(57)【要約】  Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌から得られたフカナーゼであり、Ｐ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ及びＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼを含む。また、これに関連する方法、システム、組成物などであり、かかるフカナーゼによる加水分解の後で重量平均分子量が低減したフカン組成物を含む。
2021531791.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中のＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
【請求項２】
水溶液中のＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
【請求項３】
前記添加されたフカンは原料フカン組成物である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
ｐＨが約６．５〜９．０である、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
温度が約１５℃〜４０℃である、請求項１〜請求項４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
フカン中のグリコシド結合を前記フカナーゼが加水分解できる条件にある、請求項１〜請求項５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
真核生物（eukaryotic entity）によって産生されるフカナーゼであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
【請求項８】
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号１及び配列番号３のいずれか１つにおいて１個以上且つ５％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
【請求項９】
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号２及び配列番号４のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
【請求項１０】
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌以外の原核生物（prokaryotic entity）によって産生されるフカナーゼであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
【請求項１１】
真核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
【請求項１２】
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号５及び配列番号７のいずれか１つにおいて１個以上且つ５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
【請求項１３】
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号６及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
【請求項１４】
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌以外の原核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
【請求項１５】
前記原核生物が大腸菌（Escherichia Coli）である、請求項１０又は請求項１４に記載のフカナーゼ。
【請求項１６】
人工の水溶液中でＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼを使用してフカンを選択的に酵素的に加水分解することを含む方法。
【請求項１７】
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つにおいて３％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項１９】
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つにおいて１％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、請求項１６に記載の方法。
【請求項２０】
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて３％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて１％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
前記フカンが、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一種から得たフコイダンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
前記フカンが、Saccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一種から得たフコイダンである、請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
前記フカンの平均分子量が少なくとも５％低下する、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記フカンの平均分子量が約１０％低下する、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記フカンの平均分子量が約２０％低下する、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記フカンの平均分子量が約３０％低下する、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記フカンの平均分子量が約４０％低下する、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記フカンの平均分子量が約５０％低下する、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記フカンの平均分子量が約６０％低下する、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記フカンの平均分子量が約７０％低下する、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記フカンの平均分子量が約８０％低下する、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記フカンの平均分子量が約９０％低下する、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記フカンの平均分子量が約９５％低下する、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも５％が加水分解される、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも１０％が加水分解される、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも２０％が加水分解される、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも３０％が加水分解される、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも４０％が加水分解される、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも５０％が加水分解される、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも６０％が加水分解される、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも７０％が加水分解される、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも８０％が加水分解される、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも９０％が加水分解される、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも９５％が加水分解される、請求項１６〜請求項２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物を前記原料フカン組成物中のフカンの酵素加水分解によって得るための方法であって、
前記原料フカン組成物及びＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼを水溶液中に提供すること、
前記原料フカン組成物中のフカンを加水分解するのに十分な条件下で前記原料フカン組成物及び前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼをインキュベートして、加水分解フカン及び加水分解残余分子を生成すること、並びに
前記加水分解フカンを前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから分離して、前記の所望の分子量を有するフカン組成物を得ること
を含む方法。
【請求項４８】
前記フカナーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つの遺伝子配列によってコードされる、請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記フカナーゼが、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、請求項４７に記載の方法。
【請求項５０】
前記フカンが、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一種から得たものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５１】
前記フカンが、Saccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一種から得たものである、請求項４７に記載の方法。
【請求項５２】
前記フカンの平均分子量が少なくとも５％低下する、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記フカンの平均分子量が約１０％低下する、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記フカンの平均分子量が約２０％低下する、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記フカンの平均分子量が約３０％低下する、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記フカンの平均分子量が約４０％低下する、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
前記フカンの平均分子量が約５０％低下する、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記フカンの平均分子量が約６０％低下する、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記フカンの平均分子量が約７０％低下する、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記フカンの平均分子量が約８０％低下する、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記フカンの平均分子量が約９０％低下する、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記フカンの平均分子量が約９５％低下する、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも５％が加水分解される、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも１０％が加水分解される、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも２０％が加水分解される、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも３０％が加水分解される、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも４０％が加水分解される、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも５０％が加水分解される、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも６０％が加水分解される、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも７０％が加水分解される、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも８０％が加水分解される、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも９０％が加水分解される、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７３】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも９５％が加水分解される、請求項４７〜請求項５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
発現可能なＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項７５】
発現可能なＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項７６】
発現可能なＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
【請求項７７】
発現可能な、配列番号１及び配列番号３のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列を含む発現ベクター。
【請求項７８】
発現可能な、配列番号２及び配列番号４のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列を含む発現ベクター。
【請求項７９】
プラスミドである、請求項７４〜請求項７８に記載の発現ベクター。
【請求項８０】
原核発現プラスミド（prokaryotic-expression plasmid）である、請求項７４〜請求項７８に記載の発現ベクター。
【請求項８１】
前記原核発現プラスミドが大腸菌における発現のために構成されている、請求項８０に記載の発現ベクター。
【請求項８２】
真核発現プラスミド（eukaryotic-expression plasmid）である、請求項７４〜請求項７８に記載の発現ベクター。
【請求項８３】
請求項７４〜請求項８２のいずれか一項に記載の遺伝子を発現すること、及び前記遺伝子により発現された酵素を回収することを含む、前記酵素を作製する方法。
【請求項８４】
請求項７１〜請求項８２に記載の遺伝子配列を発現すること、及びかかる遺伝子から発現された酵素を回収することを含む、前記酵素を作製する方法。
【請求項８５】
前記酵素がフカナーゼである、請求項８３又は請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
請求項７４〜請求項８２のいずれか一項に記載の発現ベクターから得られたフカナーゼを提供すること、及び発現されたフカナーゼがフカンを加水分解するよう選択された条件下で前記フカナーゼを前記フカンと組み合わせることを含む、発現されたフカナーゼを使用する方法。
【請求項８７】
前記フカンが原料フカン組成物中で提供される、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記発現されたフカナーゼが前記フカン内のグリコシド結合を加水分解する、請求項８６又は請求項８７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
フカン（フコイダンを含む）は、硫酸化多糖である。一般的に言えば、このことは、それらが多くの糖類から構成される分子であり、前記糖類に付加した硫黄原子も有することを意味する。主要糖類は、６個の炭素原子を有し且つ化学式Ｃ６Ｈ１２Ｏ５を有する糖である「フコース」と呼ばれる。「フコイダン」（又はフコイジン）は、褐藻（海草）に由来するフカンを示す。フカンは、単独で存在することが可能であり、あるいは他の糖の混合物、例えば、キシロース、ガラクトース、グルコース、グルクロン酸及び／又はマンノースなどの糖との混合物の状態で存在することも可能である。これらの他の糖は、フカンを有する海草又は他の原料から抽出されうる。フカンは現在、褐藻（海草）、ナマコなどの天然原料に由来するが、本明細書に記載される「フカン」は、フカンの（１又は複数の）究極的原料にかかわらず、本明細書で考察されるフカンの化学的モチーフ及び構造的モチーフを有するポリマー分子を含む。
【０００２】
フコイダンはAdenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaを含む褐藻類の多様な種から得ることができるが、これらに限定されるものではない。これらの例示的な種は全て分類学上の褐藻綱（Phaeophyceae）から出たものであり、これらの種の大部分は、ヒバマタ科（Fucales）又はコンブ科（Laminariaceae）に入る。
【０００３】
フコイダンを含むフカンは、線維性癒着の形成を予防、阻害、又は処置するためのバリア器具（barrier device）として供するにおいて有効であることが示されている。フカンには他の関連する疾患及び状態の処置への用途も見いだされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
所望の分子量分布を有するフカン組成物の調製における改良された方法には、まだ満たされていない需要が存在する。先行研究では、いくつかのフカンの加水分解における基質特異的ＭｆＦｃｎＡ酵素（Ｃｏｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００６）として知られている、フラボバクテリウム株ＳＷ５由来のフカン特異的フカナーゼの使用が考察されている。本方法、本システムなどは、他の利点の中でも、選択されたフカン組成物を加水分解することが可能である酵素、及び、これらの酵素を使用して、原料フカン組成物から所望の分子量分布を有するフカン組成物を得るための方法を提供することを対象とする。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
原料フカン組成物中のフカンを含むフカンの酵素加水分解が可能であるフカナーゼを得、当該フカナーゼを利用して、前記原料フカン組成物に較べて分子量分布が低分子量側にある所望のフカン（a desired lower molecular weight distribution fucan relative to the feedstock fucan composition）を得るための方法、システム、組成物などが提供される。本明細書に記載の実施形態は、フカナーゼの産生又は合成、及び、前記フカナーゼ（複数可）による加水分解後に平均分子量が低減されたフカンを有するフカン組成物の生成において使用され得るフカナーゼ遺伝子配列及びフカナーゼアミノ酸配列を含む。前記産生されたフカナーゼを使用して前記原料フカン組成物を加水分解するための方法により、フカン基質選択性及び酵素加水分解における時間ベースでの制御（time-based control during the enzymatic hydrolysis）が提供される。
【０００６】
本方法、本システムなどは、所望の分子量分布を有する所望のフカン組成物を原料フカン組成物から得ること、並びに、かかる所望のフカン分子量分布を含む組成物、及びかかる組成物の使用の方法を含む。一態様において、前記方法は以下を含む。
【０００７】
本組成物、本システム及び本方法などは、水溶液中のＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ及び／又はＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼ、並びに、添加されたフカンを含みうる組成物を提供する。前記添加されたフカンは原料フカン組成物であり得、当該組成物は、ｐＨが約６．５〜９．０、温度が約１５℃〜４０℃であり得、また、前記フカナーゼがフカン中のグリコシド結合を加水分解し得るような条件にありうる。
【０００８】
ある特定の実施形態において、本組成物、本システム及び本方法などは、原核生物又は真核生物（prokaryotic or eukaryotic entity）によって産生されるフカナーゼなどの酵素を含み、前記フカナーゼは、配列番号１〜４のいずれか１つに記載の遺伝子配列、又は、かかる配列番号に記載の遺伝子配列において少なくとも０個、１個、２個、３個、４個若しくは５個且つ１％未満、２％未満、３％未満、４％未満若しくは５％未満のコドンが置換されている遺伝子配列によってコードされている。さらなる実施形態において、本組成物、本システム及び本方法などは、原核生物又は真核生物によって産生されるフカナーゼを含み、前記フカナーゼは、配列番号５〜９のいずれか１つに記載のアミノ酸配列において少なくとも０個、１個、２個、３個、４個又は５個のアミノ酸又はアミノ酸の１％未満、２％未満、３％未満、４％未満若しくは５％未満が置換されているアミノ酸配列を含みうる。前記原核生物は、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌（Psychromonas species）又は大腸菌（Escherichia Coli）でありうる。
【０００９】
前記方法は、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌中ではなく、水溶液中、例えば、人工の容器に収容されている人工の溶液中で、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼ又は本明細書において考察されている他のフカナーゼを使用してフカンを酵素的に加水分解することを含みうる。前記フカンはフコイダンであってよく、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一つから得ることができる。特定の実施形態では、フカン又はフコイダンはSaccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一つから得られる。前記加水分解によってフカンの平均分子量は少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％低下しうる。前記加水分解によってフカンにおけるグリコシド結合のうち少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％が加水分解されうる。
【００１０】
原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物（desired lower molecular weight fucan compositions relative to a feedstock fucan compositions）を前記原料フカン組成物中のフカンの酵素加水分解によって得るための方法も提供する。前記方法は、
前記原料フカン組成物及びＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼを水溶液中に提供すること、
前記原料フカン組成物中のフカンを加水分解するのに十分な条件下で前記原料フカン組成物及び前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼをインキュベートして、加水分解フカン（hydrolyzed fucans）及び加水分解残余分子を生成すること、並びに
前記加水分解フカンを前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから分離して、前記の所望の分子量を有するフカン組成物を得ること
を含みうる。
【００１１】
前記フカナーゼは、例えば配列番号１〜８のうちの１つに記載の本明細書において考察されている遺伝子配列によってコードされ且つ／又はアミノ酸配列を含んでいてよく、前記フカン／フカン原料組成物は、本明細書において考察されているように調達されてよい。前記フカン／フカン組成物の平均分子量、及び／又は、前記フカン／フカン組成物に存在するグリコシド結合は、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％低減され得る。
【００１２】
発現可能なＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ遺伝子、Ｐ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼ遺伝子又は本明細書において考察されている他の配列を含む発現ベクター、並びに、本明細書において考察され、かかる発現ベクターから発現され、且つ典型的にはかかる発現ベクターから回収及び精製される、酵素及びフカナーゼも提供される。
【００１３】
これら及び他の態様、特徴及び実施形態は、以下の詳細な説明及び添付の図面を含め、本出願の範囲内で記載されている。別途明確に記述されていない限り、全ての実施形態、態様、特徴などは、いかなる所望の方法で、混合及び適合され、組み合わされ、順序が変えられてもよい。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】図１は、原料フカン組成物に較べて低分子量であるフカン組成物を酵素加水分解によって得る例示的な方法のフローチャートを示す。
【図２Ａ】図２Ａは、Ｓａｃｃｈａｒｉｎａ  Ｊａｐｏｎｉｃａから抽出されるフコイダン組成物がＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ及びＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼにより加水分解されることと、及びＳａｃｃｈａｒｉｎａ  Ｊａｐｏｎｉｃａから抽出されるフコイダン組成物がＭｆＦｃｎＡフカナーゼによって加水分解されないこととを示す、Ｃ−ＰＡＧＥゲルの例を提供する。
【図２Ｂ】図２Ｂは、Ｌａｍｉｎａｒｉａ  Ｈｙｐｅｒｂｏｒｅａから抽出されるフコイダン組成物がＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ及びＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼによって加水分解されることと、かかるフコイダン組成物がＭｆＦｃｎＡフカナーゼによって加水分解されないこととを示す、Ｃ−ＰＡＧＥゲルの例を提供する。
【図２Ｃ】図２Ｃは、Ｍａｃｒｏｃｙｓｔｉｓ  ｐｙｒｉｆｅｒａから抽出されるフコイダン組成物がＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ及びＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼによって加水分解されることと、かかるフコイダン組成物がＭｆＦｃｎＡフカナーゼによって加水分解されないこととを示す、Ｃ−ＰＡＧＥゲルの例を提供する。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
上記のフローチャートを含め、図面は、本開示の例示的な実施形態を提示する。本明細書に記載のシステム、方法などの実際の実施形態は、前記図面に示されていないさらなる特徴又は工程をさらに含みうる。本明細書において設定されている例示は、前記システム、方法などの、１又は複数の形態での実施形態を示しており、かかる例示は、いかなる方法によっても本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではない。本明細書に記載の実施形態は網羅的なものではなく、本開示を例えば、以下の詳細な説明において開示されている詳細形態に限定するものではない。
【００１６】
本明細書に記載の方法、システム、組成物などは、原料フカン組成物に較べて分子量分布が低分子量側にある所望のフカンを得るための、原料フカン組成物を酵素加水分解することができるフカナーゼに関する。そのため、本明細書において考察されるフカナーゼは、原料組成物におけるフカンの分子量分布が選択的且つ制御可能に低減されるように、選択的且つ制御可能に前記フカンを切断（cleave）して前記フカンのサイズを低減して、分子量分布がより低分子量側にある所望の修飾フカンを含む修飾フカン組成物を提供するために使用される。
【００１７】
フカンの例としてフコイダンを使用する図面において、前記方法などのある特定の実施形態を例として示す。天然フカナーゼ及び合成フカナーゼそれぞれのフカナーゼ遺伝子配列のコード領域及びフカナーゼアミノ酸配列の組成を考察する。前記原料フカン組成物の酵素加水分解の産物として得られる低分子量フカン組成物（lower molecular weight fucan composition）は、原料フカンの分布に較べてより低分子量側にある平均分子量分布（a lower average molecular weight distribution relative to the feedstock fucan distribution）を有する。分子量分布におけるこのシフトは、前記分布の分散度及び形状の変更に伴って起こり得る。
【００１８】
本明細書において考察されるある特定のフカナーゼの開発では、フコイダン分解性Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌株ＳＷ５Ａ及びＳＷ１９Ｄは、カドボロ湾及びウィローズビーチの岸から収集された褐色の巨大な藻類から単離されたものであった（Ｖｉｃｔｏｒｉａ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｂｒｉｔｉｓｈ  Ｃｏｌｕｍｂｉａ，Ｃａｎａｄａ）。培養されたたＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌株ＳＷ５Ａ及びＳＷ１９ＤからゲノムＤＮＡを抽出し、これらのゲノムの次世代配列決定をＩｌｌｕｍｉｎａ  ＭｉＳｅｑプラットフォームで実施した。これらのゲノムをアノテーションして、炭水化物活性酵素をコードする推定遺伝子を同定した。酵素であるＰ５ＡＦｃｎＡ及びＰ１９ＤＦｃｎＡをコードするフカナーゼ遺伝子配列を、このアノテーションプロセスの際にＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌であるＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌株ＳＷ５Ａ（Psychromonas sp. SW5A）及びＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌株ＳＷ１９Ｄ（Psychromonas sp. SW19D）のゲノムにおいて同定した。
【００１９】
酵素であるＰ５ＡＦｃｎＡ及びＰ１９ＤＦｃｎＡをコードする前記フカナーゼ遺伝子配列を、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌であるＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌株ＳＷ５Ａ及びＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌株ＳＷ１９Ｄのゲノムから得た。大腸菌における発現用にコドン最適化され且つ大腸菌発現プラスミドｐＥＴ２８ａに予め挿入された、酵素であるＰ５ＡＦｃｎＡ及びＰ１９ＤＦｃｎＡをコードする合成フカナーゼ遺伝子を、Ｇｅｎｓｃｒｉｐｔ（登録商標）からオーダーした。これらの構築物は、ｐＥＴ２８ａ＿ｐ５ＡＦｃｎＡ及びｐＥＴ２８ａ＿Ｐ１９ＤＦｃｎＡと称された。当該構築物の配列忠実度は双方向ＤＮＡ配列決定によって確認した。フカナーゼを、６ヒスチジンタグを有する大腸菌過剰発現系において発現させた。組み換えタンパク質を精製するために、細胞を採取し、化学的に溶解し、遠心分離して、細胞デブリスを細胞溶解物上清から分離した。前記タンパク質を次いで前記溶解物から固定化親和性クロマトグラフィによって精製した。精製されたタンパク質を０．５Ｍ  ＮａＣｌ緩衝液によって２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．５）中に透析し、２９μＭに濃縮してさらに使用した。天然及び合成のＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼについてのフカナーゼ遺伝子のコード領域配列、それぞれ、配列番号１及び配列番号２を、それぞれ、表１Ａ及び表１Ｂに示す。天然及び合成のＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼについてのフカナーゼ遺伝子のコード領域配列、それぞれ、配列番号３及び配列番号４を、それぞれ、表１Ｃ及び表１Ｄに示す。天然及び合成のＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼについてのアミノ酸配列、それぞれ、配列番号５及び配列番号６を、それぞれ、表１Ｅ及び表１Ｆに示す。天然及び合成のＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼについてのアミノ酸配列、それぞれ、配列番号７及び配列番号８を、それぞれ、表１Ｇ及び１Ｈに示す。いくつかの実施形態において、本明細書に示される核酸配列は、好適な発現ベクター、ｈｔｔｐｓ：／／ｅｎ．ｗｉｋｉｐｅｄｉａ．ｏｒｇ／ｗｉｋｉ／Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ＿ｖｅｃｔｏｒにおいて制御可能に発現される。かかる発現ベクターは、原核発現又は真核発現のいずれかについて最適化されてよく、所望により、プラスミド、発現ウイルス、無細胞系などを含んでもよい。前記発現ベクターはまた、所望により、選択されたプライマー、複製起源などを含んでもよい。
【００２０】
表１Ａに示されるフカナーゼ遺伝子配列である配列番号１を、以下、天然Ｐ５ＡＦｃｎＡ遺伝子配列と称する。表１Ｂに示されるフカナーゼ遺伝子配列である配列番号２を、以下、合成Ｐ５ＡＦｃｎＡ遺伝子配列と称する。表１Ｃに示されるフカナーゼ遺伝子配列である配列番号３を、以下、天然Ｐ１９ＤＦｃｎＡ遺伝子配列と称する。表１Ｄに示されるフカナーゼ遺伝子配列である配列番号４を、以下、合成Ｐ１９ＤＦｃｎＡ遺伝子配列と称する。これらの合成配列は、大腸菌による酵素の発現に最適化される。表１Ｅに示されるアミノ酸配列である配列番号５を、以下、天然Ｐ５ＡＦｃｎＡアミノ酸配列と称する。表１Ｆに示されるアミノ酸配列である配列番号６を、以下、合成Ｐ５ＡＦｃｎＡアミノ酸配列と称する。表１Ｇに示されるアミノ酸配列である配列番号７を、以下、天然Ｐ１９ＤＦｃｎＡアミノ酸配列と称する。表１Ｈに示されるアミノ酸配列である配列番号８を、以下、合成Ｐ１９ＤＦｃｎＡアミノ酸配列と称する。
【００２１】
【表１Ａ】
2021531791.tif 000003
【００２２】
2021531791.tif 000004
【００２３】
【表１Ｂ】
2021531791.tif 000005
【００２４】
2021531791.tif 000006
【００２５】
【表１Ｃ】
2021531791.tif 000007
【００２６】
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【００２７】
【表１Ｄ】
2021531791.tif 000009
【００２８】
2021531791.tif 000010
【００２９】
【表１Ｅ】
2021531791.tif 000011
【００３０】
【表１Ｆ】
2021531791.tif 000012
【００３１】
【表１Ｇ】
2021531791.tif 000013
【００３２】
【表１Ｈ】
2021531791.tif 000014
【００３３】
フカンの酵素加水分解
図１のフローチャートは、原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物を得るための、すなわち、前記原料フカン組成物の酵素加水分解によって前記組成物中のフカンの平均分子量を低減するための、例示的な方法［１００］を示す。この例示的な非限定方法において、当該方法は、前記原料フカン組成物を水溶液（すなわち、人工の、典型的には緩衝液化された、溶液）中に提供すること［１１０］、溶液中で前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートして、加水分解された前記フカン組成物、前記フカナーゼ及び加水分解残余分子を含む溶液を生成すること［１２０］、及び前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離して、所望の前記低分子量フカン組成物を得ること［１３０］、を含む。
【００３４】
前記原料フカン組成物を提供すること［１１０］は、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一つから抽出されたフカン／原料フコイダン組成物を提供することを含みうる。特定の実施形態では、前記フカンはSaccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda Filumのうち少なくとも一つから得られる。
【００３５】
前記原料フカン組成物を水溶液中に提供すること［１１０］は、前記原料フカン組成物を溶液中に約０．０１％ｗ／ｖ〜約３０％ｗ／ｖのフカン濃度で提供することを含みうる。水溶液中に前記原料フカン組成物を提供すること［１１０］は、前記原料フカン組成物を溶液中に約０．０５％ｗ／ｖ〜約１０％ｗ／ｖのフカン濃度で提供することを含みうる。水溶液中に前記原料フカン組成物を提供すること［１１０］は、前記原料フカン組成物を溶液中に約０．１％ｗ／ｖ〜約５％ｗ／ｖのフカン濃度で提供することを含みうる。
【００３６】
水溶液中に前記原料フカン組成物を提供すること［１１０］は、リン酸一ナトリウム、リン酸二ナトリウム、リン酸三ナトリウム、リン酸緩衝液、リン酸緩衝食塩水、トリシン緩衝液、ホウ酸緩衝液、トリスアミノメタン緩衝液（Ｔｒｉｓ緩衝液としても知られている）、塩化ナトリウム、Ｔｒｉｚｍａ（商標）緩衝液、ベータ−ヒドロキシ−４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−プロパンスルホン酸（ＨＥＰＰＳＯとしても知られている）緩衝液、ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物（ＰＯＰＳＯとしても知られている）緩衝液、トリエタノールアミン（ＴＥＡ）緩衝液、３−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］プロパン−１−スルホン酸（ＥＰＰＳ）緩衝液、グリシン緩衝液、Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）（ＨＥＰＢＳ）緩衝液、２−［４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−イル］エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）緩衝液、［トリス（ヒドロキシメチル）メチルアミノ］プロパンスルホン酸（ＴＡＰＳ）緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール（ＡＭＰＤとしても知られている）緩衝液、Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル−４−アミノ−ブタンスルホン酸（ＴＡＢＳとしても知られている）緩衝液、Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシ−プロパンスルホン酸（ＡＭＰＳＯ）緩衝液、２−（シクロ−ヘキシルアミノ）エタンスルホン酸（ＣＨＥＳ）緩衝液、３−（シクロヘキシルアミノ）−２−ヒドロキシ−１−プロパン−スルホン酸（ＣＡＰＳＯ）緩衝液、２−アミノ−２−メチル−１−プロパノール（ＡＭＰとしても知られている）緩衝液、３−（シクロヘキシルアミノ）−１−プロパン−スルホン酸（ＣＡＰＳ）緩衝液、４−（シクロヘキシルアミノ）−１−ブタンスルホン酸（ＣＡＢＳ）緩衝液、クエン酸緩衝液、クエン酸−リン酸緩衝液、炭酸−重炭酸ナトリウム緩衝液及び重炭酸アンモニウムのうちの少なくとも１つを含む溶液中に、前記原料フカン組成物を提供することを含みうる。これらの緩衝溶液は、ｐＨが、例えば、弱酸性から弱塩基性であり得、例えば、ｐＨが約５．５〜１０．５、６．５〜９．０、７．５〜８．８、又は８．０〜８．５でありうる。
【００３７】
前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼと共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、大腸菌によって産生された組み換えフカナーゼと共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、Ｐ５ＡＦｃｎＡ及びＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼ、例えば合成により生成された非天然Ｐ５ＡＦｃｎＡ及びＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼ、のうちの少なくとも１つ又は両方と共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、そのフカナーゼ遺伝子（its fucanase-gene）又は修飾されたフカナーゼ遺伝子から大腸菌及びＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属細菌のうちいずれか又は他の好適な原核宿主／産生種及び真核宿主／産生種のうちいずれかによって翻訳されたフカナーゼと共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。本明細書に記載の方法は、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のうちの少なくとも１つから置換されているコドンが５％未満であるフカナーゼ遺伝子配列（a fucanase-gene sequence of at least one of SEQ ID NO. 1, SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 3 and SEQ ID NO. 4 in which fewer than 5% of codons are substituted）を発現することによって酵素を産生することを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、前記天然Ｐ５ＡＦｃｎＡ配列、配列番号１及び配列番号５のそれぞれから置換されているコドン又はアミノ酸が少なくとも１つ、３つ又は５つであるが１％未満、３％未満、又は５％未満である配列によってコードされるフカナーゼ（a fucanase coded by a sequence in which at least one, three or five, but fewer than 1%, 3%, or 5% of codons or amino acids of the native P5AFcnA sequence, SEQ ID NOS. 1 and 5, respectively, are substituted）と共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、前記合成Ｐ５ＡＦｃｎＡ配列、配列番号２及び配列番号６のそれぞれから置換されているコドン又はアミノ酸が１％未満、３％未満、又は５％未満である配列によってコードされるフカナーゼ（a fucanase coded by a sequence in which fewer than 1%, 3%, or 5% of codons or amino acids of the synthetic P5AFcnA sequence, SEQ ID NOS. 2 and 6, respectively, are substituted）と共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、前記天然Ｐ１９ＤＦｃｎＡ配列、配列番号３及び配列番号７のそれぞれから置換されているコドン又はアミノ酸が少なくとも１つ、３つ又は５つであるが１％未満、３％未満、又は５％未満である配列によってコードされるフカナーゼ（a fucanase coded by a sequence in which at least one, three or five, but fewer than 1%, 3%, or 5% of codons or amino acids of the native P19DFcnA sequence, SEQ ID NOS. 3 and 7, respectively, are substituted）と共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、前記合成Ｐ１９ＤＦｃｎＡ配列、配列番号４及び配列番号８のそれぞれから置換されているコドンが１％未満、３％未満、又は５％未満である配列によってコードされるフカナーゼ（a fucanase coded by a sequence in which fewer than 1%, 3%, or 5% of codons of the synthetic P19DFcnA sequence, SEQ ID NOS. 4 and 8, respectively, are substituted）と共に前記原料フカン組成物をインキュベートすることを含みうる。
【００３８】
前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物を約０℃〜約６０℃、約１５℃〜４０℃、約２０℃〜３０℃、例えば、約２３℃、約２５℃、又は約２７℃で維持することを含みうる。
【００３９】
前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、前記混合物を、例えば、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物を例えば少なくとも１分間からインキュベーション期間全体にわたって撹拌、振とう、振動又は混合することを通じてかき混ぜる少なくとも１つの形態を含みうる。
【００４０】
前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物を、約３０分〜約３００時間、約１時間〜約１００時間、約２時間〜約５０時間、約３時間〜約２４時間、例えば約５時間、約１０時間、約１５時間又は約２０時間インキュベートすることを含みうる。
【００４１】
前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物を、前記フカン組成物において所望の分子量が得られるまでインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、前記フカン組成物の平均分子量の少なくとも約５％又は１０％の低減が得られるまで、前記フカン組成物の平均分子量の少なくとも約２０％の低減が得られるまで、例えば、前記フカン組成物の平均分子量の約４０％、約５０％又は約６０％の低減が得られるまで、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物をインキュベートすることを含みうる。前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートすること［１２０］は、前記原料フカン組成物−フカナーゼ混合物を、前記原料フカン組成物におけるフカン中のグリコシド結合の少なくとも５％又は１０％が加水分解されるまで、前記原料フカン組成物におけるフカン中のグリコシド結合の少なくとも２０％が加水分解されるまで、例えば、前記グリコシド結合の約４０％、約５０％及び約６０％が加水分解されるまで、インキュベートすることを含みうる。
【００４２】
前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離すること［１３０］は、前記の加水分解フカン組成物を含む溶液において反応制御剤によって前記フカナーゼを反応制御して前記加水分解を終了させた上で前記分離を行うこと（quenching the fucanase in the solution comprising the hydrolyzed fucan composition with a quenching agent to terminate the hydrolysis before the separating）を含みうる。前記溶液において前記フカナーゼを反応制御することは、前記溶液をアルカリ性にすることを含みうる。前記溶液をアルカリ性にすることは、前記溶液のｐＨを約９〜１４まで上昇させることを含みうる。前記溶液をアルカリ性にすることは、ＮａＯＨ、ＫＯＨ及びＬｉＯＨのうちの少なくとも１つを前記溶液に添加することを含みうる。前記溶液において前記フカナーゼを反応制御することは、前記溶液を６０〜１００℃、例えば約８０℃に又はこれを超えて加熱することも含み得、又はこれを代替的に含みうる。前記溶液において前記フカナーゼを反応制御することは、エタノール、イソプロパノール、プロパノール及びメタノールのうちの少なくとも１つなどの沈殿剤によって前記フカナーゼを沈殿させることも含み得、又はこれを代替的に含みうる。
【００４３】
前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離すること［１３０］は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）フィルタを通して前記溶液を透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、前記の加水分解フカン組成物を含む溶液を、蒸留水、塩溶液及び緩衝液溶液のうちの少なくとも１つによって透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、前記所望のフカン組成物における所望の分子量よりも分子量カットオフが小さいＴＦＦフィルタを通して前記加水分解フカン組成物を含む溶液を透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、分子量カットオフが５ｋＤａ、１０ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、７０ｋＤａ又は１００ｋＤａのいずれかであるＴＦＦフィルタを通して溶液において前記原料フカン組成物を透析濾過することを含みうる。前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離すること［１３０］は、遠心分離、濾過及び沈降のうちの少なくとも１つを含みうる。
【実施例】
【００４４】
図１において考察されている上記方法を、Saccharina japonica、Ascophyllum nodosum、Pelvetia canaliculata、Fucus vesiculosus、Laminaria hyperborea及びMacrocystis pyiferaから抽出した個々の原料フコイダン組成物に適用した。使用した前記フカナーゼは、先に考察したＭｆＦｃｎＡフカナーゼ（Ｃｏｌｉｎ，ｅｔ  ａｌ．，２００６）並びに上記で考察されたように得られたＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ及びＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼであった。原料フコイダン組成物を、０．５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ８．５の２０ｍＭのＴｒｉｓ緩衝液中に約０．１〜０．２％ｗ／ｖで溶解した。０．５ＭのＮａＣｌを含むｐＨ８．５の同じＴｒｉｓ緩衝液中のＭｆＦｃｎＡ、Ｐ５ＡＦｃｎＡ又はＰ１９ＤＦｃｎＡの２９μＭ溶液を独立に個別の原料フコイダン組成物の溶液に１０μＭの最終フカナーゼ濃度まで添加した。前記原料フコイダン組成物−フカナーゼ混合物を全て、２５℃にて軌道振とう機上で１００ｒｐｍで１５時間インキュベートした。
【００４５】
１５時間後、それぞれ個々の原料フコイダン組成物−フカナーゼ混合物において加水分解が起こったことを、炭水化物−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（Ｃ−ＰＡＧＥ）技術を使用して分析した。１０μＬの前記加水分解フコイダン組成物−フカナーゼ混合物を１０μＬのローディング染料（水中、１０％ｖ／ｖグリセロール、０．０１％ｗ／ｖブロモフェノールブルー）と混合した。得られた混合物を、氷上における２４％ｗ／ｖＣ−ＰＡＧＥのゲル泳動に、最初に１００ボルトの電圧で１５分間、次に１５０ボルトの電圧で２０分間、最後に２００ボルトの電圧で２０分間供した。
【００４６】
前記Ｃ−ＰＡＧＥ分析の結果を以下の表２に示し、加水分解の発生を評価する。前記Ｃ−ＰＡＧＥゲルにおける加水分解の非存在及び加水分解の存在の例を図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃに示す。当該表において、「＋」は前記フカン組成物の加水分解が前記ゲルにおいて観察されたことを示し、「−」は前記フカン組成物の加水分解が前記ゲルにおいて観察されなかったことを示し、「＋／−」は最小限の加水分解が観察されることを示す。
【００４７】
【表２】
2021531791.tif 000015
【００４８】
上記及び図１において考察されている方法を、異なる供給源Macrocystis pyrifera、Chorda filum、Ascophylum nodosum、Laminaria hyperborea、Saccharina japonica及びFucus vesiculosusから抽出された個々の原料フコイダン組成物に、異なる条件下で適用した。前記原料フコイダン組成物を０．２５％ｗ／ｖで溶解し、１μＭの同フカナーゼと共に室温で４０時間インキュベートした。同じＴｒｉｓ緩衝液組成物を使用してｐＨを８．０に調整した。
【００４９】
分析をＣ−ＰＡＧＥにおいて行った。結果を以下の表３に示し、加水分解の発生を評価する。当該表において、「＋」は前記フカン組成物の加水分解が前記ゲルにおいて観察されたことを示し、「−」は前記フカン組成物の加水分解が前記ゲルにおいて観察されなかったことを示し、「＋／−」は最小限の加水分解が観察されることを示す。
【００５０】
【表３】
2021531791.tif 000016
【００５１】
表２及び表３は、図２Ａ、図２Ｂ及び図２Ｃと共に、Ｐ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ及びＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼが、先に考察されたＭｆＦｃｎＡフカナーゼと較べて異なる酵素活性を示すことを示唆している。Ｐ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ及びＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼは、Laminaria hyperborea及びMacrocystis pyiferaから抽出されたフコイダンを酵素的に分解することが可能であり、Saccharina japonicaを、ＭｆＦｃｎＡフカナーゼでは達成し得ない、より高い程度まで分解することができる。上記の２つの別個の泳動実験の間において結果が変動していることは、同じ種のものであっても異なる供給源から抽出されたフコイダンが、地理的又は季節的な変動に依りうる骨格構造上の僅かな差を示しうることを実証している。
【００５２】
本出願は、本明細書において考察されている方法、システムなどの種々の要素によって作製されたフカン組成物、並びに、当該組成物の使用方法並びに本明細書に記載の方法を実施し且つ前記所望のフカン組成物を得るように構成されているシステム及びデバイスなどもさらに対象とする。
【００５３】
部分リスト：
１００  原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物を前記原料フカン組成物の酵素加水分解によって得るための方法。
１１０  水溶液中に前記原料フカン組成物を提供すること。
１２０  溶液中において前記原料フカン組成物をフカナーゼと共にインキュベートして、前記の加水分解フカン組成物、前記フカナーゼ及び加水分解残余分子を含む溶液を生成すること。
１３０  前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから前記の加水分解フカン組成物を含む前記溶液を分離して、前記所望のフカン組成物を得ること。
【００５４】
本明細書において用いられる全ての用語は、特に文脈又は定義が明確に指示しない限り、それらの通常の意味に従って用いられる。また、特に明示的に示されない限り、本開示において、「又は」の使用は「及び」を含み、且つ、逆もまた同じである。非限定的な用語は、明示的に述べられない限り、又は特に文脈が明確に指示しない限り、限定的なものとして解釈されるものではない（例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、典型的には、「含むが、これに限定されるものではない（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｌｉｍｉｔａｔｉｏｎ）」を示す）。単数形、例えば、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」及び「前記（ｔｈｅ）」は、請求項におけるものを含め、明示的に述べられない限り、又は特に文脈で明確に別途示されない限り、複数の参照（ｐｌｕｒａｌ  ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）を含む。
【００５５】
特に断らない限り、実施形態の１つの特徴又は複数の特徴の条件又は関係特性を修飾する「実質的に」及び「約」などの本明細書における形容詞は、前記条件又は特性が、それが意図される適用のための実施形態の実施のために許容し得る許容範囲内に規定されることを示す。
【００５６】
本方法、本組成物、本システムなどの範囲は、ミーンズ・プラス・ファンクション概念及びステップ・プラス・ファンクション概念の両方を含む。しかし、請求項は、「手段」という語が請求項において具体的に記載されない限り「ミーンズ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈されるものではなく、「手段」という語が請求項において具体的に記載される場合には「ミーンズ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈される。同様に、請求項は、「ステップ」という語が請求項において具体的に記載されない限り「ステップ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈されるものではなく、「ステップ」という語が請求項において具体的に記載される場合には「ステップ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈される。
【００５７】
上文から、具体的な実施形態が例示の目的のために本明細書において考察されたが、本明細書における考察の精神及び範囲から逸脱することなく各種修正を為してもよいことは理解されよう。したがって、前記システム及び前記方法などは、かかる修正並びに本明細書において記載される主題の全ての順列及び組み合わせを含むものであって、添付の請求項又は本明細書における考察及び図における適切な裏付けを有する他の請求項によるものを除き、限定されるものではない。
【図１】
2021531791.tif 000017
【図２Ａ】
2021531791.tif 000018
【図２Ｂ】
2021531791.tif 000019
【図２Ｃ】
2021531791.tif 000020
【配列表】
2021531791000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和3年1月20日(2021.1.20)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
水溶液中のＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
【請求項２】
水溶液中のＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
【請求項３】
前記添加されたフカンは原料フカン組成物である、請求項１又は請求項２に記載の組成物。
【請求項４】
前記フカナーゼが、フカン中のグリコシド結合を加水分解できる条件にある、請求項１〜請求項３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
真核生物（eukaryotic entity）によって産生されるフカナーゼであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
【請求項６】
真核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
【請求項７】
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号５及び配列番号７のいずれか１つにおいて少なくとも１個のアミノ酸且つ５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
【請求項８】
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号６及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
【請求項９】
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌以外の原核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
【請求項１０】
前記原核生物が大腸菌（Escherichia Coli）である、請求項９に記載のフカナーゼ。
【請求項１１】
人工の水溶液中でＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼを使用してフカンを選択的に酵素的に加水分解することを含む方法。
【請求項１２】
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記フカンの平均分子量が少なくとも５％低下する、請求項１１又は請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも５％が加水分解される、請求項１１〜請求項１３のいずれか一項に記載の方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００６】
本方法、本システムなどは、所望の分子量分布を有する所望のフカン組成物を原料フカン組成物から得ること、並びに、かかる所望のフカン分子量分布を含む組成物、及びかかる組成物の使用の方法を含む。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４３】
前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離すること［１３０］は、タンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）フィルタを通して前記溶液を透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、前記の加水分解フカン組成物を含む溶液を、蒸留水、塩溶液及び緩衝液溶液のうちの少なくとも１つによって透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、前記所望のフカン組成物における所望の分子量よりも分子量カットオフが小さいＴＦＦフィルタを通して前記加水分解フカン組成物を含む溶液を透析濾過することを含みうる。前記透析濾過することは、分子量カットオフが５ｋＤａ、１０ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ、７０ｋＤａ又は１００ｋＤａのいずれかであるＴＦＦフィルタを通して溶液において前記加水分解フカン組成物を透析濾過することを含みうる。前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから加水分解された前記フカン組成物を含む前記溶液を分離すること［１３０］は、遠心分離、濾過及び沈降のうちの少なくとも１つを含みうる。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５６】
本方法、本組成物、本システムなどの範囲は、ミーンズ・プラス・ファンクション概念及びステップ・プラス・ファンクション概念の両方を含む。しかし、請求項は、「手段」という語が請求項において具体的に記載されない限り「ミーンズ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈されるものではなく、「手段」という語が請求項において具体的に記載される場合には「ミーンズ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈される。同様に、請求項は、「ステップ」という語が請求項において具体的に記載されない限り「ステップ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈されるものではなく、「ステップ」という語が請求項において具体的に記載される場合には「ステップ・プラス・ファンクション」関係を示すと解釈される。
本発明の例示的な態様を以下に記載する。
＜１＞
水溶液中のＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
＜２＞
水溶液中のＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼ及び添加されたフカンを含む組成物。
＜３＞
前記添加されたフカンは原料フカン組成物である、＜１＞又は＜２＞に記載の組成物。
＜４＞
ｐＨが約６．５〜９．０である、＜１＞〜＜３＞のいずれか一項に記載の組成物。
＜５＞
温度が約１５℃〜４０℃である、＜１＞〜＜４＞のいずれか一項に記載の組成物。
＜６＞
フカン中のグリコシド結合を前記フカナーゼが加水分解できる条件にある、＜１＞〜＜５＞のいずれか一項に記載の組成物。
＜７＞
真核生物（eukaryotic entity）によって産生されるフカナーゼであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
＜８＞
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号１及び配列番号３のいずれか１つにおいて１個以上且つ５％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
＜９＞
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号２及び配列番号４のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
＜１０＞
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌以外の原核生物（prokaryotic entity）によって産生されるフカナーゼであって、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる前記フカナーゼ。
＜１１＞
真核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
＜１２＞
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号５及び配列番号７のいずれか１つにおいて１個以上且つ５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
＜１３＞
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌によって産生されるフカナーゼであって、配列番号６及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
＜１４＞
Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓ属菌以外の原核生物によって産生されるフカナーゼであって、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む前記フカナーゼ。
＜１５＞
前記原核生物が大腸菌（Escherichia Coli）である、＜１０＞又は＜１４＞に記載のフカナーゼ。
＜１６＞
人工の水溶液中でＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼを使用してフカンを選択的に酵素的に加水分解することを含む方法。
＜１７＞
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、＜１６＞に記載の方法。
＜１８＞
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つにおいて３％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、＜１６＞に記載の方法。
＜１９＞
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つにおいて１％未満のコドンが置換された遺伝子配列によってコードされる、＜１６＞に記載の方法。
＜２０＞
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて５％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、＜１６＞に記載の方法。
＜２１＞
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて３％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、＜１６＞に記載の方法。
＜２２＞
前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼが、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つにおいて１％未満のアミノ酸が置換されたアミノ酸配列を含む、＜１６＞に記載の方法。
＜２３＞
前記フカンが、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一種から得たフコイダンである、＜１６＞に記載の方法。
＜２４＞
前記フカンが、Saccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一種から得たフコイダンである、＜１６＞に記載の方法。
＜２５＞
前記フカンの平均分子量が少なくとも５％低下する、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜２６＞
前記フカンの平均分子量が約１０％低下する、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜２７＞
前記フカンの平均分子量が約２０％低下する、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜２８＞
前記フカンの平均分子量が約３０％低下する、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜２９＞
前記フカンの平均分子量が約４０％低下する、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３０＞
前記フカンの平均分子量が約５０％低下する、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３１＞
前記フカンの平均分子量が約６０％低下する、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３２＞
前記フカンの平均分子量が約７０％低下する、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３３＞
前記フカンの平均分子量が約８０％低下する、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３４＞
前記フカンの平均分子量が約９０％低下する、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３５＞
前記フカンの平均分子量が約９５％低下する、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３６＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも５％が加水分解される、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３７＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも１０％が加水分解される、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３８＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも２０％が加水分解される、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜３９＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも３０％が加水分解される、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４０＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも４０％が加水分解される、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４１＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも５０％が加水分解される、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４２＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも６０％が加水分解される、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４３＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも７０％が加水分解される、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４４＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも８０％が加水分解される、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４５＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも９０％が加水分解される、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４６＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも９５％が加水分解される、＜１６＞〜＜２４＞のいずれか一項に記載の方法。
＜４７＞
原料フカン組成物に較べて低分子量である所望のフカン組成物を前記原料フカン組成物中のフカンの酵素加水分解によって得るための方法であって、
前記原料フカン組成物及びＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼを水溶液中に提供すること、
前記原料フカン組成物中のフカンを加水分解するのに十分な条件下で前記原料フカン組成物及び前記Ｐｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼをインキュベートして、加水分解フカン及び加水分解残余分子を生成すること、並びに
前記加水分解フカンを前記加水分解残余分子及び前記フカナーゼから分離して、前記の所望の分子量を有するフカン組成物を得ること
を含む方法。
＜４８＞
前記フカナーゼが、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４のいずれか１つの遺伝子配列によってコードされる、＜４７＞に記載の方法。
＜４９＞
前記フカナーゼが、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む、＜４７＞に記載の方法。
＜５０＞
前記フカンが、Adenocystis utricularis、Ascophyllum nodosum、Chorda filum、Cystoseirabies marina、Durvillaea antarctica、Ecklonia kurome、Ecklonia maxima、Eisenia bicyclis、Fucus evanescens、Fucus vesiculosis、Hizikia fusiforme、Himanthalia Elongata、Kjellmaniella crassifolia、Laminaria brasiliensis、Laminaria cichorioides、Laminaria hyperborea、Laminaria japonica、Laminaria saccharina、Lessonia trabeculata、Macrocystis pyrifera、Pelvetia fastigiata、Pelvetia Canaliculata、Saccharina japonica、Saccharina latissima、Sargassum stenophylum、Sargassum thunbergii、Sargassum confusum、Sargassum fusiforme及びUndaria pinnatifidaのうち少なくとも一種から得たものである、＜４７＞に記載の方法。
＜５１＞
前記フカンが、Saccharina japonica、Laminaria hyperborea、Macrocystis pyifera及びChorda filumのうち少なくとも一種から得たものである、＜４７＞に記載の方法。
＜５２＞
前記フカンの平均分子量が少なくとも５％低下する、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜５３＞
前記フカンの平均分子量が約１０％低下する、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜５４＞
前記フカンの平均分子量が約２０％低下する、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜５５＞
前記フカンの平均分子量が約３０％低下する、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜５６＞
前記フカンの平均分子量が約４０％低下する、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜５７＞
前記フカンの平均分子量が約５０％低下する、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜５８＞
前記フカンの平均分子量が約６０％低下する、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜５９＞
前記フカンの平均分子量が約７０％低下する、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６０＞
前記フカンの平均分子量が約８０％低下する、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６１＞
前記フカンの平均分子量が約９０％低下する、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６２＞
前記フカンの平均分子量が約９５％低下する、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６３＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも５％が加水分解される、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６４＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも１０％が加水分解される、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６５＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも２０％が加水分解される、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６６＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも３０％が加水分解される、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６７＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも４０％が加水分解される、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６８＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも５０％が加水分解される、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜６９＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも６０％が加水分解される、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜７０＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも７０％が加水分解される、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜７１＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも８０％が加水分解される、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜７２＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも９０％が加水分解される、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜７３＞
前記フカン中のグリコシド結合のうち少なくとも９５％が加水分解される、＜４７＞〜＜５１＞のいずれか一項に記載の方法。
＜７４＞
発現可能なＰ５ＡＦｃｎＡフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
＜７５＞
発現可能なＰ１９ＤＦｃｎＡフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
＜７６＞
発現可能なＰｓｙｃｈｒｏｍｏｎａｓフカナーゼ遺伝子を含む発現ベクター。
＜７７＞
発現可能な、配列番号１及び配列番号３のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列を含む発現ベクター。
＜７８＞
発現可能な、配列番号２及び配列番号４のいずれか１つにおいて５％未満のコドンが置換された遺伝子配列を含む発現ベクター。
＜７９＞
プラスミドである、＜７４＞〜＜７８＞のいずれか一項に記載の発現ベクター。
＜８０＞
原核発現プラスミド（prokaryotic-expression plasmid）である、＜７４＞〜＜７８＞のいずれか一項に記載の発現ベクター。
＜８１＞
前記原核発現プラスミドが大腸菌における発現のために構成されている、＜８０＞に記載の発現ベクター。
＜８２＞
真核発現プラスミド（eukaryotic-expression plasmid）である、＜７４＞〜＜７８＞のいずれか一項に記載の発現ベクター。
＜８３＞
＜７４＞〜＜８２＞のいずれか一項に記載の遺伝子を発現すること、及び前記遺伝子により発現された酵素を回収することを含む、前記酵素を作製する方法。
＜８４＞
＜７１＞〜＜８２＞のいずれか一項に記載の遺伝子配列を発現すること、及びかかる遺伝子から発現された酵素を回収することを含む、前記酵素を作製する方法。
＜８５＞
前記酵素がフカナーゼである、＜８３＞又は＜８４＞に記載の方法。
＜８６＞
＜７４＞〜＜８２＞のいずれか一項に記載の発現ベクターから得られたフカナーゼを提供すること、及び発現されたフカナーゼがフカンを加水分解するよう選択された条件下で前記フカナーゼを前記フカンと組み合わせることを含む、発現されたフカナーゼを使用する方法。
＜８７＞
前記フカンが原料フカン組成物中で提供される、＜８６＞に記載の方法。
＜８８＞
前記発現されたフカナーゼが前記フカン内のグリコシド結合を加水分解する、＜８６＞又は＜８７＞に記載の方法。

【国際調査報告】
2021531791.tif 000021
2021531791.tif 000022