(57)【要約】本出願は、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む構築物を提供する。これらの構築物を作製し、使用する方法も提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＴＩＧＩＴを特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、前記単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項２】
前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、請求項１に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項３】
前記ｓｄＡｂ部分が、以下：
（１）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（９）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１０）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１１）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１２）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１３）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１４）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１５）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１６）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１７）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；または
（１８）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含む、請求項１または２に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項４】
前記ｓｄＡｂ部分が、以下：
（１）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（９）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１０）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１１）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１２）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１３）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１４）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１５）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１６）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；
（１７）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体；または
（１８）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または前記ＣＤＲ領域において最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体
のいずれか１つを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項５】
前記ｓｄＡｂ部分が、以下：
ａ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、V、Ｌ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｉ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｔ、及びＰからなる群から選択され；
ａ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、V、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｗ、Ｍ、及びＩからなる群から選択され；
ａ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｉ、Ｄ、及びVからなる群から選択され；
ａ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｍ、Ｙ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｎ、V、Ｑ、Ｐ、Ｅ、及びＣからなる群から選択され；及び
ａ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ａ、及びＨからなる群から選択され；または
ｂ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びVからなる群から選択され；
ｂ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ｅ及びＱからなる群から選択され；
ｂ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｒ及びＬからなる群から選択され；
ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｗ、Ｒ、Ｇ、及びＳからなる群から選択され；及び
ｂ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ及びＬからなる群から選択され；または
ｃ−１）３７位のアミノ酸残基が、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びVからなる群から選択され；
ｃ−２）４４位のアミノ酸残基が、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬからなる群から選択され；
ｃ−３）４５位のアミノ酸残基が、Ｌ、Ｒ、及びＣからなる群から選択され；
ｃ−４）１０３位のアミノ酸残基が、Ｐ、Ｒ、及びＳからなる群から選択され；及び
ｃ−５）１０８位のアミノ酸残基が、Ｑ及びＬからなる群から選択され；
のいずれか１つのアミノ酸配列を含むVHＨドメインを含み、
前記アミノ酸位置が、Ｋａｂａｔ番号付けに従っており、１０８位がＱである場合、１０８位が、Ｌに適宜ヒト化することができる、請求項１〜４のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項６】
前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むVHＨドメイン、または配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つに対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するその変異体を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項７】
前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むVHＨドメイン、または前記VHＨドメインにおいて最大で約３つのアミノ酸置換を含むその変異体を含む、請求項６に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項８】
前記ｓｄＡｂ部分と前記ＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄが、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍである、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項９】
前記ｓｄＡｂ部分と前記ＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄが、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍである、請求項８に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項１０】
ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分が、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項１１】
前記単離抗ＴＩＧＩＴ構築物が、ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質である、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項１２】
前記ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質が、単量体または二量体である、請求項１１に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項１３】
前記Ｆｃ断片が、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）Ｆｃ、エフェクターレス（不活性）ｈＩｇＧ１  Ｆｃ、またはｈＩｇＧ４  Ｆｃである、請求項１１または１２に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項１４】
前記ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質が、配列番号２８８〜２９４、３０６、３０８〜３１１、３１５、３１７〜３１９、３２１〜３２２、及び３６５〜３６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１１〜１３のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項１５】
前記単離抗ＴＩＧＩＴ構築物が、第２のエピトープを特異的に認識する第２の抗体部分をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項１６】
前記第２の抗体部分が、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、ＦV、一本鎖ＦV（ｓｃＦV）、ｓｃＦV−ｓｃＦV、ミニボディ、ダイアボディ、またはｓｄＡｂである、請求項１５に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項１７】
前記抗ＴＩＧＩＴ構築物が、多重特異性である、請求項１５または１６に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項１８】
ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分、及び前記第２の抗体部分が、ペプチドリンカーによって適宜連結される、請求項１５〜１７のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項１９】
前記ペプチドリンカーが、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項１８に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項２０】
前記第２の抗体部分が、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体である、請求項１５〜１９のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項２１】
前記重鎖のＦｃ断片が、ＩｇＧ１  Ｆｃ、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、またはＩｇＧ４  Ｆｃであり得る、請求項２０に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項２２】
ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＮ末端が、前記完全長抗体の少なくとも１つの重鎖のＣ末端に融合される、請求項２０または２１に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項２３】
ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＣ末端が、前記完全長抗体の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合される、請求項２０または２１に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項２４】
ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＮ末端が、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される、請求項２０または２１に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項２５】
ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分のＣ末端が、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される、請求項２０または２１に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項２６】
前記完全長抗体が、ＰＤ−１を特異的に認識する、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項２７】
前記完全長抗体が、配列番号３８５のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、及び配列番号３８６のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）を含む、請求項２６に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項２８】
前記完全長抗体が、配列番号３８７のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、及び配列番号３８８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）を含む、請求項２６に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項２９】
前記完全長抗体が、配列番号４０６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン（VH）、及び配列番号４０７のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン（VL）を含む、請求項２６に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項３０】
前記完全長抗体が、配列番号３９０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３９１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分に融合され、前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３９４または３９６のアミノ酸配列を含む、請求項２６または２９のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項３１】
前記完全長抗体が、配列番号３９０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３９１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つが、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分に融合され、前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号３９９または４０１のアミノ酸配列を含む、請求項２６または２９のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項３２】
前記完全長抗体が、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する、請求項２０〜２５のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項３３】
前記完全長抗体が、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含む重鎖相補性決定領域（ＨＣ−ＣＤＲ）１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含む軽鎖相補性決定領域（ＬＣ−ＣＤＲ）１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、請求項３２に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項３４】
前記完全長抗体が、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３３に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項３５】
前記完全長抗体が、配列番号３２３または３２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３３または３４に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項３６】
前記完全長抗体が、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３３または３４に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項３７】
前記完全長抗体が、配列番号３７９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３２に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項３８】
前記完全長抗体が、配列番号３８３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３２に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項３９】
前記完全長抗体が、配列番号３８１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む、請求項３２に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項４０】
前記完全長抗体が、配列番号３３１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３９に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項４１】
前記完全長抗体が、配列番号３３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む、請求項３９に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項４２】
前記完全長抗体が、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分に融合され、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３４３のアミノ酸配列を含む、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項４３】
前記完全長抗体が、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分に融合され、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３５７または３５９のアミノ酸配列を含む、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項４４】
前記完全長抗体が、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分に融合され、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３４１または４０２のアミノ酸配列を含む、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項４５】
前記完全長抗体が、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つが、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分に融合され、及び前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号３６２または３６４のアミノ酸配列を含む、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項４６】
前記完全長抗体が、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つが、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分に融合され、及び前記軽鎖融合ポリペプチドが、配列番号４０５のアミノ酸配列を含む、請求項３２〜３６のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項４７】
前記完全長抗体が、配列番号３３１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分に融合され、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３４７のアミノ酸配列を含む、請求項３２及び３９〜４１のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項４８】
前記完全長抗体が、配列番号３３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の重鎖の少なくとも１つが、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する前記ｓｄＡｂ部分に融合され、及び前記重鎖融合ポリペプチドが、配列番号３４５のアミノ酸配列を含む、請求項３２及び３９〜４１のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項４９】
ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、前記ｓｄＡｂ部分が、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、前記単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項５０】
請求項１〜４９のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物と競合的にＴＩＧＩＴに特異的に結合する、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物。
【請求項５１】
請求項１〜５０のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物、及び適宜、薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
【請求項５２】
ＴＩＧＩＴ関連疾患を有する個体の治療方法であって、前記個体に有効量の請求項５１に記載の医薬組成物を投与することを含む、前記方法。
【請求項５３】
前記ＴＩＧＩＴ関連疾患が、がんである、請求項５２に記載の方法。
【請求項５４】
前記がんが、固形腫瘍である、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記がんが、大腸がんである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記個体に追加の療法を投与することをさらに含む、請求項５２〜５５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５７】
前記追加の療法が、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせである、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記追加の療法が、免疫療法である、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記免疫療法が、前記個体に、免疫調節薬を含む第２の医薬組成物の有効量を投与することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
前記免疫調節薬が、免疫チェックポイント阻害薬である、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
前記免疫チェックポイント阻害薬が、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する抗体である、請求項６０に記載の方法。
【請求項６２】
前記医薬組成物が、全身投与される、請求項５２〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６３】
前記医薬組成物が、局所投与される、請求項５２〜６１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６４】
前記個体が、ヒトである、請求項５２〜６３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項６５】
請求項１〜５０のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物をコードする、単離核酸。
【請求項６６】
請求項６５に記載の単離核酸を含む、ベクター。
【請求項６７】
請求項６５に記載の単離核酸、または請求項６６に記載のベクターを含む、単離宿主細胞。
【請求項６８】
請求項１〜５０のいずれか１項に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物、請求項６５に記載の単離核酸、請求項６６に記載のベクター、または請求項６７に記載の単離宿主細胞を含む、キット。
【請求項６９】
抗ＴＩＧＩＴ構築物の生成方法であって、
（ａ）コードされた抗ＴＩＧＩＴ構築物を発現するのに有効な条件下で、請求項６５に記載の単離核酸、請求項６６に記載のベクター、または請求項６７に記載の単離宿主細胞を含む宿主細胞を培養すること；及び（ｂ）前記宿主細胞から、発現された抗ＴＩＧＩＴ構築物を得ることを含む、前記方法。
【請求項７０】
工程（ａ）が、請求項６５に記載の単離核酸または請求項６６に記載のベクターを含む宿主細胞を生成することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、２０１７年１２月２８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１１９５０６号、及び２０１８年７月２６日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１８／０９７１５９号の利益を主張し、これらの出願は、それらの全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルによる配列表の提出
ＡＳＣＩＩテキストファイル上の以下の提出物の内容、すなわち、コンピューターで読取り可能な形態（ＣＲＦ）の配列表（ファイル名：７６１４２２０００７４１ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ、記録日：２０１８年７月１８日、サイズ：３９２ＫＢ）は、その全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００３】
本発明は、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む構築物、及びこれらを作製し、使用する方法に関する。
【０００４】
Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体（ＴＩＧＩＴ：Ｖｓｔｍ３またはＷＵＣＡＭとしても知られる）は、ＣＤ２８ファミリーに属する免疫受容体である。この２６ＫＤａタンパク質は、細胞質中に細胞外ＩｇＶドメイン、Ｉ型膜貫通領域、細胞内免疫グロブリンテールチロシン（ＩＴＴ）様モチーフ、及びＣ末端免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）モチーフを含有する。ナイーブＴ細胞及びＮＫ細胞では、ＴＩＧＩＴは、細胞表面上でほとんど検出できないが、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化の際に上方調節される。腫瘍微小環境では、ＴＩＧＩＴは、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、疲弊状態のＴ細胞及びＮＫ細胞上で高度に検出される。ＴＩＧＩＴは、ＣＤ１５５（ｎｅｃｌ−５またはポリオウイルス受容体（ＰＶＲ））、ＣＤ１１２（ネクチン−２またはポリオウイルス受容体関連２（ＰＶＲＬ２））、及びＣＤ１１３（ネクチン−３またはＰＶＲＬ３）を含む、多数のリガンドを有する。ＴＩＧＩＴは、ＣＤ１５５（ＰＶＲ）に高親和性で結合することができる一方、ＣＤ１１２及びＣＤ１１３に低親和性で結合することができる。最近の報告でも、ＴＩＧＩＴが、シスでＣＤ２２６（ＰＴＡ１またはＤＮＡＭ−１）と相互作用することも示唆している。
【０００５】
ＴＩＧＩＴは、いくつかの機序を介してその阻害免疫チェックポイント機能を発揮する。第１に、その主要リガンドＣＤ１５５（ＰＶＲ）に結合する際に、そのＩＴＩＭドメインにおけるＴＩＧＩＴのその後のリン酸化は、阻害シグナルを変換して、ＮＦ−κＢ経路を介してＴ細胞及びＮＫ細胞中のＩＦＮ−γ発現を下方調節する。第２に、ＴＩＧＩＴが、ＣＤ２２６とよりもＰＶＲと高親和性で相互作用する際に、ＴＩＧＩＴは、ＣＤ２２６と競合し、ＣＤ２２６によって変換された刺激性シグナルを減衰させる。第３に、ＰＶＲが樹状細胞上でＴＩＧＩＴに結合することで、ＩＬ−１０発現の上方調節及びＩＬ−１２発現の下方調節をもたらすため、樹状細胞の抗腫瘍免疫応答を損ない得る。最後に、ＴＩＧＩＴが、シスでＣＤ２２６に直接結合して、Ｔ細胞活性化に必要なＣＤ２２６二量体化を阻害することができることが、最近の研究により示された。したがって、ＴＩＧＩＴは、感染及びがんにおける免疫応答の重要な負の調節因子として作用し、ＴＩＧＩＴシグナル伝達の遮断は、がん治療用のＴ細胞及びＮＫ細胞免疫を強化するためのアプローチとして提案されている。
【０００６】
プログラム細胞死受容体１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞機能上で重要な負の調節を有する別の阻害性免疫チェックポイント分子である。ＰＤ−１が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）シグナル伝達を調節するプログラム細胞死リガンド１（ＰＤ−Ｌ１）及び／またはプログラム細胞死リガンド２（ＰＤ−Ｌ２）に結合する場合、Ｔ細胞応答は、ＰＤ−１シグナル伝達によって減衰させることができる。ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１のいずれかを標的化する抗体を用いたＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１軸の遮断は、腫瘍特異的Ｔ細胞免疫を促進し、がん患者に大きな臨床的利益を有することが示されている。しかしながら、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１遮断の際の耐性または再発により、満たされていない巨大な臨床的ニーズがまだ存在する。
【０００７】
本明細書に参照される全ての刊行物、特許、特許出願、及び公開特許出願の開示は、それらの全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明は、ＴＩＧＩＴ（以下、「抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ」と呼ぶ）、例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、ヒト免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）の結晶性断片（Ｆｃ）断片に融合した抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、及び、例えば、他のｓｄＡｂｓに融合したまたは完全長４本鎖抗体に融合した抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを含む多重特異性（例えば、二重特異性）抗原結合タンパク質を特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物、及びこれらを作製し、使用する方法に関する。
【０００９】
本出願の一態様は、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含み、ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体。を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２中であり、ＣＤＲ３は、配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。
【００１０】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、以下のいずれか１つを含む：
（１）配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（２）配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（３）配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（４）配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（５）配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（６）配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（７）配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（８）配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（９）配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１０）配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１１）配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１２）配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１３）配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１４）配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１５）配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１６）配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；
（１７）配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；または
（１８）配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体。
【００１１】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、以下のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む：ａ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｉ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｔ、及びＰ（例えば、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、またはＶ、例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ａ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｗ、Ｍ、及びＩ（例えば、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＬ、または例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）からなる群から選択され；ａ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｉ、Ｄ、及びＶ（例えば、Ｌ、Ｃ、またはＲ、または例えば、ＬまたはＲ）からなる群から選択され；ａ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｍ、Ｙ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ｑ、Ｐ、Ｅ、及びＣ（例えば、Ｗ、Ｇ、またはＲ、または例えば、Ｗ）からなる群から選択され；及びａ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ａ、及びＨ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；またはｂ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ（例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ｂ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱからなる群から選択され；ｂ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｒ及びＬ（例えば、Ｒ）からなる群から選択され；ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ、Ｇ及びＳ（例えば、Ｗ）からなる群から選択され；及びｂ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ及びＬ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；またはｃ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ（例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ｃ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬ（例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）からなる群から選択され；ｃ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ、及びＣ（例えば、ＬまたはＲ）からなる群から選択され；ｃ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ、及びＳ（例えば、ＲまたはＳ）からなる群から選択され；及びｃ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ及びＬ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに従っている。いくつかの実施形態では、１０８位は、１０８位がＱである場合、Ｌに適宜ヒト化することができる。
【００１２】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３などのＣＤＲ内である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４などのＦＲ内である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ及びＦＲの両方の内である。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。
【００１３】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。
【００１４】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【００１５】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、単量体である。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、二量体である。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）Ｆｃ、エフェクターレス（不活性）ｈＩｇＧ１  Ｆｃ、またはｈＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及びＦｃ断片は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、配列番号２８８〜２９４、３０６、３０８〜３１１、３１５、３１７〜３１９、３２１〜３２２、及び３６５〜３６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【００１６】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、第２のエピトープを特異的に認識する第２の抗体部分をさらに含む。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、またはｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、単一特異性である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、多重特異性（例えば、二重特異性）である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、ＴＩＧＩＴ由来ではない。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、ＴＩＧＩＴ由来であるが、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分によって特異的に認識されるものとは異なる。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分によって特異的に認識されるものと同じである。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分、及び第２の抗体部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、Ｆａｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ｓｃＦＶである。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、重鎖のＦｃ断片は、ＩｇＧ１  Ｆｃ、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、またはＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の少なくとも１つの重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の少なくとも１つの重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、上述したように、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する４つの同一なｓｄＡｂ部分を含み、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分の各々のＣ末端は、適宜ペプチドリンカーを介して、完全長抗体の各鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、上述のように、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する４つの同一なｓｄＡｂを含み、２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、適宜ペプチドリンカーを介して互いに融合され、他の２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、適宜ペプチドリンカーを介して互いに融合され、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分融合ポリペプチドの各々のＣ末端は、適宜ペプチドリンカーを介して完全長抗体の各重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、以下のようなＮ末端からＣ末端までの構造を有する４つのポリペプチド鎖：（１）ＶＬ���ＣＬ；（２）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬからなり、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴのコピーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、以下のようなＮ末端からＣ末端までの構造を有する４つのポリペプチド鎖：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ；及び（４）ＶＬ−ＣＬからなり、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴのコピーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、以下のようなＮ末端からＣ末端までの構造を有する４つのポリペプチド鎖：（１）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＶＬ−ＣＬからなり、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴのコピーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、以下のようなＮ末端からＣ末端までの構造を有する４つのポリペプチド鎖：（１）ＶＬ−ＣＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂからなり、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴのコピーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、以下のようなＮ末端からＣ末端までの構造を有する４つのポリペプチド鎖：（１）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＶＬ−ＣＬ；（２）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄ���ｂ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＶＬ−ＣＬからなり、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴのコピーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、以下のようなＮ末端からＣ末端までの構造を有する４つのポリペプチド鎖：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬからなり、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴのコピーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、以下のようなＮ末端からＣ末端までの構造を有する４つのポリペプチド鎖：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬからなり、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴのコピーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、以下のようなＮ末端からＣ末端までの構造：ＶＬ−ＶＨ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＨ２−ＣＨ３を各々が有する２つのポリペプチド鎖からなり、各ポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）のコピーに特異的に結合するｓｃＦＶドメインを形成し、及び各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴのコピーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、以下のようなＮ末端からＣ末端までの構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり：（１）ＶＬ−ＣＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）��び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴのコピーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、以下のようなＮ末端からＣ末端までの構造を有する４つのポリペプチド鎖：（１）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＬ；（２）ＶＬ−ＶＨ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）Ｖ
Ｌ−ＶＨ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＬからなり、ポリペプチド鎖（２）及び（３）のＶＨ及びＶＬの各々は、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）のコピーに特異的に結合するｓｃＦＶを形成し、及び各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、ＴＩＧＩＴのコピーに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、完全長抗体（またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）は、ＰＤ−１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体（またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）は、配列番号３８５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体は、配列番号３２５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体（またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）は、配列番号３８７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体は、配列番号３９０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３９１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体（またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）は、配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３９０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３９１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、上述のように、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３９４または３９６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３９０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３９１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つは、上述のように、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分に融合され、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号３９９または４０１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体（またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）は、ＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２３または３２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）は、配列番号３７９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）は、配列番号３８３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）は、配列番号３８１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３３１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、上述のように、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３４３のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、上述のように、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３５７または３５９のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、上述のように、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３４１または４０２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つは、上述のように、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分に融合され、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号３６２または３６４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、前記完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つは、上述のように、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分に融合され、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号４０５のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３３１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、上述のように、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３４７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、配列番号３３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つは、上述のように、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分に融合され、重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３４５のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つに記載のいくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、生物学的に活性なタンパク質またはその断片をさらに含む。
【００１８】
ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物をさらに提供する。
【００１９】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つと競合的にＴＩＧＩＴに特異的に結合する単離抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合体、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ、またはＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ）をさらに提供する。
【００２０】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つ、及び適宜、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物をさらに提供する。
【００２１】
本出願の別の態様は、個体に有効量の上述の医薬組成物のいずれか１つを投与することを含む、ＴＩＧＩＴ関連疾患（例えば、がん、または免疫関連疾患）を有する個体の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ関連疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍、例えば、大腸がんである。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ関連疾患は、免疫関連疾患である。いくつかの実施形態では、免疫関連疾患は、Ｔ細胞機能不全障害と関連する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞機能不全障害は、Ｔ細胞消耗によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、免疫関連疾患は、未解明な急性感染、慢性感染、及び腫瘍免疫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ関連疾患は、病原性感染である。いくつかの実施形態では、方法は、個体に追加の療法（例えば、がん療法）、例えば、外科外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせを投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の療法は、免疫療法である。いくつかの実施形態では、免疫療法は、個体に、免疫調節薬を含む第２の医薬組成物、例えば、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１を特異的に認識する抗体）の有効量を投与することを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身に、例えば、静脈内（ｉ．ｖ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所的に、例えば、腫瘍内に投与される。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
【００２２】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つをコードする単離核酸をさらに提供する。いくつかの実施形態では、単離核酸は、配列番号246〜252のいずれか１つの核酸配列を含む。
【００２３】
上述の単離核酸のいずれか１つを含むベクターをさらに提供する。
【００２４】
上述の単離核酸またはベクターのいずれか１つを含む単離宿主細胞をさらに提供する。
【００２５】
上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物、単離核酸、ベクター、または単離宿主細胞のいずれか１つを含むキットをさらに提供する。
【００２６】
本出願の別の態様は、上述の単離核酸またはベクターのいずれか１つを含む宿主細胞を培養すること、またはコードされた抗ＴＩＧＩＴ構築物の発現に効果的な条件下で上述の単離宿主細胞のいずれか１つを培養すること；及び発現された抗ＴＩＧＩＴ構築物を前記宿主細胞から得ることを含む、上述の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つの産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、上述の単離核酸またはベクターのいずれか１つを含む宿主細胞を産生することをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】免疫前血清及び免疫後血清の免疫応答評価を示す。
【図２】最終ブースト後の規則抗体（ＩｇＧ１）及び重鎖抗体（ＩｇＧ２及びＩｇＧ３）の免疫応答評価を示す。免疫前血清から単離された対応する免疫グロブリン断片は、陰性対照として使用した。
【図３】プロメガＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断レポーターアッセイにおける非ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の機能を示す。２２Ｇ２は、陽性抗ＴＩＧＩＴ対照として使用した。
【図４−１】単体またはマウスＰＤ−１遮断抗体ＲＭＰ１−１４と組み合わせた、ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける非ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質（ＡＳ１９５８４−Ｆｃ）のインビボ効力を示す。１０Ａ７は、抗ＴＩＧＩＴ抗体の陽性対照として使用した。図４Ａは、各処置群の平均腫瘍体積を示す。図４Ｂは、各処置下でＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を浸潤する腫瘍のパーセントを示す。図４Ｃは、動物ごとのクモ状プロットを示す。
【図４−２】単体またはマウスＰＤ−１遮断抗体ＲＭＰ１−１４と組み合わせた、ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける非ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質（ＡＳ１９５８４−Ｆｃ）のインビボ効力を示す。１０Ａ７は、抗ＴＩＧＩＴ抗体の陽性対照として使用した。図４Ａは、各処置群の平均腫瘍体積を示す。図４Ｂは、各処置下でＣＤ８＋またはＣＤ４＋Ｔリンパ球を浸潤する腫瘍のパーセントを示す。図４Ｃは、動物ごとのクモ状プロットを示す。
【図５】単体または抗ＰＤ−１抗体ＲＭＰ１−１４と組み合わせた、ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける非ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質（ＡＳ１９５８４−Ｆｃ）のインビボ効力を示す。図５Ａは、各処置群の平均腫瘍体積を示す。図５Ｂは、異なる処置下で動物ごとの対数スケールの腫瘍体積のクモ状プロットを示す。
【図６】単体または抗ＰＤ−１抗体ＲＭＰ１−１４と組み合わせた、ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおける非ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質（ＡＳ１９５８４−Ｆｃ）のインビボ効力を示す。図６Ａは、各処置群の平均腫瘍体積を示す。図６Ｂは、異なる処置下で動物ごとの対数スケールの腫瘍体積のクモ状プロットを示す。
【図７】非ヒト化親抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質（ＡＳ１９５８４−Ｆｃ、ＡＳ１９８８６−Ｆｃ）と比較した、プロメガＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断レポーターアッセイを用いたヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質（ＡＳ１９５８４ＶＨ２８−Ｆｃ、ＡＳ１９８８６ＶＨ５−Ｆｃ、ＡＳ１９８８６ＶＨ８−Ｆｃ）のインビトロ機能活性を示す。２２Ｇ２は、陽性抗ＴＩＧＩＴ抗体対照として使用した。
【図８】非ヒト化親抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質（ＡＳ１９５８４−Ｆｃ、ＡＳ１９８８６−Ｆｃ）と比較した、ＩＬ−２放出アッセイを用いたヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質（ＡＳ１９５８４ＶＨ２８−Ｆｃ、ＡＳ１９８８６ＶＨ５−Ｆｃ、ＡＳ１９８８６ＶＨ８−Ｆｃ）のインビトロ機能活性を示す。２２Ｇ２は、陽性抗ＴＩＧＩＴ抗体対照として使用した。
【図９】ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質ＡＳ１９５８４ＶＨ２８−Ｆｃのインビボ薬物動態曲線を示す。２２Ｇ２は、陽性抗ＴＩＧＩＴ抗体対照として使用した。
【図１０】ＭＣ３８腫瘍モデルを担持するＴＩＧＩＴヒト化マウスにおけるヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ効力を示す。図１０Ａは、各処置群の平均腫瘍体積を示す。図１０Ｂは、動物ごとの腫瘍体積のクモ状プロットを示す。２２Ｇ２は、陽性抗ＴＩＧＩＴ抗体対照として使用した。ｈＩｇＧ１は、陰性対照として使用した。
【図１１】ＰＤ−Ｌ１の細胞ベース機能性アッセイを用いた、概念証明型（ＰＯＣ）ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ）及びそれらの親抗ＰＤ−Ｌ１抗体エレメントのインビトロ機能を示す。テセントリクバイオシミラー（ＩｇＧ１  Ｆｃまたは不活性ＩｇＧ１  Ｆｃのいずれかを有する）は、陽性抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照として使用した。ｈ５３Ｃ１（ＩｇＧ１  Ｆｃまたは不活性ＩｇＧ１  Ｆｃのいずれかを有する）は、社内開発された抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。
【図１２】混合リンパ球反応（ＭＬＲ）を用いた、ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ及び対応する親エレメント（抗ＰＤ−Ｌ１抗体及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質）のインビトロ機能を示す。テセントリクバイオシミラー（ＩｇＧ１  Ｆｃまたは不活性ＩｇＧ１  Ｆｃのいずれかを有する）は、陽性抗ＰＤ−Ｌ１抗体対照として使用した。２２Ｇ２は、陽性抗ＴＩＧＩＴ抗体対照として使用した。ｈＩｇＧ１は、陰性対照として使用した。
【図１３】プロメガＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断レポーターアッセイを用いた、ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ及び対応する親エレメント（抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質）のインビトロ機能を示す。２２Ｇ２は、陽性抗ＴＩＧＩＴ抗体対照として使用した。
【図１４】ＴＩＧＩＴターゲティング用のＩＬ−２放出アッセイを用いた、ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ及び対応する親エレメント（抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質）のインビトロ機能を示す。２２Ｇ２は、陽性抗ＴＩＧＩＴ抗体対照として使用した。
【図１５】ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二機能性レポーターアッセイを用いた、ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ  ＢＴＰ−５、その対応する親エレメント（ｈ５３Ｃ１及びＡＳ１９５８４−Ｆｃ融合タンパク質）、及びそれらの組み合わせのインビトロ機能を示す。
【図１６】その親エレメント（ｈ５３Ｃ１及びＡＳ１９５８４−Ｆｃ）及びそれらの併用療法と比較した、ＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１腫瘍を担持するＣ５７ＢＬ／６ヒトＰＤ−１  ＫＩマウスにおけるＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ  ＢＴＰ−５のインビボ効力を示す。図１６Ａは、各処置群の平均腫瘍体積を示す。図１６Ｂは、動物ごとの腫瘍体積のクモ状プロットを示す。ＩｇＧ１は、陰性対照として使用した。
【図１７】２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖、及び２つの同一の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂのＣ末端が、適宜ペプチドリンカーを介して１つの重鎖のＮ末端に融合される、例示的なＢＡＢＰの概略構造を示す。２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する。完全長抗体は、第２のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各ＶＨＨは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）のコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一または異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図１８】２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖、及び２つの同一の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂのＮ末端が、適宜ペプチドリンカーを介して１つの重鎖のＣ末端に融合される、例示的なＢＡＢＰの概略構造を示す。２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する。完全長抗体は、第２のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−ＶＨＨ；及び（４）ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各ＶＨＨは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）のコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一または異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図１９】２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖、及び２つの同一の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂのＣ末端が、適宜ペプチドリンカーを介して１つの重鎖のＮ末端に融合される、例示的なＢＡＢＰの概略構造を示す。２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する。完全長抗体は、第２のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得：（１）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各ＶＨＨは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）のコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一または異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図２０】２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖、及び２つの同一の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂのＮ末端が、適宜ペプチドリンカーを介して１つの軽鎖のＣ末端に融合される、例示的なＢＡＢＰの概略構造を示す。２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、第１のエピトープに特異的に結合する。完全長抗体は、第２のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得：（１）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各ＶＨＨは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）のコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一または異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図２１】２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖、及び４つの同一の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂのＣ末端が、適宜ペプチドリンカーを介して単一特異性完全長抗体の重鎖または軽鎖のＮ末端に融合される、例示的なＢＡＢＰの概略構造を示す。各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する。完全長抗体は、各々が第２のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得：（１）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＨＨ−ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各ＶＨＨは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）のコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一または異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図２２】２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖、及び４つの同一の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを有する単一特異性完全長抗体を含み、２つの同一の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂが各重鎖のＮ末端に融合しており、２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、適宜ペプチドリンカーを介して互いに融合され、及び２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、適宜ペプチドリンカーを介して各重鎖のＮ末端に融合される、例示的なＢＡＢＰの概略構造を示す。各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する。完全長抗体は、各々が第２のエピトープに特異的に結合する２つの抗原結合部位を有する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨＨ−ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨＨ−ＶＨＨ−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各ＶＨＨは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）のコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一または異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂと置換してもよい。単一特異性完全長抗体は、二重特異性完全長抗体と置換して、結合特異性をさらに拡張してもよい。
【図２３】２つの同一の抗原結合（Ｆａｂ）断片、２つの同一の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、及びＦｃ領域を含み、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂのＮ末端が、適宜ペプチドリンカーを介してＦａｂ断片のＣＨ１領域のＣ末端に融合され、及び各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂのＣ末端は、Ｆｃ領域のＣＨ２領域のＮ末端に融合される、例示的なＢＡＢＰの概略構造を示す。各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する。各Ｆａｂ断片は、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得：（１）ＶＬ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各ＶＨＨは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）のコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一または異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂと置換してもよい。代替フォーマットでは、特異性を拡張するため、２つのＦａｂ断片は、異なるエピトープに特異的に結合することができ、及び／またはＶＨＨ断片は、異なるエピトープに特異的に結合することができる。
【図２４】２つの同一の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）、２つの同一の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、及びＦｃ領域を含み、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂのＮ末端が、適宜ペプチドリンカーを介してｓｃＦｖのＣ末端に融合され、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂのＣ末端は、Ｆｃ領域のＮ末端に融合される、例示的なＢＡＢＰの概略構造を示す。各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する。各ｓｃＦｖは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、各々が以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する２つのポリペプチド鎖からなり得：ＶＬ−ＶＨ−ＶＨＨ−ＣＨ２−ＣＨ３、各ポリペプチド鎖のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープのコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各ＶＨＨは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）のコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、ｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端において、以下を含み得る：ＶＨ−ＶＬ。代替フォーマットでは、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは省略してもよく、または互いに融合した２つの同一または異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂと置換してもよい。さらに、特異性を拡張するため、２つのｓｃＦｖは、異なるエピトープに特異的に結合することができ、及び／またはＶＨＨ断片は、異なるエピトープに特異的に結合することができる。
【図２５】２つの同一のＦａｂ断片、各々が２つのＶＨＨ断片を含む２つの同一のＦａｂ様断片、及びＦｃ領域を含む、例示的なＢＡＢＰの概略構造を示す。各Ｆａｂ様断片では、ＶＨ及びＶＬ領域は各々、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂによって置換される。各Ｆａｂ様断片は、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する。各Ｆａｂ断片は、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得：（１）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ−ＣＬ；（２）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＨ−ＣＨ１−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＬ−ＣＬ−ＶＨＨ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（１）及び（２）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第１のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、ポリペプチド鎖（３）及び（４）のＶＨ及びＶＬは、第２のエピトープの第２のコピーに特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び各ＶＨＨは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）のコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、特異性を拡張するため、２つのＦａｂ断片は、異なるエピトープに特異的に結合することができ、及び／またはＦａｂ様断片は、異なるエピトープ（例えば、ＴＩＧＩＴから異なるエピトープ）に特異的に結合することができる。
【図２６】２つの同一のｓｃＦｖ、各々が２つのＶＨＨ断片を含む２つの同一のＦａｂ様断片、及びＦｃ領域を含む、例示的なＢＡＢＰの概略構造を示す。各Ｆａｂ様断片では、ＶＨ及びＶＬ領域は各々、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂによって置換される。各Ｆａｂ様断片は、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）に特異的に結合する。各ｓｃＦｖは、第２のエピトープに特異的に結合する。例えば、ＢＡＢＰは、以下のようなＮ末端からＣ末端の構造を有する４つのポリペプチド鎖からなり得：（１）ＶＨＨ−ＣＬ；（２）ＶＬ−ＶＨ−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；（３）ＶＬ−ＶＨ−ＶＨＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３；及び（４）ＶＨＨ−ＣＬ、ポリペプチド鎖（２）及び（３）のＶＨ及びＶＬは、各々、第２のエピトープのコピーに特異的に結合するｓｃＦｖを形成し、各ＶＨＨは、第１のエピトープ（ＴＩＧＩＴ）のコピーに特異的に結合する。代替フォーマットでは、ｓｃＦｖのＣ末端は、ＶＨＨ−ＣＬを含むＦａｂ様断片における鎖のＮ末端に融合され得；及び／またはｓｃＦｖドメインは、Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＶＬを含み得る。さらに、特異性を拡張するため、２つのｓｃＦｖは、異なるエピトープに特異的に結合することができ、及び／またはＶＨＨ断片は、異なるエピトープ（例えば、ＴＩＧＩＴから異なるエピトープ）に特異的に結合することができる。
【図２７】ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路及びＣＤ１５５／ＴＩＧＩＴ経路を同時に標的化することによってＢＡＢＰのインビトロ相乗効果を評価するためのＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二機能性レポーターアッセイを示す。ＢＴＰ−１１及びＢＴＰ−１３を試験して、ＰＤ−１またはＴＩＧＩＴを遮断する単剤療法と比較した（図２７Ａ）。ＢＴＰ−１５、ＢＴＰ−１７、ＢＴＰ−２１及びＢＴＰ−２２を試験して、ＰＤ−Ｌ１またはＴＩＧＩＴを遮断する単剤療法と比較した（図２７Ｂ及び２７Ｃ）。
【図２８】ＦＡＣＳによって検出された、ＢＴＰ−２１、ティラゴルマブ（Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ）、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、ｈ５３Ｃ１及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８の、一次ＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞へのそれぞれの結合を示す。
【図２９】３人の健康な個体からの一次ヒトＰＢＭＣによるＩＦＮ−γ放出のエクスビボ誘導におけるＢＴＰ−２１、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、及びｈ５３Ｃ１の能力を示す。
【図３０】その親エレメント（ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８）及びそれらの組み合わせと比較した、ＣＴ２６腫瘍を担持するＢａｌｂ／ｃヒトＰＤ−１  ＫＩマウスにおけるＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ  ＢＴＰ−１１のインビボ効力を示す。データをクモ状プロットで示す。ＴＦは、無腫瘍マウスを示す。
【図３１】アテゾリズマブ、その親エレメント（ｈ５３Ｃ１及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８）及びそれらの組み合わせと比較した、ヒトＰＤ−Ｌ１を過剰発現するＭＣ３８腫瘍（ＭＣ３８−ｈＰＤＬ１）を担持するＣ５７ＢＬ／６ヒトＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ダブルＫＩマウスにおけるＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ  ＢＴＰ−２１のインビボ効力を示す。データをクモ状プロットで示す。ＴＦは、無腫瘍マウスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明は、ＴＩＧＩＴを特異的に認識する新規のｓｄＡｂ（以下、「抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ」とも呼ばれる）、及びその抗体変異体（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、完全長抗体に融合した抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、Ｆａｂ、またはｓｃＦｖを含む、より大きなタンパク質またはポリペプチド、または抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを含む多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ、例えば、二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ））、及びＴＩＧＩＴ関連疾患（例えば、がん）を治療するためのそれらの使用、ならびにそれらの作製方法を提供する。
【００２９】
ｓｄＡｂは、単一単量体抗体可変ドメイン、例えば、重鎖可変ドメイン（ＶＨＨ）を有することにより、従来の４鎖抗体とは異なり、これは、軽鎖の助けを借りることなく抗原に対して高親和性を示すことができる。ラクダ科動物のＶＨＨは、おおよそ１５ｋＤの分子量を有する最小の機能的抗原結合断片として知られる。
【００３０】
したがって、本出願の一態様は、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ（例えば、天然またはヒト化）、一緒に融合した本明細書に記載の複数の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを含むポリペプチド、Ｆｃ断片（例えば、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、エフェクターレス（不活性）ＩｇＧ１  Ｆｃ、ｈＩｇＧ２  Ｆｃ、またはＩｇＧ４  Ｆｃ）に融合した本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、または完全長抗体（例えば、抗ＰＤ−１抗体、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体）もしくは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む抗原結合断片に融合した本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを含むＭＡＢＰであり得る。抗ＴＩＧＩＴ構築物は、単一特異性または多重特異性（例えば、二重特異性）、一価または多価（例えば、二価）であり得る。
【００３１】
組成物（例えば、医薬組成物）、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物を含むキット及び製造品、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物の作製方法、及本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物を用いたＴＩＧＩＴ関連疾患（例えば、がん）の治療方法も提供する。
【００３２】
Ｉ．定義
本明細書で使用する場合、「治療」または「治療すること」は、臨床結果を含む有益なまたは所望の結果を得るためのアプローチである。本発明の目的では、有益なまたは所望の結果としては、以下：疾患から生じる１つ以上の症状を緩和すること、疾患範囲を縮小すること、疾患を安定化すること（例えば、疾患の悪化の予防または遅らせること）、疾患の拡散（例えば、転移）を予防または遅らせること、疾患の再発を予防または遅らせること、疾患の進行を遅延または遅らせること、疾患状態を改善すること、疾患の寛解（部分的なまたは完全な）を提供すること、疾患を治療するために必要な１つ以上の他の薬物適用の用量を低下させること、疾患の進行を遅らせること、生活の質を向上させること、及び／または生存を延長することの１つ以上が挙げられるが、これらに限定されない。また、「治療」によって包含されるのは、がんの病理学的結果の縮小である。本発明の方法は、治療のこれらの態様のいずれか１つ以上を企図する。
【００３３】
本明細書で使用される「有効量」という用語は、特異的な疾病、状態または疾患を治療する、例えば、その症状の１つ以上を改善、緩和、軽快、及び／または遅延させるのに十分な薬剤または薬剤の組み合わせの量を指す。がんを引き合いに出す場合、有効量は、腫瘍が退縮するか、及び／または腫瘍の増殖速度が低下するか（腫瘍増殖の抑制等）、または他の望ましくない細胞増殖が予防または遅延されるのに十分な量を含む。いくつかの実施形態では、有効量は、発症を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態では、有効量は、再発を予防するかまたは遅延させるのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与によって投与することができる。薬物または組成物の有効量は、（ｉ）がん細胞の数を減少させる、（ｉｉ）腫瘍のサイズを低減させる、（ｉｉｉ）がん細胞が末梢器管に浸潤するのを阻害、遅延、ある程度まで緩徐化及び望ましくは停止させる、（ｉｖ）腫瘍の転移を阻害する（すなわち、ある程度まで緩徐化し、望ましくは停止させる）、（ｖ）腫瘍の成長を阻害する、（ｖｉ）腫瘍の発現及び／または再発を予防または遅延させる、及び／または（ｖｉｉ）がんに伴う症状の１つ以上をある程度まで緩和することができる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「個体」または「対象」は、ヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌ、げっ歯類または霊長類を含むが、これらに限定されない哺乳動物を指す。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。
【００３５】
「抗体」、「抗原結合部分」、または「抗体部分」という用語は、それらの最も広い意味で用いられ、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、完全長抗体及びその抗原結合断片を含むが、これらに限定されない種々の抗体構造を包含する。
【００３６】
「重鎖のみ抗体」または「ＨＣＡｂ」という用語は、重鎖を含むが、４鎖抗体で通常見られる軽鎖が欠けている機能的抗体を指す。ラクダ科動物（例えば、ラクダ、ラマ、またはアルカパ）は、ＨＣＡｂを産生することが知られている。
【００３７】
「単一ドメイン抗体」または「ｓｄＡｂ」という用語は、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）を有する単一抗原結合ポリペプチドを指す。ｓｄＡｂのみは、対応するＣＤＲ含有ポリペプチドと対合せずに抗原に結合することができる。場合によっては、単一ドメイン抗体は、ラクダ科動物のＨＣＡｂから操作されており、それらの重鎖可変ドメインは、「ＶＨＨ」（重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン）とも本明細書で呼ばれる。ラクダ科動物のｓｄＡｂは、公知の最小抗原結合抗体断片の１つである（例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−８（１９９３）；Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３７４：１６８−７３（１９９５）；Ｈａｓｓａｎｚａｄｅｈ−Ｇｈａｓｓａｂｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ（Ｌｏｎｄ），８：１０１３−２６（２０１３）を参照されたい）。基本的なＶＨＨは、Ｎ末端からＣ末端において以下の構造：ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を有し、ここで、ＦＲ１〜ＦＲ４は、フレームワーク領域１〜４をそれぞれ指し、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３は、相補性決定領域１〜３を指す。
【００３８】
「単離された」抗体（または構築物）は、その産生（例えば、天然または組み換え）環境の成分から同定され、単離され、及び／または回収されたものである。単離されたポリペプチドは、その産生環境からの他の全ての成分と関連しないのが好ましい。その産生環境の混入汚染成分、例えば、組み換えトランスフェクト細胞から生じるものは、典型的には、抗体の研究、診断、または治療への使用を妨げる物質であり、それらには、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質性溶質または非タンパク質性溶質が含まれ得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、（１）例えば、Ｌｏｗｒｙ法で測定した場合に、抗体の９５重量％を超えるまで、いくつかの実施形態では、９９重量％を超えるまで、（２）スピニングカップシークエネーターを使用して、Ｎ末端または内部アミノ酸配列の少なくとも１５残基を得るのに十分な程度まで、または（３）クマシーブルーまたは好ましくは銀染色を用いた非還元条件または還元条件下でのＳＤＳ−ＰＡＧＥによって均一になるまで精製される。単離された抗体（または構築物）には、抗体の天然の環境の少なくとも１つの成分は存在しないことになるため、組み換え細胞内にインサイチュ抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチド、抗体、または構築物は、少なくとも１つの精製ステップにより調製されることになる。
【００３９】
抗体の「可変領域」または「可変ドメイン」とは、抗体の重鎖または軽鎖のアミノ末端ドメインを指す。重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、それぞれ、「ＶＨ」及び「ＶＬ」と呼ばれ得る。これらのドメインは、一般的に、（同じクラスの他の抗体に対して）抗体の最も可変な部分であり、抗原結合部位を含有している。ラクダ科の種に由来する重鎖のみ抗体は、「ＶＨＨ」と呼ばれる単一重鎖可変領域を有する。従って、ＶＨＨは、特殊型のＶＨである。
【００４０】
「完全長抗体」、「無傷抗体」、または「全抗体」という用語は、交換可能に使用され、抗体断片とは対照的に、その実質的に無傷な形態の抗体を指す。具体的には、完全長４鎖抗体は、Ｆｃ領域を含む重鎖及び軽鎖を伴うものを含む。完全長重鎖のみ抗体は、重鎖（例えば、ＶＨＨ）及びＦｃ領域を含む。定常ドメインは、天然配列の定常ドメイン（例えば、ヒト天然配列の定常ドメイン）またはそのアミノ酸配列変異体であり得る。場合によっては、無傷抗体は、１つ以上のエフェクター機能を有し得る。
【００４１】
「抗体断片」または「抗原結合断片」は、無傷抗体の一部、好ましくは、無傷抗体の抗原結合及び／または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２（１９９５）を参照されたい）；抗体断片から形成される一本鎖抗体分子；単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）、及び多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。抗体のパパイン消化は、「Ｆａｂ」断片と呼ばれる２つの同一の抗原結合断片、ならびに残余「Ｆｃ」断片（この名称は容易に結晶化する能力を反映している）を産生した。Ｆａｂ断片は、Ｈ鎖の可変領域ドメイン（ＶＨ）及び１つの重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を伴う完全Ｌ鎖からなる。各Ｆａｂ断片は、抗原結合に関して一価であり、すなわち、それは単一の抗原結合部位を有する。抗体のペプシン処理は、単一大型Ｆ（ａｂ’）２断片を生じるが、これは、異なる抗原結合活性を有する２つのジスルフィド結合Ｆａｂ断片におおよそ対応し、依然として抗原に架橋し得る。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域からの１つ以上のシステインを含めてＣＨ１ドメインのカルボキシ末端に２〜３の付加的残基を有することでＦａｂ断片と異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基（複数可）が遊離チオール基を有するＦａｂ’に関する本明細書中での呼称である。Ｆ（ａｂ’）２抗体断片は、元来、それらの間にヒンジシステインを有するＦａｂ’断片の対として産生された。抗体断片の他の化学的カップリングも既知である。
【００４２】
「定常ドメイン」という用語は、抗原結合部位を含む、免疫グロブリンの他の部分である可変ドメインと比較して、より保存されたアミノ酸配列を有する免疫グロブリン分子の部分を指す。定常ドメインは、重鎖のＣＨ１、ＣＨ２、及びＣＨ３ドメイン（総称して、ＣＨ）、及び軽鎖のＣＨＬ（またはＣＬ）ドメインを含む。
【００４３】
いかなる脊椎動物に由来する抗体（免疫グロブリン）の「軽鎖」も、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて明確に区別される、カッパ（κ）及びラムダ（λ）と呼ばれる２タイプの１つに割り当てられ得る。
【００４４】
「Ｆｖ」は、完全な抗原認識及び結合部位を含有する最小の抗体断片である。この断片は、堅く、非共有的に会合した１つの重鎖及び１つの軽鎖可変領域ドメインの二量体からなる。これら２つのドメインのフォールディングから、抗原結合のためのアミノ酸残基に寄与し、抗体に抗原結合特異性を付与する６つの超可変ループ（各々Ｈ及びＬ鎖からの３つのループ）を生じる。しかしながら、単一可変ドメイン（または抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含むＦｖの半分）でさえ、完全結合部位より低い親和性ではあるが、抗原を認識し、結合する能力を有する。
【００４５】
「一本鎖Ｆｖ」（「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略される）は、単一ポリペプチド鎖に連結されるＶＨ及びＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓｃＦｖポリペプチドはさらに、ＶＨ及びＶＬドメイン間にポリペプチドリンカーを含み、これは、抗原結合のために望ましい構造をｓｃＦｖに形成させる。ｓｃＦｖの概説については、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００４６】
「超可変領域」、「ＨＶＲ」、または「ＨＶ」という用語は、本明細書で使用する場合、配列が超可変である、及び／または構造的に定義されたループを形成する、抗体可変ドメインの領域を指す。一般的に、単一ドメイン抗体は、３つのＨＶＲ（またはＣＤＲ）：ＨＶＲ１（またはＣＤＲ１）、ＨＶＲ２（またはＣＤＲ２）、及びＨＶＲ３（またはＣＤＲ３）を含む。ＨＶＲ３（またはＣＤＲ３）は、３つのＨＶＲのうち最も高い多様性を示し、抗体に優れた特異性を付与するうえで特異な役割を果たすと考えられている。例えば、Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８（１９９３）及びＳｈｅｒｉｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．３：７３３−７３６（１９９６）を参照されたい。
【００４７】
「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」という用語は、Ｋａｂａｔシステムで定義されるように、超可変領域を指すように使用される。Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ、５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）を参照されたい。
【００４８】
多くのＨＶＲ描写が本明細書において使用され、包含される。Ｋａｂａｔの相補性決定領域（ＣＤＲ）は、配列可変性に基づき、最も共通して使用される（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））。Ｃｈｏｔｈｉａは、代わりに、構造的ループの位置を指す（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））。ＡｂＭ  ＨＶＲは、ＫａｂａｔのＨＶＲとＣｈｏｔｈｉａの構造的ループの間での妥協を表わし、Ｏｘｆｏｒｄ  ＭｏｌｅｃｕｌａｒのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用可能な複雑な結晶構造の分析に基づく。これらのＨＶＲの各々からの残基を以下の表１に指摘する。
表１．ＨＶＲの描写。
【表１】
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【００４９】
ＨＶＲは以下の通りの「伸長ＨＶＲ」：ＶＬ内に、２４〜３６または２４〜３４（Ｌ１）、４６〜５６または５０〜５６（Ｌ２）、及び８９〜９７または８９〜９６（Ｌ３）、ならびに、ＶＨ内に、２６〜３５（Ｈ１）、５０〜６５または４９〜６５（Ｈ２）、及び９３〜１０２、９４〜１０２、もしくは９５〜１０２（Ｈ３）を含み得る。可変ドメイン残基を、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａに従って、これらの定義の各々について番号付けする。
【００５０】
単一ドメイン抗体（例えば、ＶＨＨ）のアミノ酸残基は、Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２０００  Ｊｕｎ．  ２３；２４０（１−２）：１８５−１９５の論文においてラクダ科動物に由来するＶＨＨドメインに適用されるように、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  ｉｎｔｅｒｅｓｔ」，ＵＳ  Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，ＮＩＨ  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ，Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ．９１）によって与えられたＶＨドメインに関する一般的な番号付けに従って番号付けされる。この番号付けに従うと、ＶＨＨのＦＲ１は、１位〜３０位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ１は、３１位〜３５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ２は、３６位〜４９位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ２は、５０位〜６５位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ３は、６６位〜９４位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＣＤＲ３は、９５位〜１０２位のアミノ酸残基を含み、ＶＨＨのＦＲ４は、１０３位〜１１３位のアミノ酸残基を含む。これに関して、ＶＨドメイン及びＶＨＨドメインに関して当該技術分野で既知のように、ＣＤＲそれぞれにおけるアミノ酸残基の総数は変わる可能性があり、Ｋａｂａｔ番号付けで示されるアミノ酸残基の総数に対応していなくてもよい（すなわち、Ｋａｂａｔ番号付けによる１つ以上の位置が実際の配列で占められていなくてもよく、または実際の配列が、Ｋａｂａｔ番号付けで可能な数より多くのアミノ酸残基を含有していてもよい）ことに留意すべきである。
【００５１】
「Ｋａｂａｔにおける可変ドメイン残基番号付け」または「Ｋａｂａｔにおけるアミノ酸位置番号付け」という表現、ならびにそのバリエーションは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａにおいて抗体の編集での重鎖可変ドメインまたは軽鎖可変ドメインについて使用される番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを使用し、実際の直鎖アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲまたはＨＶＲの短縮、またはその中への挿入に対応するより少ないまたは追加のアミノ酸を含み得る。例えば、重鎖可変ドメインは、Ｈ２の残基５２の後の単一アミノ酸挿入（Ｋａｂａｔに従った残基５２ａ）及び重鎖ＦＲ残基８２の後の挿入残基（例えば、Ｋａｂａｔに従った残基８２ａ、８２ｂ、及び８２ｃなど）を含み得る。残基のＫａｂａｔ番号付けは、「標準的な」Ｋａｂａｔ番号付け配列を伴う抗体の配列の相同性の領域でのアライメントにより所与の抗体について決定することができる。
【００５２】
本明細書で別段の指定がない限り、免疫グロブリン重鎖における残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，ｓｕｐｒａと同様のＥＵインデックスのものである。「Ｋａｂａｔと同様のＥＵインデックス」とは、ヒトＩｇＧ１  ＥＵ抗体の残基番号付けを指す。
【００５３】
「フレームワーク」または「ＦＲ」残基は、本明細書で定義されるＨＶＲ残基以外の可変ドメイン残基である。
【００５４】
本明細書で使用する場合、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、または「特異的である」という用語は、測定可能で再現性のある相互作用、例えば、標的と抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の間での結合を指し、それは、生物学的分子を含む分子の異種集団の存在において標的の存在を決定可能である。例えば、標的（エピトープであり得る）に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）は、より大きな親和性、アビディティを伴い、より容易に、及び／またはそれが他の標的に結合するよりも大きな持続時間を伴いこの標的に結合する抗体である。いくつかの実施形態では、無関係な標的への抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の結合の程度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定される通り、標的への抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の結合の約１０％未満である。いくつかの実施形態では、標的に特異的に結合する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）は、≦１０−５Ｍ、≦１０−６Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦１０−９Ｍ、≦１０−１０Ｍ、≦１０−１１Ｍ、または≦１０−１２Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、異なる種からのタンパク質間で保存されているタンパク質上のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、特異的結合は、排他的な結合を含み得るが、それを要求しない。抗体または抗原結合ドメインの結合特異性は、当該技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。そのような方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、ＥＣＬ、ＩＲＭＡ、ＥＩＡ、ＢＩＡｃｏｒｅ試験、及びペプチドスキャンを含むが、これらに限定されるものではない。
【００５５】
「特異性」という用語は、抗原の特定のエピトープに対する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）の選択的認識を指す。天然抗体は、例えば、単一特異性である。「多重特異性」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質が、ポリトロープ特異性を有する（すなわち、１つの生物学的分子上の２つ、３つ、またはそれ以上の異なるエピトープに特異的に結合することができる、または２つ、３つ、またはそれ以上の異なる生物学的分子上のエピトープに特異的に結合することができる）ことを指す。「二重特異性」は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質が２つの異なる抗原結合特異性を有することを指す。別段の指定がない限り、二重特異性抗体によって結合した抗原を表記した順番は任意である。すなわち、例えば、「抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１」、「抗ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ」、「ＴＩＧＩＴ×ＰＤ−Ｌ１」、「ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ」、「ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ」、「ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１」、「ＰＤ−Ｌ１−ＴＩＧＩＴ」、及び「ＴＩＧＩＴ−ＰＤ−Ｌ１」という用語は、ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−Ｌ１の両方を特異的に認識する二重特異性抗体を指すように交換可能に使用され得る。「単一特異性」という用語は、本明細書で使用する場合、各々が同じ抗原の同じエピトープに結合する１つ以上の結合部位を有する抗原結合タンパク質（例えば、ｓｄＡｂ）を指す。
【００５６】
「価」という用語は、本明細書で使用する場合、抗原結合タンパク質における特定の数の結合部位の存在を指す。例えば、天然抗体または完全長抗体は、２つの結合部位を有し、二価である。このように、「三価」、「四価」、「五価」、及び「六価」という用語は、抗原結合タンパク質における２つの結合部位、３つの結合部位、４つの結合部位、５つの結合部位、及び６つの結合部位の存在をそれぞれ指す。
【００５７】
本明細書において「Ｆｃ領域」または「断片結晶化可能領域」という用語は、免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域（天然配列Ｆｃ領域及び変異体Ｆｃ領域を含む）を定義するために使用される。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変動し得るが、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、通常、位置Ｃｙｓ２２６のアミノ酸残基から、またはＰｒｏ２３０から、そのカルボキシル末端まで伸展すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン（ＥＵ番号付けシステムによる残基４４７）を、抗体の産生もしくは精製の間に、または抗体の重鎖をコードする核酸の組み換え操作により除去してもよい。したがって、無傷抗体の組成物は、全てのＫ４４７残基が除去された抗体集団、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体集団、及びＫ４４７残基を伴う及び伴わない抗体の混合物を有する抗体集団を含み得る。本明細書に記載の使用のための適当な天然配列Ｆｃ領域は、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２（ＩｇＧ２Ａ、ＩｇＧ２Ｂ）、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４を含む。
【００５８】
「結合親和性」は、一般的に、分子（例えば、抗体）の単一結合部位とその結合パートナー（例えば、抗原）の間での非共有結合的な相互作用の合計の強度を指す。別段の指定がない限り、本明細書で使用する場合、「結合親和性」は、結合対のメンバーの間での１：１の相互作用を反映する内因性の結合親和性を指す。結合親和性は、Ｋｄ、Ｋｏｆｆ、Ｋｏｎ、またはＫａによって示すことができる。「Ｋｏｆｆ」という用語は、本明細書で使用する場合、動態選択の機構から決定される、抗体／抗原複合体からの抗体（または抗原結合ドメイン）の解離についてのｏｆｆ速度定数を指すことを意図し、ｓ−１の単位で表される。「Ｋｏｎ」という用語は、本明細書で使用する場合、抗体（または抗原結合ドメイン）が抗原に会合して、抗体／抗原複合体を形成するｏｎ速度定数を指すことを意図し、Ｍ−１ｓ−１の単位で表される。平衡解離定数「ＫＤ」または「Ｋｄ」という用語は、本明細書で使用する場合、特定の抗体−抗原相互作用の解離定数を指し、平衡状態にある抗体分子の溶液中に存在する全ての抗体結合ドメインの半分を占めるのに必要な抗原の濃度を示し、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎに等しく、Ｍの単位で表される。Ｋｄの測定から、全ての結合剤が溶液中にあることが想定される。例えば、酵母発現系で、抗体が細胞壁に繋がっている場合、対応する平衡速度定数は、ＥＣ５０として表され、それからＫｄの良好な近似値が得られる。親和性定数Ｋａは、解離定数Ｋｄの逆数であり、Ｍ−１の単位で表される。解離定数（ＫＤまたはＫｄ）は、抗体の抗原に対する親和性を示す指標として使用される。例えば、各種標識剤で標識した抗体を用いたスキャチャード方法、ならびに市販の測定キットであるＢｉａｃｏｒｅＸ（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社製）または類似のキットを用いて、当該キットに添付された取扱い説明書及び実験操作方法に従って容易に分析することができる。これらの方法を用いて求められるＫＤ値は、Ｍ（モル）の単位で表される。標的に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片は、例えば、≦１０−５Ｍ、≦１０−６Ｍ、≦１０−７Ｍ、≦１０−８Ｍ、≦１０−９Ｍ、≦１０−１０Ｍ、≦１０−１１Ｍ、または≦１０−１２Ｍの解離定数（Ｋｄ）を有し得る。
【００５９】
半分の最大阻害濃度（ＩＣ５０）は、特定の生物学的または生化学的機能を阻害する際の物質（例えば、抗体）の効力の尺度である。それは、どの程度の量の特定の薬物または他の物質（阻害剤、例えば、抗体）が、所与の生物学的過程（例えば、ＴＩＧＩＴ及びＣＤ１５５の間の結合、または過程の成分、すなわち、酵素、細胞、細胞受容体、または微生物）を半分まで阻害するのに必要とされるかということを示す。値は、典型的には、モル濃度として表される。ＩＣ５０は、作動薬または他の物質（例えば、抗体）に対するＥＣ５０に匹敵する。ＥＣ５０は、最大効果の５０％をインビボで細胞に基づくサイトカイン放出アッセイも表す。本明細書で使用する場合、「ＩＣ５０」は、抗原の生物学的活性（例えば、ＴＩＧＩＴの生物学的活性）の５０％をインビトロで中和するために必要な抗体（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ）の有効な濃度を示すように使用される。ＩＣ５０またはＥＣ５０は、バイオアッセイ、例えば、ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合の阻害（競合結合アッセイ）、細胞ベースサイトカイン放出アッセイ、または増幅発光近接均質アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）によって測定することができる。
【００６０】
ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」及び「相同性」は、配列を整列させ、ギャップを導入し（必要な場合）、最高パーセント配列同一性を達成した後（任意の保存的置換を配列同一性の部分として考えず）、特定のペプチドまたはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、当該技術分野内にある種々の方法で、例えば、公的に利用可能なコンピューターソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアなどを使用して達成することができる。当業者は、アライメントを測定するための適切なパラメーター（比較されている配列の全長にわたる最高アライメントを達成するために必要とされる任意のアルゴリズムを含む）を決定することができる。
【００６１】
本明細書に記載の構築物、抗体、またはその抗原結合断片をコードする「単離」核酸分子は、それが産生された環境において通常会合している少なくとも１つの混入核酸分子から同定及び分離される核酸分子である。好ましくは、単離核酸は、産生環境に関連する全ての成分との会合がない。本明細書に記載のポリペプチド及び抗体をコードする単離核酸分子は、それが天然で見出される形態または設定以外の形態である。単離核酸分子は、従って、細胞中に天然に生じる本明細書に記載のポリペプチド及び抗体をコードする核酸から区別される。単離核酸は、核酸分子を通常含有する細胞中に含有される核酸分子を含むが、その核酸分子は、染色体外に、またはその天然染色体位置とは異なる染色体位置に存在する。
【００６２】
本明細書に記載の本発明の実施形態は、実施形態「からなる」こと、及び／または実施形態「から本質的になる」を含むことを理解されたい。
【００６３】
「約」に関して、本明細書における値またはパラメーターは、その値またはパラメーターそれ自体を対象とする変化量を含む（記載されている）。例えば、「約Ｘ」という記述は、「Ｘ」の記述を含む。
【００６４】
本明細書で使用する場合、ある値またはパラメーター「ではない」という言及は、一般にある値またはパラメーター「以外」を意味し、記載する。例えば、方法は、タイプＸのがんを治療するために使用されないということは、この方法は、Ｘ以外のタイプのがんを治療するために使用されることを意味する。
【００６５】
本明細書で使用される「約Ｘ〜Ｙ」という用語は、「約Ｘ〜約Ｙ」と同じ意味を有する。
【００６６】
本明細書及び添付の特許請求の範囲で用いられる単数形の「ある」、「または」、及び「その」は、文脈が別段に決定することが明らかでない限り、複数の指示を包含する。
【００６７】
ＩＩ．抗ＴＩＧＩＴ構築物
（Ｉ）抗ＴＩＧＩＴ単一ドメイン抗体部分
本明細書に記載の単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、ＴＩＧＩＴ（または「抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ」）を特異的に認識する単一ドメイン抗体（ｓｄＡｂ）部分を含む。いくつかの実施形態では、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物は、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂである。
【００６８】
いくつかの実施形態では、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【００６９】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。従って、いくつかの実施形態では、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【００７０】
いくつかの実施形態では、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。
【００７１】
いくつかの実施形態では、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００７２】
本明細書に記載したＣＤＲの配列を以下の表２２に提供する。ＣＤＲは、種々のペアワイズ組み合わせで組み合わせて、多くの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を生成することができる。
【００７３】
例えば、いくつかの実施形態では、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００７５】
いくつかの実施形態では、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００７９】
いくつかの実施形態では、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１８２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００８０】
いくつかの実施形態では、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００８１】
いくつかの実施形態では、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００８２】
いくつかの実施形態では、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００８３】
いくつかの実施形態では、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１９９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００８５】
いくつかの実施形態では、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００８６】
いくつかの実施形態では、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００８７】
いくつかの実施形態では、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００８８】
いくつかの実施形態では、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００８９】
いくつかの実施形態では、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００９０】
いくつかの実施形態では、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、配列番号７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。
【００９１】
抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、１つ以上のＦＲ配列中に１つ以上の「ホールマーク残基」を含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、以下のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み得る：ａ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｖ、Ｌ、Ａ、Ｈ、Ｓ、Ｉ、Ｗ、Ｃ、Ｎ、Ｇ、Ｄ、Ｔ、及びＰ（例えば、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、またはＶ、例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ａ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ｅ、Ｑ、Ｇ、Ｄ、Ａ、Ｋ、Ｒ、Ｌ、Ｐ、Ｓ、Ｖ、Ｈ、Ｔ、Ｎ、Ｗ、Ｍ、及びＩ（例えば、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、またはＬ、または例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）からなる群から選択され；ａ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｈ、Ｆ、Ｇ、Ｑ、Ｓ、Ｅ、Ｔ、Ｙ、Ｃ、Ｉ、Ｄ、及びＶ（例えば、Ｌ、Ｃ、またはＲ、または例えば、ＬまたはＲ）からなる群から選択され；ａ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ、Ｇ、Ｓ、Ｋ、Ａ、Ｍ、Ｙ、Ｉ、Ｆ、Ｔ、Ｎ、Ｖ、Ｑ、Ｐ、Ｅ、及びＣ（例えば、Ｗ、Ｇ、またはＲ、または例えば、Ｗ）からなる群から選択され；及びａ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ、Ｌ、Ｒ、Ｐ、Ｅ、Ｋ、Ｓ、Ｔ、Ｍ、Ａ、及びＨ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；またはｂ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ（例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ｂ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ｅ及びＱからなる群から選択され；ｂ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｒ及びＬ（例えば、Ｒ）からなる群から選択され；ｂ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｗ、Ｒ、Ｇ、及びＳ（例えば、Ｗ）からなる群から選択され；及びｂ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ及びＬ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；またはｃ−１）３７位のアミノ酸残基は、Ｆ、Ｙ、Ｌ、Ｉ、及びＶ（例えば、ＦまたはＹ、または例えば、Ｆ）からなる群から選択され；ｃ−２）４４位のアミノ酸残基は、Ａ、Ｇ、Ｅ、Ｄ、Ｑ、Ｒ、Ｓ、及びＬ（例えば、Ｇ、Ｅ、またはＱ）からなる群から選択され；ｃ−３）４５位のアミノ酸残基は、Ｌ、Ｒ、及びＣ（例えば、ＬまたはＲ）からなる群から選択され；ｃ−４）１０３位のアミノ酸残基は、Ｐ、Ｒ、及びＳ（例えば、ＲまたはＳ）からなる群から選択され；及びｃ−５）１０８位のアミノ酸残基は、Ｑ及びＬ（例えば、Ｑ）からなる群から選択され；アミノ酸位置は、Ｋａｂａｔ番号付けに従う。Ｋａｂａｔ番号付けによるアミノ酸位置３７、４４、４５、１０３及び１０８でのこれらの「ホールマーク残基」は、天然ＶＨＨ配列の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分に適用し、及びヒト化中に置換することができることに留意すべきである。例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによるアミノ酸位置１０８でのＱは、Ｌに適宜ヒト化することができる。他のヒト化置換は、当業者には明らかであろう。例えば、潜在的に有用なヒト化置換は、天然に生じるＶＨＨのＦＲ配列を、１つ以上の密接に関連するヒトＶＨの対応するＦＲ配列と比較した後、当該技術分野で公知の（本明細書にも記載される）方法を用いて、１つ以上のそのような潜在的に有用なヒト化置換を前記ＶＨＨに導入することで決定することができる。得られるヒト化ＶＨＨ配列は、ＴＩＧＩＴ結合親和性、安定性、発現のしやすさ及びレベル、及び／または他の所望の特性について試験することができる。可能な残基置換は、抗体ＶＨドメインから来てもよく、ＶＨ／ＶＬ界面は、１つ以上の高電荷アミノ酸残基を含む。本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、部分的または完全にヒト化することができる。好ましくは、得られるヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、本明細書に記載のＫｄ、Ｋｏｎ、ＫｏｆｆでＴＩＧＩＴに結合する。
【００９２】
いくつかの実施形態では、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはその変異体を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ、例えば、ＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはその変異体を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、アミノ酸置換は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＦＲ、例えば、ＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４内である。いくつかの実施形態では、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはその変異体を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤＲ及びＦＲの両方においてアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【００９３】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のいずれか１つと競合的にＴＩＧＩＴに特異的に結合する抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分（以下、「競合抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分」または「競合抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ」と呼ばれる）または抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む、抗ＴＩＧＩＴ構築物（以下、「競合抗ＴＩＧＩＴ構築物」と呼ばれる）を提供する。いくつかの実施形態では、競合的結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分と競合的にＴＩＧＩＴに特異的に結合する。別の例では、いくつかの実施形態では、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分と競合的にＴＩＧＩＴに特異的に結合する、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分（または抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物）を提供する。いくつかの実施形態では、競合抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、競合抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【００９４】
単一ドメイン抗体
例示的なｓｄＡｂとしては、重鎖のみ抗体に由来する重鎖可変ドメイン（例えば、ラクダ科におけるＶＨＨ（重鎖抗体の重鎖の可変ドメイン）または軟骨魚類におけるＶＮＡＲ（サメ新抗原受容体の可変ドメイン））、軽鎖を天然に欠く結合分子、慣用の４鎖抗体に由来する単一ドメイン（例えば、ＶＨまたはＶＬ）、ヒト化重鎖のみ抗体、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットにより産生されたヒト単一ドメイン抗体、及び抗体に由来するもの以外の操作されたドメイン及び単一ドメイン足場が挙げられるが、これらに限定されない。ｓｄＡｂは、マウス、ラット、ヒト、ラクダ、ラマ、ヤツメウナギ、サカナ、サメ、ヤギ、ウサギ、及びウシを含むが、これらに限定されない任意の種由来であってもよい。本明細書で検討される単一ドメイン抗体は、ラクダ科及びサメ以外の種に由来する天然に生じる単一ドメイン抗体分子も含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軽鎖を欠く重鎖として知られる天然に生じる単一ドメイン抗原結合分子（「重鎖のみ抗体」、または「ＨＣＡｂ」とも本明細書中で呼ばれる）由来である。そのような単一ドメイン分子は、例えば、ＷＯ９４／０４６７８号及びＨａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ，Ｃ．ｅｔ  ａｌ．（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ  ３６３：４４６−４４８に開示されている。明確化するために、天然に軽鎖を欠く重鎖分子に由来する可変ドメインは、４鎖免疫グロブリンの慣用のＶＨと区別するために、ＶＨＨとして本明細書で知られる。そのようなＶＨＨ分子は、ラクダ科種、例えば、ラクダ、ラマ、ビクーニャ、ヒトコブラクダ、アルカパ、及びグアナコで育った抗体由来であり得る。ラクダ科以外の他の種は、天然に軽鎖を欠く重鎖分子を産生し得、そのようなＶＨＨは、本出願の範囲内である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、軟骨魚類で見られる免疫グロブリンの可変領域由来である。例えば、ｓｄＡｂは、サメの血清に見られる新規抗原受容体（ＮＡＲ）として知られる免疫グロブリンアイソタイプ由来であり得る。ＮＡＲ（「ＩｇＮＡＲ」）の可変領域に由来する単一ドメイン分子を生成する方法は、ＷＯ０３／０１４１６１号及びＳｔｒｅｌｔｓｏｖ（２００５）Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉ．１４：２９０１−２９０９に記載されている。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、組み換え、ＣＤＲ移植、ヒト化、ラクダ化、脱免疫化、及び／またはインビトロで生成される（例えば、ファージディスプレイにより選択される）。いくつかの実施形態では、フレームワーク領域のアミノ酸配列は、フレームワーク領域における特定のアミノ酸残基の「ラクダ化」によって変更され得る。ラクダ化とは、従来の４鎖抗体からの（天然に生じる）ＶＨドメインのアミノ酸配列における１つ以上のアミノ酸残基を、重鎖抗体のＶＨＨドメインにおける対応する位置（複数可）で生じる１つ以上のアミノ酸残基と置き換えるまたは置換することを指す。これは、それ自体が知られた方法で行うことができ、例えば、本明細書中のさらなる説明に基づいて、当業者には明白であろう。そのような「ラクダ化」置換は、本明細書で定義するように、ＶＨ−ＶＬ界面及び／またはいわゆるラクダ科動物のホールマーク残基に形成される、及び／または存在するアミノ酸位置に挿入するのが好ましい（例えば、ＷＯ９４／０４６７８、Ｄａｖｉｅｓ及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ３３９：２８５−２９０、１９９４；Ｄａｖｉｅｓ  ａｎｄ  Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ９（６）：５３１−５３７，１９９６；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２５９：９５７−９６９，１９９６；及びＲｉｅｃｈｍａｎｎ  ａｎｄ  Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．２３１：２５−３８，１９９９を参照されたい）。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、ヒト重鎖セグメントを発現するトランスジェニックマウスまたはラットが産生するヒトｓｄＡｂである。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、親和性成熟される。
【００９９】
いくつかの実施形態では、特定の抗原または標的に対する天然に生じるＶＨＨドメインは、ラクダ科動物のＶＨＨ配列の（ナイーブまたは免疫）ライブラリーから得ることができる。そのような方法は、１つ以上のそれ自体が知られたスクリーニング技術を使用して、前記抗原または標的、またはその少なくとも一部、断片、抗原決定基またはエピトープを用いてそのようなライブラリーをスクリーニングすることを伴ってもよいし、伴わなくてもよい。そのようなライブラリー及び技術は、例えば、ＷＯ９９／３７６８１、ＷＯ０１／９０１９０、ＷＯ０３／０２５０２０、及びＷＯ０３／０３５６９４に記載されている。あるいは、（ナイーブまたは免疫）ＶＨＨライブラリーに由来する改良した合成または半合成ライブラリーは、例えば、ＷＯ００／４３５０７に記載されるように、無作為突然変異誘発及び／またはＣＤＲシャッフリングなどの技術によって（ナイーブまたは免疫）ＶＨＨライブラリーから得られたＶＨＨライブラリーのように使用してもよい。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、従来の４鎖抗体から生成される。例えば、ＥＰ０３６８６８４、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ  １９８９  Ｏｃｔ．１２；３４１（６２４２）：５４４−６）、Ｈｏｌｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００３，２１（１１）：４８４−４９０；ＷＯ０６／０３０２２０；及びＷＯ０６／００３３８８を参照されたい。
【０１０１】
ｓｄＡｂの特有な特性により、ＶＨＨドメインを単一抗原結合タンパク質または抗原結合ドメイン（すなわち、より大きいタンパクやポリペプチドの一部として）として使用することは、従来のＶＨ及びＶＬ領域、ｓｃＦｖまたは従来の抗体断片（例えば、Ｆａｂまたは（Ｆａｂ’）２）を上回る多くの有意な優位性を提供する：１）たった１つのドメインしか抗原が高い親和性で結合するのに必要でないので、第２のドメインを有する必要も、これら２つのドメインが正しい空間的な構造及び立体配置に存在することを確かめる必要もない（例えば、折り畳み中に重鎖と軽鎖を対合する必要がない、特別に設計されたリンカー（例えば、ｓｃＦｖに対して）を使用する必要がない）；２）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、１つの遺伝子から発現することができ、転写後の折り畳みまたは改変の必要がない；３）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、簡単に多価及び多重特異的な形態（本明細書でさらに議論するように）に操作することができる；４）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、高い可溶性を示し、凝集しやすい傾向（マウス由来「ｄＡｂｓ」に見られるような、Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．１９８９  Ｏｃｔ  １２；３４１（６２４２）：５４４−６）に記載されている）が見られない；５）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、熱、ｐＨ、プロテアーゼ、及び他の変性剤や変性条件に対して高い安定性を示す；６）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、例えば、微生物発酵を用いて、（大規模な生産規模であっても）容易かつ比較的安価に調製でき、（例えば、従来の抗体断片の生産に必要な）哺乳類の発現系を必要としない；７）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、従来の４鎖抗体及びそれらの抗原結合断片と比較して比較的小さい（従来のＩｇＧよりもおおよそ１５ｋＤａまたは１０倍小さい）ため、例えば、固形腫瘍及び他の密集組織への（より）高い組織浸透能力を有する；８）ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、（従来のＶＨドメインのものと比較して拡張されたＣＤＲ３ループにより）いわゆる「空洞結合特性」を示すため、従来の４鎖抗体及びその抗原結合断片が接近できなかった標的及びエピトープに接近することができる。例えば、ＶＨＨドメイン及び他のｓｄＡｂは、酵素を阻害することができることが示されている（例えば、ＷＯ１９９７０４９８０５；Ｔｒａｎｓｕｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎｓ．１９９８  Ｓｅｐ  １；３２（４）：５１５−２２；Ｌａｕｗｅｒｅｙｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１９９８  Ｊｕｌ  １；１７（１３）：３５１２−２０を参照されたい）。
【０１０２】
ＴＩＧＩＴ
ＴＩＧＩＴは、ＣＤ２８ファミリーに属する。２６ＫＤａのタンパク質は、細胞質中に細胞外ＩｇＶドメイン、Ｉ型膜貫通領域、細胞内免疫グロブリンテールチロシン（ＩＴＴ）様モチーフ、及びＣ末端免疫受容体チロシンベース阻害モチーフ（ＩＴＩＭ）モチーフからなる。ナイーブＴ細胞及びＮＫ細胞では、ＴＩＧＩＴは、細胞表面上でほとんど検出できないが、Ｔ細胞及びＮＫ細胞の活性化の際に上方調節される。
【０１０３】
「Ｉｇ及びＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体」、「ＴＩＧＩＴ」、「ＴＩＧＩＴ抗原」、「ＴＩＧＩＴエピトープ」、「Ｖｓｔｍ３」及び「ＷＵＣＡＭ」という用語は、交換可能に使用され、ヒトＴＩＧＩＴの変異体、アイソフォーム、種ホモログ、及びＴＩＧＩＴ少なくとも１つの共通エピトープを有するアナログが含まれる。
【０１０４】
ヒトＴＩＧＩＴのアミノ酸配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６１６０で開示される。アミノ酸１〜２１の領域は、シグナルペプチドであり；２２〜１４１は、細胞外ドメインであり；１４２〜１６２は、膜貫通ドメインであり；及び１６３〜２４４は、細胞質ドメインである。ｍＲＮＡの選択的スプライシングによって１７０アミノ酸を有するアミノ酸配列の変異体が報告されている。ヒトＴＩＧＩＴ  ｍＲＮＡのヌクレオチド配列は、ＮＭ＿１７３７９９で開示される。１７３位でのＡからＧへの転移を有するヌクレオチド配列の変異体が報告されている。
【０１０５】
特定のヒトＴＩＧＩＴ配列は、一般的に、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６１６０のヒトＴＩＧＩＴに対するアミノ酸配列が少なくとも９０％同一であり、他の種（例えば、ネズミ）のＴＩＧＩＴアミノ酸配列と比較した場合にアミノ酸配列をヒトとして同定するアミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＴＩＧＩＴは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６１６０のＴＩＧＩＴに対してアミノ酸配列が少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一であり得る。いくつかの実施形態では、ヒトＴＩＧＩＴ配列は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６１６０のＴＩＧＩＴから１０未満のアミノ酸差異を示す。いくつかの実施形態では、ヒトＴＩＧＩＴは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６１６０のＴＩＧＩＴから５、４、３、２、または１未満のアミノ酸差異を示し得る。同一性パーセントは、本明細書に記載されるように決定することができる。いくつかの実施形態では、ヒトＴＩＧＩＴ配列は、例えば、保存された突然変異または非保存領域中の突然変異を有することによってＧｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６１６０のヒトＴＩＧＩＴと異なる場合があり、ＴＩＧＩＴは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６１６０のヒトＴＩＧＩＴと実質的に同じ生物学的機能を有する。例えば、ヒトＴＩＧＩＴの生物学的機能は、本開示の抗ＴＩＧＩＴ構築物によって特異的に結合されるＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン中にエピトープを有することであり、またはヒトＴＩＧＩＴの生物学的機能は、Ｔ細胞活性の調節である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６１６０のＴＩＧＩＴに対して１００％のアミノ酸配列同一性を有するＴＩＧＩＴポリペプチドを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６８のアミノ酸配列を含むＴＩＧＩＴポリペプチドを特異的に認識する。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ヒト以外の種、またはヒトＴＩＧＩＴに構造的に関連する他のタンパク質（例えば、ヒトＴＩＧＩＴホモログ）に由来するＴＩＧＩＴと交差反応し得る。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ヒトＴＩＧＩＴに対して完全に特異的であり、種または他の種類の交差反応性を示さない。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ＴＩＧＩＴの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ＴＩＧＩＴ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＮ末端部分を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ＴＩＧＩＴ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）のＣ末端部分を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ＴＩＧＩＴ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）の中央部分を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分によって特異的に認識されるＴＩＧＩＴのＥＣＤは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６１６０のＴＩＧＩＴの細胞外ドメインに対してアミノ酸配列が少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％同一である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分によって特異的に認識されるＴＩＧＩＴのＥＣＤは、Ｇｅｎｂａｎｋ受託番号ＮＰ＿７７６１６０のＴＩＧＩＴの細胞外ドメインに対してアミノ酸配列が１００％同一である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６９のアミノ酸配列を含むＴＩＧＩＴポリペプチドを特異的に認識する。
【０１０８】
抗体親和性
抗体または抗原結合ドメインの結合特異性は、当該技術分野で公知の方法によって実験的に決定することができる。そのような方法は、ウェスタンブロット、ＥＬＩＳＡ−、ＲＩＡ−、ＥＣＬ−、ＩＲＭＡ−、ＥＩＡ−、ＢＩＡｃｏｒｅ試験及びペプチドスキャンを含むが、これらに限定されるものではない。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−６Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−７Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−８Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−１１Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−６Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−１０Ｍ〜約１０−１２Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−９Ｍ〜約１０−１１Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−８Ｍ〜約１０−１０Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−７Ｍ〜約１０−９Ｍ、約１０−５Ｍ〜約１０−８Ｍ、または約１０−６Ｍ〜約１０−８Ｍである。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｏｎは、約１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０４Ｍ−１ｓ−１、約１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０６Ｍ−１ｓ−１、約１０６Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０２Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０３Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０５Ｍ−１ｓ−１〜約１０７Ｍ−１ｓ−１、約１０３Ｍ−１ｓ−１〜約１０６Ｍ−１ｓ−１、または約１０４Ｍ−１ｓ−１〜約１０６Ｍ−１ｓ−１である。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｏｆｆは、約１ｓ−１〜約１０−２ｓ−１、約１０−２ｓ−１〜約１０−４ｓ−１、約１０−４ｓ−１〜約１０−５ｓ−１、約１０−５ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−２ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−３ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−４ｓ−１〜約１０−６ｓ−１、約１０−２ｓ−１〜約１０−５ｓ−１、または約１０−３ｓ−１〜約１０−５ｓ−１である。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＥＣ５０は、増幅発光近接均質アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）で１０ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＥＣ５０は、ＦＡＣＳ分析（競合結合アッセイ）によるリガンド結合の阻害、または細胞ベースサイトカイン放出アッセイにおいて５００ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＩＣ５０は、１ｎＭ未満（例えば約０．００１ｎＭ〜約０．０１ｎＭ、約０．０１ｎＭ〜約０．１ｎＭ、約０．１ｎＭ〜約１ｎＭ等）、約１ｎＭ〜約１０ｎＭ、約１０ｎＭ〜約５０ｎＭ、約５０ｎＭ〜約１００ｎＭ、約１００ｎＭ〜約２００ｎＭ、約２００ｎＭ〜約３００ｎＭ、約３００ｎＭ〜約４００ｎＭ、または約４００ｎＭ〜約５００ｎＭ未満である。
【０１１３】
キメラまたはヒト化抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、キメラ抗体である。ある特定のキメラ抗体は、例えば、米国特許第４，８１６，５６７号、及びＭｏｒｒｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１−６８５５（１９８４））に記載されている。一例では、キメラ抗体は、非ヒト可変領域（例えば、ラクダ科の種、例えば、ラマに由来する可変領域）及びヒト定常領域を含む。さらなる例では、キメラ抗体は、クラスまたはサブクラスが親抗体のものから変更された「クラススイッチ」抗体である。キメラ抗体は、その抗原結合断片を含む。
【０１１４】
いくつかの実施形態では、キメラ抗体は、ヒト化抗体である。典型的には、非ヒト抗体は、ヒトに対する免疫原性を低減するために、親の非ヒト抗体の特異性及び親和性を保持したまま、ヒト化されている。一般的に、ヒト化抗体は、ＨＶＲ、例えば、ＣＤＲ（またはその一部）が非ヒト抗体から由来し、ＦＲ（またはその一部）がヒト抗体配列に由来する、１つ以上の可変ドメインを含む。ヒト化抗体は、場合により、ヒト定常領域の少なくとも部分も含む。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体のいくつかのＦＲ残基は、例えば、抗体特異性または親和性を回復もしくは改善するめに、非ヒト抗体（例えば、ＨＶＲ残基が由来する抗体）に由来する対応する残基で置換されている。
【０１１５】
ヒト化抗体及びそれらの製造方法は、例えば、Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）に総説される。ヒト化に用いられ得るヒトフレームワーク領域は、限定されないが、「最適フィット」法を用いて選択されるフレームワーク領域；軽鎖または重鎖の可変領域の特定のサブグループのヒト抗体のコンセンサス配列に由来するフレームワーク領域；ヒト成熟（体細胞変異）フレームワーク領域またはヒト生殖細胞系フレームワーク領域；及びＦＲライブラリースクリーニングに由来するフレームワーク領域を含む。
【０１１６】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、異種の種に対するその免疫原性を減少させながら、抗原に対するドメインの天然の親和性を減少させることなく改変される、例えば、ヒト化される。例えば、ラマ抗体の抗体可変ドメイン（ＶＨＨ）のアミノ酸残基は、決定することができ、例えば、フレームワーク領域におけるラクダ科動物のアミノ酸の１つ以上は、ポリペプチドがその典型的な特徴を失うことなく、すなわち、ヒト化が、結果として生じるポリペプチドの抗原結合能力に著しく影響を及ぼさないように、ヒトコンセンサス配列に見られるようなそれらのヒト対応物に置き換えられる。ラクダ科動物の単一ドメイン抗体のヒト化には、単一ポリペプチド鎖における限られた量のアミノ酸の導入及び突然変異誘発が必要である。これは、２本の鎖、軽鎖及び重鎖におけるアミノ酸変化の導入、ならびに両鎖のアセンブリの保存が必要なｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、及びＩｇＧのヒト化と対照的である。
【０１１７】
ＶＨＨドメインを含むｓｄＡｂは、ヒト様配列を有するようにヒト化することができる。いくつかの実施形態では、本明細書で使用されるＶＨＨドメインのＦＲ領域は、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して少なくとも約５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれか１つのアミノ酸配列相同性を含む。ヒト化ＶＨＨドメインの１つの例示的なクラスは、そのＶＨＨが、Ｋａｂａｔ番号付けに従って、位置４５にグリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、スレオニン、アスパラギン、またはグルタミンからなる群より選ばれるアミノ酸（例えば、Ｌ４５など）を持ち、位置１０３にトリプトファンを持つことを特徴とする。したがって、このクラスに属するポリペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性を示し、前記ポリペプチドは、望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を伴わず、かつさらなるヒト化の負担も伴わずに、ヒトに直接投与され得る。
【０１１８】
ヒト化ラクダ科単一ドメイン抗体の別の例示的なクラスは、ＷＯ０３／０３５６９４に記載されており、ヒト起源のまたは他の種由来の従来型抗体に典型的に見られる疎水性ＦＲ２残基を含有するが、この親水性の喪失を、二本鎖抗体由来のＶＨに存在する保存されたトリプトファン残基に代わる１０３位の荷電アルギニン残基によって補償している。したがって、これら２つのクラスに属するペプチドは、ヒトＶＨフレームワーク領域に対して高いアミノ酸配列相同性ーを示し、前記ペプチドは、望ましくない免疫応答を引き起こす可能性を伴わず、かつさらなるヒト化の負担も伴わずに、ヒトに直接投与され得る。
【０１１９】
ヒトドメイン抗体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ヒト抗体（ヒトドメイン抗体、またはヒトＤａｂとして知られる）である。ヒト抗体は、当該技術分野で公知の様々な技術を用いて生産することができる。ヒト抗体は、一般的に、Ｃｈｅｎ，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４７（４）：９１２−２１（２０１０）に記載されている。完全ヒト単一ドメイン抗体（またはＤＡｂ）を産生することができるトランスジェニックマウスまたはラットは、当該技術分野で公知である。例えば、ＵＳ２００９０３０７７８７Ａ１、米国特許第８，７５４，２８７号、ＵＳ２０１５０２８９４８９Ａ１、ＵＳ２０１００１２２３５８Ａ１、及びＷＯ２００４０４９７９４を参照されたい。
【０１２０】
ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）は、抗原攻撃に応答して、無傷ヒト抗体またはヒト可変領域を持つ無傷抗体を産生するように改変されたトランスジェニック動物に、免疫原を投与することにより調製することができる。そのような動物は、典型的には、内因性免疫グロブリン遺伝子座を置換するか、または染色体外に存在するかもしくは動物の染色体にランダムに組み込まれている、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含む。そのようなトランスジェニックマウスでは、内因性免疫グロブリン遺伝子座は、一般的に不活性化される。トランスジェニック動物からヒト抗体を得るための方法の総説については、Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２３：１１１７−１１２５（２００５）を参照されたい。そのような動物で生成された無傷抗体に由来するヒト可変領域は、例えば、異なるヒト定常領域と組み合わせることにより、さらに改変される可能性がある。
【０１２１】
ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）は、ハイブリドーマベース法によって作成することができる。ヒトモノクローナル抗体の産生のためのヒト骨髄腫及びマウス−ヒト異種細胞株は、当該技術分野において公知である。
【０１２２】
ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）は、ヒトに由来するファージディスプレイライブラリーから選択されたＦｖクローン可変ドメイン配列を単離することによっても生成され得る。そのような可変ドメイン配列は、次に所望のヒト定常ドメインと組み合わせてもよい。抗体ライブラリーからヒト抗体を選択するための技術が、以下に説明される。
【０１２３】
特定の抗原または標的に対するＶＨＨ配列を得る１つの技術は、重鎖抗体を発現することができるトランスジェニック哺乳動物を適当に免疫化すること（すなわち、免疫応答及び／または前記抗原または標的に対する重鎖抗体をもたらすために）、前記ＶＨＨ配列（をコードする核酸配列）を含有する前記トランスジェニック哺乳動物から適当な生物学的試料（例えば、血液試料、血清試料またはＢ細胞の試料）を得ること、及び次に、それ自体公知である任意の適当な技術（例えば、本明細書に記載の方法のいずれかまたはハイブリドーマ技術）を用いて、前記試料から出発して、前記抗原または標的に対するＶＨＨ配列を生成することを伴う。例えば、この目的のために、重鎖抗体を発現するマウス、及びＷＯ０２／０８５９４５、ＷＯ０４／０４９７９４及びＷＯ０６／００８５４８及びＪａｎｓｓｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２００６年１０月１０日；１０３（４１）：１５１３０〜５頁に記載されるさらなる方法及び技術を用いることができる。例えば、そのような重鎖抗体を発現するマウスは、任意の適当な（単一）可変ドメイン、例えば、天然の供給源からの（単一）可変ドメイン（例えば、ヒトの（単一）可変ドメイン、ラクダ科動物の（単一）可変ドメインまたはサメの（単一）可変ドメイン）、ならびに、例えば、合成または半合成の（単一）可変ドメインを有する重鎖抗体を発現することができる。
【０１２４】
ライブラリー由来抗体
本出願の抗体は、所望の活性または活性（複数）を有する抗体についてコンビナトリアルライブラリーをスクリーニングすることによって単離することができる。例えば、種々の方法が、ファージディスプレイライブラリーを生成し、所望の結合特性を有する抗体についてのライブラリーをスクリーニングするために、当該技術分野で知られている。単一ドメイン抗体ライブラリーを構築する方法は、例えば、米国特許第７３７１８４９号に記載されている。
【０１２５】
ある特定のファージディスプレイ法では、ＶＨ及びＶＬ遺伝子のレパートリーがポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により別々にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換えられ、これをその後、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：４３３−４５５（１９９４）に記載されるように、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ＶＨＨ遺伝子のレパートリーは、ＰＣＲにより同様にクローニングされ、ファージライブラリーにおいてランダムに組み換えられ、抗原結合ファージについてスクリーニングすることができる。ファージは、典型的には、抗体断片を、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）断片またはＦａｂ断片のいずれかとして提示する。免疫された供給源由来のライブラリーは、ハイブリドーマを構築することを必要とせずに、免疫原に対して親和性の高い抗体を提供する。あるいは、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．１２：７２５−７３４（１９９３）に記載されるようにして、ナイーブレパートリーを（例えば、ヒトから）クローニングし、いかなる免疫付与も無しに、広範囲の非自己抗原及び自己抗原に対する、単一供給源の抗体を提供できる。最後に、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１−３８８（１９９２）に記載されるように、幹細胞由来の再構成されていないＶ遺伝子セグメントをクローニングして、高度可変ＣＤＲ３領域をコードし、インビトロでの再構成を達成するランダム配列を含むＰＣＲプライマーを使用することによって、ナイーブライブラリーを合成的に製造することもできる。
【０１２６】
ヒト抗体ライブラリーから単離された抗体または抗体断片は、本明細書でヒト抗体またはヒト抗体断片とみなされる。
【０１２７】
生物学的活性
本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分の生物学的活性は、その５０％阻害濃度（ＥＣ５０）を測定することで決定することができ、これは、特異的な生物学的または生化学的機能を阻害する（例えば、ＴＩＧＩＴ及びその主要リガンドＣＤ１５５の間の結合を阻害する）抗体の効力の尺度である。例えば、ここで、ＥＣ５０は、ＴＩＧＩＴ生物活性の５０％をインビトロで中和するのに必要な抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂの有効濃度を示すために使用することができる。ＥＣ５０は、作動薬または他の物質（例えば、抗体）のＥＣ５０に匹敵する。ＥＣ５０は、最大効果の５０％をインビボで細胞に基づくサイトカイン放出アッセイも表す。ＥＣ５０は、当該技術分野で公知のアッセイ、例えば、ＦＡＣＳ分析（競合結合アッセイ）によるリガンド結合の阻害などのバイオアッセイ、細胞ベースサイトカイン放出アッセイ、または増幅発光近接均質アッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）によって測定することができる。
【０１２８】
例えば、リガンド結合の遮断は、フローサイトメトリーを用いて試験することができる（実施例２も参照されたい）。ヒトＴＩＧＩＴを発現するＣＨＯ細胞を接着培養フラスコから解離して、種々の濃度の試験用の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、及び一定濃度の標識ＣＤ１５５−Ｆｃタンパク質と混合することができる。抗ＴＩＧＩＴ抗体陽性対照、例えば、２２Ｇ２（ＵＳ２０１６／０１７６９６３における配列番号７及び９を参照されたい）を使用することができる。混合物を室温で３０分間平衡化し、ＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡを含有するＰＢＳ）で３回洗浄した。その後、一定濃度の標識ＣＤ１５５タンパク質を特異的に認識する抗体（例えば、ＰＥ／Ｃｙ５ストレプトアビジン二次抗体）を加え、室温で１５分間インキュベートする。細胞をＦＡＣＳ緩衝液で洗浄し、フローサイトメトリーで分析する。非線形回帰を用いて、ＰＲＩＳＭ（商標）（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）でデータを分析し、ＥＣ５０を算出することができる。競合アッセイからの結果は、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂが標識ＣＤ１５５とＴＩＧＩＴの間の相互作用を阻害する能力を示すことができる。
【０１２９】
抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分の生物学的活性はまた、ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断レポーターアッセイまたはＩＬ−２放出アッセイによって試験することができる（実施例２も参照されたい）。その主要リガンド、ＣＤ１５５に結合する際に、そのＩＴＩＭドメインにおけるＴＩＧＩＴのその後のリン酸化は、阻害シグナルを変換して、Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ発現を下方調節する。例えば、ＴＩＧＩＴエフェクター細胞は、一晩載置した後、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを含む抗ＴＩＧＩＴ構築物の連続希釈でインキュベートし、ＣＤ１５５  ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を適当なＥ：Ｔ比で加えることができる。３７℃、５％ＣＯ２での誘導の６時間後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を加えることができ、発光を判断することができる。結果は、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂがＣＤ１５５とＴＩＧＩＴの間の相互作用を阻害する能力を示すことができる。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ＴＩＧＩＴ受容体により形質導入されたシグナルを遮断またはまたは拮抗する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ＣＤ１５５との相互作用からＴＩＧＩＴを阻害するように、ＴＩＧＩＴ上のエピトープに結合することができる。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、抗体結合部位対ＴＩＧＩＴリガンド結合部位の比が１：１より大きく、かつ、抗体の濃度が１０−８Ｍより大きい条件下で、ＴＩＧＩＴのＣＤ１５５への結合を少なくとも約５％、１０％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、９０％、９５％、９９％、または９９．９％のいずれかまで減少させることができる。
【０１３１】
（ＩＩ）抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む構築物
抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物は、任意の可能な形式のものであり得る。
【０１３２】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物は、追加のポリペプチド配列、例えば、１つ以上の抗体部分（または抗原結合部分）、または免疫グロブリンのＦｃ断片をさらに含み得る。そのような追加のポリペプチド配列は、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂの（生物学的）特性に変化あるいはそれに影響を及ぼしても及ぼさなくてもよく、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂにさらなる機能性を追加しても追加しなくてもよい。いくつかの実施形態では、追加のポリペプチド配列は、本発明の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂに１つ以上の所望の特性または機能性を与える。
【０１３３】
いくつかの実施形態では、追加のポリペプチド配列は、第２の抗原または第２のエピトープを特異的に認識する第２の抗体部分（例えば、ｓｄＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆａｂ、完全長抗体）であってもよい。いくつかの実施形態では、第２の抗原は、ＴＩＧＩＴ由来である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、ＴＩＧＩＴ由来でない。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分（または第２の抗原結合部分）は、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂとして、ＴＩＧＩＴ上の同じエピトープを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分（または第２の抗原結合部分）は、本明細書に記載される抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂとして、ＴＩＧＩＴ上の異なるエピトープを特異的に認識する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、適宜リンカー（例えば、ペプチドリンカー）を介して一緒に連結した、本明細書に記載の２つ以上の抗ＴＩＧＩＴ−ｓｄＡｂ部分を含む。一緒に連結した２つ以上の抗ＴＩＧＩＴ−ｓｄＡｂ部分は、同じか、または異なり得る。
【０１３４】
いくつかの実施形態では、追加のポリペプチド配列は、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂそれ自体と比較して、本発明の抗ＴＩＧＩＴ構築物の抗体構築物半減期、溶解度もしくは吸収を増加させ、免疫原性もしくは毒性を低減し、望ましくない副作用を排除もしくは軽減し、及び／または他の有利な特性をそれに付与し、及び／またはその望ましくない特性を低減してもよい。そのような追加のポリペプチド配列のいくつかの非限定例は、血清タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン（例えば、ＷＯ００／２７４３５を参照されたい）またはハプテン分子（例えば、循環抗体によって認識されるハプテン、例えば、ＷＯ９８／２２１４１を参照されたい）である。免疫グロブリンの断片（例えば、ＶＨドメイン）を血清アルブミンまたはその断片に連結することが、抗体半減期を増加させ得ることを示した（例えば、ＷＯ００／２７４３５及びＷＯ０１／０７７１３７を参照されたい）。従って、いくつかの実施形態では、本発明の抗ＴＩＧＩＴ構築物は、適当なリンカー（例えば、ペプチドリンカー）を適宜介して、血清アルブミン（またはその適当な断片）に連結した本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、血清アルブミンドメインＩＩＩを少なくとも含む血清アルブミンの断片に連結することができる（ＰＣＴ／ＥＰ２００７／００２８１７を参照されたい）。抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＨＳＡ融合タンパク質は、例えば、（ｓｄＡｂ）ｎ−ＨＳＡ（ｎは、少なくとも１の整数である）、ｓｄＡｂ−ＨＳＡ−ｓｄＡｂなどの任意のフォーマットであり得る。
【０１３５】
抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、リンカー配列を適宜介して、１つ以上の（好ましくは、ヒト）ＣＨ２及び／またはＣＨ３ドメイン、例えば、Ｆｃ断片に連結して、その半減期をインビボで増加させることができる。
【０１３６】
従って、いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、免疫グロブリン、例えば、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、及びＩｇＭのＦｃ断片に融合した本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、ＩｇＧ、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４のいずれかのＦｃ配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ヒトＦｃ、例えば、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）Ｆｃ、ｈＩｇＧ２Ｆｃ、またはｈＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、抗体エフェクター機能が減少、最小化、または排除されたエフェクターレス、例えば、ＡＤＣＣ、ＣＤＣ、及び／またはＡＤＣＰ（抗体依存性細胞貪食）である。例えば、いくつかの実施形態では、エフェクターレスＦｃは、ＣＨ２領域においてＮ２９７ＡまたはＤＡＮＡ突然変異（Ｄ２６５Ａ＋Ｎ２９７Ａ）を含む。いくつかの実施形態では、エフェクターレスＦｃは、Ｋ３２２Ａ及びＬ２３４Ａ／Ｌ２３５Ａ（ＬＡＬＡ）突然変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、エフェクターレス（不活性）ＩｇＧ１  Ｆｃ、例えば、エフェクターレスｈＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、単量体である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、二量体である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分及びＦｃ断片は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ（配列番号３７０）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、変異型ヒトＩｇＧ１ヒンジ（配列番号３７１）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒトＩｇＧ４ヒンジ（配列番号３２４）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ｈＩｇＧ２ヒンジである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３７２〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列、例えば、配列番号３７２または３７３を含む。
【０１３７】
従って、例えば、いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、適宜リンカーを介して免疫グロブリンのＦｃ断片に融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、適宜リンカーを介して免疫グロブリンのＦｃ断片に融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、適宜リンカーを介して免疫グロブリンのＦｃ断片に融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、ヒトエフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ、ｈＩｇＧ２  Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、��ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、単量体である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、二量体である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分及びＦｃ断片は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３８】
いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含み、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、適宜リンカーを介して免疫グロブリンのＦｃ断片に融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、適宜リンカーを介して免疫グロブリンのＦｃ断片に融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＶＨＨドメインにおけるアミノ酸置換は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３などのＣＤＲ内である。いくつかの実施形態では、ＶＨＨドメインにおけるアミノ酸置換は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４などのＦＲ内である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つの両方のＣＤＲ及びＦＲ内である。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、適宜リンカーを介して免疫グロブリンのＦｃ断片に融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、適宜リンカーを介して免疫グロブリンのＦｃ断片に融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、エフェクターレスヒトＩｇＧ１  Ｆｃ、ｈＩｇＧ２  Ｆｃ、またはヒトＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、単量体である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、二量体である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分及びＦｃ断片は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１３９】
いくつかの実施形態では、配列番号２８８〜２９４、３０６、３０８〜３１１、３１５、３１７〜３１９、３２１〜３２２、及び３６５〜３６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、または本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つと競合的にＴＩＧＩＴに特異的に結合する、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質（以下、「競合抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質」と呼ばれる）も提供される。競合的結合は、ＥＬＩＳＡアッセイを用いて決定してもよい。例えば、いくつかの実施形態では、配列番号２８８〜２９４、３０６、３０８〜３１１、３１５、３１７〜３１９、３２１〜３２２、及び３６５〜３６７のいずれか１つのアミノ酸配列を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質と競合的にＴＩＧＩＴに特異的に結合する、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質と競合的にＴＩＧＩＴに特異的に結合する、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ（または抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物）と競合的にＴＩＧＩＴに特異的に結合する、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を提供する。いくつかの実施形態では、競合抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質のＦｃ断片は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、競合抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、競合抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１４１】
多価及び／または多重特異性抗体
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、１つ以上の他の抗体部分または抗原結合部分（例えば、別の抗原または別のエピトープを特異的に認識する抗体部分）に融合した本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む。１つ以上の他の抗体部分は、任意の抗体または抗体断片形式、例えば、多重特異性ｓｄＡｂ（例えば、二重特異性ｓｄＡｂ）、完全長抗体、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、Ｆｖ、一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ｓｃＦｖ−ｓｃＦｖ、ミニボディ、ダイアボディ、またはｓｄＡｂであり得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗体部分（または抗原結合部分）は、重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽重鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。抗体断片は、種々の技術で作成することができ、限定されないが、本明細書に記載されるように、無傷抗体のタンパク質分解、ならびに組み換え宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉまたはファージ）による産生を含む。
【０１４２】
多重特異性抗体を製造するための技術には、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖対の組み換え同時発現、及び「ノブ−イン−ホール」操作；ロイシンジッパーを使って二重特異性抗体を製造すること；二重特異性抗体断片を作製するために「ダイアボディ」技術を使用すること；及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること；及び、例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されているようにして、三重特異性抗体を調製すること；及びタンデム単一ドメイン抗体を含むポリペプチドを生成することなどが含まれるが、それらに限定されない。「オクトパス抗体」を含む、３つ以上の機能的抗原結合部位を有する改変抗体も、これに含まれる（例えば、ＵＳ２００６／００２５５７６Ａ１を参照されたい）。
【０１４３】
ペプチドリンカー
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物内の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ及び他の１つ以上の抗体部分（例えば、完全長抗体、ｓｄＡｂ、またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）は、場合により、ペプチドリンカーによって連結することができる。抗ＴＩＧＩＴ構築物で使用されるペプチドリンカー（複数可）の長さ、柔軟性の程度、及び／または他の特性は、１つ以上の特定の抗原またはエピトープに対する親和性、特異性、またはアビディティを含むが、これらに限定されない特性にいくらかの影響を与え得る。例えば、２つの隣接するドメインが互いに立体的に干渉しないことを確実にするために、より長いペプチドリンカーが選択され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、隣接するドメインが互いに自由に動くように、可動性残基（例えば、グリシン及びセリン）を含む。例えば、グリシン−セリンダブレットは、適当なペプチドリンカーであり得る。
【０１４４】
ペプチドリンカーは、任意の適当な長さであり得る。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、少なくとも約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００以上のアミノ酸長のいずれかである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約１００、７５、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５未満のアミノ酸長のいずれかである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーの長さは、約１アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１アミノ酸〜約２０アミノ酸、約１アミノ酸〜約３０アミノ酸、約５アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１０アミノ酸〜約２５アミノ酸、約５アミノ酸〜約３０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸長、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１００アミノ酸、または約１アミノ酸〜約１００アミノ酸のいずれかである。
【０１４５】
ペプチドリンカーは、天然に生じる配列または非天然に生じる配列を有し得る。例えば、重鎖のみ抗体のヒンジ領域に由来する配列は、リンカーとして使用され得る。例えば、ＷＯ１９９６／３４１０３を参照されたい。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒトＩｇＧ１ヒンジ（配列番号３７０）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、変異ヒトＩｇＧ１ヒンジ（配列番号３７１）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒトＩｇＧ４ヒンジ（配列番号３２４）である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、ヒトＩｇＧ２ヒンジである。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、可動性リンカーである。例示的な可動性リンカーとしては、グリシンポリマー（Ｇ）ｎ（配列番号３７４）、グリシン−セリンポリマー（例えば、（ＧＳ）ｎ（配列番号３７５）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３７６）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７７）、及び（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３７８）、ｎは、少なくとも１つの整数である）、グリシン−アラニンポリマー、アラニン−セリンポリマー、及び当該技術分野で公知の他の可動性リンカーが挙げられる。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３７２（ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ）または配列番号３７３（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）のアミノ酸配列を含む。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分及び１つ以上の他の抗体部分（例えば、完全長抗体、ｓｄＡｂ、またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物は、単一特異性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、及び１つ以上の他の抗体部分（例えば、完全長抗体、ｓｄＡｂ、またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物は、多重特異性（例えば、二重特異性）である。多重特異性分子は、少なくとも２つの異なるエピトープに対して結合特異性を有する分子である（例えば、二重特異性抗体は、２つのエピトープに対して結合特異性を有する）。３つ以上の価数及び／または特異性を有する多重特異性分子も考慮される。例えば、三重特異性抗体は、調製することができる。Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）。当業者であれば、本明細書に記載の個々の多重特異性分子の適切な機能を選択して、互いに組み合わせて、本発明の多重特異性の抗ＴＩＧＩＴ分子を形成できることが理解されるはずである。
【０１４７】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、多価であるが、単一特異性である、すなわち、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分と同じＴＩＧＩＴエピトープを特異的に認識する、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、及び少なくとも第２の抗体部分（例えば、完全長抗体、ｓｄＡｂ、またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分と同じＴＩＧＩＴエピトープを特異的に認識する１つ以上の抗体部分は、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分と同じＣＤＲ及び／または同じＶＨＨアミノ酸配列を含み得る。例えば、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、２つ以上の本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含み得、２つ以上の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、同じである。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー（複数可）によって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、多価及び多重特異性である、すなわち、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、及びＴＩＧＩＴ以外の第２の抗原を特異的に認識する少なくとも第２の抗体部分（例えば、完全長抗体、ｓｄＡｂ、またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合部分）、または本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分により認識される異なるＴＩＧＩＴエピトープを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ｓｄＡｂである。いくつかの実施形態では、第２の抗体部分は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を特異的に認識する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、第２の抗体部分のＮ末端及び／またはＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、三価及び二重特異性である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、本明細書に記載の２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、及び第２の抗体部分（例えば、抗ＨＳＡ  ｓｄＡｂ）を含み、前記第２の抗体部分は、２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分の間にある。いくつかの実施形態では、抗体部分は、ペプチドリンカー（複数可）によって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０１４９】
２つ以上の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む単一特異性または多重特異性の抗ＴＩＧＩＴ構築物は、本明細書に記載の単一抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のものと比較して、アビディティの増加を有し得る。
【０１５０】
完全長抗体に融合した抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む二重特異性抗体
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、第２の抗体部分に融合した本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含み、第２の抗体部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体（例えば、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体）である。完全長抗体のＦｃ断片は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、またはＩｇＧ４  Ｆｃであり得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ断片は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、刺激性免疫チェックポイント分子のアクチベーターである。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、免疫チェックポイント阻害薬、例えば、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１の阻害剤である。
【０１５１】
ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−１に対する二重特異性を含む構築物は、「抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１抗体」、「抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１構築物」、「ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ抗体」または「ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ」と以下で呼ばれる。ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−Ｌ１に対する二重特異性を含む構築物は、「抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１抗体」、「抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１構築物」、「ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ抗体」、または「ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ」と以下で呼ばれる。
【０１５２】
ＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１は、ＴＩＧＩＴと同様に、阻害性免疫チェックポイント分子である。
【０１５３】
ＰＤ−１は、Ｔ細胞活性化及び耐性を調節する共刺激分子のＢ７／ＣＤ２８ファミリーの一部であるため、アンタゴニスト抗ＰＤ−１抗体は、耐性を克服するために有用であり得る。ＰＤ−１は、Ｂ７−４の受容体として定義されている。Ｂ７−４は、免疫細胞上の阻害性受容体に結合する際に免疫細胞活性化を阻害することができる。ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１経路の関与は、Ｔ細胞エフェクター機能、サイトカイン分泌及び増殖の阻害をもたらす（Ｔｕｒｎｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ＯｎｃｏＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  １（７）：１１７２−１１７４，２０１２）。高レベルのＰＤ−１は、疲弊したＴ細胞または慢性的に刺激されたＴ細胞と関連する。さらに、ＰＤ−１発現の増加は、がん患者の生存率の低下と相関している。ＰＤ−１、Ｂ７−４、及び免疫細胞中のＢ７−４及びＰＤ−１阻害シグナル間の相互作用を下方調節する薬剤は、免疫応答の増強をもたらし得る。本出願に適用することができる例示的な抗ＰＤ−１抗体としては、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、及びニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１５４】
ＰＤ−Ｌ１（プログラム細胞死リガンド１）は、分化クラスター２７４（ＣＤ２７４）またはＢ７ホモログ１（Ｂ７−Ｈ１）としても知られる。ＰＤ−Ｌ１は、ＰＤ−１のリガンドとして機能し、特定の事象、例えば、妊娠、組織同種移植片、自己免疫疾患及び他の疾患状態、例えば、肝炎及びがんの最中の免疫系の抑制に主要な役割を果たす。ＰＤ−１受容体／ＰＤ−Ｌ１リガンド複合体の形成により、リンパ節でＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を低下させる阻害シグナルを伝える。本発明に適用することができる例示的な抗ＰＤ−Ｌ１抗体としては、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））及びデュルバルマブ（例えば、ＭＥＤＩ４７３６、ＩＭＦＩＮＺＩ（商標））、アベルマブ（例えば、Ｂａｖｅｎｃｉｏ（登録商標））、及びｈ５３Ｃ１（ヒト化５３Ｃ１）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３２３または３２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１５５】
いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；またはＣＤＲ領域において最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、ＣＤＲ１及び／またはＣＤＲ２内である。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、またはＶＨＨドメインにおいて最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、及び／またはＣＤＲ２、及び／またはＣＤＲ３などのＣＤＲ内である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＦＲ１、及び／またはＦＲ２、及び／またはＦＲ３、及び／またはＦＲ４などのＦＲ内である。いくつかの実施形態では、アミノ酸置換は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ及びＦＲの両方の内である。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号３８５のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８６のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号３８５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号３２５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号３８７のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８８のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号３８７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号４０６のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号４０７のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体のＦｃ断片は、ｈＩｇＧ１  Ｆｃ、エフェクターレスｈＩｇＧ１  Ｆｃ、ｈＩｇＧ２  Ｆｃ、またはｈＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、完全長抗体のＦｃ断片は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＮ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含み、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、完全長抗体の重鎖及び軽鎖の両方のＮ末端に融合される（図２１に例示される）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、本明細書に記載の４つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含み、２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、第１の適宜リンカーを介して一緒に融合し、他方の２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、第２の適宜リンカーを介して一緒に融合し、２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ融合体の各セットのＣ末端は、完全長抗体の各重鎖のＮ末端に第３及び第４の適宜リンカーを介して融合される（図２２に例示される）。いくつかの実施形態では、４つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、同一である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分及び完全長抗体は、ペプチドリンカーによって適宜連結される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１５６】
いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−１完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合され、抗ＰＤ−１完全長抗体は、配列番号３９０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３９１または３９５のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３９４のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−１１」と表記する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−１完全長抗体の両方の重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＮ末端は、抗ＰＤ−１完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合され、抗ＰＤ−１完全長抗体は、配列番号３９０のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３９１または３９７のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３９６のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−１２」と表記する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−１完全長抗体の両方の重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−１完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合され、抗ＰＤ−１完全長抗体は、配列番号３９０または３９８のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３９１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号３９９のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−１３」と表記する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−１完全長抗体の両方の軽鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＮ末端は、抗ＰＤ−１完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合され、抗ＰＤ−１完全長抗体は、配列番号３９０または４００のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３９１のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、軽鎖融合ポリペプチドは、配列番号４０１のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−１４」と表記する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＮ末端は、抗ＰＤ−１完全長抗体の両方の軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、配列番号３９４及び３９６のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一のコピー、及び配列番号３９１、３９５または３９７のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つの同一のコピーを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、図１７及び１８に示す構造を有する。いくつ��の実施形態では、配列番号３９０、３９８または４００のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一のコピー、及び配列番号３９９または４０１のアミノ酸配列を含む軽鎖の２つの同一のコピーを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、図１９及び２０に示す構造を有する。
【０１５７】
従って、いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含み；及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３８１のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。
【０１５８】
いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含み；及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３８１のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメイン、または配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つに対して少なくとも約８０％（例えば、少なくとも約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％のいずれか）の配列同一性を有するその変異体を含み；及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３８１のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み；及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３８１のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み；及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３８１のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実���形態では、完全長抗体のＦｃ断片は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１５９】
いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合され、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３３１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３２または３４８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３４７のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−７」と表記する）。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合され、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３４または３４６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３４５のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−６」と表記する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の両方の重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、配列番号３４５または３４７のアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一のコピー、及び配列番号３３２、３３４、３４６及び３４８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖の２つの同一のコピーを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、図１７に示す構造を有する。
【０１６０】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれかによれば、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。
【０１６１】
いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合され、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０または３４２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３４１のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−４」と表記する）。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合され、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８または３４４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３４３のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−５」と表記する）。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合され、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８または３５８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３５７のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−１５」と表記する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の両方の重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合され、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８または３６０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３５９のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−１６」と表記する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＮ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の両方の重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合され、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２３または３６１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３６２のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−１７」と表記する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄ��ｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の両方の軽鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＣ末端に融合され、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２３または３６３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号３６４のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−１８」と表記する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＮ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の両方の軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の重鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合され、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０または４０３のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号４０２のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−２１」と表記する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の両方の重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の軽鎖の少なくとも１つのＮ末端に融合され、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２９または４０４のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含み、及び重鎖融合ポリペプチドは、配列番号４０５のアミノ酸配列を含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する（以後、「ＢＴＰ−２２」と表記する）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体の両方の軽鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、配列番号３４１、３４３、３５７、３５９及び４０２のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一のコピー、及び配列番号３２８、３３０、３４２、３４４、３５８、３６０及び４０３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖の２つの同一のコピーを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、図１７及び１８に示す構造を有する。いくつかの実施形態では、配列番号３２３、３２９、３６１、３６３、及び４０４のいずれか１つのアミノ酸配列を含む重鎖融合ポリペプチドの２つの同一のコピー、及び配列番号３６２、３６４及び４０５のいずれか１つのアミノ酸配列を含む軽鎖の２つの同一のコピーを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、図１９及び２０に示す構造を有する。
【０１６２】
本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれかによるいくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３７９のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８０のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み；及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３７９のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８０のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み；及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３７９のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８０のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。
【０１６３】
本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ／抗ＰＤ−Ｌ１構築物のいずれかによるいくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３８３のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８４のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂは、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含み；及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３８３のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８４のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含み；及び抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３８３のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８４のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む、単離抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。
【０１６４】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つ（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む多重特異性または単一特異性の抗ＴＩＧＩＴ構築物、例えば、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１構築物または抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１構築物）と競合的にＴＩＧＩＴに特異的に結合するＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物（以下、「競合抗ＴＩＧＩＴ構築物」と呼ばれる）も提供される。
【０１６５】
抗ＴＩＧＩＴ多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）
本出願は、一般的には、完全長抗体またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合断片に融合した本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物であって、抗ＴＩＧＩＴ構築物は、多重特異性である（以下、「多重特異性抗ＴＩＧＩＴ構築物」または「抗ＴＩＧＩＴ多重特異性抗原結合タンパク質（ＭＡＢＰ）」と呼ぶ）、抗ＴＩＧＩＴ構築物を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰは、二重特異性（以下、「二重特異性抗ＴＩＧＩＴ構築物」または「抗ＴＩＧＩＴ二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ）」と呼ぶ）である。抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、完全長抗体またはＶＨ及びＶＬを含む抗原結合断片により認識される標的（複数可）とは異なるＴＩＧＩＴに特異的に結合することで、より広範な標的化能力を与える。ｓｄＡｂの小さいサイズのため、いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、完全長抗体または抗原結合断片成分のものと比較して、同様の分子量及び薬物動態特性を有し得る。例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰは、臨床効果及び安全性が証明されたモノクローナル抗体に１つ以上の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を融合させることで設計し、多重特異性構築物の発現性を妨げることなく臨床的有用性の増加及び望ましい薬物動態特性を提供することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の１つ以上の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、適宜ペプチドリンカーによって完全長抗体または抗原結合断片に融合される。本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、ＴＩＧＩＴの他にも種々の疾患関連エピトープまたは抗原の組み合わせ、例えば、免疫チェックポイント分子、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）、または炎症促進性分子との組み合わせによるＴＩＧＩＴを標的にするように適用し、種々の疾患及び状態、例えば、がん、炎症、及び自己免疫疾患の治療に有用な薬剤を提供することができる。抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰは、ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／０９３６４４に開示されるものなど任意の形式であってもよく、それらの全体を参照することによって本明細書に組み込まれる。
【０１６６】
従って、例えば、いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）ＶＨ及びＶＬを含む第２の抗原結合部分を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、ＭＡＢＰまたはＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）ＶＨ及びＶＬを含む第２の抗原結合部分を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、ＭＡＢＰまたはＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、免疫チェックポイント分子（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、炎症促進性分子である。いくつかの実施形態では、第２のエピトープは、細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原、または免疫エフェクター細胞上の細胞表面抗原）である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖及びＶＬを含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、重鎖のＮ末端、軽鎖のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、重鎖のＣ末端、または軽鎖のＣ末端で第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＦａｂまたはｓｃＦＶを含む。。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ＦａｂまたはｓｃＦＶのＣ末端で第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、完全長４鎖抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１完全長抗体を���む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３８５のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８６のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３８５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体は、配列番号３２５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３８７のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８８のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３８７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号４０６のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号４０７のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３８１のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３８１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３３１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、。配列番号３３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３７９のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８０のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３７９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ���完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３８３のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８４のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３８３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２３または３２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分に化学的に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０未満（例えば、約２５、２０、または１５のいずれか１つ未満）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合断片は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、またはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合断片は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。
【０１６７】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、ＭＡＢＰまたはＢＡＢＰ）は、少なくとも２つの異なるエピトープに特異的に結合することができる少なくとも２つの抗原結合部分を含む。少なくとも２つの抗原結合部分のいくつかは、ＭＡＢＰが２つの異なるエピトープに対する結合部位を有する限り、同一であってもよい。抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、対称または非対称であり得る。例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分の１〜８つのコピー、及びＶＨ及びＶＬを含む第２の抗原結合部分の１または２つのコピーを含み得る。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、２つの異なる抗原結合部分を含み、各々は、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含み、異なる抗原結合部位を一緒に形成する。例えば、第２の抗原結合部分は、二重特異性抗体であり得る。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、単一特異性完全長抗体、またはその抗原結合断片、例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖである。
【０１６８】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、１、２、３、４、５、６、７、８以上の異なる抗原結合部分のいずれか１つを含み、各々は、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む。いくつかの実施形態では、２つの同一の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、互いに融合され、第２の抗原結合部分にさらに融合される。いくつかの実施形態では、２つの異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、互いに融合され、第２の抗原結合部分にさらに融合される。
【０１６９】
抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、ＭＡＢＰ）は、ＴＩＧＩＴ及び／または第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）の任意の適当な数の価数、及び任意の適当な数の特異性を有し得る。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、二価、三価、四価、五価、六価、またはそれよりも高い価数のＴＩＧＩＴである。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、二価、三価、四価、五価、六価、またはそれよりも高い価数の第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、二重特異性（例えば、ＴＩＧＩＴ×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ、ＴＩＧＩＴ×ＰＤ−Ｌ１ＢＡＢＰ）である。例示的なＢＡＢＰを図１７〜２６に示す。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、三重特異性である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、四重特異性である。いくつかの実施形態では、ＭＡＢＰは、４つ以上の特異性である。
【０１７０】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分の１つ以上のコピー（例えば、２）、及び（ｂ）ＶＨ及びＶＬを含む第２の抗原結合部分の単一コピーを含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分の各コピーは、第２の抗原結合部分に融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。
【０１７１】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、複数（例えば、２、３、４、５、６、７、８、またはそれ以上）の同一または異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、及び（ｂ）ＶＨ及びＶＬを含む複数（例えば、２、３、４、５、６、またはそれ以上）の第２の抗原結合部分を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分の各コピーは、第２の抗原結合部分に融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分の１つ以上は各々、別の同一または異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分にさらに融合される。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体（またはＦａｂ、ｓｃＦＶ）は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２３または３２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつか���実施形態では、第２の抗原結合断片は、Ｆｃ領域、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、またはＩｇＧ４  Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合断片は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１７２】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分の単一コピー、及び（ｂ）ＶＨ及びＶＬを各々が含む第２の抗原結合部分の２つのコピーを含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分の２つのコピーに融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。
【０１７３】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を各々が含む第１の抗原結合部分の２つのコピー、及び（ｂ）ＶＨ及びＶＬを各々が含む第２の抗原結合部分の２つのコピーを含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分の１つのコピーは、第２の抗原結合部分の各コピーに融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する（図１７〜２０、２３及び２４に例示される）。いくつかの実施形態では、１つ以上の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは各々、別の同一または異なる抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分にさらに融合される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。
【０１７４】
ａ）融合ポリペプチド
本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）のＶＨ及びＶＬを含む第２の抗原結合部分は、互いに融合される（すなわち、共有結合される）。従って、本出願の抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、１つ以上の融合ポリペプチドを含む。各融合ポリペプチドは、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分、及び第２の抗原結合部分に由来するポリペプチドを含み得る。
【０１７５】
本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及びＶＨ及びＶＬを含む第２の抗原結合部分は、単一の化学結合（例えば、ペプチド結合）によって、またはペプチドリンカーを介して直接結合され得る。抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分のいずれか１つ（各々を含む）のポリペプチドのＮ末端またはＣ末端のいずれかで融合され得る、または第２の抗原結合部分のいずれか１つ（各々を含む）のポリペプチドの内部位置で、例えば、第２の抗原結合部分の重鎖中のＦｃ領域のＮ末端で融合され得る。融合ポリペプチドは、組み換え的または化学的のいずれかで得られ得る。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分のＣ末端は、化学結合（例えば、ペプチド結合）またはペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分の任意（各々を含む）のポリペプチドのＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分のＮ末端は、化学結合（例えば、ペプチド結合）またはペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分の任意（各々を含む）のポリペプチドのＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分は、アミノ酸の主鎖化学基を伴うペプチド結合ではない化学結合を介して第２の抗原結合部分に融合される。
【０１７６】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＶＨ及びＶＬを含む一本鎖抗体断片を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向において、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、適宜ペプチドリンカー、ＶＨドメイン及びＶＬドメインを含む第１の抗原結合部分を含む融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向において、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、適宜ペプチドリンカー、ＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む第１の抗原結合部分を含む融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向において、ＶＨドメイン、ＶＬドメイン、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分を含む融合ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端の方向において、ＶＬドメイン、ＶＨドメイン、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分を含む融合ポリペプチドを含む。
【０１７７】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＶＨを含む重鎖ドメイン、及びＶＬを含む軽鎖ドメインを含む。いくつかの実施形態では、重鎖は、１つ以上の重鎖定常ドメイン、例えば、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４、及び／または抗体ヒンジ領域（ＨＲ）をさらに含む。いくつかの実施形態では、軽鎖は、軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）、例えば、ラムダＣＬドメインまたはカッパＣＬドメインをさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分のＮ末端は、重鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分のＣ末端は、重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分のＮ末端は、軽鎖のＣ末端に融合される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分のＣ末端は、軽鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、重鎖、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分を含む第１のポリペプチド；及び軽鎖を含む第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、適宜ペプチドリンカー、及び重鎖を含む第１のポリペプチド；及び軽鎖を含む第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、軽鎖、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分を含む第１のポリペプチド；及び重鎖を含む第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、適宜ペプチドリンカー、及び軽鎖を含む第１のポリペプチド；及び重鎖を含む第２のポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、本明細書に記載の２つの同一の第１のポリペプチド及び２つの同一の第２のポリペプチドを含む。
【０１７８】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体（例えば、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１完全長抗体）を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体は、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖からなる完全長モノクローナル抗体である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、重鎖、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分を各々が含む２つの同一の第１のポリペプチド；及び軽鎖を各々が含む２つの同一の第２のポリペプチドを含む（例えば、図１８を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、適宜ペプチドリンカー、及び重鎖を各々が含む２つの同一の第１のポリペプチド；及び軽鎖を各々が含む２つの同一の第２のポリペプチドを含む（例えば、図１７を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、軽鎖、適宜ペプチドリンカー、及び本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分を各々が含む２つの同一の第１のポリペプチド；及び重鎖を各々が含む２つの同一の第２のポリペプチドを含む（例えば、図２０を参照されたい）。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、適宜ペプチドリンカー、及び軽鎖を各々が含む２つの同一の第１のポリペプチド；及び重鎖を含む２つの同一の第２のポリペプチドを含む（例えば、図１９を参照されたい）。
【０１７９】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、（ａ）第１及び第２の重鎖及び第１及び第２の軽鎖からなる完全長抗体であって、第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する、完全長抗体；（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分；（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分；（ｄ）第４のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第３の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分；及び（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第４の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含み；第１の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、第１の軽鎖のＮ末端に融合され、第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、第２の軽鎖のＮ末端に融合され、第３の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、第１の重鎖のＮ末端に融合され、及び第４の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、第２の重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、４つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、異なる。いくつかの実施形態では、４つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、同一である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、第３または第４の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、適宜ペプチドリンカー、及び重鎖を各々が含む２つの同一の第１のポリペプチド；及び第１または第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、適宜ペプチドリンカー、及び軽鎖を各々が含む２つの同一の第２のポリペプチドを含む。例えば、図２１を参照されたい。
【０１８０】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、（ａ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体であって、第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する、完全長抗体；（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分；（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分；（ｄ）第４のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第３の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分；及び（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第４の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含み；第１の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＮ末端に融合され、及び第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、一方の重鎖のＮ末端に融合され、及び第３の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、第４の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＮ末端に融合され、及び第４の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、他方の重鎖のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、４つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、異なる。いくつかの実施形態では、４つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、同一である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、第１または第３の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、適宜ペプチドリンカー、第２または第４の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、適宜ペプチドリンカー、及び重鎖を各々が含む２つの同一の第１のポリペプチド；及び軽鎖を各々が含む２つの同一の第２のポリペプチドを含む。例えば、図２２を参照されたい。
【０１８１】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、（ａ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体であって、第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する完全長抗体；（ｂ）第２のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分；及び（ｃ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含み、第１または第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＮ末端は、重鎖のＣＨ１領域のＣ末端に融合され、及び第１または第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、重鎖のＣＨ２領域のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、同一である。いくつかの実施形態では、２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、異なる。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−適宜ペプチドリンカー−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−ＣＨ２−ＣＨ３を各々が含む２つの同一の第１のポリペプチド；及び軽鎖を各々が含む２つの同一の第２のポリペプチドを含む。例えば、図２３を参照されたい。
【０１８２】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、（ａ）第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第１のｓｃＦｖ；（ｂ）第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第２のｓｃＦｖ；（ｃ）Ｆｃ領域；（ｄ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分；及び（ｄ）第４のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含み、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＮ末端は、ｓｃＦｖのＣ末端に融合され、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分のＣ末端は、Ｆｃ領域のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、同一である。いくつかの実施形態では、２つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、異なる。いくつかの実施形態では、２つのｓｃＦｖは、同一である。いくつかの実施形態では、２つのｓｃＦｖは、異なる。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、ｓｃＦｖ−適宜ペプチドリンカー−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＨ２−ＣＨ３、例えば、ＶＨ−ＶＬ−適宜ペプチドリンカー−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＨ２−ＣＨ３、またはＶＬ−ＶＨ−適宜ペプチドリンカー−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＨ２−ＣＨ３を各々が含む２つの同一のポリペプチドを含む。例えば、図２４を参照されたい。
【０１８３】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、（ａ）第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第１のＦａｂ；（ｂ）第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第２のＦａｂ；（ｃ）Ｆｃ領域；（ｄ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、及び第４のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１のＦａｂ様ドメイン；（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第３の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分及び第６のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第４の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第２のＦａｂ様ドメインを含み、各Ｆａｂ様ドメインのＮ末端は、ＦａｂのＣ末端に融合され、Ｆａｂ様ドメインの２つのＣ末端の１つは、Ｆｃ領域のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、４つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、同一である。いくつかの実施形態では、４つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、異なる。いくつかの実施形態では、２つのＦａｂは、同一である。いくつかの実施形態では、２つのＦａｂは、異なる。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−適宜ペプチドリンカー−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を各々が含む２つの同一の第１のポリペプチド；Ｎ末端からＣ末端において、及びＶＬ−ＣＬ−適宜ペプチドリンカー−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＬを各々が含む２つの同一の第２のポリペプチドを含む。例えば、図２５を参照されたい。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、（ａ）第１のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第１のｓｃＦｖ；（ｂ）第２のエピトープ（例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１）を特異的に認識する第２のｓｃＦｖ；（ｃ）Ｆｃ領域；（ｄ）第３のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第１の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、及び第４のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第２の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１のＦａｂ様ドメイン；（ｅ）第５のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第３の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、及び第６のエピトープを特異的に認識する本明細書に記載の第４の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第２のＦａｂ様ドメインを含み、各Ｆａｂ様ドメインの２つのＮ末端の１つは、ｓｃＦｖのＣ末端に融合され、Ｆａｂ様ドメインの２つのＣ末端の１つは、Ｆｃ領域のＮ末端に融合される。いくつかの実施形態では、４つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、同一である。いくつかの実施形態では、４つの抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、異なる。いくつかの実施形態では、２つのｓｃＦｖは、同一である。いくつかの実施形態では、２つのｓｃＦｖは、異なる。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、Ｎ末端からＣ末端において、ｓｃＦｖ−適宜ペプチドリンカー−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を各々が含む２つの同一の第１のポリペプチド；及びＮ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＬを各々が含む２つの同一の第２のポリペプチドを含む。例えば、図２６を参照されたい。
【０１８５】
本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）は、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分の間に位置する１つ以上のペプチドリンカーを含み得る。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分の重鎖ポリペプチドと第１の抗原結合部分の間のペプチドリンカーは、第２の抗原結合部分の軽鎖ポリペプチドと第１の抗原結合部分の間のペプチドリンカーと同じである。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分の重鎖ポリペプチドと第１の抗原結合部分の間のペプチドリンカーは、第２の抗原結合部分の軽鎖ポリペプチドと第１の抗原結合部分の間のペプチドリンカーと異なる。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分と第２の抗原結合部分は、その間に配置されるペプチドリンカー無しで互いに直接融合される。２つ以上の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分の間のペプチドリンカーは、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分と第２の抗原結合部分の間のものと同じかまたは異なっていてもよい。「ペプチドリンカー」セクションにおいて上述されたペプチドリンカーのいずれかを本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（またはＢＡＢＰ）のいずれかで使用することができる。
【０１８６】
ｂ）ＶＨ及びＶＬを含む第２の抗原結合部分
抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、ＶＨ及びＶＬを含む少なくとも１つの第２の抗原結合部分を含む。そのような抗原結合部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長の従来抗体、またはそれらに由来する抗原結合断片であり得る。
【０１８７】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ＶＨドメインを含む重鎖及びＶＬドメインを含む軽鎖を含む抗原結合断片である。本明細書で検討される例示的な抗原結合断片としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、及びＦｖ断片；ダイアボディ；線状抗体；一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）；及び抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１８８】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、Ｆｃ領域、例えば、ヒトＦｃ領域を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ分子、例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４サブクラスのいずれか１つに由来する。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、抗体エフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ及び／またはＣＤＣを媒介することができる。例えば、野生型Ｆｃ配列を有するサブクラスＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ３の抗体は、通常、Ｃ１ｑ及びＣ３結合を含む補体活性化を示し、一方、ＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃ１ｑ及び／またはＣ３に結合しない。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆｃ領域のＦｃ受容体への結合親和性を減少させる改変を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ１  Ｆｃは、２３３〜２３６位に１つ以上の突然変異、例えば、Ｌ２３４Ａ及び／またはＬ２３５Ａを含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、ＩｇＧ４  Ｆｃである。いくつかの実施形態では、ＩｇＧ４  Ｆｃは、３２７、３３０及び／または３３１位に突然変異を含む。例えば、Ａｒｍｏｕｒ  ＫＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｕｒ  Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９９９；２９：２６１３；及びＳｈｉｅｌｄｓ  ＲＬ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００１；２７６：６５９１を参照されたい。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｐ３２９Ｇ突然変異を含む。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号３５５、３５６及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０１８９】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、２つの同一でない重鎖のヘテロ二量体化を促進する改変を含む。そのような改変Ｆｃ領域は、非対称設計を有する本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）に対して特に興味深いものであり得る。いくつかの実施形態では、前記改変は、重鎖または重鎖融合ポリペプチドの一方にノブ改変、及び２つの重鎖または重鎖融合ポリペプチドの他方にホール改変を含むノブ−イントゥー−ホール改変である。一実施形態では、Ｆｃ領域は、ＣＨ３ドメインにおける２つの重鎖の間の界面内に改変を含み、ｉ）１つの重鎖のＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基は、より大きな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより他方の重鎖のＣＨ３ドメインにおける界面内の空洞（「ホール」）で配置可能である１つの重鎖のＣＨ３ドメインにおける界面内の隆起（「ノブ」）を生成し、ｉｉ）他方の重鎖のＣＨ３ドメインでは、アミノ酸残基は、より小さな側鎖体積を有するアミノ酸残基と置換され、それにより第１のＣＨ３ドメインにおける界面内の隆起（「ノブ」）が配置可能である第２のＣＨ３ドメインにおける界面内の空洞（「ホール」）を生成する。ノブ−イントゥー−ホール改変の例は、例えば、ＵＳ２０１１／０２８７００９、ＵＳ２００７／０１７８５５２、ＷＯ９６／０２７０１１、ＷＯ９８／０５０４３１、及びＺｈｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ６：７８１−７８８に記載されている。ヘテロ二量体化を促進するＦｃ領域に対する他の改変も、本明細書で検討される。例えば、静電ステアリング効果をＦｃ領域中に操作して、Ｆｃ−ヘテロ二量体分子を提供することができる（例えば、ＵＳ４６７６９８０、及びＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照されたい）。
【０１９０】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、Ｆａｂアーム交換を阻害する改変を含む。例えば、ＩｇＧ４  ＦｃにおけるＳ２２８Ｐ突然変異は、Ｆａｂアーム交換を阻害する。
【０１９１】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、カッパ軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ラムダ軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、重鎖定常領域を含む。
【０１９２】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体である。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなるモノクローナル抗体を含む（「４鎖抗体」とも本明細書中で呼ばれる）。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる多重特異性（例えば、二重特異性）完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、突然変異Ｌ２３４Ａ及びＬ２３５Ａを有する、ヒトＩｇＧ１サブクラス、エフェクターレスｈＩｇＧ１サブクラス、またはヒトＩｇＧ１サブクラスの完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ２サブクラスの完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ３サブクラスの完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒトＩｇＧ４サブクラスの完全長抗体、またはさらなる突然変異Ｓ２２８Ｐを有するヒトＩｇＧ４サブクラスの完全長抗体を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体のＦｃ領域は、配列番号３５５、３５６及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。
【０１９３】
当該技術分野で公知の任意の完全長４鎖抗体、またはそれに由来する抗原結合断片は、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）における第２の抗原結合部分として使用することができる。臨床効果、安全性、及び薬物動態プロファイルが証明された抗体または抗体断片が、特に注目されるものである。いくつかの実施形態では、当該技術分野で公知の抗体または抗体断片は、さらに操作され、例えば、ヒト化または突然変異誘発され、第１の抗原結合部分と融合する前に適当な親和性を有する変異体を選択し、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、当該技術分野で公知のモノクローナル抗体または抗体断片のＶＨ及びＶＬドメイン、及び改変された重鎖定常領域及び／または軽鎖定常領域を含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、当該技術分野で公知のモノクローナル抗体、及び改変Ｆｃ領域、例えば、Ｓ２２８Ｐ突然変異を有するＩｇＧ４  Ｆｃ、またはエフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、ヒト、ヒト化、またはキメラ完全長抗体、または抗体断片を含む。
【０１９４】
いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、ペムブロリズマブ（例えば、キイトルーダ（登録商標））、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ（例えば、オプジーボ（登録商標））である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号３８５のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８６のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号３８５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号３２５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号３８７のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８８のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号３８７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号４０６のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号４０７のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、第２の抗原結合部分は、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、アテゾリズマブ（例えば、テセントリク（登録商標））、デュルバルマブ（例えば、ＭＥＤＩ４７３６、ＩＭＦＩＮＺＩ（商標））、アベルマブ（例えば、バベンチオ（登録商標））、またはヒト化５３Ｃ１（ｈ５３Ｃ１）である。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号３８１のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号３８１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号３７９のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８０のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号３７９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号３８３のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８４のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号３８３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはその抗原結合断片（例えば、ＦａｂまたはｓｃＦｖ）は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３２３または３２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。
【０１９５】
ｃ）例示的な抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ及びＢＡＢＰ
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、（ａ）本明細書に記載のＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂを含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）ＶＨ及びＶＬを含む第２の抗原結合部分を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合され、「ＴＩＧＩＴ×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ」または「ＴＩＧＩＴ×ＰＤ−１  ＢＡＢＰ」と以下で呼ばれる。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、（ａ）本明細書に記載のＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）ＶＨ及びＶＬを含む第２の抗原結合部分を含み、ＶＨ及びＶＬは一緒に、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合され、「ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ」または「ＴＩＧＩＴ×ＰＤ−Ｌ１ＢＡＢＰ」と以下で呼ばれる。
【０１９６】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体（例えば、ペムブロリズマブ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ）を含む第２の抗原結合部分を含み、完全長抗体は、ＰＤ−１に特異的に結合し；第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体を含む第２の抗原結合部分を含み、完全長抗体は、ＰＤ−１に特異的に結合し；完全長抗体は、配列番号３８５のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８６のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含み；及び第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号３８５のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８６のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号３２５のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２６のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含む��の変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体を含む第２の抗原結合部分を含み、完全長抗体は、ＰＤ−１に特異的に結合し；完全長抗体は、配列番号３８７のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８８のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含み；及び第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号３８７のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８８のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体を含む第２の抗原結合部分を含み、完全長抗体は、ＰＤ−１に特異的に結合し；完全長抗体は、配列番号４０６のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号４０７のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含み；及び第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−１抗体は、配列番号４０６のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号４０７のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；��び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２つの重鎖の１つまたは各々のＮ末端、２つの軽鎖の１つまたは各々のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２つの重鎖の１つまたは各々のＣ末端、または２つの軽鎖の１つまたは各々のＣ末端で第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、第２の抗原結合部分に化学的に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０未満（例えば、約２５、２０、または１５のいずれか１つ未満）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体のＦｃ領域は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、またはＩｇＧ４  Ｆｃであり得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１９７】
いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体（例えば、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、またはｈ５３Ｃ１）を含む第２の抗原結合部分を含み、完全長抗体は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し；及び第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体を含む第２の抗原結合部分を含み、完全長抗体は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し；完全長抗体は、配列番号３８１のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含み；及び第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３８１のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８２のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３１のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３２のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３３のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３４のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、��３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体を含む第２の抗原結合部分を含み、完全長抗体は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し；完全長抗体は、配列番号３７９のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８０のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含み；及び第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３７９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体を含む第２の抗原結合部分を含み、完全長抗体は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し；完全長抗体は、配列番号３８３のアミノ酸配列のＨＣ−ＣＤＲ１、ＨＣ−ＣＤＲ２、及びＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び配列番号３８４のアミノ酸配列のＬＣ−ＣＤＲ１、ＬＣ−ＣＤＲ２、及びＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含み；及び第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３８３のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３８４のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、（ａ）配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ���、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含むＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む第１の抗原結合部分、及び（ｂ）２つの重鎖及び２つの軽鎖からなる完全長抗体を含む第２の抗原結合部分を含み、完全長抗体は、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し；完全長抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含み；及び第１の抗原結合部分及び第２の抗原結合部分は、互いに融合される、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３２３または３２７のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３２８のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３２９のアミノ酸配列を含む重鎖、及び配列番号３３０のアミノ酸配列を含む軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、２つの重鎖の１つまたは各々のＮ末端、２つの軽鎖の１つまたは各々のＮ末端、Ｆｃ領域のＮ末端、２つの重鎖の１つまたは各々のＣ末端、または２つの軽鎖の１つまたは各々のＣ末端で第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗��結合部分は、第２の抗原結合部分に化学的に融合される。いくつかの実施形態では、第１の抗原結合部分は、ペプチド結合またはペプチドリンカーを介して第２の抗原結合部分に融合される。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、約３０未満（例えば、約２５、２０、または１５のいずれか１つ未満）のアミノ酸長である。いくつかの実施形態では、ペプチドリンカーは、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、完全長抗体のＦｃ領域は、例えば、ＩｇＧ１  Ｆｃ、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ、ＩｇＧ２  Ｆｃ、またはＩｇＧ４  Ｆｃであり得る。いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域は、配列番号３５５、３５６、及び３８９のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。
【０１９８】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３９６のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号３９７のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図１８に示す構造を有する。
【０１９９】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、またはｈ５３Ｃ１由来である。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３４０の��ミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ３及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３５９のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号３６０のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図１８に示す構造を有する。
【０２００】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３−を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３９４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号３９５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図１７に示す構造を有する。
【０２０１】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、またはｈ５３Ｃ１由来である。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３��０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３４５のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号３４６のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３４７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号３４８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３４１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号３４２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３４３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号３４４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３５７のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号３５８のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号４０２のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号４０３のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図１７に示す構造を有する。
【０２０２】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＬ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号４００のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号４０１のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図２０に示す構造を有する。
【０２０３】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、またはｈ５３Ｃ１由来である。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３��０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＬ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３６３のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号３６４のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図２０に示す構造を有する。
【０２０４】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３９８のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号３９９のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図１９に示す構造を有する。
【０２０５】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、またはｈ５３Ｃ１由来である。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３��０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号３６１のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号３６２のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、（ａ）配列番号４０４のアミノ酸配列を含む第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び（ｂ）配列番号４０５のアミノ酸配列を含む第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図１９に示す構造を有する。
【０２０６】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分−ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、同じである。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、異なる。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、図２１に示す構造を有する。
【０２０７】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分−ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、同じである。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、異なる。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、またはｈ５３Ｃ１由来である。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配���番号３８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＬ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＶＨ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、図２１に示す構造を有する。
【０２０８】
（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、同じである。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、異なる。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分、及び／またはＶＨ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ���ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、図２２に示す構造を有する。
【０２０９】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分−ＶＨ−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、同じである。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、異なる。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、またはｈ５３Ｃ１由来である。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配���番号３８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分、及び／またはＶＨ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、図２２に示す構造を有する。
【０２１０】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ１及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図２３に示す構造を有する。
【０２１１】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、またはｈ５３Ｃ１由来である。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３��０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ１及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図２３に示す構造を有する。
【０２１２】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＶＨ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＨ２−ＣＨ３を含むポリペプチドを含み、ＶＬ及びＶＨは、ＰＤ−１に特異的に結合するｓｃＦｖを一緒に形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＶＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＨ２−ＣＨ３を含むポリペプチドを含み、ＶＬ及びＶＨは、ＰＤ−１に特異的に結合するｓｃＦｖを一緒に形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ（またはｓｃＦｖを形成するＶＬ及びＶＨ）は、ペムブロリズマブ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形��では、ＶＨは、配列番号３８７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖを形成するＶＨ及びＶＬ、及び／またはｓｃＦｖ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、ポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図２４に示す構造を有する。
【０２１３】
いくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＶＨ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＨ２−ＣＨ３を含むポリペプチドを含み、ＶＬ及びＶＨは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するｓｃＦｖを一緒に形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＶＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分−ＣＨ２−ＣＨ３を含むポリペプチドを含み、ＶＬ及びＶＨは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合するｓｃＦｖを一緒に形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖ（またはｓｃＦｖを形成するＶＬ及びＶＨ）は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、またはｈ５３Ｃ１由来である。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０の��ミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖを形成するＶＨ及びＶＬ、及び／またはｓｃＦｖ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、ポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図２４に示す構造を有する。
【０２１４】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、同じである。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、異なる。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、ペムブロリズマブ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ１及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分、及び／またはＣＬ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、図２５に示す構造を有する。
【０２１５】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＣＨ１−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分−ＣＨ１−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＣＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ＶＨ及びＶＬは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、同じである。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、異なる。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメインは、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、またはｈ５３Ｃ１由来である。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含み、���びＶＬは、配列番号３８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＨ１及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分、及び／またはＣＬ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、図２５に示す構造を有する。
【０２１６】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＶＨ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ｓｃＦｖを形成するＶＬ及びＶＨは、ＰＤ−１に特異的に結合し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＶＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分−ＣＬを含む第２のポリペプチド、ｓｃＦｖを形成するＶＬ及びＶＨは、ＰＤ−１に特異的に結合し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号２５３〜２５９、２７��、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、同じである。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、異なる。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメイン（またはｓｃＦｖ）は、ペムブロリズマブ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、またはニボルマブ由来である。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８５のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８６のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８７のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号４０６のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号４０７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖを形成するＶＨ及びＶＬ、及び／またはｓｃＦｖ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、図２６に示す構造を有する。
【０２１７】
いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＬ−ＶＨ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ｓｃＦｖを形成するＶＬ及びＶＨは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、（ａ）Ｎ末端からＣ末端において、ＶＨ−ＶＬ−抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分−ＣＨ２−ＣＨ３を含む第１のポリペプチド；及び（ｂ）Ｎ末端からＣ末端において、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分−ＣＬを含む第２のポリペプチドを含み、ｓｃＦｖを形成するＶＬ及びＶＨは、ＰＤ−Ｌ１に特異的に結合し、及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体を含む、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は各々、配列番号２５３〜２��９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、同じである。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ２部分は、異なる。いくつかの実施形態では、ＶＨ及びＶＬドメイン（またはｓｃＦｖ）は、アテゾリズマブ、デュルバルマブ、アベルマブ、またはｈ５３Ｃ１由来である。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、１）配列番号３４９のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５０のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５１のアミノ酸配列を含むＨＣ−ＣＤＲ３を含むＶＨ、及び２）配列番号３５２のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ１、配列番号３５３のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ２、及び配列番号３５４のアミノ酸配列を含むＬＣ−ＣＤＲ３を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ｈ５３Ｃ１抗ＰＤ−Ｌ１抗体は、配列番号３３９のアミノ酸配列を含むＶＨ、及び配列番号３４０のアミノ酸配列を含むＶＬを含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８１のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３７９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３８３のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３８４のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ＶＨは、配列番号３３９のアミノ酸配列を含み、及びＶＬは、配列番号３４０のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、ｓｃＦｖを形成するＶＨ及びＶＬ、及び／またはｓｃＦｖ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ１部分は、ペプチドリンカー、例えば、配列番号３２４及び３７０〜３７８のいずれか１つのアミノ酸配列を含むペプチドリンカーを介して互いに融合される。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ４Ｆｃ由来、例えば、配列番号３８９である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、ＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５６である。いくつかの実施形態では、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインは、エフェクターレスＩｇＧ１  Ｆｃ由来、例えば、配列番号３５５である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、第１のポリペプチドの２つの同一のコピー、及び第２のポリペプチドの２つの同一のコピーを含む。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）は、図２６に示す構造を有する。
【０２１８】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つ（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む多重特異性（例えば、二重特異性）または単一特異性の抗ＴＩＧＩＴ構築物、例えば、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１構築物（例えば、ＭＡＢＰまたはＢＡＢＰ）または抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１構築物（例えば、ＭＡＢＰまたはＢＡＢＰ））と競合的にＴＩＧＩＴに特異的に結合するＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ）（以下、「競合抗ＴＩＧＩＴ構築物」、「競合抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ」、または「競合抗ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ」と呼ばれる）も提供される。
【０２１９】
（ＩＩＩ）抗ＴＩＧＩＴ構築物抗体変異体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ／ＢＡＢＰ）のアミノ酸配列変異体が企図される。例えば、抗体の結合親和性及び／または他の生物学的特性を改善することが望ましい場合がある。抗体のアミノ酸配列変異体は、抗体をコードする核酸配列に適切な改変を導入するか、またはペプチド合成によって調製し得る。そのような改変には、例えば、抗体のアミノ酸配列内における残基の欠失、及び／または挿入、及び／または置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終構築物に到達するために、欠失、挿入及び置換のいかなる組み合わせをも行うことができる。
【０２２０】
ａ）置換、挿入、欠失、及び変異体
いくつかの実施形態では、１つ以上のアミノ酸置換を有する抗体変異体を提供する。置換突然変異誘発のための目的の部位には、ＨＶＲ（またはＣＤＲ）及びＦＲが含まれる。保存的置換は、「好ましい置換」という見出しの下で表２に示す。より実質的な変化は、「例示的な置換」という見出しの下で表２に提供し、これは、アミノ酸側鎖クラスに関連して以下にさらに記載する通りである。アミノ酸置換を目的の抗体に導入し、生成物を所望の活性、例えば、保持／改善された抗原結合、低減した免疫原性、または改善されたＡＤＣＣもしくはＣＤＣについて、スクリーニングすることができる。
表２．アミノ酸置換
【表２】
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【０２２１】
アミノ酸は、側鎖の共通する特性に従って分類することができる：（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を及ぼす残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅ。
【０２２２】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴う。
【０２２３】
置換変異体の１つのタイプは、親抗体（例えば、ヒト化またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基を置換することを伴う。一般的に、さらなる研究のために選択される得られる変異体（複数可）は、ある特定の生物学的特性（例えば、増加した親和性、低減した免疫原性）において、親抗体に比して改変（例えば、改善）されているか、及び／または、親抗体のある特定の生物学的特性が実質的に保持されている。例示的な置換変異体は、例えば、本明細書に記載するようなファージディスプレイに基づく親和性成熟技術を用いて簡便に生成され得る親和性成熟抗体である。簡単に言うと、１つ以上のＨＶＲ残基を突然変異させ、ファージ上で変異体抗体を提示させ、特定の生物学的活性（例えば、結合親和性）についてスクリーニングする。
【０２２４】
変化（例えば、置換）を、例えば、抗体親和性を改善するために、ＨＶＲにおいて起こさせてもよい。そのような変化を、ＨＶＲ「ホットスポット」、すなわち、体細胞成熟過程の間に高頻度に突然変異を起こすコドンによってコードされる残基（例えば、Ｃｈｏｗｄｈｕｒｙ，Ｐ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２０７：１７９−１９６（２００８）を参照されたい）、及び／またはＳＤＲ（ａ−ＣＤＲ）によってコードされる残基において起こさせてもよく、得られた変異体ＶＨまたはＶＬを結合親和性について試験する。二次ライブラリーを構築し、そこから再選択することによる親和性成熟は、例えば、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ｅｔ  ａｌ．ｉｎ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  １７８：１−３７（Ｏ’Ｂｒｉｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｈｕｍａｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｔｏｔｏｗａ，ＮＪ，（２００１）に記載されている。親和性成熟のいくつかの実施形態では、種々の方法（例えば、エラープローンＰＣＲ、鎖シャッフリングまたはオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発）のいずれかによって、成熟のために選択された可変遺伝子に多様性を導入する。次いで、二次ライブラリーを作製する。次いで、ライブラリーをスクリーニングして、所望の親和性を有するあらゆる抗体変異体を同定する。多様性を導入するための別の方法は、数個のＨＶＲ残基（例えば、一度に４〜６残基）をランダム化するＨＶＲ特異的なアプローチを伴う。抗原結合に関与するＨＶＲ残基は、例えば、アラニンスキャニング突然変異誘発またはモデル化を用いて具体的に同定され得る。特に、ＣＤＲ−Ｈ３及びＣＤＲ−Ｌ３は標的とされることが多い。
【０２２５】
いくつかの実施形態では、置換、挿入、または欠失は、そのような変更が、抗体が抗原に結合する能力を実質的に低減させない範囲で、１つ以上のＨＶＲ内で生じてもよい。例えば、結合親和性を実質的に低減しない保存的変化（例えば、本明細書で提供される保存的置換）を、ＨＶＲ内で起こさせてもよい。そのような変化は、例えば、HVR「ホットスポット」またはＣＤＲの外であってもよい。上で提供された変異体ＶＨＨ配列のいくつかの実施形態では、各ＨＶＲは変化していないか、１、２、または３以下のアミノ酸置換しか含まない。
【０２２６】
突然変異誘発のための標的とし得る抗体の残基または領域を同定するための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４４：１０８１−１０８５に記載されるように、「アラニンスキャニング突然変異誘発」と呼ばれる。この方法では、残基または一群の標的残基（例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、Ｌｙｓ及びＧｌｕのような荷電残基）を同定し、それを中性または負電荷を持つアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）で置換して、抗体の、抗原との相互作用が影響を受けるか否かを決定する。最初の置換に対して機能的感受性を示すアミノ酸位置に、さらなる置換を導入してもよい。あるいは、またはさらに、抗体と抗原の間の接触点を同定するために、抗原−抗体複合体の結晶構造を用いることができる。このような接触残基及びその隣接残基を、置換の候補として標的にしても、排除してもよい。変異体をスクリーニングして、それらが所望の特性を含むか否かを決定してもよい。
【０２２７】
アミノ酸配列挿入には、１残基から、１００残基またはそれ以上を含有するポリペプチドまでに及ぶ長さのアミノ末端及び／またはカルボキシル末端融合、ならびに単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入も含まれる。末端挿入の例には、Ｎ末端メチオニル残基を有する抗体が含まれる。抗体分子の他の挿入変異体には、抗体のＮ末端またはＣ末端への、酵素（例えば、ＡＤＥＰＴの場合）、または抗体の血清中半減期を増加させるポリペプチドの融合が含まれる。
【０２２８】
ｂ）グリコシル化変異体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ構築物を変化させて、構築物がグリコシル化される程度を増加または減少させる。抗体へのグリコシル化部位の付加または欠失は、１つ以上のグリコシル化部位が作出または除去されるようにアミノ酸配列を変化させることによって、簡便に達成することができる。
【０２２９】
抗ＴＩＧＩＴ構築物がＦｃ領域（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ、またはＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ）を含む場合、そこに結合する糖質を変化させてもよい。哺乳動物細胞によって産生される天然抗体は、典型的には、分岐した二分岐オリゴ糖を含み、これは一般的には、Ｆｃ領域のＣＨ２ドメインのＡｓｎ２９７にＮ連結によって結合される。例えば、Ｗｒｉｇｈｔ  ｅｔ  ａｌ．ＴＩＢＴＥＣＨ  １５：２６−３２（１９９７）を参照されたい。オリゴ糖は、種々の炭水化物、例えば、マンノース、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）、ガラクトース、シアル酸、ならびに二分岐オリゴ糖構造の「幹」のＧｌｃＮＡｃに結合したフコースを含み得る。いくつかの実施形態では、本出願の抗ＴＩＧＩＴ構築物におけるオリゴ糖の改変は、一定の改善された特性を有する抗体変異体を作成するために行われ得る。
【０２３０】
いくつかの実施形態では、Ｆｃ領域に（直接または間接的に）結合したフコースを欠く糖質構造を有する、抗ＴＩＧＩＴ構築物抗体変異体を提供する。例えば、そのような抗体におけるフコースの量は、１％〜８０％、１％〜６５％、５％〜６５％または２０％〜４０％であってもよい。フコースの量は、例えば、ＷＯ２００８／０７７５４６号に記載されているように、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析によって測定される、Ａｓｎ２９７に結合した全ての糖構造（例えば、複合型、混成型、及び高マンノース型構造）の合計に比しての、Ａｓｎ２９７における糖鎖内のフコースの平均量を算出することによって決定される。Ａｓｎ２９７は、Ｆｃ領域内の約２９７位（Ｆｃ領域残基のＥＵ番号付け）に位置するアスパラギン残基を指す；しかしながら、抗体における軽微な配列変異のため、Ａｓｎ２９７は、２９７位の上流側または下流側約±３アミノ酸、すなわち２９４位と３００位の間に位置する場合もあり得る。そのようなフコシル化変異体は、改善されたＡＤＣＣ機能を有し得る。例えば、米国特許公開第２００３／０１５７１０８号（Ｐｒｅｓｔａ，Ｌ．）；ＵＳ２００４／００９３６２１（Ｋｙｏｗａ  Ｈａｋｋｏ  Ｋｏｇｙｏ  Ｃｏ．，Ｌｔｄ）を参照されたい。「脱フコシル化」または「フコース欠損」抗体変異体に関する刊行物の例としては、ＵＳ２００３／０１５７１０８；ＷＯ２０００／６１７３９；ＷＯ２００１／２９２４６；ＵＳ２００３／０１１５６１４；ＵＳ２００２／０１６４３２８；ＵＳ２００４／００９３６２１；ＵＳ２００４／０１３２１４０；ＵＳ２００４／０１１０７０４；ＵＳ２００４／０１１０２８２；ＵＳ２００４／０１０９８６５；ＷＯ２００３／０８５１１９；ＷＯ２００３／０８４５７０；ＷＯ２００５／０３５５８６；ＷＯ２００５／０３５７７８；ＷＯ２００５／０５３７４２；ＷＯ２００２／０３１１４０；Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３６：１２３９−１２４９（２００４）；Ｙａｍａｎｅ−Ｏｈｎｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．Ｂｉｏｅｎｇ．８７：６１４（２００４）が挙げられる。
【０２３１】
抗ＴＩＧＩＴ構築物変異体は、例えば、抗体のＦｃ領域に結合した二分岐オリゴ糖がＧｌｃＮＡｃによって二分されている二分オリゴ糖とともにさらに与えられる。そのような抗体変異体は、フコシル化を減少させ、及び／またはＡＤＣＣ機能を改善している可能性がある。そのような抗体変異体の例は、例えば、ＷＯ２００３／０１１８７８（Ｊｅａｎ−Ｍａｉｒｅｔ  ｅｔ  ａｌ．）；米国特許第６，６０２，６８４号（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）；及びＵＳ２００５／０１２３５４６（Ｕｍａｎａ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。Ｆｃ領域に結合したオリゴ糖内に少なくとも１つのガラクトース残基を持つ抗体変異体も提供される。そのような抗体変異体は、ＣＤＣ機能を改善させた可能性がある。そのような抗体変異体は、例えば、ＷＯ１９９７／３００８７（Ｐａｔｅｌ  ｅｔ  ａｌ．）；ＷＯ１９９８／５８９６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）；及びＷＯ１９９９／２２７６４（Ｒａｊｕ，Ｓ．）に記載されている。
【０２３２】
ｃ）Ｆｃ領域変異体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ、またはＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ）のＦｃ領域に１つ以上のアミノ酸改変を導入することにより、Ｆｃ領域変異体を生成させてもよい。Ｆｃ領域変異体は、１つ以上のアミノ酸位置にアミノ酸改変（例えば、置換）を含むヒトＦｃ領域配列（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４Ｆｃ領域）を含み得る。
【０２３３】
いくつかの実施形態では、本出願は、インビボにおける抗ＴＩＧＩＴ構築物の半減期が重要であるが、ある特定のエフェクター機能（例えば、補体及びＡＤＣＣなど）が不要または有害である用途のための望ましい候補とならしめる、全てではないが一部のエフェクター機能を有する抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ、またはＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ）変異体を意図している。インビトロ及び／またはインビボでの細胞傷害性アッセイを、ＣＤＣ活性及び／またはＡＤＣＣ活性の減少／枯渇を確認するために行うことができる。例えば、Ｆｃ受容体（ＦｃＲ）結合アッセイは、抗体がＦｃγＲ結合を欠くが（それゆえ、恐らくＡＤＣＣ活性を欠く）、ＦｃＲｎ結合能力を保持していることを確認するために行うことができる。ＡＤＣＣ、ＮＫ細胞を媒介する初代細胞は、ＦｃγＲＩＩＩのみを発現するが、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ、及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞におけるＦｃＲの発現は、Ｒａｖｅｔｃｈ  ａｎｄ  Ｋｉｎｅｔ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９：４５７−４９２（１９９１）の４６４ページの表２に要約されている。目的の分子のＡＤＣＣ活性を評価するためのインビトロアッセイの非限定的な例は、米国特許第５，５００，３６２号（例えば、Ｈｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ．ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８３：７０５９−７０６３（１９８６）を参照されたい）及びＨｅｌｌｓｔｒｏｍ，Ｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８２：１４９９−１５０２（１９８５）；同第５，８２１，３３７号（Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１６６：１３５１−１３６１（１９８７）を参照されたい）に記載されている。あるいは、非放射性アッセイ法を用いることができる（例えば、フローサイトメトリー用のＡＣＴＩ（商標）非放射性細胞傷害性アッセイ（ＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．Ｍｏｕｎｔａｉｎ  Ｖｉｅｗ，ＣＡ；及びＣｙｔｏＴｏｘ非放射性細胞傷害性アッセイ（Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を参照されたい）。そのようなアッセイに有用なエフェクター細胞には、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞が含まれる。あるいは、またはさらに、目的の分子のＡＤＣＣ活性は、Ｃｌｙｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９５：６５２−６５６（１９９８）に開示されるように、インビボで、例えば、動物モデルにおいて評価することができる。Ｃ１ｑ結合アッセイはまた、抗体が体Ｃ１ｑを結合することができないこと、したがって、ＣＤＣ活性を欠いていることを確認するために行うことができる。例えば、ＷＯ２００６／０２９８７９及びＷＯ２００５／１００４０２のＣ１ｑ及びＣ３ｃ結合ＥＬＩＳＡを参照されたい。補体活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを行うことができる。ＦｃＲｎ結合、及びインビボでのクリアランス／半減期の測定も当該技術分野で公知の方法を用いて行うことができる（例えば、Ｐｅｔｋｏｖａ，Ｓ．Ｂ．ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ’ｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１８（１２）：��７５９−１７６９（２００６）を参照されたい）。
【０２３４】
エフェクター機能が減少した抗体は、Ｆｃ領域の残基２３８、２６５、２６９、２７０、２９７、３２７、３２９の１つ以上の置換を有するものが含まれる（米国特許第６，７３７，０５６号）。そのようなＦｃ変異体は、残基２６５及び２９７のアラニンへの置換を有する、いわゆる「ＤＡＮＡ」Ｆｃ変異体を含む、アミノ酸位置２６５、２６９、２７０、２９７及び３２７の２つ以上での置換を有するＦｃ変異体を含む（米国特許第７，３３２，５８１号）。
【０２３５】
ＦｃＲへの改善または減少させた結合を持つある特定の抗体変異体が記載されている。（例えば、米国特許第６，７３７，０５６号；ＷＯ２００４／０５６３１２、及びＳｈｉｅｌｄｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．９（２）：６５９１−６６０４（２００１）を参照されたい）。
【０２３６】
いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物変異体は、ＡＤＣＣを改善する１つ以上のアミノ酸置換、例えば、Ｆｃ領域の位置２９８、３３３、及び／または３３４における置換（残基のＥＵ番号付け）を含む。
【０２３７】
いくつかの実施形態では、改変された（すなわち、改善されたか減少したのいずれか）Ｃ１ｑ結合及び／または補体依存性細胞傷害（ＣＤＣ）を生じる、Ｆｃ領域における改変がなされ、例えば、米国特許第６，１９４，５５１号、ＷＯ９９／５１６４２、及びＩｄｕｓｏｇｉｅ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６４：４１７８−４１８４（２０００）に記載される。
【０２３８】
いくつかの実施形態では、半減期を増加し、及び／または新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合を改善する１つ以上のアミノ酸置換を含む変異体Ｆｃ領域を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ、またはＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ）変異体を提供する。増加した半減期を持ち、胎仔への母性ＩｇＧの移送を担う、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）への結合が改善された抗体（Ｇｕｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１７：５８７（１９７６）及びＫｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２４９（１９９４））が、ＵＳ２００５／００１４９３４Ａ１（Ｈｉｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）に記載されている。これらの抗体は、ＦｃＲｎへのＦｃ領域の結合を改善する１つ以上の置換を有するＦｃ領域を含む。そのようなＦｃ変異体は、Ｆｃ領域の残基の１つ以上の置換、例えば、Ｆｃ領域の残基４３４の置換を有するものが含まれる（米国特許第７，３７１，８２６号）。
【０２３９】
Ｆｃ領域の変異体の他の例に関しては、Ｄｕｎｃａｎ  ＆  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  ３２２：７３８−４０（１９８８）；米国特許第５，６４８，２６０号；米国特許第５，６２４，８２１号；及びＷＯ９４／２９３５１も参照されたい。
【０２４０】
本明細書に記載のＦｃ変異体のいずれかまたはそれらの組み合わせを含む抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、本明細書に記載の、ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、完全長抗体に融合した抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、または抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ／ＢＡＢＰ）が企図される。
【０２４１】
ｄ）システイン改変抗体変異体
いくつかの実施形態では、抗体の１つ以上の残基がシステイン残基で置換されている、システイン改変抗ＴＩＧＩＴ構築物、例えば、「チオＭＡｂ」を作成することが望まれ得る。特定の実施形態では、置換された残基は、抗体のアクセス可能な部位で起きる。それらの残基をシステインで置換することにより、反応性チオール基は、それによって抗体のアクセス可能な部位に配置され、本明細書中でさらに記載されるように、イムノコンジュゲートを作成するために、例えば、薬物部分またはリンカー−薬剤部分などの他の部分に抗体をコンジュゲートするために使用することができる。いくつかの実施形態では、以下の残基のいずれか１つ以上がシステインで置換され得る：軽鎖のＡ１１８（ＥＵ番号付け）；及び重鎖Ｆｃ領域のＳ４００（ＥＵ番号付け）。システイン改変抗ＴＩＧＩＴ構築物は、例えば、米国特許第７，５２１，５４１号に記載されるように生成され得る。
【０２４２】
ｅ）抗体誘導体
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ構築物は、当該技術分野で知られ、容易に入手されている追加の非タンパク質部分を含むようにさらに改変することができる。抗体の誘導体化に適した部分としては、限定されないが、水溶性ポリマーを含む。水溶性ポリマーの非限定的な例としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、エチレングリコール／プロピレングリコールの共重合体、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリ−１，３−ジオキソラン、ポリ−１，３，６−トリオキソラン、エチレン／無水マレイン酸共重合体、ポリアミノ酸（単独重合体またはランダム共重合体のいずれか）及びデキストランまたはポリ（ｎ−ビニルピロリドン）ポリエチレングリコール、プロピレングリコール単独重合体、プロピレンオキシド／エチレンオキシド共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール（例えば、グリセロール）、ポリビニルアルコール及びこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。ポリエチレングリコールプロピオンアルデヒドは、その水中での安定性のために製造上の利点を有し得る。ポリマーは、いずれかの分子量のものであり得、分枝鎖または未分枝鎖であり得る。抗体に結合するポリマーの数は、変動し得、１つ以上の重合体が結合する場合、それらは同じかまたは異なる分子であることができる。一般的に、誘導体化に使用するポリマーの数及び／または種類は、限定されないが、向上させるべき抗体の特定の特性または機能、抗体誘導体が特定の条件下で治療に使用されるのかなどを考慮しながら決定することができる。
【０２４３】
いくつかの実施形態では、放射線への曝露によって選択的に加熱されてもよい抗ＴＩＧＩＴ構築物と非タンパク質部分とのコンジュゲートを提供する。いくつかの実施形態では、非タンパク質部分は、カーボンナノチューブである（Ｋａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  １０２：１１６００−１１６０５（２００５）。放射線は、任意の波長であってよいが、限定されないものの、通常の細胞に害を与えないが、抗体−非タンパク質部分の近位細胞が死滅される温度に非タンパク質部分を加熱する波長が含まれる。
【０２４４】
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１二重特異性抗体、抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体、または抗ＴＩＧＩＴ  ＭＡＢＰ（例えば、ＢＡＢＰ））は、１つ以上の生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチドまたはその断片を含むようにさらに改変されてもよい。「生物活性」または「生物学的に活性な」は、本明細書で交換可能に使用する場合、具体的な機能を実行するために体内で生物学的活性を示すことを意味する。例えば、それは、特定の生体分子、例えば、タンパク質、ＤＮＡなどとの組み合わせ、次いで、そのような生体分子の活性の促進または阻害を意味し得る。いくつかの実施形態では、生物活性タンパク質またはその断片には、疾患もしくは状態の予防または治療のための活性薬物として患者に投与されるタンパク質及びポリペプチド、ならびに診断目的に使用されるタンパク質及びポリペプチド、例えば、診断検査またはインビトロアッセイで使用される酵素、ならびに疾患を予防するために患者に投与されるタンパク質及びポリペプチド、例えば、ワクチンが含まれる。いくつかの実施形態では、生物活性タンパク質またはその断片は、免疫刺激／免疫調節、膜輸送、または酵素活性を有する。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチドまたはその断片は、酵素、ホルモン、成長因子、サイトカイン、またはこれらの混合物である。いくつかの実施形態では、生物学的に活性なタンパク質、ポリペプチドまたは断片は、標的ペプチド（例えば、抗原または他のタンパク質）を特異的に認識することができる。
【０２４５】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物内に含まれ得る生物活性タンパク質またはその断片は、タンパク質結合タンパク質である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物内に含まれ得る生物活性タンパク質またはその断片は、抗体によく似ている、抗原結合ドメインを含む小さな操作されたタンパク質である抗体模倣物である（Ｇｅｅｒｉｎｇ  ａｎｄ  Ｆｕｓｓｅｎｅｇｇｅｒ，Ｔｒｅｎｄｓ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，３３（２）：６５−７９、２０１５）。これらの分子は、既存のヒト足場タンパク質に由来し、単一ポリペプチドを含む。本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物内に含まれ得る例示的な抗体模倣物は、限定されないが、設計されたアンキリンリピートタンパク質（ＤＡＲＰｉｎ；Ｎ末端及びＣ末端Ｃａｐドメインが隣接する３〜５の完全合成アンキリンリピートを含む）、アビディティマルチマー（アビマー；複数のＡドメインを含む高親和性タンパク質、各ドメインは、標的に対する親和性が低い）、またはアンチカリン（４つのアクセス可能なループを有するリポカリンの足場に基づく、各々の配列は、無作為化され得る）であり得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物内に含まれ得る生物活性タンパク質またはその断片は、アルマジロリピート単位（約４０残基長の特徴的な繰返しアミノ酸配列）を含むアルマジロリピートタンパク質（例えば、β−カテニン、α−インポーチン、プラコグロビン、大腸腺腫様性ポリポーシス（ＡＰＣ））である。各アルマジロリピートは、ヘアピン構造を形成する一対のアルファヘリックスからなる。リピート形態の複数コピーは、アルファソレノイド構造として知られるものである。アルマジロリピートタンパク質は、特定の保存された側鎖を必要とせずに、またはペプチドの遊離Ｎ末端またはＣ末端との相互作用せずに、ペプチド骨格の結合の一定の方法に依存して、異なるタイプのペプチドに結合することができる。リピートタンパク質の固有のモジュール性と組み合わせた、残基によるペプチド残基の認識の可能性により、アルマジロリピートタンパク質は、ペプチド結合に対する一般的な足場の設計の有望な候補になる。
【０２４６】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物内に含まれ得る生物学的に活性なタンパク質またはその断片は、リガンド、例えば、特定の細胞受容体と相互作用するリンホカイン及び細胞因子である。リンホカインは、抗原またはレクチンがＴ細胞の増殖を刺激する場合にＴ細胞により分泌される低分子タンパク質である。
【０２４７】
ＩＩＩ．医薬組成物
本明細書に記載されるようにＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂを含む抗ＴＩＧＩＴ構築物のいずれか１つ（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ）、または抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ））、及び適宜、薬学的に許容可能な担体を含む医薬組成物が本発明でさらに提供される。医薬組成物は、所望の純度を有する本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物を、薬学的に許容可能な担体、賦形剤、または安定剤と適宜混合することにより（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で調製することができる。
【０２４８】
医薬組成物は、安定的であることが好ましく、その中で、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物は、その物理的及び化学的安定性ならびに保管時の完全性を本質的に保持する。安定性は、選択された温度で選択された期間、測定することができる。迅速スクリーニングの場合、製剤を２週間から１ヵ月間４０℃で保持し、その間安定性を測定する。製剤が２〜８℃で保管される場合、一般的には、製剤は３０℃または４０℃で少なくとも１ヵ月間安定的であるべきであり、及び／または２〜８℃では少なくとも２年間安定的であるべきである。製剤が３０℃で保管される場合、一般的には、製剤は３０℃で少なくとも２年間安定的であるべきであり、及び／または４０℃では少なくとも６ヵ月間安定的であるべきである。例えば、保管中の凝集の程度は、タンパク質安定性の指標として使用することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物の安定製剤は、製剤中に凝集体として存在する約１０％未満（好ましくは、約５％未満）の抗ＴＩＧＩＴ構築物を含み得る。
【０２４９】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いる投与量及び濃度ではレシピエントに対して無毒性であり、緩衝液、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、異性重亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化剤；防腐剤、等張剤（例えば、塩化ナトリウム）、安定剤、金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ＥＤＴＡなどのキレート剤、及び／または非イオン性界面活性剤を含む。
【０２５０】
生理学的に許容可能な担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、またはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例として、Ｚｎ−タンパク質錯体）；及び／またはＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン界面活性剤が挙げられる。
【０２５１】
治療効果を最適化する範囲にｐＨを制御するために緩衝剤が使用され、特に安定性がｐＨ依存である場合に使用される。緩衝剤は、好ましくは、約５０ｍＭ〜約２５０ｍＭの範囲の濃度で存在する。本発明で使用するための適当な緩衝剤は、有機酸及び無機酸の両方ならびにその塩を含む。例えば、クエン酸、リン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、グルコン酸、シュウ酸、乳酸、酢酸である。さらに、緩衝剤は、ヒスチジン及びトリメチルアミン塩を含み得、例えば、Ｔｒｉｓである。
【０２５２】
保存料は微生物の増殖を遅らせるために添加され、典型的には、０．２％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。保存料の添加は、例えば、複数回使用（複数回投与）製剤の生産を容易にし得る。本発明での使用に適当な保存料には、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ベンザルコニウムハロゲン化合物（例えば、塩化物、臭化物、ヨウ化物）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノール、及びｍ−クレゾールが含まれる。
【０２５３】
「安定剤」としても知られる等張化剤は、組成物中の液体の緊張性を調節または維持するために存在する。タンパク質や抗体などの大きな荷電生体分子と共に用いる場合、それらは、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用して分子内及び分子間相互作用の潜在性を減少させることができるため、しばしば「安定剤」と称される。等張化剤は、他の成分との相対的な量を考慮して、０．１重量％〜２５重量％、好ましくは１％〜５％の間の任意の量で存在し得る。好ましい等張化剤には、多価糖アルコール、好ましくは、三水素またはより高い糖アルコール、例えば、グリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが含まれる。
【０２５４】
さらなる賦形剤には、以下のものの１つ以上として機能し得る薬剤が含まれる：（１）充填剤、（２）溶解亢進剤、（３）安定剤、及び（４）変性や容器壁への付着を防止する作用剤。そのような賦形剤は、多価糖アルコール（上に列挙）；アミノ酸、例えば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなど；有機糖または糖アルコール、例えば、スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイノシトース、ミオイノシトール、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール（例えば、イノシトール）、ポリエチレングリコール；硫黄含有還元剤、例えば、尿素、グルタチオン、チオクト酸、ナトリウムチオグリコール酸塩、チオグリセロール、α−モノチオグリセロール及びナトリウムチオ硫酸塩；低分子量タンパク質、例えば、ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチンまたは他の免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドン；単糖類（例えば、キシロース、マンノース、フルクトース、ブドウ糖）；二糖類（例えば、ラクトース、マルトース、スクロース）；三糖類、例えば、ラフィノース；及び多糖類、例えば、デキストリンまたはデキストランが含まれる。
【０２５５】
非イオン性界面活性剤または洗剤（「湿潤剤」としても公知）が存在し、治療用薬剤を安定化させ、ならびに、撹拌誘導性の凝集に対して治療用タンパク質を保護することを助け、それは、また、活性な治療用タンパク質または抗体の変性を引き起こすことなく、製剤が剪断表面ストレスに対して暴露されることを許す。非イオン性界面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍｌ〜約１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは、約０．０７ｍｇ／ｍｌ〜約０．２ｍｇ／ｍｌの範囲で存在する。
【０２５６】
適当な非イオン性界面活性剤には、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポロキサマー（１８４、１８８など）、ＰＬＵＲＯＮＩＣ（登録商標）ポリオール、ＴＲＩＴＯＮ（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０、ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化カスター油１０、５０、及び６０、グリセロールモノステアレート、スクロース脂肪性酸エステル、メチルセルロース、及びカルボキシメチルセルロースが含まれる。使用することができる陰イオン性洗剤は、ラウリル硫酸ナトリウム、ジオクチルソジウムスルホサクシネート、及びジオクチルソジウムスルホネートを含む。陽イオン性洗剤は、ベンザルコニウムクロリドまたはベンゼトニウムクロリドを含む。
【０２５７】
医薬組成物をインビボでの投与のために使用するために、それらは無菌でなければならない。医薬組成物を、無菌ろ過膜を通じたろ過により無菌にしてもよい。本明細書における医薬組成物は、一般的に、無菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針により穴を開けることができるストッパーを有する静脈用溶液のバッグまたはバイアル中に置く。
【０２５８】
投与経路は、公知の受け入れられた方法に従って、例えば、適した様式での長期間にわたる単回または複数回のボーラスまたは注入、例えば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、または関節内経路による注射または注入、局所投与、吸入あるいは持続放出または延長放出の手段による。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与、例えば、腫瘍内に投与される。
【０２５９】
徐放性調製物を調製してもよい。徐放性調製物の適当な例としては、アンタゴニストを含む固体疎水性重合体の半透性マトリックスが挙げられ、このマトリックスは、フィルムまたはマイクロカプセルなどの成形品の形態である。徐放性マトリックスの例としては、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール）、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸とエチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、分解性の乳酸−グリコール酸コポリマー、例えば、ＬＵＰＲＯＮ  ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注入可能なミクロスフィア）、及びポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸が挙げられる。
【０２６０】
ここで、医薬組成物は、治療される特定の効能に必要な１つ以上の活性化合物、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を有するものを含有し得る。あるいは、またはさらに、組成物は、細胞毒性剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、または成長阻害剤を含み得る。そのような分子は、好適には、意図した目的に有効な量で組み合わせて存在する。
【０２６１】
また、活性成分は、例えば、コアセルベーション技術または界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセル及びポリ−（メチルメタクリレート）マイクロカプセルに、コロイド状薬物送達系（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロ乳剤、ナノ粒子及びナノカプセル）またはマクロ乳剤に捕捉することができる。そのような技術は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎに開示されている。
【０２６２】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回使用のバイアル、例えば、単回使用の密封バイアル中に含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回使用のバイアル中に含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、容器中に大量に含まれる。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、凍結保存される。
【０２６３】
ＩＶ．ＴＩＧＩＴ関連疾患の治療方法
本明細書に記載されるようにＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ）、または抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ））、及びその組成物（例えば、医薬組成物）は、種々の用途、例えば、診断、分子アッセイ、及び治療において有用である。
【０２６４】
本発明の一態様は、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、それを必要とする個体におけるＴＩＧＩＴ関連疾患もしくは状態の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ関連疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ関連疾患は、病原性感染、例えば、ウイルス感染である。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ関連疾患は、免疫関連疾患である。いくつかの実施形態では、免疫関連疾患は、Ｔ細胞機能不全障害と関連する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞機能不全障害は、Ｔ細胞消耗によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、免疫関連疾患は、未解明な急性感染、慢性感染、及び腫瘍免疫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物は、それを必要とする対象における免疫応答または機能の増加、増強、または刺激に使用され得る。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ関連疾患（例えば、がん、免疫関連疾患）は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１遮断に部分的な耐性を示す（例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体治療に部分的な耐性を示す）。
【０２６５】
本発明は、一部、少なくともいくつかの態様では、薬学的に許容可能な担体または賦形剤と一緒に、単体または別の治療法と任意の組み合わせのいずれかで投与することができる、タンパク質構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ）、または抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ））、核酸分子及び／またはそれをコードするベクター、核酸分子及び／またはそれをコードするベクターを含む宿主細胞を企図している。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ構築物の投与前に、それらは、当該技術分野で周知の適当な医薬担体及び賦形剤と組み合わせてもよい。本開示に従って調製された組成物は、がんの治療またはがんの悪化の遅延、または、それを必要とする対象における免疫応答または機能の増加、増強、または刺激に使用することができる。
【０２６６】
いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ）、または抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ））を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、ＴＩＧＩＴ関連疾患（例えば、がん、免疫関連疾患、例えば、Ｔ細胞機能不全障害と関連するもの）の治療方法であって、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び適宜薬学的に許容可能な担体を含む、ＴＩＧＩＴ関連疾患の治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ関連疾患は、がんである。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍（例えば、大腸がん）である。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ関連疾患は、免疫関連疾患である。いくつかの実施形態では、免疫関連疾患は、Ｔ細胞機能不全障害と関連する。いくつかの実施形態では、Ｔ細胞機能不全障害は、Ｔ細胞消耗によって特徴付けられる。いくつかの実施形態では、免疫関連疾患は、未解明な急性感染、慢性感染、及び腫瘍免疫からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴ関連疾患（例えば、がん、免疫関連疾患）は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１遮断に部分的な耐性を示す（例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体治療に部分的な耐性を示す）。いくつかの実施形態では、方法は、追加の療法（例えば、がん療法、例えば、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせ）を個体に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の療法は、例えば、免疫調節薬を含む第２の医薬組成物の有効量を個体に投与することによる免疫療法である。いくつかの実施形態では、���疫調節薬は、免疫チェックポイント阻害薬、例えば、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与される（例えば、静脈内または腹腔内）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与される（例えば、腫瘍内）。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、がんの治療方法は、以下の生物学的活性：（１）がん細胞の死滅（バイスタンダー死滅を含む）；（２）がん細胞の増殖の阻害；（３）腫瘍における免疫応答の誘導；（４）腫瘍サイズの減少；（５）がんを有する個体における１つ以上の症状の軽減；（６）腫瘍転移の阻害；（７）生存の延長；（８）がんの進行までの時間の延長；及び（９）がんの再発の可能性の防止、阻害、または低減の１つ以上を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがん細胞の死滅方法は、少なくとも約４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの腫瘍細胞死率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがん細胞の死滅方法は、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、またはそれ以上のいずれかの（抗ＴＩＧＩＴ構築物をコードする腫瘍溶解度ＶＶによって非感染な）バイスタンダー腫瘍細胞死率を達成することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される腫瘍サイズの減少方法腫瘍サイズの少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか）を減らすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される腫瘍転移の阻害方法は、転移の少なくとも約１０％（例えば、少なくとも約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のいずれか）を阻害することができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介される個体（例えば、ヒト）の生存の延長方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１８、または２４ヵ月のいずれかまで個体の生存率を延ばすことができる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物によって仲介されるがんの進行までの時間の延長方法は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、または１２週間のいずれかまでがんの進行までの時間を延ばすことができる。いくつかの実施形態では、免疫関連疾患の治療方法は、対象における免疫応答または機能の増加、増強、または刺激することができる。いくつかの実施形態では、免疫応答または機能は、対象におけるエフェクター細胞（例えば、Ｔ細胞、例えば、ＣＤ８＋及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞）を活性化する、エフェクター細胞集団を拡張する（増加させる）、及び／または（例えば、標的腫瘍細胞）を死滅させることによって増加、増強、または刺激することができる。いくつかの実施形態では、個体におけるＣＤ４及び／またはＣＤ８  Ｔ細胞は、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物を含む医薬組成物の投与��と比べて、プライミング、活性化、増殖、サイトカイン放出、及び／または細胞溶解活性を増加または増強している。いくつかの実施形態では、ＣＤ４及び／またはＣＤ８  Ｔ細胞の数は、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物を含む医薬組成物の投与前と比べて上昇している。いくつかの実施形態では、活性化ＣＤ４及び／またはＣＤ８  Ｔ細胞の数は、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物を含む医薬組成物と比べて上昇している。いくつかの実施形態では、活性化ＣＤ４及び／またはＣＤ８  Ｔ細胞は、γ−ＩＦＮ＋産生ＣＤ４及び／またはＣＤ８  Ｔ細胞、及び／または本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物を含む医薬組成物の投与前と比べて増強された細胞溶解活性を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＣＤ４及び／またはＣＤ８  Ｔ細胞は、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、及びインターロイキンからなる群から選択されるサイトカインの放出の増加を呈する。本発明の方法のいくつかの実施形態では、ＣＤ４及び／またはＣＤ８  Ｔ細胞は、エフェクターメモリーＴ細胞である。いくつかの実施形態では、ＣＤ４及び／またはＣＤ８エフェクターメモリーＴ細胞は、γ−ＩＦＮ＋産生ＣＤ４及び／またはＣＤ８  Ｔ細胞、及び／または増強された細胞溶解活性を特徴とする。いくつかの実施形態では、ＣＤ４及び／またはＣＤ８エフェクターメモリーＴ細胞は、ＣＤ４４ｈｉｇｈＣＤ６２Ｌｌｏｗの発現を有することを特徴とする。いくつかの実施形態では、がんは、Ｔ細胞浸潤レベルが上昇している。
【０２６７】
本明細書に記載の方法は、固形がん及び液体がんの両方を含む、種々のがんの治療に適当である。方法は、早期がん、非転移性がん、原発性がん、進行がん、局所進行がん、転移性がん、または寛解のがんを含む、全てのステージのがんに適用可能である。本明細書に記載の方法は、アジュバント設定またはネオアジュバント設定において、第１の療法、第２の療法、第３の療法、または当該技術分野で公知の他の種類のがん治療、例えば、化学療法、外科手術、ホルモン療法、放射線、遺伝子療法、免疫療法（例えば、Ｔ細胞療法、または免疫調節薬の投与）、骨髄移植、幹細胞移植、標的治療、凍結療法、超音波療法、光線力学療法、ラジオ波焼灼療法などとの併用療法として使用され得る（すなわち、方法は、一次／根治治療の前に実施してもよい）。いくつかの実施形態では、方法を用いて、以前に治療されている個体を治療する。いくつかの実施形態では、がんは、前治療に無効であった。いくつかの実施形態では、方法を用いて、以前に治療されていない個体を治療する。いくつかの実施形態では、がんは、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１遮断に部分的な耐性を示す（例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体治療に部分的な耐性を示す）。
【０２６８】
いくつかの実施形態では、方法は、異常なＴＩＧＩＴ発現、活性、及び／またはシグナリングを有するがん（非限定的な例としては、非小細胞肺がん、小細胞肺がん、腎細胞がん、結腸直腸がん、卵巣がん、乳がん、膵臓がん、胃がん、膀胱がん、食道がん、中皮腫、黒色腫、頭頸部がん、甲状腺がん、肉腫、前立腺がん、膠芽腫、子宮頸がん、胸腺がん、白血病、リンパ腫、骨髄腫（例えば、多発性骨髄腫（ＭＭ））、菌状息肉腫、メルケル細胞がん、及び血液悪性腫瘍が挙げられる）の治療に適当である。
【０２６９】
従って、いくつかの実施形態では、ＴＩＧＩＴを特異的に認識するｓｄＡｂ部分を含む単離抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ）、または抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ））を含む医薬組成物の有効量を個体に投与することを含む、免疫療法応答性固形腫瘍（例えば、がん腫または腺がん、例えば、異常なＴＩＧＩＴ発現、活性、及び／またはシグナリングを有するがん）の治療方法であって、ｓｄＡｂ部分は、配列番号３６〜４２、５４、５６〜５９、６３、６５〜６７、６９〜７０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；配列番号１０６〜１１２、１２４、１２６〜１２９、１３３、１３５〜１３７、１３９〜１４０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び配列番号１７６〜１８２、１９４、１９６〜１９９、２０３、２０５〜２０７、２０９〜２１０のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または最大で約３つ（例えば、約１、２、または３のいずれか）のアミノ酸置換を含むその変異体；及び適宜薬学的に許容可能な担体を含む、治療方法を提供する。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分とＴＩＧＩＴの間の結合のＫｄは、約１０−５Ｍ〜約１０−１２Ｍ（例えば、約１０−７Ｍ〜約１０−１２Ｍ、または約１０−８Ｍ〜約１０−１２Ｍ）である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、ラクダ、キメラ、ヒト、部分ヒト化、または完全ヒト化である。いくつかの実施形態では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分は、配列番号２５３〜２５９、２７１、２７３〜２７６、２８０、２８２〜２８４、２８６〜２８７のいずれか１つのアミノ酸配列を含むＶＨＨドメインを含む。いくつかの実施形態では、がんは、固形腫瘍（例えば、大腸がん）である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、全身投与される（例えば、静脈内または腹腔内）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、局所投与される（例えば、腫瘍内）。いくつかの実施形態では、方法は、追加のがん療法（例えば、外科手術、放射線、化学療法、免疫療法、ホルモン療法、またはそれらの組み合わせ）を個体に投与することをさらに含む。いくつかの実施形態では、追加の療法は、例えば、抗ＰＤ−１または抗ＰＤ−Ｌ１抗体などの免疫調節薬を含む第２の医薬組成物の有効量を個体に投与することによる免疫療法である。いくつかの実施形態では、個体は、ヒトである。いくつかの実施形態では、免疫療法応答性固形腫瘍は、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１遮断に部分的な耐性を示す（例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体治療に部分的な耐性を示す）。
【０２７０】
いくつかの実施形態では、方法は、異常なＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２発現、活性、及び／またはシグナリングを有するがん（非限定的な例としては、血液がん及び／または固形腫瘍が挙げられる）の治療に適当である。本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得るいくつかのがんは、一般的に、免疫療法に応答するがんを含む。治療のための他のがんの非限定的な例としては、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞がん腫）、前立腺がん（例えば、ホルモン抵抗性前立腺がん）、乳がん、大腸がん及び肺がん（例えば、非小細胞性肺がん）が挙げられる。さらに、本発明は、本発明の抗体を使用して増殖が阻害され得る難治性または再発性悪性腫瘍を含む。本発明の方法を使用して治療し得る他のがんの例としては、骨がん、膵臓がん、皮膚がん、頭部または頸部のがん、皮膚または眼内の悪性黒色腫、子宮がん、卵巣がん、直腸がん、肛門領域のがん、胃がん、精巣がん、子宮がん、卵管のがん腫、子宮内膜のがん腫、子宮頸のがん腫、腟のがん腫、外陰のがん腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん、甲状腺のがん、副甲状腺のがん、副腎のがん、軟組織の肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、急性骨髄性白血病、慢性骨髄性白血病、急性リンパ芽球性白血病、慢性リンパ性白血病を含む慢性または急性白血病、幼児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓または尿管のがん、腎盂のがん腫、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、腫瘍血管形成、脊椎腫瘍、脳幹神経膠腫、下垂体腺腫、カポジ肉腫、類表皮がん、扁平上皮がん、Ｔ細胞リンパ腫、アスベストにより誘導されるがんを含む環境的に誘導されるがん、及び前記がんの組み合わせが挙げられる。本発明は、転移性がん、特に、ＰＤ−Ｌ１を発現する転移性がんの治療にも有用である（Ｉｗａｉ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１３３−１４４）。いくつかの実施形態では、異常なＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−Ｌ２発現、活性、及び／またはシグナリングを有するがんは、ＰＤ−１またはＰＤ−Ｌ１遮断に部分的な耐性を示す（例えば、抗ＰＤ−１抗体または抗ＰＤ−Ｌ１抗体治療に部分的な耐性を示す）。
【０２７１】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、大腸がん、例えば、腺がん、消化管カルチノイド腫瘍、消化管間質腫瘍、平滑筋肉腫、黒色腫、または扁平上皮細胞がん腫の治療に適当である。
【０２７２】
本出願の医薬組成物の投与量及び所望の薬物濃度は、想定される特定用途に応じて変わり得る。適切な投与量または投与経路の決定は、当業者の能力の十分に範囲内である。動物実験は、ヒトの治療に対する有効量の決定において、信頼性のあるガイダンスを提供する。有効量の外挿は、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．「Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」，Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−４６に著される原則に従って実施することができる。
【０２７３】
本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ部分を含む抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ）、または抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ））のインビボでの投与を使用する場合、通常の投与量は、投与経路に依存して、１日当たり約１０ｎｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ（哺乳動物の体重）またはそれ以上、好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ／日〜１０ｍｇ／ｋｇ／日、例えば、約１〜３ｍｇ／ｋｇ／日、約２〜４ｍｇ／ｋｇ／日、約３〜５ｍｇ／ｋｇ／日、約４〜６ｍｇ／ｋｇ／日、約５〜７ｍｇ／ｋｇ／日、約６〜８ｍｇ／ｋｇ／日、約６〜６．５ｍｇ／ｋｇ／日、約６．５〜７ｍｇ／ｋｇ／日、約７〜９ｍｇ／ｋｇ／日、または約８〜１０ｍｇ／ｋｇ／日まで変動し得る。異なる製剤が異なる治療及び異なる疾患に有効であり、特定の器官または組織の治療に意図された投与が、別の器官または組織とは異なる方法での送達を必要とし得ることは、本出願の範囲内である。さらに、投与量を、１回または複数回の別々の投与によって、または持続的注入によって投与してもよい。数日以上にわたる繰り返し投与において、その状態に応じて、疾患症状の所望される抑制が生じるまで、治療を継続する。しかしながら、他の投与計画が有用であってよい。治療の進行は、従来技術及びアッセイによって容易にモニタリングされる。
【０２７４】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、単回で投与される（例えば、ボーラス注射）。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数回で投与される（例えば、２回、３回、４回、５回、６回、またはそれ以上の回数のいずれか）。複数回投与する場合、同じまたは異なる経路で行ってもよく、同じ部位または代替部位で行ってもよい。医薬組成物は、週２回、週３回、週４回、週５回、毎日、休み無く毎日、週１回、休み無く毎週、２週間に１回、３週間に１回、１ヵ月に１回、２ヵ月に１回、３ヵ月に１回、４ヵ月に１回、５ヵ月に１回、６ヵ月に１回、７ヵ月に１回、８ヵ月に１回、９ヵ月に１回、１０ヵ月に１回、１１ヵ月に１回、または１年に１回投与してもよい。投与間隔は、約２４時間〜４８時間、２日〜３日、３日〜５日、５日〜１週間、１週間〜２週間、２週間〜１ヵ月、１ヵ月〜２ヵ月、２ヵ月〜３ヵ月、３ヵ月〜６ヵ月、または６ヵ月〜１年のいずれか１つであってもよい。間隔は、不規則であってもよい（例えば、腫瘍進行後）。いくつかの実施形態では、投与スケジュール中に休みはない。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、４日ごとに４回投与される。特定の患者に対する最適な投与量及び治療計画は、疾患の兆候について患者をモニタリングし、それに応じて治療を調整することによって、医療分野における当業者によって容易に決定できる。
【０２７５】
再溶解製剤または液体製剤などが挙げられるが、これらに限定されない本出願の医薬組成物は、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ）、または抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ））による治療を必要とする個体、好ましくはヒトに、既知の方法、例えば、単回または一定時間にわたる持続的注入による静脈内投与、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、静脈内（ｉ．Ｖ．）、関節内、滑液内、髄腔内、経口、局所、または吸入経路によって投与される。再溶解製剤は、本明細書に記載の凍結乾燥した抗ＴＩＧＩＴ構築物を、タンパク質が全体に分散されるように希釈剤中に溶解させることによって調製することができる。本出願での使用に適当な例示的な薬学的に許容可能な（ヒトへの投与について安全かつ非毒性な）希釈剤としては、滅菌水、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、ｐＨ緩衝溶液（例えば、リン酸緩衝食塩水）、無菌生理食塩液、リンゲル液、またはデキストロース溶液、または塩及び／または緩衝剤の水溶液が挙げられるが、これらに限定されない。
【０２７６】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、皮下（すなわち、皮膚の下）投与により個体に投与される。そのような目的のために、医薬組成物は、シリンジを使用して注射してもよい。しかしながら、医薬組成物の投与のための他のデバイス、例えば、注射デバイス；インジェクターペン；オートインジェクターデバイス、無針デバイス；及び皮下パッチ送達システムが利用可能である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、個体の静脈内に投与される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、点滴静注などの注入によって個体に投与される。
【０２７７】
Ｖ．調製方法
本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ）、または抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体（例えば、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ））は、当該技術分野で公知の任意の方法を用いて、または本明細書に記載されるように調製され得る。実施例１、２、４及び６も参照されたい。いくつかの実施形態では、（ａ）コードされた抗ＴＩＧＩＴ構築物の発現に効果的な条件下で本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物をコードする単離核酸またはベクターを含むの宿主細胞を培養すること；及び（ｂ）発現された抗ＴＩＧＩＴ構築物を前記宿主細胞から得ることを含む、抗ＴＩＧＩＴ構築物の産生方法を提供する。いくつかの実施形態では、方法は、（ａ）本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物をコードする単離核酸またはベクターを含む宿主細胞を産生する工程をさらに含む。
【０２７８】
ｓｄＡｂの調製方法は記載されている。例えば、Ｅｌｓ  Ｐａｒｄｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ，２０１４；９（３）：６７４を参照されたい。ｓｄＡｂ（例えば、ＶＨＨ）は、当該技術分野で公知の方法、例えば、ラクダ科の種（例えば、ラクダまたはラマ）を免疫化して、それからハイブリドーマを得ることによって、または当該技術分野で公知の分子生物学技術を用いて単一ドメイン抗体のライブラリーをクローニングして、未選択ライブラリーの個別クローンによるＥＬＩＳＡによるその後の選択によって、またはファージディスプレイを用いることによって得られ得る。
【０２７９】
ｓｄＡｂの組み換え産生の場合、単一ドメイン抗体をコードする核酸を単離し、複製可能なベクターに挿入し、さらにクローニング（ＤＮＡの増幅）または発現させる。単一ドメイン抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて（例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを用いて）容易に単離され、配列決定される。多くのベクターが入手可能である。ベクターの選択は、使用される宿主細胞に部分的に依存する。一般的に、好ましい宿主細胞は、原核生物または真核生物（一般的に、哺乳動物）起源のいずれかのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物をコードする単離核酸は、配列番号２４６〜２５２のいずれか１つの核酸配列を含む。
【０２８０】
１．原核細胞における組み換え産生
ａ）ベクター構築
本出願の抗体をコードするポリ核酸配列は、標準的な組み換え技術を使用して得ることができる。所望のポリ核酸配列は、抗体産生細胞、例えば、ハイブリドーマ細胞から単離し、配列決定してもよい。あるいは、ポリヌクレオチドをヌクレオチドシンセサイザーまたはＰＣＲ技術を使用して合成することができる。一旦得られると、ポリペプチドをコードする配列を、原核生物宿主において異種ポリヌクレオチドを複製及び発現することができる組み換えベクター中に挿入する。当該技術分野において利用可能で公知の多くのベクターを、本発明の目的のために使用することができる。適切なベクターの選択は、ベクター中に挿入される核酸のサイズ及びそのベクターを用いて形質転換される特定の宿主細胞に主に依存するであろう。各ベクターは、その機能（異種ポリヌクレオチドの増幅または発現、あるいは両方）及びそれが存在する特定の宿主細胞とのその適合性に依存して、種々の成分を含む。ベクター成分は、一般的に、限定はされないが、以下：複製起点、選択マーカー遺伝子、プロモーター、リボゾーム結合部位（ＲＢＳ）、シグナル配列、異種核酸インサート、及び転写終結配列を含む。
【０２８１】
一般的に、宿主細胞と適合する種に由来するレプリコン配列及び制御配列を含むプラスミドベクターを、これらの宿主に関連して使用する。ベクターは、通常、複製部位、ならびに形質転換細胞において表現型選択を提供することができる標識配列を持つ。
【０２８２】
また、宿主微生物と適合するレプリコン配列及び制御配列を含むファージベクターを、これらの宿主に関連して形質転換ベクターとして使用することができる。例えば、バクテリオファージ（例えば、ＧＥＭ（商標）−１１など）を、感受性宿主細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ＬＥ３９２など）を形質転換するために使用することができる組み換えベクターを作製する際に利用してもよい。
【０２８３】
本出願の発現ベクターは、ポリペプチド成分の各々をコードする２つ以上のプロモーター−シストロン対を含み得る。プロモーターは、その発現を調節するシストロンの上流（５’）に位置付けられる非翻訳調節配列である。原核生物プロモーターは、典型的には、２つのクラス（誘導的及び恒常的）に分類される。誘導的プロモーターは、培養条件における変化（例えば、栄養分の存在もしくは非存在または温度における変化）に応答したその制御下での増加レベルのシストロンの転写を開始するプロモーターである。
【０２８４】
種々の潜在的な宿主細胞により認識される多数のプロモーターが、周知である。選択されたプロモーターを、制限酵素消化を介した供給源ＤＮＡからプロモーターを除去し、単離したプロモーター配列を本発明のベクター中に挿入することにより、軽鎖または重鎖をコードするシストロンＤＮＡに機能的に連結することができる。天然プロモーター配列及び多くの異種プロモーターの両方を使用し、標的遺伝子の増幅及び／または発現に向けてもよい。いくつかの実施形態では、異種プロモーターを利用する。なぜなら、それらは、一般的に、天然標的ポリペプチドプロモーターと比較して、発現された標的遺伝子のより大きな転写及びより高い産出を許すからである。
【０２８５】
原核生物宿主との使用のために適したプロモーターは、ＰｈｏＡプロモーター、ガラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、及びハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃまたはｔｒｃプロモーターなど）を含む。しかしながら、細菌において機能的である他のプロモーター（例えば、他の公知の細菌またはファージのプロモーターなど）も適している。それらのヌクレオチド配列が発表されており、それにより当業者が、それらを、標的軽鎖及び重鎖をコードするシストロン（Ｓｉｅｂｅｎｌｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．（１９８０）Ｃｅｌｌ  ２０：２６９）に、任意の要求される制限部位を供給するためのリンカーまたはアダプターを使用して機能的に連結することが可能になる。
【０２８６】
一態様では、組み換えベクター内の各シストロンは、発現されたポリペプチドの膜を横断する直接的な転位に向ける分泌シグナル配列成分を含む。一般的に、シグナル配列は、ベクターの成分であり得る、または、それは、ベクター中に挿入される標的ポリペプチドＤＮＡの一部であり得る。本発明の目的のために選択されるシグナル配列は、宿主細胞により認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものでなければならない。異種ポリペプチドに対して天然であるシグナル配列を認識し、処理しない原核生物宿主細胞について、シグナル配列が、例えば、アルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、Ｉｐｐ、または熱安定エンテロトキシンＩＩ（ＳＴＩＩ）リーダー、ＬａｍＢ、ＰｈｏＥ、ＰｅｌＢ、ＯｍｐＡ、及びＭＢＰからなる群より選択される原核生物シグナル配列により置換される。本出願のいくつかの実施形態では、発現系の両シストロンにおいて使用されるシグナル配列は、ＳＴＩＩシグナル配列またはその変異体である。
【０２８７】
いくつかの実施形態では、本出願による抗ＴＩＧＩＴ構築物の産生は、宿主細胞の細胞質中で起こり得るが、従って、各シストロン内に分泌シグナル配列の存在は要求されない。いくつかの実施形態では、ポリペプチド成分、例えば、第１の抗原結合部分に適宜融合した第２の抗原結合部分のＶＨドメインをコードするポリペプチド、及び第１の抗原結合部分に適宜融合した第２の抗原結合部分のＶＬドメインをコードするポリペプチドは、発現され、折り畳まれ、組み立てられて、細胞質内に機能的な抗体が形成される。ある特定の宿主株（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ｔｒｘＢ−株）は、ジスルフィド結合形成に好ましい細胞質状態を提供し、それにより発現されたタンパク質サブユニットの適切な折り畳み及び組み立てを許す。Ｐｒｏｂａ  ａｎｄ  Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  Ｇｅｎｅ，１５９：２０３（１９９５）。
【０２８８】
本発明は、発現されるポリペプチド成分の定量的比率を、分泌されて適切に組み立てられる本出願の抗体の産出を最大限にするために調節することができる発現系を提供する。そのような調節は、少なくとも部分的に、ポリペプチド成分についての翻訳強度を同時に調節することにより達成される。翻訳強度を調節するための１つの技術が、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４０，５２３号に開示される。それは、シストロン内の翻訳開始領域（ＴＩＲ）の変異体を利用する。所与のＴＩＲについて、一連のアミノ酸または核酸配列変異体を、翻訳強度の範囲を用いて作製することができ、それにより特定の鎖の所望の発現レベルについてこの因子を調整するための便利な手段を提供する。ＴＩＲ変異体を、アミノ酸配列を変化させることができるコドン変化をもたらす従来の突然変異誘発技術により生成することができるが、核酸配列におけるサイレントな変化が好ましい。ＴＩＲにおける変化は、例えば、Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ配列の数または間隔における変化を、シグナル配列における変化と共に含むことができる。突然変異シグナル配列を生成するための１つの方法は、シグナル配列のアミノ酸配列を変化させない（すなわち、変化がサイレントである）コード配列の開始での「コドンバンク」の生成である。これは、各コドンの３番目のヌクレオチド位置を変化させることにより達成することができる；加えて、いくつかのアミノ酸、例えば、ロイシン、セリン、及びアルギニンなどは、バンクを作製する際に複雑度を加えることができる複数の１番目及び２番目の位置を有する。
【０２８９】
好ましくは、ベクターの組は、その中の各シストロンについてのＴＩＲ強度の範囲を用いて生成する。この限定された組は、各鎖の発現レベルの比較ならびに種々のＴＩＲ強度の組み合わせ下の所望のタンパク質産物の産出を提供する。ＴＩＲ強度を、Ｓｉｍｍｏｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，米国特許第５，８４０，５２３号に詳細に記載されるレポーター遺伝子の発現レベルを定量化することにより決定することができる。翻訳強度比較に基づき、所望の個々のＴＩＲを選択し、本出願の発現ベクター構築物において組み合わせる。
【０２９０】
ｂ）原核生物宿主細胞
本出願の抗体を発現させるために適した原核生物宿主細胞は、古細菌と真正細菌、例えば、グラム陰性またはグラム陽性生物などを含む。有用な細菌の例としては、エシェリキア属（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ）、バシラス属（例えば、Ｂ．ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、腸内細菌、シュードモナス属（例えば、Ｐ．ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、サルモネラ・チフィリウム、セラチア・マルセッセンス、クレブシエラ属、プロテウス属、シゲラ属、根粒菌、ビトレオシラ属、またはパラコッカス属が挙げられる。いくつかの実施形態では、グラム陰性細胞を使用する。いくつかの実施形態では、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を本発明のための宿主として使用する。Ｅ．ｃｏｌｉ株の例としては、Ｗ３１１０株ＡｆｈｕＡ  （ＡｔｏｎＡ）ｐｔｒ３  ｌａｃ  Ｉｑ  ｌａｃＬ８  ＡｏｍｐＴ  Ａ（ｎｍｐｃ−ｆｅｐＥ）ｄｅｇＰ４１  ｋａｎＲ（米国特許第５，６３９，６３５号）を有する３３Ｄ３株を含む。他の株及びその誘導体、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ  ２９４（ＡＴＣＣ３１，４４６）、Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ  １７７６（ＡＴＣＣ３１，５３７）及びＥ．ｃｏｌｉ  ＲＶ３０８（ＡＴＣＣ３１，６０８）なども適する。これらの例は、限定的よりも、むしろ説明的である。一般的に、細菌の細胞におけるレプリコンの複製能を考慮に入れて適切な細菌を選択することが必要である。例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ、セラチア属、またはサルモネラ属が、周知のプラスミド（例えば、ｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１７７、またはｐＫＮ４１０など）を、レプリコンを供給するために使用する場合、宿主として使用するのに適し得る。
【０２９１】
典型的には、宿主細胞は、最小量のタンパク質分解酵素を分泌すべきであり、追加のプロテアーゼ阻害剤が望ましくは細胞培養に取り込まれ得る。
【０２９２】
ｃ）タンパク質産生
宿主細胞を上記の発現ベクターを用いて形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養する。形質転換は、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、ＤＮＡが、染色体外エレメントとしてまたは染色体組み込み体のいずれかとして複製可能であることを意味する。使用する宿主細胞に依存して、形質転換は、そのような細胞に適切である標準的な技術を使用して行う。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含む細菌細胞のために一般的に使用される。形質転換のための別の方法では、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術は、エレクトロポレーションである。
【０２９３】
宿主細胞を上記の発現ベクターを用いて形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養する。形質転換は、ＤＮＡを原核生物宿主中に導入し、ＤＮＡが、染色体外エレメントとしてまたは染色体組み込み体のいずれかとして複製可能であることを意味する。使用する宿主細胞に依存して、形質転換は、そのような細胞に適切である標準的な技術を使用して行う。塩化カルシウムを用いたカルシウム処理は、実質的な細胞壁バリアを含む細菌細胞のために一般的に使用される。形質転換のための別の方法では、ポリエチレングリコール／ＤＭＳＯを用いる。使用されるさらに別の技術は、エレクトロポレーションである。
【０２９４】
本出願の抗体を産生するために使用される原核細胞は、当該技術分野において公知の、選択された宿主細胞の培養に適した培地中で増殖される。適した培地の例としては、Ｌｕｒｉａ培地（ＬＢ）＋必要な栄養分補給が挙げられる。いくつかの実施形態では、培地はまた、発現ベクターの構築に基づき選択された選択剤を含み、発現ベクターを含む原核細胞の増殖を選択的に許す。例えば、アンピシリンを、アンピシリン耐性遺伝子を発現する細胞の増殖用の培地に加える。
【０２９５】
任意の必要な補給剤（炭素、窒素、及び無機リン酸供給源の他）も、単独でまたは別の補給剤を伴う混合物もしくは培地（例えば、複雑な窒素供給源など）として導入された適切な濃度で含んでもよい。場合により、培養液は、グルタチオン、システイン、シスタミン、チオグリコレート、ジチオエリスリトール、及びジチオスレイトールからなる群より選択される１つ以上の還元剤を含んでもよい。原核生物宿主細胞を適した温度で培養する。Ｅ．ｃｏｌｉ増殖について、例えば、好ましい温度は、約２０℃〜約３９℃、より好ましくは２５℃〜約３７℃の範囲、さらにより好ましくは３０℃である。培地のｐＨは、主に宿主生物に依存して、約５〜約９の範囲の任意のｐＨであり得る。Ｅ．ｃｏｌｉについて、ｐＨは、好ましくは約６．８〜約７．４、より好ましくは約７．０である。
【０２９６】
誘導性プロモーターを本出願の発現ベクター中で使用する場合、タンパク質発現を、プロモーターの活性化のために適した条件下で誘導する。本出願の一態様では、ＰｈｏＡプロモーターをポリペプチドの転写を制御するために使用する。したがって、形質転換された宿主細胞を、誘導用のリン酸制限培地中で培養する。好ましくは、リン酸制限培地は、Ｃ．Ｒ．Ａ．Ｐ培地である。種々の他の誘導因子を、用いられるベクター構築物に応じて、当該技術分野において公知の通りに使用してもよい。
【０２９７】
本出願の発現された抗ＴＩＧＩＴ構築物は、宿主細胞のペリプラズム中に分泌され、そこから回収される。タンパク質の回収は、典型的には、微生物の破壊（一般的に、浸透圧ショック、超音波処理、または溶解などの手段による）を含む。一旦、細胞が破壊されると、細胞片または全細胞を遠心分離またはろ過により除去してもよい。タンパク質を、さらに、例えば、親和性樹脂クロマトグラフィーにより精製してもよい。あるいは、タンパク質を培養液中に輸送し、その中で単離することができる。細胞を培養物から除去してもよく、培養上清を、産生されたタンパク質のさらなる精製のためにろ過及び濃縮する。発現されたポリペプチドを、さらに、一般的に公知の方法（例えば、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）及びウエスタンブロットアッセイなど）を使用して単離及び同定することができる。
【０２９８】
あるいは、タンパク質産生は、発酵プロセスにより大量に行われる。種々の大規模流加発酵手順を、組み換えタンパク質の産生のために利用可能である。大規模発酵は、少なくとも１０００リットルの能力、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの能力を有する。これらの発酵槽ではアジテーターインペラを使用し、酸素及び栄養分、特にグルコース（好ましい炭素／エネルギー供給源）を分布させる。小規模発酵は、一般的に、わずか約１００リットルの容積である、約１リットル〜約１００リットルの範囲であり得る発酵槽中での発酵を指す。
【０２９９】
発酵プロセスの間に、タンパク質発現の誘導は、典型的には、細胞が適した条件下で所望の密度（例えば、ＯＤ５５０が約１８０〜２２０）まで増殖させた後に開始され、その段階で細胞は初期の静止期にある。種々の誘導因子を、用いられるベクター構築物に応じて、当該技術分野において公知であり、上に記載する通りに使用してもよい。細胞を、誘導前に短い期間にわたり増殖させてもよい。細胞を、通常、約１２〜５０時間にわたり誘導するが、より長いまたはより短い誘導時間を使用してもよい。
【０３００】
本出願の抗体の産出及び質を改善するために、種々の発酵プロセスを改変することができる。例えば、分泌されたポリペプチドの適切な組み立て及び折り畳みを改善するために、シャペロンタンパク質、例えば、Ｄｓｂタンパク質（ＤｓｂＡ、ＤｓｂＢ、ＤｓｂＣ、ＤｓｂＤ、及び／またはＤｓｂＧ）またはＦｋｐＡ（シャペロン活性を伴うペプチジルプロリルシス、トランスイソメラーゼ）などを過剰発現する追加のベクターを使用して、宿主原核細胞を同時形質転換することができる。シャペロンタンパク質は、細菌宿主細胞において産生される異種タンパク質の適切な折り畳み及び溶解度を促進することが実証されている。
【０３０１】
発現された異種タンパク質（特に、タンパク分解に感受性であるもの）のタンパク質分解を最小限にするために、タンパク質分解酵素が欠損したある特定の宿主株を本発明のために使用することができる。例えば、宿主細胞株を改変し、公知の細菌プロテアーゼ（例えば、プロテアーゼＩＩＩ、ＯｍｐＴ、ＤｅｇＰ、Ｔｓｐ、プロテアーゼＩ、プロテアーゼＭｉ、プロテアーゼＶ、プロテアーゼＶＩ、及びその組み合わせなど）をコードする遺伝子における遺伝的突然変異（複数可）に効果を及ぼしてもよい。
【０３０２】
タンパク質分解酵素が欠損し、１つ以上のシャペロンタンパク質を過剰発現するプラスミドを用いて形質転換されたＥ．ｃｏｌｉ株を、本出願の抗体をコードする発現系において宿主細胞として使用してもよい。
【０３０３】
ｄ）タンパク質精製
本明細書において産生される抗ＴＩＧＩＴ構築物をさらに精製し、さらなるアッセイ及び使用のための実質的に均質である調製物を得る。当該技術分野において公知の標準的なタンパク質精製方法を用いることができる。以下の手順：免疫親和性カラムまたはイオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上または陽イオン交換樹脂（例えば、ＤＥＡＥなど）上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、硫安塩析、及びゲルろ過（例えば、Ｓｅｐｈａｄｅｘ  Ｇ−７５を使用）は、適した精製手順の例示である。
【０３０４】
いくつかの実施形態では、固相に固定化されるプロテインＡは、本出願のＦｃ領域を含む抗体の免疫親和性精製のために使用される。プロテインＡは、黄色ブドウ球菌からの４１１Ｄ細胞壁タンパク質であり、高親和性を伴い抗体のＦｃ領域に結合する。Ｌｉｎｄｍａｒｋ  ｅｔ  ａｌ（１９８３）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈ．６２：１−１３。プロテインＡが固定化される固相は、好ましくは、ガラスまたはシリカ表面を含むカラム、より好ましくは制御された細孔ガラスカラムまたはケイ酸カラムである。一部の適用において、カラムを、混入物の非特異的付着を予防するために、試薬（例えば、グリセロールなど）を用いて被覆している。固相を次に洗浄し、固相に非特異的に結合した混入物を除去する。最後に、目的の抗体を、溶出により固相から回収する。
【０３０５】
２．真核細胞における組み換え産生
真核生物での発現のために、ベクター成分は、一般的に、限定はされないが、以下：シグナル配列、複製起点、１つ以上のマーカー遺伝子、ならびにエンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列の１つ以上を含む。
【０３０６】
ａ）シグナル配列成分
真核生物宿主における使用のためのベクターはまた、成熟タンパク質またはポリペプチドのＮ末端に特定の切断部位を有するシグナル配列または他のポリペプチドをコードするインサートを含んでもよい。選択される異種シグナル配列は、宿主細胞により認識され、処理される（すなわち、シグナルペプチダーゼにより切断される）ものである。哺乳動物細胞での発現において、哺乳動物シグナル配列ならびにウイルス分泌リーダー、例えば、単純ヘルペスｇＤシグナルを利用可能である。
【０３０７】
そのような前駆体領域のためのＤＮＡを、リーディングフレーム中で、本出願の抗体をコードするＤＮＡに連結する。
【０３０８】
ｂ）複製起点
一般的に、複製起点成分は、哺乳動物発現ベクターのために必要とされない（ＳＶ４０起点を典型的に使用してもよい。なぜなら、ただ、それは初期プロモーターを含むからである）。
【０３０９】
ｃ）選択遺伝子成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、選択遺伝子（選択可能マーカーとも呼ばれる）を含んでもよい。典型的な選択遺伝子は、（ａ）抗生物質または他の毒素（例えば、アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサート、またはテトラサイクリン）に対して耐性を付与する、（ｂ）栄養要求性欠損を補完する、または（ｃ）複雑な培地から利用可能ではない決定的な栄養分を供給するタンパク質をコードする（例えば、バシラス属についてのＤアラニンラセマーゼをコードする遺伝子）。
【０３１０】
選択計画の１例では、宿主細胞の増殖を停止させるための薬物を利用する。異種遺伝子を用いて成功裏に形質転換されるそれらの細胞は、薬物耐性を付与するタンパク質を産生し、このように選択計画中に生存する。そのような優性選択の例では、薬物（ネオマイシン、ミコフェノール酸、及びハイグロマイシン）を使用する。
【０３１１】
哺乳動物細胞のための適した選択マーカーの別の例は、本出願の抗体をコードする核酸を取り込む能力がある細胞の同定を可能にするものである（例えば、ＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、好ましくは霊長類のメタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼなど）。
【０３１２】
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子を用いて形質転換された細胞は、最初に、メトトレキサート（Ｍｔｘ）（ＤＨＦＲの競合的アンタゴニスト）を含む培養液中で形質転換体の全てを培養することにより同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合での適切な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性が欠損したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞株（例えば、ＡＴＣＣＣＲＬ−９０９６）である。
【０３１３】
あるいは、ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及び別の選択マーカー、例えば、アミノグリコシド３’ホスホトランスフェラーゼ（ＡＰＨ）などを用いて形質転換または同時形質転換された宿主細胞（特に、内因性ＤＨＦＲを含む野生型宿主）を、選択マーカー用の選択薬剤（例えば、アミノグリコシド抗生物質、例えば、カナマイシン、ネオマイシン、またはＧ４１８など）を含む培地中での細胞増殖により選択することができる。
【０３１４】
ｄ）プロモーター成分
発現ベクター及びクローニングベクターは、通常、宿主生物により認識され、所望のポリペプチド配列をコードする核酸に機能的に連結されたプロモーターを含む。事実上、全ての真核生物遺伝子が、転写が開始される部位から約２５〜３０塩基上流に位置付けられるＡＴリッチ領域を有する。多くの遺伝子の転写の開始から７０〜８０塩基上流に見出される別の配列は、ＣＮＣＡＡＴ領域であり、そこでＮは任意のヌクレオチドであり得る。大半の真核生物の３’末端は、ＡＡＴＡＡＡ配列であり、それはコード配列の３’末端へのポリＡテールの付加のためのシグナルであり得る。これらの配列の全てを、真核生物発現ベクター中に挿入してもよい。
【０３１５】
原核生物宿主との使用のために適した他のプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、ラクタマーゼ及びラクトースプロモーターシステム、アルカリホスファターゼプロモーター、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、及びハイブリッドプロモーター（例えば、ｔａｃプロモーターなど）を含む。しかしながら、他の公知の細菌プロモーターが適する。細菌システムにおける使用のためのプロモーターはまた、抗体をコードするＤＮＡに機能的に連結されたＳｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ（Ｓ．Ｄ．）配列を含み得る。
【０３１６】
哺乳動物宿主細胞におけるベクターからの抗体ポリペプチド転写は、例えば、以下のウイルスのゲノムから得られるプロモーターにより制御される：例えば、ポリオーマウイルス、鶏痘ウイルス、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス２など）、ウシパピローマウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及び最も好ましくははサルウイルス４０（ＳＶ４０）、異種哺乳動物プロモーターから、例えば、アクチンプロモーターまたは免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーター（そのようなプロモーターが宿主細胞系に適合するという条件で）。
【０３１７】
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルス複製起点も含むＳＶ４０制限断片として便利に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄＩＩＩ  Ｅ制限断片として便利に得られる。ウシパピローマウイルスをベクターとして使用して哺乳動物宿主においてＤＮＡを発現させるためのシステムが、米国特許第４，４１９，４４６号に開示されている。このシステムの改変が、米国特許第４，６０１，９７８号に記載されている。また、マウス細胞における単純ヘルペスウイルスからのチミジンキナーゼプロモーターの制御下でのヒトインターフェロンｃＤＮＡの発現に関するＲｅｙｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ２９７：５９８−６０１（１９８２）を参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス末端反復配列をプロモーターとして使用することができる。
【０３１８】
ｅ）エンハンサーエレメント成分
より高い真核生物による本出願の抗体をコードするＤＮＡの転写は、しばしば、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することにより増加される。多くのエンハンサー配列が、現在、哺乳動物遺伝子から公知である（グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α−フェトプロテイン、及びインスリン）。典型的には、しかしながら、真核細胞ウイルスからのエンハンサーが使用され得る。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー（１００〜２７０ｂｐ）、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー、及びアデノウイルスエンハンサーが挙げられる。エンハンサーは、抗体コード配列に対する位置５’または３’でベクター中にスプライシングされ得るが、しかし、好ましくはプロモーターから部位５’に位置付けられる。
【０３１９】
ｆ）転写終結成分
真核生物宿主細胞（酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、または他の多細胞生物からの有核細胞）において使用される発現ベクターは、転写の終結のために及びｍＲＮＡを安定化させるために必要な配列も含み得る。そのような配列は、一般的に、真核生物またはウイルスのＤＮＡまたはｃＤＮＡの５’及び、時には３’の非翻訳領域から利用可能である。これらの領域は、ポリペプチドをコードするｍＲＮＡの非翻訳部分におけるポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。１つの有用な転写終結成分は、ウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。ＷＯ９４／１１０２６及びその中で開示される発現ベクターを参照されたい。
【０３２０】
ｇ）宿主細胞の選択及び形質転換
本明細書におけるベクター中でＤＮＡをクローン化または発現するための適した宿主細胞は、本明細書に記載のより高い真核細胞（脊椎動物宿主細胞を含む）を含む。培養（組織培養）における脊椎動物細胞の増殖は、通常の手順になっている。有用な哺乳動物宿主細胞株の例は、以下：ＳＶ４０により形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株（ＣＯＳ−７，ＡＴＣＣＣＲＬ  １６５１）；ヒト胚腎臓株（２９３細胞または浮遊培養中での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．３６：５９（１９７７））；仔ハムスター腎細胞（ＢＨＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ  １０）；チャイニーズハムスター卵巣細胞／−ＤＨＦＲ（ＣＨＯ，Ｕｒｌａｕｂ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ７７：４２１６（１９８０））；マウスセルトリ細胞（ＴＭ４，Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ．２３：２４３−２５１（１９８０））；サル腎臓細胞（ＣＶ１  ＡＴＣＣＣＣＬ  ７０）；アフリカミドリザル腎臓細胞（ＶＥＲＯ−７６，ＡＴＣＣＣＲＬ−１５８７）；ヒト子宮頚癌細胞（ＨＥＬＡ，ＡＴＣＣＣＣＬ  ２）；イヌ腎臓細胞（ＭＤＣＫ，ＡＴＣＣＣＣＬ  ３４）；バッファローラット肝細胞（ＢＲＬ  ３Ａ，ＡＴＣＣＣＲＬ  １４４２）；ヒト肺細胞（Ｗ１３８，ＡＴＣＣＣＣＬ  ７５）；ヒト肝細胞（Ｈｅｐ  Ｇ２，ＨＢ  ８０６５）；マウス乳癌（ＭＭＴ  ０６０５６２，ＡＴＣＣＣＣＬ５１）；ＴＲＩ細胞（Ｍａｔｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎａｌｓ  Ｎ．Ｙ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．３８３：４４−６８（１９８２））；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；及びヒト肝細胞癌株（Ｈｅｐ  Ｇ２）である。
【０３２１】
宿主細胞を、抗体産生のための上記の発現またはクローニングベクターを用いて形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、または所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適宜改変された従来の栄養培地中で培養する。
【０３２２】
ｈ）宿主細胞の培養
本出願の抗体を産生するために使用される宿主細胞を、種々の培地中で培養してもよい。商業的に利用可能な培地、例えば、Ｈａｍ’ｓ  Ｆ１０（Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（（ＭＥＭ）、（Ｓｉｇｍａ）、ＲＰＭＩ−１６４０（Ｓｉｇｍａ）、及びダルベッコ改変イーグル培地（（ＤＭＥＭ）、Ｓｉｇｍａ）などが、宿主細胞を培養するために適する。これらの培地に、必要に応じて、以下を補給してもよい：ホルモン及び／または他の増殖因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、または上皮増殖因子など）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、及びリン酸など）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳなど）、ヌクレオチド（例えば、アデノシン及びチミジンなど）、抗生物質（例えば、ＧＥＮＴＡＭＹＣＩＮ（商標）薬物など）、微量元素（通常マイクロモル範囲の最終濃度で存在する無機化合物と定義される）、及びグルコースまたは等価のエネルギー供給源。任意の他の必要な補給剤も、当業者に公知であり得る適切な濃度で含めてもよい。培養条件、例えば、温度、ｐＨなどは、発現のために選択された宿主細胞と共に以前に使用されたものであり、当業者に明らかであろう。
【０３２３】
ｉ）タンパク質精製
組み換え技術を使用する場合、抗体は、細胞内に、ペリプラズム間隙中に産生され得る、または培地中に直接的に分泌され得る。抗体が細胞内に産生される場合、最初の工程として、微粒子細片、宿主細胞または溶解断片のいずれかを、例えば、遠心分離または限外ろ過により除去する。Ｃａｒｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：１６３−１６７（１９９２）には、Ｅ．ｃｏｌｉのペリプラズム間隙に分泌される抗体を単離するための手順が記載される。簡単に説明すると、細胞ペーストを、酢酸ナトリウム（ｐＨ３．５）、ＥＤＴＡ、及びフェニルメチルスルホニルフルオリド（ＰＭＳＦ）の存在において約３０分にわたり溶解させる。細胞片を遠心分離により除去することができる。抗体が培地中に分泌される場合、そのような発現系からの上清を、一般的に、商業的に利用可能なタンパク質濃縮フィルター、例えば、ＡｍｉｃｏｎまたはＭｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｐｅｌｌｉｃｏｎ限外ろ過ユニットを使用して最初に濃縮する。プロテアーゼ阻害剤、例えば、ＰＭＳＦなどを、先の工程のいずれかに含め、タンパク質分解を阻害してもよく、抗生物質を含め、外来性混入菌の増殖を予防してもよい。
【０３２４】
細胞から調製された抗体組成物を、例えば、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、及び親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができ、アフィニティークロマトグラフィーが好ましい精製技術である。親和性リガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する任意の免疫グロブリンＦｃドメインの種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡを使用し、１、２、または４の重鎖を含むヒト免疫グロブリンに基づく抗体を精製することができる。プロテインＧが全てのマウスアイソタイプについて及びヒト３について推奨される。親和性リガンドが付着するマトリクスは、最もしばしばアガロースであるが、しかしながら、他のマトリクスも利用可能である。機械的に安定なマトリクス、例えば、制御された細孔ガラスまたはポリ（スチレン−ジビニル）ベンゼンによって、アガロースを用いて達成することができるよりも速い流速及び短い処理時間が可能になる。抗体がＣＨ３ドメインを含む場合、Ｂａｋｅｒｂｏｎｄ  ＡＢＸ（商標）樹脂（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，Ｎ．Ｊ．）が精製のために有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば、イオン交換カラム上での分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、シリカ上でのクロマトグラフィー、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂（例えば、ポリアスパラギン酸カラムなど）上でのヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）クロマトグラフィー上でのクロマトグラフィー、クロマトフォーカシング、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、及び硫安塩析も、回収される抗体に依存して利用可能である。
【０３２５】
任意の予備精製工程（複数可）に続き、目的の抗体及び混入物を含む混合物を、ｐＨが約２．５〜４．５の溶出バッファーを使用し、好ましくは低塩濃度（例えば、約０〜０．２５Ｍ塩）で実施される、低ｐＨ疎水性相互作用クロマトグラフィーに供してもよい。
【０３２６】
３．ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体は、一般的に、関連抗原及びアジュバントの複数回の皮下（ｓ．ｃ．）または腹腔内（ｉ．ｐ．）注射により動物において産生される。関連抗原を、免疫化される種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または大豆トリプシン阻害剤に、二機能性薬剤または誘導体化薬剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を通じた抱合）、Ｎヒドロキシスクシンイミド（リジン残基を通じて）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ２、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（式中、Ｒ及びＲ１は、非依存的により低いアルキル基である）を使用して抱合することが有用であり得る。用いてもよいアジュバントの例としては、フロイント完全アジュバント及びＭＰＬ−ＴＤＭアジュバント（モノホスホリル脂質Ａ、合成トレハロースジコリノミコラート）が挙げられる。免疫化プロトコルは、過度の実験なしに当業者により選択され得る。
【０３２７】
動物を、抗原、免疫原性コンジュゲート、または誘導体に対して、例えば、１００μｇまたは５μｇのタンパク質またはコンジュゲート（それぞれウサギまたはマウス用）を３容積のフロイント完全アジュバントと組み合わせることにより、及び、溶液を複数部位に皮内注射することにより免疫化する。１ヶ月後、動物に、フロイント完全アジュバント中のペプチドまたはコンジュゲートの最初の量の１／５〜１／１０を用いて、複数部位での皮下注射により追加免役する。７〜１４日後、動物を出血させ、血清を抗体価についてアッセイする。動物に、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。コンジュゲートも、タンパク質融合体として組み換え細胞培養において作製することができる。また、凝集剤（例えば、ミョウバンなど）が免疫応答を増強するために適する。ラクダの免疫化について実施例１も参照されたい。
【０３２８】
４．モノクローナル抗体
モノクローナル抗体を実質的に均質な抗体の集団から得る、すなわち、その集団を含む個々の抗体は、少量で存在し得る、天然に生じる突然変異及び／または翻訳後改変（例えば、異性化、アミド化）を除いて同一である。従って、改変語「モノクローナル」は、別々の抗体の混合物ではないとして抗体の特徴を示す。例えば、モノクローナル抗体は、Ｋｏｈｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５（１９７５）により最初に記載されたハイブリドーマ方法を使用して作製してもよく、または組み換えＤＮＡ方法により作製してもよい（米国特許第４，８１６，５６７号）。ハイブリドーマ方法では、マウスまたは他の適切な宿主動物（例えば、ハムスターまたはラマなど）を本明細書で上に記載する通りに免疫化し、免疫化のために使用されるタンパク質に特異的に結合するであろう抗体を産生するまたは産生することができるリンパ球を誘導する。あるいは、リンパ球をインビトロで免疫化してもよい。リンパ球を、次に、ミエローマ細胞と、適した融合剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）を使用して融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する（Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，ｐｐ．５９−１０３（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，１９８６））。ラクダの免疫化について実施例１も参照されたい。
【０３２９】
免疫化薬剤は、典型的には、抗原性タンパク質またはその融合変異体を含み得る。一般的に、末梢血リンパ球（「ＰＢＬ」）が、ヒト由来細胞が所望である場合に使用され、または、脾細胞またはリンパ節細胞が、非ヒト哺乳動物の供給源が所望である場合に使用される。リンパ球を、次に、不死化細胞株と、適した融合剤（例えば、ポリエチレングリコールなど）を使用して融合し、ハイブリドーマ細胞を形成する。Ｇｏｄｉｎｇ，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９８６），ｐｐ．５９−１０３。
【０３３０】
不死化細胞株は、通常、形質転換された哺乳動物細胞、特に、げっ歯類、ウシ、及びヒトに由来するミエローマ細胞である。通常、ラットまたはマウスミエローマ細胞株を用いる。このように調製されたハイブリドーマ細胞を、好ましくは非融合親ミエローマ細胞の増殖または生存を阻害する１つ以上の物質を含む適した培養液中に播種し、増殖させる。例えば、親ミエローマ細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＧＰＲＴまたはＨＰＲＴ）を欠く場合、ハイブリドーマ用の培養培地は、典型的には、ヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジン（ＨＡＴ培地）（ＨＧＰＲＴ欠損細胞の増殖を予防する物質である）を含み得る。
【０３３１】
好ましい不死化ミエローマ細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定した高レベル産生を支持し、培地（例えば、ＨＡＴ培地など）に感受性であるものである。これらの内、マウスミエローマ株、例えば、Ｓａｌｋ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  Ｃｅｌｌ  Ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．  ＵＳＡから利用可能なＭＯＰＣ−２１及びＭＰＣ−１１マウス腫瘍に由来するもの、及びＡｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ.ＵＳＡから利用可能なＳＰ−２細胞（及びその誘導体、例えば、Ｘ６３−Ａｇ８−６５３）などが好ましい。
【０３３２】
ハイブリドーマ細胞が増殖している培養培地を、抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の産生についてアッセイする。好ましくは、ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性を、免疫沈降によりまたはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）により決定する。
【０３３３】
ハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、所望の抗原に対して向けられたモノクローナル抗体の存在についてアッセイすることができる。好ましくは、モノクローナル抗体の結合親和性及び特異性を、免疫沈降によりまたはインビトロ結合アッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）など）により決定することができる。そのような技術及びアッセイは、当該技術分野において公知である。例えば、結合親和性を、Ｍｕｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．，１０７：２２０（１９８０）のスキャチャード分析により決定してもよい。
【０３３４】
所望の特異性、親和性、及び／または活性の抗体を産生するハイブリドーマ細胞が同定された後、クローンを限界希釈手順によりサブクローン化し、標準的な方法（Ｇｏｄｉｎｇ，ｓｕｐｒａ）により増殖してもよい。この目的のための適した培養液は、例えば、Ｄ−ＭＥＭまたはＲＰＭＩ−１６４０培地を含む。また、ハイブリドーマ細胞は、哺乳動物において腫瘍としてインビボで増殖し得る。
【０３３５】
サブクローンにより分泌されるモノクローナル抗体は、培養培地、腹水、または血清から、従来の免疫グロブリン精製手順、例えば、プロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、または親和性クロマトグラフィーなどにより適切に分離される。
【０３３６】
モノクローナル抗体はまた、組み換えＤＮＡ方法により作製してもよい。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して容易に単離及び配列決定される（例えば、ネズミ抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することができるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによる）。ハイブリドーマ細胞は、そのようなＤＮＡの好ましい供給源としての役割を果たす。一旦、単離されると、ＤＮＡを発現ベクター中に置いてもよく、それを次に、本来なら免疫グロブリンタンパク質を産生しない宿主細胞、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、またはミエローマ細胞などにトランスフェクションする（そのような組み換え宿主細胞においてモノクローナル抗体を合成するために）。
【０３３７】
さらなる実施形態では、抗体を、ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３４８：５５２−５５４（１９９０）に記載される技術を使用して生成された抗体ファージライブラリーから単離することができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１−５９７（１９９１）には、ファージライブラリーを使用した、それぞれネズミ及びヒトの抗体の単離が記載されている。続く刊行物には、鎖シャッフリングによる高親和性（ｎＭ幅）ヒト抗体の産生（Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：７７９−７８３（１９９２））、ならびに組み合わせ感染及び非常に大きなファージライブラリーを構築するための戦略としてのインビボ組み換え（Ｗａｔｅｒｈｏｕｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２１：２２６５−２２６６（１９９３））が記載されている。従って、これらの技術は、モノクローナル抗体の単離のための従来のモノクローナル抗体ハイブリドーマ技術に対する実行可能な代替物である。
【０３３８】
また、ＤＮＡを、例えば、相同ネズミ配列の場所でヒト重鎖及び軽鎖定常ドメインについてのコード配列を置換することにより（米国特許第４，８１６，５６７号；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６８５１（１９８４））、または免疫グロブリンコード配列に、非免疫グロブリンポリペプチドについてのコード配列の全部または一部を共有結合的に連結させることにより改変してもよい。典型的には、そのような非免疫グロブリンポリペプチドを、抗体の定常ドメインについて置換し、または、それらを、抗体の抗原組み合わせ部位の可変ドメインについて置換し、抗原についての特異性を有する１つの抗原組み合わせ部位及び異なる抗原についての特異性を有する別の抗原組み合わせ部位を含むキメラ二価抗体を作製する。
【０３３９】
本明細書に記載のモノクローナル抗体は、一価であり得るが、その調製は、当該技術分野において周知である。例えば、１つの方法は、免疫グロブリン軽鎖及び改変重鎖の組み換え発現を含む。重鎖は、重鎖の架橋を予防するように、Ｆｃ領域中の任意の点で一般的に切断される。あるいは、関連するシステイン残基を、架橋を予防するために、別のアミノ酸残基と置換してもよく、または欠失させる。インビトロでの方法が、また、一価抗体を調製するために適している。その断片、特に、Ｆａｂ断片を産生するための抗体の消化を、当該技術分野において公知の通常の技術を使用して達成することができる。
【０３４０】
キメラ抗体またはハイブリッド抗体を、また、合成タンパク質化学において公知の方法（架橋剤を含むものを含む）を使用してインビトロで調製してもよい。例えば、免疫毒素を、ジスルフィド交換反応を使用してまたはチオエーテル結合を形成することにより構築してもよい。この目的のための適した試薬の例としては、イミノチオラート及びメチル−４−メルカプトブチルイミデートが挙げられる。
【０３４１】
モノクローナルｓｄＡｂ産生について実施例１も参照されたい。
【０３４２】
５．ヒト化抗体
非ヒト（例えば、ネズミ）抗体のヒト化形態は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含有する、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはその断片（例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２または抗体の他の抗原結合部分配列）である。ヒト化抗体は、ヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）を含み、それにおいてレシピエントのＣＤＲからの残基が、非ヒト種（例えば、所望の特異性、親和性、及び能力を有するマウス、ラット、またはウサギ、ラクダ、またはラマ）（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基により置換される。場合によっては、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基により置換される。ヒト化抗体は、レシピエント抗体においてまたは移入されたＣＤＲまたはフレームワーク配列において見出されない残基も含み得る。一般的に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的に２つの可変ドメインの実質的に全てを含み得るが、それにおいてＣＤＲ領域の全てまたは実質的に全てが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域の全てまたは実質的に全てがヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。いくつかの実施形態では、ヒト化抗体は、免疫グロブリン定常領域（Ｆｃ）の少なくとも部分、典型的には、ヒト免疫グロブリンのそれを含む。例えば、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２９（１９８８）及びＰｒｅｓｔａ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐ．Ｓｔｒｕｃｔ．Ｂｉｏｌ．２：５９３−５９６（１９９２）を参照されたい。
【０３４３】
非ヒト抗体をヒト化する方法は、当該技術分野において周知である。一般的に、ヒト化抗体は、非ヒトである供給源からその中に導入された１つ以上のアミノ酸残基を有する。これらの非ヒトアミノ酸残基は、しばしば「インポート」残基と呼ばれ、インポート残基は、典型的には「インポート」可変ドメインから取られる。ヒト化は、本質的に、Ｗｉｎｔｅｒ及び共同研究者（Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３２１：５２２−５２５（１９８６）；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３３２：３２３−３２７（１９８８）；Ｖｅｒｈｏｅｙｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２３９：１５３４−１５３６（１９８８））の方法に従い、またはヒト抗体の対応する配列についてのげっ歯類ＣＤＲまたはＣＤＲ配列の置換を通じて実施することができる。したがって、そのような「ヒト化」抗体は、抗体（米国特許第４，８１６，５６７号）であり、それにおいて実質的に無傷に満たないヒト可変ドメインが、非ヒト種からの対応する配列により置換されている。実際には、ヒト化抗体は、典型的には、一部のＣＤＲ残基及び恐らくは一部のＦＲ残基が、げっ歯類抗体中の類似部位からの残基により置換されるヒト抗体である。
【０３４４】
ヒト化抗体を作製する上で用いられる、軽鎖及び重鎖の両方のヒト可変ドメインの選択は、抗原性を低下させるために非常に重要である。いわゆる「最適フィット」法に従って、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリー全体に対してスクリーニングする。続いて、齧歯動物のものに最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク（ＦＲ）として受け入れる。Ｓｉｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５１：２２９６（１９９３）；Ｃｈｏｔｈｉａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，１９６：９０１（１９８７）。別の方法では、軽鎖または重鎖の特定のサブグループの全てのヒト抗体のコンセンサス配列に由来する特定のフレームワークを用いる。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に用いることができる。
【０３４５】
抗体は、標的抗原に対する高い親和性及び他の有利な生物学的特性を保ったままでヒト化することがさらに重要である。この目標を達成するため、好ましい方法によれば、親配列及びヒト化配列の三次元モデルを用いた親配列及び様々な概念上のヒト化産物の分析の過程によって、ヒト化抗体が調製される。免疫グロブリンの三次元モデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列に関して可能性のある三次元立体構造を図示及び表示するコンピュータープログラムが利用可能である。これらの表示の検討により、候補免疫グロブリン配列の機能における残基の考えられる役割の分析、すなわち、候補免疫グロブリンがその抗原と結合する能力に影響を及ぼす残基の分析が可能となる。このようにして、標的抗原（複数可）に対する親和性の増大といった所望の抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント配列及びインポート配列から選択し、組み合わせることができる。一般に、ＣＤＲ残基は、抗原結合に影響を及ぼすことに直接かつ最も実質的に関与している。
【０３４６】
いくつかの実施形態では、ｓｄＡｂは、抗原に対するドメインの生来の親和性を低下させない一方で、異種種に対するその免疫原性を減少させるように修飾、例えば、ヒト化される。例えば、ラマ抗体の抗体可変ドメイン（ＶＨＨ）のアミノ酸残基が決定され得、例えば、フレームワーク領域内のラクダ科アミノ酸のうちの１つ以上が、ポリペプチドがその典型的な特徴を失うことなく、すなわち、ヒト化が結果として生じるポリペプチドの抗原結合能力に著しく影響を及ぼさないように、ヒトコンセンサス配列に見られるようなそれらのヒト対応物に置き換えられる。ラクダ科単一ドメイン抗体のヒト化は、単一ポリペプチド鎖内の限定された量のアミノ酸の導入及び変異誘発を必要とする。これは、２つの鎖（軽鎖及び重鎖）へのアミノ酸変化の導入、ならびに両方の鎖のアセンブリの保存を必要とするｓｃＦｖ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２、及びＩｇＧのヒト化とは対照的である。
【０３４７】
６．ヒト抗体
ヒト化の代わりに、ヒト抗体を生成することができる。例えば、内因性の免疫グロブリン産生がなくともヒト抗体の全レパートリーを免疫化することで産生することのできるトランスジェニック動物（例えば、マウス）を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖系列突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域（ＪＨ）遺伝子の同型接合除去が、内因性抗体産生の完全な阻害をもたらすことが記載されている。このような生殖系列突然変異体マウスにおけるヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子列の転移は、抗原投与時にヒト抗体の産生をもたらす。
【０３４８】
あるいは、ファージディスプレイ技術は、免疫処置を受けていないドナーの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、インビトロでヒト抗体及び抗体断片を産生させるために用いることができる。ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４８：５５２−５５３（１９９０）；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ  ａｎｄ  Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１（１９９１）。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、糸状バクテリオファージ、例えば、Ｍ１３またはｆｄの主要コートタンパク質またはマイナーコートタンパク質の遺伝子中にインフレームでクローニングして、ファージ粒子の表面上に機能的抗体断片として提示させる。糸状粒子は、ファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むため、抗体の機能特性に基づく選択により、それらの特性を呈する抗体をコードする遺伝子の選択ももたらされる。従って、ファージは、Ｂ細胞のいくつかの特性を模倣する。ファージディスプレイは、種々のフォーマットで行うことができる。Ｖ遺伝子セグメントのいくつかの供給源をファージディスプレイに用いることができる。Ｃｌａｃｋｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３５２：６２４−６２８（１９９１）は、免疫処置を受けたマウスの脾臓に由来するＶ遺伝子の小規模なランダムコンビナトリアルライブラリーから、抗オキサゾロン抗体の多様なアレイを単離している。免疫処置を受けていないヒトドナーからＶ遺伝子のレパートリーを構築して、抗原（自己抗原を含む）の多様なアレイに対する抗体を、本質的にはＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ，２２２：５８１−５９７  （１９９１）、またはＧｒｉｆｆｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１２：７２５−７３４  （１９９３）に記載された手法に従って単離することができる。米国特許第５，５６５，３３２号及び第５，５７３，９０５号も参照されたい。
【０３４９】
Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．の技術は、ヒトモノクローナル抗体の調製のためにも利用可能である（Ｃｏｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ  ａｎｄ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，Ａｌａｎ  Ｒ．Ｌｉｓｓ，ｐ．７７（１９８５）及びＢｏｅｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７（１）：８６−９５（１９９１））。同様に、例えば内因性の免疫グロブリン遺伝子が部分的にまたは完全に不活性化されているマウスなどの、トランスジェニック動物へのヒト免疫グロブリン座の導入によって、ヒト抗体を作成することができる。チャレンジによって、ヒト抗体産生が観察され、それは、遺伝子再配列、遺伝子アセンブリ、及び抗体レパートリーを含む、全ての点においてヒトで見られる抗体産生に酷似している。このアプローチは、例えば、米国特許第５，５４５，８０７号；第５，５４５，８０６号；第５，５６９，８２５号；第５，６２５，１２６号；第５，６３３，４２５号；第５，６６１，０１６号、及びＭａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １０：７７９−７８３（１９９２）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８５６−８５９（１９９４）；Ｍｏｒｒｉｓｏｎ，Ｎａｔｕｒｅ  ３６８：８１２−１３（１９９４）；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８４５−５１（１９９６）；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  １４：８２６（１９９６）；Ｌｏｎｂｅｒｇ  ＆  Ｈｕｓｚａｒ，Ｉｎｔｅｒｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３：６５−９３（１９９５）に記載されている。例えば、いくつかの実施形態では、ヒト抗体（例えば、ヒトＤＡｂ）は、ヒトＨＣＡｂマウスの免疫化によって生成することができる。例えば、内因性マウス抗体の発現を消失させ、ヒト導入遺伝子を導入してあるトランスジェニックマウスを免疫化することによって、ＨＣＡｂ（例えば、ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質）を作製することができる。ＨＣＡｂマウスは、ＵＳ８，８８３，１５０、ＵＳ８，９２１，５２４、ＵＳ８，９２１，５２２、ＵＳ８，５０７，７４８、ＵＳ８，５０２，０１４、ＵＳ２０１４／０３５６９０８、ＵＳ２０１４／００３３３３５、ＵＳ２０１４／００３７６１６、ＵＳ２０１４／０３５６９０８、ＵＳ２０１３／０３４４０５７、ＵＳ２０１３／０３２３２３５、ＵＳ２０１１／０１１８４４４、及びＵＳ２００９／０３０７７８７に開示されており、トランスジェニックマウスにおける重鎖のみ抗体及びその作製に関するそれらの開示内容の全てが参照により本明細書に組み込まれる。ＨＣＡｂマウスを免疫化し、得られる感作脾臓細胞をマウス骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを形成させる。その後、得られるＨＣＡｂは、マウスのＣＨ２領域及びＣＨ３領域をヒト配列と置き換えることによって完全ヒトに作製可能である。
【０３５０】
最終的に、ヒト抗体は、インビトロで活性化されたＢ細胞（米国特許第５，５６７，６１０号及び同第５，２２９，２７５号を参照されたい）によって、または当該技術分野で公知の種々の技術、例えば、ファージディスプレイライブラリーを用いても産生され得る（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ及びＷｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１（１９９１）；Ｍａｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１（１９９１）。
【０３５１】
ＶＩ．製造品及びキット
単離抗ＴＩＧＩＴ構築物（例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ二重特異性構築物（例えば、ＢＡＢＰ）、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ二重特異性構築物（例えば、ＢＡＢＰ））、単離核酸またはそれをコードするベクター、または本明細書に記載の抗ＴＩＧＩＴ構築物をコードする単離核酸またはベクターを含む単離宿主細胞のいずれかを含むキット及び製造品がさらに提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の医薬組成物のいずれか１つを含むキットが提供され、好ましくは、その使用のための説明書を提供する。
【０３５２】
本出願のキットは、適当に包装されている。適当な包装には、バイアル、ボトル、ジャー、可動性包装（例えば、密封マイラーまたはビニール袋）などがあるが、これらに限定されない。キットは、例えば、緩衝剤及び解説情報などの追加の成分を適宜提供する。従って、本出願は、バイアル（例えば、密封バイアル）、ボトル、ジャー、可動性包装などを含む製造品も提供する。
【０３５３】
製造品は、容器、及び容器上のまたは容器に付随するラベルまたは添付文書を含み得る。適当な容器には、例えば、瓶、バイアル、シリンジなどが含まれる。容器は、ガラスまたはプラスチックなど種々の材料で形成され得る。一般的に、容器は、本明細書に記載の疾患または疾病（例えば、がん）を治療するのに有効な組成物を保持し、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ、または皮下注射針で突き刺すことができる栓を有するバイアルであってよい）。ラベルまたは添付文書は、その組成物が個体における特定の状態の治療に使用されることを示す。ラベルまたは添付文書は、組成物を個体に投与するための説明書をさらに含むであろう。ラベルは、再構成及び／または使用のための指示を示し得る。医薬組成物を保持する容器は、再構成製剤の反復投与（例えば、２〜６回投与）を可能にする複数回使用バイアルであり得る。添付文書は、そのような治療用製品の使用に関する適応、用途、投与量、投与、禁忌及び／または警告についての情報を含む、治療用製品の市販包装に通例含まれる指示書を指す。さらに、製造品は、静菌性注射用水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液及びデキストロース溶液などの薬学的に許容可能な緩衝剤を含む第２の容器をさらに含み得る。商業的観点及び使用者の観点から望ましい他の材料、例えば、他の緩衝剤、希釈剤、フィルター、針及びシリンジをさらに含み得る。
【０３５４】
キットまたは製造品は、複数単位用量の医薬組成物及び使用説明書を含んでもよく、薬局、例えば、病院薬局及び調剤薬局で貯蔵及び使用するために十分な量で包装されている。
【実施例】
【０３５５】
以下の実施例は、完全に本発明の例であることを意図しており、したがって決して本発明を限定すると考えられるべきではない。以下の実施例及び詳細な説明は、限定としてではなく例証として提供される。
【０３５６】
実施例１：抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂの生成
免疫化
最新の動物保護規制に全て従い、組み換えＴＩＧＩＴ−Ｆｃ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）タンパク質によりラマを免疫化した。免疫化用に、抗原をＣＦＡ（完全フロイントアジュバント；一次免疫化）またはＩＦＡ（不完全フロイントアジュバント；ブースト免疫化）による乳剤として製剤化した。抗原は、首の筋肉内に投与した。各動物に、ＣＦＡ乳剤中で１００μｇのＴＩＧＩＴ−Ｆｃを含む乳剤を５本注射し、続いてＩＦＡ乳剤中のＴＩＧＩＴ−Ｆｃを２週間間隔で４回注射した。免疫化の間の異なった時点で、動物から１０ｍｌの血液試料を回収し、血清を調製した。抗原特異的体液免疫応答の誘導は、固定化したＴＩＧＩＴ−Ｈｉｓタンパク質によるＥＬＩＳＡに基づく実験で血清試料を用いて確認し（図１及び図２）、重鎖免疫グロブリン（ＨＣＡｂ）を含む応答の十分な誘導を示した。最後の免疫化から５日後、３００ｍｌの血液試料を回収した。末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を、ラクダＨＣＡｂの遺伝源として、血液試料３００ｍｌからＦｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ勾配（Ａｍｅｒｓｈａｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて単離し、１×１０９個のＰＢＬを得た。
【０３５７】
ライブラリー構築
ＰＢＬから抽出したＲＮＡを、ＲＴ−ＰＣＲの出発物質として使用して、ｓｄＡｂをコードする遺伝子断片を増幅した。これらの断片を社内プラスミドベクターにクローニングした。ｓｄＡｂコード配列とインフレームで、ベクターは、Ｃ末端  Ｈｉｓ−Ｔａｇをコードしていた。ライブラリーサイズは、約６×１０８個である。ライブラリーファージは、標準プロトコルに従って調製し、滅菌濾過の後、さらなる使用のために４℃で保管した。
【０３５８】
選別及びハイスループットスクリーニング
選別は、固形パニングならびに細胞に基づくパニングを用いて、上記ライブラリーで実施した。両方の条件について選別を１回だけ行なった。各々の選別のアウトプットを濃縮係数（対照と比べた溶出液中に存在するファージの数）、多様性、及びＴＩＧＩＴ陽性クローンの割合（ＥＬＩＳＡ）について分析した。これらのパラメーターに基づき、さらなる分析のために最良の選別を選択した。そのために、各々の選別からのアウトプットを、ハイスループットスクリーニング用の可溶性発現ベクターにプールとして再クローニングした。ｓｄＡｂコード配列とインフレームで、ベクターは、Ｃ末端Ｈｉｓタグをコードしていた。コロニーを採取して、９６ディープウェルプレート（１ｍｌ容量）で培養し、ＩＰＴＧ及び０．１％Ｔｒｉｔｏｎを添加することにより上清中でｓｄＡｂ発現を誘導した。
【０３５９】
（ＥＬＩＳＡによって）ＴＩＧＩＴタンパク質及び（ＦＡＣＳによって）ＴＩＧＩＴ発現ＣＨＯ−Ｋ１安定細胞株に結合する能力について上清を分析した。陽性バインダーを配列決定し、固有のクローンを選別し、さらに特徴付けた。
【０３６０】
固有のクローンを２ＸＹＴ培地中で増殖させ、ＩＰＴＧにより上清中でｓｄＡｂ発現を誘導した。ＣＤ１５５とＴＩＧＩＴの間の相互作用を阻害する能力について、固有のバインダーの上清を分析した。そのために、ＴＩＧＩＴを発現する安定したＣＨＯ細胞をｓｄＡｂ含有上清でまずインキュベートした後、ＣＤ１５５−Ｆｃ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、続いて、ヒトＦｃに対するフルオロフォア標識した二次抗体でインキュベートした。抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ遮断をしない試料と比較した平均蛍光強度（ＭＦＩ）のシフトは、ＣＤ１５５／ＴＩＧＩＴ結合の遮断を表す。
【０３６１】
全ての潜在的インヒビターを選別し、ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器上の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）によってＫＤ分析した。解離相を使用して、個別のｓｄＡｂごとのｋｏｆｆ値を算出した。
【０３６２】
実施例２：抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の調製及びインビトロ評価
ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の産生
抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質構築物は、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂをヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域と融合することで生成した。構築物のマキシプレップを調製して、ＣＨＯ−Ｋ１細胞を一過性発現させて、精製した。発現した抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡアガロース樹脂を含有するカラムを通して、クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質純度は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって決定した。Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂによって生成された抗ＴＩＧＩＴ抗体、２２Ｇ２は、ヒトＩｇＧ１バックボーンにおいて、公開特許の配列（ＵＳ２０１６／０１７６９６３を参照されたい、配列番号７及び９）に従って産生された。ネズミＴＩＧＩＴを遮断するハムスター抗体、１０Ａ７は、ヒトＩｇＧ１バックボーンにおいて、公開特許で報告された配列（ＵＳ２０１５／０２１６９７０を参照されたい、配列番号１３及び１５）に従って産生された。
【０３６３】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による標的タンパク質結合及び種間反応試験
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を利用して、ＳＰＲによって、各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の親和性定数（ＫＤ）を決定した。簡単に言えば、ヒト、カニクイザルまたはマウスＴＩＧＩＴ−Ｈｉｓタンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、１００ＲＵ以下の密度でＣＭ５センサーチップにアミン結合させた。抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を、５つ以上の異なる濃度で注入した。いくつかの例示の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の動態データを表３にまとめた。
表３．ＴＩＧＩＴに対する非ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の親和性決定
【表３−１】
2021508469.tif 000004
【表３−２】
2021508469.tif 000005
【０３６４】
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合のＣＨＯ−ＴＩＧＩＴ細胞結合及び阻害
細胞結合ＥＣ５０を決定するため、ヒト、カニクイザルまたはネズミＴＩＧＩＴを発現するＣＨＯ−Ｋ１細胞を収穫し、勾配濃度の抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質でインキュベートした後、ヒトＦｃに対する二次抗体をフルオロフォア標識した。遮断アッセイでは、固定濃度のビオチン化ＣＤ１５５−Ｆｃタンパク質（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）をインキュベーションに加え、ＣＨＯ／ヒトＴＩＧＩＴ細胞へのＣＤ１５５−Ｆｃの結合をフルオロフォア標識ストレプトアビジンで検出した。フローサイトメトリーで試料を分析した。抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の結合及び遮断能力のＥＣ５０を表４にまとめた。抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、陽性対照２２Ｇ２と同様、または陽性対照２２Ｇ２より良い、ＣＨＯ細胞上で発現したヒトＴＩＧＩＴに結合する能力を有した一方、ＡＳ１９５８４−Ｆｃ、ＡＳ１９８８６−Ｆｃ及びＡＳ２０１６０−Ｆｃは、２２Ｇ２よりも優れたリガンド遮断能力を示した。さらに、ＡＳ１９５８４−Ｆｃは、ＣＨＯ細胞上で発現したマウスＴＩＧＩＴに結合し、ＣＨＯ細胞上で発現したヒトＴＩＧＩＴへのその結合のＥＣ５０は同様であることが分かった。マウスＴＩＧＩＴ架橋結合体対照、１０Ａ７は、ＡＳ１９５８４−Ｆｃと同様の０．７０９ｎＭのＣＨＯ／マウスＴＩＧＩＴ結合ＥＣ５０で検出された。
表４．ＴＩＧＩＴに対する非ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質のリガンド結合データの結合及び遮断
【表４−１】
2021508469.tif 000006
【表４−２】
2021508469.tif 000007
【０３６５】
ＣＴ２６、ネズミ大腸がん細胞株は、高発現のネズミＣＤ１５５を有する（データ不図示）。ＡＳ１９５８４−Ｆｃは、ネズミＴＩＧＩＴと交差反応するので、その主要なリガンドであるＣＤ１５５とのＴＩＧＩＴ相互作用を遮断するその能力を評価するため、ＣＴ２６細胞は、勾配濃度のＡＳ１９５８４−Ｆｃ融合タンパク質の存在下で、ネズミＴＩＧＩＴ−Ｆｃでインキュベートした。ＣＴ２６細胞へのネズミＴＩＧＩＴ−Ｆｃ結合は、ヒトＦｃに対する二次抗体を蛍光色素共役体で染色し、ＦＡＣＳによって検出することで評価した。遮断のＥＣ５０は、ＡＳ１９５８４−Ｆｃでは７７．９０ｎＭ、ネズミＴＩＧＩＴ遮断剤である１０Ａ７では７１．３３ｎＭであった。従って、ＡＳ１９５８４−Ｆｃ及び１０Ａ７は、ＴＩＧＩＴリガンドＣＤ１５５を遮断する能力が匹敵する。
【０３６６】
ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断レポーターアッセイ
ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断レポーターアッセイは、アッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＣＳ１９８８１１）のマニュアルに従って、プロメガＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断レポーターアッセイキット（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号ＣＳ１９８８１１）を用いて行った。簡単に言えば、Ｔｈａｗ−ａｎｄ−Ｕｓｅ  ＴＩＧＩＴエフェクター細胞を一晩培養した後、連続希釈の抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質でインキュベートし、その後、ＣＤ１５５  ａＡＰＣ／ＣＨＯ−Ｋ１細胞を適切なＥ：Ｔ比で加えた。３７℃、５％ＣＯ２で誘導した６時間後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を加え、発光を判断した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアで４パラメーターロジスティック曲線分析を行った。データ曲線を図３に示し、表５にまとめる。ＡＳ１９５８４−Ｆｃ、ＡＳ１９８８６−Ｆｃ及びＡＳ２０１６０−Ｆｃは、２２Ｇ２に匹敵するかまたは２２Ｇ２よりも優れた遮断機能を有する。
表５．ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断レポーターアッセイ
【表５】
2021508469.tif 000008
【０３６７】
実施例３：同系腫瘍モデルにおける抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ効力
ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおける１０Ａ７及びＡＳ１９５８４−Ｆｃの比較の効力研究
ＡＳ１９５８４−Ｆｃ融合タンパク質及び１０Ａ７は、マウスＴＩＧＩＴと非常に近い細胞結合及び遮断ＥＣ５０を有するため（表４を参照）、同じモル用量で異なる分子モダリティにおける２つの抗体を比較するように研究を実施した。ネズミＣＤ１５５を発現するＣＴ２６腫瘍細胞を培養し、マグネシウム及びカルシウムを含まないＨＢＳＳ−／−中に懸濁させて、５×１０５個の細胞を、６〜８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定し、式：（長さ×幅×幅）／２で算出した。平均腫瘍体積が９０〜１００ｍｍ３に到達した場合、マウスを無作為化して、処置を開始した。被験物質を、腹腔内（ｉ．ｐ．）を介して４日に一度投与した。研究全体を通じて体重を測定した。動物を犠牲にし、投与後の１８日目に腫瘍組織を収穫し、コラゲナーゼＩＶ／ＤＮａｓｅ  Ｉで消化させて、単細胞懸濁液を調製して、表面マーカーＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８の染色、及びフローサイトメトリー分析を行った。
【０３６８】
ＣＴ２６腫瘍モデルは、ＰＤ−１遮断に部分的な耐性を示す。図４Ａ及び４Ｃに示すように、ラット抗ネズミＰＤ−１抗体、ＲＭＰ１−１４（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）は、５ｍｇ／ｋｇでＣＴ２６腫瘍成長に対する阻害が制限されている。ＡＳ１９５８４−Ｆｃ及び１０Ａ７は両方とも、単体またはＲＭＰ１−１４との組み合わせのいずれかで、同じモル用量（それぞれ、１０ｍｇ／ｋｇ及び１８．８ｍｇ／ｋｇ）で腫瘍進行を著しく遅らせた。特に、ＡＳ１９５８４−Ｆｃは、投与後一週間以内により速い応答を示し、結果的に、試験したモル用量で、１０Ａ７よりも均一な応答を示した。この現象は、腫瘍学における異なる標的の他の研究においても観察された（データ不図示）。これは、完全長モノクローナル抗体（それぞれ、約８０ｋＤａ対１５０ｋＤａ）と比較して、より小さい分子量のｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質と関連してもよい。マウスのＰＫ研究では、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、定常状態での見かけの分布量（Ｖｓｓ）が約１．５〜２倍大きく、抗ＴＩＧＩＴ完全長抗体よりも低いピーク血漿濃度（Ｃｍａｘ）を有した（図９；さらなるデータ不図示）。この差異は、抗体がマウスＴＩＧＩＴと交差反応するかどうかに関係はなかった。ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質が、そのサイズが小さいために完全長抗体よりも速くかつ強い組織（例えば、腫瘍）透過性を有し得、より速い薬効が、この特異的な性質とも関連し得ることを、観察は示している。フローサイトメトリーで評価したように、ＡＳ１９５８４−Ｆｃによる処置は、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞腫瘍内浸潤を増強させた一方、ＲＭＰ１−１４との併用は、そのような浸潤をさらに増強させた（図４Ｂ）。
【０３６９】
ＣＴ２６同系腫瘍モデルにおけるＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ二重遮断を試験する効力研究
ＣＴ２６腫瘍細胞を培養し、マグネシウム及びカルシウムを含まないＨＢＳＳ−／−中に懸濁させて、５×１０５個の細胞を、６〜８週齢の雌のＢａｌｂ／ｃマウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定し、式：（長さ×幅×幅）／２で算出した。平均腫瘍体積が９０〜１００ｍｍ３に到達した場合、マウスを無作為化して、処置を開始した。被験物質を、腹腔内（ｉ．ｐ．）を介して４日に一度投与した。研究全体を通して体重を測定した。
【０３７０】
ＣＴ２６腫瘍モデルは、ＰＤ−１遮断に部分的な耐性を示す。図５Ａ及び５Ｂに示すように、ラット抗ネズミＰＤ−１抗体、ＲＭＰ１−１４（Ｂｉｏｘｃｅｌｌ）は、５ｍｇ／ｋｇでＣＴ２６腫瘍成長を適度ではあるが著しく阻害した。ＡＳ１９５８４−Ｆｃ融合タンパク質は、ＲＭＰ１−１４と同じモル用量で、際立った腫瘍阻害を示した。同じモル用量（それぞれ、５ｍｇ／ｋｇ及び２．６７ｍｇ／ｋｇ）でのＲＭＰ１−１４及びＡＳ１９５８４−Ｆｃの併用は、著しく改善された効力を示し、腫瘍完全退縮は、８匹のうちの６匹のマウスで観察された。
【０３７１】
ＭＣ３８同系腫瘍モデルにおけるＰＤ−１／ＴＩＧＩＴ二重遮断を試験する効力研究
ＭＣ３８腫瘍細胞を培養し、マグネシウム及びカルシウムを含まないＨＢＳＳ−／−中に懸濁させて、１×１０６個の細胞を、６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮下注射した。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定し、式：（長さ×幅×幅）／２で算出した。平均腫瘍体積が９０〜１００ｍｍ３に到達した場合、マウスを無作為化して、処置を開始した。被験物質を、腹腔内（ｉ．ｐ．）を介して４日に一度投与した。研究全体を通して体重を測定した。
【０３７２】
ＭＣ３８腫瘍モデルは、ＰＤ−１遮断に敏感である。図６Ａ及び６Ｂに示すように、ＲＭＰ１−１４は、３ｍｇ／ｋｇでＭＣ３８腫瘍成長を実質的に遅らせた。ＡＳ１９５８４−Ｆｃ融合タンパク質は、用量依存的に腫瘍成長を阻害した。同じモル用量（それぞれ、３ｍｇ／ｋｇ及び１．６ｍｇ／ｋｇ）でのＲＭＰ１−１４及びＡＳ１９５８４−Ｆｃの併用は、ＰＤ−１及びＴＩＧＩＴを同時に標的化する相乗効果を示し、７匹のうちの５匹のマウスにおいて、効力の著しい改善及び完全退縮が得られた。ＲＭＰ１−１４及び高用量のＡＳ１９５８４−Ｆｃ（それぞれ、３ｍｇ／ｋｇ及び１０ｍｇ／ｋｇ）の併用は、全ての動物（７匹のうちの７匹）における腫瘍生着を完全に廃止した。
【０３７３】
実施例４：抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質のヒト化、産生及び特徴付け
抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂのヒト化
ｓｄＡｂ  ＡＳ１９５８４及びＡＳ１９８８６のタンパク質配列を、高度の相同性を共有する５つの最も近いヒト生殖系列配列と整列させた。最良のヒト生殖系列配列は、ヒトアクセプターとして選択した。相同性モデルを作成した。モデル分析データに従って、抗原結合または抗体足場形成に潜在的に重要な残基を手付かずにした一方、残りは、ヒト対応物への変換のために選択した。最初に、４〜６個の配列最適化した変異体のパネルを生成した（ステージ１）。これらの変異体を多くのパラメーターについて分析し、得られた結果を使用して、第２セットのｓｄＡｂを設計した（ステージ２）。ヒト化ｓｄＡｂは、それらの名称において「ＶＨ」で示した。
【０３７４】
ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の産生
ヒト化変異体のうち、ＡＳ１９５８４ＶＨ２８、ＡＳ１９８８６ＶＨ５、及びＡＳ１９８８６ＶＨ８を選択して、親和性及び小規模生産レベルに従って産生し、特徴付けた。ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質構築物は、ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂをヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域と融合させることで生成した。構築物のマキシプレップを調製して、ＨＥＫ２９３細胞を一過性発現させて、精製した。発現したヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、プロテインＡアガロース樹脂を含有するカラムを通して、クロマトグラフィーによって精製した。タンパク質純度は、ＳＥＣ−ＨＰＬＣによって決定した。発現結果を表６にまとめた。
表６．ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の発現
【表６−１】
2021508469.tif 000009
【表６−２】
2021508469.tif 000010
【０３７５】
安定性分析
加熱中のより大きいタンパク質凝集物の形成は、動的光散乱法（ＤＬＳ）を用いて検出した。約０．７５℃の温度間隔を有する２５℃〜７５℃の温度傾斜を、ＤＹＮＡＰＲＯ（登録商標）ＮＡＮＯＳＴＡＲ（登録商標）プレートリーダー（Ｗｙａｔｔ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を用いて、１．５ｍｇ／ｍｌで抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質試料について行った。２０μｌの各試料をＷＹＡＴＴ（登録商標）使い捨てキュベットに加えた後、試料を１０μｌの鉱油（Ｓｉｇｍａ  ８４１０）で覆い、蒸発を防いだ。三重測定（５個の取得／各測定）を抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質試料ごとに平均化した。選択された温度間隔による実験の最中に、熱走査速度は、１．５℃／分になるように算出した。各試料を測定しながら、標的温度が７５℃（約４０分）に到達するまで温度を継続的に加熱した。凝集温度（Ｔａｇｇ）は、ＤＹＮＡＭＩＣＳ（商標）７．６．０．４８ソフトウェア（Ｗｙａｔｔ，Ｓａｎｔａ  Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）で開始分析方法により分析した。種々の試料の測定された凝集開始温度（Ｔａｇｇ）を表７に示した。
【０３７６】
酸性安定性は、以下のように評価した。各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質試料は、異なるｐＨ：３．６、３．３、３．０及び２．７を有する５０ｍＭのクエン酸ナトリウム緩衝液中で１０ｍｇ／ｍｌにて調製し、１つの対照は、ｐＨ７．２のリン酸ナトリウム緩衝液で調製した。室温で酸性条件下での暴露の１時間後、リン酸ナトリウム緩衝液によって試料をｐＨ７．２に中和した。その後、各試料は、純度分析及びＳＰＲ活性のためにＳＤＳ−ＰＡＧＥで検出した。種々の酸性条件での活性濃度のパーセントを表７にまとめた。
【０３７７】
凍結融解安定性は、以下のように試験した。４％スクロース、５０ｍＭのヒスチジン及び５０ｍＭのアルギニン（ｐＨ６．０）を有する緩衝液中の＞５０ｍｇ／ｍｌの濃度での抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質試料を５回サイクルで完全に凍結融解した。全ての試料の無傷で完全な単量体分子の画分をＳＥＣ−ＨＰＬＣで評価し、データを記録し、製造者によって提供されるＣＨＲＯＭＥＬＥＯＮ（商標）ソフトウェアを用いて分析した。凍結融解サイクル後の各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の回収率を表７に示した。
【０３７８】
表７のデータは、試験した全てのヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質が、熱、酸性、及び凍結融解の安定性試験で安定であったことを示した。
表７．ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の安定性分析
【表７−１】
2021508469.tif 000011
【表７−２】
2021508469.tif 000012
【０３７９】
疎水性分析
ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の疎水性は、疎水性相互作用  クロマトグラフィー（ＨＩＣ）によって試験した。各試料は、移動相としてトリス緩衝液（ｐＨ７．０）を含有する（ＮＨ４）２ＳＯ４の量を１ｍｌ／分の流量で増加させながら、ＴＳＫｇｅｌ（登録商標）ブチル−ＮＰＲ  ＨＰＬＣカラム上で分析した。保持時間を使用して、各試料の疎水性を比較した。表８に示すように、全てのヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、疎水性に関して適格である。
表８．ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の疎水性分析
【表８】
2021508469.tif 000013
【０３８０】
溶解度分析
溶解度を評価するため、精製したヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を、交差相互作用クロマトグラフィー（ＣＩＣ）カラムを用いて測定した。プールマウス血清から精製したネズミポリクローナル抗体は、ＳｉｇＭａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｉ５３８１）から購入した。ネズミポリクローナル抗体を樹脂マトリックスに約３０ｍｇ／ｍＬで連結させた。ＰＢＳ緩衝液中の精製抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を、ネズミＩｇＧ連結カラム及び対照カラムに０．０５〜０．２０ｍｇ／ｍＬの範囲の濃度でそれぞれ注入した。保持時間を使用して、表９に報告された保持因子ｋ’値を算出した：ｋ’＝（Ｖｒ−Ｖｏ）／Ｖｏ＝（Ｔｒ−Ｔｍ）／Ｔｍ。Ｖｒは、タンパク質連結カラム上の試料の溶出体積を表し、Ｖｏは、対照カラムからの溶出体積を表し、Ｔｒは、タンパク質連結カラム上の保持時間を表し、Ｔｍは、対照カラム上の保持時間を表す。多くの試料を同じカラム上で２回ランさせた。ｋ’値＞０．６の抗体は、一般的に大幅に少ない可溶性である。表９によれば、全てのヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質試料は、優れた溶解度を示した。
表９．ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の溶解度分析
【表９−１】
2021508469.tif 000014
【表９−２】
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【０３８１】
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）による標的タンパク質結合及び種間反応試験
ＢＩＡｃｏｒｅ  Ｔ２００機器を利用して、ＳＰＲによる各抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の親和性定数（ＫＤ）を決定した。簡単に言えば、ヒト、カニクイザルまたはマウスＴＩＧＩＴ−Ｈｉｓ（Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を、１００ＲＵ以下の密度でＣＭ５センサーチップにアミンカップリングさせた。抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を５以上の異なる濃度で注入した。動態データを表１０にまとめた。
表１０．ＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の親和性決定
【表１０】
2021508469.tif 000016
【０３８２】
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合のＣＨＯ−ＴＩＧＩＴ細胞結合及び阻害
抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質が、ＣＨＯ−Ｋ１細胞上で発現したＴＩＧＩＴに結合して、ＣＤ１５５リガンド結合を遮断する能力は、実施例２に記載のものと同じ方法で判断した。抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の結合及び遮断能力のＥＣ５０を表１１にまとめた。全てのヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、それらの親抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質に匹敵する結合及び遮断能力を有する。
表１１．ＴＩＧＩＴに対する抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の結合及び遮断データ
【表１１】
2021508469.tif 000017
【０３８３】
ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断レポーターアッセイ及びＩＬ−２放出アッセイ
ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断レポーターアッセイ：研究は、実施例２に記載の方法に従って実施した。２２Ｇ２は、陽性対照として機能した。データ曲線を図７に示し、表１２にまとめる。ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質が、リガンド遮断に関して、それらの親クローンに匹敵する機能を有することを結果が示している。
【０３８４】
ＩＬ−２放出アッセイ：ＧｅｎＳｃｒｉｐｔが開発したＣＤ１５５発現標的細胞を９６ウェルプレートで一晩培養した後、連続希釈の抗ＴＩＧＩＴ抗体または抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質でインキュベートし、その後、社内開発されたＴＩＧＩＴエフェクター細胞を適切なＥ：Ｔ比で加えた。３７℃、５％ＣＯ２での誘導の２４時間後、細胞培養上清中のインターロイキン２（ＩＬ−２）の濃度をヒトＩＬ−２  ＨＴＲＦアッセイキットによって測定した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアで４パラメーターロジスティック曲線分析を行った。データ曲線を図８に示し、表１２にまとめる。２２Ｇ２は、陽性対照として機能した。ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質が、エフェクターＴ細胞中のＩＬ−２放出誘導に関して、それらの親クローンに匹敵する機能を有することを結果が示している。
表１２．抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の機能性アッセイ
【表１２】
2021508469.tif 000018
【０３８５】
実施例５：ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ研究
ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態研究
８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスは、３ｍｇ／ｋｇの用量で、２２Ｇ２またはＡＳ１９５８４ＶＨ２８−Ｆｃ融合タンパク質のいずれかの１回の静脈内ボーラス注射を受けた。種々の時点で、末梢血液試料を収穫し、血漿を調製し、サンドイッチＥＬＩＳＡを用いて検査抗体の濃度を決定した。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎを使用して、各検査抗体の薬物動態プロファイルを非コンパートメント分析でモデリングした（モデル２０１）。データを表１３にまとめ、薬物動態曲線を図９に示した。モノクローナル抗体と比較して、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質は、半減期が短く、クリアランスが高いが、定常状態での見かけの分布量が大きいことを、本研究及びいくつかの他のもの（データ不図示）の結果が示している。
表１３．モノクローナル抗ＴＩＧＩＴ抗体及びヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の薬物動態プロファイル
【表１３】
2021508469.tif 000019
【０３８６】
ＭＣ３８腫瘍を担持するＴＩＧＩＴ−ヒト化マウスにおけるヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の効力
ＭＣ３８腫瘍細胞を培養し、マグネシウム及びカルシウムを含まないＨＢＳＳ−／−中に懸濁させて、１×１０６個の細胞を、６〜８週齢の、ヒトＴＩＧＩＴノックイン（ＫＩ）を有する雌のＣ５７ＢＬ／６マウスの脇腹に皮下注射した（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定し、式：（長さ×幅×幅）／２で算出した。平均腫瘍体積が９０〜１００ｍｍ３に到達した場合、マウスを無作為化して、処置を開始した。被験物質を、腹腔内（ｉ．ｐ．）を介して４日に一度投与した。研究全体を通して体重を測定した。
【０３８７】
図１０Ａ及び１０Ｂに示すように、３つのヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質を含む全ての検査抗体、及び陽性対照２２Ｇ２は、ＭＣ３８腫瘍の増殖を著しく阻害し、ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質のインビボ効力を実証した。本研究におけるヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質に対する２２Ｇ２の優れた効力（インビトロ研究結果と矛盾する）は、規則完全長抗体（図９及び表１３も参照されたい）と比較して抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質の短い半減期、ならびにこの場合に適用された低試験用量に恐らくよるものである。
【０３８８】
実施例６：ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１及びＴＩＧＩＴを標的化する概念証明型（ＰＯＣ）二重特異性分子の生成及びインビトロ特徴付け
ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＰＯＣ二重特異性抗原結合タンパク質（ＢＡＢＰ）の構築及び発現
ＢＡＢＰは、完全長抗体に融合した抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ、または、Ｆｃ領域がＣ末端にある完全長抗体由来のｓｃＦｖまたはＦａｂ領域、例えば、抗ＰＤ−１抗体、例えば、キイトルーダ（登録商標）（ペンブロリズマブ）、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ、オプジーボ（登録商標）（ニボルマブ）、または抗ＰＤ−Ｌ１抗体、例えば、テセントリク（登録商標）（アテゾリズマブ）、ＩＭＦＩＮＺＩ（商標）（デュルバルマブ）、バベンチオ（登録商標）（アベルマブ）、またはヒト化５３Ｃ１（ｈ５３Ｃ１）で構築することができる。抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、リンカー（例えば、９−アミノ酸Ｇｌｙ／Ｓｅｒリンカー（９ＧＳリンカー）、ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジ、または変異型ｈＩｇＧ１ヒンジ）を介して、またはリンカーを介さずに、完全長抗体（または、Ｆｃ領域がＣ末端にある完全長抗体由来のｓｃＦｖまたはＦａｂ領域）に連結することができる。ＢＡＢＰは、図１７〜２６に例示するいずれかの構成であり得る。例えば、抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂは、Ｎ末端またはＣ末端を介して、重鎖の少なくとも１つ、軽鎖の少なくとも１つ、または重鎖及び軽鎖の両方に融合することができる（図１７〜２０を参照）。
【０３８９】
本実施例は、概念証明型（ＰＯＣ）のＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの構築及び発現について説明する。抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ  ＡＳ１９５８４は、変異型ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジを介して、抗ＰＤ−Ｌ１抗体ｈ５３Ｃ１（ＢＴＰ−４及びＢＴＰ−５）またはテセントリクバイオシミラー（ＢＴＰ−６及びＢＴＰ−７）の重鎖のＮ末端に融合した。野生型ヒトＩｇＧ１  ＦｃをＢＴＰ−５及びＢＴＰ−７に使用した一方、エフェクターレスヒトＩｇＧ１（不活性ｈＩｇＧ１）ＦｃをＢＴＰ−４及びＢＴＰ−６に使用した。全てのＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ構築物は、図１７に示す構造を有する。ＰＯＣ  ＢＡＢＰ構築物は、Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞で一時的に発現され、プロテインＡ親和性カラムでタンパク質を精製した。タンパク質純度をＳＥＣ−ＨＰＬＣで決定した。結果を表１４にまとめた。
表１４．ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの発現
【表１４】
2021508469.tif 000020
【０３９０】
ＢＡＢＰの親和性決定
ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰをその親エレメント（抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質）と比較するため、テセントリク（登録商標）のＦｃ領域を、対照として野生型ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）Ｆｃに変更し、ｈ５３Ｃ１及びＡＳ１９５８４−Ｆｃ融合タンパク質は、対照として、野生型ｈＩｇＧ１  ＦｃまたはエフェクターレスヒトＩｇＧ１（不活性ｈＩｇＧ１）Ｆｃのいずれかで産生した。ヒト及びマウスＴＩＧＩＴ−Ｈｉｓ及びヒトＰＤ−Ｌ１は、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの親和性は、実施例２に記載のように試験し、データを表１５に示した。ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、それらの親エレメントのモノクローナル抗体、及び対応するアイソタイプを有する抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、標的タンパク質への親和性が同等または僅かに減少している。
表１５．ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの親和性決定
【表１５】
2021508469.tif 000021
【０３９１】
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合のＣＨＯ−ＴＩＧＩＴまたはＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞結合及び阻害
ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰが、ＣＨＯ細胞上で発現したＴＩＧＩＴに結合し、ＣＨＯ−ＴＩＧＩＴ細胞へのＣＤ１５５結合を遮断する能力は、実施例２に記載されるように評価した。ＣＨＯ細胞上で発現したＰＤ−Ｌ１に結合し、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞へのＰＤ−１結合を遮断する能力についても、実施例２に記載されるように同様に評価した。２２Ｇ２は、陽性抗ＴＩＧＩＴ  Ａｂ対照として使用した。結果を表１６にまとめる。ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、それらの親エレメントのモノクローナル抗体（抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ）、及び対応するアイソタイプを有する抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、標的細胞結合及びリガンド遮断能力が同等または僅かに減少している。
表１６．ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの結合及び遮断データ
【表１６】
2021508469.tif 000022
【０３９２】
ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰのインビトロ機能性アッセイ
ＰＤ−Ｌ１細胞ベースアッセイ：ＰＤ−Ｌ１標的細胞（ＧＳ−Ｃ２／ＰＤ−Ｌ１、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ００６１３）を一晩培養した後、連続希釈の検査試料でインキュベートし、その後、ＰＤ−１エフェクター細胞（ＧＳ−Ｊ２／ＰＤ−１、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ００６１２）を適切なＥ：Ｔ比で加えた。３７℃、５％ＣＯ２での誘導の６時間後、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を加え、発光を判断した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ６ソフトウェアで４パラメーターロジスティック曲線分析を行った。結果を図１１に示す。
【０３９３】
混合リンパ球反応（ＭＬＲ）：樹状細胞（ＤＣ）及びＣＤ４＋Ｔ細胞をヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離した。ＦＡＣＳアッセイにおける共刺激分子及びＭＨＣクラスＩＩの発現についてＤＣを分析した（それらの表面マーカー、ＣＤ１ａ、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＨＬＡ−ＤＲの発現データを検証した、データ不図示）。適切な比のＣＤ４＋Ｔ細胞及びＤＣを９６ウェルプレートのウェルに播種し、検査抗体で処理した。アッセイプレートを３７℃／５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間インキュベートし、ヒトＩＬ２  ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６４ＩＬ２ＰＥＢ）を用いて、細胞が放出したＩＬ−２を測定した。結果を図１２に示す。
【０３９４】
ＴＩＧＩＴ／ＣＤ１５５遮断レポーターアッセイ及びＩＬ−２放出アッセイは、実施例２及び実施例４に記載の方法にそれぞれ従って実施した。結果を図１３、図１４にそれぞれ示す。
【０３９５】
上記のインビトロ細胞ベース機能性アッセイの全ての結果を表１７にまとめた。ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、それらの親エレメントのモノクローナル抗体（抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ）、及び対応するアイソタイプを有する抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、同等または僅かに減少したインビトロ機能を示した。
表１７．ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰのインビトロ機能性アッセイ
【表１７−１】
2021508469.tif 000023
【表１７−２】
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【０３９６】
ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ細胞ベース二機能性レポーターアッセイ：ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ１５５標的細胞（ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１５５を発現する細胞）を一晩培養した後、連続希釈の検査試料でインキュベートし、その後、ＰＤ−１／ＴＩＧＩＴエフェクター細胞（ＰＤ−１及びＴＩＧＩＴを発現する細胞）を適切なＥ：Ｔ比で加えた。３７℃、５％ＣＯ２での誘導の６時間後、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を加え、発光を判断し、エフェクター細胞活性化を表した。
【０３９７】
図１５に示すように、ｈ５３Ｃ１は、ＰＤ−Ｌ１を遮断することによって、Ｔ細胞においてＩＬ−２発現を誘導することができた。低用量と高用量の間の効果の差異は最小であった。ＴＩＧＩＴ遮断剤であるＡＳ１９５８４−Ｆｃ（ＩｇＧ１または不活性ＩｇＧ１）のみは、アッセイ条件においてＴ細胞を活性化することができない。比較して、ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ（ＢＴＰ−４及びＢＴＰ−５）は、それらの親エレメントのモノクローナル抗体（抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ）、及び対応するアイソタイプを有する抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、エフェクター細胞におけるＩＬ−２発現を誘導することによってＴ細胞機能を増強させる能力が優れていることを示した。ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの効果は、対応する組み合わせ（ｈ５３Ｃ１＋ＡＳ１９５８４−Ｆｃ、ＩｇＧ１または不活性ＩｇＧ１  Ｆｃ断片のいずれかを有する）のものに匹敵した。
【０３９８】
実施例７：ＰＤ−Ｌ１及びＴＩＧＩＴを標的化するＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰのインビボ効力
ＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１腫瘍モデルを担持するＣ５７ＢＬ／６ヒトＰＤ−１ノックイン（ＫＩ）マウスの効力研究
ＭＣ３８腫瘍細胞におけるマウスＰＤ−Ｌ１遺伝子をノックアウトして、ヒトＰＤ−Ｌ１は、レンチウイルス形質導入によって安定して発現された。生成したＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１細胞を培養し、マグネシウム−及びカルシウムを含まないＨＢＳＳ−／−中に懸濁させて、１×１０６個の細胞を、６〜８週齢の雌のＣ５７ＢＬ／６  ヒトＰＤ−１  ＫＩマウス（Ｂｉｏｃｙｔｏｇｅｎ）の脇腹に皮下注射し、ここで、ネズミＰＤ−１遺伝子の細胞外ドメインは、ヒト対応物に置き換えている。腫瘍体積は、キャリパーを用いて測定し、式：（長さ×幅×幅）／２で算出した。平均腫瘍体積が９０〜１００ｍｍ３に到達した場合、マウスを無作為化して、処置を開始した。被験物質を、腹腔内（ｉ．ｐ．）を介して３回投与した。研究全体を通じて体重を測定した。
【０３９９】
図１６Ａ及び１６Ｂに示すように、ｈ５３Ｃ１及びＡＳ１９５８４−Ｆｃ（野生型ＩｇＧ１を有する）のみは両方とも、ＰＤ−Ｌ１及びＴＩＧＩＴをそれぞれ遮断することによって、ＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１腫瘍成長を適度に遅れさせたが、統計的有意性はなかった。ｈ５３Ｃ１及びＡＳ１９５８４−Ｆｃの併用療法は、いずれかの単剤療法の効力を改善させず、一部の動物は、非応答であった。しかしながら、ＢＴＰ−５を受けた動物は、腫瘍成長が一貫して遅れ、ＰＯＣ  ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰが、インビボでの単剤療法のいずれか及び併用療法より良い治療効力を有することを示した。
【０４００】
実施例８：ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの生成
ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの構築
この実施例は、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの構造を説明する。
【０４０１】
ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ  ＡＳ１９５８４ＶＨ２８は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナルＡｂ  ｈ５３Ｃ１の重鎖Ｎ末端、重鎖Ｃ末端、軽鎖Ｎ末端、または軽鎖Ｃ末端に融合されて、リンカーとして変異型ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジを介して、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ  ＢＴＰ−１５、ＢＴＰ−１６、ＢＴＰ−１７、及びＢＴＰ−１８をそれぞれ生成した。ｈ５３Ｃ１の重鎖は、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。ＢＴＰ−１５、ＢＴＰ−１６、ＢＴＰ−１７、及びＢＴＰ−１８は、図１７、図１８、図１９、及び図２０に示す例示的な構造をそれぞれ有する。
【０４０２】
ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ  ＡＳ１９５８４ＶＨ２８は、抗ＰＤ−１抗体の重鎖Ｎ末端、重鎖Ｃ末端、軽鎖Ｎ末端、または軽鎖Ｃ末端に融合されて、リンカーとして変異型ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジを介して、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰを生成した。抗ＰＤ−１抗体の重鎖は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む。ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、図１７〜２０に示す例示的な構造を有する。
【０４０３】
実施例９：ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの生成及び特徴付け
ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの構築
この実施例は、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ及びＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの構造を説明する。
【０４０４】
ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ  ＡＳ１９５８４ＶＨ２８は、抗ＰＤ−１モノクローナルＡｂ  ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎの重鎖Ｎ末端、重鎖Ｃ末端、軽鎖Ｎ末端、または軽鎖Ｃ末端に融合されて、リンカーとして変異型ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジを介して、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ  ＢＴＰ−１１、ＢＴＰ−１２、ＢＴＰ−１３、及びＢＴＰ−１４をそれぞれ生成した。ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎの重鎖は、ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域を含む。ＢＴＰ−１１、ＢＴＰ−１２、ＢＴＰ−１３、及びＢＴＰ−１４は、図１７、図１８、図１９、及び図２０に示す例示的な構造をそれぞれ有する。
【０４０５】
ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ  ＡＳ１９５８４ＶＨ２８は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナルＡｂ  ｈ５３Ｃ１の重鎖Ｎ末端、重鎖Ｃ末端、軽鎖Ｎ末端、または軽鎖Ｃ末端に融合されて、リンカーとして変異型ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジを介して、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ  ＢＴＰ−１５、ＢＴＰ−１６、ＢＴＰ−１７、及びＢＴＰ−１８をそれぞれ生成した。ｈ５３Ｃ１の重鎖は、野生型ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。ＢＴＰ−１５、ＢＴＰ−１６、ＢＴＰ−１７、及びＢＴＰ−１８は、図１７、図１８、図１９、及び図２０に示す例示的な構造をそれぞれ有する。
【０４０６】
ヒト化抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ  ＡＳ１９５８４ＶＨ２８は、抗ＰＤ−Ｌ１モノクローナルＡｂ  ｈ５３Ｃ１の重鎖Ｎ末端または軽鎖Ｎ末端に融合されて、リンカーとして変異型ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジを介して、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ  ＢＴＰ−２１及びＢＴＰ−２２をそれぞれ生成した。ｈ５３Ｃ１の重鎖は、不活性ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域を含む。ＢＴＰ−２１及びＢＴＰ−２２は、図１７及び図１９に示す例示的な構造をそれぞれ有する。
【０４０７】
ＢＡＢＰの親和性決定
ヒトＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ヒトＴＩＧＩＴ、及びマウスＴＩＧＩＴに対するＢＡＢＰの親和性は、上述のように評価した。結果を表１８にまとめた。簡単に言えば、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰをその親エレメント（抗ＰＤ−１Ａｂ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質）と比較するため、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８−Ｆｃ融合タンパク質は、対照として、野生型ヒトＩｇＧ４  Ｆｃで産生した。ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰをその親エレメント（抗ＰＤ−Ｌ１  Ａｂ及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質）と比較するため、ｈ５３Ｃ１及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８−Ｆｃ融合タンパク質は、対照として、エフェクターレスヒトＩｇＧ１（不活性ｈＩｇＧ１）で産生した。ヒト及びマウスＴＩＧＩＴ−Ｈｉｓ、及びヒトＰＤ−１及びＰＤ−Ｌ１は、Ａｃｒｏｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入した。ＰＤ−１ｘＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの親和性は、実施例２に記載のように試験し、データを表１８に示す。ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの両方は、それらのそれぞれの親エレメント：対応するアイソタイプを有するモノクローナル抗体及び抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、標的タンパク質に対する親和性が、同程度であるかまたはほんの少しだけ低下している。
表１８．ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの親和性決定
【表１８−１】
2021508469.tif 000025
【表１８−２】
2021508469.tif 000026
【０４０８】
ＦＡＣＳ分析によるリガンド結合のＣＨＯ−ＴＩＧＩＴ、ＣＨＯ−ＰＤ−１またはＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞結合及び阻害
ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰが、ＣＨＯ細胞上で発現したＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１またはＴＩＧＩＴに結合する能力、及び、ＣＨＯ−ＰＤ−Ｌ１細胞へのＰＤ−１の結合、ＣＨＯ−ＰＤ−１細胞へのＰＤ−Ｌ１の結合、またはＣＨＯ−ＴＩＧＩＴ細胞へのＣＤ１５５の結合を遮断するそれらの能力は、実施例２に記載されるように評価した。２２Ｇ２（ＩｇＧ１）は、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体であり、公開配列に従って発現される。Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ（臨床試験における抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体）、デュルバルマブ及びアテゾリズマブ（両方とも市販の抗ＰＤ−Ｌ１抗体として）は、それらの公開配列に従って発現され、追加の対照として使用した。結果を表１９にまとめる。ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、それらの親エレメントのモノクローナル抗体（抗ＰＤ−１Ａｂ、ＰＤ−１−ＢＭ−ｍｉｎ）、及び対応するアイソタイプを有する抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、標的細胞結合及びリガンド遮断能力が同等またはほんの僅かに減少している。ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、それらの親エレメントのモノクローナル抗体（抗ＰＤ−Ｌ１Ａｂ、ｈ５３Ｃ１）、及び対応するアイソタイプを有する抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、標的細胞結合及びリガンド遮断能力が同等またはほんの僅かに減少している。
表１９．ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの結合及び遮断データ
【表１９−１】
2021508469.tif 000027
【表１９−２】
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【０４０９】
インビトロ機能性アッセイ
ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰのインビトロ機能は、実施例２、４及び６に記載されたものと同様に、ＴＩＧＩＴに対するＰＤ−１細胞ベースアッセイ、ＰＤ−Ｌ１細胞ベースアッセイ、ＴＩＧＩＴ細胞ベースレポーターアッセイ及びＩＬ−２放出アッセイによって分析した。２２Ｇ２（ＩｇＧ１）は、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体であり、公開配列に従って発現される。Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ（臨床試験における抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体）、デュルバルマブ及びアテゾリズマブ（両方とも市販の抗ＰＤ−Ｌ１抗体として）は、それらの公開配列に従って発現され、追加の対照として使用した。結果を表２０にまとめる。ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰは、それらの親エレメントのモノクローナル抗体（それぞれ、ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ及びｈ５３Ｃ１）、及び対応するアイソタイプを有する抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ−Ｆｃ融合タンパク質と比較して、同等またはほんの僅かに減少したインビトロ機能を示した。ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ  ＢＴＰ−２１及びＢＴＰ−２２は、市販の抗ＴＩＧＩＴ抗体Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂと比較して、さらに良好なＴＩＧＩＴ遮断機能を呈した。
表２０．ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰ及びＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰのインビトロ機能性アッセイ
【表２０−１】
2021508469.tif 000029
【表２０−２】
2021508469.tif 000030
【０４１０】
ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二機能性レポーターアッセイ：ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１経路及びＣＤ１５５／ＴＩＧＩＴ経路を同時に標的化することによって、ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰまたはＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰがＴ細胞を相乗的に活性化する能力を評価するため、ＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二機能性レポーターアッセイを実施例６に記載のように実施した。簡単に言えば、ＰＤ−Ｌ１／ＣＤ１５５標的細胞（ＰＤ−Ｌ１及びＣＤ１５５を発現する細胞）を一晩培養した後、連続希釈の検査試料でインキュベートし、その後、ＰＤ−１／ＴＩＧＩＴエフェクター細胞（ＰＤ−１及びＴＩＧＩＴを発現する細胞）を適切なＥ：Ｔ比で加えた。３７℃、５％ＣＯ２での誘導の６時間後、Ｏｎｅ−Ｇｌｏ（商標）ルシフェラーゼアッセイ試薬を加え、発光を判断し、エフェクター細胞活性化を表した。２２Ｇ２（ＩｇＧ１）は、抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体であり、公開配列に従って発現される。Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ（臨床試験における抗ＴＩＧＩＴモノクローナル抗体）、ペンブロリズマブ（市販の抗ＰＤ−１モノクローナル抗体；Ｐｅｍｂｒｏと略称する）、デュルバルマブ及びアテゾリズマブ／テセントリク（登録商標）（両方とも市販の抗ＰＤ−Ｌ１抗体として）は、それらの公開配列に従って発現され、追加の対照として使用した。図２７Ａ〜２７Ｃから分かるように、抗ＰＤ−１、抗ＰＤ−Ｌ１、または抗ＴＩＧＩＴ  Ａｂを用いる単剤療法は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１及びＣＤ１５５／ＴＩＧＩＴ経路を同時に効果的に遮断して、エフェクター細胞活性化を惹起することができなかった。ＢＴＰ−１１、ＢＴＰ−１３（図２７Ａに示すように）、ＢＴＰ−１５、ＢＴＰ−１７（図２７Ｂに示すように）、ＢＴＰ−２１及びＢＴＰ−２２（図２７Ｃ及び表２１に示すように）は、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１及び／またはＣＤ１５５／ＴＩＧＩＴ経路を遮断することによって、レポーター細胞におけるシグナルを相乗的に惹起し、試験した単剤療法のいずれかと比較して、最大シグナルの劇的な増加を示した。ＢＴＰ−１１及びＢＴＰ−１３はさらに、ペンブロリズマブ（抗ＰＤ−１）及び２２Ｇ２（抗ＴＩＧＩＴ）併用療法と比較して、優れたエフェクター細胞活性化機能を呈した（図２７Ａ）。ＢＴＰ−２１及びＢＴＰ−２２  ＢＡＢＰは、Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ＋アテゾリズマブまたはＴｉｒａｇｏｌｕｍａｂ＋デュルバルマブ併用療法のものと比較して、同等またはさらに良い（ＢＴＰ−２２）同時のＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１及びＣＤ１５５／ＴＩＧＩＴ遮断活性を示した（図２７Ｃ）。
表２１．ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰのＰＤ−Ｌ１／ＴＩＧＩＴ二機能性レポーターアッセイ
【表２１−１】
2021508469.tif 000031
【表２１−２】
2021508469.tif 000032
【０４１１】
初代Ｔ細胞結合：ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰが初代細胞に結合する能力を評価するため、ＣＤ８＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９６−４９５）またはＣＤ４＋Ｔ細胞単離キット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９６−５３３）のいずれかでヒト初代Ｔ細胞をＰＢＭＣ（ＨｅｍａＣａｒｅ）から単離した。単離したＴ細胞を活性化し、Ｔ細胞活性化／拡張キットで拡張した（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ、カタログ番号１３０−０９２−９１９）。実施例２に記載のようにＦＡＣＳ分析を行い、ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰの、活性化ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞のそれぞれへの結合を判断した。図２８Ａ及び２８Ｂに示すように、ＢＴＰ−２１は、基準抗体または親抗体に匹敵する、一次ＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞に対する強力な結合能力を実証した。
【０４１２】
ＰＢＭＣ  ＩＦＮ−γ放出アッセイ：健康なドナー由来の新しく解凍したヒトＰＢＭＣ（ＨｅｍａＣａｒｅ）を、勾配濃度の被験物質の存在下で、３７℃、５％  ＣＯ２でのインキュベーターにおいて、１０％ＦＢＳが補充されたＲＰＭＩ  １６４０培地中で３：１の比で、ＰＤ−Ｌ１標的細胞（ＧＳ−Ｃ２／ＰＤ−Ｌ１、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ、カタログ番号Ｍ００６１３）と７２時間共培養した。その後、細胞をスピンダウンし、上清を回収して、ヒトＩＦＮ−γ  ＨＴＲＦキット（Ｃｉｓｂｉｏ、カタログ番号６２ＨＩＦＮＧＰＥＨ）及びＰＨＥＲＡｓｔａｒＰｌｕｓマシン（ＢＭＧ  Ｌａｂｔｅｃｈ）を用いてＩＦＮ−γ濃度を判断した。研究は、３人の異なるドナーで実施した。ＢＴＰ−２１が、基準抗体及び親抗体に匹敵するＥＣ５０を有した一方、サイトカイン放出誘導のその最大潜在性は、他のＰＤ−Ｌ１抗体におけるものよりもＢＴＰ−２１において一貫して高かったことを結果は示した（図２９）。
【０４１３】
ＰＤ−１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰのインビボ効力研究
ＢＴＰ−１１のインビボ抗腫瘍活性は、ヒトＰＤ−１  ＫＩを有するＢａｌｂ／ｃマウスで確立した（ネズミＣＤ１５５を発現する）同系ＣＴ２６大腸がんモデルで評価した。このＣＴ２６腫瘍モデルは、実施例３のように構築した。腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に到達した場合、動物は処置を受け始めた。被験物質を、腹腔内（ｉ．ｐ．）を介して４日に一度投与した。研究全体を通じて体重を測定した。腫瘍体積が１０ｍｍ３未満の動物は、無腫瘍（ＴＦ）と見なした。
【０４１４】
図３０に示すように、ＣＴ２６腫瘍モデルは、抗ＴＩＧＩＴモノ遮断（ＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＩｇＧ４を参照）に部分的な耐性を示し、８匹のうち１匹のマウスのみが無腫瘍を得られた。抗ＰＤ−１抗体（ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ）のみは、１０ｍｇ／ｋｇでＰＤ−１  ＫＩマウスにおけるＣＴ２６腫瘍成長を適度に阻害し、８匹のうち３匹のマウスが無腫瘍を得られた。ＢＴＰ−１１は、同じモル用量（１２．３３ｍｇ／ｋｇ）で腫瘍退縮を引き起こす優れた効果を実証し、８匹のうち５匹のマウスが無腫瘍を得られた。この効果は、同じモル用量（それぞれ、１０ｍｇ／ｋｇ及び５．３３ｍｇ／ｋｇ）でＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ＩｇＧ４を用いた併用療法（８匹のうち１匹のマウスのみの無腫瘍が得られた）よりもさらに良好であった。
【０４１５】
ＰＤ−Ｌ１×ＴＩＧＩＴ  ＢＡＢＰのインビボ効力研究
ＢＴＰ−２１のインビボ抗腫瘍活性を評価するため、ヒトＰＤ−Ｌ１（ＭＣ３８−ｈＰＤＬ１）を過剰発現するネズミＭＣ３８大腸がん細胞を、実施例３に記載されたものと同様に、Ｃ５７ＢＬ／６ヒトＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１ダブルＫＩマウスに移植した。アテゾリズマブ（市販の抗ＰＤ−Ｌ１抗体）は、公開配列に従って発現され、追加の対照として使用した。腫瘍サイズが約１００ｍｍ３に到達した場合、動物を無作為化して処置した。被験物質を、腹腔内（ｉ．ｐ．）を介して、０、４、６、及び８日目に投与した。研究全体を通じて体重を測定した。
【０４１６】
図３１から分かるように、アテゾリズマブ及びｈ５３Ｃ１（不活性ＩｇＧ１）モノ遮断は両方とも、５ｍｇ／ｋｇでＭＣ３８−ｈＰＤ−Ｌ１腫瘍成長を阻害することができ、処置後３０日目に、８匹のうち４匹のマウス、及び８匹のうち３匹のマウスが無腫瘍をそれぞれ得られた。２．６７ｍｇ／ｋｇでのＡＳ１９５８４ＶＨ２８不活性ＩｇＧ１を用いたモノ遮断は、８匹のうち４匹の無腫瘍マウスが得られた。ＢＴＰ−２１及び（ｈ５３Ｃ１（不活性ＩｇＧ１）及びＡＳ１９５８４ＶＨ２８不活性ＩｇＧ１の）併用療法は、より高い率の無腫瘍マウス（それぞれ、８匹のうち６匹、及び７匹のうち６匹）を示した。ＢＴＰ−２１及び併用療法が、試験したいずれの単剤療法よりも無腫瘍状態の始まりが遥かに速かったことも注目に値する。ＢＴＰ−２１処置群または併用療法処置群の最も早い応答者は、処置後１０〜１５日の間に無腫瘍状態に到達した一方、単剤療法群は、いずれかのマウスが無腫瘍状態に到達するまで２０〜２５日かかった。さらに、ＢＴＰ−２１は、高用量（６．１７ｍｇ／ｋｇ）または同じモル用量の併用療法（５ｍｇ／ｋｇのｈ５３Ｃ１＋２．６７ｍｇ／ｋｇのＡＳ１９５８４ＶＨ２８不活性ＩｇＧ１）でＢＴＰ−２１を投与した場合と比較して、低用量（２．０６ｍｇ／ｋｇ）で同様の優れた治療効果を実証した（図３１）。
【０４１７】
上記の研究は、本明細書に記載のＢＡＢＰが、ＰＤ−Ｌ１／ＰＤ−１及びＣＤ１５５／ＴＩＧＩＴ経路を同時に遮断することによって、ヒト化標的を担持するマウス腫瘍モデルにおいて、２つの経路のいずれかを標的化する単剤療法と比較して、優れた抗腫瘍活性を示したことを実証した。
【０４１８】
配列表
表２２．抗ＴＩＧＩＴ  ｓｄＡｂ配列番号
【表２２】
2021508469.tif 000033
配列番号２４６（ＡＳ１９５８４  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＡＧＴＡＣＧＧＴＧＴＣＴＡＣＴＣＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＴＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＴＣＧＣＡＧＣＣＡＴＴＴＧＴＡＧＴＧＧＣＧＧＴＡＧＡＡＣＣＡＣＡＴＡＣＴＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＧＣＣＡＡＣＣＡＡＡＴＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡＣＡＧＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＡＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＣＧＡＣＣＴＣＴＡＴＧＧＡＣＴＧＧＧＧＡＣＴＧＣＧＡＴＴＴＡＡＧＣＴＣＡＴＣＴＴＧＧＴＡＴＡＡＡＡＣＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２４７（ＡＳ１９８５２  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＣＧＧＴＡＧＴＣＧＣＣＧＧＴＡＴＧＴＧＧＣＡＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＧＴＧＴＣＧＣＡＣＧＡＣＴＣＡＴＴＡＣＴＧＡＴＡＧＴＧＧＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＣＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＡＡＧＡＡＴＴＡＧＣＡＣＣＡＧＣＴＣＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＡＴＴＴＧＧＴＴＴＧＧＴＧＧＡＣＧＧＴＡＣＴＴＣＡＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２４８（ＡＳ１９８５８  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＡＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＡＣＧＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＧＴＡＣＡＧＡＣＡＧＡＡＡＴＧＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＴＣＧＣＡＧＣＧＡＴＴＴＡＴＡＣＴＴＣＴＧＴＴＧＧＴＧＧＴＡＧＴＡＧＧＡＣＡＴＡＣＧＴＴＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＣＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＡＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＣＡＡＧＡＧＴＣＣＧＴＡＣＧＡＴＧＧＴＧＣＡＴＧＣＴＣＴＴＡＣＧＡＡＧＣＴＧＡＣＴＴＴＡＣＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２４９（ＡＳ１９８８６  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＴＣＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＴＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＴＡＧＴＡＧＧＡＡＡＴＧＴＡＧＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＴＣＧＣＧＡＣＴＣＴＴＴＡＴＡＣＴＡＧＴＴＣＡＧＧＧＧＧＧＡＣＡＴＡＴＴＴＴＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＧＧＧＧＣＣＧＧＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＧＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＧＧＡＧＧＡＣＡＧＴＧＧＣＡＴＡＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＣＧＣＣＴＧＡＧＴＡＣＧＧＡＣＴＴＴＴＧＣＧＧＡＣＣＡＡＧＡＧＣＴＧＡＣＴＴＴＧＡＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２５０（ＡＳ１９８８７  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＧＣＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＴＣＡＣＣＴＣＣＧＡＴＡＧＴＴＡＣＣＡＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＴＣＧＣＡＧＴＴＡＴＴＡＡＡＡＣＴＧＧＴＧＡＴＧＣＣＡＧＣＡＣＡＴＡＣＴＡＴＡＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＡＡＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＣＴＧＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＡＧＡＣＧＧＧＧＴＴＧＧＧＴＧＣＣＧＧＣＴＣＣＣＣＴＣＴＣＧＣＡＡＴＡＴＡＡＴＴＡＴＡＡＣＴＡＴＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２５１（ＡＳ１９８８８  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＣＡＧＧＴＧＣＡＡＣＴＧＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＡＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＴＴＣＣＴＧＴＧＡＡＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＴＧＧＣＣＧＣＣＡＧＴＧＧＣＴＡＣＴＧＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＡＡＧＧＧＴＣＧＣＡＧＣＴＡＴＴＡＧＴＡＧＴＡＡＴＧＡＴＣＴＡＧＴＴＧＣＴＴＡＣＧＣＡＧＡＣＴＣＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＡＡＧＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＡＧＡＣＣＡＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＡＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＡＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＴＧＧＡＧＧＴＴＡＴＧＧＴＧＧＴＴＡＣＴＧＣＧＧＡＣＧＧＴＴＧＣＧＡＣＣＴＧＧＣＡＣＴＧＧＴＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２５２（ＡＳ２０１６０  ｓｄＡｂ核酸配列）
ＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＣＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＣＧＧＴＧＣＡＧＧＣＴＧＧＡＧＧＧＴＣＴＣＴＧＡＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＴＡＣＡＡＣＣＴＣＴＧＧＡＴＡＣＡＣＣＴＡＣＡＧＴＣＧＣＡＡＣＴＧＣＡＴＧＧＧＣＴＧＧＴＴＣＣＧＣＣＡＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＡＧＣＧＣＧＡＧＧＧＧＧＴＣＧＣＡＡＣＴＡＴＴＴＡＴＧＴＡＡＧＴＧＣＴＧＣＡＡＧＣＡＣＡＡＧＣＴＴＴＧＣＣＡＣＡＴＡＴＧＣＣＧＡＣＴＣＣＧＴＡＡＡＧＧＧＣＣＧＡＴＴＣＡＣＣＡＴＣＴＣＣＣＴＡＧＡＣＡＡＧＧＣＣＡＡＧＡＡＣＡＣＧＧＴＡＴＡＴＣＴＧＣＡＡＡＴＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＡＣＣＴＧＡＧＧＡＣＡＣＴＧＣＣＡＴＧＴＡＣＴＡＣＴＧＴＧＣＧＧＣＡＧＡＴＣＣＣＣＣＣＧＡＴＣＧＴＡＴＣＴＣＧＡＡＣＣＣＣＴＧＣＧＧＡＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＴＧＡＣＴＴＴＧＧＡＴＡＣＴＧＧＧＧＣＣＡＧＧＧＡＡＣＣＣＡＧＧＴＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＴＣＡ
配列番号２５３（ＡＳ１９５８４  ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化１】
2021508469.tif 000034
配列番号２５４（ＡＳ１９８５２  ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化２】
2021508469.tif 000035
配列番号２５５（ＡＳ１９８５８  ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化３】
2021508469.tif 000036
配列番号２５６（ＡＳ１９８８６  ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化４】
2021508469.tif 000037
配列番号２５７（ＡＳ１９８８７  ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化５】
2021508469.tif 000038
配列番号２５８（ＡＳ１９８８８  ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化６】
2021508469.tif 000039
配列番号２５９（ＡＳ２０１６０  ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化７】
2021508469.tif 000040
配列番号２７１（ＡＳ１９５８４ＶＨ２６ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化８】
2021508469.tif 000041
配列番号２７３（ＡＳ１９５８４ＶＨ２８ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化９】
2021508469.tif 000042
配列番号２７４（ＡＳ１９５８４ＶＨ２９ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化１０】
2021508469.tif 000043
配列番号２７５（ＡＳ１９５８４ＶＨ３０ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化１１】
2021508469.tif 000044
配列番号２７６（ＡＳ１９５８４ＶＨ３１ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化１２】
2021508469.tif 000045
配列番号２８０（ＡＳ１９８８６ＶＨ５ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化１３】
2021508469.tif 000046
配列番号２８２（ＡＳ１９８８６ＶＨ８ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化１４】
2021508469.tif 000047
配列番号２８３（ＡＳ１９８８６ＶＨ９ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化１５】
2021508469.tif 000048
配列番号２８４（ＡＳ１９８８６ＶＨ１０ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化１６】
2021508469.tif 000049
配列番号２８６（ＡＳ１９８８６ＶＨ１９ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化１７】
2021508469.tif 000050
配列番号２８７（ＡＳ１９８８６ＶＨ２０ヒト化ｓｄＡｂアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化１８】
2021508469.tif 000051
配列番号２８８（ＡＳ１９５８４  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化１９】
2021508469.tif 000052
配列番号２８９（ＡＳ１９８５２  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化２０】
2021508469.tif 000053
配列番号２９０（ＡＳ１９８５８  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化２１】
2021508469.tif 000054
配列番号２９１（ＡＳ１９８８６  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化２２】
2021508469.tif 000055
配列番号２９２（ＡＳ１９８８７  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化２３】
2021508469.tif 000056
配列番号２９３（ＡＳ１９８８８  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化２４】
2021508469.tif 000057
配列番号２９４（ＡＳ２０１６０  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化２５】
2021508469.tif 000058
配列番号３０６（ＡＳ１９５８４ＶＨ２６  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化２６】
2021508469.tif 000059
配列番号３０８（ＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化２７】
2021508469.tif 000060
配列番号３０９（ＡＳ１９５８４ＶＨ２９  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化２８】
2021508469.tif 000061
配列番号３１０（ＡＳ１９５８４ＶＨ３０  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化２９】
2021508469.tif 000062
配列番号３１１（ＡＳ１９５８４ＶＨ３１  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化３０】
2021508469.tif 000063
配列番号３１５（ＡＳ１９８８６ＶＨ５  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化３１】
2021508469.tif 000064
配列番号３１７（ＡＳ１９８８６ＶＨ８  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化３２】
2021508469.tif 000065
配列番号３１８（ＡＳ１９８８６ＶＨ９  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化３３】
2021508469.tif 000066
配列番号３１９（ＡＳ１９８８６ＶＨ１０  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化３４】
2021508469.tif 000067
配列番号３２１（ＡＳ１９８８６ＶＨ１９  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化３５】
2021508469.tif 000068
配列番号３２２（ＡＳ１９８８６ＶＨ２０  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化３６】
2021508469.tif 000069
配列番号３２３（ｈ５３Ｃ１（ＩｇＧ１）ｍＡｂ＿ＨＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化３７】
2021508469.tif 000070
配列番号３２４（ヒトＩｇＧ４（ｈＩｇＧ４）ヒンジアミノ酸配列）
ＥＳＫＹＧＰＰＣＰＰＣＰ
配列番号３２５（キイトルーダバイオシミラー（ＩｇＧ４）ｍＡｂ＿ＨＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化３８】
2021508469.tif 000071
配列番号３２６（キイトルーダバイオシミラー（ＩｇＧ４）ｍＡｂ＿ＬＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化３９】
2021508469.tif 000072
配列番号３２７（ｈ５３Ｃ１（ＩｇＧ１）ｍＡｂ＿ＨＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化４０】
2021508469.tif 000073
配列番号３２８（ｈ５３Ｃ１（ＩｇＧ１）ｍＡｂ＿ＬＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化４１】
2021508469.tif 000074
配列番号３２９（ｈ５３Ｃ１（不活性ＩｇＧ１）ｍＡｂ＿ＨＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化４２】
2021508469.tif 000075
配列番号３３０（ｈ５３Ｃ１（不活性ＩｇＧ１）ｍＡｂ＿ＬＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化４３】
2021508469.tif 000076
配列番号３３１（テセントリクバイオシミラー（ＩｇＧ１）ｍＡｂ＿ＨＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化４４】
2021508469.tif 000077
配列番号３３２（テセントリクバイオシミラー（ＩｇＧ１）ｍＡｂ＿ＬＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化４５】
2021508469.tif 000078
配列番号３３３（テセントリクバイオシミラー（不活性ＩｇＧ１）ｍＡｂ＿ＨＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化４６】
2021508469.tif 000079
配列番号３３４（テセントリクバイオシミラー（不活性ＩｇＧ１）ｍＡｂ＿ＬＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化４７】
2021508469.tif 000080
配列番号３３５（２２Ｇ２（ＩｇＧ１）ｍＡｂ＿ＨＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化４８】
2021508469.tif 000081
配列番号３３６（２２Ｇ２（ＩｇＧ１）ｍＡｂ  ＿ＬＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化４９】
2021508469.tif 000082
配列番号３３７（１０Ａ７  ｍＡｂ＿ＨＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化５０】
2021508469.tif 000083
配列番号３３８（１０Ａ７  ｍＡｂ＿ＬＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化５１】
2021508469.tif 000084
配列番号３３９（ｈ５３Ｃ１  ＶＨアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化５２】
2021508469.tif 000085
配列番号３４０（ｈ５３Ｃ１  ＶＬアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化５３】
2021508469.tif 000086
配列番号３４９（ｈ５３Ｃ１  ＨＣ−ＣＤＲ１アミノ酸配列）
ＧＹＩＦＴＧＹＧＩＴ
配列番号３５０（ｈ５３Ｃ１  ＨＣ−ＣＤＲ２アミノ酸配列）
ＥＩＦＰＲＲＶＱＴＹＹＳＥＫＦＫＧ
配列番号３５１（ｈ５３Ｃ１  ＨＣ−ＣＤＲ３アミノ酸配列）
ＤＹＤＰＹＦＡＬＤＹ
配列番号３５２（ｈ５３Ｃ１  ＬＣ−ＣＤＲ１アミノ酸配列）
ＲＡＳＱＤＶＳＴＡＶＤ
配列番号３５３（ｈ５３Ｃ１  ＬＣ−ＣＤＲ２アミノ酸配列）
ＳＡＳＹＲＹＴ
配列番号３５４（ｈ５３Ｃ１  ＬＣ−ＣＤＲ３アミノ酸配列）
ＱＱＨＹＳＩＰＦＴＦ
配列番号３５５（ヒト不活性ＩｇＧ１  Ｆｃ領域アミノ酸配列）
ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＡＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
配列番号３５６（ヒトＩｇＧ１  Ｆｃ領域アミノ酸配列）
ＡＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＨＥＤＰＥＶＫＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＹＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＲＤＥＬＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＫＬＴＶＤＫＳＲＷＱＱＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＰＧＫ
表２３．抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１及び抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体アミノ酸配列（ｓｄＡｂ配列は下付き、リンカー配列は太字）
【表２３−１】
2021508469.tif 000087
【表２３−２】
2021508469.tif 000088
【表２３−３】
2021508469.tif 000089
配列番号３６５（ＡＳ１９５８４  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（不活性ＩｇＧ１）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き、リンカーは太字）
【化５４】
2021508469.tif 000090
配列番号３６６（ＡＳ１９５８４  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ４）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化５５】
2021508469.tif 000091
配列番号３６７（ＡＳ１９５８４ＶＨ２８  ｓｄＡｂ−Ｆｃ（ＩｇＧ４）融合タンパク質二量体型アミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化５６】
2021508469.tif 000092
配列番号３６８（完全長ヒトＴＩＧＩＴアミノ酸配列、シグナルペプチドを有さない）
ＭＭＴＧＴＩＥＴＴＧＮＩＳＡＥＫＧＧＳＩＩＬＱＣＨＬＳＳＴＴＡＱＶＴＱＶＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨＩＳＰＳＦＫＤＲＶＡＰＧＰＧＬＧＬＴＬＱＳＬＴＶＮＤＴＧＥＹＦＣＩＹＨＴＹＰＤＧＴＹＴＧＲＩＦＬＥＶＬＥＳＳＶＡＥＨＧＡＲＦＱＩＰＬＬＧＡＭＡＡＴＬＶＶＩＣＴＡＶＩＶＶＶＡＬＴＲＫＫＫＡＬＲＩＨＳＶＥＧＤＬＲＲＫＳＡＧＱＥＥＷＳＰＳＡＰＳＰＰＧＳＣＶＱＡＥＡＡＰＡＧＬＣＧＥＱＲＧＥＤＣＡＥＬＨＤＹＦＮＶＬＳＹＲＳＬＧＮＣＳＦＦＴＥＴＧ
配列番号３６９（ヒトＴＩＧＩＴアミノ酸配列の細胞外ドメイン）
ＭＭＴＧＴＩＥＴＴＧＮＩＳＡＥＫＧＧＳＩＩＬＱＣＨＬＳＳＴＴＡＱＶＴＱＶＮＷＥＱＱＤＱＬＬＡＩＣＮＡＤＬＧＷＨＩＳＰＳＦＫＤＲＶＡＰＧＰＧＬＧＬＴＬＱＳＬＴＶＮＤＴＧＥＹＦＣＩＹＨＴＹＰＤＧＴＹＴＧＲＩＦＬＥＶＬＥＳＳＶＡＥＨＧＡＲＦＱＩＰ
配列番号３７０（ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジアミノ酸配列）
ＥＰＫＳＣＤＫＴＨＴＣＰＰＣＰ
配列番号３７１（変異型ヒトＩｇＧ１（ｈＩｇＧ１）ヒンジアミノ酸配列）
ＥＰＫＳＳＤＫＴＨＴＳＰＰＳＰ
配列番号３７２（リンカーペプチド（９ＧＳ）アミノ酸配列）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＳ
配列番号３７３（リンカーペプチドアミノ酸配列）
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
配列番号３７４（リンカーペプチドアミノ酸配列、ｎは少なくとも１つの整数）
（Ｇ）ｎ
配列番号３７５（リンカーペプチドアミノ酸配列、ｎは少なくとも１つの整数）
（ＧＳ）ｎ
配列番号３７６（リンカーペプチドアミノ酸配列、ｎは少なくとも１つの整数）
（ＧＳＧＧＳ）ｎ
配列番号３７７（リンカーペプチドアミノ酸配列、ｎは少なくとも１つの整数）
（ＧＧＧＳ）ｎ
配列番号３７８（リンカーペプチドアミノ酸配列、ｎは少なくとも１つの整数）
（ＧＧＧＧＳ）ｎ
配列番号３７９（デュルバルマブＶＨアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化５７】
2021508469.tif 000093
配列番号３８０（デュルバルマブＶＬアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化５８】
2021508469.tif 000094
配列番号３８１（テセントリクＶＨアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化５９】
2021508469.tif 000095
配列番号３８２（テセントリクＶＬアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化６０】
2021508469.tif 000096
配列番号３８３（アベルマブＶＨアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化６１】
2021508469.tif 000097
配列番号３８４（アベルマブＶＬアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化６２】
2021508469.tif 000098
配列番号３８５（キイトルーダＶＨアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化６３】
2021508469.tif 000099
配列番号３８６（キイトルーダＶＬアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化６４】
2021508469.tif 000100
配列番号３８７（オプジーボＶＨアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化６５】
2021508469.tif 000101
配列番号３８８（オプジーボＶＬアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化６６】
2021508469.tif 000102
配列番号３８９（ヒトＩｇＧ４  Ｆｃ領域アミノ酸配列）
ＡＰＥＦＬＧＧＰＳＶＦＬＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＱＥＤＰＥＶＱＦＮＷＹＶＤＧＶＥＶＨＮＡＫＴＫＰＲＥＥＱＦＮＳＴＹＲＶＶＳＶＬＴＶＬＨＱＤＷＬＮＧＫＥＹＫＣＫＶＳＮＫＧＬＰＳＳＩＥＫＴＩＳＫＡＫＧＱＰＲＥＰＱＶＹＴＬＰＰＳＱＥＥＭＴＫＮＱＶＳＬＴＣＬＶＫＧＦＹＰＳＤＩＡＶＥＷＥＳＮＧＱＰＥＮＮＹＫＴＴＰＰＶＬＤＳＤＧＳＦＦＬＹＳＲＬＴＶＤＫＳＲＷＱＥＧＮＶＦＳＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＬＳＬＳＬＧＫ
配列番号３９０（ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ＿ＨＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化６７】
2021508469.tif 000103
配列番号３９１（ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ＿ＬＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化６８】
2021508469.tif 000104
配列番号３９２（Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ＿ＨＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化６９】
2021508469.tif 000105
配列番号３９３（Ｔｉｒａｇｏｌｕｍａｂ＿ＬＣアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化７０】
2021508469.tif 000106
表２４．抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−１及び抗ＴＩＧＩＴ／ＰＤ−Ｌ１二重特異性抗体アミノ酸配列（ｓｄＡｂ配列は下付き、リンカー配列は太字）
【表２４】
2021508469.tif 000107
配列番号４０６（ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ＿ＶＨアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化７１】
2021508469.tif 000108
配列番号４０７（ＰＤ１−ＢＭ−ｍｉｎ＿ＶＬアミノ酸配列；ＣＤＲは下線付き）
【化７２】
2021508469.tif 000109
【図１】
2021508469.tif 000110
【図２】
2021508469.tif 000111
【図３】
2021508469.tif 000112
【図４−１】
2021508469.tif 000113
【図４−２】
2021508469.tif 000114
【図５】
2021508469.tif 000115
【図６】
2021508469.tif 000116
【図７】
2021508469.tif 000117
【図８】
2021508469.tif 000118
【図９】
2021508469.tif 000119
【図１０】
2021508469.tif 000120
【図１１】
2021508469.tif 000121
【図１２】
2021508469.tif 000122
【図１３】
2021508469.tif 000123
【図１４】
2021508469.tif 000124
【図１５】
2021508469.tif 000125
【図１６】
2021508469.tif 000126
【図１７】
2021508469.tif 000127
【図１８】
2021508469.tif 000128
【図１９】
2021508469.tif 000129
【図２０】
2021508469.tif 000130
【図２１】
2021508469.tif 000131
【図２２】
2021508469.tif 000132
【図２３】
2021508469.tif 000133
【図２４】
2021508469.tif 000134
【図２５】
2021508469.tif 000135
【図２６】
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【図２７】
2021508469.tif 000137
【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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