(57)【要約】本開示は、一般に、試料中の非コード核酸配列の検出または定量化に基づいた試料中の非コードＲＮＡＳ分子の検出または対象の診断、具体的には、乳癌を含むがんの分子バイオマーカーの同定および使用に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
良性、前悪性、または悪性の過剰増殖性細胞を有する対象を診断する方法であって、
試料中の少なくとも１つの非コードＲＮＡまたはその機能的断片の存在、非存在、および／または量を検出するステップを含む方法。
【請求項２】
前記対象が、乳癌と診断されたかまたは疑われているヒトである、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記検出するステップが、前記対象から試料を得るステップの後にある、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
対象由来の試料を、配列番号１〜配列番号２０１から選択される非コードＲＮＡのうちの１つもしくは組み合わせ、または表１、２、および／もしくは３のうちの任意の核酸に対する少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性を含む非コード核酸配列のうちの１つもしくは組み合わせに相補的な少なくとも１つの核酸分子に曝露することを更に含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
前記少なくとも１つの非コードＲＮＡが、Ｔ３ｐまたはその機能的断片である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６】
前記検出するステップが、ＢＲＣＡ遺伝子発現の存在、非存在、および／または量を検出することを更に含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７】
試料中の少なくとも１つの非コードＲＮＡまたはその相同配列の存在、非存在、および／または量を検出する前記ステップが、前記試料を前記少なくとも１つの非コードＲＮＡまたはその機能的断片に特異的な１つまたは複数のプローブと接触させること、および前記試料中の前記量を対照試料から取られた測定値に正規化することを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８】
対照試料中の少なくとも１つの非コードＲＮＡまたはその相同配列の量の測定値に対する前記試料中の少なくとも１つの非コードＲＮＡまたはその相同配列の量を、前記対象が良性、前悪性、または悪性腫瘍を有する確率または可能性に関連付けることを更に含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
前記良性、前悪性、または悪性の過剰増殖性細胞が、胸部組織由来である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
前記試料が、対象由来の血液または血清である、請求項１〜９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
前記方法が、前記対象における基底または管腔がんのうちの１つまたは複数から選択される前悪性または悪性過剰増殖性細胞の存在を診断する、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記試料が、対象由来の少なくとも１個の細胞で播かれたか、または播種された細胞の培養物から採取される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記対象由来の少なくとも１つの生検を、培養培地を用いて、対象の胸部組織由来の少なくとも１個の細胞を増殖させるのに十分な条件下かつ期間、培養することを更に含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
試料中の少なくとも１つの非コードＲＮＡまたはその機能的断片の量を測定する前記ステップが、試料をデジタル画像化すること、試料を非コードＲＮＡまたはその機能的断片のエピトープに特異的な既知の量の標識抗体に曝露させること、試料を非コードＲＮＡまたはその機能的断片に特異的な１つまたは複数の色素に曝露させること、試料を前記非コードＲＮＡまたはその機能的断片の配列に相補的な少なくとも１つの標識プローブに曝露させること、試料をクロマトグラフィーに曝露させること、試料の全ＲＮＡを単離し、前記全ＲＮＡを配列解析に曝露させること、および／または前記試料を質量分析に曝露させることのうちの１つまたは組み合わせを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料由来の細胞の形態を解析することを更に含む、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記試料が、対象の血漿、血清、もしくは血液採取、ブラッシング、生検、または外科的切除による組織または液体試料を含むヒト組織試料である、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料が、新たに取得された、ホルマリン固定された、アルコール固定された、かつ／またはパラフィン包埋された細胞を含む、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
試料中の少なくとも１つの非コードＲＮＡまたはその相同配列の存在、非存在、および／もしくは量を検出する前記ステップが、化学発光プローブ、蛍光プローブ、および／または蛍光顕微鏡法を使用することを含む、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記試料中の少なくとも１つの非コードＲＮＡまたはその相同配列の存在、非存在、および／もしくは量を検出する前記ステップが、前記試料の全ＲＮＡをＴ３ｐに相補的な少なくとも１つのプローブに接触させることを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記試料中の少なくとも１つの非コードＲＮＡまたはその相同配列の存在、非存在、および／もしくは量を検出する前記ステップが、前記試料の前記全ＲＮＡを、表１、２、および／または３における配列のうちのいずれかを含む核酸配列のうちの１つまたは組み合わせに相補的な少なくとも１つのプローブに接触させることを更に含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
対象におけるがん細胞を検出する方法であって、
前記試料を、非コードＲＮＡ配列のうちの１つまたは組み合わせに相補的なプローブのうちの１つまたは組み合わせのある量と接触させることによって非コードＲＮＡが前記試料中に存在するかどうかを検出することを含む、方法。
【請求項２２】
１つの非コードＲＮＡまたはその相同配列の存在を検出するかまたはその量を定量化する前記ステップが、前記対象から試料を取得するステップの後にある、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記方法が、
１つの非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の存在、非存在、もしくは量に基づいて１つ以上のスコアを計算すること；ならびに
前記非コードＲＮＡおよび／もしくはその機能的断片の量が対照試料中の非コードＲＮＡおよび／もしくはその機能的断片の量を超える場合、または前記非コードＲＮＡおよび／もしくはその機能的断片の量ががんを有することが既知の対象から採取された試料中の非コードＲＮＡおよび／もしくはその機能的断片の量と実質的に等しい場合、前記対象が、がんを有すると診断されるように前記１つ以上のスコアを前記非コードＲＮＡおよび／またはその機能的断片の存在、非存在、もしくは量に関連付けることを更に含む、請求項２１または２２に記載の方法。
【請求項２４】
表１、２、および／もしくは３のそれらの核酸配列または表１、２、および／もしくは３の配列のうちのいずれかに対する少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性を含む核酸配列のうちの１つまたは組み合わせから選択される２つ以上の非コードＲＮＡの存在を検出することまたはこれをを定量化することを更に含む、請求項２１〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記試料が、対象の血清もしくは血漿もしくは血液採取、ブラッシング、生検、または外科的切除による組織を含むヒト組織試料である、請求項２１〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記試料が、新たに取得された、ホルマリン固定された、アルコール固定された、かつ／またはパラフィン包埋された細胞からの全ＲＮＡを含む、請求項２１〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその断片のうちの少なくとも１つの量を定量化する前記ステップが、前記試料から全ＲＮＡを単離することを含む、請求項２１〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
相補的なプローブが１つであるかまたはＴ３ｐであるＲＮＡ配列である、請求項２１〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記試料が、血漿、血液または血清である、請求項２１〜２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
対象を乳癌と診断する方法であって、
（ａ）前記対象の試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその機能的断片の存在または量を、前記試料を非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列に特異的なプローブと接触させることによって検出または定量化すること；ならびに
（ｂ）前記非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の存在または量が、検出または定量化される場合に対象を乳癌と診断すること、を含む方法。
【請求項３１】
非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の存在を検出するかまたはその量を定量化する前記ステップが、前記対象から試料を採取するステップの後にある、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
ステップ（ａ）が、
非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の存在、非存在、もしくは量に基づいて１つ以上のスコアを計算することを更に含み、
ステップ（ｂ）が、
前記非コードＲＮＡおよび／もしくはその相同配列の量が対照試料中の非コードＲＮＡおよび／もしくはその相同配列の量を超える場合、または前記非コードＲＮＡおよび／もしくはその相同配列の量が乳癌を有することが既知の対象から採取された試料中の非コードＲＮＡおよび／もしくはその相同配列の量と実質的に等しい場合、前記対象が、乳癌を有すると診断されるように、前記１つ以上のスコアを非コードＲＮＡおよび／またはその機能的断片の存在、非存在、もしくは量に関連付けることを更に含む、請求項３０または３１に記載の方法。
【請求項３３】
がん抗原の存在を検出するかまたはその量を定量化することを更に含む、請求項３０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記試料が、対象の血漿、血清もしくは血液採取、ブラッシング、生検、または外科的切除による細胞または組織を含むヒト組織試料である、請求項３０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記試料が、新たに取得された、ホルマリン固定された、アルコール固定された、かつ／またはパラフィン包埋された細胞からの全ＲＮＡを含む、請求項３０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列のうちの少なくとも１つの量を定量化する前記ステップが、蛍光イメージングおよび／またはデジタルイメージングを使用することを含む、請求項３０〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記プローブが、フルオロフォアを任意に含む、Ｔ３ｐに相補的な１つまたは複数の核酸配列である、請求項３０〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記試料がヒト血清である、請求項３０〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
乳癌と診断されたかまたは疑われる治療の必要がある対象を治療する方法であって、
（ａ）非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列のうちの１つまたは組み合わせに特異的な１つまたは複数のプローブを試料と接触させるステップ；
（ｂ）前記試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の存在、非存在、または量を定量化するステップ；
（ｃ）前記非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の存在、非存在、または量に基づいて１つ以上のスコアを計算するステップ；
（ｄ）前記非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の量が対照試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の量を超える場合、前記１つ以上のスコアを前記非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の存在、非存在、または量に関連付けるステップであって、前記関連付けるステップが、対象を乳癌と診断することを含むステップ；ならびに
（ｅ）前記乳癌に対する治療上有効量の処置薬を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項４０】
がんを有すると診断されたかまたは疑われる治療の必要がある対象を治療する方法であって、
（ａ）非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列に特異的な１つまたは複数のプローブを試料と接触させるステップ；
（ｂ）前記試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の量を定量化するステップ；
（ｃ）前記非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の量に基づいて１つ以上のスコアまたは正規化された数値を計算するステップ；
（ｄ）前記非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の量が対照試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の量を超える場合、前記１つ以上のスコアを前記非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の量に関連付けるステップであって、前記関連付けるステップが、対象をがんと診断することを含むステップ；ならびに
（ｅ）前記がんに対する治療上有効量の処置薬を前記対象に投与するステップを含む方法。
【請求項４１】
前記プローブが、表１、表２、および／または表３の配列のうちの１つまたは組み合わせから選択される核酸配列に相補的な１つまたは複数の核酸配列である、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
１つで、基質に、フルオロフォア、化学発光剤および／または消光剤が含まれる、請求項４０に記載の方法。
【請求項４３】
システムであって、
（ａ）試料と、
（ｂ）少なくとも１つの非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列に結合する１つまたは複数のプローブおよび／または染色剤と、
（ｃ）前記非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列に結合する少なくとも１つのプローブまたは染色剤の存在、非存在、および／または強度を定量化することができる１つ以上の装置と、を含むシステム。
【請求項４４】
前記試料が、乳癌を有するものとして同定されたかまたは有すると疑われる対象から採取される、請求項４３に記載のシステム。
【請求項４５】
過剰増殖性細胞を含む試料の発生段階または病理を特徴づける方法であって、
（ａ）非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列に特異的な複数のプローブを試料と接触させるステップ；
（ｂ）前記試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の量を定量化するステップ；
（ｃ）非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の存在、非存在、または量に基づいて１つ以上の正規化されたスコアを計算するステップ；ならびに
（ｄ）前記非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の量が対照試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の量を超える場合となるように、前記１つ以上のスコアを前記非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の前記量に関連付けるステップであって、前記関連付けるステップが、前記試料を過剰増殖性細胞を含むと特徴付けることを含むステップを含む方法。
【請求項４６】
対象が悪性腫瘍を有するかどうか判定する方法であって、
前記対象由来の試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の存在、非存在、または量を、前記試料を非コードＲＮＡおよび／もしくはその相同配列に特異的なプローブならびに／または非コードＲＮＡおよび／もしくはその相同配列に特異的な基質と接触させることによって検出することを含む方法。
【請求項４７】
前記対象由来の前記試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の存在、非存在、または量を、前記試料を非コードＲＮＡおよび／もしくはその相同配列に特異的なプローブならびに／またはＴ３ｐもしくはその機能的断片に特異的な基質と接触させることによって検出することを更に含む、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
対象がＢＲＣＡを発現しているがんを有するかどうか判定する方法であって、
前記対象由来の試料中の非コードＲＮＡおよび／またはその相同配列の存在、非存在、または量を、前記試料を非コードＲＮＡおよび／もしくはその相同配列に特異的なプローブならびに／または非コードＲＮＡおよび／もしくはその相同配列に特異的な基質と接触させることによって検出することを含む方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１７年１１月１２日に出願の米国特許仮出願第６２／５８４，８９９号の優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、一般に、試料中の非コード核酸配列の検出または定量化に基づいた試料中の非コードＲＮＡ分子の検出または対象の診断、具体的には、乳癌を含むがんの分子バイオマーカーの同定および使用に関する。
【背景技術】
【０００３】
遺伝子発現分布の広範囲に及ぶ再プログラム化は、がん発生の特徴である。したがって、病理学的な遺伝子発現パターンを駆動する調節経路の系統的な同定は、がんの理解および処置に向けた重要なステップである。長年にわたって、多数の調節機構が、がん細胞の分化、生存、浸潤、および転移に関与する遺伝子の発がん性発現に関係付けられてきた。多数の研究が発がんの根底にある転写経路に焦点を置いてきたが、転写後調節経路も、このプロセスの主要な調節因子として明らかになってきた。例えば、遺伝子サイレンシングにおいて機能する低分子ＲＮＡのサブクラスであるマイクロＲＮＡ（低分子非コードＲＮＡ）は、乳癌進行の最初に特徴付けられた転写後調節因子の一つであった（１）。ＲＮＡ結合タンパク質（ＲＢＰ）も遺伝子発現の重要な転写後調節因子であり、いくつかの特異的なＲＢＰが、発がんおよびがんの進行に影響を及ぼすことを示した（例えば２〜５）。近年、低分子非コードＲＮＡの他のクラスであるｔＲＮＡ（６）およびｔＲＮＡ断片（７）が、乳癌進行において根本的役割を果たすことが実証された。
【０００４】
多様なレパートリーの調節機構ががんに関与しているにもかかわらず、それらの間で共有される特徴は、それらが細胞内の既存の経路を利用するか、または調節不全にするということである。換言すれば、がん細胞は、発がん経路を過剰に活性化するため、および腫瘍抑制性経路を下方調節するために、体細胞突然変異（例えばＫＲＡＳ、８）、遺伝子融合（例えばＢＣＲ−ＡＢＬ、９）、エピジェネティクス修飾（例えばプロモーターの高メチル化、１０）、および調節機構の破壊（ＮＦｋＢ転写因子、１０）などの無数の戦略を採用する（１１、１２）。これらの戦略が、既に存在する制御プログラムの病理学的な調節に依存する一方で、がん細胞が、腫瘍形成を駆動する特殊な制御経路を発達させるかまたは作りだすことができるというしばしば見落とされる可能性が存在する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００５】
記載される本発明は、乳癌などのがんの存在を示し、対象における乳癌を正確に診断するために使用され得るバイオマーカーとして機能する新規の低分子非コードＲＮＡを提供する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、適切な試料中の細胞外循環低分子ＲＮＡの検出を含む。いくつかの実施形態では、試料は、ヒト血清試料である。いくつかの実施形態では、試料は、低分子非コードｍＲＮＡを含むエキソソームを含む分画されたヒト血清試料である。
【０００６】
本発明はまた、血液または血清試料中の非コードＲＮＡの存在を検出することに関する。いくつかの実施形態では、本開示は、対象における過剰増殖性細胞を検出するための方法であって、血清または血漿試料中の非コード核酸の非存在、存在、または量を検出することを含む方法に関する。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、試料から全ＲＮＡを単離すること、および非コードｍＲＮＡ配列の存在を検出すること、および非コードｍＲＮＡの量を対象が１つまたは複数の過剰増殖性細胞を含むかどうかの可能性に関連付けることを含む。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、試料から全ＲＮＡを単離すること、および非コードｍＲＮＡ配列の存在を検出すること、および非コードｍＲＮＡの量を対象が１つまたは複数のがん細胞を含むかどうかの可能性に関連付けることを含む。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、試料から全ＲＮＡを単離すること、および非コードｍＲＮＡ配列の存在を検出すること、および非コードｍＲＮＡの量を対象が１つまたは複数の固形腫瘍細胞を含むかどうかの可能性に関連付けることを含む。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、試料から全ＲＮＡを単離すること、および非コードｍＲＮＡ配列の存在を検出すること、および非コードｍＲＮＡの量を対象が１つまたは複数の乳癌細胞を含むかどうかの可能性に関連付けることを含む。
【０００７】
幾つかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、診断を判定するためのものであり、先に記載した方法により対象の血漿または血清試料に由来する試料から非コード核酸のうちの１つまたは組み合わせの存在を判定すること、および当該非コード核酸のうちの１つまたは組み合わせの存在に基づいて診断を提供することを含む。幾つかの実施形態では、判定される診断は、乳癌などのがんである。
【０００８】
幾つかの実施形態では、コンピュータ実施方法は、非コード核酸のうちの１つまたは組み合わせの存在または非存在を判定するために使用され、先に記載した方法を実施することを含み、非コード核酸のうちの１つまたは組み合わせを含む１つまたは複数の試料からの参照物質の非コード核酸のうちの１つまたは組み合わせの存在量を定量化すること、１つまたは複数の試料中の非コード核酸のうちの１つまたは組み合わせの正規化された量を計算により判定すること、および当該正常化された量に基づいて非コード核酸のうちの１つまたは組み合わせの存在または非存在を判定すること含む。幾つかの実施形態では、問題の試料から単離された全ＲＮＡの試料を配列決定することを含む定量化。幾つかの実施形態では、計算解析は、全血または血清試料から得られる配列データに対して実行される。いくつかの実施形態では、先に記載したコンピュータ実施方法の結果は、出力であって、診断、例えば乳癌などの過剰増殖障害の診断であり得る出力である。他の実施形態では、追加の試料関連情報、例えば、試料中の既知の腫瘍抗原の存在または非存在に関する情報が出力され得る。出力は、本明細書に記載される種々の手段によるものであり得、例えば、結果は、例えばコンピュータ・モニターなどに視覚的に出力され得るか、または出力は、ハードコピー、例えば、印刷された紙のレポートなどであり得る。
【図面の簡単な説明】
【０００９】
【図１Ａ】乳癌におけるがん特異的オーファン非コードＲＮＡの発見、注釈付け、および検証を示す。図１Ａは、乳癌株で有意に発現されているが、正常なＨＵＭＥＣでは有意に発現されていない４３７個の低分子非コードＲＮＡの相対量を表わすヒートマップである。ＨＵＭＥＣは三重反復で処理されたが、全ての他の細胞株は二重反復で分析された。図１Ｂは、（図１Ａ）において同定された４３７個の低分子ＲＮＡのうち、２０１個がＣａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡ）の一部として収集された乳房腫瘍生検の低分子ＲＮＡ遺伝子発現プロファイルにおいて有意に発現されており、またこれらの２０１が、このデータセットにおける約２００個体から収集された隣接する正常組織にはほとんど存在しなかったことを示すヒートマップである。図１Ｃは、これらの２０１個のがん特異的低分子ＲＮＡが、オーファン非コードＲＮＡまたはｏｎｃＲＮＡとして分類され、４種の正常な上皮試料および１０種の患者由来異種移植片モデルからの低分子ＲＮＡプロファイルを比較する第３のデータセットで独立して検証されたことを示すヒートマップである。
【図１Ｂ】同上。
【図１Ｃ】同上。
【図２Ａ】オーファン低分子ＲＮＡが、がん細胞において相対的に豊富であり、正常組織ではほとんど検出されないことを示す。図２Ａにおいて、がん特異的低分子ＲＮＡを同定するために、正常細胞／組織においてはほとんど存在しないが、がん細胞において一般に発現されているＲＮＡが探索された。かかるＲＮＡ種は、以下の２つの独立した供給源から同定された：（ｉ）ＨＵＭＥＣと比較した乳癌細胞株のプロファイル、および（ｉｉ）約２００個の正常組織生検および約１０００個の腫瘍試料を有するＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓデータセット（ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡ）。次いで、これらの２つの独立したセットは、オーファン非コードＲＮＡ（ｏｎｃＲＮＡ）を同定するために重ね合わせられた。図２Ａに示すように、強い重複がこれらの２つ解析間で見られた（超幾何検定、Ｐ値約０）。図２Ｂにおいて、２０１個のｏｎｃＲＮＡの全存在量が、４個の正常上皮試料および１０個のＰＤＸモデルに対して計算された。図２Ｂに示すように、全ｏｎｃＲＮＡ発現は、試料ががん性であるかまたは正常であるかを完璧に予測することができる（ＡＵＣおよびＡＵＰＲＣの両方が１．０に等しい）。
【図２Ｂ】同上。
【図３Ａ】ｏｎｃＲＮＡ  Ｔ３ｐが乳癌進行と強く関連することを示す。図３Ａは、低転移性乳癌細胞におけるｏｎｃＲＮＡの発現を、それらの高転移性派生株に対して比較するボルケーノプロットである。高転移性細胞において有意に上方調節されているｏｎｃＲＮＡ  Ｔ３ｐが強調されている。図３Ｂは、Ｔ３ｐが、テロメラーゼのＲＮＡ成分であるＴＥＲＣの３’末端（ＣＲ７ドメイン）に位置付けられることを示す概略図である。図３Ｃは、ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセットの乳房腫瘍生検およびその対応する正常組織におけるＴ３ｐ（ｃｐｍ）の発現を示す。対応のあるウィルコクソン検定を使用して関連Ｐ値を計算した。図３Ｄは、ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセット全体でのＴ３ｐ発現を示す。図３Ｅは、腫瘍におけるＴ３ｐの発現に基づいて層化された患者についてのＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセットの生存率解析を示す。上および下から３分の１の試料がこの解析に含まれた（ログランク検定）。図３Ｆは、ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセットにおける、正常試料、ステージＩ、およびステージＩＩまたはＩＩＩ試料の間のＴ３ｐの発現を示す（＊：Ｐ＜０．０５；＊＊＊、Ｐ：＜０．００１；マン・ホイットニー検定を使用）。
【図３Ｂ】同上。
【図３Ｃ】同上。
【図３Ｄ】同上。
【図３Ｅ】同上。
【図３Ｆ】同上。
【図４Ａ】ｏｎｃＲＮＡ  Ｔ３ｐが高悪性度の乳癌と関連することを示す。図４Ａは、試料タイプ（正常対乳癌）に基づいたＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセット内の試料数の集計を示す。各分割表に不随するフィッシャー正確検定カイ二乗検定も含まれる。図４Ｂは、ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセット内の患者の、それらのＴ３ｐが腫瘍生検で検出されたかどうかに基づく層別化を示す。生検でのＴ３ｐのわずかな検出でも、乳癌における悪い生存率と関連する（ｐはログランク検定に基づいて計算された）。図４Ｃは、ＥＲ、ＰＲ、またはＨＥＲ２状態に基づいて分割されたＴＣＧＡ−ＢＲＣＡ試料におけるＴ３ｐ発現レベルの比較を示す。図４Ｄは、Ｔ３ｐが乳癌ＰＤＸモデルにおいて有意に発現されていることを示す（＊＊＊：Ｐ＜０．００１；マン・ホイットニー検定）。
【図４Ｂ】同上。
【図４Ｃ】同上。
【図４Ｄ】同上。
【図５】Ｔ３ｐが転移性進行を促進することを示す。ａｎｔｉ−Ｔ３ｐ  ＬＮＡによって引き起こされた遺伝子発現の変化は、（ｉ）スクランブルＬＮＡまたは（ｉｉ）ａｎｔｉ−ＴＥＲＣ（しかし、Ｔ３ｐではない）ＬＮＡのどちらの対照が使用されるかにかかわらずほとんど同等である。ピアソン相関係数および関連Ｐ値が含まれる。
【図６Ａ】遺伝子発現調節因子および転移性進行の促進要因としてのＴ３ｐを示す。図６Ａは、ＭＤＡ−ＬＭ２細胞においてａｎｔｉ−Ｔ３ｐ  ＬＮＡによって引き起こされた遺伝子発現の変化のＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞におけるＴ３ｐ模倣物に対する比較を示す。付随するピアソン相関（Ｐ値約０）が報告されている。図６Ｂは、ａｎｔｉ−Ｔ３ｐ  ＬＮＡ（ＬＮＡ−Ｔ３ｐ）またはスクランブルＬＮＡ（ＬＮＡ−Ｓｃｒ）を用いて形質移入されたＭＤＡ−ＬＭ２細胞による肺転移の生物発光イメージングプロットを示す（各コホートにおいてｎ＝４または５）。統計的有意性は、２元配置ＡＮＯＶＡを使用して測定された。各マウスについての曲線下面積も計算された（正規化された肺の光子束掛ける経過した日数の変化）。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。＊＊：片側マン・ホイットニー検定によるＰ＜０．０１。図６Ｃは、各コホートからの３匹のマウスにおいて計数された可視的な転移性結節の数を視覚的に示す。右のパネルは、各コホートからのヘマトキシリン−エオシン染色法（Ｈ＆Ｅ）で染色された代表的肺切片を中央値カウント数と共に示す。エラーバーは、平均値の標準誤差を示す。＊：片側マン・ホイットニー検定によるＰ＜０．０５。
【図６Ｂ】同上。
【図６Ｃ】同上。
【図７Ａ】エキソソームコンパートメントにおけるｏｎｃＲＮＡの系統的プロファイリングを示す。図７Ａは、ｏｎｃＲＮＡの大部分が、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から収集されたエキソソーム低分子ＲＮＡデータにおいて検出されたが、正常ＨＵＶＥＣ細胞では検出されなかったことを示す。図７Ｂは、乳癌細胞株および正常ＨＵＭＥＣから収集されたエキソソームＲＮＡの低分子ＲＮＡプロファイリングを示す。細胞外集団間のｏｎｃＲＮＡの検出を示すヒートマップを示す。図７Ｃは、ステージＩＩおよびＩＩＩの疾患を有する乳癌患者から収集された血清試料におけるｏｎｃＲＮＡの検出を示す。評価の基準として、独立した研究の１１人の健常な個体からのデータが、参照として使用されている。
【図７Ｂ】同上。
【図７Ｃ】同上。
【図８Ａ】Ｔ３ｐがエキソソームおよび循環コンパートメントにおいて検出され得ることを示す。図８Ａは、以前に公開された低分子ＲＮＡ−ｓｅｑデータ（７）および定量ＲＴ−ＰＣＲにおける、低転移性の親細胞と比較した高転移性ＭＤＡ−ＬＭ２細胞におけるＴ３ｐ上方調節の検証の結果を示す（各試料においてｎ＝６、＊＊：Ｐ＜０．０１の；両側マン・ホイットニー検定を使用。図８Ｂは、Ｔ３ｐが患者から収集された血清の絶対多数において高レベルで検出され得、健常な個体から収集された血清試料において非常に低いレベルで存在する（または検知されない）ことを示す。
【図８Ｂ】同上。
【図９Ａ】ｏｎｃＲＮＡ  Ｔ３ｐが高悪性度の乳癌と関連することを示す。図９Ａは、Ｘ軸の示された細胞株の低分子ＲＮＡ配列決定による正規化されたＴ３ｐ発現を示す。全てのがん株は、生物的に三重反復でおよびＨＭＥＣは生物的に二重反復で調製および処理された。サブタイプによって形状分けされる細胞株：ＨＭＥＣ（パネルの左側の円）、３重に陰性の乳癌（ＴＮＢＣ；パネルの中央の正方形、三角形、およびダイヤモンド）、ＨＥＲ２陽性（パネルの右側の円および正方形）、および管腔（パネルの右側の三角形）。図９Ｂは、ＥＲ、ＰＲまたはＨＥＲ２の状態に基づいて分割されたＴＣＧＡ−ＢＲＣＡ試料におけるＴ３ｐ発現レベルの比較を示す（それぞれ、ｎ＝１０３３、１０３０および７１５）。各コホートについて平均値±標準偏差を示す。図９Ｃは、２つの低転移性および２つの高転移性乳癌ＰＤＸモデルにおけるｑＲＴ−ＰＣＲによって測定された相対的Ｔ３ｐ発現を示す。
【図９Ｂ】同上。
【図９Ｃ】同上。
【図１０Ａ】Ｔ３ｐが細胞外および循環コンパートメントにおいて検出され得ることを示す。図１０Ａは、Ｔ３ｐが、７／８の乳癌細胞株からの細胞外小胞（ＥＶ）から単離された配列決定された低分子ＲＮＡに存在したが、ＨＭＥＣ  ＥＶには存在しなかったことを示す。試料は、生物的に反復して処理および調製され、百万リード当たりのカウント数の計算の前に集約された。サブタイプによって形状分けされる細胞株：ＨＭＥＣ（Ｘ軸上で左から見て最初の列）、３重に陰性の乳癌（ＴＮＢＣ；ＨＭＥＣの右隣の４列）、ＨＥＲ２陽性（試料のうちのＨＥＲ２セットの右隣の２つのカラム）、および管腔（グラフの最も右側の最後の２つのカラム）。図１０Ｂは、全細胞内（ＩＣ）コンパートメントと全細胞外（ＣＭ）コンパートメントとの間の、およびＩＣと細胞外小胞（ＥＶ）コンパートメントとの間のｏｎｃＲＮＡ発現レベルのピアソン相関係数を示す。細胞株当たりｎ＝２の生物的に独立した実験。図１０Ｃは、ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセットのｏｎｃＲＮＡ発現レベルで訓練され、健常ボランティアまたは乳癌患者（ＧＳＥ４９０３５）からの血清試料で試験された勾配ブースティング分類器の分類性能を示す１０本のブートストラップベースの受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線を示す。図１０Ｄは、Ｔ３ｐが患者から収集された血清の絶対多数において高レベルで検出され得るが、健常な個体から収集された血清試料においては非常に低いレベルで存在する（または検知されない）ことを示す。右のパネルは、個々の乳癌患者から収集された血清のＴ３ｐレベルを示す。ｎ＝４０の生物的に独立した試料。平均値±平均値の標準誤差を示す。Ｐ値は、両側マン・ホイットニー検定を使用して計算された。図１０Ｅは、Ｔ３ｐが患者から収集された血清の絶対多数において高レベルで検出され得るが、健常な個体から収集された血清試料においては非常に低いレベルで存在する（または検知されない）ことを示す。右のパネルは、個々の乳癌患者から収集された血清のＴ３ｐレベルを示す。ｎ＝４０の生物的に独立した試料。平均値±平均値の標準誤差を示す。Ｐ値は、両側マン・ホイットニー検定を使用して計算された。ブートストラップＲＯＣ曲線（１０回）は、ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセット内のｍｉＲＮＡ発現で訓練され、健常ボランティアまたは乳癌患者からの血清試料で試験された勾配ブースティング分類器について生成された（データ非表示）。
【図１０Ｂ】同上。
【図１０Ｃ】同上。
【図１０Ｄ】同上。
【図１０Ｅ】同上。
【図１０Ｆ】同上。
【発明を実施するための形態】
【００１０】
本開示は、乳癌の存在を示し、対象の乳癌を正確に診断または段階分けするために使用され得るバイオマーカーとして機能する新規の低分子非コードＲＮＡを提供する。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、適切な試料中の細胞外循環低分子ＲＮＡの検出を伴う。
【００１１】
定義
本発明を詳細に記載する前に、本明細書において使用されるある種の用語の定義を提供する。
【００１２】
特に定義しない限り、本明細書において使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者により一般的に理解される意味と同じ意味を有する。例えば、Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ２ｎｄ  ｅｄ．，Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ（Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ  １９９４）は、本出願において使用される用語の多くの一般的な手引きを当業者に提供する。更に、本発明の実施は、特に明記しない限り、当業者の技能範囲内にある分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、および生化学の従来技術を使用する。かかる技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ”，２ｎｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９）、“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）、“Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ”（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）、“Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，４ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ＆  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｉｎｃ．，１９８７）、“Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ”（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ＆  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）、“Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）、および“ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）などの文献において詳細に説明されている。
【００１３】
本開示および特許請求の範囲において使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」には、明確に特記しない限り複数形も含まれる。
【００１４】
実施形態が用語「含む」を用いて本明細書に記載されている場合は、「からなる」および／または「本質的にからなる」という言葉で記載された別様の類似した実施形態もまた提供されていると理解されよう。更に、実施形態が用語「本質的にからなる」を用いて本明細書に記載されている場合は、「からなる」という言葉で記載された別様の類似した実施形態もまた提供されていると理解されよう。
【００１５】
本明細書において「Ａおよび／またはＢ」などの語句で使用される場合、用語「および／または」は、ＡおよびＢ；ＡまたはＢ；Ａ（単独）；およびＢ（単独）を含むことを意図する。同様に、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」などの語句で使用される場合、用語「および／または」は、以下の具体的表現の各々を包含することを意図する：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；およびＣ（単独）。
【００１６】
本明細書で使用する場合、用語「約」または「ほぼ」は、所与の値または範囲の５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内を指すことを意味する。
【００１７】
本明細書で使用する場合、用語「抗体」は、少なくとも１つの抗原結合部位によってタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、または前述の組み合わせなどの標的を認識し、特異的に結合する免疫グロブリン分子を指す。本明細書で使用する場合、上記用語は、抗体が所望の生物学的結合活性を示す限り、インタクトポリクローナル抗体、インタクトモノクローナル抗体、一本鎖抗体、抗体断片（例えばＦａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、およびＦｖ断片）、単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）抗体、二重特異性抗体などの多特異性抗体、単一特異性抗体、一価抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ヒト抗体、抗体の抗原結合部位を含む融合タンパク質、および抗原結合部位を含む任意の他の改変された免疫グロブリン分子を包含する。抗体は、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと称されるそれらの重鎖定常ドメインの同一性に基づいて、免疫グロブリンの以下の５つの主要なクラスのいずれかであり得る：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭまたはそのサブクラス（アイソタイプ）（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）。免疫グロブリンの異なるクラスは、異なるかつよく知られたサブユニット構造および三次元配置を有する。抗体は、裸であるか、または毒素および放射性同位体を含むがこれらに限定されない他の分子に複合化され得る。
【００１８】
用語「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を指し、インタクトな抗体の抗原決定可変領域を指す。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、およびＦｖ断片、直鎖状抗体、一本鎖抗体、ならびに抗体断片から形成される多特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書で使用する場合、「抗体断片」は、少なくとも１つの抗原結合部位またはエピトープ結合部位を含む。抗体の「可変領域」という用語は、単独または組み合わせの抗体軽鎖の可変領域または抗体重鎖の可変領域を指す。重鎖または軽鎖の可変領域は、一般に、「超可変領域」としても既知の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）によって連結された４つのフレームワーク領域（ＦＲ）からなる。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域によって近接してまとめられ、抗体の抗原結合部位の形成に寄与する。ＣＤＲを決定するために、以下の少なくとも２つの技術が存在する：（１）異種間の配列多様性に基づいた手法（すなわち、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ）および（２）抗原抗体複合体の結晶学的研究に基づいた手法（Ａｌ−Ｌａｚｉｋａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２７３：９２７−９４８）。加えて、これらの２つの手法の組み合わせは、ＣＤＲを決定するために当該技術分野において時々使用される。
【００１９】
本明細書で使用する場合、用語「バイオマーカー」は、異なる濃度で個体に存在する、個体のがんの状態を予測する際に有用な生体分子を指す。バイオマーカーとしては、核酸、タンパク質、およびバリアント、ならびにこれらの断片が挙げられ得るが、これらに限定されない。バイオマーカーは、バイオマーカーをコードする全体もしくは一部分の核酸配列またはこのような配列の相補体を含むＤＮＡであり得る。本発明に有用なバイオマーカー核酸には、関心対象の核酸配列のいずれかの全体または部分配列を含むＤＮＡおよびＲＮＡの両方が含まれると考えられる。
【００２０】
本明細書で使用する場合、用語「体液」は、血液（または血漿もしくは血清などの血液の画分）、リンパ液、粘液、涙液、唾液、痰、尿、精液、便、ＣＳＦ（脳脊髄液）、母乳、および腹水液を含む非コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）を含む体液を指す。幾つかの実施形態では、体液は尿である。幾つかの実施形態では、体液はエキソソームを含む分画された血清である。
【００２１】
本明細書で使用する場合、用語「がん」および「がん性」は、細胞集団が未制御の細胞増殖により特徴付けられる、哺乳動物における生理的状態を指すかまたは表現する。幾つかの実施形態では、がんは、乳癌である。
【００２２】
本明細書で使用する場合、用語「関連付ける」または「関連付けること」は、２つの事象例の間の統計的関連性を指し、ここで、事象には数値、データセットなどが含まれ得る。例えば、事象が数値を伴う場合は、正相関（本明細書において「直接相関」とも称される）は、一方が増加するにつれて、他方も増加することを意味する。負相関（本明細書において「逆相関」とも称される）は、一方が増加するにつれて、他方は減少することを意味する。本発明は、低分子非コードＲＮＡを提供し、そのレベルは低分子非コードＲＮＡのレベルと乳癌を発症する可能性との間などの特定の転帰の尺度と相関する。例えば、低分子非コードＲＮＡのレベルの増加は、患者の良好な臨床転帰の可能性と負相関を示し得る。この場合、例えば、患者のがんの再発を伴わない長期生存の可能性および／または化学療法に対する陽性反応などは減少し得る。かかる負相関により、患者が予後不良を有するまたは化学療法に対する応答が不十分になる可能性が示され、これは、種々の方法で、例えばハザード比が高いことによって統計学的に実証され得る。
【００２３】
本明細書で使用する場合、用語「高ストリンジェンシー」は、以下の条件を指す：（１）洗浄のために低イオン強度および高温、例えば５０℃にて１５ｍＭの塩化ナトリウム／１．５ｍＭのクエン酸ナトリウム／０．１％のドデシル硫酸ナトリウムを使用する条件；（２）ハイブリダイゼーション中にホルムアミドなどの変性剤、例えば、４２℃にて５ｘＳＳＣ（０．７５ＭのＮａＣｌ、７５ｍＭのクエン酸ナトリウム）中の５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％のウシ血清アルブミン／０．１％のフィコール／０．１％のポリビニルピロリドン／５０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を使用する条件；または（３）ハイブリダイゼーション中に４２℃にて５ｘＳＳＣ中の５０％ホルムアミド、５０ｍＭのリン酸ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％のピロリン酸ナトリウム、５ｘデンハルト溶液、超音波処理サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）、０．１％のＳＤＳ、および１０％の硫酸デキストランを使用し、０．２ｘＳＳＣおよび５０％のホルムアミドで４２℃にて洗浄した後、５５℃にてＥＤＴＡを含有する０．１ｘＳＳＣからなる洗浄を行う条件。
【００２４】
用語「過剰増殖障害」は、生物における細胞の異常増殖、異常成長、異常老化、異常な静止状態、異常な除去を特徴とする疾患または障害を指し、全ての形態の過形成、新形成、およびがんを含む。幾つかの実施形態では、過剰増殖疾患は、消化管または泌尿器系に由来するがんである。幾つかの実施形態では、過剰増殖疾患は、副腎、膀胱、骨、骨髄、脳、脊椎、胸部、頸部、胆嚢、神経節、消化管、胃、大腸、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、卵巣、膵臓、副甲状腺、陰茎、前立腺、唾液腺、皮膚、脾臓、精巣、胸腺、甲状腺、または子宮のがんである。幾つかの実施形態では、過剰増殖疾患という用語は、以下から選択されるがんである：肺癌、骨癌、ＣＭＭＬ、膵癌、皮膚癌、頭頸部癌、皮膚黒色腫もしくは眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門部のがん、胃癌、大腸癌、乳癌、精巣腫瘍、婦人科腫瘍（例えば、子宮肉腫、卵管癌、子宮内膜癌、子宮頸癌、膣癌、または外陰癌）、ホジキン病、食道のがん、小腸のがん、内分泌系のがん（例えば、甲状腺、副甲状腺、または副腎のがん）、軟部組織肉腫、尿道のがん、陰茎のがん、前立腺癌、慢性もしくは急性白血病、小児期の固形腫瘍、リンパ球性リンパ腫、膀胱のがん、腎臓もしくは尿管のがん（例えば、腎細胞癌、腎盂癌）、または中枢神経系腫瘍、（例えば、中枢神経系原発リンパ腫、脊髄軸腫瘍、脳幹部神経膠腫または下垂体腺腫）。
【００２５】
本明細書で使用する場合、２つ以上の核酸の文脈における用語「同一の」または「同一性パーセント」または「相同性」は、同一であるかまたは、なんらの保存的アミノ酸置換を配列同一性の一部とみなさずに最大の一致について比較およびアラインメント（必要に応じてギャップを導入）された場合に同一である特定の百分率のヌクレオチドまたはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列または部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査により測定され得る。アミノ酸またはヌクレオチド配列の配列比較を取得するために使用され得る様々なアルゴリズムおよびソフトウェアは、当技術分野において周知である。これらとしては、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、およびこれらのバリエーションが挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、本発明の２つの核酸は、実質的に同一であり、これはそれらが、配列比較アルゴリズムを使用して、または目視検査により測定されるように最大の一致について比較およびアラインメントされた場合に、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、および幾つかの実施形態では、少なくとも約９５％、９６％、９７％、９８％、９９％のヌクレオチドまたはアミノ酸残基配列同一性を有することを意味する。幾つかの実施形態では、同一性は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約４０〜６０ヌクレオチド、少なくとも約６０〜８０ヌクレオチド、またはそれらの間の任意の整数値である配列の領域にわたって存在する。幾つかの実施形態では、同一性は、少なくとも約８０〜１００ヌクレオチドなどの６０〜８０ヌクレオチドより長い領域にわたって存在し、幾つかの実施形態では、配列は、比較されている配列の全長にわたって実質的に同一である。
【００２６】
本明細書で使用される場合、用語「レベル」は、非コードＲＮＡ転写物のコピー数の定性的または定量的判定を指す。ＲＮＡ転写物のレベルが第１の試料、例えば、臨床的に関連する患者の亜集団（例えば、がんを有する患者）において、第２の試料、例えば、関連する亜集団（例えば、がんを有さない患者）におけるよりも高い場合に、ＲＮＡ転写物は「増加したレベル」を示す。個々の患者から取得した腫瘍試料におけるＲＮＡ転写物のレベルの解析の文脈において、対象におけるＲＮＡ転写物のレベルが臨床的に関連性のある患者の亜集団に特徴的なレベルに傾くまたはより密接に近づく場合、ＲＮＡ転写物は、「増加したレベル」を示す。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「転移」は、新たな位置での同様のがん病変の発生を伴う、がんが、起源部位から身体の他の領域に広がるかまたは移るプロセスを指す。「転移性」または「転移している」細胞は、隣接する細胞と接着性接触を欠き、疾患の第一部位からの第二部位に（例えば、血流またはリンパ液を介して）移動するものである。
【００２８】
本明細書で使用する場合、用語「モノクローナル抗体」は、単一の抗原決定基またはエピトープの非常に特異的な認識および結合に関与する均一な抗体集団を指す。これは、通常は、種々の異なる抗原決定基に対して作られた異なる抗体の混合物を含むポリクローナル抗体とは対照的である。用語「モノクローナル抗体」は、インタクトな、かつ全長のモノクローナル抗体、ならびに抗体断片（例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ´、Ｆ（ａｂ´）２、Ｆｖ）、単鎖（ｓｃＦｖ）抗体、抗体部分を含む融合タンパク質、ならびに抗原結合部位を含む任意の他の改変された免疫グロブリン分子を包含する。更に、「モノクローナル抗体」は、ハイブリドーマ産成、ファージ選択、組換え発現、およびトランスジェニック動物を含むがこれらに限定されない任意の数の技術によって作られるかかる抗体を指す。
【００２９】
本明細書で使用する場合、非コードＲＮＡ転写物に関する用語「正規化された」は、参照ＲＮＡ転写物のセットの転写物の平均レベルに対するＲＮＡ転写物のレベルを指す。参照ＲＮＡ転写物は、患者、組織、または治療にわたるそれらの変動が最小であることに基づく。あるいは、非コードＲＮＡ転写物は、試験したＲＮＡ転写物またはそのような試験したＲＮＡ転写物のサブセットの全体に対して正規化され得る。
【００３０】
「患者の応答」は、限定されるものではないが、（１）減速および完全な成長停止を含めた、腫瘍成長のある程度の阻害、（２）腫瘍細胞の数の減少、（３）腫瘍サイズの減少、（４）隣接する末梢器官および／または組織への腫瘍細胞の浸潤の阻害（すなわち、減少、減速または完全な停止）、（５）転移の阻害（すなわち、減少、減速または完全な停止）、（６）腫瘍の退縮または拒絶をもたらし得るが、もたらされなくてもよい抗腫瘍免疫応答の増強、（７）がんに付随する１つ以上の症状のある程度の軽減、（８）処置後の生存の長さの増加、および／または（９）処置後の所与の時点での死亡率の減少を含む、患者への利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価され得る。
【００３１】
用語「ポリヌクレオチド」ならびに「核酸」および「核酸分子」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドポリマーを指し、ＤＮＡおよびＲＮＡが含まれる。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチドもしくは塩基、および／またはそれらの類似体、またはＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼによってポリマーに組み込まれ得る任意の基質であり得る。
【００３２】
用語「ポリペプチド」および「ペプチド」および「タンパク質」は、本明細書において互換的に使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖または分枝鎖であり得、修飾アミノ酸を含み得、非アミノ酸によって中断され得る。上記用語は、自然に修飾されたかまたは介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、または標識成分との結合などの任意の他の操作もしくは修飾によって修飾されたアミノ酸ポリマーも包含する。また例えば、１つ以上のアミノ酸の類似体（例えば、非天然アミノ酸を含む）および当該技術分野において公知の他の修飾を含むポリペプチドも定義内に含まれる。本発明のポリペプチドは抗体または融合タンパク質に基づき得るため、ある種の実施形態では、ポリペプチドは単鎖または会合した鎖（例えば、二量体）として生じ得ると理解されよう。
【００３３】
本明細書で使用する場合、用語「予後」は、乳癌などの腫瘍性疾患の再発、転移拡散、および薬剤耐性を含むがんに起因し得る死亡または進行の可能性の予測を指す。
【００３４】
本明細書で使用する場合、用語「参照」ＲＮＡ転写物は、そのレベルを試験試料中のＲＮＡ転写物のレベルと比較するために使用することができるＲＮＡ転写物を指す。本発明の実施形態では、参照ＲＮＡ転写物としては、β‐グロビン、アルコールデヒドロゲナーゼなどのハウスキーピング遺伝子、または任意の他のＲＮＡ転写物が挙げられ、そのレベルもしくは発現は、ＲＮＡ転写物を含有する細胞の疾患状態に応じて変動しない。別の実施形態では、アッセイされるＲＮＡ転写物またはそのサブセットの全ては、参照ＲＮＡ転写物として機能し得る。
【００３５】
本明細書で使用する場合、用語「低分子非コードＲＮＡ」（ｎｃＲＮＡ）は、タンパク質に翻訳されないＲＮＡを指し、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（リボソームＲＮＡ）、ｓｎｏＲＮＡ、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｓｉＲＮＡ、核内低分子（ｓｎＲＮＡ）、Ｙ  ＲＮＡ、ヴォールトＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｔｉＲＮＡ（転写開始ＲＮＡ）、ＴＳＳａ−ＲＮＡ（転写開始部位関連ＲＮＡ）、およびｐｉｗｉＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）が含まれる。低分子ｎｃＲＮＡは、２００未満のヌクレオチド長を有する。好ましくは、本明細書で使用する場合、低分子ｎｃＲＮＡは、５０〜１００ヌクレオチドである。ｎｃＲＮＡは、内因性起源（例えば、ヒト低分子非コードＲＮＡ）または外因性起源（例えば、ウイルス、細菌、寄生生物）のものであり得る。「カノニカル」ｎｃＲＮＡは、ゲノム配列から予測されるようにＲＮＡの配列を指し、特定のＲＮＡについて同定される最も豊富に存在する配列である。「トリミングされた」ｎｃＲＮＡは、エキソヌクレアーゼにより媒介されるヌクレオチドのトリミングにより、分子の５’末端および／または３’末端の１つ以上のヌクレオチドが除去されたｎｃＲＮＡを指す。「延長されたｎｃＲＮＡ」は、カノニカル低分子非コードＲＮＡ配列より長い低分子非コードＲＮＡを指し、当該技術分野において理解されている用語である。延長部を構成するヌクレオチドは、前駆体配列のヌクレオチドに対応し、したがって、鋳型を使用しないヌクレオチド付加とは対照的にゲノムによってコードされる。幾つかの実施形態では、本明細書において開示される方法のいずれかは、上記の開示されたＲＮＡのいずれかまたは組み合わせを検出することを含む。
【００３６】
本明細書で使用する場合、用語「対象」は、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、げっ歯動物などを含むが、これらに限定されない任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。好ましくは、対象は、ヒト対象である。用語「対象」、「個体」、および「患者」は、本明細書において互換的に使用される。したがって、用語「対象」、「個体」、および「患者」は、がん（例えば、乳癌）を有する個体を包含し、がん組織を除去する切除術（外科手術）を受けたかまたはその候補である個体を含む。
【００３７】
用語「治療上有効量」は、所望の治療効果を達成するのに十分な量、例えば、処置されている疾患に関連する症状、例えば、がんの成長または過剰増殖障害に関連する障害の予防もしくは改善または減少をもたらす量を意味する。対象に投与される化合物の量は、疾患の種類および重症度ならびに個体の特徴、例えば、健康状態、年齢、性別、体重、および薬剤耐性に依存する。またそれは、疾患の程度、重症度、および種類にも依存する。当業者は、これらのおよび他の要素に応じて適切な投与量を決定することが可能である。投与計画は、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。更に、幾つかの分割された用量および時差用量は、毎日もしくは逐次的に投与され得るか、または用量は、継続的に注入され得るか、もしくはボーラス注射であり得る。更に、本発明の化合物の用量は、治療または予防状況の緊急性によって示されるように比例的に増加または減少され得る。通常、治療効果を達成するのに十分な本発明の化合物の有効量は、１日当たりキログラム体重当たり約０．０００００１ｍｇ〜１日当たりキログラム体重当たり約１０，０００ｍｇの範囲である。好ましくは、用量範囲は、１日当たりキログラム体重当たり約０．０００１ｍｇ〜１日当たりキログラム体重当たり約１００ｍｇである。本明細書において開示される化合物は、お互いに組み合わされて、または１つ以上の追加の治療用化合物と共に投与され得る。
【００３８】
用語「塩」は、無機および／または有機酸により形成される酸性塩ならびに無機および／または有機塩基により形成される塩基性塩を指す。これらの酸および塩基の例は、当業者に周知である。かかる酸付加塩は、通常、薬学的に許容されるが、薬学的に許容されない酸の塩は、問題となる本発明の化合物の調製および精製に有用であり得る。本発明の化合物の酸付加塩は、薬学的に許容される酸から最も適切に形成され、例えば、無機酸（例えば塩酸、臭化水素酸、硫酸、またはリン酸）および有機酸（例えばコハク、マレイン酸、酢酸、またはフマル酸）により形成されるものが含まれる。他の薬学的に許容されない塩（例えばシュウ酸塩）は、例えば本発明の化合物の単離に、実験用に、またはその後の薬学的に許容される酸付加塩への変換に使用することができる。本発明の溶媒和物および水和物も、本発明の範囲内に含まれる。本発明のある種の化合物のインビボで加水分解可能なエステルまたはアミドは、遊離ヒドロキシまたはアミノ官能性を有するそれらの化合物を不活性溶媒（例えばジクロロメタンまたはクロロホルム）中の塩基の存在下で、所望のエステルの酸塩化物で処理することによって形成され得る。適切な塩基には、トリエチルアミンまたはピリジンを含まれる。逆に、遊離カルボキシ基を有する本発明の化合物は、活性化に続く適切な塩基の存在下での所望のアルコールによる処理を含み得る標準条件を使用してエステル化され得る。薬学的に許容される付加塩の例としては、非毒性の無機および有機酸付加塩、例えば、塩酸から誘導される塩酸塩、臭化水素酸から誘導される臭化水素酸塩、硝酸から誘導される硝酸塩、過塩素酸から誘導される過塩素酸塩、リン酸から誘導されるリン酸塩、硫酸から誘導される硫酸塩、ギ酸から誘導されるギ酸塩、酢酸から誘導される酢酸塩、アコニット酸から誘導されるアコニット酸塩、アスコルビン酸から誘導されるアスコルビン酸塩、ベンゼンスルホン酸から誘導されるベンゼンスルホン酸塩、安息香酸から誘導される安息香酸塩、ケイ皮酸から誘導されるケイ皮酸塩、クエン酸から誘導されるクエン酸塩、エンボン酸から誘導されるエンボン酸塩、エナント酸から誘導されるエナント酸塩、フマル酸から誘導されるフマル酸塩、グルタミン酸から誘導されるグルタミン酸塩、グリコール酸から誘導されるグリコール酸塩、乳酸から誘導される乳酸塩、マレイン酸から誘導されるマレイン酸塩、マロン酸から誘導されるマロン酸塩、マンデル酸から誘導されるマンデル酸塩、メタンスルホン酸から誘導されるメタンスルホン酸塩、ナフタレン−２−スルホン酸から誘導されるナフタレン−２−スルホン酸塩、フタル酸から誘導されるフタル酸塩、サリチル酸から誘導されるサリチル酸塩、ソルビン酸から誘導されるソルビン酸塩、ステアリン酸から誘導されるステアリン酸塩、コハク酸から誘導されるコハク酸塩、酒石酸から誘導される酒石酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸から誘導されるトルエン−ｐ−スルホン酸塩などが挙げられるが、これらに限定されない。特に好ましい塩は、本発明の化合物のナトリウム、リシン、およびアルギニン塩である。かかる塩は、当該技術分野において周知であり、記載されている手順によって形成され得る。
【００３９】
薬学的に許容されるとみなすことができないシュウ酸などの他の酸は、本発明の化合物およびその薬学的に許容される酸付加塩の取得において中間体として有用な塩の調製に有用であり得る。本発明の化合物の金属塩には、アルカリ金属塩、例えば、カルボキシ基を含有する本発明の化合物のナトリウム塩が含まれる。本発明により取得可能な異性体の混合物は、それ自体既知の方法で個々の異性体に分離され得、ジアステレオアイソマーは、例えば、多相の溶媒混合液間での分配、再結晶化および／または例えばシリカゲルでのクロマトグラフ分離、もしくは例えば、逆相カラムでの中圧液体クロマトグラフィーにより分離され得、ラセミ体は、例えば、光学的に純粋な塩形成試薬による塩の形成およびこうして得られるジアステレオ異性体の混合物の分離によって、例えば分別結晶化によって、または光学活性カラム材料上でのクロマトグラフィーによって分離され得る。
【００４０】
本明細書で使用する場合、用語「試料」は、本明細書で記載されるように、関心対象の供給源から取得されるかまたはそれに由来する生体試料を指す。幾つかの実施形態では、関心対象の供給源には、動物またはヒトなどの生物が含まれる。幾つかの実施形態では、生体試料には、生物組織または生体液が含まれる。幾つかの実施形態では、生体試料は、骨髄；血液；血液細胞；腹水；組織もしくは微細針生検試料；細胞を含有する体液；浮動性核酸；痰；唾液；尿；脳脊髄液、腹膜液；胸膜液；糞便；リンパ液；婦人科学的液体；皮膚スワブ；膣スワブ；口腔スワブ；鼻腔スワブ；管洗浄液もしくは気管支肺胞洗浄液などの洗液もしくは洗浄液；吸引液；擦過物；骨髄検体；組織生検検体；手術検体；便、他の体液、分泌物、および／もしくは排泄物；ならびに／またはそれら由来の細胞などであるかまたはそれらを含み得る。幾つかの実施形態では、生体試料は、個体から取得される細胞であるかまたはそれを含む。幾つかの実施形態では、試料は、任意の適切な手段によって関心対象の供給源から直接に取得される「一次試料」である。例えば、幾つかの実施形態では、一次生体試料は、生検（例えば、穿刺吸引または組織生検）、外科手術、体液（例えば、血液、リンパ液、糞便など）の収集などからなる群から選択される方法によって取得される。幾つかの実施形態では、文脈から明らかであるように、用語「試料」は、一次試料を処理することによって（例えば、一次試料の１つ以上の成分を除去することによって、および／または１つ以上の薬剤を添加することによって）、取得される調製物を指す。例えば、半透膜を使用した濾過。かかる「処理された試料」には、例えば、試料から抽出されるかまたは一次試料を例えば、ｍＲＮＡの増幅もしくは逆転写、ある種の成分の単離および／もしくは精製などの技術に供することによって取得される核酸またはタンパク質が含まれ得る。
【００４１】
本明細書で使用する場合、用語「処置すること」または「処置」または「治療する」は、１）診断された病態または障害の症状を治療、遅延、軽減し、かつ／またはその進行を停止させる治療手段および２）標的とする病態または障害の発症を予防または遅延する予防薬または予防手段の両方とも指す。したがって、処置を必要とする者としては、すでに障害と診断されている者；障害を有する傾向がある者；および障害が予防されるべきである者が含まれる。幾つかの実施形態では、対象は、患者が以下のうちの１つ以上を示す場合に本発明の方法により成功裡に「治療される」：がん細胞の数の減少および／もしくはがん細胞が完全に存在しないこと；腫瘍サイズの減少；腫瘍成長の阻害；がん細胞の軟組織および骨への拡散を含むがん細胞の末梢臓器への浸潤の阻害および／もしくはその非存在；腫瘍またはがん細胞の転移の阻害および／もしくはその非存在；がん成長の阻害および／もしくは非存在；特定の特異的がんに関連する１つ以上の症状の軽減；罹患率および死亡率の低減；生活の質の改善；腫瘍形成性の低減；がん幹細胞の数もしくは頻度の低減；またはかかる効果の幾つかの組み合わせ。
【００４２】
本明細書で使用する場合、用語「腫瘍」は、悪性か良性かを問わない、全ての腫瘍細胞の成長および増殖、ならびに全ての前がん性およびがん性の細胞および組織を指す。
【００４３】
用語「Ｔ３ｐ」は、ヒトＴＥＲＣヌクレオチド配列によってコードされるかまたは生成される非コードＲＮＡの（５’〜３’の方向での）最後の４５ヌクレオチドを指す。上記配列は、ＰＣＴ番号第ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０５５７０９号および関連する配列リストにおいて見出され得、その内容はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【００４４】
本明細書で使用する場合、用語「腫瘍試料」は、がん患者から取得される腫瘍材料を含む試料を指す。上記用語は、腫瘍組織試料、例えば、外科的切除によって取得される組織および生検、例えば、コア生検または微細針生検によって取得される組織を包含する。特定の実施形態では、腫瘍試料は、固定され、蝋に包埋された組織試料、例えば、ホルマリン固定され、パラフィン包埋された組織試料である。更に、用語「腫瘍試料」は、原発性腫瘍以外の部位から取得される腫瘍細胞、例えば、循環腫瘍細胞を含む試料を包含する。上記用語は、患者の腫瘍細胞の子孫である細胞、例えば、原発性腫瘍細胞または循環腫瘍細胞に由来する細胞培養試料も包含する。上記用語は、インビボで腫瘍細胞から排出されたタンパク質または核酸材料を含み得る試料、例えば、骨髄、血液、血漿、血清などを更に包含する。上記用語は、腫瘍細胞が濃縮されたかまたは別の方法でそれらの入手後に操作された試料ならびに患者の腫瘍材料から取得されるポリヌクレオチドおよび／またはポリペプチドを含む試料も包含する。
【００４５】
がんの低分子ＲＮＡバイオマーカー
ヒトゲノムは、膨大な量の低分子非タンパク質コードＲＮＡ（ｎｃＲＮＡ）転写物をコードする。非常に豊富な転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）、リボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）、核小体低分子ＲＮＡ（ｓｎｏＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、核内低分子ＲＮＡ（ｓｎＲＮＡ）、およびＰｉｗｉ結合ＲＮＡ（ｐｉＲＮＡ）を含む複数のｎｃＲＮＡクラスが記載されている（Ａｍａｒａｌ  ｅｔ  ａｌ．，２００８、Ｍａｒｔｅｎｓ−Ｕｚｕｎｏｖａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３）。低分子非コードＲＮＡは、適切な配列相補性を有する部位で標的ｍＲＮＡに結合することによる翻訳リプレッサーとして働く（Ａｍｅｒｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００７）が、非常に豊富な細胞質Ｙ  ＲＮＡは、Ｒｏタンパク質の細胞内位置に影響を及ぼすことによってＲＮＡの品質管理において機能する（Ｓｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，２００９）。ｍＲＮＡ翻訳に対する成熟低分子非コードＲＮＡの抑制活性は、既定の細胞内位置でレトロトランスポゾンをサイレンシングするｐｉＲＮＡに加えて、ｓｉＲＮＡおよび内在性ｓｉＲＮＡを含む他のクラスのｎｃＲＮＡと共有される（Ｃｈｕｍａ  ａｎｄ  Ｐｉｌｌａｉ，２００９）。低分子非コードＲＮＡの活性は、細胞質中の十分なレベルの存在量およびエンドソーム膜に局在するＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）との相互作用に依存する（Ｇｉｂｂｉｎｇｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００９、Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００９ａ）が、少ない量の低分子非コードＲＮＡは、翻訳の抑制に対するより小さい効果を有する。結果として、ある種の低分子非コードＲＮＡのレベルの微妙な変化でも、すでに細胞プロセスに影響を与え得るが、強い撹乱は、疾患を引き起こし得る。存在量の他に、（ＲＩＳＣ）タンパク質のみならずＲＮＡパートナーとの相互作用および正しい細胞内局在は、低分子非コードＲＮＡの生理機能を制御する相互関係のある因子である（Ｍｕｌｌｏｋａｎｄｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２、Ｗｅｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【００４６】
低分子ＲＮＡは、エキソソームなどの細胞由来の細胞外小胞内に分泌され得る。ｍＲＮＡおよび低分子非コードＲＮＡ種の両方が、エキソソームに含有されることが発見されている。したがって、エキソソームは、ＲＮＡ含量の移送および環境中でのその分解からの保護のための手段を提供し得、ＲＮＡバイオマーカーの信頼性の高い検出のための安定した供給源を使用可能にする。
【００４７】
本開示は、「正常」である対象、すなわち乳癌を有さない対象と比較して、乳癌を有する対象に由来する生体試料中に差次的に存在することが分かっている低分子非コードＲＮＡバイオマーカーに関する。低分子非コードＲＮＡバイオマーカーまたは低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのセットは、試料における低分子非コードＲＮＡバイオマーカーまたは低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのセットの発現レベルの間の差が、統計的に有意であると判定される場合、試料間で差次的に存在する。統計的有意差の一般的な検定としては、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、クラスカル・ワリス、ウィルコクソン、マン・ホイットニー、およびオッズ比が挙げられるが、これらに限定されない。単独または組み合わせの低分子非コードＲＮＡバイオマーカーは、対象ががんを有するかまたは有さない相対リスクの尺度を提供するために使用され得る。
【００４８】
乳癌の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーは、複数の乳癌サブタイプおよびヒト乳房上皮細胞の低分子ＲＮＡの配列決定ならびに乳癌細胞において特異的に発現されている今まで知られていなかった低分子非コードＲＮＡの同定によって発見された。乳癌細胞において特異的に発現されている２００個の今まで知られていなかった低分子非コードＲＮＡは、このように同定された（表１を参照のこと）。現在、これらの低分子非コードＲＮＡバイオマーカーは、対象、例えば、乳癌の状態が今まで未知であった対象または乳癌に罹患していると疑われる対象のがんの状態を判定するために使用することができる。これは、対象に由来する生体試料中の同定された低分子非コードＲＮＡまたはその組み合わせのうちの１つ以上のレベルを判定することによって達成され得る。これらの低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのうちの１つ以上のレベルの正常な対象に由来する生体試料中のそれと比較した差は、対象が乳癌を有することの指標である。
【００４９】
正常な対象と比較して、１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルに差を有する対象は、初期の、中程度もしくは中期の、または重度もしくは末期の乳癌を含む乳癌を有し得る。一実施形態では、１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルは、初期のがんに特徴的な症状を有する対象の乳癌を診断するために使用され得る。
【００５０】
一実施形態では、１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルは、対象におけるがんの進行、例えば、乳癌の進行の経過をモニタリングするために使用され得る。対象のがんの状態は、経時的に変化し得る。例えば、がんは、経時的に悪化するかまたは改善し得る。かかる悪化または改善に伴い、１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルは、対象に由来する試料において検出されるように統計的に有意な様式で変化し得る。例えば、低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのうちの１つ以上のレベルは、乳癌の発生に伴って経時的に増加し得る。したがって、対象における乳癌の経過（進行）は、対象に由来する第１の試料中の１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを判定すること、および対象に由来する第２の試料中の１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを判定することによってモニタリングされ得、ここで、第２の試料は第１の試料の後に取得される。第１の試料におけるレベルと比較した第２の試料におけるレベルは、疾患進行を示す。例えば、第１の試料から第２の試料への表１、表２または表３の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのうちの１つ以上のレベルの増加は、対象が乳癌を発症したか、または疾患が悪化したことを示す。逆に、第１の試料から第２の試料への表１、表２または表３の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのうちの１つ以上のレベルの減少は、疾患が改善したことを示す。一実施形態では、１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーは、表３のものおよびその組み合わせである。
【００５１】
試験対象に由来する生体試料中の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルが、正常な対象に存在する低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルと異なるか否かは、試験対象由来の試料中の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを適切な対照と比較することによって確認され得る。当業者は、問題となるアッセイのための適切な対照を選択することができる。例えば、適切な対照は、既知の対象、例えば、がんを有さない正常な対象であることが既知の対象に由来する生体試料であり得る。適切な対照が正常な対象から取得される場合、試験対象における低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルの適切な対照と比較した統計学的有意差は、対象が乳癌を有することを示す。一実施形態では、低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルの差は、増加である。適切な対照は、参照標準でもあり得る。参照標準は、対象の乳癌の状態を推定するために試験試料を参照標準と比較できるように、比較のための参照レベルとして機能する。参照標準は、既知の対象、例えば、正常な対象であることが既知の対象または乳癌を有することが既知の対象における１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを表わし得る。同様に、参照標準は、既知の対象の集団、例えば、正常な対象であることが既知の対象の集団または乳癌を有することが既知の対象の集団における１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを表わし得る。参照標準は、例えば、複数の個体からの試料をプールすること、およびプールされた試料中の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを測定することによって取得され、これにより、平均化された集団についての標準をもたらすことができる。このような参照標準は、個体の集団中の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーの平均レベルを表す。参照標準は、例えば、複数の個体から取得された個々の試料中に存在することが判定された低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルの平均をとることによっても取得され得る。またこのような標準は、個体の集団中の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーの平均レベルも表わす。参照標準は、各々が個体の集団における既知の対象の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを表わす値の集まりでもあり得る。ある種の実施形態では、試験試料は、対象の乳癌、状態を推定するために、かかる値の集まりに対して比較され得る。ある種の実施形態では、参照標準は、絶対値である。かかる実施形態では、試験試料は、対象の乳癌、状態を推定するために、絶対値に対して比較され得る。一実施形態では、試料における１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーレベルの適切な対照に対する比較は、ソフトウェアの分類アルゴリズムを実行することによってなされる。幾つかの実施形態では、表１、２、および／または３における１つまたは組み合わせの非コードＲＮＡの増加した発現は、正常な試料における同一の非コードＲＮＡの発現と比べて約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５パーセント、または約１００％以上の発現である。幾つかの実施形態では、表１、２、および／または３における１つまたは組み合わせの非コードＲＮＡの増加した発現は、正常な試料における同一の１つまたは組み合わせの非コードＲＮＡの発現と比べて約２Ｘ、３Ｘ、４Ｘ、５Ｘ、６Ｘ、７Ｘ、８Ｘ、９Ｘ、または１０Ｘ以上の発現である。幾つかの実施形態では、表１、２、および／または３の核酸配列に対する約７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％の相同性を有する１つまたは複数の非コードＲＮＡ配列または核酸配列。幾つかの実施形態では、表１、２、または３のうちの１つまたは複数の配列の発現を伴う、単独または組み合わせの１つまたは複数の非コードＲＮＡの単なる存在または発現。幾つかの実施形態では、表１、２、および／または３の核酸配列に対する約７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％の相同性を有する配列のうちの１つまたは複数の発現を伴う、単独または組み合わせに対応する１つまたは複数の非コードＲＮＡの単なる存在または発現。幾つかの実施形態では、これらの相同配列は、表１、２、および／または３において開示される核酸配列の断片のうちの１つまたは複数を含む。
【００５２】
当業者は、問題となるアッセイに応じた適切であり得る追加の適切な対照を容易に想定することができる。上述の適切な対照は、例示であり、限定であることを意図するものではない。
【００５３】
一般に、正常な対象における表１、表２または表３の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのうちの１つ以上のレベルを表す適切な対照と比較した、試験対象に由来する生体試料における表１、表２または表３の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのうちの１つ以上のレベルの増加は、試験対象が乳癌を有することを示すであろう。２つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーレベルが試験対象において測定される幾つかの例では、適切な対照と比較して、１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルが増加し、１つ以上の追加の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルが変化しないかまたは増加し得る。かかる例では、低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのうちの１つ以上のレベルの、正常な対象における低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを表す適切な対照と比較した差は、試験対象が乳癌を有することを示す。このような差の判定は、本明細書に記載されるように、ソフトウェアの分類アルゴリズムの実行によって補助され得る。
【００５４】
生体試料
１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーの発現レベルが、対象に由来する生体試料において測定され得る。対象に由来する試料は、対象から生じるものである。かかる試料は、それが対象から取得された後に更に処理され得る。例えば、ＲＮＡは、試料から単離され得る。この例では、試料から単離されたＲＮＡは、対象に由来する試料でもある。１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを判定するのに有用な生体試料は、基本的には身体中の細胞、組織、および液体を含む任意の供給源から取得され得る。
【００５５】
幾つかの実施形態では、１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを判定するために使用される生体試料は、循環低分子非コードＲＮＡ、例えば、細胞外低分子非コードＲＮＡを含有する試料である。細胞外低分子非コードＲＮＡは、循環系からの液体などの体液、例えば、血液試料もしくはリンパ液試料または別の体液、例えば、尿もしくは唾液を含む広範囲の生物学的材料中を自由に循環する。したがって、幾つかの実施形態では、１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを判定するために使用される生体試料は、体液、例えば、血液、その画分、血清、血漿、尿、唾液、涙液、汗、精液、膣液、リンパ液、気管支分泌物、ＣＳＦ、全血などである。幾つかの実施形態では、試料は、非侵襲的に取得される試料である。幾つかの実施形態では、試料は、ヒト由来の血清試料である。
【００５６】
幾つかの実施形態では、本明細書において開示される方法のいずれかは、少量試料を使用することを含む。幾つかの実施形態では、開示される方法は、約２０マイクロリットル以下の試料、４０マイクロリットルの試料、８０マイクロリットルの試料、１００マイクロリットルの試料、２００マイクロリットルの試料、３００マイクロリットルの試料、４００マイクロリットルの試料、５００マイクロリットルの試料、６００マイクロリットルの試料、７００マイクロリットルの試料、８００マイクロリットルの試料、９００マイクロリットルの試料、１ミリリットルの試料、１．１ミリリットルの試料、１．２ミリリットルの試料、１．３ミリリットルの試料、１．４ミリリットルの試料、１．５ミリリットルの試料、１．６ミリリットルの試料、１．７ミリリットルの試料、１．８ミリリットルの試料、１．９ミリリットルの試料、２．０ミリリットルの試料のうちの試料中の全ＲＮＡを単離することおよび／または非コードＲＮＡを増幅することを含む。幾つかの実施形態では、試料サイズは、対象の血漿、全血、または血清形態の約２５マイクロリットル〜約２ミリリットルの液体試料である。
【００５７】
幾つかの実施形態では、開示される方法は、約２０マイクロリットル以下の血清、４０マイクロリットルの血清、８０マイクロリットルの血清、１００マイクロリットルの血清、２００マイクロリットルの血清、３００マイクロリットルの血清、４００マイクロリットルの血清、５００マイクロリットルの血清、６００マイクロリットルの血清、７００マイクロリットルの血清、８００マイクロリットルの血清、９００マイクロリットルの血清、１ミリリットルの血清、１．１ミリリットルの血清、１．２ミリリットルの血清、１．３ミリリットルの血清、１．４ミリリットルの血清、１．５ミリリットルの血清、１．６ミリリットルの血清、１．７ミリリットルの血清、１．８ミリリットルの血清、１．９ミリリットルの血清、２．０ミリリットルの血清の試料中の全ＲＮＡを単離することおよび／または非コードＲＮＡを増幅することを含む。
【００５８】
循環低分子非コードＲＮＡとしては、細胞中の低分子非コードＲＮＡ、マイクロ小胞中、エキソソーム中の細胞外低分子非コードＲＮＡ、および細胞またはマイクロ小胞を伴わない細胞外低分子非コードＲＮＡ（非小胞性の細胞外低分子非コードＲＮＡ）が挙げられる。幾つかの実施形態では、１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを判定するために使用される生体試料（例えば、循環低分子非コードＲＮＡを含有する試料）は、細胞を含有し得る。他の実施形態では、生体試料は、細胞を含まなくてもよく、または実質的に含まなくてもよい（例えば、血清試料）。幾つかの実施形態では、循環低分子非コードＲＮＡ（例えば、細胞外低分子非コードＲＮＡ）を含有する試料は、血液由来の試料である。例示的な血液由来の試料の種類としては、例えば、血漿試料、血清試料、血液試料などが挙げられる。他の実施形態では、循環低分子非コードＲＮＡを含有する試料は、リンパ液試料である。循環低分子非コードＲＮＡは、尿および唾液中においても見出され、これらの供給源に由来する生体試料も同様に、１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを判定するのに適している。
【００５９】
幾つかの実施形態では、本開示の方法のうちのいずれかは、試料または細胞もしくはエキソソームもしくはマイクロ小胞から全ＲＮＡを単離するステップを含む。発現解析のために血液、血漿、および／または血清からＲＮＡを単離する方法（例えば、Ｔｓｕｉ  ＮＢ  ｅｔ  ａｌ．（２００２）Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．４８，１６４７−５３を参照のこと（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））、ならびに尿からＲＮＡを単離する方法（例えば、Ｂｏｏｍ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．（１９９０）Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２８，４９５−５０３を参照のこと（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））が記載されている。
【００６０】
試料中の低分子ＲＮＡバイオマーカーのレベルの判定
生体試料中の１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルは、任意の適切な方法によって判定され得る。試料中の低分子非コードＲＮＡのレベルまたは量を測定するための任意の信頼性の高い方法が使用され得る。一般に、低分子非コードＲＮＡは、例えば、増幅ベースの方法（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）、ローリングサークル増幅など）、ハイブリダイゼーションベースの方法（例えば、ハイブリダイゼーションアレイ（例えば、マイクロアレイ）、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ解析、ノーザンブロット解析、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅法、ｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションなど）、および配列決定ベースの方法（例えば、ＩｌｌｕｍｉｎａまたはＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔプラットフォームを使用した次世代配列決定法）を含むｍＲＮＡのための公知の各種の方法によって単離されたＲＮＡ試料などの試料（その画分を含む）から検出または定量化され得る。他の例示的な技術としては、リボヌクレアーゼ保護アッセイ（ＲＰＡ）および質量分析が挙げられる。
【００６１】
幾つかの実施形態では、ＲＮＡは、解析前にＤＮＡ（ｃＤＮＡ）に変換される。ｃＤＮＡは、単離された低分子非コードＲＮＡの従来技術を使用した逆転写により生成され得る。幾つかの実施形態では、低分子非コードＲＮＡは、測定前に増幅される。他の実施形態では、低分子非コードＲＮＡのレベルは、増幅プロセスの間に測定される。更なる他の実施形態では、低分子非コードＲＮＡのレベルは、測定前に増幅されない。試料中の低分子非コードＲＮＡのレベルを判定するのに好適な幾つかの例示的な方法は、以下で更に詳細に記載される。これらの方法は、単に例証として提供される。他の好適な方法が同様に使用され得ることは、当業者にとって明らかである。
【００６２】
Ａ．増幅ベースの方法
ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＰＣＲ、およびローリングサークル増幅を含むがこれらに限定されない、低分子非コードＲＮＡ核酸配列のレベルを検出するための多数の増幅ベースの方法が、存在する。他の増幅ベースの技術としては、例えば、リガーゼ連鎖反応、多様なライゲーション可能なプローブを用いる増幅（ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ  ｌｉｇａｔａｂｌｅ  ｐｒｏｂｅ  ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、インビトロ転写（ＩＶＴ）、鎖置換増幅、転写媒介増幅、ＲＮＡ（Ｅｂｅｒｗｉｎｅ）増幅、および当業者に公知である他の方法が挙げられる。
【００６３】
典型的なＰＣＲ反応には、標的核酸種を選択的に増幅する以下の複数のステップまたはサイクルが含まれる：標的核酸が変性される変性ステップ；ＰＣＲプライマーのセット（すなわち、フォワードプライマーおよびリバースプライマー）が相補的ＤＮＡ鎖とアニーリングするアニーリングステップ、ならびに耐熱性ＤＮＡポリメラーゼがプライマーを伸長させる伸長ステップ。これらのステップを複数回繰り返すことによって、ＤＮＡフラグメントが増幅されて標的配列に対応するアンプリコンを産生する。典型的なＰＣＲ反応は、２０回以上の変性、アニーリング、および伸長のサイクルを含む。多くの場合、アニーリングステップおよび伸長ステップを同時に行うことができ、その場合、サイクルは２つのステップのみを含む。逆転写反応（低分子非コードＲＮＡと相補性を有するｃＤＮＡ配列を産生する）が、ＰＣＲ増幅の前に実行され得る。逆転写反応は、例えば、ＲＮＡベースのＤＮＡポリメラーゼ（逆転写酵素）およびプライマーの使用を含む。
【００６４】
低分子非コードＲＮＡの定量的リアルタイムＰＣＲ用のキットは、公知であり、市販されている。適切なキットの例としては、ＴａｑＭａｎ  ｍｉＲＮＡアッセイ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）およびｍｉｒＶａｎａ．ｑＲＴ−ＰＣＲ  ｍｉＲＮＡ検出キット（Ａｍｂｉｏｎ）が挙げられるが、これらに限定されない。逆転写酵素の前に、低分子非コードＲＮＡをユニバーサルプライマー配列、ポリアデニル化配列、またはアダプター配列を含有する一本鎖オリゴヌクレオチドにライゲーションし、ユニバーサルプライマー配列に相補的なプライマー、ポリ（Ｔ）プライマー、またはアダプター配列に相補的な配列を含むプライマーを使用して増幅することができる。
【００６５】
一部の例では、低分子非コードＲＮＡレベルの判定のために、カスタムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイが開発され得る。生体試料（例えば、体液）中の低分子非コードＲＮＡを測定するために、例えば、延長された逆転写プライマーおよびロックド核酸改変ＰＣＲを伴う方法を使用して、カスタムｑＲＴ−ＰＣＲアッセイが、開発され得る。カスタム低分子非コードＲＮＡアッセイは、標的配列に対応する化学合成した低分子非コードＲＮＡの希釈系列に対してアッセイ法を行うことによって検査され得る。これは、検出限界および各アッセイの定量の直線範囲の判定を可能にする。更に、検量線として使用される場合、これらのデータは、生体試料において測定された低分子非コードＲＮＡの絶対存在量の推定を可能にする。
【００６６】
場合により増幅曲線をチェックして、Ｃｔ値が各増幅プロットの直線範囲内で評価されることを検証してもよい。典型的には、直線範囲は、数桁に及ぶ。アッセイされる各候補低分子非コードＲＮＡについて、化学合成されたバージョンの低分子非コードＲＮＡを得て、希釈系列で解析し、アッセイの感度限界および定量の直線範囲を判定することができる。相対発現レベルは、例えば、Ｌｉｖａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ（２００１）Ｄｅｃｅｍｂｅｒ；２５（４）：４０２−８によって記載されているように判定され得る。
【００６７】
幾つかの実施形態では、２つ以上の低分子非コードＲＮＡが単一反応容量で増幅される。例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲなどの多重ｑ−ＰＣＲは、２対以上のプライマーおよび／または２つ以上のプローブを使用することによって、１つの反応容量で少なくとも２つの関心対象の低分子非コードＲＮＡの同時増幅および定量を可能にする。プライマー対は、各低分子非コードＲＮＡと特異的に結合する少なくとも１つの増幅プライマーを含み、プローブは、それらが互いに識別可能なように標識され、これにより、複数の低分子非コードＲＮＡの同時定量が可能となる。
【００６８】
ローリングサークル増幅は、環状化オリゴヌクレオチドプローブを等温条件下で線形または幾何学的動態のいずれかで複製することができる、ＤＮＡポリメラーゼ駆動反応である（例えば、Ｌｉｚａｒｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．（１９９８）１９（３）：２２５−２３２；Ｇｕｓｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．（２００１）１５９（１）：６３−６９、Ｎａｌｌｕｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．（２００１）２９（２３）：Ｅ１１８を参照のこと）。２つのプライマーの存在下で、一方はＤＮＡの（＋）鎖にハイブリダイズし、他方は（−）鎖にハイブリダイズし、鎖置換の複合パターンが、９０分以内に各ＤＮＡ分子の１０９個超のコピーの生成をもたらす。単一のプライマーを使用することによって、閉環状ＤＮＡ分子のタンデムに連結されたコピーが形成され得る。マトリックスに結合したＤＮＡを使用して、このプロセスを実行することもできる。ローリングサークル増幅のために使用される鋳型は、逆転写され得る。この方法を、低分子非コードＲＮＡ配列および非常に低い低分子非コードＲＮＡ濃度での発現レベルの高感度な指標として使用することができる（例えば、Ｃｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｇｅｗ  Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．（２００９）４８（１８）：３２６８−７２、Ｎｅｕｂａｃｈｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｈｅｍｂｉｏｃｈｅｍ．（２００９）１０（８）：１２８９−９１を参照のこと）。
【００６９】
Ｂ．ハイブリダイゼーションベースの方法
低分子非コードＲＮＡは、ハイブリダイゼーションアレイ（例えば、マイクロアレイ）、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ解析、ノーザンブロット解析、分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅法、およびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを含むが、これらに限定されないハイブリダイゼーションベースの方法を使用して検出され得る。
【００７０】
多数の低分子非コードＲＮＡの発現レベルを同時に測定するためにマイクロアレイが使用され得る。先細ピンを用いたガラススライド上へのプリント、予備製造されたマスクを使用するフォトリソグラフィー、ダイナミックマイクロミラーデバイス（ｄｙｎａｍｉｃ  ｍｉｃｒｏｍｉｒｒｏｒ  ｄｅｖｉｃｅ）を使用するフォトリソグラフィー、インクジェットプリント、または微小電極アレイを用いた電気化学を含む種々の技術を使用して、マイクロアレイが製作され得る。マイクロ流体ｑＲＴ−ＰＣＲ反応のアレイに基づくマイクロ流体ＴａｑＭａｎ  Ｌｏｗ−Ｄｅｎｓｉｔｙ  Ａｒｒａｙおよび関連するｑＲＴ−ＰＣＲに基づくマイクロ流体法も有用である。
【００７１】
Ａｘｏｎ  Ｂ−４０００スキャナーおよびＧｅｎｅ−Ｐｉｘ  Ｐｒｏ  ４．０ソフトウェアまたは他の適切なソフトウェアを使用して、画像をスキャンすることができる。バックグラウンド除去後の非陽性スポットおよびＥＳＤ手順によって検出された外れ値が、除去される。得られたシグナル強度値は、チップ当たりの中央値に対して正規化され、次いで、各低分子非コードＲＮＡについての幾何平均および標準誤差を取得するために使用される。各シグナルを対数の底２に変換することができ、一標本ｔ検定を実施することができる。データの強固性を上げるために各低分子非コードＲＮＡを複数回スポットして、各試料について独立したハイブリダイゼーションをチップ上で行うことができる。
【００７２】
疾患における各低分子非コードＲＮＡの発現プロファイリングのためにマイクロアレイを使用することができる。例えば、ＲＮＡを試料から抽出することができ、所望により、低分子非コードＲＮＡが全ＲＮＡからサイズ選択される。オリゴヌクレオチドリンカーを低分子非コードＲＮＡの５’および３’末端に結合させることができ、得られたライゲーション産物が、ＲＴ−ＰＣＲ反応用のテンプレートとして使用される。センス鎖ＰＣＲプライマーは、その５’末端にフルオロフォアを結合させることによって、ＰＣＲ産物のセンス鎖を標識することができる。ＰＣＲ産物は、変性され、次いでマイクロアレイにハイブリダイズされる。標的核酸と呼ばれる、アレイ上の対応する低分子非コードＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的なＰＣＲ産物は、捕捉プローブが固定されているスポットで塩基対形成を介してハイブリダイズする。次いで、スポットは、マイクロアレイレーザスキャナーを使用して励起されると、蛍光を発する。
【００７３】
次いで、幾つかの陽性および陰性対照ならびにアレイデータ正規化法を使用して、各スポットの蛍光強度が特定の低分子非コードＲＮＡのコピー数の観点から評価され、その結果、特定の低分子非コードＲＮＡの発現レベルの評価がもたらされる。
【００７４】
低分子非コードＲＮＡをサイズ選択せずに、体液試料から抽出された低分子非コードＲＮＡを含有する全ＲＮＡを直接使用することもできる。例えば、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼおよびフルオロフォア標識短鎖ＲＮＡリンカーを使用して、ＲＮＡを３’末端標識することができる。アレイ上の対応する低分子非コードＲＮＡ捕捉プローブ配列に相補的なフルオロフォア標識低分子非コードＲＮＡは、捕捉プローブが固定されているスポットで塩基対形成を介してハイブリダイズする。次いで、幾つかの陽性および陰性対照ならびにアレイデータ正規化法を使用して、各スポットの蛍光強度が特定の低分子非コードＲＮＡのコピー数の観点から評価され、その結果、特定の低分子非コードＲＮＡの発現レベルの評価がもたらされる。
【００７５】
スポットされたオリゴヌクレオチドマイクロアレイ、予め製作されたオリゴヌクレオチドマイクロアレイまたはスポットされた長鎖オリゴヌクレオチドアレイが含まれるが、これらに限定されない幾つかの種類のマイクロアレイが使用され得る。
【００７６】
増幅せずにｎＣｏｕｎｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓｅａｔｔｌｅ、Ｗａｓｈ．）を使用して低分子非コードＲＮＡを検出することもできる。この技術は、溶液中でハイブリダイズする２つの核酸ベースのプローブ（例えば、レポータープローブおよび捕捉プローブ）を使用する。ハイブリダイゼーション後に、過剰のプローブが除去され、製造者のプロトコールに従ってプローブ／標的複合体が解析される。ｎＣｏｕｎｔｅｒ  ｍｉＲＮＡアッセイキットは、ＮａｎｏＳｔｒｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから入手可能であり、高度に類似した低分子非コードＲＮＡを高い特異性で識別することができる。
【００７７】
分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）シグナル増幅法を使用して、低分子非コードＲＮＡを検出することもできる（例えば、Ｕｒｄｅａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９４），１２：９２６−９２８を参照のこと）。ｂＤＮＡシグナル増幅に基づく低分子非コードＲＮＡアッセイが市販されている。かかるアッセイの１つは、ＱｕａｎｔｉＧｅｎｅ（登録商標）２．０  ｍｉＲＮＡ  Ａｓｓａｙ（Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ，Ｓａｎｔａ  Ｃｌａｒａ，Ｃａｌｉｆ．）である。
【００７８】
ノーザンブロットおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを使用して、低分子非コードＲＮＡを検出してもよい。ノーザンブロットおよびｉｎ  ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを行うための適切な方法が、当技術分野において公知である。
【００７９】
幾つかの実施形態では、バイオマーカーの発現は、多検体プロファイル試験、酵素結合免疫吸着測定法（ＥＬＩＳＡ）、放射免疫アッセイ、ウエスタンブロットアッセイ、免疫蛍光アッセイ、酵素免疫測定法、免疫沈降アッセイ、化学発光アッセイ、免疫組織化学アッセイ、ドットブロットアッセイ、またはスロットブロットアッセイが含まれるがこれらに限定されない、当業者に公知のアッセイによって測定される。アッセイにおいて抗体が使用される幾つかの実施形態では、抗体は、検出可能に標識される。抗体標識としては、免疫蛍光標識、化学発光標識、リン光性標識、酵素標識、放射標識、アビジン／ビオチン、コロイド金粒子、着色した粒子、および磁気粒子が挙げられるが、これらに限定されない。幾つかの実施形態では、バイオマーカーの発現は、ＩＨＣアッセイによって測定される。
【００８０】
幾つかの実施形態では、バイオマーカーの発現は、バイオマーカーに特異的に結合する薬剤を使用して測定される。バイオマーカーへの特異的結合を示す任意の分子実体が、試料中のそのバイオマーカータンパク質のレベルを測定するために使用され得る。特異的に結合する薬剤としては、抗体、抗体断片、抗体ミメティック、およびポリヌクレオチド（例えば、アプタマー）が挙げられるが、これらに限定されない。技術者は、必要とされる特異性の程度が、バイオマーカータンパク質を検出するために使用される特定のアッセイによって決まることを理解する。幾つかの実施形態では、本開示は、固体支持体（例えば、Ｔ３ｐまたはその塩に結合することができる抗体、抗体断片、抗体ミメティック、および／またはポリヌクレオチドを含むＥＬＩＳＡプレート、ゲル、ビーズ、またはカラムを含むシステムに関する。
【００８１】
Ｃ．配列決定ベースの方法
利用可能な限り、高度な配列決定法が同様に使用され得る。例えば、低分子非コードＲＮＡは、Ｉｌｌｕｍｉｎａ次世代配列決定法（例えば、ＨｉＳｅｑ、ＨｉＳｃａｎ、ＧｅｎｏｍｅＡｎａｌｙｚｅｒ、またはＭｉＳｅｑシステム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、Ｃａｌｉｆ．）を使用した、例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ−Ｂｙ−ＳｙｎｔｈｅｓｉｓまたはＴｒｕＳｅｑ法）を使用して検出することができる。低分子非コードＲＮＡは、Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．、Ｇｕｌｌｉｆｏｒｄ、Ｃｏｎｎ．）または他の適切な半導体配列決定法を使用して検出することもできる。
【００８２】
Ｄ．追加の低分子非コードＲＮＡ検出ツール
ＲＮａｓｅマッピングを使用して低分子非コードＲＮＡを定量するために、質量分析を使用することができる。単離されたＲＮＡを、ＭＳまたはタンデムＭＳ（ＭＳ／ＭＳ）アプローチによるそれらの解析前に、高い特異性を有するＲＮＡエンドヌクレアーゼ（ＲＮａｓｅ）（例えば、全ての未修飾グアノシン残基の３’側で切断するＲＮａｓｅ  Ｔｌ）で酵素的に消化することができる。開発された第１の手法は、ＥＳＩーＭＳに直接カップリングした逆相ＨＰＬＣによるエンドヌクレアーゼ消化物のオンラインクロマトグラフィー分離を利用した。ＲＮＡ配列に基づき予想される質量からの質量シフトによって、転写後修飾の存在を明らかにすることができる。次に、異常な質量／電荷値のイオンをタンデムＭＳ配列決定のために単離して、転写後改変ヌクレオシドの配列の配置を突き止めることができる。
【００８３】
マトリックス支援レーザ脱離／イオン化質量分析（ＭＡＬＤＩ−ＭＳ）も、転写後修飾ヌクレオシドに関する情報を得るための解析手法として使用されている。ＭＡＬＤＩベースの手法は、分離ステップによってＥＳＩベースの手法と区別することができる。ＭＡＬＤＩ−ＭＳでは、質量分析計が使用され、低分子非コードＲＮＡが分離される。
【００８４】
限られた量のインタクトな低分子非コードＲＮＡを解析するために、カスタム製造ナノスプレーイオン源、Ｎａｎｏｖｏｌｕｍｅ  Ｖａｌｖｅ（Ｖａｌｃｏ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）、およびスプリットレスナノＨＰＬＣシステム（ＤｉＮａ，ＫＹＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を備えた、リニアイオントラップ−オービトラップハイブリット質量分析計（ＬＴＱ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ  ＸＬ，Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）またはタンデム四重極型飛行時間型質量分析計（ＱＳＴＡＲ  ＸＬ，Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用することによって、ナノＥＳＩ−ＭＳとカップリングしたキャピラリーＬＣシステムを使用することができる。分析物／ＴＥＡＡがナノ−ＬＣトラップカラムにロードされ、脱塩され、次いで濃縮される。インタクトな低分子非コードＲＮＡがトラップカラムから溶出され、Ｃｌ８キャピラリーカラムに直接注入され、漸増する極性の溶媒勾配を使用するＲＰ−ＨＰＬＣによってクロマトグラフィー分離される。ネガティブ極性モードでイオンをスキャン可能にするイオン化電圧を使用して、キャピラリーカラムに結合したスプレイヤー先端からクロマトグラフィー溶出液がスプレーされる。
【００８５】
低分子非コードＲＮＡの検出および測定のための追加の方法としては、例えば、ストランド侵入アッセイ法（Ｔｈｉｒｄ  Ｗａｖｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）、表面プラズモン共鳴法（ＳＰＲ）、ｃＤＮＡ、ＭＴＤＮＡ（メタリックＤＮＡ；Ａｄｖａｎｃｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｓａｓｋａｔｏｏｎ、ＳＫ）、およびＵＳ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓによって開発されたものなどの一分子方法が挙げられる。表面酵素反応をナノ粒子増幅ＳＰＲイメージング（ＳＰＲＩ）と組み合わせた新規な手法を使用するマイクロアレイ形式で、複数の低分子非コードＲＮＡを検出することができる。ポリ（Ａ）ポリメラーゼの表面反応は、ロックド核酸（ＬＮＡ）マイクロアレイ上にハイブリダイズされた低分子非コードＲＮＡにポリ（Ａ）テールを作り出す。次いで、ＤＮＡ修飾されたナノ粒子がポリ（Ａ）テールに吸着され、ＳＰＲＩで検出される。この超高感度ナノ粒子増幅ＳＰＲＩ方法をアトモルレベルの低分子非コードＲＮＡプロファイリングのために使用することができる。
【００８６】
Ｅ．増幅されたかまたは増幅されていない低分子非コードＲＮＡの検出
ある種の実施形態では、標識、色素、または標識プローブおよび／またはプライマーが、増幅されたかまたは増幅されていない低分子非コードＲＮＡを検出するために使用される。当業者は、検出法の感度および標的の存在量に基づいて、どの検出法が適切であるかが分かるであろう。検出法の感度および標的の存在量に応じて、検出の前に増幅が必要とされても必要とされなくてもよい。当業者は、低分子非コードＲＮＡを増幅することが好ましい検出法が分かるであろう。
【００８７】
プローブまたはプライマーは、標準的な塩基（Ａ、ＴまたはＵ、Ｇ、およびＣ）または修飾塩基を含み得る。修飾塩基としては、例えば、米国特許第５，４３２，２７２号、同５，９６５，３６４号、および同６，００１，９８３号に記載されているＡＥＧＩＳ塩基（Ｅｒａｇｅｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓから入手）が挙げられるが、これに限定されない。ある種の態様では、塩基は、天然のホスホジエステル結合または異なる化学結合で連結されている。異なる化学結合としては、例えば、米国特許第７，０６０，８０９号に記載されているペプチド結合またはロックド核酸（ＬＮＡ）による連結が挙げられるが、これらに限定されない。
【００８８】
更なる態様では、増幅反応物中に存在するオリゴヌクレオチドプローブまたはプライマーは、時間の関数として産生された増幅産物の量をモニタリングするのに適切である。ある種の態様では、二本鎖特徴に対する異なる一本鎖特徴を有するプローブが、核酸を検出するために使用される。プローブとしては、５’−エキソヌクレアーゼアッセイ（例えば、ＴＡＱＭＡＮ）プローブ（米国特許第５，５３８，８４８号を参照のこと）、ステムループ分子ビーコン（米国特許第６，１０３，４７６号および同５，９２５，５１７号を参照のこと）、ステムレスまたは直鎖状ビーコン（ＷＯ９９２１８８１、米国特許第６，４８５，９０１号、および同６，６４９，３４９号を参照のこと）、ペプチド核酸（ＰＮＡ）分子ビーコン（米国特許第６，３５５，４２１号および同６，５９３，０９１号を参照のこと）、直鎖状ＰＮＡビーコン（例えば、米国特許第６，３２９，１４４号を参照のこと）、非ＦＲＥＴプローブ（米国特許第６，１５０，０９７号を参照のこと）、Ｓｕｎｒｉｓｅ（商標）／ＡｍｐｌｉｆｌｕｏｒＢ（商標）プローブ（米国特許第６，５４８，２５０号を参照のこと）、ステムループおよび二重鎖ＳＣＯＲＰＩＯＮプローブ（米国特許第６，５８９，７４３号を参照のこと）、バルジループプローブ（米国特許第６，５９０，０９１号を参照のこと）、シュードノットプローブ（米国特許第６，５４８，２５０号を参照のこと）、サイクリコン（米国特許第６，３８３，７５２号を参照のこと）、ＭＧＢ  Ｅｃｌｉｐｓｅ（商標）プローブ（Ｅｐｏｃｈ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、ヘアピンプローブ（米国特許第６，５９６，４９０号を参照のこと）、ＰＮＡライトアッププローブ、アンチプライマークエンチプローブ（Ｌｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃｈｅｍ．５３：６２４−６３３（２００６））、自己組織化ナノ粒子プローブ、および例えば、米国特許第６，４８５，９０１号に記載されているフェロセン修飾されたプローブが挙げられるが、これらに限定されない。
【００８９】
ある種の実施形態では、増幅反応におけるプライマーのうちの１つ以上が、標識を含み得る。更に他の実施形態では、異なるプローブまたはプライマーは、互いに識別可能な検出可能な標識を含む。幾つかの実施形態では、プローブまたはプライマーなどの核酸は、２つ以上の識別可能な標識で標識され得る。
【００９０】
一部の態様では、標識は、１つ以上のプローブに結合されており、以下の特性のうちの１つ以上を有する：（ｉ）検出可能なシグナルを提供する；（ｉｉ）第２の標識と相互作用し、第２の標識、例えば、ＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動）によって提供される検出可能なシグナルを修飾する；（ｉｉｉ）ハイブリダイゼーション（例えば、二本鎖形成）を安定化する；および（ｉｖ）結合複合体または親和性セット、例えば、親和性複合体、抗体抗原複合体、イオン結合型錯体、ハプテンリガンド（例えば、ビオチン−アビジン）のメンバーを提供する。更に他の態様では、標識の使用は、既知の標識、結合、連結基、試薬、反応条件、ならびに解析法および精製法を使用する多数の既知の技術のいずれかを使用して達成され得る。
［００１００］低分子非コードＲＮＡは、直接的または間接的な方法によって検出され得る。直接的な検出法では、１つ以上の低分子非コードＲＮＡは、核酸分子に連結された検出可能な標識によって検出される。かかる方法では、低分子非コードＲＮＡは、プローブに結合する前に標識され得る。したがって、結合は、プローブに結合している標識された低分子非コードＲＮＡをスクリーニングすることによって検出される。プローブは、所望により、反応容量中のビーズに連結され得る。
【００９１】
ある種の実施形態では、核酸は、標識プローブとの直接的な結合によって検出され、その後にプローブが検出される。本発明の一実施形態では、増幅された低分子非コードＲＮＡなどの核酸は、所望の核酸を捕捉するためのプローブと複合化されたＦｌｅｘＭＡＰミクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ）を使用して検出される。幾つかの方法は、例えば、蛍光標識により修飾されたポリヌクレオチドプローブによる検出または分岐ＤＮＡ（ｂＤＮＡ）検出を伴い得る。
【００９２】
幾つかの実施形態では、バイオマーカーの発現は、各バイオマーカーに特異的なプライマーおよび／またはプローブを含むＰＣＲベースのアッセイを使用して測定される。本明細書で使用する場合、用語「プローブ」は、特に目的とする標的生体分子と選択的に結合することができる任意の分子を指す。本明細書において、幾つかの実施形態では、用語「プローブ」は、本明細書において開示される基質および／または反応産物および／またはプロテアーゼのいずれかと、間接的または直接的に、共有結合的または非共有結合的に結合または会合し得る任意の分子を指し、その会合または結合は、本明細書において開示される方法を使用して検出可能である。幾つかの実施形態では、プローブは、発蛍光性プローブ、抗体、または吸光度ベースのプローブである。吸光度ベースのプローブである場合、発色団であるｐＮＡ（パラニトロアニリン）が、本明細書において開示される標的核酸配列の検出および／または定量化のためのプローブとして使用され得る。幾つかの実施形態では、プローブは、酵素に曝露された際に発蛍光性になる発蛍光性分子または基質を含む核酸配列であり得、当該核酸配列は、表１、２および／または３における核酸配列のいずれかまたは組み合わせに対する７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または約１００％の配列同一性を含む核酸配列の断片に相補的である。
【００９３】
標的分子は、表１、２、および／または３において特定される核酸配列のいずれかまたは組み合わせであり得る。幾つかの実施形態では、標的分子は、表１、２および／または３における核酸配列のいずれかまたは組み合わせに対する７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％の配列同一性を含む核酸配列である。プローブは、既知の技術を使用して当業者によって合成されてもよく、または生物学的調製物に由来してもよい。プローブとしては、ＲＮＡ、ＤＮＡ、タンパク質、ペプチド、アプタマー、抗体、および有機分子が挙げられるが、これらに限定されない。用語「プライマー」または「プローブ」は、特定の配列を有するオリゴヌクレオチドまたは特定の配列を有するオリゴヌクレオチドを包含する。幾つかの実施形態では、標的分子は、表１、２および／または３において特定される核酸配列のいずれかもしくは組み合わせおよび／または表１、２および／または３における核酸配列のいずれかまたは組み合わせに対する７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または約９９％の配列同一性を含む核酸配列のいずれかもしくは組み合わせの任意の増幅された断片である。
【００９４】
他の実施形態では、核酸は、間接的な検出法によって検出される。例えば、ビオチン化プローブは、結合した核酸を検出するために、ストレプトアビジンと複合化された色素と組み合わされ得る。ストレプトアビジン分子は、増幅された低分子非コードＲＮＡ上のビオチン標識と結合し、結合した低分子非コードＲＮＡは、ストレプトアビジン分子に結合された色素分子を検出することによって検出される。一実施形態では、ストレプトアビジンと複合化された色素分子は、ＰＨＹＣＯＬＩＮＫを含む。Ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ  Ｒ−Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ（ＰＲＯｚｙｍｅ）。他の複合化された色素分子は、当業者に公知である。
【００９５】
標識としては、検出可能な蛍光、化学発光、または生物発光シグナルを発生させるかまたは消光する発光化合物、光散乱化合物、および光吸収化合物が挙げられるが、これらに限定されない（例えば、Ｋｒｉｃｋａ，Ｌ．，Ｎｏｎｉｓｏｔｏｐｉｃ  ＤＮＡ  Ｐｒｏｂｅ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ（１９９２）およびＧａｒｍａｎ  Ａ．，Ｎｏｎ−Ｒａｄｉｏａｃｔｉｖｅ  Ｌａｂｅｌｉｎｇ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ（１９９７）を参照のこと）。レポーターフルオロフォアおよびクエンチャーフルオロフォアを含む二重標識蛍光プローブが、幾つかの実施形態において使用される。異なる発光スペクトルを有するフルオロフォアの対が、これらを容易に区別できるように選択されることが理解されるであろう。
【００９６】
特定の実施形態では、標識は、二本鎖のハイブリダイゼーションを増強するか、安定化させるか、またはこれに影響を及ぼすハイブリダイゼーション安定化部分、例えば、挿入剤または挿入色素（臭化エチジウムおよびＳＹＢＲ−Ｇｒｅｅｎが挙げられるが、これらに限定されない）、小溝結合剤、および架橋官能基である（例えば、Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．“ＤＮＡ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ”  ｉｎ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ｉｎ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ａｎｄ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９９６）を参照のこと）。
【００９７】
他の実施形態では、低分子非コードＲＮＡを定量化するためにハイブリダイゼーションおよび／またはライゲーションに基づく方法が使用され得、これにはオリゴヌクレオチドライゲーション（ＯＬＡ）法および標的核酸配列にハイブリダイズしている、区別可能なプローブが未結合のプローブから分離されるのを可能にする方法が挙げられる。一例として、米国特許出願公開第２００６／００７８８９４号において開示されるＨＡＲＰ様プローブが、ｍｉＲＮＡの量を測定するために使用され得る。かかる方法では、プローブと標的化核酸との間のハイブリダイゼーション後に、ハイブリダイズしたプローブをハイブリダイズしていないプローブと区別するために、プローブが修飾される。その後、プローブは、増幅および／または検出され得る。一般的に、プローブ不活性化領域は、プローブの標的ハイブリダイゼーション領域内のヌクレオチドのサブセットを含む。標的核酸にハイブリダイズしていないＨＡＲＰプローブの増幅または検出を低減または防止するために、すなわち、標的核酸の検出を可能にするために、標的とされる核酸配列にハイブリダイズしているＨＡＲＰプローブと対応するハイブリダイズしていないＨＡＲＰプローブを区別することができる薬剤を使用して、ハイブリダイゼーション後のプローブ不活性化ステップが実行される。この薬剤は、ハイブリダイズしていないＨＡＲＰプローブが増幅できないように、これを不活性化または修飾することができる。プローブライゲーション反応を使用して、低分子非コードＲＮＡを定量化することもできる。多重ライゲーション依存性プローブ増幅法（Ｓｃｈｏｕｔｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ３０：ｅ５７（２００２））では、標的核酸上で互いに隣接して直ちにハイブリダイズするプローブ対は、標的核酸の存在により駆動されて、互いに連結される。幾つかの態様では、ＭＬＰＡプローブは、隣接するＰＣＲプライマー結合部位を有する。ＭＬＰＡプローブは、連結される場合に特異的に増幅され、これにより、低分子非コードＲＮＡバイオマーカーの検出および定量化を可能にする。
【００９８】
低分子ＲＮＡバイオマーカーのレベルの検出
本明細書において記載される低分子非コードＲＮＡバイオマーカーは、対象の乳癌の状態を評価するための診断試験において、個別にまたは組み合わせて使用され得る。乳癌の状態には、乳癌の存在または非存在が含まれる。乳癌の状態には、乳癌の経過をモニタリングすること、例えば、疾患の進行をモニタリングすることも含まれ得る。対象の乳癌の状態に基づいて、例えば、追加の診断試験または治療手段を含む追加の処置が指示され得る。
【００９９】
一般に、診断試験が疾患の状態を正しく予測する能力は、アッセイの正確度、アッセイの感度、アッセイの特異性、または「曲線下面積」（ＡＵＣ）、例えば、受信者動作特性（ＲＯＣ）曲線下面積の観点から測定される。本明細書で使用する場合、正確度は、誤分類された試料の割合の尺度である。正確度は、例えば、試験集団における試料の総数で割った正しく分類された試料の総数として計算され得る。感度は、試験によって陽性であると予測される「真の陽性」の尺度であり、乳癌試料の総数で割った正しく特定された乳癌試料の数として計算され得る。特異性は、試験によって陰性であると予測される「真の陰性」の尺度であり、正常な試料の総数で割った正しく特定された正常な試料の数として計算され得る。ＡＵＣは、感度対偽陽性率（１−特異性）のプロットである受信者動作特性曲線の下面積の尺度である。ＡＵＣが大きいほど、試験の適中率は高くなる。試験の有用性の他の有用な尺度としては、陽性として試験される実際の陽性の百分率である「陽性適中率」、および陰性として試験される実際の陰性の百分率である「陰性適中率」が挙げられる。好ましい実施形態では、異なる乳癌の状態を有する対象に由来する試料中の１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルは、適切な対照と比較して測定される場合、正常な対象と比較して少なくともｐ＝０．０５の、例えば、ｐ＝０．０５、ｐ＝０．０１、ｐ＝０．００５、ｐ＝０．００１などの統計学的有意差を示す。他の好ましい実施形態では、本明細書に記載の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーを個別にまたは組み合わせで使用する診断試験は、少なくとも約７５％の正確度、例えば、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％、または約１００％の正確度を示す。他の実施形態では、本明細書に記載の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーを個別にまたは組み合わせで使用する診断試験は、少なくとも約７５％の特異性、例えば、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％、または約１００％の特異性を示す。他の実施形態では、本明細書に記載の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーを個別にまたは組み合わせで使用する診断試験は、少なくとも約７５％の感度、例えば、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％、または約１００％の感度を示す。他の実施形態では、本明細書に記載の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーを個別にまたは組み合わせで使用する診断試験は、それぞれ少なくとも約７５％の特異性および感度、例えば、少なくとも約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７％、約９９％、または約１００％の特異性および感度を示す（例えば、少なくとも約８０％の特異性および少なくとも約８０％の感度、または例えば、少なくとも約８０％の特異性および少なくとも約９５％の感度）。
【０１００】
表１、２および３に列挙する各バイオマーカーは、正常な対象と比較して乳癌を有する対象に由来する生体試料中に差次的に存在し、各々が、試験対象における乳癌の判定を容易にするのにそれぞれ有用である。このような方法は、対象に由来する試料中のバイオマーカーのレベルを測定することを伴う。試料中のバイオマーカーのレベルを判定することは、任意の適切な方法、例えば、本明細書に記載の方法を使用して試料中のバイオマーカーのレベルを測定、検出、または分析することを含み得る。試料中のバイオマーカーのレベルを判定することは、試料中のバイオマーカーのレベルを測定、検出、または検定したアッセイの結果を調査することも含み得る。上記方法は、試料中のバイオマーカーのレベルを適切な対照と比較することも伴い得る。適切な対照を使用して評価される場合、バイオマーカーのレベルの正常な対象のそれに対する変化は、対象の乳癌の状態を示す。対象が特定の乳癌の状態を有さないと分類される上限または下限のバイオマーカーの量を示すバイオマーカーの診断量が使用され得る。例えば、乳癌を有する個体に由来する試料において、上記バイオマーカーが正常な個体と比較して上方調節される場合、診断的カットオフを超える測定量は、乳癌の診断を提供する。一般に、表１〜３の個々の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーは、乳癌試料において正常な個体から取得される試料と比較して上方調節される。当該技術分野において良く理解されているように、アッセイにおいて使用される特定の診断的カットオフを調整することは、所望する通りに診断アッセイの感度および／または特異性を調整することを可能にする。特定の診断的カットオフは、例えば、異なる乳癌の状態を有する対象由来の統計的に有意な数の試料におけるバイオマーカーの量を測定すること、および所望のレベルの正確度、感度、および／または特異性でカットオフを導くことによって判定され得る。ある種の実施形態では、診断的カットオフは、本明細書に記載されるように、分類アルゴリズムの援助によって判定され得る。
【０１０１】
したがって、対象由来の循環低分子非コードＲＮＡを含有する試料中の少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡのレベルを判定することによって対象における乳癌を診断するための方法であって、少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡのレベルの正常な対象のそれに対する差（適切な対照と比較して判定される）が、対象における乳癌の存在を示す方法が提供される。一実施形態では、少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡには、好ましくは表１からの１つ以上の低分子非コードＲＮＡが含まれる。一実施形態では、少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡには、好ましくは表２からの１つ以上の低分子非コードＲＮＡが含まれる。一実施形態では、少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡには、好ましくは表３からの１つ以上の低分子非コードＲＮＡが含まれる。例えば、本発明は、対象に由来する循環低分子非コードＲＮＡを含有する試料中の少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡのレベルを判定する方法であって、少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡのレベルの対照と比較した増加が、対象における乳癌の存在を示す方法を提供する。
【０１０２】
所望により、本発明の方法は、試料中の少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡのレベルに基づいて、対象が乳癌を有するかまたは有さないという診断を提供することを更に含み得る。加えて、またはあるいは、本発明の方法は、適切な対照と比較した少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡのレベルの差またはレベルを対象における乳癌の診断と関連付けることを更に含み得る。幾つかの実施形態では、かかる診断は、対象に直接的に提供されてもよく、対象の介護に関与する別の関係者に提供されてもよい。
【０１０３】
本明細書において示されるように、個々の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーは、乳癌の診断応用に有用であるが、低分子非コードＲＮＡバイオマーカーの組み合わせは、単独で使用した場合の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーよりも乳癌の状態のより高い適中率を提供し得る。具体的には、複数の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーの検出は、診断試験の正確度、感度、および／または特異性を増加させ得る。例示的な低分子非コードＲＮＡバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせを、表１に示す。例示的な低分子非コードＲＮＡバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせを、表２に示す。例示的な低分子非コードＲＮＡバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせを、表３に示す。本発明には、これらの表に記載されるような個々のバイオマーカーおよびバイオマーカーの組み合わせ、ならびに本明細書に記載の方法およびキットにおけるそれらの使用が含まれる。
【０１０４】
したがって、対象由来の循環低分子非コードＲＮＡを含有する試料中の２つ以上の低分子非コードＲＮＡのレベルを判定することによって対象における乳癌を診断するための方法であって、低分子非コードＲＮＡのレベルの正常な対象のそれに対する差（適切な対照と比較して判定される）が、対象における乳癌の存在を示す方法が提供される。一実施形態では、低分子非コードＲＮＡには、好ましくは表１に示す低分子非コードＲＮＡのうちの１つ以上が含まれる。一実施形態では、低分子非コードＲＮＡには、好ましくは表２に示す低分子非コードＲＮＡのうちの１つ以上が含まれる。一実施形態では、低分子非コードＲＮＡには、好ましくは表３に示す低分子非コードＲＮＡのうちの１つ以上が含まれる。
【０１０５】
対象由来の循環低分子非コードＲＮＡを含有する試料中の２つ以上の低分子非コードＲＮＡのレベルを判定すること、試料中の２つ以上の低分子非コードＲＮＡのレベルを正常な対象および乳癌を有する対象において存在する同一の低分子非コードＲＮＡのレベルを示すデータセットと比較すること、および対象を比較に基づいて乳癌を有するまたは有さないと診断することによる対象における乳癌を診断する方法も提供される。このような方法では、データセットは、対象由来の試料との比較のための適切な対照または参照標準として機能する。
【０１０６】
対象由来の試料のデータセットとの比較は、試料中の２つ以上の低分子非コードＲＮＡの総体的レベルと正常な対象または乳癌を有する対象において存在する同一の低分子非コードＲＮＡのレベルとの間に統計学的有意差が存在するか否か計算する分類アルゴリズムによって援助され得る。
【０１０７】
がんの状態を評価するための分類アルゴリズムの生成
幾つかの実施形態では、「既知の試料」などの試料を使用して生成されるデータは、次いで、分類モデルを「訓練する」ために使用され得る。「既知の試料」は、事前に分類された、例えば、正常な対象または乳癌を有する対象に由来するとして分類された試料である。スペクトルに由来し、分類モデルを形成するために使用されるデータは、「訓練データセット」と称され得る。一旦訓練されると、分類モデルは、未知の試料を使用して生成されるスペクトルに由来するデータのパターンを認識することができる。分類モデルは、次いで、未知の試料をクラスに分類するために使用され得る。これは、例えば、特定の生体試料がある種の生物学的状態（例えば、発症している対発症していない）に関連付けられるか否かを予測するのに有用であり得る。
【０１０８】
幾つかの実施形態では、分類モデルを形成するために使用される訓練データセットのためのデータは、定量ＰＣＲ（例えば、ダブルデルタＣｔ法を使用して取得されたＣｔ値）から、またはマイクロアレイ分析などのハイスループット発現プロファイリング（例えば、低分子非コードＲＮＡ発現アッセイからの総カウント数または正規化されたカウント数）から直接的に取得され得る。
【０１０９】
分類モデルは、データに存在する目的パラメータに基づいてデータの集合体をクラスに分離することを試みる任意の適切な統計的分類（または「学習」）法を使用して形成され得る。分類法は、教師ありまたは教師なしのいずれかであり得る。教師ありおよび教師なし分類プロセスの例は、Ｊａｉｎ，「Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ：Ａ  Ｒｅｖｉｅｗ」，ＩＥＥＥ  Ｔｒａｎｓａｃｔｉｏｎｓ  ｏｎ  Ｐａｔｔｅｒｎ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  Ｍａｃｈｉｎｅ  Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ，Ｖｏｌ．２２，Ｎｏ．１，Ｊａｎｕａｒｙ  ２０００に記載されており、その教示は参照により組み込まれる。
【０１１０】
教師あり分類では、既知の分類の例を含有する訓練データが、既知のクラスの各々を定義する関係のうちの１つ以上のセットを学習する学習機構に掲示される。次いで、新しいデータが学習機構に適用され得、次いで、学習機構は学習した関係を使用して新しいデータを分類する。教師あり分類プロセスの例としては、線形回帰プロセス（例えば、多重線形回帰（ＭＬＲ）、部分最小二乗（ＰＬＳ）回帰、および主成分退縮（ＰＣＲ））、２分決定木（例えば、ＣＡＲＴ―分類木と回帰木―などの再帰分割プロセス）、逆伝播ネットワークなどの人工ニューラルネットワーク、判別解析（例えば、ベイズ分類器またはフィッシャー解析）、ロジスティック分類器、およびサポートベクトル分類器（サポートベクトルマシン）が挙げられる。
【０１１１】
他の実施形態では、作成される分類モデルは、教師なし学習法を使用して形成され得る。教師なし分類は、訓練データセットが由来したスペクトルを事前に分類することなく、訓練データセットにおける類似性に基づいて、分類の学習を試みる。教師なし学習法には、クラスター解析が含まれる。クラスター解析は、互いに非常に類似し、他のクラスターのメンバーと非常に異なるメンバーを理想的には有するべきである「クラスター」または群にデータを区分することを試みる。次いで、データ項目間の距離を測定する幾つかの距離メトリックを使用して、類似度が測定され、これにより、互いにより近いデータ項目を一緒にクラスター化する。クラスター化技術としては、マッキーンのＫ平均アルゴリズムおよびコホーネンの自己組織化マップアルゴリズムが挙げられる。生物学的情報の分類における使用が主張されている学習アルゴリズムは、例えば、国際特許公開第ＷＯ０１／３１５８０（Ｂａｒｎｈｉｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  ｄｅｖｉｃｅｓ  ｆｏｒ  ｉｄｅｎｔｉｆｙｉｎｇ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｉｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｏｆ  ｕｓｅ  ｔｈｅｒｅｏｆ」）、米国特許出願番号第２００２  ０１９３９５０  Ａ１号（Ｇａｖｉｎ  ｅｔ  ａｌ，「Ｍｅｔｈｏｄ  ｏｒ  ａｎａｌｙｚｉｎｇ  ｍａｓｓ  ｓｐｅｃｔｒａ」）、米国特許出願番号第２００３  ０００４４０２  Ａ１号（Ｈｉｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，「Ｐｒｏｃｅｓｓ  ｆｏｒ  ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｎｇ  ｂｅｔｗｅｅｎ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｓｔａｔｅｓ  ｂａｓｅｄ  ｏｎ  ｈｉｄｄｅｎ  ｐａｔｔｅｒｎｓ  ｆｒｏｍ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｄａｔａ」）、および米国特許出願番号第２００３  ００５５６１５  Ａ１号（Ｚｈａｎｇ  ａｎｄ  Ｚｈａｎｇ，「Ｓｙｓｔｅｍｓ  ａｎｄ  ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｏｒ  ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｄａｔａ」）に記載されている。前述の特許出願の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【０１１２】
分類モデルは、任意の好適なデジタルコンピュータ上で形成され、使用され得る。好適なデジタルコンピュータとしては、Ｕｎｉｘ（登録商標）、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）、またはＬｉｎｕｘ（登録商標）ベースのオペレーティングシステムなどの任意の標準的または特殊なオペレーティングシステムを使用するマイクロ、小型、または大型コンピュータが挙げられる。
【０１１３】
訓練データセット（複数可）および分類モデルは、デジタルコンピュータにより実行または使用されるコンピュータコードによって表現され得る。コンピュータコードは、光ディスクまたは磁気ディスク、スティック、テープ等を含む任意の適切なコンピュータ読み取り可能なメディア上に記憶され得、Ｃ、Ｃ＋＋、ｖｉｓｕａｌ  ｂａｓｉｃ等の任意の適切なコンピュータプログラミング言語で記述され得る。
【０１１４】
上記の学習アルゴリズムは、乳癌の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのための分類アルゴリズムを開発するために使用され得る。次に、分類アルゴリズムは、単独でまたは組み合わされて使用されるバイオマーカーについての診断値（例えば、カットオフ点）を提供することにより、診断試験において使用され得る。
【０１１５】
追加の診断試験
乳癌の存在を示す低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルは、対象における乳癌の独立した診断上の指標として使用され得る。所望により、本発明の方法は、乳癌の診断を容易にする少なくとも１つの追加の試験の実行を含み得る。例えば、乳癌の診断を容易にするために、１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを判定することに加えて他の試験が、実行され得る。乳癌の診断を容易にするために臨床診療において使用される任意の他の試験または試験の組み合わせが、本明細書に記載の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーと共に使用され得る。
【０１１６】
処置方法
本明細書に記載の方法によって対象が乳癌と診断される幾つかの実施形態では、本発明は、乳癌を有することが確認されたかかる対象を処置する方法を更に提供する。したがって、一実施形態において、本発明は、対象における乳癌を処置する方法であって、対象に由来する試料中の少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを判定することであって、適切な対照と比較して判定される、少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルの正常な対象におけるそれに対する差が対象における乳癌の存在を示す、判定すること、および対象に治療上有効量の乳癌治療薬を投与することを含む方法に関する。別の実施形態では、本発明は、乳癌を有する対象を処置する方法であって、適切な対照と比較して判定されるように、対象に由来する試料中の少なくとも１つの低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルが、正常な対象におけるそれに対して異なる（例えば、増加している）乳癌を有する対象を特定すること、および対象に治療上有効量の乳癌治療薬を投与することを含む方法に関する。
【０１１７】
用語「乳癌治療薬」には、例えば、乳癌の処置のためのＵ．Ｓ．Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎにより認可された物質が含まれる。乳癌を処置するための認可された薬物としては、アベマシクリブ、アビトレキサート（メトトレキサート）、アブラキサン（パクリタキセル・アルブミン安定化小粒子製剤）、アドトラスツズマブエムタンシン、アフィニトール（エベロリムス）、アナストロゾール、アレディア（パミドロン酸二ナトリウム）、アリミデックス（アナストロゾール）、アロマシン（エキセメスタン）、カペシタビン、クラフェン（シクロホスファミド）、シクロホスファミド、シトキサン（シクロホスファミド）、ドセタキセル、ドキソルビシン塩酸塩、エレンス（エピルビシン塩酸塩）、エピルビシン塩酸塩、エリブリンメシル酸塩、エベロリムス、エキセメスタン、５−ＦＵ（フルオロウラシル注射薬）、フェアストン（トレミフェン）、フェソロデックス（フルベストラント）、フェマーラ（レトロゾール）、フルオロウラシル注射薬、ＦＯＬＥＸ（メトトレキサート）、Ｆｏｌｅｘ  ＰＦＳ（メトトレキサート）、フルベストラント、ゲムシタビン塩酸塩、ゲムザール（ゲムシタビン塩酸塩）、ゴセレリン酢酸塩、ハラヴェン（エリブリンメシル酸塩）、ハーセプチン（トラスツズマブ）、イブランス（パルボシクリブ）、イクサベピロン、イグゼンプラ（イクサベピロン）、カドサイラ（アドトラスツズマブエムタンシン）、キスカリ（リボシクリブ）、ラパチニブ、ジトシラート、レトロゾール、酢酸メゲストロール、メトトレキサート、メトトレキサート  ＬＰＦ（メトトレキサート）、Ｍｅｘａｔｅ（メトトレキサート）、Ｍｅｘａｔｅ−ＡＱ（メトトレキサート）、Ｎｅｏｓａｒ（シクロホスファミド）、ネラチニブマレイン酸塩、Ｎｅｒｌｙｎｘ（ネラチニブマレイン酸塩）、ノルバデックス（タモキシフェンクエン酸塩）、パクリタキセル、パクリタキセル・アルブミン安定化小粒子製剤、パルボシクリブ、パミドロン酸二ナトリウム、Ｐｅｒｊｅｔａ（ペルツズマブ）、ペルツズマブ、リボシクリブ、タモキシフェンクエン酸塩、タキソール（パクリタキセル）、タキソテール（ドセタキセル）、チオテパ、トレミフェン、トラスツズマブ、タイケルブ（ラパチニブトシル酸塩二水和物）、Ｖｅｌｂａｎ（ビンブラスチン硫酸塩）、Ｖｅｌｓａｒ（ビンブラスチン硫酸塩）、Ｖｅｒｚｅｎｉｏ（アベマシクリブ）、ビンブラスチン硫酸塩、ゼローダ（カペシタビン）、ゾラデックス（ゴセレリン酢酸塩）が挙げられるが、これらに限定されない。
【０１１８】
乳癌治療薬は、医薬組成物を使用して対象に投与され得る。適切な医薬組成物は、薬学的に有効な量の乳癌治療薬（またはその薬学的に許容される塩もしくはエステル）を含み、所望により薬学的に許容される担体を含む）。ある種の実施形態では、これらの組成物は、所望により１つ以上の追加の治療薬を更に含む。
【０１１９】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容される塩」は、適切な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー応答などを伴わずにヒトおよび下等動物の組織と接触して使用されるのに適切であり、妥当な利益／リスク比に対応する塩を指す。アミン、カルボン酸、および他のタイプの化合物の薬学的に許容される塩は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｓ．Ｍ．Ｂｅｒｇｅらは、薬学的に許容される塩を、参照により本明細書に組み入れられる、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，６６：１−１９（１９７７）において詳細に記載している。塩は、本発明の化合物の最後の単離および精製中にその場で、または別途、遊離塩基または遊離酸官能基を、適切な試薬と反応させることによって調製され得る。例えば、遊離塩基官能基は、適切な酸と反応し得る。更に、本発明の化合物が酸性部分を保有する場合、その適切な薬学的に許容される塩としては、アルカリ金属塩（例えばナトリウムまたはカリウム塩）およびアルカリ土類金属塩（例えばカルシウムまたはマグネシウム塩）などの金属塩が挙げられる。
【０１２０】
本明細書で使用する場合、用語「薬学的に許容されるエステル」は、インビボで加水分解するエステルを指し、人体内で容易に分解し、親化合物またはその塩を残すものが挙げられる。適切なエステル基としては、例えば、薬学的に許容される脂肪族カルボン酸から誘導されるもの、特にアルキルまたはアルケニル部分がそれぞれ有利には６個以下の炭素原子を有するアルカン酸、アルケン酸、シクロアルカン酸、およびアルカンジオン酸（ａｌｋａｎｅｄｉｏｉｃ  ａｃｉｄｓ）が挙げられる。
【０１２１】
前述したように、医薬組成物は、薬学的に許容される担体を付加的に含み得る。担体という用語には、所望の特定の剤形を調製するのに適したあらゆる溶媒、希釈剤、または他の液状ビヒクル、分散または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、防腐剤、固体の結合剤、滑沢剤などが含まれる。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓｉｘｔｅｅｎｔｈ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９８０）は、医薬組成物を製剤化する際に使用される様々な担体およびその調製のための既知の技術を開示している。薬学的に許容される担体として機能し得る材料の幾つかの例としては、ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖；トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体；トラガント末；麦芽；ゼラチン；タルク；ココアバターおよび座薬ワックスなどの賦形剤；落花生油、綿実油などの油；サフラワー油、ゴマ油；オリーブ油；トウモロコシ油およびダイズ油；グリコール類；プロピレングリコールなど；オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；寒天；水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；アルギン酸；発熱物質を含まない水；等張食塩水；リンガー液；エチルアルコール、ならびにリン酸緩衝液が挙げられるが、これらに限定されず、加えて、ラウリル硫酸ナトリウムおよびステアリン酸マグネシウムなどの他の非毒性の相溶性のある滑沢剤、ならびに着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味料、香味料および芳香剤、防腐剤および抗酸化物質も、配合者の判断により組成物中に存在し得る。
【０１２２】
本発明に使用するための組成物は、任意の濃度の所望の乳癌治療薬を有するように製剤化され得る。好ましい実施形態では、組成物は、治療上有効量の乳癌治療薬を含むように製剤化される。
【０１２３】
本開示は、一般に、良性、前悪性、または悪性の過剰増殖性細胞を有する対象を診断する方法であって、試料中の少なくとも１つの非コードＲＮＡまたはその機能的断片の存在、非存在、および／または量を検出するステップを含む方法に関する。幾つかの実施形態では、検出するステップは、対象（例えばヒト対象）由来の試料を１つまたは複数のプローブに曝露することであって、各プローブが試料中の１つまたは複数の非コードＲＮＡ分子と結合することができる、曝露することを含む。幾つかの実施形態では、プローブは、表１、２、および／または３の任意の核酸配列に対する少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性または配列同一性を含む核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらのハイブリッド）である。幾つかの実施形態では、プローブは、配列番号：３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８、または配列番号１９１に対する少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性または配列同一性を含む核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらのハイブリッド）である。幾つかの実施形態では、プローブは、各チミンがウラシルに置換されている、配列番号３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８、または配列番号１９１に対する少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性または配列同一性を含むＲＮＡ配列である核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたはこれらのハイブリッド）である。幾つかの実施形態では、複数のプローブは、配列番号：３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８、または配列番号１９１に対する少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列相同性または配列同一性を含む核酸配列に相補的なＲＮＡである核酸配列のうちの１つまたは組み合わせである。幾つかの実施形態では、複数のプローブは、以下から選択される核酸配列のうちの１つまたは組み合わせである：配列番号３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８、または配列番号１９１。幾つかの実施形態では、複数のプローブは、以下から選択される核酸配列に相補的な核酸配列のうちの１つまたは組み合わせである：配列番号３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８、または配列番号１９１。
【０１２４】
本開示の方法の実施形態のいずれかでは、対象は、乳癌を有すると診断されたかまたは疑われるヒトであり得る。検出するステップが対象から試料を得るステップの後にある、本開示の方法の実施形態のいずれかでは。
【０１２５】
幾つかの実施形態では、プローブまたは複数のプローブは、配列番号：３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８、または配列番号１９１に対する少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列相同性または配列同一性を含む核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらのハイブリッド）に結合するＣＤＲを含む１つまたは複数の抗体または抗体断片である。幾つかの実施形態では、プローブまたは複数個のプローブは、配列の各々が、配列番号３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８、または配列番号１９１の各々におけるチミンがウラシルに置換されように修飾されている、配列番号３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８、または配列番号１９１に対する少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％の配列相同性または配列同一性を含む核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはこれらのハイブリッド）に結合するＣＤＲを含む１つまたは複数の抗体または抗体断片である。実施形態のうちの幾つかでは、本発明の方法は、試料を１つまたは複数のプローブに曝露させる前に試料からＲＮＡを単離することを更に含む。幾つかの実施形態では、本発明の方法は、試料中の非コードＲＮＡの半定量もしくは定量ＰＣＲまたは配列解析を実行することによって試料中の低分子ＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ）などの非コードＲＮＡの量を検出または定量化することを含む。プローブは、一本鎖のヌクレオチド配列が対象由来の非コードＲＮＡを含む試料に曝露されるように、ＥＬＩＳＡプレート、プラスチック、スライドガラス、マイクロアレイ、シリカチップ、または他の表面などの固体支持体に固定化され得る。幾つかの実施形態では、プローブは、約５〜約１００ヌクレオチドの長さを含み得、表１、２、および／もしくは３の配列のいずれかまたは表１、２、および／もしくは３に記載される配列のうちのＲＮＡもしくはＤＮＡでの任意の相補配列を含む。本開示の方法の実施形態のいずれかでは、試料中の少なくとも１つの非コードＲＮＡまたは非コードＲＮＡのうちの１つに対して少なくとも７０％相同なその相同配列の存在、非存在、および／または量を検出するステップは、化学発光プローブ、蛍光プローブ、および／または蛍光顕微鏡法を使用して、検出可能なプローブのシグナルを非コードＲＮＡの存在と関連付けることによって存在または量を計算することを含む。
【０１２６】
本開示は、一般に、試料中のＴ３ｐの存在を検出すること、および試料中のＴ３ｐの存在を乳癌の存在に関連付けることに関する。また本開示は、配列番号３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８、もしくは配列番号１９１または配列識別子のいずれかにおけるチミンのうちの１つ以上がウラシルに置換されているこれらのＲＮＡ分子に対する少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列相同性または配列同一性を含む、からなる、または本質的にからなる核酸分子（ＤＮＡ、ＲＮＡまたは、これらのハイブリッド）の存在を検出することにも関する。幾つかの実施形態では、固体支持体上のプローブまたは複数のプローブは、約５〜約１０００ヌクレオチド長である配列番号３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８または配列番号１９１に対する配列相補性を含む。幾つかの実施形態では、固体支持体上のプローブまたは複数のプローブは、約５〜約５００ヌクレオチド長である配列番号３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８または配列番号１９１に対する配列相補性を含む。幾つかの実施形態では、固体支持体上のプローブまたは複数のプローブは、約５〜約１００ヌクレオチド長である配列番号３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８または配列番号１９１に対する配列相補性を含む。幾つかの実施形態では、固体支持体上のプローブまたは複数のプローブは、約５〜約５０ヌクレオチド長である配列番号３、配列番号１９、配列番号３２、配列番号４０、配列番号４１、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号１２６、配列番号１４８または配列番号１９１に対する配列相補性を含む。
【０１２７】
幾つかの実施形態では、本明細書において開示される方法のいずれかは、表１、２、および／もしくは３またはこれらの任意の組み合わせにおいて開示されるものなどの非コードＲＮＡの存在または量を、対象が乳癌などのがんを有する可能性に関連付けるステップを更に含む。
【０１２８】
検出低分子ＲＮＡバイオマーカーのためのキット
別の態様では、本発明は、対象における乳癌の状態を診断するためのキットであって、表１、表２、または表３およびこれらの組み合わせ（ここで、配列は所望により、開示されたチミンのうちの１つ、２つ以上または全ての代わりにウラシルを含む）の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのうちの１つ以上のレベルを判定するのに有用であるキットを提供する。一実施形態では、１つ以上の低分子非コードＲＮＡは、表１に列挙されるバイオマーカーから選択される。一実施形態では、２つ以上の低分子非コードＲＮＡは、表２に列挙されるバイオマーカーから選択される。一実施形態では、３つ以上の低分子非コードＲＮＡは、表３に列挙されるバイオマーカーから選択される。キットは、対象に由来する試料中の、乳癌の診断に役立つ低分子非コードＲＮＡまたは一群の低分子非コードＲＮＡの存在を選択的に検出するのに適した材料および試薬を含み得る。例えば、一実施形態では、キットは、低分子非コードＲＮＡに特異的にハイブリダイズする試薬を含み得る。かかる試薬は、低分子非コードＲＮＡを検出するのに好適な形態の核酸分子、例えば、プローブまたはプライマーであり得る。キットは、１つ以上の低分子非コードＲＮＡを検出するためのアッセイを実行するのに有用な試薬、例えば、ｑＰＣＲ反応で１つ以上の低分子非コードＲＮＡを検出するために使用され得る試薬を含み得る。同様にキットは、１つ以上の低分子非コードＲＮＡを検出するのに有用なマイクロアレイを含むことができる。
【０１２９】
更なる実施形態では、キットは、ラベルまたは添付文書の形態の適切な操作パラメータについての使用説明書を含有し得る。例えば、使用説明書は、試料を収集する方法、試料中の１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを判定する方法、または試料中の１つ以上の低分子非コードＲＮＡバイオマーカーのレベルを対象の乳癌の状態と関連付ける方法に関する情報または指示を含み得る。
【０１３０】
別の実施形態では、キットは、試験試料中のバイオマーカーを検出するためのアッセイの参照標準として、適切な対照として、または較正のために使用される低分子非コードＲＮＡバイオマーカーの試料を有する１つ以上の容器を含有し得る。
【０１３１】
他の実施形態は、以下の非限定的な実施例に記載されている。特許、公開された出願、技術論文、および学術論文を含む様々な刊行物が、本明細書全体にわたって引用される。これらの引用された刊行物の各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
【実施例】
【０１３２】
実施例１．方法
実施例２〜６は、以下を含むがそれらに限定されない方法によって実施された。
【０１３３】
組織培養
ＭＤＡ−ＭＢ−２３１およびＭＤＡ−ＬＭ２細胞を、１０％ウシ胎児血清、Ｌ−グルタミン、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン−ストレプトマイシン、およびアンホテリシンを補足したダルベッコ培地で培養した。細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  ａｎｄ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）から入手し、プロトコールに従って成長させた。
【０１３４】
全ての細胞を、３７℃、５％ＣＯ２の加湿インキュベーター内で培養した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、ＭＤＡ−ＬＭ２、ＣＮ３４−ｐａｒ、ＣＮ３４−Ｌｍ１ａ、ＭＣＦ７、およびＭＤＡ−ＭＢ−４５３細胞株を、４．５ｇ／Ｌのグルコース、１０％のＦＢＳ、４ｍＭのＬ−グルタミン、１ｍＭのピルビン酸ナトリウム、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびアンホテリシン（１μｇ／ｍＬ）を補足したＤＭＥＭベースの培地で増殖させた。ＨＣＣ１３９５、ＺＲ−７５−１、およびＨＣＣ３８細胞株を、１０％のＦＢＳ、２ｍＭのＬ−グルタミン、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびアンホテリシン（１μｇ／ｍＬ）を補足したＲＰＭＩ  １６４０ベースの培地で増殖させた。ＳＫ−ＢＲ−３細胞株を、１０％のＦＢＳ、ペニシリン（１００単位／ｍＬ）、ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍＬ）、およびアンホテリシン（１μｇ／ｍＬ）を補足したマッコイ５ａ改変培地で増殖させた。ＨＭＥＣを、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手し、既製のＨｕＭＥＣ培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で増殖させた。
【０１３５】
低分子ＲＮＡおよびエキソソームＲＮＡ抽出および配列決定細胞外小胞からのＲＮＡの単離のための馴化培地および完全な馴化培地の調製を、７×１０５で細胞を播種することによって実施した。２４時間後に、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０ｍＬのエキソソームを除去した培地を添加した。４８時間後に、培地を、２００×ｇで１５分間遠心し、上澄みを取ることによって収集した。ＦＢＳをエキソソームを除去したＦＢＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）で代用することによって、エキソソームを除去した培地を調製した。エキソソームを除去したＨＭＥＣ培地を、４℃にて１００，０００×ｇで１６時間、ウシ脳下垂体抽出物の培地成分を遠心分離することによって調製した。
【０１３６】
細胞外小胞ＲＮＡを、Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉａ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＲＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して、上記で概説されるように調製された５ｍＬの馴化培地から単離した。馴化培地からのＲＮＡを、ｍｉＲＮｅａｓｙ  ｓｅｒｕｍ／ｐｌａｓｍａ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して４００ｕｌの完全な馴化培地から単離した。細胞内の全低分子ＲＮＡ試料を、製造者のプロトコールに従ってＮｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋの低分子ＲＮＡ精製キットを使用して抽出した。その後にＲＮＡ試料を、製造者のプロトコール（Ｂｉｏｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用してＮＥＸＴｆｌｅｘ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｋｉｔ  ｖ３を用いたハイスループットな配列決定用に調製した。次いで、得られたライブラリーを、製造者によって推奨される通りに配列決定し、処理した。要約すると、ｃｕｔａｄａｐｔ（ｖ１．４）を使用してアダプター配列を除去し、各リードの最初および最後の縮重配列をトリミングした。次いで、本発明者らはｂｏｗｔｉｅ２（ｖ２．３．３）を使用して、得られた配列をヒトゲノム（ｂｕｉｌｄ  ｈｇ３８）とアラインメントした。次いで、得られたＢＡＭファイルを、ソートし、更なる解析のためにＢＥＤに変換した。細胞外小胞ＲＮＡを、製造者の使用説明書に従ってＰｌａｓｍａ／ｓｅｒｕｍ  Ｅｘｏｓｏｍｅ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ＲＮＡ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｎｏｒｇｅｎ  Ｂｉｏｔｅｋ）を使用して血清試料から単離した。
【０１３７】
ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡからの低分子ＲＮＡ配列決定データおよびＴＣＧＡ−ＢＲＣＡプロジェクトによるｏｎｃＲＮＡリードの同定を、Ｇｅｎｏｍｉｃ  Ｄａｔａ  Ｃｏｍｍｏｎｓ（ＧＤＣ）からＢＡＭフォーマット（ｈｇ３８）でダウンロードし、試料をＧＤＣ  ＡＰＩを使用して注釈付けした。ＢＥＤフォーマット変換の際に、Ｐｉｒａｎｈａパッケージ４０を使用して、発現された低分子ＲＮＡの遺伝子座を同定した。得られた遺伝子座を、ｍｅｒｇｅＢｅｄを使用した全ての試料間でマージして胸部組織および乳癌において発現された低分子ＲＮＡ遺伝子座の網羅的なリストを作成した。
【０１３８】
乳癌細胞株およびＨＭＥＣから取得された低分子ＲＮＡ配列を列挙することによって、本発明者らは、各低分子ＲＮＡ遺伝子座についてカウント表を生成した。次いで、本発明者らは、ライブラリーサイズで得られたテーブルを正規化し、３回のＨＭＥＣ反復試験全体でリードが観察されなかった遺伝子座のみを保持した。本発明者らは、以下の２つの独立した統計的検定を使用して、全てのがん細胞株または個別に各サブタイプ（ＴＮＢＣ、ＨＥＲ２＋、および管腔）を比較した：（ｉ）本発明者らはＤＥＳｅｑ  Ｒパッケージを使用して、調整済みｐ値を計算し、（ｉｉ）本発明者らはフィッシャーの正確検定を使用して、各低分子ＲＮＡの存在および非存在を比較した。本発明者らは、前者の検定において調整済みＰ値＜０．０５を有するかまたは後者の検定において全ての比較にわたってＰ＜０．１を有する遺伝子座を選択した。
【０１３９】
４３７個の遺伝子座（図１Ａに列挙する）が、これらの基準を満たした。可視化のために、本発明者らは、各列を最大値に正規化し、ｋ−平均法クラスタリング（ｋ＝３）を実行した。ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータベースについて、本発明者らは、サブタイプが注釈付された全ての試料（ＰＡＭ５０分類に基づく）および全ての低分子ＲＮＡ遺伝子座の間で同様のカウント表を生成し、得られたテーブルを正規化して、百万リード当たりのカウント数（ｃｐｍ）の表を生成した。『オーファン』低分子ＲＮＡ、すなわち正常細胞においてほとんど存在しない低分子ＲＮＡを特定するために、本発明者らは、最初に、正常な試料において０．５ｃｐｍ未満の９０パーセンタイルの発現を有する遺伝子座だけを保持した。上記の４３７個の遺伝子座のうち、２６８個が、このステップを通過した。次いで、本発明者らはフィッシャーの正確検定を実行して、腫瘍試料および正常な生検の間で全ての低分子ＲＮＡの存在を比較した。本発明者らは、正常な試料と乳癌サブタイプの各々との間で同様の比較を実行した。次いで、本発明者らは、調整済みｐ値＜０．０５を有する、これらの試験のうちの少なくとも１つで有意であった遺伝子座を保持した。２０１個の低分子ＲＮＡが、この最終ステップを通過し、したがって、オーファン非コードＲＮＡとして分類された。本発明者らは、これらの低分子ＲＮＡのいずれも以前にｍｉＲＮＡ、ｓｎｏＲＮＡ、またはｔＲＮＡとして注釈付けされていないことを確認した。
【０１４０】
ＰＤＸモデルおよび正常な上皮試料の低分子ＲＮＡ配列決定
ＰＤＸ腫瘍およびヒト非腫瘍試料を生成するために使用された全てのヒト試料は、以前に記載されていた４１。低分子ＲＮＡプロファイリングおよびデータ前処理を、Ｑ２Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓにより実施した。これらの試料中のｏｎｃＲＮＡの存在量を、上記の通りに判定した。低転移性細胞と高転移性細胞との間のｏｎｃＲＮＡ発現の比較
本発明者らは、高転移性細胞で有意に上方調節されていたｏｎｃＲＮＡを同定するために、ＤＥＳｅｑ２  Ｒパッケージを使用して、図１の親細胞株（ＭＤＡ２３１およびＣＮ３４）とそれらのインビボで選択された高転移性の派生株（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１バックグラウンド）との間でｏｎｃＲＮＡの発現を比較した。本発明者らはこの解析でＴ３ｐを同定した。また本発明者らは、これらの細胞株で以前生成された低分子ＲＮＡデータセットにおいてもＴ３ｐを確認した７。加えて、本発明者らは、定量ＲＴ−ＰＣＲアッセイも実行した。これについて、本発明者らは、ＭＤＡ−２３１親細胞およびその高転移性ＭＤＡ−ＬＭ２から低分子ＲＮＡを抽出し（ｍｉｃｒｏＲＮＡ  Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｎｏｒｇｅｎ）、以下のプライマーを使用してステムループｑＰＣＲを実行した：Ｒ：５’−ＣＣＡＧＴＧＣＡＧＧＧＴＣＣＧＡＧＧＴＡおよびＦ：５’−ＣＣＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＡＣ。
ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセットにおけるＴ３ｐの発現および臨床的関連性
本発明者らは、ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセットに付随するメタデータを使用して腫瘍試料におけるＴ３ｐの発現に基づいた生存率解析を実行した。本発明者らは、Ｔ３ｐレベルに基づいて患者を層化し、全ての三分位値を使用してカプラン・マイアー曲線を生成し、ログランク（マンテル・コックス）検定を実行して関連Ｐ値を計算した。本発明者らは、臨床データを同様に使用して、初期および末期腫瘍の間でのＴ３ｐ発現を比較した（片側マン・ホイットニーＵ検定）。
Ｔ３ｐ調節および遺伝子発現プロファイリング本発明者らは、以下の配列に対してｍｉＲＣＵＲＹ  ＬＮＡ阻害剤（Ｅｘｉｑｏｎ）を使用した：Ｔ３ｐ：ＣＡＧＧＡＣＴＣＧＧＣＴＣＡＣＡＣＡＴＧＣ；ＴＥＲＣ：ＴＴＧＴＣＴＡＡＣＣＣＴＡＡＣＴＧＡＧＡＡＧＧ；スクランブル配列：ＡＧＡＣＧＡＣＡＧＣＴＧＧＡＴＣＡＣＡＣＧ。同様に、本発明者らは、Ｔ３ｐ模倣物（ＩＤＴ）を使用した：ｒＣ＊ｒＡｒＧｒＧｒＡｒＣｒＵｒＣｒＧ  ｒＧｒＣｒＵｒＣｒＡｒＣｒＡｒＣｒＡｒＵｒＧ＊ｒＣ（Ｔ３ｐ模倣物）およびｒＡ＊ｒＧｒＡ  ｒＣｒＧｒＡ  ｒＣｒＡｒＧ  ｒＣｒＵｒＧ  ｒＧｒＡｒＵ  ｒＣｒＡｒＣ  ｒＡｒＣ＊ｒＧ（対照）。次いで、本発明者らは、ＬＮＡを高転移性ＭＤＡ−ＬＭ２細胞に、および模倣物をＭＤＡ−ＭＢ−２３１親細胞に形質移入し、前述したように遺伝子発現プロファイリングを実行した７。差次的遺伝子発現解析も、前述したように実行した７。
Ｔｏｕｇｈ  Ｄｅｃｏｙならびにインビボでの肺でのコロニー形成および腫瘍成長アッセイ
ＭＤＡ−ＬＭ２細胞を、ａｎｔｉ−Ｔ３ｐまたはスクランブルＬＮＡ（上記と同一）で形質移入し、４８時間後に、細胞を免疫不全ＮＯＤ  ＳＣＩＤγ（ＮＳＧ）マウスの尾静脈を介して血管系に注入した（マウス当たり２．５×１０４個；コホート当たりのｎ＝５）。インビボでのイメージングおよび曲線の比較を、前述したように実行した１９。次いで、コホート当たり少なくとも３匹のマウス（中間のシグナル）から肺を摘出し、固定し、薄切し、染色し（Ｈ＆Ｅ）、前述したように定量化した１９。
Ｔ３ｐの安定した阻害を引き起こすために、本発明者らは、レンチウイルスバックボーンのＲＮＡ  ＰｏｌＩＩＩプロモーター（ｐＬＫＯ．１）下にこの低分子ＲＮＡに対するＴｕＤを設計した。次いで、本発明者らは、ＭＤＡ−ＬＭ２細胞を安定的に形質導入し、肺でのコロニー形成アッセイを実行した（上記と同様；マウス当たり５×１０４個の細胞）。ＨＣＣ１３９５細胞を同様に形質導入し、マウス当たり２×１０５個の細胞で注入した。同所性の腫瘍成長アッセイを、５０ｕｌのマトリゲルを混合した５０ｕｌのＰＢＳ中に再懸濁された２．５×１０５個の細胞を同日齢の６〜８週齢の雌性ＮＯＤ／ＳＣＩＤγマウスの乳腺に２８ゲージ針を使用して注入することによって実行した。キャリパスを使用して腫瘍径（Ｌ）および幅（Ｗ）を２日毎に測定し、式πＬＷ２／６を使用して計算することによって、腫瘍体積を判定した。一旦腫瘍が８００ｍｍ３の体積に到達したら、実験はエンドポイントに到達した。インビトロでの細胞増殖：がん細胞の増殖アッセイを、０日目に５×１０４個の細胞を播種し、次いで、３日目および５日目に三重反復でそれらを計数することによって実行される。線形モデルを使用して推定される、細胞数の対数と日数との間の最良近似直線の傾きを、記録する増殖速度（日−１）とする。細胞周期解析のために、細胞を、６ｃｍプレートで８０％の培養密度まで成長させ、収集し、７０％のエタノールで固定した。次いで、細胞をペレット化し、５０ｕｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）および１ｍｇ／ｍＬのＲＮＡ分解酵素Ａ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）中に再懸濁し、３７℃にて１時間培養した。次いで、ＦＡＣＳ解析のためにＢＤ  Ａｒｉａ２フローサイトメーターを使用し、ｐｏｓｔ−ＦＡＣＳ解析および細胞周期の定量を、『ｆｃｓｐａｒｓｅｒ』のｐｙｔｈｏｎパッケージを使用して実行した。ＦＣＳｐａｒｓｅｒ：ｈｔｔｐｓ：／／ｇｉｔｈｕｂ．ｃｏｍ／ｅｙｕｒｔｓｅｖ／ｆｃｓｐａｒｓｅｒ／ｔｒｅｅ／ｍａｓｔｅｒ／ｆｃｓｐａｒｓｅｒ
【０１４１】
Ｔ３ｐ生合成因子を発見するための共発現解析Ｔ３ｐ生合成の調節因子を同定するために、本発明者らは、既知のヌクレアーゼ活性（ＧＯ：０００４５４０およびＧＯ：０００４５２５）を有する遺伝子をリストにし、更にこれらのヌクレアーゼと相互作用することが公知であるＲＮＡ結合タンパク質を追加した４２。次いで、本発明者らは、ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセット内のＴ３ｐレベルとこのリスト上の遺伝子のレベルとの間の共発現解析を実行した。本発明者らは、高転移性ＭＤＡ−ＬＭ２細胞において上方調節されており、同様にＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセットにおける正常な生検と比較して乳癌試料において高い遺伝子と強い関連性を有する遺伝子を重ね合わせた。これらの基準に基づいて、本発明者らは７個の候補を同定した。これらのうちの２つは既知の二本鎖結合活性を有した。ＴＥＲＣのＣＲ７ドメインが構築される（すなわち二本鎖領域を形成する）ため、本発明者らは、これらのタンパク質（すなわち、ＤＲＯＳＨＡおよびＴＡＲＢＰ２）が追跡調査するのに最も良い候補であると結論した。本発明者らは、ｓｉＲＮＡを使用してＤＲＯＳＨＡおよびＴＡＲＢＰ２、ならびに更にこれらのタンパク質とそれぞれ相互作用することが公知であるＤＧＣＲ８およびＤＩＣＥＲ１をノックダウンした（ＩＤＴ）。本発明者らは、以下の標的配列を使用した：ＴＡＲＢＰ２：５’−ＡＣＣＴＧＧＧＡＴＴＣＴＣＴＡＣＧＡＡＡＴＴＣＡＧＴ、ＤＲＯＳＨＡ：５’−ＣＣＴＴＧＡＴＴＧＡＧＧＴＡＴＡＧＴＴＣＴＴＧＴＣＴ、ＤＩＣＥＲ１：５’−ＴＧＧＴＧＣＴＴＡＧＴＡＡＡＣＴＣＴＴＧＧＴＴＣＣＡ、およびＤＧＣＲ８：５’−ＣＴＧＣＡＧＧＡＧＴＡＡＧＧＡＣＡＧＧＡＡＧＧＴＧＣ。ｓｉＲＮＡ遺伝子導入およびノックダウンの確認後に、本発明者らは、上記の通り低分子ＲＮＡの配列決定を実行した。
【０１４２】
ｏｎｃＲＮＡベースの分類器の訓練および試験２０１個のｏｎｃＲＮＡのうち、１００個は、少なくとも１つの血清試料において検出された。本発明者らは、これら１００個のｏｎｃＲＮＡを使用して、サブタイプが注釈付けされたＴＣＧＡ−ＢＲＣＡ試料に関してＧＢＣを訓練した（ｓｋｌｅａｒｎモジュール）。次いで、本発明者らは、３５人の健常な患者および４０人のがん患者由来の血清試料の大要を１００回ブートストラップして、分類器の性能パラメータ、すなわち、平均ＡＵＲＯＣ、精度、および正確度スコアを計算した。本発明者らは、ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡとは対照的に血清データに関して訓練および検定を実行することによってｏｎｃＲＮＡの独立した評価も実行した（５分割交差検証）。本発明者らは、以下のｍｉＲＮＡを使用して、上記と同様の解析を実行した：ｍｉＲ−１０ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１０ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−３ｐ、ｍｉＲ−１４８ｂ−５ｐ、ｍｉＲ−１５５−３ｐ、ｍｉＲ−１５５−５ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−３ｐ、ｍｉＲ−３７６ａ−３ｐ、ｍｉＲ−６５２−３ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１３９−３ｐ、ｍｉＲ−１４３−３ｐ、ｍｉＲ−１４５−３ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−３ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−３ｐ、ｍｉＲ−４２５−３ｐ、ｍｉＲ−３４ａ−５ｐ、ｍｉＲ−３７６ａ−５ｐ、ｍｉＲ−６５２−５ｐ、ｍｉＲ−１３３ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１３９−５ｐ、ｍｉＲ−１４３−５ｐ、ｍｉＲ−１４５−５ｐ、ｍｉＲ−１５ａ−５ｐ、ｍｉＲ−１８ａ−５ｐ、ｍｉＲ−４２５−５ｐ、ｍｉＲ−１２７−３ｐ、ｍｉＲ−１９４−５ｐ、ｍｉＲ−２０５−５ｐ、ｍｉＲ−２１−５ｐ、ｍｉＲ−３７５、ｍｉＲ−３７６ｃ−３ｐ、ｍｉＲ−３８２−５ｐ、ｍｉＲ−４０９−３ｐ、およびｍｉＲ−４１１−５ｐ。動物試験全ての動物試験を、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ  ＩＡＣＵＣガイドラインに従って完了した。統計的方法データの有意性を評価するために使用された統計的検定を、レジェンドに記載する。要約すると、特に明記しない限り、本発明者らは、ノンパラメトリック検定法を使用して対比較を実行した。マウス実験について、本発明者らは、共変量として時間を用いた２元配置ＡＮＯＶＡを使用した。増殖速度について、本発明者らは、線形モデルを使用した。解析は、ｐｙｔｈｏｎ、Ｒ、およびｐｒｉｓｍ環境で実行した。
【０１４３】
実施例２．乳癌におけるオーファン低分子非コードＲＮＡの系統的探索
乳癌細胞において発現されているが、正常な胸部組織では検出不可能である新規なクラスのがん特異的低分子ＲＮＡを探すために、複数の乳癌サブタイプおよびヒト乳房上皮細胞の低分子ＲＮＡ配列決定に基づいた偏りのない手法が使用された。乳癌細胞において特異的に発現されているおよそ２００個の今まで知られていなかった低分子ＲＮＡが、発見され、注釈付けされた。それらのがん特異的生合成を強調するために、これらのＲＮＡは、細菌遺伝学からの用語を借りて、『オーファン』非コードＲＮＡ（ｏｎｃＲＮＡ）と名付けられている。
【０１４４】
最初に、がん細胞にのみ存在し、これらの細胞における潜在的な調節因子のアクセス可能なプールを提供し得る低分子ＲＮＡのセットが存在するかどうかが決定された。かかるｏｎｃＲＮＡは、がん細胞株においてのみ検出可能であり、正常細胞では検出可能ではないであろうと推測された。この仮説を検証するために、低分子ＲＮＡの配列決定が、９種の乳癌細胞株（全て主要な乳癌サブタイプを表わす）および参照としてヒト乳房上皮細胞（ＨＭＥＣ）について実行された。全ての乳癌株で有意に検出されるが、ＨＭＥＣ試料では検知されない４３７個の注釈付けされていない低分子ＲＮＡが同定された（図１Ａ）。
【０１４５】
更に探索を狭め、これらの発見を強固にするために、同様の解析が、およそ２００個の正常組織試料および１２００個の乳癌生検全ての低分子ＲＮＡ発現プロフィールを提供したＴｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ（ＴＣＧＡ）から取得された低分子ＲＮＡ配列決定データに対して実行された。この解析において、２６８個のがん特異的低分子ＲＮＡが同定され、そのうちの２０１個は乳癌株の解析でも存在した。これらの２つの独立した解析間での高度に有意な重複は、下記の表１に示す高信頼度の２０１個のｏｎｃＲＮＡのセットを明らかにした（図１Ｂおよび図２Ａ）。
【表１−１】
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【表１−２】
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【表１−３】
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【表１−４】
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【表１−５】
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【表１−６】
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【表１−７】
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【表１−８】
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【表１−９】
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【表１−１０】
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【表１−１１】
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【表１−１２】
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【表１−１３】
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【０１４６】
第３の証拠として、１０の患者由来異種移植片（ＰＤＸ）モデルおよび４つの正常上皮試料（非対応）からの低分子ＲＮＡプロファイルのデータセットを解析した。図１Ｃに示すように、これらのｏｎｃＲＮＡは、正常な試料でほとんど存在しないが、ＰＤＸモデルでは頻繁に検出され得る。全ての試料で２０１個全てのｏｎｃＲＮＡの発現を合計することによって、正常なプロファイルおよびＰＤＸプロファイルを完璧に分類する単純な分類ルールを導き出すことができる（図２Ｂ）。総合すると、これらの発見は、その発現が乳癌と強く関連付けられるｏｎｃＲＮＡの大きなプールの存在を確立する。
【０１４７】
実施例３．乳癌進行に関連するｏｎｃＲＮＡであるＴ３ｐの同定
前述の細胞株に加えて、免疫不全マウスにおいてインビボで高い転移能力について選択された高転移性細胞株も、プロファイリングされた（１、１５）。これらの高転移性細胞のｏｎｃＲＮＡの発現をそれらの低転移性親株に対して比較すると、高転移性細胞においてレベルが優位に増加した１つのｏｎｃＲＮＡが認められた（図３Ａ）。この４０ヌクレオチドのｏｎｃＲＮＡは、テロメラーゼのＲＮＡ成分をコードするＴＥＲＣ遺伝子の３’末端から生成される（図３Ｂ）。したがって、この今まで知られていなかった低分子ＲＮＡは、ＴＥＲＣの３’側のＲＮＡであるためにＴ３ｐと名付けられた。同一の細胞株からの以前に公開されたデータセットの解析（７）は、高転移性細胞におけるＴ３ｐの高い発現を更に確証した（図３Ｃ）。転移細胞におけるＴ３ｐ発現のこの上方調節は、ｑＰＣＲによって確認された（図３Ｃ）。
【０１４８】
次に、Ｔ３ｐの発現増加が原疾患の病因に寄与したかどうかが調査された。ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡ（Ｔｈｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｔｌａｓ、乳癌）からの約４００個の対応する正常および乳癌腫瘍組織試料が解析され、Ｔ３ｐの発現が非常にがん特異的であることが認められた（図３Ｄ）。次いで、およそ１０００個の腫瘍試料を有するＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセット全体が、含まれた。図３Ｅに示すように、ｏｎｃＲＮＡとしてのその同一性と一致して、Ｔ３ｐは、大多数の正常な試料において検出されなかったが、腫瘍生検において相対的に高いレベルで検出された。より重要なことに、高転移性細胞株におけるＴ３ｐの高い発現と一致して、患者生存とＴ３ｐ発現との間の高度に有意な関連性が観察された（図３Ｆ）。更に、図３Ｇに示すように、Ｔ３ｐの発現は、ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセットにおける正常試料、ステージＩ、およびステージＩＩまたはＩＩＩの試料の間で増加する。腫瘍試料におけるＴ３ｐのいかなるレベルの検出も、乳癌およびより短い全生存率の両方に強く関連した（図４Ａおよび図４Ｂ）。臨床乳癌試料におけるＴ３ｐのより高い発現は、進行期乳癌とも強く相関した（図３Ｅ）。興味深いことに、ホルモン受容体およびＨＥＲ２の状態によるこれらのがん試料の層別化は、Ｔ３ｐレベルのエストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、またはＨＥＲ２受容体の発現との強い関連性を示さなかった（図４Ｃ）。この発見と一致して、正常な上皮組織と比較した乳癌のＰＤＸモデルにおけるＴ３ｐの発現増加も認められた（図４Ｄ）。総合すると、これらの結果は、高い予後値を有するがん特異的バイオマーカーとしてのｏｎｃＲＮＡ  Ｔ３ｐを確立する。
【０１４９】
実施例４．Ｔ３ｐは、乳癌細胞において遺伝子発現の幅広い調節因子として働く
複数の独立したデータセットからのＴ３ｐ発現と乳癌進行との間の強い関連性は、Ｔ３ｐが乳癌進行において直接的および機能的役割を果たす可能性を増加させる。その分子機能を解明するために、Ｔ３ｐ発現レベルの調節が結果の調節をもたらしたかどうかが調査された。このために、高転移性ＭＤＡ−ＬＭ２細胞をＴ３ｐを標的とするアンチセンスロックド核酸（ＬＮＡ）または対照のスクランブルＬＮＡを用いて形質移入することによって、Ｔ３ｐがサイレンシングされた。次いで、遺伝子発現プロファイリングを実行して、Ｔ３ｐサイレンシングのゲノム全体での調節的影響を測定した。驚くべきことに、何千もの遺伝子に影響を及ぼす、Ｔ３ｐサイレンシングによる細胞の遺伝子発現分布の高度に有意な変化が観察された。これは、低分子非コードＲＮＡなどの多数の確立されている転写後調節因子の影響と同等である（７、１６）。しかしながら、Ｔ３ｐを標的とするＬＮＡはＴＥＲＣの機能にも影響を与え、これにより、観察された遺伝子発現の変化の原因となり得るため、全長ＴＥＲＣ転写物が潜在的な交絡因子のままである。これらの２つの可能性を区別するために、２つの独立した手法が使用された。第１に、スクランブルＬＮＡに加えて、全長ＴＥＲＣ、Ｔ３ｐの５’側に対するアンチセンスＬＮＡも使用された。図５に示すように、ａｎｔｉ−Ｔ３ｐ  ＬＮＡによって引き起こされた遺伝子発現の変化は、スクランブルＬＮＡまたはａｎｔｉ−全長ＴＥＲＣ  ＬＮＡが参照として使用されるかどうかにかかわらず同程度である。この観察は、全長ＴＥＲＣの阻害がＴ３ｐ阻害によって引き起こされる同一の劇的な調節的変化を引き起こさないことを示す。更にこれらの発見を強固にするために、機能獲得型の実験も実行された。Ｔ３ｐ模倣物として合成オリゴヌクレオチドを使用して、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１親乳癌細胞を、対照としてスクランブルオリゴヌクレオチドを用いて形質移入し、次いで、遺伝子発現プロファイリングを実行した。ＬＮＡ実験と同様に、細胞の遺伝子発現分布における重要な変化が観察された。重要なことに、これらの遺伝子発現の変化は、機能欠損型のＬＮＡ実験において観察されたものと一般に反相関した（図６Ａ）。これは、ａｎｔｉ−Ｔ３ｐ  ＬＮＡおよびＴ３ｐ模倣物が反対の遺伝子発現の変化を誘発するはずであるという予想と一致している。総合すると、これらの観察は、乳癌細胞における遺伝子発現の幅広い調節因子としてのＴ３ｐを確立する。
【０１５０】
実施例５．Ｔ３ｐは、乳癌転移を促進する
Ｔ３ｐの遺伝子発現に対する幅広い調節効果、ならびにその転移との関連性および乳癌における悪い生存率との関連性を考慮して、次に、このｏｎｃＲＮＡがインビボで転移に影響を及ぼし得るかどうかを調べた。この仮説を検証するために、高転移性のＭＤＡ−ＬＭ２細胞を、ａｎｔｉ−Ｔ３ｐ  ＬＮＡを用いて形質移入し、これらの細胞を免疫不全マウスの静脈循環に注入することによって、転移性肺コロニー形成アッセイを実施した。次いで、インビボイメージングを使用して、これらの細胞の経時的な転移性肺コロニー形成に対するＴ３ｐ阻害の影響を測定した。図６Ｂに示すように、ａｎｔｉ−Ｔ３ｐ  ＬＮＡを形質移入された細胞は、肺コロニー形成能力が優位に減弱した。各コホートからの肺の肉眼での組織学的検査も、Ｔ３ｐ−ＬＮＡを遺伝子導入した細胞を注射されたマウスの肺における有意に少ない数の可視的な転移性結節を明らかにした。図６Ｃに示すように、可視的な転移性結節が、各コホートからの３匹のマウスにおいて計数された。各コホートからのＨ＆Ｅ染色された代表的肺切片も、中央値カウント数と共に示される。これらの観察は、今まで知られていなかったｎｃＲＮＡであるＴ３ｐの乳癌転移の駆動における機能的役割を強く支持する。
【０１５１】
実施例６．特定のｏｎｃＲＮＡは、エキソソームコンパートメントにソーティングされる
エキソソームコンパートメントは、低分子非コードＲＮＡおよびｔＲＮＡ断片など低分子ＲＮＡの生物学的に関連した目的地として以前に報告された（２８）。公開されているＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞からのエキソソーム低分子ＲＮＡ−ｓｅｑデータの解析（２９）は、この研究の多数の注釈付けされたｏｎｃＲＮＡが、がん細胞から分泌されるエキソソームにおいて検出され得ることを明らかにした（図７Ａ）。比較において、これらのうちの少数のｏｎｃＲＮＡのみが、ＨＵＶＥＣ細胞からのエキソソーム試料において検出された（３０）。例えば、Ｔ３ｐは、ＨＵＶＥＣ細胞でなくＭＤＡ−ＭＢ−２３１細胞から収集されたエキソソームに存在した（図８Ａ）。これらの観察は、エキソソーム低分子ＲＮＡをプロファイリングすることを目的とした次の一連の実験を促した。この目的のために、低分子ＲＮＡが、８種の乳癌細胞株およびＨＭＥＣから分泌されるエキソソームから単離された。この材料の低分子ＲＮＡ配列決定は、２０１個の注釈付けされたｏｎｃＲＮＡのうち、約２／３がこれらの乳癌株のうちの１つ以上からのエキソソームＲＮＡにおいて検出されたが、ＨＭＥＣにおいては検出されなかったことを明らかにした（図７Ｂ）。興味深いことに、Ｔ３ｐは８種の細胞株中の５種において検出された。
【０１５２】
ｏｎｃＲＮＡが循環ＲＮＡ集団中にも存在するかどうか評価するために、乳癌患者由来の血清から単離されたＲＮＡから生成されたＲＮＡ−ｓｅｑデータの集まりを再解析した（３１）。評価の基準として、１１人の健常な個体の血清から収集されたデータが含まれた（３２）。図７Ｃに示すように、ｏｎｃＲＮＡの大部分は、乳癌患者由来の循環ＲＮＡ試料中に検出され得るが、一般に、健常な個体には存在しなかった。この観察は、循環ｏｎｃＲＮＡが液体生検によるがんのフィンガープリンティングに使用することができる可能性を増加させる。この可能性を評価するために、線形モデルを、細胞株から収集されたエキソソームｏｎｃＲＮＡデータセットに関して訓練し（図７Ｂ）、それを使用して循環ＲＮＡプロファイルの分類を予測した（図７Ｃ）。訓練されたモデルは、１１／１１の健常試料および３１／４０のがん患者由来の試料を成功裡に割り当てた（ＡＵＣ：０．９６、ＡＵＰＲＣ：０．９９、およびＡＣＣ：０．８２）。例えば、Ｔ３ｐは、単独で乳癌患者と健常なボランティアとの間で有意に異なる発現レベルを示した（図７Ｃおよび図８Ｂ）。この単純な分類器の成功を考慮して、より一般化可能な機械学習手法が、ＴＣＧＡ−ＢＲＣＡデータセットの２０１個のｏｎｃＲＮＡで勾配ブースティング分類器を訓練することによって調べられた。ＴＣＧＡデータで訓練されたこのモデルを、図７Ｃの循環低分子ＲＮＡプロファイルで試験した。この分類器は、１１／１１の健常試料および３７／４０の患者試料を成功裡に分類した（ＡＵＣ：０．９７６、ＡＵＰＲＣ：０．９９３、およびＡＣＣ：０．９４８）。これらの結果に基づいて、本発明者らは、循環ｏｎｃＲＮＡの検出が、潜在的ながんの存在に関する高特異性を有する確固たる情報として使用することができると推測する。同定された６７個の循環ｏｎｃＲＮＡのリストを、以下の表２に示す。
【表２−１】
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【表２−２】
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【表２−３】
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【表２−４】
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【表２−５】
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【０１５３】
最後に、同定された２０１個のｏｎｃＲＮＡから、表３に示す以下のｏｎｃＲＮＡが、血清試料の解析によって対象における乳癌の存在を予測する際に最も強い性能を持つものであることが分かった。
【表３−１】
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【表３−２】
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【０１５４】
乳癌発生および進行の現在の仮説は、発がん性表現型の選択の増加をもたらす、異常な細胞内機構の悪性転換を強調する。その結果として、がん治療法および診断薬の開発は、これらのがん細胞の生存、分裂、または拡散する能力を低減するためにこれらの経路を標的とすることを目的とする。本発明の実施例において、がん細胞ががん特異的調節経路を創るようにも進化し得ることが提唱された。臨床的乳癌データと組み合わされた８種の乳癌細胞株およびＨＵＭＥＣを対象にした系統的および偏りのない発見ステップによって、乳癌細胞において発現されるが、正常組織においてほとんど検出不可能である２０１個のＲＮＡ種の集団が同定された。総称的にオーファン非コードＲＮＡと名付けられたこれらのＲＮＡ分子は、がん細胞が新規な調節回路を作りだすために利用することができる新規な潜在的調節因子のプールを提供する。ｏｎｃＲＮＡが乳癌進行において機能することができるかどうかを問うために、低転移性および高転移性の細胞が比較された。Ｔ３ｐと名付けられた、これらのＲＮＡのうちの１つが、細胞株モデルおよび臨床データセットの両方において転移性進行と強く関連することが発見された。最後に、本明細書に記載の実施例は、ｏｎｃＲＮＡが循環およびエキソソームコンパートメントにおいて検出され得ることを示す。
【０１５５】
これらの発見は、がんの進行および腫瘍が転移拡散への途中でどのように進化し、調節経路を配線し直すことができるかについて新規のパラダイムを提供する。更に、これらの結果は、現行の方法を補い得る乳癌検出およびモニタリングのための新規の手段も提案する。マンモグラフィーおよび超音波を含む乳癌の現行のスクリーニング方法は、低解像度に起因して限られた検出シグナルを提供し、それらの使用者の解釈への依存を考慮すると偏りがある。早期がんを発見するための開発における他の戦略は、患者の血清から循環腫瘍細胞およびＤＮＡを含むがんの生物学的マーカーを検出することを試みる、「液体生検」に焦点を置いてきた。患者の血清内の分泌されたエキソソームの高い存在量およびｏｎｃＲＮＡのがん細胞特異性は、早期発見またはスクリーニングのより信頼性が高い方法のための我々のレパートリーの大幅な強化を提供し得る。換言すれば、本明細書に記載の研究は、ｏｎｃＲＮＡが潜在的な腫瘍のデジタルフィンガープリントとして働く−すなわち、各マーカーが検出されるかまたは検出されない−という考えを支持する。
【０１５６】
本明細書に記載の実施例は、乳癌転移におけるＴ３ｐの役割にほとんど焦点を置いたが、本明細書において掲示される手法および概念は、一般化可能であり、いくつかのがんに対して適用され得る。総合すると、これらの発見は、がん特異的ＲＮＡ分布の更なる調査およびｏｎｃＲＮＡの研究が、多数のがんタイプに対する代替的な治療および診断方法をもたらし得るという可能性を開く。
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７．Ｈ．Ｇｏｏｄａｒｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔＲＮＡ−Ｄｅｒｉｖｅｄ  Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ  Ｓｕｐｐｒｅｓｓ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｖｉａ  ＹＢＸ１  Ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ．Ｃｅｌｌ．１６１，７９０−８０２（２０１５）．
８．Ｄ．Ｋ．Ｓｉｍａｎｓｈｕ，Ｄ．Ｖ．Ｎｉｓｓｌｅｙ，Ｆ．ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，ＲＡＳ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ａｎｄ  Ｔｈｅｉｒ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｉｎ  Ｈｕｍａｎ  Ｄｉｓｅａｓｅ．Ｃｅｌｌ．１７０，１７−３３（２０１７）．
９．Ｒ．Ｒｅｎ，Ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ｏｆ  ＢＣＲ−ＡＢＬ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ  ｏｆ  ｃｈｒｏｎｉｃ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ．５，１７２−１８３（２００５）．
１０．Ｒ．−Ｋ．Ｌｉｎ，Ｙ．−Ｃ．Ｗａｎｇ，Ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ  ａｎｄ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｃｏｎｔｒｏｌ  ｏｆ  ＤＮＡ  ｍｅｔｈｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｓ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ．Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｓｃｉ．４，４６（２０１４）．
１１．Ａ．Ａ．Ａｌｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｏｗａｒｄ  ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇ  ａｎｄ  ｅｘｐｌｏｉｔｉｎｇ  ｔｕｍｏｒ  ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．２１，８４６−８５３（２０１５）．
１２．Ａ．Ｎｇｕｙｅｎ，Ｍ．Ｙｏｓｈｉｄａ，Ｈ．Ｇｏｏｄａｒｚｉ，Ｓ．Ｆ．Ｔａｖａｚｏｉｅ，Ｈｉｇｈｌｙ  ｖａｒｉａｂｌｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｓｕｂｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ  ｔｈａｔ  ｅｘｈｉｂｉｔ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ  ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ  ａｎｄ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｆｉｔｎｅｓｓ．Ｎａｔ．Ｃｏｍｍｕｎ．７，１１２４６（２０１６）．
１３．Ｒ．Ｊ．Ｔａｆｔ，Ｋ．Ｃ．Ｐａｎｇ，Ｔ．Ｒ．Ｍｅｒｃｅｒ，Ｍ．Ｄｉｎｇｅｒ，Ｊ．Ｓ．Ｍａｔｔｉｃｋ，Ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ：Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｓ  ｏｆ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．２２０（２０１０），ｐｐ．１２６−１３９．
１４．Ｍ．Ｅｓｔｅｌｌｅｒ，Ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．１２，８６１−８７４（２０１１）．
１５．Ａ．Ｊ．Ｍｉｎｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  ｏｒｇａｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｐｏｔｅｎｔｉａｌ  ｏｆ  ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｐｒｉｍａｒｙ  ｔｕｍｏｒｓ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１５，４４−５５（２００５）．
１６．Ｊ．Ｍ．Ｌｏｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ  Ｅｎｅｒｇｅｔｉｃｓ  Ｃａｎ  Ｐｒｏｍｏｔｅ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ．１６０，３９３−４０６（２０１５）．
１７．Ｄ．Ｎ．Ｃｏｏｐｅｒ，Ｌ．Ｐ．Ｂｅｒｇ，Ｖ．Ｖ  Ｋａｋｋａｒ，Ｊ．Ｒｅｉｓｓ，Ｅｃｔｏｐｉｃ（ｉｌｌｅｇｉｔｉｍａｔｅ）ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ：ｎｅｗ  ｐｏｓｓｉｂｉｌｉｔｉｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ａｎｄ  ｄｉａｇｎｏｓｉｓ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｇｅｎｅｔｉｃ  ｄｉｓｅａｓｅ．Ａｎｎ．Ｍｅｄ．２６，９−１４（１９９４）．
１８．Ａ．Ａ．Ｍａｒｇｏｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ＡＲＡＣＮＥ：Ａｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ｒｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  Ｎｅｔｗｏｒｋｓ  ｉｎ  ａ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｃｏｎｔｅｘｔ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ．７，Ｓ７（２００６）．
１９．Ｈ．Ｇｏｏｄａｒｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ−ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｄｅｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ＴＡＲＢＰ２  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  ｍＲＮＡ  ｈａｉｒｐｉｎｓ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１４），ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎａｔｕｒｅ１３４６６．
２０．Ｂ．Ｋｉｍ，Ｋ．Ｊｅｏｎｇ，Ｖ．Ｎ．Ｋｉｍ，Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ＤＲＯＳＨＡ  Ｃｌｅａｖａｇｅ  Ｓｉｔｅｓ  ｏｎ  Ｐｒｉｍａｒｙ  ＭｉｃｒｏＲＮＡｓ  ａｎｄ  Ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  Ｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．６６，２５８−２６９．ｅ５（２０１７）．
２１．Ｄ．Ｒａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ａ  ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｔｉｆｓ  ｆｏｒ  ｄｅｃｏｄｉｎｇ  ｇｅｎｅ  ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ．４９９，１７２−１７７（２０１３）．
２２．Ｙ．−Ｃ．Ｔ．Ｙａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，ＣＬＩＰｄｂ：ａ  ＣＬＩＰ−ｓｅｑ  ｄａｔａｂａｓｅ  ｆｏｒ  ｐｒｏｔｅｉｎ−ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．１６，５１（２０１５）．
２３．Ｅ．Ｌ．Ｖａｎ  Ｎｏｓｔｒａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｏｂｕｓｔ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ＲＮＡ−ｂｉｎｄｉｎｇ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｓｉｔｅｓ  ｗｉｔｈ  ｅｎｈａｎｃｅｄ  ＣＬＩＰ（ｅＣＬＩＰ）．Ｎａｔ．Ｍｅｔｈｏｄｓ．１３，５０８−５１４（２０１６）．
２４．Ｈ．Ｇｏｏｄａｒｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｇｏｖｅｒｎｉｎｇ  ｓｔａｂｉｌｉｔｙ  ｏｆ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｍｅｓｓｅｎｇｅｒ  ＲＮＡｓ．Ｎａｔｕｒｅ．４８５，２６４−２６８（２０１２）．
２５．Ｓ．Ｍｅｍｃｚａｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｉｒｃｕｌａｒ  ＲＮＡｓ  ａｒｅ  ａ  ｌａｒｇｅ  ｃｌａｓｓ  ｏｆ  ａｎｉｍａｌ  ＲＮＡｓ  ｗｉｔｈ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｐｏｔｅｎｃｙ．Ｎａｔｕｒｅ．４９５，３３３−８（２０１３）．
２６．Ｐ．Ｓｕｍａｚｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎ  ｅｘｔｅｎｓｉｖｅ  ｍｉｃｒｏＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｎｅｔｗｏｒｋ  ｏｆ  ＲＮＡ−ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｏｎｃｏｇｅｎｉｃ  ｐａｔｈｗａｙｓ  ｉｎ  ｇｌｉｏｂｌａｓｔｏｍａ．Ｃｅｌｌ．１４７，３７０−３８１（２０１１）．
２７．Ａ．Ｈｅｌｗａｋ，Ｇ．Ｋｕｄｌａ，Ｔ．Ｄｕｄｎａｋｏｖａ，Ｄ．Ｔｏｌｌｅｒｖｅｙ，Ｍａｐｐｉｎｇ  ｔｈｅ  ｈｕｍａｎ  ｓｍａｌｌ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒａｃｔｏｍｅ  ｂｙ  ＣＬＡＳＨ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｆｒｅｑｕｅｎｔ  ｎｏｎｃａｎｏｎｉｃａｌ  ｂｉｎｄｉｎｇ．Ｃｅｌｌ．１５３，６５４−６５（２０１３）．
２８．Ｔ．Ｆｉｓｋａａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｉｓｔｉｎｃｔ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  ｉｎ  Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  Ｖｅｓｉｃｌｅｓ  Ｄｅｒｉｖｅｄ  ｆｒｏｍ  Ｂｒｅａｓｔ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ．ＰＬｏＳ  ＯＮＥ．１１（２０１６），ｄｏｉ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１６１８２４．
２９．Ｗ．Ｚｈｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ−ｓｅｃｒｅｔｅｄ  ｍｉＲ−１０５  ｄｅｓｔｒｏｙｓ  ｖａｓｃｕｌａｒ  ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｂａｒｒｉｅｒｓ  ｔｏ  ｐｒｏｍｏｔｅ  ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｃａｎｃｅｒ  Ｃｅｌｌ．２５，５０１−５１５（２０１４）．
３０．Ｓ．Ｋ．Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｔｙ，Ａ．Ｐｒａｋａｓｈ，Ｇ．Ｎｅｃｈｏｏｓｈｔａｎ，Ｓ．Ｈｅａｒｎ，Ｔ．Ｒ．Ｇｉｎｇｅｒａｓ，Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｖｅｓｉｃｌｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｏｆ  ｐｒｏｃｅｓｓｅｄ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ＲＮＹ５  ＲＮＡ．ＲＮＡ  Ｎ．Ｙ．Ｎ．２１，１９６６−１９７９（２０１５）．
３１．Ｘ．Ｗｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｄｅ  ｎｏｖｏ  ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  ｏｆ  ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ  ｓｍａｌｌ  ｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ  ＲＮＡｓ  ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓ  ｎｏｖｅｌ  ｍａｒｋｅｒｓ  ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｕｔｃｏｍｅ  ｏｆ  ｌｏｃａｌｌｙ  ａｄｖａｎｃｅｄ  ｂｒｅａｓｔ  ｃａｎｃｅｒ．Ｊ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．１０，４２−４２（２０１２）．
３２．Ｍ．Ｄ．Ｇｉｒａｌｄｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｃｃｕｒａｃｙ，Ｒｅｐｒｏｄｕｃｉｂｉｌｉｔｙ  Ａｎｄ  Ｂｉａｓ  Ｏｆ  Ｎｅｘｔ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ  Ｆｏｒ  Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  Ｓｍａｌｌ  ＲＮＡ  Ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ：Ａ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  Ｓｔｕｄｙ  Ａｃｒｏｓｓ  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ．ｂｉｏＲｘｉｖ，１１３０５０（２０１７）．
３３．Ｏ．Ｅｌｅｍｅｎｔｏ，Ｎ．Ｓｌｏｎｉｍ，Ｓ．Ｔａｖａｚｏｉｅ，Ａ  ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  ｆｒａｍｅｗｏｒｋ  ｆｏｒ  ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ  ｅｌｅｍｅｎｔ  ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ  ａｃｒｏｓｓ  ａｌｌ  Ｇｅｎｏｍｅｓ  ａｎｄ  ｄａｔａ  ｔｙｐｅｓ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．２８，３３７−３５０（２００７）．
【図１Ａ】
2021502069.tif 000022
【図１Ｂ】
2021502069.tif 000023
【図１Ｃ】
2021502069.tif 000024
【図２Ａ】
2021502069.tif 000025
【図２Ｂ】
2021502069.tif 000026
【図３Ａ】
2021502069.tif 000027
【図３Ｂ】
2021502069.tif 000028
【図３Ｃ】
2021502069.tif 000029
【図３Ｄ】
2021502069.tif 000030
【図３Ｅ】
2021502069.tif 000031
【図３Ｆ】
2021502069.tif 000032
【図４Ａ】
2021502069.tif 000033
【図４Ｂ】
2021502069.tif 000034
【図４Ｃ】
2021502069.tif 000035
【図４Ｄ】
2021502069.tif 000036
【図５】
2021502069.tif 000037
【図６Ａ】
2021502069.tif 000038
【図６Ｂ】
2021502069.tif 000039
【図６Ｃ】
2021502069.tif 000040
【図７Ａ】
2021502069.tif 000041
【図７Ｂ】
2021502069.tif 000042
【図７Ｃ】
2021502069.tif 000043
【図８Ａ】
2021502069.tif 000044
【図８Ｂ】
2021502069.tif 000045
【図９Ａ】
2021502069.tif 000046
【図９Ｂ】
2021502069.tif 000047
【図９Ｃ】
2021502069.tif 000048
【図１０Ａ】
2021502069.tif 000049
【図１０Ｂ】
2021502069.tif 000050
【図１０Ｃ】
2021502069.tif 000051
【図１０Ｄ】
2021502069.tif 000052
【図１０Ｅ】
2021502069.tif 000053
【図１０Ｆ】
2021502069.tif 000054
【配列表】
2021502069000001.app
【国際調査報告】
2021502069.tif 000055
2021502069.tif 000056
2021502069.tif 000057
2021502069.tif 000058
2021502069.tif 000059