(57)【要約】  本開示の菌株及び方法は、タンパク質の生産性が強化された表現型を含む糸状菌の変異菌株を生じさせる糸状菌における遺伝子改変に関する。より詳細には、本明細書に提示、記載及び例示するように、タンパク質生産性が強化された表現型を含むそのような糸状菌の変異菌株は、商業的用途の目的タンパク質の大量生産における等の、深部培養中における増殖のために適切である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
親細胞に由来する改変子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞であって、前記改変細胞は配列番号２、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む変異ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号４の８１３位に対応するアミノ酸配列でリシン（Ｋ）残基を含み、ここで前記改変細胞は、同一条件下で発酵させた場合に前記親細胞と比較してタンパク質生産性が強化された表現型を含む改変子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞。
【請求項２】
目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードするポリヌクレオチドを含む、請求項１に記載の改変細胞。
【請求項３】
配列番号１９のＮＩＫ１（Ｍ７４３Ｔ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物を含む、請求項１に記載の改変細胞。
【請求項４】
ＳＳＢ７、ＭＰＧ１  ＳＦＢ３、ＳＥＢ１、ＣＲＺ１、ＴＳＰ２及び／又はＧＡＳ１からなる群から選択されるタンパク質の前記発現／産生を欠失、破壊又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を含む、請求項１〜３の何れか一項に記載の改変細胞。
【請求項５】
前記子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種及びミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種から選択される、請求項１〜４の何れか一項に記載の改変細胞。
【請求項６】
前記親アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種細胞は、配列番号１１又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む、請求項５に記載の改変細胞。
【請求項７】
前記親ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種細胞は、配列番号１２又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む、請求項５に記載の改変細胞。
【請求項８】
前記親タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種細胞は、配列番号１３又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む、請求項５に記載の改変細胞。
【請求項９】
前記親フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種細胞は、配列番号１４又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む、請求項５に記載の改変細胞。
【請求項１０】
前記親ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種細胞は、配列番号１５又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む、請求項５に記載の改変細胞。
【請求項１１】
前記親ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種細胞は、配列番号１６又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む、請求項５に記載の改変細胞。
【請求項１２】
前記親カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種細胞は、配列番号１７又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む、請求項５に記載の改変細胞。
【請求項１３】
前記親トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種細胞は、配列番号２又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む、請求項５に記載の改変細胞。
【請求項１４】
請求項１〜１３の何れか一項に記載の前記改変細胞によって産生したＰＯＩ。
【請求項１５】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８の天然ＬＯＶタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズする野生型ポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む、親細胞に由来する改変子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞であって、ここで前記改変細胞は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８のＬＯＶタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズする改変ポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号４の８１３位に対応するアミノ酸配列でリシン（Ｋ）残基を含む改変子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞。
【請求項１６】
配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む変異ＬＯＶタンパク質をコードする、及び配列番号４の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でリシン（Ｋ）残基を含むポリヌクレオチド配列を含むベクター。
【請求項１７】
変異ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、前記変異タンパク質をコードする前記ポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８のＬＯＶタンパク質をコードする、及び配列番号４の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でリシン（Ｋ）残基を含む核酸配列とハイブリダイズするポリヌクレオチド。
【請求項１８】
親菌株に由来する突然変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株であって、前記突然変異菌株は、配列番号４又は配列番号１８との少なくとも７５％の配列同一性を含むＬＯＶ変異タンパク質をコードする遺伝子を含み、及び配列番号４の８１３位と対応する配列位置でリシン（Ｋ）残基を含む突然変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株。
【請求項１９】
前記突然変異菌株は、前記親菌株に比較してタンパク質生産性が強化された表現型を含む、請求項１８に記載の突然変異菌株。
【請求項２０】
配列番号１９のＮＩＫ１（Ｍ７４３Ｔ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物を含む、請求項１８又は１９に記載の突然変異菌株。
【請求項２１】
ＳＳＢ７、ＭＰＧ１  ＳＦＢ３、ＳＥＢ１、ＣＲＺ１、ＴＳＰ２及びＧＡＳ１からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子の発現／産生を欠失、破壊又は減少させる１つの遺伝子改変を含む、請求項１８〜２０の何れか一項に記載の突然変異菌株。
【請求項２２】
請求項１８〜２１の何れか一項に記載の突然変異菌株によって産生したＰＯＩ。
【請求項２３】
タンパク質生産性が強化された表現型を含む改変子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞を構築するための方法であって：
（ａ）親子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞を入手し、配列番号４の８１３位に対応する配列位置でリシン（Ｋ）残基を含むＬＯＶ変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物を前記細胞に導入するステップ、及び
（ｂ）ステップ（ａ）の前記改変細胞を単離するステップを含み、
前記改変細胞は、前記親細胞に比較してタンパク質生産性が強化された表現型を含む方法。
【請求項２４】
タンパク質生産性が強化された表現型を含む改変子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞を構築するための方法であって：
（ａ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８のＬＯＶタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズする野生型ｌｏｖ遺伝子を含む親細胞を入手するステップ、
（ｂ）配列番号２の８１３位に対応する配列位置でリシン（Ｋ）残基を含むＬＯＶ（変異）タンパク質をコードする遺伝子を含む改変細胞を産生するために、ステップ（ａ）の前記親細胞を改変するステップ、及び
（ｃ）ステップ（ｂ）の前記改変細胞を単離するステップを含み、
前記改変細胞は、前記親細胞に比較してタンパク質生産性が強化された表現型を含む方法。
【請求項２５】
配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む変異ＬＯＶタンパク質をコードする、及び配列番号４の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でリシン（Ｋ）残基を含むポリヌクレオチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、一般に、生物学、遺伝学、分子生物学、糸状菌、工業用タンパク質生産等の分野に関する。より特には、本開示の菌株及び方法は、タンパク質生産性が強化された表現型を含む糸状菌の変異菌株を生じさせる糸状菌における遺伝子改変に関する。より詳細には、本明細書に提示、記載及び例示するように、タンパク質生産性が強化された表現型を含む糸状菌のそのような変異菌株は、商業的用途の目的タンパク質の大量生産における等の、深部培養中における増殖のために適切である。
【０００２】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、２０１８年７月３０日に出願された米国仮特許出願第６２／７１１，８４６号に基づく優先権を主張するものである。
【０００３】
配列表の参照
「ＮＢ４１５０４−ＷＯ−ＰＣＴ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」との名称が付けられた配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、２０１９年７月２４日に作成されたものであり、サイズは１６０ＫＢであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
糸状菌（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種等）は、天然（内在性）タンパク質及び異種タンパク質を高レベルに発現させ、それらを医薬用途、動物健康用途、食品用途、飲料用途等の工業用及び／又は商業的用途のためのタンパク質（例えば、酵素）及び／又は代謝産物を大量生産するために適切にさせることができる。糸状菌は、典型的にはバイオリアクター（発酵槽）内の菌糸体用深部培養中において増殖させられ、そのバイオリアクターは、酸素及び栄養分を培養培地（即ち、培養ブロス）内に導入して分布させるために適合する。例えば、糸状菌トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）；真菌ハイポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）のアナモルフ）は、セルラーゼ酵素の効率的な生産体であることが知られている（例えば、国際公開第１９９８／１５６１９号パンフレット、同第２００５／０２８６３６号パンフレット、同第２００６／０７４００５号パンフレット、同第１９９２／０６２２１号パンフレット、同第１９９２／０６２０９号パンフレット、同第１９９２／０６１８３号パンフレット及び同第２００２／１２４６５パンフレットを参照されたい）。
【０００５】
従って、糸状菌は、セルロース（由来）エタノール、繊維加工、穀物加工、洗剤、繊維、食品添加物、飼料添加物等の生活必需品の製造に貴重であるタンパク質を産生する能力を有するために利用されてきた。例えば、そのような真菌宿主菌株における組換え遺伝子発現は、タンパク質の（即ち、工業目的及び商業目的の）生産のための一般的方法であるので、従って、真菌宿主菌株のタンパク質生産性の改善は、タンパク質生産コストの重要な経済的因子である。従って、当業者であれば理解できるように、糸状菌株におけるタンパク質産生を強化するためのそのような組成物及び方法には、商業的関心が極めて高い。
【０００６】
本明細書で記載する、一般に、タンパク質の生産性を強化／増加する表現型を含む遺伝子改変糸状菌株に関する本開示は、当分野におけるそのような進行中であり、満たされていないニーズを解決する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
本明細書で記載するのは、タンパク質生産性が強化された表現型を有する糸状菌に関連する菌株、細胞、方法、構築物等である。従って、本開示の所定の実施形態は、親細胞に由来する改変子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞であって、ここで改変細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含み、配列番号４の８１３位に対応するアミノ酸配列でリシン（Ｋ）残基を含む変異ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、ここで改変細胞は、例えば、同一条件下で発酵／培養された場合に、親細胞と比較してタンパク質生産性が強化された表現型を含む改変子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞に関する。所定の実施形態では、親細胞は、配列番号２、配列番号４、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードする野生型ポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【０００８】
関連実施形態では、真菌細胞は、目的タンパク質（ＰＯＩ）をコードする異種ポリヌクレオチドを更に含む。他の実施形態では、細胞は、配列番号１９のＮＩＫ１（Ｍ７４３Ｔ）タンパク質をコードするポリヌクレオチドを更に含む。所定の他の実施形態では、改変細胞は、ＭＰＧ１  ＳＦＢ３、ＳＥＢ１、ＣＲＺ１、ＴＳＰ２、ＳＳＢ７及びＧＡＳ１からなる群から選択されるタンパク質の発現／産生を欠失、破壊又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を更に含む。
【０００９】
他の実施形態では、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種及びミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種から選択される。
【００１０】
従って、所定の実施形態では、親アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種細胞は、配列番号１１又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００１１】
別の実施形態では、親ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種細胞は、配列番号１２又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。他の実施形態では、親タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種細胞は、配列番号１３又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００１２】
更に別の実施形態では、親フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種細胞は、配列番号１４又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００１３】
所定の他の実施形態では、親ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種細胞は、配列番号１５又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００１４】
他の実施形態では、親ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種細胞は、配列番号１６又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００１５】
別の実施形態では、親カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種細胞は、配列番号１７又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００１６】
所定の他の実施形態では、親トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種細胞は、配列番号２又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００１７】
他の実施形態では、目的タンパク質は、本開示の改変細胞によって産生され、それから精製される。
【００１８】
更に他の実施形態では、本開示は、配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８の天然ＬＯＶタンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする野生型ポリヌクレオチド配列を含む、及び配列番号２の８１３位に対応する位置のアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む親細胞に由来する改変子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞であって、ここで改変細胞が、配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８のＬＯＶタンパク質をコードする核酸配列とストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズする改変ポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号４の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でリシン（Ｋ）残基を含む改変子嚢菌（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞に関する。所定の実施形態では、細胞は、目的タンパク質をコードする異種ポリヌクレオチドを更に含む。別の実施形態では、細胞は、配列番号１９のＮＩＫ１（Ｍ７４３Ｔ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物を更に含む。他の実施形態では、細胞は、ＭＰＧ１  ＳＦＢ３、ＳＥＢ１、ＣＲＺ１、ＴＳＰ２、ＳＳＢ７及びＧＡＳ１からなる群から選択されるタンパク質の発現／産生を欠失、破壊又は減少させる少なくとも１つの遺伝子改変を更に含む。
【００１９】
所定の他の実施形態では、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種及びミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種から選択される。
【００２０】
所定の実施形態では、親アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種細胞は、配列番号１１又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００２１】
他の実施形態では、親ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種細胞は、配列番号１２又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００２２】
他の実施形態では、親タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種細胞は、配列番号１３又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００２３】
所定の他の実施形態では、親フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種細胞は、配列番号１４又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００２４】
別の実施形態では、親ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種細胞は、配列番号１５又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００２５】
更に他の実施形態では、親ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種細胞は、配列番号１６又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００２６】
所定の他の実施形態では、親カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種細胞は、配列番号１７又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。
【００２７】
他の実施形態では、親トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種細胞は、配列番号２又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む天然ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を含み、及び配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む。他の実施形態は、本開示の改変細胞により産生する目的タンパク質に関する。
【００２８】
本開示の所定の他の実施形態は、配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含む変異ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む、及び配列番号４の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でリシン（Ｋ）残基を含むベクターに関する。
【００２９】
他の実施形態では、本開示は、配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含み、及び配列番号４の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でリシン（Ｋ）残基を含む変異ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドに向けられる。
【００３０】
別の実施形態では、本開示は、変異ＬＯＶタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、ここで変異タンパク質をコードするポリヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８のＬＯＶタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズし、及び配列番号４の８１３位に対応するアミノ酸配列位置でリシン（Ｋ）を含むポリヌクレオチドに向けられる。
【００３１】
他の実施形態では、本開示は、親菌株に由来する突然変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株であって、ここで突然変異菌株は、配列番号４又は配列番号１８との少なくとも５０％の配列同一性を含み、及び配列番号４の８１３位と対応する配列位置でリシン（Ｋ）残基を含むＬＯＶ変異タンパク質をコードする遺伝子を含む突然変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株に向けられる。所定の実施形態では、突然変異菌株は、親菌株に比較してタンパク質生産性が強化された表現型を含む。他の実施形態では、突然変異菌株は、配列番号１９のＮＩＫ１（Ｍ７４３Ｔ）タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物を更に含む。他の実施形態では、突然変異菌株は、ＭＰＧ１  ＳＦＢ３、ＳＥＢ１、ＣＲＺ１、ＴＳＰ２、ＳＳＢ７及びＧＡＳ１からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質をコードする遺伝子の発現／産生を欠失、破壊又は減少させる遺伝子改変を更に含む。従って、所定の関連実施形態は、突然変異菌株によって産生する目的タンパク質に向けられる。
【００３２】
本開示の他の実施形態は、タンパク質生産性が強化された表現型を含む改変子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞を構築するための方法であって：（ｉ）ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で配列番号２、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４、配列番号１５、配列番号１６、配列番号１７又は配列番号１８のＬＯＶタンパク質をコードする核酸配列とハイブリダイズする野生型ｌｏｖ遺伝子を含む親細胞を入手するステップ、（ｉｉ）配列番号２の８１３位に対応する配列位置でリシン（Ｋ）残基を含むＬＯＶ（変異）タンパク質をコードする遺伝子を含む改変細胞を産生するためにステップ（ｉ）の親細胞を改変するステップ、及び（ｉｉｉ）ステップ（ｉｉ）の改変細胞を単離するステップを含み、改変細胞が、親細胞と比較してタンパク質生産性が強化された表現型を含む方法に関する。
【００３３】
他の実施形態では、本開示は、タンパク質生産性が強化された表現型を含む改変子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｕｙｃｏｔａ）細胞を構築するための方法であって：（ｉ）親子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞を入手し、その細胞に配列番号４の８１３に対応する配列位置でリシン（Ｋ）残基を含むＬＯＶ変異タンパク質をコードするポリヌクレオチド構築物を導入するステップ、及び（ｉｉ）ステップ（ｉ）の改変細胞を単離するステップを含み、改変細胞が、親細胞と比較してタンパク質生産性が強化された表現型を含む方法に向けられる。
【００３４】
従って、本明細書に提示及び記載するように、本開示の様々な実施形態は、一般に、変異菌株が、商業的用途の目的タンパク質の大量生産における等の深部培養中における増殖のために適切である、タンパク質生産性が強化された表現型を含む糸状菌の変異菌株に関する。
【００３５】
生物学的配列の簡単な説明
配列番号１は、配列番号２の（天然）ＬＯＶタンパク質をコードする野生型トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ｌｏｖ遺伝子の核酸配列である。
【００３６】
配列番号２は、配列番号１によってコードされた（天然）ＬＯＶタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３７】
配列番号３は、配列番号４の（変異）Ｔ８１３Ｋ（置換）ＬＯＶタンパク質をコードする「ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種突然変異対立遺伝子の核酸配列である。
【００３８】
配列番号４は、配列番号３によってコードされた（変異）Ｔ８１３Ｋ（置換）ＬＯＶタンパク質のアミノ酸配列である。
【００３９】
配列番号５は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ＭＰＧ１タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４０】
配列番号６は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ＳＥＢ１タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４１】
配列番号７は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ＳＦＢ３タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４２】
配列番号８は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ＣＲＺ１タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４３】
配列番号９は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ＧＡＳ１タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４４】
配列番号１０は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ＴＰＳ２タンパク質のアミノ酸配列である。
【００４５】
配列番号１１は、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種ＬＯＶタンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００４６】
配列番号１２は、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種ＬＯＶタンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００４７】
配列番号１３は、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種ＬＯＶタンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００４８】
配列番号１４は、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種ＬＯＶタンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００４９】
配列番号１５は、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種ＬＯＶタンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００５０】
配列番号１６は、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種ＬＯＶタンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００５１】
配列番号１７は、カンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種ＬＯＶタンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【００５２】
配列番号１８は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種（天然）ＬＯＶタンパク質（配列番号２）のＣ末端アミノ酸残基５００〜８９４位を含む。
【００５３】
配列番号１９は、配列番号１９のアミノ酸（残基）７４３位でメチオニン（Ｍ）からトレオニン（Ｔ）への置換を含む変異トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ヒスチジンキナーゼ（ＮＩＫ１）のアミノ酸配列である。配列番号１９の変異ＮＩＫ１ヒスチジンキナーゼをコードする遺伝子は、「ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）」と命名されている。
【００５４】
配列番号２０は、配列番号２１の天然ＳＳＢ７タンパク質をコードする野生型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ｓｓｂ７遺伝子の核酸配列である。
【００５５】
配列番号２１は、配列番号２０によってコードされた天然Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）ＳＳＢ７タンパク質のアミノ酸配列である。
【００５６】
配列番号２２は、フレームシフト（ｆｓ）突然変異及びｓｓｂ７遺伝子の最終イントロンの前の未成熟終止コドンを生じさせる、エキソン２におけるＧの欠失（ΔＧ）を含む対立遺伝子ｓｓｂ７（ｆｓ）の核酸配列である。
【００５７】
配列番号２３は、配列番号２２の対立遺伝子ｓｓｂ７（ｆｓ）によってコードされた変異ＳＳＢ７タンパク質のアミノ酸配列である。
【００５８】
配列番号２３は、トリコデルマ・ハルジアヌム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｈａｒｚｉａｎｕｍ）ＬＯＶタンパク質オルソログのアミノ酸配列である。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
【図１】Ｂ７ｍｓ１（親）菌株（図１、グレーのデータポイント／グレーの線）及び突然変異体由来（娘）Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２菌株（図１、黒色のデータポイント／黒色の線）を発現するグルコアミラーゼについての供給糖類に対する全タンパク質収率の比較を示す図である。従って、（ｍｐｇ１遺伝子及びｓｅｂ１遺伝子における粘度を減少させる突然変異を含む）菌株を発現するこれらのグルコアミラーゼ（ＧＡ）を発酵槽内でタンパク質生産性について評価した。図の説明文では、菌株の名称（遺伝子型については、表１を参照されたい）、その後に各線のタイプ毎の括弧内にその菌株内のｌｏｖ対立遺伝子が示されている。図１に示したように、Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２（娘）菌株（図１、黒色の線；即ち、突然変異ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子）を含む）は、Ｂ７ｍｓ１（親）菌株（図１、グレーの線；即ち、野生型ｌｏｖ遺伝子を含む）に比較してタンパク質生産性が強化された表現型を有する。例えば、図１に示したように、供給糖類に対するタンパク質収率は、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）突然変異が存在する場合には４４％増加した。
【００６０】
【図２】ＬＯＶタンパク質のアミノ酸保存を例示しているグラフ表示である。より詳細には、図２は、６９１個のチャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）ホモログのＧｅｎｅｉｏｕｓ多重配列アラインメントのグラフ提示である。図２の底部には、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ＬＯＶタンパク質アミノ酸配列を示すボックスを示したが、ここでアミノ酸（残基）は、アラインメントされた配列の９９％超が保存されている場合は黒色の影付き（又はさもなければグレー）ボックス内に示した。ＬＯＶ残基数（配列番号２）は、配列提示の上方に提示した。図２に提示したように、多重配列アラインメントにおけるトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ＬＯＶ配列又はさもなければ２％超の配列中に存在するアミノ酸配列ギャップは、グレーの影付き線で示した。ＬＯＶ（ＸＰ＿００６９６７３２４．１）についての公衆ＧｅｎＢａｎｋ配列における注釈は、グレーのボックスとしての配列提示の下方に示した。ＬＯＶについてのＧｅｎＢａｎｋエントリーに注釈されている推定活性部位残基は、配列提示の下方に黒色のボックスとして示した。菌株Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２内でリシン（Ｋ）と置換されたトレオニン（Ｔ）８１３残基は、ライトグレーのボックスで注釈した。平均疎水性及び等電点（ＰＩ）も又図２にプロット及び提示した。アラインメントにおけるアミノ酸同一性は、配列の直ぐ上にプロットした。ライトグレーのバーは、アラインメントにおいて少なくとも３０％の配列と同一である残基を提示し、より濃いグレーのバーは３０％未満の配列と同一である残基を表している。
【００６１】
【図３】Ｔ４ｍｓ菌株（グレーの線）及び遺伝子組換えｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を含む突然変異誘導体Ｔ４ｍｌｓ（黒色の線）を産生する全セルラーゼについての発酵槽内の供給糖類に対する全タンパク質の収率の比較を提示する図である。より特別には、図３は、低細胞密度（ＬＣＤ、破線、丸）及び高細胞密度（ＨＣＤ、実線、四角形）両方の発酵条件下でのこれらの菌株についての供給糖類に対する全タンパク質の収率を提示する図である。図の説明文は、発酵条件（ＬＣＤ対ＨＣＤ）、その後に菌株名（遺伝子型については、表１を参照されたい）を提示しており、存在するｌｏｖ対立遺伝子は、括弧内に示した。従って、図３に提示したように、ＬＣＤ（破線、丸）及びＨＣＤ（実線、四角形）の両方の発酵条件下で、Ｔ４ｍｌｓ菌株（図３、黒色の線；即ち、突然変異ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子）を含む）は、Ｔ４ｍｓ菌株（図３、グレーの線；即ち、野生型ｌｏｖ遺伝子）に比較してタンパク質生産性が強化された表現型を有する。例えば、図３に示したように、供給糖類に対するタンパク質収率は、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）突然変異が存在する場合には４２％（ＬＣＤ）及び３２％（ＨＣＤ）増加した。
【００６２】
【図４】菌株Ｔ４ｍ（実線、四角形）及びＴ４ｓ（破線、丸）を産生する全セルラーゼと野生型ｌｏｖ対立遺伝子（グレーの線）及び遺伝子組換えｌｏｖ（ｄｉｓ）対立遺伝子（黒い線）を含むそれらの突然変異誘導体Ｔ４ｍｌ＋（実線、四角形）及びＴ４ｓｌ＋（破線、丸）各々との発酵槽内での供給糖類に対する全タンパク質の収率の比較を提示する図である。図の説明文では、菌株の名称（遺伝子型については、表１を参照されたい）、その後に各線のタイプ毎の括弧内にその菌株内のｌｏｖ対立遺伝子が示されている。図４に示したように、Ｔ４ｍｌ＋及びＴ４ｓｌ＋（娘）菌株（図４、黒色の線；即ち、突然変異ｌｏｖ（ｄｉｓ）対立遺伝子）を含む）は、それらのＴ４ｍ及びＴ４ｓ（親）菌株（図４、グレーの線；即ち、野生型ｌｏｖ遺伝子を含む）に比較してタンパク質生産性が強化された表現型を有さない。
【００６３】
【図５】菌株の振とうフラスコ発酵槽内でのｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子、ｌｏｖ（ｄｉｓ）対立遺伝子若しくは野生型ｌｏｖ（＋）対立遺伝子何れかとの様々なマーカー挿入部位の相対全タンパク質力価の比較を提示する図である。より特別には、全セルラーゼ産生菌株を振とうフラスコ内で全タンパク質力価について並行してＴ４菌株及びＴ４ｍ菌株ランと比較して評価した。様々なマーカー挿入部位の菌株を発酵槽内で野生型ｌｏｖ（＋）対立遺伝子（図５、最も明るいグレーのバー）、突然変異ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子（図５、中程度に明るいグレーのバー）又はｌｏｖ（ｄｉｓ）対立遺伝子（図５、最も濃いグレーのバー）何れかと比較した。従って、評価した全マーカー挿入部位では、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子が存在する場合は、全タンパク質力価が上昇した。しかしながら、ｌｏｖ遺伝子自体（ｌｏｖ（ｄｉｓ）対立遺伝子）内へのｐｙｒ４（図５、菌株「４１Ｇ」）又はｐｙｒ２マーカー（菌株Ｔ４及びＴ４ｍ）の何れの挿入も相対力価における有意な向上を全く示さなかった。
【００６４】
【図６】Ｔ４ｍｐ菌株（図６、グレーのデータポイント／グレーの線）及びｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）突然変異Ｔ４ｍｌｐ菌株（図６、黒色のデータポイント／黒色の線）を生産する全セルラーゼについての供給糖類に対する全タンパク質収率の比較を示す図である。従って、これらの全セルラーゼ発現菌株を発酵槽内でのタンパク質生産性について評価した。図の説明文では、菌株の名称（遺伝子型については、表１を参照されたい）、その後に各線のタイプ毎の括弧内にその菌株内のｌｏｖ対立遺伝子が示されている。図６に示したように、Ｔ４ｍｌｐ菌株（図６、黒色の線；即ち、突然変異ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子）を含む）は、Ｔ４ｍｐ（親）菌株（図６、グレーの線；即ち、野生型ｌｏｖ遺伝子を含む）に比較してタンパク質生産性が強化された表現型を有する。例えば、図６に示したように、供給糖類に対するタンパク質収率は、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）突然変異が存在する場合には２８％増加した。
【００６５】
【図７】７つの異なる子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）ＬＯＶオルソログとアラインメントさせた、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種（天然）ＬＯＶタンパク質（配列番号２）のＣｌｕｓｔａｌ  Ｗ（１．８３）多重配列アラインメントを提示する図である。例えば、図７Ａ〜７Ｂ（配列番号２及び配列番号１１〜１７）にはＣｌｕｓｔａｌアラインメントで使用された８個のタンパク質配列が示され、図７Ｃ〜７Ｆには同一物のＣｌｕｓｔａｌアラインメントを示した。より特別には、図７Ｃ〜７Ｆに提示したように、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種（天然）ＬＯＶタンパク質（配列番号２；表示「２」、残基はボールド体の大文字で表記）がアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１１、表示「１１」）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１２、表示「１２」）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１３、表示「１３」）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１４、表示「１４」）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１５、表示「１５」）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１６、表示「１６」）及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１７、表示「１７」）とアラインメントされている。図７Ｃ〜７Ｆ（即ち、アラインメントされたアミノ酸残基の下方）に示したように、星印「＊」は、単一の十分に保存された残基を有する位置を示している；コロン「：」は、類似性が強い特性の群間の保存（即ち、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ  ２５０  ｍａｔｒｉｘにおける＞０．５のスコアリング）を示しておりピリオド「．」は、類似性が弱い特性の群間の保存（即ち、Ｇｏｎｎｅｔ  ＰＡＭ  ２５０  ｍａｔｒｉｘにおける＞０．５のスコアリング）を示している。高度に保存されたトレオニン（Ｔ）アミノ酸は、図７Ｆにおいてボールド体の下線付きＴ残基として示されている。
【００６６】
【図８】（天然）トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ＬＯＶタンパク質配列（配列番号２）のＣ末端残基５００〜８９４位（配列番号１８）を使用した、ＢＬＡＳＴタンパク質アラインメント（ＮＣＢＩ；Ｂｌａｓｔｐ  ｓｕｉｔｅ）を介して実施したアミノ酸配列アラインメントを提示する図である。例えば、図８Ａ〜８Ｇに示したように、配列番号１８は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種（天然）ＬＯＶタンパク質のＣ末端アミノ酸配列（即ち、配列番号２のアミノ酸残基５００〜８９４位に対応する、３９４のアミノ酸残基位置を含む）を含むが、ここで８１３位（Ｔ８１３）での高度に保存されたトレオニン（Ｔ）アミノ酸残基は、ボールド体の下線付きＴで示されている。従って、この３９４残基Ｃ末端アミノ酸配列（配列番号１８）は、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）ＬＯＶタンパク質オルソログ（例えば、配列番号１１〜１７；図８Ａ〜８Ｇ）と整列している。図８Ａに示したように、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１１）は、配列番号１８との約５０％のアミノ酸配列同一性を含むが、ここで配列番号２の８１３位に対応する配列位置にある高度に保存されたトレオニン（Ｔ）アミノ酸はボールド体の下線付きで示され（図８Ａ）、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１２）は、配列番号１８との約５０％のアミノ酸配列同一性を含むが、ここで配列番号２の８１３位に対応する配列位置にある高度に保存されたトレオニン（Ｔ）アミノ酸はボールド体の下線付きで示され（図８Ｂ）、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１３）は、配列番号１８との約６０％のアミノ酸配列同一性を含むが、ここで配列番号２の８１３位に対応する配列位置にある高度に保存されたトレオニン（Ｔ）アミノ酸はボールド体の下線付きで示され（図８Ｃ）、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１４）は配列番号１８との約８８％のアミノ酸配列同一性を含むが、ここで配列番号２の８１３位に対応する配列位置にある高度に保存されたトレオニン（Ｔ）アミノ酸はボールド体の下線付きで示され（図８Ｄ）、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１５）は配列番号１８との約９０％のアミノ酸配列同一性を含むが、ここで配列番号２の８１３位に対応する配列位置にある高度に保存されたトレオニン（Ｔ）アミノ酸はボールド体の下線付きで示され（図８Ｅ）、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１６）は、配列番号１８との約９０％のアミノ酸配列同一性を含むが、ここで配列番号２の８１３位に対応する配列位置にある高度に保存されたトレオニン（Ｔ）アミノ酸はボールド体の下線付きで示され（図８Ｆ）及びカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種ＬＯＶタンパク質オルソログ（配列番号１７）は配列番号１８との約５０％のアミノ酸配列同一性を含むが、ここで配列番号２の８１３位に対応する配列位置にある高度に保存されたトレオニン（Ｔ）アミノ酸はボールド体の下線付きで示されている（図８Ｇ）���
【発明を実施するための形態】
【００６７】
本明細書に規定及び記載したように、本開示は、糸状菌タンパク質の生産及び生産方法であって、タンパク質生産性が強化された表現型を含む糸状菌の変異菌株を生じさせる糸状菌における遺伝子改変を含むがそれには限定されない糸状菌タンパク質の生産及び生産方法の分野における所定の進行中の未だ満たされていないニーズを取り扱う。より詳細には、本明細書に提示、記載及び例示するように、タンパク質生産性が強化された表現型を含むそのような糸状菌の変異菌株は、商業的用途の目的タンパク質の大量生産における等の、深部培養中における増殖のために適切である。
【００６８】
Ｉ．定義
本菌株及び方法を詳細に説明する前に、明確にするために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、当該技術分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するはずである。他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明の組成物及び方法が属する分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。
【００６９】
本明細書に記載した操作、構築及び使用のための糸状菌細胞は、一般に、子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、チャワンタケ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、特に栄養菌糸状態を有する真菌に由来する。そのような生物としては、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ゲオスミチア（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種等を含むがそれらに限定されない、商業的に重要な工業用及び製薬用タンパク質を製造するために使用される糸状菌細胞が挙げられる。例えば、所定の実施形態では、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（以前はトリコデルマ・ロンギブラチアツム（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｌｏｎｇｉｂｒａｃｈｉａｔｕｍ）及びヒポクレア・ジェコリナ（Ｈｙｐｏｃｒｅａ  ｊｅｃｏｒｉｎａ）として分類されていた）、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・フミガツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｆｕｍｉｇａｔｕｓ）、アスペルギルス・イタコニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｉｔａｃｏｎｉｃｕｓ）、アスペルギルス・オリザエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギルス・ニデユランス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペルギルス・テレウス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｔｅｒｒｅｕｓ）、アスペルギルス・ソーヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ジャポニクス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、ニューロスポラ・クラッサ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ  ｃｒａｓｓａ）、ペニシリウム・フニクロスム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｆｕｎｉｃｕｌｏｓｕｍ）、ペニシリウム・クリソゲヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ  ｃｈｒｙｓｏｇｅｎｕｍ）、タラロマイセス（ゲオスミチア）・エメルソニイ（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）ｅｍｅｒｓｏｎｉｉ）、フザリウム・ベネナツム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ  ｖｅｎｅｎａｔｕｍ）、ミセリオフトラ・テルモフィラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）及びクリソスポリウム・ルクノウエンセ（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ  ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ）（Ｃ１）等を含むがそれらに限定されない糸状菌細胞及びそれらの菌株が挙げられる。
【００７０】
本明細書で使用する、例えば「糸状菌の菌株（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  ｓｔｒａｉｎ（ｓ））」、「糸状菌株（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇａｌ  ｓｔｒａｉｎ（ｓ））」、「真菌株（ｆｕｎｇｕｓ  ｓｔｒａｉｎ（ｓ））」、「真菌の菌株（ｆｕｎｇａｌ  ｓｔｒａｉｎｓ（ｓ））」、「糸状菌細胞（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇｕｓ  ｃｅｌｌ（ｓ））」、「糸状菌細胞（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ  ｆｕｎｇａｌ  ｃｅｌｌ（ｓ））」、「真菌細胞（ｆｕｎｇｕｓ  ｃｅｌｌ（ｓ））」、「真菌細胞（ｆｕｎｇａｌ  ｃｅｌｌ（ｓ））」等の用語及び語句は、説明の便宜性のために互換的に使用することができ、本開示の範囲を限定することは意図されていない。
【００７１】
所定の実施形態では、本明細書に記載した操作、構築及び使用のための糸状菌細胞は、一般に子嚢菌門（ｐｈｙｌｕｍ  Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）、チャワンタケ亜門（ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ  Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）、特に栄養菌糸状態を有し、ｌｏｖ遺伝子（又は遺伝子ホモログ）を含む真菌に由来する。
【００７２】
本明細書で使用する語句「親細胞」、「親真菌細胞」、「親菌株」、「親真菌株」、「糸状菌細胞の親菌株」、「参照菌株」等は、互換的に使用することができ、「未改変」親糸状菌細胞を意味する。例えば、「糸状菌細胞の親菌株」は、その中で「親」細胞のゲノムが、「親」及び「娘」細胞が唯一の遺伝子改変によってのみ相違するように糸状菌細胞の変異（娘）菌株を生成するために（例えば、親細胞内に導入された唯一の遺伝子改変によって）改変されている、又は改変可能である糸状菌の任意の細胞若しくは菌株を意味する。
【００７３】
本明細書で使用する語句「変異細胞」、「娘細胞」、「変異菌株」、「娘菌株」、「変異若しくは娘真菌株」、「糸状菌細胞の変異若しくは娘菌株」等は、同じ意味で用いられ、糸状菌細胞の親（若しくは参照）菌株に由来する（即ち、〜から得られた（ｏｂｔａｉｎｅｄ  ｆｒｏｍ）、又は〜から得ることができる（ｏｂｔａｉｎａｂｌｅ  ｆｒｏｍ））変異菌株を意味するが、ここで変異菌株は、比較によって、「親」及び「変異」菌株間の表現型の差を１つの遺伝子改変に帰せることができるように、親菌株内に存在しない唯一の遺伝子改変を含む。これを言い換えると、親菌株及び変異菌株は、変異菌株に「導入された」単一の遺伝子改変を除くと、他の点では同質遺伝子系である。従って、本開示では、親及び変異菌株は、遺伝子改変、発現表現型、形態表現型等の所定の特徴を有すると記載することができる；しかし、当業者であれば、それが技術的にはそのような特徴を有する親若しくは変異菌株の細胞であること、及び便宜上「菌株」と呼ばれることを理解するであろう。
【００７４】
所定の実施形態では、未改変（親）細胞は、特に、それらに由来する遺伝子改変（変異／娘）細胞と（に対して）比較した場合に、特に「コントロール細胞」若しくは「参照細胞」と呼ぶことができる。
【００７５】
本明細書中で使用する用語「野生型」及び「天然」は、互換的に使用され、天然において見出される遺伝子、タンパク質、タンパク質ミックス又は菌株を指す。
【００７６】
本明細書で使用する本開示の所定のトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）菌株／細胞は、下記の表１に規定したように命名／略記されてきた。
【表１】
2021532775.tif 000003
【００７７】
本明細書で使用する粘度が低下したトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株「Ｂ７ｍｓ１」は、国際公開第２０１２／１４５５８４号パンフレット（本明細書に全体として参照により組み込まれる）において「Ｍｏｒｐｈ  ＴｒＧＡ  ７７Ｂ７Δｍｐｇ１Δｓｅｂ１」と称されているグルコアミラーゼ発現菌株である。
【００７８】
本明細書で使用するゲノム座標（例えば、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １６上の４２５３９３）及びタンパク質識別番号（ＰＩＤ、例えばＰＩＤ  ５０２１２）は、米国エネルギー省の共同ゲノム研究所（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＪＧＩ））によって生成されたトリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）ＱＭ６ａゲノム配列アセンブリーのバージョン２を参照している（Ｔｈｅ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｏｒｔａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｅｎｅｒｇｙ  Ｊｏｉｎｔ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｇｒｉｇｏｒｉｅｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ  ２０１２  Ｊａｎ；４０（Ｄａｔａｂａｓｅ  ｉｓｓｕｅ）：Ｄ２６−３２．ｄｏｉ：１０．１０９３／ｎａｒ／ｇｋｒ９４７）。ＪＧＩが組み立てたＳｃａｆｆｏｌｄ配列は、更に、ヌクレオチドアクセッション番号ＧＬ９８５０５６．１〜ＧＬ９８５１３２．１を付してＧｅｎＢａｎｋ（米国国立生物工学情報センター（Ｔｈｅ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ））に預託されている。
【００７９】
本明細書で使用する、「Ｂ７ｍｓ１〜ＳＦ１２」と命名された突然変異（変異）トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株（Ｂ７ｍｓ１親菌株に由来する）は、タンパク質生産性が上昇した（即ち、Ｂ７ｍｓ１（親）菌株と比較して）表現型を含む。より特別には、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２菌株において同定された突然変異は、ＬＯＶ（即ち、予測タンパク質ＰＩＤ  ５０２１２；配列番号２）と命名されたタンパク質のコーディング配列を変化させるが、ここで（天然）ＬＯＶタンパク質（配列番号２）の残基８１３位（Ｔ８１３）にある高度に保存されたトレオニン（Ｔ）アミノ酸は（突然変異）Ｂ７ｍｓ１〜ＳＦ１２菌株（即ち、Ｔ８１３Ｋ置換、例えば、配列番号４の８１３位に対して配列番号２の８１３位で）のリシン（Ｔ→Ｋ８１３）で置換された。例えば、下記の実施例のセクションで記載するように、菌株Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２内のｌｏｖ突然変異対立遺伝子は、スカフォールド１６上の４２５３９３でＧ（グアニン）からＴ（チミン）への単一ヌクレオチド変化を含み、これにより（配列番号２のアミノ酸８１３位でトレオニン（Ｔ）を含む、配列番号２の天然ＬＯＶタンパク質とは対照的に）配列番号４のアミノ酸８１３位でリシン（Ｋ）を含むコードされたＬＯＶ（変異）タンパク質（配列番号４）における「Ｔ８１３Ｋ」置換を生じさせる。
【００８０】
本明細書で使用する「Ｔ４」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は、国際公開第２０１６／１３０５２３号パンフレット（本明細書に参照により全体として組み込まれる）に記載されたように、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）突然変異及び化学的突然変異誘発の組込みによってトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株ＲＬ−Ｐ３７に由来した。
【００８１】
本明細書で使用する「ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）」と命名された遺伝子対立遺伝子は、配列番号１９のアミノ酸（残基）７４３位でメチオニン（Ｍ）からトレオニン（Ｔ）への置換を含む変異ヒスチジンキナーゼ（ＮＩＫ１；配列番号１９）をコードする突然変異ヒスチジンキナーゼ遺伝子（ｎｉｋ１）を含む。
【００８２】
本明細書で使用する「Ｔ４＿ｐｙｒ２」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は、ｐｙｒ２遺伝子の突然変異及び機能消失によってトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株Ｔ４に由来したが、ここで形質転換選択マーカーとして使用され得る。
【００８３】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４に由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍは、ｍｐｇ１遺伝子（Δｍｐｇ１）及びｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）遺伝子の突然変異を含む。従って菌株Ｔ４ｍは、天然ｌｏｖタンパク質（配列番号２）をコードする野生型ｌｏｖ対立遺伝子（即ち、対立遺伝子ｌｏｖ（＋））を含む。
【００８４】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍ＿ｐｙｒ２」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｍに由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍ＿ｐｙｒ２は、ｍｐｇ１遺伝子（Δｍｐｇ１）及びｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）遺伝子の突然変異を含むが、機能性ｐｙｒ２遺伝子を含まない。
【００８５】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍ＋」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｍ＿ｐｙｒ２に由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍｌ＋は、ｍｐｇ１遺伝子（Δｍｐｇ１）及び対立遺伝子（ｄｉｓ）の突然変異を含む。
【００８６】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍｌ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｍｌ＋に由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍｌは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、ｍｐｇ１遺伝子（Δｍｐｇ１）の突然変異、対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）を含むが、機能的ｐｙｒ２遺伝子を含まない。
【００８７】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍｌｓ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｍｌに由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍｌｓは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、ｍｐｇ１遺伝子及びｓｅｂ１遺伝子の二重突然変異（Δｍｐｇ１；Δｓｅｂ１）並びに対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）を含む。
【００８８】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍｓ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｍに由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍｓは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）並びにｍｐｇ１遺伝子及びｓｅｂ１遺伝子の二重突然変異（Δｍｐｇ１；Δｓｅｂ１）を含む。
【００８９】
本明細書で使用する「Ｔ４ｓ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４に由来したが、ここで菌株Ｔ４ｓは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）及びｓｅｂ１遺伝子の突然変異（Δｓｅｂ１）を含む。
【００９０】
本明細書で使用する「Ｔ４ｓ＿ｐｙｒ２」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｓに由来したが、ここで菌株Ｔ４ｓ＿ｐｙｒ２は、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、ｓｅｂ１遺伝子の突然変異（Δｓｅｂ１）を含むが、機能的ｐｙｒ２遺伝子を含まない。
【００９１】
本明細書で使用する「Ｔ４ｓｌ＋」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｓ＿ｐｙｒ２に由来したが、ここで菌株Ｔ４ｓｌ＋は、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、ｓｅｂ１遺伝子（Δｓｅｂ１）及の突然変異び対立遺伝子ｌｏｖ（ｄｉｓ）を含む。
【００９２】
本明細書で使用する「Ｔ４ｓｌ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｓｌ＋に由来したが、ここで菌株Ｔ４ｓｌは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、ｓｅｂ１遺伝子（Δｓｅｂ１）の突然変異、対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）を含むが、機能的ｐｙｒ２遺伝子を含まない。
【００９３】
本明細書で使用する「Ｔ４ｌ＋」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４＿ｐｙｒ２に由来したが、ここで菌株Ｔ４ｌ＋は、ｎｉｋ１遺伝子（Ｍ７４３Ｔ）及び対立遺伝子ｌｏｖ（ｄｉｓ）を含む。
【００９４】
本明細書で使用する「４１Ｇ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４に由来して突然変異誘発されたが、ここで菌株４ｌＧは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）及び（野生型）ｌｏｖ（＋）対立遺伝子を含む。
【００９５】
本明細書で使用する「４１Ｇ＿ｐｙｒ４」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株４１Ｇに由来したが、ここで菌株４ｌＧ＿ｐｙｒ４は、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、（野生型）ｌｏｖ（＋）対立遺伝子を含むが、ｐｙｒ４遺伝子を欠失する。
【００９６】
本明細書で使用する「４１Ｇｌ＋」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株４ｌＧ＿ｐｙｒ４に由来したが、ここで菌株４ｌＧｌ＋は、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）及び対立遺伝子ｌｏｖ（ｄｉｓ）を含む。
【００９７】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍｃ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｍ＿ｐｙｒ２に由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍｃは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、Δｍｐｇ１、部位Ｃでのｐｙｒ２＋の挿入及び野生型ｌｏｖ（＋）対立遺伝子を含む。
【００９８】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍｌｃ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｍｌに由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍｌｃは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、Δｍｐｇ１、部位Ｃでのｐｙｒ２＋の挿入及び対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）を含む。
【００９９】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍｄ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｍ＿ｐｙｒ２に由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍｄは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、Δｍｐｇ１、部位Ｂでのｐｙｒ２＋の挿入及び野生型ｌｏｖ（＋）対立遺伝子を含む。
【０１００】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍｌｄ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｍｌに由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍｌｄは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、Δｍｐｇ１、部位Ｂでのｐｙｒ２＋の挿入及び対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）を含む。
【０１０１】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍｐ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｍ＿ｐｙｒ２に由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍｐは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、Δｍｐｇ１、部位Ａでのｐｙｒ２＋の挿入及び野生型ｌｏｖ（＋）対立遺伝子を含む。
【０１０２】
本明細書で使用する「Ｔ４ｍｌｐ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｍｌに由来したが、ここで菌株Ｔ４ｍｌｐは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、Δｍｐｇ１、部位Ａでのｐｙｒ２＋の挿入及び対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）を含む。
【０１０３】
本明細書で使用する「Ｔ４ｓｐ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｓ＿ｐｙｒ２に由来したが、ここで菌株Ｔ４ｓｐは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、Δｓｅｂ１、部位Ａでのｐｙｒ２＋の挿入及び野生型ｌｏｖ（＋）対立遺伝子を含む。
【０１０４】
本明細書で使用する「Ｔ４ｓｌｐ」と命名されたトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は菌株Ｔ４ｓｌに由来したが、ここで菌株Ｔ４ｓｌｐは、ｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）、Δｓｅｂ１、部位Ａでのｐｙｒ２＋の挿入及び対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）を含む。
【０１０５】
本明細書で使用する「グルコアミラーゼ（ＧＡ）構築物」若しくは「ＧＡ構築物」は、国際公開第２０１２／１４５５８４号パンフレット（特に本明細書に参照により全体として組み込まれる）に記載されたグルコアミラーゼをコードする。
【０１０６】
本明細書で使用する「対立遺伝子ｌｏｖ（＋）」は、天然ＬＯＶタンパク質（例えば、配列番号２）をコードする野生型ｌｏｖＤＮＡ配列を含む。
【０１０７】
本明細書で使用する「対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）」は、「Ｔ８１３Ｋ」置換（配列番号４、上記）を含む変異ＬＯＶタンパク質をコードする突然変異（ｌｏｖ）ＤＮＡ配列（菌株Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２内で同定、上記）を含む。
【０１０８】
本明細書で使用する「対立遺伝子ｌｏｖ（ｄｉｓ）」は、その中でｐｙｒ２若しくはｐｙｒ４何れかの選択可能なマーカーが、下記の実施例３で詳述するように、ｌｏｖコーディング配列内に統合されたｌｏｖ遺伝子の破壊を含む。
【０１０９】
本明細書で使用する「全セルラーゼ菌株」は、天然セクレトームが主要なセルラーゼ遺伝子の遺伝子組換えによって変化させられていないトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株を指す。
【０１１０】
本明細書で使用する目的タンパク質をコードする「内在性（若しくは天然）糸状菌遺伝子」としては、当業者には公知であり理解されているように、グリコシドヒドロラーゼ（ＧＨ）ファミリー酵素（例えば、ＥＣ番号３．２．１．１〜３．２．１．２０６等）をコードする内在性（糸状菌）遺伝子、プロテアーゼ、エステラーゼ、リパーゼ等をコードする内在性遺伝子が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１１１】
従って、一般に本明細書に記載するように、配列番号４の（変異）ＬＯＶタンパク質の８１３位と同等であるアミノ酸（残基）位置でのトレオニン（Ｔ）アミノ酸のリシン（Ｋ）アミノ酸との置換は（Ｔ→Ｋ置換）、本明細書では、（増加した）タンパク質生産性が観察された表現型の原因であると同定されている。例えば、（突然変異）Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２菌株のＴ８１３→８１３Ｋ置換（例えば、対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ））をコードする導入された対立遺伝子を含む本明細書に開示された糸状菌細胞は、同一条件下で発酵／培養された場合に、この突然変異が欠如する（即ち、天然ＬＯＶタンパク質をコードする、野生型ｌｏｖ遺伝子、対立遺伝子ｌｏｖ（＋））同質遺伝子細胞と比較してタンパク質生産性が強化された表現型を実証する。より特別には、下記の実施例のセクションで提示するように、本開示の（そのようなタンパク質生産性が強化された表現型を含む）糸状菌細胞は、（好気性）深部培養（例えば、商業用途の目的タンパク質の大量生産等）における増殖のために特に適切である。
【０１１２】
本明細書で使用する「所定のアミノ酸配列」内のアミノ酸残基の「位置」は、本明細書では、配列番号２の天然トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ＬＯＶタンパク質のアミノ酸残基のナンバリング（位置）を使用してナンバリングされる。例えば、「配列番号２の８１３位に対応する配列位置でトレオニン（Ｔ）残基を含む」及び「配列番号２の８１３位に対応する配列位置でリシン（Ｋ）残基を含む」等の語句では、天然（トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ））種ＬＯＶタンパク質のアミノ酸配列（配列番号２）が参照（親）タンパク質配列として機能する。
【０１１３】
例えば、図７Ｃ〜７Ｆに示したように、本明細書に記載した所与のアミノ酸配列は、本明細書に記載のアラインメントアルゴリズム（及び／又は当分野において公知のアラインメントアルゴリズム）を用いて天然トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種のタンパク質アミノ酸配列（配列番号２）と整列させることができ、天然配列内のアミノ酸残基と整列する（好ましくは、最適に整列する）所与のアミノ酸配列内のアミノ酸残基は、ＬＯＶ配列内の対応するアミノ酸残基を参照することによって便宜的にナンバリングすることができる。従って、図７は、様々な子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）糸状菌、例えば、配列「１２」と表示したアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種（配列番号１２）、配列「１３」と表示したペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種（配列番号１３）、配列「１４」と表示したタラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種（配列番号１４）、配列「１５」と表示したフザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種（配列番号１５）、配列「１６」と表示したミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種（配列番号１６）、配列「１７」と表示したニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種（配列番号１７）及び配列「１８」と表示したカンジダ（Ｃａｎｄｉｄａ）種（配列番号１８）由来のＬＯＶタンパク質オルソログと整列させた、配列「２」と表示した天然トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ＬＯＶタンパク質（配列番号２）の多重配列アラインメントを示している。
【０１１４】
同様に、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種ＬＯＶタンパク質（配列番号２）の一次（１°）配列との配列相同性若しくは配列同一性を確証するためには、当業者であれば、配列番号２の一次配列を１つ以上の候補ＬＯＶタンパク質（オルソログ）配列と当業者には公知である配列アラインメントアルゴリズム、ソフトウエア及び方法を用いて容易に比較することができる。従って、アラインメントを維持するために必要な挿入及び欠失を可能にして（即ち、任意の欠失及び挿入を通しての保存された残基の排除を回避する）、保存された残基を整列させた後に、子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）ＬＯＶタンパク質の一次配列内の特定アミノ酸と同等の残基が規定される。保存された残基のアラインメントは、好ましくはそのような残基の１００％を保存しなければならない。しかしながら、同等の残基を規定するためには、保存された残基の９８％、９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、５０％若しくは少なくとも４５％超のアラインメントも又適正である。
【０１１５】
従って、本明細書で使用する配列番号２の８１３位に対応する（若しくは同等である）アミノ酸（残基）でのトレオニン（Ｔ）アミノ酸のリシン（Ｋ）アミノ酸との置換（Ｔ８１３→８１３Ｋ置換）には、任意の子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）糸状菌細胞における配列番号２の８１３位に対応するアミノ酸（残基）位置での任意のＴ８１３→８１３Ｋ置換が含まれる。
【０１１６】
本明細書で使用する用語「遺伝子」は、タンパク質又はＲＮＡの発現をコード且つ指示する核酸を指す用語「対立遺伝子」と同義である。糸状菌の栄養型は一般に一倍体であり、このため特定の表現型を付与するには、特定の遺伝子の単一コピー（即ち、単一の対立遺伝子）で十分である。
【０１１７】
本明細書で使用する用語「ポリペプチド」及び「タンパク質」（及び／又はそれらのそれぞれの複数形）は、互換的に使用され、ペプチド結合によって連結されたアミノ酸残基を含む任意の長さのポリマーを指す。本明細書では、アミノ酸残基に対する従来の１文字コード又は３文字コードを使用する。ポリマーは直鎖状であっても分枝状であってよく、修飾アミノ酸を含むことができ、更に非アミノ酸によって中断されてもよい。これらの用語は、更に、自然に、又は、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化若しくは例えば標識化成分との共役結合等の任意の他の操作又は改変等のインターベンションによって改変されているアミノ酸ポリマーも含んでいる。また、この定義の範囲には、例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つ以上のアナログを含有するポリペプチド及び当該技術分野において知られる他の改変も含まれる。
【０１１８】
本明細書で使用する用語「誘導ポリペプチド／タンパク質」は、Ｎ末端及びＣ末端の何れか又は両方への１つ以上のアミノ酸の付加、アミノ酸配列中の１つ又は多数の異なる部位での１つ以上のアミノ酸の置換、タンパク質の一方若しくは両方の末端での、又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の欠失、及び／又はアミノ酸配列中の１つ以上の部位での１つ以上のアミノ酸の挿入によって、タンパク質から得られるか、又は得ることができるタンパク質を指す。タンパク質誘導体の調製は、天然のタンパク質をコードするＤＮＡ配列を改変し、そのＤＮＡ配列を好適な宿主に形質転換し、その改変ＤＮＡ配列を発現させて誘導タンパク質を形成することによって達成することができる。
【０１１９】
関連（及び誘導）タンパク質には、「変異タンパク質」が含まれる。変異タンパク質は、少ない数のアミノ酸残基における置換、欠失及び／又は挿入によって、参照／親タンパク質（例えば、野生型タンパク質）とは異なる。変異タンパク質と親タンパク質との間の異なるアミノ酸残基の数は、１個以上、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０個又はそれ以上のアミノ酸残基であり得る。変異タンパク質は、参照タンパク質と少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％又は少なくとも約９９％さえ以上のアミノ酸配列同一性を共有し得る。変異タンパク質は又、選択されたモチーフ、ドメイン、エピトープ、保存領域等において、参照タンパク質と異なっていてもよい。
【０１２０】
本明細書で使用する用語「類似配列」は、目的タンパク質（即ち、典型的には元の目的タンパク質）と類似の機能、三次構造及び／又は保存残基を提供するタンパク質内の配列を指す。例えば、αへリックス又はβシート構造を含有するエピトープ領域では、類似配列中の置換アミノ酸は、好ましくは、同一の特異的構造を維持する。この用語は、ヌクレオチド配列並びにアミノ酸配列も指す。一部の実施形態では、アミノ酸の置換が類似若しくは改良された機能を示す変異酵素を生じさせるような類似の配列が発生させられる。一部の実施形態では、目的タンパク質内のアミノ酸の三次構造及び／又は保存残基は、目的セグメント又は目的断片若しくはその付近に位置する。従って、例えば目的セグメント若しくは目的断片が例えば、αへリックス若しくはβシート構造を含有する場合、置換アミノ酸は、好ましくはその特異的構造を維持する。
【０１２１】
本明細書で使用する用語「相同タンパク質」は、参照タンパク質との類似の活性及び／又は構造を有するタンパク質を指す。ホモログが必ずしも進化的に関連していることは意図されていない。従って、この用語は異なる生物から得られる（即ち、構造及び機能に関して）同一の、類似の、又は対応するタンパク質を包含することが意図されている。一部の実施形態では、参照タンパク質と類似の四次、三次及び／又は一次構造を有するホモログを特定することが望ましい。
【０１２２】
配列間の相同性の程度は、当該技術分野で周知の任意の好適な方法を使用して決定し得る（例えば、Ｓｍｉｔｈ  ａｎｄ  Ｗａｔｅｒｍａｎ，１９８１；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０；Ｐｅａｒｓｏｎ  ａｎｄ  Ｌｉｐｍａｎ，１９８８；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ及びＴＦＡＳＴＡ等のプログラム；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４を参照されたい）。
【０１２３】
例えば、ＰＩＬＥＵＰは、配列相同性レベルを決定するための有用なプログラムである。ＰＩＬＥＵＰは、プログレッシブなペアワイズアラインメントを用いて１群の関連配列から多重配列アラインメントを作成する。それは更に、アラインメントを作成するために使用されるクラスタリング関係を示すツリーをプロットすることができる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ（１９８７）のプログレッシブアラインメント法の簡易版を使用する。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐ（１９８９）によって記載された方法に類似している。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターは、デフォルトのギャップ・ウェイト３．００、デフォルトのギャップ長ウェイト０．１０及び加重エンド・ギャップを含む。有用なアルゴリズムの又別の例は、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９０及びＫａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３によって記載されたＢＬＡＳＴアルゴリズムである。１つの特に有用なＢＬＡＳＴプログラムは、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６を参照されたい）。パラメーター「Ｗ」、「Ｔ」及び「Ｘ」は、アラインメントの感度及び速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルトとして、１１のワード長（Ｗ）、５０のＢＬＯＳＵＭ６２スコア行列（例えば、Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ａｎｄ  Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，１９８９を参照されたい）アラインメント（Ｂ）、１０の期待値（Ｅ）、Ｍ’５、Ｎ’−４及び両方の鎖の比較を使用する。
【０１２４】
本明細書で使用する語句「実質的に類似」及び「実質的に同一」は、少なくとも２つの核酸若しくはポリペプチドとの関連では、通常、ポリヌクレオチド若しくはポリペプチドが参照（即ち、野生型）配列と比較して少なくとも約７０％の同一性、少なくとも約７５％の同一性、少なくとも約８０％の同一性、少なくとも約８５％の同一性、少なくとも約９０％の同一性、少なくとも約９１％の同一性、少なくとも約９２％の同一性、少なくとも約９３％の同一性、少なくとも約９４％の同一性、少なくとも約９５％の同一性、少なくとも約９６％の同一性、少なくとも約９７％の同一性、少なくとも約９８％の同一性、又は少なくとも約９９％以上さえの同一性を有する配列を含むことを意味する。配列同一性は、標準的なパラメーターを用いて、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ及びＣＬＵＳＴＡＬ等の公知のプログラムを使用して決定することができる（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，１９９０；Ｈｅｎｉｋｏｆｆ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９３；及びＨｉｇｇｉｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ分析を実施するためのソフトウエアは、アメリカ国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）を通して公的に入手可能である。更に、ＦＡＳＴＡ（Ｐｅａｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８）を使用してデータベースを検索することができる。２つのポリペプチドが実質的に同一であるという１つの指示は、第１のポリペプチドが第２のポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。典型的には、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性である。従って、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが、１つの保存的な置換によってのみ異なる場合、第２のポリペプチドと実質的に同一である。２つの核酸配列が実質的に同一であるという又別の指示は、２個の分子が、ストリンジェントな条件下で（例えば、中程度から高度のストリンジェンンシーの範囲内で）互いにハイブリダイズすることである。
【０１２５】
本明細書で使用する「核酸」は、ヌクレオチド若しくはポリヌクレオチド配列及びそれらの断片若しくは部分並びにセンス鎖又はアンチセンス鎖の何れを表していても、二本鎖であっても一本鎖であってもよい、ゲノム又は合成起源のＤＮＡ、ｃＤＮＡ及びＲＮＡを指す。
【０１２６】
本明細書で使用する用語「発現」は、本開示の核酸分子に由来するセンス（ｍＲＮＡ）若しくはアンチセンスＲＮＡの転写及び安定した蓄積を指す。発現は、更にｍＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を指し得る。従って、用語「発現」には、ポリペプチドの産生、例えば、以下に限定されないが、転写、転写後改変、翻訳、翻訳後改変、分泌等に関与する任意のステップが含まれる。
【０１２７】
本明細書で使用する、例えば「糸状菌細胞の変異菌株が「増加した」（即ち、親細胞に比較して）量の目的タンパク質（ＰＯＩ）を発現する／生成する」との語句において使用される複合用語「発現／産生する」は、本開示のそのような変異糸状菌株におけるタンパク質の発現及び産生に関与する任意のステップを含むことが意図されている。
【０１２８】
所定の実施形態では、「配列相同性」を含むＬＯＶタンパク質をコードする遺伝子、ポリヌクレオチド若しくは核酸配列は、（それと比較される）対応する核酸配列からの極めて些細な配列変化を有する、及び（それと比較される）対応する核酸配列と実質的に同一の生物学的機能を保持するＤＮＡ若しくはＲＮＡ（核酸）配列に関する。例えば、所定の実施形態では、ＬＯＶタンパク質をコードする遺伝子、ポリヌクレオチド若しくは核酸との実質的な配列相同性を含む核酸配列は、本明細書で記載するように、コードされた遺伝子産物（ＬＯＶタンパク質）を同定することによって評価される。
【０１２９】
所定の他の実施形態では、ＬＯＶタンパク質をコードする遺伝子、ポリヌクレオチド若しくは核酸との実質的な配列相同性を含む遺伝子、ポリヌクレオチド若しくは核酸は、核酸ハイブリダイゼーション法を用いて決定／同定される。例えば、所定の実施形態では、ＬＯＶタンパク質をコードする遺伝子（例えば、配列番号２）との実質的な配列相同性を含むＤＮＡ／ＲＮＡ配列は、ストリンジェントな条件下で、そのようなＤＮＡ／ＲＮＡ配列が本開示の特定の核酸配列とハイブリダイズする能力によって同定される。
【０１３０】
本明細書で使用する「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」は、相互に対して有意に同一若しくは相同であるヌクレオチド配列が相互にハイブリダイズしたままであるハイブリダイゼーション及び洗浄のための条件を説明することが意図されている。そのようなストリンジェントな条件は、当業者には周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９５；Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９を参照されたい）。例えば、所定の実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例としては、約６５〜７０℃での４×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）中でのハイブリダイゼーション（又は約４２〜５０℃での４×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後の約６５〜７０℃での１×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。同様に、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーションの非限定的な例としては、約６５〜７０℃での１×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（又は約４２〜５０℃での４×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後の約６５〜７０℃での０．３×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。従って、高度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件としては、約５０〜６０℃での４×ＳＳＣ中でのハイブリダイゼーション（又は代わりに約４０〜４５℃での６×ＳＳＣ＋５０％のホルムアミド中でのハイブリダイゼーション）、その後の約５０〜６０℃での２×ＳＳＣ中での１回以上の洗浄が挙げられる。上記の数値、例えば６５〜７０℃で又は４２〜５０℃でまでの中間の範囲も又、本開示に含まれることが意図されている。所定の実施形態では、ＳＳＰＥ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４及び１．２５ｍＭのＥＤＴＡ、ｐＨ７．４である）は、ハイブリダイゼーション及び洗浄バッファー中でＳＳＣ（１×ＳＳＰＥは、０．１５ＭのＮａＣｌ及び１５ｍＭのクエン酸ナトリウムである）と置換することができる；洗浄は、ハイブリダイゼーションが完了した後に各１５分間実施される。長さが５０塩基対未満であると予想されたハイブリッドのためのハイブリダイゼーション温度は、ハイブリッドの溶融温度（Ｔｍ）より５〜１０℃低くなくてはならないが、ここでＴｍは、下記の方程式に従って決定される。長さが１８塩基対未満であるハイブリッドのためには、Ｔｍ（℃）＝２（Ａ＋Ｔ塩基の数）＋４（Ｇ＋Ｃ塩基の数）。長さが１８〜４９塩基対の間のハイブリッドについては、Ｔｍ（℃）＝８１．５＋１６．６（ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃ％）−（６００／Ｎ）（式中、Ｎはハイブリッド中の塩基の数であり、［Ｎａ＋］はハイブリダイゼーションバッファー中のナトリウムイオンの濃度である（１×ＳＳＣについての［Ｎａ＋］＝０．１６５Ｍ））。当業者であれば、核酸分子の例えばニトロセルロース膜若しくはナイロン膜等への非特異的ハイブリダイゼーションを減少させるために、ハイブリダイゼーション及び／又は洗浄バッファーに、ブロッキング剤（例えば、ＢＳＡ若しくはサケ若しくはニシン精子キャリアＤＮＡ）、洗剤（例えば、ＳＤＳ）、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ）、フィ���ール、ＰＶＰ等を含むがそれらに限定されない追加の試薬を添加できることは認識できるであろう。ナイロン膜を使用する場合は、特に、追加の、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の非限定的な例は、約６５℃で０．２５〜０．５ＭのＮａＨ２ＰＯ４、７％のＳＤＳ中でのハイブリダイゼーション、その後の６５℃での０．０２ＭのＮａＨ２ＰＯ４、１％のＳＤＳ中又は代わりに０．２×ＳＳＣ、１％のＳＤＳ中での１回以上の洗浄である（例えば、Ｃｈｕｒｃｈ  ａｎｄ  Ｇｉｌｂｅｒｔ，１９８４を参照されたい）。
【０１３１】
従って、概して上記で規定したように、本開示の所定の実施形態は、ＬＯＶタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む糸状菌細胞の変異菌株に関する。本明細書で使用する用語「改変」及び「遺伝子改変」は、互換的に使用され、以下の：（ａ）遺伝子内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、又は遺伝子の転写若しくは翻訳のために必要とされる調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション（例えば、アンチセンスＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等）（ｆ）特異的突然変異誘発（ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９を介した突然変異誘発を含むがそれらに限定されない）及び／又は（ｇ）本明細書に開示した任意の１つ以上の遺伝子のランダム突然変異誘発が挙げられるが、それらに限定されない。
【０１３２】
本明細書で使用する遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株としては、本明細書に開示したＬＯＶタンパク質の遺伝子改変が挙げられるがそれには限定されない。従って、以下でより詳細に記載するように、様々な分子生物学的方法は周知であり、当業者であれば、糸状菌細胞のそのような変異菌株を生成／構築するために利用することができる。
【０１３３】
本明細書で使用する「タンパク質をコードする遺伝子内の１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去」では、そのような遺伝子改変には、遺伝子のコーディング配列（即ち、エキソン）及び非コーディング介在（イントロン）配列が含まれる。
【０１３４】
本明細書で使用する「遺伝子の破壊」、「遺伝子破壊」、「遺伝子の不活化」及び「遺伝子不活化」は、互換的に使用され、標的遺伝子を実質的に破壊／不活化する任意の遺伝子改変を広く指す。例示的な遺伝子破壊方法には、限定されないがポリペプチドコーディング配列（ＣＤＳ）、プロモーター、エンハンサー又は又別の調節エレメントを含む遺伝子の任意の部分の完全若しくは部分的な消失又は同一物の突然変異誘発が含まれ、ここで突然変異誘発は、標的遺伝子を破壊／不活化し、機能的遺伝子産物（即ち、タンパク質）の産生を実質的に減少若しくは防止する、置換、挿入、欠失、逆位並びにそれらの任意の組合せ及びそれらの変形を包含する。本開示の所定の実施形態では、そのような遺伝子破壊は、宿主細胞がコードされたｌｏｖ遺伝子産物を発現／産生することを妨害する。
【０１３５】
所定の他の実施形態では、ＬＯＶタンパク質をコードする遺伝子、ポリヌクレオチド若しくは核酸配列は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９遺伝子編集、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）遺伝子編集、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ編集（ＴＡＬＥＮ）、ホーミング（メガ）ヌクレアーゼ編集等の確立された遺伝子編集技術を使用して遺伝子改変される。
【０１３６】
他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、遺伝子変換のプロセスによって構築（即ち、遺伝子改変）される（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｔｎｅｒ，１９８３を参照されたい）。
【０１３７】
他の実施形態では、本開示の子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ）細胞によって発現／産生した目的タンパク質（例えば、内在性ＰＯＩ若しくは異種ＰＯＩ）は、タンパク質移動／移動度（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）、質量分析法、ＨＰＬＣ、サイズ排除、超遠心分離沈降速度分析、トランスクリプトミクス、プロテオミクス、蛍光タグ、エピトープタグ、蛍光タンパク質（ＧＦＰ、ＲＦＰ等）キメラ／ハイブリッド等を含むがそれらに限定されないタンパク質定量法、遺伝子転写法、ｍＲＮＡ翻訳法等によって検出、同定、測定、アッセイ等される。
【０１３８】
本明細書で使用する、機能的及び／又は構造的に類似するタンパク質は、「関連タンパク質」であると見なされる。そのような関連タンパク質は、属及び／又は種が異なる生物、或いは異なる分類の生物（例えば、細菌及び真菌）に由来し得る。関連タンパク質は更に、一次配列分析によって決定されるか、二次若しくは三次構造分析によって決定されるか、又は免疫学的交差反応性によって決定されるホモログ及び／又はオルソログを包含する。
【０１３９】
本明細書で使用する用語「プロモーター」は、コーディング配列又は機能的ＲＮＡの発現を制御できる核酸配列を指す。一般に、コーディング配列は、プロモーター配列の３’（下流）に位置する。プロモーターは、それらの全体が天然遺伝子に由来してもよい、又は天然に存在する種々のプロモーターに由来する種々のエレメントから構成されていてもよい、又は合成核酸セグメントを含んでいてさえよい。種々のプロモーターが、種々の細胞型で、又は種々の生育段階で、又は種々の環境若しくは生理的条件に応答して、遺伝子の発現を指示し得ることは、当業者には理解されている。殆どの細胞型で遺伝子の発現を最も多く引き起こすプロモーターは、一般に、「構成的プロモーター」と呼ばれている。更に、殆どの場合に調節配列の正確な境界は完全には明らかになっていないため、種々の長さのＤＮＡ断片が同じプロモーター活性を有し得ることは確認されている。
【０１４０】
本明細書で使用する用語「作動可能に連結した」は、一方の機能が他方により影響されるような、単一核酸断片上での核酸配列の会合を指す。例えば、プロモーターは、それがそのコーディング配列の発現に影響を及ぼすことができる場合（即ち、そのコーディング配列がプロモーターの転写制御下にある場合）、コーディング配列（例えば、ＯＲＦ）に作動可能に連結している。コーディング配列は、センス又はアンチセンス配向で調節配列に作動可能に連結され得る。核酸は、それが他の核酸配列と機能的関係に置かれている場合、「作動可能に連結」している。例えば、分泌リーダー（即ち、シグナルペプチド）をコードするＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与するプレタンパク質として発現している場合は、ポリペプチドのためのＤＮＡに作動可能に連結している；プロモーター若しくはエンハンサーは、それがコーディング配列の転写に影響を及ぼす場合、そのコーディング配列に作動可能に連結している；又はリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように配置されている場合、コーディング配列に作動可能に連結している。一般に、「作動可能に連結した」は、連結されるＤＮＡ配列が隣接している、及び分泌リーダーの場合には、隣接してリーディング期にあることを意味する。しかしながら、エンハンサーは、隣接している必要はない。連結は、便宜的な制限部位でのライゲーションによって行われる。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプター又はリンカーが使用される。
【０１４１】
本明細書で定義する「好適な調節配列」は、コーディング配列の上流（５’非コーディング配列）、配列内又はその下流（３’非コーディング配列）に位置し、関連コーディング配列の転写、ＲＮＡプロセシング若しくは安定性又は翻訳に影響を及ぼすヌクレオチド配列を指す。調節配列には、プロモーター、翻訳リーダー配列、ＲＮＡプロセシング部位、エフェクター結合部位及びステムループ構造が含まれ得る。
【０１４２】
本明細書で定義する用語「導入する（こと）」は、少なくとも１つのポリヌクレオチドオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）、又はその遺伝子、又はそのベクターを「細菌細胞中に導入する（こと）」等の語句に使用される場合、ポリヌクレオチドを細胞中に導入するための当分野で公知の方法を含み、こうした方法としては、限定されないが、プロトプラスト融合、天然若しくは人工形質転換（例えば、塩化カルシウム、エレクトロポレーション）、形質導入、トランスフェクション等が挙げられる。
【０１４３】
本明細書で使用する「形質転換された」又は「形質転換」は、細胞が組換えＤＮＡ技術の使用によって形質転換されていることを指す。形質転換は、典型的には、１つ以上のヌクレオチド配列（例えば、１つのポリヌクレオチド、ＯＲＦ若しくは遺伝子）を細胞内に挿入することによって発生する。挿入されるヌクレオチド配列は、異種のヌクレオチド配列（即ち、形質転換する細胞中に天然には存在しない配列）であってよい。
【０１４４】
本明細書で使用する「形質転換」は、ＤＮＡが、染色体組込み体又は自己複製染色体外ベクターとして維持されるように、外来ＤＮＡを宿主細胞内に導入することを指す。本明細書で使用する「形質転換ＤＮＡ」、「形質転換配列」及び「ＤＮＡ構築物」は、配列を宿主細胞内に導入するために使用されるＤＮＡを指す。このＤＮＡは、インビトロでＰＣＲ又は任意の他の好適な技術によって生成され得る。一部の実施形態では、形質転換ＤＮＡは入来配列を含むが、他の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、ホモロジーボックスに隣接された入来配列を更に含む。更に別の実施形態では、形質転換ＤＮＡは、末端に付加された、他の非相同配列（即ち、スタッファー配列又は隣接配列）を含む。末端は、例えば、ベクター内への挿入等のように、形質転換ＤＮＡが閉環を形成するように閉じることができる。
【０１４５】
本明細書で使用する「入来配列」は、真菌細胞染色体内に導入されるＤＮＡ配列を指す。一部の実施形態では、入来配列は、ＤＮＡ構築物の一部である。他の実施形態では、入来配列は、１種以上の目的タンパク質をコードする。一部の実施形態では、入来配列は、形質転換対象の細胞のゲノム内に既に存在していても存在していなくてもよい（即ち、相同配列であっても非相同配列であってもよい）配列を含む。一部の実施形態では、入来配列は、１種以上の目的タンパク質、遺伝子及び／又は突然変異若しくは改変遺伝子をコードする。代替の実施形態では、入来配列は、機能的な野生型遺伝子若しくはオペロン、機能的な変異遺伝子若しくはオペロン又は非機能的な遺伝子若しくはオペロンをコードする。一部の実施形態では、入来配列は、遺伝子の機能を破壊させるために遺伝子内に挿入される非機能的配列である。又別の実施形態では、入来配列は、選択マーカーを含む。更に別の実施形態では、入来配列は、２つのホモロジーボックスを含む。
【０１４６】
本明細書で使用する「ホモロジーボックス」は、真菌細胞染色体内の配列と相同である核酸配列を指す。より詳細には、ホモロジーボックスは、本発明に従って、欠失する、破壊される、不活化される、ダウンレギュレートされる等の遺伝子又は遺伝子の一部の直接隣接するコーディング領域と約８０〜１００％の配列同一性、約９０〜１００％の配列同一性又は約９５〜１００％の配列同一性を有する上流又は下流領域である。これらの配列は、真菌細胞染色体内にＤＮＡ構築物が組み込まれる場所を指示し、真菌細胞染色体のどの部分を入来配列で置換するかを指示する。本開示を限定することを意図するものではないが、ホモロジーボックスには、約１塩基対（ｂｐ）〜２００キロ塩基（ｋｂ）が含まれ得る。好ましくは、ホモロジーボックスは、約１ｂｐ〜１０．０ｋｂ；１ｂｐ〜５．０ｋｂ；１ｂｐ〜２．５ｋｂ；１ｂｐ〜１．０ｋｂ、及び０．２５ｋｂ〜２．５ｋｂを含む。ホモロジーボックスは又、約１０．０ｋｂ、５．０ｋｂ、２．５ｋｂ、２．０ｋｂ、１．５ｋｂ、１．０ｋｂ、０．５ｋｂ、０．２５ｋｂ及び０．１ｋｂを含み得る。一部の実施形態では、選択マーカーの５’及び３’末端は、ホモロジーボックスに隣接されるが、ここでホモロジーボックスは、遺伝子のコーディング領域に直接隣接する核酸配列を含む。
【０１４７】
本明細書で使用する用語「選択可能マーカーをコードするヌクレオチド配列」は、宿主細胞中で発現可能であり、選択可能マーカーの発現が発現した遺伝子を含む細胞に、対応する選択剤の存在下又は必須栄養素の欠如下で増殖する能力を付与するヌクレオチド配列を指す。
【０１４８】
本明細書で使用する用語「選択可能マーカー」及び「選択マーカー」は、ベクターを含有するそれらの宿主の選択を容易にさせる、宿主細胞内で発現することができる核酸（例えば、遺伝子）を指す。そのような選択可能マーカーの例としては、抗微生物剤が挙げられるが、それらに限定されない。従って、用語「選択可能マーカー」は、宿主細胞が目的入来ＤＮＡを取り上げたか、又は何らかの他の反応が発生したことの兆候を提供する遺伝子を指す。典型的には、選択可能マーカーは、形質転換中に外来配列を受け入れていない細胞から外来ＤＮＡを含有する細胞を区別することを可能にする抗微生物剤耐性又は代謝有利性を宿主細胞に付与する遺伝子である。
【０１４９】
本明細書で定義する宿主細胞「ゲノム」、真菌細胞「ゲノム」又は糸状菌細胞「ゲノム」は、染色体遺伝子及び染色体外遺伝子を含む。
【０１５０】
本明細書で使用する用語「プラスミド」、「ベクター」及び「カセット」は、典型的には細胞の中央代謝の一部ではない遺伝子を運び、及び通常は環状の二本鎖ＤＮＡ分子の形態にある染色体外エレメントを指す。そのような要素は、多数のヌクレオチド配列が、選択された遺伝子産物のためのプロモーター断片及びＤＮＡ配列を適切な３’未翻訳配列と共に細胞内に導入できる固有の構造に接合又は再結合されている任意の起源に由来する、線状若しくは環状の、一本鎖若しくは二本鎖のＤＮＡ若しくはＲＮＡの自己複製配列、ゲノム組込み配列、ファージ又はヌクレオチド配列であってよい。
【０１５１】
本明細書で使用する用語「ベクター」は、細胞内で複製（増殖）することができ、新規な遺伝子若しくはＤＮＡセグメント（例えば、「入来配列」）を細胞中に運ぶことができる任意の核酸を指す。従って、この用語は、様々な宿主細胞間で移動するために設計された核酸構築物を指す。ベクターとしては、「エピソーム」である（即ち、自律的に複製する）か、又は宿主細胞の染色体内に組み込むことができる、ウイルス、バクテリオファージ、プロウイルス、プラスミド、ファージミド、トランスポゾン並びにＹＡＣ（酵母人工染色体）、ＢＡＣ（細菌人工染色体）、ＰＬＡＣ（植物人工染色体）等の人工染色体が挙げられる。
【０１５２】
本明細書で使用する「形質転換カセット」は、遺伝子（若しくは、そのＯＲＦ）を含み、その遺伝子に加えて、特定の宿主細胞の形質転換を促進する要素を有する特異的ベクターを指す。
【０１５３】
「発現ベクター」は、細胞内で異種ＤＮＡを組み込んで発現させる能力を有するベクターを指す。多数の原核生物及び真核生物の発現ベクターが市販されており、当業者には知られている。適切な発現ベクターの選択は、当業者の知識の範囲内である。
【０１５４】
本明細書で使用する用語「発現カセット」及び「発現ベクター」は、標的細胞中の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素を用いて、組換えにより、又は合成的に生成される核酸構築物（即ち、これらは、上述したベクター若しくはベクター要素である）を指す。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルス若しくは核酸断片内に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分には、他の配列の中でも、転写対象の核酸配列及びプロモーターが含まれる。一部の実施形態では、ＤＮＡ構築物には、標的細胞内の特定の核酸の転写を許容する一連の特定の核酸要素も又含まれる。所定の実施形態では、本開示のＤＮＡ構築物は、本明細書で定義する選択マーカー及び不活化染色体セグメント又は遺伝子セグメント又はＤＮＡセグメントを含む。
【０１５５】
本明細書で使用する「ターゲティングベクター」は、その中にターゲティングベクターが形質転換される宿主細胞の染色体内の領域に相同なポリヌクレオチド配列を含み、その領域で相同組換えを促進できるベクターである。例えば、ターゲティングベクターは、相同組換えによって宿主細胞の染色体に変異を導入するのに使用される。一部の実施形態では、ターゲティングベクターは、例えば末端に付加された他の非相同配列（即ち、スタッファー配列又は隣接配列）を含む。末端は、例えば、ベクター内への挿入等、ターゲティングベクターが閉環を形成するように閉じることができる。
【０１５６】
本明細書で使用する「タンパク質生産性が強化された表現型」を含む変異細胞（若しくは菌株）としては、タンパク質生産性が強化／増加した用量生産性を含む変異細胞（若しくは菌株）、強化／増加した炭素変換効率を含む変異細胞（若しくは菌株）、強化／増加したタンパク質収率を含む変異細胞（若しくは菌株）、増強／増加した比タンパク質生産性を含む変異細胞（若しくは菌株）が挙げられるがそれらに限定されない。例えば、所定の実施形態では、タンパク質生産性が強化された表現型を含む変異細胞若しくは菌株は、供給糖類１ｇ当たり少なくとも０．１％以上の全タンパク質（ｇ）を発現／産生するが、ここで供給糖類は、産生期（即ち、供給開始後）中に発酵槽に添加された糖の質量によって表示することができる。
【０１５７】
本明細書で定義した語句「タンパク質生産性が強化された表現型」及び「タンパク質生産性が増加された表現型」は、互換的に使用することができる。
【０１５８】
本明細書で使用するように、未改変（親）細胞対改変（変異／娘）における「タンパク質生産性が強化／増加された表現型」について記載する場合に、「親」及び「変異」細胞が同一条件（例えば、培地、温度、ｐＨ等の同一条件）下で増殖／培養／発酵させられることは理解されるであろう。同様に、未改変（親）細胞対改変（変異／娘）細胞における目的タンパク質（ＰＯＩ）の「発現／産生」について記載する場合に、「親」及び「変異」細胞が本質的に同一条件（例えば、培地、温度、ｐＨ等の同一条件）下で増殖／培養／発酵させられることは理解されるであろう。
【０１５９】
本明細書で使用する「好気性発酵」は、酸素の存在下における増殖を指す。
【０１６０】
本明細書で使用する用語「ブロス」、「細胞ブロス」、「発酵ブロス」及び／又は「培養ブロス」は、互換的に使用され、集合的に（ｉ）発酵（培養）培地及び（ｉｉ）液体（深部）培養中の細胞を指す。
【０１６１】
本明細書で使用する用語「細胞集団」は、液体（深部）培養中に存在する（インタクト細胞及び溶解細胞を含む）細胞成分を指す。細胞集団は、乾燥細胞重量（ＤＣＷ）又は湿潤細胞重量（ＷＣＷ）で表すことができる。
【０１６２】
本明細書で使用する糸状菌細胞の「粘性が低下した」菌株は、親菌株によって生成された同等の細胞ブロスと比較して、低下した（即ち、剪断応力若しくは引張応力に対する抵抗性が低下した）粘性を有する細胞ブロスを産生する改変（娘）菌株を指す。例えば、同等の細胞ブロスは、匹敵する細胞集団を有する。粘性が低下した糸状菌株を構築するための方法、及びそれらの粘度を比較するための方法は、国際公開第２０１２／０２７５８０号パンフレット、同第２０１２／１４５５９６号パンフレット、同第２０１２／１４５５９６号パンフレット及び同第２０１２／１４５５９２号パンフレット並びに国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／２７５９０号明細書（それらの各々は、全体として参照により詳細に本明細書に組み込まれる）の中で詳細に記載されている。
【０１６３】
従って、所定の実施形態では、本開示の変異菌株（例えば、タンパク質生産性が強化／増加された表現型を含む対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）をコードする遺伝子改変を含む変異菌株）を含むが、この変異菌株は、ＭＰＧ１、ＳＦＢ３、ＳＥＢ１、ＣＲＺ１、ＧＡＳ１、ＴＰＳ２及び／又はＳＳＢ７タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を更に含む。
【０１６４】
本明細書で使用するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種「ＭＰＧ１タンパク質」は、配列番号５のアミノ酸配列（本明細書に参照により全体として組み込まれるＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／１４５５８４号パンフレットに記載されている）を含む。
【０１６５】
本明細書で使用するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種「ＳＥＢ１タンパク質」は、配列番号６のアミノ酸配列（本明細書に参照により全体として組み込まれるＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／１４５５９５号パンフレットに記載されている）を含む。
【０１６６】
本明細書で使用するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種「ＳＥＢ３タンパク質」は、配列番号７のアミノ酸配列（本明細書に参照により全体として組み込まれるＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／０２７５８０号パンフレットに記載されている）を含む。
【０１６７】
本明細書で使用するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種「ＣＲＺ１タンパク質」は、配列番号８のアミノ酸配列（本明細書に参照により全体として組み込まれるＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／１４５５９６号パンフレットに記載されている）を含む。
【０１６８】
本明細書で使用するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種「ＧＡＳ１タンパク質」は、配列番号９のアミノ酸配列（本明細書に参照により全体として組み込まれるＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／１４５５９６号パンフレット及び同第２０１２／１４５５９２号パンフレットに記載されている）を含む。
【０１６９】
本明細書で使用するトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種「ＴＳＰ２タンパク質」は、配列番号１０のアミノ酸配列（本明細書に参照により全体として組み込まれるＰＣＴ出願の国際公開第２０１２／１４５５９８号パンフレットに記載されている）を含む。
【０１７０】
本明細書で使用する野生型「ｓｓｂ７遺伝子」は、２０１９年４月１６日に出願された国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／２７５９０号明細書に記載された天然「ＳＳＢ７タンパク質」をコードする。例えば、野生型Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）「ｓｓｂ７遺伝子」（配列番号２０）は、配列番号２１の天然「ＳＳＢ７タンパク質」をコードする。
【０１７１】
本明細書で使用する「対立遺伝子ｓｓｂ７（ｆｓ）」（配列番号２２）は、国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／２７５９０号明細書（本明細書に参照により全体として組み込まれる）に記載された配列番号２３の変異ＳＳＢ７タンパク質をコードする。
【０１７２】
ＩＩ．タンパク質生産性が強化された表現型を含む糸状菌株
上記で一般に記載し、下記の実施例のセクションで詳述するように、本開示の所定の実施形態は、親菌株に由来する糸状菌の突然変異菌株及び遺伝子改変（変異）菌株に関する。より特別には、所定の実施形態は、糸状菌の突然変異菌株及び遺伝子改変（変異）菌株（並びにそれらの方法）に関するが、そのような菌株は、例えば、容積効率が向上した、比生産性がより高い、炭素源に対する収率が向上した、バイオリアクター（発酵槽）運転コストが減少した等のタンパク質生産性が強化された表現型を含む。
【０１７３】
より特別には、下記の実施例１において詳述するように、突然変異（娘）トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は同定され、単離され、及び「Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２」と命名されたが、この（突然変異）菌株は、それがそれに由来した親菌株（Ｂ７ｍｓ１）と比較して４０％高い発酵槽内で供給糖類に対するタンパク質収率を有した（例えば、図１を参照されたい）。引き続いて、突然変異菌株に対して、Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２（突然変異体）の観察された（増加された生産性）表現型の原因であるとして、その中の遺伝子中の１つ以上の突然変異を同定するために、ゲノム配列分析及び遺伝子分析が突然変異Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２菌株に関して実施された。より詳細には、同定された突然変異は、配列番号２の（天然）ＬＯＶタンパク質のコーディング配列を変化させるために決定されたが、ここで（天然）ＬＯＶタンパク質（配列番号２）のアミノ酸（残基）８１３位（Ｔ８１３）での高度に保存されたトレオニン（Ｔ）は、配列番号４の（変異）ＬＯＶタンパク質の８１３位（８１３Ｋ）にあるリシンへ突然変異（置換）させられた（即ち、Ｔ８１３Ｋ置換；例えば、図２を参照されたい）。
【０１７４】
科学的文献及び関連分野の精査は、ＬＯＶタンパク質（配列番号２）及び／又は関連ＬＯＶタンパク質オルソログ（例えば、配列番号：１１〜１７）の機能的特性解析が任意の生物について文献において記載されていないことを指摘している。しかしながら、一般に本開示の実施例１に規定されたように、保存ドメイン分析（ＮＣＢＩ）は、グリコシルトランスフェラーゼファミリーグループ２と（保存）領域とが遠縁に当たることを同定した（ｐｆａｍ１３６３２、３．２５×１０−４４のＥ値、例えば、図２における「Ｇｌｙｃｏ  ｔｒａｎｓ  ２  ３」を参照されたい）。例えば、原核生物タンパク質のこの（グリコシルトランスフェラーゼ）ファミリーのメンバーとしては、細菌カプセル生合成（ＰＦＡＭ）に包含される推定グルコシルトランスフェラーゼが挙げられる。より特別には、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ＰＩＤ７９３９６Ｍに対してオルソロガスである（即ち、ＬＯＶではない、ＰＩＤ５０２１２）（グリコシルトランスフェラーゼ）ファミリーグループ２ドメイン「ＺｔＧＴ２」を備える真菌タンパク質は、固体表面上での菌糸成長にとって重要である（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【０１７５】
最も驚くべきことに、ＬＯＶタンパク質は、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）及び子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ  ｐｈｙｌａ）の中で広範に保存されている。例えば、（天然）ＬＯＶタンパク質（即ち、本明細書で開示したように、リシン（Ｋ）へのその突然変異は有益である）の８１３位のトレオニン（Ｔ）は、それにトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）及び最も工業上重要な糸状菌が属するチャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ  ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ）内で、ＮＣＢＩ非冗長性データベースのｔｏｐ  ＢＬＡＳＴｐ検索結果の間で高度に保存されている（６９１／６９１；１００％）。例えば、これらの６９１種のチャワンタケ（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）ホモログのＧｅｎｅｉｏｕｓ多重配列アラインメントのグラフ提示（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ，Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  １１．０，Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ  Ｌｔｄ．）は、図２に示した。同様に、トップ１，０００のＢＬＡＳＴｐヒットの中で、アミノ酸残基８１３位は、ＭＵＳＣＬＥ多重配列アラインメント（Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウエアパッケージ）において９７５／１０００（９７．５％）ヒットにおいて同一（即ち、残基Ｔ８１３）であったが、ここで残基８１３位は、決してリシン（Ｋ）としては発生しない（即ち、本明細書で記載した強化されたタンパク質生産性を生じさせる置換は、ＢＬＡＳＴｐによって同定されたトップ１，０００オルソログにおいては見出されなかった）。
【０１７６】
従って、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子が観察されたタンパク質生産性が強化された表現型の原因であることを更に検証するために、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）突然変異が「Ｔ４」と命名された異なるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株系統内に導入されたが（例えば、表１を参照されたい）、ここでＢ７ｍｓ１及びＴ４親系統は、どちらもトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株ＲＬ−Ｐ３７の異なる菌株向上プログラム由来の突然変異誘導体である（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４；Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，１９８７）。例えば、Ｔ４菌株は、Ｂ７ｍｓ１菌株とは、Ｔ４菌株がセルラーゼのその（内在性）天然カクテルを発現し、全タンパク質生産を増加させるｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）突然変異を含む点で顕著に異なる（例えば、国際公開第２０１６／１３０５２３号パンフレットを参照されたい）。同様に、実施例１に規定したＢ７ｍｓ１系統の観察された結果に類似して、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を含むＴ４系統（菌株）（例えば、実施例２及び実施例４を参照されたい）は、さもなければ野生型ｌｏｖ（＋）対立遺伝子を含む同一遺伝子菌株と比較して供給糖類上の平均して３４％高い全タンパク質収率を有していた。
【０１７７】
更に、真菌株のタンパク質生産性を向上するための表現型についてのｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子の有用性を更に証明するために、本出願人は、３つの他の便宜的遺伝子位置でｐｙｒ２マーカーを統合した（即ち、命名された部位Ａ〜Ｃ；更に、実施例４、表１及び表２を参照されたい）。例えば、これらの異なる菌株によるタンパク質生産は、そのような全部の場合において振とうフラスコ内で評価したが、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）突然変異は、野生型ｌｏｖ（＋）対立遺伝子を含む同質遺伝子（親）菌株と比較して、全タンパク質生産を向上させた。
【０１７８】
ＩＩＩ．分子生物学
上記で一般に記載したように、本開示の所定の実施形態は、親菌株に由来する糸状菌の突然変異菌株及び遺伝子改変（変異）菌株に関する。より特別には、所定の実施形態は、糸状菌の突然変異菌株及び遺伝子改変（変異）菌株（並びにそれらの方法）に関するが、そのような菌株は、例えば、容積効率が向上した、比生産性がより高い、炭素源に対する収率が向上した、バイオリアクター（発酵槽）運転コストが減少した等のタンパク質生産性が強化された表現型を含む。
【０１７９】
従って、本開示の所定の実施形態は、親トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株（例えば、親Ｂ７ｍｓ１）に由来する突然変異（娘）トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株（例えば、突然変異Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２）に関するが、ここで突然変異（娘）トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株は、配列番号４のアミノ酸残基８１３位に対応するアミノ酸位置でリシン（Ｋ）残基を含む変異ＬＯＶタンパク質をコードする突然変異ｌｏｖ遺伝子を含む。
【０１８０】
従って、本開示の所定の他の実施形態は、本明細書に記載した親菌株に由来する糸状菌の遺伝子改変菌株（以下では、「変異」菌株）に関する。例えば、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、配列番号２（即ち、天然ＬＯＶタンパク質配列）との配列相同性を含む変異ＬＯＶタンパク質をコードする改変ｌｏｖ遺伝子（若しくはその改変ポリヌクレオチド配列）を含み、及び配列番号４のアミノ酸８１３位に対応するアミノ酸配列位置でリシン（Ｋ）残基を含む。
【０１８１】
従って、所定の実施形態では、本開示の変異菌株は、配列番号２（又は配列番号４）のＬＯＶタンパク質との少なくとも約５０％〜約１００％の配列相同性を含むＬＯＶタンパク質をコードする改変ｌｏｖ遺伝子（若しくはその改変ポリヌクレオチド配列）を含み、及び配列番号４のアミノ酸８１３位に対応するアミノ酸配列位置でリシン（Ｔ）残基を含む。所定の実施形態では、本開示の変異菌株は、配列番号２（又は配列番号４）のＬＯＶタンパク質との５０％〜約１００％の配列同一性を含むＬＯＶタンパク質をコードする改変ｌｏｖ遺伝子（若しくはその改変ポリヌクレオチド配列）を含み、及び配列番号４のアミノ酸８１３位に対応するアミノ酸配列位置でリシン（Ｔ）残基を含む。
【０１８２】
従って、他の実施形態では、本開示の変異菌株は、少なくとも約５０％の配列番号２又は配列番号４との配列相同性若しくは同一性、配列番号２又は配列番号４との少なくとも５５％の配列相同性若しくは同一性、配列番号２又は配列番号４との少なくとも６０％の配列相同性若しくは同一性、配列番号２又は配列番号４との少なくとも６５％の配列相同性若しくは同一性、配列番号２又は配列番号４との少なくとも７０％の配列相同性若しくは同一性、配列番号２又は配列番号４との少なくとも７５％の配列相同性若しくは同一性、配列番号２又は配列番号４との少なくとも８０％の配列相同性若しくは同一性、配列番号２又は配列番号４との少なくとも８５％の配列相同性若しくは同一性、配列番号２又は配列番号４との少なくとも９０％の配列相同性若しくは同一性、配列番号２又は配列番号４との少なくとも９５％の配列相同性若しくは同一性、又は配列番号２又は配列番号４との１００％までの配列相同性若しくは同一性を含む、及び配列番号４のアミノ酸８１３位に対応するアミノ酸配列位置でリシン（Ｔ）残基を含む、ＬＯＶタンパク質をコードする改変ｌｏｖ遺伝子（又はその改変ポリヌクレオチド配列）を含む。
【０１８３】
従って、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）を菌株内に導入する少なくとも１つの遺伝子改変を含む。例えば、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は：（ａ）遺伝子（又はそのＯＲＦ若しくはポリヌクレオチド）における１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、又はその遺伝子の転写若しくは翻訳のために必要とされる調節エレメントにおける１つ以上のヌクレオチドの導入、置換若しくは除去、（ｂ）遺伝子破壊、（ｃ）遺伝子変換、（ｄ）遺伝子欠失、（ｅ）遺伝子のダウンレギュレーション、（ｆ）特異的突然変異誘発、及び／又は（ｇ）ランダム突然変異誘発を含むがそれらに限定されない遺伝子改変を含むことができる。他の実施形態では、対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）を含む糸状菌の変異菌株は、本明細書に記載したＮＩＫ１タンパク質、ＳＳＢ７タンパク質、ＭＰＧ１タンパク質、ＳＦＢ３タンパク質、ＳＥＢ１タンパク質、ＣＲＺ１タンパク質、ＴＳＰ２タンパク質及び／又はＧＡＳ１タンパク質をコードする遺伝子の１つ以上の遺伝子改変を更に含む。
【０１８４】
従って、所定の実施形態では、遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株は、所定の遺伝子産物（例えば、ＬＯＶ（＋）、ＮＩＫ１、ＳＳＢ７、ＭＰＧ１  ＳＦＢ３、ＳＥＢ１、ＣＲＺ１、ＴＳＰ２、ＧＡＳ１、内在性（バックグラウンド）プロテアーゼ、セルラーゼ等）の発現／産生を排除するために遺伝子欠失によって構築され得る。他の実施形態では、遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株は、所定の遺伝子産物の発現／産生を排除する（若しくは減少させる）ための部分的遺伝子欠失によって構築され得る。例えば、所定の実施形態では、改変糸状菌株は、遺伝子の部分的欠失を含み得るが、ここで部分的欠失は、遺伝子のコーディング配列の何れかの部分の部分的欠失を含む。例えば、所定の実施形態では、そのような変異菌株は、コードされたタンパク質を発現／産生しない、又はそのような変異菌株は、量が（親菌株と比較して）減少したコードされたタンパク質を発現／産生するが、ここで「減少した」量のコードされたタンパク質は、本明細書に記載したように測定、検出、アッセイ等をすることができる。
【０１８５】
従って、一般に実施例のセクションで規定及び記載されるように、当業者であれば、下記の遺伝子改変（及びこのセクションに記載された分子生物学的方法）を実施し、本開示の１つ以上のアミノ酸配列（配列番号２、４、１１〜１９）及び／又は核酸配列（配列番号１及び２）を参照することによりそのような（変異）糸状菌株を構築することができる。
【０１８６】
例えば、遺伝子欠失技術は、遺伝子の部分的若しくは完全な除去を可能にし、それによってタンパク質の発現／産生を排除する、若しくは減少させる、及び／又はコードされたタンパク質の発現／産生を排除する、若しくは減少させる。そのような方法では、遺伝子の欠失は、遺伝子に隣接する５’及び３’領域を接して含有するように構築された統合プラスミド／ベクターを使用する相同組換えによって達成され得る。隣接５’及び３’領域は、例えば、プラスミドが細胞内で統合されることを可能にする選択可能マーカーと会合している統合プラスミド／ベクター上で糸状菌細胞内に導入され得る。
【０１８７】
他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、本開示のタンパク質をコードする遺伝子を破壊若しくは不活化する遺伝子改変を含む。遺伝子破壊／不活化の典型的な方法としては、ポリペプチドコーディング配列（ＣＤＳ）、プロモーター、エンハンサー又は他の調節エレメントを含む遺伝子の何れかの部分を破壊することが挙げられ、その破壊は、置換、挿入、欠失、逆位並びにそれらの組合せ及びそれらの変形を含む。従って、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、遺伝子破壊技術によって構築される。遺伝子破壊技術の非限定的な例としては、本開示の１つ以上の遺伝子内へのその遺伝子と相同である核酸断片を含有する統合可能なプラスミドを挿入（統合）することが挙げられるが、これは、重複領域間の相同性の領域と組込み（挿入）ベクターＤＮＡとの重複を作り出すであろう。
【０１８８】
従って、所定の他の非限定的な例では、遺伝子破壊技術としては、遺伝子と相同である核酸断片を含有する統合可能なプラスミドを挿入することが挙げられるが、これは、重複領域間の相同性の領域と組込み（挿入）ベクターＤＮＡとの重複を作り出すが、ここで挿入されたベクターＤＮＡは、例えば、遺伝子のプロモーターをタンパク質コーディング領域から分離するか、又は遺伝子のコーディング若しくは非コーディング配列を遮断（破壊）する。従って、破壊構築物は、遺伝子と相同の５’及び３’領域が付随する選択マーカー遺伝子（例えば、ｐｙｒ２；実施例を参照されたい）であってよい。選択可能マーカーは、破壊遺伝子を含有する形質転換体の同定を可能にする。従って、所定の実施形態では、遺伝子破壊は、プロモーター、リボソーム結合部位（ＲＢＳ）、未翻訳領域（ＵＴＲ）、コドン変化等の遺伝子の制御エレメントの改変を含む。
【０１８９】
他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、それらの転写又は翻訳のために必要とされる遺伝子又は調節エレメント内の１つ以上のヌクレオチドを導入する、置換する、又は除去することによって構築（即ち、遺伝子改変）される。例えば、停止コドンの導入、開始コドンの除去又はオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のフレームシフトを生じさせるように、ヌクレオチドを挿入又は除去し得る。そのような改変は、当該技術分野の公知の方法に従って、部位特異的突然変異誘発又はＰＣＲ生成突然変異誘発によって実施され得る（例えば、Ｂｏｔｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｓｈｏｒｔｌｅ，１９８５；Ｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８５；Ｈｉｇｕｃｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９８８；Ｓｈｉｍａｄａ，１９９６；Ｈｏ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９；Ｈｏｒｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８９及びＳａｒｋａｒ  ａｎｄ  Ｓｏｍｍｅｒ，１９９０を参照されたい）。同様に、本明細書に記載したＴ８１３Ｋ置換を含む対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）は、野生型ｌｏｖ（＋）遺伝子の８１３位のトレオニンをコードするヌクレオチドを対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）の８１３位のリシンをコードするヌクレオチドと置換することによって構築され得る。
【０１９０】
他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、遺伝子変換のプロセスによって構築（即ち、遺伝子改変）される（例えば、Ｉｇｌｅｓｉａｓ  ａｎｄ  Ｔｒａｕｔｎｅｒ，１９８３を参照されたい）。例えば、遺伝子変換法では、目的遺伝子に対応する核酸配列をインビトロで変異させて欠陥のある核酸配列を生成し、次いでこれを親細胞内に形質転換させて欠陥遺伝子を含む変異細胞を産生する。相同組換えによって、欠陥のある核酸配列が内在性遺伝子に取って代わる。欠陥のある遺伝子又は遺伝子断片は又、欠陥のある遺伝子を含有する形質転換体の選択に使用され得るマーカーをコードすることが望ましい場合がある。例えば、欠陥のある遺伝子は、選択可能マーカーと会合している非複製プラスミド若しくは感温性プラスミド上に導入され得る。プラスミドを統合するための選択は、プラスミド複製を許容しない条件下でそのマーカーを選択することによって実施される。遺伝子置換をもたらす第２の組換え事象の選択は、選択可能マーカーの消失及び変異遺伝子の獲得についてコロニーを調査することによって実施される（Ｐｅｒｅｇｏ，１９９３）。
【０１９１】
他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、遺伝子の核酸配列と相補的であるヌクレオチド配列を使用して、確立されたアンチセンス（遺伝子サイレンシング）技術によって構築される（Ｐａｒｉｓｈ  ａｎｄ  Ｓｔｏｋｅｒ，１９９７）。より詳細には、糸状菌株による遺伝子の発現は、この遺伝子の核酸配列に相補的なヌクレオチド配列を導入することにより低減（ダウンレギュレート）又は排除することができ、それは細胞内で転写され、細胞内で産生されるｍＲＮＡにハイブリダイズすることができる。従って、相補的アンチセンスヌクレオチド配列がｍＲＮＡにハイブリダイズできる条件下では、翻訳されるタンパク質量は低減又は排除される。そのようなアンチセンス法としては、以下に限定されないが、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、アンチセンスオリゴヌクレオチド等が挙げられ、これらの全てが当業者に周知である。
【０１９２】
他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、化学的突然変異誘発（例えば、Ｈｏｐｗｏｏｄ，１９７０を参照されたい）及び転座（例えば、Ｙｏｕｎｇｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９８３を参照されたい）を含むがそれらに限定されない当分野において周知の方法を使用して、ランダム突然変異誘発又は特異的突然変異誘発によって構築（即ち、遺伝子改変）される。遺伝子の改変は、親細胞に突然変異誘発を受けさせること、及びその中で遺伝子の発現が低減又は排除されている変異細胞についてスクリーニングすることによって実施され得る。例えば、当業者であれば、粘性が低下した表現型を含む糸状菌細胞のそのような（突然変異した）変異菌株を同定するために、実施例のセクションに記載したスクリーニング法を容易に採用及び／又は修正することができる。
【０１９３】
特異的であってもランダムであってもよい突然変異誘発は、例えば、好適な物理的若しくは化学的変異誘発剤の使用によって、好適なオリゴヌクレオチドの使用によって、又はＤＮＡ配列をＰＣＲ生成変異誘発にかけることによって実施され得る。更に、突然変異誘発は、これらの突然変異誘発法を任意に組み合わせることにより実施され得る。本発明の目的に好適な物理的又は化学的な変異誘発剤の例としては、紫外線（ＵＶ）照射、ヒドロキシルアミン、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（ＭＮＮＧ）、Ｎ−メチル−Ｎ’−ニトロソグアニジン（ＮＴＧ）、Ｏ−メチルヒドロキシルアミン、亜硝酸、エチルメタンスルホネート（ＥＭＳ）、亜硫酸水素ナトリウム、蟻酸及びヌクレオチドアナログが挙げられる。そのような薬剤を使用する場合、突然変異誘発は、典型的には、好適な条件下で最適な変異誘発剤の存在下で突然変異誘発対象の親細胞をインキュベートするステップ、及び遺伝子の減少した発現を示す、又は発現を示さない突然変異細胞を選択するステップによって実施される。
【０１９４】
例えば、本明細書に開示した１つ以上の遺伝子のそのような遺伝子改変は、遺伝子のプロモーターの効率を減少させ、エンハンサーの効率を減少させ、遺伝子のｍＲＮＡのスプライシング若しくは編集を妨害し、遺伝子のｍＲＮＡの翻訳を妨害し、全長タンパク質の翻訳を防止するために遺伝子のコーディング配列内に終止コドンを導入し、低活性若しくは不活性のタンパク質を産生するためにタンパク質のコーディング配列を変化させ、タンパク質と他の核タンパク質構成成分との相互作用を減少させ、低安定性タンパク質を産生するため、又はタンパク質を破壊の標的とするため、又はタンパク質がミスフォールドする、又は（例えば、グリコシル化により）不正確に改変されることを誘発するため、又はタンパク質の細胞輸送を妨害するためにタンパク質のコーディング配列を変化させる。
【０１９５】
所定の他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、部位特異的な遺伝子編集技術によって構築（即ち、遺伝子改変）される。例えば、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、転写活性化因子様エンドヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、ジンクフィンガーエンドヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、ホーミング（メガ）エンドヌクレアーゼ等の使用によって構築（即ち、遺伝子改変）される。より特別には、改変対象の遺伝子の部分（例えば、コーディング領域、非コーディング領域、リーダー配列、プロペプチド配列、シグナル配列、転写ターミネーター、転写活性化因子又はコーディング領域を発現させるために必要とされる他の調節エレメント）は、ＺＦＮ遺伝子編集、ＴＡＬＥＮ遺伝子編集、ホーミング（メガ）エンドヌクレアーゼ等による遺伝子改変にかけられるが、それらの改変方法は、当業者には周知であり、利用することができる。
【０１９６】
従って、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９編集によって構築（即ち、遺伝子改変）される。より詳細には、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系による真菌ゲノム改変のための組成物及び方法は、当分野において記載されており、周知である（例えば、国際ＰＣＴ出願の国際公開第２０１６／１００５７１号パンフレット、同第２０１６／１００５６８号パンフレット、同第２０１６／１００２７２号パンフレット、同第２０１６／１００５６２号パンフレット等を参照されたい）。例えば、天然ＬＯＶタンパク質をコードする遺伝子は、ＤＮＡ上の標的配列にエンドヌクレアーゼを動員するガイドＲＮＡ（例えば、Ｃａｓ９）又はガイドＤＮＡ（例えば、ＮｇＡｇｏ）の何れかを結合することによってそれらの標的ＤＮＡを見出す、核酸誘導型エンドヌクレアーゼによって遺伝子改変することができるが、ここでエンドヌクレアーゼは、ＤＮＡにおいて一本鎖又は二本鎖切断を生成することができる。この標的化ＤＮＡ切断は、ＤＮＡ修復のための基質となり、遺伝子を破壊又は欠失させるために提供された編集鋳型と再結合し得る。例えば、核酸誘導型エンドヌクレアーゼをコードする遺伝子（例えば、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９又はＣａｓ９ヌクレアーゼをコードするコドン最適化遺伝子）は、糸状菌細胞内で活性なプロモーター及び糸状菌細胞内で活性なターミネーターに作動可能に連結されており、これにより糸状菌Ｃａｓ９発現カセットを作製する。同様に、目的遺伝子に固有の１つ以上の標的部位は、当業者により容易に同定される。
【０１９７】
例えば、目的遺伝子内の標的部位に向けられたｇＲＮＡをコードするＤＮＡ構築物を構築するためには、可変標的化ドメイン（ＶＴ）は、そのヌクレオチドが、Ｓ．ピオゲネス（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９に対するＣａｓ９エンドヌクレアーゼ認識ドメイン（ＣＥＲ）をコードするＤＮＡに融合している、（ＰＡＭ）プロトスペーサー隣接モチーフ（ＴＧＧ）の５’である標的部位のヌクレオチドを含むであろう。ＶＴドメインをコードするＤＮＡとＣＥＲドメインをコードするＤＮＡとの組合せは、それによりｇＲＮＡをコードするＤＮＡを生成する。従って、ｇＲＮＡのための糸状菌発現カセットは、糸状菌細胞内で活性なプロモーター及び糸状菌細胞内で活性なターミネーターにｇＲＮＡをコードするＤＮＡを作動可能に連結させることによって作製される。
【０１９８】
所定の実施形態では、エンドヌクレアーゼによって誘導されたＤＮＡ切断は、入来配列を用いて修復／置換される。例えば、上述したＣａｓ９発現カセット及びｇＲＮＡ発現カセットによって生成されたＤＮＡ切断を精密に修復するためには、細胞のＤＮＡ修復機構が編集鋳型を利用できるように、ヌクレオチド編集鋳型が提供される。例えば、標的化遺伝子の約５００ｂｐの５’は、編集鋳型を生成するために標的化遺伝子の約５００ｂｐの３’に融合させることができ、その鋳型は、ＲＧＥＮによって生成されたＤＮＡ切断を修復するために糸状菌宿主の機構によって使用される（ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼ）。
【０１９９】
Ｃａｓ９発現カセット、ｇＲＮＡ発現カセット及び編集鋳型は、多数の様々な方法（例えば、プロトプラスト融合法、エレクトロポレーション法、天然コンピテンス又は誘導コンピテンス）を使用して糸状菌細胞に共送達することができる。形質転換細胞は、標的遺伝子座をフォワードプライマー及びリバースプライマーを用いて増幅させることにより、ＰＣＲによってスクリーニングされる。これらのプライマーは、野生型遺伝子座又はＲＧＥＮによって編集されている改変遺伝子座を増幅させることができる。次いで、これらの断片は、編集されたコロニーを同定するために、シーケンシングプライマーを使用して配列決定される。
【０２００】
ＩＶ．目的タンパク質
先行するセクションで手短に述べたように、本菌株及び方法は、糸状菌の深部培養中における商業的に重要なタンパク質の産生において利用される。本開示の目的タンパク質（ＰＯＩ）は、任意の内在性又は異種タンパク質であってよく、そのようなＰＯＩの変異体であってもよい。タンパク質は、１つ以上のジスルフィド架橋を含有し得る、又はその機能的形態が単量体若しくは多量体であるタンパク質である。即ち、タンパク質は、四次構造を有し、複数の同一（相同）若しくは非同一（異種）サブユニットから構成され、ここで、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、好ましくは目的特性を備えるタンパク質である。
【０２０１】
所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、（未改変）親菌株と比較して増加したタンパク質力価を示すが、ここで、タンパク質力価は、１容積当たりのタンパク質の量（ｇ／Ｌ）であると規定されている。例えば、力価は、当分野において公知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＬＣ／ＭＳ等）によって測定することができる。従って、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、未改変（親）細胞と比較して少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上のタンパク質力価の増加を含む。
【０２０２】
所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、（未改変）親菌株と比較して増加した容積生産性を示すが、ここで、容積生産性は、発酵中に産生した、全発酵時間（ｈ）当たり呼び容積（Ｌ）当たりのタンパク質の量（ｇ）であると規定されている。例えば、容積生産性は、当分野において公知の方法（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＨＰＬＣ、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ、ＬＣ／ＭＳ等）によって測定することができる。従って、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、未改変（親）細胞と比較して少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の容積生産性の増加を含む。
【０２０３】
所定の他の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、（未改変）親菌株と比較して増加した全タンパク質収率を示すが、ここで、全タンパク質収率は、供給された炭水化物１ｇ当たりの産生したタンパク質の量（ｇ）であると規定されている。従って、本明細書で使用する全タンパク質収率（ｇ／ｇ）は、下記の方程式：
Ｙｆ＝Ｔｐ／Ｔｃ
【０２０４】
（式中、「Ｙｆ」は全タンパク質収率（ｇ／ｇ）であり、「Ｔｐ」は発酵中に産生した全タンパク質（ｇ）であり、及び「Ｔｃ」は発酵（バイオリアクター）作動中に供給された全炭水化物（ｇ）である）を使用して計算することができる。所定の実施形態では、改変菌株の全タンパク質収率における増加は、未改変（親）細胞と比較して少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の増加である。
【０２０５】
全タンパク質収率は、更に、例えば、全タンパク質中に組み込まれる供給された炭素のパーセンテージ（％）として、炭素変換効率／炭素収率として記載することもできる。従って、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、（未改変）親菌株と比較して、増加した炭素変換効率（例えば、全タンパク質中に組み込まれる供給された炭素のパーセンテージ（％）の増加）を含む。所定の実施形態では、改変菌株の炭素変換効率における増加は、未改変（親）細胞と比較して少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の増加である。
【０２０６】
所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、（非改変）親菌株と比較して、増加したＰＯＩの比生産性（Ｑｐ）を示す。例えば、比生産性（Ｑｐ）の検出は、タンパク質の生産性を評価するために好適な方法である。比生産性（Ｑｐ）は、下記の方程式：
「Ｑｐ＝ｇＰ／ｇＤＣＷ・ｈｒ」
（式中、「ｇＰ」は、タンク中において産生されるタンパク質のグラムであり；「ｇＤＣＷ」は、タンク中の乾燥細胞重量（ＤＣＷ）のグラムであり、「ｈｒ」は、接種時点からの発酵時間であり、これは、産生時間、並びに増殖時間を含む）を使用して決定することができる。従って、所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株は、未改変（親）細胞と比較して少なくとも約０．１％、少なくとも約１％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％又は少なくとも約１０％以上の比生産性（Ｑｐ）の増加を含む。
【０２０７】
所定の実施形態では、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、アセチルエステラーゼ、アミノペプチダーゼ、アミラーゼ、アラビナーゼ、アラビノフラノシダーゼ、炭酸脱水酵素、カルボキシペプチダーゼ、カタラーゼ、セルラーゼ、キチナーゼ、キモシン、クチナーゼ、デオキシリボヌクレアーゼ、エピメラーゼ、エステラーゼ、α−ガラクトシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、α−グルカナーゼ、グルカンリアーゼ、エンド−β−グルカナーゼ、グルコアミラーゼ、グルコースオキシダーゼ、α−グルコシダーゼ、β−グルコシダーゼ、グルクロニダーゼ、グリコシルヒドロラーゼ、ヘミセルラーゼ、ヘキソースオキシダーゼ、ヒドロラーゼ、インベルターゼ、イソメラーゼ、ラッカーゼ、リガーゼ、リパーゼ、リアーゼ、マンナナーゼ、マンノシダーゼ、オキシダーゼ、酸化還元酵素、ペクチン酸リアーゼ、ペクチンアセチルエステラーゼ、ペクチンデポリメラーゼ、ペクチンメチルエステラーゼ、ペクチン分解酵素、ペルヒドロラーゼ、ポリオールオキシダーゼ、ペルオキシダーゼ、フェノールオキシダーゼ、フィターゼ、ポリガラクツロナーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ラムノ−ガラクツロナーゼ、リボヌクレアーゼ、トランスフェラーゼ、輸送タンパク質、トランスグルタミナーゼ、キシラナーゼ、ヘキソースオキシダーゼ及びそれらの組合せからなる群から選択される。
【０２０８】
所定の実施形態では、ＰＯＩ若しくはその変異ＰＯＩは、ＥＣ１、ＥＣ２、ＥＣ３、ＥＣ４、ＥＣ５若しくはＥＣ６からなる群から選択される酵素委員会（ＥＣ）番号から選択される。
【０２０９】
例えば、所定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ１．１０．３．２（例えば、ラッカーゼ）、ＥＣ１．１０．３．３（例えば、Ｌ−アスコルビン酸オキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．１（例えば、アルコール脱水素酵素）、ＥＣ１．１１．１．１０（例えば、塩化物ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１１．１．１７（例えば、ペルオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．１．２７（例えば、Ｌ−乳酸脱水素酵素）、ＥＣ１．１．１．４７（例えば、グルコース１−脱水素酵素）、ＥＣ１．１．３．Ｘ（例えば、グルコースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１．３．１０（例えば、ピラノースオキシダーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．Ｘ（例えば、ジオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１３．１１．１２（例えば、リノール酸１３Ｓ−リポキシゲナーゼ（ｌｉｐｏｚｙｇｅｎａｓｅ））、ＥＣ１．１．３．１３（例えば、アルコールオキシダーゼ）、ＥＣ１．１４．１４．１（例えば、モノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１４．１８．１（例えば、モノフェノールモノオキシゲナーゼ）、ＥＣ１．１５．１．１（例えば、スーパーオキシドジスムターゼ）、ＥＣ１．１．５．９（以前のＥＣ１．１．９９．１０、例えば、グルコース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．１８（例えば、セロビオース脱水素酵素）、ＥＣ１．１．９９．２９（例えば、ピラノース脱水素酵素）、ＥＣ１．２．１．Ｘ（例えば、脂肪酸還元酵素）、ＥＣ１．２．１．１０（例えば、アセトアルデヒド脱水素酵素）、ＥＣ１．５．３．Ｘ（例えば、フルクトシルアミン還元酵素）、ＥＣ１．８．１．Ｘ（例えば、ジスルフィド還元酵素）及びＥＣ１．８．３．２（例えば、チオールオキシダーゼ）から選択されるＥＣ１酵素（酸化還元酵素）を含むがそれらに限定されない酸化還元酵素である。
【０２１０】
所定の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ２．３．２．１３（例えば、トランスグルタミナーゼ）、ＥＣ２．４．１．Ｘ（例えば、ヘキソシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４０（例えば、アルテルナスクラーゼ（ａｌｔｅｒｎａｓｕｃｒａｓｅ）、ＥＣ２．４．１．１８（例えば、１，４α−グルカン分枝酵素）、ＥＣ２．４．１．１９（例えば、シクロマルトデキストリングルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２（例えば、デキストリンデキストラナーゼ）、ＥＣ２．４．１．２０（例えば、セロビオースホスホリラーゼ）、ＥＣ２．４．１．２５（例えば、４−α−グルカノトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．３３３（例えば、１，２−β−オリゴグルカンリントランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．４（例えば、アミロスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．５（例えば、デキストランスクラーゼ）、ＥＣ２．４．１．６９（例えば、ガラクトシド２−α−Ｌ−フコシルトランスフェラーゼ）、ＥＣ２．４．１．９（例えば、イヌロスクラーゼ）、ＥＣ２．７．１．１７（例えば、キシルロキナーゼ）、ＥＣ２．７．７．８９（以前のＥＣ３．１．４．１５、例えば、［グルタミンシンテターゼ］−アデニリル−Ｌ−チロシンホスホリラーゼ）、ＥＣ２．７．９．４（例えば、αグルカンキナーゼ）及びＥＣ２．７．９．５（例えば、ホスホグルカンキナーゼ）から選択されるＥＣ２（トランスフェラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないトランスフェラーゼ酵素である。
【０２１１】
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ３．１．Ｘ．Ｘ（例えば、エステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．１（例えば、ペクチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．１４（例えば、クロロフィラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２０（例えば、タンナーゼ）、ＥＣ３．１．１．２３（例えば、グリセロール−エステルアシルヒドロラーゼ）、ＥＣ３．１．１．２６（例えば、ガラクトリパーゼ）、ＥＣ３．１．１．３２（例えば、ホスホリパーゼＡ１）、ＥＣ３．１．１．４（例えば、ホスホリパーゼＡ２）、ＥＣ３．１．１．６（例えば、アセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７２（例えば、アセチルキシランエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７３（例えば、フェルロイルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．７４（例えば、クチナーゼ）、ＥＣ３．１．１．８６（例えば、ラムノガラクツロナンアセチルエステラーゼ）、ＥＣ３．１．１．８７（例えば、フモシンＢ１エステラーゼ）、ＥＣ３．１．２６．５（例えば、リボヌクレアーゼＰ）、ＥＣ３．１．３．Ｘ（例えば、リン酸加水分解酵素）、ＥＣ３．１．３０．１（例えば、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）ヌクレアーゼＳ１）、ＥＣ３．１．３０．２（例えば、セラチア・マルセッセンス（Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ）ヌクレアーゼ）、ＥＣ３．１．３．１（例えば、アルカリホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．２（例えば、酸性ホスファターゼ）、ＥＣ３．１．３．８（例えば、３−フィターゼ）、ＥＣ３．１．４．１（例えば、ホスホジエステラーゼＩ）、ＥＣ３．１．４．１１（例えば、ホスホイノシチドホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．３（例えば、ホスホリパーゼＣ）、ＥＣ３．１．４．４（例えば、ホスホリパーゼＤ）、ＥＣ３．１．６．１（例えば、アリールスルファターゼ）、ＥＣ３．１．８．２（例えば、ジイソプロピル−フルオロホスファターゼ）、ＥＣ３．２．１．１０（例えば、オリゴ−１，６−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１０１（例えば、マンナンエンド−１，６−α−マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１１（例えば、α−１，６−グルカン−６−グルカノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３１（例えば、キシランα−１，２−グルクロノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３２（例えば、キトサンＮ−アセチルグルコサミノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１３９（例えば、α−グルクロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１４（例えば、キチナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５１（例えば、キシログルカン特異的エンド−β−１，４−グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１５５（例えば、キシログルカン特異的エキソ−β−１，４−グルカナーゼ）、ＥＣ３．２．１．１６４（例えば、ガラクタンエンド−１，６−β−ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７（例えば、リゾチーム）、ＥＣ３．２．１．１７１（例えば、ラムノガラクツロナンヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．１７４（例えば、ラムノガラクツロナンラムノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２（例えば、β−アミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．２０（例えば、α−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２２（例えば、α−ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２５（例えば、β−マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．２６（例えば、β−フ���クトフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３７（例えば、キシラン１，４−β−キシロシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．３９（例えば、グルカンエンド−１，３−β−Ｄ−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．４０（例えば、α−Ｌ−ラムノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５１（例えば、α−Ｌ−フコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５２（例えば、β−Ｎ−アセチルヘキソサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５５（例えば、α−Ｎ−アラビノフラノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５８（例えば、グルカン１，３−β−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．５９（例えば、グルカンエンド−１，３−α−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６７（例えば、ガラクツラン１，４−α−ガクツロニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．６８（例えば、イソアミラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７（例えば、１−β−Ｄ−フルクタンフルクタノヒドロラーゼ）、ＥＣ３．２．１．７４（例えば、グルカン１，４−β−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７５（例えば、グルカンエンド−１，６−β−グルコシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．７７（例えば、マンナン１，２−（１，３）−α−マンノシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８０（例えば、フルクタンβ−フルクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８２（例えば、エキソ−ポリ−α−ガラクツロニシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．８３（例えば、κ−カラギナーゼ）、ＥＣ３．２．１．８９（例えば、アラビノガラクタンエンド−１，４−β−ガラクトシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９１（例えば、セルロース１，４−β−セロビオシダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９６（例えば、マンノシル−グリコプロテインエンド−β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ）、ＥＣ３．２．１．９９（例えば、アラビナンエンド−１，５−α−Ｌ−アラビナナーゼ）、ＥＣ３．４．Ｘ．Ｘ（例えば、ペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．Ｘ（例えば、アミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１（例えば、ロイシルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１１．１８（例えば、メチオニルアミノペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１３．９（例えば、Ｘａａ−Ｐｒｏジペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１４．５（例えば、ジペプチジル−ペプチダーゼＩＶ）、ＥＣ３．４．１６．Ｘ（例えば、セリン型カルボキシペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．１６．５（例えば、カルボキシペプチダーゼＣ）、ＥＣ３．４．１９．３（例えば、ピログルタミル−ペプチダーゼＩ）、ＥＣ３．４．２１．Ｘ（例えば、セリンエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．１（例えば、キモトリプシン）、ＥＣ３．４．２１．１９（例えば、グルタミルエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．２６（例えば、プロリルオリゴペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２１．４（例えば、トリプシン）、ＥＣ３．４．２１．５（例えば、トロンビン）、ＥＣ３．４．２１．６３（例えば、オリジン）、ＥＣ３．４．２１．６５（例えば、テルモミコリン）、ＥＣ３．４．２１．８０（例えば、ストレプトグリシンＡ）、ＥＣ３．４．２２．Ｘ（例えば、システインエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２２．１４（例えば、アクチニダイン）、ＥＣ３．４．２２．２（例えば、パパイン）、ＥＣ３．４．２２．３（例えば、フィカイン）、ＥＣ３．４．２２．３２（例えば、ステムブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．３３（例えば、フルーツブロメライン）、ＥＣ３．４．２２．６（例えば、キモパパイン）、ＥＣ３．４．２３．１（例えば、ペプシンＡ）、ＥＣ３．４．２３．２（例えば、ペプシンＢ）、ＥＣ３．４．２３．２２（例えば、エンドチアペプシン）、ＥＣ３．４．２３．２３（例えば、ムコールペプシン）、ＥＣ３．４．２３．３（例えば、ガストリクシン）、ＥＣ３．４．２４．Ｘ（例えば、メタロエンドペプチダーゼ）、ＥＣ３．４．２４．３９（例えば、ドイテロリシン）、ＥＣ３．４．２４．４０（例えば、セラリシン）、ＥＣ３．５．１．１（例えば、アスパラギナーゼ）、ＥＣ３．５．１．１１（例えば、ペニシリンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．１４（例えば、Ｎ−アシル−脂肪族−Ｌ−アミノ酸アミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２（例えば、Ｌ−グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．２８（例えば、Ｎ−アセチルムラモイル−Ｌ−アラニンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４（例えば、アミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．４４（例えば、タンパク質−Ｌ−グルタミンアミドヒドロラーゼ）、ＥＣ３．５．１．５（例えば、ウレアーゼ）、ＥＣ３．５．１．５２（例えば、ペプチド−Ｎ（４）−（Ｎ−アセチル−β−グルコサミニル）アスパラギンアミダーゼ）、ＥＣ３．５．１．８１（例えば、Ｎ−アシル−Ｄ−アミノ酸デアシラーゼ）、ＥＣ３．５．４．６（例えば、ＡＭＰデアミナーゼ）及びＥＣ３．５．５．１（例えば、ニトリラーゼ）から選択されるＥＣ３（ヒドロラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないヒドロラーゼ酵素である。
【０２１２】
他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ４．１．２．１０（例えば、マンデロニトリルリアーゼ）、ＥＣ４．１．３．３（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸リアーゼ）、ＥＣ４．２．１．１（例えば、炭酸脱水酵素）、ＥＣ４．２．２．−（例えば、ラムノガラクツロナンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．１０（例えば、ペクチンリアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２２（例えば、ペクチン酸三糖リアーゼ）、ＥＣ４．２．２．２３（例えば、ラムノガラクツロナンエンドリアーゼ）及びＥＣ４．２．２．３（例えば、マンヌロン酸特異的アルギン酸リアーゼ）から選択されるＥＣ４（リアーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリアーゼ酵素である。
【０２１３】
所定の他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ５．１．３．３（例えば、アルドース１−エピメラーゼ）、ＥＣ５．１．３．３０（例えば、Ｄ−プシコース３−エピメラーゼ）、ＥＣ５．４．９９．１１（例えば、イソマルツロースシンターゼ）及びＥＣ５．４．９９．１５（例えば、（１→４）−α−Ｄ−グルカン１−α−Ｄ−グルコシルムターゼ）から選択されるＥＣ５（イソメラーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないイソメラーゼ酵素である。
【０２１４】
更に他の実施形態では、ＰＯＩは、ＥＣ６．２．１．１２（例えば、４−クマリン酸塩：補酵素Ａリガーゼ）及びＥＣ６．３．２．２８（例えば、Ｌ−アミノ酸α−リガーゼ）から選択されるＥＣ６（リガーゼ）酵素を含むがそれらに限定されないリガーゼ酵素である。
【０２１５】
本発明の菌株及び方法のこれらや他の態様及び実施形態は、本明細書及び下記の実施例に照らせば、当業者には明白になるであろう。
【実施例】
【０２１６】
本開示の所定の態様は、限定するものと解釈すべきでない以下の実施例に照らして更に理解することができる。材料及び方法の変更は、当業者には明白であろう。
【０２１７】
実施例１
糸状菌におけるタンパク質生産増加の原因としてのｌｏｖ遺伝子の同定
Ａ．概説
本実施例では、グルコアミラーゼ（ＧＡ）構築物を発現する、「Ｂ７ｍｓ１」と命名された、粘度の減少したトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株を振とうフラスコ条件下で菌糸塊を形成する傾向を減少させる方向に特異的に進化させた。より特別には、Ｂ７ｍｓ１の突然変異（菌株）を同定し、単離し、「Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２」と命名した。（突然変異）Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２菌株は、Ｂ７ｍｓ１（親）菌株と比較して、発酵槽内の供給糖類に対する４０％高いタンパク質収率を有していた（例えば、図１を参照されたい）。
【０２１８】
従って、本明細書に記載したように、Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２（突然変異）菌株の観察された（増加された生産性）表現型の原因である、その中の遺伝子内の１つ以上の突然変異を同定するために、Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２（突然変異）菌株に関して、ゲノム配列分析及び遺伝子分析を実施した。本明細書に開示したように、同定した突然変異は、（天然）ＬＯＶタンパク質のコーディング配列を変化させることが決定されたが、ここで（天然）ＬＯＶタンパク質（配列番号２）のアミノ酸（残基）８１３位（Ｔ８１３）での高度に保存されたトレオニン（Ｔ）は、（変異）ＬＯＶタンパク質の８１３位でリシン（８１３Ｋ）に変化（置換）させられた（配列番号４；即ち、Ｔ８１３Ｋ置換）（例えば、図２を参照されたい）。
【０２１９】
Ｂ．進化戦略
糸状菌種（例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）種、アスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）種、フザリウム（Ｆｕｓａｒｉｕｍ）種、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）種、クリソスポリウム（Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、セファロスポリウム（Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ）種、タラロマイセス（Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ）種、ゲオスミチア（Ｇｅｏｓｍｉｔｈｉａ）種、ニューロスポラ（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）種、ミセリオフトラ（Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ）種等）は、商業的／工業用発酵において使用した場合に、一般に濃い粘性発酵ブロスを生成する好気性真菌である。高い発酵（ブロス）粘度は、典型的には、溶存酸素（ＤＯ）トランスファーを減少させ、それにより細胞集団の量を限定し、そのような好気性糸状菌発酵において達成され得る容積生産性を減少させる。例えば、粘度が減少した糸状菌突然変異体の単離は、より粘度が低い発酵ブロスを産生する突然変異菌株／細胞を生じさせたが、ここでそのような粘度が減少した菌株／細胞を用いる発酵は、タンパク質生産性の増加をもたらすより多くの細胞集団を利用することができる（例えば、本出願人による国際公開第２０１２／１４５５８４号パンフレット、同第２０１２／０２７５８０号パンフレット、同第２０１２／１４５５９５号パンフレット、同第２０１２／１４５５９６及び同第２０１２／１４５５９２号パンフレットを参照されたい）。より特別には、本出願人が更に粘度が減少したその菌株を生成するために所定の粘度が減少した突然変異を組み合わせ始めるにつれて、驚くべきことに、それらの所定の（減少する）粘度の組み合わせが振とうフラスコアッセイにおいて菌糸塊（ｍｙｃｅｌｉａｌ  ｐｅｌｌｅｔｓ）を形成するより大きな傾向を有するように見えることが観察された。
【０２２０】
より特別には、本明細書で企図したように、振とうフラスコ内で観察された菌糸塊を形成する増加した傾向が発酵槽に規模を拡大できる場合は、本出願人は、指向進化実験によって、上述の菌糸塊を形成する（ｐｅｌｔｉｎｇ）表現型を緩和することを探求した。例えば、何らかの特定の理論、機構又は作用形態によって結び付けようと考えなくても、本明細書では、菌糸塊を形成するこのような傾向は、タンパク質産生及び／又はこのようなタンパク質の下流加工処理に悪影響を及ぼす可能性があると考えられる。従って本出願人は、これらの菌株の「進化した」突然変異体を生成する、スクリーニングする、及び単離することができ、そのような進化した菌株は、振とうフラスコ、発酵槽、バイオリアクター内等で菌糸塊を形成する傾向の減少を含むことを合理的に説明することができた。
【０２２１】
例えば、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株Ｂ７ｍｓ１は、完全複合培地を含有する振とうフラスコ内で１２〜２４時間増殖させ、次に７０マイクロメートル（μｍ）のふるいに通した。新鮮細胞培地に接種するためには細胞密度に依存する素通り画分（ｆｌｏｗ  ｔｈｒｏｕｇｈ）を使用したか、又は素通り画分の全体を新鮮振とうフラスコに移した。接種後、このプロセスを可能性のある突然変異体を単離するために後で平板培養される試料を時々採取しながら、数週間に渡り連続して繰返した。単離体は、振とうフラスコの形態における肉眼的変化（例えば、菌糸塊の形成若しくは大きな菌糸塊の形成（ｍｙｃｅｌｉａ  ｃｈｕｎｋｉｎｅｓｓ）を含むが、これらに限定されない振とうフラスコの変化）について（個別に）視覚的にスクリーニングした。振とうフラスコ内でより均質な増殖を示すそれらの単離体については、振とうフラスコ内、及び次に発酵槽内でのタンパク質生産について追加して試験した。
【０２２２】
Ｃ．トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）突然変異菌株Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２の単離及び特性解析。
上記に規定したそのような進化スキームにおいては、本出願人は、（突然変異）「Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２」と命名された突然変異菌株を単離し、（親）Ｂ７ｍｓ１菌株と比較して、振とうフラスコ内のより高いタンパク質産生を証明した（データは示していない）。従って、上述の菌糸塊を形成する表現型に及ぼす任意の影響とは無関係に、宿主菌株のタンパク質産生表現型を強化する任意の突然変異は、発酵／タンパク質生産コストを減少させるためのその潜在力において特に重要である。
【０２２３】
そこで、（親）Ｂ７ｍｓ１菌株及び自然突然変異（娘）菌株Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２を発酵槽内での全タンパク質産生についてアッセイした。これらの菌株は、深部（液体培地）中の同一条件下で増殖させ、１４Ｌの発酵槽内での供給糖類に対するそれらの全タンパク質収率を比較した。図１に提示したように、突然変異Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２菌株（図１；黒色の線／黒色の四角形）は、（親）Ｂ７ｍｓ１菌株（図１；グレーの線／グレーの四角形）に比較して、供給糖類に対する収率が４４％増加する向上を証明した。
【０２２４】
手短には、各菌株の胞子は、サイドバッフル及びボトムバッフルの両方を備える３Ｌのフラスコ内の５００ｍＬの培地へ別個に添加した。培養は、３４℃の振とうインキュベーター内の最小培地中で４８時間に渡り増殖させた。４８時間後、各フラスコの内容物は、４．７ｇ／ＬのＫＨＰＯ、１．０ｇ／ＬのＭｇＳＯ７ＨＯ、４．３ｇ／Ｌの（ＮＨ）ＳＯ及び２．５ｍＬ／Ｌの４００×のＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素溶液（（無水）クエン酸、１７５ｇ／Ｌ；ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、２００ｇ／Ｌ；ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１６ｇ／Ｌ；ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、３．２ｇ／Ｌ；ＭｎＳＯ４Ｈ２Ｏ、１．４ｇ／Ｌ；Ｈ３ＢＯ３、０．８ｇ／Ｌ）を含有する９．５Ｌの培地を含有する１４Ｌの発酵槽に別個に添加した。これらの成分は一緒に、３０分間に渡り１２１℃で加熱殺菌した。６０％のグルコース及び０．４８％のＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの溶液は、別個にオートクレーブ滅菌し、冷却し、７５ｇ／Ｌのグルコース及び０．６ｇ／ＬのＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏの最終濃度まで発酵槽に添加した。この培地は２８％のＮＨを用いてｐＨ３．５へ調整し、全増殖期間に渡り温度を３４℃で維持した。グルコースが排出されると、温度が２８℃に低下したので、培養にグルコース−ソホロースを供給した。乾燥細胞重量（ＤＣＷ）、全タンパク質濃度及びその他のパラメーターを計測し、全タンパク質比生産率及び供給糖類に対する収率を計算した。
【０２２５】
Ｄ．トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）突然変異菌株Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２における原因となるｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）突然変異の同定
本出願人は、Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２ゲノム内のコーディング配列を変化させると予測された２つの新規な突然変異の同定をもたらした（親）Ｂ７ｍｓ１菌株及び（突然変異）Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２（娘）菌株をシーケンシングしたが、観察されたタンパク質生産性（向上）発現型には、それらの突然変異単独の何れか（又は組み合わせ）が不可欠であったであろう。より特別には、これらの突然変異の何れが重要であるのかを決定／同定するために、野生型遺伝子座の各々をコードするＤＮＡを備える（突然変異）Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２菌株を形質転換させることによる相補性分析を使用した。例えば、唯一の遺伝子座だけが形質転換すると突然変異表現型を補完したが、この遺伝子座をｌｏｖと呼んだ。ｌｏｖ遺伝子は、予測されたタンパク質ＰＩＤ  ５０２１２（配列番号２）をコードするが、（突然変異）Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２菌株では、ｌｏｖ突然変異体（対立遺伝子）はスカフォールド１６上の４２５３９３上でＧ（グアニン）からＴ（チミン）への単一ヌクレオチド変化を含み、コードされたＬＯＶ（変異）タンパク質（配列番号４）におけるアミノ酸置換Ｔ８１３Ｋを生じさせたが、その突然変異対立遺伝子は、本明細書では対立遺伝子「ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）」と呼び、及び天然（野生型）対立遺伝子は、本明細書では「ｌｏｖ（＋）」と呼ぶ。
【０２２６】
ＬＯＶタンパク質若しくはＬＯＶタンパク質オルソログの機能的特性解析は、文献において何れの生体についても記載されていなかった。本明細書で記載するように、保存ドメイン分析（ＮＣＢＩ）は、グリコシルトランスフェラーゼファミリーグループ２と遠縁に当たる領域を同定した（ｐｆａｍ１３６３２、３．２５×１０−４４のＥ値、例えば、図２における「Ｇｌｙｃｏ  ｔｒａｎｓ  ２  ３」を参照されたい）。例えば、原核生物タンパク質のこの（グリコシルトランスフェラーゼ）ファミリーのメンバーとしては、細菌莢膜生合成（ＰＦＡＭ）に包含される推定グルコシルトランスフェラーゼが挙げられる。より特別には、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ＰＩＤ  ７９３９６に対してオルソロガスである（即ち、ＬＯＶではない、ＰＩＤ５０２１２）（グリコシルトランスフェラーゼ）ファミリーグループ２ドメインである「ＺｔＧＴ２」を備える真菌タンパク質は、固体表面上での菌糸成長にとって重要である（Ｋｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。
【０２２７】
最も驚くべきことに、ＬＯＶタンパク質は、担子菌類（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ）及び子嚢菌門（Ａｓｃｏｍｙｃｅｔｅ  ｐｈｙｌａ）の糸状菌の中で広範に保存されている。例えば、（天然）ＬＯＶタンパク質（即ち、本明細書で開示したように、リシン（Ｋ）へのその突然変異は有益である）の８１３位のトレオニン（Ｔ）は、それにトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）及び最も工業上重要な糸状菌が属するチャワンタケ亜門（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ  ｓｕｂｐｈｙｌｕｍ）内で、ＮＣＢＩ非冗長性データベースのｔｏｐ  ＢＬＡＳＴｐ検索結果の間で高度に保存されている（６９１／６９１；１００％）。これらの６９１種のチャワンタケ（Ｐｅｚｉｚｏｍｙｃｏｔｉｎａ）ホモログのＧｅｎｅｉｏｕｓ多重配列アラインメントのグラフ提示（ｗｗｗ．ｇｅｎｅｉｏｕｓ．ｃｏｍ，Ｇｅｎｅｉｏｕｓ  １１．０，Ｂｉｏｍａｔｔｅｒｓ  Ｌｔｄ．）は、図２に示した。同様に、トップ１，０００のＢＬＡＳＴｐヒットの中で、残基８１３位は、ＭＵＳＣＬＥ多重配列アラインメント（Ｇｅｎｅｉｏｕｓソフトウエアパッケージ）において９７５／１０００（９７．５％）ヒットにおいて同一（即ち、残基Ｔ８１３）であったが、ここで残基８１３位は、決してリシン（Ｋ）としては発生しない（即ち、本明細書で記載した強化されたタンパク質生産性を生じさせる置換は、ＢＬＡＳＴｐによって同定されたトップ１，０００オルソログにおいては見出されなかった）。保存された位置及び突然変異は、真菌タンパク質生産を向上させるために有用であるが、Ｔ８１３残基は、Ｇｅｎｅｂａｎｋ内で以前に注釈された領域の何れかには含まれない（図２）。ＬＯＶタンパク質は、トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ゲノム内のこのクラスのタンパク質の唯一の予測されたメンバーであるが、他方多数のゲノムは２つ以上を有する。
【０２２８】
実施例２
粘度が減少した菌株におけるｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子の標的化導入は発酵槽内のタンパク質生産性を増加させる
Ａ．概説
ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子が観察されたタンパク質生産性向上の原因であることを詳細に検証するために、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）突然変異を異なるＴ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）菌株系統（本明細書では「Ｔ４」と命名した）内に導入した。Ｂ７ｍｓ１（実施例１）及びＴ４系統は、どちらもトリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）菌株ＲＬ−Ｐ３７の異なる菌株向上プログラムから突然変異誘発された誘導体である（Ｓｈｅｉｒ−Ｎｅｉｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４；Ｍｏｎｔｅｎｅｃｏｕｒｔ，１９８７）。Ｔ４菌株は、Ｂ７ｍｓ１とは、Ｔ４菌株がセルラーゼの天然カクテルを発現し、全タンパク質生産を増加させるｎｉｋ１（Ｍ７４３Ｔ）突然変異を含有するという点で著明に異なる（米国特許出願第２０１８００３７９１９号明細書）。以前のＢ７ｍｓ１系統（実施例１）と同様に、粘度が減少した二重突然変異体（Δｍｐｇ１；Δｓｅｂ１）は、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子の存在下又は非存在下の両方においてＴ４系統内で発現した。例えば、発酵槽内では、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を含むＴ４Δｍｐｇ１；Δｓｅｂ１菌株は、平均すると、供給糖類に対する３７％高い全タンパク質収率を有した。
【０２２９】
Ｂ．ｐｙｒ４若しくはｐｙｒ２選択マーカーの何れかを用いたｌｏｖ破壊カセットを含むプラスミドの構築
トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）ｌｏｖ破壊カセットプラスミドは、標準分子生物学的手法を用いて調製したが、関連する分野の当業者であれば本明細書に開示した情報からこのプラスミドを容易に作成することができよう。このプラスミドは、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １６、４２６９４７〜４２５３９３（左フランク）に対応するＤＮＡ配列と同一である１．６Ｋｂのホモロジーボックスを有するＤＮＡ配列を含んでいた。左フランクの最後のヌクレオチドは、（突然変異）Ｂ７ｍｓ１−ＳＦ１２菌株内で同定された突然変異に対応する、単一ヌクレオチドＧ〜Ｔ突然変異を導入した（実施例１）。このプラスミド内には、Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １６、４２５３９２〜４２３８８０（右フランク）と同一であるＤＮＡ配列に対応する１．５Ｋｂのホモロジーボックスを有するＤＮＡ配列も又含まれた。これらの配列は、ｌｏｖ遺伝子を標的化し、左フランクと右フランクとの間のゲノムのヌクレオチド（Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １６、４２５３９３）を介在カセット配列で置換するために設計された。
【０２３０】
これらの介在（カセット）配列は、トリコデルマ・リーゼイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ｒｅｅｓｅｉ）（ｐＲＡＴＴ３０８）配列由来のｐｙｒ４選択マーカー又はトリコデルマ・アトロビリデ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ  ａｔｒｏｖｉｒｉｄｅ）（ｐＲＡＴＴ３１２）配列由来のｐｙｒ２選択マーカーを含んでいた。選択マーカーの直ぐ下流は、左フランク（リピート）の３’に最も近い０．５Ｋｂ領域と相同である０．５Ｋｂ領域を有するＤＮＡ配列であった。これらの繰り返し配列は、将来の菌株発生におけるこのマーカーの次の使用を可能にし、唯一の新規な標的化遺伝子改変としてのＬＯＶ（Ｔ８１３Ｋ）タンパク質（配列番号４）をコードするｌｏｖ遺伝子内に単一ヌクレオチドＧからＴへの突然変異（Ｓｃａｆｆｏｌｄ  １６、４２５３９３）を残しながら、この選択マーカーのその後の消失を促進することが意図された。
【０２３１】
Ｃ．ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を用いたＴ４由来菌株の発生
本明細書では「Ｔ４ｍ」及び「Ｔ４ｍ＿ｐｙｒ２」と命名した、粘度が減少した遺伝子ｍｐｇ１（Δｍｐｇ１）の破壊を含むＴ４菌株の誘導体は、実質的に米国特許第９，７２５，７２７号明細書（全体として参照により本明細書に組み込まれる）に記載されたように発生させた。そこで、Ｔ４ｍ＿ｐｙｒ２菌株（Δｍｐｇ１；ｐｙｒ２）は、ＰＥＧ媒介性形質転換法を使用して、ｐＲＡＴＴ３１２（ｐｙｒ２選択マーカー）由来のｌｏｖ破壊カセットを用いて形質転換させ、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されたウリジン原栄養性に基づいて候補について選択するために、１．２Ｍのソルビトールを含有するフォーゲル最少培地（Ｖｏｇｅｌ，１９５６）上で平板培養した。トリコデルマ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）形質転換法は、当分野において周知であり、記載されている（例えば、米国特許第５，２４６，８５３号明細書を参照されたい）。個々の形質転換体を単離し、フォーゲル最少培地に移動させて増殖させた。ＰＣＲ分析を使用すると、下記のガイダンスによって当業者にば公知の方法を使用して、ｌｏｖ破壊カセットがｌｏｖ遺伝子座で相同組換えによって統合された形質転換を同定することができた。
【０２３２】
目的遺伝子の破壊を正確に標的化するには、組換え細胞のサブセットしか相同フランクをうまく利用することができないので、所望の事象を備える形質転換体を同定するためには、多数の形質転換体をスクリーニングする必要がある可能性がある。ＰＣＲを使用すると、どの組換え細胞が所望の標的化破壊を有するのかを試験することができる。ホモロジーボックス領域のそれぞれに渡って増幅するプライマーが設計されなければならないが、ここで、１つのプライマーは最も近い末端から１００ｂｐ超の選択マーカー内の１つの場所でプライミングし、他方のプライマーは、隣接ゲノム配列内のホモロジーボックス領域の末端を１００ｂｐ超える場所でプライミングする。正確な標的化破壊を含有する可能性が高い細胞は、破壊カセットの左フランクと右フランクに及ぶＰＣＲ産物を作製することに成功するであろうが、他方不成功に終わる形質転換事象は予想されるサイズの産物を生成しないであろう。この段階では、培養は形質転換細胞と未形質転換細胞の混合であるので、精製のステップが必要になる可能性がある。培養の精製は、破壊部位に渡る短いＰＣＲ産物の消失についてＰＣＲによって試験することができる。
【０２３３】
より特別には、ｌｏｖ遺伝子のｐｙｒ２破壊を含む１つのそのようなＴ４ｍ由来菌株を同定し、単離し、及び「Ｔ４ｍｌ＋」と命名した（即ち、特異的Ｔ８１３Ｋ置換をコードする対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）とは対照的に対立遺伝子ｌｏｖ（ｄｉｓ）を含む）。従って、特異的ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を含む菌株を生成するために、菌株Ｔ４ｍｌ＋の懸濁液（ｌｏｖ（ｄｉｓ）対立遺伝子を含む）は、挿入された選択マーカーに隣接する繰返し領域とゲノムからの選択マーカーの不随消失との間の自然組換えが存在した誘導菌株を選択するために、５−フルオロ−オロト酸（ＦＯＡ）を含有する培地上で平板培養した。ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子の存在を確証する目的で選択マーカーの消失及びＰＣＲ産物のシーケンシングを試験するために、ウリジン栄養要求体を単離してＰＣＲによって分析した。ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を含む１つの菌株をこの方法で生成し、本明細書では「Ｔ４ｍｌ」と呼ぶ。発酵槽を評価するためにピリミジン原栄養性を回復させるために、Ｔ４ｍｌ及びＴ４ｍ＿ｐｙｒ２菌株の両方が、実質的に米国特許第９，７２５，７２７号明細書に記載されたように、本明細書では「Ｔ４ｍｌｓ」と呼ばれる菌株を生じさせる、粘度を減少させる遺伝子座ｓｅｂ１へ標的化するｐｙｒ２マーカー（ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を含む）及び「Ｔ４ｍｓ」（ｌｏｖ（＋）対立遺伝子を含む）を有していた。
【０２３４】
Ｄ．ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を含むＴ４由来菌株の発酵槽の評価
従って、実施例１に記載したように、菌株Ｔ４ｍｌｓ（ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を含む）及びＴ４ｍｓ（ｌｏｖ（＋）対立遺伝子を含む）を発酵槽内で評価した。更に、Ｔ４ｍｌｓ及びＴ４ｍｓ菌株は、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を用いて観察されたタンパク質生産性表現型がより高い細胞密度発酵には限定されなかったことを確証するために、供給開始前に提供されるグルコース量を調整することによって、実施例１に比較して低い細胞密度発酵で評価した。図３に示したように、低細胞密度（ＬＣＤ；図３、Ｔ４ｍｌｓ、黒色の丸／黒色の破線；Ｔ４ｍｓ、グレーの丸／グレーの破線）発酵条件及び高細胞密度（ＨＣＤ；図３、Ｔ４ｍｌｓ、黒色の四角形／黒色の実線；Ｔ４ｍｓ、グレーの四角形／グレーの実線）発酵条件両方の下で、供給糖類に対するタンパク質収率は、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子が存在した場合は、それぞれ４２％及び３２％増加した。
【０２３５】
実施例３
ｐｙｒ２選択マーカーの挿入によるｌｏｖ遺伝子の標的化破壊は発酵槽内での生産性を向上させることに失敗した
Ａ．概説
（天然）ＬＯＶタンパク質（配列番号２）の残基８１３位でのトレオニン（Ｔ）アミノ酸の高い保存を前提にすると、ＬＯＶタンパク質の発現／産生をブロックするであろう何らかの方法での遺伝子座の破壊は、更に菌株生産性も又同様に向上させるである可能性が高いと思われた。この仮説を試験するため、ｌｏｖ（ｄｉｓ）対立遺伝子を備える、及び備えない真菌株を発酵槽内で比較したが、ここでＬＯＶタンパク質の発現を破壊させるためにｐｙｒ２選択マーカーをｌｏｖ遺伝子内に挿入した。驚くべきことに、ｌｏｖ（ｄｉｓ）対立遺伝子は、発酵槽内の産生を向上させなかった。
【０２３６】
Ｂ．ｌｏｖ（ｄｉｓ）対立遺伝子を含む菌株の発酵槽の評価
Ｔ４ｍ及びＴ４ｍｌ＋菌株の発生については、上記の実施例２において記載した。菌株Ｔ４ｍｌ＋は、ｐｙｒ２マーカーが菌株Ｔ４ｍ＿ｐｙｒ２のｌｏｖコーディング配列内に挿入された、Ｔ４ｍの誘導体である。Ｔ４ｍ及びＴ４ｍｌ＋菌株は、供給開始前に提供されるグルコースの量を調整することによって低細胞密度の発酵であったことを除いて、実施例１に記載したものと実質的に同一であった１４Ｌの発酵槽内の同一条件下で評価した。
【０２３７】
本明細書では「Ｔ４ｓ」及び「Ｔ４ｓ＿ｐｙｒ２」（遺伝子ｓｅｂ１の粘度が減少した破壊を含む）と命名されたＴ４の誘導体は、実質的に米国特許第９，７２５，７２７号明細書に記載されたように発生させた。ｌｏｖ（ｄｉｓ）対立遺伝子は、菌株Ｔ４ｓｌ＋を生成するために、実施例２において菌株Ｔ４ｍ＿ｐｙｒ２について記載した方法に類似して、Ｔ４ｓ＿ｐｙｒ２内に導入した。従って、Ｔ４ｓ及びＴ４ｓｌ＋菌株は、２Ｌのバイオリアクター内の同一条件下で評価した。詳細には、種培養を作製するために、２Ｌのバイオリアクターに対して、各菌株の芽胞を２５０ｍＬのフラスコ内の５０ｍＬのクエン酸最少培地に個別に加えた。この培養を３０℃及び１７０ｒｐｍの振とうインキュベーター内で４８時間に渡り増殖させた。４８時間後、１４５．６ｍＬの５０％のグルコース及びｐＨ３．５に調整した０．６ｇ／ｋｇのＣａＣｌ２に種培養を接種した。その後、温度を３４℃、及びｐＨを３．５で維持した。バッチ処理グルコースを排出させた後に、グルコース−ソホロース供給材料を導入すると、温度は２５℃に低下し、ｐＨは４．８に上昇した。乾燥細胞重量（ＤＣＷ）、全タンパク質濃度及びその他のパラメーターを計測し、全タンパク質比生産率及び供給糖類に対する収率を計算した。図４に示したように、供給糖類に対するタンパク質収率は、Ｔ４ｍバックグラウンド内にｌｏｖ（ｄｉｓ）突然変異が存在した場合は１７％減少したが、Ｔ４ｓバックグラウンド内に存在した場合は変化しなかった。
【０２３８】
実施例４
他の真菌株におけるｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子の標的化導入はタンパク質生産性を向上させる
Ａ．概説
実施例２では、対立遺伝子ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）の生成及びマーカー消失が付随して生成したｐｙｒ２の栄養要求性は、ｓｅｂ１遺伝子座でのｐｙｒ２マーカーの統合によって回復させられた。このため、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を用いて観察されたタンパク質生産における向上は、実施例１及び２における、ｍｐｇ１及びｓｅｂ１両方の必ず粘度突然変異を含有する菌株では実証からは遙かに遠かった。菌株生産性の向上のためにｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子のより一般的な用途を証明するため、３つの他の便宜的な遺伝子位置：部位Ａ、部位Ｂ及び部位Ｃでｐｙｒ２マーカーを統合した。これらの異なる菌株によるタンパク質産生を振とうフラスコ内で評価したが、ここで全部の場合において、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）突然変異の存在が、野生型ｌｏｖ（＋）対立遺伝子を含む同質遺伝子菌株と比較して、全タンパク質生産を向上させた。これとは反対に、ｌｏｖ（ｄｉｓ）突然変異を含む菌株は、振とうフラスコ内のタンパク質生産における有意な向上を示さなかった。
【０２３９】
Ｂ．異なる遺伝子位置でのｐｙｒ２選択マーカーの標的化統合によるＴ４ｍｌ及びＴ４ｓｌにおける回復したピリミジン栄養要求性
ｌｏｖ（Ｔ３１８Ｋ）対立遺伝子を備える、又は備えない何れかの菌株は、当業者であれば公知の方法を用いて、部位Ａ〜Ｃと指名された３つの便宜的な遺伝子位置にｐｙｒ２を標的化統合するカセットを用いて独立して形質転換させた。手短には、ｐｙｒ２カセットを用いたＰＥＧ媒介形質転換後、プロトプラストは、ｐｙｒ２マーカーによって獲得されたウリジン栄養要求体に基づく候補について選択するために１．２Ｍのソルビトールを含有するフォーゲルの最小培地上で平板培養した。個々の形質転換体を単離し、フォーゲル最少培地に移動させて増殖させた。ＰＣＲ分析法を使用して、その中でｐｙｒ２カセットが意図された遺伝子位置で統合された形質転換体を同定した。胞子の精製後、統合が正確に発生したこと、及び形質転換体が同核状態であることを確認するために、更なるＰＣＲ分析を実施した。
【０２４０】
従って、ｐｙｒ２マーカーは、実施例２において記載したｐｙｒ２突然変異体菌株Ｔ４ｍ＿ｐｙｒ２（ｌｏｖ（＋））及びＴ４ｍｌにおける部位Ａ、部位Ｂ及び部位Ｃで統合された（Δｍｐｇ１；ｌｏｖ（Ｔ３１８Ｋ））（表１を参照されたい）。同様に、ｐｙｒ２マーカーは、実施例３に記載した突然変異体菌株Ｔ４ｓ＿ｐｙｒ２（Δｓｅｂ１；ｌｏｖ（＋））及びＴ４ｓｌ（Δｓｅｂ１；ｌｏｖ（Ｔ３１８Ｋ））内の部位Ａで統合された。更に、破壊対立遺伝子ｌｏｖ（ｄｉｓ）は、実施例２に記載したように、プラスミドｐＲＡＴＴ３１２及びｐＲＡＴＴ３０８各々を用いて全セルラーゼ菌株Ｔ４＿ｐｙｒ２（ｐｙｒ２；ｌｏｖ（＋））及び４１Ｇ＿ｐｙｒ４（ｐｙｒ４；ｌｏｖ（＋））に加えた。
【０２４１】
Ｃ．ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）若しくはｌｏｖ（ｄｉｓ）を備える、又は備えない何れかの菌株の対立遺伝子振とうフラスコの評価
菌株をそれらのタンパク質生産について振とうフラスコ発酵で評価した。評価した菌株は、表１に列挙した。試験した遺伝的バックグラウンドでは、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子が存在する場合は、全タンパク質力価が上昇した。しかしながら、ｌｏｖ遺伝子、ｐｙｒ４（４１Ｇ）若しくはｐｙｒ２マーカー（Ｔ４及びＴ４ｍ）の何れかを備えるｌｏｖ（ｄｉｓ）対立遺伝子の破壊は、相対力価における有意な向上を示さなかった。
【０２４２】
液体規定（ＬＤ）培養培地（例えば、米国特許第８，４５５，６３１号明細書を参照されたい）は、下記の成分を含有していた。カザミノ酸、９ｇ／Ｌ；（ＮＨ４）２ＳＯ４、５ｇ／Ｌ；ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ；ＫＨ２ＰＯ４、４．５ｇ／Ｌ；ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、１ｇ／Ｌ；ＰＩＰＰＳ、３３ｇ／Ｌ；４００×Ｔ．リーゼイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）微量元素、２．５ｍＬ／Ｌ；ｐＨ、ＮａＯＨを用いて５．５に調整。滅菌後、ラクトース若しくはグルコース／ソホロース混合液を１．６（重量／容積）％の最終濃度に添加した。
【０２４３】
種培養を創出するために、２５０ｍＬフラスコ内の５０ｍＬのＹＥＧ（５ｇ／Ｌの酵母抽出物、２２ｇ／Ｌのグルコース、Ｈ２Ｏ）に各菌株の芽胞を個別に加えた。培養は、振とうインキュベーター内で３６〜４８時間に渡り２８℃及び２００ｒｐｍで増殖させた。インキュベーション後、０．３ｍＬの種培養をバッフル付き振とうフラスコ内で５０  ｍＬのＬＤ培地中に加えた。この生産培養を５日間に渡り２８℃及び１８０ｒｐｍで増殖させた。分泌されたタンパク質は、細胞をペレット化し、次に上清を収集するために、遠心分離によって収穫した。タンパク質は、当量のトリクロロ酢酸（ＴＣＡ）を用いて上清から沈降させ、その後に０．１Ｎの水酸化ナトリウム（ＮａＯＨ）中で溶解させた。次に全タンパク質は、製造業者のプロトコルに従ってＢＣＡタンパク質アッセイを用いて測定した（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，Ｎ．Ｙ．，ＵＳＡ）。全振とうフラスコ実験において、原栄養性Ｔ４及びＴ４ｍ菌株を２回ずつ含めた。ＢＣＡアッセイ数は、全タンパク質生産性効率における何れかの週毎の変化が及ぼす影響を最小限に抑えるために、並行して実施されたこれらのコントロールの平均値に正規化した。
【０２４４】
図５に示したように、タンパク質力価は、上記で例示したバイオリアクター内のＴ４ｍｓバックグラウンドに加えて、Ｔ４ｍｃ（部位Ｃ）、Ｔ４ｍｄ（部位Ｂ）、Ｔ４ｍｐ（部位Ａ）及びＴ４ｓｐ（部位Ａ）バックグラウンド内にｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）突然変異が存在する場合に増加した（実施例２）。それどころか、ｐｙｒ２マーカー又はｌｏｖ遺伝子を破壊させるｐｙｒ４マーカー、即ち対立遺伝子ｌｏｖ（ｄｉｓ）の挿入を含む遺伝的バックグラウンドである４１Ｇ、Ｔ４及びＴ４ｍは、振とうフラスコ内のタンパク質産生において有意な向上を示さなかった。
【０２４５】
Ｄ．ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子を備える、及び備えない菌株Ｔ４ｍｐの発酵槽評価
１対のこれらの菌株、Ｔ４ｍｐ及びＴ４ｍｌｐ（部位Ａでのｐｙｒ２の挿入）は、更に実施例１で一般に記載したように、１４Ｌ発酵槽内で、しかし低細胞密度で詳細に評価した。図６に示したように、ｌｏｖ（Ｔ８１３Ｋ）対立遺伝子の存在下では、この遺伝的バックグラウンドは、供給糖類に対する全タンパク質の２８％の増加を示した。
【０２４６】
参考文献
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国際公開第１９９２／０６１８３号パンフレット
国際公開第１９９２／０６２０９号パンフレット
国際公開第１９９２／０６２２１号パンフレット
国際公開第１９９８／１５６１９号パンフレット
国際公開第２００２／１２４６５号パンフレット
国際公開第２００５／０２８６３６号パンフレット
国際公開第２００６／０７４００５号パンフレット
国際公開第２０１２／０２７５８０号パンフレット
国際公開第２０１２／１４５５８４号パンフレット
国際公開第２０１２／１４５５９２号パンフレット
国際公開第２０１２／１４５５９５号パンフレット
国際公開第２０１２／１４５５９６号パンフレット
国際公開第２０１２／１４５５９８号パンフレット
国際公開第２０１６／１００２７２号パンフレット
国際公開第２０１６／１００５６２号パンフレット
国際公開第２０１６／１００５６８号パンフレット
国際公開第２０１６／１００５７１号パンフレット
国際公開第２０１６／１３０５２３号パンフレット
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米国特許第８，４５５，６３１号明細書
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【図１】
2021532775.tif 000004
【図２】
2021532775.tif 000005
【図３】
2021532775.tif 000006
【図４】
2021532775.tif 000007
【図５】
2021532775.tif 000008
【図６】
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【図７Ａ】
2021532775.tif 000010
【図７Ｂ】
2021532775.tif 000011
【図７Ｃ】
2021532775.tif 000012
【図７Ｄ】
2021532775.tif 000013
【図７Ｅ】
2021532775.tif 000014
【図７Ｆ】
2021532775.tif 000015
【図８Ａ】
2021532775.tif 000016
【図８Ｂ】
2021532775.tif 000017
【図８Ｃ】
2021532775.tif 000018
【図８Ｄ】
2021532775.tif 000019
【図８Ｅ】
2021532775.tif 000020
【図８Ｆ】
2021532775.tif 000021
【図８Ｇ】
2021532775.tif 000022
【配列表】
2021532775000001.app
【国際調査報告】
2021532775.tif 000023
2021532775.tif 000024