(57)【要約】本発明は、（ｉ）シアル化ペプチドおよび捕捉部位を含むインジケータ分子、（ｉｉ）捕捉分子を含む捕捉ゾーン、ならびに（ｉｉｉ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体と結合することができる結合分子を含むシアリダーゼ酵素活性検出キットまたはデバイスを提供する。このキットまたはデバイスを使用する方法、ならびに特異的インジケータ分子および特異的結合分子も提供される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物であって、前記デバイス、キット、または組成物は、
（ｉ）インジケータ分子であって、
（ａ）以下の配列を含むペプチドであって、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−Ｘ４−Ｘ５（配列番号１７）
式中、
Ｓｉａｌは、シアリル基であり、
Ｘ３は、グリコシル受容体基を含むアミノ酸であり、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、またはホスホセリン（ＳＥＰ）から選択され、好ましくはＸ３は、Ｓｅｒであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は、任意のアミノ酸から独立して選択され、ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたは３つはＤ−アミノ酸および／または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸である、ペプチド、ならびに
ｂ）前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断後も無傷のままである、捕捉部位を含む、インジケータ分子と、
（ｉｉ）前記試験試料を受容する捕捉ゾーンであって、前記捕捉ゾーンは、前記インジケータ分子を固定化するために、前記インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、前記インジケータ分子の前記捕捉部位と結合することができる捕捉分子を含む、捕捉ゾーンと、
（ｉｉｉ）前記インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子であって、前記結合分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、前記結合分子が前記インジケータ分子に結合することができない、結合分子と、を含む、デバイス、キット、または組成物。
【請求項２】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、Ａｌａであり、好ましくは、Ｘ１およびＸ２は、共にＡｌａであり、および／または好ましくはＡｌａは、ＤＡｌａまたはβＡｌａである、請求項１に記載のデバイス、キット、または組成物。
【請求項３】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、荷電アミノ酸であり、任意選択的に、各荷電アミノ酸は、Ａｒｇ、ＤＡｓｐ、およびＬＯｒｎから選択される、請求項１〜２のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
【請求項４】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、極性アミノ酸であり、任意選択的に、各極性アミノ酸は、ＬＳｅｒ、ＤＳｅｒ、およびＴｈｒから選択される、請求項１〜３のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
【請求項５】
前記ペプチドは、以下の配列を含み、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０（配列番号１０）
式中、
Ｓｉａｌは、シアリル基であり、
Ｘ１は、存在しないか、またはＴｈｒであり、
Ｘ２は、存在しないか、またはＤＡｌａであり、
Ｘ３は、存在しないか、またはＮｌｅであり、
Ｘ４は、存在しないか、またはＧｌｕであり、
Ｘ５は、存在しないか、またはＤＡｌａであり、
Ｘ６は、存在しないか、またはＡｒｇであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｎｖａ、βＡｌａから選択され、
Ｘ８は、存在しないか、またはＤＳｅｒ、ＤＡｌａ、ＳＥＰ、Ｃｙｃから選択され、
Ｘ９は、存在しないか、またはＮｖａ、ＢＩＰ、ＤＡｌａ、βＡｌａ、Ｏｒｎから選択され、
Ｘ１０は、Ｃｙｃ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、ＤＡｌａ、ＤＳｅｒから選択され、
Ｘ１１は、ＤＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｏｒｎ、Ｎｌｅから選択され、
Ｘ１２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、またはＳＥＰから選択され、好ましくはＳｅｒであり、
Ｘ１３は、ＤＡｌａ、ＢＩＰ、βＡｌａから選択され、
Ｘ１４は、Ａｒｇ、ＤＡｓｐ、Ｎｌｅ、Ｏｒｎ、Ｎｖａから選択され、
Ｘ１５は、存在しないか、またはＰｈｅ、ＢＩＰ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＤＡｌａ、ＤＳｅｒから選択され、
Ｘ１６は、存在しないか、またはＤＳｅｒ、Ｇｌｕから選択され、
Ｘ１７は、存在しないか、またはＶａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒから選択され、
Ｘ１８は、存在しないか、またはＣｈａであり、
Ｘ１９は、存在しないか、またはＤＳｅｒであり、
Ｘ２０は、存在しないか、またはＶａｌである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
【請求項６】
前記ペプチドは、以下の配列を含むか、以下の配列から本質的になるか、または以下の配列からなる、請求項１〜５のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
（ｉ）Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ（配列番号１１）
（ｉｉ）Ｇｌｕ−ＤＳｅｒ−Ｎｖａ−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１２）
（ｉｉｉ）Ａｒｇ−ＤＡｌａ−ＢＩＰ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−ＤＡｓｐ−Ｓｅｒ（配列番号１３）
（ｉｖ）Ｓｅｒ−ＳＥＰ−ＤＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｏｒｎ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ（配列番号１４）、
（ｖ）ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−βＡｌａ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＢＩＰ−Ｏｒｎ−ＤＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１５）、または
（ｖｉ）Ｔｈｒ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−βＡｌａ−Ｃｙｃ−Ｏｒｎ−ＤＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−βＡｌａ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｃｈａ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１６）
【請求項７】
前記ペプチドは、１つ以上の特異的シアリダーゼによる切断のためにバイアスされ、任意選択的に、前記１つ以上の特異的シアリダーゼは、細菌起源であり、任意選択的に、前記細菌は、プレボテラ、バクテロイデス、および／もしくはモビルンカス種および／またはガードネレラ・バギナリスである、請求項１〜６のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
【請求項８】
前記結合分子は、請求項６で定義される前記ペプチドの前記脱シアル化型に特異的であり、好ましくはペプチドモチーフＣｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇに存在し、かつ対応するシアル化ペプチドモチーフＣｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇに存在しないか、または潜在する、エピトープに特異的である、請求項１〜７のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
【請求項９】
前記結合分子は、３つのＣＤＲを有する重鎖および３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する抗体であり、前記重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１を有し、前記重鎖ＣＤＲ２は、配列番号２を有し、重鎖ＣＤＲ３は、配列番号３を有し、前記軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号４を有し、前記軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号５を有し、前記軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号６を有し、好ましくは前記重鎖は、配列番号７を有し、および／または前記軽鎖は、配列番号８を有する、請求項１〜８のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
【請求項１０】
前記結合分子は、レポータ分子、好ましくは金粒子で標識されている、請求項１〜９のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
【請求項１１】
前記インジケータ分子の前記捕捉部位は、ビオチン分子もしくはオキシム部分を含むか、ビオチン分子もしくはオキシム部分から本質的になるか、またはビオチン分子もしくはオキシム部分からなり、かつ／または前記ペプチドのＮ末端もしくはＣ末端にある、請求項１〜１０のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
【請求項１２】
前記インジケータ分子の前記捕捉部位は、リンカーによって前記ペプチドに結合され、任意選択的に、前記リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含み、任意選択的に、前記ペプチドは、ポリエチレングリコール部分を含むか、ポリエチレングリコール部分から本質的になるか、またはポリエチレングリコールからなる、リンカーを介して、そのＮ末端またはＣ末端でビオチン基に結合されている、請求項１〜１１のいずれか一項に記載のデバイス、キットまたは組成物。
【請求項１３】
前記インジケータ分子は、以下の構造を含むか、以下の構造から本質的になるか、または以下の構造からなる、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
（ｉ）Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−ビオチン
（ｉｉ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−ＤＳｅｒ−Ｎｖａ−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ
（ｉｉｉ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−ＤＡｌａ−ＢＩＰ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−ＤＡｓｐ−Ｓｅｒ
（ｉｖ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（ＰＯ３）−ＤＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｏｒｎ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ
（ｖ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−βＡｌａ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＢＩＰ−Ｏｒｎ−ＤＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、または
（ｖｉ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−βＡｌａ−Ｃｙｃ−Ｏｒｎ−ＤＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−βＡｌａ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｃｈａ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ
【請求項１４】
前記インジケータ分子は、（ｉ）前記配列Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇを含むか、前記配列から本質的になるか、または前記配列からなる、ペプチドと、（ｉｉ）ポリエチレングリコール部分を含むか、ポリエチレングリコール部分から本質的になるか、またはポリエチレングリコール部分からなる、リンカーを介して、前記ペプチドのＮ末端またはＣ末端と任意選択的に結合される、ビオチン分子もしくはオキシム部分を含むか、ビオチン分子もしくはオキシム部分から本質的になるか、またはビオチン分子もしくはオキシム部分からなる、捕捉部位と、を含み、前記結合分子は、請求項８または９で定義される抗体であり、好ましくは、レポータ分子、最も好ましくは金粒子によって標識されている、請求項１〜１３のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物。
【請求項１５】
（ｉ）請求項１〜７のいずれか一項で定義されるペプチドの前記脱シアル化誘導体に、または（ｉｉ）請求項１〜７もしくは１１〜１４のいずれか一項で定義されるインジケータ分子に、特異的に結合することができる抗体であって、前記抗体は、シアル化ペプチドまたはインジケータ分子よりも前記脱シアル化誘導体に優先的に結合する、抗体。
【請求項１６】
前記抗体は、請求項８、９、および／または１０で定義される通りである、請求項１５に記載の抗体。
【請求項１７】
シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出する際における使用に適したインジケータ分子であって、前記インジケータ分子が、
ａ）請求項１〜７のいずれか一項で定義されるペプチドと、
ｂ）前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断後も無傷のままである捕捉部位と、を含み、前記インジケータ分子が、好ましくは、請求項１〜７または１１〜１４のいずれか一項で定義される通りである、インジケータ分子。
【請求項１８】
前記インジケータ分子は、請求項１３で定義される通りである、請求項１７に記載のインジケータ分子。
【請求項１９】
以下の配列を含むか、以下の配列から本質的になるか、または以下の配列からなる、ペプチドであって、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−Ｘ４−Ｘ５
式中、
Ｓｉａｌは、シアリル基であり、
Ｘ３は、グリコシル受容体基を含むアミノ酸であり、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、またはホスホセリン（ＳＥＰ）から選択され、好ましくはＸ３は、Ｓｅｒであり、
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は、任意のアミノ酸から独立して選択され、ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つ、好ましくは少なくとも２つまたは３つは、Ｄ−アミノ酸および／または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸であり、前記ペプチドは、好ましくは請求項１〜７のいずれか一項で定義される通りである、ペプチド。
【請求項２０】
前記ペプチドは、請求項６で定義される通りであり、好ましくは、前記配列Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇを含むか、前記配列から本質的になるか、または前記配列からなる、ペプチドである、請求項１９に記載のペプチド。
【請求項２１】
請求項１５または１６に記載の抗体を生成する際における使用のためのペプチドであって、前記ペプチドは、請求項１〜７のいずれか一項で定義される前記ペプチドの脱シアル化誘導体である、ペプチド。
【請求項２２】
シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在または不存在を検出するための方法であって、前記方法は、
（ｉ）請求項１〜７または１１〜１４のいずれか一項で定義されるインジケータ分子を前記試験試料と接触させる工程と、
（ｉｉ）前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を、前記試験試料に添加する工程であって、前記結合分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、前記インジケータ分子に結合することができず、前記結合分子は、好ましくは請求項８、９、および／または１０で定義される通りである工程、および
（ｉｉｉ）捕捉ゾーンにおける捕捉分子の前記捕捉部位への結合によって、前記捕捉ゾーンにおいて、前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、前記捕捉分子は、前記インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、前記捕捉部位に結合することができる工程、および
（ｉｖ）前記捕捉ゾーンにおいて捕捉された前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体への前記結合分子の結合を判定することによって、前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断を検出する工程を含む、方法。
【請求項２３】
シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在または不存在を検出するための方法であって、前記方法は、
（ｉ）捕捉分子を含む捕捉ゾーンに前記試験試料を添加する工程であって、前記捕捉分子は、請求項１〜７または１１〜１４のいずれか一項で定義されるインジケータ分子の前記捕捉部位に結合され、前記捕捉分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生しているかいないかに関わらず、前記捕捉部位に結合されたままである工程、
（ｉｉ）前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を添加する工程であって、前記結合分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、前記インジケータ分子に結合することができず、前記結合分子は、好ましくは請求項８、９、および／または１０で定義される通りである工程、および
（ｉｉｉ）前記捕捉ゾーンにおいて捕捉された前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体への前記結合分子の結合を判定することによって、前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断を検出する工程を含む、方法。
【請求項２４】
試験試料において細菌性膣炎を、前記試料中のシアリダーゼ酵素の切断活性を検出することによって診断するための方法であって、前記方法は、
（ｉ）請求項１〜７または１１〜１４のいずれか一項で定義されるインジケータ分子を前記試験試料と接触させる工程、
（ｉｉ）前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を、前記試験試料に添加する工程であって、前記結合分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、前記インジケータ分子に結合することができず、前記結合分子は、好ましくは請求項８、９、および／または１０で定義される通りである工程、
（ｉｉｉ）捕捉ゾーンにおける捕捉分子の前記捕捉部位への結合によって、前記捕捉ゾーンにおいて、前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、前記捕捉分子は、前記インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、前記捕捉部位に結合することができる工程、および
（ｉｖ）前記捕捉ゾーンにおいて捕捉された前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体への前記結合分子の結合を判定することによって、前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断を検出する工程であって、コントロールと比較して切断の増加したレベルが細菌性膣炎を診断する工程を含む、方法。
【請求項２５】
シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出キットであって、前記キットは、
（ｉ）請求項１〜７のいずれか一項で定義されるインジケータ分子であって、前記インジケータ分子は、好ましくは担体上に凍結乾燥されている、インジケータ分子と、
（ｉｉ）前記インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、前記インジケータ分子の前記捕捉部位に結合することができる捕捉分子であって、前記捕捉分子が好ましくはストレプトアビジンを含む、捕捉分子と、
（ｉｉｉ）前記捕捉分子を付着させることができるか、または付着させて、前記試験試料を受容するための捕捉ゾーンを形成する固体支持体であって、前記固相支持体が好ましくはニトロセルロースを含む、固相支持体と、
（ｉｖ）前記インジケータ分子の前記脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子であって、前記結合分子は、前記試料中に存在するシアリダーゼ酵素による前記インジケータ分子からの前記シアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、前記インジケータ分子に結合することができず、前記結合分子は、好ましくは請求項８、９、および／または１０で定義される通りである、結合分子と、任意選択的に、
（ｖ）抽出チューブおよび／もしくは緩衝剤と、ならびに／または
（ｖｉ）コントロール検出分子およびコントロール検出結合物質と、を含む、酵素検出キット。
【請求項２６】
試験試料において細菌性膣炎を診断するための、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物、請求項２２〜２４のいずれか一項に記載の方法、あるいは請求項２５に記載の酵素検出キットの、使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、シアリダーゼ酵素の切断活性の検出、および細菌性膣炎の検出におけるその使用に関する。特に、本発明は、シアリダーゼ酵素の切断活性を検出するために有用な特異的に設計されたペプチドおよびインジケータ分子を提供する。本発明の他の様々な態様は、本発明のインジケータ分子を切断することができるシアリダーゼ酵素の活性の試験試料における存在を検出または測定するための酵素検出デバイス、キット、方法、および使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
シアリダーゼ酵素（別名ノイラミニダーゼ）は、エキソまたはエンド（ポリ−）シアル酸を切断する２つの主要なクラスに分けられるグリコシド加水分解酵素（それぞれＥＣ３．２．１．１８およびＥＣ３．２．１．１２９）である。シアル酸は、ノイラミン酸のＮ−またはＯ−置換誘導体である（以下に示す）。
【化１】
2021531763.tif 000002
【０００３】
シアル酸は一般に、糖タンパク質および糖脂質（特にガングリオシド）で自然界に認められる。ウイルス、細菌、および哺乳類のシアリダーゼはすべて自然界で知られている。細菌性シアリダーゼ活性のレベルの上昇は、細菌性膣炎（ＢＶ）の診断マーカーとして機能することが知られている（Ｂｒｉｓｅｌｄｅｎ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１９９２，ｖｏｌ．３０，ｐａｇｅｓ  ６６３−６６６）。この背後にある理論は、膣内で発生する可能性のある細菌の不均衡、および乳酸桿菌の多い典型的な健康環境から嫌気的に進められるマイクロバイオームへの移行に基づいている（Ｐｅｔｒｏｖａ  ｅｔ．ａｌ．，Ｆｒｏｎｔ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，２０１５，６：８１）。特定の嫌気性菌はシアリダーゼ酵素を分泌し、膣における本来の天然粘液バリアを危険にさらす。それでもなお、ＢＶの正確なメカニズムがさらに完全に確立されるべきである。症候性ＢＶに苦しむ患者は、著しい不快感、膣分泌物、不快な臭い、より一般的にはそれらの膣の健康を管理できないという感覚を経験し得る（Ｂｉｌａｒｄｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，２０１３，ｖｏｌ．８，ｅ７４３７８）。治療経路には通常、局所または経口抗生物質が含まれる。局所プレバイオティクス治療（例えば、ＶＨ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｓ（登録商標））、およびｐＨジェル（例えば、バランスアクティブＢＶ）も店頭で入手できる。ＢＶは難治性であり、患者は抗生物質治療後に再発し得る（Ｂｉｌａｒｄｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ，２０１３，ｖｏｌ．８，ｅ７４３７８）。難治性の症例のうちのいくつかは、膣内におけるバイオフィルムの形成に関連していると考えられる（Ｖｅｒｓｔｒａｅｌｅｎ  ＆  Ｓｗｉｄｓｉｎｓｋｉ，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，２０１３，２６：８６−８９）。ＢＶの存在を認識しないことのリスクは、性感染症（ＨＩＶを含む）に対するより高い感受性および、早産に関連したリスクである。早産のリスクは、子宮頸管粘液バリアの未熟な弱体化に関連していると考えられる（Ｌｅｗｉｓ  ｅｔ．ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２０１３，ｖｏｌ．２８８，ｐａｇｅｓ  １２０６７−１２０７９）。現在診療所では、ＢＶの検査は、検査所での分析のために送られる膣試料塗抹標本に基づいている。分析の方法には、手がかりとなる細胞の調査、水酸化カリウム（ＫＯＨ）臭気試験、またはニュージェントスコアなどの設定基準の適用が含まれる（Ｎａｓｈ，Ｊｕｎｇｍａｎｎ，＆Ｇｕｂｅｒｔ，ＢＭＪ  Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２０１５，１−２９）。ポイントオブケアでの迅速検査の使用は、迅速な回答を引き渡し、それらを即時の治療計画に加え、結果を伝えるための全体的なプロセスをスピードアップすることによって、患者に利益をもたらす。同様に、検査所への外部委託および関連する資源と時間費用を回避して、患者の時間を最初の段階における１回の診察に抑えることによって、医療提供者に潜在的な利点がある。
【０００４】
ＢＶを診断するための製品の２つの主なタイプが、現在、米国および欧州で入手可能である。製品の１つのセットは、ｐＨを測定する、色が変化するスワブに基づいている。他の製品セットも比色分析であり、シアリダーゼ活性測定に基づいている。ｐＨベースの製品は、ポイントオブケアで利用でき、かつ店頭で入手でき、ＶＳ−ＳＥＮＳＥ  ＰＲＯ（登録商標）（Ｃｏｍｍｏｎ  Ｓｅｎｓｅが販売）およびＣａｎｅｓｔｅｓｔ（登録商標）（Ｃａｎｅｓｔｅｎが販売）が含まれる。シアリダーゼ検出に基づく、現在販売されている主な製品は、ＢＶ  Ｂｌｕｅ（Ｓｅｋｉｓｕｉ  ＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓおよびＧｒｙｐｈｕｓ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓが販売）である。ＢＶ  Ｂｌｕｅはスワブベースの試験であり、試料スワブをインジケータ溶液に入れ、色を変化させて試料におけるシアリダーゼ活性の存在を示す。試験は、実行するのに約１５分かかる。
【０００５】
様々な条件が膣の局所ｐＨに変化を引き起こし得るため、ｐＨベースの試験は精度に欠ける（例えば、ＢＶだけでなくカンジダ症およびトリコノマス症）。シアリダーゼ活性を検出するＢＶ  Ｂｌｕｅなどの既知の試験は感度が不足している。
【発明を実施するための形態】
【０００６】
本発明は、シアリダーゼ活性検出の感度および／または特異性を改善する試みからの結果である。本発明者らは現在、シアリダーゼ酵素の切断活性を検出するために有用なペプチドおよび対応するインジケータ分子を特異的に設計している。本明細書でさらに説明されるように、各ペプチドは、ガラクトシル基を介してシアリル基に結合され（したがって、シアリダーゼ酵素の基質として機能する）、ペプチド構造は特異的に設計され、そのため、シアリル基が試料中に存在する１つ以上のシアリダーゼ酵素によってペプチドから切断されると、ペプチドの脱シアル化誘導体が特異的な結合分子（例えば、抗体）によって認識および結合される。好ましい実施形態では、ペプチドは、プロテアーゼ切断に対するペプチドの耐性を増強する１つ以上のアミノ酸を組み込む。
【０００７】
したがって、一態様では、本発明は、以下の式による配列を含むペプチドを提供し、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−Ｘ４−Ｘ５
（式Ｉ）（配列番号９）
式中、
（ｉ）Ｓｉａｌは、シアリル基であり、
（ｉｉ）Ｘ３は、グリコシル受容体基を含む天然または非天然アミノ酸であり、
（ｉｉｉ）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は、任意のアミノ酸から独立して選択され、ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、Ｄ−アミノ酸および／または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸である。
【０００８】
ペプチドは、式Ｉの配列から本質的になるか、または、式Ｉの配列からなり得る。
【０００９】
本発明のすべての態様によれば、「シアリル基」とは、シアル酸置換基を意味し、シアル酸はノイラミン酸のＮ−またはＯ−置換誘導体（例えば、Ｎ−アセチルノイラミン酸：「Ｎｅｕ５Ａｃ」または「ＮＡＮＡ」と呼ばれる）である。
【００１０】
本発明のすべての態様によれば、「Ｇａｌ」とは、ガラクトシル置換基を意味する。好ましい実施形態では、ガラクトシル置換基は、以下の構造のラジカルである。
【化２】
2021531763.tif 000003
【００１１】
特定の実施形態では、ガラクトシル置換基は、β−ガラクトースのラジカルである。そのような実施形態では、ガラクトシル置換基は、シアリル基にＯ結合している。すべての可能な位置異性体は本発明によって包含される。当業者はまた、例えば、グルコース、フルクトース、ラクトース、マルトース、およびスクロースのラジカルなどの他の糖類がガラクトシル基の代わりに使用され得ることを理解するであろう。したがって、本明細書における「ガラクトシル置換基」への言及は、それに応じて解釈されるべきである。
【００１２】
−Ｇａｌ−Ｓｉａｌ基は、上記のようにＸ３に結合しており、Ｘ３は、グリコシル受容体基を含む天然または非天然アミノ酸である。すなわち、Ｘ３によって表されるアミノ酸の側鎖は、Ｇａｌ置換基（すなわち、グリコシル供与体）と結合を形成する求核性置換基を含む。例えば、求核性置換基は、ヒドロキシルまたはアミン置換基であり得る。したがって、特定の実施形態では、Ｘ３は、セリン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、ヒドロキシリジン（Ｈｙｌ）、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、アルギニン（Ａｒｇ）、およびホスホセリン（ＳＥＰ）から選択され得る。好ましい実施形態では、Ｘ３はＳｅｒである。
【００１３】
式Ｉから、−Ｇａｌ−Ｓｉａｌ基はＸ３にのみ結合していることが理解される（式Ｉで角括弧によって示される）。これは、Ｘ３をＸ４に架橋しない。誤解を避けるために、代替的なおよび同等の式（Ｉａ）を以下に示す。
【化３】
2021531763.tif 000004
【００１４】
したがって、−Ｇａｌ−Ｓｉａｌ基はペプチド骨格から分岐している。したがって、−Ｇａｌ置換基は構造の中央に配置され、そのため、それは、アミノ酸Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５によって側面に位置される。その結果、本明細書でさらに説明されるように、結合分子（例えば、抗体）は、各ペプチドの脱シアル化誘導体に対して非常に高い親和性および特異性で生成され得、Ｇａｌ置換基との相互作用を欠く周辺結合分子（例えば、抗体）の生成は最小限にされる。
【００１５】
Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は、任意のアミノ酸（天然および非天然）から独立して選択され、ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、Ｄ−アミノ酸および／または（ｉ）非標準アミノ酸または（ｉｉ）非天然アミノ酸である。非標準および非天然アミノ酸は、配列の多様性を増し、ペプチドの脱シアル化誘導体に対して高い親和性を有する抗体である結合分子を生成するときに、宿主生物における免疫応答を促進するのに役立つ。Ｄ−アミノ酸はプロテアーゼに対する感受性を低減するのに役立つ。特定の実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５の少なくとも２つ、３つ、または４つすべては、Ｄアミノ酸および／または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸である。
【００１６】
当業者は、「天然」および「非天然」アミノ酸という用語に非常に精通しているであろう。誤解を避けるために、「天然」アミノ酸は自然界に認められるものであり、標準アミノ酸および非標準アミノ酸の両方を含む。当技術分野で知られているように、標準アミノ酸は、普遍的な遺伝暗号におけるトリプレットコドンによって直接的にコードされるものである。逆に、非標準アミノ酸は、自然界に認められるが、普遍的な遺伝暗号においてトリプレットコドンによって直接的にコードされていないアミノ酸である。「非天然」アミノ酸は、自然界には認められず、人工合成によってのみ存在するものである。本明細書で使用される場合、「Ｄ」または「Ｌ」の接頭辞のない名称によるアミノ酸の言及は、ＤおよびＬの両方の立体異性体を意味するために使用される。「Ｄ」または「Ｌ」の接頭辞の使用は、その特定の立体異性体を示す。
【００１７】
ペプチドまたはインジケータ分子の「脱シアル化誘導体」は、ペプチドまたはインジケータ分子からのシアリル基の切断によって、典型的にはシアリダーゼ酵素によって、生成される生成物である。したがって、ペプチドまたはインジケータ分子の「脱シアル化誘導体」は、典型的には、シアリル化したペプチドまたはインジケータ分子とは、シアリル基の存在しないことに関してのみ、またはほとんど存在しないことに関してのみ異なる。したがって、本明細書におけるペプチドまたはインジケータ分子の「脱シアル化誘導体」への言及は、そのペプチドまたはインジケータ分子の脱シアル化型を意味すると理解されるべきである。
【００１８】
ペプチド配列トポロジーの多様性をさらに高めることは、各ペプチドの脱シアル化誘導体に対して非常に高い親和性および特異性を有する結合分子の生成をさらに促進することが示されているため、有益である。これは、抗体である結合分子に特に関連している。したがって、好ましい実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は、少なくとも２つ、３つ、または４つの異なるアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、疎水性アミノ酸である。例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、アラニン（Ａｌａ）、バリン（Ｖａｌ）、イソロイシン（Ｉｌｅ）、ロイシン（Ｌｅｕ）、メチオニン（Ｍｅｔ）、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）、チロシン（Ｔｙｒ）、トリプトファン（Ｔｒｐ）、プロリン（Ｐｒｏ）、Ｄ−アラニン（ＤＡｌａ）、１−アミノシクロヘキサン−カルボン酸（Ｃｙｃ）、β−アラニン（βＡｌａ）、ノルロイシン（Ｎｌｅ）、ノルバリン（Ｎｖａ）、２’−（アミノメチル）ビフェニル−２−カルボン酸（Ｂｉｐ）、およびシクロヘキシルアラニン（Ｃｈａ）から選択され得る。好ましくは、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、およびＣｈａのＬ−立体異性体が使用される。さらなる実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも２つまたは３つは、疎水性アミノ酸である。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５の４つのすべては、疎水性アミノ酸であり得、ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、Ｄ−アミノ酸および／または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸である。特定の実施形態では、少なくとも１つの疎水性アミノ酸は、Ａｌａである。さらなる実施形態では、Ｘ１およびＸ２は、両方ともＡｌａである。好ましい実施形態では、Ａｌａは、ＤＡｌａまたはβＡｌａである。さらなる実施形態では、各疎水性アミノ酸は、ＤＡｌａ、βＡｌａ、Ｉｌｅ、Ｖａｌ、Ｐｒｏ、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｃｙｃ、Ｃｈａ、およびＢｉｐから選択される。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、荷電アミノ酸である。例えば、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、アルギニン（Ａｒｇ）、ヒスチジン（Ｈｉｓ）、リジン（Ｌｙｓ）、アスパラギン酸（Ａｓｐ）、グルタミン酸（Ｇｌｕ）、オルニチン（Ｏｒｎ）、およびホスホセリン（ＳＥＰ）から選択され得る。好ましくは、ＯｒｎのＬ−立体異性体およびＡｓｐのＤ−立体異性体が使用される。さらなる実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも２つまたは３つは、荷電アミノ酸である。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの４つのすべては、荷電アミノ酸であり得、ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、Ｄ−アミノ酸および／または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸である。特定の実施形態では、各荷電アミノ酸は、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、ＤＡｓｐ、ＬＯｒｎ、およびＳＥＰから選択される。追加的または代替的に、いくつかの実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、極性アミノ酸である。たとえば、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、セ���ン（Ｓｅｒ）、スレオニン（Ｔｈｒ）、チロシン（Ｔｙｒ）、アスパラギン（Ａｓｎ）、グルタミン（Ｇｌｎ）、およびシステイン（Ｃｙｓ）から選択され得る。好ましくは、ＳｅｒのＤ−立体異性体が使用される。さらなる実施形態では、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも２つまたは３つは、極性アミノ酸である。Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５の４つのすべては、極性アミノ酸であり得、ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、Ｄ−アミノ酸および／または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸である。特定の実施形態では、各極性アミノ酸は、ＬＳｅｒ、ＤＳｅｒ、およびＴｈｒから選択される。好ましい実施形態では、ペプチド配列トポロジーの多様性を最大にするために、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は、疎水性、荷電、および極性アミノ酸の組み合わせである。特に、ＰｒｏおよびβＡｌａは、「ヒンジ基」としてのこれらの機能が、全体的な構造的折り畳みにおけるさらなる自由度を可能にし、それによってペプチド配列トポロジーの多様性をさらに増加させるため、本発明のペプチドにおいて有用である。
【００１９】
好ましい実施形態では、ペプチドは５０００ダルトン未満の分子量を有する。これは、ペプチドの脱シアル化誘導体に結合する抗体の生成のために、宿主生物における免疫応答の刺激を促進にする。したがって、特定の実施形態では、ペプチドは、長さが５〜２０個のアミノ酸、より好ましくは、長さが９〜２０個のアミノ酸であり得る。
【００２０】
したがって、関連する態様では、本発明は、以下の式による配列を含むペプチドを提供し、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０
（式ＩＩ）（配列番号：１０）
式中、
Ｓｉａｌは、シアリル基であり、
Ｘ１は、存在しないか、またはＴｈｒであり、
Ｘ２は、存在しないか、またはＤＡｌａであり、
Ｘ３は、存在しないか、またはＮｌｅであり、
Ｘ４は、存在しないか、またはＧｌｕであり、
Ｘ５は、存在しないか、またはＤＡｌａであり、
Ｘ６は、存在しないか、またはＡｒｇであり、
Ｘ７は、存在しないか、またはＧｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｎｖａ、βＡｌａから選択され、
Ｘ８は、存在しないか、またはＤＳｅｒ、ＤＡｌａ、ＳＥＰ、Ｃｙｃから選択され、
Ｘ９は、存在しないか、またはＮｖａ、ＢＩＰ、ＤＡｌａ、βＡｌａ、Ｏｒｎから選択され、
Ｘ１０は、Ｃｙｃ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、ＤＡｌａ、ＤＳｅｒから選択され、
Ｘ１１は、ＤＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｏｒｎ、Ｎｌｅから選択され、
Ｘ１２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、またはＳＥＰから選択され、
Ｘ１３は、ＤＡｌａ、ＢＩＰ、βＡｌａから選択され、
Ｘ１４は、Ａｒｇ、ＤＡｓｐ、Ｎｌｅ、Ｏｒｎ、Ｎｖａから選択され、
Ｘ１５は、存在しないか、またはＰｈｅ、ＢＩＰ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＤＡｌａ、ＤＳｅｒから選択され、
Ｘ１６は、存在しないか、またはＤＳｅｒ、Ｇｌｕから選択され、
Ｘ１７は、存在しないか、またはＶａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒから選択され、
Ｘ１８は、存在しないか、またはＣｈａであり、
Ｘ１９は、存在しないか、またはＤＳｅｒであり、
Ｘ２０は、存在しないか、またはＶａｌである。
【００２１】
式ＩＩから、−Ｇａｌ−Ｓｉａｌ基は、Ｘ１２にのみに結合していることが理解される（式ＩＩで角括弧によって示される）。これは、Ｘ１２をＸ１３に架橋しない。誤解を避けるために、代替的なおよび同等の式（ＩＩａ）を以下に示す。
【化４】
2021531763.tif 000005
【００２２】
したがって、−Ｇａｌ−Ｓｉａｌ基はペプチド骨格から分岐している。したがって、−Ｇａｌ置換基は、それがアミノ酸Ｘ１０〜１１およびＸ１３〜１４、ならびにアミノ酸Ｘ１〜９およびＸ１５〜２０（存在する場合）によって側面に位置されるように配置されている。その結果、本明細書でさらに説明されるように、結合分子（例えば、抗体）は、各ペプチドの脱シアル化誘導体に対して非常に高い親和性および特異性で生成され得、Ｇａｌ置換基との相互作用を欠く周辺結合分子（例えば、抗体）の生成は最小限にされる。
【００２３】
好ましい実施形態では、Ｘ１２はＳｅｒである。
【００２４】
特定の実施形態では、本発明のすべての態様によれば、ペプチドは、以下の配列を含むか、以下の配列から本質的になるか、または以下の配列からなり、
（ｉ）Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ（配列番号１１）
（ｉｉ）Ｇｌｕ−ＤＳｅｒ−Ｎｖａ−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１２）
（ｉｉｉ）Ａｒｇ−ＤＡｌａ−Ｂｉｐ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−ＤＡｓｐ−Ｓｅｒ（配列番号１３）
（ｉｖ）Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（ＰＯ３）−ＤＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｏｒｎ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ（配列番号１４）
（ｖ）ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−βＡｌａ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−Ｂｉｐ−Ｏｒｎ−ＤＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１５）、または
（ｖｉ）Ｔｈｒ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−βＡｌａ−Ｃｙｃ−Ｏｒｎ−ＤＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−βＡｌａ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｃｈａ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１６）、
それらのなかで、Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇが特に好ましい。
【００２５】
これらの特定のペプチドは、シアリダーゼ活性を検出するために特に有用であることが本発明者らによって見出されており、実施例のセクションでさらに説明されている。
【００２６】
好ましくは、Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｒｎ、および／またはＣｈａ（存在するとき）は、それぞれＬＮｌｅ、ＬＮｖａ、ＬＯｒｎ、およびＬＣｈａである。
【００２７】
いくつかの実施形態では、−Ｇａｌ  Ｓｉａｌ基の側面に位置するアミノ酸が切断の特異性および感度を確実にするように応じてペプチドを構築することによって、ペプチドは１つ以上の特定のシアリダーゼによる切断のためにバイアスされる。したがって、特定のシアリダーゼ酵素は、ペプチドに対して異なる親和性を有する可能性がある。これによって、試験試料における特定のシアリダーゼ活性を検出するために、本発明を利用することが可能になる。本明細書で説明されるように、本発明のペプチドは、細菌性膣炎を検出するために特に有用である。したがって、好ましい実施形態では、１つ以上の特定のシアリダーゼは細菌起源のものである。特に、１つ以上の特定のシアリダーゼは、プレボテラ、バクテロイデスおよび／もしくはモビルンカス種および／またはガードネレラ・バギナリスに由来し得る。
【００２８】
関連する態様では、本発明のペプチドは、シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出する際における使用のためのインジケータ分子に組み込まれる。インジケータ分子は、本明細書でさらに説明されるシアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出デバイス、酵素検出キット、酵素検出組成物、および方法のコア成分である。本明細書で説明されるインジケータ分子は、ＢＶを診断するためにシアリダーゼ活性を検出するという関連において本発明者らによって具体的に開発されており、酵素の切断活性を検出する際における使用のためのインジケータ分子、および切断された生成物に特異的に結合する結合分子に関する一般概念の本発明者らによる以前の開示に基づいている（参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＧＢ２０１４／０５３１７１を参照）。したがって、本発明は、シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出する際における使用のためのインジケータ分子を提供し、インジケータ分子は、
ａ）本明細書で説明される本発明のペプチド、および
ｂ）試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断後も無傷のままである捕捉部位、を含む。
【００２９】
捕捉部位は、インジケータ分子の個別領域であり、捕捉ゾーン内に存在する捕捉分子へのインジケータ分子の結合を媒介する（より詳細に以下で記載される）。したがって、捕捉部位はインジケータ分子の一部であり、捕捉ゾーン内でインジケータ分子を保持または局在化させることに関与する。インジケータ分子の切断後、捕捉部位は無傷または実質的に無傷のままであり得、その結果、その部位は依然としてデバイスの捕捉ゾーン内に存在する捕捉分子によって認識されて結合される。これらの状況下では、無傷のインジケータ分子と、切断後に捕捉部位を含むインジケータ分子の一部の両方が、捕捉ゾーン内の捕捉分子に結合される。捕捉部位は、任意の好適な分子、例えば、ビオチン分子またはオキシム部分を含み得る。捕捉部位は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端にあり得る。インジケータ分子の有効性の鍵は、捕捉ゾーンでの捕捉部位と捕捉分子との間の相互作用による固定化、および切断が発生した後の結合分子による同時結合である。
【００３０】
したがって、無傷のインジケータ分子は、本発明のペプチドに結合された捕捉部位部分を含み得、そのペプチドは、第１のシアリル基を含む。シアリダーゼ酵素によるインジケータ分子の切断は、ペプチドの捕捉部位部分および脱シアル化型のペプチドを含むフラグメントを生じる。フラグメント（すなわち、切断されたインジケータ分子）は、それが無傷のインジケータ分子に存在する第１のシアリル基を欠いているという点で、無傷のインジケータ分子とは構造的に異なる。この第１のシアリル基の欠如は、無傷のインジケータ分子に存在しないか、隠されているか、またはアクセスできないエピトープ（新規結合部位）をフラグメント上に表すか、または露出させる。したがって、無傷のインジケータ分子は、潜在的なエピトープを含むとみなされ得る。以下で考察されるように、本発明のデバイス、キット、組成物、および方法の結合分子は、このエピトープに特異的であり、したがって、無傷のインジケータと比較して、インジケータフラグメントにのみに、または優先的に結合する。
【００３１】
インジケータ分子のペプチドおよび捕捉部位は、当業者に知られている任意の手段によって結合され得る。好ましい実施形態では、ペプチドおよび捕捉部位は、直接的な共有結合を介して結合され得る。ペプチドおよび捕捉部位は、直接隣接し得、またはリンカーもしくはスペーサー、例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分によって離され得る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、ポリエチレングリコール部分を含むか、ポリエチレングリコール部分から本質的になるか、またはポリエチレングリコール部分からなるリンカーを介して、そのＮ末端またはＣ末端でビオチン基に結合される。リンカー基（ＰＥＧなど）をペプチドに結合するために、１つ以上の追加のアミノ酸がペプチドのＮ末端またはＣ末端に存在し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の追加のアミノ酸は、Ａｓｐを含み得る。ＰＥＧ部分は、ペプチドと捕捉部位を互いに結合させる合成の際に、ペプチドおよび／または捕捉部位（例えば、ビオチン分子）の末端残基と反応することができるＰＥＧの一端または両端に、官能基（例えば、アミン基、任意選択的にアルキルアミン基）をさらに含み得る。したがって、特定の実施形態では、インジケータ分子は、以下の構造を含むか、以下の構造から本質的になるか、または以下の構造からなり、
（ｉ）Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−ビオチン（配列番号１１−ＰＥＧ−ビオチン）
（ｉｉ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−ＤＳｅｒ−Ｎｖａ−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ（ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−配列番号：１２）
（ｉｉｉ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−ＤＡｌａ−ＢＩＰ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−ＤＡｓｐ−Ｓｅｒ（ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−配列番号１３）
（ｉｖ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ＳＥＰ−ＤＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｏｒｎ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ（ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−配列番号１４）
（ｖ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−βＡｌａ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＢＩＰ−Ｏｒｎ−ＤＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（ビオチンＰＥＧ−Ａｓｐ−配列番号１５）、または
（ｖｉ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−βＡｌａ−Ｃｙｃ−Ｏｒｎ−ＤＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−βＡｌａ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｃｈａ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ（ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−配列番号１６）
その中で、Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−ビオチン（配列番号１１−ＰＥＧ−ビオチン）が特に好ましい。
【００３２】
本発明の文脈において、インジケータ分子は（捕捉部位を介して）、比較的高い親和性で捕捉ゾーンにおける捕捉分子（より詳細に以下で記載されるように）に結合し得る。いくつかの実施形態では、インジケータ分子の解離定数（ｋｄ）は比較的低く、好ましくは０Ｍ〜１×１０−７Ｍである（アッセイに必要な感度に応じる）。本発明の特定の実施形態では、インジケータ分子の解離定数は、１×１０−１５Ｍ〜１×１０−９Ｍである。
【００３３】
本発明の特定の実施形態では、そのような結合相互作用は、インジケータ分子の捕捉部位が捕捉ゾーンに存在する捕捉分子に直接的に結合する結果として達成され得る。この文脈において、直接的結合とは、インジケータ分子が（捕捉部位を介して）、いずれの媒介も伴わずに捕捉分子に結合することを意味する。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、インジケータ分子の捕捉部位および捕捉ゾーンに存在する捕捉分子は、結合対の２つの半部分である。この文脈では、結合対は、互いに結合することができる２つの分子または実体からなる。本発明の特定の実施形態では、結合相互作用は特異的であり、そのため、結合対の各メンバーはそのそれぞれのパートナー、または限られた数の結合パートナーにのみ結合することができる。さらに、上で詳述したように、結合対は比較的高い親和性を示すことが好ましい。結合対は、自然界に認められる結合対、または相互作用する分子または実体の人工的に生成された対であり得る。
【００３５】
本発明のいくつかの実施形態では、インジケータ分子の捕捉部位および捕捉分子は、結合対の２つの半部分であり、結合対は、抗原および抗体またはその抗原結合フラグメント、ビオチンおよびアビジン、ストレプトアビジン、ニュートラアビジン、またはキャプタビジン：免疫グロブリン（またはその適切なドメイン）およびプロテインＡまたはＧ、炭水化物およびレクチン、相補的ヌクレオチド配列、リガンドおよび受容体分子、ホルモンおよびホルモン結合タンパク質、酵素補因子および酵素、酵素阻害剤および酵素、セルロース結合ドメインおよびセルロースファイバー、固定化アミノフェニルボロン酸およびシス−ジオール含有分子、キシログルカンおよびセルロースファイバー、ならびにそれらの類似体、誘導体、およびフラグメントから選択される。
【００３６】
本発明の特定の実施形態では、結合対は、ビオチンおよびストレプトアビジンからなる。本発明のさらなる実施形態では、インジケータ分子の捕捉部位はエピトープを含み、捕捉分子は抗体を含み、第１の捕捉部位に存在するエピトープに特異的に結合する。本発明の文脈において、抗体という用語は、任意の種からの天然免疫グロブリン、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓＦｖフラグメント、および特異的結合親和性を保持する抗体ドメインに基づくものなどの高度に関連する分子（例えば、単一ドメイン抗体）を包含する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。したがって、特定の実施形態では、捕捉分子は抗体を含む。他の実施形態では、捕捉部位はビオチン分子を含み、捕捉ゾーンはストレプトアビジン分子を含む。
【００３７】
本明細書でさらに説明されるシアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出デバイス、酵素検出キット、酵素検出組成物、および方法の別のコア構成要素は、結合分子である。結合分子は、試料に存在するシアリダーゼ活性によるインジケータ分子からのシアリル基の切断に続いて形成される、インジケータ分子の脱シアル化誘導体に特異的に結合するように設計される。脱シアル化誘導体の形成は、結合分子が特異的に結合することができる新たな結合部位を露出させる。したがって、好ましい実施形態では、結合分子は、インジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、インジケータ分子に結合することができない（任意の認識可能または検出可能なレベルで）。代替的な実施形態では、結合分子は、シアル化ペプチドまたはインジケータ分子よりも脱シアル化誘導体に優先的に結合する。したがって、結合分子は、シアル化型と比較した場合、脱シアル化誘導体に対してより高い親和性を有する。
【００３８】
代替的な観点から、好ましい実施形態では、結合分子は、脱シアル化インジケータ分子（フラグメント）に特異的に結合することができ、無傷の（シアル化）インジケータ分子に結合することができない（任意の認識可能または検出可能なレベルで）。
【００３９】
当業者は、特定の結合分子がシアル化型よりも優先して脱シアル化誘導体に結合するかしないか、十分に判定することができる。これは、例えば、相対的な解離定数に関連して表すことができる。例えば、特定の実施形態では、結合分子と脱シアル化誘導体との間の結合相互作用における解離定数は、結合分子とシアル化型との間の結合相互作用における解離定数よりも、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００倍（またはそれ以上）低いものであり得る。
【００４０】
特定の実施形態では、結合分子は抗体を含む。誤解を避けるために、抗体という用語は、任意の種からの天然免疫グロブリン、キメラ抗体、ヒト化抗体、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆｖフラグメント、ｓＦｖフラグメント、および特異的結合親和性を保持する抗体ドメインに基づくものなどの高度に関連する分子（例えば、単一ドメイン抗体）を包含する。抗体は、モノクローナルまたはポリクローナルであり得る。本発明者らは、インジケータ分子の脱シアル化誘導体のみを認識する抗体を生成しており、したがって、シアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、インジケータ分子に結合しない（任意の有意な程度で）。抗体は、当技術分野で知られている技術に従って生成することができる。これは、インジケータ分子の脱シアル化誘導体による、ヒツジ、ウサギ、またはヤギなどの動物の免疫化に依存し得る。代替的に、動物は、脱シアル化ペプチドで（すなわち、捕捉部位が結合されていない）免疫化され得る。ポリクローナル抗体は、血清から単離されて、アフィニティー精製され得る。モノクローナル抗体は、よく知られており、特徴付けられているハイブリドーマ技術を使用して生成され得る。
【００４１】
したがって、関連する態様では、本発明はまた、本明細書で定義される本発明のペプチドの脱シアル化誘導体、または本明細書で定義される本発明のインジケータ分子に特異的に結合することができる抗体を提供する。当業者が本明細書の開示に基づいて理解するように、抗体は、シアル化ペプチドまたはインジケータ分子よりも脱シアル化誘導体に優先的に結合し得る。したがって、抗体は、シアル化型と比較した場合、脱シアル化誘導体に対してより高い親和性を有する。当業者は、特定の抗体がシアル化型よりも優先して脱シアル化誘導体に結合するかしないかを十分に判定することができる。これは、例えば、相対的な解離定数の観点から表すことができる。例えば、特定の実施形態では、抗体と脱シアル化誘導体との間の結合相互作用の解離定数は、抗体とシアル化型との間の結合相互作用の解離定数よりも、２、３、４、５、１０、２０、３０、４０、５０、１００、２００、５００、１０００倍（またはそれ以上）低いものであり得る。特定の実施形態では、抗体は、シアル化ペプチドまたはインジケータ分子に結合することができない。すなわち、それは、シアリル基の切断が発生した後にのみ、脱シアル化誘導体に結合することができる。
【００４２】
したがって、好ましい実施形態では、抗体はエピトープ：
Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−ビオチン（配列番号１１−ＰＥＧ−ビオチンの脱シアル化型）、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のＧａｌペプチド部分に存在するエピトープ：Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ（配列番号１１の脱シアル化型）に特異的に結合することができる。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型（Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ、すなわち配列番号１１）に結合することができない（任意の認識可能または検出可能なレベルで）。
【００４３】
別の実施形態では、エピトープ：
ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−ＤＳｅｒ−Ｎｖａ−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ（ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−配列番号１２の脱シアル化型）、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のＧａｌペプチド部分に存在するエピトープ、に特異的に結合することができる抗体が提供される。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型に結合することができない（任意の認識可能または検出可能なレベルで）。
【００４４】
さらなる実施形態では、エピトープ：
ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−ＤＡｌａ−ＢＩＰ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−ＤＡｓｐ−Ｓｅｒ（ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−配列番号１３の脱シアル化型）、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のＧａｌペプチド部分に存在するエピトープに、特異的に結合することができる抗体が提供される。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型に結合することができない（任意の認識可能または検出可能なレベルで）。
【００４５】
さらなる実施形態では、エピトープ：
ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ＳＥＰ−ＤＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｏｒｎ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ（ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−配列番号１４の脱シアル化型）、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のＧａｌペプチド部分に存在するエピトープに、特異的に結合することができる抗体が提供される。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型に結合することができない（任意の認識可能または検出可能なレベルで）。
【００４６】
さらなる実施形態では、エピトープ：
ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−βＡｌａ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＢＩＰ−Ｏｒｎ−ＤＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−配列番号１５の脱シアル化型）、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のＧａｌペプチド部分に存在するエピトープに、特異的に結合することができる抗体が提供される。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型に結合することができない（任意の認識可能または検出可能なレベルで）。
【００４７】
さらなる実施形態では、エピトープ：
ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−βＡｌａ−Ｃｙｃ−Ｏｒｎ−ＤＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−βＡｌａ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｃｈａ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ（ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−配列番号１６の脱シアル化型）、特にこの分子に存在するエピトープ、より具体的にはこの分子のＧａｌペプチド部分に存在するエピトープに、特異的に結合することができる抗体が提供される。好ましくは、抗体は、この分子のシアル化型に結合することができない（任意の認識可能または検出可能なレベルで）。
【００４８】
さらなる実施形態では、３つのＣＤＲを有する重鎖および３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する抗体が提供され、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１を有し、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号２を有し、重鎖ＣＤＲ３は配列番号３を有し、軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号４を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号５を有し、および／または軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号６を有する。
【００４９】
抗体は、配列番号７を有する重鎖および／または配列番号８を有する軽鎖を有し得る。
【００５０】
好ましくは、抗体は、分子Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇに存在するエピトープに結合することができる。好ましくは、抗体は、分子Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇに結合しない（任意の感知可能または検出可能なレベルで）。
【００５１】
（脱シアル化）分子Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−オキシム（配列番号１１−ＰＥＧ−オキシムの脱シアル化型）では、抗体は、１００ｎＭ未満、好ましくは８０、６０、５０、４０、３０、２０、または１０ｎＭ未満、例えば約７．９ｎＭのＫＤを有し得る。この分子では、それは約５４０８０Ｍ−１ｓ−１のＫｏｎ、
および約０．０００４２７ｓ−１のＫｏｆｆを有し得る。
【００５２】
結合分子は、レポータ分子に直接的または間接的に結合されて（すなわち、標識される）、インジケータ分子への結合分子の結合の検出を可能にし得る。レポータ分子は、当技術分野で利用可能な任意の手段による検出に適した任意の物質または部分であり得る。したがって、レポータ分子は通常、シグナルを発生または生成することができる。本発明の特定の実施形態では、レポータ分子は、金粒子、色原体、発光化合物、蛍光分子、放射性化合物、目視可能化合物、シグナル生成物質を含むリポソームもしくは他の小胞、電気活性種、または酵素とその基質の組み合わせから選択される。レポータ部分として使用するのに適した酵素−基質の組み合わせは、酵素アルカリホスファターゼおよび基質ニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートであり得る。本発明の特定の実施形態では、レポータ分子は金粒子である。
【００５３】
レポータ分子による結合分子の間接的な標識もまた、本発明内で想定される。したがって、レポータ分子は、さらなる結合分子に結合され、今度は上記結合分子に結合して標識をもたらし得る。この間接的な結合は、結合分子とレポータ分子を同時に結合することができるアダプターによって媒介され得る。例示的な実施形態として、結合分子が抗体である場合、間接的な標識は、特異的方式で抗体結合分子に結合するさらなる抗体によって媒介され得る。さらなる抗体は、金粒子、色原体、発光化合物、蛍光分子、放射性化合物、目視可能化合物、シグナル生成物質を含むリポソームもしくは他の小胞、電気活性種、または酵素とその基質の組み合わせなどのレポータ分子によって直接的に標識され得る。レポータ部分としての使用に適した酵素−基質の組み合わせは、酵素アルカリホスファターゼおよび基質ニトロブルーテトラゾリウム−５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェートであり得る。本発明の特定の実施形態では、レポータ部分は金粒子である。
【００５４】
レポータが金粒子である実施形態では、金粒子−結合分子コンジュゲートは、少なくとも４、好ましくは、少なくとも５、６、または７、最も好ましくは、少なくとも、もしくは約、８、９または１０の光学密度が使用されるべきである。
【００５５】
レポータ分子がアダプター分子によって結合分子に結合する本発明の実施形態では、アダプターが切断されたインジケータ分子と結合分子の結合を妨げなければ、アダプターは、試験試料のインジケータ分子への添加前に結合分子と前複合体化され得る。
【００５６】
アダプターは、結合分子とレポータ分子との間接的な相互作用を媒介することができる任意の材料または分子であり得る。いくつかの実施形態では、アダプターはストレプトアビジンであり、結合分子はビオチン分子を含む。アダプターはまた、「アダプター結合対」であり得、当該結合ペアは、
（ｉ）結合分子に結合することができる第１のメンバー、および
（ｉｉ）対の第１のメンバーおよびレポータ分子に結合することができる第２のメンバー、を含む。本発明の特定の実施形態では、インジケータ分子の検出領域はビオチンを含み、アダプター結合対の第１のメンバーはアビジンまたはストレプトアビジンであり、アダプター結合対の第２のメンバーはビオチンであり、レポータ分子はビオチンに結合することができる部分を含む。
【００５７】
前述の観点から、補足的な態様では、本発明のペプチドの脱シアル化誘導体も本発明の一部を形成し、結合分子、特に抗体の生成に使用される。したがって、本発明は、本明細書で定義される抗体を生成する際における使用のためのペプチドを提供し、ペプチドは本発明によるペプチドの脱シアル化誘導体であり、抗体は本発明のペプチドの脱シアル化誘導体に特異的に結合することができる。したがって、特定の実施形態では、ペプチドは、
（ｉ）Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ（配列番号１１の脱シアル化型）
（ｉｉ）Ａｓｐ−Ｇｌｕ−ＤＳｅｒ−Ｎｖａ−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１２の脱シアル化型）
（ｉｉｉ）Ａｓｐ−Ａｒｇ−ＤＡｌａ−ＢＩＰ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−ＤＡｓｐ−Ｓｅｒ（配列番号１３の脱シアル化型）
（ｉｖ）Ａｓｐ−Ｓｅｒ−ＳＥＰ−ＤＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｏｒｎ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ（配列番号１４の脱シアル化型）
（ｖ）Ａｓｐ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−βＡｌａ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＢＩＰ−Ｏｒｎ−ＤＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ（配列番号１５の脱シアル化型）、または
（ｖｉ）Ａｓｐ−Ｔｈｒ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−βＡｌａ−Ｃｙｃ−Ｏｒｎ−ＤＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−βＡｌａ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｃｈａ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ（配列番号１６の脱シアル化型）である。
【００５８】
配列Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇを含むか、その配列から本質的になるか、またはその配列からなるペプチドは、特に好ましい。
【００５９】
特定の実施形態では、ペプチドは、免疫原性、したがって宿主生物における抗体生成を改善するために、担体タンパク質に結合され得る。例えば、ペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニンに結合され得る。担体タンパク質は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端にあり得る。
【００６０】
上記を考慮して、本発明はさらに、シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための、酵素検出デバイス、酵素検出キット、酵素検出組成物、および方法を提供し、上記で定義されるインジケータ分子、捕捉分子、および結合分子を組み込んでいる。インジケータ分子の脱シアル化誘導体にのみ結合し、切断されていないインジケータ分子には結合しない抗体などの結合分子の使用が、シアリダーゼ活性を試験試料において低濃度で検出することを可能にする。
【００６１】
したがって、さらなる態様では、本発明は、シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物を提供し、デバイスは、
（ｉ）本明細書で定義されるインジケータ分子と、
（ｉｉ）試験試料を受容する捕捉ゾーンであって、捕捉ゾーンは、インジケータ分子を固定化するために、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、インジケータ分子の捕捉部位に結合することができる本明細書で定義される捕捉分子を含む、捕捉ゾーンと、
（ｉｉｉ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない、結合分子と、を含む。
【００６２】
本発明はさらに、シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在または不存在を検出するための方法であって、本方法は、
（ｉ）本明細書で定義されるインジケータ分子を試験試料と接触させる工程、
（ｉｉ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子を、試験試料に添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、
（ｉｉｉ）捕捉ゾーンにおける捕捉分子の捕捉部位への結合によって、捕捉ゾーンにおいてインジケータ分子の脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、当該捕捉分子は、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合することができる工程、および
（ｉｖ）捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程、を含む。
【００６３】
本発明のデバイス、キット、組成物、および方法は、ＢＶの診断の分野において特定の適用を有することが本発明者らによって示されている。したがって、本発明はさらに、試験試料において細菌性膣炎を診断するための方法を、試料中のシアリダーゼ酵素の切断活性を検出することによって提供し、本方法は、
（ｉ）本明細書で定義されるインジケータ分子を試験試料と接触させる工程、
（ｉｉ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子を、試験試料に添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、
（ｉｉｉ）捕捉ゾーンにおける本明細書で定義される捕捉分子の捕捉部位への結合によって、捕捉ゾーンにおいてインジケータ分子の脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、当該捕捉分子は、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合することができる工程、および
（ｉｖ）捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程であって、コントロールと比較して切断の増加したレベルが細菌性膣炎を診断する工程、を含む。
【００６４】
特定の実施形態では、インジケータ分子は、捕捉分子を介して捕捉ゾーンに（前）固定化され得る（すなわち、試験試料との接触前に）。したがって、本発明はまた、シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在または不存在を検出するための方法を提供し、本方法は、
（ｉ）捕捉分子を含む捕捉ゾーンに試験試料を添加する工程であって、本明細書で定義される当該捕捉分子は、本明細書で定義されるインジケータ分子の捕捉部位に結合され、当該捕捉分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生しているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合されたままである工程、
（ｉｉ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子を添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、および
（ｉＩＩ）捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程、を含む。
【００６５】
同様に、本発明はまた、試験試料において細菌性膣炎を診断するための方法を、試料中のシアリダーゼ酵素の切断活性を検出することによって提供し、本方法は、
（ｉ）本明細書で定義される捕捉分子を含む捕捉ゾーンに試験試料を添加する工程であって、当該捕捉分子は、本明細書で定義されるインジケータ分子の捕捉部位に結合され、捕捉分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生しているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合されたままである工程、
（ｉｉ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子を添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、および
（ｉｉｉ）捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程であって、コントロールと比較して切断の増加したレベルが細菌性膣炎を診断する工程、を含む。
【００６６】
結果として、インジケータ分子が、方法のステップ（ｉ）の前に、捕捉分子を介して捕捉ゾーンに（前）固定化される（すなわち、試験試料と接触する前に）実施形態では、インジケータ分子は、インジケータ分子が捕捉分子を介して捕捉ゾーンに結合されるように捕捉ゾーンに添加され得る。結合分子の添加は、試験試料が捕捉ゾーンに添加されているのと同時、またはその後に発生し得る。したがって、本方法のステップ（ｉ）および（ｉｉ）は、順次または同時に発生し得る。
【００６７】
本明細書で提供される方法の文脈において、結合分子を試験試料に「添加する」ステップは、結合分子を試験試料と接触させる任意のステップを包含すると理解されるべきである。したがって、このステップは、結合分子を含むデバイスに試験試料を加えるステップを含み得る。結合分子は、溶液中に存在し得、または担体上に存在し得る。例えば、結合分子は、固体支持体上に乾燥され得るか、さもなければ、固体支持体の中または上に含侵され得、それは本明細書において他の考察される「コンジュゲートパッド」であり得る。好ましい実施形態では、試験試料は、結合分子が乾燥されている固体支持体と接触させる。試験試料に含まれ、かつ／または担体に添加される液体は、結合分子が再溶媒和することを可能にする。
【００６８】
結合分子が、固体支持体上に乾燥されるか、さもなければ固体支持体の中または上に含浸される実施形態では、固体支持体は、好ましくはグラスファイバー、ポリエステルファイバー、または同様の特性を有する材料を含むか、またはそれらからなる。固体支持体は、好ましくは、坪量約７５ｇ／ｍ２、厚さ約０．３８〜０．４３ｍｍ、吸湿率約３〜５（ｓ／２ｃｍ）、および／また吸水約６３〜７９ｍｇ／ｃｍ２の特性のうちの１つ以上を有する。したがって、コンジュゲートパッドはこれらの特性を有し得る。同様に、試料パッドはこれらの特性を有し得る。
【００６９】
好ましい実施形態では、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子はインジケータ分子に結合することができないが、いくつかの実施形態では、本明細書の他で説明されるように、結合分子は、インジケータ分子の脱シアル化誘導体に、シアル化型よりも優先して結合する。したがって、シアル化インジケータ分子にある程度結合が生じ得る（これは、場合によっては、バックグラウンドシグナルと考えられ得る）。しかしながら、結合分子は脱シアル化誘導体に優先的に結合するため、シアル化インジケータ分子が切断されていないか、またはインジケータ分子が存在しない試料と比較して、脱シアル化誘導体を含む試料において、はるかに大きなシグナルが生成される。
【００７０】
シアリダーゼ活性（存在する場合）のバックグラウンドレベルを考慮に入れるために、本方法は通常、試験試料において切断の測定されたレベルをコントロールと比較することを含む。通常、コントロールは健康な対象におけるシアリダーゼ活性の対応するレベルを表す。「健康な対象」とは、ＢＶを有さない対象を意味する。コントロールは、適合した健康なコントロールから採取された対応する試験試料におけるものであり得る。代替的に、コントロールは、健康および罹患した患者の範囲におけるシアリダーゼ活性を判定することによって設定されるシアリダーゼ活性の閾値レベルであり得る。閾値を設定するための好適な方法は、当業者によく知られている。閾値は、患者データのトレーニングセットから数学的に導出され得る。したがって、スコア閾値は、ＢＶの有無にしたがって試験試料を分ける。この量の解釈、すなわちカットオフ閾値は、既知の結果を有する患者セットからの展開またはトレーニング段階で導出され得る。したがって、閾値は、請求される方法の実行前に、当業者に知られている方法によってトレーニングデータから確定され得る。
【００７１】
例えば、キューブリーダ、例えば、ドイツ、ベルリン、Ｓｃｈｗａｒｚｓｃｈｉｌｄｓｔｒａｓｓｅ  １、Ｄ−１２４８９のＯｐＴｒｉｃｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｃｈｅｍｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  ｓｙｓｔｅｍｓ）のＯｐｔｒｉｃｏｎリーダが、実施例に示されるよう使用され得る。例として、実施例で使用されるアッセイにおいて、１０未満のキューブ読み取りは、目視可能なシグナルがなく、陰性結果であり、したがって、細菌性膣炎が存在しないことを示しているとみなされ、少なくとも３０単位のキューブ読み取りは、強い目視可能なシグナルと相関しており、陽性の結果であり、したがって細菌性膣炎が存在していることを示しているとみなされる。
【００７２】
１０〜２０単位のキューブ読み取りは、かすかに目視可能なシグナルと相関し、確立された細菌性膣炎が存在しないことを示している可能性があるか、低いレベルの感染、例えば、細菌性膣炎の初期段階を示している可能性がある。
【００７３】
特定の実施形態では、検出されるシアリダーゼ酵素は、プレボテラ、バクテロイデス、および／もしくはモビルンカス種および／またはガードネレラ・バギナリスに由来する。
【００７４】
本発明の酵素検出デバイスおよび組成物は、直ちに使用できる形式で供給され得る。代替的に、必須の構成要素は、任意選択的に、好適な試薬および／または酵素検出デバイスの組み立てのための説明書と共に、パーツのキットとして提供され得る。したがって、別の態様では、本発明は、シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出キットを提供し、キットは、
（ｉ）試験試料に添加するための本明細書で定義されるインジケータ分子と、
（ｉｉ）インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、インジケータ分子の捕捉部位に結合することができる、本明細書で定義される捕捉分子と、
（ｉｉｉ）捕捉分子を付着させて、試験試料を受容する捕捉ゾーンを形成することができる、固体支持体と、
（ｉｖ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる本明細書で定義される結合分子であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、インジケータ分子に結合することができない、結合分子と、を含む。
【００７５】
関連する態様では、本発明はまた、試験試料においてＢＶを診断するために、本明細書で説明および定義される酵素検出デバイスまたは組成物の使用を提供する。同様に、本発明はまた、試験試料においてＢＶを診断するために、本明細書で説明および定義される方法の使用を提供する。本発明はさらに、試験試料においてＢＶを診断するために、本明細書で説明および定義される酵素検出キットの使用を提供する。
【００７６】
本発明は、特定の実施形態では、側方流体または垂直流体デバイスにおいて実施され得る。したがって、一般に、本発明は、固体支持体のいくつかの形態に依存する。固体支持体は、試料のための液体流路を定め得る。特定の実施形態では、固体支持体は、クロマトグラフィー媒体または毛細管流動デバイスを含む。本発明は、いくつかの実施形態では、テストストリップ方式で提供され得る。
【００７７】
本発明の特定の実施形態では、捕捉ゾーンは、固体支持体に形成される。捕捉分子を付着させて捕捉ゾーンを形成し得る任意の支持体を包含することが意図される。固体支持体は、例えば、ビーズ（例えば、セファロースもしくはアガロースビーズ）またはウェル（例えば、マイクロプレート）の形態を採り得る。したがって、特定の実施形態では、デバイスは、捕捉分子が付着されて捕捉ゾーンを形成する固体支持体を含む。本発明のキットの場合、固体支持体は、捕捉分子が付着することなく提供され得る。それらの実施形態では、キットの使用者は、試験試料と共にデバイスを使用する前に、捕捉分子を固体支持体上に固定化して捕捉ゾーンを形成し得る。したがって、キットは、捕捉分子を固体支持体に固定化するための手段も含み得る。固定化手段は、捕捉ゾーンが形成されることを可能にする、任意の好適な試薬を含み得る。固体支持体は、好適な固定化手段を用いて事前に形成することができる。例えば、固体支持体は、捕捉分子（の一部）を形成するアビジン（例えば、ストレプトアビジン）分子と相互作用するように配置されたビオチン分子を含み得る。当然のことながら、本明細書で考察されるように、かつ当業者によって容易に理解されるように、他の結合対相互作用を使用して、捕捉分子を固体支持体上に固定化して捕捉ゾーンを形成し得る。
【００７８】
捕捉ゾーンは、インジケータ分子の捕捉部位に結合することができる捕捉分子のその中またはその上への固定化によって定められ得る。捕捉分子の固定化は、任意の好適な手段によって達成され得る。デバイスがクロマトグラフィー媒体を含む流動デバイスである場合、捕捉分子は、媒体に直接結合することによって固定化されるか、あるいはタンパク質などの担体分子への結合を介して、間接的に媒体に会合されるか、または結合されて固定化され得る。
【００７９】
さらなる実施形態では、固体支持体は、試料が適用される試料適用ゾーンをさらに含む。試料適用ゾーンは、インジケータ分子で事前に添加され得、これによって、試験試料が適用されるとき、試料中の任意の酵素が試料適用ゾーン内のインジケータ分子の切断部位に作用する。試料適用ゾーンは、試料を試料適用ゾーンに所定の期間保持するバリアを含み得る。これによって、試料は、測定可能なレベルの切断を達成するのに十分な期間、インジケータ分子と相互作用することができる。このことは、当業者によって容易に理解されるように、検出されるべきシアリダーゼ酵素に応じて、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０、６０分、またはそれ以上であり得る。約５〜１５分、５〜１０分、または約５分が好ましい。バリアは、この期間の後に試料によって分解され得るか、さもなければ除去され得、したがって、試料がデバイスを通って流れ続けることを可能にする。代替的に、試験試料およびインジケータ分子は、前混合または前インキュベートしてから、その混合物をデバイスに、試料適用ゾーンなどに添加し得る。ただし、試験試料およびインジケータ分子が前混合または前インキュベートされ得る場合、試料適用ゾーンを省くことが可能である。ここで、混合物を捕捉ゾーンに直接添加して、捕捉分子との相互作用を介してインジケータ分子を固定化させることが可能であり得る。いくつかの実施形態では、試験試料は捕捉ゾーンから上流の部位でクロマトグラフィー媒体に加えられ得、それによって、例えば毛細管現象によって捕捉ゾーンを通って引き出される。クロマトグラフィー媒体は、流体経路または多孔質膜など、流体が通過することができる任意の材料から作成され得る。本発明の特定の実施形態では、クロマトグラフィー媒体には、ストリップまたは膜、例えば、ニトロセルロースストリップまたは膜が含まれる。
【００８０】
インジケータ分子は担体に存在し得、それは不活性材料であり、好ましくは多孔性である。それは、ポリテトラフルオロエチレンなどの好適なポリマーであり得る。例えば、担体は、不活性な多孔質膜ディスクであり得る。インジケータ分子は、例えば、担体上に凍結乾燥され得る。好ましい実施形態では、試験試料およびインジケータ分子は、前混合または前インキュベートしてから、混合物をデバイスに添加し得る。これは、試料を、インジケータ分子を含む担体と、好ましくは凍結乾燥形態で、接触させることを含み得る。これは、例えば、チューブなどの容器内で行われ得る。好ましくは、試料およびインジケータ分子は、少なくとも３、４、または５分および３０分未満、好ましくは約５〜１５分、５〜１０分、または約５分、例えば３〜７または４〜６分、インキュベートされる。
【００８１】
当業者は様々な成分の好適な量および濃度を判定することができるだろうが、例えば、単回アッセイまたは単回キットにおいて、インジケータ分子は、好ましくは、少なくとも３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、または１００ｎｇ、より好ましくは、少なくとも、もしくは約、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、または１９０ｎｇの量で存在する。
【００８２】
結合分子は、試料に存在するシアリダーゼ酵素によってシアリル基がインジケータ分子から切断される場合、インジケータ分子との相互作用を可能にする方法でデバイスに提供されなければならない。したがって、結合分子は、デバイスに適用する前に、インジケータ分子と前混合され得る。これは、インジケータ分子が試験試料と混合されている前または後であり得る。好ましくは後であり、結合分子がインジケータ分子の切断部位での酵素活性（試験試料中）に及ぼし得るいずれの影響も回避するためである。結合分子は、好ましくは、捕捉ゾーンの上流の任意の地点でデバイス上またはデバイス内にもたらされ得、その結果、結合分子は、インジケータ分子が固定化される（インジケータ分子の捕捉部位と捕捉ゾーンを定める捕捉分子の間の相互作用を介して）前に、試験試料およびインジケータ分子に遭遇する。代替的に、結合分子は、試験試料およびインジケータ分子が捕捉ゾーンに加えられている後に、捕捉ゾーンに添加され得る。このことは、いずれのインジケータ分子も捕捉ゾーンで先に固定化されることを確実にし、結合分子に結合部位をもたらして（切断された（つまり脱シアル化された）インジケータ分子の場合）シグナルを生成させる。
【００８３】
固体支持体は、試料の流れに関して捕捉ゾーンの下流であるコントロールゾーンをさらに含み得、存在する場合、試料適用ゾーンはさらなる結合分子を含み、本明細書において「コントロール検出結合物質」と称され、結合分子と結合して、デバイスを使用するアッセイの正常な完了を示す。代替的に、さらなる結合分子（コントロール検出結合物質）は、試料またはデバイスに添加されて、試料と共にデバイスを通って流れる、「コントロール検出分子」と本明細書で称されるさらなる分子に結合し得る。さらなる分子（コントロール検出分子）は、本明細書で定義されるレポータ分子によって、直接的または間接的に標識され得る。好ましくは、レポータ分子は、検出を容易にするために、結合分子に付着したものと同じレポータ分子であるが、それは異なり得る。
【００８４】
コントロールゾーンは、捕捉ゾーンから空間的に離れており、例えば、レポータが各それぞれのゾーンに結合または固定化される場合、２つの別々のテストラインを生じる。このコントロールゾーンは、結合分子を含む試験試料がデバイス全体を通過していることを確認するために使用され、デバイスが正しく作用していることを確認する。シアリダーゼ活性が試料中に存在するかしないかに関わらず、陽性シグナルは、コントロールゾーンにおいて予想される。さらなる結合分子は、インジケータ分子の切断部位に結合する結合分子の性質、または試料に添加されるさらなる分子の性質に基づいて選択される。結合分子およびさらなる結合分子、またはさらなる分子およびさらなる結合分子は、本明細書で定義されるような結合対を形成し得る。例えば、結合分子が種特異的抗体（例えば、ヒツジ抗体）である場合、さらなる結合分子は、抗種抗体（例えば、抗ヒツジ抗体）であり得る。例えば、コントロール検出分子はニワトリＩｇＹ抗体であり得、コントロール検出結合物質は抗ニワトリＩｇＹ抗体であり得るか、またはその逆であり得る。代替的に、さらなる分子が異なる種、例えばニワトリまたはヤギからの抗体である場合、さらなる結合分子は適切な抗種抗体であり得る。これによって、特定の相互作用による、結合分子またはさらなる分子をコントロールゾーンで固定化することができる。さらなる結合分子は、任意の好適な手段によって、例えば、共有または非共有相互作用によって、コントロールゾーンに固定化され得る。
【００８５】
本発明のすべての態様によれば、試験試料は、膣試料、任意選択的に膣スワブであり得る。試験試料は、任意の好適な手段によって収集され、本発明による使用に適した任意の形態で提供され得る。通常、試料は滅菌スワブを使用して収集される。さらに、試験試料をその最初の供給源から入手することの一部として、試料は、本発明を使用して試験する前に、１つ以上の処理または前処理ステップを受け得る。一実施形態では、試料は、試験用の溶液または懸濁液を作成するように処理され得る。さらに、特定の実施形態では、本発明を使用して試験する前に、試験試料は、任意の所与の期間、試料を維持する手段として、保存、例えば、約−２０℃で凍結され得る。
【００８６】
本発明は、典型的には、単離された試料に基づいてインビトロで実施されることに留意されるべきである。本発明の方法は、例えば、滅菌スワブを使用して、いくつかの実施形態で試験するための試料を得るステップを含み得る。
【００８７】
上記の観点において、本発明は、以下の付番された条項によってさらに定義され得る。
１．以下の配列を含むペプチドであって、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−Ｘ４−Ｘ５
式中、
（ｉ）Ｓｉａｌは、シアリル基であり、
（ｉｉ）Ｘ３は、グリコシル受容体基を含む天然または非天然アミノ酸であり、
（ｉｉｉ）Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は、任意のアミノ酸から独立して選択され、ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、Ｄ−アミノ酸および／または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸である、ペプチド。
２．Ｘ３は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、またはホスホセリン（ＳＥＰ）から選択される、条項１のペプチド。
３．Ｘ３は、Ｓｅｒである、条項２のペプチド。
４．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも２つ、３つ、または４つすべては、Ｄ−アミノ酸および／または非標準アミノ酸または非天然アミノ酸ある、条項１〜３のいずれか一項に記載のペプチド。
５．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５は、少なくとも２つ、３つ、または４つの異なるアミノ酸を含む、条項１〜４のいずれか一項に記載のペプチド。
６．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、疎水性アミノ酸である、条項１〜５のいずれか一項に記載のペプチド。
７．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、Ａｌａである、条項１〜６のいずれか一項に記載のペプチド。
８．Ｘ１およびＸ２は、両方ともＡｌａである、条項１〜７のいずれか一項に記載のペプチド。
９．Ａｌａは、ＤＡｌａまたはβＡｌａである、条項７または８に記載のペプチド。
１０．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、荷電アミノ酸である、条項１〜９のいずれか一項に記載のペプチド。
１１．各荷電アミノ酸は、Ａｒｇ、ＤＡｓｐ、およびＬＯｒｎから選択される、請求項１０のペプチド。
１２．Ｘ１、Ｘ２、Ｘ４、およびＸ５のうちの少なくとも１つは、極性アミノ酸である、条項１〜１１のいずれか一項に記載のペプチド。
１３．各極性アミノ酸は、ＬＳｅｒ、ＤＳｅｒ、およびＴｈｒから選択される、請求項１２のペプチド。
１４．以下の配列を含むペプチドであって、
Ｘ１−Ｘ２−Ｘ３−Ｘ４−Ｘ５−Ｘ６−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−Ｘ１３−Ｘ１４−Ｘ１５−Ｘ１６−Ｘ１７−Ｘ１８−Ｘ１９−Ｘ２０
式中、Ｓｉａｌは、シアリル基であり、Ｘ１は、存在しないか、またはＴｈｒであり、Ｘ２は、存在しないか、またはＤＡｌａであり、Ｘ３は、存在しないか、またはＮｌｅであり、
Ｘ４は、存在しないか、またはＧｌｕであり、Ｘ５は、存在しないか、またはＤＡｌａであり、Ｘ６は、存在しないか、またはＡｒｇであり、Ｘ７は、存在しないか、またはＧｌｕ、Ａｒｇ、Ｓｅｒ、Ｎｖａ、βＡｌａから選択され、Ｘ８は、存在しないか、またはＤＳｅｒ、ＤＡｌａ、ＳＥＰ、Ｃｙｃから選択され、
Ｘ９は、存在しないか、またはＮｖａ、ＢＩＰ、ＤＡｌａ、βＡｌａ、Ｏｒｎから選択され、
Ｘ１０は、Ｃｙｃ、Ｓｅｒ、Ｉｌｅ、ＤＡｌａ、ＤＳｅｒから選択され、Ｘ１１は、ＤＡｌａ、Ｐｒｏ、Ｏｒｎ、Ｎｌｅから選択され、
Ｘ１２は、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｙｒ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ａｓｎ、Ａｒｇ、またはＳＥＰから選択され、
Ｘ１３は、ＤＡｌａ、ＢＩＰ、βＡｌａから選択され、Ｘ１４は、Ａｒｇ、ＤＡｓｐ、Ｎｌｅ、Ｏｒｎ、Ｎｖａから選択され、
Ｘ１５は、存在しないか、またはＰｈｅ、ＢＩＰ、Ｓｅｒ、Ｇｌｕ、ＤＡｌａ、ＤＳｅｒから選択され、
Ｘ１６は、存在しないか、またはＤＳｅｒ、Ｇｌｕから選択され、
Ｘ１７は、存在しないか、またはＶａｌ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒから選択され、Ｘ１８は、存在しないか、またはＣｈａであり、
Ｘ１９は、存在しないか、またはＤＳｅｒであり、Ｘ２０は、存在しないか、またはＶａｌである、ペプチド。
１５．Ｘ１２は、Ｓｅｒである、条項１４のペプチド。
１６．ペプチドは、以下の配列を含む、条項１〜１５のいずれか一項に記載のペプチド。
（ｉ）Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ
（ｉｉ）Ｇｌｕ−ＤＳｅｒ−Ｎｖａ−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ
（ｉｉｉ）Ａｒｇ−ＤＡｌａ−ＢＩＰ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−ＤＡｓｐ−Ｓｅｒ
（ｉｖ）Ｓｅｒ−ＳＥＰ−ＤＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｏｒｎ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ
（ｖ）ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−βＡｌａ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＢＩＰ−Ｏｒｎ−ＤＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、または
（ｖｉ）Ｔｈｒ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−βＡｌａ−Ｃｙｃ−Ｏｒｎ−ＤＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−βＡｌａ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｃｈａ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ
１７．Ｎｌｅ、Ｎｖａ、Ｏｒｎ、および／またはＣｈａは、それぞれＬＮｌｅ、ＬＮｖａ、ＬＯｒｎ、およびＬＣｈａである、条項１５または１６のいずれか一項に記載のペプチド。
１８．ペプチドは、１つ以上の特定のシアリダーゼによる切断のためにバイアスされる、条項１〜１７のいずれか一項に記載のペプチド。
１９．１つ以上の特定のシアリダーゼは、細菌起源である、条項１８に記載のペプチド。
２０．細菌は、プレボテラ、バクテロイデスおよび／もしくはモビルンカス種および／またはガードネレラ・バギナリスである、条項１９に記載のペプチド。
２１．シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出する際における使用のためのインジケータ分子であって、インジケータ分子は、
ａ）条項１〜２０のいずれか一項で定義されるペプチド、および
ｂ）試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断後も無傷のままである捕捉部位、を含む、インジケータ分子。
２２．捕捉部位は、ビオチン分子またはオキシム部分を含む、条項２１に記載のインジケータ分子。
２３．捕捉部位は、ペプチドのＮ末端またはＣ末端にある、条項２１または２２に記載のインジケータ分子。
２４．捕捉部位は、リンカーによってペプチドに結合されている、条項２１〜２３のいずれか一項に記載のインジケータ分子。
２５．リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分を含む、条項２４に記載のインジケータ分子。
２６．ペプチドは、ポリエチレングリコール部分を含むか、ポリエチレングリコール部分から本質的になるか、またはポリエチレングリコール部分からなる、リンカーを介して、そのＮ末端またはＣ末端でビオチン基に結合されている、条項２５に記載のインジケータ分子。
２７．インジケータ分子が以下の構造を含む、条項２１〜２６に記載のインジケータ分子。
（ｉ）Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−ビオチン
（ｉｉ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−ＤＳｅｒ−Ｎｖａ−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ
（ｉｉｉ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ａｒｇ−ＤＡｌａ−ＢＩＰ−Ｓｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−ＤＡｓｐ−Ｓｅｒ
（ｉｖ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｓｅｒ−Ｓｅｒ（ＰＯ３）−ＤＡｌａ−Ｉｌｅ−Ｏｒｎ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ
（ｖ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−βＡｌａ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＢＩＰ−Ｏｒｎ−ＤＡｌａ−Ｇｌｕ−Ｓｅｒ、または
（ｖｉ）ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｔｈｒ−ＤＡｌａ−Ｎｌｅ−Ｇｌｕ−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−βＡｌａ−Ｃｙｃ−Ｏｒｎ−ＤＳｅｒ−Ｐｒｏ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−βＡｌａ−Ｎｖａ−ＤＳｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｈｒ−Ｃｈａ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ
２８ａ．条項１〜２０のいずれか一項に記載のペプチドの脱シアル化誘導体、または条項２１〜２７のいずれか一項に記載のインジケータ分子に特異的に結合することができる抗体であって、抗体は、シアル化ペプチドまたはインジケータ分子よりも脱シアル化誘導体に優先的に結合する、抗体。
２８ｂ．３つのＣＤＲを有する重鎖および３つのＣＤＲを有する軽鎖を有する抗体であって、重鎖ＣＤＲ１は、配列番号１を有し、重鎖ＣＤＲ２は、配列番号２を有し、重鎖ＣＤＲ３は、配列番号３を有し、軽鎖ＣＤＲ１は、配列番号４を有し、軽鎖ＣＤＲ２は、配列番号５を有し、および／または軽鎖ＣＤＲ３は、配列番号６を有する、抗体。
２８ｃ．配列番号７の重鎖および／または配列番号８の軽鎖を有する、抗体。
「条項２８」へのいずれの言及も、条項２８ａ、条項２８ｂ、および条項２８ｃを含むと理解されるべきである。
２９．抗体は、エピトープ：
Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−ビオチン、より特定的には、エピトープ
Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇに特異的に結合することができる、条項２８に記載の抗体。
３０．抗体は、レポータ分子に結合されている、条項２８または２９に記載の抗体。
３１．レポータ分子は、金粒子である、条項３０に記載の抗体。
３２．条項２８に記載の抗体を生成する際における使用のためのペプチドであって、ペプチドは、条項１〜２０のいずれか一項で定義されるペプチドの脱シアル化誘導体である、ペプチド。
３３．ペプチドは、免疫原性を改善するために担体タンパク質に結合されている、条項３２に記載の使用のためのペプチド。
３４．ペプチドは、キーホールリンペットヘモシアニンに結合されている、条項３３に記載の使用のためのペプチド。
３５．シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物であって、デバイスは、
（ｉ）条項２１〜２７のいずれか一項で定義されるインジケータ分子と、
（ｉｉ）試験試料を受容する捕捉ゾーンであって、捕捉ゾーンは、インジケータ分子を固定化するために、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、インジケータ分子の捕捉部位と結合することができる捕捉分子を含む、捕捉ゾーンと、
（ｉｉｉ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない、結合分子と、を含む、酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
３６．デバイス、キット、または組成物は、捕捉分子が付着して捕捉ゾーンを形成する固体支持体を含む、条項３５に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
３７．固体支持体は、試料が適用される試料適用ゾーンをさらに含む、条項３６に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
３８．固体支持体は、試料適用ゾーンに関して捕捉ゾーンの下流にコントロールゾーンをさらに含み、デバイス、キット、または組成物を使用するアッセイの正常な完了を示すために結合分子に結合する、さらなる結合分子を含む、条項３６〜３７のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
３９．固体支持体は、クロマトグラフィー媒体を含む、条項３６〜３８のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
４０．インジケータ分子は、捕捉分子に結合される捕捉部位を介して捕捉ゾーンに固定化される、条項３５〜３９のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物。
４１．シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在または不存在を検出するための方法であって、方法は、
（ｉ）条項２１〜２７のいずれか一項で定義されるインジケータ分子を試験試料と接触させる工程、
（ｉｉ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を、試験試料に添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、
（ｉｉｉ）捕捉ゾーンにおける捕捉分子の捕捉部位への結合によって、捕捉ゾーンにおいてインジケータ分子の脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、捕捉分子は、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合することができる工程、および
（ｉｖ）捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程を含む、方法。
４２．シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在または不存在を検出するための方法であって、方法は、
（ｉ）捕捉分子を含む捕捉ゾーンに試験試料を添加する工程であって、当該捕捉分子は条項２１〜２７のいずれか一項で定義されるインジケータ分子の捕捉部位に結合され、当該捕捉分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生しているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合されたままである工程、
（ｉｉ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、および
（ｉｉｉ）捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程を含む、方法。
４３．インジケータ分子は、ステップ（ｉ）の前に、インジケータ分子が捕捉分子を介して捕捉ゾーンに結合されるように、捕捉ゾーンに添加される、条項４２に記載の方法。
４４．試験試料において細菌性膣炎を、試料中のシアリダーゼ酵素の切断活性を検出することによって診断するための方法であって、方法は、
（ｉ）条項２１〜２７のいずれか一項で定義されるインジケータ分子を試験試料と接触させる工程、
（ｉｉ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を試験試料に添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、
（ｉｉｉ）捕捉ゾーンにおける捕捉分子の捕捉部位への結合によって、捕捉ゾーンにおいてインジケータ分子の脱シアル化誘導体を捕捉する工程であって、捕捉分子は、インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合することができる工程、および
（ｉｖ）捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程であって、コントロールと比較して切断の増加したレベルが細菌性膣炎を診断する工程を含む、方法。
４５．試験試料において細菌性膣炎を、試料中のシアリダーゼ酵素の切断活性を検出することによって診断するための方法であって、方法は、
（ｉ）捕捉分子を含む捕捉ゾーンに試験試料を添加する工程であって、捕捉分子は条項２１〜２７のいずれか一項で定義されるインジケータ分子の捕捉部位に結合され、捕捉分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生しているかいないかに関わらず、捕捉部位に結合されたままである工程、
（ｉｉ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子を添加する工程であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない工程、および
（ｉｉｉ）捕捉ゾーンにおいて捕捉されたインジケータ分子の脱シアル化誘導体への結合分子の結合を判定することによって、インジケータ分子からのシアリル基の切断を検出する工程であって、コントロールと比較して切断の増加したレベルが細菌性膣炎を診断する工程を含む、方法。
４６．インジケータ分子は、ステップ（ｉ）の前に、インジケータ分子が捕捉分子を介して捕捉ゾーンに結合されるように、捕捉ゾーンに添加される、条項４５に記載の方法。
４７．シアリダーゼ酵素は、プレボテラ、バクテロイデスおよび／もしくはモビルンカス種および／またはガードネレラ・バギナリスに由来する、条項４１〜４６のいずれか一項に記載の方法。
４８．方法は、条項３５〜４０のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物を使用して実施される、条項４１〜４７のいずれか一項に記載の方法。
４９．方法は、条項３５〜３９のいずれか一項に記載のデバイス、キット、または組成物を使用して実施され、さらに、試験試料およびインジケータ分子は、試験試料をデバイス、キット、または組成物に接触させる前に混合される、条項４１、４４、または４７のいずれか一項に記載の方法。
５０．シアリダーゼ酵素の切断活性の試験試料における存在を検出するための酵素検出キットであって、キットは、
（ｉ）試験試料に添加するための条項２１〜２７のいずれか一項で定義される、インジケータ分子と、
（ｉｉ）インジケータ分子が切断されているかいないかに関わらず、インジケータ分子の捕捉部位に結合することができる、捕捉分子と、
（ｉｉｉ）捕捉分子を付着させて、試験試料を受容する捕捉ゾーンを形成することができる、固体支持体と、
（ｉｖ）インジケータ分子の脱シアル化誘導体に結合することができる結合分子であって、結合分子は、試料中に存在するシアリダーゼ酵素によるインジケータ分子からのシアリル基の切断が発生していない場合、および発生するまで、結合分子がインジケータ分子に結合することができない、結合分子と、を含む、酵素検出キット。
５１．キットは、結合分子に結合することができるさらなる結合分子（コントロール検出結合物質）をさらに含む、条項５０に記載の酵素検出キット。
５２．固体支持体は、試料適用ゾーンに関して捕捉ゾーンの下流に、さらなる結合分子（コントロール検出結合物質）を付着させることができるコントロールゾーンをさらに含む、条項５１に記載の酵素検出キット。
５３．結合分子は、条項２８〜３１のいずれか一項で定義される抗体を含む、条項３５〜４０のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物、条項４１〜４９のいずれか一項に記載の方法、あるいは条項５０〜５２のいずれか一項に記載の酵素検出キット。
５４．捕捉部位は、ビオチン分子を含み、捕捉ゾーンはストレプトアビジン分子を含む、条項３５〜４０または５３のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、または酵素検出組成物、条項４１〜４９または５３のいずれか一項に記載の方法、あるいは条項５０〜５３のいずれか一項に記載の酵素検出キット。
５５．細菌性膣炎を試験試料において診断するための、条項３５〜４０、５３、または５４のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、もしくは酵素検出組成物、条項４１〜４９、５３、または５４のいずれか一項に記載の方法、あるいは条項５０〜５４のいずれか一項に記載の酵素検出キットの、使用。
５６．試験試料は、膣試料、任意選択的に膣スワブである、条項２１〜２７のいずれか一項に記載のインジケータ分子、条項３５〜４０、５３、または５４のいずれか一項に記載の酵素検出デバイス、酵素検出キット、もしくは酵素検出組成物、条項４１〜４９、５３、または５４のいずれか一項に記載の方法、条項５０〜５４のいずれか一項に記載の酵素検出キット、あるいは条項５５に記載の使用。
【図面の簡単な説明】
【００８８】
次に、本発明を、添付の図面に関して例として説明する。
【００８９】
【図１】図１は、本発明によるアッセイの一形態の概略図である。この形態は、基本的な構成要素として、固体支持体（１）、捕捉分子（２）、捕捉部位（３）および本発明のペプチドであってＧａｌ−Ｓｉａｌ切断部位（４）を含むペプチドを含むインジケータ分子、ならびに切断（６）が発生した後にのみインジケータ分子に結合する結合分子（５）に依存する。インジケータ分子Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−ビオチン（配列番号１１−ＰＥＧ−ビオチン、本明細書では「ＭＯＬ６００ｃ」とも呼ぶ）は、一例として示される。
【図２】図２は、本発明による酵素検出デバイスの概略図であり、シアリダーゼ活性が存在しない（図２Ａ）、または存在する（図２Ｂ）際のデバイスの作用を示す。
【図３】図３は、試験試料中のシアリダーゼ活性のレベルを増加させたときのアッセイ（図２に示す）の視覚的読み取りを示す。
【図４】図４は、本発明による酵素検出デバイスの概略図である。図は、カード構成要素の各々の正確な縦方向の寸法および位置を特定する。
【図５】図５は、本発明のペプチドをキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）に結合するために使用される２つの結合化学の概略図であり、（Ａ）システイン／マレイミド結合、（Ｂ）ヒドラジン／ベンズアルデヒド結合である。
【図６】図６は、本発明のペプチドの設計の際に使用される非標準および非天然アミノ酸のいくつかを示す。
【図７】図７は、本発明のペプチドを生成するために使用される合方法を要約する概略図である。
【図８】図８は、トランシアリダーゼおよびフェチュイン（シアル酸供与体）を使用した酵素経路による本発明のシアル化ペプチドの生成を示す。
【図９】図９は、本発明の一部として合成された様々なペプチドおよびペプチド−タンパク質コンジュゲートを示す。（Ａ）合成されたペプチドおよびペプチド−タンパク質コンジュゲートの表形式の要約。（Ｂ）合成されたペプチドおよびペプチド−タンパク質コンジュゲートの概略図。
【図１０】図１０は、本発明のＫＬＨ−ペプチドコンジュゲートによるヒツジの免疫化後の初期ＥＬＩＳＡの結果を示す。（Ａ）検出方法の概略図、（Ｂ）〜（Ｄ）最初の採血からの結果であり、すべてのヒツジが免疫化に反応したことを示す。番号１０５６、１０５７、１０５８、１０５９、１０６２、１０６３、１０６４、１０６５、１０６６、および１０６７は、それぞれ特定の免疫化したヒツジからの抗血清を示す。
【図１１】図１１Ａ〜Ｃは、図１０に記載されているヒツジの２回目の採血からのＥＬＩＳＡの結果を示す。抗血清は、最初の採血と比較して、２回目の採血で応答の増加を示した。
【図１２】図１２Ａ〜Ｂは、ヒツジＣＦ１０６２〜１０６７について比較した３回すべての採血を示す。
【図１３】図１３は、抗血清ＣＦ１０６４をＭＯＬ１３６およびＭＯＬ１３６ｃに対して評価した場合のＥＬＩＳＡの結果を示す。（Ａ）検出方法の概略図、（Ｂ）ＥＬＩＳＡの結果は、シアル化ペプチドＭＯＬ１３６ｃよりもガラクトシル（すなわち、脱シアル化）ペプチドＭＯＬ１３６に対する有意な特異性を示す。
【図１４】図１４は、金標識ＣＦ１０６４を使用した流動アッセイによる脱シアル化ペプチドＭＯＬ１３６の検出を示し、シアル化ペプチドＭＯＬ１３６ｃまたは陰性コントロール（試料にペプチドが含まれていない）に関してほとんど／まったくシグナルが認められない。
【図１５】図１５は、金標識ＣＦ１０６４およびＣＦ１０６５を使用した側方流動アッセイによる脱シアル化ペプチドＭＯＬ１３６の検出を示し、シアル化ペプチドＭＯＬ１３６ｃまたは陰性コントロール（試料にペプチドが含まれていない）に関してほとんど／まったくシグナルが認められない。
【図１６】図１６は、健康な膣スワブ抽出物の存在下での金標識ＣＦ１０６４のＭＯＬ１３６およびＭＯＬ１３６ｃとの結合を比較する側方流動アッセイを示す。
【図１７】図１７は、２５Ｕ／ｍｌシアリダーゼの存在下でのＭＯＬ１３６ｃの側方流動アッセイを示す。
【図１８】図１８は、異なるアフィニティー精製抗血清画分間の比較を示す側方流動データを示す。（Ａ）ライン強度のグラフ表示、（Ｂ）観察された側方流動テストストリップ：（１）−金感作アフィニティー精製ポリクローナル抗体、（２）−交差反応性抗体を除去した金感作アフィニティー精製ポリクローナル抗体、（３）金感作した、アフィニティー精製からの交差反応性抗体。
【図１９】図１９は、（Ａ）ＥＬＩＳＡによるＭＯＬ１３６、ＭＯＬ１３６ｃ、ＭＯＬ６００、およびＭＯＬ６００ｃ結合の比較、ならびに（Ｂ）ＭＯＬ１３６／１３６ｃによる比較で性能の著しい改善を示す側方流動実験を示す（図１８を参照）。
【図２０】図２０は、ポリプロピレンチューブ内で熱乾燥したＭＯＬ６００ｃに関する安定性データを、異なる保存温度および２つの異なる熱乾燥方法である高速真空法およびヒートブロック法について示す。ＥＬＩＳＡでの測定は、脱シアル化のパーセンテージに基準化し、これによって、抗体による認識およびシグナルの増加が得られる。
【図２１】図２１は、ＭＯＬ６００ｃバッチの代表的なデータを示す。（Ａ）分析ＨＰＬＣトレース、（Ｂ）ポジティブイオンエレクトロスプレーＭＳの確認。
【図２２】図２２は、異なるセファロースマトリックスを用いた抗体精製のために使用されるカラム法を示す概略図である。ＭＯＬ６００およびＭＰＬ６００ｃに関して示されるオレンジ色のタグはビオチンを表す。ＭＯＬ６１５に関して示される紫色のタグは、オキシム基を表す。
【図２３】図２３は、３７℃で１２週間保存した側方流動カセットの安定性データを示す。
【図２４】図２４は、ペプチドＭＯＬ６００ｃと共に５分間インキュベートしたシアリダーゼ濃度の側方流動標準曲線を示す。テストラインは、キューブリーダを使用して定量化した。
【図２５】図２５は、フロックスワブでの健康なボランティアの膣試料の側方流動試験を示す。試料を１ｍｌの試料緩衝液で抽出し、５つの処理に分割した。（Ａ）ペプチド無添加試料、（Ｂ）ＭＯＬ６００ｃを添加した試料、（Ｃ）ＭＯＬ６００ｃおよびシアリダーゼを５００Ｕ／ｍｌで５分間添加した試料、（Ｄ）スピンダウンしたＭＯＬ６００ｃ添加試料、（Ｅ）スピンダウンしたＭＯＬ６００ｃおよび同シアリダーゼインキュベーション添加試料。
【図２６】図２６は、ＭＯＬ６１６の化学式を示す。
【図２７】図２７は、シアル化型であるＭＯＬ６００ｃと比較した、ＭＯＬ６００に対する抗体１２５．１の特異性を示す実施例１３の結果を示す。
【図２８】図２８は、異なるシアリダーゼ濃度範囲を使用したアッセイＡおよびＢの比較を示す。各シアリダーゼ濃度について、左側のバーはアッセイＢのキューブ読み取りを表し、右側のバーはアッセイＡのキューブ読み取りを表す。
【図２９】図２９は、異なるシアリダーゼ濃度および読み取り時間の範囲を使用したアッセイＡおよびＢの比較を示す。各シアリダーゼ濃度について、バーは左から右へ（ｉ）５分の読み取り時間後のアッセイＡのキューブ読み取り、（ｉｉ）１０分の読み取り時間後のアッセイＡのキューブ読み取り、（ｉｉｉ）５分の読み取り時間後のアッセイＢのキューブ読み取り、（ｉｖ）１０分の読み取り時間後のアッセイＢのキューブ読み取りを表す。
【図３０】図３０は、異なるシアリダーゼ濃度、インジケータ濃度、および読み取り時間を使用したアッセイＡ、Ａ’、Ｂ、およびＢ’の比較を示す。各シアリダーゼ濃度について、バーは左から右へ、（ｉ）ディスクあたり１μｇ／ｍｌのインジケータ分子および５分の読み取り時間を用いたアッセイＢのキューブ読み取り、（ｉｉ）ディスクあたり３μｇ／ｍｌのインジケータ分子および５分の読み取り時間を用いたアッセイＢのキューブ読み取り、（ｉｉｉ）ディスクあたり１μｇ／ｍｌのインジケータ分子および１０分の読み取り時間を用いたアッセイＡのキューブ読み取り、ならびに（ｉｖ）ディスクあたり３μｇ／ｍｌのインジケータ分子および１０分の読み取り時間を用いたアッセイＡのキューブ読み取りを表す。
【図３１】図３１は、抗体１２５．１の配列を示し、ＣＤＲおよびフレームワーク領域を表す。
【００９０】
好ましい実施形態の説明
図１は、本発明によるアッセイの１つの形態の概略図である。この形態は、次の基本的な成分として、固体支持体（１）、捕捉分子（２）、捕捉部位（３）および本発明のペプチドであってＧａｌ−Ｓｉａｌ切断部位（４）を含むペプチドを含むインジケータ分子、ならびに切断（６）が発生した後にのみインジケータ分子に結合する結合分子（５）に依存する。インジケータ分子Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−ビオチン（本明細書では「ＭＯＬ６００ｃ」とも呼ぶ）は、一例として示される。
【００９１】
示されている形態では、捕捉分子（２）はストレプトアビジンである。ここで、捕捉分子（２）は、インジケータ分子内のビオチン捕捉部位（３）に結合する。
【００９２】
図１Ａに示すように、本発明のインジケータ分子が試験試料に添加されると、試料中に存在するシアリダーゼ酵素は、Ｇａｌ−Ｓｉａｌ切断部位（４）を特異的に認識し、インジケータ分子（６）からシアリル基を切断する。
【００９３】
図１Ｂに示すように、この切断発生（６）は、特異的抗体結合分子（５）の結合部位を生じる。結合分子（５）は、切断（６）が発生するまで、インジケータ分子に結合することができない。したがって、抗体結合分子（５）は、シアリル基の切断の結果として生成されるアミノ酸配列Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇに結合する。抗体結合分子（５）は、切断前にＣｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ配列に結合しない（図示せず）。
【００９４】
図２は、本発明による酵素検出デバイスの概略図であり、シアリダーゼ活性が存在しない（図２Ａ）、または存在する（図２Ｂ）際におけるデバイスの作用を示す。テストストリップは、デバイスの他の構成要素が組み立てられる接着性ライナー（１）を含む。右から左に、試料適用ゾーン（２）は吸収パッドの形態である。これは、標識結合分子（７）が含浸されたコンジュゲートパッド（３）と部分的に重ねて配置される。代替的な実施形態では、標識結合分子は試料適用ゾーンに含浸され得、これにより、別々のコンジュゲートパッドの必要性が取り除かれる。コンジュゲートパッド（３）は、ニトロセルロース膜（４）と流体接続される。ニトロセルロース膜（４）は、捕捉ゾーンを定める固定化ストレプトアビジン分子（５）を含む。膜（４）は、捕捉ゾーンの下流に固定化されたさらなる結合分子（６）をさらに含み、試料と共にデバイスを通過し、別のコントロールゾーンを形成するさらなる標識分子（１１）に結合する。代替的に、固定化されたさらなる結合分子は、標識された結合分子に結合し得る（７）。デバイスは、任意選択的に、デバイスの端部に到達する任意の試験試料および試薬を吸収するための吸収パッド（８）をさらに含む。
【００９５】
使用中、インジケータ分子（９）は、試験試料がデバイスの試料適用ゾーン（８）と接触する前に、試験試料に添加される。図２Ａに示すように、試験試料にシアリダーゼ活性が存在しない場合、シアリル基はインジケータ分子（９）から切断されない。試料がコンジュゲートパッド（３）に流入すると、シアリル基の切断が発生していないため、結合分子（７）はインジケータ分子（９）に結合することができない。インジケータ分子は、ストレプトアビジン（５）とインジケータ分子（９）のビオチン捕捉部位（１０）の間の相互作用を介して、捕捉ゾーンで結合する。標識結合分子（７）は、インジケータ分子（９）に結合できないため、捕捉ゾーンに固定化されない。したがって、標識結合分子は、コントロールゾーンまで、かつそれを超えて通流する。さらなる標識分子（１１）もまた、デバイスを通ってコントロールゾーンまで通過し、そこで固定化されたさらなる結合分子（６）に結合することによって、それらは固定化される。したがって、シアリダーゼ活性の存在しないことは、コントロールゾーンでのみシグナルとして現れ、捕捉ゾーンでは現れない。過剰な試料は、標識結合分子（７）を含む可能性があり、吸収パッド（８）に流れ込む。
【００９６】
図２Ｂに示すように、試験試料にシアリダーゼ活性が存在する場合、シアリル基はインジケータ分子（９）から切断される。試料がコンジュゲートパッド（３）に流入すると、シアリル基の切断が発生しているため、結合分子（７）はインジケータ分子（９）に結合することができる。インジケータ分子は、ストレプトアビジン（５）とインジケータ分子（９）のビオチン捕捉部位（１０）の間の相互作用を介して、捕捉ゾーンで結合される。標識結合分子（７）は、切断部位で脱シアル化されたインジケータ分子（９）に結合することによって、捕捉ゾーンで固定化される。標識結合分子（７）は捕捉ゾーンでの結合部位よりも相対的に過剰なため、いくらかの標識結合分子（７）は、依然としてコントロールゾーンまで、かつそれを超えて通流する。さらなる標識分子（１１）もまた、デバイスを通ってコントロールゾーンまで通過し、そこで固定化されたさらなる結合分子（６）に結合することによって、それらは固定化される。したがって、シアリダーゼ活性の存在は、捕捉ゾーンおよびコントロールゾーンの両方でシグナルとして現れる。過剰な試料は、吸収パッド（８）に流れ込む。
【００９７】
コントロールゾーンは任意選択的であることに留意されたい。試料中のシアリダーゼ活性の有無は、捕捉ゾーンでの対応するシグナルの有無のみに基づいて監視することができる。
【００９８】
図３は、試験試料中のシアリダーゼ活性のレベルが増加したときのアッセイの視覚的読み取り（図２に示されている）を示す。容易に見て取れるように、コントロールゾーン（１）でのシグナルは、シアリダーゼの量が増加しても一定である。対照的に、シアリダーゼの量が増加すると、捕捉ゾーン（２）でのシグナルも増加する。これは、シアリダーゼ活性による、切断部位でのインジケータ分子からのシアリル基の切断によるものである。これは結合部位を露出させ、捕捉ゾーンを定める捕捉分子とインジケータ分子の捕捉部位との間の相互作用を介して捕捉ゾーン（２）で検出される結合分子の結合を可能にする。
【００９９】
図４は、本発明による１つの具体的な酵素検出デバイスの概略図である。以下の表は、図の凡例を示し、この特定の実施形態におけるカード構成要素の各々の正確な長手方向の寸法および位置を特定する。当然のことながら、当業者によって容易に理解されるように、寸法および位置は変化され得る。
【表１】
2021531763.tif 000006
【０１００】
本発明は、以下の実験例を参照してさらに理解されるであろう。
【実施例】
【０１０１】
実施例１：アッセイ化学原理および実験計画
要約すると、原理はシアリダーゼ反応の化学生成物の抗体認識に基づいて機能し、化学基質はシアリダーゼと反応するように特別に設計されたペプチドであり、反応の生成物はその合成生成物に対して高められた抗体によって認識される。図１および２に示すように、シアル酸を含み、ビオチンタグを有する糖ペプチドが提供される。シアリダーゼ活性を含む試験試料と接触すると、シアリル基がシアリダーゼによって糖ペプチドから切断され、ペプチドにペンダントガラクトシル基を露出する。次に、脱シアル化生成物に対して高められた抗体が、切断された生成物に特異的に結合する。抗体−金コンジュゲートおよびストレプトアビジンテストラインを備えた側方流動ストリップを使用することによって、脱シアル化生成物の存在は赤色ラインとして、かつ試料中のシアリダーゼ活性の直接測定として検出することができる。
【０１０２】
５つのペプチドを最初に設計し、続いて高められた抗体を、側方流動アッセイにおけるそれらの性能について評価してプロファイリングした。最適化された条件下で、抗体のいくつかは、基質ペプチドに対するそれらの交差反応性およびアッセイにおけるそれらの全体的なシグナルレベルに関して、他より性能の優れていることが示された。プロジェクトの実現可能性段階に関して以下に説明する評価では、ペプチドを再評価し、最高の性能を有するペプチド／抗体の組み合わせによってさらなる開発に進んだ。
【０１０３】
実施例２：ペプチド設計
候補ペプチド配列の設計では、いくつかの要因が考慮された。
サイズ
原則として、分子量（ＭＷ）が５０００ダルトン未満の分子は、宿主生物における良好な免疫応答を刺激する可能性は低い。ペプチドは、著しく効果的な免疫原をもたらすＫＬＨ（キーホールリンペットヘモシアニン）に結合することを意図して、比較的短い配列として計画された。性能におけるあらゆる変化の可能性を網羅するために、異なる長さ（９〜２０アミノ酸）が提案された。
【０１０４】
結合化学
２つの異なる結合化学を使用した。ペプチドのうちの２つについては、システイン標識が構造に組み込まれているため、標準的なマレイミドベースの化学を使用して担体タンパク質に結合させることができた。他の３つのペプチドについては、結合前のペプチドの酸化のリスクが少なく、結合の程度をＵＶ吸光度によって容易にモニタリングできるため、システイン化学よりも制御可能な処理である比較的新しいヒドラジンベースの化学を使用した。これらの結合化学の概要を図５に示す。
【０１０５】
ガラクトース糖の位置
目的は、ガラクトース糖およびペプチドの周辺領域に対して非常に高い親和性を有する抗体を得ることだった。これを念頭におき、糖を構造の中央に配置し、それにより、他の特有なペプチド特性によって側面が十分配置された。この手法は、糖部分との相互作用を欠いた周辺結合抗体を最小限に抑えることが期待される。
【０１０６】
構造多様性
広範なアミノ酸が、様々なペプチド配列を構築する際に使用された。荷電、親水性、および疎水性基を配列に沿って組み合わせることによって、多様なトポロジーが促進される。β−アラニンなどの「ヒンジ基」も採用し、全体的な構造的折り畳みにおけるさらなる自由度を可能にした。これに加えて、非天然アミノ酸を使用して、配列の多様性を増加させ、免疫応答を促進させた。プロテアーゼに対する感受性を低減するために、いくつかのＤ−アミノ酸も組み込んだ。使用されている非標準および非天然アミノ酸のいくつかを図６に示す。
【０１０７】
これらの要因の考慮後、以下のペプチド配列が推定的エピトープとして選択された。
【表２】
2021531763.tif 000007
【０１０８】
スペーサー、結合基、およびビオチン標識を、ＣまたはＮ末端に追加した。
【０１０９】
実施例３：ペプチド合成
ガラクトース標識ペプチドは、自動マイクロ波シンセサイザーで固相化学法を使用して合成した。すべてのペプチドは逆相ＨＰＬＣを使用して精製し、エレクトロスプレーＬＣＭＳによって特性付けした。ガラクトース部分をシアル酸で標識するために、Ｔ．クルーズ由来の組換えトランシアリダーゼ（ＴｃＴＳ）およびシアル酸供与体としてフェチュインを使用する酵素経路を採用した。図７および図８は、使用した合成手法をまとめて示す。
【０１１０】
担体タンパク質との結合のために関連するペプチド免疫原と同様に、各配列の２つのビオチン化誘導体も合成し、１つはシアル酸で標識した。これらのビオチン化誘導体は、側方流動アッセイ方式のための基礎を形成する。図９は、様々な免疫化によるこの研究のために合成されたペプチドを示す。シアル酸で標識されたペプチドは「ｃ」で指定され、例えば、ＭＯＬ１３６ｃである。シアリル基を欠くペプチドは、この指定がない（例えば、ＭＯＬ１３６）。
【０１１１】
実施例４Ａ：抗体生成
免疫化
５つのペプチド免疫原はすべて、適切な結合化学を使用して、ＫＬＨおよびＢＳＡに結合された（図９を参照）。ＫＬＨコンジュゲートは、１０頭のヒツジへの免疫化のため（ペプチドあたり２頭）、Ｍｉｃｒｏｐｈａｒｍ  Ｌｔｄに寄託された。計画は、ＰＢＳ中に１ｍｇのＫＬＨ−ペプチドの用量で開始された。０．５ｍｇの３回の追加免疫を、３ヶ月の期間にわたって加えた。３回の別々の採血をこの期間に実施し（１回の試料および２回の製造用採血）、Ｍｏｌｏｇｉｃに供給した。ＢＳＡコンジュゲートを保持して、多数の採血のスクリーニングを実施した。
【０１１２】
初期ＥＬＩＳＡスクリーン
ポリスチレン高結合マルチウェルプレートは、適切なＢＳＡコンジュゲートおよびコントロールとしての非コンジュゲート化ＢＳＡによって感作した。血清試料は、ＢＳＡでブロックしたウェル中で様々な希釈率でインキュベートし、さらにアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合された二次抗ヒツジ抗体と結合させた。パラ−ニトロフェニルホスフェート（ｐＮＰＰ）ＡＰ基質とのインキュベーションは、何らかの結合の存在を示した。すべての場合において、緩衝液、ＢＳＡ、および採血前コントロールは、プレートへのバックグラウンド結合を生じなかった。図１０Ａは検出方法の概略図を示す。図１０Ｂ〜１０Ｄは、最初の採血の結果を表し、すべてのヒツジが免疫化に反応したことを示す。１／１０００の血清希釈は高いシグナルを示したが、一方、ＢＳＡのコントロールは陰性であり、ペプチド特異的応答を確認した。採血前コントロールも陰性だった。
【０１１３】
さらなる採血が利用可能になると、これらもＥＬＩＳＡによって分析し、期間の経過で応答の増強を示した。図１１は、すべてのヒツジについて最初の２回の採血間の関係を示し、一方、図１２は、ヒツジＣＦ１０６２〜１０６７について比較した３回の採血すべてを示す。興味深いことに、３回目の採血は、抗原に対するそれらの全応答に関して、プラトーまたは低下さえしているように思われる。それにもかかわらず、場合によっては、結合応答が１／１００００００希釈で検出され、ペプチドに高感度であるポリクローナル応答が示唆された。３回目の採血で応答がわずかに低いにもかかわらず、これらは非常に特異的な抗体の亜集団を含む可能性が最も高いため、アフィニティー精製に適していた。
【０１１４】
実施例４Ｂ：抗血清ＣＦ１０６４およびＣＦ１０６５、ならびにＭＯＬ１３６およびＭＯＬ１３６ｃの検出
免疫原：ＫＬＨ−ＭＯＬ１２３Ａ
ビオチン化ペプチド：ＭＯＬ１３６（ガラクトシル）、ＭＯＬ１３６ｃ（シアリル）
両方のヒツジともＫＬＨ−ＭＯＬ１２３Ａによる免疫化によく応答したが、ＣＦ１０６４は全体的にわずかに強い反応を示した（図１１Ｂを参照）。ＥＬＩＳＡ方式（その概略図を図１３Ａに示す）では、ＣＦ１０６４の結合をＭＯＬ１３６およびＭＯＬ１３６ｃに対して評価し、シアル化ペプチドＭＯＬ１３６ｃよりもガラクトシル（すなわち脱シアル化）ペプチドＭＯＬ１３６に有意な特異性を示した（図１３Ｂ）。したがって、抗血清ＣＦ１０６４による２つのペプチドの優れた識別が実証される。
【０１１５】
同様の特性が側方流動方式で認められた。ＣＦ１０６４は、最適化された条件（１０ｍＭホウ酸ナトリウム緩衝液に１５μｇ／ｍｌ添加、ｐＨ８．０）で金粒子に結合させ、最終濃度１．３ｎｇ／ｍｌ（３８ｐｇ／ストリップ）でＭＯＬ１３６およびＭＯＬ１３６ｃに対してアッセイした。したがって、捕捉ゾーンは、１．５ｍｇ／ｍｌストレプトアビジンを使用して各側方流動テストストリップに最初に形成された。次に、３μｌの各ペプチド（ＰＢＳＴ中に１２．５ｎｇ／ｍｌペプチド）を１０μｌの金標識ＣＦ１０６４および１５μｌのランニング緩衝液（ｐＨ７．５の０．５Ｍ  Ｔｒｉｓ＋３％ＢＳＡ＋０．５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００）と混合し、各試料について別々の側方流動テストストリップに沿って流した。ペプチドが添加されていない陰性コントロールも、陰性コントロールとして流した。次に、１５μｌのランニング緩衝液洗浄を各側方流動テストストリップに沿って流した。脱シアル化ペプチドＭＯＬ１３６が捕捉ゾーンで明確に検出され、テストストリップ上に目視可能なラインとして認められた。逆に、シアル化ペプチドＭＯＬ１３６ｃまたは陰性コントロールに関して、シグナルはほとんど／まったく認められなかった（図１４を参照）。
【０１１６】
同様の結果が金標識ＣＦ１０６５を使用して認められ、ＣＦ１０６４と比較してＣＦ１０６５で高いシグナルレベルが認められた（図１５を参照）。
【０１１７】
実施例５：健康な膣スワブ抽出物の存在下でＣＦ１０６４を使用したＭＯＬ１３６およびＭＯＬ１３６ｃの検出
実施例４Ｂに記載される手順を、健康な膣スワブ抽出物の存在下で繰り返した。シグナルレベルはわずかに低かったが、ＭＯＬ１３６への特異性はスワブマトリックスのいずれの干渉も伴わずに維持された（図１６を参照）。
【０１１８】
実施例６：ＭＯＬ１３６ｃおよびＣＦ１０６４を使用したシアリダーゼ活性の検出
実施例４Ｂに記載される手順を、２５Ｕ／ｍｌのシアリダーゼの存在下で繰り返した。シアリダーゼが存在しない試料を陰性コントロールとして使用した。ペプチドおよびシアリダーゼが試料に含まれていない、さらなる陰性コントロールについて実施した。陽性コントロールとして、２５Ｕ／ｍｌシアリダーゼの存在下で、ＭＯＬ１３６ｃの代わりにＭＯＬ１３６を使用した。ＰＢＳＴ中の２５Ｕ／ｍｌシアリダーゼの存在下で５分間インキュベートしたＭＯＬ１３６ｃに関して明確な陽性シグナルが認められた。シグナルのレベルは、推定的最大シグナルを示す陽性コントロールの強度と同様だった。予想されたように、陰性コントロールに関してほとんど／まったくシグナルが認められなかった（図１７を参照）。
【０１１９】
全体として、ＣＦ１０６４およびＣＦ１０６５の両方が、ガラクトシル（すなわち、脱シアル化）ペプチドＭＯＬ１３６に対して優れた特異性を示し、両方ともモノクローナルスクリーニングのために可能性がある候補である。
【０１２０】
実施例７：ペプチド開発
ペプチドおよび抗血清の評価後、血清ＣＦ１０６４ならびにペプチドＭＯＬ１３６およびＭＯＬ１３６ｃが試験に最も実行可能な組み合わせをもたらすことが示された。ヒツジＣＦ１０６４は、ＭＯＬ１３６と同じペプチド配列で免疫化されたが、ビオチンの代わりにシステイン−マレイミド化学を使用して、ＫＬＨコンジュゲートとして免疫された。
【０１２１】
ＭＯＬ１３６：ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−ＤＳｅｒ−Ｎｖａ−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ−ＯＨ
ＭＯＬ１３６ｃ：ビオチン−ＰＥＧ−Ａｓｐ−Ｇｌｕ−ＤＳｅｒ−Ｎｖａ−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ＤＳｅｒ−Ｖａｌ−ＯＨ
抗血清を精製するために、ストレプトアビジンカラムを使用してＭＯＬ１３６およびＭＯＬ１３６ｃを捕捉する方法が考案された。次に、抗体を結合させてＭＯＬ１３６カラムから溶出し、ＭＯＬ１３６ｃカラムに吸収させて、２つの構造間の共通のエピトープを拾い上げる周辺結合物質をすべて除去した。精製された抗体を側方流動で評価することによって、元のガラクトシルペプチド抗原に対する全体的な特異性およびシアル化ペプチドに対する交差反応性の程度を測定した（図１８）。これは、プロトタイプにおいて陰性結果として認められる非特異的結合の量を表し、光学リーダを使用しない場合、肉眼で検出されないように大幅に低減させることが必要であるため、重要である。
【０１２２】
精製および吸収された画分は、吸収されていない材料と比較した場合、アッセイで最高の性能を示した。著しく低いバックグラウンドシグナルにもかかわらず、さらなる方法の開発が、ペプチド構造を切断することによって性能を改善するために要求された。
【０１２３】
ペプチド設計を洗練して、ペプチドにおけるガラクトース部分に結合しない抗体の周辺相互作用を取り除くために、最初の配列ＭＯＬ１３６をより短い配列ＭＯＬ６００に切断した。
ＭＯＬ６００：ＮＨ２−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−ビオチン
ＭＯＬ６００ｃ：ＮＨ２−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−ビオチン
次に、ＭＯＬ６００およびＭＯＬ６００ｃをＥＬＩＳＡによってアッセイし、側方流動で性能の大幅な改善を示した（図１９を参照）。
【０１２４】
実施例８：ＭＯＬ６００ｃ製剤化／安定性試験およびスケールアップ生成
ＭＯＬ６００ｃペプチドをどのようにして製剤化することができるか評価するため、乾燥条件を調べる試験を設定した。ペプチドは乾燥緩衝液に配合し、風乾し、プロトタイプ形態での使用の前に室温で保存した。データを図２０に示し、ポリプロピレンチューブに異なる温度で、異なる乾燥方法を用いて保存されたペプチドＭＯＬ６００ｃの安定性を実証する。ペプチドは全体で４週目までそれらの機能を維持したが、性能は８週で低下するように思われる。
【０１２５】
製造に関して、ペプチド合成はスケーラブルであることが示されており、製造バッチまで増加することができる。ペプチドは、自動システムで固相合成によって生成され、次いでＨＰＬＣによって精製される。２つのさらなる化学的ステップが必要であり、さらに９５％を超える純度の仕様になるまでＨＰＬＣによるさらなる最終精製が必要である。生成物は、エレクトロスプレー質量分析によって確認される。ペプチドの１２ｎｇのみが試験あたりで必要とされ、ペプチドの１〜２ｍｇバッチは十分なサイズである。図２１は、ＭＯＬ６００ｃの完了バッチの典型的な分析データを示す。
【０１２６】
実施例９：抗体精製開発
最適化された切断ペプチドシステムと共に抗血清ＣＦ１０６４を用いて使用される精製プロセスは、ＭＯＬ６００を添加したストレプトアビジンカラムおよびＭＯＬ６００ｃを添加した吸収カラムで実施するように最初に開発した。このプロセスは優れた交差反応特性を有した有効な抗体を生成するが、一貫性を改善し、自動化のためにマニュアルステップの数を低減するさらなる改善が必要とされた。
【０１２７】
シングルパスを使用したより洗練された方法を探求するために、他のカラム方式を試み、実行可能であり、自動化される可能性があることが示された（図２２）。２つの異なるカラムタイプを使用しており、プロセスは、シングルパス法から、不要な相互作用がアッセイにおける非特異的結合を低減するために除去される吸収後の方法まで変化している。製造に最適な選択肢は、シングルパスプロセスであり、これは担体ＢＳＡに結合したペプチドＭＯＬ６１５を使用して達成することができ、ＮＨＳセファロースカラムで誘導され得る。
【０１２８】
ＭＯＬ６１５：ＮＨ２−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−オキシム
プロトタイプにおける抗体成分は、側方流動アセンブリ内のコンジュゲートパッドに乾燥された金コンジュゲートとして製剤化される。金コンジュゲートの安定化のための条件は確立されており、さらに最適化されている。試験あたりに必要とされる計算上の抗体量は８５ｎｇと見積もられ、ＣＥマーキングを達成するのに要求されるバリデーションバッチを作成するために十分なものである。長期的には、追加のポリクローナル試薬および−より永続的な解決策として−モノクローナル抗体が開発されなければならない。新しい免疫化が開始されており、強い抗体力価がすでにペプチド標的に対して特定されている（図１０）。いくつかの選択肢がモノクローナル生成に利用され、市販のハイブリドーマ技術、ならびにまたインハウスでのファージパンニングおよびｆａｂ生成（Ｍｏｌｏｇｉｃ  ＹｏｒｋおよびＳｃｏｔｉａ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ）が含まれる。
【０１２９】
実施例１０：試料緩衝液
スワブからの試料の抽出、ペプチドの溶解、およびシアリダーゼに最適な消化条件は、試料緩衝液の主要な要件である。以下の組成を使用した。
０．１％ＢＳＡ、０．１２５％Ｔｗｅｅｎ−２０、および０．３７５％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００を含有する１００ｍＭ酢酸ナトリウム、２ｍＭ塩化カルシウム、ｐＨ６．０
緩衝液は、ドライ状態のデバイスに流して添加回収における実試料を抽出するためにも効果的に使用されている。
【０１３０】
実施例１１：側方流動デバイス
側方流動デバイスは、図４に従って組み立てた。
【０１３１】
側方流動デバイスのバッチは、３７℃で１２週間にわたって安定性について評価した。６週間後、シグナルは初期測定よりも値で上昇したが、曲線の形状およびダイナミックレンジは比較的一貫しているように思われた（図２３を参照）。
【０１３２】
実施例１２：アッセイ最適化
実現可能な性能を満足させるために、アッセイ時間の長さ、マーカーに対する応答の感度、ラインシグナル強度、および標準曲線の質などの仕様要因を評価した。
【０１３３】
このアッセイは、５分のインキュベーション時間で機能することが示されている。これによって、スワブ試料の収集から結果の読み取りまで、アッセイの合計時間が１５分以内に維持される。体外診断業界では、ポイントオブケア迅速検査の上限として、一般的に１５分が標準である。
【０１３４】
マーカー（シアリダーゼ）の全関連範囲は、４Ｕ／ｍｌから２５０Ｕ／ｍｌであると考えられている。これは文献に基づいており、蛍光シアリダーゼ対照アッセイに関して、試料データセットの広がりを推定することによる（Ｍａｒｃｏｎｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｏｂｓｔｅｔｒｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｙｎａｅｃｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｒｅｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１３，ｖｏｌ．１６７，ｐａｇｅｓ  ２０５−２０９）。ＢＶ状態では、約２０の異なる細菌種がこの状態に関連付けられているため、多くの表現型（細菌性シアリダーゼ）が試料中に存在するという、この方法でなされる想定がある。アッセイは、緩衝液中のシアリダーゼのこの範囲にわたって試験されており、この範囲を表す標準曲線が側方流動で達成されている（図２４）。
【０１３５】
アッセイは実際の健康な試料でも試験されており、シグナルはシアリダーゼを添加することによって回収されている。試料がスピンダウンされるかされないかは、差を生じないことが示されている。テストラインの外観は、試料マトリックスの存在によって悪影響を受けなかった（図２５）。試料の移動度が十分であるためには、希釈試料緩衝液の０．５ｍｌは、試料の粘度が高すぎるままであり、濃すぎることが認められた。現在、１ｍｌが使用するのに適している緩衝液の量であると考えられている。
【０１３６】
実施例１３：さらなる抗体生成
ＭＯＬ６１６と名付けられた以下のペプチドは、さらなる抗体を生成するために選択された。
Ｄｐｒ（ＡＯＡ）−ｄＳｅｒ−Ｎｖａ−Ｃｙｃ−ｄＡｌａ−Ｓｅｒ（Ｇａｌ）−ｄＡｌａ−Ａｒｇ−Ｐｈｅ−ｄＳｅｒ−Ｖａｌ−ＮＨ２。
【０１３７】
ＭＯＬ６１６の化学式を図２６に示す。
【０１３８】
ペプチドはＫＬＨに結合させ、ＫＬＨ−ＭＯＬ６１６と名付けた免疫原を生成した。ウサギ（アナウサギ）をＫＬＨ−ＭＯＬ６１６で免疫化し、脾細胞を獲得して、このペプチドの切断型（ＭＯＬ６１５、ＢＳＡに結合）によってスクリーニングした。ペプチドＭＯＬ６１５のシアル化型であるＭＯＬ６１５ｃによって、対するスクリーニングを実行した。スクリーニング処理は、マルチクローンスクリーニングとそれに続くサブクローンスクリーニングを含み、脱シアル化型に特異的な抗体を得た。
【０１３９】
この処理によって、抗体１２５．１と名付けたモノクローナル抗体の生成がもたらされた。この抗体は、脱シアル化分子Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−オキシムに存在するエピトープに、より特定的には、脱シアル化ペプチドＣｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇに存在するエピトープに、特異的である。
【０１４０】
ＭＯＬ６１５をビオチン化してＭＯＬ６００（実施例７で示される配列）を生成し、抗体結合親和性および動力学をバイオ干渉法を使用して測定した。簡単に説明すると、ＭＯＬ６００またはＭＯＬ６００ｃは、ストレプトアビジン／ビオチン相互作用によってバイオセンサーに固定した。抗体の結合は、反射光干渉のシフトによって検出した。
【０１４１】
抗体１２５．１の異なる濃度（それぞれ、１、２、４、８、または１６ｎＭ）を使用して、以下の結合親和性および動力学を抗体１２５．１について判定した。
ＫＤ＝７．９ｎＭ、Ｋｏｎ＝５４０８０Ｍ−１Ｓ−１、Ｋｏｆｆ＝０．０００４２７ｓ−１
図２７に示すように、結合は、シアル化型であるＭＯＬ６００ｃと比較してＭＯＬ６００に明らかに特異的だった。
【０１４２】
抗体が配列決定され、ガンマ重鎖およびカッパ軽鎖を有することが判定された。この抗体の配列を図３１に示し、以下に列挙する。
【０１４３】
抗体−重鎖
ＱＳＶＥＥＳＧＧＲＬＶＴＰＧＴＰＬＴＬＴＣＴＶＳＧＦＳＬＳＳＹＳＭＤＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＧＧＩＴＴＴＬＨＴＦＹＡＴＷＡＫＧＲＦＴＩＳＫＴＳＳＴＴＶＤＬＫＭＴＳＬＴＴＤＤＡＡＴＹＦＣＡＲＧＧＳＳＶＩＷＧＰＧＴＬＶＴＶＳＳＧＱＰＫＡＰＳＶＦＰＬＡＰＣＣＧＤＴＰＳＳＴＶＴＬＧＣＬＶＫＧＹＬＰＥＰＶＴＶＴＷＮＳＧＴＬＴＮＧＶＲＴＦＰＳＶＲＱＳＳＧＬＹＳＬＳＳＶＶＳＶＴＳＳＳＱＰＶＴＣＮＶＡＨＰＡＴＮＴＫＶＤＫＴＶＡＰＳＴＣＳＫＰＴＣＰＰＰＥＬＬＧＧＰＳＶＦＩＦＰＰＫＰＫＤＴＬＭＩＳＲＴＰＥＶＴＣＶＶＶＤＶＳＥＤＤＰＥＶＱＦＴＷＹＩＮＮＥＱＶＲＴＡＲＰＰＬＲＥＱＱＦＮＳＴＩＲＶＶＳＴＬＰＩＡＨＥＤＷＬＲＧＫＥＦＫＣＫＶＨＮＫＡＬＰＡＰＩＥＫＴＩＳＫＡＲＧＱＰＬＥＰＫＶＹＴＭＧＰＰＲＥＥＬＳＳＲＳＶＳＬＴＣＭＩＮＧＦＹＰＳＤＩＳＶＥＷＥＫＮＧＫＡＥＤＮＹＫＴＴＰＡＶＬＤＳＤＧＳＹＦＬＹＳＫＬＳＶＰＴＳＥＷＱＲＧＤＶＦＴＣＳＶＭＨＥＡＬＨＮＨＹＴＱＫＳＩＳＲＳＰＧ（配列番号７）
【０１４４】
抗体−軽鎖
ＡＬＶＭＴＱＴＰＳＰＶＳＡＡＶＧＧＴＶＴＩＳＣＱＳＳＱＳＶＹＧＮＮＨＬＮＷＨＱＱＫＲＧＱＰＰＫＱＬＩＧＳＡＳＲＬＡＳＧＶＰＳＲＦＫＧＳＧＳＧＴＱＦＴＬＴＩＳＧＶＱＣＤＤＡＡＴＹＹＣＱＧＳＹＹＮＧＡＷＹＶＡＦＧＧＧＴＥＬＥＩＫＲＤＰＶＡＰＳＶＬＬＦＰＰＳＫＥＥＬＴＴＧＴＡＴＩＶＣＶＡＮＫＦＹＰＳＤＩＴＶＴＷＫＶＤＧＴＴＱＱＳＧＩＥＮＳＫＴＰＱＳＰＥＤＮＴＹＳＬＳＳＴＬＳＬＴＳＡＱＹＮＳＨＳＶＹＴＣＥＶＶＱＧＳＡＳＰＩＶＱＳＦＮＲＧＤＣ（配列番号８）
【０１４５】
重鎖ＣＤＲ配列
ＣＤＲ１  ＧＦＳＬＳＳＹ（配列番号１）
ＣＤＲ２  ＴＴＴＬＨ（配列番号２）
ＣＤＲ３  ＧＧＳＳＶＩ（配列番号３）
【０１４６】
軽鎖ＣＤＲ配列
ＣＤＲ１  ＱＳＳＱＳＶＹＧＮＮＨＬＮ（配列番号４）
ＣＲＤ２  ＳＡＳＲＬＡＳ（配列番号５）
ＣＤＲ３  ＱＧＳＹＹＮＧＡＷＹＶＡ（配列番号６）
【０１４７】
注目すべき観察：
追加のＯ−結合グリコシル化部位が、２１３位と２１６位の間の重鎖定常領域で検出された。ゲル画像から、この部位でグリコシル化されている型は、グリコシル化されていない型と多くが類似している。
Ｎ−結合グリコシル化が、重鎖定常領域Ｎ＠２８５で検出された。
Ｐｙｒｏ−Ｇｌｕ（Ｑ）修飾が、重鎖のＮ末端で観察された。
通常の定常領域配列からのＣ末端リジンの排除が、重鎖で観察された。
【０１４８】
実施例１４：さらなるアッセイの最適化
さらなる最適化のために、２つの異なるシアリダーゼ活性アッセイ（ＡおよびＢ、以下を参照）を比較した。アッセイの設定は、基本的に図２に関連して説明したとおりだった。
試験抗体を金に結合させ、本明細書では「コンジュゲートパッド」と称される担体上で乾燥させた。アッセイＡにおける試験抗体は「１０６４精製Ｍｏｌ６１５抗体」、すなわちＭｏｌ６１５を使用して血清１０６４から精製されたポリクローナル抗体だった。アッセイＢにおける試験抗体は、「１２５．１」と名付けられたモノクローナル抗体だった（実施例１３を参照）。
コントロール抗体も金に結合させ、コンジュゲートパッド上で乾燥させた。アッセイＢの場合、これは、Ｌａｍｐｉｒｅから供給されたニワトリＩｇＹ、製品コード７４０１４０３だった。
捕捉分子（ポリストレプトアビジン）をニトロセルロース膜に固定化して捕捉ラインを形成させた。別のコントロール捕捉ラインを形成させた。アッセイＢの場合、これは抗ニワトリＩｇＹ抗体（Ｌａｍｐｉｒｅから供給された、製品コード７４５５２０７）だった。
図２に示すように、コンジュゲートパッドをニトロセルロース上に重ねた。
【０１４９】
試験インジケータ分子であるＮＨ２−Ｃｙｃ−ＤＡｌａ−Ｓｅｒ［Ｇａｌ−Ｓｉａｌ］−ＤＡｌａ−Ａｒｇ−ＰＥＧ−ビオチン（ＭＯＬ６００ｃ）を作成し、１μｇ／ｍｌまたは３μｇ／ｍｌを不活性多孔質材料（Ｐｏｒｅｘディスク）上で凍結乾燥して、それぞれディスクあたり３６ｎｇのインジケータ分子またはディスクあたり１０８ｎｇのインジケータ分子を含むインジケータ基質ディスクを得た。
【０１５０】
シアリダーゼは、５０、１２．５、および１．５６Ｕ／ｍｌの濃度で試験した。ペプチドディスクおよびアッセイ緩衝液を使用した陰性標準も流した。応答は、キューブ読み取りおよび視覚的スケールに対して測定した。
【０１５１】
以下の基本プロトコルを使用した。
すべての溶液が室温であり、十分に混合されていることを確認する。
５０、１２．５、および１．５６Ｕ／ｍｌのシアリダーゼ緩衝液標準溶液を使用して所望の条件の各々を試験する。
すべての標準およびシアリダーゼ緩衝液を三重測定で試験する。
１０００μｌのシアリダーゼ標準をインジケータ基質ディスクと共に抽出チューブに添加する。蓋とキャップを位置に折り重ねてチューブを密封する。チューブを静かに撹拌し、インジケータ基質ディスクと５分間インキュベートする。
抽出チューブからデバイスに試料パッドまで４滴添加する。
キューブリーダ（ドイツ、ベルリン、Ｓｃｈｗａｒｚｓｃｈｉｌｄｓｔｒａｓｓｅ  １、Ｄ−１２４８９のｏｐＴｒｉｃｏｎ  ＧｍｂＨ（Ｃｈｅｍｂｉｏ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）のＯｐｔｒｉｃｏｎリーダ）を使用して５分または１０分で読み取り、
試験およびコントロールラインシグナルを記録する。
【０１５２】
試験アッセイの特徴を以下に示す。
【表３】
2021531763.tif 000008
【０１５３】
（ｉ）読み取り時間の比較
望ましい出力は、１０分試験を有することであり、５分のインキュベーション、その後の５分の読み取り時間を有する。結果は５分および１０分で読み取り、読み取り時間の結果への影響を調べた。結果を図２８に示す。示されるように、アッセイＡは最低濃度標準について正確な応答を満たすために１０分の読み取り時間を必要とするが、アッセイＢは５分の読み取り時間を必要とするだけである。アッセイＢは、１０分の読み取り時間の利点がほとんどないようであり、これは５分の読み取りによって１０分試験の望ましい出力に適合する。
【０１５４】
（ｉｉ）感度の比較
アッセイＢの結果は５分後に読み取り、アッセイＡの結果は１０分後に読み取った。結果を図２９に示す。
【０１５５】
アッセイＢは、５０Ｕ／ｍｌ、１２．５Ｕ／ｍｌ、および１．５６Ｕ／ｍｌ標準にわたって、アッセイＡと比較して高いキューブ読み取り値を示し、０Ｕ／ｍｌ標準では低いキューブ読み取り値を有する。ＡおよびＢの両方が標準の各々について正確な応答を得ており、％ＣＶは仕様の範囲内である。アッセイＢは、標準についてデバイスの短い進展時間後にキューブ読み取り、および０標準について低いキューブ読み取りを得ている。したがって、アッセイＢはアッセイＡよりも優れている。
【０１５６】
（ｉｉｉ）ペプチド濃度の影響
アッセイＡおよびＢを互いに、かつ異なるペプチド濃度の変法と比較した。アッセイＡ’は、ペプチド濃度が３μｇ／ｍｌ（ディスクあたり１０８ｎｇ）である以外はアッセイＡに対応し、アッセイＢ’は、ペプチド濃度が１μｇ／ｍｌ（ディスクあたり１０８ｎｇ）である以外はアッセイＢに対応した。
【０１５７】
アッセイＢおよびＢ’の結果は５分後に読み取り、アッセイＡおよびＡ’の結果は１０分後に読み取った。結果を図３０に示す。より高いペプチド濃度はより良い結果をもたらし、＞１μｇ／ｍｌ（＞１０８ｎｇ／ディスク）のペプチド濃度が好ましい。
【０１５８】
結論：
アッセイＢは、抗体に行われた変更およびペプチド濃度の増加によって、より短い時間でアッセイＡよりも性能を改善している。
【０１５９】
実施例１５−追加アッセイの最適化
金の光学密度
金コンジュゲート噴霧濃度をＯＤ４からＯＤ６またはＯＤ８に増加させる効果を調査し、ＯＤ６の金はＯＤ４と比較してテストラインシグナルがわずかに増加したが、ＯＤ８は３．１２５Ｕ／ｍＬシアリダーゼでＯＤ４のテストラインシグナルの２倍を示した。したがって、約または少なくとも８のＯＤで金コンジュゲートを使用することが効果的である。
【０１６０】
試料／コンジュゲートパッド
図２に概略的に示されているタイプなどの側方流動アッセイデバイスでは、試料パッドは、試料がデバイスに沿って流れることを可能にし、試料が結合分子を含むコンジュゲートパッドと接触するようになり、続いて捕捉分子と接触するようになることを可能にする。試料の粘度に応じて、いくつかの試料パッド材料が効果的であり得る。
【０１６１】
異なる試料パッドを評価するために、合成膣液代替物をグアーガムおよびウシムチン（０．２５％グアーガム、０．１２５％ムチン、５％ブルーラテックス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．，１５７０９，２．６％、水に溶解））を使用して作成した。合成膣液はすべての試料パッドを通って流れることができた。試料がテストストリップの長さを流れるまでにかかった時間を記録した（以下の表を参照）
【表４】
2021531763.tif 000009
【０１６２】
Ａｈｌｓｔｒｏｍは、異なる密度のグラスファイバーパッドである（それぞれ８９６４、６６１３、６６１５）。
【０１６３】
さらなる比較のために、２つの試料パッド（ＦＲ１およびＡｈｌｓｔｒｏｍ８９６４）を使用して材料を作成した。デバイスに４点標準曲線（緩衝水溶液中の０、３．１２５、１２．５、および５０Ｕ／ｍＬシアリダーゼ）を使用して流し、代替試料パッドが特異的または非特異的シグナルに何らかの影響を有するかを判定した。８９６４試料パッドを使用して流した試料は、ＦＲ１と比較して高い特異的シグナルが得られ、非特異的結合（ＮＳＢ）はなかった。
【０１６４】
６．２５Ｕ／ｍｌシアリダーゼを添加した一連の臨床試料を使用して、Ａｈｌｓｔｒｏｍ８９６４試料パッドなどのグラスファイバータイプのパッドが非常に信頼性の高い試料の流れおよび酵素検出を可能にすると判定された。
【０１６５】
実施例１６−細菌性膣炎の診断
臨床試料を入手し、手がかりとなる細胞などの基準について分析してニュージェントスコアを判定し、それに基づき、試料を細菌性膣炎に対して陽性または陰性として分類した。アッセイＡまたはアッセイＢを使用して試料を分析した（実施例１４を参照）。
【０１６６】
結果を以下に示し、ｓｅは感度を表し、ｓｐは特異性を表し、ｐｐｖは陽性予測値を表し、ｎｖｐは陰性予測値を表す。
【表５】
2021531763.tif 000010
【表６】
2021531763.tif 000011
【表７】
2021531763.tif 000012
【表８】
2021531763.tif 000013
【０１６７】
したがって、両方のアッセイは、細菌性膣炎について陽性または陰性である臨床試料を識別することを十分に果たした。アッセイＢはアッセイＡよりも優れていた。
【０１６８】
本発明は、本明細書で説明される特定の実施形態によって範囲が限定されるべきではない。実際、本明細書で説明されるものに加えて、本発明の様々な変更が、前述の説明および付随する図から当業者に明らかになるであろう。このような変更は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図されている。さらに、本明細書で説明される本発明のすべての態様および実施形態は、広く適用可能であり、必要に応じて本発明の他の態様から得られるもの（独立しているものを含め）を含め、任意および他のすべての一貫した実施形態と組み合わせることができるとみなされる。様々な刊行物が本明細書に引用されており、それらの開示は、それらの全体が参照により組み込まれている。
【図１Ａ】
2021531763.tif 000014
【図１Ｂ】
2021531763.tif 000015
【図２Ａ】
2021531763.tif 000016
【図２Ｂ】
2021531763.tif 000017
【図３】
2021531763.tif 000018
【図４】
2021531763.tif 000019
【図５】
2021531763.tif 000020
【図６】
2021531763.tif 000021
【図７】
2021531763.tif 000022
【図８】
2021531763.tif 000023
【図９Ａ】
2021531763.tif 000024
【図９Ｂ】
2021531763.tif 000025
【図１０Ａ】
2021531763.tif 000026
【図１０Ｂ】
2021531763.tif 000027
【図１０Ｃ】
2021531763.tif 000028
【図１０Ｄ】
2021531763.tif 000029
【図１１Ａ】
2021531763.tif 000030
【図１１Ｂ】
2021531763.tif 000031
【図１１Ｃ】
2021531763.tif 000032
【図１２Ａ】
2021531763.tif 000033
【図１２Ｂ】
2021531763.tif 000034
【図１３】
2021531763.tif 000035
【図１４】
2021531763.tif 000036
【図１５】
2021531763.tif 000037
【図１６】
2021531763.tif 000038
【図１７】
2021531763.tif 000039
【図１８Ａ】
2021531763.tif 000040
【図１８Ｂ】
2021531763.tif 000041
【図１９Ａ】
2021531763.tif 000042
【図１９Ｂ】
2021531763.tif 000043
【図２０】
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【図２１Ａ】
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【図２１Ｂ】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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