(57)【要約】  本発明は、DNA(例えば、プラスミドとヘルパーファージ、可動遺伝要素(MGE)、又は染色体に組み込まれたヘルパーファージ遺伝子を有するプラスミド)を使用したファージ及び形質導入粒子の産生、並びにファージ、ヘルパーファージ、キット、組成物、及びこれらを含む方法に関する。粒子は、抗菌作用のために毒性ペイロードを標的細菌に送達するのに特に有用である。実施形態は、医療又は環境用途、及び粒子の封じ込めのための、そのような粒子の高純度の組成物の製造を可能にし、組成物は、抗菌作用を封じ込めるのに有用であり得る。
2021503963.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
第1のファージの集団を含む抗菌組成物であって、前記第1のファージが、第1のファージ粒子の複製のためにヘルパーファージを必要とし、前記ヘルパーファージが、第1のファージ核酸をパッケージングして第1のファージ粒子を産生することができ、前記第1のファージが前記ヘルパーファージと異なり、前記ヘルパーファージが、それ自体ではヘルパーファージ粒子を産生することができず、前記第1のファージが標的細菌に感染することができ、各第1のファージが細菌を死滅させるための抗菌手段を含む、抗菌組成物。
【請求項２】
前記組成物に含まれる少なくとも95%のファージ粒子が第1のファージ粒子である、請求項1に記載の組成物。
【請求項３】
各第1のファージがCRISPR/Casシステムの1つ又は複数の成分を含み、前記成分が、ガイドRNA(任意選択で単一ガイドRNA)をコードするか又はガイドRNAを産生するためのCRISPRアレイを含むDNA配列を含み、ガイドRNAが標的細菌のゲノムを標的とすることができる、請求項1又は2に記載の組成物。
【請求項４】
各第1のファージゲノムが、ファージタンパク質をコードする遺伝子を欠く、請求項1から3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
細菌の抗菌処理における使用のための組成物であって、第1の種又は株の第1の細菌宿主細胞中で移動することができる操作された可動遺伝要素(MGE)を含み、前記細胞がヘルパーファージゲノムを含み、前記細胞において前記MGEがヘルパーファージによってコードされるタンパク質を使用して移動し、ヘルパーファージの複製が阻害され、前記MGEが、抗菌剤をコードするか又はそのような薬剤の成分をコードし、修飾ゲノムアイランド、修飾病原性アイランド、SaPI(黄色ブドウ球菌病原性アイランド)、VコレラPLE(ファージ様誘導性染色体アイランド様エレメント)、又は大腸菌PLEを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
(a)第1のDNA、及び
b)1つ又は複数の第2のDNA
を含むキットであって、
(i)前記第1のDNAと前記第2のDNAが全体として、前記第1のDNAのコピーを含むパッケージングされたファージ粒子を産生するのに必要とされるファージ構造タンパク質遺伝子を全て含み、
(ii)前記第1のDNAが前記遺伝子を含まないか、又は少なくとも1つ含むが全ては含まず、前記1つ又は複数の第2のDNAが残りの遺伝子を含み、
(iii)前記第1のDNAが、パッケージングされたファージ粒子を産生するためのファージパッケージングシグナルを含み、
(iv)前記第2のDNAが、前記第2のDNAをファージ粒子にパッケージングするために必要とされるヌクレオチド配列を欠き、
前記第1のDNAと前記第2のDNAが、前記第1のDNAを含むパッケージングされたファージ(第1のファージ)を産生するための宿主細菌に共存する場合に作動可能であり、前記第1のファージが、その複製のために更なる第1のファージ粒子を産生する前記第2のDNAを必要とする、キット。
【請求項７】
(i)の前記ファージ粒子が標的細菌に感染することができ、前記ファージが、前記標的細菌においてタンパク質又はRNAを発現させることができる目的のヌクレオチド配列(NSI)を含み、前記標的細菌におけるNSIにコードされるタンパク質又はRNAの存在が、標的細胞の死滅、又は標的細胞の成長若しくは増幅の下方調節を媒介する、請求項6に記載のキット。
【請求項８】
(i)の前記ファージ粒子が標的細菌に感染することができ、前記ファージが、標的細菌においてタンパク質若しくはRNAを発現させることができる目的のヌクレオチド配列(NSI)、又は前記標的細菌において作動可能な調節エレメントを含むNSIを含む、請求項6に記載のキット。
【請求項９】
前記標的細菌におけるNSI又はNSIにコードされるタンパク質若しくはRNAの存在が、標的細胞の死滅、又は標的細胞の成長若しくは増幅の下方調節を媒介するか、或いは標的細胞ゲノムによってコードされる1つ若しくは複数のRNA若しくはタンパク質の発現の停止、又はその下方調節を媒介する、請求項8に記載のキット。
【請求項１０】
前記標的細菌におけるNSI又はNSIにコードされるタンパク質若しくはRNAの存在が、標的細胞の成長又は増幅の上方調節を媒介するか、或いは標的細胞ゲノムによってコードされる1つ若しくは複数のRNA若しくはタンパク質の発現の始動、又はその上方調節を媒介する、請求項8に記載のキット。
【請求項１１】
前記NSIが、前記標的細菌に対して毒性であるCRISPR/Casシステムの成分をコードする、請求項7から9のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１２】
前記NSIが標的細菌を死滅させるための操作された抗菌手段を含む、請求項7から9のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１３】
パッケージングされたファージ粒子ゲノムが、ファージタンパク質をコードする遺伝子を欠く、請求項6から12のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１４】
前記第1のDNAが前記構造タンパク質遺伝子を含まない、請求項6から13のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１５】
前記第2のDNAがファージパッケージングシグナルを欠く、請求項6から14のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１６】
各シグナルがpac若しくはcos配列、又はその相同体である、請求項6から15のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１７】
各シグナルが、配列番号2、又はそれと少なくとも70、80、90、95、96、97、98、若しくは99%同一の配列を含むか、或いは異なる種由来の相同体である、請求項6から16のいずれか一項に記載のキット。
【請求項１８】
請求項6から17のいずれか一項に規定の第1のDNAである、単離されたDNA。
【請求項１９】
前記第1のDNAがベクター(任意選択で、プラスミド、ファージミド、又はシャトルベクター)に含まれる、請求項6から18のいずれか一項に記載のキット又はDNA。
【請求項２０】
前記第2のDNAが、ベクター(任意選択で、プラスミド、ファージミド、若しくはシャトルベクター)、ヘルパーファージ(任意選択でヘルパーファージミド)に含まれるか、又は宿主細菌細胞のゲノムへ組み込まれる、請求項6から19のいずれか一項に記載のキット又はDNA。
【請求項２１】
請求項6から17、19、及び20のいずれか一項に規定の前記第1及び前記第2のDNAを含むか、又は請求項18から20のいずれか一項に記載のDNAを含む、宿主細菌細胞。
【請求項２２】
ファージ組成物を製造する方法であって、請求項21に記載の細胞においてファージタンパク質を発現させる工程であり、前記第1のDNAを含むパッケージングされた第1のファージ粒子が産生され、前記第1のファージが、その複製のために更なる第1のファージを産生する前記第2のDNAを必要とする、工程、及び任意選択で、ある量の第1のファージを細胞材料から分離する工程であり、ある量の精製されたファージが取得される、工程を含む、方法。
【請求項２３】
前記第1のファージ粒子を単離する工程を含む、請求項22に記載の方法。
【請求項２４】
請求項22又は23に記載の方法によって取得可能な第1のファージ粒子の集団を含む、組成物。
【請求項２５】
前記第2のDNAがヘルパーファージDNAに含まれ、前記組成物に含まれる総ファージ粒子の5%未満がヘルパーファージ粒子である、請求項22若しくは23に記載の方法又は請求項24に記載の組成物。
【請求項２６】
第2のDNAがヘルパーファージDNAに含まれ、前記組成物が、1×106個以上のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む、請求項22から24のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項２７】
各第1のファージ粒子が、標的細菌においてタンパク質又はRNAを発現させることができる目的のヌクレオチド配列(NSI)を含み、前記標的細菌におけるNSIにコードされるタンパク質又はRNAの存在が、標的細胞の死滅、又は標的細胞の成長若しくは増幅の下方調節を媒介する、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物、請求項22、23、25、若しくは26に記載の方法、又は請求項24から26のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
前記NSIが、標的細胞に対して毒性であるCRISPR/Casシステムの成分をコードする、請求項27に記載の方法又は組成物。
【請求項２９】
前記成分が、(i)ガイドRNA(例えば単一ガイドRNA)をコードするか若しくはガイドRNAを産生するためのCRISPRアレイを含むDNA配列であって、ガイドRNAが標的細菌のゲノムを標的とすることができる、DNA配列、(ii)CasヌクレアーゼをコードするDNA配列、及び/又は(iii)Cascadeの1つ若しくは複数の成分をコードするDNA配列を含む、請求項28に記載の方法又は組成物。
【請求項３０】
前記NSIがCasヌクレアーゼとシステムのガイドRNAとをコードし(又は前記NSIがCasヌクレアーゼとガイドRNAを産生するためのCRISPRアレイとをコードし)、前記ガイドRNAが標的細菌のゲノムを標的とすることができ、ガイドRNAが標的細胞においてCasを導いて、標的細胞の死滅、又は標的細胞の成長若しくは増幅の下方調節を媒介することができる、請求項29に記載の方法又は組成物。
【請求項３１】
前記第1のファージ粒子がファージ構造タンパク質遺伝子を含まない、請求項1から5、及び22から30のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項３２】
前記第1のDNA又は第1のファージDNAが高コピー数プラスミドに含まれる、請求項1から31のいずれか一項に記載のキット、DNA、方法、又は組成物。
【請求項３３】
前記NSIが標的細菌を死滅させるための操作された抗菌手段を含む、請求項27又は請求項27に従属する請求項28から32のいずれか一項に記載の方法又は組成物。
【請求項３４】
前記抗菌手段が、導かれたヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼ、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む、請求項33に記載の方法又は組成物。
【請求項３５】
ヒト又は動物対象への投与のための医療用途の、請求項1から5、及び24から34のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
標的細菌細胞の感染症を処置するためにヒト又は動物対象に投与するための組成物であって、前記第1のファージが標的細胞に感染して標的細胞を死滅させることができ、任意選択で前記感染症が腸内マイクロバイオーム感染症である、請求項1から5、及び24から34のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
ヒト又は動物対象の疾患又は状態を処置する完結型の方法における使用のための組成物であって、前記疾患又は状態が標的細菌によって媒介され、標的細菌が対象に含まれ(任意選択で腸内マイクロバイオームに含まれ)、前記方法が、組成物を対象に投与する工程であり、それによって前記標的細菌が抗菌手段に曝露されて死滅し、前記第1のファージの増幅が封じ込められる、工程を含む、請求項33又は34に記載の組成物。
【請求項３８】
ex vivoの環境を処理する方法であって、前記環境を、第1のファージ粒子の集団を含む組成物に曝露する工程を含み、前記組成物が、請求項22、23、及び25から34のいずれか一項に記載の方法によって取得可能であるか、又は請求項1から5、及び24から34のいずれか一項に記載の組成物であり、前記環境が標的細菌を含み、前記第1のファージが標的細菌に感染して標的細菌を死滅させる、方法。
【請求項３９】
処理を環境に封じ込めるための、請求項38に記載の方法。
【請求項４０】
対象における前記第1のファージ処理の投薬量を制御するための、請求項1から5、及び24から34のいずれか一項に記載の組成物、又は環境における前記第1のファージ処理の投薬量を制御するための、請求項38若しくは39に記載の方法。
【請求項４１】
対象中での、前記第1のファージによる外来遺伝子配列の獲得のリスクを低減するための、請求項1から5、及び24から34のいずれか一項に記載の組成物、又は環境中での、前記第1のファージによる外来遺伝子配列の獲得のリスクを低減するための、請求項38若しくは39に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、DNA(例えば、プラスミドとヘルパーファージ、又は染色体に組み込まれたヘルパーファージ遺伝子を有するプラスミド)を使用したファージの産生、並びにファージ、ヘルパーファージ、キット、組成物、及びこれらを含む方法に関する。粒子は、抗菌作用のために毒性ペイロードを標的細菌に送達するのに特に有用である。実施形態は、医療又は環境用途、及び粒子の封じ込めのための、そのような粒子の高純度の組成物の製造を可能にし、組成物は、抗菌作用を封じ込める、投薬量を制御する、又は望ましくない外来遺伝子の獲得のリスクを低減するのに有用であり得る。
【背景技術】
【０００２】
ファージミドDNAをファージウイルス粒子にパッケージングするためのヘルパーファージの使用は公知である。一例は、大腸菌(E. coli)宿主細胞において使用される、M13の誘導体であるM13KO7ヘルパーファージである。他の例はR408及びCM13である。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００３】
【特許文献１】WO2015136541
【非特許文献】
【０００４】
【非特許文献１】「Staphylococcal pathogenicity island DNA packaging system involving cos-site packaging and phage-encoded HNH endonucleases」、Quiles-Puchaltら、PNAS 2014年4月22日、111(16)6016〜6021
【非特許文献２】https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5557969/
【非特許文献３】Kahnら1991、「Bacteriophage P2 and P4」、Methods in Enzymology、204巻、264〜280頁
【非特許文献４】https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/x51522
【非特許文献５】Stuitjeら、1981、「Identification of mutations affecting replication control of plasmid Clo DF13」、Nature、290巻、264〜267頁
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００５】
本発明は、ファージの産生に関し、以下のものを提供する:
【課題を解決するための手段】
【０００６】
第1の構成では、
a)第1のDNA、及び
b)1つ又は複数の第2のDNA
を含むキットであって、
(i)第1のDNAと第2のDNAが全体として、第1のDNAのコピーを含むパッケージングされたファージ粒子を産生するのに必要とされるファージ構造タンパク質遺伝子を全て含み、
(ii)第1のDNAが前記遺伝子を含まないか、又は少なくとも1つ含むが全ては含まず、1つ又は複数の第2のDNAが残りの遺伝子を含み、
(iii)第1のDNAが、パッケージングされたファージ粒子を産生するためのファージパッケージングシグナルを含み、
(iv)第2のDNAが、第2のDNAをファージ粒子にパッケージングするために必要とされるヌクレオチド配列(例えばパッケージングシグナル)を欠き、
第1のDNAと第2のDNAが、第1のDNAを含むパッケージングされたファージを産生するための宿主細菌に共存する場合に作動可能であり、ファージが、その複製のために更なるファージ粒子を産生する第2のDNAを必要とする、キット。
【０００７】
また、
ファージを産生する方法であって、第1のDNAと第2のDNAとを含む細胞においてファージタンパク質遺伝子を発現させる工程を含み、第1のDNAを含むパッケージングされたファージが産生され、ファージが、その複製のために更なるファージ粒子を産生する第2のDNAを必要とする、方法
も提供される。
【０００８】
第2の構成では、
ヘルパーファージの集団であって、ヘルパーファージが第1のファージをパッケージングすることができ、第1のファージがヘルパーファージと異なり、ヘルパーファージが自己複製することができない、ヘルパーファージの集団。
【０００９】
第3の構成では、
第1のファージの集団を含む組成物であって、第1のファージが複製のために第2の構成に記載のヘルパーファージを必要とし、組成物に含まれる総ファージの[20%]未満がそのようなヘルパーファージである、組成物。
【００１０】
第4の構成では、
複製するためにヘルパーファージを必要とする第1のファージを産生する方法であって、
(a)パッケージングシグナルを含むDNAを用意する工程、
(b)DNAを宿主細菌細胞に導入する工程であり、
(c)宿主細菌細胞がヘルパーファージを含むか、又はヘルパーファージが工程(b)と同時若しくは順次に細菌細胞に導入され、
(d)ヘルパーファージが本発明によるものである、工程、
(e)ヘルパーファージがファージタンパク質を産生することを引き起こすか又は可能にする工程であり、パッケージングシグナルが宿主細胞において認識され、それによって第1のファージが、タンパク質を使用して産生され、DNAをパッケージングし、
(f)宿主細胞中でのヘルパーファージ複製が阻害されるか又は減少し、それによりヘルパーファージのアベイラビリティを限定する、工程、
(g)任意選択で宿主細胞を溶解させ、第1のファージを取得する工程であり、
(h)それにより複製のためにヘルパーファージを必要とする第1のファージを含む組成物を製造し、第1のファージの増幅が、ヘルパーファージアベイラビリティの限定によって妨げられるか又は減少する、工程
を含む、方法。
【００１１】
第5の構成では、
目的のヌクレオチド配列を含むファージ(例えば前述のいずれかの構成に記載の第1のファージ)(NSIファージ)を産生するためのファージ産生システムであって、成分(i)から(iii):
(i)第1のDNA、
(ii)第2のDNA、及び
(iii)NSIファージ産生因子(NPF)又はNPFをコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み、
a)第1のDNAがヘルパーファージ(例えば前述のいずれかの構成に記載の前記第1のヘルパーファージ)をコードし、
b)第2のDNAが目的のヌクレオチド配列(NSI)を含み、
c)システムが細菌宿主細胞に含まれる場合、ヘルパーファージタンパク質が第1のDNAから発現して、NPFの存在下で第2のDNAをパッケージングするファージを形成し、それによりNSIファージを産生し、
d)システムが、第1のDNAをパッケージングするファージを形成するために必要とされるヘルパーファージ産生因子(HPF)を欠くか、若しくは機能性HPFをコードする発現可能なヌクレオチド配列を欠く;又はシステムが、機能性HPFを含むか若しくはコードするヌクレオチド配列を含み、更に、第1のDNAを含むヘルパーファージの産生を排除若しくは最小化する、宿主細胞におけるHPF配列を標的とする不活性化のための手段を含み、
それによってシステムがNSIファージの集団を含む産物を産生することができ、各NSIファージが増幅のために前記ヘルパーファージを必要とし、産物中のNSIファージがヘルパーファージと混合しないか、又は産物に含まれる総ファージの[20%]未満が前記ヘルパーファージである、システム。
【００１２】
本発明はまた、以下のものも提供する:
細菌の抗菌処理における使用のための組成物であって、第1の種又は株の第1の細菌宿主細胞中で移動することができる操作された可動遺伝要素(MGE)を含み、前記細胞が第1のファージゲノムを含み、前記細胞においてMGEがファージによってコードされるタンパク質を使用して移動し、第1のヘルパーファージの複製が阻害され、MGEが抗菌剤をコードするか又はそのような薬剤の成分をコードする、組成物。
【００１３】
組み込まれたMGEを含む核酸ベクターであって、MGE又はそのコピーを宿主細菌細胞に移入することができる、核酸ベクター。
【００１４】
本発明の前記MGE又はベクターを含む非自己複製性形質導入粒子。
【００１５】
複数の形質導入粒子を含む組成物であって、各粒子が本発明のMGE又はベクターを含み、形質導入粒子が、MGE、又は薬剤若しくは成分をコードする核酸、或いはそれらのコピーを標的細菌細胞に移入することができ、
(i)標的細胞が抗菌剤によって死滅する、
(ii)標的細胞の成長若しくは増殖が抑制される、又は
(iii)標的細胞が抗生物質に感作し、それによって抗生物質が細胞に対して毒性となる、
組成物。
【００１６】
複数の非自己複製性形質導入粒子を含む組成物であって、各粒子が本発明のMGE又はプラスミドを含み、形質導入粒子が、MGE、又は薬剤若しくは成分をコードする核酸、或いはそれらのコピーを標的細菌細胞に移入することができ、薬剤がCRISPR/Casシステムであり、成分が、標的細菌細胞においてCasと作動可能である、Casを細胞の標的核酸配列に導いて配列を修飾するcrRNA又はガイドRNAをコードする核酸を含み、それによって
(i)標的細胞が抗菌剤によって死滅する、
(ii)標的細胞の成長若しくは増殖が抑制される、又は
(iii)標的細胞が抗生物質に感作し、それによって抗生物質が細胞に対して毒性となる、
組成物。
【００１７】
複数の形質導入粒子を産生する方法であって、本発明の組成物を、第1のファージを含む前記第1の種の宿主細菌細胞と組み合わせる工程、複数の前記MGEを宿主細胞に導入させる工程、及び第1のファージにコードされるタンパク質が発現し、MGEコピーが第1のファージタンパク質によってパッケージングされて複数の形質導入粒子を産生する条件下で宿主細胞を培養する工程、並びに任意選択で、形質導入粒子を細胞から分離する工程、及び細胞から分離された複数の形質導入粒子を取得する工程を含む、方法。
【００１８】
第1のファージと、本発明のMGE、ベクター、又は粒子とを含む細菌宿主細胞であって、薬剤が宿主細胞と同じ種の細胞に対して毒性であり、宿主細胞が、薬剤が毒性とならないように操作されている、細菌宿主細胞。
【００１９】
第1のファージを含む細菌宿主細胞であって、細胞がキットに含まれ、キットが本発明の組成物を更に含み、薬剤が宿主細胞と同じ種の細胞に対して毒性であり、宿主細胞が、薬剤が毒性とならないように操作されている、細菌宿主細胞。
【００２０】
第1のファージと、本発明のMGE、ベクター、又は粒子とを含む細菌宿主細胞であって、薬剤が、宿主細胞に対して毒性ではなく、宿主細胞の種又は株と異なる種又は株の第2の細胞に対して毒性であり、MGEが、MGE又はそのコピーを前記第2の細胞に移入することができる、宿主細胞によって産生可能な形質導入粒子中で移動可能であり、それによって第2の細胞が抗菌剤に曝露される、細菌宿主細胞。
【００２１】
第1のファージを含む細菌宿主細胞であって、細胞がキットに含まれ、キットが本発明の組成物を更に含み、薬剤が、宿主細胞に対して毒性ではなく、宿主細胞の種又は株と異なる種又は株の第2の細胞に対して毒性であり、MGEが、MGE又はそのコピーを前記第2の細胞に移入することができる、宿主細胞によって産生可能な形質導入粒子中で移動可能であり、それによって第2の細胞が抗菌剤に曝露される、細菌宿主細胞。
【００２２】
本発明のMGE、ベクター、又は粒子と、1つ又は複数の誘導性プロモーターの制御下にある核酸とを含む細菌宿主細胞であって、核酸が、MGE又はプラスミドのコピーをパッケージングする形質導入粒子を産生するのに必要な構造タンパク質を全てコードし、薬剤が、宿主細胞に対して毒性ではなく、宿主細胞の種又は株と異なる種又は株の第2の細胞に対して毒性であり、MGEが、MGE又はそのコピーを前記第2の細胞に移入することができる、宿主細胞によって産生可能な形質導入粒子中で移動可能であり、それによって第2の細胞が抗菌剤に曝露される、細菌宿主細胞。
【００２３】
(a)標的細菌細胞における発現のための抗菌剤又はその成分をコードするヌクレオチド配列、
(b)薬剤又は成分の発現を制御するための構成的プロモーター、
(c)任意選択のterSヌクレオチド配列、
(d)複製起点(ori)、及び
(e)ファージパッケージング配列(任意選択で、pac、cos、又はそれらの相同体)
を含み、
(f)形質導入粒子(任意選択でファージ)の産生のために必要なファージ構造タンパク質をコードする全てのヌクレオチド配列、又はそのような配列の少なくとも1つ、及び
(g)任意選択でterL
を欠く、プラスミド。
【００２４】
自己複製することができないヘルパーファージのゲノムを含む細菌宿主細胞であって、任意選択でゲノムが、プロファージ及び本発明のプラスミドとして存在し、ヘルパーファージが、プラスミドのコピーを形質導入粒子へパッケージングするように作動可能であり、粒子が、抗菌剤が毒性である細菌標的細胞に感染することができる、細菌宿主細胞。
【００２５】
複数の形質導入粒子を作製する方法であって、本発明の複数の宿主細胞を培養する工程、任意選択でヘルパーファージの溶菌サイクルを誘発する工程、及び細胞を、プラスミドのパッケージングされたコピーを含む形質導入用粒子が創製される条件下でインキュベートする工程、並びに任意選択で粒子を細胞から分離して複数の形質導入粒子を取得する工程を含む、方法。
【００２６】
医療における使用のための、例えば、標的細菌細胞によるヒト又は動物対象の感染症を処置又は予防するための、本発明の方法によって取得可能な複数の形質導入粒子であって、形質導入用粒子が、標的細胞に感染し、抗菌剤を使用して細胞を死滅させるために対象に投与される、形質導入粒子。
【００２７】
複数の形質導入粒子を作製する方法であって、
(a)第1のDNAをパッケージングすることができる形質導入粒子を産生するのに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含むゲノムを有する宿主細胞を産生する工程であり、ゲノムがファージパッケージングシグナルを欠き、タンパク質の発現が誘導性プロモーターの制御下にある、工程、
(b)抗菌剤又はその成分をコードする第1のDNAを産生する工程であり、DNAがファージパッケージングシグナルを含む、工程、
(c)DNAを宿主細胞に導入する工程、
(d)宿主細胞において構造タンパク質の産生を誘導する工程であり、それによってDNAをパッケージングする形質導入粒子が産生される、工程
(e)任意選択で複数の形質導入粒子を単離する工程、及び
(f)任意選択で粒子を、ヒト又は動物への投与のための医療用途の医薬組成物に製剤化する工程
を含む、方法。
【００２８】
方法によって取得可能な複数の形質導入粒子。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】非必須遺伝子が囲まれているP2ゲノムの遺伝子地図である。
【図２】SaPIbov1の概略図である。
【図３Ａ】P2及びP4-ファージP2及びサテライトファージP4のゲノム構造及び調節ネットワーク-の地図である。P2の灰色で四角く塗り潰した領域は欠失し、カナマイシンマーカー配列と置き換えられ、点線で示す囲みは、CGVに含まれたcos部位を含むP4の領域を示す。
【図３Ｂ】p94のゲノム地図である。
【図４】SA100産生株-欠損ヘルパーファージは誘導後にファージ産生を開始させるのみである-の概略図である。ファージパッケージングDNA配列はヘルパーから除去されてCGV(商標)に配置されているので、CGV(商標)分子のみが合成ファージ粒子にパッケージングされることになる。
【図５】感染の効率-SA100粒子のEMG-2に対する比(MOI)の増加に伴うEMG-2細胞感染率-を示すグラフである。
【図６】SA100によるCGV(商標)送達-p114若しくはp94を含有するSA100へのMG1655_pks細胞の感染(A)、又はp114を含有するSA100へのX1-blue_pks細胞の感染(B)後の総CFU及びCGV(商標)を含有するCFU-を示すグラフである。
【図７】SA100送達CGV(商標)による標的細胞の死滅-野生型及び最適化コピー数CGV(商標)を使用して非感染対照と比較した、SA100送達CGV(商標)(2つ目、4つ目、及び6つ目の棒)による、2種の標的株の死滅効率-を示すグラフである。
【図８】5ミリリットルの糞便試料(n=15)当たりのコロニー形成単位(CFU)で表される個体数をプロットしたグラフである。CRISPR誘導及び非誘導の2つの群を示す。ストレプトマイシンを含有する寒天プレートでCFUを決定した場合、群間の差は観察されなかった。
【図９】5ミリリットルの糞便試料(n=15)当たりのコロニー形成単位(CFU)で表される個体数をプロットしたグラフである。CRISPR誘導及び非誘導の2つの群を示す。統計的な差を、スチューデントのt検定を使用して算出し、スペクチノマイシンとストレプトマイシンとを補充した寒天プレートのCRISPR非誘導群において、48時間後に個体数の統計的に有意な増加(p値=0.011)を示す。このことは、CGV(スペクチノマイシンマーカーを含有する)が非自己複製性粒子であるSA100によって送達され得ることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、DNA(例えばプラスミドとヘルパーファージ)を使用したファージの産生、並びにファージ、ヘルパーファージ、組成物、及びこれらを含む方法に関する。本発明は、例えば、ファージをex vivo及びin vivoの環境に封じ込めること、ファージによる抗生物質耐性又は他の遺伝子の獲得のリスクを低減すること、並びに環境におけるファージの投薬量を制御することに関する有用性を見出す。複数の例では、ヘルパーファージによる有用なファージ集団の汚染も制限又は排除され、それによりファージが有用に使用され得る医薬、除草剤、及び他の薬剤等のファージ組成物において、ファージ増幅を制御して所望のファージの割合を高めることができる。したがって、本発明は以下の実施形態を提供する。
【００３１】
a)第1のDNA、及び
b)1つ又は複数の第2のDNA
を含むキットであって、
(i)第1のDNAと第2のDNAが全体として、第1のDNAのコピーを含むパッケージングされたファージ粒子を産生するのに必要とされるファージ構造タンパク質遺伝子を全て含み、
(ii)第1のDNAが前記遺伝子を含まないか、又は少なくとも1つ含むが全ては含まず、1つ又は複数の第2のDNAが残りの遺伝子を含み、
(iii)第1のDNAが、パッケージングされたファージ粒子を産生するためのファージパッケージングシグナルを含み、
(iv)第2のDNAが、第2のDNAをファージ粒子にパッケージングするために必要とされるヌクレオチド配列を欠き、
第1のDNAと第2のDNAが、第1のDNAを含むパッケージングされたファージを産生するための宿主細菌に共存する場合に作動可能であり、ファージが、その複製のために更なるファージ粒子を産生する第2のDNAを必要とする、キット。
【００３２】
例えば、第2のDNAは第2のDNAをパッケージングするためのパッケージングシグナルを欠く。付加的に又は代替的に、第2のDNAは、ヘルパーファージの複製のために必要とされるヌクレオチド配列を欠く。任意選択で、ヌクレオチド配列は、シグマ因子をコードするか、又はシグマ因子認識部位、DNA重合認識部位、若しくは、第2のDNAがヘルパープロファージに含まれる場合は、ヘルパーファージDNA複製のために必要とされる遺伝子のプロモーターを含む。
【００３３】
一例では、第2のDNAはM13又はM13ベースのヘルパーファージに含まれる。M13は、ファージパッケージングのために必要とされる以下のタンパク質をコードする:
a. pIII:宿主認識
b. pV:コートタンパク質
c. pVII、pVIII、pIX:膜タンパク質
d. pI、pIV、pXI:ファージを細胞外空間へ輸送するためのチャンネル。
【００３４】
この例では、第2のDNAはこれらのタンパク質をコード化する1つ又は複数の遺伝子を欠く、例えば、pIIIをコードする遺伝子、pVをコードする遺伝子、pVIIをコードする遺伝子、pVIIIをコードする遺伝子、pIXをコードする遺伝子、pIをコードする遺伝子、pIVをコードする遺伝子、及び/又はpXIをコードする遺伝子を欠く。
【００３５】
一実施形態では、(i)のファージ粒子は標的細菌に感染することができ、ファージは、標的細菌においてタンパク質若しくはRNAを発現させることができる目的のヌクレオチド配列(NSI)、又は標的細菌において作動可能な調節エレメントを含むNSIを含む。一例では、NSIは、標的細胞染色体又は標的細胞に含まれるエピソームと組換えを行って染色体又はエピソームを修飾することができる。任意選択で、このことは、染色体又はエピソームが切断され(例えば導かれたヌクレアーゼ、例えば、Cas、TALEN、ジンクフィンガー若しくはメガヌクレアーゼ、又は制限エンドヌクレアーゼを使用して所定の部位で)、同時に又は順次に細胞が第1のDNAを含むファージ粒子によって感染し、第1のDNAが細胞に導入されてNSI又はその配列が切断部位で又は切断部位に隣接して染色体又はエピソームに導入される、方法において実行される。一例では、第1のDNAは、切断を実施するように作動可能なCRISPR/Casシステムの1つ又は複数の成分(例えば、切断する部位を標的とするためのガイドRNA又はcrRNAをコードするヌクレオチド配列を少なくとも含む)を含み、NSIを更に含む。
【００３６】
一実施形態では、標的細菌におけるNSI又はNSIにコードされるタンパク質若しくはRNAの存在は、標的細胞の死滅、又は標的細胞の成長若しくは増幅の下方調節を媒介するか、或いは標的細胞ゲノムによってコードされる1つ若しくは複数のRNA若しくはタンパク質の発現の停止、又はその下方調節を媒介する。
【００３７】
一実施形態では、標的細菌におけるNSI又はNSIにコードされるタンパク質若しくはRNAの存在は、標的細胞の成長又は増幅の上方調節を媒介するか、或いは標的細胞ゲノムによってコードされる1つ若しくは複数のRNA若しくはタンパク質の発現の始動、又はその上方調節を媒介する。
【００３８】
一実施形態では、NSIは、標的細菌に対して毒性であるCRISPR/Casシステムの成分をコードする。
【００３９】
一実施形態では、DNAは前述のいずれかの段落に規定の第1のDNAである。
【００４０】
一実施形態では、第1のDNAはベクター(例えばプラスミド又はシャトルベクター)に含まれる。
【００４１】
一実施形態では、第2のDNAは、ベクター(例えば、プラスミド、若しくはシャトルベクター)、ヘルパーファージ(例えばヘルパーファージミド)に含まれるか、又は宿主細菌細胞のゲノムへ組み込まれる。
【００４２】
一実施形態は、第1及び第2のDNAを含む細菌細胞を提供する。任意選択で、細胞は、第1のDNA、例えば標的細菌に対して毒性であるCRISPR/Casシステムの成分を含む第1のDNAの移入前、機能性CRISPR/Casシステムを欠いている。一実施形態は、各細胞が任意選択で本段落によるものである複数の細胞を含む、ヒト又は動物対象への投与のための医療用途の抗菌組成物を提供する。
【００４３】
ファージを産生する方法であって、宿主細菌細胞においてファージタンパク質遺伝子を発現させる工程を含み、第1のDNAを含むパッケージングされたファージが産生され、ファージが、その複製のために更なるファージ粒子を産生する第2のDNAを必要とする、方法が提供される。任意選択で、方法はファージ粒子を単離する工程を含む。
【００４４】
方法によって取得可能なファージ粒子の集団を含む組成物であって、標的細菌細胞の感染症を処置するためにヒト又は動物対象に投与するためのものであり、ファージが標的細胞に感染して標的細胞を死滅させることができる、組成物が提供される。
【００４５】
ex vivoの環境を処理する方法であって、環境を、前記方法によって取得可能なファージ粒子の集団に曝露する工程を含み、環境が標的細菌を含み、ファージが標的細菌に感染して標的細菌を死滅させる、方法が提供される。一例では、対象は、ファージ投与と同時に又は順次に薬剤を更に投与される。一例では、薬剤は、除草剤、農薬、殺虫剤、植物肥料、又は洗浄剤である。
【００４６】
任意選択で、方法は処理を環境に封じ込めるためのものである。
【００４７】
任意選択で、方法は環境におけるファージ処理の投薬量を制御するためのものである。
【００４８】
任意選択で、方法は、環境中での、ファージによる外来遺伝子配列の獲得のリスクを低減するためのものである。
【００４９】
ヒト又は動物対象における標的細菌の感染症を処置する方法であって、細菌を、産生方法によって取得可能なファージ粒子の集団に曝露する工程を含み、ファージが標的細菌に感染して標的細菌を死滅させる、方法が提供される。
【００５０】
任意選択で、処置するための方法は処置を対象に封じ込めるためのものである。
【００５１】
任意選択で、処置するための方法は、処置を、対象が存在する環境に封じ込めるためのものである。
【００５２】
任意選択で、処置するための方法は対象におけるファージ処置の投薬量を制御するためのものである。
【００５３】
任意選択で、処置するための方法は、対象中での、ファージによる外来遺伝子配列の獲得のリスクを低減するためのものである。
【００５４】
任意選択で、処置するための方法は、対象が存在する環境中での、ファージによる外来遺伝子配列の獲得のリスクを低減するためのものである。
【００５５】
任意選択で、本明細書の標的細菌は、対象のマイクロバイオーム、例えば腸内マイクロバイオームに含まれる。或いは、マイクロバイオームは、皮膚、頭皮、毛髪、眼、耳、口腔、喉、肺、血液、直腸、肛門、膣、陰嚢、陰茎、鼻、又は舌マイクロバイオームである。
【００５６】
一例では、対象は、ファージ投与と同時に又は順次に医薬を更に投与される。一例では、医薬は、抗生物質、抗体、免疫チェックポイント阻害薬(例えば、抗PD-1、抗PD-L1、若しくは抗CTLA4抗体)、養子細胞療法(例えばCAR-T療法)、又はワクチンである。
【００５７】
一例では、本発明は目的のファージ核酸をパッケージングするためにヘルパーファージを利用する。したがって、本発明は以下の例証的な態様を提供する:
【００５８】
1.  ヘルパーファージの集団であって、ヘルパーファージが、第1のファージ核酸をパッケージングして第1のファージ粒子を産生することができ、第1のファージがヘルパーファージと異なり、ヘルパーファージが、それ自体ではヘルパーファージ粒子を産生することができない、ヘルパーファージの集団。
【００５９】
2.  第1のファージの集団を含む組成物であって、第1のファージが、第1のファージ粒子の複製のために態様1に記載のヘルパーファージを必要とし、任意選択で、組成物に含まれる総ファージ粒子の20、15、10、5、4、3、2、1、0.5、0.4、0.2、又は0.1%未満がそのようなヘルパーファージの粒子である、組成物。
【００６０】
一例では、組成物はヘルパーファージを含み、組成物に含まれる総ファージ粒子の1%未満がそのようなヘルパーファージの粒子である。一例では、組成物はヘルパーファージを含み、組成物に含まれる総ファージ粒子の0.5%未満がそのようなヘルパーファージの粒子である。一例では、組成物はヘルパーファージを含み、組成物に含まれる総ファージ粒子の0.1%未満がそのようなヘルパーファージの粒子である。一例では、組成物はヘルパーファージを含み、組成物に含まれる総ファージ粒子の0.01%未満がそのようなヘルパーファージの粒子である。一例では、組成物はヘルパーファージを含み、組成物に含まれる総ファージ粒子の0.001%未満がそのようなヘルパーファージの粒子である。一例では、組成物はヘルパーファージを含み、組成物に含まれる総ファージ粒子の0.0001%未満がそのようなヘルパーファージの粒子である。一例では、組成物はヘルパーファージを含み、組成物に含まれる総ファージ粒子の0.00001%未満がそのようなヘルパーファージの粒子である。一例では、組成物はヘルパーファージを含み、組成物に含まれる総ファージ粒子の0.000001%未満がそのようなヘルパーファージの粒子である。一例では、組成物はヘルパーファージを含み、組成物に含まれる総ファージ粒子の0.0000001%未満がそのようなヘルパーファージの粒子である。一例では、組成物はヘルパーファージを含み、組成物に含まれる総ファージ粒子の0.00000001%未満がそのようなヘルパーファージの粒子である。
【００６１】
一例では、集団は、例えば形質導入アッセイにおいて示されるように、少なくとも103、104、105、又は106個のファージ粒子を含む。一例では、集団は少なくとも103個のファージ粒子、且つ例えば1014個以下の粒子を含む。一例では、集団は少なくとも104個のファージ粒子、且つ例えば1014個以下の粒子を含む。一例では、集団は少なくとも105個のファージ粒子、且つ例えば1014個以下の粒子を含む。一例では、集団は少なくとも106個のファージ粒子、且つ例えば1014個以下の粒子を含む。第1のファージの濃度の測定を行うために、例えば、第1のファージゲノムが抗生物質マーカーを含有する場合に標準的な形質導入アッセイを実施してもよい。したがって、この場合、第1のファージが標的細菌に感染することができ、1mlの試料において集団が少なくとも103、104、105、又は106個の形質導入用粒子を含むということは、感受性細菌を0.1未満の感染多重度で感染させ、摂氏20から37度、例えば摂氏20又は37度で抗生物質マーカーに対応する選択寒天プレートにin vitroで播種することにより感染した細胞の数を決定することによって決定することができる。
【００６２】
任意選択で、組成物に含まれる総ファージ粒子の少なくとも99.9、99.8、99.7、99.6、99.5、99.4、99.3、99.2、99.1、90、85、80、70、60、50、又は40%は第1のファージの粒子である。
【００６３】
一例では、第1のファージゲノムはf1複製起点を含む。
【００６４】
一例では、ヘルパーファージは大腸菌ファージである。一例では、第1のファージは、大腸菌、Cディフィシル(difficile)、ストレプトコッカス(Streptococcus)、クレブシエラ(Klebsiella)、シュードモナス(Pseudomonas)、アシネトバクター(Acinetobacter)、腸内細菌科(Enterobacteriaceae)、フィルミクテス門(Firmicutes)、又はバクテロイデス門(Bacteroidetes)ファージである。一例では、ヘルパーファージは操作されたM13ファージである。
【００６５】
一例では、第1のファージゲノムはファージミドを含み、ファージミドはヘルパーファージの存在下で第1のファージ粒子をパッケージングするためのパッケージングシグナルを含む。
【００６６】
第1のファージ粒子は、例えば本明細書に記載の目的のヌクレオチド配列(NSI)、例えば第1のファージ粒子によって感染し得る標的細菌において作動可能なCRISPR/Casシステムの成分をコードするNSIを含有してもよい。標的細菌の内部に入ると、第1のファージDNAは、ヘルパーファージの非存在下では、パッケージングされて第1のファージ粒子を形成することができない。有用なことに、このことは、第1のファージゲノム及び第1のファージゲノムにコードされる産物(タンパク質及び/又は核酸)の活性を封じ込め、第1のファージに曝露された標的細菌を含む環境におけるNSI及びNSIにコードされる産物の投薬量を限定又は制御する。このことは、例えば、ヒト若しくは動物対象、植物に含まれる環境、又は他の環境(例えば、土壌、又は食品若しくは食料成分)の医薬的処理を制御するのに有用である。
【００６７】
3.  各第1のファージのゲノムが、第1のファージ構造タンパク質をコードする遺伝子を欠く、前述のいずれかの態様に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【００６８】
4.  ヘルパーファージDNAを含む、態様2又は3に記載の組成物。
【００６９】
5.  DNAがヘルパーDNA断片を含む、態様4に記載の組成物。
【００７０】
6.  ヘルパーファージがプロファージの形態である、前述のいずれか一つの態様に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【００７１】
したがって、プロファージは宿主細胞の染色体へ組み込まれる。
【００７２】
ファージ構造タンパク質の例は、ファージコートタンパク質、襟タンパク質(collar protein)、及びファージ尾部繊維タンパク質である。
【００７３】
7.  20個以上の連続するヌクレオチド(例えば20から25、30、35、40、50、又は100ヌクレオチドまで)の配列を含むヘルパーファージDNA、例えばヘルパーファージDNAを含まない、態様2又は3に記載の組成物。
【００７４】
このことは、従来通り、例えばPCRでDNAプローブ(公知のヘルパーファージゲノム配列に基づいて設計した)を使用して決定することができる。一例では、組成物は、残留ヘルパープロファージDNAを含んでもよいが、その他の点では本質的にヘルパーDNAを欠く。
【００７５】
8.  ヘルパーファージが宿主細菌に感染することができ、組成物が宿主細菌を含まない、態様2から5、及び7のいずれか一つに記載の組成物。
【００７６】
9.  ヘルパープロファージDNAを含む、宿主細菌細胞の溶解物であり、例えばそのようなDNAがヘルパーファージDNAの20個以上の連続するヌクレオチド(例えば20から25、30、35、40、50、又は100ヌクレオチドまで)を含む、態様2から8のいずれか一つに記載の組成物。
【００７７】
10.  全て若しくは一部のヘルパーファージDNAを除去するために処理(例えばろ過)されている、宿主細菌細胞の溶解物であるか、又は細胞材料を欠く宿主細菌細胞の溶解物である、態様2から8のいずれか一つに記載の組成物。
【００７８】
11.  ヘルパーファージ粒子を含まない、態様2から10のいずれか一つに記載の組成物。
【００７９】
12.  組成物に含まれる少なくとも95%(例えば100%)のファージ粒子が第1のファージ粒子である、態様2から11のいずれか一つに記載の組成物。
【００８０】
別の実施形態では、組成物は第2のファージ粒子を含み、第2のファージは第1のファージと異なり、且つヘルパーファージではない。
【００８１】
13.  集団が、形質導入アッセイにおいて示されるように、少なくとも103、104、105、又は106個のファージ粒子を含む、態様2から12のいずれか一つに記載の組成物。
【００８２】
14.  第1のファージが、ヘルパーファージ(例えばヘルパープロファージ)の存在下、宿主細菌中で複製することができ、第1の株又は種の標的細菌を死滅させるための抗菌手段を含み、標的細菌が異なる株又は種に属し、抗菌手段が標的細菌を死滅させるように作動可能ではない、前述のいずれかの態様に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【００８３】
15.  ファージの集団を含む組成物であって、集団が、
(a)第1のファージをパッケージングするためにヘルパーファージを必要とする第1のファージの第1の亜集団、
(b)前述のいずれかの態様に記載のヘルパーファージを含む、ファージの第2の亜集団
を含む、組成物。
【００８４】
16.  ヘルパーファージがファージミドである、前述のいずれかの態様に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【００８５】
17.  (a)前述のいずれかの態様に記載のヘルパーファージの集団、及び
(b)第1のファージパッケージングシグナルを含むベクターDNAを含む核酸ベクターの集団
を含む組成物であって、
(c)ヘルパーファージがベクターDNAをパッケージングして第1のファージを産生することができる、
組成物。
【００８６】
18.  ベクターがファージである、態様17に記載の組成物。
【００８７】
19.  ベクターがプラスミド又はファージミドである、態様17に記載の組成物。
【００８８】
20.  ベクターが、第1の細菌中で複製することができるシャトルベクター(例えばpUCベクター)であり、更に、ヘルパーファージの存在下、第2の細菌(宿主細菌)中で複製して第1のファージにパッケージングすることができ、第1の細菌が宿主細菌の株又は種と異なる株又は種に属する、態様19に記載の組成物。
【００８９】
21.  第1のファージが、第2の(更に、任意選択で第1の)細菌と異なる株又は種の第3の細菌に感染することができる、態様20に記載の組成物。
【００９０】
22.  第1のファージが、ヘルパーファージ(例えばヘルパープロファージ)の存在下、宿主細菌中で複製することができ、第1の株又は種の標的細菌を死滅させるための抗菌手段を含み、宿主細菌が異なる株又は種に属し、抗菌手段が宿主細菌を死滅させるように作動可能ではない、態様17から21のいずれか一つに記載の組成物。
【００９１】
23.  ゲノムがパッケージングシグナル(例えば下記の配列番号2)を欠き、ヘルパーファージが自己複製することができない、前述のいずれかの態様に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【００９２】
24.  シグナルがpac又はcos配列である、態様23に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【００９３】
25.  ヘルパーファージゲノムが宿主細胞中で複製することができる、前述のいずれかの態様に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【００９４】
したがって、ゲノムは、核酸複製は可能だが、ヘルパーファージのパッケージングは不可能である。
【００９５】
26.  ゲノムが、ヘルパーファージ粒子の産生のために必要とされるヌクレオチド配列を欠く、態様1から24のいずれか一つに記載のヘルパーファージ又は組成物。
【００９６】
27.  ヌクレオチド配列が、シグマ因子(例えばシグマ70)をコードするか、又はシグマ因子認識部位、DNA重合認識部位、若しくはヘルパーファージDNA複製のために必要とされる遺伝子のプロモーターを含む、態様26に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【００９７】
28.  ヘルパーファージが溶原性ファージである、前述のいずれかの態様に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【００９８】
29.  ヘルパーファージが溶菌性ファージである、態様1から27のいずれか一つに記載のヘルパーファージ又は組成物。
【００９９】
30.  第1のファージが、標的細菌に感染することができ、標的細菌においてタンパク質又はRNA(例えばgRNA若しくはcrRNA)を発現させることができる目的のヌクレオチド配列(NSI)、或いは標的細菌において作動可能な調節エレメントを含むNSIを含む、前述のいずれかの態様に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【０１００】
31.  標的細菌におけるNSI又はNSIにコードされるタンパク質若しくはRNAの存在が、標的細胞の死滅、又は標的細胞の成長若しくは増幅の下方調節を媒介するか、或いは標的細胞ゲノムによってコードされる1つ若しくは複数のRNA若しくはタンパク質の発現の停止、又はその下方調節を媒介する、態様30に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【０１０１】
32.  標的細菌におけるNSI又はNSIにコードされるタンパク質若しくはRNAの存在が、標的細胞の成長又は増幅の上方調節を媒介するか、或いは標的細胞ゲノムによってコードされる1つ若しくは複数のRNA若しくはタンパク質の発現の始動、又はその上方調節を媒介する、態様30に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【０１０２】
33.  第1のファージが標的細菌に感染することができ、各第1のファージが標的細菌を死滅させるための操作された抗菌手段を含む、態様2から32のいずれか一つに記載の抗菌組成物。
【０１０３】
「操作された」という用語の使用により、関連する手段が導入されたものであり、ファージに天然に存在するものではないということが、当業者に容易に明白となるだろう。例えば手段は、組換え、人工、又は合成手段である。
【０１０４】
34.  抗菌手段がCRISPR/Casシステムの1つ又は複数の成分を含む、態様14、22、又は33に記載の組成物。
【０１０５】
35.  前記成分が、(i)ガイドRNA(例えば単一ガイドRNA)をコードするか若しくはガイドRNAを産生するためのCRISPRアレイを含むDNA配列であって、ガイドRNAが標的細菌のゲノムを標的とすることができる、DNA配列、(ii)CasヌクレアーゼをコードするDNA配列、及び/又は(iii)Cascadeの1つ若しくは複数の成分をコードするDNA配列を含む、態様34に記載の組成物。
【０１０６】
一例では、本明細書のCasはCas9である。一例では、本明細書のCasはCas3である。Casは、標的細菌によってコードされるCasと同一である。
【０１０７】
36.  抗菌手段が、導かれたヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼ、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む、態様14、22、又は33から35のいずれか一つに記載の組成物。
【０１０８】
37.  ヘルパーファージがヒト若しくは動物対象に対して実施される医療における使用のためのものであるか、又は組成物がヒト若しくは動物対象に対して実施される医療における使用のための医薬組成物である、前述のいずれかの態様に記載のヘルパーファージ又は組成物。
【０１０９】
一例では、動物は、家畜又はコンパニオンペット動物(例えば、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコ、又はウサギ)である。一例では、動物は昆虫(ライフサイクルの任意の段階、例えば、卵、幼虫、又は蛹の段階にある昆虫)である。一例では、動物は原生動物である。一例では、動物は頭足類である。
【０１１０】
38.  除草剤、農薬、食料若しくは飲料処理剤、食料若しくは飲料添加剤、石油化学若しくは燃料処理剤、水精製剤、化粧品添加剤、洗剤添加剤、又は環境(例えば土壌)添加剤若しくは洗浄剤である、態様2から36のいずれか一つに記載の組成物。
【０１１１】
39.  ヒト又は動物対象の疾患又は状態を処置する完結型の方法における使用のためのヘルパーファージ又は組成物であり、疾患又は状態が標的細菌によって媒介され、標的細菌が対象に含まれ、方法が、組成物を対象に投与する工程であり、それによって標的細菌が抗菌手段に曝露されて死滅し、第1のファージの増幅が封じ込められる、工程を含む、態様1から37のいずれか一つに記載のヘルパーファージ又は組成物。
【０１１２】
有用なことに、第1のファージが自己複製することができず、これを行うためにヘルパーファージ又は第2のDNAを必要とすることは、例えば、そうでなければ複製された第1のファージを含有し得る対象の尿及び糞便等の分泌物に曝露されるにもかかわらず、組成物の作用位置(例えば腸)、及び/又は対象の環境への封じ込めを実現する。ヘルパーファージ又は第2のDNAが自己パッケージングすることができないことは、パッケージングされた粒子を形成するために第1のファージによって必要とされる因子のアベイラビリティを限定し、したがって第1のファージ増幅を限定することによって封じ込めを実現する。このことは、例えば、第1のファージによって提供される抗菌活性、例えばCRISPR/Cas死滅原理を封じ込めるのに有用であり得る。
【０１１３】
40.  前述のいずれかの態様に記載のヘルパーファージ又は組成物を含む細菌細胞又は複数の細菌細胞であって、第1のファージが、ヘルパーファージの存在下、細胞中で複製することができる、細菌細胞又は複数の細菌細胞。
【０１１４】
細胞は、例えば第1のファージのゲノムの担体として作用することができ、第1のファージDNAは、担体細菌が処理される環境、例えば土壌、又はヒト腸、又は本明細書に記載の他の環境に投与されると、担体から標的細菌へ水平伝播することができる。一例では、環境はヒト又は動物対象に含まれ、担体は対象における片利共生生物又はプロバイオティクスである。例えば、担体細菌は、ラクトバチルス(Lactobacillus)(例えばLロイテリ(reuteri)若しくはLラクチス(lactis))、大腸菌、又はストレプトコッカス(例えばSサーモフィルス(thermophilus))細菌である。水平伝播は、プラスミド(例えば接合性プラスミド)の標的細菌への伝播であっても、標的細菌の第1のファージ感染であってもよく、第1のファージは、担体へ予めパッケージングされている。担体が、ファージ、ヘルパー、又は組成物の、胃酸又は対象中の他の過酷な環境からの保護を提供することができる場合、担体の使用は、経口投与又は他の経路に非常に有用である。更に担体は、飲料、例えばプロバイオティクス飲料、例えば適合したYakult(商標)、Actimel(商標)、Kevita(商標)、Activia(商標)、Jarrow(商標)、又はヒトが消費するための類似の飲み物に製剤化することができる。
【０１１５】
41.  第1のファージを使用して標的細菌を死滅させることを含むヒト又は動物対象への投与のための医療用途の細胞であり、標的細菌が対象における疾患又は状態を媒介する、態様40に記載の細胞。
【０１１６】
一例では、対象がヒトである場合、対象は胎児ではない。
【０１１７】
42.  ヘルパーファージを含み、対象における共生生物又はプロバイオティクスである、態様41に記載の細胞。
【０１１８】
43.  環境における標的細菌を死滅させる方法であって、任意選択でヒト又は動物の身体に対して実施されず、環境を、態様42に記載の細胞、又は態様57から65のいずれか一つに記載の方法によって取得されたか若しくは取得可能な組成物に曝露する工程を含み、環境が、第1のファージ、又はヘルパーファージの存在下で第1のファージを産生するための前記ベクターに曝露されるか曝露されており、第1のファージが、環境中で複製することができ、標的細菌を死滅させる、方法。
【０１１９】
44.  細胞が、大腸菌、ラクトバチルス(例えばLラクチス若しくはロイテリ)、又はストレプトコッカス(例えばサーモフィルス)細胞である、態様40から43のいずれか一つに記載の細胞又は方法。
【０１２０】
45.  対象が、第1のファージを含む細胞を投与されるか又は投与されている、態様40から44のいずれか一つに記載の細胞又は方法。
【０１２１】
46.  標的細菌細胞と組み合わされる組成物であって、第1のファージが標的細菌細胞に感染することができる、態様2から45のいずれか一つに記載の組成物。
【０１２２】
47.  標的細菌を死滅させる抗菌剤の生産における、抗菌剤の環境への封じ込め、例えばex vivoでの封じ込め、又は環境を含むヒト若しくは動物対象への封じ込めのための、態様1から42、及び44から46のいずれか一つに記載のヘルパーファージ、組成物、若しくは細胞、又は態様57から65のいずれか一つに記載の方法によって取得されたか若しくは取得可能な組成物の使用。
【０１２３】
48.  標的細菌を死滅させる抗菌剤の生産における、第1のファージによる外来遺伝子の獲得のリスクを低減するための、態様1から42、及び44から46のいずれか一つに記載のヘルパーファージ、組成物、若しくは細胞、又は態様57から65のいずれか一つに記載の方法によって取得されたか若しくは取得可能な組成物の使用。
【０１２４】
例えば、このことは、例えばファージが環境において他のファージ又はプラスミドの存在下にある場合、ファージによる抗生物質耐性遺伝子のリスクを低減するのに有用である。
【０１２５】
49.  標的細菌を死滅させる抗菌剤の生産における、第1のファージによる1つ又は複数の抗生物質耐性遺伝子の獲得のリスクを低減するための、態様1から42、及び44から46のいずれか一つに記載のヘルパーファージ、組成物、若しくは細胞、又は態様57から65のいずれか一つに記載の方法によって取得されたか若しくは取得可能な組成物の使用。
【０１２６】
50.  第1のファージによる外来遺伝子の獲得のリスクを低減する方法であって、
(a)態様2から42、及び44から46のいずれか一つに記載の組成物、又は態様57から65のいずれか一つに記載の方法によって取得されたか若しくは取得可能な組成物を用意する工程、並びに
(b)標的細菌を組成物に曝露する工程であり、第1のファージが標的細菌に感染する、工程
を含み、
(c)ヘルパーファージが自己複製することができず、それにより第1のファージの増幅が限定され、第1のファージの増幅が妨げられるか又は減少し、それにより第1のファージの、外来遺伝子(例えば抗生物質耐性遺伝子)の獲得のリスクを低減する、
方法。
【０１２７】
51.  抗菌活性を環境(例えばex vivo)に封じ込める方法であって、
(a)態様2から42、及び44から46のいずれか一つに記載の抗菌組成物、又は態様57から65のいずれか一つに記載の方法によって取得されたか若しくは取得可能な組成物を用意する工程、並びに
(b)環境中の標的細菌を組成物に曝露する工程であり、細菌が第1のファージ及び抗菌手段に曝露されて死滅する、工程
を含み、
(c)ヘルパーファージが自己複製することができず、それにより第1のファージの増幅が限定され、第1のファージの増幅が妨げられるか又は減少し、それにより抗菌活性を封じ込める、
方法。
【０１２８】
52.  環境(例えばex vivo)における第1のファージの投薬量を制御する方法であって、
(a)態様2から42、及び44から46のいずれか一つに記載の抗菌組成物、又は態様57から65のいずれか一つに記載の方法によって取得されたか若しくは取得可能な組成物を用意する工程、並びに
(b)環境中の標的細菌を組成物に曝露する工程であり、細菌が第1のファージによって感染する、工程
を含み、
(c)ヘルパーファージが自己複製することができず、それにより第1のファージの増幅が限定され、第1のファージの増幅が妨げられるか又は減少し、それにより環境における第1のファージの投薬量を制御する
方法。
【０１２９】
53.  環境がヒト又は動物のマイクロバイオーム、例えば腸内マイクロバイオームである、態様43から45、51、及び52のいずれか一つに記載の方法、又は態様47に記載の使用。
【０１３０】
54.  環境が、土壌のマイクロバイオーム;植物、植物の一部(例えば、葉、果実、野菜、若しくは花)又は植物産物(例えば果肉);水;水路;流体;食品又はその成分;飲料又はその成分;医療機器;化粧品;洗剤;血液;体液;医療装置;産業装置;石油リグ;石油化学処理、保管、又は輸送装置;ビヒクル又は容器である、態様43から45、51、及び52のいずれか一つに記載の方法、又は態様47に記載の使用。
【０１３１】
55.  環境が、組成物を投与されたヒト又は動物対象のex vivoの体液(例えば、尿、血液、血液製剤、汗、涙、喀痰、若しくは唾液)、体由来の固形物(bodily solid)(例えば糞便)、又は組織である、態様43から45、51、及び52のいずれか一つに記載の方法、又は態様47に記載の使用。
【０１３２】
56.  環境が、組成物を投与されたヒト又は動物対象のin vivoの体液(例えば、尿、血液、血液製剤、汗、涙、喀痰、若しくは唾液)、体由来の固形物(例えば糞便)、又は組織である、態様43から45、51、及び52のいずれか一つに記載の方法、又は態様47に記載の使用。
【０１３３】
57.  複製するためにヘルパーファージを必要とする第1のファージを産生する方法であって、
(a)パッケージングシグナルを含むDNAを用意する工程、
(b)DNAを宿主細菌細胞に導入する工程であり、
(c)宿主細菌細胞がヘルパーファージを含むか、又はヘルパーファージが工程(b)と同時若しくは順次に細菌細胞に導入され、
(d)ヘルパーファージが前述のいずれかの態様に記載のものである、工程、
(e)ヘルパーファージがファージコートタンパク質を産生することを引き起こすか又は可能にする工程であり、パッケージングシグナルが宿主細胞において認識され、それによって第1のファージが、タンパク質を使用して産生され、DNAをパッケージングし、
(f)宿主細胞におけるヘルパーファージ粒子産生が阻害されるか又は減少し、それによりヘルパーファージ粒子のアベイラビリティを限定する、工程、
(g)任意選択で宿主細胞を溶解させ、第1のファージを取得する工程であり、
(h)それにより複製のためにヘルパーファージを必要とする第1のファージを含む組成物を製造し、組成物におけるヘルパーファージアベイラビリティの限定によって第1のファージ粒子の更なる産生が妨げられるか又は減少する、工程
を含む、方法。
【０１３４】
一実施形態では、DNAは、ファージミド又はクローニングベクター(例えばシャトルベクター、例えばpUCベクター)に含まれる。
【０１３５】
第1のファージタンパク質産生を効率的に可能にする適度な量のヘルパーファージDNA複製が存在していてもよく、ヘルパーファージDNAの複製が完全に排除されていてもよい。
【０１３６】
58.  (c)において、ヘルパーファージが細菌細胞染色体へ組み込まれたプロファージである、態様57に記載の方法。
【０１３７】
59.  (e)が、例えばUV、マイトマイシンを使用して、ヘルパーファージDNAの複製及び/又はタンパク質の発現を誘発することを含む、態様57又は58に記載の方法。
【０１３８】
60.  (g)が、第1のファージを細胞材料又はヘルパーファージDNAから分離することを更に含む、態様57から59のいずれか一つに記載の方法。
【０１３９】
61.  組成物が、第1のファージ粒子の集団を含み、ヘルパーファージDNA及び/又は粒子を含まない、態様57から60のいずれか一つに記載の方法。
【０１４０】
62.  (a)のDNAが標的細菌を死滅させるための操作された抗菌手段を含む、態様57から61のいずれか一つに記載の方法。
【０１４１】
63.  抗菌手段がCRISPR/Casシステムの1つ又は複数の成分を含む、態様62に記載の方法。
【０１４２】
64.  前記成分が、(i)ガイドRNA(例えば単一ガイドRNA)をコードするか若しくはガイドRNAを産生するためのCRISPRアレイを含むDNA配列であって、ガイドRNAが標的細菌のゲノムを標的とすることができる、DNA配列、(ii)Cas(例えば、Cas9、Cas3、Cpf1、CasX、若しくはCasY)ヌクレアーゼをコードするDNA配列、及び/又は(iii)Cascadeの1つ若しくは複数の成分(例えばCasA)をコードするDNA配列を含む、態様63に記載の方法。
【０１４３】
65.  抗菌手段が、導かれたヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼ、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む、態様62から64のいずれか一つに記載の方法。
【０１４４】
66.  ヒト又は動物対象における標的細菌の抗菌処理のための、それによって抗菌処理が対象に封じ込められる、態様1から42、及び44から46のいずれか一つに記載のヘルパーファージ、組成物、若しくは細胞、又は態様57から65のいずれか一つに記載の方法によって取得されたか若しくは取得可能な組成物。
【０１４５】
67.  ヒト又は動物対象の腸における標的細菌の抗菌処理のための、それによって対象の1つ又は複数の排泄物における抗菌活性が低下する、態様1から42、及び44から46のいずれか一つに記載のヘルパーファージ、組成物、若しくは細胞、又は態様57から65のいずれか一つに記載の方法によって取得されたか若しくは取得可能な組成物。
【０１４６】
このことは、対象の体外における第1のファージ活性を低下又は排除する安全性措置として有用である。
【０１４７】
68.  対象の1つ又は複数の排泄物における抗菌活性が排除される、態様67に記載のヘルパーファージ、組成物、又は細胞。
【０１４８】
69.  ヒト又は動物対象、例えば対象の腸における標的細菌の抗菌処理の投薬量を制御するための、態様1から42、及び44から46のいずれか一つに記載のヘルパーファージ、組成物、若しくは細胞、又は態様57から65のいずれか一つに記載の方法によって取得されたか若しくは取得可能な組成物。
【０１４９】
有用なことに、第1のファージの増幅は制限又は排除されるので、対象における投薬量は制御することができるか、又は予期される狭い範囲内に予め決定することさえできる。このことは、例えば第1のファージ又は組成物を含む医薬に有用であり、そのような医薬品のFDA及び類似の機関以前の承認の援助となり得る。
【０１５０】
或いは、投薬量は、例えば本明細書に開示される土壌等の環境の投薬量であり、第1のファージ又は組成物活性の限定はまた、自然及び他の土地における活性の拡散を限定するのにも望ましい。
【０１５１】
70.  ヒト又は動物対象、例えば対象の腸における標的細菌の抗菌処理の投薬量を固定するための、態様1から42、及び44から46のいずれか一つに記載のヘルパーファージ、組成物、若しくは細胞、又は態様57から65のいずれか一つに記載の方法によって取得されたか若しくは取得可能な組成物。
【０１５２】
71.  目的のヌクレオチド配列を含むファージ(例えば前述のいずれかの態様に規定の第1のファージ)(NSIファージ)を産生するためのファージ産生システムであって、成分(a)から(c):
(a)第1のDNA、
(b)第2のDNA、及び
(c)NSIファージ産生因子(NPF)又はNPFをコードする発現可能なヌクレオチド配列
を含み、
(d)第1のDNAがヘルパーファージ(例えば前述のいずれかの態様に記載の前記第1のヘルパーファージ)をコードし、
(e)第2のDNAが目的のヌクレオチド配列(NSI)を含み、
(f)システムが細菌宿主細胞に含まれる場合、ヘルパーファージタンパク質が第1のDNAから発現して、NPFの存在下で第2のDNAをパッケージングするファージを形成し、それによりNSIファージを産生し、
(g)システムが、第1のDNAをパッケージングするヘルパーファージ粒子を形成するために必要とされるヘルパーファージ産生因子(HPF)を欠くか、若しくは機能性HPFをコードする発現可能なヌクレオチド配列を欠く;又はシステムが、機能性HPFを含むか若しくはコードするヌクレオチド配列を含み、更に、第1のDNAを含むヘルパーファージの産生を排除若しくは最小化する、宿主細胞におけるHPF配列を標的とする不活性化のための手段を含み、
それによってシステムがNSIファージの集団を含む産物を産生することができ、各NSIファージが増幅のために前記ヘルパーファージを必要とし、任意選択で、産物中のNSIファージがヘルパーファージと混合しないか、又は産物に含まれる総ファージの20%未満が前記ヘルパーファージである、システム。
【０１５３】
本発明は、例えば、ヘルパーファージパッケージングシグナル、又はヘルパーファージゲノムにおける他のHPFヌクレオチド配列が、ファージ粒子を形成する能力をノックダウンするように変異している(例えば、欠失、置換、又はそこへのヌクレオチドの付加によって)場合等、ヘルパーファージの、複製して粒子を産生する性能が残存している場合、比較的低いレベルのヘルパーファージ粒子産生を本発明の概念に含む。好ましくは、ヘルパーファージ粒子の産生は、例えば、ヘルパーファージゲノム由来の配列の全て又は一部を欠失するか、又は配列を不活性化することによって存在しなくなる。
【０１５４】
72.  複製するためにヘルパーファージを必要とする第1のファージを産生する方法であって、
(a)態様71に記載のシステムを宿主細胞に提供する工程、
(b)ヘルパーファージタンパク質が産生されることを引き起こすか又は可能にする工程であり、それによって第2のDNAがパッケージングされて第1のファージを産生する、工程、
(c)任意選択で宿主細胞を溶解させ、第1のファージを含む組成物を取得する工程
を含む、方法。
【０１５５】
73.  工程(c)が、第1のファージを細胞材料から分離することを含む、態様72に記載の方法。
【０１５６】
74.  組成物が第1のファージの集団を含み、組成物に含まれる総ファージの20、10、5、4、3、2、1、0.5、又は0.1%未満がヘルパーファージである、態様72又は73に記載の方法。
【０１５７】
75.  第2のDNAが標的細菌を死滅させるための操作された抗菌手段を含む、態様72から74のいずれか一つに記載の方法。
【０１５８】
76.  抗菌手段がCRISPR/Casシステムの1つ又は複数の成分を含む、態様75に記載の方法。
【０１５９】
77.  前記成分が、(i)ガイドRNA(例えば単一ガイドRNA)をコードするか若しくはガイドRNAを産生するためのCRISPRアレイを含むDNA配列であって、ガイドRNAが標的細菌のゲノムを標的とすることができる、DNA配列、(ii)CasヌクレアーゼをコードするDNA配列、及び/又は(iii)Cascadeの1つ若しくは複数の成分をコードするDNA配列を含む、態様76に記載の方法。
【０１６０】
78.  抗菌手段が、導かれたヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼ、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む、態様75から77のいずれか一つに記載の方法。
【０１６１】
79.  第1のファージが標的細菌に感染することができ、NSIが標的細菌においてタンパク質若しくはRNAを発現させることができるか、又はNSIが標的細菌において作動可能な調節エレメントを含む、態様71から78のいずれか一つに記載の方法のシステム。
【０１６２】
80.  標的細菌におけるNSI又はNSIにコードされるタンパク質若しくはRNAの存在が、標的細胞の死滅、又は標的細胞の成長若しくは増幅の下方調節を媒介するか、或いは標的細胞ゲノムによってコードされる1つ若しくは複数のRNA若しくはタンパク質の発現の停止、又はその下方調節を媒介する、態様79に記載の方法のシステム。
【０１６３】
81.  標的細菌におけるNSI又はNSIにコードされるタンパク質若しくはRNAの存在が、標的細胞の成長又は増幅の上方調節を媒介するか、或いは標的細胞ゲノムによってコードされる1つ若しくは複数のRNA若しくはタンパク質の発現の始動、又はその上方調節を媒介する、態様79に記載の方法のシステム。
【０１６４】
82.  NPF及びHPFのそれぞれが、パッケージングシグナル、例えば配列番号2、又はそれと少なくとも70、80、90、95、96、97、98、若しくは99%同一の配列であるか、或いは異なる種由来の相同体である、態様71から81のいずれか一つに記載の方法のシステム。
【０１６５】
83.  各シグナルがpac若しくはcos配列、又は相同体である、態様82に記載の方法のシステム。
【０１６６】
84.  HPFがヘルパーファージの複製のために必要とされるヌクレオチド配列である、態様71から81のいずれか一つに記載の方法のシステム。
【０１６７】
85.  HPFが、シグマ因子(例えばシグマ70)をコードするか、又はシグマ因子認識部位、DNA重合認識部位、若しくはヘルパーファージDNA複製のために必要とされる遺伝子のプロモーター、ヘルパーファージインテグラーゼ、ヘルパーファージエキシシオナーゼ、若しくはヘルパーファージ複製起点を含む、態様71から81のいずれか一つに記載の方法のシステム。
【０１６８】
86.  態様72から85のいずれか一つに記載の方法によって取得可能な第1のファージの集団を含む組成物であって、各第1のファージのゲノムが、ファージタンパク質をコードする遺伝子を欠く、組成物。
【０１６９】
87.  第1のファージが態様75から78のいずれか一つに規定の抗菌手段を含む、態様86に記載の組成物。
【０１７０】
88.  第1のDNA又はその断片と同一のDNAを含む、態様87に記載の組成物。
【０１７１】
89.  組成物のDNAが、第1のDNAと同一であり、ヘルパーファージパッケージングシグナルを欠く、態様88に記載の組成物。
【０１７２】
90.  ヒト又は動物対象における標的細菌の抗菌処理のための、それによって抗菌処理が対象に封じ込められる、態様86から89のいずれか一つに記載の組成物。
【０１７３】
91.  ヒト又は動物対象の腸における標的細菌の抗菌処理のための、それによって対象の1つ又は複数の排泄物における抗菌活性が低下する、態様86から89のいずれか一つに記載の組成物。
【０１７４】
92.  対象の1つ又は複数の排泄物における抗菌活性が排除される、態様91に記載の組成物。
【０１７５】
93.  ヒト又は動物対象、例えば対象の腸における標的細菌の抗菌処理の投薬量を制御するための、態様86から89のいずれか一つに記載の組成物。
【０１７６】
94.  ヒト又は動物対象、例えば対象の腸における標的細菌の抗菌処理の投薬量を固定するための、態様86から89のいずれか一つに記載の組成物。
【０１７７】
95.  ファージ粒子を産生するために必要とされるヘルパーファージゲノムの構造タンパク質遺伝子を全て含む単離されたDNAであって、パッケージングされたヘルパーファージを産生するために必要とされるヘルパーファージ産生因子(HPF)を欠き、任意選択で、宿主細菌細胞のゲノムへ組み込まれる場合、遺伝子の発現のために1つ又は複数のプロモーターを含む、単離されたDNA。
【０１７８】
96.  任意のファージパッケージングシグナルを欠く、態様95に記載のDNA。
【０１７９】
97.  HPFが、シグマ因子をコードするヌクレオチド配列であるか、又はシグマ因子認識部位、DNA重合認識部位、ヘルパーファージDNA複製のために必要とされる遺伝子のプロモーター、ヘルパーファージインテグラーゼをコードするヌクレオチド配列、ヘルパーファージエキシシオナーゼをコードするヌクレオチド配列、若しくはヘルパーファージ複製起点を含む、態様95又は96に記載のDNA。
【０１８０】
98.  CRISPR/Casシステムリプレッサーをコードするヌクレオチド配列を含む、態様95から97のいずれか一つに記載のDNA。
【０１８１】
99.  宿主細菌細胞の染色体へ組み込まれ、遺伝子が宿主細胞において発現可能である、態様95から98のいずれか一つに記載のDNA。
【０１８２】
100.  細胞が活性CRISPR/Casシステムを欠く、態様99に記載のDNA。
【０１８３】
101.  HPFを含む第2のDNAと組み合わされる、態様95から100のいずれか一つに記載のDNA。
【０１８４】
102.  ファージパッケージングシグナルを含む第2のDNAと組み合わされ、任意選択で第1のDNAがファージパッケージングシグナルを欠く、態様95から100のいずれか一つに記載のDNA。
【０１８５】
103.  第2のDNAが、ファージミド又はプラスミド(例えばシャトルベクター)に含まれる、態様101又は102に記載のDNA。
【０１８６】
一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は、医療用容器、例えば、シリンジ、バイアル、IVバッグ、吸入器、点眼器、又はネブライザーに含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は、滅菌容器に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は、医学的適合性容器に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は、発酵槽、例えば金属製、ガラス製、又はプラスチック製の発酵槽に含まれる。
【０１８７】
一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は、例えば、医薬を経口、IV、皮下、鼻腔内、眼内、経膣、局所、直腸、又は吸入投与によってヒト又は動物対象に投与するようにという説明書、又は指示を有する包装ラベルと組み合わされて医薬に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は経口医薬製剤に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は鼻腔内又は眼用医薬製剤に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は、個人用衛生組成物(例えば、シャンプー、石鹸、若しくは消臭剤)、又は化粧用製剤に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は洗剤製剤に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は、例えば医療又は産業機器又は装置を洗浄するための洗浄製剤に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は、食品、食品成分、又は食品処理剤に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は、飲料、飲料成分、又は飲料処理剤に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は、医療用包帯、布、絆創膏、又は綿棒に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は除草剤又は農薬に含まれる。一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、又は組成物は殺虫剤に含まれる。
【０１８８】
一例では、第1のファージは、コルチコウイルス科(Corticoviridae)、シストウイルス科(Cystoviridae)、イノウイルス科(Inoviridae)、レビウイルス科(Leviviridae)、ミクロウイルス科(Microviridae)、マイオウイルス科(Myoviridae)、ポドウイルス科(Podoviridae)、シホウイルス科(Siphoviridae)、又はテクティウイルス科(Tectiviridae)のウイルスである。一例では、ヘルパーファージは、コルチコウイルス科、シストウイルス科、イノウイルス科、レビウイルス科、ミクロウイルス科、マイオウイルス科、ポドウイルス科、シホウイルス科、又はテクティウイルス科のウイルスである。一例では、ヘルパーファージは、イノウイルス科の繊維状M13、有尾(tailed)ファージ(例えばマイオウイルス科、シホウイルス科、若しくはポドウイルス科)、又は無尾(non-tailed)ファージ(例えばテクティウイルス科)である。
【０１８９】
一例では、第1のファージとヘルパーファージの両方はコルチコウイルス科である。一例では、第1のファージとヘルパーファージの両方はシストウイルス科である。一例では、第1のファージとヘルパーファージの両方はイノウイルス科である。一例では、第1のファージとヘルパーファージの両方はレビウイルス科である。一例では、第1のファージとヘルパーファージの両方はミクロウイルス科である。一例では、第1のファージとヘルパーファージの両方はポドウイルス科である。一例では、第1のファージとヘルパーファージの両方はシホウイルス科である。一例では、第1のファージとヘルパーファージの両方はテクティウイルス科である。
【０１９０】
一例では、CRISPR/Cas成分はI型CRISPR/Casシステムの成分である。一例では、CRISPR/Cas成分はII型CRISPR/Casシステムの成分である。一例では、CRISPR/Cas成分はIII型CRISPR/Casシステムの成分である。一例では、CRISPR/Cas成分はIV型CRISPR/Casシステムの成分である。一例では、CRISPR/Cas成分はV型CRISPR/Casシステムの成分である。一例では、CRISPR/Cas成分はCas9をコードするヌクレオチド配列(例えば、Sピオゲネス(pyogenes)Cas9、黄色ブドウ球菌(S aureus)Cas9、又はSサーモフィルスCas9)を含む。一例では、CRISPR/Cas成分はCas3をコードするヌクレオチド配列(例えば、大腸菌Cas3、CディフィシルCas3、又はサルモネラ(Salmonella)Cas3)を含む。一例では、CRISPR/Cas成分はCpfをコードするヌクレオチド配列を含む。一例では、CRISPR/Cas成分はCasXをコードするヌクレオチド配列を含む。一例では、CRISPR/Cas成分はCasYをコードするヌクレオチド配列を含む。
【０１９１】
一例では、第1のDNA、第1のファージ、又はベクターは、標的細菌において作動可能なプロモーターを含むヌクレオチド配列由来のCRISPR/Cas成分又は目的のタンパク質をコードする。
【０１９２】
一例では、宿主細菌及び/又は標的細菌は大腸菌である。一例では、宿主細菌及び/又は標的細菌はCディフィシルである(例えば、ベクターは大腸菌において作動可能なシャトルベクターであり、宿主細菌はCディフィシルである)。一例では、宿主細菌及び/又は標的細菌はストレプトコッカス、例えばSサーモフィルスである(例えば、ベクターは大腸菌において作動可能なシャトルベクターであり、宿主細菌はストレプトコッカスである)。一例では、宿主細菌及び/又は標的細菌はシュードモナス、例えばPエルギノーサ(aeruginosa)である(例えば、ベクターは大腸菌において作動可能なシャトルベクターであり、宿主細菌はPエルギノーサである)。一例では、宿主細菌及び/又は標的細菌はクレブシエラである(例えば、ベクターは大腸菌において作動可能なシャトルベクターであり、宿主細菌はクレブシエラである)。一例では、宿主細菌及び/又は標的細菌はサルモネラ、例えばSティフィムリウム(typhimurium)である(例えば、ベクターは大腸菌において作動可能なシャトルベクターであり、宿主細菌はサルモネラである)。
【０１９３】
任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はグラム陰性細菌(例えば螺旋菌又はビブリオ)である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はグラム陽性細菌である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌は、マイコプラズマ、クラミジア、スピロヘータ、又はマイコバクテリウムである。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はストレプトコッカス(例えばピオゲネス又はサーモフィルス)である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はブドウ球菌(Staphylococcus)(例えば黄色ブドウ球菌、例えばMRSA)である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌は、例えばCasがベクターによってコードされているか又は内在性宿主Casヌクレアーゼ活性が抑制解除されている大腸菌(例えばO157: H7)宿主である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はシュードモナス(例えばエルギノーサ)である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はビブリオ(Vibrio)(例えばコレラ(cholerae)(例えばO139)又はバルニフィカス(vulnificus))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はナイセリア(Neisseria)(例えばゴノレア(gonorrhoeae)又はメニンジティディス(meningitidis))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はボルデテラ(Bordetella)(例えばパーツシス(pertussis))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はヘモフィルス(Haemophilus)(例えばインフルエンザ菌(influenzae))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌は赤痢菌(Shigella)(例えば志賀赤痢菌(dysenteriae))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はブルセラ(Brucella)(例えばアボルツス(abortus))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はフランシセラ(Francisella)宿主である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はキサントモナス(Xanthomonas)宿主である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はアグロバクテリウム(Agrobacterium)宿主である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はエルウィニア(Erwinia)宿主である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はレジオネラ(Legionella)(例えばニューモフィラ(pneumophila))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はリステリア(Listeria)(例えばモノサイトゲネス(monocytogenes))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はカンピロバクター(Campylobacter)(例えばジェジュニ(jejuni))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はエルシニア(Yersinia)(例えばペスティス(pestis))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はボレリア(Borrelia)(例えばブルグドルフェリ(burgdorferi))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はヘリコバクター(Helicobacter)(例えばピロリ(pylori))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はクロストリジウム(Clostridium)(例えばディフィシル又はボツリヌム(botulinum))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はエーリキア(Ehrlichia)(例えばシャフェンシス(chaffeensis))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はサルモネラ(例えばティフィ(typhi)又はエンテリカ(enterica)、例えば血清型ティフィムリウム、例えばDT104)である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はクラミジア(Chlamydia)(例えばニューモニエ(pneumoniae))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はパラクラミジア(Parachlamydia)宿主である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はコリネバクテリウム(Corynebacterium)(例えばアミコラツム(amycolatum))である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はクレブシエラ(例えばニューモニエ)である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はエンテロコッカス(Enterococcus)(例えばフェカリス(faecalis)又はフェシウム(faecium)、例えばリネゾリド耐性)である。任意選択で、宿主及び/又は標的細菌はアシネトバクター(例えばバウマニ(baumannii)、例えば多剤耐性)である。
【０１９４】
本発明を使用する標的細胞及びそのような細胞における抗生物質耐性の標的化の更なる例は以下の通りである:
【０１９５】
1.  任意選択で、標的細菌は、例えばメチシリン、バンコマイシン、リネゾリド、ダプトマイシン、キヌプリスチン、ダルホプリスチン、及びテイコプラニンから選択される抗生物質に耐性の黄色ブドウ球菌細胞である。
【０１９６】
2.  任意選択で、標的細菌は、例えばセファロスポリン(例えばセフタジジム)、カルバペネム(例えばイミペネム又はメロペネム)、フルオロキノロン、アミノグリコシド(例えばゲンタマイシン又はトブラマイシン)、及びコリスチンから選択される抗生物質に耐性のシュードモナス・エルギノーサ細胞である。
【０１９７】
3.  任意選択で、標的細菌は、例えばカルバペネムに耐性のクレブシエラ(例えばニューモニエ)細胞である。
【０１９８】
4.  任意選択で、標的細菌は、例えばエリスロマイシン、クリンダマイシン、ベータ-ラクタム、マクロライド、アモキシシリン、アジスロマイシン、及びペニシリンから選択される抗生物質に耐性のストレプトコッカス(例えばサーモフィルス、ニューモニエ、又はピオゲネス)細胞である。
【０１９９】
5.  任意選択で、標的細菌は、例えばセフトリアキソン、アジスロマイシン、及びシプロフロキサシンから選択される抗生物質に耐性のサルモネラ(例えば血清型ティフィ)細胞である。
【０２００】
6.  任意選択で、標的細菌は、例えばシプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性の赤痢菌細胞である。
【０２０１】
7.  任意選択で、標的細菌は、例えばイソニアジド(INH)、リファンピシン(RMP)、フルオロキノロン、アミカシン、カナマイシン、及びカプレオマイシン、及びアジスロマイシンに対する耐性から選択される抗生物質耐性のマイコバクテリウム・ツベルクローシス(mycobacterium tuberculosis)細胞である。
【０２０２】
8.  任意選択で、標的細菌は、例えばバンコマイシンに耐性のエンテロコッカス細胞である。
【０２０３】
9.  任意選択で、標的細菌は、例えばセファロスポリン及びカルバペネムから選択される抗生物質に耐性の腸内細菌科細胞である。
【０２０４】
10.  任意選択で、標的細菌は、例えばトリメトプリム、ニトロフラントイン、セファレキシン、及びアモキシシリンから選択される抗生物質に耐性の大腸菌細胞である。
【０２０５】
11.  任意選択で、標的細菌は、例えばフルオロキノロン抗生物質及びカルバペネムから選択される抗生物質に耐性のクロストリジウム(例えばディフィシル)細胞である。
【０２０６】
12.  任意選択で、標的細菌は、例えばセフィキシム(例えば経口セファロスポリン)、セフトリアキソン(注射用セファロスポリン)、アジスロマイシン、及びテトラサイクリンから選択される抗生物質に耐性のナイセリア・ゴノレア細胞である。
【０２０７】
13.  任意選択で、標的細菌は、例えばベータ-ラクタム、メロペネム、及びカルバペネムから選択される抗生物質に耐性のアシネトバクター・バウマニ細胞である。
【０２０８】
14.  任意選択で、標的細菌は、例えばシプロフロキサシン及びアジスロマイシンから選択される抗生物質に耐性のカンピロバクター細胞である。
【０２０９】
15.  任意選択で、標的細胞はベータ(β)-ラクタマーゼを産生する。
【０２１０】
16.  任意選択で、標的細胞は、例1から14のいずれか一つに記載の抗生物質に耐性である細菌細胞である。
【０２１１】
可動遺伝要素、ゲノムアイランド、病原性アイランド等
細菌及び古細菌の遺伝的多様性は、変異、再編成、及び遺伝子水平伝播、並びに組換えによって達成され得る。増加しているゲノム配列データは、不可欠な代謝活性、情報処理、並びに細菌の構造成分及び調節成分等のハウスキーピング機能をコードするコア遺伝子に加えて、ある特定の環境条件下での適応及び生存に寄与する、抗微生物薬耐性、毒素、及び酵素をコードする大多数のアクセサリー遺伝子が可動遺伝要素(MGE)の遺伝子水平伝播によって獲得されることを実証している。可動遺伝要素は、プラスミド、バクテリオファージ、ゲノムアイランド、染色体カセット、病原性アイランド、及び組込み接合エレメントを含む、異成分からなる分子群である。ゲノムアイランドは、多くの場合16〜20bpのダイレクトリピートと隣り合うtRNA遺伝子クラスターに組み込まれる、10から200kbの範囲の比較的大きいDNAのセグメントである。ゲノムアイランドは、GC含量(G+C%)及びコドン使用の点で残りの染色体と異なり得るため、遺伝子水平伝播によって獲得された別々のDNAセグメントとして認識される。
【０２１２】
病原性アイランド(PTI)は、ゲノムアイランドとして公知の水平伝播した遺伝要素のサブセットである。黄色ブドウ球菌には、ある特定の常在性プロファージによって切出し及び複製を誘導される高度に可動性のPTIの特定のファミリーが存在する。これらのPTIは、小さな有頭ファージ様粒子にパッケージングされ、ファージのプラーク形成力価と比例する頻度で伝播する。この過程はSaPI切出し・複製・パッケージング(ERP)サイクルと称され、高頻度のSaPI伝播はSaPI特異的伝播(SPST)と称され、古典的な一般形質導入(CGT)と区別される。SaPIは、バクテリオファージの遺伝子構成に類似し、他の全ての水平獲得されたゲノムアイランドと明確に区別される、高度に保存された遺伝子構成を有する。SaPI1にコードされるインテグラーゼ及びSaPIbov2にコードされるインテグラーゼは、対応するエレメントの切出しと組込みの両方のために使用され、同様のことは他のSaPIにも当てはまると想定される。ファージ80αはいくつかの異なるSaPI、例えばSaPI1、SaPI2、及びSaPIbov1を誘導することができ、他方φ11はSaPIbov1を誘導することはできるが、その他の2種のSaPIのいずれも誘導することができない。
【０２１３】
「Staphylococcal pathogenicity island DNA packaging system involving cos-site packaging and phage-encoded HNH endonucleases」、Quiles-Puchaltら、PNAS 2014年4月22日、111(16)6016〜6021について言及する。ブドウ球菌病原性アイランド(SaPI)は、高度に可動性であり、スーパー抗原及び他の病原性遺伝子を運搬し、広める。SaPIは、無関係だが相補的な2つの機構を使用して、犠牲となるファージのパッケージング機構部分(machinery)を乗っ取ると報告された。ファージパッケージングは、ファージの種類に応じて「pac」又は「cos」と称される、ファージDNAにおける特異的な配列の認識から開始する。SaPI戦略は、ヘルパーファージ機構部分に応じて、完全なファージ粒子へのSaPIのパッケージングを保証する、SaPIゲノム中におけるヘルパーファージpac様又はcos様配列の保有を伴う。これらの戦略は、ファージ繁殖に干渉し、ファージ粒子数を減少させることによって最終的に細菌集団の決定的な利点となる。
【０２１４】
ブドウ球菌病原性アイランド(SaPI)は、種内及び種間遺伝子伝播、宿主適応、並びに病毒性に実質的に寄与する、染色体に位置する可動遺伝要素の広く知られたファミリーの代表的なメンバーである。その可動性の重要な特徴は、ある特定のヘルパーファージによるSaPIの切出し及び複製の誘導、並びにファージ様感染性粒子へのSaPIの効率的なカプシド形成である。大半のSaPIは、ヘッドフルパッケージング機構を使用し、SaPI特異的pac部位を認識してSaPIパッケージング特異性を決定する小ターミナーゼサブユニット(TerS)相同体をコードする。公知のSaPIのいくつかは、認識可能なTerS相同体をコードしないが、それにもかかわらず、ヘルパーファージによって効率的にパッケージングされ、高頻度で伝播する。Quiles-Puchaltらは、terSをコードしないSaPIの1つであるSaPIbov5を報告し、SaPIbov5が未だ説明されていない2つの異なるパッケージング戦略を使用することを見出した。SaPIbov5は、典型的なpac型ヘルパーファージ又はcos型ファージのいずれかによって完全なファージ様粒子へパッケージングされる-すなわち、SaPIbov5はpac部位とcos部位の両方を有し、ファージにコードされる2つの異なるTerSを使用する。これはcosファージによるSaPIパッケージングの一例であり、ここにおいて、SaPIbov5は、大腸菌のP4プラスミドと共通している。黄色ブドウ球菌におけるcos部位パッケージングは、大ターミナーゼサブユニットに加えて、cosファージのみによって保有されるHNHヌクレアーゼをcos部位切り離し及び融解のために必要とするという点で、更に独特である。
【０２１５】
いくつかのファージ誘導性SaPIとそれらのヘルパーファージとの特性決定により、pac(又はヘッドフル)機構がカプシド形成のために使用されることが立証されている。この概念を考慮すると、一部のSaPIは、ファージにコードされる大ターミナーゼサブユニットであるTerLと複合体形成してファージタンパク質から構成される感染性粒子へのSaPI DNAのパッケージングを可能にするTerSの相同体をコードする。これらのSaPIはまた、小さなSaPIゲノムに比例する小さなカプシドの形成を引き起こす形態形成(cpm)モジュールも含有する。最初に特性決定されたSaPI配列には、TerS相同体とcpm相同体のいずれも含まないSaPI配列がいくつか存在し、同様のことはその後同定されたウシ起源のいくつかのSaPI、及び他の種由来の多くのファージ誘導性染色体アイランドにも当てはまる。これらのいくつかのアイランドに関しては、元々これらの遺伝子を所有していたエレメントが欠損した誘導体であったか、又はterS及びcpm遺伝子が存在していたが、相同性のために認識されなかったかのいずれかであると想定された。
【０２１６】
Quiles-Puchaltらは、φSLT/SaPIbov5パッケージングの重要な特徴が、φSLTターミナーゼモジュールの隣にコードされるHNHヌクレアーゼを必要とすることであることを観察した。HNHドメインを保有するタンパク質は自然界に遍在しており、全ての界の生物に存在する。HNHモチーフは、約30〜40aa残基の変性低分子核酸結合及び切り離しモジュールであり、単一の二価金属イオンによって結合する。HNHモチーフは、多くの異なる細胞プロセス、例えば、細菌の死滅、DNAの修復、複製、及び組換え、並びにRNAに関係するプロセスにおいて重要な役割を果たす多様な酵素において見出されている。HNHエンドヌクレアーゼは、グラム陽性及び陰性細菌のいくつかのcos部位バクテリオファージに存在し、ターミナーゼ及び他の形態形成タンパク質をコードする遺伝子に常に隣接する。Quiles-Puchaltらは、φ12及び密接に関係するφSLTによってコードされるHNHヌクレアーゼが非特異的なヌクレアーゼ活性を有し、これらのファージ及びSaPIbov5のパッケージングのために必要とされることを実証した。Quiles-Puchaltらは、HNHとTerLは共にcos部位切り離しのために必要とされることを示した。Quiles-Puchaltらはまた、グラム陰性及び陽性細菌のcosファージのみがHNHヌクレアーゼをコードし、平滑末端産物を生成するpac部位切り離しと対照的なcos部位切り離しの特別な要件と一致することも観察した。HNHヌクレアーゼ活性は一部のcosファージには必要とされるが、他のcosファージには必要とされないという実証は、2種類のファージのTerLタンパク質の間に相違があること-一方は両方の鎖を切断することができるが、他方は二本鎖切断の生成を可能にするために第2のタンパク質を必要とすること-を示唆する。
【０２１７】
本発明はまた、ある特定の構成において可動遺伝要素(MGE)の使用も含む。したがって、以下の条目が提供される。上記又は本明細書の他の箇所における本発明のその他の構成、態様、実施例、又は説明のいずれも、これらの条目のいずれかと、必要な変更を加えて組合せ可能である:
【０２１８】
1.  細菌の抗菌処理における使用のための組成物であって、第1の種又は株の第1の細菌宿主細胞中で移動することができる操作された可動遺伝要素(MGE)を含み、前記細胞が第1のファージゲノムを含み、前記細胞においてMGEがファージによってコードされるタンパク質を使用して移動し、第1のヘルパーファージの複製が阻害され、MGEが抗菌剤をコードするか又はそのような薬剤の成分をコードする、組成物。
【０２１９】
代替例では、細菌に代わって宿主細胞は古細菌細胞であり、ファージに代わって古細菌細胞に感染することができるウイルスが存在する。
【０２２０】
一例では、MGEは、第1のファージのゲノムを含む宿主細胞のゲノムへの組込み、例えば宿主細胞の染色体及び/又はそのエピソームへの組込みが可能である。
【０２２１】
任意選択で、MGEは第1のファージの複製を阻害する。
【０２２２】
一例では、第1のファージの複製は完全に阻害される。一例では、宿主細胞におけるMGEの非存在下での複製と比較して少なくとも50、60、70、80、又は90%減少する。このことは、第1のファージのプラーク形成の相対量を決定する標準的なin vitroプラークアッセイによって評価することができる。
【０２２３】
任意選択で、薬剤の存在下、
(i)宿主細胞は抗菌剤によって死滅する、
(ii)宿主細胞の成長若しくは増殖は抑制される、及び/又は
(iii)宿主細胞は抗生物質に感作し、それによって抗生物質が細胞に対して毒性となる。
【０２２４】
2.  薬剤が宿主細胞と同じ種又は株の細胞に対して毒性である、条目1に記載の組成物。
【０２２５】
3.  薬剤が宿主細胞の株又は種と異なる種又は株の細胞に対して毒性である、条目1又は2に記載の組成物。
【０２２６】
4.  薬剤が宿主細胞と同じ種の細胞に対して毒性であり、宿主細胞が、薬剤が毒性とならないように操作されている、条目1に記載の組成物。
【０２２７】
5.  薬剤が導かれたヌクレアーゼシステム(任意選択でCRISPR/Casシステム)であり、宿主細胞と同じ種の細胞が、ヌクレアーゼによって切断される標的配列を含み、標的配列が宿主細胞において除去又は変更されており、それによってヌクレアーゼが標的配列を切断することができない、条目4に記載の組成物。
【０２２８】
ウイルスは宿主細胞において溶原及び溶菌サイクルを受ける。溶原サイクルが採用される場合、ファージ染色体は、細菌染色体に組み込まれるか又は宿主中でそれ自体安定なプラスミドとして確立することができ、長期間休眠状態のままでいることができる。溶原菌が誘発される場合、ファージゲノムは細菌染色体から切り出され、溶菌サイクルを開始し、結果的に細胞の溶解及びファージ粒子の放出が生じる。溶菌サイクルは、宿主の溶解によって放出される新たなファージ粒子の産生をもたらす。
【０２２９】
6.  第1のファージが溶原性ファージである、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２３０】
7.  第1の細胞が第1のファージをプロファージとして含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２３１】
8.  第1のファージが溶菌性ファージである、条目1から5のいずれか一つに記載の組成物。
【０２３２】
9.  第1のファージの存在下、MGEの可動化が宿主細胞溶解を引き起こす、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２３３】
10.  MGEが、第1のファージの構造タンパク質を一部含むが全ては含まない形質導入粒子へパッケージング可能である、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２３４】
「形質導入粒子」とは、ファージであってもファージより小さくてもよく、抗生物質又はその成分をコードする核酸を標的細菌細胞に形質導入することができる粒子である。
【０２３５】
構造タンパク質の例は、主要な頭部及び尾部タンパク質、ポータルタンパク質、尾部繊維タンパク質、並びに副次的な尾部タンパク質のうちの1つ、複数、又は全てから選択されるファージタンパク質である。
【０２３６】
MGEは、第1の宿主細胞と同じ種又は株の宿主細胞に感染することができる形質導入粒子にMGE(或いは少なくとも、薬剤又はその1つ若しくは複数の成分をコードするMGEの核酸)をパッケージングする、第1のファージによってコードされるタンパク質と作動可能なパッケージングシグナル配列を含む。
【０２３７】
11.  MGEの可動化が、薬剤又は成分をコードするMGE又は核酸のコピーの形質導入粒子へのパッケージングを含み、形質導入粒子が、コピーを標的細菌細胞に、標的細胞の抗菌処理のために移入することができる、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２３８】
12.  形質導入粒子が、前記第1の種又は株の細胞に感染することができる第2のファージの粒子である、条目10又は11に記載の組成物。
【０２３９】
13.  形質導入粒子が非自己複製性粒子である、条目10から12のいずれか一つに記載の組成物。
【０２４０】
「非自己複製性形質導入粒子」とは、抗菌剤又は成分をコードする核酸分子を細菌細胞に送達することができるが、自らの複製したゲノムを形質導入粒子にパッケージングしない粒子(例えば、ファージ若しくはファージ様粒子、又はゲノムアイランド(例えばSaPI)から産生された粒子若しくはその修飾形態)を指す。本明細書の代替例では、ファージに代わって、動物、ヒト、植物、又は酵母細胞に感染するウイルスが使用又はパッケージングされる。例えば、細胞がヒト細胞である場合はアデノウイルス。
【０２４１】
14.  MGEがファージ構造タンパク質をコードする遺伝子を欠く、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２４２】
任意選択で、MGEはファージ遺伝子rinA、terS、及びterLを1つ又は複数欠く。
【０２４３】
一例では、宿主細胞において、小ターミナーゼ(terSによってコードされる)及び大ターミナーゼ(terLによってコードされる)タンパク質を含むタンパク質複合体は、MGEの二本鎖DNA分子をpac部位(cos部位若しくはMGEに含まれる他のパッケージングシグナル配列)又はその近傍で認識して切り離すことができ、このことは、MGE又はプラスミドDNA分子がファージカプシドにパッケージングされることを可能にする。宿主細胞におけるプロファージとしての第1のファージが誘導される場合、ファージの溶菌サイクルがファージの構造タンパク質及びファージの大ターミナーゼタンパク質を産生する。MGE又はプラスミドが複製され、MGE又はプラスミドによってコードされる小ターミナーゼタンパク質が発現する。terS(及び抗菌剤又は成分をコードするヌクレオチド配列)を含有する複製されたMGE又はプラスミドDNAがファージカプシドにパッケージングされ、その結果、MGE又はプラスミドDNAのみを保有する非自己複製性形質導入粒子が生じる。
【０２４４】
15.  MGEがファージ構造遺伝子及びパッケージングシグナル配列を含み、第1のファージがパッケージングシグナル配列を欠く、条目1から13のいずれか一つに記載の組成物。
【０２４５】
16.  MGEが、第1の種又は株の細菌細胞に天然に見出されるMGEの修飾形態である、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２４６】
17.  MGEが修飾ゲノムアイランドを含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２４７】
任意選択で、ゲノムアイランドは、第1の種又は株の細菌細胞に天然に見出されるアイランドである。一例では、ゲノムアイランドは、SaPI、SaPI1、SaPI2、SaPIbov1、及びSaPibov2ゲノムアイランドからなる群から選択される。
【０２４８】
18.  MGEが修飾病原性アイランドを含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２４９】
任意選択で、病原性アイランドは、第1の種又は株の細菌細胞に天然に見出されるアイランド、例えば、ブドウ球菌SaPI、又はビブリオPLE、又はP.エルギノーサ病原性アイランド(例えばPAPI若しくはPAGI、例えばPAPI-1、PAGI-5、PAGI-6、PAGI-7、PAGI-8、PAGI-9、PAGI-10、若しくはPAGI-である。
【０２５０】
19.  病原性アイランドがSaPI(黄色ブドウ球菌病原性アイランド)である、条目18に記載の組成物。
【０２５１】
20.  第1のファージがφ11、80α、φ12、又はφSLTである、条目19に記載の組成物。
【０２５２】
ブドウ球菌ファージ80αは全ての公知のSaPIを移動させると考えられる。したがって、一例では、MGEは修飾SaPIを含み、第1のファージは80αである。
【０２５３】
21.  病原性アイランドがV.コレラPLE(ファージ誘導性染色体アイランド様エレメント)であり、任意選択で第1のファージがICP1である、条目18に記載の組成物。
【０２５４】
22.  病原性アイランドが大腸菌PLEである、条目18に記載の組成物。
【０２５５】
23.  MGEがP4 DNA、例えばP4パッケージングシグナル配列を含む、条目1から16のいずれか一つに記載の組成物。
【０２５６】
24.  第1のファージが、P2ファージ又は自己複製欠損性である修飾P2ファージであり、任意選択でプロファージとして存在する、条目23に記載の組成物。
【０２５７】
25.  MGEが腸内細菌科バクテリオファージP1のpacA遺伝子を含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２５８】
26.  MGEが、パッケージング開始部位配列、任意選択でP1のパッケージング開始部位配列を含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２５９】
27.  MGEが、第1の種又は株の細胞に有益なヌクレオチド配列であり、任意選択で第1の種又は株の細胞に有益なタンパク質をコードする、ヌクレオチド配列を含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２６０】
このことは、MGEの存在が宿主細胞中での第1のファージの複製を減少させるだけでなく、MGEが取り込まれて生存、成長、又は他の利益も宿主細胞に提供し得る場合に有用であり、宿主細胞によるMGEの取込み及び/又は保持を促進する。一例では、宿主細胞における抗菌剤の発現は、第1の種又は株の細胞に有益なヌクレオチド配列の存在のために宿主細胞へのMGEの取込みが好都合であり得る期間を可能にする誘導性プロモーター又は弱いプロモーターの制御下にある。
【０２６１】
28.  MGEがrinAを欠く、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２６２】
29.  MGEがterLを欠く、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２６３】
30.  MGEが、terS又はその相同体を含み、任意選択で任意の他のターミナーゼ遺伝子を欠く、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２６４】
terS相同体は、terSと同様に、MGE又はプラスミドに含まれるSaPI特異的pac部位(又は他のパッケージング配列)を認識し、MGEをパッケージングすることに関するパッケージング特異性を決定する配列である。
【０２６５】
ターミナーゼ遺伝子の例は、pacA、pacB、terA、terB、及びterLである。
【０２６６】
31.  第1のファージが、MGEに含まれるpacと作動可能なpac型ファージ(例えばφ11又は80α)である、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２６７】
32.  第1のファージが、MGEに含まれるcosと作動可能なcos型ファージ(例えばφ12又はφSLT)である、条目1から30のいずれか一つに記載の組成物。
【０２６８】
任意選択で、ファージはP2である。任意選択で、第1のファージは、パッケージングするためにMGEに含まれるダイレクトリピート配列を認識するT7又はT7様ファージである。
【０２６９】
33.  プラスミド又はMGEがpac及び/若しくはcos配列又はその相同体を含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２７０】
34.  プラスミド又はMGEがterS又はその相同体を含み、任意選択でterLを欠く、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２７１】
terS相同体は、terSと同様に、MGE又はプラスミドに含まれるSaPI特異的pac部位(又は他のパッケージング配列)を認識し、MGEをパッケージングすることに関するパッケージング特異性を決定する配列である。
【０２７２】
一例では、terSは配列番号1の配列を含む。
【０２７３】
35.  terSが黄色ブドウ球菌バクテリオファージφ80αterS又はバクテリオファージφ11 terSである、条目34に記載の組成物。
【０２７４】
36.  MGEが修飾SaPIbov1又はSaPIbov5であり、terSを欠く、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２７５】
37.  第1のファージが機能性パッケージングシグナル配列を欠き、MGEが、MGEのコピー、又は薬剤若しくは成分をコードする核酸のコピーをパッケージングする形質導入粒子を産生するための第1のファージによってコードされるタンパク質と作動可能なパッケージングシグナル配列を含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２７６】
38.  MGE又はプラスミドが、第1のファージTerSと複合体形成することによりTerSの機能を遮断することができるPpi又は相同体を含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２７７】
39.  MGEが形態形成(cpm)モジュールを含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２７８】
40.  MGEがcpmA及び/又はcpmBを含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２７９】
任意選択で、cpmA及びBは本明細書に開示される任意のSaPI由来である。一例では、任意のSaPIはTable 2(表4)に開示されるSaPIであり、任意選択で宿主細胞又は標的細胞はTable 2(表4)に開示される任意の対応するブドウ球菌である。
【０２８０】
41.  MGE又は第1のファージが遺伝子cp1、cp2、及びcp3を1つ、複数、又は全て含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２８１】
一例では、MGEは修飾SaPIを含み、遺伝子cp1、cp2、及びcp3を1つ、複数、又は全て含む。
【０２８２】
42.  MGE又は第1のファージがHNHヌクレアーゼをコードする、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２８３】
43.  MGE又は第1のファージが、MGEを切り出し、MGEを細菌細胞ゲノムに組み込むためのインテグラーゼをコードするインテグラーゼ遺伝子を含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２８４】
44.  MGEが機能性インテグラーゼ遺伝子を欠き、第1のファージ又は宿主細胞ゲノム(例えば細菌染色体又は細菌エピソーム)が機能性インテグラーゼ遺伝子を含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２８５】
45.  MGE核酸の転写が、宿主細胞における薬剤又は成分のコピーの転写に関して、構成的プロモーターの制御下にある、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２８６】
任意選択で、標的細胞における薬剤の構成的転写及び産生は、例えば医療現場において標的細胞が死滅すべき場合に使用され得る。
【０２８７】
任意選択で、MGE核酸の転写は、宿主細胞における薬剤又は成分のコピーの転写に関して、誘導性プロモーターの制御下にある。このことは、例えば、標的細胞を含有する環境(例えば土壌若しくは水)又は産業用培養若しくは発酵容器等において、標的細菌細胞に対する抗菌活性の始動を制御するのに有用であり得る。例えば、標的細胞は、産業プロセス(例えば醸造又は乳産業における例えば発酵のための)に有用であり得、誘導は、標的細菌に対して抗菌剤を使用することによってプロセスを制御(例えば停止又は抑制)することを可能にする。
【０２８８】
46.  プロモーターが宿主細胞に対して外来性である、条目45に記載の組成物。
【０２８９】
47.  プロモーターが、宿主細胞の内在性プロモーター配列と少なくとも80%同一のヌクレオチド配列を含む、条目45又は46に記載の組成物。
【０２９０】
48.  MGEから分離した核酸を含む組成物であって、核酸が、第1のファージ粒子を産生するために必要な遺伝子を全て含む、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２９１】
49.  MGEから分離した核酸を含む組成物であって、核酸が、第1のファージ粒子を産生するために必要な遺伝子を全ては含まないが、抗菌剤又はその1つ若しくは複数の成分をコードするMGE核酸をパッケージングする形質導入粒子の産生のための構造タンパク質をコードする遺伝子を含む、条目1から47のいずれか一つに記載の組成物。
【０２９２】
薬剤が複数の成分を含む場合、例えば、薬剤はCRISPR/Casシステムであるか、又は宿主細胞においてCasと作動可能な、crRNAをコードするCRISPRアレイ若しくはガイドRNA(例えば単一ガイドRNA)をコードする核酸であり、crRNA又はgRNAは、Casを宿主細胞における標的配列に導いて標的を修飾する(例えば標的を切断するか又は標的からの転写を抑制する)。
【０２９３】
50.  遺伝子が、宿主細胞染色体及び/又は1つ若しくは複数の宿主細胞エピソームに含まれる、条目48又は49に記載の組成物。
【０２９４】
51.  遺伝子が、第1のファージの染色体に組み込まれたプロファージに含まれる、条目50に記載の組成物。
【０２９５】
52.  薬剤が、導かれたヌクレアーゼシステム又はその成分であり、宿主細胞DNA(例えば染色体DNA)を認識及び切断することができる、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０２９６】
複数の例では、そのような切断は以下のうちの1つ又は複数を引き起こす:
(i)宿主細胞が抗菌剤によって死滅する、
(ii)宿主細胞の成長若しくは増殖が抑制される、及び/又は
(iii)宿主細胞が抗生物質に感作し、それによって抗生物質が細胞に対して毒性となる。
【０２９７】
53.  導かれたヌクレアーゼシステムが、CRISPR/Casシステム、TALENシステム、メガヌクレアーゼシステム、又はジンクフィンガーシステムから選択される、条目52に記載の組成物。
【０２９８】
54.  システムがCRISPR/Casシステムであり、各MGEが、(a)crRNAをコードするCRISPRアレイ、又は(b)ガイドRNA(gRNA、例えば単一ガイドRNA)をコードする核酸をコードし、crRNA又はgRNAが、標的細菌細胞においてCasと作動可能であり、Casを宿主細胞における標的核酸配列に導いて標的配列を修飾する(例えば標的配列を切断するか又は標的配列からの転写を抑制する)、条目52に記載の組成物。
【０２９９】
任意選択で、Casは、宿主細胞の機能性内在性核酸によってコードされるCasである。例えば、標的は宿主細胞のDNA又はRNAに含まれる。
【０３００】
55.  システムがCRISPR/Casシステムであり、各MGEが、標的細菌細胞において作動可能である、標的細胞に含まれる標的核酸配列を修飾するCas(例えばCasヌクレアーゼ)をコードする、条目52に記載の組成物。
【０３０１】
56.  Casが、Cas3、Cas9、Cas13、CasX、CasY、又はCpf1である、条目53から55のいずれか一つに記載の組成物。
【０３０２】
57.  システムがCRISPR/Casシステムであり、各MGEが1つ又は複数のCascade Cas(例えば、Cas、A、B、C、D、及びE)をコードする、条目52から56のいずれか一つに記載の組成物。
【０３０３】
58.  各MGEが、標的細菌細胞においてCascade Casと作動可能なCas3を更にコードする、条目52から57のいずれか一つに記載の組成物。
【０３０４】
59.  第1の種又は株がグラム陽性種又は株である、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０３０５】
60.  第1の種又は株がグラム陰性種又は株である、条目1から58のいずれか一つに記載の組成物。
【０３０６】
61.  第1の種又は株が、Table 1(表1、表2、表3)から選択される、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０３０７】
一例では、第1の種又は株は、ブドウ球菌(例えば黄色ブドウ球菌)種又は株であり、任意選択でMGEは修飾SaPIであり;任意選択で第1のファージはφ80α又はφ11である。一例では、第1の種又は株は、ビブリオ(例えばVコレラ)種又は株であり、任意選択でMGEはビブリオ(例えばVコレラ)PLEである。
【０３０８】
62.  第1の種又は株が、赤痢菌、大腸菌、サルモネラ、セラチア(Serratia)、クレブシエラ、エルシニア、シュードモナス、及びエンテロバクター(Enterobacter)から選択される、前述のいずれかの条目に記載の組成物。
【０３０９】
これらはP2ファージが感染することができる種である。したがって、一実施形態では、MGEは1つ又は複数のP4配列(例えばP4パッケージング配列)を含み、第1のファージはP2である。したがって、MGEはP2構造タンパク質によってパッケージングされ、その結果得られる形質導入粒子は、広い範囲の種、すなわち、赤痢菌、大腸菌、サルモネラ、セラチア、クレブシエラ、エルシニア、シュードモナス、及びエンテロバクターのうちの2種以上に感染することができる。
【０３１０】
63.  組み込まれたMGEを含む核酸ベクターであって、MGEが前述のいずれかの条目に規定のものであり、ベクターがMGE又はそのコピーを宿主細菌細胞に移入することができる、核酸ベクター。
【０３１１】
好適なベクターは、プラスミド(例えば接合性プラスミド)又はウイルス(例えばファージ若しくはパッケージングされたファージミド)である。
【０３１２】
64.  シャトルベクターである、条目63に記載のベクター。
【０３１３】
シャトルベクターは、2つの異なる宿主種において増幅することができるように構築されたベクター(通例はプラスミド)である。したがって、シャトルベクターに挿入されたDNAは、2つの異なる細胞型において試験するか又は扱うことができる。
【０３１４】
65.  第1のファージを含む宿主細菌細胞に形質転換することができるプラスミドである、条目63に記載のベクター。
【０３１５】
66.  前記MGE又は前述のいずれかの条目に記載のベクターを含む非自己複製性形質導入粒子。
【０３１６】
「非複製」とは、MGEが単独で自己複製することができないことを意味する。例えば、MGEは、MGEのコピーを含む形質導入粒子を産生するのに必要なタンパク質(例えば構造タンパク質)をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列を欠く。
【０３１７】
67.  複数の形質導入粒子を含む組成物であって、各粒子が条目1から65のいずれか一つに規定又は記載のMGE又はベクターを含み、形質導入粒子が、MGE、又は薬剤若しくは成分をコードする核酸、或いはそれらのコピーを標的細菌細胞に移入することができ、
a. 標的細胞が抗菌剤によって死滅する、
b. 標的細胞の成長若しくは増殖が抑制される、又は
c. 標的細胞が抗生物質に感作し、それによって抗生物質が細胞に対して毒性となる、
組成物。
【０３１８】
一例では、宿主細胞の成長又は増殖の抑制は、少なくとも50、60、70、80、90、又は95%である。抗生物質は本明細書に開示されるいずれの抗生物質であってもよい。
【０３１９】
68.  薬剤が、導かれたヌクレアーゼシステム又はその成分であり、宿主細胞DNA(例えば染色体DNA)を認識及び切断することができ、それによって
a. 標的細胞が抗菌剤によって死滅する、
b. 標的細胞の成長若しくは増殖が抑制される、又は
c. 標的細胞が抗生物質に感作し、それによって抗生物質が細胞に対して毒性となる、
条目67に記載の組成物。
【０３２０】
69.  複数の非自己複製性形質導入粒子を含む組成物であって、各粒子が条目1から65のいずれか一つに規定のMGE又はプラスミドを含み、形質導入粒子が、MGE、又は薬剤若しくは成分をコードする核酸、或いはそれらのコピーを標的細菌細胞に移入することができ、薬剤がCRISPR/Casシステムであり、成分が、標的細菌細胞においてCasと作動可能である、Casを細胞の標的核酸配列に導いて配列を修飾するcrRNA又はガイドRNAをコードする核酸を含み、それによって
a. 標的細胞が抗菌剤によって死滅する、
b. 標的細胞の成長若しくは増殖が抑制される、又は
c. 標的細胞が抗生物質に感作し、それによって抗生物質が細胞に対して毒性となる、
組成物。
【０３２１】
一例では、宿主細胞の成長又は増殖の抑制は、少なくとも50、60、70、80、90、又は95%である。抗生物質は本明細書に開示されるいずれの抗生物質であってもよい。
【０３２２】
70.  条目69に記載の組成物と前記抗生物質とを含むキット。
【０３２３】
71.  前記抗生物質を含む、条目69に規定の組成物。
【０３２４】
72.  組成物に含まれる10%未満の形質導入粒子が第1のファージ粒子である、条目67から69のいずれか一つに記載の組成物。
【０３２５】
73.  第1のファージ粒子が存在しない、条目67から69のいずれか一つに記載の組成物。
【０３２６】
74.  ヒト又は動物患者における医療用途の、前述のいずれかの条目に規定又は記載のMGE、ベクター、粒子、組成物、又はキット。
【０３２７】
75.  ヒト又は動物患者における標的細菌細胞による感染症を処置又は予防するための、抗菌剤が標的細胞に対して毒性である、前述のいずれかの条目に記載のMGE、ベクター、粒子、組成物、又はキット。
【０３２８】
76.  ヒト又は動物患者における標的細菌細胞による感染症を処置又は予防するための、抗菌剤の存在下、
a. 標的細胞が抗菌剤によって死滅する、
b. 標的細胞の成長若しくは増殖が抑制される、及び/又は
c. 標的細胞が抗生物質に感作し、それによって抗生物質が細胞に対して毒性となる、
前述のいずれかの条目に記載のMGE、ベクター、粒子、組成物、又はキット。
【０３２９】
77.  複数の形質導入粒子を産生する方法であって、条目1から62、67から69、及び71から76のいずれか一つに記載の組成物を、第1のファージを含む前記第1の種の宿主細菌細胞と組み合わせる工程、複数の前記MGEを宿主細胞に導入させる工程、及び第1のファージにコードされるタンパク質が発現し、MGEコピーが第1のファージタンパク質によってパッケージングされて複数の形質導入粒子を産生する条件下で宿主細胞を培養する工程、並びに任意選択で、形質導入粒子を細胞から分離する工程、及び細胞から分離された複数の形質導入粒子を取得する工程を含む、方法。
【０３３０】
78.  形質導入粒子を、任意選択でろ過又は遠心分離によって任意の第1のファージから分離する工程であり、それにより第1のファージの非存在下で複数の形質導入粒子を取得する、工程を含む、条目77に記載の方法。
【０３３１】
79.  粒子が、標的細菌細胞に含まれる標的核酸配列を切断するための導かれたヌクレアーゼシステム(任意選択でCRISPR/Casシステム)又はその成分をコードする、条目77又は78に記載の方法。
【０３３２】
80.  配列が抗生物質耐性遺伝子に含まれ、方法がキット又は混合物において複数の粒子を前記抗生物質と組み合わせる工程を含む、条目79に記載の方法。
【０３３３】
81.  前記条件が第1のファージの溶菌サイクルの誘発を含む、条目77から80のいずれか一つに記載の方法。
【０３３４】
82.  第1のファージと、条目1から66のいずれか一つに規定又は記載のMGE、ベクター、又は粒子とを含む細菌宿主細胞であって、薬剤が宿主細胞と同じ種の細胞に対して毒性であり、宿主細胞が、薬剤が毒性とならないように操作されている、細菌宿主細胞。
【０３３５】
83.  第1のファージを含む細菌宿主細胞であって、細胞がキットに含まれ、キットが、条目1から62、67から69、及び71から76のいずれか一つに記載の組成物を更に含み、薬剤が宿主細胞と同じ種の細胞に対して毒性であり、宿主細胞が、薬剤が毒性とならないように操作されている、細菌宿主細胞。
【０３３６】
84.  薬剤が導かれたヌクレアーゼシステム(任意選択でCRISPR/Casシステム)であり、宿主細胞と同じ種の細胞が、ヌクレアーゼによって切断される標的配列を含み、標的配列が宿主細胞において除去又は変更されており、それによってヌクレアーゼが標的配列を切断することができない、条目83に記載の細胞。
【０３３７】
85.  第1のファージと、条目1から66のいずれか一つに規定又は記載のMGE、ベクター、又は粒子とを含む細菌宿主細胞であって、薬剤が、宿主細胞に対して毒性ではなく、宿主細胞の種又は株と異なる種又は株の第2の細胞に対して毒性であり、MGEが、MGE又はそのコピーを前記第2の細胞に移入することができる、宿主細胞によって産生可能な形質導入粒子中で移動可能であり、それによって第2の細胞が抗菌剤に曝露される、細菌宿主細胞。
【０３３８】
86.  第1のファージを含む細菌宿主細胞であって、細胞がキットに含まれ、キットが、条目1から62、67から69、及び71から76のいずれか一つに記載の組成物を更に含み、薬剤が、宿主細胞に対して毒性ではなく、宿主細胞の種又は株と異なる種又は株の第2の細胞に対して毒性であり、MGEが、MGE又はそのコピーを前記第2の細胞に移入することができる、宿主細胞によって産生可能な形質導入粒子中で移動可能であり、それによって第2の細胞が抗菌剤に曝露される、細菌宿主細胞。
【０３３９】
87.  第1のファージがプロファージである、条目86に記載の細胞。
【０３４０】
88.  条目1から66のいずれか一つに規定又は記載のMGE、ベクター、又は粒子と、1つ又は複数の誘導性プロモーターの制御下にある核酸とを含む細菌宿主細胞であって、核酸が、MGE又はプラスミドのコピーをパッケージングする形質導入粒子を産生するのに必要な構造タンパク質を全てコードし、薬剤が、宿主細胞に対して毒性ではなく、宿主細胞の種又は株と異なる種又は株の第2の細胞に対して毒性であり、MGEが、MGE又はそのコピーを前記第2の細胞に移入することができる、宿主細胞によって産生可能な形質導入粒子中で移動可能であり、それによって第2の細胞が抗菌剤に曝露される、細菌宿主細胞。
【０３４１】
89.  構造タンパク質が溶菌性ファージの構造タンパク質である、条目88に記載の細胞。
【０３４２】
90.  核酸がterS及び/又はterLを含む、条目88又は89に記載の細胞。
【０３４３】
91.  宿主及び第2の細胞が同じ種に属し、宿主細胞が、抗生物質が毒性とならないように操作されている、条目88から90のいずれか一つに記載の細胞。
【０３４４】
92.  核酸がプラスミドに含まれる、条目88から91のいずれか一つに記載の細胞。
【０３４５】
93.  薬剤が導かれたヌクレアーゼシステム(任意選択でCRISPR/Casシステム)であり、第2の細胞がヌクレアーゼによって切断される標的配列を含み、標的配列が宿主細胞のゲノムに存在せず、それによってヌクレアーゼが宿主細胞ゲノムを切断することができない、条目88から92のいずれか一つに記載の細胞。
【０３４６】
94.  細胞、すなわち宿主細胞又は標的細胞が、ブドウ球菌、ビブリオ、シュードモナス、クロストリジウム、大腸菌、ヘリコバクター、クレブシエラ、及びサルモネラ細胞から選択される、前述のいずれかの条目に記載の組成物、ベクター、粒子、キット、又は方法。
【０３４７】
95. a.  標的細菌細胞における発現のための抗菌剤又はその成分をコードするヌクレオチド配列、
b. 薬剤又は成分の発現を制御するための構成的プロモーター、
c. 任意選択のterSヌクレオチド配列、
d. 複製起点(ori)、及び
e. ファージパッケージング配列(任意選択で、pac、cos、又はそれらの相同体)
を含み、
g. 形質導入粒子(任意選択でファージ)の産生のために必要なファージ構造タンパク質をコードする全てのヌクレオチド配列、又はそのような配列の少なくとも1つ、及び
h. 任意選択でterL
を欠く、プラスミド。
【０３４８】
96.  抗菌剤がCRISPR/Casシステムであり、プラスミドが、標的細胞においてCasと作動可能である、Casを標的ヌクレオチド配列に導いて配列を修飾(例えば切断)するcrRNa又はガイドRNA(例えば単一gRNA)をコードし、それによって
a. 標的細胞が抗菌剤によって死滅する、
b. 標的細胞の成長若しくは増殖が抑制される、又は
c. 標的細胞が抗生物質に感作し、それによって抗生物質が細胞に対して毒性となる、
条目95に記載のプラスミド。
【０３４９】
97.  抗菌剤がCRISPR/Casシステムであり、プラスミドがCasをコードし、Casが、Casを標的ヌクレオチド配列に導いて配列を修飾(例えば切断)する標的細胞におけるcrRNa又はガイドRNA(例えば単一gRNA)と作動可能であり、それによって
a. 標的細胞が抗菌剤によって死滅する、
b. 標的細胞の成長若しくは増殖が抑制される、又は
c. 標的細胞が抗生物質に感作し、それによって抗生物質が細胞に対して毒性となる、
条目95又は96に記載のプラスミド。
【０３５０】
98.  前記crRNA又はgRNAを更にコードする、条目97に記載のプラスミド。
【０３５１】
99.  条目95から98のいずれか一つに記載のプラスミドを含む宿主細胞であって、標的ヌクレオチド配列を含まない、宿主細胞。
【０３５２】
100.  プラスミドを複製することができ、複製したプラスミドを、標的細菌細胞に感染することができる形質導入粒子へパッケージングすることができる、条目99に記載の宿主細胞。
【０３５３】
101.  細胞染色体及び/又は細胞の1つ若しくは複数のエピソームへ組み込まれた、
a. terL、
b. 任意選択のterS、及び
c. プラスミドのコピーをパッケージングする形質導入粒子の産生のために必要な構造タンパク質を全てコードする発現可能なヌクレオチド配列、
を含み、
d. 細胞の染色体及びエピソーム(前記プラスミド以外)がファージパッケージング配列を欠き、プラスミドに含まれるファージパッケージング配列が、パッケージングされたプラスミドの産生において前記terS及びterLの産物と一緒に作動可能である、
条目99又は100に記載の宿主細胞。
【０３５４】
102.  terL、任意選択のterS、及び構造タンパク質をコードするヌクレオチド配列が、宿主細胞におけるファージ(任意選択でプロファージ)ゲノムに含まれる、条目101に記載の細胞。
【０３５５】
103.  自己複製することができないヘルパーファージのゲノムを含む細菌宿主細胞であって、任意選択でゲノムが、プロファージ及び条目95から98のいずれか一つに記載のプラスミドとして存在し、ヘルパーファージが、プラスミドのコピーを形質導入粒子へパッケージングするように作動可能であり、粒子が、抗菌剤が毒性である細菌標的細胞に感染することができる、細菌宿主細胞。
【０３５６】
104.  宿主細胞が第1の種又は株の細胞であり、標的細胞が同じ種又は株に属し、任意選択で宿主細胞が、抗菌剤が毒性ではない操作された細胞である、条目103に記載の細胞。
【０３５７】
105.  宿主細胞が第1の種又は株の細胞であり、標的細胞が異なる種又は株に属し、抗菌剤が宿主細胞に対して毒性ではない、条目103に記載の細胞。
【０３５８】
106.  複数の形質導入粒子を作製する方法であって、条目103から105のいずれか一つに記載の複数の宿主細胞を培養する工程、任意選択でヘルパーファージの溶菌サイクルを誘発する工程、及び細胞を、プラスミドのパッケージングされたコピーを含む形質導入用粒子が創製される条件下でインキュベートする工程、並びに任意選択で粒子を細胞から分離して複数の形質導入粒子を取得する工程を含む、方法。
【０３５９】
107.  医療における使用のための、例えば、標的細菌細胞によるヒト又は動物対象の感染症を処置又は予防するための、条目106に記載の方法によって取得可能な複数の形質導入粒子であって、形質導入用粒子が、標的細胞に感染し、抗菌剤を使用して細胞を死滅させるために対象に投与される、形質導入粒子。
【０３６０】
108.  複数の形質導入粒子を作製する方法であって、
i. 第1のDNAをパッケージングすることができる形質導入粒子を産生するのに必要な構造タンパク質をコードする核酸を含むゲノムを有する宿主細胞を産生する工程であり、ゲノムがファージパッケージングシグナルを欠き、タンパク質の発現が誘導性プロモーターの制御下にある、工程、
ii. 抗菌剤又はその成分(例えば前述のいずれかの条目に規定の)をコードする第1のDNAを産生する工程であり、DNAがファージパッケージングシグナルを含む、工程、
iii. DNAを宿主細胞に導入する工程、
iv. 宿主細胞において構造タンパク質の産生を誘導する工程であり、それによってDNAをパッケージングする形質導入粒子が産生される、工程
v. 任意選択で複数の形質導入粒子を単離する工程、及び
vi. 任意選択で粒子を、ヒト又は動物への投与のための医療用途の医薬組成物に製剤化する工程
を含む、方法。
【０３６１】
109.  DNAが前述のいずれかの条目に規定のMGEを含む、条目108に記載の方法。
【０３６２】
110.  構造タンパク質がP2ファージタンパク質であり、任意選択でパッケージングシグナルがP4ファージパッケージングシグナルである、条目108又は109に記載の方法。
【０３６３】
111.  DNAが修飾SaPI又はゲノムアイランドDNAを含む、条目108又は109に記載の方法。
【０３６４】
112.  工程(iv)における細胞がヘルパーファージ活性化因子をコードする遺伝子を含み、任意選択で、構造タンパク質がP2タンパク質である場合、活性化因子がP4ファージdelta若しくはogrタンパク質であるか、又はMGEが修飾SaPIを含む場合、活性化因子がSaPI rinA、ptiA、ptiB、若しくはptiMであり、任意選択で活性化因子の発現が誘導性プロモーター、例えばT7プロモーターによって制御される、条目108から111のいずれか一つに記載の方法。
【０３６５】
113.  パッケージングシグナルがP4ファージSid及び/若しくはpsuであるか、又はシグナルがSaPI cpmA及び/若しくはcpmBである、条目108から112のいずれか一つに記載の方法。
【０３６６】
このことはDNAをより小さなカプシドにパッケージングするのに有用である。
【０３６７】
114.  細胞ゲノムがプロファージを含み、各プロファージが構造タンパク質をコードする前記核酸を含む、条目108から113のいずれか一つに記載の方法。
【０３６８】
115.  プロファージが、cos、並びに任意選択でint、cox、orf78、B、orf80、orf81、orf82、orf83、A、orf91、tin、old、orf30、及びfun(Z)から選択される遺伝子を1つ、複数、又は全て欠くP2プロファージであり、任意選択で(ii)のパッケージングシグナルがcos又はP4パッケージングシグナルである、条目114に記載の方法。
【０３６９】
116.  プロファージが、cosを欠き、QからS、VからG、及びFIからogrまでの遺伝子を含むP2プロファージである、条目114又は115に記載の方法。
【０３７０】
117.  プロファージが、パッケージングシグナルを欠き、遺伝子29(terS)から遺伝子53(溶解素)を含むphi11プロファージであり、任意選択で(ii)のパッケージングシグナルがphi11パッケージングシグナルである、条目114に記載の方法。
【０３７１】
118.  条目108から117のいずれか一つに記載の方法によって取得可能な複数の形質導入粒子。
【０３７２】
119.  ヒト又は動物への投与のための医療用途の条目118に記載の粒子。
【０３７３】
本発明の更なる概念は以下の通りである:
【０３７４】
本発明は、任意選択で産業若しくは家庭用途であるか、又はそのような使用のための方法において使用される。例えば、本発明は、農業、石油産業、食料若しくは飲料産業、衣料産業、包装産業、電子産業、コンピュータ産業、環境産業、化学産業、航空宇宙産業、自動車産業、バイオテクノロジー産業、医療産業、ヘルスケア産業、歯科産業、エネルギー産業、消費財産業、医薬産業、採掘産業、クリーニング産業、林業、漁業、レジャー産業、リサイクル産業、化粧品産業、プラスチック産業、パルプ若しくは紙産業、繊維産業、衣料産業、皮革若しくはスエード若しくは獣皮産業、タバコ産業、又は鉄鋼産業用途であるか、或いはこれらの産業において使用される、
【０３７５】
本発明は、任意選択で産業における使用のためのものであるか、又は環境は産業環境であり、産業は、医療及びヘルスケア、医薬、ヒト食料、動物食料、植物肥料、飲料、乳、食肉加工、農業、畜産、養鶏、魚介類養殖、獣医学、油、ガス、石油化学、水処理、下水処理、包装、電子及びコンピュータ、パーソナルヘルスケア及び洗面用品、化粧品、歯科、非医療歯科、眼科、非医療眼科、鉱物採掘及び加工、金属採掘及び加工、採石、航空機、自動車、鉄道、海運、宇宙、環境、土壌処理、パルプ及び紙、衣料生産、染料、印刷、接着剤、空気処理、溶媒、生体防御、ビタミン補給剤、低温保存、繊維浸漬及び製造、バイオテクノロジー、化学、産業用洗浄製品、家庭用洗浄製品、石鹸及び洗剤、消費財、林業、漁業、レジャー、リサイクル、プラスチック、皮、皮革、及びスエード、廃棄物管理、葬儀及び葬儀業、燃料、建築、エネルギー、鉄鋼、並びにタバコ産業分野からなる群から選択される分野の産業である。
【０３７６】
一例では、第1のDNA、第1のファージ、又はベクターは標的細菌を標的とするCRISPRアレイを含み、アレイは、標的細菌のゲノムを標的とするための1つ又は2つ以上のスペーサー(例えば2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、若しくは50以上のスペーサー)を含む。
【０３７７】
一例では、標的細菌は以下の環境に含まれる。一例では、環境は、ヒトのマイクロバイオーム、例えば口腔マイクロバイオーム若しくは腸内マイクロバイオーム、又は血流である。一例では、環境はヒト中の環境でもヒト上の環境でもない。一例では、環境は非ヒト動物中の環境でも非ヒト動物上の環境でもない。一実施形態では、環境は空気環境である。一実施形態では、環境は農業環境である。一実施形態では、環境は石油回収環境、例えば石油採掘場又は石油井である。一例では、環境は、ヒト又は非ヒト動物による消費のための食品若しくは飲料中又は食品若しくは飲料上の環境である。
【０３７８】
一例では、環境はヒト又は動物マイクロバイオーム(例えば、腸内、膣、頭皮、腋窩、皮膚、又は口腔マイクロバイオーム)である。一例では、標的細菌はヒト又は動物マイクロバイオーム(例えば、腸内、膣、頭皮、腋窩、皮膚、又は口腔マイクロバイオーム)に含まれる。
【０３７９】
一例では、本発明のDNA、ファージ、又は組成物は、ヒト若しくは非ヒト動物に鼻腔内、局所、若しくは経口投与されるか、又はそのような投与のためのものである。ヒト又は動物のマイクロバイオームを処置することを目的とする当業者は、目的のマイクロバイオームに応じて最良の投与経路を決定することができるだろう。例えば、マイクロバイオームが腸内マイクロバイオームである場合、投与は鼻腔内又は経口であり得る。マイクロバイオームが頭皮又は腋窩マイクロバイオームである場合、投与は局所であり得る。マイクロバイオームが口又は喉にある場合、投与は経口であり得る。
【０３８０】
本明細書の任意の使用又は方法において、一実施形態では、第1のファージは、少なくとも0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、400、500、600、又は700の感染多重度(MOI)で標的細菌と接触する。例えばMOIは、20から200まで、20から100まで、50から200まで、50から100まで、75から150まで、100若しくは約100、又は200若しくは約200である。一例ではこれは、標的細菌を含有するマイクロバイオームの試料(例えば、対象の水路又は腸内マイクロバイオームの試料)を取得し、試料中のCFU/ml又はmgの数を決定し、これを使用して、マイクロバイオームに曝露されるか又は処置される環境若しくは対象に投与される、所望のMOIのファージ用量を滴定することによって決定することができる。
【０３８１】
一例では、環境は飲料、又は水(例えば水路若しくはヒトによる消費のための飲料用水)、又は土壌に包含される。水は、任意選択で加熱、冷却、若しくは産業用システム、又は飲料用水保管容器中にある。
【０３８２】
一例では、宿主及び/又は標的細菌は、アナエロツルンカス(Anaerotruncus)、アセトアナエロバクテリウム(Acetanaerobacterium)、アセチトマクラム(Acetitomaculum)、アセチビブリオ(Acetivibrio)、アナエロコッカス(Anaerococcus)、アナエロフィルム(Anaerofilum)、アナエロシヌス(Anaerosinus)、アナエロスティペス(Anaerostipes)、アナエロボラックス(Anaerovorax)、ブチリビブリオ(Butyrivibrio)、クロストリジウム、カプラコッカス(Capracoccus)、デハロバクター(Dehalobacter)、ディアリスター(Dialister)、ドレア(Dorea)、エンテロコッカス、エタノリゲネンス(Ethanoligenens)、フィーカリバクテリウム(Faecalibacterium)、フソバクテリウム(Fusobacterium)、グラシリバクター(Gracilibacter)、グゲンハイメラ(Guggenheimella)、ヘスペリア(Hespellia)、ラクノバクテリウム(Lachnobacterium)、ラクノスピラ(Lachnospira)、ラクトバチルス、ロイコノストック(Leuconostoc)、メガモナス(Megamonas)、モリエラ(Moryella)、ミツオケラ(Mitsuokella)、オリバクテリウム(Oribacterium)、オキソバクター(Oxobacter)、パピリバクター(Papillibacter)、プロピオニスピラ(Propionispira)、シュードブチリビブリオ(Pseudobutyrivibrio)、シュードラミバクター(Pseudoramibacter)、ロセブリア(Roseburia)、ルミノコッカス(Ruminococcus)、サルシナ(Sarcina)、セイノネラ(Seinonella)、シャトレワーシア(Shuttleworthia)、スポロバクター(Sporobacter)、スポロバクテリウム(Sporobacterium)、ストレプトコッカス、サブドリグラヌルム(Subdoligranulum)、シントロフォコッカス(Syntrophococcus)、サーモバチルス(Thermobacillus)、ツリシバクター(Turicibacter)、及びワイセラ(Weissella)から選択されるフィルミクテス門である。
【０３８３】
一例では、キット、DNA、第1のファージ、ヘルパーファージ、組成物、使用、又は方法は、病原性感染症を抑制するか又は腸内若しくは口腔微生物叢のバランスを再調整するためのもの、例えばヒト又は動物における肥満又は疾患を処置又は予防するためのものである。例えば、第1のファージ、ヘルパーファージ、組成物、使用、又は方法は、ヒト又は動物の腸内微生物叢におけるクロストリジウム・ディフィシル又は大腸菌細菌を破壊するためのものである。
【０３８４】
一例では、パッケージングシグナル、NPF、及び/又はHPFは、配列番号2又はその構造若しくは機能性相同体からなるか、又はそれらを含む。
【０３８５】
一例では、パッケージングシグナル、NPF、及び/又はHPFは、配列番号2、又はそれと少なくとも70、75、80、85、90、91、92、93、94、95、96、97、98、若しくは99%同一のヌクレオチド配列からなるか、又はそれらを含む。
【０３８６】
一例では、疾患又は状態は、癌、炎症性又は自己免疫疾患又は状態、例えば、肥満、糖尿病IBD、GI管状態、又は口腔状態である。
【０３８７】
任意選択で、環境は、腸内微生物叢、皮膚微生物叢、口腔微生物叢、喉微生物叢、毛髪微生物叢、腋窩微生物叢、膣微生物叢、直腸微生物叢、肛門微生物叢、眼微生物叢、鼻微生物叢、舌微生物叢、肺微生物叢、肝臓微生物叢、腎臓微生物叢、生殖器微生物叢、陰茎微生物叢、陰嚢微生物叢、乳腺微生物叢、耳微生物叢、尿道微生物叢、陰唇微生物叢、器官微生物叢、若しくは歯微生物叢に含まれるか、又は標的細菌はこれらの微生物叢に含まれる。任意選択で、環境は、植物(例えば、タバコ、作物植物、果樹、野菜植物、若しくはタバコ、例えば植物の表面であるか若しくは植物に含有される)又は環境(例えば土壌若しくは水若しくは水路若しくは水性液体)に含まれるか、或いは標的細菌はこれらの植物又は環境に含まれる。
【０３８８】
任意選択で、ヒト又は動物対象の疾患又は状態は、
(a)神経変性疾患又は状態、
(b)脳疾患又は状態、
(c)CNS疾患又は状態、
(d)記憶喪失又は記憶障害、
(e)心臓又は心血管疾患又は状態、例えば心臓発作、脳卒中、又は心房細動、
(f)肝疾患又は状態、
(g)腎疾患又は状態、例えば慢性腎疾患(CKD)、
(h)膵臓疾患又は状態、
(i)肺疾患又は状態、例えば嚢胞性線維症又はCOPD、
(j)胃腸疾患又は状態、
(k)喉又は口腔疾患又は状態、
(l)眼疾患又は状態、
(m)生殖器疾患又は状態、例えば膣、陰唇、陰茎、又は陰嚢疾患又は状態、
(n)性行為感染症又は状態、例えば淋病、HIV感染症、梅毒、又はクラミジア感染症、
(o)耳疾患又は状態、
(p)皮膚疾患又は状態、
(q)心疾患又は状態、
(r)鼻疾患又は状態
(s)血液疾患又は状態、例えば貧血、例えば慢性疾患に伴う貧血、又は癌、
(t)ウイルス感染症、
(u)病原性細菌感染症、
(v)癌、
(w)自己免疫疾患又は状態、例えばSLE、
(x)炎症性疾患又は状態、例えば関節リウマチ、乾癬、湿疹、喘息、潰瘍性大腸炎、大腸炎、クローン病、又はIBD、
(y)自閉症、
(z)ADHD、
(aa)双極性障害、
(bb)ALS[筋萎縮性側索硬化症]、
(cc)変形性関節症、
(dd)先天性欠損症若しくは状態、又は発生異常若しくは状態、
(ee)流産、
(ff)血液凝固状態、
(gg)気管支炎、
(hh)萎縮型又は滲出型AMD、
(ii)血管新生(例えば腫瘍又は眼の)、
(jj)風邪、
(kk)てんかん、
(ll)線維症、例えば肝又は肺線維症、
(mm)真菌性疾患又は状態、例えば鵞口瘡、
(nn)代謝性疾患又は状態、例えば肥満、食欲不振、糖尿病、I型又はII型糖尿病、
(oo)潰瘍、例えば胃潰瘍又は皮膚潰瘍、
(pp)皮膚乾燥、
(qq)シェーグレン症候群、
(rr)サイトカインストーム、
(ss)難聴、聴力消失、又は聴覚障害、
(tt)低速又は高速代謝(すなわち、対象の体重、性別、及び年齢の平均よりも低速又は高速)、
(uu)受胎障害、例えば不妊症又は低妊孕性、
(vv)黄疸、
(ww)皮疹、
(xx)川崎病、
(yy)ライム病、
(zz)アレルギー、例えばナッツ、草、花粉、チリダニ、ネコ又はイヌの毛又は鱗屑のアレルギー、
(aaa)マラリア、腸チフス、結核、又はコレラ、
(bbb)うつ病、
(ccc)精神遅滞、
(ddd)小頭症、
(eee)栄養障害、
(fff)結膜炎、
(ggg)肺炎、
(hhh)肺塞栓症、
(iii)肺高血圧症、
(jjj)骨障害、
(kkk)敗血症、又は敗血症性ショック、
(lll)副鼻腔炎、
(mmm)ストレス(例えば職業性ストレス)、
(nnn)サラセミア、貧血、フォン・ヴィレブランド病、又は血友病、
(ooo)帯状疱疹又は単純疱疹、
(ppp)月経、
(qqq)精子数減少
から選択される。
【０３８９】
本発明による処置又は予防に関する神経変性又はCNS疾患又は状態
一例では、神経変性又はCNS疾患又は状態は、アルツハイマー病、老年期精神病、ダウン症候群、パーキンソン病、クロイツフェルト・ヤコブ病、糖尿病性神経障害、パーキンソン症候群、ハンチントン病、マシャド・ジョセフ病、筋萎縮性側索硬化症、糖尿病性神経障害、及びクロイツフェルト・ヤコブ病からなる群から選択される。例えば、疾患はアルツハイマー病である。例えば、疾患はパーキンソン症候群である。
【０３９０】
本発明の方法がCNS又は神経変性疾患又は状態を処置するためにヒト又は動物対象に対して実施される一例では、方法は対象におけるTreg細胞の下方調節を引き起こし、それにより全身性単球由来マクロファージ及び/又はTreg細胞が脈絡叢を越えて対象の脳に侵入することを促進し、それによって疾患又は状態(例えばアルツハイマー病)が処置、予防されるか、又はその進行が抑制される。一実施形態では、方法は、対象のCNS系(例えば脳及び/又はCSF)におけるIFN-ガンマの増加を引き起こす。一例では、方法は、神経線維を回復させる、及び/又は神経線維損傷の進行を抑制する。一例では、方法は、神経髄鞘を回復させる、及び/又は神経髄鞘損傷の進行を抑制する。一例では、本発明の方法は、WO2015136541に開示されている疾患若しくは状態を処置若しくは予防する、及び/又は方法は、WO2015136541に開示されている任意の方法と共に使用することができる(この文献の開示は、例えば、そのような方法、疾患、状態、並びにCNS及び神経変性疾患及び状態の処置及び/又は予防をもたらすために対象に投与され得る潜在的な治療剤、例えば免疫チェックポイント阻害薬、例えば抗PD-1、抗PD-L1、抗TIM3、又はその文献に開示される他の抗体等の薬剤の開示を提供することに関して、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる)。
【０３９１】
本方法による処置又は予防に関する癌
処置され得る癌としては、血管新生していないか又は実質的に血管新生していない腫瘍、及び血管新生した腫瘍が挙げられる。癌は、非固形腫瘍(例えば血液腫瘍、例えば白血病及びリンパ腫)を含んでも、固形腫瘍を含んでもよい。本発明を用いて処置される癌の種類としては、これらに限定されないが、癌腫、芽細胞腫、及び肉腫、並びにある特定の白血病又はリンパ系悪性腫瘍、良性及び悪性腫瘍、並びに悪性病変、例えば肉腫、癌腫、及び黒色腫が挙げられる。成人腫瘍/癌及び小児腫瘍/癌もまた挙げられる。
【０３９２】
血液癌とは血液又は骨髄の癌である。血液(又は血行性)癌の例としては、白血病、例えば急性白血病(例えば急性リンパ性白血病、急性骨髄球性白血病、急性骨髄性白血病、並びに骨髄芽球性、前骨髄球性、骨髄単球性、単球性、及び赤白血病)、慢性白血病(例えば慢性骨髄球性(顆粒球性)白血病、慢性骨髄性白血病、及び慢性リンパ性白血病)、真性多血症、リンパ腫、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫(低悪性度及び高悪性度型)、多発性骨髄腫、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、重鎖病、骨髄異形成症候群、有毛細胞白血病、及び骨髄形成異常が挙げられる。
【０３９３】
固形腫瘍とは、通例嚢胞も液体領域も含有しない組織の異常な腫瘤である。固形腫瘍は良性又は悪性であり得る。様々な種類の固形腫瘍は、固形腫瘍を形成する細胞の種類に基づいて命名される(例えば肉腫、癌腫、及びリンパ腫)。固形腫瘍、例えば肉腫及び癌腫の例としては、線維肉腫、粘液肉腫、脂肪肉腫、軟骨肉腫、骨肉腫、並びに他の肉腫、滑膜腫、中皮腫、ユーイング腫瘍、平滑筋肉腫、横紋筋肉腫、結腸癌腫、リンパ性悪性腫瘍、膵臓癌、乳癌、肺癌、卵巣癌、前立腺癌、肝細胞癌腫、扁平上皮癌腫、基底細胞癌腫、腺癌腫、汗腺癌腫、甲状腺髄様癌腫、甲状腺乳頭癌腫、褐色細胞腫、脂腺癌腫、乳頭癌腫、乳頭腺癌腫、髄様癌腫、気管支原性癌腫、腎細胞癌腫、肝癌、胆管癌腫、絨毛癌腫、ウィルムス腫瘍、子宮癌、精巣腫瘍、精上皮腫、膀胱癌腫、黒色腫、並びにCNS腫瘍(例えば神経膠腫(例えば脳幹神経膠腫及び混合神経膠腫)、膠芽腫(多形性膠芽腫としても公知)、星細胞腫、CNSリンパ腫、胚細胞腫、髄芽腫、シュワン細胞腫、頭蓋咽頭腫、上衣腫、松果体腫、血管芽腫、聴神経腫、乏突起神経膠腫、髄膜腫、神経芽腫、網膜芽腫、及び転移性脳腫瘍)が挙げられる。
【０３９４】
本方法による処置又は予防に関する自己免疫疾患
1. 急性散在性脳脊髄炎(ADEM)
2. 急性壊死性出血性白質脳炎
3. アジソン病
4. 無ガンマグロブリン血症
5. 円形脱毛症
6. アミロイドーシス
7. 強直性脊椎炎
8. 抗GBM/抗TBM腎炎
9. 抗リン脂質抗体症候群(APS)
10. 自己免疫性血管性浮腫
11. 自己免疫性再生不良性貧血
12. 自己免疫性自律神経障害
13. 自己免疫性肝炎
14. 自己免疫性高脂血症
15. 自己免疫性免疫不全
16. 自己免疫性内耳疾患(AIED)
17. 自己免疫性心筋炎
18. 自己免疫性卵巣炎
19. 自己免疫性膵炎
20. 自己免疫性網膜症
21. 自己免疫性血小板減少性紫斑病(ATP)
22. 自己免疫性甲状腺疾患
23. 自己免疫性蕁麻疹
24. 軸索型及び神経性ニューロパチー
25. バロー病
26. ベーチェット病
27. 水疱性類天疱瘡
28. 心筋症
29. キャッスルマン病
30. セリアック病
31. シャーガス病
32. 慢性疲労症候群
33. 慢性炎症性脱髄性多発神経炎(CIDP)
34. 慢性再発性多発性骨髄炎(CRMO)
35. チャーグ・ストラウス症候群
36. 瘢痕性類天疱瘡/良性粘膜類天疱瘡
37. クローン病
38. コーガン症候群
39. 寒冷凝集素症
40. 先天性心ブロック
41. コクサッキー心筋炎
42. CREST症
43. 本態性混合型クリオグロブリン血症
44. 脱髄性ニューロパチー
45. 疱疹状皮膚炎
46. 皮膚筋炎
47. デビック病(視神経脊髄炎)
48. 円板状ループス
49. ドレスラー症候群
50. 子宮内膜症
51. 好酸球性食道炎
52. 好酸球性筋膜炎
53. 結節性紅斑
54. 実験的アレルギー性脳脊髄炎
55. エバンス症候群
56. 線維筋痛症
57. 線維化性肺胞炎
58. 巨細胞性動脈炎(側頭動脈炎)
59. 巨細胞性心筋炎
60. 糸球体腎炎
61. グッドパスチャー症候群
62. 多発血管炎性肉芽腫症(GPA)(以前はウェゲナー肉芽腫症と称されていた)
63. グレーブス病
64. ギラン・バレー症候群
65. 橋本脳炎
66. 橋本甲状腺炎
67. 溶血性貧血
68. ヘノッホ・シェーンライン紫斑病
69. 妊娠性疱疹
70. 低ガンマグロブリン血症
71. 特発性血小板減少性紫斑病(ITP)
72. IgA腎症
73. IgG4関連硬化性疾患
74. 免疫調節性リポタンパク質
75. 封入体筋炎
76. 間質性膀胱炎
77. 若年性関節炎
78. 若年性糖尿病(1型糖尿病)
79. 若年性筋炎
80. 川崎症候群
81. ランバート・イートン症候群
82. 白血球破砕性血管炎
83. 扁平苔癬
84. 硬化性苔癬
85. 木質結膜炎
86. 線状IgA病(LAD)
87. ループス(SLE)
88. 慢性ライム病
89. メニエール病
90. 顕微鏡的多発血管炎
91. 混合性結合組織病(MCTD)
92. モーレン潰瘍
93. ムッハ・ハーベルマン病
94. 多発性硬化症
95. 重症筋無力症
96. 筋炎
97. ナルコレプシー
98. 視神経脊髄炎(デビック)
99. 好中球減少症
100. 眼瘢痕性類天疱瘡
101. 視神経炎
102. 回帰性リウマチ
103. PANDAS(小児自己免疫性溶連菌関連性精神神経障害)
104. 傍腫瘍性小脳変性症
105. 発作性夜間ヘモグロビン尿症(PNH)
106. パリー・ロンベルグ症候群
107. パーソネージ・ターナー症候群
108. 毛様体扁平部炎(周辺部ぶどう膜炎)
109. 天疱瘡
110. 末梢神経障害
111. 静脈周囲脳脊髄炎
112. 悪性貧血
113. POEMS症候群
114. 結節性多発動脈炎
115. 多腺性自己免疫症候群I型、II型、及びIII型
116. リウマチ性多発筋痛症
117. 多発性筋炎
118. 心筋梗塞後症候群
119. 心膜切開後症候群
120. プロゲステロン皮膚炎
121. 原発性胆汁性肝硬変
122. 原発性硬化性胆管炎
123. 乾癬
124. 乾癬性関節炎
125. 特発性肺線維症
126. 壊疽性膿皮症
127. 赤芽球癆
128. レイノー現象
129. 反応性関節炎
130. 反射性交感神経性ジストロフィー
131. ライター症候群
132. 再発性多発軟骨炎
133. 下肢静止不能症候群
134. 後腹膜線維症
135. リウマチ熱
136. 関節リウマチ
137. サルコイドーシス
138. シュミット症候群
139. 強膜炎
140. 強皮症
141. シェーグレン症候群
142. 精子及び精巣自己免疫病(autoimmunity)
143. 全身硬直症候群
144. 亜急性細菌性心内膜炎(SBE)
145. スザック症候群
146. 交感性眼炎
147. 高安動脈炎
148. 側頭動脈炎/巨細胞性動脈炎
149. 血小板減少性紫斑病(TTP)
150. トロサ・ハント症候群
151. 横断性脊髄炎
152. 1型糖尿病
153. 潰瘍性大腸炎
154. 未分化結合組織病(UCTD)
155. ぶどう膜炎
156. 血管炎
157. 小水疱性皮膚症
158. 白斑
159. ウェゲナー肉芽腫症(現在は多発血管炎性肉芽腫症(GPA)と称される)
【０３９５】
本方法による処置又は予防に関する炎症性疾患
1. アルツハイマー
2. 強直性脊椎炎
3. 関節炎(変形性関節症、関節リウマチ(RA)、乾癬性関節炎)
4. 喘息
5. アテローム動脈硬化症
6. クローン病
7. 大腸炎
8. 皮膚炎
9. 憩室炎
10. 線維筋痛症
11. 肝炎
12. 過敏性腸症候群(IBS)
13. 全身性エリテマトーデス(SLE)
14. 腎炎
15. パーキンソン病
16. 潰瘍性大腸炎
【０３９６】
項目
例として、本発明は以下の項目(任意選択で上記の本開示のいずれかと組み合わせることができる)を提供する:
【０３９７】
1.  第1のファージの集団を含む抗菌組成物であって、第1のファージが、第1のファージ粒子の複製のためにヘルパーファージを必要とし、ヘルパーファージが、第1のファージ核酸をパッケージングして第1のファージ粒子を産生することができ、第1のファージがヘルパーファージと異なり、ヘルパーファージが、それ自体ではヘルパーファージ粒子を産生することができず、第1のファージが標的細菌に感染することができ、各第1のファージが細菌を死滅させるための抗菌手段を含む、抗菌組成物。
【０３９８】
2.  組成物に含まれる少なくとも95%のファージ粒子が第1のファージ粒子である、項目1に記載の組成物。
【０３９９】
任意選択で、組成物はヘルパーファージを含む。任意選択で、組成物は、1×106個以上のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。任意選択で、組成物は、1×108個以上のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。任意選択で、組成物は、1×109個以上のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。任意選択で、組成物は、1×1010個以上のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。
【０４００】
3.  各第1のファージがCRISPR/Casシステムの1つ又は複数の成分を含み、成分が、ガイドRNA(任意選択で単一ガイドRNA)をコードするか又はガイドRNAを産生するためのCRISPRアレイを含むDNA配列を含み、ガイドRNAが標的細菌のゲノムを標的とすることができる、項目1又は2に記載の組成物。
【０４０１】
4.  各第1のファージゲノムが、ファージタンパク質をコードする遺伝子を欠く、前述のいずれかの項目に記載の組成物。
【０４０２】
5.  細菌の抗菌処理における使用のための組成物であって、第1の種又は株の第1の細菌宿主細胞中で移動することができる操作された可動遺伝要素(MGE)を含み、細胞がヘルパーファージゲノムを含み、細胞においてMGEがヘルパーファージによってコードされるタンパク質を使用して移動し、ヘルパーファージの複製が阻害され、MGEが、抗菌剤をコードするか又はそのような薬剤の成分をコードし、修飾ゲノムアイランド、修飾病原性アイランド、SaPI(黄色ブドウ球菌病原性アイランド)、VコレラPLE(ファージ様誘導性染色体アイランド様エレメント)、又は大腸菌PLEを含む、前述のいずれかの項目に記載の組成物。
【０４０３】
6.  (a)第1のDNA、及び
b)1つ又は複数の第2のDNA
を含むキットであって、
(i)第1のDNAと第2のDNAが全体として、第1のDNAのコピーを含むパッケージングされたファージ粒子を産生するのに必要とされるファージ構造タンパク質遺伝子を全て含み、
(ii)第1のDNAが前記遺伝子を含まないか、又は少なくとも1つ含むが全ては含まず、1つ又は複数の第2のDNAが残りの遺伝子を含み、
(iii)第1のDNAが、パッケージングされたファージ粒子を産生するためのファージパッケージングシグナルを含み、
(iv)第2のDNAが、第2のDNAをファージ粒子にパッケージングするために必要とされるヌクレオチド配列を欠き、
第1のDNAと第2のDNAが、第1のDNAを含むパッケージングされたファージ(第1のファージ)を産生するための宿主細菌に共存する場合に作動可能であり、第1のファージが、その複製のために更なる第1のファージ粒子を産生する第2のDNAを必要とする、キット。
【０４０４】
7.  (i)のファージ粒子が標的細菌に感染することができ、ファージが、標的細菌においてタンパク質又はRNAを発現させることができる目的のヌクレオチド配列(NSI)を含み、標的細菌におけるNSIにコードされるタンパク質又はRNAの存在が、標的細胞の死滅、又は標的細胞の成長若しくは増幅の下方調節を媒介する、項目6に記載のキット。
【０４０５】
8.  (i)のファージ粒子が標的細菌に感染することができ、ファージが、標的細菌においてタンパク質若しくはRNAを発現させることができる目的のヌクレオチド配列(NSI)、又は標的細菌において作動可能な調節エレメントを含むNSIを含む、項目6に記載のキット。
【０４０６】
9.  標的細菌におけるNSI又はNSIにコードされるタンパク質若しくはRNAの存在が、標的細胞の死滅、又は標的細胞の成長若しくは増幅の下方調節を媒介するか、或いは標的細胞ゲノムによってコードされる1つ若しくは複数のRNA若しくはタンパク質の発現の停止、又はその下方調節を媒介する、項目8に記載のキット。
【０４０７】
10.  標的細菌におけるNSI又はNSIにコードされるタンパク質若しくはRNAの存在が、標的細胞の成長又は増幅の上方調節を媒介するか、或いは標的細胞ゲノムによってコードされる1つ若しくは複数のRNA若しくはタンパク質の発現の始動、又はその上方調節を媒介する、項目8に記載のキット。
【０４０８】
11.  NSIが、標的細菌に対して毒性であるCRISPR/Casシステムの成分をコードする、項目7から9のいずれか一つに記載のキット。
【０４０９】
12.  NSIが標的細菌を死滅させるための操作された抗菌手段を含む、項目7から9のいずれか一つに記載のキット。
【０４１０】
13.  パッケージングされたファージ粒子ゲノムが、ファージタンパク質をコードする遺伝子を欠く、項目6から12のいずれか一つに記載のキット。
【０４１１】
14.  第1のDNAが前記構造タンパク質遺伝子を含まない、項目6から13のいずれか一つに記載のキット。
【０４１２】
15.  第2のDNAがファージパッケージングシグナルを欠く、項目6から14のいずれか一つに記載のキット。
【０４１３】
16.  各シグナルがpac若しくはcos配列、又はその相同体である、項目6から15のいずれか一つに記載のキット。
【０４１４】
17.  各シグナルが、配列番号2、又はそれと少なくとも70、80、90、95、96、97、98、若しくは99%同一の配列を含むか、或いは異なる種由来の相同体である、項目6から16のいずれか一つに記載のキット。
【０４１５】
18.  項目6から17のいずれか一つに規定の第1のDNAである、単離されたDNA。
【０４１６】
19.  第1のDNAがベクター(任意選択で、プラスミド、ファージミド、又はシャトルベクター)に含まれる、項目6から18のいずれか一つに記載のキット又はDNA。
【０４１７】
20.  第2のDNAが、ベクター(任意選択で、プラスミド、ファージミド、若しくはシャトルベクター)、ヘルパーファージ(任意選択でヘルパーファージミド)に含まれるか、又は宿主細菌細胞のゲノムへ組み込まれる、項目6から19のいずれか一つに記載のキット又はDNA。
【０４１８】
21.  項目6から17、19、及び20のいずれか一つに規定の第1及び第2のDNAを含むか、又は項目18から20のいずれか一つに記載のDNAを含む、宿主細菌細胞。
【０４１９】
22.  ファージ組成物を製造する方法であって、項目21に記載の細胞においてファージタンパク質を発現させる工程であり、第1のDNAを含むパッケージングされた第1のファージ粒子が産生され、第1のファージが、その複製のために更なる第1のファージを産生する第2のDNAを必要とする、工程、及び任意選択で、ある量の第1のファージを細胞材料から分離する工程であり、ある量の精製されたファージが取得される、工程を含む、方法。
【０４２０】
一例では、精製されたファージは、薬学的に許容される賦形剤、担体、又は希釈剤(例えば水性液体若しくは水)と混合されて、医薬組成物を製造する。
【０４２１】
一例では、本発明の任意の組成物又はキットは、ヒトにおける疾患又は状態を処置及び/又は予防するための使用に関するラベル又は説明書と組み合わされ、任意選択で、ラベル又は説明書は販売承認番号(例えばFDA又はEMA承認番号)を含み、任意選択で、キットは第1のDNA又は第1のファージを含む注射ペン又はIV容器を含む。
【０４２２】
23.  第1のファージ粒子を単離する工程を含む、項目22に記載の方法。
【０４２３】
24.  項目22又は23に記載の方法によって取得可能な第1のファージ粒子の集団を含む、組成物(例えば抗菌組成物、例えば医療用途)。
【０４２４】
一例では、第1のファージ粒子は方法によって取得される。
【０４２５】
一例では、本発明の任意の組成物は、例えば流体(例えば液体)又は個体に含まれる場合、1ml又は1mg当たり少なくとも1×103個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×104個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×105個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×106個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×107個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×108個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×109個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×1010個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×1011個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×1012個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×1013個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×1014個の第1のファージを含む。
【０４２６】
一例では、本発明の任意の組成物は、例えば流体(例えば液体)又は個体に含まれる場合、1ml又は1mg当たり最大1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり最大1×1013個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり最大1×1012個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり最大1×1011個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり最大1×1010個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり最大1×109個の第1のファージを含む。
【０４２７】
一例では、本発明の任意の組成物は、例えば流体(例えば液体)又は個体に含まれる場合、1ml又は1mg当たり少なくとも1×103から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×104から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×105から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×106から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×107から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×108から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×109から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×1010から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×1011から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×1012から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×1013から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。一例では、本発明の任意の組成物は、1ml又は1mg当たり少なくとも1×1014から1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、又は1×1014個の第1のファージを含む。
【０４２８】
一例では、組成物は、対象への投与のための医療用途の、例えば対象における疾患又は状態を処置又は予防するための、1回又は複数回用量の第1のファージを含む。一例では、組成物は単回用量を含む。一例では、組成物は、(少なくとも)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30回用量を含む。一例では、各用量は、前記ファージを含む(少なくとも)0.5、1、2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、75、100、125、200、又は250mg又はml用量である(すなわち用量は前記量であり、例えばファージと、賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む)。
【０４２９】
一例では、組成物は、対象への投与のための非医療用途の、例えば農業用途の、1回又は複数回用量の第1のファージを含む。一例では、組成物は単回用量を含む。一例では、組成物は、(少なくとも)2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、又は30回用量を含む。一例では、各用量は、前記ファージを含む(少なくとも)0.5、1、2、3、4、5、10、20、25、30、40、50、75、100、125、200、250、500、750、1000、2000、3000、4000、5000、10000、50000、100000mg又はml用量である(すなわち用量は前記量であり、例えばファージと、賦形剤、希釈剤、又は担体とを含む)。用量は、標的細菌と接触させるための使用の前に溶媒(例えば水性溶媒又は水)に溶解又は希釈してもよい。一例では、1英ガロンは、例えば、作物への散布等の農業用途、又は飲料としての使用等の動物若しくは家畜用途のための1回用量の第1のファージを含む。
【０４３０】
25.  第2のDNAがヘルパーファージDNAに含まれ、組成物に含まれる総ファージ粒子の5%未満がヘルパーファージ粒子である、項目22若しくは23に記載の方法又は項目24に記載の組成物。
【０４３１】
26.  第2のDNAがヘルパーファージDNAに含まれ、組成物が、1×106個以上のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む、項目22から24のいずれか一つに記載の方法又は組成物。
【０４３２】
これは、実施例3において実証されており、実施例4において標的細菌の死滅に有効であることが示されている。一実施形態では、組成物は、1×107個以上のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。一実施形態では、組成物は、1×108個以上のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。一実施形態では、組成物は、1×109個以上のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。一実施形態では、組成物は、1×1010個以上のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。
【０４３３】
一実施形態では、組成物は、1×106個のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。一実施形態では、組成物は、1×107個のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。一実施形態では、組成物は、1×108個のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。一実施形態では、組成物は、1×109個のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。
【０４３４】
一実施形態では、組成物は、1×106から1×109個のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。一実施形態では、組成物は、1×106から1×108個のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。一実施形態では、組成物は、1×106から1×107個のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。一実施形態では、組成物は、1×107から1×109個のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。一実施形態では、組成物は、1×107から1×108個のファージ粒子当たり1個以下のヘルパーファージ粒子を含む。
【０４３５】
一例では、ヘルパーファージの割合は、プラーク形成単位(PFU)、例えば、前記ファージ粒子数を含むファージ組成物のPFU/mlとして決定される。例えば、非ヘルパーファージ(すなわち第1のファージ)の割合は、標的細菌の形質導入単位(TFU)、例えばファージ組成物のTFU/mlの数として決定される。PFUは、感受性指標細菌の菌叢で決定され、TFUは、感受性指標細菌の培養が指標細胞の過剰を保証しつつ(すなわち低い感染多重度(MOI<0.01で)ファージ組成物に感染し、形質導入された細胞の数が選択的プレートへの播種によって決定される形質導入アッセイにおいて決定される。
【０４３６】
したがって、組成物は1個又は複数個のヘルパーファージ粒子を含み得る。しかしながら、ヘルパー粒子のレベルは極端に低い。このことは、組成物が比較的純粋である(したがって、例えば医薬として有用である)場合に有益である。更に、第1のファージが複製される機会が極端に少なく、ファージの投薬量制御、ファージの(例えば、ヒト若しくは動物の身体、又は環境への)封じ込めという利点を提供するため、有用でもあり、ファージ複製の不足は、ファージによる望ましくない遺伝子(例えば抗生物質耐性遺伝子)を獲得する機会を減少させる。
【０４３７】
27.  各第1のファージ粒子が、標的細菌においてタンパク質又はRNAを発現させることができる目的のヌクレオチド配列(NSI)を含み、標的細菌におけるNSIにコードされるタンパク質又はRNAの存在が、標的細胞の死滅、又は標的細胞の成長若しくは増幅の下方調節を媒介する、項目1から5のいずれか一つに記載の組成物、項目22、23、25、若しくは26に記載の方法、又は項目24から26のいずれか一つに記載の組成物。
【０４３８】
28.  NSIが、標的細胞に対して毒性であるCRISPR/Casシステムの成分をコードする、項目27に記載の方法又は組成物。
【０４３９】
29.  前記成分が、(i)ガイドRNA(例えば単一ガイドRNA)をコードするか若しくはガイドRNAを産生するためのCRISPRアレイを含むDNA配列であって、ガイドRNAが標的細菌のゲノムを標的とすることができる、DNA配列、(ii)CasヌクレアーゼをコードするDNA配列、及び/又は(iii)Cascadeの1つ若しくは複数の成分をコードするDNA配列を含む、項目28に記載の方法又は組成物。
【０４４０】
30.  NSIがCasヌクレアーゼとシステムのガイドRNAとをコードし(又はNSIがCasヌクレアーゼとガイドRNAを産生するためのCRISPRアレイとをコードし)、ガイドRNAが標的細菌のゲノムを標的とすることができ、ガイドRNAが標的細胞においてCasを導いて、標的細胞の死滅、又は標的細胞の成長若しくは増幅の下方調節を媒介することができる、項目29に記載の方法又は組成物。
【０４４１】
任意選択で、NSIは、Cas9、並びにガイドRNAを産生するためのtracrRNA及びCRISPRアレイをコードする。
【０４４２】
31.  第1のファージ粒子がファージ構造タンパク質遺伝子を含まない、項目1から5、及び22から30のいずれか一つに記載の方法又は組成物。
【０４４３】
32.  第1のDNA又は第1のファージDNAが高コピー数プラスミドに含まれる、前述のいずれかの項目に記載のキット、DNA、方法、又は組成物。
【０４４４】
任意選択で、第1のDNA又は第1のファージDNAは中コピー数プラスミドに含まれる。
【０４４５】
低、中、及び高コピー数ori及びプラスミドの意味は当業者に公知であり、これらは技術用語である。当業者に公知のように、コピー数は、細胞1個当たりのプラスミドコピー数の平均を表す。例えば、低コピー数プラスミドは、プラスミドが包含される細菌細胞1個当たり1から10までのコピーで存在するプラスミドであり、中コピー数プラスミドは、細胞1個当たり11から50まで(例えば、11から40、又は20から30、又は40)のコピーで存在し、高コピー数は、細胞1個当たり50超(例えば、最大100、200、250、300、400、500、600、又は700)のコピーである。一例では、第1のDNAを含むプラスミド又はベクターは、中コピー数プラスミド又はベクターである。一例では、第1のDNAを含むプラスミド又はベクターは、高コピー数プラスミド又はベクターである。一般的なori及びプラスミドの一例をTable 7(表9)に示す。
【０４４６】
33.  NSIが標的細菌を死滅させるための操作された抗菌手段を含む、項目27又は項目27に従属する項目28から32のいずれか一つに記載の方法又は組成物。
【０４４７】
34.  前記抗菌手段が、導かれたヌクレアーゼ、例えば、Casヌクレアーゼ、TALEN、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、又はメガヌクレアーゼをコードする核酸を含む、項目33に記載の方法又は組成物。
【０４４８】
35.  ヒト又は動物対象への投与のための医療用途の、項目1から5、及び24から34のいずれか一つに記載の組成物。
【０４４９】
36.  標的細菌細胞の感染症を処置するためにヒト又は動物対象に投与するための組成物であって、第1のファージが標的細胞に感染して標的細胞を死滅させることができ、任意選択で感染症が腸内マイクロバイオーム感染症である、項目1から5、及び24から34のいずれか一つに記載の組成物。
【０４５０】
任意選択で、標的細胞は大腸菌細胞であり、第1のDNAは高コピー数プラスミドに含まれる。
【０４５１】
一例では、腸内マイクロバイオームは上部GI管マイクロバイオームである。一例では、標的細胞は対象の上部GI管に含まれる。一例では、第1のファージは対象の上部GI管に送達される。
【０４５２】
一例では、腸内マイクロバイオームは胃又は小腸マイクロバイオームである。一例では、標的細胞は対象の胃又は小腸に含まれる。一例では、第1のファージは対象の胃又は小腸に送達される。
【０４５３】
37.  ヒト又は動物対象の疾患又は状態を処置する完結型の方法における使用のための組成物であって、疾患又は状態が標的細菌によって媒介され、標的細菌が対象に含まれ(任意選択で腸内マイクロバイオームに含まれ)、方法が、組成物を対象に投与する工程であり、それによって標的細菌が抗菌手段に曝露されて死滅し、第1のファージの増幅が封じ込められる、工程を含む、項目33又は34に記載の組成物。
【０４５４】
38.  ex vivoの環境を処理する方法であって、環境を、第1のファージ粒子の集団を含む組成物に曝露する工程を含み、組成物が、項目22、23、及び25から34のいずれか一つに記載の方法によって取得可能であるか、又は項目1から5、及び24から34のいずれか一つに記載のものであり、環境が標的細菌を含み、第1のファージが標的細菌に感染して標的細菌を死滅させる、方法。
【０４５５】
39.  処理を環境に封じ込めるための、項目38に記載の方法。
【０４５６】
40.  対象における第1のファージ処置の投薬量を制御するための、項目1から5、及び24から34のいずれか一つに記載の組成物、又は環境における第1のファージ処理の投薬量を制御するための、項目38若しくは39に記載の方法。
【０４５７】
41.  対象中での、第1のファージによる外来遺伝子配列の獲得のリスクを低減するための、項目1から5、及び24から34のいずれか一つに記載の組成物、又は環境中での、第1のファージによる外来遺伝子配列の獲得のリスクを低減するための、項目38若しくは39に記載の方法。
【実施例】
【０４５８】
(実施例1)
効率的なファージCRISPR送達ビヒクル産生
背景
標的大腸菌Nissle株細菌を死滅させるためのCRISPR/Casシステムの成分を含むファージ粒子の効率的な産生のための戦略を設計した。そのため、本発明者らのファージ組成物は、ファージタンパク質をコードする配列を欠き、ヘルパーファージを有しないか又は非常に低い割合で有するファージ粒子へパッケージングされたCRISPR/Casシステム成分を主に含有する溶解物からなる。或いは、本戦略は、あまり十分に特性決定されていないファージ/細菌株の組合せにおいても機能し得る。実行した具体例を実施例3及び実施例4に提供する。
【０４５９】
これまでに知られていないファージへのCRISPR/Cas成分パッケージングの戦略の概説
(a)高又は中コピー数クローニング/シャトルベクター(第1の大腸菌株(クローニング産生株)におけるクローニング及び増幅、並びにその後の目的の第2の細菌宿主株(標的宿主株)への移入が可能)であって、大腸菌クローニング産生株中での複製のための大腸菌oriを含有する、ベクターを同定する、
(b)標的宿主(第2の)細菌から溶原性ファージを単離する、
(c)クローニング産生株を作出するために、不活性CRISPR/Casシステム(例えば抑制されたCas3若しくは他のヌクレアーゼ)を有する、及び/又は第2の株に見出される標的プロトスペーサーが欠如しており、溶原性ファージに感染して溶原化し得る宿主標的細菌(又は他の細菌)のファージ産生株を同定又は操作する、或いは産生株におけるシステムを抑制又は不活性化する、
(d)その産生株において、溶原性ファージ(ヘルパーファージ)を使用して溶原菌を作製し、誘発し得るかを試験する、
(e)全ゲノムが配列決定されたファージに関してPhargeTerm(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5557969/)を使用して、パッケージング配列(pac又はcos)を同定する、
(f)産生株細菌中のヘルパーファージにおけるpac/cosパッケージングシグナル配列を欠失させる、
(g)パッケージングシグナルを、CRISPRアレイ又は単一gRNAをコードする配列(並びに任意選択でCRISPR/Casシステムの他の成分、例えば、Cas9をコードするヌクレオチド配列、並びに任意選択でtracrRNAをコードする配列、又はCas3及び/若しくはCascadeをコードする配列)と共にシャトルベクターへ組み込む、
(h)ベクターを産生宿主株に形質転換する、
(i)誘発(例えばUV又はマイトマイシンC誘発)させ、CRISPR/Cas成分を含むファージを回収する。或いは、誘発可能なRecAを有するシステムをトランスに使用して、SOS(活性化したRecAを必要とする)を模倣する。
【０４６０】
ファージP2を使用した大腸菌Nissleに関する上記の具体例
NissleはGRAS(一般に安全と認められている)ステータスのために有用であり、P2は(例えばシュードモナスへのDNA送達に加えて)比較的広い宿主範囲(大半の大腸菌、赤痢菌、クレブシエラ、サルモネラ)を有する(Kahnら1991、「Bacteriophage P2 and P4」、Methods in Enzymology、204巻、264〜280頁)。
【０４６１】
pUC19又は他の高若しくは中コピー数クローニングベクターを使用する。溶原性ファージP2はNissleに溶原化することができる。大半の大腸菌K株は、不活性CRISPR/Casシステムを有し、P2によって感染され得るため、全ての正規のクローニング宿主を使用することができる(本実施例では大腸菌TOP10によって例示する)。
【０４６２】
P2をTOP10に導入して溶原菌を産生する。P2は、マイトマイシンCとUVのいずれを用いても誘発することができないが、本発明者らは、P2を抑制解除して溶菌期に入らせる寄生ファージP4由来のイプシロン抗リプレッサーを使用する。この遺伝子を、産生宿主株における誘導性プロモーターから発現させる。
【０４６３】
配列番号2の325bpのパッケージングシグナル配列を使用する。
【０４６４】
パッケージング配列を溶原性産生TOP10株のP2プロファージにおいて欠失させる。
【０４６５】
標的Nissle株のゲノムを標的とするガイドRNAをコードする(或いはそのようなガイドRNAを産生するためのCRISPRアレイを含む)pUC19シャトルベクターを構築し、配列番号2のパッケージングシグナルを付加する。標的Nissleが自らの内在性CRISPR/Casシステムを包含する場合は、ベクターにCas活性化遺伝子を含めることによって内在性Cas3を活性化させる活性化戦略を使用する。包含しない場合は、標的Nissleにおける発現のために、ベクターに外在性Cas3をコードするヌクレオチド配列(及び任意選択で、1つ又は複数の必要とされるCascade成分をコードする1つ又は複数のヌクレオチド配列)を含める。ベクターをTOP10産生株に形質転換し、P4抗リプレッサーを誘導し、CRISPR/Cas成分を含むファージを回収する。
【０４６６】
誘導された(ヘルパー)ファージDNAはパッケージングシグナルを含有しないため、ベクターDNAのみがパッケージングされた粒子を単離することができる。したがって、標的Nissle大腸菌細菌に感染させ、標的細菌を死滅させるためのCRISPR/Cas成分を導入するために使用することができるそのようなファージを含む組成物を得る。
【０４６７】
(実施例2)
MGE、ゲノムアイランド等
考えられる様々なMGEパッケージング戦略の概要は、以下のものである。
様々な種類のファージに適用可能:
-  ヘルパーファージにおけるパッケージングシグナル及び構造遺伝子を同定する
-  ヘルパーファージにおけるパッケージングシグナルを欠失させ、MGEを含むプラスミドに配置する
-  ヘルパーとプラスミドの両方を産生株に入れる
-  ヘルパーの構造遺伝子転写を誘導して、ヘルパーファージにパッケージングされたMGEの産生を得る。
【０４６８】
寄生可動要素(P4ファージ又はSaPI等)を使用するために、P4における寄生要素Delta、又はSaPIにおけるptiA/B/Mのうちの1つ、複数、若しくは全てから取得したヘルパーファージ活性化因子の誘導によってヘルパーファージ構造遺伝子の活性化を行う。
【０４６９】
より小さな粒子を望む場合は、MGE又はベクターにP4 Sid及びpsu、又はSaPI由来のcpmA/Bを含めることによって、寄生サイズのカプシド(典型的には10〜20kb)へパッケージングすることを選択することができる。
【０４７０】
少なくともパッケージングシグナルが除去されており、構造遺伝子がプラスミドにあるか又は産生宿主へ潜在性プロファージとして組み込まれる欠損ヘルパーファージを使用することができる。何らかの理由でこの手法を使用することができず、機能性ヘルパーファージを使用しなければならない場合は、ファージパッケージング機構部分を乗っ取って、ファージDNAよりも寄生DNA(本発明者らの場合ではCGV(商標))を優先的にパッケージングする寄生要素の遺伝子をMGE又はベクターに含めることができる。
【０４７１】
P4由来のプラスミドベクターに含めることができる最小の遺伝子の一覧
P4配列:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/x51522を参照のこと
Cosパッケージング部位:配列番号3
P2とP4の間の相同配列;これはMGE又はベクターにおける代替的なパッケージングシグナルとして使用され得る:配列番号4
小さなカプシドサイズ(33.5kbではなく11.4kbをパッケージングする)の場合、Sid及び/又はPsuをMGE又はベクターに含めることができる:
Sid:配列番号5
Psu:配列番号6
【０４７２】
ヘルパーファージP2を活性化させるために、P4由来のDeltaを宿主細胞ゲノムに含めてもよい(パッケージングされるMGE又はベクターではなく、宿主細胞に別個に提供される)。
Delta:配列番号7
【０４７３】
宿主染色体/P2由来のエピソームに含める最小遺伝子
P2配列(受託番号:NC_001895)
【０４７４】
図1は、非必須遺伝子が囲まれている-これらのうちの1つ、複数、又は全ては除外してもよい(但し、Cosは常に欠失している)-P2ゲノムの遺伝子地図を示す。Cosは欠失しており、好ましくはintからCosまでの全領域が欠失している。この領域は、例えば耐性マーカーと交換してもよく、他方、orf30及びfun(Z)遺伝子は、無傷のままであるか又は欠失させてもよい。
【０４７５】
したがって、本明細書における本発明の任意の態様の一実施形態では、intからCosまで(すなわちint及びCosを含む)は、ヘルパーファージDNA若しくは第2のDNAから排除されるか、又は、異なるファージがヘルパーファージDNA若しくは第2のDNAの基盤として使用される場合は、相同領域が排除される。
【０４７６】
P2ゲノムの種々の区間の配列は以下の通りである:
「Q」から「S」:配列番号8
「V」から「G」:配列番号9
「FI」から「ogr」:配列番号10
【０４７７】
ベクター又はMGEに含めるSaPI由来の最小の遺伝子
いくつかの異なるSaPIシステムが存在する。図2は、ファージphi11又はphi80アルファをヘルパーファージとして活用する、十分に特性決定されたSaPIのうちの1つ(SaPIbov1)を示す。SaPIbov1配列(受託番号:AF217235.1)
【０４７８】
パッケージングシグナル
パッケージングシグナルが欠失した欠損ヘルパーファージを使用する場合、ヘルパーファージ由来のそのシグナルを使用し、それをパッケージングされるDNAに含めることができる。黄色ブドウ球菌phi11(受託番号:AF424781)の一例は配列番号11である。
【０４７９】
小さなカプシドサイズ(43.6kbではなく15.8kbをパッケージングする)の場合、cpmA及び/又はcpmBをMGE又はベクターに含めることができる(配列番号12及び13)。
【０４８０】
ヘルパーファージphi11を活性化させるために、ptiA、B、及びMのうちの1つ、複数、又は全てを含めてもよい(パッケージングされるMGE又はベクターではなく、産生宿主細胞に別個に提供される)(配列番号14〜16)。
【０４８１】
宿主染色体/phi11由来のエピソームに含める最小遺伝子
Phi11配列(受託番号:AF424781)
遺伝子#29(terS)から遺伝子#53(溶解素):配列番号17
【０４８２】
SaPIと共に機能するファージの一覧
様々なSaPIが様々なヘルパーファージに連結する(下記のTable 2(表4)を参照のこと)。
【０４８３】
ヘルパーファージを変異させて、より小さなカプシドへパッケージングするようにファージに指令する構造遺伝子のみを含有するようにしてもよい。小さなカプシドへのパッケージングに関与する遺伝子(cpmA及びcpmB)のみに注目すると、これらはブドウ球菌の間で高度に保存されており、このことは、これらの遺伝子が下記の一覧表(Table 2(表4))よりも幅広い多様なファージへのパッケージングを再指令するように機能し得ることを示す。
【０４８４】
(実施例3)
合成形質導入粒子送達プラットフォームの設計、構築、及びin vitro有効性
エグゼクティブ・サマリー
SA100は、CRISPR/Cas成分をコードする核酸配列を含むDNAプラスミドをパッケージングするファージコートタンパク質を含む非自己複製性形質導入粒子を含む合成DNA送達ビヒクルであり、粒子は、標的大腸菌宿主細胞に感染して、DNAを導入することができる。導入されたDNAは次いで、宿主細胞において使用されて、成分を産生することができる。そのようなDNAをCRISPR-Guided Vector(CGV(商標))と称する。本実施例に示すように、欠損ヘルパーファージを使用してそのような粒子を作製した。合成粒子の産生後、ファージタンパク質をコードするあらゆるファージ核酸を欠く純粋な合成溶解物を取得する。本発明者らは、この溶解物がCGV(商標)の大腸菌への非常に効率的な送達をin vitroで行うことができることを示す。粒子は、非自己複製性であり、複製のためにヘルパーファージを必要とする。したがって、有用なことに、溶解物は純粋であり、CGV(商標)を含有する粒子の複製の可能性を排除する。このことは抗菌薬の作用を含有させるのに有用であり、ヒト若しくは動物対象又は環境への投与のためのより制御された(例えば所定の)投薬量を可能にする、例えば、対象又は環境中での複製の排除は、ファージが周囲のファージ又は細菌から望ましくない遺伝子又は特性(例えば望ましくない抗生物質耐性遺伝子)を獲得する機会を減少させ、また、獲得した場合でさえ、本発明の粒子複製の限定は、そのような遺伝子又は特性の拡散を抑制又は排除する手段を提供する。このことは、環境における使用のための医薬品又は抗菌薬を承認する際にそのような態様を考慮する米国FDA又はUSDA等の機関にとって利益となり得る。
【０４８５】
研究の目的
目的1:ファージベースの完全合成CGV送達プラットフォームSA100を設計及び操作する。
目的2:SA100を使用して大腸菌へのCGV送達を実証する。
【０４８６】
材料及び方法
細菌株及び成長条件
合成SAE100形質導入粒子を産生するための細菌産生株を作製した。ファージP2を包含する大腸菌株C-2323を、本発明者らのSA100/CGV産生株(Virginia Commonwealth UniversityのGail E. Christieより寄贈)を操作するための出発物質として使用した。SA100及び感染力を試験するために使用した他の株は、EMG-2、C-1a、及びC-1792(Coli Genetic Stock Center http://cgsc2.biology.yale.edu/より購入)であった。
【０４８７】
全ての細菌培養を、2mM MgCl2を補充したLB培地で成長させた。適宜、欠損プロファージ及びCGVの選択のために、培養に50μg/mLカナマイシン又は50μg/mLスペクチノマイシンをそれぞれ補充した。SA100感染研究では、培地に2.5mM CaCl2を補充して、SA100粒子の細菌細胞への吸着を補助した。CRISPR/Casシステムの誘導に関しては、細胞を0.5mM IPTG及び2mMテオフィリンに曝露した。
【０４８８】
欠損ヘルパープロファージの構築
pTK-red組換え操作プラスミド(p72)を株C-2323へ形質転換した。KamRカナマイシンマーカー遺伝子を、欠失させることを望むP2のおよそ10kbpの領域の直ぐ上流及び下流にあるP2プロファージの領域に対して50bpの相同性を有するオリゴを使用して増幅した(図3を参照のこと)。所望の領域とKanRマーカー遺伝子との成功裏の置き換え後、温度感受性のpTK-red組換え操作プラスミドを保護処理した。
【０４８９】
SA100粒子へのパッケージングのためにCGV(p94)を操作する
CGV p77を、プラスミドp53を鋳型として使用して構築した。プラスミドp53は、CRISPR/Casシステムの成分をコードするプラスミドであって、tracrRNA及びストレプトコッカス・ピオゲネス由来のCas9タンパク質(SpCas)をコードする核酸配列を含む、プラスミドである。crRNAを産生するための核酸配列を取得し、placプロモーターによって発現を駆動した。2つの断片を、ギブソン・アセンブリ(NEB E5510S)によって組み立て、大腸菌コンピテント細胞に形質転換した。組み立てたp77プラスミドを全長配列決定によって検証した。
【０４９０】
誘導性CRISPR/Casシステムを包含するp77を、サテライトファージP4由来のsidからcosまでの領域(図3)を転写するアラビノース誘導性プロモーターを含む断片の挿入のための骨格として使用した。
【０４９１】
両方の断片をPCR増幅し、制限酵素クローニングによってクローニングした。その結果得たSA100パッケージング可能CGV(p94)を配列検証した。
【０４９２】
SA100パッケージングCGVの産生
CGV p94を、以前に構築した、欠損プロファージを包含する株に形質転換し、それにより産生株#189を生成した。
【０４９３】
産生株を、集団の均衡のとれた成長を保証しつつ、カナマイシン及びスペクチノマイシンの存在下でおよそ10世代にわたって指数関数的に成長させた。1の光学密度(OD600)で、1%アラビノースを用いて培養を誘導し、光学密度測定値が低く安定するまでインキュベーションを継続した。細胞片を遠心除去した後、溶解物をろ過(0.45μm)し、後の使用まで+4℃で保管した。
【０４９４】
SA100力価を決定する形質導入プロトコル
SA100溶解物を、少なくとも100倍過剰の細菌細胞を保証する好適な細菌株と2.5mM CaCl2の存在下で混合することによって力価の決定を行った。30分のインキュベーション後、形質導入によってp94 CGVを受け取った細菌の計数のために、細菌を希釈し、スペクチノマイシンを含有するLBに播種した。SA100溶解物の純度を検証するために、希釈していない溶解物を、P2増殖を支持することが公知の、標準的な軟寒天オーバーレイを使用する細菌の菌叢(C-1a)に滴下した。プラーク形成の非存在を使用して純度を検証した。
【０４９５】
DNA送達アッセイ
SA100溶解物を希釈した後に細菌培養に感染させる形質導入プロトコルを使用して、SA100の細菌細胞に対する対数比が効果的に4に及ぶ0.01から100の範囲の感染多重度(MOI)を得た。
【０４９６】
2.5mM CaCl2の存在下での30分の感染後、細菌を、p94 CGVの送達に関するスペクチノマイシン選択を有するLBプレートと有しないLBプレートとで計数した。得られた数を使用して、所与のMOIで感染した集団の百分率を算出した。
【０４９７】
結果
SA100ビヒクルの設計
CGV及び欠損プロファージを包含するSA100大腸菌産生株の全体の設計を図4に概略的に示す。出発物質として、産生株の染色体にプロファージとして組み込まれた天然大腸菌ファージP2を使用した。プロファージにおいて、ファージが自らの増殖を開始及び実行するのに不可欠である遺伝子を欠失させ、したがって欠損ヘルパーファージを生成した。
【０４９８】
次いで、SA100形質導入粒子を産生するのに必要な構造遺伝子を、粒子の産生を開始させる誘導性プロモーターの制御下で発現させた。最後に、通常ではファージのDNAをファージ粒子にパッケージングするためにファージによって使用されるパッケージング配列をファージDNAから除去し、それをCGVに配置した(図3に示すcos部位を参照のこと)。ファージ構造遺伝子の誘導後、CGV DNAの、粒子へのパッケージングが生じ、粒子はその後、産生細胞の溶解によって放出された。
【０４９９】
欠損ヘルパーファージを操作する
染色体にファージP2を包含する大腸菌株C-2323を、欠損ヘルパーファージを有する産生株を操作するための出発物質として使用した。インテグラーゼ、ファージ増殖の開始のためのプロモーター、複製起点、DNA複製遺伝子、及びcos部位(DNAをファージ粒子にパッケージングする際に認識されるDNA配列)を含むP2ファージの領域(図3に示す四角く塗り潰されたP2 DNAを参照のこと)を、組換え操作を使用してカナマイシンマーカーに置き換えた。マーカーの部位特異的組込み、及びおよそ10kbpのファージDNAの欠失を配列決定によって検証した。
【０５００】
CGVを操作してSA100パッケージングを可能にする
誘導性プロモーターから発現したCRIPSR/Casシステムを有する単一のベクター(p77)を、本発明者らのSA100パッケージング可能CGVを操作するために使用した。
【０５０１】
欠損P2ヘルパーファージの活性化、及び合成形質導入粒子へのCGVのパッケージングを可能にするために、サテライトファージP4由来のsid-delta-psu-cos(cosパッケージング部位)を含む遺伝子領域をp77プラスミドにクローニングした。P2ファージを活性化可能であることが公知のクローニングされたP4領域(配列番号18)は、別のベクターp93へ既にクローニングされており、p93においてアラビノース誘導性プロモーターから発現した。その結果得た、P2活性化及びSA100パッケージングに必要な全てのエレメントを含有するCGV(p94)を、完全配列決定によって検証した。P4ゲノム構造、及びp94にクローニングした領域を図3Aの下部の囲みに示し、p94のゲノム地図を図3Bに示す。
【０５０２】
SA100パッケージングCGVの産生
p94 CGVを、欠損プロファージを包含する株に電気穿孔により導入して、その結果、産生株#189を得た。
【０５０３】
SA100パッケージングCGVを上述のように産生した。SA100パッケージングCGVの力価は、SA100パッケージングp94の3種の大腸菌株への形質導入によって決定し、およそ1010TFU/mLであった。予期された通り、天然P2ファージの汚染は観察されなかった(下記のTable 3(表5))。したがって、合成粒子1個当たり10億分の1未満の天然ファージ汚染を想定することができる。
【０５０４】
SA100を使用した大腸菌へのCGV送達
大腸菌集団の100%の感染のために必要とされるファージの数を決定するために、SA100粒子の細菌細胞に対する比、いわゆる感染多重度(MOI)を0.01から100まで変動させる感染実験を実施した。
【０５０５】
大腸菌細胞1個当たりSA100粒子1個を意味する1のMOIが、細菌集団の100%の感染に十分であったことを観察した(図5)。
【０５０６】
考察及び結論
ファージベースの完全合成CGV送達ビヒクルであるSA100を設計及び構築した。適合性のCGVも包含する産生株における発現後、天然ファージ汚染のないSA100パッケージングCGVの高力価溶解物を製造した。最後に、取得したSA100パッケージングCGVを大腸菌に効率的に送達した。
【０５０７】
(実施例4)
SA100合成形質導入粒子送達プラットフォームによる送達後のCGVによるin vitroでの大腸菌の死滅
エグゼクティブ・サマリー
SA100合成DNA送達ビヒクルを使用して、最適化されたCRISPRガイドベクター(CGV(商標))を2種の大腸菌標的株へ送達した。システムの誘導後、最大4logの標的集団の死滅を実証した。
【０５０８】
はじめに
これまでに、ファージベースの合成DNA送達ビヒクルSA100を、CGVの大腸菌標的細胞への送達のために操作した(実施例3)。ここでは、CGVをSA100ビヒクルによる送達のために最適化し、その後大腸菌標的細胞を死滅させることにおける有効性を試験した。
【０５０９】
研究の目的
目的1:CGVをSA100による送達のために最適化する。
目的2:大腸菌をSA100送達CGVによって死滅させる。
【０５１０】
材料及び方法
細菌株及び培養条件
全ての細菌培養を、2mM MgCl2を補充したLB培地で成長させた。適宜、欠損プロファージ及びCGVの選択のために、培養に50μg/mLカナマイシン又は50μg/mLスペクチノマイシンをそれぞれ補充した。SA100感染研究では、培地に2.5mM CaCl2を補充して、SA100粒子の細菌細胞への吸着を補助した。CRISPR/Casシステムの誘導に関しては、細胞を0.5mM IPTG及び2mMテオフィリンに曝露した。本発明者らのCGVにおけるガイドRNAスペーサー配列に対して相補的な20ヌクレオチドの配列の、MG1655及びXL1-blueのlacZ遺伝子への組換え操作により、標的株MG1655_pks及びXL1-blue_pksをそれぞれ生成することによって標的株MG1655_pks及びXL1-blue_pksを構築した。
【０５１１】
SA100パッケージングCGVの産生
CGV(p94及びp114)を、欠損プロファージを包含するそれぞれの株に別個に形質転換し、それにより産生株#189及び産生株#226をそれぞれ生成した。
【０５１２】
産生株を、集団の均衡のとれた成長を保証しつつ、カナマイシン及びスペクチノマイシンの存在下でおよそ10世代にわたって指数関数的に成長させた。1の光学密度(OD600)で、培養を10倍に濃縮し、1%アラビノースを用いて誘導し、光学密度測定値が低く安定するまでインキュベーションを継続した。細胞片を遠心除去した後、溶解物をろ過(0.45μm)し、Amicon Ultra-15遠心フィルターを使用しておよそ4倍に更に濃縮し、後の使用まで+4℃で保管した。
【０５１３】
CGV送達及び死滅
指数関数的に成長させた大腸菌標的株の培養に、2.5mM CaCl2の存在下でSA100パッケージングCGV p94又はp114を20のMOIで感染させた。
【０５１４】
摂氏37度での30分のインキュベーション後、細菌培養を連続希釈し、IPTG及びテオフィリンを含有するLBプレートに播種して(CRISPR/Cas成分の発現を誘導するため)、CGVに媒介された死滅、又はLB+スペクチノマイシンに播種して、標的集団へのCGV送達を調べた。
【０５１５】
結果
コピー数を増加させることによってCGV DNAを最適化する
CGV p94が大腸菌へ効率的に送達されることは以前に示した(実施例3)。このCGVは、Stuitjeら、1981、「Identification of mutations affecting replication control of plasmid Clo DF13」、Nature、290巻、264〜267頁によると、単一のSNPがコピー数を7から80まで増加させるCloDF13複製起点を含有する。全CGVのPCR増幅のために使用されるオリゴにSNPを組み込むことによって、変異型CloDF13 ori(配列番号23)を含有するp114を創製した。配列検証を実行した。
【０５１６】
SA100によるCGV送達
SA100にパッケージングされたp94を使用した効率的なCGV送達を以前に示した(実施例3)。本実施例では、CGV p94及びp114のMG1655_pksへの送達(図6A)、更にp114のXL1-blue_pksへの送達(図6B)を比較した。20の感染多重度(MOI)を使用して、標的集団への100%の送達を実証する。
【０５１７】
SA100送達CGVの死滅有効性
上記と同じ実験状況(標的株、SA100パッケージングCGV、及び20のMOI)を使用して、送達されたCGVの、CRISPR/Casシステムの発現の誘導後に標的細胞を死滅させる能力を調べた。
【０５１８】
MG1655_pksにおけるpks DNA配列を標的とするp94 CGVは、標的株をおよそ2log減少させることができ、同じ配列を標的とするp114は、標的集団をおよそ4log減少させた(図7)。同じ規模の死滅が、p114がXL1-blue_pks標的集団におけるpksを標的とする場合に観察された(図7)。
【０５１９】
考察及び結論
CGVの標的細胞へのSA100送達後、標的集団の死滅を、おそらくは高コピー数CGVのために、p94を使用したおよそ2logからp114を使用した4logまで増加させることができた。
【０５２０】
(実施例5)
非自己複製性粒子を使用した腸内マイクロバイオームへの抗菌薬のin vivo送達及びマイクロバイオーム環境における標的細胞の死滅
エグゼクティブ・サマリー
大腸菌AMG1655-pksを使用して、マウスの腸にコロニーを形成した。SA100送達ビヒクル(合成非自己複製性ファージ粒子、実施例3及び実施例4を参照のこと)による、CGV(商標)pSNP114のMG1655-PKSへの統計的に有意な送達を示す。大腸菌MG1655-pksを標的とするCGV(商標)の活性化後、生存率の低下が観察された。
【０５２１】
はじめに
大腸菌ATCC43888がNMRIマウスモデルのマウスの腸にコロニーを形成すること(データは示していない)、及びマウスの腸の大腸菌ATCC43888におけるCRISPRアレイの活性化が、アレイを使用して産生されたガイドRNAがCas切断に関する大腸菌ゲノムを標的とする場合に生存率を低下させること(データは示していない)はこれまでに示している。本実施例では、Synthetic Nanoboiotic(商標)、すなわちSA100によってMG1655-pksに送達されたCRISPR/Casベースの抗菌薬(CGV(商標))に対する生存率の評価に着手した。
【０５２２】
研究の目的
Synthetic Nanoboiotic(商標)SA100を用いたCGV(商標)pSNP114の送達によるマウスの腸内マイクロバイオームにおける大腸菌MG1655-pksの生存率低下を立証する。
【０５２３】
材料及び方法
大腸菌は、pks断片が挿入され、strep耐性マーカーを有する、系統群Aの大腸菌MG1655であった。
【０５２４】
細胞を、50μg/mLスペクチノマイシンを補充したLB培地で一晩成長させた。翌日、ODを測定し、培養を108CFU/mLまで希釈した。ビヒクル群、誘導群、及び非誘導群をTable 4(表6)に示す。
-  15匹の雌NMRIマウス、26〜30グラム(Taconic社)
-  テオフィリン及びL-アラビノースを含有する誘導液
【０５２５】
実験動物施設及びマウスの飼育条件
温度は21℃+/-2℃であり、暖房及び冷房によって調節することができ、明/暗周期は午前6時〜午後6時/午後6時〜午前6時の12時間間隔であった。マウスは、研究の3日前まで、食料及び国内品質の飲料用水を自由に摂取した。Tapvei社製のアスペン材の床敷、及び営巣材としてシズルネスト(Sizzle-nest)のペーパーストランドを有する標準的な施設に、マウスを6〜7匹/ケージで研究の1日前まで飼育し、その後ケージ1つ当たり1匹のGMO施設に移した。0日目から木製床敷を白色の紙製床敷に変更して、ケージからの糞便の採取を容易にした。
【０５２６】
ストレプトマイシン飲料用水の調製
5g/Lのストレプトマイシン6リットルを、1Lの滅菌水当たり6.94gのストレプトマイシン硫酸塩を溶解することによって調製した。マウスにストレプトマイシン水を-3日目から研究終了まで投与した。
【０５２７】
マウスへの接種
接種物をすぐに使用できる懸濁剤として、接種前に製剤化した。マウスに0.25mlを強制経口投与によって0日目の午前8時に接種した。およそ1011TFU/mlの力価を使用した。
【０５２８】
マウスの処置
マウスに誘導物質及び1011TFU/mLのSA100を強制経口投与によって1日目の午前7時及び午後1時に投薬し、2日目の午前7時に再び投薬した。誘導物質は各処置時点の直前に混合し、処置前に制酸薬と共にマウスに強制投与した。
【０５２９】
ケージからの糞便試料の採取
接種直前に0.5mlの糞便試料をケージから3本の15ml Nuncチューブに採取した。接種後1日目及び2日目に、0.5mlの糞便試料を午前7時の処置前に採取し、マウスを新しいケージに移した。接種後2日目は、処置の4時間後にも糞便試料を採取した。
【０５３０】
CFU決定
0.5mlの糞便物質を、1〜4時間複数回灌流させることによって5mlの滅菌生理食塩水に溶解した。コロニー数を、0.9%滅菌NaClへの糞便試料の10倍連続希釈によって決定し、20μLの液滴を寒天プレートに加えた。糞便試料の検出下限は50CFU/mlであった。全ての寒天プレートを大気下35℃で18〜22時間インキュベートした。
【０５３１】
CGVの送達を、LB+ストレプトマイシン+スペクチノマイシンプレートに播種することによって計数した。標的株の個体数は、ストレプトマイシンのみを含むLBに播種することによって計数した。
【０５３２】
マウスの臨床モニタリング
マウスの体重を研究全体にわたってモニタリングし、マウスを行動及び臨床徴候に基づいて0〜6でスコア化した(Table 5(表7))。3のスコア又は20%の体重喪失に達した場合は、マウスを安楽死させた。
【０５３３】
結果
接種前のマウスのマイクロバイオーム分析
接種前に採取した3つのプールされた試料のうち2つでは、細菌は検出されなかった。プールされた試料のうちの1つは、6.54log10CFU/mlの小さな白色コロニーを有した。MALDI分析は、1.71のスコア値でパエニバチルス・オドリファー(Paenibacillus odorifer)、及び2番目に可能性が高いものとして1.43のスコア値でスタフィロコッカス・キシローサス(Staphylococcus xylosus)を示したが、どちらも低いランクの性質であった。また、その他の2つのプールされた試料においても、48時間のインキュベーション後に3〜4log10CFU/mlの小さな白色コロニーが現れた。
【０５３４】
接種の24時間後、糞便試料のCFUレベルは、LB+strep寒天プレートで決定した場合、6.1〜8.6log10CFU/試料の範囲であった。同様のレベルが接種後2日目に観察された。2つの接種群のそれぞれにおいては、有意差は観察されなかった。
【０５３５】
LB+strep+spec寒天プレートでは、いずれの群においても1日目にコロニーは観察されなかった。2日目に、1から5log10CFU/試料の範囲のCFU数が誘導物質処置群において観察されたが、ビヒクル処置群では観察されなかった。
【０５３６】
動物研究の計画
24匹のマウスを各マウス介入研究に使用した。
【０５３７】
マウス臨床スコア
マウスは、研究期間全体にわたって感染症の臨床徴候も不快感の臨床徴候も一切示さなかった。
【０５３８】
MG1655-pksの誘導死滅
糞便物質抽出物を、ストレプトマイシンを含有するプレートに播種して、大腸菌MG1655-PKS株のCFUを決定した(図8)。ストレプトマイシンCFU数は種々の処置群の間の差を示さない。
【０５３９】
糞便試料をスペクチノマイシン及びストレプトマイシンに播種してCGV pSNP114の送達を決定する場合、(このCGVはスペクチノマイシン耐性マーカーを保有しているため)48時間後にCFUの有意な増加、したがってCGV送達が観察される(図9)。CRISPRシステムを誘導した場合、平均CFU数の有意な減少が観察された。
【０５４０】
考察及び結論
Synthetic Nanobiotic(商標)プラットフォームであるSA100を使用した、マウス腸モデルにおける大腸菌MG1655-pksへの導かれたヌクレアーゼ抗菌薬(CGV(商標))送達を成功裏に実証した。したがって、非自己複製性粒子を使用する抗菌薬のin vivoのマイクロバイオームへの送達は立証された。CFU数の統計的に有意な減少は、CGV(商標)の活性化したCRISPRシステムを使用して観察された。
【０５４１】
【表１Ａ】
2021503963.tif 000003
【０５４２】
【表１Ｂ】
2021503963.tif 000004
【０５４３】
【表１Ｃ】
2021503963.tif 000005
【０５４４】
【表１Ｄ】
2021503963.tif 000006
【０５４５】
【表１Ｅ】
2021503963.tif 000007
【０５４６】
【表１Ｆ】
2021503963.tif 000008
【０５４７】
【表１Ｇ】
2021503963.tif 000009
【０５４８】
【表２Ａ】
2021503963.tif 000010
【０５４９】
【表２Ｂ】
2021503963.tif 000011
【０５５０】
【表２Ｃ】
2021503963.tif 000012
【０５５１】
【表２Ｄ】
2021503963.tif 000013
【０５５２】
【表３Ａ】
2021503963.tif 000014
【０５５３】
【表３Ｂ】
2021503963.tif 000015
【０５５４】
【表３Ｃ】
2021503963.tif 000016
【０５５５】
【表３Ｄ】
2021503963.tif 000017
【０５５６】
【表３Ｅ】
2021503963.tif 000018
【０５５７】
【表３Ｆ】
2021503963.tif 000019
【０５５８】
【表３Ｇ】
2021503963.tif 000020
【０５５９】
【表３Ｈ】
2021503963.tif 000021
【０５６０】
【表３Ｉ】
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【０５６１】
【表３Ｊ】
2021503963.tif 000023
【０５６２】
【表３Ｋ】
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【０５６３】
【表３Ｌ】
2021503963.tif 000025
【０５６４】
【表３Ｍ】
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【０５６５】
【表３Ｎ】
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【０５６６】
【表３Ｏ】
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【０５６７】
【表３Ｐ】
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【０５６８】
【表３Ｑ】
2021503963.tif 000030
【０５６９】
【表３Ｒ】
2021503963.tif 000031
【０５７０】
【表３Ｓ】
2021503963.tif 000032
【０５７１】
【表３Ｔ】
2021503963.tif 000033
【０５７２】
【表３Ｕ】
2021503963.tif 000034
【０５７３】
【表３Ｖ】
2021503963.tif 000035
【０５７４】
【表３Ｗ】
2021503963.tif 000036
【０５７５】
【表３Ｘ】
2021503963.tif 000037
【０５７６】
【表３Ｙ】
2021503963.tif 000038
【０５７７】
【表４】
2021503963.tif 000039
【０５７８】
【表５】
2021503963.tif 000040
【０５７９】
【表６】
2021503963.tif 000041
【０５８０】
【表７】
2021503963.tif 000042
【０５８１】
【表８Ａ】
2021503963.tif 000043
【０５８２】
【表８Ｂ】
2021503963.tif 000044
【０５８３】
【表８Ｃ】
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【０５８４】
【表８Ｄ】
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【０５８５】
【表８Ｅ】
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【０５８６】
【表８Ｆ】
2021503963.tif 000048
【０５８７】
【表８Ｇ】
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【０５８８】
【表８Ｈ】
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【０５８９】
【表８Ｉ】
2021503963.tif 000051
【０５９０】
【表８Ｊ】
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【０５９１】
【表８Ｋ】
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【０５９２】
【表８Ｌ】
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【０５９３】
【表８Ｍ】
2021503963.tif 000055
【０５９４】
【表８Ｎ】
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【０５９５】
【表８Ｏ】
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【０５９６】
【表８Ｐ】
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【０５９７】
【表８Ｑ】
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【０５９８】
【表８Ｒ】
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【０５９９】
【表８Ｓ】
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【０６００】
【表８Ｔ】
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【０６０１】
【表８Ｕ】
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【０６０２】
【表８Ｖ】
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【０６０３】
【表８Ｗ】
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【０６０４】
【表８Ｘ】
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【０６０５】
【表８Ｙ】
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【０６０６】
【表８Ｚ】
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【０６０７】
【表８ａ】
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【０６０８】
【表８ｂ】
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【０６０９】
【表８ｃ】
2021503963.tif 000071
【０６１０】
【表８ｄ】
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【０６１１】
【表８ｅ】
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【０６１２】
【表８ｆ】
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【０６１３】
【表８ｇ】
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【０６１４】
【表８ｈ】
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【０６１５】
【表８ｉ】
2021503963.tif 000077
【０６１６】
【表８ｊ】
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【０６１７】
【表８ｋ】
2021503963.tif 000079
【０６１８】
【表８ｌ】
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【０６１９】
【表８ｍ】
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【０６２０】
【表８ｎ】
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【０６２１】
【表８ｏ】
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【０６２２】
【表８ｐ】
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【０６２３】
【表８ｑ】
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【０６２４】
【表８ｒ】
2021503963.tif 000086
【０６２５】
【表８ｓ】
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【０６２６】
【表８ｔ】
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【０６２７】
【表８ｕ】
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【０６２８】
【表８ｖ】
2021503963.tif 000090
【０６２９】
【表８ｗ】
2021503963.tif 000091
【０６３０】
【表８ｘ】
2021503963.tif 000092
【０６３１】
【表８ｙ】
2021503963.tif 000093
【０６３２】
【表８ｚ】
2021503963.tif 000094
【０６３３】
【表８ＡＡ】
2021503963.tif 000095
【０６３４】
【表８ＢＢ】
2021503963.tif 000096
【０６３５】
【表８ＣＣ】
2021503963.tif 000097
【０６３６】
【表９】
2021503963.tif 000098
【図１】
2021503963.tif 000099
【図２】
2021503963.tif 000100
【図３Ａ】
2021503963.tif 000101
【図３Ｂ】
2021503963.tif 000102
【図４】
2021503963.tif 000103
【図５】
2021503963.tif 000104
【図６】
2021503963.tif 000105
【図７】
2021503963.tif 000106
【図８】
2021503963.tif 000107
【図９】
2021503963.tif 000108
【配列表】
2021503963000001.app
【国際調査報告】
2021503963.tif 000109
2021503963.tif 000110
2021503963.tif 000111