(57)【要約】  本発明は、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含む組成物であって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、ｉ）前記組成物中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又はｉｉ）前記組成物中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、組成物を提供する。こうした条件下で、プロテイナーゼ及び酵素的に活性なその断片は、誘導的に易熱性である。本発明は、更に、１以上のポリペプチド及びプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含む試料であって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又はｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、試料を提供する。本発明は、更に、こうしたプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の不活性化を含む方法を提供する。前記方法は、試料を加熱して前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性な断片を不活性化するステップを含み、ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又はｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含む組成物であって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｉ）前記組成物中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記組成物中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
組成物。
【請求項２】
好ましくは前記組成物が体積≦２００μｌである、１以上のポリペプチドを含む試料に適用するための溶液である、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
１以上のポリペプチド及びプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含む試料であって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
試料。
【請求項４】
試料中のプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化する方法であって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記方法が、前記試料を加熱して前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性な断片を不活性化するステップを含み、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
方法。
【請求項５】
試料中のポリペプチドを消化する方法であって、
ａ）前記試料をプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させるステップであって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むステップ、
ｂ）前記試料中のポリペプチドの少なくとも部分的消化を可能にする条件下で前記試料をインキュベーションするステップ、及び
ｃ）前記試料を加熱して前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップ
を含み、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
方法。
【請求項６】
目的の生体分子を試料から単離又は精製する方法であって、前記試料が１以上の混入ポリペプチドを含み、前記方法が、
ａ）前記試料をプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させるステップであって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むステップ、
ｂ）前記試料中のポリペプチドの少なくとも部分的消化を可能にする条件下で前記試料をインキュベーションするステップ、及び
ｃ）前記試料を加熱して前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップ
を含み、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭであり、
ｄ）前記目的の生体分子を前記試料から任意で除去するステップ
を含む方法。
【請求項７】
目的の生体分子を１以上のペプチド結合を介してそれに結合した第２の分子から遊離させる方法であって、
ａ）前記試料をプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させるステップであって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むステップ、
ｂ）前記ペプチド結合の１以上の消化によって前記目的の生体分子の遊離を可能にする条件下で前記試料をインキュベーションするステップ、及び
ｃ）前記試料を加熱して前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップ
を含み、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭであり、
前記目的の生体分子を前記試料から任意で除去するステップ
を含む方法。
【請求項８】
ｉ）前記組成物又は試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭであり、
ｉｉ）前記組成物又は試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物、試料又は方法。
【請求項９】
ｉ）前記組成物又は試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭであり、前記組成物又は試料がＥＤＴＡを本質的に含まない、好ましくはカルシウムキレート剤を本質的に含まない、又は
ｉｉ）前記組成物又は試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
請求項１から８のいずれか一項に記載の組成物、試料又は方法。
【請求項１０】
ｉ）前記組成物又は試料中の遊離カルシウム濃度が１〜８０μＭである、及び／又は
ｉｉ）前記組成物又は試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物、試料又は方法。
【請求項１１】
ｉ）前記組成物又は試料中の遊離カルシウム濃度が≦約３５μＭである、及び／又は
ｉｉ）前記組成物又は試料中の一価塩濃度が≧約４０ｍＭである、
請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物、試料又は方法。
【請求項１２】
前記試料のｐＨが６．５〜９．５、好ましくは７．５〜８．５である、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物、試料又は方法。
【請求項１３】
前記加熱ステップが前記試料を約５３〜約６７℃の温度で加熱するステップを含む、請求項４から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４】
前記加熱ステップが前記試料を約５３〜約５８℃の温度で好ましくは約４５〜約７５分間加熱することを含む、請求項４から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約１０μＭである、又は前記試料中の一価塩濃度が少なくとも約７５ｍＭである、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記加熱ステップが前記試料を約６３〜約６７℃の温度で好ましくは最大約１０分間加熱することを含む、請求項４から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約６５μＭである、又は前記試料中の一価塩濃度が少なくとも約２５ｍＭである、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記加熱ステップが前記試料を約５８〜約６３℃の温度で好ましくは約２〜約４０分間加熱することを含む、請求項４から１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
前記加熱ステップが、前記試料を
ｉ）約５〜１５分間、好ましくは、ここで、前記試料中の遊離カルシウム濃度は≦約１０μＭである、若しくは前記試料中の一価塩濃度は少なくとも約７５ｍＭである、又は
ｉｉ）約１０〜２０分間、好ましくは、ここで、前記試料中の遊離カルシウム濃度は≦約３５μＭである、若しくは前記試料中の一価塩濃度は少なくとも約５０ｍＭである、又は
ｉｉｉ）約２０〜４０分間、好ましくは、ここで、前記試料中の遊離カルシウム濃度は≦約６５μＭである、若しくは前記試料中の一価塩濃度は少なくとも約２５ｍＭである、
加熱することを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記加熱ステップが前記試料を約６５〜約７０℃の温度で最大約５分間加熱することを含む、請求項４から１２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２１】
前記加熱ステップ後の前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の残存プロテイナーゼ活性が対照に対して≦約２５％、好ましくは≦約１０％であり、前記残存活性が以下の分析ステップ、すなわち、
ｉ）１０００μｌ又は２５０μｌキュベット中で
１０〜５０ｍＵ／ｍＬ熱処理プロテイナーゼ、１ｍＭ基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ、≦１５ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2及び任意で１％ＤＭＳＯをインキュベーションするステップ、
ｉｉ）４１０ｎｍ（ε＝８８００Ｍ-1．ｃｍ-1）における吸光度の増加を分光光度計を用いて温度≦４０℃で２分間測定することによって４−ニトロアニリンへの前記基質の切断を分析するステップ、ここで、１単位は１分間あたり１μｍｏｌの４−ニトロアニリンを選択された温度で生成する酵素の量と定義される、
ｉｉｉ）ステップｉｉ）で認められた活性を、熱処理されなかったがその他の点では前記熱処理プロテイナーゼと同じ条件下で維持された同じ量の同じプロテイナーゼで認められた活性と、同じ分析によって比較するステップ
によって測定される、請求項４から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
請求項４から２１のいずれか一項に記載の方法であって、前記試料が、
ａ）ヌクレアーゼ、ＤＮＡ又はＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡ又はＲＮＡリガーゼ、メチラーゼ、トランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、トランスポザーゼ、キナーゼ、ヘリカーゼ、制限酵素及びグリコシラーゼからなる群から選択される１以上の更なる酵素、
ｂ）１以上の核酸分子、ここで、前記方法は、前記試料を加熱して前記プロテイナーゼを不活性化する前記ステップに続いて、以下のステップ、すなわち、
ｉ）前記１以上の核酸分子のヌクレアーゼ媒介消化、
ｉｉ）前記１以上の核酸分子のリン酸化若しくは脱リン酸化、又は
ｉｉｉ）前記１以上の核酸分子の連結
を、
前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに、含む、
ｃ）前記試料は、１以上のＲＮＡ分子を含み、前記方法は、前記試料を加熱して前記プロテイナーゼを不活性化する前記ステップに続いて、前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに、逆転写のステップを含む、
ｄ）１以上のＤＮＡ分子、ここで、前記方法は、前記試料を加熱して前記プロテイナーゼを不活性化する前記ステップに続いて、前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに、核酸重合、好ましくは増幅のステップを含む、又は
ｅ）１以上のウイルス粒子又は細胞、好ましくは細菌細胞、ここで、前記方法は、前記試料を加熱して前記プロテイナーゼを不活性化する前記ステップに続いて、前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに、細胞溶解のステップを含む、
を含む方法。
【請求項２３】
ｉ）請求項１、２及び８から１２のいずれか一項に記載の組成物、及び
ｉｉ）第２の酵素を含む第２の組成物、好ましくは、前記第２の酵素は、ヌクレアーゼ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、逆転写酵素、ＤＮＡリガーゼ、ＲＮＡリガーゼ、メチラーゼ、トランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ、トランスポザーゼ、キナーゼ、ヘリカーゼ、制限酵素及びグリコシラーゼからなる群から選択される、
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、誘導可能な易熱性を有するプロテイナーゼを含む組成物、及び特に核酸の単離における、その使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
プロテイナーゼ（ペプチダーゼ、プロテアーゼ及びタンパク質分解酵素とも称する）は、タンパク質中のペプチド結合を加水分解することができる。プロテイナーゼは、産業、バイオテクノロジー及び分子生物学研究技術における広範なプロセスに広く使用される。例えば、プロテイナーゼは、核酸精製中の不要なタンパク質の消化、組換え抗体断片の調製、プロテオミクスにおけるペプチド配列決定、及びタンパク質のタンパク質分解消化に使用される。
【０００３】
核酸を試料から首尾よく抽出するために、細胞壁／膜の溶解が必要である。様々な物理的又は化学的方法を採用することができ、それらはプロテアーゼの添加によって強化することができる。次いで、洗浄剤若しくは界面活性剤の適用によって、又は低張液中の浸透圧融解によって、膜脂質が除去される。次いで、プロテイナーゼを用いた試料からのタンパク質の除去が最良の手法と考えられる。プロテイナーゼは、試料中に存在する混入、すなわち不要な、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドをペプチド結合の加水分解によって消化する。試料中に存在する可能性があり、核酸を分解する可能性があるヌクレアーゼ及び他の酵素もプロテイナーゼは分解する。
【０００４】
タンパク質の除去は、増幅反応（例えば、ＰＣＲ及びＲＴ−ＰＣＲ）のための核酸試料の調製における核酸精製中に特に重要である。細胞においては、核酸は、一般に、タンパク質に結合して存在する。例えば、真核細胞中のゲノムＤＮＡはヒストンに結合し、それによってクロマチン中へＤＮＡが密にパッケージングされ得る。ＰＣＲなどの多数の分子生物学技術は、裸のＤＮＡ、すなわちヒストンに結合していないＤＮＡを必要とする。というのは、クロマチン中のＤＮＡの密なパッケージングは、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼなどのＤＮＡと相互作用する酵素が核酸に接近するのを抑制するからである。
【０００５】
核酸精製は、時間、コスト及び試料の損失を伴う多段階プロセスである。試料の損失は、試料中の核酸の開始量が少ないとき、例えば、数百以下の細胞から、例えば細い針で吸引された生検材料又は液体生検材料から単離されたときに特に望ましくない。
【０００６】
核酸精製において最も一般的に使用されるタンパク質分解酵素は、プロテイナーゼＫ（ＥＣ３．４．２１．６４）である。この酵素は、真菌Ｅｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍ  ａｌｂｕｍ（以前はＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）の抽出物中で最初に発見された。プロテイナーゼＫは、芳香族、脂肪族又は疎水性アミノ酸残基のカルボキシル側におけるペプチド結合の切断を触媒する非特異的セリンエンドペプチダーゼである。プロテイナーゼＫの広範な特異性のために、試料中の不要なタンパク質の消化においてプロテイナーゼＫは有用となり得る。プロテイナーゼＫは、さらに、試料中に存在する核酸を分解し得るヌクレアーゼを急速に不活性化する。プロテイナーゼＫは、ＳＤＳ及び尿素、ＥＤＴＡなどのキレート剤、スルフヒドリル試薬、トリプシン阻害剤及びキモトリプシン阻害剤など、他のタンパク質を変性させるＤＮＡ抽出プロセスに使用される化学物質の存在下で活性である。プロテイナーゼＫは、５０〜６５℃の範囲、一般に約５５℃で最適活性を有する。
【０００７】
プロテイナーゼＫが試料の精製に使用されるときには、下流のタンパク質／酵素、例えば、ポリメラーゼ及び逆転写酵素の添加の前にプロテイナーゼＫを不活性化又は除去する必要がある。こうした不活性化又は除去なしでは、プロテイナーゼは、その非特異的活性のために下流のタンパク質／酵素を分解する。
【０００８】
プロテイナーゼＫは、例えばフェノール抽出又はＣｓＣｌ等密度超遠心によって、試料から除去することができる。あるいは、試料量を増加させ、それによってその中のプロテイナーゼＫ活性を弱めることができる。しかし、酵素を試料から物理的に除去する行為は、混入のリスク及び所望の生成物を失うリスクがある。希釈は、ほとんどの場合には理想的でなく、特に試料サイズが小さいときにはそうである。
【０００９】
プロテイナーゼＫの不活性化の手順は様々であるが、一般には高温への加熱を含む。しかし、多くの場合において、プロテアーゼを不活性化するのに必要な熱は、試料中の１以上の所望の生成物の分解をもたらす。プロテイナーゼＫの不活性化の手順は、時には試薬と組み合わせて、７５℃への５分間の加熱（ＢｉｏＲａｄ手順）、９５℃への１０分間の加熱（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ手順）、７０℃への１５分間の加熱（Ｑｉａｇｅｎ手順）を含む。こうした高温の使用は、目的の試料には比較的苛酷である。
【００１０】
したがって、特に核酸精製手順中に、試料から所望の材料を失わずにワークフローを短縮することができ、過酷なプロテイナーゼ不活性化条件を伴わない、別のタンパク質分解法が必要とされている。
【００１１】
プロテイナーゼＸ（「セラチアペプチダーゼ」及び「ＳＰＲＫ」とも称する）は、セラチア種から単離されたプロテイナーゼＫ様プロテイナーゼである。プロテイナーゼＸの研究（非特許文献１）は、それが、プロテイナーゼＫのように、高い熱安定性を有することを確認し、更に、プロテイナーゼＸが実際にプロテイナーゼＫ（５５℃）より高い最適温度（７０℃）を有することも確認した。Ｌａｒｓｅｎらは、プロテイナーゼＸが５０℃で３０分間加熱後に十分な酵素活性を保持し、様々な濃度のＳＤＳ（試料からの核酸の単離に一般に使用される界面活性剤）の存在下で５０℃に加熱後にプロテイナーゼＫよりもはるかに高い活性を保持することを示した。Ｌａｒｓｅｎらの教示によれば、プロテイナーゼＸは、低温適応生物から単離された酵素の典型的な易熱性の特徴を示さない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１２】
【非特許文献１】Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７３：４７−６０
【発明の概要】
【発明の効果】
【００１３】
本発明者らは、驚くべきことに、プロテイナーゼＸの易熱性が、遊離カルシウムイオン濃度の低い組成物中にプロテイナーゼが存在するときに誘導されることを初めて明らかにした。本発明者らは、プロテイナーゼに結合し、その安定性及び構造に寄与し得るカルシウムイオンを、例えばＥＤＴＡを用いて、除去する必要がないことを確認した。それどころか、組成物中の遊離カルシウムイオン濃度の単なる欠如又は低さは、驚くべきことに、プロテイナーゼＸの易熱性を誘導するのに十分である。本発明者らは、驚くべきことに、プロテイナーゼＸの易熱性が、特定の一価塩濃度を有する組成物中にプロテイナーゼが存在するときに誘導されることも初めて明らかにした。
【００１４】
こうした誘導可能な易熱性は予想外であり、分子生物学用途に使用される標準プロテイナーゼであるプロテイナーゼＫでは認められない。本発明者らの知見によって、広範な分子生物学用途において誘導可能な易熱性を有するプロテイナーゼＸの有利な使用が可能である。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
ここで、本発明を以下の図面を参照して非限定的実施例によって説明する。
【００１６】
【図１】様々な温度におけるプロテイナーゼＸ及びＫのプロテイナーゼ活性を示す図である。活性は、標準分析条件下で１０ｍＭ遊離カルシウムを用いて６５℃で認められた最大活性に対する％活性として示される。
【図２】分析緩衝液中の０μＭ、５μＭ又は１０ｍＭ遊離カルシウムを用いた様々な温度におけるプロテイナーゼＸの活性を示す図である。結果は、各温度における、１０ｍＭ遊離カルシウムである標準分析条件に対する相対（％）を示す。
【図３】分析緩衝液中の０μＭ、５μＭ又は１０ｍＭ遊離カルシウムを用いた様々な温度におけるプロテイナーゼＫの活性を示す図である。結果は、各温度における、１０ｍＭ遊離カルシウムである標準分析条件に対する相対（％）を示す。
【図４】様々な遊離カルシウム濃度の存在下で６０℃で１５及び３０分間加熱後のプロテイナーゼＸの不活性化の程度を示す図である。活性は、対照（氷上で維持、加熱ステップなし）に対する、％残存活性として示される。
【図５】様々な遊離カルシウム濃度の存在下で６０℃で１５及び３０分間加熱後のプロテイナーゼＫの不活性化の程度を示す図である。活性は、対照（氷上で維持、加熱ステップなし）に対する、％残存活性として示される。
【図６】様々な遊離カルシウム濃度の存在下で６０℃で１５及び３０分間加熱後のプロテイナーゼＸ及びプロテイナーゼＫの不活性化の程度を示す図である。活性は、熱処理なしで氷上で維持された（１０ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む）同じ緩衝液中の同じプロテイナーゼで認められた最大活性に対する％活性として示される。
【図７】プロテイナーゼＸ及びプロテイナーゼＫの易熱性プロファイルに対するＮａＣｌ濃度の効果を示す図である。遊離カルシウムの非存在下及び５０ｍＭ又は３００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で指示温度における３０分間のインキュベーション。活性は、熱処理なしで氷上で維持された（１０ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む）同じ緩衝液中の同じプロテイナーゼで認められた最大活性に対する％活性として示される。
【図８】様々な濃度のＮａＣｌの存在下で５０及び６０℃におけるプロテイナーゼＸの不活性化を示す図である。活性は、熱処理なしで氷上で維持された（０Ｍ  ＮａＣｌ、０．０３ｍＭ  ＣａＣｌ2を含む）同じ緩衝液中のプロテイナーゼＸで認められた最大活性に対する％活性として示される。
【図９】様々な濃度のＮａＣｌの存在下で６０℃におけるプロテイナーゼＸの不活性化を示す図である。活性は、熱処理なしで氷上で維持された（０Ｍ  ＮａＣｌ、３０μＭ  ＣａＣｌ2を含む）同じ緩衝液中のプロテイナーゼＸで認められた最大活性に対する％活性として示される。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
したがって、一態様においては、本発明は、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含む組成物を提供する。前記プロテイナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｉ）前記組成物中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記組成物中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである。
【００１８】
好ましくは、前記組成物中の遊離カルシウム濃度は≦約８０μＭであり、前記組成物中の一価塩濃度は≧約２０ｍＭである。
【００１９】
本発明は、配列番号１の配列を含むプロテイナーゼ、及び配列番号１と少なくとも約７０％同一である配列を含むプロテイナーゼに関する。配列番号１と少なくとも約７０％同一である配列を含むプロテイナーゼを「配列番号１の変異体」、「変異プロテイナーゼ」又は単に「変異体」と本明細書では称する。定義上、本発明の配列番号１の変異体も本発明に係るプロテイナーゼであり、すなわちそれらはプロテイナーゼ活性を有する。本発明のプロテイナーゼという本明細書の表記は、配列番号１のプロテイナーゼ及び本明細書に記載の本発明の変異体を表す。本明細書のどこでもプロテイナーゼ（又は変異プロテイナーゼ）という表記は、別段の記載がない限り、酵素的に活性なその断片も表す。
【００２０】
好ましくは、組成物は、溶液、好ましくは水溶液である。本明細書では「溶液」という用語は、１以上の副成分（溶質）が主成分（溶媒）内に均一に分布した液体混合物を意味する。一般に、溶液の副成分（溶質）は、主成分（溶媒）に可溶である。しかし、本明細書では「溶液」という用語は、副成分（溶質）が主成分（溶媒）に可溶でない混合物も含む。すなわち、本明細書では「溶液」という用語は、主成分が液相であり、副成分が液相に不溶である粒子を含む混合物、すなわち分散物も包含する。好ましくは、主成分、すなわち溶媒、すなわち液相は、水である。好ましくは、溶液は水を含む。本発明の溶液は、少なくとも本発明のプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を副成分として含む。
【００２１】
好ましい一実施形態においては、本発明の溶液は、１以上のポリペプチドを含む試料に適用される試薬である。こうした試薬は、前記試薬中のプロテイナーゼが試料中に存在する前記１以上のポリペプチドを消化するために試料に適用される。好ましくは、試料は、複数のポリペプチドを含む。この実施形態においては、溶液は、好ましくは、本発明のプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含み、更なる酵素を含まない。
【００２２】
好ましくは、組成物は緩衝剤も含む。適切な緩衝剤は当該技術分野でよく知られており、任意のこうした緩衝剤を使用することができる。適切な緩衝剤及びそれらの意図された目的でその含まれる範囲を確認することは当業者の能力の範囲内であろう。好ましくは、緩衝剤は、緩衝範囲がｐＨ６．５〜９．５、好ましくはｐＨ６．８〜９．２、より好ましくはｐＨ７〜９、より好ましくはｐＨ７．５〜８．５、より好ましくは約ｐＨ８である。好ましくは、緩衝剤はＴｒｉｓ又はＨＥＰＥＳである。好ましくは、緩衝剤は、１〜２５０ｍＭ、より好ましくは１０〜２００ｍＭ、より好ましくは２０〜１５０ｍＭ、より好ましくは２５〜１００ｍＭの濃度で組成物中に存在する。
【００２３】
存在する場合、好ましくは、Ｔｒｉｓ−ＨＣｌは、２５〜２００ｍＭ、より好ましくは５０〜１５０ｍＭ、より好ましくは約１００ｍＭの濃度で存在する。存在する場合、好ましくは、ＨＥＰＥＳは、５〜５０ｍＭ、より好ましくは１０〜４０ｍＭ、より好ましくは２０〜３０ｍＭ、より好ましくは約２５ｍＭの濃度で存在する。
【００２４】
好ましくは、本発明の組成物及び試料は、ｐＨが６．５〜９．５、好ましくは６．８〜９．２、より好ましくは７〜９、より好ましくは７．５〜８．５、より好ましくは約８．０である。
【００２５】
本発明の組成物及び試料は、更にＤＭＳＯを含むことができる。存在する場合、好ましくは、ＤＭＳＯは、０．１〜５％ｗ／ｗ、より好ましくは０．５〜２．５％ＤＭＳＯ、より好ましくは約１％ＤＭＳＯの濃度で存在する。
【００２６】
「試料」という用語は、本発明のプロテイナーゼ以外の１以上のポリペプチドを含む任意の組成物を指す。
【００２７】
更なる一態様においては、本発明は、１以上のポリペプチド及びプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含む試料を提供する。前記プロテイナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである。
【００２８】
好ましくは、前記試料中の遊離カルシウム濃度は≦約８０μＭであり、前記試料中の一価塩濃度は≧約２０ｍＭである。
【００２９】
本明細書に記載のプロテイナーゼ又は酵素的に活性な断片を含まない試料は、本発明の態様ではない。「本発明の試料」という本明細書の表記は、本明細書に記載のプロテイナーゼ又は酵素的に活性な断片を本当に含む試料のみを表す。
【００３０】
「試料」の好ましい任意選択の特徴及び実施形態の以下の考察は、本発明の試料と、本発明の一部ではないが、本発明の一組成物を適用することができる試料である試料の両方に当てはまる。
【００３１】
本発明のプロテイナーゼは、混入、すなわち不要な、ポリペプチドを含む試料からの目的の生体分子の精製、すなわち単離、すなわち抽出の方法に有用である。したがって、好ましい一実施形態においては、試料は、１以上の混入ポリペプチド及び１以上の目的の生体分子を含む。本明細書では「混入ポリペプチド」という用語は、「不要なポリペプチド」と同義であり、本発明のプロテイナーゼ及び目的の任意のポリペプチド以外の試料中の任意のポリペプチドを指す。すなわち、混入ポリペプチドは、１以上の目的の生体分子を精製又は修飾するために、本発明のプロテイナーゼによって消化されるものである。
【００３２】
本発明のプロテイナーゼは、目的の生体分子を、１以上のペプチド結合を介してそれに結合した分子、好ましくはポリペプチドから、前記ペプチド結合の１以上を加水分解することによって遊離させる方法にも有用である。したがって、好ましい一実施形態においては、試料は、１以上のペプチド結合を介して、分子、好ましくはポリペプチドに結合した目的の生体分子を含む。１以上のペプチド結合は、本発明のプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片によって切断することができる。
【００３３】
本明細書では「目的の生体分子」という用語は、１以上の混入ポリペプチドも含む試料中の任意の生体分子を指し、前記試料からの前記生体分子の精製が望まれ、又は１以上のペプチド結合を介してそれに結合した分子からの前記生体分子の遊離が望まれる。好ましくは、目的の生体分子は、核酸分子、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。あるいは、目的の生体分子は、それ自体がポリペプチドである。目的の生体分子は、本発明に有用であるプロテイナーゼでも酵素的に活性なその断片でもない。
【００３４】
好ましくは、試料は細胞性物質を含む。好ましくは、試料はクルードな細胞抽出物を含む。好ましくは、試料は部分精製細胞抽出物を含む。好ましくは、試料は細胞集団を含む。前記試料中の細胞は、インタクトでも溶解されていてもよく、好ましくは溶解されていてもよい。好ましくは、試料は、組織試料又は１以上の体液を含む。好ましくは、試料は細針生検材料である。好ましくは、試料は封入ウイルスを含む。プロテイナーゼは、ウイルスのタンパク質カプセル中のＲＮＡ／ＤＮＡを遊離させて同定、定量化及び／又は増幅するために、該タンパク質カプセルの消化に使用することができる。
【００３５】
好ましくは、本発明の試料は体積が≧１０μｌである。好ましくは、本発明の試料は体積が≦１０００μｌ、より好ましくは≦５００μｌ、より好ましくは≦３００μｌ、より好ましくは≦２５０μｌ、より好ましくは≦２００μｌ、より好ましくは≦１５０μｌ、より好ましくは≦１００μｌ、より好ましくは≦７５μｌ、より好ましくは≦５０μｌである。あるいは、試料はマイクロ流体試料である。好ましくは、本発明のマイクロ流体試料は体積が≧０．０１μｌである。好ましくは、本発明のマイクロ流体試料は体積が≦１０μｌ、好ましくは≦５μｌ、より好ましくは≦１μｌ、より好ましくは≦０．５μｌ、より好ましくは≦０．１μｌである。
【００３６】
本明細書では「ポリペプチド」という用語は、本発明のプロテイナーゼによって加水分解され得る、タンパク質、ポリペプチド、ペプチド、オリゴペプチド及びトリペプチド、すなわち、ペプチド結合を介して連結された３以上のアミノ酸を含む任意の分子を指す。プロテイナーゼＸは、３アミノ酸長と短いペプチドを加水分解することが知られている。「タンパク質」、「ポリペプチド」及び「ペプチド」という用語は、本明細書では区別なく使用され、各々の使用は、タンパク質、ポリペプチド及びペプチドのいずれでもすべてを指すことが明確に意図される。したがって、本明細書に記載の試料中に存在するポリペプチドは、本発明のプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の基質である。プロテイナーゼ及び酵素的に活性なその断片は、それ自体がポリペプチドであることは明白である。しかし、本明細書では「ポリペプチド」という用語は、本発明に有用であるプロテイナーゼ及び酵素的に活性なその断片を明確に除外する。
【００３７】
「消化する」、「加水分解する、「分解する」及び「切断する」という用語は、本明細書では区別なく使用され、試料中のポリペプチド内のペプチド結合の加水分解を指す。消化は、部分消化でも完全消化でもよい。本発明に有用であるプロテイナーゼは、非特異的であり、十分な時間が与えられると、酵素機能を可能にする条件下で試料中のタンパク質を完全に消化する。
【００３８】
本発明の組成物及び試料は、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含み、前記プロテイナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００３９】
配列番号１のアミノ酸配列は、以下のとおりである。
ADQPSPTWGIDRIDQRNLPLDNNYHTDYDGSGVTAFVIDTGVLNTHNEFGGRASSGYDFIDNDYDATDCNGHGTHVAGTIGGSTYGVAKNVNVVGVRVLNCSGSGSNSGVIAGINWVKNNASGPAVANMSLGGGASQATDDAVNAAVAAGITFVVAAGNDNSNACNYSPARAADAITVGSTTSNDSRSSFSNYGTCLDIYAPGSSITSSWYTSNSATNTISGTSMASPHVAGVAALYLDENPNLSPAQVTNLLKTRATADKVTDAKTGSPNKLLFSLANDD
【００４０】
配列番号１のプロテイナーゼは、Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７３：４７−６０に記載のように、ノルウェーの北部で単離された海洋セラチア種に由来するプロテイナーゼＸのアミノ酸配列に基づく。プロテイナーゼＸは、プロテイナーゼＫ様プロテイナーゼ［Ｅ．Ｃ．３．４．２１］である。「プロテイナーゼＸ」、「プロテアーゼＸ」、「ＰｒｏｔＸ」、「ＰＲＸ」、「ペプチダーゼＸ」、「セラチアペプチダーゼ」及び「ＳＰＲＫ」という用語は、本明細書では区別なく使用される。好ましくは、本発明のプロテイナーゼは、Ｓｅｒｒａｔｉａ  ｐｒｏｔｅａｍａｃｕｌａｎｓに由来する。プロテイナーゼＸは、セリンペプチダーゼである。
【００４１】
プロテイナーゼＸをコードする遺伝子は、１８９０の塩基対（配列番号２）を有し、６２９のアミノ酸（６５．５ｋＤａ、配列番号３）の前駆体タンパク質をコードする。
【００４２】
配列番号２：
atgcataagaaacatttaatagcagtcgcagtcgcaacgggacttgcttacttccctgttaacgctaatgaataccaagcgactatggtaaatgtcccacaatctaaagccatcaaagatacttacatcgttgtattcaataccccaagtgttcttaatctaagtaataacaacaccatagctgaattcgcggttcaacaagccgagagtttagtcaatcaatatgatgtcagagtgatgaaaaactttggcaatgtgctcaacggtgtactcatcaatgccagtgcccaacaagttaaagcactgcttaaagatccaaacgtgaagtacgtagaacaagatcaagtgatgtcagtaacgcccatgatggaagccaatgcggaccaaccgagtccgacctggggcatagacagaatcgatcaacgcaacttgccattggataacaactaccacacggattacgatggatctggtgtgaccgcctttgttattgatactggggtgcttaatacacacaatgagtttggcggccgcgcaagcagtggctatgactttatcgataatgattacgatgcgactgactgtaacggtcatggtacccatgtggcggggacgattggcggctcaacctacggtgtcgcgaaaaacgtcaatgtggtgggcgtcagagtgcttaactgttcaggttctggcagtaactctggcgtgattgcagggataaactgggtgaaaaacaatgcttctggccccgctgtcgcgaacatgagtttagggggcggcgcctcccaagccacggatgatgccgtcaatgccgctgttgccgcagggatcaccttcgtcgtcgcagccggcaatgacaatagtaatgcctgtaattattcacctgctcgtgccgcagatgccatcactgtcggttcaaccaccagtaacgattcccgctcgagtttttctaactacgggacttgccttgatatctatgcgcccggttcgagcataacttcctcttggtatacctcaaattcggcgactaataccattagtggcacctcaatggcttccccccatgtggcaggcgtcgcggcattatacttagatgaaaatcctaacctctcccccgcacaggtgactaacttactcaagacgcgcgccactgcggacaaagtcacagatgctaagacaggctcaccgaataagttactgttttcacttgcaaacgatgatggaggctgtggcaacgattgcccagttgacgagactcagctgcaaaataatgtgggtattgcgatcagtggagccacaggttcagcgacttattactatatcgatgtccccgcaaatgcagcaagtttaggcatcaacctcgcggggggctctggcgatgcggatatttatgtgagccaaggacaaaaaccgactacgaccagctatcaatgccgcccatatcaaaatggcaacaatgagagctgtaatttcactgcacctacggcgggtcgttggtacgtgatggttcaaggctatagcaattatgccaacgcccagctgacagctagctacaacctcaatggcggcggaaattgtaccgatgcgaactgcttaagcaatggcgtacccgtcacgaatttaagcggcagaacgggaactgaagccctgtataaaatcgtcgtccctgcgaatagccaactcagtattaccaccagtggcgggactggtgacgtggatctgtatgtcaaagcagggactgtcccaacgaccaccagctatgattgtcgtccctataaaaacggtaacaatgaaagctgttcaatcaccgtgactcaagcgggaacttaccatgtgatgttacgtggttatgctaattactcgagcgttcagctgagtgcaagctactag
【００４３】
配列番号３：
MHKKHLIAVAVATGLAYFPVNANEYQATMVNVPQSKAIKDTYIVVFNTPSVLNLSNNNTIAEFAVQQAESLVNQYDVRVMKNFGNVLNGVLINASAQQVKALLKDPNVKYVEQDQVMSVTPMMEANADQPSPTWGIDRIDQRNLPLDNNYHTDYDGSGVTAFVIDTGVLNTHNEFGGRASSGYDFIDNDYDATDCNGHGTHVAGTIGGSTYGVAKNVNVVGVRVLNCSGSGSNSGVIAGINWVKNNASGPAVANMSLGGGASQATDDAVNAAVAAGITFVVAAGNDNSNACNYSPARAADAITVGSTTSNDSRSSFSNYGTCLDIYAPGSSITSSWYTSNSATNTISGTSMASPHVAGVAALYLDENPNLSPAQVTNLLKTRATADKVTDAKTGSPNKLLFSLANDDGGCGNDCPVDETQLQNNVGIAISGATGSATYYYIDVPANAASLGINLAGGSGDADIYVSQGQKPTTTSYQCRPYQNGNNESCNFTAPTAGRWYVMVQGYSNYANAQLTASYNLNGGGNCTDANCLSNGVPVTNLSGRTGTEALYKIVVPANSQLSITTSGGTGDVDLYVKAGTVPTTTSYDCRPYKNGNNESCSITVTQAGTYHVMLRGYANYSSVQLSASY
【００４４】
配列番号３のプロテイナーゼは、１２６残基のＮ末端プレプロ配列、２７８残基の触媒ドメイン、及び合わせて２２５残基からなる２つのＣ末端ドメイン（反復配列）からなる。
【００４５】
前記酵素は、以下の配列番号４の配列を有する３８５アミノ酸、約４０．２ｋＤａの活性ペプチダーゼとしてＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ中で組換え発現される。
NEYQATMVNVPQSKAIKDTYIVVFNTPSVLNLSNNNTIAEFAVQQAESLVNQYDVRVMKNFGNVLNGVLINASAQQVKALLKDPNVKYVEQDQVMSVTPMMEANADQPSPTWGIDRIDQRNLPLDNNYHTDYDGSGVTAFVIDTGVLNTHNEFGGRASSGYDFIDNDYDATDCNGHGTHVAGTIGGSTYGVAKNVNVVGVRVLNCSGSGSNSGVIAGINWVKNNASGPAVANMSLGGGASQATDDAVNAAVAAGITFVVAAGNDNSNACNYSPARAADAITVGSTTSNDSRSSFSNYGTCLDIYAPGSSITSSWYTSNSATNTISGTSMASPHVAGVAALYLDENPNLSPAQVTNLLKTRATADKVTDAKTGSPNKLLFSLANDD
【００４６】
配列番号４の発現プロテイナーゼは、第１のＣ末端ドメインの最初の３残基以外の両方のＣ末端ドメインを除外し、配列番号３のＮ末端プレプロドメインの最初の２２残基を除外する。この形のタンパク質は精製することができる。
【００４７】
大腸菌でのプロテイナーゼＸの組換え発現は、Ｌａｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，（２００６）ＦＥＢＳ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ２７３：４７−６０に記載されている。
【００４８】
発現に続いて、前記酵素は、自己分解によって成熟した、約３４ｋＤａ、２８１残基の成熟タンパク質に転化される。該タンパク質は、触媒ドメイン及び３つのＣ末端アミノ酸残基を含み、十分な触媒活性を保持する（配列番号１）。
【００４９】
配列番号４の残基１〜１０４は、配列番号３の残基２３〜１２６に対応する。配列番号１の残基１〜２８１は、配列番号４の残基１０５〜３８５に対応し、配列番号３の残基１２７〜４０７に対応する。
【００５０】
したがって、本発明の各々及びすべての態様及び実施形態においては、プロテイナーゼは、配列番号１、配列番号３又は配列番号４、好ましくは配列番号１のアミノ酸配列を含むことができる。配列番号３及び４は、配列番号１のプロテイナーゼの前駆体／未熟型である。当業者は、配列番号３又は４のプロテイナーゼの使用又は存在が、更なる自己分解プロセシングのために、配列番号１のプロテイナーゼの使用又は存在をもたらすことを理解されたい。簡略のため、本明細書のどこでも配列番号１という表記は、配列番号３及び／又は配列番号４も表すことが明確に意図される。
【００５１】
本発明の組成物及び試料は、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含み、前記プロテイナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む。
【００５２】
「少なくとも約７０％」とは、配列相同性が少なくとも６９％、６９．５％又は６９．９％であり得ることを意味する。
【００５３】
好ましい実施形態においては、本発明のプロテイナーゼは、配列番号１と少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％又は少なくとも７５％、好ましくは少なくとも８０％、８５％、９０％又は９５％、例えば、少なくとも９８％、９９％又は９９．５％同一であるアミノ酸配列を含む、又はからなる。
【００５４】
本発明に係る配列相同性割合は、広く利用可能なアルゴリズムのいずれかによって、例えば、ＣｌｕｓｔａｌＷ２  Ｍｕｌｔｉｐｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｌｉｇｎｍｅｎｔプログラム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｃｌｕｓｔａｌＷ２）を用い、初期設定パラメータ（ＤＮＡ  Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１５．０；ＤＮＡ  Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝６．６６；ＤＮＡ  Ｍａｔｒｉｘ＝Ｉｄｅｎｔｉｔｙ；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇａｐ  Ｏｐｅｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝１０．０；Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｇａｐ  Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ  Ｐｅｎａｌｔｙ＝０．２；Ｐｒｏｔｅｉｎ  ｍａｔｒｉｘ＝Ｇｏｎｎｅｔ；Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  ＥＮＤＧＡＰ＝−１；Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＤＮＡ  ＧＡＰＤＩＳＴ＝４）を用いて計算することができる。
【００５５】
相同性割合は、好ましくは、上記配列番号１と変異体配列の整列後に配列番号１のＮ末端Ａｌａ残基（残基１）とＣ末端Ａｓｐ残基（残基２８１）の間で決定される。
【００５６】
配列番号１の変異体は、前記配列番号の１以上のアミノ酸が保存的置換を受けた、又は前記１以上のアミノ酸の修飾バージョン若しくは天然ではないアミノ酸、例えば、前記１以上のアミノ酸のＤ異性体で置換された、アミノ酸配列を含む。好ましくは、こうした置換及び修飾は、本発明のエキソヌクレアーゼの修飾体が未修飾体と同じ酵素及び不活性化特性を有する点でサイレントな置換及び修飾である。
【００５７】
一部の実施形態においては、本発明のプロテイナーゼは、配列番号１と比較して単一又は複数のアミノ酸変化（付加、置換、挿入又は欠失）を有するアミノ酸配列を含む（又はからなる）。こうした配列は、好ましくは、最大１０、例えば、１、２、４、４、５、６、７、８、９又は１０のみ、好ましくは最大５、例えば、１、２、３、４又は５のみ、好ましくは１、２又は３、より好ましくは１又は２の改変されたアミノ酸を含むことができる。好ましくは、改変の数は、上記配列番号１と変異体配列の整列後に配列番号１のＮ末端Ａｌａ残基（残基１）とＣ末端Ａｓｐ残基（残基２８１）の間で決定される。
【００５８】
好ましくは、改変は、本発明の改変されたプロテイナーゼが不変型と同じ酵素及び不活性化特性を有する点でサイレントな改変である。置換は、保存又は非保存アミノ酸によるものとすることができる。好ましくは、前記改変は保存的アミノ酸置換である。前記改変は、配列番号１の１以上のアミノ酸の修飾バージョンによる置換、又は天然ではないアミノ酸、例えば、アミノ酸のＤ異性体による置換とすることができる。
【００５９】
配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むプロテイナーゼは、冷水ニッチで見られる原核生物から得ることができる。「原核生物」とは、細胞核のない任意の生物、すなわち、細菌及び古細菌の領域由来の任意の生物を意味する。好ましくは、前記生物は細菌である。好ましくは、前記生物は、真核生物、例えば、分類学的な動物界、植物界、真菌界又は原生生物界に分類される生物ではない。より好ましくは、前記生物は、シュワネラ属、ハロモナス属、ビブリオ属、シクロモナス属、モリテーラ属及びセラチア属、好ましくはセラチア属から選択される。
【００６０】
一部の実施形態においては、本発明の組成物及び試料は、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含み、前記プロテイナーゼは、配列番号３若しくは４のアミノ酸配列又は配列番号３若しくは４と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含む。配列番号１に言及した本明細書の別の所の部分は、必要な変更を加えて配列番号３及び配列番号４にも当てはまる。
【００６１】
好ましくは、本発明のプロテイナーゼは、配列番号１、３若しくは４のアミノ酸配列からなる、又は配列番号１、３若しくは４と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列からなる。
【００６２】
好ましくは、本発明のプロテイナーゼは、配列番号１、３又は４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、本発明のプロテイナーゼは、配列番号１、３又は４のアミノ酸配列からなる。
【００６３】
好ましくは、本発明のプロテイナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列からなる、又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列からなる。
【００６４】
好ましくは、本発明のプロテイナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態においては、本発明のプロテイナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列からなる。
【００６５】
本発明のプロテイナーゼは、配列番号１又は配列番号４の配列の更なるアミノ酸Ｎ末端又はＣ末端を含むことができる。好ましくは、こうした更なるアミノ酸は、配列番号３の６２９アミノ酸配列内の配列番号１の配列のＮ又はＣ末端に見られるそれぞれの位置のアミノ酸と同一である。好ましくは、プロテイナーゼは、配列番号１又は配列番号４の配列の１〜５０、より好ましくは１〜４０、より好ましくは１〜３０、より好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸Ｎ末端及び／又はＣ末端を含み、好ましくは、前記Ｎ及び／又はＣ末端アミノ酸は、配列番号３の配列内の配列番号１又は配列番号４の配列のＮ及び／又はＣ末端に見られるそれぞれのアミノ酸と同一である。
【００６６】
本発明の溶液又は試料中に存在するプロテイナーゼは、修飾体、例えば、それらが直接的に又はペプチドリンカー配列を介して間接的に、Ｎ末端及び／又はＣ末端において更なるペプチドに結合した融合タンパク質の形とすることができる。好ましくは、追加のＮ末端ペプチドは、及びリンカー配列が存在する場合は合わせて、配列１〜５０、より好ましくは１〜４０、より好ましくは１〜３０、より好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸長を含む。好ましくは、追加のＣ末端ペプチドは、及びリンカー配列が存在する場合は合わせて、配列１〜５０、より好ましくは１〜４０、より好ましくは１〜３０、より好ましくは１〜２０、より好ましくは１〜１０、すなわち１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０アミノ酸長を含む。
【００６７】
したがって、一実施形態においては、本発明は、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含む組成物を提供する。前記プロテイナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｉ）前記組成物中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭであり、又は
ｉｉ）前記組成物中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭであり、
前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片は、更に、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列のＮ末端である更なるペプチド配列及び／又はＣ末端である更なるペプチド配列を含む。
【００６８】
更なる１又は複数のペプチド配列は、プロテイナーゼの分泌、単離、可溶化及び／又は精製若しくは同定のプロセス、又はプロテイナーゼを固体支持体につなぎ留めるのに有用であり得る。適切なペプチド配列は当該技術分野でよく知られており、任意のこうした配列を使用することができる。適切なＮ及びＣ末端配列としては、例えば、好ましくは１〜２０、より好ましくは５〜１５、より好ましくは６、７、８、９、１０、１１又は１２のヒスチジン残基、最も好ましくは６又は１２のヒスチジン残基を含む、ヒスチジンタグが挙げられる。
【００６９】
したがって、本発明のプロテイナーゼは、修飾プロテイナーゼとすることができる。更なる修飾としては、ポリペプチドの利用可能な原子への小さい化学基、例えば、Ｎ及びＣ末端又はポリペプチド内の非必須アミノ酸残基のＲ基への保護基の導入が挙げられる。別の実施形態においては、本発明のプロテイナーゼは、固体支持体、例えば、粒子、ペレット、ビーズ、シート、ゲル、フィルター、メンブレン、繊維、キャピラリー、チップ、マイクロタイターストリップ、スライド、チューブ、プレート、ウェルなどから選択される固体支持体上に固定化して提供することができる。好ましくは、支持体は磁性（好ましくは常磁性又は超常磁性）であり、例えば、磁性粒子、例えば、磁気ビーズ及びペレットである。更なる修飾体としては、発明のプロテイナーゼの二量体又は三量体が挙げられる。こうした実体は、それらのモノマー組成が均一でも不均一でもよい。
【００７０】
好ましくは、こうした修飾は、本発明のプロテイナーゼの修飾体が未修飾体と同じ酵素特性及び不活性化特性を有する点でサイレントな修飾である。
【００７１】
本発明のプロテイナーゼ及び変異プロテイナーゼの酵素的に活性な断片も提供される。酵素的に活性な断片は、プロテイナーゼ活性を有する断片である。酵素的に活性な断片は、配列番号１の配列の少なくとも２２５、好ましくは少なくとも２３５、好ましくは少なくとも２５０、より好ましくは少なくとも２６０、少なくとも２７０、少なくとも２７１、２７２、２７３又は２７４、より好ましくは少なくとも２７５、２７６、２７７、２７８、２７９又は２８０のアミノ酸を含むことができる。
【００７２】
好ましくは、本発明の酵素的に活性な断片は、配列番号１の配列の５以下のアミノ酸、好ましくは４、３、２又は１以下のアミノ酸のＮ末端トランケーションを含む。その代わりに、又はそれに加えて、本発明の酵素的に活性な断片は、好ましくは、配列番号１の配列の３０以下のアミノ酸、好ましくは２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１以下のアミノ酸のＣ末端トランケーションを含む。
【００７３】
別の見方をすれば、本発明の酵素断片の長さは、好ましくは、配列番号１の長さ又は配列番号１と少なくとも７０％同一であるアミノ酸配列の長さの少なくとも８０％、好ましくは少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は９９．５％である。
【００７４】
本発明の酵素断片は、それ自体、配列番号１の対応する部分と好ましくは少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、少なくとも８５％若しくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％（例えば、少なくとも９８％、９９％又は９９．５％）、又は１００％同一である。相同性割合を決定する方法については上記した。
【００７５】
本願を通して、本発明のプロテイナーゼという表記は、別段の記載がない限り、酵素的に活性なその断片も表す。
【００７６】
プロテイナーゼ（ペプチダーゼ又はプロテアーゼとも称する）は、タンパク質分解、すなわちペプチド結合の加水分解によってタンパク質異化を行う酵素である。したがって、本発明に係るプロテイナーゼは、プロテイナーゼ活性、すなわちプロテアーゼ活性、すなわちペプチダーゼ活性を有する酵素である。本発明の変異体及び酵素的に活性な断片もプロテイナーゼ活性を有する。
【００７７】
配列番号１の変異体又は修飾体である本発明のプロテイナーゼは、配列番号１のプロテイナーゼのプロテイナーゼ活性の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも１００％を示す。
【００７８】
本発明の酵素的に活性な断片は、配列番号１のプロテイナーゼのプロテイナーゼ活性の少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも８５％、少なくとも９０％又は少なくとも９５％、更により好ましくは少なくとも９９％、最も好ましくは少なくとも１００％を示す。
【００７９】
プロテイナーゼ活性を分析する適切な分析は当該技術分野で知られており、任意のこうした分析を特定のポリペプチドのプロテイナーゼ活性の測定に使用することができる。したがって、こうした分析を用いて、本発明のプロテイナーゼ、変異プロテイナーゼ及び酵素的に活性なその断片のプロテイナーゼ活性を測定することができる。
【００８０】
好ましい分析は、分光光度計で検出可能な生成物への基質の酵素切断、好ましくは、４１０ｎｍ（ε＝８８００Ｍ-1．ｃｍ-1）における吸光度の増加を測定することによって分析することができる４−ニトロアニリンへのＳｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡの切断の分析を含む。こうした吸光度を生じ、検出するのに適切な基質及び装置を特定することは当業者の能力の範囲内である。好ましくは、吸光度は、分光光度計又はマイクロプレートリーダーを用いて検出される。多数の分光光度計が、体積１０００μｌのキュベットを利用する。多数のマイクロプレートリーダーが体積２５０μｌのウェルを利用する。
【００８１】
当業者は、それらの目的に適切なインキュベーション温度及び分析時間も容易に決定することができる。当業者は、分析を行う温度を本発明のプロテイナーゼの不活性化をもたらさない温度、例えば、４０℃未満、好ましくは２５℃とすべきであることを知っているであろう。適切な分析時間は、３０秒〜５分間、例えば、２分間とすることができる。
【００８２】
当業者は、分析に含まれる酵素の適切な濃度が、使用する分光光度計の検出範囲に依存することも知っているであろう。当業者は、当該分光光度計で検出することができる濃度、及び分析試料内の酵素活性レベルにするために、希釈ステップが分析を行う前に必要になり得ることを知っているであろう。１０〜５０ｍＵ／ｍＬ、好ましくは１３〜２６ｍＵ／ｍＬの活性を使用することができ、これは、本実施例に使用される配列番号１のプロテイナーゼＸの場合、０．２〜０．４μｇ／ｍＬに等しい。
【００８３】
当業者は、分析混合物の残りをそれらの意図された目的で容易に処方することができるであろう。分析混合物は、本明細書の別の所で記述するｐＨ緩衝剤、好ましくはＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８を含むことができる。
【００８４】
分析混合物は、好ましくは、プロテイナーゼを更に不活性化し得る低カルシウム条件が回避されるように過剰のカルシウムを含む（例えば、≧２ｍＭ、好ましくは約１０ｍＭ）。ＮａＣｌは、塩によって誘導されるプロテイナーゼの易熱性が誘導されないように、低濃度で存在し得る（例えば、≦１５ｍＭ）。また、当業者は、必要に応じて、成分の必要濃度を供給するために、溶液を容易に希釈することができる。
【００８５】
別の成分、例えば、ＤＭＳＯを所望のとおりに反応混合物に添加することができ、又は別の成分、例えば、ＤＭＳＯがワークフローのより早い段階で添加されたために存在することができ、活性分析に許容することができる。
【００８６】
プロテイナーゼ活性を測定する好ましい分析は、（本明細書の実施例に使用される）分析Ａである。分析Ａは、１０００μｌ又は２５０μｌキュベット中で
１３又は２６ｍＵ／ｍＬプロテイナーゼ（本実施例に使用される配列番号１のプロテイナーゼＸ０．２又は０．４μｇに相当）
１ｍＭ基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ
≦１５ｍＭ  ＮａＣｌ（例えば、１２ｍＭ  ＮａＣｌ又は４ｍＭ  ＮａＣｌ）
０．１ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、
１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、及び
１％ＤＭＳＯ（任意）
をインキュベーションすること、及び
４１０ｎｍ（ε＝８８００Ｍ-1．ｃｍ-1）における吸光度の増加を分光光度計（例えば、Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ、Ｓｗｅｄｅｎ）を用いて２５℃又は３７℃で２分間測定することによって４−ニトロアニリンへの基質の切断を分析することを含む。１単位は、温度４０℃未満、好ましくは２５℃又は３７°で１分間あたり１μｍｏｌの４−ニトロアニリンを生成する酵素の量と定義される。
【００８７】
プロテイナーゼ活性を測定するために、当業者は別法を直接考え出すことができる。
【００８８】
任意の適切な分析を使用して、本発明のプロテイナーゼの酵素的に活性な断片、変異体又は修飾体の相対活性を配列番号１のプロテイナーゼの活性と比較して測定することができる。当業者は、配列番号１のプロテイナーゼの活性を評価するのに使用されるのと同じ技術及び条件が、断片、変異体又は修飾体の活性を評価するのにも使用されるべきであることをよく知っているであろう。好ましくは、使用する分析は上記分析Ａである。
【００８９】
上記の好ましい分析Ａによれば、プロテイナーゼＸは比活性が約６５Ｕ／ｍｇ（６５．２Ｕ／ｍｇ）である。好ましくは、本発明の変異体、酵素断片及び修飾体は比活性が上記分析Ａで測定して４０〜１００Ｕ／ｍｇ、より好ましくは５０〜８０Ｕ／ｍｇ、より好ましくは６０〜７０Ｕ／ｍｇ、より好ましくは６２．５〜６７．５Ｕ／ｍｇ、好ましくは約６５Ｕ／ｍｇ又は６５．２Ｕ／ｍｇである。好ましくは、本発明の変異プロテイナーゼ及び酵素断片は、上記分析Ａで測定して配列番号１のプロテイナーゼＸと同じ比活性を有する。
【００９０】
本発明の組成物及び試料は、好ましくは≦８０μＭ遊離カルシウムを含む。本明細書では「遊離カルシウム」という用語は、本発明の組成物及び試料中で遊離した、すなわち結合していない、カルシウムイオン、すなわち本発明の組成物及び試料中に存在する任意のタンパク質又は他の成分に結合していないカルシウムイオン、すなわち自由になったカルシウムをもっぱら指す。本発明の組成物及び溶液中のカルシウム濃度という全体を通した表記は、遊離カルシウム濃度を表す。
【００９１】
プロテイナーゼＸ（配列番号１）は、残基Ａｓｐ１１、Ａｓｐ１４、Ｇｌｎ１５、Ａｓｐ２１及びＡｓｎ２３によって形成されるカルシウム結合部位を含む。Ｃａ2+イオンは、Ａｓｐ１１、Ａｓｐ１４及びＡｓｐ２１の側鎖のカルボキシル酸素原子、Ｇｌｎ１５のアミド酸素原子、並びにＡｓｐ１１及びＡｓｎ２３のカルボニル酸素原子に配位する。この結合カルシウムイオンは、正しいタンパク質折り畳みに必要である。したがって、本発明に有用であるプロテイナーゼは、天然には、この結合カルシウムイオンを含む。結合カルシウムイオンは、本発明に有用であるプロテイナーゼが組換え産生される場合にも存在する。プロテイナーゼの産生に使用されるどんな環境もカルシウムを必然的に含む。これは、結合イオンが折り畳まれたプロテイナーゼ構造中に存在することを意味する。こうした結合カルシウムイオンは、本明細書で使用する用語の「遊離カルシウム」ではない。
【００９２】
本発明の組成物又は試料を調製する当業者は、溶液又は試料に入れる適切な溶質及び溶媒を単に選択することによって必要なカルシウム濃度を直接確実に得ることができる。多量のカルシウム非含有緩衝液に対する透析、例えば５００〜１００００、好ましくは５０００容量のカルシウム非含有緩衝液に対する透析によって、遊離カルシウムを溶液から除去することは、当業者の能力の範囲内である。適切な緩衝液は、当業者に明らかであり、好ましくは、本明細書の別の所で記述する緩衝液、例えば、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７〜９であろう。好ましくは、前記緩衝液は更にグリセロールを含む。
【００９３】
任意の所与の溶液又は試料中の遊離カルシウム濃度も、当業者が容易に測定することができる。カルシウムを測定する標準方法は、当該技術分野でよく知られており、例えば、ＥＤＴＡの標準溶液を用いた滴定が挙げられる。
【００９４】
結合カルシウムイオンは、強いカルシウムキレート剤、例えば、ＥＤＴＡの適用によって、プロテイナーゼから除去することができる。しかし、多数の目的生体分子をＥＤＴＡに暴露することは望ましくない。さらに、ＥＤＴＡは、多数の核酸関連酵素（例えば、ポリメラーゼ、ヌクレアーゼ）に必要であるＭｇ2+イオンに結合する。こうした酵素は、プロテイナーゼを用いた試料調製に続く分子生物学技術に使用され、ＥＤＴＡの存在はこの状況で特に問題になる。ＥＤＴＡは、後続の下流のステップにおいて遊離Ｍｇ2+濃度に関する不確実性を持ち込み、望ましくない。Ｍｇ2+は、酵素機能に必要であるが、過剰であるとＲＮＡ分解を引き起こす。ポリペプチドを消化するどんな方法でも、試薬を含み、その後に除去することは、プロセスのコスト、時間及びワークフローを増加させるので、試薬を省略することが望ましい。
【００９５】
本発明者らは、驚くべきことに、単に遊離カルシウムの非存在が本発明のプロテイナーゼにおいて易熱性を誘導するのに十分であることを見いだした。本発明者らは、驚くべきことに、プロテイナーゼＸの易熱性が、遊離カルシウムイオン濃度の低い環境中にプロテイナーゼが存在するときに誘導されることを初めて明らかにした。本発明者らは、プロテイナーゼに結合し、その安定性及び構造に寄与し得るカルシウムイオンを、例えばＥＤＴＡを用いて、除去する必要がないことを確認した。それどころか、遊離カルシウムイオン濃度を低くするだけで、驚くべきことに、酵素に易熱性を誘導するのに十分である。こうした誘導可能な性質は予想外であり、実施例で示すように、分子生物学用途に使用される標準プロテイナーゼであるプロテイナーゼＫでは認められない。
【００９６】
したがって、好ましくは、本発明のプロテイナーゼ及び酵素的に活性なその断片は、それに結合したカルシウムイオンを含む。換言すれば、好ましくは、本発明の組成物及び試料は、プロテイナーゼ及び酵素的に活性なその断片をそれらの天然のカルシウム結合状態で含む。このシナリオでは、カルシウムはタンパク質の「補因子」と考えることができ、したがって、プロテイナーゼは、本発明の組成物及び試料中でそれらの「ホロ酵素型」である。ホロ酵素は、アポ酵素とその補因子（この場合はカルシウム）の組合せによって形成される生化学的に活性な酵素である。
【００９７】
したがって、好ましくは、本発明の組成物及び試料は、ＥＤＴＡを本質的に含まず、好ましくはＥＤＴＡを含まず、より好ましくはどんなカルシウムキレート剤も含まない。好ましくは、本発明の溶液及び試料中に存在するプロテイナーゼ及び酵素的に活性なその断片は、どの時点でもＥＤＴＡに暴露されず、より好ましくはどんなカルシウムキレート剤にも暴露されない。
【００９８】
別の見方をすれば、本発明は、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含む組成物であって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｉ）前記組成物中のカルシウム濃度が≦約８０μＭであり、前記組成物がＥＤＴＡを本質的に含まない、好ましくはカルシウムキレート剤を本質的に含まない、又は
ｉｉ）前記組成物中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
組成物を提供する。
【００９９】
別の見方をすれば、本発明は、１以上のポリペプチド及びプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含む試料であって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｉ）前記試料中のカルシウム濃度が≦約８０μＭであり、前記試料がＥＤＴＡを本質的に含まない、好ましくはカルシウムキレート剤を本質的に含まない、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
試料を提供する。
【０１００】
別の見方をすれば、本発明は、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を含む組成物であって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、
ｉ）前記組成物中のカルシウム濃度が≦約８０μＭであり、前記組成物がＥＤＴＡを本質的に含まない、好ましくはカルシウムキレート剤を本質的に含まない、又は
ｉｉ）前記組成物中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭであり、
前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片が、更に、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列に対してＮ末端である更なるペプチド配列及び／又はＣ末端である更なるペプチド配列を含む、
組成物を提供する。
【０１０１】
本明細書の別の所で記述する好ましい任意選択の特徴及び実施形態は、必要な変更を加えて、本発明の「別の見方をされた」態様にも当てはまる。特に、本明細書の別の所で開示する「遊離カルシウム」濃度は、ＥＤＴＡを本質的に含まない、より好ましくはどんなカルシウムキレート剤も本質的に含まない、本発明の別の見方をされた組成物及び試料中の（「遊離カルシウム」と定義されない）カルシウムの好ましい濃度である。同じことが、「遊離カルシウム」ではなく「カルシウム」の濃度に言及し、本発明の方法の試料又は組成物がＥＤＴＡを本質的に含まないことを明示する以下の本発明の方法にも当てはまる。
【０１０２】
好ましくは、本発明のすべての態様の組成物及び試料は、ＥＤＴＡ及びＥＧＴＡを本質的に含まず、より好ましくは、結合カルシウムをプロテイナーゼＸ構造から除去可能なカルシウムキレート剤を本質的に含まず、より好ましくは、カルシウムキレート剤を本質的に含まない。
【０１０３】
例えばＥＤＴＡ又は遊離カルシウムを、「本質的に含まない」とは、組成物及び試料が本質においてＥＤＴＡ又は遊離カルシウムを含まないことを意味するが、それらがＥＤＴＡ又は遊離カルシウムを完全に欠く厳密な要件が存在することを意味するものではない。例えば、本発明の組成物又は試料の調製に使用される市販品又は貯蔵液中の少量のＥＤＴＡ又は遊離カルシウムの存在のために、ＥＤＴＡ又は遊離カルシウムの存在を防止するステップが取られた後でも僅少レベルのＥＤＴＡ又は遊離カルシウムの可能性が存在する。詳細な検査によっていくらかのＥＤＴＡの存在が明らかになり得るものの、それは、意図された目的では存在しないとみなすことができるような少量で存在し、すなわち、ＥＤＴＡの非存在下で生じるようなレベル又は程度と比較して、遊離カルシウムレベル又は本発明のプロテイナーゼに結合するカルシウムの程度を実質的に変えるレベルでは存在しない。
【０１０４】
カルシウムキレート剤に関連した「本質的に含まない」とは、試料中のプロテイナーゼＸ濃度とカルシウムキレート剤、例えば、ＥＤＴＡ又はＥＧＴＡの濃度の比が少なくとも１０：１、より好ましくは少なくとも１００：１、より好ましくは少なくとも１０００：１であることを意味する。試料が１を超えるカルシウムキレート剤を含む場合、これらの比は、試料中のプロテイナーゼＸ濃度とカルシウムキレート剤全濃度の比である。
【０１０５】
詳細な検査によっていくらかの遊離カルシウムの存在が明らかになり得るものの、それは、意図された目的では存在しないとみなすことができるような少量で存在し、すなわち、遊離カルシウムの非存在下で生じるようなレベル又は程度と比較して、本発明のプロテイナーゼの易熱性を実質的に変えるレベルでは存在しない。
【０１０６】
好ましくは、本発明の組成物及び試料は、ＥＤＴＡを完全に含まず、より好ましくは、結合カルシウムをプロテイナーゼＸ構造から除去可能なカルシウムキレート剤を含まず、より好ましくは、カルシウムキレート剤を含まない。
【０１０７】
好ましくは、本発明の組成物及び試料は、遊離カルシウムを完全に含まない、すなわち遊離カルシウムを含まない。
【０１０８】
本発明の組成物及び試料中の遊離カルシウム濃度は、好ましくは≦約８０μＭ、好ましくは≦約６５μＭ、より好ましくは≦約４０μＭ、より好ましくは≦約３５μＭ、≦約３２μＭ又は≦約３０μＭ、より好ましくは≦約２５μＭ又は≦約２０μＭ、より好ましくは≦約１６μＭ又は≦約１５μＭ、より好ましくは≦約１０μＭ、より好ましくは≦約８μＭ又は≦約５μＭ、より好ましくは≦約２．５μＭである。「≦約Ｘ」という用語は、「０〜ＸｍＭ」と同じである。好ましくは、本発明の組成物及び試料は、遊離カルシウムを含まない。
【０１０９】
好ましくは、本発明の組成物及び試料中の遊離カルシウム濃度は、少なくとも約１μＭである。すなわち、本発明の組成物及び試料中の遊離カルシウム濃度は、好ましくは約１〜約８０μＭ、より好ましくは約１〜約６５μＭ、好ましくは約１〜約４０μＭ、好ましくは約１〜約３５μＭ、好ましくは約１〜約３２μＭ、好ましくは約１〜約３０μＭ、好ましくは約１〜約２５μＭ、好ましくは約１〜約２０μＭ、好ましくは約１〜約１６μＭ、好ましくは約１〜約１５μＭ、好ましくは約１〜約１０μＭ、好ましくは約１〜約８μＭ、好ましくは約１〜約５μＭ、好ましくは約１〜約２．５μＭである。
【０１１０】
好ましくは、本発明の組成物及び試料中の遊離カルシウム濃度は、少なくとも約２μＭである。すなわち、本発明の組成物及び試料中の遊離カルシウム濃度は、好ましくは約２〜約８０μＭ、より好ましくは約２〜約６５μＭ、好ましくは約２〜約４０μＭ、好ましくは約２〜約３５μＭ、好ましくは約２〜約３２μＭ、好ましくは約２〜約３０μＭ、好ましくは約２〜約２５μＭ、好ましくは約２〜約２０μＭ、好ましくは約２〜約１６μＭ、好ましくは約２〜約１５μＭ、好ましくは約２〜約１０μＭ、好ましくは約２〜約８μＭ、好ましくは約２〜約５μＭ、好ましくは約２〜約２．５μＭである。
【０１１１】
好ましくは、本発明の組成物及び試料は、遊離カルシウムを本質的に含まない、より好ましくは遊離カルシウムを含まない。「本質的に含まない」という用語については、本明細書の別の所で定義するとおりである。
【０１１２】
特に好ましくは、本発明の組成物及び試料中の遊離カルシウム濃度は、≦約３５μＭ、≦約３２μＭ、好ましくは≦約１６μＭ、好ましくは≦約１０μＭである。特に好ましくは、本発明の組成物及び試料中の遊離カルシウム濃度は、少なくとも約１μＭ、好ましくは少なくとも約２μＭである。すなわち、特に好ましくは、本発明の組成物及び試料中の遊離カルシウム濃度は、約１〜約３５μＭ、好ましくは約１〜約３２μＭ、好ましくは約２〜約３５μＭ、好ましくは約２〜約３２μＭ、好ましくは約１〜約１６μＭ、好ましくは約２〜約１６μＭ、好ましくは約１〜約１０μＭ、好ましくは約２〜約１０μＭである。
【０１１３】
上述したように、好ましくは、本発明の組成物及び試料は、好ましくはこうした濃度の遊離カルシウムを含み、ＥＤＴＡを本質的に含まず、好ましくはカルシウムキレート剤を本質的に含まない。
【０１１４】
好ましくは、本発明の組成物中のプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の濃度は、０．１ｍｇ／ｍｌ〜２０ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．５ｍｇ／ｍｌ〜１０ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは２ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌである。
【０１１５】
上記好ましい分析Ａを用いて、本発明者らは、プロテイナーゼＸの比活性が約６５Ｕ／ｍｇであることを確認した。好ましくは、本発明の組成物中のプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の活性は、上記分析Ａによって測定して、０．００１５Ｕ／μｌ〜０．３０Ｕ／μｌ、より好ましくは０．００８Ｕ／μｌ〜０．１５Ｕ／μｌ、最も好ましくは約０．０３Ｕ／μｌ〜０．０８Ｕ／μｌである。
【０１１６】
好ましくは、本発明の試料中のプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の濃度は、０．００１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．０１５ｍｇ／ｍｌ〜０．１ｍｇ／ｍｌである。
【０１１７】
好ましくは、本発明の試料中のプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の活性は、上記分析Ａによって測定して、０．０７Ｕ／ｍｌ〜３２５Ｕ／ｍｌ、より好ましくは３．２５Ｕ／ｍｌ〜３２．５Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは１．０Ｕ／μｌ〜６．５Ｕ／ｍｌである。
【０１１８】
任意で、本発明の組成物又は試料は、抗体、一本鎖ＤＮＡ結合タンパク質（ＳＳＢ）及び酵素からなる群から選択される１以上の更なる機能タンパク質を含む。
【０１１９】
好ましくは、前記更なる酵素は、ヌクレアーゼ（好ましくは、デオキシリボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ又はＳ１ヌクレアーゼ）、ポリメラーゼ（好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼ）、逆転写酵素、トランスポザーゼ、リガーゼ、（好ましくは、ＤＮＡリガーゼ又はＲＮＡリガーゼ）、メチラーゼ、ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ、トポイソメラーゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ（好ましくはアルカリホスファターゼ、好ましくは易熱性アルカリホスファターゼ、より好ましくはエビアルカリホスファターゼ）、キナーゼ、ヘリカーゼ、制限酵素及びグリコシラーゼからなる群から選択される。組成物又は試料は、好ましくは、こうした更なる酵素の組合せを含む。
【０１２０】
好ましくは、組成物又は試料は、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を含む。溶液又は試料が細胞又は細胞性物質を含む場合、それらは、好ましくは、外因性酵素である、すなわち、試料内の細胞でも試料中の細胞性物質が由来する細胞でも発現されない、こうした更なる酵素を含む。換言すれば、更なる酵素は、試料中の細胞又は細胞性物質によって供給されるのではなく、試料に適用される。これらの実施形態においては、内因的に産生される酵素の追加的存在は除外されない。
【０１２１】
本発明の組成物及び試料は、好ましくは、一価塩、好ましくは一価無機塩を含む。「塩」と「一価塩」という用語は、全体を通して同義で使用される。一価塩は、一価対イオンを含む塩である。二価塩は、対イオンの少なくとも１つが二価である塩、例えばＭｇＣｌ2である。無機塩は、対イオンのどれも炭素を含まない塩である。好ましくは、塩は、ナトリウム塩又はカリウム塩、より好ましくはナトリウム塩である。好ましくは、塩は、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）又は塩化カリウム（ＫＣｌ）、最も好ましくは塩化ナトリウムである。
【０１２２】
別の見方をすれば、本発明の組成物及び試料は、好ましくは一価対イオンを含む。好ましくは、本発明の組成物及び試料は、一価カチオン及び好ましくは一価アニオンも含む。好ましくは、一価イオンは無機である。好ましくは、カチオンは、ナトリウムイオン又はカリウムイオン、好ましくはナトリウムイオンである。好ましくは、組成物及び試料は、ナトリウム及び塩化物イオン又はカリウム及び塩化物イオン、最も好ましくはナトリウム及び塩化物イオンを含む。本明細書に開示される一価塩の好ましい濃度は、本質的に、一価対イオンの好ましい濃度であり、その逆も同様である。
【０１２３】
実施例に示すように、本発明者らは、一価塩濃度の増加がプロテイナーゼＸの易熱性を誘導するのに対して、一価塩濃度の増加がプロテイナーゼＫを安定化して熱不活化することを初めて示した。この結果は、特に驚くべきことである。配列番号１のプロテイナーゼＸは、塩水生物から得られ、したがって、通常、高塩分条件に耐えると予想される。それに対して、プロテイナーゼＫは、非海洋性供給源、真菌Ｅｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍ  ａｌｂｕｍ（以前はＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）から得られ、高塩分条件によって安定化されるとは予想されない。
【０１２４】
一価塩を含む本発明の試料及び組成物においては、好ましくは、組成物及び試料はｐＨが６．５〜９．５、好ましくは６．８〜９．２、より好ましくは７〜９、より好ましくは７．５〜８．５、より好ましくは約８．０である。
【０１２５】
好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、≧約２０ｍＭ、好ましくは≧約２５ｍＭ、より好ましくは≧約３０ｍＭ、より好ましくは≧約４０ｍＭ、より好ましくは≧約５０ｍＭ、より好ましくは≧約７５ｍＭ、より好ましくは≧約１００ｍＭ、より好ましくは≧約１２５ｍＭ、より好ましくは≧約１５０ｍＭ、より好ましくは≧約１７５ｍＭである。任意で、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、≧約２００ｍＭ、≧約２５０ｍＭ、≧約３００ｍＭ、≧約４００ｍＭ又は≧５００ｍＭである。
【０１２６】
好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、≦約１Ｍ、好ましくは≦約５００ｍＭ、好ましくは≦約３５０ｍＭである。本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、好ましくは約２０ｍＭ〜約１Ｍ、好ましくは約２０〜約５００ｍＭ、好ましくは約２０〜約４００ｍＭ、好ましくは約２０〜約３５０ｍＭ、好ましくは約３０〜約３５０ｍＭ、好ましくは約４０〜約３５０ｍＭ、好ましくは約５０〜約３５０ｍＭ、好ましくは約７５〜約３５０ｍＭ、好ましくは約１００〜約３５０ｍＭ、好ましくは約１２５〜約３５０ｍＭ、好ましくは約１５０〜約３５０ｍＭ、好ましくは約１７５〜約３５０ｍＭである。任意で、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約２００〜約３５０ｍＭ、又は約３００〜約３５０ｍＭである。
【０１２７】
好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、≦約５００ｍＭ、好ましくは≦約４００ｍＭ、好ましくは≦約３００ｍＭ、好ましくは≦約２５０ｍＭ、好ましくは≦約２００ｍＭ、好ましくは≦約１７５ｍＭ、好ましくは≦約１５０ｍＭである。
【０１２８】
好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約２０〜約３００ｍＭ、好ましくは約３０〜約３００ｍＭ、好ましくは約４０〜約３００ｍＭ、好ましくは約５０〜約３００ｍＭ、好ましくは約７５〜約３００ｍＭ、好ましくは約１００〜約３００ｍＭ、好ましくは約１２５〜約３００ｍＭ、好ましくは約１５０〜約３００ｍＭ、好ましくは約１７５〜約３００ｍＭである。任意で、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約２００〜約３００ｍＭである。
【０１２９】
好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約２０〜約２５０ｍＭ、好ましくは約３０〜約２５０ｍＭ、好ましくは約４０〜約２５０ｍＭ、好ましくは約５０〜約２５０ｍＭ、好ましくは約７５〜約２５０ｍＭ、好ましくは約１００〜約２５０ｍＭ、好ましくは約１２５〜約２５０ｍＭ、好ましくは約１５０〜約２５０ｍＭ、好ましくは約１７５〜約２５０ｍＭである。任意で、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約２００〜約２５０ｍＭである。
【０１３０】
好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約２０〜約２００ｍＭ、好ましくは約３０〜約２００ｍＭ、好ましくは約４０〜約２００ｍＭ、好ましくは約５０〜約２００ｍＭ、好ましくは約７５〜約２００ｍＭ、好ましくは約１００〜約２００ｍＭ、好ましくは約１２５〜約２００ｍＭ、好ましくは約１５０〜約２００ｍＭ、好ましくは約１７５〜約２００ｍＭである。
【０１３１】
好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約２０〜約１７５ｍＭ、好ましくは約３０〜約１７５ｍＭ、好ましくは約４０〜約１７５ｍＭ、好ましくは約５０〜約１７５ｍＭ、好ましくは約７５〜約１７５ｍＭ、好ましくは約１００〜約１７５ｍＭ、好ましくは約１２５〜約１７５ｍＭ、好ましくは約１５０〜約１７５ｍＭである。
【０１３２】
好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約２０〜約１５０ｍＭ、好ましくは約３０〜約１５０ｍＭ、好ましくは約４０〜約１５０ｍＭ、好ましくは約５０〜約１５０ｍＭ、好ましくは約７５〜約１５０ｍＭ、好ましくは約１００〜約１５０ｍＭ、好ましくは約１２５〜約１５０ｍＭである。
【０１３３】
特に好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約２０〜約１７５ｍＭ、好ましくは約２０〜約１５０ｍＭ、好ましくは約５０〜約１５０ｍＭである。特に好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約３０〜約１７５ｍＭ、好ましくは約３０〜約１５０ｍＭ、好ましくは約３０〜約１５０ｍＭである。特に好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約４０〜約１７５ｍＭ、好ましくは約４０〜約１５０ｍＭ、好ましくは約４０〜約１５０ｍＭである。
【０１３４】
好ましくは、本発明の組成物及び試料は、本明細書の別の所で定義する遊離カルシウム濃度及び一価塩濃度を含む。これによって、本明細書に開示される任意のカルシウム濃度値又は範囲と本発明のすべての態様及び実施形態に関して本明細書に開示される任意の一価塩濃度値又は範囲との組合せが明示される。好ましくは、一価塩はＮａＣｌ又はＫＣｌ、好ましくはＮａＣｌである。
【０１３５】
最高遊離カルシウム濃度と最低一価塩濃度の好ましい組合せを以下に示す。
【０１３６】
【表１−１】
2021516993.tif 000003
【表１−２】
2021516993.tif 000004
【表１−３】
2021516993.tif 000005
【表１−４】
2021516993.tif 000006
【０１３７】
さらに、好ましくは、本発明の組成物及び試料中の遊離カルシウム濃度は、少なくとも約１μＭ、より好ましくは少なくとも約２μＭである。さらに、好ましくは、本発明の組成物及び試料中の一価塩濃度は、約５００ｍＭ以下、好ましくは約４００ｍＭ以下、好ましくは約３５０ｍＭ以下、好ましくは３００ｍＭ以下、好ましくは約２５０ｍＭ以下、好ましくは約２００ｍＭ以下、好ましくは約１７５ｍＭ以下、好ましくは約１５０ｍＭ以下である。
【０１３８】
最高遊離カルシウム濃度と一価塩濃度の好ましい組合せを以下に示す。
【０１３９】
【表２】
2021516993.tif 000007
【０１４０】
遊離カルシウム濃度と一価塩濃度の好ましい組合せを以下に示す。
【０１４１】
【表３】
2021516993.tif 000008
【０１４２】
遊離カルシウム濃度と一価塩濃度の好ましい組合せを以下に示す。
【０１４３】
【表４】
2021516993.tif 000009
【０１４４】
特に好ましくは、本発明の組成物及び試料中の遊離カルシウム濃度は、≦約５μＭ、好ましくは≦約２μＭ、より好ましくは≦約１μＭ、最も好ましくは約０ｍＭである。特に好ましくは、組成物及び試料中の一価塩濃度は、２０〜１２５ｍＭ、好ましくは２０〜１００ｍＭ、最も好ましくは２０〜５０ｍＭである。特に好ましくは、組成物及び試料中の一価塩濃度は、３０〜１２５ｍＭ、好ましくは３０〜１００ｍＭ、最も好ましくは３０〜５０ｍＭである。
【０１４５】
本発明の組成物及び試料は、特に穏和な条件下で不活性化することができるプロテイナーゼを含む。したがって、組成物は、他の酵素のその後の使用又は事前の使用を含む、様々な分子生物学方法において有利な有用性を有する。こうした方法を以下に更に詳細に考察する。すなわち、更なる一態様は、
ｉ）本発明の組成物及び
ｉｉ）第２の酵素を含む第２の組成物
を含むキットを提供する。
【０１４６】
第２の酵素は、本発明のプロテイナーゼではない。任意で、前記キットは、複数の酵素を含む複数の溶液を含む。すなわち、それは、第３の酵素を含む第３の溶液、任意で、第４の酵素を含む第４の溶液などを含む。本発明のキット中に存在する各溶液は、好ましくは、その各々が本発明のプロテイナーゼではない異なる酵素を含む。好ましくは、第２の後続の溶液中の酵素は、ヌクレアーゼ（好ましくは、デオキシリボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ又はＳ１ヌクレアーゼ）、ポリメラーゼ（好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼ）、逆転写酵素、リガーゼ、（好ましくは、ＤＮＡリガーゼ又はＲＮＡリガーゼ）、メチラーゼ、トランスフェラーゼ（好ましくは、ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ）、トポイソメラーゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、プロテイナーゼＸ以外のプロテイナーゼ、及びホスファターゼ又はそれらの組合せからなる群から独立に選択される。
【０１４７】
好ましくは、本発明のキットは、本発明の組成物、及びＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を含む第２の組成物を含む。
【０１４８】
本発明の組成物及び試料は、特に穏和な熱処理ステップによって不活性化することができるプロテイナーゼを含む。したがって、組成物は、試料中の１以上のポリペプチドを消化するために試料へのプロテイナーゼの適用が必要である、又は望ましいが、存在する１以上の生体分子の構造又は機能に有害な影響を及ぼさないようにすることも望ましい、様々な分子生物学方法に有利な有用性を有する。標準プロテイナーゼの使用は、ｉ）存在する目的生体分子を損傷させ得るかなりの期間の高温を使用した不活性化、又はｉｉ）ワークフロー、時間及びコストを増加させ、目的生体分子の損失若しくは損傷をもたらし得る、プロテイナーゼの除去／希釈を必要とする。本組成物は、こうした望ましくないプロセシングステップを必要としない方法を可能にする。
【０１４９】
本発明は、以下で考察する方法を提供する。本発明の組成物、試料及びキットに関する上記定義並びに好ましい任意選択の特徴及び実施形態は、必要な変更を加えて、本発明の任意のすべての方法に当てはまる。本発明のすべての方法に関連して、ポリペプチド、試料、プロテイナーゼ、酵素的に活性な断片、遊離カルシウム、遊離カルシウム濃度、一価塩及び一価塩濃度については、本明細書の別の所で記述する。特に、上で開示した特徴、並びに遊離カルシウム（又はカルシウム）、一価塩及びそれらの組合せの濃度のいずれも本発明の方法に有用であり、すなわち、好ましくは、本発明の方法において接触又は処理される試料は、本明細書の別の所で開示するように、ある濃度の遊離カルシウム、一価塩又はそれらの任意の組合せを含む。
【０１５０】
したがって、本発明の方法において接触される「試料」という用語は、１以上のポリペプチドを含む任意の組成物を指す。好ましくは、試料は細胞性物質を含む。好ましくは、試料はクルードな細胞抽出物を含む。好ましくは、試料は部分精製細胞抽出物を含む。好ましくは、試料は細胞集団を含む。前記試料中の細胞は、インタクトでも溶解されていてもよく、好ましくは溶解されていてもよい。好ましくは、試料は、組織試料又は１以上の体液を含む。好ましくは、試料は細針生検材料である。好ましくは、試料は封入ウイルスを含む。プロテイナーゼは、ウイルスのタンパク質カプセル中のＲＮＡ／ＤＮＡを遊離させて同定、定量化及び／又は増幅するために、該タンパク質カプセルの消化に使用することができる。
【０１５１】
好ましくは、試料は体積が≧１０μｌである。好ましくは、試料は体積が≦１０００μｌ、より好ましくは≦５００μｌ、より好ましくは≦３００μｌ、より好ましくは≦２５０μｌ、より好ましくは≦２００μｌ、より好ましくは≦１５０μｌ、より好ましくは≦１００μｌ、より好ましくは≦７５μｌ、より好ましくは≦５０μｌである。あるいは、試料はマイクロ流体試料である。好ましくは、マイクロ流体試料は体積が≧０．０１μｌである。好ましくは、マイクロ流体試料は体積が≦１０μｌ、好ましくは≦５μｌ、より好ましくは≦１μｌ、より好ましくは≦０．５μｌ、より好ましくは≦０．１μｌである。
【０１５２】
本明細書のどこでもプロテイナーゼという表記は、別段の記載がない限り、酵素的に活性なその断片も表す。
【０１５３】
本発明のすべての方法においては、好ましくは、試料は、ＥＤＴＡ、好ましくはどんなカルシウムキレート剤も本質的に含まない。この用語の意味については、本明細書の別の所で定義するとおりである。試料は、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触した後に、ＥＤＴＡ、好ましくはどんなカルシウムキレート剤も本質的に含まない。
【０１５４】
したがって、更なる一態様においては、試料中のポリペプチドを消化する方法を提供する。前記方法は、試料をプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させるステップであって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むステップを含み、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである。
【０１５５】
別の見方をすれば、本発明は、試料中のポリペプチドを消化する方法であって、前記方法が、試料をプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させるステップであって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むステップを含み、
ｉ）前記試料中のカルシウム濃度が≦約８０μＭであり、前記試料がＥＤＴＡを本質的に含まない、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
方法を提供する。
【０１５６】
本発明のすべての方法、特に試料が一価塩を含む方法においては、好ましくは、試料はｐＨが６．５〜９．５、好ましくは６．８〜９．２、より好ましくは７〜９、より好ましくは７．５〜８．５、より好ましくは約８．０である。本発明者らは、本発明のプロテイナーゼが中性及び中性に近いｐＨを含めた穏和な条件下で不活性化され得ることを初めて確認した。
【０１５７】
好ましくは、試料中の遊離カルシウム（又はカルシウム）濃度は約８０μＭ以下であり、かつ、前記試料中の一価塩濃度は少なくとも約２０ｍＭである。好ましくは、前記試料中の一価塩濃度は、少なくとも約３０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約４０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約５０ｍＭである。
【０１５８】
「消化する」、「加水分解する、「分解する」及び「切断する」という用語は、本明細書では区別なく使用され、試料中のポリペプチド内のペプチド結合の加水分解を指す。消化は、部分消化でも完全消化でもよい。本発明に有用であるプロテイナーゼは、非特異的であり、十分な時間が与えられると、酵素機能を可能にする条件下で試料中のタンパク質を完全に消化する。
【０１５９】
「接触させる」／「接触」、「に適用する」／「適用」及び「に添加する」／「添加」という用語は、それらの通常の意味を有し、本明細書では区別なく使用される。
【０１６０】
本発明の方法においては、好ましくは、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片は、上記した本発明の一組成物の形で提供される。
【０１６１】
好ましくは、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を０．００１ｍｇ／ｍｌ〜５ｍｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０５ｍｇ／ｍｌ〜０．５ｍｇ／ｍｌ、最も好ましくは０．０１５ｍｇ／ｍｌ〜０．１ｍｇ／ｍｌの濃度で前記試料に添加する。これらの濃度は、試料中のプロテイナーゼ濃度である。
【０１６２】
好ましくは、試料に適用された後の、すなわち試料中の、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の活性は、上記分析Ａによって測定して、０．０７Ｕ／ｍｌ〜３２５Ｕ／ｍｌ、より好ましくは３．２５Ｕ／ｍｌ〜３２．５Ｕ／ｍｌ、最も好ましくは１．０Ｕ／μｌ〜６．５Ｕ／ｍｌである。
【０１６３】
したがって、本発明のプロテイナーゼ及び酵素的に活性なその断片は、試料中のポリペプチドを分解するのに使用される。特に、方法は、試料中に存在するポリペプチドの少なくとも一部の消化を可能にする条件下で試料を本発明のプロテイナーゼと接触させることを含む。したがって、好ましくは、試料がプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触した後に、方法は、更に、「消化ステップ」、すなわち試料中のポリペプチドの消化を可能にする条件下で試料をインキュベーションするステップを含む。必要な消化の量は、方法を実施する人の目的及び意図に依存し、必要な消化の量を達成する適切な条件は、当業者が容易に決定することができる。
【０１６４】
好ましくは、消化ステップは、温度４〜６５℃、より好ましくは２０〜５５℃、最も好ましくは３０〜５５℃で試料を加熱することを含む。好ましくは、インキュベーションステップは、継続時間が１秒〜４５分間、より好ましくは３０秒〜３０分間、より好ましくは１〜１５分間、より好ましくは１〜１０分間、更により好ましくは１〜５分間である。これらの範囲の上限の温度を使用する場合、インキュベーションの継続時間は、これらの範囲の下限とすることができ、その逆も同様である。当業者は、１又は２秒の極めて短いインキュベーションが、マイクロ流体試料を用いて行われる方法、及び試料中に存在する基質の量が少ない別の方法の場合には十分であることを知っている。
【０１６５】
好ましくは、上記方法は、後続の「不活性化ステップ」、すなわち、試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップを含む。こうした不活性化ステップは、試料をプロテイナーゼと接触させるステップの後、及び試料中のポリペプチドの消化を可能にする条件下で試料をインキュベーションするステップの後に行われる。
【０１６６】
消化及び不活性化のこれらのステップは、一般にインキュベーションであり、本明細書、特に実施例に記載されている。ｐＨ並びに（遊離）カルシウム、一価塩及びＥＤＴＡ濃度に関する上記特徴及び実施形態は、不活性化ステップが行われる時点の試料における条件である。
【０１６７】
したがって、更なる一態様においては、試料中のポリペプチドを消化する方法であって、前記方法が、
ａ）試料をプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させるステップであって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むステップ、
ｂ）試料中のポリペプチドの少なくとも部分的消化を可能にする条件下で試料をインキュベーションするステップ、及び
ｃ）試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップ、ここで、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
ステップを含む方法を提供する。
【０１６８】
別の見方をすれば、上記方法のステップｃ）は、
ｃ）試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化すること、ここで、
ｉ）前記試料中のカルシウム濃度が≦約８０μＭであり、前記試料がＥＤＴＡを本質的に含まない、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
を含む。
【０１６９】
好ましくは、前記試料中の遊離カルシウム（又はカルシウム）濃度は約８０μＭ以下であり、かつ、前記試料中の一価塩濃度は少なくとも約２０ｍＭである。好ましくは、一価塩は、一価無機塩、好ましくはナトリウム塩又はカリウム塩、より好ましくは塩化カリウム又は塩化ナトリウム、最も好ましくは塩化ナトリウムである。消化ステップｂ）については、上述したとおりである。
【０１７０】
上述したように、消化は部分消化でも完全消化でもよい。本発明に有用であるプロテイナーゼは、非特異的であり、十分な時間が与えられると、酵素機能を可能にする条件下で試料中のタンパク質を完全に消化する。
【０１７１】
ここで、「試料中のポリペプチドを消化する」とは、試料中の完全長ポリペプチド量がある程度まで減少することを意味する。タンパク質消化の程度は、幾つかの周知の分析によって直接分析することができる。適切な分析をそれらの意図された目的で設計することは、当業者の能力の範囲内であろう。例えば、試料中の酵素の残存活性をタンパク質分解の尺度として使用することができる。例えば質量分析法によって測定することができる、プロテオームプロファイルの変化を使用して、試料におけるポリペプチド分解の程度を測定することもできる。タンパク質分解の程度を可視化する単純な分析は、ＳＤＳ  Ｐａｇｅ及びクーマシーブルーなどのタンパク質染色色素又は他の視覚的なレポーター分子を用いた染色を行うことである。インタクトなタンパク質は、ゲルに沿ってバンドとして表示され、バンドはタンパク質分解の増加と共にシャープでなくなる。分解の程度は、ソフトウェアに基づく画像解析によって定量化することができる。
【０１７２】
好ましくは、プロテイナーゼを添加した試料は、細胞性物質を含む。好ましくは、試料はクルードな細胞抽出物を含む。好ましくは、試料は部分精製細胞抽出物を含む。好ましくは、試料は細胞集団を含む。前記試料中の細胞は、インタクトでも溶解されていてもよく、好ましくは溶解されていてもよい。好ましくは、試料は、組織試料又は１以上の体液を含む。好ましくは、試料は、約１〜約１，０００，０００の細胞を含む。好ましい一実施形態においては、試料は、１〜１０，０００の細胞、好ましくは１〜１０００の細胞、好ましくは１〜１００の細胞を含む。好ましい一実施形態においては、試料は単細胞を含む。別の好ましい実施形態においては、試料は、１００〜１，０００，０００の細胞、好ましくは１００〜１０，０００の細胞、好ましくは１００〜１０００の細胞を含む。好ましくは、試料は細針又は液体生検材料である。プロテイナーゼは、細胞性物質の溶解に使用することができる。
【０１７３】
本発明のプロテイナーゼを使用して、試料中に存在する任意のポリペプチドを消化することができる。好ましくは、試料中のポリペプチドとしては、本明細書の別の所で記述するものなど、カプシド若しくは足場タンパク質、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ結合タンパク質、及び／又はＤＮＡ若しくはＲＮＡに作用する酵素が挙げられる。
【０１７４】
更なる一態様においては、本発明は、試料中のプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化する方法を提供する。前記プロテイナーゼは、配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記方法は、試料を加熱して前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性な断片を不活性化するステップを含み、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである。
【０１７５】
別の見方をすれば、本発明は、試料中のプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化する方法であって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含み、前記方法が、試料を加熱して前記プロテイナーゼ又は酵素的に活性な断片を不活性化するステップを含み、
ｉ）前記試料中のカルシウム濃度が≦約８０μＭであり、前記試料がＥＤＴＡを本質的に含まない、好ましくはカルシウムキレート剤を本質的に含まない、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、
方法を提供する。
【０１７６】
本発明の方法のすべてにおいては、好ましくは、前記試料中の遊離カルシウム（又はカルシウム）濃度が約８０μＭ以下であり、かつ、前記試料中の一価塩濃度が少なくとも約２０ｍＭである。好ましくは、一価塩は、一価無機塩、好ましくはナトリウム塩又はカリウム塩、より好ましくは塩化カリウム又は塩化ナトリウム、最も好ましくは塩化ナトリウムである。
【０１７７】
上述したように、本発明の方法においては、本明細書の別の所で記述する遊離カルシウム（又はカルシウム）及び一価塩濃度は、不活性化ステップの開始時の試料中濃度である。好ましくは、濃度は、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片との接触後の試料中濃度でもある。本発明の方法においては、好ましくは、プロテイナーゼは、例えば、精製、抽出又は遠心分離によって、試料から除去されず、好ましくは、試料中のプロテイナーゼ濃度は、不活性化ステップ前又はステップ中に希釈されない。
【０１７８】
本発明は、本明細書に記載のプロテイナーゼが、遊離カルシウム及び／又は一価塩のある濃度が与えられると、穏和な条件下で易熱性になるという驚くべき知見に基づく。したがって、これらの条件は、本発明の方法の不活性化ステップ中に存在する必要がある。当業者は、試料をプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させると、試料の体積が増加し、したがってその中の遊離カルシウム及び一価塩濃度が減少し得ることを容易に理解するであろう。使用中、好ましくは、本発明の組成物は、試料の体積を大きく変えない小さい体積を有する。同様に、本発明のプロテイナーゼは、本発明によれば、溶液中の遊離カルシウム濃度が約８０μＭを超え、及び／又は一価塩濃度が約２０ｍＭ未満であるが、それが添加される試料中の遊離カルシウム及び／又は一価塩の体積及び濃度は、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片が適用された生成試料が約８０μＭ以下の遊離カルシウム濃度及び少なくとも約２０ｍＭの一価塩濃度を含むような溶液中で提供することができる。。
【０１７９】
好ましくは、本発明の方法における前記不活性化ステップは、前記試料中の前記プロテイナーゼの活性を、前記不活性化ステップが行われる前の試料中のプロテイナーゼの活性に対して少なくとも７５％、より好ましくは少なくとも８０％又は少なくとも８５％、より好ましくは少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％減少させることを含む。別の見方をすれば、好ましくは、前記不活性化ステップは、２５％未満、より好ましくは２０％未満、１５％未満、１０％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、１％未満の残存プロテイナーゼ活性をもたらす。好ましくは、プロテイナーゼは完全に不活性化され、すなわち、好ましくは、検出可能なプロテイナーゼ活性が残らない。
【０１８０】
熱処理プロテイナーゼを含む溶液が温度４０℃未満に戻っても、本発明のプロテイナーゼは活性を取り戻さず、すなわち、残存活性がほとんどなく、具体的には、１０％未満、好ましくは５％、２％、１％、０．５％又は０．１％未満であり、最も好ましくは検出可能なプロテイナーゼ活性が残らない。したがって、本明細書で言う不活性化は不可逆である。
【０１８１】
上述したように、プロテイナーゼ活性を測定する適切な分析は、当該技術分野で既知である。したがって、こうした分析を使用して、熱処理を受けない同じプロテイナーゼのプロテイナーゼ活性と比較して、熱処理によって不活性化を受けたプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片のプロテイナーゼ活性を測定することができ、それによって、残存活性、又は不活性化ステップによって達成される不活性化の程度を求めることができる。任意のプロテイナーゼ活性分析を使用して、未処理プロテイナーゼに対する熱処理プロテイナーゼの相対活性を求めることができる。同じ熱処理及び未処理プロテイナーゼは、同一条件下で維持すべきであり、同一手順で分析すべきであることを当業者はよく知っているであろう。好ましくは、使用される分析は上記分析Ａであり、好ましくは、未処理プロテイナーゼは、プロテイナーゼ活性が測定されるまで氷上で維持される。残存活性の更に好ましい分析は、実施例に開示したものである。
【０１８２】
したがって、本発明の方法の不活性化ステップ後の残存活性、すなわち、本発明の方法の不活性化ステップによって達成される不活性化の程度は、不活性化ステップを受けたプロテイナーゼのプロテイナーゼ活性を適切なプロテイナーゼ分析を用いて適切な条件下で測定し、それをこうした不活性化ステップを受けなかった同じプロテイナーゼの活性と比較することによって、当業者が容易に測定することができる。活性は、同じ分析を用いて同じ条件下で測定される。好ましくは、使用される分析は上記分析Ａであり、又は本実施例に使用される分析のいずれか一つである。好ましくは、未処理プロテイナーゼは、プロテイナーゼ活性が測定されるまで氷上で維持される。
【０１８３】
不活性化の程度は、未処理プロテイナーゼの活性に対する不活性化率又は残存活性率として表すことができる。
【０１８４】
試料中の遊離カルシウム濃度が約８０μＭ以下であり、及び／又は試料中の一価塩濃度が少なくとも約２０ｍＭであるため、試料中のプロテイナーゼ及び酵素的に活性なその断片を穏和な加熱条件で不活性化することができる。
【０１８５】
試料を所望の温度に所望の時間、例えば、熱ブロック、マイクロ波、ジュール加熱装置、レーザー加熱装置又は水浴を使用して、加熱することは当業者の能力の範囲内であろう。
【０１８６】
本方法の不活性化ステップ中に試料を加熱する温度、すなわち、プロテイナーゼを暴露する温度を不活性化温度と称する。好ましくは、前記不活性化温度は、≦約７０℃、好ましくは≦約６７℃、好ましくは≦約６５℃、好ましくは≦約６４℃、好ましくは≦約６３℃、好ましくは≦約６２℃、好ましくは≦約６１℃、好ましくは≦約６０℃、好ましくは≦約５８℃である。
【０１８７】
好ましくは、前記不活性化ステップは、プロテイナーゼを含む試料を温度約５０〜約６７℃、好ましくは約５０〜約６５℃、好ましくは約５０〜約６４℃、好ましくは約５０〜約６３℃、好ましくは約５０〜約６２℃、好ましくは約５０〜約６１℃、好ましくは約５０〜約６０℃、好ましくは約５０〜約５８°に加熱することを含む。
【０１８８】
好ましくは、前記不活性化ステップは、プロテイナーゼを含む試料を温度約５３〜約６７℃、好ましくは約５３〜約６５℃、好ましくは約５３〜約６４℃、好ましくは約５３〜約６３℃、好ましくは約５３〜約６２℃、好ましくは約５３〜約６１℃、好ましくは約５３〜約６０℃、好ましくは約５３〜約５８°に加熱することを含む。
【０１８９】
好ましくは、前記不活性化ステップは、プロテイナーゼを含む試料を温度約５５〜約６７℃、好ましくは約５５〜約６５℃、好ましくは約５５〜約６４℃、好ましくは約５５〜約６３℃、好ましくは約５５〜約６２℃、好ましくは約５５〜約６１℃、好ましくは約５５〜約６０℃に加熱することを含む。
【０１９０】
好ましくは、前記不活性化ステップは、プロテイナーゼを含む試料を温度約５６〜約６７℃、好ましくは約５６〜約６５℃、好ましくは約５６〜約６４℃、好ましくは約５６〜約６３℃、好ましくは約５６〜約６２℃、好ましくは約５６〜約６１℃、好ましくは約５６〜約６０℃に加熱することを含む。
【０１９１】
好ましくは、前記不活性化ステップは、プロテイナーゼを含む試料を温度約５７〜約６７℃、好ましくは約５７〜約６５℃、好ましくは約５７〜約６４℃、好ましくは約５７〜約６３℃、好ましくは約５７〜約６２℃、好ましくは約５７〜約６１℃、好ましくは約５７〜約６０℃に加熱することを含む。
【０１９２】
好ましくは、前記不活性化ステップは、プロテイナーゼを含む試料を温度約５８〜約６７℃、好ましくは約５８〜約６５℃、好ましくは約５８〜約６４℃、好ましくは約５８〜約６３℃、好ましくは約５８〜約６２℃、好ましくは約５８〜約６１℃、好ましくは約５８〜約６０℃に加熱することを含む。
【０１９３】
好ましくは、前記不活性化ステップは、プロテイナーゼを含む試料を温度約５９〜約６７℃、好ましくは約５９〜約６５℃、好ましくは約５９〜約６４℃、好ましくは約５９〜約６３℃、好ましくは約５９〜約６２℃、好ましくは約５９〜約６１℃、好ましくは約５９〜約６０℃に加熱することを含む。
【０１９４】
好ましくは、前記不活性化ステップは、プロテイナーゼを含む試料を温度約５５℃〜約６５℃、好ましくは約６０℃〜約６５℃、より好ましくは約５５℃〜約６０℃に加熱することを含む。
【０１９５】
特に好ましくは、前記不活性化ステップは、約５３℃〜約６０℃、より好ましくは約５３℃〜約５８℃、より好ましくは約５５℃で加熱することを含む。
【０１９６】
特に好ましくは、前記不活性化ステップは、約５８℃〜約６７℃、より好ましくは約５８℃〜約６３℃、より好ましくは約６０℃で加熱することを含む。
【０１９７】
特に好ましくは、前記不活性化ステップは、約６０〜約６７℃、より好ましくは約６３〜約６７℃、より好ましくは約６５℃で加熱することを含む。
【０１９８】
好ましくは、不活性化ステップは、試料を上記温度のいずれか一つで「保持時間」と呼ばれる時間加熱することを含む。必要な保持時間は、使用する不活性化温度、試料中の遊離カルシウム及び一価塩濃度、並びに必要な不活性化の程度に依存する。本願の教示を考慮して、当業者は、それら特定の目的のための保持時間を選択することができるであろう。
【０１９９】
好ましくは、保持時間は、≦約７５分間、好ましくは≦約６０分間、好ましくは≦約５５分間、好ましくは≦約５０分間、好ましくは≦約４５分間、好ましくは≦約４０分間、好ましくは≦約３５分間、好ましくは≦約３０分間、好ましくは≦約２５分間、好ましくは≦約２０分間、好ましくは≦約１５分間、好ましくは≦約１０分間、好ましくは≦約５分間、好ましくは≦約２分間である。
【０２００】
好ましくは、保持時間は、少なくとも約１分間、好ましくは少なくとも約２分間、好ましくは少なくとも約５分間、好ましくは少なくとも約１０分間、好ましくは少なくとも約１５分間、好ましくは少なくとも約２０分間、好ましくは少なくとも約２５分間、好ましくは少なくとも約３０分間、好ましくは少なくとも約３５分間、好ましくは少なくとも約４０分間、好ましくは少なくとも約４５分間、好ましくは少なくとも約５０分間、好ましくは少なくとも約６０分間である。
【０２０１】
好ましくは、保持時間は、約２〜約７５分間、好ましくは約２〜約６０分間、好ましくは約２〜約５５分間、好ましくは約２〜約５０分間、好ましくは約２〜約４５分間、好ましくは約２〜約４０分間、好ましくは約２〜約３５分間、好ましくは約２〜約３０分間、好ましくは約２〜約２５分間、好ましくは約２〜約２０分間、好ましくは約２〜約１５分間、好ましくは約２〜約１０分間、好ましくは約２〜約５分間である。
【０２０２】
好ましくは、保持時間は、約５〜約７５分間、好ましくは約５〜約６０分間、好ましくは約５〜約５５分間、好ましくは約５〜約５０分間、好ましくは約５〜約４５分間、好ましくは約５〜約４０分間、好ましくは約５〜約３５分間、好ましくは約５〜約３０分間、好ましくは約５〜約２５分間、好ましくは約５〜約２０分間、好ましくは約５〜約１５分間、好ましくは約５〜約１０分間である。
【０２０３】
好ましくは、保持時間は、約１０〜約７５分間、好ましくは約１０〜約６０分間、好ましくは約１０〜約５５分間、好ましくは約１０〜約５０分間、好ましくは約１０〜約４５分間、好ましくは約１０〜約４０分間、好ましくは約１０〜約３５分間、好ましくは約１０〜約３０分間、好ましくは約１０〜約２５分間、好ましくは約１０〜約２０分間、好ましくは約１０〜約１５分間である。
【０２０４】
好ましくは、保持時間は、約１５〜約７５分間、好ましくは約１５〜約６０分間、好ましくは約１５〜約５５分間、好ましくは約１５〜約５０分間、好ましくは約１５〜約４５分間、好ましくは約１５〜約４０分間、好ましくは約１５〜約３５分間、好ましくは約１５〜約３０分間、好ましくは約１５〜約２５分間、好ましくは約１５〜約２０分間である。
【０２０５】
好ましくは、保持時間は、約２０〜約７５分間、好ましくは約２０〜約６０分間、好ましくは約２０〜約５５分間、好ましくは約２０〜約５０分間、好ましくは約２０〜約４５分間、好ましくは約２０〜約４０分間、好ましくは約２０〜約３５分間、好ましくは約２０〜約３０分間、好ましくは約２０〜約２５分間である。
【０２０６】
好ましくは、保持時間は、約２５〜約７５分間、好ましくは約２５〜約６０分間、好ましくは約２５〜約５５分間、好ましくは約２５〜約５０分間、好ましくは約２５〜約４５分間、好ましくは約２５〜約４０分間、好ましくは約２５〜約３５分間、好ましくは約２５〜約３０分間である。
【０２０７】
好ましくは、保持時間は、約３０〜約７５分間、好ましくは約３０〜約６０分間、好ましくは約３０〜約５５分間、好ましくは約３０〜約５０分間、好ましくは約３０〜約４５分間、好ましくは約３０〜約４０分間、好ましくは約３０〜約３５分間である。
【０２０８】
好ましくは、保持時間は、約３５〜約７５分間、好ましくは約３５〜約６０分間、好ましくは約３５〜約５５分間、好ましくは約３５〜約５０分間、好ましくは約３５〜約４５分間、好ましくは約３５〜約４０分間である。
【０２０９】
好ましくは、保持時間は、約４０〜約７５分間、好ましくは約４０〜約６０分間、好ましくは約４０〜約５５分間、好ましくは約４０〜約５０分間、好ましくは約４０〜約４５分間である。
【０２１０】
好ましくは、保持時間は、約４５〜約７５分間、好ましくは約４５〜約６０分間、好ましくは約４５〜約５５分間、好ましくは約４５〜約５０分間である。
【０２１１】
好ましくは、保持時間は、約５０〜約７５分間、好ましくは約５０〜約６０分間、好ましくは約５０〜約５５分間である。
【０２１２】
好ましくは、保持時間は、約５５〜約７５分間、好ましくは約５５〜約６０分間である。
【０２１３】
好ましくは、保持時間は、約５分間〜約４０分間、好ましくは約１０〜約３５分間、好ましくは約１５〜約３０分間である。特に好ましくは、保持時間は、約５〜約１５分間、又は約１０〜約２０分間、又は約２０〜約４０分間、好ましくは約２５〜約３５分間である。
【０２１４】
上記保持時間は、体積≦１０００μｌ、好ましくは≦５００μｌ、より好ましくは≦３００μｌ、より好ましくは≦２５０μｌ、より好ましくは≦２００μｌ、より好ましくは≦１５０μｌ、より好ましくは≦１００μｌ、より好ましくは≦７５μｌ、より好ましくは≦５０μｌである試料に特に適切である。
【０２１５】
当業者は、加熱温度と保持時間の一方の調節を他方を調節することによって補償できることを知っている。例えば、不活性化温度の上昇によって、保持時間を短縮できる可能性がある。逆に、保持時間の延長によってより低い不活性化温度を使用できる可能性がある。
【０２１６】
さらに、当業者は、存在するプロテイナーゼの量が少ないとき、例えば、マイクロ流体試料の場合には、十分な不活性化が極めて短い時間枠で、例えば、１〜３０秒、好ましくは１〜２０秒、好ましくは１〜１０秒、好ましくは１〜５秒、潜在的には１又は２秒のみのうちにでも起こり得ることを知っている。上記不活性化温度のいずれもこれらの短い保持時間で使用することができる。こうした短い保持時間が有効であるためには、不活性化されるプロテイナーゼを含む試料は、好ましくは、体積が≦１０μｌ、好ましくは≦５μｌ、より好ましくは≦１μｌ、より好ましくは≦０．５μｌ、より好ましくは≦０．１μｌである。
【０２１７】
不活性化ステップを含む本発明の方法においては、上記不活性化温度のいずれかを上記保持時間のいずれかと組み合わせて使用することができる。本明細書の別の所で開示する不活性化温度と保持時間の任意のすべての組合せが明確に開示される。
【０２１８】
好ましくは、不活性化ステップは、温度約５３℃〜約６７℃、好ましくは約５５℃〜約６５℃、好ましくは約５５〜約６３℃で保持時間約２〜約７５分間、好ましくは約５〜約４０分間、より好ましくは約１０〜約３０分間、例えば、約１０、約１５又は約３０分間の加熱を含む。
【０２１９】
好ましくは、不活性化ステップは、温度約５５〜約６０℃で保持時間約２〜約７５分間、好ましくは約５〜約４０分間、より好ましくは約１０〜約３０分間、例えば、約１０、約１５又は約３０分間の加熱を含む。
【０２２０】
好ましくは、不活性化ステップは、温度約６０〜約６５℃で保持時間約２〜約７５分間、好ましくは約５〜約４０分間、より好ましくは約１０〜約２０分間、例えば、約１０又は約１５分間の加熱を含む。
【０２２１】
本発明の好ましい不活性化ステップは、以下のとおりである。
【０２２２】
Ａ）約５３〜約５８℃、好ましくは約５５℃で約４５〜約７５分間、より好ましくは約４５〜約６０分間、より好ましくは約６０分間の加熱。
こうした実施形態においては、試料中の遊離カルシウム濃度は、好ましくは≦約１０μＭ、より好ましくは≦約８μＭ、より好ましくは≦５μＭであり、より好ましくは、試料は遊離カルシウムを含まない。
【０２２３】
その代わりに、又はそれに加えて、こうした実施形態においては、試料中の一価塩濃度は、好ましくは少なくとも約５０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約７５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１００ｍＭ又は少なくとも約１５０ｍＭである。
【０２２４】
Ｂ）約５８〜約６３℃、好ましくは約６０℃で下記Ｂ１〜Ｂ４のいずれか一つに記載の以下の時間の加熱。
Ｂ１）約２〜約４０分間、より好ましくは約５〜約３０分間。
こうした実施形態においては、試料中の遊離カルシウム濃度は、好ましくは≦約８０μＭ、より好ましくは≦約６５μＭ、より好ましくは≦約３５μＭ、より好ましくは≦約２０μＭ、より好ましくは≦約１０μＭ、より好ましくは≦約５μＭである。
【０２２５】
その代わりに、又はそれに加えて、こうした実施形態においては、試料中の一価塩濃度は、好ましくは少なくとも約２０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約２５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約３０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約４０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約５０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約７５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１００ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１５０ｍＭである。
【０２２６】
Ｂ２）約５〜約１５分間、より好ましくは約１０分間。
こうした実施形態においては、試料中の遊離カルシウム濃度は、好ましくは≦約１０μＭ、≦約８μＭ、より好ましくは≦約５μＭであり、より好ましくは、試料は遊離カルシウムを含まない。
【０２２７】
その代わりに、又はそれに加えて、こうした実施形態においては、試料中の一価塩濃度は、好ましくは少なくとも約７５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１００ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１５０ｍＭである。
【０２２８】
Ｂ３）約１０〜約２０分間、より好ましくは約１５分間。
こうした実施形態においては、試料中の遊離カルシウム濃度は、好ましくは≦約３５μＭ、より好ましくは≦約１６μＭ、より好ましくは≦約８μＭ、より好ましくは≦約５μＭであり、より好ましくは、試料は遊離カルシウムを含まない。
【０２２９】
その代わりに、又はそれに加えて、こうした実施形態においては、試料中の一価塩濃度は、好ましくは少なくとも約５０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約７５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１００ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１５０ｍＭである。
【０２３０】
Ｂ４）約２０〜４０分間、より好ましくは約３０分間。
こうした実施形態においては、試料中の遊離カルシウム濃度は、好ましくは≦約８０μＭ、≦約６５μＭ、より好ましくは≦約３５μＭ、より好ましくは≦約３０μＭ、より好ましくは≦約１６μＭである。
【０２３１】
その代わりに、又はそれに加えて、こうした実施形態においては、試料中の一価塩濃度は、好ましくは少なくとも約２５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約３０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約４０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約５０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約７５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１００ｍＭである。
【０２３２】
好ましくは、こうした実施形態においては、一価塩濃度が１００ｍＭ以下である場合、カルシウム濃度は３０μＭ以下である。好ましくは、一価塩濃度が７５ｍＭ以下である場合、カルシウム濃度は２０μＭ以下である。好ましくは、一価塩濃度が５０ｍＭ以下である場合、カルシウム濃度は１０μＭ以下である。
【０２３３】
Ｃ）約６３〜約６７℃、好ましくは約６５℃で最大約１５分間、より好ましくは最大約１０分間、より好ましくは最大約５分間加熱。
こうした実施形態においては、試料中の遊離カルシウム濃度は、好ましくは≦約８０μＭ、より好ましくは≦約６５μＭ、より好ましくは≦約３５μＭ、より好ましくは≦約２０μＭ、より好ましくは≦約１０μＭ、より好ましくは≦約５μＭである。
【０２３４】
その代わりに、又はそれに加えて、こうした実施形態においては、試料中の一価塩濃度は、好ましくは少なくとも約２０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約２５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約３０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約４０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約５０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約７５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１００ｍＭである。
【０２３５】
本発明者らによって確認された易熱性に対する遊離カルシウム依存的及び一価塩依存的な効果も、本発明のプロテイナーゼ及び酵素的に活性なその断片の不活性化を高温で驚くほど短時間で可能にする。したがって、別の好ましい一実施形態においては、不活性化ステップは、以下を含む。
【０２３６】
Ｄ）約６５〜約７０℃、好ましくは約６７〜約７０℃、より好ましくは約６７℃又は約７０で最大約５分間、より好ましくは最大約２分間の加熱。
こうした実施形態においては、試料中の遊離カルシウム濃度は、好ましくは≦約８０μＭ、より好ましくは≦約６５μＭ、より好ましくは≦約３５μＭ、より好ましくは約≦２０μＭである。
【０２３７】
その代わりに、又はそれに加えて、こうした実施形態においては、試料中の一価塩濃度は、好ましくは少なくとも約２０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約２５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約３０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約４０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約５０ｍＭ、より好ましくは少なくとも約７５ｍＭ、より好ましくは少なくとも約１００ｍＭである。
【０２３８】
最も好ましくは、加熱／不活性化ステップｃ）は、試料を温度５５〜６０℃で１５〜３０分間加熱することを含む。
【０２３９】
パラメータである加熱時間、加熱温度、遊離カルシウム濃度及び一価塩濃度の１つの調節は、その他の１つ以上の調節によって補償できることを当業者は容易に理解できる。
【０２４０】
しかし、非常に重要なことに、本発明によれば、最高遊離カルシウム濃度は８０μＭである。有利な穏和な条件下で、特に不活性化温度５３〜６７℃及び保持時間２〜７５分間、好ましくは５〜６０分間、より好ましくは１０〜４０分間、好ましくは１５〜３０分間で、プロテイナーゼの実質的な不活性化（７５％不活性化）が達成され得る程度に本発明のプロテイナーゼの易熱性が誘導されるのは、この遊離カルシウム濃度以下である。
【０２４１】
同様に、本発明によれば、最低一価塩濃度は２０ｍＭである。有利な穏和な条件下で、特に不活性化温度５３〜６７℃及び保持時間２〜７５分間、好ましくは５〜６０分間、より好ましくは１０〜４０分間、好ましくは１５〜３０分間で、プロテイナーゼの実質的な不活性化（７５％不活性化）が達成され得る程度に本発明のプロテイナーゼの易熱性が誘導されるのは、この一価塩濃度以上である。
【０２４２】
上述したように、当該分野で使用される標準プロテイナーゼの典型的な不活性化手順は、はるかに過酷な条件、例えば、７５℃で５分間の加熱（ＢｉｏＲａｄ手順）、９５℃で１０分間の加熱（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  ＢｉｏＬａｂｓ手順）、７０℃で１５分間の加熱（Ｑｉａｇｅｎ手順）を必要とする。
【０２４３】
本発明の方法においては、好ましくは、試料は、それがプロテイナーゼと接触する時点で、ＥＤＴＡを本質的に含まず、より好ましくはＥＤＴＡを含まず、より好ましくはどんなカルシウムキレート剤も含まない。別の見方をすれば、好ましくは、プロテイナーゼが適用される試料は、ＥＤＴＡを本質的に含まず、より好ましくはＥＤＴＡを含まず、好ましくはどんなカルシウムキレート剤も含まない。好ましくは、本発明の方法は、プロテイナーゼの添加後にＥＤＴＡ、好ましくは任意のカルシウムキレート剤を試料に適用するステップを含まない。試料は、ワークフロー初期のある時点で、又はその調製中に、カルシウムキレート剤と接触した可能性があるが、その場合、カルシウムキレート剤は、プロテイナーゼ適用前に除去されていなければならない。カルシウムキレート剤は、本明細書の別の所で記述するとおりであり、試料をプロテイナーゼと接触させる前にそれらを試料から除去することは当業者の能力の範囲内である。
【０２４４】
上述したように、本発明のすべての方法、特に試料が一価塩を含む方法においては、好ましくは、試料はｐＨが６．５〜９．５、好ましくは６．８〜９．２、より好ましくは７〜９、より好ましくは７．５〜８．５、より好ましくは約８．０である。本発明者らは、本発明のプロテイナーゼが中性及び中性に近いｐＨを含めた穏和な条件下で不活性化され得ることを初めて確認した。したがって、好ましくは、方法は、更に、不活性化ステップ前に試料のｐＨを６．５〜９．５、好ましくは６．８〜９．２、より好ましくは７〜９、より好ましくは７．５〜８．５、より好ましくは約８．０に調節するステップを含む。試料のｐＨを調節するステップは当業者によく知られており、任意のこうしたステップを本発明の方法に使用することができる。
【０２４５】
好ましくは、プロテイナーゼを添加する試料は体積が≧１０μｌである。好ましくは、試料は体積が≦１０００μｌ、より好ましくは≦５００μｌ、より好ましくは≦３００μｌ、より好ましくは≦２５０μｌ、より好ましくは≦２００μｌ、より好ましくは≦１５０μｌ、より好ましくは≦１００μｌ、より好ましくは≦７５μｌ、より好ましくは≦５０μｌである。あるいは、試料はマイクロ流体試料である。好ましくは、マイクロ流体試料は体積が≧０．０１μｌである。好ましくは、マイクロ流体試料は体積が≦１０μｌ、好ましくは≦５μｌ、より好ましくは≦１μｌ、より好ましくは≦０．５μｌ、より好ましくは≦０．１μｌである。
【０２４６】
好ましくは、プロテイナーゼ又は酵素的に活性な断片を添加する試料は、目的の生体分子及び１以上の混入、すなわち不要な、ポリペプチドを含む。
【０２４７】
したがって、更なる一態様においては、本発明は、目的の生体分子を試料から単離又は精製する方法を提供する。前記試料は、１以上の混入ポリペプチドを含み、前記方法は、
ａ）試料をプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させるステップであって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むステップ、
ｂ）試料中のポリペプチドの少なくとも部分的消化を可能にする条件下で試料をインキュベーションするステップ、及び
ｃ）試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップ、ここで、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、及び
ｄ）目的の生体分子を試料から任意で除去するステップ
を含む。
【０２４８】
別の見方をすれば、上記方法のステップｃ）は、以下を含む。
【０２４９】
試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップ、ここで、
ｉ）前記試料中のカルシウム濃度が≦約８０μＭであり、前記試料がＥＤＴＡを本質的に含まない、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである。
【０２５０】
好ましくは、「目的の生体分子」は、核酸分子、好ましくはＤＮＡ又はＲＮＡ分子である。好ましくは、目的の生体分子は、それ自体がポリペプチドである。目的の生体分子は、プロテイナーゼでも酵素的に活性なその断片でもない。
【０２５１】
本発明のプロテイナーゼは、同定、定量化及び／又は増幅のためにウイルスのタンパク質カプセル中のＲＮＡ／ＤＮＡを遊離させるために、該タンパク質カプセルを消化するのに使用することができる。したがって、好ましくは、生体試料は１以上の封入ウイルスを含み、目的の生体分子は前記ウイルスの核酸分子、好ましくはＲＮＡ又はＤＮＡであり、混入ポリペプチドは前記ウイルスタンパク質カプセルのものであり、ステップｂ）は、前記１又は複数のウイルスのタンパク質カプセルの少なくとも部分的消化、すなわち前記核酸分子を前記カプセルから遊離させるのに十分な消化を可能にする条件下で試料をインキュベーションすることを含む。
【０２５２】
好ましくは、試料はクロマチンを含み、目的の生体分子は結合ヒストンを含まないＤＮＡであり、混入タンパク質はそれに結合したヒストンであり、ステップｂ）は、試料中のヒストンの少なくとも部分的消化を可能にする条件下で試料をインキュベーションすることを含む。
【０２５３】
好ましくは、試料は、核の増幅反応、例えば、ＰＣＲ反応の産物であり、又は産物を含み、ＤＮＡ結合ポリメラーゼを含み、目的の生体分子は結合ポリメラーゼを含まないＤＮＡであり、混入タンパク質は結合ポリメラーゼであり、ステップｂ）は、試料中のポリメラーゼの少なくとも部分的消化を可能にする条件下で試料をインキュベーションすることを含む。増幅方法としては、ＰＣＲ及びその変形、３ＳＲ、ＳＤＡ、ＬＡＲ又はＬＣＲ及びＬＡＭＰ並びにそれらの変形が挙げられるが、それらに限定されない。
【０２５４】
「核酸増幅反応」という用語は、核酸の標的配列又はその相補配列のコピー数を増加させる任意のインビトロ手段を指す。
【０２５５】
「核酸増幅反応の産物」は、したがって、当該反応の最終増幅ステップから直接得られる成分の本質的にすべてを含むと考えられる。他の成分を添加することができ、又は成分のいくつかは何らかの修飾若しくはプロセシングを受け得るが、本質的に成分のどれも、又は少なくとも核酸成分のどれも、除去されない。好ましくは、核酸増幅反応の産物は、最終増幅ステップの直接産物である。しかし、核酸増幅反応の産物は、取り込まれないＮＴＰの脱リン酸化を起こす処理、例えば、本発明のプロテイナーゼによる処理前にアルカリホスファターゼ、好ましくは易熱性アルカリホスファターゼ、例えば、易熱性エビアルカリホスファターゼ（ＳＡＰ）による処理を受けることが好ましい場合もある。有利な組換えＳＡＰは、ＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓ（商標）ＡＳから入手可能である。
【０２５６】
好ましくは、前記試料中の目的の生体分子は、１以上のペプチド結合を介して分子、好ましくはポリペプチドに結合する。更なる一態様においては、本発明は、したがって、目的の生体分子を、１以上のペプチド結合を介してそれに結合した分子、好ましくはポリペプチドから遊離させる方法を提供する。前記方法は、
ａ）試料をプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させるステップであって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むステップ、
ｂ）１以上のペプチド結合の消化によって目的の生体分子の遊離を可能にする条件下で試料をインキュベーションするステップ、及び
ｃ）試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップ、ここで、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、及び
ｄ）目的の生体分子を試料から任意で除去するステップ
を含む。
【０２５７】
別の見方をすれば、上記方法のステップｃ）は、試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップを含み、
ｉ）前記試料中のカルシウム濃度が≦約８０μＭであり、前記試料がＥＤＴＡを本質的に含まない、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである。
【０２５８】
好ましくは、目的の生体分子はポリペプチド又はタンパク質であり、それが結合する分子は、ポリペプチドシグナル配列又は融合タグ、好ましくはｈｉｓタグ（例えば、ヘキサヒスチジンタグ）、ＦＬＡＧタグ、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、グルタチオンＳトランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、チオレドキシン（ＴＲＸ）、低分子ユビキチン様修飾因子（ＳＵＭＯ）、ユビキチン（Ｕｂ）又は緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）である。
【０２５９】
更なる一態様においては、本発明は、目的のペプチドを前駆体ポリペプチドから生成する方法を提供する。前記方法は、
ａ）ポリペプチドをプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させるステップであって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むステップ、
ｂ）目的のペプチドを遊離させるために、前駆体ポリペプチドの消化を可能にする条件下で試料をインキュベーションするステップ、
ｃ）試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップ、ここで
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、及び
ｄ）目的の生体分子を試料から任意で除去するステップ
を含む。
【０２６０】
別の見方をすれば、上記方法のステップｃ）は、試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップを含み、
ｉ）前記試料中のカルシウム濃度が≦約８０μＭであり、前記試料がＥＤＴＡを本質的に含まない、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである。
【０２６１】
プロテイナーゼは、１以上の細胞を組織内の別の細胞から、又はそれらが付着した基質から、細胞外基質タンパク質の消化によって分離するのにも使用される。更なる一態様においては、本発明は、１以上の細胞を組織内の別の細胞から、又は前記１以上の細胞が付着した基質から分離する方法を提供する。前記方法は、
ａ）１以上の細胞をプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させるステップであって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むステップ、
ｂ）１以上の細胞の遊離を１以上の細胞外基質タンパク質の消化によって可能にする条件下で試料をインキュベーションするステップ、及び
ｃ）試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップ、ここで、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、及び
ｄ）目的の生体分子を試料から任意で除去するステップ
を含む。
【０２６２】
別の見方をすれば、上記方法のステップｃ）は、試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップを含み、
ｉ）前記試料中のカルシウム濃度が≦約８０μＭであり、前記試料がＥＤＴＡを本質的に含まない、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである。
【０２６３】
好ましくは、試料は、ポリペプチドを含むポリアクリルアミドゲルであり、又は該ポリアクリルアミドゲルを含み、前記ポリペプチドの消化が質量分析法による分析のための小断片の作製に要求される。したがって、本発明は、好ましくは質量分析のために、タンパク質断片試料を調製する方法を提供する。前記方法は、
ａ）１以上のポリペプチドを含む試料をプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片と接触させるステップであって、前記プロテイナーゼが配列番号１のアミノ酸配列又は配列番号１と少なくとも約７０％同一であるアミノ酸配列を含むステップ、
ｂ）試料中のポリペプチドの少なくとも部分的消化を可能にする条件下で試料をインキュベーションするステップ、及び
ｃ）試料を加熱してプロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を不活性化するステップ、ここで、
ｉ）前記試料中の遊離カルシウム濃度が≦約８０μＭである、又は
ｉｉ）前記試料中の一価塩濃度が≧約２０ｍＭである、及び
ｄ）目的の生体分子を試料から任意で除去するステップ
を含む。
【０２６４】
好ましくは、試料は、１以上のポリペプチドを含むポリアクリルアミドゲルである。
【０２６５】
好ましくは、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片を添加する試料は、１以上の更なる酵素を含む。好ましくは、前記更なる酵素は、ヌクレアーゼ（好ましくは、デオキシリボヌクレアーゼ、エキソヌクレアーゼ、Ｂａｌ３１ヌクレアーゼ、リボヌクレアーゼ、マングビーンヌクレアーゼ又はＳ１ヌクレアーゼ）、ポリメラーゼ（好ましくは、ＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼ）、逆転写酵素、リガーゼ、（好ましくは、ＤＮＡリガーゼ又はＲＮＡリガーゼ）、メチラーゼ、トランスフェラーゼ（好ましくは、ポリヌクレオチドアデニリルトランスフェラーゼ）、トポイソメラーゼ、グアニリルトランスフェラーゼ、ホスファターゼ（好ましくは、アルカリホスファターゼ、好ましくは、易熱性アルカリホスファターゼ、より好ましくは、エビアルカリホスファターゼ）、キナーゼ、ヘリカーゼ、制限酵素及びグリコシラーゼからなる群から選択される。試料は、好ましくは、こうした更なる酵素の組合せを含む。好ましくは、試料は、ＤＮＡポリメラーゼ又は逆転写酵素を含む。好ましくは、こうした酵素は外因性酵素であり、すなわち、試料内の細胞でも試料中の細胞性物質が由来する細胞でも発現されない。本発明の方法は、こうした追加の酵素によって許容され得る有利な穏和なプロテイナーゼ不活性化条件を提供し、したがって、こうした酵素がプロテイナーゼ不活性化ステップ中に存在することができ、それによって後続のワークフローを単純化することができる。
【０２６６】
上述したように、当該分野で現在使用される標準プロテイナーゼであるプロテイナーゼＫは、試料中の酵素又は目的の生体分子を損傷させ得る高温での不活性化を必要とした。プロテイナーゼＫの不活性化が高温加熱なしで要求される場合、プロテイナーゼを試料から除去するか、又は酵素の濃度をかなり希釈しなければならない。こうした除去又は希釈ステップは、ワークフローを延長し、コストを増加させ、試料中の材料の損失又は損傷をもたらし得る。それらは、小さい試料サイズを処理するときに特に不適である。
【０２６７】
好ましくは、プロテイナーゼを添加する試料は体積が≦１０００μｌ、より好ましくは≦５００μｌ、より好ましくは≦３００μｌ、より好ましくは≦２５０μｌ、より好ましくは≦２００μｌ、より好ましくは≦１５０μｌ、より好ましくは≦１００μｌ、より好ましくは≦７５μｌ、より好ましくは≦５０μｌである。あるいは、試料はマイクロ流体試料である。好ましくは、マイクロ流体試料は体積が≧０．０１μｌである。好ましくは、マイクロ流体試料は体積が≦１０μｌ、好ましくは≦５μｌ、より好ましくは≦１μｌ、より好ましくは≦０．５μｌ、より好ましくは≦０．１μｌである。
【０２６８】
したがって、好ましくは、上記方法のいずれかは、不活性化ステップに続いて、基質の酵素触媒作用を含むステップを含み、前記後続ステップは、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに行われる。
【０２６９】
「事前の除去なしに」とは、プロテイナーゼが試料から、例えば、精製、抽出又は遠心分離によって、物理的に除去されないことを意味する。
【０２７０】
「事前の希釈なしに」とは、試料中のプロテイナーゼ濃度がさほど希釈されない、すなわち、希釈によって実質的に不活性化されないことを意味する。実質的に不活性化の定義については、本明細書の別の所で記述する。好ましくは、試料中のプロテイナーゼ濃度は、４倍を超えて、より好ましくは３倍を超えて、より好ましくは２倍を超えて希釈されない。
【０２７１】
好ましくは、試料は１以上の核酸分子を含み、方法は、不活性化ステップに続いて、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに核酸分子のヌクレアーゼ媒介消化のステップを含む。
【０２７２】
好ましくは、試料は１以上の核酸分子を含み、方法は、不活性化ステップに続いて、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに核酸分子のリン酸化又は脱リン酸化のステップを含む。
【０２７３】
好ましくは、試料は１以上の核酸分子を含み、方法は、不活性化ステップに続いて、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに核酸分子の連結のステップを含む。
【０２７４】
好ましくは、試料は１以上のＲＮＡ分子を含み、方法は、不活性化ステップに続いて、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに逆転写のステップを含む。
【０２７５】
好ましくは、試料は１以上の核酸分子を含み、方法は、不活性化ステップに続いて、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに核酸重合のステップを含む。
【０２７６】
好ましくは、試料は１以上の核酸分子を含み、方法は、不活性化ステップに続いて、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに核酸増幅のステップを含む。
【０２７７】
好ましくは、試料は１以上の核酸分子を含み、方法は、不活性化ステップに続いて、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしにナノポア配列決定のステップを含む。
【０２７８】
好ましくは、試料は１以上のウイルス粒子又は細胞、好ましくは細菌細胞を含み、方法は、不活性化ステップに続いて、プロテイナーゼ又は酵素的に活性なその断片の事前の除去又は希釈なしに細胞溶解のステップを含む。
【実施例】
【０２７９】
実施例１：プロテイナーゼ比活性
すべての実施例において、プロテイナーゼＫをＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｃｈｅｒから購入し（ｐｒｏｄ．Ｎｏ．ＥＯ０４９１、２８．９ｋＤａ）、プロテイナーゼＸをＡｒｃｔｉｃＺｙｍｅｓにおいてＰｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓの組換えによって生成させた（バッチ１６０２−１、配列番号１）。
【０２８０】
２つのプロテイナーゼの比活性（Ｕ／ｍｇプロテイナーゼ）を測定するために、溶液中のプロテイナーゼ濃度をまずＮａｎｏＤｒｏｐによって測定した。Ｎａｎｏｄｒｏｐは、波長２８０ｎｍにおける吸光度を測定してタンパク質濃度を定量化する分光光度手法である。
【０２８１】
プロテイナーゼＫは、濃度１４．３ｍｇ／ｍｌで存在することが確認された。１０，０００倍希釈原液（１．４３μｇ／ｍｌ）を続いて使用した。プロテイナーゼＸは、濃度９．２ｍｇ／ｍｌで存在することが確認された。１，０００倍希釈原液（９．２μｇ／ｍｌ）を続いて使用した。
【０２８２】
プロテイナーゼＸ及びＫの活性（Ｕ／ｍＬ）を標準動力学的ペプチドベース分析によって測定した。１０００μｌキュベットに
０．４μｇ／ｍｌプロテイナーゼＸ又は０．０６μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ
１ｍＭ基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ
１２ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、
１％ＤＭＳＯ
を総体積１０００μｌで供給した。
【０２８３】
４−ニトロアニリンへの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＡの酵素切断を４１０ｎｍ（ＥＭ８．８）における吸光度の増加をＵＶ分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃ、スウェーデン）を用いて２５℃で２分間測定することによって分析した。１分間あたり１μｍｏｌの４−ニトロアニリンを２５℃で生成する酵素の量を１単位と定義する。
【０２８４】
以下の比活性を測定した（表１）。
【０２８５】
【表５】
2021516993.tif 000010
【０２８６】
異なる業者からのプロテイナーゼＫのバイアルを用いて結果を確認した（Ｓｉｇｍａ、Ｏ４８５０、４００Ｕ／ｍｇまで測定）。
【０２８７】
実施例２：プロテイナーゼ活性に対する遊離カルシウム濃度の効果
プロテイナーゼＸ及びＫの活性を様々な温度で標準ペプチドベース分析によって測定した。１．５ｍｌキュベットに
０．３７μｇ／ｍｌプロテイナーゼＸ又は０．０６μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（２４ｍＵ／ｍＬプロテイナーゼに相当）
１ｍＭ基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡ
１２ｍＭ  ＮａＣｌ、０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、
１％ＤＭＳＯ
を総体積１０００μｌで供給した。
【０２８８】
キュベットを指示温度で分析の間インキュベーションした。４−ニトロアニリンへの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＡの酵素切断を４１０ｎｍ（ＥＭ８．８）における吸光度の増加を経時的に３０秒間１．５ｍＬセミミクロキュベット（Ｂｒａｎｄ、ドイツ）中でＵＶ分光光度計（Ｕｌｔｒｏｓｐｅｃ  ２０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、スウェーデン）を用いて測定することによって分析した。
【０２８９】
６５℃で観察された最大活性に対する％相対活性として活性を計算した。６５℃を超える測定は技術的に不可能であった。先行技術の教示によれば、プロテイナーゼＸとＫの両方に最適な温度は６５〜７０℃である。
【０２９０】
図１に示すように、２つのプロテイナーゼは、１０ｍＭカルシウムの存在下で類似した温度−活性プロファイルを有する。
【０２９１】
プロテイナーゼＸ及びＫの温度−活性プロファイルを低カルシウム（５μＭ）及びカルシウム非含有（０μＭ）条件下でも測定した。また、２４ｍＵ／ｍＬプロテイナーゼ（０．３７μｇ／ｍｌプロテイナーゼＸ又は０．０６μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫに相当）を１ｍＭ基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡと一緒に指示温度で緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、０ｍＭ／０．００５ｍＭ／１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１％ＤＭＳＯ、１２ｍＭ  ＮａＣｌ）中で総体積１０００μｌでインキュベーションした。
【０２９２】
４−ニトロアニリンへの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＡの酵素切断を４１０ｎｍ（ＥＭ８．８）における吸光度の増加を経時的に３０秒間ＵＶ分光光度計を用いて測定することによって分析した。
【０２９３】
１０ｍＭ  ＣａＣｌ2の存在下で６５℃で観察された活性に対する％相対活性として活性を計算した（表２）。６５℃で観察された活性は、観察された最大活性であった。
【０２９４】
【表６】
2021516993.tif 000011
【０２９５】
各カルシウム濃度において、両方のプロテイナーゼの温度プロファイルは類似しており、最大活性が６５℃で観察された。カルシウム濃度の減少によってプロテイナーゼ活性が幾つかの温度でほんの少し減少したように見えた。１０ｍＭカルシウムを用いて各特定の温度において達成された活性と比較して活性を考えると、２つのプロテイナーゼの活性プロファイルは異なった。結果を表３及び４並びに図２及び３に示す。これらは、様々な温度におけるプロテイナーゼ活性に対するカルシウム依存的な効果を強調するものである。
【０２９６】
【表７】
2021516993.tif 000012
【０２９７】
【表８】
2021516993.tif 000013
【０２９８】
図２及び表３によれば、プロテイナーゼＸでは、低カルシウム濃度又はカルシウムの非存在が５５℃及び４５℃における活性のいくらかの損失（最大減少＜１０％）をもたらし、２５℃又は３５℃において認識できる活性の低下はない。約２０％の活性低下が６５℃でカルシウムの非存在下で認められ、約１０％の低下が６５℃で低カルシウム（０．００５ｍＭ）で認められた。
【０２９９】
それに対して、図３及び表４によれば、各温度におけるプロテイナーゼＫの活性は、カルシウム条件によってほとんど影響されなかった。すなわち、高カルシウム濃度の存在下であろうと、低カルシウム濃度であろうと、又はカルシウムの非存在下であろうと、温度増加と共にほんのわずかな活性変化しか認められなかった。
【０３００】
まとめると、データは、低カルシウム濃度がプロテイナーゼＸの熱失活をプロテイナーゼＫよりも大きく誘導し得ることを示唆している。
【０３０１】
実施例３：プロテイナーゼのＣａ2+依存的な誘導可能なである易熱性
プロテイナーゼＸ及びＫのカルシウム依存的易熱性を更に調べた。
【０３０２】
熱処理ステップ：
プロテイナーゼを６０℃で１５又は３０分間ＰＣＲサーモサイクラー（Ｖｅｒｉｔｉ、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）中で多様な濃度の遊離カルシウムを含む緩衝液中でインキュベーションした。緩衝液は、
０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＸ（６．５Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＸ初期活性に相当）又は０．０１４ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（５．６Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ初期活性に相当）
０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌ、
ＣａＣｌ2（１ｍＭ／０．２５ｍＭ／０．１２５ｍＭ／０．０６３ｍＭ／０．０３１ｍＭ／０．０１６ｍＭ／０．００８ｍＭ／０ｍＭ）
を体積５０μｌで含む。
【０３０３】
不活性化後に試料を氷上に戻した。対照として用いた試料を全体を通して氷上で維持した。
【０３０４】
残存活性の分析
熱処理ステップ後、試料を０．０２５Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌで１：１０希釈した。希釈ステップを行って、試料中の酵素活性Ｕ／ｍｌを低下させて、それらを反応分析で検出可能な範囲にした。
【０３０５】
プロテイナーゼの残存活性を以下のように評価した。
【０３０６】
０．４μｇ／ｍｌプロテイナーゼＸ又は０．０６μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（それぞれ２６及び２４ｍＵ／ｍｌ初期活性に相当）を１ｍＭ基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡと一緒に３７℃で標準反応緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１％ＤＭＳＯ、１２ｍＭ  ＮａＣｌ）中で総体積２５０μｌでインキュベーションした。
【０３０７】
４−ニトロアニリンへの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＡの酵素切断を４０５ｎｍ（ＥＭ８．８）における吸光度の増加を経時的に１０分間、多モードプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）を用いて１１秒ごとにシグナルを検出して測定することによって分析した。
【０３０８】
結果を図４及び５に示す。対照試料（加熱ステップを経ない氷上で維持された同じプロテイナーゼ及び緩衝液）に対する残存活性率として活性を示す。
【０３０９】
図５に示すように、遊離カルシウム濃度の減少は、プロテイナーゼＫの熱失活に影響せず、プロテイナーゼＫは、６０℃でインキュベーションしたすべての試料において遊離Ｃａ２+濃度とは無関係に約４０％活性を失う。プロテイナーゼＫの実質的な不活性化（≧７５％）は、どの条件下でも達成されなかった。
【０３１０】
それに対して、図４に示すように、遊離カルシウム濃度の減少は、プロテイナーゼＸの易熱性の増加をもたらした。実質的な不活性化（≧７５％、すなわち２５％未満の残存活性）は、６０℃で遊離カルシウム濃度≦０．０６３ｍＭで３０分間の加熱、また、６０℃で遊離カルシウム濃度≦０．０１６ｍＭで１５分間の加熱によって行われた。≧９０％の不活性化が好ましく、これは、プロテイナーゼＸでは６０℃で遊離カルシウム濃度≦０．０３１ｍＭで３０分間、又は遊離カルシウムの非存在下で１５の加熱によって行われた。
【０３１１】
したがって、プロテイナーゼＸが低カルシウム濃度の存在下で誘導的に易熱性であるのに対して、プロテイナーゼＫの易熱性はカルシウム濃度によって影響されない。
【０３１２】
この相違は更に図６で示される。図６は、６０℃で１５／３０分間様々なカルシウム濃度で加熱後の２つのプロテイナーゼの不活性化プロファイルである。
【０３１３】
実施例４：プロテイナーゼの遊離カルシウム依存的な不活性化プロファイル
プロテイナーゼＸ及びＫの不活性化に対する異なる熱処理ステップの効果を評価した。以下の実験においては、５μＭの遊離カルシウム上限を使用し、熱失活ステップをある範囲の温度及び加熱時間で行った。
【０３１４】
熱処理ステップ：
プロテイナーゼを様々な温度（４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃及び７０℃）で様々な時間（２、５、１０、１５、３０６０分間）、多様な遊離カルシウム濃度（ＣａＣｌ2、０μＭ、２．５μＭ又は５μＭ）を含む緩衝液中でインキュベーションした。緩衝液は、更に、０．１ｍｇ／ｍｌ（６．５Ｕ／ｍｌ初期活性）プロテイナーゼＸ又は０．０１６ｍｇ／ｍｌ（６．４Ｕ／ｍｌ初期活性）プロテイナーゼＫ、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌ、総体積５０μｌを含んだ。
【０３１５】
プロテイナーゼＫを使用前にＣａを含まない貯蔵緩衝液に対して透析して、その中の遊離カルシウムを除去した。不活性化後に試料を氷上に戻した。対照として用いた試料を全体を通して氷上で維持した。
【０３１６】
残存活性の分析
熱処理ステップ後、試料を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌで１：２０希釈した。希釈ステップを行って、試料中の酵素活性Ｕ／ｍｌを低下させて、それらを反応分析で検出可能な範囲にした。
【０３１７】
プロテイナーゼの残存活性を以下のように評価した。
【０３１８】
０．２μｇ／ｍｌプロテイナーゼＸ又は０．０３μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（それぞれ１３ｍＵ及び１２ｍＵ初期活性に相当）を１ｍＭ基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡと一緒に３７℃で標準反応緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１％ＤＭＳＯ、４ｍＭ  ＮａＣｌ）中で総体積２５０μｌでインキュベーションした。
【０３１９】
４−ニトロアニリンへの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＡの酵素切断を４０５ｎｍ（ＥＭ８．８）における吸光度の増加を経時的に１０分間、多モードプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）を用いて１１秒ごとにシグナルを検出して測定することによって分析した。氷上で維持された以外は試験試料と同一である対照試料と残存活性を比較する。
【０３２０】
結果を表５〜７に示す。
【０３２１】
【表９】
2021516993.tif 000014
【０３２２】
上記データによれば、遊離カルシウムの非存在下で、プロテイナーゼＸの≧約７５％不活性化は、
少なくとも７０℃で加熱時に２分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６０℃で加熱時に１０分以内に、及び
少なくとも５５℃で加熱時に６０分以内に
達成される。
【０３２３】
プロテイナーゼＸの≧約９０％不活性化は、
少なくとも７０℃で加熱時に２分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６０℃で加熱時に１５分以内に、及び
少なくとも５５℃で加熱時に６０分以内に
達成される。
【０３２４】
【表１０】
2021516993.tif 000015
【０３２５】
上記データによれば、遊離カルシウム濃度２．５μＭ未満で、プロテイナーゼＸの≧約７５％不活性化は、
少なくとも７０℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６０℃で加熱時に１５分以内に、及び
少なくとも５５℃で加熱時に６０分以内に
達成される。
【０３２６】
プロテイナーゼＸの≧約９０％不活性化は、
少なくとも７０℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に１０分以内に、及び
少なくとも６０℃で加熱時に３０分以内に
達成される。
【０３２７】
【表１１】
2021516993.tif 000016
【０３２８】
上記データによれば、遊離カルシウム濃度５μＭ未満で、プロテイナーゼＸの≧約７５％不活性化は、
少なくとも７０℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６０℃で加熱時に１５分以内に、及び
少なくとも５５℃で加熱時に６０分以内に
達成される。
【０３２９】
プロテイナーゼＸの≧約９０％不活性化は、
少なくとも７０℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に１０分以内に、及び
少なくとも６０℃で加熱時に３０分以内に
達成される。
【０３３０】
すなわち、遊離カルシウム濃度≦５μＭでは、７０℃におけるインキュベーションはプロテイナーゼＸの≧９５％不活性化を５分以内に達成し、６５℃におけるインキュベーションはプロテイナーゼＸの≧９５％不活性化を１０分以内に（遊離カルシウムの非存在下で５分以内に）達成した。
【０３３１】
２．５と５μＭの両方の遊離カルシウムの存在下では、６０℃におけるインキュベーションはプロテイナーゼＸの≧９０％不活性化を３０分以内に（遊離カルシウムの非存在下で１５以内に）達成した。
【０３３２】
≧５５℃で６０分間のインキュベーションは、５μＭ遊離カルシウムの存在下でプロテイナーゼＸの８０％不活性化、≦２．５μＭ遊離カルシウムの存在下で８５％不活性化、及び遊離カルシウムの非存在下で約９０％不活性化を達成した。
【０３３３】
比較のためにプロテイナーゼＫを用いて同じ検討を行った。結果を下表８〜１０に示す。
【０３３４】
【表１２】
2021516993.tif 000017
【０３３５】
上記データによれば、遊離カルシウムの非存在下で、プロテイナーゼＫの≧約７５％不活性化は、
少なくとも７０℃で加熱時に２分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に１０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは５分以内に）、
少なくとも６０℃で加熱時に３０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは１０分以内に）、
少なくとも５５℃で加熱時に６０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘよりも少ない不活性化）
達成される。
【０３３６】
プロテイナーゼＫの≧約９０％不活性化は、
少なくとも７０℃で加熱時に２分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に１０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは５分以内に）、及び
少なくとも６０℃で加熱時に６０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは１５分以内に）
達成される。
【０３３７】
【表１３】
2021516993.tif 000018
【０３３８】
上記データによれば、遊離カルシウム濃度２．５μＭ未満で、プロテイナーゼＫの≧約７５％不活性化は、
少なくとも７０℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に１０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは５分以内に）、
少なくとも６０℃で加熱時に３０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは１５分以内に）、及び
少なくとも５５℃で加熱時に６０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘよりも少ない不活性化）
達成される。
【０３３９】
プロテイナーゼＫの≧約９０％不活性化は、
少なくとも７０℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に１５分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは１０分以内に）、及び
少なくとも６０℃で加熱時に６０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは３０分以内に）
達成される。
【０３４０】
【表１４】
2021516993.tif 000019
【０３４１】
上記データによれば、遊離カルシウム濃度５μＭ未満で、プロテイナーゼＫの≧約７５％不活性化は、
少なくとも７０℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に１０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは５分以内に）、
少なくとも６０℃で加熱時に３０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは１５分以内に）、及び
少なくとも５５℃で加熱時に６０分以内に
達成される。
【０３４２】
プロテイナーゼＫの≧約９０％不活性化は、以下の加熱ステップによって、
少なくとも７０℃で加熱時に５分以内に、
少なくとも６５℃で加熱時に１５分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは１０分以内に）、及び
少なくとも６０℃で加熱時に６０分以内に（Ｐｒｏｔ  Ｘでは３０分以内に）
達成される。
【０３４３】
したがって、結果の示すところによれば、すべての遊離カルシウム濃度において、同程度の不活性化を所与の温度で達成するのに必要な加熱時間は、プロテイナーゼＸがプロテイナーゼＫよりもかなり短い。別の見方をすれば、試験した加熱時間及び温度の大部分において、プロテイナーゼＫよりもプロテイナーゼＸの不活性化が大きい。これは、プロテイナーゼＸの観察された易熱性が低カルシウム濃度で誘導されるためであり、これはプロテイナーゼＫでは観察されない。
【０３４４】
したがって、熱処理によって不活性化されるプロテイナーゼＫの能力に対するカルシウムの効果は、プロテイナーゼＸに対する効果よりもかなり目立たない。
【０３４５】
実施例５：プロテイナーゼの一価塩依存的な誘導可能である易熱性
プロテイナーゼＸ及びＫの易熱性に対するＮａＣｌの効果を判定するために、両方のプロテイナーゼの不活性化プロファイルを様々な温度でｉ）５０ｍＭ（低塩分条件）又はｉｉ）３００ｍＭ  ＮａＣｌ（高塩分条件）を含む溶液中で測定した。
【０３４６】
熱処理ステップ：
プロテイナーゼを様々な温度（４５℃、５０℃、５５℃、６０℃、６５℃及び７０℃）で３０分間、５０ｍＭ又は３００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液中でインキュベーションした。緩衝液は、０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼ（６．５Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＸ又は４０Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫに相当）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、０μＭ  ＣａＣｌ2を体積５０μｌで含んだ。
【０３４７】
不活性化後に試料を氷上に戻した。対照として用いた試料を全体を通して氷上で維持した。
【０３４８】
残存活性の分析
熱処理ステップ後、プロテイナーゼＸ又はプロテイナーゼＫの試料を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌでそれぞれ１：１０又は１：１００希釈した。プロテイナーゼの残存活性を以下のように評価した。
【０３４９】
０．４μｇ／ｍｌプロテイナーゼＸ（２６ｍＵ／ｍｌの初期活性に相当）又は０．０４μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（１６ｍＵ／ｍｌの初期活性に相当）を１ｍＭ基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡと一緒に３７℃で標準反応緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１％ＤＭＳＯ、１２ｍＭ  ＮａＣｌ）中で総体積２５０μｌでインキュベーションした。
【０３５０】
４−ニトロアニリンへの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＡの酵素切断を４０５ｎｍ（ＥＭ８．８）における吸光度の増加を経時的に１０分間、多モードプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）を用いて１１秒ごとにシグナルを検出して測定することによって分析した。氷上で維持された以外は試験試料と同一である対照試料と残存活性を比較する。
【０３５１】
図７に示すように、ＮａＣｌ濃度の増加は、ＰｒｏｔＸの易熱性に対してＰｒｏｔＫとは逆の効果を有する。高いＮａＣｌ濃度はプロテイナーゼＫを高温で安定化するのに対して、高いＮａＣｌ濃度はプロテイナーゼＸの易熱性を誘導する。
【０３５２】
この結果は、特に驚くべきことである。配列番号１のプロテイナーゼＸは、塩水生物から得られ、したがって、通常、高塩分条件に耐えると予想される。それに対して、Ｐｒｏｔ  Ｋは、非海洋性供給源、真菌Ｅｎｇｙｏｄｏｎｔｉｕｍ  ａｌｂｕｍ（以前はＴｒｉｔｉｒａｃｈｉｕｍ  ａｌｂｕｍ）から得られ、高塩分条件によって安定化されることは予想されない。
【０３５３】
実施例６：プロテイナーゼの一価塩依存的な易熱性プロファイル
プロテイナーゼＸの易熱性に対するＮａＣｌの効果を更に検討するために、実施例５よりも広範なＮａＣｌ濃度を評価した。
【０３５４】
熱処理ステップ：
プロテイナーゼＸを５０℃又は６０℃で１５又は３０分間、０、５０、１５０、３００又は６００ｍＭ  ＮａＣｌを含む緩衝液中でインキュベーションした。緩衝液は、０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＸ（６．５Ｕ／ｍｌに相当）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、０．０３ｍＭ  ＣａＣｌ2を体積５０μｌで含んだ。
【０３５５】
不活性化後に試料を氷上に戻した。対照として用いた試料を全体を通して氷上で維持した。
【０３５６】
残存活性の分析
熱処理ステップ後、試料を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、３００ｍＭ  ＮａＣｌで１：１０希釈した。プロテイナーゼの残存活性を以下のように評価した。
【０３５７】
０．４μｇ／ｍｌプロテイナーゼＸ（２６ｍＵ／ｍｌ初期活性に相当）を１ｍＭ基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡと一緒に３７℃で標準反応緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１％ＤＭＳＯ、１２ｍＭ  ＮａＣｌ）中で総体積２５０μｌでインキュベーションした。
【０３５８】
４−ニトロアニリンへの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＡの酵素切断を４０５ｎｍ（ＥＭ８．８）における吸光度の増加を経時的に１０分間、多モードプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）を用いて１１秒ごとにシグナルを検出して測定することによって分析した。氷上で維持された以外は試験試料と同一である対照試料と残存活性を比較する。
【０３５９】
結果を図８及び表１１に示す。
【０３６０】
【表１５】
2021516993.tif 000020
【０３６１】
上記データによれば、ＮａＣｌ濃度≧１５０ｍＭにおいて、プロテイナーゼＸの≧約８０％不活性化が６０℃で３０分以内の加熱によって達成される。
【０３６２】
やはり上記データによれば、ＮａＣｌ濃度≧３００ｍＭにおいて、プロテイナーゼＸの≧約９５％不活性化が６０℃で３０分以内の加熱によって達成され、プロテイナーゼＸの≧約８０％不活性化が６０℃で１５０分以内の加熱によって達成される。
【０３６３】
ＮａＣｌ濃度（ｘ軸）対６０℃で３０／１５分加熱後の残存活性（ｙ軸）のプロットである図９によれば、実質的な不活性化（≧７５％）がＮａＣｌ濃度少なくとも約２１０ｍＭでは６０℃で１５分の加熱で、ＮａＣｌ濃度少なくとも約１００ｍＭでは３０分の加熱で達成される。
【０３６４】
実施例７：プロテイナーゼの易熱性に対する遊離カルシウム濃度と一価塩濃度の併用効果
上記検討によれば、ｉ）遊離カルシウム濃度の低下又はｉｉ）ＮａＣｌ濃度の上昇は、プロテイナーゼＸの易熱性をプロテイナーゼＫよりも大きく誘導する。これらの条件の併用効果を続けて検討した。
【０３６５】
熱処理ステップ：
プロテイナーゼＸ及びＫを６０℃で３０分間、様々な濃度のＮａＣｌ（０、２５、５０、７５、１００、１２５ｍＭ）及び遊離カルシウム（０、５、１０、２０及び２０μＭ  ＣａＣｌ2）を含む緩衝液中でインキュベーションした。緩衝液は、６．５Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＸ又は６．４Ｕ／ｍｌプロテイナーゼＫ（０．１ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＸ又は０．０１６ｍｇ／ｍｌプロテイナーゼＫに相当）、２５ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８を体積５０μｌで含んだ。
【０３６６】
プロテイナーゼＫを使用前にＣａを含まない貯蔵緩衝液に対して透析して、その中の遊離カルシウムを除去した。
【０３６７】
不活性化後に試料を氷上に戻した。対照として用いた試料を全体を通して氷上で維持した。
【０３６８】
残存活性の分析
熱処理ステップ後、試料を５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８、１００ｍＭ  ＮａＣｌで１：２０希釈した。プロテイナーゼの残存活性を以下のように評価した。
【０３６９】
０．２μｇ／ｍｌプロテイナーゼＸ（１３ｍＵ／ｍｌ初期活性に相当）又は０．０３μｇ／ｍｌプロテイナーゼＫ（１２ｍＵ／ｍｌ初期活性に相当）を１ｍＭ基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ｐＮＡと一緒に３７℃で標準反応緩衝液（０．１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．０、１０ｍＭ  ＣａＣｌ2、１％ＤＭＳＯ、４ｍＭ  ＮａＣｌ）中で総体積２５０μｌでインキュベーションした。
【０３７０】
４−ニトロアニリンへの基質Ｓｕｃ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｐｈｅ−ＮＡの酵素切断を４０５ｎｍ（ＥＭ８．８）における吸光度の増加を経時的に１０分間、多モードプレートリーダー（Ｓｙｎｅｒｇｙ  Ｈ１、ＢｉｏＴｅｋ、ＵＳＡ）を用いて１１秒ごとにシグナルを検出して測定することによって分析した。氷上で維持された以外は試験試料と同一である対照試料と残存活性を比較する。
【０３７１】
結果を表１２及び１３に示す。
【０３７２】
【表１６】
2021516993.tif 000021
【０３７３】
実質的な不活性化（≧７５％）をすべての遊離カルシウム濃度で≧１００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で達成した。
【０３７４】
さらに、実質的な不活性化（≧約７５％）を最高遊離カルシウム濃度２０μＭで少なくとも７５ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で達成した。
【０３７５】
さらに、実質的な不活性化（≧約７５％）を最高遊離カルシウム濃度１０μＭで少なくとも５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で達成した。
【０３７６】
さらに、実質的な不活性化（≧約７５％）を最高遊離カルシウム濃度５μＭで少なくとも５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で達成した。
【０３７７】
さらに、実質的な不活性化（≧約７５％）を遊離カルシウムの非存在下かつ少なくとも２５ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で達成した。
【０３７８】
優れた不活性化（≧約９０％）を最高遊離カルシウム濃度２０μＭで少なくとも１２５ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で達成した。
【０３７９】
優れた不活性化（≧約９０％）を最高遊離カルシウム濃度１０μＭで少なくとも１００ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で達成した。
【０３８０】
優れた不活性化（≧約９０％）を最高遊離カルシウム濃度５μＭで少なくとも７５ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で達成した。
【０３８１】
遊離カルシウムの非存在下で、優れた不活性化（≧約９０％）を少なくとも５０ｍＭ  ＮａＣｌの存在下で達成した。
【０３８２】
【表１７】
2021516993.tif 000022
【０３８３】
結果によれば、プロテイナーゼＫは、プロテイナーゼＸとは極めて異なる易熱性プロファイルを有する。プロテイナーゼＫは、低塩分条件下で次第に易熱性になり、高塩分条件下で安定化され、カルシウム濃度によってほとんど影響されない。他方、プロテイナーゼＸは、高塩分条件及び低遊離カルシウム条件下で次第に易熱性になる。
【図１】
2021516993.tif 000023
【図２】
2021516993.tif 000024
【図３】
2021516993.tif 000025
【図４】
2021516993.tif 000026
【図５】
2021516993.tif 000027
【図６】
2021516993.tif 000028
【図７】
2021516993.tif 000029
【図８】
2021516993.tif 000030
【図９】
2021516993.tif 000031
【配列表】
2021516993000001.app
【国際調査報告】
2021516993.tif 000032
2021516993.tif 000033
2021516993.tif 000034