(57)【要約】  本発明は、定義された配列の核酸を検出するための方法、及び前記方法における使用のためのキット及び装置に関する。該方法は、制限酵素、ポリメラーゼ、及びオリゴヌクレオチドプライマーを利用して、標的核酸の存在下で増幅産物を生産する。該増幅産物をオリゴヌクレオチドプローブと接触させてディテクター産物を生産する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中の定義された配列の一本鎖標的核酸の存在を検出するための方法であって：
a) 該試料を：
i. 第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
ii. 鎖置換型DNAポリメラーゼ； 
iii. dNTP；
iv. 1以上の修飾dNTP；
v. ニッキング酵素ではないが、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の第1のプライマー鎖のみを切断することができる、第1の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第1の制限酵素；並びに
vi. ニッキング酵素ではないが、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の該第2のプライマー鎖のみを切断することができる、第2の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第2の制限酵素； 
と接触させて、温度周期変化を用いることなく、該標的核酸の存在下で増幅産物を生産すること；
b) 工程a）の増幅産物を：
i. 該増幅産物中の少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、その検出を可能とする部分と結合されている、第1のオリゴヌクレオチドプローブ；及び
ii. 増幅産物中の該少なくとも1つの種の該第1の一本鎖検出配列の上流又は下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合される、第2のオリゴヌクレオチドプローブ；
と接触させることであって、該増幅産物中の該少なくとも1つの種との該第1及び第2のプローブのハイブリダイゼーションにより、ディテクター種が生産される、前記接触させること；並びに
c) 工程b)で生産された該ディテクター種の存在を検出することであって、該ディテクター種の存在は、該試料における該標的核酸の存在を示す、前記検出すること、
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが、前記DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できない、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記阻止されたオリゴヌクレオチドプローブが、1以上の配列ミスマッチ及び/又は1以上の修飾、例えばホスホロチオエート結合の存在のために前記第1又は第2の制限酵素によって切断されることができなくなる、請求項2記載の方法。
【請求項４】
前記阻止されたオリゴヌクレオチドプローブを工程a)の実施と同時に前記試料と接触させる、請求項2又は3記載の方法。
【請求項５】
前記阻止されたオリゴヌクレオチドプローブが追加の領域を含み、該阻止されたオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする前記増幅産物中の種の3'末端が前記鎖置換型DNAポリメラーゼによって伸長されることができる、請求項2〜4のいずれか1項記載の方法。
【請求項６】
工程a)において前記試料をさらに：（A）5'から3'の方向に前記第1の制限酵素の認識配列及び切断部位並びに前記標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、DNAポリメラーゼによる伸長が3'末端で阻止される、第3のオリゴヌクレオチドプライマー；及び/又は（B) 5'から3'の方向に前記第2の制限酵素の認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、前記DNAポリメラーゼによる伸長が3'末端で阻止される、第4のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる、請求項1〜5のいずれか1項記載の方法。
【請求項７】
存在する場合、前記第3のオリゴヌクレオチドプライマーは前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーより過剰に提供され、かつ存在する場合、前記第4のオリゴヌクレオチドプライマーは前記第2のオリゴヌクレオチドより過剰に提供される、請求項5記載の方法。
【請求項８】
前記1以上の修飾dNTPが、αチオール修飾dNTPである、請求項1〜7のいずれか1項記載の方法。
【請求項９】
前記第1及び第2の制限酵素が同じ制限酵素である、請求項1〜8のいずれか1項記載の方法。
【請求項１０】
工程a)、b)、及びc)のうちの2以上を同時に実施する、請求項1〜9のいずれか1項記載の方法。
【請求項１１】
工程a）を50℃以下の温度で実施する、請求項1〜10のいずれか1項記載の方法。
【請求項１２】
開始周囲温度、例えば15〜30℃の範囲から、40〜50℃の範囲の温度までの増加など、工程a)の実施の間温度を増加させる、請求項1〜11のいずれか1項記載の方法。
【請求項１３】
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの検出を可能とする部分が、比色定量色素若しくは蛍光定量色素、又は比色定量若しくは蛍光定量色素との結合を可能とする部分、例えばビオチンである、請求項1〜12のいずれか1項記載の方法。
【請求項１４】
前記ディテクター種が電気シグナルの変化によって検出される、請求項1〜13のいずれか1項記載の方法。
【請求項１５】
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの検出を可能とする部分が、基質との接触後に検出可能なシグナル、例えば比色定量若しくは蛍光シグナルを生じる酵素である、請求項1〜14のいずれか1項記載の方法。
【請求項１６】
前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能とする部分が、一本鎖オリゴヌクレオチドである、請求項1〜15のいずれか1項記載の方法。
【請求項１７】
一本鎖オリゴヌクレオチド部分の配列は、2〜4塩基のDNA配列モチーフの3以上の反復コピーを含む、請求項16記載の方法。
【請求項１８】
工程c)において前記ディテクター種の存在が核酸ラテラルフローによって検出される、請求項1〜17のいずれか1項記載の方法。
【請求項１９】
前記核酸ラテラルフローが、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能にする部分との配列特異的ハイブリダイゼーションを可能とする1以上の核酸を利用する、請求項18記載の方法。
【請求項２０】
工程c)によりカーボン又は金、好ましくはカーボンを使用して比色定量又は電気化学的シグナルが生成される、請求項1〜19のいずれか1項記載の方法。
【請求項２１】
前記第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、前記制限酵素認識配列及び前記切断部位の上流の、例えば5又は6塩基長の安定化配列を含む、請求項1〜20のいずれか1項記載の方法。
【請求項２２】
前記第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイズ領域が、9〜16塩基長である、請求項1〜21のいずれか1項記載の方法。
【請求項２３】
前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方を、他方のプライマーより過剰に提供する、請求項1〜22のいずれか1項記載の方法。
【請求項２４】
前記標的核酸中の前記第1及び第2のハイブリダイゼーション配列が0〜15塩基により隔てられている、請求項1〜23のいずれか1項記載の方法。
【請求項２５】
前記標的核酸中の前記第1及び第2のハイブリダイゼーション配列が3〜15塩基により隔てられている、請求項1〜24のいずれか1項記載の方法。
【請求項２６】
工程b)において前記増幅産物中の前記少なくとも1つの種の前記第1又は第2の一本鎖検出配列が、請求項24で定義した3〜15塩基に対応する少なくとも3塩基の配列を含む、請求項1〜25のいずれか1項記載の方法。
【請求項２７】
前記試料中の前記標的核酸のレベルを工程c)で定量化する、請求項1〜26のいずれか1項記載の方法。
【請求項２８】
前記標的核酸が二本鎖RNA由来一本鎖RNA及び二本鎖DNA由来一本鎖RNAを含む、一本鎖RNA、又は、一本鎖RNA由来一本鎖DNA及び二本鎖DNA由来一本鎖DNAを含む、一本鎖DNAである、請求項1〜27のいずれか1項記載の方法。
【請求項２９】
一本鎖標的核酸が、鎖侵入により二本鎖DNAから得た一本鎖DNA である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
前記一本鎖DNAが、ヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼ若しくはエキソヌクレアーゼIIIの使用により二本鎖DNAから得られるか、又は逆転写酵素の使用により一本鎖RNAから得られる、請求項28記載の方法。
【請求項３１】
定義された配列の2以上の異なる標的核酸の存在が同じ試料中で検出される、請求項1〜30のいずれか1項記載の方法。
【請求項３２】
前記試料が生体試料、例えば鼻若しくは鼻咽頭スワブ若しくは吸引液、血液若しくは血液由来試料、又は尿である、請求項1〜31のいずれか1項記載の方法。
【請求項３３】
前記標的核酸がウイルス性又はウイルス性核酸材料に由来し、細菌性である又は細菌性核酸材料に由来し、癌細胞又は胎児細胞から放出される循環型無細胞DNAであり、マイクロRNAである又はマイクロRNA由来のものである、請求項1〜32のいずれか1項記載の方法。
【請求項３４】
前記標的核酸の検出を、疾患又は罹患状態の診断、予後判定又はモニタリングのために使用する、請求項1〜33のいずれか1項記載の方法。
【請求項３５】
前記疾患が、これらに限定はされないが、HIV、インフルエンザ、RSV、ライノウイルス、ノロウイルス、結核、HPV、髄膜炎、肝炎、MRSA、エボラ、クロストリジウム・ディフィシル、エプスタイン・バーウイルス、マラリア、ペスト、ポリオ、クラミジア、ヘルペス、淋病、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、コレラ、又は天然痘を含む感染症である、請求項34記載の方法。
【請求項３６】
前記疾患が、これらに限定はされないが、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、膵癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、白血病、食道癌、卵巣癌、腎癌、胃癌、又は黒色腫を含む癌である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
前記標的核酸の検出を、ヒトの遺伝子検査、出生前検査、血液汚染スクリーニング、薬理ゲノミクス、又は薬物動態学のために使用する、請求項1〜36のいずれか1項記載の方法。
【請求項３８】
前記試料がヒト試料、法医学試料、農学試料、獣医学試料、環境試料、又は生体防御試料である、請求項1〜37のいずれか1項記載の方法。
【請求項３９】
キットであって：
a) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに定義された配列の一本鎖標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
b) ニッキング酵素ではなく、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該切断部位を切断することができる第1の制限酵素、及びニッキング酵素ではなく、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該切断部位を切断することができる、第2の制限酵素； 
c) 鎖置換型DNA ポリメラーゼ；
d) dNTP 、
e) 1以上の修飾dNTP；
f) 該標的核酸の存在下で生産された増幅産物中の少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、その検出を可能とする部分と結合されている、第1のオリゴヌクレオチドプローブ；並びに
g) 増幅産物中の該少なくとも1つの種の該第1の一本鎖検出配列の上流又は下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合される、第2のオリゴヌクレオチドプローブ、を含む、前記キット。
【請求項４０】
前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが、前記DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、例えば1以上の配列ミスマッチ及び/又は1以上の修飾、例えばホスホロチオエート結合の存在のために前記第1又は第2の制限酵素によって切断されることができない、請求項39記載のキット。
【請求項４１】
前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが、前記第1若しくは第2のプライマーのハイブリダイズ領域との5塩基以上の相補性又は該第1若しくは第2のプライマーのハイブリダイズ領域の逆相補鎖を有する、請求項39又は40記載のキット。
【請求項４２】
前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方のハイブリダイズ領域との5塩基以上の相補性を有し、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの他方のハイブリダイズ領域の逆相補鎖との5塩基以上の相補性を有する、請求項41記載のキット。
【請求項４３】
前記標的核酸の存在下で生産されたディテクター種の存在を検出するための手段をさらに含む、請求項39〜42のいずれか1項記載のキット。
【請求項４４】
前記増幅産物中の少なくとも1つの種における前記標的核酸、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー、及び/又は前記第2のオリゴヌクレオチドプライマー、及び/又は前記第1の制限酵素、及び/又は前記第2の制限酵素、及び/又は前記DNAポリメラーゼ、及び/又は前記dNTP、及び/又は前記1以上の修飾dNTP、及び/又は前記第1のオリゴヌクレオチドプローブ、及び/又は前記第2のオリゴヌクレオチドプローブ、及び/又は前記第1若しくは第2の一本鎖検出配列が、請求項5、8、9、13、15〜17、21〜26、又は28〜33のいずれか1項で定義された通りである、請求項39〜43のいずれか1項記載のキット。
【請求項４５】
請求項5又は6で定義された通りの第3及び/又は第4のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、請求項39〜44のいずれか1項記載のキット。
【請求項４６】
請求項39〜45のいずれか1項記載のキットを含む装置。
【請求項４７】
動力付きの装置である、請求項46記載の装置。
【請求項４８】
加熱手段を備える、請求項46又は47記載の装置。
【請求項４９】
使い捨て診断装置である、請求項46〜48のいずれか1項記載の装置。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（背景）
（技術分野）
本発明は、定義された配列の核酸を検出するための方法、及び前記方法における使用のためのキット及び装置に関する。
【背景技術】
【０００２】
（関連技術）
ポリメラーゼに基づく核酸配列増幅方法は、分子診断の分野で広く使用されている。最も確立された方法であるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）では、典型的に各標的配列用の2つのプライマーが関与し、周期的指数関数的増幅のプロセスにおける温度の周期的変化を使用して、プライマーのアニーリング、DNAポリメラーゼによる伸長、及び新たに合成されたDNAの変性を達成する。温度周期変化の要件は複雑な装置を必要とし、このことが特定の応用におけるPCRベースの方法の使用を制限している。
【０００３】
鎖置換増幅（Strand Displacement Amplification）（SDA）（EP0497272; US5455166; US5712124）は、等温でのPCRの代替法として開発され、ポリメラーゼ増幅の間の二本鎖DNAのアニーリング及び変性を達成するために温度周期変化を必要とせず、代わりに鎖置換型ポリメラーゼと組み合わせた制限酵素を使用して、2本のDNA鎖を分離する。
【０００４】
SDAでは、各プライマーの 5'末端にある制限酵素部位が、1以上のαチオールヌクレオチドの存在下で増幅産物に導入され、制限酵素を使用して、その認識部位の未修飾ヘミホスホロチオエート形態の鎖のみを切断するその能力により、制限部位にニックを形成する。鎖置換型ポリメラーゼは、各ニックの3'末端を伸長させ、下流のDNA鎖を置換する。指数関数的増幅はセンス及びアンチセンス反応物の対形成をもたらす。ここでセンス反応物から置換された鎖はアンチセンス反応物の標的としての役割を果たし、逆も同様である。SDAは典型的に実行に1時間以上かかり、このことが臨床診断の分野における利用のためのその潜在性を大いに制限している。さらに、増幅後の産物の特異的検出及び反応の開始のために別々のプロセスが要件となるため、この方法は顕著に複雑さを増す。
【０００５】
その後Maplesらの文献（WO2009/012246）では、その特異的二本鎖認識配列に結合した後、DNAの2本鎖のうちの一方のみ切断することができる制限酵素のサブクラスである、ニッキング酵素を用いたSDAを実施した。彼らはこの方法をニッキング及び伸長増幅反応（NEAR）と呼んだ。制限酵素ではなく、ニッキング酵素を利用するNEARはまた、その後ソフトウェアで最適化したプライマーを使用して（WO2014/164479）、及びウォームスタート又は制御下の温度低下（WO2018/002649）を通じてこの方法の改良を試みた他の研究者らによって利用されている。しかしながら、ごく少数のニッキング酵素のみが利用可能であるため、特定の応用のための所望の特性を有する酵素を見いだすことはより困難である。
【０００６】
制限酵素又はニッキング酵素を使用するSDA（NEAR）のきわめて重大な欠点は、この方法により二本鎖核酸産物が生産され、従って増幅シグナルの効率的検出のための本質的プロセスを提供しないことである。これにより、例えば低コストの診断装置におけるその有用性が顕著に制限される。生産される増幅産物の二本鎖の性質は、増幅法をシグナル検出と組み合わせるのに困難を提示する。それは、最初に二本鎖を分離しないことにはハイブリダイゼーションベースの検出を実施することができないためである。そのため、より複雑な検出方法、例えば分子ビーコン及び蛍光物質/クエンチャープローブが必要となる。このことは、分離プロセス工程を要求することでアッセイプロトコルが複雑にする場合があり、マルチプレックスアッセイを開発する潜在性を顕著に低下させる。
【０００７】
SDAの限界を克服するための要件として、迅速、高感度かつ特異的な核酸配列検出のための増強された増幅方法が重要となる。本発明は、5'制限部位を有するプライマー対に加えて、追加のオリゴヌクレオチドプローブを利用して効率的シグナル検出を可能とするディテクター種を生産する、標的核酸配列を増幅及び検出する方法に関する。
【発明の概要】
【０００８】
（概要）
本発明は、試料中の定義された配列の一本鎖標的核酸の存在を検出するための方法であって：
a) 該試料を：
i. 第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
ii. 鎖置換型DNAポリメラーゼ； 
iii. dNTP；
iv. 1以上の修飾dNTP；
v. ニッキング酵素ではないが、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の第1のプライマー鎖のみを切断することができる、第1の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第1の制限酵素；並びに
vi. ニッキング酵素ではないが、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の該第2のプライマー鎖のみを切断することができる、第2の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第2の制限酵素； 
と接触させて、温度周期変化を用いることなく、該標的核酸の存在下で増幅産物を生産すること；
b) 工程a）の増幅産物を：
i. 該増幅産物中の少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、その検出を可能とする部分と結合されている、第1のオリゴヌクレオチドプローブ；及び
ii. 増幅産物中の該少なくとも1つの種の該第1の一本鎖検出配列の上流又は下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合される、第2のオリゴヌクレオチドプローブ；
と接触させることであって、該増幅産物中の該少なくとも1つの種との該第1及び第2のプローブのハイブリダイゼーションにより、ディテクター種が生産される、前記接触させること；並びに
c) 工程b)で生産された該ディテクター種の存在を検出することであって、該ディテクター種の存在は、該試料における該標的核酸の存在を示す、前記検出すること、
を含む、前記方法を提供する。
【０００９】
該方法の実施態様を図1に示す。
【００１０】
様々な実施態様において、標的核酸の存在下、該方法では理想的には高感度検出に好適な多くのコピーのディテクター種を迅速に生産する。
【００１１】
様々な態様における本発明は、増幅産物の効率的検出のための本質的なプロセスを提供することに加え、温度周期変化を用いない迅速増幅を包含するため、公知の手法よりも有利である。
【００１２】
本発明の方法は、SDAが増幅産物の二本鎖特性により増幅シグナルを効率的に検出するための本質的なプロセスを提供しないという、ニッキング酵素によるSDA（NEAR）を含むSDAの主要な欠点を克服する。本方法では、増幅産物中の少なくとも1つの種とハイブリダイズしてその迅速かつ特異的な検出を促進する2つの追加のオリゴヌクレオチドプローブを利用することにより、この制約を克服する。これら2つの追加のオリゴヌクレオチドプローブの使用は、本発明にSDAなどの公知の方法を上回るいくつかのさらなる利点を提供する。第1のオリゴヌクレオチドプローブはその検出を可能とする部分と結合し、第2のオリゴヌクレオチドプローブは固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合されている。例えば、オリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、制限酵素によって切断できず、工程a) の実施と同時に試料と接触させる本発明の実施態様において、予期せぬことに増幅の顕著で不利な阻害は観察されず、一本鎖領域を含むプレ-ディテクター種が効率的に生産される。本発明のこの態様は、そのような阻止されたプローブが、プレディテクター種に含まれる対向増幅産物鎖に偏る非対称増幅をもたらすと仮定され得るため、直観に反する。実際には、前記プレディテクター種は効率的に生産され、理想的には効率的検出に好適となる。露出された一本鎖領域が他のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションに容易に利用可能であるためである。
【００１３】
本方法の本質的試料検出アプローチは、例えば一方のアンプリコン鎖を他方の鎖よりも過剰に生産することを目的として、不均一なプライマー比を使用することにより「非対称」増幅を実施することを含む、SDAの重大な制約を克服するための過去の試みと根本から対照をなす。本方法は、非対称増幅を必要とせず、かつアンプリコンの一方の鎖を他方よりも過剰に生産する必要もなく、代わりに第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーション後のディテクター種の生産に重点を置く。ディテクター種の生産を含む本方法の本質的な試料検出アプローチは、理想的には他の検出方法、とりわけ工程ｃ)における検出を実施する簡素化された、迅速かつ低コストの手段を提供する、例えば第2のオリゴヌクレオチドプローブをラテラルフローストリップ上にプリントすることによる、核酸ラテラルフローとの組合わせに好適である。この方法を核酸ラテラルフローと組み合わせるとまた、各々試料中の異なる標的核酸配列について設計された異なる配列を有する、ラテラルフローストリップ上の不連続位置に結合された複数の第2のオリゴヌクレオチドプローブの差次的ハイブリダイゼーションに基づく効率的なマルチプレックス系が可能となる。方法のさらなる実施態様において、第2のオリゴヌクレオチドプローブ中のその固体材料との結合を可能とする部分としての一本鎖オリゴヌクレオチドの使用によりラテラルフロー検出の効率が増強され、前記部分との逆相補的配列をストリップ上にプリントする。後者のアプローチはまた、複数の標的の適用にわたる単一の「ユニバーサル」検出系として最適化され、製造されたラテラルフローストリップを可能とする。これは、ラテラルフローストリップに結合された配列を定義されたものとすることができ、標的核酸の配列に相当するものである必要はないためである。従って、本発明の方法における、2つの追加のオリゴヌクレオチドプローブの不可欠な要件は、ニッキング酵素を用いるSDA（NEAR）を含むSDA を上回る、多くの利点を提供する。
【００１４】
本発明では、ニッキング酵素ではない制限酵素及び1以上の修飾dNTPの使用が要求されるため、ニッキング酵素を用いて実施されるSDA（NEAR）と根本的に異なるものであり、そのようなニッキング酵素依存的な方法を上回るいくつかのさらなる利点を有する。例えば、ニッキング酵素よりはるかに多くの、ニッキング酵素ではない制限酵素を利用可能である。このことは、本発明の方法において使用する制限酵素を数多くの潜在性を有する酵素から選択し、所与の応用、例えば反応温度、緩衝液適合性、安定性、及び反応速度（感度）に対し優れた特性を有するものを識別することができることを意味する。本方法のこの重要な利点のために、本発明者らはニッキング酵素を用いて達成可能であるより低い至適温度及びより速い速度を有する制限酵素を選択することができる。そのような制限酵素は、低コストの診断装置での利用にはるかに好適である。さらに、1以上の修飾dNTPを使用するという要件は、制限酵素にそれらの制限部位の一方のみの鎖を切断させることに加え、重要な利点を提供する本発明に不可欠な特徴である。例えば、特定のdNTP、例えばαチオールdNTPを用いると、それを組み込んだDNAの融解温度（Tm）が低下する。このことは、この方法におけるオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブが、増幅の間に生産された修飾dNTPを含む任意の競合する相補鎖よりも増幅産物中の種とのハイブリダイゼーションについて高い親和性を有することを意味する。さらに、修飾dNTP塩基挿入の結果として増幅産物のTmが低下すると、二本鎖DNA種の分離が促進され、それにより増幅速度が増強され、至適温度が低下し、感度が向上する。あるいは、他の修飾dNTPを使用すると、それが取り込まれたDNAのTmが増加し、これにより所与の応用のための方法の実施を目的に合わせるさらなる機会が提示される。
【００１５】
SDA を上回る本発明の多くの利点を合わせると、制限酵素又はニッキング酵素（NEAR）の使用により、低コストの使い捨て診断装置において、公知の方法では不可能な増幅速度の向上及び増幅シグナルの単純な可視化によりこの方法の有用性が提供される。
【００１６】
上記本発明の態様の様々な実施態様及びさらなる態様は、以下により詳細に記載する。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
（図面の簡単な説明）
【図１】本発明の一態様による方法の模式的表示。
【図２】前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)において試料と接触させる、方法の模式的表示。
【図３】前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能とする部分が、一本鎖オリゴヌクレオチドである、方法の工程b)及びc)の模式的表示。
【図４】工程a)において試料をさらに第3及び第4のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる、方法の工程a)の部分の模式的表示。
【図５】第2のオリゴヌクレオチドプローブを固体材料、ニトロセルロースラテラルフローストリップと結合させる、方法の実施（実施例1を参照されたい）。
【図６】図6A及び6B。前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)において試料と接触させる、方法の実施（実施例2を参照されたい）。
【図７】図7A、7B、7C、及び7D。定義された配列の2以上の異なる標的核酸の存在が同じ試料中で検出される、方法の実施（実施例3を参照されたい）。
【図８】前記標的核酸中の前記第1及び第2のハイブリダイゼーション配列が5塩基により隔てられている、方法の実施（実施例4を参照されたい）。
【図９】第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能とする部分が抗原であり、対応する抗体を固体表面、ニトロセルロースラテラルフローストリップと結合させる、方法の実施（実施例5を参照されたい）。
【図１０】図10A及び10B。第2のオリゴヌクレオチドプローブを固体材料と結合させることを可能とする部分が3塩基DNA配列モチーフの4つの反復コピーを含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記一本鎖オリゴヌクレオチド配列の逆相補鎖が固体材料に結合されている、方法の実施（実施例6を参照されたい）。
【図１１】臨床検体中のRNAウイルス検出法の使用（実施例7を参照されたい）。
【図１２】図12A及び12B。異なる温度での方法の実施（実施例8を参照されたい）。
【図１３】図13A及び13B。標的核酸が鎖侵入により二本鎖DNAから得られる方法の実施（実施例9を参照されたい）。
【図１４】図14A及び14B。本発明の方法と公知の方法の比較実施（実施例10を参照されたい）。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
（詳細な説明）
本発明は、試料中の定義された配列の一本鎖標的核酸の存在を検出するための方法を提供する。標的核酸は例えば熱変性による、又はポリメラーゼの鎖置換活性を通じた試料中の二本鎖の解離後の二本鎖DNA由来一本鎖DNA、又は例えば逆転写酵素の活性による、RNA由来一本鎖DNA、又は例えばヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼ若しくはエキソヌクレアーゼIIIの使用による、二本鎖DNA由来一本鎖DNA、又は例えば酵素、例えばリボヌクレアーゼHを通じたRNA/DNAハイブリッド由来一本鎖DNA、を含む、一本鎖DNAであり得る。標的核酸は、DNAポリメラーゼ、ヘリカーゼ、又はリコンビナーゼによる試料中のDNA由来一本鎖DNAであり得る。二本鎖DNA中の一本鎖部位は、例えば二本鎖DNA中の1以上のDNA塩基対の一過的開口が、第1のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション及び3'ヒドロキシルの伸長を可能とするに十分に発生する、「鎖侵入」により、又はDNA塩基対の自発開口、フーグスティーン対への遷移的変換により、又は制限酵素若しくは熱化学的アプローチによるDNAの生産的ニッキングにより、方法を開始させるための第1のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長のために十分に露出され得る。標的核酸は、例えば熱変性による2つの鎖の解離後の試料中の二本鎖RNA由来一本鎖RNAを含む一本鎖RNA、又は例えば転写による二本鎖DNA由来一本鎖RNAであり得る。
【００１９】
方法は、工程a）において試料を：(i)第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
(ii) 鎖置換型DNAポリメラーゼ；
(iii) dNTP；
(iv) 1以上の修飾dNTP；
(v) ニッキング酵素ではないが、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の第1のプライマー鎖のみを切断することができる、第1の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用してDNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第1の制限酵素；並びに
(vi) ニッキング酵素ではないが、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の該第2のプライマー鎖のみを切断することができる、第2の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用してDNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第2の制限酵素、と接触させることを含む。
【００２０】
試料中で検出することとなる標的核酸が二本鎖である場合、いずれかの鎖はこの方法の一本鎖標的核酸とみなすことができる。これは、2つのオリゴヌクレオチドプライマーのうちの一方が一方の鎖とハイブリダイゼーションすることができ、他方のオリゴヌクレオチドプライマーが他方の鎖とハイブリダイゼーションすることができるためである。典型的に、この方法で使用されるオリゴヌクレオチドプライマーは、DNA又はRNA標的とともに二本鎖DNA又はRNA及びDNAの両方の鎖を含むハイブリッド二本鎖を形成するDNAプライマーである。しかしながら、非天然塩基及び/又は代替骨格構造など、他の核酸を含むプライマーも使用し得る。
【００２１】
標的核酸の存在下では、第1のオリゴヌクレオチドプライマーは標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズする。前記ハイブリダイゼーション後、第1のプライマーの3'ヒドロキシル基は、鎖置換型DNAポリメラーゼ、又は任意に、標的核酸がRNAの場合は、逆転写酵素（例えば、M-MuLV）によって伸長され、伸長された第1のプライマー及び標的核酸を含む二本鎖種を生産する（図1を参照されたい）。鎖置換型DNAポリメラーゼ又は存在する場合は逆転写酵素は、前記伸長においてdNTP及び1以上の修飾dNTPを使用する。制限酵素認識配列の一方の鎖及び第1のプライマーの5'末端の切断部位は、典型的にハイブリダイズしない。これは、それらとの逆相補的配列は一般的に標的核酸配列中に存在しないためである。従って、第1のプライマーは一般的に、制限酵素認識配列及び切断部位の一方の鎖を後続の増幅産物種に導入するために使用する。第1のプライマーの伸長後、「標的除去」が発生する。標的除去により、伸長された第1のプライマー種は、第2のオリゴヌクレオチドプライマーの第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とのハイブリダイゼーションのためにアクセス可能となる。標的核酸がRNAである場合、標的除去は、例えばRNAのRNアーゼH分解によって達成され、存在する場合逆転写酵素のRNアーゼH活性によって、又はこの酵素の別途の追加によって、達成することができる。あるいは、標的核酸が二本鎖DNA中に一本鎖領域を含む一本鎖DNAである場合、標的除去は追加の上流プライマー又はバンププライマー（bump primer）を用いた鎖置換によって達成することができる。あるいは、そのような標的除去は、特に、所与の標的核酸分子から短い伸長産物のみが生産された場合に、自発的な解離後に発生し得、又は標的除去は、二本鎖伸長第1のプライマー種中の1以上のDNA塩基対の一過的開口が、鎖置換した第2のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション及び3'ヒドロキシルの伸長を可能とするに十分に発生する、鎖侵入によって発生し得る。
【００２２】
第2のオリゴヌクレオチドプライマーの第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とのハイブリダイゼーション後、鎖置換型DNAポリメラーゼは、dNTP及び1以上の修飾dNTPを用いて、前記プライマーの3'ヒドロキシルを伸長する。第1の制限酵素の二本鎖制限認識配列及び切断部位が形成され、1以上の修飾dNTP塩基は逆相補鎖に取り込まれて前記第1の制限酵素による前記鎖の切断を阻止する作用をする。第1の制限酵素はその認識配列を認識し、切断部位の第1のプライマー鎖のみを切断する。これにより、3'ヒドロキシルが生成され、それは鎖置換型DNAポリメラーゼによりdNTP及び1以上の修飾dNTPを用いて伸長され、第1のプライマー鎖が置換される。第2の制限酵素の二本鎖制限認識配列及び切断部位が形成され、1以上の修飾dNTP塩基は逆相補鎖に取り込まれて前記第2の制限酵素による前記鎖の切断を阻止する作用をする。従って、2つのプライマー配列が並置された二本鎖種が生産され、第1の制限酵素及び第2の制限酵素の部分的に阻止された認識部位が存在する。続いて第1のプライマー鎖の第1の制限酵素による切断、及び第2のプライマー鎖の第2の制限酵素による切断が起こり、2つの二本鎖種が生産され、一方は第1のプライマー配列を含み、他方は第2のプライマー配列を含む。続いて、第1のプライマー鎖及び第2のプライマー鎖の連続的切断及び置換が周期的増幅プロセスにおいて起こり、ここで置換された第1のプライマー鎖は第2のプライマーの標的として作用し、置換された第2のプライマー鎖は第1のプライマーの標的として作用する。
【００２３】
標的核酸の存在下では、増幅産物は温度周期変化を一切要さずに生産される。
【００２４】
本発明の不可欠な態様は、工程a)の増幅産物を直接検出するのではなく、第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブの両方の増幅産物中の少なくとも1つの種との特異的ハイブリダイゼーション後に、ディテクター種が生産されることである。第1のオリゴヌクレオチドプローブは、その検出を可能にする部分と結合し、前記少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズする。第2のオリゴヌクレオチドプローブは、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合されており、前記少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列の上流又は下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズする。
【００２５】
当業者であれば、図1を参照することにより、増幅産物が、いくつかの異なる種、例えば第1のプライマー及び第2のプライマーの両方の全長又は部分的配列又は逆相補的配列からなり、当該配列は標的核酸中の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列と結合するプライマーが1以上の塩基によって隔てられているならば、標的由来配列により隔てられ得る一本鎖検出配列を含む種を含むことが明らかであろう。さらに、前記種のいずれかを第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズさせ、ディテクター種を形成させるために選択することができることは、明らかであろう。
【００２６】
工程b)で生産された該ディテクター種を工程c)で検出する。ここで該ディテクター種の存在は、該試料における該標的核酸の存在を示す。
【００２７】
2つのオリゴヌクレオチドプローブ（一方は検出用、もう一方は固体材料との結合用）を利用することにより、本発明の方法では迅速かつ効率的なシグナル検出を提供する。これにより、より複雑な二次検出法の要求が克服され、例えば核酸ラテラルフローによって、標的の存在下生産されるシグナルの効率的可視化が提供される。
【００２８】
前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つの鎖置換型DNAポリメラーゼによる伸長が3’末端で阻止され、第1又は第2の制限酵素によって切断できない、本発明の方法を実施し得る。従って、さらなる実施態様により、本発明は試料中の定義された配列の一本鎖標的核酸の存在を検出するための方法であって：
a) 該試料を：
i. 第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
ii. 鎖置換型DNAポリメラーゼ； 
iii. dNTP；
iv. 1以上の修飾dNTP；
v. ニッキング酵素ではないが、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の第1のプライマー鎖のみを切断することができる、第1の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第1の制限酵素；並びに
vi. ニッキング酵素ではないが、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の該第2のプライマー鎖のみを切断することができる、第2の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第2の制限酵素； 
と接触させて、温度周期変化を用いることなく、該標的核酸の存在下で増幅産物を生産すること；
b) 工程a ）の増幅産物を：
i. 該増幅産物中の少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、その検出を可能とする部分と結合されている、第1のオリゴヌクレオチドプローブ；及び
ii. 増幅産物中の該少なくとも1つの種の該第1の一本鎖検出配列の上流又は下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合される、第2のオリゴヌクレオチドプローブ；
と接触させることであって、該第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが、前記DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、該第1又は第2の制限酵素によって切断されることができず、該第1及び第2のプローブの増幅産物中の前記少なくとも1つの種とのハイブリダイゼーションにより、ディテクター種が生産される、前記接触させること；並びに
c) 工程b)で生産された該ディテクター種の存在を検出することであって、該ディテクター種の存在は、該試料における該標的核酸の存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法を提供する。
【００２９】
一実施態様において、前記1つの阻止されたオリゴヌクレオチドプローブは、1以上の配列ミスマッチ及び/又は1以上の修飾、例えばホスホロチオエート結合の存在のために前記第1又は第2の制限酵素によって切断されることができなくなる。さらなる実施態様において、1つの阻止されたオリゴヌクレオチドプローブを、それが標的核酸の存在下での増幅産物の生産の間存在することとなるように、工程a)の実施と同時に、すなわち工程a)の実施の間に試料と接触させる。従って、さらなる実施態様により、本発明は試料中の定義された配列の一本鎖標的核酸の存在を検出するための方法であって：
a) 該試料を：
i. 第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
ii. 鎖置換型DNAポリメラーゼ； 
iii. dNTP；
iv. 1以上の修飾dNTP；
v. ニッキング酵素ではないが、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の第1のプライマー鎖のみを切断することができる、第1の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第1の制限酵素；並びに
vi. ニッキング酵素ではないが、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の該第2のプライマー鎖のみを切断することができる、第2の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第2の制限酵素； 
と接触させて、温度周期変化を用いることなく、該標的核酸の存在下で増幅産物を生産すること；
b) 工程a）の増幅産物を：
i. 該増幅産物中の少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、その検出を可能とする部分と結合されている、第1のオリゴヌクレオチドプローブ；及び
ii. 増幅産物中の該少なくとも1つの種の該第1の一本鎖検出配列の上流又は下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合される、第2のオリゴヌクレオチドプローブ；
と接触させることであって、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが、該DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、該第1又は第2の制限酵素によって切断されることができず、工程a)の実施と同時に該試料と接触し、該第1及び第2のプローブの増幅産物中の前記少なくとも1つの種とのハイブリダイゼーションにより、ディテクター種が生産される、前記接触させること；並びに
c) 工程b)で生産された該ディテクター種の存在を検出することであって、該ディテクター種の存在は、該試料における該標的核酸の存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法を提供する。
【００３０】
例えば、図2に示す実施態様において、第1のオリゴヌクレオチドプローブは阻止され、増幅産物中の少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズして、一本鎖領域を含むプレディテクター種を形成する。前記少なくとも1つの種は、その3'ヒドロキシル基を伸長する鎖置換型DNAポリメラーゼによって伸長され、従ってさらに前記プレディテクター種を安定化し得る。従って、前記実施態様において、前記阻止されたオリゴヌクレオチドプローブが追加の領域を含み、該阻止されたオリゴヌクレオチドプローブがハイブリダイズする前記増幅産物中の種の3'末端が前記鎖置換型DNAポリメラーゼによって伸長することができる。図2に示すように、「安定したプレディテクター種」が生産される。当業者であれば、阻止されたオリゴヌクレオチドプローブ中のこの追加のプレディテクター種安定化領域が、増幅産物中の少なくとも1つの種中の第1又は第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズする領域の上流にあることを認識するであろう。阻止されたオリゴヌクレオチドプローブを用いる実施態様において、阻止されたオリゴヌクレオチドプローブ及び適切な濃度のプライマーのハイブリダイゼーション配列は、増幅産物中で生産される特定の比率の関連する種が各周期において阻止されたオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズし、そのような種の残存するコピーが周期的増幅プロセスへの参加に利用可能であり続けるように、最適化され得る。オリゴヌクレオチドプローブは、例えば3'リン酸修飾の使用により伸長を阻止され、またこの実施態様において、その検出を可能とする部分、例えば5'ビオチン修飾と結合させる。あるいは、単一の3'修飾は、伸長を阻止するために、及びその検出を可能とする部分として使用することができる。様々な他の修飾が、C-3スペーサーなどのオリゴヌクレオチドの3'末端を阻止するために利用可能であり、その代わりにミスマッチ塩基を利用することもできる。前記プレディテクター種は理想的には効率的検出に好適となる。露出された一本鎖領域が第2のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーションに容易に利用可能であり続けるためである。第2のオリゴヌクレオチドプローブは、核酸ラテラルフローストリップのニトロセルロース表面に結合させることができる。これにより、プレディテクター種がそれを流れる際に、配列特異的ハイブリダイゼーションが容易に起こり、ディテクター種がストリップ上の定義された位置に局在するようになる。核酸ラテラルフローストリップのコンジュゲートパッド中に、又は増幅反応の間に存在し得るストレプトアビジン結合カーボン、金、又はポリスチレン粒子などの検出部分に結合する色素は、標的核酸の存在下で生産されるディテクター種の存在の迅速な色ベースの可視化を提供する。
【００３１】
別の実施態様において、それは前記鎖置換型DNAポリメラーゼによる伸長が3'末端で阻止される前記第2のオリゴヌクレオチドプローブであり、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、試料を工程a)の実施と同時に接触させる。第2のオリゴヌクレオチドプローブは、試料と接触させる前に、電気化学的プローブの表面、96ウェルプレート、ビーズ、若しくはアレイ表面などの固体材料と結合させること、又は固体材料とのその結合を可能とする部分と結合させることができる。増幅中に生産された特定の比率の少なくとも1つの種は、周期的増幅プロセスにさらに参加する関連する反応プライマーとハイブリダイズするのではなく、その生産後第2のオリゴヌクレオチドプローブとハイブリダイズする。第2のオリゴヌクレオチドプローブとのハイブリダイゼーション後、前記種はオリゴヌクレオチドプローブ上でポリメラーゼによって伸長され、安定したプレディテクター種を生産する。また、第1のオリゴヌクレオチドプローブ及び検出部分は、工程a)の実施と同時に試料と接触させることができ、第2のオリゴヌクレオチドプローブの部位で前記表面に局在するようになる。増幅プロセスの間の部位での検出部分の蓄積を検出することにより、試料中に存在する標的核酸のコピー数の定量化を提供するリアルタイムシグナルを得る。従って、本発明の実施態様により、工程a)、b)、及びc)のうちの2以上を同時に実施する。
【００３２】
前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが、前記DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断されることができず、工程a)の実施と同時に該試料と接触させるこれらの実施態様の実施において、本発明者らは増幅速度の一切の顕著な阻害を観察せず、プレディテクター種が最適周期的増幅プロセスを破綻させることなくリアルタイムで蓄積されることが示される。これは、一方のアンプリコン鎖を他方よりも過剰に生産することを目的として、不均一なプライマー比を利用することにより、非対称SDAを運用する試みとは対照的である。阻止されたオリゴヌクレオチドプローブを使用して反応物から一方のアンプリコン鎖を除去し、それにより他方の鎖の比率を増加させることを模索するのではなく、本発明は、増幅プロセスの間の一本鎖領域の露出を促進するために、阻止されたプローブを利用した、ディテクター種の生産及び検出に焦点を当てている。従って、本発明者らは前記実施態様における増幅プロセスへの阻害効果を一切観察しなかっただけでなく、ある実施態様において、本発明者らはディテクター種の量の少なくとも100倍の増加に相当する生成したシグナルの、予期せぬ増強を観察した（実施例2を参照されたい）（図6）。
【００３３】
さらに、第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが、DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、第1又は第2の制限酵素によって切断されることができず、工程a)の実施と同時に試料と接触させ、プローブを阻止することなく多工程プロセスで核酸ラテラルフローを用いてNEARを統合する試みの報告を上回る根本的な利点となる、本発明の方法の前記実施態様。例えばWO2014/164479では、48℃での30分間という長時間のインキュベーションが、核酸ラテラルフローを使用して増幅産物を可視化するために要求されていたが、これは、ポイントオブケア診断装置、特に低コスト又は使い捨て装置における方法の使用の主要な障壁となる。まったく対照的に、本発明の方法では、より低いインキュベーション温度、例えば40〜45℃で5分以内に同等の増幅が容易に実施される。さらに直接的な比較研究（実施例10を参照されたい）では、本発明の方法は、ニッキング酵素ではない制限酵素の使用、修飾dNTP塩基の使用、及び前記阻止されたオリゴヌクレオチドプローブの使用の組合わせから得た従来技術の方法（WO2014/164479）と比較して、予期せぬ非常に優れた速度を示す。
【００３４】
また、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの他方が、前記DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、先に記載の前記第1又は第2の制限酵素によって切断できないことを認識されたい。
【００３５】
本方法の不可欠な態様は、ニッキング酵素ではないが、前記認識配列及び切断部位が二本鎖であり、逆相補鎖の切断が1以上の修飾dNTP、例えばそのポリメラーゼによる取込み後のヌクレアーゼ抵抗性を付与するdNTPを用いて鎖置換型DNAポリメラーゼによって前記逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される際に、その認識配列を認識し、その切断部位の一方の鎖のみを切断することができる1以上の制限酵素の使用である。
【００３６】
「制限酵素」[又は「制限エンドヌクレアーゼ」]は、特定の認識配列に結合した後、特定の切断部位で二本鎖核酸分子の一方又は両方の鎖に１以上のホスホジエステル結合を切断する幅広いクラスの酵素である。多数の制限酵素が利用可能であり、3,000種超が報告されており、600種超が市販されており、多種多様な異なる物理化学特性及び認識配列特異性がカバーされている。
【００３７】
「ニッキング酵素」[又は「ニッキングエンドヌクレアーゼ」]は制限酵素の特定のサブクラスであり、特定の認識配列と結合した後、特定の切断部位で二本鎖核酸分子の一方の鎖のみを切断することができ、他方の鎖をインタクトなまま残す。ごく少数の（c.10）ニッキング酵素のみが利用可能であり、天然の酵素及び操作された酵素の両方がある。ニッキング酵素には、ボトム鎖切断酵素（bottom strand cutters）Nb.BbvCI、Nb.BsmI、Nb.BsrDI、Nb.BssSI、及びNb.BtsI並びにトップ鎖切断酵素（top strand cutters）Nt.AlwI、Nt.BbvCI、Nt.BsmAI、Nt.BspQI、Nt.BstNBI、及びNt.CviPIIがある。
【００３８】
本発明の方法において限定的に利用されるニッキング酵素ではない制限酵素は、二本鎖核酸の両方の鎖を切断することができるにもかかわらず、その認識配列と結合した後、特定の状況下でその二本鎖DNA切断部位の一方の鎖のみを切断し、又はニック形成することもできる。これは、いくつかの方法で達成し得る。本方法との関連性が特に高いことに、このことは切断部位での二本鎖核酸中の鎖の一方が、二本鎖核酸標的部位の一方の鎖が修飾されており、それにより一方の鎖上の切断部位のホスホジエステル結合がヌクレアーゼ抵抗性修飾、例えばホスホロチオエート（PTO）、ボラノホスフェート、メチルホスフェート、又はペプチド-ヌクレオチド間結合を用いて保護されているために切断することができない状態にされている際に達成され得る。特定の修飾ヌクレオチド間結合、例えばPTO結合は、化学合成によりオリゴヌクレオチドプローブ及びプライマー中に設けることができ、又は例えば1以上のαチオール修飾デオキシヌクレオチドを使用して、ポリメラーゼにより二本鎖核酸に取り込ませることができる。従って、一実施態様において、1以上の修飾dNTPはαチオール修飾dNTPである。典型的に、取り込まれてヌクレアーゼ抵抗性をより効果的に付与するS異性体を利用する。
【００３９】
利用可能なニッキング酵素ではない制限酵素の数が非常に多いため、異なる特性を有する多種多様な酵素を所望の性能特性、例えば所与の応用のための方法における使用のための、温度プロファイル、速度、緩衝液適合性、ポリメラーゼの交叉適合性、認識配列、熱安定性、製造性などについてスクリーニングするために利用可能である。対照的にごく少数のニッキング酵素しか利用できないという事実より、ニッキング酵素を使用する従来技術の方法の潜在性は制限され、例えばより低い反応速度（感度、結果を得るまでの時間）及びより高い反応温度がもたらされ得る。この方法における使用のために選択されるニッキング酵素ではない制限酵素は天然の又は操作された酵素であり得る。
【００４０】
この方法における使用のためのニッキング酵素ではない制限酵素の選択において、当業者であれば修飾が適当な位置に取り込まれて関連する鎖の切断が阻止され、他方の鎖の切断は阻止されないことを確保するために、適切な切断部位を有する酵素を同定することが必要であることを認識するであろう。例えば、修飾dNTP、例えばαチオールdNTPを使用する実施態様において、プライマー配置に十分な柔軟性を提供し、それにより標的核酸配列が適切な位置で修飾ヌクレオチド塩基を含み、その取込み後に関連する鎖の切断が阻止されるようにするために、非パリンドローム認識配列を有する非対称制限酵素など、認識配列の外に切断部位を有する制限酵素を選択することが好ましい場合がある。例えば、αチオールdATPを使用する場合、方法の実施においてプライマーが適切に切断されることを確保するために、関連するオリゴヌクレオチドプライマーの制限酵素切断部位の逆相補的配列は、前記逆相補鎖中の切断部位の下流にあるアデノシン塩基を含むが、プライマー配列中の切断部位の下流にあるアデノシン塩基は含まない。従って、理想的にはその認識配列の外で切断する非パリンドローム認識配列を有する非対称制限酵素は、本発明における使用に好適である。その認識部位中で切断する部分的又は縮重パリンドローム配列を認識する制限酵素も使用することができる。ヌクレアーゼ抵抗性ヌクレオチド結合修飾、例えばPTOを使用すると、様々な異なるクラスの多種多様な市販の二本鎖切断因子による、いずれかの鎖の切断を阻止することができる。そのようなクラスの二本鎖切断因子には、本発明の方法におけるその使用を可能にするための、部分的又は縮重パリンドローム及び非対称制限酵素配列の両方を有するIIS型及びIIG型制限酵素がある。
【００４１】
制限酵素は典型的に、0.1〜100単位の量でこの方法において利用され、ここで1単位は総反応体積50 μl中所与の温度（例えば、37℃）で1時間の間に1 μg T7 DNAを消化するのに要求される作用剤の量として定義する。しかしながら、量は選択した酵素の活性、酵素の濃度及び形態、標的核酸の予測濃度、反応体積、プライマーの濃度、反応温度などのいくつかの要因に応じて異なり、いかなる方法であれ限定するものとみなすべきではない。当業者であれば、この方法で利用される制限酵素が、効果的かつ効率的機能、pH制御、及び酵素の安定化のために、好適な緩衝液及び塩、例えば二価金属イオンを要求することを理解されよう。
【００４２】
一実施態様において、第1及び第2の制限酵素は、同じ制限酵素である。単一の制限酵素のみを使用することによって、方法は多くの点で簡素化される。例えば、他の反応成分と適合可能なただ一つの酵素は、識別され、方法の実施について最適化され、製造及び安定化される必要がある。また、単一の制限酵素を利用することで、オリゴヌクレオチドプライマーの設計が簡素化され、増幅プロセスの対称性が支持される。
【００４３】
方法において、制限酵素は核酸二本鎖の一方の鎖のみを切断し、従って切断後に、それらは効率的なポリメラーゼの起点部位（priming site）として作用し得る露出された3’ヒドロキシル基を提示する。ポリメラーゼは、プライマーを伸長し、塩基対合相互作用を用いてDNA又はRNA鋳型鎖の逆相補的コピーを生成することにより、核酸の鎖又はポリマーを合成する酵素である。鎖置換能を備えたポリメラーゼは、鎖を適切に置換させて増幅プロセスに影響を及ぼすため、方法の実施に利用される。「鎖置換」という用語は、合成中に遭遇する下流のDNAを置換させるポリメラーゼの能力を指す。異なる温度で動作する鎖置換能を備えた様々なポリメラーゼが特徴づけられており、市販されている。例えば、Phi29ポリメラーゼは鎖を置換させる能力が非常に強い。バチルス種由来ポリメラーゼ、例えばBst DNAポリメラーゼ大断片は、典型的に高い鎖置換活性を示し、方法の実施における使用によく適する。大腸菌（E. coli）クレノウ断片（エキソ-）は、広く使用されているもう1つの鎖置換型ポリメラーゼである。鎖置換型ポリメラーゼ、例えばKlenTaqは、内在の酵素の関連する活性ポリメラーゼドメインのみのクローニング及び任意のエキソヌクレアーゼ活性のノックアウトなどによって、容易に操作することができる。一本鎖標的核酸がRNAである方法の実施について、RNA依存的DNA合成（逆転写酵素）活性も要求される。この活性は、鎖置換型ポリメラーゼにより、及び/又は工程a)の別個の追加の逆転写酵素、例えばM-MuLVやAMVによって実施することができる。
【００４４】
ポリメラーゼは典型的に、方法の関連する工程において、酵素、試薬の濃度、及び所望の反応温度に応じて最適化された適切な量で、利用される。例えば、バチルスポリメラーゼの0.1〜100単位を使用することができ、1単位は、65℃、30分の間に25 nmolのdNTPを酸不溶性材料に取り込む酵素量として定義する。しかしながら、量はいくつかの要因、例えばポリメラーゼ活性、その濃度及び形態、標的核酸の予測濃度、反応体積、オリゴヌクレオチドプライマーの数及び濃度、並びに反応温度に応じて決まり、いかなる方法であれ限定するものとみなすべきではない。
【００４５】
当業者であれば、ポリメラーゼがポリメラーゼ活性を有するためにはdNTPモノマーが要求されること、またポリメラーゼは緩衝塩、二価イオン、及び安定化剤などの成分を含む適切な緩衝液を要求することを知悉するであろう。さらに、鎖置換型ポリメラーゼによる取込み後のプライマーの逆相補鎖の切断を阻止するために、1以上の修飾dNTPをこの方法において使用する。典型的に、単一の修飾dNTPを使用する場合、この方法で使用されるdNTPは対応する塩基が欠落する。例えば、修正dNTPがαチオールdATP である実施態様において、dNTPはdTTP、dCTP、及びdGTPのみを含み、dATPは含まない。対応する天然のdNTP塩基を除去することで、修飾塩基のみがポリメラーゼによる取込みに利用可能となるため、プライマーの逆相補的配列中の全ての要求されるボトム鎖の切断部位が阻止されることが確保される。しかしながら、対応する天然のdNTP塩基の完全な又は部分的除去は、必須ではない。dNTPは典型的にこの方法において、他のポリメラーゼ方法で利用されている濃度と同程度の濃度、例えば10マイクロモルから1ミリモルの濃度範囲で使用され得るが、活性を最大化し、バックグラウンドシグナルの生成を回避するために1からの合成を最小化することを目的として、dNTP濃度はこの方法のために任意の所与の酵素及び試薬について最適化することができる。特定のポリメラーゼが1以上の修飾dNTP塩基のより低い速度での取り込みを示し得ることを考慮すると、1以上の修飾塩基を、未修飾dNTPよりも高い相対濃度、例えば5倍高い濃度でこの方法に使用することができるが、これは、非限定的なものとみなされるべきである。
【００４６】
1以上の修飾dNTPの使用は、制限酵素にそれらの制限部位の一方のみの鎖を切断させることに加え、重要な利点を提供する本発明の不可欠な特徴である。例えば、特定の修飾dNTP、例えばαチオールdNTPを用いると、それを組み込んだDNAの融解温度（Tm）が低下する。このことは、この方法において使用するオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブが、増幅の間に生産された任意の競合する修飾dNTP相補鎖よりも増幅産物中の種とのハイブリダイゼーションについて高い親和性を有することを意味する。この重要な特徴は、例えば、置換された鎖の1つがその逆相補鎖とハイブリダイズして「非生産的」終点種を生産する際に、1以上の修飾塩基の存在がハイブリダイゼーションのTmの低下をもたらすことにより、それは前記置換された鎖のさらなるプライマーとの「生産的」ハイブリダイゼーションより容易に解離するため、増幅速度が増強される。ホスホロチオエートヌクレチド間結合は、Tm（二本鎖のちょうど半数の一本鎖がハイブリダイズする温度）を付加当たり1〜3℃低下させ、物理化学特性を大きく変化させ得ることが報告されている。また、本発明者らはホスホロチオエートヌクレオチド結合がDNA配列中に存在すると、鎖置換速度が増強することを観察した。さらに、この方法で使用するオリゴヌクレオチドプローブは、工程a)の実施と同時に試料と接触させたか、工程a)の後に試料と接触させたかにかかわらず、任意の競合修飾種よりも増幅産物中の種に対して高い親和性を有し、従って優先的にハイブリダイズし、又はハイブリダイズした鎖を置換させさえして、ディテクター種の生産を促進し得る。それに含まれる修飾ヌクレオチド間結合の結果、増幅産物種のTmの低下及び置換の増強は、この方法の速度を根本的に増強させ、迅速な増幅が起こるのに必要な温度を低下させる役割を果たす。
【００４７】
1以上の修飾ヌクレオチドの使用による速度増強に加えて、オリゴヌクレオチドプライマー及びこの方法のプローブのハイブリダイゼーションの特異性も強化される。典型的に、1つの特定のヌクレオチドのすべての塩基が増幅産物中で置換されると仮定すると、プライマー及びプローブのハイブリダイゼーション部位には、典型的に修飾塩基を含み、ホスホロチオエートヌクレオチド間結合に起因するTmの低下は、例えば非特異的ハイブリダイゼーションによる配列ミスマッチが許容される可能性がより低いことを意味する。
【００４８】
従って、1以上の修飾dNTPの本発明の方法の不可欠な特徴は、増幅の感度及び特異性の両方を増強し、そのような修飾ヌクレオチドを要件としない公知の方法、例えばソフトウェアで最適化されたプライマーを使用するNEARの変法（WO2014/164479）又はウォームスタート若しくは制御下の温度低下（WO2018/002649）を含むNEAR（WO2009/012246）とはまったく対照的である根本的な利点をもたらす。
【００４９】
いくつかの異なる修飾dNTP、ポリメラーゼによるその取込み後にヌクレアーゼ抵抗性を付与する修正dNTPが存在し、制限酵素による切断に対する抵抗性及び実施態様において、所与の応用のためのこの方法の成績を高める他の特徴を達成する方法において、利用可能である。ヌクレアーゼ抵抗性及びTmの低下を提供するαチオールdNTPに加え、ポリメラーゼ取込みの潜在性を有し、ヌクレアーゼ抵抗性を付与することが報告されている修飾dNTPには、ボラーノ誘導体、2'-O-メチル(2'OMe)修飾塩基及び2'-フルオロ塩基などの同等のヌクレオチド誘導体がある。ポリメラーゼによって取り込まれ、この方法の特定の特性を増強するための方法の実施態様において使用され得る他の修飾dNTP又は同等の化合物には、結合親和性を低下させるもの、例えばイノシン-5'-三リン酸又は2'- デオキシゼブラリン-5'-三リン酸、結合特異性を増加させるもの、例えば 5-メチル-2'-デオキシシチジン-5'-三リン酸、又は5-[(3-インドリル)プロピオンアミド-N-アリル]-2'-デオキシウリジン-5'-三リン酸、及びGCリッチ領域の合成を増強するもの、例えば7-デアザ-dGTPがある。特定の修飾によりTmを増加させることができ、この方法の実施態様においてハイブリダイゼーション事象を制御する潜在性をさらに提供する。
【００５０】
工程a）、b）、及びc）は、広範囲の温度で実施することができる。各工程の最適温度は、関連するポリメラーゼ及び制限酵素の至適温度並びに、オリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイズ領域の融解温度によって決定される。注視すべきことに、この方法では、工程a)で温度周期変化を使用しない。さらに、増幅工程a)では、温度の制御された増減、ホットスタート若しくはウォームスタート、プレヒート、又は制御された温度低下が一切要求されない。この方法は、広い温度範囲、例えば15℃〜60℃、例えば20〜60℃又は15〜45℃にわたり、工程を実施することができる。実施態様に従って、工程a)は50℃以下、又は約50℃の温度で実施する。この方法で使用するためのニッキング酵素ではない多種多様な制限酵素が利用可能であることを考慮すると、ニッキング酵素を使用する代替法と比較して相対的に低い温度で迅速な速度を有する制限酵素を選択することが可能である。また、1以上の修飾ヌクレオチドを使用することで、増幅に要求される温度が低下する。公知の方法と比較して、最適な温度プロファイルを低くする潜在性を有することに加え、本発明の方法は、並外れて広い温度範囲で実施することができる。そのような特徴は、低コストの診断装置でのこの方法の使用に非常に魅力的である。ここで加熱制御は使い捨て装置又は機器を不要とする装置が商業的に現実的でない点までそのような装置の商品原価を高める複雑な物理的制約を課す。例えば、周囲温度又はおよそ37℃で標的核酸の迅速な検出を実施することができる方法を使用して、いくつかのアッセイが開発されている。従って、さらなる実施態様において、工程a)は45℃以下、又は約45℃の温度で実施する。ユーザ工程を簡素化し、結果が出るまでの全体的な時間を短縮するために、標的温度より低い温度でこの方法を開始することが好ましい場合がある。従って、この方法のさらなる実施態様において、工程a)の温度は増幅の間に増加する。例えば、この方法の温度は、周囲温度、例えば20℃から開始して、一定期間、例えば2分間にわたり増加させ、最終温度、例えばおよそ45℃又は50℃に達する。一実施態様において、開始周囲温度、例えば15〜30℃の範囲から、40〜50℃の範囲の温度までの増加など、工程a)の実施の間温度を増加させる。
【００５１】
本発明の方法の低温における潜在性及び汎用性は、本発明の方法が公知の方法とは対照的に、タンパク質又は低分子などの他のバイオマーカーを検出するための免疫アッセイ又は酵素アッセイなど、様々な他のアッセイに必要な条件と適合することを意味する。従って、この方法は例えば試料中の関心対象とする核酸及びタンパク質又は低分子の両方の同時検出に使用することができる。ニッキング酵素ではない制限酵素、鎖置換型DNAポリメラーゼ、オリゴヌクレオチドプライマー、オリゴヌクレオチドプローブ、dNTP及び1以上の修飾dNTPを含むこの方法の実施に要求される成分は、安定保存のために減圧凍結乾燥され、又は凍結乾燥され、反応は続いて再水和によって、例えば試料の追加に際して誘発され得る。そのような安定保存のための減圧凍結乾燥又は凍結乾燥には、典型的に1以上の賦形剤、例えばトレハロースを、成分を乾燥させる前に追加することが要求される。減圧凍結乾燥又は凍結乾燥のための非常に多種多様なそのような賦形剤及び安定剤が公知であり、この方法の実施に要求される成分の好適な組成を特定するための試験に利用可能である。
【００５２】
当業者であれば、本発明の方法がポリメラーゼベースの増幅法であり、PCR又は他のポリメラーゼベースの増幅法を増強することが示されている1以上の添加剤を加えることにより増強され得ることは、明らかであろう。そのような添加剤には、これらに限定はされないが、テトラヒドロチオフェン1-オキシド、L-リジン遊離塩基、L-アルギニン、グリシン、ヒスチジン、5-アミノ吉草酸、1,5-ジアミノ-2-メチルペンタン、N,N′-ジイソプロピルエチレンジアミン、テトラメチレンジアミン(TEMED)、塩化テトラメチルアンモニウム、シュウ酸テトラメチルアンモニウム（tetramethylammonium oxylate）、メチルスルホンアセトアミド、臭化ヘキサデシルトリメチルアンモニウム、ベタインアルデヒド、テトラエチルアンモニウムクロリド、(3-カルボキシプロピル)トリメチルアンモニウムクロリド、テトラブチルアンモニウムクロリド、テトラプロピルアンモニウムクロリド、ホルムアミド、ジメチルホルムアミド(DMF)、N-メチルホルムアミド、N-メチルアセトアミド、N,N-ジメチルアセトアミド、L-スレオニン、N,N-ジメチルエチレンジアミン、2-ピロリドン、HEP (N-ヒドロキシエチルピロリドン), NMP (N-メチルピロリドン)、及び1-メチル、1-シクロヘキシル-2-ピロリドン(ピロリジノン)、δ-バレロラクタム, N-メチルスクシンイミド、1-ホルミルピロリジン、4-ホルミルモルホリン、DMSO、スルホラン、トレハロース、グリセロール、Tween-20、DMSO、ベタイン、及びBSAがある。
【００５３】
本発明者らの研究より、本方法は、非常に低いコピー数、単一コピー数の検出さえ含み、広範囲の標的核酸レベルにわたり有効であることが明らかとなった。オリゴヌクレオチドプライマーは、典型的に標的核酸に大過剰に提供する。典型的に、各プライマーの濃度は10〜200 nMの範囲内であるが、限定するものではないとみなすべきである。プライマー濃度が高いとハイブリダイゼーションの効率が増強され、従って反応速度が増加し得る。しかしながら、高濃度ではプライマーダイマーなどの非特異的バックグラウンド効果も観察され得るため、第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの濃度は、この方法を利用する任意の所与のアッセイについての最適化プロセスの一部を形成する。一実施態様において、第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーは同じ濃度で提供する。別の実施態様において、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方を、他方のプライマーより過剰に提供する。周期的増幅プロセスの自然対称性のために、一方のプライマーを他方より過剰に提供するが、特定の状況において、それはこの方法の非特異的バックグラウンドシグナルを低下させ、かつ/又は第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズしてディテクター種を生産する能力を増強するために使用することができる実施態様において、反応速度は低下し得る。選択した検出手段で検出するのに十分なディテクター種が生産される前に、両方のプライマーが制約となるほどではないレベルで存在することが望ましい。
【００５４】
この方法の成績を高めるための、オリゴヌクレオチドプライマーの設計にはいくつかの検討事項がある。第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーは各々、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びにハイブリダイズ領域の1つの鎖を含まなくてはならない。ここで前記ハイブリダイズ領域は第1のプライマーの場合は標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション領域と、第2のプライマーの場合は標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイズ配列の逆相補鎖と、ハイブリダイズすることができる。従って、一対のプライマーは標的核酸の領域を増幅するように設計される。プライマーの制限酵素認識配列は典型的に、標的核酸配列中には存在しないため、最初のハイブリダイゼーション事象の間にオーバーハングを形成した後、アンプリコンに導入される（図1を参照されたい）。非対称制限酵素を使用する場合、切断部位は典型的に認識配列の下流にあり、従って任意にプライマーのハイブリダイズ配列中に存在し得る。
【００５５】
オリゴヌクレオチドプライマーは、この方法におけるその切断後に切断部位の配列5'は、所望の反応条件下でその逆相補鎖とハイブリダイズし続け、かつ鎖置換型DNAポリメラーゼによって3'ヒドロキシル基の伸長後切断部位の下流の鎖が置換するのに十分な融解温度（Tm）を有する上流プライマーを形成するように設計する。従って、さらなる「安定化」領域がオリゴヌクレオチドプライマーの 5'末端に含まれる場合がある。その最適な長さは、関連する制限酵素の認識配列に対する切断部位の位置及び工程a)における増幅に利用される温度などの他の要因によって決定される。従って、一実施態様において前記第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記制限酵素認識配列及び前記切断部位の上流の、例えば5'末端、及び例えば5又は6塩基長の安定化配列を含む。
【００５６】
プライマー設計では、最適な配列特異的ハイブリダイゼーション及び鎖置換を可能にしてこの方法において特異的かつ高感度な増幅を確保するために、各ハイブリダイズ領域の配列及び長さを定義する必要がある。検出したい標的核酸、例えばウイルス又は細菌病原体のゲノム中のプライマーの位置決めはプライマーのハイブリダイズ領域の配列を様々に定義し、従って増幅の感度及び特異性が最適化され、オリゴヌクレオチドプローブとの適合性を有するプライマーを選択することができる。従って、異なるプライマー対をスクリーニングして、この方法の成績を高めるための最適な配列及び位置決めを特定することができる。典型的には、プライマーのハイブリダイズ領域の長さは、その理論的Tmが所望の反応温度で効率的なハイブリダイゼーションを可能にするが、同時に切断後にも容易に置換されるように、設計する。プライマーの設計中、ハイブリダイズ配列及び置換された鎖の配列の理論的Tmは、期待される反応温度及び選択した制限酵素の状況下で検討する。これは、配列の長さが長くなると生じ得る配列由来結合特異性に向かう理論的改善と釣り合っている。本発明者らの様々な研究により、この方法で効果的に使用するプライマーの設計には、かなりの汎用性があることが示された。一実施態様において、第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイズ領域は、6〜30塩基長、例えば9〜16塩基長である。さらなる実施態様において、修飾、例えば非天然塩基及び代替ヌクレオチド間結合、又は無塩基部位をプライマーのハイブリダイズ領域に利用して、特定の応用のため、それらの特性及びこの方法の運用を精緻にすることができる。例えば、Tmを増強する修飾、例えばPNA、LNA、G-clampは、アンプリコンをより短くし、従って増幅速度を増強することができるより短くより特異的なプライマーハイブリダイゼーション領域を可能とし得る。
【００５７】
本発明者らの様々な研究により、この方法の速度及びその感度は、短いアンプリコンを有することにより増強され、従ってある実施態様においてそのハイブリダイズ配列を含む両方のプライマーの全長を短くすること、及び標的核酸の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列の間に例えば10又は15ヌクレオチド塩基以下のただ1つの短いギャップを有するプライマーを位置決めすることが好ましい場合があることが明らかとなった。一実施態様において、標的核酸の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列は0〜15又は0〜6塩基で分離され、ある実施態様において、それらは3〜15又は3〜6塩基、例えば5、7、又は11塩基により分離される。さらなる実施態様において、例えば1〜2塩基だけ、ハイブリダイゼーション配列はオーバーラップしている。
【００５８】
この方法における使用のための、オリゴヌクレオチドプローブの配列の設計にはいくつかの検討事項がある。まず、第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズする第1のオリゴヌクレオチドプローブの領域及び第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズする第2のオリゴヌクレオチドプローブの領域は典型的に、それらがオーバーラップせず、又は最小限のオーバーラップを有し、両方のオリゴヌクレオチドプローブが増幅産物中の少なくとも1つの種と同時に結合することを可能とするように、設計する。また、増幅産物中の1以上の種に効率的に標的化させることを確保し、両方のオリゴヌクレオチドプローブを同じ鎖に結合させるために、それらは典型的に主に増幅産物種の一方の鎖の切断部位の位置及びその逆相補鎖上の切断部位の反対側の位置の間にある配列とハイブリダイズするように設計する。任意の所与のプライマー対について、いずれの鎖もオリゴヌクレオチドプローブによる標的化のために選択することができる。オリゴヌクレオチドプローブが典型的に、この方法においてポリメラーゼにより伸長されないことを考慮すると、ハイブリダイズ配列は増幅産物中の種の関連配列に基づいて設計され、このことはそれらのTm、%GC、及び得られる実験成績データを決定する。一実施態様において、第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズ配列は9〜20ヌクレオチド塩基長である。標的核酸の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列が0塩基によって隔てられている一実施態様において、オリゴヌクレオチドプローブのうちの1つのハイブリダイズ領域の配列は、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの1つに対応する場合があり、他のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズ領域は、他のオリゴヌクレオチドプライマーの逆相補鎖に対応する。しかしながら、この方法の所望の実施態様のためのオリゴヌクレオチドプローブの特性を最適化して、工程b)の全て又は一部を工程a)と同時に実施する場合のあらゆる阻害効果を回避するため、ハイブリダイズ配列の長さを縮めることができる。第1又は第2のオリゴヌクレオチドプローブが第1又は第2の制限酵素の認識配列及び切断部位を包含し、前記オリゴヌクレオチドプローブを工程a)の実施と同時に試料と接触させる場合、前記プローブ中の切断部位は、例えばプローブの化学合成中に修飾ヌクレオチド間結合、例えばホスホロチオエート結合を含めること、又は前記認識配列を除去するためにミスマッチを導入することにより、典型的に阻止される。ハイブリダイズ領域以外にも、オリゴヌクレオチドプローブの配列及びそれらが含み得る任意の修飾ヌクレオチド塩基、ヌクレオチド結合、又は他の修飾にはかなりの汎用性がある。オリゴヌクレオチドに化学的に挿入してそれらの特性を変更し、この方法の実施態様において利用され得る修飾塩基、例えば2-アミノ-dA、5-メチル-dC、Super T（登録商標）、2-フルオロ塩基、及びG clampは、Tmの増加を提供する一方、他の修飾ヌクレオチド塩基、例えばIso-dC及びIso-GはTmを増加させずに結合特異性を増強させることができる。他の修飾、例えばイノシン又は無塩基部位は、結合の特異性を低下させ得る。ヌクレアーゼ抵抗性を付与する公知の修飾には、逆向きdT及びddT及びC3スペーサがある。修飾によりTmを増加又は��下させることができ、この方法の実施態様においてハイブリダイゼーション事象を制御する潜在性を提供する。オリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズ領域中での修飾塩基の使用は、例えばハイブリダイズ領域の長さを増加させることなくその結合親和性を増強させることにより、オリゴヌクレオチドプローブの性能を向上させる機会を提供する。一実施態様において、一方又は両方のオリゴヌクレオチドプローブ中の修飾塩基は、関連する一本鎖検出配列との相補性を有する増幅産物中の任意の種より効率的に、従って、それに勝って、それらとハイブリダイズすることを可能とする。
【００５９】
第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが伸長を3'末端で阻止され、切断されることができず、工程a)の実施と同時に試料と接触させる実施態様において、典型的に1つのオリゴヌクレオチドプローブが追加の5'領域を含み、記載されている通りプレディテクター種を安定化させる機会が提供される（図2を参照されたい）。一実施態様において、前記1つのオリゴヌクレオチドプローブは、オリゴヌクレオチドプライマーのうちの1つの正確な配列を含むが、鎖置換型DNAポリメラーゼによるその伸長を3'末端で阻止する修飾及び制限酵素切断部位を阻止する単一のホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含む。そのような実施態様は、アッセイ設計を簡素化し、非特異的バックグラウンド増幅をもたらし得る追加の配列モチーフを導入しないことを確保する。
【００６０】
ディテクター種を生産する第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブは、好ましくは生産されるディテクター種のコピー数が検出の容易な前記ディテクター種について利用される手段の検出限界を十分に上回るレベルで提供される。さらに、第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプローブによるハイブリダイゼーションの効率は、その濃度に影響される。典型的に、工程a)の実施と同時に試料と接触させるオリゴヌクレオチドプローブの濃度は、オリゴヌクレオチドプライマーの濃度と同程度、例えば10〜200 nMとなり得るが、それは限定するものでないものとみなすべきである。一実施態様において、一方又は両方のオリゴヌクレオチドプローブの濃度は、一方又は両方のオリゴヌクレオチドプライマーの濃度より過剰に提供されるのに対し、別の実施態様において、一方又は両方のオリゴヌクレオチドプローブの濃度は、一方又は両方のオリゴヌクレオチドプライマーよりも低濃度で提供される。一方又は両方のオリゴヌクレオチドプローブを増幅工程a)の実施後に試料と接触させる場合において、濃度をより高くすると、必要に応じて最も効率的なハイブリダイゼーションを達成することが可能となり、工程a)の結果として生じ得る増幅に対する阻害について何ら検討する必要はない。
【００６１】
ハイブリダイゼーション配列は、この方法の実施のためのオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの両方の重要な特徴である。ハイブリダイゼーションとは、標的核酸又は増幅産物中の種と結合するオリゴヌクレオチドプライマー又はプローブの能力である配列特異的ハイブリダイゼーションを指し、各核酸の配列中の相補的塩基の間の水素結合塩基対に起因する。典型的な塩基対は、アデニン-チミン（A-T）、又はRNA若しくはRNA/DNAハイブリッド二本鎖の場合はアデニン-ウラシル、及びシトシン-グアニンであるが、核酸塩基の様々な天然及び非天然類似体も特定の結合選好性を有することが公知である。さらに、本発明において、オリゴヌクレオチドプローブ又はプライマーの相補的領域は、必ずしも標的核酸又は増幅産物中の種中のそのハイブリダイゼーション配列との完全かつ正確な相補性を有する配列中の完全に天然の核酸塩基を含む必要はない：むしろ、この方法の実施のためには、オリゴヌクレオチドプローブ/プライマーは制限酵素による切断及び鎖置換型DNAポリメラーゼによる伸長を含むこの方法の正しい運用に必要な二本鎖配列を形成するのに十分なその標的ハイブリダイゼーション配列との配列特異的ハイブリダイゼーションが可能でありさえすればよい。従って、そのようなハイブリダイゼーションは、正確に相補的ではなく、非天然塩基又は無塩基部位を有していても、起こり得る。一実施態様において、この方法で使用するオリゴヌクレオチドプライマー又はオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイズ領域は、標的核酸の関連する領域の配列との完全相補鎖、増幅産物中の種、又は必要に応じて、その逆相補的配列からなり得る。他の実施態様において、1以上の非相補的塩基対がある。いくつかの状況では、この方法においてオリゴヌクレオチドプライマー及び/又はプローブの混合物を使用することが有利な場合がある。従って、例として標的核酸が2つの多型位置を有する一塩基多形（SNP）部位を含む場合、オリゴヌクレオチドプライマー及びその位置で異なるオリゴヌクレオチドプローブの1:1混合物（各成分はSNPの各塩基に対する相補性を有する）を利用することができる。オリゴヌクレオチドの製造時に、合成プロセスの間1以上の塩基を無作為化することは、慣例的に実践される。
【００６２】
当業者であれば、ポリメラーゼを含む増幅プロセスが、1からの合成及び/又はプライマー間結合に起因するような非特異的バックグラウンド増幅を課題とし得ることを理解されよう。この発明の方法は典型的に、アンプリコンの長さができるだけ短くなるように、例えばプライマーのハイブリダイズ配列、標的核酸における第1及び第2のハイブリダイゼーション配列の間のギャップ、及び任意の安定化領域の長さを可能な範囲で最小化することにより設計されている場合、より迅速な増幅を示すのに対し、所与の反応温度での機能を依然として保持する。より短いアンプリコンを用いると、増幅産物種を生産するために必要な全ての配列がオリゴヌクレオチドプライマーによって提供されるという事実から、非特異的バックグラウンドが悪化する場合がある。1から合成されたDNA又はプライマー間結合を介して「連結された」第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの両方を含む非標的特異的様式でアンプリコンが生産された場合は、擬陽性の結果がこの方法において発生し得る。本方法で2つのオリゴヌクレオチドプローブを用いることで、様々な実施態様の追加的特徴を包含する方法が可能になり、任意の非標的特異的バックグラウンドシグナルの可能性が最小化する。2つのオリゴヌクレオチドプローブを使用することで実現されるそのような実施態様は、この点で公知の方法に比べて大きな利点がある。
【００６３】
1つのアプローチは、標的核酸中の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列を分離し、この方法のオリゴヌクレオチドプローブを使用して標的ベースの配列特異性チェックを提供することである。従って、一実施態様において、標的核酸の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列は3〜15又は3〜6塩基、例えば5、7、又は11塩基により隔てられる。プライマー間のこのギャップは最適なサイズギャップを提示し、短いアンプリコンの速度増強を維持しながら、増幅産物中の種の追加的特異性チェックを提供する。従って一実施態様において、工程b)において前記増幅産物中の前記少なくとも1つの種の前記第1又は第2の一本鎖検出配列が、前記3〜15塩基、又は3〜6塩基に対応する少なくとも3塩基の配列を含む。例えば、本発明者らは実施例4（図8）に示すように、特異的標的依存的増幅産物及び非標的特異的バックグラウンド増幅産物を識別する潜在性を実証した。
【００６４】
代替アプローチでは、第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプライマーの濃度を減少させ、1からの増幅及びプライマー間結合に起因するバックグラウンドの確率を低下させる。増幅速度を維持することを確保するために、鎖置換型DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止された追加のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することができる。この実施態様において、阻止されていない第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、初回のハイブリダイゼーション及び伸長事象について標的核酸由来のアンプリコンを生産するために十分な濃度で利用可能であり、続く増幅は好ましくは高濃度で提供される阻止されたプライマーを用いて続行される。ここで阻止されたプライマーの切断は、3'阻止修飾を除去し、かつ増幅プロセスを損失なく続行させるために、その伸長及び鎖置換の前に起こる（図4を参照されたい）。従って、一実施態様において、工程a)において前記試料をさらに：（A）5'から3'の方向に前記第1の制限酵素の認識配列及び切断部位並びに前記標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、DNAポリメラーゼによる伸長が3'末端で阻止される、第3のオリゴヌクレオチドプライマー；及び/又は（B)5'から3'の方向に前記第2の制限酵素の認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、前記DNAポリメラーゼによる伸長が3'末端で阻止される、第4のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる。さらなる実施態様において、存在する場合、前記第3のオリゴヌクレオチドプライマーは前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーより過剰に提供され、かつ存在する場合、前記第4のオリゴヌクレオチドプライマーは前記第2のオリゴヌクレオチドプライマーより過剰に提供される。第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの濃度を大幅に低下させ、これを第3及び第4のオリゴヌクレオチドプライマーの存在により埋め合わせることにより、非標的依存的バックグラウンド増幅の除去の観点で最大の潜在的利益を得る。オリゴヌクレオチドプライマー合成中に、例えば3'リン酸又はC-3修飾の使用を通じて容易に達成できるポリメラーゼ伸長を阻止するための3'修飾の存在以外では、第1及び第2のプライマーに利用されるものと同じ設計パラメータが、第3及び第4のプライマーに適用される。
【００６５】
上記の通り特異性の増強及びバックグラウンド増幅の除去を提供する本発明の方法の実施態様は、配列確認の厳密さを向上させ、それにより特異性の損失なく低温反応を実施することが可能となり、かつ/又はマルチプレックス性を増加させて、複数の反応が複数の標的の同時検出により実施されることが可能となる。また、この厳密な特異性の利点は、この方法が広い温度範囲及び最適を下回る条件（例えば、試薬濃度）でも特異性を損失することなく許容できることを意味する。例えば、本発明者らは全ての成分の濃度を20%ずつ増減させてこの方法を実施し、本発明者らは工程a)で増幅を実施した後、かなりの期間を周囲温度でこの方法を実施したが、各事例において、特異性の損失は一切観察されなかった。従って、そのような実施態様は、公知の方法を上回る本発明の方法の重要な利点となり、低コスト及び/又は使い捨ての診断装置での利用に理想的に好適であることを意味する。
【００６６】
工程c）でのディテクター種の検出は、試料中に存在する他の試薬及び成分からディテクター種の存在を差次的に検出する任意の技術によって達成することができる。あるいは、ディテクター種の存在又はレベルは、1以上の反応成分、例えば第1又は第2のオリゴヌクレオチドプローブの除去から推定できる。ディテクター種の検出における使用に利用可能な多種多様な物理化学的技術から、第1のオリゴヌクレオチドプローブ及び第2のオリゴヌクレオチドプローブの増幅産物中の関連する種とのハイブリダイゼーション後にのみ存在する高感度シグナルを生成することが可能な技術をこの方法の使用について優先した。当業者であれば、第1のオリゴヌクレオチドプローブに容易に結合させることができる様々な比色定量色素又は蛍光定量色素が存在し、その視覚による又は装置を使用した（例えば吸光度又は蛍光分光法）検出の基礎を形成することが明らかであろう。
【００６７】
従って一実施態様において、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの検出を可能とする部分が、比色定量色素若しくは蛍光定量色素、又は比色定量若しくは蛍光定量色素との結合を可能とする部分、例えばビオチンである。
【００６８】
比色定量色素を利用する方法の実施態様は、蛍光励起及び検出を行う装置を必要とせず、潜在的に標的核酸の存在を目で判断できるという利点がある。比色定量検出は、この方法におけるその使用の前に、第1のオリゴヌクレオチドプローブに比色定量色素、又は比色定量色素と結合可能な部分を直接結合させ、あるいは切断後のプローブ断片に色素又は部分を特異的に結合させ（attaching）、又は結合させる（binding）ことにより達成することができる。例えば、第1のオリゴヌクレオチドプローブには、引き続きそれを検出するためのストレプトアビジンをコンジュゲートした比色定量色素とのその結合を可能にするビオチン部分を含み得る。検出に使用できるそのような比色定量色素の一例は、金ナノ粒子である。同様の方法では、様々な他の本質的比色定量部分を利用することができ、これらは非常に多くのものが公知であり、例えばカーボンナノ粒子、銀ナノ粒子、酸化鉄ナノ粒子、ポリスチレンビーズ、量子ドットなどがある。吸光係数の高い色素はまた、この方法における高感度リアルタイム定量の潜在性を提供する。
【００６９】
所与の応用に適切な色素を選択する際には、いくつかの検討事項を考慮する。例えば、溶液中で可視比色定量検出の実施を意図した実施態様において、検出のしやすさから、一般的により大きなサイズの粒子及び/又は、より吸光係数の高い粒子を選択することが有利である一方、可視検出を意図するラテラルフロー膜を組み込んだ実施形態では、 膜に沿ってより迅速に拡散する、より小さいサイズの粒子の能力から利益を受ける場合がある。様々なサイズ及び形状の金ナノ粒子が利用可能であるが、ポリスチレン又はラテックスをベースとしたミクロスフェア/ナノ粒子を含むいくつかの関心対象とする他の比色定量部分も利用可能である。また、この性質の粒子はいくつかの色を利用可能である。いくつかの色は、この方法の実施中に異なるディテクター種にタグ付加し、差次的に検出する、すなわち検出反応中に「マルチプレックス」に比色定量シグナルを生産するために、有用となり得る。
【００７０】
蛍光定量検出は、適切な励起刺激の下でディテクター種の引き続きの検出を導く蛍光シグナルを放出する任意の色素の使用を通じて達成することができる。例えば、直接蛍光検出用の色素には、限定はされないが：量子ドット、ALEXA色素、フルオレセイン、ATTO色素、ローダミン、及びテキサスレッドがある。オリゴヌクレオチドプローブに結合させた蛍光色素部分を利用する方法の実施態様においてまた、蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）、例えば核酸検出のためのTaqMan定量PCR又は分子ビーコンベースの戦略の利用に基づく検出を実施することも可能である。それにより、ディテクター種と色素の結合後に増加又は低下する。一般的に、蛍光定量アプローチを使用する場合、いくつかの異なる検出装置、例えばCCDカメラ、蛍光スキャナ、蛍光ベースマイクロプレートリーダー、又は蛍光顕微鏡などを使用して、蛍光シグナルの生成を記録することができる。
【００７１】
さらなる実施態様において、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの検出を可能とする部分が、基質との接触後に検出可能なシグナル、例えば比色定量若しくは蛍光定量シグナルを生じる酵素である。当業者であれば、いくつかの酵素基質システム、例えばELISA及び免疫組織化学検出が利用可能であり、診断の分野で慣例的に使用されていることは明らかであろう。セイヨウワサビペルオキシダーゼ（HRP）がその一例である。工程c)におけるディテクター種の検出のために第1のオリゴヌクレオチドプローブに結合された酵素を利用することは、いくつかの潜在的利点、例えば検出感度の増強及び基質の追加を含む分離した工程を通じたシグナル発色の制御の向上を提供する。他の好適な比色定量酵素には：グリコシルヒドロラーゼ、ペプチダーゼ又はアミラーゼ、エステラーゼ（例えば、カルボキシエステラーゼ）、グリコシダーゼ（例えば、ガラクトシダーゼ）、及びホスファターゼ（例えば、アルカリホスファターゼ）などがあり得る。このリストは、いかなる方法においても限定的なものとみなされるべきではない。
【００７２】
別のアプローチにおいて、工程c)におけるディテクター種の存在は電気的に、例えばインピーダンスの変化又は伝導性シグナル変化、電流測定シグナル変化、ボルタンメトリーシグナル変化、又は電位差測定シグナル変化によってディテクター種の存在が検出される。このように、一実施態様において、ディテクター種は電気シグナルの変化によって検出される。電気シグナルの変化は、電気シグナルの変化を増強する化学基など、第1のオリゴヌクレオチドプローブの検出を可能にする部分によって促進される場合がある。電気シグナルの検出は非常に感度が高いため、前記検出の部分は単純にオリゴヌクレオチド配列であり得るが、ある実施態様において、シグナルは金属、例えば金及びカーボンなどの電気シグナルを増強することが知られている化学基の存在によって、増強される。
【００７３】
一実施態様において、ディテクター種の蓄積に起因する電気シグナルの変化は増幅中の水性反応で検出することができ、他の実施態様において、電気シグナルの検出は、その検出のための第2のオリゴヌクレオチドプローブによって仲介される特定の部位、例えば電気化学的プローブの表面へのディテクター種の局在化によって促進される。
【００７４】
ディテクター種などの核酸の検出に慣例的に利用され、この方法における検出にも利用できる他の技術には、質量分析（例えば、MALDI又はLC-TOF）、発光分光法又は分光分析、蛍光分光法又は分光分析、液体クロマトグラフィー、及び蛍光偏光法がある。
【００７５】
一実施態様において、工程c)では、カーボン又は金、好ましくはカーボンを使用して比色定量又は電気化学的シグナルが生成される。
【００７６】
一実施態様において、ディテクター種は核酸ラテラルフローによって検出される。核酸が典型的にはニトロセルロースでできた膜を通じたその拡散により他の反応成分から分離される核酸ラテラルフローは、迅速かつ低コストの検出方法であり、比色定量、蛍光定量、及び電気的シグナルを含む様々なシグナル読取値を結合させることができる。核酸ラテラルフローは、この方法におけるディテクター種の検出における使用によく適しており、いくつかの利点を提供する。一実施態様において、ディテクター種中の第1のオリゴヌクレオチドプローブを使用して比色定量色素又は蛍光定量色素を結合させ、ディテクター種中の第2のオリゴヌクレオチドプローブを使用して、前記色素をラテラルフローストリップの定義された位置に局在化させる、核酸ラテラルフロー検出が実施される。このようにして、迅速な検出を実施して、目又は読取装置により結果を可視化することができる。核酸ラテラルフローでは、第2のオリゴヌクレオチドプローブのディテクター部分として抗原を利用し、関連する抗体をラテラルフローストリップ上に固定することができる。あるいは、本方法においてラテラルフローストリップ上のプレディテクター種又はディテクター種のハイブリダイゼーションを介する配列特異的検出は、容易に実施することができ、マルチプレックスの潜在性が向上した抗体ベースのアッセイに代わる簡素化された低コストの代替法を提供する。本方法の2つのオリゴヌクレオチドプローブを利用しない公知の方法、例えばSDAは、典型的に配列特異的ハイブリダイゼーションに基づく検出の利用可能でない二本鎖DNA産物を生成する。本方法では対照的に、ディテクター種は、位置特異的ハイブリダイゼーションベースの検出を使用することにより、特にマルチプレックス検出に適応する。カーボン又は金のナノ粒子は、核酸ラテラルフローに容易に利用可能である。ディテクター種の局在により、カーボン又は金が局所に集中し、それぞれ黒又は赤色が現れる。一実施態様において、第1のオリゴヌクレオチドプローブは、配列特異的ハイブリダイゼーションによるストリップ上への局在化の前にその比色定量色素との結合を可能とする、ビオチンなどの部分を含む。
【００７７】
ディテクター種の空間的配置は、例えば特定の位置でのデイテクター種のハイブリダイゼーションベースの結合が許容される場合、ディテクター種の検出に利用される技術と密接に関連する。迅速かつ特異的な検出を促進するだけでなく、そのような物理的結合は、複数の異なる標的核酸のマルチプレックス検出における方法の使用を増強し得る。一実施態様において、第2のオリゴヌクレオチドプローブは、核酸ラテラルフローストリップ又は電気化学的プローブの表面、96ウェルプレート、ビーズ、又はアレイ表面に結合させる。従って、増幅産物中の少なくとも1つの種は、そのような位置でのディテクター種の形成後に容易に検出される第2のオリゴヌクレオチドプローブの物理的位置に局在するようになる。あるいは、一本鎖オリゴヌクレオチドを固体材料へのその結合を可能にする第2のオリゴヌクレオチドプローブと結合する部分として使用することは、有利となり得る。このようにして、固相に結合されたオリゴヌクレオチドの配列を標的核酸配列とは独立に定義し、結合効率を増強することができる。従って、一実施態様において、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能とする部分が、一本鎖オリゴヌクレオチドである。前記一本鎖オリゴヌクレオチドは、ハイブリダイゼーションの親和性及び効率を向上させ、この方法の成績を増強させるように設計することができる。例えば、この方法のある実施態様において、第2のオリゴヌクレオチドプローブをラテラルフローストリップに直接結合させるのではなく、 第2のオリゴヌクレオチドプローブ中に存在する一本鎖オリゴヌクレオチド部分との効率的ハイブリダイゼーションが可能なストリップ上ハイブリダイゼーション用に最適化された配列を有する別個のオリゴヌクレオチドが採用されている。
【００７８】
様々な研究において、本発明者らは一本鎖オリゴヌクレオチドを第2のオリゴヌクレオチドプローブの結合部分として使用する核酸ラテラルフローによる方法の成績を顕著に高め、ストリップ上ハイブリダイゼーション配列を強化した。例えば、G-Cリッチ配列をストリップ上ハイブリダイゼーションに利用することができ、又は第2のオリゴヌクレオチドプローブの長さを補うよりTmの高いより長い配列を利用することができる。あるいは、前記一本鎖オリゴヌクレオチド部分は、その親和性を増強するための1以上の修飾塩基又はヌクレオチド間結合、例えばPNA、LNA、又はG-clampを含むことができる。本発明者らは、一本鎖オリゴヌクレオチド部分に反復配列モチーフを利用すると、その予測Tmによっては予測されない予期せぬハイブリダイゼーション効率の増強が観察されることを認めた。従って、一実施態様において、一本鎖オリゴヌクレオチド部分の配列は、2〜4塩基のDNA配列モチーフの3以上の反復コピーを含む。例えば、そのような配列モチーフを利用した様々な研究において、本発明者らは核酸ラテラルフローによる検出感度が、多くは100倍以上のシグナル増強により、大幅に増強されることを観察した。
【００７９】
従ってディテクター種の存在が核酸ラテラルフローによって検出される一実施態様において、前記核酸ラテラルフローが、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能にする部分との配列特異的ハイブリダイゼーションを可能とする1以上の核酸を利用する。
【００８０】
さらなる利点は、結合のための固体材料から、又は検出手段から標的核酸配列を分離することにより付与される。これは、一本鎖オリゴヌクレオチドを第1のオリゴヌクレオチドプローブ中の検出部分として及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプローブとの結合部分として使用することにより可能となる。このようにして、結合のための関連する固体材料、又は前記固体材料を含む装置、例えば核酸ラテラルフローストリップ、及び/又は検出手段は、検出することとなる標的核酸の配列を考慮せずに、最適化し、定義することができる。そのような「ユニバーサル」検出装置は、応用ごと、標的ごとに変更することを必要とせずに、使用することができる。例えば、効率的なストリップ上ハイブリダイゼーションをする能力を有し、意図しないクロストークを定義し得ないオリゴヌクレオチド配列の適合するセットに対応する線がプリントされ、複数の標的核酸配列の検出のための方法のオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの開発とは独立して最適化され、効率的に製造されている核酸ラテラルフローストリップ。
【００８１】
いくつかの実施態様において、検出は定量的に実施することができる。従って、試料中の一本鎖標的核酸のレベルは、工程c)において定量化することができる。定量化は、単一の終点ではなく、反応の時系列の中の複数の時点で例えば比色定量的、蛍光定量的、又は電気的にディテクター種を測定するにより、達成することができる。定量の代替戦略には、ドロップレットデジタルPCRに類似した試料の連続希釈がある。さらなる実施態様において、試料中の一本鎖標的核酸のレベルは、半定量的に決定することができる。例えば、核酸ラテラルフローストリップ上の比色定量シグナルの強度が、試料中の一本鎖標的核酸のおよそのレベルに対応する。あるいは、阻害因子を使用することもでき、それにより阻害剤を克服し、検出可能なコピー数のディテクター種を生産するためには、一本鎖核酸標的のコピー数が一定の定義されたコピー数を超えなければならない。
【００８２】
本発明の方法において、第2のオリゴヌクレオチドプローブは固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合される。実施態様においてまた、任意に1以上の他のオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分に結合することができる。当業者であれば、オリゴヌクレオチドの固体材料との結合は、様々な異なる方法において達成することができることは明白であろう。例えば、適切に修飾されたオリゴヌクレオチドプローブと結合又は反応させる目的に有用となるように、十分な密度の官能基を備えた、又はそれらと結合することができる、又はそれらに官能基付与することができるいくつかの異なる固体材料が利用可能である。さらに、ビーズ、樹脂、表面コーティングプレート、スライド、及びキャピラリーを含む、多種多様な形状、サイズ、及び形態のそのような固体材料を利用可能である。オリゴヌクレオチドの共有結合に使用されるそのような固体材料の例には、非限定的に、スライドガラス、ガラスビーズ、フェライトコアポリマーコーティング磁気マイクロビーズ、シリカマイクロ粒子又は磁気シリカマイクロ粒子、シリカベースキャピラリーマイクロチューブ、3D反応性ポリマースライド、マイクロプレートウェル、ポリスチレンビーズ、ポリ（乳酸）（PLA）粒子、ポリ（メチルメタクリレート）（PMMA）マイクロ粒子、制御された細孔ガラス樹脂、グラフェンオキシド表面、及び官能基付与アガロース又はポリアクリルアミド表面がある。ポリアクリルアミドなどのポリマーは、ポリマーの生成に使用されるモノマー（例えば、アクリルアミドモノマー）間の重合反応中に、官能基付与オリゴヌクレオチドが共有結合し得るというさらなる利点を有する。官能基付与オリゴヌクレオチドを重合反応に含めて、共有結合したオリゴヌクレオチドを含む固体ポリマーを生産する。そのような重合は、生成されるオリゴヌクレオチド結合固体材料のサイズ、形状、及び形態を制御して、オリゴヌクレオチドを固体材料に結合させる高度に効率的な手段となる。
【００８３】
典型的に、オリゴヌクレオチドプローブを任意のそのような固体材料と結合させるために、3'又は5'末端に官能基を有するオリゴヌクレオチドを合成するが、官能基はオリゴヌクレオチドの生産プロセス中に、ほとんどすべての塩基位置で付加することもできる。続いて、オリゴヌクレオチド中の官能基及び関連する固体材料上の官能基の間で特異的反応を実施して安定な共有結合を形成させ、固体材料に結合されたオリゴヌクレオチドを得ることができる。典型的に、そのようなオリゴヌクレオチドは、5'又は3'末端で固体材料と結合する。例として、2つの一般的に使用され、信頼性の高い結合化学では、チオール（SH）又はアミン（NH3）基及びオリゴヌクレオチド中の官能基を利用する。チオール基は、固体担体上のマレイミド部分と反応してチオエステル結合を形成し得る一方、アミン はスクシンイミジルエステル（NHSエステル）修飾カルボン酸と反応してアミド結合を形成し得る。他にもいくつかの化学を使用することもできる。オリゴヌクレオチドプローブの固体材料との化学的コンジュゲートだけでなく、この方法の実施における使用のために、固体材料上でオリゴヌクレオチドプローブを直接合成することが可能であり、潜在的に有利である。
【００８４】
他の実施態様において、第2のオリゴヌクレオチドプローブはその固体材料との結合を可能にする部分と結合される。1つの戦略は、アフィニティー結合の方法を利用するものであり、それにより特異的結合を可能にする部分をオリゴヌクレオチドプローブと結合させてその関連するアフィニティーリガンドとの結合が促進され得る。これは、例えば抗体抗原結合若しくはポリヒスチジンタグなどのアフィニティータグを使用して、又は相補的核酸を固体材料、例えばニトロセルロース核酸ラテラルフローストリップと結合させる核酸ベースのハイブリダイゼーションを使用することにより、実施することができる。例示的なそのような部分は、ビオチンである。ビオチンは、それ自体がビーズ又は別の固体表面と結合しているストレプトアビジン又はアビジンと高いアフィニティーで結合することができる。
【００８５】
定義された配列の2以上の異なる標的核酸の存在は同じ試料中で検出することができる。この方法の一実施態様において、2以上の標的核酸の各々について異なるオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブを使用して、別個に一連の工程a)、b)、及びc)を実施する。ここで、別個の工程は同時に実施することができる。例えば、一実施態様において、あるセットのオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブを使用して試料中の1つの標的核酸を検出し、別のセットのオリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブを、同じ試料中の別の標的核酸の検出に使用する。2以上の異なるセットのプライマー/プローブから生産されたディテクター種の検出は、各々マルチプレックス検出を可能とする特定のシグナル、例えば異なる比色定量色素又は蛍光定量色素又は酵素と結合させることができる。あるいは、マルチプレックス検出は、その固体材料との結合を可能にする部分を通じて直接的又は間接的に第2のオリゴヌクレオチドプローブを固体材料と結合させることにより、達成することができる。そのようなアプローチでは、異なる検出手段に頼るのではなく、異なる一連の工程a)、b)、及びc)によって生産されるディテクター種の物理的分離を利用する。従って、例えば核酸ラテラルフロー上で単一の色素を使用して、複数の異なる標的核酸を検出することができ、生産された各々の異なるディテクター種がラテラルフローストリップ上の特定のプリントラインに局在し、第2のオリゴヌクレオチドプローブとの直接的又は間接的な配列ベースのハイブリダイゼーションにより、差別化された検出の基礎が形成される。あるいは、電気的検出アレイを使用することができ、複数の異なる第2のオリゴヌクレオチドプローブをアレイの特定の領域と結合させ、これによりマルチプレックス反応にあり、複数の異なるディテクター種を同時に生産し、各ディテクター種は、マルチプレックス検出を可能とするアレイの不連続領域に対するハイブリダイゼーションによって局在化される。
【００８６】
上記の検出プロセス、例えば核酸ラテラルフロー及び電気的検出、並びに同じ試料中の複数の異なる標的核酸を容易に検出するその能力は、本方法が2つのオリゴヌクレオチドプローブを本質的に要求することによって実現される。そのため、当該検出プロセスは、公知の方法を上回る本発明の方法の利点を効果的に実証する。
【００８７】
本発明は、試料中の定義された配列の標的核酸の検出を要求する様々な分野及び応用に対する広い有用性を有する。本発明は、試料中の標的核酸配列の存在を迅速、安価、かつ利便性高く決定する手段となる。限定するものではない応用のリストを通じて、本発明者らは本発明が、診断、法医学、農学、動物衛生、環境、防衛、ヒトの遺伝子検査、出生前検査、血液汚染スクリーニング、薬理ゲノミクス又は薬物動態学、並びに微生物学、臨床及び生物医学研究などの分野において価値のあるものであると想定する。好適には、試料は、ヒト試料などの生物学的試料である。前記試料はヒト試料、法医学試料、農学試料、獣医学試料、環境試料、又は生体防御試料であり得る。
【００８８】
標的核酸の検出は、 疾患又は罹患状態、例えばこれらに限定はされないが、HIV、インフルエンザ、RSV、ライノウイルス、ノロウイルス、結核、HPV、髄膜炎、肝炎、MRSA、エボラ、クロストリジウムディフィシレ、エプスタイン・バーウイルス、マラリア、ペスト、ポリオ、クラミジア、ヘルペス、淋病、麻疹、 流行性耳下腺炎、風疹、コレラ、若しくは天然痘を含む感染症、又はこれらに限定はされないが、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、膵癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、白血病、食道癌、卵巣癌、腎癌、胃癌、若しくは黒色腫を含む癌の診断、予後判定、又はモニタリングのために、又はヒトの遺伝子検査、出生前検査、血液汚染スクリーニング、薬理遺伝学、若しくは薬物動態学の分野において使用し得る。
【００８９】
本発明は、例えば：鼻スワブ又は吸引液、鼻咽頭スワブ又は吸引液、喉スワブ又は吸引液、頬スワブ又は吸引液、血液又は血液由来試料、尿又は尿由来試料、喀痰又は喀痰由来試料、糞便又は糞便由来試料、脳脊髄液（CSF）又はCSF由来試料、及び胃液又は胃液由来試料、任意の形態の組織生検又は体液由来ヒト又は動物試料などの幅広い種類の試料で使用することができる。また、本発明者らは以下の臨床検体：VTMの鼻スワブ、VTMの鼻咽頭スワブ、thin prep培地、液体Amies中の喉スワブ、M4培地中のHSV疼痛部スワブ、滑液、2M NaOH/イソプロパノール、続いてDNA捕捉ビーズで処理された喀痰、TE中の直腸スワブ、ホモジナイゼーション及びDNA捕捉ビーズで処理された糞便試料、CSF、APTIMAスワブ、羊水、液体Amies中の口腔スワブ、尿、TE中のVREスワブ、胸水、全血、K2EDTA血漿、L.ヘパリン血漿、及び血液血清の少なくとも10〜20%を含む広範囲の試料でこの方法を実施している。これらの実験では、様々な臨床応用に対するこの方法の注目に値する汎用性及び関連する試料中で阻害が認められないことが実証された。これは、PCRを阻害するヘパリン及びフィチン酸など、生体検体中に見いだされる阻害因子によって阻害される他の方法とはまったく対照的であり、従って複雑な試料調製手順を一切要求せずに低コスト又は使い捨ての装置でこの方法を使用することの潜在性を実証する。
【００９０】
標的核酸は、とりわけ（a）ウイルス性若しくはウイルス性核酸材料由来、（b）細菌性若しくは細菌性核酸材料由来、（c）癌細胞から放出された循環型無細胞DNA、（d）胎児細胞から放出された循環型無細胞DNA、又は（e）マイクロRNA若しくはマイクロRNA由来であり得る。
【００９１】
この方法の一本鎖標的核酸は、天然に存在しても、天然に存在しなくてもよい。標的核酸は、その場で生成されても、この方法の実施の前に天然の核酸から生産されてもよい。この方法の一本鎖標的核酸は、工程a)の前又はそれと同時に実施される1以上の追加工程によって調製することができ、この追加工程には、ポリメラーゼ及び制限酵素などの1以上の酵素が包含され得る。このようなこの方法の標的核酸の生成には、さらにより高度のマルチプレックスアッセイを可能にし、かつ/又は1からのバックグラウンドを克服するなどのいくつかの潜在的な利点がある。例えば、工程a)における増幅の前に増幅することなく生体試料中の核酸材料の高度に特異的な変換を実施することができる。試料は、例えば処理され、精製され、緩衝液交換に付され、エキソーム捕捉に付され、夾雑物質を部分的に除去され、かつ/又は1以上の修飾dNTPを含む方法のために一本鎖標的核酸に変換され得る。試料中の検出することとなる「真の」標的核酸が、信頼性の高い変換（<1:1、1:1又は1:>1であり得る、すなわちいくつかの増幅エレメントを有する可能性がある）によりこの方法の実施のための、「代理」標的核酸に変換される場合、「代理」標的核酸の検出は、「真の」核酸を検出し、かつ/又は定量化することを可能にするであろう。さらに、天然の標的由来の代理標的の生産をこのように使用して、任意の所望の配列を有する方法の標的核酸を特異的に生成する生成することができる。一本鎖標的核酸が例えば鎖侵入による2つの鎖の解離後に二本鎖DNAから得られる一実施態様において2つの相補的一本鎖核酸標的が存在し、同じオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブによって相互プロセスで増幅され、検出され得る。標的が-ve鎖一本鎖RNAウイルスのゲノムである場合、試料中には+ve鎖転写物も存在する場合があり、同じオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを使用するこの方法においていずれかの鎖又は両方の鎖を一本鎖標的核酸として増幅し、かつ検出することができる。
【００９２】
また、本発明は、無細胞DNA及び例えばDNA配列のCpGメチル化などの後成的修飾について試料をスクリーニングする際に有用となる潜在性を有することが想定される。特定の癌関連標的遺伝子のそのような後成的修飾は、多くの疾患及び罹患状態において有用なバイオマーカーとしての機能を果たし得る。ヒト疾患における後成的修飾の重要性の評価がますます高まっていることを考慮すると、鎖置換型DNAポリメラーゼ及び/又は制限酵素の差別化された活性に基づいて、特定の標的核酸バイオマーカーの後成的修飾を特異的に評価するために、本発明が使用される潜在性がある。従って、一実施態様において、標的核酸はメチル化などの後成的修飾部位を含む。あるいは、上記のこの方法の実施のための「代理」標的核酸を生産するために使用する「真の」核酸は、後成的修飾部位を含む。
【００９３】
本発明のさらなる態様は、試料中の定義された配列の核酸検出に使用するキットに関する。従って、本発明はまた、以下：
a) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに定義された配列の一本鎖標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
b) ニッキング酵素ではなく、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該切断部位を切断することができる第1の制限酵素及びニッキング酵素ではなく、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該切断部位を切断することができる、第2の制限酵素；
c) 鎖置換型DNAポリメラーゼ；
d) dNTP、
e) 1以上の修飾dNTP；
f) 前記標的核酸の存在下で生産された増幅産物中の少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、その検出を可能とする部分と結合されている、第1のオリゴヌクレオチドプローブ；並びに
g) 増幅産物中の該少なくとも1つの種の該第1の一本鎖検出配列の上流又は下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合される、第2のオリゴヌクレオチドプローブ、を含むキットを提供する。
【００９４】
一実施態様において、キットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つは、前記DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、例えば1以上の配列ミスマッチ及び/又は1以上の修飾、例えばホスホロチオエート結合の存在のために前記第1又は第2の制限酵素によって切断されることができない。
【００９５】
一実施態様において、キットの前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つは、前記第1若しくは第2のプライマーのハイブリダイズ領域との5塩基以上の相補性又は該第1若しくは第2のプライマーのハイブリダイズ領域の逆相補鎖を有する。
【００９６】
別の実施態様において、キットの前記第1のオリゴヌクレオチドプローブは、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方のハイブリダイズ領域との多少の相補性、例えば5塩基以上の相補性を有し、かつ/又はキットの前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、該第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの他方のハイブリダイズ領域の逆相補鎖との、多少の相補性、例えば5塩基以上の相補性を有する。
【００９７】
さらなる実施態様において、上記のように、第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプローブは、標的核酸の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列間のギャップとの多少の相補性又は逆相補性を有し得る。
【００９８】
キットには逆転写酵素も含み得る。
【００９９】
キットは、前記標的核酸の存在下で生産されたディテクター種の存在を検出するための手段をさらに含み得る。例えば、キットにはさらに、核酸ラテラルフローストリップ、電気化学的プローブ、96ウェルプレート、ビーズ又はアレイ表面、及び/又は比色定量色素若しくは蛍光定量色素、及び/又は電気シグナルの変化を検出するための装置、及び/又はカーボン若しくは金を含み得る。
【０１００】
様々な実施態様において、キットに含まれる標的核酸及びキットの構成要素、例えば前記増幅産物中の少なくとも1つの種における前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー、及び/又は前記第2のオリゴヌクレオチドプライマー、及び/又は前記第1の制限酵素、及び/又は前記第2の制限酵素、及び/又は前記DNAポリメラーゼ、及び/又は前記dNTP、及び/又は前記1以上の修飾dNTP、及び/又は前記第1のオリゴヌクレオチドプローブ、及び/又は前記第2のオリゴヌクレオチドプローブ、及び/又は前記第1若しくは第2の一本鎖検出配列は、本発明の方法について本明細書中に定義した通りである。例えば、キットには、本明細書に記載の構成要素の特徴の任意の組合わせ、例えば非限定的に、以下を含む場合がある：第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つはDNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、任意に1以上の配列ミスマッチ及び/又は1以上の修飾、例えばホスホロチオエート結合の存在のために前記第1又は第2の制限酵素によって切断されることができなくなり；前記第1の制限酵素及び第2の制限酵素は同じ制限酵素であり；前記1以上の修飾dNTPは、αチオール修飾dNTPであり；第1のオリゴヌクレオチドプローブの検出を可能とする部分は比色定量色素若しくは蛍光定量色素又は比色定量色素若しくは蛍光定量色素に結合させることができる部分、例えばビオチンであり；第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能にする部分は任意に2〜4塩基のDNA配列モチーフの3以上の反復コピーを含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり；前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、前記制限酵素認識配列及び前記切断部位の上流の、例えば5'末端、及び例えば5又は6塩基長の安定化配列を含み；第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイズ領域は、6〜30塩基長、例えば9〜16塩基長であり；かつ標的核酸の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列は0〜15又は0〜6塩基で隔てられ、ある実施態様において、それらは3〜15又は3〜6塩基、例えば5、7、又は11塩基により隔てられ、又はそれらは例えば1〜2塩基だけオーバーラップする。
【０１０１】
キットは、前記標的核酸の存在下で生産された前記ディテクター種の存在を検出するための手段、例えば核酸ラテラルフローストリップを含み得る。さらなる実施態様において、キットは、本明細書で定義する第3及び/又は第4のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む。
【０１０２】
また、キットは、反応緩衝液、塩、例えば二価金属イオン、添加剤、及び賦形剤などの試薬も含み得る。
【０１０３】
本発明によるキットは本発明による方法の実施のための指示書と一緒に提供されてもよい。
【０１０４】
また、本発明は、試料中の定義された配列の一本鎖標的核酸を検出するために、本発明のキットの使用も提供する。
【０１０５】
本発明の方法に関連する本明細書に記載の本発明の全ての任意かつ/又は好ましい実施態様はまた、本発明のキット及びその使用に関連して適用され、その反対も成り立つことを理解されたい。
【０１０６】
前述したように、本発明の方法及びキットは、理想的に使い捨て診断装置などの装置における使用に好適である。従って、本発明はまた、上記の通り装置を含むキット、特に前記標的核酸の存在下で生産されたディテクター種の存在を検出するための手段、例えば核酸ラテラルフローストリップを含むキットを提供する。装置は、動力付き装置、例えば電動装置であり得、また装置は、加熱手段を含み得、かつ自己充足型装置、すなわち補助的検査機器を要求しない装置であり得る。
【０１０７】
また、本発明の方法は、定義された配列の標的核酸に由来する核酸シグナルを増幅するための検出工程c)から独立して使用することができ、そのような方法は、例えば増幅されたシグナルが必要に応じて将来の時点で、かつ/又は代替の場所で、標的核酸を検出するために保存され、かつ/又は輸送されることとなる場合、使用することができる。増幅されたシグナルは、方法の実施を通じて生産されるプレディテクター種又はディテクター種を含む。従って、さらなる実施態様において、本発明は、試料中の定義された配列の標的核酸に由来する核酸シグナルを増幅する方法であって、本発明の方法の工程a)及び全て又は一部、例えば工程b)の部分i.又はii.を含む、前記方法を提供する。
【０１０８】
また、本発明は、先に定義した定義された配列の標的核酸由来の核酸シグナルを増幅するための、本発明のキットの使用も提供する。
【０１０９】
試料中の定義された配列の標的核酸の存在を検出する本発明の方法に関連して、本明細書に記載した本発明の全ての任意の及び/又は好ましい実施態様は、定義された配列の標的核酸に由来する核酸シグナルを増幅するための方法に関連して適用されることを理解されたい。
【０１１０】
以下の実施例は、本明細書に記載する方法の様々な態様及び実施態様をさらに実証する役割を果たす。これらの実施例は、いかなる方法においても限定的なものとみなされてはならない。
【実施例】
【０１１１】
（実施例）
（材料及び方法）
以下の材料及び方法は、別途示されない限り、以下の実施例において使用する。
オリゴヌクレオチド：別途示されている場合を除き、カスタムオリゴヌクレオチドは、Integrated DNA Technologies社によりホスホロアミダイト法を使用して製造された。
【０１１２】
核酸ラテラルフロー：カーボンナノ粒子を、様々なビオチン結合タンパク質、例えばストレプトアビジンと非共有結合性吸着を介してコンジュゲートさせた。典型的に、コロイド性カーボン懸濁液をホウ酸緩衝液中で調製し、続いてプローブ式超音波処理装置を使用して超音波処理を行った。その後、カーボンを室温でのインキュベーションによりビオチン結合タンパク質に吸着させた。カーボンは反応混合物中で直接使用するか、ガラス繊維コンジュゲートパッドに適用した。ラテラルフローストリップは、製造業者(Merck Millipore社)のガイドラインに従って、減圧凍結乾燥した糖を含むコンジュゲートパッド及び視覚的外観を改善するために使用する添加剤を含むコンジュゲートパッドを、試料パッド、ニトロセルロース膜、及び吸着パッドと組み合わせることにより構築した。ラテラルフローストリップでそれを使用する前に、この方法において検出することとなる配列の逆相補鎖を含む関連オリゴヌクレオチドを、ニトロセルロース膜上の定義された位置にプリントし、UV架橋を介して膜と結合させた。
【０１１３】
（実施例1）
（第2のオリゴヌクレオチドプローブを固体材料、ニトロセルロースラテラルフローストリップと結合させる、方法の実施）
この実施例では、第2のオリゴヌクレオチドプローブを固体材料、ニトロセルロースラテラルフローストリップと結合させ、第1のオリゴヌクレオチドプローブを増幅工程a)の実施と同時には試料と接触させない方法の実施を示す。
【０１１４】
5'から3'の方向に：7塩基の安定化領域；5塩基のニッキング酵素ではない制限酵素認識配列；及び標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列の逆相補的配列を含む12塩基のハイブリダイゼーション領域を含む全長24塩基の第1のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。同じ安定化領域及び制限酵素認識配列を含むが、標的核酸中の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる12塩基のハイブリダイズ領域を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。この実施例において、第1の制限酵素及び第2の制限酵素は、同じ制限酵素である。制限酵素は、5塩基認識配列の下流のトップ鎖切断部位を有する非対称の二本鎖切断制限酵素である。前記標的核酸中の前記第1及び第2のハイブリダイゼーション配列は1塩基により隔てられている。
【０１１５】
オリゴヌクレオチドプライマーは標的核酸を使用して設計し、それによりプライマーの逆相補鎖の切断部位の下流のヌクレオチド塩基がアデノシンとなり、その結果αチオールdATPがこの方法における修飾dNTPとして利用される。ホスホロチオエート修飾を鎖置換型ポリメラーゼによって挿入し、前記逆相補鎖の切断を阻止する。
【０１１６】
5'から3'の方向に：増幅産物中の少なくとも1つの種に相補的な12塩基領域；6塩基の中間スペーサー領域；及び合成中に付加される3'ビオチン修飾を含む全長20塩基の第1のオリゴヌクレオチドプローブを設計し、ここで前記ビオチン修飾により、第1のオリゴヌクレオチドプローブを比色定量色素、カーボンナノ粒子と結合させることが可能となる。ビオチン結合タンパク質に吸着させたカーボンを調製し、第1のオリゴヌクレオチドプローブで飽和させた。5'から3'の方向に：10×チミジン塩基を含む中間スペーサー；増幅産物中の前記少なくとも1つの種における第1の一本鎖検出配列の下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができる13塩基領域の3×反復配列を含む全長49塩基の第2のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。およそ30 pmolの前記第2のオリゴヌクレオチドプローブを核酸フローストリップ上にプリントした。
【０１１７】
1.6 pmolの第1のプライマー；0.1 pmolの第2のプライマー；Enzo Life Sciences社製の250 μM 2'-デオキシアデノシン-5'-O-(1-チオ三リン酸) SP-異性体 (Sp-dATP-α-S) ；各々60 μMのdTTP、dCTP、及びdGTP；2 Uの制限酵素；及び2 Uのバチルス鎖置換型DNAポリメラーゼを含む、反応液を調製した。核酸標的（一本鎖DNA標的）は、適切な反応緩衝液中10 μlの総反応体積で、様々なレベル（++＝1 amol 、+＝10 zmol 、NTC＝標的なし対照）で追加した。反応液を45℃で7分間又は10分間インキュベートした。続いて、6.5 μlの終結反応ミックスを0.056 mgml-1のコンジュゲートカーボンを含む60 μlのラテラルフロー実行緩衝液に加えた後、核酸ラテラルフローストリップにプリントされた線で当該ストリップと結合させた第2のオリゴヌクレオチドプローブを負荷した。
【０１１８】
図5に、本実施例の実施で得られたラテラルフローストリップの写真を示す。矢印は、第2のオリゴヌクレオチドプローブをニトロセルロースストリップ上にプリントし、従って陽性シグナルが出現している位置を示す。カーボンシグナルの存在に対応する明確な黒い線は、両方の標的レベル、両方の時点で標的核酸の存在下でのみ観察され、本発明の方法による標的核酸配列の迅速かつ高感度な検出を実証する。
【０１１９】
（実施例2）
（前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)において試料と接触させる、方法の実施）
本実施例では、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)の実施と同時に試料と接触させる、方法の実施態様の実施を実証する。そのような実施態様において、本発明者らは増幅速度の顕著な阻害は一切観察せず、最適な周期的増幅プロセスを中断することなく、プレディテクター種がリアルタイムで蓄積されたことが示された。本発明者らは前記実施態様における増幅プロセスへ阻害効果を一切観察しなかっただけでなく、本発明者らはディテクター種の量の少なくとも100倍の増加に相当する生成したシグナルの、予期せぬ増強を観察した。
【０１２０】
（実施例2.1）前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)の実施と同時に試料と接触させる、方法の実施態様を利用して、実施例1で使用したアッセイの変法を設計した。実施例1で利用したものと同じオリゴヌクレオチドプライマー、制限酵素、dNTP、修飾dNTP、及びポリメラーゼを使用したが、5'から3'の方向に：5'ビオチン修飾；8塩基の中間領域；増幅産物中の少なくとも1つの種にハイブリダイズすることができる13塩基領域；3'リン酸修飾（ビオチン修飾により、第1のオリゴヌクレオチドプローブを比色定量色素、カーボンナノ粒子との結合が可能となる。リン酸修飾は、鎖置換型DNAポリメラーゼによるその伸長を阻止する）を含む全長21塩基の代替の第1のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。ビオチン結合タンパク質に吸着させたカーボンを調製し、第1のオリゴヌクレオチドプローブで飽和させた。
【０１２１】
5'から3'の方向に：増幅産物中の前記少なくとも1つの種において第1の一本鎖検出配列の上流に第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができる14塩基領域；6塩基中間スペーサー配列；14塩基ハイブリダイズ領域の反復；第2の6塩基中間スペーサー配列；及び10×チミジンベーススペーサーを含む全長51塩基の代替の第2のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。およそ30 pmolの前記第2のオリゴヌクレオチドプローブを核酸フローストリップ上にプリントした。
【０１２２】
0.8 pmolの第1のプライマー；0.8 pmolの第2のプライマー；0.6 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプローブ；300 μM Sp-dATP-α-S ；各々60 μMのdTTP、dCTP、及びdGTP；2 Uの制限酵素；及び2 Uのバチルス鎖置換型DNAポリメラーゼを含む、反応液を調製した。核酸標的（一本鎖DNA標的）は、適切な反応緩衝液中10 μlの総反応体積で、様々なレベル（++＝1 amol 、+＝10 zmol 、NTC＝標的なし対照）で追加した。反応液を45℃で6分間インキュベートした。続いて、5 μlの終結反応ミックスを0.03 mgml-1のコンジュゲートカーボンを含む60 μlのラテラルフロー実行緩衝液に加えた後、核酸ラテラルフローストリップに負荷した。反応中に第1のオリゴヌクレオチドプローブが存在しなかった場合にディテクター種が生産されないことを実証するために、対照反応を実施した。ラテラルフローストリップの検出中にプローブが存在することによるあらゆる意図せぬ影響の対照をとるために、同等レベル（0.6 pmol）のプローブを工程a)の後に前記対照に追加した。
【０１２３】
図6Aは、その発色後の核酸ラテラルフローストリップの写真を提示する。反応中に第1のオリゴヌクレオチドプローブを提供した場合、カーボンナノ粒子の堆積に相当する明確なシグナルが両方の標的レベルで観察された。予想通り、反応中に第1のオリゴヌクレオチドが提供されなかった場合、いずれの標的レベルでもシグナルは検出されなかった。本実施例では、前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)の実施と同時に試料と接触させる、方法の実施態様におけるディテクター種の生産を大幅に増強する潜在性を明確に実証する。実施例1とは対照的に、等濃度の第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーを提供し、より迅速な増幅が可能となることは、注目に値する。
【０１２４】
（実施例2.2）次に、全く異なる標的核酸を用いた方法の前記実施形態の汎用性を実証する別個のアッセイを設計した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブは、実施例1及び2.1に記載したのと同様に、関連標的核酸、一本鎖DNA標的用に設計した。
【０１２５】
0.8 pmolの第1のプライマー；0.4 pmolの第2のプライマー；0.6 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプローブ；300 μM Sp-dATP-α-S ；各々60 μMのdTTP、dCTP、及びdGTP；2 Uの制限酵素；及び2 Uのバチルス鎖置換型DNAポリメラーゼを含む、反応液を調製した。核酸標的（一本鎖DNA標的）は、適切な反応緩衝液中10 μlの総反応体積で、様々なレベル（+＝1 amol 、NTC＝標的なし対照）で追加した。反応液を45℃で6分間インキュベートした。続いて、5 μlの終結反応ミックスを0.08 mgml-1のコンジュゲートカーボンを含む60 μlのラテラルフロー実行緩衝液に加えた後、核酸ラテラルフローストリップに負荷した。工程a)の実施と同時に試料とも接触させた、第1のオリゴヌクレオチドプローブの短縮されたバリアントを含む対照反応を実施した。
【０１２６】
図6Bは、その発色後の核酸ラテラルフローストリップの写真を提示する。標的核酸の存在下、明確な陽性シグナルが視認され、標的なし対照ではシグナルは視認されなかった。これにより、アッセイの運用の適切な設計及び前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)の実施と同時に試料と接触させる、方法の実施態様の頑健な潜在性が実証された。第1のオリゴヌクレオチドプローブの短縮形態を利用した対照アッセイでは、予想通り、ごく最小限のシグナルのみが観察され、ディテクター種を効率的に生産するための工程a)における増幅の実施と同時に第1のオリゴヌクレオチドプローブの適切なハイブリダイゼーションが要求されることが実証された。
【０１２７】
（実施例3）
（定義された配列の2以上の異なる標的核酸の存在が同じ試料中で検出される、方法の実施）
本実施例では、試料中の定義された配列の2以上の異なる標的核酸を検出するための方法の潜在性を実証する。この方法におけるプライマーに加えて2つのオリゴヌクレオチドプローブを使用することは、同じ試料中の2以上の異なる標的核酸の検出に理想的に好適な方法で増幅産物を検出するための不可欠なアプローチを提供する。本実施例において、第2のオリゴヌクレオチドプローブの配列特異的ハイブリダイゼーションに基づいて、代替ディテクター種を差次的に検出できることが実証される。
【０１２８】
まず、この方法を2以上の異なる標的核酸の検出に利用することができることを実証するために、本発明者らは2つの異なる標的（A及びB）を検出するためのオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブの適合性を有するセットを開発した。各事例において、5'から3'の方向に以下の特徴：5'ビオチン修飾、7塩基の安定化領域、5塩基の制限エンドヌクレアーゼ認識部位、制限酵素の切断部位にホスホロチオエート結合を含む標的A又はBの3'末端と相補的な11〜13塩基領域、及び3'リン酸修飾を含む、第1のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。5'から3'の方向に：標的A又はBの5'末端に相補的な12〜14塩基領域、5×チミジン塩基の中間スペーサー、及び第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能にする部分である12塩基の一本鎖オリゴヌクレオチド部分を含む、第2のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。各標的の一本鎖オリゴヌクレオチド結合部分の配列は、各ディテクター種のラテラルフローストリップ上の異なる位置への結合を可能とするために、異なる配列を使用して設計した。分離した位置に各一本鎖オリゴヌクレオチド検出部分に対する逆相補的配列を含むオリゴヌクレオチドの30 pmolの不連続スポットを含む、核酸のラテラルフローストリップを準備した。
【０１２９】
0.032 mgml-1のビオチン結合タンパク質に吸着されたカーボンを含む65 μlの適切な緩衝液中の0.5 pmol標的A及び標的B用第1のオリゴヌクレオチドプローブ；0.5 pmol標的A及びB用第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む、反応液を構築した。異なるレベルの各標的（+＝0.1 pmol、++＝1 pmol）を加えて反応を別個に分離し、両方の標的を一緒に加えた。標的なし対照（NTC）も実施した。
【０１３０】
図7Aに、本実験で得られたラテラルフローストリップの写真を示す。ディテクター種を含むカーボンの堆積に対応する明確な黒いスポットが、両方の標的レベルで、両方のアッセイについて観察された。さらに、両方の反応が同時に実施された場合、標的A及びBの両方に対応するシグナルが観察された。バックグラウンドシグナル又は異なるアッセイ間でのクロストークは、観察されなかった。
【０１３１】
方法の頑健性を実証するため、さらなる実験を続けて試料中の定義された配列の3つの異なる標的核酸の検出のための方法の潜在性を実証するために、3つの別個のアッセイを開発した。上記と同様の方法論を利用した。図7Bに、得られたラテラルフローストリップの写真を示す。標的P1、P2、及びP3は、示されているように個別に、及び様々な組み合わせで追加した。第2のオリゴヌクレオチドプローブの一本鎖オリゴヌクレオチド検出部分に対する逆相補鎖を核酸ラテラルフローストリップ上の分離した線にプリントした。黒いシグナルは、全ての事例で迅速高感度検出について予測された位置に局在するカーボンと結合したディテクター種の堆積を示し、意図せぬアッセイ間のクロストークも、一切のバックグラウンドシグナルもない。別個の4つのアッセイを含む同等の実験では、試料中の定義された配列の4つの異なる標的核酸（P1、P2、P3、及びP4）の検出方法の潜在性が実証される。結果を図7Cに示す。この4標的実験において、P4は陽性対照として全ての反応液中に存在し、他の標的は分離した反応液に別個に加えた。示されているラテラルフローストリップの写真は、カーボンと結合した関連するディテクター種の存在に対応する予測された位置に明確な黒いバンドを示す。そのようなマルチプレックスアッセイは、いくつかの異なる病原体によって引き起こされる疾患の診断検査に使用されるべき方法の潜在性を実証する。ここで対照アッセイのディテクター種の存在を検出することが、この方法が実施に成功したことを示し、かつラテラルフローストリップ上の1以上の他のディテクター種の可視化が、適切な臨床検体中の関連する原因病原体の存在を示す。2以上の病原体が同じ検体中に存在する共感染を観察することは、そのような診断応用、例えば感染症の分野においては稀であるが、本発明の方法は、検出することとなるマルチプレックス反応の標的の任意の組合わせに対して高度の汎用性を有する。図7Dでは、4つの標的（P1、P2、P3、及びP4）の異なる組合わせが加えられる実験の結果を示す。各標的を別個に検出し、非特異的バックグラウンドを生ずることなく各標的が省略された場合に他の3つの標的を検出する能力は、本発明の方法の検出の注目に値する特異性を実証する。
【０１３２】
上記及び様々な他の実験においてまた、本発明者らは非常に低い標的濃度で、例えば1 zmol（600コピー）又は17 ymol（10コピー）で3〜5個の標的を検出するためのマルチプレックスアッセイを実施している。この実施例では、本発明者らは試料中に定義された配列の2以上の異なる標的核酸の存在を検出する方法の潜在性、及び例えば核酸ラテラルフローによるその迅速、低コストなシグナル検出の潜在性を明確に実証した。定義された配列の2以上の異なる標的核酸が同じ試料中で容易に検出され得ることは、本発明の方法の並外れた有利な特徴である。検出することとなる追加の各標的について、追加のセットのオリゴヌクレオチドプライマーが要求される。追加のプライマーは非特異的増幅産物を形成する傾向を高めるために、このことは、温度周期的変化を伴わない従来技術の方法において2以上の異なる標的核酸の存在を検出することの顕著な困難を提示する。本発明の方法において、この課題は例えば修飾塩基の使用、改良酵素の選択、及び追加の配列特異的ハイブリダイゼーション事象を利用するオリゴヌクレオチドプローブを使用するディテクター種の形成に起因する特異性増強によって克服する。
【０１３３】
（実施例4）
（前記標的核酸中の前記第1及び第2のハイブリダイゼーション配列が5塩基により隔てられている、方法の実施）
この実施例では、前記標的核酸中の前記第1及び第2のハイブリダイゼーション配列が5塩基により隔てられている、方法の実施を実証する。オリゴヌクレオチドプライマーには存在せず、2つのオリゴヌクレオチドプライマーが第1及び第2のハイブリダイゼーション配列間にギャップをとるように設計されている場合、標的依存的方法で増幅産物中にのみ生産される標的由来配列を使用する能力は、1からの合成又はプライマー間結合から生じる一切のバックグラウンドシグナルを克服し得る方法の実施態様において特異性が増強される潜在性を提供する。前記実施態様において、増幅産物が適切な標的由来配列を含む場合にのみ、ディテクター種が生産されるようにするために、第1又は第2のオリゴヌクレオチドプローブの配列特異的ハイブリダイゼーションを、2つのハイブリダイゼーション領域間のギャップを利用して設計する。
【０１３４】
この実施例では、本発明者らは標的核酸中の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列間のギャップの配列においてのみ異なる様々な異なる増幅産物に対する第2のオリゴヌクレオチドプローブのハイブリダイゼーションを実証するために、様々なアッセイを設計した。第2のオリゴヌクレオチドプローブは、増幅産物中の少なくとも1つの種に対する11塩基ハイブリダイズ領域をその5'末端に含むように設計した。前記領域は、第1のオリゴヌクレオチドプライマーの逆相補的配列である7塩基配列及び2つのプライマー間のギャップから得た増幅産物中の追加の標的由来配列に対する逆相補的配列である5塩基配列から構成される。また、第2のオリゴヌクレオチドプローブは、5'から3'の方向に5×チミジン塩基の中間スペーサー及びその固体材料との結合のための12塩基一本鎖オリゴヌクレオチド部分を含む。前記部分の逆相補的配列を含む30 pmolのオリゴヌクレオチドをプリントしたニトロセルロース核酸フローストリップを準備した。第1のオリゴヌクレオチドプローブは、第2のオリゴヌクレオチドプライマーと配列は同じであるが、5'ビオチン修飾、3'リン酸修飾、及び制限酵素切断部位の位置にホスホロチオエートヌクレオチド間結合を含むように設計した。
【０１３５】
4つの異なる人工標的核酸配列（T1、T2、T3、及びT4）を設計し、その各々が第1及び第2のハイブリダイゼーション配列に対応する正確な配列を有していたが、第1及び第2のハイブリダイゼーション配列間では5つの塩基において相違があった：T1は、第2のオリゴヌクレオチドプローブの11塩基ハイブリダイズ領域に対する完全相補性を有する検出に適切な塩基を含み；T2は、ギャップの5つの塩基のうち4つのミスマッチを含み；T3は、ギャップの5つの塩基のうち4つの塩基が除去されるように設計され、従って増幅産物の種は4塩基短くなっている。T4は、ギャップの5つの塩基のうち2つのミスマッチを含む。
【０１３６】
3.6 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプライマー；1.8 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプライマー；2.4 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプローブ；300 μM Sp-dATP-α-S、60 μM dTTP、dCTP、dGTP；12Uの制限酵素；適切な反応緩衝液中60 μlの総反応体積中の12Uのバチルス鎖置換型DNAポリメラーゼを含む反応液を構築した。各反応に 1 amol標的（T1、T2、T3、又はT4）を加えた後、45℃で6.5分間インキュベートしてから、60 μl中53.5 μlの反応液をラテラルフローストリップ上で実行した。ラテラルフローストリップへの反応液の適用前に、1.5 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプローブ及び2 μgのビオチン結合タンパク質に吸着させたカーボンをコンジュゲートパッドに堆積させて5分間乾燥させた。
【０１３７】
図8に、本実験で得られた核酸ラテラルフローストリップの写真を示す。標的T1を用いて得られたストリップは、ニトロセルロースの固体材料に結合したディテクター種に結合させたカーボンに対応する明確な黒い線を示し、これによりオリゴヌクレオチドプライマー及びプローブを含むこの実施例において開発したアッセイが、適切に機能し、迅速かつ高感度な検出のための潜在性を有することが立証された。標的T2及びT3を用いて実施された反応は、陽性シグナルに相当する一切のカーボンも示さなかった。これにより4つのミスマッチ及び4塩基の除去は両方とも、第2のオリゴヌクレオチドの反応中に生産されたプレディテクター種と効率的にハイブリダイズする能力を失わせることが立証された。非常にかすかなシグナルがT4を使用して生産されたストリップ上に観察された。このことは、わずか2つのミスマッチ塩基の存在によりストリップ上の線に結合することができるディテクター種を生産するプレディテクター種とのハイブリダイゼーションに成功した第2のオリゴヌクレオチドプローブの能力の大幅な低下がもたらされることを示している。ポリアクリルアミドゲル電気泳動を反復反応を用いて実施し、全ての標的についての全ての反応が適切に機能し、顕著な量の増幅産物が生産されたことを確認した。4塩基短縮された標的T3を用いて実施した反応においては、予測されるサイズシフトが視認された。
【０１３８】
この実施例では、本発明の不可欠な特徴である第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブが、増幅産物の迅速かつ高感度の検出を提供するだけでなく、どのようにプライマーハイブリダイゼーション単独に起因する増幅産物を乗り越えて増幅産物のさらなる標的配列ベースの特異性チェックを提供するために使用され得るかを実証する。この強力な技術は、1からの合成又はプライマー間結合に起因する特定のアッセイにおける非標的特異的バックグラウンド増幅から生じる従来技術の方法の公知の課題を克服する。本発明の方法は、従来技術の方法と比較しての特異性の増強を示すのに対し、高感度の検出及び迅速、低コストの結果の可視化は維持されることを実証する。
【０１３９】
（実施例5）
（第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能とする部分が抗原であり、対応する抗体を固体表面、ニトロセルロースラテラルフローストリップと結合させる、方法の実施）
本発明の方法において、いくつかの異なる部分を第2のオリゴヌクレオチドプローブを固体材料と結合させるための部分として利用することができる。この実施例では、第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能とする部分が抗原であり、対応する抗体を固体表面、ニトロセルロースラテラルフローストリップと結合させる、方法を実施することができることを実証する。
【０１４０】
第2のオリゴヌクレオチドプローブは、増幅産物中の少なくとも1つの種との相同性を有する領域を含む32塩基の配列及び合成時に付加された3' ジゴキシゲニンNHSエステル修飾を含むように設計した。ヒツジから精製されたFab断片抗ジゴキシゲニン抗体（Sigma-Aldrich社）を、スポット及び空気乾燥によって核酸ラテラルフローストリップ上に固定化した。
【０１４１】
第2のオリゴヌクレオチドプローブの性能を、様々なレベルの標的（+++＝1 pmol；++＝0.1 pmol；+＝10 fmol； NTC＝標的なし対照）を、0.016 mgml-1ビオチン結合タンパク質に吸着されたカーボンを含む、カーボン核酸ラテラルフロー反応を用いた検出のために必要な試薬を含む60 μlの設計された反応緩衝液に加えた実験において実証した。ストリップは、2.5 mMホウ酸及び0.5 ％ Tween20を含む0.2 μlの緩衝液中の0.5 μgの抗ジゴキシゲニンFab断片をストリップ上にスポットして準備した。溶液をラテラルフローストリップのニトロセルロース膜中で2時間にわたり乾燥させた。反応液を45℃で2分間インキュベートし、設計されたディテクター種を形成させた後、各反応の全反応ミックスをラテラルフローストリップに適用した。
【０１４２】
図9に、本実験で生産されたラテラルフローストリップの写真を示す。ラテラルフローストリップ上のカーボンの堆積に相当する黒いスポットが各標的レベルで視認され、NTCでは視認されず、ディテクター種が特異的に検出されていることを示している。検出部分（カーボン）を結合させるためのビオチンベースのアフィニティー相互作用及び固体材料結合部分のための抗体ベースのアフィニティー相互作用の組合わせを示す。この実施例は、第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合に利用可能な異なるアプローチの観点で、この方法の汎用性を実証する目的に適う。
【０１４３】
（実施例6）
（第2のオリゴヌクレオチドプローブを固体材料と結合させることを可能とする部分が3塩基DNA配列モチーフの4つの反復コピーを含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、前記一本鎖オリゴヌクレオチド配列の逆相補鎖が固体材料に結合されている、方法の実施）
本実施例は、第2のオリゴヌクレオチドプローブを固体材料と結合させることを可能とする部分が3塩基DNA配列モチーフの4つの反復コピーを含む一本鎖オリゴヌクレオチドである、方法の実施を示す。前述のように、第2のオリゴヌクレオチドプローブの検出部分として一本鎖オリゴヌクレオチドを利用する方法の実施態様は、核酸ラテラルフローによる検出を容易にし、同じ試料中の複数の異なる標的核酸の検出を容易に実現する、この方法の単純で汎用性の高い態様を提示する。さらに、一本鎖オリゴヌクレオチド検出部分を事前に定義し、効率的なストリップ上ハイブリダイゼーションのために最適化して、検出感度を増強し、核酸ラテラルフローストリップの効率的なスケールアップ製造に備えることができる。
【０１４４】
本発明の一態様において、本発明者らはDNA配列モチーフの複数の反復コピーから構成される一本鎖オリゴヌクレオチド検出部分の使用による、ストリップ上ハイブリダイゼーションの予期せぬ改善を観察した。本実施例では、複数の横並び実験（side-by-side experiments）の結果を提示する。ここでラテラルフローストリップに直接結合された第2のオリゴヌクレオチドを用いたアッセイの成績は、3塩基DNA配列モチーフの4つの反復コピーを含む一本鎖検出部分の使用により大幅に高められ、かつ前記一本鎖オリゴヌクレオチド配列の逆相補鎖はラテラルフローストリップと結合されている。
【０１４５】
（実施例6.1）前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)の実施と同時に試料と接触させる、方法の実施態様を利用して、アッセイを設計した。5'から3'の方向に：5'ビオチン修飾；7塩基の中間領域；ニッキング酵素ではない5塩基の制限酵素認識部位；制限酵素の切断部位にホスホロチオエート結合を含む標的中の第1のハイブリダイゼーション領域とハイブリダイズすることができる13塩基領域；及び3'リン酸修飾（ビオチン修飾により、第1のオリゴヌクレオチドプローブの比色定量色素、カーボンナノ粒子との結合が可能となる。リン酸修飾は、鎖置換型DNAポリメラーゼによるその伸長を阻止する）を含む全長25塩基の第1のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。
【０１４６】
同じ標的種（I及びII）を検出するための2つの代替の第2のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。第2のオリゴヌクレオチドプローブ「I」は、5'から3'の方向に：標的中の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる14塩基領域の3×反復配列；及び9×チミジン塩基スペーサーを含むように設計した。核酸ラテラルフローストリップを、30 pmolのプローブを含むスポットを用いて調製した。
【０１４７】
5'から3'の方向に：標的中の第2のハイブリダイゼーション領域の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる14塩基領域；5×チミジン塩基の中間スペーサー；及び第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能にする部分として働く3塩基配列モチーフの4×反復配列を含む12塩基の一本鎖オリゴヌクレオチド部分を含む、代替の第2のオリゴヌクレオチドプローブ「II」を設計した。5'から3'の方向に：11×チミジン塩基スペーサー；第2のオリゴヌクレオチドIIの固体材料との結合を可能とする部分を形成する3塩基の配列モチーフに対する逆相補鎖の12×反復配列を含む36塩基領域を含むように、追加の一本鎖オリゴヌクレオチドを設計した。第2のオリゴヌクレオチドプローブIIについて、30 pmolの前記追加の一本鎖オリゴヌクレオチドをスポットした、核酸ラテラルフローストリップを準備した。
【０１４８】
0.016 mgml-1のビオチン結合タンパク質に吸着させたカーボンを含む60 μlの適切な緩衝液中の、0.5 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプローブを含む、オリゴヌクレオチドプローブI及びIIの成績を検査するための反応を実施した。IIの反応は同様に構築したが、0.5 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプローブIIを追加した。核酸標的（設計されたアッセイ試薬から得た増幅産物中の少なくとも1つの種を代表する一本鎖DNA標的）を、様々なレベルで（+++＝1 pmol 、++＝0.1 pmol、NTC＝標的なし対照）追加した。構築した反応液を45℃で2分間インキュベートした後、全反応ミックスを適切な核酸ラテラルフローストリップに負荷した。
【０１４９】
図10Aは本実験で得たラテラルフローストリップの写真を示す。左のパネルには第2のオリゴヌクレオチドプローブIを用いた結果を表示し、右のパネルには第2のオリゴヌクレオチドプローブIIを用いた結果を示す。カーボンと結合したディテクター種の堆積に対応する黒いスポットを標的の存在下で可視化した。反復配列モチーフを含む第2のオリゴヌクレオチドプローブIIについて、全ての標的レベルでより強いシグナルを観察した。
【０１５０】
（実施例6.2）次に、この方法の前記実施態様の汎用性及びその広い応用性を実証するために、別個のアッセイを完全に異なる標的核酸について設計した。オリゴヌクレオチドプローブは、実施例6.1に記載されているのと同様の方法で、関連する標的核酸、一本鎖DNAについて設計した；ここでも第2のオリゴヌクレオチドプローブの2つの形式を「I」及び「II」と呼び、様々な標的レベル（+++＝1 pmol、++＝0.1 pmol、+＝0.001 pmol）を使用した。図10Bに示された生産されたラテラルフローストリップの写真に示されているように、さらに著しい効果が観察された。試験したうち2つの低標的レベルにおいて、第2のオリゴヌクレオチドプローブIは一切のシグナルを生成せず、一方対応する反復配列オリゴヌクレオチドプローブIIは、堆積したカーボンの黒いスポットによって示される明確な陽性シグナルを生産した。
【０１５１】
本実施例では、DNA配列モチーフの反復コピーを含む第2のオリゴヌクレオチド検出部分を利用した、ラテラルフローハイブリダイゼーションベースの検出に対する著しい改善を示す。これは、ディテクター種の核酸ラテラルフローベースの検出の感度を100倍の改善が得られることを実証する。シグナル強度が増強され、シグナルがより迅速に発生し、これにより例えば核酸ラテラルフローによる迅速な検出を伴う応用への適用を容易にする本発明の前記実施態様の潜在性が実証される。さらに、第2のオリゴヌクレオチドプローブと結合された検出部分としての一本鎖オリゴヌクレオチドの使用の潜在性を例証する。
【０１５２】
（実施例7）
（臨床検体中のRNAウイルス検出法の使用）
本実施例では、第1のオリゴヌクレオチドプローブを増幅工程a)の実施と同時に試料と接触させ、第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能にする部分が3塩基DNA配列モチーフの4つの反復コピーを含む一本鎖オリゴヌクレオチドであり、かつ前記一本鎖オリゴヌクレオチド配列の逆相補鎖が固体材料と結合されている、方法の実施態様を用いる、臨床検体中のRNAウイルスを検出する方法の実施を実証する。様々な研究において、本発明者らはウイルスゲノム抽出物などの非常に低いコピー数のRNA標的を慣例的に検出している。例えば、定量化されたウイルスゲノム抽出物を用いて、本発明者らは本発明の方法を利用して、100未満のゲノム相当コピーのウイルスを結果まで合計10分未満で検出し、増幅工程a)を5分未満とする。この注目に値する速度及び感度から、診断の分野における応用方法の潜在性が実証される。従って、本実施例において、本発明者らは病原性一本鎖RNAウイルスを検出するアッセイを開発し、ウイルスに感染した臨床検体を使用したそのアッセイの成績を実証した。
【０１５３】
5'から3'の方向に：各塩基間のホスホロチオエート結合を含む8塩基の合成安定化領域；5塩基のニッキング酵素ではない制限酵素認識部位；及び一本鎖RNAウイルスゲノム中の領域を標的化するように設計された、標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列の逆相補的配列を含む12塩基のハイブリダイゼーション領域を含む全長25ヌクレオチド塩基の第1のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。同じ安定化領域を含むが、ホスホロチオエート結合を含まず、及び同じ制限酵素認識配列を含むが、第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる12塩基のハイブリダイズ領域を含む第2のオリゴヌクレオチドプライマーを設計した。この実施例において、第1の制限酵素及び第2の制限酵素は、同じ制限酵素である。前記標的核酸中の前記第1及び第2のハイブリダイゼーション配列は0塩基により隔てられている。
【０１５４】
オリゴヌクレオチドプライマーは標的核酸を使用して設計し、それによりプライマーの逆相補鎖の切断部位の下流のヌクレオチド塩基がアデノシンとなり、その結果αチオールdATPがこの方法における使用のための修飾dNTPとして利用される。ホスホロチオエート修飾を鎖置換型DNAポリメラーゼ又は逆転写酵素によって挿入し、前記逆相補鎖の切断を阻止する。
【０１５５】
5'から3'の方向に：第1のオリゴヌクレオチドプローブの比色定量色素、カーボンナノ粒子との結合を可能とする、合成時に付加される5'ビオチン修飾；8塩基の安定化領域；第1のオリゴヌクレオチドプローブ中の前記制限酵素の切断部位が合成中に付加されたホスホロチオエートヌクレオチド間結合によって保護される、ニッキング酵素ではない制限酵素のための5塩基の認識配列；増幅産物中の少なくとも1つの種とハイブリダイズすることができる11塩基領域；及び鎖置換型DNAポリメラーゼによる伸長を妨げる3'リン酸修飾を含む、全長24塩基の第1のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。
【０１５６】
5'から3'の方向に：増幅産物中の前記少なくとも1の種の第1の一本鎖検出配列の下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができる、14塩基領域；5×チミジン塩基を含むスペーサー；ラテラルフローストリップ上でそれに対する逆相補鎖が固定化された3塩基DNA配列モチーフの4×反復配列を含む全長31塩基の第2のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。11×チミジン塩基を含む中間スペーサー；第2のオリゴヌクレオチドプローブの3塩基配列モチーフに相補的である3塩基配列モチーフの12×反復配列；を含む、全長47塩基の固定化されたラテラルフローにプリントされたオリゴヌクレオチドを設計した。5'から3'の方向に：第2のオリゴヌクレオチドプローブ上のものとは異なる5×トリプレット反復配列；5×チミジン塩基を含む中間スペーサー；合成中に付加された3'ビオチン分子を含む20塩基の長さのラテラルフロー対照オリゴヌクレオチドを設計した。対照オリゴヌクレオチドは、ラテラルフローストリップ上のその逆相補鎖と結合し、カーボンラテラルフロー手順が成功しているかどうかを検証する。
【０１５７】
1.8 pmolの第1のプライマー；9.6 pmolの第2のプライマー；3.6 pmolの第1のプローブ；1pmolの第2のプローブ；Enzo Life Sciences社製の300 μM Sp-dATP-α-S；各々60 μMのdTTP、dCTP、及びdGTP；28 Uの制限酵素；14 Uのバチルス鎖置換型DNAポリメラーゼ；35 U のウイルス逆転写酵素；3.5U RNアーゼH、3 μgのビオチン結合タンパク質に吸着させたカーボンを含む、反応液を調製した。臨床設定で患者から収集した5 μlの鼻咽頭スワブ試料（Discovery Life Sciences社から入手）には、7つのウイルス陽性試料及び6つのウイルス陰性臨床試料が含まれる（PCRアッセイにより検証済み）。反応は、適切な反応緩衝液中で70 μlの体積で実施した。反応液は45℃で4分30秒インキュベートした後、全反応液をおよそ50 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプローブの3塩基トリプレット反復配列部分の逆相補鎖（下）及び対照オリゴヌクレオチドの逆相補鎖（上の線）をプリントされた核酸ラテラルフローストリップに負荷した。
【０１５８】
図11に、本実施例の実施で得られたラテラルフローストリップの写真を示す。矢印は、第2のオリゴヌクレオチドプローブのトリプレット反復配列部分との逆相補鎖がプリントされている、従って陽性シグナルが出現する位置（＋）、及びラテラルフローの実行に成功したか否かを検証する、従ってアッセイに陽性でも陰性でも出現する対照オリゴヌクレオチド（CTL）との逆相補鎖の位置を示す。上のパネル（+ve）には、ウイルス陽性の臨床試料を用いて、下のパネル（-ve）には、ウイルス陰性の試料を用いて、得られた結果を示す。標的核酸の存在を示す明確な黒い線が陽性試料の各々において存在し、これにより本発明の方法による臨床検体の迅速な検出が実証された。偽陽性は観察されず、例えば1からの合成又はプライマー間結合を通じたディテクター種の非特異的生産の完全な不存在が実証された。偽陰性は観察されず、この方法の頑健性及び異なる臨床検体中に存在する異なる標的核酸コピー数レベルにわたるその感度が立証された。
【０１５９】
（実施例8）
（異なる温度での方法の実施）
本発明の方法は広範囲の温度にわたって効率的に実施され、温度の周期的変化を要求も、任意のホットスタート若しくはウォームスタート、プレヒート、又は制御された温度低下も要求しない。本実施例では、異なる温度範囲にわたる典型的なアッセイの実施を示す。所望の至適温度を有する酵素を選択し、その取込み後にハイブリダイゼーションの融解温度を低下させるホスホロチオエート塩基を使用して、増幅が予期せぬ広範囲の温度にわたり実施され、通常は低い温度範囲をカバーするアッセイが、容易に開発された。さらに別個の実験では、本発明の方法を使用して開発されたアッセイが、工程a)の開始前に試料をプレヒートすることを要さずに開発され、ここで温度を工程a)における増幅の実施の間に増加させる場合に成績の低下は観察されないことが実証される。
【０１６０】
（実施例8.1）前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)の実施と同時に試料と接触させる、方法の実施態様を利用して、アッセイを設計した。5'から3'の方向に：7塩基の中間領域；制限酵素の認識部位；及び標的核酸、DNA標的中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる11塩基領域を含む、第1のプライマーを設計した。5'から3'の方向に：7塩基の中間領域；第1のプライマーと同じ制限酵素の認識部位；及び標的核酸中の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる12塩基領域を含むように、第2のプライマーを設計した。
【０１６１】
5'から3'の方向に：5'ビオチン修飾；6塩基の中間領域；第2位にミスマッチを含む制限酵素の塩基の認識部位の塩基；第6位にG-clamp修飾を含む標的中の第1のハイブリダイゼーション領域とハイブリダイズすることができる10塩基領域；及び3'リン酸修飾（ビオチン修飾により、第1のオリゴヌクレオチドプローブを比色定量色素、カーボンナノ粒子との結合が可能となる。リン酸修飾は、鎖置換型DNAポリメラーゼによるその伸長を阻止する）を含むように、全長21塩基の第1のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。
【０１６２】
5'から3'の方向に：標的中の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる11塩基領域；第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能とする部分として働く4×チミジン塩基スペーサー及び3塩基配列モチーフの4×反復配列を含む12塩基を含むように、第2のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。5'から3'の方向に：11×チミジン塩基スペーサー；第2のオリゴヌクレオチドの固体材料との結合を可能とする部分を形成する3塩基の配列モチーフに対する逆相補鎖の11×反復配列を含む33塩基領域を含むように、追加の一本鎖オリゴヌクレオチドを設計した。第2のオリゴヌクレオチドプローブについて、30 pmolの前記追加の一本鎖オリゴヌクレオチドをスポットした、核酸ラテラルフローストリップを準備した。
【０１６３】
1.5 pmolの第1のプライマー；1.0 pmolの第2のプライマー；1 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプローブ；Enzo Life Sciences社製の60 μM Sp-dATP-α-S ；各々60 μMのdTTP、dCTP、及びdGTP；並びに様々なレベルの標的DNA（++＝1 amol, +＝10 zmol, NTC＝標的なし対照）を含む適切な緩衝液中で反応液を調製した。構築した反応液は、標的温度（I＝37℃; II＝45℃、III＝50℃、及びIV＝55℃）で2分間インキュベートした後、最終的な5 Uの制限酵素及び5 Uのバチルス鎖置換型DNAポリメラーゼの25 μlの最終反応体積への追加によって反応を開始した。その後、反応液を5分間（T1）又は8分間（T2）、関連する標的温度でインキュベートした。インキュベーション後、各反応液を1.5 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプローブ及び8 μgのビオチン結合タンパク質に吸着させたカーボンを含む、75 μlの緩衝液に移した。その後、核酸ラテラルフローストリップの試料パッドに適用した。
【０１６４】
図12Aは、各標的レベル、温度、及び時点での実験で得たラテラルフローストリップの写真を示す。観察された明確な黒い線は、標的存在下で生産されたディテクター種に結合されたカーボンの堆積に対応する。全ての温度において、8分以内に両方の標的レベルで標的の存在下、非常に強いシグナルが出現し、この方法による効率的増幅の広い温度範囲が実証された。NTC試料中での非特異的増幅は観察されなかった。また、45℃及び50℃でわずか5分後に強力な増幅が観察され、このアッセイの最適温度が40℃〜50℃である可能性が高いことが示された。
【０１６５】
（実施例8.2）前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)の実施と同時に試料と接触させる、方法の実施態様を利用して、第2のアッセイを設計した。5'から3'の方向に：6塩基の中間領域；制限酵素の認識部位；及び標的核酸標的のための12塩基ハイブリダイゼーション領域を含む、第1及び第2のプライマーの両方を設計した。前記標的中の前記第1及び第2のハイブリダイゼーション配列が10塩基により隔てられるように、プライマーを設計した。
【０１６６】
5'から3'の方向に：5'ビオチン修飾；6塩基の中間領域；第4位にミスマッチを含む制限酵素の塩基の認識部位；標的中の第1のハイブリダイゼーション領域とハイブリダイズすることができる12塩基領域；及び3'リン酸修飾（ビオチン修飾により、第1のオリゴヌクレオチドプローブを比色定量色素、カーボンナノ粒子との結合が可能となる。リン酸修飾は、鎖置換型DNAポリメラーゼによるその伸長を阻止する）を含む全長23塩基の第1のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。
【０１６７】
5'から3'の方向に：標的中の第2のハイブリダイゼーション配列の3塩基の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる13塩基領域並びに第1及び第2のハイブリダイゼーション配列間の10塩基のギャップ；第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能とする部分として働く3×チミジン塩基スペーサー及び3塩基配列モチーフの4×反復配列を含む12塩基を含むように、第2のオリゴヌクレオチドプローブを設計した。5'から3'の方向に：11×チミジン塩基スペーサー；第2のオリゴヌクレオチドの固体材料との結合を可能とする部分を形成する3塩基の配列モチーフに対する逆相補鎖の12×反復配列を含む36塩基領域を含むように、追加の一本鎖オリゴヌクレオチドを設計した。第2のオリゴヌクレオチドプローブについて、30 pmolの前記追加の一本鎖オリゴヌクレオチドをスポットした、核酸ラテラルフローストリップを準備した。
【０１６８】
6 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプライマー；8 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプライマー；6 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプローブ；Enzo Life Sciences社製の60 μM Sp-dATP-α-S ；各々60 μMのdTTP、dCTP、及びdGTP；60 μgのビオチン結合タンパク質に吸着されたカーボン；並びに適用可能である場合、標的を含む適切な緩衝液中で反応液を調製した。構築した反応液は、開始温度（I＝15℃; II＝45℃）で2分間インキュベートした後、最終的な20 Uの制限酵素、20 Uのバチルス鎖置換型DNAポリメラーゼ、及び40 Uの逆転写酵素を100 μlの最終反応体積への追加によって反応を開始した。酵素追加後、開始温度を15℃とした反応を、他の反応とともに直ちに45℃に移した。
【０１６９】
続いて、反応液を45℃で6分間インキュベートした。インキュベーション後、各反応液を3 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む核酸ラテラルフローストリップの試料パッドに移した。図12Bは各温度のインキュベーション条件での実験で得たラテラルフローストリップの写真を示す。観察された明確な黒い線は、標的存在下で生産されたディテクター種に結合されたカーボンの堆積に対応する。増幅工程a)で温度を15℃から45℃に増加させた反応において、差は観察されなかった。プレヒートした反応と同程度の著しい増幅速度が得られ、NTC試料では非特異的増幅は観察されなかった。
【０１７０】
この実施例8は、本発明の方法を使用して、公知の方法と比較して低い最適温度プロファイルを有し、かつ並外れて広い温度範囲にわたる高感度の検出を利用することができるアッセイを容易に開発することができることを実証する。また、本発明の方法は、工程a)の実施において温度を増加させるプレヒートを用いることなく実施することができる。そのような特徴は、低コストの診断装置でのこの方法の使用に非常に魅力的である。ここで高温及び厳密な加熱制御は使い捨て装置又は機器を要さない装置が商業的に現実的でない点までそのような装置の商品原価を高める複雑な物理的制約を課す。さらに、増幅開始前に試料をプレヒートする公知の方法の要件を回避することにより、本発明の方法は、より少ないユーザ工程でより簡素化された一連の操作で実施することができ、従ってそのような診断装置の使いやすさが向上し、結果が出るまでの全体的な時間が短縮される。
【０１７１】
（実施例9）
（標的核酸が鎖侵入により二本鎖DNAから得られる方法の実施）
本実施例では、一本鎖標的核酸が、DNA鎖を分離するための任意の特定の行為、例えば温度変性、バンププライマー、又は追加の酵素（例えば、ヘリカーゼ又はリコンビナーゼ）の使用を一切要件とせずに検出される、二本鎖DNA中の一本鎖部位である、この方法の使用を実証する。本発明の方法を使用して、ユーザ工程、成分又はこの方法の実施に使用する装置に課される物理的要件を追加することなく、一本鎖RNA及び二本鎖DNA標的の両方を容易に検出できることは、この方法に診断応用における使用のための高度の汎用性を付与する。
【０１７２】
（実施例9.1）ウイルス標的の二本鎖DNAゲノム中のタンパク質コード領域のための、アッセイを開発した。臨床診断におけるウイルスの存在のバイオマーカーとして、二本鎖ゲノム又はmRNA転写物を使用することができる。前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)の実施と同時に試料と接触させる、方法の実施態様を利用して、アッセイを設計した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの設計は、他の実施例に記載したアプローチと同様のアプローチに従って、標的核酸中の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列間にギャップを設けずに、実施した。
【０１７３】
4 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプライマー；2 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプライマー；2 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプローブ；Enzo Life Sciences社製の60 μM Sp-dATP-α-S ；各々60 μMのdTTP、dCTP、及びdGTP；60 μgのビオチン結合タンパク質に吸着されたカーボン；並びに二本鎖DNA標的（I)又は一本鎖RNA標的（II)又は標的なしを含む適切な緩衝液中で反応液を調製した。構築した反応液は、45℃で2分間インキュベートした後、最終的な20 Uの制限酵素、20 Uのバチルス鎖置換型DNAポリメラーゼ、及び25 Uの逆転写酵素を100 μlの最終反応体積への追加によって反応を開始した。酵素の追加後、反応液を45℃で7分間インキュベートした。
【０１７４】
インキュベーション後、1.5 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプローブを各反応液に追加し、全反応体積を核酸ラテラルフローストリップの試料パッドに移した。核酸のラテラルフロー対照標的も全ての試料に追加した。図13Aに、各標的について本実験で得られたラテラルフローストリップの写真を示す。観察された明確な黒い線は、標的の存在下で生産されたディテクター種と結合したカーボンの堆積に対応する。よりかすかなシグナルは、高い標的レベル（++）よりも低い標的レベル（+）に対応する。一本鎖RNA及び二本鎖DNA標的の間で増幅速度の差は観察されなかった。
【０１７５】
（実施例9.2）アッセイを、細菌病原体のc.2.5メガベースの二本鎖DNAゲノム中の一本鎖標的核酸用に設計した。前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)の実施と同時に試料と接触させる、方法の実施態様を利用して、アッセイを設計した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの設計は、他の実施例に記載したアプローチと同様のアプローチに従って、標的核酸中の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列間に4塩基のギャップを設けて、実施した。
【０１７６】
2 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び0.5 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプライマーを含む適切な緩衝液中で、反応液を調製した。二本鎖DNA標的を使用するため、実際には2つの一本鎖標的核酸が同時に追加され、同時に第2の相互プロセスが発生すると推定される。ここで標的核酸の検出のための第2のオリゴヌクレオチドプライマーは、第2の標的核酸を検出するための第1のオリゴヌクレオチドプライマーであり、標的核酸の逆相補鎖となる。この事実は、この方法の成績にほとんど影響を与えない。2 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプローブ；Enzo Life Sciences社製の60 μM Sp-dATP-α-S；各々60 μMのdTTP、dCTP、及びdGTP；15 μgのビオチン結合タンパク質に吸着されたカーボン；並びに様々なレベル（++＝1 amol; +＝10 zmol; NTC＝標的なし対照）で標的を含む細菌のゲノム抽出物。さらに、1 amolの大腸菌のゲノム抽出物を含む特異性対照反応も実施した。構築した反応液は、45℃で3分間インキュベートした後、最終的な4 Uの制限酵素、及び2 Uのバチルス鎖置換型DNAポリメラーゼを25 μlの最終反応体積への追加によって反応を開始した。酵素の追加後、反応液を45℃で6分間インキュベートした。
【０１７７】
インキュベーション後、75 μlの3 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む緩衝液を各反応液に追加し、続いて全体積を核酸ラテラルフローストリップの試料パッドに移した。図13Bに、各標的について本実験で得られたラテラルフローストリップの写真を示す。標的存在下で生産されたディテクター種に結合されたカーボンの堆積に対応する明確な黒い線は、試験された両方の標的レベルで観察された。標的なし対照において又は大腸菌ゲノムDNAの存在下において、非特異的なシグナルは観察されず、この方法がわずか6分以内に臨床に関連するコピー数の複雑な二本鎖DNAゲノムの特異的検出に利用可能であることが、実証された。
【０１７８】
本実施例では、本発明の方法が、二本鎖DNA中の一本鎖核酸標的の検出に、容易に使用できることを実証する。注目すべきことに、一本鎖RNA標的及び二本鎖DNA中の同じ標的配列の検出について、DNA二本鎖を分離させる特定の行為、例えば温度変性を一切要件とせずに同程度の増幅速度が観察された。その代わり、一本鎖部位が第1のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイゼーション及び伸長のために十分に露出され、「鎖侵入」によるこの方法が開始される。ここで二本鎖DNA中の1以上のDNA塩基対の一過性の開口が、第1のオリゴヌクレオチドプライマーの3'ヒドロキシルのハイブリダイゼーション及び伸長を可能にするのに十分に発生する。このことは、二本鎖核酸のアッセイにおいて熱変性及びバンププライマーを利用するSDAなどの公知の方法とは対照的である。一本鎖DNA及び一本鎖RNA中の標的だけでなく、二本鎖DNA中の標的を容易に検出するための、本発明の方法を使用する能力は、その診断的応用、例えば二本鎖DNAゲノムを有する細菌性、真菌性、及びウイルス性病原体の検出における使用のための高度の汎用性を付与する。この方法が二本鎖DNAゲノムを有する生物の検出に複雑な追加のユーザ工程、酵素、成分、又は物理的制約を要件としないという事実は、この方法が簡素化された低コストの診断装置での検査に特によく適することを意味する。例えば、公知の方法について報告されている増幅の実施前の熱変性の要件により、高価な追加構成要素が必要となり、そのような装置の商品原価及び結果を得るまでの総時間が増加する。このことは使い捨て又は自己充足型の、機器を要さない装置が現実的でないことを意味する。
【０１７９】
（実施例10）
（本発明の方法と公知の方法の比較実施）
本実施例では、ウイルス標的の検出についてWO2014/164479で開示された公知の方法に対する発明の方法の比較評価を提示する。公知の方法は、ニッキング酵素を要求し、1以上の修飾dNTPの使用を要求しないという点で、本発明の方法と根本的に異なる。本発明の方法は非常に優れた感度及び特異性を有することを実証する。
【０１８０】
この比較評価のために、本発明の方法を使用して一本鎖RNAゲノムを有するウイルス標的のためのアッセイをまず開発した。前記第1のオリゴヌクレオチドプローブが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3'末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できず、当該プローブを工程a)の実施と同時に試料と接触させる、方法の実施態様を利用して、前記アッセイを設計した。オリゴヌクレオチドプライマー及びオリゴヌクレオチドプローブの設計は、他の実施例に記載したアプローチと同様のアプローチに従って、標的核酸中の第1及び第2のハイブリダイゼーション配列間に6塩基のギャップを設けて、実施した。
【０１８１】
公知の方法を使用するアッセイのために、本発明の方法で使用する同等のプライマーと同じ6塩基中間領域を5'末端に、及び同じハイブリダイゼーション領域を3'末端に、含む類似したプライマーを設計した。このようにして、方法の厳密な比較を行うために、2つのアッセイ間の一貫性を可能な限り確保した。しかしながら、制限酵素認識部位の塩基は、WO2014/164479、Nt.BbvCIに報告された例示的ニッキング酵素の認識部位の塩基に置換した（p.20-21の実施例5を参照されたい）。
【０１８２】
（実施例10.1）第1の例では、各方法の反応は、等しいプライマー比を使用して実施した。本発明の方法のために：2 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプライマー；2 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプライマー；1.6 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプローブ；Enzo Life Sciences社製の60 μM Sp-dATP-α-S ；各々60 μMのdTTP、dCTP、及びdGTP；並びに様々なレベル（+++＝10 zmol; ++＝100コピー; +＝10コピー; NTC＝標的なし対照）のウイルスゲノムRNA抽出物を標的として含む適切な緩衝液中で反応液を調製した。構築した反応液は、周囲温度（c.20℃）で5分間プレインキュベートした後、5 Uの制限酵素、5 Uのバチルス鎖置換型DNAポリメラーゼ、及び10 Uの逆転写酵素を25 μlの最終反応体積への追加によって反応を開始した。酵素の追加後、反応液を45℃で8分間（T1）又は15分間（T2）インキュベートした。インキュベーション後、各反応液に75 μl緩衝液中の60 μgのビオチン結合タンパク質に吸着させたカーボンを追加し、全100 μlの体積を試料パッド上に1.5 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む核酸ラテラルフローストリップに移した。
【０１８３】
公知の方法のために：6.25 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプライマー；6.25 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプライマー；各々200 μMのdATP、dTTP、dCTP、及びdGTP；並びに様々なレベル（+++＝10 zmol; ++＝100コピー; +＝10コピー; NTC＝標的なし対照）のウイルスゲノムRNA抽出物を標的として含む適切な緩衝液中で反応液を調製した。構築した反応液は、周囲温度（c.20℃）で5分間プレインキュベートした後、4 UのNt.BbvCI、20 UのBst大断片DNAポリメラーゼ、及び10 UのM-MuLV逆転写酵素を25 μlの最終反応体積への追加によって反応を開始した。酵素の追加後、反応液を45℃で8分間（T1）及び15分間（T2）インキュベートした。インキュベーション後、60 μgのビオチン結合タンパク質に吸着させたカーボン及び5 pmolの第1のオリゴヌクレオチドプローブを含む75 μl緩衝液を各反応液に追加し、全100 μlの体積を試料パッド上に5 pmolの第2のオリゴヌクレオチドプローブを含む核酸ラテラルフローストリップに移した。
【０１８４】
図14Aでは、様々な標的レベル及び示された時点での、本発明の方法（I）を用いた実験及び公知の方法（II）を用いた実験において得られるラテラルフローストリップの写真を示す。観察された黒い線は、標的存在下で生産されたディテクター種に結合されたカーボンの堆積に対応する。公知の方法を使用して仮にも何らかのシグナルを観察することを可能にするまでに、何度かの試行が必要であり、酵素及び緩衝液、並びに顕著に高いレベルのプライマー、dNTP、及び酵素の特定の組合わせを使用する必要があった。本発明の方法（I）を用いると、プレヒートなしでわずか8分後の最も短い時点ですらわずか10コピーの標的という最低の標的レベルでさえも、生産されたディテクター種を明確に確認することができた。当業者にとって自明でない公知の方法を最適化する取り組みの後でさえも、最も高い標的レベル（+++＝10zmol）かつ最も長い時点（15分）でかすかなシグナルしか観察されなかった。
【０１８５】
（実施例10.2）さらに、自明ではない広範な試みを行った後、この実施例10.2に記載の通り、非常に高濃度の第1のプライマーを用いた、2:1の比の第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによってのみではあるが、公知の方法の成績を高めることが可能であった。本発明の方法は、ここでも実施例10.1に記載の通り、実施した。公知の方法については、反応は第1のオリゴヌクレオチドプライマーのレベルを12.5 pmolに増加させたことを除き、実施例10.1に記載の通り実施した。各事例において、以下の標的レベル：+++＝1 zmol；++＝100コピー；+＝10コピー；NTC＝標的なし対照を使用した。
【０１８６】
図14Bでは、様々な標的レベル及び示された時点での、本発明の方法（I）を用いた実験及び公知の方法（II）を用いた実験において得られるラテラルフローストリップの写真を示す。観察された黒い線は、標的存在下で生産されたディテクター種に結合されたカーボンの堆積に対応する。ここでも、本発明の方法（I）は、最も短い時点において、わずか10コピーの標的という非常に低い標的レベルにおいてさえ、視認されるシグナルを伴う、注目に値する速度を得ることが実証された。公知の方法を用いると、最も高い標的レベル（+++＝1 zmol）でもかすかなシグナルしか観察されず、最も長い時点（15分）においても100コピー試料においてに非常にかすかなシグナルが視認された。しかしながらまた、NTCストリップでも方法を機能させるために要求される非常に高いオリゴヌクレオチドプライマーレベル及び酵素レベルの結果としての非特異的産物に対応し得るかすかなシグナルが観察された。これらのデータは、WO2014/164479における、30分のインキュベーション時間を報告したデータと一致する。この公知の方法を使用して実施される増幅を高速化するために並外れて高いプライマーレベルの追加を要求することは、同じ試料中での2以上の異なる標的の検出のためのその潜在的応用性を大幅に制限する。それは、非特異的産物に伴う問題を悪化させることなく総プライマーレベルをさらに増加させるための範囲が非常に限られているためである。
【０１８７】
本実施例14は、増幅がはるかに迅速に実施され、感度がより高く、かつより明確な結果のシグナルが生産されるという、WO2014/164479に開示された公知の方法を上回る本発明の方法の著しい優位性を実証する。プレインキュベーションをせずにわずか8分で、本発明の方法は、わずか100コピーの標的を用いて、60倍の標的レベルを用いる最高の標的レベルで15分間行い得る公知の方法において生産され得るよりも強いシグナルを生産した。この公知の方法に対する本発明の方法の利点は、それがニッキング酵素ではない制限酵素である、異なるクラスの酵素を要求すること、及びそれが増幅の感度及び特異性を増強する1以上の修飾dNTP、例えばホスホロチオエート塩基の使用を要求することから生じる。さらに、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが、前記DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断されることができず、工程a)の実施と同時に該試料と接触し、増幅をシグナル検出と効率的に共役させることを可能とし、かつディテクター種の形成中に効率的な配列ベースのハイブリダイゼーションに由来する特異性の増強を促進する、方法の実施態様。これらの利点により、本発明の方法は、診断の分野での利用及び簡素化された、超高速の、ユーザ重視の、低コスト診断装置、例えば使い捨て又は機器を要さない分子診断検査装置の開発に理想的に適する。以下の明細書及び特許請求の範囲の全体を通じて、別途文脈が要求しない限り、用語「含む（comprise）」、及び「含む（comprises）」、「含んでいる（comprising）」などの変形は、言及された整数、工程、整数群、又は工程群を含むことを含意するが、任意の他の整数、工程、整数群、又は工程群を除外するものではないことは、理解されよう。
【０１８８】
本発明のさらなる態様には、以下に列記するものが含まれる：
態様1.試料中の定義された配列の一本鎖標的核酸の存在を検出するための方法であって：
a) 該試料を：
i. 第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
ii. 鎖置換型DNAポリメラーゼ； 
iii. dNTP；
iv. 1以上の修飾dNTP；
v. ニッキング酵素ではないが、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の第1のプライマー鎖のみを切断することができる、第1の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用してDNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第1の制限酵素；並びに
vi. ニッキング酵素ではないが、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の該第2のプライマー鎖のみを切断することができる、第2の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用してDNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第2の制限酵素； 
と接触させて、温度周期変化を用いることなく、該標的核酸の存在下で増幅産物を生産すること；
b) 工程a ）の増幅産物を：
i. 該増幅産物中の少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、その検出を可能とする部分と結合されている、第1のオリゴヌクレオチドプローブ；及び
ii. 増幅産物中の該少なくとも1つの種の該第1の一本鎖検出配列の上流又は下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合される、第2のオリゴヌクレオチドプローブ、と接触させることであって、該増幅産物中の該少なくとも1つの種との該第1及び第2のプローブのハイブリダイゼーションにより、ディテクター種が生産される、前記接触させること；並びに
c) 工程b)で生産された該ディテクター種の存在を検出することであって、該ディテクター種の存在は、該試料における該標的核酸の存在を示す、前記検出すること、を含む、前記方法。
態様2.前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが前記DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断できない、態様1記載の方法。
態様3.前記一方のオリゴヌクレオチドプローブが、1以上の配列ミスマッチ及び/又は1以上の修飾、例えばホスホロチオエート結合の存在のために前記第1又は第2の制限酵素によって切断されることができなくなる、態様2記載の方法。
態様4.前記一方のオリゴヌクレオチドプローブを工程a)の実施と同時に前記試料と接触させる、態様2.又は3記載の方法。
態様5.工程a)において前記試料をさらに：（A）5'から3'の方向に前記第1の制限酵素の認識配列及び切断部位並びに前記標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、DNAポリメラーゼによる伸長が3'末端で阻止される、第3のオリゴヌクレオチドプライマー；及び/又は（B）5'から3'の方向に前記第2の制限酵素の認識配列及び切断部位並びに該標的配列中の該第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、前記DNAポリメラーゼによる伸長が3'末端で阻止される、第4のオリゴヌクレオチドプライマーと接触させる、態様1〜4のいずれか1つに記載の方法。
態様6.存在する場合、前記第3のオリゴヌクレオチドプライマーは前記第1のオリゴヌクレオチドプライマーより過剰に提供され、かつ存在する場合、前記第4のオリゴヌクレオチドプライマーは前記第2のオリゴヌクレオチドより過剰に提供される、態様5記載の方法。
態様7.前記1以上の修飾dNTPが、αチオール修飾dNTPである、態様1〜6のいずれか1つ記載の方法。
態様8.前記第1及び第2の制限酵素が同じ制限酵素である、態様1〜7のいずれか1つ記載の方法。
態様9.工程a)、b)、及びc)のうちの2以上を同時に実施する、態様1〜8のいずれか1つ記載の方法。
態様10. 工程(a）を50℃以下の温度で実施する、態様1〜9のいずれか1つ記載の方法。
態様11.前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの検出を可能とする部分が、比色定量色素若しくは蛍光定量色素、又は比色定量若しくは蛍光定量色素との結合を可能とする部分、例えばビオチンである、態様1〜10のいずれか1つ記載の方法。
態様12.前記ディテクター種が電気シグナルの変化によって検出される、態様1〜11のいずれか1つ記載の方法。
態様13. 前記第1のオリゴヌクレオチドプローブの検出を可能とする部分が、基質との接触後に検出可能なシグナル、例えば比色定量若しくは蛍光定量シグナルを生じる酵素である、態様1〜12のいずれか1つ記載の方法。
態様14.前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能とする部分が、一本鎖オリゴヌクレオチドである、態様1〜13のいずれか1つ記載の方法。
態様15.一本鎖オリゴヌクレオチド部分の配列は、2〜4塩基のDNA配列モチーフの3以上の反復コピーを含む、態様14記載の方法。
態様16.工程c)において前記ディテクター種の存在が核酸ラテラルフローによって検出される、態様1〜15のいずれか1つ記載の方法。
態様17.前記核酸ラテラルフローが、前記第2のオリゴヌクレオチドプローブの固体材料との結合を可能にする部分との配列特異的ハイブリダイゼーションを可能とする1以上の核酸を利用する、態様16記載の方法。
態様18.工程c)によりカーボン又は金、好ましくはカーボンを使用して比色定量又は電気化学的シグナルが生成される、態様1〜17のいずれか1つ記載の方法。
態様19.第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプライマーが、制限酵素認識配列及び切断部位の上流の5'末端に例えば5塩基長の安定化配列を含む、態様1〜18のいずれか1つ記載の方法。
態様20.前記第1及び/又は第2のオリゴヌクレオチドプライマーのハイブリダイズ領域が、9〜16塩基長である、態様1〜19のいずれか1つ記載の方法。
態様21.前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方を、他方のプライマーより過剰に提供する、態様1〜20のいずれか1つ記載の方法。
態様22.前記標的核酸中の前記第1及び第2のハイブリダイゼーション配列が0〜6塩基により隔てられている、態様1〜21のいずれか1つ記載の方法。
態様23.前記標的核酸中の前記第1及び第2のハイブリダイゼーション配列が3〜6塩基により隔てられている、態様1〜21のいずれか1つ記載の方法。
態様24.工程b)において前記増幅産物中の前記少なくとも1つの種の前記第1又は第2の一本鎖検出配列が、態様23で定義した3〜6塩基に対応する配列を含む、態様1〜23のいずれか1つ記載の方法。
態様25. 前記試料中の前記標的核酸のレベルを工程c)で定量化する、態様1〜24のいずれか1つ記載の方法。
態様26.前記標的核酸が二本鎖RNA由来一本鎖RNA及び二本鎖DNA由来一本鎖RNAを含む、一本鎖RNA、又は、一本鎖RNA由来一本鎖DNA及び二本鎖DNA由来一本鎖DNAを含む、一本鎖DNAである、態様1〜25のいずれか1つ記載の方法。
態様27.前記一本鎖DNAが、ヌクレアーゼ、例えば制限エンドヌクレアーゼ若しくはエキソヌクレアーゼIIIの使用により二本鎖DNAから得られるか、又は逆転写酵素の使用により一本鎖RNAから得られる、態様26記載の方法。
態様28.定義された配列の2以上の異なる標的核酸の存在が同じ試料中で検出される、態様1〜27のいずれか1つ記載の方法。
態様29.前記試料が生体試料、例えば鼻若しくは鼻咽頭スワブ若しくは吸引液、血液若しくは血液由来試料、又は尿である、態様1〜28のいずれか1つ記載の方法。
態様30.前記標的核酸がウイルス性である又はウイルス性核酸材料に由来し、細菌性又は細菌性核酸材料に由来し、癌細胞又は胎児細胞から放出される循環型無細胞DNAであり、マイクロRNAである又はマイクロRNA由来のものである、態様1〜29のいずれか1つ記載の方法。
態様31.前記標的核酸が、メチル化などの後成的修飾部位を含む、態様1〜30のいずれか1つ記載の方法。
態様32.前記標的核酸の検出を、疾患又は罹患状態の診断、予後判定又はモニタリングのために使用する、態様1〜31のいずれか1つ記載の方法。
態様33.前記疾患が、これらに限定はされないが、HIV、インフルエンザ、RSV、ライノウイルス、ノロウイルス、結核、HPV、髄膜炎、肝炎、MRSA、エボラ、クロストリジウム・ディフィシル、エプスタイン・バーウイルス、マラリア、ペスト、ポリオ、クラミジア、ヘルペス、淋病、麻疹、流行性耳下腺炎、風疹、コレラ、又は天然痘を含む感染症である、態様32記載の方法。
態様34.前記疾患が、これらに限定はされないが、結腸直腸癌、肺癌、乳癌、膵癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、白血病、食道癌、卵巣癌、腎癌、胃癌、又は黒色腫を含む癌である、態様32記載の方法。
態様35.前記標的核酸の検出を、ヒトの遺伝子検査、出生前検査、血液汚染スクリーニング、薬理ゲノミクス、又は薬物動態学のために使用する、態様1〜34のいずれか1つ記載の方法。
態様36.前記試料がヒト試料、法医学試料、農学試料、獣医学試料、環境試料、又は生体防御試料である、態様1〜35のいずれか1項記載の方法。
態様37.キットであって：
a) 第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに定義された配列の一本鎖標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
b) ニッキング酵素ではなく、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該切断部位を切断することができる第1の制限酵素及びニッキング酵素ではなく、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該切断部位を切断することができる、第2の制限酵素； 
c) 鎖置換型DNA ポリメラーゼ； 
d) dNTP 、
e) 1以上の修飾dNTP；
f) 該第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの一方のハイブリダイズ領域とのある程度の相補性を有し、その検出を可能とする部分と結合された、第1のオリゴヌクレオチドプローブ；並びに
g) 該第1及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーの他方のハイブリダイズ領域の逆相補鎖とある程度の相補性を有し、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合されている、第2のオリゴヌクレオチドプローブ、を含む、前記キット。
態様38.ディテクター種の存在を検出するための手段をさらに含む、態様37記載のキット。
態様39.前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー、及び/又は前記第2のオリゴヌクレオチドプライマー、及び/又は前記第1の制限酵素、及び/又は前記第2の制限酵素、及び/又は前記DNAポリメラーゼ、及び/又は前記dNTP、及び/又は前記1以上の修飾dNTP、及び/又は前記第1のオリゴヌクレオチドプローブ、及び/又は前記第2のオリゴヌクレオチドプローブが、態様2、3、7、8、11、13〜17、19、20、又は22〜24のいずれか1つで定義された通りである、態様37又は38記載のキット。
態様40.態様5又は6で定義された通りの第3及び/又は第4のオリゴヌクレオチドプライマーをさらに含む、態様37〜39のいずれか1項記載のキット。
態様41.試料中の定義された配列の一本鎖標的核酸の存在を検出するための方法であって：
a) 該試料を：
i. 第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマーであって、該第1のプライマーは、5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の第1のハイブリダイゼーション配列とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含み、かつ該第2のプライマーは5'から3'の方向に制限酵素認識配列及び切断部位並びに該標的核酸中の該第1のハイブリダイゼーション配列の上流の第2のハイブリダイゼーション配列の逆相補鎖とハイブリダイズすることができる領域の1つの鎖を含む、前記第1のオリゴヌクレオチドプライマー及び第2のオリゴヌクレオチドプライマー；
ii. 鎖置換型DNAポリメラーゼ； 
iii. dNTP；
iv.1以上の修飾dNTP；
v. ニッキング酵素ではないが、該第1のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の第1のプライマー鎖のみを切断することができる、第1の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第1の制限酵素；並びに
vi. ニッキング酵素ではないが、該第2のプライマーの該認識配列を認識し、該認識配列及び該切断部位が二本鎖である場合に該切断部位の該第2のプライマー鎖のみを切断することができる、第2の制限酵素であって、逆相補鎖の切断が該1以上の修飾dNTPを使用して該DNAポリメラーゼによって該逆相補鎖に取り込まれた1以上の修飾の存在により阻止される、前記第2の制限酵素； 
と接触させて、温度周期変化を用いることなく、該標的核酸の存在下で増幅産物を生産すること；
b) 工程a）の増幅産物を：
i. 該増幅産物中の少なくとも1つの種の第1の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、その検出を可能とする部分と結合されている、第1のオリゴヌクレオチドプローブ；及び
ii. 増幅産物中の該少なくとも1つの種の該第1の一本鎖検出配列の上流又は下流の第2の一本鎖検出配列とハイブリダイズすることができ、固体材料又はその固体材料との結合を可能にする部分と結合される、第2のオリゴヌクレオチドプローブ、と接触させることであって、前記第1及び第2のオリゴヌクレオチドプローブのうちの1つが、前記DNAポリメラーゼによる伸長を3’末端で阻止され、前記第1又は第2の制限酵素によって切断されることができず、該第1及び第2のプローブの増幅産物中の前記少なくとも1つの種とのハイブリダイゼーションにより、ディテクター種が生産される、前記接触させること；並びに
c) 工程b)で生産された該ディテクター種の存在を検出することであって、該ディテクター種の存在は、該試料における該標的核酸の存在を示す、前記検出すること、を含み；
ここで工程b)で定義した該第1又は第2のオリゴヌクレオチドプローブを、工程a)の実施と同時に該試料と接触させる、前記方法。
【０１８９】
本明細書中で言及されている全ての特許及び特許出願は、参照によりその全体が組み込まれている。
【図１】
2021531778.tif 000003
【図２】
2021531778.tif 000004
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
2021531778.tif 000008
【図７Ａ】
2021531778.tif 000009
【図７Ｂ】
2021531778.tif 000010
【図７Ｃ】
2021531778.tif 000011
【図７Ｄ】
2021531778.tif 000012
【図８】
2021531778.tif 000013
【図９】
2021531778.tif 000014
【図１０】
2021531778.tif 000015
【図１１】
2021531778.tif 000016
【図１２Ａ】
2021531778.tif 000017
【図１２Ｂ】
2021531778.tif 000018
【図１３】
2021531778.tif 000019
【図１４Ａ】
2021531778.tif 000020
【図１４Ｂ】
2021531778.tif 000021
【国際調査報告】
2021531778.tif 000022
2021531778.tif 000023
2021531778.tif 000024