(57)【要約】  本発明は、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体およびその製造方法と使用を提供する。具体的に、本発明は、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体であって、ＢＣＭＡを標的とするｓｃＦｖ、ヒンジ領域、膜貫通領域、および細胞内シグナルドメインを含む受容体を提供する。本発明は、当該キメラ抗原受容体をコードする核酸分子および相応する発現ベクター、ＣＡＲ−Ｔ細胞ならびにその使用を提供する。本発明のキメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡ陽性細胞を標的とするため、ＢＣＭＡ陽性のＢ細胞性リンパ腫、多発性骨髄腫や形質細胞性白血病などの疾患の治療に使用することができる。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインはＢＣＭＡを標的とする細胞外領域の抗体一本鎖可変領域の配列であることを特徴とする、前記キメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記抗原結合ドメインがＢＣＭＡ配列の２４〜４１番目のアミノ酸残基を標的とする抗体一本鎖可変領域の配列であることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記抗原結合ドメインの構造が下記式Ｉで表されることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
ＶＬ−ＶＨ                          （Ｉ）
（ただし、ＶＨは抗体の重鎖可変領域で、ＶＬは抗体の軽鎖可変領域で、「−」は連結ペプチドまたはペプチド結合である。
かつ、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号２で示され、
あるいは、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号３で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４で示され、
あるいは、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号６で示される。）
【請求項４】
前記キメラ抗原受容体の構造は下記式ＩＩで表されることを特徴とする、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
Ｓ−ＶＬ−ＶＨ−Ｈ−ＴＭ−Ｃ−ＣＤ３ζ        （ＩＩ）
（ただし、
Ｓは任意のシグナルペプチド（すなわちsignal peptide）である。
Ｈはヒンジ領域である。
ＴＭは膜貫通ドメインである。
Ｃは共刺激シグナル分子である。
ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列である。
ＶＨとＶＬはそれぞれ上記の通りである。）
【請求項５】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードすることを特徴とする核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子を含むことを特徴とするベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含むか、あるいは染色体に外来の請求項５に記載の核酸分子が組み込まれているか、あるいは請求項１に記載のキメラ抗原受容体を発現することを特徴とする宿主細胞。
【請求項８】
ＣＡＲ−Ｔ細胞を製造する方法であって、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞は、請求項１に記載のＣＡＲを発現する、
請求項５に記載の核酸分子または請求項６に記載のベクターをＴ細胞内に形質導入することによって、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞を得る工程、
を含むことを特徴とする、前記方法。
【請求項９】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体、請求項５に記載の核酸分子、請求項６に記載のベクター、または請求項７に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含有することを特徴とする製剤。
【請求項１０】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体、請求項５に記載の核酸分子、請求項６に記載のベクター、または請求項７に記載の宿主細胞の使用であって、癌または腫瘍を予防および／または治療する薬物または製剤の製造に使用されることを特徴とする、前記使用。
【請求項１１】
前記腫瘍が、ＢＣＭＡ陽性腫瘍であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記腫瘍が、ＢＣＭＡ陽性のＢ細胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、または形質細胞性白血病であることを特徴とする、請求項１０に記載の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬の分野に関し、より具体的に、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体およびその製造方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＣＭＡはＢ細胞成熟抗原で、ＣＤ２６９またはＴＮＦＲＳＦ１７とも呼ばれ、腫瘍壊死因子受容体スーパーファミリーのメンバーで、そのリガンドはＢ細胞活性化因子（ＢＡＦＦ）および増殖誘導リガンド（ＡＰＲＩＬ）である。
ＢＣＭＡとＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの結合はＮＦ−ｋＢを活性化させ、抗アポトーシスＢｃｌ−２のメンバー、たとえばＢｃｌ−ｘＬまたはＢｃｌ−２およびＭｃｌ−１の上方調節を誘導する。ＢＣＭＡとそのリガンドの相互作用は様々な面から体液免疫、Ｂ細胞の生長、分化を調節することによって人体内環境の安定した平衡を維持する。
【０００３】
ＢＣＭＡの発現はＢ細胞系に限られ、形質芽球では、形質細胞および一部の成熟Ｂ細胞で発現され、末梢Ｂ細胞の分化時に増加するが、一方、大半のＢ細胞、たとえばナイーブＢ細胞、メモリーＢ細胞や胚中心Ｂ細胞およびほかの器官では発現されない。ＢＣＭＡの発現は骨髄における長寿で、定着した形質細胞に重要であることが報告された。そのため、ＢＣＭＡ欠陥マウスでは、骨髄における形質細胞は減少するが、脾臓における形質細胞レベルは影響されない。成熟Ｂ細胞はＢＣＭＡノックアウトマウスにおいて正常に形質細胞に分化する。ＢＣＭＡノックアウトマウスは見かけはすべて正常で、健康そうで、しかもＢ細胞の数が正常であるが、形質細胞は長期間生存することができない。
【０００４】
ＢＣＭＡは悪性形質細胞でも高度発現され、たとえば多発性骨髄腫や形質細胞性白血病、ホジキンリンパ腫の患者のＨＲＳ細胞でもＢＣＭＡが検出された。米国では、血液系の悪性腫瘍は悪性腫瘍全体の約１０％を占め、骨髄腫は悪性血液腫瘍全体の１５％を占める。文献では、ＢＣＭＡの発現は多発性骨髄腫の疾患進展に関連することが報告された。ＢＣＭＡ遺伝子は骨髄腫の検体では高度発現されるが、慢性リンパ性白血病、急性リンパ性白血病、急性Ｔリンパ性白血病では発現レベルが低い。ＢＣＭＡリガンドであるＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬを過剰発現するネズミモデルにおいて、Ｂ細胞リンパ腫が顕著に増殖する。ＢＣＭＡと結合するリガンドはＢＣＭＡを発現する多発性骨髄腫の増殖と生存を調節することができることが証明された。ＢＣＭＡとＢＡＦＦおよびＡＰＲＩＬの結合は悪性形質細胞を生存させることができるため、ＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞を消耗させ、ＢＣＭＡリガンドと受容体の間の相互作用を破壊することは、多発性骨髄腫またはほかのＢＣＭＡ陽性Ｂ細胞性悪性リンパ腫に対する治療効果を改善することができる。
【０００５】
多発性骨髄腫は、形質細胞腫またはケーラー病とも呼ばれ、難治性のＢ細胞系の悪性腫瘍で、特徴は形質細胞の異常増殖で、形質細胞は白血球の種類の一つで、抗体を生成する役割を担う。米国国立癌研究所によって２０１７年に発表されたデータでは、骨髄腫は腫瘍症例全体の１．８％を占め、致死率が２．１％であることが示されている。２０１０年−２０１４年の統計結果では、毎年の発症率が約１０万分の６．６で、死亡率が約５０％であることが示されている。多発性骨髄腫は、中高年疾患に属し、欧米では発症年齢の中央値は６８歳で、男性は女性よりも多く、我が国の統計では、発症年齢のピークは５５−６５歳で、男女比は２．３５：１で、我が国では、多発性骨髄腫の確実な流行病学の調査資料がまだないが、一般的に、発症率が周辺の東南アジアと日本に近く、約１０万分の１であると推測されている。多発性骨髄腫の従来の治療手段は、化学治療および造血幹細胞移植を含むが、これらの方法は再発率が高い。ボルテゾミブ（ＰＳ−３４１）は初めてのプロテアソーム阻害剤で、２００３年にＦＤＡによって単独または既存薬物との併用で再発性・難治性の多発性骨髄腫の治療への使用が許可され、結果は喜ばしいものであった。当該薬物は２００５年に中国でも市販され、現在、サリドマイド、デキサメタゾンなどとともに多発性骨髄腫の治療によく使用される選択の一つになっている。多発性骨髄腫の治療方法は、通常、併用のものであるが、同時に複数の薬物を使用すると、費用が高価で、副作用が累積するという、よくない結果もある。臨床では、多発性骨髄腫を治療する新規な方法の開発がまだ切望されている。
【０００６】
最近、免疫療法、特に養子Ｔ細胞療法は、血液系の悪性腫瘍を治療する臨床試験において強い治療効果および明るい将来性が示されている。Ｔ細胞はキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するように遺伝子修飾されてもよく、抗原認識部分およびＴ細胞活性化領域を含む。ＣＡＲはモノクローナル抗体の抗原結合の性質を利用してＴ細胞の特異性と反応性をリダイレクトしてＭＨＣに拘束されずにターゲッティングすることができる。このような非ＭＨＣ拘束性抗原認識によって、ＣＡＲを発現するＴ細胞は抗原を加工せずに抗原を認識するため、腫瘍の逃避の主な機序の一つが避けられる。そのほか、ＣＡＲは内因性ＴＣＲのα鎖、β鎖と二量体になることがない。
【０００７】
現在、海外では既に２つのＣＤ１９を標的とするキメラ抗原受容体Ｔ細胞療法（ＣＡＲ−Ｔ）の製品が市販され、児童と若年の患者の急性リンパ性白血病の治療および成人の再発性または難治性の大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫の第二選択以上の治療に使用される。しかしながら、ＣＤ１９は多発性骨髄腫の悪性形質細胞において発現されることが少ない。本分野では、多発性骨髄腫を治療する、ＢＣＭＡを標的とするＣＡＲ−Ｔ製品の開発が切望されている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００８】
発明の概要
本発明の目的は、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体およびその製造方法と使用を提供することにある。
具体的に、本発明の目的は、ＢＣＭＡ抗原を標的とするキメラ抗原受容体の配列、およびその修飾Ｔ細胞（ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ）の製造方法と活性同定を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００９】
本発明は、ＢＣＭＡ陽性のＢ細胞性リンパ腫を治療するためのキメラ抗原受容体の構造を提供する。
本発明の第一の側面では、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（配列）であって、前記キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインはＢＣＭＡを標的とする細胞外領域の抗体一本鎖可変領域の配列であるものを提供する。
もう一つの好適な例において、前記の抗原結合ドメインはＢＣＭＡ配列の２４〜４１番目のアミノ酸残基を標的とする抗体一本鎖可変領域の配列である。
もう一つの好適な例において、前記のＢＣＭＡ配列のＮＣＢＩ登録番号はＡＹ６８４９７５．１である。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記の抗原結合ドメインの構造は、下記式Ｉで表される。
ＶＬ−ＶＨ                          （Ｉ）
（ただし、ＶＨは抗体の重鎖可変領域で、ＶＬは抗体の軽鎖可変領域で、「−」は連結ペプチドまたはペプチド結合である。
かつ、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号２で示され、
あるいは、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号３で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４で示され、
あるいは、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号６で示される。）
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記の連結ペプチドのアミノ酸配列は配列番号１０または配列番号１１で示される。
もう一つの好適な例において、前記の抗体一本鎖可変領域はヒト化の抗体一本鎖可変領域、ネズミ由来の抗体一本鎖可変領域、ヒトとネズミのキメラの抗体一本鎖可変領域である。
もう一つの好適な例において、前記キメラ抗原受容体の構造は、下記式ＩＩで表される。
Ｓ−ＶＬ−ＶＨ−Ｈ−ＴＭ−Ｃ−ＣＤ３ζ        （ＩＩ）
（ただし、
Ｓは任意のシグナルペプチド（すなわちsignal peptide）である。
Ｈはヒンジ領域である。
ＴＭは膜貫通ドメインである。
Ｃは共刺激シグナル分子である。
ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列である。
ＶＨとＶＬはそれぞれ上記の通りである。）
【００１２】
もう一つの好適な例において、前記のＳは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ４、ＣＤ１３７、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質のシグナルペプチドである。
もう一つの好適な例において、前記のＳは、ＣＤ８由来のシグナルペプチドである。
もう一つの好適な例において、Ｓのアミノ酸配列は、配列番号９で示される。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記のＨは、ＣＤ８、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質のヒンジ領域である。
もう一つの好適な例において、前記のＨは、ＣＤ８由来のヒンジ領域である。
もう一つの好適な例において、Ｈのアミノ酸配列は、配列番号１２で示される。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記のＴＭは、ＣＤ２８、ＣＤ３ε、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１３７、ＣＤ１５４、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質の膜貫通ドメインである。
もう一つの好適な例において、前記のＴＭは、ＣＤ８由来の膜貫通ドメインである。
もう一つの好適な例において、ＴＭの配列は、配列番号１３で示される。
【００１５】
もう一つの好適な例において、前記のＣは、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ７０、ＣＤ１３４、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＰＤ１、Ｄａｐ１０、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、ＮＫＧ２Ｄ、ＧＩＴＲ、ＴＬＲ２、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれるタンパク質の共刺激シグナル分子である。
もう一つの好適な例において、前記のＣは、４−１ＢＢ由来の共刺激シグナル分子である。
もう一つの好適な例において、Ｃのアミノ酸配列は、配列番号１４で示される。
もう一つの好適な例において、ＣＤ３ζのアミノ酸配列は、配列番号１５で示される。
【００１６】
本発明の第二の側面では、本発明の第一の側面に記載のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする核酸分子を提供する。
もう一つの好適な例において、前記核酸分子は単離されたものである。
本発明の第三の側面では、本発明の第二の側面に記載の核酸分子を含むベクターを提供する。
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、プラスミド、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、レトロウイルスベクター、トランスポゾン、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。
【００１７】
本発明の第四の側面では、本発明の第三の側面に記載のベクターを含有するか、あるいは染色体に外来の本発明の第二の側面に記載の核酸分子が組み込まれたか、あるいは本発明の第一の側面に記載のＣＡＲを発現する宿主細胞を提供する。
もう一つの好適な例において、前記細胞は単離された細胞で、および／または前記細胞は遺伝子改変された細胞である。
もう一つの好適な例において、前記細胞は哺乳動物の細胞である。
もう一つの好適な例において、前記細胞はＴ細胞である。
【００１８】
本発明の第五の側面では、ＣＡＲ−Ｔ細胞を製造する方法であって、前記のＣＡＲ−Ｔ細胞は本発明の第一の側面に記載のＣＡＲを発現し、
本発明の第二の側面に記載の核酸分子または本発明の第三の側面に記載のベクターをＴ細胞内に形質導入することによって、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞を得る工程、
を含む方法を提供する。
【００１９】
本発明の第六の側面では、本発明の第一の側面に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第二の側面に記載の核酸分子、本発明の第三の側面に記載のベクター、または本発明の第四の側面に記載の細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含有する薬物組成物を提供する。
もう一つの好適な例において、前記製剤は液体製剤である。
もう一つの好適な例において、前記製剤の剤形は注射剤である。
もう一つの好適な例において、前記製剤で、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の濃度が１×１０３〜１×１０８細胞／ｍＬ、好ましくは１×１０４〜１×１０７細胞／ｍＬである。
【００２０】
本発明の第七の側面では、本発明の第一の側面に記載のキメラ抗原受容体、本発明の第二の側面に記載の核酸分子、本発明の第三の側面に記載のベクター、または本発明の第四の側面に記載の細胞の使用であって、癌または腫瘍を予防および／または治療する薬物または製剤の製造における使用を提供する。
もう一つの好適な例において、前記腫瘍は、血液腫瘍、固形腫瘍、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記血液腫瘍は、急性骨髄球性白血病（ＡＭＬ）、多発性骨髄腫（ＭＭ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、びまん性大細胞型Ｂ細胞性リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記の固形腫瘍は、胃癌、胃癌腹膜転移、肝臓癌、白血病、腎臓腫瘍、肺癌、小腸癌、骨癌、前立腺癌、結直腸癌、乳癌、大腸癌、子宮頸癌、卵巣癌、リンパ癌、鼻咽頭癌、副腎腫瘍、膀胱腫瘍、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、脳膠細胞腫、子宮内膜癌、またはからなる群から選ばれる。
もう一つの好適な例において、前記の腫瘍は、ＢＣＭＡ陽性腫瘍、好ましくはＢＣＭＡ陽性のＢ細胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、または形質細胞性白血病である。
【００２２】
本発明の第八の側面では、本発明の第四の側面に記載の細胞を製造するためのキットであって、容器と、容器内にある本発明の第二の側面に記載の核酸分子、または本発明の第三の側面に記載のベクターを含むキットを提供する。
本発明の第九の側面では、本発明の第四の側面に記載の細胞、または本発明の第六の側面に記載の製剤の使用であって、癌または腫瘍の予防および／または治療における使用を提供する。
【００２３】
本発明の第十の側面では、疾患を治療する方法であって、治療が必要な対象に適量の本発明の第四の側面に記載の細胞、および／または本発明の第六の側面に記載の製剤を施用する工程を含む方法を提供する。
もう一つの好適な例において、前記疾患は癌または腫瘍である。
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００２４】
【図１】図１は、ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ比較例のクリーニング結果の図を示す。図１Ａは、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の遺伝子改変Ｔ細胞への形質導入効率の検出を示す。組み換えヒトＢＣＭＡタンパク質Ｆｃ断片染色法によって、６日目まで培養したＣＡＲ−ＢＣＭＡｓ細胞におけるＣＡＲ遺伝子によってコードされるタンパク質のＴ細胞の膜表面における発現レベルを同定した。順に１０日目まで培養したＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ細胞を１×１０５個取り、それぞれＢＣＭＡ陽性のＫ５６２−ＢＣＭＡ−Ｂ９腫瘍細胞系、天然のＢＣＭＡを発現する腫瘍細胞系ＭＭ．１ＳおよびＲＰＭＩ８２２６、ならびにＢＣＭＡ陰性のＫ５６２腫瘍細胞系と、あるいは腫瘍細胞を添加せずに、２００μｌのＧＴ−５５１培地において１：１の比率で１８ｈ培養した後、Ｔ細胞の膜表面おけるＣＤ１３７の発現レベル（図１Ｂ）および培養上清におけるＩＦＮγの分泌レベル（図１Ｃ）を検出した。
【図２】図２は、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の構造概略図である。ＣＡＲの構造は、リーダー配列、抗原認識配列、連結領域、膜貫通領域、共刺激因子シグナル領域およびＣＤ３ζシグナル伝達領域を含む。
【図３】図３は、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の遺伝子改変Ｔ細胞への形質導入効率の検出を示す。組み換えヒトＢＣＭＡタンパク質Ｆｃ断片染色法によって、７日目（図３Ａ）、２１日目（図３Ｂ）および２９日目（図３Ｃ）まで培養したＣＡＲ−ＢＣＭＡｓ細胞におけるＣＡＲ遺伝子によってコードされるタンパク質のＴ細胞の膜表面における発現レベルを同定した。
【００２５】
【図４】図４は、Ｔ細胞の膜表面おけるＣＤ１３７の発現レベル（図４Ａ）および培養上清におけるＩＦＮγの分泌レベル（図４Ｂ）を示す。具体的に、順に７日目まで培養したＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ細胞を１×１０５個取り、それぞれＢＣＭＡ陽性のＫ５６２−ＢＣＭＡ−Ｅ７腫瘍細胞系、ならびにＢＣＭＡ陰性のＫ５６２腫瘍細胞系と、あるいは腫瘍細胞を添加せずに、２００μｌのＧＴ−５５１培地において１：１の比率で１８ｈ培養した後、Ｔ細胞の膜表面おけるＣＤ１３７の発現レベルおよび培養上清におけるＩＦＮγの分泌レベルを検出した。
【図５】図５は、ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓによる腫瘍細胞の末期アポトーシスの誘導のレベルの検出を示す。具体的に、それぞれＣＦＳＥで標識されたＢＣＭＡ陰性（ＮＨ９２９）またはＢＣＭＡ陽性（ＮＨ９２９−ＢＣＭＡ）の腫瘍細胞系を１×１０４個取り、１００μｌのＧＴ−５５１培地において図面に示される比率で相応するＴ細胞とそれぞれ４ｈ共培養した後、１００μｌの２５％ＰＩ色素で１５ｍｉｎ染色した後、フローサイトメーターによってＣＦＳＥ陽性細胞におけるＰＩ陽性細胞の比率を分析した。この図では、ＰＩ陽性細胞の相応する共培養サンプルにおける統計分析結果が示された。
【００２６】
【図６】図６は、ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓによる腫瘍細胞の末期アポトーシスの誘導のレベルの検出を示す。図６Ａは、分析されたＣＡＲＴ陽性細胞の比率を示すが、ここで、ＮＴおよびＢＣＭＡ−ＭＯ６は６０％で計算された。それぞれＣＦＳＥで標識されたＢＣＭＡ陰性（ＮＨ９２９）またはＢＣＭＡ陽性（ＮＨ９２９−ＢＣＭＡ、ＭＭ．１Ｓ）の腫瘍細胞系を１×１０４個取り、１００μｌのＧＴ−５５１培地において図面に示される比率で相応するＴ細胞とそれぞれ４ｈ共培養した後、１００μｌの２５％ＰＩ色素で１５ｍｉｎ染色した後、フローサイトメーターによってＣＦＳＥ陽性細胞におけるＰＩ陽性細胞の比率を分析した。図６Ｂは、ＰＩ陽性細胞の相応する共培養サンプルにおける統計分析結果を示す。
【図７】図７は、ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓの骨髄腫細胞系ＲＰＭＩ−８２２６のＢ−ＮＤＧマウス体内における増殖に対する阻害作用を示す。対数増殖期にあるＲＰＭＩ−８２２６細胞を収集し、マウスの右側背部に４．０×１０６個の腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍体積が１２０ｍｍ３程度に達した時点で、動物を腫瘍体積によってランダムに４群に分けた後、それぞれ尾静脈から溶媒対照、７．５×１０６個のＮＴ（Ｔ細胞のみ）および７．５×１０６個のＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ細胞を注射した。図７Ａは、尾静脈からＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−１およびＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−２０を単回で注射することによって、有効にヒト骨髄腫ＲＰＭＩ−８２２６細胞の生長を抑制することができたことを示す。図７Ｂは、ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−１およびＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−２０は顕著にヒト骨髄腫ＲＰＭＩ−８２２６細胞の腫瘍担持マウスの生存時間を延ばすことができたことを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２７】
具体的な実施形態
本発明者らは、幅広く深く研究し、大量のスクリーニングを行ったところ、初めてＢＣＭＡ抗原を標的とするキメラ抗原受容体を得た。具体的に、本発明では、ＢＣＭＡ−１、ＢＣＭＡ−２０、ＢＣＭＡ−ＣＡ８、ＢＣＭＡ−ＭＯ６の４つのモノクローナル抗体配列に基づいて構築されたＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の構造を獲得し、そしてこれらのキメラ抗原受容体の初代Ｔ細胞における発現レベル、体外活性化能力および腫瘍細胞殺傷力などの面における分析と同定を完成させた。研究では、本発明のキメラ抗原受容体は、ＢＣＭＡ陽性細胞を標的とし、ＢＣＭＡ陽性のＢ細胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、形質細胞性白血病またはほかの疾患の治療に使用することができることが明らかになった。
【００２８】
具体的に、本発明では、異なるＣＡＲ構造とウイルス感染後の細胞膜表面における発現時間および発現強度の関連性を同定し、さらに異なるＣＡＲ構造のタンパク質発現の難易度の違いを同定したが、この発見はＣＡＲ構造によって同様の感染条件においてＣＡＲタンパク質の膜表面における発現レベルおよびＣＡＲＴの体内活性の持続性が変わることを示唆する。大量のスクリーニングによって、本発明の構造のＣＡＲを得たが、結果から、本発明におけるＣＡＲ構造によってコードされるタンパク質がいずれも十分な発現と膜局在化ができることが示された。
本発明において、ＢＣＭＡ抗原を標的とするＣＡＲ構造で修飾されたＴ細胞の製造プロセスを改良し、主に１％ヒト血清アルブミンを添加したＧＴ−５５１無血清培地で体外でリンパ球を培養した。
【００２９】
用語
本開示が理解しやすくなるように、まず、一部の用語を定義する。本願に用いられるように、本明細書で別途に明確に規定しない限り、以下の用語はいずれも下記の意味を有する。出願全体において、ほかの定義が記述されている。
用語「約」とは当業者によって決定される特定の値または組成の許容される誤差範囲内にある値または組成で、それによって部分的にどのように値または組成を計量または測定するかというのが決まる。
用語「投与」とは当業者に既知の様々な方法および送達システムの任意の一つによって本発明の製品を物理的に被験者に導入することで、静脈内、筋肉内、皮下、腹膜内、脊髄またはほかの胃腸外の投与経路、たとえば注射または輸注によるものを含む。
【００３０】
用語「抗体」（Ａｂ）はグロブリンを含むが、これに限定されず、特異的に抗原に結合し、かつジスルフィド結合を介して互いに連結した少なくとも２本の重（Ｈ）鎖および２本の軽（Ｌ）鎖あるいはその抗原結合部分を含む。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書でＶＨと略する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの定常ドメインＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書でＶＬと略する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメインＣＬを含む。ＶＨとＶＬ領域はさらに相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変領域に細分してもよく、これらはフレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれるより保存的な領域に散在している。各ＶＨとＶＬは３つのＣＤＲと４つのＦＲを含み、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で並ぶ。重鎖と軽鎖の可変領域は抗原と相互作用する結合ドメインを含有する。
【００３１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、標的特異的結合エレメント（抗原結合ドメインとも呼ばれる）を含む。細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達領域およびζ鎖部分を含む。共刺激シグナル伝達領域は、共刺激分子の細胞内ドメインの一部を含む。共刺激分子は、リンパ球の抗原に対する有効な応答に必要な細胞表面分子で、抗原受容体またはそのリガンドではない。
【００３２】
ＣＡＲの細胞外ドメインと膜貫通ドメインの間、またはＣＡＲの細胞内ドメインと膜貫通ドメインの間に、リンカーを導入してもよい。本明細書で用いられるように、用語「リンカー」とは、通常、膜貫通ドメインをポリペプチド鎖の細胞外ドメインまたは細胞内ドメインに連結させる作用を果たす任意のオリゴペプチドまたはポリペプチドをいう。リンカーは、０〜３００個のアミノ酸、好ましくは２〜１００個のアミノ酸、最も好ましくは３〜５０個のアミノ酸を含んでもよい。
本発明の一つの好適な実施形態において、本発明によって提供されるＣＡＲの細胞外ドメインはＢＣＭＡを標的とする抗原結合ドメインを含む。本発明のＣＡＲがＴ細胞において発現される場合、抗原結合の特異性に基づいて抗原を認識することができる。それが関連抗原に結合すると、腫瘍細胞に影響し、腫瘍細胞が成長せず、死亡するように、またはほかの形で影響され、そして患者の腫瘍負荷が軽減または解消する。抗原結合ドメインは、共刺激分子およびζ鎖から由来する一つまたは複数の細胞内ドメインと融合することが好ましい。好ましくは、抗原結合ドメインは４−１ＢＢシグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζシグナルドメインと組み合わせた細胞内ドメインと融合している。
【００３３】
本明細書で用いられるように、「抗原結合ドメイン」、「一本鎖抗体断片」とはいずれも抗原結合活性を有するＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単一のＦｖ断片である。Ｆｖ抗体は抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域を含有するが、定常領域がなく、かつすべての抗原結合部位を有する最小の抗体断片である。一般的に、Ｆｖ抗体はさらにＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含み、かつ抗原結合に必要な構造を形成することができる。抗原結合ドメインは、通常、ｓｃＦｖ（single-chain variable fragment、一本鎖可変断片）である。ｓｃＦｖの大きさは、通常、完全の抗体の１／６である。一本鎖抗体は一本のヌクレオチド鎖によってコードされる一本のアミノ酸鎖配列が好ましい。本発明の好適な形態として、前記ｓｃＦｖは特異的にＢＣＭＡ細胞外領域を認識する抗体、特に特異的にＢＣＭＡ配列の２４−４１番目のアミノ酸残基を認識する抗体を含み、好ましくは一本鎖抗体である。
【００３４】
ヒンジ領域と膜貫通領域（膜貫通ドメイン）について、ＣＡＲはＣＡＲの細胞外ドメインに融合した膜貫通ドメインを含むように設計してもよい。一つの実施形態において、天然のＣＡＲにおけるドメインの一つと関連する膜貫通ドメインが使用される。一部の例において、膜貫通ドメインを選択するか、アミノ酸置換で修飾することによって、このようなドメインが同様または相異の表面膜タンパク質の膜貫通ドメインに結合することを避けることで、受容体複合体のほかのメンバーとの相互作用を最小限にする。
本発明のＣＡＲにおける細胞内ドメインは、４−１ＢＢのシグナル伝達ドメインおよびＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインを含む。
【００３５】
好ましくは、本発明のＣＡＲの構造は、シグナルペプチド、抗原認識配列（抗原結合ドメイン）、連結領域、膜貫通領域、共刺激因子シグナル領域およびＣＤ３ζシグナル伝達領域（ζ鎖部分）を含み、連結順は以下の通りである。
［ＣＤ８  Ｓ］−［ＶＬ−リンカー−ＶＨ］−［ヒンジ−ＣＤ８ＴＭ］−［４−１ＢＢ］−［ＣＤ３ζ］
具体的に、本発明で使用される配列は以下の通りである。
（１）シグナルペプチドである、ＣＤ８由来のシグナルペプチド配列：
ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ  （配列番号９）
（２）ＢＣＭＡ−１抗体由来の一本鎖の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列：
ＤＩＶＬＴＱＳＰＰＳＬＡＭＳＬＧＫＲＡＴＩＳＣＲＡＳＥＳＶＴＩＬＧＳＨＬＩＨＷＹＱＱＫＰＧＱＰＰＴＬＬＩＱＬＡＳＮＶＱＴＧＶＰＡＲＦＳＧＳＧＳＲＴＤＦＴＬＴＩＤＰＶＥＥＤＤＶＡＶＹＹＣＬＱＳＲＴＩＰＲＴＦＧＧＧＴＫＬＥＩＫ  （配列番号７）
（３）ＢＣＭＡ−１抗体由来の一本鎖の重鎖可変領域（ＶＨ）配列：
ＱＩＱＬＶＱＳＧＰＥＬＫＫＰＧＥＴＶＫＩＳＣＫＡＳＧＹＴＦＴＤＹＳＩＮＷＶＫＲＡＰＧＫＧＬＫＷＭＧＷＩＮＴＥＴＲＥＰＡＹＡＹＤＦＲＧＲＦＡＦＳＬＥＴＳＡＳＴＡＹＬＱＩＮＮＬＫＹＥＤＴＡＴＹＦＣＡＬＤＹＳＹＡＭＤＹＷＧＱＧＴＳＶＴＶＳＳ  （配列番号８）
ここで、ＢＣＭＡ−１は、既に発表されたＣａｒ−Ｔ配列に含まれる抗体配列で、本願において対照として使用される。
【００３６】
（４）ＢＣＭＡ−２０抗体由来の一本鎖の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＧＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＰＬＩＹＹＴＳＮＬＱＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＭＧＱＴＩＳＳＹＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫ  （配列番号１）
（５）ＢＣＭＡ−２０抗体由来の一本鎖の重鎖可変領域（ＶＨ）配列：
ＥＶＱＬＶＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＦＤＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＶＷＶＳＳＩＴＴＧＡＤＨＡＩＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＡＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＶＲＨＧＹＹＤＧＹＨＬＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ  （配列番号２）
（６）ＢＣＭＡ−ＣＡ８抗体由来の一本鎖の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列：
ＤＩＱＬＴＱＴＴＳＳＬＳＡＳＬＧＤＲＶＴＩＳＣＳＡＳＴＴＴＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＤＧＴＶＥＬＶＩＹＹＴＳＮＬＨＧＧＧＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＹＳＬＴＩＧＹＬＥＰＥＤＶＡＴＹＹＣＱＱＹＲＫＬＰＷＴＦＧＧＧＳＫＬＥＩＫＲ  （配列番号３）
（７）ＢＣＭＡ−ＣＡ８抗体由来の一本鎖の重鎖可変領域（ＶＨ）配列：
ＥＶＱＬＱＱＳＧＡＶＬＡＲＰＧＡＳＶＫＭＳＣＫＧＳＧＹＴＦＴＮＹＷＭＨＷＶＫＱＲＰＧＱＧＬＥＷＩＧＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＫＡＫＬＴＡＶＴＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＴＮＥＤＳＡＶＹＹＣＴＲＧＡＩＹＮＧＹＤＶＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ  （配列番号４）
【００３７】
（８）ＢＣＭＡ−ＭＯ６抗体由来の一本鎖の軽鎖可変領域（ＶＬ）配列：
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＳＡＳＱＤＩＳＮＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＹＴＳＮＬＨＳＧＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＹＲＫＬＰＷＴＦＧＱＧＴＫＬＥＩＫＲ  （配列番号５）
（９）ＢＣＭＡ−ＭＯ６抗体由来の一本鎖の重鎖可変領域（ＶＨ）配列：
ＱＶＱＬＶＱＳＧＡＥＶＫＫＰＧＳＳＶＫＶＳＣＫＡＳＧＧＴＦＳＮＹＷＭＨＷＶＲＱＡＰＧＱＧＬＥＷＭＧＡＴＹＲＧＨＳＤＴＹＹＮＱＫＦＫＧＲＶＴＩＴＡＤＫＳＴＳＴＡＹＭＥＬＳＳＬＲＳＥＤＴＡＶＹＹＣＡＲＧＡＩＹＤＧＹＤＶＬＤＮＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ  （配列番号６）
（１０）ＢＣＭＡ−１の一本鎖可変領域の重鎖と軽鎖の間の連結配列：
ＧＳＴＳＧＳＧＫＰＧＳＧＥＧＳＴＫＧ  （配列番号１０）
（１１）ＢＣＭＡ−２０、ＢＣＭＡ−ＣＡ８、ＢＣＭＡ−ＭＯ６の一本鎖可変領域の重鎖と軽鎖の間の連結配列：
ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ  （配列番号１１）
【００３８】
（１２）ヒンジ領域および連結領域の配列：
ＦＶＰＶＦＬＰＡＫＰＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ  （配列番号１２）
（１３）膜貫通領域であるＣＤ８（ＣＤ８ＴＭ）抗原の膜貫通配列：
ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ  （配列番号１３）
（１４）共刺激因子シグナル領域である４−１ＢＢ由来の細胞内シグナル伝達モチーフの配列：
ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ  （配列番号１４）
（１５）ＣＤ３ζシグナル伝達領域であるＴＣＲ複合体におけるＣＤ３ζの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（immunorecceptor tyrosine-based activation motif、ＩＴＡＭ）の配列：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＱＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＱＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ  （配列番号１５）
【００３９】
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）
本明細書で用いられるように、用語「ＣＡＲ−Ｔ細胞」、「ＣＡＲ−Ｔ」、「ＣＡＲＴ」、「本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞」とはいずれも本発明の第二の側面に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞である。
本発明は、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の構造の構築、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の遺伝子改変Ｔ細胞の製造方法およびその活性同定に関する。
【００４０】
ベクター
所期の分子をコードする核酸配列は本分野で既知の組み換え方法、たとえば遺伝子を発現する細胞においてライブラリーをスクリーニングすること、既知の当該遺伝子を含むベクターから当該ベクターを得ること、あるいは標準の技術で当該遺伝子を含む細胞および組織から直接単離することによって得ることができる。必要により、興味のある遺伝子は合成によって生産することもできる。
また、本発明は本発明の発現カセットが挿入されたベクターを提供する。レトロウイルス、たとえばレンチウイルス由来のベクターは、導入された遺伝子の長期間で、安定した組み込みおよびその子細胞における増殖を可能にするため、長期間の遺伝子の移動を実現させる適切な道具である。レンチウイルスは、増殖しない細胞、たとえば肝細胞に導入することができるため、発癌性レトロウイルス、たとえばマウス白血病ウイルスのベクターを超える利点を持つ。また、低免疫原性という利点もある。
【００４１】
簡単に要約すると、通常、本発明の発現カセットまたは核酸配列を操作可能にプロモーターに連結し、そしてそれを発現ベクターに組み込む。当該ベクターは、真核細胞の複製および組み込みに適する。典型的なクローニングベクターは、所期の核酸配列の発現を調節するのに使用できる転写と翻訳のターミネーター、開始配列およびプロモーターを含む。
本発明の発現構築体は標準の遺伝子送達プロトコールによって、核酸免疫および遺伝子療法に使用することもできる。遺伝子送達の方法は、本分野では既知である。たとえば、米国特許番号５，３９９，３４６、５，５８０，８５９、５，５８９，４６６を参照し、ここで引用によって全文を取り込む。もう一つの実施形態において、本発明は、遺伝子療法ベクターを提供する。
【００４２】
当該核酸は様々な種類のベクターにクローニンすることができる。たとえば、当該核酸がクローニングできるベクターは、プラスミド、ファージ、ファージ誘導体、動物ウイルスやコスミドを含むが、これらに限定されない。特定の興味のあるベクターは、発現ベクター、複製ベクター、プローブ生成ベクターおよびシークエンシングベクターを含む。
さらに、発現ベクターはウイルスベクターの形態によって細胞に提供することができる。ウイルスベクターの技術は本分野公知のもので、そしてたとえばSambrookら（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）およびほかのウイルス学と分子生物学のマニュアルに記載されている。ベクターとして使用できるウイルスは、レトロウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ヘルペスウイルスやレンチウイルスを含むが、これらに限定されない。通常、適切なベクターは少なくとも１種類の有機体において作用する複製開始点、プロモーター配列、便利な制限酵素切断部位および１つまたは複数の選択できるマーカーを含む（たとえば、ＷＯ０１／９６５８４、ＷＯ０１／２９０５８および米国特許番号６，３２６，１９３）。
【００４３】
すでに多くのウイルスに基づいたシステムが開発され、哺乳動物細胞への遺伝子の導入に使用されている。たとえば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための便利なプラットホームを提供する。本分野で既知の技術によって選択された遺伝子をベクターに挿入してレトロウイルス顆粒にパッケージングすることができる。当該組み換えウイルスは、さらに分離されて体内または体外の対象細胞に送達される。多くのレトロウイルスシステムは本分野では既知である。一部の実施形態において、アデノウイルスベクターが使用される。多くのアデノウイルスベクターは本分野では既知である。一部の実施形態において、レンチウイルスベクターが使用される。
【００４４】
付加のプロモーターエレメント、たとえばエンハンサーは転写が開始する頻度を調節することができる。通常、これらは開始点の上流の３０〜１１０ｂｐの領域に位置するが、最近、多くのプロモーターは開始点の下流の機能エレメントも含むことが明らかになった。プロモーターエレメントの間の間隔は、エレメントが別のエレメントに対して逆さまになったか、移動した場合、プロモーターの機能が維持できるように、可動性のものが多い。チミジンキナーゼ（ｔｋ）プロモーターにおいて、プロモーターエレメントの間の間隔は、活性が低下することなく、５０ｂｐまで増加することができる。プロモーターによって、単一のエレメントは共同にまたは独立に作用し、転写を開始させる。
【００４５】
適切なプロモーターの一例は、前初期サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター配列である。当該プロモーター配列は操作可能にそれに連結した任意のポリヌクレオチド配列を高レベルで発現させることができる強力な構成型プロモーター配列である。適切なプロモーターのもう一例は、伸長因子１α（ＥＦ−１α）である。しかし、ほかの構成型プロモーター配列を使用してもよく、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）長鎖末端反復（ＬＴＲ）プロモーター、ＭｏＭｕＬＶプロモーター、トリ白血病ウイルスプロモーター、エプスタイン・バール（Epstein-Barr）ウイルス前初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、およびヒト遺伝子プロモーターを含むが、これらに限定されず、ヒト遺伝子プロモーターは、たとえばアクチンプロモーター、ミオシンプロモーター、ヘムプロモーターやクレアチンキナーゼプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。さらに、本発明は構成型プロモーターの使用に限定されない。誘導型プロモーターも本発明の一部として考えられる。誘導型プロモーターの使用は分子スイッチを提供し、それによって、そのような発現が必要な場合、操作可能に誘導型プロモーターに連結したポリヌクレオチド配列の発現を開始させ、あるいは発現が必要ではない場合、発現を終止させることができる。誘導型プロモーターの例は、メタロチオネインプロモーター、糖質コルチコイドプロモーター、プロゲステロンプロモーターやテトラサイクリンプロモーターを含むが、これらに限定されない。
【００４６】
ＣＡＲポリペプチドまたはその一部の発現を評価するため、細胞に導入された発現ベクターは選択できるマーカー遺伝子またはレポーター遺伝子のうちの任意の一方または両方を含むようにすることによって、ウイルスベクターで形質導入または感染された細胞群から発現細胞を同定および選択することもできる。また、選択できるマーカーは単独のＤＮＡ断片に載せて共形質移入のプロセスに使用することができる。選択できるマーカー遺伝子およびレポーター遺伝子の両者の隣接する領域には、いずれも適切な調節配列を有することによって、宿主細胞において発現できるようにしてもよい。有用な選択できるマーカーは、たとえば抗生物質耐性遺伝子、たとえばｎｅｏなどを含む。
【００４７】
レポーター遺伝子は形質導入された可能性のある細胞の同定および調節配列の機能性の評価に使用される。通常、レポーター遺伝子は、レシピエントの有機体または組織に存在しないか、レシピエントの有機体または組織によって発現され、そしてその発現が容易に検出できる性質、たとえば酵素活性によって明確に示すことができるポリペプチドをコードする遺伝子である。ＤＮＡがすでにレシピエントの細胞に導入されると、レポーター遺伝子の発現は適切な時間で測定される。適切なレポーター遺伝子は、ルシフェラーゼ、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチル基転移酵素、分泌型アルカリホスファターゼや緑色蛍光タンパク質をコードする遺伝子を含む（たとえば、Ui-Teiら，2000FEBS Letters479:79-82）。適切な発現系は公知で、かつ既知の技術によって製造するか、市販品として入手することができる。通常、最高レベルのレポーター遺伝子の発現を示す、少なくとも５つのフランキング領域を有する構築体はプロモーターと同定される。このようなプロモーター領域はレポーター遺伝子に連結され、かつ試薬のプロモーターを調節して転写を活性化させる能力の評価に使用することができる。
【００４８】
遺伝子を細胞に導入する方法および細胞において遺伝子を発現させる方法は、本分野では既知である。発現ベクターの内容において、ベクターは本分野における任意の方法によって宿主細胞、たとえば、哺乳動物、細菌、酵母や昆虫の細胞に容易に導入することができる。たとえば、発現ベクターは物理、化学または生物学の手段によって宿主細胞に導入することができる。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する物理的方法は、リン酸カルシウム沈殿、リポフェクション、粒子衝突、マイクロインジェクション、エレクトロポレーションなどを含む。ベクターおよび／または外来核酸を含む細胞を生産する方法は本分野では公知である。たとえば、Sambrookら（2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York）を参照する。ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する好適な方法は、リン酸カルシウム形質導入である。
【００４９】
興味のあるポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する生物学的方法は、ＤＮＡおよびＲＮＡベクターを使用する方法を含む。ウイルスベクター、特にレトロウイルスベクターは、すでに最も幅広く使用される、遺伝子を哺乳動物、たとえばヒト細胞に挿入する方法になっている。ほかのウイルスベクターはレンチウイルス、ポックスウイルス、単純ヘルペスウイルスＩ、アデノウイルスやアデノ随伴ウイルスなどからのものでもよい。例えば、米国特許番号５，３５０，６７４および５，５８５，３６２を参照する。
ポリヌクレオチドを宿主細胞に導入する化学的手段は、コロイド分散系、たとえば大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、および水中油型乳剤、ミセル、混合ミセル、やリポソームを含む脂質に基づいた系を含む。体外および体内の送達担体（delivery vehicle）として使用される例示的なコロイド系はリポソーム（たとえば、人工膜小胞）である。
【００５０】
非ウイルス送達系を使用する場合、例示的な送達担体はリポソームである。脂質製剤を使用し、核酸を宿主細胞に導入することが考えられる（体外、エクスビボ（ex vivo）または体内）。また、当該核酸は脂質と関連してもよい。脂質と関連した核酸は、リポソームの水性の内部に封入し、リポソームの脂質二重層に散在し、リポソームとオリゴヌクレオチドの両者に連結する連結分子を介してリポソームに接着し、リポソームに取り込まれ、リポソームと複合体化し、脂質を含む溶液に分散し、脂質と混合し、脂質と配合し、懸濁液として脂質に含まれ、ミセルに含まれるか、ミセルと複合体化し、あるいはほかの形態で脂質と結合することができる。組成物と関連する脂質、脂質／ＤＮＡまたは脂質／発現ベクターは溶液における具体的な構造のいずれにも限定されない。たとえば、二重層の構造において、ミセルとして、または「崩壊した」構造で存在してもよい。簡単に溶液に分散し、大きさや形状が異なる集合体を形成してもよい。脂質は脂肪物質で、天然の脂質でも合成の脂質でもよい。たとえば、脂質は細胞質で自然に発生する脂肪小滴、ならびに長鎖脂肪族炭化水素およびその誘導体、たとえば脂肪酸、アルコール類、アミン類、アミノアルコール類やアルデヒド類のような化合物を含む。
本発明の一つの好適な実施形態において、前記ベクターはレンチウイルスベクターである。
【００５１】
製剤
本発明は、本発明の第一の側面に記載のＣＡＲ−Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含有する製剤を提供する。一つの実施形態において、前記製剤は液体製剤である。好ましくは、前記製剤は注射剤である。好ましくは、前記製剤で、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞の濃度が１×１０３〜１×１０８細胞／ｍＬ、より好ましくは１×１０４〜１×１０７細胞／ｍＬである。
一つの実施形態において、前記製剤は、緩衝液、たとえば中性緩衝食塩水、硫酸塩緩衝食塩水など、炭水化物、たとえばブドウ糖、マンノース、ショ糖やデキストラン、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、たとえばグリシン、酸化防止剤、キレート剤、たとえばＥＤＴＡやグルタチオン、アジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含んでもよい。本発明の製剤は、静脈内で施用するように調製することが好ましい。
【００５２】
治療的使用
本発明は、本発明の発現カセットをコードするレンチウイルスベクター（ＬＶ）で形質導入された細胞（たとえば、Ｔ細胞）で行われる治療的使用を含む。形質導入された細胞は、腫瘍細胞のマーカーであるＢＣＭＡを標的とし、協同してＴ細胞を活性化させ、Ｔ細胞の免疫応答を引き起こすことによって、その腫瘍細胞に対する殺傷効率を顕著に向上させることができる。
そのため、本発明は、哺乳動物の標的細胞群または組織に対するＴ細胞による免疫応答を刺激する方法であって、哺乳動物に本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞を施用する工程を含む方法も提供する。
【００５３】
一つの実施形態において、本発明は、患者の自己Ｔ細胞（または異系ドナー）を分離し、活性化させて遺伝子改変し、ＣＡＲ−Ｔ細胞が生成した後、同患者の体内に注入する細胞療法を含む。このような方法では、移植片対宿主病に罹る確率は極めて低く、抗原はＴ細胞によってＭＨＣに拘束されずに認識される。また、一つのＣＡＲ−Ｔで当該抗原を発現するすべての癌を治療することができる。抗体療法と異なり、ＣＡＲ−Ｔ細胞は体内で複製可能で、持続的に腫瘍を抑える長期間の持久性が生じる。
一つの実施形態において、本発明のＣＡＲ−Ｔ細胞は安定した体内におけるＴ細胞の増殖を経て延長した時間で持続することができる。また、ＣＡＲによる免疫応答は養子免疫療法の工程の一部でもよく、ここで、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞はＣＡＲにおける高原結合ドメインに特異的な免疫応答を誘導する。たとえば、抗ＢＣＭＡのＣＡＲ−Ｔ細胞はＢＣＭＡを発現する細胞に抵抗する特異的な免疫応答を引き起こす。
【００５４】
本明細書で公開されたデータは、具体的に抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖ、ヒンジおよび膜貫通領域、および４−１ＢＢとＣＤ３ζシグナル伝達ドメインを含むレンチウイルスベクターを公開したが、本発明は構築体の各構成部分の任意の数の変化を含むと解釈されるべきである。
治療可能な癌は、血管新生がしていない腫瘍または血管新生が基本的にしていない腫瘍、および血管新生がした腫瘍を含む。癌は、非固形腫瘍（たとえば血液腫瘍、たとえば白血病やリンパ腫）または固形腫瘍を含んでもよい。本発明のＣＡＲで治療する癌の種類は、癌、胚細胞腫瘍や肉腫、および一部の白血病やリンパ性悪性腫瘍、良性腫瘍および悪性腫瘍、および悪性腫瘍、たとえば肉腫、癌やメラノーマを含むが、これらに限定されない。成人腫瘍／癌および児童腫瘍／癌も含む。
【００５５】
血液癌は血液または骨髄の癌である。血液（または血液原性）癌の例は、白血病を含み、それに急性白血病（たとえば急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病および骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球型、単核球性や赤白血病）、慢性白血病（たとえば慢性骨髄球性（顆粒球性）白血病、慢性骨髓性白血病や慢性リンパ性白血病）、真性赤血球増加症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンスリンパ腫（無痛および重症の場合）、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレーム型マクログロブリン血症、Ｈ鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病や脊髄形成異常が含まれる。
固形腫瘍は、通常、嚢腫や液体領域の組織の腫瘤を含まない。固形腫瘍は良性でも悪性でもよい。異なる種類の固形腫瘍はこれらを形成する細胞の種類によって命名される（たとえば肉腫、癌やリンパ腫）。固形腫瘍は、たとえば肉腫および癌の例は、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、中皮腫、リンパ性悪性腫瘍、膵臓癌、卵巣癌を含む。
【００５６】
本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞は哺乳動物に対する体外免疫および／または体内療法のワクチンとしても有用である。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
体外免疫について、ｉ）細胞の増殖、ｉｉ）ＣＡＲをコードする核酸の細胞への導入、および／またはｉｉｉ）細胞の凍結保存のうちの少なくとも一つが細胞を哺乳動物に施用する前に体外で行われる。
体外プロトコールは本分野では公知で、そして後記でより完全に検討される。簡単に言えば、細胞を哺乳動物（好ましくはヒト）から単離して本明細書で公開されるＣＡＲを発現するベクターで遺伝子修飾を行う（すなわち、体外形質転換または形質導入）。ＣＡＲ修飾細胞は哺乳動物のレシピエントに施用し、治療の有益な効果を提供することができる。哺乳動物のレシピエントはヒトでもよく、そしてＣＡＲ修飾細胞はレシピエント自身の細胞でもよい。必要により、細胞はレシピエントに対して同種異系、同系（syngeneic）または異種でもよい。
体外免疫について細胞に基づいたワクチン以外、本発明は、体内免疫によって患者における抗原に対する免疫応答を引き起こす組成物および方法も提供する。
【００５７】
本発明は、腫瘍を治療する方法であって、それが必要な対象に治療有効量の本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞を施用する工程を含む方法を提供する。
本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞は単独で、または薬物組成物として希釈剤および／またはほかの成分、たとえばＩＬ−２、ＩＬ−１７やほかのサイトカインまたは細胞群と合わせて施用することができる。簡単に言えば、本発明の薬物組成物は、本明細書に記載の標的細胞群を含み、一つまたは複数の薬学または生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と合わせてもよい。このような組成物は、緩衝液、たとえば中性緩衝食塩水、硫酸塩緩衝食塩水など、炭水化物、たとえばブドウ糖、マンノース、ショ糖やデキストラン、マンニトール、タンパク質、ポリペプチドまたはアミノ酸、たとえばグリシン、酸化防止剤、キレート剤、たとえばＥＤＴＡやグルタチオン、アジュバント（たとえば、水酸化アルミニウム）、および防腐剤を含んでもよい。本発明の組成物は、静脈内で施用するように調製することが好ましい。
【００５８】
本発明の薬物組成物は、治療（または予防）が必要な疾患に適する形態によって施用することができる。施用の数量および頻度は、患者の病床、および患者の疾患の種類と重篤度のような要素によって決まるが、適切な投与量は臨床試験によって決定する。
「免疫学的な有効量」、「抗腫瘍有効量」、「腫瘍抑制有効量」または「治療量」と記載する場合、施用される本発明の組成物の精確な量は、患者（対象）の年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度および病症の個体差を考慮し、医師によって決められる。通常、本明細書に記載のＴ細胞を含む薬物組成物は、１０４〜１０９個細胞／ｋｇ体重の投与量、好ましくは１０５〜１０６個細胞／ｋｇ体重の投与量（これらの範囲内におけるすべての整数値を含む）で施用することができる。Ｔ細胞の組成物はこれらの投与量で数回施用してもよい。細胞は、免疫療法で公知の注入技術（たとえばRosenbergら，NewEng.J. of Med. 319:1676,1988）によって施用することができる。具体的な患者対する最適な投与量および治療プランは、患者の疾患の所見をモニタリングしてそれに基づいて調整して治療することができ、医学分野の技術者によって容易に決めることができる。
【００５９】
対象への組成物の施用は噴霧法、注射、経口、輸液、植込みまたは移植を含む任意の便利な手段によって行ってもよい。本明細書に記載の組成物は皮下、皮内、腫瘍内、節内、脊髄内、筋肉内、静脈内（ｉ．ｖ．）注射または腹膜内で患者に施用されてもよい。一つの実施形態において、本発明のＴ細胞の組成物は皮内または皮下注射によって患者に施用される。もう一つの実施形態において、本発明のＴ細胞の組成物はｉ．ｖ．注射によって施用することが好ましい。Ｔ細胞の組成物は直接腫瘍、リンパ節または感染の箇所に注入してもよい。
【００６０】
本発明の一部の実施形態において、本明細書に記載の方法または本分野で既知のほかのＴ細胞を治療的レベルに増殖させる方法によって活性化および増殖した細胞を使用し、任意の数量の関連治療手段と合わせて（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用し、前記治療手段は、抗ウイルス療法、シドフォビルおよびインターロイキン−２、アザシチジン（ＡＲＡ−Ｃとして知られる）のような試薬で治療するもの、あるいはＭＳ患者に対するナタリズマブによる治療または乾癬患者に対するエファリズマブによる治療またはＰＭＬ患者に対するほかの治療を含むが、これらに限定されない。さらなる実施形態において、本発明のＴ細胞は、化学治療、放射線、免疫抑制剤、たとえばシクロスポリンＡ、アザチオプリン、メトトレキセート、ミコフェノール酸モフェチルやＦＫ５０６、抗体またはほかの免疫治療剤と併用することができる。さらなる実施形態において、本発明の細胞組成物は、骨髄移植、化学治療剤、たとえばフルダラビン、外部光線放射線療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミドと併用して（たとえば、その前、同時またはその後に）患者に施用する。たとえば、一つの実施形態において、対象は高投与量の化学治療の後、末梢血幹細胞移植してもよい。一部の実施形態において、移植後、対象は本発明の増殖した免疫細胞の注入を受ける。別の一つの実施形態において、増殖した細胞は外科手術前または外科手術後に施用される。
【００６１】
患者に施用する以上の治療の投与量は治療する病症の精確な属性および治療するレシピエントによって変わる。患者へ施用する投与量の比率は本分野で許容される実践によって実施することができる。通常、１回の治療または１回の治療クールに、１×１０６個〜１×１０１０個の本発明の修飾されたＴ細胞（たとえば、ＣＡＲ−Ｔ−ＢＣＭＡ細胞）を、たとえば静脈輸液の手段によって、患者に施用することができる。
【００６２】
本発明の主な利点は以下の通りである。
（ａ）本発明のキメラ抗原受容体は、細胞外抗原結合ドメインが特定の抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖで、当該特定の抗ＢＣＭＡ  ｓｃＦｖは特定のヒンジ領域および細胞内ドメインと結合してなるＣＡＲは非常に強力な腫瘍細胞に対する殺傷能力を示し、しかも細胞毒性が小さく、副作用が低い。
（ｂ）本発明によって提供されるキメラ抗原受容体はＣＡＲ遺伝子を担持するレンチウイルスでＴ細胞を感染させた後、ＣＡＲタンパク質の安定した発現および膜局在化を実現することができる。
（ｃ）本発明のＣＡＲ修飾Ｔ細胞は体内で生存時間が長く、かつ抗湯用効果が強く、本発明で使用されるｓｃＦｖはヒト化抗体またはヒト由来の抗体で、特異的な免疫拒絶反応が生じる可能性が小さい。
【００６３】
以下、具体的な実施例によって、さらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例で具体的な条件が示されていない実験方法は、通常、たとえばSambrookら、「モレキュラー・クローニング：研究室マニュアル」（ニューヨーク、コールド・スプリング・ハーバー研究所出版社、１９８９）に記載の条件などの通常の条件に、あるいは、メーカーのお薦めの条件に従う。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。
【００６４】
実施例１
レンチウイルス発現ベクターの構築
コードプラスミドの構築は、上海博益生物科技有限公司に全長ＤＮＡの合成およびクローンを依頼し、実現させた。ｐＷＰＴレンチウイルスベクターをクローニングベクターとし、クローニング部位はＢａｍＨ  ＩおよびＳａｌ  Ｉ部位である。具体的な配列は前記の通りである。
【００６５】
実施例２
ＣＡＲ−Ｔ細胞の製造
（１）健常者の静脉血を採取し、密度勾配遠心法によって単核球を単離した（ＰＢＭＣｓ）。
（２）０日目に、ＰＢＭＣｓを事前に最終濃度が５μｇ／ｍＬのＣＤ３モノクローナル抗体（ＯＫＴ３）および最終濃度が１０μｇ／ｍＬのRetronectin（TAKARA社から購入）でコーティングした細胞培養瓶に接種し、培地は１％ヒト血清アルブミン含有ＧＴ−Ｔ５５１細胞培地で、培地に最終濃度が１０００Ｕ／ｍＬになるように組み換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）を添加し、３７℃、飽和湿度、５％  ＣＯ２のインキュベーターで培養した。
【００６６】
（３）１日目に、ゆっくりＰＢＭＣｓを培養する上清液を吸い取って捨て、そして新しい１％ヒト血清アルブミン含有ＧＴ−Ｔ５５１細胞培地を入れ、培地に最終濃度が１０００Ｕ／ｍＬになるように組み換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）を入れ、３７℃、飽和湿度、５％  ＣＯ２のインキュベーターで培養した。
（４）３日目に、新鮮な培養液、濃縮・精製されたＣＡＲ−ＢＣＭＡｓレンチウイルス液、プロタミン硫酸塩（１２μｇ／ｍｌ）、および最終濃度が１０００Ｕ／ｍＬのＩＬ−２を入れた。３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーターで１２時間感染させた後、培養液を捨て、新鮮な培地を入れ、３７℃、５％  ＣＯ２のインキュベーターで培養を続けた。
（５）６日目から、ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ細胞を取って相応する活性検出試験を行うことができた。
【００６７】
実施例３
ＣＡＲ遺伝子のＴ細胞ゲノムにおける組み込み率およびそれによってコードされるタンパク質の膜表面における発現レベルの検出
それぞれ０．５×１０６の実施例２で７日目（図３Ａ）、２１日目（図３Ｂ）および２９日目（図３Ｃ）まで培養したＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ細胞のサンプルを取り、組み換えヒトＢＣＭＡタンパク質のＦｃ断片で染色した後、フローサイトメーターによってＣＡＲ−ＢＣＭＡタンパク質のＴ細胞の膜表面における発現レベルを分析した。
結果は図３に示すように、本発明で設計された４つのＣＡＲ構造はいずれもその相応する修飾Ｔ細胞で発現され、そして細胞膜表面における局在化が完成した。
【００６８】
実施例４
ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓの体外活性化能力の検出
実施例２における７日目まで培養されたＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ細胞で細胞の活性化レベル指標であるタンパク質ＣＤ１３７およびＩＦＮγの検出を行った。順に７日目まで培養したＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ細胞を１×１０５個取り、それぞれＢＣＭＡ陽性のＫ５６２−ＢＣＭＡ＋Ｅ７腫瘍細胞系、ならびにＢＣＭＡ陰性のＫ５６２腫瘍細胞系と、あるいは腫瘍細胞を添加せずに、２００μｌのＧＴ−５５１培地において１：１の比率で１８ｈ培養した後、フローサイトメトリーによってＴ細胞の膜表面おけるＣＤ１３７の発現レベルを、ＥＬＩＳＡ方法によって培養上清におけるＩＦＮγの分泌レベルを検出した。
結果は図４Ａおよび図４Ｂに示すように、４つのＣＡＲＴ細胞の表面はいずれもＣＤ１３７の発現が検出され、かついずれも培養上清にＩＦＮγの発現が検出された。中では、ＣＡＲ−ＢＣＭＡ−２０は最も優れたＣＤ１３７活性化レベルおよびＩＦＮγ放出レベルを有し、ヒト化ＭＯ６抗体配列に基づいて構築されたＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−ＭＯ６はネズミ由来抗体配列に基づいて構築されたＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−ＣＡ８と比べて弱いＣＤ１３７活性化レベルを有するが、高いＩＦＮγ放出レベルを有する。
【００６９】
実施例５
ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ細胞による腫瘍細胞の末期アポトーシスの誘導活性の検出
（１）１：１、２．５：１、５：１、１０：１、２０：１の比率（図５に示される比率）で、それぞれ実施例２における１７日目まで培養されたＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ細胞を１×１０４個のＣＦＳＥで標識されたＢＣＭＡ陰性細胞（ＮＨ９２９）またはＢＣＭＡ陽性の構築された細胞ＮＨ９２９−ＢＣＭＡ過剰発現腫瘍細胞株と混合し、１００μｌのＧＴ−５５１培地において４ｈ共培養した後、１００μｌの２５％ＰＩ色素で１５ｍｉｎ染色し、フローサイトメーターによってＣＦＳＥ陽性細胞におけるＰＩ陽性細胞の比率を分析した。
（２）１：１、５：１、１０：１、２０：１、４０：１の比率（図６Ｂに示される比率）で、それぞれ実施例２における２２日目まで培養されたＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ細胞を１×１０４個のＣＦＳＥで標識されたＢＣＭＡ陰性細胞（ＮＨ９２９）、ＢＣＭＡ陽性の構築された細胞ＮＨ９２９−ＢＣＭＡ過剰発現腫瘍細胞株、または天然のＢＣＭＡを発現するＭＭ．１Ｓ細胞系と混合し、１００μｌのＧＴ−５５１培地において４ｈ共培養した後、１００μｌの２５％ＰＩ色素で１５ｍｉｎ染色し、フローサイトメーターによってＣＦＳＥ陽性細胞におけるＰＩ陽性細胞の比率を分析した。
結果は図５および図６に示すように、４つのＣＡＲＴ細胞はいずれも好適にＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞のアポトーシスを誘導することができた。中では、ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−２０はＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−１よりも好適にＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞の末期アポトーシスを誘導し、ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−ＭＯ６およびＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−ＣＡ８はＢＣＭＡ陽性腫瘍細胞の末期アポトーシスを誘導する能力が類似する。
【００７０】
実施例６
ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓのＲＰＭＩ−８２２６骨髄腫異種移植モデルに対する抑制作用
対数増殖期にあるＲＰＭＩ−８２２６細胞を収集し、６−８週のＢ−ＮＤＧマウスの右側背部に４．０×１０６個の腫瘍細胞を皮下接種し、腫瘍体積が１２０ｍｍ３程度に達した時点で、動物を腫瘍体積によってランダムに４群に各群の腫瘍体積の違いが平均値の１０％よりも小さいように分けた後、それぞれ尾静脈から溶媒対照、７．５×１０６個のＮＴおよび７．５×１０６個のＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ細胞を注射した。
結果は図７に示すように、対照群と比べ、ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−１およびＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−２０の単回の尾静脈注射は、有効にヒト骨髄腫ＲＰＭＩ−８２２６細胞の生長を抑制し（相対腫瘍増殖率％Ｔ／ＣＲＴＶ≦４０％、Ｐ＜０．０５）、かつ顕著にヒト骨髄腫担持マウスの生存時間を延ばし（対照群で生存期間が２３日で、ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡｓ治療群で生存期間の中央値＞３３日）、中では、ＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−１およびＣＡＲＴ−ＢＣＭＡ−２０による治療を受けたマウスは、相対腫瘍増殖率および生存期間の中央値に有意差がなかった。
【００７１】
比較例
本願のキメラ抗原受容体のスクリーニング過程中において、発明者らは大量の候補配列をテストしたが、以下、例を挙げて説明する。
スクリーニングされた抗体は、ＢＣＭＡ−１、ＢＣＭＡ−２、ＢＣＭＡ−６９、ＢＣＭＡ−７２、ＢＣＭＡ−２Ａ１、ＢＣＭＡ−１Ｅ１、ＢＣＭＡ−Ｊ２２．９、ＢＣＭＡ−２０、ＢＣＭＡ−ＣＡ８、ＢＣＭＡ−ＭＯ６である。上記抗体に基づいて構築された、ＢＣＭＡを標的とするキメラ抗原受容体の構造である。ここで、ＢＣＭＡ−１およびＢＣＭＡ−２はすでに発表されたＣａｒ−Ｔ配列で、スクリーニングの陽性対照として、ＣＡＲ−Ｔ細胞の製造方法は実施例２と同様で、検出方法は実施例３、４と同様である。
結果は図１に示すように、それぞれ２ロットのＣＡＲ−Ｔ細胞の実施結果である。ＢＣＭＡ−Ｆｃ融合タンパク質でＣａｒ−Ｔの発現を検出したところ、初代Ｔ細胞に高発現が見られ、図１Ａを参照する。図１Ｂにおいて、ＢＣＭＡ−１、ＢＣＭＡ−２０、ＢＣＭＡ−１Ｅ１、ＢＣＭＡ−ＣＡ８、ＢＣＭＡ−ＭＯ６、およびＢＣＭＡ−Ｊ２２．９はＢＣＭＡ抗原によって活性化されたことがわかる。図１Ｃでは、活性化されたＢＣＭＡ−１、ＢＣＭＡ−２０、ＢＣＭＡ−１Ｅ１、ＢＣＭＡ−ＣＡ８、ＢＣＭＡ−ＭＯ６、およびＢＣＭＡ−Ｊ２２．９のＣａｒ−Ｔは比較的に高いＩＦＮ−γを生成したことが示された。これらの結果をまとめると、ＢＣＭＡ−１、ＢＣＭＡ−２０、ＣＡ８およびＭＯ６で得られたＣＡＲ−Ｔは機能が近いことが示されたため、ＢＣＭＡ−２０、ＣＡ８およびＭＯ６ＣＡＲ−Ｔをさらに分析し、研究した。
【００７２】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年11月17日(2020.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原受容体であって、前記キメラ抗原受容体の抗原結合ドメインは、ＢＣＭＡを標的とする細胞外領域の抗体一本鎖可変領域の配列である、前記キメラ抗原受容体。
【請求項２】
前記抗原結合ドメインが、ＢＣＭＡ配列の２４〜４１番目のアミノ酸残基を標的とする抗体一本鎖可変領域の配列である、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３】
前記抗原結合ドメインの構造が下記式Ｉで表される、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
ＶＬ−ＶＨ                          （Ｉ）
（ただし、ＶＨは抗体の重鎖可変領域で、ＶＬは抗体の軽鎖可変領域で、「−」は連結ペプチドまたはペプチド結合である。
かつ、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号１で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号２で示され、
あるいは、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号３で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号４で示され、
あるいは、ＶＬのアミノ酸配列は配列番号５で示され、ＶＨのアミノ酸配列は配列番号６で示される。）
【請求項４】
前記キメラ抗原受容体の構造が、下記式ＩＩで表される、請求項１に記載のキメラ抗原受容体。
Ｓ−ＶＬ−ＶＨ−Ｈ−ＴＭ−Ｃ−ＣＤ３ζ        （ＩＩ）
（ただし、
Ｓは任意のシグナルペプチドである。
Ｈはヒンジ領域である。
ＴＭは膜貫通ドメインである。
Ｃは共刺激シグナル分子である。
ＣＤ３ζはＣＤ３ζ由来の細胞内シグナル伝達配列である。
ＶＨとＶＬはそれぞれ請求項３に記載の通りである。）
【請求項５】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体をコードする、核酸分子。
【請求項６】
請求項５に記載の核酸分子を含む、ベクター。
【請求項７】
請求項６に記載のベクターを含むか、あるいは染色体に外来の請求項５に記載の核酸分子が組み込まれているか、あるいは請求項１に記載のキメラ抗原受容体を発現する、宿主細胞。
【請求項８】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞を製造する方法であって、
請求項５に記載の核酸分子または請求項６に記載のベクターをＴ細胞内に形質導入することによって、前記ＣＡＲ−Ｔ細胞を得る工程を含む、前記方法。
【請求項９】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体、請求項５に記載の核酸分子、請求項６に記載のベクター、または請求項７に記載の宿主細胞と、薬学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤とを含有する、製剤。
【請求項１０】
請求項１に記載のキメラ抗原受容体、請求項５に記載の核酸分子、請求項６に記載のベクター、または請求項７に記載の宿主細胞の使用であって、癌または腫瘍を予防および／または治療する薬物または製剤の製造に使用される、前記使用。
【請求項１１】
前記腫瘍が、ＢＣＭＡ陽性腫瘍である、請求項１０に記載の使用。
【請求項１２】
前記腫瘍が、ＢＣＭＡ陽性のＢ細胞性リンパ腫、多発性骨髄腫、または形質細胞性白血病である、請求項１０に記載の使用。
【国際調査報告】
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2021520185.tif 000011
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