(57)【要約】【課題】本発明は、Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物を提供する。【解決手段】本発明の医薬組成物は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤及び化学療法薬剤を含み、ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体、例えばリツキシマブを更に含む。本願が提供する医薬組成物は、特に、再発／難治性Ｂ細胞リンパ腫の治療に適用する。  【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物であって、
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤及び化学療法薬剤を含む、ことを特徴とするＢ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物。
【請求項２】
ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体を更に含む、ことを特徴とする請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体は、リツキシマブである、ことを特徴とする請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
薬学的に許容される担体または賦形剤を更に含む、ことを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記化学療法薬剤は、シクロホスファミド、ドキソルビシン及びビンクリスチンのうちの１種または１種以上から選ばれる、ことを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤またはＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ上流及び下流の関連タンパク質の阻害剤から選ばれる、ことを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項７】
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂまたはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグから選ばれる、ことを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ＦＡＫ阻害剤、Ｓｙｋ阻害剤及びＳｒｃ阻害剤から選ばれる、ことを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項９】
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂまたはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグから選ばれる、ことを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤、ＡＺＤ４５４７またはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグから選ばれる、ことを特徴とする請求項１または２に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物であって、
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤及び薬学的に許容される担体からなる第１製剤と、ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体からなる第２製剤と、化学療法薬剤及び薬学的に許容される担体からなる第３製剤とを含む、ことを特徴とするＢ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物。
【請求項１２】
前記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂまたはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグから選択される、ことを特徴とする請求項１１に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体及び化学療法薬剤の、Ｂ細胞リンパ腫の治療のための併用薬剤の製造における用途。
【請求項１４】
前記Ｂ細胞リンパ腫は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫である、ことを特徴とする請求項１３に記載の用途。
【請求項１５】
前記Ｂ細胞リンパ腫は、化学療法薬剤に対して薬剤耐性があるＢ細胞リンパ腫である、ことを特徴とする請求項１３に記載の用途。
【請求項１６】
前記Ｂ細胞リンパ腫は、ＣＳＣ比率が上昇したＢ細胞リンパ腫である、ことを特徴とする請求項１３に記載の用途。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願はＢ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物に関し、特に、再発／難治性Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
薬物耐性は、がん治療において悩み続けられている一つの大きい問題であり、このような獲得耐性は、少なくとも一部が腫瘍内部の、各種類の快速に成長する分化がん細胞及び極少数の緩慢に成長するがん幹細胞（Ｃａｎｃｅｒ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ、ＣＳＣ）を含む細胞種類の多様性から由来する。腫瘍伝統療法、例えば放射線療法及び化学療法等は、腫瘍の中の大部の分化細胞を除去できるが、がん幹細胞は依然として生存し、おそらくこれが薬物耐性の発展を促進する重要な原因の一つであろう。ＣＳＣは、最初は白血病で発見され、その比率も極めて低いが、新しい腫瘍を播種でき、該特性はその後、固形腫瘍においてさらに検証されている。ＣＳＣは特定の膜タンパク質マーカーを有し、自己複製、分化及び休止の能力、及び薬物耐性、再発及び転移と高度に関連する特徴を備えている。そこで、当業者は、伝統療法及びＣＳＣ特異的療法の組合せ療法に対する研究と開発に力を入れ続けている。
【０００３】
数年または数十年に渡って継続して行われる、がん遺伝子の活性化または過剰発現、及び／又はがん抑制遺伝子の低発現または欠損発現を含む一連の遺伝学事象の蓄積は、最終的に何れも腫瘍の発生及び発展を招き得る。腫瘍の進展につれて、腫瘍は次第に分化表現型を失う一方で、幹細胞様特徴を獲得するようになり、ＣＳＣ比率が増加し、これにより腫瘍の遠くへの転移、及び治療に対しての薬物耐性が生じる。しかしながら、現在行われている、ＣＳＣの成長を間接的に緩慢化または直接ＣＳＣを消去とのことを通じて薬物耐性を逆転させようにする、いろいろの試みは、何れも成功とはまたまた距離があり、試みとしては、ＣＳＣ依存性のシグナル伝達分子（Ｗｎｔ／β−カテニン、Ｈｅｄｇｅｈｏｇ、Ｎｏｔｃｈ、ＮＦ−κＢ、ＦＡＫ、ＰＴＥＮ、Ｎａｎｏｇ及びＪＡＫ／ＳＴＡＴ等）阻害剤、腫瘍微小環境制御剤、ＣＤ４４を標的とするナノ粒子薬物またはＣＤ１３３を標的とする免疫療法、及び分化療法が含まれている。なお、オールトランスレチノイン酸（ＡＴＲＡ）／三酸化ヒ素（ＡＴＯ）薬物で急性前骨髄球性白血病（ＡＰＬ）を治療する分化療法は、直接ＣＳＣをターゲットとするのではない。ＡＰＬは、ＰＭＬ／ＲＡＲＡ融合遺伝子産物を特徴とし、ＡＴＲＡのみを用いてＰＭＬ／ＲＡＲαの分解、細胞アポトーシス及びターミナル分化を誘導することにより、ＡＰＬ患者の約８５％の完全寛解率が実現できる。しかし、該分化療法方案は、他の造血系悪性腫瘍及び固形腫瘍、特にそれらのＣＳＣに対しては、無効である。現在、ＣＳＣを特異的標的とする分化療法方案として、主に、ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤（例えば、スベロイルアニリドヒドロキサム酸）及びヒストンメチル基転移酵素阻害剤（例えば、ＥＺＨ２阻害剤）が採用されているが、これらエピジェネティクス薬物は、依然として、研究の初期段階に留まっており、且つそれらの副作用は、後続の更なる評価が必要である。
【０００４】
ＳＯＸ２は、幹性細胞関連の転写因子であって、胚性幹細胞及び誘導型多能性幹細胞の幹性（ｓｔｅｍｎｅｓｓ）の維持に極めて重要である。しかしながら、ＳＯＸ２の腫瘍細胞における発現は、腫瘍増殖、浸潤転移を促進し、治療の薬物耐性を誘導するので、腫瘍の治療に非常に悪影響を与える。ＳＯＸ２の発現の制御に対する研究は、主に、非コードＲＮＡのＳＯＸ２に対する制御に集中されており、ＳＯＸ２の転写制御及び翻訳後修飾に対しての報告はかなり少ない。また、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路は、腫瘍発生、腫瘍進展及び薬物耐性方面において重要な制御作用を発揮するだけでなく、ＣＳＣの制御に対しても非常に重要な役割を果たしている。報告によれば、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の活性化は、ＳＯＸ２のメチル化（Ｋ１１９位）及びリン酸化（Ｔ１１８位）のスイッチングを制御することにより、ＳＯＸ２のユビキチン化を抑制し、これによりＳＯＸ２のタンパク質の安定性を増加させる。
【０００５】
非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）による腫瘍患者の死亡率は、腫瘍関連死亡率の前から十位内入っており、その中、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）は、ＮＨＬの最も一般的なサブタイプであり、全部成人リンパ腫の３０％を占める。遺伝子発現プロファイル解析結果により、現在、ＤＬＢＣＬは、更に三つの種類の異なるサブーサブタイプ、即ち胚中心Ｂ細胞様（ＧＣＢ）、活性化Ｂ細胞様（ＡＢＣ）及び比率が更に低い（１０−２０％）縦隔原発Ｂ細胞リンパ腫（ＰＭＢＬ）に細分される。半分以上のＤＬＢＬＣ患者は、Ｒ−ＣＨＯＰ（リツキシマブ／Ｒ、シクロホスファミド／Ｃ、ドキソルビシン／Ｈ、ビンクリスチン／Ｏ及びプレドニゾン／Ｐ）方案により治癒されるが、三分の一の患者は、最終的に再発する。これら患者にとって、他の選択できる治療方案は、高用量の化学療法及び自己幹細胞移植が挙げられるが、その効果は極めて有限であり、成功率が非常に低く、最終的には死亡に至る。そこで、再発／難治性ＤＬＢＣＬの新規治療方法の開発が切実に必要である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００６】
現有技術に存在する上記問題に鑑みて、本願の目的は、Ｂ細胞リンパ腫に対する治療方法及びその薬物、特に、再発／難治性Ｂ細胞リンパ腫に対する治療方法及びその薬物を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
上記目的を実現するために、本願は、大量の実験と研究により、ＣＳＣに対する独特の治療対策を見つけており、プロー分化療法（ｐｒｏ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ、ＰＤＴ）と命名する。該方法の治療メカニズムは、図８０に示す。要すると、ＲＣＨＯ薬物耐性のＤＬＢＣＬ細胞において、ＢＣＲ−及びＴＣＦ−３／ＳＨＰ−１によって媒介されるＳｙｋ、インテグリン、ＣＣＲ７及びＦＧＦＲ１／２の各種のシグナル伝達分子は、何れもＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化でき、これによりＳＯＸ２のリン酸化が増強し且つＳＯＸ２のメチル化が減少し、ＳＯＸ２が安定化されてユビキチン化により分解しなくなり、最終的に、アップレギュレートされたＳＯＸ２がＣＤＫ６またはＦＧＦＲ１／２（薬物耐性のＤＬＢＣＬ細胞のサブタイプによって決まる）を介してがん幹細胞（ＣＳＣ）の比率を上向させ、ＣＳＣの生存期間を延長させるようになり、これによりＤＬＢＣＬ細胞のＲＣＨＯに対する薬物耐性が誘導される。Ｒ−ＣＨＯＰと併用投与する場合、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＯＸ２のユビキチン化分解を加速させることで、ＣＳＣの分化を促進し、元は薬物耐性のＤＬＢＣＬ細胞がＲ−ＣＨＯＰ治療に対して異常に敏感になるようになって、結局薬物耐性を完全に逆転させる。
【０００８】
上記の治療原理に基づき、本願は、まず、ＣＳＣの分化を促進する薬物及び化学療法薬剤を含む、Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物を提供する。
【０００９】
更に、上記Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤及び化学療法薬剤を含む。
【００１０】
更に、上記化学療法薬剤は、任意一種または一種以上の、腫瘍の治療に有効である化学療法薬剤でもよい。上記化学療法薬剤は、シクロホスファミド（Ｃ）、ドキソルビシン（Ｈ）及びビンクリスチン（Ｏ）のうちの一種または一種以上から選択されるのが好ましい。本願の好ましい実施例において、上記化学療法薬剤は、前記の３種類の薬剤及びホルモン剤であるプレドニゾン（Ｐ）の組合わせである。
【００１１】
好ましくは、上記Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物は、ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体をさらに含み、モノクローナル抗体はリツキシマブ（Ｒｉｔｕｘｉｍａｂ、Ｒ）を含むが、これに限定されない。
【００１２】
更に、上記Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物は、薬学的に許容される担体または賦形剤を更に含む。
【００１３】
更に、上記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤及びＡＫＴ阻害剤から選ばれてもよい。更に、上記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ上流及び下流の関連タンパク質の阻害剤でもよい。
【００１４】
更に、上記ＰＩ３Ｋ阻害剤は、広域スペクトル型ＰＩ３Ｋ阻害剤またはサブタイプ特異的ＰＩ３Ｋ阻害剤である。上記ＰＩ３Ｋ阻害剤は、チエノピリミジン系及びその誘導体、チエノピラン系及びその誘導体、ピリミジン系及びその類似物、キナゾロン系及びその類似物、ジケテン系及びその類似物、イミダゾキノリン系及びその類似物、イミダゾピリジン系及びその誘導体、チアゾリジンジオン系及びその誘導体、Ｐｙｒｉｄｏｆｕｒｏｐｙｒｉｍｉｄｉｎｅｓ及びその類似物を含むが、これらに限定されない。
【００１５】
好ましくは、上記ＰＩ３Ｋ阻害剤は、ＩＰＩ−１４５（ＩＮＫ１１９７，ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ）又はその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグの中に１種又は１種以上から選ばれる。ＩＰＩ−１４５（ＩＮＫ１１９７、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ）は、選択性ＰＩ３Ｋδ／γ阻害剤であり、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂは、下記の式Ｉで示す化学構造を有する。
【００１６】
2021532168.tif 000003
【００１７】
更に、上記ＡＫＴ阻害剤は、ＰＨドメイン阻害剤、アロステリック阻害剤、ＡＴＰ競合的阻害剤、例えばＭＫ−２２０６、ＧＳＫ６９０６９３、Ｉｐａｔａｓｅｒｔｉｂ（ＧＤＣ−００６８）等を含むが、これらに限定されない。
【００１８】
本願の一実施形態において、上記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ上流タンパク質阻害剤であり、ＦＡＫ阻害剤、Ｓｙｋ阻害剤及びＳｒｃ阻害剤のうちの１種または１種以上から選ばれるのが好ましい。上記ＦＡＫ阻害剤は、ＰＦ−５７３２２８（式ＩＩ）またはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグのうちの１種または１種以上から選ばれるのが好ましい。上記Ｓｙｋ阻害剤は、Ｒ７８８（Ｆｏｓｔａｍａｔｉｎｉｂ、式ＩＩＩ）またはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグのうちの１種または１種以上から選ばれるのが好ましい。上記Ｓｒｃ阻害剤は、ｓａｒａｃａｔｉｎｉｂ（ＡＺＤ０５３０、式ＩＶ）またはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグのうちの１種または１種以上から選ばれるのが好ましい。上記式ＩＩ−ＩＶは、下記構造式ＩＩ−ＩＶで示す。
【００１９】
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【００２０】
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【００２１】
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【００２２】
更に、上記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、薬剤耐性細胞の幹細胞性を制御するＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＳＯＸ２軸阻害剤であり、上記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＳＯＸ２軸阻害剤は、ＳＯＸ２下流タンパク質阻害剤であるのが好ましく、上記下流タンパク質は、ＣＤＫ６及び／又はＦＧＦＲ１／２であるのが好ましい。
【００２３】
本願の好ましい一実施形態において、上記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＳＯＸ２軸阻害剤は、ＣＤＫ６阻害剤であり、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ、Ｒｉｂｏｃｉｃｌｉｂ、Ｐａｌｂｏｃｉｃｌｉｂから選ばれるが、これらに限定されなく、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ（ＬＹ２８３５２１９）またはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグのうちの１種または１種以上から選ばれるのが最も好ましい。ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂは、下記式Ｖで示す化学構造を有する。
【００２４】
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【００２５】
本願の他の一好ましい実施形態において、上記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＳＯＸ２軸阻害剤は、ＦＧＦＲ１／２阻害剤であり、ＢＧＪ３９８、ＡＺＤ４５４７、ＰＲＮ１３７１、ＬＹ２８７４４５５、ＦＩＩＮ−２から選ばれるが、これらに限定され、ＡＺＤ４５４７またはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグのうちの１種または１種以上から選ばれるのが最も好ましい。ＡＺＤ４５４７は、下記式ＶＩで示す化学構造を有する。
【００２６】
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【００２７】
本願では、薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞でのＣＳＣの比率が顕著に上昇し、その幹細胞性が活性化されたＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＳＯＸ２軸により制御されることを発見した。また、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＯＸ２レベルを低下させることにより、ＣＳＣを分化した腫瘍細胞に転換させ、これによりＲ−ＣＨＯＰ方案と組合わせる際、接種された薬剤耐性細胞の成長を完全に阻止することができる。
【００２８】
上記研究成果に基づき、本願は、更に、Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、異なる規格単位の製剤である、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤、ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体と化学療法薬剤及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。これら製剤を用いる場合、同時に投与、またはそれぞれ投与、または順次投与する。
【００２９】
好ましくは、上記ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体は、リツキシマブである。
【００３０】
さらに、上記化学療法薬剤は、任意の１種または１種以上の、腫瘍の治療に有効である化学療法薬剤でよい。上記化学療法薬剤は、シクロホスファミド、ドキソルビシン及びビンクリスチンのうちの１種または１種以上から選ばれるのが好ましい。本願の好ましい一実施形態において、上記化学療法薬剤は、前述の三つの薬剤及びホルモン剤であるプレドニゾンの組合わせである。
【００３１】
更に、本願は、Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤及び薬学的に許容される担体からなる第１製剤と、ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体及び薬学的に許容される担体からなる第２製剤と、化学療法薬剤及び薬学的に許容される担体からなる第３製剤とを含む。
【００３２】
好ましくは、上記ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体は、リツキシマブである。
【００３３】
好ましくは、上記製剤の剤形は、注射投与製剤、胃腸管経由投与製剤、気道投与製剤、経皮投与製剤、粘膜投与製剤または管腔投与製剤である。
【００３４】
その中、本願において、上記注射投与製剤は、静脈内注射、筋内注射、皮下注射、皮内注射及び腔内注射等を含むが、これらに限定されない。本願において、上記胃腸管経由投与製剤は、経口投与後胃腸管に入って、局部で作用または吸収されて全身での作用を発揮する薬剤の剤形を指し、剤形として、散剤、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、溶液剤、乳剤、懸濁剤等を含むが、これらに限らない。本願において、上記気道投与製剤は、噴霧剤、エアロゾル剤、パウダースプレー剤等を含むが、これらに限らない。本願において、上記経皮投与製剤は、外用溶液剤、ローション剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、ペースト剤、貼付剤等を含むが、これらに限らない。本願において、上記粘膜投与剤形は、点眼剤、点鼻剤、眼科用軟膏剤、含嗽剤、舌下錠剤、貼付シート及びフィルム貼付剤等を含むが、これらに限らない。本願において、上記管腔投与製剤は、坐剤、エアロゾル剤、沸騰錠剤、ドロップ剤及び滴丸剤等を含むが、これらに限らない。
【００３５】
好ましくは、上記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂまたはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグのうちの１種または１種以上から選択される。
【００３６】
本願は、更に、Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、ＣＤＫ６阻害剤及び化学療法薬剤を含む。さらに、該医薬組成物は、ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体、例えばリツキシマブを含んでよい。
【００３７】
更に、本願は、Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、異なる規格単位の製剤である、ＣＤＫ６阻害剤、リツキシマブと化学療法薬剤及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。これら製剤を用いる場合、同時に投与、またはそれぞれ投与、または順次投与する。
【００３８】
好ましくは、上記ＣＤＫ６阻害剤は、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂまたはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグのうちの１種または１種以上から選択される。
【００３９】
本願は、さらに、Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、ＦＧＦＲ１／２阻害剤及び化学療法薬剤を含む。さらに、該医薬組成物は、ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体、例えばリツキシマブを含んでよい。
【００４０】
更に、本願は、Ｂ細胞リンパ腫の治療のための医薬組成物を提供する。該医薬組成物は、異なる規格単位の製剤である、ＦＧＦＲ１／２阻害剤、リツキシマブと化学療法薬剤及び薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。これら製剤を用いる場合、同時に投与、またはそれぞれ投与、または順次投与する。
【００４１】
好ましくは、上記ＦＧＦＲ１／２阻害剤は、ＡＺＤ４５４７またはその誘導体、その薬学的に許容される塩、その溶媒和物及びそのプロドラッグのうちの１種または１種以上から選択される。
【００４２】
更に、本願は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤の、化学療法薬剤に対して薬剤耐性があるＢ細胞リンパ腫の治療のための用途、及び化学療法薬剤に対して薬剤耐性があるＢ細胞リンパ腫の治療用薬剤のための用途を提供する。その中、上記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ上流タンパク質の阻害剤であるＦＡＫ阻害剤、Ｓｙｋ阻害剤とＳｒｃ阻害剤、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ下流タンパク質の阻害剤であるＣＤＫ６阻害剤とＦＧＦＲ１／２阻害剤を含む。
【００４３】
更に、本願は、化学療法薬剤及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路に阻害剤の、Ｂ細胞リンパ腫の治療のための用途、及びＢ細胞リンパ腫の治療用併用薬剤の製造のための用途を提供する。その中、上記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ上流タンパク質の阻害剤であるＦＡＫ阻害剤、Ｓｙｋ阻害剤とＳｒｃ阻害剤、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ下流タンパク質の阻害剤であるＣＤＫ６阻害剤とＦＧＦＲ１／２阻害剤を含む。
【００４４】
更に、本願は、化学療法薬剤、ＣＤ２０を標的とするモノクローナル抗体及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤の、Ｂ細胞リンパ腫の治療のための用途、及びＢ細胞リンパ腫の治療用併用薬剤の製造のための用途を提供する。その中、上記ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＡＫＴ阻害剤、及びＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ上流タンパク質の阻害剤であるＦＡＫ阻害剤、Ｓｙｋ阻害剤とＳｒｃ阻害剤、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ下流タンパク質の阻害剤であるＣＤＫ６阻害剤とＦＧＦＲ１／２阻害剤を含む。
【００４５】
その中、上記Ｂ細胞リンパ腫はびまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫であり、または上記Ｂ細胞リンパ腫は化学療法薬剤に対して薬剤耐性があるＢ細胞リンパ腫であり、または上記Ｂ細胞リンパ腫はＣＳＣの比率が上昇されているＢ細胞リンパ腫であり、または上記Ｂ細胞リンパ腫はＳＯＸ２の安定性が上昇されているＢ細胞リンパ腫である。
【００４６】
転移及び薬剤耐性過程におけるＣＳＣの重要な作用に鑑みて、本願は、新規の、ＣＳＣ対処のＰＤＴ対策を提出する。即ち腫瘍幹細胞の幹性を維持するキーシグナル伝達経路を確定し、次いで該経路を妨害することによりＣＳＣ分化を誘導する。分化した細胞は最終的に慣用的療法（例えば化学療法）に対して敏感になるようになる。この状況下で、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤とＲ−ＣＨＯＰ方案の併用で、移植モデルマウスにおいて良好な治療効果が得られたため、該方案を臨床試験において薬剤耐性ＤＬＢＣＬ患者の評価に用いるのは考慮されるべきであろう。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
本願の目的、特徴及び利点がより一層明らかになるように、以下、図面と関連して本願の構想、具体的構造及び発揮される技術的利点について、更に説明する。
【図１】薬剤の濃度を上昇させることによって薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞を作製するフローチャート概略図である。その中、Ｌ、Ｍ及びＨは、それぞれ低用量、中用量及び高用量の薬剤を示す。
【００４８】
【図２】補体によって媒介される細胞毒性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ−Ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙ、ＣＤＣ）の測定により薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞のＲ−によって媒介されるＣＤＣに対する薬剤耐性を確認した結果図である。その中、細胞は３．２μｇ／ｍＬのリツキシマブと２０％のＮＨＳで２時間処理し、データは平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【００４９】
【図３】ＣＣＫ−８方法により薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞の化学療法薬剤に対する薬剤耐性を測定及び確認した結果図である。その中、細胞を用量が漸増する４−ヒドロキシシクロホスファミド（４−ＨＣ）、ドキソルビシンまたはビンクリスチンでそれぞれ４８時間処理し、データは平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３である。
【００５０】
【図４】オリジナル（Ｏｒｉｇｎｉａｌ、ＯＲＩ）及び薬剤耐性（Ｒ、ＣＨＯ、ＲＣＨＯは、それぞれＲ、ＣＨＯ、またはＲＣＨＯに対して薬剤耐性があることを意味する）ＤＬＢＣＬ細胞における幹細胞様球体の数量の統計比較及びその写真である。スケールバー：１００μｍ、データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【００５１】
【図５】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞におけるＡＬＤＨ１陽性細胞のパーセンテージ比較図である。オリジナル細胞と比べて、薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞におけるＡＬＤＨ１陽性細胞のパーセンテージは、Ｒ、ＣＨＯ及びＲＣＨＯ薬剤耐性細胞の順で次第に増強され、薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞の幹細胞性が増強されるのが表明された。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である；
【００５２】
【図６】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞に対して行ったＡｌｄｅｆｌｕｏｒ測定結果における代表的画像である。
【００５３】
【図７】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞において、幹細胞マーカーであるＣＤ３４、ＣＤ１３３の発現に対するウエスタンブロット解析結果である。
【００５４】
【図８】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞において、幹細胞性関連転写因子であるＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃの発現に対するウエスタンブロット解析結果である。その中、ＳＯＸ２の発現だけが、薬剤耐性の増強の傾向に従って次第に上昇した。
【００５５】
【図９】ＧＣＢサブタイプ（６セット）において、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＳＯＸ２に対する免疫組織化学染色の比較画像である。スケールバー：２０μｍ、Ｐ：患者（Ｐａｔｉｅｎｔ）。
【００５６】
【図１０】ＡＢＣサブタイプ（６セット）において、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＳＯＸ２に対する免疫組織化学染色の比較画像である。スケールバー：２０μｍ，Ｐ：患者（Ｐａｔｉｅｎｔ）。
【００５７】
【図１１】ＧＣＢ及びＡＢＣサブタイプにおいて、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＳＯＸ２に対する免疫組織化学染色の定量スコアの比較結果である。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３，＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【００５８】
【図１２】ＣＤＣ測定結果である。その中、Ｒ＋ＮＨＳで処理したＳＯＸ２を過剰発現するオリジナルＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞（空のベクターを処理したオリジナル細胞を対照とする）、及びＲ＋ＮＨＳで処理したＳＯＸ２サイレントのＲＣＨＯ薬剤耐性のＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞（ＳＣＲサイレントの薬剤耐性細胞を対照とする）においての結果は、異常のＳＯＸ２発現は、オリジナル細胞のリツキシマブによって媒介されるＣＤＣに対する感受性を低下させるが、ＳＯＸ２サイレントは、ＲＨＯ薬剤耐性細胞において相反の作用を呈するのを表明した。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【００５９】
【図１３】ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ細胞毒性測定結果である。その中、ＣＨＯで処理したＳＯＸ２過剰発現のオリジナルＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞（空のベクターを処理したオリジナル細胞を対照とする）、及びＣＨＯで処理したＳＯＸ２サイレントのＲＣＨＯ薬剤耐性のＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞（非関連ｓｈＲＮＡ，即ちＳＣＲサイレントの薬剤耐性細胞を対照とする）においての結果は、異常のＳＯＸ２発現は、ＣＨＯのオリジナル細胞における細胞毒性作用を低下させるが、ＳＯＸ２サイレントは、ＲＨＯ薬剤耐性細胞でのＣＨＯに対する感受性を回復させることを表明した。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【００６０】
【図１４】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞においての、ＳＯＸ２のｍＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ測定結果である。結果により、殆ど全部の薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞でのＳＯＸ２のｍＲＮＡレベルが何れも顕著に低下されることが表明された。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【００６１】
【図１５】ＲＮＡ−ｓｅｑの差異遺伝子データに基づき、Ｃｙｔｏｓｃａｐｅソフトウェアを利用して生成したシグナル伝達ネットワーク及びそれのＫＥＧＧデータベースにおいての相互作用スコアの結果図である。結果により、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｐａｔｈｗａｙ）及びステロイド生合成（Ｓｔｅｒｏｉｄ  ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）が最高の相互作用スコアを示すことが表明された。
【００６２】
【図１６】ＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞において、ＲＮＡ−ｓｅｑの差異遺伝子データに基づき、遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧｅｎｅＳｅｔＥｎｒｉｃｈｍｅｎｔＡｎａｌｙｓｉｓ）を行って得られたＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路のＧＳＥＡエンリッチ特徴図である。ＦＤＲ＜０．２５である場合、差異が有意であるとして認められる。
【００６３】
【図１７】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞においての、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の各タンパク質の発現（ｐ１１０α／β／γ／δ、ｐ８５、Ａｋｔ１）及びＡＫＴ（Ｓ４７３）、ＳＯＸ２（Ｔ１１８）リン酸化とＳＯＸ２（Ｋ１１９）メチル化に対するウエスタンブロット解析結果である。該結果は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達が活性化され、これによりＳＯＸ２のリン酸化が促進され且つＳＯＸ２のメチル化が減少されることを表明した。
【００６４】
【図１８】ＧＣＢサブタイプ（６セット）において、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）に対する免疫組織化学染色の比較画像である。スケールバー：２０μｍ、Ｐ：患者。
【００６５】
【図１９】ＡＢＣサブタイプ（６セット）において、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）に対する免疫組織化学染色の比較画像である。スケールバー：２０μｍ、Ｐ：患者。
【００６６】
【図２０】ＧＣＢ及びＡＢＣサブタイプにおいて、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のｐ−ＡＫＴ（Ｓ４７３）に対する免疫組織化学染色の定量スコア比較結果である。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１である。
【００６７】
【図２１】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞を１０μＭのＭＧ−１３２（ユビキチンプロテアソーム阻害剤）で８時間処理した後の、ＳＯＸ２発現に対するウエスタンブロット解析結果である。結果により、ＳＯＸ２のユビキチン化が薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞で減少されることが表明された。
【００６８】
【図２２】ＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞それぞれでのＰＫ３Ｋ／ＡＫＴ経路におけるアップレギュレートされた遺伝子数及び互いに重合する遺伝子数について説明するベン図（Ｖｅｎｎ  ｄｉａｇｒａｍ）である。
【００６９】
【図２３】全部で１２４個のアップレギュレートされた遺伝子からエンリッチされる前から１０位のシグナル伝達経路リストである。
【００７０】
【図２４】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞においての、ＦＡＫ発現及びそのリン酸化に対するウエスタンブロット解析結果である。結果は、ＦＡＫが薬剤耐性ＬＹ８では活性化されるが、薬剤耐性ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞では活性化されないことを表明した。
【００７１】
【図２５】オリジナル及び薬剤耐性ＬＹ８細胞においての、インテグリン（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ）各サブユニットのｍＲＮＡレベルのｑＲＴ−ＰＣＲ検測結果である。結果により、インテグリンサブユニットＩＴＧＡ１及びＩＴＧＢ５のｍＲＮＡレベルが薬剤耐性ＬＹ８細胞において顕著にアップレギュレートされることが分かった。
【００７２】
【図２６】オリジナル及び薬剤耐性ＬＹ８細胞においての、インテグリンα１及びβ５サブユニット発現に対するウエスタンブロット解析結果である。結果により、インテグリンα１及びβ５サブユニットが薬剤耐性ＬＹ８細胞においてアップレギュレートされることが分かった。
【００７３】
【図２７】ＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞において、ＩＴＧＡ１またはＩＴＧＢ５をノックダウンした後、ＦＡＫ−ＡＫＴシグナル伝達軸に対して行ったウエスタンブロット解析結果である。結果により、ＩＴＧＡ１またはＩＴＧＢ５のノックダウンにより、ＦＡＫ−ＡＫＴシグナル伝達軸が抑制され、これによりＳＯＸ２の分解が誘導されることが分かった。
【００７４】
【図２８】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞においての、ＢＣＲシグナル伝達経路に対するウエスタンブロット解析結果である。結果により、薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞において、ＳｙｋはＢＣＲ／Ｌｙｎ及びＴＣＦ−３／ＴＨＰ−１シグナル伝達経路を介して活性化されることが分かった。
【００７５】
【図２９】ＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞において、ＣＤ７９Ａをノックダウンした後、ＢＣＲ−Ｌｙｎ−Ｓｙｋ−ＡＫＴシグナル伝達軸に対して行ったウエスタンブロット解析結果である。結果により、ＢＣＲの組成サブユニットＣＤ７９Ａのサイレントにより、ＢＣＲ−Ｌｙｎ−Ｓｙｋ−ＡＫＴシグナル伝達軸が抑制され、これによりＳＯＸ２の分解が誘導されることが分かった。
【００７６】
【図３０】ＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞において、ＲＮＡ−ｓｅｑの差異遺伝子データに基づき、遺伝子セットエンリッチメント解析を行って得られたケモカインシグナル伝達経路のＧＳＥＡエンリッチ特徴図である。ＦＤＲ＜０．２５である場合、差異が有意であるとして認められる。
【００７７】
【図３１】ケモカインシグナル伝達経路において、アップレギュレートされた遺伝子の中、前から１０位のリストである。
【００７８】
【図３２】ｑＲＴ−ＰＣＲによって得られた、オリジナル及び薬剤耐性ＬＹ８細胞におけるＣＣＲ７のｍＲＮＡレベルの検測結果である。結果により、ＣＣＲ７のｍＲＮＡレベルが薬剤耐性ＬＹ８細胞において顕著に上昇したことが分かった。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【００７９】
【図３３】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞においての、ＣＣＲ７、Ｓｒｃ発現及びＳｒｃリン酸化レベルに対するウエスタンブロット解析結果である。結果により、ＣＨＯ及びＲＣＨＯ薬剤耐性細胞において、ＣＣＲ７の発現がアップレギュレートされ、これにより下流のＳｒｃ（Ｙ４１８）のリン酸化が増強されることが分かった。
【００８０】
【図３４】ＬＹ８−ＲＣＨＯ及びＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞において、ＣＣＲ７をノックダウンした後、ＣＣＲ７−Ｓｒｃ−ＡＫＴシグナル伝達軸に対して行ったウエスタンブロット解析結果である。結果により、ＣＣＲ７のノックダウンにより、ＣＣＲ７−Ｓｒｃ−ＡＫＴシグナル伝達軸が抑制され、これによりＳＯＸ２の分解が誘導されることが分かった。
【００８１】
【図３５】２種類のＲＣＨＯ薬剤耐性細胞をＰＩ３Ｋ阻害剤であるｄｕｖｅｌｉｓｉｂを単独で、及びｄｕｖｅｌｉｓｉｂとＣＨＯとを共同で処理した後、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ細胞毒性測定法により細胞死率を測定して比較した結果図である。結果により、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂとＣＨＯとを併用する場合、ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞のＣＨＯに対する薬剤耐性を顕著に逆転させるが、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂを単独で使用する場合、直接の細胞死誘導に対する影響は無視できることが分かった。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【００８２】
【図３６】ＬＹ８−ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞をＦＡＫ阻害剤であるＰＦ−５７３２２８を単独で、及びＰＦ−５７３２２８とＣＨＯとを共同で処理した後、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ細胞毒性測定法により細胞死率を測定して比較した結果図である。結果により、ＰＦ−５７３２２８とＣＨＯとを併用する場合、ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞のＣＨＯに対する薬剤耐性を顕著に逆転させるが、ＰＦ−５７３２２８を単独で使用する場合、直接の細胞死誘導に対する影響は無視できることが分かった。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【００８３】
【図３７】２種類のＲＣＨＯ薬剤耐性細胞をＳｙｋ阻害剤であるＲ７８８を単独で、及びＲ７８８とＣＨＯと共同で処理した後、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ細胞毒性測定法により細胞死率を測定して比較した結果図である。結果により、Ｒ７８８とＣＨＯとを併用する場合、ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞のＣＨＯに対する薬剤耐性を顕著に逆転させるが、Ｒ７８８を単独で使用する場合、直接の細胞死誘導に対する影響は無視できることが分かった。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【００８４】
【図３８】２種類のＲＣＨＯ薬剤耐性細胞をＳｒｃ阻害剤であるＳａｒａｃａｔｉｎｉｂを単独で、及びＳａｒａｃａｔｉｎｉｂとＣＨＯとを共同で処理した後、ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ細胞毒性測定法により細胞死率を測定して比較した結果図である。結果により、ＳａｒａｃａｔｉｎｉｂとＣＨＯとを併用する場合、ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞のＣＨＯに対する薬剤耐性を顕著に逆転させるが、Ｓａｒａｃａｔｉｎｉｂを単独で使用する場合、直接の細胞死誘導に対する影響は無視できることが分かった。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【００８５】
【図３９】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞におけるＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＤ２０の膜発現の評価に用いるＦＡＣＳ解析の体表的画像である。
【００８６】
【図４０】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞におけるＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＤ２０の膜発現の評価に用いるＦＡＣＳ解析の定量ヒートマップであって、各セルは３回の繰返しの平均値を代表する。該図面により、Ｒ及びＲＣＨＯに対して耐性のＤＬＢＣＬ細胞における膜のＣＤ４６、ＣＤ５５及びＣＤ５９の発現レベルは上昇されるが、膜ＣＤ２０の発現レベルは顕著に低下されることが分った。
【００８７】
【図４１】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞におけるＣＤ２０の発現レベルに対するウエスタンブロット解析結果である。
【００８８】
【図４２】オリジナル及び薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞におけるＣＤ２０の相対ｍＲＮＡレベルに対する検測結果である。結果により、特に、Ｒ及びＲＣＨＯ薬剤耐性細胞において顕著に低下されることが分った。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【００８９】
【図４３】ＳＯＸ２を異常に発現させたオリジナルＬＹ８細胞及びＳＯＸ２をノックダウンさせたＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８細胞におけるＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＤ２０の膜発現の評価に用いるＦＡＣＳ解析の代表的画像及びその対応の定量ヒートマップであって、各セルは３回の繰返しの平均値を代表する。結果により、ＳＯＸ２の異常発現は、膜ＣＤ２０のレベルを低下させるが、ＳＯＸ２が不足する場合、膜ＣＤ２０のレベルを増加させるのが分かった。
【００９０】
【図４４】ＳＯＸ２を異常発現させたオリジナルＮＵ−ＤＵＬ−１細胞及びＳＯＸ２をノックダウンさせたＲＣＨＯ薬剤耐性ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞におけるＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＤ２０の膜発現の評価に用いるＦＡＣＳ解析の代表的画像及びその対応の定量ヒートマップであって、各セルは３回の繰返しの平均値を代表する。結果により、ＳＯＸ２の異常発現は、膜ＣＤ２０のレベルを低下させるが、ＳＯＸ２が不足する場合、膜ＣＤ２０のレベルを増加させるのが分かった。
【００９１】
【図４５】ＲＣＨＯ薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞において、ＰＩ３Ｋ阻害剤であるｄｕｖｅｌｉｓｉｂ及びＡＫＴ阻害剤であるＭＫ−２２０６の処理の、ＣＤ４６、ＣＤ５５、ＣＤ５９及びＣＤ２０の膜発現に対する影響の評価に用いるＦＡＣＳ解析の代表的画像及びその対応の定量ヒートマップであって、各セルは３回の繰返しの平均値を代表する。該図面により、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂまたはＭＫ−２２０６を処理した後、ＣＤ２０の発現は顕著に低下するが、その他の三つのｍＣＲＰは変化しないのが分かった。
【００９２】
【図４６】ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴがｄｕｖｅｌｉｓｉｂまたはＭＫ−２２０６により抑制された後、ＲＣＨＯ薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞におけるＣＤ２０の相対的ｍＲＮＡレベルの検測結果である。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【００９３】
【図４７】ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴがｄｕｖｅｌｉｓｉｂまたはＭＫ−２２０６により抑制された後、ＲＣＨＯ薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞におけるＡＫＴ、ＣＤ２０、ＳＯＸ２の発現レベル及びＡＫＴリン酸化レベルに対するウエスタンブロット解析結果である。
【００９４】
【図４８】ＣＤＣ測定により、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂまたはＭＫ−２２０６によるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの抑制のＲＣＨＯ薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞のＲ−によって媒介されるＣＤＣに対する薬剤耐性に係る影響を確認した結果である。その中、細胞は濃度が１μＭのｄｕｖｅｌｉｓｉｂまたはＭＫ−２２０６で２４時間処理し、データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５である。
【００９５】
【図４９】ＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞それぞれでのＰＫ３Ｋ／ＡＫＴ経路におけるアップレギュレートされた遺伝子数及びそれとＳＯＸ２標的部位との間での重合する遺伝子数について説明するベン図（Ｖｅｎｎｄｉａｇｒａｍ）である。
【００９６】
【図５０】オリジナル及び薬剤耐性ＬＹ８細胞におけるＣＤＫ６の発現レベルに対するウエスタンブロット解析結果である。結果により、ＣＤＫ６が薬剤耐性ＬＹ８細胞において過剰発現されることを分かった。
【００９７】
【図５１】ＧＣＢサブタイプ（６セット）において，同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＣＤＫ６に対する免疫組織化学染色の比較画像である。比較画像の結果により、再発組織におけるＣＤＫ６の発現レベルが初回受診時の組織より高いことが分った。スケールバー：２０μｍ、Ｐ：患者。
【００９８】
【図５２】ＡＢＣサブタイプ（６セット）において、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＣＤＫ６に対する免疫組織化学染色の比較画像である。スケールバー：２０μｍ、Ｐ：患者。
【００９９】
【図５３】ＧＣＢサブタイプ及びＡＢＣサブタイプにおいて、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＣＤＫ６に対する免疫組織化学染色の定量スコアの比較結果である。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、ＮＳ：有意ではない。
【０１００】
【図５４】オリジナル及び薬剤耐性ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞において、ＦＧＦＲ１／２の発現レベルに対するウエスタンブロット解析結果である。結果により、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２が薬剤耐性ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞において過剰発現されることが分かった。
【０１０１】
【図５５】ＡＢＣサブタイプ（６セット）において、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＦＧＦＲ１に対する免疫組織化学染色の比較画像である。画像の結果により、再発組織におけるＦＧＦＲ１の発現レベルが初回受診時の組織より高いことが分った。スケールバー：２０μｍ、Ｐ：患者。
【０１０２】
【図５６】ＧＣＢサブタイプ（６セット）において、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＦＧＦＲ１に対する免疫組織化学染色の比較画像である。スケールバー：２０μｍ、Ｐ：患者。
【０１０３】
【図５７】ＧＣＢサブタイプ及びＡＢＣサブタイプにおいて、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＦＧＦＲ１に対する免疫組織化学染色の定量スコアの比較結果である。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、ＮＳ：有意ではない。
【０１０４】
【図５８】ＡＢＣサブタイプ（６セット）において、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＦＧＦＲ２に対する免疫組織化学染色の比較画像である。比較画像の結果による、再発組織におけるＦＧＦＲ２の発現レベルが初回受診時の組織より高いことが分った。スケールバー：２０μｍ、Ｐ：患者。
【０１０５】
【図５９】ＧＣＢサブタイプ（６セット）において、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＦＧＦＲ２に対する免疫組織化学染色の比較画像である。スケールバー：２０μｍ、Ｐ：患者。
【０１０６】
【図６０】図６０是在ＧＣＢサブタイプ及びＡＢＣサブタイプにおいて、同一患者の初回受診時及び再発後の組織中のＦＧＦＲ２に対する免疫組織化学染色の定量スコアの比較結果である。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、ＮＳ：有意ではない。
【０１０７】
【図６１】ＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞をＤｕｖｅｌｉｓｉｂで処理した後の、ＡＫＴ１リン酸化及びＡＫＴ、ＳＯＸ２とＣＤＫ６の発現レベルに対するウエスタンブロット解析結果である。結果により、Ｄｕｖｅｌｉｓｉｂが、ＡＫＴリン酸化を抑制することでＳＯＸ２及びＣＤＫ６の発現を低下させることが分った。
【０１０８】
【図６２】ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞をＤｕｖｅｌｉｓｉｂ処理した後の、ＡＫＴ１リン酸化及びＡＫＴ、ＳＯＸ２とＦＧＦＲ１／２の発現レベルに対するウエスタンブロット解析結果である。結果により、Ｄｕｖｅｌｉｓｉｂが、ＡＫＴリン酸化を抑制することでＳＯＸ２及びＦＧＦＲ１／２の発現を低下させることが分った。
【０１０９】
【図６３】ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ細胞毒性測定結果であり、その中、ＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞をそれぞれａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂを単独で又はＣＨＯと共同で処理した。結果により、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂでＣＤＫ６を抑制することにより、ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞のＣＨＯに対する感受性を回復させることが表明され、一方、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂを単独で処理する場合の細胞死誘導における影響は無視してもよいことが分かった。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【０１１０】
【図６４】ＣｙｔｏＴｏｘ−Ｇｌｏ細胞毒性測定結果であり、その中、ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞をそれぞれＡＺＤ４５４７を単独で又はＣＨＯと共同で処理した。結果により、ＡＺＤ４５４７でＦＧＦＲ１／２を抑制することにより、ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞のＣＨＯに対する感受性を回復させることが表明され、一方、ＡＺＤ４５４７を単独で処理する場合の細胞死誘導における影響は無視してもよいことが分かった。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【０１１１】
【図６５】ＣＤＣ測定結果であり、その中、ＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞をａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂで２４時間予備処理し、その後、リツキシマブ及び２０％のＮＨＳでＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞を２時間処理した。対照群と比べた結果により、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂは、Ｒ−によって媒介されるＣＤＣに対する薬剤耐性を逆転できないことが分かった。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３である。
【０１１２】
【図６６】ＣＤＣ測定結果であり、その中、ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞をＡＺＤ４５４７で２４時間予備処理し、その後、リツキシマブ及び２０％のＮＨＳでＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞を２時間処理した。対照群と比べた結果により、ＡＺＤ４５４７は、Ｒ−によって媒介されるＣＤＣに対する薬剤耐性をさらに悪化させることが分かった。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５である。
【０１１３】
【図６７】オリジナルＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞のおいて、ＳＯＸ２を過剰発現させた後、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣ、ＣＤ３４及びＣＤ１３３の発現レベルに対するウエスタンブロット解析結果である。結果により、ＳＯＸ２の異常発現により、オリジナル細胞におけるＣＳＣ関連分子のレベルが上昇されることが分かった。
【０１１４】
【図６８】ＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞において、ＳＯＸ２をノックダウンさせた後、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣ、ＣＤ３４及びＣＤ１３３発現レベルに対するウエスタンブロット解析結果である。結果により、ＳＯＸ２のノックダウンにより、ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞におけるＣＳＣ関連分子のレベルが低下されることが分かった。
【０１１５】
【図６９】ＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞をＤｕｖｅｌｉｓｉｂ及びＡｂｅｍａｃｉｃｌｉｂで処理し、ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞をＤｕｖｅｌｉｓｉｂ及びＡＺＤ４５４７で処理した後の、ＡＬＤＨ１＋細胞の比率に対する比較図である。結果により、ＤｕｖｅｌｉｓｉｂはＬＹ８−ＲＣＨＯ及びＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞中のＡＬＤＨ１＋サブグループを顕著に低下させ、ＡｂｅｍａｃｉｃｌｉｂはＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞中のＡＬＤＨ１＋サブグループに対して影響を与えず、ＡＺＤ４５４７はＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞中のＡＬＤＨ１＋サブグループを顕著に降低させるが、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂと比べると、その程度が大幅に低下するのが分かった。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【０１１６】
【図７０】２種類のＲＣＨＯ薬剤耐性細胞をＤｕｖｅｌｉｓｉｂ、Ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ及びＡＺＤ４５４７でそれぞれ処理した後の、ＡＫＴ、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣ、ＣＤ３４及びＣＤ１３３の発現レベル及びｐ−ＡＫＴリン酸化レベルに対するウエスタンブロット解析結果である。結果により、ＤｕｖｅｌｉｓｉｂはＲＣＨＯ薬剤耐性細胞におけるＣＳＣ関連分子のレベルを顕著に低下させ、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂはそのレベルに対して影響を与えないがＣ−ＭＹＣを減少させ、一方、ＡＺＤ４５４７もそれらのレベルを低下させるが、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂと比べると、その程度が大幅に低下するのが分かった。
【０１１７】
【図７１】ＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞をＤｕｖｅｌｉｓｉｂ及びＡｂｅｍａｃｉｃｌｉｂで処理し、ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞をＤｕｖｅｌｉｓｉｂ及びＡＺＤ４５４７で処理した後、４８時間及び１２０時間でのＥｄＵ参入による細胞増殖情況に対する測定結果である。データは、平均値±ＳＤで示し、ｎ＝３、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【０１１８】
【図７２】図７２是ＬＹ８−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞を接種し、表１に示す方式に従って群にわけて投与した後、第５０日目及び第９０日目の腫瘍の成長状況を示す図である。腫瘍質量は、ホタルルシフェラーゼの活性強度により示し、“Ｘ”は死んだマウスを代表する。
【０１１９】
【図７３】図７２における総光子フラックスに対する定量結果である。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝７）で示し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【０１２０】
【図７４】ＬＹ８−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞を接種した後、異なる薬剤処理群のマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線である。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝７）で示し、＊Ｐ＜０．０５、＊＊Ｐ＜０．０１及び＊＊＊Ｐ＜０．００１である。
【０１２１】
【図７５】ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞を接種した後、第５０日目、第７０日目及び第９０日目の腫瘍の成長状況を示す図である。腫瘍質量は、ホタルルシフェラーゼの活性強度により示し、“Ｘ”は死んだマウスを代表する。
【０１２２】
【図７６】図７５における総光子フラックスに対する定量結果である。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝７）で示し、＊Ｐ＜０．０５及び＊＊Ｐ＜０．０１である。
【０１２３】
【図７７】ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞を接種した後、異なる薬剤処理群のマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線である。データは、平均値±ＳＥＭ（ｎ＝７）で示し、＊＊Ｐ＜０．０１、＊＊＊Ｐ＜０．００１及び＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１である。
【０１２４】
【図７８】ＬＹ８−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞を接種した後、異なる薬剤処理群の成長した腫瘍組織中のＳＯＸ２に対して免疫組織化学染色を行った後の画像である。スケールバー：２０μｍ。結果により、生理食塩水の対照群と比べて、ＤｕｖｅｌｉｓｉｂはＳＯＸ２の発現レベルを顕著に低下させるが、Ｒ−ＣＨＯＰ及びａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂはＳＯＸ２の発現レベルに対して影響がないことが分った。
【０１２５】
【図７９】ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞を接種した後、異なる薬剤処理群の成長した腫瘍組織中のＳＯＸ２に対して免疫組織化学染色を行った後の画像である。スケールバー：２０μｍ。結果により、生理食塩水の対照群と比べて、Ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ及びＡＺＤ４５４７はＳＯＸ２の発現レベルを顕著に低下させるが、Ｒ−ＣＨＯＰはＳＯＸ２の発現レベルに対して影響がないことが分った。
【０１２６】
【図８０】ＣＳＣに対する分化促進療法によるＤＬＢＣＬにおけるＲ−ＣＨＯＰの薬剤耐性の逆転に係るメカニズムの概略図である。
【発明を実施するための形態】
【実施例１】
【０１２７】
ＳＯＸ２は幹細胞様薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞の薬剤耐性を制御する。
抗体依存性細胞毒性（ＡＤＣＣ）及び補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）は、リツキシマブ治療効果における主な機構である。ＡＤＣＣに対する寛容性は、患者個体の免疫細胞の内在特徴に由来する可能性があり、ＣＤＣに対する寛容性は、ＣＤ２０の低発現レベル及び／又は膜結合補体制御タンパク質（ｍＣＲＰ）の高発現レベル（ＣＤ４６、ＣＤ５５及び特別にはＣＤ５９を含む）によって媒介される。ＣＨＯ化学薬剤は、ＤＮＡの損傷を誘導またはチューブリンと結合することにより腫瘍細胞の複製を抑制し、一方、これら作用は、シクロホスファミドが細胞において必ず代謝且つ活性化されて４−ヒドロキシシクロホスファミド（４−ＨＣ）になる場合にこそ発揮される。そこで、本願では、リツキシマブに正常のヒト血清（ＮＨＳ、補体のソースとする）を加えた薬剤、４−ＨＣにドキソルビシン及びビンクリスチンを加えた薬剤、及びそれらを組合わせた薬剤を用いて、薬剤耐性のＬＹ８（ＧＣＢのサブタイプ）またはＮＵ−ＤＵＬ−１（ＡＢＣのサブタイプ）のＤＬＢＣＬ細胞を作製し、それぞれＲ、ＣＨＯ及びＲＣＨＯと命名した（図１）。本願において、これら薬剤がＣＤＣ（図２）及び化学療法薬剤（図３）に対する薬剤耐性を検証し、且つ一定の程度でこれら薬剤がリツキシマブによって媒介されるＣＤＣ及びＣＨＯによって媒介される化学療法に対する交差の薬剤耐性が観察された。なお、オリジナル（ＯＲＩ）細胞と比べて、薬剤耐性の細胞は異なる大きさの幹細胞様の球体を呈し、且つ球体の数量はＲ、ＣＨＯ及びＲＣＨＯの順で次第に増加した（図４）。ＮＨＬ中にＣＳＣが存在することを実験を通じて証明した研究はかなり少ないが、これらＣＳＣは確実に存在する。そこで、本願では、いろんながん種類のＣＳＣ中のアセトアルデヒドデヒドロゲナーゼ１（ＡＬＤＨ１）及び白血病にＣＳＣ中のＣＤ３４及びＣＤ１３３を用いて、薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞の幹細胞性を確定した。その結果は、オリジナル細胞と比べて、薬剤耐性細胞中のＡＬＤＨ１＋細胞の比率が顕著に上昇（図５及び図６）することを表明した。また、ＣＤ３４及びＣＤ１３３の発現レベルも増加（図７）するのが分かった。
【０１２８】
薬剤耐性細胞における幹細胞性の分子制御機構を解明するために、本願では、最も重要な幹細胞性関連転写因子、即ちＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃの発現を検測した。図８に示すように、ＳＯＸ２の発現レベルだけが薬剤耐性の増強の携行に従って次第に上昇された。また、本願では、ＤＬＢＣＬ患者からの臨床サンプルのＧＣＢ及びＡＢＣサブタイプにおいて、再発組織におけるＳＯＸ２の免疫組織化学（ＩＨＣ）染色率が、対応の初回受診時の組織に比べて、明らかに高いことが観察された（図９、図１０及び図１１）。オリジナルＬＹ８またはＮＵ−ＤＵＬ−１細胞において、異常のＳＯＸ２の発現（図６７）は、リツキシマブ（図１２）またはＣＨＯ（図１３）により誘導された細胞死を顕著に低下させた。一方、ＳＯＸ２の不足（図６８）は、ＲＣＨＯ薬剤耐性にＬＹ８またはＮＵ−ＤＵＬ−１細胞において、相反する効果を誘導した（図１２及び図１３）。これら結果により、薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞において、ＣＳＣの比率が顕著に増加しており、且つＳＯＸ２の上昇はリツキシマブ及びＣＨＯに対して薬剤耐性を生じる原因であることが分かった。
【実施例２】
【０１２９】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達リン酸化及びこれによりＳＯＸ２を安定化させて、ユビキチン化によって媒介される分解を抵抗する。
【０１３０】
本願では、次いで、薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞におけるＳＯＸ２アップレギュレートの機構に対して検討した。思いがけずに、ＳＯＸ２のｍＲＮＡレベルは、薬剤耐性細胞、特に薬剤耐性ＬＹ８細胞において顕著に低下されており（図１５）、このことは、転写の制御がＳＯＸ２の過剰発現に関与しないことを表明した。オリジナル細胞及び薬剤耐性細胞のＲＮＡ−ｓｅｑデータに基づき、ＫＥＧＧ経路の解析においての相互作用のスコアは、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路（ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ）及びステロイド生合成（Ｓｔｅｒｏｉｄｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）は、最もエンリッチの経路であることを示した（図１５）。また、遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）により、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路の遺伝子特徴（ｇｅｎｅｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ）は、２種類のＲＣＨＯ薬剤耐性細胞系において何れも顕著に活性化されることが分かった（図１６）。実験を通じて、ＡＫＴ（Ｓ４７３）のリン酸化は、薬剤耐性程度の増加に従って増加し、これによりＳＯＸ２（Ｔ１１８）のリン酸化を増強し、続いて２種類の細胞系においてＳＯＸ２（Ｋ１１９）のメチル化を抑制することを確認した。また、薬剤耐性ＬＹ８細胞中のＰＩ３Ｋサブユニットｐ１１０α／δとｐ８５の発現及び薬剤耐性ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞中のｐ１１０γの発現も上昇した（図１７）。相応に、ＧＣＢ及びＡＢＣサブタイプにおいて、ＡＫＴ（Ｓ４７３）リン酸化も、再発生検組織に置いて、対応の患者の初回受診時の組織と比べて、顕著に増加した（図１８、図１９及び図２０）。本実施例により、ＳＯＸ２の安定性は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴにより制御されるＳＯＸ２のリン酸化−メチル化の転換がユビキチン化システムにより制御されることが確認された。相応に、ユビキチン化されたＳＯＸ２は薬剤耐性細胞において、顕著に減少された（図２１）。従って、ＧＣＢ及びＡＢＣサブタイプにおいて、薬剤耐性のＣＳＣにおけるＳＯＸ２の発現の上昇は、たぶんＡＫＴにより制御されるリン酸化−メチル化の転換によるものであり、これによりＳＯＸ２のユビキチン化及び分解がさらに抑制される。
【実施例３】
【０１３１】
薬剤耐性細胞において複数のシグナル伝達事象によりＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路が活性化される。
【０１３２】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路の上流のキー制御因子を研究することは、ＳＯＸ２の発現を減少させることができる潜在の薬剤標的部位を探し出すことに有利である。そこで、本願では、ＰＫ３Ｋ／ＡＫＴ経路における１２４個のアップレギュレートされた遺伝子（図１６）を確定し、且つ細胞サブタイプに基づきそれらを分類（図２２）した。２種類の細胞サブタイプにおいて重合する遺伝子の数量が限られて（１８個だけである）いたため、本願では、全部の１２４個の遺伝子を用いて、ＫＥＧＧ経路解析を行った。図２３に前から１０位の経路が例示され、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路は第１位に位置する。ＰＩ３Ｋα／βサブタイプは広く発現されるが、ＰＩ３Ｋγ／δサブタイプは造血細胞だけにおいて発現され、その中、ＰＩ３ＫδはＢ細胞の発育及び機能において重要な作用を発揮し、且つＢ細胞悪性腫瘍においてＢＣＲ及びその他の受容体からのシグナルをいろいろの種類のインテグリン及び細胞因子／ケモカインに伝達することにより、常に高度の活性を維持する。同じくに、本願において、インテグリンにより制御される接着斑（ｆｏｃａｌａｄｈｅｓｉｏｎ）経路が第２位（図２３）に位置されたが、下流のＦＡＫは、薬剤耐性ＬＹ８細胞だけにおいて活性化された（図２４）。続いて、ｑＲＴ−ＰＣＲを通じて全部のインテグリンサブユニットの転写レベルを測定し、３種類の薬剤耐性ＬＹ８細胞系において、ＩＴＧＡ１及びＩＴＧＢ５だけが顕著に上昇（図２５）されることを発見した。この点については、タンパク質レベルを通じてさらに確認（図２６）された。本願では、ＩＴＧＡ１またはＩＴＧＢ５をノックダウンしたＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞に対するウエスタンブロット解析結果により、ＩＴＧＡ１またはＩＴＧＢ５の不足によりＦＡＫの発現及びリン酸化を顕著に抑制され、これによりＳＯＸ２の分解が増加（図２７）されたことが分った。これらの結果は、インテグリンサブユニットα１及びβ５の発現上昇は、薬剤耐性ＬＹ８細胞におけるＦＡＫ／ＡＫＴリン酸化を介してＳＯＸ２の安定化を促進したことを表明した。なお、ＢＣＲシグナル伝達経路もＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの活性化（図２３）に関与した。ＢＣＲ／Ｌｙｎ及びＴＣＦ３／ＳＨＰ−１シグナル伝達は、異なる薬剤耐性細胞において、Ｓｙｋを活性化（図２８）したが、ＣＤ７９Ａ（ＢＣＲシグナル伝達経路のサブユニット組成）の不足は、ＢＣＲ／Ｌｙｎ／Ｓｙｋ／ＡＫＴシグナル伝達軸を抑制し、これによりＳＯＸ２の不安定化が誘導（図２９）された。また、本願では、更に、ケモカインの発現に対して研究し、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路を活性化（図２３）するのが認められた。ＧＳＥＡ結果により、ケモカインシグナル伝達経路がＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８細胞において顕著にエンリッチ（図３０）されるが、ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞においてはエンリッチされないことも分かった。図３１において、前から１０位の関連遺伝子が例示されている。本願において、ＣＣＲ７が第１位に位置するのが確認され、異なる薬剤耐性ＬＹ８細胞、特に、ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞においてＣＣＲ７的ｍＲＮＡレベルが顕著に上昇（図３２）するのが発見された。ＣＣＲ７のタンパク質レベルも、特にはＣＨＯ及びＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８細胞において上昇（図３３���左）された。また、薬剤耐性ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞において、ＣＣＲ７の発現も上昇されたが、上昇の程度が低かった（図３３の右）。ＣＣＲ７の不足が、Ｓｒｃ／ＡＫＴ的シグナル伝達を弱化し、これにより２種類のＲＣＨＯ薬剤耐性細胞系においてのＳＯＸ２の分解を（図３４）引き起こした。
【０１３３】
続いて、機能上において、上記シグナル伝達分子の阻害剤の薬剤耐性細胞の化学療法（ＣＨＯ）の薬剤耐性を逆転させる作用について検測した。単独使用ＰＩ３Ｋ阻害剤であるｄｕｖｅｌｉｓｉｂを単独で処理した時、細胞毒性が誘導されたとしても、それはただわずかの細胞毒性にすぎなかったが、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ及びＣＨＯを共同で処理した場合は、ＣＨＯの２種類のＲＣＨＯ薬剤耐性細胞系における細胞毒性作用を用量依存的に顕著に増強（図３５）させた。類似に、ＦＡＫ、ＳｙｋまたはＳｒｃ阻害剤を単独で処理した時の誘導される細胞毒性は無視できる一方、ＣＨＯと共同で処理した場合は、ＣＨＯの細胞毒性作用を顕著増強させるが、その程度は、ＣＨＯとｄｕｖｅｌｉｓｉｂの共同処理時に比べてかなり低かった（図３６−図３８）。要するに、薬剤耐性ＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞において、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の増強は複数の要素により誘導され、例えばインテグリン、ＢＣＲ及びケモカインシグナル伝達を含むが、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴを抑制すること以外に、その上流経路に対する抑制することは何れも薬剤耐性細胞の化学療法の期間における生存率を有効に低下させることができない。
【実施例４】
【０１３４】
ＳＯＸ２により制御されるＣＤ２０の発現は、リツキシマブにより誘導されるＣＤＣ薬剤耐性に対する決定的要因である。
【０１３５】
ＣＤＣは、リツキシマブの重要な細胞毒性作用であり、薬剤耐性発展の機構に対して理解することは、薬剤耐性を逆転させる治療薬剤の開発に有利である。本願では、ＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１のＲ及びＲＣＨＯ薬剤耐性細胞において、ＣＤ２０の膜発現が顕著に低下されるが、その他の３種類のｍＣＲＰの発現は若干だけ下がる（図３９及び図４０）ことが観察された。ウエスタンブロット法により、この結果と一致する総ＣＤ２０の発現レベルの結果が得られた（図４１）。ＣＤ２０の膜レベルが顕著に低下されるのは、たぶん転写の抑制によることであると考えられる（図４２）。
【０１３６】
リツキシマブによって媒介されるＣＤＣ薬剤耐性のＤＬＢＣＬにおけるＳＯＸ２のキー作用は、前述により検証され（図１２）たことで、更にその基本的機構について研究した。オリジナルのＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞において、ＳＯＸ２の異常発現は、ＣＤ２０の発現を顕著に降低させる一方で、薬剤耐性のＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞において、ＳＯＸ２の不足はＣＤ２０の発現を顕著に増加させた（図４３及び図４４）。しかしながら、その他の３種類のｍＣＲＰの発現は、リツキシマブによって媒介されるＣＤＣ薬剤耐性と常に関連されるのではなかった（図４３及び図４４）。これらの結果により、その他のｍＣＲＰに比べて、ＳＯＸ２により制御されるＣＤ２０の発現は、リツキシマブによって媒介されるＣＤＣのＤＬＢＣＬ薬剤耐性に対する決定的要因であることが表明された。
【０１３７】
本願では、さらに、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤がリツキシマブによって媒介されるＣＤＣに対する作用について確認した。２種類のＲＣＨＯ薬剤耐性細胞系において、ＰＩ３ＫまたはＡＫＴを抑制することで、いずれにおいてもＣＤ２０の発現が顕著に低下できたが、その他の３種類のｍＣＲＰの発現レベルに対しては顕著な改変ができなかった（図４５）。類似に、ＣＤ２０の発現を減少させる最も可能性がある原因としては、その転写が抑制されたことである（図４６）。本願ではウエスタンブロット法を利用してＡＫＴの抑制及びＣＤ２０とＳＯＸ２の発現（図４７）を検討した。これらの結果は、さらに、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴのＣＤ２０発現に対する制御はたぶんＳＯＸ２と関係がないことを表明した。その後、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴを抑制することで、ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞のリツキシマブによって媒介されるＣＤＣが分解されることを発見した（図４８）。従って、化学療法に対する薬剤耐性を逆転させる作用とは逆に、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達経路阻害剤は、むしろリツキシマブによって媒介されるＣＤＣに対する薬剤耐性を激化させるかも知らない。
【実施例５】
【０１３８】
ＧＣＢ及びＡＢＣ細胞において、ＳＯＸ２の下流の異なるシグナル伝達分子により薬剤耐性を生じる。
【０１３９】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの抑制またはＳＯＸ２の不足がリツキシマブ及び／又はＣＨＯ治療に対する薬剤耐性の逆転に係る影響を鑑みて、本願では、さらに、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ経路におけるアップレギュレートされた遺伝子（図１６）及びＳＯＸ２−標的遺伝子（分子特徴データベース、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ  Ｄａｔａｂａｓｅ、ＭＳｉｇＤＢ）により、ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞におけるＳＯＸ２のキー標的部位を同定した。ＲＣＨＯ薬剤耐性のＬＹ８細胞において、ＣＤＫ６、ＧＳＫ３Ｂ及びＳＧＫの３つの遺伝子がアップレギュレートされたが、ＲＣＨＯ薬剤耐性のＮＵ−ＤＵＬ−１細胞においては、ＦＣＨＲ１、ＦＧＦＲ２、ＫＤＲ及びＴＮＣの４つの遺伝子がアップレギュレートされた（図４９）。ＣＤＫ４／６及びＦＧＦＲの阻害剤について、いろんながんの治療のための臨床試験が行われていることを考慮した上、続いて、それらの発現及び機能について研究した。ＣＤＫ６は、薬剤耐性ＬＹ８細胞（図５０）及び再発のＧＣＢサブタイプにおいて、高度に発現されたが、ＡＢＣサブタイプのＤＬＢＣＬ組織においては過剰発現されなかった（図５１−図５３）。同じくに、ＦＧＦＲ１／２は、薬剤耐性ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞（図５４）及び再発のＡＢＣサブタイプにおいて過剰発現されたが、ＧＣＢサブタイプのＤＬＢＣＬ組織においては過剰発現されなかった（図５５−図６０）。ｄｕｖｅｌｉｓｉｂでＰＩ３Ｋを抑制することにより、ＡＫＴのリン酸化が阻止され且つＳＯＸ２の分解が誘導され、これによりＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８細胞におけるＣＤＫ６の発現（図６１）またはＲＣＨＯ薬剤耐性ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞におけるＦＧＦＲ１／２的発現（図６２）が減少された。ＰＩ３Ｋを抑制する作用と類似に、ＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８細胞においてａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂでＣＤＫ６を抑制またはＲＣＨＯ薬剤耐性ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞においてＡＺＤ４５４７でＦＧＦＲ１／２を抑制すると、ＣＨＯの細胞毒性が顕著増強された。一方、これらの阻害剤を単独で使用する場合、薬剤耐性細胞に対して無視できるような程度の細胞毒性作用を示した（図６３及び図６４）。しかしながら、ＬＹ８−ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞においてＣＤＫ６を抑制またはＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞においてＦＧＦＲ１／２を抑制しても、Ｒ−によって媒介されるＣＤＣに対する薬剤耐性を逆転できなかった（図６５及び図６６）。これらの結果により、ＳＯＸ２の標的部位（ＬＹ８−ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞におけるＣＤＫ６及びＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞におけるＦＧＦＲ１／２）を抑制することにより、少なくとも化学療法に対する薬剤耐性を一定の程度で逆転できるが、Ｒ−によって媒介されるＣＤＣに対しては無効であることが表明された。
【実施例６】
【０１４０】
ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの抑制はＳＯＸ２の減少を介してＣＳＣの分化を促進する。
【０１４１】
薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞でのＣＳＣ比率の増加及びＲＣＨＯ薬剤耐性におけるＳＯＸ２のキー作用に鑑みて、本願では、ＳＯＸ２のＣＳＣの幹細胞性維持に対する作用について研究した。ＳＯＸ２の異常発現またはＳＯＸ２の不足はそれぞれ、ＣＤ３４及びＣＤ１３３のレベル及びその他の幹細胞性と関連するＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びｃ−ＭＹＣを含む転写因子を顕著に増加または抑制した（図６７及び図６８）。これらの結果により、ＳＯＸ２は、たぶんＲＣＨＯ薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞における幹細胞性の決定的転写因子であることが表明された。また、２種類のＲＣＨＯ薬剤耐性細胞系において、ＰＩ３Ｋの抑制はＣＳＣ（ＡＬＤＨ１＋細胞として標記）の比率を顕著に低下させ（図６９）、ＣＤＫ６の抑制はＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８細胞におけるＣＳＣの比率を改変できなく（図６９の左）、一方、ＦＧＦＲ１／２の抑制はＲＣＨＯ薬剤耐性ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞におけるＣＳＣの比率を顕著に低下させたが、その程度はＰＩ３Ｋの抑制時の作用と比べるとかなり低く（図６９の右）、先行の研究と一致した。この結果は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴはたぶんＦＧＦＲシグナルにより活性化されることを表明した。また、ＣＤ３４、ＣＤ１３３及び幹細胞性関連転写因子（ＳＯＸ２、ＯＣＴ４、ＮＡＮＯＧ、ＫＬＦ４及びｃ−Ｍｙｃを含む）の発現レベルは、２種類のＲＣＨＯ薬剤耐性細胞系のＰＩ３Ｋが抑制された後、確実に低下されたが、ＣＤＫ６が抑制された場合、上記分子の発現に顕著な影響を与えなかった一方で、ｃ−ＭＹＣの減少が招かれ、上記分子の発現レベルもＦＧＦＲ１／２が抑制された後に低下されたが、その程度はＰＩ３Ｋを抑制した場合と比べて低かった（図７０）。注目すべきことは、ＦＧＦＲ１／２がアップレギュレートされ且つＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナルの活性化に関与したことであり、従って、これらの抑制によりＡＫＴのリン酸化が減少され且つＳＯＸ２の安定性が低下された（図７０）。これらの結果は、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂで直接またはＡＺＤ４５４７で間接にＰＩ３Ｋ／ＡＫＴを抑制しＣＳＣの分化を促進できることを示した。
【０１４２】
分化された腫瘍細胞はＣＳＣより成長が更に速い。そこで、本願では、ＥｄＵ取込み測定法によりＰＩ３Ｋの抑制が細胞増殖に対する影響を機能的に検測した。ｄｕｖｅｌｉｓｉｂで４８時間処理した後、直接的なＰＩ３Ｋの抑制は、ＬＹ８−ＲＣＨＯ及びＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞の増殖を強烈に阻止しており、処理してから１２０時間になった時、細胞の増殖を顕著に促進した（図７１）。この結果により、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂによって、ＣＳＣから分化細胞に分化される動態的過程が誘導されることが分った。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達に対する抑制がないので、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂでＣＤＫ６を抑制した時、処理後の４８時間及び１２０時間でいずれもＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞の成長を阻止した（図７１）。ＡＺＤ４５４７のＦＧＦＲ１／２に対する抑制は、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴシグナル伝達の抑制に関与したので、ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞の増殖を促進したが、その程度はＰＩ３Ｋの抑制する場合に比べて低かった（図７１の右）。これらの結果により、ＣＤＫ６またはＦＧＦＲ１／２の阻害剤及びＰＩ３Ｋの阻害剤は、たぶん異なる機構によって化学療法の薬剤耐性を逆転させることが分った。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴの抑制はＣＳＣを分化細胞に有効に転化させ、ＣＤＫ６の抑制は細胞周期を通じてＣＳＣの成長を標的に直接阻止するが、ＦＧＦＲ１／２はＣＳＣに対して二重の作用があるかも知らない。あらゆるこれらの介入措置の何れも最終的にはＣＳＣの異なる治療効果の化学療法に対する感受性を増強させた。
【実施例７】
【０１４３】
ＰＩ３Ｋ阻害剤とＲ−ＣＨＯＰとの組合わせにより構成されたＣＳＣの予備分化療法は、ＲＣＨＯ薬剤耐性細胞の腫瘍成長を完全に抑制する。
【０１４４】
移植モデルの構築：ホタルルシフェラーゼ遺伝子を過剰発現するレンチウイルスをＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞及びＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞に形質導入して、ホタルルシフェラーゼを発現する安定な細胞を得、それぞれＬＹ８−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞及びＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞と呼んだ。８週齢のメスのＳＣＩＤマウスは、ＳＬＡＣ（ＳｈａｎｇｈａｉＬａｂｏｒａｔｏｒｙＡｎｉｍａｌＣｅｎｔｅｒ、上海実験動物センター）から購入した。ＬＹ８−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞及びＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞をＰＢＳに再懸濁し、その後、毎匹のマウスに１．５×１０７個の細胞を腹腔内注射した。ＬＹ８−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞を腹腔内注射した後、マウスをランダムに６群（群ごとに７匹のマウス）に分け、それぞれ生理食塩水、Ｒ−ＣＨＯＰ、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ、Ｒ−ＣＨＯＰ＋ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ及びＲ−ＣＨＯＰ＋ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂを投与した。ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ−Ｌｕｃ細胞を接種したマウスをランダムに６群（群ごとに７匹のマウス）に分け、それぞれ生理食塩水、Ｒ−ＣＨＯＰ、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ、ＡＺＤ４５４７、Ｒ−ＣＨＯＰ＋ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ及びＲ−ＣＨＯＰ＋ＡＺＤ４５４７を投与した。一回の治療周期に基づき、臨床で使用した薬剤投与方法を表１に示した。Ｒ−ＣＨＯＰ方案は臨床においてＤＬＢＣＬの治療に用い、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ及びＡＺＤ４５４７について臨床試験を通じてテスト（関連するＮＣＴ番号は、それぞれＮＣＴ０２５７６２７５、ＮＣＴ０１７３９３０９及びＮＣＴ０１７３９３０９である）した。接種した後、第５０日目及び第９０日目に生物発光により腫瘍の成長情況を観測した。生体内の生物発光画像の形成のために、Ｄ−フルオレセイン（Ｐｒｏｍｅｇａ会社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）マウスの体内に腹腔内注射（１５０ｍｇ／ｋｇ）した。１０分後、ペントバルビタール（５０ｍｇ／ｋｇ）を腹腔内注射してマウス麻酔し、次いでＩｎＶｉｖｏＭＳＦＸＰＲＯシステム（Ｂｒｕｋｅｒ会社、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ，ＭＡ）によりその生物発光の強度を検査した。３０秒間曝露させて発光画像を捕獲し、ＢｒｕｋｅｒＭＩソフトウェアにより腫瘍のシグナル強度を測量した。毎匹マウスごとの生存期間を記録した。接種した後、第１２０日目に、生存したマウスを安楽死させて解剖を行ったところ、腹膜内腫瘍は発見されなかった。死亡直前のマウスから腫瘍組織を収集し４％のホルマリンで固定した。全部の動物実験は何れも復旦大学上海医学院動物倫理委員会から許可した実験動物方案に厳格に従って行った。
【０１４５】
表１．移植モデルにおける投与方法
【０１４６】
2021532168.tif 000009
【０１４７】
2021532168.tif 000010
【０１４８】
ルシフェラーゼを発現するプラスミドを形質導入したＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８細胞及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞をそれぞれ免疫欠損ＳＣＩＤマウスに移植し、いろいろの治療方案を実施した。図７２−図７４から分かるように、ＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８細胞を携帯するマウスにおいて、Ｒ−ＣＨＯＰは生存率を顕著に延長（図７４）させたが、食塩水対照群と比べると、Ｒ−ＣＨＯＰ治療は、腫瘍の成長に対して治療効果がなかった（図７２及び図７３）。これらの結果により、ＬＹ８細胞のＲＣＨＯに対するインビトロ薬剤耐性は、マウスにおいて高度に再現された。不幸にも、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂまたはａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂを単独で使用した場合、いずれにしても腫瘍成長を抑制または生存率を延長することができなかった（図７２−図７４）。逆に、生理食塩水と比べると、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂは腫瘍の成長を加速させた。これらの差異は、統計学的に有意ではなかったが（図７２及び図７３）、生存率が顕著に短縮された（図７４）。これと対照的に、Ｒ−ＣＨＯＰと併用する場合、Ｒ−ＣＨＯＰまたは阻害剤を単独で使用する場合と比べて、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂまたはａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂは、腫瘍の成長を顕著に抑制し且つ生存率を延長させた（図７２−図７４）。もっと注目すべきのは、Ｒ−ＣＨＯＰとｄｕｖｅｌｉｓｉｂとの併用治療により腫瘍の発生が完全に抑制され、且つ治療を受けた全部のマウスは実験終了の第１２０日目までずっと生存していたが、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂとの併用治療を受けた２匹のマウスは、第６２日目及び第７８日目に死亡した（図７２−図７４）ことである。図７５−図７７から分かるように、ＲＣＨＯ薬剤耐性ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞を携帯するマウスにおいて、類似であるが完全に同じではない結果が得られた。Ｒ−ＣＨＯＰは、腫瘍の成長を顕著に抑制させ且つ生存期間を延長させており（図７５−図７７）、これはたぶん幹細胞性の弱さ及びＣＳＣの比率の減少により、ＲＣＨＯに対する寛容性がＲＣＨＯ薬剤耐性ＬＹ８細胞より弱くなったことが原因であろう（図４、図５及び図７）。Ｄｕｖｅｌｉｓｉｂを単独で使用する場合、腫瘍の成長及び生存期間のいずれに対しても治療効果がなかったが、ＡＺＤ４５４７を単独で使用する場合、生存期間を顕著に延長させた（図７５−図７７）。重要なのは、Ｒ−ＣＨＯＰと併用で使用する場合、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ及びＡＺＤ４５４７は何れも腫瘍の成長を完全に抑制させ且つ生存期間を実験終了の第１２０日目まで延長させた（図７５−図７７）。Ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ及びＡＺＤ４５４７は、それらの異なる腫瘍抑制作用は、さらに、それらの潜在的な異なる薬剤耐性に対する逆転機構を支持した。即ち、ｄｕｖｅｌｉｓｉｂはＣＳＣを分化した細胞に転化させ、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂはＣＳＣの成長を抑制する一方、ＡＺＤ４５４７はＣＳＣに対して２重の作用を示した。異なる薬剤で処理した、接種後に成長した腫瘍組織におけるＳＯＸ２に対する染色は、この発見を支持した。ＤｕｖｅｌｉｓｉｂまたはＡＺＤ４５４７ＳＯＸ２の発現を顕著に低下させたが、Ｒ−ＣＨＯＰまたはａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂはＳＯＸ２の発現を低下させなかった（図７８及び図７９）。従って、これらの併用治療が成功したのは、たぶんＣＳＣがＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ＳＯＸ２軸の抑制により分化した細胞に転化されたのが原因であろう。
【実施例８】
【０１４９】
関連実験の具体的方法
【０１５０】
一、ＤＬＢＣＬ組織サンプルの採集
【０１５１】
本願では、復旦大学上海がんセンターの２００８年から２０１５年までの全部のＤＬＢＣＬ患者の病歴について調査し、２４人の患者に対して初回受診時及び再発時の組織サンプルのパラフィン包埋実験を行ったことが分った。ハンス免疫組織化学計算方法に基づき、ＤＬＢＣＬ症例をＧＣＢ（１２例）またはＡＢＣ（１２例）分子サブタイプに分けた。再発患者は少なくとも６回の治療周期でＲ−ＣＨＯＰ治療を受けた。第１回の生検は、初回受診時に行って診断に用い、第２回の生検は再発状態か若しくは原発かを確定するための診断に用いた。患者ごとの２回の生検の時間間隔は互いに異なった。その後、これらＤＬＢＣＬサンプルを収集しＩＨＣ染色に用いた。この研究は、復旦大学上海がんセンター倫理委員会から許可され、全部の患者さんがインフォームドコンセントに署名した。
【０１５２】
二、細胞培養及び試薬
【０１５３】
ヒトＤＬＢＣＬ細胞系のＧＣＢサブタイプＯＣＩ−ＬＹ８及びＡＢＣサブタイプＮＵ−ＤＵＬ−１は、復旦大学上海がんセンター（中国上海）病理学研究室からもらった。ＬＹ８細胞は、１０％（ｖ／ｖ）のウシ胎児血清及び１％（ｖ／ｖ）のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＩＭＤＭ（Ｉｓｃｏｖｅ’ｓｍｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓｍｅｄｉｕｍ）培地で培養した。ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞は、１０％のウシ胎児血清及び１％のペニシリン／ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。
【０１５４】
補充剤のソースとして、１０人の健康人体から正常ヒト血清（ＮＨＳ）を採集して合併した後分注し、−８０℃において使用するまで保存した。使用する前に、６５℃の水浴で３０分間インキュベートして熱不活化ヒト血清（ＩＨＳ）を作製し、陰性対照とした。
【０１５５】
実験前に、抗ＳＯＸ２−Ｔ１１８ｐ及び抗ＳＯＸ２−Ｋ１１９ｍｅのポリクローナル抗体を製造した。表２において、本研究で用いた市販の抗体情報をリストアップした。
【０１５６】
ＰＩ３Ｋ阻害剤であるＩＰＩ−１４５（ｄｕｖｅｌｉｓｉｂ）、ＣＤＫ６阻害剤であるａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ、ＦＧＦＲ１／２阻害剤であるＡＺＤ４５４７、ＦＡＫ阻害剤であるＰＦ−５７３２２８、Ｓｙｋ阻害剤であるＲ７８８、Ｓｒｃ阻害剤であるｓａｒａｃａｔｉｎｉｂ及びプレドニゾロン（ｐｒｅｄｎｉｓｏｌｏｎｅ）は、ＭｅｄＣｈｅｍＥｘｐｒｅｓｓ会社（ＭｏｎｍｏｕｔｈＪｕｎｃｔｉｏｎ，ＮＪ）から購入した。
【０１５７】
三、ＲＣＨＯ薬剤耐性ＤＬＢＣＬ細胞の作製及び特性
【０１５８】
本願では、リツキシマブによって媒介される補体依存性細胞毒性（ＣＤＣ）に対して耐性を有するＬＹ８細胞及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞を作製した。簡単に言うと、オリジナルＬＹ８（ＬＹ８−ＯＲＩ）細胞及びオリジナルＮＵ−ＤＵＬ−１（ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＯＲＩ）細胞に対して、２０％（ｖ／ｖ）のＮＨＳを含むリツキシマブ（Ｒｏｃｈｅ会社、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を４μｇ／ｍＬの濃度から次第に３２μｇ／ｍＬの濃度まで上げて処理することにより薬剤耐性細胞を作製した。リツキシマブに対して薬剤耐性の細胞を、ＬＹ８−Ｒ及びＮＵ−ＤＵＬ−１−Ｒで示す。毎２１日置きに２０％（ｖ／ｖ）のＮＨＳを含む３２μｇ／ｍＬリツキシマブを処理し、ＬＹ８−Ｒ及びＮＵ−ＤＵＬ−１−Ｒ細胞が薬剤耐性を維持するようにする。蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）法を用いて、ヨウ化プロピジウム（ＰＩ）染色陽性の細胞を選別することで、ＣＤＣにより誘導された細胞溶解を評価した。
【０１５９】
更に、本願では、化学療法薬剤に対して薬剤耐性を有するＬＹ８及びＮＵ−ＤＵＬ−１細胞を作製した。簡単に言うと、上昇した濃度で、即ちドキソルビシン（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ会社、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）及びビンクリスチン（Ｓｅｌｌｅｃｋ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ会社、Ｈｏｕｓｔｏｎ，ＴＸ）を５０：１．４の臨床比率でＬＹ８−ＯＲＩ及びＮＵ−ＤＵＬ−１−ＯＲ１細胞を処理した。ＬＹ８細胞に対する最大の薬剤耐性用量は、ドキソルビシンが１２５ｎｇ／ｍＬ及びビンクリスチンが３．５ｎｇ／ｍＬであり、ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞に対する最大の薬剤耐性用量は、ドキソルビシンが２５ｎｇ／ｍＬ及びビンクリスチンが０．７ｎｇ／ｍＬである。その後、これらの細胞を毎２１日置きに２μｇ／ｍＬの４−ヒドロペルオキシシクロホスファミド（４−ＨＣ）（Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ会社、Ｓａｎｔａ  Ｃｒｕｚ，ＣＡ）で３回の周期で処理した。得られたＣＨＯ薬剤耐性の細胞をそれぞれＬＹ８−ＣＨＯ及びＮＵ−ＤＵＬ−１−ＣＨＯと呼ぶ。毎２１日置きにドキソルビシン、ビンクリスチン及び４−ＨＣを処理して、ＣＨＯ薬剤耐性の細胞がＣＨＯに対する寛容性を維持するようにする。
【０１６０】
類似の方法により、ＬＹ８−Ｒ及びＮＵ−ＤＵＬ−１−Ｒ細胞を処理し、薬剤耐性のＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞及び薬剤耐性のＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞を作製した。ＲＣＨＯの薬剤耐性を維持させるために、毎２１日置きに、まず２０％（ｖ／ｖ）のＮＨＳを含む３２μｇ／ｍＬのリツキシマブでＬＹ８−ＲＣＨＯ細胞及びＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ細胞を処理し、その後、ドキソルビシン、ビンクリスチン及び４−ＨＣで処理する。ドキソルビシン、ビンクリスチン及び４−ＨＣで処理して４８時間後、一連のＣＣＫ−８測定により、ＣＨＯ及びＲＣＨＯに対する薬剤耐性を確定する。
【０１６１】
四、Ａｌｄｅｆｌｕｏｒ解析
【０１６２】
ＡＬＤＨ１は、いろんな種類の正常及びがんの幹細胞の選択性マーカーであり、造血幹細胞を含む。そこで、本願では、ＡＬＤＨ１陽性細胞を測定することにより造血系悪性腫瘍におけるがん幹細胞の数量を評価する。前述したように、本願では、ＡＬＤＥＦＬＵＯＲＴＭ試薬キット（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ会社、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，ＢＣ，ＣＡ）を用いて、高いＡＬＤＨ１活性を備える群体を検測した。簡単に言うと、１ｘ１０６個の細胞を１μＭの濃度のＭＡＬＤＨ１の基質であるＢＡＡＡを含む１ｍＬの測定緩衝液に懸濁した。その後、懸濁した細胞を２つの試料に分け、一つは陰性対照とし、もう一つは測定サンプルとする。陰性対照を形成するために、５０ｍＭのＤＥＡＢ（ＡＬＤＨ特異的阻害剤である）を一つの等分のサンプルに添加した。その後、フローサイトメトリー分析を行う前に、細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。
【０１６３】
五、球形成解析
【０１６４】
細胞を０．４％（ｖ／ｖ）のＢＳＡ、ビタミンＡを含まない０．２×Ｂ２７（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ会社、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、１０ｎｇ／ｍＬの濃度の組換えＥＧＦ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ会社、ＲｏｃｋｙＨｉｌｌ，ＮＪ）、１０ｎｇ／ｍＬの濃度の組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ会社、Ｒｏｃｋｙ  Ｈｉｌｌ，ＮＪ）及び５μｇ／ｍＬの濃度のインスリン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ会社、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を含む無血清培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、３：１で混合）に懸濁させた。その後、細胞を１×１０４個細胞／ｍＬの密度で超低付着性の２４穴プレートに播種した。毎７日置きに一回培地を交換し、第１４日目に球体をカウントし細胞を集めた。上記培地を用いて、クローン密度に従い球細胞を継代培養した。継代培養を３回行った後の第１４日に写真を撮って画像を得た。
【０１６５】
六、ＣｙｔｏＴｏｘ−ＧｌｏＴＭ細胞毒性解析
【０１６６】
細胞を１×１０４个／１００μＬ／穴の密度で９６穴プレートに播種した。ＣｙｔｏＴｏｘ−ＧｌｏＴＭ細胞毒性測定を行う前に、ＣＨＯを含有又は含有しない且つ濃が次第に上昇するように調製したＩＰＩ−１４５、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂ、ＡＺＤ４５４７、ＰＦ−５７３２２８、Ｒ７８８またはｓａｒａｃａｔｉｎｉｂで細胞を４８時間予備処理した。ＣｙｔｏＴｏｘ−ＧｌｏＴＭ細胞毒性測定試薬キット（Ｐｒｏｍｅｇａ会社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用い、その使用説明書に従って細胞毒性測定を行った。簡単に言うと、５０μＬのＣｙｔｏＴｏｘ−ＧｌｏＴＭ細胞毒性測定試薬を全部の穴に加え、軌道振盪機により混合し、次いで室温下で１５分間インキュベートした。ＳｙｎｅｒｇｙＨＴマイクロプレートリーダー（ＢｉｏＴｅｋ会社、ＢｉｏｔｅｋＷｉｎｏｏｓｋｉ，ＭＮ）にて実験性死細胞の発光量を測定した。その中、５０μＬの溶解液を全部の穴に加えて混合し、室温下で１５分間インキュベートした後、総発光量を測定した。下記式により細胞毒性を計算する。
細胞毒性（％）＝実験性死細胞発光量／総発光量×１００％。
【０１６７】
七、ＩＨＣ染色
【０１６８】
患者または動物モデルからの腫瘍組織を４％のホルマリンで固定し、パラフィン包理を行い、切片を作製した。パラフィン切片を３％の過酸化水素において３７℃下で１５分間インキュベートすることで内因性ペルオキシダーゼをブロックし、０．０１ＭのＰＢＳで洗浄し、次いでＥＤＴＡ緩衝液において抗原回復を行った。その後、切片とウサギ抗抗ＳＯＸ２ものくろナーる抗体（１：２００、Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ会社、Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ）を４℃下で一晩インキュベートした。ＰＢＳにおいて３回洗浄した後、切片にペルオキシダーゼが結合されたＡｆｆｉｎｉＰｕｒｅヤギ抗ウサギＩｇＧＨ＆Ｌ（１：２００、Ｐｒｏｔｅｉｎｔｅｃｈ会社、Ｃｈｉｃａｇｏ，ＩＬ）を加え、室温下で１時間インキュベートした。その後、ＧＴＶｉｓｉｏｎＩＩＩ免疫組織化学測定試薬キット（ＧＫ５００７０５、ＧｅｎｅＴｅｃｈ会社、中国上海）を用い、その使用説明書に従って免疫反応性を測定した。表２において、組織マイクロアレイの免疫組織化学染色に用いる一次抗体の希釈比率をリストアップした。顕微鏡下で、３つの独立の切片において、ＳＯＸ２、ｐ−ＡＫＴ、ＣＤＫ６、ＦＧＦＲ１及びＦＧＦＲ２に対する免疫染色定量スコアを計算した。計算式：スコア＝３（強陽性）×パーセンテージ＋２（中程度陽性）×パーセンテージ＋１（弱陽性）×パーセンテージ＋０（陰性）×パーセンテージ。
【０１６９】
八、ウエスタンブロット解析
【０１７０】
標準的方法によりウエスタンブロット解析を行った。関連抗体は、表２に示した。
【０１７１】
九、定量的リアルタイムＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）
【０１７２】
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用い、細胞から総ＲＮＡを抽出し、続いて逆転写システム（Ｐｒｏｍｅｇａ会社、Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を使用して、ＲＮＡをｃＤＮＡに転写させた。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）及び遺伝子特異的プライマーを用いて、ＲｏｃｈｅＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ４８０システム（Ｒｏｃｈｅ会社、Ｂａｓｅｌ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）にて添加したｃＤＮＡを標準化し且つ４０サイクルの増幅を行った。β−ａｃｔｉｎをコードするＡＣＴＢ遺伝子を内在性コントロールとして使用し、毎サンプルは、３回の繰り返し解析を行った。表３において、ｑＲＴ−ＰＣＲに用いたプライマーをリストアップした。
【０１７３】
十、ＦＡＣＳ解析
【０１７４】
ＰＢＳで洗浄した後、細胞をフルオレセインが結合された抗体とともに３０分間インキュベートし、次いで洗浄し且つ細胞をＰＢＳに再懸濁した。フローサイトメトリー解析は、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００ＭＰＬ機器（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ会社、Ｂｒｅａ，ＣＡ）にて行い、ＦｌｏｗＪｏソフト（Ａｓｈｌａｎｄ会社、ＯＲ）にて解析を行った。その後、ＭｏＦｌｏＸＤＰソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ会社、Ｂｒｅａ，ＣＡ）を用い、その相対的蛍光強度により細胞選別を行った。
【０１７５】
十一、ＥｄＵ細胞増殖測定
【０１７６】
ＥｄＵ測定前に、ＲＣＨＯ薬剤耐性のＤＬＢＣＬ細胞を１μＭの濃度のｄｕｖｅｌｉｓｉｂ、ａｂｅｍａｃｉｃｌｉｂまたはＡＺＤ４５４７で４８時間または１２０時間予備処理して。１２０時間処理する場合は、４８時間時に１μＭの阻害剤を含有する新しい培地で元の培地を交換する。Ｃｅｌｌ−ＬｉｇｈｔＥｄＵＡｐｏｌｌｏ６４３インビトロサイトメとリー試薬キット（広州ＲｉｂｏＢｉｏ有限会社、広州，中国）を用い、その使用説明書に従ってＥｄＵ細胞増殖測定を行った。続いて、Ｃｙｔｏｍｉｃｓ  ＦＣ５００ＭＰＬフローサイトメトリー（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｂｒｅａ，ＣＡ）にてＥｄＵ染色陽性細胞を検出した。
【０１７７】
十二、プラスミド作製及びレンチウイルスの形質導入
【０１７８】
Ａ５４９細胞のｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅を行い、ヒトＳＯＸ２をコードするＤＮＡ配列（ＣＤＳ）を得た。通過ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩのエンドヌクレアーゼ部位を利用して、該配列をｐＣＤＨ  ｃＤＮＡクローン及び発現型レンチウイルスベクター（ｃａｔ＃ＣＤ５１１Ｂ−１、Ｓｙｓｔｅｍ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ会社、Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，ＣＡ９４３０３）にクローニングし、ＯＣＩ−ＬＹ８及びＯＣＩ−ＮＵ−ＤＵＬ−１細胞において、ＳＯＸ２を安定に過剰発現させた。ホタルルシフェラーゼ遺伝子のＣＤＳは、ｐＧＬ３−ＢａｓｉｃプラスミドからＰＣＲ増幅を通じて獲得し、ＥｃｏＲＩ及びＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ部位を利用してｐＣＤＨｃＤＮＡクローン及び発現型レンチウイルスベクターにさにインサートした。ｐＬＫＯ．３Ｇクローニングベクター（プラスミド＃１４７４８、Ａｄｄｇｅｎｅ会社、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）を用いて、Ｓｃｒａｍｂｌｅ（ＳＣＲ）、ＳＯＸ２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＣＤ７９Ａ及びＣＣＲ７のｓｈＲＮＡプラスミドを作製した。２９３ＦＴ細胞とｐＣＤＨまたはｐＬＫＯ．３Ｇプラスミド及びｐＭＤ．２ＧとｐｓＰＡＸ２プラスミドを共トランスフェクトして、それぞれＳＯＸ２、ホタルルシフェラーゼを過剰発現するレンチウイルス、またはＳＯＸ２、ＩＴＧＡ１、ＩＴＧＢ５、ＣＤ７９Ａ、またはＣＣＲ７をノックダウンしたレンチウイルスを作製した。その後、該レンチウイルスをＯＣＩ−ＬＹ８、ＯＣＩ−ＮＵ−ＤＵＬ−１、ＬＹ８−ＲＣＨＯまたはＮＵ−ＤＵＬ−１−ＲＣＨＯ培地において４８時間インキュベートした。本願では、レンチウイルスを形質導入した全部の細胞を、何れもＧＦＰを利用して、ＭｏＦｌｏＸＤＰソーター（Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ会社、Ｂｒｅａ，ＣＡ）選別した。関連ｓｈＲＮＡオリゴヌクレオチド配列の上方は表３に示した。
【０１７９】
十三、ＲＮＡ配列測定
【０１８０】
ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ会社、Ｇｒａｎｄ  Ｉｓｌａｎｄ，ＮＹ）を用いて、ＬＹ８−ＯＲＩ、ＬＹ８−Ｒ、ＬＹ８−ＣＨＯ、ＬＹ８−ＲＣＨＯ、ＮＵ−ＤＵＬ−１、ＮＵ−ＤＵＬ−１−Ｒ、ＮＵ−ＤＵＬ−１−ＣＨＯ及びＮＵ−ＤＵＬ−ＲＣＨＯ細胞から、総ＲＮＡを抽出した。３つの異なる継代からの各群ごとの総ＲＮＡをそれぞれ合わせた。上海Ｎｏｖｅｌｂｉｏ有限会社が、彼らから構築した方法に基づき、ＲＮＡ配列測定（ＲＮＡ−ｓｅｑ）及び生物情報学的分析を行った。本願では、ＤＥｓｅｑ計算方法により、発現差異がある遺伝子をスクリーニングし、その有意性及び偽発見率（ＦＤＲ）解析は以下の標準に従った。即ち、（１）倍数変化＞１．５または＜０．６６７、（２）ＦＤＲ＜０．０５である。ＫＥＧＧデータベースに基づき、経路分析を用いて差異遺伝子の有意経路を確定した。ＯＲＩ−Ｒ−ＲＣＨＯ及びＯＲＩ−ＣＨＯ−ＲＣＨＯ配列のシグナル密度により、シリーズクラスタ分析を行い、発現の全般的傾向及びモデルのプロファイルを確定した。Ｆｉｓｈｅｒ精確検定及び多重比較検定は、有意経路の選択に用いられ、有意性閾値はＰ値及びＦＤＲにより定義された。ＯＲＩ−Ｒ−ＲＣＨＯ及びＯＲＩ−ＣＨＯ−ＲＣＨＯ配列において、増加傾向が有意であるエンリッチ経路をスクリーニングし、次いでＣｙｔｏｓｃａｐｅソフトウェアを利用してこれら群の間におけるこれら経路の相互作用頻度を解析した。
【０１８１】
本願のＲＮＡ−ｓｅｑデータは、ＧＥＯシリーズの登録番号であるＧＳＥ１１２９８９及びＧＳＥ１１３００１によりＮＣＢＩ  ＧＥＯデータベースから獲得することができる。
【０１８２】
十四、遺伝子セットエンリッチメント解析
【０１８３】
Ｂｒｏａｄ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ブロードインスティテュート、ＭＩＴ）のＧＳＥＡソフトウェアを利用して、ＲＮＡ−ｓｅｑの差異発現遺伝子機能に基づいた遺伝子セットエンリッチメント解析（ＧＳＥＡ）を行った。該ソフトウェアの予備オーダリングバージョンは、有意にエンリッチされた経路の確定に用いられ、ＦＤＲ＜０．２５であるエンリッチ経路が有意差があるとして認められた。本願で用いられたＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路の遺伝子セットは、ＰａｔｈＣａｒｄｓ経路統一データベース（バージョン４．６．０．３７，Ｗｅｉｚｍａｎｎ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ  ｏｆ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）におけるＰＩ３Ｋ−ＡＫＴシグナル伝達経路ＳｕｐｅｒＰａｔｈの３４１個の遺伝子からなる。ＧＳＥＡ用語であるＫＥＧＧ＿ＣＨＥＭＯＫＩＮＥ＿ＳＩＧＮＡＬＩＮＧ＿ＰＡＴＨＷＡＹもケモカインシグナル伝達経路の特定に用いられる。
【０１８４】
十五、統計方法
【０１８５】
特に説明がない限り、本願に実施例におけるデータは、平均値±標準偏差で示したものである。両側スチューデントｔ検定不対応データを利用して２つの群の間の有意差を確定し、且つＰ＜０．０５である時、統計的に有意差があるとして認められた。組織マイクロアレイのＩＨＣ染色のスコアについて、両側対応ｔ検定により有意差を確定し、且つＰ＜０．０５である時、統計的に有意差があるとして認められた。動物モデルの総光子フラックスについて、片側Ｍａｎｎ−Ｗｈｉｔｎｅｙ検定により有意差を確定し、且つＰ＜０．０５である時、統計的に有意差があるとして認められた。Ｍａｎｔｅｌ−Ｃｏｘ検定を利用して、２つの群の異種移植モデルの生存率を比較し、Ｐ＜０．０５である時、統計的に有意差があるとして認められた。
【０１８６】
表２．実施例で使用した抗体の製品リスト
【０１８７】
2021532168.tif 000011
【０１８８】
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【０１８９】
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【０１９０】
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【０１９１】
表３．実施例で使用したプライマー及びｓｈＲＮＡの配列リスト
【０１９２】
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【０１９３】
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【０１９４】
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【０１９５】
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【０１９６】
以上にように本願の好適な実施例を詳しく説明した。当業者にとって、創造的な労働費やしなく、本願の構想に基づき、いろんな変更及び変化がなし得ることは理解するであろう。従って、当業者が本願の構想に基づき、現有技術の元で、論理的分析、推理、又は有限の実験を通じて得られた技術方案は、何れも請求項により確定される保護範囲に含まれるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【図４５】
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【図４６】
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【図４７】
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【図４８】
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【図４９】
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【図５０】
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【図５１】
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【図５２】
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【図５３】
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【図５４】
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【図５５】
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【図５６】
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【図５７】
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【図５８】
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【図５９】
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【図６０】
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【図６１】
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【図６２】
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【図６３】
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【図６４】
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【図６５】
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【図６６】
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【図６７】
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【図６８】
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【図６９】
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【図７０】
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【図７１】
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【図７２】
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【図７３】
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【図７４】
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【図７５】
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【図７６】
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【図７７】
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【図７８】
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【図７９】
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【図８０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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