６６．９７A、ｃ＝２１８．３１A、β＝１０４．５４°のセル軸を伴う空間群Ｃ２に属し、２．１７Aの分解能で回折する。構造を、検索モデルとして、Ｆａｂフラグメント及びＶＥＧＦの関連する自社構造の配位を使用し、ＰＨＡＳＥＲ（McCoy, A.J, Grosse-Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Storoni, L.C., and Read, R.J. J. Appl. Cryst. 40, 658-674 (2007)）を用いた分子置換により決定した。ＣＣＰ４スイートからのプログラム（Collaborative Computational Project, Number 4 Acta Cryst. D50, 760-763 (1994)）及びBuster（Bricogne, G., Blanc, E., Brandl, M., Flensburg, C., Keller, P., Paciorek, W., Roversi, P., Sharff, A., Smart, O.S., Vonrhein, C., Womack, T.O . (2011). Buster version 2.9.5 Cambridge, United Kingdom : Global Phasing Ltd）を使用し、その後にデータを精密化している。異なる電子密度を使用したタンパク質の手動再構築を、ＣＯＯＴを用いて行った（Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. and Cowtan, K. Acta Cryst D66, 486-501 (2010)）。両方の構造についてのデータ収集及び精密化の統計を表１０中に要約する。全てのグラフ表示を、PYMOL（DeLano Scientific、カリフォルニア州パロアルト、２００２年）を用いて作成した。
【０３２０】
【表１２】
2021508472.tif 000029
2021508472.tif 000030
【０３２１】
ヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１二量体との複合体における２つのＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂフラグメントの結晶構造の模式図を図１２中に示す。５A以内の距離で抗体ＶＥＧＦ−  ００８９  Ｆａｂフラグメントと接触しているＶＥＧＦ−Ａ１２１二量体中のアミノ酸残基によって、ＶＥＧＦ−Ａ１２１二量体上のＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂにより結合された立体構造エピトープが形成される。ＶＥＧＦ−Ａ１２１のアミノ酸配列は配列番号４５である。ＶＥＧＦ二量体中の両方のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子上のエピトープ中に含まれるアミノ酸の図示を、図１３中に強調表示する。
【０３２２】
抗体ＶＥＧＦ−００８９  Ｆａｂは、ＶＥＧＦ−Ａ１２１二量体上の以下のエピトープに結合する：
−  ＶＥＧＦ二量体のアミノ酸Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｒ２３、Ｙ２５、Ｈ２７、Ｐ２８、Ｉ２９、Ｅ３０、Ｍ５５、Ｎ６２、Ｌ６６、Ｎ１００、Ｋ１０１、Ｃ１０２、Ｅ１０３、Ｃ１０４、Ｒ１０５、及びＰ１０６内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子の１つにおいて；並びに
−  ＶＥＧＦ二量体のアミノ酸Ｅ３０、Ｋ４８、Ｍ８１、及びＱ８７内の個々のＶＥＧＦ−Ａ１２１分子の他の１つにおいて。
【０３２３】
上述の発明を、理解を明確にする目的のための例証及び実施例によりある程度詳細に記載してきたが、記載及び実施例は、本発明の範囲を限定するものとして解釈すべきではない。本明細書において引用する全ての特許及び科学文献の開示は、参照によりその全体が明示的に援用される。
【図１】
2021508472.tif 000031
【図２】
2021508472.tif 000032
【図３】
2021508472.tif 000033
【図４Ａ】
2021508472.tif 000034
【図４Ｂ】
2021508472.tif 000035
【図５】
2021508472.tif 000036
【図６】
2021508472.tif 000037
【図７】
2021508472.tif 000038
【図８】
2021508472.tif 000039
【図９】
2021508472.tif 000040
【図１０】
2021508472.tif 000041
【図１１】
2021508472.tif 000042
【図１２】
2021508472.tif 000043
【図１３】
2021508472.tif 000044
【配列表】
2021508472000001.app
【国際調査報告】
2021508472.tif 000045
2021508472.tif 000046
2021508472.tif 000047