(57)【要約】  本開示は標的核酸のためのシステム、方法および組成物を提供する。特に、本発明は、新規なＲＮＡを標的とするCas12bエフェクタータンパク質およびガイドＲＮＡまたはcrRNAのような少なくとも１種の標的核酸成分を含む非天然起源または遺伝子操作されたＲＮＡを標的とするシステムを提供する。
2021532815.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
i）表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質、および
ii）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイド
を含む非天然起源または遺伝子操作されたシステム。
【請求項２】
アリシクロバチルス・カケガウェンシス（Alicyclobacillus kakegawensis）、バチルス属種V3-13（Bacillus sp. V3-13）、バチルス・ヒサシイ（Bacillus hisashii）、レンティスファエラ・バクテリウム（Lentisphaeria bacterium）、およびラセエラ・セデミニス（Laceyella sediminis）からなる群から選択される細菌に由来する、請求項１のシステム。
【請求項３】
トランス活性化型クリスパーＲＮＡ（tracr RNA）は直接反復配列の５’末端においてクリスパーＲＮＡ（crRNA）に融合している、請求項１のシステム。
【請求項４】
２つの異なる標的配列または同じ標的配列の異なる領域をハイブリダイズさせることが可能な２つ以上のガイド配列を含む、請求項１のシステム。
【請求項５】
前記ガイド配列は原核細胞中の１つ以上の標的配列にハイブリダイズする、請求項１のシステム。
【請求項６】
前記ガイド配列は真核細胞中の１つ以上の標的配列にハイブリダイズする、請求項１のシステム。
【請求項７】
前記Cas12bエフェクタータンパク質は１つ以上の核局在化シグナル（NLS）を含む、請求項１のシステム。
【請求項８】
前記Cas12bエフェクタータンパク質は触媒的に不活性である、請求項１のシステム。
【請求項９】
前記Cas12bエフェクタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合している、請求項１のシステム。
【請求項１０】
前記１つ以上の機能ドメインは前記１つ以上の標的ＤＮＡ配列を切断する、請求項９のシステム。
【請求項１１】
前記機能ドメインは前記１つ以上の標的配列の転写または翻訳を改変する、請求項１０のシステム。
【請求項１２】
前記Cas12bエフェクタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合しており、かつ、前記Cas12bエフェクタータンパク質はリゾルバーゼ(RuvC)ドメインおよび／またはヌクレアーゼ(Nuc)ドメイン内に１つ以上の変異を含み、これにより、形成されたCRISPR複合体は、標的配列にあるか標的配列に隣接する後生修飾因子または転写もしくは翻訳活性化もしくは抑制シグナルを送達することができる、請求項１のシステム。
【請求項１３】
前記Cas12bエフェクタータンパク質はアデノシン脱アミノ酵素またはシチジン脱アミノ酵素と会合している、請求項１のシステム。
【請求項１４】
更に組換え鋳型を含む、請求項１のシステム。
【請求項１５】
前記組換え鋳型は相同性指向修復（ＨＤＲ）により挿入されている、
請求項１４のシステム。
【請求項１６】
更にtracr RNAを含む、請求項１のシステム。
【請求項１７】
表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合している第１の調節エレメント、ならびに
i）ａ）ガイド配列をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合している第２の調節エレメント、およびｂ）tracr RNAをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合している第３の調節エレメント、または
ii）ガイド配列およびtracr RNAをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合している第２の調節エレメント、
を含む１種以上のベクターを含む、Cas12bベクターシステム。
【請求項１８】
Cas12bエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は真核細胞内での発現のために最適化されたコドンである、請求項１７のベクターシステム。
【請求項１９】
単一のベクター内に含まれる、請求項１７または１８のベクターシステム。
【請求項２０】
前記１種以上のベクターはウイルスベクターを含む、請求項１７から１９のいずれかのベクターシステム。
【請求項２１】
前記１種以上のベクターは、１種以上のレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、または単純ヘルペスウイルスベクターを含む、請求項１７から２０のいずれかのベクターシステム。
【請求項２２】
i）表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質、
ii）１つ以上の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、および
iii）tracr RNA
を含む、非天然起源または遺伝子操作された組成物のCas12bエフェクタータンパク質および１種以上の核酸成分を送達するように構成された送達システム。
【請求項２３】
１種以上のベクターまたは１種以上のポリヌクレオチド分子を含む、請求項２２の送達システムであって、前記１種以上のベクターまたは１種以上のポリヌクレオチド分子は、非天然起源または遺伝子操作された組成物のCas12bエフェクタータンパク質および１種以上の核酸成分をコードする１種以上のポリヌクレオチド分子を含む、請求項２２の送達システム。
【請求項２４】
リポソーム、粒子、エキソソーム、微少胞、遺伝子銃、またはウイルスベクターを含む送達媒介物を含む、請求項２２または２３の送達システム。
【請求項２５】
治療的処置方法に使用するための、請求項１から１６の非天然起源または遺伝子操作されたシステム、請求項１７から２１のベクターシステム、もしくは請求項２２から２４の送達システム。
【請求項２６】
１つ以上の関心のある標的配列を、
i）表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質、
ii）１つ以上の標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、および
iii）tracr RNA
を含む１種以上の非天然起源または遺伝子操作された組成物と接触させることを含み、
これにより、前記crRNAおよびtracr RNAと複合化したCas12bエフェクタータンパク質を含むCRISPR複合体が形成され、前記ガイド配列は細胞中の１つ以上の標的配列への配列特異的結合を導き、それにより前記１つ以上の標的配列の発現を改変する、
１つ以上の標的配列を改変する方法。
【請求項２７】
前記１つ以上の標的配列を改変することは前記１つ以上の標的配列を切断することを含む、請求項２６の方法。
【請求項２８】
前記１つ以上の標的配列を改変することは前記１つ以上の標的配列の発現を増強あるいは減弱させることを含む、請求項２６または２７の方法。
【請求項２９】
前記組成物は組換え鋳型を更に含み、前記１つ以上の標的配列を改変することは組換え鋳型またはその一部の挿入を含む、請求項２８の方法。
【請求項３０】
前記１つ以上の標的配列は原核細胞内にある、請求項２６から２９のいずれかの方法。
【請求項３１】
前記１つ以上の標的配列は真核細胞内にある、請求項２６から３０のいずれかの方法。
【請求項３２】
１つ以上の標的配列が、請求項２３から２９のいずれかの方法により改変されており、必要に応じて治療用Ｔ細胞または抗体生成Ｂ細胞であるか、又は細胞が植物細胞である、１つ以上の標的配列を含む細胞またはその後代。
【請求項３３】
前記細胞は原核細胞である、請求項３２の細胞。
【請求項３４】
前記細胞は真核細胞である、請求項３２の細胞。
【請求項３５】
前記１つ以上の標的配列の改変は、
少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む細胞、
少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含み、この少なくとも１つの遺伝子産物の発現が増強した細胞、
少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含み、この少なくとも１つの遺伝子産物の発現が減弱した細胞、または
内因性または非内因性の生物学的産物または化合物を産生かつ／あるいは分泌する細胞または集団
をもたらす、請求項３２から３４のいずれかに記載の細胞。
【請求項３６】
前記細胞は哺乳動物の細胞またはヒト細胞である、請求項３２または３５のいずれか１項に記載の真核細胞。
【請求項３７】
請求項３２から３６のいずれか１項に記載の細胞の細胞株又は前記細胞を含む細胞株もしくはそれらの後代。
【請求項３８】
請求項３２から３６のいずれか１項に記載の１つ以上の細胞を含む多細胞生物。
【請求項３９】
請求項３２から３６のいずれか１項に記載の１つ以上の細胞を含む植物または動物モデル。
【請求項４０】
請求項３２から３６のいずれか１項の細胞、請求項３７の細胞株、請求項３８の生物、または請求項３９の植物もしくは動物モデルからの遺伝子産物。
【請求項４１】
前記発現された遺伝子産物の量は発現が変化していない細胞からの遺伝子産物の量より多いか少ない、請求項４０の遺伝子産物。
【請求項４２】
表１または表２に記載の単離されたCas12bエフェクタータンパク質。
【請求項４３】
請求項４２のCas12bエフェクタータンパク質をコードする単離された核酸。
【請求項４４】
前記単離された核酸はＤＮＡであり、crRNAおよびtracr RNAをコードする配列を更に含む、請求項４３に記載の単離された核酸。
【請求項４５】
請求項４３もしくは４４に記載の核酸または請求項４２のCas12bを含む、単離された真核細胞。
【請求項４６】
i）表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質をコードするメッセンジャーＲＮＡ（mRNA）、
ii）ガイド配列、および
iii）tracr RNA
を含む非天然起源または遺伝子操作されたシステム。
【請求項４７】
前記tracr RNAは直接反復配列の５’末端においてcrRNAに融合している、請求項４６に記載の非天然起源または遺伝子操作されたシステム。
【請求項４８】
標的ドメインおよびアデノシン脱アミノ酵素、シチジン脱アミノ酵素、またはそれらの触媒ドメインを含み、前記標的ドメインはCas12bエフェクタータンパク質またはオリゴヌクレオチド結合活性を維持するその断片、およびガイド分子を含む、部位指向塩基編集のための遺伝子操作された組成物。
【請求項４９】
前記Cas12bエフェクタータンパク質は触媒的に不活性である、請求項４８の組成物。
【請求項５０】
前記Cas12bエフェクタータンパク質は表１または表２から選択される、請求項４８の組成物。
【請求項５１】
前記Cas12bエフェクタータンパク質は、  アリシクロバチルス・カケガウェンシス（Alicyclobacillus kakegawensis）、バチルス属種V3-13（Bacillus sp. V3-13）、バチルス・ヒサシイ（Bacillus hisashii）、レンティスファエラ・バクテリウム（Lentisphaeria bacterium）、およびラセエラ・セデミニス（Laceyella sediminis）からなる群から選択される細菌に由来する、請求項５０の組成物。
【請求項５２】
１種以上の関心のある標的オリゴヌクレオチドに請求項４８から５１のいずれか１項に記載の組成物を送達することを含む、前記１種以上の標的オリゴヌクレオチド中のアデノシンまたはシチジンを改変する方法。
【請求項５３】
病原性のＴ→ＣまたはＡ→Ｇの点変異を含む転写物によって発症する疾患の治療または予防に使用するための、請求項５２の方法。
【請求項５４】
請求項４８もしくは４９のいずれか１項の方法で得られた、および／または請求項４８から５１のいずれか１項の組成物を含む、単離された細胞。
【請求項５５】
前記真核細胞、好適にはヒトまたは非ヒト動物細胞、必要に応じて治療用植物Ｔ細胞または抗体生成植物Ｂ細胞であるか、または前記細胞は植物細胞である、請求項５４の細胞またはその後代。
【請求項５６】
請求項５０または５１の前記改変された細胞またはその後代を含む、非ヒト動物。
【請求項５７】
請求項５６の前記改変された細胞を含む植物。
【請求項５８】
治療用、好ましくは細胞治療に使用するための請求項５６または５７に記載の改変された細胞。
【請求項５９】
標的オリゴヌクレオチドに
（ａ）触媒的に不活性なCas12bタンパク質、
（ｂ）直接反復配列に結合したガイド配列を含むガイド分子、および
（ｃ）アデノシンもしくはシチジン脱アミノ酵素タンパク質またはその触媒ドメイン
を送達することを含み、
前記アデノシンもしくはシチジン脱アミノ酵素タンパク質またはその触媒ドメインは前記触媒的に不活性なCas12bタンパク質に共有結合もしくは非共有結合されているか、あるいは前記ガイド分子は送達後にそれに適合もしくは結合されており、
前記ガイド分子は前記触媒的に不活性なCas12bタンパク質と複合体を形成し、この複合体を前記標的オリゴヌクレオチドに結合させるように導き、前記ガイド配列は前記標的オリゴヌクレオチド内で標的配列とハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド二重鎖を形成することが可能である、
標的オリゴヌクレオチド中のアデノシンまたはシトシンを改変する方法。
【請求項６０】
（Ａ）前記シトシンは前記オリゴヌクレオチド二本鎖を形成する前記標的配列の外側にあり、前記シチジン脱アミノ酵素タンパク質またはその触媒ドメインは前記オリゴヌクレオチド二本鎖の外側にある前記シトシンを脱アミノ化するか、あるいは（Ｂ）前記シトシンは前記オリゴヌクレオチド二本鎖を形成する前記標的配列内にあり、前記ガイド配列は前記オリゴヌクレオチド二本鎖内のＣ−ＡまたはＣ−Ｕ不適正塩基対をもたらす前記シトシンに相当する位置で非対合アデノシンまたはウラシルを含み、かつ前記シチジン脱アミノ酵素タンパク質またはその触媒ドメインは前記非対合アデノシンまたはウラシルと反対側のオリゴヌクレオチド二本鎖中のシトシンを脱アミノ化する、請求項５９の方法。
【請求項６１】
前記アデノシン脱アミノ酵素タンパク質またはその触媒ドメインはオリゴヌクレオチド二本鎖内の前記アデノシンまたはシトシンを脱アミノ化する、請求項５９の方法。
【請求項６２】
前記Cas12bタンパク質は表１または表２から選択される、請求項５９の方法。
【請求項６３】
前記Cas12bタンパク質は、アリシクロバチルス・カケガウェンシス（Alicyclobacillus kakegawensis）、バチルス属種V3-13（Bacillus sp. V3-13）、バチルス・ヒサシイ（Bacillus hisashii）、レンティスファエラ・バクテリウム（Lentisphaeria bacterium）、およびラセエラ・セデミニス（Laceyella sediminis）からなる群から選択される細菌に由来する、請求項６２の方法。
【請求項６４】
Cas12bタンパク質、
１つ以上の標的配列と所定の程度の相補性を持ち、かつCas12bタンパク質と複合体を形成するように設計されたガイド配列を含む少なくとも１種のガイドポリヌクレオチド、および
非標的配列を含む、オリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物、
を含み、前記Cas12bタンパク質は、側副核酸分解酵素活性を示し、かつ前記１つ以上の標的配列により活性化されると前記オリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物の非標的配列を切断する、
１つ以上のin vitro試料中の１つ以上の標的配列の存在を検出するシステム。
【請求項６５】
Cas12bタンパク質、
それぞれが１種以上の標的ポリペプチドのうちの１種に結合するように設計され、マスクされたプロモーター結合部位もしくはマスクされたプライマー結合部位およびトリガー配列鋳型を含む１つ以上の検出アプタマー、および
非標的配列を含むオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物
を含む、１つ以上のin vitro試料中の標的ポリペプチドの存在を検出するシステム。
【請求項６６】
前記標的配列またはトリガー配列を増幅するための核酸増幅試薬を更に含む、請求項６４または６５のシステム。
【請求項６７】
前記核酸増幅試薬は等温増幅試薬である、請求項６６のシステム。
【請求項６８】
前記Cas12bタンパク質は表１または表２から選ばれる、請求項６５から６７のいずれか１項のシステム。
【請求項６９】
前記Cas12bタンパク質は、アリシクロバチルス・カケガウェンシス（Alicyclobacillus kakegawensis）、バチルス属種V3-13（Bacillus sp. V3-13）、バチルス・ヒサシイ（Bacillus hisashii）、レンティスファエラ・バクテリウム（Lentisphaeria bacterium）、およびラセエラ・セデミニス（Laceyella sediminis）からなる群から選択される細菌に由来する、請求項６８のシステム。
【請求項７０】
１つ以上のin vitro試料を
i）Cas12bエフェクタータンパク質、
ii）１つ以上の標的配列と所定の程度の相補性を持ち、かつCas12bエフェクタータンパク質と複合体を形成するように設計されたガイド配列を含む少なくとも１種のガイドポリヌクレオチド、および
iii）非標的配列を含むオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物
と接触させることを含み、
前記Cas12エフェクタータンパク質は側副核酸分解酵素活性を示し、かつ前記オリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物の非標的配列を切断する、
前記１つ以上のin vitro試料中の１つ以上の標的配列を検出する方法。
【請求項７１】
前記Cas12bエフェクタータンパク質は表１または表２から選ばれる、請求項７０の方法。
【請求項７２】
前記Cas12bエフェクタータンパク質は、  アリシクロバチルス・カケガウェンシス（Alicyclobacillus kakegawensis）、バチルス属種V3-13（Bacillus sp. V3-13）、バチルス・ヒサシイ（Bacillus hisashii）、レンティスファエラ・バクテリウム（Lentisphaeria bacterium）、およびラセエラ・セデミニス（Laceyella sediminis）からなる群から選択される細菌に由来する、請求項７１の方法。
【請求項７３】
酵素またはレポーター成分の不活性な第１部分に結合したCas12bタンパク質を含む非天然起源または遺伝子操作された組成物であって、
前記酵素またはレポーター成分は、前記酵素またはレポーター成分の相補部分に接触させたときに再構成される、組成物。
【請求項７４】
前記酵素またはレポーター成分はタンパク質分解酵素を含む、請求項７３の組成物
【請求項７５】
前記Cas12bタンパク質は酵素またはレポーター成分の相補部分に結合した第１のCas12bタンパク質および第２のCas12bタンパク質を含む、請求項７３または７４の組成物。
【請求項７６】
i）前記第１のCas12bタンパク質と複合体を形成し、標的核酸の第１の標的配列にハイブリダイズすることが可能な第１のガイド、および
ii）前記第２のCas12bタンパク質と複合体を形成し、前記標的核酸の第２の標的配列にハイブリダイズすることが可能な第２のガイドを更に含む、
請求項７３の組成物。
【請求項７７】
前記酵素はカスパーゼを含む、請求項７３から７６のいずれか１項の組成物。
【請求項７８】
前記酵素はタバコエッチウイルス（ＴＥＶ）を含む、請求項７３から７７のいずれか１項の組成物。
【請求項７９】
ａ）細胞または細胞の集団を、
i）タンパク質分解酵素の不活性部分に結合した第１のCas12bエフェクタータンパク質、
ii）前記タンパク質分解酵素の相補部分に結合し、前記タンパク質分解酵素の前記第１の部分と前記相補部分が接触したときに前記タンパク質分解酵素のタンパク質分解活性が再構成される、第２のCas12bエフェクタータンパク質、
iii）前記第１のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、かつ前記標的オリゴヌクレオチドの第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド、および
iv）前記第２のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、かつ前記標的オリゴヌクレオチドの第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド
に接触させることを含み、
これにより前記タンパク質分解酵素の前記第１の部分と前記相補部分を接触させて、前記タンパク質分解酵素のタンパク質分解活性を再構成する、
標的オリゴヌクレオチドを含む細胞中にタンパク質分解活性を提供する方法。
【請求項８０】
前記酵素はカスパーゼである、請求項７９の方法。
【請求項８１】
前記タンパク質分解酵素はＴＥＶプロテアーゼであり、このＴＥＶプロテアーゼのタンパク質分解活性は再構成され、それによりＴＥＶ基質は切断され活性化される、請求項８０の方法。
【請求項８２】
前記ＴＥＶ基質は、ＴＥＶ標的配列を含み、それにより前記ＴＥＶプロテアーゼによる切断がプロカスパーゼを活性化するように遺伝子操作されたプロカスパーゼである、請求項８１の方法。
【請求項８３】
細胞中の関心のあるオリゴヌクレオチドを、
i）タンパク質分解酵素の不活性な第１の部分に結合した第１のCas12bエフェクタータンパク質、
ii）前記タンパク質分解酵素の相補部分に結合し、前記タンパク質分解酵素の前記第１の部分と前記相補部分が接触したときに前記タンパク質分解酵素の活性が再構成される、第２のCas12bエフェクタータンパク質、
iii）前記第１のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、かつ前記オリゴヌクレオチドの第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド、
iv）前記第２のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、かつ前記オリゴヌクレオチドの第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド、および
v）検出可能に切断されたレポーター
を含む組成物と接触させることを含み、
前記関心のあるオリゴヌクレオチドが細胞中に存在すると前記タンパク質分解酵素の前記第１の部分と前記相補部分が接触して、前記タンパク質分解酵素の活性を再構成しかつ前記レポーターを検出可能に切断する、
前記関心のあるオリゴヌクレオチドを含む細胞を同定する方法。
【請求項８４】
細胞中の関心のあるオリゴヌクレオチドを、
i）レポーターの不活性な第１の部分に結合した第１のCas12bエフェクタータンパク質、
ii）前記レポーターの相補部分に結合し、前記レポーターの前記第１の部分と前記相補部分が接触したときに前記レポーターの活性が再構成される、第２のCas12bエフェクタータンパク質、
iii）前記第１のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、かつ前記オリゴヌクレオチドの第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド、
iv）前記第２のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、かつ前記オリゴヌクレオチドの第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド、および
V）前記レポーター
を含む組成物と接触させることを含み、
前記関心のあるオリゴヌクレオチドが細胞中に存在すると前記レポーターの前記第１の部分と前記相補部分が接触して、前記レポーターの活性を再構成する、
前記関心のあるオリゴヌクレオチドを含む細胞を同定する方法。
【請求項８５】
前記レポーターは蛍光タンパク質または発光タンパク質である、請求項８３または８４の方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願に対する相互参照】
【０００１】
本出願は、2018年8月7日付け米国仮特許出願第62/715,640号、2018年10月10日付け米国仮特許出願第62/744,080号、2018年10月26日付け米国仮特許出願第62/751,196号、2019年1月21日付け米国仮特許出願第62/794,929号、および2019年4月8日付け米国仮特許出願第62/831,028号の利益を主張する。上記に特定された出願の全内容は、参照により本明細書に完全に組み込まれる。
【連邦政府より資金提供を受けた研究に関する陳述】
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所より授与された助成金番号MH110049およびHL141201の下で政府の支援を受けて実施された。政府は本発明に一定の権利を保有する。
【電子配列表の参照】
【０００３】
電子配列表（「BROD-2670_ST25.txt」；容量は879,558バイトであり、これは2019年7月25日に作成された）の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００４】
本明細書に開示される主題は、一般に、クラスター化され規則的に間隔をおいた短鎖回文配列反復（CRISPR）およびその構成要素に関連するシステム、方法、および組成物に関する。本発明はまた、一般に、大量の有効量の送達に関連し、特に脂質粒子およびウイルス粒子を用いる新規の送達粒子および新規のウイルスキャプシドタンパク質を含み、これら両者は、例えばクラスター化され規則的に間隔をおいた短鎖回文配列反復（CRISPR）、CRISPRタンパク質（例えば、Cas、C2c1）、CRISPR-CasまたはCRISPRシステムあるいはCRISPR-Cas複合体、それらの構成成分、特に前述の全ておよびそれらの使用を含むベクターなどの核酸分子の大量の有効量の送達に適している。さらに、本発明は、CRISPR-Casシステムに基づく治療法または治療技術を開発あるいは設計する方法に関する。
【背景技術】
【０００５】
ゲノム配列決定技術およびゲノム分析手法における最近の進歩は、多様な範囲の生物学的機能および疾患に関連する遺伝的要因を分類および解読する能力を著しく加速させてきた。個々の遺伝因子を選択的に摂動させて、因果関係のある遺伝的変異の体系的な逆行分析を可能にし、かつ合成生物学、生物工学、および医療への利用を進めるためには、高精度のゲノム標的化技術が必要とされる。遺伝子改変ジンクフィンガー、転写活性化因子様エフェクター（TALE）、ホーミングメガヌクレアーゼなどのゲノム編集技術を標的化ゲノムの摂動を生成するのに利用できるが、新規の手法および分子機構を用いてかつ真核生物のゲノム内の複数の位置を標的化するのに、経済性があり、設定が容易であり、拡張性が有り、かつ適応性がある新規のゲノム操作技術が依然必要とされている。この技術により、ゲノム工学およびバイオテクノロジーでの新規用途への主要な資源を提供することになる。
【０００６】
細菌および古細菌の適応免疫でのCRISPR-Casシステムは、タンパク質組成物およびゲノム遺伝子座構築物に非常に高い多様性を示す。このCRISPR-Casシステムの遺伝子座は50個を超える遺伝子ファミリーを有するが、遺伝子座構築物の急速な進展および非常に高い多様性を示す厳密に普遍的な遺伝子はない。現在のところ、多面的な取組みにより、93個のCasタンパク質に対して約395個の特徴を持つ包括的なCas遺伝子が見出されている。これらの分類として、シグネチャー遺伝子特性と遺伝子座構築物のシグネチャーの組合せが含まれる。CRISPR-Casシステムの新規分類が提案されており、これらのシステムは、大別して２種の部類に区分される。第１の部類は、多数のサブユニットエフェクター複合体を含み、第２の部類は、Cas9タンパク質などの単一のサブユニットエフェクターモジュールを含む。第２の部類のCRISPR-Casシステムに会合する新規のエフェクタータンパク質は、強力なゲノム操作ツールとして発展させてもよく、仮想の新規エフェクタータンパク質の予測およびそれらの遺伝子操作かつ最適化が重要となる。新規のCas12b相同分子種およびその使用が望ましい。
【０００７】
本出願中の任意の文献の引用あるいは特定は、その文献が本発明の先行技術として利用できると認めるものではない。
【発明の概要】
【０００８】
一側面では、本開示は、ｉ）表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質、およびii）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドを含む、非天然起源または遺伝子操作されたシステムを提供する。実施形態によっては、システムは、トランス活性化クリスパーRNA（tracr RNA）をさらに含む。
【０００９】
実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、アリシクロバチルス・カケガウェンシス（Alicyclobacillus kakegawensis）、バチルス属種V3-13（Bacillus sp. V3-13）、バチルス・ヒサシイ（Bacillus hisashii）、レンティスファエラ綱の細菌（Lentisphaeria bacterium）、およびラセエラ・セディミニス（Laceyella sediminis）からなる群から選択される細菌に由来する。実施形態によっては、tracr RNAは、直接反復の5’末端でクリスパーRNA（crRNA）に融合される。実施形態によっては、このシステムは、２つ以上のcrRNAを含む。実施形態によっては、ガイド配列は、原核細胞中で１つ以上の標的配列にハイブリダイズする。実施形態によっては、ガイド配列は、真核細胞中で１つ以上の標的配列にハイブリダイズする。実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、１つ以上の核局在化シグナル（NLS）を含む。実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、触媒的に不活性である。実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインに会合している。実施形態によっては、１つ以上の機能ドメインは、１つ以上の標的配列を切断する。実施形態によっては、機能ドメインは、１つ以上の標的配列の転写または翻訳を修飾する。実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインに会合し、かつCas12bエフェクタータンパク質は、リゾルバーゼ（RuvC）および／またはヌクレアーゼ（Nuc）ドメイン内に１つ以上の変異を含み、それによって、形成されたCRISPR複合体は、標的配列にまたは標的配列の近傍に、連続的発現の修飾因子、あるいは転写または翻訳の活性化シグナルもしくは抑制シグナルを送達可能である。実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、アデノシン脱アミノ酵素またはシチジン脱アミノ酵素と会合している。実施形態によっては、このシステムはさらに、組換え鋳型を含む。実施形態によっては、組換え鋳型は、相同指向性修復（HDR）によって挿入される。
【００１０】
別の側面では、本開示は、表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合された第１の調節エレメント、およびｉ）ａ）ガイド配列をコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合された第２の調節エレメントとｂ）tracr RNAをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合された第３の調節エレメント、あるいはii）ガイド配列およびtracr RNAをコードするヌクレオチド配列に操作可能に結合された第２の調節エレメントを含む１つ以上のベクターを含むCas12bベクターシステムを提供する。
【００１１】
実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列は、真核細胞中での発現のためにコドン最適化されている。実施形態によっては、このシステムは単一のベクター中に含まれている。実施形態によっては、１つ以上のベクターは、ウイルスベクターを含む。実施形態によっては、１つ以上のベクターは、１つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルスの各ベクターを含む。
【００１２】
別の側面では、本開示は、Cas12bエフェクタータンパク質、かつｉ）表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質、ii）１つ以上の標的配列にハイブリダイズが可能な3’ガイド配列、およびiii）tracrRNAを含む非天然起源または遺伝子操作された組成物の１つ以上の核酸成分を送達するように構成された送達システムを提供する。
【００１３】
実施形態によっては、この送達システムは、１つ以上のベクターまたは１つ以上のポリヌクレオチド分子を含み、この１つ以上のベクターまたはポリヌクレオチド分子は、Cas12bエフェクタータンパク質をコードする１つ以上のポリヌクレオチド分子、および非天然起源または遺伝子操作された組成物の１つ以上の核酸成分を含む。実施形態によっては、送達システムは、リポソーム、粒子、エキソソーム、微小胞、遺伝子銃、またはウイルスベクターを含む送達媒介物を含む。
【００１４】
別の側面では、本開示は、治療法に使用するための、本明細書の非天然起源または遺伝子操作されたシステム、本明細書のベクターシステム、あるいは本明細書の送達システムを提供する。
【００１５】
別の側面では、本開示は、関心のある１つ以上の標的配列を改変する方法を提供し、この方法は、１つ以上の標的配列を、ｉ）表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質、ii）標的DNA配列にハイブリダイズが可能な3’ガイド配列、およびiii）tracr RNAを含む１つ以上の非天然起源または遺伝子操作された組成物と接触させて、それにより、crRNAとtracr RNAを複合化させたCas12bエフェクタータンパク質を含むCRISPR複合体を形成することを含み、このガイド配列は細胞内の１つ以上の標的配列に配列特異的結合を導いて、それにより１つ以上の標的配列の発現を改変する。実施形態によっては、標的遺伝子発現を改変することは、１つ以上の標的配列を切断することを含む。実施形態によっては、標的遺伝子発現を改変することは、１つ以上の標的配列の発現を増強あるいは減弱させることを含む。実施形態によっては、この組成物さらに、組換え鋳型を含み、１つ以上の標的配列を改変することは、組換え鋳型またはその一部の挿入を含む。実施形態によっては、１つ以上の標的配列は、原核生物細胞内にある。実施形態によっては、１つ以上の標的配列は、真核細胞内にある。
【００１６】
別の側面では、本開示は、１つ以上の改変された標的配列を含む細胞またはその後代を提供し、この１つ以上の標的配列は本明細書の方法により改変されていて、この細胞は、必要に応じて治療用T細胞あるいは抗体産生B細胞であり、あるいは植物細胞でもよい。実施形態によっては、細胞は原核細胞である。実施形態によっては、細胞は真核細胞である。実施形態によっては、１つ以上の標的配列の改変は、少なくとも１つの遺伝子産物に発現の変化を含む細胞、少なくとも１つの遺伝子産物の発現を増強させる少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む細胞、少なくとも１つの遺伝子産物の発現を減弱させる少なくとも１つの遺伝子産物の発現の変化を含む細胞、および内因性または非内因性の生物由来の産物または化合物を産生かつ／あるいは分泌する細胞または集団をもたらす。実施形態によっては、この細胞は、哺乳動物細胞またはヒト細胞である。別の側面では、本開示は、本明細書の細胞の細胞株またはその細胞を含む細胞株、あるいはその後代の細胞株を提供する。
【００１７】
別の側面では、本開示は、本明細書の１つ以上の細胞を含む多細胞生物を提供する。
【００１８】
別の側面では、本開示は、本明細書の１つ以上の細胞を含む植物モデルまたは動物モデルを提供する。
【００１９】
別の側面では、本開示は、本明細書の細胞、細胞株、生物、あるいは植物モデルまたは動物モデルからの遺伝子産物を提供する。実施形態によっては、発現された遺伝子産物の量は、発現を変化させない細胞からの遺伝子産物の量よりも多いかあるいは少ない。
【００２０】
別の実施形態では、本開示は、表１または表２に記載の単離されたCas12bエフェクタータンパク質を提供する。
【００２１】
別の側面では、本開示は、Cas12bエフェクタータンパク質をコードする単離された核酸を提供する。実施形態によっては、単離された核酸はDNAであり、さらにcrRNAおよびtracr RNAをコードする配列を含む。
【００２２】
別の側面では、本開示は、本明細書の核酸またはCas12bタンパク質を含む単離された真核細胞を提供する。
【００２３】
別の側面では、本開示は、ｉ）表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質をコードするメッセンジャーRNA（mRNA）、ii）ガイド配列、およびiii)tracr RNAを含む、非天然起源または遺伝子操作されたシステムを提供する。実施形態によっては、tracr RNAは、直接反復の5’末端でcrRNAに融合される。
【００２４】
別の側面では、本開示は、標的化ドメインおよびアデノシン脱アミノ酵素、シチジン脱アミノ酵素、またはそれらの触媒ドメインを含む部位特異的塩基編集のための遺伝子操作されたシステムを提供し、この標的化ドメインは、オリゴヌクレオチド結合活性を維持するCas12bエフェクタータンパク質またはその断片、およびガイド分子を含む。実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、触媒的に不活性である。実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、表１または表２から選択される。実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、アリシクロバチルス・カケガウェンシス、バチルス属種V3-13、バチルス・ヒサシイ、レンティスファエラ綱の細菌、およびラセエラ・セディミニスからなる群から選択される。
【００２５】
別の側面では、本開示は、本明細書の組成物を関心のある１つ以上の標的オリゴヌクレオチドに送達することを含む、１つ以上の標的オリゴヌクレオチド中のアデノシンまたはシチジンを改変する方法を提供する。実施形態によっては、本開示は、病原性のT→CまたはA→Gの点変異を含む転写物に起因する疾患の治療または予防に使用するために提供する。別の側面では、本開示は、本明細書の方法から得られ、かつ／あるいは本明細書の組成物を含む単離された細胞を提供する。実施形態によっては、前記真核細胞は、好ましくはヒトまたはヒト以外の動物細胞であり、必要に応じて治療T細胞または抗体産生B細胞であり、あるいはその細胞は植物細胞である。
【００２６】
別の側面では、本開示は、前記改変された細胞またはその後代を含むヒト以外の動物を提供する。
【００２７】
別の側面では、本開示は、本明細書の改変された細胞を含む植物を提供する。
【００２８】
別の側面では、本開示は、治療、好ましくは細胞治療に使用するための改変された細胞を提供する。
【００２９】
別の側面では、本開示は、標的オリゴヌクレオチドに、触媒的に不活性なCas12bタンパク質、直接反復に結合されたガイド配列を含むガイド分子、およびアデノシンまたはシチジン脱アミノ酵素タンパク質またはその触媒ドメインを送達することを含む、前記標的オリゴヌクレオチド中のアデニンまたはシトシンを改変する方法を提供し、前記アデノシンまたはシチジン脱アミノ酵素タンパク質またはその触媒ドメインは、前記触媒的に不活性なCas12bタンパク質または前記ガイド分子に共有結合または非共有結合しているか、あるいは送達後にそれに結合するように構成されていて、前記ガイド分子は、前記触媒的に不活性なCas12bとの複合体を形成し、かつ前記複合体を前記標的オリゴヌクレオチドに結合するように導き、前記ガイド配列は、前記標的オリゴヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド二重鎖を形成できる。
【００３０】
実施形態によっては、（Ａ）前記シトシンは、前記オリゴヌクレオチド二重鎖を形成する前記標的配列の外側にあり、前記シチジン脱アミノ酵素タンパク質またはその触媒ドメインは、前記RNA二重鎖の外側にある前記シトシンを脱アミノ化し、あるいは（Ｂ）前記シトシンは、前記RNA二重鎖を形成する前記標的配列内にあり、前記ガイド配列は、前記シトシンに対応する位置に非対合アデニンまたはウラシルを含み、前記オリゴヌクレオチド二重鎖中にC−AまたはC−Uの不適正をもたらし、かつシチジン脱アミノ酵素タンパク質またはその触媒ドメインは、非対合アデニンまたはウラシルの反対側のオリゴヌクレオチド二重鎖中のシトシンを脱アミノ化する。実施形態によっては、前記アデノシン脱アミノ酵素タンパク質またはその触媒ドメインは、オリゴヌクレオチド二本鎖中の前記アデニンまたはシトシンを脱アミノ化する。実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、表１または表２から選択される。実施形態によっては、Cas12bタンパク質は、アリシクロバチルス・カケガウェンシス、バチルス属種V3-13、バチルス・ヒサシイ、レンティスファエラ綱の細菌、およびラセエラ・セディミニスからなる群から選択される細菌に由来する。
【００３１】
別の側面では、本開示は、Cas12bタンパク質、標的配列と所定の程度の相補性を有するように設計され、かつCas12bと複合体を形成するように設計されたガイド配列を含む少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、および非標的配列を含むオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物を含む１つ以上のin vitro試料中の核酸標的配列の存在を検出するためのシステムを提供し、このCas12bは、側副核酸分解酵素活性を示し、かつ標的配列によって活性化されるとオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物の非標的配列を切断する。
【００３２】
別の側面では、本開示は、Cas12bタンパク質、それぞれが１種以上の標的ポリペプチドのうちの１種に結合するように設計され、かつそれぞれがマスクされたプロンプター結合部位またはマスクされたプライマー結合部位およびトリガー配列鋳型を含む１つ以上の検出アプタマー、および非標的配列を含むオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物を含む１つ以上のin vitro試料中の１つ以上の標的ポリペプチドの存在を検出するためのシステムを提供する。
【００３３】
実施形態によっては、システムはさらに、標的配列またはトリガー配列を増幅するための核酸増幅試薬を含む。実施形態によっては、この核酸増幅試薬は、恒温増幅試薬である。実施形態によっては、Cas12bタンパク質は、表１または表２から選択される。実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、アリシクロバチルス・カケガウェンシス、バチルス属種V3-13、バチルス・ヒサシイ、レンティスファエラ綱の細菌、およびラセエラ・セディミニスからなる群から選択される細菌に由来する。
【００３４】
別の側面では、本開示は１つ以上のin vitro試料中の核酸配列を検出する方法を提供し、この方法は、１つ以上の試料をｉ）Cas12bタンパク質、ii）標的配列に対し所定の程度の相補性を有するように設計され、かつCas12bタンパク質と複合体を形成するように設計されたガイド配列を含む少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、およびiii）非標的配列を含むオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物と接触させることを含み、前記Cas12タンパク質は、側副核酸分解酵素活性を示し、かつオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物の非標的配列を切断する。
【００３５】
実施形態によっては、Cas12bタンパク質は、表１または表２から選択される。実施形態によっては、Cas12bタンパク質は、アリシクロバチルス・カケガウェンシス、バチルス属種V3-13、バチルス・ヒサシイ、レンティスファエラ綱の細菌、およびラセエラ・セディミニスからなる群から選択される細菌に由来する。別の側面では、本開示は、酵素またはレポーター成分の不活性な第１の部分に結合されたCas12bタンパク質を含む非天然起源または遺伝子操作された組成物を提供し、この酵素またはレポーター成分は、酵素またはレポーター成分の相補部分と接触すると再構成される。実施形態によっては、酵素またはレポーター成分は、タンパク質分解酵素を含む。実施形態によっては、Cas12bタンパク質は、酵素またはレポーター成分の相補部分に結合された第１のCas12bタンパク質および第２のCas12bタンパク質を含む。実施形態によっては、組成物は、ｉ）第１のCas12bタンパク質と複合体を形成し、標的核酸の第１の標的配列にハイブリダイズできる第１のガイド、およびii）第２のCas12bタンパク質と複合体を形成し、標的核酸の第２の標的配列にハイブリダイズできる第２のガイドをさらに含む。実施形態によっては、タンパク質分解酵素は、カスパーゼを含む。実施形態によっては、タンパク質分解酵素は、タバコエッチウイルス（TEV）を含む。
【００３６】
別の側面では、本開示は、標的オリゴヌクレオチドを含む細胞中にタンパク質分解活性を提供する方法を提供し、この方法は、ａ）細胞または細胞集団を、i）タンパク質分解酵素の不活性部分に結合した第１のCas12bエフェクタータンパク質、ii）タンパク質分解酵素の相補部分に結合し、タンパク質分解酵素の第１の部分と相補部分が接触するとタンパク質分解酵素のタンパク質分解活性が再構成される第２のCas12bエフェクタータンパク質、iii）第１のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、標的オリゴヌクレオチドの第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド、およびiv）第２のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、標的オリゴヌクレオチドの第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイドと接触させることを含み、これにより、タンパク質分解酵素の第１の部分と相補部分が接触して、タンパク質分解酵素のタンパク質分解活性が再構成される。
【００３７】
実施形態によっては、タンパク質分解酵素は、カスパーゼである。実施形態によっては、タンパク質分解酵素はTEVプロテアーゼであり、TEVプロテアーゼのタンパク質分解活性が再構成され、それによりTEV基質が切断されかつ活性化される。実施形態によっては、TEV基質はTEV標的配列を含むように遺伝子操作されたプロカスパーゼであり、それによりTEVプロテアーゼによる切断がプロカスパーゼを活性化する。
【００３８】
別の側面では、本開示は、関心のあるオリゴヌクレオチドを含む細胞を識別する方法を提供し、この方法は、細胞内のオリゴヌクレオチドを、ｉ）タンパク質分解酵素の不活性な第１の部分に結合した第１のCas12bエフェクタータンパク質、ii）タンパク質分解酵素の相補部分に結合し、タンパク質分解酵素の第１の部分と相補部分が接触するとタンパク質分解酵素の活性が再構成される、第２のCas12bエフェクタータンパク質、iii）第１のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、オリゴヌクレオチドの第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド、iv）第２のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、オリゴヌクレオチドの第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド、およびv）検出可能に切断されるレポーターを含む組成物と接触させることを含み、関心のあるオリゴヌクレオチドが細胞内に存在するとタンパク質分解酵素の第１の部分と相補部分が接触して、それによりタンパク質分解酵素の活性が再構成され、かつレポーターを検出可能に切断する。
【００３９】
別の側面では、本開示は、関心のあるオリゴヌクレオチドを含む細胞を識別する方法を提供し、この方法は、細胞内のオリゴヌクレオチドを、ｉ）レポーターの不活性な第１の部分に結合した第１のCas12bエフェクタータンパク質、ii）レポーターの相補部分に結合し、レポーターの第１の部分と相補部分が接触するとレポーターの活性が再構成される、第２のCas12bエフェクタータンパク質、iii）第１のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、オリゴヌクレオチドの第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド、iv）第２のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、オリゴヌクレオチドの第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド、およびv）レポーターを含む組成物と接触させることを含み、関心のあるオリゴヌクレオチドが細胞内に存在するとレポーターの第１の部分と相補部分は接触して、それによりレポーターの活性が再構成される。実施形態によっては、レポーターは蛍光タンパク質または発光タンパク質である。
【００４０】
実施形態例のこれらおよびその他の側面、目的、特徴、および利点は、例示された実施形態例の以下の詳細な説明を考慮することで当業者には明白になる。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
本発明の特徴および利点について、本発明の原理を利用できる例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明、およびそれらの添付図面を参照することで理解が進む。
【００４２】
【図１】図１は、フィシスファエラ細菌（Phycisphaerae bacterium）のCRISPR-C2c1遺伝子座を示している。小領域のRNAseqは、tracrRNAの位置および成熟crRNAの構造を明示している。
【００４３】
【図２】図２Ａ〜２Ｃは、予測されたtracrRNA（図２Ａ）（配列番号1〜11）およびTracer番号1（図２Ｂ）およびTracer番号5（図２Ｃ）（配列番号12、656、および13）の直接反復（赤色）を伴うトレーサー（緑色）の二重鎖の倍数予測を示す。
【００４４】
【図３】図３Ａは、最も緩く予測されたPAMに対して提供されるSeqlogoでのPAM検査の結果を示し、図３Ｂは、最も厳格に予測されたPAMを示している。
【００４５】
【図４】図４は、TTH（HはA、TまたはC）としてPhbC2c1 PAMのin vivo確認を示している。細胞は、認識可能なプロトスペーサーの5’に位置する種々のPAM配列をコードするプラスミドDNAで形質転換された。
【００４６】
【図５】図５は、Cpf1ニッカーゼを使用する配列特異的ニッカーゼ増幅を示す。
【００４７】
【図６】図６は、アプタマーの色生成を示す。
【００４８】
【図７】図７は、プランクトミケス（Planctomycetes）のCRISPR-C2c1遺伝子座を示している。小領域のRNAseqは、tracrRNAの位置および成熟crRNAの構造を明示している。
【００４９】
【図８】図８Ａは、最も緩く予測されたPAMに対して提供されるSeqlogoでのPAM検査の結果を示し、図８Ｂは、最も厳格に予測されたPAM (B)を示している。この検査では、プランクトミケスのPAMがTTR（RはGまたはA）であることを示している。
【００５０】
【図９】図９は、TTR（RはGまたはA）としてプランクトミケスのC2c1 PAMのin vivo確認を示している。細胞は、認識可能なプロトスペーサーの5’に位置する種々のPAM配列をコードするプラスミドDNAで形質転換された。
【００５１】
【図１０】図１０は、crRNA−tracrRNA複合体を用いてC2c1を単離するためのプラスミド例を示している。プラスミドには、PhyciC2c1および／またはtracrRNAおよび／またはCRISPR配列が含まれている。処理済みのcrRNAおよびtracrRNAをC2c1との複合体として、C2c1タンパク質（C2c1-RNA複合体）とともに共精製することができる。
【００５２】
【図１１】図１１Ａは、タンパク質プルダウンアッセイでのPhyciC2c1およびPlancC2c1の帯域を示している。RNA分解酵素およびDNA分解酵素の消化実験を実施し、この実験では、図１１ＢのようにRNAはPhysiC2c1タンパク質中に存在することが示された（PhyC2c1タンパク質は、RNA分解酵素の消化に感受性があったが、DNA分解酵素には感受性が無かった）。PhysiC2c1タンパク質中のRNAの存在を、図１１Ｃのようにさらに確認した。共精製されたRNAのサイズはcrRNAに一致するものの、118ヌクレオチド長の予測されたtracrRNAよりも大きいと見受けられた。
【００５３】
【図１２】図１２は、in vitro切断実験の条件および結果を示し、これら結果は、PhysiC2c1−RNA複合体が、CRISPR配列の第１のガイドに一致するプロトスペーサー配列を含むDNAを切断できることを実証していた。
【００５４】
【図１３】図１３は、種々のsgRNAを示している。大腸菌内で発現したBhCas12b遺伝子座からの小領域RNA-seqは、tracrRNAおよびcrRNAを明示していた。sgRNA変異体（配列番号14〜29）を形成するためのtracrRNAおよびcrRNAの融合の図を示す。
【００５５】
【図１４】図１４は、種々の標的部位について、プラスミド形質移入後に図１３の種々のsgRNAにより得られた挿入欠失（indel）の百分率を示している。用いられたCas12bはバチルス・ヒサシイ株C4由来であった。HEK293細胞中でのBhCas12bおよびsgRNA変異体の発現は、複数のゲノム部位に挿入欠失変異を生成する。
【００５６】
【図１５】図１５Ａ〜１５Ｃは、それぞれLs、Ak、およびBvからのCas12b相同分子種を使用した、精製されたタンパク質およびRNAによるPAM検出およびin vitro切断を示す（図１５Ａ：配列番号30および657、図１５Ｂ：配列番号31および658、図１５Ｃ：配列番号32および659）。図１５Ｄ〜１５Ｅは、それぞれPhyciおよびPlancからのCas12b相同分子種を使用した精製タンパク質およびRNAによるin vitro切断を示している。
【００５７】
【図１６】図１６は、精製されたAmCas12b（AmC2C1）タンパク質、および小領域RNAseqとは異なる予測されたtracrRNAを用いたin vitro切断アッセイを示している。
【００５８】
【図１７】図１７Ａ〜１７Ｅは、AmC2C1に対するsgRNAの設計を示している（図１７Ａ：配列番号33および660、図１７Ｂ：配列番号34および661、図１７Ｃ：配列番号35、図１７Ｄ：配列番号36、図１７Ｅ：配列番号37）。
【００５９】
【図１８】図１８は、sgRNAの効率の比較のためのAmC2C1によるin vitro切断を示す。
【００６０】
【図１９】図１９は、AmC2C1 RuvC変異体の活性を示す。
【００６１】
【図２０】図２０は、in vitroのPAM検査によるCas12b相同分子種のPAMの決定を示す。
【００６２】
【図２１】図２１Ａは、小領域RNAseqのtracr予測を示す。図２１Ｂは、in vivo検査からのBhC2C1（バチルス・ヒサシイのCas12b）PAMを示す。図２１Ｃは、BhC2C1タンパク質精製を示す。図２１Ｄは、それぞれ37°Cおよび48°CでのBhC2C1タンパク質および予測されたtracr RNAによるin vitro切断を示す。
【００６３】
【図２２】図２２Ａ〜２２Ｄは、BhC2C1に対するsgRNAの設計を示す（図２２Ａ：配列番号38および662、図２２Ｂ：配列番号39、図２２Ｃ：配列番号40、図２２Ｄ：配列番号41）。
【００６４】
【図２３】図２３は、BhC2C1を含む例示的な構築物のプラスミドマップを示す。
【００６５】
【図２４】図２４は、表１２の種々の標的部位に対して、プラスミド形質移入後に表１２の種々のsgRNAで得られた挿入欠失百分率を示す。用いたCas12bは、BvCas12bであった（配列番号42〜47）。
【００６６】
【図２５】図２５は、BvCas12bを含む例示的な構築物のプラスミドマップを示す。
【００６７】
【図２６】図２６は、BhCas12bを含む例示的な構築物のプラスミドマップを示す。
【００６８】
【図２７】図２７は、EbCas12bを含む例示的な構築物のプラスミドマップを示す。
【００６９】
【図２８】図２８は、AkCas12bを含む例示的な構築物のプラスミドマップを示す。
【００７０】
【図２９】図２９は、PhyciCas12bを含む例示的な構築物のプラスミドマップを示す。
【００７１】
【図３０】図３０は、PlancCas12bを含む例示的な構築物のプラスミドマップを示す。
【００７２】
【図３１】図３１は、BvCas12bを含む例示的な構築物pZ143-pcDNA3-BvCas12bのプラスミドマップを示す。
【００７３】
【図３２】図３２は、BvCas12b sgRNA足場を含む例示的な構築物pZ147-BvCas12b-sgRNA-足場のプラスミドマップを示す。
【００７４】
【図３３】図３３は、BhCas12b sgRNA足場を含む例示的な構築物pZ148-BhCas12b-sgRNA-足場のプラスミドマップを示す。
【００７５】
【図３４】図３４は、S893、K846、およびE836に変異を有するBhCas12bを含む例示的な構築物pZ149-BhCas12b-S893R-K846R-E836Gのプラスミドマップを示す。
【００７６】
【図３５】図３５は、S893、K846、およびE836に変異を有するBhCas12bを含む例示的な構築物pZ150-pCDNA3-BhCas12b-S893R-K846R-E836Kのプラスミドマップを示す。
【００７７】
【図３６】図３６は、様々な条件でのBhCas12bでのPAM検出結果を示す。
【００７８】
【図３７】図３７は、様々な条件でのBvCas12bのPAM検出結果を示す。
【００７９】
【図３８】図３８は、種々の結合部位でのBhCas12b変異体の挿入欠失百分率を示す。
【００８０】
【図３９】図３９は、種々の結合部位での別のBhCas12b変異体の挿入欠失百分率を示す。
【００８１】
【図４０】図４０Ａは、DNMT1-1（配列番号48〜51）でのBhCas12b（実施例２０の変異体4）およびBvCas12bによる切断を伴うHDRを示す。図４０Ｂは、VEGFA-2（配列番号52〜55）でのBhCas12b（実施例２０の変異体4）およびBvCas12bによる切断を伴うHDRを示す。
【００８２】
【図４１】図４１Ａは、TTTV PAMでのAsCas12aおよびBhCas12b変異体4およびBvCas12b ATTN PAMの挿入欠失百分率の比較を示す。図４１Ｂは、種々のPAM配列でのBhCas12b変異体4およびBvCas12b活性の内訳を示している。
【００８３】
【図４２】図４２Ａは、ssDNA供与体（配列番号56〜59）で導入される所望の変化を含むVEGFA標的の概略図を示す。図４２Ｂは、VEGFA標的部位での各ヌクレアーゼの挿入欠失活性を示す。図４２Ｃは、VEGFA部位で所望の編集（2ヌクレオチド置換）を含む細胞の百分率を示す。図４２Ｄは、ssDNA供与体（配列番号60〜63）で導入される所望の変化を含むDNMT1標的の概略図を示す。図４２Ｅは、DNMT1標的部位での各ヌクレアーゼの挿入欠失活性を示す。図４２Ｆは、DNMT1部位で所望の編集（2ヌクレオチド置換）を含む細胞の百分率を示す。
【００８４】
【図４３】図４３の左の図は、CXCR4の標的化エクソンおよびBhCas12b（v4）およびBvCas12bのそれぞれ（配列番号64〜77）により標的化されたCXCR4配列を示す。右の図は、2個の供与体からのT細胞でのCXCR4に対するBhCas12b（v4）およびBvCas12bの効果を示す挿入欠失百分率を示す。
【００８５】
【図４４】図４４Ａ〜４４Ｅは、中温性Cas12bヌクレアーゼの識別を示す。図４４Ａは、Cas9、Cas12a、およびCas12bヌクレアーゼの差異を強調する遺伝子座の概略図およびタンパク質ドメイン構造、またSpCas9（PDB：4oo8）、AsCas12a（PDB：5b43）、およびAacCas12b（PDB：5u30）の結晶構造を示す。図４４Ｂは、精製Cas12bタンパク質およびRNA-Seqにより識別された合成crRNAおよびtracrRNAによるCas12bシステムのin vitro再構成を示し、この反応は、指示温度で90分間および250 nMのCas12bタンパク質で実施した。図４４Ｃおよび図４４Ｄは、6個のsgRNA変異体を有する293T細胞でのAkCas12bおよびBhCas12bの挿入欠失活性を示す。誤差棒は4個の複製物からの標準偏差を表す。sgRNA配列については、図５０Ｂおよび図５０Ｃを参照のこと。図４４Ｅは、BhCas12b sgRNA構造および試験した変異体（配列番号78）の位置の概略図を示す。
【００８６】
【図４５】図４５Ａ〜４５Ｈは、BhCas12bの合理的な遺伝子操作を示す。図４５Ａは、種々に標識化されたDNA鎖とのin vitroのCas12b反応を示す。より遅い移動生成物は、未変性PAGE分離中に観察され、PAGEの変性による分離は、より低い温度で非標的鎖を切断するためのAkCas12bおよびBhCas12bに対する優先度を表している。図４５Ｂは、標的鎖とRuvC活性部位（紫色）の間のポケット内の12個の試験された残基のうちの10個の位置を示す。BhCas12b残基は、非常に類似したBthCas12b（PDB：5wti）の構造中に強調表示されている。図４５Ｃは、野生型（灰色記号）に対し正規化されたDNMT1標的4およびVEGFA標的2での268個のBhCas12b変異の挿入欠失活性を示す。誤差棒は2個の複製物からの標準偏差を表す。図４５Ｄは、グリシンに変異した表面露出残基の位置を示す。図４５Ｅは、野生型（灰色記号）に対し正規化されたDNMT1標的4およびVEGFA標的2での66個のBhCas12b変異の挿入欠失活性を示す。誤差棒は2個の複製物からの標準偏差を表す。図４５Ｆは、BhCas12b過活性変異体の総括を示す。図４５Ｇは、4個の標的部位でのBhCas12b変異体の挿入欠失活性を示す。誤差棒は3〜6個の複製物からの標準偏差を表す。図４５Ｈは、BhCas12b WTおよびv4変異体の濃度を増大させたin vitro切断を示す。ゲルは2回の実験からの代表画像である。
【００８７】
【図４６】図４６Ａ〜４６Ｇは、BhCas12b v4およびBvCas12bがヒト細胞株でゲノム編集を媒介することを示す。図４６Ａは、28個のTTTV標的でのAsCpf1、33個のATTN標的でのBhCas12bv4、および37個のATTN標的でのBvCas12bの293T細胞での挿入欠失活性を示す。各点は、4個の複製物から平均された単一の標的部位を表す。図４６Ｂは、30個の活性ガイドから平均されたCas12bゲノム編集からの平均挿入欠失長を示す。図４６Ｃは、SpCas9およびCas12a/bヌクレアーゼならびにTGからCAへの変異およびPAM破壊変異（配列番号79〜83）を含む120ヌクレオチド長のssODN供与体によって標的可能なDNMT1標的部位の概略図である。図４６Ｄは、遺伝子座での各ヌクレアーゼの挿入欠失活性を示す。誤差棒は8個の複製物からの標準偏差を表す。図４６Ｅは、標的鎖（T）または非標的鎖（NT）供与体を使用した相同性指向修復（HDR）の頻度を示す。灰色の棒はTGからCAへの変異の頻度を示し、赤色の棒は、変異を持たない図Ｃ中のHDR配列を含む完全な編集を示している。誤差棒は6個の複製物からの標準偏差を表す。図４６Ｆは、30個の活性なBhCas12bガイド、45個の活性なAsCas12aガイド、および39個の活性なSpCas9ガイドを使用したゲノム編集中の平均挿入欠失長を示す。図４６Ｇは、BhCas12b v4 RNPの送達後のCD4 +ヒトT細胞での挿入欠失活性を示す。各点は2個の個々のエレクトロポレーションを表す。原生データは、原生データファイルとして示される。
【００８８】
【図４７】図４７Ａ〜４７Ｂは、BhCas12bv4およびBvCas12bが非常に特異的なヌクレアーゼであることを示す。図４７Ａは、Guide-Seq分析のために選択された9個の標的部位での293T細胞での挿入欠失活性を示す。誤差棒は4個の複製物からの標準偏差を表す。図４７Ｂは、各ヌクレアーゼに対して検出された切断部位の数および相対比率を示すGuide-Seq分析の結果である。非特異的標的部位は薄灰色のくさび形として表示され、特異的標的部位は青色で強調表示され、特異的標的部の読取り値が小数でその下に示されている。非特異的標的は、SpCas9でのみ検出された。完全な分析結果については、図５５を参照のこと。
【００８９】
【図４８】図４８Ａ〜４８Ｅは、Cas12b相同分子種のPAM検出を示す。図４８ＡはCas12b相同分子種の配列である。図４８Ｂは、その配列に基づく亜型V-BエフェクターCas12bタンパク質の系統樹を示す。配列はGenbankタンパク質受託番号と種名で示されている。この検討で実験的に研究されたタンパク質は太字で示されている。37°Cで堅牢な編集活性を示し、詳細に研究された4個のタンパク質には下線が引かれている。図４８Ｃは、大腸菌でのPAM検出アッセイの概略図を示す。図４８Ｄは、枯渇したPAMが大腸菌中の14個のCas12bシステムのうち4個でのみ検出されたことを示している。枯渇の閾値として、log2比で3.32（点線表示）に設定され、但しEbCas12bでは閾値が2.32に設定された。枯渇したPAMは、配列情報を示す第１の5’塩基のホイールの中央から始まる配列モチーフならびにPAMホイール22として示される。図４８Ｅは、亜型V-BエフェクターCas12bタンパク質の系統樹を示す。配列はGenbankタンパク質受託番号および種名で示されている。この検討で実験的に研究されたタンパク質は青色で強調表示されている。
【００９０】
【図４９】図４９Ａ〜４９Ｆは、Cas12b RNA-Seqおよびin vitroの再構成を示す。図４９Ａ〜４９Ｄは、AkCas12b、BhCas12b、EbCas12b、およびLsCas12bの小領域RNA-Seq読取りの配列を示す。切断反応に使用されるtracrRNAの位置は、黄色で強調表示されている。図４９Ｅは、この検討で使用された精製Cas12bタンパク質および商業的に生産されたAsCas12a（IDT）のクマシー染色されたSDS-PAGEゲルを示す。図４９Ｆは、tracrRNAおよびcrRNAをv1 sgRNA足場との比較によるAkCas12bおよびBhCas12bを用いるin vitro切断反応を示す。
【００９１】
【図５０】図５０Ａ〜５０Ｅは、哺乳動物細胞でのCas12b sgRNAの最適化を示す。図５０Ａは、哺乳動物細胞での発現構築物および挿入欠失活性のアッセイの概略図を示す。図５０Ｂは、AkCas12b sgRNA変異体（配列番号84〜89）を示す。図５０Ｃは、BhCas12b sgRNA変異体（配列番号90〜95）を示す。図５０Ｄは、AkCas12b sgRNA構造および試験された変異体の位置（配列番号96）の概略図を示す。図５０Ｅは、BhCas12bおよび様々なスペーサー長を有する293T細胞での挿入欠失活性を示す。誤差棒は2個の複製物からの標準偏差を表す。
【００９２】
【図５１】図５１Ａ〜５１Ｊは、BhCas12bの論理的な遺伝子操作を示す。図５１Ａは、293T細胞中のBhCas12bと非常に類似したBthCas12bとの間の挿入欠失活性の比較を示す。誤差棒は2個の複製物からの標準偏差を表す。図５１Ｂ〜図５１Ｅは、DNMT1標的4およびVEGFA標的2でのBhCas12b変異体の組合せの挿入欠失活性を示す。誤差棒は最少の2個の複製物からの標準偏差を表す。図５１Ｆは、Pymol（Schrodinger社製）を用いてBthCas12bの構造中にモデル化されたBhCas12b v4変異を示す。図５１Ｇは、精製したBhCas12b WTおよびv4タンパク質のクマシー染色されたSDS-PAGEゲルを示す。図５１Ｈは、BhCas12bWTおよびv4変異体によるin vitro切断の経時的変化を示す。ゲルは3回の実験からの代表画像である。図５１Ｉおよび図５１Ｊは、図Ｈに示される反応からのdsDNA切断産物（図５１Ｉ）および上部ニック産物（図５１Ｊ）の定量結果を示す。誤差棒は3個の複製物からの標準偏差を表す。
【００９３】
【図５２】図５２Ａ〜５２Ｊは、BvCas12bの特性評価を示す。図５２Ａは、図４８Ｃおよび４８Ｄに説明されるPAM検出を示す。図５２Ｂは、BvCas12bの小領域RNA-Seqの読取りの配列を示す。切断反応で使用されるtracrRNAの位置は、黄色で強調表示されている。図５２Ｃ〜５２Ｄは、精製タンパク質および合成RNAによるBvCas12のin vitro再構成反応が、指示温度で90分間かつ250 nMのBvCas12bタンパク質で実施されたことを示している。図５２Ｅは、精製BvCas12bのクマシー染色されたSDS-PAGEのゲルを示す。図５２Ｆは、BvCas12b sgRNA変異体（配列番号97〜102）を示す。図５２Ｇは、試験された変異体（配列番号103）のBvCas12b sgRNA構造および位置の概略図を示す。図５２Ｈは、sgRNA変異体による293T細胞でのBvCas12bの挿入欠失活性を示す。誤差棒は4個の複製物からの標準偏差を表す。図５２Ｉは、57個の標的での293T細胞中のBvCas12bの挿入欠失活性を示す。各点は、4個の複製物から平均された単一の標的部位を表す。図５２Ｊは、一致した標的部位でのBhCas12b v4とBvCas12bの活性の相関を示す。原生データは、原生データファイルとして示す。
【００９４】
【図５３】図５３Ａ〜５３Ｅは、BvCas12bの変異誘発を示す。図５３Ａは、強調表示位置に識別された標的鎖のBhCas12b位置およびBvCas12b中のそれらに対応するアミノ酸の配列を示す。図５３Ｂは、図４５Ａに説明されるような種々に標識されたDNA鎖とのBvCas12bのin vitro反応を示す。図５３Ｃは、残基Q635、D748、R849、H896、T909、I914およびI919を標的とする79個のBvCas12b変異の挿入欠失活性を示す。挿入欠失は、野生型（灰色記号）に対し正規化されたDNMT1標的6およびVEGFA標的5で測定された。誤差棒は2個の複製物からの標準偏差を表す。図５３Ｄ〜５３Ｅは、DNMT1標的6およびVEGFA標的5でのBhCas12b変異の挿入欠失活性を示す。誤差棒は2個の複製物からの標準偏差を表す。
【００９５】
【図５４】図５４Ａ〜５４Ｆは、BhCas12b v4およびBvCas12bがヒト細胞株中でのゲノム編集を媒介したことを示している。図５４Ａは、293T細胞中の56個の標的でのBhCas12b v4および57個の標的でのBvCas12bの挿入欠失活性を示す。各点は4個の複製物から平均された単一の標的部位を表す。図５４Ｂは、一致する標的部位でのBhCas12b v4とBvCas12bの活性の相関を示す。図５４Ｃは、第２部類のCRISPR-CasヌクレアーゼのPAM優先度の分析、またマスクされていないヒトコード配列内の各塩基から最近接のCas9またはCas12切断部位までの距離に対する質量での確率関数を示す。図５４Ｄは、SpCas9およびCas12bヌクレアーゼ、ならびにTCからCAへの変異およびPAM破壊変異を含む120ヌクレオチド長のssODN供与体によって標的可能なVEGFA標的部位の概略図を示す（配列番号104〜108）。図５４Ｅは、遺伝子座での各ヌクレアーゼの挿入欠失活性を示す。誤差棒は3個の複製物からの標準偏差を表す。図５４Ｆは、標的鎖（T）または非標的鎖（NT）供与体を使用した相同性指向修復（HDR）の頻度を示す。灰色の棒は、TCからCAへの変異の頻度を示し、青色の棒は、変異のない図ＤでのHDR配列を含む完全な編集を示している。誤差棒は3個の複製物からの標準偏差を表す。
【００９６】
【図５５】図５５Ａ〜５５Ｃは、BhCas12b v4とBvCas12bの不一致の許容性および特異性を示す。図５６Ａは、各ヌクレアーゼに対し検出された切断部位の数および相対比率を示す不一致の標的のGuide-Seq分析を示す。非特異的標的は、薄灰色のくさび形として表示され、特異的標的部位は青色で強調表示され、特異的標的部の読取り値が小数でその下に示されている。完全な分析については図５７を参照のこと。図５５Ｂ〜５５Ｃは、不一致がガイドsgRNAと標的DNAの間に存在する場合の293T細胞中でのCas12bの挿入欠失活性を示す。不一致は、標的鎖に一致するように（すなわちCからG、AからT）sgRNA内に挿入された。BhCas12b v4はDNMT1標的6およびVEGFA標的2で試験され、BvCas12bはDNMT1標的6およびVEGFA標的5で試験された。誤差棒は4個の複製物からの標準偏差を表す。
【００９７】
【図５６】図５６は、一致したCRISPR-Casヌクレアーゼ標的の特異性分析を示す。図４７Ｂで検出された非特異的標的の完全なGuide-Seq分析結果を示す。検出された切断部位の一覧（一標的あたり最大20個）を、各ヌクレアーゼについて、小さな箱形に記載された特異的標的部位とともに示している。以下の標的でのガイド配列との不一致が強調表示されていて、それら標的は、標的1：EMX1（配列番号109〜130）、標的2：EMX1（配列番号131〜152）、標的3：DNMT1（配列番号153〜174）、標的4：CXCR4（配列番号175〜176）、標的5：CXCR4（配列番号178〜181）、標的6：CXCR4（配列番号182〜186）、標的7：VEGFA（配列番号187〜209）、標的8：GRIN2B（配列番号210〜215）、標的9：CXCR4（配列番号216〜221）、および標的10：HPRT1（配列番号222〜225）である。
【００９８】
【図５７】図５７は、不一致のCRISPR-Casヌクレアーゼ標的の特異性分析を示す。図５６の検出された非特異的標的の完全なGuide-Seq分析結果を示す。検出された切断部位（一標的あたり最大20個）の一覧を、各ヌクレアーゼについて、小さな箱形に記載された特異的標的部位とともに示している。以下の標的でのガイド配列との不一致が強調表示されていて、それら標的は、SpCas9不一致1：DNMT1（配列番号226）、SpCas9不一致2：EMX1（配列番号227〜246）、SpCas9不一致3：VEGFA（配列番号247〜248）、SpCas9不一致4：VEGFA（配列番号249〜268）、SpCas9不一致5：VEGFA（配列番号269〜288）; SpCas9不一致6：GRIN2B（配列番号289〜290）、AsCas12a不一致1：DNMT1（配列番号291）、AsCas12a不一致2：VEGFA（配列番号292〜293）、AsCas12a不一致2：EMX1（配列番号294）; AsCas12a不一致2：EMX1（配列番号295）、SpCas9不一致7：VEGFA（配列番号296〜311）、SpCas9不一致8：EMX1（配列番号312〜320）、SpCas9不一致9：GRIN2B（配列番号321〜322）、SpCas9不一致10：TUBB（配列番号323〜334）、BhCas12b v4不一致1：DNMT1-BvCas12b不一致8：DNMT1（配列番号335〜353）、およびBhCas12b v4不一致9：CXCR4-BvCas12b不一致14：VEGFA（配列番号354〜367）である。
【００９９】
【図５８】図５８は、（PDB構造5U30に基づく）Cas12中の構造的に予測されたssDNA経路を示す。
【０１００】
【図５９】図５９は、RESCUE変異体の用量応答がTモチーフで試験されたことを示す。
【０１０１】
【図６０】図６０は、RESCUE変異体の用量応答がCおよびGモチーフで試験されたことを示す。
【０１０２】
【図６１−６２】図６１および６２は、RESCUE v3、v6、v7、およびv8による内因性標的化を示す。
【０１０３】
【図６３】図６３は、RESCUE v9に対する変異の選別が実行されたことを示す。
【０１０４】
【図６４】図６４は、RESCUE v9に対する潜在的な変異が特定されたことを示す。
【０１０５】
【図６５】図６５は、塩基フリップおよびモチーフ試験が実行されたことを示す。
【０１０６】
【図６６】図６６は、RESCUE v9の効果が様々なモチーフフリップで試験されたことを示す。
【０１０７】
【図６７】図６７は、50塩基対ガイドを備えるRESCUE v1〜v8を用いて、B6とB12間の比較を示す。
【０１０８】
【図６８】図６８は、30塩基対ガイドを備えるRESCUE v1〜v8を用いて、B6とB12間の比較を示す。
【０１０９】
【図６９】図６９は、選別されたRESCUE変異の総括を示す。
【０１１０】
【図７０】図７０は、より良好なβカテニン変異体が選択された実験の結果を示すグラフである。
【０１１１】
【図７１】図７１は、RESCUE round 12の結果を示すグラフである。
【０１１２】
【図７２】図７２は、βカテニン遊走アッセイを示す概略図である。
【０１１３】
【図７３】図７３は、βカテニンによって誘発された細胞遊走アッセイの結果を示すグラフである。
【０１１４】
【図７４】図７４は、特異性変異がA〜I非特異的標的を排除することを示すグラフである。
【０１１５】
【図７５】図７５は、Stat1/3リン酸化部位を標的化することがシグナル伝達を低減させることを示すグラフである。
【０１１６】
【図７６】図７６は、Stat1/3リン酸化部位を標的化することがシグナル伝達を減少させることを示すグラフであり、図６４ＡはStat1による処理無しの結果を示し、図６４ＢはStat1 IFNγ処理の結果を示す。
【０１１７】
【図７７】図７７は、Stat1/3リン酸化部位を標的化することがシグナル伝達を減少させることを示すグラフであり、図６５ＡはStat3 IL6による活性化の結果を示し、図６５ＢはStat3による処理無しの結果を示す。
【０１１８】
【図７８】図７８は、RESCUE round 12の結果を示すグラフである。
【０１１９】
【図７９】図７９は、RESCUE round 13の結果を示すグラフである。
【０１２０】
【図８０】図８０は、βカテニンによって誘発された細胞遊走アッセイの結果を示すグラフである。
【０１２１】
【図８１】図８１は、CからTへの塩基編集能力を備えたBhv4切り詰め化を示す。触媒的に不活性なBhv4のC末端142アミノ酸（dBhv4  143：不活性化変異D574A、新規サイズ966アミノ酸）を除去し、リンカーとラットのApobecドメインをC末端に融合した後に、CからTへの塩基編集を非標的鎖のガイド塩基対位置14で最大10.95%の頻度により観察する。6.97%の編集効率をガイド位置15で検出する。この活性はガイド依存である。既存の構築物への融合または遊離発現のいずれかによるウラシル−DNAグリコシラーゼ阻害剤（UGI）ドメインの添加は、このCからTへの変換を増強させると予想される。列記されたガイド配列（大文字）は、HEK 293T細胞（配列番号368）中のGRIN2B内の領域を標的とする。
【０１２２】
【図８２】図８２Ａ〜８２Ｃにおいて、図８２Ａは、Guide-Seq分析用に選択された9個の標的部位での293T細胞中のCas9、Cas12b、およびCas12a（3個のTTTV PAM部位でのみ試験されたCas12aは除く）の挿入欠失活性の比較を示す。誤差棒は4個の複製物からの標準偏差を表す。図８２Ｂは、各ヌクレアーゼに対して検出された切断部位の数と相対比率を表すGuide-Seq分析を示す。非特異的標的は薄灰色のくさび形として表示され、特異的標的部位は、紫色（SpCas9の場合）、暗青色（BhCas12b v4の場合）、または薄青色（AsCas12aの場合）で強調表示されて、特異的標的部の読取り値が小数でその下に示されている。非特異的標的は、試験されていないSpCas9 n.t.でのみ検出された。図８２Ｃは、ガイドsgRNAと標的DNAの間に不一致が存在する場合の293T細胞中のBhCas12b挿入欠失活性を示す。不一致は、標的鎖に一致するようにsgRNA中に挿入された（すなわちCからG、AからT）。誤差棒は4個の複製物からの標準偏差を表す。
【０１２３】
【図８３】図８３は、Cas12の切り詰め化、およびAPOBECとその塩基編集活性を用いたN末端およびC末端の融合の概略図を示す。
【０１２４】
【図８４】図８４は、特定の実施形態例（配列番号369〜375）に従うCas12塩基編集データを示す。
【０１２５】
【図８５】図８５は、特定の実施形態例に従うCas12塩基編集データを提供する。
【０１２６】
【図８６】図８６は、特定の実施形態例（配列番号376〜377）に従うガイド表面でのCas12塩基編集を示す。
【０１２７】
【図８７】図８７は、全長BhCas12b（配列番号378）を使用する例示的な塩基編集手法を示す。
【０１２８】
【図８８】図８８Ａ〜８８Ｃにおいて、図８８Ａは、BhCas12b v4と異なる相同分子種AaCas12bの挿入欠失活性の比較を示す。図８８Ｂおよび８８Ｃは、BhCas12b v4またはBhCas12bを発現するAAV1/2によるラットの神経細胞の形質導入を示している。
【０１２９】
【図８９】図８９Ａ〜８９Ｂにおいて、図８９Ａはpx602-bh-optimize-AAVのマップを示す。図８９Ｂはpx602-bv-optimize-AAVのマップを示す。
【０１３０】
本明細書の図は、例示のみを目的としており、必ずしも縮尺通りに描かれてはいない。
［実施形態例の詳細説明］
一般的定義
【０１３１】
他に定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本開示が関連する当業者が一般に理解するのと同一の意味を有する。分子生物学での一般的な用語および技術の定義は、分子クローニング：実験室マニュアル第２版（Molecular Cloning：A Laboratory Manual、2nd edition）（1989）（Sambrook、Fritsch、and Maniatis）、分子クローニング：実験室マニュアル第４版（Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4thedition）(2012) (Green and Sambrook)、分子生物学での最新手法（Current Protocols in Molecular Biology）(1987) (F.M. Ausubel et al. eds.)、酵素学での一連の手法（the series Methods in Enzymology）(Academic Press, Inc.)、PCR2：実用手法（PCR 2: A Practical Approach）(1995) (M.J. MacPherson, B.D. Hames, and G.R. Taylor eds.)、抗体：実験室マニュアル（Antibodies, A Laboratory Manual）(1988) (Harlow and Lane, eds.)、抗体：実験室マニュアル第２版（Antibodies A Laboratory Manual, 2ndedition）( 2013) (E.A. Greenfield ed.)、動物細胞の培養（Animal Cell Culture）(1987) (R.I. Freshney, ed.)、Benjamin Lewin, 遺伝子IX（Genes IX）Jones and Bartletから出版, 2008 (ISBN 0763752223)、Kendrew et al. (eds.), 分子生物学の百科事典（The Encyclopedia of Molecular Biology）Blackwell Science Ltd.から出版, 1994 (ISBN 0632021829)、Robert A. Meyers (ed.), 分子生物学および生物工学：総括的な参考書（Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference）, VCH Publishers, Inc.から出版, 1995 (ISBN 9780471185710)、Singleton et al., 微生物学および分子生物学の辞書第２版（Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed.）, J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), March, 先進的有機化学反応、機構、および構造第４版（Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed.）, John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)、およびMarten H. Hofker and Jan van Deursen, 遺伝子導入マウスの方法および手法第２版（Transgenic Mouse Methods and Protocols, 2ndedition）(2011)に示される内容から引用されてもよい。
【０１３２】
本明細書で使用される単数形「a」、「an」、および「the」は、文脈で別段に明示しない限り、単数および複数の両方の指示対象を含む。
【０１３３】
用語「任意の」または「任意に」は、その後に説明される事象、状況、または置換が発生する場合もあり発生しない場合もあり、この説明には、事象または状況が発生する事例および発生しない事例が含まれることを意味する。
【０１３４】
終端点による数値範囲の詳述は、それぞれの範囲内に含まれる全ての数値および小数値、ならびに詳述された終端点を含む。
【０１３５】
パラメータ、量、持続時間などの測定値を指す際の本明細書で使用される用語「約」または「おおよそ」により、±10%以下、±5%以下、±1%以下、および±0.1%以下の変動などの特定値の変動および特定値からの変動を包含し、かつ特定値からのその変動が本開示の発明を実施するのに適切である範囲を包含することを意味する。修飾語「約」または「おおよそ」が指す数値それ自体も、明確にかつ好ましく開示されていることは当然である。
【０１３６】
用語「例示的な」は、本明細書では、実施例、事例、または例示として機能することを意味するように使用される。本明細書で「例示的な」として説明される任意の側面または構想を、必ずしもその他の側面、実施形態、または構想よりも好ましい、あるいは有効であるとは解釈すべきではない。
【０１３７】
本明細書で使用される「生体試料」は、全細胞および／または生細胞および／または細胞断片を含んでいてもよい。生体試料は、「体液」を含んでもよい（またはそれに由来してもよい）。本発明は、体液が、膜液、眼房水、硝子体液、胆汁、血清、乳汁、脳脊髄液、耳垢（耳糞）、乳糜、粥状液、内リンパ液、外リンパ液、滲出液、糞便、雌射精液、胃酸、胃液、リンパ液、（鼻腔廃液および痰を含む）粘液、心膜液、腹水、胸膜液、膿、粘膜分泌物、唾液、皮脂（皮膚油）、精液、痰、滑液、汗、涙、尿、膣分泌物、嘔吐物、およびそれらの１種以上の混合物から選択される実施形態を包含する。生体試料には、細胞培養物、体液、体液からの細胞培養物が含まれる。体液は、例えば穿刺または他の収集または採取手順によって、哺乳動物から得ることができる。
【０１３８】
用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書では互換的に使用されて、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトを指す。哺乳動物として、限定はされないが、ネズミ、類人猿、ヒト、家畜、競技動物、およびペットが含まれる。in vivoで得られた、またはin vitroで培養された生体の組織、細胞、およびそれらの後代も含まれる。
【０１３９】
様々な実施形態は、以下に説明する通りである。特定の実施形態は、包括的な説明として、または本明細書で検討されるより広い側面に対する制限として、意図するものではない。特定の実施形態に関連して説明される１つの側面は、必ずしもその実施形態に限定されるものではなく、その他の任意の実施形態でも実施することができる。本明細書全体を通して「一実施形態」、「実施形態」、「実施形態例」は、実施形態に関連して説明される特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。従って、本明細書全体の様々な場所での「一実施形態では」、「実施形態では」、または「実施形態例では」という語句の出現は、必ずしも全てが同一の実施形態を指すとは限らないが、同一の実施形態を指す場合があってもよい。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態内に、本開示が当業者にとって明白となるように任意の適切な形態で組合せることができる。さらに本明細書に説明されるいくつかの実施形態に、その他の実施形態に含まれるその他の特徴をいくつか含むかまたは含まなくとも、異なる実施形態での特徴の組合せは、本発明の範囲内にあることを意味している。例えば、添付の特許請求の範囲では、請求される実施形態のいずれかを任意に組合せて使用することができる。
【０１４０】
本明細書で引用される全ての刊行物、公開された特許文書、および特許出願は、それぞれの個別の刊行物、公開された特許文書、または特許出願が参照により組み込まれるように具体的かつ個別に示されたのと同じ程度に、参照により本明細書に組み込まれている。
【概要】
【０１４１】
一態様では、本明細書に開示される実施形態は、遺伝子操作された、または単離されたCRISPR-Casエフェクタータンパク質および相同分子種を対象とする。特に、本発明は、Cas12bエフェクタータンパク質および相同分子種に関する。本明細書で使用される用語「Cas12b」は、C2c1と互換的に使用される。本発明はさらに、その相同分子種を含むCRISPR-Casシステム、ならびにその相同分子種またはシステムをコードするポリヌクレオチド配列、それを含むベクターまたはベクターシステム、およびそれを含む送達システムに関する。本発明はさらに、そのCas12bタンパク質、CRISPR-Casシステム、ポリ核酸配列、ベクター、ベクターシステム、送達システムを含む細胞または細胞株または生物に関する。本発明はさらに、そのタンパク質、CRISPR-Casシステム、ポリ核酸配列、ベクター、ベクターシステム、送達システム、細胞、細胞株などの医学的および非医学的な使用に関する。別の側面では、本明細書に開示される実施形態は、未改変のCRISPR-Casエフェクタータンパク質に対比して、結合部位へのCRISPR複合体の結合を増強し、かつ／あるいは野生型と比較して編集優先度を変更する少なくとも１つの改変を含む遺伝子操作されたCRISPR-Casエフェクタータンパク質を対象とする。特定の実施形態では、CRISPR-Casエフェクタータンパク質は、V型のエフェクタータンパク質、好ましくはV-B型である。特定の別の実施形態例では、V-B型のエフェクタータンパク質は、C2c1である。本明細書に開示される実施形態での使用に適するC2c1タンパク質の例を、以下でさらに詳細に述べる。別の側面では、開示の実施形態は、遺伝子操作されたガイドを含む遺伝子操作されたCRISPR-Casシステムに関する。本明細書で使用される用語「CRISPRエフェクター」または「CRISPRタンパク質」または「Cas（タンパク質またはエフェクター）」は、Cas12bタンパク質またはエフェクターと互換的に使用され、（点変異および／または切り詰め化などの）変異を受けたタンパク質、または野生型タンパク質であってもよい。
【０１４２】
実施例によっては、本開示は、ｉ）表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質、ii）ａ）１つ以上の標的配列に、特定の実施形態では１つ以上の標的DNA配列にハイブリダイズ可能な3’ガイド配列およびｂ）5’直接反復配列を含むcrRNA、およびiii）tracr RNAを含む非天然起源または遺伝子操作されたシステムを提供し、これにより、crRNAおよびtracrRNAと複合化したCas12bエフェクタータンパク質を含むCRISPR複合体が形成される。
【０１４３】
実施例によっては、本開示は、ｉ）表１または表２に記載のCas12bエフェクタータンパク質、およびii）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列を含むガイドを含む非天然起源または遺伝子操作されたシステムを提供する。場合によっては、このシステムはさらにtracrRNAを含む。
【０１４４】
別の側面では、本明細書に開示される実施形態は、C2c1を含むCRISPR-Casエフェクタータンパク質の送達のためのベクターに関する。特定の実施形態例では、ベクターは、単一のベクター内にCRISPR-Casエフェクタータンパク質の封入を可能にするように設計されている。また封入して、それにより標的化送達および組織特異性のためにより大量の導入遺伝子を発現する小型のプロモーターの設計に関心が高まっている。従って、別の側面では、本明細書に開示される特定の実施形態は、全身への送達のためにより大量の遺伝子を送達する送達ベクター、構築物、および方法に関する。
【０１４５】
別の側面では、本発明は、CRISPR-Casシステムを開発または設計するための方法に関する。一側面では、本発明は、限定はされないが、治療促進、生物産出、ならびに植物および農業用途を含む広範囲の用途に最適化されたCRISPR-Casシステムを開発または設計するための方法に関する。特定の治療法または治療技術では、本発明は、特に、CRISPR-Casシステム、例えばCRISPR-Casシステムに基づく治療法または治療技術を改善するための方法に関する。CRISPR-Casシステムに基づく治療法や治療技術など、成功したCRISPR-Casシステムの主要な特徴には、高い特異性、高い効力、高い安全性が含まれる。非特異的標的効果の低減により、とりわけ高い特異性と高い安全性を達成できる。改善された特異性および効力は、同様に、植物および生物産出での応用
を改善するために使用されてもよい。
【０１４６】
従って一側面では、本発明は、CRISPR-Casシステムに基づく治療法または治療技術などのCRISPR-Casシステムの特異性を高める方法に関する。さらなる側面では、本発明は、CRISPR-Casシステムに基づく治療法または治療技術などのCRISPR-Casシステムの効力を高める方法に関する。さらなる側面では、本発明は、CRISPR-Casシステムに基づく治療法または治療技術などのCRISPR-Casシステムの安全性を高める方法に関する。さらなる側面では、本発明は、CRISPR-Casシステムに基づく治療法または治療技術などのCRISPR-Casシステムの特異性、効力、および／または安全性、好ましくはそれら全てを高める方法に関する。
【０１４７】
特定の実施形態では、CRISPR-Casシステムは、本明細書の他の部分で定義されるようなCRISPRエフェクターを含む。
【０１４８】
本発明の方法は、特に、本明細書の他の部分でさらに説明されるように、CRISPR-Casシステムおよび／またはその機能に関連する選択されたパラメータまたは変数の最適化を含む。本明細書に説明される方法でのCRISPR-Casシステムの最適化は、治療標的などの標的、CRISPR-Casシステムに基づく治療標的調節、変更、または操作などのCRISPR-Casシステム調節の方式または型式、ならびにCRISPR-Casシステム成分の送達に依存していてもよい。１つ以上の標的は、遺伝子型および／または表現型の結果に応じて、選択してもよい。例えば、１つ以上の治療標的は、（遺伝的）疾患の病因または所望の治療結果に応じて、選択してもよい。（治療）標的は、単一の遺伝子、遺伝子座、または他のゲノム部位であってもよく、あるいは複数の遺伝子、遺伝子座、または他のゲノム部位であってもよい。当技術分野で知られているように、単一の遺伝子、遺伝子座、または他のゲノム部位は、複数のgRNAの使用などによって、複数回標的化されてもよい。
【０１４９】
CRISPR-Casシステム設計などのCRISPR-Casシステム動作は、遺伝子ノックアウトへの到達などの標的変異などの標的破壊を含んでもよい。CRISPR-Casシステム設計などのCRISPR-Casシステム動作は、標的補正への到達など、特定の標的部位の置換を含んでもよい。CISPR-Casシステム設計は、標的排除への到達など、特定の標的部位の削除を含んでもよい。CRISPR-Casシステム動作は、例えば（転写および／または後成）遺伝子またはゲノム領域の活性化あるいは遺伝子またはゲノム領域のサイレンシングに繋がる、標的部位の活性や近接性などの標的部位の機能性の調節を含んでもよい。当業者には、本明細書の他の段落に説明されるように、標的部位の機能性の調節が、（例えば、触媒的に不活性なCRISPRエフェクターの生成などの）CRISPRエフェクターの変異および／または（例えば、CRISPRエフェクターの転写活性化因子または抑制因子などの異種機能ドメインとの融合などの）官能化を含んでもよいことが分かる。従って、別の側面では、本発明は、改変されたCRISPRエフェクタータンパク質および機能ドメインを含む部位特異的塩基編集のための遺伝子操作された組成物に関する。本発明の一実施形態では、RNA塩基編集が存在する。本発明の一実施形態では、DNA塩基編集が存在する。特定の実施形態では、機能ドメインは、シチジン脱アミノ酵素およびアデノシン脱アミノ酵素を含む脱アミノ酵素またはその触媒ドメインを含む。本明細書に開示される実施形態での使用に適する機能ドメインの例は、以下でさらに詳述される。
【０１５０】
特定の実施形態例では、遺伝子操作されたCRISPR-Casエフェクタータンパク質は、ガイド配列を含む核酸と複合化してCRISPR複合体を形成し、CRISPR複合体では、核酸分子は１つ以上のポリヌクレオチド遺伝子座を標的とし、このタンパク質は、野生型と比較してCRISPR複合体の結合部位への結合を増強しかつ／あるいは編集の優先度を変更する、未改変タンパク質と対比して少なくとも１つの改変を含む。この編集の優先度は、挿入欠失形成に関連する場合がある。特定の実施形態例では、少なくとも１つの改変は、標的遺伝子座での１つ以上の特定の挿入欠失の形成を高めることができる。CRISPR-Casエフェクタータンパク質は、V型のCRISPR-Casエフェクタータンパク質であってもよい。特定の実施形態例では、CRISPR-Casタンパク質は、Cas12bとしても知られるC2c1、またはその相同分子種である。
【０１５１】
本発明は、関心のある標的遺伝子座に会合する配列、またはその位置にある配列をゲノム編集または改変する方法を提供し、この方法は、C2c1エフェクタータンパク質複合体を任意の所望の細胞型、原核細胞、または真核細胞に導入することを含み、それによりC2c1エフェクタータンパク質複合体は、DNA挿入物を真核細胞または原核細胞のゲノム中に組み込むように効果的に機能する。好ましい実施形態では、細胞は真核細胞であり、ゲノムは哺乳動物ゲノムである。好ましい実施形態では、DNA挿入物の組み込みは、非相同末端結合（NHEJ）に基づく遺伝子挿入機構によって促進される。好ましい実施形態では、DNA挿入物は、外因的に導入されたDNA鋳型または修復鋳型である。好ましい一実施形態では、外因的に導入されたDNA鋳型または修復鋳型は、複合体成分の発現のために、C2c1エフェクタータンパク質複合体、または一成分、またはポリヌクレオチドベクターとともに送達される。より好ましい実施形態では、真核細胞は非分裂細胞である（例えば、HDRを介したゲノム編集が特に困難である非分裂細胞）。
【０１５２】
本発明はまた、関心のある標的遺伝子座を改変する方法を提供し、この方法は、C2c1遺伝子座エフェクタータンパク質および１つ以上の核酸成分を含む非天然起源または遺伝子操作された組成物を前記遺伝子座に送達することを含み、このC2c1エフェクタータンパク質は、１つ以上の核酸成分と複合体を形成し、前記複合体が関心のある遺伝子座に結合すると、エフェクタータンパク質は、関心のある標的遺伝子座の改変を誘発する。一実施形態では、改変は鎖切断の導入である。鎖切断の後に、非相同末端結合が発生してもよい。別の実施形態では、修復鋳型が提供されて、切断の後に相同組換えが発生する。
【０１５３】
本発明によると、核酸を改変する酵素が提供される。その一実施形態では、DNAの塩基編集が存在する。その別の実施形態では、RNAの塩基編集が存在する。より具体的には、本発明は、細胞内の核酸塩基を改変することが可能な脱アミノ酵素および脱アミノ酵素変異体を提供する。一実施形態では、脱アミノ酵素は、DNA／RNA二重鎖の不一致を標的とし、標的の不一致DNA塩基を編集する。別の実施形態では、脱アミノ酵素は、RNA／RNA二重鎖の不一致を標的とし、標的RNAを編集する。
【０１５４】
この方法では、関心のある標的遺伝子座は、細胞内の核酸分子中に含まれていてもよい。細胞は、原核細胞または真核細胞であってもよい。細胞は哺乳動物細胞であってもよい。哺乳動物細胞は、ヒト以外の霊長類、ウシ、ブタ、げっ歯類、またはマウスの細胞であってもよい。細胞は、家禽、魚、またはエビなどの非哺乳動物の真核細胞であってもよい。細胞はまた、植物細胞であってもよい。植物細胞は、キャッサバ、トウモロコシ、ソルガム、小麦、またはイネなどの作物植物の細胞であってもよい。植物細胞はまた、藻類、樹木、または野菜の細胞であってもよい。本発明によって細胞に導入される改変は、細胞および細胞の後代が、抗体、デンプン、アルコール、またはその他の所望の細胞産物などの生物学的産物の産出を改善するために変更されるような改変であってもよい。本発明によって細胞に導入される改変は、細胞および細胞の後代が、産出される生物学的産物を変化させる変更を含むような改変であってもよい。
【０１５５】
任意の説明された方法では、関心のある標的遺伝子座は、関心のあるゲノムまたはエピゲノムの遺伝子座であってもよい。任意の説明された方法では、複合体は、多重使用のための複数のガイドとともに送達されてもよい。任意の説明された方法では、複数のタンパク質を使用してもよい。
CRISPR-Casシステム
【０１５６】
一般に、CRISPRシステムは、国際特許出願WO2014/093622（PCT/US2013/074667）号などの先行文献に使用されているシステムであってもよく、このシステムは、特にC2c1遺伝子などのCRISPR会合（「Cas」）遺伝子をコードする配列を含むCas遺伝子、tracr（トランス活性化CRISPR）配列（例えば、tracrRNAまたは活性な部分tracrRNA）、（内因性CRISPRシステムの文脈での「直接反復」およびtracrRNAで処理された部分直接反復を包含する）tracr-mate配列、（内因性CRISPRシステムの文脈では「スペーサー」とも呼ばれる）ガイド配列、またはその用語を本明細書に使用する（例えば、CRISPR RNAなどのC2c1を誘導するためのRNA、およびトランス活性化（tracr）RNAまたは単一ガイドRNA（sgRNA）（キメラRNA）などの）「RNA」、またはCRISPR遺伝子座からのその他の配列および転写物の発現に含まれ、あるいはそれらの活性を誘導する転写物および他の要素を集合的に指している。
【０１５７】
一般に、CRISPRシステムは、（内因性のCRISPRシステムの文脈ではプロトスペーサーとも呼ばれる）標的配列の部位でCRISPR複合体の形成を促進する要素によって特徴付けられている。CRISPR複合体の形成の文脈では、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイズは、CRISPR複合体の形成を促進する。Cas12bタンパク質を含む実施形態で形成されるCRISPR複合体は、本明細書の他の段落に説明されているcrRNAおよびtracrRNAとの複合体を含んでもよい。標的配列への相補性が切断活性にとって重要であるガイド配列の一断片は、本明細書ではシード配列と呼ばれる。標的配列は、DNAポリヌクレオチドまたはRNAポリヌクレオチドなどの任意のポリヌクレオチドを含んでもよい。実施形態によっては、標的配列は、細胞の核または細胞質に位置していて、細胞内に存在するミトコンドリア、細胞小器官、小胞、リポソーム、または粒子内の核酸、あるいはそれらからの核酸を含んでもよい。実施形態によっては、特に核の無い細胞への適用では、NLSは好ましくない。実施形態によっては、CRISPRシステムは、１つ以上の核外搬出シグナル（NES）を含む。実施形態によっては、CRISPRシステムは、１つ以上のNLSおよび１つ以上のNESを含む。実施形態によっては、直接反復は、以下の基準のいずれかまたは全てを満たす反復モチーフを検索してコンピュータ上で識別できる。それら基準とは、１）II型のCRISPR遺伝子座に隣接するゲノム配列の2Kbウィンドウ内に指定される基準、２）20〜50塩基対の全範囲での基準、および３）20〜50塩基対内の一部範囲での基準である。実施形態によっては、これらの基準のうちの2個、例えば、１）および２）、２）および３）、または１）および３）を使用してもよい。実施形態によっては、3個全ての基準を使用してもよい。
【０１５８】
一般に、CRISPRシステムは、標的配列の部位でのCRISPR複合体の形成を促進する要素によって特徴付けられている。CRISPR複合体の形成の文脈では、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を持つように設計されている配列を指し、標的DNA配列とガイド配列との間のハイブリダイズは、CRISPR複合体の形成を促進する。
【０１５９】
用語「ガイド分子」、「ガイドRNA」、および「ガイド」は、本明細書では互換的に使用されて核酸系の分子を指し、これらガイド等は、限定はされないが、CRISPR-Casタンパク質との複合体を形成可能であり、かつ標的核酸配列とハイブリダイズして複合体の標的核酸配列への配列特異的結合を導くために十分な標的核酸配列との相補性を有するガイド配列を含むRNA系の分子を含む。ガイド分子またはガイドRNAは、具体的には、本明細書に説明されるように、（例えば、２つのリボヌクレオチドを化学的に結合すること、あるいは１つ以上のリボヌクレオチドを１つ以上のデオキシリボヌクレオチドで置換することによる）１種以上の化学改変を有するRNA系の分子を包含する。
【０１６０】
特定の実施形態では、標的配列は、PAM（プロトスペーサー隣接モチーフ）またはPFS（プロトスペーサー隣接配列または部位）と会合すべきであり、すなわち、CRISPR複合体によって認識される短配列である。CRISPR-Casタンパク質の性質に応じて、（本明細書では非標的配列とも呼ばれる）DNA二重鎖中のその相補配列がPAMの上流または下流になるように標的配列を選択すべきである。CRISPR-Casタンパク質がC2c1タンパク質である本発明の実施形態では、標的配列の相補配列は、PAMの下流またはその3’に存在する。PAMの正確な配列およびその長さの要件として、使用するC2c1タンパク質によって異なるが、PAMは通常、プロトスペーサーに隣接する2〜5塩基対の配列（すなわち標的配列）である。種々のC2c1相同分子種での天然のPAM配列の例が本明細書で以下のように示され、当業者は、所定のC2c1タンパク質で使用するためのさらなるPAM配列を特定できる。
【０１６１】
このシステムは、（例えば、細胞または細胞集団中の）１つ以上の標的配列の改変のために使用されてもよい。この改変は、少なくとも１つの遺伝子産物の発現に変化をもたらす可能性がある。例によっては、少なくとも１つの遺伝子産物の発現は増強されてもよい。例によっては、少なくとも１つの遺伝子産物の発現は減弱されてもよい。
【０１６２】
例によっては、この改変は、細胞または細胞集団に実施されてもよく、改変は、内因性または非内因性の生体産物または化合物を産生かつ／あるいは分泌する細胞または細胞集団をもたらすことができる。化合物または生体産物は、低分子量化合物を含んでもよいが、より高分子量の化合物であってもよく、またはアンチセンス核酸、siRNAまたはshRNAなどのRNAi、CRISPR-Casシステム、ペプチド、ペプチド模倣体、受容体、リガンド、および抗体、アプタマー、ポリペプチド、核酸類似体またはそれらの変異体などの改変および非改変核酸を含む、所定の環境で有効な任意の有機分子または無機分子であってもよく、例えば、限定はされないが、タンパク質、オリゴヌクレオチド、リボザイム、DNAザイム、糖タンパク質、siRNA、リポタンパク質、アプタマー、およびそれらの改変物および組合せ物を含む核酸、アミノ酸、または炭水化物のオリゴマーが挙げられる。薬剤は、化学物質、小分子、核酸配列、核酸類似体、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、またはそれらの断片を含む群から選択されてもよい。核酸配列は、RNAまたはDNAであってもよく、一本鎖または二本鎖であってもよく、関心のあるタンパク質をコードする核酸、オリゴヌクレオチド、例えばペプチド−核酸（PNA）、疑似相補的PNA（pc-PNA）、ロックド核酸（LNA）、改変RNA（mod-RNA）、単一ガイドRNAなどの核酸類似体を含む群から選択されてもよい。この核酸配列として、限定はされないが、例えば転写抑制因子、アンチセンス分子、リボザイム、小分子阻害性核酸配列などとして作用するタンパク質をコードする核酸配列が挙げられ、また限定はされないが、例えばCRISPR酵素を特定のDNA標的配列などに標的化するRNAi、shRNAi、siRNA、マイクロRNAi（mRNAi）、アンチセンスオリゴヌクレオチド、CRISPRガイドRNAが挙げられる。タンパク質および／またはペプチドまたはその断片は、任意の関心のあるタンパク質であってもよく、例えば、限定はされないが、変異タンパク質、治療用タンパク質、および切り詰め型タンパク質であってもよく、このタンパク質は通常、細胞内に存在しないか、細胞内に低濃度で発現される。タンパク質はまた、変異タンパク質、遺伝子操作されたタンパク質、ペプチド、合成ペプチド、組換えタンパク質、キメラタンパク質、抗体、ミニボディ、ヒト化タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、改変タンパク質、およびそれらの断片を含む群から選択されてもよい。あるいは、薬剤は、細胞内への核酸配列の導入およびその転写の結果として細胞内に存在していてもよく、それにより、細胞内の遺伝子の核酸および／またはタンパク質活性調節因子が産生される。実施形態によっては、薬剤は、限定はされないが、合成および天然起源の非タンパク質物質を含む任意の化学物質または部分である。特定の実施形態では、薬剤は、化学部分を有する小分子である。薬剤は、所望の活性および／または特性を有する既知のものであるか、または多様な化合物のライブラリーから選択してもよい。
PAMの決定
【０１６３】
出願人らは、PAMおよび耐性遺伝子の両方を含むプラスミドを異種の大腸菌中に導入し、次に対応する抗生物質表面に播種する。プラスミドにDNA切断が有った場合は、出願人らは生コロニーを観察できない。より詳細には、DNA標的について測定は以下の通りに実施する。この測定では、2個の大腸菌株を使用する。一方は、細菌株からの内因性エフェクタータンパク質遺伝子座をコードするプラスミドを保持する。他方の株は、空のプラスミドを保持する（例えばpACYC184、対照株）。考えられる全ての7または8塩基対のPAM配列は、抗生物質耐性プラスミド（アンピシリン耐性遺伝子を有するpUC19）に提供される。PAMは、プロトスペーサー1配列（内因性エフェクタータンパク質遺伝子座中の第１のスペーサーに対するDNA標的）に隣接して配置される。２つのPAMライブラリーがクローンされる。一方はプロトスペーサーの8個の無作為なbp5’を保有する（例えば、合計65536個の種々のPAM配列、すなわち複雑性あり）。他方のライブラリーには、プロトスペーサーの7個の無作為なbp3’を保有する（例えば、全体の複雑性は16384個の種々のPAMである）。両方のライブラリーは、考えられるPAM当たり平均500個のプラスミドを持つようにクローンされた。試験株と対照株は、5’のPAMおよび3’のPAMライブラリーで別々の形質転換物として形質転換され、形質転換された細胞はアンピシリン皿に個別に播種された。プラスミドによる認識およびそれに続く切断／干渉により、アンピシリンに対して脆弱な細胞となり、増殖が妨げられる。形質転換の約12時間後に、試験株および対照株により形成された全てのコロニーが採取され、プラスミドDNAが単離された。プラスミドDNAは、PCR増幅およびその後のディープ配列決定のための鋳型として使用された。形質転換されないライブラリー中の全てのPAMの表現型は、形質転換された細胞中に予測されるPAMの表現型を示していた。対照株に見られた全てのPAMの表現型は、実存する表現型を示していた。試験株中の全てのPAMの表現型は、どのPAMが酵素によって認識されないかを示しており、対照株との比較により、欠失したPAMの配列を抽出することができる。
【０１６４】
現在までに識別されたC2c1相同分子種として、以下の２つのPAMが識別されている。アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris）ATCC 49025 C2c1p（AacC2c1）は、5’のTTN PAMが先行する標的部位を切断でき、この式中のNはA、C、G、またはTであり、より好ましくは、Nは、A、G、またはTである。バチルス・テルモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans）株B4166C2c1p（BthC2c1）は、ATTNが先行する部位を切断でき、式中のNはA、C、G、またはTである。
コドン最適化された核酸配列
【０１６５】
エフェクタータンパク質が核酸として投与される場合に、本出願は、コドン最適化CRISPR-Cas V型タンパク質、より詳しくはC2c1をコードする核酸配列（場合によりタンパク質配列）の使用を想定している。コドン最適化配列の例として、ヒトなどの真核細胞動物での発現のために最適化された（すなわちヒトでの発現のために最適化されている）配列、または本明細書で説明されるような別の真核細胞動物または哺乳動物のために最適化された配列が挙げられる。コドン最適化配列の例として、例えば、国際特許出願WO 2014/093622（PCT/US2013/074667）号のSaCas9ヒトコドン最適化配列を参照のこと（当技術分野の情報および本開示により、特にエフェクタータンパク質（例えばC2c1）に関するコドン最適化コード核酸分子は、当業者の理解の範囲内にある）。この配列は好ましいものの、その他の例も可能であり、ヒト以外の宿主種のコドン最適化、または特定の器官のコドン最適化が知られていることも分かっている。実施形態によっては、DNA／RNA標的Casタンパク質をコードする酵素コード配列は、真核細胞などの特定の細胞中での発現のためにコドン最適化されている。真核細胞は、本明細書での説明のように、限定はされないが、ヒト、ヒト以外の真核細胞、あるいは、例えばマウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、またはヒト以外の哺乳類もしくは霊長類を含む動物もしくは哺乳動物の細胞、あるいはそれらに由来する細胞を含んでもよい。実施形態によっては、ヒトの生殖系の遺伝的同一性を改変するプロセス、および／またはヒトまたは動物ならびにそのプロセスから生じる動物に、実質的な医学的な利益が得られずに、それらに苦痛をもたらす可能性のある動物の遺伝的同一性を改変するためのプロセスは、排除される場合がある。一般にコドン最適化は、未変性のアミノ酸配列を維持しながら、その宿主細胞の遺伝子中により頻繁にまたは最も頻繁に使用されるコドンにより、少なくとも1個のコドン（例えば、約1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個、またはそれ以上のコドン）を置換して、関心のある宿主細胞中の発現を増強するために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種では、特定のアミノ酸の特定のコドンに対して特定の偏向を示す。コドンの偏向（生物間のコドン使用での差異）は、メッセンジャーRNA（mRNA）の翻訳効率と相関することが多く、このことは、とりわけ翻訳されるコドンの特性および特定のトンスファーRNA（tRNA）分子の有効性に依存すると考えられる。細胞内で選択されるtRNAが優勢であると、一般に、ペプチド合成で最も頻繁に使用されるコドンが反映されることになる。従って遺伝子を、コドン最適化に基づいて、所定の生物中での最適な遺伝子発現のために設計することができる。コドン使用表は、例えば、www.kazusa.orjp/codon/で入手可能な「コドン使用データベース」から容易に取得でき、これらの表を、種々の方法で適合させることができる。Nakamura, Y., et al.の「国際的なDNA配列データベースから集計されたコドン使用頻度：2000年の状況（Codon usage tabulated from the international DNA sequence databases: status for the year 2000）」Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)を参照。Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA)などの特定の宿主細胞での発現のための特定の配列を最適化するコドン用のコンピュータアルゴリズムもまた利用可能である���実施形態によっては、DNA／RNA標的化Casタンパク質をコードする配列中の1個以上のコドン（例えば、1、2、3、4、5、10、15、20、25、50個、またはそれ以上、または全てのコドン）は、特定のアミノ酸に最も頻繁に使用されるコドンに対応する。酵母でのコドンの使用については、www.yeastgenome.org/community/codon_usage.shtmlで入手可能なオンラインの酵母ゲノムデータ表、または「酵母でのコドン選択（Codon selection in yeast）」, Bennetzen and Hall, J BiolChem. 1982 Mar 25;257(6):3026-31を参照。藻類を含む植物でのコドン使用については、「高等植物、緑藻、およびシアノバクテリアでのコドン使用（Codon usage in higher plants, green algae, and cyanobacteria）」, Campbell and Gowri, Plant Physiol. 1990 Jan; 92(1): 1-11.、ならびに「植物遺伝子でのコドン使用（Codon usage in plant genes）」, Murray et al, Nucleic Acids Res. 1989 Jan 25;17(2):477-98、または「種々の植物および藻類系統での葉緑体およびチアネル遺伝子のコドン偏向に関する選択（Selection on the codon bias of chloroplast and cyanelle genes in different plant and algal lineages）」, Morton BR, J Mol Evol. 1998 Apr;46(4):449-59を参照。
ガイド分子
【０１６６】
V型またはVI型CRISPR-Cas遺伝子座エフェクタータンパク質の「crRNA」または「ガイドRNA」または「単一ガイドRNA」または「sgRNA」または「１つ以上の核酸成分」という本明細書で使用される用語は、標的核酸配列とハイブリダイズして、かつ標的核酸配列に核酸標的化複合体の配列特異的結合を導くのに十分な標的核酸配列との相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含み、ここで適切な整列アルゴリズムを使用して最適に整列される際の相補性の程度は、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、またはそれ以上である。最適な整列は、配列を整列するための任意の適切なアルゴリズムを使用して決定することができ、そのアルゴリズムの例として、限定はされないが、the Smith-Waterman algorithm、the Needleman-Wunsch algorithm、algorithms based on the Burrows-Wheeler Transform（例えばthe Burrows Wheeler Aligner）、ClustalW、Clustal X、BLAT、Novoalign（Novocraft Technologies; www.novocraft.comで入手可能）、ELAND（Illumina, San Diego, CA）、SOAP（soap.genomics.org.cnで入手可能）、およびMaq（maq.sourceforge.netで入手可能）が挙げられる。（核酸標的化ガイドRNA内の）ガイド配列が標的核酸配列に核酸標的化複合体の配列特異的結合を誘導する能力は、任意の適切な測定法によって評価されてもよい。例えば、試験されるガイド配列を含み、かつ核酸標的化複合体を形成するのに十分な核酸標的化CRISPRシステムの成分は、核酸標的化複合体の成分をコードするベクターを用いる遺伝子導入などによって、またそれに続いて本明細書に説明のSurveyor assayなどの標的核酸配列内の優先標的化（例えば切断）の評価によって、対応する標的核酸配列を有する宿主細胞に提供されてもよい。同様に、標的核酸配列の切断は、標的核酸配列、および試験されるガイド配列ならびに試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含む核酸標的化複合体の成分を提供し、かつ試験ガイド配列反応と対照ガイド配列反応との間の標的配列での結合または切断速度を比較することにより、試験管内で評価してもよい。その他の測定法も可能性が有り、それらを当業者は実施できる。ガイド配列すなわち核酸標的化ガイドは、任意の標的核酸配列を標的化するように選択されてもよい。標的配列はDNAであってもよい。標的配列は、任意のRNA配列であってもよい。実施形態によっては、標的配列は、メッセンジャーRNA（mRNA）、プレmRNA、リボソームRNA（rRNA）、トランスファーRNA（tRNA）、マイクロRNA（miRNA）、低分子干渉RNA（siRNA）、低分子核RNA（snRNA）、低分子核RNA（snoRNA）、二本鎖RNA（dsRNA）、非翻訳RNA（ncRNA）、長鎖非翻訳RNA（lncRNA）、および低分子細胞質RNA（scRNA）からなる群から選択されるRNA分子内の配列であってもよい。好ましい実施形態によっては、標的配列は、mRNA、プレmRNA、およびrRNAからなる群から選択されるRNA分子内の配列であってもよい。好ましい実施形態によっては、標的配列は、ncRNAおよびlncRNAからなる群から選択されるRNA分子内の配列であってもよい。好ましい実施形態によっては、標的配列は、mRNA分子またはプレmRNA分子内の配列であってもよい。脱アミノ酵素結合体の文脈では、標的核酸配列または標的配列は、本明細書では「標的アデノシン」とも呼ばれる、脱アミノ化される標的アデノシンを含む配列である。実施形態によっては、本明細書の上述の相補性には、本明細書に説明のdA−C不一致などの意図された不一致は除外する。ガイド配列は、原核細胞内の標的DNA配列にハイブリダイズしてもよい。ガイド配列は、真核細胞内の標的DNA配列にハイブリダイズしてもよい。
【０１６７】
実施形態によっては、核酸標的化ガイドは、核酸標的化ガイド内の二次構造の程度を減弱するように選択される。実施形態によっては、核酸標的化ガイド中の約75%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%、またはそれ以下のヌクレオチドが、最適に折り畳まれる際に、自己補完的な塩基対形成に関与する。最適な折り畳みは、任意の適切なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定されてもよい。一部のプログラムは、Gibbsの最小自由エネルギーの計算に基づいている。このアルゴリズムの一例は、mFoldであり、それはZuker and Stiegler（Nucleic AcidsRes. 9 (1981), 133-148）によって説明されている。別の折り畳みアルゴリズムの例は、重心構造予測アルゴリズムを使用して、ウィーン大学の理論化学研究所で開発されたonline webserver RNAfoldである（例えば、A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24、およびPA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62を参照）。
【０１６８】
特定の実施形態では、ガイドRNAまたはcrRNAは、直接反復（DR）配列およびガイド配列またはスペーサー配列を含んでもよく、本質的にそれらからなってもよく、またはそれらからなってもよい。特定の実施形態では、ガイドRNAまたはcrRNAは、ガイド配列またはスペーサー配列に融合または結合された直接反復配列を含んでもよく、本質的にそれからなってもよく、またはそれからなってもよい。特定の実施形態では、直接反復配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の上流（すなわち5’）に位置してもよい。他の実施形態では、直接反復配列は、ガイド配列またはスペーサー配列の下流（すなわち3’）に位置してもよい。
【０１６９】
実施形態によっては、ガイド分子は、ガイド配列と標的配列との間に形成されるヘテロ二本鎖が、標的配列の脱アミノ化のためにガイド配列内に標的Aに対向する非対合Cを含むように、標的配列と少なくとも１つの不一致を有するように設計されたガイド配列を含む。実施形態によっては、このA−Cの不一致は別として、相補性の程度は、適切な整列アルゴリズムを使用して最適に整列した場合に、約50%、60%、75%、80%、85%、90%、95%、97.5%、99%、またはそれ以上である。
【０１７０】
特定の実施形態では、ガイド分子のガイド配列またはスペーサーの長さは、10〜50ヌクレオチド長、より具体的には、15〜35ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ガイドRNAのスペーサー長さは、少なくとも15ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、スペーサー長さは、例えば、10、11、12、13、14、14の10〜15ヌクレオチド長、例えば15、16、または17ヌクレオチド長の15〜17ヌクレオチド長、例えば17、18、19、または20ヌクレオチド長の17〜20ヌクレオチド長、例えば、20、21、22、23、または24ヌクレオチド長の20〜24ヌクレオチド長、例えば、23、24、または25ヌクレオチド長の23〜25ヌクレオチド長、例えば、24、25、26、または27ヌクレオチド長の24〜27ヌクレオチド長、例えば27、28、29、または30ヌクレオチド長の27〜30ヌクレオチド長、例えば30、31、32、33、34、または35ヌクレオチド長の30〜35ヌクレオチド長、または35ヌクレオチド長以上である。特定の実施形態例では、ガイド配列は、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、または100ヌクレオチド長である。
【０１７１】
CRISPR-Casシステムの実施形態によっては、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約50%以上、60%以上、75%以上、80%以上、85%以上、90%以上、95%以上、97.5%以上、99%以上、または100%であってもよく、ガイドすなわちRNAまたはsgRNAは、約5以上、10以上、11以上、12以上、13以上、14以上、15以上、16以上、17以上、18以上、19以上、20以上、21以上、22以上、23以上、24以上、25以上、26以上、27以上、28以上、29以上、30以上、35以上、40以上、45以上、50以上、75以上、またはそれ以上のヌクレオチド長であってもよく、またはガイドすなわちRNAまたはsgRNAは、約75未満、50未満、45未満、40未満、35未満、30未満、25未満、20未満、15未満、12未満、またはそれ未満のヌクレオチド長であってもよく、好ましくは、tracrRNAは、30または50ヌクレオチド長である。しかし、本発明の一側面は、非特異的標的の相互作用を減弱させることであり、例えば、低い相補性を有する標的配列と相互作用するガイドを減少させることである。実際に例によっては、本発明は、例えば83%〜84%または88〜89%または94〜95%の相補性などの80%超〜約95%の相補性を有する非特異的標的配列と標的とを区別可能な（例えば、18ヌクレオチドを持つ標的と1、2、または3の不一致を持つ18ヌクレオチドの非特異的標的とを区別可能な）CRISPR-Casシステムをもたらす変異を含むことが示されている。従って、本発明の文脈では、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、94.5%超、または95%超、または95.5%超、または96%超、または96.5%超、または97%超、または97.5%超、または98%超、または98.5%超、または99%超、または99.5%超、または99.9%超、または100%である。非特異的標的の配列とガイド間の相補性は、100%未満、または99.9%未満、または99.5%未満、または99%未満、または99%未満、または98.5%未満、または98%未満、または97.5%未満、または97%未満、または96.5%未満、または96%未満、または95.5%未満、または95%未満、または94.5%未満、または94%未満、93%未満、または92%未満、または91%未満、または90%未満、または89%未満、または88%未満、または87%未満、または86%未満、または85%未満、または84%未満、または83%未満、または82%未満、または81%未満、または80%未満であり、好ましくは、非特異的標的の配列とガイド間の相補性は、100%、または99.9%、または99.5%、または99%、または99%、または98.5%、または98%、または97.5%、または97%、または96.5%、または96%、または95.5%、または95%、または94.5%である。
【０１７２】
本発明による特に好ましい実施形態では、（Casを標的遺伝子座に誘導可能な）ガイドRNAは、（１）真核細胞中のゲノム標的遺伝子座にハイブリダイズ可能なガイド配列、（２）tracr配列、および（３）tracr mate配列を含んでもよい。（１）から（３）は全て、単一のRNA、すなわち（5’から3’の方向に配置された）sgRNAに存在してもよく、あるいはtracrRNAは、ガイドとtracr配列を含むRNAとは異なるRNAであってもよい。tracrはtracr mate配列にハイブリダイズし、CRISPR-Cas複合体を標的配列に導く。tracrRNAがガイドとtracr配列を含むRNAとは異なるRNAに存在する場合に、各RNAの長さは、それぞれの未変性の長さから短くなるように最適化され、各RNAは、細胞のRNA分解酵素による分解から保護するように、またはそうでないなら安定性を高めるように、独立して化学的に改変されてもよい。
【０１７３】
「tracrRNA」配列または類似の用語は、ハイブリダイズするためにcrRNA配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列を含む。実施形態によっては、最適に整列されたときの２つのうちの短い方の長さに沿ったtracrRNA配列とcrRNA配列との間の相補性の程度は、約25%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%、97.5%以上、99%以上、またはそれ以上である。実施形態によっては、tracr配列は、約5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、40、50、またはそれ以上のヌクレオチド長である。実施形態によっては、tracr配列およびcrRNA配列は、単一の転写物内に含まれ、その結果、２つの間のハイブリダイスは、ヘアピンなどの二次構造を有する転写物を生成する。本発明の一実施形態では、転写物または転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも2個以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態では、転写物は、2個、3個、4個、または5個のヘアピンを有する。本発明のさらなる実施形態では、転写物は、最大で5個のヘアピンを有する。ヘアピン構造では、最後の「N」の配列5’の部分とループの上流はtracr mate配列に対応し、ループの配列3’の部分はtracr配列に対応する。実施形態によっては、システムは、1個以上のcrRNAを含む。例えば、システムは、2個以上のcrRNAを含んでもよい。
【０１７４】
一般に、相補性の程度は、２つの配列の内の短い方の長さに沿って、ガイド配列およびtracr配列の最適な配置に関連する。最適な配置は、任意の適切な配置アルゴリズムによって決定されてもよく、さらにsca配列またはtracr配列のいずれか配列内の自己相補性などの二次構造を占めていてもよい。実施形態によっては、最適に配置されたときの２つの内の短い方の長さに沿ったtracr配列とcrRNA配列との間の相補性の程度は、約25%以上、30%以上、40%以上、50%以上、60%以上、70%以上、80%以上、90%以上、95%以上、97.5%以上、99%以上、またはそれ以上である。
【０１７５】
本発明の一側面では、ガイドは、5’ハンドル、シード領域をさらに含むガイド区画、および3’末端を有する、C2c1の改変されたcrRNAを含む。実施形態によっては、改変されたガイドは、表１および表２に列記された相同分子種のうちのいずれか１種のC2c1とともに使用してもよい。
改変されたガイド
【０１７６】
特定の実施形態では、本発明のガイドは、非天然起源の核酸および／または非天然起源のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体、および／または化学改変を含む。非天然起源の核酸は、例えば、天然および非天然起源のヌクレオチドの混合物を含んでもよい。非天然起源のヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体は、リボース、リン酸、および／または塩基部分で改変されていてもよい。本発明の一実施形態では、ガイド核酸は、リボヌクレオチドおよび非リボヌクレオチドを含む。その一実施形態では、ガイドは、１つ以上のリボヌクレオチドおよび１つ以上のデオキシリボヌクレオチドを含む。本発明の実施形態では、ガイドは、１つ以上の非天然起源のヌクレオチド、またはホスホロチオ酸結合、ボラノリン酸結合、リボース環の2’と4’炭素の間のメチレン架橋を含むロックド核酸（LNA）ヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）、または架橋核酸（BNA）を有するヌクレオチ供与体などのヌクレオチド類似体を含む。改変ヌクレオチドのその他の例として、2’-O-メチル類似体、2’-デオキシ類似体、2-チオウリジン類似体、N6-メチルアデノシン類似体、または2’−フルオロ類似体が挙げられる。改変ヌクレオチドのさらなる例として、限定はされないが、ペプチド、核局在化配列（NLS）、ペプチド核酸（PNA）、ポリエチレングリコール（PEG）、トリエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール（TEG）を含む2’位置での化学部分の結合が含まれる。改変塩基のさらなる例として、限定はされないが、2-アミノプリン、5-ブロモ−ウリジン、疑似ウリジン（Ψ）、N1-メチル疑似ウリジン（me1Ψ）、5-メトキシウリジン（5moU）、イノシン、7-メチルグアノシンが含まれる。ガイドRNAの化学改変の例として、1個以上の末端ヌクレオチドへの、限定はされないが、2’-O-メチル（M）、2’-O-メチル-3’-ホスホロチオ酸（MS）、ホスホロチオ酸（PS）、S-拘束エチル（cEt）、2’-O-メチル-3’-チオPACE（MSP）、または2’-O-メチル-3’-ホスホノ酢酸（MP）の取り込みを含む。この化学的に改変されたガイドは、未変性のガイドに比較して、安定性と活性の増強を含むことができるが、特異的標的と非特異的標的の特異性の比較は予測できない。（Hendel, 2015, Nat Biotechnol. 33(9):985-9, doi: 10.1038/nbt.3290, published online 29 June 2015, Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111、Allerson et al., J. Med. Chem. 2005, 48:901-904、Bramsen et al., Front. Genet., 2012, 3:154、Deng et al., PNAS, 2015, 112:11870-11875、Sharma et al., MedChemComm., 2014, 5:1454-1471、Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985-989、Li et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1, 0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066、およびRyan et al., Nucleic Acids Res. (2018) 46(2): 792-803を参照）。
【０１７７】
実施形態によっては、ガイドへの改変は、化学的改変、挿入、欠失、または分離である。実施形態によっては、化学改変には、限定はされないが、2’-O-メチル（M）類似体、2’-デオキシ類似体、2-チオウリジン類似体、N6-メチルアデノシン類似体、2’-フルオロ類似体、2-アミノプリン、5-ブロモ−ウリジン、疑似ウリジン（Ψ）、N1-メチル疑似ウリジン（me1Ψ）、5-メトキシウリジン（5moU）、イノシン、7-メチルグアノシン、2’-O-メチル-3’-ホスホロチオ酸（MS）、S-拘束エチル（cEt）、ホスホロチオ酸（PS）、2’-O-メチル-3’-チオPACE（MSP）、または2’-O-メチル-3’-ホスホノ酢酸（MP）の組み込みを含む。実施形態によっては、ガイドは、１つ以上のホスホロチオ酸改変を含む。特定の実施形態では、ガイド中の少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または25個のヌクレオチドは化学的に改変されている。実施形態によっては、全てのヌクレオチドは化学的に改変されている。特定の実施形態では、シード領域の1個以上のヌクレオチドは化学的に改変されている。特定の実施形態では、3’末端の1個以上のヌクレオチドは化学的に改変されている。特定の実施形態では、5’ハンドルのヌクレオチドのいずれも化学的に改変されていない。実施形態によっては、シード領域での化学改変は、2’-フルオロ類似体の組み込みなどの軽微な改変である。特定の実施形態では、シード領域の1個のヌクレオチドは、2’-フルオロ類似体で置換される。実施形態によっては、3’末端の5または10個のヌクレオチドは化学的に改変されている。Cpf1 CrRNAの3’末端でのこのような化学改変は、遺伝子の切断効率を改善する（Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066を参照）。特定の実施形態では、3’末端の5個のヌクレオチドは2’-フルオロ類似体で置換されている。特定の実施形態では、3’末端の10個のヌクレオチドは2’-フルオロ類似体で置換されている。特定の実施形態では、3’末端の5個のヌクレオチドは2’-O-メチル（M）類似体で置換されている。実施形態によっては、3’および5’末端のそれぞれの3個ヌクレオチドは化学的に改変されている。特定の実施形態では、改変は、2’-O-メチルまたはホスホロチオ酸類似体を含む。特定の実施形態では、四塩基ループの12個のヌクレオチドおよびステムループ領域の16個のヌクレオチドは、2’-O-メチル類似体で置換されている。この化学改変は、in vivo編集および安定性を向上させる（Finn et al., Cell Reports (2018), 22: 2227-2235を参照）。
【０１７８】
実施形態によっては、ガイドRNAの5’および／または3’末端は、蛍光色素、ポリエチレングリコール、コレステロール、タンパク質、または検出タグを含む様々な機能的部分によって改変されている。（Kelly et al., 2016, J. Biotech. 233:74-83を参照）。特定の実施形態では、ガイドは、標的DNAに結合する領域内のリボヌクレオチド、ならびにCas9、Cpf1、またはC2c1に結合する領域内の1個以上のデオキシリボヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体を含む。本発明の一実施形態では、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはヌクレオチド類似体は、限定されないが、5’および／または3’末端、ステムループ領域、およびシード領域などの遺伝子操作されたガイド構造内に組み込まれている。特定の実施形態では、改変は、ステムループ領域の5’ハンドル中には存在しない。ガイドのステムループ領域の5’ハンドル中の化学改変により、その機能が失われる可能性がある（see Li, et al., Nature Biomedical Engineering, 2017, 1:0066を参照）。特定の実施形態では、ガイドの少なくとも1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または75個のヌクレオチドは、化学的に改変されている。実施形態によっては、ガイドの3’末端または5’末端のいずれかでの3〜5個のヌクレオチドは、化学的に改変されている。実施形態によっては、2’-F改変などの軽微な改変のみがシード領域に導入されている。実施形態によっては、2’-F改変は、ガイドの3’末端に導入されている。特定の実施形態では、ガイドの5’および／または3’末端の3〜5ヌクレオチドは、2’-O-メチル（M）、2’-O-メチル-3’-ホスホロチオ酸（MS）、S-拘束エチル（cEt）、2’-O-メチル-3’-チオPACE（MSP）、または2’-O-メチル-3’-ホスホノ酢酸（MP）により化学的に改変されている。このような改変は、ゲノム編集効率を高めることができる（Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33(9): 985-989、および Ryan et al., Nucleic Acids Res. (2018) 46(2): 792-803を参照）。特定の実施形態では、ガイドの全てのホスホジエステル結合は、遺伝子破壊の程度を高めるためにホスホロチオ酸（PS）で置換されている。特定の実施形態では、ガイドの5’および／または3’末端の5個を超えるヌクレオチドは、2’-O-Me、2’-F、またはS拘束エチル（cEt）で化学的に改変されている。この化学的に改変されたガイドは、遺伝子破壊の程度の向上を媒介してもよい（Ragdarm et al., 0215, PNAS, E7110-E7111を参照）。本発明の一実施形態では、ガイドは、その3’および／または5’末端に化学部分を含むように改変されている。この部分には、限定はされないが、アミン、アジド、アルキン、チオ、ジベンゾシクロオクチン（DBCO）、ローダミン、ペプチド、核局在化配列（NLS）、ペプチド核酸（PNA）、ポリエチレングリコール（PEG）、トリエチレングリコール、またはテトラエチレングリコール（TEG）を含む。特定の実施形態では、化学部分は、アルキル鎖などのリンカーによってガイドに接合される。特定の実施形態では、改変されたガイドの化学的部分は、ガイドを使用して、DNA、RNA、タンパク質、またはナノ粒子などの別の分子に付着させることができる。この化学的に改変されたガイドを使用して、CRISPRシステムによって遺伝子編集された細胞を識別または濃縮できる（Lee et al., eLife, 2017, 6:e25312, DOI:10.7554を参照）。実施形態によっては、3’および5’末端のそれぞれの3個のヌクレオチドが化学的に改変されている。特定の実施形態では、改変は、2’-O-メチルまたはホスホロチオ酸類似体を含む。特定の実施形態では、四塩基ループの12個のヌクレオチドおよびステムループ領域の16個のヌクレオチドは、2’-O-メチル類似体で置換されている。この化学改変は、in vivoでの編集および安定性を向上させる（Finn et al., Cell Reports (2018), 22: 2227-2235を参照）。実施形態によっては、ガイドの60または70個を超えるヌクレオチドは、化学的に改変されている。実施形態によっては、この改変は、2’-O-メチルまたは2’-フルオロヌクレオチド類似体によるヌクレオチドの置換、またはホスホジエステル結合のホスホロチオ酸（PS）改変を含む。実施形態によっては、化学改変は、CRISPR複合体が形成される際のヌクレアーゼタンパク質の外側に延びるガイドヌクレオチドの2’-O-メチルまたは2’-フルオロ改変、またはガイドの3’-末端の20〜30個以上のヌクレオチドのPS改変を含む。特定の実施形態では、化学改変は、ガイドの5’末端に2’-O-メチル類似体、またはシードおよびテール領域に2’-フルオロ類似体をさらに含む。このような化学改変は、ヌクレアーゼ分解に対する安定性を改善し、ゲノム編集活性または効率を維持または増強するが、全てのヌクレオチドの改変はガイドの機能を無効にする可能性がある（Yin et al., Nat. Biotech. (2018), 35(12): 1179-1187を参照）。このような化学改変は、限定された数のヌクレアーゼおよびRNA 2’-OH相互作用の情報を含む、CRISPR複合体の構造情報によって誘導してもよい（Yin et al., Nat. Biotech. (2018), 35(12): 1179-1187を参照）。実施形態によっては、1個以上のガイドRNAヌクレオチドは、DNAヌクレオチドで置換されていてもよい。実施形態によっては、5’末端テール／シードガイド領域の最大2、4、6、8、10、または12個のRNAヌクレオチドがDNAヌクレオチドで置換されている。特定の実施形態では、3’末端のガイドRNAヌクレオチドの大部分は、DNAヌクレオチドで置換されている。特定の実施形態では、3’末端の16個のガイドRNAヌクレオチドは、DNAヌクレオチドで置換されている。特定の実施形態では、5’末端テール／シード領域の8個のガイドRNAヌクレオチドおよび3’末端の16個のRNAヌクレオチドは、DNAヌクレオチドで置換されている。特定の実施形態では、CRISPR複合体が形成される際のヌクレアーゼタンパク質の外側に延びるガイドRNAヌクレオチドは、DNAヌクレオチドで置換されている。複数のRNAヌクレオチドのDNAヌクレオチドによるこのような置換により、非特異的標的活性を低下させるが、未変性のガイドと同等の特異的標的活性は維持する。ただし、3’末端の全てのRNAヌクレオチドを置換すると、ガイドの機能が喪失する可能性がある（Yin et al., Nat. Chem. Biol. (2018) 14, 311-316を参照）。この改変は、限定された数のヌクレアーゼおよびRNA 2’-OH相互作用の情報を含むCRISPR複合体の構造情報によって誘導されてもよい（Yin et al., Nat. Chem. Biol. (2018) 14, 311-316を参照）。
【０１７９】
ガイド配列すなわち核酸標的化ガイドRNAは、任意の標的核酸配列を標的化するように選択されてもよい。標的配列はDNAであってもよい。標的配列はゲノムDNAであってもよい。標的配列はミトコンドリアDNAであってもよい。第２部類のV型CRISPR-Casタンパク質のガイド分子またはガイドRNAは、（内因性CRISPRシステムの文脈での「直接反復」を包含する）tracr-mate配列および（内因性CRISPRシステムの文脈で「スペーサー」とも呼ばれる）ガイド配列を含む。未変性のCas12b CRISPR-Casシステムはtracr配列を使用している。
【０１８０】
特定の実施形態では、（C2c1を標的遺伝子座に誘導可能な）ガイド分子は、（１）標的遺伝子座にハイブリダイズが可能なガイド配列、および（２）tracr-mate配列すなわち直接反復配列を含み、それにより直接反復配列は、ガイド配列の上流（すなわち5’）に位置する。特定の実施形態では、C2c1ガイド配列のシード配列（すなわち、標的遺伝子座での配列に対する認識および／またはハイブリダイズに重要で必須の配列）は、ガイド配列の最初の10個のヌクレオチド内にほぼ位置している。特定の実施形態では、シード配列は、ガイド配列の5’末端の最初の5ヌクレオチド内にほぼ位置している。
【０１８１】
実施形態によっては、ガイドの5’ハンドルのループが改変される。実施形態によっては、ガイドの5’ハンドルのループは、欠失、挿入、分離、または化学改変を持つように改変される。特定の実施形態では、改変されたループは、3、4、または5個のヌクレオチドを含む。特定の実施形態では、このループは、UCUU、UUUU、UAUU、またはUGUUの配列を含む。実施形態によっては、ガイド分子は、DNAまたはRNAであってもよい別々の非共有結合配列を有するステムループを形成する。
ステムループおよびヘアピン
【０１８２】
核酸標的化複合体またはシステムに関して、crRNA配列およびキメラガイド配列は1個以上のステムループまたはヘアピンを含むのが好ましい。アプタマー改変ガイドを使用すると、アダプター含有タンパク質をガイドに結合させることができる。アダプターを任意の機能ドメインに融合でき、それによりガイドへの機能ドメインの接続が可能になる。2個の異なるアプタマーを使用すると、2個のガイドによる別々の標的化が可能になる。多数の、例えば10または20または30個などのその改変された核酸標的化ガイドRNAは、全て同時に使用してもよいが、エフェクタータンパク質分子のうちの1個のみ（または少なくとも最小数）を、比較的少数のタンパク質分子を多数の改変ガイドとともに使用できるように、送達する必要がある。アダプタータンパク質と活性化因子または抑制因子などの機能ドメインとの間の融合には、リンカーが含まれてもよい。例えば、GlySerリンカーGGGSを使用してもよい。それらを、3個の（GGGGS）3（配列番号393）、または6個（配列番号394）、9個（配列番号395）、または12個（配列番号396）、またはそれ以上の反復に使用して、必要に応じて適切な長さを提供してもよい。リンカーは、ガイドRNAと機能ドメイン（活性化因子または抑制因子）との間で、または核酸標的化Casタンパク質（Cas）と機能ドメイン（活性化因子または抑制因子）との間で使用してもよい。リンカーを使用して、適切な量の「機械的柔軟性」を操作する。
【０１８３】
特定の実施形態では、ステムは、相補的なX配列およびY配列を含む少なくとも約4塩基対を含むが、例えばより多い5、6、7、8、9、10、11、または12塩基対、あるいはより少ない3、または2塩基対のステムも想定される。従って、例えば、X：2〜10およびY：2〜10（ここでXおよびYは、任意の相補的なヌクレオチドの組を表す）も考えられる。一側面では、XおよびYヌクレオチドからなるステムは、ループとともに、全体的な二次構造中に完全なヘアピンを形成し、かつこれは有益であって、この塩基対の量は、完全なヘアピンを形成する任意の量であってもよい。一側面では、ガイド分子全体の二次構造が保持されている限り、（例えば長さに関して）任意の相補的なX：Y塩基対配列は許容される。一側面では、X：Y塩基対からなるステムを接続するループは、ガイド分子の全体的な二次構造を妨害しない同一の長さ（例えば4または5個のヌクレオチド）またはそれ以上の長さの任意の配列であってもよい。一側面では、ステムループは、例えばMS2アプタマーをさらに含んでもよい。一側面では、ステムは、相補的なX配列およびY配列を含む約5〜7塩基対を含むが、それより多いまたは少ない塩基対のステムもまた想定される。一側面では、非ワトソン−クリックの塩基対が想定され、この場合、その対合は、一般にその位置にステムループの構築物を保持する。
【０１８４】
特定の実施形態では、ガイド分子の天然のヘアピンまたはステムループ構造は、伸長されるか、または伸長されたステムループによって置換される。特定の場合に、ステムの伸長により、ガイド分子とCRISPR-Casタンパク質との結合を促進できることが示されている（Chen et al. Cell. (2013); 155(7): 1479-1491）。特定の実施形態では、ステムループのステムは、少なくとも1、2、3、4、5個、またはそれ以上の相補的塩基対によって伸長される（すなわち、ガイド分子での2、4、6、8、10個またはそれ以上のヌクレオチドの付加に対応する）。特定の実施形態では、これら塩基対は、ステムループのループに隣接して、ステムの末端に位置する。
【０１８５】
実施形態によっては、ガイド分子は、DNAまたはRNAであってもよい別々の非共有結合配列を有するステムループを形成する。特定の実施形態では、ガイドを形成する配列は、まず標準的なホスホラミダイト合成手順を用いて合成される（Herdewijn, P., ed., 分子生物学での手法（Methods in Molecular Biology）Col 288, オリゴヌクレオチド合成：方法および応用（Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications）, Humana Press, New Jersey (2012)）。実施形態によっては、これらの配列は、当技術分野で既知の標準手順を用いて、連結のための適切な官能基を含むように官能化されてもよい（Hermanson, G. T., 生体結合技術（Bioconjugate Techniques）, Academic Press (2013)）。官能基の例として、限定はされないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、アルデヒド、カルボニル、クロロカルボニル、イミダゾリルカルボニル、ヒドロジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオール、マレイミド、ハロアルキル、スフォニル、アリル、プロパルギル、ジエン、アルキン、およびアジドが挙げられる。この配列が官能化されると、この配列と直接反復配列との間に共有化学結合または連結が形成される。化学結合の例として、限定はされないが、カルバミン酸、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、スルホンアミド、スルホン酸、フルフォン、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光不安定性結合、Diels-Alder環状付加対または閉環メタセシス対などのC−C結合形成基、およびMichael反応対に基づく結合が挙げられる。
【０１８６】
実施形態によっては、これらのステムループ形成配列は、化学的に合成されてもよい。実施形態によっては、化学合成は、2’-アセトキシエチルオルトエステル（2'-ACE）（Scaringe et al., J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 11820-11821; Scaringe, Methods Enzymol. (2000) 317: 3-18）または2’-チオノカルバミン酸（2'-TC）（Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc. (2011) 133: 11540-11546; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33:985-989）の化学作用による自動化された固相オリゴヌクレオチド合成装置を用いる。
RNA分解酵素の感受性の減弱
【０１８７】
実施形態によっては、Cas12bによる切断などのRNA切断に対するガイド分子の感受性を減弱させることを目的とする。従って、特定の実施形態では、ガイド分子は、Cas12bまたは他のRNA切断酵素による切断を回避するように調節される。
【０１８８】
特定の実施形態では、RNA分解酵素または発現の低下に対するガイド分子の感受性は、その機能に影響を及ぼさない程度のガイド分子の配列の微細な改変によって減弱させることができる。例えば、特定の実施形態では、U6 Pol-IIIの早期転写などの転写の早期完結は、ガイド分子配列中の仮想Pol-III終止因子（4つの連続するUの因子）を改変して排除することができる。ガイド分子のステムループ中にその配列改変が必要な場合には、その改変は、好ましくは塩基対フリップによって確実にできる。
二次構造の縮小
【０１８９】
実施形態によっては、ガイド分子（直接反復および／またはスペーサー）の配列は、ガイド分子内の二次構造の程度を低減するように選択される。実施形態によっては、核酸標的化ガイドRNAの約75%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、1%、またはそれ以下のヌクレオチドは、最適に折り畳まれた際の自己相補的な塩基対形成に関与する。最適な折り畳みは、任意の適切なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定されてもよい。一部のプログラムは、Gibbsの最小自由エネルギーの計算に基づいている。そのアルゴリズムの一例は、ZukerおよびStiegler（Nucleic Acids Res. 9 (1981), 133-148）によって説明されているmFoldである。別の折り畳みアルゴリズムの例としては、重心構造予測アルゴリズムを用いてウィーン大学の理論化学研究所で開発されたオンラインのウェブサーバーRNAfoldである（例えば、A.R. Gruber et al., 2008, Cell 106(1): 23-24、およびPA Carr and GM Church, 2009, Nature Biotechnology 27(12): 1151-62を参照）。
結合tracr配列
【０１９０】
実施形態によっては、ガイド分子は、非ホスホジエステル結合を介して化学的に連結または結合されたtracr配列およびtracr mate配列を含む。一側面では、ガイドは、非ヌクレオチドループを介して化学的に連結または結合されたtracr配列およびtracr mate配列を含む。実施形態によっては、tracr配列およびtracr mate配列は、非ホスホジエステル共有結合リンカーを介して結合される。共有結合リンカーの例として、限定はされないが、カルバミン酸、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、スルホンアミド、スルホン酸、フルフォン、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光不安定性結合、Diels-Alder環状付加対または閉環メタセシス対などのC−C結合形成基、およびMichael反応対からなる群から選択される化学的部分が挙げられる。
【０１９１】
実施形態によっては、tracr配列およびtracr mate配列は、まず標準的なホスホルアミダイト合成手順を用いて合成される（Herdewijn, P., ed., 分子生物学での手法（Methods in Molecular Biology）Col 288, オリゴヌクレオチド合成：方法および応用（Oligonucleotide Synthesis: Methods and Applications）, Humana Press, New Jersey (2012)）。実施形態によっては、tracr配列およびtracr mate配列は、当技術分野で知られている標準手順を用いて、連結のための適切な官能基を含むように官能化されてもよい（Hermanson, G. T., 生体結合技術（Bioconjugate Techniques）, Academic Press (2013)）。官能基の例として、限定はされないが、ヒドロキシル、アミン、カルボン酸、カルボン酸ハロゲン化物、カルボン酸活性エステル、アルデヒド、カルボニル、クロロカルボニル、イミダゾリルカルボニル、ヒドロジド、セミカルバジド、チオセミカルバジド、チオール、マレイミド、ハロアルキル、スフォニル、アリル、プロパルギル、ジエン、アルキン、およびアジドが挙げられる。tracr配列およびtracrmate配列が官能化されると、２つのオリゴヌクレオチド間に共有化学結合または連結が形成される。化学結合の例として、限定はされないが、カルバミン酸、エーテル、エステル、アミド、イミン、アミジン、アミノトリジン、ヒドロゾン、ジスルフィド、チオエーテル、チオエステル、ホスホロチオ酸、ホスホロジチオ酸、スルホンアミド、スルホン酸、フルフォン、スルホキシド、尿素、チオ尿素、ヒドラジド、オキシム、トリアゾール、光不安定性結合、Diels-Alder環状付加対または閉環メタセシス対などのC−C結合形成基、およびMichael反応対に基づく結合が挙げられる。
【０１９２】
実施形態によっては、tracr配列およびtracr mate配列を化学的に合成してもよい。実施形態によっては、化学合成は、2’-アセトキシエチルオルトエステル（2'-ACE）（Scaringe et al., J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 11820-11821; Scaringe, Methods Enzymol. (2000) 317: 3-18）または2’-チオノカルバミン酸（2'-TC）（Dellinger et al., J. Am. Chem. Soc. (2011) 133: 11540-11546; Hendel et al., Nat. Biotechnol. (2015) 33:985-989）の化学作用による自動化された固相オリゴヌクレオチド合成装置を用いる。
【０１９３】
実施形態によっては、tracr配列およびtracr mate配列を、糖、ヌクレオチド間ホスホジエステル結合、プリン残基、およびピリミジン残基の改変を介して、様々な生物結合反応、ループ、架橋、および非ヌクレオチド連結を用いて共有結合してもよい。Sletten et al., Angew. Chem. Int. Ed. (2009) 48:6974-6998、Manoharan, M. Curr. Opin. Chem. Biol. (2004) 8: 570-9、Behlke et al., Oligonucleotides (2008) 18: 305-19、Watts, et al., Drug. Discov. Today (2008) 13: 842-55、およびShukla, et al., ChemMedChem (2010) 5: 328-49を参照。
【０１９４】
実施形態によっては、tracr配列およびtracr mate配列を、クリックケミストリーを用いて共有結合してもよい。実施形態によっては、tracr配列およびtracr mate配列を、トリアゾールリンカーを用いて共有結合してもよい。実施形態によっては、tracr配列およびtracr mate配列を、アルキンおよびアジドを含むHuisgen 1,3-双極環化付加反応を用いて共有結合して、非常に安定なトリアゾールリンカーを生成してもよい（He et al., ChemBioChem (2015) 17: 1809-1812; WO2016/186745）。実施形態によっては、tracr配列およびtracr mate配列を、5’−ヘキシンtracrRNAおよび3’−アジドcrRNAを連結して共有結合する。実施形態によっては、5’−ヘキシンtracrRNAおよび3’−アジドcrRNAの一方または両方は、2’-アセトキシエチルオルトエステル（2’-ACE）基で保護されていてもよく、これは、その後にDharmaconの手順を用いて除去されてもよい（Scaringe et al., J. Am. Chem. Soc. (1998) 120: 11820-11821; Scaringe, Methods Enzymol. (2000) 317: 3-18）。
【０１９５】
実施形態によっては、tracr配列およびtracr mate配列を、スペーサー、付加物、生体結合物、発色団、レポーター基、色素標識RNA、および非天然起源ヌクレオチド類似体などの部分を含むリンカー（例えば非ヌクレオチドループ）を介して共有結合してもよい。より具体的には、本発明の目的に適するスペーサーには、限定はされないが、ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール、ポリアルコール、ポリプロピレングリコール、またはエチレングリコールとプロピレングリコールの混合物）、ポリアミン基（例えば、スペニン、スペルミジン、およびそれらのポリマー誘導体）、ポリエステル（例えば、ポリアクリル酸エチル）、ポリホスホジエステル、アルキレン、およびそれらの組合せが含まれる。適切な付加物には、限定はされないが、リンカーに追加の特性を付加するためにリンカーに付加できる蛍光標識などの任意の部分を含んでもよい。適切な生体結合物には、限定はされないが、ペプチド、グリコシド、脂質、コレステロール、リン脂質、ジアシルグリセロールおよびジアルキルグリセロール、脂肪酸、炭化水素、酵素基質、ステロイド、ビオチン、ジゴキシゲニン、炭水化物、多糖類が含まれる。適切な発色団、レポーター基、および色素標識RNAには、限定はされないが、フルオレセインおよびローダミンなどの蛍光色素、化学発光、電気化学発光、および生物発光の各マーカー化合物が含まれる。２つのRNA成分を結合するリンカー例の設計はまた、国際特許出願WO2004/015075号に説明されている。
【０１９６】
リンカー（例えば、非ヌクレオチドループ）は、任意の長さであってもよい。実施形態によっては、リンカーは、約0〜16個のヌクレオチドに相当する長さを有する。実施形態によっては、リンカーは、約0〜8個のヌクレオチドに相当する長さを有する。実施形態によっては、リンカーは、約0〜4個のヌクレオチドに相当する長さを有する。実施形態によっては、リンカーは、約2個のヌクレオチドに相当する長さを有する。リンカー設計の例はまた、国際特許出願WO2011/008730号に説明されている。
【０１９７】
典型的なCas9 sgRNAは、（5’→3’方向に）ガイド配列、ポリU路、第１の相補的伸長（「反復」）、ループ（四塩基ループ）、第２の相補的伸長（反復に相補的な「アンチ反復」）、ステム、さらにステムループとステム、およびポリA（RNAでは多くはポリU）テール（終止因子）を含む。典型的なCas12b sgRNAは同様の成分を含むが、方向が逆、すなわち3’→5’の方向である。直接反復（DR）は、tracrRNAとハイブリダイズしてcrRNA：tracrRNA二重鎖を形成し、これは、Cas12bに負荷されて、DNAの認識および切断を誘導する。Cas12bは、プロトスペーサー配列の5’末端にあるT富化PAMを認識して、DNA干渉を媒介する。特定の実施形態では、tracrの5’末端は、ステムループを形成する。特定の実施形態では、tracrRNAおよび5’DRのヌクレオチドは、反復：アンチ反復の二重鎖を形成する。特定の実施形態では、sgRNA構築物は、Shmakov et al., 2015, Molecular Cell 60, 385-397によって予測された構造と一致する。特定の実施形態では、sgRNA構築物は、Liu et al., 2017, Molecular Cell 65, 310-322によって予測された構造と一致する。好ましい実施形態では、ガイド構築物の特定の側面が保持され、ガイド構築物の特定の側面は、例えば、機能の追加、削除、または置換によって改変されてもよいが、ガイド構築物の他の特定の側面は維持される。限定はされないが、挿入、欠失、および置換を含む、遺伝子操作されたsgRNA改変の好ましい位置には、CRISPRタンパク質および／または標的、例えば四塩基ループおよび／またはループ2と複合体を形成するときに露出するsgRNAのガイド末端および領域が含まれる。
【０１９８】
特定の実施形態では、本発明のガイドは、アダプタータンパク質に対する特異的結合部位（例えばアプタマー）を含み、これは、（例えば融合タンパク質を介する）1個以上の機能ドメインを含んでもよい。このガイドがCRISPR複合体（すなわちガイドおよび標的に結合するCRISPR酵素）を形成する場合に、アダプタータンパク質は結合し、アダプタータンパク質に会合する機能ドメインは、属性機能を有効にするのに有益な空間的な方向に配置される。例えば、機能ドメインが転写活性化因子（例えば、VP64またはp65）である場合に、転写活性化因子は、それが標的の転写に影響を与えることを可能にする空間的な方向に配置される。同様に、転写抑制因子は、標的の転写に影響を与えるように有効に配置され、ヌクレアーゼ（例えばFok1）は、標的を切断または部分的に切断するように有効に配置される。
【０１９９】
当業者は、アダプター＋機能ドメインの結合を可能にするが（例えば、CRISPR複合体の三次元構造内の立体障害により）アダプター＋機能ドメインの適切な配置を可能にしないガイドへの改変が意図しない改変であることを分かっている。1個以上の改変ガイドは、本明細書に説明されるように、四塩基ループ、ステムループ1、ステムループ2、またはステムループ3で、好ましくは四塩基ループまたはステムループ2のいずれかで、最も好ましくは四塩基ループおよびステムループ2の両方で改変されてもよい。
【０２００】
反復：アンチ反復の二重鎖は、sgRNAの二次構造から明白になる。典型的なCas9 sgRNAでは、その二重鎖は通常、（5’→3’方向の）ポリU路の後かつ四塩基ループの前の第１の相補的な伸長部、および（5’→3’方向の）四塩基ループの後かつポリA路の前の第２の相補的な伸長部であってもよい。第１の相補的な伸長部（「反復」）は、第２の相補的な伸長部（「アンチ反復」）に相補的である。特定の実施形態では、Cas12b sgRNAの構築物は、Shmakov et al., 2015, Molecular Cell 60, 385-397によって予測される構造と一致する。特定の実施形態では、Cas12b sgRNAの構築物は、Liu et al., 2017, Molecular Cell 65, 310-322によって予測される構造と一致する。このように、それらのsgRNAは、ワトソン−クリック塩基対を含んで、互いに折り畳まれる際にdsRNAの二重鎖を形成する。このように、アンチ反復配列は、A−UまたはC−Gの塩基対の観点から、またアンチ配列がステムループまたは他の構築形態のために逆方向にあるという事実の観点から、反復の相補的な配列となる。
【０２０１】
本発明の一実施形態では、ガイド構築物の改変は、ステムループ2中の塩基を置換することを含む。例えば、実施形態によっては、ステムループ2中の「actt」（RNAでは「acuu」）塩基および「aagt」（RNAでは「aagu」）塩基は、「cgcc」および「gcgg」で置換される。実施形態によっては、ステムループ2中の「actt」塩基および「aagt」塩基は、4個のヌクレオチドの相補的なGCリッチ領域で置換される。実施形態によっては、4個のヌクレオチドの相補的なGCリッチ領域は、（両方とも5’→3’方向での）「cgcc」および「gcgg」である。実施形態によっては、4個のヌクレオチドの相補的なGCリッチ領域は、（両方とも5’→3’方向での）「gcgg」および「cgcc」である。4個のヌクレオチドの相補的なGCリッチ領域中のCとGの他の組合せは、CCCCとGGGGを含むのが明白である。
【０２０２】
一側面では、ステムループ2、例えば「ACTTgtttAAGT」（配列番号397）は、任意の「XXXXgtttYYYY」（配列番号398）によって置換されてもよく、例えば、式中のXXXXおよびYYYYは、共に互いに塩基対となってステムを形成する任意のヌクレオチド組を表す。
【０２０３】
一側面では、ステムは、相補的なX配列およびY配列を含む少なくとも約4塩基対を含むが、例えばより多い5、6、7、8、9、10、11、または12個の塩基対、あるいは例えばより少ない3、2個の塩基対もまた想定される。従って、例えば、X：2〜12およびY：2〜12（XおよびYは、任意の相補的なヌクレオチド組を表す）が想定されてもよい。一側面では、XおよびYヌクレオチドからなるステムは、「gttt」と共に、全体的な二次構造中に完全なヘアピンを形成し、このステムは有益であって、塩基対の量は、完全なヘアピンを形成する任意の量であってもよい。一側面では、sgRNA全体の二次構造が保持されている限り、（例えば長さに関して）任意の相補的なX：Y塩基対配列は許容される。一側面では、ステムは、DR：tracr二重鎖および3個のステムループを有するという点で、sgRNA全体の二次構造を破壊しないX：Y塩基対形成の形態であってもよい。一側面では、ACTTとAAGT（またはX：Y塩基対からなる任意の代替ステム）を接続する「gttt」四塩基ループは、sgRNAの全体の二次構造を分断しない同じ長さ（例えば4塩基対）以上の任意の配列であってもよい。一側面では、ステムループは、ステムループ2をさらに伸長するものであってもよく、例えばMS2アプタマーであってもよい。一側面では、ステムループ3「GGCACCGagtCGGTGC」（配列番号399）は、同様に「XXXXXXXagtYYYYYYY」（配列番号400）形態を取ってもよく、例えば、X：7およびY：7は、共に互いに対し塩基対となってステムを形成する任意の相補的なヌクレオチド組を表す。一側面では、ステムは、相補的なX配列およびY配列を含む約7塩基対を含むが、より多い、またはより少ない塩基対のステムもまた想定される。一側面では、XおよびYヌクレオチドからなるステムは、「agt」とともに、全体的な二次構造中に完全なヘアピンを形成する。一側面では、sgRNA全体の二次構造が保持されている限り、任意の相補的X：Y塩基対配列が許容される。一側面では、ステムは、DR：tracr二重鎖および3つのステムループを有するという点で、sgRNA全体の二次構造を破壊しないX：Y塩基対形成の形態であってもよい。一側面では、ステムループ3の「agt」配列は、伸長されるか、またはMS2アプタマーなどのアプタマー、またはその他の方法で一般にステムループ3の構築物を保持する配列によって置換されてもよい。代替ステムループ2および/または3の１つの側面では、XおよびYの各対は任意の塩基対を指していてもよい。一側面では、非ワトソン−クリック塩基対が想定されており、この場合に、その対は、その他の方法で一般にその位置でステムループの構築物を保持する。
【０２０４】
一側面では、DR：tracrRNA二本鎖は、（ヌクレオチドの標準IUPAC命名法を用いて）gYYYYag(N)NNNNxxxxNNNN(AAN)uuRRRRu（配列番号401）の形態で置換されてもよく、式中、（N）および（AAN）は二重鎖のバルジの一部を表し、「xxxx」はリンカー配列を表す。直接反復のNNNNは、それがtracrRNAの対応するNNNN部分と塩基対を形成する限り、どんなものでもよい。一側面では、DR：tracrRNA二重鎖は、それが全体的な構造を変化させない限り、任意の長さ（xxxx…）かつ任意の塩基組成物のリンカーによって結合されていてもよい。
【０２０５】
一側面では、sgRNAの構造的要件は、二重鎖および3個のステムループを有することである。殆どの側面では、多くの特定の塩基要件での現実的な配列要件は、DR：tracrRNA二重鎖の構築物を保持すべきであるという点で制限は緩く、構築物を形成する配列、すなわちステム、ループ、バルジは、変更されていてもよい。
【０２０６】
第１のアプタマー／RNA結合タンパク質の対を有する１つのガイドは、活性化因子に連結または融合することができ、第２のアプタマー／RNA結合タンパク質の対を有する第２のガイドは、抑制因子に連結または融合することができる。ガイドは異なる標的（遺伝子座）を対象とするので、これにより１つの遺伝子を活性化して１つの遺伝子を抑制できる。例えば、次の系統図はその方式を示している。
【０２０７】
ガイド1：MS2アプタマー------- MS2 RNA結合タンパク質------- VP64活性化因子、および
【０２０８】
ガイド2：PP7アプタマー------- PP7 RNA結合タンパク質------- SID4x抑制因子。
【０２０９】
本発明はまた、オルソゴナル（直交；orthogonal）PP7/MS2遺伝子の標的化に関する。この例では、異なる遺伝子座を標的とするsgRNAは、それぞれ標的遺伝子座を活性化および抑制するMS2-VP64またはPP7-SID4Xを動員するために、個別のRNAループで改変されている。PP7は、バクテリオファージであるシュードモーナス属のRNA結合外皮タンパク質である。MS2と同様に、それは特定のRNA配列および二次構造に結合する。PP7 RNA認識モチーフは、MS2のモチーフとは異なる。その結果、PP7およびMS2を多重化して、異なるゲノム遺伝子座で同時に異なる効果を媒介できる。例えば、遺伝子座Aを標的とするsgRNAをMS2ループで改変してMS2-VP64活性化因子を動員し、遺伝子座Bを標的とする別のsgRNAをPP7ループで改変してPP7-SID4X抑制因子ドメインを動員できる。従って、同じ細胞内で、dC2c1はオルソゴナルである遺伝子座特異的改変を媒介できる。この原理を拡張して、Q-betaなどの他のオルソゴナルRNA結合タンパク質を組み込むことができる。
【０２１０】
オルソゴナル抑制のための別の選択は、相互作用の抑制機能を有する非翻訳RNAループをガイド中に（ガイド中に組み込まれたMS2/PP7ループと同様の位置またはガイドの3’末端のいずれかに）組み込むことを含む。例えば、ガイドは（抑制的であることは知られているが）非翻訳RNAループにより（例えば、哺乳類細胞中のRNAポリメラーゼIIに干渉する（RNA内の）Alu抑制因子を使用して）設計された。Alu RNA配列は、本明細書で使用される（例えば、四塩基ループおよび／またはステムループ2での）MS2 RNA配列に代えて配置され、かつ／あるいはガイドの3’末端に配置された。これにより、四塩基ループ位置および／またはステムループ2位置でMS2、PP7、またはAluの可能な組み合わせが得られ、任意にガイドの3’末端にAluが（リンカーの有無にかかわらず）付加される。
【０２１１】
２つの異なるアプタマー（別々のRNA）を使用すると、異なるガイドと共に、活性化因子−アダプタータンパク質融合および抑制因子−アダプタータンパク質融合を使用して、１つの遺伝子の発現を活性化する一方で、別の遺伝子を抑制することが可能になる。これらアプタマーは、これらの異なるガイドとともに、多重化された手法で、共にあるいは実質的に共に付与することができる。例えば10または20または30個などの多数のこの改変されたガイドを同時に使用してもよいが、比較的少数のC2c1として送達される1個のみ（または少なくとも最小数）のC2c1は、多数の改変されたガイドとともに使用してもよい。アダプタータンパク質は、1個以上の活性化因子または1個以上の抑制因子に会合（好ましくは結合または融合）してもよい。例えば、アダプタータンパク質は、第１の活性化因子および第２の活性化因子と会合してもよい。第１および第２の活性化因子は同一であってもよいが、これらは、好ましくは異なる活性化因子である。例えば、一方はVP64であってもよく他方はp65であってもよいが、これらは単なる例であり、他の転写活性化因子が想定される。3個以上さらに4個以上の活性化因子（または抑制因子）を使用してもよいが、封入サイズは、その数が5個を超える異なる機能ドメインにより制限される場合がある。リンカーは、好ましくは、アダプタータンパク質への直接融合よりも多く使用され、この場合は、2個以上の機能ドメインがアダプタータンパク質に会合している。適切なリンカーとして、GlySerリンカーを含んでもよい。
【０２１２】
酵素−ガイド複合体は、全体として、2個以上の機能ドメインと会合してもよいこともまた想定されている。例えば、酵素に会合する2個以上の機能ドメインがあってもよく、あるいは（1個以上のアダプタータンパク質を介して）ガイドに会合する2個以上の機能ドメインがあってもよく、あるいは酵素に会合する1個以上の機能ドメインおよび（1個以上のアダプタータンパク質を介して）ガイドに会合する1個以上の機能ドメインがあってもよい。
【０２１３】
アダプタータンパク質と活性化因子または抑制因子との間の融合は、リンカーを含んでもよい。例えば、GlySerリンカーGGGSを使用してもよい。それらリンカーは、必要に応じて適切な長さを提供するために、3個の（（GGGGS）3）または6、9、さらには12個、またはそれ以上の反復で使用してもよい。リンカーは、RNA結合タンパク質と機能ドメイン（活性化因子または抑制因子）の間に、またはCRISPR酵素（C2c1）と機能ドメイン（活性化因子または抑制因子）の間に使用してもよい。リンカーを使用して、適切な量の「機械的柔軟性」を操作する。
エスコートガイドおよび誘導ガイド
【０２１４】
好ましい実施形態では、直接反復は、1個以上のタンパク質結合RNAアプタマーを含むように改変されてもよい。特定の実施形態では、最適化された二次構造の一部などの1個以上のアプタマーを含んでもよい。これらのアプタマーは、本明細書でさらに詳述されるように、バクテリオファージ外皮タンパク質に結合できる可能性がある。
【０２１５】
特定の実施形態では、ガイドは、エスコートされたガイドである。「エスコートされた」とは、Cas12b CRISPR-Casシステムまたは複合体またはガイドが指定の時間でまたは細胞内の場所に送達されることを意味し、その結果、Cas12b CRISPR-Casシステムまたは複合体またはガイドの活性は、空間的または時間的に制御される。例えば、Cas12b CRISPR-Casシステムまたは複合体またはガイドの活性および目的地は、細胞表面タンパク質または他の局在化した細胞成分などのアプタマーリガンドに対して結合親和性を有するエスコートRNAアプタマー配列によって制御されてもよい。あるいは、エスコートアプタマーは、例えば、特定の時間に細胞に適用される外部エネルギー源の一時的エフェクターなどの、細胞表面または細胞内のアプタマーエフェクターに応答してもよい。
【０２１６】
エスコートされたCas12b CRISPR-Casシステムまたは複合体は、ガイド分子構造、構築物、安定性、遺伝子発現、またはそれらの任意の組合せを改善するように設計された機能的構造を備えるガイド分子を有する。この構造は、アプタマーを含んでもよい。
【０２１７】
アプタマーは、例えば、指数関数的な濃縮によるリガンドの系統的進化と呼ばれる技術を使用して、他のリガンドに強固に結合するように設計または選択されることが可能な生体分子である（SELEX; Tuerk C, Gold L:「指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化：バクテリオファージT4 DNAポリメラーゼに対するRNAリガンド」“Systematic evolution of ligands by exponential enrichment: RNA ligands to bacteriophage T4 DNA polymerase.” Science 1990, 249:505-510）。核酸アプタマーは、例えば、無作為配列オリゴヌクレオチドの集合から選択されてもよく、生物医学的に関連する広範囲の標的に対して高い結合親和性および特異性を有して、アプタマーの幅広い治療的有用性を示唆している（Keefe, Anthony D., Supriya Pai, and Andrew Ellington.「治療薬としてのアプタマー」"Aptamers as therapeutics." Nature Reviews Drug Discovery 9.7 (2010): 537-550）。これらの特徴はまた、薬物送達媒体としてのアプタマーの幅広い使用を示唆している（Levy-Nissenbaum, Etgar, et al.「ナノテクノロジーおよびアプタマー：薬物送達への応用」"Nanotechnology and aptamers: applications in drug delivery." Trends in biotechnology 26.8 (2008): 442-449、およびHicke BJ, Stephens AW.「エスコートアプタマー：診断と治療のための送達サービス」“Escort aptamers: a delivery service for diagnosis and therapy.” J Clin Invest 2000, 106:923-928.）。アプタマーは、分子スイッチとして機能するように構築され、蛍光体に結合して緑色蛍光タンパク質の活性を模倣するRNAアプタマーなどの変化特性に応答する（Paige, Jeremy S., Karen Y. Wu, and Samie R. Jaffrey.「緑色蛍光タンパク質のRNA模倣物」"RNA mimics of green fluorescent protein." Science 333.6042 (2011): 642-646）。アプタマーは、例えば細胞表面タンパク質を標的とする標的化されたsiRNA治療送達システムの成分として使用されてもよいことも示唆されている（Zhou, Jiehua, and John J. Rossi.「アプタマー標的化細胞特異的RNA干渉」"Aptamer-targeted cell-specific RNA interference." Silence 1.1 (2010): 4）。
【０２１８】
従って、特定の実施形態では、ガイド分子は、例えば、細胞膜を貫通して細胞内区画に、または核内に送達することを含む、ガイド分子の送達を改善するように設計された1個以上のアプタマーによって改変される。この構造は、1個以上のアプタマーに加えて、またはその1個以上のアプタマーを含まずに、選択されたエフェクターにガイド分子を送達可能、誘導可能、または応答可能にするような部分を含んでもよい。従って、本発明は、限定はされないが、ｐＨ、低酸素、Ｏ２濃度、温度、タンパク質濃度、酵素濃度、脂質構造、露光量、機械的破壊（例えば超音波）、磁界、電界、または電磁放射を含む、正常または病理学的かつ生理学的な状態に応答するガイド分子を包含する。
【０２１９】
誘導性システムの光応答性は、クリプトクロム-2およびCIB1の活性化および結合を介して達成されてもよい。青色光刺激は、クリプトクロム-2に活性な高次構造変化を誘発して、その結合相手であるCIB1の動員をもたらす。この結合は高速かつ可逆的であり、パルス刺激後に15秒未満で飽和して、刺激の終止後に15分未満で基準線に戻る。これらの迅速な結合動態は、誘導剤の取込みおよび排出ではなく、転写／翻訳および転写物／タンパク質の分解の速度によってのみ一時的に結合されるシステムをもたらす。クリプトクロム-2の活性化もまた非常に感度が高く、低光度による刺激の使用を可能にし、光毒性のリスクを軽減する。さらに、無処置の哺乳動物の脳などの環境では、可変光強度を使用して刺激領域のサイズを制御でき、ベクター送達のみが提供するよりも高い精度を可能にする。
【０２２０】
本発明では、ガイドを誘導するために、電磁放射、音響エネルギー、または熱エネルギーなどのエネルギー源が考えられる。好ましくは、電磁放射は可視光の構成要素である。好ましい実施形態では、光は、約450〜約495 nmの波長を有する青色光である。特に好ましい実施形態では、波長は約488 nmである。別の好ましい実施形態では、光刺激はパルス状である。光出力は、約0〜9m W/cm2の範囲であってもよい。好ましい実施形態では、15秒毎に0.25秒という短い刺激構造が最大の活性化をもたらすはずである。
【０２２１】
化学的またはエネルギー感受性のガイドは、化学原料の結合によって、あるいはガイドとして作用しかつC2c1 CRISPR-Casシステムまたは複合的な機能をもつことを可能とするエネルギーによって誘導されると、高次構造変化を受ける可能性がある。本発明は、ガイド機能およびC2c1 CRISPR-Casシステムまたは複合的な機能を有するように、化学原料またはエネルギーを使用すること、および必要に応じて、ゲノム遺伝子座の発現が変化していることをさらに決定することを含んでもよい。
【０２２２】
この化学的誘導性システムには、いくつかの種々の方式が存在する。これら方式は、１）アブシジン酸（ABA）によって誘導可能なABI-PYL系システム（例えば、stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/sigtrans;4/164/rs2を参照）、２）ラパマイシン（またはラパマイシンに基づく関連化学物質）によって誘導されるFKBP-FRB系システム（例えば、www.nature.com/nmeth/journal/v2/n6/full/nmeth763.htmlを参照）、および３）ジベレリン（GA）によって誘導可能なGID1-GAI系システム（例えば、www.nature.com/nchembio/journal/v8/n5/full/nchembio.922.htmlを参照）である。
【０２２３】
化学的誘導性システムは、4-ヒドロキシタモキシフェン（4OHT）によって誘導可能なエストロゲン受容体（ER）系システムであってもよい（例えば、www.pnas.org/content/104/3/1027.abstractを参照）。ERT2と呼ばれるエストロゲン受容体の変異したリガンド結合ドメインは、4-ヒドロキシタモキシフェンの結合時に細胞の核内に移動する。本発明のさらなる実施形態では、任意の核内受容体、甲状腺ホルモン受容体、レチノイン酸受容体、エストロゲン受容体、エストロゲン関連受容体、グルココルチコイド受容体、プロゲステロン受容体、およびアンドロゲン受容体の任意の天然起源または遺伝子操作された誘導体を、ER系の誘導性システムに類似した誘導性システムに使用してもよい。
【０２２４】
別の誘導性システムは、エネルギー、熱、または電波によって誘導可能な一過性受容体電位（TRP）イオンチャネル系システムを使用する方式に基づく（例えば、www.sciencemag.org/content/336/6081/604を参照）。これらのTRPファミリータンパク質は、光および熱などの様々な刺激に応答する。このタンパク質が光または熱によって活性化されると、イオンチャネルが開き、カルシウムなどのイオンが原形質膜に進入することができる。このイオンの流入は、C2c1 CRISPR-Cas複合体またはシステムのガイドおよび他の成分を含むポリペプチドに連結された細胞内イオン相互作用相手に結合し、この結合はポリペプチドの細胞内局在化の変化を誘発して、ポリペプチド全体の細胞核への進入を導く。核内に入ると、C2c1 CRISPR-Cas複合体のガイドタンパク質およびその他の成分が活性になり、細胞内の標的遺伝子の発現を調節する。
【０２２５】
光活性化は有効な実施形態ではあるものの、特に光が皮膚または他の器官を透過しない可能性があるin vivo用途にとっては、不都合な場合がある。この場合には、エネルギー活性化のその他の方法、特に同様の効果を有する電界エネルギーおよび／または超音波が考えられる。
【０２２６】
電界エネルギーは、好ましくは、in vivo条件下で約1 V/cm〜約10 kV/cmの１つ以上の電気パルスを使用して、当技術分野に説明されるように実質的に印加される。パルスに代えて、またはパルスに加えて、電界は連続的な方法で送達されてもよい。電気パルスを、1マイクロ秒〜500ミリ秒、好ましくは1マイクロ秒〜100ミリ秒で適用してもよい。電界を、連続的に、またはパルス方式で約５分間印加してもよい。
【０２２７】
本明細書で使用される「電界エネルギー」は、細胞が曝露される電気エネルギーである。好ましくは、電界は、in vivo条件下で約1 V/cm〜約10 kV/cmまたはそれ以上の強度を有する（国際特許出願WO97/49450号を参照）。
【０２２８】
本明細書で使用される用語「電場」は、可変静電容量および電圧で、指数関数波および／または矩形波および／または変調波および／または変調矩形波の形態を含む１つ以上のパルスを含む。電界および電気についての記載は、細胞の環境での電位差の存在の記載を含むと解釈すべきである。この環境は、当技術分野で知られるように、静電気、交流(AC)、直流(DC)などによって設定してもよい。電界は、均一、不均一、またはその他の形態であってもよく、時間に依存して強度および／または方向が変化してもよい。
【０２２９】
電場の単一または複数の印加、ならびに超音波の単一または複数の印加もまた、任意の順序および任意の組合せにより可能である。超音波および／または電場は、単一または複数の連続的な印加として、またはパルスとして送達されてもよい（脈動送達）。
【０２３０】
エレクトロポレーション（電気穿孔）は、生細胞に異物を導入するために、in vitroおよびin vivoの両方の手順で使用されてきた。in vitro適用では、生細胞の試料はまず関心のある薬剤と混合されて、平行平板などの電極の間に配置される。次に、電極は細胞／移植物の混合物に電界を印加する。in vitroエレクトロポレーションを実行するシステム例として、Electro Cell ManipulatorECM600、およびElectroSquare Porator T820があげられ、どちらもGenetronics、IncのBTX部門によって製造されている（米国特許第5,869,326号を参照）。
【０２３１】
（in vitroおよびin vivo両方の）既知のエレクトロポレーション技術を、治療領域の周りに配置された電極に短い高電圧パルスを印加して機能させる。電極間に発生する電界により、細胞膜が一時的に多孔質になり、関心のある薬剤分子が細胞に進入する。既知のエレクトロポレーション用途では、この電界は、1000 V/cmで約100マイクロ秒の持続時間の単一の矩形波パルスを含む。このパルスは、例えば、Electro Square Porator T820の既知の適用法により生成してもよい。
【０２３２】
好ましくは、電界は、in vitro条件下で約1 V/cm〜約10 kV/cmの強度を有する。従って、電界は、1 V/cm、2 V/cm、3 V/cm、4 V/cm、5 V/cm、6 V/cm、7 V/cm、8 V/cm、9 V/cm、10 V/cm、20 V/cm、50 V/cm、100 V/cm、200 V/cm、300 V/cm、400 V/cm、500 V/cm、600 V/cm、700 V/cm、800 V/cm、900 V/cm、1 kV/cm、2 kV/cm、5 kV/cm、10 kV/cm、20 kV/cm、50 kV/cm、またはそれ以上の強度を有してもよい。より好ましくは、in vitro条件下で約0.5 kV/cm〜約4.0 kV/cmである。好ましくは、電界は、in vivo条件下で約1 V/cm〜約10 kV/cmの強度を有する。しかし、標的部位に送達されるパルスの数を増加させる場合には、電界強度は低下させてもよい。従って、より低い電界強度での電界の脈動送達が想定される。
【０２３３】
好ましくは、電場の印加は、同一強度および静電容量の二重パルス、または様々な強度および／または静電容量の連続パルスなどの複数のパルス形態である。本明細書で使用される用語「パルス」は、可変静電容量および電圧で、指数波および／または矩形波および／または変調波／矩形波形を含む１つ以上の電気パルスを含む。
【０２３４】
好ましくは、電気パルスは、指数波形、矩形波形、変調波形、および変調矩形波から選択される波形として送達される。
【０２３５】
好ましい実施形態では、低電圧の直流を使用する。従って、出願人らは、100ミリ秒以上、好ましくは15分以上の期間にわたって、1 V/cm〜20 V/cmの電界強度で細胞、組織、または組織塊に印加される電界の使用を開示する。
【０２３６】
超音波は、約0.05 W/cm2〜約100 W/cm2の電力水準で有効に付与される。診断用または治療用の超音波、またはそれらの組合せを使用してもよい。
【０２３７】
本明細書で使用される用語「超音波」は、周波数が非常に高くヒトの可聴範囲を超える機械的振動からなるエネルギーの形態を指す。超音波スペクトルの下限周波数は、一般に約20 kHzと見做すことができる。超音波の多くの診断への応用には、1〜15 MHzの範囲の周波数を使用する（医療診断での超音波（Ultrasonics in Clinical Diagnosis）, P. N. T. Wells, ed., 2nd. Edition, Publ. Churchill Livingstone [Edinburgh, London & NY, 1977]を参照）。
【０２３８】
超音波は、診断および治療の両方の用途で使用されてきた。診断手段（「診断用超音波」）として使用する場合に、超音波は通常、最大約100 mW/cm2のエネルギー密度範囲（FDA推奨）で使用されるが、最大750 mW/cm2のエネルギー密度が使用されてきた。理学療法では、超音波は通常、最大約3〜4 W/cm2の範囲（WHO推奨）のエネルギー源として使用される。他の治療用途では、より高い強度の超音波、例えば、100 W/cm2〜1 kW/cm2（またはそれ以上）のHIFUを短時間で使用してもよい。本明細書で使用される用語「超音波」は、診断用超音波、治療用超音波、および集束超音波を包含することを意図している。
【０２３９】
集束超音波（FUS）は、侵襲性プローブを使用せずに熱エネルギーを送達することを可能にする（Morocz et al 1998 Journal of Magnetic Resonance Imaging Vol.8, No. 1, pp.136-142を参照）。集束超音波の別の形態は、Moussatov et al in Ultrasonics (1998) Vol.36, No.8, pp.893-900およびTranHuuHue et al in Acustica (1997) Vol.83, No.6, pp.1103-1106に説明される高強度集束超音波（HIFU）である。
【０２４０】
好ましくは、診断用超音波と治療用超音波の組合せを使用する。しかしながら、この組合せは限定を意図するものではなく、当業者には、超音波の任意の様々な組合せを使用できることが分かる。さらに、エネルギー密度、超音波の周波数、および曝露期間を変更してもよい。
【０２４１】
好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約0.05〜約100 W/cm2の出力密度である。さらに好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約1〜約15 W/cm2の出力密度である。
【０２４２】
好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約0.015〜約10.0 MHzの周波数である。より好ましくは、超音波エネルギー源への曝露は、約0.02〜約5.0 MHzまたは約6.0 MHzの周波数である。最も好ましくは、超音波は3 MHzの周波数で適用される。
【０２４３】
好ましくは、曝露時間は、約10ミリ秒〜約60分である。好ましくは、曝露時間は、約1秒〜約5分である。より好ましくは、超音波は約2分間印加される。しかし分解すべき特定の標的細胞に応じて、曝露はより長い期間、例えば15分間であってもよい。
【０２４４】
好ましくは、標的組織は、約0.05 W/cm2〜約10 W/cm２の音波出力密度、かつ約0.015〜約10 MHzの範囲の周波数の超音波エネルギー源に曝露される（国際特許出願WO98/52609号を参照）。ただし別の条件として、例えば、100 W/cm2を超える音波出力密度での超音波エネルギー源への曝露、また例えば1000 W/cm2でミリ秒などの短時間の曝露も可能である。
【０２４５】
好ましくは、超音波の適用は、複数のパルス形態であり、従って、連続波とパルス波の両方（超音波の脈動送達）を任意に組合せて使用してもよい。例えば、連続波の超音波を印加して、続いてパルス波の超音波を印加してもよく、またはそれらを逆にして印加してもよい。この印加は、任意の順序および組合せで、任意の回数を繰返してもよい。パルス波の超音波を、連続波の超音波をバックグラウンドとして印加してもよく、任意のパルス数を任意の数の群として使用してもよい。
【０２４６】
好ましくは、超音波は、パルス波の超音波を含んでもよい。非常に好ましい実施形態では、超音波は、連続波として0.7 W/cm2または1.25 W/cm2の出力密度で印加される。パルス波の超音波を使用する場合は、より高い出力密度を使用してもよい。
【０２４７】
超音波の使用は、光のように、それを標的に正確に合焦できるので有効である。さらに、超音波は、光とは異なり、組織内により深く合焦できるので有効である。従って、（限定はされないが、肝臓の葉部などの）組織全体への浸透、あるいは（限定はされないが、肝臓全体または心臓などの筋肉全体などの）臓器全体の治療に適している。別の重要な利点は、超音波が非侵襲的な刺激であり、様々な診断用途および治療用途で使用されることである。一例として、超音波は、医療用の画像技術、さらには整形外科治療では周知である。さらに、対象である脊椎動物への超音波の印加に適する機器は、広範囲に利用可能であり、またそれらの使用は当技術分野では周知である。
【０２４８】
本発明の迅速な転写応答および内因性の標的化は、転写の動力学の研究のための理想的なシステムとなる。例えば、本発明は、標的遺伝子の発現が誘導された際の変異体産生の動力学を研究するのに使用されてもよい。転写サイクルの他方の目的として、多数の遺伝子に発現水準の変化をもたらす強力な細胞外刺激に応答するmRNA分解の研究が実施されることも多い。本発明を利用して、内因性標的の転写を可逆的に誘導することができ、その後に、点刺激を停止して、固有標的の分解動態を追跡できる。
【０２４９】
本発明の経時的な精度は、実験操作に呼応する遺伝子調節の時間を測定する能力を提供できる。例えば、長期増強（LTP）に関与している疑いのある標的は、器官型の神経細胞培養物または解離される神経細胞培養物中で調節されてもよいが、細胞の正常な発達を妨げることを避けるため、LTPを誘発する刺激中のみに調節されてもよい。同様に、疾患の表現型を示す細胞モデルでは、特定の治療法の有効性に関与していると疑われる標的は、治療中のみに調節されてもよい。逆に、遺伝性の標的は、病理学的な刺激中にのみ調節されてもよい。外部の実験刺激に対する遺伝的なきっかけの時機が関連する任意の数の実験により、本発明の有用性から潜在的に利益が得られる可能性がある。
【０２５０】
in vivoの環境では、本発明が遺伝子発現を制御するための均等に十分な機会が提供される。光誘導性は、空間精度について潜在能力を提供できる。オプトロード(optrode)技術の発展を利用して、刺激用の光ファイバー導線を高精度に脳領域に配置することができる。次に、刺激領域のサイズを光の強度によって調整してもよい。この調整は、本発明のC2c1 CRISPR-Casシステムまたは複合体の送達とともに実施することができ、または遺伝子組換えのC2c1動物の場合に、本発明のガイドRNAを送達することができ、オプトロード技術は、高精度な脳領域での遺伝子発現の調節を可能とする。透明なC2c1発現生物では、それに投与された本発明のガイドRNAを保持することができ、次いで、非常に高精度なレーザーに誘導された局所遺伝子発現変化が発生する。
【０２５１】
宿主細胞を培養するための培地には、特に、M199-earle base、Eagle MEM（E-MEM）、Dulbecco MEM（DMEM）、SC-UCM102、UP-SFM（GIBCO BRL）、EX-CELL302（ニチレイ）、EX-CELL293-S（ニチレイ）、TFBM-01（ニチレイ）、ASF104などの組織培養に一般的に用いられる培地が含まれる。特定の細胞型に適する培地は、米国培養細胞系統保存機関（ATCC）または欧州培養細胞系統保存機関（ECACC）から入手できる。培地には、L-グルタミンなどのアミノ酸、塩、Fungizone(R)、ペニシリン−ストレプトマイシン、動物血清などの抗真菌剤または抗菌剤を補充してもよい。細胞培養培地は、場合によっては無血清であってもよい。
【０２５２】
本発明はまた、価値のあるin vivoでの経時的精度を提供できる。本発明を用いて、増殖の特定の段階中に遺伝子発現を改変してもよい。本発明を用いて、特定の実験ウィンドウへの遺伝的なきっかけの時間を測定してもよい。例えば、学習に関与する遺伝子は、未処置のげっ歯類または霊長類の脳の高精度な領域での学習刺激中にのみ過剰発現または抑制されてもよい。さらに、本発明を用いて、疾患発症の特定の段階中にのみ遺伝子発現の変化を誘発してもよい。例えば、癌遺伝子は、腫瘍が特定のサイズまたは転移段階に達した時にのみ過剰発現されてもよい。逆に、アルツハイマー病の発症に疑いのあるタンパク質は、動物の生涯中の指定の時点でのみ、かつ特定の脳領域内でのみ抑制されてもよい。これらの例は、本発明の潜在的な用途を網羅的に列記していないが、本発明が強力な技術となる可能性があるいくつかの分野を強調している。
保護ガイド
【０２５３】
特定の実施形態では、ガイド分子は、CRISPR-Casシステムの特異性を高めるために二次構造によって改変されていて、この二次構造は、エキソヌクレアーゼ活性から保護でき、本明細書で保護ガイド分子とも呼ばれるガイド配列への5’付加を可能にする。
【０２５４】
一側面では、本発明は、「プロテクターRNA」をガイド分子の配列にハイブリダイズすること開示し、「プロテクターRNA」は、ガイド分子の3’末端に相補的なRNA鎖であり、それにより部分二本鎖ガイドRNAを生成する。本発明の一実施形態では、不一致塩基（すなわちガイド配列の一部を形成しないガイド分子の塩基）を完全に相補的なプロテクター配列で保護すると、標的DNAが3’末端で不一致塩基対に結合する可能性を低下させる。本発明の特定の実施形態では、伸長された長さを含む追加の配列がさらに、ガイドがガイド分子内にプロテクター配列を含むように、ガイド分子内に存在してもよい。この「プロテクター配列」では、ガイド分子が（標的配列にハイブリダイズするガイド配列の一部を含む）「露出された配列」に加えて「保護された配列」を含むことが確実である。特定の実施形態では、ガイド分子は、ヘアピンなどの二次構造を含むようにプロテクターガイドの存在によって改変される。好都合なことに、保護された配列、ガイド配列、またはその両方に対して相補性を有する3個または4個〜30個以上、例えば、約10個以上の連続する塩基対が存在する。好都合なことに、保護部分は、その標的と相互作用するCRISPR-Casシステムの熱力学を妨害しない。部分二本鎖のガイド分子を含むそのような伸長を提供して、ガイド分子は保護されていると見做され、特定の活性を維持しながら、CRISPR-Cas複合体に特異的結合の改善をもたらす。
【０２５５】
ゲノム標的に一致するガイドRNA（gRNA）伸長は、gRNAの保護を提供し、かつ特異性を増強する。個々のゲノム標的のスペーサーシード部の末端から遠位にある一致配列を有するgRNAの伸長は、特異性を増強するように想定される。特異性を増強する一致gRNAの伸長は、切り詰めされていない細胞で観察されている。これらの安定な長さへの伸長に伴うgRNA構造の予測は、安定した形態が保護状態から生じることを示しており、スペーサー伸長部とスペーサーシード部中の相補配列により、伸長によりgRNAシードとともに閉ループを形成する。これらの結果は、保護されたガイドの概念として、20merのスペーサー結合領域の遠位にあるゲノム標的配列に一致する配列も含むことを示している。熱力学的予測を用いて、保護されたgRNA状態をもたらす完全に一致または部分的に一致するガイド伸長を予測できる。これにより、保護gRNAの概念がXとZの間の相互作用に拡張され、ここで、Xの長さは通常17〜20ヌクレオチド長であり、Zの長さは1〜30ヌクレオチド長である。熱力学的予測を使用して、Zの最適な伸長状態を決定し、Zに少数の不一致を導入して、XとZの間の保護された立体構造の形成を促進する可能性がある。本出願の全体を通して、用語「X」および「シード長（SL）」は、標的DNAが結合するために利用可能なヌクレオチドの数を示す露出長（EpL）という用語と互換的に使用され、用語「Y」および「プロテクターの長さ（PL）」は、プロテクターの長さを表すように互換的に使用され、また用語「Z」、「E」、「E’」および「EL」は、標的配列が伸長されるヌクレオチドの数を表す用語「伸長長さ（ExL）」に対応するように互換的に使用される。
【０２５６】
伸長長さ（ExL）に対応する伸長配列は、場合によっては、保護されるガイド配列の3’末端でガイド配列に直接付加されてもよい。伸長配列は、2〜12ヌクレオチド長であってもよい。好ましくは、ExLは、0、2、4、6、8、10、または12ヌクレオチド長として示されてもよい。好ましい実施形態では、ExLは、0または4ヌクレオチド長として示されている。より好ましい実施形態では、ExLは4ヌクレオチド長である。伸長配列は、標的配列に相補的であってもよく、相補的でなくてもよい。
【０２５７】
伸長配列はさらに、場合によっては、保護されるガイド配列の5’末端のガイド配列、ならびに保護する配列の3’末端に直接接合されてもよい。結果として、伸長配列は、保護される配列と保護する配列との間の連結する配列として機能する。理論に拘束されることを望まないが、このような連結は、保護する配列の保護される配列への結合を改善するために、保護する配列を保護される配列の近傍に配置してもよい。シード、プロテクター、および伸長の上述の関係は、例えばCasシステムで機能するガイドなどのガイドの遠位端（すなわち標的端部）が5’末端である場合に成り立つことが分かる。ガイドの遠位端が3’末端である実施形態では、その関係は逆になる。この実施形態では、本発明は、「プロテクターRNA」をガイド配列にハイブリダイズすることを開示し、「プロテクターRNA」は、ガイドRNA（gRNA）の3’末端に相補的なRNA鎖であり、それにより部分的に二重鎖gRNAを生成する。
【０２５８】
gRNAの遠位端へのgRNA不一致の付加により、特異性を増強できることが示される。Y中の保護されていない遠位での不一致の導入、または遠位の不一致（Z）を伴うgRNAの伸長により、特異性を増強できることが示される。前述のこの概念は、保護されたgRNAで使用されるX、Y、およびZ成分に関連付けられている。保護されていない不一致の概念は、保護されたガイドRNAに関し説明されるX、Y、およびZの概念へ、さらに一般化することができる。
tru-ガイド
【０２５９】
特定の実施形態では、切り詰め型ガイド（tru-guide）、すなわち標準的なガイド配列長さに対して長さが切り詰められたガイド配列を含むガイド分子が用いられる。Nowak et al.（Nucleic Acids Res (2016) 44 (20): 9555-9564）によって説明されているように、このようなガイドは、触媒的に活性なCRISPR-Cas酵素が標的DNAを切断することなくその標的に結合することを可能にする。特定の実施形態では、標的の結合を可能にするが、CRISPR-Cas酵素のニッカーゼ活性のみを保持する切り詰め型ガイドが用いられる。
【０２６０】
特定の実施形態では、ガイド分子は、直接反復配列に結合されたガイド配列、または直接反復配列およびtracr配列に結合されたガイド配列を含み、ここで、直接反復配列、crRNA配列、および／またはtracr配列は、1個以上のステムループまたは最適化された二次構造を含む。特定の実施形態では、直接反復は、16ヌクレオチド長の最小長および単一のステムルーフ゜を有する。さらなる実施形態では、直接反復は、16ヌクレオチド長を超える、好ましくは17ヌクレオチド長を超える長さを有し、2個以上のステムループまたは最適化された二次構造を有する。特定の実施形態では、ガイド分子は、天然の直接反復配列の全部または一部に結合されたガイド配列を含むか、またはそれからなる。典型的なV-B型C2c1/Cas12bガイド分子は（3’→5’方向に）、ガイド配列、およびtracrの3’末端に相補的な相補伸長部（「反復」）を含む。反復およびtracrは、第２の相補的伸長部（反復に相補的であるtracrの「アンチ反復」）およびポリA（RNAではポリUの場合が多い）テール（ターミネーター）を含むステムループ（ループは通常4または5ヌクレオチド長）を形成するように設計された領域を含むキメラガイド中に結合されてもよい。特定の実施形態では、ガイド構築物の特定の側面は、例えば、形質の追加、排除、または置換によって改変できるが、ガイド構築物の特定の他の側面は維持される。遺伝子操作されたガイド分子改変での好ましい位置には、限定はされないが、例えば直接反復配列のステムループなどのC2c1タンパク質および／または標的と複合体を形成する際に露出されるガイド末端およびガイド分子の領域を含む、挿入、欠失、および置換を含む。
キメラガイド
【０２６１】
本発明は、様々なCas12bシステムガイドを提供する。特定の実施形態では、ガイドは、２つのハイブリダイズ可能な部分を含み、第１の部分の3’末端は、第２の部分の5’末端と少なくとも部分的に相補的であり、ハイブリダイズ可能である。特定の実施形態では、２つの部分は結合されている。すなわち、ガイド配列に対応する5’末端の第１の区画および天然のCas12bガイドの直接反復を含み、Cas12b tracr配列に対応する3’末端の第２の区画に結合された単一のガイド（「キメラガイド」）を使用できる。２つの区画は、第１の区画の3’末端および第２の区画の5’末端の相補配列が、例えばステムループ構造中でハイブリダイズできるように結合される。
死滅ガイド
【０２６２】
一側面では、本発明は、CRISPR複合体の形成および標的への結合の成功を可能にする方法で改変されたガイド配列を提供するが、同時にヌクレアーゼ活性を成功することは不可能である（すなわち、ヌクレアーゼ活性は無く、挿入欠失活性も無い）。説明によっては、この改変されたガイド配列は、「死滅ガイド（dead guide）」または「死滅ガイド配列（dead guide sequence）」と呼ばれる。これらの死滅ガイドまたは死滅ガイド配列は、ヌクレアーゼ活性に関して触媒的に不活性であるか、または立体配座的に不活性であると考えることができる。ヌクレアーゼ活性は、当技術分野で一般的に用いられるSURVEYOR分析またはディープ配列決定、好ましくはSURVEYOR分析を使用して測定できる。同様に、死滅ガイド配列は、触媒活性を促進する能力、または特異的標的および非特異的標的の結合活性を区別する能力に関する塩基対の形成に十分に関与できない。簡潔に説明すると、SURVEYOR分析では、遺伝子のCRISPR標的部位を精製および増幅し、CRISPR標的部位を増幅するプライマーとともにヘテロ二本鎖を形成することを含む。再アニール後に、産物は製造者の推奨手順に従って、SURVEYORヌクレアーゼおよびSURVEYORエンハンサーS（Transgenomics社製）で処理され、ゲルで分析されて、相対的な帯域強度に基づいて定量化される。
【０２６３】
従って、関連する側面では、本発明は、本明細書に説明の機能的Cas12bを含む非天然起源または遺伝子操作された組成物であるC2c1 CRISPR-Casシステム、およびgRNAが死滅ガイド配列を含むガイドRNA（gRNA）を提供し、それにより、Cas12b CRISPR-Casシステムが、SURVEYOR分析により検出されるシステムの非変異型Cas12b酵素のヌクレアーゼ活性に起因する検出可能な挿入欠失活性は含まずに細胞内の関心のあるゲノム遺伝子座に誘導されるように、gRNAは標的配列にハイブリダイズが可能となる。簡潔に言うと、Cas12b CRISPR-Casシステムが、SURVEYOR分析によって検出されたシステムの非変異Cas12b酵素のヌクレアーゼ活性に起因する検出可能な挿入欠失活性を含まずに細胞内の関心のあるゲノム遺伝子座に誘導されるように、標的配列にハイブリダイズが可能である死滅ガイド配列を含むgRNAは、本明細書では「死滅gRNA」と言う用語で呼ばれる。本明細書の他の段落に説明される本発明によるgRNAのうちのいずれかは、以下に説明されるような死滅gRNA／死滅ガイド配列を含むgRNAとして使用されてもよいことは理解できる。本明細書の他の段落に記載される方法、製品、組成物、および使用のいずれもが、以下でさらに詳述するように、死滅gRNA／死滅ガイド配列を含むgRNAに同等に適用可能である。さらなる解説として、以下の特定の側面および実施形態が提供される。
【０２６４】
CRISPR複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導する死滅ガイド配列の能力は、任意の適切な測定法によって評価されてもよい。例えば、試験される死滅ガイド配列を含む、CRISPR複合体を形成するのに十分なCRISPRシステムの成分は、CRISPR配列の成分をコードするベクターによる遺伝子導入などによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に提供され、続いて、本明細書に説明のSURVEYOR分析などによって標的配列内の優先的な切断を評価してもよい。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、ならびに試験される死滅ガイド配列および試験される死滅ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むCRISPR複合体の成分を提供し、かつ試験ガイド配列の反応と対照ガイド配列の反応の間の標的配列の結合度または切断率を比較することによって、試験管内で評価されてもよい。当業者が思い付くような他の分析法も可能である。死滅ガイド配列は、任意の標的配列を標的にするように選択してもよい。実施形態によっては、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。
【０２６５】
本明細書でさらに説明されるように、いくつかの構造パラメータは、適切なフレームワークがその死滅ガイドに到達することを可能にする。死滅ガイド配列は、それぞれのガイド配列よりも短く、活性なCas12b固有の挿入欠失をもたらす。死滅ガイドは、同一のCas12bに導かれるそれぞれのガイドよりも5%、10%、20%、30%、40%、50%短く、活性なCas12b固有の挿入欠失形成に繋がる。
【０２６６】
以下に説明され、かつ当技術分野で知られているように、gRNA−C2c1特異性の一側面は、そのガイドに適切に連結される直接反復配列である。特にこのことは、直接反復配列がC2c1の起源に依存して設計されることを意味する。従って、検証済みの死滅ガイド配列に利用できる構造データは、C2c1固有の同等物を設計するために使用できる。例えば、2個以上のC2c1エフェクタータンパク質の相同性のあるヌクレアーゼドメインRuvC間の構造的類似性を使用して、設計が同等の死滅ガイドを移送することができる。従って、本明細書での死滅ガイドを、長さおよび配列を適切に改変して、そのようなC2c1特異的同等物を反映させて、CRISPR複合体の形成および標的への結合を成功させてもよいが、同時にヌクレアーゼ活性を成功させることはできない。
【０２６７】
本明細書の文脈ならびに最新の技術での死滅ガイドの使用は、in vitro、ex vivoの両方、およびin vivoの用途でのネットワーク生物学および／またはシステム生物学のために意外でかつ予想外のプラットフォームを提供し、多重遺伝子標的、特に双方向の多重遺伝子標的を可能にする。死滅ガイドを使用する以前は、例えば遺伝子活性の活性化、抑制、および／またはサイレンシングのために複数の標的に対処することは困難であり、場合によっては不可能であった。死滅ガイドの使用により、複数の標的、従って複数の活性を、例えば、同一の細胞、同一の動物、または同一の患者で対処できる。このような多重化は、同時に起こる場合もあれば、所望の時間枠でずれて起こる場合もある。
【０２６８】
例えば、死滅ガイドは、ヌクレアーゼ活性の結果が無くとも、遺伝子標的化のための手段として最初にgRNAを使用することを可能にするとともに、活性化または抑制を誘導する手段を提供する。死滅ガイドを含むガイドRNAは、遺伝子活性の活性化または抑制を可能にする方法で、要素を、特に遺伝子エフェクター（例えば、活性化因子または抑制因子）の機能的な配置を可能にする本明細書の他の段落に記載されるタンパク質アダプター（例えばアプタマー）をさらに含むように改変されてもよい。一例として、本明細書および最新の技術で説明されるように、アプタマーの組込みが挙げられる。死滅ガイドを含むgRNAを遺伝子操作してタンパク質相互作用アプタマーを組み込むことによって（参照により本明細書に組み込まれているKonermann et al.,「遺伝子操作されたCRISPR-Cas9複合体によるゲノム規模での転写活性化」“Genome-scale transcription activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex,” doi:10.1038/nature14136）、複数の異なるエフェクタードメインからなる合成転写活性化複合体を組み立ててもよい。これは、自然な転写活性化プロセスの後にモデル化してもよい。例えば、エフェクター（例えば、活性化因子または抑制因子；活性化因子または抑制因子との融合タンパク質としての二量体化MS2バクテリオファージ外皮タンパク質）に選択的に結合するアプタマー、またはそれ自体がエフェクター（例えば、活性化因子または抑制因子）に結合するタンパク質を、死滅gRNA四塩基ループおよび／またはステムループ2に付加してもよい。MS2の場合に、融合タンパク質MS2-VP64は、四塩基ループおよび／またはステムループ2に結合し、続いて例えばNeurog2の転写性の発現上昇を媒介する。他の転写活性化因子は、例えばVP64、P65、HSF1、およびMyoD1である。この概念の単なる例として、PP7に相互作用するステムループによるMS2ステムループの置換を用いて、抑制要素を動員してもよい。
【０２６９】
従って１つの側面は、死滅ガイドを含む本発明のgRNAであり、このgRNAは、本明細書に説明されるように、遺伝子活性化または抑制を提供する改変をさらに含む。死滅gRNAは1個以上のアプタマーを含んでもよい。アプタマーは、遺伝子エフェクター、遺伝子活性化因子、または遺伝子抑制因子に特異的であってもよい。あるいは、アプタマーは、特定の遺伝子エフェクター、遺伝子活性化因子、または遺伝子抑制因子に特異的であり、かつそれらを動員／結合するタンパク質に特異的であってもよい。活性化因子または抑制因子の動員のための複数の部位が存在する場合に、これらの部位は、活性化因子または抑制因子のいずれかに特異的であることが好ましい。活性化因子または抑制因子の結合のために複数の部位が存在する場合に、これらの部位は、同一の活性化因子または同一の抑制因子に特異的であってもよい。これらの部位はまた、異なる活性化因子または異なる抑制因子に特異的であってもよい。遺伝子エフェクター、遺伝子活性化因子、遺伝子抑制因子は、融合タンパク質の形態で存在してもよい。
【０２７０】
一実施形態では、本明細書に説明の死滅gRNAまたは本明細書に説明のC2c1 CRISPR-Cas複合体は、2個以上のアダプタータンパク質を含む非天然起源または遺伝子操作された組成物を含み、各タンパク質は1個以上の機能ドメインと会合していて、アダプタータンパク質は、死滅gRNAの少なくとも1個のループ中に挿入された個別のRNA配列に結合する。
【０２７１】
従って、一側面は、細胞内の関心のあるゲノム遺伝子座の標的配列にハイブリダイズが可能な死滅ガイド配列を含むガイドRNA（gRNA）を含む、非天然起源または遺伝子操作された組成物を提供する。この死滅ガイド配列は、本明細書で定義されるように、少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むC2c1であり、C2c1は、場合によっては、死滅gRNAの少なくとも1個のループが、1個以上のアダプタータンパク質に結合する個別のRNA配列の挿入によって改変される少なくとも１つの変異を含む。アダプタータンパク質は1個以上の機能ドメインに会合し、または、死滅gRNAは少なくとも1個の非翻訳機能ループを有するように改変され、この組成物は、2個以上のアダプタータンパク質を含み、各タンパク質は1個以上の機能ドメインに会合している。
【０２７２】
特定の実施形態では、アダプタータンパク質は、機能ドメインを含む融合タンパク質であり、融合タンパク質は、場合によっては、アダプタータンパク質と機能ドメインとの間にリンカーを含み、リンカーは、場合によっては、GlySerリンカーを含む。
【０２７３】
特定の実施形態では、死滅gRNAの少なくとも1個のループは、2個以上のアダプタータンパク質に結合する個別のRNA配列の挿入による改変はされていない。
【０２７４】
特定の実施形態では、アダプタータンパク質に会合される1個以上の機能ドメインは、転写活性化ドメインである。
【０２７５】
特定の実施形態では、アダプタータンパク質に会合される1個以上の機能ドメインは、VP64、p65、MyoD1、HSF1、RTA、またはSET7/9を含む転写活性化ドメインである。
【０２７６】
特定の実施形態では、アダプタータンパク質に会合される1個以上の機能ドメインは、転写抑制因子ドメインである。
【０２７７】
特定の実施形態では、転写抑制因子ドメインは、KRABドメインである。
【０２７８】
特定の実施形態では、転写抑制因子ドメインは、NuEドメイン、NcoRドメイン、SIDドメイン、またはSID4Xドメインである。
【０２７９】
特定の実施形態では、アダプタータンパク質に会合される1個以上の機能ドメインのうちの少なくとも1個は、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、DNA組込み活性、RNA切断活性、DNA切断活性、または核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有する。
【０２８０】
特定の実施形態では、DNA切断活性は、Fok1ヌクレアーゼに帰因する。
【０２８１】
特定の実施形態では、死滅gRNAは、死滅gRNAがアダプタータンパク質に結合しさらにC2c1および標的に結合した後に、機能ドメインがその属性機能により作用することを可能にする空間的な方向となるように改変される。
【０２８２】
特定の実施形態では、死滅gRNAの少なくとも1個のループは、四塩基ループおよび／またはループ2である。特定の実施形態では、死滅gRNAの四塩基ループおよびループ2は、個別のRNA配列の挿入によって改変される。
【０２８３】
特定の実施形態では、1個以上のアダプタータンパク質に結合する個別のRNA配列の挿入により、アプタマー配列となる。特定の実施形態では、アプタマー配列は、同じアダプタータンパク質に特異的な2個以上のアプタマー配列である。特定の実施形態では、アプタマー配列は、異なるアダプタータンパク質に特異的な2個以上のアプタマー配列である。
【０２８４】
特定の実施形態では、アダプタータンパク質は、MS2、PP7、Qβ、F2、GA、fr、JP501、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、φCb5、φCb8r、φCb12r、φCb23r、7s、またはPRR1を含む。
【０２８５】
特定の実施形態では、細胞は真核細胞である。特定の実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞、場合によってはマウス細胞である。特定の実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。
【０２８６】
特定の実施形態では、第１のアダプタータンパク質は、p65ドメインに会合し、第２のアダプタータンパク質は、HSF1ドメインに会合する。
【０２８７】
特定の実施形態では、組成物は、少なくとも３つの機能ドメインを有するC2c1 CRISPR-Cas複合体を含み、そのうちの少なくとも１つはC2c1に会合し、少なくとも２つは死滅gRNAに会合する。
【０２８８】
特定の実施形態では、組成物は第２のgRNAをさらに含み、第２のgRNAは、C2c1 CRISPR-Casシステムが、システムのC2c1酵素のヌクレアーゼ活性から生じる第２のゲノム遺伝子座に位置する、検出可能な挿入欠失活性を持つ細胞中の第２の関心のあるゲノム遺伝子座に誘導されるように、第２の標的配列にハイブリダイズが可能な生gRNAである。
【０２８９】
特定の実施形態では、組成物は、複数の死滅gRNAおよび／または複数の生gRNAをさらに含む。
【０２９０】
本発明の一側面は、gRNA足場のモジュール性およびカスタマイズ可能性を利用して、個別の型のエフェクターをオルソゴナル的に動員するための異なる結合部位（特にアプタマー）を有する一連のgRNA足場を構築することである。繰り返しになるが、より広い概念の例およびその例示のために、PP7相互作用ステムループによるMS2ステムループの置換を利用し、抑制要素を結合／動員して、多重化された双方向転写制御を可能とする。従って、一般に、死滅ガイドを含むgRNAを使用して、多重転写制御および好適な双方向転写制御を提供してもよい。この転写制御は遺伝子には最も好ましい。例えば、死滅ガイドを含む1個以上のgRNAを、１つ以上の標的遺伝子の活性化を標的化するために使用してもよい。同時に、死滅ガイドを含む1個以上のgRNAを、１つ以上の標的遺伝子の抑制を標的化するために使用してもよい。このような配列は、様々な異なる組合せに適用されてもよく、その組合せとして、例えば、標的遺伝子がまず抑制され、次に適切な期間で他の標的が活性化される、あるいは選択遺伝子が活性化されると同時に選択遺伝子が抑制され、その後にさらに活性化および／または抑制されるなどが挙げられる。結果として、１つ以上の生体システムの複数の成分が、有効に共に処理されてもよい。
【０２９１】
一側面では、本発明は、死滅gRNAまたはC2c1 CRISPR-Cas複合体または本明細書に説明の組成物をコードする核酸分子を提供する。
【０２９２】
一側面では、本発明は、本明細書に定義の死滅ガイドRNAをコードする核酸分子を含むベクターシステムを提供する。特定の実施形態では、ベクターシステムは、C2c1をコードする核酸分子をさらに含む。特定の実施形態では、ベクターシステムは、（生）gRNAをコードする核酸分子をさらに含む。特定の実施形態では、核酸分子またはベクターは、ガイド配列（gRNA）をコードする核酸分子かつ／あるいはC2c1および／または任意の核局在化配列をコードする核酸分子に操作可能に結合された、真核細胞中で操作可能な調節エレメントをさらに含む。
【０２９３】
別の実施形態では、構造解析を用いて、死滅ガイドとDNA結合を可能にするがDNA切断を可能にしない活性C2c1ヌクレアーゼとの間の相互作用を検討できる。このように、C2c1のヌクレアーゼ活性に重要なアミノ酸が決定される。このようなアミノ酸の改変により、遺伝子編集に使用されるC2c1酵素の改善が可能になる。
【０２９４】
別の側面は、本明細書に説明されならびに当技術分野で知られるように、本明細書で説明の死滅ガイドの使用を、本明細書で説明のCRISPRの他の用途と組み合わせる。例えば、標的多重遺伝子活性または抑制または標的多重双方向遺伝子活性／抑制のための死滅ガイドを含むgRNAは、本明細書で説明のように、ヌクレアーゼ活性を維持するガイドを含むgRNAと組み合わせてもよい。ヌクレアーゼ活性を維持するガイドを含むこのgRNAは、遺伝子活性の抑制を可能にする改変（例えばアプタマー）をさらに含んでもよいか、あるいは含まなくてもよい。ヌクレアーゼ活性を維持するガイドを含むこのgRNAは、遺伝子活性の活性化を可能にする改変（例えばアプタマー）をさらに含んでもよいか、あるいは含まなくてもよい。このように、多重遺伝子制御のための別の手段が導入される（例えば、ヌクレアーゼ活性の無い／挿入欠失活性の無い多重遺伝子標的活性化は、ヌクレアーゼ活性を伴う遺伝子標的抑制と同時に、またはそれと組み合わせて提供されてもよい）。
【０２９５】
例えば、１）１つ以上の遺伝子を標的とし、かつ遺伝子活性化因子の動員のために適切なアプタマーでさらに改変された死滅ガイドを含む（例えば、1〜50個、1〜40個、1〜30個、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個の）１個以上のgRNAを使用して、２）１つ以上の遺伝子を標的とし、かつ遺伝子抑制因子の動員のために適切なアプタマーでさらに改変された死滅ガイドを含む（例えば、1〜50個、1〜40個、1〜30個、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個の）１個以上のgRNAと組み合わせる。次に１）および／または２）を、３）１つ以上の遺伝子を標的とする（例えば、1〜50個、1〜40個、1〜30個、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個の）１個以上のgRNAと組み合わせてもよい。次にこの組合せでは、１）＋２）＋３）、さらに４）１つ以上の遺伝子を標的とし、かつ遺伝子活性化因子の動員のために適切なアプタマーでさらに改変された（例えば、1〜50個、1〜40個、1〜30個、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個の）１個以上のgRNA、の順番で実施してもよい。次にこの組合せでは、１）＋２）＋３）＋４）、さらに５）１つ以上の遺伝子を標的とし、かつ遺伝子抑制因子の動員のために適切なアプタマーでさらに改変された（例えば、1〜50個、1〜40個、1〜30個、1〜20個、好ましくは1〜10個、より好ましくは1〜5個の）１個以上のgRNA、の順番で実施してもよい。結果として、様々な使用および組合せが本発明に含まれる。例えばそれらの組合せは、１）＋２）の組合せ、１）＋３）の組合せ、２）＋３）の組合せ、１）＋２）＋３）の組合せ、１）＋２）＋３）＋４）の組合せ、１）＋３）＋４）の組合せ、２）＋３）＋４）の組合せ、１）＋２）＋４）の組合せ、１）＋２）＋３）＋４）＋５）の組合せ、１）＋３）＋４）＋５）の組合せ、２）＋３）＋４）＋５）の組合せ、１）＋２）＋４）＋５）の組合せ、１）＋２）＋３）＋５）の組合せ、１）＋３）＋５）の組合せ、２）＋３）＋５）の組合せ、および１）＋２）＋５）の組合せである。
【０２９６】
一側面では、本発明は、C2c1 CRISPR-Casシステムを標的遺伝子座に導くための死滅ガイドRNA標的配列（死滅ガイド配列）を設計、評価、または選択するためのアルゴリズムを提供する。特に、死滅ガイドRNAの特異性は、ｉ）GC含量およびii）標的配列の長さの変更に関連し、それにより最適化できることが確認されている。一側面では、本発明は、死滅ガイドRNAの非特異的標的結合または相互作用を最小化する死滅ガイドRNA標的配列を設計または評価するためのアルゴリズムを提供する。本発明の実施形態では、CRISPRシステムを生物中の遺伝子座に誘導するための死滅ガイドRNA標的配列を選択するアルゴリズムは、ａ）遺伝子座中の1個以上のCRISPRモチーフの位置を特定すること、ｂ）ｉ）配列のGC含量を決定し、かつii）生物のゲノム内にCRISPRモチーフに最も近い15個の下流ヌクレオチドの非特異的標的一致があるかどうかを判断して、各CRISPRモチーフの下流の20ヌクレオチド長の配列を分析すること、およびｃ）配列のGC含量が70%以下でありかつ非特異的標的が検出されない場合に、死滅ガイドRNAで使用する15個のヌクレオチド配列を選択することを含む。一実施形態では、GC含量が60%以下である場合に、その配列は標的配列として選択される。特定の実施形態では、GC含量が55%以下、50%以下、45%以下、40%以下、35%以下、または30%以下である場合に、その配列は標的配列として選択される。一実施形態では、遺伝子座の２つ以上の配列が分析されて、最小のGC含量、または次に小さいGC含量、または次に小さいGC含量を有する配列を選択する。一実施形態では、生物のゲノム中で非特異的標的一致が検出されない場合に、その配列は標的配列として選択される。一実施形態では、ゲノムの調節配列中に非特異的標的一致が検出されない場合に、標的配列が選択される。
【０２９７】
一側面では、本発明は官能化されたCRISPRシステムを生物中の遺伝子座に導くための死滅ガイドRNA標的配列を選択する方法を提供し、この方法は、ａ）遺伝子座中の1個以上のCRISPRモチーフの位置を特定すること、ｂ）ｉ）配列のGC含量を決定し、かつii）生物のゲノム内に配列の最初の15ヌクレオチド長の非特異的標的一致があるかどうかを判断して、各CRISPRモチーフの下流の20ヌクレオチド長の配列を分析すること、およびｃ）配列のGC含量が70%以下でありかつ非特異的標的が検出されない場合に、ガイドRNAで使用する配列を選択することを含む。一実施形態では、GC含量が50%以下である場合にその配列は選択される。一実施形態では、GC含量が40%以下である場合にその配列は選択される。一実施形態では、GC含量が30%以下である場合にその配列は選択される。一実施形態では、２つ以上の配列を分析して、最小のGC含量を有する配列を選択する。一実施形態では、非特異的標的一致を、生物の調節配列中で決定する。一実施形態では、遺伝子座は調節領域である。一側面は、前述の方法に従って選択された標的配列を含む死滅ガイドRNAを提供する。
【０２９８】
一側面では、本発明は、官能化されたCRISPRシステムを生物中の遺伝子座に標的化するための死滅ガイドRNAを提供する。本発明の一実施形態では、死滅ガイドRNAは標的配列を含み、標的配列のGC含量は70%以下であり、標的配列の最初の15ヌクレオチド長は、生物中の別の遺伝子座の調節配列中のCRISPRモチーフの下流の非特異的標的配列と一致しない。特定の実施形態では、標的配列のGC含量は、60%以下、55%以下、50%以下、45%以下、40%以下、35%以下、または30%以下である。特定の実施形態では、標的配列のGC含量は、70%~60%、または60%~50%、または50%~40%、または40%~30%である。一実施形態では、標的配列は、遺伝子座の潜在的な標的配列の中で最小のGC含量を有する。
【０２９９】
本発明の一実施形態では、死滅ガイドの最初の15ヌクレオチド長は標的配列と一致する。別の実施形態では、死滅ガイドの最初の14ヌクレオチド長は標的配列と一致する。別の実施形態では、死滅ガイドの最初の13ヌクレオチド長は標的配列と一致する。別の実施形態では、死滅ガイドの最初の12ヌクレオチド長は標的配列と一致する。別の実施形態では、死滅ガイドの最初の11ヌクレオチド長は標的配列と一致する。別の実施形態では、死滅ガイドの最初の10ヌクレオチド長は標的配列と一致する。本発明の一実施形態では、死滅ガイドの最初の15ヌクレオチド長は、別の遺伝子座の調節領域中のCRISPRモチーフの下流の非特異的標的配列と一致しない。他の実施形態では、死滅ガイドの最初の14ヌクレオチド長もしくは最初の13ヌクレオチド長、またはそのガイドの最初の12ヌクレオチド長、または死滅ガイドの最初の11ヌクレオチド長、または死滅ガイドの最初の10ヌクレオチド長は、別の遺伝子座の調節領域中のCRISPRモチーフの下流の非特異的標的配列と一致しない。他の実施形態では、死滅ガイドの最初の15ヌクレオチド長、または14ヌクレオチド長、または13ヌクレオチド長、または12ヌクレオチド長、または11ヌクレオチド長は、ゲノム中のCRISPRモチーフの下流の非特異的標的配列と一致しない。
【０３００】
特定の実施形態では、死滅ガイドRNAは、標的配列と一致しない3’末端に追加のヌクレオチドを含む。従って、CRISPRモチーフの下流に最初の15ヌクレオチド長、または14ヌクレオチド長、または13ヌクレオチド長、または12ヌクレオチド長、または11ヌクレオチド長を含む死滅ガイドRNAは、3’末端で12ヌクレオチド長、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、またはそれ以上まで長さを伸長できる。
【０３０１】
本発明は、限定はされないが、死滅C2c1（dC2c1）または（官能化されたC2c1または官能化されたガイドを含んでもよい）官能化されたC2c1システムを含むC2c1 CRISPR-Casシステムを遺伝子座に誘導する方法を提供する。一側面では、本発明は、死滅ガイドRNA標的配列を選択し、かつ官能化されたCRISPRシステムを生物中の遺伝子座に誘導する方法を提供する。一側面では、本発明は、死滅ガイドRNA標的配列を選択し、かつ官能化されたC2c1 CRISPR-Casシステムによって標的遺伝子座の遺伝子調節を実施する方法を提供する。特定の実施形態では、この方法を用いて、非特異的標的効果を最小限に抑えながら、標的遺伝子調節を実施する。一側面では、本発明は、2個以上の死滅ガイドRNA標的配列を選択し、かつ官能化されたC2c1 CRISPR-Casシステムによって2個以上の標的遺伝子座の遺伝子調節を実施する方法を提供する。特定の実施形態では、この方法を用いて、非特異的標的効果を最小限に抑えながら、2個以上の標的遺伝子座の調節を実施する。
【０３０２】
一側面では、本発明は、官能化C2c1を生物中の遺伝子座に誘導するための死滅ガイドRNA標的配列を選択する方法を提供し、この方法は、ａ）遺伝子座中の1個以上のCRISPRモチーフの位置を特定すること、ｂ）ｉ）CRISPRモチーフに隣接する10〜15ヌクレオチド長を選択しかつii）配列のGC含量を決定して、各CRISPRモチーフの下流の配列を分析すること、およびｃ）配列のGC含量が40%以上の場合に、ガイドRNAに使用する標的配列として10〜15ヌクレオチド長の配列を選択することを含む。一実施形態では、GC含量が50%以上である場合に、その配列を選択する。一実施形態では、GC含量が60%以上である場合に、その配列を選択する。一実施形態では、GC含量が70%以上である場合に、その配列を選択する。一実施形態では、２つ以上の配列が分析され、最高のGC含量を有する配列が選択される。一実施形態では、この方法は、CRISPRモチーフの下流の配列と一致しない選択された配列の3’末端にヌクレオチドを追加することをさらに含む。一側面は、前述の方法に従って選択された標的配列を含む死滅ガイドRNAを提供する。
【０３０３】
一側面では、本発明は、官能化されたCRISPRシステムを生物中の遺伝子座に誘導するための死滅ガイドRNAを提供し、死滅ガイドRNAの標的配列は、遺伝子のCRISPRモチーフに隣接する10〜15ヌクレオチドからなり、標的配列のCG含量は50%以上である。特定の実施形態では、死滅ガイドRNAは、遺伝子座のCRISPRモチーフの下流の配列と一致しない標的配列の3’末端に付加されたヌクレオチドをさらに含む。
【０３０４】
一側面では、本発明は、1個以上のまたは2個以上の遺伝子座に誘導される単一のエフェクターを提供する。特定の実施形態では、エフェクターは、C2c1に会合し、1個以上のまたは2個以上の選択された死滅ガイドRNAを使用して、C2c1会合エフェクターを1個以上のまたは2個以上の選択された標的遺伝子座に誘導する。特定の実施形態では、エフェクターは、1個以上のまたは2個以上以上の選択された死滅ガイドRNAと会合し、C2c1酵素と複合体を形成すると、それぞれの選択された死滅ガイドRNAは、その会合エフェクターを死滅ガイドRNA標的に局在化させる。そのCRISPRシステムの１つの非限定例は、同一の転写因子による調節の対象となる1個以上のまたは2個以上の遺伝子座の活性を調節する。
【０３０５】
一側面では、本発明は、1個以上の遺伝子座に誘導される2個以上のエフェクターを提供する。特定の実施形態では、2個以上の死滅ガイドRNAが使用され、2個以上のエフェクターのそれぞれは、選択された死滅ガイドRNAに会合し、2個以上のエフェクターのそれぞれは、その死滅ガイドRNAの選択された標的に局在化する。このCRISPRシステムの１つの非限定例は、異なる転写因子による調節の対象となる1個以上のまたは2個以上の遺伝子座の活性を調節する。従って、１つの非限定の実施形態では、２つ以上の転写因子は、単一の遺伝子の異なる調節配列に局在化する。別の非限定の実施形態では、２つ以上の転写因子は、異なる遺伝子の異なる調節配列に局在化する。特定の実施形態では、１つの転写因子は、活性化因子である。特定の実施形態では、１つの転写因子は阻害因子である。特定の実施形態では、１つの転写因子は活性化因子であり、別の転写因子は阻害因子である。特定の実施形態では、同一の調節経路の異なる成分を発現する遺伝子座は調節される。特定の実施形態では、異なる調節経路の成分を発現する遺伝子座は調節される。
【０３０６】
一側面では、本発明はまた、活性なC2c1 CRISPR-Casシステムによって媒介される標的DNAの切断または標的結合および遺伝子調節に特異的な死滅ガイドRNAを設計および選択するための方法およびアルゴリズムを提供する。特定の実施形態では、C2c1 CRISPR-Casシステムは、ある遺伝子座で標的DNAを切断し、同時に別の遺伝子座に結合してその調節を促進する活性なC2c1を用いるオルソゴナル遺伝子制御を提供する。
【０３０７】
一側面では、本発明は、官能化されたCas12bを切断せずに生物中の遺伝子座に誘導するための死滅ガイドRNA標的配列を選択する方法を提供する。特定の実施形態では、この方法は、ａ）遺伝子座中の1個以上のCRISPRモチーフの位置を特定すること、ｂ）ｉ）CRISPRモチーフに隣接する10〜15ヌクレオチド長を選択しかつii）配列のGC含有量を決定して、各CRISPRモチーフの下流の配列を分析すること、およびｃ）配列のGC含量が30%以上、40%以上の場合に、死滅ガイドRNA中で使用する標的配列として10〜15ヌクレオチド長の配列を選択することを含む。特定の実施形態では、標的配列のGC含量は、35%以上、40%以上、45%以上、50%以上、55%以上、60%以上、65%以上、または70%以上である。特定の実施形態では、標的配列のGC含有量は、30%〜40%、または40%〜50%、または50%〜60%、または60%〜70%である。本発明の一実施形態では、遺伝子座内の２つ以上の配列が分析され、最大のGC含量を有する配列が選択される。
【０３０８】
本発明の一実施形態では、GC含量が評価される標的配列の部分は、PAMに最も近い15個の標的ヌクレオチドのうちの10〜15個の連続するヌクレオチドである。本発明の実施形態では、GC含量が考慮に入れられるガイド部分は、PAMに最も近い15個の連続ヌクレオチドの内の10〜11ヌクレオチド、または11〜12ヌクレオチド、または12〜13ヌクレオチド、または13、または14、または15ヌクレオチドである。
【０３０９】
一側面では、本発明はさらに、機能的活性化または阻害を回避しながら、CRISPRシステム遺伝子座の切断を促進する死滅ガイドRNAを識別するためのアルゴリズムを提供する。16〜20ヌクレオチドの死滅ガイドRNA中のGC含量の増加は、DNA切断の増加および機能的活性化の減少と一致することが観察されている。
【０３１０】
官能化されたCas12bの効率は、CRISPRモチーフの下流の標的配列に一致しないガイドRNAの3’末端にヌクレオチドを付加して増大させることができる。例えば、長さが11〜15ヌクレオチド長の死滅ガイドRNAでは、ガイドが短いと標的の切断が促進される可能性は低くなるが、CRISPRシステムの結合および機能制御を促進する効率もまた低下する。特定の実施形態では、死滅ガイドRNAの3’末端に標的配列と一致しないヌクレオチドの付加は、望ましくない標的切断を増加させずに、活性化効率を増大させる。一側面では、本発明はまた、DNA切断を促進することなく、DNAを結合および遺伝子を調節するCRISPRシステム機能を効果的に促進する死滅ガイドRNAの改善を識別するための方法およびアルゴリズムを提供する。従って、特定の実施形態では、本発明は、CRISPRモチーフの下流の最初の15ヌクレオチド長、または14ヌクレオチド長、または13ヌクレオチド長、または12ヌクレオチド長、または11ヌクレオチド長を含み、かつ3’末端での長さが標的に不一致であるヌクレオチドにより12ヌクレオチド長、13ヌクレオチド長、14ヌクレオチド長、15ヌクレオチド長、16ヌクレオチド長、17ヌクレオチド長、18ヌクレオチド長、19ヌクレオチド長、20ヌクレオチド長、またはそれ以上に伸長される死滅ガイドRNAを提供する。
【０３１１】
一側面では、本発明は、選択的オルソゴナル遺伝子制御を実施する方法を提供する。本明細書の開示から分かるように、本発明による死滅ガイドの選択は、ガイド長およびGC含量を考慮して、機能的Cas12b CRISPR-Casシステムによる効果的かつ選択的な転写制御を提供して、例えば、活性化または阻害によって遺伝子座の転写を調節し、非特異的標的効果を最小限に抑える。従って、個々の標的遺伝子座の効果的な調節を提供して、本発明はまた、2個以上の標的遺伝子座の効果的なオルソゴナル調節を提供する。
【０３１２】
特定の実施形態では、オルソゴナル遺伝子制御は、2個以上の標的遺伝子座の活性化または阻害に基づく。特定の実施形態では、オルソゴナル遺伝子制御は、1個以上の標的遺伝子座の活性化または阻害、および1個以上の標的遺伝子座に基づく。
【０３１３】
一側面では、本発明は、本明細書に説明の方法またはアルゴリズムに従って開示あるいは産出された1個以上の死滅ガイドRNAを含む非天然起源のCas12b CRISPR-Casシステムを含む細胞を提供し、これら1個以上の遺伝子産物の発現は改変されている。本発明の一実施形態では、2個以上の遺伝子産物の細胞内での発現は改変されている。本発明はまた、その細胞からの細胞株を提供する。
【０３１４】
一側面では、本発明は、本明細書に説明の方法またはアルゴリズムに従って開示あるいは産出された1個以上の死滅ガイドRNAを含む非天然起源のCas12b CRISPR-Casシステムを含む1個以上の細胞を含む多細胞生物を提供する。一側面では、本発明は、本明細書に説明の方法またはアルゴリズムに従って開示あるいは産出された1個以上の死滅ガイドRNAを含む非天然起源のCas12b CRISPR-Casシステムを含む細胞、細胞株、または多細胞生物からの産物を提供する。
【０３１５】
本発明のさらなる側面は、本明細書に説明の死滅ガイドを含むgRNAの使用であり、場合によっては、本明細書に説明あるいは最新技術のガイドを含むgRNAと組み合わせた使用であり、あるいはCas12bの過剰発現または好ましくはCas12bのノックインのいずれかにより遺伝子操作された細胞、遺伝子導入動物、遺伝子導入マウス、誘導性遺伝子導入動物、誘導性遺伝子導入マウスなどのシステムと組み合わせた使用である。結果として、単一のシステム（例えば、遺伝子導入動物、細胞）は、システム／ネットワーク生物学での多重遺伝子改変の基礎として役立ててもよい。死滅ガイドの寄与により、このシステムは、現在、in vitro、ex vivoの両方、およびin vivoで可能となっている。
【０３１６】
例えば、Cas12bが提供されると、1個以上の死滅gRNAを提供して、多重遺伝子調節、好ましくは多重双方向遺伝子調節を誘導できる。1個以上の死滅gRNAは、必要な場合または所望の場合に、空間的および時間的に適切な方法で提供されてもよい（例えば、Cas12b発現の組織特異的誘導）。遺伝子導入／誘導性Cas12bが関心のある細胞、組織、動物に提供される（例えば発現される）ために、死滅ガイドを含むgRNAまたはガイドを含むgRNAの両方が同等に効果的である。同様に、本発明のさらなる側面は、本明細書に説明の死滅ガイドを含むgRNAの使用であり、場合によっては、本明細書に説明あるいは最新技術のガイドを含むgRNAと組み合わせた使用であり、あるいはノックアウトCas12b CRISPR-Casにより遺伝子操作された（細胞、遺伝子導入動物、遺伝子導入マウス、誘導性遺伝子導入動物、誘導性遺伝子導入マウスなどの）システムと組み合わせた使用である。
【０３１７】
結果として、本明細書に説明の死滅ガイドと、本明細書に説明のCRISPR処理および当技術分野で既知のCRISPR処理との組合せは、システムの多重選別のための非常に効率的かつ正確な手段をもたらす（例えば、ネットワーク生物学）。この選別は、例えば、疾患、特に遺伝子関連疾患の原因となる遺伝子を認識するための遺伝子活性の特定の組合せ（例えば、特異的／非特異的の組合せ）の識別を可能にする。この選別の好ましい用途は癌である。同様に、その疾患の治療のための選別が本発明に含まれる。細胞または動物は、疾患または疾患に近い影響をもたらす異常な状態に曝される可能性がある。候補の組成物が提供されて、所望の多重環境中での影響に対して選別されてもよい。例えば、患者の癌細胞は、どの遺伝子の組合せがそれら細胞を死滅させるかに関して選別され、次にこの情報を使用して適切な治療法を確立してもよい。
【０３１８】
一側面では、本発明は、本明細書に説明の１つ以上の構成要素を含むキットを提供する。キットは、本明細書に説明のガイドを伴いあるいはガイドを伴わずに本明細書に説明の死滅ガイドを含んでもよい。
【０３１９】
本明細書に提供の構造情報は、標的DNAおよびCas12bとの死滅gRNA相互作用の調査を可能にし、死滅gRNA構造の遺伝子操作または改変を可能にして、Cas12b CRISPR-Casシステム全体の機能性を最適化する。例えば、死滅gRNAのループは、RNAに結合できるアダプタータンパク質の挿入によってCas12bタンパク質と相反することなく伸長できる。これらのアダプタータンパク質は、1個以上の機能ドメインを含むエフェクタータンパク質または融合体をさらに動員できる。
【０３２０】
好ましい実施形態によっては、機能ドメインは、転写活性化ドメイン、好ましくはVP64である。実施形態によっては、機能ドメインは、転写抑制ドメイン、好ましくはKRABである。実施形態によっては、転写抑制ドメインは、SID、またはSIDの鎖状体（例えばSID4X）である。実施形態によっては、機能ドメインは、後成的改変酵素が提供されるように、後成的改変ドメインである。実施形態によっては、機能ドメインは、P65活性化ドメインであってもよい活性化ドメインである。実施形態によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は、1個以上の機能ドメインに会合している。またCas12bエフェクタータンパク質は、RuvCおよび/またはNucドメイン内に１つ以上の変異を含み、それによって形成されたCRISPR複合体は後成的改変因子または転写または翻訳の活性化シグナルまたは抑制シグナルを送達することが可能である。
【０３２１】
本発明の一側面は、上記の要素が単一の組成物に含まれるか、または個々の組成物に含まれることである。これらの組成物は、ゲノムレベルでの機能的効果を引き出すために宿主に効果的に適用されてもよい。
【０３２２】
一般に、死滅gRNAは、（例えば融合タンパク質を介する）結合のための1個以上の機能ドメインを含むアダプタータンパク質に特異的結合部位（例えばアプタマー）を提供するように改変される。改変された死滅gRNAは、死滅gRNAがCRISPR複合体（すなわち死滅gRNAおよび標的に結合するCas12b）を形成すると、アダプタータンパク質が結合しかつアダプタータンパク質の機能ドメインが属性機能を効果的とするのに都合のよい空間的な方向に配置されるように改変される。例えば、機能ドメインが転写活性化因子（例えばVP64またはp65）である場合に、転写活性化因子は、それが標的の転写に影響を与えることを可能にする空間的な方向に配置される。同様に、転写抑制因子は、標的の転写に影響を与えるように都合よく配置され、ヌクレアーゼ（例えばFok1）は、標的を切断または部分的に切断するように都合よく配置される。
【０３２３】
当業者は、アダプターと機能ドメインの結合を可能にするがアダプターと機能ドメインの適切な配置を可能にしない死滅gRNAに対する改変は、（例えばCRISPR複合体の三次元構造内の立体障害のために）意図しない改変であることを分かっている。
【０３２４】
本明細書で説明するように、機能ドメインは、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、RNA切断活性、DNA切断活性、核酸結合活性、および（例えば光誘導性の）分子スイッチからなる群からの1個以上のドメインであってもよい。場合によっては、さらに少なくとも１つのNLSが提供されることが都合がよい。場合によっては、NLSをN末端に配置することが都合がよい。複数の機能ドメインが含まれている場合に、機能ドメインは同じであっても、異なっていてもよい。
【０３２５】
死滅gRNAは、同じまたは異なるアダプタータンパク質に特異的な複数の結合認識部位（例えばアプタマー）を含むように設計されてもよい。死滅gRNAは、転写開始部位（すなわちTSS）の上流のプロモーター領域−1000−＋1の核酸、好ましくは−200の核酸に結合するように設計されてもよい。この配置により、遺伝子の活性化（転写活性化因子など）または遺伝子阻害（転写抑制因子など）に影響を及ぼす機能ドメインが改善される。改変された死滅gRNAは、組成物中に含まれる1個以上の標的遺伝子座を標的とする1個以上の改変された死滅gRNA（例えば、少なくとも1個のgRNA、少なくとも2個のgRNA、少なくとも5個のgRNA、少なくとも10個のgRNA、少なくとも20個のgRNA、少なくとも30個のgRNA 、少なくとも50個のgRNA）であってもよい。
【０３２６】
アダプタータンパク質は、改変された死滅gRNA中に導入されたアプタマーまたは認識部位に結合し、かつ死滅gRNAがCRISPR複合体に組み込まれていると、1個以上の機能ドメインの適切な配置を可能にして属性機能を有する標的に影響を及ぼす任意の数のタンパク質であってもよい。本出願での詳細な説明のように、そのタンパク質は、外皮タンパク質、好ましくはバクテリオファージ外皮タンパク質であってもよい。このアダプタータンパク質に（例えば融合タンパク質の形態で）会合する機能ドメインは、例えば、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、RNA切断活性、DNA切断活性、核酸結合活性、および（例えば光誘導性の）分子スイッチからなる群からの1個以上のドメインを含んでもよい。好ましいドメインは、Fok1、VP64、P65、HSF1、またはMyoD1である。機能ドメインが転写活性化因子または転写抑制因子である場合に、少なくともNLSがさらに、好ましくはN末端に提供されることが好都合である。複数の機能ドメインが含まれている場合に、その機能ドメインは同じであっても異なっていてもよい。アダプタータンパク質は、既知のリンカーを利用してその機能ドメインを付加してもよい。
【０３２７】
従って、改変された死滅gRNA、（不活化された）Cas12b（機能ドメインを伴っても伴わなくてもよい）、および1個以上の機能ドメインを有する結合タンパク質は、それぞれ個別に組成物中に含まれ、個々にまたは集合的に宿主に投与されてもよい。あるいは、これらの成分は、宿主に投与するために単一の組成物で提供されてもよい。宿主への投与は、当業者に知られている、または宿主への送達について本明細書に説明のウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、AAVベクター）を介して実施してもよい。本明細書で説明のように、（例えば、レンチウイルスgRNA選択のための）種々の選択マーカーおよび（例えば、複数のgRNAが使用されるかどうかにも依るが）種々のgRNA濃度の使用は、改善された効果を引き出すために有効な可能性がある。
【０３２８】
この考え方に基づいて、いくつかの条件変更は、DNA切断、遺伝子活性化、または遺伝子非活性化を含むゲノム遺伝子座の事象を誘発するのに適切である。提供された組成物を使用して、当業者は、都合よくかつ具体的に、同じまたは異なる機能ドメインを有する単一または複数の遺伝子座を標的化して、１つ以上のゲノム遺伝子座事象を誘発することができる。この組成物を、細胞内のライブラリー中での選別およびin vivoでの機能モデル化（例えば、lincRNAの遺伝子活性化および機能の識別、機能獲得モデル化、機能喪失モデル化、最適化および選別の目的で細胞株および遺伝子導入動物を確立するための本発明の組成物の使用）のための多種多様な方法に応用してもよい。
【０３２９】
本発明は、本発明または本出願の以前には考案されていなかった、条件付きのまたは誘導性のCRISPR遺伝子導入細胞／動物を確立しかつ利用するための本発明の組成物の使用を包含する。例えば、標的細胞は、条件付きでまたは誘導的に（例えばCre依存性構築物の形態での）Cas12b、および／または条件付きでまたは誘導的にアダプタータンパク質を含み、標的細胞に導入されたベクターが発現すると、このベクターは、標的細胞中でCas12bの発現および／またはアダプターの発現の条件を誘導しかつ引き起こす。CRISPR複合体を形成する既知の方法に本発明の教示および組成物を応用することにより、機能ドメインによって影響を受ける誘導性ゲノム事象もまた、本発明の一側面となる。この一例としては、CRISPRノックイン／条件付きの遺伝子導入動物（例えば、Lox-Stop-polyA-Lox（LSL）カセットを含むマウス）の創造、およびそれに続く本明細書に説明の1個以上の改変された（例えば、遺伝子活性化の目的で関心のある標的遺伝子のTSSに対して−200のヌクレオチドの）死滅gRNA（例えば、外皮タンパク質によって認識される1個以上のアプタマーを有する、MS2などの改変された死滅gRNA）を提供する１つ以上の組成物の送達、本明細書に記載される1個以上のアダプタータンパク質（1個以上のVP64に結合したMS2結合タンパク質）および条件付きの動物を誘導するための手段（例えば、Cas12b発現を誘導可能にするためのCre組換え酵素）が挙げられる。あるいは、アダプタータンパク質は、条件付きのまたは誘導性のCas12bとともに条件付きのまたは誘導性の要素として提供されて、選別の目的のために有効なモデルを提供でき、このタンパク質は、好都合なことには、多数の用途のための特定の死滅gRNAの最低限の設計および投与のみを必要とする。
【０３３０】
別の実施形態では、死滅ガイドは、特異性を改善するようにさらに改変される。保護された死滅ガイドを合成してもよく、それによって二次構造が死滅ガイドの3’末端に導入され、その特異性が向上する。保護されたガイドRNA（pgRNA）は、細胞内の関心のあるゲノム遺伝子座中の標的配列にハイブリダイズが可能なガイド配列およびプロテクター鎖を含み、このプロテクター鎖は、場合によってはガイド配列に相補的であり、このガイド配列は、一部はプロテクター鎖にハイブリダイズできる。pgRNAには、場合によっては伸長配列が含まれる。pgRNA−標的DNAのハイブリダイズ化での熱力学は、ガイドRNAと標的DNAの間の相補的な塩基の数によって決定される。「熱力学的な保護」を用いて、プロテクター配列を付加して死滅gRNAの特異性を改善できる。例えば、ある方法では、死滅gRNA内のガイド配列の3’末端に様々な長さの相補的なプロテクター鎖を付加する。その結果として、プロテクター鎖は死滅gRNAの少なくとも一部に結合し、保護されたgRNA（pgRNA）を提供する。次に本明細書に例示の死滅gRNAは、説明済みの実施形態を用いて容易に保護でき、pgRNAをもたらす。プロテクター鎖は、死滅gRNAガイド配列の3’末端に結合した、個別のRNA転写産物、またはRNA鎖、またはキメラ型RNAのいずれであってもよい。
【０３３１】
本発明者らは、本明細書で定義のCRISPR酵素として、活性を喪失することなく、２つ以上のRNAガイドが使用できることを示している。これにより、本明細書で定義の単一の酵素、システムまたは複合体を用いて、複数のDNA標的、遺伝子、または遺伝子座を標的化するために、本明細書で定義のCRISPR酵素、システム、または複合体の使用が可能になる。ガイドRNAは、場合によっては本明細書で定義の直接反復などのヌクレオチド配列によって分離されて、タンデム型に配置されていてもよい。種々のガイドRNAの位置として、タンデム型は活性に影響を及ぼさない。
多重型CRISPR-Casシステム
【０３３２】
一側面では、本発明は、タンデム型すなわち多重型の標的化に用いられる非天然起源または遺伝子操作されたCRISPR酵素、好ましくは第２の部類のCRISPR酵素、好ましくは、限定はされないが本明細書の他の段落に説明のCas12bなどの本明細書に説明のV型またはVI型のCRISPR酵素を提供する。本明細書の他の段落に説明の本発明によるCRISPR（またはCRISPR-CasまたはCas）酵素、複合体、またはシステムのいずれかは、このような取組みに使用してもよいことは分かっている。本明細書の他の段落に説明の方法、製品、組成物、および使用のいずれもが、以下でさらに詳述する多重型すなわちタンデム型の標的化の取組みに等しく適用可能である。さらなる解説によって、以下の特定の側面および実施形態が示される。
【０３３３】
一側面では、本発明は、複数の遺伝子座を標的とするための本明細書で定義のCas12b酵素、複合体、またはシステムの使用を提供する。一実施形態では、本発明は、複数の（タンデム型すなわち多重型の）ガイドRNA（gRNA）配列を使用して構築できる。
【０３３４】
一側面では、本発明は、タンデム型すなわち多重型の標的化のために本明細書で定義のCas12b酵素、複合体、またはシステムの１つ以上の要素を使用する方法を提供し、前記CRISPシステムは複数のガイドRNA配列を含む。好ましくは、前記gRNA配列は、本明細書の他の段落で定義の直接反復などのヌクレオチド配列によって分離される。
【０３３５】
本明細書で定義のCas12b酵素、システム、または複合体は、複数の標的ポリヌクレオチドを改変するための効果的な手段を提供する。本明細書で定義のCas12b酵素、システム、または複合体は、多数の細胞型中に１つ以上の標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）を含む多種多様な効用を有する。従って、本発明の本明細書で定義のCas12b酵素、システム、または複合体は、単一のCRISPRシステム内の複数の遺伝子座を標的とすることを含む、例えば、遺伝子治療、薬物選別、疾患診断、および予後判断などに幅広い用途を有する。
【０３３６】
一側面では、本発明は、本明細書で定義のCas12b酵素、システム、または複合体、すなわち、それに会合する少なくとも１つの不安定化ドメインを有するCas12bタンパク質、およびDNA分子などの複数の核酸分子を標的とする複数のガイドRNAを有するCas12b CRISPR-Cas複合体を提供し、それによって、前記複数のガイドRNAのそれぞれは、対応する核酸分子、例えば、DNA分子を特異的に標的とする。核酸分子の標的、例えばDNA分子のそれぞれは、遺伝子産物をコードするか、あるいは遺伝子座を含んでもよい。従って、複数のガイドRNAを使用すると、複数の遺伝子座または複数の遺伝子を標的することができる。実施形態によっては、Cas12b酵素は、遺伝子産物をコードするDNA分子を切断してもよい。実施形態によっては、遺伝子産物の発現は変化する。Cas12bタンパク質およびガイドRNAは、自然には共に存在しない。本発明は、タンデム型に配置されたガイド配列を含むガイドRNAを包含する。本発明はさらに、真核細胞での発現のためにコドン最適化されたCas12bタンパク質のコード配列を含む。好ましい実施形態では、真核細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、または酵母細胞であり、より好ましい実施形態では、哺乳動物細胞は、ヒト細胞である。遺伝子産物の発現は、減弱させてもよい。Cas12b酵素は、CRISPRシステムまたは複合体の一部を形成してもよく、かつ一連の2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、25、25、30個、または30個を超えるガイド配列を含むタンデム型に配置されたガイドRNA（gRNA）をさらに含み、それぞれの酵素は、細胞内の関心のあるゲノム遺伝子座中の標的配列に特異的にハイブリダイズすることが可能である。実施形態によっては、機能的なCas12b CRISPRシステムまたは複合体は、複数の標的配列に結合する。実施形態によっては、機能的なCRISPRシステムまたは複合体は、複数の標的配列を編集してもよく、例えば、標的配列はゲノム遺伝子座を含んでもよく、実施形態によっては、遺伝子発現に変化があってもよい。実施形態によっては、機能的CRISPRシステムまたは複合体は、さらなる機能ドメインを含んでもよい。実施形態によっては、本発明は、複数の遺伝子産物の発現を改変または改変するための方法を提供する。この方法は、前記標的核酸、例えばDNA分子を含む細胞中に導入すること、あるいは標的核酸、例えばDNA分子を含有しかつ発現することを含んでもよい。例えば、標的核酸は、遺伝子産物をコードするか、あるいは遺伝子産物（例えば調節配列）の発現を提供してもよい。
【０３３７】
好ましい実施形態では、多重標的化に使用されるCRISPR酵素はCas12bであるか、あるいはCRISPRシステムまたは複合体は、Cas12bを含む。実施形態によっては、多重標的化に用いられるCas12b酵素は、DNAの両方の鎖を切断して、二本鎖切断（DSB）を形成する。実施形態によっては、多重標的化に用いられるCRISPR酵素はニッカーゼである。実施形態によっては、多重標的化に用いられるCas12b酵素は、二重ニッカーゼである。実施形態によっては、多重標的化に用いられるCas12b酵素は、本明細書の他の段落で定義のDD Cas12b酵素などのCas12b酵素である。
【０３３８】
一般的な実施形態によっては、多重標的化に用いられるCas12b酵素は、1個以上の機能ドメインに会合している。より具体的な実施形態によっては、多重標的化に用いられるCRISPR酵素は、本明細書の他の段落で定義の死滅Cas12bである。
【０３３９】
一側面では、本発明は、本明細書で定義の複数の標的化に使用するCas12b酵素、システム、または複合体、あるいは本明細書で定義のポリヌクレオチドを送達する手段を提供する。その送達手段の非限定例は、例えば、複合体の成分を送達する粒子、および（例えば、CRISPR酵素をコードし、CRISPR複合体をコードするヌクレオチドを提供する）本明細書で説明のポリヌクレオチドを含むベクターである。実施形態によっては、ベクターは、AAVなどのプラスミドまたはウイルスベクター、あるいはレンチウイルスであってもよい。一過性のHEK細胞などへのプラスミドによる遺伝子導入は、特にAAVのサイズ制限がありかつCas12bはAAVに適合はするが付加するガイドRNAにより上限値に達する場合には、有効な場合がある。
【０３４０】
さらに、多重標的化で使用する本明細書で使用されるCas12b酵素、複合体、またはシステムを構成的に発現するモデルが提供される。生物は、遺伝子導入生物であってもよく、かつ本発明のベクターで遺伝子導入されていてもよく、またはそのように遺伝子導入された生物の後代であってもよい。さらなる側面では、本発明は、本明細書に定義のCRISPR酵素、システム、および複合体、あるいは本明細書に説明のポリヌクレオチドまたはベクターを含む組成物を提供する。さらに、複数のガイドRNAを好ましくはタンデム型に配置された方式で含むCas12b CRISPRシステムまたは複合体を提供する。前記複数のガイドRNAは、直接反復などのヌクレオチド配列によって分離されていてもよい。
【０３４１】
さらに、対象、例えばそれを必要とする対象を治療する方法が提供され、この方法は、Cas12b CRISPRシステムまたは複合体をコードするポリヌクレオチドまたは本明細書に説明の任意のポリヌクレオチドまたはベクターにより対象を形質転換して遺伝子編集を誘導すること、およびそれらを対象に投与することを含む。適切な修復鋳型がさらに提供されてもよく、例えば、前記修復鋳型を含むベクターによって送達されてもよい。さらに、対象、例えばそれを必要とする対象を治療する方法が提供され、この方法は、本明細書に説明のポリヌクレオチドまたはベクターにより対象を形質転換して複数の標的遺伝子座の転写活性化または抑制を誘導することを含み、前記ポリヌクレオチドまたはベクターは、好ましくはタンデム型に配置される複数のガイドRNAを含むCas12b酵素、複合体、またはシステムをコードするかあるいは含む。任意の治療がex vivoで、例えば細胞培養で実施される場合に、「対象」という用語は「細胞または細胞培養」という語句に置き換えられてもよいことが分かる。
【０３４２】
本明細書の他の段落に定義の治療方法に用いるための、好ましくはタンデム型に配置された複数のガイドRNAを含むCas12b酵素、複合体、またはシステムを含む組成物、あるいは好ましくはタンデム型に配置された複数のガイドRNAを含む前記Cas12b酵素、複合体、またはシステムをコードするあるいは含むポリヌクレオチドまたはベクターが、さらに提供される。その組成物を含む部分を持つキットが提供されてもよい。その治療方法のための薬剤の製造への前記組成物の使用がまた提供される。例えば機能獲得選別などの選別でのCas12bCRISPRシステムの使用がまた、本発明によって提供される。遺伝子を人工的に過剰発現させる細胞は、例えば負帰還ループによって、経時的に遺伝子を下方制御（平衡を再構築）することができる。選別が始まる時までに、未調節の遺伝子は再度減弱するかもしれない。誘導性のCas12b活性化因子を使用すると、選別の直前に転写を誘導できるので、偽陰性の的中の可能性を最小限に抑えることが可能となる。従って、機能獲得選別などの選別での本発明の使用により、偽陰性の結果の可能性を最小限に抑えることができる。
【０３４３】
一側面では、本発明は、Cas12bタンパク質および細胞内の遺伝子産物をコードするDNA分子をそれぞれ特異的に標的とする複数のガイドRNAを含む、遺伝子操作された非天然起源のCRISPRシステムを提供し、それによって、複数のガイドRNAはそれぞれ、遺伝子産物をコードするそれらの特定のDNA分子を標的とし、かつCas12bタンパク質は遺伝子産物をコードする標的DNA分子を切断し、それにより遺伝子産物の発現を変化させる。CRISPRタンパク質およびガイドRNAは、自然には共に存在しない。本発明は、好ましくは直接反復などのヌクレオチド配列によって分離された、場合によってはtracr配列に融合された複数のガイド配列を含む複数のガイドRNAを包含する。本発明の一実施形態では、CRISPRタンパク質は、V型またはVI型のCRISPR-Casタンパク質であり、より好ましい実施形態では、CRISPRタンパク質は、Cas12bタンパク質である。本発明はさらに、真核細胞での発現のためにコドン最適化されたCas12bタンパク質を包含する。好ましい実施形態では、真核細胞は哺乳動物細胞であり、より好ましい実施形態では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本発明のさらなる実施形態では、遺伝子産物の発現は減弱される。
標的配列の改変
【０３４４】
特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、鋳型DNA配列を挿入すなわち「ノックイン」することによって、CRISPR-C2c1複合体によって改変される。特定の実施形態では、DNA挿入は、適切な方向にゲノム内に組み込まれるように設計される。好ましい実施形態では、関心のある遺伝子座は、相同性指向修復（HDR）機構を介するゲノム編集が特に困難となる非分裂細胞中でCRISPR-C2c1システムによって改変される（Chan et al., Nucleic acids research. 2011;39:5955-5966）。Maresca et al.（Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-546）は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）およびTaleヌクレアーゼ（TALEN）に適用可能な部位特異的かつ高精度の挿入の方法を説明していて、この方法では、5’オーバーハングを有する短い二本鎖DNAが相補的な末端に結合され、これによりヒト細胞株中の定義された遺伝子座に15-kbの外因性発現カセットを高精度に挿入可能となる。He et al.（Nucleic Acids Res. 2016 May 19; 44(9)）は、GAPDH遺伝子座中への4.6kbのプロモーター不含ires-eGFP断片のCRISPR-Cas9誘導部位特異的ノックインが、体細胞系のLO2細胞中で20%までのGFP+細胞を産生し、かつNHEJ経路によって媒介されるヒト胚性幹細胞中で1.70%までのGFP+細胞を産生することを説明し、またNHEJに基づくノックインが、試験された全てのヒト細胞型でHDR媒介遺伝子標的化よりも効率的であることも報告していた。C2c1は5’オーバーハングにより千鳥状の切断部を生成するため、当業者はMeresca et al.およびHe et al.で説明されているのと同様の方法を用いて、本明細書に開示のCRISPR-C2c1システムにより関心のある遺伝子座に外因性DNAの挿入を形成できる。
【０３４５】
特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、まずPAM配列の遠位端でCRISPR-C2c1システムによって改変され、次いで、PAM配列の近傍でCRISPR-C2c1システムによって改変され、HDRを介して修復される。特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、HDRを介して外因性DNA配列の変異、欠失、または挿入を導入して、CRISPR-C2c1システムによって改変される。実施形態によっては、関心のある遺伝子座は、NHEJを介して外因性DNA配列の変異、欠失、または挿入を導入して、CRISPR-C2c1システムによって改変される。好ましい実施形態では、外因性DNAは、3’末端および5’末端の両方で単一のガイドDNA−PAM配列に隣接している。好ましい実施形態では、外因性DNAは、CRISPR-C2c1の切断後に放出される。Zhang et al., Genome Biology 201718:35; He et al., Nucleic Acids Research, 44: 9, 2016を参照。
鋳型
【０３４６】
実施形態によっては、組換え鋳型がさらに提供される。組換え鋳型は、本明細書に説明の別のベクター成分であってもよく、別々のベクターに含まれてもよく、あるいは別々のポリヌクレオチドとして提供されてもよい。実施形態によっては、組換え鋳型は、核酸標的化複合体の一部としての核酸標的化エフェクタータンパク質によって刻み目を付けられまたは切断された標的配列内またはその近傍などで相同組換えでの鋳型として機能するように設計される。例によっては、システムは組換え鋳型を含む。組換え鋳型は、相同性指向修復（HDR）によって挿入されてもよい。
【０３４７】
一実施形態では、鋳型核酸は、標的位置の配列を変更する。一実施形態では、鋳型核酸は、改変された塩基、または非天然起源の塩基の標的核酸への組込みをもたらす。
【０３４８】
鋳型配列は、標的配列により媒介された破断または触媒された組換えを受けてもよい。一実施形態では、鋳型核酸は、C2c1媒介の切断事象によって切断される標的配列の部位に対応する配列を含んでもよい。一実施形態では、鋳型核酸は、第１のC2c1媒介事象で切断される標的配列の第１の部位、および第２のC2c1媒介事象で切断される標的配列の第２の部位の両方に対応する配列を含んでもよい。
【０３４９】
特定の実施形態では、鋳型核酸は、翻訳された配列のコード配列に変化をもたらす配列、例えば、タンパク質産物中でアミノ酸の別のアミノ酸への置換をもたらす配列、例えば、変異対立遺伝子を野生型対立遺伝子に変換する配列、野生型対立遺伝子を変異対立遺伝子に変換する配列、および／または終止コドン、アミノ酸残基の挿入、アミノ酸残基の欠失、またはナンセンス変異を導入する配列を含んでもよい。特定の実施形態では、鋳型核酸は、非コード配列の変化、例えば、エクソンまたは5’もしくは3’の非翻訳または非転写領域の変化をもたらす配列を含んでもよい。その変化には、制御要素、例えばプロモーター、エンハンサーの変化、およびシス作用性またはトランス作用性の制御要素の変化が含まれる。
【０３５０】
標的遺伝子中の標的位置と相同性を有する鋳型核酸を使用して、標的配列の構造を変更してもよい。鋳型配列を使用して、望ましくない構造、例えば、望ましくないヌクレオチドまたは変異ヌクレオチドを変更してもよい。鋳型核酸は、組み込まれると、陽性対照要素の活性の低下、陽性対照要素の活性の増大、陰性対照要素の活性の低下、陰性対照要素の活性の増大、遺伝子の発現の減弱、遺伝子の発現の増強、障害または病気に対する耐性の増強、ウイルス侵入に対する耐性の増強、変異の修正または望ましくないアミノ酸残基の変更、遺伝子産物の生物学的特性の付与、増強、排除、または低減、酵素の酵素活性の増強、あるいは遺伝子産物が別の分子と相互作用する能力の増強をもたらす配列を含んでもよい
【０３５１】
鋳型核酸は、標的配列の1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12個またはそれ以上のヌクレオチドの配列の変化をもたらす配列を含んでもよい。
【０３５２】
鋳型ポリヌクレオチドは、約10、15、20、25、50、75、100、150、200、500、1000、またはそれ以上のヌクレオチド長などの任意の適切な長さであってもよい。一実施形態では、鋳型核酸は、20±10、30±10、40±10、50±10、60±10、70±10、80 ±10、90±10、100±10、110±10、120±10、130±10、140 ±10、150±10、160±10、170±10、180±10、190±10、200±10、210±10、220±10のヌクレオチド長であってもよい。一実施形態では、鋳型核酸は、30±20、40±20、50±20、60±20、70±20、80±20、90±20、100±20、110±20、120±20、130±20、140±20、150±20、160±20、170±20、180±20、190±20、200±20、210±20、220±20のヌクレオチド長であってもよい。一実施形態では、鋳型核酸は、10〜1000、20〜900、30〜800、40〜700、50〜600、50〜500、50〜400、50〜300、50〜200、または50〜100のヌクレオチド長である。
【０３５３】
実施形態によっては、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適に整列された場合に、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の1個以上のヌクレオチド（例えば、約1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70 、80、90、100個またはそれ以上のヌクレオチド）と重複する可能性がある。実施形態によっては、鋳型配列および標的配列を含むポリヌクレオチドが最適に整列される場合に、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約1、5、10、15、20、25、50、75、100、200、300、400、500、1000、5000、10000個、またはそれ以上のヌクレオチド以内である。
【０３５４】
外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれる配列（例えば変異遺伝子）を含む。組込みのための配列は、細胞に対して内因性または外因性の配列であってもよい。組み込まれる配列の例として、タンパク質または非コードRNA（例えばマイクロRNA）をコードするポリヌクレオチドが含まれる。従って、組込みのための配列は、適切な制御配列に動作可能に結合されてもよい。あるいは、組み込まれる配列は、調節機能を提供してもよい。
【０３５５】
上流または下流の配列は、約20塩基対〜約2500塩基対、例えば、約50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、または2500塩基対を含んでもよい。方法によっては、上流または下流の配列の例として、約200塩基対〜約2000塩基対、約600塩基対〜約1000塩基対、またはより具体的には約700塩基対〜約1000塩基対を有する。
【０３５６】
上流または下流の配列は、約20塩基対〜約2500塩基対、例えば、約50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、2100、2200、2300、2400、または2500塩基対を含んでもよい。方法によっては、上流または下流の配列の例として、約200塩基対〜約2000塩基対、約600塩基対〜約1000塩基対、またはより具体的には約700塩基対〜約1000塩基対を有する。
【０３５７】
特定の実施形態では、一方または両方の相同性アームを短縮して、特定の配列反復要素を含むことを回避してもよい。例えば、5’相同性アームを短縮して、配列反復要素を回避してもよい。他の実施形態では、3’相同性アームを短縮して、配列反復要素を回避してもよい。実施形態によっては、5’および3’相同性アームの両方を短縮して、特定の配列反復要素を含むことを回避してもよい。
【０３５８】
方法によっては、外因性のポリヌクレオチド鋳型は、マーカーをさらに含んでもよい。このマーカーを使用すると、対象とする組込みを容易に選別できる。適切なマーカーの例として、制限部位、蛍光タンパク質、または選択可能なマーカーが挙げられる。本発明の外因性のポリヌクレオチド鋳型は、組換え技術を用いて構築できる（例えば、Sambrook et al., 2001 and Ausubel et al., 1996を参照）。
【０３５９】
特定の実施形態では、変異を修正する鋳型核酸は、一本鎖オリゴヌクレオチドとして使用するために設計されてもよい。一本鎖オリゴヌクレオチドを使用する場合に、5’および3’相同性アームの長さは、最大約200塩基対、例えば、少なくとも25、50、75、100、125、150、175、または200塩基対の範囲であってもよい。
【０３６０】
Suzukiら、CRISPR-Cas9の媒介による相同性に依存しない標的組込みを介するin vivoゲノム編集について説明している（2016, Nature 540:144-149）。
【０３６１】
従って、本明細書でのCRISPRシステムについて、側面または実施形態によっては、CRISPRシステムは、(i)CRISPRタンパク質またはCRISPRエフェクタータンパク質をコードするポリヌクレオチド、および(ii)CRISPRタンパク質と複合化してCRISPR複合体を形成するように、かつ標的配列と複合化するように遺伝子操作される1個以上のポリヌクレオチドを含む。
【０３６２】
実施形態によっては、治療は、in vivoまたはex vivoのいずれかでの真核細胞への送達（または投与）である。
【０３６３】
実施形態によっては、CRISPRタンパク質は、標的配列の位置での一方または両方の鎖の切断を誘導するヌクレアーゼであるか、あるいはCRISPRタンパク質は、標的配列の位置での切断を誘導するニッカーゼである。
【０３６４】
実施形態によっては、CRISPRタンパク質は、CRISPR-CasシステムのRNAポリヌクレオチド配列と複合化するC2c1タンパク質であり、このポリヌクレオチド配列は、a)標的HBV配列にハイブリダイズが可能なガイドRNAポリヌクレオチド、および(b)直接反復RNAポリヌクレオチドを含む。
【０３６５】
実施形態によっては、CRISPRタンパク質はC2c1であり、システムは、I)CRISPR-CasシステムのRNAポリヌクレオチド配列を含み、このポリヌクレオチド配列は、(a)標的配列にハイブリダイズが可能なガイドRNAポリヌクレオチド、および(b）直接反復RNAポリヌクレオチドを含み、かつシステムは、I I)C2c1をコードするポリヌクレオチド配列、場合によっては少なくとも１つ以上の核局在化配列を含み、この直接反復配列は、ガイド配列にハイブリダイズし、かつCRISPR複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導し、このCRISPR複合体は、(1)標的配列にハイブリダイズされるまたはハイブリダイズ可能なガイド配列、および(2)直接反復配列と複合化されるCRISPRタンパク質を含み、CRISPRタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、DNAまたはRNAである。
【０３６６】
本発明はまた、細胞を、本明細書に説明の遺伝子操作されたCRISPR酵素（例えば、遺伝子操作されたCasエフェクターモジュール）または組成物のいずれか、あるいは本明細書に説明のシステムまたはベクターシステムのいずれかと接触させることを含む、細胞中の関心のある遺伝子座を改変する方法を提供し、この細胞は、細胞内に存在する本明細書に説明のいずれかのCRISPR複合体を含む。これらの方法では、細胞は、原核生物または真核生物の細胞、好ましくは真核生物の細胞であってもよい。これらの方法では、生物はこの細胞を含んでもよい。これらの方法では、生物はヒトではなく、それ以外の動物であってもよい。特定の実施形態では、細胞は、A/T富化ゲノムを含んでもよい。実施形態によっては、細胞ゲノムは、T富化PAMを含む。特定の実施形態では、PAMは5’-TTN-3’または5’-ATTN-3’である。特定の実施形態では、PAMは5’-TTG-3’である。特定の実施形態では、細胞は熱帯熱マラリア原虫細胞である。
【０３６７】
実施形態によっては、CRISPRエフェクタータンパク質は、C2c1タンパク質である。Cas9によって形成されたPAMの近位端での切断とは対照的に、C2c1はPAMの遠位端で二本鎖切断を形成する（Jinek et al., 2012; Cong et al., 2013）。Cpf1変異標的配列は、単一のgRNAによる反復切断を受けやすく、従ってHDRを介するゲノム編集でのCpf1の適用を促進する可能性があることが示されている（Front Plant Sci. 2016 Nov 14;7:1683）。Cpf1とC2c1はどちらも、構造の類似性を共有するV型のCRISPR-Casタンパク質である。PAMの近位端に平滑な切断部を形成するCas9とは異なり、Cpf1およびC2c1はPAMの遠位端に千鳥状の切断部を形成する。従って、特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、相同性指向修復（HRまたはHDR）を介してCRISPR-C2c1複合体によって改変される。特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、HRとは独立したCRISPR-C2c1複合体によって改変される。特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、非相同末端結合（NHEJ）を介してCRISPR-C2c1複合体によって改変される。
【０３６８】
C2c1は、Cas9によって生成される平滑末端とは対照的に、5’オーバーハングを有する千鳥状の切断部を形成する（Garneau et al., Nature. 2010;468:67-71; Gasiunas et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:E2579-2586）。切断産物のこの構造は、哺乳動物ゲノムへの非相同末端結合（NHEJ）に基づく遺伝子挿入を促進するために特に有効な可能性がある（Maresca et al., Genome research. 2013;23:539-546）。
【０３６９】
特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、鋳型DNA配列を挿入すなわち「ノックイン」して、CRISPR-C2c1複合体によって改変される。特定の実施形態では、DNA挿入は、適切な方向でゲノムに組み込まれるように設計されている。好ましい実施形態では、関心のある遺伝子座は、相同性指向修復（HDR）機構を介するゲノム編集が特に困難である場合に、非分裂細胞中でCRISPR-C2c1システムによって改変される（Chan et al., Nucleic acids research. 2011;39:5955-5966）。Maresca et al.（Genome Res. 2013 Mar; 23(3): 539-546）は、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）およびTaleヌクレアーゼ（TALEN）に適用可能な部位特異的かつ高精度の挿入の方法を説明していて、この方法では、5’オーバーハングを有する短い二本鎖DNAが相補的な末端に結合され、これによりヒト細胞株中の定義された遺伝子座に15-kbの外因性発現カセットを高精度に挿入可能となる。He et al.（Nucleic Acids Res. 2016 May 19; 44(9)）は、GAPDH遺伝子座中への4.6kbのプロモーター不含ires-eGFP断片のCRISPR-Cas9誘導部位特異的ノックインが、体細胞性のLO2細胞中で20%までのGFP+細胞を産生し、かつNHEJ経路によって媒介されるヒト胚性幹細胞中で1.70％までのGFP+細胞を産生することを説明し、またNHEJに基づくノックインが、試験された全てのヒト細胞型でHDR媒介遺伝子標的化よりも効率的であることも報告していた。C2c1は5’オーバーハングにより千鳥状の切断部を生成するため、当業者はMeresca et al.およびHe et al.で説明されているのと同様の方法を用いて、本明細書に開示のCRISPR-C2c1システムにより関心のある遺伝子座に外因性DNAの挿入を形成できる。
【０３７０】
特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、まずPAM配列の遠位端でCRISPR-C2c1システムによって改変され、次いで、PAM配列の近傍のCRISPR-C2c1システムによって改変され、HDRを介して修復される。特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、HDRを介して外因性DNA配列の変異、欠失、または挿入を導入して、CRISPR-C2c1システムによって改変される。実施形態によっては、関心のある遺伝子座は、NHEJを介して外因性DNA配列の変異、欠失、または挿入を導入して、CRISPR-C2c1システムによって改変される。好ましい実施形態では、外因性DNAは、3’末端および5’末端の両方で単一ガイドDNA(sgDNA)-PAM配列に隣接している。好ましい実施形態では、外因性DNAは、CRISPR-C2c1の切断後に放出される。Zhang et al., Genome Biology201718:35およびHe et al., Nucleic Acids Research, 44: 9, 2016を参照。
【０３７１】
実施形態によっては、CRISPRタンパク質は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestri）ATCC 49025またはバチルス・テルモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans）株B4166からのC2c1である。
【０３７２】
本発明はまた、本明細書に説明の方法または組成物のいずれかで、真核生物または真核細胞中での発現のためにコドン最適化されたエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列を提供する。本発明の一実施形態では、コドン最適化エフェクタータンパク質は、本明細書に説明の任意のC2c1であり、真核細胞または真核生物、例えば、本明細書の他の段落で説明の細胞または生物、例えば、限定はされないが、酵母細胞、あるいはマウス細胞、ラット細胞、およびヒト細胞または植物などの非ヒト真核生物を含む哺乳動物細胞または生物での操作性について対し最適化される。
【０３７３】
実施形態によっては、CRISPRタンパク質は、CRISPRタンパク質の蓄積を生物の細胞核中に検出可能な量まで駆動が可能な１つ以上の核局在化シグナル（NLS）をさらに含む。
【０３７４】
本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つの核局在化シグナル（NLS）は、C2c1エフェクタータンパク質をコードする核酸配列に付加される。好ましい実施形態では、少なくとも１つ以上のC末端またはN末端NLSが付加されている（従って、C2c1エフェクタータンパク質をコードする核酸分子は、発現された産物が付加されたあるいは結合されたNLSを持つように、NLSをコードすることを含んでもよい）。好ましい実施形態では、真核細胞、好ましくはヒト細胞中での最適な発現および核標的化のために、C末端NLSが付加されている。好ましい実施形態では、コドン最適化エフェクタータンパク質はC2c1であり、ガイドRNAのスペーサー長は、15〜35ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、ガイドRNAのスペーサー長は、少なくとも17ヌクレオチド長などの少なくとも16ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、スペーサー長は、15〜17ヌクレオチド長、17〜20ヌクレオチド長、20、21、22、23、または24ヌクレオチド長などの20〜24ヌクレオチド長、23、24、または25ヌクレオチド長などの23〜25ヌクレオチド長、24〜27ヌクレオチド長、27〜30ヌクレオチド長、30〜35ヌクレオチド長、または35以上のヌクレオチド長である。本発明の特定の実施形態では、コドン最適化エフェクタータンパク質はC2c1であり、ガイドRNAの直接反復長は少なくとも１６ヌクレオチド長である。特定の実施形態では、コドン最適化エフェクタータンパク質はC2c1であり、ガイドRNAの直接反復長は、16、17、18、19、または20ヌクレオチド長などの16〜20ヌクレオチド長である。特定の好ましい実施形態では、ガイドRNAの直接反復長は、19ヌクレオチド長である。
【０３７５】
実施形態によっては、CRISPRタンパク質は、１つ以上の変異を含む。
【０３７６】
実施形態によっては、CRISPRタンパク質は、触媒ドメインに１つ以上の変異を有し、タンパク質は、１つ以上の機能ドメインをさらに含む。
【０３７７】
実施形態によっては、CRISPRシステムは、送達システム内に含まれ、場合によっては、１つ以上のベクターを含むベクターシステム、場合によっては、ベクターは１つ以上のウイルスベクターを含み、場合によっては、１つ以上のウイルスベクターは、１つ以上のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、あるいは粒子または脂質粒子を含み、場合によっては、CRISPRタンパク質は、ポリヌクレオチドと複合化してCRISPR複合体を形成する。
【０３７８】
実施形態によっては、システム、複合体、またはタンパク質は、関心のあるゲノム遺伝子座中の標的配列の操作によって、生物または非ヒト生物を改変する方法に使用される。
【０３７９】
実施形態によっては、CRISPRシステムをコードするまたは提供する配列をコードするポリヌクレオチドは、リポソーム、粒子、細胞透過性ペプチド、エキソソーム、微小胞、または遺伝子銃を介して送達される。実施形態によっては、送達システムが含まれる。実施形態によっては、送達システムは、遺伝子操作されたポリヌクレオチドおよびCRISPRタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターを含むベクターシステムを含み、場合によっては、ベクターは１つ以上のウイルスベクターを含み、場合によっては、１つ以上のウイルスベクターは、１つ以上のレンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、またはアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター、あるいはCRISPRシステムまたはCRISPR複合体を含む粒子または脂質粒子を含む。
【０３８０】
実施形態によっては、組換え／修復鋳型が提供される。
【０３８１】
本明細書に説明の本発明による方法は、本明細書に説明のベクターを細胞に送達することを含む、本明細書に説明の真核細胞（in vitroの、すなわち単離された真核細胞）に１つ以上の変異を誘導することを含む。この変異は、ガイドRNAまたはsgRNAを介する細胞の各標的配列での１つ以上のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでもよい。変異は、ガイドRNAまたはsgRNAを介する前記細胞の各標的配列での1〜75個のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでもよい。変異は、ガイドRNAまたはsgRNAを介する前記細胞の各標的配列での1、5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または75個のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでもよい。変異は、ガイドRNAまたはsgRNAを介する前記細胞の各標的配列での5、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または75個ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでもよい。変異は、ガイドRNAまたはsgRNAを介する前記細胞の各標的配列での10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または75個ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでもよい。変異は、ガイドRNAまたはsgRNAを介する前記細胞の各標的配列での20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、または75個ヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでもよい。変異は、ガイドRNAまたはsgRNAを介する前記細胞の各標的配列での40、45、50、75、100、200、300、400、または500個のヌクレオチドの導入、欠失、または置換を含んでもよい。
【０３８２】
毒性および非特異的標的効果を最小化するために、送達されるCas mRNAおよびガイドRNAの濃度を制御することが重要となる可能性がある。Cas mRNAおよびガイドRNAの最適濃度は、細胞モデルまたは非ヒト真核動物モデル中で種々の濃度を試験して、かつディープ配列決定を使用して潜在的な非特異的標的ゲノム遺伝子座での改変の程度を分析して決定してもよい。あるいは、毒性と非特異的標的効果の水準を最小限に抑えるために、CasニッカーゼmRNA（例えば、D10A変異を持つ化膿性連鎖球菌Cas9）を、関心のある部位を標的とするガイドRNA対とともに送達してもよい。毒性および非特異的標的効果を最小限に抑えるためのガイド配列および手法は、国際特許出願WO2014/093622（PCT/US2013/074667）号のようにしてもよく、または本明細書のような変異を介してもよい。
【０３８３】
典型的には、内因性CRISPRシステムの環境では、（標的配列にハイブリダイズし、かつ１つ以上のCasタンパク質と複合化されるガイド配列を含む）CRISPR複合体の形成は、標的配列内または標的配列の近傍（例えば、標的配列から1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、50個、またはそれ以上の塩基対内）にある一方または両方の鎖の切断をもたらす。理論により拘束されることを望まないが、野生型tracr配列の全部または一部（例えば、約20、26、32、45、48、54、63、67、85個またはそれ以上の野生型tracr配列のヌクレオチド）を含んでもよいか、あるいはそれからなってもよいtracr配列は、tracr配列の少なくとも一部に沿ったガイド配列に操作可能に連結されているtracr mate配列の全てまたは一部へのハイブリダイズ化などによって、CRISPR複合体の一部を形成することもある。
遺伝子操作されたCRISPR-Casシステム
【０３８４】
一般に、SPIDR（SPacer Interspersed Direct Repeats：スペーサー分散型直接反復）としても知られるCRISPR（クラスター化され規則的に間隔をおいた短鎖回文配列反復）は、通常は特定の細菌種に特異的であるDNA遺伝子座ファミリーを構成する。CRISPR遺伝子座は、大腸菌で認識された異なる部類の分散型短鎖配列反復（SSR）（Ishino et al., J. Bacteriol., 169:5429-5433 [1987]、およびNakata et al., J. Bacteriol., 171:3553-3556 [1989]を参照）、および関連する遺伝子を含む。
同様の分散型SSRは、ハロフラックス・メディテラネイ（Haloferax mediterranei）、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）、アナベナ属（Anabaena）、および結核菌（Mycobacterium tuberculosis）で確認されている（Groenen et al., Mol. Microbiol., 10:1057-1065 [1993]、Hoe et al., Emerg. Infect. Dis., 5:254-263 [1999]、Masepohl et al., Biochim. Biophys. Acta 1307:26-30 [1996]、およびMojica et al., Mol. Microbiol., 17:85-93 [1995]を参照）。CRISPR遺伝子座は通常、反復の構造が他のSSRとは異なり、短い規則的間隔の反復（SRSR）と呼ばれている（Janssen et al., OMICS J. Integ. Biol., 6:23-33 [2002]、およびMojica et al., Mol. Microbiol., 36:244-246 [2000]を参照）。一般に、反復は、実質的に一定の長さを有する固有の介在配列によって規則的に間隔をおいたクラスター中で発生する短い要素である（上述のMojica et al., [2000]）。反復配列は株間で高度に保存されているが、分散型の反復数とスペーサー領域の配列は、通常、株ごとに異なる（van Embden et al., J. Bacteriol., 182:2393-2401 [2000]）。CRISPR遺伝子座は、40個を超える原核生物中で確認されていて（例えば、Jansen et al., Mol. Microbiol., 43:1565-1575 [2002]、およびMojica et al., [2005]を参照）、これら原核生物として、限定はされないが、アエロピルム属（Aeropyrum）、ピロバキュラム属（Pyrobaculum）、スルフォロブス属（Sulfolobus）、アルカエオグロブス属（Archaeoglobus）、ハロカルキュラ属（Halocarcula）、メタノバクテリウム属（Methanobacterium）、メタノコッカス属（Methanococcus）、メタノサルキナ属（Methanosarcina）、メタノピルス属（Methanopyrus）、ピロコッカス属（Pyrococcus）、ピクロフィルス属（Picrophilus）、テルモプラズマ属（Thermoplasma）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ストレプトマイセス属（Streptomyces）、アクイフェックス属（Aquifex）、ポルフィロモナス属（Porphyromonas）、クロモバクテリウム属（Chlorobium）、テルムス属（Thermus）、バチルス属（Bacillus）、リステリア属（Listeria）、スタフィロコッカス属（Staphylococcus）、クロストリジウム属（Clostridium）、テルモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter）、マイコプラズマ属（Mycoplasma）、フソバクテリウム属（Fusobacterium）、アゾアルカス属（Azarcus）、クロモバクテリウム属（Chromobacterium）、ネイセリア属（Neisseria）、ニトロソモナス属（Nitrosomonas）、デスルフォビブリオ属（Desulfovibrio）、ジオバクター属（Geobacter）、ミキソコッカス属（Myxococcus）、カンピロバクター属（Campylobacter）、ウォリネラ属（Wolinella）、アシネトバクター属（Acinetobacter）、エルウィニア属（Erwinia）、エシェリヒア属（Escherichia）、レジオネラ属（Legionella）、メチロコッカス属（Methylococcus）、パスツレラ属（Pasteurella）、フォトバクテリウム属（Photobacterium）、サルモネラ属（Salmonella）、キサントモナス属（Xanthomonas）、エルシニア属（Yersinia）、トレポネーマ属（Treponema）、およびテルモトガ属（Thermotoga）が挙げられる。
側副（collateral）活性
【０３８５】
Cas12酵素は、側副活性を有してもよく、すなわち、特定の環境では、活性化されたCas12酵素は、標的配列の結合後でも活性を維持し、非標的オリゴヌクレオチドを非特異的に切断し続ける。このガイド分子でプログラムされた側副切断活性は、Cas12bシステムを使用して、特定の標的オリゴヌクレオチドの存在を検出し、かつ読取りとして機能できるin vivoでのプログラム細胞死またはin vitroでの非特異的RNA分解を開始する機能を提供する。（Abudayyeh et al. 2016; East-Seletsky et al, 2016）。
【０３８６】
RNAガイドC2c1のプログラムの可能性、特異性、および側副活性はまた、そのC2c1を核酸の非特異的切断のための理想的な交換可能なヌクレアーゼとする。一実施形態では、C2c1システムは、ssDNAなどの核酸の側副非特異的切断を提供かつ利用するように遺伝子操作されている。別の実施形態では、C2c1システムは、ssDNAの側副非特異的切断を提供かつ利用するように遺伝子操作されている。従って、遺伝子操作されたC2c1システムは、核酸検出およびトランスクリプトームの操作かつ細胞死の誘導のためのプラットフォームを提供する。C2c1は、哺乳類の転写産物のノックダウンおよび結合ツールとして使用するために開発されている。C2c1は、配列特異的な標的DNA結合によって活性化されると、RNAおよびssDNAの堅牢な側副切断を可能とする。
【０３８７】
特定の実施形態では、C2c1は、in vitroシステムまたは細胞中で、提供されて一過性または安定的に発現され、細胞核酸を非特異的に切断するように標的化または誘発される。一実施形態では、C2c1は、ssDNA、例えばウイルスssDNAをノックダウンするように遺伝子操作されている。別の実施形態では、C2c1は、RNAをノックダウンするように遺伝子操作されている。このシステムは、ノックダウンが細胞またはin vitroシステム中に存在する標的DNAに依存するように、またはシステムまたは細胞への標的核酸の付加によって引き起こされるように工夫されていてもよい。
【０３８８】
一実施形態では、C2c1システムは、例えば、異常なDNAの切断が完全でなくまたは効果がない可能性がある場合に、異常なDNA配列の存在によって識別可能な細胞の部分集合中でRNAを非特異的に切断するように操作される。１つの非限定例では、癌細胞中に存在し、かつ細胞の形質転換を駆動するDNA転座が標的とされる。染色体DNAおよび修復を受ける細胞の亜集団は生き残る可能性があるが、非特異的な側副リボヌクレアーゼ活性は、潜在的な生存物の細胞死に有効に誘導する。
【０３８９】
側副活性は、最近、多くの臨床診断に有用であるSHERLOKと呼ばれる高感度で特異的な核酸検出プラットフォームに活用されている（Gootenberg, J. S. et al. 「CRISPR-Cas13a/C2c2による核酸検出」Nucleic acid detection with CRISPR-Cas13a/C2c2. Science 356, 438-442 (2017)）。
【０３９０】
本発明によれば、遺伝子操作されたC2c1システムは、DNAまたはRNAエンドヌクレアーゼ活性について最適化され、哺乳動物細胞中で発現しかつ細胞内のレポーター分子または転写物を効果的にノックダウンするように標的化できる。
【０３９１】
恒温増幅を伴う遺伝子操作されたC2c1の側副効果は、高感度および単一塩基不一致特異性を備えた迅速なDNAまたはRNA検出を提供するCRISPRに基づく診断を提供する。C2c1に基づく分子検出プラットフォームを用いて、ウイルスの特定の株を検出し、病原菌を識別し、ヒトDNAの遺伝子型を特定し、かつ無細胞腫瘍DNA変異を特定する。さらに反応試薬は、低温流通系に依存せずに、長期保存のために凍結乾燥が可能であり、現場での適用時に紙の上に簡単に再構成できる。
【０３９２】
携帯型プラットフォーム上で高感度で核酸および単一塩基特異性を迅速に検出する能力は、疾患の診断および監視、疫学、および一般的な実験室作業に役立てることができる。核酸を検出する方法は複数存在するが、それら方法には、感度、特異性、簡潔性、コスト、および速度の間に相反関係がある。
【０３９３】
微生物のクラスター化され規則的に間隔をおいた短鎖回文配列反復（CRISPR）およびCRISPR会合（CRISPR-Cas）適応免疫システムは、CRISPRに基づく診断（CRISPR-Dx）に活用できるプログラム可能なエンドヌクレアーゼを含む。（Cas12bとしても知られる）C2c1は、CRISPR RNA（crRNA）により再プログラムして、特定のDNA検出のためのプラットフォームを提供できる。そのDNA標的を認識すると、活性化されたC2c1は、近傍の非標的核酸（すなわちRNAおよび／またはssDNA）の「側副」切断に関与する。このcrRNAでプログラムされた側副切断活性により、C2c1は、プログラム細胞死の誘発によって、あるいは標識RNAまたはssDNAの非特異的分解によって、in vivoで特定のDNAの存在を検出できる。ここでは、核酸増幅および市販のレポーターRNAのC2c1を介する側副切断に基づく高感度のin vitro核酸検出プラットフォームについて説明しており、標的の即時検出を可能にする。
【０３９４】
特定の実施形態例では、本明細書に開示される相同分子種は、診断組成物および測定法において、単独で、または他のCas12またはCas13相同分子種と組合せて用いられてもよい。例えば、本明細書に開示されるCas12b相同分子種は、標的配列を検出するための多重測定法で使用されてもよく、次いで、オリゴヌクレオチドに基づくレポーターの非特異的切断により、検出可能なシグナルを生成してもよい。
レポーター／マスキング構造
【０３９５】
本明細書で使用される「マスキング構築物」は、本明細書に説明の活性化されたCRISPRシステムエフェクタータンパク質によって切断またはその他の方法で不活化されてもよい分子を指す。用語「マスキング構築物」は、代わりに「検出構築物」と呼ばれることもある。CRISPRエフェクタータンパク質のヌクレアーゼ活性に応じて、マスキング構築物は、RNAに基づくマスキング構築物またはDNAに基づくマスキング構築物であってもよい。核酸に基づくマスキング構築物は、CRISPRエフェクタータンパク質によって切断可能な核酸要素を含む。核酸要素の切断により、検出可能なシグナルの発生を可能にする媒体を放出するか、あるいは立体配座的な変化を生成する。検出可能シグナルの発生を防止またはマスクするための核酸要素の使用方法を示す構築物の例を以下に説明し、本発明の実施形態にはその変異体を含む。切断の前あるいはマスキング構築物が「活性な」状態にある場合に、マスキング構築物は正の検出可能信号の発生または検出を阻止する。特定の実施形態例では、最小の背景信号が、活性なマスキング構築物の存在で発生してもよいことが分かる。正の検出可能信号は、光学的、蛍光的、化学発光的、電気化学的な各方法、または当技術分野で既知の他の検出方法を用いて検出できる任意の信号であってもよい。用語「正の検出可能信号」は、マスキング構築物の存在で検出できる他の検出可能な信号と区別するために用いられる。例えば、特定の実施形態では、マスキング剤が存在するときに第１の信号（すなわち負の検出可能信号）が検出でき、次いで、活性化されたCRISPRエフェクタータンパク質によって標的分子が検出され、かつマスキング剤が切断または不活化されると、第１の信号は、第２の信号（例えば正の検出可能信号）に変換される。
【０３９６】
特定の実施形態例では、マスキング構築物は、遺伝子産物の生成を抑制してもよい。遺伝子産物は、試料に付加されるレポーター構築物によってコードされていてもよい。マスキング構築物は、短いヘアピンRNA（shRNA）または低分子干渉RNA（siRNA）などのRNA干渉経路に関与する干渉RNAであってもよい。マスキング構築物はまた、マイクロRNA（miRNA）を含んでもよい。マスキング構築物は、存在する間は、遺伝子産物の発現を抑制する。遺伝子産物は、蛍光タンパク質またはその他のRNA転写物、あるいは、標識プローブ、アプタマー、またはマスキング構築物の存在がなかったら抗体によってその他の方法で検出可能なタンパク質であってもよい。エフェクタータンパク質が活性化されると、マスキング構築物が切断されるか、さもなければ発現停止され、正の検出可能信号としての遺伝子産物の発現および検出が可能になる。
【０３９７】
特定の実施形態例では、マスキング構築物は、マスキング構築物からの１種以上の試薬の放出で正の検出可能信号が発生すように、正の検出可能信号を発生するために必要な１種以上の試薬を隔絶していてもよい。１種以上の試薬を組み合わせて、比色信号、化学発光信号、蛍光信号、または任意の他の検出可能信号を発生してもよく、あるいは、その目的に適うことが分かっている任意の試薬を含んでもよい。特定の実施形態例では、１種以上の試薬は、１種以上の試薬に結合するRNAアプタマーによって隔絶されている。標的分子の検出時にエフェクタータンパク質が活性化され、かつRNAアプタマーまたはDNAアプタマーが分解されると、１種以上の試薬が放出される。
【０３９８】
特定の実施形態例では、マスキング構築物は、（以下でさらに定義される）個々に設定された容量で固体基板の表面に固定でき、単一の試薬を隔絶する。例えば、試薬は、色素を含むビーズであってもよい。固定された試薬によって隔絶される場合に、個々のビーズは散らばり過ぎて検出可能信号を発生できないが、マスキング構築物から解放されると、これらビーズは、例えば凝集または溶液濃度の単純な増加によって検出可能信号を発生できる。特定の実施形態例では、固定されたマスキング剤は、標的分子の検出時に活性化されたエフェクタータンパク質によって切断可能となるRNAまたはDNAに基づくアプタマーである。
【０３９９】
特定の他の実施形態例では、マスキング構築物は、溶液中で固定された試薬に結合して、それにより、溶液中に遊離している個々の標識された結合相手に結合する試薬の能力を遮断する。従って、洗浄工程を試料に用いると、標的分子が存在しない場合は、標識された結合相手を試料から洗い流すことができる。しかしながら、エフェクタータンパク質が活性化されている場合には、マスキング構築物は、試薬に結合するマスキング構築物の能力を妨害するのに十分な程度まで切断されて、それにより、標識された結合相手が固定化試薬に結合することを可能にする。従って、標識された結合相手は、洗浄工程後も残留して、試料中に標的分子が存在することを示している。特定の側面では、固定された試薬に結合するマスキング構築物は、DNAアプタマーまたはRNAアプタマーである。固定された試薬はタンパク質であってもよく、標識記憶の相手は標識された抗体であってもよい。あるいは、固定された試薬はストレプトアビジンであってもよく、標識された結合相手は標識されたビオチンであってもよい。上述の実施形態で使用される結合相手表面の標識は、当技術分野で既知の任意の検出可能な標識であってもよい。さらに、他の既知の結合相手を、本明細書に説明の全体的な設計に従って用いてもよい。
【０４００】
特定の実施形態例では、マスキング構築物は、リボザイムを含んでもよい。リボザイムは、触媒特性を持つRNA分子である。リボザイムすなわち天然起源および遺伝子操作された両方のリボザイムは、本明細書に開示のエフェクタータンパク質によって標的化されてもよいRNAを含むか、またはそれからなる。リボザイムは、負の検出可能信号を発生するか、または正の制御信号の発生を妨げる反応を触媒するように選択されてもよく、あるいは操作されてもよい。活性化されたエフェクタータンパク質によりリボザイムが不活化されると、負の制御信号を発生するか、または正の検出可能信号の発生を妨げる反応は排除されて、それによって正の検出可能信号の発生が可能になる。一実施形態では、リボザイムは、比色反応を触媒して、溶液を第１の色として出現させることができる。リボザイムが不活化されると、溶液はその後に第２の色に変化し、この第２の色は正の検出可能信号である。リボザイムを用いて比色反応を触媒する方法の一例は、Zhao et al.「リボザイムglmSに基づくグルコサミン-6-リン酸の信号増幅」“Signal amplification of glucosamine-6-phosphate based on ribozyme glmS,” Biosens Bioelectron. 2014; 16:337-42に説明されていて、本明細書に開示の実施形態の環境でそのシステムがどのように改変されて作用するのかの例を提供している。あるいは、リボザイムは、存在する場合には、例えば、RNA転写物の切断産物を生成できる。従って、正の検出可能信号の検出は、リボザイムが存在しない場合にのみ生成される切断されていないRNA転写物の検出を含んでもよい。
【０４０１】
特定の実施形態例では、１種以上の試薬は、比色信号、化学発光信号、または蛍光信号などの検出可能な信号の発生を促進できる酵素などのタンパク質であり、１種以上の試薬は、１つ以上のDNAアプタマーまたはRNAアプタマーがタンパク質に結合してタンパク質が検出可能信号を発生できないように阻害されているか、あるいは隔絶されている。本明細書に開示のエフェクタータンパク質が活性化されると、DNAアプタマーまたはRNAアプタマーは、これらアプタマーが検出可能信号を発生するタンパク質の能力をもはや阻害しない程度まで切断されるか、あるいは分解される。特定の実施形態例では、アプタマーは、トロンビン阻害剤アプタマーである。特定の実施形態例では、トロンビン阻害剤アプタマーは、GGGAACAAAGCUGAAGUACUUACCCの配列（配列番号439）を有する。このアプタマーが切断されると、トロンビンが活性になり、ペプチド比色基質または蛍光基質を切断する。特定の実施形態例では、比色基質は、トロンビンのペプチド基質に共有結合されたp-ニトロアニリド（pNA）である。トロンビンにより切断されると、pNAが放出されて、黄色になり、目に見え易くなる。特定の実施形態例では、蛍光基質は、蛍光検出器を用いて検出可能な青色蛍光色素である7-アミノ-4-メチルクマリンである。阻害性アプタマーはまた、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）、β-ガラクトシダーゼ、または子ウシアルカリホスファターゼ（CAP）に使用してもよく、上述の一般的な原理の範囲内で使用してもよい。
【０４０２】
特定の実施形態では、RNA分解酵素またはDNA分解酵素の活性は、酵素阻害アプタマーの切断を介して比色分析により検出される。DNA分解酵素またはRNA分解酵素の活性を比色信号に変換する１種の可能性のある方式は、DNAアプタマーまたはRNAアプタマーの切断を、比色出力を生成可能な酵素の再活性化と結合させることである。RNAまたはDNAの切断がない場合には、無傷のアプタマーは、酵素の標的に結合し、かつその活性を阻害する。この出力システムの利点は、酵素がさらなる増幅工程を提供することであり、（C2c1の側副活性などの）側副活性を介してアプタマーから遊離すると、比色酵素は、比色生成物を生成し続けて信号の増殖が誘導される。
【０４０３】
特定の実施形態では、比色出力により酵素を阻害する既存のアプタマーを使用する。比色出力と共に、トロンビン、タンパク質C、好中球エラスターゼ、スブチリシンなどのいくつかのアプタマー／酵素の対が存在する。これらのタンパク質分解酵素は、pNAに基づく比色基質を有し、市販されている。特定の実施形態では、一般的な比色酵素を標的とする新規のアプタマーが使用される。β-ガラクトシダーゼ、西洋ワサビペルオキシダーゼ、または子ウシ腸アルカリホスファターゼなどの一般的で堅牢な酵素は、SELEXなどの選択手法によって設計された遺伝子操作アプタマーによって標的とされる可能性がある。これらの手法は、ナノモルの結合効率を備えるアプタマーの迅速な選択を可能として、比色出力のためのさらなる酵素／アプタマー対の開発に使用できる可能性がある。
【０４０４】
特定の実施形態では、RNA分解酵素またはDNA分解酵素の活性は、RNA繋留阻害剤の切断を介して比色分析により検出される。多くの一般的な比色酵素には、競争力のある可逆的な阻害剤があり、例えば、β-ガラクトシダーゼはガラクトースによって阻害される。これらの阻害剤の多くの効果は弱いが、それらの効果は局所濃度の増加によって増大させることができる。阻害剤の局所濃度をDNA分解酵素および／またはRNA分解酵素の活性に関連付けて、比色酵素と阻害剤の対をDNA分解酵素センサーおよびRNA分解酵素センサーに組み込むことができる。小分子阻害剤に基づく比色DNA分解酵素またはRNA分解酵素センサーには、比色酵素、阻害剤、および阻害剤および酵素の両方に共有結合し阻害剤を酵素に繋ぐ架橋RNAまたはDNAの３つの構成要素が含まれる。非切断の構成では、酵素は小分子の局所濃度の増加によって阻害され、DNAまたはRNAが（例えばCas13またはCas12の側副切断によって）切断されると、阻害剤が放出されて、比色酵素が活性化される。
【０４０５】
特定の実施形態では、RNA分解酵素またはDNA分解酵素の活性は、グアニン四重鎖の生成および／または活性化を介して比色分析により検出される。DNAのグアニン四重鎖は、ヘム（鉄(III)-プロトポルフィリンIX）と複合体を形成して、ペルオキシダーゼ活性を持つDNAザイムを生成する。ペルオキシダーゼ基質（例えば、ABTS：（2,2’-アジノビス［3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸］-ジアンモニウム塩））が供給されると、グアニン四重鎖-ヘム複合体は、過酸化水素の存在で基質が酸化され、その後溶液中で緑色を生成する。DNA配列を形成するグアニン四重鎖の例は、GGGTAGGGCGGGTTGGGA（配列番号440）である。本明細書で「ステープル」と呼ばれる追加のDNAまたはRNA配列をこのDNAアプタマーにハイブリダイズさせることにより、グアニン四重鎖構造の形成が制限される。側副活性化が起こると、ステープルが切断され、グアニン四重鎖が形成されてヘムが結合する。色の生成は酵素によるために、この手法は特に興味を引くものであり、すなわち側副活性化を超えてさらなる増幅があることを意味している。
【０４０６】
特定の実施形態例では、マスキング構築物は、（以下でさらに定義される）個々の個別の容量で固体基板上に固定化されてもよく、かつ単一の試薬を隔離する。例えば、試薬は、色素を含むビーズであってもよい。固定された試薬によって隔離されると、個々のビーズは散在し過ぎて検出可能な信号を発生できないが、マスキング構築物から解放されると、例えば凝集または溶液濃度の単純な増加によって検出可能信号を発生できる。特定の実施形態例では、固定されたマスキング剤は、標的分子の検出時に活性化されたエフェクタータンパク質によって切断可能なDNAまたはRNAに基づくアプタマーである。
【０４０７】
一実施形態例では、マスキング構築物は、検出剤が溶液中に凝集しているか分散しているかに応じて、色が変化する検出剤を含む。例えば、コロイド状の金などの特定のナノ粒子は、凝集体から分散粒子に移行すると、目に見える紫色から赤色への変化を受ける。従って、特定の実施形態例では、その検出剤は、１つ以上の架橋分子によって集合として保持されていてもよい。架橋分子の少なくとも一部は、RNAまたはDNAを含む。本明細書に開示のエフェクタータンパク質が活性化されると、架橋分子のRNA部分またはDNA部分が切断され、検出剤が分散して対応する色の変化がもたらされる。特定の実施形態例では、検出剤はコロイド状の金属である。コロイド状の金属材料は、液体、ヒドロゾル、または金属ゾルに分散された水不溶性の金属粒子または金属化合物を含んでもよい。コロイド状の金属は、周期律表のIA、IB、IIB、およびIIIB族の金属、ならびに遷移金属、特にVIII族の金属から選択することができる。好ましい金属として、金、銀、アルミニウム、ルテニウム、亜鉛、鉄、ニッケル、およびカルシウムが挙げられる。他の適切な金属としてはまた、リチウム、ナトリウム、マグネシウム、カリウム、スカンジウム、チタン、バナジウム、クロム、マンガン、コバルト、銅、ガリウム、ストロンチウム、ニオブ、モリブデン、パラジウム、インジウム、スズ、タングステン、レニウム、白金、およびガドリニウムが種々の酸化状態として挙げられる。金属は、好ましくは、適切な金属化合物、例えば、Ａ１３＋、Ｒｕ３＋、Ｚｎ２＋、Ｆｅ３＋、Ｎｉ２＋、およびＣａ２＋イオンに由来するイオン形態で提供される。
【０４０８】
RNAまたはDNA架橋が活性化されたCRISPRエフェクターによって切断されると、前述の色の変化が観察される。特定の実施形態例では、粒子はコロイド状金属である。特定の別の実施形態例では、コロイド状金属はコロイド状の金である。特定の実施形態例では、コロイド状のナノ粒子は、15 nmの金ナノ粒子（AuNP）である。コロイド状の金ナノ粒子の独特の表面特性により、溶液に完全に分散した際に520 nmで最大の吸光度が観察され、肉眼では赤色に見える。AuNPは、凝集すると最大吸光度の赤方移動を示しかつ色が暗くなり、最終的には溶液から濃い紫色の凝集体として沈殿する。特定の実施形態例では、ナノ粒子は、ナノ粒子の表面から延びるDNAリンカーを含むように改変される。個々の粒子は、DNAリンカーの少なくとも一部分に両端でハイブリダイズする一本鎖RNA（ssRNA）架橋または一本鎖DNA架橋によって互いに結合される。従って、ナノ粒子は結合された粒子と凝集体の網状体を形成し、暗い沈殿物として出現する。本明細書に開示のCRISPRエフェクターが活性化されると、ssRNA架橋またはssDNA架橋が切断され、結合された網状体からAuNPが解放され、目に見える赤色が生成される。DNAリンカーおよび架橋配列の例を以下に示す。DNAリンカーの末端にあるチオールリンカーは、AuNPへの表面結合に使用できる。その他の形態の結合が使用されてもよい。特定の実施形態例では、各DNAリンカーに１つずつ、AuNPの２つの集団を生成してもよい。これにより、ssRNA架橋が適切な方向に適切に結合し易くなる。特定の実施形態例では、第１のDNAリンカーは3’末端によって結合され、第２のDNAリンカーは5’末端によって結合される。
【表１】
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【０４０９】
特定の別の実施形態例では、マスキング構築物は、検出可能な標識およびその検出可能な標識のマスキング剤が付加されているRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドを含んでもよい。その検出可能な標識／マスキング剤の対の例は、蛍光体および蛍光体の消光剤である。蛍光体の消光は、蛍光体と別の蛍光体または非蛍光分子との間の非蛍光複合体の形成の結果として生じてもよい。この機構は、基底状態の複合体形成、静的消光、または接触消光として知られている。従って、RNAまたはDNAオリゴヌクレオチドは、蛍光体および消光剤が接触消光するのに十分な近接状態に設計されてもよい。蛍光体およびそれらの同族の消光剤は、当技術分野では知られており、当業者ならこの目的のために選択できるものである。特定の蛍光体／消光剤の対は、本発明の環境では必須ではなく、蛍光体／消光剤の対を選択すると、蛍光体のマスキングを確実にできるというだけである。本明細書に開示のエフェクタータンパク質が活性化されると、RNAまたはDNAオリゴヌクレオチドが切断されて、それにより、接触消光効果を維持するために必要な蛍光体と消光剤との間の近接性が切断される。従って、蛍光体の検出を用いて、試料中の標的分子の存在を判断できる。
【０４１０】
特定の別の実施形態例では、マスキング構築物は、金ナノ粒子などの１つ以上の金属ナノ粒子が付着している１つ以上のRNAオリゴヌクレオチドを含んでもよい。実施形態によっては、マスキング構築物は、閉ループを形成する複数のRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドによって架橋された複数の金属ナノ粒子を含む。一実施形態では、マスキング構築物は、閉ループを形成する３つのRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドによって架橋された３つの金ナノ粒子を含む。実施形態によっては、CRISPRエフェクタータンパク質でRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドを切断すると、金属ナノ粒子によって検出可能信号が生成される。
【０４１１】
特定の別の実施形態例では、マスキング構築物は、１つ以上の量子ドットが付着している１つ以上のRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドを含んでもよい。実施形態によっては、CRISPRエフェクタータンパク質によるRNAまたはDNAオリゴヌクレオチドの切断は、量子ドットによって生成される検出可能信号をもたらす。
【０４１２】
一実施形態例では、マスキング構築物は、量子ドットを含んでもよい。量子ドットは、表面に複数のリンカー分子を付着させてもよい。リンカー分子の少なくとも一部分は、RNAまたはDNAを含む。リンカー分子は、量子ドットの消光が起こるのに十分な近接状態で消光剤が保持されるように、一端にある量子ドットに、かつリンカーの長さに沿ってまたは末端にある１つ以上の消光剤に付着している。リンカーは分岐していてもよい。上述のように、量子ドットと消光剤の対は必須ではなく、量子ドットと消光剤の対を選択すると、蛍光体のマスキングを確実にできるというだけである。量子ドットおよびそれらの同族の消光剤は、当技術分野で知られており、当業者ならこの目的のために選択できるものである。本明細書に開示のエフェクタータンパク質が活性化すると、リンカー分子のRNA部分またはDNA部分が切断され、それにより、量子ドットと消光効果を維持するのに必要な１つ以上の消光剤との間の近接性が排除される。特定の実施形態例では、量子ドットはストレプトアビジン結合体である。RNAまたはDNAはビオチンリンカーを介して結合し、各配列：/5Biosg/UCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/（配列番号444）または/5Biosg/UCUCGUACGUUCUCUCGUACGUUC/3IAbRQSp/（配列番号445）を有する消光分子を動員し、/5Biosg/はビオチンタグであり、/3lAbRQSp/はアイオワブラック消光剤である。切断されると、本明細書に開示の活性化されたエフェクターによって、量子ドットは可視的に蛍光を発する。
【０４１３】
同様の方法で、蛍光エネルギー移動（FRET）を使用して、正の検出可能信号を発生することができる。FRETは、エネルギー励起された蛍光体（すなわち「供与体蛍光体」）からの光子が別の分子（すなわち「受容体」）内の電子のエネルギー状態を励起された一重項状態のより高い振動水準に上昇させる非放射プロセスである。供与体蛍光体は、その蛍光体に特徴的な蛍光を発することなく基底状態に戻る。受容体は、別の蛍光体または非蛍光分子であってもよい。受容体が蛍光体である場合に、伝達されたエネルギーは、その蛍光体に特徴的な蛍光として放射される。受容体が非蛍光分子の場合、吸収されたエネルギーは、熱としての損失となる。従って、本明細書に開示の実施形態の文脈では、蛍光体／消光剤の対は、オリゴヌクレオチド分子に付加された供与体蛍光体と受容体の対で置き換えられる。無傷の場合には、マスキング構築物は、受容体から放射される蛍光または熱によって検出されるような第１の信号（負の検出可能信号）を発生する。本明細書に開示のエフェクタータンパク質が活性化されると、RNAオリゴヌクレオチドが切断され、FRETが中断されて供与体蛍光体の蛍光（正の検出可能信号）が検出される。
【０４１４】
特定の実施形態例では、マスキング構築物は、長いRNAまたはDNAの短いヌクレオチドへの切断に応答する、それらの吸光度を変化させる挿入色素の使用を含む。そのような色素がいくつか存在する。例えばピロニンYは、RNAと複合化して、572 nmに吸光度を持つ複合体を生成する。RNAが切断されると、吸光度が失われて色が変化する。メチレンブルーも類似の方法で使用してもよいが、RNA切断時に688 nmで吸光度が変化する。従って、特定の実施形態例では、マスキング構築物は、本明細書に開示のエフェクタータンパク質によるRNAの切断時に吸光度を変化させるRNAおよび挿入色素複合体を含む。
【０４１５】
特定の実施形態例では、マスキング構築物は、HCR反応（ハイブリダイズ連鎖反応）のための開始剤を含んでもよい。例えば、Dirks and Pierce. PNAS 101, 15275-15728 (2004)を参照。HCR反応は、２つのヘアピン種の位置エネルギーを利用する。ヘアピンのうちの１つに対応する領域に相補的な部分を有する一本鎖開始剤が予め安定な混合物に放出されると、その開始剤は一方の種のヘアピンを開く。このプロセスは、次に他方の種のヘアピンを開く一本鎖領域を露出させる。このプロセスは、次に元の開始剤と同一の一本鎖領域を露出させる。得られた連鎖反応は、ヘアピンの供給が消失するまで成長する切れ目の入った二重螺旋の形成に導く可能性がある。得られた生成物の検出は、ゲルによりまたは比色分析により実施してもよい。比色検出法の例として、例えば、Lu et al.「ハイブリダイズ連鎖反応によって引き起こされる酵素カスケード増幅に基づく超高感度比色分析システム」“Ultra-sensitive colorimetric assay system based on the hybridization chain reaction-triggered enzyme cascade amplification ACS Appl Mater Interfaces, 2017, 9(1):167-175、Wang et al.「ハイブリダイズ連鎖反応増幅および分裂アプタマーを使用する酵素不含の比色分析」“An enzyme-free colorimetric assay using hybridization chain reaction amplification and split aptamers” Analyst 2015, 150, 7657-7662,、およびSong et al.「高感度DNA検出のためのハイブリダイズ連鎖反応と組合せたヘアピンDNAプローブの非共有結合蛍光標識」“Non covalent fluorescent labeling of hairpin DNA probe coupled with hybridization chain reaction for sensitive DNA detection.” Applied Spectroscopy, 70(4): 686-694 (2016)が挙げられる。
【０４１６】
特定の実施形態例では、マスキング構築物は、HCR開始剤配列、および開始剤がHCR反応を開始することを妨げるループまたはヘアピンなどの切断可能な構造要素を含んでもよい。活性化されたCRISPRエフェクタータンパク質によって構造要素が切断されると、開始剤が放出されてHCR反応を始動させ、その検出により、試料内に１つ以上の標的が存在することが示される。特定の実施形態例では、マスキング構築物は、RNAループを備えたヘアピンを含む。活性化されたCRISRPエフェクタータンパク質がRNAループを切断すると、開始剤が放出されてHCR反応を始動させる
標的オリゴヌクレオチドの増幅
【０４１７】
特定の実施形態例では、標的RNAおよび／またはDNAは、CRISPRエフェクタータンパク質を活性化する前に増幅されてもよい。任意の適切なRNAまたはDNA増幅技術を使用してもよい。特定の実施形態例では、RNAまたはDNA増幅は、等温増幅である。特定の実施形態例では、等温増幅は、核酸配列決定系増幅（NASBA）、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）、ループ媒介等温増幅（LAMP）、鎖置換増幅（SDA）、ヘリカーゼ依存性増幅（HDA）、またはニッキング酵素増幅反応（NEAR）であってもよい。特定の実施形態例では、限定はされないが、PCR、多重置換増幅（MDA）、ローリングサークル増幅（RCA）、リガーゼ連鎖反応（LCR）、または分岐増幅法（RAM）を含む非等温増幅法を使用してもよい。
【０４１８】
特定の実施形態例では、RNAまたはDNA増幅は、NASBAであり、これは配列特異的逆プライマーによる標的RNAの逆転写により開始されて、RNA／DNA二重鎖を形成する。次に、RNA分解酵素Hを使用してRNA鋳型を分解し、T7プロモーターなどのプロモーターを含む順方向プライマーを結合させ相補鎖の伸長を開始して、二本鎖DNA産物を生成する。次に、RNAポリメラーゼプロモーターを媒介としたDNA鋳型の転写により、標的RNA配列のコピーが作成される。重要なことに、新規の標的RNAのそれぞれは、ガイドRNAによって検出できるため、測定の感度がさらに向上する。次に、ガイドRNAによる標的RNAの結合は、CRISPRエフェクタータンパク質の活性化に繋がり、この方法は上記の概説のように進行する。NASBA反応には、中程度の等温条件で、例えば約41°Cで進行できるというさらなる利点があり、臨床検査室から遠く離れた現場での早期かつ直接的な検出に展開されるシステムや機器に適している。
【０４１９】
特定の別の実施形態例では、リコンビナーゼポリメラーゼ増幅（RPA）反応を使用して、標的核酸を増幅してもよい。RPA反応では、配列特異的プライマーを二本鎖DNA中の相同配列と対合できるリコンビナーゼを使用する。標的DNAが存在すると、DNA増幅が開始するが、熱サイクルや化学的融解などのその他の試料操作は必要ない。RPA増幅システムの全体は、乾燥製剤として安定していて、冷蔵せずとも安全に輸送できる。RPA反応はまた、37〜42°Cの最適な反応温度により等温で実施できる。配列特異的プライマーは、検出すべき標的核酸配列を含む配列を増幅するように設計されている。特定の実施形態例では、T7プロモーターなどのRNAポリメラーゼプロモーターは、プライマーのうちの１つに添加される。これにより、標的配列およびRNAポリメラーゼプロモーターを含む増幅された二本鎖DNA産物が得られる。RPA反応の後に、または反応中に、二本鎖DNA鋳型からRNAを生成するRNAポリメラーゼが添加される。その後に増幅された標的RNAは、CRISPRエフェクターシステムによって検出できる。このようにして、本明細書に開示の実施形態を用いて、標的DNAを検出できる。RPA反応は、標的RNAの増幅にも使用できる。標的RNAは、まず逆転写酵素を使用してcDNAに変換され、続いて第２の鎖DNA合成が実施され、その時点でのRPA反応は上述のように進行する。
【０４２０】
本発明の一実施形態では、ニッキング酵素はCRISPRタンパク質である。従って、dsDNA中へのニックの導入は、プログラム可能で配列特異的であってもよい。図５は、本発明の実施形態を示していて、これは、dsDNA標的の反対の鎖を標的とするように設計された2個のガイドで始まる。本発明によれば、ニッカーゼは、C2c1またはCpf1、C°Cと共同して使用されるC2c1であってもよい。他の実施形態では、等温増幅の温度は、異なる温度で操作可能なポリメラーゼ（例えば、Bsu、Bst、Phi29、クレノウ断片など）から選択されてもよい。
【０４２１】
従って、ニック等温増幅技術が、ニック基質を配列の末端に付加するプライマーのアニーリングおよび伸長を可能にするために元のdsDNA標的の変性を必要とする（例えば、ニッキング酵素増幅反応またはNEARでの）一定の配列優先性を有するニッキング酵素を使用する場合に、ガイドRNAを介してニック部位をプログラムできるCRISPRニッカーゼを使用することは、変性工程が不要になり、反応全体を真に等温にすることが可能になることを意味している。ニック基質を付加するこれらのプライマーは、反応の後半で使用されるプライマーとは異なるため、このことはまた、反応を簡素化し、NEARは2組のプライマー（すなわち4個のプライマー）を必要とするが、C2c1のニック増幅は1組のプライマー組（すなわち2個のプライマー）のみを必要とすることを意味する。これにより、変性を実行してその等温温度まで冷却するための複雑な機器を使用せずに、ニックC2c1増幅をはるかに簡素にかつ簡単に操作できる。
【０４２２】
従って、特定の実施形態例では、本明細書に開示のシステムは、増幅試薬を含んでもよい。核酸の増幅に有用な異なる成分または試薬が本明細書に説明されている。例えば、本明細書に説明の増幅試薬は、Tris緩衝液などの緩衝液を含んでもよい。Tris緩衝液は、例えば、限定はされないが、1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM、10 mM、11 mM、12 mM、13 mM、14 mM、15 mM、25 mM、50 mM、75 mM、1Mなどの濃度を含む、所望の用途または使用に適切な任意の濃度で使用してもよい。当業者は、本発明で使用するためのTrisなどの緩衝液の適切な濃度を決定できる。
【０４２３】
塩化マグネシウム（MgCl2）、塩化カリウム（KCl）、または塩化ナトリウム（NaCl）などの塩を、核酸断片の増幅を改善するために、PCRなどの増幅反応に含んでもよい。塩濃度は特定の反応および用途にも依るが、実施形態によっては、特定のサイズの核酸断片は、特定の塩濃度で最適な結果を生む可能性がある。より大きな産物は、望ましい結果を生み出すために、変更された塩濃度、通常より低い塩濃度を必要とするが、より小さな産物の増幅は、より高い塩濃度でより良い結果を生み出す可能性がある。当業者には、塩の存在および／または濃度が、塩濃度の変化につれて生体反応または化学反応の厳密性を変化させる可能性があり、従って、本発明の本明細書に説明の反応のためには、適切な条件を提供する任意の塩を使用してもよいことが分かっている。
【０４２４】
生体反応または化学反応のその他の成分は、その内部の材料分析のために細胞を破壊するかまたは溶解するために、細胞溶解成分を含んでもよい。細胞溶解成分として、限定はされないが、界面活性剤、NaCl、KCl、硫酸アンモニウム［(NH4)2SO4］などの上述の塩、または他の成分を含んでもよい。本発明に適切である界面活性剤として、Triton X-100、ドデシル硫酸ナトリウム（SDS）、CHAPS（3-[(3−コラミドプロピル)ジメチルアンモニオ]-1-プロパンスルホン酸）、臭化エチルトリメチルアンモニウム、ノニルフェノキシポリエトキシルエタノール（NP-40）を挙げてもよい。界面活性剤の濃度は、特定の用途に依ってもよく、場合によっては反応に固有であってもよい。増幅反応は、限定はされないが、100 nM、150 nM、200 nM、250 nM、300 nM、350 nM、400 nM、450 nM、500 nM、550 nM、600 nM、650 nM、700 nM、750 nM、800 nM、850 nM、900 nM、950 nM、1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM、10 mM、20 mM、30 mM、40 mM、50 mM、60 mM、70 mM、80 mM、90 mM、100 mM、150 mM、200 mM、250 mM、300 mM、350 mM、400 mM、450 mM、500mMなどの濃度を含む、本発明に適切な任意の濃度で使用されるdNTPおよび核酸プライマーを含んでもよい。同様に、本発明に従って有用なポリメラーゼは、当技術分野で知られていて、Taqポリメラーゼ、Q5ポリメラーゼなどを含む特定のまたは一般的なポリメラーゼであってもよい。
【０４２５】
実施形態によっては、本明細書に説明の増幅試薬は、ホットスタート増幅での使用に適切であってもよい。ホットスタート増幅は、実施形態によっては、アダプター分子またはオリゴの二量体化を低減または排除し、あるいは望ましくない増幅産物または人工産物を防止しかつ所望の産物の最適な増幅を得るために有益である可能性がある。増幅に使用するための本明細書に説明の多くの成分は、ホットスタート増幅にも使用できる。実施形態によっては、ホットスタート増幅と共に使用するのに適切な試薬または成分は、必要に応じて、１つ以上の組成物成分に代えて使用されてもよい。例えば、特定の温度または他の反応条件で所望の活性を示すポリメラーゼまたは他の試薬を使用してもよい。実施形態によっては、ホットスタート増幅で使用するために設計または最適化された試薬を使用してもよく、例えば、ポリメラーゼは、転位後または特定の温度に到達した後に活性化してもよい。このポリメラーゼは、抗体系、またはアプタマー系であってもよい。本明細書に説明のポリメラーゼは当技術分野で知られている。この試薬の例には、限定はされないが、ホットスタートポリメラーゼ、ホットスタートdNTP、および光ケージ化dNTPが含まれてもよい。この試薬は知られており、当技術分野では入手可能である。当業者は、個々の試薬に適切な最適温度を決定できる。
【０４２６】
核酸の増幅は、特定の熱サイクル機器または装置を使用して実施してもよく、任意の所望の反応数を同時に実施できるように、単一の反応または纏めて実施してもよい。実施形態によっては、増幅は、マイクロ流体装置またはロボット装置を用いて実施してもよく、または温度について手動変更を用いて実施して、所望の増幅を達成してもよい。実施形態によっては、最適化して、特定の用途または材料に対し最適な反応条件を得てもよい。当業者は、十分な増幅を得るために反応条件を理解して最適化できる。
【０４２７】
特定の実施形態では、本発明の方法またはシステムによるDNAの検出は、検出の前に（増幅された）DNAのRNAへの転写を必要とする。
【０４２８】
本発明の検出方法が、様々な組合せでの核酸増幅および検出手順を含んでもよいことは明白である。検出される核酸は、限定はされないが、DNAおよびRNAを含む任意の天然起源のまたは合成の核酸であってもよく、これらは任意の適切な方法によって増幅されて、検出可能な中間産物を提供する。中間産物の検出は、限定はされないが、直接活性または側副活性によって検出可能信号部分を生成するCRISPRタンパク質の結合および活性化を含む任意の適切な方法によって実施してもよい。
【０４２９】
本明細書に開示のシステム、装置、および方法はまた、特異的に構成されたポリペプチド検出アプタマーの組込みを介して、核酸の検出に加えて、ポリペプチド（またはその他の分子）の検出に適合されてもよい。ポリペプチド検出アプタマーは、上述のマスキング構築物アプタマーとは異なる。まずアプタマーは、１つ以上の標的分子に特異的に結合するように設計されている。一実施形態例では、標的分子は標的ポリペプチドである。別の実施形態例では、標的分子は、標的治療分子などの標的化合物である。SELEXなどの所定の標的に特異性を有するアプタマーを設計および選択する方法は、当技術分野で知られている。所定の標的に対する特異性に加えて、アプタマーは、ポリメラーゼプロモーター結合部位を組み込むようにさらに設計されている。特定の実施形態例では、ポリメラーゼプロモーターは、T7プロモーターである。アプタマー結合を標的に結合する前に、ポリメラーゼ部位は、ポリメラーゼに接近可能ではないか、さもなければ認識可能ではない。しかしながら、アプタマーは、標的の結合時にアプタマーの構造は立体配座的な変化を受け、その結果、ポリメラーゼプロモーターが続いて露出されるように構成されている。ポリメラーゼプロモーターの下流のアプタマー配列は、RNAまたはDNAポリメラーゼによるトリガーオリゴヌクレオチドの生成の鋳型として機能する。従って、アプタマーの鋳型部分は、所定のアプタマーおよびその標的を識別するバーコードまたは他の識別配列をさらに組み込んでもよい。次に上述のガイドRNAは、これらの特定のトリガーオリゴヌクレオチド配列を認識するように設計されてもよい。ガイドRNAのトリガーオリゴヌクレオチドへの結合により、CRISPRエフェクタータンパク質が活性化し、それにより前述のようにマスキング構築物が不活化され、かつ正の検出可能信号が発生するように進行する。
【０４３０】
従って、特定の実施形態例では、本明細書に開示の方法は、１つの試料または１組の試料を、それぞれがペプチド検出アプタマー、CRISPRエフェクタータンパク質、１つ以上のガイドRNA、マスキング構築物を含む個々の個別の容量の組中に分配し、かつ１つ以上の標的分子への検出アプタマーの結合を可能にするのに十分な条件で試料または試料組を培養する追加の工程を含み、対応する標的にアプタマーが結合すると、トリガーオリゴヌクレオチドの合成がRNAポリメラーゼプロモーター結合部位へのRNAポリメラーゼの結合によって開始されるように、ポリメラーゼプロモーターが露出する。
【０４３１】
別の実施形態例では、アプタマーの結合は、アプタマーが標的ポリペプチドに結合すると、プライマー結合部位を露出させてもよい。例えば、アプタマーは、RPAプライマー結合部位を露出させてもよい。従ってプライマーは、次に、上記で概説のRPA反応などの増幅反応に添加または含有されるように供給される。
【０４３２】
特定の実施形態例では、アプタマーは、立体配座切り替えアプタマーであってもよく、これは、関心のある標的に結合すると、二次構造を変化させ、かつ一本鎖DNAの新規領域を露出させることができる。特定の実施形態例では、一本鎖DNAのこれらの新規領域は、連結のための基質として用いてもよく、アプタマーを伸長して、本明細書に開示の実施形態を使用して特異的に検出できるより長いssDNA分子を形成する。アプタマーの設計は、グルコースなどの低エピトープ標的を検出するための三元系複合体とさらに組み合わせることができる（Yang et al. 2015: pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.analchem.5b01634）。立体配座シフトアプタマーおよび対応するガイドRNA（crRNA）の例を以下に示す。
【表２】
2021532815.tif 000004
2021532815.tif 000005
CRISPRシステムの使用方法に関する一般的なコメント
【０４３３】
特定の実施形態では、本明細書に説明の方法は、関心のある１つ以上のポリヌクレオチド標的を標的化することを含んでもよい。関心のあるポリヌクレオチド標的は、特定の疾患またはその治療に関連する、所定の関心のある形質の生成に関連する、または関心のある分子の産生に関連する標的であってもよい。「ポリヌクレオチド標的」の標的化について、この標的化は、翻訳領域、イントロン、プロモーター、および終結領域、リボソーム結合部位、エンハンサー、サイレンサーなどの他の任意の5’または3’調節領域の１つ以上を標的化することを含んでもよい。遺伝子は、関心のあるタンパク質またはRNAをコードしていてもよい。従って、標的は、mRNA、tRNA、またはrRNAに転写されてもよい翻訳領域であってもよいが、それらの複製、転写および調節に関与するタンパク質の認識部位でもあってもよい。
【０４３４】
特定の実施形態では、本明細書に説明の方法は、１つ以上の関心のある遺伝子を標的とすることを含んでもよく、この少なくとも１つの関心のある遺伝子は、長鎖非翻訳RNA（lncRNA）をコードする。lncRNAは、細胞機能にとって重要であることが分かっているが、必須となるlncRNAは細胞型ごとに異なると分かっているので（C.P. Fulco et al., 2016, Science, doi:10.1126/science.aag2445; N.E. Sanjana et al., 2016, Science, doi:10.1126/science.aaf8325）、本明細書で提供の方法は、関心のある細胞の細胞機能に関連するlncRNAを決定する工程を含んでもよい。
【０４３５】
外因性ポリヌクレオチド鋳型を組み込んで標的ポリヌクレオチドを改変するための例示的な方法では、二本鎖切断は、CRISPR複合体によってゲノム配列内に導入され、切断は、外因性ポリヌクレオチド鋳型の相同組換えを介して、その鋳型がゲノム中に組込まれるように修復される。二本鎖切断の存在は、鋳型の組込みを容易にする。
【０４３６】
他の実施形態では、本発明は、真核細胞中でのポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。この方法は、ポリヌクレオチドに結合するCRISPR複合体を用いて、標的ポリヌクレオチドの発現を増強または減弱させることを含む。
【０４３７】
方法によっては、標的ポリヌクレオチドは、細胞内での発現の改変をもたらすように不活化されてもよい。例えば、細胞内の標的配列へCRISPR複合体が結合すると、標的ポリヌクレオチドは、配列が転写されないように、コードされたタンパク質が生成されないように、または配列が野生型配列として機能しないように不活化される。例えば、タンパク質またはマイクロRNAコード配列は、タンパク質が産生されないように不活化されてもよい。
【０４３８】
方法によっては、制御配列は、それがもはや制御配列として機能しないように不活化されてもよい。本明細書で使用される「制御配列」は、核酸配列の転写、翻訳、または到達可能性に影響を及ぼす任意の核酸配列を指す。制御配列の例として、プロモーター、転写ターミネーター、およびエンハンサーが挙げられる。不活化された標的配列は、欠失変異（すなわち１つ以上のヌクレオチドの欠失）、挿入変異（すなわち１つ以上のヌクレオチドの挿入）、またはナンセンス変異（すなわち停止コドンが導入されるように別のヌクレオチドへの単一ヌクレオチドの置換）を含んでもよい。方法によっては、標的配列の不活化は、標的配列の「ノックアウト」をもたらす。
【０４３９】
複数の組合せた摂動を導入し、かつ観察されたゲノム的、遺伝的、プロテオミクス的、後成的、および／または表現型の各効果を単一細胞で検出された摂動と相関させることによって細胞相互作用を識別することを含む、「摂動配列決定（perturb-seq）」とも呼ばれる機能ゲノミクス方法もまた本明細書に提供される。一実施形態では、これらの方法は、単一細胞RNA配列決定（RNA-seq）とクラスター化され規則的に間隔をおいた短鎖回文配列反復（CRISPR）に基づく摂動とを組み合わせる（Dixit et al. 2016, Cell 167, 1853-1866、およびAdamson et al. 2016, Cell 167, 1867-1882）。一般に、これらの方法は、細胞集団内の各細胞が少なくとも１つの摂動を受ける複数の細胞に複数の組合せ摂動を導入することを含み、これら方法は、単一細胞内のゲノム的、遺伝的、プロテオミクス的、後成的、および／または表現型の各差異を、単一細胞内の摂動を受けなかった１つ以上の細胞と比較して検出すること、および測定された差異に対する共変量を説明するモデルを適用して、摂動に関連する測定された差異を判断することを含み、それにより、細胞間および／または細胞内のネットワークまたは回路が推測される。より具体的には、単一細胞の配列決定は、細胞バーコードを含み、それにより、各RNAの起源の細胞が記録される。より具体的には、単一細胞の配列決定は、固有の分子識別子（UMI）を含み、それにより単一細胞内の転写物コピー数またはプローブ結合事象などの測定された信号の捕捉率が決定される。
【０４４０】
これらの方法は、細胞回路の組合せ探索、細胞回路の精査、分子経路の描写、および／または治療法開発のための関連標的の識別に使用できる。より具体的には、これらの方法は、それらの分子鑑定に基づく細胞群を識別するために用いられてもよい。（例えば疾患の）有機的状態と（例えば小分子による）誘発状態との間の遺伝子発現鑑定での類似性は、臨床的に有効な治療法を特定できる可能性がある。
【０４４１】
従って、特定の実施形態では、本明細書で提供される治療方法は、対象から単離された細胞の集団について、上述の摂動配列決定を使用して、最適な治療標的および／または治療法を決定することを含む。
【０４４２】
特定の実施形態では、本明細書の他の段落で説明の摂動配列決定法を使用して、単離された細胞または細胞株中で、関心のある分子の産生に影響を及ぼす可能性のある細胞回路を決定する。
さらなるCRISPR-Casの開発および使用に関する考察
【０４４３】
本発明は、以下の各項目に述べるような、特にCRISPRタンパク質複合体の送達に関連するCRISPR-Cas9の開発および使用ならびに細胞および生物中でのRNAにガイドされたエンドヌクレアーゼの使用という側面に基づいて、さらに詳細に説明できる。
＊「CRISPR-Casシステムを使用する多重ゲノム操作」Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Cong, L., Ran, F.A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., Hsu, P.D., Wu, X., Jiang, W., Marraffini, L.A., & Zhang, F. Science Feb 15;339(6121):819-23 (2013)、
＊「CRISPR-Casシステムを使用する細菌ゲノムのRNAガイドによる編集」RNA-guided editing of bacterial genomes using CRISPR-Cas systems. Jiang W., Bikard D., Cox D., Zhang F, Marraffini LA. Nat Biotechnol Mar;31(3):233-9 (2013)、
＊「CRISPR-Cas媒介ゲノム操作による複数の遺伝子に変異を持つマウスの一段階産出」One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering. Wang H., Yang H., Shivalila CS., Dawlaty MM ., Cheng AW., Zhang F., Jaenisch R. Cell May 9;153(4):910-8 (2013)、
＊「哺乳類の内因性転写状態および後成的状態の光学的制御」Optical control of mammalian endogenous transcription and epigenetic states. Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Hsu PD, Heidenreich M, Cong L, Platt RJ, Scott DA, Church GM, Zhang F. Nature. Aug 22;500(7463):472-6. doi: 10.1038/Nature12466. Epub 2013 Aug 23 (2013)、
＊「ゲノム編集の特異性を向上するRNAガイドCRISPR-Cas9による二重ニッキング」Double Nicking by RNA-Guided CRISPR Cas9 for Enhanced Genome Editing Specificity. Ran, FA., Hsu, PD., Lin, CY., Gootenberg, JS., Konermann, S., Trevino, AE., Scott, DA., Inoue, A., Matoba, S., Zhang, Y., & Zhang, F. Cell Aug 28. pii: S0092-8674(13)01015-5 (2013-A)、
＊「RNAガイドCas9ヌクレアーゼの特異性を標的するDNA」DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Hsu, P., Scott, D., Weinstein, J., Ran, FA., Konermann, S., Agarwala, V., Li, Y., Fine, E., Wu, X., Shalem, O., Cradick, TJ., Marraffini, LA., Bao, G., & Zhang, F. Nat Biotechnol doi:10.1038/nbt.2647 (2013)、
＊「CRISPR-Cas9システムを使用するゲノム操作」Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Ran, FA., Hsu, PD., Wright, J., Agarwala, V., Scott, DA., Zhang, F. Nature Protocols Nov;8(11):2281-308 (2013-B)、
＊「ヒト細胞のゲノム規模でのCRISPR-Cas9ノックアウト選別」Genome-Scale CRISPR-Cas9 Knockout Screening in Human Cells. Shalem, O., Sanjana, NE., Hartenian, E., Shi, X., Scott, DA., Mikkelson, T., Heckl, D., Ebert, BL., Root, DE., Doench, JG., Zhang, F. Science Dec 12. (2013). [Epub ahead of print]、
＊「ガイドRNAと標的DNAとの複合体でのCas9の結晶構造」Crystal structure of cas9 in complex with guide RNA and target DNA. Nishimasu, H., Ran, FA., Hsu, PD., Konermann, S., Shehata, SI., Dohmae, N., Ishitani, R., Zhang, F., Nureki, O. Cell Feb 27, 156(5):935-49 (2014)、
＊「哺乳類細胞でのCRISPRエンドヌクレアーゼCas9のゲノム全域での結合」Genome-wide binding of the CRISPR endonuclease Cas9 in mammalian cells. Wu X., Scott DA., Kriz AJ., Chiu AC., Hsu PD., Dadon DB., Cheng AW., Trevino AE., Konermann S., Chen S., Jaenisch R., Zhang F., Sharp PA. Nat Biotechnol. Apr 20. doi: 10.1038/nbt.2889 (2014)、
＊「ゲノム編集および癌モデリング用のCRISPR-Cas9ノックインマウス」CRISPR-Cas9 Knockin Mice for Genome Editing and Cancer Modeling. Platt RJ, Chen S, Zhou Y, Yim MJ, Swiech L, Kempton HR, Dahlman JE, Parnas O, Eisenhaure TM, Jovanovic M, Graham DB, Jhunjhunwala S, Heidenreich M, Xavier RJ, Langer R, Anderson DG, Hacohen N, Regev A, Feng G, Sharp PA, Zhang F. Cell 159(2): 440-455 DOI: 10.1016/j.cell.2014.09.014(2014)、
＊「ゲノム操作のためのCRISPR-Cas9の開発および応用」Development and Applications of CRISPR-Cas9 for Genome Engineering, Hsu PD, Lander ES, Zhang F., Cell. Jun 5;157(6):1262-78 (2014)、
＊「CRISPR-Cas9システムを用いるヒト細胞での遺伝子選別」Genetic screens in human cells using the CRISPR/Cas9 system, Wang T, Wei JJ, Sabatini DM, Lander ES., Science. January 3; 343(6166): 80-84. doi:10.1126/science.1246981 (2014)、
＊「CRISPR-Cas9媒介による遺伝子不活化のための高活性sgRNAの合理的な設計」Rational design of highly active sgRNAs for CRISPR-Cas9-mediated gene inactivation, Doench JG, Hartenian E, Graham DB, Tothova Z, Hegde M, Smith I, Sullender M, Ebert BL, Xavier RJ, Root DE., (published online 3 September 2014) Nat Biotechnol. Dec;32(12):1262-7 (2014)、
＊「CRISPR-Cas9を使用する哺乳類の脳での遺伝子機能のin vivo調査」In vivo interrogation of gene function in the mammalian brain using CRISPR-Cas9, Swiech L, Heidenreich M, Banerjee A, Habib N, Li Y, Trombetta J, Sur M, Zhang F., (published online 19 October 2014) Nat Biotechnol. Jan;33(1):102-6 (2015)、
＊「操作されたCRISPR-Cas9複合体によるゲノム規模での転写活性化」Genome-scale transcriptional activation by an engineered CRISPR-Cas9 complex, Konermann S, Brigham MD, Trevino AE, Joung J, Abudayyeh OO, Barcena C, Hsu PD, Habib N, Gootenberg JS, Nishimasu H, Nureki O, Zhang F., Nature. Jan 29;517(7536):583-8 (2015)、
＊「誘導性ゲノム編集および転写調節のための分離したCas9構築物」A split-Cas9 architecture for inducible genome editing and transcription modulation, Zetsche B, Volz SE, Zhang F., (published online 02 February 2015) Nat Biotechnol. Feb;33(2):139-42 (2015)、
＊「腫瘍の成長および転移のマウスモデルでのゲノム全域のCRISPR選別」Genome-wide CRISPR Screen in a Mouse Model of Tumor Growth and Metastasis, Chen S, Sanjana NE, Zheng K, Shalem O, Lee K, Shi X, Scott DA, Song J, Pan JQ, Weissleder R, Lee H, Zhang F, Sharp PA. Cell 160, 1246-1260, March 12, 2015（マウスでの多重選別；multiplex screen in mouse）、
＊「黄色ブドウ球菌Cas9を使用するin vivoゲノム編集」In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9, Ran FA, Cong L, Yan WX, Scott DA, Gootenberg JS, Kriz AJ, Zetsche B, Shalem O, Wu X, Makarova KS, Koonin EV, Sharp PA, Zhang F., (published online 01 April 2015), Nature. Apr 9;520(7546):186-91 (2015)、
＊「CRISPR-Cas9を使用する高処理能機能ゲノミクス」“High-throughput functional genomics using CRISPR-Cas9, Shalem et al., Nature Reviews Genetics 16, 299-311 (May 2015)、
＊「CRISPR sgRNA設計を改善する配列決定因子」“Sequence determinants of improved CRISPR sgRNA design,” Xu et al., Genome Research 25, 1147-1157 (August 2015)、
＊「調節ネットワークを分析するための初代免疫細胞でのゲノム全域のCRISPR選別」“A Genome-wide CRISPR Screen in Primary Immune Cells to Dissect Regulatory Networks,” Parnas et al., Cell 162, 675-686 (July 30, 2015)、
＊「CRISPR-Cas9によるウイルスDNAの切断は、B型肝炎ウイルスを効率的に抑制する」“CRISPR/Cas9 cleavage of viral DNA efficiently suppresses hepatitis B virus,”Ramanan et al., Scientific Reports 5:10833. doi: 10.1038/srep10833 (June 2, 2015)、
＊「黄色ブドウ球菌Cas9の結晶構造」“Crystal Structure of Staphylococcus aureus Cas9,” Nishimasu et al., Cell 162, 1113-1126 (Aug. 27, 2015)、
＊「Cas9媒介のin situ飽和変異誘発によるBCL11Aエンハンサーの詳細解析」“BCL11A enhancer dissection by Cas9-mediated in situ saturating mutagenesis, Canver et al., Nature 527(7577):192-7 (Nov. 12, 2015) doi: 10.1038/nature15521. Epub 2015 Sep 16、
＊「Cpf1は、第２部類のCRISPR-Casシステムの単一RNAガイドヌクレアーゼである」Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System, Zetsche et al., Cell 163, 759-71 (Sep 25, 2015)、
＊「多様な第２部類のCRISPR-Casシステムの発見および機能特性」Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems, Shmakov et al., Molecular Cell, 60(3), 385-397 doi: 10.1016/j.molcel.2015.10.008 Epub October 22, 2015、
＊「改善された特異性を備える合理的に遺伝子操作されたCas9ヌクレアーゼ」Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity, Slaymaker et al., Science 2016 Jan 1 351(6268): 84-88 doi: 10.1126/science.aad5227. Epub 2015 Dec 1. [Epub ahead of print]、および
＊「種々のPAM特異性を持つ遺伝子操作されたCpf1酵素」“Engineered Cpf1 Enzymes with Altered PAM Specificities,” Gao et al, bioRxiv 091611; doi: dx.doi.org/10.1101/091611 (Dec. 4, 2016)。
これら項目のそれぞれは、参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において考慮されてもよく、以下にそれらを概説する。
＊  Congらは、真核細胞での使用のための高温性連鎖球菌Cas9と黄色ブドウ球菌Cas9の両方に基づくII型CRISPR-Casシステムを遺伝子操作し、Cas9ヌクレアーゼが短鎖RNAに誘導されて、ヒト細胞とマウス細胞内にDNAの高精度の切断を誘導できることを示した。彼らの研究はさらに、ニッキング酵素に変換されたCas9を使用して、最小限の変異原性活性により真核細胞中で相同性指向修復を促進できることを示した。さらに彼らの研究は、複数のガイド配列を単一のCRISPR配列にコードして、哺乳類ゲノム内の内因性ゲノム遺伝子座部位での複数の同時編集を可能にすることを示し、RNA誘導ヌクレアーゼ技術の容易なプログラム可能性および幅広い適用性を実証した。RNAを使用して細胞内の配列特異性のDNA切断をプログラムするこの能力により、新規領域のゲノム操作ツールを定義付けした。これらの研究はさらに、その他のCRISPR遺伝子座は、哺乳類細胞に移植可能である可能性が高く、さらに哺乳類のゲノム切断を媒介できることを示している。重要なことに、CRISPR-Casシステムのいくつかの側面はさらに改善されて、その効率性および汎用性を向上できると考えられる。
＊  Jiangらは、二本鎖RNAと複合体を形成したクラスター化され規則的に間隔をおいた短鎖回文配列反復（CRISPR）会合Cas9エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎球菌および大腸菌のゲノムに高精度の変異を導入した。この手法は、標的ゲノム部位での二本鎖RNA：Cas9誘導の切断に依存して、未変異の細胞を死滅させ、かつ選択性マーカーまたは対抗選択システムの必要性を回避させた。この研究では、短いCRISPR RNA（crRNA）の配列を変更して、鋳型編集で単ヌクレオチドおよび多重ヌクレオチドの変更を実施して、二本鎖RNA：Cas9の特異性を再プログラミングすることが報告された。この研究は、2個のcrRNAの同時使用が多重変異誘発を可能にすることを示した。さらに、この手法を再結合処理と組み合わせて用いた場合には、肺炎球菌では、説明された手法で回収されたほぼ100%の細胞に所望の変異が含まれ、大腸菌では、回収された65％の細胞にその変異が含まれていた。
＊  Wangら(2013)は、CRISPR-Casシステムを使用して、胚性幹細胞での連続組換えおよび／または単一の変異を有するマウスの長時間の交配によって、従来は複数の段階により産出された複数の遺伝子の変異を有するマウスを一段階で産出した。CRISPR-Casシステムは、機能的に冗長な遺伝子と上位遺伝子との相互作用のin vivo研究を大幅に加速する。
＊  Konermannら(2013)は、CRISPR-Cas9酵素および転写活性化因子様エフェクターに基づくDNA結合ドメインの光学的調節および化学的調節を可能にする多用途で堅牢な技術の必要性に対処した。
＊  Ranら(2013-A)は、Cas9ニッカーゼ変異体とガイドRNA対を組み合わせて、標的となる二本鎖切断を導入する手法について説明している。この手法により、ガイド配列によって特定のゲノム遺伝子座を標的とする微生物CRISPR-CasシステムからのCas9ヌクレアーゼの問題点に対処し、これにより、DNA標的との特定の不一致を許容して、それによって望ましくない非特異的標的の変異誘発を促進できる。ゲノム内の個々のニックは高い忠実度で修復されるために、適切に位置をずらしたガイドRNAを介する同時ニッキングは、二本鎖切断に必要とされ、標的切断のために特異的に認識される塩基の数を増大する。この著者らは、対になったニッキングを使用すると、細胞株内で非特異的標的活性を50〜1,500倍低減し、特異的標的の切断効率を犠牲にすることなくマウス接合子での遺伝子ノックアウトを促進できることを実証した。この多彩な手法により、高い特異性を要する多種多様なゲノム編集用途への対応が可能となる。
＊  Hsuら(2013)は、ヒト細胞でのSpCas9標的特異性を明らかにして、標的部位の選択に関する情報を提供し、非特異的標的の影響を回避した。この研究では、293T細胞および293FT細胞中の700個を超えるガイドRNA変異体、および100個を超える予測ゲノム非特異的標的遺伝子座でのSpCas9誘導の挿入欠失変異の程度を評価した。著者らは、SpCas9が、不一致の数、位置、および分布に敏感な配列依存的に異なる位置でのガイドRNAと標的DNAとの間の不一致を許容することを示した。著者らはさらに、SpCas9を媒介とする切断はDNAメチル化による影響を受けず、SpCas9およびgRNAの投与量を調整して非特異的標的の改変を最小限に抑えることができることを示した。さらに、哺乳類のゲノム操作を容易にするために、著者らは、標的配列の選択および検証ならびに非特異的標的分析を誘導するWebベースのソフトウェアツールを提供できることを報告した。
＊  Ranら(2013-B)は、哺乳類細胞での非相同末端結合（NHEJ）または相同性指向修復（HDR）を介するCas9を媒介するゲノム編集、ならびに下流での機能研究のための改変細胞株の生成のための一連のツールについて説明している。非特異的標的切断を最小限に抑えるために、著者らはさらに、Cas9ニッカーゼ変異体をガイドRNA対とともに使用した二重ニッキング手法について説明している。著者が提供する手順は、標的部位の選択、切断効率の評価、および非特異的標的活性の分析のためのガイドラインを実験的に導き出した。この研究によると、標的の設計から始めて、遺伝子の改変は僅か１〜２週間で達成でき、改変されたクローン細胞株は２〜３週間で誘導できることが示されている。
＊  Shalemらは、ゲノムの全域規模で遺伝子機能を調べる新しい方法を説明している。彼らの研究は、ゲノム規模のCRISPR-Cas9ノックアウト（GeCKO）ライブラリーの送達により、64,751個の固有のガイド配列を有する18,080個の遺伝子を標的とし、ヒト細胞での陰性および陽性の両方の選択検査が可能になることを示した。まず著者らは、GeCKOライブラリーを使用して、癌および多能性幹細胞の細胞生存率に不可欠な遺伝子を特定することを示した。次にメラノーマのモデルで、著者らは、変異タンパク質キナーゼBRAFを阻害する治療薬であるベムラフェニブに対する耐性でその喪失が関与している遺伝子を選別した。彼らの研究によると、最高ランクの候補として、過去に検証された遺伝子であるNF1とMED12、および新規の的中物であるNF2、CUL3、TADA2B、およびTADA1が含まれることを示した。著者らは、同一の遺伝子を標的とする独立したガイドRNA間の高水準の一貫性および高い的中率の確認を観察し、Cas9によるゲノム規模の選別の可能性を実証した。
＊  Nishimasuらは、2.5Åの分解能でsgRNAとその標的DNAとの複合体の化膿性連鎖球菌Cas9の結晶構造を報告した。この構造は、標的認識とヌクレアーゼ葉部で構成される二葉構造を明示し、それらの界面での正に帯電した溝にsgRNA：DNAヘテロ二本鎖が収容されている。認識葉部はsgRNAとDNAの結合には不可欠であるが、ヌクレアーゼ葉部にはHNHおよびRuvCヌクレアーゼドメインが含まれ、それぞれは、標的DNAの相補鎖および非相補鎖の切断のために適切に配置されている。ヌクレアーゼ葉部には、プロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）との相互作用に関与するカルボキシル末端ドメインも含まれる。この高解像度の構造およびそれに伴う機能分析により、Cas9によるRNA誘導DNA標的化の分子機構が明らかになり、それにより新規で多彩なゲノム編集技術の合理的な設計への道が開拓された。
＊  Wuらは、マウス胚性幹細胞（mESC）に短鎖ガイドRNA（sgRNA）を負荷した化膿性連鎖球菌からの触媒的に不活なCas9（dCas9）のゲノム全域での結合部位の位置を解明した。著者らは、試験した4個のsgRNAのそれぞれが、sgRNAの5ヌクレオチド長のシード領域およびNGGプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）が頻繁に特定する数十〜数千のゲノム部位にdCas9を標的化することを示した。クロマチンの非到達性により、シード配列が一致する他の部位へのdCas9の結合が減少し、従って、非特異的標的部位の70％は遺伝子に会合している。著者らは、触媒的に活性なCas9で遺伝子導入されたmESCの295個のdCas9結合部位の標的配列決定により、バックグラウンド水準を超えて変異した１つの部位のみが識別されることを示した。著者らは、Cas9の結合と切断の２つの状態モデルを提案し、これらのモデルでは、シードの一致が結合を誘発するが、切断には標的DNAとの広範な対合が必要となることを示した。
＊  Plattらは、Cre依存性のCas9ノックインマウスを構築した。著者らは、神経細胞、免疫細胞、および内皮細胞でのガイドRNAのアデノ随伴ウイルス（AAV）、レンチウイルス、または粒子が媒介する送達を使用するin vivoならびにex vivoのゲノム編集を提案した。
＊  Hsuら(2014)は、細胞の遺伝子選別を含む、ヨーグルトからゲノム編集までのCRISPR-Cas9の来歴を一般的に説明する総説を示している。
＊  Wangら(2014)は、ゲノム規模のレンチウイルスの単一ガイドRNA（sgRNA）ライブラリーを使用する陽性選択および陰性選択の両方に適する貯蔵された機能喪失型遺伝子選別手法に関わった。
＊  Doenchらは、sgRNAの貯蔵物を形成し、6個の内因性マウス遺伝子および3個の内因性ヒト遺伝子のパネルの全ての可能な標的部位をタイル化し、抗体染色と流動細胞計測法によって標的遺伝子のヌル対立遺伝子を産生するそれらの能力を定量的に評価した。著者らは、PAMの最適化により活性が向上し、またsgRNAを設計するためのオンラインツールも提供されることを示した。
＊  Swiechらは、AAVを媒介とするSpCas9ゲノム編集により、脳内の遺伝子機能の逆遺伝学的研究が可能になることを実証した。
＊  Konermannら(2015)は、リンカーの有無にかかわらず、ステムまたは四塩基ループなどのガイド上の適切な位置に、複数のエフェクタードメイン、例えば、転写活性化因子、機能的およびエピゲノム調節因子を付着させる能力について説明している。
＊  Zetscheらは、Cas9酵素を２つに分割でき、それにより活性化のためのCas9の集合を制御できることを示している。
＊  Chenらは、マウスのゲノム全域のin vivoでのCRISPR-Cas9選別により、肺転移を調節する遺伝子を明らかにする多重選別に関わった。
＊  Ranら(2015)は、SaCas9およびそのゲノム編集能力に関連し、それらは生化学的アッセイから推定できないことを示している。
＊  Shalemら(2015)は、触媒的に不活性なCas9（dCas9）融合が合成的に発現を抑制（CRISPRi）する、または発現を活性化（CRISPRa）するのに使用される方法を説明していて、これは配列による選別および蓄積による選別を含むゲノム全域での選別にCas9を使用する技術進歩、ゲノム遺伝子座を不活化するノックアウト手法、および転写活性を調節する手法を示している。
＊  Xuら(2015)は、CRISPRに基づく選別で単一ガイドRNA（sgRNA）の効率に寄与するDNA配列の特徴を評価した。著者らは、CRISPR-Cas9ノックアウトの効率および切断部位でのヌクレオチドの優先度を調査した。著者らはまた、CRISPR i/aの配列優先度がCRISPR-Cas9ノックアウトの優先度とは実質的に異なることを見出した。
＊  Parnasら(2015)は、ゲノム全域に蓄積されたCRISPR-Cas9ライブラリーを樹状細胞（DC）内に導入して、細菌性リポ多糖（LPS）による腫瘍壊死因子（Tnf）の誘導を制御する遺伝子を識別した。Tlr4シグナル伝達の既知の調節因子および従来不明であった候補因子を、特定しかつLPSへの標準的な応答に明確な影響を及ぼす３つの機能モジュールに分類した。
＊  Ramananら(2015)は、感染細胞中のウイルスエピソームDNA（cccDNA）の切断を実証した。HBVゲノムは、感染した肝細胞の核に、共有結合的に閉じた環状DNA（cccDNA）と呼ばれる3.2kbの二本鎖エピソームDNA種として存在し、この環状DNAは、現状の治療法では複製が阻害されないHBV寿命サイクルの重要な成分である。著者らは、HBVの高度に保存された領域を特異的に標的とするsgRNAが、ウイルス複製および欠失したcccDNAを強力に抑制することを示した。
＊  Nishimasuら(2015)は、5’-TTGAAT-3’ PAMおよび5’-TTGGGT-3’ PAMを含む単一ガイドRNA（sgRNA）およびその二本鎖DNA標的と複合化したSaCas9の結晶構造を報告した。SaCas9のSpCas9との構造比較は、構造の保存性および分岐性の両方を強調して、それらの明確なPAM特異性および相同分子種sgRNA認識を説明している。
＊  Canverら(2015)は、非コードゲノム要素のCRISPR-Cas9に基づく機能調査を示した。著者らは、蓄積されたCRISPR-Cas9ガイドRNAライブラリーを発展させて、ヒトおよびマウスのBCL11Aエンハンサーのin situ飽和変異誘発を実行し、エンハンサーの重要な機能を明らかにした。
＊  Zetscheら(2015)は、Cas9とは異なる特徴を持つフランシセラ・ノビシダ菌U112からの第２部類のCRISPRヌクレアーゼであるCpf1の特性を報告した。Cpf1は、tracrRNAを欠く単一のRNA誘導エンドヌクレアーゼであり、T富化プロトスペーサー隣接モチーフを利用し、かつ千鳥状のDNA二本鎖切断を介してDNAを切断する。
＊  Shmakovら(2015)は、３種の異なる第２部類のCRISPR-Casシステムを報告した。２つのシステムCRISPR酵素（C2c1およびC2c3）には、Cpf1に遠縁のRuvC様エンドヌクレアーゼドメインが含まれる。Cpf1とは異なり、C2c1はDNA切断に関してcrRNAおよびtracrRNAの両方に依存している。第３の酵素（C2c2）は、２つの予測されるHEPN RNA分解酵素ドメインを含み、かつtracrRNAに依存していない。
＊  Slaymakerら(2016)は、化膿性連鎖球菌Cas9（SpCas9）の特異性を改善するための構造誘導タンパク質操作の使用を報告した。著者らは、非特異的標的効果を低減しつつ堅牢な特異的標的切断を維持する「増強された特異性」のSpCas9（eSpCas9）変異体を開発した。
【０４４４】
本明細書で提供の方法およびツールは、tracrRNAを使用しないII型ヌクレアーゼであるC2c1について例示されている。C2c1の相同分子種は、本明細書に記載のように異なる細菌種内で識別されている。類似の特性を有するさらなるII型ヌクレアーゼは、当技術分野で記載の方法（Shmakovら2015, 60:385-397; Abudayeh et al. 2016, Science, 5;353(6299)）を使用して識別できる。特定の実施形態では、新規のCRISPRエフェクタータンパク質を識別するこの方法は、CRISPR-Cas遺伝子座の存在を識別するシードをコードするデータベースから配列を選択する工程、選択された配列中でオープン読み取り枠（ORF）を含むシードの10 kb内に位置する遺伝子座を識別する工程、および単一のORFのみが700個を超えるアミノ酸および既知のCRISPRエフェクターと90％以下の相同性を有する新規CRISPRエフェクターをコードするORFを含む遺伝子座を選択する工程を含む。特定の実施形態では、このシードは、Cas1などのCRISPR-Casシステムに共通のタンパク質である。さらなる実施形態では、CRISPR配列は、新規のエフェクタータンパク質を識別するためのシードとして使用される。
【０４４５】
C2c1およびcrRNAを含む予め組立てられた組換えCRISPR-C2c1複合体は、例えばエレクトロポレーションによって遺伝子導入されてもよく、高い変異率および検出可能な非特異的標的変異の排除をもたらす。Hur, J.K. et al,「Cpf1リボ核タンパク質のエレクトロポレーションによるマウスの標的変異誘発」Targeted mutagenesis in mice by electroporation of Cpf1 ribonucleoproteins, Nat Biotechnol. 2016 Jun 6. doi: 10.1038/nbt.3596［印刷前に電子出版］を参照。Cpf1を使用する効率的な多重化システムは、本発明のtRNAを含む配列から処理されたgRNAを使用するショウジョウバエで実証されている。Port, F. et al,「tRNAに隣接するCas9およびCpf1 gRNAを有する動物中でのCRISPRツールボックスの伸長」Expansion of the CRISPR toolbox in an animal with tRNA-flanked Cas9 and Cpf1 gRNAs. doi: dx.doi.org/10.1101/046417を参照。Cpf1およびC2c1はどちらも、構造の類似性を共有するV型CRISPR-Casタンパク質である。C2c1と同様に、（PAMの近位端で平滑切断部を形成するCas9とは対照的に）Cpf1はPAMの遠位端で千鳥状の二本鎖切断を形成する。従って、C2c1を使用する同様の多重化システムが想定される。
【０４４６】
また、「非常に特異的なゲノム編集のための二量体CRISPR RNA誘導FokIヌクレアーゼ」“Dimeric CRISPR RNA-guided FokI nucleases for highly specific genome editing”, Shengdar Q. Tsai, Nicolas Wyvekens, Cyd Khayter, Jennifer A. Foden, Vishal Thapar, Deepak Reyon, Mathew J. Goodwin, Martin J. Aryee, J. Keith Joung Nature Biotechnology 32(6): 569-77 (2014)は、伸長配列を認識し、かつヒト細胞内で高効率に内因性遺伝子を編集できる二量体RNA誘導FokIヌクレアーゼに関する。
【０４４７】
CRISPR-Casシステム、その成分、およびその成分の送達についての一般情報に関して、それらの方法、材料、送達媒体、ベクター、粒子、AAV、ならびにそれらの製造および使用を含み、かつその量および処方を含む本発明の実施に有用となる全ての情報として、以下の特許が参照される。それらの特許は、米国特許番号8,697,359、8,771,945、8,795,965、8,865,406、8,871,445、8,889,356、8,889,418、8,895,308、8,906,616、8,932,814、8,945,839、8,993,233、および8,999,641；米国特許公開US 2014-0310830（米国出願番号14/105,031）、US 2014-0287938 A1（14/213,991）、US 2014-0273234 A1（14/293,674）、US 2014-0273232 A1（14/290,575）、US 2014-0273231（14/259,420）、US 2014-0256046 A1（14/226,274）、US 2014-0248702 A1（14/258,458）、US 2014-0242700 A1（14/222,930）、US 2014-0242699 A1（14/183,512）、US 2014-0242664 A1（14/104,990）、US 2014-0234972 A1（14/183,471）、US 2014-0227787 A1（14/256,912）、US 2014-0189896 A1（14/105,035）、US 2014-0186958（14/105,017）、US 2014-0186919 A1（14/104,977）、US 2014-0186843 A1（14/104,900）、US 2014-0179770 A1（14/104,837）、US 2014-0179006 A1（14/183,486）、US 2014-0170753（14/183,429）、およびUS 2015-0184139（14/324,960）；14/054,414欧州特許出願EP2 771 468（EP13818570.7）、EP 2 764 103（EP13824232.6）、およびEP 2 784 162（EP14170383.5）；およびPCT特許公報（国際特許出願）WO 2014/093661（PCT/US2013/074743）、WO 2014/093694（PCT/US2013/074790）、WO 2014/093595（PCT/US2013/074611）、WO 2014/093718（PCT/US2013/074825）、WO 2014/093709（PCT/US2013/074812）、WO 2014/093622（PCT/US2013/074667）、WO 2014/093635（PCT/US2013/074691）、WO 2014/093655（PCT/US2013/074736）、WO 2014/093712（PCT/US2013/074819）、WO 2014/093701（PCT/US2013/074800）、WO 2014/018423（PCT/US2013/051418）、WO 2014/204723（PCT/US2014/041790）、WO 2014/204724（PCT/US2014/041800）、WO 2014/204725（PCT/US2014/041803）、WO 2014/204726（PCT/US2014/041804）、WO 2014/204727（PCT/US2014/041806）、WO 2014/204728（PCT/US2014/041808）、WO 2014/204729（PCT/US2014/041809）、WO 2015/089351（PCT/US2014/069897）、WO 2015/089354（PCT/US2014/069902）、WO 2015/089364（PCT/US2014/069925）、WO 2015/089427（PCT/US2014/070068）、WO 2015/089462（PCT/US2014/070127）、WO 2015/089419（PCT/US2014/070057）、WO 2015/089465（PCT/US2014/070135）、WO 2015/089486（PCT/US2014/070175）、PCT/US2015/051691、PCT/US2015/051830である。出願日がそれぞれ、2013年1月30日、2013年3月15日、2013年3月28日、2013年4月20日、2013年5月6日、および2013年5月28日付けの米国仮特許出願61/758,468、61/802,174、61/806,375、61/814,263、61/819,803、および61/828,130も参照される。出願日が2013年6月17日付けの米国仮特許出願61/836,123も参照される。さらに、出願日がいずれも2013年6月17日付けの米国仮特許出願61/835,931、61/835,936、61/835,973、61/836,080、61/836,101、および61/836,127も参照される。さらに出願日が2013年8月5日付けの米国仮特許出願61/862,468および61/862,355、2013年8月28日付けの61/871,301、2013年9月25日付けの61/960,777、および2013年10月28日付けの61/961,980も参照される。さらに参照されるのは、出願日が2014年10月28日付けのPCT/US2014/62558、およびいずれも2013年12月12日付けの米国仮特許出願番号61/915,148、61/915,150、61/915,153、61/915,203、61/915,251、61/915,301、61/915,267、61/915,260、および61/915,397；それぞれ2013年1月29日および2013年2月25日付けの61/757,972および61/768,959；いずれも2014年6月11日付けの62/010,888および62/010,879；いずれも2014年6月10日付けの62/010,329、62/010,439および62/010,441；いずれも2014年2月12日付けの61/939,228および61/939,242；2014年4月15日付けの61/980,012；2014年8月17日付けの62/038,358；いずれも2014年9月25日付けの62/055,484、62/055,460および62/055,487；および2014年10月27日付けの62/069,243である。特に、出願日が2014年6月10日付けの米国を指定する国際出願番号PCT/US14/41806が参照される。出願日が2014年1月22日付けの米国仮特許出願61/930,214が参照される。特に、出願日が2014年6月10日の米国を指定する国際出願番号PCT/US14/41806が参照される。
【０４４８】
さらに記述が以下にある：2015年6月17日付けの米国出願62/180,709「保護ガイドRNA」PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS)；2014年12月12日付けの米国出願62/091,455「保護ガイドRNA」PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS)；2014年12月24日付けの米国出願62/096,708「保護ガイドRNA」PROTECTED GUIDE RNAS (PGRNAS)；2014年12月12日付けの米国出願62/091,462、2014年12月23日付けの62/096,324、2015年6月17日付けの62/180,681、および2015年10月5日付けの62/237,496「CRISPR転写因子のための死滅ガイド」DEAD GUIDES FOR CRISPR TRANSCRIPTION FACTORS；2014年12月12日付けの米国出願62/091,456および2015年6月17日付けの62/180,692、「CRISPR-Casシステムのためのエスコートガイドおよび官能化ガイド」ESCORTED AND FUNCTIONALIZED GUIDES FOR CRISPR-CAS SYSTEMS；2014年12月12日付けの米国出願62/091,461「造血幹細胞（HSC）に関するゲノム編集のためのCRISPR-Casシステムおよび組成物の送達、使用、および治療的応用」DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING AS TO HEMATOPOETIC STEM CELLS (HSCs)；2014年12月19日付けの米国出願62/094,903「ゲノム全域の挿入捕捉配列決定による二本鎖切断およびゲノム再配列の不偏性識別」UNBIASED IDENTIFICATION OF DOUBLE-STRAND BREAKS AND GENOMIC REARRANGEMENT BY GENOME-WISE INSERT CAPTURE SEQUENCING；2014年12月24日付けの米国出願62/096,761「配列操作のためのシステム、方法、最適化された酵素およびガイド足場の遺伝子操作」ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS FOR SEQUENCE MANIPULATION；2014年12月30日付けの米国出願62/098,059、2015年6月18日付けの62/181,641、および2015年6月18日付けの62/181,667「RNA標的システム」RNA-TARGETING SYSTEM；2014年12月24日付けの米国出願62/096,656および2015年6月17日62/181,151「不安定化ドメインを有する、またはそれに会合するCRISPR」CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH DESTABILIZATION DOMAINS；2014年12月24日付けの米国出願62/096,697「AAVを有する、またはそれに会合するCRISPR」CRISPR HAVING OR ASSOCIATED WITH AAV；2014年12月30日付けの米国出願62/098,158「遺伝子操作されたCRISPR複合体挿入標的システム」ENGINEERED CRISPR COMPLEX INSERTIONAL TARGETING SYSTEMS；2015年4月22日付けの米国出願62/151,052「細胞外エキソソーム報告のための細胞標的」CELLULAR TARGETING FOR EXTRACELLULAR EXOSOMAL REPORTING；2014年9月24日付けの米国出願62/054,490「粒子送達成分を使用して疾患および病気を標的とするためのCRISPR-Casシステムならびに組成物の送達、使用、および治療的応用」DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS；2014年2月12日付けの米国出願61/ 939,154「最適化された機能的CRISPR-Casシステムを用いる配列操作のためのシステム、方法、および組成物」SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS；2014年9月25日付けの米国出願62/055,484「最適化された機能的CRISPR-Casシステムを使用する配列操作のためのシステム、方法、および組成物」SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS；2014年12月4日付けの米国出願62/087,537「最適化された機能的CRISPR-CASシステムを使用した配列操作のためのシステム、方法、および組成物」SYSTEMS, METHODS AND COMPOSITIONS FOR SEQUENCE MANIPULATION WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS；2014年9月24日付けの米国出願62/054,651「複数の癌変異の競合をin vivoでモデル化するためのCRISPR-Casシステムならびに組成物の送達、使用、およ��治療的応用」DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO；2014年10月23日付けの米国出願62/067,886「複数の癌変異の競合をin vivoでモデル化するためのCRISPR-Casシステムならびに組成物の送達、使用、および治療的応用」DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR MODELING COMPETITION OF MULTIPLE CANCER MUTATIONS IN VIVO；2014年9月24日付けの米国出願62/054,675および2015年6月17日付けの62/181,002「神経細胞／組織中のCRISPR-Casシステムおよび組成物の送達、使用、および治療的応用」DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN NEURONAL CELLS/TISSUES；2014年9月24日付けの米国出願62/054,528「免疫疾患または免疫障害でのCRISPR-Casシステムおよび組成物の送達、使用、および治療的応用」DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS IN IMMUNE DISEASES OR DISORDERS；2014年9月25日付けの米国出願62/055,454、「細胞透過性ペプチド（CPP）を使用して疾患および病気を標的するためのCRISPR-Casシステムおよび組成物の送達、使用、および治療的応用」DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING CELL PENETRATION PEPTIDES (CPP)；2014年9月25日付けの米国出願62/055,460「多機能的CRISPR複合体および／または最適化された酵素結合した機能的CRISPR複合体」MULTIFUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES；2014年12月4日付けの米国出願62/087,475および2015年6月18日付けの62/181,690「最適化された機能的CRISPR-Casシステムによる機能的選別」FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS；2014年9月25日付けの米国出願62/055,487「最適化された機能的CRISPR-Casシステムによる機能的選別」FUNCTIONAL SCREENING WITH OPTIMIZED FUNCTIONAL CRISPR-CAS SYSTEMS；2014年12月4日付けの米国出願62/087,546および2015年6月18日付けの62/181,687「多機能的CRISPR複合体および／または最適化された酵素結合した機能的CRISPR複合体」MULTIFUNCTIONAL CRISPR COMPLEXES AND/OR OPTIMIZED ENZYME LINKED FUNCTIONAL-CRISPR COMPLEXES；および2014年12月30日付けの米国出願62/098,285「CRISPR媒介されたin vivoモデリングおよび腫瘍の成長および転移の遺伝子選別」CRISPR MEDIATED IN VIVO MODELING AND GENETIC SCREENING OF TUMOR GROWTH AND METASTASISである。
【０４４９】
記述が、2015年6月18日付けの米国出願62/181,659および2015年8月19日付けの62/207,318「配列操作のためのCAS9相同分子種および変異体のシステム、方法、酵素、およびガイド足場の遺伝子操作および最適化」ENGINEERING AND OPTIMIZATION OF SYSTEMS, METHODS, ENZYME AND GUIDE SCAFFOLDS OF CAS9 ORTHOLOGS AND VARIANTS FOR SEQUENCE MANIPULATIONにある。記述が、2015年6月18日付けの米国出願62/181,663および2015年10月22日付けの62/245,264「新規CRISPR酵素およびシステム」NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS；2015年6月18日付けの米国出願62/181,675、2015年10月22日付けの62/285,349、2016年2月17日付けの62/296,522、および2016年4月8日62/320,231「新規CRISPR酵素およびシステム」NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS；2015年9月24日付けの米国出願62/232,067、2015年12月18日付けの米国出願14/975,085、2015年8月16日付けの欧州出願16150428.7および米国出願62/205,733、2015年8月5日付けの米国出願62/201,542、2015年7月16日付けの米国出願62/193,507、および2015年6月18日付けの米国出願62/181,739「新規CRISPR酵素およびシステム」NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMS；および2015年10月22日付けの米国出願62/245,270「新規CRISPR酵素およびシステム」NOVEL CRISPR ENZYMES AND SYSTEMSにある。さらに記述が、2014年2月12日付けの米国出願61/939,256および2014年12月12日付けのWO 2015/089473（PCT/US2014/070152）「配列操作のための新規構築物を備えたシステム、方法、および最適化されたガイド組成物の操作」ENGINEERING OF SYSTEMS, METHODS AND OPTIMIZED GUIDE COMPOSITIONS WITH NEW ARCHITECTURES FOR SEQUENCE MANIPULATIONにある。さらに記述が、それらの特許は、2015年8月15日付けのPCT/US2015/045504、2015年6月17日付けの米国出願62/180,699および2014年8月17日米国出願62/038,358「CAS9ニッカーゼを使用するゲノム編集」GENOME EDITING USING CAS9 NICKASESにある。
【０４５０】
さらに、記述が以下にある：参照によって本明細書内に組込まれる（2014年9月24日付けの米国仮特許出願62/054,490、2014年6月10日付けの62/010,441、ならびにいずれも2013年12月12日付けの61/915,118、61/915,215、および61/915,148のうちの１つ以上または全てからの優先権を主張する）代理人参照番号が47627.99.2060およびBI-2013/107である国際特許出願PCT/US14/70057：名称は「粒子送達成分を用いて疾患および病気を標的するためのCRISPR-Casシステムおよび組成物の送達、使用、および治療的応用」（DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR TARGETING DISORDERS AND DISEASES USING PARTICLE DELIVERY COMPONENTS）（「粒子送達PCT」“the Particle Delivery PCT”と呼ぶ）、および参照によって本明細書内に組込まれる（いずれも2013年12月12日付けの米国仮特許出願61/915,176、61/915,192、61/915,215、61/915,107、61/915,145、61/915,148、および61/915,153のうちの１つ以上または全てからの優先権を主張する）代理人参照番号が47627.99.2091およびBI-2013/101である国際特許出願PCT/US14/70127：名称は「ゲノム編集のためのCRISPR-Casシステムおよび組成物の送達、使用、および治療的応用」（DELIVERY, USE AND THERAPEUTIC APPLICATIONS OF THE CRISPR-CAS SYSTEMS AND COMPOSITIONS FOR GENOME EDITING）（「注目PCT」“the Eye PCT”と呼ぶ）であり、これら特許は、sgRNAおよびCpf1タンパク質を含む混合物（場合によってはHDR鋳型）を、界面活性剤、リン脂質、生分解性ポリマー、リポタンパク質、およびアルコールを含む、またはそれらから本質的になる、またはそれらからなる混合物とさらに混合することを含むsgRNA−Cpf1タンパク質含有粒子を調製する方法、およびその方法による粒子に関連する。例えばこの方法では、Cpf1タンパク質およびsgRNAを、3:1〜1:3、2:1〜1:2、または1:1などの適切なモル比で、15〜30°C、20〜25°C、または室温などの適切な温度で、15〜45分間など、例えば30分間の適切な時間で、有利には1X PBSなどの無菌のヌクレアーゼ不含緩衝液中で共に混合した。これとは別に、例えば1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン（DOTAP）であるカチオン性脂質などの界面活性剤、ジミリストイルホスファチジルコリン（DMPC）などのリン脂質、エチレングリコールポリマーまたはPEGなどの生分解性ポリマー、および例えばコレステロールである低密度リポタンパク質などのリポタンパク質のような粒子成分またはそれらを含む粒子成分を、アルコール、有利にはメタノール、エタノール、2-プロパノールなどのC1〜6アルキルアルコール、例えば100％エタノール中に溶解した。これら２つの溶液を共に混合して、Cas9−sgRNA複合体を含有する粒子を生成した。従って、sgRNAは、粒子内に複合体全体を処方する前に、Cpf1タンパク質と予め複合体を生成してもよい。製剤は、細胞内への核酸の送達を促進することが知られている異なる成分の異なるモル比により作製してもよい（例えば、1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン（DOTAP）、1,2−ジテトラデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン（DMPC）、ポリエチレングリコール（PEG）、およびコレステロール）。例えば、DOTAP：DMPC：PEG：コレステロールのモル比は、DOTAP；100、DMPC；0、PEG；0、コレステロール；0、またはDOTAP；90、DMPC；0、PEG；10、コレステロール；0、またはDOTAP；90、DMPC；0、PEG；5、コレステロール；5であってもよい。従って���この出願は、sgRNA、Cpf1タンパク質、および粒子を形成する成分の混合、ならびにその混合による粒子を包含する。本発明の側面は、粒子を含んでもよく、例えば、本発明のようなsgRNAおよび／またはCpf1を含む混合物と、例えば粒子送達PCTまたは注目PCT内の粒子を形成する成分とを混合して、この混合から得られる粒子（または当然ではあるが、本発明のようなsgRNAおよび／またはCpf1を含む他の粒子）を形成することによる粒子送達PCTまたは注目PCTの方法に類似した方法を使用する粒子を含んでもよい。Cpf1およびC2c1はどちらも、構造の類似性を共有するV型のCRISPR-Casタンパク質である。PAMの近位端で平滑な切断部を形成するCas9とは異なり、Cpf1およびC2c1はPAMの遠位端に千鳥状の切断部を形成する。従って、C2c1を備えた同様のシステムが想定されてもよい。
【０４５１】
本発明は、結果またはデータを伝達する研究プログラムの一部として使用してもよい。コンピュータシステム（またはデジタル装置）を使用して、結果を受信、送信、表示、および／または保存し、データおよび／または結果を解析し、かつ／あるいは結果および／またはデータおよび／または解析の報告書を作成してもよい。コンピュータシステムは、（ソフトウェアなどの）媒体および／または（例えばインターネットからの）ネットワークポートからの命令を読み取ることができる論理装置として考えてもよく、場合によっては、このシステムは、固定媒体を有するサーバーに接続されていてもよい。コンピュータシステムは、１つ以上のCPU、ディスクドライブ、キーボードおよび／またはマウスなどの入力装置、および（モニターなどの）表示部を備えてもよい。指示書や報告書の送信などのデータ通信は、通信媒体を通して地方のまたは離れた場所にあるサーバーに対し達成できる。通信媒体は、データを送信および／または受信する任意の手段を含んでもよい。例えば、通信媒体は、ネットワーク接続、無線接続、またはインターネット接続であってもよい。この接続は、全世界網（World Wide Web）を介して通信を提供できる。本発明に関連するデータは、受信および／または受信者による検討のために、そのようなネットワークまたは接続（または限定はされないが、例えば印刷した物理的な報告書の郵送を含む情報を送信するための他の適切な手段）を介して送信できることが想定される。受信装置は、限定はされないが、個別システムまたは電子システム（例えば、１台以上のコンピュータおよび／または１台以上のサーバー）であってもよい。実施形態によっては、コンピュータシステムは、１台以上の処理装置を含む。処理装置は、コンピュータシステムの１つ以上の制御装置、計算装置、および／または他の装置に関連付けられてもよく、または必要に応じてファームウェアに埋込まれてもよい。ソフトウェアで実行される場合に、操作手順は、RAM、ROM、フラッシュメモリ、磁気ディスク、レーザーディスク、または他の適切な記憶媒体中など、任意のコンピュータ可読メモリに格納してもよい。同様に、このソフトウェアは、例えば、電話回線、インターネット、無線接続などの通信チャネルを介して、あるいは、コンピュータ可読ディスク、フラッシュドライブなどの可搬型媒体を介して、任意の既知の配信方法を介して計算装置に送達されてもよい。様々な工程は、種々のブロック、操作、ツール、モジュール、および技術として実行されてもよく、これらは、ハードウェア、ファームウェア、ソフトウェア、またはハードウェア、ファームウェア、および／またはソフトウェアの任意の組合せで実行されてもよい。ハードウェアで実行される場合に、ブロック、操作、技術などの一部または全ては、例えば、カスタム集積回路（IC）、特定用途向け集積回路（ASIC）、フィールドプログラマブルロジックアレイ（FPGA）、プログラマブルロジックアレイ（PLA）などで実行されてもよい。本発明の実施形態では、顧客サーバーの関連データベース構築物を使用してもよい。顧客サーバー構築物は、ネットワーク上の各コンピュータまたはプロセスが顧客またはサーバーのいずれかであるネットワーク構築物である。サーバーコンピュータは通常、ディスクドライブ（ファイルサーバー）、印刷装置（印刷サーバー）、またはネットワーク通行（ネットワークサーバー）の管理を専用とする強力なコンピュータである。顧客コンピュータには、使用者がアプリケーションを実行するPC（パーソナルコンピュータ）またはワークステーション、ならびに例えば本明細書に開示の出力装置が含まれる。顧客コンピュータは、ファイル、装置、さらには処理能力などの供給源をサーバーコンピュータに依存している。本発明の実施形態によっては、サーバーコンピュータは、データベース機能の全てを処理する。顧客コンピュータには、全てのフロントエンドのデータ管理を処理するソフトウェアを搭載でき、また使用者からのデータ入力を受信できる。コンピュータ実行可能コードを含む機械可読媒体は、限定はされないが、有形記憶媒体、搬送波媒体、または物理的伝送媒体を含む多くの形態を取ってもよい。不揮発性記憶媒体は、例えば、図面に示されるデータベースなどを実行するために用いてもよい、任意のコンピュータ中などの任意の記憶装置などの光学ディスクまたは磁気ディスクを含む。揮発性記憶媒体には、そのようなコンピュータプラットフォームの主要メモリなどのダイナミックメモリが含まれる。有形の伝送媒体には、同軸ケーブル、すなわちコンピュータシステム内のバスを構成するワイヤを含む銅線および光ファイバーが含まれる。搬送波伝送媒体は、電気信号または電磁信号、あるいは無線周波数（RF）および赤外線（IR）データ通信中に生成される音響波または光波の形態を取ってもよい。従って、コンピュータ可読媒体の一般的な形態として、例えば、フロッピーディスク、フレキシブルディスク、ハードディスク、磁気テープ、その他の磁気媒体、CD-ROM、DVD、またはDVD−ROM、その他の光学媒体、パンチカード、紙テープ、穴パターンを有する他の物理記憶媒体、RAM、ROM、PROMおよびEPROM、FLASH−EPROM、その他のメモリチップまたはカートリッジ、データまたは命令を転送するキャリア波、そのキャリア波を転送するケーブルまたはリンク、またはコンピュータがプログラミングコードおよび／またはデータを読み取ることができるその他の媒体が挙げられる。これらの形態のコンピュータ可読媒体の多くは、実行のための１つ以上の系統の１つ以上の命令をプロセッサへ搬送することを含んでもよい。従って、本発明は、本明細書で説明の任意の方法を実行すること、中間品を含む本明細書で説明の任意の方法からの産物とともに、データおよび／またはそれからの結果および／またはそれらの解析結果を保存かつ／あるいは送信することを包含する。
Cas12b（C2c1）
【０４５２】
本発明は、C2c1（V-B型Cas12b）エフェクタータンパク質および相同分子種を提供する。用語「相同分子種(orthologue)」および「相同体(homologue)」は、当技術分野でよく知られている。さらなる説明によっては、本明細書で使用のタンパク質の「相同体」は、相同体となるタンパク質と同一または類似の機能を発揮する同一種のタンパク質である。相同タンパク質は、構造的に同族であってもよいが、必ずしもそうである必要はなく、または一部分のみが構造的に同族であってもよい。本明細書で使用のタンパク質の「相同分子種」は、相同分子種となるタンパク質と同一または類似の機能を発揮する異なる種のタンパク質である。相同分子種タンパク質は、構造的に同族であってもよいが、必ずしもそうである必要はなく、または一部分のみが構造的に同族であってもよい。相同体および相同分子種は、相同性モデリング（例えば、Greer, Science vol. 228 (1985) 1055、およびBlundell et al. Eur J Biochem vol 172 (1988), 513を参照）、あるいは「構造的BLAST」（Dey F, Cliff Zhang Q, Petrey D, Honig B.「機能を推測する構造的関係を使用する"構造的BLAST "に向けて」Toward a "structural BLAST": using structural relationships to infer function、Protein Sci. 2013 Apr;22(4):359-66. doi: 10.1002/pro.2225を参照）によって定義される。さらにCRISPR-Cas遺伝子座分野での応用のためのShmakovら(2015)を参照。相同タンパク質は、構造的に同族であってもよいが、必ずしもそうである必要はなく、または一部分のみが構造的に同族であってもよい。
【０４５３】
C2c1遺伝子は、いくつかの多様な細菌ゲノム、典型的には、cas1、cas2、およびcas4遺伝子およびCRISPRカセットと同じ遺伝子座中に見出される。従って、この推定上の新規CRISPR-Casシステムの配置は、II-B型の配置と類似しているように見受けられる。さらにCas9と同様に、C2c1タンパク質には、活性なRuvC様ヌクレアーゼ、アルギニン富化領域、および（Cas9には存在しない）Znフィンガーが含まれる。
【０４５４】
本発明は、V-B部分型として表示のC2c1遺伝子座に由来するC2c1（Cas12b）エフェクタータンパク質の使用を含む。本明細書では、そのエフェクタータンパク質は、「C2c1p」、例えばC2c1タンパク質とも呼ばれる（かつ、そのエフェクタータンパク質またはC2c1タンパク質またはC2c1遺伝子座に由来するタンパク質は、「CRISPR酵素」とも呼ばれる）。現状では、V-B部分型の遺伝子座には、cas1-Cas4融合、cas2、C2c1と呼ばれる個別の遺伝子、およびCRISPR配列が含まれる。C2c1（CRISPR会合タンパク質C2c1）は、Cas9の対応するドメインに相同なRuvC様ヌクレアーゼドメインを、Cas9の特徴的なアルギニン富化クラスターへの相対物とともに含む高分子のタンパク質（約1100〜1300のアミノ酸）である。ただし、C2c1は全てのCas9タンパク質に存在するHNHヌクレアーゼドメインを欠いており、RuvC様ドメインは、HNHドメインを含む長い挿入物を含むCas9とは対照的に、C2c1配列内で連続している。従って、特定の実施形態では、CRISPR-Cas酵素は、RuvC様ヌクレアーゼドメインのみを含む。
【０４５５】
（Cas12bとしても知られる）C2c1タンパク質は、RNA誘導ヌクレアーゼである。その切断は、tracrRNAに依存して、ガイド配列と直接反復を含むガイドRNAを動員し、このガイド配列は、標的ヌクレオチド配列とハイブリダイズしてDNA/RNAヘテロ二本鎖を形成する。現時点の研究に基づくと、C2c1ヌクレアーゼ活性はまた、PAM配列を必要とし、かつPAM配列の認識に依存する。C2c1 PAM配列は、T富化配列であってもよい。実施形態によっては、PAM配列は、5’ TTN 3’または5’ ATTN 3’であり、式中、Nは任意のヌクレオチドである。特定の実施形態では、PAM配列は5’ TTC 3’である。特定の実施形態では、PAMは熱帯熱マラリア原虫の配列内にある。
【０４５６】
C2c1は、標的遺伝子座に、5’オーバーハングまたは標的配列のPAM遠位側にある「粘着末端」を有する千鳥状の切断を形成する。実施形態によっては、5’オーバーハングは7ヌクレオチド長である。Lewis and Ke, Mol Cell. 2017 Feb 2;65(3):377-379を参照。
【０４５７】
本発明はまた、C2c1エフェクタータンパク質の使用を含むCRISPR-C2c1システムを提供する。実施形態によっては、このシステムは、I）（ａ）直接反復ポリヌクレオチドおよび（ｂ）標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列ポリヌクレオチドを含むcrRNAを含むCRISPR-CasシステムRNAポリヌクレオチド配列、II）tracr RNAポリヌクレオチド、およびIII）場合によっては少なくとも１つ以上の核局在化配列を含む、C2c1をコードするポリヌクレオチド配列を含み、この直接反復配列は、ガイド配列にハイブリダイズしかつCRISPR複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導し、このCRISPR複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズされるまたはハイブリダイズ可能なガイド配列、および（２）直接反復配列と複合化されたCRISPRタンパク質を含み、このCRISPRタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列は、DNAまたはRNAである。このtracrはcrRNAに融合してもよい。例えば、tracr RNAは直接反復の5’末端でcrRNAに融合してもよい。本明細書で使用される用語「crRNA」は、CRISPR RNAを指し、本明細書では、用語「gRNA」または用語「ガイドRNA」と互換的に使用されてもよい。tracrがgRNAのcrRNAに融合する場合に、これは単一ガイドRNAまたは合成ガイドRNA（sgRNA）と呼んでもよい。
【０４５８】
C2c1は、Cas9によって形成されたPAMの近位端での切断とは対照的に、PAMの遠位端で二本鎖切断を形成する（Jinek et al., 2012; Cong et al., 2013）。Cpf1変異標的配列は、単一gRNAによる反復切断を受けやすく、それによりHDRを媒介とするゲノム編集でのCpf1の応用を促進する可能性があることが提案されている（Front Plant Sci. 2016 Nov 14;7:1683）。Cpf1とC2c1はどちらも、構造の類似性を共有するV型CRISPR-Casタンパク質である。C2c1と同様に、Cpf1は（PAMの近位端で平滑な切断部を形成するCas9とは対照的に）PAMの遠位端で千鳥状の二本鎖切断を形成するが、Cpf1とは異なりC2c1システムはtracrRNAを使用する。従って、特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、相同性指向修復（HRまたはHDR）を介してCRISPR-C2c1複合体によって改変される。特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、HRとは独立してCRISPR-C2c1複合体によって改変される。特定の実施形態では、関心のある遺伝子座は、非相同末端結合（NHEJ）を介してCRISPR-C2c1複合体によって改変される。
【０４５９】
C2c1は、Cas9によって生成された平滑末端とは対照的に、5’オーバーハングを有する千鳥状の切断部を形成する（Garneau et al., Nature. 2010;468:67-71、およびGasiunas et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109:E2579-2586）。切断産物のこの構造は、哺乳動物ゲノムへの非相同末端結合（NHEJ）に基づく遺伝子挿入を促進するために特に有利である可能性がある（Maresca et al., Genome research. 2013;23:539-546）。
【０４６０】
特定の実施形態では、エフェクタータンパク質は、アリシクロバチルス（Alicyclobacillus）、デスルホビブリオ（Desulfovibrio）、デスルホナトロナム（Desulfonatronum）、オピツタセアエ（Opitutaceae）、ツベリバチルス（Tuberibacillus）、バチルス（Bacillus）、ブレビバチルス（Brevibacillus）、カンジダトゥス（Candidatus）、デスルファチルハブディウム（Desulfatirhabdium）、シトロバクター（Citrobacter）、エルシミクロビア（Elusimicrobia）、メチロバクテリウム（Methylobacterium）、オムニトロフィカ（Omnitrophica）、フィシスファエラエ（Phycisphaerae）、プランクトミケス（Planctomycetes）、スピロヘータ（Spirochaetes）、ベルコミクロビアセア（Verrucomicrobiaceae）、レンティスファエリア（Lentisphaeria）、ラセイラ（Laceyella）を含む属からの生物に由来するC2c1エフェクタータンパク質である。
【０４６１】
さらなる特定の実施形態では、C2c1エフェクタータンパク質は、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（Alicyclobacillus acidoterrestris：例えばATCC 49025）、アリシクロバチルス・コンタミナンス（Alicyclobacillus contaminans：例えばDSM 17975）、アリシクロバチルス・マクロスポランギイダス（Alicyclobacillus macrosporangiidus：例えばDSM 17980）、バチルス・ヒサシイ株（Bacillus hisashii strain）C4、カンジダトゥス・リンドウバクテリア細菌（Candidatus Lindowbacteria bacterium）RIFCSPLOWO2、デスルフォビブリオ・イノピナトゥス（Desulfovibrio inopinatus：例えばDSM 10711）、デスルフォナトロナム・チオディスムタンス（Desulfonatronum thiodismutans：例えばMLF-1株またはGenbank受託番号WP_031386437）、エルシミクロビア細菌（Elusimicrobia bacterium）RIFOXYA12、オムニトロフィカWOR_2細菌（Omnitrophica WOR_2 bacterium）RIFCSPHIGHO2、オピツタセアエ細菌（Opitutaceae bacterium：TAV5またはGenbank受託番号WP_009513281）、フィフィスファレア細菌（Phycisphaerae bacterium）ST-NAGAB-D1、プランクトマイセス細菌（Planctomycetes bacterium）RBG_13_46_10、スピロヘータ細菌（Spirochaetes bacterium）GWB1_27_13、ベルコミクロビアセア細菌（Verrucomicrobiaceae bacterium）UBA2429、ツベリバチルス・カリドゥス（Tuberibacillus calidus：例えばDSM 17572）、バチルス・テルモアミロボランス（Bacillus thermoamylovorans：例えばB4166株）、ブレビバチルス種（Brevibacillus sp.）CF112、バチルス種（Bacillus sp.）NSP2.1、デスルフェチルハブジウム・ブチラチボランス（Desulfatirhabdium butyrativorans：例えばDSM 18734またはGenbank受託番号WP_028326052）、アリシクロバチルス・ヘルバリウス（Alicyclobacillus herbarius：例えばDSM 13609）、シトロバクター・フロインデイ（Citrobacter freundii：例えばATCC 8090）、ブレビバチルス・アグリ（Brevibacillus agri：例えばBAB-2500）、メチロバクテリウム・ノデュランス（Methylobacterium nodulans：例えばORS 2060またはGenbank受託番号WP_043747912）、アリシクロバチルス・カケガウェンシス（Alicyclobacillus kakegawensis：例えばGenbank受託番号WP_067936067）、バチルス種V3-13（Bacillus sp. V3-13：例えばGenbank受託番号WP_101661451）、レンティスファエリア細菌（Lentisphaeria bacterium：例えばDCFZ01000012）、およびラセエラ・セディミニス（Laceyella_sediminis：例えばGenbank受託番号WP_106341859）から選択される種に由来する。
【０４６２】
特定の実施形態では、C2c1エフェクタータンパク質は、アリシクロバチルス属、バチルス属、デスルファチルハブディウム属、デスルホナトロナム属、レンティスファエラ属、レーセイエラ属、メチロバクテリウム属、またはオピツタセア属から選択される種に由来するか、またはそれに由来する。
【０４６３】
特定の実施形態では、C2c1エフェクタータンパク質は、アリシクロバチルス・カケガウェンシス、バチルス種V3-13、デスルフェチルハブジウム・ブチラチボランス、レンティスファエリア細菌、ラセエラ・セディミニス、メチロバクテリウム・ノデュランス、またはオピツタセアエ細菌から選択される種に由来する。
【０４６４】
特定の実施形態では、C2c1エフェクタータンパク質は、その野生型配列はWP_067936067の配列に対応するアリシクロバチルス・カケガウェンシス、その野生型配列はWP_101661451の配列に対応するバチルス種V3-13、その野生型配列はWP_028326052の配列に対応するデスルフェチルハブジウム・ブチラチボランス、その野生型配列はWP_031386437の配列に対応するデスルフォナトロナム・チオディスムタンス、その野生型配列はDCFZ01000012の配列に対応するレンティスファエリア細菌、その野生型配列はWP_106341859の配列に対応するラセエラ・セディミニス、その野生型配列はWP_043747912の配列に対応するメチロバクテリウム・ノデュランス、またはその野生型配列はWP_009513281の配列に対応するオピツタセア細菌から選択される種に由来する。
【０４６５】
特定の実施態様では、C2c1エフェクタータンパク質は表１から選択された種に由来し、表１に示すように野生型配列を持っている。当然のことだが、本明細書のどこかで述べるように変異または切り詰めCas12bタンパク質は示された配列から乖離している可能性がある。
【表３】
2021532815.tif 000006
2021532815.tif 000007
2021532815.tif 000008
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2021532815.tif 000011
2021532815.tif 000012
【０４６６】
特定の実施態様では、C2c1エフェクタータンパク質は、レンティスファエリア綱またはラセエラ属から選ばれた種に由来する。
【０４６７】
特定の実施態様では、C2c1エフェクタータンパク質は、アリシクロバチルス・カケガウェンシス、バチルス属種V3-13、レンティスファエリア綱細菌、またはラセエラ・セディミニスから選ばれた種に由来する。
【０４６８】
特定の実施態様では、C2c1エフェクタータンパク質は、アリシクロバチルス・カケガウェンシス（野生型配列はWP_067936067の配列に相当）、バチルス属種V3-13（野生型配列はWP_101661451の配列に相当）、レンティスファエリア綱細菌（野生型配列はDCFZ01000012の配列に相当）、またはラセエラ・セディミニス（野生型配列はWP_106341859の配列に相当）から選ばれた種に由来する。
【０４６９】
特定の実施態様では、C2c1エフェクタータンパク質は表２から選ばれた種に由来し、表２に示すような野生型配列を持っている。当然のことだが、本明細書のどこかで述べるように変異または切り詰めCas12bタンパク質は示された配列から乖離している可能性がある。
【表４】
2021532815.tif 000013
2021532815.tif 000014
2021532815.tif 000015
【０４７０】
エフェクターは、第１のエフェクタータンパク質（例えば、C2c1）相同分子種からの第１の断片および第２のエフェクタータンパク質（例えば、C2c1）相同分子種からの第２の断片を含むキメラエフェクタータンパク質を含んでもよい。ここで第１のエフェクタータンパク質相同分子種と第２のエフェクタータンパク質相同分子種は異なっている。第１のエフェクタータンパク質（例えば、C2c1）相同分子種および第２のエフェクタータンパク質（例えば、C2c1）相同分子種のうちの少なくとも一方は、以下の生体由来のエフェクタータンパク質（例えば、C2c1）を含んでいてもよい：アリシクロバチルス、デスルフォビブリオ、デスルフォナトロヌム、オピツタセアエ科、ツベリバチルス、バチルス、ブレビバチルス、カンジダトゥス、デスルフェチルハブジウム、エルシミクロビウム門、シトロバクター、メチロバクテリウム、オムニトロフィカ、フィシスファエラ綱、プランクトミケス門、スピロヘータ門、ベルコミクロビア科、レンティスファエリア綱またはラセエラ属。例えば、キメラエフェクタータンパク質は第１の断片と第２の断片を含み、第１および第２の断片はそれぞれアリシクロバチルス、デスルフォビブリオ、デスルフォナトロヌム、オピツタセアエ科、ツベリバチルス、バチルス、ブレビバチルス、カンジダトゥス、デスルフェチルハブジウム、エルシミクロビウム門、シトロバクター、メチロバクテリウム、オムニトロフィカ、フィシスファエラ綱、プランクトミケス門、スピロヘータ門、ベルコミクロビア科、レンティスファエリア綱またはラセエラ属を含む生体のC2c1から選ばれ、第１の断片と第２の断片は同じバクテリア綱からのものではない。例えばキメラエフェクタータンパク質は第１の断片と第２の断片を含み、第１の断片と第２の断片はアリシクロバチルス・アシドテレストリス（例えば、ATCC 49025）、アリシクロバチルス・コンタミナンス（例えば、DSM 17975）、アリシクロバチルス・マクロスポランギイドゥス（Alicyclobacillus macrosporangiidus）（例えば、DSM 17980）、バチルス・ヒサシイ菌株C4、カンジダトゥス・リンドウバクテリア細菌RIFCSPLOWO2、硫黄還元細菌（例えば、DSM 10711）、デスルフォナトロヌム・チオディスムタンス（例えば、菌株MLF-1またはgenbank受託番号WP_031386437）、エルシミクロビウム門細菌RIFOXYA12、オムニトロフィカWOR_2細菌RIFCSPHIGHO2、オピツタセアエ科細菌TAV5またはgenbank受託番号WP_009513281、フィシスファエラ綱細菌ST-NAGAB-D1、プランクトミケス門細菌RBG_13_46_10、スピロヘータ門細菌GWB1_27_13、ベルコミクロビア科細菌UBA2429、ツベリバチルス・カリドゥス（例えば、DSM 17572）、バチルス・テルモアミロボランス（例えば、菌株B4166）、ブレビバチルス属CF112、バチルス属NSP2.1、デスルフェチルハブジウム・ブチラチボランス（例えば、DSM 18734またはgenbank受託番号WP_028326052）、アリシクロバチルス・ヘルバリウス（例えば、DSM 13609）、シトロバクター・フロインデイ菌（例えば、ATCC 8090）、ブレビバチルス・アグリ（例えば、BAB-2500）、メチロバクテリウム・ノデュランス（例えば、ORS 2060またはgenbank受託番号WP_043747912）、アリシクロバチルス・カケガウェンシス（例えばgenbank受託番号WP_067936067）、バチルス属V3-13（例えばgenbank受託番号WP_101661451）、レンティスファエリア綱細菌（例えばDCFZ01000012から）、ラセエラ・セディミニス（例えばgenbank受託番号WP_106341859）のC2c1から選ばれ、第１の断片と第２の断片は同じバクテリア綱由来ではない。Cas12タンパク質（例えば、Cas12b）がある種に由来する場合、そのタンパク質はその種の野生型Cas12タンパク質でも、その種の野生型Cas12タンパク質の相同体でもよい。その種中の野生型Cas12タンパク質の相同体であるCas12タンパク質はその種中の野生型Cas12タンパク質の１つ以上の変種（例えば、変異、切り詰め等）を含んでいてもよい。
【０４７１】
より好ましい実施態様では、C2c1bは、アリシクロバチルス・アシドテレストリス（例えば、ATCC 49025）、アリシクロバチルス・コンタミナンス（例えば、DSM 17975）、アリシクロバチルス・マクロスポランギイドゥス（例えば、DSM 17980）、バチルス・ヒサシイ菌株C4、カンジダトゥス・リンドウバクテリア細菌RIFCSPLOWO2、硫黄還元細菌（例えば、DSM 10711）、デスルフォナトロヌム・チオディスムタンス（例えば、菌株MLF-1またはgenbank受託番号WP_031386437）、エルシミクロビウム門細菌RIFOXYA12、オムニトロフィカWOR_2細菌RIFCSPHIGHO2、オピツタセアエ科細菌TAV5またはgenbank受託番号WP_009513281、フィシスファエラ綱細菌ST-NAGAB-D1、プランクトミケス門細菌RBG_13_46_10、スピロヘータ門細菌GWB1_27_13、ベルコミクロビア科細菌UBA2429、ツベリバチルス・カリドゥス（例えば、DSM 17572）、バチルス・テルモアミロボランス（例えば、菌株B4166）、ブレビバチルス属CF112、バチルス属NSP2.1、デスルフェチルハブジウム・ブチラチボランス（例えば、DSM 18734またはgenbank受託番号WP_028326052）、アリシクロバチルス・ヘルバリウス（例えば、DSM 13609）、シトロバクター・フロインデイ菌（例えば、ATCC 8090）、ブレビバチルス・アグリ（例えば、BAB-2500）、メチロバクテリウム・ノデュランス（例えば、ORS S 2060またはgenbank受託番号WP_043747912）、アリシクロバチルス・カケガウェンシス（例えばgenbank受託番号WP_067936067）、バチルス属V3-13（例えばgenbank受託番号WP_101661451）、レンティスファエリア綱細菌（例えばDCFZ01000012から）、ラセエラ・セディミニス（例えばgenbank受託番号WP_106341859）から選ばれた細菌種に由来する。特定の実施態様では、C2c1pはアリシクロバチルス・アシドテレストリス（例えば、ATCC 49025）、アリシクロバチルス・コンタミナンス（例えば、DSM 17975）から選ばれた細菌種に由来する。 
【０４７２】
特定の実施態様では、ここに述べるC2c1の相同体または相同分子種は、野生型C2c1と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、それより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%の配列相同性または同一性を持つ。さらなる実施態様では、ここに述べるC2c1の相同体または相同分子種は、野生型C2c1と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、それより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%の配列同一性を持つ。ここで、C2c1は１種以上の変異を持ち、ここに述べるC2c1の相同体または相同分子種は、変異C2c1と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、それより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%の配列同一性を持つ。
【０４７３】
一実施態様では、C2c1タンパク質は以下に述べる属（これらに限定されるものではないが）の生体の相同分子種であってもよい：アリシクロバチルス、デスルフォビブリオ、デスルフォナトロヌム、オピツタセアエ、ツベリバチルス、バチルス、ブレビバチルス、カンジダトゥス、デスルフェチルハブジウム、エルシミクロビウム、シトロバクター、メチロバクテリウム、オムニトロフィカ、フィシスファエラ、プランクトミケス、スピロヘータ、ベルコミクロビア、レンティスファエリア、またはラセエラ。特定の実施態様では、V型Casタンパク質は以下に述べる種（これらに限定されるものではないが）の生体の相同分子種であってもよい：アリシクロバチルス・アシドテレストリス（例えば、ATCC 49025）、アリシクロバチルス・コンタミナンス（例えば、DSM 17975）、アリシクロバチルス・マクロスポランギイドゥス（例えば DSM 17980）、バチルス・ヒサシイ菌株C4、カンジダトゥス・リンドウバクテリア細菌RIFCSPLOWO2、硫黄還元細菌（例えば、DSM 10711）、デスルフォナトロヌム・チオディスムタンス（例えば、菌株MLF-1またはgenbank受託番号WP_031386437）、エルシミクロビウム門 細菌RIFOXYA12、オムニトロフィカWOR_2 細菌RIFCSPHIGHO2、オピツタセアエ科細菌TAV5またはgenbank受託番号WP_009513281、フィシスファエラ綱細菌ST-NAGAB-D1、プランクトミケス門細菌RBG_13_46_10、スピロヘータ門細菌GWB1_27_13、ベルコミクロビア科細菌UBA2429、ツベリバチルス・カリドゥス（例えば、DSM 17572）、バチルス・テルモアミロボランス（例えば、菌株B4166）、ブレビバチルス属CF112、バチルス属NSP2.1、デスルフェチルハブジウム・ブチラチボランス（例えば、DSM 18734またはgenbank受託番号WP_028326052）、アリシクロバチルス・ヘルバリウス（例えば、DSM 13609）、シトロバクター・フロインデイ菌（例えば、ATCC 8090）、ブレビバチルス・アグリ（例えば、BAB-2500）、メチロバクテリウム・ノデュランス（例えば、ORS 2060またはgenbank受託番号WP_043747912）、アリシクロバチルス・カケガウェンシス（例えばgenbank受託番号WP_067936067）、バチルス属V3-13（例えばgenbank受託番号WP_101661451）、レンティスファエリア綱細菌（例えばDCFZ01000012から）、ラセエラ・セディミニス（例えばgenbank受託番号WP_106341859）、バチルス属種V3-13（例えばgenbank受託番号WP_101661451）。特定の実施態様では、ここに述べるC2c1の相同体または相同分子種は、ここに開示したC2c1配列のうちの１つ以上と、少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、それより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%の配列相同性または同一性を持つ。さらなる実施態様では、ここに述べたC2c1の相同体または相同分子種は、野生型AacC2c1またはBthC2c1と少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、それより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%の配列同一性を持つ。
【０４７４】
特定の実施態様では、本発明のC2c1タンパク質はAacC2c1またはBthC2c1と少なくとも60%、とりわけ少なくとも70%、例えば少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、それより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%の配列相同性または同一性を持つ。さらなる実施態様では、本明細書に述べるC2c1タンパク質は野生型AacC2c1と少なくとも60%、例えば少なくとも70%、とりわけ少なくとも80%、より好ましくは少なくとも85%、それより好ましくは少なくとも90%、例えば少なくとも95%の配列同一性を持つ。特定の実施態様では、本発明のC2c1タンパク質はAacC2c1と60%未満の配列同一性を持つ。これはタンパク質の切り詰め型を含み、それにより配列同一性は切り詰め型の鎖長を超えて決定されることを当業者は理解する。
【０４７５】
特定の実施態様では、Cas12b相同分子種はある温度、例えば、約25°C、約26°C、約27°C、約28°C、約29°C、約30°C、約31°C、約32°C、約33°C、約34°C、約35°C、約36°C、約37°C、約38°C、約39°C、約40°C、約41°C、約42°C、約43°C、約44°C、約45°C、約46°C、約47°C、約48°C、約49°C、または約50°Cで活性（例えば、核酸（RNAまたはDNA）の切断活性）を持っていてもよい。所与のCas12b相同分子種はある温度範囲、例えば、30°Cから50°Cまで、30°Cから48°Cまで、37°Cから42°Cまで、または37°Cから48°Cまでに最適な活性を持つ。実施態様によっては、BvCas12bは約37°Cで活性を持つ。実施態様によっては、BhCas12b（例えば、ここに開示された変異体4）は約37°Cで活性を持つ。実施態様によっては、AkCas12bは約48°Cで活性を持つ。この活性は、真核細胞中のCas12b相同分子種の活性である。その代わりにあるいはそれに加えて、この活性は原核生物細胞中の相同分子種の活性である。実施態様によっては、このような活性は最適な活性である。
改変C2c1酵素
【０４７６】
特定の実施態様では、本明細書に規定するように、遺伝子操作されたC2c1タンパク質を活用することは興味深いことである。このタンパク質はRNAを含む核酸分子と複合化して、CRISPR複合体を形成する。CRISPR複合体中で、核酸分子は１つ以上の標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的とし、このタンパク質は未改変C2c1タンパク質と比較して少なくとも１つの改変を含み、改変タンパク質を含むCRISPR複合体は未改変C2c1タンパク質を含む複合体と比較して改変された活性を持つ。当然のことだが、本明細書中でCRISPR「タンパク質」という場合に、C2c1タンパク質は好ましくは（例えば増強または減弱酵素活性（もしくは無酵素活性）を持つ）改変されたCRISPR酵素、例えば、限定はされないがC2c1である。用語「CRISPRタンパク質」は「CRISPR酵素」と互換的に使用してもよく、CRISPRタンパク質が改変されたか、例えば野生型のCRISPRタンパク質と比較して、酵素活性が増強または減弱されたか無活性化されたかは関係ない。
【０４７７】
上記の変異に加えて、CRISPR-Casタンパク質はさらに改変されていてもよい。本明細書で使用される、CRISPR-Casタンパク質に関する用語「改変」は、CRISPR-Casタンパク質が由来する野生型Casタンパク質に比較して、通常１つ以上の改変または変異（点変異、切り詰め、挿入、欠失、キメラ、融合タンパク質などを含む）を持つCRISPR-Casタンパク質を意味する。「由来する」は、野生型酵素と高度の配列相同性を持つという意味で、生成された酵素が大部分は野生型酵素に基づいているが、当技術分野で知られる、あるいはここに記述された何らかの方法で変異（改変）されていることを意味する。
【０４７８】
CRISPR-Casタンパク質のさらなる改変は、改変機能基を生じるかも知れないし、生じないかも知れない。例えば、特にCRISPR-Casタンパク質に関しては、改変機能基を生じない改変は、例えば特定の宿主への発現のためのコドン最適化、またはヌクレアーゼに（例えば可視化のための）特定のマーカーを提供することを含む。改変機能基を生じる改変は、変異、例えば点変異、挿入、欠失、（核酸分解酵素の開裂を含む）切り詰めなどを含む。融合タンパク質は例えば異種ドメインまたは機能性ドメイン（例えば局在化シグナル、触媒ドメイン等）を含むがそれらに限定されない。特定の実施態様では、種々の異なる改変が組み合わされてもよい（例えば触媒的に反応不活性な変異ヌクレアーゼ、およびさらに機能性ドメインに融合して、限定がされないが、例えば切断（例えば異なるヌクレアーゼ（ドメイン）による）、変異、欠失、挿入、置換、連結、消化、切断または再結合などのDNAメチル化または核酸改変を誘導する変異ヌクレアーゼ）。本明細書で使用される「改変機能基」は、（改変標的認識、特異性の増加（例えば「強化」Casタンパク質）もしくは減少、または改変PAM認識などの）改変特異性、（触媒的に反応不活性な核酸分解酵素またはニッカーゼを含む触媒活性の増加または減少などの）改変活性、および／または（非安定化ドメインとの融合などの）改変安定性を含むが、これらに限定はされない。適切な異種ドメインは、ヌクレアーゼ、リガーゼ、修復タンパク質、メチルトランスフェラーゼ、（ウイルスの）インテグラーゼ、組換え酵素、転移酵素、アルゴノート、シチジンデアミナーゼ、レトロン、グループIIイントロン、フォスファターゼ、ホスホリラーゼ、スルフリラーゼ、キナーゼ、ポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼなどを含むが、これらに限定はされない。これらすべての改変例は当技術分野で知られている。当然のことだが、本明細書で述べる「改変」ヌクレアーゼ、特に「改変」Casまたは「改変」CRISPR-Casシステムまたは複合体は、好ましくは（例えばガイド分子との複合体中で）ポリ核酸と相互作用あるいは結合する能力を依然として持っている。このような改変Casタンパク質はここで述べるようなデアミナーゼタンパク質またはその活性ドメインと結合することができる。
【０４７９】
特定の実施態様では、CRISPR-Casタンパク質は、活性および／または特異性の強化をもたらす１種以上の改変、例えば、標的または非標的鎖を安定化させる変異残基（例えばeCas9;「特異性の改善された合理的に改変されたCas9核酸分解酵素」、Slaymaker et al. (2016)、Science、351(6268）:84-88、参照によりその全体が取り込まれる）を含んでいてもよい。特定の実施態様では、遺伝子操作CRISPRタンパク質の改変または改変活性は標的効率の増加または非特異的結合の減少を含む。特定の実施態様では、遺伝子操作CRISPRタンパク質の改変活性は改変切断活性を含む。特定の実施態様では、改変活性は、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関しては切断活性の増加を含む。特定の実施態様では、改変活性は、標的ポリヌクレオチド遺伝子座に関しては切断活性の減少を含む。特定の実施態様では、改変活性は、非特異的なポリヌクレオチド遺伝子座に関しては切断活性の減少を含む。特定の実施態様では、改変ヌクレアーゼの改変または改変活性は改変ヘリカーゼ動態を含む。特定の実施態様では、改変ヌクレアーゼは、タンパク質とRNAを含む核酸分子（Casタンパク質の場合）、または標的ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖、または非特異的ポリヌクレオチド遺伝子座の鎖との会合を改変する改変を含む。本発明の一側面では、遺伝子操作CRISPRタンパク質はCRISPR複合体の形成を改変する改変を含む。特定の実施態様では、改変活性は非特異的なポリヌクレオチド遺伝子座に関しては切断活性の増加を含む。従って、特定の実施態様では、非特異的なポリヌクレオチド遺伝子座と比べて標的ポリヌクレオチド遺伝子座では特異性が増加する。他の実施態様では、ポリヌクレオチド遺伝子座に比べて標的ポリヌクレオチド遺伝子座では特異性が減少する。特定の実施態様では、変異は非特異的効果（例えば切断もしくは結合特性、活性、または動態）の減少、例えばCasタンパク質の場合の標的RNAとガイドRNA間の不一致に対する許容度の低下に繋がる。他の変異が非特異的効果（例えば切断もしくは結合特性、活性、または動態）の増加に繋がるかも知れない。他の変異が非特異的効果（例えば切断もしくは結合特性、活性、または動態）の増加または減少に繋がるかも知れない。特定の実施態様では、変異はヘリカーゼ活性の改変（増加または減少）、機能性ヌクレアーゼ複合体（例えばCRISPR-Cas複合体）の会合または結合に繋がる。特定の実施態様では、上述の通り、変異は改変PAMの認識に繋がる。言い換えれば、異なるPAMが未改変Casタンパク質との比較で（付加または置換部位に）認識される。特に好適な変異は、特異性を増強するために、正に帯電した残基および／または（漸進的な）保存残基、例えば正に帯電した保存残基を含む。特定の実施態様では、このような残基はアラニンのような非帯電残基に対する変異であってもよい。
【０４８０】
C2c1の結晶構造から、もう一つのV型Casタンパク質であるCpf1（Cas12aとしても知られている）との類似が明らかになる。C2c1とCpf1はどちらもα-らせん認識ローブ (REC)とヌクレアーゼローブ(NUC)からなる。NUCローブはさらにオリゴヌクレオチド結合 (WED/OBD)ドメイン、RuvCドメイン、Nucドメイン、および架橋らせん(BH)を含み、構造の組換えと折り畳みによる未変化の三次元C2c1構造（Liuet al. Mol. Cell, 65、310-322）の形成を伴う。Nucドメイン中の特定の変異（例えばAsCpf1中のR1226A、BvCas12b中のR894A）によりCpf1は非標的鎖切断のためのニッカーゼになる。RuvCドメイン中の触媒残基の変異（例えばAsCpf1のD908、E933、D1263における変異）ヌクレアーゼとしてのCpf1の触媒活性を消失させる。さらに、Cpf1のPAM相互作用 (PI)ドメインの変異（例えばAsCpf1のS542、K548、N522、およびK607における変異）がCpf1特異性を改変、すなわち、非特異的切断の潜在的な増加または減少（See Gao et al., Cell Research (2016) 26、901-913 (2016)および Gao et al. Nature Biotechnology 35、789-792 (2017)）をもたらすことが分かっている。C2c1の結晶構造からはC2c1が識別可能なPIドメインを欠き、C2c1が配座調整を受けてPAM認識とR−ループ形成のためのPAM近位二本鎖DNAの結合に順応させる。C2c1はWED／OBDとαらせんドメインを会合させ、主溝側と副溝側の両方からPAM二本鎖を認識させる（Yanget et al., Cell, 167、1814-1828 (2016)）。
【０４８１】
本発明に従えば、酵素の失活を起こすか二本鎖ヌクレアーゼをニッカーゼ活性に改変する、またはC2c1のPAM認識特異性を改変する変異体が生成される。特定の実施態様では、この情報を用いて非特異的な効果を減弱した酵素を開発する。
【０４８２】
特定の実施態様では、編集の優先度は標的領域内の特異的挿入または欠失である。特定の実施態様では、少なくとも１種の改変により１つ以上の特異的挿入欠失の形成が増強される。特定の実施態様では、少なくとも１種の改変はC末端RuvC様ドメイン、NUCドメイン、N末端α-らせん領域、αおよびβ混合領域、またはそれらの組み合わせである。特定の実施態様では、改変編集の優先度は挿入欠失の形成である。特定の実施態様では、少なくとも１種の改変は１つ以上の特異的挿入の形成を増強することである。
【０４８３】
特定の実施態様では、少なくとも１種の改変で１つ以上の特異的挿入の形成が増強される。特定の実施態様では、少なくとも１種の改変で標的領域中のA、T、G、またはCの隣にAが挿入される。他の実施態様では、少なくとも１種の改変で標的領域中のA、T、G、またはCの隣にTが挿入される。他の実施態様では、少なくとも１種の改変で標的領域中のA、T、G、またはCの隣にGが挿入される。他の実施態様では、少なくとも１種の改変で標的領域中のA、T、G、またはCの隣にCが挿入される。挿入は隣接ヌクレオチドに対して5’または3’であってもよい。一実施態様では、１種以上の改変により既存のTの隣にTを挿入する。特定の実施態様では、既存のTはガイド配列の結合領域中の4番目の位置に相当する。特定の実施態様では、１種以上の改変で上に述べたようなより精密な一塩基挿入または欠失を確実にする酵素が得られる。より詳しくは、１種以上の改変により、酵素による他の種類の挿入欠失の形成を減弱してもよい。一塩基挿入または欠失を生成する能力は、特に相同組換え修復が不可能な小さな欠失により起こる病気の遺伝子変異の修正などの、いくつかの応用、例えば、最も一般的な遺伝型の嚢胞性線維症である３つのTの挿入を意図する３つのsRNAの送達を介したCFTR中のF508del変異の修正、あるいは脳内のCDKL5におけるAlia Jafarの単一ヌクレオチド欠失の修正では興味深い。この編集方法は非相同末端結合のみを必要とするので、編集は脳のような分割終了細胞でも可能である。一塩基対挿入／欠失を生成する能力はゲノム全体のCRISPR-Cas陰性選択選抜に有用である。特定の実施態様では、少なくとも１種の改変は変異である。特定の他の実施態様では、１種以上の改変を、１種以上のさらなる改変または結合特異性を増強する改変および／もしくは非特異的な効果を減弱する改変を含む下記の変異と組み合わせてもよい。
【０４８４】
特定の実施態様では、野生型と比較して編集の優先度を改変する少なくとも１種の改変を含む遺伝子操作CRISPR-Casエフェクターは、RNAまたは標的ポリペプチド遺伝子座を含む核酸分子に関して結合特性を改変する、核酸分子または標的分子または標的ポリヌクレオチドに関して結合動態を改変する、あるいは核酸分子に関して結合特異性を改変する１種以上のさらなる改変をさらに含んでもよい。このような改変の例を次の段落にまとめる。上記の情報に基づき、酵素の失活を引き起こす、あるいは二本鎖ヌクレアーゼをニッカーゼ活性に改変する変異体を生成することができる。代替の実施態様では、この情報を使用して非特異的効果の減弱した酵素を開発する。
改変ニッカーゼ
【０４８５】
変異はヌクレアーゼ活性に関与するアミノ酸における隣接残基で行うことができる。実施態様によっては、RuvCドメインのみが失活され、他の実施態様では、もう一つの推定ヌクレアーゼドメインが失活されるが、ここでエフェクタータンパク質複合体はニッカーゼとして機能し一DNA鎖のみを切断する。実施態様によっては、２つの（ニッカーゼが異なる）C2c1変異体を使用して特異性を増強し、２つのニッカーゼ変異体を使用して標的にあるDNAを切断する（ここで両方のニッカーゼがDNA鎖を切断する一方で、一本だけのDNA鎖が切断され、次いで修復される非特異的な改変を最小にするか排除する）。好ましい実施態様では、C2c1エフェクタータンパク質は、２つのC2c1エフェクタータンパク質分子を含むホモ二量体としての関心のある標的遺伝子座と会合した配列またはその遺伝子座にある配列を切断する。好ましい実施態様では、ホモ二量体はそれらの対応するRuvCドメイン中の異なる変異を含む２つのC2c1エフェクタータンパク質分子を含んでいてもよい。
【０４８６】
本発明は２種以上のニッカーゼを用いる方法、特に、双対的なニッカーゼ手法を目論んでいる。側面および実施態様によっては、単一型C2c1ニッカーゼ、例えば本明細書に記載される改変C2c1または改変C2c1ニッカーゼが供給されてもよい。その結果、標的DNAは２つのC2c1ニッカーゼにより束縛される。さらに、異なる相同分子種、例えば、DNAの一本鎖状のC2c1ニッカーゼ（例えば、コード鎖）と非コードすなわち反対側のDNA鎖上の相同分子種を用いてもよいことも想定される。相同分子種はSaCas9ニッカーゼまたはSpCas9ニッカーゼのようなCas9ニッカーゼであってもよいが、これらに限定されるものではない。異なるPAMを必要とし、異なるガイド要件を持ちうる２つの異なる相同分子種を使用するのが有利であり、利用者にとってはより十分な制御が可能となる。特定の実施態様では、DNA 切断は少なくとも４種のニッカーゼを含み、それぞれは標的DNAの異なる配列にガイドされ、各対は第１のニックを第１のDNA鎖に導入し、かつ第２のニックを第２のDNA鎖に導入する。このような方法では、少なくとも２対の単鎖切断が標的DNAに導入され、第１および第２の対の単鎖の切断の導入が起こると、第１のおよび第２の対の単鎖切断間の標的配列が切り取られる。特定の実施態様では、相同分子種の片方または両方が制御可能すなわち誘導可能である。
【０４８７】
本発明に従う特定の方法では、CRISPR-Casタンパク質は、好ましくは対応する野生型酵素に関して、変異CRISPR-Casタンパク質が標的配列を含む標的遺伝子座の片方または両方のDNA鎖を切断する能力を欠くように変異されている。特定の実施態様では、C2c1タンパク質の１箇所以上の触媒ドメインは変異されて、標的配列の１本だけのDNA鎖を切断する変異Casタンパク質を生成する。
【０４８８】
この方法の特定の実施態様では、CRISPR-Casタンパク質は、一本だけのDNA鎖を切断する変異CRISPR-Casタンパク質、すなわちニッカーゼである。具体的には、本発明の文脈では、ニッカーゼは非標的配列、すなわち、標的配列の反対側のDNA鎖にありPAM配列の3’である配列内の切断を確実にする。さらなるガイダンスにより、制限なしに、アリシクロバチルス・アシドテレストリスからのC2c1のNucメイン中のアルギニンからアラニンへの置換 (R911A)は、C2c1を両方の鎖をニッカーゼに切断する（単鎖を切断する）ヌクレアーゼから転換する。酵素がAacC2c1でない場合、変異は対応する位置内の残基によって行われうることを当業者なら分かっている。
【０４８９】
特定の実施態様では、C2c1タンパク質はNucドメイン中の変異を含むC2c1ニッカーゼである。実施態様によっては、C2c1ニッカーゼはアリシクロバチルス・アシドテレストリスC2c1中のアミノ酸位置R911、R1000、またはR1015に対応する変異を含む。実施態様によっては、C2c1ニッカーゼはアリシクロバチルス・アシドテレストリスC2c1中のR911A、R1000A、またはR1015Aに対応する変異を含む。実施態様によっては、C2c1ニッカーゼはバチルス属V3-13 C2c1中のR894Aに対応する変異を含む。特定の実施態様では、C2c1タンパク質は、このタンパク質の未変異すなわち未改変型に比べて特異性が増強または減弱されたPAMを認識する。実施態様によっては、C2c1タンパク質はこのタンパク質の未変異すなわち未改変型に対して改変PAMを認識する。
失活／不活化C2c1タンパク質
【０４９０】
C2c1タンパク質がヌクレアーゼ活性を持っている場合、このタンパク質のヌクレアーゼ活性を減弱する、例えば、野生型酵素と比べて、少なくとも70%、少なくとも80%、少なくとも90%、少なくとも95%、少なくとも97%、または100%のヌクレアーゼを失活するように改変してもよい。別の言い方をすれば、C2c1酵素が未変異または野生型C2c1酵素またはCRISPR 酵素のヌクレアーゼ活性の約0%を持つように、あるいは未変異または野生型C2c1酵素ヌクレアーゼ活性の約3%以下、約5%以下、または約10%以下を持つように改変してもよい。実施態様によっては、変異酵素のDNA切断活性がその酵素の未変異型のDNA切断活性の約25%以下、10%以下、5%以下、1%以下、0.1%以下、または0.01%以下のとき、CRISPR-Casタンパク質は実質的にすべてのDNA切断活性を欠いていると考えられる。そのような例は変異型のDNA切断活性が未変異型と比べて皆無か無視できる場合である。これらの実施態様では、CRISPR-Casタンパク質は一般のDNA結合タンパク質として用いられる。これは、変異をC2c1およびその相同分子種のヌクレアーゼドメインに導入することで可能である。
【０４９１】
特定の実施態様では、CRISPR酵素は、遺伝子操作されてヌクレアーゼ活性を減じるか消失させる１種以上の変異を含むことができる。
【０４９２】
特定の実施態様では、C2c1タンパク質はRuvCドメイン中に変異を含む触媒的に反応不活性なC2c1である。実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、アリシクロバチルス・アシドテレストリスC2c1中のアミノ酸位置D570、E848、またはD977に対応する変異を含む。実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、アリシクロバチルス・アシドテレストリスC2c1中のD570A、E848A、またはD977Aに対応する変異を含む。
【０４９３】
実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、バチルス・ヒサシイC2c1中のアミノ酸位置D574、E828、またはD952に対応する変異を含む。実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、バチルス・ヒサシイC2c1中のD574A、E828A、またはD952Aに対応する変異を含む。
【０４９４】
実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、バチルス属V3-13 C2c1中のアミノ酸位置D567、E831、またはD963に対応する変異を含む。実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、バチルス属V3-13 C2c1中のD567A、E831A、またはD963Aに対応する変異を含む。
【０４９５】
特定の実施態様では、C2c1タンパク質はRuvCドメイン中に変異を含む触媒的に反応不活性なC2c1である。実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、アリシクロバチルス・アシドテレストリスC2c1中のアミノ酸位置D570、E848、またはD977に対応する変異を含む。実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、アリシクロバチルス・アシドテレストリスC2c1中のD570A、E848A、またはD977Aに対応する変異を含む。
【０４９６】
実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、バチルス・ヒサシイC2c1中のアミノ酸位置D574、E828、またはD952に対応する変異を含む。実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、バチルス・ヒサシイC2c1中のD574A、E828A、またはD952Aに対応する変異を含む。
【０４９７】
実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、バチルス属V3-13 C2c1中のアミノ酸位置D567、E831、またはD963に対応する変異を含む。実施態様によっては、触媒的に反応不活性なC2c1タンパク質は、バチルス属V3-13 C2c1中のD567A、E831A、またはD963Aに対応する変異を含む。
【０４９８】
特定の実施態様では、C2c1タンパク質はNucドメイン中に変異を含むC2c1ニッカーゼである。実施態様によっては、C2c1ニッカーゼは、アリシクロバチルス・アシドテレストリスC2c1中のアミノ酸位置R911、R1000、またはR1015に対応する変異を含む。実施態様によっては、C2c1ニッカーゼは、アリシクロバチルス・アシドテレストリスC2c1中のR911A、R1000A、またはR1015Aに対応する変異を含む。実施態様によっては、C2c1ニッカーゼは、バチルス属種V3-13 C2c1中のR894Aに対応する変異を含む。特定の実施態様では、C2c1タンパク質は、タンパク質の未変異または未改変型に比べて大きなまたは小さな特異性でPAMを認識する。実施態様によっては、C2c1タンパク質はこのタンパク質の未変異または未改変型との比較で改変PAMを認識する。
【０４９９】
実施態様によっては、変異酵素のDNA切断活性が、酵素の未変異型のDNA切断活性の約25%以下、10%以下、5%以下、1%以下、0.1%以下、または0.01%以下であるとき、CRISPR-Casタンパク質は、実質的にすべてのDNA切断活性を欠いていると考えられる。その一例は変異型のDNA切断活性がその未変異型との比較で皆無か無視できる場合である。これらの実施態様では、CRISPR-Casタンパク質は一般的なDNA 結合タンパク質として使用される。変異は人工的に導入された変異または機能獲得型もしくは機能喪失型の変異であってもよい。
【０５００】
上記の変異に加えて、CRISPR-Casタンパク質はさらに改変されてもよい。本明細書で使用される、CRISPR-Casタンパク質に関する用語「改変」は、通常、野生型Casタンパク質に由来する改変との比較で、１種以上の改変または変異（点変異、切り詰め、挿入、欠失、キメラ、融合タンパク質等を含む）を持つCRISPR-Casタンパク質を意味する。「由来する」は、野生型酵素と高度の配列相同性を持つという意味で、生成された酵素は、大部分が野生型酵素に基づいているが、当技術分野で知られる、あるいはここに記述された何らかの方法で変異（改変）されていることを意味する。
【０５０１】
不活性化C2c1 CRISPR酵素は、（例えば、融合タンパク質または適切なリンカーを介して）会合した１つ以上の機能ドメイン、例えばデアミナーゼ活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写昂進活性、転写抑制活性、転写終結因子活性、ヒストン修飾活性、RNA切断活性、DNA切断活性、核酸結合活性、および分子スイッチ（例えば、光誘起性）を含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる群からの１つ以上のドメインを持っていてもよい。本発明の方法で使用に適するリンカーは当業者には周知で、限定はされないが、直鎖状または分岐鎖状の炭素リンカー、複素環炭素リンカー、またはペプチドリンカーを含む。なお、本明細書で使用されるリンカーは共有結合（炭素−炭素結合または炭素−異種原子結合）であってもよい。特定の実施態様では、リンカーは標的ドメインとアデノシンデアミナーゼを、各タンパク質が要求される機能性を維持するのに十分な距離だけ分離するのに使用される。好適なペプチドリンカー配列は柔軟な伸張配座に適合し、規則的な二次構造を発達させる傾向を示さない。特定の実施態様では、リンカーは、単量体、二量体、多量体または重合体である化学部分であってもよい。好ましくは、リンカーはアミノ酸を含む。柔軟なリンカー中の典型的なアミノ酸はGly、AsnおよびSerを含む。従って、特定の実施態様では、リンカーGly、AsnおよびSerアミノ酸のうちの１種以上の組み合わせを含む。ThrおよびAlaなどの他のほぼ中性アミノ酸もリンカー配列中に使用されてもよい。典型的なリンカーはMaratea et al. (1985), Gene 40: 39-46; Murphy et al. (1986) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 83: 8258-62、米国特許第4,935,233号、および米国特許第4,751,180号に開示されている。例えば、GlySerリンカーGGS、GGGS（配列番号402）またはGSGが使用できる。GGS、GSG、GGGSまたはGGGGS（配列番号403）リンカーは３つ、例えば(GGS)3（配列番号404）、(GGGGS)3（配列番号393）または５つ（配列番号405）、６つ（配列番号394）、７つ（配列番号406）、９つ（配列番号395）さらには１２（配列番号396）以上の反復配列中に使用して適当な鎖長を提供することができる。特定の実施態様では、リンカー(GGGGS)3が本明細書中で好適に使用される。(GGGGS)6 (GGGGS)9または(GGGGS)12は代替物として好適に使用できる。他の好適な代替物は(GGGGS)1（配列番号403）、(GGGGS)2（配列番号407）、(GGGGS)4（配列番号408）、(GGGGS)5（配列番号405）、(GGGGS)7（配列番号406）、(GGGGS)8（配列番号409）、(GGGGS)10（配列番号410）、または(GGGGS)11（配列番号411）である。さらなる実施態様では、LEPGEKPYKCPECGKSFSQSGALTRHQRTHTR（配列番号412）がリンカーとして使用される。さらなる実施態様では、リンカーはXTENリンカーである。さらに、N-およびC-末端NLSもリンカー（例えば、PKKKRKVEASSPKKRKVEAS（配列番号413））として機能する。
【０５０２】
リンカーの例を下表に示す。
【表５】
2021532815.tif 000016
【０５０３】
典型的な機能ドメインは (ADAD)ファミリーのメンバーであるFok1、VP64、P65、HSF1、MyoD1を含むアデノシンデアミナーゼドメインである。デアミナーゼがあれば、ガイド配列がガイド配列と標的配列の間に形成されたRNA二本鎖またはRNA/DNAヘテロ二本鎖中に１つ以上の不一致を導入するように意図されている点で有利である。特定の実施態様では、ガイド配列と標的配列の間の二本鎖はA−C不一致を含む。Fok1があれば、Tsai et al. Nature Biotechnology, Vol. 32, Number 6, June (2014)に具体的に記載されているように、複数のFok1機能ドメインが機能性二量体を可能にするように提供され、かつ機能的使用(Fok1)のためにgRNAが適切な間隔を提供するように意図されている点で有利である。アダプタータンパク質はこのような機能ドメインに結合する既知のリンカーを利用してもよい。場合によってはさらに少なくとも１つのNLSが提供されるのが好ましい。場合によっては、N末端にNLSを配置するのが好ましい。２つ以上の機能ドメインが含まれる場合、これらの機能ドメインは同じでも異なっていてもよい。
【０５０４】
一般に、不活性化C2c1酵素上への１つ以上の機能ドメインの配置は、機能ドメインの正確な空間定位を可能にし、帰属された機能効果を持つ標的に影響させる配置である。例えば、機能ドメインが転写活性化因子（例えば、VP64またはp65）の場合、その転写活性化因子は標的の転写に影響する空間定位に配置される。同様に、転写抑制因子は好ましくは標的の転写に影響するように配置され、かつヌクレアーゼ（例えば、Fok1）は好ましくは標的を切断または部分的に切断するように配置される。この配置はCRISPR酵素のN-/C-末端以外の配置を含んでいてもよい。機能ドメインは標的DNA配列の転写または翻訳を改変する。
【０５０５】
実施態様によっては、Cas12bエフェクタータンパク質は１つ以上の機能ドメインと会合し、かつCas12bエフェクタータンパク質はRuvCおよび／またはNucドメイン中に１つ以上の変異を含み、それにより形成されたCRISPR複合体により、後成的な改変因子または転写もしくは翻訳活性化または抑制シグナルの送達が可能となる。
【０５０６】
特定の実施態様では、本明細書に開示されたCRISPR-Casシステムは自己不活性化システムであり、Casエフェクタータンパク質は一過性に発現される。実施態様によっては、自己不活性化システムはアデノ随伴ウイルスベクターのようなウイルスのベクターを含む。実施態様によっては、自己不活性化システムは内因性標的配列と80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、97%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、100%の同一性を共有するDNA配列を含む。実施態様によっては、自己不活性化システムは２つ以上のベクターシステムを含む。実施態様によっては、自己不活性化システムは単一のベクターを含む。実施態様によっては、自己不活性化システムは、内因性DNA標的配列を同時に標的にするCasエフェクターとこのCasエフェクタータンパク質をコードするベクター配列を含む。実施態様によっては、自己不活性化システムは、内因性DNA標的配列を標的にするCasエフェクターとこのCasエフェクタータンパク質を順にコードするベクター配列を含む。実施態様によっては、Casエフェクターとガイド配列をコードするヌクレオチドは、単一ベクター上の分離調節エレメントに作動可能に連結されている。実施態様によっては、Casエフェクターとガイド配列をコードするヌクレオチドは、分離ベクター上の分離調節エレメントに作動可能に連結されている。実施態様によっては、調節エレメントは恒常的である。実施態様によっては、調節エレメントは誘導性である。
不安定化C2c1
【０５０７】
特定の実施態様では、本発明に従うエフェクタータンパク質（CRISPR 酵素；C2c1）は不安定化ドメイン(DD)と会合または融合する。実施態様によっては、DDはER50である。このDDに関して対応する安定化リガンドは、実施態様によっては、4HTである。そのために、実施態様によっては、DDまたは複数のDDのうちの１つはER50であり、そのための安定化リガンドは4HTまたはCMP8である。実施態様によっては、DDはDHFR50である。このDDに関して対応する安定化リガンドは、実施態様によっては、TMPである。そのために、実施態様によっては、DDまたは複数のDDのうちの１つはDHFR50であり、そのための安定化リガンドはTMPである。実施態様によっては、DDはER50である。このDDに関して対応する安定化リガンドは、実施態様によっては、CMP8である。従ってCMP8はER50システムにおける4HTに対する代替安定化リガンドである。CMP8および4HTは使用に関して競合するが、細胞種によってはこれら２つのリガンドのうちの一方または他方により影響を受けやすい。この開示と当分野における知見から、当業者はCMP8および／または4HTを使用することができる。
【０５０８】
実施態様によっては、１つまたは２つのDDがCRISPR酵素のN-末端に融合し、１つまたは２つのDDはCRISPR 酵素のC-末端に融合する。実施態様によっては、少なくとも２つのDDはCRISPR酵素と融合し、これらのDDは同じ、すなわち相同である。従って、複数のDDのうちの２つ以上がER50 DDであってもよい。実施態様によってはこのことが好ましい。あるいは、複数のDDのうちの２つ以上がDHFR50 DDであってもよい。実施態様によってはこのことが好ましい。実施態様によっては、少なくとも２つのDDはCRISPR酵素と融合し、これらのDDは異なり、すなわち異種性である。複数のDDのうちの１つはER50であり、複数のDDのうちの１つ以上または任意の他のDDはDHFR50であってもよい。異種性の２つ以上のDDを持つことは、高水準の分解制御を提供するので、有利な可能性がある。NまたはC末端における２つ以上のDDの並列融合は分解を促進し、このような並列融合は例えばER50-ER50-C2c1であってもよい。高水準の分解はいずれの安定化リガンドも存在しない場合に起こり、中程度の分解は１つの安定化リガンドが存在せずかつ他の安定化リガンドが存在する場合に起こり、低水準の分解は複数の安定化リガンドのうちの２つ以上が存在する場合に起こることが想定される。制御はN-末端ER50 DDおよびC-末端DHFR50 DDを持つことによって付与される。
【０５０９】
実施態様によっては、CRISPR酵素とDDの融合はDDとCRISPR酵素間のリンカーを含む。実施態様によっては、リンカーはGlySerリンカーである。実施態様によっては、DD-CRISPR酵素はさらに少なくとも１つ核外輸送シグナル (NES)を含む。実施態様によっては、DD-CRISPR酵素は２つ以上のNESを含む。実施態様によっては、DD-CRISPR酵素は少なくとも１つの核局在化シグナル (NLS)を含む。このシグナルはNESに追加されていてもよい。実施態様によっては、CRISPR酵素は、CRISPR酵素とDDの間のリンカーまたはその一部としての局在化（核内または核外輸送）シグナルを含む、または実質的にそれからなる、またはそれからなる。HAすなわちFlagタグもリンカーとして本発明の範囲内にある。出願人達はNLSおよび／またはNESをリンカーとして使用し、GSから(GGGGS)3までの短いグリシンセリンリンカーも使用する。
【０５１０】
不安定化ドメインは広範囲のタンパク質に不安定性を与えるという一般的な有用性を持つ（例えば、Miyazaki、J Am Chem Soc. Mar 7, 2012; 134(9): 3942-3945、参照として本明細書に取り込まれる）。CMP8すなわち4−ヒドロキシタモキシフェンは不安定化ドメインであってもよい。一般に、哺乳類DHFR (DHFRts)の温度感受性変異体（N-末端則による不安定化残基）は許容温度では安定だが37°Cで不安定であることが分かった。メトトレキサート（哺乳類DHFR用の高親和性リガンド）のDHFRtsを発現する細胞への添加はタンパク質の分解を部分的に阻止した。これは、小分子リガンドが細胞内での分解の標的となるタンパク質を安定化できるという重要な実証だった。ラパマイシン誘導体を使用して、mTORのFRBドメインの不安定な変異体(FRB*)を安定化し、融合キナーゼGSK-3β.6,7の機能を回復した。このシステムは、リガンド依存性の安定性が複雑な生物学的環境における特定のタンパク質の機能を調節する魅力的な方法であることを示した。タンパク質活性を制御するシステムは、FK506結合タンパク質とFKBP12のラパマイシン誘発二量体化によってユビキチン相補性が発生したときにDDが機能するようになることを含む可能性がある。ヒトFKBP12またはecDHFRタンパク質の変異体は、それぞれ高親和性リガンドであるShield-1またはトリメトプリム (TMP)がない場合に代謝的に不安定になるように改変することができる。これらの変異体は、本発明の実施に有用な可能性のある不安定化ドメイン (DD)のうちのいくつかであり、CRISPR酵素と融合する場合のDDの不安定性は、プロテアソームによる融合タンパク質全体のCRISPRタンパク質分解に繋がる。Shield-1とTMPは、用量依存的にDDに結合して安定化する。エストロゲン受容体リガンド結合ドメイン（ERLBD、ERS1の残基305-549）も不安定化ドメインとして操作することができる。エストロゲン受容体シグナル伝達経路は乳がんなどのさまざまな疾患に関与しているため、この経路は広く研究されており、エストロゲン受容体の多くの作動薬と拮抗薬が開発されている。従って、ERLBDと薬物の互換性のある対が知られている。ERLBDの野生型ではなく変異体に結合するリガンドがある。３つの変異（L384M、M421G、G521R）12をコードするこれらの変異ドメインの１つを使用することにより、内因性エストロゲン感受性ネットワークを摂動させないリガンドを用いて、ERLBD由来のDDの安定性を調節することができる。追加の変異（Y537S）を導入して、ERLBDをさらに不安定にし、潜在的なDDの候補として構成することができる。この四変異遺伝子（tetra-mutant）は有利なDD開発である。変異体ERLBDはCRISPR酵素に融合させることができ、その安定性はリガンドを用いて調節または摂動させることができ、それによってCRISPR酵素はDDを持つ。別のDDは、Shield1リガンドによって安定化された変異FKBPタンパク質に基づく12 kDa（107アミノ酸）のタグである（例えば、Nature Methods 5, (2008)を参照）。例えば、DDは合成の生物学的に不活性な小分子であるShield-1に結合し、それによって可逆的に安定化される改変FK506結合タンパク質12（FKBP12）である可能性がある（例えば、Banaszynski LA, Chen LC, Maynard-Smith LA, Ooi AG, Wandless TJ, A rapid, reversible, and tunable method to regulate protein function in living cells using synthetic small molecules（合成小分子を用いて生細胞のタンパク質機能を調節するための、迅速で可���的かつ調整可能な方法）. Cell. 2006; 126:995-1004; Banaszynski LA、Sellmyer MA、Contag CH、Wandless TJ、Thorne SH. Chemical control of protein stability and function in living mice（生きているマウスにおけるタンパク質の安定性と機能の化学的制御）Nat Med. 2008;14:1123-1127; Maynard-Smith LA, Chen LC, Banaszynski LA, Ooi AG, Wandless TJ. A directed approach for engineering conditional protein stability using biologically silent small molecules（生物学的にサイレントな小分子を使用して条件付きタンパク質の安定性を操作するための指示された手法）The Journal of biological chemistry. 2007;282:24866-24872;およびRodriguez, Chem Biol. Mar 23, 2012; 19(3): 391-398を参照−これらはすべて参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施ではCRISPR酵素と結合するために選択されたDDでは本発明を実施するのに使用することができる）。以上のように、当技術分野の知識は、いくつかのDDを含み、DDは、例えば、リンカーと会合、有利には、CRISPR酵素に融合し、それにより、DDは、リガンドの存在下で安定化される。リガンドが存在しない場合、DDは不安定化する可能性があり、それによってCRISPR酵素が完全に不安定化するか、DDがリガンドの非存在下で安定化され、リガンドの存在下で不安定化する可能性がある。DDにより、CRISPR酵素、従ってCRISPR-Cas複合体またはシステムを制御でき、いわばオンまたはオフになり、それによって、例えばin vivoまたはin vitro環境でシステムを制御する手段が提供される。例えば、関心のあるタンパク質がDDタグとの融合体として発現される場合、それは細胞内で不安定化され、例えばプロテアソームによって急速に分解される。従って、安定化リガンドが存在しない場合は、D会合Casが分解される。新しいDDが関心のあるタンパク質に融合すると、DDの不安定性により関心のあるタンパク質も不安定になり、融合タンパク質全体が急速に分解される。Casに対するピーク活性は、非特異的な効果を減弱することがある。従って、高活動の短いバーストが好ましい。本発明は、そのようなピークを提供することができる。ある意味で、システムは誘導性である。他のいくつかの意味では、システムは安定化リガンドの非存在下で抑制され、安定化リガンドの存在下で抑制解除された。
分割設計
【０５１１】
C2c1は安定した核酸検出も可能である。特定の実施態様では、C2c1は、そのヌクレアーゼ活性の不活性化によって、核酸結合タンパク質（「死滅C2c1すなわちdC2c1）」に変換される。核酸結合タンパク質に変換されると、C2c1は他の機能成分を局在化して配列依存的に核酸を標的にするのに有用となる。成分は天然でも合成でもよい。本発明によれば、dC2c1は、（i）エフェクターモジュールを特定の核酸に運搬し、機能または転写を調節し、これは、合成調節回路の大規模なスクリーニング、構築および他の目的に使用できる；（ii）特定の核酸に蛍光タグを付けて、それらの輸送および／または局在化を視覚化する；（iii）特定の細胞内区画に親和性を持つドメインを介して核酸の局在を改変する；かつ（iv）特定の核酸を捕捉して（dC2c2の直接プルダウン、またはdC2c2を用いるビオチンリガーゼ活性の局在化により）、RNAやタンパク質などの近位分子パートナーを富化する、のに使用される。dC2c1は、i）細胞の成分を組織化し、ii）細胞の成分または活動を作動または休止させ、かつ、iii）細胞内に存在する特定の転写産物の存在または量に基づいて細胞の状態を制御するのに使用できる。典型的な実施態様では、本発明は、分割酵素およびレポーター分子を提供し、その一部は核酸結合CRISPRエフェクター（C2c1などであるがこれらに限定されない）を含むハイブリッド分子内に提供される。細胞内の核酸の存在下で近接させると、分割レポーターまたは酵素の活性が再構成され、次に活性を測定することができる。そのような方法で再構成された分割酵素は、細胞成分および／または経路（内因性成分もしくは経路または外因性成分もしくは経路を含むがこれらに限定されない）に検出可能に作用することができる。そのような方法で再構成された分割レポーターは、検出可能なシグナル（蛍光または他の検出可能な部分などであるがこれらに限定されない）を提供することができる。特定の実施態様では、再構成されたときに１つ以上の成分（内因性または外因性）に検出可能な方法で作用する分割タンパク質分解酵素が提供される。典型的な一実施態様では、細胞内の核酸種の検出時にプログラムされた細胞死を誘導する方法が提供される。例えば、細胞内のウイルスの存在に基づいて、そのような方法を使用して細胞の集団を切除することができる方法は明らかである。
【０５１２】
本発明によれば、関心のある核酸を含む細胞内に細胞死を誘導する方法が提供される。この方法は、細胞内の核酸を、細胞死を誘導することができるタンパク質分解酵素の第１の不活性部分に連結された第１のCRIPSRタンパク質、タンパク質の第１の部分と相補的部分が接触したときにタンパク質分解酵素の酵素活性が再構成される酵素の相補的部分に連結された第２のCRISPRタンパク質、および第１のCRISPRタンパク質に結合して核酸の第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド、および第２のCRISPRタンパク質に結合して核酸の第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイドを含む組成物と接触させることを含む。関心のある標的核酸が存在する場合、タンパク質分解酵素の第１および第２の部分が接触し、酵素のタンパク質分解活性が再構成され、細胞死を誘導する。本発明のそのような一実施態様では、タンパク質分解酵素はカスパーゼである。別のそのような実施態様では、タンパク質分解酵素は、TEVプロテアーゼであり、ここで、TEVプロテアーゼのタンパク質分解活性が再構成されるとき、TEVプロテアーゼ基質は、切断および／または活性化される。本発明の一実施態様では、TEVプロテアーゼ基質は、TEVプロテアーゼが再構成されるとき、プロカスパーゼが切断されて活性化され、それによってアポトーシスが起こるように操作されたプロカスパーゼである。本発明の一実施態様では、タンパク質分解的に切断可能な転写因子を、選択した任意の下流レポーター遺伝子と組み合わせて、「転写共役」レポーターシステムを生成することができる。一実施態様では、分割プロテアーゼを使用して、検出可能な基質からデグロンを切断または露出させる。
【０５１３】
本発明によれば、関心のある核酸を含む細胞をマーキングまたは同定する方法が提供され、この方法は、細胞内の核酸を、タンパク質分解酵素の不活性な第１の部分に連結された第１のCRIPSRタンパク質、酵素の相補的部分に連結された第２のCRISPRタンパク質（タンパク質の第１の部分と相補的部分が接触するとタンパク質分解酵素の酵素活性が再構成される）、第１のガイドCRISPRタンパク質に結合し、核酸の第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド、第２のCRISPRタンパク質に結合し、核酸の第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド、および再構成されたタンパク質分解酵素によって検出可能に切断される指示薬を含む組成物と接触させることを含む。関心のある核酸が細胞内に存在する場合、タンパク質分解酵素の第１の部分と第２の部分が接触し、それによってタンパク質分解酵素の活性が再構成され、指示薬が検出可能に切断される。そのような一実施態様では、検出可能な指示薬は、緑色蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質であるがこれに限定されない。本発明の別のそのような実施態様では、検出可能な指示薬は、ルシフェラーゼなどの発光タンパク質であるがそれに限定されない。一実施態様では、分割レポーターは、Renilla reniformisルシフェラーゼ (Rluc)の分割断片の再構成に基づいている。本発明の一実施態様では、分割レポーターは、黄色蛍光タンパク質 (YFP)の２つの非蛍光断片間の相補性に基づく。
転写と調節
【０５１４】
一側面では、本発明は、細胞または組織中の特定の核酸の存在または水準に基づいて、細胞または組織の状態を識別、測定、および／または調節する方法を提供する。一実施態様では、本発明は選択された目的核酸種の存在に基づいて、細胞システムまたは成分の存在および／または活性を調節するように設計されたCRISPRに基づく制御システムを提供するが、この制御システムは天然または合成システムあるいは合成成分でもよい。一般に、制御システムは、選択された目的核酸種が存在する場合に再構成される不活性化されたタンパク質、酵素、または活性を特徴とする。本発明の一実施態様では、不活性化されたタンパク質、酵素、または活性を再構成することは、不活性な成分をまとめて活性複合体に組み立てることを含む。
分割アポトーシス構築物
【０５１５】
特定の細胞型の役割を研究するための基本的な生物学的用途、または癌もしくは感染細胞クリアランスなどの治療的用途のいずれかのために、異常な内因性または外来DNAの存在に基づいて細胞を枯渇または死滅させることがしばしば望ましい（Baker, D.J., Childs, B.G., Durik, M., Wijers, M.E., Sieben, C.J., Zhong, J., Saltness, R.A., Jeganathan, K.B., Verzosa, G.C., Pezeshki, A., et al. (2016), Naturally occurring p16(Ink4a)-positive cells shorten healthy lifespan（天然起源のp16(Ink4a) 陽性細胞は健康寿命を短くする. Nature 530, 184-189）。この標的細胞死は、分割したアポトーシスドメインをC2c1タンパク質に融合することによって達成され、C2c1タンパク質は、DNAに結合すると再構成され、標的遺伝子または数組の遺伝子を特異的に発現する細胞死につながる。特定の実施態様では、アポトーシスドメインは、分割カスパーゼ3であってもよい（Chelur, D.S., and Chalfie, M. (2007). Targeted cell killing by reconstituted caspases（再構成カスパーゼによる標的細胞死）. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 2283-2288.）。他の可能性は、C2c1結合を介して近接している２つのカスパーゼ8（Pajvani, U.B., Trujillo, M.E., Combs, T.P., Iyengar, P., Jelicks, L., Roth, K.A., Kitsis, R.N., and Scherer, P.E. (2005). Fat apoptosis through targeted activation of caspase 8: a new mouse model of inducible and reversible lipoatrophy（カスパーゼ8の標的活性化による脂肪アポトーシス：誘導性および可逆性脂肪萎縮症の新しいマウスモデル）. Nat. Med. 11, 797-803.）またはカスパーゼ9（Straathof, K.C., Pule, M.A., Yotnda, P., Dotti, G., Vanin, E.F., Brenner, M.K., Heslop, H.E., Spencer, D.M., and Rooney, C.M. (2005). An inducible caspase 9 safety switch for T-cell therapy（T細胞療法用の誘導性カスパーゼ9安全スイッチ）. Blood 105, 4247-4254.）エフェクターのようなカスパーゼの会合体である。転写産物へのC2c1結合を介して分割TEVを再構成することも可能である（Gray, D.C., Mahrus, S., and Wells, J.A. (2010). Activation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-activated protease（遺伝子操作された小分子活性化プロテアーゼを用いる特定のアポトーシスカスパーゼの活性化）. Cell 142, 637-646.）。この分割TEVは、発光および蛍光の読み取り（Wehr, M.C., Laage, R., Bolz, U., Fischer, T.M., Grunewald, S., Scheek, S., Bach, A., Nave, K.-A., and Rossner, M.J. (2006). Monitoring regulated protein-protein interactions using split TEV（分割TEVを用いた調節されたタンパク質間相互作用のモニタリング）. Nat. Methods 3, 985-993.）を含むさまざまな読み取りに使用できる。一実施態様は、改変されたプロカスパーゼ3またはプロカスパーゼ7を切断するためのこの分割TEVの再構成（Gray, D.C., Mahrus, S., and Wells, J.A. (2010). Activation of specific apoptotic caspases with an engineered small-molecule-activated protease（遺伝子操作された小分子活性化プロテアーゼを用いる特定のアポトーシスカスパーゼの活性化）. Cell 142, 637-646）を含み、細胞死に至る。
【０５１６】
誘導性アポトーシス。本発明によれば、ガイドを使用してアポトーシスを誘導するための機能的ドメインを有するC2c1複合体を見つけることができる。C2c1は任意の相同分子種でよい。一実施態様では、機能ドメインは、タンパク質のC末端で融合されている。C2c1は、例えばヌクレアーゼ活性をノックアウトする変異を介して触媒的に不活性である。システムの適応性は、様々なカスパーゼ活性化方法を採用し、標的核酸に沿ったガイド間隔を最適化することで実証できる。カスパーゼ8およびカスパーゼ9（別名「イニシエーター」カスパーゼ）活性は、C2c1複合体形成により誘導され、C2c1に会合したカスパーゼ8またはカスパーゼ9酵素をまとめることができる。あるいは、カスパーゼ3およびカスパーゼ7（別名「エフェクター」カスパーゼ）活性は、タバコエッチングウイルス (TEV)のN末端およびC末端部分（「スニッパー」）を持つC2c1複合体が近くに維持されるときに誘導され、TEVプロテアーゼを活性化し、かつカスパーゼ3またはカスパーゼ7プロタンパク質の切断と活性化につながる。このシステムは、標的核酸に結合したC2c1複合体への結合によるカスパーゼ3部分のヘテロ二量体化を伴う分割カスパーゼ3を採用することができる。典型的なアポトーシス成分を、以下の表３に記載する。
【表６】
2021532815.tif 000017
2021532815.tif 000018
2021532815.tif 000019
分割−検出構築物
【０５１７】
本発明のシステムは、細胞または組織に存在し得る目的転写物上の連結された酵素部分を有するCRISPRタンパク質を局在化するためのガイドをさらに含む。従って、このシステムは、第１のCRISPRタンパク質に結合して関心のある転写物にハイブリダイズする第１のガイドと、第２のＣCRISPRタンパク質に結合して関心のある核酸にハイブリダイズする第２のガイドとを含む。ほとんどの実施態様では、第１および第２のガイドは、隣接する位置で関心のある核酸にハイブリダイズすることが好ましい。その位置は直接隣り合うかあるいはいくつかのヌクレオチド、例えば1ヌクレオチド、2ヌクレオチド、3ヌクレオチド、4ヌクレオチド、5ヌクレオチド、6ヌクレオチド、7ヌクレオチド、8ヌクレオチド、9ヌクレオチド、10ヌクレオチド、11ヌクレオチド、または12ヌクレオチドまたはそれ以上だけ離れていてもよい。特定の実施態様では、第１および第２のガイドは、予想されるステムループによって核酸上で分離された位置に結合することができる。鎖状核酸に沿って分離されているが、核酸は、ガイド標的配列を近接させる二次構造をとることができる。
【０５１８】
本発明の一実施態様では、タンパク質分解酵素はカスパーゼを含む。本発明の一実施態様では、タンパク質分解酵素は、限定されないが、カスパーゼ8またはカスパーゼ9などのイニシエーターカスパーゼを含む。イニシエーターカスパーゼは、一般に、モノマーとして不活性であり、ホモ二量体化時に活性を獲得する。本発明の一実施態様では、タンパク質分解酵素は、カスパーゼ3またはカスパーゼ7などであるがこれらに限定されないエフェクターカスパーゼを含む。このようなイニシエーターカスパーゼは、通常、断片に切断されるまで不活性である。切断されると、切断片は会合して活性酵素を形成する。典型的な一実施態様では、タンパク質分解酵素の第１の部分は、カスパーゼ3p12を含み、タンパク質分解酵素の相補的部分は、カスパーゼ3p17を含む。
【０５１９】
本発明の一実施態様では、タンパク質分解酵素は特定のアミノ酸配列を標的とするように選択され、基質はそれに応じて選択または操作される。そのようなプロテアーゼの非限定的な例はタバコエッチウイルス (TEV）プロテアーゼである。従って、TEVプロテアーゼ（いくつかの実施態様で切断可能なように操作される）によって切断可能な基質は、プロテアーゼによって作用されるシステムの成分として機能する。一実施態様では、NEVプロテアーゼ基質は、プロカスパーゼおよび１つ以上のTEV切断部位を含む。プロカスパーゼは、例えば、再構成されたTEVプロテアーゼによって切断可能なように操作されたカスパーゼ3またはカスパーゼ7である。切断されると、プロカスパーゼフラグメントは自由に有効な確認を行うことができる。
【０５２０】
本発明の一実施態様では、TEV基質は蛍光タンパク質およびTEV切断部位を含む。別の実施態様では、TEV基質は発光タンパク質およびTEV切断部位を含む。特定の実施態様では、TEV切断部位は基質タンパク質の蛍光または発光特性が切断時に失われるように、基質の切断を提供する。特定の実施態様では、蛍光または発光タンパク質は、例えば、TEVプロテアーゼが再構成されるときに切断される蛍光または発光を妨害する部分を付加することによって改変される。
【０５２１】
本発明によれば、関心のある核酸を含む細胞内にタンパク質分解活性を提供する方法が提供され、これは、細胞内の核酸を、タンパク質分解酵素の不活性な第１の部分に連結された第１のCRIPSRタンパク質とタンパク質分解酵素の相補的部分に連結された第２のCRISPRタンパク質を含む組成物と接触させることを含む。タンパク質の第１の部分および相補的部分が接触するとタンパク質分解酵素の活性が再構成され、さらに第１のガイドは第１のCRISPRタンパク質に結合して核酸の第１の標的配列にハイブリダイズし、第２のガイドは第２のCRISPRタンパク質に結合して核酸の第２の標的配列にハイブリダイズする。関心のある標的核酸が存在する場合、タンパク質分解酵素の第１および第２の部分が接触し、酵素のタンパク質分解活性が再構成され、酵素の基質が切断される。
【０５２２】
分割蛍光体構築物は、２つのC2c1タンパク質が転写物に結合する際の分割蛍光体の再構成を介した低ノイズ画像化に有用である。これらの分割タンパク質には、iSplit（Filonov, G.S., and Verkhusha, V.V. (2013). A near-infrared BiFC reporter for in vivo imaging of protein-protein interactions（タンパク質間相互作用のin vivo画像化用の近赤外BiFCレポーター）. Chem. Biol. 20, 1078-1086.）、分割ビーナス（Wu, B., Chen, J., and Singer, R.H. (2014). Background free imaging of single mRNAs in live cells using split fluorescent proteins（分割蛍光タンパク質を用いた生細胞内の単一mRNAのノイズのない画像化）. Sci. Rep. 4, 3615.）、および分割超肯定的GFP GFP （Blakeley, B.D., Chapman, A.M., and McNaughton, B.R. (2012). Split-superpositive GFP reassembly is a fast, efficient, and robust method for detecting protein-protein interactions in vivo（スプリット超肯定的GFP再構成は、in vivoでのタンパク質間相互作用を検出するための高速、効率的かつ堅牢な方法である）. Mol. Biosyst. 8, 2036-2040.）を含む。このようなタンパク質を以下の表４に示す。
【表７】
2021532815.tif 000020
dCasによる標的富化 
【０５２３】
特定の例示的な実施態様では、標的RNAまたはDNAは、標的RNAまたはDNAの検出または増幅の前に、最初に富化されてもよい。特定の例示的な実施態様では、この富化は、CRISPRエフェクターシステムによる標的核酸の結合によって達成されてもよい。
【０５２４】
現在の標的特異的富化プロトコルは、プローブとのハイブリダイゼーションの前に一本鎖核酸を必要とする。様々な利点の中で、本実施態様は、この工程を飛ばして、二本鎖DNA（部分的または完全に二本鎖のいずれか）に直接標的化することができる。さらに、本明細書に開示される実施態様は、等温富化を可能にするより高い反応速度とより容易な作業手順を提供する酵素駆動型標的化方法である。特定の例示的な実施態様では、富化は、20〜37℃という低い温度で起こり得る。特定の例示的な実施態様では、異なる標的核酸に対する一組のガイドRNAを検定で使用し、複数の標的および／または単一の標的の複数の変異体の検出ができる。
【０５２５】
特定の例示的な実施態様では、死滅CRISPRエフェクタータンパク質は、溶液中の標的核酸に結合し、その後、前記溶液から単離されてもよい。例えば、標的核酸に結合した死滅CRISPRエフェクタータンパク質は、死滅CRISPRエフェクタータンパク質に特異的に結合する抗体またはアプタマーなどの他の分子を使用して、溶液から単離される。
【０５２６】
他の例示的な実施態様では、死滅CRISPRエフェクタータンパク質は、固体基質に結合していてもよい。固定基質は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドの付着に適切であるか、または適切であるように改変することができる任意の材料であればよい。可能な基質には、ガラスおよび変性官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレン、およびスチレンと他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、TeflonTMなどを含む）、多糖類、ナイロンまたはニトロセルロース、セラミック、樹脂、シリカまたはシリコンおよび変性シリコンを含むシリカ系材料、炭素、金属、無機ガラス、プラスチック、光ファイバ束、およびその他のさまざまなポリマーが含まれるが、これらに限定されない。実施態様によっては、固体支持体は、秩序だったパターンで分子を固定化するのに適したパターン化された表面を意味する。特定の実施態様では、パターン化された表面は、固体支持体の露出層の中または上の異なる領域の配置を意味する。実施態様によっては、固体支持体は、表面のウェルまたはくぼみの配列を含む。固体支持体の組成と形状は、その用途によって異なる。実施態様によっては、固体支持体は、スライド、チップ、マイクロチップ、および／またはそれらを配列したものなどの平面構造である。従って、基質の表面は、平面層の形態である。実施態様によっては、固体支持体は、フローセルの１つ以上の表面を含む。本明細書で使用される「フローセル」という用語は、１種以上の流体試薬が流れることができる固体表面を含む小室を意味する。本開示の方法で容易に使用することができる例示的なフローセルおよび関連する流体システムおよび検出プラットフォームは、例えば、Bentley et al. Nature 456:53-59 (2008), WO04/0918497, U.S. 7,057,026; WO91/06678; WO07/123744; US 7,329,492; US 7,211,414; US 7,315,019; U.S. 7,405,281, およびUS 2008/0108082に記載されている。実施態様によっては、固体支持体またはその表面は、管または容器の内面または外面などの非平面である。実施態様によっては、固体支持体は、微小球またはビーズを含む。「微小球」、「ビーズ」、「粒子」は、固体基質の文脈内で、プラスチック、セラミック、ガラス、およびポリスチレンを含むがこれらに限定されない様々な材料で作られた小さな離散粒子を意味することを意図する。特定の実施態様では、微小球は、磁性微小球またはビーズである。その代わりまたはそれに加えて、ビーズは多孔性であってもよい。ビーズのサイズはナノメートル例えば100 nmからミリメートル例えば1 mmの範囲にある。
【０５２７】
次に、標的核酸を含む、または含むと思われる試料を基質に曝露して、標的核酸を結合した死滅CRISPRエフェクタータンパク質に結合することができる。次に、非標的分子を洗い流してもよい。特定の例示的な実施態様では、標的核酸は、本明細書に開示される方法を用いるさらなる検出のために、CRISPRエフェクタータンパク質／ガイドRNA複合体から解放されてもよい。特定の例示的な実施態様では、標的核酸は、本明細書に記載されるように最初に増幅されてもよい。
【０５２８】
特定の例示的な実施態様では、CRISPRエフェクターは、結合タグで標識されてもよい。特定の例示的な実施態様では、CRISPRエフェクターは、化学的にタグ付けされる。例えば、CRISPRエフェクターは化学的にビオチン化されている可能性がある。別の例示的な実施態様では、融合は、融合をコードする追加の配列をCRISPRエフェクターに追加することで作成される。このような融合の一例は、AviTagTMである。これは、ユニークな15アミノ酸のペプチドタグ上に単一のビオチンの高度に標的化された酵素的結合を採用している。特定の実施態様では、CRISPRエフェクターは、GST、Myc、血球凝集素 (HA)、緑色蛍光タンパク質 (GFP)、フラグ、Hisタグ、TAPタグ、およびFcタグなどであるがこれらに限定されない捕捉タグで標識される。結合タグは、融合タグ、化学タグ、捕獲タグのいずれであっても、標的核酸に結合した後、CRISPRエフェクターシステムをプルダウンするか、CRISPRエフェクターシステムを固体基質に固定するのに使用できる。
【０５２９】
特定の例示的な実施態様では、ガイドRNAは、結合タグで標識されてもよい。特定の例示的な実施態様では、ガイドRNA全体は、ビオチン化ウラシルなどの１つ以上のビオチン化ヌクレオチドを組み込んだin vitro転写 (IVT)を用いて標識される。実施態様によっては、ビオチンは、ガイドRNAの3’末端への１つ以上のビオチン基の付加など、ガイドRNAに化学的または酵素的に付加される。結合タグは、例えば、ガイドRNA／標的核酸をストレプトアビジン被覆された固体基質に曝露することで、結合が起こった後にガイドRNA／標的核酸複合体をプルダウンするために使用される。
切り詰め
【０５３０】
特定の例示的な実施態様では、Cas12タンパク質は切り詰められてもよい。特定の例示的な実施態様では、切り詰められた型は、不活性化または死滅Cas12タンパク質である。 Cas12タンパク質は、N末端、C末端、またはその両方で改変されている可能性がある。例示的な一実施態様では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150個のアミノ酸が、N末端、C末端、またはそれらの組み合わせから除去される。別の例示的な実施態様では、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150個のアミノ酸がC末端から除去される。特定の例示的な実施態様では、1〜10、1〜20、1〜30、1〜40、1〜50、1〜60、1〜70、1〜80、1〜90、1〜100、1〜110、1〜120、1〜130、1〜140、1〜150、1〜160、1〜170、1〜180、1〜190、1〜200、1〜220、1〜230、1〜240、1〜250、200〜250、100〜200、110〜200、120〜200、130〜200、140〜200、150〜200、160〜200、170〜200、180〜200、190〜200、10〜100、20〜100、30〜100、40〜100、50〜100、60〜100、70〜100、80〜100、90〜100、または150〜250個のアミノ酸が、N末端、C末端、またはそれらの組み合わせから除去される。特定の例示的実施態様では、アミノ酸位置は、BhCas12bの位置またはそれに対応する相同分子種のアミノ酸である。特定の例示的な実施態様では、切り詰めは、ヌクレオチドデアミナーゼに融合または他の方法で付着され、以下により詳細に開示される塩基編集の実施態様で使用される。
塩基編集
【０５３１】
特定の例示的な実施態様では、Cas12b、例えば、dCas12bは、塩基編集の目的で、アデノシンデアミナーゼまたはシチジンデアミナーゼと融合される。
アデノシンデアミナーゼ
【０５３２】
本明細書で使用される用語「アデノシンデアミナーゼ」または「アデノシンデアミナーゼタンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、または、以下に示すように、アデニン（または分子のアデニン部分）をヒポキサンチン（または分子のヒポキサンチン部分）に転換する加水分解性脱アミノ化反応を触媒することができるタンパク質もしくはポリペプチドの１つ以上の機能ドメインを意味する。実施態様によっては、アデニン含有分子はアデノシン (A)であり、ヒポキサンチン含有分子はイノシン (I)である。アデニン含有分子は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸 (RNA)であってもよい。
【化１】
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【０５３３】
本開示によれば、本開示に関連して使用することができるアデノシンデアミナーゼには、RNA (ADAR)に作用するアデノシンデアミナーゼとして知られる酵素ファミリーのメンバー、tRNA (ADAT)に作用するアデノシンデアミナーゼとして知られるファミリーのメンバー、およびその他のアデノシンデアミナーゼドメイン含有(ADAD)ファミリーのメンバー、が含まれるが、これらに限定されない。実際、Zheng et al. (Nucleic Acids Res. 2017, 45(6): 3369-3377)は、ADARがRNA／DNAおよびRNA／RNA二重鎖でアデノシンからイノシンへの編集反応を実行できることを示している。特定の実施態様では、アデノシンデアミナーゼは、本明細書で以下に詳述するように、RNA二重鎖のRNA／DNAヘテロ二本鎖のDNAを編集するその能力を高めるように改変されている。
【０５３４】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、哺乳動物、鳥、カエル、イカ、魚、ハエ、および虫を含むがこれらに限定されない、１つ以上の後生動物種に由来する。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、ヒト、イカ、またはショウジョウバエのアデノシンデアミナーゼである。
【０５３５】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR1、hADAR2、hADAR3を含むヒトADARである。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、ADR-1およびADR-2を含むカエノラブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）のADARタンパク質である。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、dAdarを含むショウジョウバエのADARタンパク質である。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、イカのロリゴペアリ（Loligo pealeii）のADARタンパク質であり、sqADAR2aおよびsqADAR2bを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、ヒトADATタンパク質である。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、ショウジョウバエのADATタンパク質である。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、TENR (hADAD1)およびTENRL (hADAD2)を含むヒトADADタンパク質である。
【０５３６】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAなどのTadAタンパク質である。Kim et al., Biochemistry 45:6407-6416 (2006); Wolf et al., EMBO J. 21:3841-3851 (2002)を参照。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、マウスADAである。Grunebaum et al., Curr. Opin. Allergy Clin. Immunol. 13:630-638 (2013)を参照。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、ヒトADAT2である。Fukui et al., J. Nucleic Acids 2010:260512 (2010)を参照。実施態様によっては、デアミナーゼ（例えば、アデノシンまたはシチジンデアミナーゼ）は、Cox et al., Science. 2017, November 24; 358(6366): 1019-1027; Komore et al., Nature. 2016 May 19;533(7603):420-4; およびGaudelli et al., Nature. 2017 Nov 23;551(7681):464-471に記載されているもののうちの１種以上である。
【０５３７】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖核酸基質中の１つ以上の標的アデノシン残基を認識し、イノシン残基に変換する。実施態様によっては、二本鎖核酸基質は、RNA−DNAハイブリッド二本鎖である。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖基質上の結合ウィンドウを認識する。実施態様によっては、結合ウィンドウは、少なくとも１つの標的アデノシン残基を含む。実施態様によっては、結合ウィンドウは、約3塩基対から約100塩基対の範囲にある。実施態様によっては、結合ウィンドウは、約5塩基対から約50塩基対の範囲にある。実施態様によっては、結合ウィンドウは、約10塩基対から約30塩基対の範囲にある。実施態様によっては、結合ウィンドウは、約1塩基対、2塩基対、3塩基対、5塩基対、7塩基対、10塩基対、15塩基対、20塩基対、25塩基対、30塩基対、40塩基対、45塩基対、50塩基対、55塩基対、60塩基対、65塩基対、70塩基対、75塩基対、80塩基対、85塩基対、90塩基対、95塩基対、または100塩基対である。
【０５３８】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、１つ以上のデアミナーゼドメインを含む。特定の理論に拘束されることを意図するものではないが、デアミナーゼドメインは、二本鎖核酸基質に含まれる１つ以上の標的アデノシン(A)残基を認識してイノシン (I)残基に変換するように機能すると考えられる。実施態様によっては、デアミナーゼドメインは、活性中心を含む。実施態様によっては、活性中心は亜鉛イオンを含む。実施態様によっては、AからIへの編集プロセス中に、標的アデノシン残基での塩基対形成が破壊され、標的アデノシン残基が二重らせんから「反転」して、アデノシンデアミナーゼによりアクセス可能になる。実施態様によっては、活性中心内またはその近傍のアミノ酸残基は標的アデノシン残基の5'側の１つ以上のヌクレオチドと相互作用する。実施態様によっては、活性中心内またはその近傍のアミノ酸残基は標的アデノシン残基の3’側の１つ以上のヌクレオチドと相互作用する。実施態様によっては、活性中心内またはその近傍のアミノ酸残基は反対側の鎖上の標的アデノシン残基に相補的なヌクレオチドとさらに相互作用する。実施態様によっては、アミノ酸残基はヌクレオチドの2’ヒドロキシル基と水素結合を形成する。
【０５３９】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、ヒトADAR2完全タンパク質 (hADAR2)またはそのデアミナーゼドメイン (hADAR2-D)を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2またはhADAR2-Dに相同であるADARファミリーメンバーである
【０５４０】
特に、実施態様によっては、相同ADARタンパク質は、ヒトADAR1 (hADAR1)またはそのデアミナーゼドメイン(hADAR1-D)である。実施態様によっては、hADAR1-Dのグリシン1007は、グリシン487 hADAR2-Dに対応し、hADAR1-Dのグルタミン酸1008は、hADAR2-Dのグルタミン酸488に対応する。
【０５４１】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dの野生型アミノ酸配列を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dの編集効率、および／または基質編集優先度が特定の必要性に従って変更されるように、hADAR2-D配列中に１つ以上の変異を含む。
【０５４２】
hADAR1およびhADAR2タンパク質の特定の変異は、Kuttan et al., Proc Natl Acad Sci U S A.  (2012) 109(48):E3295-304、Want et al. ACS Chem Biol. (2015) 10(11):2512-9、およびZheng et al. Nucleic Acids Res. (2017) 45(6):3369-337に記載されており、それぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０５４３】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のグリシン336または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置336のグリシン残基はアスパラギン酸残基(G336D)で置換されている。
【０５４４】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のグリシン487または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置487のグリシン残基は比較的小さな側鎖を有する非極性アミノ酸残基で置換されている。例えば、実施態様によっては、位置487のグリシン残基はアラニン残基(G487A)で置換されている。実施態様によっては、位置487のグリシン残基はバリン残基 (G487V)で置換されている。実施態様によっては、位置487のグリシン残基は比較的大きな側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている。実施態様によっては、位置487のグリシン残基はアルギニン残基(G487R)で置換されている。実施態様によっては、位置487のグリシン残基はリジン残基(G487K)で置換されている。実施態様によっては、位置487のグリシン残基はトリプトファン残基(G487W)で置換されている。実施態様によっては、位置487のグリシン残基はチロシン残基(G487Y)で置換されている。
【０５４５】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のグルタミン酸488または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置488のグルタミン酸残基はグルタミン残基 (E488Q)で置換されている。実施態様によっては、位置488のグルタミン酸残基はヒスチジン残基(E488H)で置換されている。実施態様によっては、位置488のグルタミン酸残基はアルギニン残基(E488R)で置換されている。実施態様によっては、位置488のグルタミン酸残基はリジン残基(E488K)で置換されている。実施態様によっては、位置488のグルタミン酸残基はアスパラギン残基(E488N)で置換されている。実施態様によっては、位置488のグルタミン酸残基はアラニン残基(E488A)で置換されている。実施態様によっては、位置488のグルタミン酸残基はメチオニン残基(E488M)で置換されている。実施態様によっては、位置488のグルタミン酸残基はセリン残基(E488S)で置換されている。実施態様によっては、位置488のグルタミン酸残基はフェニルアラニン残基(E488F)で置換されている。実施態様によっては、位置488のグルタミン酸残基はリジン残基(E488L)で置換されている。実施態様によっては、位置488のグルタミン酸残基はトリプトファン残基(E488W)で置換されている。
【０５４６】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のスレオニン490または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置490のスレオニン残基はシステイン残基(T490C)で置換されている。実施態様によっては、位置490のスレオニン残基はセリン残基(T490S)で置換されている。実施態様によっては、位置490のスレオニン残基はアラニン残基(T490A)で置換されている。実施態様によっては、位置490のスレオニン残基はフェニルアラニン残基(T490F)で置換されている。実施態様によっては、位置490のスレオニン残基はチロシン残基(T490Y)で置換されている。実施態様によっては、位置490のスレオニン残基はセリン残基(T490R)で置換されている。実施態様によっては、位置490のスレオニン残基はアラニン残基(T490K)で置換されている。実施態様によっては、位置490のスレオニン残基はフェニルアラニン残基(T490P)で置換されている。実施態様によっては、位置490のスレオニン残基はチロシン残基(T490E)で置換されている。
【０５４７】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のバリン493または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置493のバリン残基はアラニン残基(V493A)で置換されている。実施態様によっては、位置493のバリン残基はセリン残基(V493S)で置換されている。実施態様によっては、位置493のバリン残基はスレオニン残基(V493T)で置換されている。実施態様によっては、位置493のバリン残基はアルギニン残基(V493R)で置換されている。実施態様によっては、位置493のバリン残基はアスパラギン酸残基(V493D)で置換されている。実施態様によっては、位置493のバリン残基はプロリン残基(V493P)で置換されている。実施態様によっては、位置493のバリン残基はグリシン残基(V493G)で置換されている。
【０５４８】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアラニン589または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置589のアラニン残基はバリン残基(A589V)で置換されている。
【０５４９】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアスパラギン597または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置597のアスパラギン残基はリジン残基(N597K)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは野生型配列にアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置597に変異を含む。実施態様によっては、位置597のアスパラギン残基はアルギニン残基(N597R)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは野生型配列にアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置597に変異を含む。実施態様によっては、位置597のアスパラギン残基はアラニン残基(N597A)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは野生型配列にアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置597に変異を含む。実施態様によっては、位置597のアスパラギン残基はグルタミン酸残基(N597E)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは野生型配列にアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置597に変異を含む。実施態様によっては、位置597のアスパラギン残基はヒスチジン残基(N597H)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは野生型配列にアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置597に変異を含む。実施態様によっては、位置597のアスパラギン残基はグリシン残基(N597G)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは野生型配列にアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置597に変異を含む。実施態様によっては、位置597のアスパラギン残基はチロシン残基(N597Y)で置換されている。実施態様によっては位置597のアスパラギン残基はフェニルアラニン残基(N597F)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N597Iを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N597Lを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N597Vを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N597Mを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N597Cを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N597Pを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N597Tを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N597Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N597Wを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N597Qを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N597Dを含む。特定の例示的な実施態様では、上記のN597での変異はE488Qバックグラウンドの状況でさらに行われる。
【０５５０】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のセリン599または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置599のセリン残基はスレオニン残基(S599T)で置換されている。
【０５５１】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアスパラギン613または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置613のアスパラギン残基はリジン残基(N613K)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは野生型配列にアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置613に変異を含む。実施態様によっては、位置613のアスパラギン残基はアルギニン残基(N613R)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは野生型配列にアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置613に変異を含む。実施態様によっては、位置613のアスパラギン残基はアラニン残基(N613A)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは野生型配列にアスパラギン残基を有するアミノ酸配列の位置613に変異を含む。実施態様によっては、位置613のアスパラギン残基はグルタミン酸残基(N613E)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Iを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Lを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Vを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Fを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Mを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Cを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異N613Pを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Tを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Yを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Wを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Qを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異N613Hを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異N613Dを含む。いくつかの実施態様では、上記のN613での変異は、E488Q変異と組み合わせてさらに作られる。
【０５５２】
実施態様によっては、編集効率を改善するために、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異、すなわちG336D、G487A、G487V、E488Q、E488H、E488R、E488N、E488A、E488S、E488M、T490C、T490S、V493T、V493S、V493A、V493R、V493D、V493P、V493G、N597K、N597R、N597A、N597E、N597H、N597G、N597Y、A589V、S599T、N613K、N613R、N613A、N613E、および上記に対応する相同ADARタンパク質の変異のうちの１つ以上を含んでもよい。
【０５５３】
実施態様によっては、編集効率を下げるために、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異、すなわちE488F、E488L、E488W、T490A、T490F、T490Y、T490R、T490K、T490P、T490E、N597F、および上記に対応する相同ADARタンパク質の変異のうちの１つ以上を含んでもよい。特定の実施態様では、低効力のアデノシンデアミナーゼ酵素を用いて非特異的効果を低減することが興味深い場合がある。
【０５５４】
実施態様によっては、非特異的効果を低減するために、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異、すなわちR348、V351、T375、K376、E396、C451、R455、N473、R474、K475、R477、R481、S486、E488、T490、S495、R510、および上記に対応する相同ADARタンパク質の変異のうちの１つ以上を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異E488、ならびにR348、V351、T375、K376、E396、C451、R455、N473、R474、K475、R477、R481、S486、T490、S495、R510から選択される１つ以上のさらなる位置での変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、T375での変異、および必要に応じて１つ以上のさらなる位置での変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、N473での変異、および必要に応じて１つ以上のさらなる位置での変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、V351での変異、ならびに必要に応じて１つ以上のさらなる位置での変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、E488およびT375での変異、ならびに必要に応じて１つ以上のさらなる位置での変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、E488およびN473、ならびに必要に応じて１つ以上のさらなる位置での変異を含む。いくつかの実施態様では、アデノシンデアミナーゼは、変異E488およびV351、ならびに必要に応じて１つ以上のさらなる位置での変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、E488、ならびにT375、N473、およびV351のうちの１つ以上に変異を含む。
【０５５５】
実施態様によっては、非特異的効果を低減するために、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づくR348E、V351L、T375G、T375S、R455G、R455S、R455E、N473D、R474E、K475Q、R477E、R481E、S486T、E488Q、T490A、T490S、S495T、およびR510Eから選択される変異、および上記に対応する相同ADARタンパク質の変異のうちの１つ以上を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異E488Q、ならびにR348E、V351L、T375G、T375S、R455G、R455S、R455E、N473D、R474E、K475Q、R477E、R481E、S486T、T490A、T490S、S495TおよびR510Eから選択される１つ以上のさらなる変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375GまたはT375S、および必要に応じて１つ以上のさらなる変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異N473D、および必要に応じて１つ以上のさらなる変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351L、および必要に応じて１つ以上のさらなる変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異E488Q、およびT375GまたはT375G、ならびに必要に応じて１つ以上のさらなる変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異E488QおよびN473D、ならびに必要に応じて１つ以上のさらなる変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異E488QおよびV351L、ならびに必要に応じて１つ以上のさらなる変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異E488Q、およびT375G/S、N473DおよびV351Lのうちの１つ以上を含む。
【０５５６】
特定の例では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、hADAR2-Dアミノ酸配列のE488、好ましくはE488Q、または相同ADARタンパク質の対応する位置での変異を含むように改変されており、かつ／あるいはアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、hADAR2-Dアミノ酸配列のT375、好ましくはT375G、または相同ADARタンパク質の対応する位置での変異を含むように改変されている。特定の例では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、hADAR1dアミノ酸配列のE1008、好ましくはE1008Q、または相同ADARタンパク質の対応する位置での変異を含むように改変されている。
【０５５７】
二本鎖RNAに結合したヒトADAR2デアミナーゼドメインの結晶構造から、改変部位の5’側でRNAに結合するタンパク質ループが明らかとなる。この5’結合ループは、ADARファミリーメンバー間の基質特異性の違いの１つの要因である。Wang et al., Nucleic Acids Res., 44(20):9872-9880 (2016)を参照、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。さらに、ADAR2特異的RNA結合ループが酵素活性部位の近くに同定された。Mathews et al., Nat. Struct. Mol. Biol., 23(5):426-33 (2016)参照、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、編集の特異性および／または効率を上げるために、RNA結合ループに１つ以上の変異を含む。
【０５５８】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアラニン454、または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置454のアラニン残基はセリン残基(A454S)で置換されている。実施態様によっては、位置454のアラニン残基はシステイン残基(A454C)で置換されている。実施態様によっては、位置454のアラニン残基はアスパラギン酸残基(A454D)で置換されている。
【０５５９】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアルギニン455、または相同ADAR質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置455のアルギニン残基はアラニン残基(R455A)で置換されている。実施態様によっては、位置455のアルギニン残基はバリン残基(R455V)で置換されている。実施態様によっては、位置455のアルギニン残基はヒスチジン残基(R455H)で置換されている。実施態様によっては、位置455のアルギニン残基はグリシン残基(R455G)で置換されている。実施態様によっては、位置455のアルギニン残基はセリン残基(R455S)で置換されている。実施態様によっては、位置455のアルギニン残基はグルタミン酸残基(R455E)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Cを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Iを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Kを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Lを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Mを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Nを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Qを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Fを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Wを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Pを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Yを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R455Dを含む。実施態様によっては、上記のR455での変異は、E488Q変異と組み合わせてさらに作られる。
【０５６０】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のイソロイシン456、または相同ADAR質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置456のイソロイシン残基はバリン残基(I456V)で置換されている。実施態様によっては、位置456のイソロイシン残基はロイシン残基(I456L)で置換されている。実施態様によっては、位置456のイソロイシン残基はアスパラギン酸残基 (I456D)で置換されている。
【０５６１】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のフェニルアラニン457、または相同ADAR質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置457のフェニルアラニン残基はチロシン残基 (F457Y)で置換されている。実施態様によっては、位置457のフェニルアラニン残基はアルギニン残基(F457R)で置換されている。実施態様によっては、位置457のフェニルアラニン残基はグルタミン酸残基(F457E)で置換されている。
【０５６２】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のセリン458または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置458のセリン残基はバリン残基 (S458V)で置換されている。実施態様によっては、位置458のセリン残基はフェニルアラニン残基(S458F)で置換されている。実施態様によっては、位置458のセリン残基はプロリン残基 (S458P)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Iを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Lを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Mを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Cを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Aを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Tを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Yを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Wを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Qを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Nを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Hを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Dを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Kを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは変異S458Rを含む。実施態様によっては、上記のS458での変異はE488Q変異と組み合わせてさらに行われる。
【０５６３】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のプロリン459または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置459のプロリン残基はシステイン残基 (P459C)で置換されている。実施態様によっては、位置459のプロリン残基はヒスチジン残基(P459H)で置換されている。実施態様によっては、位置459のプロリン残基はトリプトファン残基(P459W)で置換されている。
【０５６４】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のヒスチジン460または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置460のヒスチジン残基はアルギニン残基(H460R)で置換されている。実施態様によっては、位置460のヒスチジン残基はイソロイシン残基(H460I)で置換されている。実施態様によっては、位置460のヒスチジン残基はプロリン残基 (H460P)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Lを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Vを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Fを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Mを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Cを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Aを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Tを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Yを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Wを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Qを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Nを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Dを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異H460Kを含む。実施態様によっては、上記のH460での変異は、E488Q変異と組み合わせてさらに行われる。
【０５６５】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のプロリン462または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置462のプロリン残基はセリン残基(P462S)で置換されている。実施態様によっては、位置462のプロリン残基はトリプトファン残基(P462W)で置換されている。実施態様によっては、位置462のプロリン残基はグルタミン酸残基(P462E)で置換されている。
【０５６６】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアスパラギン酸469または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置469のアスパラギン酸残基はグルタミン残基(D469Q)で置換されている。実施態様によっては、位置469のアスパラギン酸残基はセリン残基(D469S)で置換されている。実施態様によっては、位置469のアスパラギン酸残基はチロシン残基(D469Y)で置換されている。
【０５６７】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアルギニン470または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置470のアルギニン残基はアラニン残基(R470A)で置換されている。実施態様によっては、位置470のアルギニン残基はイソロイシン残基(R470I)で置換されている。実施態様によっては、位置470のアルギニン残基はアスパラギン酸残基(R470D)で置換されている。
【０５６８】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のヒスチジン471または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置471のヒスチジン残基はリジン残基(H471K)で置換されている。実施態様によっては、位置471のヒスチジン残基はスレオニン残基(H471T)で置換されている。実施態様によっては、位置471のヒスチジン残基はバリン残基 (H471V)で置換されている。
【０５６９】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のプロリン472または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置472のプロリン残基はリジン残基(P472K)で置換されている。実施態様によっては、位置472のプロリン残基はスレオニン残基(P472T)で置換されている。実施態様によっては、位置472のプロリン残基はアスパラギン酸残基(P472D)で置換されている。
【０５７０】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアスパラギン473または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置473のアスパラギン残基はアルギニン残基(N473R)で置換されている。実施態様によっては、位置473のアスパラギン残基はトリプトファン残基(N473W)で置換されている。実施態様によっては、位置473のアスパラギン残基はプロリン残基(N473P)で置換されている。実施態様によっては、位置473のアスパラギン残基はアスパラギン酸残基(N473D)で置換されている。
【０５７１】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアルギニン474または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置474のアルギニン残基はリジン残基(R474K)で置換されている。実施態様によっては、位置474のアルギニン残基はグリシン残基(R474G)で置換されている。実施態様によっては、位置474のアルギニン残基はアスパラギン酸残基(R474D)で置換されている。実施態様によっては、位置474のアルギニン残基はグルタミン酸残基(R474E)で置換されている。
【０５７２】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のリジン475または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置475のリジン残基はグルタミン残基(K475Q)で置換されている。実施態様によっては、位置475のリジン残基はアスパラギン残基(K475N)で置換されている。実施態様によっては、位置475のリジン残基はアスパラギン酸残基(K475D)で置換されている。
【０５７３】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアラニン476または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置476のアラニン残基はセリン残基(A476S)で置換されている。実施態様によっては、位置476のアラニン残基はアルギニン残基(A476R)で置換されている。実施態様によっては、位置476のアラニン残基はグルタミン酸残基(A476E)で置換されている。
【０５７４】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアルギニン477または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置477のアルギニン残基はリジン残基(R477K)で置換されている。実施態様によっては、位置477のアルギニン残基はスレオニン残基(R477T)で置換されている。実施態様によっては、位置477のアルギニン残基はフェニルアラニン残基(R477F)で置換されている。実施態様によっては、位置474のアルギニン残基はグルタミン酸残基(R477E)で置換されている。
【０５７５】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のグリシン478または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置478のグリシン残基はアラニン残基(G478A)で置換されている。実施態様によっては、位置478のグリシン残基はアルギニン残基(G478R)で置換されている。実施態様によっては、位置478のグリシン残基はチロシン残基(G478Y)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Iを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Lを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Vを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Fを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Mを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Cを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Pを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Tを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Wを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Qを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Nを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Hを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Dを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478Kを含む。いくつかの実施態様では、上記のG478での変異は、E488Q変異と組み合わせてさらに行われる。
【０５７６】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のグルタミン479または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置479のグルタミン残基はアスパラギン残基(Q479N)で置換されている。実施態様によっては、位置479のグルタミン残基はセリン残基(Q479S)で置換されている。実施態様によっては、位置479のグルタミン残基はプロリン残基(Q479P)で置換されている。
【０５７７】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のアルギニン348または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置348のアルギニン残基はアラニン残基(R348A)で置換されている。実施態様によっては、位置348のアルギニン残基はグルタミン酸残基(R348E)で置換されている。
【０５７８】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のバリン351または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置351のバリン残基はロイシン残基(V351L)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Yを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Mを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Tを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Aを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Fを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Iを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Cを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Hを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Pを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Kを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Nを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Wを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Qを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Dを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異V351Rを含む。実施態様によっては、上記のV351での変異は、E488Q変異と組み合わせてさらに行われる。
【０５７９】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のスレオニン375または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置375のスレオニン残基はグリシン残基(T375G)で置換されている。実施態様によっては、位置375のスレオニン残基はセリン残基(T375S)で置換されている。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Hを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Qを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Cを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Nを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Mを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Aを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Wを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Vを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Rを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Kを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Fを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Iを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Dを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Pを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Lを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375Yを含む。実施態様によっては、上記のT375Yでの変異は、E488Q変異と組み合わせてさらに行われる。
【０５８０】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のArg481または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置481のアルギニン残基はグルタミン酸残基(R481E)で置換されている。
【０５８１】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のSer486または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置486のセリン残基はスレオニン残基(S486T)で置換されている。
【０５８２】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のThr490または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置490のスレオニン残基はアラニン残基(T490A)で置換されている。実施態様によっては、位置490のスレオニン残基はセリン残基(T490S)で置換されている。
【０５８３】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のSer495または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置495のセリン残基はスレオニン残基(S495T)で置換されている。
【０５８４】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のArg510または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置510のアルギニン残基はグルタミン残基(R510Q)で置換されている。実施態様によっては、位置510のアルギニン残基はアラニン残基(R510A)で置換されている。実施態様によっては、位置510のアルギニン残基はグルタミン酸残基(R510E)で置換されている。
【０５８５】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のGly593または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置593のグリシン残基はアラニン残基(G593A)で置換されている。実施態様によっては、位置593のグリシン残基はグルタミン酸残基(G593E)で置換されている。
【０５８６】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列のLys594または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置594のリジン残基はアラニン残基(K594A)で置換されている。
【０５８７】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列の位置A454、R455、I456、F457、S458、P459、H460、P462、D469、R470、H471、P472、N473、R474、K475、A476、R477、G478、Q479、R348、R510、G593、K594、または相同ADARタンパク質の対応する位置のうちの任意の１つ以上の位置に変異を含む。
【０５８８】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列の位置A454S、A454C、A454D、R455A、R455V、R455H、I456V、I456L、I456D、F457Y、F457R、F457E、S458V、S458F、S458P、P459C、P459H、P459W、H460R、H460I、H460P、P462S、P462W、P462E、D469Q、D469S、D469Y、R470A、R470I、R470D、H471K、H471T、H471V、P472K、P472T、P472D、N473R、N473W、N473P、R474K、R474G、R474D、K475Q、K475N、K475D、A476S、A476R、A476E、R477K、R477T、R477F、G478A、G478R、G478Y、Q479N、Q479S、Q479P、R348A、R510Q、R510A、G593A、G593E、K594A、または相同ADARタンパク質の対応する位置のうちの任意の１つ以上の位置に変異を含む。
【０５８９】
特定の実施態様では、アデノシンデアミナーゼは、活性をシチジンデアミナーゼに変換するために変異される。従って、実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、E396、C451、V351、R455、T375、K376、S486、Q488、R510、K594、R348、G593、S397、H443、L444、Y445、F442、E438、T448、A353、V355、T339、P539、T339、P539、V525、I520、P462およびN579から選択される位置に1つ以上の変異を含む。特定の実施態様では、アデノシンデアミナーゼは、V351、L444、V355、V525およびI520から選択される位置に１つ以上の変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づくE488、V351、S486、T375、S370、P462、N597の変異、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。
【０５９０】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Qおよび上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、I398V、および上記に対応するADARタンパク質相同体における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、I398V、K350I、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、I398V、K350I、M383L、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、I398V、K350I、M383L、D619G、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、I398V、K350I、M383L、D619G、S582T、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ��配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、I398V、K350I、M383L、D619G、S582T、V440I、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、I398V、K350I、M383L、D619G、S582T、V440I、S495N、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、I398V、K350I、M383L、D619G、S582T、V440I、S495N、K418E、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、I398V、K350I、M383L、D619G、S582T、V440I、S495N、K418E、S661T、および上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。例によっては、本明細書で提供されるのは、変異アデノシンデアミナーゼ、例えば、死滅Cas12bタンパク質またはCas12ニッカーゼと融合したE488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、I398V、K350I、M383L、D619G、S582T、V440I、S495N、K418E、S661Tのうちの１つ以上の変異を含むアデノシンデアミナーゼである。特定の例では、本明細書で提供されるのは、変異アデノシンデアミナーゼ、例えば、死滅Cas12bタンパク質またはCas12ニッカーゼと融合したE488Q、V351G、S486A、T375S、S370C、P462A、N597I、L332I、I398V、K350I、M383L、D619G、S582T、V440I、S495N、K418E、およびS661Tを含むアデノシンデアミナーゼである。
【０５９１】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、必要に応じてE488の変異と組み合わせて、hADAR2-Dアミノ酸配列の位置T375、V351、G478、S458、H460のいずれか１つ以上の位置、または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、必要に応じてE488Qと組み合わせて、T375G、T375C、T375H、T375Q、V351M、V351T、V351Y、G478R、S458F、H460Iから選択される１つ以上の変異を含む。
【０５９２】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、必要に応じてE488Qと組み合わせて、T375H、T375Q、V351M、V351Y、H460Pから選択される１つ以上の変異を含む。
【０５９３】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、必要に応じてE488Qと組み合わせて、変異T375SおよびS458Fを含む。
【０５９４】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、必要に応じてE488の変異と組み合わせて、hADAR2-Dアミノ酸配列の位置T375、N473、R474、G478、S458、P459、V351、R455、R455、T490、R348、Q479、または相同ADARタンパク質の対応する位置のうちの２つ以上の位置に変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、必要に応じてE488Qと組み合わせて、T375G、T375S、N473D、R474E、G478R、S458F、P459W、V351L、R455G、R455S、T490A、R348E、Q479Pから選択される２つ以上の変異を含む。
【０５９５】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375GおよびV351Lを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375GおよびR455Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375GおよびR455Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375GおよびT490Aを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375GおよびR348Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375SおよびV351Lを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375SおよびR455Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375SおよびR455Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375SおよびT490Aを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異T375SおよびR348Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異N473DおよびV351Lを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異N473DおよびR455Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異N473DおよびR455Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異N473DおよびT490Aを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異N473DおよびR348Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R474EおよびV351Lを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R474EおよびR455Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R474EおよびR455Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R474EおよびT490Aを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異R474EおよびR348Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異S458FおよびT375Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異S458FおよびT375Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異S458FおよびN473Dを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異S458FおよびR474Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異S458FおよびG478Rを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478RおよびT375Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478RおよびT375Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478RおよびN473Dを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異G478RおよびR474Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異P459WおよびT375Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異P459WおよびT375Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異P459WおよびN473Dを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異P459WおよびR474Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異P459WおよびG478Rを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異P459WおよびS458Fを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異Q479PおよびT375Gを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異Q479PおよびT375Sを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異Q479PおよびN473Dを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは���変異Q479PおよびR474Eを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異Q479PおよびG478Rを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異Q479PおよびS458Fを含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異Q479PおよびP459Wを含む。この段落で説明されているすべての変異は、E488Q変異と組み合わせてさらに行うこともできる。
【０５９６】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、必要に応じてE488での変異と組み合わせて、hADAR2-Dアミノ酸配列の位置K475、Q479、P459、G478、S458のいずれか１つ以上の位置、または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、必要に応じてE488Qと組み合わせて、K475N、Q479N、P459W、G478R、S458P、S458Fから選択される１つ以上の変異を含む。
【０５９７】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、必要に応じてE488での変異と組み合わせて、hADAR2-Dアミノ酸配列の位置T375、V351、R455、H460、A476のいずれか１つ以上の位置、または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、必要に応じてE488Qと組み合わせて、T375G、T375C、T375H、T375Q、V351M、V351T、V351Y、R455H、H460P、H460I、A476Eから選択される１つ以上の変異を含む。
【０５９８】
特定の実施態様では、編集の改善および非特異的改変の低減は、gRNAの化学改変によって達成される。gRNAはVogel et al. (2014), Angew Chem Int Ed, 53:6267-6271, doi:10.1002/anie.201402634（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に例示されているように化学的に改変されており、非特異的活性を低減するが特異的効率を改善する。2’-O-メチルおよびホスホチオエート改変ガイドRNAは、一般に細胞内の編集効率を向上させる。
【０５９９】
ADARは、編集されたAのいずれかの側の隣接ヌクレオチドに対する優先度を示すことが知られている（www.nature.com/nsmb/journal/v23/n5/full/nsmb.3203.html, Matthews et al. (2017), Nature Structural Mol Biol, 23(5): 426-433、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。従って、特定の実施態様では、gRNA、標的、および／またはADARは、モチーフの優先度に最適化されて選択される。
【０６００】
好ましくないモチーフの編集を可能にするための意図的な不一致がin vitroで実証されている（academic.oup.com/nar/article-lookup/doi/10.1093/nar/gku272; Schneider et al (2014), Nucleic Acid Res, 42(10):e87；Fukuda et al. (2017), Scientific Reports, 7, doi:10.1038/srep41478、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。従って、特定の実施態様では、好ましくない5’または3’隣接塩基でのRNA編集効率を高めるために、隣接塩基に意図的な不一致が導入される。
【０６０１】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、tRNA特異的アデノシンデアミナーゼまたはその変異体であってもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異W23L、W23R、R26G、H36L、N37S、P48S、P48T、P48A、I49V、R51L、N72D、L84F、S97C、A106V、D108N、H123Y、G125A、A142N、S146C、D147Y、R152H、R152P、E155V、I156F、K157N、およびK161T、ならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異D108Nならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異A106VおよびD108Nならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異A106V、D108N、D147Y、およびE155Vならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異A106VおよびD108Nならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異A106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、およびI156Fならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異A106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I156F、およびA142Nならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異A106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I156F、H36L、R51L、S146C、およびK157Nならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異A106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I156F、H36L、R51L、S146C、K157N、およびP48Sならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異A106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I156F、H36L、R51L、S146C、K157N、P48S、およびA142Nならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異A106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I156F、H36L、R51L、S146C、K157N、P48S、W23R、およびP48Aならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異A106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I156F、H36L、R51L、S146C、K157N、P48S、W23R、P48A、およびA142Nならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置に基づく変異A106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I156F、H36L、R51L、S146C、K157N、P48S、W23R、P48A、およびR152Pならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上を含んでもよい。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、大腸菌TadAのアミノ酸配列位置変異に基づく変異A106V、D108N、D147Y、E155V、L84F、H123Y、I156F、H36L、R51L、S146C、K157N、P48S、W23R、P48A、R152P、およびA142Nならびに上記に対応する相同デアミナーゼタンパク質における変異のうちの１つ以上を含んでもよい。
【０６０２】
結果は、ADARデアミナーゼドメインの標的窓におけるCに向き合うAが、他の塩基よりも優先的に編集されることを示唆している。さらに、標的塩基の数塩基内のUと塩基対合したAは、Cas12b-ADAR融合による編集レベルが低いことを示しており、酵素が複数のAを編集する柔軟性があることを示唆している。これらの２つの観察結果は、Cas12b-ADAR融合の活動的な窓内の複数のAが、編集されるすべてのAをCと一致させないことにより、編集用に指定できることを示唆している。従って、特定の実施態様では、活動的な窓内の複数のA：C不一致は、複数のA：I編集を作成するように設計されている。特定の実施態様では、活動的な窓での潜在的な非特異的編集を抑制するために、非標的Aは、AまたはGと対合している。
【０６０３】
「編集特異性」および「編集優先度」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、二本鎖基質の特定のアデノシン部位でのAからIへの編集の程度を指す。いくつかの実施態様では、基質編集の優先度は、標的アデノシン残基の5'最近傍および／または3’最近傍によって決定される。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、U>A>C>Gとして格付けされた基質の5’最近傍を優先する（「>」は、より高い優先度を示す）。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、G>C≒A>Uとして格付けされた基質の3’最近傍を優先する（「>」はより高い優先度を示し、「≒」は同様の優先度を示す）。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、G>C>U≒Aとして格付けされた基質の3’最近傍を優先する（「>」はより高い優先度を示し、「≒」は同様の優先度を示す）。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、G>C>A>Uとして格付けされた基質の3’最近傍を優先する（「>」は、より高い優先度を示す）。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、C≒G≒A>Uとして格付けされた基質の3’最近傍を優先する（「>」はより高い優先度を示し、「≒」は同様の優先度を示す）。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、TAG>AAG>CAC>AAT>GAA>GACとして格付けされた標的アデノシン残基を含む三連配列を優先し（「>」はより高い優先度を示す）、中心Aは標的アデノシン残基である。
【０６０４】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼの基質編集優先度は、アデノシンデアミナーゼタンパク質中の核酸結合ドメインの有無によって影響を受ける。実施態様によっては、基質編集優先度を改変するために、デアミナーゼドメインは、二本鎖RNA結合ドメイン(dsRBD)または二本鎖RNA結合モチーフ(dsRBM)と接続される。実施態様によっては、dsRBDまたはdsRBMは、hADAR1またはhADAR2などのADARタンパク質に由来してもよい。実施態様によっては、少なくとも１つのdsRBDおよびデアミナーゼドメインを含む全長ADARタンパク質が使用される。実施態様によっては、１つ以上のdsRBMまたはdsRBDは、デアミナーゼドメインのN末端にある。他の実施態様では、１つ以上のdsRBMまたはdsRBDは、デアミナーゼドメインのC末端にある。
【０６０５】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼの基質編集優先度は、酵素の活性中心の近くまたは中心内のアミノ酸残基によって影響を受ける。実施態様によっては、基質編集選考を改変するために、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異G336D、G487R、G487K、G487W、G487Y、E488Q、E488N、T490A、V493A、V493T、V493S、N597K、N597R、A589V、S599T、N613K、およびN613Rならびに上記に対応する相同ADARタンパク質の変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。
【０６０６】
特に、実施態様によっては、編集特異性を低減するために、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E488Q、V493A、N597K、およびN613Kならびに上記に対応する相同ADARタンパク質の変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。実施態様によっては、編集特異性を高めるために、アデノシンデアミナーゼは変異T490Aを含んでいてもよい。
【０６０７】
実施態様によっては、中心Aが標的アデノシン残基である三連配列GACを含む基質などの、すぐ後に5'Gを有する標的アデノシン(A)の編集優先度を高めるために、アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異G336D、E488Q、E488N、V493T、V493S、V493A、A589V、N597K、N597R、S599T、N613K、およびN613Rならびに上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。
【０６０８】
特に、実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、変異E488Qまたは中心Aが標的アデノシン残基である三連配列GAC、GAA、GAU、GAG、CAU、AAU、UACを含む基質を編集するための相同ADARタンパク質の対応する変異を含む。
【０６０９】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR1-Dの野生型アミノ酸配列を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR1-Dの編集効率、および／または基質編集優先度が特定の必要性に従って変更されるように、hADAR1-D配列に１つ以上の変異を含む。
【０６１０】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR1-Dアミノ酸配列のグリシン1007に、または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置1007のグリシン残基は比較的小さな側鎖を有する非極性アミノ酸残基で置換されている。例えば、実施態様によっては、位置1007のグリシン残基はアラニン残基(G1007A)で置換されている。実施態様によっては、位置1007のグリシン残基はバリン残基(G1007V)で置換されている。実施態様によっては、位置1007のグリシン残基は比較的大きな側鎖を有するアミノ酸残基で置換されている。実施態様によっては、位置1007のグリシン残基はアルギニン残基(G1007R)で置換されている。実施態様によっては、位置1007のグリシン残基はリジン残基(G1007K)で置換されている。実施態様によっては、位置1007のグリシン残基はトリプトファン残基(G1007W)で置換されている。実施態様によっては、位置1007のグリシン残基はチロシン残基(G1007Y)で置換されている。さらに、他の実施態様では、位置1007のグリシン残基はロイシン残基(G1007L)で置換されている。他の実施態様では、位置1007のグリシン残基はスレオニン残基(G1007T)で置換されている。他の実施態様では、位置1007のグリシン残基はセリン残基(G1007S)で置換されている。
【０６１１】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR1-Dアミノ酸配列のグルタミン酸1008に、または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基は比較的大きな側鎖を有する極性アミノ酸残基で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はグルタミン残基(E1008Q)で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はヒスチジン残基(E1008H)で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はアルギニン残基(E1008R)で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はリジン残基(E1008K)で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基は非極性または小さな極性アミノ酸残基で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はフェニルアラニン残基(E1008F)で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はトリプトファン残基 (E1008W)で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はグリシン残基(E1008G)で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はイソロイシン残基(E1008I)で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はバリン残基(E1008V)で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はプロリン残基(E1008P)で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はセリン残基(E1008S)で置換されている。他の実施態様では、位置1008のグルタミン酸残基はアスパラギン残基(E1008N)で置換されている。他の実施態様では、位置1008のグルタミン酸残基はアラニン残基(E1008A)で置換されている。他の実施態様では、位置1008のグルタミン酸残基はメチオニン残基(E1008M)で置換されている。実施態様によっては、位置1008のグルタミン酸残基はロイシン残基(E1008L)で置換されている。
【０６１２】
実施態様によっては、編集効率を改善するために、アデノシンデアミナーゼは、hADAR1-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E1007S、E1007A、E1007V、E1008Q、E1008R、E1008H、E1008M、E1008N、およびE1008Kならびに上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。
【０６１３】
実施態様によっては、編集効率を低下させるために、アデノシンデアミナーゼは、hADAR1-Dのアミノ酸配列位置に基づく変異E1007R、E1007K、E1007Y、E1007L、E1007T、E1008G、E1008I、E1008P、E1008V、E1008F、E1008W、E1008S、E1008N、およびE1008Kならびに上記に対応する相同ADARタンパク質における変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。
【０６１４】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼの基質編集優先度、効率および／または選択性は、酵素の活性中心の近くまたは中のアミノ酸残基によって影響を受ける。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、hADAR1-D配列中のグルタミン酸1008に、または相同ADARタンパク質の対応する位置における変異を含む。実施態様によっては、変異は、E1008Rまたは相同ADARタンパク質の対応する変異である。実施態様によっては、E1008R変異体は、反対側の鎖に不一致のG残基を有する標的アデノシン残基の編集効率が向上している。
【０６１５】
実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、二本鎖核酸基質を認識して結合するための１つ以上の二本鎖RNA (dsRNA)結合モチーフ (dsRBM)またはドメイン(dsRBD)をさらに含むか、またはそれらに接続される。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼと二本鎖基質との間の相互作用は、CRISPR/CASタンパク質因子を含む１つ以上の追加のタンパク質因子によって媒介される。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼと二本鎖基質との間の相互作用は、ガイドRNAを含む１つ以上の核酸成分によってさらに媒介される。
【０６１６】
CからUへの脱アミノ化活性を有する改変アデノシンデアミナーゼ
【０６１７】
特定の実施態様例では、定向進化を用いて、アデニンのヒポキサンチンへの脱アミノ化の他に、追加の反応を触媒できる改変ADARタンパク質を設計してもよい。例えば、改変ADARタンパク質は、シチジンのウラシルへの脱アミノ化を触媒可能であってもよい。特定の理論には拘束されないが、CからUへの活性を改善する変異は、結合ポケットの形状を変化させて、より小さなシチジン塩基をより受容し易くする可能性がある。
【０６１８】
実施態様によっては、CからUへの脱アミノ化活性を有する改変アデノシンデアミナーゼは、hADAR2-Dアミノ酸配列の位置V351、T375、R455、およびE488のいずれか１つ以上の位置、または相同ADARタンパク質の対応する位置に変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、E488Qの変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、V351I、V351L、V351F、V351M、V351C、V351A、V351G、V351P、V351T、V351S、V351Y、V351W、V351Q、V351N、V351H、V351E、V351D、V351K、V351R、T375I、T375L、T375V、T375F、T375M、T375C、T375A、T375G、T375P、T375S、T375Y、T375W、T375Q、T375N、T375H、T375E、T375D、T375K、T375R、R455I、R455L、R455V、R455F、R455M、R455C、R455A、R455G、R455P、R455T、R455S、R455Y、R455W、R455Q、R455N、R455H、R455E、R455D、およびR455Kから選択される１つ以上の変異を含む。実施態様によっては、アデノシンデアミナーゼは、E488Qの変異を含み、さらに、V351I、V351L、V351F、V351M、V351C、V351A、V351G、V351P、V351T、V351S、V351Y、V351W、V351Q、V351N、V351H、V351E、V351D、V351K、V351R、T375I、T375L、T375V、T375F、T375M、T375C、T375A、T375G、T375P、T375S、T375Y、T375W、T375Q、T375N、T375H、T375E、T375D、T375K、T375R、R455I、R455L、R455V、R455F、R455M、R455C、R455A、R455G、R455P、R455T、R455S、R455Y、R455W、R455Q、R455N、R455H、R455E、R455D、およびR455Kから選択される１つ以上の変異を含む。
【０６１９】
CからUへの脱アミノ化活性を有する前述の改変ADARタンパク質に関連して、本明細書に説明の本発明はまた、標的RNAまたはDNAに本明細書に開示のAD機能化組成物を送達することを含む、関心のある標的RNA配列中のCを脱アミノ化する方法に関する。
【０６２０】
特定の実施態様例では、標的RNA配列中のCを脱アミノ化する方法は、前記標的RNAに、（a）触媒的に不活性な（死滅）Cas、（b）直接反復配列に連結されたガイド配列を含むガイド分子、および（c）CからUへの脱アミノ化活性を有する改変ADARタンパク質またはその触媒ドメインを送達することを含む。ここで前記改変ADARタンパク質またはその触媒ドメインは、前記死滅Casタンパク質または前記ガイド分子に共有結合または非共有結合するか、または送達後にそれに結合するように構成されていて、ガイド分子は、前記死滅Casタンパク質と複合体を形成しかつ前記複合体を関心のある前記標的RNA配列に結合させるように導き、前記ガイド配列は、前記Cを含む標的配列とハイブリダイズしてRNA二重鎖を形成することができ、場合によっては、前記ガイド配列は、前記Cに対応する位置に非対合のAまたはUを含み形成されたRNA二重鎖に不一致をもたらし、また前記改変ADARタンパク質またはその触媒ドメインは、前記RNA二本鎖中の前記Cを脱アミノ化する。
【０６２１】
CからUへの脱アミノ化活性を有する前述の改変ADARタンパク質に関連して、本明細書に説明の本発明はさらに、関心のある標的遺伝子座中のCを脱アミノ化するのに適する遺伝子操作された非天然起源のシステムに関し、このシステムは、（a）直接反復配列に連結されたガイド配列を含むガイド分子、または前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列、（b）触媒的に不活性なCas13タンパク質、または前記触媒的に不活性なCas13タンパク質をコードするヌクレオチド配列、および（c）CからUへの脱アミノ化活性を有する改変ADARタンパク質またはその触媒ドメイン、または前記改変ADARタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む。ここで前記改変ADARタンパク質またはその触媒ドメインは、前記Cas13タンパク質または前記ガイド分子に共有結合または非共有結合するか、または送達後にそれに結合するように構成されていて、前記ガイド配列は、Cを含む標的RNA配列とハイブリダイズして、RNA二重鎖を形成でき、場合によっては、前記ガイド配列は、前記Cに対応する位置に非対合のAまたはUを含み形成されたRNA二重鎖に不一致をもたらす。場合によっては、このシステムは、（a）前記ガイド配列を含む前記ガイド分子をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第１の調節エレメント、（b）前記触媒的に不活性なCas13タンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第２の調節エレメント、および（c）前記第１または第２の調節エレメントの制御下にあるか、または第３の調節エレメントに操作可能に連結されている、CからUへの脱アミノ化活性を有する改変ADARタンパク質またはその触媒ドメインをコードするヌクレオチド配列を含む１つ以上のベクターを含むベクターシステムである。ここで改変ADARタンパク質またはその触媒ドメインをコードする前記ヌクレオチド配列が第３の調節エレメントに操作可能に連結される場合に、前記改変ADARタンパク質またはその触媒ドメインは、発現後に前記ガイド分子または前記Cas13タンパク質に連結するように構成され、（a）、（b）および（c）の構成要素は、システムの同一のまたは異なるベクター上に位置し、場合によっては、前記第１、第２、および／または第３の調節エレメントは誘導性プロモーターである。
【０６２２】
本発明の一実施態様では、アデノシンデアミナーゼの基質は、ガイド分子がそのDNA標的に結合すると形成されるRNA／DNAヘテロ二本鎖であり、次いで、その基質はCRISPR-Cas酵素とCRISPR-Cas複合体を形成する。RNA／DNAまたはDNA／RNAヘテロ二本鎖は、本明細書では「RNA／DNA混成物」、「DNA／RNA混成物」または「二本鎖基質」とも呼ばれる。
【０６２３】
本発明によれば、アデノシンデアミナーゼの基質は、ガイド分子がそのDNA標的に結合すると形成されるRNA／DNAn RNA二重鎖であり、次いで、その基質はCRISPR-Cas酵素とCRISPR-Cas複合体を形成する。アデノシンデアミナーゼの基質はまた、ガイド分子がそのRNA標的に結合すると形成されるRNA／RNA二重鎖であってもよく、次いで、その基質はCRISPR-Cas酵素とCRISPR-Cas複合体を形成する。RNA／DNAまたはDNA／RNAn RNA二重鎖は、本明細書では「RNA／DNA混成物」、「DNA／RNA混成物」または「二本鎖基質」とも呼ばれる。ガイド分子とCRISPR-Cas酵素の特定の機能を以下に詳述する。
【０６２４】
本明細書で使用される用語「編集選択率」は、二本鎖基質上でアデノシンデアミナーゼによって編集される全ての部位の比率を指す。理論に拘束されることなく、アデノシンデアミナーゼの編集選択率は、二本鎖基質の長さ、および不一致な塩基、バルジ、および／または内部ループの存在などの二次構造によって影響を受けると考えられる。
【０６２５】
実施態様によっては、基質が50塩基対より長い完全に塩基対合した二重鎖である場合に、アデノシンデアミナーゼは、二重鎖内の複数のアデノシン残基（例えば、全てのアデノシン残基のうちの50%）を脱アミノ化することができる可能性がある。実施態様によっては、基質が50塩基対より短い場合に、アデノシンデアミナーゼの編集選択率は、標的アデノシン部位での不一致の存在によって影響を受ける。特に、実施態様によっては、反対側の鎖上に不一致のシチジン（C）残基を有するアデノシン（A）残基は、高効率で脱アミノ化される。実施態様によっては、反対側の鎖上に不一致のグアノシン（G）残基を有するアデノシン（A）残基は、編集されずに無視される。
【０６２６】
特定の実施態様では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、細胞に送達されるか、あるいは細胞内で別々のタンパク質として発現されるが、C2c1タンパク質またはガイド分子のいずれかに連結できるように改変される。特定の実施態様では、これは、バクテリオファージ外皮タンパク質の多様性の範囲内に存在するオルソゴナルRNA結合タンパク質またはアダプタータンパク質／アプタマーの組合せを用いることで確実になる。この外皮タンパク質の例として、限定はされないが、MS2、Qβ、F2、GA、fr、JP501、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、φCb5、φCb8r、φCb12r、φCb23r、7s、およびPRR1が挙げられる。アプタマーは、特定の標的に結合するために、in vitro選択またはSELEX（指数関数的濃縮によるリガンドの系統的進化）の繰り返し回数を通して遺伝子操作された天然起源または合成のオリゴヌクレオチドであってもよい。
【０６２７】
特定の実施態様では、ガイド分子は、アダプタータンパク質を動員できる１つ以上の異なるRNAループまたは異なる配列を備えている。ガイド分子は、異なるRNAループまたは異なる配列に結合できるアダプタータンパク質を動員できる異なるRNAループまたは異なる配列の挿入によって、C2c1タンパク質と衝突することなく伸長させることができる。改変されたガイドの例、およびエフェクタードメインをC2c1複合体に動員する際のそれらの使用は、Konermann（Nature 2015, 517(7536): 583-588）に説明されている。特定の実施態様では、アプタマーは、哺乳動物細胞中の二量体化MS2バクテリオファージ外皮タンパク質に選択的に結合し、かつステムループ中および／または四塩基ループ中などのガイド分子に導入される最小のヘアピンアプタマーである。これらの実施態様では、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、MS2に融合されている。次に、アデノシンデアミナーゼタンパク質は、C2c1タンパク質および対応するガイドRNAと共に同時送達される。
【０６２８】
実施態様によっては、本明細書に説明のC2c1−ADAR塩基編集システムは、（a）触媒的に不活性であるかまたはニッカーゼであるC2c1タンパク質、（b）ガイド配列を含むガイド分子、および（c）アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを含む。ここでアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、C2c1タンパク質またはガイド分子に共有結合または非共有結合で連結しているか、または送達後にそれらに結合するように構成され、ガイド配列は、標的配列に実質的に相補的であるが、脱アミノ化の標的となるAに対応する非対合のCを含み、ガイド配列および標的配列によって形成されるDNA−RNA二重鎖またはRNA−RNA二重鎖にA−C不一致をもたらす。真核細胞中に適用する場合に、C2c1タンパク質および／またはアデノシンデアミナーゼは、NLSタグ付であることが好ましい。
【０６２９】
実施態様によっては、構成要素（a）、（b）、および（c）は、リボ核タンパク質複合体として細胞に送達される。リボ核タンパク質複合体は、１つ以上の脂質ナノ粒子を介して送達されてもよい。
【０６３０】
実施態様によっては、構成要素（a）、（b）、および（c）は、１つ以上のガイドRNA、およびC2c1タンパク質、アデノシンデアミナーゼタンパク質、および場合によってはアダプタータンパク質をコードする１つ以上のmRNA分子などの１つ以上のRNA分子として細胞に送達される。RNA分子は、１つ以上の脂質ナノ粒子を介して送達されてもよい。
【０６３１】
実施態様によっては、構成要素（a）、（b）および（c）は、１つ以上のDNA分子として細胞に送達される。実施態様によっては、１つ以上のDNA分子は、ウイルスベクター（例えばAAV）などの１つ以上のベクター内に含まれる。実施態様によっては、１つ以上のDNA分子は、C2c1タンパク質、ガイド分子、およびアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを発現するように操作可能に構成された１つ以上の調節エレメントを含み、場合によっては、１つ以上の調節エレメントは誘導性プロモーターを含む。
【０６３２】
実施態様によっては、ガイド分子は、標的遺伝子座の第１のDNA鎖またはRNA鎖内で脱アミノ化されるアデニンを含む標的配列とハイブリダイズして、前記アデニンの反対側の非対合のシトシンを含むDNA−RNA二重鎖またはRNA−RNA二重鎖を形成することが可能である。二本鎖が形成されると、ガイド分子は、C2c1タンパク質と複合体を形成し、かつ関心のある標的遺伝子座で前記第１のDNA鎖または前記RNA鎖に結合するようにその複合体を誘導する。C2c1−ADAR塩基編集システムのガイドの側面を以下に詳述する。
【０６３３】
実施態様によっては、標準的な長さ（例えば、AacC2c1については約20ヌクレオチド長）を有するC2c1ガイドRNAを使用して、標的DNAまたはRNAとのDNA−RNA二重鎖またはRNA−RNA二重鎖を形成する。実施態様によっては、標準的な長さより長いC2c1ガイド分子（例えば、AacC2c1については20超のヌクレオチド長）を使用して、C2c1−ガイドRNA−標的DNA複合体の外部を含み、標的DNAまたはRNAとのDNA−RNA二重鎖またはRNA−RNA二重鎖を形成する。特定の実施態様例では、ガイド配列は、前記標的配列とのDNA−RNA二重鎖またはRNA−RNA二重鎖を形成できる約29〜53ヌクレオチド長を有する。特定の他の実施態様例では、ガイド配列は、前記標的配列とのDNA−RNA二重鎖またはRNA−RNA二重鎖を形成できる約40〜50ヌクレオチド長を有する。特定の実施態様例では、前記非対合のCと前記ガイド配列の5’末端との間の距離は、20〜30ヌクレオチドである。特定の実施態様例では、前記非対合のCと前記ガイド配列の3’末端との間の距離は、20〜30ヌクレオチドである。
【０６３４】
少なくとも第１の設計では、C2c1−ADARシステムは、（a）触媒的に不活性であるかまたはニッカーゼであるC2c1タンパク質に融合または連結されたアデノシンデアミナーゼ、および（b）ガイド配列と標的配列の間に形成されたDNA−RNA二重鎖またはRNA−RNA二重鎖にA−C不一致を導入するように設計されたガイド配列を含むガイド分子を含む。実施態様によっては、C2c1タンパク質および／またはアデノシンデアミナーゼは、N末端またはC末端のいずれかに、あるいはその両方にNLSタグ付けされている。
【０６３５】
少なくとも第２の設計では、C2c1−ADARシステムは、（a）触媒的に不活性であるかまたはニッカーゼであるC2c1タンパク質、（b）ガイド配列と標的配列の間に形成されたDNA−RNA二重鎖またはRNA−RNA二重鎖にA−C不一致を導入するように設計されたガイド配列を含むガイド分子、およびアダプタータンパク質（例えば、MS2被覆タンパク質またはPP7外皮タンパク質）に結合できるアプタマー配列（例えば、MS2 RNAモチーフまたはPP7 RNAモチーフ）、および（c）アダプタータンパク質に融合または連結されたアデノシンデアミナーゼを含む。ここでアプタマーとアダプタータンパク質の結合は、ガイド配列と標的配列の標的配列との間に形成されたDNA−RNA二重鎖またはRNA−RNA二重鎖に、A−C不一致のAでの標的脱アミノ化のためにアデノシンデアミナーゼを動員する。実施態様によっては、アダプタータンパク質および／またはアデノシンデアミナーゼは、N末端またはC末端のいずれかに、あるいはその両方にNLSタグ付けされている。C2c1タンパク質はまた、NLSタグ付けされていてもよい。
【０６３６】
異なるアプタマーおよび対応するアダプタータンパク質の使用により、さらにオルソゴナル遺伝子編集を実施することが可能になる。アデノシンデアミナーゼをシチジンデアミナーゼと組合せてオルソゴナル遺伝子編集／脱アミノ化のために使用する一例では、MS2−アデノシンデアミナーゼおよびPP7−シチジンデアミナーゼ（またはPP7−アデノシンデアミナーゼおよびMS2−シチジンデアミナーゼ）のそれぞれを動員するために、異なる遺伝子座を標的とするsgRNAを異なるRNAループで改変して、それぞれ関心のある標的遺伝子座でのAまたはCのオルソゴナル脱アミノ化をもたらすことができる。PP7は、シュードモナス属バクテリオファージのRNA結合外皮タンパク質である。MS2と同様に、PP7は特定のRNA配列および二次構造に結合する。PP7 RNA認識モチーフは、MS2のモチーフとは異なる。その結果として、PP7およびMS2を多重化して、異なるゲノム遺伝子座で同時に異なる効果を媒介できる。例えば、遺伝子座Aを標的とするsgRNAは、MS2ループで改変されてMS2−アデノシンデアミナーゼを動員でき、遺伝子座Bを標的とする別のsgRNAは、PP7ループで改変されてPP7−シチジンデアミナーゼを動員できる。従って、同じ細胞内でオルソゴナルする遺伝子座固有の改変が実現される。この原理を拡張して、他のオルソゴナルRNA結合タンパク質を組み込むことができる。
【０６３７】
少なくとも第３の設計では、C2c1−ADAR CRISPRシステムは、（a）触媒的に不活性であるかまたはニッカーゼであるC2c1タンパク質の内部ループまたは非構造化領域内に挿入されたアデノシンデアミナーゼ、および（b）ガイド配列と標的配列との間に形成されたDNA−RNA二重鎖またはRNA−RNA二重鎖にA−C不一致を導入するように設計されたガイド配列を含むガイド分子を含む。
【０６３８】
アデノシンデアミナーゼの挿入に適するC2c1タンパク質分割部位は、結晶構造の助けを借りて識別できる。例えば、AacC2c1変異体に関して、例えば、配列の整列においてどの位置が対応するかは容易に明白になるはずである。他のC2c1タンパク質について、相同分子種と目的のC2c1タンパク質との間に比較的高度な相同性が存在する場合には、その相同分子種の結晶構造を使用できる。
【０６３９】
分割位置は、領域またはループ内に位置してもよい。好ましくは、分割位置は、アミノ酸配列の中断が構造的特徴（例えば、α螺旋またはβ薄板）の部分的または完全な破壊をもたらさない場合に発生する。未構造化領域（これらの領域は結晶内で「凍結」されるのに十分に構造化していないために、結晶構造内に現出しなかった領域）が、選択肢として好ましい場合が多い。本発明の実施では、C2c1の表面に露出している全ての非構造化領域内での分割が想定されている。非構造化領域または外側のループ内の位置は、正確に上記に示された数である必要はない可能性はあるが、分割位置が依然外側ループの非構造化領域内にある限り、ループのサイズに応じて上記の位置のいずれかの側で、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9個、さらに10個のアミノ酸により変化していてもよい。
【０６４０】
本明細書に説明のC2c1−ADARシステムを使用して、脱アミノ化のためにDNA配列内の特定のアデニンを標的することができる。例えば、ガイド分子は、C2c1タンパク質と複合体を形成して、その複合体を誘導して関心のある標的遺伝子座で標的配列に結合できる。ガイド配列は非対合Cを持つように設計されているために、ガイド配列と標的配列との間に形成されるヘテロ二本鎖は、A−C不一致を含み、アデノシンデアミナーゼを非対合Cの反対側のAに接触させて脱アミノ化するように誘導し、それをイノシン(I)に変換する。イノシン(I)塩基はCと対合し細胞プロセスでGのように機能するので、本明細書に説明のAの標的脱アミノ化は、望ましくないG−AおよびC−T変異の修正、ならびに望ましいA−GおよびT−C変異の生成に有用である。
塩基除去修復阻害剤
【０６４１】
実施態様によっては、AD機能化CRISPRシステムは、塩基除去修復(BER)阻害剤をさらに含む。特定の理論に拘束されることを望まないが、I：T対合の存在に対する細胞のDNA修復応答は、細胞での核酸塩基の編集効率の低下の原因となる可能性がある。（DNA-3-メチルアデニングリコシラーゼ、3-アルキルアデニンDNAグリコシラーゼ、またはN-メチルプリンDNAグリコシラーゼとしても知られている）アルキルアデニンDNAグリコシラーゼは、細胞内のDNAからのヒポキサンチンの除去を触媒し塩基除去修復を開始でき、結果としてI：T対をA：T対に戻す。
【０６４２】
実施態様によっては、BER阻害剤は、アルキルアデニンDNAグリコシラーゼの阻害剤である。実施態様によっては、BER阻害剤は、ヒトアルキルアデニンDNAグリコシラーゼの阻害剤である。実施態様によっては、BER阻害剤は、ポリペプチド阻害剤である。実施態様によっては、BER阻害剤は、ヒポキサンチンに結合するタンパク質である。実施態様によっては、BER阻害剤は、DNA中のヒポキサンチンに結合するタンパク質である。実施態様によっては、BER阻害剤は、触媒的に不活性なアルキルアデニンDNAグリコシラーゼタンパク質またはその結合ドメインである。実施態様によっては、BER阻害剤は、触媒的に不活性なアルキルアデニンDNAグリコシラーゼタンパク質またはその結合ドメインであり、これらはDNAからヒポキサンチンを除去しない。アルキルアデニンDNAグリコシラーゼ塩基除去修復酵素を阻害する（例えば立体的に遮断する）ことが可能な他のタンパク質は、本開示の範囲内である。さらに、塩基除去修復を遮断または阻害する任意のタンパク質もまた、本開示の範囲内である。
【０６４３】
特定の理論に拘束されることを望まないが、塩基除去修復は、編集された鎖に結合し、編集された塩基を遮断し、アルキルアデニンDNAグリコシラーゼを阻害し、塩基除去修復を阻害し、編集された塩基を保護し、かつ／あるいは編集されていない鎖の固定を促進する分子によって阻害されてもよい。本明細書に説明のBER阻害剤の使用は、AからIへの変化を触媒可能なアデノシンデアミナーゼの編集効率を向上できると考えられている。
【０６４４】
従って、上記に説明のAD機能化CRISPRシステムの第１の設計では、CRISPR-Casタンパク質またはアデノシンデアミナーゼは、BER阻害剤（例えば、アルキルアデニンDNAグリコシラーゼの阻害剤）に融合または連結されていてもよい。実施態様によっては、BER阻害剤は、以下の構造のうちの１つに含まれてもよい（nC2c1はC2c1ニッカーゼであり、dC2c1は死滅C2c1である）：［AD］−［任意のリンカー］−［nC2c1/dC2c1］−［任意のリンカー］−［BER阻害剤]；［AD］−［任意のリンカー］−［BER阻害剤］−［任意のリンカー］−［nC2c1/dC2c1］；［BER阻害剤］−［任意のリンカー］−［AD］−［任意のリンカー］−［nC2c1/dC2c1］；［BER阻害剤］−［任意のリンカー］−［nC2c1/dC2c1］−［任意のリンカー］−［AD］；［nC2c1/dC2c1］−［任意のリンカー］−［AD］−［任意のリンカー］−［BER阻害剤］；［nC2c1/dC2c1］−［任意のリンカー］−［BER阻害剤］−［任意のリンカー］−［AD］。
【０６４５】
同様に、上記に説明のAD機能化CRISPRシステムの第２の設計では、CRISPR-Casタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、またはアダプタータンパク質は、BER阻害剤（例えば、アルキルアデニンDNAグリコシラーゼの阻害剤）に融合または連結されていてもよい。実施態様によっては、BER阻害剤は、以下の構造のうちの１つに含まれてもよい（nC2c1はC2c1ニッカーゼであり、dC2c1は死滅C2c1である）：［nC2c1/dC2c1］−［任意のリンカー］−［BER阻害剤］；［BER阻害剤］−［任意のリンカー］−［nC2c1/dC2c1］；［AD］−［任意のリンカー］−［アダプター］−［任意のリンカー］−［BER阻害剤］；［AD］−［任意のリンカー］−［BER阻害剤］−［任意のリンカー］−［アダプター］；［BER阻害剤］−［任意のリンカー］−［AD］−［任意のリンカー］−［アダプター］；［BER阻害剤］−［任意のリンカー］−［アダプター］−［任意のリンカー］−［AD］；［アダプター］−［任意のリンカー］−［AD］−［任意のリンカー］−［BER阻害剤］；［アダプター］−［任意のリンカー］−［BER阻害剤］−［任意のリンカー］−［AD］。
【０６４６】
上記に説明のAD機能化CRISPRシステムの第３の設計では、BER阻害剤は、CRISPR-Casタンパク質の内部ループまたは非構造化領域に挿入されていてもよい。
シチジンデアミナーゼ
【０６４７】
実施態様によっては、デアミナーゼは、シチジンデアミナーゼである。本明細書で使用される用語「シチジンデアミナーゼ」または「シチジンデアミナーゼタンパク質」は、タンパク質、ポリペプチド、またはタンパク質またはポリペプチドの１つ以上の機能ドメインを指し、これらは、以下に示すように、シトシン（または分子のシトシン部分）をウラシル（または分子のウラシル部分）に変換する加水分解性脱アミノ化反応を触媒することができる。実施態様によっては、シトシン含有分子はシチジン(C)であり、ウラシル含有分子はウリジン(U)である。シトシン含有分子は、デオキシリボ核酸(DNA)またはリボ核酸(RNA)であってもよい。
【化２】
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【０６４８】
本開示によれば、本開示に関連して使用できるシチジンデアミナーゼには、限定はされないが、アポリポタンパク質B mRNA編集複合体(APOBEC)ファミリーのデアミナーゼ、活性誘導デアミナーゼ (AID)、またはシチジンデアミナーゼ1 (CDA1)として知られる酵素ファミリーのメンバーが含まれる。特定の実施態様では、デアミナーゼは、APOBEC1デアミナーゼ、APOBEC2デアミナーゼ、APOBEC3Aデアミナーゼ、APOBEC3Bデアミナーゼ、APOBEC3Cデアミナーゼ、APOBEC3Dデアミナーゼ、APOBEC3Eデアミナーゼ、APOBEC3Fデアミナーゼ、APOBEC3Gデアミナーゼ、APOBEC3Hデアミナーゼ、またはAPOBEC4デアミナーゼである。
【０６４９】
本発明の方法およびシステムでは、シチジンデアミナーゼは、DNA一本鎖中のシトシンを標的可能である。特定の実施態様例では、シチジンデアミナーゼは、結合成分、例えば結合Cas13の外側に存在する一本鎖で編集してもよい。他の実施態様例では、シチジンデアミナーゼは、標的編集部位であるがガイド配列での不一致によって形成される局所バブルなどの局所バブルで編集してもよい。特定の実施態様例では、シチジンデアミナーゼは、Kim et al., Nature Biotechnology (2017) 35(4):371-377 (doi:10.1038/nbt.3803に開示されるような活性を合焦するのを助ける変異を含んでもよい。
【０６５０】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、限定はされないが、哺乳動物、鳥、カエル、イカ、魚、ハエ、および虫を含む１種以上の後生動物種に由来する。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、ヒト、霊長類、ウシ、イヌ、ラット、またはマウスのシチジンデアミナーゼである。
【０６５１】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、hAPOBEC1またはhAPOBEC3を含むヒトAPOBECである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼはヒトAIDである。
【０６５２】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼタンパク質は、RNA二本鎖の一本鎖バブル中の１つ以上の標的シトシン残基を認識し、かつウラシル残基に変換する。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼタンパク質は、RNA二本鎖の一本鎖バブル上の結合ウィンドウを認識する。実施態様によっては、結合ウィンドウは、少なくとも１つの標的シトシン残基を含む。実施態様によっては、結合ウィンドウは、約3塩基対〜約100塩基対の範囲内にある。実施態様によっては、結合ウィンドウは、約5塩基対〜約50塩基対の範囲内にある。実施態様によっては、結合ウィンドウは、約10塩基対〜約30塩基対の範囲内にある。実施態様によっては、結合ウィンドウは、約1塩基対、2塩基対、3塩基対、5塩基対、7塩基対、10塩基対、15塩基対、20塩基対、25塩基対、30塩基対、40塩基対、45塩基対、50塩基対、55塩基対、60塩基対、65塩基対、70塩基対、75塩基対、80塩基対、85塩基対、90塩基対、95塩基対、または100塩基対である。
【０６５３】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼタンパク質は、１つ以上のデアミナーゼドメインを含む。理論に拘束されることを意図しないが、デアミナーゼドメインは、RNA二本鎖の一本鎖バブルに含まれる１つ以上の標的シトシン(C)残基を認識し、ウラシル(U)残基に変換するように機能すると考えられる。実施態様によっては、デアミナーゼドメインは活性中心を含む。実施態様によっては、活性中心は亜鉛イオンを含む。実施態様によっては、活性中心内またはその近傍のアミノ酸残基は、標的シトシン残基の5’側の１つ以上のヌクレオチドと相互作用する。実施態様によっては、活性中心内またはその近傍のアミノ酸残基は、標的シトシン残基の3’側の１つ以上のヌクレオチドと相互作用する。
【０６５４】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、ヒトAPOBEC1完全タンパク質 (hAPOBEC1)またはそのデアミナーゼドメイン (hAPOBEC1-D)またはそのC末端切り詰め形態 (hAPOBEC-T)を含む。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、hAPOBEC1、hAPOBEC-D、またはhAPOBEC-Tに相同であるAPOBECファミリーのメンバーである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、ヒトAID1完全タンパク質(hAID)またはそのデアミナーゼドメイン(hAID-D)またはそのC末端切り詰め形態 (hAID-T)を含む。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、hAID、hAID-D、またはhAID-Tに相同であるAIDファミリーのメンバーである。実施態様によっては、hAID-Tは、約20個のアミノ酸によってC末端が切り詰められたhAIDである。
【０６５５】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、シトシンデアミナーゼの野生型アミノ酸配列を含む。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、シトシンデアミナーゼの編集効率および／または基質編集優先度が特定の必要性に従って変更されるように、シトシンデアミナーゼ配列中に１つ以上の変異を含む。
【０６５６】
APOBEC1およびAPOBEC3タンパク質の特定の変異は、Kim et al., Nature Biotechnology (2017) 35(4):371-377 (doi:10.1038/nbt.3803)、およびHarris et al. Mol. Cell (2002) 10:1247-1253に説明されていて、これらのそれぞれは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれている。
【０６５７】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、ラットのAPOBEC1中のW90、R118、H121、H122、R126、またはR132に対応するアミノ酸位置に１つ以上の変異を含むAPOBEC1デアミナーゼ、あるいはヒトAPOBEC3G中のW285、R313、D316、D317X、R320、またはR326に対応するアミノ酸位置に１つ以上の変異を含むAPOBEC3Gデアミナーゼである。
【０６５８】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、ラットのAPOBEC1アミノ酸配列のトリプトファン90での変異、またはAPOBEC3Gのトリプトファン285などの相同APOBECタンパク質中の対応する位置での変異を含む。実施態様によっては、位置90のトリプトファン残基は、チロシンまたはフェニルアラニン残基（W90YまたはW90F）によって置換されている。
【０６５９】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、ラットのAPOBEC1アミノ酸配列のアルギニン118での変異、または相同APOBECタンパク質中の対応する位置での変異を含む。実施態様によっては、位置118のアルギニン残基は、アラニン残基 (R118A)によって置換されている。
【０６６０】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、ラットのAPOBEC1アミノ酸配列のヒスチジン121での変異、または相同APOBECタンパク質中の対応する位置での変異を含む。実施態様によっては、位置121のヒスチジン残基は、アルギニン残基 (H121R)によって置換されている。
【０６６１】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、ラットのAPOBEC1アミノ酸配列のヒスチジン122での変異、または相同APOBECタンパク質中の対応する位置での変異を含む。実施態様によっては、位置122のヒスチジン残基は、アルギニン残基 (H122R)によって置換されている。
【０６６２】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、ラットのAPOBEC1アミノ酸配列のアルギニン126での変異、またはAPOBEC3Gのアルギニン320などの相同APOBECタンパク質中の対応する位置での変異を含む。実施態様によっては、位置126のアルギニン残基は、アラニン残基 (R126A)またはグルタミン酸 (R126E)によって置換されている。
【０６６３】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、APOBEC1アミノ酸配列のアルギニン132での変異、または相同APOBECタンパク質中の対応する位置での変異を含む。実施態様によっては、位置132のアルギニン残基は、グルタミン酸残基 (R132E)によって置換されている。
【０６６４】
実施態様によっては、編集ウィンドウの幅を狭くするために、シチジンデアミナーゼは、ラットのAPOBEC1のアミノ酸配列位置に基づく変異：W90Y、W90F、R126E、およびR132E、ならびに上記に対応する相同APOBECタンパク質中の変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。
【０６６５】
実施態様によっては、編集効率を低下させるために、シチジンデアミナーゼは、ラットのAPOBEC1のアミノ酸配列位置に基づく変異：W90A、R118A、およびR132E、ならびに上記に対応する相同APOBECタンパク質中の変異のうちの１つ以上の変異を含んでもよい。特定の実施態様では、非特異的標的効果を低減するために、効力が低下したシチジンデアミナーゼ酵素を使用することが興味深い場合がある。
【０６６６】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、野生型ラットのAPOBEC1 (rAPOBEC1)、またはその触媒ドメインである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、rAPOBEC1の編集効率および／または基質編集優先度が特定の必要性に応じて変更されるように、rAPOBEC1配列中に１つ以上の変異を含む。
【０６６７】
rAPOBEC1:
MSSETGPVAVDPTLRRRIEPHEFEVFFDPRELRKETCLLYEINWGGRHSIWRHTSQNTNKHVEVNFIEKFTTERYFCPNTRCSITWFLSWSPCGECSRAITEFLSRYPHVTLFIYIARLYHHADPRNRQGLRDLISSGVTIQIMTEQESGYCWRNFVNYSPSNEAHWPRYPHLWVRLYVLELYCIILGLPPCLNILRRKQPQLTFFTIALQSCHYQRLPPHILWATGLK（配列番号433）
【０６６８】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、野生型ヒトAPOBEC1 (hAPOBEC1)またはその触媒ドメインである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、hAPOBEC1の編集効率および／または基質編集優先度が特定の必要性に応じて変更されるように、hAPOBEC1配列中に１つ以上の変異を含む。
【０６６９】
APOBEC1:
MTSEKGPSTGDPTLRRRIEPWEFDVFYDPRELRKEACLLYEIKWGMSRKIWRSSGKNTTNHVEVNFIKKFTSERDFHPSMSCSITWFLSWSPCWECSQAIREFLSRHPGVTLVIYVARLFWHMDQQNRQGLRDLVNSGVTIQIMRASEYYHCWRNFVNYPPGDEAHWPQYPPLWMMLYALELHCIILSLPPCLKISRRWQNHLTFFRLHLQNCHYQTIPPHILLATGLIHPSVAWR（配列番号434）
【０６７０】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、野生型ヒトAPOBEC3G (hAPOBEC3G)またはその触媒ドメインである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、hAPOBEC3Gの編集効率および／または基質編集優先度が特定の必要性に応じて変更されるように、hAPOBEC3G配列中に１つ以上の変異を含む。
【０６７１】
hAPOBEC3G:
MELKYHPEMRFFHWFSKWRKLHRDQEYEVTWYISWSPCTKCTRDMATFLAEDPKVTLTIFVARLYYFWDPDYQEALRSLCQKRDGPRATMKIMNYDEFQHCWSKFVYSQRELFEPWNNLPKYYILLHIMLGEILRHSMDPPTFTFNFNNEPWVRGRHETYLCYEVERMHNDTWVLLNQRRGFLCNQAPHKHGFLEGRHAELCFLDVIPFWKLDLDQDYRVTCFTSWSPCFSCAQEMAKFISKNKHVSLCIFTARIYDDQGRCQEGLRTLAEAGAKISIMTYSEFKHCWDTFVDHQGCPFQPWDGLDEHSQDLSGRLRAILQNQEN（配列番号435）
【０６７２】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、野生型ヤツメウナギCDA1 (pmCDAl)またはその触媒ドメインである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、pmCDAlの編集効率および／または基質編集優先度が特定の必要性に応じて変更されるように、pmCDAl配列中に１つ以上の変異を含む。
【０６７３】
pmCDAl:
MTDAEYVRIHEKLDIYTFKKQFFNNKKSVSHRCYVLFELKRRGERRACFWGYAVNKPQSGTERGIHAEIFSIRKVEEYLRDNPGQFTINWYSSWSPCADCAEKILEWYNQELRGNGHTLKIWACKLYYEKNARNQIGLWNLRDNGVGLNVMVSEHYQCCRKIFIQSSHNQLNENRWLEKTLKRAEKRRSELSIMIQVKILHTTKSPAV（配列番号436）
【０６７４】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、野生型ヒトAID (hAID)またはその触媒ドメインである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、pmCDAlの編集効率および／または基質編集優先度が特定の必要性に応じて変更されるように、pmCDAl配列中に１つ以上の変異を含む。
【０６７５】
hAID:
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPYLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILLPLYEVDDLRDAFRTLGLLD（配列番号437）
【０６７６】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、hAIDの切り詰め形態 (hAID-DC)またはその触媒ドメインである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、hAID-DCの編集効率および／または基質編集優先度が特定の必要性に応じて変更されるように、hAID-DC配列中に１つ以上の変異を含む。
【０６７７】
hAID-DC:
MDSLLMNRRKFLYQFKNVRWAKGRRETYLCYVVKRRDSATSFSLDFGYLRNKNGCHVELLFLRYISDWDLDPGRCYRVTWFTSWSPCYDCARHVADFLRGNPNLSLRIFTARLYFCEDRKAEPEGLRRLHRAGVQIAIMTFKDYFYCWNTFVENHERTFKAWEGLHENSVRLSRQLRRILL（配列番号438）
【０６７８】
シチジンデアミナーゼのさらなる実施態様は、名称が「核酸塩基エディターおよびその使用」である国際特許出願WO2017/070632号に開示されていて、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。
【０６７９】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、脱アミノ化編集を受け易いヌクレオチドを封入する効率的な脱アミノ化ウィンドウを有する。従って実施態様によっては、「編集ウィンドウ幅」は、シチジンデアミナーゼの編集効率がその標的部位の最大値の半分を超える、所定の標的部位でのヌクレオチド位置の数を指している。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、約1〜約6個のヌクレオチドの範囲の編集ウィンドウ幅を有する。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼの編集ウィンドウ幅は、1、2、3、4、5、または6個のヌクレオチドである。
【０６８０】
理論に拘束されることを意図しないが、実施態様によっては、リンカー配列の長さが編集ウィンドウ幅に影響を及ぼすことが考えられる。実施態様によっては、編集ウィンドウ幅は、リンカーの長さが伸長する（例えば、約3〜約21個のアミノ酸）につれて増加する（例えば、約3〜約6個のヌクレオチド）。非限定的な例では、16個の残基のリンカーは、約5個のヌクレオチドの効率的な脱アミノ化ウィンドウを提供する。実施態様によっては、ガイドRNAの長さは、編集ウィンドウの幅に影響を及ぼす。実施態様によっては、ガイドRNAを短縮すると、シチジンデアミナーゼの効率的な脱アミノ化ウィンドウは狭くなる。
【０６８１】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼへの変異は、編集ウィンドウ幅に影響を及ぼす。実施態様によっては、CD機能化CRISPRシステムのシチジンデアミナーゼ成分は、シチジンデアミナーゼの触媒効率を低下させる１つ以上の変異を含み、その結果、デアミナーゼでは、DNA結合事象ごとの複数のシチジンの脱アミノ化を防ぐ。実施態様によっては、APOBEC1の残基90 (W90)でのトリプトファンまたは相同配列中の対応するトリプトファン残基は変異している。実施態様によっては、触媒的に不活性なCas13は、W90YまたはW90F変異を含むAPOBEC1変異体に融合または連結される。実施態様によっては、APOBEC3Gの残基285 (W285)のトリプトファン、または相同配列中の対応するトリプトファン残基が変異している。実施態様によっては、触媒的に不活性なCas13は、W285YまたはW285F変異を含むAPOBEC3G変異体に融合または連結される。
【０６８２】
実施態様によっては、CD機能化CRISPRシステムのシチジンデアミナーゼ成分は、デアミナーゼ活性部位へのシチジンの非最適な提供に対する耐性を低下させる１つ以上の変異を含む。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、デアミナーゼ活性部位の基質結合活性を変化させる１つ以上の変異を含む。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、デアミナーゼ活性部位によって認識され、かつ結合されるDNAの立体構造を変化させる１つ以上の変異を含む。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、デアミナーゼ活性部位への基質の到達性を変化させる１つ以上の変異を含む。実施態様によっては、APOBEC1の残基126 (R126)のアルギニンまたは相同配列中の対応するアルギニン残基が変異している。実施態様によっては、触媒的に不活性なCas13は、R126AまたはR126E変異を含むAPOBEC1に融合または連結される。実施態様によっては、APOBEC3Gの残基320 (R320)のトリプトファン、または相同配列中の対応するアルギニン残基が変異している。実施態様によっては、触媒的に不活性なCas13は、R320AまたはR320E変異を含むAPOBEC3G変異体に融合または連結される。実施態様によっては、APOBEC1の残基132 (R132)のアルギニンまたは相同配列中の対応するアルギニン残基は変異している。実施態様によっては、触媒的に不活性なCas13は、R132E変異を含むAPOBEC1変異体に融合または連結される。
【０６８３】
実施態様によっては、CD機能化CRISPRシステムのAPOBEC1ドメインは、W90Y、W90F、R126A、R126E、およびR132Eから選択される１つ、２つ、または３つの変異を含む。実施態様によっては、APOBEC1ドメインは、W90YおよびR126Eの２つの変異を含む。実施態様によっては、APOBEC1ドメインは、W90YおよびR132Eの２つの変異を含む。実施態様によっては、APOBEC1ドメインは、R126EおよびR132Eの２つの変異を含む。実施態様によっては、APOBEC1ドメインは、W90Y、R126E、およびR132Eの３つの変異を含む。
【０６８４】
実施態様によっては、本明細書に開示のシチジンデアミナーゼ中の１つ以上の変異は、編集ウィンドウ幅を約２個のヌクレオチドに減少させる。実施態様によっては、本明細書に開示のシチジンデアミナーゼ中の１つ以上の変異は、編集ウィンドウ幅を約１個のヌクレオチドに減少させる。実施態様によっては、本明細書に開示のシチジンデアミナーゼ中の１つ以上の変異は、酵素の編集効率に最小限または中程度の影響を及ぼすだけの範囲内で、編集ウィンドウ幅を減少させる。実施態様によっては、本明細書に開示のシチジンデアミナーゼ中の１つ以上の変異は、酵素の編集効率を低下させることなく、編集ウィンドウ幅を減少させる。実施態様によっては、本明細書に開示のシチジンデアミナーゼ中の１つ以上の変異は、別の方法でシチジンデアミナーゼによって類似の効率で編集される隣接するシチジンヌクレオチドとの識別を可能とする。
【０６８５】
実施態様によっては、シチジンデアミナーゼタンパク質はさらに、二本鎖核酸基質を認識して結合するための１つ以上の二本鎖RNA (dsRNA)結合モチーフ (dsRBM）またはドメイン (dsRBD)を含むか、あるいはそれらに結合される。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼと基質との間の相互作用は、CRISPR/CASタンパク質因子を含む１つ以上のさらなるタンパク質因子によって媒介される。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼと基質との間の相互作用は、ガイドRNAを含む１つ以上の核酸成分によってさらに媒介される。
【０６８６】
本発明によれば、シチジンデアミナーゼの基質は、関心のあるシトシンを含むRNA二本鎖のDNA一本鎖バブルであり、ガイド分子がそのDNA標的に結合するとシチジンデアミナーゼに接近でき、次にCRISPR-Cas酵素とのCRISPR-Cas複合体を形成し、それによりシトシンデアミナーゼは、CRISPR-Cas複合体の１つ以上の成分、すなわちCRISPR-Cas酵素および／またはガイド分子に融合されるか、あるいは結合が可能になる。ガイド分子およびCRISPR-Cas酵素の特定の特性を以下に詳述する。
塩基編集ガイド分子設計の考察
【０６８７】
実施態様によっては、ガイド配列は、長さが10〜50ヌクレオチド長のRNA配列であるが、より具体的には、約20〜30ヌクレオチド長、好ましくは約20ヌクレオチド長、23〜25ヌクレオチド長、または24ヌクレオチド長のRNA配列である。塩基編集の実施態様では、ガイド配列は、脱アミノ化されるアデノシンを含む標的配列にそのガイド配列がハイブリダイズすることが確実になるように選択される。これについては、以下で詳述する。選択には、脱アミノ化の効力および特異性を高めるさらなる工程を含んでもよい。
【０６８８】
実施態様によっては、ガイド配列は、約20ヌクレオチド長〜約30ヌクレオチド長であり、標的アデノシン部位にdA−C不一致を有することを除いて、標的DNA鎖にハイブリダイズしてほぼ完全に一致する二重鎖を形成する。特に実施態様によっては、dA−C不一致は、標的配列の中心（すなわち、ガイド配列の標的配列へのハイブリダイズ時の二本鎖の中心）に近接して位置し、それにより、アデノシンデアミナーゼを狭い編集ウィンドウ（例えば約4塩基対の幅）に制限する。実施態様によっては、標的配列は、脱アミノ化される２つ以上の標的アデノシンを含んでもよい。さらなる実施態様では、標的配列は、標的アデノシン部位の3’に１つ以上のdA−C不一致をさらに含んでもよい。実施態様によっては、標的配列中の意図しないアデニン部位での標的外編集を回避するために、ガイド配列は、dA−G不一致を導入するために、前記意図しないアデニンに対応する位置に非対合のグアニンを含むように設計できるが、このガイド配列は、ADAR1およびADAR2などの特定のアデノシンデアミナーゼには触媒として好ましくない。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるWong et al., RNA 7:846-858 (2001)を参照。
【０６８９】
実施態様によっては、標準的な長さ（例えば、AacC2c1については約20ヌクレオチド長）を有するCas12bガイド配列を使用して、標的DNAと共にヘテロ二本鎖を形成する。実施態様によっては、標準的な長さより長い（例えば、AacC2c1については20ヌクレオチド長を超える）Cas12bガイド分子を使用して、Cas12bガイドRNA−標的DNA複合体の外側を含む標的DNAと共にヘテロ二本鎖を形成する。このガイド分子は、ヌクレオチドの所定の伸長範囲内の複数のアデニンの脱アミノ化を目的とする場合に対象としてもよい。別の実施態様では、標準的なガイド配列の長さの制限を維持することを対象とする。実施態様によっては、ガイド配列は、Cas12bガイドの標準的な長さの外側にdA−C不一致を導入するように設計されるが、このガイド配列は、Cas12bによる立体障害を低減させ、アデノシンデアミナーゼとdA−C不一致との間の接触の頻度を増大させることができる。
【０６９０】
いくつかの塩基編集の実施態様では、不一致の核酸塩基（例えばシチジン）の位置は、DNA標的上のPAMが在ると思われる場所から計算される。実施態様によっては、不一致の核酸塩基は、PAMから12〜21ヌクレオチド長、またはPAMから13〜21ヌクレオチド長、またはPAMから14〜21ヌクレオチド長、またはPAMから14〜20ヌクレオチド長、またはPAMから15〜20ヌクレオチド長、またはPAMから16〜20ヌクレオチド長、またはPAMから14〜19ヌクレオチド長、またはPAMから15〜19ヌクレオチド長、またはPAMから16〜19ヌクレオチド長、またはPAMから17〜19ヌクレオチド長、または約PAMから20ヌクレオチド長、またはPAMから約19ヌクレオチド長、またはPAMから約18ヌクレオチド長、またはPAMから約17ヌクレオチド長、またはPAMから約16ヌクレオチド長、またはPAMから約15ヌクレオチド長、またはPAMから約14ヌクレオチド長に位置する。好ましい実施態様では、不一致の核酸塩基は、PAMから17〜19ヌクレオチド長、または18ヌクレオチド長に位置する。
【０６９１】
不一致の距離は、Cas12bスペーサーの3’末端と不一致の核酸塩基（例えばシチジン）との間の塩基の数であり、不一致塩基は、不一致の距離計算値の一部として含まれる。実施態様によっては、不一致の距離は、1〜10ヌクレオチド長、または1〜9ヌクレオチド長、または1〜8ヌクレオチド長、または2〜8ヌクレオチド長、または2〜7ヌクレオチド長、または2〜6ヌクレオチド長、または3〜8ヌクレオチド長、または3〜7ヌクレオチド長、または3〜6ヌクレオチド長、または3〜5ヌクレオチド長、または約2ヌクレオチド長、または約3ヌクレオチド長、または約4ヌクレオチド長、または約5ヌクレオチド長、または約6ヌクレオチド長、または約7ヌクレオチド長、または約8ヌクレオチド長である。好ましい実施態様では、不一致の距離は、3〜5ヌクレオチド長または4ヌクレオチド長である。
【０６９２】
実施態様によっては、本明細書に説明のCas12b−ADARシステムの編集ウィンドウは、PAMから12〜21ヌクレオチド長、またはPAMから13〜21ヌクレオチド長、またはPAMから14〜21ヌクレオチド長、またはPAMから14〜20ヌクレオチド長、またはPAMから15〜20ヌクレオチド長、またはPAMから16〜20ヌクレオチド長、またはPAMから14〜19ヌクレオチド長、またはPAMから15〜19ヌクレオチド長、またはPAMから16〜19ヌクレオチド長、またはPAMから17〜19ヌクレオチド長、またはPAMから約20ヌクレオチド長、またはPAMから約19ヌクレオチド長、またはPAMから約18ヌクレオチド長、またはPAMから約17ヌクレオチド長、またはPAMから約16ヌクレオチド長、または約PAMから15ヌクレオチド長、またはPAMから約14ヌクレオチド長である。実施態様によっては、本明細書に説明のCas12b−ADARシステムの編集ウィンドウは、Cas12bスペーサーの3’末端から1〜10ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から1〜9ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から1〜8ヌクレオチド長、またはC2c1スペーサーの3’末端から2〜8ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から2〜7ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から2〜6ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から3〜8ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から3〜7ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から3〜6ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から3〜5ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から約2ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から約3ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から約4ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’端から約5ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’端から約6ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’端から約7ヌクレオチド長、またはCas12bスペーサーの3’末端から約8ヌクレオチド長である。
ベクター
【０６９３】
一般にかつ本明細書全体を通して、用語「ベクター」は、それが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。このベクターは、プラスミド、ファージ、またはコスミドなどの複製子であり、その中に、挿入された区画の複製をもたらすように別のDNA区画が挿入されてもよい。一般にベクターは、適切な制御エレメントに会合される場合に複製できる。
【０６９４】
実施態様によっては、本開示は、CRISPR-Casシステムの１つ以上の構成要素をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターシステムを提供する。実施態様によっては、ベクターシステムは、１つ以上のベクターを含むCas12bベクターシステムであり、このベクターは、表１または表２からのCas12bエフェクタータンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第１の調節エレメント、ならびにi）a）crRNAをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第２の調節エレメントおよびb）tracr RNAをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第３の調節エレメント、あるいはii）crRNAおよびtracr RNAをコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第２の調節エレメントを含む。場合によっては、ベクターシステムは１本のベクターを含む。あるいは、ベクターシステムは複数のベクターを含む。ベクターはウイルスベクターであってもよい。
【０６９５】
ベクターには、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子、１つ以上の自由端を含むかまたは自由端を含まない（例えば環状の）核酸分子、DNA、RNA、またはその両方を含む核酸分子、および当技術分野で既知の他の種類のポリヌクレオチドが含まれる。１種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローン技術などによって追加のDNA区画を挿入できる環状の二本鎖DNAループを指している。別種のベクターはウイルスベクターであり、ここでウイルス由来のDNA配列またはRNA配列は、（レトロウイルス、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠陥アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルスなどの）ウイルス中に封入するためにベクター内に存在する。ウイルスベクターには、宿主細胞への遺伝子導入のためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含まれる。特定のベクター（例えば、細菌の複製起源を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）は、それらが導入される宿主細胞中で自律的な複製を可能とする。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムと共に複製される。さらに、特定のベクターは、それらが操作可能に連結されている遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。真核生物細胞での発現のための、かつ発現をもたらすベクターは、本明細書では「真核生物発現ベクター」と呼んでもよい。組換えDNA技術で有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。
【０６９６】
組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適する形態で本発明の核酸を含んでもよく、このことは、組換え発現ベクターが、発現に使用される宿主細胞の数に基づいて選択されてもよく、かつ発現される核酸配列に操作可能に連結されている１つ以上の調節エレメントを含むことを意味している。組換え発現ベクター内で、「操作可能に連結される」とは、関心のあるヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方法で（例えば、in vitro転写／翻訳システムで、あるいはベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞内で）調節エレメントに連結する意味を意図している。有効なベクターとして、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれ、そのベクター種はまた、特定の細胞型を標的とするために選択されてもよい。
【０６９７】
組換えおよびクローンの方法に関して、米国特許公開2004-0171156 A1号として2004年9月2日付けで公開された米国特許出願10/815,730号が述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６９８】
「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位 (IRES)、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリ−U配列などの転写終結シグナル）を含むことを意図している。その調節エレメントは、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY（発現技術：酵素学での方法）185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に説明されている。調節エレメントには、多種の宿主細胞でヌクレオチド配列の直接構成的発現を誘導するエレメント、および特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列（例えば、組織特異的調節配列）の発現を誘導するエレメントが含まれる。組織特異的プロモーターは、主に、筋肉、神経細胞、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えばリンパ球）などの所望の関心のある組織での発現を誘導できる。調節エレメントはまた、細胞周期依存性または発達段階依存性の手法などの時間依存性の手法で発現を誘導でき、このエレメントは組織に特異的または細胞型に特異的であってもよく、あるいはそうでなくてもよい。実施態様によっては、ベクターは、1個以上のpol IIIプロモーター（例えば、1、2、3、4、5個、またはそれ以上のpol IIIプロモーター）、1個以上のpol IIプロモーター（例えば、1、2、3、4、5個、またはそれ以上のpol IIプロモーター）、1個以上のpol Iプロモーター（例えば、1、2、3、4、5個、またはそれ以上のpol Iプロモーター）、またはそれらの組合せを含む。pol IIIプロモーターの例として、限定はされないが、U6およびH1プロモーターが挙げられる。pol IIプロモーターの例として、限定はされないが、レトロウイルス性ラウス肉腫ウイルス (RSV) LTRプロモーター（場合によってはRSVエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス (CMV)プロモーター（場合によってはCMVエンハンサーを含む）（例えば、Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)を参照）、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ (PGK)プロモーター、およびEF1αプロモーターが挙げられる。用語「調節エレメント」には、WPRE、CMVエンハンサー、HTLV-IのLTR中のR-U5’区画（Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988）、SV40エンハンサー、およびウサギβ-グロビンのエクソン2と3の間のイントロン配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981）などのエンハンサーエレメントも含まれる。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現水準などの要因に依存してもよいことは当業者なら分かっている。ベクターは、宿主細胞中に導入されて、それにより、本明細書に説明の核酸によってコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む転写産物、タンパク質、またはペプチド（例えば、クラスター化され規則的に間隔をおいた短鎖回文配列反復(CRISPR)転写産物、タンパク質、酵素、それらの変異型、それらの融合タンパク質など）を産出できる。調節配列に関しては、米国特許出願10/491,026号が述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。プロモーターに関しては、国際特許出願WO2011/028929号および米国特許出願12/511,940号が述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０６９９】
有効なベクターには、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれ、そのベクター種はまた、特定の細胞型を標的とするために選択されてもよい。
【０７００】
特定の実施態様では、ガイドRNAおよび（任意に改変または変異された）CRISPR酵素（例えばC2c1）のためのバイシストロン性ベクターが使用される。ガイドRNAおよび（任意に改変または変異された）CRISPR酵素のためのバイシストロン性発現ベクターが好ましい。この実施態様では、一般にかつ特に（任意に改変または変異された）CRISPR酵素は、好ましくはCBhプロモーターによって駆動される。RNAは、好ましくは、U6プロモーターなどのPol IIIプロモーターによって駆動されてもよい。理想的には、この２つが組み合わされる。
【０７０１】
原核細胞または真核細胞でのCRISPR転写産物（例えば、核酸転写産物、タンパク質、または酵素）の発現のためのベクターを設計できる。例えば、CRISPR転写産物は、大腸菌、（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞などの細菌細胞中で発現させることができる。適切な宿主細胞については、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY （遺伝子発現技術：酵素学での方法）185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)にさらに説明される。あるいは、組換え発現ベクターを、例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを用いて、in vitroで転写かつ翻訳することができる。
【０７０２】
ベクターは、原核生物細胞または原核生物細胞中に導入され、かつ増殖されてもよい。実施態様によっては、原核生物は、真核細胞中に導入されるベクターの複製物を増幅するために用いられ、または（例えば、ウイルスベクターの封入システムの一部としてのプラスミドを増幅して）真核細胞中に導入されるベクターの産生での中間ベクターとして用いられる。実施態様によっては、原核生物を用いてベクターの複製物を増幅し、例えば宿主細胞または宿主生物への送達のための１つ以上のタンパク質の供給源を提供して、１種以上の核酸を発現する。原核生物でのタンパク質の発現は、殆どの場合に、融合タンパク質または非融合タンパク質のいずれかの発現を誘導する構成的なまたは誘導性のプロモーターを含むベクターを用いて大腸菌内で行われる。融合ベクターは、組換えタンパク質のアミノ末端など、その内部にコードされているタンパク質に複数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、次の１つ以上の目的に役立てることができる：（i）組換えタンパク質の発現を増強すること；（ii）組換えタンパク質の溶解度を増大すること；および（iii）親和性精製でのリガンドとして作用させて組換えタンパク質の精製を支援すること。多くの場合に、融合発現ベクターでは、タンパク質分解性の切断部位が融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入されて、融合タンパク質の精製に続いて融合部分から組換えタンパク質を分離できるようにする。この酵素およびそれらの同族の認識配列として、第Xa因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例として、グルタチオンS転移酵素 (GST)を融合するpGEX（Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40）、pMAL（New England Biolabs, Beverly, Mass.）およびpRIT5（Pharmacia, Piscataway, N.J.）、それぞれ目的の組換えタンパク質に対するマルトースE結合タンパク質またはプロテインAが挙げられる。適切な誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例として、pTrc（Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315）およびpET 11d（Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY（発現技術：酵素学での方法）185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89）が挙げられる。実施態様によっては、ベクターは、酵母発現ベクターである。出芽酵母（Saccharomyces cerivisae）での発現のためのベクターの例として、pYepSec1（Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234）、pMFa（Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943）、pJRY88（Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123）、pYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）、およびpicZ（InVitrogen Corp, San Diego, Calif.）が挙げられる。実施態様によっては、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞でのタンパク質発現を駆動する。培養昆虫細胞（例えばSF9細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、pAc系列（Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165）およびpVL系列（Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39）が含まれる。
【０７０３】
実施態様によっては、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞での１つ以上の配列の発現を駆動することができる。哺乳動物発現ベクターの例として、pCDM8（Seed, 1987. Nature 329: 840）およびpMT2PC（Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195）が挙げられる。哺乳類細胞で使用される場合に、発現ベクターの制御機能は、通常１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス40、および本明細書に開示され当技術分野で既知のその他のウイルスに由来する。原核細胞と真核細胞の両方に適する他の発現システムについては、例えば、Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL（分子クローニング：実験室マニュアル）. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989の第16章および第17章を参照。
【０７０４】
実施態様によっては、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型では優先的に核酸の発現を誘導することができる（例えば、組織特異的な調節エレメントを用いて核酸を発現する）。組織特異的な調節エレメントは当技術分野で知られている。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例として、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277）、リンパ系特異的プロモーター（Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275）、特にT細胞受容体（Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733）および免疫グロブリン（Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748）のプロモーター、神経細胞特異的プロモーター（例えば神経細繊維プロモーター；Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916）、および乳腺特異的プロモーター（例えば乳清プロモーター；米国特許4,873,316号および欧州出願特許264,166号）が挙げられる。発達調節プロモーター、例えば、マウスhoxプロモーター（Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379）およびα-フェトプロテインプロモーター（Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546）もまた包含される。これらの原核生物および真核生物のベクターに関して、米国特許6,750,059号が述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の他の実施態様は、ウイルスベクターの使用に関連してもよく、これに関しては、米国特許出願13/092,085号に述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。組織特異的調節エレメントは当技術分野で知られており、これに関しては米国特許7,776,321号に述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施態様によっては、調節エレメントは、CRISPRシステムの１つ以上の要素の発現を駆動するように、CRISPRシステムの１つ以上の要素に操作可能に連結されている。
【０７０５】
実施態様によっては、核酸標的化システムの１つ以上の要素の発現を駆動する１つ以上のベクターは、核酸標的化システムの要素の発現が１つ以上の標的部位での核酸標的化複合体の形成を誘導するように、宿主細胞中に導入される。例えば、核酸標的化エフェクター酵素および核酸標的化ガイドRNAおよび／またはtracrは、それぞれ、別のベクターの別の調節エレメントに操作可能に連結できる。核酸標的化システムのRNAは、遺伝子導入核酸標的化エフェクタータンパク質の動物または哺乳動物、例えば、構成的にまたは誘導的にまたは条件付きで核酸標的化エフェクタータンパク質を発現する動物または哺乳動物、あるいは、他の方法で核酸標的化エフェクタータンパク質を発現している動物または哺乳動物、または核酸標的化エフェクタータンパク質を含む細胞を有する動物または哺乳動物に、例えば核酸標的化エフェクタータンパク質をコードする、かつそのタンパク質をin vivoで発現する１つ以上のベクターのその動物への事前投与によって送達することができる。あるいは、同一のまたは異なる調節エレメントから発現される２つ以上の要素を、第１のベクターに含まれない核酸標的化システムの任意の構成要素を提供する１つ以上の追加のベクターとともに単一のベクター内に組み込んでもよい。単一のベクター内に組み込まれる核酸標的化システム要素は、例えば、第２の要素に対する（その「上流」の）5’、または第２の要素に対する（その「下流」の）3’に配置される１つの要素のように、任意の適切な方向に配置されてもよい。１つの要素のコード配列は、第２の要素のコード配列の同一または反対の鎖上に位置し、同一または反対の方向に方向付けされてもよい。実施態様によっては、単一のプロモーターは、（例えば、それぞれが異なるイントロン内、２つ以上が少なくとも１つのイントロン内、または全てが１つのイントロン内にある）１つ以上のイントロン配列内に埋め込まれた、核酸標的化エフェクタータンパク質および核酸標的化ガイドRNAをコードする転写産物の発現を駆動する。実施態様によっては、核酸標的化エフェクタータンパク質および核酸標的化ガイドRNAは、同一プロモーターに操作可能に連結され、かつそれから発現されてもよい。核酸標的化システムの１つ以上の要素を発現させるための送達媒体、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤、およびそれらの成分は、国際特許出願WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)などの前述の文献内で使用されている通りである。実施態様によっては、ベクターは、（「クローン部位」とも呼ばれる）制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位を含む。実施態様によっては、１つ以上の挿入部位（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列要素の上流および／または下流に位置する。複数の異なるガイド配列が使用される場合に、単一の発現構築物を用いて、細胞内の複数の異なる対応標的配列に核酸標的化活性を標的化することができる。例えば、単一のベクターは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、またはそれ以上のガイド配列を含んでもよい。実施態様によっては、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のそのガイド配列を含有するベクターが提供され��もよく、かつ場合によっては細胞に送達されてもよい。実施態様によっては、ベクターは、核酸標的化エフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列に操作可能に連結された調節エレメントを含む。核酸標的化エフェクタータンパク質または１つ以上の核酸標的化ガイドRNAは、別々に送達することができ、好ましくは、これらの少なくとも１つは、粒子複合体を介して送達される。核酸標的化エフェクタータンパク質mRNAは、核酸標的化ガイドRNAに先行して送達されて、核酸標的化エフェクタータンパク質が発現されるための時間を付与できる。核酸標的化エフェクタータンパク質mRNAは、核酸標的化ガイドRNAの投与の1〜12時間（好ましくは約2〜6時間）前に投与されてもよい。あるいは、核酸標的化エフェクタータンパク質mRNAおよび核酸標的化ガイドRNAは、同時に投与されてもよい。好ましくは、ガイドRNAの第２の促進用量は、核酸標的化エフェクタータンパク質mRNAおよびガイドRNAの初期投与の1〜12時間（好ましくは約2〜6時間）後に投与されてもよい。核酸標的エフェクタータンパク質mRNAおよび／またはガイドRNAの追加投与は、最も効率的な水準のゲノム改変を達成するために有用である可能性がある。
【０７０６】
実施態様によっては、ベクターは、１つ以上の核局在化配列 (NLS)、例えば約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のNLSを含むC2c1エフェクタータンパク質をコードする。より具体的には、ベクターは、C2c1エフェクタータンパク質に天然に存在しない１つ以上のNLSを含む。最も具体的には、NLSはC2c1エフェクタータンパク質配列のベクターの5’および／または3’に存在する。実施態様によっては、RNA標的化エフェクタータンパク質は、アミノ末端またはその近傍に約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のNLS、カルボキシ末端またはその近傍に約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のNLS、あるいはこれらの組合せ（例えば、アミノ末端に0または少なくとも1つ以上のNLS、およびカルボキシ末端に0または１つ以上のNLS）を含む。複数のNLSが存在する場合に、それぞれが他とは独立して選択されてもよく、その結果、単一のNLSが複数の複製物中に存在してもよく、かつ／あるいは１つ以上の複製物中に存在する１つ以上の他のNLSとの組合せで存在してもよい。実施態様によっては、NLSの最も近いアミノ酸がN末端またはC末端からのポリペプチド鎖に沿って約1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、40、50、またはそれ以上のアミノ酸以内にある場合に、NLSは、N末端またはC末端の近傍にあるものと見做される。NLSの非限定的な例として、以下に由来するNLS配列が挙げられる：アミノ酸配列PKKKRKV（配列番号462）を有するSV40ウイルスの大規模T抗原のNLS；ヌクレオプラスミン由来のNLS（例えば、配列KRPAATKKAGQAKKKK（配列番号463）を有するヌクレオプラスミン二連NLS）；アミノ酸配列PAAKRVKLD（配列番号464）またはRQRRNELKRSP（配列番号465）を有するc-myc NLS；配列NQSSNFGPMKGGNFGGRSSGPYGGGGQYFAKPRNQGGY（配列番号466）を有するhRNPA1 M9 NLS；インポーチンαからのIBBドメインの配列RMRIZFKNKGKDTAELRRRRVEVSVELRKAKKDEQILKRRNV（配列番号467）；筋腫Tタンパク質の配列VSRKRPRP（配列番号468）およびPPKKARED（配列番号469）；ヒトp53の配列PQPKKKPL（配列番号470）；マウスc-abl IVの配列SALIKKKKKMAP（配列番号471）；インフルエンザウイルスNS1の配列DRLRR（配列番号472）およびPKQKKRK（配列番号473）；肝炎ウイルスδ抗原の配列RKLKKKIKKL（配列番号474）；マウスMx1タンパク質の配列REKKKFLKRR（配列番号475）；ヒトポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼの配列KRKGDEVDGVDEVAKKKSKK（配列番号476）；およびステロイドホルモン受容体（ヒト）糖質コルチコイドの配列RKCLQAGMNLEARKTKK（配列番号477）。一般に、１つ以上のNLSは、真核細胞の核内で検出可能な量のDNA／RNA標的化Casタンパク質の蓄積を促進するのに十分な強度を有する。一般に、核局在化活性の強度は、核酸標的化エフェクタータンパク質中のNLSの数、使用される特定のNLS、またはこれらの因子の組合せに由来する可能性がある。核内での蓄積の検出は、任意の適切な技術によって実施できる。例えば、検出可能マーカーは、核の位置を検出する手段（例えば、DAPIなどの核に特異的な染色）との組合せなどで細胞内の位置が視覚化できるように、核酸標的化タンパク質に融合されてもよい。細胞核はまた、細胞から単離されてもよく、その内容物は、その後に、免疫組織化学、ウエスタンブロット、または酵素活性測定などのタンパク質を検出するための任意の適切なプロセスによって分析されてもよい。核内の蓄積はまた、核酸標的化Casタ��パク質または核酸標的化複合体に曝露されていない対照、あるいは１つ以上のNLSを欠く核酸標的化Casタンパク質に曝露された対照と比較して、核酸標的化複合体の形成効果の測定（例えば、標的配列でのDNAまたはRNAの切断あるいは変異の測定、またはDNAまたはRNA標的化複合体形成および／またはDNAまたはRNA標的化Casタンパク質活性によって影響を受ける改変された遺伝子発現活性の測定）などによって間接的に決定されてもよい。本明細書に説明のC2c1エフェクタータンパク質複合体およびシステムの好ましい実施態様では、コドン最適化C2c1エフェクタータンパク質は、タンパク質のC末端に付着したNLSを含む。特定の実施態様では、その他の局在化タグが、ミトコンドリア、プラスチド、葉緑体、小胞、ゴルジ、（核または細胞）膜、リボソーム、核小体、ER、細胞骨格、空胞、中心体、ヌクレオソーム、顆粒、中心粒などの、例えば細胞小器官の細胞内の特定部位にCasを局在化するために、限定はされないが、Casタンパク質に融合されてもよい。
【０７０７】
本発明はまた、非天然起源または遺伝子操作された組成物、または前記組成物の成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチド、または治療法での使用のために前記組成物の成分をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを含むベクターシステムを提供する。この治療法は、遺伝子またはゲノム編集、または遺伝子治療を含んでもよい。
【０７０８】
実施態様によっては、治療法は、標的生物の集団での治療または療法に基づいて設計されたガイド配列を含むCRISPR−Casシステムを含む。実施態様によっては、標的生物集団は、少なくとも1000個体、例えば少なくとも5000個体、例えば少なくとも10000個体、例えば少なくとも50000個体を含む。実施態様によっては、集団全体にわたって最小の配列変異を有する標的部位は、集団の少なくとも99%、好ましくは少なくとも99.9%、より好ましくは少なくとも99.99%が配列変異を含まないことを特徴としている。
【０７０９】
本明細書で使用される用語「ハプロタイプ（半数体遺伝子型）」は、単一の親から共に遺伝する生物中での遺伝子群である。本明細書で使用される「ハプロタイプ頻度推定」（「フェージング」としても知られる）は、遺伝子型のデータからのハプロタイプの統計的推定のプロセスを意味する。Toshikazu et al. (Am J Hum Genet. 2003 Feb; 72(2): 384-398)は、本明細書に開示される本発明で使用されてもよいハプロタイプ頻度の推定のための方法を説明している。
【０７１０】
本明細書に説明の核酸標的化システム、ベクターシステム、ベクター、および組成物は、タンパク質、核酸切断、核酸編集、核酸組換え、標的核酸の輸送、標的核酸の追跡、標的核酸の単離、標的核酸の視覚化などの遺伝子産物の合成を変更または改変する様々な核酸標的化用途に使用できる。
【０７１１】
一般にかつ本明細書全体を通して、用語「ベクター」は、そのベクターが連結されている別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターには、限定はされないが、一本鎖、二本鎖、または部分的に二本鎖である核酸分子、１つ以上の自由端を含む、自由端を含まない（例えば環状の）核酸分子、DNA、RNA、またはその両方を含む核酸分子、および当技術分野で知られている他種のポリヌクレオチドが含まれる。１種のベクターは「プラスミド」であり、これは、標準的な分子クローン技術などによって、追加のDNA区画を挿入できる環状の二本鎖DNAループを指す。別種のベクターはウイルスベクターであり、ウイルス由来のDNAまたはRNA配列が、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠陥レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠陥アデノウイルス、およびアデノ随伴ウイルス）に封入するためにベクター中に存在する。ウイルスベクターにはまた、宿主細胞中への遺伝子導入のためにウイルスが運ぶポリヌクレオチドも含まれる。特定のベクターは、それらが導入された宿主細胞中で自律的に複製できる（例えば、細菌の複製起点を有する細菌ベクターおよびエピソーム哺乳動物ベクター）。別のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞への導入時に宿主細胞のゲノム中に組み込まれ、それにより、宿主ゲノムとともに複製される。さらに、特定のベクターは、それらが機能的に連結されている遺伝子の発現を誘導できる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。真核細胞中での発現のためのベクターおよび発現をもたらすベクターは、本明細書では「真核生物発現ベクター」と呼んでもよい。組換えDNA技術で有用な一般的な発現ベクターは、多くの場合、プラスミド形態である。
【０７１２】
特定の実施態様では、ベクターシステムは、逆の順序でプロモーターガイド発現カセットを含む。
【０７１３】
組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適する形態の本発明の核酸を含むことができ、このことは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に操作可能に連結されている、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択され得る１つ以上の調節エレメントを含むことを意味する。
【０７１４】
有効なベクターには、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれ、この種のベクターがまた、特定の細胞種を標的とするために選ばれてもよい。
【０７１５】
実施態様によっては、核酸標的化システムの１つ以上の要素の発現を駆動する１つ以上のベクターは、核酸標的化システムの要素の発現が１つ以上の標的部位での核酸標的化複合体の形成を誘導するように、宿主細胞中に導入される。例えば、核酸標的化エフェクターモジュールおよび核酸標的化ガイドRNAは、それぞれ、別のベクター上の別の調節エレメントに操作可能に連結できる。核酸標的化システムのRNAは、遺伝子導入核酸標的化エフェクターモジュールの動物または哺乳動物、例えば、構成的にまたは誘導的にまたは条件付きで核酸標的化エフェクターモジュールを発現する動物、あるいは、他の方法で核酸標的化エフェクターモジュールを発現している動物または哺乳動物、または核酸標的化エフェクターモジュールを含む細胞を有する動物または哺乳動物に、例えば核酸標的化エフェクターモジュールをコードするかつin vivoで発現する１つ以上のベクターのその動物への事前投与によって送達することができる。あるいは、同一のまたは異なる調節エレメントから発現される２つ以上の要素を、第１のベクターに含まれない核酸標的化システムの任意の構成要素を提供する１つ以上の追加のベクターとともに単一のベクター内に組み込んでもよい。単一のベクター内に組み込まれた核酸標的化システム要素は、例えば、第２の要素に対する（その「上流」の）5’、または第２の要素に対する（その「下流」の）3’に配置された１つの要素のように、任意の適切な方向に配置されてもよい。１つの要素のコード配列は、第２の要素のコード配列の同一または反対の鎖上に位置し、同一または反対の方向に方向付けされてもよい。実施態様によっては、単一のプロモーターは、（例えば、それぞれが異なるイントロン内、２つ以上が少なくとも１つのイントロン内、または全てが１つのイントロン内にある）１つ以上のイントロン配列内に埋め込まれた、核酸標的化エフェクターモジュールおよび核酸標的化ガイドRNAをコードする転写産物の発現を駆動する。実施態様によっては、核酸標的化エフェクターモジュールおよび核酸標的化ガイドRNAは、同一のプロモーターに操作可能に連結されてもよく、かつそれから発現されてもよい。
【０７１６】
本発明はまた、複数の核酸成分を送達するための方法を包含し、それぞれの核酸成分は、異なる関心のある標的遺伝子座に特異的であり、それにより、複数の関心のある標的遺伝子座を改変する。複合体の核酸成分は、１つ以上のタンパク質結合RNAアプタマーを含んでもよい。１つ以上のアプタマーは、バクテリオファージ外皮タンパク質に結合できる可能性がある。バクテリオファージ外皮タンパク質は、Qβ、F2、GA、fr、JP501、MS2、M12、R17、BZ13、JP34、JP500、KU1、M11、MX1、TW18、VK、SP、FI、ID2、NL95、TW19、AP205、φCb5、φCb8r、φCb12r、φCb23r、7s、およびPRR1を含む群から選択してもよい。好ましい実施態様では、バクテリオファージ外皮タンパク質はMS2である。本発明はまた、30以上、40以上、または50以上のヌクレオチド長である複合体の核酸成分を提供する。
【０７１７】
一側面では、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクターシステムを提供し、１つ以上のベクターは、（a）本明細書に定義の遺伝子操作されたCRISPRタンパク質をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第１の調節エレメント、および場合によっては、（b）ガイド配列、直接反復配列を含むガイドRNAを含む１つ以上の核酸分子をコードする１つ以上のヌクレオチド配列に操作可能に連結された第２の調節エレメントを含み、場合によっては、構成要素（a）および（b）は同一または異なるベクター上に位置する。
【０７１８】
本発明はまた、遺伝子操作された非天然起源のクラスター化され規則的に間隔をおいた短鎖回文配列反復(CRISPR)−CRISPR会合（Casエフェクターモジュール）（CRISPR−Casエフェクターモジュール）ベクターシステムを提供し、このベクターシステムは、（a）本明細書の本発明の構築物のいずれかの非天然起源のCRISPR酵素をコードするヌクレオチド配列に操作可能に連結された第１の調節エレメント、および（b）ガイド配列、直接反復配列を含む１つ以上のガイドRNAをコードする１つ以上のヌクレオチド配列に操作可能に連結された第２の調節エレメントを含み、構成要素（a）および（b）は、同一または異なるベクター上に位置し、CRISPR複合体が形成される。ガイドRNAは標的ポリヌクレオチド遺伝子座を標的とし、酵素はポリヌクレオチド遺伝子座を改変して、CRISPR複合体中の酵素は、未改変酵素と比較して、１つ以上の非特異的標的遺伝子座を改変する能力が低下している、かつ／あるいは、CRISPR複合体中の酵素は、未改変の酵素と比較して１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が向上している。
【０７１９】
本明細書で使用されるCRISPR CasエフェクターモジュールまたはCRISRPエフェクターモジュールは、限定はされないがC2c1を含む。実施態様によっては、CRISPR-Casエフェクターモジュールは、遺伝子操作されていてもよい。
【０７２０】
このシステムでは、構成要素（II）は、ガイド配列、直接反復配列を含むポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された第１の調節エレメントを含んでもよく、構成要素（II）は、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された第２の調節エレメントを含んでもよい。このシステムでは、該当する場合は、ガイドRNAはキメラRNAを含んでもよい。
【０７２１】
このシステムでは、構成要素（I）は、ガイド配列および直接反復配列に操作可能に連結された第１の調節エレメントを含んでもよく、構成要素（II）は、CRISPR酵素をコードするポリヌクレオチド配列に操作可能に連結された第２の調節エレメントを含んでもよい。このシステムは、複数のガイドRNAを含んでもよく、各ガイドRNAは、多重性が存在する異なる標的を有する。構成要素（a）および（b）は同一のベクター上にあってもよい。
【０７２２】
ベクターを含む任意のこのシステムでは、１つ以上のベクターは、１つ以上のレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、または単純ヘルペスウイルスなどの１つ以上のウイルスベクターを含んでもよい。
【０７２３】
調節エレメントを含む任意のこのシステムでは、前記調節エレメントのうちの少なくとも１つは、組織特異的プロモーターを含んでもよい。組織特異的プロモーターは、哺乳動物の血液細胞中で、哺乳動物の肝細胞中で、または哺乳動物の眼の中で発現を誘導してもよい。
【０７２４】
上記の組成物またはシステムのいずれかで、直接反復配列は、１つ以上のタンパク質相互作用RNAアプタマーを含んでもよい。１つ以上のアプタマーは、四塩基ループ中に配置されてもよい。１つ以上のアプタマーは、MS2バクテリオファージ外皮タンパク質に結合できる可能性がある。
【０７２５】
上記の組成物またはシステムのいずれかで、細胞は真核細胞または原核細胞であってもよい。CRISPR複合体は細胞内で操作可能であり、それによってCRISPR複合体中の酵素は、未改変の酵素と比較して、細胞の１つ以上の非特異的標的遺伝子座を改変する能力が低下している、かつ／あるいはCRISPR複合体中の酵素は、未改変の酵素と比較して、１つ以上の標的遺伝子座を改変する能力が向上している。
【０７２６】
本発明はまた、上記の組成物のいずれかの、または上記のシステムのいずれかからのCRISPR複合体を提供する。
【０７２７】
本発明はまた、細胞内の関心のある遺伝子座を改変する方法を提供し、この方法は、その細胞を本明細書に説明の遺伝子操作されたCRISPR酵素（例えば、遺伝子操作されたCasエフェクターモジュール）もしくは組成物のいずれかと、または本明細書に説明のシステムもしくはベクターシステムのいずれかと接触させることを含み、あるいはその細胞は、細胞内に存在する本明細書に説明のCRISPR複合体のいずれかを含む。この方法では、その細胞は、原核生物または真核生物の細胞、好ましくは真核生物の細胞であってもよい。この方法では、生物はその細胞を含んでいてもよい。この方法では、生物はヒトまたはその他の動物でなくてもよい。
【０７２８】
特定の実施態様では、本発明はまた、非天然起源の遺伝子操作された組成物（例えば、AAVベクターに適合できるC2c1または任意のCasタンパク質）を提供する。参照により本明細書に組み込まれる米国特許8,697,359号の図１９Ａ、１９Ｂ、１９Ｃ、１９Ｄ、および２０Ａ〜Ｆを参照して、使用され得るその他のタンパク質の一覧および指針が提供される。
【０７２９】
この方法はどれも、ex vivoまたはin vitroであってもよい。
【０７３０】
特定の実施態様では、前記ガイドRNAまたはC2c1エフェクターモジュールのうちの少なくとも１つをコードするヌクレオチド配列は、関心のある遺伝子のプロモーターを含む調節エレメントと細胞内で操作可能に接続され、それにより、少なくとも１つのCRISPR-Casエフェクターモジュールシステム構成要素の発現は、関心のある遺伝子のプロモーターによって駆動される。「操作可能に接続される」とは、ガイドRNAおよび／またはCasエフェクターモジュールをコードするヌクレオチド配列が、本明細書の他の場所でも参照されるように、ヌクレオチド配列の発現を可能にする手法で調節エレメントに連結される意味を意図する。用語「調節エレメント」は、本明細書の他の場所でも説明されている。本発明によれば、調節エレメントは、好ましくは関心のある内因性遺伝子のプロモーターなどの関心のある遺伝子のプロモーターを含む。特定の実施態様では、プロモーターは、その内因性ゲノム位置に在る。そのような実施態様では、CRISPRおよび／またはCasエフェクターモジュールをコードする核酸は、その天然のゲノム位置で関心のある遺伝子のプロモーターの転写制御下にある。特定の他の実施態様では、プロモーターは、ベクターまたはプラスミドなどの（別の）核酸分子、または他の染色体外核酸上に提供され、すなわち、プロモーターは、その天然のゲノム位置には提供されない。特定の実施態様では、プロモーターは、非天然のゲノム位置にゲノムとして組み込まれている。
【０７３１】
本発明はまた、哺乳動物細胞での関心のあるゲノム遺伝子座の発現を変更する方法を提供し、この方法は、細胞を、本明細書に説明の遺伝子操作されたCRISPR酵素（例えば、遺伝子操作されたCasエフェクターモジュール）、組成物、システム、またはCRISPR複合体と接触させること、それによりCRISPR-Casエフェクターモジュール（ベクター）を送達しかつCRISPR-Casエフェクターモジュール複合体を形成させて標的に結合させること、およびゲノム遺伝子座の発現が変化したか、例えば、発現が増強または減弱されたか、あるいは遺伝子産物が改変されたかを判断することを含む。
【０７３２】
本発明はさらに、本明細書に説明の本発明によるCRISPR酵素の相同分子種であるCasエフェクターモジュールあるいは変異または改変されたCasエフェクターモジュールに変異を引き起こす方法を提供し、この方法は、その相同分子種がDNA、RNA、gRNAなどの核酸分子かつ／あるいは改変および／または変異のための本明細書に説明の本発明によるCRISPR酵素中の本明細書で特定されるアミノ酸に類似または対応するアミノ酸に近接しているか、または接触しているかについてアミノ酸を見極めること、ならびに改変および／または変異を含む、それらからなる、または本質的にそれらからなる相同分子種を合成または調製または発現すること、あるいは本明細書に説明のように変異させること、例えば中性のアミノ酸を例えばアラニンのような正に帯電した帯電アミノ酸に、例えば改変すること、例えば変更または変異させることを含む。そのように改変された相同分子種は、CRISPR-Casエフェクターモジュールシステムで使用でき、それを発現する核酸分子は、分子を送達するか、または本明細書で説明のCRISPR-Casエフェクターモジュールシステムの構成要素をコードするベクターシステム中で使用されてもよい。
【０７３３】
一側面では、本発明は、本明細書に説明の１つ以上の構成要素を含むキットを提供する。実施態様によっては、このキットは、ベクターシステムおよびキットを使用するための説明書を含む。実施態様によっては、このベクターシステムは、（a）直接反復配列およびDR配列の下流に１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位に操作可能に連結された第１の調節エレメントを含み、発現されると、ガイド配列は真核細胞内の標的配列へのCRISPR-Casエフェクターモジュール複合体の標的特異的結合を誘導し、CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体は、（1）標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、（2）DR配列、および（3）tracr配列と複合化したCasエフェクターモジュールを含み、このベクターシステムはかつ／あるいは（b）核局在化配列を含む前記Casエフェクターモジュールをコードする酵素コード配列に操作可能に連結された第２の調節エレメントを含み、好ましくは、これは分割Casエフェクターモジュールを含む。実施態様によっては、キットは、システムの同じまたは異なるベクターに配置された構成要素（a）および（b）を含む。実施態様によっては、構成要素（a）はさらに、第１の調節エレメントに操作可能に連結された２つ以上のガイド配列を含み、発現されると、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体の真核細胞中の異なる標的配列への配列特異的結合を誘導する。tracrは、ガイド（スペーサー）および直接反復配列と同じポリヌクレオチドに融合（またはコード）されていても、されていなくてもよい。
【０７３４】
一側面では、本発明は、真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。実施態様によっては、この方法は、CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体が標的ポリヌクレオチドに結合して前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、それにより標的ポリヌクレオチドを改変できることを含み、CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされたガイド配列と複合化されたCasエフェクターモジュールを含み、前記ガイド配列は直接反復配列に連結されている。実施態様によっては、前記切断は、前記Casエフェクターモジュールによって標的配列の位置で１本鎖または２本鎖を切断することを含み、この複合体には、分割されたCasエフェクターモジュールが含まれる。実施態様によっては、前記切断は、標的遺伝子の転写の減弱をもたらす。実施態様によっては、この方法はさらに、外因性鋳型ポリヌクレオチドとの相同組換えによって前記切断された標的ポリヌクレオチドを修復することを含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異をもたらす。実施態様によっては、前記変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質に１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。実施態様によっては、この方法はさらに、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することを含み、１つ以上のベクターは、CasエフェクターモジュールおよびDR配列に連結されたガイド配列のうちの１つ以上の発現を駆動する。実施態様によっては、前記ベクターは、対象中の真核細胞に送達される。実施態様によっては、前記改変は、細胞培養物中の前記真核細胞内で起こる。実施態様によっては、この方法はさらに、前記改変に先立って前記真核細胞を対象から単離することを含む。実施態様によっては、この方法はさらに、前記真核細胞および／またはそれに由来する細胞を前記対象に戻すことを含む。一側面では、本発明は、真核細胞中の標的ポリヌクレオチドを改変または編集する方法を提供する。実施態様によっては、この方法は、CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体が標的ポリヌクレオチドに結合してDNA塩基編集をもたらすことを含み、CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされたガイド配列と複合化したCasエフェクターモジュールを含み、前記ガイド配列は直接反復配列に連結されている。実施態様によっては、Casエフェクターモジュールは、触媒的に不活性なCRISPR-Casタンパク質を含む。実施態様によっては、ガイド配列は、標的配列とガイド配列との間に形成されたDNA／RNAヘテロ二本鎖に１つ以上の不一致を導入するように設計されている。特定の実施態様では、不一致はA−C不一致である。実施態様によっては、Casエフェクターは、１つ以上の機能ドメインと（例えば、融合タンパク質または適切なリンカーを介して）会合していてもよい。実施態様によっては、エフェクタードメインは、加水分解性脱アミノ化を介する内因性編集を媒介する１つ以上のシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼを含む。
【０７３５】
一側面では、本発明は、真核細胞中のポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。実施態様によっては、この方法は、CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体がポリヌクレオチドに結合することを可能にし、その結果、前記結合が前記ポリヌクレオチドの発現の増強または減弱をもたらすことを含む。CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされたガイド配列と複合化したCasエフェクターモジュールを含み、前記ガイド配列は、直接反復配列に連結され、この複合体には、分割されたCasエフェクターモジュールが含まれてもよい。実施態様によっては、この方法はさらに、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達することを含み、１つ以上のベクターは、CasエフェクターモジュールおよびDR配列に連結されたガイド配列のうちの１つ以上の発現を駆動する。
【０７３６】
一側面では、本発明は、真核細胞中の標的転写産物を改変または編集する方法を提供する。実施態様によっては、この方法は、CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体が標的ポリヌクレオチドに結合してRNA塩基編集をもたらすことを含み、CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされたガイド配列と複合化したCasエフェクターモジュールを含み、前記ガイド配列は直接反復配列に連結されている。実施態様によっては、Casエフェクターモジュールは、触媒的に不活性なCRISPR-Casタンパク質を含む。実施態様によっては、ガイド配列は、標的配列とガイド配列との間に形成されたRNA／RNA二重鎖に１つ以上の不一致を導入するように設計されている。特定の実施態様では、不一致はA−C不一致である。実施態様によっては、Casエフェクターは、１つ以上の機能ドメインと（例えば、融合タンパク質または適切なリンカーを介して）会合していてもよい。実施態様によっては、エフェクタードメインは、加水分解性脱アミノ化を介する内因性編集を媒介する１つ以上のシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼを含む。特定の実施態様では、エフェクタードメインは、RNA (ADAR)ファミリーの酵素に作用するアデノシンデアミナーゼを含む。特定の実施態様では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、RNA中のアデノシンまたはシチジンを脱アミノ化でき、またはRNA特異的アデノシンデアミナーゼであり、かつ／あるいは細菌、ヒト、頭足類、またはショウジョウバエのアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインであり、好ましくはTadA、より好ましくはADAR、場合によってはhuADAR、場合によっては(hu)ADAR1または(hu)ADAR2、好ましくはhuADAR2、あるいはその触媒ドメインである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、ヒト、ラット、またはヤツメウナギのシチジンデアミナーゼである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、アポリポタンパク質B mRNA編集複合体 (APOBEC)ファミリーデアミナーゼ、活性化誘導デアミナーゼ (AID)、またはシチジンデアミナーゼ1 (CDA1)である。
【０７３７】
本出願は、関心のある標的DNA配列を改変することに関する。
【０７３８】
本発明のさらなる側面は、予防処置または治療処置で使用するために本明細書で想定される方法および組成物に関し、好ましくは、前記関心のある標的遺伝子座がヒトまたは動物内にあり、かつアデニンまたはシチジンを関心のある標的DNA配列内で改変する方法に関し、この方法は、前記標的DNAに上述の組成物を送達することを含む。特定の実施態様では、CRISPRシステムおよびアデノシンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインは、１つ以上のポリヌクレオチド分子として、リボ核タンパク質複合体として、場合によっては粒子、小胞、または１つ以上のウイルスベクターを介して送達される。特定の実施態様では、この組成物は、病原性のG→AまたはC→T点変異を含む転写産物によって引き起こされる疾患の治療または予防に使用するものである。特定の実施態様では、従って、本発明は治療に使用する組成物を含む。これにより、これらの方法はin vivo、ex vivo、またはin vitroで実施できることを意味する。特定の実施態様では、これらの方法は、動物またはヒトの身体への処置方法ではなく、またはヒト細胞の生殖系の遺伝的同一性を改変するための方法でもない。特定の実施態様では、この方法を実施する場合に、標的DNAはヒトまたは動物の細胞内に含まれてはいない。特定の実施態様では、標的がヒトまたは動物の標的である場合に、この方法は、ex vivoまたはin vitroで実施される。
【０７３９】
本発明のさらなる側面は、予防処置または治療処置で使用するために本明細書で想定される方法に関し、好ましくは前記関心のある標的がヒトまたは動物内にあり、かつ関心のある標的DNA配列中のアデニンまたはシチジンを改変する方法に関し、この方法は、前記標的RNAに上述の組成物を送達することを含む。特定の実施態様では、CRISPRシステムおよびアデノシンデアミナーゼ、またはその触媒ドメインは、１つ以上のポリヌクレオチド分子として、リボ核タンパク質複合体として、場合によっては粒子、小胞、または１つ以上のウイルスベクターを介して送達される。特定の実施態様では、この組成物は、病原性のG→AまたはC→T点変異を含む転写産物によって引き起こされる疾患の治療または予防に使用するものである。特定の実施態様では、本発明は治療に使用する組成物を含む。これにより、これらの方法はin vivo、ex vivo、またはin vitroで実施できることを意味する。特定の実施態様では、これらの方法は、動物またはヒトの身体への処置方法ではなく、またはヒト細胞の生殖系の遺伝的同一性を改変するための方法でもない。特定の実施態様では、この方法を実施する場合に、標的DNAはヒトまたは動物の細胞内に含まれてはいない。特定の実施態様では、標的がヒトまたは動物の標的である場合に、この方法は、ex vivoまたはin vitroで実施される。
【０７４０】
本発明はまた、標的化された脱アミノ化により疾患を治療または予防する方法、または異形を誘発する疾患を治療または予防する方法に関する。例えば、Aの脱アミノ化により、病原性のG→AまたはC→T点変異を含む転写産物によって引き起こされる疾患を治療できる。本発明で治療または予防できる疾患の例として、癌、マイヤーゴーリン症候群、ゼッケル症候群4、ジュベール症候群5、レーバー先天性黒内障10、シャルコー・マリー・トゥース病2型、アッシャー症候群2C型、脊髄小脳失調症28、QT延長症候群2、シェーグレン・ラルソン症候群、遺伝性フルクトース尿症、神経芽細胞腫、カルマン症候群1、および異染性白質ジストロフィーが挙げられる。
【０７４１】
一側面では、本発明は、変異した疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成する方法を提供する。実施態様によっては、疾患遺伝子は、疾患を有するまたは発症するリスクの増大に関連する任意の遺伝子である。実施態様によっては、この方法は、（a）Casエフェクターモジュールおよび直接反復配列に連結されたガイド配列のうちの１つ以上の発現を駆動する１つ以上のベクターを真核細胞中に導入すること、および（b）CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体が標的ポリヌクレオチドに結合して、前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断をもたらすことを含み、ここでCRISPR-Casエフェクターモジュール複合体は、（1）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列、（2）DR配列、および（3）tracr配列と複合化したCasエフェクターモジュールを含み、それにより、変異した疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を生成する。この複合体には、分割されたCasエフェクターモジュールを含む。実施態様によっては、前記切断は、前記Casエフェクターモジュールによって標的配列の位置で１本鎖または２本鎖を切断することを含む。好ましい実施態様では、鎖切断は、5’オーバーハングを伴うねじれ型の切断である。実施態様によっては、前記切断は、標的遺伝子の転写の減弱をもたらす。実施態様によっては、この方法はさらに、外因性鋳型ポリヌクレオチドとの相同組換えによって前記切断された標的ポリヌクレオチドを修復することを含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を含む変異をもたらす。実施態様によっては、前記変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現に１つ以上のアミノ酸変化をもたらす。実施態様によっては、モデル真核細胞は、変異した疾患遺伝子を含み、この変異は、5’オーバーハングを伴うねじれ型の二本鎖切断によって導入される。特定の実施態様では、5’オーバーハングは7ヌクレオチド長である。実施態様によっては、モデル真核細胞は、変異した疾患遺伝子を含み、この変異は、HDRを介してねじれ型の5’オーバーハングにDNA挿入物によって導入される。実施態様によっては、モデル真核細胞は、変異した疾患遺伝子を含み、この変異は、NHEJを介してねじれ型の5’オーバーハングにDNA挿入物によって導入される。実施態様によっては、モデル真核細胞は、CRISPR-C2c1システムによって導入された外因性DNA配列挿入を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは、5’末端および3’末端の両方にガイド配列が隣接する外因性DNAを含む。実施態様によっては、モデル真核細胞は、変異した疾患遺伝子を含み、変異cは、特定の実施態様ではねじれ型の5’オーバーハングにDNA挿入物によって導入され、Casエフェクターモジュールは、C2c1タンパク質またはその触媒ドメインを含み、PAM配列はT富化配列である。特定の実施態様では、PAMは5’-TTNまたは5’-ATTNであり、ここでNは任意のヌクレオチドである。特定の実施態様では、PAMは5’-TTGである。特定の実施態様では、モデル真核細胞は、癌に関連する変異遺伝子を含む。特定の実施態様では、モデル真核細胞は、子宮頸部上皮内腫瘍 (CIN)中のヒトパピローマウイルス(HPV)駆動型の発癌に関連する変異疾患遺伝子を含む。他の特定の実施態様では、モデル真核細胞���、パーキンソン病、嚢胞性線維症、心筋症、および虚血性心疾患に関連する変異疾患遺伝子を含む。
【０７４２】
一側面では、本発明は、１つ以上の細胞内の遺伝子に１つ以上の変異を導入して１つ以上の細胞を選択する方法を提供し、この方法は、１つ以上のベクターを細胞内に導入することを含み、１つ以上のベクターは、Casエフェクターモジュール、直接反復配列に連結されたガイド配列、および編集鋳型のうちの１つ以上の発現を駆動し、この編集鋳型は、Casエフェクターモジュールの切断を無効にする１つ以上の変異を含む。この方法はさらに、編集鋳型と細胞内の標的ポリヌクレオチドとの相同組換えを可能にすること、およびCRISPR-Casエフェクターモジュール複合体が標的ポリヌクレオチドに結合して、前記遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの切断をもたらすことを含み、CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体は、（1）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列および（2）直接反復配列と複合化したCasエフェクターモジュールを含み、CasエフェクターモジュールすなわちCRISPR-Casエフェクターモジュール複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合は細胞死を誘発し、それによって１つ以上の変異が導入された１つ以上の細胞が選択されることを可能にする。この複合体には、分割されたCasエフェクターモジュールが含まれる。本発明の別の好ましい実施態様では、選択された細胞は真核細胞であってもよい。本発明の側面は、選択マーカーまたは逆選択システムを含む２段階工程を必要とせずに、特定の細胞の選択を可能にする。
【０７４３】
一側面では、本発明は、改変または編集された遺伝子を含む真核細胞を生成する方法を提供する。実施態様によっては、改変または編集された遺伝子は、疾患遺伝子である。実施態様によっては、この方法は、（a）１つ以上のベクターを真核細胞中に導入することを含み、１つ以上のベクターは、Casエフェクターモジュール、および直接反復配列に連結されたガイド配列のうちの１つ以上の発現を駆動し、Casエフェクターモジュールは、塩基編集を媒介する１つ以上のエフェクタードメインに会合し、かつこの方法は（b）CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体が標的ポリヌクレオチドに結合して、前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドの塩基編集をもたらすことを含み、CRISPR-Casエフェクターモジュール複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズされるガイド配列と複合化したCasエフェクターモジュールを含み、ガイド配列は、ガイド配列と標的配列との間に形成されたDNA／RNAヘテロ二本鎖またはRNA／RNA二重鎖間に１つ以上の不一致を導入するように設計されてもよい。特定の実施態様では、この不一致はA−C不一致である。実施態様によっては、Casエフェクターは、１つ以上の機能ドメインと（例えば、融合タンパク質または適切なリンカーを介して）会合していてもよい。実施態様によっては、エフェクタードメインは、加水分解性脱アミノ化を介する内因性編集を媒介する１つ以上のシチジンデアミナーゼまたはアデノシンデアミナーゼを含む。特定の実施態様では、エフェクタードメインは、RNA (ADAR)ファミリーの酵素に作用するアデノシンデアミナーゼを含む。特定の実施態様では、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、RNA中のアデノシンまたはシチジンを脱アミノ化でき、またはRNA特異的アデノシンデアミナーゼであり、かつ／あるいは細菌、ヒト、頭足類、またはショウジョウバエアデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメイン、好ましくはTadA、より好ましくはADAR、場合によってはhuADAR、場合によっては(hu)ADAR1または(hu)ADAR2、好ましくはhuADAR2、あるいはその触媒ドメインである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、ヒト、ラット、またはヤツメウナギのシチジンデアミナーゼである。実施態様によっては、シチジンデアミナーゼは、アポリポタンパク質B mRNA編集複合体 (APOBEC)ファミリーデアミナーゼ、活性化誘導デアミナーゼ (AID)、またはシチジンデアミナーゼ1 (CDA1)である。
【０７４４】
さらなる側面は、上記の方法から得られる、または得ることが可能な単離された細胞、かつ／あるいは上記の組成物または前記改変された細胞の後代を含む単離された細胞に関し、好ましくは、前記細胞は、この方法に供されていない対応する細胞に対比して、関心のある前記標的RNA中の前記アデニンの代わりにヒポキサンチンまたはグアニンを含む。特定の実施態様では、この細胞は真核細胞、好ましくはヒトまたはヒト以外の動物細胞であり、場合によっては治療用T細胞または抗体産生B細胞であり、あるいは前記細胞は植物細胞である。さらなる側面は、前記改変された細胞またはその後代を含むヒト以外の動物または植物を提供する。さらに別の側面は、治療、好ましくは細胞治療で使用するための上述のように改変された細胞を提供する。
【０７４５】
実施態様によっては、改変された細胞は、CAR-T療法に適するT細胞などの治療用T細胞である。この改変は、限定はされないが、免疫チェックポイント受容体（例えばPDA、CTLA4）の発現の低下、HLAタンパク質（例えばB2M、HLA-A）の発現の低下、および内因性TCRの発現の低下を含む１つ以上の望ましい形質を治療用T細胞にもたらすことができる。
【０７４６】
本発明はさらに、それを必要とする患者に本明細書に説明の改変された細胞を投与することを含む細胞療法のための方法に関し、改変された細胞の存在により患者の疾患を治療する。一実施態様では、細胞療法のための改変された細胞は、腫瘍細胞を認識および／または攻撃することができるCAR-T細胞である。別の実施態様では、細胞療法のための改変された細胞は、神経幹細胞、間葉系幹細胞、造血幹細胞、またはiPSC細胞などの幹細胞である。
【０７４７】
好ましくは縦列に配置された複数のガイドRNAを含むCasエフェクターモジュール、複合体、またはシステムを含む組成物、あるいは好ましくは縦列に配置された複数のガイドRNAを含むCasエフェクターモジュール、複合体、またはシステムをコードする、またはそれらを含むポリヌクレオチドまたはベクターが、本明細書の他の場所に定義の治療方法での使用のために提供される。その組成物を含むキット部品が提供されてもよい。その治療方法のための薬剤の製造での前記組成物の使用もまた提供される。検査でのCasエフェクターモジュールCRISPRシステムの使用もまた本発明によって提供され、例えば、その検査は機能獲得型の検査である。遺伝子を人為的に過剰発現させる細胞は、例えば負帰還ループによって、時間の経過とともに遺伝子を下方制御することができる（平衡を再構築できる）。検査が始まる時点までに、未調節の遺伝子は再び減少してしまうかもしれない。誘導性Casエフェクターモジュール活性因子を使用すると、検査の直前に転写を誘導できるので、偽陰性の的中の可能性を最小限に抑えることができる。従って、検査、例えば機能獲得型の検査での本発明の使用により、偽陰性の結果の可能性を最小限に抑えることができる。
【０７４８】
別の側面では、本発明は、１つ以上のベクターを含む遺伝子操作された非天然起源のベクターシステムを提供し、このベクターは、遺伝子産物をコードするDNA分子をそれぞれ特異的に標的とする複数のCas12b CRISPRシステムガイドRNAに操作可能に連結された第１の調節エレメント、およびCRISPRタンパク質をコードするように操作可能に連結された第２の調節エレメントを含む。両方の調節エレメントは、システムの同じベクターまたは異なるベクターに配置されてもよい。複数のガイドRNAは、細胞内で複数の遺伝子産物をコードする複数のDNA分子を標的とし、CRISPRタンパク質は、遺伝子産物をコードする複数のDNA分子を切断してもよく（一方または両方の鎖を切断してもよく、またはヌクレアーゼ活性を実質的に持たなくてもよく）、それによって複数の遺伝子産物の発現が変更される。ここでCRISPRタンパク質と複数のガイドRNAは自然には同時に発生しない。好ましい実施態様では、CRISPRタンパク質は、Cas12bタンパク質であり、場合によっては、真核細胞での発現のために最適化されたコドンである。好ましい実施態様では、真核細胞は、哺乳動物細胞、植物細胞、または酵母細胞であり、より好ましい実施態様では、哺乳動物細胞はヒト細胞である。本発明のさらなる実施態様では、複数の遺伝子産物のそれぞれの発現は、変更され、好ましくは減弱される。
【０７４９】
一側面では、本発明は、１つ以上のベクターを含むベクターシステムを提供する。実施態様によっては、このシステムは、（a）直接反復配列に操作可能に連結された第１の調節エレメント、および直接反復配列の上流または下流（該当のどちらにも）に１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位を含み、発現されると、１つ以上のガイド配列は、真核細胞内の１つ以上の標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を誘導し、CRISPR複合体は、１つ以上の標的配列にハイブリダイズされる１つ以上のガイド配列と複合化するCas12b酵素を含み、かつこのシステムは、（b）前記Cas12b酵素をコードする酵素コード配列に操作可能に連結され、好ましくは少なくとも１つの核局在化配列および／または少なくとも１つのNESを含む第２の調節エレメントを含み、構成要素（a）および（b）は、このシステムの同じまたは異なるベクターに配置される。該当する場合は、tracr配列も提供されてもよい。実施態様によっては、構成要素（a）はさらに、第１の調節エレメントに操作可能に連結された２つ以上のガイド配列を含み、発現されると、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、Cas12b CRISPR複合体の真核細胞中の異なる標的配列への配列特異的結合を誘導する。実施態様によっては、CRISPR複合体は、真核細胞の核内または核外での前記Cas12b CRISPR複合体の検出可能な量の蓄積を駆動するのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列および／または１つ以上のNESを含む。実施態様によっては、第１の調節エレメントは、ポリメラーゼIIIプロモーターである。実施態様によっては、第２の調節エレメントは、ポリメラーゼIIプロモーターである。実施態様によっては、ガイド配列のそれぞれは、少なくとも16、17、18、19、20、25ヌクレオチド長、または16〜30、または16〜25、または16〜20ヌクレオチド長である。
【０７５０】
組換え発現ベクターは、宿主細胞中での核酸の発現に適する形態で、本明細書に定義の複数の標的化に使用するためのCas12b酵素、システム、または複合体をコードするポリヌクレオチドを含むことができ、このことは、組換え発現ベクターが１つ以上の調節エレメントを含むことを意味し、このベクターは、発現される核酸配列に操作可能に連結されている、発現に用いられる宿主細胞に基づいて選択されてもよい。組換え発現ベクター内で、「操作可能に連結」とは、関心のあるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方式で（例えば、in vitro転写／翻訳システム内で、またはベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞内で）調節エレメントに連結されるとの意味を意図する。
【０７５１】
実施態様によっては、宿主細胞は、本明細書に定義の複数の標的化で使用するためのCas12b酵素、システム、または複合体をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターにより一過的または非一過的に遺伝子導入される。実施態様によっては、細胞は、それが対象内で自然に発生するように遺伝子導入される。実施態様によっては、遺伝子導入された細胞は、対象から採取される。実施態様によっては、細胞は、細胞株など、対象から採取された細胞に由来する。組織培養のための多種多様な細胞株は、当技術分野で知られていて、本明細書の他の場所で例示されている。細胞株は、当業者には既知の様々な供給源から入手可能である（例えば、米国培養細胞系統保存機関（ATCC; Manassus, Va.）を参照）。実施態様によっては、本明細書に定義の複数の標的化で使用するためのCas12b酵素、システム、または複合体をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターにより遺伝子導入された細胞を用いて、１つ以上のベクター由来の配列を含む新規の細胞株を構築する。実施態様によっては、（例えば、１つ以上のベクターの一過的な遺伝子導入またはRNAでの遺伝子導入による）本明細書に説明の複数の標的化で使用するためのCas12b CRISPRシステムまたは複合体の成分により一過的に遺伝子導入され、かつCas12b CRISPRシステムまたは複合体の活性を介して改変された細胞を用いて、改変を含むが他の外因性配列を欠く細胞を含む新規の細胞株を構築する。実施態様によっては、本明細書に定義の複数の標的化で使用するためのCas12b酵素、システム、または複合体をコードするポリヌクレオチドを含む１つ以上のベクターにより一過的または非一過的に遺伝子導入された細胞、またはその細胞に由来する細胞株を、１つ以上の試験化合物の評価に使用する。
【０７５２】
用語「調節エレメント」は、本明細書の他の場所に定義の通りである。
【０７５３】
有利なベクターには、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれ、そのベクターの型はまた、特定の細胞型を標的とするために選択できる。
【０７５４】
一側面では、本発明は真核生物宿主細胞を提供し、この細胞は、（a）直接反復配列に操作可能に連結された第１の調節エレメント、および直接反復配列の上流または下流（該当のどちらにも）に１つ以上のガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位を含み、発現されると、ガイド配列は、真核細胞内のそれぞれの標的配列へのCas12b CRISPR複合体の配列特異的結合を誘導し、Cas12b CRISPR複合体は、それぞれの標的配列にハイブリダイズされる１つ以上のガイド配列と複合化するCas12b酵素を含み、かつ／あるいは、この細胞は（b）好ましくは少なくとも１つの核局在化配列および／またはNESを含む、前記Cas12b酵素をコードする酵素コード配列に操作可能に連結された第２の調節エレメントを含む。実施態様によっては、宿主細胞は、構成要素（a）および（b）を含む。該当する場合に、tracr配列も提供されてもよい。実施態様によっては、構成要素（a）、構成要素（b）、または構成要素（a）および（b）は、宿主真核細胞のゲノム中に安定的に組み込まれる。実施態様によっては、構成要素（a）はさらに、第１の調節エレメントに操作可能に連結され、場合によっては直接反復によって分離される２つ以上のガイド配列を含み、発現されると、２つ以上のガイド配列のそれぞれは、Cas12b CRISPR複合体の真核細胞内の異なる標的配列への配列特異的結合を誘導する。実施態様によっては、Cas12b酵素は、真核細胞の核内および／または核外での前記CRISPR酵素の検出可能な量の蓄積を駆動するのに十分な強度の１つ以上の核局在化配列および／または核外輸送配列すなわちNESを含む。
【０７５５】
実施態様によっては、ガイド分子は、編集される少なくとも１つの標的アデノシン残基を含む標的DNA鎖とともに二重鎖を形成する。ガイドRNA分子が標的DNA鎖にハイブリダイズすると、アデノシンデアミナーゼは二本鎖に結合し、かつDNA−RNA二本鎖内に含まれる１つ以上の標的アデノシン残基の脱アミノ化を触媒する。
【０７５６】
さらに、PAM相互作用 (PI)ドメインの遺伝子操作により、例えば、Kleinstiver BP et al. Engineered CRISPR-Cas9 nucleases with altered PAM specificities（PAM特異性が改変された遺伝子操作CRISPR-Cas9ヌクレアーゼ）. Nature. 2015 Jul 23;523(7561):481-5. doi: 10.1038/nature14592）にCas9について説明されるように、PAM特異性のプログラムを可能にし、標的部位認識忠実度を改善し、かつCRISPR-Casタンパク質の多様性を増大できる。本明細書にさらに詳述のように、当業者なら、C2c1タンパク質が同様に改変されてもよいことが分かる。
【０７５７】
特定の実施態様では、ガイド配列は、脱アミノ化されるアデニンでのデアミナーゼの最適な効率を確実とするために選択される。C2c1ニッカーゼの切断部位に対する標的鎖でのアデニンの位置を考慮に入れてもよい。特定の実施態様では、ニッカーゼが、非標的鎖上の脱アミノ化されるアデニンの近傍で作用することを確実とすることを目的とする。例えば、特定の実施態様では、Cas12bニッカーゼは、PAMの下流の非標的鎖を切断し、脱アミノ化されるアデニンに対応するシトシンが、対応する非標的鎖の配列中のニッカーゼ切断部位の上流または下流の10塩基対内のガイド配列中に位置するように、ガイドを設計することを目的とする。
送達
【０７５８】
実施態様によっては、CRISPR-Casシステムの構成要素は、DNA／RNAまたはRNA／RNAまたはタンパク質RNAの組合せなどの様々な形態で送達されてもよい。例えば、C2c1タンパク質は、DNAをコードするポリヌクレオチドまたはRNAをコードするポリヌクレオチドとして、あるいはタンパク質として送達されてもよい。ガイドは、DNAをコードするポリヌクレオチドまたはRNAとして送達されてもよい。送達の混合形態を含んで、考えうる全ての組合せが想定される。
【０７５９】
側面によっては、本発明は、本明細書に説明の１つ以上のベクターなどの１つ以上のポリヌクレオチド、その１つ以上の転写産物、および／またはそれから転写される１つ以上のタンパク質を宿主細胞に送達することを含む方法を提供する。
送達媒体としてのベクター
【０７６０】
組換え発現ベクターは、宿主細胞中の核酸の発現に適する形態で本発明の核酸を含むことができ、このことは、組換え発現ベクターが、発現される核酸配列に操作可能に連結される、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択され得る１つ以上の調節エレメントを含むことを意味している。組換え発現ベクター内で、「操作可能に連結」とは、関心のあるヌクレオチド配列が、ヌクレオチド配列の発現を可能にする方式で（例えば、in vitro転写／翻訳システム内で、またはベクターが宿主細胞に導入される場合の宿主細胞内で）調節エレメントに連結されるとの意味を意図する。有利なベクターには、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれ、そのベクターの型はまた、特定の細胞型を標的とするために選択されてもよい。
【０７６１】
組換え方法およびクローン方法に関しては、米国特許2004-0171156 A1号として2004年9月2日に公開の米国特許出願第10/815,730号に述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０７６２】
「調節エレメント」という用語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム侵入部位 (IRES)、および他の発現制御エレメント（例えば、ポリアデニル化シグナルおよびポリ−U配列などの転写終結シグナル）を含むことを意図している。その調節エレメントは、例えば、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY（発現技術：酵素学での方法）185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)に説明されている。調節エレメントには、多種の宿主細胞でヌクレオチド配列の直接構成的発現を誘導するエレメント、および特定の宿主細胞でのみヌクレオチド配列（例えば、組織特異的調節配列）の発現を誘導するエレメントが含まれる。組織特異的プロモーターは、主に、筋肉、神経細胞、骨、皮膚、血液、特定の器官（例えば肝臓、膵臓）、または特定の細胞型（例えばリンパ球）などの所望の関心のある組織での発現を誘導できる。調節エレメントはまた、細胞周期依存性または発達段階依存性の方式などの時間依存性の方式で発現を誘導でき、このエレメントは組織に特異的または細胞型に特異的であってもよく、あるいはそうでなくてもよい。実施態様によっては、ベクターは、1個以上のpol IIIプロモーター（例えば、1、2、3、4、5個、またはそれ以上のpol IIIプロモーター）、1個以上のpol IIプロモーター（例えば、1、2、3、4、5個、またはそれ以上のpol IIプロモーター）、1個以上のpol Iプロモーター（例えば、1、2、3、4、5個、またはそれ以上のpol Iプロモーター）、またはそれらの組合せを含む。pol IIIプロモーターの例として、限定はされないが、U6およびH1プロモーターが挙げられる。pol IIプロモーターの例として、限定はされないが、レトロウイルス性ラウス肉腫ウイルス (RSV) LTRプロモーター（場合によってはRSVエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス (CMV)プロモーター（場合によってはCMVエンハンサーを含む）（例えば、Boshart et al, Cell, 41:521-530 (1985)を参照）、SV40プロモーター、ジヒドロ葉酸還元酵素プロモーター、β-アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ (PGK)プロモーター、およびEF1αプロモーターが挙げられる。用語「調節エレメント」には、WPRE、CMVエンハンサー、HTLV-IのLTR中のR-U5’区画（Mol. Cell. Biol., Vol. 8(1), p. 466-472, 1988）、SV40エンハンサー、およびウサギβ-グロビンのエクソン2と3の間のイントロン配列（Proc. Natl. Acad. Sci. USA., Vol. 78(3), p. 1527-31, 1981）などのエンハンサーエレメントも含まれる。発現ベクターの設計が、形質転換される宿主細胞の選択、所望の発現水準などの要因に依存してもよいことは当業者なら分かっている。ベクターは、宿主細胞中に導入されて、それにより、本明細書に説明の核酸によってコードされる、融合タンパク質またはペプチドを含む転写産物、タンパク質、またはペプチド（例えば、クラスター化され規則的に間隔をおいた短鎖回文配列反復(CRISPR)転写産物、タンパク質、酵素、それらの変異型、それらの融合タンパク質など）を産出できる。調節配列に関しては、米国特許出願10/491,026号が述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。プロモーターに関しては、国際特許出願WO2011/028929号および米国特許出願12/511,940号が述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０７６３】
有利なベクターには、レンチウイルスおよびアデノ随伴ウイルスが含まれ、そのベクターの型はまた、特定の細胞型を標的とするために選択できる。
【０７６４】
特定の実施態様では、ガイドRNAおよびアデノシンデアミナーゼに融合された（場合によっては改変または変異された）CRISPR-Casタンパク質のためのバイシストロン性ベクターが使用される。ガイドRNAおよびアデノシンデアミナーゼに融合された（場合によっては改変または変異された）CRISPR-Casタンパク質のためのバイシストロン性発現ベクターが好ましい。一般にかつ特に、この実施態様では、アデノシンデアミナーゼに融合された（場合によっては改変または変異された）CRISPR-Casタンパク質は、好ましくは、CBhプロモーターによって駆動される。RNAは、好ましくは、U6プロモーターなどのPol IIIプロモーターによって駆動されてもよい。理想的には２つの組合せである。
【０７６５】
原核細胞または真核細胞でのCRISPR転写産物（例えば、核酸転写産物、タンパク質、または酵素）の発現のためのベクターを設計できる。例えば、CRISPR転写産物は、大腸菌などの細菌細胞、（バキュロウイルス発現ベクターを使用する）昆虫細胞、酵母細胞、または哺乳類細胞で発現させることができる。適切な宿主細胞については、Goeddel, GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY（発現技術：酵素学での方法）185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990)にさらに説明されている。あるいは、組換え発現ベクターは、例えば、T7プロモーター調節配列およびT7ポリメラーゼを使用して、in vitroで転写かつ翻訳することができる。
【０７６６】
ベクターは、原核生物または原核細胞中に導入され、かつ増殖されてもよい。実施態様によっては、原核生物を使用して、真核細胞中に導入されるベクターの複製物を増幅する、あるいは原核生物を真核細胞中に導入されるベクターの生成での中間ベクターとして使用する（例えば、ウイルスベクター封入システムの一部としてのプラスミド増幅する）。実施態様によっては、原核生物を使用して、ベクターの複製物を増幅し、例えば、宿主細胞または宿主生物への送達のために１つ以上のタンパク質の供給源を提供するなど、１つ以上の核酸を発現する。原核生物でのタンパク質の発現は、殆どの場合に、融合タンパク質あるいは非融合タンパク質のいずれかの発現を誘導する構成的または誘導性プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌内で行われる。融合ベクターは、その内部にコードされているタンパク質に、例えば組換えタンパク質のアミノ末端に複数のアミノ酸を付加する。このような融合ベクターは、次の１つ以上の目的に役立てることができる：（i）組換えタンパク質の発現を増強すること；（ii）組換えタンパク質の溶解度を増大すること；および（iii）親和性精製でのリガンドとして作用させて組換えタンパク質の精製を支援すること。多くの場合に、融合発現ベクターでは、タンパク質分解性の切断部位が融合部分と組換えタンパク質の接合部に導入されて、融合タンパク質の精製に続いて融合部分から組換えタンパク質を分離できるようにする。この酵素およびそれらの同族の認識配列として、第Xa因子、トロンビン、およびエンテロキナーゼが含まれる。融合発現ベクターの例として、グルタチオンS転移酵素 (GST)を融合するpGEX（Pharmacia Biotech Inc; Smith and Johnson, 1988. Gene 67: 31-40）、pMAL（New England Biolabs, Beverly, Mass.）およびpRIT5（Pharmacia, Piscataway, N.J.）、それぞれ目的の組換えタンパク質に対するマルトースE結合タンパク質またはプロテインAが挙げられる。適切な誘導性の非融合大腸菌発現ベクターの例として、pTrc（Amrann et al., (1988) Gene 69:301-315）およびpET 11d（Studier et al., GENE EXPRESSION TECHNOLOGY: METHODS IN ENZYMOLOGY（発現技術：酵素学の方法） 185, Academic Press, San Diego, Calif. (1990) 60-89）が挙げられる。実施態様によっては、ベクターは、酵母発現ベクターである。出芽酵母（Saccharomyces cerivisae）での発現のためのベクターの例として、pYepSec1（Baldari, et al., 1987. EMBO J. 6: 229-234）、pMFa（Kuijan and Herskowitz, 1982. Cell 30: 933-943）、pJRY88（Schultz et al., 1987. Gene 54: 113-123）、pYES2（Invitrogen Corporation, San Diego, Calif.）、およびpicZ（InVitrogen Corp, San Diego, Calif.）が挙げられる。実施態様によっては、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを使用する昆虫細胞でのタンパク質発現を駆動する。培養昆虫細胞（例えばSF9細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターには、pAc系列（Smith, et al., 1983. Mol. Cell. Biol. 3: 2156-2165）およびpVL系列（Lucklow and Summers, 1989. Virology 170: 31-39）が含まれる。
【０７６７】
実施態様によっては、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを使用して、哺乳動物細胞中の１つ以上の配列の発現を駆動することができる。哺乳動物発現ベクターの例として、pCDM8（Seed, 1987. Nature 329: 840）およびpMT2PC（(Kaufman, et al., 1987. EMBO J. 6: 187-195）が挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合に、発現ベクターの制御機能は、典型的には１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス2、サイトメガロウイルス、シミアンウイルス40、および本明細書に開示かつ当技術分野で既知の他のウイルスに由来する。原核細胞と真核細胞の両方に適する他の発現システムについては、例えば、Chapters 16 and 17 of Sambrook, et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL（分子クローニング：実験室マニュアル）. 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989を参照。
【０７６８】
実施態様によっては、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型での優先的な核酸の発現を誘導できる（例えば、組織特異的調節エレメントを使用して核酸を発現する）。組織特異的調節エレメントは当技術分野で知られている。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例として、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Pinkert, et al., 1987. Genes Dev. 1: 268-277）、リンパ系特異的プロモーター（Calame and Eaton, 1988. Adv. Immunol. 43: 235-275）、特にT細胞受容体（Winoto and Baltimore, 1989. EMBO J. 8: 729-733）および免疫グロブリン（Baneiji, et al., 1983. Cell 33: 729-740; Queen and Baltimore, 1983. Cell 33: 741-748）のプロモーター、神経細胞特異的プロモーター（例えば、神経細繊維プロモーター；Byrne and Ruddle, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 5473-5477）、膵臓特異的プロモーター（Edlund, et al., 1985. Science 230: 912-916）、および乳腺特異的プロモーター（例えば、乳清プロモーター；米国特許4,873,316号および欧州出願特許264,166号）が挙げられる。発達調節プロモーター、例えば、マウスhoxプロモーター（Kessel and Gruss, 1990. Science 249: 374-379）およびα-フェトプロテインプロモーター（Campes and Tilghman, 1989. Genes Dev. 3: 537-546）もまた包含される。これらの原核生物および真核生物のベクターに関して、米国特許6,750,059号が述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。本発明の他の実施態様は、ウイルスベクターの使用に関連してもよく、これに関しては、米国特許出願13/092,085号に述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。組織特異的調節エレメントは当技術分野で知られており、これに関しては米国特許7,776,321号に述べられ、その内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。実施態様によっては、調節エレメントは、CRISPRシステムの１つ以上の要素の発現を駆動するように、CRISPRシステムの１つ以上の要素に操作可能に連結されている。
【０７６９】
実施態様によっては、核酸標的化システムの１つ以上の要素の発現を駆動する１つ以上のベクターは、核酸標的化システムの要素の発現が１つ以上の標的部位での核酸標的複合体の生成を誘導するように、宿主細胞中に導入される。例えば、核酸標的化エフェクター酵素および核酸標的化ガイドRNAは、それぞれ、別のベクターの別の調節エレメントに操作可能に連結されてもよい。核酸標的化システムのRNAは、遺伝子導入核酸標的化エフェクタータンパク質の動物または哺乳動物、例えば、構成的にまたは誘導的にまたは条件付きで核酸標的化エフェクタータンパク質を発現する動物または哺乳動物、あるいは、他の方法で核酸標的化エフェクタータンパク質を発現している動物または哺乳動物、または核酸標的化エフェクタータンパク質を含む細胞を有する動物または哺乳動物に、例えば核酸標的化エフェクタータンパク質をコードする、かつそのタンパク質をin vivoで発現する１つ以上のベクターのその動物への事前投与によって送達することができる。あるいは、同一のまたは異なる調節エレメントから発現される２つ以上の要素を、第１のベクターに含まれない核酸標的化システムの任意の構成要素を提供する１つ以上の追加のベクターとともに単一のベクター内に組み込んでもよい。単一のベクター内に組み込まれる核酸標的化システム要素は、例えば、第２の要素に対する（その「上流」の）5’、または第２の要素に対する（その「下流」の）3’に配置される１つの要素のように、任意の適切な方向に配置されてもよい。１つの要素のコード配列は、第２の要素のコード配列の同一または反対の鎖上に位置し、同一または反対の方向に方向付けされてもよい。実施態様によっては、単一のプロモーターは、（例えば、それぞれが異なるイントロン内、２つ以上が少なくとも１つのイントロン内、または全てが１つのイントロン内にある）１つ以上のイントロン配列内に埋め込まれた、核酸標的化エフェクタータンパク質および核酸標的化ガイドRNAをコードする転写産物の発現を駆動する。実施態様によっては、核酸標的化エフェクタータンパク質および核酸標的化ガイドRNAは、同一プロモーターに操作可能に連結され、かつそれから発現されてもよい。核酸標的化システムの１つ以上の要素を発現させるための送達媒体、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤、およびそれらの成分は、国際特許出願WO 2014/093622 (PCT/US2013/074667)号などの前述の文献内で使用されている通りである。実施態様によっては、ベクターは、（「クローン部位」とも呼ばれる）制限エンドヌクレアーゼ認識配列などの１つ以上の挿入部位を含む。実施態様によっては、１つ以上の挿入部位（例えば、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上の挿入部位）は、１つ以上のベクターの１つ以上の配列要素の上流および／または下流に位置する。複数の異なるガイド配列が使用される場合に、単一の発現構築物を用いて、細胞内の複数の異なる対応する標的配列に核酸標的化活性を標的化することができる。例えば、単一のベクターは、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、またはそれ以上のガイド配列を含んでもよい。実施態様によっては、約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、またはそれ以上のそのガイド配列を含有するベクターが提供されてもよく���かつ場合によっては細胞に送達されてもよい。実施態様によっては、ベクターは、核酸標的化エフェクタータンパク質をコードする酵素コード配列に操作可能に連結された調節エレメントを含む。核酸標的化エフェクタータンパク質または１つ以上の核酸標的化ガイドRNAは、別々に送達することができ、好ましくは、これらの少なくとも１つは、粒子複合体を介して送達される。核酸標的化エフェクタータンパク質mRNAは、核酸標的化ガイドRNAに先行して送達されて、核酸標的化エフェクタータンパク質が発現されるための時間を付与できる。核酸標的化エフェクタータンパク質mRNAは、核酸標的化ガイドRNAの投与の1〜12時間（好ましくは約2〜6時間）前に投与されてもよい。あるいは、核酸標的化エフェクタータンパク質mRNAおよび核酸標的化ガイドRNAは、同時に投与されてもよい。好ましくは、ガイドRNAの第２の促進用量は、核酸標的化エフェクタータンパク質mRNAおよびガイドRNAの初期投与の1〜12時間（好ましくは約2〜6時間）後に投与されてもよい。核酸標的エフェクタータンパク質mRNAおよび／またはガイドRNAの追加投与は、最も効率的な水準のゲノム改変を達成するために有用である可能性がある。
【０７７０】
従来からのウイルスおよび非ウイルスに基づく遺伝子導入法を用いて、哺乳動物の細胞または標的組織に核酸を導入できる。その方法を用いて、核酸標的化システムの構成要素をコードする核酸を、培養中の細胞または宿主生物中に投与できる。非ウイルスベクター送達システムには、DNAプラスミド、RNA（例えば、本明細書に説明のベクターの転写産物）、ネイキッド核酸、およびリポソームなどの送達媒体と複合化された核酸が含まれる。ウイルスベクター送達システムには、細胞への送達後にエピソームあるいは組込まれたゲノムのいずれかを有するDNAウイルスおよびRNAウイルスが含まれる。遺伝子治療手順の概要として、Anderson, Science 256:808-813 (1992)、Nabel & Felgner, TIBTECH 11:211-217 (1993)、Mitani & Caskey, TIBTECH 11:162-166 (1993)、Dillon, TIBTECH 11:167-175 (1993)、Miller, Nature 357:455-460 (1992)、Van Brunt, Biotechnology 6(10):1149-1154 (1988)、Vigne, Restorative Neurology and Neuroscience 8:35-36 (1995)、Kremer & Perricaudet, British Medical Bulletin 51(1):31-44 (1995)、Haddada et al., in Current Topics in Microbiology and Immunology, Doerfler and Bohm (eds) (1995)、およびYu et al., Gene Therapy 1:13-26 (1994)を参照。
【０７７１】
核酸の非ウイルス送達の方法には、リポフェクション、ヌクレオフェクション、微量注入、遺伝子銃、ビロソーム、リポソーム、免疫リポソーム、ポリ陽イオンまたは脂質−核酸複合体、ネイキッドDNA、人工ウイルス粒子、および薬剤増強DNA取込みが含まれる。リポフェクションは、例えば、米国特許5,049,386号、4,946,787号、および4,897,355号に説明され、リポフェクション試薬は市販されている（例えば、TransfectamTMおよびLipofectinTM）。ポリヌクレオチドの効率的な受容体認識リポフェクションに適する陽イオン性および中性の脂質として、Felgnerからの国際特許出願WO91/17424号およびWO91/16024号が挙げられる。送達は、（例えば、in vitroまたはex vivo投与での）細胞への送達、あるいは（例えば、in vivo投与による）標的組織への送達であってもよい。
【０７７２】
プラスミドの送達は、ガイドRNAをCRISPR-Casタンパク質発現プラスミドにクローンし、細胞培養物中にDNAを形質導入することを含む。プラスミド骨格は市販されていて、特別な設備の必要はない。それらはモジュール式であり、（より大きなサイズのタンパク質をコードするものを含む）異なるサイズのCRISPR-Casコード配列ならびに選択マーカーを保持できるという利点がある。プラスミドのこの両方の利点は、一過性ではあるが持続的な発現を保証できることにある。但し、プラスミドの送達は単純ではないため、その結果、in vivoでの効率は低くなることが多い。持続的な発現はまた、非特異的標的編集を増強するという点で不都合になる可能性がある。さらに、CRISPR-Casタンパク質の過剰な蓄積は、細胞に有毒となる可能性がある。最後に、プラスミドは、特に（特異的標的および非特異的標的で）二本鎖切断が生成されることを考慮すると、dsDNAが宿主ゲノムに無作為に組込まれるリスクを常に抱えている。
【０７７３】
免疫脂質複合体などの標的化リポソームを含む脂質−核酸複合体の調製は、当業者に周知である（例えば、Crystal, Science 270:404-410 (1995)、Blaese et al., Cancer Gene Ther. 2:291-297 (1995)、Behr et al., Bioconjugate Chem. 5:382-389 (1994)、Remy et al., Bioconjugate Chem. 5:647-654 (1994)、Gao et al., Gene Therapy 2:710-722 (1995)、Ahmad et al., Cancer Res. 52:4817-4820 (1992)、米国特許4,186,183号、4,217,344号、4,235,871号、4,261,975号、4,485,054号、4,501,728号、4,774,085号、4,837,028号、および4,946,787号を参照）。これについては、以下に詳述する。
【０７７４】
核酸の送達のためのRNAウイルスまたはDNAウイルスに基づくシステムの使用では、ウイルスを体内の特定細胞に標的化し、ウイルス負荷量を核に輸送するための高度に進化したプロセスを利用する。ウイルスベクターを、患者に（in vivoで）直接的に投与でき、またはそれらベクターを使用して細胞をin vitroで処理でき、改変された細胞は、場合によっては（ex vivoで）患者に投与できる。従来からのウイルスに基づくシステムには、遺伝子導入のためのレトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、および単純ヘルペスウイルスの各ベクターが含まれる可能性がある。宿主ゲノムへの組込みは、レトロウイルス、レンチウイルス、およびアデノ随伴ウイルスの遺伝子導入法によって可能であり、挿入された導入遺伝子に長期の発現をもたらす場合が多い。さらに、高い遺伝子導入効率が、多くの種々の細胞型および標的組織内で観察されている。
【０７７５】
レトロウイルスの指向性は、外来外膜タンパク質を組み込むことによって変更され、標的細胞の潜在的な標的集団を伸長できる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞に遺伝子導入または感染させることができ、かつ典型的には高いウイルス力価を生み出すレトロウイルスベクターである。従って、レトロウイルス遺伝子導入システムの選択は、標的組織に依存してもよい。レトロウイルスベクターは、最大6〜10kbの外来配列の封入能力を備えたシス作用性の長末端反復配列から構成されている。最小のシス作用性LTRは、ベクターの複製と封入には十分であり、次にそれを使用して、治療遺伝子を標的細胞中に組み込んで永続的な導入遺伝子の発現を提供する。広く使用されているレトロウイルスベクターには、マウス白血病ウイルス (MuLV)、テナガザル白血病ウイルス(GaLV)、シミアン免疫不全ウイルス (SIV)、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)、およびそれらの組合せに基づくベクターが含まれる（例えば、Buchscher et al., J. Virol. 66:2731-2739 (1992)、Johann et al., J. Virol. 66:1635-1640 (1992)、Sommnerfelt et al., Virol. 176:58-59 (1990)、Wilson et al., J. Virol. 63:2374-2378 (1989)、Miller et al., J. Virol. 65:2220-2224 (1991)、および国際特許出願PCT/US94/05700号を参照）。
【０７７６】
一過性の発現が好ましい用途では、アデノウイルスに基づくシステムを使用してもよい。アデノウイルスに基づくベクターは、多くの細胞型で非常に高い遺伝子導入効率を達成でき、かつ細胞分裂を必要としない。このベクターの使用により、高い力価および発現水準が得られている。このベクターは、比較的簡潔な方法で大量に生成できる。アデノ随伴ウイルス（「AAV」）ベクターはまた、例えば、核酸およびペプチドのin vitroでの生成において、かつin vivoおよびex vivoでの遺伝子治療手順のために、標的核酸により細胞を形質導入するのに使用できる（例えば、West et al., Virology 160:38-47 (1987)、米国特許4,797,368号、国際特許出願WO 93/24641号、Kotin, Human Gene Therapy 5:793-801 (1994)、およびMuzyczka, J. Clin. Invest. 94:1351 (1994)を参照）。組換えAAVベクターの構築は、米国特許5,173,414号、Tratschin et al., Mol. Cell. Biol. 5:3251-3260 (1985)、Tratschin, et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072-2081 (1984)、Hermonat & Muzyczka, PNAS 81:6466-6470 (1984)、およびSamulski et al., J. Virol. 63:03822-3828 (1989)などの複数の出版物に説明されている。
【０７７７】
本発明は、CRISPRシステムをコードする外因性核酸分子、例えば複数のカセットを含む、あるいは本質的にそれからなるAAVを提供する。例えばこの複数のカセットは、プロモーター、C2c1などのCRISPR会合 (Cas)タンパク質（推定ヌクレアーゼまたはヘリカーゼタンパク質）、ターミネーター、および好ましくは最大封入限界サイズの１つ以上のベクターをコードする核酸分子を含む、あるいは本質的にそれらからなる第１のカセットを含み、あるいはそのカセットからなり、例えば（第１のカセットを含む）合計５つのカセットは、プロモーター、ガイドRNA (gRNA)をコードする核酸分子、およびターミネーター、または２つ以上の個別のrAAVを含む、あるいは本質的にそれからなる（例えば、各カセットは、プロモーター−gRNA1−ターミネーター、プロモーター−gRNA2−ターミネーター・・・プロモーター−gRNA(N)−ターミネーターとして概略的に表され、式中のNは、ベクターの封入サイズ限界の上限にある挿入可能な数である）。２つ以上の個別のrAAVのそれぞれは、CRISPRシステムの１つ以上のカセットを含み、例えば第１のrAAVは、プロモーター、Cas (C2c1)などのCasをコードする核酸分子、およびターミネーターを含む、あるいは本質的にそれらからなる第１のカセットを含み、かつ第２のrAAVは、それぞれがプロモーター、ガイドRNA (gRNA)をコードする核酸分子、およびターミネーターを含む、あるいは本質的にそれらからなる１つ以上のカセット（例えば、プロモーター−gRNA1−ターミネーター、プロモーター−gRNA2−ターミネーター・・・プロモーター−gRNA(N)−ターミネーターとして概略的に表され、式中のNは、ベクターの封入サイズ限界の上限にある挿入可能な数である）を含む。あるいは、C2c1はその独自のcrRNA／gRNAを処理できるので、単一のcrRNA／gRNA配列を多重遺伝子編集に使用できる。従って、gRNAを送達するために複数のカセットを含む代わりに、rAAVは、プロモーター、複数のcrRNA／gRNA、およびターミネーターを含む、または本質的にそれらからなる単一のカセット（例えば、プロモーター−gRNA1−gRNA2・・・gRNA(N)−ターミネーターとして概略的に表され、式中のNは、ベクターの封入サイズ限界の上限にある挿入可能な数である）を含んでもよい。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるZetsche et al Nature Biotechnology 35, 31-34 (2017)を参照。rAAVはDNAウイルスであるので、AAVまたはrAAVに関する本明細書の説明の核酸分子は、有利にはDNAである。プロモーターは、実施態様によっては、有利には、ヒトシナプシンIプロモーター (hSyn)である。核酸を細胞に送達するための別の方法は、当業者に知られている。例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開20030087817号を参照。
【０７７８】
別の実施態様では、球菌ベシクロウイルス外膜偽型レトロウイルスベクター粒子が想定される（例えば、Fred Hutchinson癌研究センターに譲渡された米国特許公開第20120164118号を参照）。球菌ウイルスはベシクロウイルス属に属し、哺乳類の水胞性口内炎の原因物質である。球菌ウイルスは、元々トリニダードのダニから単離され（Jonkers et al., Am. J. Vet. Res. 25:236-242 (1964)）、感染は、トリニダード、ブラジル、アルゼンチンで、昆虫、ウシ、およびウマから見出されている。哺乳類に感染するベシクロウイルスの多くは、自然に感染した節足動物から単離されていて、それらは節足動物媒介性であることを示唆している。ベシクロウイルスに対する抗体は、ウイルスが風土性である農村地域に住む人々の間で一般的であり、かつ実験室で取得され、ヒトへの感染では通常インフルエンザのような症状を引き起こす。球菌ウイルス外膜糖タンパク質は、アミノ酸水準でVSV-Gインディアナ株と71.5％の同一性を共有し、ベシクロウイルスの外膜遺伝子の系統発生的比較では、ベシクロウイルスの中のVSV-Gインディアナ株とは球菌ウイルスは血清学的に異なるものの、最も密接に関連していることを示している。Jonkers et al., Am. J. Vet. Res. 25:236-242 (1964)、およびTravassos da Rosa et al., Am. J. Tropical Med. & Hygiene 33:999-1006 (1984)を参照。球菌ベシクロウイルス外膜偽型レトロウイルスベクター粒子には、例えば、レンチウイルス、αレトロウイルス、βレトロウイルス、γレトロウイルス、δレトロウイルス、およびεレトロウイルスの各ベクター粒子を含んでもよく、これらには、レトロウイルスのGag、Pol、および／または１つ以上の補助タンパク質、および球菌ベシクロウイルス外膜タンパク質を含んでもよい。これらの実施態様の特定の側面では、Gag、Pol、および補助タンパク質は、レンチウイルスおよび／またはγレトロウイルスである。
【０７７９】
実施態様によっては、宿主細胞は、本明細書に記載される１つ以上のベクターで一過的または非一過的に形質導入される。実施態様によっては、細胞は、場合によってはその内部に再導入される対象内で自然発生するように形質導入される。実施態様によっては、形質導入された細胞は、対象から採取される。実施態様によっては、細胞は、細胞株など、対象から採取された細胞に由来する。組織培養のための多種多様な細胞株が当技術分野では知られている。細胞株の例として、限定はされないが、C8161、CCRF-CEM、MOLT、mIMCD-3、NHDF、HeLa-S3、Huh1、Huh4、Huh7、HUVEC、HASMC、HEKn、HEKa、MiaPaCell、Panc1、PC-3、TF1、CTLL-2、C1R、Rat6、CV1、RPTE、A10、T24、J82、A375、ARH-77、Calu1、SW480、SW620、SKOV3、SK-UT、CaCo2、P388D1、SEM-K2、WEHI- 231、HB56、TIB55、Jurkat、J45.01、LRMB、Bcl-1、BC-3、IC21、DLD2、Raw264.7、NRK、NRK-52E、MRC5、MEF、Hep G2、HeLa B、HeLa T4、COS、COS-1、COS-6、COS-M6A、BS-C-1サル腎臓上皮細胞、BALB/3T3マウス胚繊維芽細胞、3T3 Swiss、3T3-L1、132-d5ヒト胎児繊維芽細胞、10.1マウス繊維芽細胞、293-T、3T3、721、9L、A2780、A2780ADR、A2780cis、A172、A20、A253、A431、A-549、ALC、B16、B35、BCP-1細胞、BEAS-2B、bEnd.3、BHK-21、BR 293、BxPC3、C3H-10T1/2、C6/36、Cal-27、CHO、CHO-7、CHO-IR、CHO-K1、CHO-K2、CHO-T、CHO Dhfr -/-、COR-L23、COR-L23/CPR、COR-L23/5010、COR-L23/R23、COS-7、COV-434、CML T1、CMT、CT26、D17、DH82、DU145、DuCaP、EL4、EM2、EM3、EMT6/AR1、EMT6/AR10.0、FM3、H1299、H69、HB54、HB55、HCA2、HEK-293、HeLa、Hepa1c1c7、HL-60、HMEC、HT-29、Jurkat、JY細胞、K562細胞、Ku812、KCL22、KG1、KYO1、LNCap、Ma-Mel 1-48、MC-38、MCF-7、MCF-10A、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-435、MDCK II 、MDCK II、MOR/0.2R、MONO-MAC 6、MTD-1A、MyEnd、NCI-H69/CPR、NCI-H69/LX10、NCI-H69/LX20、NCI-H69/LX4、NIH-3T3、NALM-1、NW-145、OPCN/OPCT細胞株、Peer、PNT-1A/PNT 2、RenCa、RIN-5F、RMA/RMAS、Saos-2細胞、Sf-9、SkBr3、T2、T-47D、T84、THP1細胞株、U373、U87、U937、VCaP、Vero細胞、WM39、WT-49、X63、YAC-1、YAR、およびそれらの遺伝子導入種が挙げられる。細胞株は、当業者に知られている様々な供給源から入手可能である（例えば、米国培養細胞系統保存機関（ATCC; Manassus, Va.）を参照）。
【０７８０】
特定の実施態様では、AD機能化CRISPRシステムの１つ以上の構成要素の一過性の発現および／またはその存在により、非特異的標的効果を低減することを目的とする。実施態様によっては、本明細書に説明の１つ以上のベクターで形質導入された細胞を使用して、１つ以上のベクター由来配列を含む新規の細胞株を構築する。実施態様によっては、（例えば、１つ以上のベクターの一過性の形質導入またはRNAによる形質導入によって）本明細書に説明のAD機能化CRISPRシステムの構成要素で一過的に形質導入され、かつCRISPR複合体の活性を介して改変される細胞を使用して、改変を含むが他の外因性配列を欠く細胞を含む新規の細胞株を構築する。実施態様によっては、本明細書に説明の１つ以上のベクターで一過的または非一過的に形質導入された細胞、またはその細胞に由来する細胞株は、１つ以上の試験化合物を評価する際に使用される。
【０７８１】
実施態様によっては、RNAおよび／またはタンパク質を宿主細胞に直接的に導入することが想定される。例えば、CRISPR-Casタンパク質は、in vitroで転写されたガイドRNAとともにmRNAをコードするように送達できる。この方法は、CRISPR-Casタンパク質の効果を確定する時間を短縮でき、さらにCRISPRシステム成分の長期に亘る発現を防止できる。
【０７８２】
実施態様によっては、本発明のRNA分子は、リポソーム製剤またはリポフェクチン製剤などで送達され、これは当業者に周知の方法によって調製できる。その方法は、例えば、米国特許5,593,972号、5,589,466号、および5,580,859号に説明され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。特に哺乳動物細胞中へのsiRNA送達の増強および改善を目的とした送達システムが開発されていて（例えば、Shen et al FEBS Let. 2003, 539:111-114、Xia et al., Nat. Biotech. 2002, 20:1006-1010、Reich et al., Mol. Vision. 2003, 9: 210-216、Sorensen et al., J. Mol. Biol. 2003, 327: 761-766、Lewis et al., Nat. Gen. 2002, 32: 107-108、およびSimeoni et al., NAR 2003, 31, 11: 2717-2724を参照）、本発明に適用することができる。最近、siRNAの霊長類での遺伝子発現の阻害への使用にも成功している（例えば、本発明に適用され得るTolentino et al., Retina 24(4):660を参照）。
【０７８３】
実際、RNA送達は、in vivo送達の有用な方法である。リポソームまたは粒子を使用して、CcC1、アデノシンデアミナーゼ、およびガイドRNAを細胞内に送達することが可能である。従って、C2c1などのCRISPR-Casタンパク質の送達、（CRISPR-Casタンパク質またはアダプタータンパク質に融合され得る）アデノシンデアミナーゼの送達、および／または本発明のRNAの送達は、RNA形態であってもよく、微小胞、リポソーム、粒子、またはナノ粒子を介してもよい。例えば、C2c1 mRNA、アデノシンデアミナーゼmRNA、およびガイドRNAは、in vivoでの送達のためにリポソーム粒子中に封入できる。Life Technologies製のリポフェクタミンなどのリポソーム形質導入試薬や市販のその他の試薬は、RNA分子を肝臓内に効果的に送達できる。
【０７８４】
RNAの好ましい送達手段はまた、粒子（Cho, S., Goldberg, M., Son, S., Xu, Q., Yang, F., Mei, Y., Bogatyrev, S., Langer, R. and Anderson, D., Lipid-like nanoparticles for small interfering RNA delivery to endothelial cells（内皮細胞への低分子干渉RNA送達のための脂質様ナノ粒子）, Advanced Functional Materials, 19: 3112-3118, 2010）またはエキソソーム（Schroeder, A., Levins, C., Cortez, C., Langer, R., and Anderson, D., Lipid-based nanotherapeutics for siRNA delivery （siRNA送達のための脂質系ナノ治療薬）, Journal of Internal Medicine, 267: 9-21, 2010, PMID: 20059641）を介するRNAの送達を含む。実際、エキソソームは、CRISPRシステムといくつかの類似点を備える、特にsiRNAの送達に有用であるシステムであることが示されている。例えば、El-Andaloussi Sら（“Exosome-mediated delivery of siRNA in vitro and in vivo.”（「in vitroおよびin vivoでのsiRNAのエキソソーム媒介送達」）Nat Protoc. 2012 Dec;7(12):2112-26. doi: 10.1038/nprot.2012.131. Epub 2012 Nov 15.）は、エキソソームが種々の生物学的障壁を越える薬物送達のためにいかに有望なツールであり、かつどのようにin vitroおよびin vivoでのsiRNAの送達に利用できるかを説明している。彼らの検討では、まずペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質を含む発現ベクターの形質導入を通して標的エキソソームを生成する。次にエキソソームを、形質導入された細胞上清から精製しかつその特性を明らかにし、その後にRNAをエキソソーム中に詰め込む。本発明による送達または投与は、特に脳内とは限定はされないが、エキソソームを用いて実施できる。ビタミンE（α-トコフェロール）をCRISPR-Casと結合して、高密度リポタンパク質 (HDL)とともに、例えばUnoら（HUMAN GENE THERAPY（ヒト遺伝子療法）22:711-719 (June 2011)）が脳への短鎖干渉RNA (siRNA)の送達の為に実施したのと類似の方法で脳に送達できる。マウスが、リン酸緩衝生理食塩水 (PBS)または遊離TocsiBACEまたはToc-siBACE/HDLで満たされた浸透圧ミニポンプ（model 1007D; Alzet, Cupertino, CA）を介して注入され、Brain Infusion Kit 3（Alzet）に接続された。脳注入排管は、背側の第三脳室への注入のために正中線の十字縫合部の約0.5mm後方に配置された。Unoらは、HDLを含むわずか3 nmolのToc-siRNAが、同じICV注入法によって同等程度に標的の減弱を誘発する可能性があることを発見した。α-トコフェロールに結合し脳を標的とするHDLとともに同時投与される類似の投与用量のCRISPR Casが、本発明でのヒトに対して想定することができ、例えば、脳を標的とする約3 nmol〜約3 μmolのCRISPR Casが想定できる。Zouら（HUMAN GENE THERAPY（ヒト遺伝子療法）22:465-475 (April 2011)）は、ラットの脊髄でのin vivoの遺伝子サイレンシングのために、PKCγを標的とする短ヘアピンRNAのレンチウイルス媒介による送達方法を説明している。Zouらは、くも膜下腔内カテーテルにより、1 x 109遺伝子導入単位 (TU)/mlの力価を有する約10 μlの組換えレンチウイルスを投与した。脳を標的とするレンチウイルスベクターで発現される類似の用量のCRISPR Casを、例えば本発明のヒトについて想定してもよく、1 x 109遺伝子導入単位 (TU)/mlの力価を有するレンチウイルスでの脳を標的とする約10〜50 mlのCRISPR Casが想定されてもよい。
ベクターの投与用量
【０７８５】
実施態様によっては、ベクター、例えば、プラスミドベクターまたはウイルスベクターは、例えば、筋肉内注射によって関心のある組織に送達され、その他の場合には、送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、口腔内、粘膜内、または他の送達方法を介する。その送達は、単回投与あるいは複数回投与のいずれかであってもよい。当業者には、本明細書で送達される実際の用量は、ベクターの選択、標的細胞、生物、または組織、治療される対象の一般的な症状、必要とされる変容／改変の程度、投与経路、投与様式、必要とされる変容／改変の形態などの種々の因子に依って、大幅に変更してもよいことが分かっている。
【０７８６】
その投与用量にはさらに、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセリン、乳糖、ショ糖、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容される担体（例えばリン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容される賦形剤、および／または当技術分野で既知の他の化合物が含まれる。用量にはさらに、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの鉱酸塩、および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸塩の１つ以上の薬学的に許容される塩を含んでもよい。さらに、湿潤剤または乳化剤、pH緩衝物質、ゲルまたはゲル化材料、香料、着色剤、小球体、ポリマー、懸濁剤などの補助物質が、本発明中では存在してもよい。さらに、防腐剤、保湿剤、懸濁剤、界面活性剤、抗酸化剤、凝固防止剤、充填剤、キレート剤、被覆剤、化学安定剤などの１つ以上のその他の従来からの医薬成分もまた、特に剤形が再構成可能な形状である場合には、存在してもよい。適切な成分例として、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート80、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン、およびそれらの組合せが含まれる。薬学的に許容される賦形剤の詳細は、参照により本明細書に組み込まれるREMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES（レミントンの薬科学）(Mack Pub. Co., N.J. 1991)に説明されている。
【０７８７】
本明細書の一実施態様では、送達は、アデノウイルスを介し、この送達では、少なくとも1 x 105粒子（粒子単位；puとも呼ばれる）のアデノウイルスベクターを含む単回の促進用量であってもよい。本明細書の一実施態様では、この用量は、好ましくは少なくとも約1 x 106粒子（例えば、約1 x 106〜1 x 1012粒子）、より好ましくは少なくとも約1 x 107粒子、より好ましくは少なくとも約1 x 108粒子（例えば、約1 x 108〜1 x 1011粒子、または約1 x 108〜1 x 1012粒子）、かつ最も好ましくは少なくとも約1 x 100粒子（例えば、約1 x 109〜1 x 1010粒子、または約1 x 109〜1 x 1012粒子）、あるいは少なくとも約1 x 1010粒子（例えば、約1 x 1010〜1 x 1012粒子）のアデノウイルスベクターである。あるいは、この用量は、約1 x 1014粒子以下、好ましくは約1 x 1013粒子以下、さらにより好ましくは約1 x 1012粒子以下、さらにより好ましくは約1 x 1011粒子以下、かつ最も好ましくは、約1 x 1010粒子以下（例えば、約1 x 109粒子以下）である。従って、この用量は、例えば、約1 x 106粒子単位 (pu)、約2 x 106 pu、約4 x 106 pu、約1 x 107 pu、約2 x 107 pu、約4 x 107 pu、約1 x 108 pu、約2 x 108 pu、約4 x 108 pu、約1 x 109 pu、約2 x 109 pu、約4 x 109 pu、約1 x 1010 pu、約2 x 1010 pu、約4 x 1010 pu、約1 x 1011 pu、約2 x 1011 pu、約4 x 1011 pu、約1 x 1012 pu、約2 x 1012 pu、または約4 x 1012puのアデノウイルスベクターを有するアデノウイルスベクターの単回用量を含んでもよい。例えば、参照により本明細書に組み込まれる、Nabelらが2013年6月4日に出願した米国特許8,454,972 B2号の29列の36〜58行目に示される用量のアデノウイルスベクターを参照。本明細書の一実施態様では、アデノウイルスは、複数回用量で送達される。
【０７８８】
本明細書の一実施態様では、送達は、AAVを介する。ヒトへのAAVのin vivo送達のための治療有効用量は、約1 x 1010〜約1 x 1010の機能AAV/ml溶液を含む約20〜約50 mlの生理食塩水の範囲であると考えられる。用量は、治療効果と副作用が平衡するように調整されてもよい。本明細書の一実施態様では、AAV用量は、一般に、約1 x 105〜1 x 1050のゲノムAAV、約1 x 108〜1 x 1020のゲノムAAV、約1 x 1010〜約1 x 1016のゲノムAAV、または約1 x1011〜約1x1016のゲノムAAVの濃度範囲にある。ヒトへの用量は、約1 x 1013のゲノムAAVであってもよい。その濃度として、約0.001ml〜約100 ml、約0.05 ml〜約50 ml、または約10 ml〜約25 mlの担体溶液により送達されてもよい。その他の有効な用量は、用量応答曲線を確立する日常的な試験を通して当業者なら容易に明確にできる。例えば、2013年3月26日にHajjarらが出願した米国特許8,404,658 B2号の27列の45〜60行目を参照。
【０７８９】
本明細書の一実施態様では、送達はプラスミドを介する。このプラスミド組成物では、用量を、応答を誘発するのに十分なプラスミドの量とすべきである。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドDNAの適切な量は、70 kgの個体あたり約0.1〜約2 mgまたは約1 μg〜約10 μgであってもよい。本発明のプラスミドは、一般に、（i）プロモーター、（ii）前記プロモーターに操作可能に連結された、CRISPR-Casタンパク質をコードする配列、（iii）選択可能なマーカー、（iv）複製の起点、および（v）（ii）の下流にあり（ii）に操作可能に連結されている転写ターミネーターを含む。プラスミドは、CRISPR複合体のRNA成分をコードすることもできるが、代わりにこれらの１つ以上を別のベクターにコードしてもよい。
【０７９０】
本明細書の用量は、平均として70 kgの個体に基づく。投与の頻度は、例えば、医師または獣医、あるいは当業者が決定する範囲内である。なお、実験で使用されるマウスは典型的には約20 gであり、マウス実験から70 kgの個体まで拡大できる。
【０７９１】
本明細書に提供の組成物に使用される用量は、反復投与または反復投薬のための用量を含む。特定の実施態様では、投与は、数週間、数ヶ月、または数年の期間内で繰り返される。最適な投与計画を得るために、適切な測定を実施してもよい。反復投与により、より低用量を使用できるようになり、非特異的標的の改善に良好な影響を及ぼすことができる。
RNA送達
【０７９２】
特定の実施態様では、RNAに基づく送達が使用される。これらの実施態様では、CRISPR-Casタンパク質のmRNA、（CRISPR-Casタンパク質またはアダプターに融合され得る）アデノシンデアミナーゼのmRNAは、in vitroで転写されたガイドRNAと共に送達される。Liangらは、RNAに基づく送達を使用する効率的なゲノム編集について説明している（Protein Cell. 2015 May; 6(5): 363-372）。実施態様によっては、C2c1および／またはアデノシンデアミナーゼをコードするmRNAは、化学的に改変でき、これは、プラスミドにコードされたC2c1および／またはアデノシンデアミナーゼと比較して、活性を改善できる。例えば、mRNA中のウリジンは、疑似ウリジン (Ψ)、N1-メチル疑似ウリジン (me1Ψ)、5-メトキシウリジン (5moU)で部分的にまたは完全に置換できる。参照によりその全体が本明細書に組み込まれるLi et al., Nature Biomedical Engineering 1, 0066 DOI:10.1038/s41551-017-0066 (2017)を参照。
送達手法の例示
RNP
【０７９３】
特定の実施態様では、予め複合化されたガイドRNA、CRISPR-Casタンパク質、および（CRISPR-Casタンパク質またはアダプターに融合され得る）アデノシンデアミナーゼは、リボヌクレオタンパク質 (RNP)として送達される。RNPには、RNA法よりもさらに迅速な編集効果が得られるという利点があり、というのは、このプロセスでは転写が不要になるからである。重要な利点は、両方のRNPの送達は一過的なものであり、非特異的標的効果および毒性の問題が軽減されることである。種々の細胞型での効率的なゲノム編集は、Kim et al. (2014, Genome Res. 24(6):1012-9), Paix et al. (2015, Genetics 204(1):47-54)、Paix et al. (2015, Genetics 204(1):47-54)、Chu et al. (2016, BMC Biotechnol. 16:4)、およびWang et al. (2013, Cell. 9;153(4):910-8)によって観察されている。
【０７９４】
特定の実施態様では、リボ核タンパク質は、国際特許出願WO2016161516号に説明されるように、ポリペプチドに基づくシャトル剤を介して送達される。WO2016161516号は、細胞透過性ドメイン (CPD)に、またはヒスチジン富化ドメインおよびCPDに操作可能に連結されたエンドソーム漏出ドメイン (ELD)を含む合成ペプチドを使用するポリペプチドカーゴの効率的な伝達を説明している。同様に、これらのポリペプチドを、真核細胞でのCRISPRエフェクターに基づくRNPの送達のために使用できる。
粒子
【０７９５】
側面または実施態様によっては、送達粒子製剤を含む組成物を使用してもよい。側面または実施態様によっては、製剤は、CRISPR複合体、CRISPRタンパク質を含む複合体、およびCRISPR複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導するガイドを含む。実施態様によっては、送達粒子は、脂質系の粒子、場合によっては脂質ナノ粒子、または陽イオン性脂質、および場合によっては生分解性ポリマーを含む。実施態様によっては、陽イオン性脂質は、1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン (DOTAP)を含む。実施態様によっては、親水性ポリマーは、エチレングリコールまたはポリエチレングリコールを含む。実施態様によっては、送達粒子はさらに、リポタンパク質、好ましくはコレステロールを含む。実施態様によっては、送達粒子は、直径500 nm未満、場合によっては直径250 nm未満、場合によっては直径100 nm未満、場合によっては直径約35 nm〜約60 nmである。
【０７９６】
いくつかの種の粒子送達システムおよび／または製剤が、多様な範囲の生物医学的用途に有用であることが知られている。一般に、粒子は、その移動性と特性に関して全体単位として動作する小さな物体として定義される。粒子はさらに直径によって分類される。粗粒子は2,500〜10,000 nmの範囲にある。微粒子は100〜2,500 nmのサイズである。超微粒子またはナノ粒子は、一般に、1〜100 nmのサイズである。100 nmの限界値は、塊の材料とは異なる粒子での新規の特性が、通常100nm未満の臨界長さ寸法で発生するという事実に基づいている。
【０７９７】
本明細書で使用される場合に、粒子送達システム／製剤は、本発明による粒子を含む任意の生体送達システム／製剤として定義される。本発明による粒子は、（例えば直径で）100 μm未満の最大寸法を有する任意の物体である。実施態様によっては、本発明の粒子は、10 μm未満の最大寸法を有する。実施態様によっては、本発明の粒子は、2000 nm未満の最大寸法を有する。実施態様によっては、本発明の粒子は、1000 nm未満の最大寸法を有する。実施態様によっては、本発明の粒子は、900 nm、800 nm、700 nm、600 nm、500 nm、400 nm、300 nm、200 nm、または100 nm未満の最大寸法を有する。典型的には、本発明の粒子は、（例えば直径で）500 nm以下の最大寸法を有する。実施態様によっては、本発明の粒子は、（例えば直径で）250 nm以下の最大寸法を有する。実施態様によっては、本発明の粒子は、（例えば直径で）200 nm以下の最大寸法を有する。実施態様によっては、本発明の粒子は、（例えば直径で）150 nm以下の最大寸法を有する。実施態様によっては、本発明の粒子は、（例えば直径で）100 nm以下の最大寸法を有する。本発明の実施態様によっては、例えば、50 nm以下の最大寸法を有するより小さな粒子が使用される。実施態様によっては、本発明の粒子は、25 nm〜200 nmの範囲の最大寸法を有する。
【０７９８】
本発明に関して、CRISPR複合体の１つ以上の成分、例えば、CRISPR-Casタンパク質またはmRNA、あるいは（CRISPR-Casタンパク質またはアダプターに融合され得る）アデノシンデアミナーゼまたはmRNA、あるいはナノ粒子または脂質外膜を使用して送達されるガイドRNAを持つことが好ましい。その他の送達システムまたはベクターを、本発明の粒子の側面と組み合わせて使用してもよい。
【０７９９】
一般に、「ナノ粒子」は、1000 nm未満の直径を有する任意の粒子を指す。特定の実施態様では、本発明のナノ粒子は、（例えば直径で）500 nm以下の最大寸法を有する。他の実施態様では、本発明のナノ粒子は、25 nm〜200 nmの範囲の最大寸法を有する。他の実施態様では、本発明のナノ粒子は、100 nm以下の最大寸法を有する。他の実施態様では、本発明のナノ粒子は、35 nm〜60 nmの範囲の最大寸法を有する。なお本明細書での粒子またはナノ粒子は、適切な場合には、互換的に述べられてもよい。
【０８００】
なお粒子のサイズは、そのサイズが充填の前あるいは後に測定されるかどうかに依って異なる。従って、特定の実施態様では、用語「ナノ粒子」は、充填前の粒子にのみ使用されてもよい。
【０８０１】
本発明に包含される粒子は、異なる形態で、例えば、固形粒子（例えば、銀、金、鉄、チタンなどの金属、非金属、脂質系固体、ポリマー）、粒子の懸濁液、またはそれらの組合せとして提供されてもよい。金属、誘電体、および半導体の各粒子、ならびに混成物構造（例えば、コア−シェル粒子）を調製してもよい。半導体材料から作製される粒子は、電子エネルギー準位の量子化が発生する程度に十分に小さい（典型的には10 nm未満）場合には、量子ドットと標識してもよい。そのようなナノ寸法の粒子は、薬物担体または造影剤のような生体用途に使用され、本発明での類似の目的に適合できる。
【０８０２】
半固形粒子および軟質粒子が製造されており、それらは本発明の範囲内である。半固形の性質の原形粒子はリポソームである。種々の種類のリポソーム粒子が、現在、抗癌剤やワクチンの送達システムとして臨床的に使用されている。一方の半分が親水性で他方の半分が疎水性の粒子はヤヌス粒子と呼ばれ、乳濁液を安定化するのに特に効果的である。それらは水／油の界面で自己組織化し、固形界面活性剤として機能できる。
【０８０３】
（例えば、形態、寸法などの特性解析を含む）粒子の特性解析は、様々な異なる技術を用いて実施される。一般的な手法は、電子顕微鏡 (TEM、SEM)、原子間力顕微鏡 (AFM)、動的光散乱 (DLS)、X線光電子分光法 (XPS)、粉末X線回折 (XRD)、フーリエ変換赤外分光法(FTIR)、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析 (MALDI-TOF)、紫外可視分光法、二面偏光干渉計、および核磁気共鳴 (NMR)である。特性解析（寸法測定）を、天然粒子（すなわち詰込み前）、またはカーゴ（本明細書でのカーゴは、例えば、CRISPR-Casシステムの１つ以上の成分、例えば、CRISPR-Casタンパク質またはmRNA、（CRISPR-Casタンパク質またはアダプターに融合し得る）アデノシンデアミナーゼまたはmRNA、あるいはガイドRNA、あるいはそれらの任意の組合せを指し、かつ追加の担体および／または賦形剤を含んでもよい）の詰込み後に実施して、本発明の任意のin vitro、ex vivo、および／またはin vivo適用での送達に最適なサイズの粒子を提供する。特定の好ましい実施態様では、粒子の寸法（例えば直径）の特性解析は、動的レーザー散乱 (DLS)を使用する測定に基づく。粒子、それらの製造方法および使用方法、ならびにその測定に関して、米国特許8,709,843号、米国特許6,007,845号、米国特許5,855,913号、米国特許5,985,309号、米国特許5,543,158号、および2014年5月11日にdoi:10.1038/nnano.2014.84でオンライン公開されたJames E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014)の刊行物に述べられている。
【０８０４】
本発明の範囲内の粒子送達システムは、限定はされないが、固形、半固形、乳濁液、またはコロイドの各粒子を含む任意の形態で提供されてもよい。従って、限定はされないが、例えば、脂質系システム、リポソーム、ミセル、微小胞、エキソソーム、または遺伝子銃を含む本明細書に説明の送達システムのいずれかが、本発明の範囲内の粒子送達システムとして提供されてもよい。
【０８０５】
CRISPR-Casタンパク質mRNA、（CRISPR-Casタンパク質またはアダプターに融合され得る）アデノシンデアミナーゼまたはmRNA、およびガイドRNAは、粒子または脂質外膜を用いて同時に送達されてもよい。例えば、本発明のCRISPR-Casタンパク質およびRNAは、例えば複合体として、Dahlmanらの国際特許出願WO2015089419 A2号、およびその中に引用された文献にあるような粒子、例えば7C1（例えば2014年5月11日にdoi:10.1038/nnano.2014.84でオンライン公開されたJames E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014)を参照）を介して送達されてもよい。例えば、送達粒子は、脂質またはリピドイド、および親水性ポリマー、例えばカチオン性脂質親水性ポリマーを含み、ここで例えばカチオン性脂質は、1,2−ジオレオイル−3−トリメチルアンモニウム−プロパン (DOTAP)、または1,2−ジテトラデカノイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン (DMPC)を含み、および／または親水性ポリマーは、エチレングリコールまたはポリエチレングリコール (PEG)を含み、かつ／あるいは、粒子はさらにコレステロールを含む（例えば、製剤番号1：DOTAP 100、DMPC 0、PEG 0、コレステロール0からの粒子、製剤番号2：DOTAP 90、DMPC 0、PEG 10、コレステロール0からの粒子、製剤番号3：DOTAP 90、DMPC 0、PEG 5、コレステロール5からの粒子など）。粒子は、まずエフェクタータンパク質とRNAを、例えば1：1のモル比で、例えば室温で、例えば30分間、例えば無菌のヌクレアーゼ不含の1X PBS中で混合し、製剤に適用可能なDOTAP、DMPC、PEG、およびコレステロールを個別に、アルコール、例えば100%エタノール中に溶解し、２つの溶液を共に混合して複合体を含有する粒子を形成する、効率的な多段階工程を使用して形成される。
【０８０６】
核酸標的化エフェクタータンパク質（例えば、C2c1などのV型タンパク質）mRNAおよびガイドRNAは、粒子または脂質外膜を使用して同時に送達されてもよい。適切な粒子の例として、米国特許9,301,923号に説明される粒子が挙げられるが、これに限定はされない。
【０８０７】
例えば、Su X、Fricke J、Kavanagh DG、およびIrvine DJ（“In vitro and in vivo mRNA delivery using lipid-enveloped pH-responsive polymer nanoparticles”「脂質外膜pH応答性ポリマーナノ粒子を用いるin vitroおよびin vivo mRNA送達」Mol Pharm. 2011 Jun 6;8(3):774-87. doi: 10.1021/mp100390w. Epub 2011 Apr 1）は、リン脂質の二層シェルにより封入されたポリ（β-アミノエステル）(PBAE)コアを備えた生分解性コア−シェル構造粒子を説明している。これらは、in vivoでのmRNA送達のために開発された。pH応答性PBAE成分は、エンドソームの分解を促進するために選択され、脂質表面層は、ポリ陽イオンコアの毒性を最小限に抑えるように選択された。従って、この成分は本発明のRNAの送達用に好ましい。
【０８０８】
一実施態様では、自己組織化生体接着性ポリマーに基づく粒子／ナノ粒子が想定され、これは、ペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達、およびペプチドの経鼻送達に適用され、全てが脳への送達に適用されてもよい。疎水性薬物の経口吸収および眼内送達などの他の実施態様もまた想定される。分子外膜技術は、保護されかつ疾患部位に送達される操作されたポリマー外膜を含む（例えば、Mazza, M. et al. ACSNano, 2013. 7(2): 1016-1026、Siew, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(1):14-28、Lalatsa, A., et al. J Contr Rel, 2012. 161(2):523-36、Lalatsa, A., et al., Mol Pharm, 2012. 9(6):1665-80、Lalatsa, A., et al. Mol Pharm, 2012. 9(6):1764-74、Garrett, N.L., et al. J Biophotonics, 2012. 5(5-6):458-68、Garrett, N.L., et al. J Raman Spect, 2012. 43(5):681-688、Ahmad, S., et al. J Royal Soc Interface 2010. 7:S423-33、Uchegbu, I.F. Expert Opin Drug Deliv, 2006. 3(5):629-40、Qu, X.,et al. Biomacromolecules, 2006. 7(12):3452-9、およびUchegbu, I.F., et al. Int J Pharm, 2001. 224:185-199を参照）。標的組織に応じて、単回または複数回の投与で、約5 mg/kgの投与が想定される。
【０８０９】
一実施態様では、MITのDan Andersonの研究室によって開発された腫瘍増殖を停止するためのRNAを癌細胞に送達できる粒子／ナノ粒子を使用でき、かつ／あるいは本発明のAD機能化CRISPR-Casシステムに適合させることができる。特に、Andersonの研究室は、新規の生体材料およびナノ製剤の合成、精製、特性解析、および製剤化のための完全に自動化された組合せのシステムを開発した。例えば、Alabi et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 2013 Aug 6;110(32):12881-6、Zhang et al., Adv Mater. 2013 Sep 6;25(33):4641-5、Jiang et al., Nano Lett. 2013 Mar 13;13(3):1059-64、Karagiannis et al., ACS Nano. 2012 Oct 23;6(10):8484-7、Whitehead et al., ACS Nano. 2012 Aug 28;6(8):6922-9、およびLee et al., Nat Nanotechnol. 2012 Jun 3;7(6):389-93を参照。
【０８１０】
米国特許公開20110293703号は、本発明のAD機能化CRISPR-Casシステムを送達するために適用できるポリヌクレオチドの投与でも特に有用であるリピドイド化合物に関する。一側面では、アミノアルコールリピドイド化合物を、細胞または対象に送達される薬剤と組み合わせて、ミクロ粒子、ナノ粒子、リポソーム、またはミセルを形成する。粒子、リポソーム、またはミセルによって送達される薬剤は、気体、液体、または固体の形態であってもよく、この薬剤は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、または小分子であってもよい。アミノアルコールリピドイド化合物を、他のアミノアルコールリピドイド化合物、（合成または天然の）ポリマー、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質などと組み合わせて、粒子を生成してもよい。これらの粒子を、続いて、場合によっては医薬賦形剤と組み合わせて、医薬組成物を生成してもよい。
【０８１１】
米国特許公開20110293703号はまた、アミノアルコールリピドイド化合物を調製する方法を提供する。１当量以上のアミンを、適切な条件で１当量以上のエポキシド末端化合物と反応させて、本発明のアミノアルコールリピドイド化合物を生成できる。特定の実施態様では、アミンの全てのアミノ基は、エポキシド末端化合物と完全に反応して、第三級アミンを生成する。他の実施態様では、アミンの全てのアミノ基は、エポキシド末端化合物と完全に反応して第三級アミンを生成するのではなく、それによってアミノアルコールリピドイド化合物中に第一級アミンまたは第二級アミンが生じる。これらの第一級または第二級アミンはそのまま放置するか、別のエポキシド末端化合物などの別の求電子剤と反応させてもよい。当業者には分かっているように、アミンを過剰でない量のエポキシド末端化合物と反応させると、様々な数のテールを有する複数の異なるアミノアルコールリピドイド化合物が得られる。特定のアミンは、２つのエポキシド由来の化合物テールで完全に官能化されてもよいが、他の分子は、エポキシド由来の化合物テールで完全に官能化されていない。例えば、ジアミンまたはポリアミンは、第一級、第二級、および第三級アミンをもたらす分子の様々なアミノ部分から離れて、１つ、２つ、３つ、または４つのエポキシド由来の化合物を含んでもよい。特定の実施態様では、全てのアミノ基が完全に官能化されてはいない。特定の実施態様では、同一型のエポキシド末端化合物のうちの２つが使用される。他の実施態様では、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコールリピドイド化合物の合成は、溶媒の有無にかかわらず実行され、合成は、30〜100°Cの範囲にある高い温度で、好ましくは約50〜90°Cで実行されてもよい。調製されたアミノアルコールリピドイド化合物は、必要に応じて精製されてもよい。例えば、アミノアルコールリピドイド化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来の化合物テールを有するアミノアルコールリピドイド化合物を生成してもよい。あるいは、混合物を精製して、特定の立体異性体または位置異性体を生成してもよい。アミノアルコールリピドイド化合物はまた、ハロゲン化アルキル（例えばヨウ化メチル）または他のアルキル化剤を使用してアルキル化してもよく、かつ／あるいはそれらをアシル化してもよい。
【０８１２】
米国特許公開20110293703号はまた、本発明の方法によって調製されたアミノアルコールリピドイド化合物のライブラリーを提供する。これらのアミノアルコールリピドイド化合物を、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピュータなどを含む高速処理技術を使用して、調製かつ／あるいは選別することができる。特定の実施態様では、アミノアルコールリピドイド化合物を、ポリヌクレオチドまたは（タンパク質、ペプチド、小分子などの）その他の薬剤を細胞内に形質導入するそれらの能力について選別する。
【０８１３】
米国特許公開20130302401号は、組合せ重合を使用して調製された一部類のポリ（β-アミノアルコール）(PBAA)に関する。本発明のPBAAは、被覆剤（医療用素子または移植片用のフィルムまたは多層フィルムの被覆剤など）、添加剤、材料、賦形剤、非生物付着剤、微細化剤、および細胞封入剤として、バイオテクノロジー用途および生物医学的用途に使用できる。これらのPBAAを表面被覆剤として使用した場合に、それらの化学構造に応じて、in vitroとin vivoの両方で種々の程度の炎症が誘発された。この部類の材料の広い化学的多様性により、in vitroでマクロファージの活性化を阻害するポリマー被覆剤を特定できた。さらに、これらの被覆剤は、カルボキシル化ポリスチレン微粒子の皮下移植後に、炎症細胞の動員を減弱しかつ線維症を低減する。これらのポリマーを用いて、細胞カプセル化のための高分子電解質複合カプセルを形成できる。本発明にはまた、抗菌被覆、DNAまたはsiRNAの送達、および幹細胞組織の操作などの他の多くの生物学的用途が存在する。米国特許公開第20130302401号の教示により、本発明のAD機能化CRISPR-Casシステムに適用できる。
【０８１４】
C2c1、（C2c1またはアダプタータンパク質に融合され得る）アデノシンデアミナーゼ、およびガイドRNAを含む予め構築された組換えCRISPR-Cas複合体は、例えばエレクトロポレーション法によって形質導入されてもよく、高い変異率および検出可能な非特異的標的変異の排除をもたらす。Hur, J.K. et al, Targeted mutagenesis in mice by electroporation of C2c1 ribonucleoproteins（C2c1リボ核タンパク質のエレクトロポレーション法によるマウスでの標的変異誘発）,Nat Biotechnol. 2016 Jun 6. doi: 10.1038/nbt.3596を参照。
【０８１５】
脳への局所送達に関して、この送達は種々の方法で達成できる。例えば、材料を線条体内注射などによって送達できる。注射は、開頭術を介して定位固定法により実施できる。
【０８１６】
実施態様によっては、糖に基づく粒子、例えばGalNAcを、本明細書に記載されるように、かつ（参照により本明細書に組み込まれる）国際特許出願WO2014118272号およびNair, JK et al., 2014, Journal of the American Chemical Society 136 (49), 16958-16961を参照として使用してもよく、これらでの教示を、特に他に明示のない限り、全ての粒子の送達に適用する。このGalNAcは、糖に基づく粒子であると見做すことができ、その他の粒子送達システムおよび／または製剤に関しては、本明細書にさらに詳述される。従って、GalNAcは、本明細書に説明のその他の粒子と同じ意味付けでの粒子であると見做すことができ、結果として、一般的な使用法および他の考慮事項、例えば、前記粒子の送達法は、GalNAc粒子にも適用される。例えば、液相複合手法を用いて、PFP（ペンタフルオロフェニル）エステルとして活性化された三本触覚性のGalNAcクラスター（分子量：約2000）を、5’−ヘキシルアミノ改変オリゴヌクレオチド（5’-HA ASO、分子量：約8000 Da、Oestergaard et al., Bioconjugate Chem., 2015, 26 (8), pp 1451-1455を参照）に付加してもよい。同様に、ポリ（アクリラート）ポリマーも、in vivo核酸送達について説明されている（参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願WO2013158141号を参照）。さらに別の実施態様では、送達を改善するために、CRISPRナノ粒子（またはタンパク質複合体）の天然起源の血清タンパク質との事前混合を使用してもよい（Akinc A et al, 2010, Molecular Therapy vol. 18 no. 7, 1357-1364を参照）。
ナノクルー
【０８１７】
さらに、AD機能化CRISPRシステムは、例えば、Sun W et al, Cocoon-like self-degradable DNA nanoclew for anticancer drug delivery.（抗癌剤送達のための繭様自己分解性DNAナノクルー）, J Am Chem Soc. 2014 Oct 22;136(42):14722-5. doi: 10.1021/ja5088024. Epub 2014 Oct 13.、またはSun W et al, Self-Assembled DNA Nanoclews for the Efficient Delivery of CRISPR-Cas9 for Genome Editing.（ゲノム編集用のCRISPR-Cas9の効率的な送達のための自己集合化DNAナノクルー）, Angew Chem Int Ed Engl. 2015 Oct 5;54(41):12029-33. doi: 10.1002/anie.201506030. Epub 2015 Aug 27に説明されている。
脂質粒子
【０８１８】
実施態様によっては、送達は、LNPなどの脂質粒子中へのC2c1タンパク質またはmRNAのカプセル化形態によって実施される。従って、実施態様によっては、各種の脂質粒子 (LNP)が想定される。抗トランスチレチン低分子干渉RNAは、脂質ナノ粒子にカプセル化されてヒトに送達されており（例えば、Coelho et al., N Engl J Med 2013;369:819-29を参照）、そのシステムを本発明のCRISPR Casシステムに適合・応用することができる。静脈内投与では、体重1 kgあたり約0.01〜約1 mgの用量が想定される。注入関連反応のリスクを低減するために、デキサメタゾン、アセタンピノフェン、ジフェンヒドラミン、またはセチリジンなどの薬物療法が想定され、かつラニチジンが想定される。4週間ごとの5回の投与で、1 kgあたり約0.3mgの複数回投与も考えられる。
【０８１９】
LNPは、肝臓へのsiRNAの送達に非常に効果的であることが示されており（例えば、Tabernero et al., Cancer Discovery, April 2013, Vol. 3, No. 4, pages 363-470を参照）、従ってLNPでは、CRISPR CasをコードするRNAの肝臓への送達が想定される。2週間ごとの6 mg/kgでのLNPの約4回投与が想定されてもよい。Taberneroらは、腫瘍の退縮が0.7 mg/kgで投与されたLNPの最初の2サイクル後に観察され、6サイクルの終了までに、患者はリンパ節転移の完全な退縮および肝腫瘍の実質的な縮小を伴う部分的な応答を達成したことを示していた。この患者では、40回の投与後に完全な応答が得られ、26ヶ月を超えて投与を受けた後に、寛解を維持して治療を完了した。VEGF経路阻害剤による先行治療後に進行していた、腎臓、肺、リンパ節を含む腎細胞がん (RCC)および肝外部位疾患を有する２人の患者は、全ての部位で約8〜12ヶ月間疾患は安定し、膵神経内分泌腫瘍 (PNET)および肝転移を有する患者では、18ヶ月間（36回投与）の延長検討で、疾患の安定性が継続した。
【０８２０】
但し、LNPの電荷を考慮に入れる必要がある。陽イオン性脂質は、負に帯電した脂質と結合して、細胞内送達を促進する非二重層構造を誘導する。帯電したLNPは静脈内注射後に循環から急速に排除されるために、pKa値が7未満のイオン化可能な陽イオン性脂質が開発された（例えば、Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011を参照）。RNAなどの負に帯電したポリマーは、イオン化可能な脂質が正の帯電を示す低pH値（例えばpH 4）でLNP中に詰込まれてもよい。しかし生理的なpH値では、LNPはより長い循環時間と両立できる低い表面帯電を示す。4種のイオン化可能な陽イオン性脂質、すなわち1,2−ジリノイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパン (DLinDAP)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−N,N−ジメチルアミノプロパン (DLinDMA)、1,2−ジリノレイルオキシ−ケト−N,N−ジメチル−3−アミノプロパン (DLinK-DMA)、および1,2−ジリノレイル−4−(2−ジメチルアミノエチル)−[1,3]−ジオキソラン (DLinKC2-DMA)が注目されている。これらの脂質を含むLNP siRNAシステムは、肝細胞中で顕著に異なるin vivoでの遺伝子サイレンシング特性を示し、その効力は、第VII因子遺伝子サイレンシングモデルを用いると、DLinKC2-DMA>DLinKDMA>DLinDMA>>DLinDAPの順に従って変化することが示されている（例えば、Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011を参照）。特にDLinKC2-DMAを含有する製剤の場合に、LNPあるいはLNP内のまたはLNPに会合するCRISPR-Cas RNAでは、1 μg/mlの用量が想定されてもよい。
【０８２１】
LNPとCRISPR-Casとのカプセル化の調製には、Rosin et al, Molecular Therapy, vol. 19, no. 12, pages 1286-2200, Dec. 2011の説明内容を用いてもよく、かつ／あるいはそれを応用してもよい。陽イオン性脂質である1,2−ジリノイル−3−ジメチルアンモニウム−プロパン (DLinDAP)、1,2−ジリノレイルオキシ−3−N,N−ジメチルアミノプロパン (DLinDMA)、1,2−ジリノレイルオキシ−ケト−N,N−ジメチル−3−アミノプロパン (DLinKDMA)、1,2−ジリノレイル−4−(2−ジメチルアミノエチル)−[1,3]−ジオキソラン (DLinKC2-DMA)、(3−o−[2"−(メトキシポリエチレングリコール2000)スクシノイル]−1,2−ジミリストイル−sn−グリコール（PEG-S-DMG）、およびR−3−[（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）2000）カルバモイル]−1,2−ジミリスチロキシルプロピル−3−アミン（PEG-C-DOMG）は、Tekmira Pharmaceuticals (Vancouver, Canada)から取り寄せてもよく、合成してもよい。コレステロールはSigma (St Louis, MO)から購入してもよい。特定のCRISPR-Cas RNAは、（陽イオン性脂質：DSPC：CHOL：PEGS-DMGまたはPEG-C-DOMGのモル比が、40：10：40：10である）DLinDAP、DLinDMA、DLinK-DMA、およびDLinKC2-DMAを含有するLNP内にカプセル化されてもよい。必要に応じて、0.2%のSP-DiOC18（Invitrogen, Burlington, Canada）を組込んで、細胞への取込み、細胞内送達、および生体内分布を評価してもよい。カプセル化は、（40：10：40：10のモル比の）陽イオン性脂質：DSPC：コレステロール：PEG-C-DOMGから構成される脂質混合物をエタノール中に溶解して最終脂質濃度を10 mmol/lとすることにより実施してもよい。この脂質のエタノール溶液を、50 mmol/l、pH 4.0のクエン酸に滴下し、最終濃度30% (vol/vol)エタノールとして、多層小胞を形成してもよい。大単層小胞は、押出機（Northern Lipids, Vancouver, Canada）を使用して２層の80 nmのNucleporeポリカーボネートフィルターを通して多層小胞を押出した後に生成してもよい。カプセル化は、30% (vol/vol)エタノールを含む50 mmol/l、pH4.0のクエン酸塩中に2mg/mlで溶解したRNAを、押出し予備成形された大単層小胞に滴下し、0.06／1 (wt/wt)の最終RNA／脂質重量比まで一定に混合しつつ31°Cで30分間培養して達成してもよい。Spectra/Por 2再生セルロース透析膜を使用して、pH 7.4のリン酸緩衝生理食塩水 (PBS)に対して16時間透析することにより、エタノールの除去および製剤緩衝液の中和を実施した。ナノ粒子のサイズ分布は、NICOMP 370粒子分析計、小胞／強度モード、およびガウス分布近似（Gaussian fitting：Nicomp Particle Sizing, Santa Barbara, CA）を使用する動的光散乱によって決定してもよい。３種の全てのLNPシステムでの粒子寸法は、直径が約70 nmであってもよい。RNAカプセル化の効率は、透析の前後に採取された試料からVivaPureD MiniHカラム（Sartorius Stedim Biotech）を使用して遊離RNAを除去して決定してもよい。カプセル化されたRNAは、溶出された粒子から抽出され、かつ260 nmで定量される。脂質に対するRNAの比を、Wako Chemicals USA（Richmond, VA）のコレステロールE酵素測定法を使用して小胞中のコレステロール含量の測定によって決定した。LNPおよびPEG脂質の本明細書での考察と併せて、PEG化リポソームまたはLNPは、同様に、CRISPR-Casシステムまたはその成分の送達に適している。
【０８２２】
脂質の予備混合溶液（20.4 mg/mlの総脂質濃度）を、50：10：38.5のモル比でDLinKC2-DMA、DSPC、およびコレステロールを含有するエタノール中で調製してもよい。酢酸ナトリウムを、0.75：1（酢酸ナトリウム：DLinKC2-DMA）のモル比で脂質の予備混合物に添加してもよい。続いて、激しく攪拌しながら1.85容量のクエン酸緩衝液（10 mmol/l、pH 3.0）とその混合物とを混ぜ合わせて脂質を水和し、35%のエタノールを含む水性緩衝液中で自発的にリポソームを生成してもよい。リポソーム溶液を37°Cで培養して、粒子サイズを経時的に増大させてもよい。動的光散乱（Zetasizer Nano ZS, Malvern Instruments, Worcestershire, UK）によるリポソームサイズの変化を調査するために、培養中の種々の時点で定分量を取り出してもよい。所望の粒子サイズが達成されたなら、水性PEG脂質溶液（原料溶液は、35% (vol/vol)エタノール中に10 mg/mlのPEG-DMGを含有）をリポソーム混合物に添加して、総脂質の3.5%の最終PEGモル濃度を得ることができる。PEG脂質を添加すると、リポソームはそのサイズとなり、さらなる成長が効率的に抑制される。次にRNAを空のリポソームに約1：10（wt：wt）のRNA：総脂質の比で添加してもよく、続いて37°Cで30分間培養して、詰め込まれたLNPを形成する。続いて混合物をPBS中で一晩透析して、0.45 μmのシリンジフィルターで濾過してもよい。
【０８２３】
球状核酸（SNATM）構築物および他の粒子（特に金ナノ粒子）もまた、意図された標的にCRISPR-Casシステムを送達するための手段として想定されている。有意なデータとして、核酸で機能化された金ナノ粒子に基づくAuraSense TherapeuticsのSpherical Nucleic Acid（SNATM）構築物が有用であることが示されている。
【０８２４】
本明細書の教示とともに使用し得る文献として、Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2011 133:9254-9257、Hao et al., Small. 2011 7:3158-3162、Zhang et al., ACS Nano. 2011 5:6962-6970、Cutler et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:1376-1391、Young et al., Nano Lett. 2012 12:3867-71、Zheng et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012 109:11975-80、Mirkin, Nanomedicine 2012 7:635-638、Zhang et al., J. Am. Chem. Soc. 2012 134:16488-1691、Weintraub, Nature 2013 495:S14-S16、Choi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013 110(19):7625-7630、Jensen et al., Sci. Transl. Med. 5, 209ra152 (2013)、およびMirkin, et al., Small, 10:186-192が挙げられる。
【０８２５】
RNAを有する自己集合性粒子は、ポリエチレングリコール (PEG)の遠位端に付着したArg−Gly−Asp (RGD)ペプチドリガンドでPEG化されたポリエチレンイミン (PEI)で構築されてもよい。このシステムは、例えば、インテグリンを発現する腫瘍血管新生を標的とし、血管内皮増殖因子受容体−2 (VEGF R2)の発現を阻害するsiRNAを送達し、それによって腫瘍血管新生を達成する手段として使用されてきた（例えば、Schiffelers et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 19を参照）。ナノプレックスは、陽イオン性ポリマーと核酸の等容量の水溶液を混合し、リン酸塩（核酸）に対するイオン化可能な窒素（ポリマー）の正味モルを2〜6の範囲で過剰にして調製できる。陽イオン性ポリマーと核酸の間の静電相互作用は、約100 nmの平均粒子サイズ分布を有するポリプレックスの形成をもたらすので、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。Schiffelersらの自己集合性粒子での送達には、約100〜200 mgのCRISPR Casの用量が想定される。
【０８２６】
Bartlettら（PNAS, September 25, 2007,vol. 104, no. 39）のナノプレックスもまた、本発明に適用されてもよい。Bartlettらのナノプレックスは、陽イオン性ポリマーと核酸の等量の水溶液を混合して、リン酸塩（核酸）に対するイオン化可能な窒素（ポリマー）の正味モルを2〜6の範囲で過剰にして調製される。陽イオン性ポリマーと核酸の間の静電相互作用は、約100 nmの平均粒子サイズ分布を有するポリプレックスの生成をもたらすので、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。BartlettらのDOTA−siRNAは以下のように合成された。1,4,7,10−テトラアザシクロドデカン−1,4,7,10−テトラ酢酸モノ（N−ヒドロキシスクシンイミドエステル）(DOTA-NHS-ester)はMacrocyclics（Dallas, TX）から取り寄せた。炭酸緩衝液（pH 9）中の100倍のモル過剰のDOTA−NHS−エステルを有するアミン改変RNAセンス鎖をマイクロ遠心管に添加した。内容物を室温で4時間撹拌して反応させた。DOTA-RNAセンス複合体をエタノール沈殿させ、水中に再懸濁し、未改変のアンチセンス鎖にアニールしてDOTA−siRNAを生成した。全ての液体をChelex-100（Bio-Rad, Hercules, CA）で前処理して、微量金属汚染物質を除去した。Tf標的化および非標的化siRNA粒子は、シクロデキストリン含有ポリ陽イオンを使用して生成できる。典型的には、粒子は、3（+/-）の電荷比および0.5 g/lのsiRNA濃度に水中で生成された。標的粒子の表面のアダマンタン−PEG分子の1%は、Tf（アダマンタン−PEG−Tf）で改変された。この粒子は、注射用の5% (wt/vol)グルコース担体溶液中に懸濁された。
【０８２７】
Davisら（Nature, Vol 464, 15 April 2010）は、標的ナノ粒子送達システム（臨床試験登録番号NCT00689065）を使用するRNA臨床試験を実施している。標準治療では難治性の固形癌の患者には、21日サイクルの1、3、8、および10日目に、30分の静脈内注入によって標的ナノ粒子の用量を投与する。ナノ粒子は、（1）鎖状のシクロデキストリン系ポリマー (CDP)、（2）癌細胞の表面でTF受容体 (TFR)と結合するナノ粒子の外側に表示されたヒトトランスフェリンタンパク質 (TF)標的リガンド、（3）親水性ポリマー（生体液中のナノ粒子の安定性を促進するように使用されるポリエチレングリコール (PEG)）、および（4）RRM2の発現を低減するように設計されたsiRNA（臨床で使用される配列は、以前はsiR2B+5と表記されていた）を含む合成送達システムからなっている。TFRは悪性細胞中で上方制御されることが長い間知られており、RRM2は確立された抗癌標的である。（CALAA-01として示される臨床方式である）これらの粒子は、ヒト以外の霊長類での複数回投与の研究で十分に許容されることが示されている。１人の慢性骨髄性白血病の患者へのリポソーム送達によってsiRNAが投与されたが、Davisらの臨床試験は、標的送達システムでsiRNAを全身に送達して固形癌の患者を治療する最初のヒト試験である。標的送達システムがヒト腫瘍への機能的なsiRNAの効果的な送達を提供できるかどうかを確かめるために、Davisらは、3つの異なる投与群からの3人の患者での生検を調査した。患者A、B、およびCは、全員が転移性黒色腫を患っていて、それぞれ18、24、および30 mg/m2のsiRNAのCALAA-01用量を投与された。同様の用量を、本発明のCRISPR-Casシステムについて想定してもよい。本発明の送達は、鎖状のシクロデキストリン系ポリマー (CDP)、癌細胞の表面でTF受容体 (TFR)と結合する粒子の外側に表示されたヒトトランスフェリンタンパク質 (TF)標的リガンド、および／または親水性ポリマー（例えば、生体液中の粒子の安定性を促進するために使用されるポリエチレングリコール(PEG)）を含む粒子により達成されてもよい。
【０８２８】
参照により本明細書に組み込まれる米国特許8,709,843号は、組織、細胞、および細胞内区画への治療薬含有粒子の標的送達のための薬物送達システムを提供する。本発明は、界面活性剤に結合したポリマー、親水性ポリマー、または脂質を含む標的粒子を提供する。参照により本明細書に組み込まれる米国特許6,007,845号は、多機能化合物を１つ以上の疎水性ポリマーおよび１つ以上の親水性ポリマーと共有結合して形成されるマルチブロック共重合体のコアを有し、かつ生物学的に活性な材料を含む粒子を提供する。参照により本明細書に組み込まれる米国特許5,855,913号は、肺システムへの薬物送達のために、その表面に界面活性剤を組み込んだ、タップ密度が0.4 g/cm3未満で平均直径が5 μm〜30 μmの空気力学的に軽い粒子を有する粒子組成物を提供する。参照により本明細書に組み込まれる米国特許5,985,309号は、肺システムへの送達のために、界面活性剤、および／または正または負に帯電した治療薬または診断薬と反対の電荷の帯電分子との親水性または疎水性の複合体を組み込んだ粒子を提供する。参照により本明細書に組み込まれる米国特許5,543,158号は、生物学的に活性な材料および表面にポリアルキレングリコール部分を含有する生分解性固体コアを有する生分解性の注射用粒子を提供する。参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願WO2012135025号（US20120251560号としても公開）は、共役ポリエチレンイミン (PEI)ポリマーおよび共役アザ大環状化合物（総称して「共役リポマー」または「リポマー」と呼ばれる）を説明している。特定の実施態様では、そのような共役リポマーをCRISPR-Casシステムの環境で使用して、タンパク質発現の調節を含む遺伝子発現を改変するためのin vitro、ex vivo、およびin vivoでのゲノム摂動を達成できることが意図されてもよい。
【０８２９】
一実施態様では、粒子は、エポキシド修飾脂質ポリマー、好ましくは7C1であってもよい（例えば、2014年5月11日にdoi:10.1038/nnano.2014.84でオンライン公開されたJames E. Dahlman and Carmen Barnes et al. Nature Nanotechnology (2014)を参照）。C71を、C15エポキシド末端脂質をPEI600と14：1のモル比で反応させて合成し、かつC14PEG2000を配合して、安定な粒子（直径35〜60 nm）をPBS溶液中で少なくとも40日かけて生成した。
【０８３０】
エポキシド修飾脂質ポリマーを利用して、本発明のCRISPR-Casシステムを肺細胞、心臓血管細胞、または腎細胞に送達できるが、当業者ならこのシステムを他の標的臓器への送達に適合させることができる。約0.05〜約0.6 mg/kgの範囲の用量が想定される。数日または数週間にわたる用量も想定され、総用量は約2 mg/kgである。
【０８３１】
実施態様によっては、RNA分子を送達するためのLNPは、例えば、国際特許出願WO2005/105152 (PCT/EP2005/004920)号、WO2006/069782 (PCT/EP2005/014074)号、WO2007/121947 (PCT/EP2007/003496)号、およびWO2015/082080 (PCT/EP2014/003274)号に説明されている方法などの当技術分野で知られている方法によって調製され、これらは参照により本明細書に組み込まれる。哺乳動物細胞へのsiRNAの増強および改善された送達を特に目的とするLNPは、例えば、Aleku et al., Cancer Res., 68(23): 9788-98 (Dec. 1, 2008)、Strumberg et al., Int. J. Clin. Pharmacol. Ther., 50(1): 76-8 (Jan. 2012)、Schultheis et al., J. Clin. Oncol., 32(36): 4141-48 (Dec. 20, 2014)、およびFehring et al., Mol. Ther., 22(4): 811-20 (Apr. 22, 2014)に説明され、これらは参照により本明細書に組み込まれ、本技術に適用できる。
【０８３２】
実施態様によっては、LNPは、WO2005/105152 (PCT/EP2005/004920)号、WO2006/069782 (PCT/EP2005/014074)号、WO2007/121947 (PCT/EP2007/003496)号、およびWO2015/082080 (PCT/EP2014/003274)号に開示されているいずれかのLNPを含む。
【０８３３】
実施態様によっては、LNPは、式Iを有する少なくとも１つの脂質を含む。
【化３】
2021532815.tif 000023
式中、R1およびR2はそれぞれ、アルキルを含む群から独立して選択され、nは1〜4の任意の整数であり、R3は、リシル、オルニチル、2,4-ジアミノブチリル、ヒスチジル、および式IIに従うアシル部分を含む群から選択されるアシルである。
【化４】
2021532815.tif 000024
式中、mは1〜3の任意の整数であり、Y−は薬学的に許容される陰イオンである。実施態様によっては、式Iによる脂質は、少なくとも2個の非対称のC原子を含む。実施態様によっては、式Iの鏡像異性体は、限定はされないが、R−R、S−S、R−S、およびS−R鏡像異性体を含む。
【０８３４】
実施態様によっては、R1はラウリルであり、R2はミリスチルである。別の実施態様では、R1はパルミチルであり、R2はオレイルである。実施態様によっては、mは1または2である。実施態様によっては、Y−は、ハロゲン化物、酢酸塩、またはトリフルオロ酢酸塩から選択される。
【０８３５】
実施態様によっては、LNPは、以下から選択される１つ以上の脂質を含む。
【０８３６】
−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸塩（式III）：
【化５】
2021532815.tif 000025
−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸塩（式IV）：
【化６】
2021532815.tif 000026
および
−アルギニル−リジン−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸塩（式V）：
【化７】
2021532815.tif 000027
【０８３７】
実施態様によっては、LNPはまた、１つの成分を含む。限定はされないが、実施態様によっては、この成分は、例えばペプチド、タンパク質、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、核酸、またはそれらの組合せから選択される。実施態様によっては、成分は、抗体、例えばモノクローナル抗体である。実施態様によっては、成分は、例えば、リボザイム、アプタマー、シュピーゲルマー、DNA、RNA、PNA、LNA、またはそれらの組合せから選択される核酸である。実施態様によっては、核酸は、ガイドRNAおよび／またはmRNAである。
【０８３８】
実施態様によっては、LNPの成分は、CRIPSR-Casタンパク質をコードするmRNAを含む。実施態様によっては、LNPの成分は、II型またはV型のCRIPSR-Casタンパク質をコードするmRNAを含む。実施態様によっては、LNPの成分は、（CRISPR-Casタンパク質またはアダプタータンパク質に融合され得る）アデノシンデアミナーゼをコードするmRNAを含む。
【０８３９】
実施態様によっては、LNPの成分はさらに、１つ以上のガイドRNAを含む。実施態様によっては、LNPは、前述のmRNAおよびガイドRNAを血管内皮に送達するように構成される。実施態様によっては、LNPは、前述のmRNAおよびガイドRNAを肺内皮に送達するように構成される。実施態様によっては、LNPは、前述のmRNAおよびガイドRNAを肝臓に送達するように構成される。実施態様によっては、LNPは、前述のmRNAおよびガイドRNAを肺に送達するように構成される。実施態様によっては、LNPは、前述のmRNAおよびガイドRNAを心臓に送達するように構成される。実施態様によっては、LNPは、前述のmRNAおよびガイドRNAを脾臓に送達するように構成される。実施態様によっては、LNPは、前述のmRNAおよびガイドRNAを腎臓に送達するように構成される。実施態様によっては、LNPは、前述のmRNAおよびガイドRNAを膵臓に送達するように構成される。実施態様によっては、LNPは、前述のmRNAおよびガイドRNAを脳に送達するように構成される。実施態様によっては、LNPは、前述のmRNAおよびガイドRNAをマクロファージに送達するように構成される。
【０８４０】
実施態様によっては、LNPはまた、少なくとも１つのヘルパー脂質を含む。実施態様によっては、ヘルパー脂質は、リン脂質およびステロイドから選択される。実施態様によっては、リン脂質は、リン酸のジエステルおよび／またはモノエステルである。実施態様によっては、リン脂質は、ホスホグリセリドおよび／またはスフィンゴ脂質である。実施態様によっては、ステロイドは、部分的に水素化されたシクロペンタ［a］フェナントレンに基づく天然起源および／または合成の化合物である。実施態様によっては、ステロイドは、21〜30個のC原子を含む。実施態様によっては、ステロイドはコレステロールである。実施態様によっては、ヘルパー脂質は、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン (DPhyPE)、セラミド、および1,2−ジオレイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン(DOPE)から選択される。
【０８４１】
実施態様によっては、少なくとも１つのヘルパー脂質は、PEG部分、HEG部分、ポリヒドロキシエチルスターチ (polyHES)部分、およびポリプロピレン部分を含む群から選択される部分を含む。実施態様によっては、この部分は、約500〜10,000 Daまたは約2000〜5000 Daの分子量を有する。実施態様によっては、PEG部分は、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、1,2−ジアルキル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、およびセラミド−PEGから選択される。実施態様によっては、PEG部分は、約500〜10,000 Daまたは約2000〜5000 Daの分子量を有する。実施態様によっては、PEG部分は、2000 Daの分子量を有する。
【０８４２】
実施態様によっては、ヘルパー脂質は、組成物の総脂質含量の約20 mol%〜80 mol%である。実施態様によっては、ヘルパー脂質成分は、LNPの総脂質含量の約35 mol%〜65 mol%である。実施態様によっては、LNPは、LNPの総脂質含量の50 mol%の脂質および50 mol%のヘルパー脂質を含む。
【０８４３】
実施態様によっては、LNPは、DPhyPEと組み合わせて、  −3−アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸塩、  −アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸塩、または  −アルギニル−リジン−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸塩のいずれかを含み、DPhyPEの含量は、LNPの総脂質含量の約80 mol%、65 mol%、50 mol%、および35 mol%である。実施態様によっては、LNPは、  −アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸塩（脂質）および1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン（ヘルパー脂質）を含む。実施態様によっては、LNPは、  −アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸塩（脂質）、1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン（第１のヘルパー脂質）、および1,2−ジステロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−PEG2000（第２のヘルパー脂質）を含む。
【０８４４】
実施態様によっては、第２のヘルパー脂質は、総脂質含量の約0.05 mol%〜4.9 mol%、または約1 mol%〜3 mol%である。実施態様によっては、LNPは、脂質、第１のヘルパー脂質、および第２のヘルパー脂質の含量の総計が総脂質含量の100 mol%であり、第１のヘルパー脂質および第２のヘルパー脂質の総計が総脂質含量の50 mol%であり、かつ総脂質含量の約0.1 mol％〜5 mol％、約1 mol％〜4 mol％、または約2 mol％のPEG化された第２ヘルパー脂質が存在するという条件の下で、総脂質含量の約45 mol%〜50 mol%の脂質、総脂質含量の約45 mol%〜50 mol%の第１のヘルパー脂質を含む。実施態様によっては、LNPは、（a）50 mol%の  −アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸塩、48 mol%の1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、および2 mol%の1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−PEG2000、あるいは（b）50 mol％の  −アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸塩、49 mol％の1,2−ジフィタノイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン、および1mol%のN（カルボニル−メトキシポリエチレングリコール−2000）−1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミンまたはそのナトリウム塩を含む。
【０８４５】
実施態様によっては、LNPは、核酸骨格リン酸：陽イオン性脂質窒素原子の電荷比が約1：1.5〜7または約1：4である核酸を含む。
【０８４６】
実施態様によっては、LNPはまた、in vivo条件で脂質組成物から除去可能な遮蔽化合物を含む。実施態様によっては、遮蔽化合物は生物学的に不活性な化合物である。実施態様によっては、遮蔽化合物は、その表面またはその分子自体に電荷を持たない。実施態様によっては、遮蔽化合物は、ポリエチレングリコール (PEG)系ポリマー、ヒドロキシエチルグルコース (HEG)系ポリマー、ポリヒドロキシエチルスターチ (polyHES)、およびポリプロピレンである。実施態様によっては、PEG、HEG、polyHES、およびポリプロピレンの分子量は、約500〜10,000 Daまたは約2000〜5000 Daである。実施態様によっては、遮蔽化合物は、PEG2000またはPEG5000である。
【０８４７】
実施態様によっては、LNPは、少なくとも１つの脂質、第１のヘルパー脂質、およびin vivo条件で脂質組成物から除去可能な遮蔽化合物を含む。実施態様によっては、LNPはまた、第２のヘルパー脂質を含む。実施態様によっては、第１のヘルパー脂質はセラミドである。実施態様によっては、第２のヘルパー脂質はセラミドである。実施態様によっては、セラミドは、6〜10個の炭素原子の少なくとも１つの短い炭素鎖置換基を含む。実施態様によっては、セラミドは、8個の炭素原子を含む。実施態様によっては、遮蔽化合物はセラミドに付着している。実施態様によっては、遮蔽化合物は、セラミドに共有結合している。実施態様によっては、遮蔽化合物は、LNP内の核酸に付着している。実施態様によっては、遮蔽化合物は、核酸に共有結合している。実施態様によっては、遮蔽化合物は、リンカーによって核酸に付着している。実施態様によっては、リンカーは、生体条件で切断される。実施態様によっては、リンカーは、ssRNA、ssDNA、dsRNA、dsDNA、ペプチド、S−Sリンカー、およびpH感受性リンカーから選択される。実施態様によっては、リンカー部分は、核酸のセンス鎖の3’末端に付着している。実施態様によっては、遮蔽化合物は、pH感受性リンカーまたはpH感受性部分を含む。実施態様によっては、pH感受性リンカーまたはpH感受性部分は、陰イオン性リンカーまたは陰イオン性部分である。実施態様によっては、陰イオン性リンカーまたは陰イオン性部分は、酸性環境では陰イオン性がより低いか、あるいは中性である。実施態様によっては、pH感受性リンカーまたはpH感受性部分は、オリゴグルタミン酸、オリゴフェノラートおよびジエチレントリアミン五酢酸から選択される。
【０８４８】
前の段落でのLNPの実施態様のいずれかで、LNPは、約50〜600 mosmole/kg、約250〜350 mosmole/kg、または約280〜320 mosmole/kgのモル浸透圧濃度を有してもよく、かつ／あるいは、脂質および／または1個または2個のヘルパー脂質および遮蔽化合物によって形成されるLNPの粒径は、約20〜200 nm、約30〜100 nm、または約40〜80 nmである。
【０８４９】
実施態様によっては、遮蔽化合物は、in vivoでのより長い循環時間を提供し、LNPを含む核酸のより良好な生体内分布を可能にする。実施態様によっては、遮蔽化合物は、LNPが血清化合物または他の体液または細胞質膜の化合物、例えばLNPが投与される血管構造の内皮内層の細胞質膜との即時的な相互作用を防止する。さらに、またはあるいは、実施態様によっては、遮蔽化合物はまた、免疫系の要素がLNPと即時的に相互作用することを防止する。さらに、またはあるいは、実施態様によっては、遮蔽化合物は、抗オプソニン化化合物として作用する。いかなる機構または理論に拘束されることを望まないが、実施態様によっては、遮蔽化合物は、その環境との相互作用に利用可能なLNPの表面積を減少させる被膜または被覆物を形成する。さらに、またはあるいは、実施態様によっては、遮蔽化合物は、LNPの全体的な帯電を遮蔽する。
【０８５０】
別の実施態様では、LNPは、式VIを有する少なくとも１つの陽イオン性脂質を含む。
【化８】
2021532815.tif 000028
式中、nは1、2、3、または4であり、mは1、2、または3であり、Y−は陰イオンであり、R1およびR2のそれぞれは、鎖状C12〜C18アルキルおよび鎖状C12〜C18アルケニル、ステロール化合物、およびPEG化脂質からなる群から個別にかつ独立して選択され、ステロール化合物は、コレステロールおよびスチグマステロールからなる群から選択され、PEG化脂質はPEG部分を含み、PEG化脂質は、以下からなる群から選択される。
式VIIのPEG化ホスホエタノールアミン：
【化９】
2021532815.tif 000029
式中、R3およびR4は、個別にかつ独立して鎖状C13〜C17アルキルであり、pは、15〜130の任意の整数である；
式VIIIのPEG化セラミド：
【化１０】
2021532815.tif 000030
式中、R5は鎖状C7〜C15アルキルであり、qは15〜130の任意の数である；および
式IXのPEG化ジアシルグリセロール：
【化１１】
2021532815.tif 000031
式中、R6およびR7のそれぞれは、個別にかつ独立して鎖状のC11〜C17アルキルであり、rは、15〜130の任意の整数である。
【０８５１】
実施態様によっては、R1およびR2は互いに異なる。実施態様によっては、R1はパルミチルであり、R2はオレイルである。実施態様によっては、R1はラウリルであり、R2はミリスチルである。実施態様によっては、R1およびR2は同じである。実施態様によっては、R1およびR2のそれぞれは、C12アルキル、C14アルキル、Cl6アルキル、Cl8アルキル、Cl2アルケニル、C14アルケニル、Cl6アルケニル、およびCl8アルケニルからなる群から個別にかつ独立して選択される。実施態様によっては、C12アルケニル、C14アルケニル、Cl6アルケニル、およびCl8アルケニルのそれぞれは、１つまたは２つの二重結合を含む。実施態様によっては、Cl8アルケニルは、C9とC10との間に１つの二重結合を有するCl8アルケニルである。実施態様によっては、C18アルケニルは、シス−9−オクタデシルである。
【０８５２】
実施態様によっては、陽イオン性脂質は、式Xの化合物である：
【化１２】
2021532815.tif 000032
実施態様によっては、Y−は、ハロゲン化物、酢酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩から選択される。実施態様によっては、陽イオン性脂質は、式IIIの  −アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−パルミチル−N−オレイル−アミド三塩酸塩である。
【化１３】
2021532815.tif 000033
実施態様によっては、陽イオン性脂質は、式IVの  −アルギニル−2,3−ジアミノプロピオン酸−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸塩である。
【化１４】
2021532815.tif 000034
実施態様によっては、陽イオン性脂質は、式Ｖの  −アルギニル−リジン−N−ラウリル−N−ミリスチル−アミド三塩酸塩である。
【化１５】
2021532815.tif 000035
【０８５３】
実施態様によっては、ステロール化合物はコレステロールである。実施態様によっては、ステロール化合物はスチグマステロールである。
【０８５４】
実施態様によっては、PEG化脂質のPEG部分は、約800〜5000 Daの分子量を有する。実施態様によっては、PEG化脂質のPEG部分の分子量は、約800 Daである。実施態様によっては、PEG化脂質のPEG部分の分子量は、約2000 Daである。実施態様によっては、PEG化脂質のPEG部分の分子量は、約5000 Daである。実施態様によっては、PEG化脂質は、式VIIのPEG化ホスホエタノールアミンであり、R3およびR4のそれぞれは、個別にかつ独立して鎖状C13〜C17アルキルであり、pは、18、19、または20、あるいは44、45、または46、あるいは113、114、または115からの任意の整数である。実施態様によっては、R3およびR4は同じである。実施態様によっては、R3およびR4は異なる。実施態様によっては、R3およびR4のそれぞれは、C13アルキル、Cl5アルキル、およびCl7アルキルからなる群から個別にかつ独立して選択される。実施態様によっては、式VIIのPEG化ホスホエタノールアミンは、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−2000］（アンモニウム塩）である。
【化１６】
2021532815.tif 000036
実施態様によっては、式VIIのPEG化ホスホエタノールアミンは、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン−N−［メトキシ（ポリエチレングリコール）−5000］（アンモニウム塩）である。
【化１７】
2021532815.tif 000037
実施態様によっては、PEG化脂質は、式VIIIのPEG化セラミドであり、式中、R5は鎖状C7〜C15アルキルであり、qは、18、19、または20、あるいは44、45、または46、あるいは113、114、または115からの任意の整数である。実施態様によっては、R5は鎖状C7アルキルである。実施態様によっては、R5は鎖状Cl5アルキルである。実施態様によっては、式VIIIのPEG化セラミドは、N−オクタノイル−スフィンゴシン−1−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）2000］｝である。
【化１８】
2021532815.tif 000038
実施態様によっては、式VIIIのPEG化セラミドは、N−パルミトイル−スフィンゴシン−1−｛スクシニル［メトキシ（ポリエチレングリコール）2000］｝である。
【化１９】
2021532815.tif 000039
実施態様によっては、PEG化脂質は、式IXのPEG化ジアシルグリセロールであり、R6およびR7のそれぞれは、個別にかつ独立して鎖状Cl1〜Cl7アルキルであり、rは、18、19、または20、あるいは44、45、または46、あるいは113、114、または115からの任意の整数である。実施態様によっては、R6およびR7は同じである。実施態様によっては、R6およびR7は異なる。実施態様によっては、R6およびR7のそれぞれは、鎖状Cl7アルキル、鎖状C15アルキル、および鎖状Cl3アルキルからなる群から個別にかつ独立して選択される。実施態様によっては、式IXのPEG化ジアシルグリセロールは、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロール［メトキシ（ポリエチレングリコール）2000］である。
【化２０】
2021532815.tif 000040
実施態様によっては、式IXのPEG化ジアシルグリセロールは、1,2−ジパルミトイル−sn−グリセロール［メトキシ（ポリエチレングリコール）2000］である。
【化２１】
2021532815.tif 000041
実施態様によっては、式IXのPEG化ジアシルグリセロールは、以下の通りである。
【化２２】
2021532815.tif 000042
実施態様によっては、LNPは、式III、IV、およびVから選択される少なくとも１つの陽イオン性脂質、コレステロールおよびスチグマステリンから選択される少なくとも１つのステロール化合物を含み、PEG化脂質は、式XIおよびXIIから選択される少なくとも１つである。実施態様によっては、LNPは、式III、IV、およびVから選択される少なくとも１つの陽イオン性脂質、コレステロールおよびスチグマステリンから選択される少なくとも１つのステロール化合物を含み、PEG化脂質は、式XIIIおよびXIVから選択される少なくとも１つである。実施態様によっては、LNPは、式III、IV、およびVから選択される少なくとも１つの陽イオン性脂質、コレステロールおよびスチグマステリンから選択される少なくとも１つのステロール化合物を含み、PEG化脂質は、式XVおよびXVIから選択される少なくとも１つである。実施態様によっては、LNPは、式IIIの陽イオン性脂質、ステロール化合物としてのコレステロールを含み、PEG化脂質は式XIである。
【０８５５】
前段落のいずれかのLNPの実施態様では、陽イオン性脂質組成物の含量は約65 mol%〜75 mol%であり、ステロール化合物の含量は約24 mol%〜34 mol%であり、PEG化脂質の含量は約0.5 mol%〜1.5 mol%であり、ここで脂質組成物に対する陽イオン性脂質、ステロール化合物、およびPEG化脂質の各含量の総計は100mol%である。実施態様によっては、陽イオン性脂質は約70 mol%であり、ステロール化合物の含量は約29 mol%であり、PEG化脂質の含量は約1 mol%である。実施態様によっては、LNPは、式IIIが70 mol%、コレステロールが29mol%、および式XIが1 mol%である。
エキソソーム
【０８５６】
エキソソームは、RNAおよびタンパク質を移送し、かつRNAを脳および他の標的臓器に送達できる内因性ナノ小胞である。免疫原性を低減するために、Alvarez-Ervitiら（2011, Nat Biotechnol 29: 341）は、エキソソームの生成のために自己由来の樹状細胞を用いた。脳への標的化は、神経細胞に特異的なRVGペプチドに融合されるエキソソーム膜タンパク質であるLamp2bを発現するように樹状細胞を遺伝子操作することによって達成された。精製されたエキソソームには、エレクトロポレーション法によって外因性RNAが詰め込まれた。静脈内注射されたRVG標的のエキソソームは、GAPDH siRNAを脳内の神経細胞、小膠細胞、乏突起膠細胞に特異的に送達し、特定の遺伝子ノックダウンをもたらした。RVGエキソソームへの前曝露は、ノックダウンを減弱させず、他の組織中への非特異的な取込みは観察されなかった。エキソソームを介するsiRNA送達の治療能力は、アルツハイマー病での治療標的であるBACE1の強力なmRNA（60%）およびタンパク質（62%）のノックダウンによって実証された。
【０８５７】
免疫学的に不活性なエキソソームの貯蔵物を得るために、Alvarez-Ervitiらは、均質な主要組織適合遺伝子複合体 (MHC)のハプロタイプを持つ近交系C57BL/6マウスから骨髄を採取した。未成熟樹状細胞は、MHC-IIやCD86などのT細胞活性化因子を欠く大量のエキソソームを産生するので、Alvarez-Ervitiらは、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子 (GM-CSF)を有する樹状細胞を7日間にわたって選別した。その翌日に、エキソソームを、確立された超遠心分離手法を使用して培養上清から精製した。生成されたエキソソームは、物理的に均質であり、直径80 nmにピークを持つサイズ分布を有し、これは粒子追跡分析 (NTA)および電子顕微鏡によって決定された。Alvarez-Ervitiらは、106個の細胞あたりに6〜12 μgのエキソソーム（タンパク質濃度に基づいて測定）を取得した。
【０８５８】
次に、Alvarez-Ervitiらは、ナノ寸法の応用に適合するエレクトロポレーション手順を使用して、改変されたエキソソームに外因性のカーゴを詰め込むことが可能かを調査した。ナノメートル寸法での膜粒子のエレクトロポレーションは十分に確立されていないので、非特異的なCy5標識RNAを、エレクトロポレーション手順を経験的に最適化するために使用した。カプセル化されたRNAの量を、エキソソームの超遠心分離および溶解の後に分析した。400 Vおよび125 μFでのエレクトロポレーションは、RNAを最大限に保持し、その後の全ての実験に使用された。
【０８５９】
Alvarez-Ervitiらは、150 μgのRVGエキソソーム中にカプセル化された150 μgのBACE1 siRNAをそれぞれ正常なC57BL/6マウスに投与し、ノックダウン効率について、4種の対照、すなわち未処理マウス、RVGエキソソームのみを注入したマウス、in vivoの陽イオン性リポソーム試薬と複合化したBACE1 siRNAを注入したマウス、およびRVG-9Rと複合化したBACE1 siRNAを注入したマウスと比較した。このRVGペプチドは、静電的にsiRNAに結合する9個のD−アルギニンに接合されている。皮質組織試料を投与の3日後に分析したところ、siRNA-RVG-9R処理マウスとsiRNA RVGエキソソーム処理マウスの両方で有意なタンパク質のノックダウン（45%かつP<0.05対62%かつP<0.01）が観察され、これはBACE1 mRNA濃度の有意な減少（それぞれ66%±15%かつP<0.001、および61%±13%かつP<0.01）に起因していた。さらに、出願人らは、RVG−エキソソーム処理した動物では、アルツハイマー病態におけるアミロイド沈着物の主成分であるβ−アミロイド1−42の総濃度に有意な減少（55%かつP<0.05）があることを見出した。この観察された減少は、BACE1阻害剤の脳室内注入後に正常なマウスが示すβ−アミロイド1−40の減少よりも大きかった。Alvarez-Ervitiらは、BACE1切断産物にcDNA末端の5’−迅速増幅 (RACE)を実行し、これにより、siRNAによるRNAiを媒介とするノックダウンの確証が得られた。
【０８６０】
最後に、Alvarez-Ervitiらは、RNA−RVGエキソソームがin vivoで免疫応答を誘導するかどうかを、IL-6、IP-10、TNFα、およびIFN-αの血清濃度を評価することにより調査した。エキソソーム処理後に、IL-6の分泌を強力に刺激するsiRNA−RVG−9Rとは対照的に、全てのサイトカインで顕著でない変化が、siRNA形質導入試薬処理と同様に記録されて、エキソソーム処理の免疫学的に不活性な特徴が確認できた。エキソソームがsiRNAの20％にしかカプセル化していないとすると、同等のmRNAノックダウンおよびより多量のタンパク質のノックダウンは、対応する水準の免疫刺激なしに5分の1と少ないsiRNAにより達成されるので、RVG−エキソソームによる送達は、RVG−9R送達よりも効率的であるように見受けられる。この実験は、神経変性疾患に関連する遺伝子の長期サイレンシングに潜在的に適するRVG−エキソソーム技術の治療能力を実証した。Alvarez-Ervitiらのエキソソーム送達システムを、本発明のAD機能化CRISPR-Casシステムを治療標的、特に神経変性疾患に送達するのに応用してもよい。本発明では、約100〜1000 mgのRVGエキソソーム中にカプセル化された約100〜1000 mgのCRISPR-Casの用量を想定してもよい。
【０８６１】
El-Andaloussiら（Nature Protocols 7,2112-2126(2012)）は、培養細胞に由来するエキソソームを利用して、in vitroおよびin vivoでRNAを送達する方法を開示している。この方法では、まずペプチドリガンドと融合したエキソソームタンパク質を含む発現ベクターの形質導入による標的エキソソームの生成を説明している。次に、El-Andaloussiらは、形質導入された細胞上清からエキソソームを精製かつ特性解析する方法を説明している。続いてEl-Andaloussiらは、エキソソーム中にRNAを詰め込む重要な工程を詳述している。最後にEl-Andaloussiらは、エキソソームを用いて、in vitroおよびin vivoでマウスの脳にRNAを効率的に送達する方法を概説している。エキソソームを媒介とするRNA送達が機能測定および画像化によって評価される予測結果の例も提供している。この方法は、全体で約3週間を要する。本発明による送達または投与は、自己由来樹状細胞から産生されたエキソソームを用いて実施してもよい。本明細書での教示から、これは本発明の実施に使用できる。
【０８６２】
別の実施態様では、Wahlgrenらの血漿エキソソーム（Nucleic Acids Research, 2012, Vol. 40, No. 17 e130）が想定されている。エキソソームは、樹状細胞 (DC)、B細胞、T細胞、肥満細胞、上皮細胞、および腫瘍細胞などの多数の細胞型によって生成されるナノサイズの小胞（サイズは30〜90 nm）である。これらの小胞は、後期エンドソームの内側への出芽によって生成され、次に原形質膜と融合すると細胞外の環境に放出される。エキソソームは自発的に細胞間でRNAを移送するので、この特性は、遺伝子治療に有用になる可能性があり、かつこの開示内容から本発明の実施に活用できる。
【０８６３】
血漿からのエキソソームは、軟層を900 gで20分間遠心分離して血漿を単離し、続いて細胞上清を採取し、細胞を排除するように300 gで10分間遠心分離し、かつ16,500gで30分間遠心分離して、続いて0.22 mmフィルターにより濾過して調製できる。エキソソームを、120,000gで70分間の超遠心分離にかけてペレット化する。エキソソーム中へのsiRNAの化学的形質移入は、RNAi Human/Mouse Starter Kit（Quiagen製, Hilden, Germany）で製造元の指示書に従って実行される。siRNAを、100 mlのPBSに2 mmol/mlの最終濃度まで加える。HiPerFect形質移入試薬を加えた後に、混合液を室温で10分間培養する。過剰なミセルを取り除くために、アルデヒド／硫酸ラテックスビーズを使用してエキソソームを再単離する。エキソソーム中へのCRISPR-Casの化学的形質移入は、siRNAと同様に実施してもよい。エキソソームを、健康な提供者の末梢血から単離された単球およびリンパ球と共培養してもよい。従って、CRISPR-Casを含むエキソソームを、ヒトの単球およびリンパ球に導入し、かつヒト中に自己移植的に再導入することを想定してもよい。従って、本発明による送達または投与は、血漿エキソソームを用いて実施できる。
【０８６４】
リポソーム
【０８６５】
本発明による送達または投与は、リポソームを用いて実施できる。リポソームは、内側の水性区画を取り囲む単層または多層の脂質二重層および比較的不浸透性の外側の親油性リン脂質二重層から構成される球状の小胞構造である。リポソームは、生体適合性があり、毒性がなく、親水性および親油性の両方の薬物分子を送達し、血漿酵素による分解からそれらのカーゴを保護し、かつ生体膜および血液脳関門 (BBB)を越えてそれらの負荷を輸送できるために、リポソームは、薬物送達担体としてかなりの注目を集めている（例えば、Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679の総説を参照）。
【０８６６】
リポソームは、いくつかの異なる脂質型から作製できるが、リン脂質を最も一般的に使用して薬物担体としてのリポソームを生成する。リポソームは、脂質膜が水溶液と混合されると自発的に生成されるが、破砕分散装置、超音波処理装置、または押出装置を用いて振盪の形態で力を加えて促進することもできる（例えば、Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679の総説を参照）。
【０８６７】
それらの構造および特性を改変するために、いくつかの他の添加剤をリポソームに添加してもよい。例えば、コレステロールまたはスフィンゴミエリンのいずれかをリポソーム混合物に添加して、リポソーム構造の安定化を助け、かつリポソーム内部のカーゴの漏出を防止してもよい。さらに、リポソームを、水素化卵ホスファチジルコリンまたは卵ホスファチジルコリン、コレステロール、およびリン酸ジセチルから調製し、それらの平均小胞サイズを、約50および100 nmに調整した。（例えば、Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679の総説を参照）。
【０８６８】
リポソーム製剤は、天然のリン脂質、および1,2−ジステアロリル−sn−グリセロ−3−ホスファチジルコリン(DSPC)、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、およびモノシアロガングリオシドなどの脂質から主に構成されてもよい。この製剤はリン脂質のみで構成されているために、リポソーム製剤は多くの課題に直面していて、その１つの課題は血漿中の不安定さである。これらの課題を克服するために、いくつかの検討が、特に脂質膜の取扱いについて進められてきた。これらの検討の１つとして、コレステロールの取扱いが注目された。従来からの製剤にコレステロールを添加すると、カプセル化された生物活性化合物の血漿への急速な放出が低減され、あるいは1,2−ジオレオイル−sn−グリセロ−3−ホスホエタノールアミン (DOPE)が安定性を向上させる（例えば、Spuch and Navarro, Journal of Drug Delivery, vol. 2011, Article ID 469679, 12 pages, 2011. doi:10.1155/2011/469679の総説を参照）。
【０８６９】
特に有利な実施態様では、（分子状トロイの木馬としても知られている）トロイの木馬リポソームが望ましく、その手順は、cshprotocols.cshlp.org/content/2010/4/pdb.prot5407.longに見出すことができる。これらの粒子により、血管内注射後に脳全体への導入遺伝子の送達が可能になる。限定に拘束されることはないが、表面に結合した特定の抗体を有する中性脂質粒子は、細胞内取り込み作用を介して血液脳関門の通過が可能になると考えられている。トロイの木馬リポソームを使用して、CRISPRファミリーのヌクレアーゼを、血管内注射を介して脳まで送達でき、これにより、胚での操作は必要とせずに脳全体にまで遺伝子導入された動物が可能になると思われる。リポソームでのin vivo投与には、約1〜5 gのDNAまたはRNAが想定されてもよい。
【０８７０】
別の実施態様では、AD機能化CRISPR-Casシステムまたはその成分は、安定核酸脂質粒子(SNALP)などのリポソームで投与されてもよい（例えば、Morrissey et al., Nature Biotechnology, Vol. 23, No. 8, August 2005を参照）。SNALP中に標的化された特定のCRISPR-Casの約1、3、または5 mg/kg/日での毎日の静脈内注射が想定される。毎日の処置は、約3日間を超えて実施され、その後は約5週間にわたって毎週実施される。別の実施態様では、約1または2.5 mg/kgの用量で静脈内注射によって投与される特定のCRISPR-Casをカプセル化したSNALPもまた想定される（例えば、Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006を参照）。SNALP製剤には、2：40：10：48のmol%比で、3−N−［（ω−メトキシポリ（エチレングリコール）2000）カルバモイル］−1,2−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン (PEG-C-DMA)、1,2−ジリノレイルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパン (DLinDMA)、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン (DSPC)、およびコレステロールの各脂質が含有されていてもよい（例えば、Zimmerman et al., Nature Letters, Vol. 441, 4 May 2006を参照）。
【０８７１】
別の実施態様では、安定核酸脂質粒子 (SNALP)は、高度に血管新生されたHepG2由来の肝腫瘍への効果的な送達分子であることが証明されているが、血管新生が不十分なHCT-116由来の肝腫瘍では証明されてはいない（例えば、Li, Gene Therapy (2012) 19, 775-780を参照）。SNALPリポソームは、25：1の脂質／siRNA比および48／40／10／2のモル比のコレステロール／D-Lin-DMA／DSPC／PEG-C-DMAを用いて、ジステアロイルホスファチジルコリン (DSPC)、コレステロール、およびsiRNAと共にD-Lin-DMAおよびPEG-C-DMAを処方して調製されてもよい。得られたSNALPリポソームのサイズは約80〜100 nmである。
【０８７２】
さらに別の実施態様では、SNALPは、合成コレステロール（Sigma-Aldrich製, St Louis, MO, USA）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Avanti Polar Lipids製, Alabaster, AL, USA）、3−N−［（ω−メトキシポリ（エチレングリコール）2000）カルバモイル]−1,2−ジミレスチルオキシプロピルアミン、および陽イオン性の1,2−ジリノレイルオキシ−3−N,N−ジメチルアミノプロパンを含んでもよい（例えば、Geisbert et al., Lancet 2010; 375: 1896-905を参照）。例えば、静脈内ボーラス注射として投与される用量あたり約2 mg/kgのCRISPR-Cas総量の投与が想定されてもよい。
【０８７３】
さらに別の実施態様では、SNALPは、合成コレステロール（Sigma-Aldrich製）、1,2−ジステアロイル−sn−グリセロ−3−ホスホコリン（DSPC；Avanti Polar Lipids Inc.製）、PEG−cDMA、および1,2−ジリノレイルオキシ−3−（N,N−ジメチル）アミノプロパン(DLinDMA)を含んでもよい（例えば、Judge, J. Clin. Invest. 119:661-673 (2009)を参照）。in vivoでの検討に使用される製剤は、約9：1の最終脂質／RNAの質量比を含んでもよい。
【０８７４】
RNAiナノ製剤の安全性特性は、Alnylam Pharmaceuticals社のBarrosandとGollobによって論評されている（例えば、Advanced Drug Delivery Reviews 64 (2012) 1730-1737を参照）。安定核酸脂質粒子 (SNALP)は、4種の異なる脂質、すなわち低pHで陽イオンのイオン性脂質 (DLinDMA)、中性ヘルパー脂質、コレステロール、および拡散性ポリエチレングリコール (PEG)脂質で構成されている。粒子の直径は約80 nmであり、生理学的pHは電荷中性である。処方中に、イオン性脂質は、粒子形成中に脂質を陰イオン性のRNAとともに凝縮させるように作用する。酸性度が強くなるエンドソーム条件で正に帯電すると、イオン性脂質はまた、SNALPとエンドソーム膜との融合を媒介して、細胞質中へのRNAの放出を可能にする。PEG脂質は、粒子を安定化し、製剤中の凝集を減少させ、続いて薬物動態特性を改善する中性の親水性外皮を提供する。
【０８７５】
現在までに、RNAを含むSNALP製剤を使用して、２つの臨床プログラムが開始された。Tekmira Pharmaceuticals社は最近、LDLコレステロールが高い成人の希望者を対象としてSNALP−ApoBの第I相の単回投与試験を完了した。ApoBは、主に肝臓と空腸で発現し、VLDLとLDLの会合および分泌に必須である。17人の被験者は、SNALP−ApoBの単回投与を受けた（7種の投与濃度で用量を増大）。（前臨床試験に基づく潜在的な用量制限毒性として予測された）肝臓毒性の確証は見られなかった。最高用量の（2人の内の）1人の被験者が、免疫系刺激に一致するインフルエンザ様症状を発症して、試験の終了を決めた。
【０８７６】
Alnylam Pharmaceuticals社も同様に、最新のALN-TTR01を有し、これは上述のSNALP技術を用い、変異型TTRおよび野生型TTRの両方の肝細胞での産生を標的としてTTRアミロイドーシス (ATTR)を治療する。3種のATTR症候群が報告されていて、それら症候群は、家族性アミロイド多発神経障害 (FAP)、家族性アミロイド心筋症(FAC)、および老人性全身アミロイドーシス (SSA)であり、FAPおよびFACのどちらもがTTRの常染色体の優性変異に起因し、SSAは野生型TTRに起因する。ALN-TTR01の偽薬対照試験および単回用量漸増第I相試験が、最近ATTR患者で完了した。ALN-TTR01を、31人の患者（23人が治験薬対象、8人が偽薬対象）に、0.01〜1.0 mg/kg（重量はsiRNAに基づく）の用量範囲内で15分間のIV注入として投与した。治療は許容性が高く、肝機能検査に有意な増大は無かった。注入に関連する反応として、0.4 mg/kg以上で23人中3人の患者に認められ、全員が注入速度の減少に反応し、全員で検討を続けた。血清サイトカインであるIL-6、IP-10およびIL-1raの最小かつ一過性の上昇が、（前臨床およびNHP研究から予測されるように）1 mg/kgの最高用量で2人の患者に認められた。ALN-TTR01の予測される薬物動力学の効果である血清TTRの減少は、1 mg/kgで観察された。
【０８７７】
さらに別の実施態様では、SNALPを、例えばエタノール中に、陽イオン性脂質、DSPC、コレステロール、およびPEG脂質を、例えばそれぞれ40：10：40：10のモル比で溶解して作製してもよい（Semple et al., Nature Niotechnology, Volume 28 Number 2 February 2010, pp. 172-177を参照）。この脂質混合物を水性緩衝液（50 mMのクエン酸塩、pH 4）に加え、最終のエタノールおよび脂質濃度をそれぞれ30% (vol/vol)および6.1 mg/mlになるように混合して、押出しの前に22°Cで2分間平衡化させた。この水和脂質は、動的光散乱分析によって決定される小胞直径が70〜90 nmとなるまで、Lipex Extruder（Northern Lipids製）を使用して22°Cで2層の80 nmの孔径フィルター（Nuclepore）を通して押し出した。このためには、通常1〜3回の通過が必要であった。（30%のエタノールを含有する50 mMクエン酸塩のpH 4の水溶液に溶解された）siRNAを、混合しながら約5 ml/minの速度で事前に（35°Cで）平衡化した小胞に添加した。最終的な標的siRNA／脂質の比が0.06 (wt/wt)に達した後に、混合物を35°Cでさらに30分間培養して、小胞の再構築およびsiRNAのカプセル化を可能とした。次にエタノールを除去して、透析または接線流透析濾過のいずれかにより、外部緩衝液をPBS（155 mMのNaCl、3 mMのNa2HPO4、1 mMのKH2PO4、pH 7.5）に置き換えた。siRNAを、制御された段階希釈プロセスを使用してSNALP中にカプセル化した。KC2-SNALPの脂質成分は、57.1：7.1：34.3：1.4のモル比で用いられたDLin-KC2-DMA（陽イオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（DPPC；Avanti Polar Lipids製）、合成コレステロール（Sigma製）、およびPEG-C-DMAであった。詰め込まれた粒子が生成されると、SNALPをPBSに対して透析し、使用前に0.2 μmのフィルターを通してフィルター滅菌した。平均粒子径は75〜85 nmであり、siRNAの90〜95%は、脂質粒子内にカプセル化された。in vivoでの試験に使用された製剤での最終的なsiRNA／脂質の比は、約0.15 (wt/wt）であった。第VII因子のsiRNAを含むLNP−siRNAシステムを使用直前に滅菌PBS中で適切な濃度に希釈し、その製剤を総量10 ml/kgで側方の尾静脈を通して静脈内投与した。この方法およびこれらの送達システムは、本発明のAD機能化CRISPR-Casシステムに外挿することができる。
その他の脂質
【０８７８】
アミノ脂質である2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノエチル−［1,3］−ジオキソラン (DLin-KC2-DMA)などの他の陽イオン性脂質を利用して、例えばSiRNAに類似のCRISPR-Casまたはその成分またはそれをコードする核酸分子をカプセル化してもよく（例えば、Jayaraman, Angew. Chem. Int. Ed. 2012, 51, 8529 -8533を参照）、従って、この脂質を本発明の実施に使用してもよい。以下の脂質組成物を有する事前に生成された小胞が想定されてもよく、その組成物は、それぞれモル比として40／10／40／10のアミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン (DSPC)、コレステロール、および（R）−2,3−ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−1−（メトキシポリ（エチレングリコール）2000）カルバミン酸プロピル（PEG脂質）であり、FVII siRNA／総脂質の比は約0.05 (w/w)である。70〜90 nmの範囲の狭い粒子サイズ分布、および0.11+0.04（n=56）の低い多分散度指数を確実にするために、ガイドRNAを添加する前に粒子を80 nmの膜を通して最大3回押し出してもよい。非常に強力なアミノ脂質16を含む粒子を使用してもよく、この場合、4つの脂質成分である16、DSPC、コレステロール、およびPEG脂質のモル比は、in vivo活性を高めるためにさらに最適化されていてもよい（50／10／38.5／1.5）。
【０８７９】
Michael S D Kormannら（”Expression of therapeutic proteins after delivery of chemically modified mRNA in mice”「マウスでの化学改変mRNAの送達後の治療用タンパク質の発現」：Nature Biotechnology, Volume:29, Pages: 154-157 (2011)）は、RNAを送達するための脂質外膜の使用について説明している。脂質外膜の使用も本発明では好ましい。
【０８８０】
別の実施態様では、脂質を、本発明のAD機能化CRISPR-Casシステムまたはその成分またはそれをコードする核酸分子を用いて処方して、脂質ナノ粒子（LNP）を生成してもよい。脂質には、限定はされないが、DLin-KC2-DMA4、C12-200が含まれ、かつ共脂質であるジステロイルホスファチジルコリン、コレステロール、およびPEG-DMGは、自発的な小胞生成手順を使用して、siRNAに代えてCRISPR-Casにより製剤化してもよい（例えば、Novobrantseva, Molecular Therapy-Nucleic Acids (2012) 1, e4; doi:10.1038/mtna.2011.3を参照）。成分のモル比は、約50／10／38.5／1.5（DLin-KC2-DMAまたはC12-200／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／PEG-DMG）であってもよい。DLin-KC2-DMAおよびC12-200脂質ナノ粒子 (LNP)の場合に、最終的な脂質：siRNAの重量比は、それぞれ約12：1および9：1としてもよい。製剤は、90％を超える捕捉効率で、平均粒子径が約80 nmであってもよい。3 mg/kgの用量が想定されてもよい。
【０８８１】
Tekmira Pharmaceuticals社は、LNPおよびLNP製剤の様々な側面を対象とする、米国および海外の約95のファミリー特許群を有し（例えば、米国特許7,982,027号、7,799,565号、8,058,069号、8,283,333号、7,901,708号、7,745,651号、7,803,397号、8,101,741号、8,188,263号、7,915,399号、8,236,943号、および7,838,658号、ならびに欧州特許1766035号、1519714号、1781593号、および1664316号を参照）、これらは全て本発明に使用かつ／あるいは応用できる。
【０８８２】
AD機能化CRISPR-Casシステムまたはその成分またはそれをコードする核酸分子は、米国公開特許20130252281号、20130245107号、および20130244279号（Moderna Therapeutics社に譲渡済み）にさらに説明されるようなPLGA小球体中にカプセル化され送達されてもよく、これら特許は、タンパク質、タンパク質前駆体、またはタンパク質またはタンパク質前駆体が部分的にまたは完全に処理された形態をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤化の側面に関する。製剤は、50：10：38.5：1.5〜3.0（陽イオン性脂質：融合性脂質：コレステロール：PEG脂質）のモル比を有してもよい。PEG脂質は、PEG-c-DOMG、PEG-DMGから選択されてもよいが、これらに限定はされない。融合性脂質はDSPCであってもよい。Schrumらの名称がDelivery and Formulation of Engineered Nucleic Acids（遺伝子操作された核酸の送達および製剤化）である米国公開特許20120251618号も参照。
【０８８３】
Nanomerics社の技術は、低分子量の疎水性薬物、ペプチド、および核酸系の治療薬（プラスミド、siRNA、miRNA）を含む、広範囲の治療薬の生体利用能の課題に対処している。この技術が明確な利点を示す特定の投与経路としては、経口経路、血液脳関門を通過する輸送、固形腫瘍への送達ならびに眼内への送達が含まれる。例えば、Mazza et al., 2013, ACS Nano. 2013 Feb 26;7(2):1016-26、Uchegbu and Siew, 2013, J Pharm Sci. 102(2):305-10、およびLalatsa et al., 2012, J Control Release. 2012 Jul 20; 161(2):523-36を参照。
【０８８４】
米国特許公開20050019923号は、ポリヌクレオチド分子、ペプチド、およびポリペプチド、かつ／あるいは医薬品などの生物活性分子を哺乳動物の体に送達するための陽イオン性デンドリマーを説明している。このデンドリマーは、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓、または心臓（さらに脳）への生物活性分子の送達を目標とするのに適している。デンドリマーは、単純な分岐モノマー単位から段階的に調製される合成の三次元高分子であり、その性質と機能は容易に制御かつ変更できる。デンドリマーは、構成要素の反復付加から多機能のコアへ合成され（合成への分岐手法）、あるいは多機能のコアに向かって合成され（合成への収束手法）、構成要素の三次元シェルのそれぞれの付加は、デンドリマーの上位世代の生成に繋がる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、ジアミノブタンコアから出発し、このコアには、第一級アミンへのアクリロニトリルの２回のマイケル付加反応、かつそれに続くニトリルの水素付加反応によって、２倍のアミノ基の数が付加されている。これにより、２倍のアミノ基がもたらされる。ポリプロピレンイミンデンドリマーには、100%の陽子化可能な窒素、および最大64個の末端アミノ基（第5世代、DAB 64）が含まれる。陽子化可能な基とは、通常、中性のpHで陽子を受容できるアミン基である。遺伝子送達剤としてのデンドリマーの使用は、ポリアミドアミン、およびアミン／アミドまたはN--P(O2)Sの混合物をそれぞれ共役単位とするリン含有化合物の使用に多くは集中していて、遺伝子送達のための下位世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの使用に関する研究は報告されていなかった。ポリプロピレンイミンデンドリマーはまた、薬物送達のための、かつ周辺のアミノ酸基によって化学的に改変された場合のゲスト分子のそれらのカプセル化のためのpH感受性徐放システムとして研究されてきた。ポリプロピルエニミンデンドリマーの細胞毒性およびDNAとのその相互作用、ならびにDAB 64の形質移入効力も検討されている。
【０８８５】
米国特許公開20050019923号は、過去の報告とは逆に、ポリプロピレンイミンデンドリマーなどの陽イオン性デンドリマーが、遺伝物質などの生物活性分子の標的化送達に使用するために特定の標的化および低毒性などの適切な特性を示すという観察結果に基づいている。さらに、陽イオン性デンドリマーの誘導体はまた、生物活性分子の標的化送達に適する特性を示している。名称がBioactive Polymers（生活性ポリマー）である米国公開特許20080267903号も参照とし、この特許は、「陽イオン性のポリアミンポリマーおよびデンドリマーポリマーを含む種々のポリマーは、抗増殖活性を有することが示され、従って、新生物および腫瘍、（自己免疫疾患を含む）炎症性疾患、乾癬、およびアテローム性動脈硬化症などの望ましくない細胞増殖を特徴とする疾患の治療に使用できる」ことを開示している。このポリマーは、単独で活性剤として、あるいは薬物分子または遺伝子治療用の核酸などのその他の治療薬のための送達媒体として使用できる。この場合は、ポリマー自体の固有の抗腫瘍活性は、送達される薬剤の活性を補完することができる。これらの特許刊行物の開示は、AD機能化CRISPR-Casシステムまたはその成分またはそれをコードする核酸分子の送達のために、本明細書での教示と併せて使用してもよい。
過帯電タンパク質
【０８８６】
過帯電タンパク質は、異常に高い正または負の正味の理論電荷を有する天然起源または遺伝子操作されたタンパク質の部類であり、AD機能化CRISPR-Casシステムまたはその成分またはそれをコードする核酸分子の送達に使用されてもよい。負に過帯電したタンパク質および正に過帯電したタンパク質は両方とも、熱的または化学的に誘発された凝集に耐える顕著な能力を示す。正に過帯電したタンパク質は、哺乳類の細胞にも浸透することができる。カーゴをプラスミドDNA、RNA、または他のタンパク質などのこれらのタンパク質に会合させることにより、in vitroおよびin vivoの両方で哺乳動物細胞中にこれらの高分子を機能的に送達できる。過帯電タンパク質の生成および特性解析は、2007年に報告されている（Lawrence et al., 2007, Journal of the American Chemical Society 129, 10110-10112）。
【０８８７】
哺乳動物細胞中へのRNAおよびプラスミドDNAの非ウイルス送達は、研究用途および治療用途の両方にとって価値がある（Akinc et al., 2010, Nat. Biotech. 26, 561-569）。精製された+36 GFPタンパク質（または他の正に過帯電したタンパク質）は、適切な無血清培地中でRNAと混合されて、細胞に添加する前に複合体を形成できる。この段階で血清が混入すると、過帯電タンパク質−RNA複合体の形成が阻害され、治療の有効性が低下する。以下の手順は、様々な細胞株に有効であることが分かっている（McNaughton et al., 2009, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116）（但し、タンパク質とRNAの用量を変化させる予備的実験を、特定の細胞株の手順を最適化するために実行する必要がある）。この手順は、（1）処理の1日前に48ウェルプレートにウェルあたり1 x105個の細胞を播種すること、（2）処理当日に精製された+36 GFPタンパク質を無血清培地で200 nMの最終濃度に希釈し、RNAを50 nMの最終濃度になるまで添加し、渦状に混合して室温で10分間培養すること、（3）培養中に細胞から培地を吸引してPBSで1回洗浄すること、（4）+36 GFPおよびRNAの培養後にタンパク質−RNA複合体を細胞に添加すること、（5）細胞を複合体とともに37°Cで4時間培養すること、（6）培養後に培地を吸引して20 U/mLのヘパリンPBSで3回洗浄し、活性の測定法に応じて細胞を血清含有培地とともにさらに48時間以上培養すること、（7）免疫ブロット、qPCR、表現型解析、またはその他の適切な方法により細胞を分析すること、から構成される。
【０８８８】
+36 GFPは、ある範囲の細胞では効果的なプラスミド送達試薬であることがさらに見出された。プラスミドDNAはsiRNAよりも大きなカーゴであるので、プラスミドを効果的に複合化するには、それに比例してより多くの+36 GFPタンパク質が必要となる。効果的なプラスミド送達のために、出願人らは、インフルエンザウイルス血球凝集素タンパク質に由来する既知のエンドソーム破壊ペプチドである、C末端HA2ペプチドタグを保持する+36 GFPの変異体を開発した。以下の手順は様々な細胞に効果的であるが、上記のように、プラスミドDNAと過帯電タンパク質の用量は特定の細胞株および送達用途に対して最適化されることが推奨される。この手順は、（1）処理の1日前に48ウェルプレートにウェルあたり1 x 105個を播種すること、（2）処理当日に精製されたp36 GFPタンパク質を無血清培地で2 mMの最終濃度に希釈し、1 mgのプラスミドDNAを添加し、渦状に混合して室温で10分間培養すること、（3）培養中に細胞から培地を吸引してPBSで1回洗浄すること、（4）p36 GFPおよびプラスミドDNAの培養後に、タンパク質−DNA複合体を細胞に徐々に添加すること、（5）細胞を複合体とともに37°Cで4時間培養すること、（6）培養後に培地を吸引してPBSで洗浄し、細胞を血清含有培地中でさらに24〜48時間培養すること、（7）必要に応じてプラスミドの送達を（例えば、プラスミド駆動型遺伝子発現によって）分析すること、から構成される。
【０８８９】
さらに、例えば、McNaughton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106, 6111-6116 (2009)、Cronican et al., ACS Chemical Biology 5, 747-752 (2010)、Cronican et al., Chemistry & Biology 18, 833-838 (2011)、Thompson et al., Methods in Enzymology 503, 293-319 (2012)、およびThompson, D.B., et al., Chemistry & Biology 19 (7), 831-843 (2012)を参照。過帯電タンパク質の方法は、本発明のAD機能化CRISPR-Casシステムの送達に使用かつ／あるいは応用できる。これらのシステムを、本明細書での教示と併せて、AD機能化CRISPR-Casシステムまたはその成分またはそれをコードする核酸分子の送達に使用できる。
細胞透過性ペプチド (CPP)
【０８９０】
さらに別の実施態様では、細胞透過性ペプチド (CPP)が、AD機能化CRISPR-Casシステムの送達のために想定される。CPPは、（DNAのナノサイズ粒子から小さな化学分子や大きな断片まで）様々な分子カーゴの細胞への取込みを容易にする短いペプチドである。本明細書で使用される用語「カーゴ」には、限定はされないが、治療薬、診断プローブ、ペプチド、核酸、アンチセンスオリゴヌクレオチド、プラスミド、タンパク質、ナノ粒子などの粒子、リポソーム、発色団、小分子、および放射性物質からなる群が含まれる。本発明の側面では、カーゴはまた、AD機能化CRISPR-Casシステムの任意の成分またはAD機能化CRISPR-Casシステムの全体を含んでもよい。本発明の側面はさらに、所望のカーゴを対象内に送達する方法を提供し、この方法は、（a）本発明の細胞透過性ペプチドと所望のカーゴを含む複合体を調製し、（b）この複合体を、経口的に、関節腔内に、腹腔内に、髄腔内に、動脈内に、鼻腔内に、柔組織内に、皮下内に、筋肉内に、静脈内に、経皮的に、直腸内に、または局所的に対象に投与することを含む。カーゴは、共有結合による化学結合、または非共有相互作用による化学結合のいずれかを介してペプチドと会合される。
【０８９１】
CPPの機能は、カーゴを細胞内に送達することであり、これは、生きている哺乳動物細胞のエンドソームにカーゴが送達される細胞内取込み作用を通して、通常に引き起こされるプロセスである。細胞透過性ペプチドは、サイズ、アミノ酸配列、および電荷が異なるが、全てのCPPには、原形質膜を移動させ、かつ細胞質または細胞小器官への種々の分子カーゴの送達を容易にする能力である１つの固有の特徴を有する。CPPの移動は、３種の主要な侵入過程に分類でき、それらの過程は、膜への直接浸透、細胞内取込み作用により媒介される侵入、および一過性の構造の形成による移動である。CPPでは、癌阻害剤およびウイルス阻害剤などの種々の疾患の治療における薬物送達剤として、ならびに細胞標識用の造影剤として、多くの医学用途が見出されている。後者の例として、GFP造影剤、MRI造影剤、または量子ドットの担体として機能することが含まれる。CPPは、研究や医療で使用するためのin vitroおよびin vivo送達ベクターとして大きな可能性を秘めている。CPPは典型的に、リジンやアルギニンなどの正に帯電したアミノ酸を比較的豊富に含むか、極性すなわち帯電したアミノ酸と非極性の疎水性アミノ酸の交互配置形態を含む配列を持つかのいずれかのアミノ酸組成物を有する。これらの２種の構造は、それぞれポリ陽イオン性または両親媒性と呼ばれる。CPPの第３の部類は、非極性残基のみを含み、正味電荷が低い疎水性ペプチドであるか、あるいは細胞への取込みに重要な疎水性アミノ酸基を有する。発見された初期のCPPの１つは、ヒト免疫不全ウイルス1 (HIV-1）からのトランス活性化転写活性化因子 (Tat)であり、HIV-1は、培養中の多数の細胞種によって周囲の培地から効率的に取り込まれることが分かった。それ以来、既知となるCPPの数は大幅に増加し、より効果的なタンパク質遺伝子導入特性を備えた小分子の合成類似体が生成されている。CPPには、限定はされないが、ペネトラチン、Tat (48-60)、トランスポータン、およびR-AhX-R4（Ahxはアミノヘキサノイルである）が含まれる。
【０８９２】
米国特許8,372,951号は、高い細胞浸透効率および低い毒性を示す好酸球陽イオン性タンパク質(ECP)に由来するCPPを提供している。カーゴとともにCPPを脊椎動物対象に送達する側面もまた提供されている。CPPおよびその送達のさらなる側面は、米国特許第8,575,305号、8,614,194号、および8,044,019号に説明されている。CPPを用いて、AD機能化CRISPR-Casシステムまたはその成分を送達できる。CPPを用いてAD機能化CRISPR-Casシステムまたはその成分を送達できることはまた、Suresh Ramakrishna, Abu-Bonsrah Kwaku Dad, Jagadish Beloor, et al. Genome Res. 2014 Apr 2の名称が「Cas9タンパク質およびガイドRNAの細胞透過性ペプチドを媒介とする送達による遺伝子破壊」である論文に説明されていて、参照によりその全体が組み込まれ、CPP結合組換えCas9タンパク質およびCPP複合ガイドRNAによる処理は、ヒト細胞株での内因性遺伝子破壊を導くことが示されている。この論文では、Cas9タンパク質はチオエーテル結合を介してCPPに結合していたが、ガイドRNAはCPPと複合化し、凝縮した正に帯電した粒子を生成している。胚性幹細胞、皮膚線維芽細胞、HEK 293T細胞、HeLa細胞、および胚性癌細胞を含むヒト細胞を、改変されたCas9およびガイドRNAで同時に連続的に処理すると、効率的な遺伝子破壊がもたらされ、プラスミドの遺伝子導入に比較して非特異的標的変異が低減されることが示されていた。
エアロゾル送達
【０８９３】
肺疾患を治療される対象は、例えば、自発呼吸中に気管支内に送達される、肺あたりで薬学的に有効な量のエアロゾル化されたAAVベクターシステムを受けてもよい。このように、エアロゾル化送達は、一般にAAVの送達に好ましい。アデノウイルス粒子またはAAV粒子を送達に使用してもよい。それぞれが１つ以上の調節配列に操作可能に連結されている適切な遺伝子構築物を、送達ベクターにクローンしてもよい。
封入およびプロモーター
【０８９４】
CRISPR-Casタンパク質、および場合によっては核酸分子をコードする機能ドメイン（例えばアデノシンデアミナーゼ）の発現を駆動するために使用されるプロモーターは、プロモーターとして機能できるAAV ITRを含んでもよい。これは、（ベクター内の空間を占める可能性がある）追加のプロモーター要素の必要性を排除するのに有効である。解放された追加の空間は、追加の要素（gRNAなど）の発現を駆動するために使用できる。またITR活性は比較的弱いので、C2c1の過剰発現による潜在的な毒性を減弱するために使用できる。
【０８９５】
随所での発現の場合に、使用できるプロモーターには、CMV、CAG、CBh、PGK、SV40、フェリチンの重鎖または軽鎖などが含まれる。脳または他の中枢神経系 (CNS)での発現の場合に、シナプシンIは全ての神経細胞に使用でき、CaMKIIαは興奮性神経細胞に使用でき、GAD67またはGAD65またはVGATは、GABA作動性神経細胞に使用できる。肝臓での発現には、アルブミンプロモーターを使用できる。肺での発現には、SP-Bを使用できる。内皮細胞には、ICAMを使用できる。造血細胞には、IFNβまたはCD45を使用できる。骨芽細胞には、OG-2を使用できる。
【０８９６】
ガイドRNAを駆動するために使用されるプロモーターは、ガイドRNAを発現するために、U6またはH1などのPol IIIプロモーターを含んでもよく、ならびにPol IIプロモーターおよびイントロンカセットを使用してもよい。
【０８９７】
特定の実施態様では、CRISPR-Casシステムは、アデノ随伴ウイルス (AAV)、白血病ウイルス (MuMLV)、レンチウイルス、アデノウイルス、または他のプラスミドまたはウイルスベクター型を使用して送達される。
アデノ随伴ウイルス (AAV)
【０８９８】
CRISPR-Casタンパク質、アデノシンデアミナーゼ、および１つ以上のガイドRNAは、アデノ随伴ウイルス (AAV)、レンチウイルス、アデノウイルス、または他のプラスミドまたはウイルスベクター型を使用して、特に、例えば米国特許8,454,972号（アデノウイルスの製剤、用量）、8,404,658号（AAVの製剤、用量）、および5,846,946号（DNAプラスミドの製剤、用量）からの製剤および用量を使用して、ならびにレンチウイルス、AAV、およびアデノウイルスを含む臨床試験およびそれらを含む臨床試験に関する出版物からの製剤および用量を使用して送達できる。例えば、AAVの場合に、投与経路、製剤、および用量は、米国特許8,454,972号のようにしてもよく、かつAAVを含む臨床試験のようにしてもよい。アデノウイルスの場合に、投与経路、製剤、および用量は、米国特許8,404,658号のようにしてもよく、かつアデノウイルスを含む臨床試験のようにしてもよい。プラスミド送達の場合に、投与経路、製剤、および用量は、米国特許5,846,946号のようにしてもよく、かつプラスミドを含む臨床研究のようにしてもよい。用量は、平均70 kgの個体（例えば、成人男性）に基づくか、または外挿してもよく、異なる体重および種の患者、被験者、哺乳動物に合わせて調節してもよい。投与の頻度は、患者または対象の年齢、性別、一般的な健康状態、その他の状態、および対処される特定の病状または症状を含む通常の因子に応じて、医者または獣医が決定する範囲内とする。ウイルスベクターを、関心のある組織に注入できる。細胞型に特異的なゲノム改変の場合に、C2c1およびアデノシンデアミナーゼの発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動されてもよい。例えば、肝臓特異的発現は、アルブミンプロモーターを使用してもよく、（例えば、CNS障害を標的とするための）神経細胞特異的発現は、シナプシンIプロモーターを使用してもよい。
【０８９９】
in vivo送達に関して、AAVは２つの理由で他のウイルスベクターよりも有利であり、それらの理由は、毒性が低いこと（この特性は、免疫応答を活性化できる細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製方法に起因する可能性がある）、および挿入変異が宿主ゲノム内に組み込まれていないので、挿入変異を引き起こす可能性が低いことである。
【０９００】
AAVは、4.5または4.75 Kbの封入の限界を有する。これは、C2c1ならびにプロモーターおよび転写ターミネーターが全て同一のウイルスベクターに適合する必要があることを意味している。4.5または4.75 Kbを超える構築物は、ウイルス産生の大幅な減少をもたらす。SpCas9は極めて大きく、遺伝子自体は4.1 Kbを超えているので、AAV内に詰め込むことが困難になる。従って、本発明の実施態様は、より短いC2c1の相同体を利用することを含む。実施態様によっては、ウイルスキャプシドは、１つ以上のVP1、VP2、VP3の各キャプシドタンパク質を含む。
【０９０１】
AAVについて、AAVは、AAV1、AAV2、AAV5、またはそれらの任意の組合せであってもよい。標的とされる細胞に関連するAAVの中からAAVを選択してもよく、例えば、脳または神経細胞を標的とするために、AAV血清型1、2、5、あるいは混成キャプシドAAV1、AAV2、AAV5、またはそれらの任意の組合せを選択してもよく、かつ心臓組織を標的とするためにAAV4を選択してもよい。AAV8は肝臓への送達に有用である。本明細書でのプロモーターおよびベクターは、いずれも好ましい。これらの細胞に関する特定のAAV血清型の集計（Grimm, D. et al, J. Virol. 82: 5887-5911 (2008)を参照）は以下の通りである。
【表８】
2021532815.tif 000043
レンチウイルス
【０９０２】
レンチウイルスは、有糸分裂細胞および有糸分裂後細胞の両方で、それらの遺伝子に感染しかつ発現する能力を有する複合レトロウイルスである。最も一般的に知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス (HIV)であり、他のウイルスの外膜糖タンパク質を用いて、様々な種類の細胞型を標的とする。
【０９０３】
レンチウイルスは、以下のように調製できる。（レンチウイルス移動プラスミド骨格を含む）pCasES10をクローンした後に、抗生物質を含まない10%のウシ胎児血清を有するDMEM中での形質移入の前日に、50%の集密度まで低継代（p=5）のHEK293FTをT-75フラスコに播種した。20時間後に、培地を（無血清の）OptiMEM培地に交換し、4時間後に形質移入を実施した。細胞に、10 μgのレンチウイルス移動プラスミド (pCasES10)、および5 μgのpMD2.G（VSV-g偽型）と7.5 μgのpsPAX2（gag/pol/rev/tat）である封入プラスミドを形質移入した。形質移入は、陽イオン性脂質送達剤（50 μLのリポフェクタミン2000および100 μlのプラス試薬）を有する4mLのOptiMEM中で実施した。6時間後に、培地を10%のウシ胎児血清を有する抗生物質不含のDMEMに交換した。これらの方法には、細胞培養中に血清を使用するが、無血清の方法の方が好ましい。
【０９０４】
レンチウイルスは、以下のように精製できる。ウイルスの上清を48時間後に回収した。上清からまず破片を除去し、0.45 μmの低タンパク質結合（PVDF）フィルターにより濾過した。次に、それらを超遠心分離機内で24,000 rpmで2時間回転させた。ウイルスのペレットを50 μlのDMEM中に4°Cで一晩再懸濁した。次にそれらを等分量にして、直ちに-80°Cで凍結した。
【０９０５】
別の実施態様では、特に眼の遺伝子治療のために、ウマ伝染性貧血ウイルス (EIAV)に基づく最小の非霊長類レンチウイルスベクターもまた想定される（例えば、Balagaan, J Gene Med 2006; 8: 275 - 285を参照）。別の実施態様では、加齢性黄斑変性症の網状形態の治療のために、網膜下注射を介して送達される血管新生抑制タンパク質であるエンドスタチンおよびアンギオスタチンを発現するウマ伝染性貧血ウイルスに基づくレンチウイルス遺伝子治療ベクターであるRetinoStat(R)もまた想定され（例えば、Binley et al., HUMAN GENE THERAPY 23:980-991 (September 2012)）、このベクターは、本発明のAD機能化CRISPR-Casシステム用に改変できる。
【０９０６】
別の実施態様では、HIV tat/revによって共有される共通のエキソン、核小体局在化デコイ、および抗CCR5特異的ハンマーヘッド型リボザイムを標的とするsiRNAを有する自己不活化レンチウイルスベクター（例えば、DiGiusto et al. (2010) Sci Transl Med 2:36ra43を参照）は、本発明のAD機能化CRISPR-Casシステムに使用かつ／あるいは応用することができる。患者体重の1 kgあたり最小で2.5 x 106個のCD34+細胞を採取し、かつ2 μmol/Lのグルタミン、幹細胞因子（100 ng/ml）、Flt-3リガンド (Flt-3L)（100 ng/ml）、および2 x 106細胞/mlの密度でのトロンボポエチン（10 ng/ml）（CellGenix製）を含むX-VIVO 15培地（Lonza製）中で16〜20時間予備刺激してもよい。予備刺激された細胞は、フィブロネクチン（25 mg/cm2）で被覆された75 cm2の組織培養フラスコ（RetroNectin,Takara Bio Inc.製）中で、感染多重度を5として16〜24時間レンチウイルスで形質導入された。
【０９０７】
レンチウイルスベクターは、パーキンソン病の治療として開示されていて、例えば、米国特許公開20120295960号、および米国特許7303910号および7351585号を参照。レンチウイルスベクターはまた、眼疾患の治療について開示されていて、例えば、米国特許公開20060281180号、20090007284号、20110117189号、20090017543号、20070054961号、および20100317109号を参照。レンチウイルスベクターはまた、脳への送達について開示されていて、例えば、米国特許公開20110293571号、20110293571号、20040013648号、20070025970号、20090111106号、および米国特許7259015号を参照。
ポリマー系粒子
【０９０８】
本明細書のシステムおよび組成物は、ポリマー系粒子（例えばナノ粒子）を使用して送達されてもよい。実施態様によっては、ポリマー系粒子は、膜融合のウイルス機構を模倣できる。ポリマー系粒子は、インフルエンザウイルス機構による合成的な複製であってもよく、細胞が細胞内取込み作用経路および酸性区画の形成を含むプロセスを介して取り込む種々の核酸型（siRNA、miRNA、プラスミドDNAまたはshRNA、mRNA）との形質移入複合体を形成してもよい。後期エンドソームでの低いpHは、粒子表面を疎水性にし、かつ膜の通過を促進する化学スイッチとして機能する。細胞基質に入ると、粒子は細胞作用のためのその有効量を放出する。この活性エンドソーム逸脱技術は、安全であり、かつ自然な取込み経路を使用しているので形質移入効率を最大化する。実施態様によっては、ポリマー系粒子は、アルキル化およびカルボキシアルキル化された分岐ポリエチレンイミンを含んでもよい。例によっては、ポリマー系粒子は、VIROMER、例えば、VIROMER RNAi、VIROMER RED、VIROMER mRNA、VIROMER CRISPRである。本明細書のシステムおよび組成物を送達する例示的な方法として、Bawage SS et al., Synthetic mRNA expressed Cas13a mitigates RNA virus infections（Cas13aで発現した合成mRNAは、RNAウイルス感染を軽減する）, www.biorxiv.org/content/10.1101/370460v1.full doi: doi.org/10.1101/370460, Viromer(R) RED, a powerful tool for transfection of keratinocytes（ケラチン産生細胞の形質移入のための強力な手段）. doi: 10.13140/RG.2.2.16993.61281, Viromer(R) Transfection - Factbook（Viromer(R)の形質移入−実情調査）2018: technology, product overview, users' data（技術、産物一覧、使用者データ）., doi:10.13140/RG.2.2.23912.16642に説明される方法が挙げられる。
一般的な応用
【０９０９】
本開示は、標的核酸（例えばDNA）、または１つ以上の標的核酸の発現を本明細書の成分およびシステムで改変する方法を提供する。実施態様によっては、この方法は、標的核酸を本明細書の１つ以上の非天然起源または遺伝子操作された組成物またはシステムと接触させることを含む。例えば、本開示は、関心のある標的遺伝子を改変する方法を提供し、この方法は、標的DNAを、i）表１または２からのCas12bエフェクタータンパク質、ii）a）標的DNA配列にハイブリダイズできる3’ガイド配列およびb）5’直接反復配列を含むcrRNA、ならびにiii）tracr RNAを含む１つ以上の非天然起源または遺伝子操作された組成物と接触させることを含み、これにより、crRNAおよびtracr RNAと複合化したCas12bエフェクタータンパク質を含むCRISPR複合体を形成し、ガイド配列は細胞内の標的RNA配列への配列特異的結合を誘導し、これにより関心のある標的遺伝子座の発現が改変される。
【０９１０】
この方法は、標的遺伝子の発現を改変するために使用されてもよい。この改変は、システムまたは組成物により処理しない、またはそれによる処理前の標的遺伝子の発現と比較して、標的遺伝子の発現を変化させることができる。この改変は、システムまたは組成物により処理しない、またはそれによる処理前の標的遺伝子の発現と比較して、標的遺伝子の発現を増強させることができる。この改変は、システムまたは組成物により処理しない、またはそれによる処理前の標的遺伝子の発現と比較して、標的遺伝子の発現を減弱させることができる。
【０９１１】
実施態様によっては、この方法は、標的オリゴヌクレオチド中の１つ以上の塩基（例えば、アデニンまたはシトシン）を改変することを含んでもよい。そのような方法は、本明細書の塩基エディターの１つ以上の成分を標的オリゴヌクレオチドに送達することを含んでもよい。例によっては、方法は、前記標的オリゴヌクレオチドに、触媒的に不活性なCas12bタンパク質、直接反復に連結されたガイド配列を含むガイド分子、およびアデノシンまたはシチジンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインを送達することを含み、前記アデノシンまたはシチジンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、前記触媒的に不活性なCas12bタンパク質または前記ガイド分子に共有結合または非共有結合しているか、あるいは送達後にそれに結合するように構成され、前記ガイド分子は、前記触媒的に不活性なCas12bと複合体を形成し、かつ前記複合体を前記標的オリゴヌクレオチドに結合するように誘導し、前記ガイド配列は、前記標的オリゴヌクレオチド内の標的配列とハイブリダイズしてオリゴヌクレオチド二重鎖を形成することができる。実施態様によっては、シトシンは、オリゴヌクレオチド二重鎖を形成する標的配列の外側にあり、シトシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、RNA二重鎖の外側にあるシトシンを脱アミノ化し、またはシトシンは、RNA二重鎖を形成する標的配列内にあり、ガイド配列は、シトシンに対応する位置に非対合のアデニンまたはウラシルを含み、RNA二重鎖にC−AまたはC−Uの不一致をもたらし、シトシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、非対合のアデニンまたはウラシルの反対側のRNA二重鎖中のシトシンを脱アミノ化する。ガイド分子は、前記CRISPRエフェクタータンパク質と複合体を形成し、かつ前記複合体が関心のある標的オリゴヌクレオチド配列に結合するように誘導し、ガイド配列は、アデニンまたはシトシンを含む標的配列とハイブリダイズして、RNA二重鎖を形成することができ、アデノシンデアミナーゼタンパク質またはその触媒ドメインは、RNA二重鎖中のアデニンまたはシトシンを脱アミノ化する。
【０９１２】
実施態様によっては、方法およびシステムは、１つ以上の試料中の核酸標的配列の存在を検出するために使用できる。実施態様によっては、１つ以上のin vitro試料中の核酸標的配列の存在を検出するためのシステムは、Cas12bタンパク質、標的配列と所定の程度の相補性を有するように設計され、かつCas12bと複合体を形成するように設計されたガイド配列を含む少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、および非標的配列を含むオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物を含んでもよく、Cas12bは側副ヌクレアーゼ活性を示し、かつ標的配列によって活性化されるとオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物の非標的配列を切断する。特定の実施態様では、１つ以上のin vitro試料中の標的ポリペプチドの存在を検出するためのシステムは、Cas12bタンパク質、それぞれが１つ以上の標的ポリペプチドのうちの１つに結合するように設計され、かつそれぞれがマスクされたプロンプター結合部位またはマスクされたプライマー結合部位およびトリガー配列鋳型を含む１つ以上の検出アプタマー、および非標的配列を含むオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物を含む。１つ以上のin vitro試料中の核酸配列を検出するための方法は、１つ以上の試料を、i）Cas12bエフェクタータンパク質、ii）標的配列と所定の程度の相補性を有するように設計され、かつCas12bエフェクタータンパク質と複合体を形成するように設計されたガイド配列を含む少なくとも１つのガイドポリヌクレオチド、およびiii）非標的配列を含むオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物と接触させることを含み、前記Cas12エフェクタータンパク質は、側副ヌクレアーゼ活性を示し、かつオリゴヌクレオチドに基づくマスキング構築物の非標的配列を切断する。
【０９１３】
別の側面では、本開示は、標的オリゴヌクレオチドを含む細胞中に酵素活性（例えばタンパク質分解活性）を提供するための方法を提供する。この方法は、細胞を、酵素の不活性部分に連結された第１のCasタンパク質および酵素の相補部分に連結された第２のCasタンパク質と接触させることを含んでもよい。酵素の不活性部分と相補部分が接触すると、酵素の活性が再構成される。実施態様によっては、標的オリゴヌクレオチドを含む細胞中にタンパク質分解活性を提供する方法は、a）細胞または細胞集団を、i）タンパク質分解酵素の不活性部分に連結された第１のCas12bエフェクタータンパク質、ii）タンパク質分解酵素の相補部分に連結された第２のCas12bエフェクタータンパク質、iii）第１のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、かつRNAの第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド、およびiv）第２のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、かつRNAの第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイドと接触させることを含み、ここでタンパク質分解酵素の第１の部分と相補部分が接触すると、タンパク質分解酵素のタンパク質分解活性が再構成され、これにより、タンパク質分解酵素の第１の部分および第２の部分が接触して、タンパク質分解酵素のタンパク質分解活性が再構成される。
【０９１４】
別の側面では、本開示は、関心のあるオリゴヌクレオチドを含む細胞を識別するための方法を提供する。この方法は、レポーターの不活性部分に連結された第１のCasタンパク質、およびレポーターの相補部分に連結された第２のCasタンパク質により細胞を識別することを含んでもよい。レポーターの不活性部分と相補部分が接触すると、レポーターの活性が再構成される。実施態様によっては、関心のあるオリゴヌクレオチドを含む細胞を識別する方法は、細胞内のオリゴヌクレオチドを、i）レポーターの不活性な第１の部分に連結された第１のCas12bエフェクタータンパク質、ii）レポーターの相補部分に連結された第２のCas12bエフェクタータンパク質、iii）第１のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、かつオリゴヌクレオチドの第１の標的配列にハイブリダイズする第１のガイド、iv）第２のCas12bエフェクタータンパク質に結合し、かつオリゴヌクレオチドの第２の標的配列にハイブリダイズする第２のガイド、及びv）レポーターを含む組成物と接触させることを含み、ここでレポーターの第１の部分と相補部分が接触するとレポーターの活性が再構成され、関心のあるオリゴヌクレオチドが細胞内に存在するとレポーターの第１の部分と第２の部分は接触し、それにより、レポーターの活性は再構成される。実施例によっては、レポーターは蛍光タンパク質または発光タンパク質である。
動物以外の生物への応用
C2c1-CRISPRシステムの植物および酵母への応用
【０９１５】
一般に、「植物」という用語は、細胞分裂によって特徴的に生育し、葉緑体を含み、セルロースからなる細胞壁を有する、植物界の種々の光合成生物、真核生物、単細胞生物、または多細胞生物に関する。植物という用語は、単子葉植物および双子葉植物を包含する。具体的に植物は、限定はされないが、被子植物および裸子植物、例えば、アカシア、アルファルファ、アマランス、リンゴ、アンズ、アーティチョーク、トネリコ、アスパラガス、アボカド、バナナ、大麦、豆、ビート、カバノキ、ブナ、ブラックベリー、ブルーベリー、ブロッコリー、芽キャベツ、キャベツ、セイヨウアブラナ、カンタロープ、ニンジン、キャッサバ、カリフラワー、ヒマラヤスギ、穀物類、セロリ、栗、サクランボ、白菜、柑橘類、ミカン、クローバー、コーヒー、コーン、綿、ササゲ、キュウリ、イトスギ、ナス、ニレ、キクヂシャ、ユーカリ、ウイキョウ、イチジク、モミ、ゼラニウム、ブドウ、グレープフルーツ、落花生、ホオズキ、ドクニンジン、ヒッコリー、ケール、キウイフルーツ、コールラビ、カラマツ、レタス、ニラ、レモン、ライム、ニセアカシア、ホウライシダ、トウモロコシ、マンゴー、カエデ、メロン、キビ、キノコ、カラシナ、ナッツ、オーク、オート麦、アブラヤシ、オクラ、タマネギ、オレンジ、観賞用植物または花または木、パパイヤ、ヤシ、パセリ、アメリカボウフウ、エンドウ豆、モモ、ピーナッツ、ナシ、ピート、コショウ、柿、ハトエンドウ豆、マツ、パイナップル、オオバコ、プラム、ザクロ、ジャガイモ、カボチャ、赤チコリ、大根、菜種、ラズベリー、イネ、ライ麦、モロコシ、ベニバナ、サルヤナギ、大豆、ほうれん草、トウヒ、カボチャ、イチゴ、テンサイ、サトウキビ、ヒマワリ、サツマイモ、スイートコーン、タンジェリン、茶、タバコ、トマト、木、ライコムギ、芝草、カブ、つる植物、クルミ、クレソン、スイカ、小麦、ヤムイモ、イチイ、およびズッキーニなどを含むことを意図している。植物という用語はまた藻類も含み、藻類は主に、高等植物を特徴付ける根、葉、その他の器官の欠如によって主に統合された光合成独立栄養生物である。
【０９１６】
本明細書に説明のC2c1システムを使用するゲノム編集のための方法は、本質的に任意の植物に所望の形質を付与するために使用できる。多種多様な植物および植物細胞システムは、本開示の核酸構築物および上記の様々な形質転換方法を使用して、本明細書に説明の所望の生理学的および農学的特性のために遺伝子操作されてもよい。好ましい実施態様では、遺伝子操作のための標的植物および植物細胞として、限定はされないが、例えば、穀物作物（例えば、小麦、トウモロコシ、イネ、キビ、大麦）、果物作物（例えば、トマト、リンゴ、ナシ、イチゴ、オレンジ）、飼料作物（例えば、アルファルファ）、根菜作物（例えば、ニンジン、ジャガイモ、テンサイ、ヤムイモ）、および葉野菜作物（例えば、レタス、ほうれん草）を含む作物、顕花植物（例えばペチュニア、バラ、菊）、針葉樹および松の樹木（例えば、松モミ、トウヒ）、植物環境修復に使用される植物（例えば、重金属蓄積植物）、油料作物（例えば、ヒマワリ、菜種）、および実験目的で使用される植物（例えば、シロイヌナズナ）などの単子葉植物および双子葉植物が挙げられる。従って、この方法およびCRISPR-Casシステムは、例えば、モクレン目 (Magniolales)、シキミ目 (Illiciales)、クスノキ目 (Laurales)、コショウ目 (Piperales)、ウマノスズクサ目 (Aristochiales)、スイレン目 (Nymphaeales)、キンポウゲ目 (Ranunculales)、ケシ目 (Papeverales)、サラセニア科 (Sarraceniaceae)、ヤマグルマ目 (Trochodendrales)、マンサク目 (Hamamelidales)、トチュウ目 (Eucomiales)、レイトネリア目 (Leitneriales)、ヤマモモ目 (Myricales)、ブナ目 (Fagales)、モクマオウ目 (Casuarinales)、ナデシコ目 (Caryophyllales)、バテス目 (Batales)、タデ目 (Polygonales)、イソマツ目 (Plumbaginales)、ビワモドキ目 (Dilleniales)、ツバキ目 (Theales)、アオイ目 (Malvales)、イラクサ目 (Urticales)、サガリバナ目 (Lecythidales)、スミレ目 (Violales)、ヤナギ目 (Salicales)、フウチョウソウ目 (Capparales)、ツツジ目 (Ericales)、イワウメ目 (Diapensales)、カキノキ目 (Ebenales)、サクラソウ目 (Primulales)、バラ目 (Rosales)、マメ目 (Fabales)、カワゴケソウ目 (Podostemales)、アリノトウグサ目 (Haloragales)、テンニンカ目 (Myrtales)、ミズキ目 (Cornales)、ヤマモガシ目 (Proteales)、ビャクダン目 (Santales)、ラフレシア目 (Rafflesiales)、ニシキギ目 (Celastrales)、トウダイグサ目 (Euphorbiales)、クロウメモドキ目 (Rhamnales)、ムクロジ目 (Sapindales)、クルミ目 (Juglandales)、フクロソウ目 (Geraniales)、ヒメハギ目 (Polygalales)、セリ目 (Umbellales)、リンドウ目 (Gentianales)、ハナシノブ目 (Polemoniales)、シソ目 (Lamiales)、オオバコ目 (Plantaginales)、ゴマノハグサ目 (Scrophulariales)、キキョウ目 (Campanulales)、アカネ目 (Rubiales)、マツムシソウ目 (Dipsacales)、およびキク目 (Asterales)に属する双子葉植物などにより、広範囲の植物にわたって使用でき、この方法およびCRISPR-Casシステムは、例えば、オモダカ目(Alismatales)、トチカガミ目 (Hydrocharitales)、イバラモ目 (Najadales)、ホンゴウソウ目 (Triuridales)、ツユクサ目 (Commelinales)、ホシクサ目 (Eriocaulales)、レスティオ目 (Restionales)、イネ目 (Poales)、イグサ目 (Juncales)、カヤツリグサ目 (Cyperales)、ガマ目 (Typhales)、パイナップル目 (Bromeliales)、ショウガ目 (Zingiberales)、ヤシ目 (Arecales)、パナマソウ目 (Cyclanthales)、タコノキ目 (Pandanales)、サトイモ目 (Arales)、ユリ目 (Lilliales)、およびラン目 (Orchidales)に属する単子葉植物、あるいは、例えば、マツ目 (Pinales)、イチョウ目 (Ginkgoales)、ソテツ目 (Cycadales)、ナンヨウスギ目 (Araucariales)、ヒノキ目 (Cupressales)、およびグネツム目 (Gnetales)などの裸子植物に属する植物により使用できる。
【０９１７】
本明細書に説明のCRISPR-C2c1システムおよび使用方法は、以下の属の双子葉植物、単子葉植物、または裸子植物の非限定的な一覧に含まれる広範囲の植物種にわたって使用できる：オオカミナスビ属 (Atropa)、クスノキ属 (Alseodaphne)、ラッカセイ属 (Arachis)、アカハダクスノキ属 (Beilschmiedia)、アブラナ属 (Brassica)、ベニバナ属 (Carthamus)、アオツヅラフジ属 (Cocculus)、ハズ属 (Croton)、キュウリ属 (Cucumis)、ミカン属 (Citrus)、スイカ属 (Citrullus)、トウガラシ属 (Capsicum)、ニチニチソウ属(Catharanthus)、ココヤシ属 (Cocos)、コーヒーノキ属 (Coffea)、カボチャ属 (Cucurbita)、ニンジン属 (Daucus)、ドグエテイア属 (Duguetia)、ハナビシソウ属 (Eschscholzia)、イチジク属 (Ficus)、オランダイチゴ属 (Fragaria)、ツノゲシ属 (Glaucium)、ダイズ属 (Glycine)、ワタ属 (Gossypium)、ヒマワリ属 (Helianthus)、パラゴムノキ属 (Hevea)、ヒヨス属 (Hyoscyamus)、アキノノゲシ属 (Lactuca)、ランドフィア属 (Landolphia)、アマ属 (Linum)、ハマビワ属 (Litsea)、トマト属 (Lycopersicon)、ルピナス属 (Lupinus)、イモノキ属 (Manihot)、ハナハッカ属 (Majorana)、リンゴ属 (Malus)、ウマゴヤシ属 (Medicago)、タバコ属 (Nicotiana)、オリーブ属 (Olea)、パルテニウム属 (Parthenium)、ケシ属 (Papaver)、ワニナシ属 (Persea)、インゲンマメ属 (Phaseolus)、カイノキ属 (Pistacia)、エンドウ属 (Pisum)、ナシ属 (Pyrus)、サクラ属 (Prunus)、ダイコン属 (Raphanus)、トウゴマ属 (Ricinus)、キオン属 (Senecio)、ツヅラフジ属 (Sinomenium)、ハスノハカズラ属 (Stephania)、シロガラシ属 (Sinapis)、ナス属 (Solanum)、カカオ属 (Theobroma)、ジャジクソウ属 (Trifolium)、レイリョウコウ属 (Trigonella)、ソラマメ属 (Vicia)、ツルニチニチソウ属 (Vinca)、ヴィリス属 (Vilis)、およびササゲ属 (Vigna)、ならびにネギ属 (Allium)、メリケンカルカヤ属 (Andropogon)、スズメガヤ属 (Aragrostis)、クサスギカズラ属 (Asparagus)、カラスムギ属 (Avena)、ギョウギシバ属 (Cynodon)、アブラヤシ属 (Elaeis)、ウシノケグサ属 (Festuca)、フェスツリウム属 (Festulolium)、ワスレグサ属 (Heterocallis)、オオムギ属 (Hordeum)、アオウキクサ属 (Lemna)、ドクムギ属 (Lolium)、バショウ属 (Musa)、イネ属 (Oryza)、キビ属 (Panicum)、チカラシバ属 (Pannesetum)、アワガエリ属 (Phleum)、イチゴツナギ属 (Poa)、ライムギ属 (Secale)、モロコシ属 (Sorghum)、コムギ属 (Triticum)、トウモロコシ属 (Zea)、コウヨウザン属(Cunninghamia)、マオウ属 (Ephedra)、トウヒ属 (Picea)、マツ属 (Pinus)、およびトガサワラ属 (Pseudotsuga)。
【０９１８】
CRISPR-C2c1システムおよび使用方法はまた、例えば紅藻類(Rhodophyta)、緑藻類 (Chlorophyta)、褐藻類 (Phaeophyta)、珪藻類 (Bacillariophyta)、真核藻類 (Eustigmatophyta)、渦鞭毛藻類 (dinoflagellates)を含むいくつかの真核生物門、ならびに原核ラン藻類門（青緑藻類：phylum Cyanobacteria）から選択された藻類を含む、広範囲の「藻類」または「藻類細胞」にわたって使用できる。「藻類」という用語は、例えば、アンフォラ属 (Amphora)、アナベナ属 (Anabaena)、アンキストロデスムス属 (Anikstrodesmis)、ボツリオコッカス属 (Botryococcus)、キートケロス属 (Chaetoceros)、クラミドモナス属 (Chlamydomonas)、クロレラ属 (Chlorella)、クロロコックム属 (Chlorococcum)、キクロテラ属 (Cyclotella)、シリンドロテカ属 (Cylindrotheca)、ドナリエラ属 (Dunaliella)、エミリアーナ属 (Emiliana)、ユーグレナ属 (Euglena)、ヘモトコッカス属 (Hematococcus)、イソクリシス属 (Isochrysis)、モノクリシス属 (Monochrysis)、モノラフィジウム属 (Monoraphidium)、ナンノクロリス属 (Nannochloris)、ナンノクロロプシス属 (Nannnochloropsis)、ナヴィクラ属 (Navicula)、ネフロクロリス属 (Nephrochloris)、ネフロセミス属 (Nephroselmis)、ニッチア属 (Nitzschia)、ノジュラリア属 (Nodularia)、ノストック属 (Nostoc)、オクロモナス属 (Oochromonas)、オオキスティス属 (Oocystis)、オシラトリア属 (Oscillartoria)、パブロバ属 (Pavlova)、ファエオダクチルム属 (Phaeodactylum)、プラチモナス属 (Playtmonas)、プレウロクリシス属 (Pleurochrysis)、ポルフィラ属 (Porhyra)、プセウドアナベナ属(Pseudoanabaena)、ピラミモナス属 (Pyramimonas)、スチココッカス属 (Stichococcus)、シネココッカス属 (Synechococcus)、シネコシスティス属 (Synechocystis)、テトラセルミス属 (Tetraselmis)、タラシオシーラ属 (Thalassiosira)、およびトリコデスミウム属 (Trichodesmium)から選択される藻類を含む。
【０９１９】
植物の一部、すなわち「植物組織」を、本発明の方法に従って処理して、改良された植物を産出できる。植物組織はまた植物細胞を包含する。本明細書で使用される用語「植物細胞」は、in vitroでの組織培養物中で、培地または寒天表面で、または増殖培地または緩衝液の懸濁液中で成長した、無処理の全体植物形態または単離形態のいずれかの生きている植物の個々の単位、あるいは、例えば、植物組織、植物器官、または全体植物などのより高度に組織化された単位の一部を指す。
【０９２０】
「原形質体」は、例えば、機械的または酵素的な手段を使用して、その保護細胞壁が完全にまたは部分的に取り除かれた植物細胞を指し、この細胞は、細胞壁を再生成し、増殖し、かつ適切な成長条件下で全体植物にまで再生・成長できる、生きている植物の無処理の生化学的に形質転換受容性のある単位をもたらす。
【０９２１】
用語「形質転換」は、広い意味で、アグロバクテリウム (Agrobacterium)を用いて、または様々な化学的または物理的方法の内の１つを用いて、DNAの導入によって植物宿主が遺伝子改変されるプロセスを指す。本明細書で使用される用語「植物宿主」は、植物の任意の細胞、組織、器官、またはその後代を含む植物を指す。多くの適切な植物組織または植物細胞は、形質転換されてもよく、これらは、限定はされないが、原形質体、体細胞胚、花粉、葉、苗、茎、カルス、走根、微小塊茎、および若枝を含む。植物組織はまた、有性的または無性的に生成されたそのような植物、種子、後代、繁殖体の任意のクローン体、および挿し木または種子などのこれらのいずれかの派生体を指す。
【０９２２】
本明細書で使用される用語「形質転換された」は、構築物などの外来DNA分子が導入された細胞、組織、器官、または生物を指す。導入されたDNA分子は、導入されたDNA分子がその後の後代に伝達されるように、受容体の細胞、組織、器官、または生物のゲノムDNA中に組み込まれてもよい。これらの実施態様では、「形質転換された」または「遺伝子導入の」細胞もしくは植物はまた、細胞もしくは植物の後代を含んでもよく、およびそのような形質転換植物を交配の親として使用しかつ導入されたDNA分子の存在に起因する変化した表現型を示す育種計画から産出された後代を含んでもよい。好ましくは、遺伝子導入植物は、繁殖力があり、かつ有性生殖を介して導入されたDNAを後代に伝達することができる。
【０９２３】
遺伝子導入植物の後代などの用語「後代」は、植物または遺伝子導入植物から生まれる、生じる、または由来するものである。導入されたDNA分子はまた、導入されたDNA分子がその後の後代に受け継がれず、従って「遺伝子導入」とは見做されないように、受容体細胞に一過的に導入されてもよい。従って、本明細書で使用される「非遺伝子導入」植物または植物細胞は、そのゲノム中に安定的に組み込まれた外来DNAを含まない植物である。
【０９２４】
本明細書で使用される用語「植物プロモーター」は、その起源が植物細胞であるかどうかにかかわらず、植物細胞中で転写を開始できるプロモーターである。適切な植物プロモーターの例として、限定はされないが、植物、植物ウイルス、および植物細胞中で発現される遺伝子を含むアグロバクテリウムまたはリゾビウム (Rhizobium)などの細菌から得られるものが挙げられる。
【０９２５】
本明細書で使用される「真菌細胞」は、真菌界内の任意の真核細胞型を指す。真菌界の門には、子嚢菌門 (Ascomycota)、担子菌門 (Basidiomycota)、コウマクノウキン門 (Blastocladiomycota)、ツボカビ門 (Chytridiomycota)、グロムス門 (Glomeromycota)、微胞子虫門 (Microsporidia)、およびネオカリマスティクス門 (Neocallimastigomycota)が含まれる。真菌細胞には、酵母、カビ、および糸状菌を含んでもよい。実施態様によっては、真菌細胞は酵母細胞である。
【０９２６】
本明細書で使用される用語「酵母細胞」は、子嚢菌門および担子菌門内の任意の真菌細胞を指す。酵母細胞には、出芽酵母細胞、分裂酵母細胞、およびカビ細胞を含んでもよい。これらの生物に限定されることなく、実験室および産業分野で使用される多くの種類の酵母は子嚢菌門の一部である。実施態様によっては、酵母細胞は、Ｓ．セルビシエ (S. cerervisiae)、クリュイベロミセス・マルシアヌス (Kluyveromyces marxianus)、またはイサチェンキア・オリエンタリス (Issatchenkia orientalis)の各細胞である。その他の酵母細胞として、限定はされないが、カンジダ属 (Candida spp.)（例えばカンジダ・アルビカンス (Candida albicans)）、ヤロウイア属 (Yarrowia spp.)（例えばヤロウイア・リポリティカ (Yarrowia lipolytica)）、ピキア属 (Pichia spp.)（例えばピキア・パストリス (Pichia pastoris)）、クリベロミセス属 (Kluyveromyces spp.)（例えばクリベロミセス・ラクティス (Kluyveromyces lactis)およびクリュイベロミセス・マキシアヌス (Kluyveromyces marxianus)）、ニューロスポラ属 (Neurospora spp.)（例えばニューロスポラ・クラッサ (Neurospora crassa)）、フザリウム属 (Fusarium spp.)（例えばフザリウム・オキシスポルム (Fusarium oxysporum)）、およびイサチェンキア属 (Issatchenkia spp.)（例えばイサチェンキア・オリエンタリス (Issatchenkia orientalis)、別名としてピキア・クドリアブゼビ (Pichia kudriavzevii)およびカンジダ・アシドテルモフィルム (Candida acidothermophilum)）を含んでもよい。実施態様によっては、真菌細胞は糸状真菌細胞である。本明細書で使用される用語「糸状真菌細胞」は、糸状に増殖する任意の真菌細胞型、すなわち菌糸または菌糸体を指す。糸状真菌細胞の例には、限定はされないが、アスペルギルス属 (Aspergillus spp.)（例えばアスペルギルス・ニガー (Aspergillus niger)）、トリコデルマ属 (Trichoderma spp.)（例えばトリコデルマ・リーゼイ (Trichoderma reesei)）、リゾプス属 (Rhizopus spp.)（例えばリゾプス・オリーゼ (Rhizopus oryzae)）、およびモリチェレラ属 (Mortierella spp.)（例えばモリチェレラ・イザベリーナ (Mortierella isabellina)）を含んでもよい。
【０９２７】
実施態様によっては、真菌細胞は、工業株である。本明細書で使用される「工業株」とは、工業プロセス、例えば、商業的または工業的規模での製品の生産に使用されるか、または工業プロセスから単離される真菌細胞の任意の株を指す。工業株は、工業プロセスで典型的に使用される真菌種を指してもよく、あるいは非工業目的（例えば実験室研究）にも使用され得る真菌種の分離株を指してもよい。工業プロセスの例には、（例えば、食品または飲料製品の製造での）発酵、蒸留、バイオ燃料の製造、化合物の製造、およびポリペプチドの製造が含まれてもよい。工業株の例として、限定はされないが、JAY270およびATCC4124が含まれてもよい。
【０９２８】
実施態様によっては、真菌細胞は、倍数体細胞である。本明細書で使用される「倍数体」細胞とは、ゲノムが複数の複製物中に存在する任意の細胞を指してもよい。倍数体細胞は、倍数体状態で自然に見られる細胞型を指してもよく、または（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはDNA複製の特定の調節、変更、不活性化、活性化、または改変によって）倍数体状態で存在するように誘導された細胞を指してもよい。倍数体細胞は、ゲノム全体が倍数体である細胞を指してもよく、あるいは、関心のある特定のゲノム遺伝子座中の倍数体である細胞を指してもよい。理論に縛られることを望まないが、ガイドRNAの存在量は、一倍体細胞でのゲノム操作よりも倍数体細胞でのゲノム操作において律速成分となる可能性が高いと考えられ、従って、本明細書に説明のC2c1 CRISPRシステムを使用する方法では、特定の真菌細胞型の使用を利用してもよい。
【０９２９】
実施態様によっては、真菌細胞は、二倍体細胞である。本明細書で使用される「二倍体」細胞は、ゲノムが２つの複製物中に存在する任意の細胞を指してもよい。二倍体細胞は、二倍体状態で自然に見られる細胞型を指してもよく、または（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはDNA複製の特定の調節、変更、不活性化、活性化、または改変によって）二倍体状態で存在するように誘導された細胞を指してもよい。例えば、Ｓ．セルビシエ株S228Cは、一倍体または二倍体状態で維持されてもよい。二倍体細胞は、ゲノム全体が二倍体である細胞を指してもよく、あるいは、関心のある特定のゲノム遺伝子座中の二倍体である細胞を指してもよい。実施態様によっては、真菌細胞は一倍体細胞である。本明細書で使用される「一倍体」細胞は、ゲノムが１つの複製物中に存在する任意の細胞を指してもよい。一倍体細胞は、一倍体状態で自然に見られる細胞型を指してもよく、または（例えば、減数分裂、細胞質分裂、またはDNA複製の特定の調節、変更、不活性化、活性化、または改変によって）一倍体状態で存在するように誘導された細胞を指してもよい。例えば、Ｓ．セルビシエ株S228Cは、一倍体または二倍体状態で維持されてもよい。一倍体細胞は、ゲノム全体が一倍体である細胞を指してもよく、あるいは、関心のある特定のゲノム遺伝子座中の一倍体である細胞を指してもよい。
【０９３０】
本明細書で使用される「酵母発現ベクター」は、RNAおよび／またはポリペプチドをコードする１つ以上の配列を含む核酸、かつ核酸の発現を制御する任意の所望の要素ならびに酵母細胞内の発現ベクターの複製と維持を可能にする任意の要素をさらに含んでいてもよい核酸を指す。多くの適切な酵母発現ベクターおよびその特徴は当技術分野で知られていて、例えば、種々のベクターおよびその技術は、Yeast Protocols, 2nd edition, Xiao, W., ed. (Humana Press, New York, 2007)およびBuckholz, R.G. and Gleeson, M.A. (1991) Biotechnology (NY) 9(11): 1067-72に説明されている。酵母ベクターは、限定はされないが、動原体性 (CEN)配列、自律複製配列 (ARS)、関心のある配列または遺伝子に操作可能に連結されたRNAポリメラーゼIIIプロモーターなどのプロモーター、RNAポリメラーゼIIIターミネーターなどのターミネーター、複製起点、およびマーカー遺伝子（例えば、栄養要求性マーカー、抗生物質マーカー、またはその他の選択可能なマーカー）を含んでもよい。酵母で使用するための発現ベクターの例には、プラスミド、酵母人工染色体、2μプラスミド、酵母統合プラスミド、酵母複製プラスミド、シャトルベクター、およびエピソームプラスミドが含まれてもよい。
植物および植物細胞のゲノム中でのCRISPR-C2c1システム構成要素の安定な組込み
【０９３１】
特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムの構成要素をコードするポリヌクレオチドを、植物細胞のゲノム中への安定な組込みのために導入することが想定される。これらの実施態様では、形質転換ベクターまたは発現システムの設計を、ガイドRNAおよび／またはC2c1遺伝子が発現する日時、場所、および条件に応じて調整できる。
【０９３２】
特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムの構成要素を、植物細胞のゲノムDNA中に安定に導入することが想定される。さらに、またはあるいは、限定はされないが、色素体、ミトコンドリア、または葉緑体などの植物細胞小器官のDNA中への安定な組込みのために、CRISPR-C2c1システムの構成要素を導入することが想定される。
【０９３３】
植物細胞のゲノム中への安定な組込みのための発現システムは、以下の要素のうちの１つ以上を含んでもよく、それらの要素は、植物細胞中でのRNAおよび／またはC2c1酵素の発現に用いることができるプロモーター要素、発現を増強するための5’非翻訳領域、単子葉植物細胞などの特定の細胞中で発現をさらに増強するイントロン要素、ガイドRNAおよび／またはC2c1遺伝子配列および他の所望の要素を挿入する簡便な制限部位を提供するための複数のクローン部位、および発現された転写産物の効率的な停止を提供する3’非翻訳領域である。
【０９３４】
発現システムの要素は、プラスミドまたは形質転換ベクターのように環状であるか、あるいは鎖状二本鎖DNAのように非環状であるかのいずれかである１つ以上の発現構築物表面に存在してもよい。
【０９３５】
特定の実施態様では、C2c1 CRISPR発現システムは、少なくとも
（a）植物中の標的配列とハイブリダイズし、かつガイド配列および直接反復配列を含むガイドRNA (gRNA)をコードするヌクレオチド配列、
（b）tracr RNAをコードするヌクレオチド配列、および
（c）C2c1タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含み、
構成要素（a）または（b）または（c）は、同一のまたは異なる構築物表面に位置し、それにより、異なるヌクレオチド配列は、植物細胞中で操作可能な同一のまたは異なる調節エレメントの制御の下にあってもよい。tracr RNAはガイドRNAに融合していてもよい。
【０９３６】
CRISPR-C2c1システムの構成要素を含むDNA構築物、および該当する場合には鋳型配列は、様々な従来技術によって、植物、植物部分、または植物細胞のゲノム中に導入されてもよい。このプロセスは、一般に、適切な宿主細胞または宿主組織を選択し、構築物をこの宿主細胞または宿主組織に導入して、植物細胞または植物をそれから再生する工程を含む。
【０９３７】
特定の実施態様では、DNA構築物は、限定はされないが、植物細胞原形質体のエレクトロポレーション法、微量注入法、エアロゾルビーム注入法などの技術を使用して植物細胞に導入されてもよく、あるいはDNA構築物は、DNA粒子衝撃などの遺伝子銃の方法（Fu et al., Transgenic Res.2000 Feb;9(1):11-9を参照）を用いて植物組織に直接導入されてもよい。粒子衝撃の原理は、関心のある遺伝子で被覆された粒子を細胞に向かって加速することであり、その結果として、粒子が原形質に浸透してゲノム中に通常は安定的に組み込まれる（例えば、Klein et al, Nature (1987), Klein et ah, Bio/Technology (1992), Casas et ah, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993)を参照）。
【０９３８】
特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムの構成要素を含むDNA構築物は、アグロバクテリウムにより媒介される形質転換によって植物中に導入されてもよい。DNA構築物は、適切なT−DNA隣接領域と組み合わせて、従来型のアグロバクテリウム・ツメファシエンス (Agrobacterium tumefaciens)宿主ベクター中に導入されてもよい。外来DNAは、植物に感染させるか、あるいは植物の原形質体を１つ以上のTi（腫瘍誘導）プラスミドを含むアグロバクテリウム菌とともに培養して、植物のゲノム中に組み込んでもよい（例えば、Fraley et al., (1985), Rogers et al., (1987)および米国特許5,563,055号を参照）。
植物プロモーター
【０９３９】
植物細胞での適切な発現を確実にするために、本明細書に説明のCRISPR-C2c1システムの構成要素は、典型的には、植物プロモーター、すなわち植物細胞中で操作可能なプロモーターの制御の下に配置される。異なるプロモーター型の使用も想定される。
【０９４０】
構成型植物プロモーターは、植物の全てまたはほぼ全ての発育段階中に、全てまたはほぼ全ての植物組織中でそのプロモーターが制御する開放読み取り枠 (ORF)を発現できる（「構成型発現」と呼ばれる）プロモーターである。構成型プロモーターの非限定的な一例は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターである。「調節されたプロモーター」は、構成的にではなく、時間的および／または空間的に調節される手法で遺伝子発現を誘導するプロモーターを指し、組織特異的な、組織優先的な、かつ誘導性のプロモーターを含む。異なるプロモーターは、異なる組織または細胞型で、あるいは異なる発達段階で、あるいは異なる環境条件に応答して、遺伝子の発現を誘導できる。特定の実施態様では、１つ以上のC2c1 CRISPR成分は、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターなどの構成型プロモーターの制御の下で発現され、好ましいプロモーターを利用して、特定の植物組織内の特定の細胞型、例えば、葉または根または種子の特定の細胞中の導管細胞での発現の増強を標的化することができる。CRISPR-C2c1システムで使用する特定のプロモーターの例を、Kawamata et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:792-803、Yamamoto et al., (1997) Plant J 12:255-65、Hire et al, (1992) Plant Mol Biol 20:207-18、Kuster et al, (1995) Plant Mol Biol 29:759-72、およびCapana et al., (1994) Plant Mol Biol 25:681 -91に見出すことができる。
【０９４１】
誘導性であり、かつ遺伝子編集または遺伝子発現の時空間制御を可能にするプロモーターの例として、ある形態のエネルギーを使用してもよい。エネルギーの形態には、限定はされないが、音響エネルギー、電磁放射エネルギー、化学エネルギー、および／または熱エネルギーが含まれてもよい。誘導性システムの例には、テトラサイクリン誘導性プロモーター（Tet-OnまたはTet-Off）、小分子二重混成転写活性化システム（FKBP、ABAなど）、または転写活性の変化を配列特異的に誘導する光誘導性転写エフェクター (LITE)などの光誘導性システム（フィトクロム、LOVドメイン、またはクリプトクロム）が含まれる。光誘導性システムの成分として、C2c1 CRISPR酵素、（例えばシロイヌナズナ由来の）光応答性シトクロムヘテロ二量体、および転写活性化／抑制ドメインを含んでもよい。誘導性DNA結合タンパク質およびそれらの使用方法のさらなる例は、米国特許出願61/736465号および61/721,283号に提供されており、これらは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０９４２】
特定の実施態様では、一過性または誘導性の発現は、例えば、化学的に調節されるプロモーターを使用して、すなわち外因性化学物質の応用によって遺伝子発現を誘導して達成できる。遺伝子発現の調節はまた、化学物質の応用により遺伝子発現を抑制する化学物質抑制性プロモーターによって達成できる。化学的誘導性プロモーターとして、限定はされないが、ベンゼンスルホンアミド除草剤の毒性緩和剤によって活性化されるトウモロコシln2-2プロモーター（De Veylder et al., (1997) Plant Cell Physiol 38:568-77）、発芽前除草剤として用いられる疎水性求電子性化合物によって活性化されるトウモロコシGSTプロモーター（GST-ll-27、国際特許出願WO93/01294号）、およびサリチル酸によって活性化されるタバコPR-1aプロモーター（Ono et al., (2004) Biosci Biotechnol Biochem 68:803-7）が挙げられる。テトラサイクリン誘導性プロモーターおよびテトラサイクリン抑制性プロモーター（Gatz et al., (1991) Mol Gen Genet 227:229-37、米国特許5,814,618号および5,789,156号）などの抗生物質によって調節されるプロモーターも本明細書で使用できる。
特定の植物細胞小器官への移動および／またはその植物細胞小器官中での発現
【０９４３】
発現システムは、特定の植物細胞小器官への移動および／またはその植物細胞小器官中での発現のための要素を含んでもよい。
【０９４４】
葉緑体の標的化について、特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムを使用して、葉緑体遺伝子を特異的に改変するか、あるいは葉緑体での発現を確実にすることを意図する。この目的のために、葉緑体の形質転換方法、または葉緑体へのC2c1 CRISPR構成要素の仕分け方法を用いる。例えば、色素体ゲノムに遺伝子改変を導入すると、花粉を貫通する遺伝子の流動などの生物学的安全性の問題を低減できる。
【０９４５】
葉緑体形質転換の方法は、当技術分野で知られており、粒子衝撃、PEG処理、および微量注入法を含む。さらに、核ゲノムから色素体への形質転換カセットの移動を含む方法を、国際特許出願WO2010061186号に説明されるように使用できる。
【０９４６】
あるいは、１つ以上のC2c1 CRISPR構成要素を植物葉緑体に標的化することを意図する。これは、C2c1タンパク質をコードする配列の5’領域に操作可能に連結された、葉緑体輸送ペプチド (CTP)または色素体輸送ペプチドをコードする配列を発現構築物中に組み込むことによって達成される。CTPは、葉緑体への移動中の処理工程で除去される。発現されたタンパク質の葉緑体標的化は、当業者には周知である（例えば、Protein Transport into Chloroplasts（葉緑体中へのタンパク質輸送）, 2010, Annual Review of Plant Biology,Vol. 61: 157-180を参照）。この実施態様では、ガイドRNAを植物葉緑体に標的化することもまた望ましい。葉緑体局在化配列によってガイドRNAを葉緑体中に移動させるのに用いることができる方法および構築物は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開20040142476号に説明されている。構築物のそのような変異体を、C2c1−ガイドRNAを効率的に移動させるために本発明の発現システムに組み込むことができる。
藻類細胞へのCRISPR-C2c1システムをコードするポリヌクレオチドの導入
【０９４７】
遺伝子導入藻類（または菜種などの他の植物）は、植物油またはアルコール（特にメタノールおよびエタノール）などのバイオ燃料または他の製品の生産に特に利用可能である。これらは、石油産業またはバイオ燃料産業で使用するために、高濃度の石油またはアルコールを発現または過剰発現するように遺伝子操作してもよい。
【０９４８】
米国特許8945839号は、Cas9を用いて微細藻類（コナミドリムシ (Chlamydomonas reinhardtii)細胞）種を遺伝子操作する方法を説明している。同様の手段を用いて、本明細書で説明のCRISPR-C2c1システムの方法を、コナミドリムシ種やその他の藻類に応用できる。特定の実施態様では、C2c1およびガイドRNAを、Hsp70A-Rbc S2またはβ2-チューブリンなどの構成型プロモーターの制御の下でC2c1を発現するベクターを用いて発現される藻類に導入する。ガイドRNAは、場合によっては、T7プロモーターを含むベクターを用いて送達される。あるいは、C2c1 mRNAおよびin vitroで転写されたガイドRNAを、藻類細胞に送達できる。GeneArt(R) Chlamydomonas Engineering（コナミドリムシ遺伝子操作）キットの標準的な推奨手順などのエレクトロポレーション法の手順を、当業者は利用可能である。
【０９４９】
特定の実施態様では、本明細書で使用されるエンドヌクレアーゼは、分割C2c1酵素である。分割C2c1酵素は、国際特許出願WO2015086795号でのCas9で説明されるように、標的ゲノム改変のために藻類で優先的に使用されている。C2c1分割システムの使用は、ゲノム標的化の誘導方法に特に適していて、藻類細胞内でのC2c1過剰発現の潜在的な毒性の影響を回避する。特定の実施態様では、前記C2c1分割ドメイン（RuvCドメイン）を、前記C2c1分割ドメインが藻類細胞内の標的核酸配列を処理するように、同時にまたは連続的に細胞内に導入できる。野生型C2c1と比較して分割されたC2c1のサイズは小さいことにより、本明細書に説明の細胞透過性ペプチドの使用など、細胞へのCRISPRシステムの送達について他の方法が可能になる。この方法は、遺伝子組み換え藻類の生成に特に興味深いものである。
酵母細胞へのC2c1構成要素をコードするポリヌクレオチドの導入
【０９５０】
特定の実施態様では、本発明は、酵母細胞のゲノム編集のためのCRISPR-C2c1システムの使用に関する。CRISPR-C2c1システムの構成要素をコードするポリヌクレオチドを導入するために使用できる酵母細胞を形質転換する方法は、当業者には周知であり、Kawai et al., 2010, Bioeng Bugs. 2010 Nov-Dec; 1(6): 395-403)によって総説されている。非限定的な例として、（担体DNAおよびPEG処理をさらに含んでもよい）酢酸リチウム処理、衝撃、またはエレクトロポレーションによる酵母細胞の形質転換が含まれる。
植物および植物細胞でのC2c1 CRISPシステム構成要素の一過性発現
【０９５１】
特定の実施態様では、ガイドRNAおよび／またはC2c1遺伝子が植物細胞中で一過的に発現すことが想定される。これらの実施態様では、CRISPR-C2c1システムは、ガイドRNAおよびC2c1タンパク質の両方が細胞内に存在する場合にのみ標的遺伝子の改変を確実にして、その結果、ゲノム改変をさらに制御できる。C2c1酵素の発現は一過性であるために、この植物細胞から再生された植物は、典型的には外来DNAを含まない。特定の実施態様では、C2c1酵素は、植物細胞によって安定的に発現され、ガイド配列は一過的に発現される。
【０９５２】
特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムの構成要素を、植物ウイルスベクターを用いて植物細胞中に導入できる（Scholthof et al. 1996, Annu Rev Phytopathol. 1996;34:299-323）。さらに特定の実施態様では、前記ウイルスベクターは、DNAウイルスからのベクターであり、例えば、ジェミニウイルス（キャベツ葉巻ウイルス、豆黄化萎縮ウイルス、小麦萎縮ウイルス、トマト葉巻ウイルス、トウモロコシ線条ウイルス、タバコ葉巻ウイルス、またはトマトゴールデンモザイクウイルスなど）、あるいはナノウイルス（ソラマメ壊死性黄色ウイルスなど）である。他の特定の実施態様では、前記ウイルスベクターは、RNAウイルスからのベクターであり、例えば、トブラウイルス（タバコ茎壊疽ウイルス、タバコモザイクウイルスなど）、ポルテクスウイルス（ジャガイモウイルスXなど）、またはホルデイウイルス（ムギ斑葉モザイクウイルスなど）である。植物ウイルスの複製ゲノムは非統合型ベクターである。
【０９５３】
特定の実施態様では、C2c1 CRISPR構築物の一過性発現に使用されるベクターは、例えば、原形質体でのアグロバクテリウムにより媒介される一過性発現（Sainsbury F. et al., Plant Biotechnol J. 2009 Sep;7(7):682-93）に適合させたpEAQベクターである。ゲノム位置の高精度の標的化は、CRISPR酵素を発現する安定な遺伝子導入植物中でgRNAを発現する改変キャベツ葉巻ウイルス (CaLCuV)ベクターを用いて実証された（Scientific Reports 5, Article number: 14926 (2015), doi:10.1038/srep14926）。
【０９５４】
特定の実施態様では、ガイドRNAおよび／またはC2c1遺伝子をコードする二本鎖DNA断片を、植物細胞中に一過的に導入できる。その実施態様では、導入された二本鎖DNA断片は、細胞を改変するのに十分な量で提供されるが、所定の期間が経過した後には、または１回以上の細胞分裂後には持続しない。植物での直接的なDNA転移の方法は、当業者には知られている（例えば、Davey et al. Plant Mol Biol. 1989 Sep;13(3):273-85を参照のこと）。
【０９５５】
他の実施態様では、C2c1タンパク質をコードするRNAポリヌクレオチドは、植物細胞中に導入され、次いで宿主細胞によって翻訳および処理され、（少なくとも１つのガイドRNAの存在下で）細胞を改変するのに十分な量のタンパク質を生成するが、所定の期間が経過した後には、または１回以上の細胞分裂の後には持続しない。一過性発現のために植物原形質体にmRNAを導入する方法は、当業者には知られている（例えば、Gallie, Plant Cell Reports (1993), 13;119-122を参照）。
【０９５６】
上記の異なる方法の組合せも想定される。
C2c1 CRISPR構成要素の植物細胞への送達
【０９５７】
特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムの１つ以上の構成要素を植物細胞に直接的に送達することを目的とする。これは、特に非遺伝子導入植物の生成を目的とする（以下を参照）。特定の実施態様では、１つ以上のC2c1構成要素は、植物または植物細胞の外側で調製されて、細胞に送達される。例えば、特定の実施態様では、C2c1タンパク質を、植物細胞に導入する前にin vitroで調製する。C2c1タンパク質は、当業者なら知っている様々な方法によって調製でき、かつ組換え産生を含む。発現後に、C2c1タンパク質を単離し、必要に応じて再折畳みを実施し、精製し、かつ必要に応じて処理してHisタグなど任意の精製タグを除去する。天然のままの、部分的に精製された、あるいはより完全に精製されたC2c1タンパク質が得られたら、そのタンパク質を植物細胞に導入してもよい。
【０９５８】
特定の実施態様では、C2c1タンパク質を、関心のある遺伝子を標的とするガイドRNAと混合して、予め構築されたリボ核タンパク質を形成する。
【０９５９】
個々の構成要素または予め構築されたリボヌクレオタンパク質は、エレクトロポレーション法を介して、C2c1を会合した遺伝子産物被覆粒子による衝撃によって、化学的形質導入によって、または細胞膜を通過するその他の輸送手段によって植物細胞中に導入できる。例えば、予め構築されたCRISPRリボ核タンパク質による植物原形質体の遺伝子導入は、植物ゲノムの標的改変を確実にすることが実証されている（Woo et al. Nature Biotechnology, 2015; DOI: 10.1038/nbt.3389に説明）。
【０９６０】
特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムの構成要素を、粒子を使用して植物細胞中に導入する。タンパク質または核酸またはそれらの組合せのいずれかとしての構成要素を、（例えば、国際特許出願WO2008042156号および米国特許公開20130185823号での説明のように）粒子に載置または充填し、植物に組み込んでもよい。特に、本発明の実施態様は、国際特許出願WO2015089419号に説明されるように、C2c1タンパク質をコードするDNA分子、ガイドRNAおよび／または単離されたガイドRNAをコードするDNA分子が載置または充填された粒子を含む。
【０９６１】
CRISPR-C2c1システムの１つ以上の構成要素を植物細胞に導入するさらなる手段は、細胞透過性ペプチド (CPP)を用いることによる。従って、特定の実施態様では、本発明は、C2c1タンパク質に連結された細胞透過性ペプチドを含む組成物を含む。本発明の特定の実施態様では、C2c1タンパク質および／またはガイドRNAを、１つ以上のCPPに結合して、それらを植物原形質体内に効果的に輸送する。Ramakrishna（ヒト細胞中のCas9のための20140ゲノム Res. 2014 Jun; 24(6):1020-7）を参照。他の実施態様では、C2c1遺伝子および／またはガイドRNAは、植物原形質体の送達のために１つ以上のCPPに結合する１つ以上の環状または非環状のDNA分子によってコードされる。次に植物原形質体は、植物細胞に、さらには植物に再生される。CPPは、一般に、タンパク質またはキメラ配列のいずれかに由来する35個のアミノ酸未満の短いペプチドとして説明されていて、受容体に依存しない方式で細胞膜を貫通して生体分子を輸送できる。CPPは、陽イオン性ペプチド、疎水性配列を有するペプチド、両親媒性ペプチド、プロリン富化の抗菌配列を有するペプチド、およびキメラペプチドまたは二分割ペプチドであってもよい（Pooga and Langel 2005）。CPPは、生体膜を貫通することができ、様々な生体分子の細胞膜を横切る細胞質への移動を誘発して細胞内経路を改善し、それによって生体分子と標的との相互作用を促進する。CPPの例として、特に、Tat、すなわちHIV型1、ペネトラチン、カポジ線維芽細胞成長因子 (FGF)シグナルペプチド配列、インテグリンβ3シグナルペプチド配列によるウイルス複製に必要な核転写活性化因子タンパク質、ポリアルギニンペプチドArgs配列、グアニン富化分子輸送体、スイートアローペプチドなどが挙げられる。
遺伝子改変された非遺伝子導入植物の産出のためのCRISPR-C2c1システムの使用
【０９６２】
特定の実施態様では、本明細書に説明の方法を用いて、植物ゲノム中の外来DNAの存在を回避するように、内因性遺伝子を改変する、あるいはCRISPR構成要素をコードする遺伝子を含む植物ゲノム中への任意の外来遺伝子の恒久的な導入を実施せずにそれらの発現を改変する。非遺伝子導入植物の規制条件はそれほど厳格ではないので、この改変に着目できる。
【０９６３】
特定の実施態様では、これは、C2c1 CRISPR構成要素の一過的な発現によって保証される。特定の実施態様では、１つ以上のCRISPR構成要素を、本明細書に説明の方法に従って関心のある遺伝子の改変を一貫して着実に確実とするのに十分なC2c1タンパク質およびガイドRNAを産生する１つ以上のウイルスベクター表面で発現する。
【０９６４】
特定の実施態様では、C2c1 CRISPR構築物の一過的な発現は、植物原形質体中で確実になり、従ってゲノム中には組み込まれない。発現ウィンドウの限定を、CRISPR-C2c1システムが本明細書に説明のように標的遺伝子の改変を確実にすることを可能にするのに十分な範囲にできる。
【０９６５】
特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムの異なる構成要素は、本明細書で上述の粒子またはCPP分子などの粒子送達分子の助けを借りて、別々にまたは混合して、植物細胞、原形質体、または植物組織中に導入される。
【０９６６】
C2c1 CRISPR構成要素の発現は、C2c1ヌクレアーゼの直接活性および場合によっては鋳型DNAの導入によって、あるいは本明細書に説明のCRISPR-C2c1システムを用いて標的化された遺伝子の改変によって、ゲノムの標的化改変を誘発できる。上述の種々の手法により、C2c1 CRISPR構成要素を植物ゲノム中に導入することなく、C2c1を媒介とする標的化ゲノム編集が可能になる。植物細胞中に一過的に導入される構成要素は、通常は、交配時に取り除かれる。
植物ゲノム選択マーカーでの改変の検出
【０９６７】
方法が植物ゲノムの内因性標的遺伝子の改変を含む特定の実施態様では、任意の適切な方法を使用して、植物、植物部分、または植物細胞がCRISPR-C2c1システムに感染あるいは形質導入された後に、遺伝子標的化または標的変異誘発が標的部位で発生したかどうかを決定することができる。方法が導入遺伝子の導入を含む場合に、形質転換された植物細胞、カルス、組織、または植物を、導入遺伝子の存在または導入遺伝子によってコードされた形質に関して、遺伝子操作された植物材料を選択または選別することにより識別かつ単離してもよい。物理的方法および生化学的方法を使用して、挿入された遺伝子構築物または内因性DNAの改変を含む植物または植物細胞の形質転換体を識別してもよい。これらの方法には、限定はされないが、1）組換えDNA挿入物または改変内因性遺伝子の構造を検出および決定するためのサザン解析法またはPCR増幅法、2）遺伝子構築物のRNA転写産物を検出および検査するためのノーザンブロット法、S1 RNA分解酵素保護法、プライマー伸長法、または逆転写酵素PCR増幅法、3）この遺伝子産物が遺伝子構築物によってコードされているか、あるいは発現が遺伝子改変によって影響を受けている場合の酵素またはリボザイム活性を検出するための酵素測定法、および4）遺伝子構築物または内因性遺伝子産物がタンパク質である場合のタンパク質のゲル電気泳動法、ウエスタンブロット技術、免疫沈降法、または酵素結合免疫測定法が含まれる。In situハイブリダイズ、酵素染色、および免疫染色などの追加の技術をまた使用して、組換え構築物の存在または発現を検出してもよく、あるいは特定の植物器官および組織での内因性遺伝子の改変を検出してもよい。これら全ての測定を実施する方法は、当業者に周知である。
【０９６８】
さらに（またはあるいは）、C2c1 CRISPR構成要素をコードする発現システムは、典型的には、初期段階で大規模にCRISPR-C2c1システムを含む細胞、かつ／あるいはそのシステムによって改変された細胞を単離または効率的に選択する手段を提供する１つ以上の選択可能または検出可能なマーカーを含むように設計される。
【０９６９】
アグロバクテリウムが媒介する形質転換の場合に、マーカーカセットは、隣接するT-DNA境界に隣接していてもよく、またはそれら境界の間にあってもよく、かつバイナリーベクター内に含まれてもよい。別の実施態様では、マーカーカセットは、T-DNAの外側にあってもよい。選択可能なマーカーカセットはまた、発現カセットと同じT-DNA境界内にあってもよく、または隣接していてもよく、あるいは（例えば2個のT-DNAシステムである）バイナリーベクター上の第２のT-DNA内のどこかにあってもよい。
【０９７０】
粒子衝撃または原形質体の形質転換を伴う場合に、発現システムは、１つ以上の単離された鎖状断片を含んでもよく、あるいは細菌複製要素、細菌選択可能マーカー、または他の検出可能要素を含む可能性があるより大きな構築物の一部分であってもよい。ガイドおよび／またはC2c1をコードするポリヌクレオチドを含む発現カセットは、マーカーカセットに物理的に連結されていてもよく、あるいはマーカーカセットをコードする第２の核酸分子と混合されていてもよい。マーカーカセットは、形質転換細胞の効率的な選択を可能にする検出可能または選択可能なマーカーを発現するために必要な要素により構成されている。
【０９７１】
選択可能なマーカーに基づく細胞の選択手順は、マーカー遺伝子の性質に依存する。特定の実施態様では、選択可能なマーカー、すなわち、マーカーの発現に基づいて細胞の直接的な選択を可能にするマーカーが使用される。選択可能なマーカーは、正または負の選択を付与することができ、外部基質の存在については条件を付ける場合、または付けない場合がある（Miki et al. 2004, 107(3): 193-232）。最も一般的には、抗生物質耐性遺伝子または除草剤耐性遺伝子がマーカーとして使用され、この場合の選択は、マーカー遺伝子が耐性を付与する抗生物質または除草剤の阻害量を含む培地で遺伝子操作された植物材料を成長させることで実施される。この遺伝子の例として、ハイグロマイシン (hpt)やカナマイシン (nptII)などの抗生物質に対して耐性を付与する遺伝子、およびホスフィノトリシン (bar)やクロロスルフロン (als)などの除草剤に対する耐性を付与する遺伝子が挙げられる。
【０９７２】
形質転換された植物および植物細胞はまた、目視可能なマーカー、典型的には着色された基質（例えば、β-グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、B遺伝子またはC1遺伝子）を処理できる酵素の活性を選別して識別できる。その選択および選別の各方法は、当業者には周知である。
植物の培養および再生
【０９７３】
特定の実施態様では、改変されたゲノムを有し、かつ本明細書に説明の方法のいずれかによって産生または得られる植物細胞を培養して、形質転換または改変された遺伝子型、結果として所望の表現型を有する植物全体を再生できる。従来型の再生技術は当業者に周知である。そのような再生技術の特定の例は、組織培養増殖培地での特定の植物ホルモンの操作に依存し、典型的には、所望のヌクレオチド配列とともに導入された殺生物剤マーカーおよび／または除草剤マーカーに依存する。さらに特定の実施態様では、植物の再生は、培養された原形質体、植物カルス、外植片、器官、花粉、胚、またはそれらの一部から得られる（例えば、Evans et al. (1983), Handbook of Plant Cell Culture, Klee et al (1987) Ann. Rev. of Plant Physを参照）。
【０９７４】
特定の実施態様では、本明細書に説明の形質転換または改良された植物は、自家受粉して本発明のホモ接合性改良植物（DNA改変に対しホモ接合性）の種子を提供でき、あるいは非遺伝子導入植物または異なる改良植物と交配してヘテロ接合性植物の種子を提供できる。組換えDNAが植物細胞中に導入された場合に、その交配の結果として生じる植物は、組換えDNA分子に対してヘテロ接合性である植物である。改良された植物から交配によって得られ、かつ（組換えDNAであってもよい）遺伝子改変を含むそのようなホモ接合性植物およびヘテロ接合性植物の両方は、本明細書では「後代」と呼ばれる。後代の植物は、元の遺伝子導入植物の系統を引き、かつゲノム改変または本明細書に提供の方法によって導入された組換えDNA分子を含む植物である。あるいは、遺伝子組み換え植物は、Cfp1酵素を用いて上述の方法のうちの１つによって得ることができ、ここでは外来DNAはゲノム中に組み込まれない。さらなる育種によって得られるこの植物の後代もまた、遺伝子組み換えを含んでもよい。育種は、種々の作物に一般的に用いられる育種方法によって実施される（例えば、Allard, Principles of Plant Breeding, John Wiley & Sons, NY, U. of CA, Davis, CA, 50-98 (1960)）。
農学的形質が向上した植物の生成
【０９７５】
本明細書に提供のC2c1に基づくCRISPRシステムは、標的化された二本鎖切断または一本鎖切断を導入し、かつ／あるいは遺伝子活性化因子および／または抑制因子システムを導入するために使用でき、限定はされないが、遺伝子標的化、遺伝子置換、標的変異誘発、標的化された欠失または挿入、標的化された反転、および／または標的化された転座のために使用できる。単一細胞で複数の改変を達成するように誘導された複数の標的化RNAを共発現させて、多重化ゲノム改変を確実にできる。この技術は、栄養価の向上、病気への耐性ならびに生物的および非生物的ストレスへの耐性の向上、および商業的に価値のある植物製品または異種化合物の生産の向上などの特性が改善された植物の高精度な遺伝子操作に使用できる。
【０９７６】
特定の実施態様では、本明細書に説明のCRISPR-C2c1システムを使用して、内因性DNA配列中に標的化された二本鎖切断 (DSB)を導入する。このDSBは、細胞のDNA修復経路を活性化し、これを利用して切断部位の近傍で所望のDNA配列の改変を達成できる。これは、内因性遺伝子の不活性化または改変が、所望の形質を付与できる場合、あるいはその形質に寄与できる場合を対象とする。実施態様によっては、関心のある遺伝子を導入するために、鋳型配列による相同組換え (HR)が、DSBの部位で促進される。実施態様によっては、HR−非依存性組換えは、ねじれ型のDSBに関心のある配列または遺伝子を導入するために、DSBの部位で促進される。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは、5’オーバーハングを有するねじれ型のDSBを生成する。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは、ガイド配列中に挿入鋳型配列を含み、ねじれ型のDSBに特定のDNA挿入物を導入する。
【０９７７】
特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは、内因性植物遺伝子の活性化および／または抑制のために、機能ドメインに融合された、または機能ドメインに操作可能に連結された一般的な核酸結合タンパク質として使用されてもよい。機能ドメインの例として、限定はされないが、RNAまたはDNAデアミナーゼ、翻訳開始剤、翻訳活性化因子、翻訳抑制因子、特にリボヌクレアーゼであるヌクレアーゼ、スプライセオソーム、ビーズ、光誘導性／制御性ドメイン、または化学誘導性／制御性ドメインが含まれてもよい。典型的には、これらの実施態様では、C2c1タンパク質は、少なくとも１つの変異を持たないC2c1タンパク質の活性が５％以下となるように、少なくとも１つの変異を有する。ガイドRNAは、標的配列にハイブリダイズできるガイド配列を含む。
【０９７８】
本明細書に説明の方法は、一般に、野生型植物と比較して１つ以上の望ましい形質を有するという観点での「改良された植物」の生成をもたらす。特定の実施態様では、得られる植物、植物細胞、または植物部分は、植物の細胞の全部または一部のゲノム中に組み込まれた外因性DNA配列を含む遺伝子導入植物である。特定の実施態様では、非遺伝子導入性の遺伝子改変植物、植物部分、または細胞は、外因性DNA配列が植物のいずれの植物細胞のゲノム中にも組み込まれていないという観点で得られたものである。そのような実施態様では、改良された植物は非遺伝子導入性である。内因性遺伝子の改変のみが保証され、かつ外来遺伝子が植物ゲノムに導入または保持されない場合に、結果として生じる遺伝子改変作物は、外来遺伝子を含まず、それにより基本的に非遺伝子導入性と見做すことができる。植物ゲノム編集のためのCRISPR-C2c1システムの様々な応用について、以下に詳しく説明する。
a）関心のある農学的形質を付与するための１つ以上の外来遺伝子の導入
【０９７９】
本発明は、関心のある標的遺伝子座に会合する配列、またはその遺伝子座にある配列をゲノム編集または改変する方法を提供し、この方法は、C2c1エフェクタータンパク質複合体を植物細胞に導入することを含み、それにより、C2c1エフェクタータンパク質複合体は、植物細胞のゲノム中にDNA挿入物を組み込むように、例えば関心のある外来遺伝子をコードするように、効果的に機能する。実施態様によっては、DNA挿入物の組込みは、外因的に導入されたDNA鋳型または修復鋳型を用いるHRによって促進される。好ましい実施態様によっては、DNA挿入物の組込みは、HRに依存しない組込み（例えばNHEJ）によって促進される。典型的には、外因的に導入されたDNA鋳型または修復鋳型は、C2c1エフェクタータンパク質複合体、または１つの構成要素、または複合体の構成要素の発現のためのポリヌクレオチドベクターとともに送達される。
【０９８０】
本明細書で提供のCRISPR-C2c1システムは、標的化された遺伝子の送達を可能にする。関心のある遺伝子を発現する効率は、ゲノム中への組込み位置によって大部分が決定されることが次第に明確になりつつある。本発明の方法は、外来遺伝子のゲノム内の所望の位置への標的化された組込みを可能にする。その位置は、過去に発生した事象の情報に基づいて選択でき、または本明細書の他の場所に開示された方法によって選択できる。
【０９８１】
特定の実施態様では、本明細書で提供の方法は、（a）直接反復および植物細胞に対し内因性である標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むガイドRNAを含むC2c1 CRISPR複合体を細胞中に導入すること、（b）ガイド配列が標的配列にハイブリダイズし、かつガイド配列が標的とされる配列でまたはその近傍で二本鎖切断を誘発するときに、ガイドRNAと複合化するC2c1エフェクター分子を植物細胞中に導入すること、および（c）関心のある遺伝子をコードし、かつHDRの結果としてDS切断の位置に導入されるHDR修復鋳型をコードするヌクレオチド配列を細胞中に導入することを含む。特定の実施態様では、導入工程は、C2c1エフェクタータンパク質、ガイドRNA、および修復鋳型をコードする１つ以上のポリヌクレオチドを植物細胞に送達することを含んでもよい。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、DNAウイルス（例えばジェミニウイルス）またはRNAウイルス（例えばトブラウイルス）によって細胞内に送達される。特定の実施態様では、導入工程は、C2c1エフェクタータンパク質、ガイドRNA、および修復鋳型をコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含むT-DNAを植物細胞に送達することを含み、この送達はアグロバクテリウムを介する。C2c1エフェクタータンパク質をコードする核酸配列は、構成型プロモーター（例えばカリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター）などのプロモーター、または細胞特異性または誘導性プロモーターに操作可能に連結されていてもよい。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、微小発射物の衝撃によって導入される。特定の実施態様では、この方法はさらに、修復鋳型、すなわち関心のある遺伝子が導入されたかどうかを決定するために、導入工程後に植物細胞を選別することを含む。特定の実施態様では、この方法は、植物細胞から植物を再生する工程を含む。さらなる実施態様では、この方法は、遺伝的に所望の植物系統を得るために植物を交配育種することを含む。関心のある形質をコードする外来遺伝子の例を以下に列記する。
b）関心のある農学的形質を付与する内因性遺伝子の編集
【０９８２】
本発明は、対象の標的遺伝子座に会合するまたはその遺伝子座の位置にある配列をゲノム編集または改変する方法を提供し、この方法は、C2c1エフェクタータンパク質複合体を植物細胞中に導入することを含み、それによりC2c1複合体は、植物の内因性遺伝子の発現を改変する。この改変は、異なる方法により達成してもよい。特定の実施態様では、内因性遺伝子の発現の排除が望ましく、C2c1 CRISPR複合体を使用して、遺伝子発現を改変するように内因性遺伝子を標的化して切断する。これらの実施態様では、本明細書で提供の方法は、（a）直接反復および植物細胞のゲノム中の関心のある遺伝子内の標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むガイドRNAを含むC2c1 CRISPR複合体を植物細胞中に導入すること、および（b）C2c1エフェクタータンパク質を細胞中に導入することを含み、C2c1エフェクタータンパク質は、ガイドRNAに結合すると、標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含み、かつガイド配列が標的化される配列でまたはその近傍で二本鎖切断を確実にする。特定の実施態様では、導入工程は、C2c1エフェクタータンパク質およびガイドRNAをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを植物細胞に送達することを含んでもよい。
【０９８３】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、DNAウイルス（例えばジェミニウイルス）またはRNAウイルス（例えばトブラウイルス）によって細胞中に送達される。特定の実施態様では、導入工程は、C2c1エフェクタータンパク質およびガイドRNAをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含むT-DNAを植物細胞に送達することを含み、この送達はアグロバクテリウムを介する。CRISPR-C2c1システムの構成要素をコードするポリヌクレオチド配列は、構成型プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター）などのプロモーター、または細胞特異性または誘導性プロモーターに操作可能に連結されてもよい。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、微小発射物の衝撃によって導入される。特定の実施態様では、この方法はさらに、導入工程後に植物細胞を選別して関心のある遺伝子の発現が改変されているかを決定することを含む。特定の実施態様では、この方法は、植物細胞から植物を再生する工程を含む。さらなる実施態様では、この方法は、遺伝的に所望の植物系統を得るために植物を交配育種することを含む。
【０９８４】
上述の方法の特定の実施態様では、耐病性作物は、病害感受性遺伝子または植物防御遺伝子の負の調節因子（例えばMlo遺伝子）をコードする遺伝子の標的変異によって得られる。特定の実施態様では、除草剤耐性の作物は、アセト乳酸合成酵素 (ALS)およびプロトポルフィリノーゲン酸化酵素 (PPO)をコードする遺伝子などの植物遺伝子での特定のヌクレオチドの標的置換によって生成される。特定の実施態様では、この作物は、非生物的ストレス耐性の負の調節因子をコードする遺伝子の標的変異による耐干ばつ性および耐塩性の作物、ワキシー遺伝子の標的変異による低アミロース穀粒、アリューロン層中の主要な脂肪分解酵素遺伝子の標的変異によって酸敗が低減されたイネまたは他の穀粒などである。特定の実施態様では、関心のある形質をコードする内因性遺伝子の例を以下に列記する。
c）関心のある農学的形質を付与するCRISPR-C2c1システムによる内因性遺伝子の調節
【０９８５】
また、本明細書で提供のC2c1タンパク質を用いて内因性遺伝子の発現を調節する（すなわち活性化または抑制する）ための方法が本明細書に提供される。この方法では、C2c1複合体によって植物ゲノムに標的化される別のRNA配列を利用する。より具体的には、別のRNA配列は、２つ以上のアダプタータンパク質（例えばアプタマー）に結合し、それにより各アダプタータンパク質は、１つ以上の機能ドメインに会合し、アダプタータンパク質に会合する１つ以上の機能ドメインの内の少なくとも１つは、デアミナーゼ活性、メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、DNA組込み活性、RNA切断活性、DNA切断活性、または核酸結合活性を含む１つ以上の活性を有し、この機能ドメインを用いて、所望の形質を獲得するように内因性植物遺伝子の発現を調節する。典型的には、これらの実施態様では、C2c1タンパク質は、少なくとも１つの変異を持たないC2c1タンパク質の活性が５％以下となるように、少なくとも１つの変異を有する。
【０９８６】
特定の実施態様では、本明細書に提供の方法は、（a）tracr RNAならびに直接反復および植物細胞に対して内因性である標的配列にハイブリダイズするガイド配列を含むガイドRNAを含むC2c1 CRISPR複合体を、細胞中に導入する工程、および（b）ガイド配列が標的配列にハイブリダイズするときにガイドRNAと複合化するC2c1エフェクター分子を、植物細胞中に導入する工程を含み、ガイドRNAは、機能ドメインに結合する別のRNA配列（アプタマー）結合を含むように改変され、かつ／あるいはC2c1エフェクタータンパク質は、それが機能ドメインに連結されるという形態で改変される。特定の実施態様では、導入工程は、（改変された）C2c1エフェクタータンパク質および（改変された）ガイドRNAをコードする１つ以上のポリヌクレオチドを植物細胞に送達することを含んでもよい。これらの方法で使用するCRISPR-C2c1システムの構成要素の詳細は、本書の他の場所に説明されている。
【０９８７】
特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、DNAウイルス（例えばジェミニウイルス）またはRNAウイルス（例えばトブラウイルス）によって細胞中に送達される。特定の実施態様では、導入工程は、C2c1エフェクタータンパク質およびガイドRNAをコードする１つ以上のポリヌクレオチド配列を含むT-DNAを植物細胞に送達することを含み、この送達はアグロバクテリウムを介する。CRISPR-C2c1システムの１つ以上の構成要素をコードする核酸配列は、構成型プロモーター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーター）などのプロモーター、または細胞特異性または誘導性プロモーターに操作可能に連結されてもよい。特定の実施態様では、ポリヌクレオチドは、微小発射物の衝撃によって導入される。特定の実施態様では、この方法はさらに、導入工程後に植物細胞を選別して、関心のある遺伝子の発現が改変されているかを決定することを含む。特定の実施態様では、この方法は、植物細胞から植物を再生する工程を含む。さらなる実施態様では、この方法は、遺伝的に所望の植物系統を獲得するために植物を交配育種することを含む。関心のある形質をコードする内因性遺伝子のより広範な一覧を以下に列記する。
倍数体植物を改変するためのC2c1の使用
【０９８８】
多くの植物は倍数体であり、このことは、これら植物はそれらのゲノムの複製物を保有し、時にはコムギのように６倍と多くなることを意味している。C2c1 CRISPRエフェクタータンパク質を利用する本発明による方法は、遺伝子の全ての複製物に影響を及ぼすように、または一度に数十の遺伝子を標的化するように「多重化」することができる。例えば、特定の実施態様では、本発明の方法を用いて、病気に対する防御の抑制の要因となる異なる遺伝子での機能変異の喪失が同時に確実になる。特定の実施態様では、本発明の方法を用いて、コムギ植物がウドンコ病に耐性を持つことを確実にするために、コムギ植物細胞でのTaMLO-A1、TaMLO-B1、およびTaMLO-D1核酸配列の発現を同時に抑制して、その細胞からコムギ植物を再生する（国際特許出願WO2015109752号も参照）。
農学的形質を付与する遺伝子例
【０９８９】
上述のように、特定の実施態様では、本発明は、１つ以上の発現可能な植物遺伝子を含む、関心のあるDNAの挿入のための本明細書に説明のCRISPR-C2c1システムの使用を包含する。さらなる特定の実施態様では、本発明は、１つ以上の発現される植物遺伝子の部分的または完全な欠失のために、本明細書に説明のC2c1システムを使用する方法および手段を包含する。他のさらなる特定の実施態様では、本発明は、１つ以上のヌクレオチドの変異、置換、挿入による１つ以上の発現される植物遺伝子の改変を確実にするための本明細書に説明のC2c1システムを使用する方法および手段を包含する。他の特定の実施態様では、本発明は、本明細書に説明のCRISPR-C2c1システムを使用して、前記遺伝子の発現を誘導する１つ以上の調節エレメントの特異的改変によって、１つ以上の発現される植物遺伝子の発現の改変を確実にすることを包含する。
【０９９０】
特定の実施態様では、本発明は、以下に列記されるように、外因性遺伝子の導入および／または内因性遺伝子およびそれらの調節エレメントの標的化を含む方法を包含する。
１．有害生物または疾患に対する抵抗性を付与する遺伝子
【０９９１】
植物の疾患抵抗性遺伝子。クローン化された抵抗性遺伝子で植物を形質転換して、特定の病原体株に抵抗性をもつ植物を設計することができる。たとえば、Jones et al., Science 266: 789 (1994)（トマト葉かび病菌（Cladosporium fulvum）に対する抵抗性のためのトマトＣｆ−９遺伝子のクローン化）；Martin et al., Science 262: 1432 (1993)（トマト斑葉細菌病菌（Pseudomonas syringae pv. tomato）に対する抵抗性のためのトマトPto遺伝子はタンパク質キナーゼをコードする）；Mindrinos et al., Cell 78: 1089 (1994)（アラビドプス（Arabidops）は、シュードモナス・シリンゲ（Pseudomonas syringae）に対する抵抗性のためのRSP2遺伝子である可能性がある）を参照のこと。病原体感染中に増加または減少する植物遺伝子を、病原体抵抗性のために遺伝子操作することができる。たとえば、Thomazella et al., bioRxiv 064824; doi: doi.org/10.1101/064824 Epub. July 23, 2016（通常は病原体感染中に増加するSlDMR6-1を欠失したトマト植物）を参照のこと。
【０９９２】
ダイズシストセンチュウなどの有害生物に対する抵抗性を付与する遺伝子。たとえば、PCT出願WO96/30517号；PCT出願WO93/19181号を参照のこと。
【０９９３】
バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）タンパク質。たとえば、Geiser et al., Gene 48:109 (1986)を参照のこと。
【０９９４】
レクチン。たとえば、Van Damme et al., Plant Molec. Biol. 24:25 (1994)を参照のこと。
【０９９５】
ビタミン結合タンパク質、たとえばアビジン。PCT出願US93/06487号を参照のこと。同出願は、アビジンおよびアビジン相同体を害虫に対する幼虫駆除剤として使用することを教示している。
【０９９６】
酵素阻害剤、たとえば、プロテアーゼもしくはプロテイナーゼ阻害剤またはアミラーゼ阻害剤。たとえば、Abe et al., J. Biol. Chem. 262:16793 (1987)、Huub et al., Plant Molec. Biol. 21:985 (1993)、Sumitani et al., Biosci. Biotech. Biochem. 57:1243 (1993)、および米国特許第5,494,813号を参照のこと。
【０９９７】
昆虫特異的ホルモンまたはフェロモン、たとえば、エクジステロイドもしくは幼若ホルモン、それらの多様体、それらに基づく模倣物、またはそれらの拮抗物質もしくは作用物質。たとえば、Hammock et al., Nature 344: 458 (1990)を参照のこと。
【０９９８】
発現されると、影響を受けた有害生物の生理機能を破壊する、昆虫特異的ペプチドまたは神経ペプチド。たとえば、Regan, J. Biol. Chem. 269: 9 (1994)、およびPratt et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243 (1989)を参照のこと。米国特許第5,266,317号も参照のこと。
【０９９９】
ヘビ、スズメバチ、または他の任意の生物によって天然に産生される昆虫特異的毒液。たとえば、Pang et al., Gene 116: 165 (1992)を参照のこと。
【１０００】
殺虫活性を有するモノテルペン、セスキテルペン、ステロイド、ヒドロキサム酸、フェニルプロパノイド誘導体または別の非タンパク質分子の高蓄積に関与する酵素。
【１００１】
生物活性分子の改変（翻訳後修飾を含む）に関与する酵素、たとえば、天然のものであるか合成のものであるかにかかわらず、糖分解酵素、タンパク質分解酵素、脂肪分解酵素、ヌクレアーゼ、シクラーゼ、トランスアミナーゼ、エステラーゼ、ヒドロラーゼ、ホスファターゼ、キナーゼ、ホスホリラーゼ、ポリメラーゼ、エラスターゼ、キチナーゼ、およびグルカナーゼ。PCT出願WO93/02197、Kramer et al., Insect Biochem. Molec. Biol. 23:691 (1993)、およびKawalleck et al., Plant Molec. Biol. 21 :673 (1993)を参照のこと。
【１００２】
シグナル伝達を刺激する分子。たとえば、Botella et al., Plant Molec. Biol. 24:757 (1994)、およびGriess et al., Plant Physiol. 104:1467 (1994)を参照のこと。
【１００３】
ウイルス侵襲性タンパク質またはそれに由来する複合毒素。Beachy et al., Ann. rev. Phytopathol. 28:451 (1990)を参照のこと。
【１００４】
病原体または寄生虫によって天然に産生される発育抑制（developmental-arrestive）タンパク質。Lamb et al., Bio/Technology 10:1436 (1992)、およびToubart et al., Plant J. 2:367 (1992)を参照のこと。
【１００５】
植物によって天然に産生される発育抑制タンパク質。たとえば、Logemann et al., Bio/Technology 10:305 (1992)を参照のこと。
【１００６】
植物では、病原体は宿主に特異的であることが多い。たとえば、一部のフサリウム属（Fusarium）種はトマトの萎れを起こすが、トマトのみを攻撃し、別のフサリウム属種は小麦のみを攻撃する。植物は、ほとんどの病原体に抵抗するために存在し誘導される防御力を持つ。植物の世代にわたる変異および組換え事象は、感受性を引き起こす遺伝的変動をもたらす。というのも、特に病原体が植物よりも頻繁に繁殖するからである。植物では、非宿主抵抗性が存在する（たとえば、宿主と病原体が適合しない）可能性がある。、または、病原体のすべての種族に対する部分的な抵抗性（典型的には多くの遺伝子によって制御される）および／もしくは病原体の一部の種族に対する完全な抵抗性（他の品種に対してはない）が存在する可能性がある。このような抵抗性は、典型的にはわずかな遺伝子によって制御される。CRISPR-C2c1システムの方法および成分を用いて、現在、このことに関して予想される特異的変異を誘導するための新たな手段が存在する。したがって、抵抗性遺伝子の由来源のゲノムを解析することができ、所望の特性または形質を持つ植物で、CRISPR-C2c1システムの方法および成分を用いて抵抗性遺伝子の増加を誘導することができる。本システムは、これまでの変異原性物質よりも正確にそれを行うことができ、したがって、植物の育種計画を加速かつ改善することができる。
２．植物病害に関与する遺伝子
【１００７】
植物病害に関与する遺伝子。植物を、病害に感受性または関連のある遺伝子を改変するCRISPR-C2c1システムで形質転換して、特定の病原体株に抵抗性を持つ植物を設計することができる。たとえば、推定上の糖輸送体をコードする、植物のSWEET遺伝子は、イネ病原性のイネ白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae）に由来するTALエフェクターによって誘導され、病原体感染の拡大を促進することが知られている。Streubel et al, New Phytologist, 2013 Nov;200(3):808-19. doi: 10.1111/nph.12411. Epub 2013 Jul 24を参照のこと。柑橘類のCsLOBは、柑橘類の病害、たとえば柑橘類潰瘍病に関与するTALエフェクターによって誘導されることが知られている。
【１００８】
本発明はさらに、植物細胞の目的の遺伝子座を改変する方法を提供する。この方法は、本明細書に記載の遺伝子操作されたCRISPR酵素（たとえば、遺伝子操作されたCasエフェクターモジュール）のいずれか、組成物、または本明細書に記載のシステムもしくはベクターシステムのいずれかに細胞を接触させることを含む、あるいは、細胞は、細胞内に存在する本明細書に記載のCRISPR複合体のいずれかを含む。特定の実施態様では、植物細胞は、A/Tに富むゲノムを含んでいてもよい。実施態様によっては、細胞ゲノムはTに富むプロトスペーサー隣接モチーフ（PAM）を含んでいてもよい。特定の実施態様では、PAMは5'-TTN-3'または5'-ATTN-3'である。特定の実施態様では、改変された遺伝子座は植物病害に関連する。特定の実施態様では、植物病害は病原体感受性に関連する。特定の実施態様では、改変された遺伝子座はSWEET遺伝子座またはCsLOB遺伝子座を含む。特定の実施態様では、植物病害は柑橘類潰瘍病またはイネ枯病である。実施態様によっては、細胞ゲノムはTに富むPAMを含む。特定の実施態様では、PAMは5'-TTN-3'または5'-ATTN-3'である。実施態様によっては、CRISPR-CasシステムはCRISPR-C2c1システムである。実施態様によっては、目的の遺伝子座は、5'末端が突出したねじれ型の切断を導入することによってC2c1エフェクタータンパク質で改変される。特定の実施態様では、5'末端の突出は7ヌクレオチドである。実施態様によっては、目的の遺伝子座は、単一のヌクレオチド欠失または変異によって改変される。実施態様によっては、目的の遺伝子座は50ヌクレオチド未満の変異または欠失によって改変される。実施態様によっては、目的の遺伝子座は、CRISPR-C2c1システムによって導入された5'末端が突出したねじれ型切断と相同性指向修復（HDR）とによって改変される。実施態様によっては、目的の遺伝子座は、CRISPR-C2c1システムによって導入された5'末端が突出したねじれ型切断と非相同性末端結合（NHEJ）とによって改変される。実施態様によっては、目的の遺伝子座は、PAMの遠位端にCRISPR-C2c1システムによって導入された5'末端が突出したねじれ型切断によって改変された後、HDRによって修復される。実施態様によっては、目的の遺伝子座は、5'末端の突出にCRISPR-C2c1システムによって導入された外来DNA配列の挿入と、HDRとによって改変される。好ましい実施態様では、目的の遺伝子座は、5'末端の突出にCRISPR-C2c1システムによって導入された外来DNA配列の挿入と、HDRとによって改変される。
【１００９】
植物病害に関与する遺伝子、たとえばWO 2013046247に列挙されている以下のもの。
【１０１０】
イネの病害：イネいもち病菌（Magnaporthe grisea）、イネごま葉枯病菌（Cochliobolus miyabeanus）、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、イネばか苗病菌（Gibberella fujikuroi）；小麦の病害：うどんこ病菌（Erysiphe graminis）、フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、Ｆ．アベナケウム（F. avenaceum）、Ｆ．クルモルム（F. culmorum）、ミクロドキウム・ニバレ（Microdochium nivale）、プッキニア・ストリイフォルミス（Puccinia striiformis）、Ｐ．グラミニス（P. graminis）、Ｐ．レコンディタ（P. recondita）、ミクロネクトリエラ・ニバレ（Micronectriella nivale）、ガマノホタケ属種（Typhula sp.）、裸黒穂病菌（Ustilago tritici）、ティレティア・カリエス（Tilletia caries）、シュードサーコスポレラ・エルポトリコイデス（Pseudocercosporella herpotrichoides）、コムギ葉枯病菌（Mycosphaerella graminicola）、スタゴノスポラ・ノドルム（Stagonospora nodorum）、ピレノフォラ・トリチシ・レペンティス（Pyrenophora tritici-repentis）；大麦の病害：エリシフェ・グラミニス（Erysiphe graminis）、フサリウム・グラミネアルム（Fusarium graminearum）、Ｆ．アベナケウム（F. avenaceum）、Ｆ．クルモルム（F. culmorum）、ミクロドキウム・ニバレ（Microdochium nivale）、プッキニア・ストリイフォルミス（Puccinia striiformis）、Ｐ．グラミニス（P. graminis）、Ｐ．オルデイ（P. hordei）、ウスティラゴ・ヌダ（Ustilago nuda）、リンコスポリウム・セカリス（Rhynchosporium secalis）、網斑病菌（Pyrenophora teres）、コクリオボルス・サティブス（Cochliobolus sativus）、斑葉病菌（Pyrenophora graminea）、リゾクトニア・ソラニ；トウモロコシの病害：トウモロコシ黒穂病菌（Ustilago maydis）、トウモロコシごま葉枯病菌（Cochliobolus heterostrophus）、豹紋病菌（Gloeocercospora sorghi）、プッキニア・ポリソラ（Puccinia polysora）、サーコスポラ・ゼアエ・マイディス（Cercospora zeae-maydis）、リゾクトニア・ソラニ；
【１０１１】
柑橘類の病害：ディアポルテ・キトリ（Diaporthe citri）、カンキツそうか病菌（Elsinoe fawcetti）、ミドリカビ病菌（Penicillium digitatum）、Ｐ．イタリクム（P. italicum）、フィトフトラ・パラシティカ（Phytophthora parasitica）、フィトフトラ・シトロフトラ（Phytophthora citrophthora）；リンゴの病害：モニリニア・マリ（Monilinia mali）、リンゴ腐らん病菌（Valsa ceratosperma）、ポドスファエラ・レウコトリカ（Podosphaera leucotricha）、アルテルナリア・アルテルナータ（Alternaria alternata）リンゴ病原型、ベントゥリア・イナエクアリス（Venturia inaequalis）、多犯性炭疽病菌（Colletotrichum acutatum）、フィトフトラ・カクトルム（Phytophthora cactorum）；
【１０１２】
ナシの病害：ナシ黒星病菌（Venturia nashicola）、Ｖ．ピリナ、アルテルナリア・アルテルナータ和ナシ病原型、ジムノスポランギウム・アラエアヌム（Gymnosporangium haraeanum）、フィトフトラ・カクトルム；
【１０１３】
モモの病害：灰星病菌（Monilinia fructicola）、黒星病菌（Cladosporium carpophilum）、ホモプシス属（Phomopsis）種；
【１０１４】
ブドウの病害：ブドウ黒とう病菌（Elsinoe ampelina）、グロメレラ・シングラタ（Glomerella cingulata）、ブドウうどんこ病菌（Uncinula necator）、ファコプソラ・アンペロプシディス（Phakopsora ampelopsidis）、ブドウ黒腐病菌（Guignardia bidwellii）、ブドウべと病菌（Plasmopara viticola）；
【１０１５】
カキの病害：グロエスポリウム・カキ（Gloesporium kaki）、サーコスポラ・カキ（Cercospora kaki）、ミコスファエレラ・ナワエ（Mycosphaerella nawae）；
【１０１６】
ウリの病害：コレトトリクム・ラゲナリウム（Colletotrichum lagenarium）、スファエロテカ・フリギネア（Sphaerotheca fuliginea）、ミコスファエレラ・メロニス（Mycosphaerella melonis）、フサリウム・オキシスポルム（Fusarium oxysporum）、シュードペロノスポラ・クベンシス（Pseudoperonospora cubensis）、フィトフトラ属（Phytophthora）種、ピティウム属（Pythium）種；
【１０１７】
トマトの病害：アルテルナリア・ソラニ（Alternaria solani）、トマト葉かび病菌、フィトフトラ・インフェスタンス（Phytophthora infestans）；トマト斑葉細菌病菌（Pseudomonas syringae pv. Tomato）；フィトフトラ・カプシキ（Phytophthora capsici）；キサントモナス属（Xanthomonas）；
【１０１８】
ナスの病害：ナス褐紋病菌（Phomopsis vexans）、エリシフェ・キコラケアルム（Erysiphe cichoracearum）；
アブラナ科野菜の病害：アルテルナリア・ジャポニカ（Alternaria japonica）、サーコスポレラ・ブラッシカエ（Cercosporella brassicae）、プラスモディオフォラ・ブラッシカエ（Plasmodiophora brassicae）、ペロノスポラ・パラシティカ（Peronospora parasitica）；
【１０１９】
ネギの病害：プッキニア・アリイ（Puccinia allii）、ネギべと病菌（Peronospora destructor）；
【１０２０】
ダイズの病害：サーコスポラ・キクチイ（Cercospora kikuchii）、エルシノエ・グリシネス（Elsinoe glycines）、ディアポルテ・ファセオロルム変種ソジャエ（Diaporthe phaseolorum var. sojae）、セプトリア・グリシネス（Septoria glycines）、サーコスポラ・ソジナ（Cercospora sojina）、ファコスポラ・パキリジ（Phakopsora pachyrhizi）、フィトフトラ・ソジャエ（Phytophthora sojae）、リゾクトニア・ソラニ、コリネスポラ・カシイコラ（Corynespora casiicola）、スクレロティニア・スクレロティオルム（Sclerotinia sclerotiorum）；
【１０２１】
インゲンマメの病害：コレトリクム・リンデンティアヌム（Colletrichum lindemthianum）；
【１０２２】
ピーナツの病害：サーコスポラ・ペルソナタ（Cercospora personata）、サーコスポラ・アラキディコラ（Cercospora arachidicola）、スクレロティウム・ロルフシイ（Sclerotium rolfsii）；
【１０２３】
エンドウの病害：エリシフェ・ピシ（Erysiphe pisi）；
【１０２４】
ジャガイモの病害：アルテルナリア・ソラニ（Alternaria solani）、フィトフトラ・インフェスタンス、フィトフトラ・エリスロセプティカ（Phytophthora erythroseptica）、スポンゴスポラ・スブテラネアン（Spongospora subterranean, f. sp. Subterranean）；
【１０２５】
イチゴの病害：スファエロテカ・ウムリ（Sphaerotheca humuli）、グロメレラ・シングラタ（Glomerella cingulata）；
【１０２６】
チャの病害：エキソバシディウム・レティクラトゥム（Exobasidium reticulatum）、エルシノエ・レウコスピラ（Elsinoe leucospila）、ペスタロティオプシス属（Pestalotiopsis）種、コレトトリクム・テアエ・シネンシス（Colletotrichum theae-sinensis）；
【１０２７】
タバコの病害：アルテルナリア・ロンギペス（Alternaria longipes）、エリシフェ・キコラケアルム（Erysiphe cichoracearum）、コレトトリクム・タバクム（Colletotrichum tabacum）、ペロノスポラ・タバキナ（Peronospora tabacina）、フィトフトラ・ニコチアナエ（Phytophthora nicotianae）；
【１０２８】
ナタネの病害：スクレロティニア・スクレロティオルム（Sclerotinia sclerotiorum）、リゾクトニア・ソラニ；
【１０２９】
綿の病害：リゾクトニア・ソラニ；
【１０３０】
ビートの病害：サーコスポラ・ベティコラ（Cercospora beticola）、タナテフォルス・ククメリス（Thanatephorus cucumeris）、タナテフォルス・ククメリス（Thanatephorus cucumeris）、アファノミケス・コクリオイデス（Aphanomyces cochlioides）；
【１０３１】
バラの病害：ディプロカルポン・ロザエ（Diplocarpon rosae）、スファエロテカ・パノサ（Sphaerotheca pannosa）、ペロノスポラ・スパルサ（Peronospora sparsa）；
【１０３２】
キクおよびキク科の病害：ブレミア・ラクトゥカ（Bremia lactuca）、セプトリア・クロサンテミ・インディシ（Septoria chrysanthemi-indici）、プッキニア・オリアナ（Puccinia horiana）；
【１０３３】
様々な植物の病害：ピティウム・アファニデルマトゥム（Pythium aphanidermatum）、ピティウム・デバリアヌム（Pythium debarianum）、ピティウム・グラミニコラ（Pythium graminicola）、ピティウム・イレグラレ（Pythium irregulare）、ピティウム・ウルティムム（Pythium ultimum）、ボトリティス・キネレア（Botrytis cinerea）、スクレロティニア・スクレロティオルム（Sclerotinia sclerotiorum）；
【１０３４】
ダイコンの病害：キャベツ黒すす病菌（Alternaria brassicicola）；
【１０３５】
シバの病害：スクレロティニア・オメオカルパ（Sclerotinia homeocarpa）、リゾクトニア・ソラニ；
【１０３６】
バナナの病害：ミコスファエレラ・フィジエンシス（Mycosphaerella fijiensis）、ミコスファエレラ・ムジコラ（Mycosphaerella musicola）；
【１０３７】
ヒマワリの病害：プラスモパラ・アルステディイ（Plasmopara halstedii）；
【１０３８】
アスペルギルス属（Aspergillus）種、アオカビ属（Penicillium）種、フサリウム属種、ジベレラ属（Gibberella）種、トリコデルマ属（Tricoderma）種、ティエラビオプシス属（Thielaviopsis）種、クモノスカビ属（Rhizopus）種、ケカビ属（Mucor）種、コルティシウム属（Corticium）種、ロマ属（Rhoma）種、リゾクトニア属（Rhizoctonia）種、ディプロディア属（Diplodia）種などによって引き起こされる、様々な植物の種子の病害または成長初期の病害；
【１０３９】
ポリミキサ属（Polymixa）種、オルピディウム属（Olpidium）種などによって媒介される、様々な植物のウイルス病害。
【１０４０】
３．除草剤に対する抵抗性を付与する遺伝子の例：
【１０４１】
成長点すなわち分裂組織を阻害する除草剤、たとえばイミダゾリノンまたはスルホニル尿素に対する抵抗性（たとえば、それぞれLee et al., EMBO J. 7:1241 (1988)、およびMiki et al., Theor. Appl. Genet. 80:449 (1990)による）。
【１０４２】
グリホサート抵抗性（たとえば、変異型5-エノールピルビルシキミ酸-3-リン酸シンターゼ（EPSP）遺伝子、aroA遺伝子、およびグリホサートアセチルトランスフェラーゼ（GAT）遺伝子によってそれぞれ付与される抵抗性）、または他のホスホノ化合物に対する抵抗性、たとえばグルホシナートに対する抵抗性（ストレプトミセス・ヒグロスコピクス（Streptomyces hygroscopicus）、ストレプトミセス・ビリディクロモゲネス（Streptomyces viridichromogenes）などのストレプトミセス属（Streptomyces）種由来のホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（PAT）遺伝子による）、ならびにピリジノキシもしくはフェノキシプロピオン酸およびシクロヘキソンへの抵抗性（ACCアーゼ阻害剤コード遺伝子による）。たとえば、米国特許第4,940,835号および米国特許第6,248,876号、米国特許第4,769,061号、EP 0 333 033、ならびに米国特許第4,975,374号を参照のこと。EP 0242246、DeGreef et al., Bio/Technology 7:61 (1989)、Marshall et al., Theor. Appl. Genet. 83:435 (1992)、WO 2005012515（Castleら）、およびWO 2005107437も参照のこと。
【１０４３】
光合成を阻害する除草剤、たとえばトリアジンに対する抵抗性（psbAおよびgs+遺伝子）またはベンゾニトリルに対する抵抗性（ニトリラーゼ遺伝子）、およびグルタチオンSトランスフェラーゼ（Przibila et al., Plant Cell 3:169 (1991)、米国特許第4,810,648号、およびHayes et al., Biochem. J. 285: 173 (1992)）。
【１０４４】
除草剤を解毒する酵素、または阻害抵抗性を持つ変異型グルタミンシンターゼ酵素をコードする遺伝子（たとえば、米国特許出願第11/760,602号）。あるいは、解毒酵素はホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ（ストレプトミセス属種由来のbarまたはpatタンパク質など）をコードする酵素である。ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼは、たとえば米国特許第5,561,236号、第5,648,477号、第5,646,024号、第5,273,894号、第5,637,489号、第5,276,268号、第5,739,082号、第5,908,810号、および第7,112,665号に記載されている。
【１０４５】
ヒドロキシフェニルピルビン酸ジオキシゲナーゼ（HPPD）阻害剤、すなわち天然のHPPD抵抗性酵素、または変異もしくはキメラHPPD酵素をコードする遺伝子（WO 96/38567、WO 99/24585、およびWO 99/24586、WO 2009/144079、WO 2002/046387、または米国特許第6,768,044号に記載）。
４．非生物的ストレス抵抗性に関与する遺伝子の例：
【１０４６】
植物細胞または植物におけるポリ（ADP-リボース）ポリメラーゼ（PARP）遺伝子の発現および／または活性を低下させることができる導入遺伝子（WO 00/04173またはWO/2006/045633に記載）。
【１０４７】
植物または植物細胞のPARGコード遺伝子の発現および／または活性を低下させることができる導入遺伝子（たとえばWO 2004/090140に記載）。
【１０４８】
ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド再合成経路の植物機能性酵素、たとえばニコチンアミダーゼ、ニコチン酸ホスホリボシルトランスフェラーゼ、ニコチン酸モノヌクレオチドアデニルトランスフェラーゼ、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドシンテターゼまたはニコチンアミドホスホリボシルトランスフェラーゼなどをコードする導入遺伝子（たとえば、EP 04077624.7、WO 2006/133827、PCT/EP07/002,433、EP 1999263、またはWO 2007/107326に記載）。
【１０４９】
炭水化物生合成に関与する酵素としては、たとえば以下の文献：EP 0571427、WO 95/04826、EP 0719338、WO 96/15248、WO 96/19581、WO 96/27674、WO 97/11188、WO 97/26362、WO 97/32985、WO 97/42328、WO 97/44472、WO 97/45545、WO 98/27212、WO 98/40503、WO99/58688、WO 99/58690、WO 99/58654、WO 00/08184、WO 00/08185、WO 00/08175、WO 00/28052、WO 00/77229、WO 01/12782、WO 01/12826、WO 02/101059、WO 03/071860、WO 2004/056999、WO 2005/030942、WO 2005/030941、WO 2005/095632、WO 2005/095617、WO 2005/095619、WO 2005/095618、WO 2005/123927、WO 2006/018319、WO 2006/103107、WO 2006/108702、WO 2007/009823、WO 00/22140、WO 2006/063862、WO 2006/072603、WO 02/034923、EP 06090134.5、EP 06090228.5、EP 06090227.7、EP 07090007.1、EP 07090009.7、WO 01/14569、WO 02/79410、WO 03/33540、WO 2004/078983、WO 01/19975、WO 95/26407、WO 96/34968、WO 98/20145、WO 99/12950、WO 99/66050、WO 99/53072、米国特許第6,734,341号、WO 00/11192、WO 98/22604、WO 98/32326、WO 01/98509、WO 01/98509、WO 2005/002359、米国特許第5,824,790号、米国特許第6,013,861号、WO 94/04693、WO 94/09144、WO 94/11520、WO 95/35026もしくはWO 97/20936に記載の酵素、または、ポリフルクトース（特にイヌリンおよびレバン型のもの）の産生に関与する酵素（EP 0663956、WO 96/01904、WO 96/21023、WO 98/39460およびWO 99/24593に開示）、α-1,4-グルカンの産生に関与する酵素（WO 95/31553、US 2002031826、米国特許第6,284,479号、米国特許第5,712,107号、WO 97/47806、WO 97/47807、WO 97/47808、およびWO 00/14249に開示）、α-1,6分岐α-1,4-グルカンの産生に関与する酵素（WO 00/73422に開示）、アルテルナンの産生に関与する酵素（たとえばWO 00/47727、WO 00/73422、EP 06077301.7、米国特許第5,908,975号およびEP 0728213に開示）、ヒアルロナンの産生に関与する酵素（たとえばWO 2006/032538、WO 2007/039314、WO 2007/039315、WO 2007/039316、JP 2006304779、およびWO 2005/012529に開示）が挙げられる。
【１０５０】
耐乾燥性を改善する遺伝子。たとえば、WO 2013122472には、機能性ユビキチン・タンパク質リガーゼタンパク質（UPL）（より詳細にはUPL3）が存在しない、または量が減少すると、その植物の水の必要性が低下する、または耐乾燥性が改善することが開示されている。耐乾燥性の向上した遺伝子組換え植物の他の例は、たとえばUS 2009/0144850、US 2007/0266453、およびWO 2002/083911に開示されている。US 2009/0144850には、DR02核酸の発現の変化により耐乾燥性表現型を示す植物について記載されている。US 2007/0266453には、DR03核酸の発現の変化により耐乾燥性表現型を示す植物について記載されており、WO 2002/083911には、孔辺細胞で発現するＡＢＣ輸送体の活性の低下により乾燥ストレスに対する抵抗性の向上した植物について記載されている。別の例は、Kasugaと共同著者による研究（1999年）であり、彼らは、遺伝子組換え植物におけるDREB1 AをコードするcDNAの過剰発現によって通常の成長条件で多くのストレス抵抗性遺伝子の発現が活性化し、その結果、乾燥、塩分負荷、および凍結に対する抵抗性が改善したことを記載している。しかし、DREB1Aの発現により、通常の成長条件で深刻な成長の遅れも起こった（Kasuga (1999) Nat Biotechnol 17(3) 287-291）。
【１０５１】
さらなる特定の実施態様では、特定の植物形質に影響を及ぼすことによって農作物を改良することができる。これは、たとえば、農薬抵抗性植物の開発、植物の耐病性の改善、植物の昆虫および線虫抵抗性の改善、植物の寄生雑草に対する抵抗性の改善、植物の耐乾燥性の改善、植物の栄養価の改善、植物のストレス抵抗性の改善、自家受粉の回避、植物飼料の消化率、バイオマス、穀物収量などの改善による。特定の非限定的な例を以下にいくつか示す。
【１０５２】
単一の遺伝子の標的変異に加えて、C2c1 CRISPR複合体を設計して、植物の複数の遺伝子の標的変異、染色体断片の欠失、導入遺伝子の部位特異的な組込み、in vivoでの部位特異的な変異誘発、および正確な遺伝子置換もしくは対立遺伝子交換を可能にすることができる。したがって、本明細書に記載の方法は、遺伝子の発見および検証、変異による育種およびシスジェネシス（＝同種または近縁種の遺伝子を導入すること）による育種、ならびに雑種育種において広範な用途を持つ。これらの用途は、様々な改善された農学的形質（除草剤抵抗性、耐病性、非生物的ストレス抵抗性、高収量、および優れた品質など）を持つ新世代の遺伝子改変作物の生産を促進する。
雄性不稔性植物を作るためのC2c1遺伝子の使用
【１０５３】
雑種植物は、典型的には、近交系植物と比較して有利な農学的形質を持つ。ただし、自家受粉植物の場合、雑種の作成は困難である可能性がある。様々な植物の種類で、植物の稔性、特に雄性稔性に重要な遺伝子が特定されている。たとえば、トウモロコシでは、稔性に重要な少なくとも２つの遺伝子が特定されている（Amitabh Mohanty International Conference on New Plant Breeding Molecular Technologies Technology Development And Regulation, Oct 9-10, 2014, Jaipur, India; Svitashev et al. Plant Physiol. 2015 Oct;169(2):931-45; Djukanovic et al. Plant J. 2013 Dec;76(5):888-99）。本明細書で提供する方法を用いて雄性稔性に必要な遺伝子を標的とし、雑種の生成のために容易に交雑可能な雄性稔性植物を生成することができる。特定の実施態様では、本明細書で提示するCRISPR-C2c1システムをチトクロムP450様遺伝子（MS26）またはメガヌクレアーゼ遺伝子（MS45）の標的変異誘発のために用いることによりトウモロコシ植物に雄性稔性を付与する。このように遺伝子改変されたトウモロコシ植物を雑種育種計画に用いることができる。
植物の稔性期の延長
【１０５４】
特定の実施態様では、本明細書で提示する方法を用いて植物（イネ植物など）の稔性期を延長する。たとえば、遺伝子に変異を起こすためにイネの稔性期遺伝子（Ehd3など）を標的にすることができ、再生植物の延長された稔性期について未発育の植物を選択することができる（CN 104004782に記載）。
目的の作物で遺伝的多様性を起こすためのC2c1の使用
【１０５５】
農作物の野生の生殖質と遺伝的変種の利用可能性は農作物改良計画の鍵であるが、農作物由来の生殖質の利用可能な多様性は限られている。本発明は、目的の生殖質の多様な遺伝的変種を生成する方法を包含する。CRISPR-C2c1システムのこの用途では、植物ゲノムの様々な位置を標的とするガイドRNAのライブラリーが提供され、これをC2c1エフェクタータンパク質と共に植物細胞に導入する。このようにして、ゲノム規模の点変異および遺伝子欠損の一群を生成することができる。特定の実施態様では、方法は、そのようにして得た細胞から植物部分または植物を生成し、目的の形質について細胞を選別することを含む。標的遺伝子は、翻訳領域と非翻訳領域の両方を含み得る。特定の実施態様では、形質はストレス抵抗性であり、方法はストレス抵抗性の作物変種を生成するための方法である。
果実の熟成に影響を及ぼすためのC2c1の使用
【１０５６】
熟成は果物および野菜の成熟過程の通常の段階である。熟成開始後、わずか数日で果物または野菜は食べられなくなる。この過程は、農家と消費者の両方に重大な損失をもたらす。特定の実施態様では、本発明の方法は、エチレン産生を減らすのに用いられる。これは、以下のうちの１つ以上を確実にすることによって保証される。a．ACCシンターゼ遺伝子の発現の抑制。ACC（1-アミノシクロプロパン-1-カルボン酸）シンターゼは、S-アデノシルメチオニン（SAM）のACCへの変換（エチレン生合成の最後から2番目の工程）に関与する酵素である。シンターゼ遺伝子のアンチセンス（「鏡像」）または切断型コピーを植物ゲノムに挿入すると、酵素の発現が妨げられる。b．ACCデアミナーゼ遺伝子の挿入。この酵素をコードする遺伝子は一般的な非病原性の土壌細菌であるシュードモナス・クロロラフィス（Pseudomonas chlororaphis）から得られる。これは、ACCを別の化合物に変換することで、エチレン産生に利用できるACCの量を減らす。c．SAMヒドロラーゼ遺伝子の挿入。この手法はACCデアミナーゼと似ており、前駆体代謝物の量が減るとエチレン産生が妨げられるが、この場合、SAMはホモセリンに変換される。この酵素をコードする遺伝子は大腸菌（E. coli）T3バクテリオファージから得られる。d．ACCオキシダーゼ遺伝子発現の抑制。ACCオキシダーゼは、ACCのエチレンへの酸化（エチレン生合成経路の最後の工程）を触媒する酵素である。本明細書に記載の方法を用いると、ACCオキシダーゼ遺伝子の発現減少によってエチレン産生が抑制され、それによって果実の熟成が遅れる。特定の実施態様では、上記の改変に加えて、またはそれらに代えて、本明細書に記載の方法を用いてエチレン受容体を改変して、果実が得るエチレンシグナルを妨害する。特定の実施態様では、エチレン結合タンパク質をコードするETR1遺伝子の発現を改変、より詳細には抑制する。特定の実施態様では、上記の改変に加えて、またはそれらに代えて、本明細書に記載の方法を用いて、植物の細胞壁の完全性を維持する物質であるペクチンの分解に関与する酵素、ポリガラクツロナーゼ（PG）をコードする遺伝子の発現を改変する。ペクチン分解は熟成過程の開始時に起こり、果実の軟化につながる。したがって、特定の実施態様では、本明細書に記載の方法を用いて、産生されるPG酵素の量を減らすことでペクチン分解を遅らせるために、PG遺伝子に変異を導入またはＰＧ遺伝子の活性化を抑制する。
【１０５７】
したがって、特定の実施態様では、方法は、上記のような植物細胞のゲノムの１つ以上の改変を確実にし、そこから植物を再生するためのCRISPR-C2c1システムの使用を包含する。特定の実施態様では、植物はトマト植物である。
植物の貯蔵寿命の延長
【１０５８】
特定の実施態様では、本発明の方法は、植物全体または植物の部分の貯蔵寿命に影響を及ぼす化合物の産生に関与する遺伝子を改変するのに用いられる。より詳細には、改変は、ジャガイモ塊茎に還元糖が蓄積するのを防ぐ遺伝子の改変である。高温処理の際、これらの還元糖は遊離アミノ酸と反応し、褐色で苦味のある生成物を発生し、（発がん物質である可能性がある）アクリルアミド量を増加させる。特定の実施態様では、本明細書で提示する方法は、ショ糖をグルコースとフルクトースに分解するタンパク質をコードする液胞型インベルターゼ遺伝子（VInv）の発現を減少または阻害する（Clasen et al. DOI: 10.1111/pbi.12370）ために使用される。
付加価値のある形質を保証するためのCRISPR-C2c1システムの使用
【１０５９】
特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは、栄養改善された農作物を作るのに用いられる。特定の実施態様では、本明細書で提供する方法は、「機能性食品」（すなわち、それが含む従来の栄養素を超える健康上の利益を提供し得る改良された食品もしくは食品成分）、および／または「栄養補助食品」（すなわち、食品もしくは食品の一部と見なすことができる物質）を作るのに適しており、疾患の予防および治療などの健康上の利益を提供する。特定の実施態様では、栄養補助食品は、がん、糖尿病、循環器疾患、高血圧のうちの１つ以上を予防および／または治療するのに有用である。
【１０６０】
栄養改善された作物の例としては、以下が挙げられる（Newell-McGloughlin, Plant Physiology, July 2008, Vol. 147, pp. 939-953）：
【１０６１】
タンパク質の質、含有量、および／またはアミノ酸組成の改良（たとえば、バヒアグラス（Luciani et al. 2005, Florida Genetics Conference Poster）、キャノーラ（Roesler et al., 1997, Plant Physiol 113 75-81）、トウモロコシ（Cromwell et al, 1967, 1969 J Anim Sci 26 1325-1331, O'Quin et al. 2000 J Anim Sci 78 2144-2149, Yang et al. 2002, Transgenic Res 11 11-20, Young et al. 2004, Plant J 38 910-922）、ジャガイモ（Yu J and Ao, 1997 Acta Bot Sin 39 329-334; Chakraborty et al. 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97 3724-3729; Li et al. 2001, Chin Sci Bull 46 482-484）、イネ（Katsube et al. 1999, Plant Physiol 120 1063-1074）、ダイズ（Dinkins et al. 2001, Rapp 2002, In Vitro Cell Dev Biol Plant 37 742-747）、サツマイモ（Egnin and Prakash 1997, In Vitro Cell Dev Biol 33 52A）について記載されている）；
【１０６２】
必須アミノ酸含有量（たとえば、キャノーラ（Falco et al. 1995, Bio/Technology 13 577-582）、ルピナス（White et al. 2001, J Sci Food Agric 81 147-154）、トウモロコシ（Lai and Messing, 2002, Agbios 2008 GM crop database (March 11, 2008)）、ジャガイモ（Zeh et al. 2001, Plant Physiol 127 792-802）、モロコシ（Zhao et al. 2003, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands, pp 413-416）、ダイズ（Falco et al. 1995 Bio/Technology 13 577-582; Galili et al. 2002 Crit Rev Plant Sci 21 167-204）について記載されている）；
【１０６３】
油および脂肪酸（たとえば、キャノーラ（Dehesh et al. (1996) Plant J 9 167-172 [PubMed] ; Del Vecchio (1996) INFORM International News on Fats, Oils and Related Materials 7 230-243; Roesler et al. (1997) Plant Physiol 113 75-81 [PMC無料文献] [PubMed]; Froman and Ursin (2002, 2003) Abstracts of Papers of the American Chemical Society 223 U35; James et al. (2003) Am J Clin Nutr 77 1140-1145 [PubMed]; Agbios (2008、上記))、綿(Chapman et al. (2001). J Am Oil Chem Soc 78 941-947; Liu et al. (2002) J Am Coll Nutr 21 205S-211S [PubMed]; O'Neill (2007) Australian Life Scientist. www.biotechnews.com.au/index.php/id;866694817;fp;4;fpid;2 (June 17, 2008))、アマニ(Abbadi et al., 2004, Plant Cell 16: 2734-2748)、トウモロコシ(Young et al., 2004, Plant J 38 910-922)、油ヤシ(Jalani et al. 1997, J Am Oil Chem Soc 74 1451-1455; Parveez, 2003, AgBiotechNet 113 1-8)、イネ(Anai et al., 2003, Plant Cell Rep 21 988-992)、ダイズ(Reddy and Thomas, 1996, Nat Biotechnol 14 639-642; Kinney and Kwolton, 1998, Blackie Academic and Professional, London, pp 193-213)、ヒマワリ(Arcadia, Biosciences 2008)について記載されている）；
【１０６４】
炭水化物、たとえば、フルクタン（チコリー(Smeekens (1997) Trends Plant Sci 2 286-287, Sprenger et al. (1997) FEBS Lett 400 355-358, Sevenier et al. (1998) Nat Biotechnol 16 843-846)、トウモロコシ(Caimi et al. (1996) Plant Physiol 110 355-363)、ジャガイモ(Hellwege et al. ,1997 Plant J 12 1057-1065)、テンサイ(Smeekens et al. 1997 (上記))について記載されている）、イヌリン（ジャガイモ(Hellewege et al. 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97 8699-8704)について記載されている）、デンプン（イネ(Schwall et al. (2000) Nat Biotechnol 18 551-554, Chiang et al. (2005) Mol Breed 15 125-143)について記載されている）；
【１０６５】
ビタミンおよびカロテノイド（たとえば、キャノーラ(ShintaniとDellaPenna (1998) Science 282 2098-2100)、トウモロコシ(Rocheford et al. (2002) . J Am Coll Nutr 21 191S-198S, Cahoon et al. (2003) Nat Biotechnol 21 1082-1087, Chen et al. (2003) Proc Natl Acad Sci USA 100 3525-3530)、カラシの種子(Shewmaker et al. (1999) Plant J 20 401-412)、ジャガイモ(Ducreux et al., 2005, J Exp Bot 56 81-89)、イネ(Ye et al. (2000)Science 287 303-305)、イチゴ(Agius et al. (2003), Nat Biotechnol 21 177-181)、トマト(Rosati et al. (2000) Plant J 24 413-419, Fraser et al. (2001) J Sci Food Agric 81 822-827, Mehta et al. (2002) Nat Biotechnol 20 613-618, Diaz de la Garza et al. (2004) Proc Natl Acad Sci USA 101 13720-13725, Enfissi et al. (2005) Plant Biotechnol J 3 17-27, DellaPenna (2007) Proc Natl Acad Sci USA 104 3675-3676)について記載されている）；
【１０６６】
機能性二次代謝物（たとえば、リンゴ(スチルベン、Szankowski et al. (2003) Plant Cell Rep 22: 141-149)、アルファルファ(レスベラトロール、Hipskind and Paiva (2000) Mol Plant Microbe Interact 13 551-562)、キウイフルーツ(レスベラトロール、Kobayashi et al. (2000) Plant Cell Rep 19 904-910)、トウモロコシおよびダイズ(フラボノイド、Yu et al. (2000) Plant Physiol 124 781-794)、ジャガイモ(アントシアニンおよびアルカロイド配糖体、Lukaszewicz et al. (2004) J Agric Food Chem 52 1526-1533)、イネ(フラボノイドおよびレスベラトロール、Stark-Lorenzen et al. (1997) Plant Cell Rep 16 668-673, Shin et al. (2006) Plant Biotechnol J 4 303-315)、トマト(+レスベラトロール、クロロゲン酸、フラボノイド、スチルベン、Rosati et al. (2000) (上記), Muir et al. (2001) Nature 19 470-474, Niggeweg et al. (2004) Nat Biotechnol 22 746-754, Giovinazzo et al. (2005) Plant Biotechnol J 3 57-69)、コムギ(カフェ酸およびフェルラ酸、レスベラトロール、United Press International (2002))について記載されている）；ならびに
【１０６７】
ミネラル利用性（たとえば、アルファルファ(フィターゼ、Austin-Phillips et al. (1999) www.molecularfarming.com/nonmedical.html)、レタス（鉄分、Goto et al. (2000)Theor Appl Genet 100 658-664)、イネ(鉄分、Lucca et al. (2002) J Am Coll Nutr 21 184S-190S)、トウモロコシ、ダイズ、およびコムギ(フィターゼ、Drakakaki et al. (2005) Plant Mol Biol 59 869-880, Denbow et al. (1998) Poult Sci 77 878-881, Brinch-Pedersen et al. (2000) Mol Breed 6 195-206)について記載されている）。
【１０６８】
特定の実施態様では、付加価値のある形質は、植物に含まれる化合物の予想される健康上の利益に関連する。たとえば、特定の実施態様では、付加価値のある作物を、本発明の方法を利用して以下のうちの１種以上の化合物の改変を保証する、またはその合成を誘導／増進することによって得る。
【１０６９】
カロテノイド、たとえばニンジンに含まれるα-カロテン（細胞に損傷を起こす可能性のある遊離基（フリーラジカル）を中和する）、または様々な果物や野菜に含まれるβ-カロテン（遊離基を中和する）。
【１０７０】
緑色野菜に含まれるルテイン（健常な視力の維持に関与する）。
【１０７１】
トマトやトマト製品に含まれるリコピン（前立腺がんのリスクを下げると考えられている）。
【１０７２】
柑橘類やトウモロコシに含まれるゼアキサンチン（健常な視力の維持に関与する）。
【１０７３】
食物繊維、たとえばコムギ糠に含まれる不溶性繊維（乳がんおよび／または大腸がんのリスクを下げる可能性がある）、カラスムギに含まれるβ-グルカン、サイリウムおよび全穀粒に含まれる可溶性繊維（循環器疾患（CVD）のリスクを下げる可能性がある）など。
【１０７４】
脂肪酸、たとえばω3脂肪酸（CVDのリスクを下げ、精神機能および視覚機能を改善する可能性がある）、共役リノール酸（体組成を改善する可能性があり、特定のがんのリスクを下げる可能性がある）、ならびにγ-リノレン酸（GLA）（がんおよびCVDの炎症リスクを下げる可能性があり、体組成を改善する可能性がある）。
【１０７５】
フラボノイド、たとえばコムギに含まれるヒドロキシケイ皮酸エステル（抗酸化のような作用を持ち、変性疾患のリスクを下げる可能性がある）、果物や野菜に含まれるフラボノール、カテキン、およびタンニン（遊離基を中和し、がんのリスクを下げる可能性がある）。
【１０７６】
グルコシノラート、インドール、イソチオシアナート、たとえば、アブラナ科の野菜（ブロッコリー、ケール）やセイヨウワサビに含まれるスルフォラファン（遊離基を中和し、がんのリスクを下げる可能性がある）。
【１０７７】
フェノール類、たとえばブドウに含まれるスチルベン（変性疾患、心疾患、およびがんのリスクを下げる可能性があり、寿命延長作用を持つ可能性がある）、野菜および柑橘類に含まれるカフェ酸およびフェルラ酸（抗酸化のような活性を持ち、変性疾患、心疾患、および眼疾患のリスクを下げる可能性がある）、カカオに含まれるエピカテキン（抗酸化のような活性を持ち、変性疾患および心疾患のリスクを下げる可能性がある）。
【１０７８】
トウモロコシ、ダイズ、コムギ、木の油に含まれる植物性スタノール／ステロール（血中コレステロール値を下げることで冠状動脈性心疾患のリスクを下げる減らす可能性がある）
【１０７９】
キクイモ、エシャロット、玉ねぎ粉末に含まれるフルクタン、イヌリン、フラクトオリゴ糖（胃腸の健康を増進する可能性がある）。
【１０８０】
ダイズに含まれるサポニン（LDLコレステロールを低下させる可能性がある）。
【１０８１】
ダイズに含まれるダイズタンパク質（心疾患のリスクを下げる可能性がある）。
【１０８２】
植物エストロゲン、たとえばダイズに含まれるイソフラボン（ほてりなどの閉経期の症状を軽減する可能性があり、骨粗鬆症およびCVDを低減する可能性がある）、アマ、ライムギ、および野菜に含まれるリグナン（心疾患およびいくつかのがんから防御する可能性があり、LDLコレステロール、総コレステロールを下げる可能性がある）。
【１０８３】
硫化物およびチオール、たとえばタマネギ、ニンニク、オリーブ、リーキ、および春タマネギに含まれる硫化ジアリル、ならびに三硫化アリルメチル、アブラナ科の野菜に含まれるジチオールチオン（LDLコレステロールを下げる可能性があり、健常な免疫系を維持するのに役立つ）。
【１０８４】
タンニン、たとえばクランベリー、ココアに含まれるプロアントシアニジン（泌尿器の健康を改善する可能性があり、CVDおよび高血圧のリスクを下げる可能性がある）。
【１０８５】
また、本発明の方法はさらに、タンパク質／デンプンの機能性、保存可能期間、味／美観、繊維品質、ならびにアレルギー誘発物質、反栄養素、および毒素低減形質を改変することを構想している。
【１０８６】
したがって、本発明は、栄養面で付加価値を持つ植物を生産する方法を包含する。前記方法は、本明細書に記載のCRISPR-C2c1システムを用いて、付加栄養価値の成分の産生に関与する酵素をコードする遺伝子を植物細胞に導入することと、前記植物細胞から植物を再生することを含み、前記植物は、前記付加栄養価値の成分の発現の増加を特徴とする。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムを用いて、これらの化合物の内因的合成を（たとえば、この化合物の代謝を制御する１つ以上の転写因子を改変することによって）間接的に改変する。目的の遺伝子を植物細胞に導入し、かつ／またはCRISPR-C2c1システムを用いて内在性遺伝子を改変する方法は、本明細書で前述したとおりである。
【１０８７】
付加価値形質を付与するために改変された植物における改変のいくつかの特定の例は、たとえば、ステアリル-ACPデサチュラーゼのアンチセンス遺伝子で植物を形質転換して植物のステアリン酸含有量を増加させることで脂肪酸代謝を改変した植物である。Knultzon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:2624 (1992)を参照のこと。別の例としては、たとえば少量のフィチン酸を特徴とするトウモロコシ変異体の原因である可能性のある単一の対立遺伝子と会合したDNAをクローン化した後に再導入することでフィチン酸含有量を減少させることが挙げられる。Raboy et al, Maydica 35:383 (1990)を参照のこと。
【１０８８】
同様に、トウモロコシ(Zea mays) Tfs C1およびR（強力なプロモーターの制御下でトウモロコシのアリューロン層のフラボノイド産生を調節する）の発現によって、シロイヌナズナ（Arabidopsis、Arabidopsis thaliana）のアントシアニン蓄積率が増加した。これは、おそらく経路全体の活性化による(Bruce et al., 2000, Plant Cell 12:65-80)。DellaPenna (Welsch et al., 2007 Annu Rev Plant Biol 57: 711-738)は、Tf RAP2.2とその相互作用パートナーであるSINAT2がシロイヌナズナの葉のカロテノイド生成を増進することを発見した。Tf Dof1の発現によって、遺伝子組換えシロイヌナズナの炭素骨格形成のための酵素をコードする遺伝子の発現上昇、アミノ酸含有量の著しい増加、およびGlc量の減少が誘導され(Yanagisawa, 2004Plant Cell Physiol 45: 386-391)、DOF Tf AtDof1.1 (OBP2)によって、シロイヌナズナのグルコシノラート生合成経路の全過程が増加した(Skirycz et al., 2006 Plant J 47: 10-24)。
植物のアレルギー誘発物質の低減
【１０８９】
特定の実施態様では、本明細書で提供する方法は、アレルギー誘発物質の量を低減した植物を作り、植物を消費者にとってより安全にするために用いられる。特定の実施態様では、この方法は、植物アレルギー誘発物質の産生に関与する１つ以上の遺伝子の発現を改変することを含む。たとえば、特定の実施態様では、方法は、CRISPR-C2c1システムを送達して植物細胞（たとえばドクムギ植物細胞）でのLol p5遺伝子の発現を減少させることと、その細胞から植物を再生して前記植物の花粉のアレルギー誘発性を低減することを含む(Bhalla et al. 1999, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 96: 11676-11680)。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは、１つ以上のねじれ型二本鎖切断(DSB)をLol p5遺伝子に導入する。他の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは、Lol p5遺伝子を改変する機能ドメインと会合した触媒的に不活性なC2c1タンパク質を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは、Lol p5遺伝子に単一の変異を導入する。別の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは、Lol p5遺伝子の転写物に単一のヌクレオチド改変を導入する。
【１０９０】
ピーナッツアレルギーおよびマメ科植物アレルギーは一般に、現実の深刻な健康上の懸念事項である。本発明のC2c1エフェクタータンパク質システムを用いて、このようなマメ科植物のアレルギー誘発タンパク質をコードする遺伝子を特定した後、それを編集または抑制することができる。このような遺伝子およびタンパク質に限定することなく、Nicolaouらはピーナッツ、ダイズ、レンズマメ、エンドウマメ、ルピナス、サヤマメ、およびリョクトウでアレルギー誘発タンパク質を特定している。Nicolaou et al., Current Opinion in Allergy and Clinical Immunology 2011;11(3):222を参照のこと。
目的の内在性遺伝子の選別方法
【１０９１】
本明細書で提供する方法によってさらに、種、門、および植物界全体で、付加栄養価値の成分の産生に関与する酵素をコードする有用な遺伝子、または一般に目的の農学的形質に影響を及ぼす遺伝子を特定することができる。たとえば、本明細書に記載のCRISPR-C2c1システムを使用して植物の代謝経路の酵素をコードする遺伝子を選択的に標的化することにより、植物の特定の栄養面に関与する遺伝子を特定することができる。同様に、望ましい農学的形質に影響を及ぼす可能性のある遺伝子を選択的に標的化することにより、関連する遺伝子を特定することができる。したがって、本発明は、特定の栄養的価値および／または農学的形質を持つ化合物の産生に関与する酵素をコードする遺伝子の選別方法を包含する。
バイオ燃料におけるCRISPR-C2c1システムの使用
【１０９２】
本明細書で使用する「バイオ燃料」という用語は、植物および植物由来の資源から作られた代替燃料である。再生可能なバイオ燃料を、炭素固定の過程によってエネルギーを得た有機物から抽出する、またはバイオマスの使用もしくは変換によって生成することができる。このバイオマスをバイオ燃料に直接使用することもできるし、熱変換、化学変換、および生化学的変換によって好都合なエネルギー含有物質に変換することもできる。このバイオマス変換によって固体、液体、または気体の形態の燃料を得ることができる。バイオ燃料には、バイオエタノールとバイオディーゼルの２種類がある。バイオエタノールは、多くの場合トウモロコシやサトウキビに由来するセルロース（デンプン）の糖発酵過程によって主に生産される。一方、バイオディーゼルはナタネ、ヤシ、ダイズなどの油料作物から主に生産される。バイオ燃料は主に輸送に使用される。
バイオ燃料生産用植物の特性の向上
【１０９３】
特定の実施態様では、本明細書に記載のCRISPR-C2c1システムを用いる方法は、発酵される糖をより効率的に放出するのに重要な加水分解物質を到達しやすくするために、細胞壁の特性を変更するのに用いられる。特定の実施態様では、セルロースおよび／またはリグニンの生合成を改変する。セルロースは細胞壁の主成分である。セルロースとリグニンの生合成は同時調節されている。植物中のリグニンの割合を減らすことにより、セルロースの割合を増やすことができる。特定の実施態様では、本明細書に記載の方法は、植物のリグニン生合成を減少させて、発酵性炭水化物を増加させるために用いられる。より詳細には、本明細書に記載の方法は、4-クマル酸-3-ヒドロキシラーゼ（C3H）、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL）、ケイヒ酸-4-ヒドロキシラーゼ（C4H）、ヒドロキシシンナモイルトランスフェラーゼ（HCT）、カフェ酸-O-メチルトランスフェラーゼ（COMT）、カフェオイル補酵素（Co）A3-O-メチルトランスフェラーゼ（CCoAOMT）、フェルラ酸-5-ヒドロキシラーゼ（F5H）、シンナミルアルコールデヒドロゲナーゼ（CAD）、シンナモイルCoA-レダクターゼ（CCR）、4-クマル酸-CoAリガーゼ（4CL）、モノリグノール-リグニン特異的グリコシルトランスフェラーゼ、およびアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH）（WO 2008064289 A2に開示）からなる群より選択される少なくとも第１のリグニン生合成遺伝子を発現低下させるために使用される。
【１０９４】
特定の実施態様では、本明細書に記載の方法は、より少量の酢酸を発酵時に発生する植物集団を作るのに用いられる（WO 2010096488も参照のこと）。より詳細には、本明細書に開示する方法は、CaslLの相同体に変異を起こして多糖類のアセチル化を低減するのに用いられる。
バイオ燃料生産用の酵母の改変
【１０９５】
特定の実施態様では、本明細書で提供するC2c1酵素は、組換え微生物によるバイオエタノール生産に用いられる。たとえば、C2c1を用いて酵母などの微生物を、発酵性糖からバイオ燃料または生体高分子を生成し、必要に応じて、発酵性糖の供給源として、農業廃棄物から得られる植物由来のリグノセルロースを分解することができるように操作する。より詳細には、本発明は、C2c1 CRISPR複合体を用いてバイオ燃料生産に必要な外来遺伝子を微生物に導入し、かつ／またはバイオ燃料合成を妨げる可能性のある内在性遺伝子を改変する方法を提供する。より詳細には、方法は、ピルビン酸のエタノールまたは別の目的生成物への変換に関与する酵素をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を酵母などの微生物に導入することを含む。特定の実施態様では、この方法により、微生物をセルロースを分解することができるようにする１種以上の酵素（セルラーゼなど）の導入が保証される。さらに別の実施態様では、C2c1 CRISPR複合体はバイオ燃料生産経路と競合する内因性代謝経路を改変するのに用いられる。
【１０９６】
したがって、より詳細な態様では、本明細書に記載の方法は以下の目的で微生物の改変に用いられる。
【１０９７】
植物細胞壁分解酵素をコードする、少なくとも１つの異種核酸の導入または少なくとも１つの内在性核酸の発現の増加によって、前記微生物が前記核酸を発現し、かつ前記植物細胞壁分解酵素を産生・分泌することができるようにするため。
【１０９８】
ピルビン酸をアセトアルデヒドに変換する酵素をコードする、少なくとも１つの異種核酸の導入または少なくとも１つの内在性核酸の発現の増加（必要に応じて、アセトアルデヒドをエタノールに変換する酵素をコードする少なくとも１つの異種核酸と組み合わせて）によって、前記宿主細胞が前記核酸を発現することができるようにするため。
【１０９９】
前記宿主細胞の代謝経路の酵素をコードする少なくとも１つの核酸を改変するため（前記経路は、ピルビン酸からのアセトアルデヒドまたはアセトアルデヒドからのエタノール以外の代謝物を産生し、前記改変によって前記代謝物の産生量は減少する）、あるいは前記酵素の阻害物質をコードする少なくとも１つの核酸を導入するため。
植物油またはバイオ燃料生産用の藻類および植物の改変
【１１００】
遺伝子導入藻類または他の植物（アブラナなど）は、たとえば植物油またはアルコール（特にメタノールおよびエタノール）などのバイオ燃料の生産に特に有用な可能性がある。これらを、油またはバイオ燃料産業で用いるための多量の油またはアルコールを発現または過剰発現するように遺伝子操作してもよい。
【１１０１】
本発明の特定の実施態様によれば、CRISPR-C2c1システムはバイオ燃料生産に有用な脂質豊富な珪藻を作成するのに用いられる。
【１１０２】
特定の実施態様では、植物によって産生されるバイオマス生産に関連する遺伝子を特異的に改変することが想定される。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムを用いて、テオシント分岐（tb）遺伝子またはその相同体を標的化して高バイオマス植物を作る。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは１つ以上のねじれ型二本鎖切断（DSB）をtb遺伝子に導入する。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一の変異をtb遺伝子に導入する。別の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一のヌクレオチド改変をtb遺伝子の転写物に導入する。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは、単一のヌクレオチド変異をtb遺伝子またはその相同体に導入するための、アデノシンまたはシチジンデアミナーゼなどの機能ドメインと（たとえば融合タンパク質または好適なリンカーによって）会合した触媒的に不活性なC2c1タンパク質を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムを用いて、tb1aおよびtb1b遺伝子を標的化し、単一のヌクレオチド変異を導入して高バイオマスのスイッチグラス植物を作る。Liu et. al, Plant Biotechnology Journal (doi:10.1111/pbi.12778)を参照のこと。
【１１０３】
特定の実施態様では、藻類細胞によって産生される脂質の量および／または脂質の質の変更に関与する遺伝子を特異的に改変することが想定される。脂肪酸合成経路に関与する酵素をコードする遺伝子の例は、たとえば、アセチルCoAカルボキシラーゼ活性、脂肪酸シンターゼ活性、3-ケトアシル-アシル担体タンパク質シンターゼIII活性、グリセロール-3-リン酸デヒドロゲナーゼ（G3PDH）活性、エノイル-アシル担体タンパク質レダクターゼ（エノイル-ACPレダクターゼ）活性、グリセロール-3-リン酸アシルトランスフェラーゼ活性、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼ活性またはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、リン脂質：ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ活性、ホスファチジン酸ホスファターゼ活性、脂肪酸チオエステラーゼ（パルミトイルタンパク質チオエステラーゼなど）活性、またはリンゴ酸酵素活性を有するタンパク質をコードすることができる。さらなる実施態様では、脂質蓄積の増加した珪藻を作ることが想定される。これは、脂質の異化を減少させる遺伝子を標的化することによって達成可能である。本発明の方法での使用について特に有益なものは、トリアシルグリセロールと遊離脂肪酸の両方の活性化に関与する遺伝子、ならびに脂肪酸のβ酸化に直接関与する遺伝子（アシル-CoAシンテターゼ、3-ケトアシル-CoAチオラーゼ、アシル-CoAオキシダーゼ、およびホスホグルコムターゼ活性）である。本明細書に記載のCRISPR-C2c1システムおよび方法を用いて、珪藻のそのような遺伝子を特異的に活性化して、それらの脂質含有量を増加させることができる。
【１１０４】
微細藻類などの生物は合成生物学に広く用いられている。Stovicekらの文献(Metab. Eng. Comm., 2015; 2:13)には、産業生産用の強い株を効率的に生産するための、産業用酵母、たとえば出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）のゲノム編集について記載されている。Stovicekは、内在性遺伝子の両方の対立遺伝子を同時に破壊し、かつ異種遺伝子を組み込むように酵母にコドンを最適化したCRISPR-Cas9システムを用いた。ゲノムまたはエピソーム（遺伝子副体）の2 μベースのベクター位置からCas9およびgRNAが発現した。著者らはさらに、Cas9とgRNAの発現量を最適化することで遺伝子破壊効率を改善することができることを示した。Hlavovaら(Biotechnol. Adv. 2015)は、CRISPRなどの技術を使用して核および葉緑体遺伝子を挿入変異および選別の標的とする微細藻類の種または株の開発について考察している。StovicekおよびHlavovaの方法を本発明のC2c1エフェクタータンパク質システムに応用してもよい。CRISPR-C2c1システムについて、実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムはPAM配列5' TTN 3'または5' ATTN 3'（Nは任意のヌクレオチド）を認識してもよい。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは１つ以上のねじれ型二本鎖切断(DSB)を標的遺伝子に導入する。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは鋳型DNA配列をねじれ型DSBにHRまたはNHEJによって導入する。特定の実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムはLol p5遺伝子を改変する機能ドメインと会合した触媒的に不活性なC2c1 タンパク質を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一の変異を導入する。別の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一のヌクレオチド改変を転写物に導入する。
【１１０５】
US 8,945,839には、Cas9を用いて微細藻類（コナミドリムシ（Chlamydomonas reinhardtii）細胞型）を操作する方法が記載されている。同様の手段を用いて、本明細書に記載のCRISPR-C2c1システムの方法をクラミドモナス（Chlamydomonas）種および他の藻類に応用することができる。特定の実施態様では、C2c1およびガイドRNAを、C2c1を発現するベクターを用いて発現した藻類に構成的プロモーター（Hsp70A-Rbc S2またはβ2-チューブリン）の制御下で導入する。ガイドRNAは、T7プロモーターを含むベクターを用いて送達される。あるいは、C2c1 mRNAおよびin vitroで転写されたガイドRNAを藻類細胞に送達することができる。エレクトロポレーションの手順はGeneArtクラミドモナス操作キットの標準の推奨手順に従う。US 8,945,839の方法を本発明のC2c1エフェクタータンパク質システムに応用してもよい。CRISPR-C2c1システムについて、実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムはPAM配列5' TTN 3'または5' ATTN 3'（Nは任意のヌクレオチド）を認識してもよい。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは１つ以上のねじれ型二本鎖切断(DSB)を標的遺伝子に導入する。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは鋳型DNA配列をねじれ型DSBにHRまたはNHEJによって導入する。特定の実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは標的遺伝子を改変する機能ドメインと会合した触媒的に不活性なC2c1タンパク質を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一の変異を導入する。別の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一のヌクレオチド改変を転写物に導入する。
脂肪酸を産生することができる微生物の生成におけるC2c1の使用
【１１０６】
特定の実施態様では、本発明の方法は、脂肪エステル、たとえば脂肪酸メチルエステル（「FAME」）および脂肪酸エチルエステル（「FAEE」）を産生することができる遺伝子操作された微生物を作るのに用いられる。
【１１０７】
典型的には、チオエステラーゼをコードする遺伝子、アシルCoAシンターゼをコードする遺伝子、およびエステルシンターゼをコードする遺伝子の発現または過剰発現によって、培地に含まれる炭素源（アルコールなど）から脂肪エステルを産生するように宿主細胞を操作することができる。したがって、本明細書で提供する方法は、チオエステラーゼ遺伝子、アシルCoAシンターゼをコードする遺伝子、およびエステルシンターゼをコードする遺伝子を過剰発現または導入するように微生物を改変するのに用いられる。特定の実施態様では、チオエステラーゼ遺伝子は、tesA、'tesA、tesB、fatB、fatB2、fatB3、fatAl、またはfatAから選択される。特定の実施態様では、アシルCoAシンターゼをコードする遺伝子は、fadDJadK、BH3103、pfl-4354、EAV15023、fadDl、fadD2、RPC_4074、fadDD35、fadDD22、faa39、または同じ特性を持つ酵素をコードする特定遺伝子から選択される。特定の実施態様では、エステルシンターゼをコードする遺伝子は、ホホバ（Simmondsia chinensis）、アシネトバクター属種（Acinetobacter sp.）ADP、アルカニヴォラックス・ボルクメンシス（Alcanivorax borkumensis）、緑膿菌（Pseudomonas aeruginosa）、フンディバクテル・ジャデンシス（Fundibacter jadensis）、シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）、またはアルカリゲネス・ユートロフス（Alcaligenes eutrophus）、またはそれらの多様体に由来する、シンターゼ/アシル-CoA:ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子である。
それに加えて、またはその代わりに、本明細書で提供する方法は、アシル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子、外膜タンパク質受容体をコードする遺伝子、および脂肪酸生合成の転写制御因子をコードする遺伝子のうちの少なくとも１つの前記微生物での発現量を減少させるのに用いられる。特定の実施態様では、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、たとえば変異の導入によって不活化されている。特定の実施態様では、アシル-CoAデヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はfadEである。特定の実施態様では、脂肪酸生合成の転写制御因子をコードする遺伝子は、DNA転写抑制因子、たとえばfabRをコードする。
【１１０８】
それに加えて、またはその代わりに、前記微生物はピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子のうちの少なくとも一方、または両方の発現量を減少させるように改変される。特定の実施態様では、ピルビン酸ギ酸リアーゼをコードする遺伝子はpflBである。特定の実施態様では、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする遺伝子はldhAである。特定の実施態様では、これらの遺伝子のうちの１つ以上は、たとえば変異の導入によって不活化されている。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは5'末端が突出した１つ以上のねじれ型二本鎖切断（DSB）を標的遺伝子に導入する。実施態様によっては、5'末端の突出は7ヌクレオチドである。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは鋳型DNA配列をねじれ型DSBにHRまたはNHEJによって導入する。特定の実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは標的遺伝子を改変する機能ドメインと会合した触媒的に不活性なC2c1タンパク質を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一の変異を導入する。別の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一のヌクレオチド改変を転写物に導入する。
【１１０９】
特定の実施態様では、微生物は、エスケリキア属（Escherichia）、バチルス属（Bacillus）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ロドコッカス属（Rhodococcus）、シネココッカス属（Synechococcus）、シネコシスティス属（Synechocystis）、シュードモナス属（Pseudomonas）、アスペルギルス属（Aspergillus）、トリコデルマ属（Trichoderma）、ニューロスポラ属（Neurospora）、フサリウム属（Fusarium）、フミコラ属（Humicola）、リゾムコール属（Rhizomucor）、クリベロミセス属（Kluyveromyces）、ピキア属（Pichia）、ケカビ属（Mucor）、ミセリオフトラ属（Myceliophthora）、アオカビ属（Penicillium）、ファネロカエテ属（Phanerochaete）、ヒラタケ属（Pleurotus）、ホウロクタケ属（Trametes）、クリソスポリウム属（Chrysosporium）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、ステノトロホモナス属（Stenotrophomonas）、シゾサッカロミセス属（Schizosaccharomyces）、ヤロウイア属（Yarrowia）、またはストレプトミセス属（Streptomyces）から選択される。
【１１１０】
有機酸を産生することができる微生物の作成におけるC2c1の使用
【１１１１】
本明細書で提供する方法はさらに、有機酸を（より詳細には五炭糖または六炭糖から）産生することができる微生物を設計するために用いられる。特定の実施態様では、方法は、微生物に外来性LDH遺伝子を導入することを含む。特定の実施態様では、それに加えて、またはその代わりに、前記微生物における有機酸産生を、目的の有機酸以外の代謝物を産生する内因性代謝経路、および／またはその有機酸を消費する内因性代謝経路に関与するタンパク質をコードする内在性遺伝子を不活化することによって増加させる。特定の実施態様では、この改変によって目的の有機酸以外の代謝物の産生が確実に減少する。特定の実施態様によれば、この方法を用いて、目的の有機酸が消費される内因性経路または目的の有機酸以外の代謝物を産生する内因性経路に関与する生成物をコードする遺伝子の少なくとも１つの操作された遺伝子欠失および／または不活化を導入する。特定の実施態様では、少なくとも１つの操作された遺伝子欠失または不活化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（pdc）、フマル酸レダクターゼ、アルコールデヒドロゲナーゼ（adh）、アセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ、ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ（ppc）、D-乳酸デヒドロゲナーゼ（d-ldh）、L-乳酸デヒドロゲナーゼ（l-ldh）、乳酸-2-モノオキシゲナーゼからなる群より選択される酵素をコードする１つ以上の遺伝子にある。さらなる実施態様では、少なくとも１つの操作された遺伝子欠失および／または不活化は、ピルビン酸デカルボキシラーゼ（pdc）をコードする内在性遺伝子にある。
【１１１２】
さらなる実施態様では、微生物は乳酸を産生するように操作され、少なくとも１つの操作された遺伝子欠失および／または不活性化は、乳酸デヒドロゲナーゼをコードする内在性遺伝子にある。それに加えて、またはその代わりに、微生物は、チトクロムB2依存性L-乳酸デヒドロゲナーゼなどのチトクロム依存性乳酸デヒドロゲナーゼをコードする内在性遺伝子の少なくとも１つの操作された遺伝子欠失または不活性化を含む。
改良型キシロースまたはセロビオース利用酵母菌株の作成におけるC2c1の使用
【１１１３】
特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムを、改良型キシロースまたはセロビオース利用酵母菌株を選択するために応用してもよい。エラーが発生しやすいPCRを使用して、キシロース利用またはセロビオース利用経路に関与する１つ（以上）の遺伝子を増幅することができる。キシロース利用経路およびセロビオース利用経路に関与する遺伝子の例としては、Ha, S.J., et al. (2011) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 108(2):504-9およびGalazka, J.M., et al. (2010) Science 330(6000):84-6に記載されているものを挙げることができるが、これらに限定されない。選択されたこのような遺伝子に無作為な変異をそれぞれ含む二本鎖DNA分子から得られるライブラリーを、CRISPR-C2c1システムの成分と共に酵母株（たとえばS288C）に同時形質転換することができ、キシロースまたはセルビオース利用能の向上した株を選択することができる（WO2015138855に記載のとおり）。
イソプレノイド生合成に使用するための改良酵母株の生成におけるC2c1の使用
【１１１４】
Tadas Jakociunasらは、多重CRISPR/Cas9システムを応用して、パン酵母である出芽酵母（Saccharomyces cerevisiae）中の一形質転換工程で最大５つの異なるゲノム遺伝子座のゲノム操作に成功し(Metabolic EngineeringVolume 28, March 2015, Pages 213-222)、産業上重要なイソプレノイド生合成経路の主要な中間体であるメバロン酸の産生量の多い株を得たことを記載している。特定の実施態様では、イソプレノイド合成に使用するためのさらなる高生産酵母株を特定するために、CRISPR-C2c1システムを本明細書に記載の多重ゲノム操作方法に応用してもよい。C2c1タンパク質について、実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムはPAM配列5' TTN 3'または5' ATTN 3'（Nは任意のヌクレオチド）を認識してもよい。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは7ヌクレオチドの5'末端に突出を有する１つ以上のねじれ型二本鎖切断（DSB）を標的遺伝子に導入する。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは鋳型DNA配列をねじれ型DSBにHRまたはNHEJによって導入する。特定の実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは標的遺伝子を改変する機能ドメインと会合した触媒的に不活性なC2c1タンパク質を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一の変異を導入する。別の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一のヌクレオチド改変を転写物に導入する。 
乳酸産生酵母株の作成におけるC2c1の使用
【１１１５】
別の実施態様では、成功した多重CRISPR-C2c1システムの応用が包含される。Vratislav Stovicekら(Metabolic Engineering Communications, Volume 2, December 2015, Pages 13-22)と同様に、改良型乳酸産生株を１つの形質転換事象で設計し入手することができる。特定の実施態様では、異種性の乳酸デヒドロゲナーゼ遺伝子の挿入と２つの内在性遺伝子PDC1およびPDC5遺伝子の破壊を同時に行うためにCRISPR-C2c1を用いる。C2c1タンパク質について、実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムはPAM配列5' TTN 3'または5' ATTN 3'（Nは任意のヌクレオチド）を認識してもよい。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは5'末端が突出した１つ以上のねじれ型二本鎖切断（DSB）を標的遺伝子に導入する。特定の実施態様では、5'末端の突出は7ヌクレオチドである。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは鋳型DNA配列をねじれ型DSBにHRまたはNHEJによって導入する。特定の実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは標的遺伝子を改変する機能ドメインと会合した触媒的に不活性なC2c1タンパク質を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一の変異をPDC1またはPDC5遺伝子に導入する。別の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一のヌクレオチド改変をPDC1またはPDC5遺伝子の転写物に導入する。
植物におけるCRISPR-C2c1システムのさらなる応用
【１１１６】
特定の実施態様では、本明細書に記載のCRISPRシステムおよび好ましくはCRISPR-C2c1システムを、遺伝要素の可視化のために用いることができる。たとえば、CRISPRイメージングは、反復ゲノム配列も非反復ゲノム配列も可視化し、テロメア長の変化やテロメア運動を報告し、細胞周期を通じて遺伝子座の動態を監視することができる(Chen et al., Cell, 2013)。これらの方法を植物にも応用してもよい。
【１１１７】
本明細書に記載のCRISPRシステムおよび好ましくはCRISPR-C2c1システムのその他の応用は、in vitroおよびin vivoでの標的遺伝子破壊の正選択選別である(Malina et al., Genes and Development, 2013)。これらの方法を植物にも応用してもよい。
【１１１８】
特定の実施態様では、不活性なC2c1エンドヌクレアーゼとヒストン改変酵素の融合によって、複雑なエピゲノムに所望の変化を起こすことができる(Rusk et al., Nature Method, 2014)。これらの方法を植物にも応用してもよい。
【１１１９】
特定の実施態様では、本明細書に記載のCRISPRシステムおよび好ましくはCRISPR-C2c1システムを用いて染色質の特定の部分を精製し、関連タンパク質を特定することで、転写におけるそれらの調節的役割を解明することができる(Waldrip et al., Epigenetics, 2014)。これらの方法を植物にも応用してもよい。
【１１２０】
特定の実施態様では、本発明はウイルスDNAとRNAの両方を切断することができるため、植物系のウイルス除去のための治療法として本発明を用いることができる。ヒトの系での過去の研究により、CRISPRを利用して一本鎖RNAウイルスであるC型肝炎ウイルスの標的化(A. Price, et al., Proc. Natl. Acad. Sci, 2015)および二本鎖DNAウイルスであるB型肝炎ウイルスの標的化(V. Ramanan, et al., Sci. Rep, 2015)に成功したことがわかっている。これらの方法を、植物でのCRISPR-C2c1システムの使用に適応させてもよい。
【１１２１】
特定の実施態様では、本発明を用いてゲノムの複雑さを変えることができる。さらなる特定の実施態様では、本明細書に記載のCRISPRシステムおよび好ましくはCRISPR-C2c1システムを用いて、染色体を分裂させて染色体数を変え、一方の親からの染色体のみを含む一倍体植物を作成することができる。このような植物を、染色体重複を起こすように誘導してホモ接合性対立遺伝子のみを含む二倍体植物に変換することができる(Karimi-Ashtiyani et al., PNAS, 2015; Anton et al., Nucleus, 2014)。これらの方法を植物にも応用してもよい。
【１１２２】
特定の実施態様では、本明細書に記載のCRISPR-C2c1システムを自己切断に使用することができる。これらの実施態様では、C2c1酵素およびgRNAのプロモーターは、構成的プロモーターであってもよく、第２のgRNAを同じ形質転換カセットに導入するが、誘導性プロモーターによって制御する。この第２のgRNAを、機能しないC2c1を作成するためにC2c1遺伝子の部位特異的切断を誘導するように指定することができる。さらなる特定の実施態様では、第２のgRNAは形質転換カセットの両端で切断を誘導し、その結果、宿主ゲノムからカセットが除去される。このシステムによって、細胞がCas酵素に暴露される時間が制御され、さらには非特異的な編集が最小限に抑えられる。さらに、CRISPR/Casカセットの両端の切断を利用して、導入遺伝子を含まない二対立遺伝子の変異を持つT0植物を作成することができる(Cas9についてたとえばMoore et al., Nucleic Acids Research, 2014; Schaeffer et al., Plant Science, 2015に記載のとおり)。Mooreらの方法を本明細書に記載のCRISPR-C2c1システムに応用してもよい。
【１１２３】
Suganoら(Plant Cell Physiol. 2014 Mar;55(3):475-81. doi: 10.1093/pcp/pcu014. Epub 2014 Jan 18)は、苔類であるゼニゴケ（Marchantia polymorpha L.）の標的変異誘発へのCRISPR-Cas9の応用について報告している（ゼニゴケは陸生植物の進化を研究するためのモデル種として浮上している）。ゼニゴケのU6プロモーターを特定し、クローン化してgRNAを発現させた。gRNAの標的配列を、ゼニゴケのオーキシン受容因子（ARF1）をコードする遺伝子を破壊するように設計した。アグロバクテリウムを介した形質転換を利用して、Suganoらはゼニゴケの配偶体生成において安定した変異体を単離した。Cas9を発現するためにカリフラワーモザイクウイルス35SまたはゼニゴケEF1αプロモーターのいずれかを用いて、CRISPR-Cas9に基づくin vivoでの部位特異的変異誘発を達成した。オーキシン抵抗性の表現型を示す単離された変異個体はキメラ型ではなかった。さらに、T1植物の無性生殖によって安定した変異体を作成した。CRIPSR-Cas9に基づく標的変異誘発を用いて、複数のarf1対立遺伝子を容易に確立した。Suganoらの方法を本発明のC2c1エフェクタータンパク質システムに応用してもよい。
【１１２４】
Kabadiら(Nucleic Acids Res. 2014 Oct 29;42(19):e147. doi: 10.1093/nar/gku749. Epub 2014 Aug 13)は、便利なGolden Gateクローン化法でベクターに組み込まれた独立のRNAポリメラーゼIIIプロモーターからCas9多様体とレポーター遺伝子と最大4つのsgRNAとを独立のRNAポリメラーゼIIIプロモーターを発現する単一のレンチウイルスシステムを開発した。各sgRNAは効率的に発現され、不死化初代ヒト細胞で多重の遺伝子編集と持続的な転写活性化を媒介することができる。Kabadiらの方法を本発明のC2c1エフェクタータンパク質システムに応用してもよい。
【１１２５】
Lingら(BMC Plant Biology 2014, 14:327)は、pGreenまたはpCAMBIA骨格およびｇRNAに基づくCRISPR-Cas9二成分ベクターセットを開発した。このツールキットはBsaI以外の制限酵素を必要とせず、トウモロコシコドンに最適化したCas9と１つ以上のgRNAとを有する最終構築物をわずか１つのクローン化工程で効率よく作成する。トウモロコシ原形質体、遺伝子組換えトウモロコシ系統、および遺伝子組換えシロイヌナズナ系統を用いてツールキットを検証し、高い効率と特異性を示すことがわかった。さらに重要なことに、このツールキットを用いて3つのシロイヌナズナ遺伝子の標的変異がT1世代の遺伝子組換え実生で検出された。また、複数遺伝子の変異は次世代に受け継がれる可能性がある。植物の多重ゲノム編集用ツールキットとしての（ガイドRNA）モジュールベクターセット。Linらのツールボックスを本発明のC2c1エフェクタータンパク質システムに応用してもよい。
【１１２６】
CRISPR-C2c1を介した標的植物ゲノム編集の手順は、Methods in Molecular Biologyシリーズの第1284巻（pp 239-255 10 February 2015）でCRISPR-Cas9システムについて開示されているものに基づいて利用できる。シロイヌナズナ（Arabidopsis thaliana）およびベンサミアナタバコ（Nicotiana benthamiana）の原形質体のモデル細胞システムを用いた、植物コドン最適化Cas9（pcoCas9）によるゲノム編集のための二重gRNAを設計、構築、および評価する詳細な手順が記載されている。CRISPR-Cas9システムを応用して全植物の標的ゲノム改変を起こすための方策についても説明されている。その章に記載されている手順を本発明のC2c1エフェクタータンパク質システムに応用してもよい。
【１１２７】
上記の方法および手順におけるC2c1タンパク質について、CRISPR-C2c1システムはPAM配列5' TTN 3'または5' ATTN 3'（Nは任意のヌクレオチド）を認識してもよい。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは5'末端が突出した１つ以上のねじれ型二本鎖切断（DSB）を標的遺伝子に導入する。特定の実施態様では、5'末端の突出は7ヌクレオチドである。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは鋳型DNA配列をねじれ型DSBにHRまたはNHEJによって導入する。特定の実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは標的遺伝子を改変する機能ドメインと会合した触媒的に不活性なC2c1タンパク質を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一の変異を導入する。別の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一のヌクレオチド改変を転写物に導入する。
【１１２８】
Maら(Mol Plant. 2015 Aug 3;8(8):1274-84. doi: 10.1016/j.molp.2015.04.007)は、植物コドン最適化Cas9遺伝子を利用した、単子葉植物および双子葉植物の好都合かつ高効率な多重ゲノム編集のための強いCRISPR-Cas9ベクターシステムについて報告している。Maらは、多重sgRNA発現カセットを迅速に作成するためのPCRに基づく手順を設計した。Golden Gate連結またはGibson Assemblyによって１回のクローン化でこの発現カセットを二成分CRISPR-Cas9ベクターに組み込むことができる。このシステムを用いて、Maらはイネで46個の標的部位を編集した（変異率85.4%、主に二対立遺伝子・ホモ接合状態）。Maらは、複数（最大8）の遺伝子ファミリーメンバー、生合成経路の複数の遺伝子、または単一の遺伝子の複数部位を同時標的化することにより、T0イネ植物およびT1シロイヌナズナ植物の機能欠失型遺伝子変異の例を挙げている。Maらの方法を本発明のC2c1エフェクタータンパク質システムに応用してもよい。C2c1タンパク質について、CRISPR-C2c1システムはPAM配列5' TTN 3'または5' ATTN 3'（Nは任意のヌクレオチド）を認識してもよい。 実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは5'末端が突出した１つ以上のねじれ型二本鎖切断（DSB）を標的遺伝子に導入する。特定の実施態様では、5'末端の突出は7ヌクレオチドである。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは鋳型DNA配列をねじれ型DSBにHRまたはNHEJによって導入する。特定の実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは標的遺伝子を改変する機能ドメインと会合した触媒的に不活性なC2c1タンパク質を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一の変異を導入する。別の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一のヌクレオチド改変を転写物に導入する。
【１１２９】
Lowderら(Plant Physiol. 2015 Aug 21. pii: pp.00636.2015)も、植物中に発現された、発現抑制された、または非翻訳領域の遺伝子の多重ゲノム編集および転写調節を行うことができるCRISPR-Cas9ツールボックスを開発した。このツールボックスにより、研究者らはGolden Gateクローン化法やGatewayクローン化法で迅速かつ効率よく単子葉植物および双子葉植物に機能性CRISPR-Cas9 T-DNA構築物を組み込むための手順および試薬を得られる。ツールボックスには植物の内在性遺伝子の多重遺伝子編集および転写活性化もしくは抑制など、機能の完全な一式が備わっている。T-DNAに基づく形質転換技術は、現代の植物の生物工学、遺伝学、分子生物学、および生理学の基本である。したがって、C2c1（WT、ニッカーゼ、またはdC2c1）とgRNAを目的のT-DNA最終ベクターに組み込んでもよい。組込み方法は、Golden Gate組込み法とMultiSite Gateway組換え法の両方に基づく。組込みには３つのモジュールが必要である。第1のモジュールはC2c1エントリーベクターであり、これにはプロモーターのないC2c1、またはattL1およびattR5部位に隣接するその派生遺伝子が含まれる。第２のモジュールはgRNAエントリーベクターであり、これにはattL5およびattL2部位に隣接するエントリーgRNA発現カセットが含まれる。第３のモジュールには、C2c1発現に最適なプロモーターを提供する、attR1〜attR2を含む最終T-DNAベクターが含まれる。Lowderらのツールボックスを本発明のC2c1エフェクタータンパク質システムに応用してもよい。C2c1タンパク質について、CRISPR-C2c1システムはPAM配列5' TTN 3'または5' ATTN 3'（Nは任意のヌクレオチド）を認識してもよい。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは5'末端が突出した１つ以上のねじれ型二本鎖切断(DSB)を標的遺伝子に導入する。特定の実施態様では、5'末端の突出は7ヌクレオチドである。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは鋳型DNA配列をねじれ型DSBにHRまたはNHEJによって導入する。特定の実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは標的遺伝子を改変する機能ドメインと会合した触媒的に不活性なC2c1タンパク質を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一の変異を導入する。別の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一のヌクレオチド改変を転写物に導入する。
【１１３０】
Wangら(bioRxiv 051342; doi: doi.org/10.1101/051342; Epub. May 12, 2016)は、単一のプロモーターの制御下にあるいくつかのgRNA-tRNAユニットを備えた多重遺伝子編集構築物を使用して、6倍体コムギの重要な農学的形質に影響を及ぼす4つの遺伝子の同祖コピーの編集を示している。
【１１３１】
有利な実施態様では、植物は樹木であってもよい。本発明は、本明細書に記載のCRISPR Casシステムを草木系にも利用してもよい(たとえばBelhaj et al., Plant Methods 9: 39およびHarrison et al., Genes & Development 28: 1859-1872を参照のこと)。特に有利な実施態様では、本発明のCRISPR Casシステムは樹木の一塩基多型（SNP）を標的としてもよい(たとえばZhou et al., New Phytologist, Volume 208, Issue 2, pages 298-301, October 2015を参照のこと)。Zhouらの研究では、著者らは事例研究として、CRISPR Casシステムを、4-クマル酸:CoAリガーゼ(4CL)遺伝子ファミリーを用いてポプラ属（Populus）の木に応用し、標的とした２つの4CL遺伝子について、100%の変異誘発効率を達成した。調査したすべての形質転換体は二対立遺伝子の改変を含んでいた。Zhouらの研究では、CRISPR-Cas9システムは一塩基多型（SNP）に非常に敏感であった。というのも、第３の4CL遺伝子の切断は標的配列のSNPが原因で無効になったからである。これらの方法を本発明のC2c1エフェクタータンパク質システムに応用してもよい。C2c1タンパク質について、CRISPR-C2c1システムはPAM配列5' TTN 3'または5' ATTN 3'（Nは任意のヌクレオチド）を認識してもよい。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは5'末端が突出した１つ以上のねじれ型二本鎖切断（DSB）を標的遺伝子に導入する。特定の実施態様では、5'末端の突出は7ヌクレオチドである。実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは鋳型DNA配列をねじれ型DSBにHRまたはNHEJによって導入する。特定の実施態様によっては、CRISPR-C2c1システムは標的遺伝子を改変する機能ドメインと会合した触媒的に不活性なC2c1タンパク質を含む。特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一の変異を導入する。別の特定の実施態様では、CRISPR-C2c1システムは単一のヌクレオチド改変を転写物に導入する。
【１１３２】
Zhouらの方法(New Phytologist, Volume 208, Issue 2, pages 298-301, October 2015)を以下のように本発明に応用してもよい。リグニンおよびフラボノイドの生合成にそれぞれ関連する２つの4CL遺伝子、4CL1および4CL2がCRISPR-Cas9編集の標的である。形質転換に通常用いられるヨーロッパヤマナラシ×ギンドロ（Populus tremula × alba）のクローン717-1B4は、ゲノム配列決定したポプラ（Populus trichocarpa）とは異なる。そこで、基準ゲノムから設計した4CL1および4CL2のgRNAを社内の717 RNA-Seqデータを用いて調べ、Casの効率を制限する可能性のあるSNPがないことを確認する。4CL1のゲノム複製である4CL5のために設計された３番目のgRNAも含む。対応する717配列は、PAMの付近／内部の各対立遺伝子に１つのSNPを含み、いずれも4CL5-gRNAによる標的化を無効にすると予想される。３つのgRNA標的部位はすべて、第１エクソン内にある。717形質転換の場合、gRNAはMedicago U6.6プロモーターから、CaMV 35Sプロモーターの制御下にあるヒトコドン最適賥䎖獡臣놅臣貺裦蚈菣꾂苣벃蛥ꞁ駧뺏臣貂苣芀慃꺁臣꺁菣꾂苣벃臣袂苣ꊽ돨ꊻ迦꾁꿥ꆱ臣鞁臣龩菨馁苣鎁臣貁臣趁苣芀蓧鲽苧ꮁ臩麊臣龁䌴ㅌ臣袂臣㒳䱃ꪠ苣鞢맥ꎔ觧꺁藩鞈뇦骮臣뺯뇨ꢁ臣讂胣ꆬ臣ꞁ菣벃苣銂蟥蚐臣膀臣릁臣꺁ꃥ袐臣ꒁ臣ꚁ뫤뺯ꯧ몁볤邭臣覤闧銂ꋧ趪臣讂胣鎁苣覂臣릖돦銂鳦몙飦꺁㉃ㅣ苣閃苣꾂苣벃苣뎃菣꾂돨랂苣蚃菣ꮁ뿥ꢔ臣ꚁ苣袂臣芀㉃ㅣ苣뎃菣꾂돨ꮁ臣蒁臣膀剃卉剐䌭挲랂苣蚃菣꾁䅐超裥㖗‧呔⁎✳臣龁臣㖯‧呁乔㌠袼꾁믤辄臣貃苣것苣膃菣覼苣趪귨鞁臣节苣蒁胣龮雦讅꟦ꮁ苣ꎁ臣꾁胣䎁䥒偓ⵒ㉃ㅣ苣릂菣ꂃ臣㖯ꮜꯧ貁ꫧ몇臣龁볯ꒁ믤誸臣궁臣貂黥貺鳦階裥궖볯䒈䉓볯銂꣦蒚臩鶼귥ꮁ냥ꖅ臣讂胣릉껥꺁껥붖藦颧臣꾁胣㖁ꮜꯧ꺁ꫧ몇臣㞯菣꾂菣ꪂ菣覃臣芁苣芀껥붖藦颧臣袂臣ꚁ臣膀剃卉剐䌭挲랂苣蚃菣꾁诩讞乄超裥銂臣颁苣讞卄ꮁ剈臣龁臣亯䕈ꮁ苣ꎁ臣躰藥馁苣芀觧骮臣龮雦讅꟦ꮁ苣ꎁ臣꾁胣䎁䥒偓ⵒ㉃ㅣ苣릂菣ꂃ臣馨髧몁볤邭苣릔ꓥ馁苣龩菨覃菣ꒂ菣ꢁ볤袐臣龁꟨銪髧ꮁ룤뮴胦ꪁ㉃ㅣ苣뎃菣꾂돨銂郥肂胣릉껥꺁껥붖藦颧臣꾁胣䎁䥒偓ⵒ㉃ㅣ苣릂菣ꂃ臣颍룤꺁ꓥ낕苣躰藥馁苣芀裥꺁觧骮臣龮雦讅꟦ꞁ臣膀剃卉剐䌭挲랂苣蚃菣꾁跥肸臣貃苣것苣膃菣릔ꓥ銂믨馆觧ꮁ냥ꖅ臣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鎼胣㲑䐯噉ਾ†ꓦꦉ臣꾁胣薗軥鎽臣뾮룤릉闧蒚臣芁苣鎁臣貁ꓥ蒁胣龁臣袁臣膀菣麃菣躐蟥薗迨袼畆慳楲浵漠祸灳牯浵映‮灳‮祬潣数獲捩覼臣袃菣袃苣躐苣閁臣讂臣膀菣麃菣꺁臣銂铦莒臣膀苣벃菣벃苣ꞃ菣躐蟥薗迨袼⹆漠祸灳牯浵映‮灳‮楤湡桴覼胣뎂菣꺂믩閁臣薗迨袼畐捣湩慩朠慲業楮⁳⹦猠⹰琠楲楴楣볯꾁苣ꂃ苣꺁臣銂铦莒臣讂胣趤觧꾁胣뮁臣鎂臣꺁韧龎뷤ꮁ諦鞊臣讂臣膂臣颭鳥鞁ꫨ躰臣貂苣늘뻥鮊苣��臣芀ꓦꦉ臣隸믤ꮁ苣龁苣覤闧誁苣뎁뗧鮏臣论뇨ꮁ苣誂胣龄迥Ꞁ苣閼臣략臣馁臩鶼髧覤该貁뗨鎁苣芀臣蒁臣꺁苣膀觧ꮁ韧龎뷤貁ꓦꦉ苣誂苣뮠맧ꮁ맧隮臣讂臣覂臣芁苣芀ꓦꦉ臣꾁胣麝껥뮸諦鞊胦貁귥ꢜ臣讂迥붃胦貁臣讂볯龁臣袁臣膀껥뮸臣薗軥鎽臣ꦁ郥鞁臣蒁볯芀냦뎹諦鞊胦膀臣ꢁ臣낁韧龎뷤꺁臣릁臣꺁꣧ꮁ꿥馁苣ꢃ裥蒚臣떊諦Ꞁ볯뢅黥蒚臣꾁ꓥ辁臣몁볤邭臣袂臣ꚁ裥ꆾ臣貂苣覼臣袂臣芞鯧떊諦Ꞁ胣龁臣袁臣薗軥鎽臣肸菩꺁꣧ꮁ꿥馁苣貮藥ꪁ諦鞊胦袼믤꺁鏥꺨臣뺯臣ꚁ臣ꪁ臣芀藥讞髧ꮁ臣辂臣讁臣몁볤邭臣袂臣ꚁ裥ꆾ臣貂苣覼苣颭鳥馁苣꾏菨Ꞁ臣芁苣芀臩鶼귥뺯臩鶼귥꺁菣馃菣ꞁ臣膀ꓦꦉ臣薗軥鎽臣놅臣늀賥鞁胣肸雦꺁臩鶼귥覤賥꾁胣隻雦꺁ꓥ隌臣螝ꇨ馁苣芀臣龁臣ꎁ臣膀蟨뚄臣覤该銂裥ꢔ臣ꚁ胣늂꣧薀臣躏蟩膀鏥ꪳ胣螝룤Ꞁ胣邀매鮊胣떊諦Ꞁ臣龁苣ꮁ鳦节鳦ꢔ臣몁볤邭苣蒵臣袐苣鮁苣芀諦鞊胦몁볤邭臣놔鷦邺臣鞁臣꾁胣ꦤ蓧뺁臣꾁ꓥꖝ臣覤꣧膀鳥ꖝ臣覤꣧膀蟩龔ꓦꦉ뿨膸꣧膀臣袂臣颪냥閁苣龁ꓥ낕볯龁臣袁臣覤闧颪駧ꦉ돨ꮁ苣讂ꓦꦉ鷦首臣ꚇ郧覼臣馌臣覂苣讂胣겜駧躘苣ꢔ臣ꚁ胣趤觧늂꣧薀臣꾁ꓥ낕苣颪냥馁苣龁苣꺁雦龁臣讉껦貁迦鮾臣貂苣芀臣龁臣ꎁ臣膀뷥궥胨꾁諦鞊胦몁볤邭臣놔鷦邺臣늂菣ꂃ苣ꎧ黦馁苣鎁臣貁臣趁胣肉鳦꺁觧Ꞁ臣龁臣ꊽ돨銂賦ꒁꓥ꺨臣꾁胣겜駧躘苣ꢔ臣ꚁ믤趉臣覤闧颪駧ꦉ돨袂苣节귦몢臣떊諦Ꞁ臩鶼귥꺁ꋥꂊ苣颪냥鞁胣늁臣ꚁ臣趤觧꺁苨꺨꣨뮔苣ꂊ胩讁臣릔雥馁苣鎁臣貁臣趁苣芀㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 ꖻ룤꺁ꇨꮁ臣覂臣讂迥ꞅ雦꺌胣ꪁ苣뎁臣龔觧龔铧銂铦蒖臣讂臣膂臣䎫䥒偓ⵒ慃螤郥鎽胣릔ꓥꢂ菣Ꞃ苣뾂菣뾂菣醃苣ꪳ胣랂苣蚃菣膀臣袂臣肜臩隌雦閳苣ꢔ臣ꚁ苣袂臣ꊖ胩蚈蟩銂ꓧ馁胣龮雦讅꟦ꮁ苣ꎁ臣꾁胣䎁䥒偓ⵒ慃螤郥鎽臣膀牴捡⁲乒ꢁꓨ袐賥鞁臣䎟挲뾂菣醃苣ꪳ臣龁臣鶁臣ꚧꫥ覃菣ꒂ菣ꢁ胣뒛軦趏뻥超裥ꮁ뗧袐臣龁苣ꒂ菣超裥銂郥肂苣ꒂ菣劉䅎臣銂郥뾁胣겂苣覃藩鞈臣馨髧超裥ꢁ菣ꒂ菣ꪃ菣ꒂ苣馁苣芀㉃ㅣ苣뎃菣꾂돨ꮁ臣蒁臣膀剃卉剐䌭挲랂苣蚃菣꾁䅐超裥㖗‧呔⁎✳臣龁臣㖯‧呁乔㌠袼꾁믤辄臣貃苣것苣膃菣覼苣趪귨鞁臣节苣蒁胣龮雦讅꟦ꮁ苣ꎁ臣꾁胣䎁䥒偓ⵒ㉃ㅣ苣릂菣ꂃ臣㖯ꮜꯧ貁ꫧ몇臣龁볯ꒁ믤誸臣궁臣貂黥貺鳦階裥궖볯䒈䉓볯銂꣦蒚臩鶼귥ꮁ냥ꖅ臣讂胣릉껥꺁껥붖藦颧臣꾁胣㖁ꮜꯧ꺁ꫧ몇臣㞯菣꾂菣ꪂ菣覃臣芁苣��껥붖藦颧臣袂臣ꚁ臣膀剃卉剐䌭挲랂苣蚃菣꾁诩讞乄超裥銂臣颁苣讞卄ꮁ剈臣龁臣亯䕈ꮁ苣ꎁ臣躰藥馁苣芀觧骮臣龮雦讅꟦ꮁ苣ꎁ臣꾁胣䎁䥒偓ⵒ㉃ㅣ苣릂菣ꂃ臣馨髧몁볤邭苣릔ꓥ馁苣龩菨覃菣ꒂ菣ꢁ볤袐臣龁꟨銪髧ꮁ룤뮴胦ꪁ㉃ㅣ苣뎃菣꾂돨銂郥肂胣릉껥꺁껥붖藦颧臣꾁胣䎁䥒偓ⵒ㉃ㅣ苣릂菣ꂃ臣颍룤꺁ꓥ낕苣躰藥馁苣芀裥꺁觧骮臣龮雦讅꟦ꞁ臣膀剃卉剐䌭挲랂苣蚃菣꾁跥肸臣貃苣것苣膃菣릔ꓥ銂믨馆觧ꮁ냥ꖅ臣讂胣㲂牢ਾ䐼噉邀ꇨ馼胣㲑䐯噉ਾ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㌵㠲㔱琮晩㸢〲ㄲ㌵㠲㔱琮晩ꃂ〰〰㐴⼼㹡⼼䥄㹖ਊ䐼噉㰾⁡牨晥∽〲ㄲ㌵㠲㔱琮晩㸢〲ㄲ㌵㠲㔱琮晩ꃂ〰〰㔴⼼㹡⼼䥄㹖릔觨趤觧誁苣뎁藩趯듧麃㰊䐯噉ਾ䐼噉㰾䥄㹖胣醼볯鎼볯醀⼼䥄㹖 겜駧躘臣閁苣ꮁ胣겜飦내鯦ꮁ꣨覼臣릖돦ꮁ苣ꎁ臣ꖅ触꾏菨ꞁ臣誂藥讉臣貂苣趤觧誁苣뎁藩趯듧麃苣邏뻤馁苣芀鳦躘듧뢛臣風볨꺁雦閳臣袂臣ꚁ뻥覂苣讂铦꾉ꓦꦉ臣膀臣ꢁ臣낁ꓦꦉ臣뎮駨膀駩覍觥膀매ꖇ胣躽룦节臣辁臣颫룦膀臩낉臣뒰臣ꦁ臣뺯臣讂諦鞊胦銂뿤벨臣讂臩鶼귥꺁駧뺏臣袂臣ꚁꏩꦉ臣龁臣벣雦꺁铧ꎔ臣립ꯧꒁ胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯隼胣㲑䐯噉ਾ†鳦躘듧뢛臣風볨꺁雦閳臣鞾苣貂臣릔觨趤觧膀觧ꮁ뷤ꦉ臣袂臣뮗ꇩ꾁胣龁臣袁臣膀蟩龔黥ꮁ胩뢸ꛨ覂苣讂苣誂苣骤蟩꺁苣뎃菣꾂돨膀苧뒰賥ꦉ胣蒠ꓩꂴ胣뺁臣꾁菣뾂菣뎃臣몙迧ꮁ苣誂胣龣觧节臣辁臣벣雦꺁铧ꎔ臣覜铧ꢁ臣讂迥붃胦貁臣讂胣鎁臣릂臣ꒁ臣ꚁ胣릔觨趤觧膀觧ꮁ뇨麡臣袂臣誡賨貁ꗥ뺁臣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯鞼胣㲑䐯噉ਾ†铦꾉臣貂臣뮗ꇩ뺁臣꾁믤꺁ꓦꦉ볯ꊂ菣ꦃ菣ꪁ臣覼臣膀臣ꢁ臣낁ꓦꦉ닦뺁臣꾁苣ꮃ苣벃菣袼觧ꮁ菣뾂菣벃菣誁苣뎁苣뾂菣벃菣覼臣ꦁ臣邃苣ꪂ蟧首臣龔铧ꮁ觧ꮁ鳦ꢔ臣꾏菨Ꞁ臣芁苣芀臣貂苣銂胣릲臣龁臣邃苣ꪂ蟧首铧궥臣ꢔ臣讂臣膂臣骤蟩꺁닦뺁臣꾁苣ꮃ苣벃菣銂駧뺏臣龁臣躁觥몙迧馁苣袂臣ꮁ臩鶼귥趓뷤鞁臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯颼胣㲑䐯噉ਾ†鳦몙飦꾁臣龁胣趤觧꺁铦꾉臣貂臣ꢃ裥銂迦鮾臣讂胣趤觧꺁菩蚈臣鞁臣꾁胣覑胣躌胣릠胣誡賨膀꣧邭胣骃매膀菨ꂏ胣誁苣뎁諨覲臣馌臣覂苣讂臣膀臣貂苣ꮁ駩骮臣ꪁ臣芀鳦躘듧뢛臣뎃껥鞁臣蒁苣趤觧꺁菩蚈臣膀铧늂迥붃胣龔苨趸菨膀蛥龔迥붃胣誁苣뎁볯뺁臣꾁蛥龔룤꾏菨ꞁ臣ꎁ臣节苣蒁胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯馼胣㲑䐯噉ਾ†룤龮雦讅꟦ꞁ臣膀潓歹攠⁴污‮丨瑡䜠湥瑥‮〲㜱䨠湡㐻⠹⤱ㄺ㈶ㄭ㠶ꮁ꣨覼臣膀菣麃菣ꞁ諦뚈鯥邭偓䜵苣馨髧ꢁ臣讂剃卉剐䌭獡ꮁ苣讂ꓥ��낕苣ꢔ臣ꚁ韦龜迥ꮩ菣麃菣銂뷤讂雦閳苣겜駧躘臣讖ꓧ馁苣䎋䥒偓ⵒ慃랂苣蚃菣ꮁ郥辂臣ꚁꓥ뒛臣ꚁ苣袂臣芀껥붖藦颧臣袂臣ꚁ臣膀剃卉剐苣뎃菣꾂돨꾁㉃ㅣ臣芁苣膀苣릂菣ꂃ臣膀⹉⠠⥡꣦蒚藩鞈臣较苣隃菣肃苣몂臣讂臣ꢁ臣꾏菨ꪁ苣ꒂ菣劉䅎菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃臣袂臣⢳⥢鯧ꖎ迥ꦾ乒鶃菣貃苣것苣膃菣銂郥肂剃卉剐䌭獡苣릂菣ꂃ乒鶃菣貃苣것苣膃菣超裥ꢁ胣䦁⹉醰臣辁臣节볯ꒁ믤誸臣뢠뇥ꢜ賥超裥銂믤辄臣ꮐ苣膀㉃ㅣ苣뎂菣覃臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣銂郥肂胣鎁臣ꞁ胣뒛軦趏뻥超裥꾁苣ꒂ菣超裥ꮁ菣ꒂ菣ꪃ菣ꒂ苣鞁胣馨髧超裥뢁臣䎮䥒偓螤郥鎽臣超裥릉闧蒚뗧袐苣躰臣芀剃卉剐ꓨ袐뷤꾁胣⢁⤱꣦蒚藩鞈臣较苣隃菣肃苣몂臣貂苣膀臣龁臣较苣隃菣肃苣몂臣讂臣ꢁ臣꾏菨ꪁ苣ꒂ菣超裥誁苣뎁㈨뒛軦趏뻥超裥ꢁꓨ袐賥閁苣龁剃卉剐苣뎃菣꾂돨銂郥뾁胣䎁䥒偓뾂菣醃苣ꪳ苣뎂菣覃臣讂菣ꪃ菣꾂菣ꪂ菣覃藩鞈臣䒯䅎臣龁臣劯䅎臣芁苣芀껥붖藦颧臣袂臣ꚁ臣膀ꓦꦉ듧麃苣躃菣꾁ꮁ꿥肂䅐銂郥肂胣릉껥꺁껥붖藦颧臣꾁胣傁䵁臣㖯ⴧ呔ⵎ✳臣龁臣㖯ⴧ呁乔㌭ꞁ臣讂胣릉껥꺁껥붖藦颧臣꾁胣傁䵁臣㖯ⴧ呔ⵇ✳臣芁苣芀껥붖藦颧臣袂臣ꚁ臣膀剃卉剐苣閃苣꾂苣벃苣뎃菣꾂돨꾁㉃ㅣ苣뎃菣꾂돨ꞁ臣讂胣䎂獡ꮁ苣ꎁ臣략臣讂䅐꺁뿨趽鳦꾫臣螈雦ꢁ臣뺯藧蒚臣膀㉃ㅣ臣傯䵁臣ꂁ뷤ꮜꯧꮁ뫤겜軩螈雦銂뗨鎁臣⢙楊敮⁫瑥愠⹬‬〲㈱※潃杮攠⁴污Ⱞ㈠㄰⤳胣䎂晰覤闧馨髧超裥꾁跥肸臣枮删䅎臣袂苣趏뻥蒚裥궖臣놽鿩閁苣蒂臣蒁臣节臣貂臣蒁臣ꢁ臣邏铥閁苣ꚁ臣誂胣鞁臣貁臣ꚁ䑈銂믤鞁臣늂菣ꂃ럧蚛臣꺁灃ㅦ臣鲿铧貁뿤늀臣貂臣蒁苣⢋牆湯⁴汐湡⁴捓⹩㈠㄰‶潎⁶㐱㜻ㄺ㠶⤳胣䎂晰誁苣뎁㉃ㅣ臣蒁臣貂苣讧胩꺁볤龁讞剃卉剐䌠獡苣뎃菣꾂돨ꞁ臣讂胣䎂挲ꢁ郥颧臣膀볯傈䵁臣醿뷤ꮜꯧꮁ맥醻裥궖苣략臣馁慃㥳臣꾁꿥ꞅ髧ꮁ볯䎉晰꾁臣颁苣讞뫤겜軩螈雦銂䅐꺁臩趽鳦꾫臣략臣馁胣鞁臣貁臣ꚁ胣릉껥꺁껥붖藦颧臣꾁胣꺛髧꺁臩鶼귥Ꞻ臣뢛郥Ꞁ賦醐뿤ꦾ볯䢈뺁臣꾁䑈覼苣讻臣ꚁ剃卉剐䌭挲螤郥鎽臣袂臣ꚁ铦覤臣貂苣芀觧骮臣龮雦讅꟦ꞁ臣膀鯧蒚臣몁볤邭뫥꾁剈臣꾁诧讫臣䎫䥒偓ⵒ㉃ㅣꓨ袐뷤ꮁ苣ꎁ臣릔ꓥ閁苣讂胣릉껥꺁껥붖藦颧臣꾁胣꺛髧꺁臩鶼귥Ꞻ臣麝鯧貐胦ꮜꯧ邵郥袼䡎䩅볯銂믤鞁臣䎦䥒偓ⵒ㉃ㅣꓨ袐뷤ꮁ苣ꎁ臣릔ꓥ閁苣讂胣ં⼼䥄㹖㰊䥄㹖䐼噉邀볯醼볯邼胣㲑䐯噉ਾ†鳦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