(57)【要約】  インフルエンザヘマグルチニンステムポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、前記核酸を含むベクター、及びそれを含む医薬組成物、並びに、特にインフルエンザウイルス感染の予防及び／又は治療におけるそれらの使用方法が本明細書において提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含むグループ１インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドであって、
（ｉ）前記ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失；
（ｉｉ）前記ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変；
（ｉｉｉ）単量体内ジスルフィド架橋を形成する少なくとも２つのシステイン残基；
（ｉｖ）単量体間ジスルフィド架橋を形成する少なくとも２つのシステイン残基
を含むアミノ酸配列を含み、
ここで、３９２位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＰ、Ｒ又はＹ、好ましくは、Ｐ又はＲであり、４３４位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＱであり、前記アミノ酸の位置の番号付けはＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）で使用されているＨ３番号付けに基づいている、ＨＡステムポリペプチド。
【請求項２】
前記ステムポリペプチドは、
（ｉ）前記ＨＡ１ドメインの前記ヘッド領域の欠失であって、少なくとも５３位のアミノ酸に対応するアミノ酸から３０２位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を含む欠失；
（ｉｉ）前記ＨＡ２ドメインの前記三量体化領域の改変、好ましくはＣヘリックスにおける三量体化領域の改変であって、前記三量体化領域は、４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸から４１９位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を含む改変；
（ｉｉｉ）３１０位に対応するアミノ酸位置のシステイン及び４２２位に対応する位置のシステイン；
（ｉｖ）４０５位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９７位に対応する位置のシステイン、又は４０８位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９６位に対応する位置のシステイン、又は４０５位のシステインと組み合わせて３９９位に対応する位置のシステイン
を含むアミノ酸配列を含み、
ここで、３９２位に対応する位置のアミノ酸はＰ、Ｒ又はＹ、好ましくは、Ｐ又はＲであり、４３４位に対応する位置のアミノ酸はＱである、
請求項１に記載のポリペプチド。
【請求項３】
前記ＨＡ１ドメインの前記欠失は、少なくとも４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む、請求項１又は２に記載のポリペプチド。
【請求項４】
前記三量体化ドメインの前記改変は、前記Ｃヘリックスにおける異種三量体化ドメインの導入を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項５】
前記異種三量体化ドメインはＧＣＮ４配列である、請求項４に記載のポリペプチド。
【請求項６】
前記三量体化ドメインの前記改変は、Ｃヘリックスにおけるヘプタッド反復配列の最適化を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項７】
アミノ酸３９２に対応するアミノ酸はＹ、Ｐ又はＲであり、４３４位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＱであり、且つ４４２位に対応する位置のアミノ酸はＡである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項８】
４０５位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９７位に対応する位置にシステインを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項９】
−  ３９５位に対応する位置のアミノ酸はＩであり；
−  ３９９位に対応する位置のアミノ酸はＹ若しくはＣ、好ましくはＹであり；
−  ４００位に対応する位置のアミノ酸はＰであり；
−  ４０１位に対応する位置のアミノ酸はＫであり；
−  ４０２位に対応する位置のアミノ酸はＳであり；且つ／又は
−  ４０４位に対応する位置のアミノ酸はＲ若しくはＱである、
請求項１〜８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１０】
３２３位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＫであり、且つ／又は３２６位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＫである、請求項１〜９のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１１】
３３９位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＴである、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１２】
前記ポリペプチドはプロテアーゼ切断部位を含まない、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１３】
３２９位のアミノ酸はアルギニン（Ｒ）でなく、好ましくは３２９位のアミノ酸はグルタミン（Ｑ）である、請求項１２に記載のポリペプチド。
【請求項１４】
前記ポリペプチドは天然の切断部位又は多塩基性の切断部位を含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１５】
前記ポリペプチドはシグナル配列（の一部）を含む、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１６】
トランケートされたＨＡ２ドメインを含む、請求項１〜１５のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１７】
前記ポリペプチドは、膜貫通及び細胞質ドメインを含まない、請求項１６に記載のポリペプチド。
【請求項１８】
少なくとも、５１６位のアミノ酸に対応するアミノ酸で始まる前記ＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されている、請求項１〜１７のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項１９】
前記ＨＡ１ドメインにおける前記欠失は１〜１０個のアミノ酸からなる連結配列によって置換されている、請求項１〜１８のいずれか一項に記載のポリペプチド。
【請求項２０】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチドをコードする核酸。
【請求項２１】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のグループ１  ＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクター。
【請求項２２】
前記ベクターは組換えアデノウイルスベクターである、請求項２１に記載のベクター。
【請求項２３】
請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド及び／又は請求項２０に記載の核酸及び／又は請求項２１又は２２に記載のベクター、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項２４】
インフルエンザウイルスに対する免疫応答の誘導に使用するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド、請求項２０に記載の核酸、及び／又は請求項２１又は２２に記載のベクター。
【請求項２５】
ワクチンとして使用するための、請求項１〜１９のいずれか一項に記載のポリペプチド及び／又は請求項２０に記載の核酸及び／又は請求項２１又は２２に記載のベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は医薬の分野に関する。インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムドメインポリペプチド、前記ポリペプチドをコードする核酸、前記ポリペプチドを含む医薬組成物、及びそれらの使用方法が本明細書において提供される。
【背景技術】
【０００２】
インフルエンザウイルスは、不顕性感染から死亡をもたらし得る原発性ウイルス肺炎まで重症度に幅がある呼吸器疾患（一般に「インフルエンザ（ｉｎｆｌｕｅｎｚａ）」又は「流感（ｔｈｅ  ｆｌｕ）」と称される）を引き起こす、主要なヒト病原体である。感染の臨床作用は、インフルエンザ株の病原性並びに宿主の曝露、既往歴、年齢及び免疫状態によって変動する。毎年、世界中で約１０億人の人々がインフルエンザウイルスに感染し、３〜５百万例の重症例及び推定３００，０００〜５００，０００例のインフルエンザ関連死をもたらすと推定されている。これらの感染の大部分は、Ｈ１又はＨ３ヘマグルチニン亜型を担持するインフルエンザＡウイルスに起因し得、インフルエンザＢウイルスからの寄与は小さく、したがって、これらの代表物は通常、季節性ワクチンに含まれる。現在の予防接種の実施は、効果的な季節性インフルエンザワクチンの適時の生産を可能にするために、循環しているインフルエンザウイルスを早期に同定することに依存している。翌シーズンに有力になるであろう株を予測する固有の困難さとは別に、抗ウイルス薬耐性及び免疫逃避もまた、現在のワクチンが罹患及び死を防ぐのに失敗してしまう一因となっている。これに加え、病原体保有動物から発生し、ヒトからヒトへの拡散を増加させるように再集合した高病原性のウイルス株によって引き起こされるパンデミックの可能性は、地球規模の保健にとって重大で現実的な脅威をもたらす。
【０００３】
インフルエンザウイルスは、オルトミクソウイルス（Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ）科に属するエンベロープＲＮＡウイルスである。それらのゲノムは、１１種の異なるタンパク質、１種の核タンパク質（ＮＰ）、３種のポリメラーゼタンパク質（ＰＡ、ＰＢ１及びＰＢ２）、２種のマトリックスタンパク質（Ｍ１及びＭ２）、３種の非構造タンパク質（ＮＳ１、ＮＳ２及びＰＢ１−Ｆ２）並びに２種の外部糖タンパク質：ヘマグルチニン（ＨＡ）及びノイラミニダーゼ（ＮＡ）をコードする８つの一本鎖ＲＮＡセグメントからなる。
【０００４】
インフルエンザＡウイルスは、天然に広く分布しており、種々の鳥類及び哺乳動物に感染し得る。ウイルスは、ＨＡ及びＮＡタンパク質の抗原構造の差に基づき分類され、それらの様々な組合せは、特異的インフルエンザウイルス株にさらに分類される固有のウイルス亜型を表す。知られている全ての亜型は鳥類において見出すことができるが、現在循環しているヒトインフルエンザＡ亜型は、Ｈ１Ｎ１及びＨ３Ｎ２である。インフルエンザＡウイルスの系統解析により、ヘマグルチニンが２つの主要な、いわゆる系統グループ、とりわけ系統グループ１（グループ１ウイルス）のＨ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ９亜型と、とりわけ系統グループ２（グループ２ウイルス）のＨ３、Ｈ４及びＨ７亜型に細分化されることが示されている
【０００５】
インフルエンザＢ型ウイルス株は、厳密には、ヒトである。インフルエンザＢ型ウイルス株内のＨＡにおける抗原変異は、Ａ型株内で観察されるものよりも小さい。ヒトでは、Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ／１６／８８系統（Ｂ／Ｙａｍａｇａｔａ系統とも称される）及びＢ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ／２／８７（Ｂ／Ｖｉｃｔｏｒｉａ）系統によって表される通りの、２つの遺伝的及び抗原的に異なる系統のインフルエンザＢウイルスが循環している。インフルエンザＢウイルスにより引き起こされる疾患の範囲は一般にインフルエンザＡウイルスにより引き起こされるものよりも軽度であるが、入院を要する重度の病気がインフルエンザＢ感染で依然として頻繁に観察される。
【０００６】
インフルエンザウイルスを中和する抗体が主としてヘマグルチニン（ＨＡ）に対して向けられることは知られている。ヘマグルチニン又はＨＡは、ウイルス膜に固定され、以下の二重の機能を有する三量体糖タンパクである：細胞表面受容体シアル酸への結合に関与し、取り込まれた後は、ウイルスとエンドソーム膜の融合を媒介し、その結果、ウイルスＲＮＡが標的細胞の細胞質に放出される。ＨＡは、大型のヘッドドメイン及びより小型のステムドメインを含む。ステムドメインはＣ末端膜貫通ドメイン配列によってウイルス膜に固定される。このタンパク質は翻訳後に切断されて、２つのＨＡポリペプチド、ＨＡ１及びＨＡ２（完全な配列はＨＡ０と呼ばれる）を生じる（図１Ａ）。膜遠位ヘッド領域は、主としてＨＡ１に由来し、膜近位ステム領域は、主としてＨＡ２に由来する。ウイルス感染能の活性化にはＨＡ前駆体分子ＨＡ０の切断が必要であり、宿主における活性化プロテアーゼの分布はインフルエンザウイルスの病原性の決定因子の１つである。哺乳動物及び非病原性鳥ウイルスのＨＡは細胞外で切断されるため、宿主内での拡散は適切なプロテアーゼに出会う組織に限定される。一方、病原性ウイルスのＨＡは普遍的に存在するプロテアーゼによって細胞内で切断されるため、様々な細胞型に感染し、全身感染を引き起こす能力を有している。
【０００７】
季節性インフルエンザワクチンが毎年新しくされなければならない理由は、ウイルスの大きい変異性にある。ＨＡタンパク質において、この変異は、抗原ドリフト及びシフトが多数の異なるバリアントをもたらした頭部ドメイン中で特に顕在化される。これは、免疫優性の区域でもあるため、殆どの中和抗体はこのドメインに対して指向され、受容体結合を妨げることにより作用する。この免疫優性とヘッドドメインの大きな変異の組合せが、特定の株による感染が他の株に対する免疫につながらない理由を説明する。すなわち、初回感染によって誘発される抗体は、一次感染のウイルスと密接に関連した限られた数の株のみを認識する。
【０００８】
最近、完全なインフルエンザヘマグルチニン球状ヘッドドメイン又はその実質的な部分を欠くインフルエンザヘマグルチニンステムポリペプチドが報告され、ステムドメインポリペプチドの１つ以上の保存エピトープに対する免疫応答を生成するために使用されてきている。ステムドメインポリペプチドのエピトープは、球状ヘッドドメインの免疫原性高い領域よりも免疫原性が低く、したがってステムドメインポリペプチドに球状ヘッドドメインが存在しないことにより、ステムドメインポリペプチドの１つ以上のエピトープに対する免疫応答の発現が可能になると考えられている（Ｓｔｅｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。したがって、Ｓｔｅｅｌらは、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１Ｎ１）及びＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１９６８（Ｈ３Ｎ２）株のＨＡ１ドメインからアミノ酸残基５３〜２７６を欠失させ、その欠失させた配列を短い柔軟な連結配列ＧＧＧＧで置換することによって、インフルエンザＨＡステムポリペプチドを作製した。Ｈ３ＨＫ６８構築物によるマウスのワクチン接種は、グループ１のＨＡと交差反応性の抗血清を誘発しなかった。さらに、国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットにおいて示される通り、このステムポリペプチドは不安定であり、ステム領域中の保存エピトープに結合することが示された抗体の結合の欠落により証明される通り、正確な立体構造を採らなかった。
【０００９】
Ｂｏｍｍａｋａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）は、アミノ酸残基３３０〜５０１（ＨＡ２）、７アミノ酸リンカー（ＧＳＡＧＳＡＧ）、ＨＡ１のアミノ酸残基１６〜５５、６アミノ酸リンカーＧＳＡＧＳＡ、続くＨＡ１の残基２９０〜３２１を、ＨＡ１中の変異Ｖ２９７Ｔ、Ｉ３００Ｅ、Ｙ３０２Ｔ及びＣ３０５Ｔと共に含むＨＡ２をベースとしたポリペプチドを記載した。設計は、Ｈ３ＨＡ（Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１９６８）の配列をベースとした。このポリペプチドは、Ｈ３亜型内の別のインフルエンザウイルス株に対する交差保護を提供したにすぎなかった（Ａ／Ｐｈｉｌ／２／８２に対して提供したが、Ｈ１亜型（Ａ／ＰＲ／８／３４に対しては提供しなかった）。より最近のＢｏｍｍａｋａｎｔｉ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）による論文では、Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４）由来のＨＡに基づくステムポリペプチド（Ｈ１ＨＡ０ＨＡ６）が報告された。このポリペプチドでは、アミノ酸残基４８〜２８８の等価物が欠失され、そして変異Ｉ２９７Ｔ、Ｖ３００Ｔ、Ｉ３０２Ｎ、Ｃ３０５Ｓ、Ｆ３９２Ｄ、Ｆ３９５Ｔ及びＬ４０２Ｄが作られた。Ｈ３ベースポリペプチド及びＨ１ベースポリペプチドの両方が、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）中で発現され、したがって、天然のＨＡタンパク質の一部であるグリカンを欠く。
【００１０】
さらに最近、Ｌｕ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）もまた、Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０５／２００９のＨＡに由来する可溶性ステムポリペプチドを報告した。最終設計では、５２〜２７７のアミノ酸残基を欠失させ（リーダー配列も存在しない）、２つの変異、すなわちＦ３９２Ｄ及びＬ４０２Ｄをタンパク質のＢループに導入した。さらに、このポリペプチドは、Ｃ末端三量体化ドメイン（フォルドン）を含有した。さらに、２つの単量体間ジスルフィド架橋を、１つは三量体フォルドンドメインの区域に、１つは４１６位及び４１７位に導入した（すなわち、Ｈ３番号付けではＧ４１６Ｃ及びＦ４１７Ｃ）。このポリペプチドは、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）ベース無細胞系中で産生され（したがって、天然ＨＡタンパク質の一部であるグリカンを欠く）、使用前にリフォールドさせる必要がある変性形態で回収される。リフォールドされたタンパク質は、保存立体配座ステムエピトープに結合している広く中和する抗体（ｂｎＡｂ）ＣＲ６２６１に結合することができなかった。インフルエンザチャレンジの免疫学的データも保護データも示されていなかった。
【００１１】
別の論文、Ｍａｌｌａｊｏｓｙｕｌａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１４）もまたインフルエンザＨＡステムポリペプチドを報告した。この設計では、Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４由来のＨＡをベースとし、ＨＡ１配列の大部分が欠失しているだけでなく（残基４８〜２８９、Ｈ３番号付け）、ＨＡ２のＮ及びＣ末端配列の大部分も欠失している（それぞれ、残基３２３〜３６９、及び４４３〜末端）。このポリペプチドは、Ｃ末端にフォルドン三量体化ドメインを含有し、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）においても産生されたため、ウイルスＨＡ上の天然グリカンを欠いている。このポリペプチドは、ｂｎＡｂ  ＣＲ６２６１、Ｆ１０及びＦＩ６ｖ３に結合することが示され、マウスを致死的インフルエンザウイルスチャレンジ（Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４の１ＬＤ９０）から保護した。Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９及びＨ１Ｎ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０４／２００９のＨＡに由来する等価のポリペプチドも、部分的に保護し得た。Ｈ５Ｎ１  Ａ／Ｖｉｅｔ  Ｎａｍ／１２０３／２００４に由来するポリペプチドは、このチャレンジモデルにおいて限定された保護を与えたにすぎなかった。さらに、使用されるチャレンジモデルは、比較的低い投与用量（１〜２ＬＤ９０）で軽度であった。
【００１２】
最後に、Ｙａｓｓｉｎｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）もまた、Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｎｅｗ  Ｃａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９のＨＡに由来する安定化ＨＡステムポリペプチドの開発について報告した。この設計では、ＨＡ１配列（残基４３〜３１３、Ｈ３番号付け）及びＨＡ２配列（残基５０４〜末端）の大部分が欠失している。さらに、この設計はＨＡ２中に２つの安定化変異（Ｋ３８０Ｍ及びＥ４３２Ｌ）を含み、Ｈ．ピロリ（Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ）のフェリチンサブユニットに遺伝的に融合されて、安定化されたＨＡ−ステムポリペプチドを示す自己集合ナノ粒子を作製する。安定化ＨＡ−ステムポリペプチドは、フェリチンサブユニットに融合されなければ、可溶性でも機能的でもないようであった。ナノ粒子に集合したＨＡステム−フェリチンポリペプチドを、ヘテロ亜型Ｈ５Ｎ１  ２００４  ＶＮインフルエンザウイルスチャレンジモデル（マウス及びフェレットにおいてそれぞれ２５×ＬＤ５０及び１，０００×ＴＣＩＤ５０）において試験し、マウスを死から保護することができたが、フェレットでは部分的保護のみが観察された。ヒトでフェリチン反応がどの程度誘発されるか、また複数回投与でどのような影響が生じるかは不明である。
【００１３】
したがって、強固な広域中和抗体応答の産生を刺激し、広範な現在及び将来のインフルエンザウイルス株（季節性及び流行性の両方）に対する保護を提供する安全で有効な「ユニバーサル」ワクチン、特にインフルエンザの有効な予防及び／又は治療のために系統グループ１及び／又は系統グループ２内の１つ以上のインフルエンザＡウイルス亜型に対する保護を提供するワクチンが依然として必要とされている。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１４】
本発明は、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）由来の新規ポリペプチドを提供するものであり、このポリペプチドは、インフルエンザＨＡステムドメインを含み、球状ヘッド領域を欠き、本明細書中では、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドと呼ばれる。このポリペプチドは、対象、特にヒト対象に投与された場合、ＨＡに対する免疫応答を誘導する。本発明のポリペプチドは、膜遠位ヘッドドメイン中に存在する優性エピトープの非存在下で、ＨＡ分子の膜近位ステムの保存エピトープを、免疫系に提示する。したがって、ＨＡ０タンパク質の一次配列の一部、すなわち、ヘッドドメインを構成する部分は欠失しており、残りのアミノ酸配列は、アミノ酸鎖の連続性を回復させるために、直接、又はいくつかの実施形態では、短い柔軟な連結配列（「リンカー」）を導入して再連結されている。得られたアミノ酸配列は、ＨＡ分子の残留部分の天然三次元構造を安定化する特定の変異を導入することによりさらに改変される。
【００１５】
第１の態様では、本発明は、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含むグループ１インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドに関し、前記ポリペプチドは、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含む完全長ＨＡポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、
（ｉ）ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失；
（ｉｉ）ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、好ましくはＣヘリックスの改変、
（ｉｉｉ）単量体内ジスルフィド架橋を形成する（ことができる）少なくとも２つのシステイン残基；
（ｉｖ）単量体間ジスルフィド架橋を形成する（ことができる）少なくとも２つのシステイン残基
（ここで、３９２位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＰ、Ｒ又はＹ（好ましくは、Ｐ又はＲ）であり、４３４位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＱであり、アミノ酸の位置の番号付けはＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）で使用されているＨ３番号付けに基づいている）を含むアミノ酸配列を含む。
【００１６】
特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含むグループ１インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドに関し、前記ＨＡステムポリペプチドは、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含む完全長ＨＡポリペプチド（ＨＡ０）のアミノ酸配列と比較して、
（ｉ）ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失であって、少なくとも５３位のアミノ酸に対応するアミノ酸から３０２位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を含む欠失；
（ｉｉ）ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、好ましくはＣヘリックスにおける三量体化領域の改変であって、前記三量体化領域は４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸から４１９位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を含む、改変；
（ｉｉｉ）単量体内ジスルフィド架橋を形成する（ことができる）、３１０位に対応するアミノ酸位置のシステイン及び４２２位に対応する位置のシステイン；
（ｉｖ）４０５位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９７位に対応する位置のシステイン、又は４０８位に対応する位置のシステインと組み合わせて３９６位に対応する位置のシステイン、又は４０５位のシステインと組み合わせて３９９位に対応する位置のシステイン
（ここで、３９２位に対応する位置のアミノ酸はＰ、Ｒ又はＹ（好ましくは、Ｐ又はＲ）であり、４３４位に対応する位置のアミノ酸はＱであり、アミノ酸の位置の番号付けはＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）で使用されているＨ３番号付けに基づいている）を含むアミノ酸配列を含む。
【００１７】
本発明によれば、驚くべきことに、本発明の新規なインフルエンザＨＡステムポリペプチドは高レベルで発現され得、細胞培養上清中で圧倒的に三量体であり、より大きな安定性をもたらす高い融解温度を有することが示された。さらに、本発明のＨＡステムポリペプチドは、ＣＲ９１１４及び／又はＣＲ６２６１などのＨＡステム結合ｂｎＡｂのエピトープを安定して提示することによって、完全長ＨＡのステムを模倣する。
【００１８】
さらなる態様では、本発明は、インフルエンザＨＡステムドメインポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。
【００１９】
さらに別の態様では、本発明は、インフルエンザＨＡステムポリペプチドをコードする核酸を含むベクター、特に組換えアデノウイルスベクターを提供する。
【００２０】
さらなる態様では、本発明は、それを必要とする対象にインフルエンザＨＡに対する免疫応答を誘導する方法であって、対象に、本発明によるインフルエンザＨＡステムポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターを投与することを含む方法を提供する。
【００２１】
別の態様では、本発明は、本発明によるインフルエンザＨＡステムポリペプチド、核酸分子及び／又はベクター、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００２２】
さらなる態様では、本発明は、薬剤として使用するための、特に系統グループ１及び／若しくは２のインフルエンザウイルスＡ株、並びに／又はインフルエンザＢウイルス株によって引き起こされる疾患又は病態の予防及び／又は治療のためのワクチンとして使用するための、インフルエンザＨＡステムポリペプチド、前記インフルエンザＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子、及び／又は前記核酸分子を含むベクターを提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】Ａ．本発明のポリペプチドの図式的外観；Ｂ．ＨＡのヘッド領域の除去は、本発明のステムポリペプチド（ミニＨＡ）をもたらす；Ｃ．本発明のステムベースのポリペプチドの三次元表示。
【図２】Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅベースの親構築物５３６７の概略図。
【図３】Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅベースの親構築物５３６９の概略図。
【図４】Ｂループの３９２位のアミノ酸のＰ又はＲへの新しい変異、４３４位のアミノ酸のＱへの変異、及び４４２位のＡへの変異を示し、さらに４０４位のアミノ酸のＱへの変異を含む、本発明のポリペプチドの実施形態の概略図。
【図５】本発明のいくつかのポリペプチド（灰色）及び親設計（黒色）の発現レベル及び三量体含量。Ａ：ＯＣＴＥＴによって決定されたタンパク質発現レベル（ＣＲ９１１４）；Ｂ及びＣ：ＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定された三量体含量（値は、１００％に設定したポリペプチドＵＦＶ１６０６５６に対する％で表される；ポリペプチド５３６７の値はウェスタンブロットに基づく推定値である）。実験は複数回実施され、これらのデータは観察された値の代表値である。安定化変異を左のパネルに示す。
【図６】サイズ排除クロマトグラフィーによって分離した、プールアフィニティークロマトグラフィー溶出画分；凝集体、三量体及び単量体を示す（パネルＡ及びＢ）。プール三量体画分のＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析は、本発明のポリペプチドが非常に純粋であり、モル質量が均一であることを示す（パネルＣ）。
【図７】本発明の三量体ステムポリペプチド及びＦａｂフラグメントのＳＥＣプロファイル。オーバーレイは、ポリペプチド（黒色）、Ｆａｂフラグメント（破線）、及び両方を含む試料（灰色）のクロマトグラムを示す。ポリペプチド１６０６５６の結果を表示する。パネルＡにおける重なり合ったピークは、陰性対照として使用したＦａｂがポリペプチドに結合しないことを示し、一方、Ｆａｂ６２６１（パネルＢ）及びＦａｂ９１１４（パネルＣ）と共にプレインキュベートされたポリペプチドは、複合体の形成（３つのＦａｂフラグメントによって結合された１つの三量体）を示すピークシフト（保持時間の減少）を示す。
【図８】ＨＡヘッドドメイン（ＨＡ１）除去の概略図。親デザインにおいて、ヘッドドメインを除去し、２つのＨＡ１末端を人工の「ＧＧＧＧリンカー」（左のパネル）で連結する。本発明のポリペプチドにおいて、末端を、直接連結する（代替切断位置）か、又はヘッドドメインに由来する相同リンカー配列によって連結する。
【図９】ＡｌｐｈａＬＩＳＡによって決定される、本発明のポリペプチドの発現レベル、抗体結合及び三量体含量。Ａ：発現レベル、Ｂ：ＣＲ９１１４結合、及びＣ：三量体含量。代替切断を含むデザインは灰色に着色され（左パネル）、代替リンカーを含むデザインは淡灰色に着色されている。全てのデータは、参照デザインＵＦＶ１６０３６０（黒）に対して正規化されている。
【図１０】本発明のポリペプチドの発現レベル及び三量体化。発現レベルはＯＣＴＥＴ（パネルＡ）によって決定し、三量体含量は、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ（パネルＢ）によって決定した。データは参照ポリペプチドＵＦＶ１５０８５０に対して正規化されている。
【図１１】正規化された発現レベル、三量体含量、及びＣＲ９１１４結合。培養上清をＡｌｐｈａＬＩＳＡによって分析した。参照構築物ＵＦＶ１６００９７はＧＣＮ４様ヘプタッド反復を含み、黒色で示され、一方、代替ヘプタッド反復を含むポリペプチドは灰色に着色されている。ＣＲ９１１４結合レベルを、決定された発現レベルによって正規化した。
【図１２】発現及び代替Ｃ末端切断を有するポリペプチドバリアントへの抗体結合。Ａ：ＨＡ特異的単一ドメイン抗体を用いたウェスタンブロット。殆ど全ての試料が、両参照ポリペプチド（ＵＦＶ５３６７及びＵＦＶ５３６９）に類似する三量体高さに明瞭なバンドを示す。Ｂ：ＯＣＴＥＴによって決定された、広域中和抗体ＣＲ９１１４に対するポリペプチドの結合を、参照デザインＵＦＶ５３６７及びＵＦＶ５３６９と比較した、ポリペプチドの相対Ｋｏｎ値で示す。
【図１３】正規化した発現レベル、三量体含量及びＣＲ９１１４結合。培養上清をＡｌｐｈａＬＩＳＡによって分析した。参照構築物ＵＦＶ１６００９０は黒色で示され、一方、選択的な位置に導入されたシステインを含むポリペプチドは灰色に着色されている。三量体含量及びＣＲ９１１４結合レベルを、決定された発現レベルに基づいて正規化した。
【図１４】Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）のＨ３番号付けによる、Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９及びＵＦＶ１６０６６４におけるアミノ酸位置の番号付け。
【図１５】本発明のポリペプチドでマウスを免疫した後のＨ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７  ＦＬ  ＨＡ特異的抗体力価。破線はＬＬＯＱ（定量下限）を示し、１グループごとの水平線はグループ中央値を示す。
【図１６】上のパネル：本発明のポリペプチドで免疫したマウスのＨ１Ｎ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７チャレンジ後の追跡期間中の生存率。下のパネル：本発明のポリペプチドで免疫したマウスのＨ１Ｎ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７チャレンジ後の追跡期間中の相対体重。相対体重変化は、０日目に対して表した。追跡期間中の累積体重減少は曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することにより決定した。エラーバーは、９５％信頼区間を示す。
【図１７】上のパネル：本発明のポリペプチドで免疫したマウスのＨ１Ｎ１  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４チャレンジ後の追跡期間中の生存率。下のパネル：本発明のポリペプチドで免疫したマウスのＨ１Ｎ１  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４チャレンジ後の追跡期間中の相対体重。相対体重変化は、０日目に対して表した。追跡期間中の累積体重減少は曲線下面積（ＡＵＣ）を計算することにより決定した。エラーバーは、９５％信頼区間を示す。
【図１８】本発明のポリペプチドによるフェレットの免疫化後のＨ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９  ＦＬ  ＨＡ特異的抗体力価。最高用量で開始する事後ｔ検定及び多重比較のためのボンフェローニ調整を含む打ち切りＡＮＯＶＡを用いた、異なる用量の本発明のポリペプチド及びＳＯＣの、アジュバントのみの群に対する統計的比較。破線は、ＵＬＬＯＱ（定量上限）及びＬＬＯＱを示す。１グループごとの水平線はグループ中央値を示す。
【図１９】本発明のポリペプチドによるフェレットの免疫化後のＨ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９  ＦＬ  ＨＡステム特異的抗体力価。最高用量で開始する事後ｔ検定及び多重比較のためのボンフェローニ調整を含む打ち切りＡＮＯＶＡを用いた、異なる用量の本発明のポリペプチド及びＳＯＣの、アジュバントのみの群に対する統計的比較。１グループごとの水平線はグループ中央値を示す。
【図２０】本発明のポリペプチドでフェレットを免疫化し、続いてＨ１Ｎ１  Ａ／ＮＬ／６０２／０９でチャレンジした後の追跡期間の終わり（チャレンジ後４日目）における肺のウイルス量力価。１グループごとの水平線はグループ中央値を示し、白抜きの記号は、検出限界（ＬＯＤ）における試料を示す。
【図２１】本発明のポリペプチド、Ｈ５  ＦＬ  ＨＡ（陽性チャレンジ対照）及びアジュバントのみ（陰性チャレンジ対照）で免疫化し、続いてＨ５Ｎ１  Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５でチャレンジしたフェレットの５日間の追跡期間中の生存。
【図２２】本発明のポリペプチドで免疫化し、続いてＨ５Ｎ１  Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５でチャレンジしたフェレットの追跡期間（０〜５日目）中の連続した毎日の体重測定から得られた、個々の動物の、０日目の体重に対する累積（ＡＵＣ）体重減少。１グループごとの水平線はグループ中央値を示す。
【図２３】本発明のポリペプチドでフェレットを免疫化し、続いてＨ５Ｎ１  Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５でチャレンジした後、死亡日又は追跡期間の終わり（チャレンジ後５日目）の肺ウイルス量力価。１グループごとの水平線はグループ中央値を示し、白抜きの記号は、検出限界（ＬＯＤ）における試料を示す。
【図２４】本発明のポリペプチドで免疫化し、続いてＨ５Ｎ１  Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５でチャレンジしたフェレットの追跡期間（０〜５日目）中の連続した毎日の咽頭スワブから得られた、０日目の体重に対する累積（ＡＵＣ）咽頭ウイルス量。１グループごとの水平線はグループ中央値を示す。
【図２５】本発明のポリペプチドによるマウスの免疫化後のＨ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９  ＦＬ  ＨＡ特異的抗体力価。破線はＬＬＯＱ（定量下限）を示し、白抜きの記号はＬＬＯＱにおける試料を示し、１グループごとの水平線はグループ中央値を示す。
【図２６】本発明のポリペプチドによるマウスの免疫化後のＨ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９  ＦＬ  ＨＡステム特異的抗体力価。破線はＬＬＯＱ（定量下限）を示し、白抜きの記号はＬＬＯＱにおける試料を示し、１グループごとの水平線はグループ中央値を示す。
【図２７】インビトロでのＵＦＶ１６０６６４ペプチドによる刺激後の、免疫化マウス脾細胞１００万個当たりのＩＦＮ−γ産生Ｔ細胞。破線はＬＬＯＱ（定量下限）を示し、白抜きの記号はＬＬＯＱにおける試料を示し、１グループごとの水平線はグループ中央値を示す。
【図２８−１】ＵＦＶ１６０６６４構築物の変異を転移させた、異なったグループ１インフルエンザ株由来の三量体ステムポリペプチドを発現したＥＸＰＩ−ＣＨＯの培養上清のインビトロでの特性評価。Ａ．ＯＣＴＥＴ（抗Ｈｉｓ２）により測定されたタンパク質発現レベル；Ｂ．ＳＥＣプロフィール、三量体及び単量体ピークをそれぞれ「Ｔ」及び「Ｍ」で示す；Ｃ．ＡｌｐｈａＬＩＳＡにより測定されたｍＡｂ  ＣＲ９１１４及びＭＤ３６０６に対するポリペプチドの結合曲線。Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９）株における本発明の三量体ステムポリペプチドの変異は、他のグループ１の骨格に転移可能であり；三量体ミニＨＡが発現され、ステム特異的抗体ＣＲ９１１４及びマルチドメインＭＤ３６０６の結合が観察される。
【図２８−２】（上記の通り。）
【発明を実施するための形態】
【００２４】
定義
本発明において使用される用語の定義を以下に示す。
【００２５】
本発明によるアミノ酸は、２０の天然（若しくは「標準」アミノ酸）又はそのバリアント、例えばＤ−プロリン（プロリンのＤ−エナンチオマー）など、或いはタンパク質中に天然では見出されない任意のバリアント、例えばノルロイシンなどのいずれかであり得る。標準アミノ酸は、その特性に基づいて、いくつかのグループに分類することができる。重要な因子は、電荷、親水性又は疎水性、サイズ、及び官能基である。これらの特性は、タンパク質構造及びタンパク質間相互作用にとって重要である。一部のアミノ酸は、特別な特性を有し、例えば、システインは、他のシステイン残基と共有ジスルフィド結合（又はジスルフィド架橋）を形成し得、プロリンは、ポリペプチド骨格と環を形成し、グリシンは、他のアミノ酸よりもフレキシブルである。表１２は、標準アミノ酸の略語及び特性を示す。
【００２６】
本明細書で使用される用語「含まれる（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」又は「例として（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の後には、語「限定されるものではないが」が続くとみなされる。
【００２７】
本明細書で使用される用語「感染」は、細胞又は対象におけるウイルスの侵入、増殖及び／又は存在を意味する。一実施形態では、感染は、「活性」感染、すなわち、ウイルスが細胞又は対象において複製しているものである。このような感染は、ウイルスが最初に感染した細胞、組織、及び／又は器官から他の細胞、組織、及び／又は器官へウイルスが拡散することを特徴とする。感染はまた、潜伏感染、すなわち、ウイルスが複製していないものであり得る。特定の実施形態では、感染は、細胞若しくは対象中のウイルスの存在から生じる、又はウイルスの細胞若しくは対象への侵入による病理学的状態を指す。
【００２８】
インフルエンザウイルスは一般的に次のインフルエンザウイルス型：Ａ属、Ｂ属及びＣ属に分類される。本明細書で使用される用語「インフルエンザウイルス亜型」は、ヘマグルチニン（Ｈ）及びノイラミニダーゼ（Ｎ）のウイルス表面タンパク質の組合せを特徴とするインフルエンザＡウイルスバリアントを指す。本発明によれば、インフルエンザウイルス亜型は、それらのＨ番号、例えば、「Ｈ３亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス」、「Ｈ３亜型のインフルエンザウイルス」若しくは「Ｈ３インフルエンザ」など、又はＨ番号及びＮ番号の組合せ、例えば、「インフルエンザウイルス亜型Ｈ３Ｎ２」若しくは「Ｈ３Ｎ２」などにより称することができる。用語「亜型」には、具体的には、通常、変異から生じ、異なる病原プロファイルを示すそれぞれの亜型内の全ての個々の「株」、例として、天然分離株、及び人工変異体又はリアソータントなどが含まれる。かかる株はまた、ウイルス亜型の様々な「分離株」と称され得る。したがって、本明細書で使用される場合、用語「株」と「分離株」とは互換的に使用され得る。ヒトインフルエンザウイルス株又は分離株についての現在の命名法には、ウイルスの型（属）、すなわち、Ａ、Ｂ又はＣ、最初の分離の地理的場所、株番号及び分離年に、通常括弧内に挙げられるＨＡ及びＮＡの抗原の記載が含まれ、例えば、Ａ／Ｍｏｓｃｏｗ／１０／００（Ｈ３Ｎ２）である。非ヒト株には、命名法において起源の宿主も含まれる。
【００２９】
インフルエンザＡウイルスの亜型は、それらの系統グループを参照することによりさらに分類することができる。系統解析により、ヘマグルチニンの２つの主要なグループへの細分化が示されている：とりわけ系統グループ１（「グループ１」インフルエンザウイルス）のＨ１、Ｈ２、Ｈ５及びＨ９亜型と、とりわけ系統グループ２（「グループ２」インフルエンザウイルス）のＨ３、Ｈ４、Ｈ７及びＨ１０亜型。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「インフルエンザウイルス疾患」又は「インフルエンザ」は、対象におけるインフルエンザウイルス（例えば、インフルエンザＡ又はＢウイルス）の存在から生じる病理学的状態を指す。本明細書で使用される場合、用語「疾患」及び「障害」は、互換的に使用される。特定の実施形態では、この用語は、インフルエンザウイルスによる対象の感染によって引き起こされる呼吸器の病気を指す。
【００３１】
本明細書で使用される場合、用語「核酸」又は「核酸分子」には、ＤＮＡ分子（例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡ）及びＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）並びにヌクレオチドアナログを使用して生成されたＤＮＡ又はＲＮＡのアナログが含まれるものとする。核酸は、一本鎖又は二本鎖であり得る。核酸分子は、当業者には容易に理解されるであろうように、化学的若しくは生化学的に改変されてもよいし、非天然若しくは誘導体化ヌクレオチド塩基を含んでもよい。このような改変には、例えば、標識、メチル化、アナログによる天然ヌクレオチドの１つ以上の置換、ヌクレオチド間改変、例えば、無荷電結合（例えば、メチルホスホネート、ホスホトリエステル、ホスホラミデート、カルバメートなど）、荷電結合（例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエートなど）、懸垂部分（例えば、ポリペプチド）、挿入剤（例えば、アクリジン、プソラレンなど）、キレート化剤、アルキル化剤、及び改変結合（例えば、アルファアノマー核酸など）が含まれる。核酸配列について述べる場合、核酸配列は、別段の記載がない限り、その相補体を包含する。したがって、特定の配列を有する核酸分子について述べる場合、この核酸分子は、その相補的な配列を有する相補鎖を包含すると理解されたい。相補鎖はまた、例えばアンチセンス療法、ハイブリダイゼーションプローブ及びＰＣＲプライマーに有用である。
【００３２】
本明細書で使用される場合、ＨＡ中のアミノ酸の番号付けは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）に記載されるようなＨ３番号付けに基づいている。したがって、アミノ酸残基又はアミノ酸位置の番号付けは、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）の図２に記載され示されるように、完全長Ｈ３  ＨＡにおける番号付け（特に、Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／６８におけるアミノ酸位置の番号付け）を指す。  番号付けは、特に、配列番号１５におけるアミノ酸位置の番号付けを指す。例えば、「３９２位のアミノ酸」又は「３９２位のアミノ酸に対応するアミノ酸」（これらは、本願を通して互換的に使用される）という表現は、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）のＨ３番号付けによる３９２の位置にあるアミノ酸残基を指す。本発明のポリペプチドにおいて、ＨＡ１ドメイン（ヘッドドメイン）の一部は欠失されているので、本明細書で使用される番号付けは、本発明のＨＡステムポリペプチドにおけるアミノ酸の実際の位置を指すとは限らないことに留意されたい。さらに、他のインフルエンザウイルス株及び／又はサブタイプ、例えば（Ｈ１  ＨＡ）及び本発明のステムポリペプチドにおける等価なアミノ酸は、配列アラインメント（例えば、図１４に示すような）によって決定し得ることは、当業者であれば理解されよう。
【００３３】
「ポリペプチド」は、当業者に知られているように、アミド結合により結合しているアミノ酸の重合体を指す。本明細書で使用される場合、この用語は、共有アミド結合により結合している単一ポリペプチド鎖を指し得る。この用語はまた、非共有相互作用、例えば、イオン接触、水素結合、ファン・デル・ワールス接触及び疎水性接触により会合している複数のポリペプチド鎖を指し得る。この用語に、例えば、シグナルペプチド切断、ジスルフィド結合形成、グリコシル化（例えば、Ｎ結合及びＯ結合グリコシル化）、プロテアーゼ切断及び脂質改変（例えば、Ｓ−パルミトイル化）などの翻訳後プロセシングにより改変されたポリペプチドが含まれることを、当業者は認識するであろう。
【００３４】
「ＨＡステムポリペプチド」は、天然（又は野生型）ヘマグルチニン（ＨＡ）のヘッドドメインを含まないＨＡ由来のポリペプチドを指す。本明細書で使用される場合、用語「野生型」は、天然に循環しているインフルエンザウイルス由来のＨＡを指す。
【００３５】
詳細な説明
インフルエンザウイルスは、世界規模の公衆衛生に対して顕著な影響を及ぼし、毎年数百万の重病の症例、数千人の死亡、及びかなりの経済的損失を引き起こしている。現在の３価又は４価のインフルエンザワクチンは、ワクチン株及び密接に関連する分離株に対し、強力な中和抗体応答を誘発するが、ある亜型内のより分岐した株又は他の亜型に及ぶことは殆どない。さらに、適切なワクチン株の選択は多くの困難を提示し、準最適保護を頻繁にもたらす。さらに、次の流行性ウイルスの亜型を予測することは、それがいつどこで生じるかを含め、現在は未だ不可能である。
【００３６】
ヘマグルチニン（ＨＡ）は、中和抗体の主要な標的であるインフルエンザウイルスからの主要なエンベロープ糖タンパク質である。ヘマグルチニンは、侵入プロセスの間の２つの主要な機能を有する。第１に、ヘマグルチニンは、シアル酸受容体との相互作用によって標的細胞の表面へのウイルスの付着を媒介する。第２に、ウイルスのエンドサイトーシス後、ヘマグルチニンは、続いてウイルス及びエンドソーム膜の融合を生んでそのゲノムを標的細胞の細胞質中に放出させる。ＨＡは、宿主由来の酵素により開裂されてジスルフィド結合により結合状態が保たれる２つのポリペプチド（ＨＡ１及びＨＡ２）を生成する約５００のアミノ酸からなる大型エクトドメインを含む。Ｎ末端断片（ＨＡ１ドメイン、３２０〜３３０アミノ酸）の大部分は、受容体結合部位及びウイルス中和抗体により認識される殆どの抗原決定基を含有する膜遠位球状「ヘッドドメイン」を形成する。より小型のＣ末端部分（ＨＡ２ドメイン、約１８０アミノ酸）は、球状ドメインを細胞膜又はウイルス膜に固定するステム様構造を形成する。亜型間の配列同一性の程度は、ＨＡ１ポリペプチド（３４％〜５９％の亜型間同一性）がＨＡ２ポリペプチド（５１〜８０％の同一性）よりも小さい。殆どの保存領域は、プロテアーゼによる切断部位周囲の配列、特にＨＡ２  Ｎ末端の２３アミノ酸であり、それは全てのインフルエンザＡウイルス亜型で保存される（Ｌｏｒｉｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。この領域の一部は、ＨＡ前駆体分子（ＨＡ０）中で表面ループとして曝露されるが、ＨＡ０がＨＡ１及びＨＡ２に開裂されると接近不可能になる。
【００３７】
殆どの中和抗体は、受容体結合部位を包囲するループに結合し、それによって受容体結合及び付着を妨げる。これらのループは変異性が高いため、それらの領域を標的化する殆どの抗体は、株特異的であり、なぜ現在のワクチンがそのような限定された株特異的免疫を誘発するかを説明する。しかしながら、近年、例えば、ＣＲ６２６１などの、広域交差中和効力を有するインフルエンザウイルスヘマグルチニンに対する完全ヒトモノクローナル抗体が生成された。機能及び構造分析により、それらの抗体が膜融合プロセスを妨げ、グループ１のインフルエンザＨＡタンパク質のステムドメイン中の保存性の高いエピトープに向けられることが明らかになった（Ｔｈｒｏｓｂｙ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｅｋｉｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．２００９、国際公開第２００８／０２８９４６号パンフレット）。グループ１及び２の多くのＨＡ分子と交差反応するＣＲ９１１４様抗体の同定により（国際公開第２０１３／００７７７０号パンフレットに記載されている）、ヒト免疫系がインフルエンザウイルスに対する極めて広域の中和抗体を誘発することが可能であることが明らかになった。しかしながら、毎年のワクチン接種スキームの必要性を考慮すると、それらの抗体は、亜型Ｈ１及び／又はＨ３の（季節性）インフルエンザウイルスによる感染後にもワクチン摂取後にも明らかに誘発されないか、又は極めて低い程度で誘発されるにすぎない。
【００３８】
本発明によれば、抗体ＣＲ６２６１（配列番号１１の重鎖可変領域及び配列番号１２の軽鎖可変領域を含む）及び／又は抗体ＣＲ９１１４（配列番号９の重鎖可変領域及び配列番号１０の軽鎖可変領域を含む）の特異的エピトープを模倣する新規なＨＡステムポリペプチドが提供される。本発明のポリペプチドは、インビボで単独で、又は他の予防的及び／又は治療的処置と組み合わされて投与された場合に、インフルエンザウイルス中和抗体、好ましくは交差中和抗体を誘発するために使用され得る。「交差中和抗体」とは、系統グループ１のインフルエンザＡウイルスの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、４つ、若しくは５つの異なる亜型、又は系統グループ２のインフルエンザＡウイルスの少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、４つ、若しくは５つの異なる亜型、又はインフルエンザＢウイルスの少なくとも２つの異なる亜型を中和することができる抗体、或いは、少なくとも１つのグループ１インフルエンザウイルス、及び少なくとも１つのグループ２インフルエンザウイルス、及び／又は少なくとも１つのインフルエンザＢウイルスを中和することができる抗体を意味する。
【００３９】
このような抗体のエピトープを安定に提示するインフルエンザＨＡステムポリペプチドは、以前に国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットに記載されている。これらのＨＡステムポリペプチドの少なくともいくつかは、ＣＲ６２６１及び／又はＣＲ９１１４のエピトープを安定に提示することができ、マウスにおいて免疫原性であることが示された。ＣＲ６２６１及び／又はＣＲ９１１４のエピトープを安定に提示することができるさらなるＨＡステムドメインポリペプチドは、国際公開第２０１４／１９１４３５号パンフレット、国際公開第２０１６／００５４８０号パンフレット、及び国際公開第２０１６／００５４８２号パンフレットに記載されている。
【００４０】
新規な改変を含む本発明のＨＡステムポリペプチドは、先に記載されたＨＡステムポリペプチドと比較して、哺乳動物細胞における発現レベルの増加、三量体化傾向の増加（例えば、ＡｌｐｈａＬＩＳＡによる測定）及び／又は熱安定性レベルの増加（例えば、動的走査蛍光測定／熱量測定（ＤＳＦ／ＤＳＣ）による測定）を示す。さらに、本発明のポリペプチドに対する親和性を試験した全てのｂｎＡｂで、親和性は１ｎＭ未満であり（Ｏｃｔｅｔ及びＥＬＩＳＡによる測定）、これは完全長ＨＡに対する抗体の親和性に類似する。これは、ポリペプチドが天然の完全長ＨＡのステムを模倣していることを明らかに示している。さらに、この新規なＨＡステムポリペプチドは、人工リンカーも、タグも、Ｎ末端三量体化ドメインも、Ｃ末端三量体化ドメインも必要としない。
【００４１】
したがって、本発明は、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含むグループ１インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドを提供し、前記ポリペプチドは、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含む完全長ＨＡポリペプチド（ＨＡ０）のアミノ酸配列と比較して、
（ｉ）ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失；
（ｉｉ）ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、好ましくはＣヘリックスの改変、
（ｉｉｉ）単量体内ジスルフィド架橋を形成する（ことができる）少なくとも２つのシステイン残基；
（ｉｖ）単量体間ジスルフィド架橋を形成する（ことができる）少なくとも２つのシステイン残基；
（ここで、３９２位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＰ、Ｒ又はＹ（好ましくは、Ｐ又はＲ）であり、４３４位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＱであり、アミノ酸の位置の番号付けはＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）によるＨ３番号付けに基づいている）を含むアミノ酸配列を含む。
【００４２】
したがって、本発明は、
ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、好ましくはＣヘリックスの改変、
単量体内ジスルフィド架橋を形成する少なくとも２つのシステイン残基；
単量体間ジスルフィド架橋を形成する少なくとも２つのシステイン残基；
（ここで、３９２位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＰ、Ｒ又はＹ（好ましくは、Ｐ又はＲ）であり、４３４位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＱであり、アミノ酸の位置の番号付けはＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）で使用されているＨ３番号付けに基づいている）を含むＨＡステムポリペプチド（すなわち、ヘッドレスＨＡポリペプチド）を提供する。
【００４３】
特定の実施形態では、本発明は、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含むグループ１インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドを提供し、前記ＨＡステムポリペプチドは、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含む、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含む完全長ＨＡポリペプチド（ＨＡ０）のアミノ酸配列と比較して、
（ｉ）ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失であって、少なくとも５３位のアミノ酸から３０２位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む、欠失；
（ｉｉ）ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、好ましくはＣヘリックスにおける三量体化領域の改変であって、前記領域は４０５位のアミノ酸に対応するアミノ酸から４１９位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を含む、改変；
（ｉｉｉ）３１０位のシステイン及び４２２位のシステイン；
（ｉｖ）４０５位のシステインと組み合わせて３９７位のシステイン、又は４０８位のシステインと組み合わせて３９６位のシステイン、又は４０５位のシステインと組み合わせて３９９位のシステイン
（ここで、３９２位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＰ、Ｒ又はＹ（好ましくは、Ｐ又はＲ）であり、４３４位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＱであり、アミノ酸の位置の番号付けはＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）によるＨ３番号付けに基づいている）を含むアミノ酸配列を含む。
【００４４】
特定の実施形態では、本発明は、
（ｉ）ＨＡ１ドメインのヘッド領域の欠失であって、少なくとも５３位のアミノ酸から３０２位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む欠失；
（ｉｉ）ＨＡ２ドメインの三量体化領域の改変、好ましくはＣヘリックスにおける三量体化領域の改変であって、前記領域は４０５位のアミノ酸から４１９位のアミノ酸に対応するアミノ酸までのアミノ酸配列を含む、改変；
（ｉｉｉ）３１０位及び４２２位のアミノ酸のＣへの変異；
（ｉｖ）３９７位のアミノ酸のＣへの変異及び４０５位のアミノ酸のＣへの変異、又は３９６位のアミノ酸のＣへの変異及び４０８位のアミノ酸のＣへの変異、又は３９９位のアミノ酸のＣへの変異及び４０５位のアミノ酸のＣへの変異
（ここで、ポリペプチドはＢループにおける少なくとも１つの変異をさらに含み、前記Ｂループは３８５位のアミノ酸から４０４位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含み、前記Ｂループにおける少なくとも１つの変異は３９２位のアミノ酸のＰ、Ｒ又はＹ、好ましくはＰ又はＲへの変異であり、ポリペプチドは４３４位のアミノ酸のＱへの変異を含み、
アミノ酸の位置の番号付けはＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）で使用されているＨ３番号付けに基づいている）を含むグループ１インフルエンザＡヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドを提供する。
【００４５】
本発明によれば、驚くべきことに、例えば、４３４位のアミノ酸のＱへの変異を導入することによる、４３４位のアミノ酸位置Ｑと組み合わされて、例えば、Ｂループの３９２位のアミノ酸のＹ、Ｐ又はＲ、好ましくはＰ又はＲへの変異を導入することによる、３９２位にアミノ酸残基Ｙ、Ｐ又はＲ、好ましくはＰ又はＲを有するＨＡステムポリペプチドは、以前に報告されたＨＡステムポリペプチドと比較して、発現レベルの増加、三量体化傾向の増加、及び／又は安定性の増加を示すことがわかった。さらに、本発明のＨＡステムポリペプチドは、インフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導することができる。
【００４６】
当業者知られているように、完全長インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ０）は、通常、ＨＡ１ドメイン及びＨＡ２ドメインを含む。ステムドメインは、ＨＡ１ドメインの２つのセグメントと、ＨＡ２ドメインの殆ど又は全てによって形成されている。ＨＡ１ドメインの２つのセグメントは、一次配列においては、球状ヘッドドメインによって分離されている。本明細書に記載されるように、本発明のＨＡステムポリペプチドは、野生型の完全長ＨＡポリペプチド（ＨＡ０）のアミノ酸配列、特にグループ１  ＨＡのアミノ酸配列と比較して、ＨＡ１ドメイン及び／又はＨＡ２ドメインにいくつかの改変を含むアミノ酸配列を含む。
【００４７】
したがって、インフルエンザＨＡポリペプチドのＨＡ１ドメインにおける変異性の高い免疫優性のヘッドの少なくとも一部であって、５３位のアミノ酸から始まり３０２位のアミノ酸までのアミノ酸配列を少なくとも含む部分は、完全長ＨＡ（ＨＡ０）タンパク質から欠失されて、「ミニＨＡ」とも呼ばれるステムポリペプチドが作製された（図１Ａ、第２のデザイン）。ＨＡ１ドメインの残りの部分は、直接、又は１〜１０アミノ酸からなるリンカーを介して連結される。したがって、例えば、５３位のアミノ酸から３０２位のアミノ酸までのアミノ酸配列が欠失される場合、５２位のアミノ酸は３０３位のアミノ酸に、直接、又は欠失したヘッド領域を１〜１０アミノ酸からなるリンカーで置換することにより、連結される。５３位のアミノ酸から３０２位のアミノ酸までのアミノ酸配列の欠失は、ＨＡ１ドメインにおける最小欠失である（図１Ａ、第２のデザイン）。本発明によれば、ＨＡ１ドメインのより大きな部分、例えば、図１Ａ、第３のデザインに示すように、４６位のアミノ酸から始まり３０８位のアミノ酸までのアミノ酸配列を欠失させることもできる。
【００４８】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４６位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００４９】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００５０】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４８位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００５１】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４９位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００５２】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、５０位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００５３】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、５１位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００５４】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、５２位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００５５】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、５３位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００５６】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、５３位のアミノ酸から３０５位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００５７】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４８位のアミノ酸から３０４位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００５８】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４８位のアミノ酸から３０５位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００５９】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４６位のアミノ酸から３０２位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００６０】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４６位のアミノ酸から３０８位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００６１】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４７位のアミノ酸から３０８位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００６２】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４８位のアミノ酸から３０８位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００６３】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４９位のアミノ酸から３０８位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００６４】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、５０位のアミノ酸から３０８位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００６５】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、５１位のアミノ酸から３０８位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００６６】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、５２位のアミノ酸から３０８位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００６７】
特定の実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、５３位のアミノ酸から３０８位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００６８】
好ましい実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、少なくとも４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む。
【００６９】
好ましい実施形態では、ＨＡ１ドメインの欠失は、４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸配列からなる。
【００７０】
いくつかの実施形態では、ＨＡ１ドメインにおける欠失は、１〜１０アミノ酸の連結配列によって置換されている。
【００７１】
さらに、本発明のＨＡステムポリペプチドは、ヘッド領域の欠失後のＨＡステムポリペプチドの三量体化を改善するために、ＨＡ２ドメイン中の三量体化領域の改変、好ましくはＣヘリックスにおける改変を含む。本発明によれば、ＨＡ２ドメインにおける前記改変は、ＨＡステムポリペプチドの三量体化を増強する改変である。
【００７２】
特定の実施形態では、前記改変は、Ｃヘリックスにおける異種三量体化ドメインの導入を含む。一般に、Ｃヘリックスは４０５位のアミノ酸から４３４位のアミノ酸までのアミノ酸配列（Ｈ３番号付け）を含むと理解されている。好ましい実施形態では、前記異種三量体化ドメインは、４０５位のアミノ酸から４１９位のアミノ酸までのアミノ酸配列に対応する位置に導入されている（図１Ａ）。したがって、特定の実施形態では、４０５位から４１９位までのＨＡ２ドメイン中の元の（ｗｔ）アミノ酸配列は、同じ長さの異種三量体化配列、すなわち同じ数のアミノ酸で置換されている。
【００７３】
特定の実施形態では、異種三量体化ドメインはＧＣＮ４配列である。
【００７４】
特定の好ましい実施形態では、異種三量化配列は、
ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号１８）；
ＲＩＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号１９）；
ＲＭＥＡＬＥＫＫＶＤＤＩＥＫＫ（配列番号２０）；
ＲＩＥＡＬＥＫＫＶＤＤＩＥＫＫ（配列番号２１）；
ＲＭＥＮＬＥＫＫＶＤＤＩＥＥＫ（配列番号２２）；及び
ＲＩＥＮＬＥＫＫＶＤＤＩＥＥＫ（配列番号２３）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００７５】
いくつかの実施形態では、異種三量体化配列のアミノ酸の少なくとも１つはＣに変異されており、単量体間システイン架橋の形成を可能にしている。
【００７６】
したがって、特定の好ましい実施形態では、異種三量体化配列は
ＣＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２４）；
ＣＩＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２５）；
ＣＭＥＡＬＥＫＫＶＤＤＩＥＫＫ（配列番号２６）；
ＣＩＥＡＬＥＫＫＶＤＤＩＥＫＫ（配列番号２７）；
ＲＭＥＣＬＥＫＫＶＤＤＩＥＫＫ（配列番号２８）；及び
ＲＩＥＣＬＥＫＫＶＤＤＩＥＫＫ（配列番号２９）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００７７】
好ましい実施形態では、異種三量体化配列は、アミノ酸配列ＣＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号２４）を含む。
【００７８】
特定の実施形態では、改変は、Ｃヘリックス、好ましくは４０５位のアミノ酸から４１９位のアミノ酸までのアミノ酸を含む三量体化領域におけるヘプタッド反復配列の最適化を含む。［ａｂｃｄｅｆｇ］ｎと表されるヘプタッド反復は、一般に、ａ及びｄに疎水性残基を有し、ｅ及びｇに極性／荷電残基を有する。これらのモチーフは殆どのコイルドコイル構造の基礎であり、これは、アルファヘリックスがロープの糸のように一緒にらせん状に巻かれているタンパク質の構造モチーフである（二量体及び三量体が最も一般的な型である）（Ｃｉａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０）。
【００７９】
さらなる改変として、本発明によるＨＡステムポリペプチドは、単量体内システイン（又はジスルフィド）架橋を形成する（ことができる）少なくとも２つのシステイン残基を含む。遺伝子操作システイン架橋は、少なくとも一方（他方が既にシステインである場合）を変異させることによって導入することができるが、通常は、空間的に近い２つの残基をシステインに変異させ、それが自然に又は活性酸化によりそれらの残基の硫黄原子間に共有結合が形成されることにより導入され得る。好ましい実施形態では、ポリペプチドは３１０位及び４２２位にシステインを含み、単量体内システイン架橋の形成を可能にする。特定の実施形態では、ポリペプチドは３１０位及び４２２位のアミノ酸のＣへの変異を含み、前記単量体内システイン架橋を作出する。したがって、これらのシステイン残基は、タンパク質を安定化する単量体内システイン（又はジスルフィド）架橋を形成する（図４を参照）。
【００８０】
さらに、本発明のポリペプチドは、安定な三量体ＨＡステムポリペプチドを得るために、単量体間（プロトマー間）システイン架橋を形成する少なくとも２つのシステイン残基を含む。したがって、特定の実施形態では、ポリペプチドは、４０５位のシステインと組み合わせて３９７位のシステイン、又は４０８位のシステインと組み合わせて３９６位のシステイン、又は４０５位のシステインと組み合わせて、３９９位のシステインを含む。
【００８１】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、３９７位のアミノ酸のＣへの変異及び４０５位のアミノ酸のＣへの変異、又は３９６位のアミノ酸のＣへの変異及び４０８位のアミノ酸のＣへの変異、又は３９９位のアミノ酸のＣへの変異及び４０５位のアミノ酸のＣへの変異を含み、第１の単量体の３９７位のシステインと第２の単量体の４０５位のシステインとの間、又は第１の単量体の３９６位のシステインと第２の単量体の４０８位のシステインとの間、又は第１の単量体の３９９位のシステインと第２の単量体の４０５位のシステインとの間に単量体間システイン架橋を形成する。いくつかの実施形態では、４０５位と４０８位のアミノ酸は異種三量体化配列内にあることに留意されたい。
【００８２】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、３９７位のシステインと４０５位のシステインとを含み、第１の単量体の３９７位のシステインと第２の単量体の４０５位のアミノ酸との間に単量体間システイン架橋を形成する。
【００８３】
特定の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、３９７位のアミノ酸のシステインへの変異と４０５位のアミノ酸のシステインへの変異とを含み、第１の単量体の３９７位のシステインと第２の単量体の４０５位のアミノ酸との間に単量体間システイン架橋を形成する。
【００８４】
さらに、特定の実施形態では、少なくとも１つの変異がいわゆるＢループに導入されており、このＢループは３８５位のアミノ酸から始まり４０４位のアミノ酸までのアミノ酸配列を含む（図１Ｃを参照）。本発明によれば、少なくとも１つの変異は３９２位のアミノ酸のＰ、Ｒ又はＹ、好ましくはＲ又はＰへの変異である。Ｒ（荷電アミノ酸）への変異により、ヘッドドメイン除去後に露出した元の疎水性アミノ酸（殆どのインフルエンザＨＡでＦ）が除かれ、発現ステムポリペプチドの溶解性及び発現が増加する。Ｐアミノ酸への変異はＢループのヘリックス傾向を低下させる。特定の実施形態では、Ｂループにおける少なくとも１つの変異は３９２位のアミノ酸のＲへの変異である。特定の実施形態では、Ｂループにおける少なくとも１つの変異は３９２位のアミノ酸のＰへの変異である。
【００８５】
さらに、本発明のポリペプチドの特定の実施形態では、３９５位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＩであり、３９９位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＹ又はＣ、好ましくはＹであり、４００位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＰであり、４０１位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＫであり、４０２位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＳであり、且つ／又は４０４位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＲ又はＱである（再び、Ｈ３番号付けによる番号付け）。特定の実施形態では、３９２位のアミノ酸はＰ又はＲであり、３９５位のアミノ酸はＩであり、３９９位のアミノ酸はＹであり、４０２位のアミノ酸はＳであり、４０４位のアミノ酸はＲ又はＱである。
【００８６】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＡポリペプチドと比較して、したがって、
−  ３９５位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＩへの変異；
−  ３９９位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＹ又はＣ、好ましくはＹへの変異；
−  ４００位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＰへの変異；
−  ４０１位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＫへの変異；
−  ４０２位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＳへの変異；
−  ４０４位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＱ又はＲへの変異；
からなる群から選択されるＢループにおける少なくとも１つのさらなる変異を含む。
【００８７】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＡポリペプチドと比較して、３９２位のアミノ酸のＰ又はＲへの変異、３９５位のアミノ酸のＩへの変異、３９９位のアミノ酸のＹへの変異、４０２位のアミノ酸のＳへの変異、及び任意選択で４０４位のアミノ酸のＱ又はＲへの変異を含む。
【００８８】
特定の実施形態では、３９２位のアミノ酸はＰ又はＲであり、３９５位のアミノ酸はＩであり、３９９位のアミノ酸はＹであり、４０１位のアミノ酸はＫであり、４０２位のアミノ酸はＳであり、任意選択で４０４位のアミノ酸はＲ又はＱである。
【００８９】
別の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、野生型ＨＡポリペプチドと比較して、３９２位のアミノ酸のＰ又はＲへの変異、３９５位のアミノ酸のＩへの変異、３９９位のアミノ酸のＹへの変異、４０１位のアミノ酸のＫへの変異、４０２位のアミノ酸のＳへの変異、及び任意選択で４０４位のアミノ酸のＲ又はＱへの変異を含む。
【００９０】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、
ＩＥＫＭＮＴＱＹＴＡＩＧＫＥＹＮＫＳＥＲ（配列番号１２６）；
ＩＥＫＭＮＴＱＹＴＡＩＧＣＥＹＮＫＳＥＲ（配列番号１２７）；
ＩＥＫＭＮＴＱＰＴＡＩＧＣＥＹＮＫＳＥＱ（配列番号１２８）；
ＩＥＫＭＮＴＱＲＴＡＩＧＣＥＦＮＫＳＥＱ（配列番号１２９）；
ＩＥＫＭＮＴＱＰＴＡＩＧＣＥＹＮＫＳＥＲ（配列番号１３０）；
ＩＥＫＭＮＴＱＰＴＡＩＧＣＥＦＮＫＳＥＱ（配列番号１３１）；
ＩＥＫＭＮＴＱＲＴＡＩＧＣＥＹＮＫＳＥＲ（配列番号１３２）；
ＩＥＫＭＮＴＱＲＴＡＩＣＫＥＹＰＫＳＥＱ（配列番号１３３）；及び
ＩＥＫＭＮＴＱＲＴＡＩＧＫＥＣＮＫＳＥＲ（配列番号１３４）
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むＢループを含む。
【００９１】
さらに、本発明によれば、４３４位のアミノ酸はＱである。特定の実施形態では、したがって、ＨＡステムポリペプチドは４３４位のアミノ酸のＱへの変異を含み、これはその水素結合相互作用を改善する。特定の実施形態では、４３４位のアミノ酸はＱであり、４４２位のアミノ酸はＡである。特定の実施形態では、ポリペプチドは、４３４位のアミノ酸のＱへの変異、及び４４２位のＡへの変異を含む。これらの変異は、Ｄ及びＥヘリックス、並びに近くの融合ペプチド及びＢ２Ｂ３ループにおける三量体界面相互作用を改善する。
【００９２】
本明細書で使用されるアミノ酸位置の番号付けがＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）によるＨ３番号付けに基づくことに再度留意されたい。また、本明細書で使用されるアミノ酸位置の番号付けが完全長Ｈ３  ＨＡポリペプチド（ＨＡ０）の位置の番号付けに基づくことにも再度留意されたい。したがって、本明細書中で使用される場合、「４３４位のアミノ酸」は、Ｈ３  ＨＡ０中の４３４位のアミノ酸を指す。したがって、番号付けは、ヘッド領域の欠失による、本発明のＨＡステムポリペプチドにおけるアミノ酸の実際の位置を指さない（図１４を参照）。
【００９３】
さらに、特定の実施形態では、３２３位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＫであり、且つ／又は３２６位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＫである。好ましい実施形態では、３２３位のアミノ酸はＫであり、３２６位のアミノ酸はＫである。
【００９４】
特定の実施形態では、３３９位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＴである。
【００９５】
特定の実施形態では、４３８位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＥであり、且つ／又は４４２位のアミノ酸に対応するアミノ酸はＩである。
【００９６】
特定の実施形態では、したがって、ＨＡステムポリペプチドは、野生型ＨＡポリペプチドと比較して、ＨＡ１及び／又はＨＡ２ドメインに１つ以上のさらなる変異をさらに含む。
【００９７】
特定の実施形態では、ポリペプチドが３２３位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＫへの変異、及び／又は３２６位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＫへの変異を含む。これらの変異は分子の溶解性及び発現を増加させる。別の実施形態では、本発明のステムポリペプチドは、３２３位のアミノ酸のＫへの変異、及び３２６位のアミノ酸のＫへの変異を含む。
【００９８】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、３３９位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＴへの変異を含む。この変異は融合ペプチドループ（ＦＰループ）中の溶媒に曝露された疎水性アミノ酸を除去し、それによって分子の溶解性を増加させる。
【００９９】
特定の好ましい実施形態では、３２３位のアミノ酸はＫであり、３２６位のアミノ酸はＫであり、３３９位のアミノ酸はＴであり、３９２位のアミノ酸はＹ、Ｐ又はＲ、好ましくはＰ又はＲであり、３９５位のアミノ酸はＩであり、３９９位のアミノ酸はＹであり、４０２位のアミノ酸はＳであり、４０４位のアミノ酸はＱ又はＲであり、４３４位のアミノ酸はＱである。
【０１００】
特定の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、３２３位のアミノ酸のＫへの変異、３２６位のアミノ酸のＫへの変異、３３９位のアミノ酸のＴへの変異、３９２位のアミノ酸のＰ又はＲへの変異、３９５位のアミノ酸のＩへの変異、３９９位のアミノ酸のＹへの変異、４０２位のアミノ酸のＳへの変異、４０４位のアミノ酸のＱ又はＲへの変異、及び４３４位のアミノ酸のＱへの変異を含む。
【０１０１】
特定の好ましい実施形態では、３２３位のアミノ酸はＫであり、３２６位のアミノ酸はＫであり、３３９位のアミノ酸はＴであり、３９２位のアミノ酸はＰ又はＲであり、３９５位のアミノ酸はＩであり、３９９位のアミノ酸はＹであり、４０２位のアミノ酸はＳであり、４０４位のアミノ酸はＱ又はＲであり、４３４位のアミノ酸はＱであり、４４２位のアミノ酸はＡである。
【０１０２】
特定の好ましい実施形態では、ポリペプチドは、３２３位のアミノ酸のＫへの変異、３２６位のアミノ酸のＫへの変異、３３９位のアミノ酸のＴへの変異、３９２位のアミノ酸のＰ又はＲへの変異、３９５位のアミノ酸のＩへの変異、３９９位のアミノ酸のＹへの変異、４０２位のアミノ酸のＳへの変異、４０４位のアミノ酸のＱ又はＲへの変異、４３４位のアミノ酸のＱへの変異、及び４４２位のアミノ酸のＡへの変異を含む。
【０１０３】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、三量体界面における疎水性を増加させるため、可能な代替の負の荷電アミノ酸として、４３８位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＥへの変異、及び４４２位のアミノ酸に対応するアミノ酸のＩへの変異からなる群から選択される少なくとも１つのさらなる変異を含む。
【０１０４】
本発明によれば、ＨＡステムポリペプチドは、グループ１  ＨＡポリペプチドである。したがって、本発明によれば、本明細書に記載の改変は、系統グループ１のインフルエンザウイルス、例えば、Ｈ１、Ｈ２又はＨ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスのＨＡに導入され、本発明のＨＡステムポリペプチドを生じる。特定の実施形態では、ＨＡステムポリペプチドがＨ１  ＨＡポリペプチドである。したがって、特定の実施形態では、ＨＡステムポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を有するインフルエンザウイルス  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（Ｈ１Ｎ１）、又は配列番号２のアミノ酸配列を有するインフルエンザウイルス  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（Ｈ１Ｎ１）などのＨ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルスのＨＡに由来する。本発明のポリペプチドがまた、グループ１の他のインフルエンザＡウイルス株、例として、以下に限定されないが、Ａ／Ｔｅｘａｓ／ＵＲ０６−０５２６／２００７（Ｈ１Ｎ１）（配列番号３）、Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／６２９／１９９５（Ｈ１Ｎ１）（配列番号４）、Ａ／ＡＡ＿Ｍａｒｔｏｎ／１９４３（Ｈ１Ｎ１）（配列番号５）、Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４（Ｈ１）、Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５（Ｈ１）、Ａ／Ａｄａｃｈｉ／２／５７（Ｈ２Ｎ２）（配列番号６）、Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）（配列番号７）、又はＨ５亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルス、例として、以下に限定されないが、Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／２００４（Ｈ５Ｎ１）（配列番号８）若しくはＡ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７（Ｈ５）のＨＡに由来し得ることは、当業者に理解されよう。
【０１０５】
上記のように、ステムポリペプチドは欠失したＨＡ１配列を置換し、それによって２つの残りのＨＡ１部分を連結する１〜１０個のアミノ酸残基からなる連結配列を含んでも含まなくてもよい。特定の実施形態では、連結配列は、１〜５個のアミノ酸を含む。特定の実施形態では、連結配列は、２、３又は４個のアミノ酸を含む。連結配列は異種連結配列、すなわち、以下に限定されないが、Ｇ、ＧＳ、ＧＧＧ、ＧＳＧ、ＧＳＡ、ＧＳＧＳ、ＧＳＡＧ、ＧＧＧＧ、ＧＳＡＧＳ、ＧＳＧＳＧ、ＧＳＡＧＳＡ、ＧＳＡＧＳＡＧ、及びＧＳＧＳＧＳＧなどの、天然に存在しない、又は野生型のＨＡに存在しないアミノ酸配列であってもよい。
【０１０６】
好ましい実施形態では、連結配列は相同連結配列、すなわち、以下に限定されないが、ＡＧＳＧ、ＡＧＳ、ＧＳＧ、ＨＡＧＡ、ＤＱＥＧ、ＤＴＰＶ、ＦＰＫＴ、ＥＰＧＤ、ＥＰＧ、ＴＧＮＬ、ＴＰＳＳ、ＴＰＳ、ＡＴＧＮ、ＹＰＧＤなどの欠失した対応する頭部領域に由来するアミノ酸配列である。
【０１０７】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは連結配列を含まない。
【０１０８】
上記のように、インフルエンザＨＡ０タンパク質（ＨＡ１及びＨＡ２における）の切断はその活性に必要であり、宿主のエンドソーム膜とウイルス膜との融合を引き起こすことにより、ウイルスゲノムの標的細胞への侵入を促進する。
【０１０９】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、天然のプロテアーゼ切断部位を含む。したがって、ＨＡ１及びＨＡ２にまたがるＡｒｇ（Ｒ）−Ｇｌｙ（Ｇ）配列（すなわち、アミノ酸位置３２９及び３３０）は、トリプシン及びトリプシン様プロテアーゼの認識部位であり、ヘマグルチニン活性化のために通常切断されることが知られている（図１Ａ）。
【０１１０】
特定の実施形態では、ポリペプチドはプロテアーゼ切断部位を含まない。したがって、特定の好ましい実施形態では、プロテアーゼ切断部位は、３２９位のアミノ酸残基をアルギニン（Ｒ）又はリシン（Ｋ）以外の任意のアミノ酸に変異させることによって除去されている。特定の実施形態では、３２９位のアミノ酸残基はアルギニン（Ｒ）ではない。好ましい実施形態では、ポリペプチドは、３２９位のアミノ酸のグルタミン（Ｑ）への変異を含む。したがって、特定の実施形態では、本発明のポリペプチドは、投与後のインビトロ又はインビボでの産生中の分子の推定切断を防止するため、切断部位ノックアウト変異Ｒ３２９Ｑを含む。
【０１１１】
他の実施形態では、ポリペプチドは、多塩基性切断部位、例えばフーリン切断部位（実施例６に記載）を含む。したがって、ポリペプチドは、細胞内でフーリン様プロテアーゼによって切断されて、天然に折り畳まれ、プロセシングされたＨＡに類似した切断ミニＨＡを産生し得る。
【０１１２】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、シグナル配列を含まない。シグナル配列（シグナルペプチド、標的シグナル、局在化シグナル、局在化配列、トランジットペプチド、リーダー配列又はリーダーペプチドと呼ばれることもある）は、分泌経路に向かう新しく合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する短いペプチド（通常、１６〜３０アミノ酸長）である。シグナル配列は、細胞にタンパク質の移行を、通常は細胞膜への移行を促す働きをする。多くの場合、シグナルペプチドを含むアミノ酸は、その最終目的地に到達すると、タンパク質から切断される。インフルエンザＨＡでは、シグナル配列は、通常、完全長ＨＡ０のアミノ酸配列の最初の１６個のアミノ酸（Ｈ３番号付けによる−６位から１０位までのアミノ酸に対応する）を含む。
【０１１３】
特定の実施形態では、ポリペプチドはシグナル配列（の一部）を含む。ポリペプチドは、野生型シグナル配列（の一部）、又は代替シグナル配列、例えば、以下に限定されないが、
ＭＧＳＴＡＩＬＧＬＬＬＡＶＬＱＧＶＣＡ（配列番号１３６）及び
ＭＧＭＴＳＡＬＬＡＬＬＡＬＡＬＫＰＧＡＷＡ（配列番号１３７）
の群から選択されるシグナル配列（の一部）を含み得る。
【０１１４】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通及び細胞質ドメイン（５１５位のアミノ酸に対応するアミノ酸から始まり５５０位のアミノ酸に対応するアミノ酸まで（Ｈ３番号付け）のアミノ酸配列に対応する）を含むＨＡ２ドメインを含む。
【０１１５】
分泌（可溶性）ステムポリペプチドを産生するために、特定の実施形態では、ポリペプチドは、膜貫通及び細胞質ドメインを含まない。したがって、特定の実施形態では、ポリペプチドは、トランケートされたＨＡ２ドメイン、特にＣ末端でトランケートされたＨＡ２ドメインを含む。したがって、本発明によるトランケートＨＡ２ドメインは、ＨＡ２ドメインのＣ末端における１つ以上のアミノ酸残基の欠失によって、完全長ＨＡ２配列よりも短い。
【０１１６】
特定の実施形態では、５１６位のアミノ酸に対応するアミノ酸で始まるＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されており、したがって、完全な膜貫通及び細胞質ドメインが実質的に除去されている。
【０１１７】
特定の実施形態では、Ｃ末端ヘリックスの一部も欠失している。本発明によれば、ＨＡ２ドメインのかなり大きな部分が欠失された場合でさえ、安定な可溶性ＨＡステムポリペプチドが提供され得ることがわかった。したがって、特定の実施形態では、５００位、５０１位、５０２位、５０３位、５０４位、５０５位、５０６位、５０７位、５０８位、５０９位、５１０位、５１１位、５１２位、５１３位、５１４位又は５１５位のアミノ酸配列で開始するＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されて（再び、Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（前出）により記載されるＨ３番号付けによる番号付け）、細胞における発現後に可溶性ポリペプチドを産生する（図１２）。
【０１１８】
好ましい実施形態では、５１６に対応する位置からのＨＡ２ドメインのＣ末端部分が欠失されている。
【０１１９】
場合により、異種アミノ酸配列（すなわち、インフルエンザＨＡにおいて天然には存在しないアミノ酸配列）が、（トランケートされた）ＨＡ２ドメインに連結されている。
【０１２０】
したがって、特定の実施形態では、Ｈｉｓタグ配列、例えば、ＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１３）若しくはＨＨＨＨＨＨＨ（配列番号１１４）、又はＦＬＡＧタグ（ＤＹＫＤＤＤＤＫ）（配列番号１１５）、又はこれらの組合せが、検出及び／又は精製の目的のために、（任意選択でトランケート切断された）ＨＡ２ドメインのＣ末端アミノ酸に連結されている。特定の実施形態では、Ｈｉｓタグ配列などの異種アミノ酸配列が、リンカーを介して（トランケートされた）ＨＡ２ドメインに接続され得る。特定の実施形態では、リンカーは、精製後にＨｉｓタグ配列を酵素的に除去するために、タンパク質分解切断部位（の一部）、例えばアミノ酸配列ＩＥＧＲ（配列番号１１６）又はＬＶＰＲＧＳ（配列番号１１７）を含み得る。
【０１２１】
特定の実施形態では、（トランケートされた）ＨＡ２ドメインのＣ末端アミノ酸に連結される異種アミノ酸配列は、
ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（フォルドン）、（配列番号１１８）、
【化１】
2021511077.tif 000002
【化２】
2021511077.tif 000003
【化３】
2021511077.tif 000004
【化４】
2021511077.tif 000005
ＥＧＲＡＡＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＡＡＷＳＨＰＱＦＥＫＧＡＡＷＳＨＰＱＦＥＫ（Ｓｔｒｅｐタグ、配列番号１５４）、
ＥＧＲＡＡＡＬＰＥＴＧＧＧＡＡＥＰＥＡ（ソルターゼ−Ｃタグ）、（配列番号１２３）、
【化５】
2021511077.tif 000006
【化６】
2021511077.tif 000007
からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２２】
特定の実施形態では、異種三量体化ドメインは、（任意選択でトランケートされた）ＨＡ２ドメインのＣ末端アミノ酸、例えば、以下に限定はされないが、「フォルドン（Ｆｏｌｄｏｎ）」三量体化ドメイン（Ｌｅｔａｒｏｖ  ｅｔ  ａｌ．（１９９３）、Ｓ−Ｇｕｔｈｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００４）に記載）に連結されている。
【０１２３】
特定の実施形態では、ＨＡステムポリペプチドは、少なくとも配列番号３０の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号３１の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号５２の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号５３の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号５４の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号５５の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号５６の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号５７の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号５８の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号５９の１〜２３７のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号６０の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号６１の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号６２の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号６３の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号６４の１〜２３０のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号６５の１〜２３１のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号６６の１〜２３２のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号６７の１〜２３３のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号６８の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号６９の１〜２３５のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号７０の１〜２３６のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号７１の１〜２３７のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号７２の１〜２３８のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号７３の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号７４の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号７５の１〜２２８のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号７６の１〜２２９のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号７７の１〜２３０のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号７８の１〜２３１のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号７９の１〜２３２のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号８０の１〜２３３のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号８１の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号８２の１〜２３５のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号８３の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号８４の１〜２３３のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号８５の１〜２３５のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号８６の１〜２３３のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号８７の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号８８の１〜２３３のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号８９の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号９０の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号９１の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号９２の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号９３の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号９４の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号９５の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号９６の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号９７の１〜２３３のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号９８の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号９９の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１００の１〜２３２のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１０１の１〜２３７のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１０２の１〜２３８のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１０３の１〜２３１のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１０４の１〜２３１のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１０５の１〜２３７のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１０６の１〜２３１のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１０７の１〜２３７のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１０８の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１０９の１〜２３１のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１１０の１〜２３１のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１１１の１〜２３７のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１１２の１〜２３７のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１３５の１〜２３４のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１４７の１８〜２４８のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１４８の１８〜２４８のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１４９の１８〜２４８のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１５０の１７〜２４７のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１５１の１７〜２４７のアミノ酸を含むアミノ酸配列、
少なくとも配列番号１５２の１６〜２４６のアミノ酸を含むアミノ酸配列、又は
少なくとも配列番号１５３の１８〜２４８のアミノ酸を含むアミノ酸配列
を含む。
【０１２４】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも配列番号１０３、１０４、１０９又は１１０の１〜２３１のアミノ酸を含むアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、配列番号３１、３１、５２〜１１２及び１３５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２６】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、配列番号１０３、１０４、１０９及び１１０からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０１２７】
特定の実施形態では、ポリペプチドは、好適な細胞（例えば、哺乳動物細胞）において発現される際にグリコシル化される。ポリペプチドは、１つ以上の天然グリコシル化モチーフを含み得る。特定の実施形態では、ポリペプチドは、少なくとも１つの追加の／導入されたグリコシル化モチーフを含む。特定の実施形態では、この少なくとも１つのグリコシル化モチーフは、４０２位のアミノ酸のＳへの変異によって導入されている。この変異は４００位にｎ結合グルコシル化モチーフを導入する。
【０１２８】
ポリペプチドはまた、例えばポリマー、リポソーム、ビロソーム、ウイルス様粒子などのナノ粒子と組み合わせて、又はそれにコンジュゲートさせて投与することができる。ポリペプチドは、ナノ粒子と組み合わせる、ナノ粒子でカプシド化させる、又はナノ粒子にコンジュゲートさせる（例えば、共有結合又は吸着させる）ことができる。
【０１２９】
本発明はさらに、本発明のインフルエンザＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。多数の異なる核酸分子が、遺伝子コードの縮重の結果として、同じポリペプチドをコードし得ることは、当業者に理解されている。また、当業者がルーチンの手法を用いて、記載されるポリヌクレオチドによりコードされるポリペプチド配列に影響を及ぼさないヌクレオチド置換を行って、ポリペプチドが発現する任意の特定の宿主生物のコドン使用を反映し得ることも理解されている。したがって、別段の記載がない限り、「アミノ酸配列をコードする核酸配列」には、互いの縮重型であり、且つ同じアミノ酸配列をコードする全てのヌクレオチド配列が含まれる。
【０１３０】
特定の実施形態では、インフルエンザＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子は、ヒト細胞などの哺乳動物細胞における発現のためにコドン最適化されている。コドン最適化の方法は知られており、既に報告されている（例えば、国際公開第９６／０９３７８号パンフレット）。
【０１３１】
特定の実施形態では、インフルエンザＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１３８〜１４５から選択される核酸配列を含む。
【０１３２】
インフルエンザヘマグルチニンステムドメインポリペプチドは、当業者に好適であると考えられる任意の手法、例として、下記の手法にしたがって調製することができる。したがって、本発明のポリペプチドは、当該技術分野において知られる標準的方法によりＤＮＡ配列として合成し、当該技術分野において知られる好適な制限酵素及び方法を使用してクローニングし、続いてインビトロ又はインビボで発現させることができる。
【０１３３】
本発明はさらに、本発明のポリペプチドをコードする核酸分子を含むベクターに関する。特定の実施形態では、本発明による核酸分子はしたがって、ベクター、例えば、プラスミドの一部である。このようなベクターは、当業者によく知られた方法により容易に操作することができ、例えば、原核細胞及び／又は真核細胞において複製できるように設計することができる。使用されるベクターは、ＤＮＡのクローニングに好適であり、且つ目的の核酸の転写に使用することができるものであればいかなるベクターでもよい。宿主細胞が使用される場合、ベクターは組込みベクターであることが好ましい。あるいは、ベクターは、エピソーム複製ベクターであり得る。当業者は、好適な発現ベクターを選択し、本発明の核酸配列を機能的に挿入することができる。ポリペプチドをコードする核酸配列の発現を得るため、発現を駆動し得る配列を、ポリペプチドをコードする核酸配列に機能的に結合させ、タンパク質又はポリペプチドを発現可能なフォーマットでコードする組換え核酸分子をもたらすことができることは当業者によく知られている。発現を駆動する配列には、プロモーター、エンハンサーなど、及びそれらの組合せが含まれ得る。これらは、宿主細胞中で機能し、それによりそれらに機能的に結合している核酸配列の発現を駆動することができなければならない。当業者は、宿主細胞内での遺伝子の発現を得るのに様々なプロモーターを使用し得ることを認識している。プロモーターは構成的であっても調節的であってもよく、種々の供給源、例として、ウイルス、原核生物、若しくは真核生物の供給源から入手すること、又は人為的に設計することが可能である。目的の核酸の発現は、天然プロモーター若しくはその誘導体から、又は完全に異種のプロモーター（Ｋａｕｆｍａｎ，２０００）からのものであり得る。いくつかのよく知られ、且つ真核細胞での発現に多く使用されているプロモーターは、アデノウイルスなどのウイルスに由来するプロモーター、例えば、Ｅ１Ａプロモーター、サイトメガロウイルス（ｃｙｔｏｍｅｇａｌｏｖｉｒｕｓ）（ＣＭＶ）に由来するプロモーター、例えば、ＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーター（本明細書中、ＣＭＶプロモーターと称する）（例えば、ｐｃＤＮＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから得られる）、シミアンウイルス４０（Ｓｉｍｉａｎ  Ｖｉｒｕｓ  ４０）（ＳＶ４０）に由来するプロモーター（Ｄａｓ  ｅｔ  ａｌ，１９８５）などを含む。好適なプロモーターはまた、真核細胞からも由来し得、例えば、メタロチオネイン（ＭＴ）プロモーター、伸長因子１α（ＥＦ−１α）プロモーター（Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、ユビキチンＣ又はＵＢ６プロモーター（Ｇｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００１）、アクチンプロモーター、免疫グロブリンプロモーター、熱ショックプロモーターなどである。プロモーター機能及びプロモーターの強度についての試験は、当業者の定型事項であり、一般に、例えば、試験遺伝子、例えば、プロモーター配列後方のｌａｃＺ、ルシフェラーゼ、ＧＦＰなどのクローニング、及び試験遺伝子の発現試験を包含し得る。当然ながら、プロモーターは、その配列の欠失、付加、変異により改変し、機能性について試験して新たな、強度を���めた、又は改善されたプロモーター配列を見出すことができる。本発明によれば、最適な真核細胞中で高い転写レベルを付与する強力なプロモーターが好ましい。
【０１３４】
当業者によく知られた方法を使用して、構築物を真核細胞（例えば、植物、真菌、酵母又は動物細胞）又はＥ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの好適な原核発現系にトランスフェクトすることができる。一部の例では、上述したように、好適な「タグ」配列（例えば、以下に限定されるものではないが、ｈｉｓタグ、ｍｙｃタグ、ｓｔｒｅｐタグ、可動性若しくはｆｌａｇタグなど）又は完全タンパク質（例えば、以下に限定されるものではないが、マルトース結合タンパク質若しくはグルタチオンＳトランスフェラーゼなど）を本発明の配列に付加して、細胞又は上清からのポリペプチドの精製及び／又は同定を可能とすることができる。任意選択により、特異的タンパク質分解部位を含有する配列を含めて、後でタグをタンパク質分解消化により除去することができる。
【０１３５】
好ましい実施形態では、ポリペプチドは、哺乳動物細胞において産生される。
【０１３６】
精製ポリペプチドは、当該技術分野において知られる分光法（例えば、円偏光二色分光法、フーリエ変換赤外分光法、及びＮＭＲ分光法又はＸ線結晶分析法）により分析して、へリックス及びベータシートなどの所望の構造の存在を調べることができる。ＥＬＩＳＡ、ＡｌｐｈａＬＩＳＡ、バイオレイヤー干渉法（Ｏｃｔｅｔ）及びＦＡＣＳなどを用いて、ＣＲ６２６１及び／又はＣＲ９１１４などの広域中和抗体への本発明のポリペプチドの結合を調べることができる。したがって、正確な立体構造を有する本発明によるポリペプチドを選択することができる。三量体含量は、例えば、非還元条件下でのＳＤＳゲル電気泳動、ＣＲ６２６１及び／又はＣＲ９１１４などの広域中和抗体の抗体Ｆａｂフラグメントの存在下でのサイズ排除クロマトグラフィー、並びに異なる標識抗体を使用するＡｌｐｈａＬＩＳＡを使用して分析することができる。ポリペプチドの安定性は、温度ストレス、凍結融解サイクル、タンパク質濃度の増大、又は撹拌の後に、上記のように評価することができる。さらに、ポリペプチドの融解温度は、示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）及び／又は示差走査熱量測定（ＤＳＣ）によって評価することができる。
【０１３７】
特定の実施形態では、ベクターはヒト組換えアデノウイルスである。したがって、本発明はまた、本発明によるＨＡステムポリペプチドをコードする核酸分子を含む組換えアデノウイルスベクターを提供する。好ましい実施形態では、ステムポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号１４２、配列番号１４３、配列番号１４４及び配列番号１４５からなる群から選択される核酸配列を含む。
【０１３８】
組換え体アデノウイルスベクターの調製法は、当該技術分野でよく知られている。アデノウイルスに関する「組換え」という用語は、本明細書で使用される場合、アデノウイルスが人為的に改変されていること、例えば、その中に能動的にクローン化された改変末端を有し、且つ／又は異種遺伝子を含む、すなわち、天然に存在する野生型アデノウイルスではないことを含意する。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域、例えばＥ１ａ領域及び／又はＥ１ｂ領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能が欠損している。特定の実施形態では、本発明によるアデノウイルスベクターは、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部が欠損している。特定の実施形態では、ベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの必須遺伝子機能と、非必須Ｅ３領域の少なくとも一部とが欠損している。アデノウイルスベクターは、「多重欠損」であり得、これは、アデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域のそれぞれに１つ以上の必須遺伝子機能が欠損していることを意味する。例えば、前述のＥ１−欠損又はＥ１−、Ｅ３−欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域の少なくとも１つの必須遺伝子、及び／又はＥ２領域（例えば、Ｅ２Ａ領域及び／又はＥ２Ｂ領域）の少なくとも１つの必須遺伝子をさらに欠損し得る。アデノウイルスベクター、その構築方法及びその増殖方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、米国特許  第５，５５９，０９９号明細書、同第５，８３７，５１１号明細書、同第５，８４６，７８２号明細書、同第５，８５１，８０６号明細書、同第５，９９４，１０６号明細書、同第５，９９４，１２８号明細書、同第５，９６５，５４１号明細書、同第５，９８１，２２５号明細書、同第６，０４０，１７４号明細書、同第６，０２０，１９１号明細書、及び同第６，１１３，９１３号明細書に記載されている。
【０１３９】
特定の実施形態では、アデノウイルスは血清型２６又は３５のヒトアデノウイルスである。
【０１４０】
本発明はさらに、本発明によるポリペプチド、核酸、及び／又はベクター、並びに薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。本発明は特に、治療有効量の本発明のポリペプチド、核酸、及び／又はベクターを含む医薬組成物に関する。医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。本文脈において、用語「薬学的に許容される」は、担体が用いられる投与量及び濃度において、それが投与される対象中で所望しない効果も有害効果も引き起こさないことを意味する。このような薬学的に許容される担体及び賦形剤は、当該技術分野でよく知られている（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１８ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ，Ｅｄ．，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ［１９９０］、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｓ．Ｆｒｏｋｊａｅｒ  ａｎｄ  Ｌ．Ｈｏｖｇａａｒｄ，Ｅｄｓ．，Ｔａｙｌｏｒ＆Ｆｒａｎｃｉｓ［２０００］、及びＨａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ，３ｒｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｋｉｂｂｅ，Ｅｄ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ［２０００］を参照されたい）。用語「担体」は、ポリペプチド、核酸、及び／又はベクターが投与される希釈剤、賦形剤、又はビヒクルを指す。生理食塩溶液及び水性デキストロース及びグリセロール溶液は、例えば、特に注射溶液のための液体担体として用いることができる。
【０１４１】
本発明はさらに、薬剤として使用するための、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、及び／又はベクターに関する。
【０１４２】
本発明は特に、インフルエンザウイルスに対する免疫応答の誘導に使用するための、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、及び／又はベクターに関する。
【０１４３】
本発明はまた、それを必要とする対象においてインフルエンザＡ型ウイルスに対する免疫応答を誘導する方法に関し、この方法は、上記のようなポリペプチド、核酸分子及び／又はベクターを前記対象に投与することを含む。本発明による対象は、好ましくは、インフルエンザウイルスに感染し得、又はさもなければ免疫応答の誘導から利益を受け得る哺乳動物であり、そのような対象は、例えば、げっ歯類、例えば、マウス、フェレット、又は家庭若しくは農場動物、又は非ヒト霊長類、又はヒトである。好ましくは、対象は、ヒト対象である。
【０１４４】
特定の実施形態では、本発明は、グループ１インフルエンザＡウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。免疫応答には、体液性（すなわち、インフルエンザウイルス中和抗体の誘導）及び／又は細胞性免疫応答が含まれ得る。特定の実施形態では、本発明は、インフルエンザＡウイルスの少なくとも２、３、４、５又は６つの亜型に対する免疫応答を誘導する方法を提供する。特定の実施形態では、本発明は、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスに対する免疫応答を誘導する方法を提供する。
【０１４５】
特定の実施形態では、誘導される免疫応答は、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザＡウイルス、及び／又はＨ２サブタイプのＨＡを含むインフルエンザＡウイルス、及び／又はＨ５サブタイプのＨＡを含むインフルエンザＡウイルスなどの、グループ１インフルエンザＡウイルスによって引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び／又は治療するために有効である。特定の実施形態では、誘導される免疫応答は、Ｈ１亜型のＨＡを含むインフルエンザウイルスにより引き起こされるインフルエンザウイルス感染を予防及び／又は治療するために有効である。
【０１４６】
本発明はさらに、インフルエンザワクチンとして使用するための、本明細書に記載のポリペプチド、核酸、及び／又はベクターに関する。
【０１４７】
特定の実施形態では、本発明のポリペプチド、核酸分子及び／又はベクターは、アジュバントと組み合わせて投与される。本発明のポリペプチド、核酸分子及び／又はベクターの投与前、投与と同時に、又は投与後に、アジュバントを投与することができる。好適なアジュバントの例には、アルミニウム塩、例えば、水酸化アルミニウム及び／又はリン酸アルミニウム；油−エマルション組成物（又は水中油型組成物）、例として、スクアレン−水エマルション、例えば、ＭＦ５９（例えば、国際公開第９０／１４８３７号パンフレットを参照）；サポニン配合物、例えば、ＱＳ２１及び免疫刺激複合体（ＩＳＣＯＭ）など（例えば、米国特許第５，０５７，５４０号明細書、国際公開第９０／０３１８４号パンフレット、国際公開第９６／１１７１１号パンフレット、国際公開第２００４／００４７６２号パンフレット、国際公開第２００５／００２６２０号パンフレットを参照）；細菌又は微生物誘導体（その例は、モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬ）、３−Ｏ−脱アシル化ＭＰＬ（３ｄＭＰＬ）、ＣｐＧモチーフ含有オリゴヌクレオチド、ＡＤＰリボシル化細菌毒素又はその変異体、例えば、Ｅ．コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）熱不安定エンテロトキシンＬＴ、コレラ毒素ＣＴ、百日咳毒素ＰＴ、又は破傷風トキソイドＴＴである）、Ｍａｔｒｉｘ  Ｍ、又はこれらの組合せが含まれる。さらに、知られた免疫強化技術、例えば、免疫応答を向上させることが当該技術分野において知られているタンパク質（例えば、破傷風トキソイド、ＣＲＭ１９７、ｒＣＴＢ、細菌性フラジェリンなど）への本発明のポリペプチドの融合、又はビロソーム中へのポリペプチドの包含、又はこれらの組合せを使用することができる。
【０１４８】
本発明によるポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターの投与は、標準的な投与経路を使用して実施することができる。非限定的な例には、非経口投与、例えば、静脈内、皮内、経皮、筋肉内、皮下など、又は粘膜投与、例えば、鼻腔内、経口などが含まれる。当業者は、本発明によるポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターを投与して免疫応答を誘導する種々の可能性を決定することができよう。
【０１４９】
特定の実施形態では、ポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターは、２回以上、すなわち、いわゆる同種プライムブーストレジメンで投与される。２回目の投与は、例えば、本発明のポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターの１回目の投与後１週間、１回目の投与後２週間、１回目の投与後３週間、１回目の投与後１ヶ月、１回目の投与後６週間、１回目の投与後２ヶ月、１回目の投与後３ヶ月、又は１回目の投与後４ヶ月以上など、１回目の投与後数年まで行うことができる。ポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターを、第１のプライム投与後に２回以上のブースト投与が続くように、３回以上、例えば、３回、４回など投与することも可能である。
【０１５０】
ポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターは、プライム又はブーストとして、異種プライムブーストレジメンで投与することもできる。
【０１５１】
本発明はさらに、それを必要としている対象におけるインフルエンザウイルス疾患を予防及び／又は治療、好ましくは予防する方法であって、本明細書に記載のポリペプチド、核酸分子及び／又はベクターを前記対象に投与することを含む方法を提供する。治療有効量は、インフルエンザによる感染から生じる疾患又は病態を予防、寛解、及び／又は治療するのに効果のあるポリペプチド、核酸分子、又はベクターの量を指す。予防は、インフルエンザウイルスの拡散の阻害若しくは低減、又はインフルエンザウイルスによる感染に伴う症状の１つ以上の発症、発現若しくは進行の阻害若しくは低減を包含する。本明細書において使用する改善は、目に見える又は知覚できる疾患症状、ウイルス血症、又はインフルエンザ感染のあらゆる他の計測可能な徴候の低減を指し得る。
【０１５２】
治療を必要とする対象には、インフルエンザウイルスの感染から生じる病態に既に苦しんでいる対象、及びインフルエンザウイルスの感染が予防されるべき対象が含まれる。したがって、本発明のポリペプチド、核酸及び／又はベクターは、未投薬の対象、すなわち、インフルエンザウイルス感染により引き起こされる疾患を有さない、若しくはインフルエンザウイルス感染により感染されたことがなく、現在も感染されていない対象、又はインフルエンザウイルスにより既に感染されている対象に投与することができる。
【０１５３】
一実施形態では、予防及び／又は治療は、インフルエンザウイルス感染を受けやすい患者群において標的化することができる。そのような患者群には、以下に限定されるものではないが、例えば、高齢者（例えば、≧５０歳、≧６０歳、及び好ましくは≧６５歳）、若齢者（例えば、≦５歳、≦１歳）、入院患者、免疫不全対象、及び抗ウイルス性化合物で治療されたが、十分な抗ウイルス応答を示さなかった患者が含まれる。
【０１５４】
本発明のポリペプチド、核酸分子、及び／又はベクターは、代替インフルエンザワクチン、モノクローナル抗体、抗ウイルス剤、抗菌剤、及び／又は免疫調節剤などの１つ以上の他の活性剤と組み合わせて対象に投与し得る。１つ以上の他の活性剤は、インフルエンザウイルス疾患の治療及び／又は予防に有益であり得、又はインフルエンザウイルス疾患に伴う症状又は病態を改善し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の他の活性剤は、鎮痛剤、抗発熱薬、又は呼吸を緩和若しくは補助する治療物である。
【０１５５】
以下の実施例及び図面で本発明をさらに説明する。実施例は、本発明の範囲を決して限定するものではない。
【実施例】
【０１５６】
実施例１：本発明のステムベースのポリペプチドの調製
国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットには、インフルエンザの予防及び／又は治療におけるインフルエンザヘマグルチニンステムポリペプチド、組成物及びワクチンの第１系列、並びにインフルエンザの予防及び／又は治療におけるそれらの使用方法、例として、ポリペプチドＨ１−ミニ２−クラスター１＋５＋６−ＧＣＮが膜結合型（天然膜貫通ドメインを有する、国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレット中の配列番号４５）及びその可溶型として、ｓ−Ｈ１−ミニ２−クラスター１＋５＋６−ＧＣＮ４（天然膜貫通ドメインを有さない、国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレット中の配列番号１４５）が記載されている。
【０１５７】
国際公報第２０１４／１９１４３５号パンフレットには、Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７の完全長ＨＡに由来するさらなるステムポリペプチドが記載されており、これは、Ｈ１−ミニ２−クラスター１＋５＋６−ＧＣＮ４と比較してさらなる変異を含み、またＣＲ６２６１及び／又はＣＲ９１１４の広域中和エピトープを安定に提供した。
【０１５８】
これらのステムポリペプチドを全て、国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットに記載されているように、ＨＡ１からのヘッドドメイン、特に４６位から始まって３０６位のアミノ酸までのアミノ酸を含む領域を欠失させ、この欠失領域をリンカーで置換することによって作製した。国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレットでは、アミノ酸位置の番号付けはインフルエンザＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７（すなわち、国際公開第２０１３／０７９４７３号パンフレット中の配列番号１）の完全長ＨＡの番号付けに基づいたが、本発明ではＷｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．によるＨ３番号付けが使用されることに留意されたい。
【０１５９】
頭部ドメインの除去は、水性溶媒から既に保護された分子の一部を曝露されたままとし、本発明のポリペプチドの構造を潜在的に脱安定化させる。この理由により、Ｂループ中の１つ以上のアミノ酸残基、すなわちアミノ酸３８５〜４０４を含む領域（図１Ｃ）を変異させて、ポリペプチドを安定化した。同様に、融合ペプチド周辺の区域において、多数の疎水性残基が溶媒に曝露され、このことは、天然完全長ＨＡとは異なり、ポリペプチドが切断されず、タンパク質内部に疎水性融合ペプチドを埋め込む関連立体構造変化を受ける事実により引き起こされる。この問題に対処するために、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｌｅ／５９／２００７からの野生型完全長ＨＡと比較して、３２３、３２６、及び３３９位の疎水性アミノ酸残基のいくつか又は全てを親水性残基に変異させた。
【０１６０】
さらに、天然の切断部位の変異、例えば３２９位のアミノ酸のＱへの変異によって、ポリペプチドをプロテアーゼ切断に耐性とした。
【０１６１】
国際公開第２０１６／００５４８０号パンフレットには、さらなる一連のステムポリペプチドが記載されており、そこでは、ＧＣＮ４由来の配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号１８）が、例えば、Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７に由来する１２７Ｈ１−ｔ２、ｓ１２７Ｈ１−ｔ２、及びｓ１２７Ｈ１−ｔ２ｌｏｎｇと命名されたポリペプチドのように、４０５〜４１９位に導入された。さらに、異なるインフルエンザ株由来のＨＡを用いて、同じ改変を有するステムポリペプチド、例えば、Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９株由来のＨＡに基づくポリペプチド、例えば、ｓｍＨ１Ｃａｌｉ３９６４−１２７Ｈ１−ｔ２、及びｍＨ１Ｃａｌｉ３９６４−１２７Ｈ１−ｔ２が作製された。
【０１６２】
国際公開第２０１６／００５４８２号パンフレットには、三量体ステムポリペプチドの増量をもたらす、単量体間システイン架橋の導入が記載され、例として、インフルエンザＡ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７のＨＡに基づく、１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８（５３６７とも呼ばれる）及び可溶性バージョン１２７Ｈ−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇと呼ばれるポリペプチドが記載されている。同様のポリペプチド、例えば、ｍＨ１  Ｃａｌｉ３９６４−１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８（５３６９とも呼ばれる）及びｓｍＨ１  Ｃａｌｉ３９６４−１２７Ｈ１−ｔ２−ｃｌ１８ｌｏｎｇと呼ばれるポリペプチドを、例えば、インフルエンザウイルスＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９のＨＡに基づいて設計した。これらのステムポリペプチドは、とりわけ、４６位から始まって３０６位のアミノ酸までのアミノ酸を含むヘッド領域の欠失（ここで、得られたＨＡ１ドメインを４アミノ酸リンカー（ＧＧＧＧ）を介して連結した）、４０５〜４１９位のＨＡ２ドメインに導入されたＧＣＮ４由来の配列ＲＭＫＱＩＥＤＫＩＥＥＩＥＳＫ（配列番号１８）、及び、プロテアーゼ切断に抵抗性を示すポリペプチドを作るための３２９位のアミノ酸のＱへの変異を含んだ。このポリペプチドはさらに、３９７位のアミノ酸のＣへの変異、及び４０５位のアミノ酸のＣへの変異（すなわち、ＧＣＮ４配列の最初のアミノ酸）を含み、したがって、第１の単量体の３９７位のシステインと第２の単量体の４０５位のアミノ酸との間に単量体間システイン架橋を形成した。
【０１６３】
本発明を導いた研究においては、先に報告されたステムポリペプチドが最適化されている。Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７及びＡ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９に由来する野生型ＨＡのアミノ酸配列は、それぞれ配列番号１及び２の配列である。ポリペプチドＵＦＶ５３６７（配列番号１６）及びＵＦＶ５３６９（配列番号１７）は、本明細書においては「親株／構築物」と呼ばれる（それぞれ、図２及び３に概略的に示す）。
【０１６４】
したがって、新規なＨＡステムポリペプチド、例として、例えば、ＵＦＶ１５０５５８（配列番号３０）及びＵＦＶ１５０８５０（配列番号５３）が設計され、これは、以前に報告されたステムポリペプチドＵＦＶ５３６７（配列番号１６）及びＵＦＶ５３６９（配列番号１７）と比較して、さらなる改変を含む。特に、ポリペプチドＵＦＶ１５０５５８及びＵＦＶ１５０８５０は、Ｂループの３９２位のアミノ酸のＰ又はＲへの変異を４３４位のアミノ酸のＱへの変異と組み合わせて、又は、Ｂループの３９２位のアミノ酸のＰ又はＲへの変異を４３４位のアミノ酸のＱへの変異及び４４２位のアミノ酸のＡへの変異と組み合わせて含む。
【０１６５】
さらに、欠失ヘッド領域を置換する人工リンカーを使用しない、さらなるステムポリペプチドを設計した。ステムポリペプチドＵＦＶ１６０６５５（配列番号１０３）、ＵＦＶ１６０６５６（配列番号１０４）、ＵＦＶ１６０６６４（配列番号１０９）及びＵＦＶ１６０６６５（配列番号１１０）は、４７位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までのヘッド領域の欠失を含み、したがってアミノ酸４６までのアミノ酸を含むＨＡ１ドメインの第１の部分と、３０７位のアミノ酸から始まってＨＡ１ドメインのＣ末端アミノ酸（すなわち、３２９位のアミノ酸）までのアミノ酸を含むＨＡ１ドメインの第２の部分を残した。第１のＨＡ１部分はヘッドの欠失後に第２のＨＡ１部分に直接連結した。すなわち、４６位の残存するアミノ酸（ＨＡ１ドメインの第１の部分のＣ末端アミノ酸）を、３０７位の残存するアミノ酸（ＨＡ１ドメインの第２の部分のＮ末端アミノ酸）に直接連結した。人工リンカーを導入しなかった（図１Ａ、下の構築物を参照）。ペプチドはまた、Ｂループの３９２位のアミノ酸のＰ又はＲへのさらなる変異を、４３４位のアミノ酸のＱへの変異と組み合わせて、又は、４３４位のアミノ酸のＱへの変異及び４４２位のアミノ酸のＡへの変異と組み合わせて含んだ（図４に概略的に示すように）。
【０１６６】
実施例２：本発明によるポリペプチドの発現
哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現
本発明のポリペプチドＵＦＶ１５０５５８、ＵＦＶ１５０８５０、ＵＦＶ１６０６５５、ＵＦＶ１６０６５６、ＵＦＶ１６０６６４及びＵＦＶ１６０６６５）をコードするＤＮＡフラグメントを合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ｐｃＤＮＡ２００４プラスミド（社内で改変した強化ＣＭＶプロモーターを有するｐｃＤＮＡ３ベクター）にクローニングした。調製した発現プラスミドの２９３ｆｅｃｔｉｎ（商標）トランスフェクション試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いた一過性トランスフェクションにより、Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ（商標）培地中で培養したＨＥＫ２９３Ｆ細胞中でポリペプチドを産生した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）トランスフェクション試薬（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた一過性トランスフェクションにより、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地中のＥｘｐｉ−ＣＨＯ細胞培養物においてポリペプチドを産生した。Ｅｘｐｉ−ＣＨＯ細胞の培養のために、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ＣＨＯエンハンサー及びＥｘｐｉＣＨＯフィード（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、トランスフェクションの１日後に添加した。分泌されたポリペプチドを含有する培養上清を、７日目〜１１日目（ＥｘｐｉＣＨＯ細胞について）の間に遠心分離によって回収し、続いて０．２μｍボトルトップフィルター（Ｃｏｒｎｉｎｇ）で濾過した。
【０１６７】
培養上清の分析
回収した培養上清中の発現ポリペプチドのレベルを、ＯＣＴＥＴプラットフォームを使用するバイオレイヤー干渉法によって評価した。要するに、ビオチン化ｍＡｂ  ＣＲ９１１４をストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定し、その後、明確な精製相同ポリペプチドの希釈系列の結合シフトを評価することによって標準曲線を確立した。続いて、本発明のポリペプチド（動態緩衝液中に希釈された５〜１５μｇ／ｍＬ）を含む、予め希釈された回収培養上清の結合シフトを測定し、確立した標準曲線を使用して、ポリペプチドの濃度を計算した。
【０１６８】
培養上清中のポリペプチドの三量体含量を、１．５ｎＭのＣＲ９１１４及び配列番号１３の配列を有する１．５ｎＭのＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ標識単一ドメイン抗体（ＳＤ１５０１６）の同時結合によって、ＡｌｐｈａＬＩＳＡで評価した。抗ヒトＩｇＧアクセプター及びＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の存在下で、抗体及び単一ドメイン抗体と共にポリペプチドを室温で２時間インキュベートした後、６１５ｎｍでの化学発光を測定した。このアッセイでは、２つ以上の正しく折り畳まれたエピトープを示した三量体分子のみが両抗体に同時に結合され、したがってシグナルを与えた（単量体及び潜在的な凝集体とは対照的に）。ポリペプチドを、ＯＣＴＥＴによって評価したタンパク質濃度に基づいて滴定した。
【０１６９】
結果及び結論
ポリペプチド発現レベル及び三量体含量を、トランスフェクション後９日目に、３つの独立した７０ｍＬ  ＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクションについて決定した。結果を図５に示す。親デザイン／構築物とも呼ばれる、前述の構築物５３６７（配列番号１６）（４６位から始まって３０６位のアミノ酸までのアミノ酸のＨＡ１ドメインにおける欠失を含み、ＨＡ１ドメインにおける欠失部分を置換する４Ｇリンカーを含む）と比較して、Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／０７／５９ベースのポリペプチドＵＦＶ１６０６５５（４７位から始まって３０６位のアミノ酸までのアミノ酸のＨＡ１ドメインにおける欠失を含み、ＨＡ１ドメインにおける欠失部分を置換する４Ｇリンカーを含まず、点変異Ｙ３９２Ｐ、Ｒ４０４Ｑ、Ｅ４３４Ｑ、及びＳ４４２Ａを含む）（配列番号１０３）は、発現レベルが明らかに増加し（最大４０倍）、約５００ｍｇ／Ｌ培養上清に達した（図５Ａ）。
【０１７０】
Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９由来の親ポリペプチドＵＦＶ５３６９（配列番号１７）は、約３５０ｍｇ／Ｌ培養上清のレベルで発現された。ポリペプチドＵＦＶ５３６９とデザインが類似し、さらに点変異Ｙ３９２Ｐ、Ｒ４０４Ｑ、Ｅ４３４Ｑ、及びＳ４４２Ａを含むポリペプチドＵＦＶ１５０５５８（配列番号３０）は、約４２７ｍｇ／Ｌのレベルで発現された。ポリペプチドＵＦＶ１６０６５６（配列番号１０４）（４７位から始まって３０６位のアミノ酸までのアミノ酸を含む欠失を含み、ＨＡ１ドメインにおける欠失部分を置換する４Ｇリンカーを含まず、点変異Ｙ３９２Ｐ、Ｒ４０４Ｑ、Ｅ４３４Ｑ、及びＳ４４２Ａを含む）、ＵＦＶ１６０６６４（同じ欠失を含むが、点変異はＹ３９２Ｒ及びＥ４３４Ｑのみを含む）（配列番号１０９）、及びＵＦＶ１６０６６５（同じ欠失を含み、点変異Ｙ３９２Ｐ及びＥ４３４Ｑを含む）（配列番号１１０）は、５３６９と比較して、より高いレベルで発現され、最大約８００ｍｇ／Ｌ培養上清であった（図５Ａ）。
【０１７１】
三量体含量に関して、１つ以上のさらなる新たな変異を含むポリペプチドは全て、それらの株の骨格、ヘッドの欠失の大きさ、及びＨＡ１ドメインの欠失部分を置換する４Ｇリンカーの有無と関係なく、親デザインで得られたよりもはるかに高い９０％を超えるレベルに達し、親デザインは、首尾よく三量体を形成した発現タンパク質の約２５％にすぎなかった（図５Ｂ）。
【０１７２】
３９２位のアミノ酸のＹ、Ｐ又はＲへの変異を、４３４位のアミノ酸のＱへの変異と組み合わせて含むさらなるポリペプチド、例として、ＵＦＶ１６０３０２（配列番号６０）及びＵＦＶ１６０３０３（配列番号６１）を作製した。ポリペプチドＵＦＶ１６０３０２と同様のデザインを含むが、点変異Ｙ３９２Ｒを含まないポリペプチドＵＦＶ１６０３０４（配列番号６２）は、より低い三量体含量（約１．７倍）を示した（図５Ｃ）。
【０１７３】
まとめると、３９２位にＹ、Ｐ又はＲを４３４位のＱと組み合わせて含む、本実施例に記載の本発明のポリペプチドは、親デザインと比較して、タンパク質発現及び三量体含量（首尾よく形成された三量体のパーセンテージ）のレベルの大幅な増加を示した。３９２位及び４３４位におけるこれらのアミノ酸の存在が、発現、三量体化及び安定性の大幅な改善をもたらした。
【０１７４】
実施例３：本発明の三量体ポリペプチドの精製
精製
ポリペプチドを２段階プロトコルによって精製した。最初に、回収し清澄化した培養上清を、Ｐｏｒｏｓビーズ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手）に固定化したＨＡ特異的単一ドメイン抗体からなるアフィニティーレジン（Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ）を充填したＨｉＳｃａｌｅ  １６／２０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。このレジンは、Ｈ１株由来のヘマグルチニン蛋白質に対する特異性が高い。三量体の単離を向上させるため、カラムに意図的に約１５％過剰ロードした。５０ｍＭトリス、０．５Ｍ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．４中での結合及び平衡化に続いて、ポリペプチドを、０．１Ｍトリス、２Ｍ  ＭｇＣｌ２、４０％プロピレングリコール、ｐＨ７．４への段階勾配を適用することによって溶出した。ＵＶシグナル（Ａ２８０）に基づいて、溶出画分をプールし、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＶ  ０．２２μｍフィルター膜（Ｍｅｒｃｋ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を通して濾過した。続いて、精度を高める目的で、すなわち、最小量の多量体及び単量体タンパク質を除去するために、収集した溶出ピークを、泳動用緩衝液（２０ｍＭトリス、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．８）中で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ  ２００ｐｇ  ２６／６０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に適用した。三量体画分をプールし、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）Ｉｎｆｉｎｉｔｙ  １２６０シリーズセットアップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）における分析ＳＥＣ−ＭＡＬＳによって純度を評価した。精製された各ポリペプチドの４０μｇをＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に流し（１ｍＬ／分）、溶出した物質のモル質量を、ｍｉｎｉＤＡＷＮ  Ｔｒｅｏｓ多角度光散乱検出器及びＯｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒｅｘ示差屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって、溶出した物質のモル質量を測定した。データをＡｓｔｒａ６ソフトウェアパッケージで解析し、分子量計算は屈折率シグナルから導いた。
【０１７５】
結果及び結論
第２の精製工程（サイズ排除クロマトグラフィー）の溶出プロファイルは、大量の非三量体（凝集体及び単量体）ポリペプチド５３６７がアフィニティーカラムのプールされた溶出画分中に存在することを示した。対照的に、ＵＦＶ１６０６５６のクロマトグラムは少量の凝集体を示しただけで、存在する主要な種は三量体ポリペプチドであった（図６Ａ及びＢ）。
【０１７６】
親構築物ＵＦＶ５３６７及びＵＦＶ５３６９の収量はそれぞれ５及び７０ｍｇ／Ｌであったが、本発明のポリペプチドの収量は１２０〜２４０ｍｇ／Ｌで変動した。培養上清及び三量体最終産物中に存在するタンパク質の量の比較によって計算された回収率は、およそ４０〜６０％であった。分析ＳＥＣ−ＭＡＬＳによるプールされた三量体画分の分析は、精製された物質が純粋であることを示した；ＵＶシグナルにおける他のピークは観察されなかった（図６Ｂ）。さらに、計算分子量、約９６〜１０６ｋＤａは、グリコシル化三量体ポリペプチドの予想分子量に対応した（図６Ｃ）。
【０１７７】
上記データは、ポリペプチドの精製が簡単な２段階プロトコルによって達成され、高効率で非常に純粋な三量体タンパク質が得られ、１００ｍｇ／Ｌ培養上清をはるかに上回る収量となることを示した。
【０１７８】
実施例４：結合Ｆａｂフラグメントの存在下でのサイズ排除クロマトグラフィーによる本発明のポリペプチドの三量体化の特性評価
特性評価
精製ポリペプチドのフォールディング及び温度安定性を、（ｉ）Ｆａｂフラグメントの存在下でのＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析、（ｉｉ）酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ）、及び（ｉｉｉ）示差走査蛍光測定（ＤＳＦ）によって評価した。
【０１７９】
本発明のポリペプチド（「ミニＨＡタンパク質」とも呼ばれる）へのＦａｂフラグメントの溶液中結合を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）、並びにＯｐｔｉｌａｂ  Ｔ−ｒＥＸ屈折率検出器（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）に接続された高速液体クロマトグラフィーシステム（Ａｇｉｌｅｎｔ）及びｍｉｎｉＤＡＷＮ  ＴＲＥＯＳ機器を使用する多角度光散乱（ＭＡＬＳ）分析によってモニターした。合計で、ポリペプチド、又はｍＡｂｓ  ＣＲ６２６１、ＣＲ９１１４及び陰性対照抗体のＦａｂフラグメント４０μｇを、泳動用緩衝液（１５０ｍＭ  ＮａＰｉ、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ７．０）中で平衡化したＴＳＫ−Ｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ）に適用した。１．２倍モル過剰のＦａｂフラグメントの存在下でインキュベートしたポリペプチドの分析によって、複合体の形成を確認した。データをＡｓｔｒａ６ソフトウェアパッケージで解析し、分子量計算は屈折率シグナルから導いた。
【０１８０】
ポリペプチドに対するＣＲ６２６１及びＣＲ９１１４結合のアビディティを、Ｏｃｔｅｔ  ＲＥＤ３８４（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を用いたバイオレイヤー干渉測定によって評価した。ビオチン化抗体を、反応速度測定用ストレプトアビジン（ＳＡ）Ｄｉｐ  ａｎｄ  Ｒｅａｄバイオセンサー（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定した。２倍階段希釈を行った一連の、ＰＢＳで希釈した１０倍濃縮カイネティクス緩衝液（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）中のポリペプチドにセンサーを適用することによって、リアルタイム結合曲線を測定した。ポリペプチドの出発濃度は、０．１５〜１０ｎＭの範囲であった。ｂｎＡｂのポリペプチドへの１：１結合モデルを仮定し、定常状態解析を用いて、解離定数（ＫＤ）を決定した。
【０１８１】
さらに、本発明のステムポリペプチドへの抗体及び単一ドメイン抗体（ＳＤ）の結合を、ＥＬＩＳＡによって評価した。最初に、１ウェル当たり５０μｇのタンパク質をリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を用いてＯｐｔｉＰｌａｔｅ−９６高結合プレート（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）の表面にコーティングした。４℃での終夜のインキュベーション、洗浄（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回）、ブロッキング（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋１％ウシ血清アルブミンにより室温で１．５時間）、及び洗浄（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回）に続いて、プレートを、それぞれ出発濃度７０ｎＭ又は１００ｎＭの３倍階段希釈系列のｍＡｂ及びＳＤと共にＲＴで１時間インキュベートした。さらに洗浄（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回）した後、マウス抗ヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ）にコンジュゲートした西洋ワサビペルオキシダーゼを、ブロック緩衝液（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０＋１％ウシ血清アルブミン）による１：１０００希釈液として添加した。ＲＴでさらに１時間インキュベートし、続いて洗浄（ＰＢＳ＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０で３回）した後、ＢＭ化学発光ＥＬＩＳＡ基質（Ｒｏｃｈｅ）を添加し、１５分間インキュベートした後、Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｎｅｏプレートリーダー（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて発光シグナルを測定した。半数効果濃度（ＥＣ５０）値を、Ｓｐｏｔｆｉｒｅスイート（Ｔｉｂｃｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）によって計算した。ＥＣ５０はそれぞれの抗体の結合強度に直接相関し、それによって抗原の品質、すなわちその適切なフォールディング及び安定性の尺度となる。
【０１８２】
タンパク質温度安定性を、５×Ｓｙｐｒｏ  Ｏｒａｎｇｅ色素（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）の存在下でポリペプチド溶液（６μｇ）の蛍光発光をＤＳＦでモニターすることによって決定した。温度を２５℃から９５℃（６０℃／時）に徐々に上昇させると、ポリペプチドは開き、蛍光色素が露出した疎水性残基に結合する。融解曲線をＶｉｉＡ７リアルタイムＰＣＲマシン（Ａｐｐｌｉｅｄ  ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）を使用して測定し、Ｔｍ５０値をＳｐｏｔｆｉｒｅスイート（Ｔｉｂｃｏ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｉｎｃ．）によって計算した。Ｔｍ５０値はタンパク質の５０％が展開する温度を表し、したがって、ポリペプチドの温度安定性の尺度となる。さらに、熱誘導変性もＤＳＣによって測定し、熱転移中点温度（Ｔｍ）を、ＭａｃｒｉＣａｌ  ＤＳＣシステム（Ｍａｌｖｅｒｎ）を使用して、試料とリファレンスセルとの間のエネルギー入力の差をモニターすることによって測定した。１ｍｇ／ｍＬの濃度の試料を２０℃から９０℃まで徐々に（１００℃／時）加熱し、Ｏｒｉｇｉｎソフトウェア（Ｍａｌｖｅｒｎ）によって実験を分析した。温度（℃）対熱容量（ｋｃａｌ／ｍｏｌ／℃）プロットに基づいて、Ｔｍ値を算出した。
【０１８３】
結果及び結論
アミノ酸のみに基づく三量体ポリペプチドの理論的分子量は約９０ｋＤａであるが、各タンパク質は５個のＮ結合グリコシル化モチーフ（ＮｘＴ／Ｓ）を含むので、哺乳動物発現系において産生される場合、分子量はより高くなる。ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析によって決定された分子量は９６〜１０６ｋＤａの範囲にあると計算されたが、これはこれらのタンパク質が予想通りかなりグリコシル化されていることを示している（表１）。
【０１８４】
【表１】
2021511077.tif 000008
【０１８５】
ポリペプチドへの抗体結合は、ポリペプチドの正しいフォールディングと、広域中和抗体（ｂｎＡｂ）の正しくフォールディングされたエピトープの存在とを示す。ＦａｂフラグメントＣＲ９１１４、ＣＲ６２６１及び非結合性Ｆａｂ（陰性対照）の溶液中における結合を、上述のように、ＳＥＣ−ＭＡＬＳ分析により評価した。Ｆａｂフラグメントがポリペプチドに結合すると、分子量の増加により、ＳＥＣにおいて目に見えるピークシフト（保持時間の短縮）を生じる。さらに、ＭＡＬＳシグナルをモニターすることにより、形成された複合体の分子量計算が可能になる。予想通り、陰性対照として使用したＦａｂフラグメントは結合しなかった。すなわち、Ｆａｂフラグメントを添加しても、ポリペプチドのピークシフトは観察されなかった（図７Ａ）。対照的に、他の２つのＦａｂフラグメントとのインキュベーションでは、より短い保持時間への明確なピークシフトが観察された（図７Ｂ及びＣ）。さらに、複合体の分子量測定は、ポリペプチドが３つのＦａｂフラグメントに結合することを示し（表１）、三量体ポリペプチド内の３つの単量体が全て適切にフォールディングされ、抗体に接近可能であることが確認された。
【０１８６】
ポリペプチドの質及びフォールディングをさらに評価するために、ｂｎＡｂ  ＣＲ６２６１及びＣＲ９１１４結合の解離定数（ＫＤ）を、バイオレイヤー干渉法によって決定した（表２）。全てのポリペプチドで、結合アビディティは１ｎＭ未満であり、三量体ポリペプチドが天然のＨＡステム表面を表すことを示した。
【０１８７】
【表２】
2021511077.tif 000009
【０１８８】
さらに、抗体の結合をＥＬＩＳＡによって評価した。Ｓ曲線に基づいてＥＣ５０値を計算し、ポリペプチドの適切なフォールディングを確認した。両抗体は、１ｎＭ未満のＥＣ５０値で非常に強く結合した（表３）。
【０１８９】
【表３】
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【０１９０】
熱安定性は、ストレスに曝露された場合のポリペプチドのレジリエンスの尺度、したがってポリペプチドの安定性の尺度である。実験の間、アンフォールディングタンパク質に結合する蛍光色素の存在下で、本発明のポリペプチドを徐々に加熱し、生じた蛍光強度の変化を使用して、Ｔｍ５０値を計算した（表４）。親デザイン（ＵＦＶ５３６７及びＵＦＶ５３６９）はそれぞれ約５２℃及び約５７℃のＴｍ５０値を明確に示し、一方、本発明のポリペプチドは有意により高い値（最大約７℃）を示し、安定性の有意な改善を示した。親デザインと本発明のポリペプチドとの間の同様の差異が、ＤＳＣによって決定されるＴｍ値で観察された。全体的には、Ｔｍ値（ＤＳＣ）はＴｍ５０値（ＤＳＦ）より約２℃高かったが、これはこれらの値が決定される方法の違いによるものであり、ＤＳＣではピーク最大での温度が決定され、一方、ＤＳＦでは１／２のピーク高さで温度が決定された。
【０１９１】
【表４】
2021511077.tif 000011
【０１９２】
ポリペプチドの分子量、溶液中で観察されたＦａｂフラグメントの結合及びＡｂの強力な結合は、親デザインと本発明のポリペプチドが三量体であり、良好にフォールディングされていることを示した。さらに、算出されたＴｍ５０／Ｔｍ値によって示されるように、本発明のポリペプチドは、親デザインと比較して、熱ストレスに対しかなり高い抵抗性を示した。まとめると、結合データ及び熱安定性データは、本発明のポリペプチドが溶液中で三量体であり、適切にフォールディングされ（３つのエピトープ）、且つそれらの親デザインと比較して熱安定性が大きく改善されていることを示している。
【０１９３】
実施例５：本発明による代替的欠失、リンカー及びヘッドドメイン配列
デザイン
上記の本発明のインフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）ステムポリペプチドを、４７位から３０６位のアミノ酸までのアミノ酸を含むＨＡ１ドメインの一部を欠失させることによって、完全長ＨＡから生成した。連結配列は導入しなかった。親デザインでは、欠失は４６〜３０６のアミノ酸からなり、欠失後の２つのＨＡ１末端を、人工的な「ＧＧＧＧ−リンカー」によって連結した（図８）。
【０１９４】
この実施例では、ヘッド及び代替相同リンカーのさらなる代替の切断位置を探索した。表５は、ＨＡ１ヘッドドメインを除去するための代替切断位置を示す。親デザインのＨＡ１末端を灰色で示す。構築物ＵＦＶ１６０３６０（配列番号６３）は、４６位のアミノ酸から３０６位のアミノ酸までの欠失、及びＨＡ１ドメインの欠失部分を置換する４Ｇリンカーを含み、さらに点変異Ｙ３９２Ｐ、Ｒ４０４Ｑ、Ｅ４３４Ｑ、及びＳ４４２Ａを含む。ＨＡ１ドメイン（ＨＡ１上部）、第１（Ｎ末端）ＨＡ１ドメインの最大７個の付加的アミノ酸残基、及びＨＡ１下部ストランド（第２、又はＣ末端ＨＡ１ドメイン）の最大４個の付加的アミノ酸残基が含まれるか、又は最大２個のアミノ酸残基が欠失され、したがってヘッド欠失サイズが変化している、新しい構築物を作製した。これらの構築物もまた、全て、点変異Ｙ３９２Ｐ、Ｒ４０４Ｑ、Ｅ４３４Ｑ、及びＳ４４２Ａを含んだ。
【０１９５】
【表５】
2021511077.tif 000012
【０１９６】
以下の表６は、代替相同リンカーを示す。親デザインのＨＡ１末端を濃い灰色で示す。最大５残基長の相同リンカー、すなわちＨＡ１ドメインに由来するものを導入して、ＨＡ１末端を連結した。さらに、これらの他の構築物もまた、全て、点変異Ｙ３９２Ｐ、Ｒ４０４Ｑ、Ｅ４３４Ｑ、及びＳ４４２Ａを含んだ。
【０１９７】
【表６】
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【０１９８】
特性評価
表５及び６に列挙したポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ｐｃＤＮＡ２００４プラスミド（社内で改変した強化ＣＭＶプロモーターを有するｐｃＤＮＡ３ベクター）にクローニングした。スクリーニング目的のためのＣ末端ＦＬＡＧリンカー−Ｈｉｓタグを含むポリペプチドを、真核細胞株Ｅｘｐｉ２９３Ｆ細胞においてマイクロスケール（２００μＬ）で産生した。要するに、細胞を、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ）中、２．５Ｅ＋０６生細胞（ｖｃ）／ｍＬの細胞密度で、９６ウェルマイクロプレートフォーマット（Ｇｒｅｉｎｅｒ）に播種した。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ２９３トランスフェクションキット（Ｇｉｂｃｏ）を用いて細胞を一過性にトランスフェクトし、３７℃、２５０ｒｐｍ、８％ＣＯ２、及び湿度７５％で３日間インキュベートした。培養上清を、白色９６ウェルフィルタープレート（０．２２μｍ  ＰＶＤＦ膜）を使用して遠心分離（４００×ｇで１０分間）により回収し、凝集体及び細胞残屑を除去した。
【０１９９】
培養上清中に存在するポリペプチドの量、タンパク質フォールディング、及び三量体含量を全て化学増幅ホモジニアスアッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）によって評価した。曲線の直線範囲における適切なポリペプチド希釈を分析のために使用し、全てのデータを、１００％に設定した構築物ＵＦＶ１６０３６０（配列番号６３）に対し正規化した。
【０２００】
回収した培養上清中の相対ポリペプチド量を、ニッケルドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）及び抗Ｆｌａｇアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して決定した。曲線の直線範囲における培養上清の適切な希釈を使用して、フック効果を回避した。
【０２０１】
同様に、発現されたポリペプチドのフォールディングを、抗体ＣＲ９１１４（２ｎＭ）及び単一ドメインＳＤ１５００４（２ｎＭ）の結合を評価することによって検証した。抗体結合の検出のために、抗ヒトＩｇＧアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）及びニッケルドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用し、Ｓｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ標識単一ドメインの結合を検出するために、抗Ｈｉｓアクセプタービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）及びＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎドナービーズ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用した。
【０２０２】
実施例２に記載したのと同様のプロトコルを用いて、ＣＲ９１１４（２ｎＭ）及びＳｔｒｅｐｔａｃｔｉｎ標識ＳＤ１５０１６（２ｎＭ）の同時結合によって、多量体含量を測定した。ポリペプチドを、ＯＣＴＥＴによって決定したタンパク質濃度に基づいて滴定した。結合する両方の抗体を提供する三量体分子のみが、このアッセイにおいてシグナルを与える（単量体、二量体及び潜在的凝集体とは対照的に）。
【０２０３】
結果及び結論
全体的には、ポリペプチドは参照タンパク質（ＵＦＶ１６０３６０）と同様のレベルで発現され、代替切断位置（すなわち、代替ヘッドドメイン欠失）を有するデザインと、ＨＡ１末端をヘッドドメインに由来するリンカーで連結したデザインとの間で有意差は観察されなかった（図９Ａ）。同様に、ｂｎＡｂ  ＣＲ９１１４の結合について有意差は観察されなかった（図９Ｂ）。
【０２０４】
対照的に、相対三量体含量では差が観察され（図９Ｃ）、これらの設計は三量体ミニＨＡを形成する傾向が少なかった。平均して、代替切断が導入されたデザインでは約２倍の減少が観察され、一方、「ＧＧＧＧリンカー」がヘッドドメインからの配列で置き換えられたデザインでは約３倍の減少が観察された。
【０２０５】
これらの結果は、三量体含量はいくらか減少するが、広域中和抗体ＣＲ９１１４のエピトープを提示するように正確にフォールディングされた、十分に発現し且つ安定なステムポリペプチドが得られたことを示す。
【０２０６】
実施例６：ＨＡ１／ＨＡ２切断部位のバリエーション：ノックアウト、一塩基性及び多塩基性切断部位
インフルエンザＨＡ０タンパク質（ＨＡ１及びＨＡ２における）の切断がその活性に必要であり、宿主の膜とウイルスの膜との融合を引き起こすことにより、ウイルスゲノムの標的細胞への侵入を促進する。上述した本発明のポリペプチドは全て、切断部位ノックアウト変異Ｒ３２９Ｑを持って発現され、インビトロ及び／又はインビボでの産生中の分子の推定切断が防止された。
【０２０７】
この実施例では、いくつかのステムポリペプチドは天然の一塩基性切断部位を持って発現され、又は多塩基性切断部位（例えば、Ｆｕｒｉｎ切断部位）を含んだ（表７）。ポリペプチドはまた、３９２位及び４３４位に変異を含んだ。
【０２０８】
【表７】
2021511077.tif 000014
【０２０９】
培養上清の分析
表７に列挙したポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを、実施例５に記載のように合成した。
【０２１０】
回収した培養上清中の発現ポリペプチドのレベルを、ＯＣＴＥＴプラットフォームを使用するバイオレイヤー干渉法によって評価した。要するに、ビオチン化ｍＡｂ  ＣＲ９１１４をストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定し、その後、明確な精製相同ポリペプチドの希釈系列の結合シフトを評価することによって標準曲線を確立した。続いて、予め希釈したポリペプチドを含有する回収培養上清（カイネティクス緩衝液で５〜１５μｇ／ｍＬに希釈）の結合シフトを測定し、確立した標準曲線を用いて濃度を計算した。
【０２１１】
結果及び結論
一塩基性（Ｒ）又は多塩基性切断部位（ＲＲＲＫＫ）が挿入されたポリペプチド、すなわち、それぞれＵＦＶ１６０３０２及びＵＦＶ１６０３０１では、発現レベルに対する効果は観察されなかった（図１０）。両ポリペプチドは、類似したレベルで発現され、３２９位のアミノ酸のＱへの変異によってプロテアーゼ切断に抵抗性のある参照ポリペプチドＵＦＶ１５０８５０と比較して類似したレベルの三量体含量を示した。
【０２１２】
（ＲＫＲＲ）が導入された、第２の導入多塩基性切断部位では、発現レベル及び三量体含量の約２倍の減少が観察された（ＵＦＶ１６０５０３）。
【０２１３】
実施例７：ＧＣＮ４又は代替ヘプタッド反復三量体化ドメインの配列の例
デザイン
上記の本発明のポリペプチドにおいて、ＣヘリックスのＮ末端（分子の上部、図１Ｃを参照）、特にＨＡ２ドメインの４０５位のアミノ酸から始まり４１９位のアミノ酸までのアミノ酸配列を、分子の三量化傾向を改善するために、配列番号１１３のＧＣＮ４三量化ドメインによって置換した。この例では、コイルドコイル界面の最適化がＣヘリックスのヘプタッド反復配列の最適化によって首尾よく探索された。表８は、ポリペプチドＵＦＶ１６００９０における代替の三量体化配列（配列番号５６）を示す。ＣヘリックスのＮ末端領域における変異は、明るい灰色で強調されている。ＵＦＶ１６００９７の三量体化配列（配列番号５８）は、実施例１に記載のポリペプチドと同一である。ＣヘリックスのＮ末端部分のヘプタッド反復配列の野生型ＨＡとの相違部分を灰色で強調した。
【０２１４】
【表８】
2021511077.tif 000015
【０２１５】
培養上清の分析
表８に列挙したポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを、実施例５に記載のように合成した。
【０２１６】
回収した培養上清についての全ての評価を、実施例５に記載したのと同様にＡｌｐｈａＬＩＳＡによって行った。ＣＲ９１１４結合データを発現レベルで正規化した。
【０２１７】
結果及び結論
ポリペプチド発現レベル、三量体含量、及びＣＲ９１１４結合についての回収した培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡ評価は、Ｃヘリックス三量体界面（すなわち、上記のポリペプチド中に存在するようなＧＣＮ４様反復以外）の代替の最適化が許容されることを示した。タンパク質発現レベルの改善が観察されたが（約２倍）、三量体含量は減少が観察された（約２倍）。ＣＲ９１１４の結合は影響を受けなかった（図１１）。
【０２１８】
実施例８：本発明のステムポリペプチドのＣ末端における代替トランケーション
デザイン
ヘマグルチニンはウイルス粒子の表面に位置し、タンパク質のＣ末端部分がウイルス膜に埋め込まれた膜タンパク質である。本発明のポリペプチドの可溶性バージョンでは、膜貫通ドメイン（ＴＭ）の開始時のトランケーションによって膜貫通ドメインが欠失された。さらに、代替のトランケーション位置も評価した（表９及び１０）。
【０２１９】
【表９】
2021511077.tif 000016
【０２２０】
【表１０】
2021511077.tif 000017
【０２２１】
培養上清の分析
表９及び表１０に列挙したポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを、実施例５に記載のように合成した。
【０２２２】
培養上清を回収し、発現ポリペプチドの存在についてウェスタンブロッティングにより分析した。試料を非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル、４〜１２％ビス−トリス（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）上に泳動させ、ｉＢｌｏｔ  ｉｄ２．０システム（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてＰＶＤＦ膜に移した。ポリペプチドに対応するバンドを可視化するために、膜を０．２％ブロッキング剤（Ｍｉｌｋ  ｐｏｗｄｅｒ−ＢｉｏＲａｄ）を含むＴＢＳＴでブロックした後、ブロック緩衝液で十分に希釈したＨ１株特異的由来ヘマグルチニンタンパク質及びビオチン化単一ドメイン抗体（インフルエンザ６）と共にインキュベーションした。洗浄（ＴＢＳＴ）後、膜をＨＲＰ標識ストレプトアビジン（Ｂｅｃｔｏｎ  Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ  １：２５０ブロック緩衝液希釈）と共にインキュベートした。続いて、さらなる洗浄工程（ＴＢＳＴ）を行った後、Ｔｒｕｅｂｌｕｅペルオキシダーゼ基質（ＫＰＬ）と共にインキュベートすることによりタンパク質バンドを可視化した。
【０２２３】
発現された本発明のポリペプチドへの広域中和モノクローナル抗体ＣＲ９１１４の結合を、バイオレイヤー干渉法によりＯＣＴＥＴプラットフォームを使用して、回収した培養上清において評価した。要するに、カイネティクス緩衝液（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）により２倍希釈した上清を、ビオチン化ＣＲ９１１４をロードしたストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）によって評価した。会合工程の最初の２０秒の曲線フィッティングを行って、Ｋｏｎ値を計算し、培養上清中のポリペプチドの濃度を５０ｍＭに設定し、曲線を１：１モデルにフィットさせた。ＭＯＣＫ試料を陰性対照として含めた。
【０２２４】
結果及び結論
代替Ｃ末端トランケーションの最小の効果が、ポリペプチドの発現レベルで観察された。ＵＦＶ１５０５６５及びＵＦＶ１５０５７４を除く全てのバリアントが、回収した培養上清のウェスタンブロット分析において、三量体高さに明瞭なバンドを示した（図１２Ａ）。
【０２２５】
Ｏｃｔｅｔ分析は、ほぼ全てのデザイン（ＵＦＶ１５０５７５を除く）が固定されたＣＲ９１１４に結合することを示したが（図１２Ｂ）、参照デザイン５３６７及び５３６９と比較して、全体的により低いＫｏｎ値がＣ末端バリアントで観察された。これは、おそらく、全てのデザインで同一のタンパク質濃度と仮定する基本的な曲線フィッティング手順に一部、原因があったのであろう。しかし、ポリペプチドが抗体に結合したのは明らかである。
【０２２６】
これらの結果は、５０２までのトランケーションが可能であることを明らかに示している。
【０２２７】
実施例９：プロトマー間ジスルフィド架橋；代替位置
デザイン
本発明のポリペプチドは、共有結合三量体タンパク質として培養上清から精製される。前述したポリペプチドにおいて、共有結合はＢループ（３９７位）及びＣヘリックス（４０５位）における２つのシステイン残基の導入によって確立され、これらは隣接する単量体のシステイン残基と対合することによってジスルフィド架橋を形成する（単量体間ジスルフィド架橋）。この実施例では、これらのプロトマー間ジスルフィド架橋の２つの代替位置を探索した（表１１）。
【０２２８】
【表１１】
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【０２２９】
培養上清の分析
ポリペプチドをコードするＤＮＡフラグメントを上記のように合成した。回収した培養上清の全ての評価を、実施例７に記載のようにＡｌｐｈａＬＩＳＡによって行った。
【０２３０】
結果及び結論
ポリペプチド発現レベル、三量体含量、及びＣＲ９１１４結合についての回収された培養上清のＡｌｐｈａＬＩＳＡによる評価は、代替のプロトマー間ジスルフィド架橋が参照ポリペプチドＵＦＶ１６００９０と同等であるか又はより良好であることを示した（図１３）。これらのデータは、３９８位及び４０５位（ＵＦＶ１６００９３）、並びに３９６位及び４０８位（ＵＦＶ１６００８８）におけるシステイン残基の導入が、３９７位及び４０５位（ＵＦＶ１６００９０）に導入されたシステインによって形成されるプロトマー間ジスルフィド架橋の代替物を提供することを示した。
【０２３１】
実施例１０：本発明のポリペプチドによりナイーブマウスを免疫した後の、Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７による致死的チャレンジに対する保護
この実施例では、ＡｌＯＨ３アジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４の用量範囲の保護効果（追跡期間終了時の生存率に基づく）を、偽免疫（ＰＢＳ）動物及び固定用量のＵＦＶ４９００（探索的）と比較評価した。
【０２３２】
８〜１１匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（６〜８週齢）を、５０μｇのＡｌＯＨ３（２％Ａｌｙｈｙｄｒｏｇｅｌとして製剤化）をアジュバントとして加えた可溶性三量体ＵＦＶ１６０６６４の用量範囲で、３週間隔で２回、筋肉注射により免疫した。用量範囲は３０μｇから始めて０．０３μｇまでの４回の１０倍希釈からなった。チャレンジモデルの陽性対照として、マウスを３０μｇの可溶性三量体ＵＦＶ４９００で２回免疫し（ｎ＝１０）、ＰＢＳによる２回の免疫付与を陰性対照とした（ｎ＝１１）。最後の免疫付与から４週間後に、マウスから採血して免疫応答（Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７完全長（ＦＬ）ＨＡ  ＥＬＩＳＡ）を分析し、その１日後にマウスに２５×ＬＤ５０のマウス馴化Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７チャレンジウイルスでチャレンジし、３週間モニターした（生存、体重、臨床スコア）。追跡調査終了時の生存率を主要アウトカムパラメータとした。
【０２３３】
結果
ＡｌＯＨ３アジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４は、Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７  ＦＬ  ＨＡ  ＥＬＩＳＡ力価が試験した全ての用量でＰＢＳ群と比較して有意に増加した（Ｐ＜０．００１；マン・ホイットニーのＵ検定、最高用量から開始するステップワイズ法、及び多重比較のためのボンフェローニの調整を含む）ので、免疫原性であることが示された。３０μｇＵＦＶ１６０６６４投与免疫動物の力価は、３０μｇＵＦＶ４９００群に匹敵した（図１５）。
【０２３４】
さらに、ＡｌＯＨ３アジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４は、ＰＢＳ群と比較して、０．０３μｇを除く全ての用量で有意な保護を提供した（Ｐ≦０．００３；フィッシャーの直接確率検定、構築物に対するボンフェローニ補正、及び段階的検定、最高用量から開始するステップワイズ試験）。３０μｇのＵＦＶ１６０６６４群の生存率（８７．５％）は、３０μｇのＵＦＶ４９００群（９０％）に匹敵した（図１６、上のパネル）。（曲線下面積によって定義される）体重減少は、ＰＢＳ群と比較して、０．０３μｇを除く全ての用量で有意に減少した（Ｐ≦０．０１２；ＡＮＯＶＡ、構築物に対する２倍のボンフェローニ補正、及び最高用量から開始するステップワイズ試験）。３０μｇのＵＦＶ１６０６６４群の体重減少は、３０μｇのＵＦＶ４９００群に匹敵した（図１６、下のパネル）。
【０２３５】
結論
本発明によれば、ＡｌＯＨ３アジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４は免疫原性であり、致死的Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／０７マウスチャレンジモデルにおいて保護を提供することが示された。免疫原性及び保護効果は、ＡｌＯＨ３アジュバント添加ＵＦＶ４９００に匹敵する。
【０２３６】
実施例１１：本発明のポリペプチドによりナイーブマウスを免疫した後の、Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４による致死的チャレンジに対する保護
この実施例では、２％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４の用量範囲の保護効果（追跡期間終了時の生存率に基づく）を、偽免疫（ＰＢＳ）動物及び固定用量のＵＦＶ４９００（探索的）と比較評価した。
【０２３７】
再び、８〜１１匹の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス群（６〜８週齢）を、２％（ｖ／ｖ）のＡｄｊｕｐｌｅｘをアジュバントとして加えた可溶性三量体ＵＦＶ１６０６６４の用量範囲で、３週間隔で２回、筋肉注射により免疫した。用量範囲は３０ｍｃｇから始めて０．０３μｇまでの４回の１０倍希釈からなった。チャレンジモデルの陽性対照として、マウスを３０μｇの可溶性三量体ＵＦＶ４９００で２回免疫し（ｎ＝１０）、ＰＢＳによる２回の免疫付与を陰性対照とした（ｎ＝１１）。最後の免疫付与から４週間後に、マウスに１２．５×ＬＤ５０のマウス馴化Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４チャレンジウイルスでチャレンジし、３週間モニターした（生存、体重、臨床スコア）。追跡調査終了時の生存率を主要アウトカムパラメータとした。
【０２３８】
結果
２％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４は、ＰＢＳ群と比較して、０．０３μｇを除く全ての用量で有意な保護を提供した（Ｐ≦０．００３；フィッシャーの直接確率検定、構築物に対するボンフェローニ補正、及び段階的検定、最高用量から開始するステップワイズ試験）ことが示された。３０μｇのＵＦＶ１６０６６４群の生存率（１００％）は、３０μｇのＵＦＶ４９００群（１００％）と同一であった（図１７、上のパネル）。
【０２３９】
（曲線下面積によって定義される）体重減少は、ＰＢＳ群と比較して、全ての用量で有意に減少した（Ｐ≦０．０２６；ＡＮＯＶＡ、構築物に対する２倍のボンフェローニ補正、及び最高用量から開始するステップワイズ試験）。３０ｍｃｇのＵＦＶ１６０６６４群の体重減少は、３０μｇのＵＦＶ４９００群に匹敵した（図１７、下のパネル）。
【０２４０】
結論
本発明によれば、２％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４は、致死的Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／３４マウスチャレンジモデルにおいて保護を提供することが示された。保護効果は２％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ４９００に匹敵する。
【０２４１】
実施例１２：本発明のポリペプチドは免疫原性であり、Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／６０２／０９ナイーブフェレットチャレンジモデルにおいて標準治療ワクチンに匹敵する有効性を示す
この実施例では、ＵＦＶ１６０６６４の２回投与によるインビボでの免疫原性及び保護効果（追跡終了時の肺ウイルス量に基づく）を、アジュバント単独免疫動物、及びＨ１Ｎ１  Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／６０２／０９ナイーブフェレットチャレンジモデルにおける標準治療の季節性インフルエンザワクチンと比較評価した。
【０２４２】
ナイーブ雌フェレット群（ｎ＝６）を、５％Ａｄｊｕｐｌｅｘをアジュバントとして加えた５０μｇ又は５μｇのＵＦＶ１６０６６４で、３週間隔で３回、筋肉注射により免疫した。陰性対照群は、アジュバントのみで免疫した。標準治療を示す参照群を、市販の標準治療（ＳｏＣ）の季節性インフルエンザワクチンで免疫した。最終の免疫付与から４週間後、０日目に、気管内投与により、動物に１０６ＴＣＩＤ５０  Ｈ１Ｎ１  Ａ／Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ／６０２／０９でチャレンジした。４日間の追跡期間中、いくつかのウイルス学的及び臨床的パラメータを記録した。
【０２４３】
結果
５％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４は両用量で、アジュバント単独群の力価と比較して有意に高いＨ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９ＨＡ特異的抗体力価を誘導した（Ｐ＜０．００１；事後ｔ検定、多重比較のためのボンフェローニ調整、及び最高用量で開始するステップワイズ試験を含む打ち切りＡＮＯＶＡ）が、ＳｏＣは誘導しなかったことが示された（図１８）。５％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４は両用量で、アジュバント単独群の力価と比較して有意に高いＨ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９ＨＡ特異的抗体力価を誘導した（Ｐ＜０．００１；事後ｔ検定、多重比較のためのボンフェローニ調整、及び最高用量で開始するステップワイズ試験を含む打ち切りＡＮＯＶＡ）が、ＳｏＣは誘導しなかった（図１８）。
【０２４４】
さらに、５％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４は両用量で、アジュバント単独群の力価と比較して有意に高いＨ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９ＨＡステム特異的抗体力価（ＣＲ９１１４競合アッセイにより測定）を誘導した（Ｐ＜０．００１；事後ｔ検定、多重比較のためのボンフェローニ調整、及び最高用量で開始するステップワイズ試験を含む打ち切りＡＮＯＶＡ）が、ＳｏＣは誘導しなかった（図１９）。
【０２４５】
５０μｇの５％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４用量及びＳｏＣは、アジュバント単独群と比較して肺ウイルス量を有意に減少させた（５０μｇＵＦＶ１６０６６４：Ｐ＜０．００１、ＳｏＣ：Ｐ＜０．０５；事後ｔ検定、多重比較のためのボンフェローニ調整、及び最高用量で開始するステップワイズ試験を含む打ち切りＡＮＯＶＡ）（図２０）。
【０２４６】
結論
本発明によれば、両用量の５％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４が免疫原性であり、且つ５０μｇ用量はＳｏＣワクチン参照群に匹敵する保護を提供することが示された。
【０２４７】
実施例１３：本発明のポリペプチドは、Ｈ５Ｎ１  Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５ナイーブフェレットチャレンジモデルにおいて陽性対照と同等の効力を示す
この実施例では、ＵＦＶ１６０６６４の２つの用量のインビボでの免疫原性及び保護効果（追跡終了時の肺ウイルス量に基づく）を、アジュバント単独免疫動物、及び異亜型のＨ５Ｎ１  Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５ナイーブフェレットチャレンジモデルにおいて、チャレンジ株に相同のＨ５  ＦＬ  ＨＡ（探索的）で免疫した陽性対照群と比較評価した。
【０２４８】
ナイーブ雌フェレット群（ｎ＝６）を、５％Ａｄｊｕｐｌｅｘをアジュバントとして加えた５０μｇ又は５μｇのＵＦＶ１６０６６４で、３週間隔で３回、筋肉注射により免疫した。陰性対照群は、アジュバントのみで免疫した。陽性対照群は、５％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバントを添加した、チャレンジ株と相同のＨ５  Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５  ＨＡで免疫した。最終の免疫付与から４週間後、０日目に、気管内投与により、動物に１０５ＴＣＩＤ５０  Ｈ５Ｎ１Ａ／Ｉｎｄｏｎｅｓｉａ／０５／０５でチャレンジした。５日間の追跡期間中、いくつかのウイルス学的及び臨床的パラメータを記録した。
【０２４９】
結果
５％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４の両用量で免疫した動物及び陽性対照群は、追跡期間を生存したが、アジュバント単独群の生存率は２５％であったことが示された（図２１）。追跡期間中の累積体重減少は、５％Ａｄｊｕｐｌｅｘをアジュバントとして添加した５０μｇのＵＦＶ１６０６６４で免疫した６匹の動物のうち４匹で、アジュバント単独群と比較して減少した。陽性対照群は５０μｇＵＦＶ１６０６６４群の４匹と体重減少が同等であり、アジュバント単独群と比較すると体重の減少は有意に少なかった（Ｐ＜０．００１；事後ｔ検定、多重比較のためのボンフェローニ調整、及び最高用量で開始するステップワイズ試験を含むＡＮＯＶＡ）（図２２）。
【０２５０】
５０ｍｃｇの５％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４及び陽性対照群はいずれも、アジュバント単独群と比較して肺ウイルス量を有意に減少させた（５０μｇＵＦＶ１６０６６４：Ｐ＜０．０１、陽性対照：Ｐ＜０．０５；事後ｔ検定、多重比較のためのボンフェローニ調整、及び最高用量で開始するステップワイズ試験を含む打ち切りＡＮＯＶＡ）（図２３）。
【０２５１】
５０μｇの５％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４及び陽性対照群はいずれも、アジュバント単独群と比較して累積（毎日のスワブ）咽喉ウイルス量を有意に減少させた（５０ｍｃｇＵＦＶ１６０６６４：Ｐ＜０．０５、陽性対照：Ｐ＜０．００１；事後ｔ検定、多重比較のためのボンフェローニ調整、及び最高用量で開始するステップワイズ試験を含むＡＮＯＶＡ）（図２４）。
【０２５２】
結論
本発明によれば、ＵＦＶ１６０６６４は５μｇ及び５０μｇの両用量で、死亡の発生が防がれたことが示された。さらに、ＵＦＶ１６０６６４の５０μｇの用量では、体重減少が減り、且つ肺及び咽喉のウイルス量が有意に減少し、陽性対照群に匹敵した。
【０２５３】
実施例１４：本発明のポリペプチドを発現するアデノウイルスベクターによるナイーブマウス免疫後の体液性及び細胞性免疫原性
この実施例では、本発明のポリペプチド（特にポリペプチドＵＦＶ１７１５９０）を発現する核酸を含有するアデノベクター２６（Ａｄ２６）の用量範囲の体液性及び細胞性免疫原性を評価した。比較のために、対照マウスを、空のアデノベクター、固定用量の２％Ａｄｊｕｐｌｅｘアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４タンパク質、又はＵＦＶ１７１５９０プライム、アジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４ブーストの異種免疫レジメンで免疫した。
【０２５４】
雌のＢＡＬＢ／ｃマウス群に、４週間の間隔をあけて２回の筋肉内免疫を与えた。８匹のマウスからなる３つの群を、ＵＦＶ１７１５９０の１０８、１０９又は１０１０ウイルス粒子（ｖｐ）で免疫した。陰性対照として、４匹のマウスに、１０１０ｖｐの空のアデノベクター（Ａｄ２６＿ｅｍｐｔｙ）で２回免疫を与えた。５匹のマウスの１群に、２％Ａｄｊｕｐｌｅｘをアジュバントとして加えた３０μｇの可溶性三量体ＵＦＶ１６０６６４で２回のタンパク質免疫を与えた。５匹のマウスの１群に、１０１０ｖｐのＵＦＶ１７１５９０によるプライム免疫を行い、続いて２％Ａｄｊｕｐｌｅｘをアジュバントとして加えた３０μｇの可溶性三量体ＵＦＶ１６０６６４によるブースト免疫を行った。ブースト免疫の３週間後に、マウスを屠殺し、血液及び脾臓試料を単離して、それぞれＨ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９（完全長（ＦＬ）ＥＬＩＳＡ及びステム競合ＥＬＩＳＡ）に対する体液性免疫応答及びＵＦＶ１６０６６４ペプチド（Ｔ細胞ＥＬＩＳｐｏｔ）に対する細胞性免疫応答を分析した。
【０２５５】
結果
本発明のポリペプチドを発現する核酸を含有するアデノベクターは全ての用量で、空のベクターによる免疫と比較して、有意なＨ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ＦＬ  ＨＡ  ＥＬＩＳＡ結合力価を誘導したことが示された（１０８ｖｐ、１０９ｖｐ及び１０１０ｖｐ：ｐ＜０．００１、尤度比検定に基づくトービット回帰モデル）。（図２５）。さらに、空のベクターと比較して、有意なＨＡステム特異的抗体力価（ＣＲ９１１４競合アッセイにより測定）が、１０９ｖｐ及び１０１０ｖｐのＵＦＶ１７１５９０によって誘導された（ｐ＜０．００１；尤度比検定に基づくトービット回帰モデル）（図２６）。アジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４によるプライムブースト、及びＵＦＶ１７１５９０プライム、アジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４ブーストはいずれも、有意なＨ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９  ＦＬ  ＨＡ結合力価（図２５）及びＨＡステム特異的抗体力価を誘導した（ｐ＜０．００１  尤度比検定に基づくトービット回帰モデル）（図２６）。
【０２５６】
有意な体液性応答に加えて、ＵＦＶ１７１５９０は、Ｔ細胞ＥＬＩＳｐｏｔによるＵＦＶ１６０６６４ペプチドでの刺激後の測定で、空のベクターと比較して、有意なＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答を誘導した（図２７）。ＵＦＶ１７１５９０の全ての用量で、有意なＴ細胞応答を誘導し（ｐ＜０．００１；尤度比検定に基づくトービット回帰モデル）、ＵＦＶ１７１５９０プライムを受けた後にＵＦＶ１６０６６４ブースト免疫を受けたマウス群も同様に誘導した（ｐ＜０．００１）。アジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４による２回の免疫付与は、検出可能なＩＦＮ−γ  Ｔ細胞応答を誘導しなかった（図２７）。
【０２５７】
結論
本発明のポリペプチド（ＵＦＶ１７１５９０）を発現するアデノベクター２６は、相同免疫レジメン、又はアジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４ブーストと組み合わせた場合に、マウスモデルにおいて、Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９  ＦＬ  ＨＡに対する有意な体液性応答及び細胞性応答を誘導することが示された。アジュバント添加ＵＦＶ１６０６６４もまた、有意な体液性免疫応答を誘導したが、ＵＦＶ１７１５９０によるプライムがなければ、検出可能なＴ細胞応答を誘導しなかった。
【０２５８】
実施例１５：ポリペプチド１６０６６４から異なるグループ１骨格への変異の転移
哺乳動物細胞におけるタンパク質の発現
本発明のさらなるポリペプチド（すなわち、異なるＨＡ骨格に基づく、図２８Ａを参照）をコードするＤＮＡフラグメントを合成し（Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ）、ｐｃＤＮＡ２００４プラスミド（強化ＣＭＶプロモーターを有する社内改変ｐｃＤＮＡ３ベクター）中にクローニングした。ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いた一過性トランスフェクションにより、ＥｘｐｉＣＨＯ（商標）発現培地中のＥｘｐｉ−ＣＨＯ細胞培養物においてポリペプチドを産生した。Ｅｘｐｉ−ＣＨＯ細胞培養物に、ＥｘｐｉＦｅｃｔａｍｉｎｅ  ＣＨＯエンハンサー及びＥｘｐｉＣＨＯフィード（Ｇｉｂｃｏ、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、トランスフェクションの１日後に添加した。７日目に遠心分離し、続いて０．２μｍ濾過によって、分泌されたポリペプチドを含む培養上清を回収した。
【０２５９】
培養上清の分析
回収した培養上清中の発現ポリペプチドのレベルを、ＯＣＴＥＴプラットフォームを使用してバイオレイヤー干渉法により評価した。要するに、ビオチン化ｍＡｂ  ＣＲ９１１４をストレプトアビジン（ＳＡ）バイオセンサー（Ｐａｌｌ  ＦｏｒｔｅＢｉｏ）に固定し、その後、明確な精製相同ポリペプチドの希釈系列の結合シフトを評価することによって標準曲線を確立した。続いて、予め希釈したポリペプチドを含有する回収培養上清（カイネティクス緩衝液で約５〜１５μｇ／ｍＬに希釈）の結合シフトを測定し、確立した標準曲線を用いて濃度を計算した。
【０２６０】
次に、Ｅｘｐｉ−ＣＨＯ培養回収物中の本発明のポリペプチドの含量を、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）Ｉｎｆｉｎｉｔｙ１２６０シリーズセットアップ（Ａｇｉｌｅｎｔ）における分析用ＳＥＣによって評価した。ＵＦＶ１８０５００（０．８μｇ）を除いて、ポリペプチド約３μｇのプロテインインジェクションを含む培養上清をＴＳＫｇｅｌ  Ｇ３０００ＳＷｘｌカラム（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）に流し（１ｍＬ／分）、溶出液をＵＶ検出（ＯＤ２８０、ｍＡＵ）によってモニターした。ＳＥＣプロファイルを、Ａｓｔｒａ６ソフトウェアパッケージ（Ｗｙａｔｔ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）によって分析した。ポリペプチドのフォールディングを、化学増幅ホモジニアスアッセイ（ＡｌｐｈａＬＩＳＡ）によって評価した。この溶解結合平衡アッセイは、ドナービーズ及びアクセプタービーズの両方のポリペプチドへの首尾よい結合に基づく。近接している場合、６８０ｎｍでのドナービーズのレーザー照射は一重項酸素の流れを生成し、近くのアクセプタービーズにおける化学的事象を誘発し、６１５ｎｍの化学発光を生じる。ＣＲ９１１４（２ｎＭ）又はＭＤ３６０６（２ｎＭ）の存在下で、ニッケルドナービーズ（１０μｇ／ｍＬ）及び抗ヒトＩｇＧアクセプタービーズ（１０μｇ／ｍＬ、いずれもＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を培養上清に同時に添加することによって、ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイを行った。ポリペプチド含有培養上清を、１６６７ｎｇ／ｍＬで開始する３倍希釈範囲で滴定した。２時間のインキュベーション（室温）後、ＥｎＳｉｇｈｔ（商標）マルチモードプレートリーダー（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）を用いて読み出しを行った。
【０２６１】
結果及び結論
３５ｍＬのＥｘｐｉＣＨＯトランスフェクションの分析は、Ｈｉｓタグ付きポリペプチドが発現されることを示す（図２８Ａ）。発現レベルは４２ｍｇ／Ｌ（骨格Ｈ５  Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４）から３７５ｍｇ／Ｌ（骨格Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９）まで変化し、全てのポリペプチドが良好に発現することを示す。さらに、ＳＥＣプロファイル（図２８Ｂ）は、発現された各ポリペプチドで、有意な三量体（Ｔ）及び単量体（Ｍ）画分が検出可能であることを示す。利用した骨格株に応じて、相対的な三量体及び単量体の含量の差が観察された。ポリペプチドの正しいフォールディングをさらに評価するために、関連する抗体（ＣＲ９１１４）及びマルチドメイン（ＭＤ３６０６）の結合をＡｌｐｈａＬＩＳＡによって評価した。全てのポリペプチドで、ＣＲ９１１４及びＭＤ３６０６の両方に対する特異的結合シグナルが観察された（図２８Ｃ）。発現、ＳＥＣプロファイル及び結合データは、本発明による変異（例えば、Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９株に基づくＵＦＶ１６０６６４の変異）が他のグループ１の骨格に転移可能であることを示す。したがって、ポリペプチドＵＦＶ１８０４９６、ＵＦＶ１８０４９７、ＵＦＶ１９０４９８、ＵＦＶ１８０４９９、ＵＦＶ１８０５００及びＵＦＶ１８０５０１は全て正しくフォールディングされ、三量体であり、培養上清中に分泌された。
【０２６２】
【表１２】
2021511077.tif 000019
【０２６３】
参考文献
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Ｗｉｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９８１）Ｎａｔｕｒｅ  ２９２：７２−７５．
【０２６４】
配列
配列番号１：Ｈ１完全長（Ａ／Ｂｒｉｓｂａｎｅ／５９／２００７）
【化７】
2021511077.tif 000020
【０２６５】
配列番号２：Ｈ１完全長（Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／２００９）
【化８】
2021511077.tif 000021
【０２６６】
配列番号３：Ａ／Ｔｅｘａｓ／ＵＲ０６−０５２６／２００７（Ｈ１Ｎ１）
【化９】
2021511077.tif 000022
【０２６７】
配列番号４：Ａ／ＮｅｗＹｏｒｋ／６２９／１９９５（Ｈ１Ｎ１）
【化１０】
2021511077.tif 000023
【０２６８】
配列番号５：Ａ／ＡＡ＿Ｍａｒｔｏｎ／１９４３（Ｈ１Ｎ１）
【化１１】
2021511077.tif 000024
【０２６９】
配列番号６：Ａ／Ａｄａｃｈｉ／２／５７（Ｈ２Ｎ２）
【化１２】
2021511077.tif 000025
【０２７０】
配列番号７：Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７（Ｈ２Ｎ２）
【化１３】
2021511077.tif 000026
【０２７１】
配列番号８：Ａ／Ｖｉｅｔ  Ｎａｍ／１２０３／２００４  Ｈ５Ｎ１）
【化１４】
2021511077.tif 000027
【０２７２】
＞ＣＲ９１１４  ＶＨタンパク質（配列番号９）
【化１５】
2021511077.tif 000028
【０２７３】
＞ＣＲ９１１４  ＶＬタンパク質（配列番号１０）
【化１６】
2021511077.tif 000029
【０２７４】
＞ＣＲ６２６１  ＶＨタンパク質（配列番号１１）
【化１７】
2021511077.tif 000030
【０２７５】
＞ＣＲ６２６１  ＶＬタンパク質（配列番号１２）
【化１８】
2021511077.tif 000031
【０２７６】
配列番号１３：ＳＤ１５０１６
【化１９】
2021511077.tif 000032
【０２７７】
配列番号１４：ＳＤ１５００４
【化２０】
2021511077.tif 000033
【０２７８】
配列番号１５  ＣＡＡ２４２６９．１ヘマグルチニン（インフルエンザＡウイルス（Ａ／Ａｉｃｈｉ／２／１９６８（Ｈ３Ｎ２）（シグナル配列を除く）
【化２１】
2021511077.tif 000034
【０２７９】
配列番号１６：ＵＦＶ５３６７
【化２２】
2021511077.tif 000035
【０２８０】
配列番号１７：ＵＦＶ５３６９
【化２３】
2021511077.tif 000036
【０２８１】
配列番号１３５：ＵＦＶ１５０５５３
【化２４】
2021511077.tif 000037
【０２８２】
配列番号３０：ＵＦＶ１５０５５８
【化２５】
2021511077.tif 000038
【０２８３】
配列番号３１：ＵＦＶ１５０５５９
【化２６】
2021511077.tif 000039
【０２８４】
配列番号３２：ＵＦＶ１５０５６５
【化２７】
2021511077.tif 000040
【０２８５】
配列番号３３：ＵＦＶ１５０５６６
【化２８】
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【０２８６】
配列番号３４：ＵＦＶ１５０５６７
【化２９】
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【０２８７】
配列番号３５：ＵＦＶ１５０５６８
【化３０】
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【０２８８】
配列番号３６：ＵＦＶ１５０５６９
【化３１】
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【０２８９】
配列番号３７：ＵＦＶ１５０５７０
【化３２】
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【０２９０】
配列番号３８：ＵＦＶ１５０５７１
【化３３】
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【０２９１】
配列番号３９：ＵＦＶ１５０５７２
【化３４】
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【０２９２】
配列番号４０：ＵＦＶ１５０５７３
【化３５】
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【０２９３】
配列番号４１：ＵＦＶ１５０５７４
【化３６】
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【０２９４】
配列番号４２：ＵＦＶ１５０５７５
【化３７】
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【０２９５】
配列番号４３：ＵＦＶ１５０５７６
【化３８】
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【０２９６】
配列番号４４：ＵＦＶ１５０５７７
【化３９】
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【０２９７】
配列番号４５：ＵＦＶ１５０５７８
【化４０】
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【０２９８】
配列番号４６：ＵＦＶ１５０５７９
【化４１】
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【０２９９】
配列番号４７：ＵＦＶ１５０５８０
【化４２】
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【０３００】
配列番号４８：ＵＦＶ１５０５８１
【化４３】
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【０３０１】
配列番号４９：ＵＦＶ１５０５８２
【化４４】
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【０３０２】
配列番号５０：ＵＦＶ１５０５８３
【化４５】
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【０３０３】
配列番号５１：ＵＦＶ１５０５８４
【化４６】
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【０３０４】
配列番号５２：ＵＦＶ１５０８４９
【化４７】
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【０３０５】
配列番号５３：ＵＦＶ１５０８５０
【化４８】
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【０３０６】
配列番号５４：ＵＦＶ１５０５５２
【化４９】
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【０３０７】
配列番号５５：ＵＦＶ１６００８８
【化５０】
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【０３０８】
配列番号５６：ＵＦＶ１６００９０
【化５１】
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【０３０９】
配列番号５７：ＵＦＶ１６００９３
【化５２】
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【０３１０】
配列番号５８：ＵＦＶ１６００９７
【化５３】
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【０３１１】
配列番号５９：ＵＦＶ１６０３０１
【化５４】
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【０３１２】
配列番号６０：ＵＦＶ１６０３０２
【化５５】
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【０３１３】
配列番号６１：ＵＦＶ１６０３０３
【化５６】
2021511077.tif 000069
【０３１４】
配列番号６２：ＵＦＶ１６０３０４
【化５７】
2021511077.tif 000070
【０３１５】
配列番号６３：ＵＦＶ１６０３６０
【化５８】
2021511077.tif 000071
【０３１６】
配列番号６４：ＵＦＶ１６０３６１
【化５９】
2021511077.tif 000072
【０３１７】
配列番号６５：ＵＦＶ１６０３６２
【化６０】
2021511077.tif 000073
【０３１８】
配列番号６６：ＵＦＶ１６０３６３
【化６１】
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【０３１９】
配列番号６７：ＵＦＶ１６０３６４
【化６２】
2021511077.tif 000075
【０３２０】
配列番号６８：ＵＦＶ１６０３６５
【化６３】
2021511077.tif 000076
【０３２１】
配列番号６９：ＵＦＶ１６０３６６
【化６４】
2021511077.tif 000077
【０３２２】
配列番号７０：ＵＦＶ１６０３６７
【化６５】
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【０３２３】
配列番号７１：ＵＦＶ１６０３６８
【化６６】
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【０３２４】
配列番号７２：ＵＦＶ１６０３６９
【化６７】
2021511077.tif 000080
【０３２５】
配列番号７３：ＵＦＶ１６０３７０
【化６８】
2021511077.tif 000081
【０３２６】
配列番号７４：ＵＦＶ１６０３７１
【化６９】
2021511077.tif 000082
【０３２７】
配列番号７５：ＵＦＶ１６０３７２
【化７０】
2021511077.tif 000083
【０３２８】
配列番号７６：ＵＦＶ１６０３７３
【化７１】
2021511077.tif 000084
【０３２９】
配列番号７７：ＵＦＶ１６０３７４
【化７２】
2021511077.tif 000085
【０３３０】
配列番号７８：ＵＦＶ１６０３７５
【化７３】
2021511077.tif 000086
【０３３１】
配列番号７９：ＵＦＶ１６０３７６
【化７４】
2021511077.tif 000087
【０３３２】
配列番号８０：ＵＦＶ１６０３７７
【化７５】
2021511077.tif 000088
【０３３３】
配列番号８１：ＵＦＶ１６０３７８
【化７６】
2021511077.tif 000089
【０３３４】
配列番号８２：ＵＦＶ１６０３７９
【化７７】
2021511077.tif 000090
【０３３５】
配列番号８３：ＵＦＶ１６０３８０
【化７８】
2021511077.tif 000091
【０３３６】
配列番号８４：ＵＦＶ１６０３８１
【化７９】
2021511077.tif 000092
【０３３７】
配列番号８５：ＵＦＶ１６０３８２
【化８０】
2021511077.tif 000093
【０３３８】
配列番号８６：ＵＦＶ１６０３８３
【化８１】
2021511077.tif 000094
【０３３９】
配列番号８７：ＵＦＶ１６０３８４
【化８２】
2021511077.tif 000095
【０３４０】
配列番号８８：ＵＦＶ１６０３８５
【化８３】
2021511077.tif 000096
【０３４１】
配列番号８９：ＵＦＶ１６０３８６
【化８４】
2021511077.tif 000097
【０３４２】
配列番号９０：ＵＦＶ１６０３８７
【化８５】
2021511077.tif 000098
【０３４３】
配列番号９１：ＵＦＶ１６０３８８
【化８６】
2021511077.tif 000099
【０３４４】
配列番号９２：ＵＦＶ１６０３８９
【化８７】
2021511077.tif 000100
【０３４５】
配列番号９３：ＵＦＶ１６０３９０
【化８８】
2021511077.tif 000101
【０３４６】
配列番号９４：ＵＦＶ１６０３９１
【化８９】
2021511077.tif 000102
【０３４７】
配列番号９５：ＵＦＶ１６０３９２
【化９０】
2021511077.tif 000103
【０３４８】
配列番号９６：ＵＦＶ１６０３９３
【化９１】
2021511077.tif 000104
【０３４９】
配列番号９７：ＵＦＶ１６０３９４
【化９２】
2021511077.tif 000105
【０３５０】
配列番号９８：ＵＦＶ１６０３９５
【化９３】
2021511077.tif 000106
【０３５１】
配列番号９９：ＵＦＶ１６０３９６
【化９４】
2021511077.tif 000107
【０３５２】
配列番号１００：ＵＦＶ１６０３９７
【化９５】
2021511077.tif 000108
【０３５３】
配列番号１０１：ＵＦＶ１６０５０３
【化９６】
2021511077.tif 000109
【０３５４】
配列番号１０２：ＵＦＶ１６０５０４
【化９７】
2021511077.tif 000110
【０３５５】
配列番号１０３：ＵＦＶ１６０６５５
【化９８】
2021511077.tif 000111
【０３５６】
配列番号１０４：ＵＦＶ１６０６５６
【化９９】
2021511077.tif 000112
【０３５７】
配列番号１０５：ＵＦＶ１６０６５７
【化１００】
2021511077.tif 000113
【０３５８】
配列番号１０６：ＵＦＶ１６０６５８
【化１０１】
2021511077.tif 000114
【０３５９】
配列番号１０７：ＵＦＶ１６０６５９
【化１０２】
2021511077.tif 000115
【０３６０】
配列番号１０８：ＵＦＶ１６０６６３
【化１０３】
2021511077.tif 000116
【０３６１】
配列番号１０９：ＵＦＶ１６０６６４
【化１０４】
2021511077.tif 000117
【０３６２】
配列番号１１０：ＵＦＶ１６０６６５
【化１０５】
2021511077.tif 000118
【０３６３】
配列番号１１：ＵＦＶ１６０６６６
【化１０６】
2021511077.tif 000119
【０３６４】
配列番号１１２：ＵＦＶ１６０６６７
【化１０７】
2021511077.tif 000120
【０３６５】
配列番号１３８：ＵＦＶ１６０６５５
【化１０８】
2021511077.tif 000121
【０３６６】
配列番号１３９：ＵＦＶ１６０６５６
【化１０９】
2021511077.tif 000122
【０３６７】
配列番号１４０：ＵＦＶ１６０６６４
【化１１０】
2021511077.tif 000123
【０３６８】
配列番号１４１：ＵＦＶ１６０６６５
【化１１１】
2021511077.tif 000124
【０３６９】
配列番号１４２：ＵＦＶ１７１５８８（ＵＦＶ１６０６５５＋ＴＭ））
【化１１２】
2021511077.tif 000125
【０３７０】
配列番号１４３：ＵＦＶ１７１５８９（ＵＦＶ１６０６５６＋ＴＭ）
【化１１３】
2021511077.tif 000126
【０３７１】
配列番号１４４：ＵＦＶ１７１５９０（ＵＦＶ１６０６６４＋ＴＭ）
【化１１４】
2021511077.tif 000127
【０３７２】
配列番号１４５：ＵＦＶ１７１５９１（ＵＦＶ１６０６６５＋ＴＭ）
【化１１５】
2021511077.tif 000128
【０３７３】
配列番号１４６：ＭＤ３６０６タンパク質
【化１１６】
2021511077.tif 000129
【０３７４】
配列番号１４７：ＵＦＶ１８０４９６  Ｈ１  Ａ／Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ／０７／０９
【化１１７】
2021511077.tif 000130
【０３７５】
配列番号１４８：ＵＦＶ１８０４９７  Ｈ１  Ａ／Ｍｉｃｈｉｇａｎ／４５／２０１５
【化１１８】
2021511077.tif 000131
【０３７６】
配列番号１４９：ＵＦＶ１８０４９８  Ｈ１  Ａ／Ｐｕｅｒｔｏ  Ｒｉｃｏ／８／１９３４
【化１１９】
2021511077.tif 000132
【０３７７】
配列番号１５０：ＵＦＶ１８０４９９  Ｈ５  Ａ／Ｈｏｎｇ  Ｋｏｎｇ／１５６／９７
【化１２０】
2021511077.tif 000133
【０３７８】
配列番号１５１：ＵＦＶ１８０５００  Ｈ５  Ａ／Ｖｉｅｔｎａｍ／１２０３／０４
【化１２１】
2021511077.tif 000134
【０３７９】
配列番号１５２：ＵＦＶ１８０５０１  Ｈ２  Ａ／Ｓｉｎｇａｐｏｒｅ／１／５７
【化１２２】
2021511077.tif 000135
【０３８０】
配列番号１５３：ＵＦＶ１７１５９０（ＵＦＶ１６０６６４＋ＴＭ）
【化１２３】
2021511077.tif 000136
【図１】
2021511077.tif 000137
【図２】
2021511077.tif 000138
【図３】
2021511077.tif 000139
【図４】
2021511077.tif 000140
【図５】
2021511077.tif 000141
【図６】
2021511077.tif 000142
【図７】
2021511077.tif 000143
【図８】
2021511077.tif 000144
【図９】
2021511077.tif 000145
【図１０】
2021511077.tif 000146
【図１１】
2021511077.tif 000147
【図１２】
2021511077.tif 000148
【図１３】
2021511077.tif 000149
【図１４】
2021511077.tif 000150
【図１５】
2021511077.tif 000151
【図１６】
2021511077.tif 000152
【図１７】
2021511077.tif 000153
【図１８】
2021511077.tif 000154
【図１９】
2021511077.tif 000155
【図２０】
2021511077.tif 000156
【図２１】
2021511077.tif 000157
【図２２】
2021511077.tif 000158
【図２３】
2021511077.tif 000159
【図２４】
2021511077.tif 000160
【図２５】
2021511077.tif 000161
【図２６】
2021511077.tif 000162
【図２７】
2021511077.tif 000163
【図２８−１】
2021511077.tif 000164
【図２８−２】
2021511077.tif 000165
【配列表】
2021511077000001.xml
【国際調査報告】
2021511077.tif 000283
2021511077.tif 000284
2021511077.tif 000285