(57)【要約】  本発明は、遺伝子改変γδＴ細胞であって、前記γδＴ細胞に高親和性αβＴＣＲ遺伝子を導入し、前記高親和性αβＴＣＲとその特異的ｐＭＨＣの親和性は、対応する野生型αβＴＣＲの少なくとも２倍であることを特徴とする、前記遺伝子改変γδＴ細胞を提供する。本発明は、前記γδＴ細胞の用途および調製方法をさらに提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
遺伝子改変γδＴ細胞であって、
高親和性αβＴＣＲ遺伝子が導入されており、高親和性αβＴＣＲのその特異的ｐＭＨＣに対する親和性は、対応する野生型αβＴＣＲのそれの少なくとも２倍である、γδＴ細胞。
【請求項２】
高親和性αβＴＣＲのその特異的ｐＭＨＣに対する親和性の平衡解離定数値ＫＤが≦ １０μＭである、
請求項１に記載のγδＴ細胞。
【請求項３】
高親和性αβＴＣＲのその特異的ｐＭＨＣに対する親和性の平衡解離定数値ＫＤが≦ ４μＭであり、例えば、５ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、５０ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、１００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、４００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、４５０ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、４００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭ、５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭ、１０００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭまたは１５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭである、
請求項１に記載のγδＴ細胞。
【請求項４】
高親和性αβＴＣＲのその特異的ｐＭＨＣに対する親和性の平衡解離定数値ＫＤが、１ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭであり、例えば、１００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、４００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、４５０ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、１０００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭまたは１５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭである、
請求項１に記載のγδＴ細胞。
【請求項５】
腫瘍または感染症を治療するための医薬を調製するために使用される、
請求項１〜４のいずれか一項に記載のγδＴ細胞。
【請求項６】
感染は、ウイルス感染または細菌感染である、
請求項５に記載のγδＴ細胞。
【請求項７】
腫瘍または感染症の治療のための医薬を調製するための、請求項１〜６のいずれか一項に記載のγδＴ細胞の使用。
【請求項８】
薬学的に許容される担体および請求項１〜６のいずれか一項に記載のγδＴ細胞を含む、薬学的組成物。
【請求項９】
適切な量の請求項１〜６のいずれか一項に記載のγδＴ細胞または請求項８に記載の薬学的組成物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、疾患の治療のための方法。
【請求項１０】
高親和性αβＴＣＲ遺伝子をγδＴ細胞に形質導入するステップ（ｉ）と、
（ｉ）に記載のγδＴ細胞を培養するステップ（ｉｉ）とを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載のγδＴ細胞の調製のための方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオテクノロジーの分野に関し、より具体的には、改変されたγδＴ細胞、および前記細胞の用途および調製方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
悪性腫瘍は、人間の健康を危険にさらす最も危険な病気の１つである。世界中で毎年約８００万人が癌で亡くなっており、中国では１分あたり平均６人が悪性腫瘍と診断されており、悪性腫瘍の新薬や治療法の開発が世界的な注目を集めている。癌免疫療法は、２０１３年に「サイエンス」によって最も重要な科学的進歩であると評価された。その中で、養子細胞免疫療法は特に興味深いものである。
【０００３】
養子細胞免疫療法は、患者自身の免疫細胞を体内外で拡大または修飾した後、腫瘍を治療する目的を達成するために体内に再導入することである。前記療法は、特異性が高く、副作用が少なく、特に後期に他の治療を受けられない患者さんに特に適しており、現在、Ｔリンパ球は養子免疫療法の新たなスターとなっている。
【０００４】
Ｔリンパ球は、表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の構造に基づいて、αβＴ細胞とγδＴ細胞の２つの主要なカテゴリーに分類される。ヒトγδＴ細胞は、保守的に進化した独特なＴリンパ球サブセットであり、そのＴＣＲ受容体は、γ鎖とδ鎖で構成されており、体の免疫モニタリングに抗感染作用と抗腫瘍作用がある。γδＴ細胞は種類が多く、さまざまなサブタイプがあり、そのうちＶδ鎖には１〜８個、Ｖγ鎖には１〜９個のサブタイプがある。ヒト末梢血では、γδＴ細胞は全Ｔリンパ球の１％〜５％を占め、そのうちＶγ９Ｖδ２γδＴ細胞は全γδＴ細胞の５０％〜９５％を占める。αβＴ細胞と比較して、γδＴ細胞は広範囲の抗原認識タイプを認識し、主要な組織適合性複合体（ＭＨＣ）による制限を受けない。
現在、Ｔ細胞養子免疫療法の研究は主にＣＡＴ−Ｔ療法とＴＣＲ−Ｔ療法に焦点を当てており、その中でもＴＣＲ−Ｔ療法は主に改変されたＴＣＲ遺伝子を使用してＴ細胞を修飾する。現在主に使用されているαβＴＣＲ形質導入αβＴ細胞プロトコルと比較して、αβＴＣＲ形質導入γδＴ細胞は自然的な利点を有し、その外因性αβＴＣＲはγδＴ細胞の内因性γ鎖およびδ鎖とほとんどミスマッチせず、体に自己免疫反応を引き起こす可能性を避けた。
【０００５】
２００９年、日本の学者Ａ  Ｈｉａｓａら［Ａ  Ｈｉａｓａ１  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ（２００９）  １６，  ６２０-６２８］が初めてαβＴＣＲをγδＴ細胞に形質導入し、αβＴＣＲによって形質導入されたγδＴ細胞は、自身のγδＴＣＲを介して細胞に活性化シグナルを伝達できることを発見し、また、外因性αβＴＣＲを介して特異的抗原に応答することができ、同時に活性化ダイナミクスから、αβＴＣＲ形質導入γδＴ細胞はαβＴＣＲ形質導入αβＴ細胞よりも速く応答する。しかし、この方案では未修飾の野生型αβＴＣＲを使用し、αβＴＣＲのみをγδＴ細胞に形質導入すると、腫瘍抗原を特異的に認識できなくなり、結局、認識を支援するために同時にＣＤ８分子を形質導入することしかできない。これは間違いなく細胞の不安定性を増加させ、追加の遺伝子編集はより多くの予測不可能性と潜在的なリスクをもたらす。
【０００６】
したがって、当技術分野では、他のＣＤ分子を同時形質転換することなく腫瘍抗原を特異的に認識するγδＴ細胞が緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【０００７】
本発明の目的は、他のＣＤ分子を同時形質転換することなく腫瘍抗原を特異的に認識することができるγδＴ細胞を提供することである。
【０００８】
本発明の目的はまた、前記γδＴ細胞の調製方法および使用を提供することである。
【０００９】
第１の態様では、本発明は、遺伝子改変γδＴ細胞であって、前記γδＴ細胞に高親和性αβＴＣＲ遺伝子が導入されており、前記高親和性αβＴＣＲのその特異的ｐＭＨＣに対する親和性は、対応する野生型αβＴＣＲの親和性の少なくとも２倍である、前記遺伝子改変γδＴ細胞を提供する。
【００１０】
好ましい実施形態では、前記遺伝子改変γδＴ細胞は、外因性ＣＤ８分子なしで腫瘍抗原を特異的に認識することができ、好ましくは、遺伝子改変γδＴ細胞は、外因性ＣＤ分子なしで腫瘍抗原を特異的に認識することができ、最も好ましくは、前記遺伝子改変γδＴ細胞は、外因性補助分子なしで腫瘍抗原を特異的に認識することができる。
【００１１】
具体的な実施形態では、前記高親和性αβＴＣＲのその特異的ｐＭＨＣに対する親和性の平衡解離定数値ＫＤは≦ １０μＭである。
【００１２】
具体的な実施形態では、前記高親和性αβＴＣＲのその特異的ｐＭＨＣに対する親和性の平衡解離定数値ＫＤは≦ ４μＭであり、例えば、５ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、５０ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、１００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、４００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、４５０ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、４００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭ、５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭ、１０００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭ或いは１５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭである。
【００１３】
具体的な実施形態では、前記高親和性αβＴＣＲのその特異的ｐＭＨＣに対する親和性の平衡解離定数値ＫＤは１ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭであり、例えば、１００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、４００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、４５０ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、１０００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ或いは１５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭである。
【００１４】
好ましい実施形態では、前記高親和性αβＴＣＲ遺伝子は、全長である。
【００１５】
好ましい実施形態では、前記高親和性αβＴＣＲのα鎖の核酸配列は配列番号：５であり、β鎖の核酸配列は配列番号：７であり、または、α鎖の核酸配列は配列番号：９であり、β鎖の核酸配列は配列番号：１１であり、または、α鎖の核酸配列は配列番号：１３であり、β鎖の核酸配列は配列番号：１５であり、または、α鎖の核酸配列は配列番号：１７であり、β鎖の核酸配列は配列番号：１９であり、または、α鎖の核酸配列は配列番号：２１であり、β鎖の核酸配列は配列番号：２３である。
【００１６】
好ましい実施形態では、前記高親和性αβＴＣＲは、レンチウイルスベクターを含むがこれに限定されないウイルスベクターによってγδＴ細胞に形質導入される。
【００１７】
好ましい実施形態では、前記γδＴ細胞のγδ対は、Ｖγ１−９およびＶδ１−８である。
【００１８】
好ましい実施形態では、前記細胞は、Ｖγ９Ｖδ２γδＴ細胞である。
【００１９】
具体的な実施形態では、前記γδＴ細胞は、腫瘍または感染症を治療するための医薬を調製するために使用される。
【００２０】
具体的な実施形態では、前記感染は、ウイルス感染または細菌感染である。
【００２１】
好ましい実施形態では、前記γδＴ細胞は、治療対象自体または健康なドナーに由来することを特徴とする。
【００２２】
第２の態様では、本発明は、腫瘍または感染症を治療するための医薬を調製するための、第１の態様記載のγδＴ細胞の使用を提供する。
好ましい実施形態では、前記感染は、ウイルス感染または細菌感染である。
【００２３】
第３の態様では、本発明は、薬学的組成物であって、前記薬学的組成物は、薬学的に許容される担体および第１の態様に記載のγδＴ細胞を含む、前記薬学的組成物を提供することを特徴とする。
【００２４】
第４の態様では、本発明は、疾患の治療のための方法であって、適切な量の第１の態様に記載のγδＴ細胞または第３の態様に記載の薬学的組成物を、治療を必要とする対象に投与することを含む、前記疾患の治療方法を提供する。
【００２５】
好ましい実施形態では、前記疾患は、腫瘍または感染症である。
【００２６】
好ましい実施形態では、前記感染は、ウイルス感染または細菌感染である。
【００２７】
第５の態様では、本発明は、第１の態様に記載のγδＴ細胞の調製のための方法であって、
高親和性αβＴＣＲ遺伝子をγδＴ細胞に形質導入するステップ（ｉ）  と、
（ｉ）に記載のγδＴ細胞を培養するステップ（ｉｉ）とを含む、前記γδＴ細胞の調製のための方法を提供する。
好ましい実施形態では、前記高親和性αβＴＣＲのその特異的ｐＭＨＣに対する親和性は、対応する野生型αβＴＣＲの親和性の少なくとも２倍である。
【発明の効果】
【００２８】
本発明の範囲内で、本発明の上記の技術的特徴および以下（例えば、実施例）に具体的に説明する各技術的特徴を互いに組み合わせて、新規または好ましい技術的解決手段を形成することができることを理解されたい。スペースの制限のため、ここでは繰り返しない。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１ａ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｂ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｃ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｄ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｅ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｆ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｇ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｈ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｉ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｊ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｋ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｌ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｍ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｎ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｏ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｐ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｑ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｒ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｓ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｔ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｕ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｖ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｗ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図１ｘ】１Ｇ４の３２μＭＴＣＲ（野生型）、４μＭＴＣＲ、１．０７μＭＴＣＲ、４５０ｎＭＴＣＲ、８４ｎＭＴＣＲおよび５ｎＭＴＣＲに対するα鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列、ならびにβ鎖の核酸配列および対応するアミノ酸配列を順に示す。
【図２】親和性の異なる１Ｇ４ＴＣＲ形質導入γδＴ細胞群のＴ２で特異的短いペプチドと対照短いペプチドを負荷した場合、および短いペプチドを負荷しなかった場合におけるサイトカイン（ＩＦＮ−γ）の放出応答を示す。
【図３】異なる親和性の１Ｇ４ＴＣＲ形質導入γδＴ細胞群の腫瘍細胞株におけるサイトカイン（ＩＦＮ−γ）の放出応答を示す。
【図４】腫瘍細胞株における１Ｇ４ＴＣＲ形質導入γδＴ細胞群の特異的殺害の比較を示す：ＬＤＨ検出。
【図５】ルシフェラーゼ（ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）反応による腫瘍細胞株における１Ｇ４ＴＣＲ形質導入γδＴ細胞の殺害の違いを示す。
【図６】腫瘍細胞株における異なる親和性の１Ｇ４ＴＣＲ形質導入γδＴ細胞の殺傷動力学反応のリアルタイムでのモニタリングを示す
【発明を実施するための形態】
【００３０】
徹底的かつ詳細な研究の結果、発明者らは、高親和性αβＴＣＲをγδＴ細胞に形質導入した後、腫瘍抗原の特異的認識を達成するために他のＣＤ分子を同時形質転換する必要がないことを予期せず発見した。そして、改変されたγδＴ細胞は、活性化機能および殺傷機能の実験において、予想外のより優れた効果を示した。支援のために他のＣＤ分子を同時変換する必要がないため、この改変された細胞は安定性の面で明らかに有利であり、それによって調製プロセスにおける予測不能性と潜在的なリスクが大幅に減少する。これに基づいて、本発明を完成した。
【００３１】
用語
ｐＭＨＣ：主要な組織適合性複合体（ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、すなわちＭＨＣは、すべての生体適合性複合体抗原の総称であり、ＭＨＣ遺伝子ファミリーによってコードされる分子である。ヒトＭＨＣは通常ＨＬＡ遺伝子またはＨＬＡ複合体と呼ばれる。腫瘍抗原は、細胞内でタンパク質分解により８〜１６アミノ酸のペプチドフラグメント、すなわちＣＴＬエピトープに処理され、ペプチドフラグメントは、小胞体腔内のＭＨＣ分子と結合して、ペプチド−ＭＨＣ複合体（ｐｅｐｔｉｄｅ−ＭＨＣ  ｃｏｍｐｌｅｘ）、すなわちｐＭＨＣを形成する。ｐＭＨＣは、ＣＤ８＋Ｔ細胞の表面のαβＴ細胞受容体（αβＴＣＲ）による認識のために、最終的に細胞表面に提示される。異なるαβＴＣＲは異なるｐＭＨＣ分子を認識でき、αβＴＣＲはｐＭＨＣ認識に特異的である。野生型αβＴＣＲは、その特異的のｐＭＨＣに対して一定の親和性を有する。
【００３２】
高親和性αβＴＣＲ：その特異的ｐＭＨＣ分子に対する親和性が、対応する野生型αβＴＣＲと前記ｐＭＨＣ分子の親和性の少なくとも２倍であるαβＴＣＲを指す。
【００３３】
腫瘍：病理学的タイプや感染のステージに関係なく、すべてのタイプの癌細胞の成長または発癌プロセス、転移組織または悪性の形質転換細胞、組織または臓器を指す。腫瘍の実施例は、固形腫瘍、軟部組織腫瘍、および転移性病変を含むが、これらに限定されない。固形腫瘍の実施例は、肉腫、肺扁平上皮癌、癌など、さまざまな臓器系の悪性腫瘍を含む。例えば、感染した前立腺、肺、乳房、リンパ、消化管（例えば、結腸）、尿生殖路（例えば、腎臓、上皮細胞）、咽頭。肺扁平上皮癌は、悪性腫瘍、例えば、多数の結腸癌、直腸癌、腎細胞癌、肝臓癌、肺の非小細胞癌、小腸癌、および食道癌を含む。本発明の教示に基づいて、当業者は、本発明の高親和性αβＴＣＲ形質導入γδＴ細胞が、腫瘍細胞の殺傷を達成するために、ＣＤ８分子などの外因性補助分子なしにまたは発現せずに腫瘍抗原を特異的に認識できることを理解できる。したがって、本発明のアイデアによって調製された様々な遺伝子改変γδＴ細胞は、様々な腫瘍に対して潜在的な治療効果を有する。
【００３４】
薬用担体：賦形剤または安定剤とも呼ばれ、投与量および濃度は、それに曝露された細胞または個体に対して毒性がないものである。多くの場合、生理学的に許容される担体は、ｐＨ緩衝水溶液である。生理学的に許容される担体の例は、リン酸塩、クエン酸塩、その他の有機酸などの緩衝液と、アスコルビン酸などの抗酸化剤と、低分子量（約１０残基未満）のポリペプチドと、血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質と、ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマーと、グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸、単糖類、二糖類、およびグルコース、マンノース、デキストリンなどの他の糖類と、ＥＤＴＡなどの錯化剤と、マンニトールまたはソルビトールなどの糖アルコールと、ナトリウムなどの塩を形成する対イオンと、および／またはＴＷＥＥＮＴＭ、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳＴＭなどの非イオン性界面活性剤を含む。
【００３５】
遺伝子改変γδＴ細胞
徹底的かつ詳細な研究の結果、発明者らは、高親和性αβＴＣＲ遺伝子が導入され、高親和性αβＴＣＲとその特異的ｐＭＨＣの親和性がそれと対応する野生型αβＴＣＲの少なくとも２倍である優れた性能を持つ遺伝子改変γδＴ細胞を得た。したがって、本発明のγδＴ細胞は、外因性ＣＤ８分子なしにまたは発現せずに腫瘍抗原を特異的に認識することができ、好ましくは、本発明のγδＴ細胞は、任意の外因性ＣＤ分子（例えば、ＣＤ８、ＣＤ４分子に限定されず）なしにまたは発現せずに腫瘍抗原を特異的に認識することができ、最も好ましくは、本発明のγδＴ細胞は、外因性補助分子なしにまたは発現せずに腫瘍抗原を特異的に認識することができる。
【００３６】
具体的に、前記高親和性αβＴＣＲとその特異的ｐＭＨＣの親和性の平衡解離定数値はＫＤ ≦ １０μＭである。より具体的に、前記高親和性αβＴＣＲとその特異的ｐＭＨＣの親和性の平衡解離定数値はＫＤ ≦ ４μＭであり、例えば、５ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、５０ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、１００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、４００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、４５０ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ４０００ｎＭ、４００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭ、５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭ、１０００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭ或１５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ３０００ｎＭである。
【００３７】
別の好ましい例では、前記高親和性αβＴＣＲとその特異的ｐＭＨＣの親和性の平衡解離定数値ＫＤは１ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭであり、例えば、１００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、４００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、４５０ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ、１０００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭ或１５００ｎＭ ≦ ＫＤ ≦ ２０００ｎＭである。
【００３８】
当業者は、αβＴＣＲとその特異的ｐＭＨＣとの間の親和性を決定する方法に精通している。任意の適切な機器を使用することができ、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲまたはＦｏｒｔｅＢｉｏなどを含むがこれらに限定されない任意の適切な方法によって測定することができ、例えば、関連する機器の取扱説明書に従って測定することができる。結合親和性を測定するとき、αβＴＣＲおよびｐＭＨＣは両方とも可溶性タンパク質の形態である、すなわち、αβＴＣＲおよびｐＭＨＣは両方とも水に可溶性であることに注意すべきである。当業者は、文献（Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｍ．Ｂｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１６（９）：７０７−７１１）または特許文書ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７７６８０に記載のような、可溶性形態でαβＴＣＲおよびｐＭＨＣ複合体を得る方法に精通している。
【００３９】
周知のように、親和性は平衡解離定数ＫＤに反比例するため、ＴＣＲの親和性を２倍にすると、ＫＤ値が半分になる。当業者は、ＫＤ値単位間の変換関係、すなわち、１Ｍ ＝ １０００μＭ、１μＭ ＝ １０００ｎＭ、および１ｎＭ ＝ １０００ｐＭに精通している。結合定数はｋａとして表され、解離定数はｋｄとして表され、ＫＤ ＝ ｋｄ／ｋａ。Ｔ１／２（半減期）は、Ｉｎ２を解離定数（ｋｄ）で除算して計算される。したがって、Ｔ１／２を２倍にすると、ｋｄが半分になる。同じ試験プロトコルを使用して、所定のＴＣＲの結合親和性または結合半減期を数回、例えば３回以上検出し、結果の平均を取ることが好ましい。
【００４０】
好ましい実施形態では、これらの試験は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲ法を使用して行われる。Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲ：表面プラズモン共鳴測定法、すなわち、１５０  ｎｍでのバイオセンサーの屈折率の変化に対する表面プラズモンの感度の共鳴原理を使用して、リアルタイムの非侵襲的な方法でバイオセンサーの表面上の分子の濃度の変化に反応する。したがって、バイオセンサーチップ上のリガンドと分析物との間の相互作用が検出される。
【００４１】
Ｔリンパ球は、表面のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の構造に基づいて、αβＴ細胞とγδＴ細胞の２つの主要なカテゴリーに分類される。αβＴ細胞表面のＴＣＲは、α鎖とβ鎖で構成され、αβＴＣＲと呼ばれ、γδＴ細胞表面のＴＣＲは、γ鎖とδ鎖で構成され、γδＴＣＲと呼ばれる。その中で、Ｖδ鎖には１〜８個あり、Ｖγ鎖には１〜９個の異なるサブタイプがある。その中で、Ｖγ９Ｖδ２γδＴ細胞はＶδ２Ｔ細胞とも呼ばれ、本発明では両者を互換的に使用することができる。本発明の好ましい例では、γδＴ細胞に移入された高親和性αβＴＣＲ遺伝子は全長であり、細胞外領域、膜貫通領域、および細胞質領域を含む。
【００４２】
好ましくは、高親和性αβＴＣＲは、ウイルスベクターによってγδＴ細胞に形質導入される。ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、ヘルペスウイルスベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、およびバキュロウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。本発明の好ましい例では、使用されるベクターはレンチウイルスベクターである。好ましくは、高親和性αβＴＣＲ遺伝子は、γδＴ細胞の染色体に組み込まれる。
【００４３】
本発明のγδＴ細胞は、腫瘍または感染症を治療するために使用することができる。前記腫瘍は、肝臓癌、肺癌、胃癌、悪性黒色腫、前立腺癌、膀胱癌、乳癌、多発性骨髄腫、肝細胞癌、口腔扁平上皮癌、および食道癌などを含むが、これらに限定されない。前記感染は、ウイルス感染症、細菌感染症、真菌感染症、原生動物感染症などを含む。本発明のγδＴ細胞は養子免疫療法に適用することができ、当業者は養子療法のための多くの適切な方法を知ることができる（例えば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇら，（２００８）Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｃａｎｃｅｒ８（４）：２９９−３０８）。
【００４４】
γδＴ細胞による抗原の認識は、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）と特定の抗原の短いペプチドによって形成される複合体によって制限されず、広範な抗腫瘍および抗感染特性を有し、抗原によって刺激された後、迅速に応答し、大幅に拡大することができるため、臨床用量を満たすことができる。したがって、前記疾患の治療において、前記γδＴ細胞は患者からだけでなく他の健康なドナーからも抽出することができる。前記Ｔ細胞は、対象から単離されたＴ細胞に由来してもよく、または末梢血リンパ球（ＰＢＬ）集団の一部など、対象から単離された混合細胞集団であってもよい。例えば、前記細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から単離することができる。あるいは、本発明の細胞はまた、造血幹細胞（ＨＳＣ）などの幹細胞であり得るか、またはそれに由来し得る。
【００４５】
関連疾患のある患者のγδＴ細胞を単離し、前記Ｔ細胞に高親和性αβＴＣＲを導入した後、これらの遺伝子改変細胞を患者に再導入することにより治療できる。健康な人のγδＴ細胞を分離し、高親和性αβＴＣＲをγδＴ細胞に導入し、改変されたγδＴ細胞を得て、将来の使用のためにそれらを保持して、必要な人にそれらを注入ことも可能である。再注入の回数は医師によって決定される。
【００４６】
したがって、本発明のγδＴ細胞は、商業的供給源を含むがこれに限定されない様々な供給源から得ることができる。
【００４７】
本明細書のアミノ酸名は、国際的な単一の英語の文字ロゴを採用しており、対応するアミノ酸名の３つの英文字の略語は、以下のとおりである：Ａｌａ（Ａ）、Ａｒｇ（Ｒ）、Ａｓｎ（Ｎ）、Ａｓｐ（Ｄ）、Ｃｙｓ（Ｃ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ｇｌｕ（Ｅ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｈｉｓ（Ｈ）、Ｉｌｅ（Ｉ）、Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｌｙｓ（Ｋ）、Ｍｅｔ（Ｍ）、Ｐｈｅ（Ｆ）、Ｐｒｏ（Ｐ）、Ｓｅｒ（Ｓ）、Ｔｈｒ（Ｔ）、Ｔｒｐ（Ｗ）、Ｔｙｒ（Ｙ）、Ｖａｌ（Ｖ）。
【００４８】
本発明の主な利点：
１．高親和性αβＴＣＲを導入した本発明のγδＴ細胞は、腫瘍抗原のそれらの特異的同定を助けるために他のＣＤ分子と同時形質転換する必要がなく、調製方法およびプロセスがより便利である。
２．高親和性αβＴＣＲを導入した本発明のγδＴ細胞は、予想外の、より優れた活性化機能、および標的細胞を殺す効力を有する。
【００４９】
以下、具体的な実施例に結びつけて、本発明をさらに説明する。これらの実施例は、単に本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲はこれに限定されないことを理解されたい。下記の実施例では、具体的な条件を明示していない実験方法は、一般に、例えば、（ＳａｍｂｒｏｏｋおよびＲｕｓｓｅｌｌら、分子クローニング：実験室マニュアル（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ−Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）（第３版）（２００１）ＣＳＨＬ出版社）に記載の条件、またはメーカーが提案する条件に従う。特に明記しない限り、パーセンテージと部は重量で計算される。特に明記しない限り、以下の実施例で使用される実験材料および試薬は、市販のチャネルから入手できる。
【００５０】
本発明を説明する前に、本発明は、そのような方法と条件は異なる可能性があるため、記載された具体的な方法および実験条件に限定されないことを理解されたい。また、本明細書で使用される用語は、具体的な実施形態を説明するためのものであり、限定を意図するものではなく、本発明の範囲は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定されることも理解されたい。
【００５１】
特に定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されているのと同じ意味を有する。
【００５２】
本発明に記載されるものと類似または同等の任意の方法および材料を本発明の実施または試験に使用することができるが、本明細書では好ましい方法および材料を例示する。
【００５３】
実施例１．Ｔ細胞受容体遺伝子のレンチウイルスパッケージング
ＴＣＲαおよびβ鎖の全長遺伝子をレンチウイルス発現ベクターに接続した。
【００５４】
主な材料源
３つのレンチウイルスパッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（品番：１２２５１）、ｐＲＳＶ−ＲＥＶ（品番：１２２５３）、ｐＭＤ２．Ｇ（品番：１２２５９）はすべてａｄｄｇｅｎｅから購入し、プラスミドＰＥＩ（品番：２３９６６）はｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅから購入した。
【００５５】
本発明者らは、リポソームトランスフェクション法を使用して、第３世代レンチウイルスシステム４プラスミド（レンチウイルスベクターとしてのpＬｅｎｔｉ（ａｄｄｇｅｎｅ）、および感染性であるが複製しないレンチウイルス粒子の構築に必要な他の成分を含む３つのプラスミド）を２９３Ｔパッケージング細胞でリポソームトランスフェクション法により同時トランスフェクトして、標的Ｔ細胞受容体遺伝子を含むレンチウイルスを調製した。
【００５６】
方法
細胞培養：１５ｃｍディッシュで、１．５−２ ＊ １０７個の２９３Ｔ細胞懸濁液（１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地）を各ディッシュに均一にプレーティングし、３７度、５％ＣＯ２で一晩培養し、約８０％の結合程度に成長すると、レンチウイルスのパッケージングを開始した。
レンチウイルスのパッケージング：発現プラスミドＰＬｅｎｔｉ−ＴＣＲα−Ｐ２Ａ−ＴＣＲβ（１５ｕｇ／皿）およびパッケージングプラスミドｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（５ｕｇ／皿）、ｐＲＳＶ−ＲＥＶ（５ｕｇ／皿）およびｐＭＤ２．Ｇ（５ｕｇ／皿）および１８００マイクロリットルのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を十分に混合し、室温で５分間放置してＤＮＡ混合物を形成し、ＰＥＩ（６０ｕｇ／皿）と１８００マイクロリットルのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を取り、十分に混合し、室温で５分間放置してＰＥＩ混合液を形成した。ＤＮＡ混合液とＰＥＩ混合液を混合し、室温で３０分間放置してから、３１５０マイクロリットルのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地を加え、十分に混合した後、ＤＭＥＭ培地を１１．２５ｍｌのｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地に変換済みの２９３Ｔ細胞培養ディッシュに加え、穏やかに混合し、３７度、５％ＣＯ２で７−８時間培養してから、トランスフェクション培地を１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ培地に変更した。トランスフェクションの４８時間後と７２時間後にそれぞれ上澄みウイルスを収集した。収集したウイルス溶液を３０００ｇで１０〜１５分間遠心分離して細胞破片を除去し、０．４５ミクロンのフィルターでろ過した後、５０ＫＤカットオフ濃縮チューブを使用して低温遠心濃縮を行い、最後に１皿を１ｍｌのウイルス濃縮液に濃縮した後、分注後、−８０度で凍結した。
【００５７】
実施例２．標的遺伝子形質導入γδＴ細胞
実施例１で構築された標的遺伝子を含むレンチウイルス発現ベクターを使用して、γδＴ細胞で形質導入された。
【００５８】
主な試薬と材料源
ヒト末梢血単核球（ＰＢＭＣ）は健康なドナーからのものであり、ＺｏｌｅｄｒｏｎｅｔｅはＮＯＶＡＲＴＩＳ社から購入し、製品バッチ番号：Ｓ０４２５輸入薬物登録アカウント：Ｈ２０１４０２１８、注射液組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）：山東省  Ｑｕａｎｇａｎｇ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｃｏ．、Ｌｔｄ．、製品バッチ番号：２０１４０７００４、ＩＬ−７：ブランドＰＥＰＲＯＴＥＣＨ品番：ＡＦ−２００−０７、ＩＬ−１５：ブランドＰＥＰＲＯＴＥＣＨ品番：ＡＦ−２００−１５、ＩＬ−２１：ブランドＰＥＰＲＯＴＥＣＨ品番：ＡＦ−２００−２１、培地：１０％ＦＢＳ（オーストラリアのウシ胎仔血清、不活化）：Ｇｉｂｃｏから購入  品番：１８２８７２８、ＰＲＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ，  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）は、ＧＭＩから購入  品番：８１１７１０７  フローサイトメーター：ＢＤ社のＦＡＣＳＡｒｉａ  ＩＩＩ。
【００５９】
方法
（ａ）Ｖγ９Ｖδ２γδＴ細胞の刺激：健康なドナーからのＰＢＭＣをＲＰＭＩ１６４０＋１０％Ａｕ＋１％ＰＳ完全培地で再懸濁し、混合した。２×１０６／ｍｌの濃度で細胞を２４ウェルプレートに分註した。初期刺激をＤ０として記録し、分註されたＰＢＭＣにｚｏｌｅｄｒｏｎｅｔｅ（使用濃度は５ｕＭ）を添加し、同時にサイトカインＩＬ−２（使用濃度１００ＩＵ／ｍｌ）を追加し、このシステムで、ＰＢＭＣに存在するＶγ９Ｖδ２γδＴ細胞の活性化を方向性誘導し始まった。細胞培養プレートを３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターに入れて培養した。フォローアップ培養では、２〜３日ごとに、培地の半分を新鮮な培地とＩＬ−２を加えることにより交換した。
（ｂ）Ｖγ９Ｖδ２γδＴ細胞のレンチウイルス形質導入：活性化Ｄ２／Ｄ３に、４８ウェルプレート、２００μｌの感染システムで、ＭＯＩ ＝ ５の比率で標的遺伝子を含む濃縮レンチウイルスを追加した。同時に、１０ｕｇ／ｍｌのプロタミンを添加し、Ｄ４は、レンチウイルス感染Ｖγ９Ｖδ２γδＴ細胞を４８ウェルプレートの２００マイクロリットルシステムから２４ウェルプレートの１ｍｌシステムに移し、培養した。
【００６０】
実施例３．αβＴＣＲとその特異的ｐＭＨＣとの間の親和性の測定
任意の適切な機器を使用することができ、結合親和性は、Ｂｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲまたはＦｏｒｔｅＢｉｏなどを含むがこれらに限定されない任意の適切な方法によって測定することができ、例えば、関連する機器の取扱説明書に従って測定することができる。結合親和性を測定するとき、αβＴＣＲおよびｐＭＨＣは両方とも可溶性タンパク質の形態であることに注意すべきである。当業者は、文献（Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｍ．Ｂｏｕｌｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ，２００３，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１６（９）：７０７−７１１）または特許文書ＰＣＴ／ＣＮ２０１６／０７７６８０に記載のような、可溶性形態でαβＴＣＲおよびｐＭＨＣ複合体を得る方法に精通している。
【００６１】
可溶性ｐＭＨＣ複合体を調製は以下の方法を使用することができる、すなわち、封入体でＭＨＣの重鎖と軽鎖を発現させ、短いペプチドを合成し、溶解したＭＨＣ重鎖軽鎖と短いペプチドを再生バッファーに追加し、再生および精製する。ビオチン化ｐＭＨＣ分子は、後で使用するために−８０℃で個別に保存できる。
【００６２】
本実施例では、αβＴＣＲタンパク質とその特異的ｐＭＨＣの間の親和性をＧＥ社のＢｉａｃｏｒｅ装置によって測定した。ストレプトアビジンをアミノカップリング法によりＣＭ５チップの表面に固定し、その固定量は数百ＲＵ以上である。参照チャネルと検出チャネルはそれぞれビオチン化非特異的ｐＭＨＣと特異的ｐＭＨＣをキャプチャした後、ビオチンを使用して、ストレプトアビジンの残りのビオチン結合部位をブロックした。ランニングバッファーを使用してＴＣＲをいくつかの適切な濃度に希釈し、順次注入し、解離時間はＴＣＲの親和性に依存する。Ｂｉａｃｏｒｅの分析ソフトウェアを使用して測定したデータを分析し、１：１の結合モデルを使用して動力学パラメーターを適合させ、平衡解離定数はＫＤ ＝ ｋｄ／ｋａである。
【００６３】
実施例４．Ｔ２細胞に対して特異的応答する高親和性１Ｇ４ＴＣＲ形質導入γδＴ細胞の活性化実験
この実験は、標的細胞Ｔ２に特異的に応答する高親和性１Ｇ４ＴＣＲ形質導入γδＴ細胞の活性化を検証するために行われた。この効果は、野生型１Ｇ４ＴＣＲによって形質導入されたγδＴ細胞の効果よりもはるかに優れている。ＥＬＩＳＰＯＴテストで検出されたＩＦＮ−γ産生を、ＴＣＲ形質導入γδＴ細胞活性化の読み出し値として使用した。
【００６４】
主な試薬と材料源
１０％ＦＢＳ（会社（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号１６０００−０４４）、ＲＰＭＩ  １６４０（会社（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号Ｃ１１８７５５００ｂｔ）、ＰＶＤＦ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ９６ウェルプレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＳＩＰＳ４５１０）、ヒト  ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ  ＰＶＤＦ酵素キット（ＢＤ）には、必要な他のすべての試薬（キャプチャーおよび検出抗体、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液）が含まれ、Ｅｌｉｓｐｏｔのキット（ＢＤTMＥＬＩＳＰＯＴ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｓｅｔ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  品番：５５１２８２）、短いペプチド：Ｐ１Ｂは抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１  １５７−１６５段に特異的、その配列はＳＬＬＭＷＩＴＱＣで、そのＨＬＡ遺伝子ジェノタイピングはＡ０２０１で、Ｐ７２Ａは対照抗原ＧＰ１００に対し、その配列はＹＬＥＰＧＰＶＴＡで、対応するＨＬＡ遺伝子ジェノタイピングもＡ０２０１である。
【００６５】
方法
標的細胞を調製
本実施例の標的細胞は、リンパ芽腫Ｔ２細胞であり、前記細胞のＨＬＡタイピングはＡ０２０１であるが、１Ｇ４ＴＣＲに対する特異的抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現せず、Ｔ２に抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的短いペプチドＰ１Ｂ（負荷濃度０．１μＭ￥０．０１μＭ￥０．０００１μＭ）と対照ペプチドＰ７２Ａ（負荷濃度０．１μＭ）、および短いペプチドをロードしていないＴ２細胞をロードし、それぞれ本実験の３種類の標的細胞として使用した。
【００６６】
エフェクター細胞の調製
異なる群のエフェクター細胞をそれぞれ調製した：１Ｇ４ＴＣＲを形質導入しないＶδ２Ｔ細胞と、異なる親和性１Ｇ４ＴＣＲを形質導入するＶδ２Ｔ細胞。γδＴ細胞の種類はＶγ９Ｖδ２γδＴ細胞（Ｖδ２Ｔ細胞）である。前記１Ｇ４ＴＣＲ（Ｙａｎｇｂｉｎｇ  Ｚｈａｏ，＊  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，  ２００７，  １７９：５８４５−５８５４）は、高親和性αβＴＣＲであり、本実施例で使用されるＴＣＲの親和性はそれぞれ、３２μＭ（野生型）（そのα鎖の核酸配列は配列番号：１であり、アミノ酸配列は配列番号：２であり、そのβ鎖の核酸配列は配列番号：３であり、アミノ酸配列は配列番号：４）、４μＭ（そのα鎖の核酸配列は配列番号：５であり、アミノ酸配列は配列番号：６であり、そのβ鎖の核酸配列は配列番号：７であり、アミノ酸配列は配列番号：８であり）、１．０７μＭ（そのα鎖の核酸配列は配列番号：９であり、アミノ酸配列は配列番号：１０であり、そのβ鎖の核酸配列は配列番号：１１であり、アミノ酸配列は配列番号：１２であり）、４５０ｎＭ（そのα鎖の核酸配列は配列番号：１３であり、アミノ酸配列は配列番号：１４であり、そのβ鎖の核酸配列は配列番号：１５であり、アミノ酸配列は配列番号：１６であり）、８４ｎＭ（そのα鎖の核酸配列は配列番号：１７であり、アミノ酸配列は配列番号：１８であり、そのβ鎖の核酸配列は配列番号：１９であり、アミノ酸配列は配列番号：２０であり）および５ｎＭ（そのα鎖の核酸配列は配列番号：２１であり、アミノ酸配列は配列番号：２２であり、そのβ鎖の核酸配列は配列番号：２３であり、アミノ酸配列は配列番号：２４であり）である。
【００６７】
ＥＬＩＳＰＯＴ操作
メーカーによって提供される取扱説明書に従って次のようにウェルプレートを準備する：プレートあたり１０ｍｌの滅菌ＰＢＳで抗ヒトＩＦＮ−γキャプチャー抗体を１：２００に希釈し、各ウェルに１００μｌの希釈されたキャプチャー抗体を添加する。ウェルプレートを４度で一晩インキュベートした。インキュベートした後、ウェルプレートを洗浄して過剰なキャプチャー抗体を除去した。１０％ＦＢＳを含む１００マイクロリットルのＲＰＭＩ１６４０培地を各ウェルに加え、ウェルプレートを室温で２時間インキュベートしてウェルプレートを閉じた。その後、培地をウェルプレートから洗い流し、ＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートをフリックして紙の上で軽くたたくことにより、残りの洗浄バッファーを除去した。遠心分離とカウントにより、上記で調製したエフェクター細胞と標的細胞をＥＬＩＳＰＯＴウェルプレートにそれぞれ添加した：１ｍｌあたり１００μｌの標的細胞は２×１０５細胞（１ウェルあたり２００００細胞）、１ｍｌあたり１００μｌのエフェクター細胞は２×１０４細胞（ウェルあたり２０００細胞）であり、注：勾配希釈によって生成された短いペプチド希釈は、Ｔ２細胞を再懸濁するために直接使用される。すべてのウェルに３回ずつ添加した。
【００６８】
次に、ウェルプレートを４度で一晩（３７度、５％ＣＯ２）インキュベートし、翌日、培地を捨て、ウェルプレートを再蒸留水で２回洗浄し、次にウォッシュプレートを３回洗浄し、ペーパータオルで軽くたたいて残留洗浄バッファーを取り除いた。次に、一次抗体を１０％ＦＢＳを含むＰＢＳで希釈し、各ウェルに１００μｌ／ウェルで加えた。ウェルプレートを室温で２時間インキュベートし、洗浄バッファーで３回洗浄し、ペーパータオルで軽くたたいて余分な洗浄バッファーを取り除いた。
【００６９】
１０％ＦＢＳを含むＰＢＳでストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを１：１００に希釈し、各ウェルに１００μｌの希釈したストレプトアビジン−アルカリホスファターゼを加え、ウェルを室温で１時間インキュベートした。次に、洗浄バッファーで３回、ＰＢＳで２回洗浄し、ウェルプレートをペーパータオルで軽くたたいて、余分な洗浄バッファーとＰＢＳを除去した。洗浄後、キットで提供されるＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を１００μｌ／ウェルで添加して発現させた。光が当たらないように、発現中にウェルプレートをスズ箔紙で覆い、５〜１５分間放置した。この間、定期的に発現ウェルプレートのスポットを検査して、反応を停止するのに最適な時間を決定した。ＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液を取り除き、ウェルプレートを再蒸留水でリンスして発現反応を停止させ、スピン乾燥させてからウェルプレートの底部を取り除き、各ウェルが完全に乾くまでウェルプレートを室温で乾燥させ、イムノスポットプレートカウンター（ＣＴＬ、Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｌｉｍｉｔｅｄ）でウェルプレートの底部メンブレンに形成されたスポットの数をカウントした。
【００７０】
結果
ＥＬＩＳＰＯＴ実験（上記のとおり）で発明のＴＣＲにより形質導入されたΓδＴ細胞のＮＹ−ＥＳＯ−１  １５７−１６５  Ｐ１Ｂ  ＳＬＬＭＷＩＴＱＣ短いペプチドをロードしたＴＣＲ細胞および対照ペプチドＰ７２ＡのＴ２細胞に対して反応するＩＦＮ−γの放出をテストした。検出されたスポットの数は、ソフトウェアＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７を使用して分析およびプロットした。
【００７１】
実験結果は図２に示したように、横軸は異なる処理を行ったエフェクター細胞群を示し、縦軸はＩＦＮ−γを産生するスポットの数を示し、スポットの数が多いほど、標的細胞とインキュベートしたときの対応するエフェクター細胞群の活性化効果が強くなり、高親和性αβＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞は、特異的短いペプチドをロードしたＴ２細胞に対して強い特異的活性化効果があり、その効果は、野生型αβＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞よりも著しく高く、より多くのＩＦＮ−  γを放出する。例えば、短いペプチドの濃度が０．１μＭの場合、親和性ＫＤが４μＭ−５ｎＭのαβＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞のＩＦＮ−γ活性化ＩＦＮ−γスポットの数は４００〜６００で、そのほとんどが６００近くであるが、野生型αβＴＣＲを形質導入されたγδＴ細胞のＩＦＮ−γ活性化スポットの数は約１５０しかない。αβＴＣＲ親和性数値が４μＭ≦ＫＤ≦５ｎＭである場合、形質導入されたγδＴ細胞は、標的細胞に対して強力な活性化応答を示すことができることを示している。しかし、非特異的な短いペプチドをロードして空にしたＴ２細胞に対して基本的に応答しない。外因性αβＴＣＲを形質導入されていないＶδ２Ｔ細胞も関連する腫瘍細胞株に対して基本的に応答しない。
【００７２】
実施例５．腫瘍細胞株に対して特異的応答する高親和性１Ｇ４ＴＣＲ形質導入γδＴ細胞の活性化実験
この実験は、腫瘍細胞株に特異的に応答する高親和性１Ｇ４ＴＣＲ形質導入γδＴ細胞の活性化を検証するために行われた。この効果は、野生型１Ｇ４ＴＣＲによって形質導入されたγδＴ細胞の効果よりもはるかに優れている。ＥＬＩＳＰＯＴテストで検出されたＩＦＮ−γ産生を、ＴＣＲ形質導入γδＴ細胞活性化の読み出し値として使用した。ＥＬＩＳＰＯＴ実験の具体的な操作は、実施例４で説明したとおりである。
【００７３】
主な試薬と材料源
１０％ＦＢＳ（会社（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号１６０００−０４４）、ＲＰＭＩ  １６４０（会社（Ｇｉｂｃｏ）、カタログ番号Ｃ１１８７５５００ｂｔ）、ＰＶＤＦ  ＥＬＩＳＰＯＴ  ９６ウェルプレート（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、カタログ番号ＭＳＩＰＳ４５１０）、ヒト  ＩＦＮ−γＥＬＩＳＰＯＴ  ＰＶＤＦ酵素キット（ＢＤ）には、必要な他のすべての試薬（キャプチャーおよび検出抗体、ストレプトアビジン−アルカリホスファターゼおよびＢＣＩＰ／ＮＢＴ溶液）が含まれ、Ｅｌｉｓｐｏｔのキット（ＢＤTMＥＬＩＳＰＯＴ  ＥＬＩＳＰＯＴ  Ｓｅｔ  Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  Ｍａｎｕａｌ  品番：５５１２８２）、腫瘍細胞株：ＩＭ９は多発性骨髄腫、ＨＬＡ遺伝子ジェノタイピングはＡ０２０１で、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原も発現し、Ｕ２６６Ｂ１は骨髄腫、形質細胞で、ＨＬＡ遺伝子タイピングはＡ０２０１で、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原も発現し、ＮＣＩ−Ｈ１２９９は肺癌細胞株で、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を発現するが、ＨＬＡ遺伝子ジェノタイピングはＡ０２０１ではなく、対照として使用され、ＬＣＬｓは、不死化リンパ芽球細胞株で、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原も発現せず、そのＨＬＡ遺伝子タイピングは、対照としてＡ０２０１ではない。上記の腫瘍細胞株はＡＴＣＣから購入した。
【００７４】
方法
標的細胞の調製
本実験例の標的細胞はＩＭ９およびＵ２６６Ｂ１であり、この２つの細胞株のＨＬＡ遺伝子タイピングはＡ０２０１であり、同時に本実験の陽性腫瘍細胞株として、抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１も発現し、ＮＣＩ−Ｈ１２９９はＮＹ−ＥＳＯ−１抗原を発現するが、ＨＬＡの遺伝子タイピングはＡ０２０１ではなく、ＬＣＬｓは、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原も発現せず、そのＨＬＡ遺伝子タイピングは、Ａ０２０１でもなく、これらの２つの細胞は、この実験で陰性腫瘍細胞株として使用された。
【００７５】
エフェクター細胞の調製
エフェクター細胞の調製は、実施例に記載されているように、異なる群のエフェクター細胞をそれぞれ調製した：１Ｇ４ＴＣＲおよび１Ｇ４ＴＣＲの形質導入なしのＶδ２Ｔ細胞と３２μＭ（野生型）、４μＭ、１．０７μＭ、４５０ｎＭ、８４ｎＭおよび５ｎＭの異なる親和性で形質導入された１Ｇ４ＴＣＲのＶδ２Ｔ細胞。
【００７６】
実験結果は図３に示したように、高親和性αβＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞は、陽性腫瘍細胞株に対して強力な活性化効果があり、その効果は野生型αβＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞よりも著しく高く、より多くのＩＦＮ−γを放出する。例えば、陽性細胞株ＩＭ９の場合、野生型αβＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞には基本的に特異的な活性化応答がなく、ＫＤ値が４μＭの高親和性αβＴＣＲを形質導入すると、特異的活性化応答が増強され、ＩＦＮ−γスポットの数は約１００であり、親和性が上がると明らかに活性化応答が高まり、ＫＤ値が５ｎＭになるとＩＦＮ−γスポットの数は約６５０に達する。しかし、陰性腫瘍細胞株には基本的に応答がなく、特異性が非常に高いことが示されている。外因性αβＴＣＲを形質導入しなかったＶδ２Ｔ細胞は、関連する腫瘍細胞株に基本的に応答しなかった。
【００７７】
実施例６．非放射性細胞毒性実験
この試験では、従来の５１Ｃｒ放出法の代わりに、比色法ベースの検出法であるＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性試験を使用して、細胞溶解中に放出された乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）を定量的に測定した。反応原理は次のとおりである：溶解により、細胞はＬＤＨを培地の上清に放出するが、これは３０分の共役酵素反応で検出でき、酵素反応では、ＬＤＨはテトラゾリウム塩（ＩＮＴ）を赤いホルマザン（ｆｏｒｍａｚａｎ）に変換できる。生成された赤い産物の量は、溶解した細胞の数に正比例する。標準の９６ウェルプレートリーダーを使用して、４９０  ｎｍでの可視光吸収データを収集した。この方法は、エフェクター細胞と標的細胞を一緒にインキュベートしたときの標的細胞の殺傷力を反映するために使用される。
【００７８】
材料
ＣｙｔｏＴｏｘ９６（登録商標）非放射性細胞毒性検出（会社：Ｐｒｏｍｅｇａ；品番：Ｇ１７８０）キットとそのセットの基質混合物、試験緩衝液、溶解液および停止緩衝液。培地：１０％ＦＢＳ（Ｇｉｂｃｏ社、カタログ番号：１６０００−０４４）、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０（Ｇｉｂｃｏ、カタログ番号：Ｃ１１８７５５００ｂｔ）培地に追加。注：ＦＢＳは使用前に非アクティブ化された。丸底９６ウェル組織培養プレート（コーニング社、品番：３７９９）；９６ウェルイムノプレート（ｔｈｅｒｍｏ社、品番：１６７００８）。腫瘍細胞株：Ａ３７５黒色腫（ＨＬＡタイピングはＡ０２０１であり、抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現）およびＮＣＩ−Ｈ１６５０肺癌細胞株（ＨＬＡタイピングはＡ０２０１であり、抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現しない）はＡＴＣＣから購入、ＮＣＩ−Ｈ１２９９肺癌細胞（ＨＬＡタイピングはＡ０２０１であり、抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１を発現）は、ＡＴＣＣから研究所が購入した野生型の改変版である。
【００７９】
方法
標的細胞の調製
実験で使用された陽性腫瘍細胞株（ＨＬＡ−Ａ２と抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１の両方を発現）は、Ａ３７５とＮＣＩ−Ｈ１２９９で、陰性腫瘍細胞株（ＨＬＡ−Ａ２とＮＹ−ＥＳＯ−１の中１つを選択して発現）は、ＮＣＩ−Ｈ１６５０である。調整後の標的細胞密度は２＊１０５個／ｍｌで、各ウェルは２＊１０４個／１００μｌに分註した。
【００８０】
エフェクター細胞の調製
エフェクター細胞の調製は、実施例２で説明したとおりであり、本試験中のエフェクター細胞はそれぞれ、レンチウイルス形質導入なしのＶδ２γδＴ細胞（対照）、ＧＦＰ形質導入ありのＶδ２γδＴ細胞（対照）および野生型（ＫＤ＝３２μＭ）形質導入１Ｇ４ＴＣＲのＶδ２γδＴ細胞、および異なる親和性の１Ｇ４ＴＣＲ形質導入Ｖδ２γδＴ細胞であり、前記高親和性１Ｇ４ＴＣＲのＫＤ値はそれぞれ、４μＭ、１．０７μＭ、４５０ｎＭ、８４ｎＭおよび５ｎＭであり、前記細胞はすべてＢＤ  Ａｒｉａフローソーティングで得られたポリクローナル細胞集団を拡大して得られたものである。エフェクター細胞と標的細胞の比率（Ｅ：Ｔ比）はそれぞれ、１０：１、５：１、１：１、１：５である。
【００８１】
実験群分け設定は次のとおりである：
ＮＹ−ＥＳＯ−１特異的１Ｇ４ＴＣＲ異なる親和性の変異体で形質導入されたＶδ２γδＴ細胞特異的殺傷腫瘍細胞株実験群を設定：最初に１００μｌの標的細胞を９６ウェルの丸底に添加し、次に４つの効率目標比率の標的エフェクター細胞を丸底の９６ウェルプレートに１００μｌの容量で添加した。
【００８２】
すべての対照群は次のように設定：エフェクター細胞自発ＬＤＨ実験ウェル：１００μｌのエフェクター細胞懸濁液を添加、標的細胞自発ＬＤＨ実験群：１００μｌの標的細胞懸濁液を添加、標的細胞最大ＬＤＨ放出群：１００μｌの標的細胞懸濁液を添加、培地バックグラウンド対照群：２００μｌのみの培地、容量補正対照群：２００μｌのみの培地。すべての実験用ウェルと対照ウェルは３つずつ準備し、すべてのウェルの最終容量は２００μｌである（不十分な分はフェノールレッドを含まない完全培地で満たす）。
【００８３】
３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーターにプレートを置き、２４時間インキュベートした。標的細胞の最大ＬＤＨ放出ウェルと容量補正ウェルに１００μｌ培地あたり１０μｌの溶解液（１０Ｘ）を加え、細胞を溶解し、３７℃、５％加湿ＣＯ２インキュベーターで４５分間インキュベートし、プレートを２５０ｘｇで４分間遠心分離した。各ウェルから５０μｌの上清を取り、新しい９６ウェル平底（酵素分析）プレートに移した。５０μｌの準備した基質混合液（１２ｍｌの室温のアッセイバッファーをＳｕｂｓｔｒａｔｅ  Ｍｉｘに溶解）を各ウェルに加え、光が当たらないように、プレートをスズ箔または不透明ボックスで覆い、室温で３０分間インキュベートした。各ウェルに５０μｌの停止液を加えて反応を停止させた。停止液を加えてから１時間以内に４９０ｎｍでの吸光度値を測定し、分析のために、データをＥＸＣＥＬの形式でエクスポートして、保存した。計算式は次のとおりである。
【００８４】
％細胞毒性 ＝ ［１００＊（実験-エフェクター細胞自発-標的細胞自発）］／（標的細胞最大-標的細胞自発）注：実験用ウェルは、異なる効果と標的の比率（平均値）−培地バックグラウンド（平均値）、標的細胞自発ウェルは標的細胞自発（平均値）−培地バックグラウンド（平均値）であり、エフェクター細胞自発ウェルは異なる比率のエフェクター細胞自発（平均値）−培地バックグラウンド（平均値）であり、標的細胞最大ウェルは標的細胞最大（平均値）−容量補正対照（平均値）である。最終的な描画ソフトウェアは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７によって描画された。
【００８５】
結果
実験結果は、図４に示したように、横軸は異なる効果と標的の比率を示し、縦軸はエフェクター細胞と標的細胞を一緒にインキュベートした後の標的細胞の特異的殺傷効率を示す。結果は、異なる高親和性αβ１Ｇ４ＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞が陽性腫瘍細胞株に対して強い殺傷効果を有し、その殺傷効力が野生型αβＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞よりも著しく高かったことを示した。例えば、効果と標的の比率が１０：１の場合、親和性ＫＤが１．０７μＭの高親和性αβ１Ｇ４ＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞は、標的細胞に対して７０％の殺傷率を示し、野生型αβ１Ｇ４ＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞の標的細胞に対する割合を少なくとも２倍である。別の例として、効果と標的の比率が５：１の場合、親和性ＫＤが８４ｎＭの高親和性αβ１Ｇ４ＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞は、標的細胞に対して５０％の殺傷率を示したが、野生型αβ１Ｇ４ＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞の殺傷率は３０％未満、その他は１０％未満である。
【００８６】
概算によると、異なる効果と標的の比率において、αβＴＣＲ親和性のＫＤ値が４μＭ〜５ｎＭの場合、形質導入されたγδＴ細胞による標的細胞の殺傷率は、野生型αβＴＣＲと比較して少なくとも倍増加し、好ましくは、少なくとも２〜３倍増加する。全体として、αβＴＣＲの親和性が１．０７μＭの場合、γδＴ細胞の殺傷効率はより優れている。
異なる高親和性αβ１Ｇ４ＴＣＲで形質導入されたγδＴ細胞は、陰性腫瘍細胞株に対して基本的に殺害効果を持たない。外因性αβＴＣＲを形質導入していないγδＴ細胞またはＧＦＰで形質導入したのみのγδＴ細胞は、関連する腫瘍細胞株に対して基本的に応答しない。
【００８７】
実施例７．ルシフェラーゼ測定実験
ルシフェラーゼレポーター遺伝子は、ホタルルシフェラーゼ（ｆｉｒｅｆｌｙｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）活性を検出するための基質としてルシフェリン（ｌｕｃｉｆｅｒｉｎ）を使用するレポーターシステムを指す。ルシフェラーゼはルシフェリンのオキシルシフェリンへの酸化を触媒でき、ルシフェリンの酸化中に生物発光（ｂｉｏｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）を放出する。ルシフェリンの酸化中に放出される生物発光を蛍光分析装置で測定した。これは、レドックス反応がエネルギーを提供するために細胞を必要とするからであり、我らは、エフェクター細胞と特異的標的細胞を使用して一緒にインキュベートするより、標的細胞を殺し、標的細胞のエネルギーを減少し、フルオレセイン基質を触媒するときの発光を減少する。したがって、エフェクター細胞の標的細胞への殺傷能力を間接的に反映でき、乳酸デヒドロゲナーゼＬＤＨの機能を確認するための副次的検証として使用できる。この方法は、エフェクター細胞と標的細胞を一緒にインキュベートしたときの標的細胞の殺傷力を反映するために使用される。
【００８８】
主な試薬と材料
ルシフェラーゼによって触媒される基質は、Ｄ−ルシフェリン（カリウムイオン塩、１５０μｇ／ｍｌ、Ｃａｙｍａｎ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ、米国）であり、実験用９６ウェルプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇから購入、品番：３７９２、腫瘍細胞株：Ａ５４９、ルシフェラーゼはＡＴＣＣから購入し、本実験ではＮＹ−ＥＳＯ−１抗原とＨＬＡ−Ａ０２０１の両方を発現する細胞株を構築した。
【００８９】
標的細胞の調製
標的細胞として、ルシフェラーゼ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、およびＡ０２０１を発現するＡ５４９を陽性腫瘍細胞として使用し、野生型Ａ５４９（Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ）を陰性対照腫瘍細胞および対応する標的細胞のみを含む対照群として使用した。
【００９０】
エフェクター細胞の調製
エフェクター細胞の調製は、実施例２で説明したとおりであり、レンチウイルス形質導入なしのＶδ２Ｔ細胞群、ＧＦＰで形質導入されたＶδ２Ｔ細胞群、および野生型αβ１Ｇ４ＴＣＲ（ＫＤ ＝ ３２ｕＭ）で形質導入されたＶδ２Ｔ細胞群とＫＤ ＝ １．０７ｕＭの高親和性αβ１Ｇ４ＴＣＲ形質導入Ｖδ２Ｔ細胞群
を含む。
【００９１】
方法
ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１％ＰＳ完全培地でエフェクター細胞と標的細胞を再懸濁し、Ｅ：Ｔ ＝ ５：１、標的細胞２＊１０４個／ウェルでエフェクター細胞と標的細胞を同時に９６ウェルプレートに入れ、３７度、５％のＣＯ２で、２４時間インキュベートし、実験群と対照群の各ウェルにそれぞれ１００ｕｌのルシフェラーゼ基質を添加し、光を避けて操作した。４５０ｎＭ励起光でマイクロプレートリーダーを使用して、実験群と対照群のタ標的細胞の生存率を検出し、Ｅｘｃｅｌデータをエクスポートし、式に従ってエフェクター細胞の殺害効率を計算した。数式は次のとおりである：殺傷％＝（１−実験群の信号／最大標的細胞の信号）％。最終的な描画ソフトウェアは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７によって描画された。
【００９２】
結果
検出結果は、図５に示したように、横軸は異なるエフェクター細胞群を示し、縦軸は検出用フルオレセイン基質を添加した場合の反応系１ｍｌあたりの検出値の対数を示す。結果は、陽性腫瘍細胞株Ａ５４９では、高親和性αβ１Ｇ４ＴＣＲで形質導入されたＶδ２Ｔ細胞群の相対発光単位が、野生型αβ１Ｇ４ＴＣＲで形質導入されたＶδ２Ｔ細胞群よりも著しく低く、高親和性αβＴＣＲで形質導入されたＶδ２Ｔ細胞がより強い殺害効果有することを示した。ＧＦＰが導入されていない、または導入されたＶδ２Ｔ細胞では、発光ユニットは減少しなかった。陰性腫瘍細胞株では、各群の相対発光単位に有意な減少はなく、殺害は形質導入されたＴＣＲに依存していることを示した。この実験はまた、ルシフェラーゼを用いた検出とＬＤＨ検出法の結果が一貫していることを示した。
【００９３】
実施例８．異なる親和性の１Ｇ４ＴＣＲで形質導入されたＶδ２Ｔ細胞の殺傷試験プロトコル
リアルタイムダイナミックライブセルイメージングアナライザー−ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍは、細胞のリアルタイムの成長ステータスを記録する非侵襲的な方法である。γδＴの形質導入後の異なる親和性を持つＴＣＲの殺傷能力を動的に比較できる。
【００９４】
主な試薬と材料
９６ウェルプレート：Ｃｏｒｎｉｎｇから購入、品番：３６０３
ＹＯ−ＹＯ−３染色：ＮＣＩ−Ｈ１２９９肺癌細胞、ＡＴＣＣから購入したのは、野生型発現抗原ＮＹ−ＥＳＯ−１であるが、ＨＬＡタイピングはＡ０２０１ではない。
リアルタイムダイナミックライブセルイメージングアナライザー−ＩｎｃｕＣｙｔｅ  Ｚｏｏｍ：米国Ｅｓｓｅｎ社。
【００９５】
標的細胞の調製
ＮＣＩ−Ｈ１２９９：ＡＴＣＣから購入した野生型を本実験室で形質転換し、ＨＬＡ−Ａ０２０１レンチウイルスで直接野生型ＮＣＩ−Ｈ１２９９細胞株で形質導入され、ＮＹ−ＥＳＯ−１抗原とＨＬＡ−Ａ０２０１を発現できる陽性腫瘍細胞株を構築した。
【００９６】
エフェクター細胞の調製
エフェクター細胞の調製は、実施例２で説明したとおりであり、１Ｇ４ＴＣＲを形質導入しないＶδ２Ｔ細胞およびＧＦＰを形質導入したＶδ２Ｔ細胞群、および異なる親和性３２μＭ（野生型）、４μＭ、１．０７μＭ、４５０ｎＭ、８４ｎＭおよび５ｎＭの１Ｇ４ＴＣＲを形質導入したＶδ２Ｔ細胞をそれぞれ調製した。
【００９７】
方法
標的細胞を消化して遠心分離し、フェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ完全培地で再懸濁し、カウントし、７＊１０３個／ウェル／１００ｕｌとし、標的細胞を９６ウェルプレートに均一に広げ、３７度、５％のＣＯ２のインキュベーターに戻し、一晩インキュベートし、Ｅ：Ｔ＝５：１にしたがってエフェクター細胞を準備し、遠心分離し、元の培地を廃棄し、新しいフェノールレッドを含まないＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ培地（培地は、最終濃度１００００＊のＹＯＹＯ−３色素が混合された）と交換し、３．５＊１０４個／ウェル／１００ｕｌを使用して、エフェクター細胞と標的細胞を含む実験群を一緒にインキュベートし、標的細胞またはエフェクター細胞の対照群に、１００ｕｌの完全培地を各ウェルに追加して、各ウェルのＹＯＹＯ−３色素の最終濃度が１００００＊であることを保証し、プレートをＩｎｃｕｃｙｔｅ検出専用のリアルタイムダイナミックライブセルイメージングアナライザー−ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺｏｏＭに入れ、リアルタイム観察を開始して写真を撮り、ＩｎｃｕＣｙｔｅ  ＺｏｏＭ  ２０１６Ａを採用して検出結果を処理し、データをエクスポートして分析した。最終的な描画ソフトウェアは、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ７によって描画された。
【００９８】
結果
図６の検出結果に示したように、横軸はエフェクター細胞と標的細胞を一緒にインキュベートした時間を示し、縦軸は死滅細胞によるＹＯ−ＹＯ−３色素の吸収レベルを示し、殺傷の強さを測定するために使用される。殺傷動力学の分析から、野生型ＴＣＲの形質導入と比較して、高親和性ＴＣＲで形質導入されたＶδ２Ｔ細胞は、陽性腫瘍細胞株に対して有意に速い殺傷効果を示し、殺傷効率も大幅に向上された。
【００９９】
本発明に関する配列は以下の表のとおりである：
2021502815.tif 000002
2021502815.tif 000003
2021502815.tif 000004
2021502815.tif 000005
2021502815.tif 000006
2021502815.tif 000007
2021502815.tif 000008
2021502815.tif 000009
2021502815.tif 000010
2021502815.tif 000011
2021502815.tif 000012
2021502815.tif 000013
2021502815.tif 000014
2021502815.tif 000015
【０１００】
本発明で言及されるすべての文書は、あたかも各文書が個々に参照により組み込まれたかのように、本出願に参照により組み込まれている。さらに、本発明の上記の教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態も本願に添付された特許請求の範囲によって定義される範囲内にあることを理解されたい。
【図１ａ】
2021502815.tif 000016
【図１ｂ】
2021502815.tif 000017
【図１ｃ】
2021502815.tif 000018
【図１ｄ】
2021502815.tif 000019
【図１ｅ】
2021502815.tif 000020
【図１ｆ】
2021502815.tif 000021
【図１ｇ】
2021502815.tif 000022
【図１ｈ】
2021502815.tif 000023
【図１ｉ】
2021502815.tif 000024
【図１ｊ】
2021502815.tif 000025
【図１ｋ】
2021502815.tif 000026
【図１ｌ】
2021502815.tif 000027
【図１ｍ】
2021502815.tif 000028
【図１ｎ】
2021502815.tif 000029
【図１ｏ】
2021502815.tif 000030
【図１ｐ】
2021502815.tif 000031
【図１ｑ】
2021502815.tif 000032
【図１ｒ】
2021502815.tif 000033
【図１ｓ】
2021502815.tif 000034
【図１ｔ】
2021502815.tif 000035
【図１ｕ】
2021502815.tif 000036
【図１ｖ】
2021502815.tif 000037
【図１ｗ】
2021502815.tif 000038
【図１ｘ】
2021502815.tif 000039
【図２】
2021502815.tif 000040
【図３】
2021502815.tif 000041
【図４】
2021502815.tif 000042
【図５】
2021502815.tif 000043
【図６】
2021502815.tif 000044
【配列表】
2021502815000001.app
【国際調査報告】
2021502815.tif 000045
2021502815.tif 000046
2021502815.tif 000047
2021502815.tif 000048
2021502815.tif 000049
2021502815.tif 000050