(57)【要約】  ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８におけるセルピン発現を増加させるための、ラクトース、フルクトース及びラフィノースから選択される糖の使用。【選択図】  なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８におけるセルピン発現を増加させるための、ラクトース、フルクトース及びラフィノースから選択される糖の使用。
【請求項２】
０．０２〜０．５重量％の濃度でラクトース、フルクトース、及びラフィノースから選択される前記糖を含む培地で、前記ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を培養する、請求項１に記載の使用。
【請求項３】
前記培地が、ラクトース、フルクトース、及びラフィノースから選択される前記糖を０．０５〜０．１５重量％、０．０８〜０．１２重量％、又は約０．１％の濃度で含む、請求項２に記載の使用。
【請求項４】
前記糖がラクトースである、請求項１〜３のいずれか一項に記載の使用。
【請求項５】
ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８におけるセルピン発現を増加させるための方法であって、培養培地でビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を増殖させることを含み、前記培養培地がラクトース、フルクトース、及びラフィノースから選択される糖を含むことを特徴とする、方法。
【請求項６】
前記培養培地が、０．０２〜０．５重量％の濃度で前記糖を含む、請求項５に記載の方法。
【請求項７】
培養培地が、０．０５〜０．１５重量％、０．０８〜０．１２重量％又は約０．１％の濃度で前記糖を含む、請求項５又は６に記載の方法。
【請求項８】
前記糖がラクトースである、請求項５〜７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９】
培養培地でビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を増殖させる方法によって産生され、前記培養培地がラクトース、フルクトース、及びラフィノースから選択される糖を含むことを特徴とする、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８。
【請求項１０】
前記培養培地が、０．０２〜０．５重量％の濃度で前記糖を含む、請求項９に記載の方法によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８。
【請求項１１】
前記培養培地が、０．０５〜０．１５重量％、０．０８〜０．１２重量％、又は約０．１％の濃度で前記糖を含む、請求項９又は１０に記載の方法によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８。
【請求項１２】
前記糖がラクトースである、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の方法によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８。
【請求項１３】
請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法によって産生された前記ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を含む、組成物。
【請求項１４】
炎症性腸疾患、セリアック病、非セリアックグルテン過敏症、グルテン失調症、疱疹状皮膚炎、又は小麦アレルギーの治療又は予防に使用するための、請求項９〜１２のいずれか一項に記載の方法によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８又は請求項１３に記載の組成物。
【請求項１５】
炎症性腸疾患、セリアック病、非セリアックグルテン過敏症、グルテン失調症、疱疹状皮膚炎、又は小麦アレルギーの治療又は予防に使用するための、（ｉ）ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８と（ｉｉ）ラクトース、フルクトース及びラフィノースから選択される糖との組み合わせ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、セルピンを発現する細菌、細菌におけるセルピン産生を増加させるための方法、及びその使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
グルテン関連障害は、グルテンにより誘導される全ての疾患を含む。これらには、他の病態生理のなかでも、セリアック病、及び非セリアックグルテン過敏症が挙げられる。現在、さまざまなグルテン関連障害の発生率が世界中で上昇しており、セリアック病及び非セリアックグルテン過敏症に関しては特に上昇している。両疾患は、グルテンの摂取によって誘導される。先天性免疫及び適応免疫はいずれもセリアック病に関与し、かつ先天性免疫は非セリアックグルテン過敏症に関与している。
【０００３】
生涯に及ぶグルテンフリーの食生活は、セリアック病及び非セリアックグルテン過敏症患者に対する代表的な治療であるが、疾患の腸管外での症状をある程度制限し得る（Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２，Ｏｒａｌ  Ｓｕｒｇｅｒｙ，Ｏｒａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｏｒａｌ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ，Ｏｒａｌ  Ｒａｄｉｏｌｏｇｙ，ａｎｄ  Ｅｎｄｏｄｏｎｔｏｌｏｇｙ，９４（４），４７４−４７８）。低レベルでの二次汚染を回避することは困難であり、穀物の生育から製造加工までの食品生産チェーンの全体で発生する可能性があるため、厳密なグルテンフリーの食生活に従うことは非常に難しいことが示されている（Ｍｉｔｃｈｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９１，Ｇｕｔ，３２（３），２６０−２６５）。更に、厳密なグルテンフリーダイエット下で、考慮外のグルテンを毎日最大３ｇ消費している可能性があることが報告されている（Ａｚｉｚ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０９（９），１４９８）。
【０００４】
セリアック病は、特に米国及び欧州で頻繁であり、対象の約１％が抗体検査で陽性であった（Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１２８（４），Ｓ５７−Ｓ６７）。セリアック病は、さまざまな免疫学的要因、遺伝的要因、及び環境的要因の間での複雑な相互作用から生じる複雑な疾患である（Ａｌａｅｄｉｎｉ  ＆  Ｇｒｅｅｎ，２００５）。この疾患は、小麦グルテン、並びにライ麦及び大麦タンパク質などの他の関連する穀類タンパク質の消化によって誘導される。セリアック病に関連する症状は、子供の発育遅延、易怒性、及び思春期遅延、並びに不快感、下痢、潜伏便（ｏｃｃｕｌｔ  ｓｔｏｏｌ）、脂肪便及び鼓腸などの多くの胃腸の症状である（Ｄｕｂｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００５；Ｓｅｄｇｈｉｚａｄｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，２００２）。
【０００５】
非セリアックグルテン過敏症（非セリアック小麦過敏症とも呼ばれる）は、新興の状態である。これは、グルテンの摂取によって誘発される腸及び／又は腸外症状を引き起こす臨床単位として定義され、食事からグルテン含有食品を除去することで改善される可能性がある（Ｌｕｎｄｉｎ  ＆  Ａｌａｅｄｉｎｉ，２０１２）。グリアジン（グルテンの主要細胞毒性抗原）に加えて、グルテン及びグルテン含有穀物（小麦、ライ麦、大麦、及びそれらの誘導体）中に存在する他のタンパク質／ペプチドが症状の出現に関与し得る。非セリアックグルテン過敏症は、一般集団において０．５〜１３％（平均５％）の有病率を示す、グルテン関連障害のなかでも最も一般的な症候群である（Ｃａｔａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，５（１０），３８３９−３８５３）。
【０００６】
セリンプロテアーゼ阻害剤（セルピン）は、真核生物（Ｇｅｔｔｉｎｓ，２００２  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｒｅｖｉｅｗｓ，１０２（１２），４７５１−４８０４）及び原核生物（Ｋａｎｔｙｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍｉｅ，９２（１１），１６４４−１６５６）に見られるタンパク質のスーパーファミリーである。
【０００７】
近年では、ヒトセリンプロテアーゼ阻害剤が、グルテン関連障害において強く関与していることが示されている。エラフィンは、さまざまな形態のエラスターゼ及びプロテイナーゼに対し強力な阻害能を示すヒトセリンプロテアーゼ阻害剤である（Ｙｉｎｇ  ＆  Ｓｉｍｏｎ，１９９３，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３２（７），１８６６−１８７４）。エラフィンは胃腸管の上皮全体で発現し、炎症性腸疾患及びセリアック病を有する患者ではその発現及び誘導は低下している（Ｂａｒａｎｇｅｒ，Ｚａｎｉ，Ｌａｂａｓ，Ｄａｌｌｅｔ−Ｃｈｏｉｓｙ，  ＆  Ｍｏｒｅａｕ，２０１１；Ｍｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。近年では、エラフィンはトランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）の架橋活性の基質として同定されている（Ｂａｒａｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２０１１，ＰｌｏＳ  ｏｎｅ，６（６），ｅ２０９７６；Ｍｏｔｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，４（１５８），１５８ｒａ１４４−１５８ｒａ１４４）。インビトロデータでは、エラフィンの添加によりトランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）が適度に阻害され、したがって、セリアック病における適応免疫反応の誘因である可能性のある、消化抵抗性３３−ｍｅｒグリアジンペプチドの脱アミド化が阻害されることを示す（ＭｃＣａｒｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２０１５，Ｃｕｒｒｅｎｔ  ｏｐｉｎｉｏｎ  ｉｎ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ，２５，７−１２）。
【０００８】
組換えラクトコッカスラクティスによって産生されたエラフィンの送達により、グルテン誘発性の病状は軽減し、グルテン過敏症のマウスモデルにおいては腸の炎症が正常化されることが示されている（Ｇａｌｉｐｅａｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１４，Ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ，１０９（５），７４８−７５６）。しかしながら、この提案された療法は、遺伝子組み換え微生物（ＧＭＯ）に基づくものであり、消費者によるＧＭＯの受容は非常に低いことから、食品用途に適さない。
【０００９】
より最近では、原核生物のセルピンが報告されている。コンピュータによる解析では、異なるビフィドバクテリウム種にセルピン様タンパク質をコードする遺伝子が存在していることが明らかになった。ビフィドバクテリウムロンガム亜種ロンガム（ビフィドバクテリウムロンガム（Bifidobacterium longum）と命名）ＮＣＣ  ２７０５によりコードされたタンパク質は、ヒトセルピンの抗プロテアーゼ活性と類似する抗プロテアーゼ活性を示した（Ｉｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ  ２００６，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２８１（２５），１７２４６−１７２５２）。
【００１０】
ビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ  ２７０５は、２００１年１月２９日にブダペスト条約によりパスツール研究所、ＣＮＣＭ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  ｎａｔｉｏｎａｌｅ  ｄｅ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｄｅ  ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ，２５，ｒｕｅ  ｄｕ  Ｄｒ  Ｒｏｕｘ，７５７２４  Ｐａｒｉｓ  Ｃｅｄｅｘ  １５，Ｆｒａｎｃｅに寄託され、寄託番号ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を付されている。
【００１１】
最近では、ビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ  ２７０５（ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８）が、グルテン過敏症のマウスモデルにおいてグルテンにより誘発された病態生理をセルピン産生を通して改善することができ、グルテン関連障害の解決策としての可能性を示すことが示されている（ＭｃＣａｒｖｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｏｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｖｏｌ．８３，ｎｏ．１９，ｅ０１３２３−１７）。
【００１２】
［発明の概要］
本発明者らは、驚くべきことに、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８（ビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ  ２７０５）の増殖培地に特定の糖を添加すると、セルピンの発現を増加させることができることを見出した。
【００１３】
したがって、本発明の第１の態様では、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８におけるセルピンの発現を増加させるための、ラクトース、フルクトース、及びラフィノース、又はこれらの組み合わせから選択される糖の使用が提供される。
【００１４】
本発明の別の態様では、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８におけるセルピン発現を増加させる方法であって、培養培地でビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を増殖させることを含み、当該培養培地がラクトース、フルクトース、及びラフィノースから選択される糖を含むことを特徴とする、方法が提供される。
【００１５】
本発明の別の態様によると、培養培地でビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を増殖させる方法によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８において、当該培養培地がラクトース、フルクトース、及びラフィノース、又はこれらの組み合わせから選択される糖を含むことを特徴とする、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８が提供される。
【００１６】
本発明によるビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８は、ラクトース、フルクトース若しくはラフィノース、又はこれらの組み合わせの非存在下で増殖させたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８と比較して、セルピン産生がより大きい。
【００１７】
一実施形態において、糖はラクトースである。
【００１８】
本発明によると、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を、ラクトース、フルクトース若しくはラフィノース、又はこれらの組み合わせから選択される糖を、例えば、０．０２〜０．５０重量％の濃度で含む培地で培養してもよい。
【００１９】
例えば、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を、ラクトース、フルクトース若しくはラフィノース、又はこれらの組み合わせから選択される糖を、０．０５〜０．１５重量％、０．０８〜０．１２重量％、又は約０．１０％の濃度で含む培地で培養してもよい。
【００２０】
本発明の別の態様によれば、本明細書に記載の方法によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を含む組成物が提供される。
【００２１】
一実施形態では、組成物は、食品、医療食品、経管栄養、又は栄養補給剤である。
【００２２】
一実施形態では、食品は、乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、米ベースの製品、乳ベースの粉末、乳児用フォーミュラ、及びペットフードから選択される。
【００２３】
一実施形態では、組成物は、医薬組成物であり、この医薬組成物は、１つ以上の医薬的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含む。
【００２４】
本発明の別の態様によると、グルテン過敏症に関連する又はセリンプロテアーゼ阻害剤の活性の低下を伴う状態の治療又は予防に使用するための、本明細書に記載される方法によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８、又は当該ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を含む組成物が提供される。
【００２５】
本発明の別の態様によると、グルテン関連障害の治療又は予防に使用するための、本明細書に記載の方法によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８、又は当該ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を含む組成物が提供される。
【００２６】
本発明の一態様によると、セリアック病、非セリアックグルテン過敏症、グルテン失調症、疱疹状皮膚炎、又は小麦アレルギーの治療又は予防に使用するための、本明細書に記載される方法によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８、又は当該ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を含む組成物が提供される。
【００２７】
本発明の別の態様によると、炎症性腸疾患の治療又は予防に使用するための、本明細書に記載の方法によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８、又は当該ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を含む組成物が提供される。
【００２８】
糖がビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８と組み合わせて投与されるとき、糖が、インビボでのビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８におけるセルピン産生も増加させ得ることも理解されよう。
【００２９】
したがって、本発明の別の態様によると、（ｉ）ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８と（ｉｉ）ラクトース、フルクトース、及びラフィノース、又はこれらの組み合わせから選択される糖との組み合わせも提供される。
【００３０】
また本発明の別の態様によると、グルテン過敏症に関連する状態又はセリンプロテアーゼ阻害剤のレベルの低下に関連する状態の治療又は予防に使用するための、（ｉ）ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８と（ｉｉ）ラクトース、フルクトース、及びラフィノース、又はこれらの組み合わせから選択される糖との組み合わせも提供される。
【００３１】
一実施形態では、この組み合わせは、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８とラクトースとの組み合わせである。
【００３２】
本発明の別の態様によると、グルテン過敏症に関連する状態又はセリンプロテアーゼ阻害剤のレベルの低下に関連する状態の治療又は予防に使用するための、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８も提供され、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８は、ラクトース、フルクトース、及びラフィノース、又はこれらの組み合わせから選択される糖と組み合わせて投与される。
【００３３】
本発明の別の態様によると、グルテン過敏症に関連する状態又はセリンプロテアーゼ阻害剤のレベルの低下に関連する状態の治療又は予防に使用するための、ラクトース、フルクトース及びラフィノース、又はこれらの組み合わせから選択される糖が提供され、糖は、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８と組み合わせて投与される。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
【図１】濃度０．１％の糖による誘導から１８０分後のビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ  ２７０５における、セルピン遺伝子の相対的な転写レベルである。この棒グラフは、ＭＲＳｃのみでの増殖のものと比較した特定のサンプルのセルピンｍＲＮＡの相対量を示す。黒色のバーは、有意な誘導を表す。標準偏差は、少なくとも２つの異なる実験から得た（９５％信頼区間）。
【図２】異なる増殖培地で、８時間、１２時間及び１６時間発酵させた後のビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ  ２７０５のセルピンｍＲＮＡレベルである。さまざまなグルコースの割合を、ｙ軸に示すようにラクトース及びフルクトースと置き換え、糖の総量のパーセンテージを５．５％のまま安定させて維持した。値は、５．５％グルコースで８時間後のビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ  ２７０５の増殖に基づいて計算した。黒色のバーは、有意な誘導を表す。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
組成物
本発明の組成物は、食品、医療食品、経管栄養、栄養組成物、又は栄養補給剤の形態であってもよい。用語「栄養補給剤」とは、対象の普段の食生活を補助することを意図する製品を指す。
【００３６】
一実施形態では、食品は、乳、ヨーグルト、カード、チーズ、発酵乳、乳ベースの発酵製品、米ベースの製品、乳ベースの粉末、乳児用フォーミュラ、及びペットフードから選択される。
【００３７】
組成物は、医療食品の形態であってもよい。本明細書で使用するとき、用語「医療食品」は、医学的疾患又は状態の食事管理のために特別に配合された食料製品を指す。医療食品は、医学的管理下で投与される場合がある。医療食品は、経口摂取又は経管栄養のためのものであってもよい。
【００３８】
組成物は、経管栄養の形態であってもよい。用語「経管栄養」とは、栄養を供給管によって対象の胃腸管（ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ）に直接導入することが意図された、製品を指す。経管栄養は、例えば、対象の鼻を通して配置された供給管（経鼻胃管、経鼻十二指腸管、及び経鼻空腸管など）、又は対象の腹部に直接配置された供給管（胃瘻供給管（ｇａｓｔｒｏｓｔｏｍｙ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｔｕｂｅ）、胃空腸瘻供給管（ｇａｓｔｒｏｊｅｊｕｎｏｓｔｏｍｙ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｔｕｂｅ）、又は空腸供給管（ｊｅｊｕｎｏｓｔｏｍｙ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｔｕｂｅ）など）によって投与される場合がある。
【００３９】
組成物は、医薬組成物の形態であってもよく、１つ以上の好適な医薬的に許容される担体、希釈剤、及び／又は賦形剤を含んでもよい。
【００４０】
本明細書に記載される組成物に好適な、このような賦形剤の例は、“Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｅｘｃｉｐｉｅｎｔｓ”，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，（１９９４），（Ａ  Ｗａｄｅ  ａｎｄ  ＰＪ  Ｗｅｌｌｅｒ編）に見出すことができる。
【００４１】
治療用途に許容される担体又は希釈剤は、医薬分野において既知であり、例えば、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”，Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ  ｅｄｉｔ．１９８５）に記載されている。
【００４２】
好適な担体の例としては、ラクトース、デンプン、グルコース、メチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、マンニトール、ソルビトールなどが挙げられる。好適な希釈剤の例としては、エタノール、グリセロール、及び水が挙げられる。
【００４３】
医薬担体、賦形剤又は希釈剤の選定にあたっては、意図した投与経路及び標準的な薬局業務に関連して選択することができる。医薬組成物は、担体、賦形剤、若しくは希釈剤として、又はそれに加え、任意の好適な結合剤（複数可）、潤滑剤（複数可）、懸濁化剤（複数可）、コーティング剤（複数可）、及び／若しくは可溶化剤（複数可）を含んでもよい。
【００４４】
好適な結合剤の例としては、デンプン、ゼラチン、グルコース、無水ラクトース、流動性ラクトース、β−ラクトースなどの天然糖類、コーン甘味料類、アカシア、トラガカントなどの天然及び合成ガム類、又はアルギン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロース、及びポリエチレングリコールが挙げられる。好適な潤滑剤の例としては、オレイン酸ナトリウム、ステアリン酸ナトリウム、ステアリン酸マグネシウム、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウムなどが挙げられる。
【００４５】
複数の防腐剤、複数の安定剤、複数の染料、及び更には複数の香味剤を、組成物に提供してもよい。複数の防腐剤の例としては、安息香酸ナトリウム、ソルビン酸、及びｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルが挙げられる。複数の酸化防止剤及び複数の懸濁剤もまた、使用されてもよい。
【００４６】
栄養学的に許容される担体、希釈剤、及び賦形剤としては、食品業界で規格として使用されるヒト又は動物の摂取に好適なものが挙げられる。典型的な栄養学的に許容される担体、希釈剤、及び賦形剤は、当業者によく知られている。
【００４７】
組成物は、錠剤、糖衣錠、薬用キャンディ、カプセル、ゲルキャップ、粉末、顆粒、溶液、エマルジョン、懸濁液、被覆粒子、噴霧乾燥粒子、又はピルの形態とすることができる。
【００４８】
代替の実施形態では、組成物は、局所投与用のゲル、クリーム、軟膏、エマルジョン、懸濁液、又は溶液などの局所投与用組成物の形態であってもよい。
【００４９】
理想的な用量は、例えば、治療する対象、その健康状態、性別、年齢、又は体重、及び投与経路によって異なることは、当業者には明らかである。その結果、理想的に使用される用量は、さまざまであり得るが、当業者によって容易に決定することができる。
【００５０】
しかしながら、一般に、本発明の組成物が、１日用量当たり１０６〜１０１０ｃｆｕ、及び／又は細胞１０６〜１０１０個のビフィドバクテリウムロンガム株ＣＭ  Ｉ−２６１８を含む場合が好ましい。また、本発明の組成物は、組成物の乾燥重量１ｇ当たり１０６〜１０１１ｃｆｕ、及び／又は細胞１０６〜１０１１個のビフィドバクテリウムロンガム株ＣＭ  Ｉ−２６１８を含んでもよい。
【００５１】
糖
本発明で使用される糖は、ラクトース、フルクトース、及びラフィノース、又はこれらの組み合わせから選択される。ラクトースは、乳中に見られ、グルコース及びガラクトースからなる二糖類である。フルクトースは、多くの植物において見られる単糖類である。ラフィノースは、植物にも見出され、ガラクトース、グルコース、及びフルクトースからなる三糖類である。
【００５２】
ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を、ラクトース、フルクトース若しくはラフィノース、又はこれらの混合物を、例えば、０．０２〜０．５０重量％の濃度で含む培地で培養してもよい。例えば、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を、ラクトース、フルクトース若しくはラフィノース、又はこれらの混合物を、０．０５〜０．１５重量％、０．０８〜０．１２重量％、又は約０．１０％の濃度で含む培地で培養してもよい。
【００５３】
ラクトース、フルクトース、ラフィノース、又はこれらの混合物を、最大８重量％、好ましくは最大６重量％、例えば４〜６重量％の、グルコース又はスクロースなどであるがこれらに限定されないビフィドバクテリウムロンガムの増殖を維持するのに好適な別の糖を含む従来の培養培地に添加してもよい。ビフィドバクテリウムロンガムの増殖に好適な従来の培養培地は、当業者に周知である。
【００５４】
一実施形態では、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８を、０．０３〜０．４０、０．０４〜０．３０又は０．０５〜０．２０重量％の濃度で糖を含む培地で培養してもよい。
【００５５】
一実施形態では、培養培地は、ラクトース、フルクトース若しくはラフィノース、又はこれらの組み合わせを、０．０３〜０．１５、０．０４〜０．１５、０．０５〜０．１５、０．０６〜０．１５、０．０７〜０．１５、０．０８〜０．１５、０．０９〜０．１５又は０．１０〜０．１５重量％の濃度で含んでもよい。
【００５６】
一実施形態では、培養培地は、ラクトース、フルクトース若しくはラフィノース、又はこれらの組み合わせを、０．０５〜０．１４、０．０５〜０．１３、０．０５〜０．１２又は０．０５〜０．１１重量％の濃度で含んでもよい。
【００５７】
一実施形態では、培養培地は、ラクトース、フルクトース若しくはラフィノース、又はこれらの組み合わせを、０．０６〜０．１４、０．０７〜０．１３、０．０８〜０．１２、０．０９〜０．１１又は約０．１０重量％の濃度で含んでもよい。
【００５８】
一実施形態では、ラクトースは、上記の濃度で使用される。
一実施形態では、フルクトースは、上記の濃度で使用される。
一実施形態では、ラフィノースは、上記の濃度で使用される。
【００５９】
培養粉末の製造方法
ビフィドバクテリウムロンガム種に属する株を嫌気性条件下で増殖させる。嫌気性条件下での発酵方法は周知である。当業者は、増殖させる微生物に応じて、その一般知識に基づき、発酵培地の好適な成分を特定し、発酵条件を調節することができる。発酵培地は典型的には、
−酵母抽出物などの窒素源と、
−糖などの炭素源と、
−微生物に必要なさまざまな増殖因子（例えば、ミネラル、ビタミンなど）と、
−水と、を含む。
【００６０】
ビフィドバクテリウムロンガムの典型的な増殖培地の非限定例は、０．０５％のシステインを補充したＭＲＳ（Ｄｅ  Ｍａｎ，Ｒｏｇｏｓａ  ａｎｄ  Ｓｈａｒｐｅ）培地（ＭＲＳｃ）である。
【００６１】
発酵は、好ましくは２工程で実施され、主発酵工程の前にスターター発酵が実施される。発酵培地は、スターター発酵及び主発酵で異なっても、同一であってもよい。
【００６２】
この方法の第２の工程は、バイオマスの濃縮である。これはまた、例えば遠心分離又は濾過などの、当業者に既知の方法を使用して実施することもできる。濃縮後のバイオマスの総固形分は、バイオマスの総乾燥重量（すなわち、発酵培地及び産生された微生物の総量）に基づいて、好ましくは１０〜３５重量％、好ましくは１４〜３５重量％を構成する。
【００６３】
任意選択的に、濃縮は、発酵培地の残留物及び／又は発酵中に生成された化合物を除去するために、洗浄工程に先行しても又は組み合わせてもよい。例えば、洗浄は、バイオマスを濃縮し、濃縮したバイオマスをリン酸緩衝液又は同様の組成物などの緩衝液に再懸濁させ、バイオマスを再濃縮することによって行うことができる。
【００６４】
例えば、国際公開第２０１７／００１５９０号に記載されている方法を適用することができ、これは、参照により全体が組み込まれる。
【００６５】
組み合わせ
本発明の一態様では、（ｉ）ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８と（ｉｉ）ラクトース、フルクトース、及びラフィノースから選択される糖との組み合わせが提供される。
【００６６】
本明細書で使用するとき、用語「組み合わせ」は、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８とラクトース、フルクトース又はラフィノースとの組み合わせ投与を指し、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８及び糖は、同時に又は連続的に投与され得る。
【００６７】
本明細書で使用するとき、用語「同時の」又は「同時に」は、２つの剤（ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８及び糖）が同時に、すなわち同じ時に投与されることを意味するために使用される。
【００６８】
用語「連続的な」又は「連続的に」は、２つの剤が、１つずつ順に投与されることを意味するために使用され、ここで、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８と糖のどちらを最初に投与してもよい。
【００６９】
剤は、別個の製剤として、又は単一の組み合わせ製剤としての、いずれで投与されてもよい。
【００７０】
化合物が共配合される場合、すなわち同じ組成物又は製剤に配合される場合、それらは同時にのみ投与することができる。化合物が別個の組成物又は製剤に配合される場合、それらは、同時に又は連続して投与することができる。同じ製剤又は別個の製剤における剤の同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）投与はまた、２つの化合物の同時（ｃｏ−）投与又は組み合わせ（ｊｏｉｎｔ−）投与として記載することもできる。
【００７１】
一実施形態では、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８及び糖は混合物である。別の実施形態では、ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８及び糖は、２つの剤の調製を含み、任意選択的に、調製物を必要とする対象への同時投与又は連続投与についての指示書を含むキットの形態で存在する。
【００７２】
治療
本発明によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８、又はそれを含む組成物は、セリンプロテアーゼ阻害剤の活性の低下を伴うグルテン関連障害又は状態の治療又は予防に使用することができる。
【００７３】
例えば、本発明によって産生されたビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８、又はそれを含む組成物は、炎症性腸疾患、セリアック病、非セリアックグルテン過敏症、グルテン失調症、疱疹状皮膚炎、及び小麦アレルギーの治療又は予防に使用することができる。
【００７４】
好ましくは、疾患は、グルテン関連障害である。グルテン関連障害は、グルテンによって誘導された疾患を包含する。用語「グルテン過敏症に関する状態」及び「グルテン関連障害」は、本明細書において互換的に使用される。グルテン関連障害としては、セリアック病、非セリアックグルテン過敏症、グルテン失調症、疱疹状皮膚炎、及び小麦アレルギーが挙げられる。
【００７５】
セリアック病
セリアック病は、最も一般的な免疫介在性障害のうちの１つである。これは世界的な状態であり、特に米国及び欧州で頻繁であり、対象の約１％が抗体検査で陽性であった。セリアック病は、さまざまな免疫学的要因、遺伝的要因、及び環境的要因の間での複雑な相互作用から生じる複雑な疾患である。これは、小麦グルテン並びにライ麦及び大麦タンパク質などの他の関連する穀類タンパク質の消化によって誘導される。セリアック病に関連する症状は、子供の発育遅延、易怒性、及び思春期遅延、並びに不快感、下痢、潜伏便、脂肪便、鼓腸などの多くの胃腸の症状である。
【００７６】
臨床的証拠では、セリアック病の病状に強く関連するクラスＩＩのヒト白血球型抗原（ＨＬＡ−ＤＱＩＩ）が、セリアック病患者の約９５％で発現していることが示されている。腸内腔において、グルテンタンパク質は部分的に消化され、タンパク質分解耐性の３３−ｍｅｒグルテンペプチドを形成する。小腸バリアを通過した後、それらは、負電荷を有するトランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）によって脱アミド化され（Ｓｏｌｌｉｄ，２０００，Ａｎｎｕａｌ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，１８（１），５３−８１）、次いでＨＬＡ−ＤＱ２．５／８の正に帯電する結合部位に結合する（Ｄｉｅｔｅｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，３（７），７９７−８０１）。ＨＬＡ−ＤＱ２．５／  ８は、これらの特異的グルテンペプチドシグナルをヘルパーＴ細胞に示し、他の免疫細胞が、小腸における更なる損傷を引き起こす。グルテンタンパク質に対する抗体及び結合組織成分（ＴＧ２）に対する自己抗体もまた、セリアック病の進行に関連している（Ａｌａｅｄｉｎｉ  ＆  Ｇｒｅｅｎ，２００５，Ａｎｎａｌｓ  ｏｆ  ｉｎｔｅｒｎａｌ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１４２（４），２８９−２９８）。
【００７７】
非セリアックグルテン過敏症
非セリアックグルテン過敏症（非セリアック小麦過敏症とも呼ばれる）は、新興の状態である。これは、グルテンの摂取によって誘導される腸及び／又は腸外症状を引き起こす臨床単位として定義され、食事からグルテン含有食品を除去することで改善される可能性がある（Ｌｕｎｄｉｎ  ＆  Ａｌａｅｄｉｎｉ，２０１２）。非セリアックグルテン過敏症の病因は、未だ解明されていない。グルテン及びグルテン含有穀物（小麦、ライ麦、大麦、及びそれらの誘導体）中に存在する、グリアジン（グルテンの主要な細胞毒性抗原）以外の他のタンパク質／ペプチドが、症状の出現に関与し得ることが示されている。非セリアックグルテン過敏症は、一般集団において０．５〜１３％の有病率を示す、グルテン関連障害のなかでも最も一般的な症候群である（Ｃａｔａｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．，２０１３，Ｎｕｔｒｉｅｎｔｓ，５（１０），３８３９−３８５）。非セリアックグルテン過敏症の診断は、他のグルテン関連障害を除外することによって行われる。
【００７８】
疱疹状皮膚炎
疱疹状皮膚炎は、広範囲で対称的な分布を有し、摩擦の大きい領域で優勢であり、主に両方の肘、膝、臀部、足首に影響を及ぼし、また頭皮及び身体の他の部分にも影響を与え得る皮膚損傷が存在することを特徴とする、慢性的な水疱形成性皮膚自己免疫疾患である。病変部は小胞性の痂皮に覆われ、それらが剥がれると、その領域の色素沈着、又は慢性的な激しい灼熱感、かゆみ及び水疱性発疹に発展する。
【００７９】
発症年齢はさまざまである。小児及び青年期で開始し得るが、彼らの人生のあらゆる年齢で、いずれの性別でも個人に影響を及ぼし得る。
疱疹状皮膚炎を有する人では、腸管は中程度の粘膜病変から絨毛萎縮の存在までの範囲にわたり、さまざまに関係する。
【００８０】
小麦アレルギー
小麦アレルギーの胃腸症状は、セリアック病及び非セリアックグルテン過敏症のものと類似しているが、小麦への曝露から症状の発症までの間隔が異なる。小麦アレルギーは、小麦を含有する食品の摂取後の発症が早く（数分から数時間）、アナフィラキシーにつながり得る。
【００８１】
グルテン失調症
グルテン失調症は、グルテン関連性障害である。グルテン失調症では、小脳と、歩行、発語、及び嚥下のような協調運動及び複雑な動きを制御する脳の平衡中枢に損傷が生じる。グルテン失調症は、散発性特発性失調症のなかでも最も一般的な原因の１つである。これは、４０％の由来不明の失調症と、１５％の全ての失調症とからなる。
【００８２】
グルテン失調症は、遺伝的に過敏症である個人においてグルテンの摂取によって誘発される免疫介在性疾患である。特発性散発性失調症を有する全ての患者の鑑別診断において考慮されるべきである。治療の有効性は、失調症の発症から診断までの経過時間に依存する。対象のグルテンへの曝露の結果として生じる、小脳におけるニューロンの死は不可逆的なものである。
【００８３】
早期診断及びグルテンを含まない食生活による治療は、失調症を改善し、その進行を防止することができる。グルテン失調症を有する人の１０％未満がなんらかの胃腸症状を有しているが、約４０％は腸の損傷を有する。グルテン失調症の感受性マーカーとしては、抗グリアジン抗体が挙げられる。小腸及び腸外部位においてトランスグルタミナーゼ２（ＴＧ２）に対して沈着する免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）は、更に信頼性が高いことが証明されている。
【００８４】
投与
本明細書に記載されるビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８又は組成物は、経腸的に投与されることが好ましい。
【００８５】
経腸的投与は、経口、経胃、及び／又は経直腸投与であってよい。
【００８６】
一般論として、本明細書に記載される組み合わせ又は組成物の投与は、例えば、経口経路又は別の経路により胃腸管へと投与するというものであってよく、例えば、投与は経管栄養によるものであり得る。
【００８７】
代替的な実施形態では、本明細書に記載の組み合わせ又は組成物の投与は、局所投与であってもよい。
【００８８】
対象は、ヒト、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、ブタ、シカ、及び霊長類などの哺乳動物であってもよい。好ましくは、対象は、ヒトである。
【００８９】
本発明の好ましい特徴及び実施形態を、これより非限定的な例によって記述する。
【００９０】
本発明の実施は、特に指示がない限り、当業者の能力の範囲内である、化学、生化学、分子生物学、微生物学、及び免疫学の従来技術を使用する。かかる技術は文献で説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．ａｎｄ  Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ｅｔ  ａｌ．（１９９５  ａｎｄ  ｐｅｒｉｏｄｉｃ  ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔｓ）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｃｈ．９，１３  ａｎｄ  １６，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｒｏｅ，Ｂ．，Ｃｒａｂｔｒｅｅ，Ｊ．ａｎｄ  Ｋａｈｎ，Ａ．（１９９６）ＤＮＡ  Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ；Ｐｏｌａｋ，Ｊ．Ｍ．ａｎｄ  ＭｃＧｅｅ，Ｊ．Ｏ’Ｄ．（１９９０）Ｉｎ  Ｓｉｔｕ  Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ；Ｇａｉｔ，Ｍ．Ｊ．（１９８４）Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ、並びに、Ｌｉｌｌｅｙ，Ｄ．Ｍ．ａｎｄ  Ｄａｈｌｂｅｒｇ，Ｊ．Ｅ．（１９９２）Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ  Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ  Ｐａｒｔ  Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ａｎｄ  Ｐｈｙｓｉｃａｌ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  ＤＮＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓを参照されたい。これらの一般的なテキストの各々は、本明細書に参照により組み込まれる。
【実施例】
【００９１】
実施例１−方法
ＢＬ  ＮＣＣ  ２７０５（ビフィドバクテリウムロンガム株ＣＮＣＭ  Ｉ−２６１８）をＢｉｏｌｅｃｔｏｒ（増殖条件−嫌気性、３７℃、ＭＲＳ＋５ｍＭのＬ−システイン（ＭＲＳｃ）で増殖させた。
【００９２】
ｐＨセンサ及び溶存酸素（ＤＯ）センサと併せて４８ウェルマイクロタイタープレートを使用して、Ｂｉｏｌｅｃｔｏｒ（ｍ２ｐ−ｌａｂｓ  Ａａｃｈｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）において株を培養した。細菌の凝集を防止するために連続的に振盪し、１５分毎に測定を行った。プレートを気体透過性フィルムで密閉し、嫌気性チャンバにより、明確に定義された嫌気性気体発生条件がもたらされる。バイオマス、ｐＨ及び溶存酸素（ＤＯ）のような発酵パラメータを、ＢｉｏＬｅｃｔｉｏｎ  ＨＭＩソフトウェアを使用して、増殖全体にわたってオンラインでモニターした。増殖パラメータは、以下のとおりであった。
接種率（％）  ２
各ウェルの体積（ｍＬ）  １
発酵時間（ｈ）  １６
温度（℃）  ３７
供給される外部ガス  Ｎ２
外部ガス圧（バール）  ２
振盪速度（ｒｐｍ）  ４００
測定サイクル時間（分）  １５
【００９３】
以下の炭水化物を個々に培養物に添加した。
単糖類−グルコース、Ｎ−アセチル−グルコサミン、フルクトース、ガラクトース。
二糖類−ラクトース、メリビオース、スクロース
多糖類−ラフィノース、
全ての糖をＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから購入した。
【００９４】
次いで、ビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ  ２７０５を同じ条件で更に１８０分間培養した後、サンプル（５００μＬ）を回収し、セルピンｍＲＮＡレベルを測定した。全ての発酵は、少なくとも重複して実施された。
【００９５】
図１に示されるように、ラクトース、フルクトース、及びラフィノースは、ビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ  ２７０５のセルピンｍＲＮＡレベルを増加させることが示された。
【００９６】
セルピンｍＲＮＡの検出及び定量
トータルＲＮＡの単離−５００μＬの細菌培養物を１ｍＬのＲＮＡ  ｐｒｏｔｅｃｔ  ｂａｃｔｅｒｉａ  ｒｅａｇｅｎｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）に懸濁し、５０００ｇで１０分間短時間遠心分離して、トータルＲＮＡ抽出のために細胞を回収した。
【００９７】
プロテアーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａ．Ｎｏ．１９１３１）とＲＮｅａｓｙ  ｔｏｔａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａ．Ｎｏ．７４１０１）を使用してトータルＲＮＡを抽出し、ＲＮａｓｅ−ｆｒｅｅ  ＤＮａｓｅ  ｓｅｔ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ，Ｃａ．Ｎｏ．７９２５４）を使用して更に処理した。次いで、トータルＲＮＡを４０μＬの水に溶出させた。
【００９８】
ＲＮＡの品質管理及び定量−ＱＩＡｘｃｅｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、ＲＮＡサンプルの品質及び定量の制御を電気泳動により分析した。
【００９９】
１μＬのＲＮＡサンプル及びＲＮＡサイズマーカーを、同じ体積のＲＮＡ変性緩衝液と別々に混合し、７０℃で２分間インキュベートした後、氷上で１分間冷却した。次いで、分析及び測定のために、サンプルをＱＸ  ＲＮＡ希釈により１０μＬに希釈した。１６Ｓに対する２３Ｓの比を用いてＲＮＡの品質の評価を行った。１．６〜２．３の比の値を有するＲＮＡを、後のｑＲＴ−ＰＣＲ用に選択した。
【０１００】
ｃＤＮＡ合成及びＰＣＲの両方を、ＡＢＩ  Ｐｒｉｓｍ  ７９００ＨＴシステムを使用して、ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ  ＩＩＩ  Ｐｌａｔｉｎｕｍ  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ  ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｋｉｔ  ｗｉｔｈ  ＲＯＸ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，ｃａｔ．Ｎｏ．１１７４６−５００）により、１工程反応で実施した。
【０１０１】
ＰＣＲ産物をＳＹＢＲ緑色蛍光色素で検出し、ＲＯＸリファレンス色素で正規化した。
【０１０２】
ｃＤＮＡ合成のために以下のプライマーを使用した：セルピン遺伝子に関して：順方向５’−ＡＣＣＡＡＴＣＧＣＴＧＣＴＡＡＧＴＴＣＧ−３’、逆方向５’−ＴＣＧＣＴＧＧＣＡＡＧＡＧＡＧＴＡＧＴＣ−３’；ｌｄｈに関して：順方向、５’−ＣＧＡＡＣＧＣＣＡＴＣＴＡＣＡＴＧＣＴＣ−３’及び逆方向、５’−ＡＡＧＡＴＣＴＧＧＴＴＣＴＣＴＴＧＣＡＧ−３。ビフィドバクテリウムロンガムＮＣＣ  ２７０５に基づいて、セルピン用プライマーを作製し、ビフィドバクテリウムロンガムＡＴＣＣ１５７０７におけるＤＮＡ相同性を確認した。信頼性は、解離曲線分析によって確認した。
【０１０３】
ｍＲＮＡ発現倍率の解析法−Ｐｆａｆｆｌ法を使用して、式が式１に示される相対的な転写変化を計算した（Ｐｆａｆｆｌ，２０１２，Ｍａｒｔｉｎ  Ｆｉｌｉｏｎ，Ｈｇ．，Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ  ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ  ｉｎ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，５３−６２）。
【０１０４】
式１
【数１】
2021508462.tif 000002
【０１０５】
実施例２−結果
ＢＬ  ＮＣＣ  ２７０５セルピンの誘導におけるラクトースの効果を最適化するために、用量反応を行った。発酵は、０．０５％システインを塩基として補充したＭＲＳｃ培地を入れた１０ＬのＢｉｏｓｔａｒ  Ｂ  Ｐｌｕｓ発酵装置で実施し、異なる濃度のラクトース（０．０５％、０．１％、１％、２％及び２．７５％）を培地に添加した。全糖の最終合計量が５．５％に達するように、グルコースを異なる配合に補充した。セルピンｍＲＮＡの誘導倍率は、８時間ＭＲＳｃで増殖したＢＬ  ＮＣＣ  ２７０５培養物をベースとして使用して計算した（図２）。
【０１０６】
図２に示されるように、ラクトースを使用することにより、発酵終了時（１６時間）に最も高いセルピンｍＲＮＡレベルが得られることが、０．１％の添加で観察された。
【図１】
2021508462.tif 000003
【図２】
2021508462.tif 000004
【配列表】
2021508462000001.app
【国際調査報告】
2021508462.tif 000005
2021508462.tif 000006
2021508462.tif 000007
2021508462.tif 000008
2021508462.tif 000009