(57)【要約】サンプル中の標的核酸配列の存在を決定するためおよび／またはその量を定量化するための方法および試薬を提供する。いくつかの局面において、本方法は、プローブのTmにおいてシグナルを検出せずに、プローブのTmよりも低い温度におけるプローブからのシグナルおよびプローブのTmよりも高い温度におけるシグナルを検出することにより、融解分析を行うことを含む。2021511056.tif 000016
2021511056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
以下の段階を含む、反応混合物中の標識付加二重鎖核酸について融解分析を行う方法であって、標識付加二重鎖核酸は所定Tmを有する、前記方法：
(a) 標識付加二重鎖核酸の所定Tmよりも低い第1温度において、標識付加二重鎖核酸からの第1シグナルを測定する段階；
(b) 標識付加二重鎖核酸の所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、該所定Tmよりも高い第2温度において、標識付加二重鎖核酸からの第2シグナルを測定する段階；および
(c) 第1シグナルと第2シグナルを比較し、第1シグナルと第2シグナルとの間に変化がある場合に、標識付加二重鎖核酸が反応混合物中での標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であると判定する段階。
【請求項２】
標的特異的プローブが、標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの際に切断される切断可能なプローブである、請求項1記載の方法。
【請求項３】
シグナルが、標識付加二重鎖核酸の所定Tmから2セルシウス度の範囲内では測定されない、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
シグナルが、標識付加二重鎖核酸の所定Tmから5セルシウス度の範囲内では測定されない、請求項1または2記載の方法。
【請求項５】
第1温度と第2温度との差が2セルシウス度よりも大きい、請求項1または2記載の方法。
【請求項６】
第1温度と第2温度との差が5セルシウス度よりも大きい、請求項1または2記載の方法。
【請求項７】
第1温度と第2温度との差が8セルシウス度よりも大きい、請求項1または2記載の方法。
【請求項８】
反応混合物中のすべての標識付加二重鎖核酸が変性する第3温度において第3シグナルを測定する段階、ならびに第1および第2シグナルを第3シグナルに対して正規化する段階をさらに含む、請求項1または2記載の方法。
【請求項９】
反応混合物が、それぞれが特有の所定Tmを有する少なくとも2種類の異なる二重鎖核酸を含有し、それぞれの異なる二重鎖核酸が、同じシグナル発生標識を有する、請求項1記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法：
(d) 標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも低い温度および標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高い温度において、それぞれの異なる標識付加二重鎖核酸からのシグナルを測定する段階であって、
ここで、それぞれの異なる標識付加二重鎖核酸について、特有の所定Tmよりも低い温度で測定されたシグナルおよび特有の所定Tmよりも高い温度で測定されたシグナルにおける変化は、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブのその標的への特異的ハイブリダイゼーションの結果であることを示す、
段階。
【請求項１０】
シグナルが、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応混合物中の異なる標的特異的プローブの数である、請求項9記載の方法。
【請求項１１】
第1シグナルと第2シグナルとの間の変化が所定の閾値を超える、請求項1または2記載の方法。
【請求項１２】
(a) 反応混合物中に標的核酸配列が存在する場合にそれに特異的にハイブリダイズし得る少なくとも1種の切断可能な標的特異的プローブに、ハイブリダイゼーション条件下でサンプルを接触させる段階、
(b) 標的核酸配列に特異的にハイブリダイズしたプローブを切断して、切断型プローブを形成させる段階；
(c) 切断型プローブを捕捉配列にハイブリダイズさせる条件を提供する段階；
(d) 切断型プローブを伸長させて、所定Tmおよびシグナル発生標識を有する二重鎖核酸を形成させる段階；
(e) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い温度において第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い温度において第2シグナルを測定する段階、ならびに
(f) 第1シグナルと第2シグナルとの間の変化を検出することにより、標的核酸配列の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の少なくとも1種の標的核酸配列の存在を決定するための方法。
【請求項１３】
サンプルが、それぞれが異なる標的核酸配列に特異的である少なくとも2種類の異なる切断可能なプローブに接触され、その特異的標的核酸配列の存在下で、それぞれの異なる切断可能なプローブが、特有の所定Tmを有する二重鎖核酸を形成し、特有の所定Tmを有する二重鎖核酸がすべて、同じシグナル発生標識を有する、請求項12記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法：
特有の所定Tmを有するそれぞれの二重鎖核酸について、所定Tmよりも低い温度において第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い温度において第2シグナルを測定する段階、ならびに
第1シグナルと第2シグナルとの間の変化を検出することにより、標的核酸配列の存在を決定する段階。
【請求項１４】
シグナルが、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応混合物中の異なる切断可能なプローブの数である、請求項13記載の方法。
【請求項１５】
異なる二重鎖核酸の特有の所定Tmが少なくとも2セルシウス度異なる、請求項13記載の方法。
【請求項１６】
異なる二重鎖核酸の特有の所定Tmが少なくとも5セルシウス度異なる、請求項13記載の方法。
【請求項１７】
異なる二重鎖核酸の特有の所定Tmが少なくとも10セルシウス度異なる、請求項13記載の方法。
【請求項１８】
捕捉配列と切断型プローブが単分子である、請求項12記載の方法。
【請求項１９】
捕捉配列と切断型プローブが二分子である、請求項12記載の方法。
【請求項２０】
第1シグナルと第2シグナルとの間の比が所定の閾値を超える場合に、標的核酸が存在すると判定される、請求項12記載の方法。
【請求項２１】
シグナルが、所定Tmから2セルシウス度の範囲内の温度では測定されない、請求項12記載の方法。
【請求項２２】
シグナルが、所定Tmから5セルシウス度の範囲内の温度では測定されない、請求項12記載の方法。
【請求項２３】
少なくとも1種の切断可能なプローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識され、少なくとも1種の切断可能なプローブは、その標的核酸配列にハイブリダイズした場合に第1立体構造をとる、請求項12記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも1種の切断可能なプローブがその標的配列に特異的にハイブリダイズすると、切断部位においてプローブが切断され、切断型プローブが標的核酸配列から放出されて第2立体構造をとり、切断部位から鎖伸長が起こる、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
鎖伸長が、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーと相互作用するレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを取り込むことを含む、請求項24記載の方法。
【請求項２６】
第1立体構造が直鎖状立体構造であり、第2立体構造がヘアピン立体構造である、請求項24記載の方法。
【請求項２７】
(a) 標識付加二重鎖核酸が第1立体構造にある第1温度において、標識付加二重鎖核酸からの第1シグナルを測定する段階；
(b) 標識付加二重鎖核酸が第2立体構造にある第2温度において、標識付加二重鎖核酸からの第2シグナルを測定する段階であって、シグナルは第1温度と第2温度の中間にある温度において測定されない、段階；および
(c) 第1シグナルと第2シグナルを比較することにより、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であるかどうかを判定する段階であって、第1シグナルと第2シグナルとの間の変化は、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であることを示す、段階
を含む、反応混合物中の標識付加二重鎖核酸の融解分析を行う方法。
【請求項２８】
反応混合物が、少なくとも2種類の異なる標識付加二重鎖核酸を含有し、それぞれの異なる標識付加二重鎖核酸が、特有の温度において第2立体構造をとることができ、それぞれの異なる標識付加核酸が、同じシグナル発生標識を有する、請求項27記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法：
それぞれの標識付加二重鎖核酸について、標識付加二重鎖核酸が主に第1立体構造にある温度において第1シグナルを測定する段階、および標識付加二重鎖核酸が主に第2立体構造にある温度において第2シグナルを測定する段階、ならびに第1シグナルと第2シグナルを比較する段階。
【請求項２９】
シグナルが、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応混合物中の異なる二重鎖核酸の数である、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
第1立体構造がヘアピン立体構造であり、第2立体構造が直鎖状立体構造である、請求項27記載の方法。
【請求項３１】
標的特異的プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識された切断可能なプローブである、請求項27記載の方法。
【請求項３２】
標的特異的プローブがその標的配列に特異的にハイブリダイズすると、切断部位においてプローブが切断されて切断型プローブを形成し、該切断型プローブが標的核酸配列から放出されてヘアピンプローブを形成し、該切断部位から鎖伸長が起こる、請求項31記載の方法。
【請求項３３】
鎖伸長が、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーと相互作用するレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを取り込んで、シグナルの変化を生じることを含む、請求項32記載の方法。
【請求項３４】
(a) 標的核酸配列が存在する場合にそれに特異的にハイブリダイズし得る少なくとも1種の切断可能なプローブに、サンプルを接触させる段階であって、切断可能なプローブはシグナル発生標識を含む、段階；
(b) 標的核酸配列に特異的にハイブリダイズしたプローブを切断して、切断型プローブを形成させる段階；
(c) 切断型プローブと相補的である配列を含む捕捉配列に切断型プローブをハイブリダイズさせる条件を提供する段階；
(d) 捕捉配列を鋳型として用いて切断型プローブを伸長させて、所定Tmを有する二本鎖プローブを形成させる段階；
(e) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い第1温度においてシグナル発生標識からの第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い第2温度において第2シグナルを測定する段階、ならびに
(f) 第1温度と第2温度において測定されたシグナルの変化を検出することにより、標的核酸配列の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の少なくとも1種の標的核酸配列の存在または非存在を検出するための方法。
【請求項３５】
それぞれが異なる標的核酸に特異的であり、かつそれぞれがその各々の標的核酸の存在下で、特有の所定Tmを有する二本鎖プローブを形成し得る、2種類またはそれ以上の異なる切断可能なプローブに、サンプルを接触させ、それぞれの異なる二本鎖プローブが、同じレポーター-クエンチャー対を含む、請求項34記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法：
それぞれの異なる二本鎖プローブについて、所定Tmよりも低い第1温度において第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い第2温度において第2シグナルを測定する段階、ならびにそれぞれの異なる二本鎖プローブについて測定された第1シグナルと第2シグナルを比較する段階。
【請求項３６】
捕捉配列と切断型プローブが単分子である、請求項34記載の方法。
【請求項３７】
捕捉配列と切断型プローブが二分子である、請求項34記載の方法。
【請求項３８】
単一の反応コンパートメント中で、2種類またはそれ以上の異なる切断可能なプローブにサンプルを接触させる、請求項35記載の方法。
【請求項３９】
シグナルが、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応コンパートメント中の異なる切断可能なプローブの数である、請求項38記載の方法。
【請求項４０】
異なる二本鎖プローブの特有の所定Tmが少なくとも2セルシウス度異なる、請求項35記載の方法。
【請求項４１】
異なる二本鎖プローブの特有の所定Tmが少なくとも5セルシウス度異なる、請求項35記載の方法。
【請求項４２】
異なる二本鎖プローブの特有の所定Tmが少なくとも8セルシウス度異なる、請求項35記載の方法。
【請求項４３】
第1シグナルと第2シグナルとの間の比が所定の閾値を超える場合に、標的核酸が存在すると判定される、請求項34記載の方法。
【請求項４４】
シグナルが、所定Tmから2セルシウス度の範囲内の温度では測定されない、請求項34記載の方法。
【請求項４５】
シグナルが、所定Tmから5セルシウス度の範囲内の温度では測定されない、請求項34記載の方法。
【請求項４６】
シグナル発生標識が、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーであり、二本鎖プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーと相互作用するレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを含む、請求項34記載の方法。
【請求項４７】
切断可能なプローブが、シグナル発生標識が付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、二重鎖核酸が、第1非天然ヌクレオチドにハイブリダイズする第2非天然ヌクレオチドを含み、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが、第2非天然ヌクレオチドに付着している、請求項46記載の方法。
【請求項４８】
レポーター-クエンチャー対の第1メンバーが、蛍光実体であり、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが、蛍光実体の蛍光を消光するクエンチャーである、請求項46および47のいずれか一項記載の方法。
【請求項４９】
第1および第2非天然ヌクレオチドが、iso-Cおよびiso-Gのうちの1つである、請求項47記載の方法。
【請求項５０】
(a) 少なくとも第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸を提供する段階であって、
ここで、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸のそれぞれは特有の所定Tmを有し、
第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmは、第1標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高く、
第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmは、第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高く、
ここで、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸は同じ標識で標識付加されている、
段階；
(b) 第1標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも低い第1温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第1シグナルを検出する段階；
(c) 第1標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmと第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmとの間の第2温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第2シグナルを検出する段階；
(d) 第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmと第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmとの間の第3温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第3シグナルを検出する段階；
(e) 第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高い第4温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第4シグナルを検出する段階；ならびに
(f) 第1、第2、第3、および第4シグナルを比較することにより、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸のうちの1つまたは複数が標的特異的プローブの切断の結果であるかどうかを判定する段階であって、
ここで、第1シグナルと第2シグナルとの間の変化は、第1標識付加二重鎖核酸が第1標的特異的プローブの切断の結果であることを示し、第2シグナルと第3シグナルとの間の変化は、第2標識付加二重鎖核酸が第2標的特異的プローブの切断の結果であることを示し、第3シグナルと第4シグナルとの間の変化は、第3標識付加二重鎖核酸が第3標的特異的プローブの切断の結果であることを示す、
段階
を含む、複数の標識付加核酸二重鎖について融解分析を行う方法。
【請求項５１】
シグナルが、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmにおいて検出されない、請求項50記載の方法。
【請求項５２】
第1温度と第2温度との間の差が2セルシウス度よりも大きく、第2温度と第3温度との間の差が2セルシウス度よりも大きく、第3温度と第4温度との間の差が2セルシウス度よりも大きい、請求項50記載の方法。
【請求項５３】
反応混合物中のすべての二重鎖核酸が変性する第3温度において第3シグナルを測定する段階、ならびに第1および第2シグナルを第3シグナルに対して正規化する段階をさらに含む、請求項12、27、または34記載の方法。
【請求項５４】
前記段階がdPCR反応における複数の区画において行われる、請求項1、12、27、34、または50記載の方法。
【請求項５５】
第1および第2シグナルが、第1および第2シグナルから第3シグナルを減算することにより、第3シグナルに対して正規化される、請求項8または53記載の方法。
【請求項５６】
第1および第2シグナルが、第1および第2シグナルを第3シグナルで割ることにより、第3シグナルに対して正規化される、請求項8または53記載の方法。
【請求項５７】
前記段階がdPCR反応における複数の区画にわたって行われる、請求項12または34記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法：
切断の前に、複数の区画における切断可能なプローブの標識からのシグナルを測定する段階、および、切断の前に測定されたシグナルを用いて、標的核酸を含む区画と標的核酸を含まない区画を区別するための閾値を設定する段階。
【請求項５８】
前記段階がdPCR反応における複数の区画にわたって行われる、請求項12または34記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法：
切断の前に、ある範囲の温度において複数のシグナルを測定する段階、ならびに、測定されたシグナルを用いて、融解分析中に測定されたシグナルにおける光および温度依存的変化を補正する段階。
【請求項５９】
前記段階がdPCR反応における複数の区画にわたって行われる、請求項1、12、27、または34記載の方法であって、以下の段階をさらに含む、前記方法：
標的核酸の存在を決定する段階の前に、第1シグナルと第2シグナルとの間に変化がない区画を標的陰性区画として同定する段階、ならびに、標的陰性区画から測定されたシグナルを用いて、各区画において測定された第1および第2シグナルにおける光および温度依存的変化を正規化する段階。
【請求項６０】
(a) サンプルとシグナル発生標的特異的プローブとを含む反応混合物を提供する段階であって、標的特異的プローブは、第1一本鎖立体構造にある場合に第1シグナルを生じる、段階；
(b) 反応混合物中の標的特異的プローブからの第1シグナルを測定する段階；
(c) 標的核酸が存在する場合にそれに標的特異的プローブがハイブリダイズして第2立体構造をとるための条件を提供する段階であって、第2立体構造が、所定Tmを有しかつ所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを生じ得る二重鎖核酸である、段階；
(d) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い温度において二重鎖核酸からの第2シグナルを測定する段階；
(e) 第1シグナルと第2シグナルとの間に差がある場合に、標的核酸の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の標的核酸の存在を決定するための方法。
【請求項６１】
標的特異的プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションの際に切断されて切断型プローブを形成する、切断可能なプローブである、請求項60記載の方法。
【請求項６２】
切断型プローブが、捕捉配列に結合し、伸長されて二重鎖核酸を形成する、請求項61記載の方法。
【請求項６３】
第1および第2シグナルが蛍光シグナルである、請求項60記載の方法。
【請求項６４】
第1シグナルが、標的特異的プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションの前に検出される、請求項60記載の方法。
【請求項６５】
第1シグナルが、標的特異的プローブが第1立体構造にある条件下で、切断および伸長の後に検出される、請求項62記載の方法。
【請求項６６】
切断可能なプローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識された第1非天然ヌクレオチドを含み、二重鎖核酸が、第1非天然ヌクレオチドと塩基対合することができかつレポーター-クエンチャー対の第2メンバーで標識された第2非天然ヌクレオチドを含む、請求項61記載の方法。
【請求項６７】
第1および第2非天然ヌクレオチドが、iso-Cおよびiso-Gのうちの1つである、請求項66記載の方法。
【請求項６８】
標的特異的プローブが、捕捉配列への結合前にフルオロフォアで標識され、クエンチャーが、フルオロフォアの消光をもたらす位置において二重鎖核酸中に取り込まれる、請求項62記載の方法。
【請求項６９】
反応混合物が、段階 (b) の後に標的核酸の増幅のための条件に供される、請求項60記載の方法。
【請求項７０】
捕捉配列と切断型プローブが単分子であり、ハイブリダイズしてヘアピンプローブを形成する、請求項62記載の方法。
【請求項７１】
捕捉配列と切断型プローブが二分子である、請求項62記載の方法。
【請求項７２】
(a) サンプルと、反応混合物中に標的核酸配列が存在する場合にそれに特異的にハイブリダイズし得る少なくとも1種の標識付加された切断可能な標的特異的プローブとを含む反応混合物を提供する段階であって、標識がレポーター-クエンチャー対の第1メンバーである、段階；
(b) 反応混合物中の標識付加標的特異的プローブからの第1シグナルを測定する段階；
(c) 反応混合物中に標的核酸配列が存在する場合にそれに標識付加切断可能標的特異的プローブをハイブリダイズさせる条件を提供する段階；
(d) 標的核酸配列に特異的にハイブリダイズしたプローブを切断して、切断型プローブを形成させる段階；
(e) 切断型プローブを捕捉配列にハイブリダイズさせる条件を提供する段階；
(f) 切断型プローブを伸長させて、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーと所定Tmとを有する二重鎖核酸を形成させる段階；
(g) 所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを測定する段階；ならびに
(h) 第1シグナルと第2シグナルとの間に所定の閾値を超える差がある場合に、標的核酸の存在を検出する段階
を含む、サンプル中の標的核酸の存在を検出するための方法。
【請求項７３】
捕捉配列と切断型プローブが単分子であり、ハイブリダイズしてヘアピンプローブを形成する、請求項72記載の方法。
【請求項７４】
捕捉配列と切断型プローブが二分子である、請求項72記載の方法。
【請求項７５】
標的特異的プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーが付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、二重鎖核酸が、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが付着している第2非天然ヌクレオチドを含み、第1非天然ヌクレオチドと第2非天然ヌクレオチドが互いに塩基対合し得る、請求項72記載の方法。
【請求項７６】
第1および第2非天然ヌクレオチドが、isoCおよびisoGの一方または他方である、請求項75記載の方法。
【請求項７７】
レポーター-クエンチャー対の第1メンバーがフルオロフォアであり、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーがクエンチャーである、請求項72記載の方法。
【請求項７８】
(a) サンプルとシグナル発生標的特異的プローブとを含む反応混合物を提供する段階であって、標的特異的プローブは、第1一本鎖立体構造にある場合に第1シグナルを生じる、段階；
(b) 反応混合物中の標的特異的プローブからの第1シグナルを測定する段階；
(c) 反応混合物を標的核酸の増幅のための条件に供する段階であって、増幅中に、標的特異的プローブは修飾されて、所定Tmを有しかつ所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを生じ得る二重鎖核酸を含む修飾型標的特異的プローブを形成する、段階；
(d) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを測定する段階；
(e) 第1シグナルと第2シグナルとの間に所定の閾値を超える差がある場合に、標的核酸の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の標的核酸の存在を決定するための方法。
【請求項７９】
標的特異的プローブが、標的核酸へのハイブリダイゼーションの際に切断され、捕捉配列に結合しかつ伸長されて二重鎖核酸を形成する切断型プローブを形成することによって、修飾される、請求項78記載の方法。
【請求項８０】
第1および第2シグナルが蛍光シグナルである、請求項78記載の方法。
【請求項８１】
第1シグナルが、標的特異的プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションの前に検出される、請求項79記載の方法。
【請求項８２】
第1シグナルが、修飾型標的特異的プローブが一本鎖立体構造にある条件下で、切断および伸長の後に検出される、請求項79記載の方法。
【請求項８３】
標的特異的プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識された第1非天然ヌクレオチドを含み、修飾型標的特異的プローブが、第1非天然ヌクレオチドと塩基対合することができかつレポーター-クエンチャー対の第2メンバーで標識された第2非天然ヌクレオチドを含む、請求項78記載の方法。
【請求項８４】
第1および第2非天然ヌクレオチドが、iso-Cおよびiso-Gのうちの1つである、請求項83記載の方法。
【請求項８５】
標的特異的プローブが、捕捉配列への結合前にフルオロフォアで標識され、クエンチャーが、フルオロフォアの消光をもたらす位置において伸長中に二重鎖核酸中に取り込まれる、請求項79記載の方法。
【請求項８６】
(a) 第1および第2蛍光シグナル発生標的特異的プローブと第1および第2標的核酸を含有する可能性のあるサンプルとを含む増幅反応混合物を形成する段階；
(b) 各区画が平均して0個または1個の第1および／または第2標的核酸を含むように、反応混合物を区画化する段階；
(c) 予め選択された温度T1、T2、およびT3において、区画の少なくとも1つのサブセットの画像から第1、第2、および第3セットの蛍光強度値を取得し、区画の該サブセット中の各区画について、予め選択された温度T1における第1蛍光強度値、予め選択された温度T2における第2蛍光強度値、および予め選択された温度T3における第3蛍光強度値を決定する段階；
(d) 第1および第2標的核酸を増幅するための、ならびにその標的核酸の存在下で第1シグナル発生プローブを修飾して第1所定Tmを有する第1二重鎖核酸を形成するための、ならびにその標的核酸の存在下で第2シグナル発生プローブを修飾して第2所定Tmを有する第2二重鎖核酸を形成するための条件に、増幅反応混合物を含む区画を供する段階；
(e) 第1所定Tmよりも低い温度T1において、区画の該サブセットの画像から第4セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第4強度値を算出する段階；
(f) 第1所定Tmよりも高いが、第2所定Tmよりも低い温度T2において、区画の該サブセットの画像から第5セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第5強度値を算出する段階；
(g) 第2所定Tmよりも高い温度T3において、区画の該サブセットの画像から第6セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第6強度値を算出する段階；
(h) 各区画について、第4強度値を第1強度値で割って、T1に関連する第7強度値を得る段階；
(i) 各区画について、第5強度値を第2強度値で割って、T2に関連する第8強度値を得る段階；
(j) 各区画について、第6強度値を第3強度値で割って、T3に関連する第9強度値を得る段階；
(k) 各区画について、第8強度値と第7強度値との間の変化を検出して、第1標的核酸の存在を決定する段階；ならびに
(l) 各区画について、第9平均強度値と第8平均強度値との間の変化を検出して、第2標的核酸の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の第1および第2標的核酸の存在を検出する方法。
【請求項８７】
第1および第2蛍光シグナル発生プローブが、同じシグナル発生標識を有する、請求項86記載の方法。
【請求項８８】
シグナル発生標識がレポーター-クエンチャー対の第1メンバーであり、第1および第2二重鎖核酸がレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを含む、請求項87記載の方法。
【請求項８９】
第1および第2シグナル発生プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーが付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、第1および第2二重鎖核酸が、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが付着している第2非天然ヌクレオチドを含み、第1非天然ヌクレオチドと第2非天然ヌクレオチドが互いに塩基対合し得る、請求項88記載の方法。
【請求項９０】
非天然ヌクレオチドがiso-Cまたはiso-Gのうちの1つである、請求項89記載の方法。
【請求項９１】
第1および第2シグナル発生プローブが、増幅中に切断される切断可能なプローブである、請求項86記載の方法。
【請求項９２】
第8強度値と第7強度値との間の変化が所定の閾値を超え、第9強度値と第8強度値との間の変化が所定の閾値を超える、請求項86記載の方法。
【請求項９３】
(a) 蛍光シグナル発生標的特異的プローブと標的核酸を含有するサンプルとを含む増幅反応混合物を形成する段階；
(b) 各区画が平均して0個または1個の標的核酸を含むように、反応混合物を区画化する段階；
(c) 予め選択された温度T1およびT2において、区画の少なくとも1つのサブセットの画像から第1および第2セットの蛍光強度値を取得し、区画の該サブセット中の各区画について、予め選択された温度T1における第1蛍光強度値および予め選択された温度T2における第2蛍光強度値を決定する段階；
(d) 標的核酸を増幅するための、およびその標的核酸の存在下でシグナル発生プローブを修飾して所定Tmを有する二重鎖核酸を形成するための条件に、増幅反応混合物を含む区画を供する段階；
(e) 所定Tmよりも低い温度T1において、区画の該サブセットの画像から第3セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第3強度値を算出する段階；
(f) 所定Tmよりも高い温度T2において、区画の該サブセットの画像から第4セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第4強度値を算出する段階；
(g) 各区画について、第3強度値を第1強度値で割って、T1に関連する第5強度値を得る段階；
(h) 各区画について、第4強度値を第2強度値で割って、T2に関連する第6強度値を得る段階；
(i) 各区画について、第6強度値と第5強度値との間の変化を検出して、標的核酸の存在を決定する段階
を含む、サンプル中の標的核酸の存在を検出する方法。
【請求項９４】
標的核酸が第1標的核酸であり、シグナル発生標的特異的プローブが第1蛍光シグナル発生標的特異的プローブであり、所定Tmが第1所定Tmである、請求項93記載の方法であって、
第2標的核酸の存在を検出する段階であって、反応混合物が第2蛍光シグナル発生標的特異的プローブをさらに含む、段階
をさらに含み、
(j) 段階 (b) において、各区画が平均して0個または1個の第1および／または第2標的核酸を含むように、反応混合物を区画化する段階；
(k) 段階 (c) において、予め選択された温度T3において、区画の少なくとも1つのサブセットの画像から第5セットの蛍光強度値を取得し、区画の該サブセット中の各区画について、予め選択された温度T3における第7蛍光強度値を決定する段階；
(l) 段階 (d) において、標的核酸を増幅するための、およびその標的核酸の存在下で第2シグナル発生プローブを修飾して第2所定Tmを有する第2二重鎖核酸を形成するための条件に、増幅反応混合物を含む区画を供する段階；
(m) 第2所定Tmよりも高い温度T3において、区画の該サブセットの画像から第6セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第8強度値を算出する段階；
(n) 各区画について、第8強度値を第7強度値で割って、T3に関連する第9強度値を得る段階；
(o) 各区画について、第9強度値と第6強度値との間の変化を検出して、第2標的核酸の存在を決定する段階
をさらに含む、前記方法。
【請求項９５】
第6強度値と第5強度値との間の変化および第9強度値と第6強度値との間の変化が、所定の閾値を超える、請求項93または94記載の方法。
【請求項９６】
第1および第2蛍光シグナル発生プローブが、同じシグナル発生標識を有する、請求項94記載の方法。
【請求項９７】
シグナル発生標識がレポーター-クエンチャー対の第1メンバーであり、第1および第2二重鎖核酸がレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを含む、請求項94記載の方法。
【請求項９８】
第1および第2シグナル発生プローブが、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーが付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、第1および第2二重鎖核酸が、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが付着している第2非天然ヌクレオチドを含み、第1非天然ヌクレオチドと第2非天然ヌクレオチドが互いに塩基対合し得る、請求項94記載の方法。
【請求項９９】
非天然ヌクレオチドがiso-Cまたはiso-Gのうちの1つである、請求項98記載の方法。
【請求項１００】
第1および第2シグナル発生プローブが、増幅中に切断される切断可能なプローブである、請求項94記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、2018年1月22日に出願された米国仮特許出願第62/620,298号の恩典を主張するものであり、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
1. 発明の分野
本発明は一般に分子生物学の分野に関する。より詳細には、本発明は、生物学的サンプル中の核酸標的を同定および定量化するための方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
2. 関連技術の説明
二重鎖核酸の融解分析は、アンプリコンの同一性を識別するために融解ピークまたはアニールピークを利用するが、融解ピークは、同じ温度付近で融解するアンプリコンまたは核酸二重鎖では、そのアンプリコンまたは核酸が明確に標識されていない限り、容易に区別できない。さらに、融解分析は一般に標的増幅後に行われ、この分析では、サンプルの温度をゆっくりと増減させ、複数の温度において画像を取得するために必要な時間のせいで、アッセイの所要時間が増す。
【０００４】
デジタルポリメラーゼ連鎖反応 (dPCR) は従来のPCRを改良したものであり、核酸、例えば、DNA、cDNA、またはRNAを直接定量化するおよびクローン的に増幅するために使用することができる。従来のPCRは一般に核酸量を測定するために使用され、1サンプル当たり単一反応によって行われる。dPCR方法論を利用しても、1サンプルについて単一反応がやはり行われるが、サンプルは多数の区画に分離され、反応は各区画で個々に行われる。この分離により、核酸量のより信頼性の高い収集および高感度な測定が可能になる。
【０００５】
dPCRの現在の方法は、標的核酸の存在を定量化するためにエンドポイントPCRに依存する。このエンドポイントPCR解析は、様々な方法で限定的である。第1に、DNAインターカレート色素およびTaqManプローブの使用は、非特異的増幅の可能性をもたらして、区画において偽陽性シグナルを生じる。加えて、既存の市販のシステムでは、利用可能な蛍光チャネルの数が限られており、これによって複数の標的を検出する能力が限定される。最後に、陽性または陰性としての区画の分類は、区画のエンドポイント蛍光強度のみに依存する。
【０００６】
うまく設計されたアッセイでは、陽性区画と陰性区画の平均強度値において良好な分離が望ましい。しかしながら、デジタルPCRではより頻繁に、「レイン (rain)」として公知である現象が、区画をこれらの2つのカテゴリーに分類することを混乱させる。レインは、増幅後の中間強度の区画として説明され得る。陽性区画は、不完全な増幅に起因して、予測強度よりも低い強度を有する場合があり、陰性区画は、非特異的な増幅に起因して、予測強度よりも高い強度を有する場合がある。これは、蛍光強度の変動に加えて、機器の光学的なおよび温度によるシステム変動性に起因する。
【０００７】
定量的リアルタイムPCR (qPCR) において適用されたのと類似の様式で、融解分析をdPCR反応に適用する試みによって、潜在的な欠点が明らかにされた。欠点の1つは、dPCR適用において融解プロファイルを取得するのに必要な時間である。画像は、多数（例えば、最大30,000個まで）の区画にわたって、およそ35〜70の特有な温度などの多くの異なる温度で取得されなければならず、これは多大な時間を必要とし得る。典型的な曝露時間は、画像化の前にLEDを点灯させるための時間を考慮せずに、1sのオーダーである。30,000個の1nL区画のためのフットプリントは、12.5mm x 12.5mmのオーダーであり得る。1 nL区画において適切な分解能を達成するための典型的な視野の寸法は、6mm x 6mmのオーダーである。したがって、0.5℃の分解能において融解プロファイルを作成するためには、単一のサンプルに対して630個の画像が必要であると考えられ、画像の取得単独で、追加のチャネルにおける融解取得を考慮せずに、10分超を要すると考えられる。この方法はまた、区画を連続して高温で長時間維持することを必要とし、およびサンプルの光に対する長時間曝露を必要とし、これは光退色を通じて蛍光シグナルを分解させ得る。
【０００８】
データ収集および分析に必要な時間を短縮するため、ならびに反応の特異性を改善して正確な結果を確実にするために、dPCR適用において融解分析を行うための改良法を見出すことが望ましいと考えられる。
【発明の概要】
【０００９】
いくつかの態様において、本開示は、反応混合物中の標識付加二重鎖核酸について融解分析を行う方法を提供し、ここで標識付加二重鎖核酸は所定Tmを有し、この方法は、(a) 標識付加二重鎖核酸の所定Tmよりも低い第1温度において、標識付加二重鎖核酸からの第1シグナルを測定する段階；(b) 標識付加二重鎖核酸の所定Tmよりも高い第2温度において、標識付加二重鎖核酸からの第2シグナルを測定する段階；および (c) 第1シグナルと第2シグナルを比較することにより、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であるかどうかを判定する段階であって、第1シグナルと第2シグナルとの間の変化は、標識付加二重鎖核酸が反応混合物中での標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であることを示し、かつシグナルは標識付加二重鎖核酸の所定Tmにおいて測定されない、段階を含む。いくつかの局面において、反応混合物中の標識付加二重鎖核酸について融解分析を行う段階を含む方法が提供され、ここで標識付加二重鎖核酸は所定Tmを有し、この方法は、(a) 標識付加二重鎖核酸の所定Tmよりも低い第1温度において、標識付加二重鎖核酸からの第1シグナルを測定する段階；(b) 標識付加二重鎖核酸の所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、該所定Tmよりも高い第2温度において、標識付加二重鎖核酸からの第2シグナルを測定する段階；および (c) 第1シグナルと第2シグナルを比較し、第1シグナルと第2シグナルとの間に変化がある場合に、標識付加二重鎖核酸が反応混合物中での標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であると判定する段階を含む。いくつかの局面において、標的特異的プローブは、標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの際に切断される切断可能なプローブである。いくつかの局面において、標的特異的プローブは、第1温度依存性立体構造または第2温度依存性立体構造をとることができる。いくつかの局面において、シグナルは、標識付加二重鎖核酸の所定Tmから2セルシウス度の範囲内では測定されない。いくつかの局面においては、標識付加二重鎖核酸の所定Tmから5セルシウス度の範囲内では測定されない。いくつかの局面において、第1温度と第2温度との差は、2セルシウス度よりも大きい。いくつかの局面において、第1温度と第2温度との差は、5セルシウス度よりも大きい。いくつかの局面において、第1温度と第2温度との差は、8セルシウス度よりも大きい。いくつかの局面において、本方法は、反応混合物中のすべての標識付加二重鎖核酸が変性する第3温度において第3シグナルを測定する段階、ならびに第1および第2シグナルを第3シグナルに対して正規化する段階をさらに含む。いくつかの局面では、反応混合物は、それぞれが特有の所定Tmを有する少なくとも2種類の異なる二重鎖核酸を含有し、それぞれの異なる二重鎖核酸は、同じシグナル発生標識を有し、e) 標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも低い温度および標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高い温度において、それぞれの異なる標識付加二重鎖核酸からのシグナルを測定する段階を含み、それぞれの異なる標識付加二重鎖核酸について、特有の所定Tmよりも低い温度で測定されたシグナルおよび特���の所定Tmよりも高い温度で測定されたシグナルにおける変化は、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブのその標的への特異的ハイブリダイゼーションの結果であることを示す。いくつかの局面において、シグナルは、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応混合物中の特有の標的特異的プローブの数である。いくつかの局面において、これらの段階は、dPCR反応における複数の区画において行われる。いくつかの局面において、第1および第2シグナルは、第1および第2シグナルから第3シグナルを減算することにより、第3シグナルに対して正規化される。さらなる局面において、第1シグナルと第2シグナルとの間の変化は、所定の閾値を超える。
【００１０】
いくつかの態様において、本開示は、サンプル中の少なくとも1種の標的核酸配列の存在を決定するための方法であって、a) 反応混合物中に標的核酸配列が存在する場合にそれに特異的にハイブリダイズし得る少なくとも1種の切断可能な標的特異的プローブに、ハイブリダイゼーション条件下でサンプルを接触させる段階；b) 標的核酸配列に特異的にハイブリダイズしたプローブを切断して、切断型プローブを形成させる段階；c) 切断型プローブを捕捉配列にハイブリダイズさせる条件を提供する段階；d) 切断型プローブを伸長させて、所定Tmおよびシグナル発生標識を有する二重鎖核酸を形成させる段階；e) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い温度において第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い温度において第2シグナルを測定する段階（により融解分析を行う段階）；ならびにf) 第1シグナルと第2シグナルの変化を検出することにより、標的核酸配列の存在を決定する段階を含む方法を提供する。いくつかの局面では、それぞれが異なる標的核酸配列に特異的である少なくとも2種類の異なる切断可能なプローブに、サンプルを接触させ、その特異的標的核酸配列の存在下で、それぞれの異なる切断可能なプローブは、特有の所定Tmを有する二重鎖核酸を形成し、特有の所定Tmを有する二重鎖核酸がすべて、同じシグナル発生標識を有し、特有の所定Tmを有するそれぞれの二重鎖核酸について、所定Tmよりも低い温度において第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い温度において第2シグナルを測定する段階、ならびに第1シグナルと第2シグナルとの間の変化を検出することにより、標的核酸配列の存在を決定する段階をさらに含む。いくつかの局面において、シグナルは、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応混合物中の異なる切断可能なプローブの数である。いくつかの局面において、該異なる二重鎖核酸の特有の所定Tmは、少なくとも2セルシウス度異なる。いくつかの局面において、該異なる二重鎖核酸の特有の所定Tmは、少なくとも5セルシウス度異なる。いくつかの局面において、該異なる二重鎖核酸の特有の所定Tmは、少なくとも10セルシウス度異なる。いくつかの局面において、捕捉配列と切断型プローブは単分子である。他の局面において、捕捉配列と切断型プローブは二分子である。いくつかの局面においては、第1シグナルと第2シグナルとの間の比が所定の閾値を超える場合に、標的核酸は存在すると判定される。いくつかの局面において、本方法は、所定Tmから2セルシウス度の範囲内の温度ではシグナルを測定せずに行われる。いくつかの局面において、本方法は、所定Tmから5セルシウス度の範囲内の温度ではシグナルを測定せずに行われる。いくつかの局面において、少なくとも1種の切断可能なプローブは、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識され、少なくとも1種の切断可能なプローブは、その標的核酸配列にハイブリダイズした場合に第1立体構造をとる。
【００１１】
いくつかの局面においては、少なくとも1種の切断可能なプローブがその標的配列に特異的にハイブリダイズすると、切断部位においてプローブが切断され、切断型プローブが標的核酸配列から放出されて第2立体構造をとり、切断部位から鎖伸長が起こる。いくつかの局面において、鎖伸長は、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーと相互作用するレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを取り込む（シグナルの変化を生じる）ことを含む。いくつかの局面において、第1立体構造は直鎖状立体構造であり、第2立体構造はヘアピン立体構造である。いくつかの局面において、前記方法は、反応混合物中のすべての核酸が変性する第3温度において第3シグナルを測定する段階、ならびに第1および第2シグナルを第3シグナルに対して正規化する段階をさらに含む。いくつかの局面において、これらの段階は、dPCR反応における複数の区画において行われる。いくつかの局面では、融解分析は、dPCR反応における複数の区画にわたって行われ、切断の前に、複数の区画における切断可能なプローブの標識からのシグナルを測定する段階、および、切断の前に測定されたシグナルを用いて、標的核酸を含む区画と標的核酸を含まない区画を区別するための閾値を設定する段階をさらに含む。いくつかの局面では、融解分析は、dPCR反応における複数の区画にわたって行われ、伸長の後かつ融解分析の前に、ある範囲の温度において複数のシグナルを測定する段階、ならびに、測定されたシグナルを用いて、融解分析中に測定されたシグナルにおける光および温度依存的変化を補正する段階をさらに含む。
【００１２】
いくつかの態様において、本開示は、反応混合物中の標識付加二重鎖核酸の融解分析を行う方法であって、a) 標識付加二重鎖核酸が主に第1立体構造にある第1温度において、標識付加二重鎖核酸からの第1シグナルを測定する段階；(b) 標識付加二重鎖核酸が主に第2立体構造にある第2温度において、標識付加二重鎖核酸からの第2シグナルを測定する段階であって、シグナルは、二重鎖核酸の約半数が第1立体構造にあり、二重鎖核酸の半数が第2立体構造にある、第1温度と第2温度の中間にある温度において測定されない、段階；および (c) 第1シグナルと第2シグナルを比較することにより、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であるかどうかを判定する段階であって、第1シグナルと第2シグナルとの間の変化は、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であることを示す、段階を含む方法を提供する。さらなる局面において、方法は、反応混合物中の標識付加二重鎖核酸の融解分析を行う段階を含み、(a) 標識付加二重鎖核酸が第1立体構造にある第1温度において、標識付加二重鎖核酸からの第1シグナルを測定する段階；(b) 標識付加二重鎖核酸が第2立体構造にある第2温度において、標識付加二重鎖核酸からの第2シグナルを測定する段階であって、シグナルは、第1温度と第2温度の中間にある温度において測定されない、段階；および (c) 第1シグナルと第2シグナルを比較することにより、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であるかどうかを判定する段階であって、第1シグナルと第2シグナルとの間の変化は、標識付加二重鎖核酸が標的特異的プローブの標的配列への特異的ハイブリダイゼーションの結果であることを示す、段階を含む。いくつかの局面では、反応混合物は少なくとも2種類の異なる標識付加二重鎖核酸を含有し、それぞれの異なる標識付加二重鎖核酸は、特有の温度において第2立体構造をとることができ、それぞれの異なる標識付加核酸は同じシグナル発生標識を有し、それぞれの標識付加二重鎖核酸について、標識付加二重鎖核酸が主に第1立体構造にある温度において第1シグナルを測定する段階、および標識付加二重鎖核酸が主に第2立体構造にある温度において第2シグナルを測定する段階、ならびに第1シグナルと第2シグナルを比較する段階をさらに含む。いくつかの局面において、シグナルは、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応混合物中の異なる二重鎖核酸の数である。いくつかの局面において、第1立体構造はヘアピン立体構造であり、第2立体構造は直鎖状立体構造である。いくつかの局面において、標的特異的プローブは、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識された切断可能なプローブである。いくつかの局面においては、標的特異的プローブがその標的配列に特異的にハイブリダイズすると、切断部位においてプローブが切断されて切断型プローブを形成し、該切断型プローブが標的核酸配列から放出されてヘアピンプローブを形成し、該切断部位から鎖伸長が起こる。いくつかの局面において、鎖伸長は、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーと相互作用するレポーター-クエンチャー対の第2��ンバーを取り込んで、シグナルの変化を生じることを含む。いくつかの局面において、本方法は、反応混合物中のすべての核酸が変性する第3温度において第3シグナルを測定する段階、ならびに第1および第2シグナルを第3シグナルに対して正規化する段階をさらに含む。いくつかの局面において、これらの段階は、dPCR反応における複数の区画において行われる。
【００１３】
いくつかの態様において、本開示は、サンプル中の少なくとも1種の標的核酸配列の存在を検出するための方法であって、a) 標的核酸配列が存在する場合にそれに特異的にハイブリダイズし得る少なくとも1種の切断可能なプローブに、サンプルを接触させる段階であって、切断可能なプローブは、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識された第1非天然ヌクレオチドを含む、段階；b) 標的核酸配列に特異的にハイブリダイズしたプローブを切断して、切断型プローブを形成させる段階；c) 切断型プローブにヘアピンプローブを形成させる条件を提供する段階；d) 第1非天然ヌクレオチドと塩基対合し得る、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーで標識された第2非天然ヌクレオチドの存在下でヘアピンプローブを伸長させて、所定Tmを有するヘアピンプローブを形成させる段階；e) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い温度において、レポーター-クエンチャー対からの第1シグナル、および所定Tmよりも高い温度において第2シグナルを測定する段階（により融解分析を行う段階）；ならびにf) 第1シグナルと第2シグナルの変化を検出することにより、標的核酸配列の存在を決定する段階を含む方法を提供する。いくつかの局面では、それぞれが異なる核酸に特異的であり、かつそれぞれがその各々の標的核酸の存在下で、特有の所定Tmを有するヘアピンプローブを形成し得る、2種類またはそれ以上の異なる切断可能なプローブに、サンプルを接触させ、それぞれの異なるヘアピンプローブは同じレポーター-クエンチャー対を含み、それぞれの異なるヘアピンプローブについて、ヘアピンプローブの所定Tmよりも低い温度において第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い温度において第2シグナルを測定する段階、ならびにそれぞれの異なるヘアピンプローブについて、第1シグナルと第2シグナルを比較する段階をさらに含む。いくつかの局面においては、単一の反応コンパートメント中で、2種類またはそれ以上の異なる切断可能なプローブにサンプルを接触させる。いくつかの局面において、シグナルは、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応コンパートメント中の異なる切断可能なプローブの数である。いくつかの局面において、該異なるヘアピンプローブの特有の所定Tmは、少なくとも2セルシウス度異なる。いくつかの局面において、該異なるヘアピンプローブの特有の所定Tmは、少なくとも5セルシウス度異なる。いくつかの局面において、該異なるヘアピンプローブの特有の所定Tmは、少なくとも10セルシウス度異なる。いくつかの局面においては、第1シグナルと第2シグナルとの間の比が所定の閾値を超える場合に、標的核酸は存在すると判定される。いくつかの局面において、融解分析は、所定Tmから2セルシウス度の範囲内の温度ではシグナルを測定せずに行われる。いくつかの局面において、融解分析は、所定Tmから5セルシウス度の範囲内の温度ではシグナルを測定せずに行われる。いくつかの局面において、本方法は、反応混合物中のすべての核酸が変性する第3温度において第3シグナルを測定する段階、ならびに第1および第2シグナルを第3シグナルに対して正規化する段階をさらに含む。いくつかの局面において、これらの段階は、dPCR反応における複数の区画において行われる���いくつかの局面では、融解分析は、dPCR反応における複数の区画にわたって行われ、切断の前に、複数の区画における切断可能なプローブの標識からのシグナルを測定する段階、および、切断の前に測定されたシグナルを用いて、標的核酸を含む区画と標的核酸を含まない区画を区別するための閾値を設定する段階をさらに含む。いくつかの局面では、融解分析は、dPCR反応における複数の区画にわたって行われ、伸長の後かつ融解分析の前に、ある範囲の温度において複数のシグナルを測定する段階、ならびに、測定されたシグナルを用いて、融解分析中に測定されたシグナルにおける光および温度依存的変化を補正する段階をさらに含む。
【００１４】
いくつかの態様において、本開示は、サンプル中の少なくとも1種の標的核酸配列の存在または非存在を検出するための方法であって、a) 標的核酸配列が存在する場合にそれに特異的にハイブリダイズし得る少なくとも1種の切断可能なプローブに、サンプルを接触させる段階であって、切断可能なプローブはシグナル発生標識を含む、段階；b) 標的核酸配列に特異的にハイブリダイズしたプローブを切断して、切断型プローブを形成させる段階；c) 切断型プローブと相補的である配列を含む捕捉配列に切断型プローブをハイブリダイズさせる条件を提供する段階；d) 捕捉配列を鋳型として用いて切断型プローブを伸長させて、所定Tmを有する二本鎖プローブを形成させる段階；ならびにe) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い第1温度においてシグナル発生標識からの第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い第2温度において第2シグナルを測定する段階（により融解分析を行う段階）；ならびにf) 第1温度と第2温度において測定されたシグナルの変化を検出することにより、標的核酸配列の存在を決定する段階を含む方法を提供する。いくつかの局面では、それぞれが異なる標的核酸に特異的であり、かつそれぞれがその各々の標的核酸の存在下で、特有の所定Tmを有する二本鎖プローブを形成し得る、2種類またはそれ以上の異なる切断可能なプローブに、サンプルを接触させ、それぞれの異なる二本鎖プローブは同じレポーター-クエンチャー対を含み、それぞれの異なる二本鎖プローブについて、所定Tmよりも低い第1温度において第1シグナルを測定し、所定Tmよりも高い第2温度において第2シグナルを測定する段階、ならびにそれぞれの異なる二本鎖プローブについて測定された第1シグナルと第2シグナルを比較する段階をさらに含む。いくつかの局面において、捕捉配列と切断型プローブは単分子である。他の局面において、捕捉配列と切断型プローブは二分子である。いくつかの局面においては、単一の反応コンパートメント中で、2種類またはそれ以上の異なる切断可能なプローブにサンプルを接触させる。いくつかの局面において、シグナルは、n + 1種類以下の異なる温度において測定され、nは、反応コンパートメント中の異なる切断可能なプローブの数である。いくつかの局面において、該異なる二本鎖プローブの特有の所定Tmは、少なくとも2セルシウス度異なる。いくつかの局面において、該異なる二本鎖プローブの特有の所定Tmは、少なくとも5セルシウス度異なる。いくつかの局面において、該異なる二本鎖プローブの特有の所定Tmは、少なくとも8セルシウス度異なる。いくつかの局面においては、第1シグナルと第2シグナルとの間の比が所定の閾値を超える場合に、標的核酸は存在すると判定される。いくつかの局面において、本方法は、所定Tmから2セルシウス度の範囲内の温度ではシグナルを測定せずに行われる。いくつかの局面において、本方法は、所定Tmから5セルシウス度の範囲内の温度ではシグナルを測定せずに行われる。さらなる局面において、シグナル発生標識はレポーター-クエンチャー対の第1メンバーであり、二本鎖プローブは、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーと相互作用するレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを含む。いくつかの局面において、切断可能なプローブは、シグナル発生標識が付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、二重鎖核酸は、第1非天然ヌクレオチドにハイブリダイズする第2非天然ヌクレオチドを含み、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーは、第2非天然ヌクレオチドに付着している。ある特定の局面において、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーは蛍光実体であり、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーは、蛍光実体の蛍光を消光するクエンチャーである。なおさらなる局面において、第1および第2非天然ヌクレオチドは、iso-Cおよびiso-Gのうちの1つである。いくつかの局面において、本方法は、反応混合物中のすべての核酸が変性する第3温度において第3シグナルを測定する段階、ならびに第1および第2シグナルを第3シグナルに対して正規化する段階をさらに含む。いくつかの局面において、これらの段階は、dPCR反応における複数の区画において行われる。いくつかの局面では、融解分析は、dPCR反応における複数の区画にわたって行われ、切断の前に、複数の区画における切断可能なプローブの標識からのシグナルを測定する段階、および、切断の前に測定されたシグナルを用いて、標的核酸を含む区画と標的核酸を含まない区画を区別するための閾値を設定する段階をさらに含む。いくつかの局面では、融解分析は、dPCR反応における複数の区画にわたって行われ、伸長の後かつ融解分析の前に、ある範囲の温度において複数のシグナルを測定する段階、ならびに、測定されたシグナルを用いて、融解分析中に測定されたシグナルにおける光および温度依存的変化を補正する段階をさらに含む。
【００１５】
いくつかの態様において、本開示は、複数の標識付加核酸二重鎖について融解分析を行う方法であって、(a) 少なくとも第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸を提供する段階であって、ここで、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸のそれぞれは特有の所定Tmを有し、第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmは第1標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高く、第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmは第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高く、ここで、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸は同じ標識で標識されている、段階；(b) 第1標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも低い第1温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第1シグナルを検出する段階；(c) 第1標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmと第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmとの間の第2温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第2シグナルを検出する段階；(d) 第2標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmと第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmとの間の第3温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第3シグナルを検出する段階；(e) 第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmよりも高い第4温度において、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸からの第4シグナルを検出する段階；ならびに (f) 第1、第2、第3、および第4シグナルを比較することにより、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸のうちの1つまたは複数が、標的特異的プローブの切断の結果であるかどうかを判定する段階であって、ここで、第1シグナルと第2シグナルとの間の変化は、第1標識付加二重鎖核酸が第1標的特異的プローブの切断の結果であることを示し、第2シグナルと第3シグナルとの間の変化は、第2標識付加二重鎖核酸が第2標的特異的プローブの切断の結果であることを示し、第3シグナルと第4シグナルとの間の変化は、第3標識付加二重鎖核酸が第3標的特異的プローブの切断の結果であることを示す、段階を含む方法を提供する。いくつかの局面において、シグナルは、第1、第2、および第3標識付加二重鎖核酸の特有の所定Tmにおいて検出されない。いくつかの局面において、第1温度と第2温度との間の差は2セルシウス度よりも大きく、第2温度と第3温度との間の差は2セルシウス度よりも大きく、第3温度と第4温度との間の差は2セルシウス度よりも大きい。いくつかの局面において、これらの段階は、dPCR反応における複数の区画において行われる。いくつかの局面において、第1および第2シグナルは、第1および第2シグナルから第3シグナルを減算することにより、第3シグナルに対して正規化される。さらなる局面において、方法は、反応混合物中のすべての二重鎖核酸が変性する第3温度において第3シグナルを測定する段階、ならびに第1および第2シグナルを第3シグナルに対して正規化する段階を含む。
【００１６】
なおさらなる態様において、サンプル中の標的核酸の存在を決定するための方法であって、(a) サンプルとシグナル発生標的特異的プローブとを含む反応混合物を提供する段階であって、標的特異的プローブは、第1一本鎖立体構造にある場合に第1シグナルを生じる、段階；(b) 反応混合物中の標的特異的プローブからの第1シグナルを測定する段階；(c) 標的核酸が存在する場合にそれに標的特異的プローブがハイブリダイズして第2立体構造をとるための条件を提供する段階であって、第2立体構造が、所定Tmを有しかつ所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを生じ得る二重鎖核酸である、段階；(d) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い温度において二重鎖核酸からの第2シグナルを測定する段階；ならびに (e) 第1シグナルと第2シグナルとの間に差がある場合に、標的核酸の存在を決定する段階を含む方法が提供される。ある特定の局面において、標的特異的プローブは、標的核酸へのハイブリダイゼーションの際に切断されて切断型プローブを形成する、切断可能なプローブであり、および／または切断型プローブは、捕捉配列に結合し、伸長されて二重鎖核酸を形成する。いくつかの局面において、第1および第2シグナルは蛍光シグナルである。ある特定の局面において、第1シグナルは、標的特異的プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションの前に検出される。いくつかの局面において、第1シグナルは、標的特異的プローブが第1立体構造にある条件下で、切断および伸長の後に検出される。さらなる局面において、切断可能なプローブは、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識された第1非天然ヌクレオチドを含み、二重鎖核酸は、第1非天然ヌクレオチドと塩基対合することができかつレポーター-クエンチャー対の第2メンバーで標識された第2非天然ヌクレオチドを含む。例えば、場合によっては、第1および第2非天然ヌクレオチドは、iso-Cおよびiso-Gのうちの1つである。場合によっては、標的特異的プローブは、捕捉配列への結合前にフルオロフォアで標識され、クエンチャーは、フルオロフォアの消光をもたらす位置において二重鎖核酸中に取り込まれる。場合によっては、反応混合物は、段階 (b) の後に標的核酸の増幅のための条件に供される。ある特定の局面において、捕捉配列と切断型プローブは単分子であり、ハイブリダイズしてヘアピンプローブを形成する。場合によっては、捕捉配列と切断型プローブは二分子である。
【００１７】
なおさらなる態様において、サンプル中の標的核酸の存在を検出するための方法であって、(a) サンプルと、反応混合物中に標的核酸配列が存在する場合にそれに特異的にハイブリダイズし得る少なくとも1種の標識付加された切断可能な標的特異的プローブとを含む反応混合物を提供する段階であって、標識がレポーター-クエンチャー対の第1メンバーである段階；(b) 反応混合物中の標識付加標的特異的プローブからの第1シグナルを測定する段階；(c) 反応混合物中に標的核酸配列が存在する場合にそれに標識付加切断可能標的特異的プローブをハイブリダイズさせる条件を提供する段階；(d) 標的核酸配列に特異的にハイブリダイズしたプローブを切断して、切断型プローブを形成させる段階；(e) 切断型プローブを捕捉配列にハイブリダイズさせる条件を提供する段階；(f) 切断型プローブを伸長させて、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーと所定Tmとを有する二重鎖核酸を形成させる段階；(g) 所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを測定する段階；ならびに (h) 第1シグナルと第2シグナルとの間に所定の閾値を超える差がある場合に、標的核酸の存在を検出する段階を含む方法が提供される。いくつかの局面において、捕捉配列と切断型プローブは単分子であり、ハイブリダイズしてヘアピンプローブを形成する。ある特定の場合、捕捉配列と切断型プローブは二分子である。ある特定の局面において、標的特異的プローブは、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーが付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、二重鎖核酸は、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが付着している第2非天然ヌクレオチドを含み、第1非天然ヌクレオチドと第2非天然ヌクレオチドは互いに塩基対合し得る。例えば、場合によっては、第1および第2非天然ヌクレオチドは、isoCおよびisoGの一方または他方である。ある特定の局面において、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーはフルオロフォアであり、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーはクエンチャーである。
【００１８】
なおさらなる態様において、サンプル中の標的核酸の存在を決定するための方法であって、(a) サンプルとシグナル発生標的特異的プローブとを含む反応混合物を提供する段階であって、標的特異的プローブは、第1一本鎖立体構造にある場合に第1シグナルを生じる、段階；(b) 反応混合物中の標的特異的プローブからの第1シグナルを測定する段階；(c) 反応混合物を標的核酸の増幅のための条件に供する段階であって、増幅中に、標的特異的プローブは修飾されて、所定Tmを有しかつ所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを生じ得る二重鎖核酸を含む修飾型標的特異的プローブを形成する、段階；(d) 所定Tmにおいてシグナルを測定せずに、所定Tmよりも低い温度において第2シグナルを測定する段階；ならびに (e) 第1シグナルと第2シグナルとの間に所定の閾値を超える差がある場合に、標的核酸の存在を決定する段階を含む方法が提供される。いくつかの局面において、標的特異的プローブは、標的核酸へのハイブリダイゼーションの際に切断され、捕捉配列に結合しかつ伸長されて二重鎖核酸を形成する切断型プローブを形成することによって、修飾される。ある特定の局面において、第1および第2シグナルは蛍光シグナルである。場合によっては、第1シグナルは、標的特異的プローブの標的核酸へのハイブリダイゼーションの前に検出される。ある特定の局面において、第1シグナルは、修飾型標的特異的プローブが一本鎖立体構造にある条件下で、切断および伸長の後に検出される。ある特定の局面において、標的特異的プローブは、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーで標識された第1非天然ヌクレオチドを含み、修飾型標的特異的プローブは、第1非天然ヌクレオチドと塩基対合することができかつレポーター-クエンチャー対の第2メンバーで標識された第2非天然ヌクレオチドを含む。例えば、場合によっては、第1および第2非天然ヌクレオチドは、iso-Cおよびiso-Gのうちの1つである。ある特定の局面において、標的特異的プローブは、捕捉配列への結合前にフルオロフォアで標識され、クエンチャーは、フルオロフォアの消光をもたらす位置において伸長中に二重鎖核酸中に取り込まれる。
【００１９】
さらなる態様において、サンプル中の第1および第2標的核酸の存在を検出する方法であって、(a) 第1および第2蛍光シグナル発生標的特異的プローブと第1および第2標的核酸を含有する可能性のあるサンプルとを含む増幅反応混合物を形成する段階；(b) 各区画が平均して0個または1個の第1および／または第2標的核酸を含むように、反応混合物を区画化する段階；(c) 予め選択された温度T1、T2、およびT3において、区画の少なくとも1つのサブセットの画像から第1、第2、および第3セットの蛍光強度値を取得し、区画の該サブセット中の各区画について、予め選択された温度T1における第1蛍光強度値、予め選択された温度T2における第2蛍光強度値、および予め選択された温度T3における第3蛍光強度値を決定する段階；(d) 第1および第2標的核酸を増幅するための、ならびにその標的核酸の存在下で第1シグナル発生プローブを修飾して第1所定Tmを有する第1二重鎖核酸を形成するための、ならびにその標的核酸の存在下で第2シグナル発生プローブを修飾して第2所定Tmを有する第2二重鎖核酸を形成するための条件に、増幅反応混合物を含む区画を供する段階；(e) 第1所定Tmよりも低い温度T1において、区画の該サブセットの画像から第4セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第4強度値を算出する段階；(f) 第1所定Tmよりも高いが、第2所定Tmよりも低い温度T2において、区画の該サブセットの画像から第5セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第5強度値を算出する段階；(g) 第2所定Tmよりも高い温度T3において、区画の該サブセットの画像から第6セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第6強度値を算出する段階；(h) 各区画について、第4強度値を第1強度値で割って、T1に関連する第7強度値を得る段階；(i) 各区画について、第5強度値を第2強度値で割って、T2に関連する第8強度値を得る段階；(j) 各区画について、第6強度値を第3強度値で割って、T3に関連する第9強度値を得る段階；(k) 各区画について、第8強度値と第7強度値との間の変化を検出して、第1標的核酸の存在を決定する段階；ならびに (l) 各区画について、第9平均強度値と第8平均強度値との間の変化を検出して、第2標的核酸の存在を決定する段階を含む方法が提供される。場合によっては、第1および第2蛍光シグナル発生プローブは、同じシグナル発生標識を有する。ある特定の局面において、シグナル発生標識はレポーター-クエンチャー対の第1メンバーであり、第1および第2二重鎖核酸はレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを含む。ある特定の局面において、第1および第2シグナル発生プローブは、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーが付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、第1および第2二重鎖核酸は、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが付着している第2非天然ヌクレオチドを含み、第1非天然ヌクレオチドと第2非天然ヌクレオチドは互いに塩基対合し得る。例えば、いくつかの局面において、非天然ヌクレオチドはiso-Cまたはiso-Gのうちの1つである。ある特定の場合、第1および第2シグナル発生プローブは、増幅中に切断される切断可能なプローブである。さらなる局面において、第8強度値と第7強度値との間の変化は所定の閾値を超え、第9強度値と第8強度値との間の変化は所定の閾値を超える。
【００２０】
なおさらなる態様において、サンプル中の標的核酸の存在を検出する方法であって、(a) 蛍光シグナル発生標的特異的プローブと標的核酸を含有するサンプルとを含む増幅反応混合物を形成する段階；(b) 各区画が平均して0個または1個の標的核酸を含むように、反応混合物を区画化する段階；(c) 予め選択された温度T1およびT2において、区画の少なくとも1つのサブセットの画像から第1および第2セットの蛍光強度値を取得し、区画の該サブセット中の各区画について、予め選択された温度T1における第1蛍光強度値および予め選択された温度T2における第2蛍光強度値を決定する段階；(d) 標的核酸を増幅するための、およびその標的核酸の存在下でシグナル発生プローブを修飾して所定Tmを有する二重鎖核酸を形成するための条件に、増幅反応混合物を含む区画を供する段階；(e) 所定Tmよりも低い温度T1において、区画の該サブセットの画像から第3セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第3強度値を算出する段階；(f) 所定Tmよりも高い温度T2において、区画の該サブセットの画像から第4セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第4強度値を算出する段階；(g) 各区画について、第3強度値を第1強度値で割って、T1に関連する第5強度値を得る段階；(h) 各区画について、第4強度値を第2強度値で割って、T2に関連する第6強度値を得る段階；(i) 各区画について、第6強度値と第5強度値との間の変化を検出して、標的核酸の存在を決定する段階を含む方法が提供される。さらなる局面では、標的核酸は第1標的核酸であり、シグナル発生標的特異的プローブは第1蛍光シグナル発生標的特異的プローブであり、かつ所定Tmは第1所定Tmであり、第2標的核酸の存在を検出する段階をさらに含み、反応混合物は第2蛍光シグナル発生標的特異的プローブをさらに含み、本方法は、(j) 段階 (b) において、各区画が平均して0個または1個の第1および／または第2標的核酸を含むように、反応混合物を区画化する段階；(k) 段階 (c) において、予め選択された温度T3において、区画の少なくとも1つのサブセットの画像から第5セットの蛍光強度値を取得し、区画の該サブセット中の各区画について、予め選択された温度T3における第7蛍光強度値を決定する段階；(l) 段階 (d) において、標的核酸を増幅するための、およびその標的核酸の存在下で第2シグナル発生プローブを修飾して第2所定Tmを有する第2二重鎖核酸を形成するための条件に、増幅反応混合物を含む区画を供する段階；(m) 第2所定Tmよりも高い温度T3において、区画の該サブセットの画像から第6セットの蛍光強度値を取得し、各区画について第8強度値を算出する段階；(n) 各区画について、第8強度値を第7強度値で割って、T3に関連する第9強度値を得る段階；(o) 各区画について、第9強度値と第6強度値との間の変化を検出して、第2標的核酸の存在を決定する段階をさらに含む。いくつかの局面において、第6強度値と第5強度値との間の変化および第9強度値と第6強度値との間の変化は、所定の閾値を超える。ある特定の場合、第1および第2蛍光シグナル発生プローブは、同じシグナル発生標識を有する。さらなる局面において、シグナル発生標識はレポーター-クエンチャー対の第1メンバーであり、第1および第2二重鎖核酸はレポーター-クエンチャー対の第2メンバーを含む。場合によっては、第1および第2���グナル発生プローブは、レポーター-クエンチャー対の第1メンバーが付着している第1非天然ヌクレオチドを含み、第1および第2二重鎖核酸は、レポーター-クエンチャー対の第2メンバーが付着している第2非天然ヌクレオチドを含み、第1非天然ヌクレオチドと第2非天然ヌクレオチドは互いに塩基対合し得る。例えば、いくつかの局面において、非天然ヌクレオチドはiso-Cまたはiso-Gのうちの1つである。いくつかの局面において、第1および第2シグナル発生プローブは、増幅中に切断される切断可能なプローブである。
【００２１】
いくつかのさらなる局面では、段階がdPCR反応における複数の区画にわたって行われる、前記方法のいずれかを行うことができ、標的核酸の存在を決定する段階の前に、第1シグナルと第2シグナルとの間に変化がない区画を標的陰性区画として同定する段階、ならびに、標的陰性区画から測定されたシグナルを用いて、各区画において測定された第1および第2シグナルにおける光および温度依存的変化を正規化する段階をさらに含む。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、特定の成分のいずれも、意図的に組成物中に製剤化されていない、および／または混入物としてもしくは微量でのみ存在することを意味するために用いられる。組成物の任意の意図的でない混入によって生じる特定の成分の総量は、好ましくは0.01%よりも低い。特定の成分の量が標準的な分析方法で検出され得ない組成物が最も好ましい。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、明細書および特許請求の範囲において、「1つの (a)」または「1つの (an)」は、1つまたは複数を意味し得る。本明細書で用いられる場合、明細書および特許請求の範囲において、「含む」という語と共に用いられる場合には、「1つの (a)」または「1つの (an)」という語は、1つまたは2つ以上を意味し得る。本明細書で用いられる場合、明細書および特許請求の範囲において、「別の」または「さらなる」は、少なくとも2番目またはそれ以降を意味し得る。
【００２４】
本明細書および特許請求の範囲で用いられる場合、用語「約」は、ある値が、その値を決定するために使用される装置もしくは方法の固有の誤差変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために用いられる。
【００２５】
本発明の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明および具体的な例は、本発明の特定の態様を示すものの、単なる例示として提供されることを理解すべきである。というのは、本発明の精神および範囲内のさまざまな変更および修飾が、この詳細な説明から当業者には明らかになるからである。
【図面の簡単な説明】
【００２６】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本発明の特定の局面をさらに実証するために含められる。本発明は、本明細書に提示された特定の態様の詳細な説明と併せて、これらの図面の1つ以上を参照することにより、よりよく理解され得る。
【図１】それぞれ65℃、75℃、および85℃の融解温度を有する3種の標的特異的プローブに対する標的を含有するサンプルについての、相対蛍光単位 (RFU) 対温度 (A) および温度に対するRFUの負の微分値 (B)を示す、連続融解分析の例示的なプロット。連続融解分析では、0.5〜1.0℃の温度変化ごとにRFU測定が行われる。
【図２】本発明の方法を用いた、単一の標的特異的プローブに対する標的を含有するサンプル（A、C）および図1に示される3種の標的特異的プローブに対する標的を含有するサンプル（B、D）についての、RFU対温度（A、B）および温度に対するRFUの負の微分値（C、D）を示す、融解分析プロットの例。蛍光画像は、Xで示される温度でのみ取得した。
【図３】dPCR適用に関する、36個の区画における、図1に示された3種の標的特異的プローブに対する標的のランダム分布の例。各区画は、0、1、2、または3種の標的を含む。
【図４】T1（この例では60℃）で撮像された、図3に示されるシステムの蛍光画像であり、相対的な明るさは、区画内の切断されていない、伸長されていない特有のプローブの数を示す。切断可能なプローブを使用するこの例では、すべての標的陰性区画は、切断されていない、伸長されていないプローブの蛍光に起因して明るく、すべての標的含有区画は、各区画内の標的の数に応じて相対的に暗くなる。
【図５】T2 (70℃) で撮像された、図3に示されるシステムの蛍光画像であり、標的Aを含む区画は、標的Aプローブが変性して蛍光とクエンチャーが分離した結果として蛍光の増加を示す。
【図６】図3に示されるシステムの画像比較の例。T2で各区画について算出された平均蛍光強度を、T1で各区画について算出された平均蛍光強度で割って、どの区画が蛍光強度の変化を示すかを決定する (A)。図6Bは、標的について陰性であると決定された区画 (1) および標的について陽性であると決定された区画 (>1) に対応する区画の2つのクラスター（>1および1）を示す1D振幅プロットを表す。
【図７】各区画における標的の存在または非存在を決定するための、図3に示されるシステムの、T1、T2、T3、およびT4で撮像された画像の画像比較の例 (A)。各区画について算出された蛍光強度をT2対T1、T3対T2、およびT4対T3において比較して、付随する1D振幅プロットを作成すると、各温度セットについて、標的について陰性であると決定された区画のクラスター (1) および標的について陰性であると決定された区画のクラスター (>1) が得られる (B)。
【図８】区画特異的なシステム誘発性の変動を考慮するために画像の正規化を使用する例。図8Aおよび8Bは、それぞれ生データおよび（95℃で撮像された画像に対して）正規化された蛍光画像を示す；図8Cおよび8Dは、対応する強度ヒストグラムを示す；図8Eおよび8Fは、対応する1D振幅プロットを示す。
【図９】予備閾値を確立するために増幅前画像を使用する例。区画化されたサンプルの増幅前画像（図9A）；区画化されたサンプルの増幅後画像（図9B）；増幅前画像（濃い灰色のバー）および増幅後画像（白色のバー）からの平均液滴強度ヒストグラム（図9C）；平均液滴強度を示す、増幅前画像および増幅後画像（それぞれ黒糸および白色）からの1D振幅プロット（図9D）。CおよびDの両方において、灰色の線は、増幅前平均強度の平均値からの3σを表す。
【図１０】プローブの蛍光強度における温度依存的および光線量依存的変化を補正する例。3種の標的およびTmが異なる3種のプローブを有する区画（上部の実線トレース）ならびに0個の標的および3種のプローブを有する区画（上部の破線トレース）からの未補正の生データを使用する、蛍光対温度のプロット；同じサンプルからの補正された蛍光対温度データのプロットを、図の下半分に示す。補正は、蛍光の光退色および蛍光の温度依存的変化に起因する、陰性区画で観察された直線的減衰から決定される。
【図１１】一重連続融解分析。左側：単一標的サンプルを含み、切断可能なプローブを使用して検出されたdPCR反応物の区画から1℃間隔で撮像された画像からの蛍光対温度プロット；A：未補正の生データ；B：60℃における区画当たりのシグナル強度を示す、Aに対応する1D振幅プロット；C：システム誘発性の区画変動性を補正するために95℃での蛍光に対して正規化された、Aに示されるデータ；D：60℃における区画当たりのシグナル強度を示す、Cに対応する1D振幅プロット；E：プローブの光および温度依存的な蛍光変動を補正するために正規化された、Cに示されるデータ；F：60℃における区画当たりのシグナル強度を示す、Eに対応する1D振幅プロット；G：各区画中の標的特異的プローブのTmを示す、Eに示されるデータの逆微分値；H：標的特異的融解ウィンドウにわたる積分シグナル強度を示す、Gに対応する1D振幅プロット。ポアソン統計を用いて、区画当たりの予測コピー数を算出し、μL当たりの標的のコピー数に外挿する。
【図１２】一重不連続融解分析。A：温度T1およびT2で測定された、図11に示されるサンプルの区画の蛍光対温度プロット；B：T2/T1での区画当たりの蛍光強度の1D振幅プロット；C：システム変動性を補正するための正規化後の、Cからのデータの蛍光対温度プロット。標的濃度は、区画当たりの平均コピー数を算出することによって決定される。
【図１３】多重連続融解分析。左側パネル：3種の標的および識別可能なTmを有する3種のプローブを含有するサンプルについての、1℃の温度間隔で撮像された35枚の画像からの蛍光対温度プロット。上から下へ：A：融解分析中の区画当たりの平均蛍光対温度；C：システム誘発性の区画変動性を補正するために正規化された、区画当たりの平均蛍光；E：光依存的および温度依存的な蛍光減衰についてさらに補正された、Cからの区画当たりの平均蛍光；G：3つの識別可能なプローブTmを示す、Eの逆微分値プロット；右側パネル：B：95℃の画像に対して正規化された、57℃における区画当たりの平均強度の1D振幅プロット；D、E、およびF：各標的特異的融解ウィンドウに関する微分値の積分のプロット。
【図１４】多重不連続融解分析。A：温度T1、T2、T3、およびT4で測定された、図13に示されるサンプルの区画の蛍光対温度プロット；B：95℃における区画当たりの平均蛍光強度に対して正規化された、57℃における区画当たりの平均蛍光強度；C：システム誘発性の区画変動性を補正するために正規化した後の、Aからのデータの蛍光対温度プロット；D：第1温度間隔について算出された、区画当たりの蛍光強度の比率 (T2/T1)；E：光依存的および温度依存的な蛍光減衰を補正するために正規化した後の、Cからのデータの蛍光対温度プロット；F：第2温度間隔について算出された、区画当たりの蛍光強度の比率 (T3/T2)；G：第3温度間隔について算出された、区画当たりの蛍光強度の比率 (T4/T3)。この場合もやはり、算出された区画当たりの平均コピー数を使用して、特定の標的濃度が決定される。
【図１５】不連続融解分析のためのdPCRワークフロー：各区画中で複数の標的特異的プローブを使用するdPCR融解分析のためのワークフローの例。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
例示的態様の説明
I. 本発明の態様
本開示は、増幅された標的が類似の融解ピークを有する場合でさえサンプル内の標的の存在または非存在を判定するための、迅速な融解分析を行うための方法を提供する。好ましい態様において、融解分析は、標的特異的プローブのTmよりも低いおよび標的特異的プローブのTmよりも高い不連続融解温度において行われ、標的特異的プローブのTmにおいて行われない。
【００２８】
II.  定義
本明細書で使用する「核酸」は、一本鎖または二本鎖の、DNAまたはRNAのいずれか、およびそれらの任意の化学修飾を意味する。修飾には、限定するものではないが、核酸リガンド塩基にまたは全体としての核酸リガンドに付加的な電荷、分極率、水素結合、静電相互作用、および流動性(fluxionality)を組み込む、他の化学基を提供するものが含まれる。このような修飾としては、限定するものではないが、2'位糖修飾、5位ピリミジン修飾、8位プリン修飾、環外アミンでの修飾、4-チオウリジンの置換、5-ブロモまたは5-ヨード-ウラシルの置換、主鎖修飾、メチル化、および普通ではない塩基対合の組み合わせ、例えばイソ塩基、が挙げられる。したがって、本明細書に記載の核酸は、標準塩基のアデニン(A)、シトシン(C)、グアニン(G)、チミン(T)、およびウラシル(U)だけでなく、非標準または非天然のヌクレオチドをも含む。水素結合性の塩基対を形成する非標準または非天然ヌクレオチドは、例えば、米国特許第5,432,272号、第5,965,364号、第6,001,983号、第6,037,120号、および第6,140,496号に記載されており、これらの全ては参照により本明細書に組み入れられる。「非標準ヌクレオチド」または「非天然ヌクレオチド」とは、オリゴヌクレオチドへの組み込みを受け易く、かつ塩基対を形成するために水素結合によって、または疎水性、エントロピーもしくはファンデルワールス相互作用によって相補的な非標準または非天然ヌクレオチドと塩基対合することができる、A、G、C、TまたはU以外の塩基を意味する。いくつかの例には、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,037,120号に示されるような、iso-C/iso-G、K/X、K/P、H/J、およびM/Nの塩基対組み合わせが含まれる。
【００２９】
これらの非標準または非天然ヌクレオチド対の水素結合は、天然塩基の水素結合に類似しており、その場合、2つまたは3つの水素結合が、対になっている非標準または非天然ヌクレオチドの水素結合アクセプターと水素結合ドナーとの間に形成される。天然塩基とこれらの非標準または非天然ヌクレオチドの違いの1つは、水素結合アクセプターと水素結合ドナーの数および位置である。例えば、シトシンはドナー/アクセプター/アクセプター塩基であり、グアニンは相補的なアクセプター/ドナー/ドナー塩基であるとみなすことができる。参照により本明細書に組み入れられる米国特許第6,037,120号に示されるように、iso-Cはアクセプター/アクセプター/ドナー塩基であり、iso-Gは相補的なドナー/ドナー/アクセプター塩基である。
【００３０】
オリゴヌクレオチド中で使用するための他の非天然ヌクレオチドには、例えば、Ren, et al., 1996およびMcMinn et al., 1999(両方とも参照により本明細書に組み入れられる)に記載されるような、例えば、ナフタレン、フェナントレン、およびピレン誘導体が含まれる。これらの塩基は、安定化のために水素結合を利用しないが、代わりに、塩基対を形成するために疎水性またはファンデルワールス相互作用に依存する。
【００３１】
本明細書で使用する用語「サンプル」は、その最も広い意味で使用される。サンプルは、体組織または体液、例えば、限定するものではないが、血液(もしくは血液の画分、例えば血漿、血清など)、リンパ液、粘液、涙、尿および唾液を含むことができる。サンプルは、細胞、染色体、オルガネラ、またはウイルスからの抽出物を含み得る。サンプルは、DNA(例えば、ゲノムDNA)、RNA(例えば、mRNA)、および/またはcDNAを含むことができ、そのいずれも増幅核酸を提供するために増幅され得る。サンプルは、溶液中の核酸、または(例えば、マイクロアレイの一部として)基板に結合された核酸を含むことができる。サンプルは、環境地点(例えば、水域、土壌など)から得られた物質、または媒介物(fomite)(すなわち、ある宿主から別の宿主に病原体を伝染させる無生物(inanimate object))から得られた物質を含むことができる。
【００３２】
用語「核酸の供給源」は、核酸(RNAまたはDNA)を含む任意のサンプルを指す。標的核酸の特に好ましい供給源は、血液、血漿、血清、唾液、脳脊髄液、胸膜液、乳、リンパ液、痰および精液を含むがこれらに限定されない、生物学的サンプルである。
【００３３】
本明細書で使用する用語「検出限界」は、検出および定量化することができる、核酸などの、アナライトの最低のレベルまたは量を指す。検出限界は、モル値(例えば、2.0nMの検出限界)、グラム測定値(例えば、特定の反応条件の下での、2.0μgの検出限界)、コピー数(例えば、1×105コピー数の検出限界)、または当技術分野で公知の他の表現として表すことができる。
【００３４】
核酸分子に関して本明細書で使用する用語「単離された」は、核酸分子の天然源に存在する生物および生物学的物質(例えば、血液、細胞、血清、血漿、唾液、尿、便、痰、鼻咽頭吸引物など)から分離された核酸分子を指す。cDNA分子などの、単離された核酸分子は、組換え技術によって産生された場合には他の細胞材料または培養培地を実質的に含まず、化学的に合成された場合には化学的前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。いくつかの態様では、ポリペプチド/タンパク質をコードする核酸分子もまた、単離または精製され得る。核酸の単離方法は当技術分野で周知であり、全核酸単離/精製法、RNA特異的単離/精製法、またはDNA特異的単離/精製法を含むことができる。
【００３５】
本明細書で使用する用語「マイクロアレイ」は、基板上の複数のポリヌクレオチド、ポリペプチド、または他の化合物の配置を指す。用語「素子」および「アレイ素子」は、マイクロアレイ上に規定された固有の位置を有するポリヌクレオチド、ポリペプチドまたは他の化合物を指す。
【００３６】
本明細書で使用する場合、オリゴヌクレオチドは、特定の間隔で主として同一のモノマー単位からなる主鎖上に塩基の配列を有する分子であると理解される。塩基は、該オリゴヌクレオチドの塩基に相補的な塩基の配列を有する核酸との結合に入ることができるように、主鎖上に配置される。最も一般的なオリゴヌクレオチドは、糖リン酸単位の主鎖を有する。区別は、2'位にヒドロキシル基を有しない「dNTP」からなるオリゴデオキシリボヌクレオチドと、2'位にヒドロキシル基を有する「NTP」からなるオリゴリボヌクレオチドとの間でなされ得る。オリゴヌクレオチドはまた、ヒドロキシル基の水素が有機基、例えばアリル基、で置換された誘導体を含むことができる。
【００３７】
オリゴヌクレオチドは、少なくとも2個のヌクレオチドを含む核酸である。本明細書に開示される方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、典型的には少なくとも約10個のヌクレオチド、より典型的には少なくとも約15個のヌクレオチドを含む。本明細書に開示される方法に好適なオリゴヌクレオチドは、約10〜100個のヌクレオチドを含む。オリゴヌクレオチドは、「プライマー」として機能するように設計することができる。「プライマー」は、相補的塩基対合によって標的ポリヌクレオチドにアニーリングされ得る短い核酸、通常はssDNAオリゴヌクレオチドである。次いで、プライマーは、DNAポリメラーゼ酵素などのポリメラーゼ酵素によって標的DNAまたはRNAテンプレート鎖に沿って伸長させることができる。プライマー対は、(例えば、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)による)核酸配列の増幅(および同定)のために使用され得る。オリゴヌクレオチドは、「プローブ」として機能するように設計することができる。「プローブ」は、同一の、対立遺伝子の、または関連する核酸配列を検出するために使用されるオリゴヌクレオチド、その相補体、またはその断片を指す。プローブは、検出可能な標識またはレポーター分子に結合されたオリゴヌクレオチドを含み得る。典型的な標識としては、蛍光色素、クエンチャー、放射性同位体、リガンド、シンチレーション剤、化学発光剤、および酵素が挙げられる。プローブはまた、標的核酸または自己相補的領域をテンプレートとして用いてポリメラーゼによって伸長され得る。
【００３８】
オリゴヌクレオチドは、サンプル中の標的核酸配列に特異的であるように設計することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、標的核酸の「アンチセンス」核酸配列を含むように設計される。本明細書で使用する用語「アンチセンス」は、核酸配列の「センス」(コード)鎖と塩基対合することが可能な任意の組成を指す。アンチセンス核酸配列は、標的核酸配列に「相補的」であり得る。本明細書で使用する場合、「相補性」は、塩基対合によってアニーリングする2つの一本鎖核酸配列間の関係を表す。例えば、5'-AGT-3'は、その相補体である3'-TCA-5'と対合する。いくつかの態様では、プライマーまたはプローブは、さまざまな位置にミスマッチを含むように設計され得る。本明細書で使用する「ミスマッチ」とは、標準的なワトソン-クリック塩基対を含まないヌクレオチド対、または水素結合を優先的に形成しないヌクレオチド対を意味する。ミスマッチは、標的中の特定の塩基(複数可)に向かい合って置換された天然ヌクレオチドまたは非天然もしくは非標準ヌクレオチドを含み得る。例えば、プローブまたはプライマー配列5'-AGT-3'は、標的配列3'-ACA-5'と単一のミスマッチを有する。プローブまたはプライマーの5'「A」は、標的の3'「A」とミスマッチである。同様に、標的配列5'-AGA-3'は、プローブまたはプライマー配列3'-(iC)CT-5'と単一のミスマッチを有する。ここでは、天然の「T」の代わりにiso-Cに置換されている。しかし、配列3'-(iC)CT-5'は、配列5'-(iG)GA-3'とミスマッチではない。
【００３９】
オリゴヌクレオチドはまた、縮重オリゴヌクレオチドとして設計することもできる。本明細書で使用する「縮重オリゴヌクレオチド」とは、異なる配列の混合物を含むオリゴヌクレオチドの集団、プール、または大多数を含むことを意味し、その場合、配列の相違は集団の各オリゴヌクレオチドの特定の位置で起こる。種々の置換は、どのような天然または非天然のヌクレオチドを含んでもよく、任意の所定位置にさまざまな可能なヌクレオチドを含むことができる。例えば、上記の縮重オリゴヌクレオチドは、代わりに、R＝iCまたはiG、あるいはR＝AまたはGまたはTまたはCまたはiCまたはiGを含み得る。
【００４０】
本明細書に記載のオリゴヌクレオチドは、典型的には、相補的塩基配列を有するオリゴヌクレオチドと水素結合を形成することが可能である。こうした塩基には、A、G、C、TおよびUのような天然塩基、ならびにイソシトシンおよびイソグアニンのような人工的な、非標準または非天然のヌクレオチドが含まれる。本明細書に記載されるように、オリゴヌクレオチドの第1の配列は、第1の配列の連続塩基(5'から3'へと読む)が第2の配列の連続塩基(3'から5'へと読む)に照らして塩基対合のワトソン・クリック規則に従う場合、第2の配列のオリゴヌクレオチドと100％相補的であると言える。オリゴヌクレオチドは、ヌクレオチドの置換を含み得る。例えば、天然塩基の代わりに人工塩基を用いて、その人工塩基が天然塩基と同様の特異的相互作用を示すようにしてもよい。
【００４１】
標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドはまた、標的核酸配列に対して「相同性」を有する核酸配列に特異的であり得る。本明細書で使用する「相同性」とは、2つ以上のポリヌクレオチド配列または2つ以上のポリペプチド配列の間の配列類似性または、相互交換可能に、配列同一性を指す。ポリヌクレオチド配列に適用される「同一性パーセント」および「同一性％」という用語は、標準化アルゴリズム(例えば、BLAST)を用いてアライメントされた少なくとも2つのポリヌクレオチド配列間の残基一致率を指す。
【００４２】
標的核酸に特異的なオリゴヌクレオチドは、適切な条件下でその標的核酸に「ハイブリダイズする」であろう。本明細書で使用する「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」は、オリゴヌクレオチド一本鎖が規定されたハイブリダイゼーション条件下で塩基対合により相補鎖とアニーリングするプロセスを指す。「特異的ハイブリダイゼーション」は、2つの核酸配列が高度の相補性を共有することの指標である。特異的ハイブリダイゼーション複合体は、許容されるアニーリング条件下で形成され、後続の洗浄ステップの後にハイブリダイズしたままである。核酸配列の許容されるアニーリング条件は、当業者がルーチンに決めることができ、例えば、約6×SSCの存在下に65℃で起こり得る。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、一部には、洗浄ステップが実施される温度を基準にして表すことができる。このような温度は、典型的には、特定のイオン強度およびpHで特定の配列の熱融解点(Tm)より約5℃〜20℃低いように選択される。Tmは、標的配列の50％が完全に一致したプローブにハイブリダイズする(規定されたイオン強度およびpHの下での)温度である。最近傍パラメータ(nearest-neighbor parameter)などのTmを計算するための式、および核酸ハイブリダイゼーションの条件は、当技術分野で公知である。
【００４３】
本明細書で使用する「標的」または「標的核酸」は、プローブまたはプライマーのようなオリゴヌクレオチドとの少なくとも部分的な相補性を有する配列を含む核酸分子を指す。「標的」配列は、遺伝子またはゲノムの一部を含み得る。
【００４４】
本明細書で使用する場合、「核酸」、「ヌクレオチド配列」または「核酸配列」は、ヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、ポリヌクレオチド、またはその任意の断片を指し、かつ天然に存在する分子または合成の分子を指す。これらの用語はまた、一本鎖もしくは二本鎖であってよく、かつセンス鎖もしくはアンチセンス鎖を表し得る、ゲノム起源または合成起源のDNAもしくはRNA、またはDNA様もしくはRNA様の物質を指す。DNA配列に関して「RNA等価物」は、窒素含有塩基チミンの全ての存在がウラシルに置き換えられ、かつ糖骨格がデオキシリボースの代わりにリボースで構成されることを除いて、参照DNA配列と同じヌクレオチドの直鎖状配列からなる。RNAは、本明細書に記載の方法で使用され、かつ/または本明細書に記載の方法で使用するために逆転写によってcDNAに変換され得る。
【００４５】
本明細書で使用する「増幅」または「増幅する」とは、核酸配列のさらなるコピーの作製を指す。増幅は、当技術分野で公知のポリメラーゼ連鎖反応(PCR)または他の増幅技術を用いて実施され得る。用語「増幅反応システム」は、標的核酸配列の少なくとも第1の相補的コピーを作製するためのインビトロ手段を指す。いくつかの局面では、増幅により、標的核酸配列の複数コピーが作製される。用語「増幅反応混合物」は、標的核酸を増幅するために使用される種々の試薬を含む水溶液を指す。これらは、酵素(例えば、熱安定性ポリメラーゼ)、水性緩衝液、塩類、増幅プライマー、標的核酸、ヌクレオシド三リン酸、および任意に、少なくとも1つの標識プローブ、および/または任意に、増幅された標的核酸の融解温度を決定するための少なくとも1つの作用剤(例えば、二本鎖核酸の存在下で蛍光の変化を示す蛍光インターカレート剤)を含み得る。
【００４６】
核酸の増幅は、核酸またはこれらの核酸の部分領域の増幅を含むことができる。例えば、増幅は、適切なプライマー配列を選択し、PCRを使用することにより、30〜50、50〜100、または100〜300塩基長の核酸の部分を増幅することを含み得る。さらなる局面では、増幅は、等温増幅技術(すなわち、熱サイクリングを必要としない)を使用して達成することができる。例えば、ループ介在等温増幅(LAMP)のような等温核酸増幅法は、米国特許第6,410,278号および米国特許出願公開第20080182312号に提供されており、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【００４７】
増幅混合物は、天然ヌクレオチド(A、C、G、TおよびUを含む)および非天然または非標準ヌクレオチド(例えば、iCおよびiGなど)を含み得る。DNAおよびRNAオリゴヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によって連結された、それぞれ、デオキシリボースまたはリボースを含む。各デオキシリボースまたはリボースは、糖に連結された塩基を含む。天然に存在するDNAおよびRNAに組み込まれる塩基は、アデノシン(A)、グアノシン(G)、チミジン(T)、シトシン(C)、およびウリジン(U)である。これらの5つの塩基は「天然塩基」である。ワトソンとクリックによって精巧に考えられた塩基対合の規則によれば、天然塩基はハイブリダイズしてプリン-ピリミジン塩基対を形成し、その場合にGはCと、AはTまたはUと対になる。これらの対合規則は、オリゴヌクレオチドと相補的オリゴヌクレオチドとの特異的ハイブリダイゼーションを容易にする。
【００４８】
天然塩基による塩基対の形成は、各塩基対の2塩基間に2つまたは3つの水素結合が生成することによって促進される。各塩基は、2つまたは3つの水素結合ドナーおよび水素結合アクセプターを含む。塩基対の水素結合はそれぞれ、一方の塩基上の少なくとも1つの水素結合ドナーと他方の塩基上の水素結合アクセプターとの相互作用によって形成される。水素結合ドナーは、例えば、少なくとも1個の水素が結合されているヘテロ原子(例えば、酸素または窒素)を含む。水素結合アクセプターは、例えば、孤立電子対を有するヘテロ原子(例えば、酸素または窒素)を含む。
【００４９】
本明細書で使用される天然または非天然ヌクレオチドは、修飾された天然または非天然ヌクレオチドを形成するために、非水素結合部位での置換によって誘導体化することができる。例えば、天然ヌクレオチドは、支持体への結合のために、ヌクレオチドの非水素結合原子に反応性官能基(例えば、チオール、ヒドラジン、アルコール、アミンなど)を結合させることによって誘導体化され得る。他の可能な置換基には、例えば、ビオチン、ジゴキシゲニン、蛍光基、アルキル基(例えば、メチルまたはエチル)などが含まれる。
【００５０】
本明細書に開示される方法による非天然ヌクレオチドの使用は、サンプル中に存在する核酸配列の検出と定量の域を越えて拡張可能である。例えば、非天然ヌクレオチドは、核酸に関連した反応を触媒する多くの酵素によって認識され得る。ポリメラーゼはオリゴヌクレオチド鎖の重合と伸長を継続するために相補的ヌクレオチドを必要とするが、他の酵素は相補的ヌクレオチドを必要としない。非天然ヌクレオチドがテンプレート中に存在し、かつその相補的な非天然ヌクレオチドが反応混合物中に存在しない場合、ポリメラーゼは、非天然ヌクレオチドを通り越して伸長プライマーを伸長させようとするとき、典型的には失速する(または、場合によっては、十分な時間量が与えられた場合には塩基を誤って取り込む)だろう。しかし、リガーゼ、キナーゼ、ヌクレアーゼ、ポリメラーゼ、トポイソメラーゼ、ヘリカーゼなどの、核酸に関連した反応を触媒する他の酵素は、非天然ヌクレオチドが関与する反応を触媒することができる。非天然ヌクレオチドのこのような特徴は、本開示の方法およびキットに利用することができ、本開示の範囲内である。
【００５１】
非天然ヌクレオチドを含むことができる、本明細書に開示されるヌクレオチドは、標識(例えば、クエンチャーまたはフルオロフォア)に結合され得る。結合は当技術分野で公知の方法を用いて行うことができる。
【００５２】
本方法のオリゴヌクレオチドはプライマーとして機能し得る。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは標識される。例えば、オリゴヌクレオチドは、検出可能なシグナルを発するレポーター(例えば、フルオロフォア)で標識することができる。オリゴヌクレオチドは、少なくとも1個の非天然ヌクレオチドを含み得る。例えば、オリゴヌクレオチドは、A、C、G、TまたはUではない塩基(例えば、iCまたはiG)を有する少なくとも1個のヌクレオチドを含み得る。このオリゴヌクレオチドがPCRのためのプライマーとして使用される場合、増幅混合物は、クエンチャー(例えば、Dabcyl)で標識された少なくとも1個のヌクレオチドを含むことができる。標識されたヌクレオチドは、少なくとも1個の非天然または非標準ヌクレオチドを含み得る。例えば、標識されたヌクレオチドは、A、C、G、TまたはUではない塩基(例えば、iCまたはiG)を有する少なくとも1個のヌクレオチドを含み得る。
【００５３】
いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、ヘアピンのような分子内構造を形成しないように設計することができる。他の態様では、オリゴヌクレオチドは、ヘアピンのような分子内構造を形成するように設計することができる。例えば、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが標的核酸にハイブリダイズした後で変化し、かつ任意で、標的核酸がオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いて増幅された後で変化する、ヘアピン構造を形成するように設計することができる。さらに他の態様では、オリゴヌクレオチドは、標的配列へのハイブリダイゼーションの際に切断されて切断後に分子内構造をとるように、設計され得る。
【００５４】
オリゴヌクレオチドは、増幅産物中にプライマーとして取り込まれたときに消光を示す、フルオロフォアで標識することができる。他の態様では、オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが増幅産物中にプライマーとして組み込まれた後に検出可能なシグナルを(例えば、本来的に、または蛍光誘導もしくは蛍光発光によって)発することができる。そのようなプライマーは当技術分野で公知である(例えば、LightCyclerプライマー、Amplifluor(商標)プライマー、Scorpion(商標)プライマー、およびLux(商標)プライマー)。オリゴヌクレオチドを標識するために使用されるフルオロフォアは、二本鎖核酸にインターカレートされたときにシグナルを発することができる。このように、フルオロフォアは、オリゴヌクレオチドが核酸を増幅するためのプライマーとして用いられた後にシグナルを発することができる。
【００５５】
開示された方法で使用されるオリゴヌクレオチドは、サンプル中の少なくとも1つの核酸を増幅するためのプライマーとして、また、サンプル中の少なくとも1つの核酸を検出するためのプローブとして適切であり得る。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、検出可能なシグナルを生成し得る少なくとも1つの蛍光色素で標識される。蛍光色素は、蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)のための蛍光ドナーとして機能し得る。検出可能なシグナルは、オリゴヌクレオチドが標的核酸を増幅するために使用された場合に消光され得る。例えば、増幅混合物は、フルオロフォアから発せられた検出可能なシグナルのためのクエンチャーにより標識されたヌクレオチドを含むことができる。任意で、オリゴヌクレオチドは、蛍光アクセプター(例えば、FRETの場合)として機能し得る第2の蛍光色素またはクエンチャー色素で標識されてもよい。オリゴヌクレオチドが第1の蛍光色素と第2の蛍光色素で標識される場合、シグナルは第1の蛍光色素、第2の蛍光色素、またはその両方から検出することができる。シグナルは、(例えば、アンプリコン、標的核酸にハイブリダイズしたプローブを含む複合体、ヘアピンプローブ、またはTプローブ複合体などの二重鎖核酸の融解プロファイルを決定するために)温度の勾配で検出され得る。あるいは、シグナルは、二重鎖核酸の融解プロファイルを決定するために、選択された温度で検出され得る。
【００５６】
開示された方法は、適切なオリゴヌクレオチド数を用いて実施することができる。複数のオリゴヌクレオチド(例えば、2つ以上のオリゴヌクレオチド)を使用する場合、異なるオリゴヌクレオチドは、識別可能で検出可能なシグナルを生成することができる異なる蛍光色素で標識され得る。いくつかの態様では、オリゴヌクレオチドは、2つの異なる蛍光色素のうちの少なくとも1つで標識される。さらなる態様では、オリゴヌクレオチドは、3つの異なる蛍光色素のうちの少なくとも1つで標識される。
【００５７】
いくつかの態様では、異なる蛍光色素のそれぞれは、オリゴヌクレオチドの標識に用いられた異なる蛍光色素の他のどの蛍光色素によって発せられたシグナルとも区別することができるシグナルを発する。例えば、異なる蛍光色素は、少なくとも約5nm(好ましくは、少なくとも約10nm)だけ互いに異なる発光極大波長を有し得る。いくつかの態様では、異なる蛍光色素のそれぞれは、異なる波長エネルギーによって励起される。例えば、異なる蛍光色素は、少なくとも約5nm(好ましくは、少なくとも約10nm)だけ互いに異なる吸収極大波長を有し得る。
【００５８】
蛍光色素が本方法において核酸の融解プロファイルを決定するために使用される場合、その蛍光色素は、オリゴヌクレオチドの標識に使用された異なる蛍光色素の他のどの蛍光色素によって発せられたシグナルとも区別され得るシグナルを発することができる。例えば、核酸の融解プロファイルを決定するための蛍光色素は、オリゴヌクレオチドの標識に使用された他のどの蛍光色素の発光極大波長とも少なくとも約5nm(好ましくは、少なくとも約10nm)だけ異なる発光極大波長を有し得る。いくつかの態様では、核酸の融解プロファイルを決定するための蛍光色素は、オリゴヌクレオチドの標識に使用された異なる蛍光色素の他のどの蛍光色素とも異なる波長エネルギーによって励起され得る。例えば、核酸の融解プロファイルを決定するための蛍光色素は、オリゴヌクレオチドの標識に使用されたどの蛍光色素の吸収極大波長とも少なくとも約5nm(好ましくは、少なくとも約10nm)だけ異なる吸収極大波長を有し得る。
【００５９】
本方法は、サンプル中の少なくとも1種の核酸（例えば、標的核酸にハイブリダイズしたプローブ、または自己相補的領域にハイブリダイズしたプローブ、または相補的捕捉配列にハイブリダイズしたプローブを含むアンプリコンまたは二重鎖核酸）の融解プロファイルを決定する段階を含むことができ、これを用いて核酸を同定することができる。融解プロファイルを決定する段階は、アンプリコンまたは二重鎖核酸を温度勾配に曝露すること、および温度勾配にわたってフルオロフォアからの検出可能なシグナルを観察することを含み得る。あるいは、融解プロファイルを決定する段階は、アンプリコンまたは二重鎖核酸を選択された不連続温度に曝露すること、および選択された不連続温度においてのみ検出可能なシグナルを観察することを含み得る。任意で、本方法のオリゴヌクレオチドが第1の蛍光色素で標識される場合、検出された核酸の融解プロファイルを決定する段階は、第1の蛍光色素とは異なる第2の蛍光色素からのシグナルを観察することを含んでもよい。いくつかの態様では、検出された核酸の融解プロファイルを決定するための第2の蛍光色素は、インターカレート剤である。適切なインターカレート剤としては、限定するものではないが、以下を挙げることができる：SYBR(商標)Green 1色素、SYBR色素、Pico Green、SYTO色素、SYTOX色素、臭化エチジウム、エチジウムホモダイマー1、エチジウムホモダイマー2、エチジウム誘導体、アクリジン、アクリジンオレンジ、アクリジン誘導体、エチジウム-アクリジンヘテロダイマー、エチジウムモノアジド、ヨウ化プロピジウム、シアニン単量体、7-アミノアクチノマイシンD、YOYO-1、TOTO-1、YOYO-3、TOTO-3、POPO-1、BOBO-1、POPO-3、BOBO-3、LOLO-1、JOJO-1、シアニン二量体、YO-PRO-1、TO-PRO-1、YO-PRO-3、TO-PRO-3、TO-PRO-5、PO-PRO-1、BO-PRO-1、PO-PRO-3、BO-PRO-3、LO-PRO-1、JO-PRO-1、およびこれらの混合物。適切な態様では、選択されたインターカレート剤はSYBR(商標)Green 1色素である。
【００６０】
開示された方法において、増幅された標的核酸、レポータープローブ-テンプレート対、またはハイブリダイズされたプローブのそれぞれは、異なる融解温度または異なる融解プロファイルを有し得る。例えば、増幅された標的核酸、レポータープローブ-テンプレート対、またはハイブリダイズされたプローブのそれぞれは、他の増幅された標的核酸、レポータープローブ-テンプレート対、またはハイブリダイズされたプローブのいずれの融解温度とも1〜10℃、例えば少なくとも約1℃、より好ましくは少なくとも約2℃または約4℃、さらにより好ましくは少なくとも約5℃、異なる融解温度を有する。
【００６１】
本明細書で使用する「標識」または「レポーター分子」は、核酸を標識するのに有用な化学的または生化学的モイエティ(moiety)である。「標識」および「レポーター分子」には、蛍光剤、化学発光剤、発色剤、消光剤、放射性核種、酵素、基質、補因子、シンチレーション剤、阻害剤、磁性粒子、および当技術分野で公知の他のモイエティが含まれる。「標識」または「レポーター分子」は、測定可能なシグナルを生成することができ、オリゴヌクレオチドに共有的または非共有的に結合させることができる。
【００６２】
本明細書で使用する「蛍光色素」または「フルオロフォア」は、光によって励起されて蛍光を発することができる化学基である。いくつかの適切なフルオロフォアは、光によって励起されてリン光を発することができる。色素は、蛍光ドナー色素からの蛍光シグナルを消光させることができるアクセプター色素を含み得る。開示された方法で使用することができる色素としては、限定するものではないが、以下のようなフルオロフォアが挙げられる：赤色蛍光スクアリン色素、例えば2,4-ビス[1,3,3-トリメチル-2-インドリニリデンメチル]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオキソレート、赤外色素、例えば2,4-ビス[3,3-ジメチル-2-(1H-ベンズ[e]インドリニリデンメチル)]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオキソレート、またはオレンジ色蛍光スクアリン色素、例えば2,4-ビス[3,5-ジメチル-2-ピロリル]シクロブテンジイリウム-1,3-ジオキソレート。フルオロフォアのさらなる非限定的な例としては、以下が挙げられる：量子ドット、Alexa Fluor(商標)色素、AMCA、BODIPY(商標)630/650、BODIPY(商標)650/665、BODIPY(商標)-FL、BODIPY(商標)-R6G、BODIPY(商標)-TMR、BODIPY(商標)-TRX、Cascade Blue(商標)、CyDye(商標)、例えば、限定するものではないが、Cy2(商標)、Cy3(商標)、Cy5(商標)など、DNAインターカレート色素、6-FAM(商標)、フルオレセイン、HEX(商標)、6-JOE、Oregon Green(商標)488、Oregon Green(商標)500、Oregon Green(商標)514、Pacific Blue(商標)、REG、フィコビリタンパク質、例えば、限定するものではないが、フィコエリトリンおよびアロフィコシアニン、Rhodamine Green(商標)、Rhodamine Red(商標)、ROX(商標)、TAMRA(商標)、TET(商標)、テトラメチルローダミン、またはTexas Red(商標)。
【００６３】
蛍光色素またはフルオロフォアは、別の反応性分子への連結を容易にするように修飾された誘導体を含むことができる。こうして、蛍光色素またはフルオロフォアは、アミン反応性誘導体、例えば、フルオロフォアのイソチオシアネート誘導体および/またはスクシンイミジルエステル誘導体を含み得る。
【００６４】
開示された方法のオリゴヌクレオチドおよびヌクレオチドは、クエンチャーにより標識することができる。消光(クエンチング)には、動的消光(例えば、FRETによる)、静的消光、またはその両方が含まれ得る。適切なクエンチャーとしてDabcylが挙げられる。適切なクエンチャーにはダーククエンチャーも含まれ、これは、「BHQ」の商品名で販売されるブラックホールクエンチャー(例えば、BHQ-0、BHQ-1、BHQ-2およびBHQ-3、Biosearch Technologies社, Novato, CA)を含むことができる。ダーククエンチャーはまた、「QXL(商標)」(Anaspec社, San Jose, CA)の商品名で販売されるクエンチャーを含み得る。ダーククエンチャーはまた、2,4-ジニトロフェニル基を含むDNP型非フルオロフォアを含み得る。
【００６５】
本明細書に開示される方法および組成物は、区画化された反応において使用され得る。反応を区画化するための1つのアプローチは、液滴を用いることによるものであり、液滴は、第2の流体によって、または第2の流体と1つ以上の表面によって、完全に取り囲まれた第1の流体の分離された体積である。いくつかの態様では、第1および第2の流体は、2つの非混和性の液体である。本明細書で開示されるさまざまな態様は、非水性連続相中に複数の水性液滴を含む油中水型エマルションを使用する。水性液滴の全てまたはサブセットは、関心対象のアナライトを含むことができる。エマルションは、しばしば1種以上の界面活性剤の存在下で、2つの非混和性相(例えば、水と油)を混合することによって形成される。エマルションの基本的なタイプは、水中油型(o/w)、油中水型(w/o)、および両連続型である。液滴ベースの生物学的アッセイでは、エマルションは、典型的には、水相中にアッセイ試薬(例えば、PCRプライマー、塩類、酵素など)が含まれる油中水型エマルションである。「油」相は、単一の油であっても、異なる油の混合物であってもよい。適切な非水性流体はどれも、本明細書に開示されるエマルションの非水性連続相を形成し得る。いくつかの態様では、非水性連続相は、鉱油、シリコーン油、またはフッ素化油(例えば、Fluorinert(登録商標)FC-40 [Sigma-Aldrich社])を含む。
【００６６】
液滴は、さまざまな技術を使用して画像化することができる。画像化を容易にするために、液滴を含む組成物は、液滴が表面上に実質的に単層で配置されるように、表面上に分散させることができる。イメージング表面は、例えば、スライド上またはチャンバ内、例えばガラスもしくは石英チャンバ内であり得る。液滴、ならびに液滴内の標識されたアナライトまたは反応産物(例えば、ヘアピンプローブ)は、イメージングシステムを用いて検出することができる。例えば、検出は、標識されたヘアピンプローブから発せられた蛍光波長および/または蛍光強度を画像化することを含み得る。液滴がまた、コード化マイクロスフェアのような、コード化された粒子を含む態様では、イメージングは、コード化粒子の第1のデコーディング画像(decoding image)を撮り、かつ液滴中のプローブを検出するために第2のアッセイ画像を撮ることを含むことができる。デコーディング画像とアッセイ画像との比較は、フルオロフォアの組み合わせを用いることによって、より大きな多重化能力を可能にする。本発明の方法は、直接または間接的に標識された増幅産物からのシグナルを、サンプル中のDNAまたはRNAの濃度と相関させることをさらに含むことができる。本明細書に開示された方法および組成物とともに使用するのに適したイメージングシステムの例は、米国特許第8,296,088号および米国特許出願公開第2012/0288897号に記載されており、これらは参照により本明細書に組み入れられる。加えて、コード化マイクロスフェアの使用は、液滴追跡に役立ち得る。十分な濃度で含まれる、ランダムに分布した、特有にコード化されたマイクロスフェアは、それぞれの液滴に隣接液滴との関連で独特のシグネチャーを付与する。このシグネチャーは、PCR増幅または増幅後の融解分析中に任意の移動が起こるはずである液滴を追跡するのに有用であると考えられる。アッセイにおける特有のマイクロスフェアコードの数およびマイクロスフェアの総数を最適化して、区画シグネチャーの最小限の反復を確実にすることができる。
【００６７】
あるいは、液滴の代わりに、コンパートメントまたは区画を、例えば、シリコン、金属、もしくはガラスの制御されたエッチングを通じて、または従来のもしくはマイクロインジェクション成形技法を通じて、平面上の静的アレイで形成することができる。例えば、参照により本明細書に組み入れられるU.S. 9,039,993、PCT/US2003/041356、US6391559、EP2906348、US9643178、およびDuら、2009 「SlipChip.」 Lab on a Chip 9 (16):2286におけるような、静的アレイまたは反応チャンバを形成するいくつかの異なる方法が記載されている。任意に、区画は、全表面積を小さくするためにごく近接して詰め込まれ、区画の充填を改善するためにマイクロ流体チャネルによって接続され得る。後者の態様においては、充填後の区画の完全な分離を確実にするために、U.S. 9,163,277に記載されているような方法が使用され得る。
【００６８】
上述したように、ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) は、区画内で行われ得る反応の一例である。特に、区画はデジタルPCR (dPCR) 技法において有用である。dPCRは、サンプル中に含まれる個々の核酸分子が、マイクロウェルプレート中の個々のウェルもしくは微小区画、エマルションの分散相、または核酸結合表面のアレイなどの、多くの別々の領域に局在するように、サンプルを区画化する段階を伴う。理想的には、各区画は、0または1コピーの標的核酸を含み、それぞれ陰性または陽性の反応を提供する。従来のPCRとは異なり、dPCRは、サンプル中の標的核酸の初期量を決定するために増幅サイクル数に依存しない。したがって、dPCRは、標的核酸を定量化するための指数関数的データへの依存を排除し、絶対的定量化をもたらす。エマルション中のビーズ上で核酸をクローン的に増幅するビーズエマルションPCRは、反応物が液滴に分割されるdPCR技法の一例である。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,048,627号および第7,842,457号を参照されたい。dPCRがエマルション中で行われる場合、エマルションは温度サイクリング条件に耐えることができるように熱安定性でなければならない。
【００６９】
エマルション中でまたは静的アレイ上でdPCRを行う様々な方法が存在する。いずれの場合にも、DNAサンプルを適切な濃度に希釈し、PCR試薬（プライマー、dNTP、等）と混合し、多くの個別の反応サンプルに適切に区画化する。それらの区画をPCR温度サイクリングに供し、アンプリコンを上記のように蛍光（または他の適切なレポーター）画像化によって検出する。本発明の切断可能なプローブの態様との関連において、アンプリコンはプローブの蛍光（または他の適切なレポーター）の変化によって検出される。
【００７０】
区画の温度サイクリングは、当技術分野で公知の任意の適切な技法によって実施することができる。例えば、加熱および冷却が可能なチューブまたはチャンバ内で、区画の温度サイクリングを行うことができる。いくつかの態様において、前記方法は、核酸鋳型を増幅するために連続流増幅を利用する。連続流増幅の様々な方法が報告されている。例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第7,927,797号は、連続流PCRと共に使用される油中水型エマルションを記載している。あるいは、静的アレイベースのデジタルPCRにおいて温度サイクリングを行うために用いられる方法と同様に、液滴を2Dアレイに配置し、フラットブロックサーマルサイクラーを用いて温度サイクリングを行うことができる。等温反応（例えば、ローリングサークル増幅、全ゲノム増幅、NASBA、または鎖置換増幅）もまた、液滴または静的アレイ区画内で行うことができる。このシステムを用いて、温度を上昇または下降させながら液滴または区画をモニターして、区画内のプローブの融解プロファイルを得ることができ、これによって多重化された検出および定量化が可能になる。プローブ自体を液滴または区画内で用いて、シグナルを等温的に増幅することができ、その結果、PCRまたは他の等温増幅反応などの他の形態の増幅は、液滴または静的アレイ区画内の低コピー数の標的を検出するのに必要でなくなる。
【００７１】
III 定量化のための不連続融解法
融解曲線（解離曲線）は、反応の温度が上昇するにつれて二本鎖DNAが一本鎖DNAに解離または「融解」する際に観察される蛍光の変化をグラフ化する。例えば、二本鎖DNAがインターカレート色素の存在下でゆっくりと加熱されると、融点 (Tm) に達し、色素が二重鎖から解離する時に、突然蛍光の低下が検出される。核酸のTmは、いくつかある要因の中でも特に長さ、GC含量、および塩基ミスマッチの存在によって影響を受けるため、異なる二重鎖核酸はそれらの異なる融解特性によって区別することができる。増幅後の融解曲線分析を用いて、プライマー二量体アーティファクトおよび非標的核酸と標的由来アンプリコンを区別して、反応特異性を確実にすることができる。さらに、反応産物、例えばプライマー二量体対アンプリコンの融解曲線分析による特性決定は、時間のかかるゲル電気泳動の必要性を低減する。リアルタイムPCRアッセイの特異性は、使用されるプライマーおよび反応条件によって決定される。しかしながら、うまく設計されたプライマーでさえ、プライマー二量体を形成するか、または非特異的な産物を増幅する可能性が常に存在する。またqRT-PCRを行う際に、RNAサンプルがゲノムDNAを含有する可能性もあり、ゲノムDNAもまた増幅され得る。qPCRまたはqRT-PCR反応産物の特異性は、融解曲線分析を使用して確認することができる。
【００７２】
高分解能融解曲線 (HRM) 分析は、単一ヌクレオチド差異、例えばSNP、新規突然変異、およびメチル化パターンを同定するための均一な増幅後の方法である。HRM分析は伝統的な融解曲線プロファイリングに対するより高感度なアプローチであり、二本鎖DNAを、それが一本鎖DNAに解離する温度 (Tm) についてモニターする。HRMでは、蛍光を連続してモニターしながら、増幅反応物を小さな漸増的温度増加（典型的には、1分当たり0.1〜0.5℃）に供する。二本鎖核酸と結合するインターカレート色素の存在下において、蛍光は、温度が二重鎖のTmに接近するまでゆっくりと低下し、Tmにおいて、サンプルが二本鎖DNAから一本鎖DNAに移行する時に、蛍光の劇的な低下が観察される。Tmは、数ある中でも特にヌクレオチド配列および二重鎖内のミスマッチヌクレオチドの存在に依存するため、変異は、HRM分析において、Tmのシフトまたは融解曲線の形状の変化のいずれかとして検出することができる。伝統的な融解曲線分析とは対照的に、HRMはアンプリコン間の単一ヌクレオチド識別をもたらし得る。
【００７３】
多くの温度間隔において（2℃間隔またはそれよりも小さい間隔において、例えば、1℃、0.5℃、0.3℃、0.2℃、またはさらには0.1℃間隔などにおいて）蛍光測定を行うことにより、蛍光強度の変化率（すなわち、温度に対する蛍光強度の微分値）を追跡し、有意な融解活動が起こった1つまたは複数の温度 (Tm) を決定することができる。温度に対する相対蛍光単位 (RFU) の微分値のプロットにおけるピークは、標的二重鎖の融解温度 (Tm) に対応する。例えば、図1Aおよび1Bは、それぞれ65℃、75℃、および85℃の融解温度を有する3種の標的プローブを含有するサンプルにおける、温度を上昇させた際の蛍光の連続モニタリングからの、RFU対温度のプロット、および温度に対する負の微分値のプロットを示す。標的核酸が増幅されたかどうかを判定するために、特定のプローブまたは二重鎖核酸の測定されたTmと予測されたTmとの比較が用いられる。
【００７４】
伝統的に、dPCR適用では、サンプル中の標的核酸の存在または非存在を決定するために、個々の区画における蛍光の増幅後エンドポイント測定が用いられてきた。より最近では、dPCRにおいて標的核酸を特異的に同定するために、インターカレート色素を使用する融解分析が用いられてきた。融解事象の単なるノイズと実際の存在を区別するために、RFUプロットおよび負の微分値プロットのいずれかまたは両方について閾値を設定することができる。RFUプロットについては、傾き補正された対照曲線の標準偏差のある一定の割合、例えば標準偏差の200%、300%、400%、500%、1000%、または2000%を用いることにより、シグナル閾値を選択することができる。蛍光強度が、所与の融解温度ウィンドウ（例えば、融解温度が65℃であると予測される標的プローブについては60〜70℃）にわたって閾値量を超えて変化したと判定される場合、標的は存在すると見なすことができる。負の微分値プロットについては、対照サンプルに関する傾き補正されたRFU曲線の負の微分値の標準偏差のある一定の割合、例えば標準偏差の200%、300%、400%、500%、1000%、または2000%を用いることにより、シグナル閾値を選択することができる。次いで、任意の負の微分値低ピークが、ゼロ未満の閾値の大きさよりも大きいと見なされる場合に、正の融解事象が関連標的プローブについて起こったと見なされ、対応する標的がその区画中に存在すると見なされる。閾値はあるいは、過去のデータを考慮し、負の微分値融解ピークの典型的な大きさのごく一部を用いて設定することができる。例えば、閾値は、その特異的標的プローブの平均的な負の微分値融解ピークの大きさの10%〜50%のどこかに設定することができる。
【００７５】
US2016/0310949は、dPCRにおいて定量的多重化を達成するために、デジタルマイクロ流体システムにおける伝統的融解分析または高分解能融解分析 (HRM) から作成された特有の融解シグネチャーを使用することを記載している。WO2015023616は、ユニバーサルプライマーを用いて標的核酸を非特異的に増幅し、HRM分析を用いて個々の細菌種を同定するデジタルシステムを記載している。標的核酸を含む個々のウェルにおける融解シグネチャーを標準的融解曲線と比較して、存在する標的配列を同定する。個々の細菌種の正確な同定には、特有の標的間の融解プロファイルの注意深い比較が必要であり、したがって典型的にΔT < 1℃の高分解能融解データに依存する。
【００７６】
不連続融解分析 (DMA) は、融解分析を実施するための改善法を提供し、この方法は、蛍光対温度のより少ない測定を必要とし、したがってより速いデータ収集および分析をもたらし、かつ結果としてアッセイのためのより少ない所要時間を提供する。概念として、DMAは、連続融解分析またはHRM分析のアンダーサンプリグを表す。後者の2つの方法とは対照的に、DMAは、標的当たり2つの温度のみにおける蛍光の測定を必要とし、標的核酸を同定するためにTmの算出を必要としない。(1) 標的を表すプローブまたは二重鎖核酸がすべて、ハイブリダイズした二重鎖立体構造にある温度、および (2) 標的を表すプローブまたは二重鎖核酸がすべて、一本鎖立体構造にあるか、または完全に変性している温度において、特定の標的核酸の蛍光画像を取得する。これら2つの立体構造を区別する適切な標識付加スキームを使用することにより、標的の存在下での2つの測定温度における立体構造の変化の検出が可能になる。この概念を、単一の標的特異的プローブを有するサンプル（左側）、および特有のTmを有することによって識別可能である3種の標的特異的プローブを有するサンプル（右側）について、図2に表す。
【００７７】
DMAは、参照により本明細書に組み入れられる米国出願番号第14/82,288号に記載されているようなプローブを用いて行われる融解分析に特によく適しており、デジタル増幅システムにおける多重化の効率的でかつ対費用効果の高い手段を提供する。
【００７８】
本発明の方法は、デジタルPCRにおいて個々の区画中の特定の標的核酸の存在を同定するために、所定の特有の融解シグネチャーを有する切断可能なプローブを使用し得る。特定の局面において、本発明の方法は、標的核酸の存在を確認するための、多数の温度において取得された複数の画像ではなく、2つの温度のみにおいて取得された蛍光画像由来の不連続融解シグネチャーの使用に関係する。DMAの使用は具体的には、検出しようとする二重鎖核酸またはプローブのTmにおける蛍光画像の取得を必要としない。
【００７９】
標的特異的な切断可能な融解プローブの使用は、そのようなプローブによって可能となる不連続融解分析が、検出された標的の存在および同一性を確認する効率的な手段を提供しながら、標的特異的プローブが非特異的増幅産物の検出の発生率を減少させ得るという理由で、特異性を改善する2つの機構を提供する。さらに、本発明の方法は、dPCR適用において多重化能力を増大させるために、標的特異的な切断可能なプローブを使用し得る。
【００８０】
したがって、本発明の方法は、反応混合物中の1種または複数種の標的を検出するために使用することができる。本方法は、qPCR反応およびdPCR反応の両方に適用することができる。dPCR反応については、単一の蛍光チャネルを用いて単一の区画において3種またはそれ以上の特有の融解シグネチャーを検出することができ、これは、最低でも、4つの異なる蛍光チャネルを使用して、単一の区画において12種の特有の標的を検出することができることを意味する。
【００８１】
重要なことには、本明細書に記載される方法は、温度を漸増的に変化させながら多数の画像を取得する必要がある、時間のかかる融解分析に対する解決法を提供する。伝統的融解曲線分析およびHRM融解曲線分析からの画像取得およびデータ処理が多大な時間を必要とし、かつ計算集約的であるdPCR適用において、本方法は特に有用であると考えられる。DMAは、標的解明のために最低n+1個の画像の取得を必要とし、nは、同じ波長で蛍光を発する異なる特異的プローブの数である。これは、標的を正確に同定し定量化する能力を犠牲にすることなく、標的の存在を決定するのに必要な画像の数を有意に減少させ得る。伝統的な融解分析およびHRMとは対照的に、本発明の方法は代わりに、所定のプローブTmよりも高いおよび低い温度で行われる不連続蛍光測定を使用し、特定の標的の存在を示すために強度の段階的変化を利用する。 
【００８２】
1つの態様において、米国出願番号第14/823,288号に記載されているような切断可能なプローブは、第1標的に特異的なプローブが、標的ハイブリダイゼーション媒介性の切断、それに続く切断型プローブの伸長を支持するヘアピン形成の後に、反応混合物中の任意の他の標的核酸に特異的なプローブと少なくとも5℃異なるTmを示すように設計される。このような条件下で、多重検出スキームにおける各プローブセットに関する融解プロファイルの微分値のプロットは、互いに識別可能である高度に区別される融解ピークをもたらす。好ましい態様においては、より高いTmにおいて融解するように設計されたプローブが変性し始める前に、同じTmで融解するすべてのプローブが完全に変性する／一本鎖化するように、異なるプローブTmは約10℃で隔てられる。典型的に、プローブは増幅反応混合物中に含まれ、増幅後に、反応混合物中の修飾型プローブに関する融解プロファイルを決定するために用いられる。切断可能なプローブは、それらの同族標的核酸に遭遇し、切断され、伸長されたか否かによって、異なる蛍光強度を示す。図2〜7に示される態様において、プローブは、プローブの5'末端に蛍光レポーターが結合している結果として、標的の非存在下で蛍光を示し、その蛍光は伸長中のクエンチャーの取り込みによって消光される。
【００８３】
画像取得
所定のTmを有するプローブをDMAにおいて使用することで、所定の融解ピークよりも低いおよび高い温度間隔において蛍光を測定して、増幅後に標的の存在を解明することが可能になる。図2の左側パネルは、所定のTmを有する単一プローブの融解分析における、2つの蛍光画像（Xで示される温度で撮像される）のみの取得を図示する。画像取得がプローブの所定のTmにおいて行われないことに留意されたい。図2の右側パネルは、それぞれが、それぞれ特有の融解ピーク（Tm1= 65℃、Tm2= 75℃、およびTm3= 85℃）を有し、同じ蛍光チャネルにおいて検出可能である、3種のプローブを含有する反応混合物に関して、融解プロファイルを作成するために4つの画像のみが必要であることを図示する。第1画像は、PCR増幅において用いられるプライマーのアニーリング温度におけるか、またはそれよりもわずかに低い温度T1であって、増幅後に、それらの対応する標的に遭遇したすべてのプローブが、ハイブリダイズした二重鎖状態にある温度T1において取得される。第2画像は、Tm1プローブは変性するが、Tm > Tm1を有するプローブはハイブリダイズした状態のままである温度T2において取得される。第3画像は、Tm2とTm3の中間にある温度、T3において取得される。第4画像は、Tm3よりも高く、すべてのプローブが変性する変性温度T4において取得される。dPCR適用では、全4つの取得画像について、個々の区画における平均蛍光強度が測定される。
【００８４】
代替方法では、米国出願番号第14/823,288号（参照により本明細書に組み入れられる）に記載されているような切断可能なプローブを使用する場合、初期画像および関連する蛍光を増幅前に取得することができ、これは反応物中のすべてのプローブの最大蛍光を表す。この蛍光測定値は理論的には、反応物中のすべてのプローブが完全に変性し、それらの同族標的に遭遇したか否かにかかわらず最大蛍光を示す、温度T4において取得された画像に等しい。増幅後、温度T1、T2、およびT3においてその後の画像を取得し、増幅前に撮像された画像と比較して、温度が上昇するにつれてプローブが二重鎖立体構造から一本鎖立体構造に移行する際の蛍光の変化を測定することができる。すべてのプローブが完全に変性する高温 (T4) 画像の増幅前画像による置換は、非修飾型（増幅前）プローブが最大の蛍光を発し、そのような同じプローブが、ひとたび修飾されると、それらが標的に遭遇したかどうかに基づいてシグナルの変化を示す任意のアッセイ形式に適用することができる。
【００８５】
測定温度の選択は、RFU対温度プロットの最も平らな領域が、各プローブの融解ピークの両側（すなわち、最低融解温度よりも低い、および最高融解温度よりも高い）のどこに存在するかを示す、以前の臨床データまたは検査データに基づき得る。あるいは、測定温度はまた、負の微分曲線のピーク (Tm) に隣接する最高点（最小の負の値）に基づいて選択することもできる。関連する温度領域全体にわたる以前の高分解能RFUおよび／または微分値データがない場合でさえ、測定温度はなお、反応混合物中の各プローブの所定の融解温度よりも低いおよび高い温度を単に選択することによって、選択することができる。この過程は、インシリコのモデリングデータによってさらに支持され得る。図2は、蛍光画像が等間隔の温度間隔において取得されることを示しているが、これは必要条件ではない。
【００８６】
図2に示される蛍光強度プロットは理想化されており、この場合、標的融解温度よりも低いおよび高い温度における蛍光はほとんど変化を示さず、比較的緩やかな、ほぼ平らな傾き（ほぼゼロに等しい傾き）をもたらす。しかしながら、実際には、光退色および／または蛍光レポーター色素の温度依存性によって、関連の温度範囲にわたる蛍光の傾きは変化し得る。融解シグネチャーのより明白な同定のために、融解分析の前に、傾きの補正および/または正規化を蛍光強度対温度の生データに適用することができる。
【００８７】
図3〜7は、dPCR適用においてDMAを使用してインプット標的コピー数を決定するために用いられる画像解析過程を図示する。図3は、36個の区画間に様々な組み合わせで分布した、図2に記載されたのと同じ3種の標的A、B、およびCを示し、その中には標的を有さない4つの区画（空の区画）が含まれる。この例では、増幅後に、いくつかの区画は標的A、標的B、または標的Cのみを含み、いくつかは2種類の標的（AB、BC、またはAC）を含み、いくつかは3種類の標的 (ABC) を含み、およびいくつかは標的を含まない。標的は、図2に記載されたのと同じプローブを用いて検出することができ、それらは特有の融解温度Tm1、Tm2、およびTm3を有するように設計されており、Tm1<Tm2<Tm3である。
【００８８】
この態様において、画像解析過程は一般に、標的増幅後に、所与の標的プローブまたは二重鎖の予測融解温度よりも高い温度と低い温度において取得された2つの蛍光画像を比較する段階を伴う。最初に、Tm1よりも低い温度T1（この例では60℃）において、出発蛍光強度画像を取得する。図4は、増幅が完了した後の、図3に示されるシステムの個々の区画中の、T1における蛍光強度を図示している。図4に示される画像は、すべてのプローブが二重鎖（ヘアピン）立体構造にあり、切断されず伸長されなかったプローブ（すなわち、標的が存在しないプローブ）のみが蛍光を発する条件を表す。この条件において、それらの対応する標的核酸の存在下で切断され伸長された、全3種の標的のプローブからの蛍光は、消光され、標的が存在しなかった条件または切断され伸長されたプローブが変性する条件と比較して、蛍光強度の減少をもたらす。次に、温度をTm1よりも高いがTm2よりも低い温度T2（この例では70℃）まで上昇させ、第2画像を取得する（図5）。この温度において、および標的Aの存在下では、標的A特異的プローブは変性し、消光の消失の結果として蛍光の相対的増加を示す。
【００８９】
標的Aについて検査で陽性と出る区画の数を決定するために、以下の画像処理段階が行われる：i) 個々の区画内の積分ピクセル強度値を区画画像中のピクセル数で割ったものと定義される、個々の区画内の平均ピクセル強度を算出する段階；ii) T2対T1における平均蛍光強度の比 (FT2/T1) を決定する段階；iii) 画像比較の結果をプロットして、温度測定ウィンドウにわたって蛍光強度の変化を示す区画を同定する段階。あるいは、比を使用するのではなく（平均強度値を使用して）、T1において得られた蛍光値をT2において取得された蛍光値から減算してもよい (FT2-T1)。平均強度値はまた、区画内のピクセルのサブセットまたは関心対象の領域 (ROI) のみを調べてもよい。あるいは、本明細書に記載されるすべての分析において、平均強度の代わりに積分強度を使用することができる。最後に、ピクセルごとに画像間で直接、対比または減算を行うことができ、結果として得られた画像から区画強度（平均または積分）を決定することができる。
【００９０】
図3〜7において、蛍光の変化は、各末端においてフルオロフォアおよびクエンチャーを含むヘアピンプローブが変性し、したがってフルオロフォア分子とクエンチャー分子が分離する際の蛍光の増加を表す。当然のことながら、融解分析中に二重鎖が変性する際に蛍光強度の減少をもたらす、代替の検出化学および標識付加スキームを使用してもよい。
【００９１】
T2において取得された画像はまた、その融解温度がTm2である標的Bの所定のTmよりも低い温度において撮像される画像を表す。各標的について、各プローブの所定のTmよりも高いおよび低い温度において、同じ一般的手順を行うことができる。DMAの特徴は、指定されたプローブの所定のTmよりも高い温度Txで得られた測定値をまた、Txよりも高いTmを有するプローブの所定のTmよりも低い温度で得られる測定値として役立てることができ、したがって各プローブについて少なくとも2つの測定値を得る必要がないことである。したがって、反応混合物が、異なるTmを有するn種類の標的特異的プローブを含有する場合、蛍光画像は、n+1の異なる温度において取得されることのみを必要とする。図6は、図3に示されるシステムに関する画像比較の一例であり、T2 (70℃) において算出された平均蛍光強度をT1 (60℃) において算出された強度で割って、どの区画が強度の変化を示すかを決定する。結果として得られた1D振幅プロット（図6、下部）は、標的について陰性である区画（連続する画像間で蛍光強度の識別可能な変化がない場合は、1に近い比を生じる）または標的について陽性である区画（連続する画像間の蛍光強度の変化は、比 > 1を生じる）に相当する、2つの強度における区画のクラスターを含む。区画のこれら2群への分類は、手動閾値を設定することにより、またはk-meansクラスタリングなどのアルゴリズムベースのアプローチを用いることによって行うことができる。すべての標的プローブのそれぞれのTmよりも低いおよび高い温度において、ひとたび画像が取得されたならば、画像解析を行って、画像の各セットを比較し、測定値の各セットについて蛍光強度比を算出する（図7）。画像のセット間の区画強度の比をプロットすることにより、対応する陽性区画数および陰性区画数の算出が可能になる。各標的について検査で陽性と出る区画の数がわかったならば、ポアソン統計を用いて、区画当たりの平均標的インプットコピー数λを推定することができる。数式1を各標的に個々に適用することができる。区画にわたる標的A、B、およびCの分布は独立していると仮定され、したがって数式1の算出において標的Aについて陰性であり得る区画は、標的BもしくはCまたはその両方について陽性であり得ることに留意することが重要である。しかしながら、これは個々の標的の定量化に影響を及ぼさない。
2021511056.tif 000003
【００９２】
平均荷重 (λ) からの+/- Z標準偏差の範囲内の信頼区間は、数式2における式（式中、λCILは信頼区間の下限値であり、λCIUは上限値である）によって与えられる。95%信頼区間に関して、Z = 1.96である。代替の信頼区間は、Zに適宜代入することによって得ることができる。区画の体積が一定に保たれるのであれば、区画数が増加するにつれて、信頼区間は狭くなる。したがって、区画数を増やすことは、区画当たりの平均インプット標的コピーを推定する精度を高めるための1つの方法である。
2021511056.tif 000004
【００９３】
精度を定量化するために、数式3における式で、信頼区間の長さを、区画当たりの平均標的コピー数と比較する。より小さい値は、より高い精度を意味する。相対標準偏差および相対信頼区間は、定量化可能な検出の限界（すなわち、ほとんどない標的陽性区画またはほとんどない標的陰性区画）において劇的に増加し得るが、そのような場合の誤差の大きさはなお許容可能であり得る。例えば、極めて稀な標的を検出しようと試みる場合、標的の単純な存在は、誤差の程度にかかわらず、それ自体で既に極めて有益な情報であり得る。
2021511056.tif 000005
【００９４】
データ分析
dPCR増幅前および増幅後の両方で取得された画像を使用してデータ分析を最適化するための戦略もまた提供される。そのような戦略は、融解分析中に測定された蛍光強度を正規化するために、増幅前または増幅後に取得された画像を使用すること（実施例2を参照されたい）、ならびに増幅前および増幅後の画像を使用して、陽性シグナルおよび陰性シグナルをバックグラウンドと区別するためのバックグラウンド（陰性区画）閾値を確立すること（実施例3を参照されたい）を含む。さらなる態様（実施例4を参照されたい）は、温度プロファイルにわたる蛍光強度の温度依存的および光線量依存的変化を考慮するために、融解分析中に取得された画像を補正するための方法を提供する。例えば、FAMは光感受性が非常に高いことが公知であり、光曝露の増加により蛍光強度の減少を示し、FAMおよびHEXなどの多くの色素は、より高温で蛍光の減少を示す。
【００９５】
実施例5は、0または3種の標的を含む区画の予備同定のために、増幅前画像と増幅後画像を比較するための方法を提供する。データ分析を単純化するおよびデータ分析に必要な時間を短縮するために、そのような区画をさらなる分析から除外することは、望ましいと考えられる。データ分析に含まれない区画の予備同定はまた、これらの区画に関して画像が取得される必要がないため、融解段階中に取得される画像の数を限定するのにも有用である。したがってこの方法により、有用なデータをもたらすのに適していると見なされた結果として、関心対象の区画からのみの画像取得が可能となる。ある特定の実験条件において、これは融解取得時間およびその後のデータ分析を大幅に減らし得る。
【００９６】
したがって、本発明の方法は、1種または複数種の標的に関する陽性または陰
性としての区画分類の改善を提供し、これは定量化の改善をもたらす。融解分析のためにDNAインターカレート色素に依存する方法とは対照的に、本発明の方法は、アッセイ設計（例えば、プライマー領域、アンプリコン長、等）における適応性を維持しながら特異性を向上させるために、標的特異的プローブの融解分析を使用する。加えて、記載される方法は、標的核酸を検出および同定するために低分解能デジタル融解プロファイルの使用に依存し、これは、融解データの取得および分析を単純化し、最終的により迅速なデータ取得およびデータの分析をもたらす。
【００９７】
DMAは、伝統的な連続融解分析よりも少ないデータ点を必要とし、これによってデータ取得に必要な時間が短縮され、処理するための画像が少なくなり、光感受性レポータープローブの光退色が軽減される。これは、区画（すなわち、液滴または静的アレイ区画）の多くの画像が各融解温度において処理される、画像化ベースのデジタルPCRシナリオにおいて特に有用である。dPCR反応の融解分析は典型的には、画像が、融解プロファイルの各温度において一連の区画にわたって取得されることを必要とする。区画の数に応じて、画像が取得される範囲の面積は極めて大きくなり得る。加えて、画像は、頑強な区画同定および標的の陽性または陰性としての割り当てを確実にするために、分解能が十分に高くなくてはならない。これは、一連の区画当たり複数の画像を取得することを必要とする場合が多い。さらに、デジタルアッセイおよび大量容積アッセイにおいて多重化を達成するために、複数の蛍光チャネルにおいて画像が取得される。融解分析に必要な画像取得事象の数を減少させることにより、DMAは、融解データを取得するおよび取得された画像を処理するのに必要な時間を短縮するため、デジタル適用において特に価値がある。
【００９８】
DMAの使用はまた、サンプルが、損傷を与える可能性のある光および高温にそれほど曝露されない点で、利点をもたらす。いくつかの一般的に使用されるフルオロフォア（例えば、FAM）は光感受性が高い。この光感受性はデジタルPCRにおいて顕著である、というのは、全体積よりも少ない局所体積が典型的に調べられる大量容積PCRとは対照的に、サンプル全体が各蛍光測定値に関して調べられるからである。後者の場合のフルオロフォアは、局所体積の中におよび外に自由に拡散することができ、平均してより少ない励起曝露を受け、したがって光退色を経験する可能性がより低いため、この違いは重要である。デジタルPCR反応におけるフルオロフォアは、特に融解分析が行われる場合に、付随的励起の増加量に曝露され、したがって光退色を経験する可能性がより高くなる。DMAは曝露事象の数を減少させ、ひいてはフルオロフォアが経験する光退色の程度を軽減する。ある場合には、蛍光プローブの高温への繰り返し曝露および連続曝露もまた有害作用を有し、これはDMAによって軽減され得る。
【００９９】
DMAを切断可能なプローブと共に使用する別の利点は、それが特異性の強化をもたらす点である。米国出願番号第14/82,228号に記載されている切断可能なプローブは、標的DNAの存在下でのみ切断され伸長されるが、伸長のための鋳型として標的DNAを使用しない。したがって、そのようなプローブは、標的核酸配列変動の存在下でさえ変動しない、非常に予測可能なTmを有する。対照的に、少なくとも部分的に標的核酸またはその増幅産物の組成によって決定されるTmを有する核酸二重鎖およびプローブ／標的二重鎖は、軽微な標的配列変動の結果として、サンプルごとにTmの変動を示し得る。このような理由で、HRMは典型的に、サンプル中の未知の標的配列の同一性を確認するために、融解ピークを決定することを必要とする。対照的に、切断可能なプローブと組み合わせたDMAの使用は、標的核酸の同一性を決定するために融解ピークTmの決定を必要としない。DMAは、陽性サンプルと陰性サンプルを識別するために、2つの値間の比または差を決定するための、プローブの予測されるTmよりも低い温度または高い温度においてのみ取得される蛍光強度値を必要とする。DMAはまた、付加的な予め選択された温度において蛍光強度値を取得することを含み得るが、標的を同定するために融解温度の決定を必要としない。さらに、いくつかの態様において、蛍光強度値は、反応物中のすべてのプローブが変性する温度で取得する代わりに、増幅前に取得してもよい。
【０１００】
しかしながら、DMAはdPCR態様に限定されない。それはまた、融解プロファイリングのためのデータを取得するのに必要な時間を短縮するために、リアルタイムPCRおよびqPCR融解分析的適用にも容易に適用可能である。本方法また、分子ビーコン (MB)、TaqMan、TOCE技術などの、他のプローブベースの検出法、およびSYBRまたはEvaGreenなどのDNAインターカレート色素の特定の使用にも適用可能である。
【０１０１】
分子ビーコンプローブは、特有の所定の融解温度を有するように設計することができる。しかしながら、MBプローブを使用する融解分析は、それがハイブリダイズした標的配列からのプローブの解離を反映するため、融解温度は標的配列により決定され、したがって設計の点で制約される。MBプローブ融解分析中に温度が上昇するにつれて、MBプローブは標的から解離し、ランダムコイル立体構造をとるため、蛍光は減少する。同様に、TaqManプローブを使用する融解分析についても、融解プロファイルは、検出されるよう意図される標的配列により決定され、プローブ設計はしたがって制約される。分子ビーコンプローブおよびTaqManプローブを使用する融解分析は、参照により本明細書に組み入れられる、Huang et al., PLoS One, 6(4) 2011に記載されている。DMAは特定の二重鎖Tmの決定を必要とせず、そのため標的配列のわずかな変化は有意な悪影響を及ぼさないため、所定の融解プロファイルを有するように設計されたMBプローブおよびTaqManプローブを、DMAにおいて使用することもできる。
【０１０２】
DMAはまた、参照により本明細書に組み入れられるWO2012096523に記載されているTOCEプローブと共に使用することもできる。その標的核酸の存在下における上流プライマーのハイブリダイゼーションおよび伸長は、下流のハイブリダイズしたピッチャーオリゴヌクレオチドの切断をもたらして、タギングオリゴヌクレオチドを放出させる。タギングオリゴヌクレオチドは次いで、タギング領域の伸長のための鋳型として役立つ標識付加プローブまたはキャッチャーオリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、所定のTmを有する二重鎖核酸を生成する。二重鎖核酸の融解分析を支持するために、様々な標識付加スキームを使用することができる。例えば、タギング領域の伸長は、ランダムコイル標識付加プローブのクエンチャーとフルオロフォアの分離を引き起こして、蛍光を生じ得る。したがって、二重鎖が形成される際の蛍光の増加を検出することにより、増幅をリアルタイムで検出することができ、ランダムコイルプローブがランダムコイル立体構造を再びとる際の蛍光の減少として、融解分析を検出することができる。キャッチャーオリゴヌクレオチドは標的非依存的であり、所定のTmを有するように設計することができるため、この検出方法はDMAにおける使用に十分に適している。
【０１０３】
DMAはまた、SYBRまたはEvaGreenなどのインターカレート色素と共に使用することもできる。標的の同定は、異なる長さまたは配列組成、およびひいては異なTm値を有する標的領域の増幅を通して達成され得る。増幅後、反応混合物を不連続融解分析において温度の上昇に供して、二本鎖アンプリコンまたは二重鎖解離に相当する蛍光強度の変化を測定することができる。プライマー二量体（典型的に、真の標的二重鎖よりもTmが低い）などの非標的増幅産物を含むTm範囲の外側にあるように設計され得る、関心対象の二重鎖の所定のTmよりも高いおよび低い不連続温度において、シグナルを検出することができるため、DMAは、インターカレート色素およびプローブベースの検出方法において有用である。例えば、融解分析において、非標的の偽二重鎖は、60〜75℃の温度範囲内にTmを有し得る。関心対象の標的アンプリコンまたは二重鎖は、83℃のTmを有するように設計され得る。このシナリオにおいて、DMAは、大量反応またはdPCR形式のいずれにおいても、78℃および88℃において行うことができる。この分析方法は、迅速かつ効率的な様式で、非標的増幅事象と関連したシグナルの取得を回避し、これは、単一温度測定と比較して特異性が優れており、高分解能融解分析よりもスピードおよび処理の点で優れている。
【０１０４】
DMAは、閉鎖チューブまたはリアルタイム大量PCR法などの非デジタルまたは均一アッセイ化学法に適用することができるが、反応物中の標的の出発濃度を定量化するための陽性区画の正確な計数に特定の利点をもたらすため、デジタル増幅適用において特に有用である。
【０１０５】
加えて、様々な分析技法を用いて、dPCRにおいて標的核酸を定量化するおよびその定量化を改善するための様々な方法が、本明細書において記載される。
【０１０６】
A. dPCRにおいて対照を使用するための方法
dPCRにおいて対照を利用するための戦略は、サンプル処理およびdPCRを単一の装置およびワークフローに組み入れるdPCRシステム（サンプル-回答型）、またはサンプル処理とdPCRワークフローとの間の分離を維持するシステムについて記載されている。記載されている方法はすべて、dPCRシステム、特に単一反応コンパートメントまたは区画中の複数の標的を同定するために融解分析を利用するdPCRシステムを用いる標的定量化において精度を最適化することを目的としている。本明細書に記載される方法は、装置性能を測定することができる参照データセットおよび基準を作成するために、較正色素、プローブ、および対照標的に依存する。これらの色素、プローブ、および標的での試験を、サンプル反応とは別々に、またはサンプル反応と同時に行って、サンプル処理、光学系、および温度制御を含むシステム性能を検証することができる。好ましい態様は、サンプル試験反応と同時に実行される対照反応、およびサンプル試験反応とは別々に実行される対照反応を含む。
【０１０７】
現在のdPCRシステムは、多重化能力が限定されているため、本明細書において企図されるように単一反応物中に複数の対照を含めるという利点を有していない。したがって、既存のdPCR法は、そのような対照を、サンプル反応物内ではなく、別々のウェルまたはチップ中に含めることを必要とし、これはサンプルと対照との性能の間に変動性を導入し得る。同様に、qPCR反応は大量容積PCR反応物内に含まれる対照に依存するため、複数の対照を含める能力はやはり、利用可能な多重化の程度によって限定される。
【０１０８】
較正色素およびプローブのセットを利用して、装置性能を適切な頻度でモニターすることができる参照データのセットを作成することができる。色素およびプローブのこのセットは、適切な較正を行うための、水溶性にすることを目的とした短いオリゴ配列で標識されたシステム特異的色素、およびある範囲の融解プロファイルを示すように設計された種々のヘアピンプローブ（融解較正対照）を含み得る。
【０１０９】
較正色素のセットを用いて、装置が、すべてのチャネルにわたって、予測される蛍光強度を検出し報告していることを確実にすることができる。各チャネルに対する異なる較正色素を対照サンプル中に含めることができ、測定された強度を、所望の温度範囲（55〜95℃など）の下端および上端において以前に決定された強度と比較することができる。測定値のいずれかが、予測値から所定の許容可能な範囲を超えて逸脱する場合、これは、装置、試薬ミックス、または操作条件に関する問題を表し得る。さらに、較正色素を用いて、生の測定値を正規化および／または調整することができ、その結果として、測定値を参照データの全セット（例えば、標的またはプローブの予測される融解振幅および温度）に対して適切に評価することができる。
【０１１０】
別の態様においては、公知の融解プロファイルおよび融解温度を有する1つまたは複数の融解較正対照が、反応混合物中または別々の区画中に含まれる。dPCR適用において融解較正対照を評価する1つの方法は、蛍光の微分値対温度のプロットにおける融解ピークを同定するために、連続融解分析を行うことである。観察された正確な融解温度が同定されたならば、それを予測値と比較し、観察値と予測値との間の任意の差を用いて、温度補正をすべての測定値に適用する。所望される場合には、2つ以上の融解較正対照を含めて、融解分析温度ウィンドウ全体にわたる正確な温度補正を確実にすることができる。しかしながら、融解対照を用いてDMAを行う場合、融解ピークを決定する標準方法を用いて任意の必要な温度補正の範囲を正確に決定することは難しいと考えられる。
【０１１１】
この限界を克服するために、DMAにおいて使用するための融解較正対照は、DMA分析のために用いられる測定温度を挟む狭い温度範囲にわたって融解する（>90%が5℃以内で融解する）ように設計されるべきである。DMAでは標的特異的プローブのTmにおいて蛍光を測定しないため、融解較正物質のTmをDMA測定温度（T1、T2、T3、およびT4）の狭い範囲内に有することは、融解較正物質の蛍光がシステム温度の変動に対して最大限に敏感であることを確実にする。融解較正物質について導出された、参照値と比較した蛍光強度値の変動によって、温度変動性の程度が決まる。温度変動性が所定の許容規格内にある場合には、融解分析は完了したと見なすことができる。しかしながら、融解較正物質の値が温度性能の変動性を示唆する場合には、適切に調整された温度において融解分析を繰り返すことができ、または適切な補正係数を適用してもよい。温度変動を最も正確に定量化するためには、特定のチャネルについて決定された最小および最大蛍光が、そのチャネルの予測強度（参照例）と一致することを確実にすることが重要である。これらの融解較正対照は、システムの維持および較正の一部として独立して評価することができ、または1つのチャネルにおけるもしくは複数のチャネルにわたる所望の融解数が確保されるのであれば、それらを内蔵対照として含め、すべてのサンプルと並行して処理してもよい。
【０１１２】
個々の実験条件によって結果は予測値から逸脱し得るため、融解較正対照をサンプル測定と並行して同時に測定することが最適である。例えば、オリゴヌクレオチドおよび塩の濃度は、極端な例では融解温度を10〜20℃ほども変化させ得る。1つの方法では、予測されるTmが公知である融解較正対照を含める。試験される標的との混同を回避するために、融解較正対照は、照明チャネルおよび発光波長領域が標的の発光波長と一致しないように選択され得る。一例として、予測される融解温度が84.1℃であるFAM標識対照を、試験される分析物に含めることができ、またはそれを別々に測定することができる。+/- 2.5℃または81.6〜86.6℃などの許容可能な範囲を特定することができる。次いで、生の融解データ（例えば、0.5℃刻みで55℃から95℃まで測定を行うことによって得られる）が、蛍光の負の微分値対温度のプロットにおいて、83.1℃の設定点温度において融解ピークを示す場合には、必要に応じて設定点温度をシフトするために必要とされる温度補正、ΔTcorrを算出することができる。この例では、設定点温度から予測温度を減算することにより、ΔTcorr = 83.1-84.1℃ = -1.0℃の温度補正が得られる。-1.0℃の温度補正によってその後の設定点温度を調整することにより、予測される融解は予測温度で起こるはずである。84.1℃のデータ点に関して、対照を繰り返すが、今回は温度補正を考慮する場合、算出された温度補正は、設定点について、84.1℃ + ΔTcorr = 84.1-1.0 = 83.1℃を使用するべきであることを指示し、これによって所望される84.1℃データ点において融解ピークが生じるはずである。
【０１１３】
所望される場合には、2つ以上の融解較正対照を含めて、適切な温度補正のみならず、予測される融解ピーク間の適切な温度差を確実にすることができる。例えば、第1融解較正対照は、予測される融解温度が84.1℃であるFAM標識対照オリゴヌクレオチドであってよく、第2融解較正対照は、予測される融解温度が71.0℃であるAP-593標識オリゴヌクレオチドであってよい。13.1℃の温度差が予測されるため、観察された融解ピーク間の値からの任意の実質的逸脱は、欠陥のあるまたは不適切な温度勾配などのシステムの問題を表し得る‐例えば、接触不良によって、熱電加熱／冷却単位に必要な電流よりも少ない電流が送られ、それによって所与の設定点から予測されるよりも少ない熱および低い温度がもたらされた可能性がある。
【０１１４】
温度較正のための代替法は、十分に特徴づけされた温度感受性蛍光色素の使用に依存する。この用途のための例示的な色素は、ローダミンおよびAP662である。これらの色素は、融解分析範囲にわたって頑強な再現性のある温度依存的蛍光を示す。予測される色素性能からの逸脱を用いて、それに応じてシステム温度を調整する。
【０１１５】
同じインプット標的濃度についてさえ、実際の濃度測定値は、抽出および精製過程の変動性；操作条件の変動性；観察される融解温度のオリゴヌクレオチド濃度および／または塩濃度に対する依存性；設備効率の変動性を含む種々の理由で変動し得る。これらの理由で、本開示のさらなる態様は、結果の最適な比較および解釈のために、測定されたインプット標的値をどのように補償するまたは補正するかを決定するための対照を含めるおよび使用するための方法を提供する。一般に、これらの方法は、サンプル処理の様々な段階で含まれる核酸対照の使用を含む。
【０１１６】
1つの方法は、サンプル調製効率を決定するために、反応混合物中に、再現性のある公知の濃度を有するサンプル処理対照を含めることを含む。測定された対照の最終濃度を公知のインプットと比較することにより、適切な補正を、サンプルについて算出された未知の分析物の濃度に適用することができる。この補正は、対照の予測されるインプット値をアッセイで得られた測定値で割って乗数値を得ることにより、得ることができる。この乗数値を、ポアソン補正後に各分析物について得られた初期値に適用して、患者サンプル中の各分析物の真の濃度をより正確に反映するであろうサンプル調製効率補正値を得ることができる。サンプル処理対照は、サンプルが典型的に添加されるのと同じ段階で添加することができる。それは手動で添加してもよいし、または例えばカートリッジ内の指定のウェルから自動工程により機械的に添加してもよい。それは液体形態または乾燥もしくは凍結乾燥状態であってよい。あるいは、関心対象のサンプル型に関して比較的安定した濃度で存在すると予測される内因性の核酸対照を用いてもよい。
【０１１７】
加えて、前記方法は、公知の濃度の対照標的に関して陽性区画および陰性区画の分布を特徴づけるために、オリゴヌクレオチド標的配列および対応する標的特異的プローブを含む増幅対照をPCRマスターミックス中に添加すること（サンプル処理後）を含み得る。公知の濃度の対照標的を添加することにより、陽性区画および陰性区画の予測される蛍光強度を決定し、これを用いて、未知の標的を分類するための予備閾値を設定することができる。さらに、予備閾値は、その後、手動の閾値設定方法またはアルゴリズムベースの方法を使用して調整される初期分類閾値として使用することができる。いずれの場合でも、サンプル処理対照または増幅対照を設定するための例示的な理想的な濃度は、1.59のラムダ（区画当たりの予測コピー）値を有するものである。この値において、デジタルPCRは定量化において最高の精度を達成し (Majumdar et al., Digital PCR Modeling for Maximal Sensitivity, Dynamic Range 2 and Measurement Precision, PLOS One, 2015)、これは、サンプル処理による変動性がポアソン分布の固有の変動性から最も分離されることを意味する。これらの対照は、単一の蛍光チャネルにおいてまたはすべての蛍光チャネルにわたって、単一のTmで含めることができる。前者の場合には、較正色素を用いた前述の検証済みデータセットによって、ユーザーは、単一の蛍光チャネルデータを他の蛍光チャネルに外挿することができる。
【０１１８】
あるいは、未知の標的に関する測定温度極値での陽性液滴と陰性液滴の分布およびそれらの強度は、結果を最適に解釈するための有益な情報をもたらし得る。例えば、少なくとも1つの区画がすべての標的について検査で陰性と出ると仮定して、標的陰性区画の蛍光強度を内部対照として使用することができる。標的陰性区画の平均強度を決定し、参照事例または過去の事例と比較することができる。測定値と過去の値の違いは、操作条件、サンプル組成の変化、または設備問題を示し得る。標的陽性区画の蛍光強度を、同様に参照事例または過去の事例と比較して、システム性能を評価することができる。
【０１１９】
画像は、区画の2次元アレイにわたる照明または蛍光測定の不均一性により、ある程度の変動性を示す場合がある。この変動性は、単一サンプルの全区画の集合画像を作成するために複数の画像をまとめる場合に、より大きな影響を及ぼす。この変動性を補正する1つの方法では、区画化後であるが核酸増幅前に取得された画像を使用して、増幅後に取得された画像を正規化することができる。増幅前画像における全区画にわたる平均区画強度を算出し、個々の区画における平均強度で割る。結果として得られた区画特異的比率は、任意の照明または測定誘発性の不均一性を考慮して、その後に取得された画像にわたって強度を正規化するために使用することができる。最終的な計装態様において、同様の戦略を各チャネルについて使用してもよい。
【０１２０】
別の態様では、含まれる増幅前プローブの固有の蛍光シグナルに依存するのではなく、蛍光の不均一性を補正するために、受動的参照色素が用いられる。内部参照色素は、受動的参照色素が既存のリアルタイムまたは定量的PCR装置で使用されるのと同様に、すべての蛍光測定のためのチャネルに依存しない強度正規化因子として使用することができる。加えて、液滴の態様では、プローブベースの蛍光測定は、プローブTmに依存して増幅状態および温度に対して可変的であるため、液滴の同定を補助するために受動的参照色素を使用することができる。
【０１２１】
複数のサンプルが並行して処理される、ある特定のdPCRシステムでは、本明細書に記載されているタイプの対照を含めるための単一のサンプルウェルを確保することが可能である。1つの方法では、US9039993に記載されているようなマイクロ流体デバイス内のウェル／区画を、蛍光正規化および温度較正のために確保することができる。サンプルウェル内に含まれる内部対照の場合と同様に、このウェルは、すべての蛍光測定のためのチャネルに依存しない強度正規化因子として使用され得る受動的参照色素を含み得る。任意の温度変動性を考慮して、1つまたは複数の融解較正物質を含めることができる。このまたはこれらの融解較正物質の測定されたピークは、較正物質の公知の融解ピークと較正物質の測定された融解ピークとの差を決定することにより、温度較正のために使用することができる。温度軸に沿った単純な移動で、日々の小さな変動性を考慮することができる。
【実施例】
【０１２２】
IV.  実施例
以下の実施例は、本発明の好ましい態様を実証するために含められる。当業者には理解されるように、以下の実施例に開示された技術は、本発明の実施において良好に機能すると本発明者によって見出された技術を表しており、したがって、その好ましい実施形態を構成すると見なすことができる。しかし、当業者であれば、本開示に照らして、本発明の精神および範囲から逸脱することなく、開示された特定の態様において多くの変更を行うことができ、依然として同様のまたは類似の結果を得ることができることを認識すべきである。
【０１２３】
実施例1‐核酸増幅前または核酸増幅後に取得された画像を使用して、区画分類を改善するために画像を正規化する方法
リアルタイムPCRでは、ROXなどの受動的参照色素を使用するウェル間の正規化により、光学系および反応体積の変動によって生じる変動性が最小限に抑えられる。同様の正規化スキームは、アレイベースのデジタルPCRにおいて有益であると考えられるが、単一の受動的参照色素に専念するチャネルを含めることは、最終的にシステムの多重化能力を制限することになる。記載される態様では、選択された蛍光チャネルにおける完全に変性したプローブが、各区画内の内部受動的参照色素として役立ち得る。一例では、すべてのプローブが変性し、したがって最大蛍光を示す温度（例えば、95℃）で、画像を取得する。この95℃の画像は、区画化後であるが、核酸増幅の前、または核酸増幅後の融解分析の過程で取得することができる。画像内で区画を同定し、区画当たりの平均ピクセル強度を決定する。様々な温度での融解系列で取得されたすべての区画平均強度は、融解分析中に測定された強度から95℃の平均強度を減算することにより、区画特異的な変動を考慮して、対応する95℃の区画平均強度に対して正規化することができる。
【０１２４】
図8は、単一のプローブを含む区画から作成された不連続融解データに対するこの正規化の効果を示している。図8Aは、T1で撮像された生データ画像を示し、図8Bは、95℃画像を使用して正規化された同じデータを示す。見られ得るように、正規化された画像では、陽性液滴と陰性液滴との間でコントラストが増強されている。図8Cおよび8Dに示される対応する強度ヒストグラムは、正規化の結果、予測される2つの集団（暗い液滴に関連するピクセルおよび明るい液滴に関連するピクセル）にクラスター化されることを示している。正規化の前に、3つの明確なピークが見える（図8C）。理論によって縛られることはないが、1つの集団が暗い液滴に関連し、2つの集団が明るい液滴に関連しており、それらは照明および蛍光収集の不均一性に起因して明るさが変動すると仮定する。正規化の正の効果は、図8Eおよび図8Fに示される1D振幅プロットにおいてさらに実証される。パネルEでは、2つの識別可能な集団の間にかなりの数の液滴が存在するため、液滴を陽性または陰性として分類するための適切な閾値を決定することは難しいと考えられる。しかしながら正規化後は（図8F）、2つの識別可能な集団の間に位置する液滴ははるかに少ない。
【０１２５】
実施例2‐コンパートメント化後であるが核酸増幅前に取得された画像を使用して、陰性区画と陽性区画の予備的カットオフを確立する方法
デジタルPCRを用いた正確な定量化のためには、陰性区画と陽性区画の正確な分類が必要である。既存のdPCR法は、区画を標的核酸について陽性または陰性として分類するために、エンドポイント画像化のみに依存する。本発明の方法では、区画化後であるが核酸増幅の前に、区画アレイの画像を取得する（図9A）。この段階では、各区画は理論的には、標的特異的プローブに由来する同じ均一な蛍光強度を有するはずである。しかしながら、実際には、異なる区画の平均強度値は、いくらかの分散または標準偏差を伴った平均値または予測値に関する分布に従う。コンパートメントの平均強度値は、前述されたように算出される。
【０１２６】
区画の集団全体にわたるこれらの平均強度値が共にグループ化され、平均値（予測値）および標準偏差（分散の平方根）が算出される（図9C；灰色のバー）。この分布の現在定義されている標準偏差を使用して、区画を陽性または陰性として分類するための閾値は、すべての増幅前区画にわたる平均強度値から、平均的な増幅前区画集団の平均強度値の3標準偏差を差し引いた値（図9CおよびDの灰色の線）に設定される。この初期閾値設定は、増幅後の反復的な閾値精緻化のための基礎を形成し得る。図9Bは、増幅後の液滴の画像を示す。明るい液滴は標的に関して陰性であり、薄暗い液滴は標的に関して陽性である。強度分布（図9C）および強度事象プロット（図9D）の重ね合わせにおいて、陰性集団における高度の重複は、このような方法で初期閾値を設定することの実現可能性を実証している。加えて、陽性区画と陰性区画を同定するためにk-meansクラスタリングなどの分類アルゴリズムが使用される態様では、この画像を介して取得されたデータは、分類アルゴリズムのための訓練セットとして使用され得る。この分類前作業のために、増幅前画像と増幅後画像は同じ温度で取得すべきである。標的増幅が進行するにつれてプローブシグナルが減少する検出スキームでは、増幅後に強度値が閾値の上方にある区画が陰性液滴として分類されることに留意されたい。増幅後に強度値が閾値の下方にある区画は、陽性液滴として分類される。標的の存在下で消光されないDNAインターカレート色素またはプローブを使用するシグナリングスキームでは、標的の増幅が進行するにつれて蛍光強度が増加するため、閾値を下回る区画は陰性として分類され、閾値を上回る区画は陽性として分類される。
【０１２７】
実施例3‐プローブの蛍光強度の温度依存的および光線量依存的変化に対して増幅後画像を補正する方法
核酸増幅後、特定の標的を同定するための融解分析は、55℃〜95℃の温度範囲にわたって行われる。いくつかの蛍光色素の蛍光強度は、この温度範囲内で可変的であることが示されている。加えて、FAM（フルオレセインの誘導体）などのいくつかの色素は、複数の画像取得の間に持続されるような繰り返しの光曝露の結果として光退色を示すことが公知である (Song et al., Photobleaching Kinetics of Fluorescein in Quantitative Fluorescence Microscopy, Biophysical Journal, 68, 2588-2600 (1995))。
【０１２８】
そのような変動性を補正するために、一連の画像を、55℃から95℃に及ぶ温度で、区画化の後であるが核酸増幅の前に取得することができる。好ましくは、融解分析において使用される各波長について、融解プロファイルの温度範囲全体にわたって等間隔の温度間隔で、最低でも3枚の画像を取得する。個々の区画における平均強度を、前述の方法（区画全体対ROI）の1つを用いて決定し、画像が取得された温度に対してグラフのY軸上にプロットする。このデータ点の集合を、温度および光の両方に対するプローブの感受性に関する事前知識に基づいて、最小二乗回帰を使用して適切なモデル（線形または指数関数）に適合させる。光感受性が優位に立ち、光退色が強度損失の重大な原因であるプローブの場合には、指数モデルまたは線形と指数の混合モデルがデータに最もよく適合すると考えられる。温度依存性が優位に立ち、光退色が最小限のプローブの場合には、線形モデルがデータに最もよく適合すると考えられる。適合度は、回帰の標準誤差または決定係数、R2のいずれかによって決定される。これらの適合から得られる重要なメトリクスには、傾き、時定数、および/またはy切片が含まれ得る。メトリクスの特有のセットが、存在する各蛍光チャンネルについて決定される。
【０１２９】
核酸増幅後に、一連の融解画像を取得する。融解分析（すなわち、プローブ特異的標的の存在を決定するための融解プロファイルの評価）の前に、融解プロファイルの温度範囲全体にわたってそれぞれの個々の区画について決定された平均強度を、各蛍光チャンネルに特異的な任意の温度依存的および光線量依存的な損失について補正する。具体的には、増幅前データから得られたフィットを増幅後融解プロファイルから減算することにより、一連の増幅後融解画像について、蛍光シグナルの直線的または指数関数的な減衰が補正され、補正された融解プロファイルが作成される。プローブ特異的な標的の存在を同定し定量化するためのさらなる分析が、補正された融解プロファイルを使用してここで行われる。あるいは、個々のコンパートメントまたは液滴における平均強度を算出する前に、温度依存的および光線量依存的な蛍光損失に関する補正が、画像全体にピクセル単位で適用される。
【０１３０】
別の代替方法では、温度依存的および光線量依存的な蛍光損失を補正するために、既存のデータセットが用いられる。前述されたように、プローブ強度は、融解測定の過程で、線形もしくは非線形の様式で、またはさらには線形と非線形の関係の組み合わせを介して変動し得る。例えば、Songら（Photobleaching kinetics of fluorescein in quantitative fluorescence microscopy, 1995. Biophysical Journal, 68(6), 2588-2600. doi:10.1016/s0006-3495(95)80442-x) によると、フルオレセイン強度は、酸素の乏しい条件では二重指数的な光退色挙動をとることが示されたのに対し、酸素の多い環境では単一指数的な挙動が見られた。任意の温度依存性および／または光退色に関して強度の傾きを補正するために、対照サンプルからのデータを使用し、ここで、最も適切な曲線を対照データに適合させ（例えば、二重指数曲線適合）、実験データから適合させた曲線を対照値に対して減算または正規化する。あるいは、増幅後に十分な陰性結果の区画が存在する場合、それらは対照として機能し、温度依存的および光依存的な蛍光変化による傾きの変化を調整するために、曲線適合の目的で使用することができる。
【０１３１】
図10は、陰性（標的なし）の対照区画から測定された蛍光強度が、試験サンプルにおける温度依存的および／または光線量依存的な蛍光変動を補償する／補正するためにどのように使用できるかを説明している。図10は、それぞれが異なる融解温度を有する3種の標的特異的プローブを伴うサンプル（標的）および陰性区画（対照）について収集された生データから作成された融解曲線、ならびにサンプル（補正された標的）および陰性対照（補正された対照）の補正された融解曲線を示す。対照の未補正（生）データから、陰性対照において、温度の上昇に伴う蛍光強度の直線的減衰が起こることが明らかである。予測された蛍光強度よりも低い蛍光強度は、RFUの予測された増加が検出されない、陽性サンプルの融解プロファイルの最後の10°においても顕著である。未補正データからわかるように、補正なしの不連続サンプリングでは、3番目のデータポイントと4番目のデータポイントの間に測定可能な蛍光強度の増加がないため、標的3の陰性コールが生じる（グラフ上で大きなドットによって強調表示されている）。各融解事象について予測される段階的な強度の増加は、蛍光の退色の結果としての温度依存的な強度の減少によって隠される。しかしながら、線形減衰補正（およびここでの比較表示のためのY軸に沿った移動）を適用すると、3種のプローブすべてについて、不連続な融解事象が容易に検出可能になる。
【０１３２】
実施例4‐初期区画分類のために全体の蛍光変化について全範囲の値を決定する方法
増幅後、最初に、融解分析温度プロファイルの中で最も低い温度 (T1) で画像を取得する。蛍光の温度依存的および光線量依存的な減衰に関する補正を、実施例3に記載された方法のうちの1つを使用して、すべての画像に適用する必要がある。T1画像における平均または積分区画強度を、次いで、実施例1に記載されたように、温度サイクリング前もしくは後に得られたT4での画像または温度サイクリングの前にT1で得られた画像のいずれかによって正規化する。静的アレイdPCRの場合、補正および正規化は、画像全体にわたって、または個々の区画内の平均もしくは積分強度について、ピクセルごとに適用することができる。液滴dPCRの場合には、画像取得中に液滴が移動する場合、液滴ごとの区画蛍光の比を決定する前に、最初に2つの画像から液滴を同定し相関させる必要があると考えられる。その後の分析は、T1画像の補正および正規化によって決定された平均強度を使用して、または数式5に示されるような、補正および正規化されたT1画像とT4画像との間の差を使用して行うことができる。
2021511056.tif 000006
【０１３３】
補正および正規化されたT1画像または算出されたΔF値のいずれかの区画特異的な平均強度のヒストグラムまたは1D振幅プロットは、0、1、2、または3種の特有の標的を含む区画の最初の分類を通知する。標的分子を含まない陰性区画は、蛍光強度の変化をほとんどから全く示さない（すなわち、IAVG = 1またはΔF = 0）。3種の標的をすべて含む区画は、蛍光強度の最大の変化を示す。1種または2種の標的を含む区画は、蛍光強度の中間的な変化を示し、2種の標的の区画は、単一の標的を含む区画よりも大きな蛍光強度の変化を示す。単一チャネルでの三重アッセイにおける初期の液滴分類を実証する1D振幅プロットの例を、図13Bに示す。
【０１３４】
すべてのプローブが三重反応物中に同等の濃度で含まれていると仮定すると、解離画像からの区画強度の分布は、0または1、ΔRFUmax、(1/3)*ΔRFUmax、(2/3)*ΔRFUmaxの強度を中心とし、ここでΔRFUは具体的にはΔRFU95-56を指す。十分に特徴づけられたアッセイにおける所与のプローブに関して、ΔRFUmaxは一貫した値であるはずであり、初期閾値は、参照データセットに基づいて区画を分類するように設定することができる。これらの閾値は次いで、手動でまたはk-meansクラスタリングなどのアルゴリズムベースの手段を用いて、さらに精緻化することができる。例えば、k-meansクラスタリングを使用するdefinetherainと称される方法は、Bio-Radシステムを使用して得られたデジタル液滴データへの適用のために、ウェブインターフェース (definetherain.org.uk) を介して第三者によって利用可能となっている。区画分類に適用することができる、種々のさらなる分類またはクラスター分析アルゴリズムが存在する。
【０１３５】
標的を含まない、または3種の標的をすべて含む区画は、前述の過程を使用して分類することができる。これらの区画はそれ以降、簡略化のためにさらなる分析（融解取得またはデータ分析）から除外することができる。さらなる分析からこれらの区画を除外することで、取得が必要なmale分析画像の数が減少して、さらには画像取得およびデータ分析に必要な時間が短縮される。しかしながら、3種の標的特異的プローブが単一のチャネル内で検出可能であり、区画が単一の標的のみを含む場合には、融解分析を使用して、区画内の特定の標的の存在を区別することができる。
【０１３６】
初期区画分類を行うために記載された方法はまた、正規化のための受動的参照色素の使用にも適用することができる。Eq 1で算出されたΔF値は、リアルタイムまたは定量的リアルタイムPCRでRnおよびΔRnが算出されるのと同じように、受動的参照色素シグナルによって正規化される。Rnは測定された蛍光と受動的参照色素蛍光の比であり、ΔRnはベースライン補正後のRnである。受動的参照色素の使用は、受動的参照色素が単一チャネルにおけるこの損失を考慮するにすぎず、チャネル間の損失は均一ではないと予測されるため、融解プロファイル作成の過程で温度依存的および光線量依存的な蛍光強度損失を考慮する必要性を排除するものではない。同様に、異なるフルオロフォアの温度依存性および光線量依存性に変動性がある可能性がある。
【０１３７】
実施例5‐一重の連続融解分析 対 不連続融解分析
一重連続分析
一重PCRを、本明細書において標的Bと称される標的に対して行い、74℃の予測Tmを有する、米国出願番号第14/822,288号に記載されているような切断可能なプローブを使用して検出した。PCRサンプルは、10mM ビス-トリスプロパン (pH 9.1)、0.3mg/mL BSA、100μM dNTP、90μM DTT、1μM Dabcyl-diGTP、10mM トリス塩基、2.5mM MgCl2、および50mM KClを含有する緩衝液中に調製した。反応物中に含めた酵素には、4XのTiTaq (Clontech) および16 mU/uLのHot Start RNase H2 (Takara) が含まれる。フォワードプライマーB（標的Bに対する）
2021511056.tif 000007
は480nMの濃度で含め、リバースプライマーB
2021511056.tif 000008
は120nMの濃度で含め、プローブB
2021511056.tif 000009
は300nMの濃度で含めた。Ultramer B
2021511056.tif 000010
は、907コピー／uLの予測濃度で含めた。アッセイが予測通りに行われたことを確実にするために、鋳型なしの対照反応物を含めたが、データは本明細書に含めていない。連続融解分析のために、製造業者の説明書に従って、QuantStudio 3D (QS3D) ローダーおよびv2デジタルPCRチップ（チップ当たり14.5μL）を使用してサンプルを複数の区画に区画化し、密封した。
【０１３８】
区画化された反応物は、以下の温度サイクリングプロトコールを使用して、ProFlexサーマルサイクラーにおいて、11°の傾斜（QS3Dマニュアルによる）でエンドポイントまで温度サイクリングを行った：96℃で10分、57℃で2分および98℃で30秒の45サイクル、ならびに最後に57℃で5分間保持。温度サイクリングに続いて、融解分析を、熱電冷却器 (TEC) および画像化装置からなるLabView制御のカスタム融解リーダーを使用して実施した。連続融解分析のために、チップを1℃刻みで60℃から90℃まで加熱し、HEXに適した励起 (511/55nM) および発光フィルタリング (549/15) を使用して、各温度で画像を取得した。画像は、カスタムソフトウェアを用いてMatlabで解析した。ハフ変換に基づく組み込み循環検出アルゴリズムを利用して個々の区画を同定し、融解プロファイルにわたって（画像に基づいて）平均強度値を決定した。一重アッセイにおいて、プローブの自己アニーリング温度で撮像されたエンドポイント画像は、区画を標的について陽性または陰性として分類するのに十分である。図11は、融解分析からの生の蛍光データ (A) と、プローブのアニーリング温度における区画当たりの平均強度のプロット (B) を示す。鋳型に関する陽性または陰性としての区画の分類およびその後の算出を、以下、数式1に適用して、平均鋳型コピー数／区画、およびひいては反応物中に存在する鋳型の濃度を決定する。この分類は、手動でまたは分類アルゴリズムを使用して行うことができる。k-means分類により、予測される907コピー／μLに対して、1,100コピー／μLという決定がもたらされる、手動での分類は、かなりの「レイン」が存在するせいで、ユーザーによって可変的な結果を生じると予測される。個々の区画の融解プロファイルを95℃で測定された平均区画強度に対して正規化することで、レインが減少し、陽性液滴と陰性液滴の手動分類が単純化される（図11. CおよびD）。この補正の影響は、実験で使用された蛍光色素がそのような減衰を示すかどうかに依存するが、融解プロファイルにわたる温度依存的または光線量依存的な蛍光減衰を考慮するために、さらなる補正を適用することができる（図11 EおよびF）。融解プロファイルの微分値を使用して、鋳型の存在を定量化することもできる。正規化融解曲線の逆微分値を算出し、融解ピークにわたって強度を積分する。区画当たりの積分区画強度を図11 GおよびHに示す。以前と同様に、反応物中に存在する鋳型コピーの数を決定するために、手動またはアルゴリズムベースの分類を適用することができる。一重の場合には、k-means分類を使用した鋳型の定量化は、融解分析とエンドポイント分析で同一であり、上記で議論された補正係数を適用することにより、907コピー／μLの予測値により近い値（1,038コピー／μL）が得られるように見えることに留意されたい。多重アッセイでは、エンドポイント画像は、所与の区画中に存在する特有の標的の数（0、1、2、または3種）を決定するのに十分なだけであり、どの特定の標的が存在するのかを同定するためには、融解分析が必要である。
【０１３９】
一重不連続分析
連続融解一重PCRについて前述された通りに、サンプル反応物を調製し、デジタル化し、温度サイクリングを行った。融解画像を、プローブの予測Tmよりも低い温度 (T1 = 67℃) およびプローブの予測Tmよりも高い温度 (T2 = 78℃) で取得し、各区画の平均強度を各温度で測定した（図12A）。画像を、95℃で取得された画像に対して正規化し（図12C）、T2/T1の比を決定した（図B）。k-meansを用いて区画を分類し、標的濃度は1,050コピー／μLであると決定された。
【０１４０】
これらの結果の比較から、不連続融解分析が十分に連続融解分析の代わりになることが明らかである。前者の場合、1,038コピー／μLに対して1,050コピー／μLというインプットコピー濃度が算出され、不連続融解解析に関してその差はわずか1.2%であった。
【０１４１】
実施例6‐多重の連続融解分析 対 不連続融解分析
多重連続融解分析
連続融解分析を用いて、サンプル中の複数の標的の存在を決定した。対応するプローブがそれぞれ63℃、74℃、および85℃のTmを有する3種の標的（A、B、およびC）を、各反応物中に含めた。サンプルおよび増幅緩衝液は、上記の通りに調製した。それぞれ標的AおよびCのためのフォワードプライマーAFおよびCF
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、リバースプライマーARおよびCR
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、ならびにプローブAPおよびCP
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を、標的Bのための前述のプライマーおよびプローブと共に、標的Bについて記載されたのと同じ濃度で含めた。同様に、2種類のさらなる鋳型（AおよびC）を含めた
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。標的Aは770コピー／μLの濃度で含め、標的Bは453コピー／μLの濃度で含め、標的Cは775コピー／μLの濃度で含めた。サンプルは、前述通りに区画化し、温度サイクリングを行い、融解させた。画像を同じカスタムソフトウェアを用いて分析し、融解温度の全範囲にわたって区画内の平均シグナル強度を決定した。図13A、C、E、およびGは、生データ (A)、95℃正規化データ、(C) 温度および蛍光減衰補正データ (E)、ならびに融解微分値 (G) の融解曲線を表す。
【０１４２】
プローブアニーリング温度で取得された融解データに基づく区画の分類によって、標的0の区画、1種の標的によって占有される区画、2種の標的によって占有される区画、および3種の標的によって占有される区画に相当する4つの別個のクラスターが同定された（図13B）。しかしながら、1種の標的によって占有される区画および2種の標的によって占有される区画の特定の標的の占有を決定するためには、融解分析が必要である。サンプル中に存在する標的Aの量を決定するために、第1融解プロファイルの積分を算出し、各区画について分類を行った（図13D）。残りの2種類の鋳型についても、同じ工程を実施した（図13FおよびH）この分析に基づいて、標的Aの測定濃度は692コピー／μLであり、標的Bは537コピー／μLであり、および標的Cは392コピー／μLであった。
【０１４３】
多重不連続融解分析
前述された通りに、サンプル反応物を調製し、デジタル化し、温度サイクリングを行った。融解画像を、T1 = 57℃、T2 = 69℃、T3 = 81℃、T4 = 93℃の4つの温度で取得し、4つの画像について各区画の平均強度を測定し（図14A）、95℃に対して正規化し（図14C）、ならびに温度依存性および光量依存性について補正した（図14E）。また、57℃の画像における全区画の1D振幅プロットも示し、これは、0、1、2、または全3種の標的を含む区画を分類するために使用することができる（図14B）。鋳型Aの濃度を決定するために、T2/T1の比を決定した（図14D）。k-meansを用いて区画を分類し、数式1を用いて標的濃度を決定した。鋳型Bについては、T3/T2の比を決定し、k-meansを用いて区画を分類し、数式1を利用した（図14F）。最後に、鋳型Cについては、T4/T3の比を決定し、k-meansを用いて区画を分類し、数式1を用いて鋳型濃度を決定した（図14G）。一重の場合に実証されたように、多重反応における不連続融解分析によって、連続融解分析で測定された濃度と実質的に同一の推定濃度が得られた。一重および多重の両方の、連続 対 不連続融解分析の、算出された標的濃度を表1に示す。
【０１４４】
（表１）単一の標的または複数の異なる標的を含む区画から、連続および不連続融解分析を使用して算出された標的濃度。
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【０１４５】
実施例7‐切断可能なプローブを使用するdPCRワークフロー
本実施例は、米国出願番号第14/823,288号に記載されているような、所定の融解プロファイルを有する標的特異的プローブ使用する、dPCR解析のための例示的なワークフローを提供する。そのようなプローブは、プローブが標的核酸と遭遇した結果として二重鎖立体構造にあるか、または一本鎖構造にあるかに基づいて、識別可能なシグナルを示す。これらのプローブに関して、最大蛍光は、プローブに結合されたフルオロフォアの結果として、標的核酸に遭遇する前の任意の温度において、または標的核酸に遭遇した後に二重鎖の所定のTmを上回る温度において、プローブに組み込まれたクエンチャーが、分子内二重鎖がこれらの温度で解離する際にフルオロフォアから分離される場合に、検出され得ることに留意されたい。このワークフローは、必ずしもこれらのプローブに限定されるものではなく、同様の標識付加スキームを有する他の種類のプローブにも適用することができる。
【０１４６】
dPCR反応のための不連続融解画像解析は、融解データの正確な解釈および陰性区画または陽性区画への区画の最適な分類を確実にするために、3つの重要な段階を必要とする：1) 測定された蛍光値を、蛍光の温度依存性の結果としての蛍光強度の変動について補正する段階；2) 測定された蛍光値を、システム依存性の蛍光変動性（例えば、光学的不均一性または区画体積の変動）について正規化する段階；および3) プローブの予め選択されたTmよりも高い予め選択された温度と、該Tmよりも低い予め選択された温度での、蛍光強度の変化を検出することにより、標的の存在を決定する段階。図15は、これらの段階を実行するための例示的なワークフローを提供する。
【０１４７】
区画化後の第一段階では、温度による蛍光強度の変動を決定するために、温度サイクリングの前に、ある範囲の温度において画像を取得する。温度は、温度サイクリング後のDMAに使用される温度に対応するように選択することができ、またはより広範な温度（例えば、DMAに使用される最低温度と最高温度の間のすべての度数）を選択することができ、または各蛍光色素に関して以前に取得された画像のセットを使用することができる。
【０１４８】
蛍光の温度依存性の補正は、いくつかの方法で、温度サイクリング後に取得された画像に適用することができる：i) 増幅前に様々な温度で区画について算出された平均強度値に対して曲線を適合させ、その式を使用して、関連する温度における増幅後画像を補正する；ii) 増幅前に、DMAに使用される温度で区画の画像を取得し、各増幅後画像を対応する増幅前画像で正規化する；iii) データの例示的なセットから、選択された温度における適切な補正式を導出し、これらを、選択された温度において増幅後に撮像された画像に適用する；およびiv) 増幅後の陰性区画に関連した強度値を使用して、陽性区画における積分強度値を補正する。この最後の例では、単一温度で取得された画像における陰性区画強度が、同じ温度で取得された増幅前画像から決定された区画強度の代わりになる。好ましい態様においては、(ii) に記載される方法が、システム依存性の蛍光変動性について画像を同時に正規化する利点を提供するという理由で、この方法が使用される。別の態様においては、蛍光の温度依存性の補正が行われ、続いて、増幅前に撮像された任意の画像を用いる正規化が行われる。同様に、増幅後に95℃で取得され、温度依存的な蛍光変動について補正された画像を、正規化のために使用することができる。ROXなどの受動的参照色素について取得された画像を、正規化のために代用することも可能である。
【０１４９】
画像が上述のように補正され正規化された後、各プローブの所定のTmよりも低い温度と高い温度において取得された画像からの蛍光強度の比較を行って、標的が存在するかどうかを決定することができる。当業者は、強度の比較が、異なる温度で取得された強度測定値の比または差を算出することを伴い得ることを認識するであろう。加えて、当業者は、検出された強度値、または関心対象の各領域の積分強度もしくは平均強度を使用して、算出を行うことができることを認識するであろう。いずれにしても、調べた各標的に関して、結果は、各区画について、陽性区画または陰性区画の2群のうちの1つにクラスター化されると予測される。多重化シナリオでは、いくつかの区画は複数の標的を含むため、陽性区画の多重カテゴリーが予測され得る。このクラスター化により、陽性区画と陰性区画を区別するための閾値が、手動でまたは分類アルゴリズムを使用して決定され得るはずである。特に、様々な温度で取得された増幅前画像は、陰性区画の予測強度（平均値および標準偏差を含む）周りの統計を確立するのに役立つはずである。
【０１５０】
本明細書に開示され特許請求された方法の全ては、本開示に照らして過度の実験をすることなく実施および達成され得る。本発明の組成物および方法は、好ましい態様に関して記載されているが、当業者には、本発明の概念、精神および範囲から逸脱することなく、本方法に対して、および本明細書に記載された方法の段階または該段階の順序において、変形を適用することができることは明らかであろう。より具体的には、化学的にも生理学的にも関連する特定の薬剤は、同じまたは類似の結果を達成しつつ、本明細書に記載の薬剤と置き換えて使用できることが明らかであろう。当業者には明らかなこのような類似の置換および修飾は全て、添付の特許請求の範囲によって規定される本発明の精神、範囲および概念の範囲内であるとみなされる。
【０１５１】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されたものに補足的な例示的手順または他の詳細を提供する程度に、参照により本明細書に具体的に組み入れられる。
公開出願WO 2015023616 (Yang et al.)
Velez, et al., Scientific Reports, 7 (2017): 42326,
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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