(57)【要約】  本発明は、癌治療に特に適した新規の抗体に関する。本発明による抗体は、二重特異性または多重特異性抗体であり、ＬＡＧ３に結合する第１の抗原結合部位を含む。第１の抗原結合部位は自律性ＶＨドメインである。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＬＡＧ３に結合する第１の抗原結合部位を含む二重特異性または多重特異性抗体であって、前記第１の抗原結合部位が自律性ＶＨドメインである、二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項２】
ＰＤ１に結合する第２の抗原結合部位を含む、請求項１に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項３】
前記自律性ＶＨドメインが、Ｋａｂａｔ番号付けによる（ｉ）５２ａ位および７１位または（ｉｉ）３３位および５２位にシステインを含み、前記システインが適切な条件下でジスルフィド結合を形成する、請求項１または２に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項４】
ＬＡＧ３に結合する前記自律性ＶＨドメインが、
（ｉ）配列番号１４６の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４７の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１４８の配列を有するＣＤＲ３；または
（ｉｉ）配列番号１４９の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５０の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１５１の配列を有するＣＤＲ３；または
（ｉｉｉ）配列番号１５２の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５３の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１５４の配列を有するＣＤＲ３；または
（ｉｖ）配列番号１５５の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５６の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１５７の配列を有するＣＤＲ３；または
（ｖ）配列番号１５８の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５９の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１６０の配列を有するＣＤＲ３；または
（ｖｉ）配列番号１６１の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６２の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１６３の配列を有するＣＤＲ３；または
（ｖｉｉ）配列番号１６４の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６５の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１６６の配列を有するＣＤＲ３；または
（ｖｉｉｉ）配列番号１６７の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６８の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１６９の配列を有するＣＤＲ３；または
（ｉｘ）配列番号１７０の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７１の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１７２の配列を有するＣＤＲ３；または
（ｘ）配列番号１７３の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７４の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１７５の配列を有するＣＤＲ３；または
（ｘｉ）配列番号１７６の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７７の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１７８の配列を有するＣＤＲ３
を含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項５】
前記自律性ＶＨドメインが、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項６】
前記自律性ＶＨドメインが、Ｈ３５Ｇ、Ｑ３９Ｒ、Ｌ４５ＥおよびＷ４７Ｌからなる群から選択される置換をさらに含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項７】
前記自律性ＶＨドメインが、Ｌ４５Ｔ、Ｋ９４ＳおよびＬ１０８Ｔからなるリストから選択される置換をさらに含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項８】
前記自律性ＶＨドメインが、特にハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）のＶＨフレームワークに基づく、ＶＨ３＿２３ヒトフレームワークを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項９】
前記ＰＤ１に結合する第２の抗原結合部位が、
（ｉ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と
を含むＶＨドメイン；および
（ｉ）配列番号２０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と
を含むＶＬドメインを含む、請求項２から８のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項１０】
前記ＰＤ１に結合する第２の抗原結合部位が、配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび／または配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む、請求項２から９のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項１１】
前記二重特異性または多重特異性抗体が、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である、請求項１から１０のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項１２】
前記二重特異性または多重特異性抗体が、Ｆｃドメインおよび前記ＰＤ１に結合する第２の抗原結合部位を含むＦａｂ断片を含む、請求項２から１１のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項１３】
前記ＦｃドメインがＩｇＧ、特にＩｇＧ１  ＦｃドメインまたはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである、請求項１２に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項１４】
前記Ｆｃドメインが、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む、請求項１２または１３に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項１５】
前記Ｆｃドメインが、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスのものである、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項１６】
前記Ｆｃドメインが、前記Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項１７】
ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂｓ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅｓ）技術に従って、前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットがノブを含み、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットがホールを含む、請求項１２から１６のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項１８】
前記Ｆｃドメインの前記第１のサブユニットが、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、前記Ｆｃドメインの前記第２のサブユニットが、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項１９】
前記Ｆｃドメインが、前記ａＶＨドメインのＣ末端に融合され、前記融合体は、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１７からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項２０】
前記ＰＤ１に結合する抗原結合部位を含む前記Ｆａｂ断片の可変ドメインＶＬおよびＶＨが互いに置き換えられている、請求項１２から１８のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項２１】
前記Ｆａｂ断片の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸が、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、前記Ｆａｂ断片の定常ドメインＣＨ１において、１４７位および２１３位のアミノ酸が、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、請求項１２から１９のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項２２】
（ａ）配列番号１９２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１７からなる群から選択される配列、特に、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項２３】
（ａ）配列番号１４３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、または配列番号１４５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、および
（ｂ）配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１７からなる群から選択される配列、特に、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体。
【請求項２４】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド。
【請求項２５】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドを含む、ベクター、特に発現ベクター。
【請求項２６】
請求項２４に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２５に記載のベクターを含む、宿主細胞、特に真核生物または原核生物の宿主細胞。
【請求項２７】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性抗体を産生するための方法であって、
（ａ）前記二重特異性または多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含む少なくとも１つのベクターで宿主細胞を形質転換するステップ、
（ｂ）前記宿主細胞を前記二重特異性または多重特異性抗体の発現に適した条件下で培養するステップ、および任意に
（ｃ）培養物、特に宿主細胞から前記二重特異性または多重特異性抗体を回収するステップ
を含む、方法。
【請求項２８】
請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体と、少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤とを含む、医薬組成物。
【請求項２９】
医薬として使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体または請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３０】
ｉ）免疫応答の調節、例えば、Ｔ細胞活性の回復において、
ｉｉ）免疫応答または機能の刺激において、
ｉｉｉ）感染の処置において、
ｉｖ）癌の処置において、
ｖ）癌の進行を遅らせることにおいて、
ｖｉ）癌を患う患者の生存を延長することにおいて
使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体または請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３１】
癌の予防または処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体または請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３２】
慢性ウイルス感染の処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体または請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３３】
前記二重特異性または多重特異性抗体が、癌免疫療法で使用するための化学療法剤、放射線および／または他の薬剤と組み合わせて投与される、癌の予防または処置に使用するための、請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性もしくは多重特異性抗体または請求項２８に記載の医薬組成物。
【請求項３４】
個体において腫瘍細胞の増殖を阻害する方法であって、前記腫瘍細胞の増殖を阻害するために、有効量の請求項１から２３のいずれか一項に記載の二重特異性または多重特異性抗体を前記個体に投与することを含む、方法。
【請求項３５】
本明細書で上に記載するような発明。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、操作された免疫グロブリンドメイン、より具体的には改善された安定性を有する操作された免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、およびそのような免疫グロブリンドメインのライブラリーに関する。本発明はさらに、そのような免疫グロブリンドメインを調製するための方法、およびこれらの免疫グロブリンドメインを使用する方法に関する。本発明はさらに、ＬＡＧ３に結合する抗原結合部位を含む二重特異性または多重特異性抗体、そのような抗体をコードするポリヌクレオチド、およびそのような抗体の産生方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
シングルドメイン抗体断片は、ラクダ科の天然に存在する重鎖ＩｇＧ（ＶＨＨと呼ばれる）または軟骨性であるサメのＩｇＮＡＲ（ＶＮＡＲと呼ばれる）に由来し得る。シングルドメイン抗体には、臨床開発の興味深い候補となるいくつかの特性があるが、非ヒトシングルドメイン抗体は、ヒトでの免疫原性のために治療用途には適していない。
【０００３】
しかしながら、従来のヒトＩｇＧに由来するシングルドメイン抗体断片は、安定性と溶解性が低いために凝集しやすく、（Ｗａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ３４１，５４４−５４６（１９８９））、これにより、タンパク質の安定性が不可欠である治療でのそれらの用途が制限される。不安定なタンパク質は、部分的に展開して凝集する傾向にあり、これにより、最終的には治療効果の低下と望ましくない副作用がもたらされる。
【０００４】
シングルドメインおよび他の組換え抗体断片の安定性／溶解性を改善するためのいくつかのアプローチが行われている。選択ベースのアプローチには、例えば高温、極端なｐＨでの、またはプロテアーゼもしくは変性剤の存在下における抗体のライブラリー選択が含まれる。
【０００５】
エンジニアリングベースのアプローチとして、ジスルフィド結合および他の安定化変異の抗体への導入が挙げられる。
【０００６】
安定性が改善されたシングルドメイン抗体を得るための方法は、多数のシングルドメイン抗体変種を含むライブラリーからの選択である。そのようなライブラリーを生成するために、１つのシングルドメイン抗体が足場として使用され、これは安定性が向上するように操作され得る。次いで、所望の標的結合特異性を有する子孫シングルドメイン抗体が、従来のパニングによりライブラリーから選択され得る。なぜなら、それらの抗体は、親の足場の改善された特性を大きく継承することになるからである。安定性が改善されたシングルドメイン抗体を得るための別の方法は、表面に露出した親水性または荷電アミノ酸などの安定化変異を、予め選択したシングルドメイン抗体に所望の結合特性で導入することである。
【０００７】
人工ジスルフィド結合のタンパク質への導入は、タンパク質の立体配座の安定性を高めるための戦略として認識されている。しかしながら、タンパク質の安定性を高める代わりに、不適切な位置のジスルフィド結合は、折り畳みタンパク質の周囲のアミノ酸に好ましくない影響を及ぼしたり、既存の好ましい相互作用を妨害したりする可能性がある。ジスルフィド架橋のための適切な位置の選択は不可欠であるが、そのための確立された規則はない。それらの安定性を改善するための戦略として、人工的な非標準ジスルフィド結合の導入によるシングルドメイン抗体の操作が提案されている。
【０００８】
重鎖可変（ＶＨ）ドメインは、システイン残基２３と１０４の間（ＩＭＧＴ番号付け、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる残基２２と９２に対応）に高度に保存されたジスルフィド結合を自然に含み、これはＶＨのコアにおける２つのβ鎖ＢとＦを結合し、それらの安定性と機能に非常に重要である。
【０００９】
５４位と７８位の間（ＩＭＧＴ番号付け、Ｋａｂａｔ番号付けシステムによる４９位と６９位に対応）の２番目の非ネイティブジスルフィド結合の、ラクダ科ＶＨＨ（Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３７７，４７８−４８８（２００８），Ｃｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４７，１１０４１−１１０４５（２００８），Ｈｕｓｓａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ６，ｅ２８２１８（２０１１））またはヒトＶＨ（Ｋｉｍ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  Ｄｅｓ  Ｓｅｌ  ２５，５８１−５８９）（２０１２）、国際公開第２０１２／１００３４３号）への導入は、それらの熱安定性および（ＶＨＨの場合）プロテアーゼ耐性の増加につながることが示された（Ｈｕｓｓａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ６，ｅ２８２１８（２０１１））。この特定のジスルフィド結合は、特異的ヒトコブラクダＶＨＨにおいて天然に存在することが以前に確認されていた（Ｓａｅｒｅｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ  Ｃｈｅｍ  ２７９，５１９６５−５１９７２（２００４））。それはＶＨＨ疎水性コアにおけるフレームワーク領域２（ＦＲ２）とフレームワーク領域３（ＦＲ３）を結合する。
【００１０】
原則として効果的であるが、このアプローチには、アフィニティー、特異性および発現収量の低下など、いくつかの欠点がないわけではない（Ｈｕｓｓａｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ  ６，ｅ２８２１８（２０１１））。
【００１１】
したがって、安定化されたシングルドメイン抗体が依然として必要とされている。
【００１２】
癌（がん）に対する防御における免疫系の重要性は、免疫系が異常細胞を検出し、破壊する能力に基づく。しかしながら、ある種の腫瘍細胞は、免疫抑制状態を作り出すことによって、免疫系から逃れることができる（Ｚｉｔｖｏｇｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ６（２００６），７１５−７２７）。Ｔ細胞は、抗ウイルス性および抗腫瘍性の免疫応答において、重要な役割を持つ。抗原特異性Ｔ細胞の適切な活性化によって、それらのクローン性増殖およびエフェクター機能の獲得が起こり、細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の場合には、ＣＴＬによって標的細胞を特異的に溶解することができる。Ｔ細胞は、全ての細胞内コンパートメント中のタンパク質に由来するペプチドの選択的な認識に関するそれらの能力、抗原発現細胞を直接的に認識し、死滅させる能力（細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）としても知られている、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞による）、および多様な免疫応答を調整し（ＣＤ４＋ヘルパーＴ細胞による）、獲得エフェクター機構と自然エフェクター機構とを統合する能力に起因して、内因性抗腫瘍免疫を治療的に操作する取り組みが主に注目されている。Ｔ細胞の機能不全は、長期にわたる抗原曝露の結果として生じる。Ｔ細胞は、抗原の存在下で増殖する能力を失い、漸進的にサイトカインを産生できなくなり、標的細胞１を溶解できなくなる。機能不全のＴ細胞は、疲弊したＴ細胞と呼ばれており、増殖することができず、抗原刺激に応答して細胞毒性およびサイトカイン分泌などのエフェクター機能を発揮することができない。更なる研究は、疲弊したＴ細胞が、阻害分子ＰＤ−１（プログラム細胞死タンパク質１）の継続的な発現によって特徴付けられることと、ＬＣＭＶ感染マウスにおいて、ＰＤ−１とＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１リガンド）の相互作用の遮断が、Ｔ細胞の疲弊を逆行させ、抗原特異的なＴ細胞応答を回復させることができることを特定した（Ｂａｒｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４３９（２００６），６８２−６８７）。しかしながら、ＰＤ−１−ＰＤ−Ｌ１経路のみを標的としても、Ｔ細胞疲弊の逆行が常に起こるわけではなく（Ｇｅｈｒｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ  １３７（２００９），６８２−６９０）、このことは、他の分子がおそらくＴ細胞疲弊に関与していることを示している（Ｓａｋｕｉｓｈｉ，Ｊ．Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄ．２０７（２０１０），２１８７−２１９４）。
【００１３】
リンパ球活性化遺伝子−３（ＬＡＧ３またはＣＤ２２３）は、ＩＬ−２依存性ＮＫ細胞株において発現した分子を選択的に単離するように設計された実験で、最初に発見された（Ｔｒｉｅｂｅｌ  Ｆ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｌｅｔｔ．２３５（２００６），１４７−１５３）。ＬＡＧ３は、ＣＤ４に対して構造相同性を持ち、４つの細胞外免疫グロブリンスーパーファミリー様ドメイン（Ｄ１〜Ｄ４）を有する、特異的膜貫通タンパク質である。この膜の遠位にあるＩｇＧドメインは、短いアミノ酸配列（他のＩｇＧスーパーファミリータンパク質にはみられない、いわゆるエキストラループ）を含む。細胞内ドメインは、ＬＡＧ３がＴ細胞機能に対して悪影響を及ぼすのに必要とされる特異的アミノ酸配列（ＫＩＥＥＬＥ、配列番号７５）を含む。ＬＡＧ３は、メタロプロテアーゼによって連結ペプチド（ＣＰ）で開裂されて、可溶性形態を生成することができ、この形態は、血清中で検出可能である。ＣＤ４と同様に、ＬＡＧ３タンパク質は、ＭＨＣクラスＩＩ分子に結合するが、アフィニティーがより高く、ＣＤ４とは別の部位で結合する（Ｈｕａｒｄ  ｅｔ  ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９４（１９９７），５７４４−５７４９）。ＬＡＧ３は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、ＮＫ細胞および形質細胞様樹状細胞（ｐＤＣ）で発現し、Ｔ細胞活性化に従ってアップレギュレーションする。ＬＡＧ３は、Ｔ細胞の機能だけでなくＴ細胞のホメオスタシスも調節する。免疫不応答性であるか、または機能不全を示す従来のＴ細胞の一部は、ＬＡＧ３を発現する。ＬＡＧ３＋Ｔ細胞は、腫瘍部位に、そして慢性ウイルス感染中に豊富に含まれる（Ｓｉｅｒｒｏ  ｅｔ  ａｌ  Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ  １５（２０１１），９１−１０１）。ＬＡＧ３は、ＣＤ８  Ｔ細胞の疲弊において、ある役割を果たすことが示されている（Ｂｌａｃｋｂｕｒｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．１０（２００９），２９−３７）。したがって、ＬＡＧ３の活性をアンタゴナイズし、腫瘍に対する免疫応答を生成し、回復させるために使用可能な抗体が必要とされている。
【００１４】
ＬＡＧ３に対するモノクローナル抗体は、例えば、国際公開第２００４／０７８９２８号に記載されており、ＣＤ２２３に特異的に結合する抗体と抗癌ワクチンとを含む組成物が請求されている。国際公開第２０１０／０１９５７０号は、ＬＡＧ３に結合するヒト抗体（例えば、抗体２５Ｆ７および２６Ｈ１０）を開示している。米国特許出願公開第２０１１／０７０２３８号明細書は、臓器移植拒絶および自己免疫疾患の治療または予防に有用な細胞毒性抗ＬＡＧ３抗体に関する。国際公開第２０１４／００８２１８号は、抗体２５Ｆ７と比較して、最適化された機能特性（すなわち、脱アミノ化部位の減少）を有するＬＡＧ３抗体を記載している。さらに、ＬＡＧ３抗体は、国際公開第２０１５／１３８９２０号（例えば、ＢＡＰ０５０）、国際公開第２０１４／１４０１８０号、国際公開第２０１５／１１６５３９号、国際公開第２０１６／０２８６７２号、国際公開第２０１６／１２６８５８号、国際公開第２０１６／２００７８２号および国際公開第２０１７／０１５５６０号に開示されている。
【００１５】
プログラム細胞死タンパク質１（ＰＤ−１またはＣＤ２７９）は、受容体のＣＤ２８ファミリーの阻害性メンバーであり、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、ＩＣＯＳおよびＢＴＬＡも含まれる。ＰＤ−１は、細胞表面受容体であり、活性化されたＢ細胞、Ｔ細胞および骨髄細胞で発現している（Ｏｋａｚａｋｉ  ｅｔ  ａｌ（２００２）Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４：３９１７７９−８２；Ｂｅｎｎｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７０：７１１−８）。ＰＤ−１の構造は、１つの免疫グロブリン可変様の細胞外ドメインと、免疫受容体阻害性モチーフ（ＩＴＩＭ）および免疫受容体チロシンに基づくスイッチモチーフ（ＩＴＳＭ）を含む細胞質ドメインとからなるモノマー型１膜貫通タンパク質である。活性化されたＴ細胞は、一時的にＰＤ１を発現するが、ＰＤ１およびそのリガンドＰＤＬ１の持続的な超発現は、免疫の疲弊を促進し、ウイルス感染、腫瘍回避を持続させ、感染および致死を増やす。ＰＤ１発現は、Ｔ細胞受容体による抗原認識によって誘発され、その発現は、連続的なＴ細胞受容体シグナル伝達によって主に維持される。長期間抗原に曝露した後、ＰＤ１の遺伝子座は、再メチル化することができず、連続的な超発現を促進する。ＰＤ１経路をブロックすると、癌および慢性ウイルス感染において、疲弊したＴ細胞の機能を回復させることができる（Ｓｈｅｒｉｄａｎ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ３０（２０１２），７２９−７３０）。ＰＤ−１に対するモノクローナル抗体は、例えば、国際公開第２００３／０４２４０２号、国際公開第２００４／００４７７１号、国際公開第２００４／０５６８７５号、国際公開第２００４／０７２２８６号、国際公開第２００４／０８７１９６号、国際公開第２００６／１２１１６８号、国際公開第２００６／１３３３９６号、国際公開第２００７／００５８７４号、国際公開第２００８／０８３１７４号、国際公開第２００８／１５６７１２号、国際公開第２００９／０２４５３１号、国際公開第２００９／０１４７０８号、国際公開第２００９／１０１６１１号、国際公開第２００９／１１４３３５号、国際公開第２００９／１５４３３５号、国際公開第２０１０／０２７８２８号、国際公開第２０１０／０２７４２３号、国際公開第２０１０／０２９４３４号、国際公開第２０１０／０２９４３５号、国際公開第２０１０／０３６９５９号、国際公開第２０１０／０６３０１１号、国際公開第２０１０／０８９４１１号、国際公開第２０１１／０６６３４２号、国際公開第２０１１／１１０６０４号、国際公開第２０１１／１１０６２１号、国際公開第２０１２／１４５４９３号、国際公開第２０１３／０１４６６８号、国際公開第２０１４／１７９６６４号、国際公開第２０１５／１１２９００号に記載されている。
【００１６】
癌または細菌、真菌もしくはウイルスなどの病原体に関連する疾患の処置に使用するためのＰＤ１およびＬＡＧ３との免疫反応性を有する二重特異性Ｆｃダイアボディは、国際公開第２０１５／２００１１９号に記載されている。しかしながら、ＰＤ１およびＬＡＧ３に同時に結合し、ひいてはＰＤ１およびＬＡＧ３を両方とも発現する細胞を選択的に標的化するだけではなく、ＬＡＧ３の広範囲にわたる発現パターンが与えられる他の細胞に対してＬＡＧ３のブロックを回避する新規な二重特異性抗体を提供する必要がある。本発明の二重特異性抗体は、ＰＤ１およびＬＡＧ３の両方を過剰発現するＴ細胞に対して、ＰＤ１およびＬＡＧ３を効率的にブロックするだけではなく、これらの細胞に対して非常に選択的であり、それによって、非常に活性なＬＡＧ３抗体を投与することによる副作用が回避され得る。
【発明の概要】
【００１７】
本発明は、自律性ＶＨドメインが、有益な特性を有する二重特異性または多重特異性抗体における抗原結合実体として利用され得るという発見に基づく。
【００１８】
本発明の第１の態様は、ＬＡＧ３に結合する第１の抗原結合部位を含む二重特異性または多重特異性抗体に関し、第１の抗原結合部位は自律性ＶＨドメインである。特に、抗体は単離された抗体である。特に、自律性ＶＨドメインは、適切な条件下でジスルフィド結合を形成する少なくとも２つの非標準システインを介して安定化される。
【００１９】
本発明の一実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体は、ＰＤ１に結合する第２の抗原結合部位を含む。
【００２０】
本発明の１つの実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体の自律性ＶＨドメインは、以下に開示される特徴を含む自律性ＶＨドメインである。
【００２１】
自律性ＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ番号付けによる（ｉ）５２ａ位および７１位または（ｉｉ）３３位および５２位にシステインを含むことができ、前記システインは適切な条件下でジスルフィド結合を形成する。特に、自律性ＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ番号付けによる５２ａ、７１、３３および５２位のシステインを含む。
【００２２】
自律性ＶＨドメインは、
（ａ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＦＲ１と、
（ｂ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含むＦＲ２と、
（ｃ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＦＲ３と、
（ｄ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＦＲ４と
を含む重鎖可変ドメインフレームワーク
または
（ａ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含むＦＲ１と、
（ｂ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含むＦＲ２と、
（ｃ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＦＲ３と、
（ｄ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＦＲ４と
を含む重鎖可変ドメインフレームワーク
【００２３】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｉ）配列番号１４６の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４７の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１４８の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
【００２４】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｉｉ）配列番号１４９の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５０の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１５１の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。
【００２５】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｉｉｉ）配列番号１５２の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５３の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１５４の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。
【００２６】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｉｖ）配列番号１５５の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５６の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１５７の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｖ）配列番号１５８の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５９の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１６０の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｖｉ）配列番号１６１の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６２の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１６３の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｖｉｉ）配列番号１６４の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６５の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１６６の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号８９のアミノ酸配列を含む。
【００３０】
好ましい態様では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｖｉｉｉ）配列番号１６７の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６８の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１６９の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。
【００３１】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｉｘ）配列番号１７０の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７１の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１７２の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【００３２】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｘ）配列番号１７３の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７４の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１７５の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。
【００３３】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｘｉ）配列番号１７６の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７７の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１７８の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。
【００３４】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、Ｈ３５Ｇ、Ｑ３９Ｒ、Ｌ４５ＥおよびＷ４７Ｌからなる群から選択される置換をさらに含む。
【００３５】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、Ｌ４５Ｔ、Ｋ９４ＳおよびＬ１０８Ｔからなる群から選択される置換を含む。
【００３６】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、特にハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）のＶＨ配列に基づくＶＨ３＿２３フレームワークを含む。
【００３７】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、Ｆｃドメインに融合される。いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、Ｆｃドメインの末端のＮ末端またはＣ末端に融合される。本発明の好ましい実施形態では、Ｆｃドメインは、本明細書に記載の「ノブ・イントゥ・ホール技術（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」に関連するノブ変異またはホール変異、特にノブ変異を含む。Ｎ末端およびＣ末端の両方のＦｃ融合について、グリシン−セリン（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）リンカー、リンカー配列「ＤＧＧＳＰＴＰＰＴＰＧＧＧＳＡ」を有するリンカーまたは任意の他のリンカーが、好ましくは、自律性ＶＨドメインとＦｃドメインとの間で発現され得る。
【００３８】
本発明の一実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体のＰＤ１に結合する第２の抗原結合部位は、
（ｉ）配列番号２０１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ１と、
（ｉｉ）配列番号２０２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２０３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３と
を含むＶＨドメイン；および
（ｉ）配列番号２０４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ１と、
（ｉｉ）配列番号２０５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ２と、
（ｉｉｉ）配列番号２０６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｌ３と
を含むＶＬドメイン
を含む。
【００３９】
本発明の一実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体のＰＤ１に結合する第２の抗原結合部位は、配列番号１９２のアミノ酸配列を含むＶＨドメインおよび／または配列番号１９３のアミノ酸配列を含むＶＬドメインを含む。
【００４０】
本発明の一実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体である。
【００４１】
本発明の一実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体は、ＦｃドメインおよびＰＤ１に結合する第２の抗原結合部位を含むＦａｂ断片を含む。
【００４２】
本発明の一実施形態では、Ｆｃドメインは、ＩｇＧ、特にＩｇＧ１  ＦｃドメインまたはＩｇＧ４  Ｆｃドメインである。
【００４３】
本発明の一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃ受容体、特にＦｃγ受容体に対する結合を低下させる１つ以上のアミノ酸置換を含む。
【００４４】
本発明の一実施形態では、Ｆｃドメインは、アミノ酸変異Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５ＡおよびＰ３２９Ｇ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を有するヒトＩｇＧ１サブクラスである。
【００４５】
本発明の一実施形態では、Ｆｃドメインは、Ｆｃドメインの第１および第２のサブユニットの会合を促進する修飾を含む。
【００４６】
本発明の一実施形態では、ノブ・イントゥ・ホール方法（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ  ｍｅｔｈｏｄ）に従って、Ｆｃドメインの第１のサブユニットがノブを含み、Ｆｅドメインの第２のサブユニットがホールを含む、二重特異性抗体が提供される。「ノブ・イントゥ・ホール方法（ｋｎｏｂｓ  ｉｎｔｏ  ｈｏｌｅｓ  ｍｅｔｈｏｄ」は、「ノブ・イントゥ・ホール技術（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」を指す。
【００４７】
本発明の一実施形態では、Ｆｃドメインの第１のサブユニットは、アミノ酸置換Ｓ３５４ＣおよびＴ３６６Ｗ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含み、Ｆｃドメインの第２のサブユニットは、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃ、Ｔ３６６ＳおよびＹ４０７Ｖ（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）を含む。
【００４８】
本発明の一実施形態では、Ｆｃドメインは、二重特異性または多重特異性抗体のために、自律性ＶＨドメインのＣ末端に融合され、融合体は、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列、特に、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００４９】
本発明の一実施形態では、ＰＤ１に結合する抗原結合部位を含むＦａｂ断片の可変ドメインＶＬおよびＶＨは、互いに置き換えられる。その場合、ＶＨドメインは軽鎖の一部になり、ＶＬドメインは重鎖の一部になる。
【００５０】
本発明の一実施形態では、Ｆａｂ断片の定常ドメインＣＬにおいて、１２４位のアミノ酸は、独立して、リシン（Ｋ）、アルギニン（Ｒ）またはヒスチジン（Ｈ）によって置換されており（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）、Ｆａｂ断片の定常ドメインＣＨ１において、１４７位および２１３位のアミノ酸は、独立して、グルタミン酸（Ｅ）またはアスパラギン酸（Ｄ）によって置換されている（Ｋａｂａｔ  ＥＵインデックスによる番号付け）。
【００５１】
本発明の一実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体は、
（ａ）配列番号１９２の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の重鎖、配列番号１９３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第１の軽鎖、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１７からなる群から選択される配列、特に、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【００５２】
本発明の好ましい実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体は、（ａ）配列番号１４３の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む重鎖、または配列番号１４５の配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む軽鎖、およびｂ）配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１７からなる群から選択される配列、特に、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１からなる群から選択される配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【００５３】
本発明の好ましい実施形態では、二重特異性または多重特異性抗体は、（ａ）配列番号１４３のアミノ酸配列を含む重鎖、または配列番号１４５のアミノ酸配列を含む軽鎖、およびｂ）配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１７からなる群から選択される配列、特に、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む第２の重鎖を含む。
【００５４】
本発明の更なる態様は、上記に開示された二重特異性または多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドに関する。
【００５５】
更なる態様では、本発明は、上記に開示されたポリヌクレオチドを含むベクター、特に発現ベクターを提供する。
【００５６】
本発明の更なる態様は、上記に開示されたポリヌクレオチドまたはベクターを含む宿主細胞、特に真核生物または原核生物の宿主細胞に関する。
【００５７】
本発明の更なる態様は、上記に開示された二重特異性または多重特異性抗体を産生するための方法に関し、
（ａ）前記二重特異性または多重特異性抗体をコードするポリヌクレオチドを含むベクターで宿主細胞を形質転換するステップ、
（ｂ）二重特異性または多重特異性抗体の発現に適した条件下で宿主細胞を培養するステップ、および任意に
（ｃ）培養物、特に宿主細胞から二重特異性または多重特異性抗体を回収するステップ
を含む。
【００５８】
本発明の更なる態様は、上記に開示された二重特異性または多重特異性抗体および少なくとも１つの医薬的に許容される賦形剤を含む医薬組成物に関する。
【００５９】
本発明の更なる態様は、薬剤として使用するための、上記に開示された二重特異性もしくは多重特異性抗体または上記に開示された医薬組成物に関する。
【００６０】
本発明の更なる態様は、
（ｉ）Ｔ細胞活性の回復などの免疫応答の調節において、
（ｉｉ）免疫応答または機能の刺激において、
（ｉｉｉ）感染の処置において、
（ｉｖ）癌の処置において、
（ｖ）癌の進行を遅らせることにおいて、
（ｖｉ）癌を患う患者の生存を延長することにおいて使用するための、二重特異性もしくは多重特異性抗体または医薬組成物に関する。
【００６１】
本発明の更なる態様は、癌の予防または治療に使用するための、上記に開示された二重特異性もしくは多重特異性抗体または医薬組成物に関する。
【００６２】
本発明の更なる態様は、慢性ウイルス感染の治療に使用するための、上記に開示された二重特異性もしくは多重特異性抗体または医薬組成物に関する。
【００６３】
本発明の更なる態様は、癌の予防または処置に使用するための、上記に開示された二重特異性もしくは多重特異性抗体または医薬組成物に関し、二重特異性または多重特異性抗体は、癌免疫療法で使用するための化学療法剤、放射線および／または他の薬剤と組み合わせて投与される。
【００６４】
本発明の更なる態様は、有効量の二重特異性または多重特異性抗体を個体に投与して腫瘍細胞の増殖を阻害することを含む、個体における腫瘍細胞の増殖を阻害する方法で使用するための、上記に開示された二重特異性もしくは多重特異性抗体または医薬組成物に関する。
【図面の簡単な説明】
【００６５】
【図１】図１Ａ−Ｂ：新しいａＶＨライブラリーの配列とランダム化戦略。図１Ａ：ハーセプチン重鎖の配列アラインメントと、モノマーで安定した自律性ヒト重鎖可変ドメインの発現を可能にする修飾された配列（Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，２８３：３６３９−３６５４）。図１Ｂ：第１のａＶＨライブラリーのＣＤＲ３領域のランダム化戦略。フレームワーク３領域の一部、Ｋａｂａｔの番号付けによる３つの異なるＣＤＲ３配列の長さのＣＤＲ３領域（ボックス）、およびフレームワーク４領域が示されている。太字の文字は、配列Ｂ１ａｂと比較して異なる配列を示し、（Ｘ）はランダム化された位置を表す。
【図２】図２Ａ−Ｄ：生成されたＦｃベースのａＶＨコンストラクトの概略図。Ａ）ＤＮＡレベルでは、ａＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列は、２つのＧＧＧＧＳリンカーまたはリンカー配列ＤＧＧＳＰＴＰＰＴＰＧＧＧＳＡをコードするＤＮＡ配列に融合されており、これは、Ｆｃドメインコード配列をコードするＤＮＡ配列に融合されていた。最終的なタンパク質コンストラクトでは、ａＶＨドメインは、前述のリンカーの１つを介して、ヒト由来のＩｇＧ１  Ｆｃ配列のＮ末端、ここでは、Ｆｃノブ断片に融合され、これは、Ｆｃ二量体あたりモノマーディスプレイをもたらすＦｃ−ホール断片をコードする配列と共発現される。ＦｃノブおよびＦｃホールの両方がＰＧ−ＬＡＬＡ変異も含んでいる可能性がある。図２Ｂ：ＩｇＧ抗体のＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列は、ａＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列と置き換えられた。さらに、カッパ軽鎖の可変ドメインをコードする配列は削除され、唯一のカッパドメインの発現がもたらされた。共発現により、二価のａＶＨディスプレイを備えたＩｇＧ様コンストラクトが生じる。図２Ｃ：ＤＮＡレベルでは、ａＶＨドメインをコードするヌクレオチド配列は、２つのＧＧＧＧＳリンカーをコードするＤＮＡ配列に融合されており、これは、Ｆｃドメインコード配列をコードするＤＮＡ配列に融合されていた。最終的なタンパク質コンストラクトでは、ａＶＨドメインは、前述のリンカーを介して、ヒト由来のＩｇＧ１  Ｆｃ配列のＮ末端、ここでは、野生型ＦｃドメインまたはＰＧ−ＬＡＬＡ変異を保有するＦｃドメインのいずれかに融合されている。発現により、二価のａＶＨディスプレイを備えたＩｇＧ様コンストラクトが生じる。図２Ｄ：抗ＰＤ１重鎖（ＦｃホールおよびＰＧ−ＬＡＬＡ変異を含む）をコードするプラスミド、抗ＰＤ１軽鎖をコードするプラスミド、および抗ＬＡＧ３  ａＶＨ−Ｆｃ（ＦｃノブおよびＰＧ−ＬＡＬＡ変異を含む）ドメインをコードするプラスミドの共発現が、二重特異性１＋１抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体様コンストラクトの生成をもたらす。ａＶＨとＦｃドメインは、２つのＧＧＧＧＳリンカーを介して融合されている。
【図３】図３Ａ−Ｂ：ジスルフィド安定化ａＶＨの配列アラインメントと新しいライブラリー用に設計されたテンプレート。図３Ａ：ａＶＨライブラリーテンプレートのアラインメントが、Ｐ５２ａＣ／Ａ７１Ｃの組合せに基づいて示されている。図３Ｂ：ａＶＨライブラリーテンプレートのアラインメントが、Ｙ３３Ｃ／Ｙ５２Ｃの組合せに基づいて示されている。
【図４】フローサイトメトリーによる細胞結合分析。一価のａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトとしての、選択されたＭＣＳＰ特異的クローンのＭＶ３細胞への結合分析。濃度範囲は０．２７〜６００ｎＭであった。アイソタイプコントロール抗体が、ネガティブコントロールとして機能した。
【図５】ＴｆＲ１特異的ａＶＨクローンのＦＲＥＴ分析。テルビウムで標識された膜貫通ＴｆＲ１−ＳＮＡＰタグ融合タンパク質を発現する一過性トランスフェクト細胞のＦＲＥＴ分析。分析は、抗体を０．４から７２ｎＭまでの範囲の濃度で加えて、続いて受容体分子として抗ヒトＦｃ−ｄ２（最終的にはウェルあたり２００ｎＭ）を加えることにより行った。３時間後に特異的ＦＲＥＴ信号を測定し、ＫＤ値を計算した。
【図６】グランザイムＢおよびＩＬ２発現の誘導。前処理されたＣＤ４  Ｔと抗ＰＤ１抗体および精製された二価の抗ＬＡＧ３  ａＶＨ−Ｆｃコンストラクトを同時にインキュベートした後のグランザイムＢ（図６Ａ）およびＩＬ２レベル（図６Ｂ）の誘導。
【図７】二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３  １＋１抗体様コンストラクトを介した同時係合後のＰＤ１およびＬＡＧ３の二量体化。受容体ＰＤ１およびＬａｇ３の「二量体化」時に誘導される化学発光シグナルが示されている。曲線は、ＰＤ１結合部分と４つの異なる抗Ｌａｇ３  ａＶＨとからなる４つの所定の二重特異性抗体様コンストラクトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ効力を示している。
【図８】Ｂ細胞リンパ芽球様細胞株（ＡＲＨ７７）と共培養されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞による細胞毒性グランザイムＢ放出に対するＰＤ−１／ＬＡＧ−３二重特異性１＋１抗体様コンストラクトの効果。前処理されたＣＤ４  Ｔと、ｉ）抗ＰＤ１抗体単独、ｉｉ）二価の抗ＬＡＧ３  ａＶＨ−ＦｃコンストラクトもしくはＬＡＧ３抗体のいずれかと組み合わせた抗ＰＤ１抗体、またはｉｉｉ））二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体様１＋１コンストラクトとの同時インキュベーション後のグランザイムＢの誘導。
【発明を実施するための形態】
【００６６】
発明の実施形態の詳細な説明
Ｉ．定義
他の意味であると定義されない限り、本明細書で使用される技術用語および科学用語は、本発明が属する技術分野で一般的に使用されるのと同じ意味を有する。本明細書を解釈する目的で、以下の定義が適用され、適切な場合にはいつでも、単数形で使用される用語は、複数形も含み、その逆に、複数形で使用される用語は、単数形も含む。
【００６７】
本明細書で使用される場合、「抗原結合分子」との用語は、最も広い意味で、抗原決定基に特異的に結合する分子を指す。抗原結合分子の例は、抗体、抗体断片および足場抗原結合タンパク質である。
【００６８】
本明細書の「抗体」との用語は、最も広い意味で使用され、種々の抗体構造を包含し、限定されないが、所望の抗原結合活性を示す限り、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、単一特異性抗体および多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、および抗体断片を含む。
【００６９】
「単一特異性」抗体との用語は、本明細書で使用される場合、同じ抗原の同じエピトープにそれぞれ結合する１つ以上の結合部位を有する抗体を示す。「二重特異性」との用語は、抗体が、２つの別個の抗原決定基、例えば、異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに結合している抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）と抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）の対または自律性ＶＨドメインの対によってそれぞれ形成される２つの結合部位に特異的に結合することができることを意味する。そのような二重特異性抗体は、例えば１＋１フォーマットである。他の二重特異性抗体フォーマットは、２＋１フォーマット（第１の抗原またはエピトープに対する２つの結合部位と、第２の抗原またはエピトープに対する１つの結合部位とを含む）、または２＋２フォーマット（第１の抗原またはエピトープに対する２つの結合部位と、第２の抗原またはエピトープに対する２つの結合部位とを含む）である。典型的には、二重特異性抗体は、２つの抗原結合部位を含み、それぞれが異なる抗原決定基に対して特異的である。
【００７０】
「多重特異性」抗体との用語は、本明細書で使用される場合、異なる抗原または同じ抗原上の異なるエピトープに結合する３つ以上の結合部位を有する抗体を指す。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、少なくとも３つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープまたは同じ抗原上の異なるエピトープに対する結合特異性を有するモノクローナル抗体である。多重特異性（例えば、二重特異性）抗体はまた、細胞毒性剤または細胞を、標的を発現する細胞に局在化するために使用され得る。
【００７１】
「価数」との用語は、本出願で使用される場合、抗原結合分子内の特定数の結合部位の存在を示す。したがって、「二価」、「四価」および「六価」との用語は、抗原結合分子中のそれぞれ２個の結合部位、４個の結合部位および６個の結合部位の存在を示す。本発明による二重特異性抗体は、少なくとも「二価」であり、「三価」または「多価」（例えば、「四価」または「六価」）であってもよい。特定の態様では、本発明の抗体は、２つ以上の結合部位を有し、二重特異性または多重特異性である。すなわち、２つより多い結合部位が存在する場合であっても（すなわち、抗体は三価または多価である）、抗体は、二重特異性であってもよい。特に、本発明は、特異的に結合する各抗原に対して１つの結合部位を有する二重特異性二価抗体に関する。
【００７２】
「全長抗体」、「インタクト抗体」および「全抗体」との用語は、ネイティブ抗体構造に実質的に類似した構造を有する抗体を指すために、本明細書で相互に置き換え可能に用いられる。「ネイティブ抗体」は、さまざまな構造を有する天然に存在する免疫グロブリン分子を指す。例えば、ネイティブＩｇＧクラス抗体は、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖とから構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）（可変重鎖ドメインまたは重鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、続いて３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ）（可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変ドメインとも呼ばれる）と、続いて軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。抗体の重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）およびα２（ＩｇＡ２）などのサブタイプにさらに分けられてもよい。抗体の軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。
【００７３】
「抗体断片」は、インタクト抗体が結合する抗原に結合するインタクト抗体の一部を含むインタクト抗体以外の分子を指す。抗体断片の例として、限定されないが、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）２、ダイアボディ、トリアボディ、テトラボディ、クロスＦａｂ断片、直鎖抗体、一本鎖抗体分子（例えば、ｓｃＦｖ）、抗体断片から作られる多重特異性抗体、およびシングルドメイン抗体が挙げられる。特定の抗体断片の総説として、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）を参照。ｓｃＦｖ断片の総説として、例えば、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ，Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ｖｏｌ．１１３，Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照。また、国際公開第９３／１６１８５号および米国特許第５，５７１，８９４号および第５，５８７，４５８号を参照。サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。ダイアボディは、二価または二重特異性であってもよい２つの抗原結合部位を含む抗体断片であり、例えば、欧州特許出願公開第４０４，０９７号明細書；国際公開第１９９３／０１１６１号；Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）、およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８（１９９３）を参照。トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）に記載されている。
【００７４】
シングルドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインの全てもしくは一部もしくは軽鎖可変ドメインの全てもしくは一部または自律性ＶＨドメインを含む抗体断片である。特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ。例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照）。さらに、抗体断片は、ＶＨドメインに特徴的な（すなわち、ＶＬドメインと共に集合させることが可能な）、またはＶＬドメインに特徴的な（すなわち、機能的抗原結合部位にＶＨドメインと共に集合させることが可能な）一本鎖ポリペプチドを含み、それによって、全長抗体の抗原結合特性を与えることができる。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、および組換え宿主細胞（例えば大腸菌）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
【００７５】
慣例的に、インタクト抗体のパパイン消化により、２つの同一の抗原結合断片が得られ、これは、それぞれ重鎖および軽鎖可変ドメインと、さらに、軽鎖の定常ドメインおよび重鎖の第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む「Ｆａｂ」断片と呼ばれる。したがって、本明細書で使用される場合、「Ｆａｂ断片」との用語は、軽鎖（ＣＬ）のＶＬドメインおよび定常ドメインを含む軽鎖断片と、重鎖のＶＨドメインおよび第１の定常ドメイン（ＣＨ１）を含む抗体断片を指す。Ｆａｂ’断片は、抗体ヒンジ領域由来の１つ以上のシステインを含め、重鎖ＣＨ１ドメインのカルボキシ末端での数個の残基の付加によって、Ｆａｂ断片とは異なる。Ｆａｂ’−ＳＨは、定常ドメインのシステイン残基が有機チオール基を有するＦａｂ’断片である。ペプシン処理により、２つの抗原結合部位（２つのＦａｂ断片）と、Ｆｃ領域の一部とを含む、Ｆ（ａｂ’）２断片が得られる。
【００７６】
「クロスＦａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」との用語は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域１（ＣＨ１）とで構成されるポリペプチド鎖、および重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電または非荷電アミノ酸変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照。
【００７７】
「一本鎖Ｆａｂ断片」または「ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメインおよび前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する：（ａ）ＶＨ−ＣＨ１−リンカー−ＶＬ−ＣＬ、（ｂ）ＶＬ−ＣＬ−リンカー−ＶＨ−ＣＨ１、（ｃ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１、または（ｄ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ。ここで、前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸、好ましくは３２〜５０アミノ酸のポリペプチドである。前記一本鎖Ｆａｂ断片は、ＣＬドメインとＣＨ１ドメインとの間の天然ジスルフィド結合によって安定化される。さらに、これらの一本鎖Ｆａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の４４位および可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるだろう。
【００７８】
「クロスオーバー一本鎖Ｆａｂ断片」または「ｘ−ｓｃＦａｂ」は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、抗体定常ドメイン１（ＣＨ１）、抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、抗体軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）およびリンカーからなるポリペプチドであり、前記抗体ドメインおよび前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端への方向で、以下の順序の１つを有する。（ａ）ＶＨ−ＣＬ−リンカー−ＶＬ−ＣＨ１および（ｂ）ＶＬ−ＣＨ１−リンカー−ＶＨ−ＣＬ。ここで、ＶＨとＶＬは一緒になって、ある抗原に特異的に結合する抗原結合部位を形成し、前記リンカーは、少なくとも３０アミノ酸のポリペプチドである。さらに、これらのｘ−ｓｃＦａｂ分子は、システイン残基の挿入（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けによれば、可変重鎖の４４位および可変軽鎖の１００位）による鎖間ジスルフィド結合の生成によって、さらに安定化されるだろう。
【００７９】
「一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）」は、１０〜約２５アミノ酸の短いリンカーペプチドを用いて接続された、抗体の重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。リンカーは、通常、柔軟性のためにグリシンが豊富であり、溶解度のためにセリンまたはトレオニンが豊富であり、ＶＨのＮ末端とＶＬのＣ末端とが接続していてもよく、または逆に接続していてもよい。このタンパク質は、定常領域が除去され、リンカーが導入されているが、元々の抗体の特異性を保持している。ｓｃＦｖ抗体は、例えば、Ｈｏｕｓｔｏｎ，Ｊ．Ｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌ．２０３（１９９１）４６−９６）に記載されている。
【００８０】
「一本鎖ドメイン抗体」は、一本のモノマー性可変抗体ドメインからなる抗体断片である。第１のシングルドメインは、ラクダ由来の抗体重鎖の可変ドメインに由来した（ナノボディまたはＶＨＨ断片）。さらに、シングルドメイン抗体との用語は、自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）またはサメ由来ＶＮＡＲ断片を含む。
【００８１】
「エピトープ」との用語は、抗体が結合する相手である、タンパク質性または非タンパク質性のいずれかの、抗原上の部位を示す。エピトープは、隣接するアミノ酸ストレッチ（線状エピトープ）から形成することも、非隣接アミノ酸（立体構造エピトープ）、例えば、抗原の折り畳みにより、すなわち、タンパク質性抗原の三次折り畳みによって空間的に近位になる非隣接アミノ酸を含むこともできる。線状エピトープは、典型的には、タンパク質性抗原を変性剤に曝露した後も依然として抗体によって結合されているが、コンフォメーションエピトープは、典型的には、変性剤での処理により破壊される。エピトープは、独特の空間的構造で、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、または８〜１０個アミノ酸を含む。
【００８２】
特定のエピトープに結合する抗体（すなわち、同じエピトープに結合する抗体）のスクリーニングは、例えば、限定されないが、アラニンスキャニング、ペプチドブロット（Ｍｅｔｈ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８（２００４）４４３−４６３）、ペプチド切断分析、エピトープ切除、エピトープ抽出、抗原の化学的修飾（Ｐｒｏｔ．Ｓｃｉ．９（２０００）４８７−４９６を参照）、およびクロスブロッキング（「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ」，Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．，ＮＹを参照）などの、当該技術分野で慣用の方法を用いて行われ得る。
【００８３】
修飾支援プロファイリング（ＭＡＰ）としても知られる抗原構造ベースの抗体プロファイリング（ＡＳＡＰ）では、多数のモノクローナル抗体からの各抗体の、化学的または酵素的に修飾された抗原表面への結合プロファイルに基づいて、標的に特異的に結合するそれらの抗体を類別することができる（例えば、米国特許出願公開第２００４／０１０１９２０号明細書を参照）。各類型における抗体は、別の類型によって表されるエピトープと明確に異なるか、または部分的に重複する特異的エピトープであり得る同じエピトープに結合する。
【００８４】
また、競合結合は、抗体が参照抗体と同じ標的のエピトープに結合するか、または参照抗体との結合について競合するかを容易に決定するために使用することができる。例えば、参照抗体と「同じエピトープに結合する抗原」は、競合アッセイにおいて、参照抗体のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする抗体を指し、逆に、参照抗体は、競合アッセイにおいて、抗体のその抗原に対する結合を５０％以上ブロックする。また、例えば、抗体が参照と同じエピトープに結合するかどうかを決定するために、参照抗体は、飽和条件下で標的に結合することができる。過剰な参照抗体を除去した後、対象の抗体が標的に結合する能力が評価される。抗体が参照抗体の飽和結合後に標的に結合できる場合、対象の抗体は、参照抗体とは異なるエピトープに結合すると結論付けることができる。しかし、対象の抗体が参照抗体の飽和結合後に標的に結合できない場合、対象の抗体は、参照抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する可能性がある。対象の抗体が同じエピトープに結合するか、または立体的な理由で結合が妨げられているかを確認するために、通常の実験を使用することができる（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＲＩＡ、表面プラズモン共鳴、フローサイトメトリー、または他の定量的もしくは定性的な当該技術分野で利用可能な抗体結合アッセイ）。このアッセイは、２つの設定で実行する必要がある。すなわち、両方の抗体が飽和抗体である。両方の設定において、第１の（飽和）抗体のみが標的に結合できる場合、対象の抗体と参照抗体は、標的への結合をめぐって競合すると結論付けることができる。
【００８５】
いくつかの実施形態では、競合結合アッセイで測定して、一方の抗体の１、５、１０、２０または１００倍過剰が他方の結合を少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、さらには９９％以上阻害する場合、２つの抗体は同じまたは重複するエピトープに結合すると見なされる。（例えば、Ｊｕｎｇｈａｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．５０（１９９０）１４９５−１５０２を参照）。
【００８６】
一部の実施形態では、一方の抗体の結合を低減または排除する抗原中の本質的に全てのアミノ酸変異が他方の抗体の結合も低減または排除する場合、２つの抗体は同じエピトープに結合すると見なされる。一方の抗体の結合を低減または排除するアミノ酸変異のサブセットのみが他方の結合を低減または排除する場合、２つの抗体は「重複エピトープ」を有すると見なされる。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「抗原結合部位」または「抗原結合ドメイン」との用語は、抗原決定基に特異的に結合する抗原結合分子の一部を指す。より具体的には、「抗原結合部位」との用語は、ある抗原の一部または全てに特異的に結合し、ある抗原の一部または全てに対して相補的な領域を含む抗体の一部を指す。抗原が大きい場合、抗原結合分子は、抗原の特定の部分のみに結合してもよく、この部分は、エピトープと呼ばれる。抗原結合部位は、例えば、１つ以上の可変ドメイン（可変領域とも呼ばれる）によって与えられてもよい。好ましくは、抗原結合部位は、抗体軽鎖可変領域（ＶＬ）と、抗体重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む。一態様では、抗原結合部位は、その抗原に結合し、その機能をブロックするか、または部分的にブロックすることができる。ＰＤ１、ＭＣＳＰ、ＴｆＲ１、ＬＡＧ３などに特異的に結合する抗原結合部位は、本明細書でさらに定義するように、抗体およびその断片を含む。さらに、抗原結合部位は、足場抗原結合タンパク質、例えば、設計された反復タンパク質または設計された反復ドメインに基づく結合ドメインを含んでいてもよい（例えば、国際公開第２００２／０２０５６５号を参照）。
【００８８】
「特異的に結合する」とは、その結合が抗原選択性であり、望ましくない相互作用または非特異的な相互作用とは判別できることを意味する。抗体のＫｄが１μＭ以下の場合、抗体は、標的、特にＰＤ１またはＬａｇ３に「特異的に結合」すると言われる。抗原結合分子が特定の抗原（例えば、ＰＤ−１）に結合する能力は、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または当該技術分野で知られている他の技術、例えば、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技術（ＢＩＡｃｏｒｅ装置で分析される）（Ｌｉｌｊｅｂｌａｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｇｌｙｃｏ  １５  Ｊ  １７，３２３−３２９（２０００））、および従来の結合アッセイ（Ｈｅｅｌｅｙ，Ｅｎｄｏｃｒ  Ｒｅｓ  ２８，２１７−２２９（２００２））によって測定することができる。一実施形態では、無関係なタンパク質に対する抗原結合分子の結合度は、例えばＳＰＲによって測定される抗原に対する抗原結合分子の結合の約１０％未満である。特定の実施形態では、抗原に結合する分子は、解離定数（Ｋｄ）が、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭまたは≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−７Ｍ以下、例えば、１０−７Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）である。
【００８９】
「アフィニティー」または「結合アフィニティー」は、分子の単一の結合部位（例えば、抗体）と、その結合対（例えば、抗原）との間の非共有結合性相互作用の合計強度を指す。特に示されない限り、本明細書で使用される場合、「結合アフィニティー」は、結合対（例えば、抗体と抗原）のメンバー間の１：１相互作用を反映する特異的結合アフィニティーを指す。分子Ｘのその結合対Ｙに対するアフィニティーは、一般的に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができ、脱離速度定数と解離速度定数（それぞれｋｏｆｆおよびｋｏｎ）の比である。したがって、速度定数の比率が同じである限り、等価なアフィニティーが、異なる速度定数を含む場合がある。アフィニティーは、本明細書に記載するものを含め、当該技術分野で一般的な方法によって測定することができる。アフィニティーを測定する特定の方法は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）である。
【００９０】
本明細書で使用される場合、ある抗体の「高アフィニティー」との用語は、標的抗原に対するＫｄが１０−９Ｍ以下、さらにより特定的には１０−１０Ｍ以下の抗体を指す。「低アフィニティー」の抗体は、Ｋｄが１０−８以上の抗体を指す。
【００９１】
「アフィニティー成熟した」抗体は、１つ以上の超可変領域（ＨＶＲ）に１つ以上の変更を有する抗体を指し、これに対して、親抗体は、そのような変更を有しておらず、そのような変更によって、抗原に対する抗体のアフィニティーが向上する。
【００９２】
「ＰＤ１」との用語は、プログラム細胞死タンパク質１としても知られ、１９９２年に最初に記述された２８８アミノ酸のＩ型膜タンパク質である（Ｉｓｈｉｄａ  ｅｔ  ａｌ．，ＥＭＢＯ  Ｊ．，１１（１９９２），３８８７−３８９５）。ＰＤ１は、Ｔ細胞制御因子の伸長したＣＤ２８／ＣＴＬＡ−４ファミリーのメンバーであり、２つのリガンドＰＤ−Ｌ１（Ｂ７−Ｈ１、ＣＤ２７４）およびＰＤ−Ｌ２（Ｂ７−ＤＣ、ＣＤ２７３）を有する。このタンパク質の構造は、細胞外ＩｇＶドメインと、その後に膜貫通領域と、細胞内尾部とを含む。細胞内尾部は、免疫受容体チロシン系阻害モチーフおよび免疫受容体チロシン系スイッチモチーフ中に位置する２つのリン酸化部位を含み、ＰＤ−１がＴＣＲシグナルを負の方向に制御することを示唆している。このことは、リガンド結合の際の、ＰＤ１の細胞質尾部に対するＳＨＰ−１およびＳＨＰ−２ホスファターゼの結合に一致している。ＰＤ−１は、ナイーブＴ細胞では発現しないが、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）が介在する活性化に従ってアップレギュレーションされ、活性化したＴ細胞および疲弊したＴ細胞の両方で観察される（Ａｇａｔａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ８（１９９６），７６５−７７２）。これらの疲弊したＴ細胞は、機能不全の表現型を有し、適切に応答することができない。ＰＤ−１は、比較的広い発現パターンを有するが、その最も重要な役割は、Ｔ細胞に対する共阻害受容体としての機能であろう（Ｃｈｉｎａｉ  ｅｔ  ａｌ，Ｔｒｅｎｄｓ  ｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  ３６（２０１５），５８７−５９５）。したがって、現在の治療手法は、Ｔ細胞応答を向上させるために、ＰＤ−１とそのリガンドとの相互作用をブロックすることに集中している。「プログラム死１」、「プログラム細胞死１」、「タンパク質ＰＤ−１」、「ＰＤ−１」、「ＰＤ１」、「ＰＤＣＤ１」、「ｈＰＤ−１」および「ｈＰＤ−Ｉ」との用語は、相互に置き換え可能に使用することができ、ヒトＰＤ１のバリアント、アイソフォーム、種ホモログ、ＰＤ１と共通の少なくとも１つのエピトープを有するアナログを含む。ヒトＰＤ１のアミノ酸配列は、ＵｎｉＰｒｏｔ（ｗｗｗ．ｕｎｉｐｒｏｔ．ｏｒｇ）寄託番号Ｑ１５１１６に示される。
【００９３】
「抗ＰＤ１抗体」および「ＰＤ１に結合する抗原結合部位を含む抗体」との用語は、抗体が、ＰＤ１を標的とする際に診断および／または治療薬剤として有用であるように十分なアフィニティーで、ＰＤ１（特に、細胞表面で発現するＰＤ１ポリペプチド）に結合することが可能な抗体を指す。一実施形態では、無関係な非ＰＤ１タンパク質に対する抗ＰＤ１抗体の結合度は、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）またはフローサイトメトリー（ＦＡＣＳ）によって、またはＢｉａｃｏｒｅ（登録商標）システムなどのバイオセンサシステムを用いた表面プラズモン共鳴アッセイによって測定する場合、ＰＤ１に対する抗体の結合の約１０％未満である。
【００９４】
特定の実施形態では、ヒトＰＤ１に結合する抗原結合タンパク質は、ヒトＰＤ１に結合する結合アフィニティーのＫＤ値が≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、≦０．１ｎＭ、≦０．０１ｎＭ、または≦０．００１ｎＭ（例えば、１０−８Ｍ以下、例えば、１０−８Ｍ〜１０−１３Ｍ、例えば、１０−９Ｍ〜１０−１３Ｍ）である。好ましい一実施形態では、結合アフィニティーのそれぞれのＫＤ値は、ＰＤ１結合アフィニティーについて、ヒトＰＤ１の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）（ＰＤ１−ＥＣＤ）を用い、表面プラズモン共鳴アッセイで決定される。「抗ＰＤ１抗体」との用語は、ＰＤ１および第２の抗原に結合することが可能な二重特異性抗体も包含する。
【００９５】
「ブロッキング」抗体または「アンタゴニスト」抗体は、これらが結合する抗原の生体活性を阻害するか、または減らす抗体である。いくつかの実施形態では、ブロッキング抗体またはアンタゴニスト抗体は、抗原の生体活性を実質的に、または完全に阻害する。例えば、本発明の二重特異性抗体は、抗原刺激に対する機能不全状態から、Ｔ細胞による機能応答（例えば、増殖、サイトカイン産生、標的細胞死）を回復するように、ＰＤ１およびＴＩＭ−３によるシグナル伝達をブロックする。
【００９６】
「可変領域」または「可変ドメイン」との用語は、抗原に対する抗原結合分子の結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然の抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれＶＨおよびＶＬ）は、一般的に、同様の構造を有し、それぞれのドメインは、４つの保存されたフレームワーク領域（ＦＲ）と、３つの超可変領域（ＨＶＲ）とを含む。例えば、Ｋｉｎｄｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｋｕｂｙ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，６ｔｈ、Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏ．，ｐａｇｅ  ９１（２００７）を参照。抗原結合特異性を与えるために、単一のＶＨまたはＶＬドメインで十分な場合がある。
【００９７】
「超可変領域」または「ＨＶＲ」との用語は、本明細書で使用される場合、配列において超可変性であり（「相補性決定領域」または「ＣＤＲ」）、および／または構造的に所定のループ（「超可変ループ」）を形成し、および／または抗原に接触する残基（「抗原接触」）を含有する抗体可変ドメインのそれぞれの領域を指す。一般的に、抗体は、６個のＨＶＲを含み、ＶＨに３個（Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３）、ＶＬに３個（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）含む。本発明の例示的なＨＶＲとして、以下のものが挙げられる。
（ａ）アミノ酸残基２６−３２（Ｌ１）、５０−５２（Ｌ２）、９１−９６（Ｌ３）、２６−３２（Ｈ１）、５３−５５（Ｈ２）および９６−１０１（Ｈ３）で生じる超可変ループ（Ｃｈｏｔｈｉａ  ａｎｄ  Ｌｅｓｋ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１−９１７（１９８７））；
（ｂ）アミノ酸残基２４−３４（Ｌ１）、５０−５６（Ｌ２）、８９−９７（Ｌ３）、３１−３５ｂ（Ｈ１）、５０−６５（Ｈ２）および９５−１０２（Ｈ３）に存在するＣＤＲ（Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ、Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ（１９９１））；
（ｃ）アミノ酸残基２７ｃ−３６（Ｌ１）、４６−５５（Ｌ２）、８９−９６（Ｌ３）、３０−３５ｂ（Ｈ１）、４７−５８（Ｈ２）および９３−１０１（Ｈ３）で生じる抗原接触（ＭａｃＣａｌｌｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６２：７３２−７４５（１９９６））；ならびに
（ａ）、（ｂ）および／または（ｃ）の組合せ、ＨＶＲアミノ酸残基４６−５６（Ｌ２）、４７−５６（Ｌ２）、４８−５６（Ｌ２）、４９−５６（Ｌ２）、２６−３５（Ｈ１）、２６−３５ｂ（Ｈ１）、４９−６５（Ｈ２）、９３−１０２（Ｈ３）および９４−１０２（Ｈ３）を含む。
【００９８】
特に示されない限り、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）残基および可変ドメイン中の他の残基（例えば、ＦＲ残基）は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．（前出）に従って本明細書では番号付けされる。
【００９９】
Ｋａｂａｔｅｔ  ａｌ．は、任意の抗体に適用可能な可変領域配列の番号付けシステムも定義した。当業者は、任意の可変領域配列に対し、配列自体を超える実験データに頼ることなく、「Ｋａｂａｔ番号付け」のこのシステムを明確に割り当てることができる。本明細書で使用される場合、「Ｋａｂａｔ番号付け」は、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ，Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，「Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ」（１９８３）に記載される番号付けシステムを指す。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるような、ＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
【０１００】
ＶＨ中のＣＤＲ１を除き、ＣＤＲは、一般的に、超可変ループを形成するアミノ酸残基を含む。ＣＤＲは、「特異性決定領域」、すなわち「ＳＤＲ」も含み、ＳＤＲは、抗原と接触する残基である。ＳＤＲは、省略−ＣＤＲ、すなわちａ−ＣＤＲと呼ばれるＣＤＲの領域内に含まれる。例示的なａ−ＣＤＲ（ａ−ＣＤＲ−Ｌ１、ａ−ＣＤＲ−Ｌ２、ａ−ＣＤＲ−Ｌ３、ａ−ＣＤＲ−Ｈ１、ａ−ＣＤＲ−Ｈ２およびａ−ＣＤＲ−Ｈ３）は、Ｌ１の３１−３４、Ｌ２の５０−５５、Ｌ３の８９−９６、Ｈ１の３１−３５Ｂ、Ｈ２の５０−５８およびＨ３の９５−１０２のアミノ酸残基に存在する。（Ａｌｍａｇｒｏ  ａｎｄ  Ｆｒａｎｓｓｏｎ，Ｆｒｏｎｔ．Ｂｉｏｓｃｉ．１３：１６１９−１６３３（２００８）を参照。）簡単にするために、自律性ＶＨドメインの文脈では、第２のポリペプチド鎖が存在せず、例えば、ＶＬドメインが自律性ＶＨドメインに存在するため、本明細書ではＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３と呼ぶ。
【０１０１】
「フレームワーク」または「ＦＲ」は、超可変領域（ＨＶＲ）残基以外の可変ドメイン残基を指す。可変ドメインのＦＲは、一般的に、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４の４つのＦＲドメインからなる。したがって、ＨＶＲおよびＦＲ配列は、一般的に、ＶＨ（またはＶＬ）中で以下の配列で現れる。ＦＲ１−Ｈ１（Ｌ１）−ＦＲ２−Ｈ２（Ｌ２）−ＦＲ３−Ｈ３（Ｌ３）−ＦＲ４。簡単にするために、自律性ＶＨドメインの文脈では、自律性ＶＨドメインは、特にＶＨドメインとＶＬドメインによって２つの鎖で構成されていないことから、ＦＲ１、ＦＲ２、ＦＲ３およびＦＲ４と呼ばれる。
【０１０２】
本明細書での目的のために、「受容体ヒトフレームワーク」は、ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク由来の軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）フレームワークまたは重鎖可変ドメイン（ＶＨ）フレームワークのアミノ酸配列を含むフレームワークである。ヒト免疫グロブリンフレームワークまたはヒトコンセンサスフレームワーク「由来の」受容体ヒトフレームワークは、その同じアミノ酸配列を含んでいてもよく、またはアミノ酸配列の変更を含んでいてもよい。いくつかの実施形態では、アミノ酸変更の数は、１０以下、９以下、８以下、７以下、６以下、５以下、４以下、３以下、または２以下である。いくつかの実施形態では、ＶＬ受容体ヒトフレームワークは、ＶＬヒト免疫グロブリンフレームワーク配列またはヒトコンセンサスフレームワーク配列に対して、配列が同一である。
【０１０３】
「キメラ」抗体との用語は、重鎖および／または軽鎖の一部が、特定の供給源または種に由来する抗体を指し、一方、重鎖および／または軽鎖の残りは、異なる供給源または種に由来する。
【０１０４】
抗体の「クラス」は、その重鎖が保有する定常ドメインまたは定常領域の種類を指す。５種類の主要なクラスの抗体ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ、およびこれらのいくつかは、サブクラス（アイソタイプ）、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１、およびＩｇＡ２にさらに分類され得る。免疫グロブリンの異なる種類に対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、δ、ε、γおよびμと呼ばれる。
【０１０５】
「ヒト化」抗体は、非ヒトＨＶＲ由来のアミノ酸残基と、ヒトＦＲ由来のアミノ酸残基とを含むキメラ抗体を指す。特定の実施形態では、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含み、ＨＶＲ（例えばＣＤＲ）の全てまたは実質的に全てが、非ヒト抗体に対応し、ＦＲの全てまたは実質的に全てが、ヒト抗体に対応する。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含んでいてもよい。
【０１０６】
ある抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。本発明に包含される「ヒト化抗体」の他の形態は、特に、Ｃ１ｑ結合および／またはＦｃ受容体（ＦｃＲ）結合という観点で、本発明に係る特性を作り出すために、定常領域が、元々の抗体の定常領域からさらに修飾されるか、または変更されているものである。
【０１０７】
「ヒト」抗体は、ヒトまたはヒト細胞によって産生されるか、またはヒト抗体のレパートリーまたは他のヒト抗体コード配列を利用する非ヒト源から誘導される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するものである。このヒト抗体の定義は、非ヒト抗原結合残基を含むヒト化抗体を特定的に除外する。
【０１０８】
「モノクローナル抗体」との用語は、本明細書で使用される場合、実質的に均一な抗体の集合から得られる抗体を指し、すなわち、集合に含まれる個々の抗体が、同一であり、かつ／または同じエピトープに結合するが、但し、例えば、天然に存在する変異またはモノクローナル抗体製剤の製造中に生じる変異を含む、可能なバリアント抗体は除く。そのようなバリアントは、一般的に少量で存在する。典型的には異なる決定基（エピトープ）に対して指向する異なる抗体を含むポリクローナル抗体製剤とは対照的に、モノクローナル抗体製剤のそれぞれのモノクローナル抗体は、１つの抗原上の単一の決定基に対して指向する。したがって、修飾詞「モノクローナル」は、抗体の実質的に均一な集合から得られる抗体の特徴を示し、任意の特定の方法による抗体の産生を必要とするように構築されない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、限定されないが、ハイブリドーマ方法、組換えＤＮＡ方法、ファージディスプレイ方法、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の全てまたは一部を含むトランスジェニック動物を利用する方法を含め、種々の技術によって作られてもよい。
【０１０９】
「Ｆｃドメイン」または「Ｆｃ領域」との用語は、本明細書において、定常領域の少なくとも一部を含む抗体重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。この用語は、ネイティブ配列Ｆｃ領域とバリアントＦｃ領域を含む。特に、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域は、Ｃｙｓ２２６から、またはＰｒｏ２３０から、重鎖のカルボキシル末端まで延びている。しかし、Ｆｃ領域のＣ末端リシン（Ｌｙｓ４４７）は、存在していてもよく、または存在していなくてもよい。重鎖のアミノ酸配列は、Ｃ末端リシンを伴って存在するが、Ｃ末端リシンを含まないバリアントが、本発明に含まれてよい。
【０１１０】
ＩｇＧ  Ｆｃ領域は、ＩｇＧ  ＣＨ２ドメインと、ＩｇＧ  ＣＨ３ドメインとを含む。ヒトＩｇＧ  Ｆｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」は、通常、おおよそのアミノ酸２３１位のアミノ酸残基から、おおよそのアミノ酸３４０位のアミノ酸残基まで延びている。一実施形態では、炭水化物鎖は、ＣＨ２ドメインに接続している。本発明のＣＨ２ドメインは、ネイティブ配列ＣＨ２ドメインまたはバリアントＣＨ２ドメインであってもよい。「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域中のＣＨ２ドメインに対してＣ末端に残基の伸長部を含む（すなわち、ＩｇＧのおおよその３４１位のアミノ酸残基から、おおよその４４７位のアミノ酸残基まで）。本発明のＣＨ３領域は、ネイティブ配列ＣＨ３ドメインまたはバリアントＣＨ３ドメインであってもよい（例えば、その１つの鎖に導入された「突起部」（「ノブ」）を有し、その他の鎖に対応する導入された「空洞」（「ホール」）を有するＣＨ３ドメイン、本明細書に参考として明確に組み込まれる米国特許第５，８２１，３３３号を参照）。そのようなバリアントＣＨ３ドメインを使用して、本明細書に記載される２つの同一ではない抗体重鎖のヘテロ二量体化を促進してもよい。本明細書で特に明記されない限り、Ｆｃ領域または定常領域におけるアミノ酸残基の番号付けは、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるＥＵ番号付けシステム（ＥＵインデックスとも呼ばれる）に従う。
【０１１１】
「ノブ・イントゥ・ホール（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ）」技術は、例えば、米国特許第５，７３１，１６８号明細書、米国特許第７，６９５，９３６号明細書、Ｒｉｄｇｗａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９，６１７−６２１（１９９６）およびＣａｒｔｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ  ２４８，７−１５（２００１）に記載されている。一般的に、この方法は、第１のポリペプチドの界面にある突起（「ノブ」）と、第２のポリペプチドの界面にある空洞（「ホール」）とを導入することを含み、その結果、突起が、ヘテロ二量体形成を促進し、ホモ二量体形成を妨害するように空洞内に位置することができる。突起は、第１のポリペプチドの界面からの小さなアミノ酸側鎖を、より大きな側鎖（例えば、チロシンまたはトリプトファン）と交換することによって構築される。突起と同一または同様の大きさの相補性空洞が、大きなアミノ酸側鎖を、より小さなアミノ酸側鎖（例えば、アラニンまたはトレオニン）と置き換えることによって、第２のポリペプチドの界面に作られる。突起および空洞は、ポリペプチドをコードする核酸を変えることによって、例えば、部位特異的変異導入法によって、またはペプチド合成によって作り出すことができる。具体的な実施形態では、ノブ修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｗを含み、ホール修飾は、Ｆｃドメインの２つのサブユニットのうち他方の１つにアミノ酸置換Ｔ３６６Ｓ、Ｌ３６８ＡおよびＹ４０７Ｖを含む。さらに具体的な実施形態では、ノブ修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、さらに、アミノ酸置換Ｓ３５４Ｃを含み、ホール修飾を含むＦｃドメインのサブユニットは、さらに、アミノ酸置換Ｙ３４９Ｃを含む。これら２つのシステイン残基の導入によって、Ｆｃ領域の２つのサブユニット間にジスルフィド架橋が生成し、それにより、ダイマーをさらに安定化する（Ｃａｒｔｅｒ，Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２４８，７−１５（２００１））。
【０１１２】
「免疫グロブリンのＦｃ領域に等価な領域」は、天然に存在する免疫グロブリンのＦｃ領域の対立遺伝子バリアントおよび置換、付加または欠失を生じるが、エフェクター機能（例えば、抗体依存性細胞毒性）に介在する免疫グロブリンの能力を実質的に低下させない変更を有するバリアントを含むことが意図される。例えば、１つ以上のアミノ酸は、生体機能を実質的に失うことなく、免疫グロブリンのＦｃ領域のＮ末端またはＣ末端から欠失されていてもよい。そのようなバリアントは、活性に対して最小限の影響を有するように、当該技術分野で知られた一般的な規則に従って選択することができる（例えば、Ｂｏｗｉｅ，Ｊ．Ｕ．ｅｔ  ａｌ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１０（１９９０）を参照）。
【０１１３】
「エフェクター機能」との用語は、抗体のＦｃ領域に帰属可能な生体活性を指し、抗体アイソタイプによって変わる。抗体エフェクター機能の例として、以下のものが挙げられる：Ｃ１ｑ結合および補体依存性細胞障害（ＣＤＣ）、Ｆｃ受容体結合、抗体依存性細胞障害（ＡＤＣＣ）、抗体依存性細胞食作用（ＡＤＣＰ）、サイトカイン分泌、抗原提示細胞による免疫複合体媒介性抗原取り込み、細胞表面受容体（例えば、Ｂ細胞受容体）のダウンレギュレーション、およびＢ細胞活性化。
【０１１４】
「活性化Ｆｃ受容体」は、抗体のＦｃ領域による係合の後に、エフェクター機能を発揮するために受容体を含む細胞を刺激するシグナル伝達事象を誘発するＦｃ受容体である。活性化Ｆｃ受容体として、ＦｃγＲＩＩＩａ（ＣＤ１６ａ）、ＦｃγＲＩ（ＣＤ６４）、ＦｃγＲＩＩａ（ＣＤ３２）およびＦｃαＲＩ（ＣＤ８９）が挙げられる。特定の活性化Ｆｃ受容体は、ヒトＦｃγＲＩＩＩａである（ＵｎｉＰｒｏｔ寄託番号Ｐ０８６３７，ｖｅｒｓｉｏｎ  １４１を参照）。
【０１１５】
「ペプチドリンカー」との用語は、１つ以上のアミノ酸、典型的には、約２〜２０のアミノ酸を含むペプチドを指す。ペプチドリンカーは、当該技術分野で知られているか、または本明細書に記載される。適切な非免疫原性リンカーペプチドは、例えば、（Ｇ４Ｓ）ｎ、（ＳＧ４）ｎまたはＧ４（ＳＧ４）ｎペプチドリンカーであり、ここで、「ｎ」は、一般に、１〜１０の間、典型的には２〜４の数、特に２である。
【０１１６】
「〜に融合する」または「〜に接続する」とは、コンポーネント（例えば、抗原結合部位およびＦｃドメイン）が、ペプチド結合によって直接的に、または１つ以上のペプチドリンカーを介して連結することを意味する。
【０１１７】
「アミノ酸」との用語は、本明細書中で使用される場合、アラニン（三文字コード：ａｌａ、一文字コード）Ａ）、アルギニン（ａｒｇ、Ｒ）、アスパラギン（ａｓｎ、Ｎ）、アスパラギン酸（ａｓｐ、Ｄ）、システイン（ｃｙｓ、Ｃ）、グルタミン（ｇｌｎ、Ｑ）、グルタミン酸（ｇｌｕ、Ｅ）、グリシン（ｇｌｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ｈｉｓ、Ｈ）、イソロイシン（ｉｌｅ、Ｉ）、ロイシン（ｌｅｕ、Ｌ）、リシン（ｌｙｓ、Ｋ）、メチオニン（ｍｅｔ、Ｍ）、フェニルアラニン（ｐｈｅ、Ｆ）、プロリン（ｐｒｏ、Ｐ）、セリン（ｓｅｒ、Ｓ）、トレオニン（ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（ｔｒｐ、Ｗ）、チロシン（ｔｙｒ、Ｙ）およびバリン（ｖａｌ、Ｖ）を含む天然に存在するカルボキシα−アミノ酸の一群を示す。
【０１１８】
参照ポリペプチド配列に対する「アミノ酸配列の同一性率（％）」は、アラインメントの目的で、配列をアラインメントし、最大の配列同一性率を達成するために、必要ならばギャップを導入した後、配列同一性の一部として任意の保存的置換を考慮せずに、参照ポリペプチド配列中のアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基の割合であると定義される。アミノ酸配列同一性率を決定するためのアラインメントは、当該技術分野の技術の範囲内にある種々の様式で、例えば、公的に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、Ｃｌｕｓｔａｌ  Ｗ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェアまたはＦＡＳＴＡプログラムパッケージを用いて達成することができる。当業者は、比較される配列の全長にわたって最大アラインメントを達成するのに必要な任意のアルゴリズムを含め、配列をアラインメントするのに適切なパラメータを決定することができる。しかしながら、本明細書での目的のために、アミノ酸配列同一性％の値は、ＦＡＳＴＡパッケージバージョン３６．３．８ｃのｇｇｓｅａｒｃｈプログラムを使用するか、またはその後にＢＬＯＳＵＭ５０比較マトリックスを用いて生成される。ＦＡＳＴＡプログラムパッケージは、Ｗ．Ｒ．ＰｅａｒｓｏｎおよびＤ．Ｊ．Ｌｉｐｍａｎ（１９８８），「Ｉｍｐｒｏｖｅｄ  Ｔｏｏｌｓ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ」，ＰＮＡＳ  ８５：２４４４−２４４８；Ｗ．Ｒ．Ｐｅａｒｓｏｎ（１９９６）「Ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ」Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：２２７−２５８；およびＰｅａｒｓｏｎ  ｅｔ．ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ４６：２４−３６によって記載されており、ｗｗｗ．ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｆａｓｔａ＿ｄｏｗｎ．ｓｈｔｍｌ．またはｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｓｓｓ／ｆａｓｔａから公的に入手可能である。これに代えて、ｆａｓｔａ．ｂｉｏｃｈ．ｖｉｒｇｉｎｉａ．ｅｄｕ／ｆａｓｔａ＿ｗｗｗ２／ｉｎｄｅｘ．ｃｇｉでアクセス可能な公的なサーバーを使用して、ｇｇｓｅａｒｃｈ（ｇｌｏｂａｌ  ｐｒｏｔｅｉｎ：ｐｒｏｔｅｉｎ）プログラムおよびデフォルトオプション（ＢＬＯＳＵＭ５０；オープン：−１０；ｅｘｔ：−２；Ｋｔｕｐ＝２）を用い、ローカルではなくグローバルのアラインメントを確実に行い、配列を比較することができる。アミノ酸同一性率は、出力アラインメントヘッダーに示される。特定の態様では、本明細書で提供される本発明のａＶＨの「アミノ酸配列バリアント」が企図される。例えば、ａＶＨの結合アフィニティーおよび／または他の生体特性を改良することが望ましい場合がある。ａＶＨのアミノ酸配列バリアントは、分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって調製されてもよく、またはペプチド合成によって調製されてもよい。そのような修飾として、例えば、ａＶＨのアミノ酸配列内の残基からの欠失、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基への挿入、および／または抗体のアミノ酸配列内の残基の置換が挙げられる���欠失、挿入および置換の任意の組合せは、最終コンストラクトが、所望の特徴（例えば、抗原結合）を有する限り、最終コンストラクトに到達するように行うことができる。置換による突然変異生成のための目的部位として、ＨＶＲおよびフレームワーク（ＦＲ）が挙げられる。保存的置換は、「好ましい置換」の見出しで表Ｂに与えられており、アミノ酸側鎖クラス（１）〜（６）を参照しつつ、以下にさらに記載される。アミノ酸置換は、目的の分子および所望の活性（例えば、抗原結合の保持／向上、免疫原性の低下、またはＡＤＣＣまたはＣＤＣの向上）についてスクリーニングされた産物に導入されていてもよい。
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【０１１９】
アミノ酸は、共通の側鎖特性に従ってグループ分けされてもよい。
（１）疎水性：ノルロイシン、Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；
（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｓｎ、Ｇｌｎ；
（３）酸性：Ａｓｐ，Ｇｌｕ；
（４）塩基性：Ｈｉｓ，Ｌｙｓ，Ａｒｇ；
（５）鎖の配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ，Ｐｒｏ；
（６）芳香族：Ｔｒｐ，Ｔｙｒ，Ｐｈｅ。
【０１２０】
非保存的置換は、これらのクラスの１つのメンバーを別のクラスと交換することを伴うだろう。
【０１２１】
「アミノ酸配列バリアント」との用語は、親抗原結合分子（例えば、ヒト化抗体またはヒト抗体）の１つ以上の超可変領域残基中にアミノ酸置換が存在する実質的なバリアントを含む。一般的に、更なる試験のために選択され、得られたバリアントは、親抗原結合分子と比較して、特定の生物学的特性の修飾（例えば、改良）（例えば、アフィニティーの増加、免疫原性の低下）を有し、および／または親抗原結合分子の特定の生物学的特性を実質的に保持しているだろう。例示的な置換バリアントは、アフィニティー成熟した抗体であり、例えば、本明細書に記載されるようなファージディスプレイに基づくアフィニティー成熟技術を用い、簡便に生成されてもよい。簡単に言うと、１つ以上のＨＶＲ残基は、変異しており、ファージディスプレイされ、特定の生体活性（例えば、結合アフィニティー）についてスクリーニングされたバリアント抗原結合分子である。特定の実施形態では、置換、挿入または欠失は、そのような変更が、抗原結合分子が抗原に結合する能力を実質的に減らさない限り、１つ以上のＨＶＲ内で起こってもよい。例えば、結合アフィニティーを実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書に提供される保存的置換）が、ＨＶＲ中に作られてもよい。変異を標的とし得る抗体の残基または領域の同定のための有用な方法は、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ（１９８９）Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４４：１０８１−１０８５によって記載されるように、「アラニンスキャンニング突然変異生成」と呼ばれる。この方法では、抗体と抗原との相互作用が影響を受けるかどうかを決定するために、残基または標的残基群（例えば、荷電残基、例えば、Ａｒｇ、Ａｓｐ、Ｈｉｓ、ＬｙｓおよびＧｌｕ）が同定され、中性または負に荷電したアミノ酸（例えば、アラニンまたはポリアラニン）によって置き換えられる。更なる置換が、初期置換に対する機能的感受性を示すアミノ酸位置に導入されてもよい。
【０１２２】
これに代えて、またはこれに加えて、抗体と抗原との間の接触点を同定するための、抗原−抗原結合分子複合体の結晶構造。そのような接触残基および隣接残基は、置換の候補として標的とされるか、または除去されてもよい。バリアントは、所望の特性を有するか否かを判定するためにスクリーニングされてもよい。
【０１２３】
アミノ酸配列挿入として、１個の残基から１００個以上の残基を含むポリペプチドまでの長さ範囲のアミノ末端および／またはカルボキシル末端の融合、ならびに１個または複数のアミノ酸残基の配列内挿入が挙げられる。末端挿入の例として、Ｎ末端メチオニル残基を有する二重特異性抗体が挙げられる。分子の他の挿入として、二重特異性抗体の血清半減期を延ばすポリペプチドに対する、Ｎ末端またはＣ末端に対する融合が挙げられる。
【０１２４】
「免疫抱合体」は、限定されないが、細胞毒性薬剤を含め、１つ以上の異種分子に抱合される抗体である。
【０１２５】
特定の実施形態では、本明細書で提供される抗体は、多重特異性抗体、例えば、二重特異性抗体である。多重特異性抗体は、少なくとも２つの異なる部位、すなわち、異なる抗原上の異なるエピトープまたは同じ抗原上の異なるエピトープに対して結合特異性を有するモノクローナル抗体である。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。特定の実施形態では、結合特異性の１つは抗原に対するものであり、他の（２つ以上の）特異性は他の任意の抗原に対するものである。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、抗原の２つ（またはそれ以上）の異なるエピトープに結合し得る。多重特異性抗体を使用して、抗原を発現する細胞に細胞毒性剤または細胞を局在化させることもできる。多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体フラグランスとして調製できる。
【０１２６】
多重特異性抗体を作るための技術として、限定されないが、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖−軽鎖ペアの組換え共発現（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ  ａｎｄ  Ｃｕｅｌｌｏ，Ｎａｔｕｒｅ  ３０５：５３７（１９８３）を参照）および「ノブをホールに入れる」操作（例えば、米国特許第５，７３１，１６８号およびＡｔｗｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２７０：２６（１９９７）を参照）が挙げられる。多重特異性抗体はまた、抗体Ｆｃヘテロ二量体分子を作るための静電ステアリング効果を操作すること（国際公開第２００９／０８９００４号を参照）；２つ以上の抗体または断片を架橋すること（例えば米国特許第４，６７６，９８０号；およびＢｒｅｎｎａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２２９：８１（１９８５）を参照））；ロイシンジッパーを使用して二重特異性抗体を生成すること（例えば、Ｋｏｓｔｅｌｎｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１４８（５）：１５４７−１５５３（１９９２）および国際公開第２０１１／０３４６０５号を参照）；一般的な軽鎖技術を使用して軽鎖のミスペアリング問題を回避すること（例えば、国際公開第９８／５０４３１号を参照）；二重特異性抗体断片を作るために「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Ｈｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：６４４４−６４４８（１９９３）を参照）；および単鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Ｇｒｕｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５２：５３６８（１９９４）を参照）；および例えば、Ｔｕｔｔ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：６０（１９９１）に記載されるように三重特異性抗体を調製することによって作られ得る。
【０１２７】
例えば、「オクトパス抗体」を含め、３つ以上の抗原結合部位を有する操作抗体、またはＤＶＤ−Ｉｇもまたここに含まれる（例えば、国際公開第２００１／７７３４２号および国際公開第２００８／０２４７１５号を参照）。３つ以上の抗原結合部位を有する多重特異性抗体の他の例は、国際公開第２０１０／１１５５８９号、国際公開第２０１０／１１２１９３号、国際公開第２０１０／１３６１７２号、国際公開第２０１０／１４５７９２号および国際公開第２０１３／０２６８３１号に見出されうる。二重特異性抗体またはその抗原結合断片には、［［ＰＲＯ］］と別の異なる抗原、または［［ＰＲＯ］］の２つの異なるエピトープに結合する抗原結合部位を含む「二重作用ＦＡｂ」または「ＤＡＦ」も含まれる（例えば、米国特許出願公開第２００８／００６９８２０号明細書および国際公開第２０１５／０９５５３９号を参照）。
【０１２８】
多重特異性抗体はまた、同じ抗原特異性の１つまたは複数の結合アームにドメインクロスオーバーを持つ非対称の形で、すなわちＶＨ／ＶＬドメイン（例えば、国際公開第２００９／０８０２５２号および国際公開第２０１５／１５０４４７号を参照）、ＣＨ１／ＣＬドメイン（国際公開第２００９／０８０２５３号を参照）または完全なＦａｂアーム（国際公開第２００９／０８０２５１号、国際公開第２０１６／０１６２９９号を参照、Ｓｃｈａｅｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ，ＰＮＡＳ，１０８（２０１１）１１８７−１１９１、およびＫｌｅｉｎ  ａｔ  ａｌ．，ＭＡｂｓ  ８（２０１６）１０１０−２０も参照）を交換することによっても提供され得る。一実施形態では、多重特異性抗体はクロスＦａｂ断片を含む。「クロスＦａｂ断片」または「ｘＦａｂ断片」または「クロスオーバーＦａｂ断片」との用語は、重鎖および軽鎖の可変領域または定常領域のいずれかが交換されたＦａｂ断片を指す。クロスＦａｂ断片は、軽鎖可変領域（ＶＬ）と重鎖定常領域１（ＣＨ１）とで構成されるポリペプチド鎖、および重鎖可変領域（ＶＨ）と軽鎖定常領域（ＣＬ）とで構成されるポリペプチド鎖を含む。非対称Ｆａｂアームは、荷電または非荷電アミノ酸変異をドメインインターフェースに導入して正しいＦａｂペアリングを指示することによって操作することもできる。例えば、国際公開第２０１６／１７２４８５号を参照。
【０１２９】
多重特異性抗体のさまざまな更なる分子フォーマットが当該技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６７（２０１５）９５−１０６を参照）。
【０１３０】
本明細書に同様に含まれる特定のタイプの多重特異性抗体は、標的細胞、例えば腫瘍細胞上の表面抗原、およびＴ細胞受容体（ＴＣＲ）複合体の活性化不変コンポーネント、例えば、Ｔ細胞を再標的化して標的細胞を殺すためのＣＤ３に同時に結合するように設計された二重特異性抗体である。
【０１３１】
この目的に役立ち得る二重特異性抗体フォーマットの例として、限定されないが、２つのｓｃＦｖ分子が柔軟なリンカーによって融合されている、いわゆる「ＢｉＴＥ」（二重特異性Ｔ細胞エンゲージャー）分子（例えば、国際公開第２００４／１０６３８１号、国際公開第２００５／０６１５４７号、国際公開第２００７／０４２２６１号、および国際公開第２００８／１１９５６７号、Ｎａｇｏｒｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂａｅｕｅｒｌｅ，Ｅｘｐ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｓ  ３１７，１２５５−１２６０（２０１１）を参照）；ダイアボディ（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔ  Ｅｎｇ  ９，２９９−３０５（１９９６））およびその誘導体、例えばタンデムダイアボディ（「ＴａｎｄＡｂ」；Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ２９３，４１−５６（１９９９））；ダイアボディフォーマットに基づくが、更なる安定化のためにＣ末端ジスルフィド架橋を特徴とする分子（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｏｌ  Ｂｉｏｌ  ３９９，４３６−４４９（２０１０））、いわゆるトリオマブ（これはマウス／ラットＩｇＧハイブリッド分子全体である（Ｓｅｉｍｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ  Ｔｒｅａｔ  Ｒｅｖ  ３６，４５８−４６７（２０１０）に概説）が挙げられる。本明細書に含まれる特定のＴ細胞二重特異性抗体フォーマットは、国際公開第２０１３／０２６８３３号、国際公開第２０１３／０２６８３９号、国際公開第２０１６／０２０３０９号；Ｂａｃａｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ５（８）（２０１６）ｅ１２０３４９８に記載されている。
【０１３２】
「核酸分子」または「ポリヌクレオチド」との用語は、ヌクレオチドのポリマーを含む任意の化合物および／または物質を含む。各ヌクレオチドは、塩基で構成され、具体的には、プリン塩基またはピリミジン塩基（すなわち、シトシン（Ｃ）、グアニン（Ｇ）、アデニン（Ａ）、チミン（Ｔ）またはウラシル（Ｕ））、糖（すなわち、デオキシリボースまたはリボース）、およびホスフェート基で構成される。多くは、核酸分子は、塩基配列によって記述され、ここで、前記塩基は、核酸分子の一次構造（線形構造）を表す。塩基の配列は、典型的には、５’から３’へと表される。本明細書中、核酸分子との用語は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）、例えば、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）およびゲノムＤＮＡ、リボ核酸（ＲＮＡ）、特に、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＤＮＡまたはＲＮＡの合成形態、およびこれらの分子の２つ以上を含む混合ポリマーを包含する。核酸分子は、線形または環状であってもよい。これに加え、核酸分子との用語は、センス鎖およびアンチセンス鎖、および一本鎖形態および二本鎖形態の両方を含む。さらに、本明細書で記載される核酸分子は、天然に存在するヌクレオチドまたは天然に存在しないヌクレオチドを含んでいてもよい。誘導体化された糖またはホスフェート骨格結合または化学修飾された残基を含む、天然に存在しないヌクレオチドの例として、修飾されたヌクレオチド塩基が挙げられる。核酸分子は、例えば、宿主または患者において、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏで本発明の抗体の直接的な発現のためのベクターとして適したＤＮＡ分子およびＲＮＡ分子も包含する。そのようなＤＮＡ（例えば、ｃＤＮＡ）またはＲＮＡ（例えば、ｍＲＮＡ）ベクターは、修飾されていなくてもよく、または修飾されていてもよい。例えば、ｍＲＮＡは、ｉｎ  ｖｉｖｏで抗体を産生するために被験体にｍＲＮＡを注入することができるように、ＲＮＡベクターの安定性および／またはコードされた分子の発現を高めるように化学修飾されてもよい（例えば、Ｓｔａｄｌｅｒ  ｅｒｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ２０１７、２０１７年６月１２日にオンラインで公開、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｍ．４３５６または欧州特許第２１０１８２３Ｂ１号明細書を参照）。
【０１３３】
「単離された」核酸分子またはポリヌクレオチドは、その天然環境の構成成分から分離された核酸分子を指す。単離された核酸は、元々その核酸分子を含む細胞に含まれているが、その核酸分子が、染色体外に存在するか、またはその天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子を含む。
【０１３４】
「単離された」ポリペプチドまたはそのバリアント、またはその誘導体、特に、単離された抗体は、その天然の環境にはないポリペプチドを意図している。特定のレベルの精製は、必要とされない。例えば、単離されたポリペプチドは、そのネイティブ環境または天然環境から取り出すことができる。宿主細胞で発現する組換え産生されたポリペプチドおよびタンパク質は、本発明の目的のために単離されたと考えられ、任意の適切な技術によって、分離され、フラクション化され、または部分的または実質的に精製される、ネイティブポリペプチドまたは組換えポリペプチドも同様である。
【０１３５】
本発明の参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも、例えば９５％「同一の」ヌクレオチド配列を有する核酸またはポリヌクレオチドとは、このポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、ポリヌクレオチド配列が、参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチドあたり５個までの点変異を含んでいてもよいことを除けば、参照配列に対して同一であることを意図している。言い換えると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％同一なヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドを得るために、参照配列中のヌクレオチドの５％までが、欠失していてもよく、または別のヌクレオチドで置換されていてもよく、または参照配列中の全ヌクレオチドの５％までが、参照配列に挿入されていてもよい。参照配列のこれらの変更は、参照ヌクレオチド配列の５’または３’末端位置で、またはこれらの末端位置の間のどこかで起こってもよく、参照配列中の残基中で個々に散在していてもよく、または参照配列中の１つ以上の連続した基の中に散在していてもよい。実際の様式として、任意の特定のポリヌクレオチド配列が、本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％同一であるかどうかは、既知のコンピュータプログラム、例えば、ポリペプチドについて上に記載したもの（例えば、ＡＬＩＧＮ−２）を用いて、従来通りに決定することができる。
【０１３６】
「発現カセット」との用語は、組換えによって、または合成によって作られるポリヌクレオチドを指し、標的細胞内の特定の核酸の転写が可能な特定の一連の核酸要素を含む。組換え発現カセットは、プラスミド、染色体、ミトコンドリアＤＮＡ、プラスチドＤＮＡ、ウイルスまたは核酸断片に組み込むことができる。典型的には、発現ベクターの組換え発現カセット部分は、配列の中でも特に、転写される核酸配列とプロモーターとを含む。特定の実施形態では、本発明の発現カセットは、本発明の二重特異性抗体をコードするポリヌクレオチド配列またはその断片を含む。
【０１３７】
「ベクター」との用語は、本明細書で使用される場合、それが連結されている別の核酸を増殖させることができる核酸分子を指す。この用語は、自己複製する核酸構造としてのベクター、および導入される宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクターを含む。特定のベクターは、それらが機能的に連結されている核酸の発現を指示することができる。そのようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。「宿主細胞」、「宿主細胞株」および「宿主細胞培養物」との用語は、相互に置き換え可能に使用され、外因性核酸が導入された細胞を指し、かかる細胞の子孫を含む。宿主細胞は、「形質転換体」および「形質転換された細胞」を含み、これらは、継代数にかかわらず、初代の形質転換された細胞と、初代の形質転換された細胞から誘導された子孫を含む。子孫は、親細胞の核酸含有量と完全に同一でなくてもよいが、変異を含んでいてもよい。元々の形質転換された細胞についてスクリーニングされるか、または選択されるのと同じ機能または生体活性を有する変異体子孫が本発明に含まれる。
【０１３８】
ある薬剤の「有効量」は、その薬剤が投与される細胞または組織において、ある生理学的変化を引き起こすのに必要な量を指す。
【０１３９】
ある薬剤（例えば、医薬組成物）の「治療有効量」は、所望の治療結果または予防結果を達成するのに有効な量、必要な投薬量および必要な期間を指す。ある薬剤の治療有効量は、例えば、ある疾患の副作用をなくし、減らし、遅らせ、最低限にし、または防ぐ。
【０１４０】
「個体」または「被験体」は、哺乳動物である。哺乳動物として、限定されないが、家畜動物（例えば、ウシ、ヒツジ、ネコ、イヌおよびウマ）、霊長類（例えば、ヒトおよびサルなどの非ヒト霊長類）、ウサギ、げっ歯類（例えば、マウスおよびラット）が挙げられる。特に、個体または被験体は、ヒトである。
【０１４１】
「医薬組成物」との用語は、その中に含まれる有効成分の生体活性を有効にし、製剤が投与される被験体に対して受け入れられないほど毒性である更なる構成要素を含まないような形態での製剤を指す。
【０１４２】
「医薬的に許容される賦形剤」は、医薬組成物中の成分であって、有効成分以外であり、被験体にとって毒性ではない成分を指す。医薬的に許容される賦形剤として、限定されないが、緩衝液、安定化剤または防腐剤が挙げられる。
【０１４３】
「パッケージ添付文書」との用語は、治療製品の市販パッケージに通常含まれる指示を指すために用いられ、そのような治療製品に関する適応症、使用、投薬量、投与、併用療法、禁忌および／または警告に関する情報を含む。
【０１４４】
本明細書で使用される場合、「処置」（およびその文法的な変形語、例えば、「処置する」または「処置すること」）は、処置される個体において本来の経過を変える試みにおける臨床的介入を指し、予防のために、または臨床病理の経過の間に行うことができる。所望の処置効果として、限定されないが、疾患の発生または再発の予防、症状の軽減、疾患の任意の直接的または間接的な病的状態、転移の予防、疾患の進行率を下げる、疾患状態の軽減または緩和、回復または改良された予後が挙げられる。いくつかの実施形態では、本発明の分子を使用して、疾患の発生を遅らせるか、または疾患の進行を遅らせる。
【０１４５】
「癌」との用語は、本明細書で使用される場合、増殖性疾患、例えば、リンパ腫、リンパ性白血病、肺癌、非小細胞肺（ＮＳＣＬ）癌、肺胞細胞性肺癌、骨腫瘍、膵臓癌、皮膚癌、頭部または頸部の癌、皮膚または眼内黒色腫、子宮癌、卵巣癌、直腸癌、肛門領域の癌、胃癌、消化器癌、結腸癌、乳癌、子宮癌、卵管癌腫、子宮内膜癌腫、頸部の癌腫、膣の癌腫、陰門の癌腫、ホジキン病、食道の癌、小腸癌、内分泌系の癌、甲状腺癌、副甲状腺癌、副腎癌、軟組織の肉腫尿道の癌、陰茎癌、前立腺癌、膀胱癌、腎臓または尿管の癌、腎細胞癌腫、腎盂癌腫、中皮腫、肝細胞癌、胆管癌、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、脊髄軸腫瘍、脳幹神経膠腫、多形性膠芽腫、星状細胞腫、神経鞘腫、上衣腫、髄芽腫、髄膜腫、扁平上皮癌腫、下垂体腺腫およびユーイング肉腫（上述のいずれかの癌の難治性態様を含む）、または上述の癌の１つ以上の組合せを指す。
【０１４６】
「自律性ＶＨ（ａＶＨ）ドメイン」との用語は、免疫グロブリンの折り畳みを保持する単一の免疫グロブリン重鎖可変（ＶＨ）ドメインを指し、すなわち、それは、最大３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）と最大４つのフレームワーク領域（ＦＲ）が抗原結合部位を形成する可変ドメインである。
【０１４７】
「免疫グロブリン分子」との用語は、天然に存在する抗体の構造を有するタンパク質を指す。例えば、ＩｇＧクラスの免疫グロブリンは、約１５０，０００ダルトンのヘテロテトラマー糖タンパク質であり、ジスルフィド結合した２つの軽鎖と２つの重鎖から構成される。Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの重鎖は、可変ドメイン（ＶＨ）（可変重鎖ドメインまたは重鎖可変領域とも呼ばれる）と、その後に３つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３）（重鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。同様に、Ｎ末端からＣ末端まで、それぞれの軽鎖は、可変ドメイン（ＶＬ（可変軽鎖ドメインまたは軽鎖可変領域とも呼ばれる）と、その後に定常軽鎖（ＣＬ）ドメイン（軽鎖定常領域とも呼ばれる）を有する。免疫グロブリンの重鎖は、α（ＩｇＡ）、δ（ＩｇＤ）、ε（ＩｇＥ）、γ（ＩｇＧ）またはμ（ＩｇＭ）と呼ばれる５種類の１つに割り当てられてもよく、このいくつかは、例えば、γ１（ＩｇＧ１）、γ２（ＩｇＧ２）、γ３（ＩｇＧ３）、γ４（ＩｇＧ４）、α１（ＩｇＡ１）およびα２（ＩｇＡ２）などの更なるサブタイプに分けられてもよい。免疫グロブリンの軽鎖は、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づき、カッパ（κ）およびラムダ（λ）と呼ばれる２種類の１つに割り当てられてもよい。免疫グロブリンは、免疫グロブリンヒンジ領域を介して接続する、２つのＦａｂ分子とＦｃドメインとからなる。
【０１４８】
サルベージ受容体結合エピトープ残基を含み、ｉｎ  ｖｉｖｏでの半減期が長くなったＦａｂおよびＦ（ａｂ’）２断片の説明については、米国特許第５，８６９，０４６号を参照。ダイアボディは、二価または二重特異性であってもよい、２つの抗原結合部位を有する抗体断片である。例えば、欧州特許出願公開第４０４，０９７号明細書、国際公開第１９９３／０１１６１号、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）およびＨｏｌｌｉｎｇｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ  ９０，６４４４−６４４８（１９９３）を参照。トリアボディおよびテトラボディも、Ｈｕｄｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔ  Ｍｅｄ  ９，１２９−１３４（２００３）に記載されている。シングルドメイン抗体は、本明細書で定義される重鎖可変ドメインの全てまたは一部を含む抗体断片である。特定の実施形態では、シングルドメイン抗体は、ヒトシングルドメイン抗体である（Ｄｏｍａｎｔｉｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ。例えば、米国特許第６，２４８，５１６Ｂ１号を参照）。抗体断片は、限定されないが、本明細書に記載されるように、インタクト抗体のタンパク質分解による消化、および組換え宿主細胞（例えば、大腸菌またはファージ）による産生を含め、種々の技術によって作られてもよい。
【０１４９】
配列表のポリペプチド配列は、Ｋａｂａｔ番号付けシステムに従って番号付けされていない。しかしながら、配列表の配列の番号付けをＫａｂａｔ番号付け、特に、Ｋａｂａｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ  Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ  Ｈｅａｌｔｈ  Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，ＭＤ，１９９１に記載されるような、ＥＵインデックスとも呼ばれるＥＵ番号付けシステムに変換することは、当業者の通常の技術の範囲内である。配列がＣＤＲに向けられている場合、Ｋａｂａｔ番号付けが適用される。配列がＦｃドメインに向けられている場合、ＥＵインデックスが適用される。
【０１５０】
「アミノ酸変異」との用語は、本明細書で使用される場合、アミノ酸の置換、欠失、挿入および修飾を包含することを意味している。置換、欠失、挿入および修飾の任意の組合せは、最終コンストラクトが、所望の特徴を有する限り、最終コンストラクトに到達するように行うことができる。アミノ酸配列の欠失および挿入は、アミノ末端および／またはカルボキシ末端のアミノ酸の欠失および挿入を含む。特定のアミノ酸変異は、アミノ酸置換である。ペプチドの特定の特性を変える目的のために、非保存的アミノ酸置換（すなわち、１つのアミノ酸を、構造特性および／または化学特性が異なる別のアミノ酸と置き換えること）が特に好ましい。アミノ酸置換として、天然に存在しないアミノ酸による置き換え、または２０種類の標準的なアミノ酸（例えば、４−ヒドロキシプロリン、３−メチルヒスチジン、オルニチン、ホモセリン、５−ヒドロキシリシン）の天然に存在するアミノ酸誘導体による置き換えが挙げられる。アミノ酸変異は、当該技術分野で周知の遺伝的方法または化学的方法を用いて生成することができる。遺伝的方法として、部位特異的変異導入、ＰＣＲ、遺伝子合成などが挙げられ得る。遺伝子操作以外の方法によってアミノ酸の側鎖基を変える方法、例えば、化学的修飾も有用な場合があることが想定される。同じアミノ酸変異を示すために、本明細書でさまざまな名称を使用してもよい。例えば、ＶＨドメインの７１位のアラニンからシステインへの置換は、７１Ｃ、Ａ７１Ｃ、またはＡｌａ７１Ｃｙｓとして示され得る。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「ポリペプチド」との用語は、アミド結合（ペプチド結合としても知られている）によって線形に接続したモノマー（アミノ酸）で構成される分子を指す。「ポリペプチド」との用語は、２つ以上のアミノ酸の任意の鎖を指し、特定の長さの産物を指さない。したがって、ペプチド、ジペプチド、トリペプチド、オリゴペプチド、「タンパク質」、「アミノ酸鎖」、または２つ以上のアミノ酸の鎖を指すために使用される任意の他の用語は、「ポリペプチド」の定義に含まれ、「ポリペプチド」との用語は、これらのいずれかの用語の代わりに、または相互に置き換え可能に使用されてもよい。「ポリペプチド」との用語も、限定されないが、グリコシル化、アセチル化、リン酸化、アミド化、既知の保護／ブロック基による誘導体化、タンパク質分解による開裂、または天然に存在しないアミノ酸による修飾を含め、ポリペプチドの発現後修飾の産物を指すことを意図している。ポリペプチドは、天然の生体源から誘導されてもよく、または組換え技術によって産生されてもよいが、指定の核酸配列から必ずしも翻訳されなくてもよい。ポリペプチドは、化学合成によるものを含め、任意の様式で作られてもよい。本発明のポリペプチドは、約３以上、５以上、１０以上、２０以上、２５以上、５０以上、７５以上、１００以上、２００以上、５００以上、１，０００以上、または２，０００以上のアミノ酸のサイズであってよい。ポリペプチドは、所定の三次元構造を有していてもよいが、ポリペプチドは、そのような構造を必ずしも有していなければならないわけではない。所定の三次元構造を有するポリペプチドは、折り畳まれていると呼ばれ、所定の三次元構造を有しておらず、むしろ多数の異なる配座をとり得るポリペプチドは、折り畳まれていないと呼ばれる。
【０１５２】
ジスルフィド結合の形成を可能にする条件は、例えば、細菌のペリプラズムまたは真核細胞の小胞体に見られるような、酸化条件に関係する。さらに、ジスルフィドを形成するアミノ酸ペアは、４〜６ÅのＣα／Ｃα間の距離を有している必要がある。
【０１５３】
ＩＩ．実施形態
ａＶＨＳ
一態様では、本発明は、安定化された自律性ＶＨドメインに部分的に基づく。特定の実施形態では、Ｋａｂａｔ番号付けによる５２ａおよび７１位または３３および５２位にシステインを含む自律性ＶＨドメインが提供される。前記システインは、適切な条件下でジスルフィド結合を形成する。本発明の更なる態様では、Ｋａｂａｔ番号付けによる５２ａ、７１、３３および５２位にシステインを含む自律性ＶＨドメインが提供される。本発明の好ましい実施形態では、ａＶＨは、配列番号２０７のアミノ酸配列によるフレームワーク領域１または配列番号２０８のアミノ酸配列によるフレームワーク領域２または配列番号２０９のアミノ酸配列によるフレームワーク領域３または配列番号２１０のアミノ酸配列によるフレームワーク領域４を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、ａＶＨは、配列番号２０７のアミノ酸配列によるフレームワーク領域１およびは配列番号２０８のアミノ酸配列によるフレームワーク領域２を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、ａＶＨは、配列番号２０９のアミノ酸配列によるフレームワーク領域１およびは配列番号２１０のアミノ酸配列によるフレームワーク領域３を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、ａＶＨは、配列番号２０７のアミノ酸配列によるフレームワーク領域１およびは配列番号２１０のアミノ酸配列によるフレームワーク領域４を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、ａＶＨは、配列番号２０７のアミノ酸配列によるフレームワーク領域１、配列番号２０９のアミノ酸配列によるフレームワーク領域３および配列番号２１０のアミノ酸配列によるフレームワーク領域４を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、ａＶＨは、配列番号２０７のアミノ酸配列によるフレームワーク領域１、配列番号２０８のアミノ酸配列によるフレームワーク領域２および配列番号２０９のアミノ酸配列によるフレームワーク領域３を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、ａＶＨは、配列番号２０７のアミノ酸配列によるフレームワーク領域１、配列番号２０８のアミノ酸配列によるフレームワーク領域２、配列番号２０９のアミノ酸配列によるフレームワーク領域３および配列番号２１０のアミノ酸配列によるフレームワーク領域４を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、ａＶＨは、配列番号２０８のアミノ酸配列によるフレームワーク領域２、配列番号２０９のアミノ酸配列によるフレームワーク領域３および配列番号２１０のアミノ酸配列によるフレームワーク領域４を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、ａＶＨは、配列番号２０８のアミノ酸配列によるフレームワーク領域２および配列番号２０９のアミノ酸配列によるフレームワーク領域３を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、ａＶＨは、配列番号２０８のアミノ酸配列によるフレームワーク領域２および配列番号２２０のアミノ酸配列によるフレームワーク領域４を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。本発明の好ましい実施形態では、ａＶＨは、配列番号２０９のアミノ酸配列によるフレームワーク領域３および配列番号２１０のアミノ酸配列によるフレームワーク領域４を含む重鎖可変ドメインフレームワークを含む。あるいは、フレームワーク領域１は、前述の実施形態において配列番号２１１によるものであり、フレームワーク領域１は、配列番号２０７により定義された。
【０１５４】
本発明の好ましい一実施形態では、ａＶＨはＶＨ３＿２３ヒトフレームワークを含む。本発明の好ましい一実施形態では、フレームワークは、ハーセプチン（登録商標）（トラスツズマブ）のＶＨフレームワークに基づく。
【０１５５】
ａＶＨテンプレート
本発明の更なる態様では、テンプレートａＶＨが提供される。好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号４０（テンプレート１）のアミノ酸配列を含む。配列番号４０のアミノ酸配列は、Ｐ５２ａＣ位およびＡ７１Ｃ位のシステイン変異に基づく。好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号４２（テンプレート２）のアミノ酸配列を含む。配列番号４２のアミノ酸配列は、Ｐ５２ａＣ位およびＡ７１Ｃ位のシステイン変異に基づいており、更なる変異、すなわちＧ２６Ｓを含む。好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号４４（テンプレート３）のアミノ酸配列を含む。配列番号４２のアミノ酸配列は、Ｐ５２ａＣ位およびＡ７１Ｃ位のシステイン変異に基づいており、３１ａ位にセリン挿入を含み、３１位と３２位の間にセリンが付加されている。好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号４６（テンプレート４）のアミノ酸配列を含む。配列番号４４のアミノ酸配列は、Ｐ５２ａＣ位とＡ７１Ｃ位のシステイン変異に基づいており、３１ａ位と３１ｂ位に２つのセリン挿入を含み、つまり、３１位と３２位の間の配列に２つのセリンが付加されていた。好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号１８０のアミノ酸配列（テンプレート５）を含む。配列番号１８０のアミノ酸配列は、Ｙ３３Ｃ位およびＹ５２位のシステイン変異に基づく。配列番号４０、４２、４４、４６および１８０の配列は、更なる安定化の目的で、突然変異Ｋ９４ＳおよびＬ１０８Ｔを含む。しかしながら、テンプレート１〜５は、Ｋ９４Ｓおよび／またはＬ１９８Ｔ変異を含む必要はない。
【０１５６】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号４０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む。本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号４２のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む。本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号４４のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む。本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号４６のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む。本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号１８０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む。
【０１５７】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、変異Ｈ３５Ｇ、および／またはＱ３９Ｒ、および／またはＬ４５ＥまたはＬ４５Ｔ、および／またはＷ４７Ｌを含む。
【０１５８】
特異的標的のａＶＨ結合物質
更なる態様では、本発明は、黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）に結合するａＶＨドメインに部分的に基づく。好ましい実施形態では、ＭＣＳＰに結合するａＶＨドメインは、配列番号５７のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＭＣＳＰに結合するａＶＨドメインは、配列番号５９のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＭＣＳＰに結合するａＶＨドメインは、配列番号６１のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＭＣＳＰに結合するａＶＨドメインは、配列番号６３のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＭＣＳＰに結合するａＶＨドメインは、配列番号６５のアミノ酸配列を含む。
【０１５９】
更なる態様では、本発明は、トランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）に結合するａＶＨドメインに部分的に基づく。好ましい実施形態では、ＴｆＲ１に結合するａＶＨドメインは、配列番号１９４のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＴｆＲ１に結合するａＶＨドメインは、配列番号１９５のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＴｆＲ１に結合するａＶＨドメインは、配列番号１９６のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＴｆＲ１に結合するａＶＨドメインは、配列番号１９７のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＴｆＲ１に結合するａＶＨドメインは、配列番号１９８のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＴｆＲ１に結合するａＶＨドメインは、配列番号１９９のアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、ＴｆＲ１に結合するａＶＨドメインは、配列番号２００のアミノ酸配列を含む。
【０１６０】
一態様では、本発明は、リンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に結合するａＶＨドメインに部分的に基づく。好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｉ）配列番号１４６の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１４７の配列を有するＣＤＲ２、および配列番号１４８の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号７７のアミノ酸配列を含む。
【０１６１】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｉｉ）配列番号１４９の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５０の配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５１の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号７９のアミノ酸配列を含む。
【０１６２】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｉｉｉ）配列番号１５２の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５３の配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５４の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号８１のアミノ酸配列を含む。
【０１６３】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｉｖ）配列番号１５５の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５６の配列を有するＣＤＲ２および配列番号１５７の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号８３のアミノ酸配列を含む。
【０１６４】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｖ）配列番号１５８の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１５９の配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６０の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号８５のアミノ酸配列を含む。
【０１６５】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｖｉ）配列番号１６１の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６２の配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６３の配列を有するＣＤＲ３（抗ＬＡＧ３  ａＶＨドメインＰ１１０Ｄ１のＣＤＲに対応）を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号８７のアミノ酸配列を含む。
【０１６６】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｖｉｉ）配列番号１６４の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６５の配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６６の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号８９のアミノ酸配列を含む。
【０１６７】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｖｉｉｉ）配列番号１６７の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１６８の配列を有するＣＤＲ２および配列番号１６９の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号９１のアミノ酸配列を含む。
【０１６８】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｉｘ）配列番号１７０の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７１の配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７２の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号９３のアミノ酸配列を含む。
【０１６９】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｘ）配列番号１７３の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７４の配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７５の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号９５のアミノ酸配列を含む。
【０１７０】
好ましい実施形態では、ＬＡＧ３に結合するａＶＨドメインは、（ｘｉ）配列番号１７６の配列を有するＣＤＲ１、配列番号１７７の配列を有するＣＤＲ２および配列番号１７８の配列を有するＣＤＲ３を含む。本発明のより好ましい実施形態では、ａＶＨドメインは、配列番号９７のアミノ酸配列を含む。
【０１７１】
ＶＨライブラリー
本明細書に記載される自律性ＶＨドメインを含むＶＨライブラリーの生成のために、テンプレート配列はランダム化した。テンプレート１（配列番号４０に基づく）は、３つ全てのＣＤＲでランダム化した。テンプレート２、３および４（それぞれ、配列番号４２、配列番号４４、配列番号４６による）は、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３でランダム化した。テンプレート５（配列番号１８０による）は、第１のライブラリーでは３つ全てのＣＤＲにおいてランダム化し、第２のライブラリーではＣＤＲ２および３でのみランダム化した。
【実施例】
【０１７２】
ＩＩＩ．実施例
以下は、本発明の方法および組成物の例である。上に提供した一般的な記載が与えられ、種々の実施形態が実施されてもよいことが理解される。
【０１７３】
組換えＤＮＡ技術
標準的な方法を使用して、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ；Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９８９に記載されるようにＤＮＡを操作した。分子生物学的試薬は、製造業者の指示に従って使用した。ヒト免疫グロブリンの軽鎖および重鎖のヌクレオチド配列に関連する一般的な情報は、Ｋａｂａｔ，Ｅ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．（１９９１）Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｆｉｆｔｈ  Ｅｄ．，ＮＩＨ  Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎ  Ｎｏ  ９１−３２４２に示されている。
【０１７４】
遺伝子合成
必要な場合、望ましい遺伝子セグメントは、適切なテンプレートを使用してＰＣＲにより生成したか、またはＧｅｎｅａｒｔ  ＡＧ（レーゲンスブルク、ドイツ）で合成オリゴヌクレオチドとＰＣＲ産物から自動遺伝子合成によって合成した。単一の制限エンドヌクレアーゼ切断部位に隣接する遺伝子セグメントを、標準的なクローニング／配列決定ベクターにクローニングした。プラスミドＤＮＡを形質転換細菌から精製し、ＵＶ分光法で濃度を測定した。サブクローン化された遺伝子断片のＤＮＡ配列は、ＤＮＡ配列決定によって確認した。遺伝子セグメントは、それぞれの発現ベクターへのサブクローニングを可能にする適切な制限部位を用いて設計した。真核細胞での分泌に使用される全てのコンストラクトを、リーダーペプチドをコードする５’末端のＤＮＡ配列で設計した。配列番号１および２は、代表的なリーダーペプチドを与える。
【０１７５】
抗原発現ベクターのクローニング
特異的ａＶＨドメインの選択のために、３つの異なる抗原を生成した。
【０１７６】
「成熟黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン」のアミノ酸１５５３から２１８４をコードするＤＮＡ断片（ＭＣＳＰ、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｑ６ＵＶＫ１）は、Ｎ末端リーダー配列を含む哺乳類のレシピエントベクターにインフレームでクローニングした。さらに、コンストラクトには、Ｂｉｒ  Ａビオチンリガーゼとの共発現中に特異的ビオチン化を可能にするＣ末端ａｖｉタグと、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）による精製に使用されるＨｉｓタグとが含まれている（配列番号３および４）。
【０１７７】
ヒトトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｐ０２７８６）のアミノ酸１２２〜７６０をコードする増幅されたＤＮＡ断片は、溶解性タグおよび精製タグとして機能するハムＩｇＧ１  Ｆｃコード断片の下流にある哺乳類のレシピエントベクターにインフレームで挿入した。Ｎ末端のａｖｉタグにより、ｉｎ  ｖｉｖｏでのビオチン化が可能になった。モノマー状態で抗原を発現させるために、Ｆｃ−ＴｆＲ１融合コンストラクトは、「ホール」変異（配列番号５および６）を含み、「Ｆｃノブ」対応物（配列番号７および８）と組み合わせて共発現させた。
【０１７８】
細胞死受容体５（ＤＲ５、Ｕｎｉｐｒｏｔ：Ｏ１４７６３）、細胞外ドメイン（アミノ酸１〜１５２）をコードするＤＮＡ断片を、ハムＩｇＧ１  Ｆｃコード断片の上流にあるＮ末端リーダー配列を有する哺乳類のレシピエントベクターにインフレームで挿入した。Ｃ末端のａｖｉタグにより、特異的ｉｎ  ｖｉｖｏビオチン化が可能になった（配列番号９および１０）。
【０１７９】
ＭＣＳＰ、ＴｆＲ１およびＤＲ５の抗原発現は、一般にＭＰＳＶプロモーターによって駆動され、転写は、コード配列の下流にある合成ｐｏｌｙＡシグナル配列によって終了される。発現カセットに加えて、各ベクターには、ＥＢＶ−ＥＢＮＡ発現細胞株における自律性複製のためのＥＢＶ  ｏｒｉＰ配列が含まれている。
【０１８０】
ビオチン化されたＣ末端Ａｖｉタグを有する可溶性ヒトＬａｇ３−ＩｇＧ１−Ｆｃ−の生成のために、プラスミド２１７０７＿ｐＩｎｔｒｏｎＡ＿ｓｈＬａｇ３＿ｈｕＩｇＧ１−Ｆｃ−ＡｖｉをヒトＬａｇ３細胞外ドメイン（ｓｗ：ｌａｇ３＿ｈｕｍａｎのｐｏｓ．２３−４５０）とＡｖｉタグ配列（５’ＧＳＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）のＣ末端が結合したヒトＩｇＧ１重鎖ｃＤＮＡ発現ベクターのＧｌｙ３２９までのＰｒｏ１００位のＮ末端にあるＩＥＧＲＭＤリンカー（配列番号１１および１２）の遺伝子合成（ＧｅｎｅＡｒｔ  ＧｍｂＨ）によって生成した。
【０１８１】
Ｆｃ融合コンストラクトとＨｉｓタグコンストラクトの生成および精製
ＤＲ５−Ｆｃ−ａｖｉ、モノマーＴｆＲ１−Ｆｃ−ａｖｉ、ならびに一価および二価のａＶＨ  Ｆｃコンストラクトの発現のために、ＥＢＶ由来タンパク質ＥＢＮＡを安定して発現するＨＥＫ  ２９３細胞に一過性トランスフェクトした。タンパク質は、標準プロトコルを参照しつつ、ろ過した細胞培養物上清から精製した。簡単に言うと、Ｆｃを含むタンパク質を、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ａ  Ｓｅｐｈａｒｏｓｅカラム（ＧＥ  ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にアプライし、ＰＢＳで洗浄した。溶出はｐＨ２．８で達成され、続いて試料をすぐに中和した。凝集したタンパク質は、サイズ排除クロマトグラフィー（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ  ２００、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）によって、ＰＢＳ中、または２０ｍＭ  ヒスチジン、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ（ｐＨ６．０）中に、単量体フラクションから分離した。モノマータンパク質フラクションをプールし、例えば、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ  Ａｍｉｃｏｎ  Ｕｌｔｒａ（３０  ＭＷＣＯ）遠心分離濃縮器を用いて濃縮し（必要な場合）、凍結させ、−２０℃または−８０℃で保存した。試料の一部を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または質量分析法によるその後のタンパク質分析および分析による特性決定のために提供した。
【０１８２】
ＬＡＧ３−Ｆｃ−ａｖｉの発現のために、最終的なプラスミド２１７０７＿ｐＩｎｔｒｏｎＡ＿ｓｈＬａｇ３＿ｈｕＩｇＧ１−Ｆｃ−Ａｖｉを、製造元の指示に従って、２リットルのスケールでＥｘｐｉ２９３（商標）発現システム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）にトランスフェクトした。上清を回収し、タンパク質Ａカラムクロマトグラフィーで精製した。精製されたタンパク質は、製造元の指示に従って、ＢｉｒＡビオチンタンパク質リガーゼ標準反応キット（Ａｖｉｄｉｔｙ）を介してビオチン化した。タンパク質のタンパク質分解を回避するために、プロテアーゼ阻害剤Ｍｉｎｉ  ＥＤＴＡ−ｆｒｅｅ（Ｒｏｃｈｅ）を加えた。ゲルろ過カラム（Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００  １６／６０，ＧＥ）を使用して、ビオチン化タンパク質から遊離ビオチンとＢｉｒＡリガーゼを除去した。ビオチン化は、ストレプトアビジンを加えることによって確認された。得られたビオチン化タンパク質／ストレプトアビジン複合体は、分析用ＳＥＣクロマトグラムで保持時間のシフトを示した。
【０１８３】
ｈｉｓタグを発現するコンストラクトをＨＥＫ  ２９３細胞に一過性トランスフェクトし、ＥＢＶ由来タンパク質ＥＢＮＡ（ＨＥＫ  ＥＢＮＡ）を安定して発現させた。ビオチンリガーゼＢｉｒＡをコードする同時に共トランスフェクトされたプラスミドが、ｉｎ  ｖｉｖｏでのａｖｉタグ特異的なビオチン化を可能にした。タンパク質を、固定化金属アフィニティークロマトグラフィー（ＩＭＡＣ）とその後のゲルろ過を使用した標準プロトコルを参照して、ろ過された細胞培養上清から精製した。モノマータンパク質フラクションをプールし、濃縮し（必要な場合）、凍結させ、−２０℃または−８０℃で保存した。試料の一部を、例えば、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）または質量分析法によるその後のタンパク質分析および分析による特性決定のために提供した。
【０１８４】
実施例１
汎用自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）ライブラリーの生成
汎用ａＶＨライブラリーを、Ｂａｒｔｈｅｌｅｍｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２００８，２８３：３６３９−３６５４に掲載された自律性ヒト重鎖可変ドメインのハーセプチン由来のテンプレート（配列番号１３および１４）である配列Ｂ１ａｂに基づき生成した。Ｂ１ａｂでは、軽鎖界面がない場合に表面に露出されるようになる４つの疎水性残基が、ファージディスプレイによって同定されたより親水性の高い残基で置き換えられた。これらの変異は、ＶＨドメインの折り畳みの構造と互換性があることがわかっている。それらは親水性を高め、ひいては足場の安定性を高め、軽鎖パートナーの非存在下で安定かつ可溶性であるａＶＨドメインの発現を可能にする（図１Ａ）。
【０１８５】
Ｂ１ａｂの配列に基づく、ＣＤＲ３領域でランダム化されたａＶＨファージディスプレイライブラリーを生成するために、２つの断片が「オーバーラップエクステンションによるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって組み立てられた。断片１は、フレームワーク３を含むａＶＨをコードする遺伝子の５’末端を含み、断片２は、フレームワーク３の末端、ランダム化されたＣＤＲ３領域、およびａＶＨ断片のフレームワーク４を含む。
【０１８６】
以下のプライマーの組合せを使用して、ライブラリー断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３（配列番号１５）およびＤＰ４７＿ＣＤＲ３バック（ｍｏｄ）（配列番号１６））および断片２（ＤＰ４７−ｖ４プライマー（配列番号１８〜２０）およびｆｄｓｅｑｌｏｎｇ（配列番号１７））（表１）。このライブラリーの生成のために、３つの異なるＣＤＲ３の長さを使用した（図２Ｂ）。十分な量の完全長ランダム化ａＶＨ断片を組み立てた後、それらを等しく切断された受容体ファージミドベクターと共にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化した。６μｇのＦａｂライブラリーインサートを２４μｇのファージミドベクターにライゲーションした。精製したライゲーションを６０の形質転換に使用し、６×１０９個の形質転換体を得た。ａＶＨライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製することで選択のために使用した。
【０１８７】
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【０１８８】
汎用ａＶＨライブラリーからの抗ＤＲ５結合物質の選択
新しいライブラリーの機能をテストするために、ＤＲ５の細胞外ドメイン（ＥＣＤ）に対する選択を、ＨＥＫ２９３で発現されたタンパク質を使用して行った。パニングラウンドを、以下のパターンに従って溶液中で行った：（１）全容量１ｍｌで０．５時間、１００ｎＭビオチン化抗原タンパク質への約１０１２ファージミド粒子の結合、（２）ビオチン化抗原の捕捉および５．４×１０７のストレプトアビジン被覆磁性ビーズの１０分間の添加による特異的結合ファージの付着、（３）５×１ｍｌ  ＰＢＳ／Ｔｗｅｅｎ  ２０および５ｘ１ｍｌ  ＰＢＳを使用したビーズの洗浄、（４）１ｍｌの１００ｍＭトリエチルアミン（ＴＥＡ）の１０分間の添加によるファージ粒子の溶出および５００μｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ  ｐＨ７．４の添加による中和、（５）上清のファージ粒子による対数増殖期の大腸菌ＴＧ１細胞の再感染、ヘルパーファージＶＣＳＭ１３による感染、その後の選択ラウンドで使用されることになるファージミド粒子のその後のＰＥＧ／ＮａＣｌ沈殿。
【０１８９】
抗原濃度の（１０−７Ｍから５×１０−９Ｍへの）減少を使用して選択を３ラウンド行った。ラウンド２では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを使用して抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。特異的結合物質を、ＥＬＩＳＡによって以下のように同定した：ウェルあたり１００μｌの５０ｎＭビオチン化抗原をニュートラアビジンプレートに被覆した。Ｆａｂを含む細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用して結合ＦａｂをそれらのＦａｂタグを介して検出した。バックグラウンドよりも有意なシグナルを示すクローンを、配列決定用にショートリストした（配列番号２１〜２８）。
【０１９０】
実施例２
安定化ジスルフィド架橋を含むａＶＨドメインの同定
ａＶＨ足場をさらに安定させるために、タンパク質鎖の柔軟性を制約する追加のジスルフィド架橋の導入をテストした。システインに変異したときにジスルフィド架橋の形成を可能にする位置は、１）構造モデリングまたは２）追加の安定化ジスルフィドを保有する自然状態のＩｇ様Ｖ型配列を検索することによって同定した。
【０１９１】
１つ目のアプローチでは、使用されたａＶＨに最も近い構造相同性を持つ分子の結晶構造を同定した。（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ、ｅｎｔｒｙ  Ｎｏ．３Ｂ９Ｖ）。コンピューターアルゴリズムを使用して、Ｃα／Ｃαペアの距離が５Å未満の６３ペアのアミノ酸を同定した。この６３ペアから、コアパッキングに強い影響を与えるアミノ酸ペア、またはＣβ／Ｃβ幾何学的配置の明らかな破れがあるアミノ酸ペアは除外した。その結果、８つの異なる残基のペアを選択した。
【０１９２】
２つ目のアプローチでは、２２位と９２位の間の標準ジスルフィド結合（Ｋａｂａｔ番号付け）に加えて、ジスルフィド架橋を有する免疫グロブリンファミリーの生殖細胞系コードＶ型ドメインを同定するために、手動データベース画面を実行した。ラマ、ラクダまたはウサギからの既知のジスルフィドパターンは明示的に回避した。１つの例では、３３位と５２位に２つの追加のシステインを保有するナマズ（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ  ｐｕｎｃｔａｔｕｓ、ＡＹ２３８３７３）からの配列を同定した。タンパク質構造データベース（ｗｗｗ．ｐｄｂ．ｏｒｇ）の検索により、このジスルフィドパターンが存在する２つの既存の天然抗体（ＰＤＢエントリー１ＡＩ１および１ＡＣＹ）が明らかになり、これは、初めてヒト抗体足場に導入されていた。
【０１９３】
近接しており、したがって安定化ジスルフィド架橋の形成を可能にする２つの追加のシステインを保有する全ての選択されたバリアントを、ドメインの安定性に及ぼす有益な影響について個別にテストした。予め同定されたＤＲ５特異的結合物質の配列誘導体（配列番号３８）に基づいて、全てのバリアントを生成した。ジスルフィド安定化効果の分析のために、全てのバリアントを、ＣＨ３領域のノブ変異を保有するＦｃ（ノブ）断片のＮ末端に融合した（配列番号２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８）。それぞれのＦｃホール断片との共発現により、非対称の１価のａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトが得られた（図２Ａ）。ＨＥＫ−ＥＢＮＡ細胞における発現および精製は、上記のように行った。コンストラクトの安定性は、動的光散乱（ＤＬＳ）によって測定された熱誘起凝集によって評価した。表３に、それぞれのコンストラクトの測定された凝集温度を示す。これらの結果に基づいて、２つのバリアント（ＤＳ−Ｄｅｓ９（Ｃｙｓ  Ｙ３３Ｃ／Ｙ５２Ｃ）（配列番号３０）およびＤＳ−Ｄｅｓ２（Ｃｙｓ  Ｐ５２ａＣ／Ａ７１Ｃ）（配列番号３７））を、ＶＨランダム化ライブラリーの世代の基準として選択した。
【０１９４】
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【０１９５】
実施例３
安定化された汎用自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）ライブラリーを生成するための新しいライブラリーテンプレート
配列番号３０および３７に基づいて、より安定性の高いａＶＨライブラリーを生成するために、新しいａＶＨライブラリーテンプレートを設計した。以下の任意の修飾は、テンプレート配列で行った（１）変異Ｋ９４Ｓの導入。（２）抗体Ｊエレメントで頻繁に見られる配列バリアントである変異Ｌ１０８Ｔの導入。しかしながら、前述の変異は特定の効果を有していなかった。全てのライブラリーテンプレートの概要を図３に示している。
【０１９６】
安定化ジスルフィド架橋５２ａ／７１を保有する新しい汎用自律性重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）ライブラリーの生成
５２ａ位と７１位での追加の安定化ジスルフィド架橋に基づく新しいａＶＨライブラリーの生成のために、４つの新しいテンプレートを設計した（配列番号３９、４１、４３、４５）。４つのテンプレートのうち３つは、ＣＤＲ１領域に追加の配列修飾を保有する（図３Ａ）。テンプレート２（配列番号４２）では、グリシン２６がセリン（Ｇ２６Ｓ修飾）に置き換えられ、テンプレート３および４（配列番号４４および４６）は、それぞれ３１ａ位および３１ａ／ｂ位に１つおよび２つのセリン挿入を有する（Ｓ３１ａおよびＳ３１ａｂ修飾）。テンプレート１（配列番号４０）は３つ全てのＣＤＲでランダム化し、テンプレート２〜４（配列番号４２、４４および４６）はＣＤＲ２およびＣＤＲ３のみでランダム化した。全てのランダム化において、３つの断片が「オーバーラップエクステンションによるスプライシング」（ＳＯＥ）ＰＣＲによって組み立てられた。断片１は、フレームワーク１、ＣＤＲ１、およびフレームワーク２の一部を含むａＶＨ遺伝子の５’末端を含む。断片２は、フレームワーク２の断片１とオーバーラップし、ＣＤＲ２およびフレームワーク３領域をコードする。断片３は断片２とアニーリングし、ＣＤＲ３領域とａＶＨのＣ末端を保有する。
【０１９７】
３つ全てのＣＤＲをランダム化するために、以下のプライマーの組合せを使用して、ライブラリー断片を生成した：断片１（ＬＭＢ３（配列番号１４）およびａＶＨ＿Ｐ５２ａＣ＿Ａ７１Ｃ＿Ｈ１＿ｒｅｖ＿Ｐｒｉｍｅｒ＿ＴＮ（配列番号４７））、断片２（ａＶＨ＿Ｐ５２ａＣ＿Ａ７１Ｃ＿Ｈ２＿ｆｏｒ＿Ｐｒｉｍｅｒ＿ＴＮ（配列番号４８）およびａＶＨ＿Ｈ３リバースプライマー（配列番号４９））、ならびに断片３（ａＶＨ＿Ｈ３＿４／５／６＿ｆｏｒ＿Ｐｒｉｍｅｒ＿ＴＮ（配列番号５０〜５２）およびｆｄｓｅｑｌｏｎｇ（配列番号１７））（表４）。ＣＤＲ２と３でのみランダム化された３つのライブラリーの生成では、ランダム化プライマーの配列番号１５を、定常プライマーの配列番号５３に置き換えた（表５）。十分な量の完全長ランダム化ａＶＨ断片の組立て後、それらを同様に処理された受容体ファージミドベクターと共にＮｃｏＩ／ＮｏｔＩで消化した。６μｇのａＶＨライブラリーインサートを２４μｇのファージミドベクターにライゲーションした。精製したライゲーションを６０の形質転換に使用し、５×１０９〜１０１０個の形質転換体を得た。ａＶＨライブラリーを表示するファージミド粒子を救出し、ＰＥＧ／ＮａＣｌ精製によって精製することで選択のために使用した。
【０１９８】
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【０１９９】
2021511793.tif 000006
【０２００】
安定化ジスルフィド架橋３３／５２を保有する新しい汎用自律性ヒト重鎖可変ドメイン（ａＶＨ）ライブラリーの生成
３３位および５２位でジスルフィド架橋により安定化されたａＶＨテンプレート５（図３Ｂ；ＤＮＡ：配列番号１７９；タンパク質配列番号１８０）のランダム化のために、前述のものと同じＰＣＲ戦略を選択した。３つのランダム化されたＣＤＲを有するライブラリーの生成のために、断片１はプライマーＬＭＢ３（配列番号１５）およびａＶＨ＿Ｙ３３Ｃ＿Ｙ５２Ｃ＿Ｈ１＿ｒｅｖ＿Ｐｒｉｍｅｒ＿ＴＮ（配列番号５４）を使用して生成し、断片２はａＶＨ＿Ｙ３３Ｃ＿Ｙ５２Ｃ＿Ｈ２＿ｆｏｒ＿Ｐｒｉｍｅｒ＿ＴＮ（配列番号５５）およびａＶＨ＿Ｈ３リバースプライマー（配列番号４９）を使用して生成し、断片３はａＶＨ＿Ｈ３＿４／５／６＿ｆｏｒ＿Ｐｒｉｍｅｒ＿ＴＮ（配列番号５０〜５２）およびｆｄｓｅｑｌｏｎｇ（配列番号１７）を使用して生成した（表６）。ＣＤＲ２および３のみでランダム化されたライブラリーの生成のために、ランダム化プライマー配列番号５４を、定常プライマー配列番号５３で置き換えた（表７）。得られたファージライブラリーのサイズは、約５×１０９の形質転換体であった。
【０２０１】
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【０２０２】
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【０２０３】
実施例４
汎用ジスルフィド安定化ａＶＨライブラリーからの抗ＭＣＳＰおよび抗ＴｆＲ１結合物質の選択
ライブラリーの複雑さの品質をテストし、結果として得られる結合物質をさらに特性決定するために、前述のように、組換えＭＣＳＰおよびＴｆＲ１に対する概念実証選択を溶液中で行った。両方の選択について、６つのファージライブラリー全てを個別に、前述の抗原に対する結合物質についてスクリーニングした。抗原濃度の（１０−７Ｍからｘ１０−８Ｍへの）減少を使用して選択を３ラウンド行った。ラウンド２では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを使用して抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。特異的結合物質を、ＥＬＩＳＡによって以下のように同定した：ウェルあたり１００μｌの５０ｎＭビオチン化抗原をニュートラアビジンプレートに被覆した。個々のａＶＨを含む細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用して結合ａＶＨをそれらのＦｌａｇタグを介して検出した。バックグラウンドよりも有意なシグナルを示すクローンを、配列決定用にショートリストし（例示的なＤＮＡ配列は、ＭＣＳＰ特異的ａＶＨの配列番号５６、５８、６０、６２および６４としてリストし、ＴｆＲ１特異的ａＶＨの配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１および７２としてリストした）、さらに分析した。
【０２０４】
大腸菌からのａＶＨの精製
選択したクローンをさらに特性決定するために、ＥＬＩＳＡポジティブａＶＨ（ＭＣＳＰ特異的ａＶＨの配列番号５７、５９、６１、６３および６５としてリストされた可変ドメインの例示的なタンパク質配列）を、反応速度パラメータの正確な分析のために精製した。各クローンについて、５００ｍｌの培養物に、対応するファージミドを保有する細菌を接種し、ＯＤ６０００．９で１ｍＭ  ＩＰＴＧを用いて誘導した。その後、培養物を２５℃で一晩インキュベートし、遠心分離により回収した。再懸濁したペレットを２５ｍｌのＰＰＢ緩衝液（３０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０％ショ糖）で２０分間インキュベートした後、細菌を再度遠心分離し、上清を回収した。このインキュベーションステップを、２５ｍｌの５ｍＭ  ＭｇＳＯ４溶液で１回繰り返した。両方のインキュベーションステップの上清をプールし、ろ過し、ＩＭＡＣカラム（Ｈｉｓ  ｇｒａｖｉｔｒａｐ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）にロードした。続いて、カラムを４０ｍｌの洗浄緩衝液（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４  ｐＨ７．４）で洗浄した。溶出後（５００ｍＭ  ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４ｐＨ７．４）、ＰＤ１０カラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して溶出液を再緩衝化し、続いてゲルろ過ステップを行った。精製タンパク質の収量は５００〜２０００μｇ／Ｌの範囲であった。
【０２０５】
ＳＰＲによるＭＣＳＰ特異的ジスルフィド安定化ａＶＨクローンのアフィニティー決定
選択されたａＶＨクローンのアフィニティー（ＫＤ）は、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、表面プラズモン共鳴により、ニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップにビオチン化ＭＣＳＰ抗原を固定化して測定した。組換え抗原（リガンド）の固定：抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム  ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いでさまざまな接触時間で３０μｌ／分で注入して、垂直方向で２００、４００または８００の応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成した。分析物の注入：ワンショット反応速度測定では、注入方向を水平方向に変更し、精製されたａＶＨの２倍希釈系列（２００〜６．２５ｎＭのさまざまな濃度範囲）を１８０秒の間の結合時間と８００秒の解離時間で、別々のチャネル１〜５に沿って６０μｌ／ｍｉｎで同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。結合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ  を使用して、結合と解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。分析されたクローンにより、非常に広い範囲（８〜１９３ｎＭ）のＫＤ値が明らかになった。全てのクローンの速度論的および熱力学的データ、凝集温度、ランダム化されたＣＤＲ、ならびに安定化ジスルフィド架橋の位置を表８にまとめている。
【０２０６】
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【０２０７】
選択されたジスルフィド安定化ａＶＨクローンのＦｃベースのフォーマットへの変換
選択されたａＶＨクローンをさらに特性決定するために、全ての結合物質をＦｃベースのフォーマットに変換した。ＭＣＳＰ特異的ａＶＨ配列は、「ノブ」変異を保有するヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインにＮ末端で融合された。特に、同定されたａＶＨ  ＤＮＡ配列（配列番号５６、５８、６０、６２、６４）は、配列番号７３のａＶＨをコードするテンプレート配列を置き換えた。ａＶＨ−Ｆｃ融合配列は、「ホール」変異を持つＦｃ配列（配列番号７４）と組み合わせて発現され、Ｎ末端のモノマーａＶＨを有するＦｃドメインをもたらした（図２Ａ）。
【０２０８】
ＴｆＲ１特異的結合物質の場合、代替的なＦｃベースのフォーマットが選択された：ヒトＩｇＧ１抗体に基づいて、ＶＨドメインをコードする配列は、選択されたａＶＨドメインをコードするＤＮＡ配列断片（配列番号６６、６７、６８、６９、７０、７１および７２）で置き換えられた。さらに、カッパ型の軽鎖をコードする発現コンストラクトでは、ＶＬドメインが削除され、定常カッパドメイン（配列番号７５）がシグナル配列に直接融合された。両方のプラスミドの共発現により、全ての抗体定常ドメインと各ＣＨ１のＮ末端に融合したａＶＨドメインとからなる二価のコンストラクトが得られる（図２Ｂ）。これらのコンストラクトは、全ての更なる特性決定のために使用された。
【０２０９】
ＭＣＳＰ特異的ジスルフィド安定化ａＶＨクローンの結合分析
ジスルフィド安定化ＭＣＳＰ特異的クローンのＭＶ３細胞株への結合をＦＡＣＳで測定した。ネガティブコントロールとして、無関係の抗体を使用した。９６ウェルの丸底プレートのウェルあたり０．２ｍｉｏ細胞を、３００μｌのＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ）とモノマーのａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクト（０．２７、０．８、２．５、７．４、２２．２、６６．６、２００および６００ｎＭ）で４℃にて３０分間インキュベートした。非結合分子は、細胞をＰＢＳ（０．１％ＢＳＡ）で洗浄することにより除去した。結合分子は、ＦＩＴＣ抱合ＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆｃガンマ断片特異的二次Ｆ（ａｂ’）２断片（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ  ♯１０９−０９６−０９８；ＰＢＳ中１：２０希釈標準溶液、０．１％ＢＳＡ）で検出された。４℃で３０分のインキュベーション後、非結合抗体を洗浄により除去し、細胞を１％ＰＦＡを使用して固定した。ＢＤ  ＦＡＣＳ  ＣａｎｔｏＩＩ（ソフトウェアＢＤ  ＤＩＶＡ）を使用して細胞を分析した。全てのクローンの結合（図４）が観察された。ＳＰＲによって測定されたアフィニティーと結合分析の感度は相関しており、クローン２（配列番号５７）がＳＰＲ分析と細胞結合研究の両方で最良の結合物質であった。
【０２１０】
選択されたＭＣＳＰ特異的ジスルフィド安定化ａＶＨクローンの特性決定
選択および精製されたａＶＨをさらに特性決定するために、ＭＣＳＰ特異的クローンの凝集温度を前述のように決定した。興味深いことに、全てのジスルフィド安定化ＭＣＳＰ特異的クローンの凝集温度は５９〜６４℃であり、追加のジスルフィド架橋の安定化効果を明確に実証している（表８）。
【０２１１】
ＴｆＲ１特異的ジスルフィド安定化ａＶＨクローンの蛍光共鳴エネルギー移動アッセイ
ＴｆＲ１特異的二価ａＶＨ−ＦｃコンストラクトのＴｆＲ１発現細胞上のそれらのエピトープへの結合は、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）分析によって決定した。この分析では、ＳＮＡＰタグ（Ｃｉｓｂｉｏから購入したプラスミド）をコードするＤＮＡ配列をＰＣＲで増幅し、完全長ＴｆＲ１配列（Ｏｒｉｇｅｎｅ）を含む発現ベクターにライゲーションした。得られた融合タンパク質は、Ｃ末端ＳＮＡＰタグを有する全長ＴｆＲ１を含む。Ｈｅｋ２９３細胞に、トランスフェクション試薬としてＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００を使用して、１０μｇのＤＮＡをトランスフェクションした。２０時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、１００ｎＭのＳＮＡＰ−Ｌｕｍｉ４Ｔｂ（Ｃｉｂｓｉｏ）を含むＬａｂＭｅｄ緩衝液（Ｃｉｓｂｉｏ）で３７℃にて１時間インキュベートし、ＳＮＡＰタグの特異的標識をもたらした。その後、細胞をＬａｂＭｅｄ緩衝液で４回洗浄して、非結合色素を除去した。標識効率は、緩衝液と比較して６１５ｎｍでテルビウムの発光を測定することにより決定した。次いで、細胞を−８０℃で６ヶ月まで冷凍保存した。結合は、０．５〜６０ｎＭまでの範囲の濃度のＴｆＲ１特異的ａＶＨ  Ｆｃ融合体を標識細胞（ウェルあたり１００細胞）に加え、続いてＦＲＥＴの受容体分子として抗ヒトＦｃ−ｄ２（Ｃｉｓｂｉｏ、最終濃度はウェルあたり２００ｎＭであった）を加えて測定した。ＲＴで３時間のインキュベーション時間後、受容体色素（６６５ｎｍ）ならびにドナー色素（６１５ｎｍ）の発光を、蛍光リーダー（Ｖｉｃｔｏｒ  ３、Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して決定した。受容体とドナー発光の比率を計算し、バックグラウンドコントロール（抗ｈｕＦｃ−ｄ２を含む細胞）の比率を差し引いた。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ５（図５）で曲線を分析し、ＫＤを計算した（表９）。
【０２１２】
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【０２１３】
実施例５
汎用ジスルフィド安定化ａＶＨライブラリーからの抗ＬＡＧ３特異的結合物質の選択
ＬＡＧ３特異的ａＶＨの選択は、前述のように行った。この選択のために、６つ全てのファージライブラリーを個別に、上述の抗原に対する結合物質についてスクリーニングした。抗原濃度の（１０−７Ｍからｘ１０−８Ｍへの）減少を使用して選択を３ラウンド行った。ラウンド２では、ストレプトアビジンビーズの代わりにニュートラアビジンプレートを使用して抗原：ファージ複合体の捕捉を行った。特異的結合物質を、ＥＬＩＳＡによって以下のように同定した：ウェルあたり１００μｌの５０ｎＭビオチン化抗原をニュートラアビジンプレートに被覆した。ａＶＨを含む細菌の上清を加え、抗Ｆｌａｇ／ＨＲＰ二次抗体を使用して結合ａＶＨをそれらのＦｌａｇタグを介して検出した。バックグラウンドよりも有意なシグナルを示すクローンを、配列決定用にショートリストし（配列番号７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６としてリストされるＤＮＡ配列；配列番号７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７としてリストされるタンパク質配列）、さらに分析した。
【０２１４】
ＳＰＲによるＬＡＧ３特異的ジスルフィド安定化ａＶＨクローンのアフィニティー決定
選択されたａＶＨクローンのアフィニティー（ＫＤ）は、２５℃でＰｒｏｔｅＯｎ  ＸＰＲ３６装置（Ｂｉｏｒａｄ）を使用して、表面プラズモン共鳴により、ニュートラアビジン捕捉によってＮＬＣチップにビオチン化ＬＡＧ３−Ｆｃ抗原を固定化して測定した。組換え抗原（リガンド）の固定：抗原をＰＢＳＴ（１０ｍＭリン酸、１５０ｍＭ塩化ナトリウム  ｐＨ７．４、０．００５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）で１０μｇ／ｍｌに希釈し、次いでさまざまな接触時間で３０μｌ／分で注入して、垂直方向で２００、４００または８００の応答単位（ＲＵ）の固定化レベルを達成した。ＬＡＧ３結合相互作用のネガティブコントロールとして、ビオチン化Ｆｃドメインを同じ条件で固定化した。分析物の注入：ワンショット反応速度測定では、注入方向を水平方向に変更した。精製されたａＶＨの２倍希釈系列（２００〜６．２５ｎＭのさまざまな濃度範囲）を３００秒の間の結合時間と３６０秒の解離時間で、別々のチャネル１〜５に沿って６０μｌ／ｍｉｎで同時に注入した。参照用の「インライン」ブランクを提供するために、６つ目のチャネルに沿って緩衝液（ＰＢＳＴ）を注入した。結合速度定数（ｋｏｎ）と解離速度定数（ｋｏｆｆ）は、ＰｒｏｔｅＯｎ  Ｍａｎａｇｅｒ  ｖ３．１ソフトウェアの単純な１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌ  を使用して、結合と解離センサーグラムを同時にフィッティングすることで計算した。平衡解離定数（ＫＤ）は、ｋｏｆｆ／ｋｏｎの比として計算した。分析されたクローンにより、非常に広い範囲（５〜７６６ｎＭ）のＫＤ値が明らかになった。全てのクローンの速度論的および熱力学的データ、凝集温度、ランダム化されたＣＤＲ、ならびに安定化ジスルフィド架橋の位置を表１０にまとめている。
【０２１５】
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【０２１６】
細菌から精製されたａＶＨドメインを有するＡ３７５細胞のＭＨＣＩＩ競合アッセイ
細菌で精製されたＬＡＧ３特異的ａＶＨドメインがＴ細胞で発現するＭＨＣＩＩへのＬＡＧ３の結合をブロックして妨げる能力を評価するために、細菌から精製されたａＶＨｓドメインを使用して細胞ベースの結合阻害アッセイを行った。最初のステップでは、２０μｇ／ｍｌ〜０．０５μｇ／ｍｌの範囲のａＶＨドメインの連続希釈液を、１μｇ／ｍｌのビオチン化ＬＡＧ３−Ｆｃと共にＰＦＡＥ緩衝液（２％ＦＣＳ、０．０２％アジ化ナトリウムおよび１ｍＭ  ＥＤＴＡを含むＰＢＳ）でインキュベートした。室温で２０分後、混合物を２×１０５のＰＦＡＥで洗浄したＡ３７５細胞に加えた。４℃で３０分後、細胞をＰＦＡＥで１回洗浄した。Ａ３７５細胞で発現したＭＨＣＩＩへのＬＡＧ３−Ｆｃの結合は、Ａｌｅｘａ  ６４７標識ヤギ抗ヒトＦｃの添加により検出された。インキュベーションの３０分後、細胞をＰＦＡＥ緩衝液で洗浄し、ＦＡＣＳ  ｃａｌｉｂｕｒフローサイトメーターを使用して結合分析を行った。
【０２１７】
実施例６
選択されたジスルフィド安定化ａＶＨクローンのＦｃベースのフォーマットへの変換
選択されたａＶＨクローンをさらに特性決定するために、全ての結合物質をＦｃベースのフォーマットに変換した。ａＶＨコード配列は、ヒトＩｇＧ１  Ｆｃドメインまたは「ノブ」変異を保有するヒトＩｇＧ１  ＦｃドメインのいずれかにＮ末端で融合された。両方のＦｃバリアントは、ＦｃγＲ結合を完全に無効にするＰＧ−ＬＡＬＡ変異を含んでいた。Ｐ３２９Ｇ、Ｌ２３４ＡおよびＬ２３５Ａ（ＥＵ番号付け）のＦｃドメインにおける変異に関連するＰＧ−ＬＡＬＡ変異は、その全体が本明細書に組み込まれるＷＯ２０１２／１３０８３１に記載されている。
【０２１８】
得られたａＶＨ−Ｆｃ（ＰＧ−ＬＡＬＡ）融合配列（配列番号９８、１００、１０２、１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８を有するＤＮＡ配列および配列番号９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９を有するそれぞれのタンパク質配列）の発現により二価の融合コンストラクトが得られ（図２Ｃ）、ａＶＨ  Ｆｃ（ノブ、ＰＧ−ＬＡＬＡ）融合コンストラクト（配列番号１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０を有するＤＮＡ配列および配列番号１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１を有するそれぞれのタンパク質配列）と「ホール」変異を持つＦｃ配列断片（配列番号７４）との共発現により一価のａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトがもたらされた（図２Ａ）。分子の生成および精製は、前で記載されたように行った。
【０２１９】
一価ａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトの生化学的特性
それらの生化学的および生物物理学的特性を特性決定して比較するために、全ての一価のａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトを詳細に分析した：
【０２２０】
化学分解試験
試料を３つのアリコートに分け、２０ｍＭ  Ｈｉｓ／Ｈｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ６．０（Ｈｉｓ／ＮａＣｌ）またはＰＢＳにそれぞれ再緩衝化し、４０℃（Ｈｉｓ／ＮａＣｌ）または３７℃（ＰＢＳ）で２週間保存した。コントロール試料は−８０℃で保存した。
【０２２１】
インキュベーションが終了した後、試料を相対活性濃度（ＳＰＲ）、凝集（ＳＥＣ）および断片化（ＣＥ−ＳＤＳ）について分析し、未処理のコントロールと比較した。
【０２２２】
疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）
見かけの疎水性は、２０μｇの試料を２５ｍＭリン酸ナトリウム、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ  ７．０で平衡化したＨＩＣ−Ｅｔｈｅｒ−５ＰＷ（Ｔｏｓｏｈ）カラムに注入することにより決定した。溶出は、０〜１００％の緩衝液Ｂ（２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）の直線勾配で６０分以内に行った。リテンションタイムを、既知の疎水性を有するタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は、０〜０．３５の相対リテンションタイムを示す。
【０２２３】
熱安定性
試料を、２０ｍＭ  Ｈｉｓ／Ｈｉｓ−ＨＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ中、ｐＨ６．０で１ｍｇ／ｍＬの濃度にて調製し、０．４μｍフィルタープレートで遠心分離して光学３８４ウェルプレートに移し、パラフィンオイルで覆った。流体力学的半径は、試料を２５℃〜８０℃に０．０５℃／ｍｉｎの速度で加熱している間、ＤｙｎａＰｒｏプレートリーダー（Ｗｙａｔｔ）で動的光散乱によって繰り返し測定する。
【０２２４】
ＦｃＲｎアフィニティークロマトグラフィー
ＦｃＲｎは、記載されているように（Ｓｃｈｌｏｔｈａｕｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）発現、精製およびビオチン化した。カップリングのために、調製した受容体をストレプトアビジン−セファロース（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に加えた。得られたＦｃＲｎ−セファロースマトリックスをカラムハウジングに充填した。カラムを２０ｍＭ  ２−（Ｎ−モルホリン）−エタンスルホン酸（ＭＥＳ）、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ５．５（溶離液Ａ）で０．５  ｍｌ／ｍｉｎの流速で平衡化した。３０μｇの抗体試料を溶離液Ａで１：１の容量比で希釈し、ＦｃＲｎカラムにアプライした。カラムを５カラム容量の溶離液Ａで洗浄し、続いて２０〜１００％の直線勾配で３５カラム容量の２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、１４０ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．８（溶離液Ｂ）で溶出した。分析は、２５℃のカラムオーブンで行った。溶出プロファイルは、２８０ｎｍでの吸光度を継続的に測定することでモニターした。リテンションタイムを、既知のアフィニティーを有するタンパク質標準と比較した。ほとんどの抗体は、０〜１の相対リテンションタイムを示す。
【０２２５】
表１１は、異なる試験済み試料の生物物理学的および生化学的特性をまとめたものである。全てが予想外に高い熱安定性と見かけの疎水性を示した。しかしながら、クローン１７Ｄ７および１９Ｇ３は、ＦｃＲｎへの異常に強い結合を示した。全ての試料はストレス時にわずかな断片化のみを示したが（表１２）、クローンＰ１１Ｅ２およびＰ１１Ｅ９はストレス時に有意な凝集傾向を示した（表１２）。最後に、ＳＰＲ測定により、Ｐ１１Ａ２を除く全ての試料が、ストレス後にそれらのＬａｇ３標的への結合特性のほとんどを保持していることが明らかになった（相対活性濃度＞８０％）（表１３）。
【０２２６】
2021511793.tif 000012
【０２２７】
2021511793.tif 000013
【０２２８】
2021511793.tif 000014
【０２２９】
実施例７
二価のａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトのｉｎ  ｖｉｔｒｏ特性決定
下記のインビトロ実験では、以下の試薬を使用した。全ての結果の概要を表１４に見出すことができる。
【０２３０】
使用した材料は、ＰＢＳ（ＤＰＢＳ、ＰＡＮ、Ｐ０４−３６５００）、ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ、１０７３５０８６００１）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ  ２０（ｕｓｂ、＃２０６０５、５００ｍｌ））、ＰＢＳＴブロッキング緩衝液（ＰＢＳ（１０×、Ｒｏｃｈｅ、＃１１６６６７８９００１）／２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン分画Ｖ、脂肪酸フリー、Ｒｏｃｈｅ、＃１０７３５０８６００１）／０，０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）、１ステップＥＬＩＳＡ緩衝液（ＯＳＥＰ）（ＰＢＳ（１０×、Ｒｏｃｈｅ、＃１１６６６７８９００１）、０．５％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン分画Ｖ、脂肪酸フリー、Ｒｏｃｈｅ、＃１０７３５０８６００１）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）であった。
【０２３１】
2021511793.tif 000015
【０２３２】
ヒトＬａｇ３のＥＬＩＳＡ
Ｎｕｎｃ  ｍａｘｉｓｏｒｐプレート（Ｎｕｎｃ  ４６４７１８）を、ＰＢＳ緩衝液で希釈した２５μｌ／ウェルの組換えヒトＬＡＧ３  Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、２３１９−Ｌ３）を用い、タンパク質濃度８００ｎｇ／ｍｌでコーティングし、４℃で一晩、または室温で１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ緩衝液を用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、各ウェルを、９０μｌのブロッキング緩衝液（ＰＢＳ＋２％  ＢＳＡ＋０．０５％  Ｔｗｅｅｎ  ２０）と共に、室温で１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ緩衝液を用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌの抗Ｌａｇ３試料を濃度１０００または３０００〜０．０５ｎｇ／ｍｌ（ＯＳＥＰ緩衝液中１：３希釈）で加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ緩衝液を用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｆ（ａｂ’）２−ＨＲＰ抱合体（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＪＩＲ１０９−０３６−００６）を１：８００希釈状態で加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ緩衝液を用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１８３５０３３００１）を加え、２〜１０分間インキュベートした。測定をＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２機器で、３７０／４９２ｎｍで行った。（米国特許出願公開第２０１１／０１５０８９２号明細書および国際公開第２０１４／００８２１８号に開示されている）コントロール抗体ＭＤＸ２５Ｆ７と比較して、ほとんどのａＶＨクローンはより高いＥＣ５０値を示した。さらに、マウスＬＡＧ３−Ｆｃ抗原（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，３３２８−Ｌ３−０５０）を使用したそれぞれのＥＬＩＳＡ実験は、どの結合物質もマウスＬＡＧ３と交差反応しないことを明らかにした（データは示していない）。
【０２３３】
オフレート決定
ヒトＬａｇ３への結合からの抗Ｌａｇ３  ａＶＨ  Ｆｃ融合コンストラクトのオフレートを、ＢＩＡＣＯＲＥ  Ｂ４０００またはＴ２００機器（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用した表面プラズモン共鳴により調査した。全ての実験は、ランニング緩衝液としてＰＢＳＴ緩衝液（ｐＨ  ７．４＋０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）を使用して２５℃で行った。抗ヒトＦｃ（ＪＩＲ１０９−００５−０９８，Ｊａｃｋｓｏｎ）は、Ｓｅｒｉｅｓ  Ｓ  Ｃ１  Ｓｅｎｓｏｒ  Ｃｈｉｐ（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に約２４０〜３１５ＲＵで固定した。１または５μｇ／ｍｌの抗Ｌａｇ３  ａＶＨ抗体を１０μｌ／ｍｉｎで６０秒間捕捉した。次のステップでは、２５０μｇ／ｍｌの濃度で１０μｌ／ｍｉｎの２ｘ１２０秒の注入によるヒトＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＪＩＲ−００９−０００−００３）の注入により、遊離の抗ヒトＦｃ結合部位をブロックした。０、５および２５ｎＭのヒトＬＡＧ−３  Ｆｃキメラタンパク質（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ，２３１９−Ｌ３）を、３０μｌ／ｍｉｎの流速で１８０秒間アプライした。解離相は、ランニング緩衝液で洗浄することにより、９００秒間モニターした。Ｈ３ＰＯ４（０．８５％）を３０μｌ／ｍｉｎの流速で７０秒間注入することにより、表面を再生した。
【０２３４】
バルクの屈折率差を、模擬表面から得られた応答を差し引くことにより補正した。ブランク注入は差し引いた（二重参照）。導出された曲線は、ＢＩＡｅｖａｌｕａｔｉｏｎソフトウェアを使用して１：１  Ｌａｎｇｍｕｉｒ  ｂｉｎｄｉｎｇ  ｍｏｄｅｌに適合させた。測定されたオフレートを、予め測定された一価のａＶＨｓドメインのオフレートと比較すると、二価のａＶＨ−Ｆｃコンストラクトの結合は非常に強くアビディティを介していると結論付けることができる。
【０２３５】
実施例８
細胞上のａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトの特性決定
以下のセクションでは、選択されたａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトをいくつかの細胞ベースのアッセイで特性決定した。下記のインビトロ実験では、以下の試薬を使用した。全ての結果の概要を表１５に見出すことができる。
【０２３６】
使用した材料は、ＰＢＳ（ＤＰＢＳ、ＰＡＮ、Ｐ０４−３６５００）、ＢＳＡ（Ｒｏｃｈｅ、１０７３５０８６００１）、Ｔｗｅｅｎ  ２０（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔ  ２０（ｕｓｂ、＃２０６０５、５００ｍｌ））、ＰＢＳＴブロッキング緩衝液（ＰＢＳ（１０×、Ｒｏｃｈｅ、＃１１６６６７８９００１）／２％ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン分画Ｖ、脂肪酸フリー、Ｒｏｃｈｅ、＃１０７３５０８６００１）／０，０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）、１ステップＥＬＩＳＡ緩衝液（ＯＳＥＰ）（ＰＢＳ（１０×、Ｒｏｃｈｅ、＃１１６６６７８９００１）、０．５％  ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン分画Ｖ、脂肪酸フリー、Ｒｏｃｈｅ、＃１０７３５０８６００１）、０．０５％Ｔｗｅｅｎ  ２０）であった。
【０２３７】
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【０２３８】
細胞表面Ｌａｇ３結合ＥＬＩＳＡ
２５μｌ／ウェルのＬａｇ３細胞（Ｌａｇ３を発現する組換えＣＨＯ細胞、１００００細胞／ウェル）を、組織培養処理された３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７０１）に播種し、３７℃で１日間または２日間インキュベートした。培地を除去した次の日、２５μｌの二価の抗Ｌａｇ３  ａＶＨ−Ｆｃコンストラクト（ＯＳＥＰ緩衝液中１：３希釈、６μｇ／ｍｌの濃度で開始）を加え、４℃で２時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ中で１ｘ９０μｌ）、３０μｌ／ウェルのグルタルアルデヒドを、最終濃度０．０５％（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ５８８２）に室温で１０分間添加することによって細胞を固定した。洗浄した後（ＰＢＳＴ緩衝液を用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのヤギ抗ヒトＩｇＧ  Ｈ＋Ｌ−ＨＲＰ抱合体（Ｊａｃｋｓｏｎ，ＪＩＲ１０９−０３６−０８８）を１：２０００希釈状態で加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ緩衝液を用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１８３５０３３００１）を加え、６〜１０分間インキュベートした。測定をＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２機器で、３７０／４９２ｎｍで行った。要約すると、全ての試験された分子は、ＬＡＧ３を組換え発現するＣＨＯ細胞に結合した。それらのＥＣ５０値は、主にナノモル未満の範囲にあり、非常に強いアビディティを介した結合を示し、ＥＬＩＳＡで測定して強い結合が確認された（表１４）。
【０２３９】
Ａ３７５  ＭＨＣＩＩ競合ＥＬＩＳＡ
２５μｌ／ウェルのＡ３７５細胞（１０，０００細胞／ウェル）を、組織培地で処理した３８４ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ、３７０１）に播種し、３７℃で一晩インキュベートした。二価の抗Ｌａｇ３  ａＶＨ−Ｆｃコンストラクトを、３μｇ／ｍｌの抗体濃度で出発して、１：３の希釈率で、細胞培地中でビオチン化Ｌａｇ３（２５０ｎｇ／ｍｌ）を用いて１時間プレインキュベートした。播種した細胞を含むウェルから培地を取り出した後、２５μｌのａＶＨ−Ｌａｇ３プレインキュベート混合物をウェルに移し、４℃で２時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ中で１ｘ９０μｌ）、３０μｌ／ウェルのグルタルアルデヒドを、最終濃度０．０５％（Ｓｉｇｍａカタログ番号Ｇ５８８２）に室温で１０分間添加することによって細胞を固定した。洗浄した後（ＰＢＳＴ緩衝液を用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのポリ−ＨＲＰ４０−ストレプトアビジン（Ｆｉｔｚｇｅｒａｌｄ、６５Ｒ−Ｓ１０４ＰＨＲＰｘ）を１：２０００または１：８０００希釈状態で加え、ＲＴで１時間インキュベートした。洗浄した後（ＰＢＳＴ緩衝液を用いて３ｘ９０μｌ／ウェル）、２５μｌ／ウェルのＴＭＢ基質（Ｒｏｃｈｅ、番号１１８３５０３３００１）を加え、２〜１０分間インキュベートした。測定をＴｅｃａｎ  Ｓａｆｉｒｅ  ２機器で、３７０／４９２ｎｍで行った。コントロール抗体ＭＤＸ２５Ｆ７と比較して、いくつかのａＶＨクローンは、３μｇ／ｍｌの濃度で同様のまたはさらに優れた阻害と、同等のＩＣ５０値を示した。
【０２４０】
ａＶＨ−Ｆｃコンストラクトの組換えｃｙｎｏ  Ｌａｇ３ポジティブＨＥＫ細胞への結合
ヒトＬａｇ３を組換え発現するＣＨＯ細胞を用いた結合分析に加え、カニクイザルＬａｇ３ポジティブＨＥＫ細胞への結合も評価した。この実験のために、予めｃｙｎｏ  ＬＡＧ３で一過性トランスフェクションされ、凍結させたＨＥＫ２９３Ｆ細胞を解凍し、遠心分離し、ＰＢＳ／２％ＦＢＳに再補充した。１．５ｘ１０５個の細胞／ウェルを９６ウェルプレートに播種した。二価の抗Ｌａｇ３  ａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトのセットを１０μｇ／ｍｌの正規化された最終濃度まで加えた。参照するためにコントロールとして、自己蛍光でポジティブコントロール（ＭＤＸ  ２５Ｆ７およびＭＤＸ  ２６Ｈ１０）ならびにアイソタイプコントロール（Ｓｉｇｍａ製ｈｕＩｇＧ１、カタログ番号♯Ｉ５１５４）抗体を調製し、この実験で測定した。ＨＥＫ細胞を、示したａＶＨ−Ｆｃコンストラクトと共に氷上で４５分間インキュベートし、２００μｌの氷冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、二次抗体（ＡＰＣ標識されたヤギ抗ヒトＩｇＧ−カッパ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号♯ＭＨ１０５１５）を加え（ＦＡＣＳ緩衝液／ウェルで１：５０に希釈）、さらに氷上で３０分間インキュベートした。細胞を再び、２００μｌの氷冷ＰＢＳ／２％ＦＢＳ緩衝液で２回洗浄した後、試料を最終的に、１５０μｌのＦＡＣＳ緩衝液に再懸濁させ、ＦＡＣＳ  ＣＡＮＴＯ−ＩＩ  ＨＴＳ  Ｍｏｄｕｌｅで結合を測定した。
【０２４１】
実施例９
ａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトの機能特性
同種異系成熟樹状細胞と共培養されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞による細胞毒性グランザイムＢ放出およびＩＬ−２分泌に対するＰＤ−１およびＬＡＧ−３ブロックの効果。
以下の実験のために、国際公開第２０１７／０５５４４３  Ａ１号による抗ＰＤ−１抗体（０３７６）を生成し、使用した。ＰＤ１−０１０３＿０１（０３７６）のヒト化バリアント−重鎖可変ドメインＶＨについては配列番号１９２が参照され、ＰＤ１−０１０３＿０１（０３７６）のヒト化バリアント−軽鎖可変ドメインＶＬについては配列番号１９３が参照される。
【０２４２】
同種異系設定で抗ＰＤ−１（０３７６）と組み合わせたａＶＨ−Ｆｃコンストラクトによる二価ＬＡＧ３−ブロッキングの効果を分析するために、新しく精製したＣＤ４  Ｔ細胞を、単球由来同種異系成熟樹状細胞（ｍＤＣ）と５日間、共培養するアッセイを開発した。単球を、プラスチック接着し、続いて非接着細胞を除去する１週間前に、ＰＢＭＣから単離した。次いで、ＧＭ−ＣＳＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）およびＩＬ−４（１００ｎｇ／ｍｌ）を含有する培地中、未成熟ＤＣ（ｉＤＣ）を５日間培養することによって、それらを単球から生成した。ｉＤＣ成熟を誘発するために、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１βおよびＩＬ−６（それぞれ５０ｎｇ／ｍｌ）を培地にさらに２日間かけて加えた。その後、フローサイトメトリー（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によるＭａｊｏｒ  Ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｃｌａｓｓ  ＩＩ（ＭＨＣＩＩ）、ＣＤ８０、ＣＤ８３およびＣＤ８６のその表面発現を測定することによって、ＤＣ成熟を評価した。
【０２４３】
最小混合リンパ球反応（ｍＭＬＲ）の日に、ＣＤ４  Ｔ細胞を、マイクロビーズキット（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）によって、無関係のドナーから得られた１０８個のＰＢＭＣから濃縮した。培養前に、ＣＤ４  Ｔ細胞を、５μＭのカルボキシ−フルオレセイン−スクシンイミジルエステル（ＣＦＳＥ）で標識した。次いで、１０５個のＣＤ４  Ｔ細胞を、抗ＰＤ１抗体（０３７６）単独の存在下もしくは非存在下で、または濃度１０μｇ／ｍｌでＮｏｖａｒｔｉｓ（ＢＡＰ０５０）およびＢｒｉｓｔｏｌ  Ｍｅｙｅｒｓ  Ｓｑｕｉｂｂ（ＢＭＳ−９８６０１６）からの二価の抗ＬＡＧ３  ａＶＨ−ＦｃコンストラクトもしくはＬＡＧ３特異的コントロール抗体と組み合わせて、成熟ａｌｌｏ−ＤＣ（５：１）と共に９６ウェルプレートにプレーティングした。ＤＰ４７は、ＦｃγＲによる認識を回避するためにＦｃ部分にＰＧ−ＬＡＬＡ変異を有する非結合性ヒトＩｇＧであり、これをネガティブコントロールとして使用した。
【０２４４】
５日後、細胞培養上清を集め、これを後で使用して、ＥＬＩＳＡ（Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍｓ）によりＩＬ−２レベルを測定し、Ｇｏｌｇｉ  Ｐｌｕｇ（Ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ  Ａ）およびＧｏｌｇｉ  Ｓｔｏｐ（Ｍｏｎｅｎｓｉｎ）の存在下で、細胞を３７℃にてさらに５時間放置した。次いで、細胞を洗浄し、その表面を、抗ヒトＣＤ４抗体およびＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｄｙｅ  Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。その後、細胞内染色を、グランザイムＢ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）およびＩＦＮ−γ（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）について実施した。二価Ｐ２１Ａ０３  ＬＡＧ３  ａＶＨ−Ｆｃコンストラクトは、抗ＰＤ−１（０３７６）抗体と組み合わせると、抗体ＢＡＰ０５０に匹敵する形でＣＤ４  Ｔ細胞によるグランザイムＢおよびＩＬ−２分泌を誘導する。さらに、いくつかの追加のａＶＨクローンも、グランザイムＢ発現および／またはＩＬ２分泌のレベルの増加を示した。６人の独立したドナーからの血液細胞を用いた実験の統合結果を図６ＡおよびＢに示している。
【０２４５】
（活性化した）カニクイザルＰＢＭＣ／Ｌａｇ３を発現するＴ細胞に対するａＶＨの結合
この実験では、活性化したカニクイザルＴ細胞に発現したＬａｇ３への結合を評価した。
【０２４６】
カニクイザルＴ細胞またはＰＢＭＣの細胞表面で発現したＬａｇ３に対する、４つの抗Ｌａｇ３  ａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトの結合特性を、ＦＡＣＳ分析によって確認した。Ｌａｇ３は、ナイーブＴ細胞では発現しないが、活性化するとアップレギュレーションされ、かつ／または疲弊したＴ細胞で発現される。したがって、カニクイザル末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を、新しいカニクイザル血液から調製し、次いで、抗ＣＤ３／ＣＤ２８前処理（１μｇ／ｍｌ）によって２〜３日間かけて活性化させた。その後、活性化された細胞を、Ｌａｇ３発現について分析した。簡単に言うと、１−３×１０５の活性化された細胞を、指定の抗Ｌａｇ３  ａＶＨ−Ｆｃコンストラクトおよびそれぞれのコントロール抗体を最終濃度１０μｇ／ｍｌで用い、氷上で３０〜６０分間かけて染色した。結合された抗Ｌａｇ３  ａＶＨ／抗体は、Ａｌｅｘａ４８８に抱合した抗ヒトＩｇＧ二次抗体を介して検出された。染色後、細胞をＰＢＳ／２％ＦＣＳで２回洗浄し、ＦＡＣＳ  Ｆｏｒｔｅｓｓａ（ＢＤ）で分析した。
【０２４７】
表１６は、活性化されたカニクイザルＰＢＭＣ内のＬａｇ３ポジティブ細胞の割合をまとめたものである。活性化されたカニクイザルＴ細胞では、ａＶＨのほとんどがＬａｇ３への有意な結合を示した。興味深いことに、全ての一価ａＶＨ−Ｆｃは、ヒト抗Ｌａｇ３参照抗体（ＭＤＸ２５Ｆ７、ＢＭＳ−９８６０１６）と比較してポジティブ細胞の割合が高く、全ての二価コンストラクトは、３つ全てのコントロール抗体と比較してさらに高い結合を示した。
【０２４８】
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【０２４９】
ＮＦＡＴ  Ｌａｇ３レポーターアッセイ
抑制されたＴ細胞応答を回復する際に、Ｌａｇ３  ａＶＨクローンの中和能力を試験するために、市販のレポーターシステムを使用した。このシステムは、Ｌａｇ３＋ＮＦＡＴ  Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞（Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号♯ＣＳ１９４８０１）、ＭＨＣ−ＩＩ＋Ｒａｊｉ細胞（ＡＴＣＣ、♯ＣＬＬ−８６）および超抗原からなる。簡単に言うと、このレポーター系は、以下の３つのステップに基づく：（１）超抗原によって誘発されるＮＦＡＴ細胞の活性化、（２）ＭＨＣＩＩ（Ｒａｊｉ細胞）とＬａｇ３＋ＮＦＡＴ  Ｊｕｒｋａｔエフェクター細胞との相互作用によって媒介される活性化シグナルの阻害、（３）Ｌａｇ３アンタゴニスト／中和ａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトによるＮＦＡＴ活性化シグナルの回復。
【０２５０】
この実験のために、ＲａｊｉおよびＬａｇ−３＋Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ２エフェクターＴ細胞を上記のように培養した。５つの抗Ｌａｇ３  ａＶＨｓ−Ｆｃコンストラクトと参照抗体の連続希釈液を、白い平底の９６ウェル培養プレート（Ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号＃３９１７）のアッセイ培地（ＲＰＭＩ  １６４０（ＰＡＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、カタログ番号＃Ｐ０４−１８０４７）、１％ＦＣＳ）で調製した。１×１０５個のＬａｇ３＋ＮＦＡＴ−Ｊｕｒｋａｔ細胞／ウェル）を抗体溶液に加えた。このステップの後で、２．５×１０４個のＲａｊｉ細胞／ウェルを、Ｊｕｒｋａｔ細胞／ａＶＨ−Ｆｃミックスおよび５０ｎｇ／ｍｌの最終濃度のＳＥＤ超抗原（Ｔｏｘｉｎ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、カタログ番号ＤＴ３０３）に加えた。３７℃および５％ＣＯ２で６時間インキュベートした後、Ｂｉｏ−Ｇｌｏ基質（Ｐｒｏｍｅｇａ、♯Ｇ７９４０）を室温まで加温して加え、５〜１０分間インキュベートした後、製造業者の推奨に従って、Ｔｅｃａｎインフィニットリーダーで全体的な発光を測定した。
【０２５１】
表１７に示されるのは、ＳＥＤ刺激の際の一価および二価の抗Ｌａｇ３  ａＶＨ−ＦｃコンストラクトによるＮＦＡＴルシフェラーゼシグナルＭＨＣＩＩ／Ｌａｇ３が媒介した抑制の回復である（ＥＣ５０値として与えられる）。一価および二価のコンストラクトＰ９Ｇ１およびＰ２１Ａ０３のＥＣ５０値を比較すると、両方の二価のコンストラクトはＬＡＧ３のブロッキングが大幅に改善され、その結果、ＮＦＡＴ＋Ｊｕｒｋａｔ細胞の活性化が示されていることが明らかになる。これはおそらく、二価の融合コンストラクトとしてのＬＡＧ３へのアビディティ主導の強い結合によるものである。注目すべきことに、二価のａＶＨ−Ｆｃコンストラクトは、コントロール抗体ＭＤＸ２５Ｆ７と比較して同様のＥＣ５０値を示す。
【０２５２】
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【０２５３】
修飾されたＮＦＡＴ  Ｌａｇ３レポーターアッセイ
上記のＮＦＡＴ  Ｌａｇ３レポーターアッセイの代替的なバリアントとして、ＳＥＤ刺激およびＲａｊｉ細胞の非存在下で抗Ｌａｇ３  ａＶＨｓ−Ｆｃコンストラクトの影響を評価した。このアッセイでは、Ｌａｇ−３＋Ｊｕｒｋａｔ／ＮＦＡＴ−ｌｕｃ２エフェクターＴ細胞のみを培養し（＝１ｘ１０５細胞／ウェル）、上記のように単独で、または滴定されたコントロール抗体もしくはいくつかのＶＨ−Ｆｃコンストラクトの存在下で、３７℃および５％ＣＯ２で２０時間培養した後、発光をＢｉｏＧｌｏ基質の添加後に測定した。
【０２５４】
このアッセイの目的は、組換えＪｕｒｋａｔ細胞の基底ＮＦＡＴ活性と、第２の細胞株によって提供されるＭＨＣ−ＩＩとの相互作用なしの活性化状態に対するａＶＨ−Ｆｃコンストラクトの阻害効果を評価することであった。
【０２５５】
表１８に、ａＶＨ−Ｆｃコンストラクトおよびコントロール抗体ＭＤＸ２５Ｆ７によるルシフェラーゼ活性のほぼ完全な減少のＩＣ５０値を示す。前でのアッセイと同様に、二価のコンストラクトは大幅に改善された機能を示し、その結果、ＩＣ５０が改善される。また、これはおそらく、二価の融合コンストラクトとしてのＬＡＧ３へのアビディティ主導の強い結合によるものである。二価のａＶＨ−ＦｃコンストラクトのＩＣ５０値をＭＤＸ２５Ｆ７と比較すると、再び同様の値が示される。
【０２５６】
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【０２５７】
実施例１０
二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体様１＋１コンストラクトの機能特性
二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３二重特異性１＋１抗体様コンストラクトの同時係合の後の細胞ＰＤ１およびＬＡＧ３の二量体化。
二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体様１＋１コンストラクトを生成した（図２Ｄ）。Ｌａｇ３結合部分は自律性ＶＨドメインであった。これらのコンストラクトの生成のために、ＰＤ１軽鎖をコードするプラスミド（配列番号１４４のＤＮＡ配列；配列番号１４５のタンパク質配列）、ＰＤ１重鎖をコードするプラスミド（ホール、ＰＧ−ＬＡＬＡ）（配列番号１４２のＤＮＡ配列；配列番号１４３のタンパク質配列）およびａＶＨ−Ｆｃ融合体をコードするプラスミドの１つ（ノブ、ＰＧ−ＬＡＬＡ）（結果として生じる配列番号１２７（２１Ａ３）、配列番号１２９（Ｐ９Ｇ１）、配列番号１３１（Ｐ１０Ｄ１）、配列番号１３９（Ｐ１９Ｇ３）によるタンパク質配列））をＨＥＫ２９３細胞に共トランスフェクションした。それぞれのＰＤ１−ＬＡＧ  １＋１抗体コンストラクトのインキュベーションおよび精製を、上記のように実施した。コンストラクトを使用して、ＰＤ１−ＬＡＧ３二重特異性コンストラクトの存在下でのＰＤ１およびＬＡＧ３の二量体化または少なくとも局所的な共蓄積を分析した。この特異的な相互作用を測定するために、両受容体の細胞質ゾルＣ末端は、レポーター酵素の異種サブユニットに個々に融合する。１つの酵素サブユニットのみがレポーター活性を示さなかった。しかしながら、両受容体に対する抗ＰＤ１／抗Ｌａｇ３二重特異性抗体コンストラクトの同時結合は、両受容体の局所的な細胞蓄積、２種類の異種酵素サブユニットの相補性を引き起こし、最終的に、基質を加水分解し、それによって、化学発光シグナルを生成する特異的で機能的な酵素が生成すると予想される。
【０２５８】
二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体様コンストラクトの架橋効果を分析するために、１０，０００個のＰＤ１＋Ｌａｇ３＋ヒトＵ２ＯＳ細胞／ウェルを、白い平底の９６ウェルプレート（ｃｏｓｔａｒ、カタログ番号♯３９１７）に播種し、１００μｌの完全培地（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ  ＃９３−０５６３Ｒ５Ｂ）で一晩培養した。次の日に、細胞培地を捨て、５５μｌの新しい培地と交換した。抗体希釈液を調製し、５５μｌの滴定量の指示されたコンストラクトを加え、３７℃で２時間３７℃でインキュベートした。次に、１１０μｌ／ｗｅｌｌの基質／緩衝液ミックス（例えばＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ  Ｆｌａｓｈ検出試薬）を加え、再び１時間インキュベートした。同時結合および二量体化の際に誘発される化学発光を測定するために、Ｔｅｃａｎインフィニットリーダーを使用した（図７）。
【０２５９】
Ｂ細胞リンパ芽球様細胞株（ＡＲＨ７７）と共に培養されたヒトＣＤ４  Ｔ細胞による細胞毒性グランザイムＢ放出に対する、ＰＤ−１／ＬＡＧ−３二重特異性１＋１抗体様コンストラクトの効果。
ＣＤ４細胞を腫瘍細胞株ＡＲＨ７７と共培養し、ｉ）抗ＰＤ１抗体（０３７６）単独、ｉｉ）二価の抗ＬＡＧ３  ａＶＨ−ＦｃコンストラクトもしくはＬＡＧ３抗体と組み合わせた抗ＰＤ１抗体（０３７６）、またはｉｉｉ）二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体様コンストラクトを含め、抗体または抗体様コンストラクトでインキュベートした。実験手順は上記（ａＶＨ−Ｆｃ融合コンストラクトの機能的特性についての説明）のように実施した。５日後、細胞を洗浄し、細胞を洗浄し、その表面を、抗ヒトＣＤ４抗体およびＬｉｖｅ／Ｄｅａｄ  ｆｉｘａｂｌｅ  ｄｙｅ  Ａｑｕａ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色した後、Ｆｉｘ／Ｐｅｒｍ緩衝液（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で固定／透過処理した。その後、細胞内染色を、グランザイムＢ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）について実施した。
【０２６０】
計４つのＬＡＧ３特異的ａＶＨ、すなわち、Ｐ２１Ａ０３、Ｐ９Ｇ１、Ｐ１０Ｄ１、１９Ｇ３を、抗ＰＤ１抗体と組み合わせた二価のａＶＨ−Ｆｃコンストラクトとして、または二重特異性抗ＰＤ１／抗ＬＡＧ３抗体様１＋１コンストラクトとして試験した。興味深いことに、抗ＰＤ−１単独に対する有意な相加効果または相乗効果は観察されなかったが、抗ＰＤ−１抗体（０３７６）と組み合わせ二価のａＶＨ−Ｆｃコンストラクトについても、二重特異性抗体様フォーマットについても、ＣＤ４  Ｔ細胞によるグランザイムＢ分泌の増加傾向が、以下の二重特異性抗体様コンストラクト：ＰＤ１／Ｐ２１Ａ０３  ａＶＨ、ＰＤ１／Ｐ９Ｇ１  ａＶＨ、およびＰＤ１／Ｐ１０Ｄ１  ａＶＨの場合に観察された。これらのコンストラクトの場合、グランザイムＢの放出は、ＰＤ−１ブロッキング抗体（０３７６）と組み合わせた競合的ＬＡＧ−３抗体に匹敵した（図８）。
【０２６１】
本発明の更なる態様
本発明が提供する更なる態様では、自律性ＶＨドメインは、Ｋａｂａｔ番号付けによる（ｉ）５２ａ位および７１位または（ｉｉ）３３位および５２位にシステインを含み、前記システインは適切な条件下でジスルフィド結合を形成する。特に、自律性ＶＨドメインは単離された自律性ＶＨドメインである。自律性ＶＨドメインは安定性が向上している。
【０２６２】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、
（ａ）配列番号２０７のアミノ酸配列を含むＦＲ１と、
（ｂ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含むＦＲ２と、
（ｃ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＦＲ３と、
（ｄ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＦＲ４と、
または
（ａ）配列番号２１１のアミノ酸配列を含むＦＲ１と、
（ｂ）配列番号２０８のアミノ酸配列を含むＦＲ２と、
（ｃ）配列番号２０９のアミノ酸配列を含むＦＲ３と、
（ｄ）配列番号２１０のアミノ酸配列を含むＦＲ４と
を含む重鎖可変ドメインフレームワーク
【０２６３】
自律性ＶＨドメインは、配列番号２０７〜２１１によるＦＲ１−４がヒトにおいて免疫原性ではないため、特に有用である。したがって、本発明の自律性ＶＨドメインは、抗原結合分子の同定のためのＶＨライブラリーを生成するための有望な候補である。
【０２６４】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号４０、または配列番号４２、または配列番号４４、配列番号４６、または配列番号１８０の配列を含む。
【０２６５】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、配列番号４０、または配列番号４２、または配列番号４４、配列番号４６、または配列番号１８０のアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を含む。
【０２６６】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、死受容体５（ＤＲ５）、または黒色腫関連コンドロイチン硫酸プロテオグリカン（ＭＣＳＰ）、またはトランスフェリン受容体１（ＴｆＲ１）、またはリンパ球活性化遺伝子３（ＬＡＧ３）に結合する。
【０２６７】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、以下を含むＭＣＳＰに結合する：
（ｉ）配列番号２１２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２１４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｉｉ）配列番号２１５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２１７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｉｉｉ）配列番号２１８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２１９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２２０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３、または
（ｉｖ）配列番号２２１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２２２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２２３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｖ）配列番号２２４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２２５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２２６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。
【０２６８】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、以下を含むＴｆＲ１に結合する。
（ｉ）配列番号２２７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２２８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２２９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｉｉ）配列番号２３０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２３１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２３２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｉｉｉ）配列番号２３３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２３４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２３５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｉｖ）配列番号２３６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２３７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２３８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｖ）配列番号２３９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２４１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｖｉ）配列番号２４２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２４４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または
（ｖｉｉ）配列番号２４５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号２４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号２４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３。
【０２６９】
自律性ＶＨドメインはＭＣＳＰに結合し得る。ＭＣＳＰに結合する自律性ＶＨドメインは、配列番号５７、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６３、配列番号６５からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。自律性ＶＨドメインはＴｆＲ１に結合し得る。ＴｆＲ１に結合する自律性ＶＨドメインは、配列番号１９４のアミノ酸配列、配列番号１９５の配列、配列番号１９６のアミノ酸配列、配列番号１９７のアミノ酸配列、配列番号１９８のアミノ酸配列、配列番号１９９のアミノ酸配列、配列番号２００のアミノ酸配列からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。自律性ＶＨドメインはＬＡＧ３に結合し得る。Ｌａｇ３に結合する自律性ＶＨドメインは、配列番号７７、配列番号７９、配列番号８１、配列番号８３、配列番号８５、配列番号８７、配列番号８９、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７からなる群から選択されるアミノ酸配列を含み得る。
【０２７０】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、（ｉ）配列番号１４６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１４７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１４８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ−Ｈ３；または（ｉｉ）配列番号１４９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１５１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｉｉｉ）配列番号１５２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１５４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｉｖ）配列番号１５５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１５７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｖ）配列番号１５８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１５９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１６０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｖｉ）配列番号１６１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１６２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１６３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｖｉｉ）配列番号１６４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１６５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１６６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｖｉｉｉ）配列番号１６７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１６８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１６９のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｉｘ）配列番号１７０のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７１のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１７２のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｘ）配列番号１７３のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７４のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１７５のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３；または（ｘｉ）配列番号１７６のアミノ酸配列を含むＣＤＲ１、配列番号１７７のアミノ酸配列を含むＣＤＲ２、および配列番号１７８のアミノ酸配列を含むＣＤＲ３を含むＬＡＧ３に結合する。
【０２７１】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、Ｈ３５Ｇ、Ｑ３９Ｒ、Ｌ４５ＥおよびＷ４７Ｌからなる群から選択される置換をさらに含む。
【０２７２】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、Ｌ４５Ｔ、Ｋ９４ＳおよびＬ１０８Ｔからなる群から選択される置換を含む。
【０２７３】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、特にハーセプチンのＶＨ配列に基づくＶＨ３＿２３フレームワークを含む。
【０２７４】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、Ｆｃドメインに融合される。
【０２７５】
いくつかの実施形態では、Ｆｃドメインは、ヒトＦｃドメインである。
【０２７６】
本発明の好ましい実施形態では、自律性ＶＨドメインは、Ｆｃドメインの末端のＮ末端またはＣ末端に融合される。本発明の好ましい実施形態では、Ｆｃドメインは、本明細書に記載の「ノブ・イントゥ・ホール技術（ｋｎｏｂ−ｉｎｔｏ−ｈｏｌｅ−ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）」に関連するノブ変異またはホール変異、特にノブ変異を含む。Ｎ末端およびＣ末端の両方のＦｃ融合について、グリシン−セリン（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）リンカー、リンカー配列「ＤＧＧＳＰＴＰＰＴＰＧＧＧＳＡ」を有するリンカーまたは任意の他のリンカーが、好ましくは、自律性ＶＨドメインとＦｃドメインとの間で発現され得る。自律性ＶＨドメインおよびＦｃドメインの例示的な好ましい融合は、配列番号１２１、配列番号１２３、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２９、配列番号１３１、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１４１からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。自律性ＶＨドメインおよびＦｃドメインの例示的な好ましい融合は、配列番号９９、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０５、配列番号１０７、配列番号１０９、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む。
【０２７７】
本発明の更なる態様は、本明細書に開示されるさまざまな自律性ＶＨドメインを含むＶＨドメインライブラリーに関する。
【０２７８】
本発明の更なる態様は、さまざまなポリヌクレオチドから生成された、本明細書に開示されるさまざまな自律性ＶＨドメインを含むＶＨドメインライブラリーに関する。
【０２７９】
本発明の更なる態様は、本明細書に開示されるさまざまな自律性ＶＨドメインをコードするさまざまなポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドライブラリーに関する。
【０２８０】
本発明の更なる態様は、本明細書に開示される自律性ＶＨドメインをコードするポリヌクレオチドに関する。
【０２８１】
本発明の更なる態様は、ポリヌクレオチドを含む発現ベクターに関し、ポリヌクレオチドは、本明細書に開示される自律性ＶＨドメインをコードする。
【０２８２】
本発明の更なる態様は、本明細書に開示される発現ベクターを含む宿主細胞、特に真核生物または原核生物の宿主細胞に関する。
【０２８３】
本発明の更なる態様は、抗体、特に二重特異性または多重特異性抗体に関する。抗体、特に二重特異性抗体または多重特異性抗体は、本明細書に開示される自律性ＶＨドメインを含む。特に、抗体は単離された抗体である。特定の実施形態では、多重特異性抗体は、３つ以上の結合特異性を有する。特定の実施形態では、二重特異性抗体は、標的の２つ（またはそれ以上）の異なるエピトープに結合し得る。二重特異性および多重特異性抗体は、完全長抗体または抗体断片として調製され得る。多重特異性抗体のさまざまな分子フォーマットが当該技術分野で知られており、本明細書に含まれる（例えば、Ｓｐｉｅｓｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ６７（２０１５）９５−１０６を参照）。
【０２８４】
本発明の更なる態様は、本明細書に開示されるＶＨドメインライブラリーを使用して抗原結合分子を同定するための方法に関する。この方法は、（ｉ）ＶＨドメインライブラリーを標的と接触させるステップ、および（ｉｉ）標的に結合するライブラリーのＶＨドメインを同定するステップを含む。ステップ（ｉｉ）では、標的に結合するライブラリーのＶＨドメインを、その同定のために単離することができる。
【０２８５】
本発明の更なる態様は、本明細書に開示されるポリヌクレオチドライブラリーを使用して抗原結合分子を同定するための方法に関する。この方法は、（ｉ）特に宿主細胞においてポリヌクレオチドライブラリーを発現させるステップ、（ｉｉ）発現したＶＨドメインライブラリーを標的と接触させるステップ、および（ｉｉｉ）標的に結合する発現したＶＨドメインライブラリーのＶＨドメインを同定するステップを含む。ステップ（ｉｉ）では、標的に結合するライブラリーのＶＨドメインを、その同定のために単離することができる。
【０２８６】
本発明の更なる態様は、本明細書に開示される方法での、本明細書に開示されるＶＨドメインライブラリーの使用に関する。
【０２８７】
本発明の更なる態様は、本明細書に開示される方法での、本明細書に開示されるポリヌクレオチドライブラリーの使用に関する。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021511793.tif 000029
2021511793.tif 000030
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