(57)【要約】  本開示は、全体として、非骨髄破壊的な化学療法剤および化学療法耐性の細胞を使用して骨髄移植を行うための方法および組成物に関する。本明細書において記載される方法および組成物を使用して、患者の骨髄を再構成することができ、患者は、骨髄破壊および／または免疫系の障害を含む有害な副作用を避ける。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
患者において骨髄移植を行うための方法であって、
シクロホスファミド耐性の修飾された細胞の集団および非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法薬を患者に投与すること
を含む前記方法。
【請求項２】
シクロホスファミド耐性の修飾された細胞の集団は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）をコードする異種遺伝子を含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
シクロホスファミド耐性の修飾された細胞の集団はＡＬＤＨ１を発現する、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
シクロホスファミド耐性の修飾された細胞のシクロホスファミド耐性は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）の発現によって付与される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
患者の骨髄の５０％超が、６カ月間以内に、シクロホスファミド耐性の修飾された細胞またはそれに由来する細胞で置き換えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
患者はＨＩＶを有する、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
修飾された細胞のシクロホスファミド耐性は一過性である、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
細胞は幹細胞または免疫細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
幹細胞は、胎性幹細胞、臍帯血由来の幹細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、または、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ１７＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ−細胞、ＣＤ３８−などの、これらに由来する細胞、またはこれらのあらゆる組み合わせである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
免疫細胞はＴ細胞である、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
修飾された細胞は、患者にとって自家である、患者にとって同種である、またはこれらの組み合わせである、請求項１に記載の方法。
【請求項１２】
未修飾の細胞を、ＡＬＤＨ１の発現をコードする発現ベクターと接触させて、シクロホスファミド耐性の修飾された細胞を生産することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１３】
発現ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
ウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
発現ベクターは、レトロウイルス、トランスポゾン、エピソーム性の発現ベクター、修飾されたＲＮＡ、プラスミド、またはこれらのあらゆる組み合わせである、請求項１２に記載の方法。
【請求項１６】
非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤は、修飾された細胞を投与した後に投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
化学療法剤の非骨髄破壊的な少なくとも１用量は、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量である、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．１６ｍｇ／ｋｇ／日から２．５ｍｇ／ｋｇ／日未満である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．４１ｍｇ／ｋｇ／日から約１．６３ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．８１ｍｇ／ｋｇ／日から約１．４６ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２１】
シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約１．３ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２２】
患者は、１００ｍｇ／ｍ２／日の用量のシクロホスファミドを１〜１４日間の連続する日数にわたって投与されない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２３】
患者は、５〜７ｇ／ｍ２の用量のシクロホスファミドを１２〜２４時間にわたって投与されない、請求項１７に記載の方法。
【請求項２４】
非骨髄破壊的な化学療法剤は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも５カ月間、または少なくとも６カ月間にわたり毎日投与される、請求項１に記載の方法。
【請求項２５】
シクロホスファミド耐性の修飾された細胞の投与と非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤の投与との間のある期間にわたり、非骨髄破壊的な用量の化学療法剤を投与しないことをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項２６】
期間は、約３日間、約７日、約１０日間、および約１４日間からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または１００％が、修飾された細胞で置き換えられる、請求項１に記載の方法。
【請求項２８】
患者は、非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤を投与した結果、骨髄破壊される、および／または免疫不全となることはない、請求項１に記載の方法。
【請求項２９】
患者は、臨床的に関連する貧血、好中球減少、血小板減少、汎血球減少、低血小板、低白血球、またはこれらのあらゆる組み合わせもしくは関連する症状を経験しない、請求項１に記載の方法。
【請求項３０】
事前調整工程は細胞を投与する前に行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項３１】
事前調整工程は、非骨髄破壊的な化学療法事前調整工程である、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
修飾された細胞はＨＩＶ感染に対して耐性である、請求項１に記載の方法。
【請求項３３】
修飾された細胞は、ＨＩＶ感染に対して耐性の少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の１つの突然変異もしくは複数の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ共受容体の発現を低減させる分子、またはこれらのあらゆる組み合わせを異種発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３４】
修飾された細胞は、ｓｈＣＣＲ５、ｓｈＣＸＣＲ４、Ｃ−ペプチド融合阻害剤、またはこれらのあらゆる組み合わせを異種発現する、請求項３２に記載の方法。
【請求項３５】
修飾された細胞はＨＩＶ共受容体を発現しない、請求項３２に記載の方法。
【請求項３６】
修飾された細胞は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４を発現しないか、またはＣＣＲ５−Δ３２を発現するか、またはこれらの組み合わせである、請求項３２に記載の方法。
【請求項３７】
ＡＬＤＨ１、ならびに
ｉ）少なくとも１つのＨＩＶ共受容体突然変異体、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の１つの突然変異もしくは複数の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ共受容体の発現を低減させる分子、もしくはこれらのあらゆる組み合わせをコードする異種ヌクレオチド分子；および／またはｉｉ）内因性のＨＩＶ共受容体の突然変異もしくは欠失の１つ
の発現をコードする異種ヌクレオチド分子を含む細胞。
【請求項３８】
細胞は、
ｉ．ＣＣＲ５の発現を低減させる分子をコードする；
ｉｉ．ＣＸＣＲ４の発現を低減させる分子をコードする；
ｉｉｉ．Ｃ−ペプチド融合阻害剤の発現をコードする；
ｉｖ．１、３、６、７、８、９、１２、１３、１４、１６、１８、もしくはこれらのあらゆる組み合わせの配列を含む；
ｖ．配列番号１０、１１、６、７、１３、１５、１７、１９、もしくはこれらのあらゆる組み合わせの配列をコードする；
またはこれらのあらゆる組み合わせである
異種ヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の細胞。
【請求項３９】
ｓｈＣＣＲ５、ｓｈＣＸＣＲ４、および／またはＣ４４などのＣ−ペプチド融合阻害剤を発現する、請求項３７に記載の細胞。
【請求項４０】
非ウイルス遺伝子移入系を用いて、異種ヌクレオチド配列を発現するように修飾されている、請求項３７に記載の細胞。
【請求項４１】
非ウイルス遺伝子移入系はトランスポゾン遺伝子移入系である、請求項４０に記載の細胞。
【請求項４２】
トランスポゾン遺伝子移入系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ遺伝子移入系またはＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン遺伝子移入系である、請求項３７に記載の細胞。
【請求項４３】
配列番号４の異種核酸配列を含む、請求項３７に記載の細胞。
【請求項４４】
請求項３７に記載の１つまたはそれ以上の細胞を含む組成物。
【請求項４５】
ＡＬＤＨ１、および
ｉ）少なくとも１つのＨＩＶ共受容体突然変異体、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の１つの突然変異もしくは複数の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ共受容体の発現を低減させる分子、またはこれらのあらゆる組み合わせをコードする異種ヌクレオチド分子の１つ
をコードする核酸分子。
【請求項４６】
異種ヌクレオチド配列は、
ｉ．ＣＣＲ５の発現を低減させる；
ｉｉ．ＣＸＣＲ４の発現を低減させる；
ｉｉｉ．Ｃ−ペプチド融合阻害剤の発現をコードする；
またはこれらのあらゆる組み合わせである
分子をコードする、請求項４５に記載の核酸分子。
【請求項４７】
核酸分子は、ｓｈＣＣＲ５、ｓｈＣＸＣＲ４、および／またはＣ−ペプチド融合阻害剤の発現をコードする、請求項４５に記載の核酸分子。
【請求項４８】
分子は、１、３、６、７、８、９、１２、１３、１４、１６、１８、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列を含む、請求項４５に記載の核酸分子。
【請求項４９】
分子は、配列番号１０、１１、６、７、１３、１５、１７、１９、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列をコードする核酸分子を含む、請求項４５に記載の核酸分子。
【請求項５０】
請求項４５に記載の核酸分子を含むベクター。
【請求項５１】
レンチウイルスを生産するために使用することができるベクターである、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５２】
レンチウイルスベクターである、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５３】
配列番号１、３、６、７、８、９、１２、１３、１４、１６、１８、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列を含む、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５４】
配列番号１０、１１、６、７、１３、１５、１７、１９、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列をコードする核酸分子を含む、請求項５０に記載のベクター。
【請求項５５】
ＡＬＤＨ１、および
ｉ）少なくとも１つのＨＩＶ共受容体突然変異体、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の１つの突然変異もしくは複数の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ共受容体の発現を低減させる分子、またはこれらのあらゆる組み合わせをコードする異種ヌクレオチド分子の１つ
を異種発現する細胞の集団；ならびに
非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤
を対象に投与することを含む、対象においてＨＩＶを処置する方法。
【請求項５６】
細胞は、ｓｈＣＣＲ５、ｓｈＣＸＣＲ４、および／またはＣ−ペプチド融合阻害剤を発現する、請求項５５に記載の方法。
【請求項５７】
細胞は、１、３、６、７、８、９、１２、１３、１４、１６、１８、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列を含む核酸分子を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５８】
細胞は、配列番号１０、１１、６、７、１３、１５、１７、１９、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列をコードする核酸分子を含む、請求項５５に記載の方法。
【請求項５９】
ＡＬＤＨ１および目的の分子を異種発現する細胞を対象に投与すること；ならびに非骨髄破壊的な用量のシクロホスファミドを投与することを含む、対象において目的の分子を発現させる方法。
【請求項６０】
細胞は、ＣＤ３４＋および／もしくはＣＤ４＋、または本明細書において提供される他のものである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６１】
目的の分子は、ＣＣＲ５の発現を低減させる；ＣＸＣＲ４の発現を低減させる；Ｃ−ペプチド融合阻害剤の発現をコードする；またはこれらのあらゆる組み合わせであるものである、請求項５９に記載の方法。
【請求項６２】
ＣＣＲ５の発現を低減させる目的の分子は、ｓｈＣＣＲ５である、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
分子は、配列番号６および／または配列番号７を含むまたはコードする核酸分子を含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
Ｃ−ペプチド融合阻害剤は、配列番号１１、１５、１９、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列を含む、請求項６１に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本願は、参照によってその全体を本明細書に組み入れる、２０１７年１１月１５日に出願された米国仮特許出願第６２／５８６，８１３号に対する優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本開示は、ＨＩＶ、がん（例えば血液がん）、およびそれに類するものなどの様々な疾患の処置の際を含む非骨髄破壊的な骨髄移植のための方法および組成物を提供する。一部の実施形態では、本明細書において、患者の骨髄にグラフトされ、従来の骨髄移植の際に経験される負の副作用を伴うことなく骨髄の再構成を可能にする、修飾された幹細胞が提供される。この細胞はまた、本質的に治療的であり得る目的のタンパク質を発現させるために使用することもできる。
【背景技術】
【０００３】
骨髄移植（ＢＭＴ）は、損傷したまたは破壊された骨髄を、患者（自家）または他人（同種）のいずれかから単離された健康な骨髄幹細胞で置き換える手順である。ＢＭＴは、白血病だけではなく、重度の再生不良性貧血、リンパ腫、多発性骨髄腫、免疫不全障害、および一部の固形腫瘍がんを含む多くの他の疾患を処置するために使用されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
骨髄破壊的なＢＭＴは、最初に、骨髄内の細胞（正常な細胞および異常な細胞の両方）を死滅させるために患者を処置し、その後、健康な骨髄細胞を注入することを伴う。第１の工程では、高用量の化学療法および／または放射線照射が細胞を死滅させるために必要であり、その後、同種細胞または自家細胞が導入される。患者の骨髄を根絶するこのプロセスは、骨髄破壊と呼ばれる。このプロセスは、不健康な細胞だけではなく健康な免疫細胞および幹細胞も死滅させるため、患者は非常に感染しやすく、複数の抗生物質を投与され、無菌の環境に居続ける必要があることが多い。骨髄が再構成されるまで、患者は感染に対してハイリスクであり続け、回復期間は最大６カ月間続く。この期間、患者は、合併症が生じているケースでは、処置を受けている病院またはクリニックの近くに居続けることが推奨される。急性毒性に加えて、骨髄破壊的な化学療法は、白内障、成長遅延、心臓毒性、ならびに内分泌上のおよび生殖上の問題を含む、多くの他の副作用に関連している。若年の患者は、これらの影響を特に受けやすい。したがって、ＢＭＴを行うための新規な組成物および方法が必要とされている。この開示は、これらの要求などを満たすものである。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
［特許請求の範囲の記載が決定されたら全て記載される］
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＥＧＦＰを発現するレンチウイルスベクター（「コントロールベクター」）により形質導入された骨髄細胞、またはＥＧＦＰ＋ＡＬＤＨ１Ａ１を発現するレンチウイルスベクター（「試験ベクター」、配列番号２、図４）により形質導入された骨髄細胞を投与され、示された濃度の１日に１回の腹腔内（ｉ．ｐ．）シクロホスファミド（ＣＴＸ）で処置されたマウスの末梢血における、生きたＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）陽性（ＧＦＰ＋）顆粒球のパーセンテージを示す図である。研究の２３日目、３５日目、および４２日目（これは、ＣＴＸ投与の１６日目、２８日目、および３５日目にそれぞれ対応する）に、眼窩後方から出血させることによって血液を回収し、末梢血における生きたＧＦＰ＋顆粒球のパーセンテージをフローサイトメトリーによって評価した。移植後のＣＴＸ処置がない群の各々ではｎ＝３であり、全ての他の群ではｎ＝６であった。
【図２Ａ】コントロールベクターにより形質導入された骨髄細胞または試験ベクターにより形質導入された骨髄細胞を投与され、示された濃度のＣＴＸの１日に１回のレジメンに供されたマウスについての、フローサイトメトリーによって評価された、骨髄におけるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す図である。移植後のＣＴＸ処置がない群の各々ではｎ＝３であり、全ての他の群ではｎ＝６であった。図２Ａは、全（死滅したおよび生きた）ＧＦＰ＋細胞の％を示す。
【図２Ｂ】コントロールベクターにより形質導入された骨髄細胞または試験ベクターにより形質導入された骨髄細胞を投与され、示された濃度のＣＴＸの１日に１回のレジメンに供されたマウスについての、フローサイトメトリーによって評価された、骨髄におけるＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを示す図である。移植後のＣＴＸ処置がない群の各々ではｎ＝３であり、全ての他の群ではｎ＝６であった。図２Ｂは、生きたＧＦＰ＋顆粒球の％を示す。
【図３】コントロールベクターにより形質導入された骨髄細胞または試験ベクターにより形質導入された骨髄細胞を投与され、示された濃度のＣＴＸの１日に１回のレジメンに供されたマウスについての、白血球（ＷＢＣ）数を示す図である。各々について、移植後のＣＴＸ処置がない群ではｎ＝３であり、全ての他の群ではｎ＝５であった。
【図４】本開示の一実施形態に従ったレンチウイルスベクターの非限定的な概略図を示す図である。
【図５】本開示の一実施形態に従ったレンチウイルスベクターの非限定的な概略図を示す図である。
【図６】本開示の一実施形態に従ったレンチウイルスベクターの非限定的な概略図を示す図である。
【図７】用量範囲およびレンチウイルスベクターの効能の研究のための研究設計の非限定的な概略図を示す図である。
【図８】レンチウイルスベクターの発現およびｓｈＲＮＡノックダウン研究の効能のための研究設計の非限定的な概略図を示す図である。
【図９】ＨＩＶに対する多耐性およびＣＴＸに対する化学療法耐性を有する細胞を本開示の一実施形態に従ったＨＩＶ＋患者に移植するための研究設計の非限定的な概略図を示す図である。
【図１０】ＨＩＶに対する多耐性およびＣＴＸに対する化学療法耐性を有する細胞を患者に移植した後に、ＨＩＶ＋患者を１日に１回のＣＴＸで処置する研究設計の非限定的な概略図を示す図である。同一の研究設計を、ＨＩＶを予防するためにＨＩＶ−対象に対して行い得ることが検討される。
【図１１】本開示の一実施形態に従ったレンチウイルスベクターの非限定的な概略図を示す図である。
【図１２】本開示の一実施形態に従ったレンチウイルスベクターの非限定的な概略図を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
常に明確に言及されるわけではないが、全ての数値的な指定が用語「約」の後に来ることが理解される。本明細書において使用される場合、用語「約」は、数値が近似値であり、わずかな変化は開示される実施形態の実施に有意に影響しないことを意味する。
【０００８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用される場合、文脈から別段のことが明らかに示されない限り、単数形態「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」には複数形の指示物が含まれることが理解されなくてはならない。したがって、例えば、「細胞」への言及には、複数の細胞が含まれる。
【０００９】
定義
本明細書において使用される場合、以下の用語は、以下の意味を有する。
【００１０】
用語「約」は、数値的な指定、例えば、範囲を含む、温度、時間、量、濃度、およびその他のものの前で使用される場合、（＋）または（−）２０％、１０％、５％、または１％変化し得る近似値を示す。
【００１１】
同様に本明細書において使用される場合、「および／または」は、関連する列挙された項目のうちの１つまたはそれ以上の任意のおよび全ての考えられる組み合わせを、ならびに選択肢（「または」）によって解釈される場合には組み合わせの欠如を指し、包含する。
【００１２】
用語「投与すること」、「投与する」などは、作用剤（例えば細胞）を対象に導入することを指す。典型的には有効量が投与され、この量は、処置する医師などによって決定される。局所経路、皮下経路、腹膜経路、静脈内経路、動脈内経路、吸入経路、膣経路、直腸経路、鼻経路、経口経路、口腔内経路、脳脊髄液内への導入、または身体区画内への点滴などの任意の投与経路を使用することができる。用語および表現「投与すること」および「〜の投与」は、組成物（および文法的な同等物）に関連して使用される場合、医療専門家による、もしくは患者による自己投与による、患者への投与であり得る直接投与、および／または薬剤を処方する行為であり得る間接投与の両方を指す。例えば、作用剤（例えば細胞）を自己投与することを患者に指示する、および／または患者に薬剤についての規定を提供する医師が、作用剤を患者に投与している。「断続的な投与」または「定期的に投与すること」は、１日に１回、週に１回、または月に１回の原則で行われる複数の処置を指す。断続的な投与はまた、１日当たり１回、２回、３回、またはそれを超える回数の作用剤の投与を指し得る。
【００１３】
本明細書において使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（ならびに、含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、および「含まれる（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ））、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」（ならびに、有する（ｈａｖｉｎｇ）の任意の形態、例えば「有する（ｈａｖｅ）」および「有する（ｈａｓ）」）、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（ならびに、含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」）、または「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（ならびに、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）の任意の形態、例えば、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ」）は、包括的であるかまたは制限のないものであり、さらなる列挙されていない要素または方法工程を排除しない。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ」）という移行句を使用する任意の工程または組成物はまた、「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」または「構成する（ｃｏｎｓｉｓｔｓ）」という移行句でそれを記載すると言うこともできる。
【００１４】
「有効量」は、有利なまたは所望の結果をもたらすために十分な作用剤または化合物（例えば、細胞または細胞集団）の量である。有効量は、１つまたはそれ以上の投与、適用、または用量中にあり得る。これらのパラメータの決定は、十分に当技術分野の技術の範囲内である。これらの検討、ならびに効果的な製剤および投与手順は、当技術分野において周知であり、標準的なテキストにおいて記載されている。
【００１５】
本明細書において使用される場合、用語「接触させること」は、インビトロ系またはインビボ系において２つの要素を一緒にすることを意味する。例えば、ウイルスを細胞とまたは個体もしくは患者もしくは細胞と「接触させること」には、ウイルスをヒトなどの個体または患者に投与すること、および、例えば、目的の細胞を含有する細胞調製物または精製調製物を含有するサンプルに化合物を導入することが含まれる。
【００１６】
用語「異種の」は、核酸分子、タンパク質、ベクター、または発現カセットに言及する場合、ユーザーの操作を介して細胞において発現している、および天然ではない、核酸分子、タンパク質、ベクター、または発現カセットを指す。例えば、異種遺伝子は、細胞内に導入されられたベクターもしくは他の媒体によって発現している遺伝子を、またはＣＲＩＳＰＲなどの遺伝子編集方法もしくは細胞内の遺伝子を置き換えるための他の組換え技術を介して修飾されているゲノム内にある遺伝子を指す。当業者には、用語「異種の」が、修飾されていない細胞のゲノム内の天然の遺伝子を指さないことが理解される。「異種の」はまた、「外因性の」とも言うことができる。
【００１７】
用語「単離された」は、ＤＮＡまたはＲＮＡなどの核酸に関して本明細書において使用される場合、高分子の天然由来源内に存在する他のＤＮＡまたはＲＮＡから分離された分子をそれぞれ指す。用語「単離された」はまた、本明細書において使用される場合、細胞材料、ウイルス材料、または組換えＤＮＡ技術によって生産される場合の培養培地、または化学的に合成される場合には化学物質前駆体もしくは他の化学物質を実質的に有さない、核酸またはペプチドも指す。さらに、「単離された核酸」は、断片としては天然に存在せず天然の状態では見られない核酸断片を含むものである。「単離された細胞」、例えば、単離された骨髄細胞は、それが天然に見られる環境の他の細胞材料、組織、培地を実質的に有さない細胞である。
【００１８】
用語「骨髄破壊的な」は、長く続く（通常は不可逆的な）汎血球減少を生じさせ、骨髄中の細胞を投与から１から３週間以内に死滅させ、および自家の血液学的回復をさせない処置を意味する。Ｂａｃｉｇａｌｕｐｏら、Ｂｉｏｌ  Ｂｌｏｏｄ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．２００９、１５（１２）：１６２８〜１６３３頁。シクロホスファミドの骨髄破壊的な用量の例には、限定はしないが、蓄積毒性をもたらす、ある期間にわたる２．５ｍｇ／ｋｇ／日のＣＴＸまたはそれ以上が含まれる（ＭｃＫｉｎｌｅｙら、Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００９、４：１７５４〜１７６０頁）。
【００１９】
用語「非骨髄破壊的な」は、血球減少を生じさせない、最少の血球減少を生じさせる、または可逆の血球減少を生じさせる、毒性をほとんど伴わない処置を意味する。非骨髄破壊的なレジメンは、免疫除去である。非骨髄破壊的な用量の例には、限定はしないが、蓄積毒性を生じさせない、ある期間にわたるおよそ１．３ｍｇ／ｋｇ／日、または２から４カ月間にわたる１．０から１．５ｍｇ／ｋｇ／日が含まれる（ＭｃＫｉｎｌｅｙら、Ｃｌｉｎ  Ｊ  Ａｍ  Ｓｏｃ  Ｎｅｐｈｒｏｌ．２００９、４：１７５４〜１７６０頁）。他の非骨髄破壊的な用量は全体にわたって記載されており、非骨髄破壊的な用量の定義に含まれている。「蓄積毒性」をもたらす作用剤または作用剤の用量は、患者において毒性を経時的にもたらす用量を指す。例えば、シクロホスファミドを２．５ｍｇ／ｋｇ／日の用量で数週間にわたってヒトに投与すると、蓄積毒性をもたらす。
【００２０】
「対象」、「個体」、または「患者」は、本明細書において区別せずに使用され、脊椎動物、例えば、霊長類、哺乳動物、または好ましくはヒトを指す。哺乳動物には、限定はしないが、ウマ、イヌ、ウシ、ヒツジ、マウス、ラット、サル、およびヒトが含まれる。
【００２１】
タンパク質配列もしくはアミノ酸配列（またはＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列）に関する用語「配列同一性」は、配列をアラインし、必要に応じてギャップを導入して、最大の配列同一性パーセントを得た後の、また、配列同一性の一部として任意の保存的な置換を考慮することがない、候補配列における、特異的なタンパク質配列もしくはアミノ酸配列中のアミノ酸残基（または特異的なＤＮＡ配列もしくはＲＮＡ配列中のヌクレオチド残基）に同一なアミノ酸残基（またはヌクレオチド残基）のパーセンテージを指す。アラインメントは、当業者に知られている任意の方法によって、例えば、ＢＬＡＳＴおよびＥＭＢＯＳＳなどの公開されているプログラムを使用することによって行うことができる。当業者は、比較対象の配列の完全長にわたって最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができるが、一部の実施形態において、デフォルトパラメータが使用される。プログラムは、例えばアメリカ国立生物工学情報センターでアクセスすることができる。
【００２２】
用語「変異体」は、本明細書において使用される場合、参照核酸または参照タンパク質（すなわち、カルモジュリンまたはその断片）と異なるが、基本的な特性（すなわち、生物学的活性）は保持している、核酸またはタンパク質である。ポリヌクレオチドの典型的な変異体は、別の参照ポリヌクレオチドとヌクレオチド配列が異なる。ヌクレオチド配列の変化は、参照ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドのアミノ酸配列を改変するかもしれないし、しないかもしれない。ヌクレオチドの変化は、参照配列によってコードされるポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、付加、欠失、融合、および／またはトランケーションを生じさせ得る。
【００２３】
用語「ベクター」は、別の核酸分子を移動させ得るまたは運搬し得る核酸分子を指すために本明細書において用いられる。移動された核酸は、一般に、例えばベクターの核酸分子に連結する。ベクターは、細胞における自律複製を指示する配列を含み得るか、または細胞ＤＮＡ内への組み込みを可能にするために十分な配列を含み得る。ベクターとしては、例えば、プラスミド（例えば、ＤＮＡプラスミドまたはＲＮＡプラスミド）、トランスポゾン、コスミド、細菌人工染色体または酵母人工染色体、およびウイルスベクターが含まれる。有用なウイルスベクターには、例えば、アデノウイルス、レトロウイルス、特に複製欠損レトロウイルス、およびレンチウイルスが含まれる。一部の実施形態において、ベクターは、配列番号２または配列番号４のヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態において、ベクターは、配列番号１、配列番号３、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９のヌクレオチド配列、またはそのあらゆる組み合わせを含む。
【００２４】
表現「薬学的に許容可能な」は、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わない、人間および動物の組織と接触させる使用に適した、健全な医学的判断の範囲に含まれる、化合物、材料、組成物、および／または投薬形態を指すために本明細書において用いられる。
【００２５】
骨髄移植を行うための方法
本明細書において、それを必要とする患者において骨髄移植を行うための方法が提供される。また、対象の骨髄細胞を、１つの異種核酸分子発現カセットもしくは複数の異種発現カセットを発現する細胞の集団で、またはゲノム編集され対象のゲノムと異なる細胞で置き換えるための方法が提供される。一部の実施形態において、これらの方法は、患者に１つまたはそれ以上の化学療法耐性の修飾された細胞を投与すること、および少なくとも１用量の化学療法剤の投与を含む。ある特定の実施形態において、用量は、化学療法剤の非骨髄破壊的な用量である。一部の実施形態において、細胞の量は、治療有効量である。
【００２６】
本明細書において提供される方法の一部の実施形態において、患者はＨＩＶを有している。
【００２７】
開示される方法において使用するための化学療法耐性の修飾された細胞は、当業者に知られている任意の適切な細胞であり得る。例えば、細胞は、幹細胞または免疫細胞であり得る。幹細胞の非限定的な例としては、臍帯血細胞、胎性幹細胞、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、造血幹細胞（ＨＳＣ）、造血前駆細胞、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）、またはこれらに由来する細胞が含まれる。一部の実施形態において、免疫細胞はＴ細胞である。一部の実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋および／またはＣＤ４＋である。一部の実施形態において、細胞は、間葉系幹細胞、間質幹細胞、臍帯血由来の造血幹細胞／造血前駆細胞、臍帯組織由来の幹細胞／前駆細胞、ｉＰＳＣ、ＨＥＳＣ、胎児組織由来の幹細胞、ＣＤ４＋細胞、およびそれに類するものである。一部の実施形態において、幹細胞はＣＤ３４＋である。
【００２８】
化学療法耐性
本方法において使用するための化学療法耐性の細胞は、化学療法耐性を付与するための、当技術分野において知られている任意の方法を使用して生成することができる。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される骨髄移植方法は、１つまたはそれ以上の細胞を修飾して化学療法耐性とすることを含む。例えば、ある特定の実施形態において、化学療法耐性の修飾された細胞を生成すること、有効量の化学療法耐性の修飾された細胞を患者に投与すること、および少なくとも１用量の化学療法剤を投与することを含む、それを必要とする患者において骨髄移植を行うための方法が提供される。ある特定の実施形態において、用量は、化学療法剤の非骨髄破壊的な用量である。一部の実施形態において、化学療法耐性の細胞は、シクロホスファミドに対して耐性である。一部の実施形態において、化学療法耐性の細胞は、非骨髄破壊的な量のシクロホスファミドに対して耐性である。
【００２９】
一部の実施形態において、細胞は、外因性の化学療法耐性の遺伝子（すなわち、形質導入された遺伝子）を発現するように修飾することができ、例えば、外因性の化学療法耐性遺伝子は、シクロホスファミド耐性遺伝子、その変異体、またはその部分をコードする核酸配列であり得る。一部の実施形態において、シクロホスファミド耐性遺伝子は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）である。一部の実施形態において、ＡＬＤＨ１は、配列番号１で示される配列またはその変異体を含む核酸分子である。一部の実施形態において、ＡＬＤＨ１は、配列番号２もしくは配列番号４で示される配列またはその変異体を含むレンチウイルスベクターにおいて発現する。ＡＬＤＨ１で修飾されているがシクロホスファミドに対して耐性である細胞は、他の非シクロホスファミド化学療法薬に対して感受性のままであり得る（すなわち、細胞は多剤耐性とならない）。
【００３０】
ウイルスベクター（例えば、アデノウイルス、複製欠損レトロウイルスなどのレトロウイルス、およびレンチウイルス）、非ウイルスベクター（例えば、エピソーム性のプラスミド）、またはトランスポゾン系（例えば、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ＢｅａｕｔｙもしくはＰｉｇｇｙＢａｃ）を含めて、当業者に知られている任意の修飾方法を利用して外因性の化学療法耐性遺伝子を発現させることができる。一部の実施形態において、ベクターは、配列番号２または配列番号４のヌクレオチド配列を有する。一部の実施形態において、化学療法耐性遺伝子は、合成メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）である。合成ｍＲＮＡは、目的のタンパク質を作るための遺伝情報を提供するものであり、免疫応答を引き起こすことを避けるために化学的に修飾することができる。Ｚａｎｇｉら（２０１３）Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ３１：８９８〜９０７頁。ｍＲＮＡは宿主細胞ゲノム内に組み込まれないため、合成ＲＮＡは、ある期間にわたって作用し、その後、細胞が分割すると消える。一部の実施形態において、合成ｍＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡに対する固有の抗ウイルス応答を低減させるために、例えばシュードウリジンおよび／または５−メチル−シチジンで修飾される。一部の実施形態において、合成ＲＮＡは、ＡＬＤＨ（例えばＡＬＤＨ１）および／またはそのそれぞれの同等物をコードする。
【００３１】
一部の実施形態において、化学療法耐性、例えばシクロホスファミド耐性は、修飾された細胞によって一過性発現される。一部の実施形態において、一過性発現されたシクロホスファミドは、約１週間、約２週間、約３週間、約１カ月間、約２カ月間、約３カ月間、約６カ月間、約１年間、約２年間、または約３年間の期間にわたって、修飾された細胞によって発現される。一過性発現は、耐性を付与する遺伝子またはタンパク質の発現の持続性を指す。一過性とは、耐性が恒久的ではないことを意味する。
【００３２】
一部の実施形態において、外因性の化学療法耐性遺伝子、例えばシクロホスファミド耐性遺伝子は、細胞の非ウイルスベースのトランスフェクションなどの様々な周知の技術のいずれか１つを使用して、細胞内に導入される。細胞内への導入は、当技術分野において知られている任意の非ウイルスベースのトランスフェクション方法、例えば、限定はしないが、エレクトロポレーション、リン酸カルシウムを介する移入、ヌクレオフェクション、ソノポレーション、熱ショック、マグネトフェクション、リポソームを介する移入、マイクロインジェクション、微粒子銃を介する移入（ナノ粒子）、陽イオン性ポリマーを介する移入（ＤＥＡＥ−デキストラン、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、およびそれに類するもの）、または細胞融合によって行うことができる。トランスフェクションの他の方法としては、リポフェクタミン（商標）、同仁化学研究所のハイリーマックス（商標）、Ｆｕｇｅｎｅ（商標）、ｊｅｔＰＥＩ（商標）、Ｅｆｆｅｃｔｅｎｅ（商標）、およびＤｒｅａｍＦｅｃｔ（商標）などのトランスフェクション試薬が含まれる。
【００３３】
細胞の単離および／または精製
本方法において使用するための化学療法耐性の修飾された細胞は、化学療法耐性を付与するように修飾されている、患者の細胞（すなわち、自家細胞）、ドナーの細胞（すなわち、同種細胞）、またはこれらのあらゆる組み合わせであり得る。ある特定の実施形態において、本明細書において提供される方法はさらに、患者またはドナーから細胞を単離および／または精製することを含む。ある特定のこれらの実施形態において、本方法はさらに、細胞を修飾して化学療法耐性とすることを含む。例えば、ある特定の実施形態において、患者または対象から１つまたはそれ以上の細胞を単離および／または精製すること、１つまたはそれ以上の細胞を修飾して本明細書において記載される化学療法耐性とすること、有効量の１つまたはそれ以上の化学療法耐性の修飾された細胞を患者に投与すること、ならびに少なくとも１用量の化学療法剤を投与することを含む、それを必要とする患者において骨髄移植を行うための方法が提供される。
【００３４】
細胞は、ある特定のマーカーの発現／発現の欠如、増殖速度、および分化の可能性に例えば基づく、当業者に知られている任意の方法によって単離することができる。一部の実施形態において、細胞は、例えばＣＤ３４、ＣＤ４、Ｓｃａ−１  ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、抗原提示細胞マーカー（ＣＤ８、ＣＤ８アルファ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＣＤ２０５、ＣＤ２４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、ＣＤ１１ｃｌｏｗ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１２３、ＩＬＴ−７、ＭＨＣクラスＩＩ、ＭＨＣクラスＩＩｌｏｗ、ＴＬＲ７、および／またはＴＲＬ９）を含む、特定のマーカーまたはマーカーの組み合わせの存在に基づいて単離される。一部の実施形態において、細胞は、特定のマーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ５６、および／またはＣＤ６６ｂの不在に基づいて単離される。他の実施形態において、負の選択が、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、顆粒球、および／または骨髄単球のマーカーについて行われる。一部の実施形態において、細胞は、単独の、または任意の他のマーカーと組み合わされた、Ｔｈｙ−１の存在に基づいて単離される。一部の実施形態において、ＨＳＣは、Ｌｉｎ−Ｔｈｙ１＋Ｓｃａ−１＋発現プロファイルに基づいて単離される。一部の実施形態において、マウスＨＳＣは、発現プロファイルＣＤ３４−、Ｓｃａ１＋、ｃ−ｋｉｔ＋によって単離することができる。一部の実施形態において、ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４の発現に基づいて単離することができる。
【００３５】
化学療法剤
一部の実施形態において、本明細書において提供される方法は、１用量またはそれ以上の用量の化学療法剤を患者に投与することを含む。一部の実施形態において、用量は、化学療法剤の非骨髄破壊的な用量である。化学療法剤は、当業者に知られている任意の適切な化学療法剤であり得る。化学療法剤の非限定的な例としては、アクチノマイシン、全トランス型レチノイン酸、アザシチジン、アザチオプリン、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、シスプラチン、クロラムブシル、シクロホスファミド、シタラビン、ダウノルビシン、ドセタキセル、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポチロン、エトポシド、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、イダルビシン、イマチニブ、イリノテカン、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、メクロレタミン、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、ミトキサントロン、ニムスチン（ＡＣＮＵ）オキサリプラチン、パクリタキセル、ペメトレキセド、テメゾラミド、テニポシド、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレオスルファン、バルルビシン、ベムラフェニブ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、およびビノレルビンが含まれる。
【００３６】
疾患特異的な修飾
本明細書において提供される方法のある特定の実施形態において、化学療法耐性の修飾された細胞は、化学療法耐性に関連しない１つまたはそれ以上のさらなる修飾を含み得る。例えば、ある特定の実施形態において、細胞はさらに、さらなるＨＩＶ／疾患特異的な修飾を発現するように修飾される。したがって、ある特定の実施形態において、本明細書において提供される骨髄移植方法はさらに、１つまたはそれ以上のＨＩＶ／疾患特異的な修飾を含む、１つまたはそれ以上のさらなる修飾を組み込むことを含む。例えば、ある特定の実施形態において、患者または対象から１つまたはそれ以上の細胞を単離および／または精製すること、１つまたはそれ以上の細胞を修飾して本明細書において記載される化学療法耐性とすること、１つまたはそれ以上のさらなる修飾を１つまたはそれ以上の細胞に組み込むこと、有効量の１つまたはそれ以上の化学療法耐性の修飾された細胞を患者に投与すること、ならびに少なくとも１用量の化学療法剤を投与することを含む、それを必要とする患者において骨髄移植を行うための方法が提供される。一部の実施形態において、用量は、化学療法剤の非骨髄破壊的な用量である。
【００３７】
一部の実施形態において、修飾された細胞はさらに修飾されて、ＨＩＶ耐性とされる。例えば、修飾された細胞をさらに、ＨＩＶ感染に対する耐性を付与する少なくとも１つの突然変異ＨＩＶ共受容体、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の１つの突然変異もしくは複数の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ融合阻害剤の発現、またはこれらのあらゆる組み合わせを発現するように修飾することができる。一部の実施形態において、細胞は、ＨＩＶ共受容体の発現を阻害するまたは低減させる分子を発現するように修飾されている。一部の実施形態において、分子は、アンチセンス分子である。一部の実施形態において、細胞は、ｓｈＣＣＲ５、ｓｈＣＸＣＲ４、ＧＰ−４１融合阻害剤、Ｃ４６融合阻害剤、Ｃ３４融合阻害剤、あらゆる他のＣ−ペプチド融合阻害剤、またはこれらのあらゆる組み合わせを発現するように修飾されている。一部の実施形態において、ＣＣＲ５突然変異は、ＣＣＲ５−デルタ３２突然変異である。一部の実施形態において、細胞におけるＣＣＲ５遺伝子の両コピーが、ＣＣＲ５−デルタ３２突然変異で置き換えられている。一部の実施形態において、ＣＣＲ５遺伝子の一方のコピーが、ＣＣＲ５−デルタ３２突然変異で置き換えられている。
【００３８】
本開示は、化学療法耐性、例えばシクロホスファミド耐性、およびＨＩＶ耐性を有するように修飾されている細胞を提供する。一部の実施形態において、細胞は、シクロホスファミド耐性およびＨＩＶ耐性を有するように修飾することができる。ＨＩＶ耐性は、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の発現の低減、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の１つの突然変異もしくは複数の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ融合阻害剤の発現、またはこれらのあらゆる組み合わせによって付与される。ＨＩＶ耐性は、ＣＣＲ５  ＨＩＶ共受容体の発現の低減、ＣＸＣＲ４共受容体の発現の低減、Ｃ−ペプチド融合阻害剤（例えば、Ｃ４６融合阻害剤もしくはＣ３４融合阻害剤）の発現、またはこれらのあらゆる組み合わせから付与される。
【００３９】
細胞はまた、任意の目的の分子を発現するように修飾することができる。目的の分子は、利用者によるまたは具体的な患者の要求による決定に応じて修飾することができる。
【００４０】
患者への投与
一部の実施形態において、本明細書において提供される方法は、有効量の化学療法耐性修飾された細胞および非骨髄破壊的な用量の化学療法剤を対象に投与することを含む。修飾された細胞および化学療法剤は、処置対象の疾患または状態に応じて、当業者に明らであろう任意の適切な経路によって投与することができる。典型的な投与経路には、静脈内経路、動脈内経路、筋肉内経路、皮下経路、頭蓋内経路、鼻腔内経路、皮内経路、経口経路、または腹腔内経路が含まれる。
【００４１】
一部の実施形態において、対象の体表面積１ｍ２当たり約１×１０８から約１×１０１１個の細胞が、対象に投与される。細胞は、細胞の絶対数基準で個体に投与することができ、例えば、前記個体には、約１０００個細胞／注射から最大約１００億個細胞／注射を投与することができ、例えば、注射当たり、約、少なくとも約、または最大で、約１×１０８、１×１０７、５×１０７、１×１０６、５×１０６、１×１０５、５×１０５、１×１０４、５×１０４、１×１０３、５×１０３個（など）の細胞、または、終点を含めた、これらの数値のうちの任意の２つの間の任意の範囲を投与することができる。一部の実施形態において、細胞約５×１０６個／ｋｇから約１０×１０６個／ｋｇが、ＨＳＣ移植に使用される。
【００４２】
他の実施形態において、対象には、約１０００個細胞／注射／ｍ２から最大約１００億個細胞／注射／ｍ２を投与することができ、例えば、注射当たり、約、少なくとも約、または最大で、約１×１０８個／ｍ２、１×１０７個／ｍ２、５×１０７個／ｍ２、１×１０６個／ｍ２、５×１０６個／ｍ２、１×１０５個／ｍ２、５×１０５個／ｍ２、１×１０４個／ｍ２、５×１０４個／ｍ２、１×１０３個／ｍ２、５×１０３個／ｍ２（など）の細胞、または、終点を含めた、これらの数値のうちの任意の２つの間の任意の範囲を投与することができる。
【００４３】
他の実施形態において、細胞は、細胞の相対数基準でこのような個体に投与することができ、例えば、前記個体には、個体１キログラム当たり約１０００個の細胞から最大約１００億個の細胞を投与することができ、例えば、個体１キログラム当たり、約、少なくとも約、または最大で、約１×１０８個、５×１０７個、１×１０７個、５×１０６個、１×１０６個、５×１０５個、１×１０５個、５×１０４個、１×１０４個、５×１０３個、１×１０３個（など）の細胞、または、終点を含めた、これらの数値のうちの任意の２つの間の任意の範囲を投与することができる。
【００４４】
一部の実施形態において、非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤が患者に投与される。化学療法剤の投与は、修飾された細胞の投与と同時にまたは連続的に行うことができる。一部の実施形態において、非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤が、修飾された細胞を投与した後に投与される。一部の実施形態において、事前調整工程（本明細書において「前処置工程」とも呼ばれる）が、細胞を投与する前に行われ、この工程において、少なくとも１用量の化学療法剤、例えばフルダラビンまたはシクロホスファミドが、修飾された細胞を投与する前に患者に投与される。一部の実施形態において、事前調整工程は、非骨髄破壊的な化学療法薬による事前調整工程である。一部の実施形態において、事前調整工程は、細胞を投与する前に行われない。細胞を投与する前に事前調整工程（例えばフルダラビン）が行われなくても、本開示の細胞が依然として患者の骨髄に効率的にグラフトされると考えられる。
【００４５】
一部の実施形態において、ヒト対象または患者のための化学療法剤の非骨髄破壊的な少なくとも１用量は、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量である。一部の実施形態において、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．１５ｍｇ／ｋｇ／日から２．５ｍｇ／ｋｇ／日未満、約０．４ｍｇ／ｋｇ／日から約１．７ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．８ｍｇ／ｋｇ／日から約１．５ｍｇ／ｋｇ／日である。一部の実施形態において、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．１５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．２ｍｇ／ｋｇ／日、約０．２５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．３ｍｇ／ｋｇ／日、約０．３５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．４ｍｇ／ｋｇ／日、約０．４５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．６５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．７ｍｇ／ｋｇ／日、約０．７５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．８５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．９ｍｇ／ｋｇ／日、約０．９５ｍｇ／ｋｇ／日、約１．０ｍｇ／ｋｇ／日、約１．１ｍｇ／ｋｇ／日、約１．２ｍｇ／ｋｇ／日、約１．３ｍｇ／ｋｇ／日、約１．４ｍｇ／ｋｇ／日、約１．５ｍｇ／ｋｇ／日、約１．６ｍｇ／ｋｇ／日、約１．７ｍｇ／ｋｇ／日、約１．８ｍｇ／ｋｇ／日、約１．９ｍｇ／ｋｇ／日、約２．０ｍｇ／ｋｇ／日、約２．１ｍｇ／ｋｇ／日、約２．２ｍｇ／ｋｇ／日、約２．３ｍｇ／ｋｇ／日、または約２．４ｍｇ／ｋｇ／日である。一部の実施形態において、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約１．３ｍｇ／ｋｇ／日である。一部の実施形態において、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．８ｍｇ／ｋｇ／日から約１．６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．９８ｍｇ／ｋｇ／日、約１．３ｍｇ／ｋｇ／日、約１．５ｍｇ／ｋｇ／日、または約１．６ｍｇ／ｋｇ／日である。一部の実施形態において、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．５から約２ｍｇ／ｋｇ／日である。
【００４６】
一部の実施形態において、化学療法剤の非骨髄破壊的な用量は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約１週間、少なくとも約２週間、少なくとも約３週間、少なくとも約１カ月間、少なくとも約２カ月間、少なくとも約３カ月間、少なくとも約４カ月間、少なくとも約５カ月間、少なくとも約６カ月間、少なくとも約１年間、またはそれを超える期間にわたり、毎日投与される。
【００４７】
一部の実施形態において、非骨髄破壊的な用量は、蓄積毒性を生じさせない、ある期間にわたって提供される。例えば、蓄積毒性を生じさせない期間は、約１年間未満、約６カ月間未満、約３カ月間未満、約２カ月間未満、約１カ月間未満、約３週間未満、約２週間未満、約１週間未満、約６日間未満、約５日間未満、約４日間未満、約３日間未満、または約２日間未満の、ある期間である。
【００４８】
一部の実施形態において、シクロホスファミド耐性の修飾された細胞の投与と非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤の投与との間で、少なくとも１回の、ある期間の中断がある。例えば、期間は、約２日間、約３日間、約４日間、約５日間、約６日間、約１週間、約２週間、約３週間、約１カ月間、約２カ月間、約３カ月間、約６カ月間、約１年間、またはそれを超える期間であり得る。一部の実施形態において、期間は、約３日間、約７日間、約１０日間、および約１４日間である。
【００４９】
一部の実施形態において、患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または１００％が、修飾された細胞で置き換えられる。一部の実施形態において、患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または１００％が、約１年間以内に、修飾された細胞で置き換えられる。一部の実施形態において、患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または１００％が、約６カ月間以内に、修飾された細胞で置き換えられる。一部の実施形態において、患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％、約９０％、約９５％、または１００％が、約５カ月間以内に、修飾された細胞で置き換えられる。一部の実施形態において、患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または１００％が、約４カ月間以内に、修飾された細胞で置き換えられる。一部の実施形態において、患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または１００％が、約３カ月間以内に、修飾された細胞で置き換えられる。一部の実施形態において、患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または１００％が、約２カ月間以内に、修飾された細胞で置き換えられる。一部の実施形態において、患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または１００％が、約１カ月以内に、修飾された細胞で置き換えられる。一部の実施形態において、患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または１００％が、約２週間以内に、修飾された細胞で置き換えられる。一部の実施形態において、患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または１００％が、約１週間以内に、修飾された細胞で置き換えられる。
【００５０】
一部の実施形態において、患者は、本方法の間、骨髄破壊される、および／または免疫不全となることはない。一部の実施形態において、患者は、臨床的に関連する貧血、好中球減少、血小板減少、汎血球減少、低血小板、低白血球、低赤血球、またはこれらのあらゆる組み合わせ、もしくは関連する症状を経験しない。
【００５１】
別の実施形態において、本開示の細胞および化学療法剤で処置すると、対象または対象群は、以下の結果の１つまたはそれ以上を示し得る：
（ｉ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）の白血球の増大；
（ｉｉ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）の顆粒球の増大；
（ｉｉｉ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）の好中球の増大；
（ｉｖ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）のリンパ球の増大；
（ｖ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）の好酸球の増大；
（ｖｉ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）の単球の増大；
（ｖｉｉ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）の好塩基球の増大；
（ｖｉｉｉ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）の赤血球の増大；
（ｉｘ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）の３つの血中細胞成分（赤血球、白血球、および血小板）の全ての増大；
（ｘ）少なくとも約６カ月間、約１年間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、約２０年間、約２５年間、約３０年間、約３５年間、約４０年間、約４５年間、約５０年間、約５５年間、約６０年間、またはそれを超える期間にわたり再発がない；
（ｘｉ）コントロールと比較して、少なくとも約１年間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、約２０年間、約２５年間、約３０年間、約３５年間、約４０年間、約４５年間、約５０年間、約５５年間、約６０年間、またはそれを超える期間の患者の無再発生存率の増大；
（ｘｉｉ）コントロールと比較して、少なくとも約１年間、約２年間、約３年間、約４年間、約５年間、約６年間、約７年間、約８年間、約９年間、約１０年間、約１５年間、約２０年間、約２５年間、約３０年間、約３５年間、約４０年間、約４５年間、約５０年間、約５５年間、約６０年間、またはそれを超える期間の、患者の生存率の増大；
（ｘｉｉｉ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）のＨＩＶの細胞内寿命の短縮；
（ｘｉｖ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）のＨＩＶ保有宿主の減少；および
（ｘｖ）コントロールと比較して、少なくとも約５％、少なくとも約１０％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも約７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％（実際の変化％、または変化％の中央値）のウイルスＤＮＡの枯渇。
【００５２】
一部の実施形態において、コントロールは、プラセボで処置された対象、ベースラインコントロール、または未修飾の細胞で処置された対象であり得る。
【００５３】
一部の実施形態において、修飾された細胞は、ＨＩＶの少なくとも１つの症状をコントロールと比較して少なくとも約２％、少なくとも約３％、少なくとも約４％、少なくとも約５％、少なくとも約６％、少なくとも約７％、少なくとも約８％、少なくとも約９％、少なくとも約１０％、少なくとも約１１％、少なくとも約１２％、少なくとも約１３％、少なくとも約１４％、少なくとも約１５％、少なくとも約２０％、少なくとも約２５％、少なくとも約３０％、少なくとも約３５％、少なくとも約４０％、少なくとも約４５％、少なくとも約５０％、少なくとも約５５％、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または１００％低減させるために効果的な期間にわたり対象に投与される。コントロールは、プラセボで処置された対象、ベースラインコントロール、または未修飾の細胞で処置された対象であり得る。
【００５４】
非限定的な症状としては、発熱、頭痛、活力不足、皮膚発疹、皮膚疼痛、腺肥大、感染（例えば、肺炎、結核、Ｃ型肝炎）、寝汗、下痢、吐き気および嘔吐、体重減少、重度の頭痛、関節痛、筋肉痛、ならびに慢性的な咳が含まれる。
【００５５】
一部の実施形態において、修飾された細胞は、少なくとも１つの他のＨＩＶ療法と共に投与される。適切な他のＨＩＶ療法には、当業者に知られている任意のＨＩＶ療法が含まれる。他のＨＩＶ療法の非限定的な例としては、組み合わせ薬剤（例えば、エファビレンツ／エムトリシタビン／テノフォビルジソプロキシルフマレート（Ａｔｒｉｐｌａ（登録商標））、エムトリシタビン／リルピビリン／テノフォビルジソプロキシルフマレート（Ｃｏｍｐｌｅｒａ（登録商標））、エルビテグラビル／コビシスタット／エムトリシタビン／テノフォビルジソプロキシルフマレート（Ｓｔｒｉｂｉｌｄ（登録商標））、およびアバカビル／ドルテグラビル／ラミブジン（Ｔｒｉｕｍｅｑ（登録商標）））、ヌクレオシド／ヌクレオチド逆転写酵素阻害剤（ＮＲＴＩ）（例えば、アバカビル（Ｚｉａｇｅｎ（登録商標））、エファビレンツ／エムトリシタビン／テノフォビルジソプロキシルフマレート（Ａｔｒｉｐｌａ（登録商標））、ラミブジン／ジドブジン（Ｃｏｍｂｉｖｉｒ（登録商標））、エムトリシタビン／リルピビリン／テノフォビルジソプロキシルフマレート（Ｃｏｍｐｌｅｒａ（登録商標））、エムトリシタビン（Ｅｍｔｒｉｖａ（登録商標））、ラミブジン（Ｅｐｉｖｉｒ（登録商標））、アバカビル／ラミブジン（Ｅｐｚｉｃｏｍ（登録商標））、ジドブジン（Ｒｅｔｒｏｖｉｒ（登録商標））、アバカビル／ラミブジン／ジドブジン（Ｔｒｉｚｉｖｉｒ）、エムトリシタビン／テノフォビルジソプロキシルフマレート（Ｔｒｕｖａｄａ（登録商標））、ジダノシン（Ｖｉｄｅｘ（登録商標））、ジダノシン持続放出（Ｖｉｄｅｘ  ＥＣ（登録商標））、テノフォビルジソプロキシルフマレート（Ｖｉｒｅａｄ（登録商標））、およびスタブジン（Ｚｅｒｉｔ（登録商標）））、非ヌクレオシド逆転写酵素阻害剤（ＮＮＲＴＩ）、プロテアーゼ阻害剤（例えば、チプラナビル（Ａｐｔｉｖｕｓ（登録商標））、インジナビル（Ｃｒｉｘｉｖａｎ（登録商標））、アタザナビル／コビシスタット（Ｅｖｏｔａｚ（登録商標））、サキナビル（Ｉｎｖｉｒａｓｅ（登録商標））、ロピナビル／リトナビル（Ｋａｌｅｔｒａ（登録商標））、ホスアンプレナビル（Ｌｅｘｉｖａ（登録商標））、リトナビル（Ｎｏｒｖｉｒ（登録商標））、ダルナビル／コビシスタット（Ｐｒｅｚｃｏｂｉｘ（登録商標））、ダルナビル（Ｐｒｅｚｉｓｔａ（登録商標））、アタザナビル（Ｒｅｙａｔａｚ（登録商標））、ネルフィナビル（Ｖｉｒａｃｅｐｔ（登録商標）））、侵入阻害剤（例えば、エンフビルチド（Ｆｕｚｅｏｎ（登録商標）））、インテグラーゼ阻害剤（例えば、ラルテグラビル（Ｉｓｅｎｔｒｅｓｓ（登録商標））、ドルテグラビル（Ｔｉｖｉｃａｙ（登録商標））、およびエルビテグラビル（Ｖｉｔｅｋｔａ（登録商標）））、ケモカイン共受容体アンタゴニスト（ＣＣＲ５アンタゴニスト）（例えば、マラビロク（Ｓｅｌｚｅｎｔｒｙ（登録商標））またはビクリビロック）、シトクロムＰ４５０３Ａ阻害剤、ならびに免疫に基づく治療法（例えば、ヒドロキシクロロキンスルフェート（Ｐｌａｑｕｅｎｉｌ）が含まれる。一部の実施形態において、修飾された細胞および少なくとも１つの他のＨＩＶ療法は、同時���投与される。他の実施形態において、修飾された細胞および少なくとも１つの他のＨＩＶ療法は、連続的に投与される。一部の実施形態において、上記の他のＨＩＶ療法のうちの少なくとも１つの投与が明確に排除され、例えば、一部の実施形態において、ＮＲＴＩが明確に排除される。一部の実施形態において、本明細書において開示されている修飾された細胞および非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤（例えば、シクロホスファミド）以外の他のＨＩＶ療法は投与されない。
【００５６】
細胞、化学療法剤、および場合により他のＨＩＶ療法は、ＨＩＶを有する患者に１回投与することができるか、または、治療法の間に複数回、例えば、１時間ごと、２時間ごと、３時間ごと、４時間ごと、５時間ごと、６時間ごと、７時間ごと、８時間ごと、９時間ごと、１０時間ごと、１１時間ごと、１２時間ごと、１３時間ごと、１４時間ごと、１５時間ごと、１６時間ごと、１７時間ごと、１８時間ごと、１９時間ごと、２０時間ごと、２１時間ごと、２２時間ごと、もしくは２３時間ごとに１回、もしくは１日ごと、２日ごと、３日ごと、４日ごと、５日ごと、６日ごと、もしくは７日ごとに１回、もしくは１週間ごと、２週間ごと、３週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと、１０週間ごと、もしくはそれを超える週ごとに１回、もしくは終点を含めた、これらの数値のうちの任意の２つの間の任意の範囲ごとに１回、投与することができる。
【００５７】
一部の実施形態において、ＨＩＶを有する患者を処置する方法が提供される。一部の実施形態において、本方法は、患者のＣＤ３４＋幹細胞を骨髄から末梢に動員することを含む。一部の実施形態において、細胞は、Ｇ−ＣＳＦ（顆粒球コロニー刺激因子）を投与することによって動員される。Ｇ−ＣＳＦは、例えば１日間、２日間、３日間、４日間、または５日間のレジメンとして投与することができる。一部の実施形態において、Ｇ−ＣＳＦは、３〜５日間投与される。動員された細胞は、アフェレーシスなどの方法論を使用して捕捉することができる。一部の実施形態において、例えばアフェレーシスによる細胞の単離は、ＣＤ３４＋細胞数が体重１ｋｇ当たり１０．０から２０．０×１０６となるかまたはそれを超えると行われる。一部の実施形態において、細胞数は、体重１ｋｇ当たり５．０から２５．０×１０６であるかまたはそれを超える。Ｃｄ３４＋細胞は、形質導入のために細胞を捕捉するためのマーカーとして使用されるが、本明細書において記載されるものなどの他の細胞マーカーも使用することができる。例えば、特定のマーカーまたはマーカーの組み合わせの存在に基づいて単離される、使用される細胞としては、例えば、ＣＤ３４、ＣＤ４、Ｓｃａ−１  ＣＤ３８、ＣＤ１２３、ＣＤ９０、ＣＤ４５、ＣＤ１３３、抗原提示細胞マーカー（ＣＤ８、ＣＤ８アルファ、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ１０３、ＣＤ２０５、ＣＤ２４、ＣＤ１１５、ＣＤ１１７、ＣＤ１３５、ＣＤ１１ｃｌｏｗ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ１２３、ＩＬＴ−７、ＭＨＣクラスＩＩ、ＭＨＣクラスＩＩｌｏｗ、ＴＬＲ７、および／またはＴＲＬ９）が含まれる。一部の実施形態において、細胞は、特定のマーカー、例えば、ＣＤ３、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ５６、および／またはＣＤ６６ｂの不在に基づいて単離される。他の実施形態において、負の選択が、例えばＴ細胞、Ｂ細胞、顆粒球、および／または骨髄単球のマーカーについて行われる。一部の実施形態において、細胞は、単独のまたは任意の他のマーカーと組み合わされた、Ｔｈｙ−１の存在に基づいて単離される。一部の実施形態において、ＨＳＣは、Ｌｉｎ−Ｔｈｙ１＋Ｓｃａ−１＋発現プロファイルに基づいて単離される。一部の実施形態において、マウスＨＳＣは、発現プロファイルＣＤ３４−、Ｓｃａ１＋、ｃ−ｋｉｔ＋によって単離することができる。一部の実施形態において、ヒトＨＳＣは、ＣＤ３４の発現に基づいて単離することができる。一部の実施形態において、単離された細胞は、ＣＤ３４＋もしくはＣＤ４＋、またはこれらのあらゆる組み合わせである。
【００５８】
一部の実施形態において、本方法は、細胞回収物を遠心分離することを含む。これは、細胞に富んだペレットを例えば開発するために行われる。細胞は次いで、凍結保存溶液中に再懸濁され、凍結される。一部の実施形態において、凍結保存溶液は、ヘパリン化されたＰｌａｓｍａｌｙｔｅ溶液および１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）の溶液を含む。一部の実施形態において、細胞は、最初に−４℃で保管され、次いで、サンプルは、−１５６℃（蒸気相で保管される場合）から−１９６℃（液相で保管される場合）の標的温度にまで下げて凍結される。
【００５９】
一部の実施形態において、本方法は、単離された細胞に形質導入して、シクロホスファミドなどの化学療法剤に対して耐性とすることを含む。本明細書において記載するように、化学療法耐性は、ＡＬＤＨ１の発現によって達成される。ＡＬＤＨ１は、レンチウイルスベクターの使用などの、ベクター（本明細書全体を通して記載される）の使用を通して、選択された細胞に導入することができる。ＡＬＤＨ１は、細胞特異的であり得るプロモーターに機能可能に接続させることができる。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＤ３４プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、ｈＣＤ３４プロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、配列番号１２の配列を有する。一部の実施形態において、プロモーターは、配列番号８で提供されるようなｈＣＤ４プロモーターである。一部の実施形態において、ＡＬＤＨ１の配列は、配列番号１０で提供されるタンパク質として発現される。一部の実施形態において、ＡＬＤＨ１は、配列番号１の配列を含む核酸分子によってコードされる。遺伝子コードの縮重の性質に起因して、配列番号１の配列は非限定的な例として提供され、他の核酸分子も、配列番号１０を含むタンパク質の発現をコードするために使用される。一部の実施形態において、ＡＬＤＨ１は、ＡＬＤＨ１の機能を変化させない１〜１０個の保存的な置換を含む。一部の実施形態において、発現したＡＬＤＨ１は、配列番号１０に少なくとも９５％相同であるかまたは同一である。
【００６０】
ベクターにおけるＡＬＤＨ１の発現はまた、エンハンサーエレメントによっても駆動される。例えば、エンハンサーエレメントは、ＣＤ３Ｅエンハンサーであり得る。一部の実施形態において、ＣＤ３Ｅエンハンサーは、配列番号９の配列を含む。
【００６１】
一部の実施形態において、ＣＤ３４＋細胞は、磁気ビーズ分離によって単離することができる。レンチウイルスベクターを介するヒトＣＤ３４＋細胞の形質導入は、例えば、サイトカイン幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−３、フィブロネクチン、またはこれらのあらゆる組み合わせを添加した培地における細胞の２４時間の予備刺激を含み得る。一部の実施形態において、細胞は次いで、ＡＬＤＨ１を発現するレンチウイルスと接触させられる（感染させられる）。一部の実施形態において、ベクターは、配列番号２、配列番号４、または配列番号５の配列を含む。接触は、無血清Ｘ−Ｖｉｖｏ  １０培地において、サイトカインＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、およびＴＰＯ（それぞれ１００ｎｇ・ｍｌ−１）の存在下で行うことができる。細胞は次いで、場合により凍結されることも、または凍結されないこともある。一部の実施形態において、細胞は、ＡＡＶまたはＡＶベクターと接触させられない。
【００６２】
一部の実施形態において、本方法は、形質導入された細胞を対象に注入することを含む。一部の実施形態において、対象はＨＩＶを有している。一部の実施形態において、対象は、ＨＩＶを有していないがＨＩＶに罹るリスクが高く、したがって、ＨＩＶ耐性となることを希望している。
【００６３】
一部の実施形態において、修飾された細胞を注入した後、非骨髄破壊的な用量の、シクロホスファミドなどの化学療薬が投与される。一部の実施形態において、投薬量は、５０〜２００ｍｇの用量であり、１日に１回投与される。一部の実施形態において、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．１５ｍｇ／ｋｇ／日から２．５ｍｇ／ｋｇ／日未満、約０．４ｍｇ／ｋｇ／日から約１．７ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．８ｍｇ／ｋｇ／日から約１．５ｍｇ／ｋｇ／日である。一部の実施形態において、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．１５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．２ｍｇ／ｋｇ／日、約０．２５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．３ｍｇ／ｋｇ／日、約０．３５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．４ｍｇ／ｋｇ／日、約０．４５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．６５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．７ｍｇ／ｋｇ／日、約０．７５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．８５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．９ｍｇ／ｋｇ／日、約０．９５ｍｇ／ｋｇ／日、約１．０ｍｇ／ｋｇ／日、約１．１ｍｇ／ｋｇ／日、約１．２ｍｇ／ｋｇ／日、約１．３ｍｇ／ｋｇ／日、約１．４ｍｇ／ｋｇ／日、約１．５ｍｇ／ｋｇ／日、約１．６ｍｇ／ｋｇ／日、約１．７ｍｇ／ｋｇ／日、約１．８ｍｇ／ｋｇ／日、約１．９ｍｇ／ｋｇ／日、約２．０ｍｇ／ｋｇ／日、約２．１ｍｇ／ｋｇ／日、約２．２ｍｇ／ｋｇ／日、約２．３ｍｇ／ｋｇ／日、または約２．４ｍｇ／ｋｇ／日である。一部の実施形態において、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約１．３ｍｇ／ｋｇ／日である。一部の実施形態において、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．８ｍｇ／ｋｇ／日から約１．６ｍｇ／ｋｇ／日、約０．８ｍｇ／ｋｇ／日、約０．９８ｍｇ／ｋｇ／日、約１．３ｍｇ／ｋｇ／日、約１．５ｍｇ／ｋｇ／日、または約１．６ｍｇ／ｋｇ／日である。一部の実施形態において、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．５から約２ｍｇ／ｋｇ／日である。用量は、本明細書で示されるように投与することができる。いかなる特定の理論にも拘束されないが、グラフトを容易にするための１日に１回の経口シクロホスファミドは、遺伝子修飾された骨髄細胞を増大させる。修飾されたＣＤ３４＋細胞が注入される時点で患者がＨＩＶ＋であり得ることが考えられ、このケースでは、細胞は、ＨＩＶを処置および／もしくは治癒するために機能しており、または、修飾されたＣＤ３４＋細胞が注入される時点で患者がＨＩＶ−であり得ることが考えられ、このケースでは、細胞は、将来的なＨＩＶ感染を予防するために機能している。ＨＩＶ＋患者の処置についての非限定的な概略図が図９および図１０で示されるが、患者がＨＩＶ−でもあり得ることが理解される。
【００６４】
一部の実施形態において、対象はまた、修飾された細胞を注入する前にフルダラビンでも処置される。一部の実施形態において、回収後２日目（または移植前−５日目）に、患者は、５日間にわたり（移植前−１日目まで）フルダラビン（１５ｍｇ／ｍ２）で処置される。一部の実施形態において、フルダラビンに代わって、移植前−１日目に、患者を４ｍｇ／ｋｇのブスルファンで処置することができる。一部の実施形態において、患者は、移植前−２日目に、単回用量の１０００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドで処置される。しかし、細胞を注入した後、対象は、本明細書で示される非骨髄破壊的な用量のシクロホスファミドで処置される。
【００６５】
本明細書において記載するように、ベクターはまた、ｓｈＣＣＲ５または融合阻害剤、例えば、本明細書において記載されるＣ４４、Ｃ４６、もしくはその他を発現するものを含む他の発現カセットを含み得る。融合阻害剤は、ＧＰＩアンカーおよびＨＩＶ融合阻害剤の融合体であり得る。一部の実施形態において、融合阻害剤は、配列番号３の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態において、融合阻害剤は、配列番号１１のアミノ酸配列を含むタンパク質である。一部の実施形態において、融合阻害剤は、配列番号１４の核酸配列によってコードされる。一部の実施形態において、融合阻害剤は、配列番号１５のアミノ酸配列を含むタンパク質である。一部の実施形態において、融合阻害剤は、ＧＰＩアンカーによって膜に固定されている。一部の実施形態において、アンカーは、配列番号１６の配列を含む核酸分子によってコードされる。一部の実施形態において、アンカーは、配列番号１７の配列を含む。一部の実施形態において、融合体−アンカータンパク質は、ＩｇＧヒンジ領域を含む。一部の実施形態において、ＩｇＧヒンジ領域は、ＩｇＧ３である。一部の実施形態において、融合阻害剤タンパク質は、配列番号１９の配列を含む。一部の実施形態において、融合阻害剤タンパク質は、配列番号１８の配列を含む核酸分子によってコードされる。一部の実施形態において、アンカーは、ＧＰ４１である。
【００６６】
一部の実施形態において、融合阻害剤は、ＡＬＤＨ１プロモーターのものとは異なるプロモーターの制御下に置かれる。一部の実施形態において、プロモーターは、ＥＦＳプロモーターである。一部の実施形態において、プロモーターは、ＣＤ４プロモーター、例えば、本明細書において記載されるＣＤ４プロモーターである。
【００６７】
一部の実施形態において、本明細書において提供されるように細胞に形質導入されるベクターは、ＣＣＲ５の発現を低減させるまたは阻害するアンチセンス分子を発現した。一部の実施形態において、ベクターは、ｓｈＣＣＲ５阻害剤分子をコードする。一部の実施形態において、レンチウイルスベクターは、配列番号６のｈＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡのセンス配列、もしくはその相補体、および／または、配列番号７のｈＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡのアンチセンス配列、もしくはその相補体をコードする。一部の実施形態において、配列はまた、逆方向でもあり得る。一部の実施形態において、ベクターは、ｍｉｒ３０発現カセットを含む。一部の実施形態において、ｍｉｒ３０発現カセットは、ｈＣＣＲ５  ｓｈＲＮＡをコードする。一部の実施形態において、ｍｉｒ３０構築物は、配列番号１３の配列を含む。ＣＣＲ５の発現を阻害するために使用することができるアンチセンス分子は非限定的な例であり、ＣＣＲ５を標的化する他のアンチセンス分子も使用することができる。
【００６８】
したがって、一部の実施形態において、配列番号６、配列番号７、および／または配列番号１３の配列を含む核酸分子が提供される。
【００６９】
一部の実施形態において、本開示は、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１４、配列番号１７、配列番号１８、および／または配列番号１９を含むタンパク質を提供する。
【００７０】
一部の実施形態において、配列番号１もしくはその変異体、配列番号３もしくはその変異体、配列番号６もしくはその変異体、配列番号７もしくはその変異体、配列番号１３もしくはその変異体、配列番号１４もしくはその変異体、配列番号１６もしくはその変異体、配列番号１８もしくはその変異体、またはこれらのあらゆる組み合わせを含む核酸分子が提供される。一部の実施形態において、核酸分子は、配列番号１またはその変異体、配列番号６またはその変異体、配列番号７またはその変異体、ならびに配列番号３、配列番号１４、および配列番号１８の１つまたはそれ以上を含む。一部の実施形態において、配列番号２、ならびに配列番号１１、配列番号１５、および配列番号１９の１つまたはそれ以上を含むタンパク質をコードする核酸分子が提供される。
【００７１】
一部の実施形態において、本開示は、ＡＬＤＨ１もしくはその変異体、ｓｈＣＣＲ５分子もしくはその変異体、および／または固定された融合阻害剤を含む融合阻害剤をコードする核酸分子を提供する。
【００７２】
一部の実施形態において、単一のベクターなどの単一の核酸分子が、本明細書において提供される核酸分子またはタンパク質のそれぞれをコードするまたは発現するために使用される。一部の実施形態において、単一のレンチウイルスは、本明細書で提供される核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＡＬＤＨ１もしくはその変異体、ｓｈＣＣＲ５分子もしくはその変異体、および／または融合阻害剤のそれぞれをコードする単一の発現構築物を含むレンチウイルスが提供される。本明細書において記載される様々なエレメントを含むベクターの非限定的な例は、図４、図５、図６、図１１、および図１２で示されている。ＡＬＤＨ１、ｓｈＣＣＲ５、および融合阻害剤（固定された融合阻害剤を含む）をコードする核酸分子を機能可能に接続しているプロモーターおよび応答エレメントは、非限定的であり、他のプロモーターおよび応答エレメントも使用することができる。当業者には、説明される異なるプロモーターが互いに交換可能であることが理解される。
【００７３】
ウイルスベクターとして、またはレンチウイルスを形成するための基礎として使用することができる核酸配列の非限定的な例には、例えば、配列番号２、配列番号４、および配列番号５を含む核酸配列が含まれる。
【００７４】
一部の実施形態において、核酸分子は、ＡＬＤＨ１、ｓｈＣＣＲ５、および／または融合阻害剤タンパク質をコードする核酸分子に隣接する５’ＬＴＲおよび３’ＬＴＲを含む。疑問を残さないよう述べると、ｓｈＣＣＲ５配列および融合阻害剤配列は、ＡＬＤＨ１と共発現させるために使用される目的の他の配列に換えることができる。したがって、一部の実施形態において、核酸分子は、ＡＬＤＨ１をコードする配列と、例えばあらゆる他のタンパク質、アンチセンス、ｍｉＲＮＡ、または骨髄もしくは本明細書で提供される細胞型において発現させるために望ましい他の核酸分子であり得る、目的の配列とを含む。
【００７５】
したがって、一部の実施形態において、ＡＬＤＨ１および目的の分子を発現する細胞を個体に投与すること、ならびに非骨髄破壊的な用量の化学療法薬（例えば、シクロホスファミド）を対象に投与することを含む方法が提供される。
【００７６】
一部の実施形態において、ＡＬＤＨ１、およびｉ）少なくとも１つのＨＩＶ共受容体突然変異体、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の１つの突然変異もしくは複数の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ共受容体の発現を低減させる分子、またはこれらのあらゆる組み合わせをコードする異種ヌクレオチド分子の１つを異種発現している細胞の集団を対象に投与することを含む、対象においてＨＩＶを処置する方法が提供される。一部の実施形態において、本方法は、非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤を投与することを含む。一部の実施形態において、細胞は、対象にとって自家である。一部の実施形態において、細胞は、対象にとって同種である。一部の実施形態において、細胞は、ｓｈＣＣＲ５、ｓｈＣＸＣＲ４、および／またはＣ−ペプチド融合阻害剤を発現する。一部の実施形態において、細胞は、１、３、６、７、８、９、１２、１３、１４、１６、１８、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列を含む核酸分子を含む。一部の実施形態において、細胞は、配列番号１０、１１、６、７、１３、１５、１７、１９、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列をコードする核酸分子を含む。一部の実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋および／もしくはＣＤ４＋であるか、または本明細書において提供される他のものである。
【００７７】
一部の実施形態において、ＡＬＤＨ１および目的の分子を異種発現する細胞を対象に投与すること；ならびに非骨髄破壊的な用量のシクロホスファミドを投与することを含む、対象において目的の分子を発現させる方法が提供される。一部の実施形態において、細胞は、ＣＤ３４＋および／もしくはＣＤ４＋、または本明細書において提供される他のものである。一部の実施形態において、目的の分子は、ＣＣＲ５の発現を低減させる分子；ＣＸＣＲ４の発現を低減させる分子；Ｃ−ペプチド融合阻害剤の発現をコードする分子；またはこれらのあらゆる組み合わせである。一部の実施形態において、ＣＣＲ５の発現を低減させる目的の分子は、ｓｈＣＣＲ５である。一部の実施形態において、分子は、配列番号６および／または配列番号７を含むまたはコードする核酸分子を含む。一部の実施形態において、Ｃ−ペプチド融合阻害剤は、配列番号１１の配列、配列番号１５の配列、配列番号１９の配列、またはこれらのあらゆる組み合わせを含む。
【００７８】
様々な配列が本明細書で提供されることが理解される。正確な配列に加えて、開示される配列の変異体である配列もまた提供される。一部の実施形態において、言及された配列に対して少なくとも、約、または正確に７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９パーセントの相同性または同一性を有する配列が提供される。当業者には、２つのタンパク質または核酸の相同性を決定する方法が容易に理解される。例えば、相同性は、２つの配列をアラインして相同性がその最も高いレベルとなるようにした後に、計算することができる。一部の実施形態において、相同性の計算は、公開されたアルゴリズムによって行うことができる。比較のための配列の最適なアラインメントは、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎ  Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２（１９８１）の局所的相同性アルゴリズムによって、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈ、Ｊ．ＭｏＬ  Ｂｉｏｌ．４８：４４３（１９７０）の相同性アラインメントアルゴリズムによって、ＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：２４４４（１９８８）の類似性方法のためのサーチによって、これらのアルゴリズムのコンピュータ化された実装（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ｇｒｏｕｐ、５７５  Ｓｃｉｅｎｃｅ  Ｄｒ．，Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．における、ＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、およびＴＦＡＳＴＡ）によって、または検査によって、行うことができる。同一のタイプの相同性を、少なくとも核酸アラインメントに関する材料について参照によって本明細書に組み込まれる、例えばＺｕｋｅｒ，Ｍ．Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：４８〜５２頁、１９８９；Ｊａｅｇｅｒら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ８６：７７０６〜７７１０頁、１９８９；Ｊａｅｇｅｒら、Ｍｅｔｈｏｄｓ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８３：２８１〜３０６頁、１９８９において開示されているアルゴリズムによって、核酸について得ることができる。例えば、デフォルトの設定を使用したＢｌａｓｔｎまたはＢｌａｓｔＰを使用して、アメリカ国立生物工学情報センターによって維持されているウェブサイトを使用して２つの配列をアラインすることができる。
【００７９】
例えば、本明細書において使用される場合、別の配列に対して特定の相同性パーセントを有すると言及される配列は、上記の計算方法のいずれか１つまたはそれ以上によって計算された場合に言及された相同性を有する配列を指す。例えば、Ｚｕｋｅｒの計算方法を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算される場合、他の計算方法のいずれかによって計算すると第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有さないとしても、本明細書において定義されるところでは、第１の配列は、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有する。別の例として、Ｚｕｋｅｒの計算方法ならびにＰｅａｒｓｏｎおよびＬｉｐｍａｎの計算方法の両方を使用して第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算される場合、ＳｍｉｔｈおよびＷａｔｅｒｍａｎの計算方法、ＮｅｅｄｌｅｍａｎおよびＷｕｎｓｃｈの計算方法、Ｊａｅｇｅｒの計算方法、または他の計算方法のいずれかによって計算すると第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有さないとしても、本明細書において定義されるところでは、第１の配列は、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有する。さらに別の例として、計算方法の各々を使用して、第１の配列が第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有すると計算される場合、本明細書において定義されるところでは、第１の配列は、第２の配列に対して８０パーセントの相同性を有する（しかし、実際には、異なる計算方法では、相同性パーセンテージの異なる計算結果が生じることが多い）。
【００８０】
細胞および組成物
ある特定の実施形態において、開示された方法に関連する、上記の化学療法耐性の修飾された細胞、および開示された方法におけるこれらの細胞の使用が、本明細書において提供される。また、化学療法耐性を付与する１つまたはそれ以上の修飾を適切な細胞に組み込むことによって、および場合により、化学療法耐性に関連しない１つまたはそれ以上のさらなる修飾、例えばさらなるＨＩＶ／疾患特異的な修飾を組み込むことによって、これらの細胞を生成させる方法も提供される。
【００８１】
また、ある特定の実施形態において、本明細書において提供される少なくとも１つの化学療法耐性の修飾された細胞を含む、本明細書において提供される方法において使用するための組成物が含まれる、組成物が、本明細書において提供される。一部の実施形態において、組成物はさらに、薬学的に許容可能な賦形剤、希釈剤、担体、またはこれらのあらゆる組み合わせを含む。
【００８２】
組成物は、薬学的に許容可能な賦形剤、薬学的に許容可能な塩、希釈剤、担体、媒体、および当業者に周知のこのような他の不活性作用剤を含み得る。医薬調製物において一般に利用される媒体および賦形剤には、例えば、タルク、アラビアガム、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、ココアバター、水性または非水性溶媒、油、パラフィン誘導体、グリコールなどが含まれる。溶液は、水または生理学的に適合する有機溶媒、例えば、エタノール、１，２−プロピレングリコール、ポリグリコール、ジメチルスルホキシド、脂肪族アルコール、トリグリセリド、グリセリンの部分エステル、およびそれに類するものを使用して調製することができる。組成物は、無菌の等張生理食塩水、水、１，３−ブタンジオール、エタノール、１，２−プロピレングリコール、水と混合したポリグリコール、リンゲル液などが含まれる、従来の技術を使用して調製することができる。一態様において、着色剤は、組成物の位置を確認すること、および組成物を意図した処置部位に正確に置くことを容易にするために添加される。
【００８３】
組成物は、防腐剤および／または安定剤を含み得る。防腐剤の非限定的な例としては、メチルパラベン、エチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、安息香酸、ソルビン酸、ソルビン酸カリウム、プロピオン酸、塩化ベンザルコニウム、ベンジルアルコール、チメロサール、フェニル水銀塩、クロルヘキシジン、フェノール、３−クレゾール、四級アンモニウム化合物（ＱＡＣ）、クロルブタノール、２−エトキシエタノール、およびイミド尿素が含まれる。
【００８４】
張性を調節するために、組成物は、ナトリウム塩などの生理学的な塩を含み得る。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、これは、１から２０ｍｇ／ｍｌの間で存在し得る。存在し得る他の塩には、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム、および塩化カルシウムが含まれる。
【００８５】
組成物は、１つまたはそれ以上のバッファーを含み得る。典型的なバッファーとしては：リン酸バッファー；トリスバッファー；ホウ酸バッファー；コハク酸バッファー；ヒスチジンバッファー；またはクエン酸バッファーが含まれる。バッファーは、典型的には、５〜２０ｍＭの範囲の濃度で含まれる。組成物のｐＨは、一般に、５から８の間、さらに典型的には６から８の間、例えば６．５から７．５の間、または７．０から７．８の間である。
【００８６】
一部の実施形態において、組成物は、凍結保護剤を含み得る。凍結保護剤の非限定的な例としては、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコール、およびグリセリン）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ホルムアミド、ショ糖、トレハロース、デキストロース、およびこれらのあらゆる組み合わせが含まれる。
【００８７】
一実施形態において、細胞は、培養された細胞の集団の一部である（すなわち、インビトロ）。別の実施形態において、細胞は、対象の細胞の集団の一部である（すなわち、インビボ）。例えば、修飾された細胞および／または非骨髄破壊的な用量の化学療法剤は、ＨＩＶまたは目的の疾患を処置または予防する目的で、インビボの細胞に、または対象内の組織もしくは器官を形成するインビボの細胞の集団に送達される。あるいは、修飾された細胞および／または非骨髄破壊的な用量の化学療法剤は、特定のタイプの細胞に対するその影響を研究するための実験を行う目的で、培養された細胞または培養された細胞の集団に送達される。
【００８８】
組成物は、インプラント可能な装置に含めることができる。本発明によって検討される適切なインプラント可能な装置としては、血管内のステント（例えば、自己拡張型のステント、バルーン拡張型のステント、およびステントグラフト）、足場、グラフト、およびそれに類するものが含まれる。このようなインプラント可能な装置は、少なくとも片面を、ＨＩＶもしくは他の疾患を処置もしくは予防し得る組成物で被覆するか、またはＨＩＶもしくは他の疾患を処置もしくは予防し得る組成物を含浸させることができる。
【００８９】
配列が本明細書において参照され、以下の表またはそれと同等のものにおける配列が参照される：
【００９０】
【表１】
2021503015.tif 000003
【表２】
2021503015.tif 000004
【表３】
2021503015.tif 000005
【表４】
2021503015.tif 000006
【表５】
2021503015.tif 000007
【表６】
2021503015.tif 000008
【表７】
2021503015.tif 000009
【表８】
2021503015.tif 000010
【表９】
2021503015.tif 000011
【表１０】
2021503015.tif 000012
【表１１】
2021503015.tif 000013
【表１２】
2021503015.tif 000014
【表１３】
2021503015.tif 000015
【００９１】
組成物は、任意の適切な様式および経路によって対象に投与することができる。非限定的な例には、内部経路、肺経路、直腸経路、鼻経路、膣経路、舌経路、静脈内経路、動脈内経路、筋肉内経路、腹腔内経路、皮内経路、および皮下経路が含まれる。組成物はまた、クリーム、ゲル、またはパッチの一部として、経皮送達に適している。他の投薬形態としては、錠剤；カプセル；ピル；粉末；エアロゾル；坐剤；非経口投与薬；ならびに懸濁液、溶液、およびエマルジョンを含む経口液体が含まれる。持続放出投薬形態もまた使用することができる。非骨髄破壊的な用量の化学療法薬は、経口的に、または本明細書において提供される他の方法で投与することができる。
【００９２】
一部の実施形態において、本明細書において提供される実施形態はまた、限定はしないが、以下のものを含む：
【００９３】
１．患者において骨髄移植を行うための方法であって、シクロホスファミド耐性の修飾された細胞の集団および非骨髄破壊的な少なくとも１用量のシクロホスファミドを患者に投与することを含む前記方法。
【００９４】
２．シクロホスファミド耐性の修飾された細胞の集団は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）をコードする異種遺伝子を含む、実施形態１の方法。
【００９５】
３．シクロホスファミド耐性の修飾された細胞の集団はＡＬＤＨ１を発現する、実施形態１の方法。
【００９６】
４．シクロホスファミド耐性の修飾された細胞のシクロホスファミド耐性は、アルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）の発現によって付与される、実施形態１の方法。
【００９７】
５．患者の骨髄の５０％超が、６カ月間以内に、シクロホスファミド耐性の修飾された細胞またはそれに由来する細胞で置き換えられる、実施形態１〜４のいずれか１つの方法。
【００９８】
６．患者はＨＩＶを有する、実施形態１〜５のいずれか１つの方法。
【００９９】
７．修飾された細胞のシクロホスファミド耐性は一過性である、実施形態１〜６のいずれか１つの方法。
【０１００】
８．細胞は幹細胞または免疫細胞である、実施形態１〜７のいずれか１つに記載の方法。
【０１０１】
９．幹細胞は、胎性幹細胞、臍帯血由来の幹細胞、造血幹細胞（ＨＳＣ）、多能性幹細胞（ＰＳＣ）、人工ＰＳＣ（ｉＰＳＣ）、胚性幹細胞（ＥＳＣ）、または、ＣＤ３４＋細胞、ＣＤ９０＋細胞、ＣＤ４５＋細胞、ＣＤ１７＋細胞、ＣＤ４５ＲＡ−細胞、ＣＤ３８−などの、これらに由来する細胞、またはこれらのあらゆる組み合わせである、実施形態８の方法。
【０１０２】
１０．免疫細胞はＴ細胞である、実施形態８の方法。
【０１０３】
１１．修飾された細胞は、患者にとって自家である、患者にとって同種である、またはこれらの組み合わせである、実施形態１〜１０のいずれか１つの方法。
【０１０４】
１２．未修飾の細胞を、ＡＬＤＨ１の発現をコードする発現ベクターと接触させて、シクロホスファミド耐性の修飾された細胞を生産することをさらに含む、実施形態１〜１１のいずれか１つの方法。
【０１０５】
１３．発現ベクターはウイルスベクターまたは非ウイルスベクターである、実施形態１２の方法。
【０１０６】
１４．ウイルスベクターはレンチウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターである、実施形態１３の方法。
【０１０７】
１５．発現ベクターは、レトロウイルス、トランスポゾン、エピソーム性の発現ベクター、修飾されたＲＮＡ、プラスミド、またはこれらのあらゆる組み合わせである、実施形態１２の方法。
【０１０８】
１６．非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤は、修飾された細胞を投与した後に投与される、実施形態１〜１５のいずれか１つの方法。
【０１０９】
１７．化学療法剤の非骨髄破壊的な少なくとも１用量は、シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量である、実施形態１〜１６のいずれか１つの方法。
【０１１０】
１８．シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．１６ｍｇ／ｋｇ／日から２．５ｍｇ／ｋｇ／日未満である、実施形態１７の方法。
【０１１１】
１９．シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．４１ｍｇ／ｋｇ／日から約１．６３ｍｇ／ｋｇ／日である、実施形態１７の方法。
【０１１２】
２０．シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約０．８１ｍｇ／ｋｇ／日から約１．４６ｍｇ／ｋｇ／日である、実施形態１７の方法。
【０１１３】
２１．シクロホスファミドの非骨髄破壊的な用量は、約１．３ｍｇ／ｋｇ／日である、実施形態１７の方法。
【０１１４】
２２．患者は、１００ｍｇ／ｍ２／日の用量のシクロホスファミドを１〜１４日間の連続する日数にわたって投与されない、実施形態１７〜２１のいずれか１つの方法。
【０１１５】
２３．患者は、５〜７ｇ／ｍ２の用量のシクロホスファミドを１２〜２４時間にわたって投与されない、実施形態１７〜２２のいずれか１つの方法。
【０１１６】
２４．非骨髄破壊的な化学療法剤は、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも３週間、少なくとも１カ月間、少なくとも２カ月間、少なくとも３カ月間、少なくとも４カ月間、少なくとも５カ月間、または少なくとも６カ月間にわたり毎日投与される、実施形態１〜２３のいずれか１つに従った方法。
【０１１７】
２５．シクロホスファミド耐性の修飾された細胞の投与と非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤の投与との間のある期間にわたり、非骨髄破壊的な用量の化学療法剤を投与しないことをさらに含む、実施形態１〜２４のいずれか１つに従った方法。
【０１１８】
２６．期間は、約３日間、約７日、約１０日間、および約１４日間からなる群から選択される、実施形態２５の方法。
【０１１９】
２７．患者の骨髄の約６０％超、約７０％超、約８０％超、約９０％超、約９５％超、または１００％が、修飾された細胞で置き換えられる、実施形態１〜２６のいずれか１つの方法。
【０１２０】
２８．患者は、非骨髄破壊的な少なくとも１用量の化学療法剤を投与した結果、骨髄破壊される、および／または免疫不全となることはない、実施形態１〜２７のいずれか１つに記載の方法。
【０１２１】
２９．患者は、臨床的に関連する貧血、好中球減少、血小板減少、汎血球減少、低血小板、低白血球、またはこれらのあらゆる組み合わせもしくは関連する症状を経験しない、実施形態１〜２８のいずれか１つに記載の方法。
【０１２２】
３０．事前調整工程は細胞を投与する前に行われる、実施形態１〜２９のいずれか１つに記載の方法。
【０１２３】
３１．事前調整工程は、非骨髄破壊的な化学療法事前調整工程である、実施形態３０の方法。
【０１２４】
３２．修飾された細胞はＨＩＶ感染に対して耐性である、実施形態１〜３１のいずれか１つに記載の方法。
【０１２５】
３３．修飾された細胞は、ＨＩＶ感染に対して耐性の少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の１つの突然変異もしくは複数の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ共受容体の発現を低減させる分子、またはこれらのあらゆる組み合わせを異種発現する、実施形態３２の方法。
【０１２６】
３４．修飾された細胞は、ｓｈＣＣＲ５、ｓｈＣＸＣＲ４、Ｃ−ペプチド融合阻害剤、またはこれらのあらゆる組み合わせを異種発現する、実施形態３２の方法。
【０１２７】
３５．修飾された細胞はＨＩＶ共受容体を発現しない、実施形態３２の方法。
【０１２８】
３６．修飾された細胞は、ＣＣＲ５、ＣＸＣＲ４を発現しないか、またはＣＣＲ５−Δ３２を発現するか、またはこれらの組み合わせである、実施形態３２の方法。
【０１２９】
３７．ＡＬＤＨ１、ならびに
ｉ）少なくとも１つのＨＩＶ共受容体突然変異体、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の１つの突然変異もしくは複数の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ共受容体の発現を低減させる分子、もしくはこれらのあらゆる組み合わせをコードする異種ヌクレオチド分子；および／またはｉｉ）内因性のＨＩＶ共受容体の突然変異もしくは欠失の１つ
の発現をコードする異種ヌクレオチド分子を含む細胞。
【０１３０】
３８．細胞は、ｉ．ＣＣＲ５の発現を低減させる分子をコードする；ｉｉ．ＣＸＣＲ４の発現を低減させる分子をコードする；ｉｉｉ．Ｃ−ペプチド融合阻害剤の発現をコードする；ｉｖ．１、３、６、７、８、９、１２、１３、１４、１６、１８、もしくはこれらのあらゆる組み合わせの配列を含む；ｖ．配列番号１０、１１、６、７、１３、１５、１７、１９、もしくはこれらのあらゆる組み合わせの配列をコードする；またはこれらのあらゆる組み合わせである異種ヌクレオチド配列を含む、実施形態３７の細胞。
【０１３１】
３９．ｓｈＣＣＲ５、ｓｈＣＸＣＲ４、および／またはＣ４４などのＣ−ペプチド融合阻害剤を発現する、実施形態３７または３８の細胞。
【０１３２】
４０．非ウイルス遺伝子移入系を用いて、異種ヌクレオチド配列を発現するように修飾されている、実施形態３７の細胞。
【０１３３】
４１．非ウイルス遺伝子移入系はトランスポゾン遺伝子移入系である、実施形態４０の細胞。
【０１３４】
４２．トランスポゾン遺伝子移入系は、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ遺伝子移入系またはＰｉｇｇｙＢａｃトランスポゾン遺伝子移入系である、実施形態３７の細胞。
【０１３５】
４３．配列番号４の異種核酸配列を含む、実施形態３７〜４２のいずれか１つの細胞。
【０１３６】
４４．実施形態３７〜４３のいずれか１つの１つまたはそれ以上の細胞を含む組成物。
【０１３７】
４５．ＡＬＤＨ１、および
ｉ）少なくとも１つのＨＩＶ共受容体突然変異体、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の１つの突然変異もしくは複数の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ共受容体の発現を低減させる分子、またはこれらのあらゆる組み合わせをコードする異種ヌクレオチド分子の１つ
をコードする核酸分子。
【０１３８】
４６．異種ヌクレオチド配列は、ｉ．ＣＣＲ５の発現を低減させる、ｉｉ．ＣＸＣＲ４の発現を低減させる；Ｃ−ペプチド融合阻害剤の発現をコードする；またはこれらのあらゆる組み合わせである分子をコードする、実施形態４５の核酸分子。
【０１３９】
４７．核酸分子は、ｓｈＣＣＲ５、ｓｈＣＸＣＲ４、および／またはＣ−ペプチド融合阻害剤の発現をコードする、実施形態４５または４６の核酸分子。
【０１４０】
４８．分子は、１、３、６、７、８、９、１２、１３、１４、１６、１８、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列を含む、実施形態４５の核酸分子。
【０１４１】
４９．分子は、配列番号１０、１１、６、７、１３、１５、１７、１９、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列をコードする核酸分子を含む、実施形態４５の核酸分子。
【０１４２】
５０．実施形態４５〜４９のいずれか１つの核酸分子を含むベクター。
【０１４３】
５１．レンチウイルスを生産するために使用することができるベクターである、実施形態５０のベクター。
【０１４４】
５２．レンチウイルスベクターである、実施形態５０のベクター。
【０１４５】
５３．配列番号１、３、６、７、８、９、１２、１３、１４、１６、１８、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列を含む、実施形態５０のベクター。
【０１４６】
５４．配列番号１０、１１、６、７、１３、１５、１７、１９、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列をコードする核酸分子を含む、実施形態５０のベクター。
【０１４７】
５５．ＡＬＤＨ１、および
ｉ）少なくとも１つのＨＩＶ共受容体突然変異体、少なくとも１つのＨＩＶ共受容体の１つの突然変異もしくは複数の突然変異、少なくとも１つのＨＩＶ融合阻害剤、ＨＩＶ共受容体の発現を低減させる分子、またはこれらのあらゆる組み合わせをコードする異種ヌクレオチド分子の１つ
を異種発現する細胞の集団；ならびに
少なくとも１つの非骨髄破壊的な用量の化学療法剤
を対象に投与することを含む、対象においてＨＩＶを処置する方法。
【０１４８】
５６．細胞は、ｓｈＣＣＲ５、ｓｈＣＸＣＲ４、および／またはＣ−ペプチド融合阻害剤を発現する、実施形態５５の方法。
【０１４９】
５７．細胞は、１、３、６、７、８、９、１２、１３、１４、１６、１８、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列を含む核酸分子を含む、実施形態５５の方法。
【０１５０】
５８．細胞は、配列番号１０、１１、６、７、１３、１５、１７、１９、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列をコードする核酸分子を含む、実施形態５５の方法。
【０１５１】
５９．ＡＬＤＨ１および目的の分子を異種発現する細胞を対象に投与すること；ならびに非骨髄破壊的な用量のシクロホスファミドを投与することを含む、対象において目的の分子を発現させる方法。
【０１５２】
６０．細胞は、ＣＤ３４＋および／もしくはＣＤ４＋、または本明細書において提供される他のものである、実施形態５９の方法。
【０１５３】
６１．目的の分子は、ＣＣＲ５の発現を低減させる；ＣＸＣＲ４の発現を低減させる；Ｃ−ペプチド融合阻害剤の発現をコードする；またはこれらのあらゆる組み合わせであるものである、実施形態５９の方法。
【０１５４】
６２．ＣＣＲ５の発現を低減させる目的の分子は、ｓｈＣＣＲ５である、実施形態６１の方法。
【０１５５】
６３．分子は、配列番号６および／または配列番号７を含むまたはコードする核酸分子を含む、実施形態６２の方法。
【０１５６】
６４．Ｃ−ペプチド融合阻害剤は、配列番号１１、１５、１９、またはこれらのあらゆる組み合わせの配列を含む、実施形態６１の方法。
【０１５７】
以下の実施例は例示的なものであるが、本明細書において記載される化合物、組成物、および方法を限定するものではない。当業者に知られている他の適切な修正および適合は、以下の実施形態の範囲内である。
【実施例１】
【０１５８】
マウスにおける自家骨髄移植におけるグラフトの効率
方法
骨髄の単離。骨髄を、０．５ｍＭのＥＤＴＡ、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、および抗生物質を含有するイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）を用いて、８から１６週齢の同系ドナーマウスの大腿骨および脛骨から流し出した。細胞を、５ｍＭのＥＤＴＡおよびウシ血清アルブミンを含有するバッファー（リン酸緩衝生理食塩水［ＰＢＳ］）で洗浄した。
【０１５９】
骨髄の形質導入。マウス骨髄細胞に、ＥＧＰＦのみを発現するレンチウイルスベクター（すなわち、ｐＬＶ−Ｐｕｒｏ−ＥＦ１Ａ−ＥＧＦＰ（「コントロールベクター」））、またはＥＧＦＰおよびヒトＡＬＤＨ１Ａを発現するレンチウイルスベクター（すなわち、ｐＬＶ−Ｐｕｒｏ−ＥＦ１Ａ−ＥＧＦＰ−ｈＡＬＤＨ１Ａ、図４、配列番号２（「試験ベクター」））によりＭＯＩ  １０で形質導入した。形質導入の４８時間後、形質導入の効率を判定した。細胞を次いで、放射線照射したマウスに、以下に記載するように移植した。
【０１６０】
移植。同系のレシピエントマウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を、−５日目および−４日目に０．５ｍｇ／ｋｇのフルダラビンで、−２日目にシクロホスファミドで、ならびに−１日目にブスルファンで前処置した。移植の日（０日目）に、マウスを麻酔し、マウス当たり、１００μｌのＩＭＤＭ中の４×１０６個の骨髄細胞を、尾静脈注射によって移植した。移植物の造血の回復を、ＧＦＰのＦＡＣＳ分析によってモニタリングした。
【０１６１】
シクロホスファミドでの処置。移植の７日後、マウスに、異なる用量のＣＴＸ：０ｍｇ／ｋｇ（「０ｍｇ／ｋｇの移植後ＣＴＸ」）、１６ｍｇ／ｋｇ（「１６ｍｇ／ｋｇの移植後ＣＴＸ」）、または３０ｍｇ／ｋｇ（「３０ｍｇ／ｋｇの移植後ＣＴＸ」）を、１日に１回、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射した。この研究の間、処置は、５週間のＣＴＸ、１週間のＣＴＸなし、その後の１週間のＣＴＸ処置、すなわち、全部で６週間のＣＴＸ処置を含んでいた。
【０１６２】
末梢血のＧＦＰ分析。各マウスの５０マイクロリットルの末梢血を、眼窩後から、または尾静脈から回収し、０．５ｍＭのＥＤＴＡを含有する１ｍｌのＰＢＳと混合した。細胞を赤血球溶解させ、ＰＢＳ中で洗浄し、次いで４００ｕｌのＰＢＳ中でさらに希釈した。生きたＧＦＰ＋顆粒球のパーセンテージを、フローサイトメーターを使用して分析した。
【０１６３】
骨髄の末端分析。ＣＴＸ処置の６週間後、動物を屠殺し、骨髄中のＧＦＰ＋細胞のパーセンテージを、フローサイトメトリーによって評価した。顆粒球／好中球を、従来の前方散乱対側方散乱の分散を使用して同定し、これにおいて、細胞を、光の反射に従って、サイズおよび内部の複雑性（粒度）によってそれぞれプロットした。移植後のＣＴＸ処置がない群の各々ではｎ＝３であり、全ての他の群ではｎ＝６であった。６週間後、血中の白血球数を各マウスについて判定した。結果は、ＣＴＸで処置した群のそれぞれにおける外れ値の存在を示し、これらのデータは、統計分析では除かれた。したがって、移植後のＣＴＸ処置がない群の各々ではｎ＝３であり、全ての他の群ではｎ＝５であった。
【０１６４】
結果および考察
移植後の骨髄の再生着を観察する場合、末梢血は移植の成功の指標を提供し得るが、骨髄は異なる寿命を有する様々な免疫細胞を生じさせるため、移植を行う前の免疫細胞の細胞の複雑性を理解することが必要である。例えば、リンパ球の寿命は１８０日間程度であり得るが、好中球の寿命はほんの５〜７日である。さらに、単球は、末梢においてはほんの数日間しか生きることができないが、単球は組織常在性となることもでき、その寿命を数カ月間まで延ばすことができる。したがって、ドナー骨髄の再構成についてリンパ球集団を分析しようとする場合、ドナーの移植前のリンパ球の全てが死滅するまで、すなわちこの手順の６カ月間後まで、正確な反映は得られない。レシピエント細胞の骨髄グラフトの、より「リアルタイムな」読み取りを提供するために、顆粒球集団は、最良の指標を提供する。ドナーの移植前の好中球の全てが７日以内に死滅するため、移植後２週目に、これらの細胞は、骨髄環境およびレシピエント移植の成功の最も直接的な反映であり、これはまた、グラフト率を反映する形質導入された好中球のパーセンテージを同定することによっても測定することができる。
【０１６５】
上記の方法に従って、研究の２３日目、３５日目、および４２日目（それぞれＣＴＸ投与の１６日目、２８日目、および３５日目）に、眼窩後方から出血させることによって血液を回収し、各マウスの末梢血中のＧＦＰ＋顆粒球のパーセンテージをフローサイトメトリーによって評価した。
【０１６６】
結果は、全てのマウス群が生きたＧＦＰ＋顆粒球を含有していることを示した（図１）。さらに、研究の４２日目に、試験ベクターにより形質導入された骨髄細胞（すなわち、ＥＧＦＰ＋ＡＬＤＨ１Ａ１を発現する細胞）を投与され、１６ｍｇ／ｋｇ／日のＣＴＸで処置されたマウスは、試験ベクターにより形質導入された骨髄細胞を投与され、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＣＴＸで処置されたマウスと比較して、生きたＧＦＰ＋顆粒球の類似のパーセンテージを示した（図１、「試験ベクター、１６ｍｇ／ｋｇの移植後ＣＴＸ」と「試験ベクター、３０ｍｇ／ｋｇの移植後ＣＴＸ」とを比較されたい）。
【０１６７】
６週間後、結果は、総ＧＦＰ＋細胞（生きた細胞および死細胞）の存在を実証した（図２Ａ）。グラフトは、生きたＧＦＰ＋顆粒球／好中球集団のパーセンテージによって示された（図２Ｂ）。驚くべきことに、試験ベクターにより形質導入された骨髄細胞（すなわち、ＥＧＦＰ＋ＡＬＤＨ１Ａ１を発現する）を投与され、非骨髄破壊的な１６ｍｇ／ｋｇ／日のＣＴＸで処置されたマウスと、試験ベクターにより形質導入された骨髄細胞を投与され、骨髄破壊的な３０ｍｇ／ｋｇ／日のＣＴＸで処置されたマウスとの両方が、４０％を超える類似のグラフトを実証した（図２Ｂ、「試験ベクター、１６ｍｇ／ｋｇのｐ．ｔ．移植後ＣＴＸ」と「試験ベクター、３０ｍｇ／ｋｇのｐ．ｔ．移植後ＣＴＸ」とを比較されたい）。さらに、試験ベクターにより形質導入された骨髄細胞を投与され、１６ｍｇ／ｋｇ／日のＣＴＸで処置されたマウスは、コントロールベクターにより形質導入された骨髄細胞を投与され、同用量のＣＴＸ（すなわち、１６ｍｇ／ｋｇ／日のＣＴＸ）で処置されたマウスと比較して、有意に高いグラフトパーセンテージを有していた（図２Ｂ、「試験ベクター、１６ｍｇ／ｋｇのｐ．ｔ．移植後ＣＴＸ」と「コントロールベクター、１６ｍｇ／ｋｇのｐ．ｔ．移植後ＣＴＸ」とを比較されたい）。
【０１６８】
白血球（ＷＢＣ）は、身体に侵入する外来因子の攻撃による感染との闘いを助ける。ＷＢＣ数は、隠れた感染および／または感染に対する感受性を検出するために役立ち得る。末梢血中のＷＢＣ数が、６週間のＣＴＸ処置後に、各研究群について判定された。図３において示されるように、コントロールベクターまたは試験ベクターのいずれかにより形質導入された骨髄細胞を投与され、ＣＴＸ処置をされなかったマウスは、正常な範囲内のＷＢＣ数を有していた。各ＣＴＸ処置群で１つの外れ値があり、これは、統計分析では除去された。高い、正常な、および低いＷＢＣの範囲は、Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｍｏｄｅｌｓ（ＢＡＬＢ／Ｃ  Ｍｏｕｓｅ  Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ、Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｏｎｉｅｓ、２００８年１月〜２０１２年１２月）、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ。ｃｒｉｖｅｒ．ｃｏｍ／ｆｉｌｅｓ／ｐｄｆｓ／ｒｍｓ／ｂａｌｂｃ／ｒｍ＿ｒｍ＿ｒ＿ｂａｌｂ−ｃ＿ｍｏｕｓｅ＿ｃｌｉｎｉｃａｌ＿ｐａｔｈｏｌｏｇｙ＿ｄａｔａ．ａｓｐｘにおいてオスのマウスについて提供されている、当技術分野における既知の範囲に従っている。特に、試験ベクターにより形質導入された骨髄細胞を投与され、１６ｍｇ／ｋｇ／日のＣＴＸで処置されたマウスは、試験ベクターにより形質導入された骨髄細胞を投与され、３０ｍｇ／ｋｇ／日のＣＴＸで処置されたマウスと比較して、有意に多くの数のＷＢＣを有していた（図３、「試験ベクター、１６ｍｇ／ｋｇのｐ．ｔ．移植後ＣＴＸ」と「試験ベクター、３０ｍｇ／ｋｇのｐ．ｔ．移植後ＣＴＸ」とを比較されたい）。
【実施例２】
【０１６９】
インビボでのヒト化マウスの研究♯１
幹細胞の精製。ヒトＰＢＭＣを、５ｍｃｇ／ｋｇ／日の顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）で５日間処置した健康なドナーから回収し、その後、白血球除去療法を５日目および６日目に行った。患者に１０μｇ／ｋｇのフィルグラスチムまたはＧ−ＣＳＦのレジメンを行って、ＣＤ３４＋幹細胞を単離のために骨髄から末梢に動員した。末梢血中のＣＤ３４＋細胞数が体重１ｋｇ当たり１０．０から２０．０×１０６個を超えたら、アフェレーシスを行った。ＣＤ３４＋を、正の選択による濃縮を使用して精製し、その後、磁気ビーズ単離を行った。サンプルを、２％ＦＢＳを含有するＰＢＳ中で洗浄し、遠心分離し、ＰＢＳ中に再懸濁した。ＣＤ３４＋細胞を次いで、ＣＤ３４の染色によるＦＡＣＳ分析によって純度について試験し、生存能力をトリパンブルー染色によって評価した。細胞を次いで、マウスにすぐに移植した。ヘルシンキ宣言のプロトコルに準拠した適切な書面によるインフォームドコンセントを、回収の前に、ドナーから得た。
【０１７０】
ＮＯＧマウスへのヒトＨＳＣの移植。成体マウスは、１０〜１２週齢のＮＯＧマウスであった。新生児マウスでは、誕生の１〜２日後のマウスを使用した。マウスを、成体マウスでは２〜２．５Ｇｙで、新生児では１Ｇｙで、ＳＰＦ条件下で、細胞移入の１日前に放射線照射した。１８ｇ未満の体重のマウスは、この用量の放射線照射で死亡することがある。成体マウスでは、細胞懸濁液０．２５ｍＬ（１〜０．５×１０４個）を、イソフルランでわずかに麻酔しながら、２７Ｇの針を有する１ｍＬのシリンジまたは２９Ｇの針を有するマイクロインジェクターシリンジを用いて、尾静脈を介してマウスに注射した。
【０１７１】
幹細胞の形質導入。同一のドナーのＣＤ３４＋細胞を、フィブロネクチンで被覆された試験管内の、幹細胞因子（ＳＣＦ）１００ｎｇ／ｍｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびＦｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した、および場合によりＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、またはこれらのあらゆる組み合わせを添加した、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １０培地（Ｌｏｎｚａ）において、１６時間、３７℃および５％ＣＯ２で、１×１０６個細胞／ｍｌで培養した。予備刺激培地を次いで除去し、ＭＯＩ  ２とＭＯＩ  ５０との間の感染多重度（ＭＯＩ）に相当する、１．３５×１０８ｔｕ／ｍｌのベクター（「コントロールベクター」＝ｐＬＶ−Ｐｕｒｏ−ＥＦ１Ａ−ＥＧＦＰ、または「試験ベクター」＝配列番号４、図５）、および４ｍｇ／ｍｌのプロタミンスルフェート（Ｓｉｇｍａ、Ｓａｉｎｔ  Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）をさらに含有する、新鮮な培養培地を添加した。この形質導入混合物を、１２時間から４８時間の間、インキュベーターに戻した。形質導入された細胞を、トリプシン（Ｌｏｎｚａ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、ＭＤ）で剥離させ、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、そしてマウスにすぐに移植した（放射線照射を伴わずに、上記のように）。
【０１７２】
末梢血のＧＦＰ分析、ならびに脾臓、血液、および骨髄の末端分析を、上記のように行った。研究の概略図を図８に示すが、この描写は例示する目的のものにすぎず、他の研究設計も使用することができる。
【実施例３】
【０１７３】
インビボでのヒト化マウスの研究♯２
幹細胞の精製。ヒトＰＢＭＣを、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）（Ａｍｇｅｎ、Ｔｈｏｕｓａｎｄ  Ｏａｋｓ、ＣＡ）５ｍｃｇ／ｋｇ／日で５日間処置した健康なドナーから回収し、その後、白血球除去療法を５日目および６日目に行った。ＣＤ３４＋を、免疫磁気ビーズを使用する正の選択によって精製した。サンプルを、０．５％ＨＳＡを含有するＰＢＳ中で洗浄し、遠心分離し、ＰＢＳ中に再懸濁した。ＣＤ３４＋細胞を次いで、ＣＤ３４の染色によるフローサイトメトリー分析によって純度について試験し、生存能の染色を行った。細胞を次いで、マウスにすぐに移植した。ヘルシンキ宣言のプロトコルに準拠した適切な書面によるインフォームドコンセントを、回収の前に、ドナーから得た。
【０１７４】
ＮＯＧマウスへのヒトＨＳＣの移植。成体マウスでは、１０〜１２週齢のＮＯＧマウスを使用した。新生児マウスでは、誕生の１〜２日後のマウスを使用した。マウスを、成体マウスでは２〜２．５Ｇｙで、新生児では１Ｇｙで、ＳＰＦ条件下で、細胞移入の１日前に放射線照射した。１８ｇ未満の体重のマウスは、この用量の放射線照射で死亡することがある。成体マウスでは、細胞懸濁液０．２５ｍＬ（１〜０．５×１０４個）を、２７Ｇを有する１ｍＬのシリンジを用いて、尾静脈を介してマウスに注射した。
【０１７５】
幹細胞の形質導入。同一のドナーのＣＤ３４＋細胞を、フィブロネクチンで被覆された試験管内の、幹細胞因子（ＳＣＦ）１００ｎｇ／ｍｌ、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびＦｍｓ様チロシンキナーゼ３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ、Ｆｒｅｉｂｅｒｇ、Ｇｅｒｍａｎｙ）を添加した、および場合によりＩＬ−３およびＩＬ−６を添加した、Ｘ−Ｖｉｖｏ  １０培地（Ｌｏｎｚａ）において、１６時間、３７℃および５％ＣＯ２で、１×１０６個細胞／ｍｌで培養した。予備刺激培地を次いで除去し、ＭＯＩ  ２とＭＯＩ  ５０との間の感染多重度（ＭＯＩ）に相当する、１．３５×１０８ｕｌ／ｍｌのベクター（「コントロールベクター」＝ｐＬＶ−Ｐｕｒｏ−ＥＦ１Ａ−ＥＧＦＰ、または「試験ベクター」）をさらに含有する、新鮮な培養培地を添加した。適切な「試験ベクター」は、以下のいずれか１つまたは組み合わせを含んでいた：
【０１７６】
【表１４】
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【０１７７】
この形質導入混合物を、１２時間から４８時間の間、インキュベーターに戻した。形質導入された細胞を採取し、洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、そしてマウスにすぐに移植した（放射線照射を伴わずに、上記のように）。
【０１７８】
末梢血のＧＦＰ分析、ならびに脾臓、血液、および骨髄の末端分析を、上記のように行った。研究の概略図を図８に示すが、この描写は例示する目的のものにすぎず、他の研究設計も使用することができる。
【実施例４】
【０１７９】
概念研究のレンチウイルスでの証明
レンチウイルスベクターの発現。ヒトＣＤ３４＋細胞に、４つの発現カセットを含有するレンチウイルス（ＬＶ）ベクターにより形質導入した。ＡＬＤＨおよびＣ−ペプチドの発現レベル、ｓｈＲＮＡ介在性ＣＣＲ５のノックダウン、および場合により、ｓｈＲＮＡ介在性ＣＸＣＲ４のノックダウンを、形質導入された細胞において評価した。細胞のＣ−ペプチドの発現を次いで、ＣＣＲ５のノックダウンに対して相関させた。
【０１８０】
簡潔に述べると、動員されたＣＳＦ、冷凍保存されたヒトＣＤ３４＋細胞を、３７℃で、バイアルの内容物が完全に液相となるまで解凍した。細胞を、無菌の１５ｍＬのコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）に移した。滴下で、および穏やかに撹拌しながら、事前に温めた培地Ｘ−Ｖｉｖｏ  １０無血清培地（Ｌｏｎｚａ、Ｂａｓｅｌ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、１５ｍＬまで添加した。細胞を次いで、２００〜３００×ｇで５分間遠心分離した。上清を吸引した後、ペレットを１０ｍＬの培地中に再懸濁し、少量のアリコートを、計数および生存能の判定のために保持した。細胞を次いで遠心分離し、上清を吸引し、そして１．０×２．０×１０６個細胞／ｍの密度まで再懸濁し、そしてＴ７５ｃｍ３の組織培養フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ、Ｔｅｗｋｓｂｕｒｙ、ＭＡ）に移した。
【０１８１】
細胞を、幹細胞因子（ＳＣＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、およびｆｌｔ３／ｆｌｋ２リガンド（Ｆｌｔ３Ｌ）（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ、ＭＮ）のそれぞれ１００ｎｇ／ｍＬを培養培地に添加することによって予備刺激し、５％ＣＯ２のインキュベーター内で、３７℃で２４時間培養した。その後、細胞をインキュベーターから除去し、遠心分離した。細胞を、１００ｎｇ／ｍＬのＳＣＦおよびＦｌｔ３Ｌの両方、１０ｎｇ／ｍＬのＴＰＯ、ならびに６０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を添加したＸ−Ｖｉｖｏ  １０培地において、１．０×１０６個細胞／ｍＬの密度で再懸濁した。１２ウェルの組織培養処置されていないレトロネクチン（５μｇ／ｃｍ２）被覆プレート（タカラバイオ株式会社、滋賀県、日本）のウェル当たり１．０×１０６個細胞を次いで播種した。
【０１８２】
レンチウイルス粒子を３７℃で解凍し（ＣＣＲ５．Ｃペプチド．ＬＶまたはＣＣＲ５．Ｃペプチド．ＡＬＤＨ．ＬＶ）、解凍の際には穏やかに混合した。粒子のそれぞれを、約２から５０の、例えば９のＭＯＩで培養物に添加し、プレートを穏やかに旋回させることによって混合した。細胞を次いで、３７℃の５％ＣＯ２のインキュベーターに戻し、２４から４８時間にわたり培養した。その後、サンプルを、フローサイトメトリーおよびｑＲＴＰＣＲ評価による、細胞数、生存能、および形質導入効率の評価のために保持した。
【０１８３】
残りの細胞を遠心分離し、上清を穏やかに吸引し、そして１ｍＬ／ウェルの新鮮なＸ  Ｖｉｖｏ  １０培地を各ウェルに添加した。プレートをインキュベーターに戻した。細胞を、形質導入の最大３日後まで増殖させた。
【０１８４】
フローサイトメトリー染色および分析をすぐに進めた。ＬＶ構築物が蛍光マーカーを含有していれば、ＭａｃｓＱｕａｎｔ  ＦＡＣＳ  Ａｎａｌｙｚｅｒでの取り込みが行われた。蛍光マーカーがベクターに含有されていなければ、標的タンパク質またはＨＩＶ−１  ＬＴＲの転写活性化のための染色手順が行われた。
【０１８５】
細胞を使用して、さらなる特徴付けを行うことができる。さらなる特徴付けが不要であれば、形質導入（または形質導入後の増殖）の直後に、細胞を、コントロールレートフリーザーにおいて、５０％ＩＭＥＭ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）、４５％ヒト血清アルブミン（ＨＡＳ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）、および０．２μｍで濾過された５％ＤＭＳＯからなる溶液中で、５×１０６個細胞／ｍＬの密度で冷凍保存した。細胞は次いで、すぐに液体窒素に移すか、またはドライアイスの上で輸送することができる。
【０１８６】
化学的保護。ＡＬＤＨの発現を示すＬＶベクター（例えば、配列番号２または配列番号５）により形質導入されたヒトＣＤ３４＋細胞を、様々な用量のシクロホスファミドで処置して、化学療法剤に対する耐性を実証した。実験はまた、形質導入された細胞および形質導入されていない細胞の混合培養物を、様々な用量のマホスファミドで処置することによっても行うことができる。形質導入された細胞および形質導入されていない細胞の両方の生存を、各用量のシクロホスファミドで処置した後に測定した。
【０１８７】
簡潔に述べると、凍結乾燥されたマホスファミドを、滅菌水の中で、１ｍｇ／ｍＬのワーキングストック溶液に再懸濁した。形質導入された細胞を次いで、通常の培地（ＲＰＭＩ＋１０％ＦＢＳ）で一度洗浄し、形質導入された細胞（試験ベクター（例えば、配列番号４）およびコントロールベクター（例えば、配列番号５）の両方）を、ＭｅｔｈｏＣｕｌｔ  ３３３０培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）中に０．５×１０６個細胞／ｍＬの密度まで再懸濁した。最終溶液は、ＦＢＳ、エリスロポエチン（１Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−３（２００Ｕ／ｍｌ）、ＩＬ−６（２００Ｕ／ｍｌ）、ＳＣＦ（１００ｎｇ／ｍｌ）、ＩＬ−１β（２００ｎｇ／ｍｌ）、および１００ｎｇ／ｍｌの顆粒球コロニー刺激因子（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を添加したα培地中の、０．８％メチルセルロースからなるものであった。
【０１８８】
皿の各セット（コントロール皿および試験皿）に、マホスファミドを以下の最終濃度まで添加した：０．１５、２．５、５、１０、１５、２０μＭ。プレートを次いで、３７℃、５％ＣＯ２で１４日間インキュベートした。１４日後、倒立光学顕微鏡を使用して、コロニーを各プレートにおいてスコア付けした。マン・ホイットニーのＵ検定を次いで行って、試験ベクターを発現する細胞およびコントロールベクターを発現する細胞によって形成されるコロニーの数における、何らかの有意な統計差があるかを判定した。
【実施例５】
【０１８９】
融合阻害研究
ヒト化マウスの脾臓および胸腺から単離されたＴ細胞を、上記ようにＨＩＶ株と共培養した。Ｃ４４の発現レベルを、フローサイトメトリーによって検出される、Ｃペプチドを認識する抗Ｇｐ４１抗体を使用して評価した。Ｃ−ペプチドの発現レベル（正のパーセンテージおよび蛍光強度の中央値）を次いで、ＨＩＶ融合の遮断の程度に対して相関させた。
【０１９０】
材料および試薬。２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ）；ｐＡｄＶＡｎｔａｇｅ（Ｐｒｏｍｅｇａ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）；ｐＣＭＶ４−ＢｌａＭ−Ｖｐｒ（Ａｄｄｇｅｎｅ）；ｐＮＬ４−３プロウイルスＤＮＡ（ＮＩＨ  ＡＩＤＳ  Ｒｅａｇｅｎｔ  Ｐｒｏｇｒａｍ）、または一次ＥｎｖをコードするＴＮ６−ＧＦＰ；ＤＭＥＭ（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標））；ＲＰＭＩ  １６４０（Ｍｅｄｉａｔｅｃｈ、Ｃｅｌｌｇｒｏ（登録商標））；１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；ウシ胎児血清（ＦＢＳ）；１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００Ｕ／ｍｌのストレプトマイシン（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標））；２ＭのＣａＣｌ２；Ａｌｌｉａｎｃｅ  ＨＩＶ−Ｉ  ｐ２４  ＥＬＩＳＡキット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）またはＦｌａＱアッセイ試薬（Ｈａｙｄｅｎら、２００３）；末梢血リンパ球（ＰＢＬ）；ＣＣＦ２−ＡＭ基質およびローディング溶液（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＣＯ２非依存性培地（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｇｉｂｃｏ（登録商標））；プロベネシド（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）；ＡＰＣ−Ｃｙ７にコンジュゲートしたマウス抗ヒトＣＤ３およびＰＥ−Ｃｙ７にコンジュゲートしたマウス抗ヒトＣＤ４（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＢＤ  ＣｏｍｐＢｅａｄｓ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）；１６％パラホルムアルデヒド（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ  Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）；ＨＢＳＳ（製法を参照されたい）；ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）培養培地（製法を参照されたい）；ロズウェルパーク記念研究所（ＲＰＭＩ）培養培地（製法を参照されたい）；ＣＣＦ２ローディング溶液（製法を参照されたい）；２５０ｍＭのＮａＯＨ中で調製されたプロベネシド（２５０ｍＭ）のストック溶液（製法を参照されたい）；成長培地（製法を参照されたい）。
【０１９１】
ベクター。ｐＬＶ［Ｅｘｐ］−Ｈ１＞ｈＣＣＲ５［ｓｈＲＮＡ］
ＥＦ１Ａ＞ｈＡＬＤＨ１Ａ１［ＮＭ＿０００６８９．４］（ｎｓ）：Ｔ２Ａ：｛Ｃペプチド｝（例えば、配列番号４）
【０１９２】
製法。ＨＢＳＳ（２８０ｍＭのＮａＣｌ；１０ｍＭのＫＣｌ；１．５ｍＭのＮａ２ＨＰＯ４；１２ｍＭのデキストロース；５０ｍＭのＮ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン）−Ｎ’−（２−エタンスルホン酸）（ＨＥＰＥＳ）（ｐＨ７．０５）；−２０℃で保管。
【０１９３】
フローサイトメトリー染色バッファー（Ｃａ＋＋およびＭｇ＋＋を含まない１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；０．５％ＨＳＡ；４℃で保管）。
【０１９４】
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）培養培地（ＤＭＥＭ；熱不活化された１０％ウシ胎児血清；ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ；ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）。
【０１９５】
ＲＰＭＩ培養培地（ＲＰＭＩ  １６４０；熱不活化された１０％ウシ胎児血清；ペニシリン１００Ｕ／ｍｌ；ストレプトマイシン１００μｇ／ｍｌ）。
【０１９６】
ＣＣＦ２ローディング溶液：ＣＣＦ２−ＡＭをジメチルスルホキシド（ＣＣＦ２キットの溶液Ａ）に再懸濁して、ストック溶液（１ｍＭのＣＣＦ２−ＡＭ）を得た。アリコートに分け、暗所において−８０℃で保管した。１ｍＭのＣＣＦ２−ＡＭ  １μｌと、プルロニック−Ｆ１２７  １００ｍｇ／ｍｌおよび０．１％酢酸を含有する溶液（ＣＣＦ２キットの溶液Ｂ）９μｌとをボルテックスミキシングすることによって混合した。ＣＯ２非依存性培地１ｍｌを添加し、再びボルテックスにかけた。２５０ｍＭのＮａＯＨ中で調製されたプロベネシド（２５０ｍＭ）のストック溶液。アリコートに分け、−２０℃で保管した。
【０１９７】
成長培地（２．５ｍＭのプロベネシド；ＣＯ２非依存性培地中の１０％ウシ胎児血清）。
【０１９８】
設備。Ｔ１７５ｃｍ２の培養フラスコ；９６ウェルのＶ底プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）；５ｍｌ、１０ｍｌ、２５ｍｌのピペット；５０ｍｌのファルコンチューブ；０．２２μｍの孔サイズのＳｔｅｒｉｆｌｉｐ（ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）；２ｍｌのナルゲンチューブ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；澄明な超遠心機用チューブ（ＢＤ）；３７℃、５％ＣＯ２のインキュベーター；ＳＷ２８ローターを備えた超遠心分離設備；フローサイトメーター。融合アッセイ単独では、バイオレットレーザー励起（４０５ｎｍ）および２つの測定パラメータを備えたフローサイトメーターが必要であった。パシフィックブルーの検出に一般に使用される４５０／５０ｎｍのバンドパスフィルターを有する光電子倍増管（ＰＭＴ）を、切断されたＣＣＦ２基質の検出に使用した。Ａｍｃｙａｎの検出に一般に使用される５１５／２０ｎｍのバンドパスフィルターを有する他のＰＭＴを、切断されていないＣＣＦ２基質の検出に使用した。さらなるＰＭＴが、ＣＤ３抗体およびＣＤ４抗体に関連する蛍光色素の測定に必要であった。ＡＰＣ−Ｃｙ７を６３３ｎｍの赤色レーザーによって励起させ、７５５ロングパスフィルターを有するＰＭＴで検出した。ＰＥ−Ｃｙ７を５３１ｎｍの黄緑色のレーザーで励起させ、７５５ロングパスフィルターを有するＰＭＴで検出した。
【０１９９】
ソフトウェア。ＦｌｏｗＪｏＸソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）または他のＦＡＣＳ分析ソフトウェア。
【０２００】
融合阻害アッセイ。１．５×１０７個の２９３Ｔ細胞を、２０ｍｌのＤＭＥＭ培養培地を有するＴ１７５ｃｍ２の組織培養フラスコに播種し、３７℃の５％ＣＯ２の加湿インキュベーターで一晩培養した。ＴＮ６−ＧＦＰプロウイルスＤＮＡ  ６０μｇ、ｐＣＭＶ−ＢｌａＭ−Ｖｐｒ  ２０μｇ、およびｐＡｄＶＡｎｔａｇｅベクター１０μｇを含有する、Ｈ２Ｏ  １．７５ｍｌを調製した。２×ＨＢＳＳ  ２ｍｌを次いでゆっくりと添加し、上下にピペッティングすることによって穏やかに混合した。２ＭのＣａＣｌ２  ２５０μｌを滴下で添加した。ＤＮＡを、１０分間、室温でインキュベートすることによって沈殿させた。２９３Ｔ細胞培養培地を、３７℃に事前に温めた新鮮なＤＭＥＭ培養培地４０ｍｌで置き換えた。次に、ＤＮＡ沈殿物４ｍｌを添加し、１６時間、３７℃でインキュベートした。培地を次いで、３７℃に事前に温めた新鮮なＤＭＥＭ培養培地４０ｍｌで置き換え、２４時間、３７℃でインキュベートした。
【０２０１】
トランスフェクトした２９３Ｔ細胞の上清を５０ｍｌのファルコンチューブ内に採取し、室温で１０分間遠心分離して、細胞の残屑を除去した。澄明化した上清を次いで、Ｓｔｅｒｉｆｌｉｐを通して濾過した。３６ｍｌのビリオン含有上清をウルトラクリア遠心分離チューブに移した。チューブを、必要に応じてＤＭＥＭ培養培地で均衡を保ったＳＷ２８ローターのバケットの中に置き、ブレーキを使用せずに４℃で超遠心分離した（７２０００×ｇ、９０分間）。上清を除去し、ウイルスペレットを１ｍｌのＤＭＥＭ中に再懸濁し、１００μｌのアリコートに分け、−８０℃で保管した。
【０２０２】
ウイルス調製物のｐ２４Ｇａｇ含有量を、酵素結合免疫吸着アッセイまたはＦｌａＱアッセイによって定量した（Ｍａｉｔｉら、２０１４）。
【０２０３】
ＰＢＬをＲＰＭＩ培養培地で洗浄し、ＰＢＬを計数し、そしてＲＰＭＩ培養培地中に２×１０７個細胞／ｍｌで懸濁させた。細胞懸濁液を、Ｖ底９６ウェルプレートにおいて、試験対象の条件ごとに１００μｌ（２×１０６個細胞）のアリコートに分けた。２つのさらなる細胞アリコートを２つのウェルに分配して、コンペンセーションコントロールとした。一方のウェルにＣＣＦ２基質をロードし、その一方で、他方はロードしないままとした。これらの２つのコントロールウェルは、抗ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｃｙ７抗体および抗ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７抗体で染色されなかった。
【０２０４】
４００ｎｇのｐ２４Ｇａｇに等しいＢｌａＭ−Ｖｐｒを含有するＨＩＶ−１ビリオンの量を、「非感染コントロール」および２つのコンペンセーションコントロールを除いた全てのウェルに添加し、２時間、３７℃でインキュベートした。
【０２０５】
細胞を次いで、５分間室温で遠心分離することによって回収し、ＣＯ２非依存性培地２００μｌで一度洗浄し、５分間、室温で遠心分離した。ペレットをＣＣＦ２−ＡＭローディング溶液１００μｌ中に再懸濁し、１時間、室温で、暗所でインキュベートし、１つのウェルは、ＣＯ２非依存性培地のみで再懸濁することによって、確実に染色されないまま維持するようにした。細胞を、３６５×ｇで５分間、室温で遠心分離することによって回収した。回収された細胞を次に成長培地２００μｌで洗浄し、５分間室温で遠心分離し、そしてペレットを成長培地２００μｌに再懸濁し、細胞を室温で１６時間、暗所でインキュベートした。
【０２０６】
２つの空のウェルに、ＢＤコンペンセーションビーズバイアル（ネガティブコントロールおよび抗マウスＩｇＫ）のそれぞれを滴下して添加した。細胞およびビーズを次いで、５分間、４℃で遠心分離することによって回収した。細胞およびビーズを次いで、ＦＡＣＳ染色バッファー２００μｌを添加することによって一度洗浄し、５分間、４℃で遠心分離することによって回収し、ペレットを、１／１００希釈の抗ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｃｙ７および１／５０希釈の抗ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７を含有する免疫染色溶液１００μｌ（フローサイトメトリー染色バッファー中の）に再懸濁した。２つのコンペンセーションコントロールも、コンペンセーションビーズも、染色されなかった。ＣｏｍｐＢｅａｄｓを、１／１００希釈の抗ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｃｙ７または１／５０希釈の抗ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７のいずれかを含有するフローサイトメトリー染色バッファーで染色した。サンプルを、３０分間、４℃でインキュベートした。
【０２０７】
４℃で３０分間インキュベーションした後、細胞およびビーズを、５分間、４℃で遠心分離することによって回収した。細胞およびビーズを次いで、フローサイトメトリー染色バッファー２００μｌで洗浄した。１．２％パラホルムアルデヒドを添加したフローサイトメトリー染色バッファーを使用して、細胞を２４時間にわたり４℃で固定した。
【０２０８】
フローサイトメーター−ＭＡＣＳＱｕａｎｔ機器を使用して、サンプルを取り込んだ。サンプルセットには：ロードされていない未染色の細胞、ＣＣＦ２をロードされた未染色の細胞、ＣＤ３−ＡＰＣ−Ｃｙ７で染色されたビーズ、ＣＤ４−ＰＥ−Ｃｙ７で染色されたビーズ、ＣＣＦ２をロードされ免疫染色された非感染コントロール、およびＣＣＦ２をロードされ免疫染色された感染サンプルが含まれていた。データを、ＦｌｏｗＪｏを使用して分析した。
【実施例６】
【０２０９】
ＨＩＶチャレンジ：レンチウイルスベクターにより形質導入されたヒトＣＤ４＋Ｔ細胞
ＣＣＲ５ｓｈＲＮＡ／ｃ−ペプチド／ＡＬＤＨを含有するＬＶにより形質導入されたＧＦＰレポーターＣＤ４＋Ｔ細胞、または空のコントロールベクターを含有するＬＶにより形質導入されたＴ細胞を、Ｒ５株、Ｘ４株、または両実験用ＨＩＶ株と培養した。ＨＩＶの感染性を、レポーターマーカー（Ｔ細胞レポーター系を使用する場合）によって、またはｐ２４  ＥＬＩＳＡによって分析した。
【実施例７】
【０２１０】
用量範囲およびレンチウイルスベクターの効能の研究
ＣＣＲ５ｓｈＲＮＡ／Ｃ−ペプチド／ＡＬＤＨ発現ベクターまたはコントロールの空のベクターを含有するレンチウイルスにより形質導入されたＳｃａ１＋／ｃ−ｋｉｔ−幹細胞および前駆細胞を、事前に馴化したＣ５７ＢＬ／６同系マウスに移植した。
【０２１１】
簡潔に述べると、７日後、全てのマウスで、シクロホスファミド（ＣＴＸ）処置の１日に１回のレジメンを開始した。両マウス群を、様々な投薬量のＣＴＸ（用量当たり群当たり６頭のマウス）：０、１０、１３、１６、１９、および４０ｍｇ／ｋｇで処置した。ＣＴＸ処置を開始した１週間後、マウスを週に１回の原則で採血した。全血球計算（ＣＢＣ）パネルを行って、化学療法の何らかの細胞傷害効果があるかをモニタリングし（グラフトの効能：ＡＬＤＨによるＣＴＸ耐性の付与（ｃｏｎｆｅｒｅｎｃｅ））、その一方で、フローサイトメトリー分析は、これらの細胞における系統特異的なマーカーの発現ならびにＣ−ペプチドおよびＣＣＲ５の発現を測定した（発現効率：ｓｈＲＮＡが標的遺伝子をノックダウンする効能）。研究は、少なくとも１０週間のＣＴＸ処置にわたり、または骨髄の完全なグラフトが行われるまで続けられた。研究の概略図を図７に示し、より詳細なプロトコルは以下に示す。
【０２１２】
材料および試薬。ＥａｓｙＳｅｐ（商標）マウス造血前駆細胞単離キット（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；Ｆａｌｃｏｎの１５ｍＬのコニカルチューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）；５ｍＬ（１２×７５ｍｍ）のポリスチレン製丸底チューブ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）；ＳｔｅｍＳｐａｎ無血清培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）；マウス造血幹細胞増殖キットサイトカインパネル（Ｒ＆Ｄ）；レトロネクチン組換えヒトフィブロネクチン断片（Ｃｌｏｎｔｅｃ）；ＲＰＭＩ−１６４０（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ペトリ皿（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＨＢＳＳ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；２７Ｇ×１／２針（ＢＤ）；遠心分離機（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；Ｓｏｒｖａｌｌ  ＳＴ  ４０Ｒ  Ｃｏｕｎｔｅｓｓ  ＩＩ自動細胞カウンター（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；トリパンブルー（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；系統カクテル（ｍＣＤ３、ｍＧｒ−１、ｍＣＤ１１ｂ、ｍＢ２２０、ｍＴｅｒ１１９）（アイソタイプコントロールを含む）（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；Ｌｙ−６Ａ／Ｅ（Ｓｃａ−１）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；生存能染料ｅＦｌｕｏｒ  ５０６（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）；抗マウスＣＤ１６／３２  ＦＣ  Ｂｌｏｃｋ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；細胞染色バッファー（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）；Ｂａｌｂ／ｃメスマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ  Ｒｉｖｅｒ）。
【０２１３】
ベクター。ｐＬＶ［Ｅｘｐ］−Ｈ１＞ｈＣＣＲ５［ｓｈＲＮＡ］−
ＥＦ１Ａ＞ｈＡＬＤＨ１Ａ１［ＮＭ＿０００６８９．４］（ｎｓ）：Ｔ２Ａ：｛Ｃペプチド｝（例えば、配列番号４）
【０２１４】
骨髄からの前駆細胞の単離（必要な前駆細胞の数）。以下の表から、形質導入で必要な細胞数を得るために必要な（ドナー）マウスの数を計算した。
【０２１５】
【表１５】
2021503015.tif 000017
【０２１６】
マウス骨髄の単離。ＢＡＬＢ／ｃマウス（メス、２０から２５ｇ、８〜１０週齢）を、ＣＯ２での窒息によって安楽死させた。その後の実験工程は、層流空気流バイオセーフティーキャビネット（ＢＳＣ）内で行った。骨髄細胞を大腿骨から回収した。簡潔に述べると、骨髄の内容物を、２７Ｇ×１／２針を有する１ｍｌのインスリンシリンジを使用して、２ｍｌのＨＢＳＳで流した。内容物を無菌の５０ｍｌの遠心分離チューブに回収した。上記で回収したＢＭ細胞懸濁液を次いで、ＲＰＭＩ−１６４０で７．５ｍｌの最終容積まで希釈した。骨髄懸濁液中の全てのクラスターを、激しくピペッティングすることによってばらばらにした。細胞を次いで遠心分離し、洗浄し、再び遠心分離した。各大腿骨からの細胞ペレットを、ＲＰＭＩ−１６４０  ７．５ｍｌ中に穏やかに再懸濁して、均質な懸濁液を調製した。ＮＣ−２００自動細胞カウンターを使用して全細胞の数および生存能のために、細胞懸濁液のアリコートを取り出した。
【０２１７】
前駆細胞の単離。単離された細胞を新たなチューブに移し、回転させて沈殿させ、０．５〜２ｍＬの容積範囲のＥａｓｙＳｅｐバッファー（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁して、１×１０８個細胞／ｍＬの濃度とした。ラット血清を次いで、５０μＬ／ｍＬでサンプルに添加し、サンプルを５ｍＬ（１２×７５ｍｍ）のポリスチレン製丸底チューブに移した。ＥａｓｙＳｅｐマウス造血前駆細胞単離カクテルを次いで、サンプル１ｍＬ当たり５０μＬでサンプルに添加した。サンプルを混合し、４℃で１５分間インキュベートした。Ｒａｐｉｄ  ｓｐｈｅｒｅｓを３０秒間ボルテックスし、次いで、７５μＬ／ｍＬでサンプルに添加した。サンプルを混合し、４℃で１０分間インキュベートし、ＥａｓｙＳｅｐバッファーを使用して総容積を２．５ｍＬまで増やした。磁気選別を使用して、前駆細胞を単離した。
【０２１８】
フローサイトメーターによる単離された前駆細胞の評価。細胞を新たな９６ウェルプレートに移し、回転させて沈殿させ、ＦＡＣＳバッファー５０μＬ（ＰＢＳ＋２％ＦＢＳ＋１ｍＭのＥＤＴＡ）中に再懸濁した。ＦＣ  Ｂｌｏｃｋ（抗ＣＤ１６／３２）３μＬを各サンプルに添加し、４℃で１５分間インキュベートした。以下のパネルおよび量を使用した：
【０２１９】
【表１６】
2021503015.tif 000018
【０２２０】
コントロールは以下を含んでいた：ＣＤ１１７のＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ  Ｍｉｎｕｓ  Ｏｎｅ（ＦＭＯ）コントロール、Ｌｙ６Ａ／Ｅ、および系統カクテルアイソタイプコントロール。
【０２２１】
各ウェルを１００μＬの総容積まで増やし、暗所において４℃で３０分間インキュベートした。細胞を次いで、フローサイトメーターバッファー２００μＬで洗浄し、ある容積で再懸濁した。フローサイトメーターはＭＡＣＳＱｕａｎｔＣｙｔｏｍｅｔｅｒで入手した。純度を、Ｓｃａ１−／ｃ−ｋｉｔ＋、Ｓｃａ１＋／ｃ−ｋｉｔ−、Ｓｃａ１＋／ｃ−ｋｉｔ＋の％を合計し、生きた系統カクテル陰性の事象のパーセントをかけることによって計算した。
【０２２２】
レンチウイルスによる形質導入および前駆細胞の増殖。０日目に、１２ウェルプレートまたは２４ウェルプレートを、０．３ｍｌのレトロネクチン（１００ｎｇ／ｍｌ）で被覆し、少なくとも２時間、室温でインキュベートした。被覆培地を次いでプレートから吸引し、プレートを、１×ＰＢＳ中の２％ＢＳＡで、室温で少なくとも３０分間ブロックし、次いで、１×ＰＢＳで３回洗浄した。プレートはこれで、すぐに使える状態となった。プレートを乾燥させないことに留意すべきである。
【０２２３】
新鮮な単離された骨髄前駆細胞を、骨髄前駆細胞培養培地１ｍｌ当たりおよそ０．２〜０．４×１０６個細胞の間で播種した。レンチウイルスを細胞に２４時間にわたり添加した（ＭＯＩ＝３）。
【０２２４】
１日目に、細胞を回転させて沈殿させ、レンチウイルスを含有する培地を取り除き、新鮮な骨髄前駆細胞培養培地を添加した。
【０２２５】
２日目に、レンチウイルスにより形質導入した後、ピューロマイシン（１μｇ／ｍｌ）を骨髄前駆細胞培養培地に添加して、レンチウイルス感染細胞を選択した。細胞を４日間処置した。
【０２２６】
４日目に、ピューロマイシンを有する新鮮な培地を添加した。
【０２２７】
６日目に、細胞を回転させて沈殿させ、ピューロマイシンを含まない新鮮な培地を与えた。
【０２２８】
７日目に、細胞を、細胞数計数のために回収し、ＧＦＰフローを行って、形質導入効率を決定した。新鮮な骨髄前駆細胞培養培地を残りの細胞に与えた。
【０２２９】
骨髄前駆細胞を１０日目までさらに３日間培養し、９日目に培地を交換した。
【０２３０】
１０日目に、細胞を計数のために採取し、フローサイトメトリー分析を行って、形質導入効率を決定した。
【０２３１】
【表１７】
2021503015.tif 000019
【０２３２】
骨髄前駆細胞の移植および処置  −  事前調整：
移植の前に、マウスに２用量のフルダラビン（５ｍｇ／Ｋｇを２日間）を投与した。０日目（フルダラビンでの処置の２日後）に、３６頭のマウスに、コントロールベクターにより形質導入された幹細胞および前駆細胞を、ＩＶを介して移植し、３６頭のマウスに、試験ベクターにより形質導入された幹細胞および前駆細胞を移植した。移植後、動物を、罹患率および死亡率について１日に１回チェックした。通常のモニタリングの時点で、動物を、運動性などの正常な行動に対する処置の何らかの影響、眼／毛のつやのなさ、および任意の他の異常な影響があるかについてチェックし、また、飼料および水の消費の視覚的な推定、体重の増加／減少（体重は１週間に２回測定した）もチェックした。死亡および観察された臨床的兆候を、各動物について詳細に、データシートのコメント欄に記録した。
【０２３３】
ＣＴＸ処置。骨髄移植の７日後、ＣＴＸ（シクロホスファミド）処置を、以下の用量：０、１０、１３、１６、１９、および４０ｍｇ／ｋｇを１日に１回、１２週間にわたりＩ．Ｐ．投与することによって開始し、この処置は、体重減少＞１５％とならない限り中断はしなかった。実験群および処置の詳細を以下の表に示す。
【０２３４】
【表１８】
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【０２３５】
サンプルの回収。最初のＣＴＸ投薬の７日後、尾静脈を穿刺することによって血液を回収した。血液１００μＬを、ＬＶベクターの発現およびｓｈＲＮＡノックダウンの効能に対応する免疫表現型決定パネルのために回収した（以下の表を参照されたい）。サンプルをＦＡＣＳによって分析した。さらなる血液２０μＬを回収して、完全なＣＢＣ分析を行った。回収物は、研究が終わるまで、各動物から７日ごとに採取した。骨髄を研究の終わりに回収して、完全なグラフトを評価した。
【０２３６】
【表１９】
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【０２３７】
終了。許容できない毒性および／もしくはひどい体重減少（＞２０％）が認められる場合には、または昏睡状態に達する前に、状態の継続的な悪化を示す動物を人道的に安楽死させた。重度の苦痛および／または痛みの明らかな兆候を示す動物は、ＣＯ２とその後の頚部脱臼とによって人道的に安楽死させた。完全なグラフト（９０％を超える）が１つの動物群において見られた場合に、研究を終了した。
【実施例８】
【０２３８】
ヒトでの研究
幹細胞の動員および回収。回収の３日前に、患者は、ＣＤ３４＋幹細胞を動員させるために、３から５日間のＧ−ＣＳＦレジメンを開始した。末梢血中のＣＤ３４＋細胞の数が体重１ｋｇ当たり１０．０から２０．０×１０６個を超えたら、アフェレーシスを行った。この材料は、ＣＤ３４＋幹細胞の単離および形質導入のために、２〜８℃の制御された運搬でＧＭＰ施設に輸送された。目標で３．０から４．０×１０６個のＣＤ３４＋細胞／ｋｇを、２から３×１０６個細胞／ｋｇの再注入のために回収した。回収後２日目（または移植前−５日目）に、患者を、１５ｍｇ／ｍ２のフルダラビンで５日間にわたり（移植前−１日目まで）処置した。あるいは、移植前−１日目に、患者を４ｍｇ／ｋｇのブスルファンで処置した。次いで、患者を、移植前−２日目に、単回用量の１０００ｍｇ／ｍ２のシクロホスファミドで処置した。
【０２３９】
幹細胞の冷凍保存。患者由来の細胞（造血幹細胞を含有する）を、場合により遠心分離して、細胞に富んだペレットを得た。ヘパリン化されたプラズマライト溶液および１０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）からなる溶液を血漿上清に添加し、この中で、ペレット化された細胞を再懸濁した。細胞は、最初に−４℃で保存され、次いで、サンプルは、−１５６℃（蒸気相で保管される場合）から−１９６℃（液相で保管される場合）の標的温度にまで下げて凍結された。細胞は場合により、標準的な手順に従って輸送された。
【０２４０】
ＣＤ３４＋細胞のレンチウイルスによる形質導入。ＧＭＰ施設に到着すると、ＣＤ３４＋細胞を磁気ビーズ分離によって単離した。レンチウイルスベクターを介するヒトＣＤ３４＋細胞の形質導入は、サイトカイン幹細胞因子（ＳＣＦ）、Ｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、ＩＬ−６、ＩＬ−２、ＩＬ−３、フィブロネクチン、またはこれらのあらゆる組み合わせを添加した培地における細胞の２４時間の予備刺激と、その後の、２４時間のベクターへの曝露（例えば、配列番号２または配列番号４）とを含み、これらは共に、無血清Ｘ−Ｖｉｖｏ  １０培地中のサイトカインＳＣＦ、ＦＬＴ３Ｌ、およびＴＰＯ（それぞれ１００ｎｇ・ｍｌ−１）の存在下で行った。細胞を次いで冷凍保存し、臨床現場まで輸送した。
【０２４１】
修飾されたＣＤ３４＋細胞の再注入。修飾されたＣＤ３４＋細胞を解凍した後。ニューヨーク血液センターのプロトコルに従った現在の標準的な洗浄プロトコルを使用した。これは、解凍された幹細胞単位を２．５％ヒト血清アルブミンおよび５％デキストラン４０で２工程の希釈を行うことと、その後の、１０℃で１０分間遠心分離することとを含むものであった。上清を次いで除去し、ＨＳＡおよびデキストラン溶液を、１．７％未満の最終ＤＭＳＯ濃度まで再び２回添加した。洗浄された溶液をできるだけ早く患者に注入した。細胞を注入した一定時間後、例えば７〜４５日後、患者は、遺伝子修飾された骨髄細胞のグラフトの増大を容易にするために、低用量（５０〜２００ｍｇまたは本明細書において記載する非骨髄破壊的な用量）の１日に１回の経口シクロホスファミドの摂取を開始した。修飾されたＣＤ３４＋細胞が注入される時点で患者がＨＩＶ＋であり得ることが考えられ、このケースでは、細胞は、ＨＩＶを処置するおよび／もしくは治癒するために機能しており、または、修飾されたＣＤ３４＋細胞が注入される時点で患者がＨＩＶ−であり得ることが考えられ、このケースでは、細胞は、将来的なＨＩＶ感染を予防するために機能している。ＨＩＶ＋患者の処置についての概略図が図９および図１０で示されるが、患者がＨＩＶ−でもあり得ることが理解される。
【０２４２】
本技術の実施形態の上記の詳細な説明は網羅的であることを意図したものでも、本技術を上記で開示される正確な形態に限定することを意図したものでもない。本技術の具体的な実施形態および本技術についての実施例が、説明する目的で、上記で記載されているが、当業者には認識されるであろうが、様々な同等な修正が本技術の範囲内で可能である。本明細書において記載される様々な実施形態はまた、さらなる実施形態を提供するために組み合わせることもできる。
【０２４３】
これまでの記載から、本技術の具体的な実施形態が説明を目的として本明細書において記載されているが、本技術の実施形態の記載を不必要に不明瞭にすることを避けるために、周知の構造および機能は示されていないか、または詳細には記載されていないことが理解される。文脈から可能な箇所では、単数形または複数形の用語は、それぞれ複数形または単数形の用語も含み得る。
【０２４４】
具体的な実施形態が説明を目的として本明細書において記載されているが、様々な修正を、本技術から逸脱することなく行うことができることも理解される。さらに、本技術のある特定の実施形態に関連する利点が、これらの実施形態の文脈で記載されているが、他の実施形態もまた、このような利点を示し得、また、本技術の範囲内に含まれるために、全ての実施形態がこのような利点を必ずしも示さなくてはならないわけではない。したがって、開示、および関連する技術は、明確に示されてはいないまたは本明細書において記載されていない他の実施形態を包含し得る。
【図１】
2021503015.tif 000022
【図２Ａ】
2021503015.tif 000023
【図２Ｂ】
2021503015.tif 000024
【図３】
2021503015.tif 000025
【図４】
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【図５】
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【図６】
2021503015.tif 000028
【図７】
2021503015.tif 000029
【図８】
2021503015.tif 000030
【図９】
2021503015.tif 000031
【図１０】
2021503015.tif 000032
【図１１】
2021503015.tif 000033
【図１２】
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【配列表】
2021503015000001.app
【国際調査報告】
2021503015.tif 000035
2021503015.tif 000036