(57)【要約】  抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｃＦｖを含むタンパク質および抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｃＦｖをコードする核酸分子が開示されている。ヒンジドメイン配列、膜貫通ドメイン配列およびシグナルドメイン配列に連結された抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｃＦｖに連結されたシグナル配列を含むタンパク質が開示されている。ヒンジドメイン配列、膜貫通ドメイン配列およびシグナルドメイン配列に連結された抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｃＦｖに連結されたシグナル配列を含むタンパク質をコードする核酸分子が開示されている。そのようなタンパク質およびそのような核酸分子を含むＴ細胞が開示されている。Ｔ細胞を作製する方法およびＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌を治療または予防するためにＴ細胞を使用する方法が開示されている。【選択図】図１
2021520229.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択される５Ｆ９抗ＧＣＣ  ｓｃＦＶ配列を含むタンパク質。
【請求項２】
シグナル配列、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項３】
シグナル配列、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項２に記載のタンパク質。
【請求項４】
前記シグナル配列は、ＧＭ−ＣＳＦシグナル配列、ＣＤ８アルファシグナル配列、ＣＤ８ベータシグナル配列、ＣＤ４シグナル配列、ＴＣＲアルファシグナル配列、ＴＣＲベータシグナル配列、ＣＤ３デルタシグナル配列、ＣＤ３イプシロンシグナル配列、ＣＤ３ガンマシグナル配列、ＣＤ２８シグナル配列、およびＢｉＰシグナル配列からなる群から選択される、請求項３に記載のタンパク質。
【請求項５】
前記ヒンジ領域が、ＣＤ８αヒンジ領域、ＩｇＧ１−Ｆｃヒンジ領域、ＩｇＧ４−Ｆｃヒンジ領域、およびＣＤ２８ヒンジ領域からなる群から選択される、請求項２〜４のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項６】
前記膜貫通領域が、ＣＤ８α膜貫通領域、ＩｇＧ１−Ｆｃ膜貫通領域、ＩｇＧ４−Ｆｃ膜貫通領域、およびＣＤ２８膜貫通領域からなる群から選択される、請求項２〜５のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項７】
前記シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８シグナル伝達ドメイン、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２７シグナル伝達ドメイン、ＣＤ３０シグナル伝達ドメイン、ＣＤ４０Ｌシグナル伝達ドメイン、ＣＤ７９Ａシグナル伝達ドメイン、ＣＤ７９Ｂシグナル伝達ドメイン、ＣＤ２２６シグナル伝達ドメイン、ＤＲ３シグナル伝達ドメイン、ＧＩＴＲシグナル伝達ドメイン、ＨＶＥＭシグナル伝達ドメイン、ＩＣＯＳシグナル伝達ドメイン、ＬＩＧＨＴシグナル伝達ドメイン、ＯＸ４０シグナル伝達ドメイン、およびＳＬＡＭシグナル伝達ドメインからなる群から選択される、請求項２〜６のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項８】
少なくとも１つの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をさらに含む、請求項２〜７のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項９】
ＣＤ３ζ、ＣＤ７９−アルファ、ＣＤ７９−ベータ、またはＦｃ受容体由来のＩＴＡＭを含む細胞内配列を含む請求項８に記載のタンパク質。
【請求項１０】
アフィニティタグをさらに含む、請求項１〜９のいずれか一項に記載のタンパク質。
【請求項１１】
ＣＤ８αヒンジドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ならびに４−１ＢＢ細胞内配列およびＣＤ３ζ細胞内配列を含むシグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１に記載のタンパク質。
【請求項１２】
ＧＭ−ＣＳＦシグナル配列をさらに含む、請求項１１に記載のタンパク質。
【請求項１３】
配列番号２を有する、請求項１２に記載のタンパク質。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか一項に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項１５】
請求項１２に記載のタンパク質をコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項１６】
前記タンパク質をコードする核酸配列が、ヒトＴ細胞における発現のための調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１５に記載の核酸分子。
【請求項１７】
請求項１６に記載の核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項１８】
請求項１６に記載の核酸分子を含む組換えＴ細胞。
【請求項１９】
配列番号１を含む請求項１３に記載の核酸分子。
【請求項２０】
配列番号１が、ヒトＴ細胞における発現のための調節エレメントに作動可能に連結されている、請求項１９に記載の核酸分子。
【請求項２１】
請求項２０に記載の核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項２２】
請求項２０に記載の核酸分子を含む組換えＴ細胞。
【請求項２３】
請求項１５に記載の核酸分子を含む組換え細胞。
【請求項２４】
請求項１５に記載の核酸分子を含む組換えＴ細胞。
【請求項２５】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組換え細胞。
【請求項２６】
請求項１〜１５のいずれか一項に記載のタンパク質を含む組換えＴ細胞。
【請求項２７】
請求項１１に記載のタンパク質を含む組換え細胞。
【請求項２８】
請求項１１に記載のタンパク質を含む組換えＴ細胞。
【請求項２９】
請求項１３に記載のタンパク質を含む組換え細胞。
【請求項３０】
請求項１３に記載のタンパク質を含む組換えＴ細胞。
【請求項３１】
ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌を有する患者を治療する方法であって、請求項１７、１８、および２１〜３０のいずれか一項に記載の複数の組換え細胞を前記患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項３２】
前記複数の組換え細胞が複数の組換えＴ細胞である、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌を有する患者を治療する方法であって、前記患者からＴ細胞を単離するステップと、前記Ｔ細胞を請求項２０に記載の核酸分子で形質転換して、配列番号１を発現し、膜結合タンパク質として配列番号２を含む形質転換Ｔ細胞の集団を産生するステップと、形質転換Ｔ細胞の前記集団を増殖して、複数の形質転換Ｔ細胞を産生するステップと、前記患者に前記複数の組換えＴ細胞を投与するステップと、を含む、方法。
【請求項３４】
前記患者から細胞を単離する前に、癌細胞のサンプルが前記患者から単離され、ＧＵＣＹ２Ｃが前記癌細胞上で検出される、請求項３１または３３のいずれかに記載の方法。
【請求項３５】
リスクが高いと特定された患者においてＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌を予防する方法であって、請求項１７、１８、および２１〜３０のいずれか一項に記載の複数の組換え細胞を前記患者に投与するステップを含む、方法。
【請求項３６】
前記複数の組換え細胞が複数の組換えＴ細胞である、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
リスクが高いと特定された患者においてＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌を予防する方法であって、前記患者からＴ細胞を単離するステップと、前記Ｔ細胞を請求項２０に記載の核酸分子で形質転換して、配列番号１を発現し、膜結合タンパク質として配列番号２を含む形質転換Ｔ細胞の集団を産生するステップと、形質転換Ｔ細胞の前記集団を増殖して、複数の形質転換Ｔ細胞を産生するステップと、前記患者に前記複数の形質転換Ｔ細胞を投与するステップと、を含む、方法。
【請求項３８】
請求項２１に記載の複数の組換え細胞を作製する方法であって、個体から細胞を単離するステップと、前記細胞を、細胞内で機能する調節エレメントに作動可能に連結された配列番号２をコードする核酸分子で形質転換して、膜結合タンパク質として配列番号２を含む形質転換細胞の集団を産生するステップと、形質転換細胞の前記集団を増殖して、複数の組換え細胞を産生するステップと、を含む、方法。
【請求項３９】
請求項２２に記載の複数の組換えＴ細胞を作製する方法であって、個体からＴ細胞を単離するステップと、前記Ｔ細胞を、Ｔ細胞内で機能する調節エレメントに作動可能に連結された配列番号２をコードする核酸分子で形質転換して、膜結合タンパク質として配列番号２を含む形質転換Ｔ細胞の集団を産生するステップと、形質転換Ｔ細胞の前記集団を増殖して、複数の組換えＴ細胞を産生するステップと、を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、グアニリルシクラーゼＣに結合するキメラ抗原受容体、およびそのようなキメラ抗原受容体をコードする核酸分子に関する。本発明はまた、そのようなキメラ抗原受容体を含む細胞、そのようなキメラ抗原受容体および細胞を作製する方法、ならびにそのような細胞を使用して、グアニリルシクラーゼＣを発現する癌細胞を有する癌を患っている個体を治療する方法およびグアニリルシクラーゼＣを発現する癌細胞を有する癌から個体を保護する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞をベースとした免疫療法は、癌を治療するための新たなモダリティとなっている。ＣＡＲは、細胞表面標的分子のＨＬＡ非依存性結合を提供するように機能するドメインと、様々なタイプの宿主免疫細胞、典型的には末梢血Ｔ細胞を活性化できるシグナル伝達ドメインを含む融合受容体であり、これらには、細胞毒性リンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）またはヘルパーＴ細胞と呼ばれる細胞の集団を含み得る。すなわち、典型的にはＴ細胞に導入されるが、ＣＡＲをコードする遺伝物質は、ＮＫ細胞などのＴ細胞ではない免疫細胞に加えられてもよい。
【０００３】
グアニリルシクラーゼＣ（同義的にＧＣＣまたはＧＵＣＹ２Ｃとも呼ばれる）は、膜結合受容体であり、ホルモンリガンドであるグアニリンまたはウログアニリンによる活性化後にセカンドメッセンジャーｃＧＭＰを産生し、腸の恒常性、腫瘍形成、および肥満を調節する。ＧＵＣＹ２Ｃ細胞表面の発現は、腸上皮の内腔表面および視床下部ニューロンのサブセットに限定されている。その発現は、９５％を超える大腸癌転移において維持され、食道癌、胃癌、口腔癌、唾液腺癌、および膵癌などの腸上皮化生から進展する腫瘍において異所的に発現する。
【０００４】
分極した上皮組織の頂端膜では、ＧＵＣＹ２Ｃの細胞内制限によりＧＵＣＹ２Ｃが到達できないことにより、腸毒性を伴うことなく、頂端−側底分極を失った結腸直腸起源の転移性病変を標的とする治療の機会となる。
【０００５】
同系の免疫担当マウスモデルは、マウスＧＵＣＹ２Ｃを標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞が、腸毒性がない場合に肺への結腸直腸癌転移に対して有効であることを示した。同様に、抗体薬物コンジュゲートおよびワクチンなど、他のＧＵＣＹ２Ｃ標的療法は、前臨床動物モデルにおいて安全であり、転移性食道癌、胃癌、膵癌、および結腸直腸癌の臨床試験において、これらのプラットフォームを利用した治療レジメンがある（ＮＣＴ０２２０２７５９、ＮＣＴ０２２０２７８５、ＮＣＴ０１９７２７３７）。
【０００６】
これらの治療レジメンの安全性は、腸の吻側−尾側軸でのＧＵＣＹ２Ｃ発現の文脈において、上皮細胞の頂端膜では多く含まれるが、側底膜では制限されている区画化されたＧＵＣＹ２Ｃの発現を反映するものである。ＧＵＣＹ２Ｃリガンドにコンジュゲートした全身放射性標識造影剤は、腸に局在することなくＧＵＣＹ２Ｃ発現転移を標的とし、これにより受容体の粘膜区画化が確認される。
【０００７】
腫瘍は、通常の上皮細胞と比較して、最大１０倍高い量のＧＵＣＹ２Ｃを発現し、側底膜にＧＵＣＹ２Ｃが少ない／存在していない腸上皮から受容体過剰発現腫瘍を区別するための定量的な治療ウィンドウを作り出し得る。
【０００８】
米国特許出願公開第２０１２０２５１５０９（Ａ１）号および米国特許出願公開第２０１４−０２９４７８４（Ａ１）号（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）は、グアニリルシクラーゼＣに結合するＣＡＲなどのＣＡＲ、ＧＵＣＹ２Ｃに結合するＣＡＲを含むＴ細胞などのＣＡＲを含むＴ細胞およびＧＵＣＹ２Ｃを含む標的細胞など、キメラ抗原受容体およびＴ細胞を作製する方法、ならびにＧＵＣＹ２Ｃに結合するＣＡＲを含むＴ細胞およびＧＵＣＹ２Ｃを含む標的細胞を使用して、ＧＵＣＹ２Ｃが発現する癌細胞から個体を保護するためおよび癌細胞がＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌に罹患している個体を治療するための方法について開示している。
【０００９】
ＧＵＣＹ２Ｃが発現する癌細胞から個体を保護するため、および癌細胞がＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌に罹患している個体を治療するための改善された組成物および方法が依然として必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｃＦＶ配列を含むタンパク質が提供される。抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｃＦＶ配列は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択され得る。
【００１１】
５Ｆ９抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｃＦＶ配列を含み、シグナル配列、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインをさらに含むタンパク質が提供される。
【００１２】
そのようなタンパク質をコードする核酸分子が提供される。核酸分子は、ヒトＴ細胞などのヒト細胞においてタンパク質を発現するように機能し得る調節エレメントに作動可能に連結され得る。核酸分子は、プラスミドまたは組換えウイルスベクターなどの核酸ベクターに組み込むことができ、これらを使用して、ヒト細胞をタンパク質を発現するヒト細胞に形質転換することができる。
【００１３】
核酸分子を含み、タンパク質を発現するヒト細胞が提供される。
【００１４】
そのような細胞を作製する方法が提供される。
【００１５】
ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌を有する患者を治療する方法、およびリスクが高いと特定された患者においてＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌を予防する方法が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】パネルＡ〜Ｅは、ヒトＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の生成を示す図である。図１パネルＡ：組換え５Ｆ９抗体は、１μｇ／ｍＬでプレーティングされたｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤまたはＢＳＡ（陰性対照）への特異的結合についてＥＬＩＳＡにより評価した。二元配置分散分析；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。図１パネルＢ：フローサイトメトリー分析は、親ＣＴ２６マウス結腸直腸癌細胞またはｈＧＵＣＹ２Ｃ（ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ）を発現するように操作され、５Ｆ９抗体で染色されたＣＴ２６細胞で行った。図１パネルＣ：マウス配列のＢｉＰシグナル配列、５Ｆ９  ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ２８の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の細胞内ドメイン、ならびにＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む第三世代マウスＣＡＲ構築物（５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ）の概略図である。ＣＡＲ構築物は、ＭＳＣＶレトロウイルスプラスミドｐＭＩＧのＩＲＥＳ−ＧＦＰマーカー上流に挿入した。図１パネルＤ：対照（１Ｄ３．ｍ２８ＢＢｚ）ＣＡＲまたは５Ｆ９抗体由来ＣＡＲ（５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ）を含むレトロウイルスにより形質導入されたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞は、精製された６ｘＨｉｓ−ｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ（１０μｇ／ｍＬ）で標識し、抗５ｘＨｉｓ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートにより検出した。フロープロットは、生存ＣＤ８＋細胞でゲーティングした。図１パネルＥ：生存ＣＤ８＋ＧＦＰ＋細胞でゲーティングした、５Ｆ９由来または対照（１Ｄ３）ＣＡＲの６ｘＨｉｓ−ｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ結合曲線（図５のデータを参照）。３つの独立した実験から組み合わせた。
【図２】パネルＡ〜Ｅ。ｈＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＡＲによる、抗原依存性Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能の媒介を示す図である。図２のパネルＡ〜Ｅでは、マウスＣＤ８＋Ｔ細胞を非形質導入（なし）のままにするか、示されているように対照１Ｄ３．ｍ２８ＢＢｚまたは５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ構築物により形質導入した。図２パネルＡ：図２パネルＢ〜Ｄのすべての分析のゲーティング戦略を示す図である。図２パネルＢ：ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌに基づく代表的なＣＡＲ−Ｔ細胞表現型プロットを示す図である。二元配置分散分析；ＮＳ：有意でない。バー：２〜３回の独立した実験からの平均±ＳＤ。Ｔｎ／ｓｃｍ：ナイーブまたはＴメモリー幹細胞。Ｔｃｍ：セントラルメモリーＴ細胞；Ｔｅｍ：エフェクターメモリーＴ細胞；Ｔｅｍｒａ：ＣＤ４５ＲＡを発現するエフェクターメモリーＴ細胞。（Ｃ〜Ｄ）１０６のＣＡＲ−Ｔ細胞を、プレートコーティングされた抗原（ＢＳＡもしくはｈＧＵＣＹ２Ｃ）またはＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／ＩＯＮＯ）により、６時間刺激した。次に、Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９、またはＣＤ４４）および細胞内サイトカイン産生（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ２、およびＭＩＰ１α）をフローサイトメトリーによって定量化した。グラフは、平均±ＳＤを示している。図２のパネルＣは、活性化マーカーのアップレギュレーション（ＭＦＩ）を示し、図２のパネルＤは、３回の独立した実験からの多機能サイトカイン産生（ＣＡＲ＋細胞の％）を示す。図２パネルＥ：Ｅ−Ｐｌａｔｅ内の親ＣＴ２６またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃマウス結腸直腸癌細胞を、ＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ比５：１）、培地、または１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（Ｔｒｉｔｏｎ）により治療し、相対電気インピーダンスを１５分ごとに１０時間定量化して、癌細胞死を定量化した（時間＝０に正規化）。特異的溶解値（％）は、正規化のために培地およびＴｒｉｔｏｎを添加後、インピーダンス値を使用して計算した（それぞれ、特異的溶解値は０％および１００％）。二元配置分散分析、Ｂ〜Ｅ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【図３】パネルＡ〜Ｅ。ｈＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、同系の肺転移モデルにおいて長期的な保護をもたらすことを示す図である。図３のパネルＡ〜Ｅでは、ＢＡＬＢ／ｃマウスに５ｘ１０５ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ細胞を尾静脈から注射して、肺転移を確立した。対照（４Ｄ５．ｍ２８ＢＢｚ）または５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ構築物をマウスＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入した。図３パネルＡ：マウスを３日後に５Ｇｙ全身照射（ＴＢＩ）で治療した後、１０６〜１０７５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ（Ｎ＝７〜８／群）または１０７対照（Ｎ＝６）ＣＡＲＴ細胞で治療した。図３パネルＢ：マウスを３日目（Ｄ３）または７日目（Ｄ７）に５Ｇｙ  ＴＢＩで治療した後、１０７の対照（Ｎ＝１０／群）または５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ（Ｎ＝９〜１０／群）ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療した。図３パネルＣ：マウスを７日目に５Ｇｙ  ＴＢＩで治療した後、７日目および１４日目に１０７の対照（Ｎ＝１０）または５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ（Ｎ＝１２）ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療した。図３パネルＤ：７日目に５Ｇｙ  ＴＢＩおよびＰＢＳ、または１０７対照または５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療したマウスを、１８日目に屠殺し、肺を墨汁で染色し、腫瘍／肺を数えた。一元配置分散分析；＊ｐ＜０．０５。図３パネルＥ：５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療されたＢおよびＣの生存マウス、またはナイーブマウスを５ｘ１０５ＣＴ２６（Ｎ＝４〜７／群）またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ（Ｎ＝７／群）細胞でチャレンジした。再チャレンジは、最初のチャレンジの１６〜４０週間後に行った。ログランクマンテル・コックス検定、図３パネルＡ〜ＣおよびＥ；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。上向き矢印は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の治療日を示している。各パネルは、独立した実験を示している。
【図４】パネルＡ〜Ｅ。ｈＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞により、ヒト結腸直腸腫瘍異種移植片が消失することを示す図である。図４パネルＡ：Ｔ８４ヒト結腸直腸癌細胞でのｈＧＵＣＹ２Ｃの発現は、組換え５Ｆ９抗体を使用したフローサイトメトリーによって定量化した。図４のパネルＢ〜Ｅでは、対照（１Ｄ３．ｍ２８ＢＢｚ）または５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ構築物をマウスＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入した。図４パネルＢ：Ｅ−Ｐｌａｔｅ内のＴ８４結腸直腸癌細胞を、５Ｆ９−ｍ２８ＢＢｚまたは対照ＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ比５：１）、培地、または１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（Ｔｒｉｔｏｎ）で２回治療し、相対電気インピーダンスを１５分ごとに２０時間測定して、癌細胞死を定量化した（時間＝０に正規化）。特異的溶解値（％）は、正規化のために培地およびＴｒｉｔｏｎを添加後、インピーダンス値を使用して計算した（それぞれ、特異的溶解値は０％および１００％）。二元配置分散分析；＊＊ｐ＜０．０１；２つの独立した実験の代表値。図４パネルＣ〜Ｅでは、免疫不全ＮＳＧマウスに２．５ｘ１０６ルシフェラーゼ発現Ｔ８４結腸直腸癌細胞を腹腔内注射で注射し、１４日目に腹腔内注射により、１０７の対照（Ｎ＝５）または５Ｆ９−ｍ２８ＢＢｚ（Ｎ＝４）ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療した。図４のパネルＣ〜Ｄでは、総腫瘍発光（光子／秒）をＴ細胞注入の直前およびその後毎週定量化した。二元配置分散分析；＊ｐ＜０．０５。図４パネルＥ：生存に関して、マウスを追跡した。ログランクマンテル・コックス検定；＊ｐ＜０．０５。
【図５】５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲの表面発現の検出を示す図である。対照ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲまたは５Ｆ９抗体由来のＣＡＲ（５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ）をＩＲＥＳ−ＧＦＰマーカーの上流に含むレトロウイルスにより形質導入されたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞を、精製６ｘＨｉｓｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ（０〜１４３０ｎＭ）により標識し、α５ｘＨｉｓ−Ａｌｅｘａ−６４７コンジュゲートにより検出した。フロープロットは、生存ＣＤ８＋細胞でゲーティングした。
【図６】ｈＧＵＣＹ２Ｃ発現マウス結腸直腸癌細胞により、５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞が活性化することを示す図である。１０６のＣＡＲ−Ｔ細胞を、１０６の親ＣＴ２６、ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ結腸直腸癌細胞、またはＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／ＩＯＮＯ）により、６時間刺激した。Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９、またはＣＤ４４）はフローサイトメトリーによって定量化した。
【図７】パネルＡおよびＢ。ｈＧＵＣＹ２Ｃ発現マウス結腸直腸癌細胞が、５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のサイトカイン産生を誘導することを示す図である。１０６のＣＡＲ−Ｔ細胞をプレートコーティングされた抗原により６時間刺激した。図７パネルＡは、ＢＳＡ、ｈＧＵＣＹ２Ｃ、ならびにＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／ＩＯＮＯ）のデータを示す。図７パネルＢは、１０６の親ＣＴ２６またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ結腸直腸癌細胞またはＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／ＩＯＮＯ）のデータを示す。細胞内サイトカイン産生（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２またはＭＩＰ１α）はフローサイトメトリーによって定量化した。
【図８】パネルＡおよびＢ。５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ｈＧＵＣＹ２Ｃを発現するマウス結腸直腸癌細胞を死滅させることを示す図である。β−ガラクトシダーゼ発現ＣＴ２６（図８パネルＡのデータ）またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ（図８パネルＢのデータ）マウス結腸直腸癌細胞を、様々なエフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞：標的癌細胞比（Ｅ：Ｔ比）で４時間培養した。特異的溶解は、発光基質によって検出された上清へのβ−ガラクトシダーゼ放出によって決定した。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１（二元配置分散分析）。
【図９】パネルＡおよびＢ。５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ｈＧＵＣＹ２Ｃ欠損ヒト結腸直腸腫瘍を死滅させないことを示す図である。図９パネルＡ：ＳＷ４８０ヒト結腸直腸癌細胞でのｈＧＵＣＹ２Ｃの発現は、組換え５Ｆ９抗体を使用したフローサイトメトリーによって定量化した。図９パネルＢ：Ｅ−Ｐｌａｔｅ内のＳＷ４８０細胞を、５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚまたは対照１Ｄ３．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、培地、または２．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（Ｔｒｉｔｏｎ）により治療し、相対電気インピーダンスを１５分ごとに２０時間定量化して、癌細胞死を定量化した（時間＝０に正規化）。特異的溶解値（％）は、正規化のために培地およびＴｒｉｔｏｎを添加後、インピーダンス値を使用して計算した（それぞれ、特異的溶解値は０％および１００％）。
【図１０】パネルＡ〜Ｃ。５Ｆ９．ｈ２８ＢＢｚ  ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞が、ＧＵＣＹ２Ｃ発現結腸直腸癌細胞を認識して死滅させることを示す図である。図１０パネルＡ：ヒト５Ｆ９  ＣＡＲ構築物（５Ｆ９．ｈ２８ＢＢｚ）発現ＣＡＲ−Ｔ細胞を、プレートコーティングされた抗原（ＢＳＡまたはｈＧＵＣＹ２Ｃ）またはＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／ＩＯＮＯ）により、６時間刺激した。次に、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９および細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ−２）をフローサイトメトリーで定量化した。図１０のパネルＢ〜Ｃのデータを参照すると、Ｅ−Ｐｌａｔｅ内で培養した親（ＣＴ２６）、ヒトＧＵＣＹ２Ｃ発現ＣＴ２６（ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ）マウス結腸直腸癌細胞（データは、図１０パネルＢに示す）、またはＴ８４ヒト結腸直腸癌細胞（データは、図１０パネルＣに示す）を対照または５Ｆ９．ｈ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ比１０：１）、培地、または２．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００により治療し、相対電気インピーダンスを１５分ごとに定量化し、癌細胞死を定量化した（時間＝０に正規化）。特異的溶解値（％）は、正規化のために培地およびＴｒｉｔｏｎを添加後、インピーダンス値を使用して計算した（それぞれ、特異的溶解値は０％および１００％）。＊＊＊、ｐ＜０．００１（二元配置分散分析）。
【図１１】パネルＡおよびＢ。５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞が、ｍＧＵＣＹ２Ｃを発現するマウス結腸直腸癌細胞を死滅させないことを示す図である。β−ガラクトシダーゼおよびマウスＧＵＣＹ２Ｃ（図１１パネルＡ；ＣＴ２６．ｍＧＵＣＹ２Ｃ）またはヒトＧＵＣＹ２Ｃ（図１１パネルＢ；ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ）を発現するＣＴ２６細胞を、様々なエフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞：標的癌細胞の比（Ｅ：Ｔ比）の範囲で４時間培養した。特異的溶解は、発光基質によって検出された上清へのβ−ガラクトシダーゼ放出によって決定した。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１（二元配置分散分析）。
【発明を実施するための形態】
【００１７】
ヒトＧＵＣＹ２Ｃの細胞外ドメインに結合する一本鎖タンパク質配列は、ヒトＧＵＣＹ２Ｃの細胞外ドメインに結合する抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体の可変軽鎖および可変重鎖の断片を使用して生成した。リンカー配列により、可変軽鎖断片を可変重鎖断片に接続して、ヒトＧＵＣＹ２Ｃの細胞外ドメインに結合する一本鎖抗体可変断片融合タンパク質配列（ｓｃＦｖ）にする。
【００１８】
ｓｃＦｖは、より大きい融合タンパク質であるＣＡＲの構成要素である。ＣＡＲの機能構成要素としては、免疫グロブリン由来の抗原結合ドメイン、抗体配列、すなわちｓｖＦｖ（ヒトＧＵＣＹ２Ｃに結合する）、発現する細胞の細胞膜にタンパク質を固定する膜貫通ドメインにｓｃＦＶを連結させるヒンジドメイン、およびヒトＧＵＣＹ２ＣへのｓｃＦｖ結合時に細胞を活性化するシグナル伝達細胞内配列（細胞質配列とも呼ばれる）として機能するシグナルドメインが挙げられる。ＣＡＲをコードする核酸配列には、翻訳されたＣＡＲの細胞膜への輸送を容易にする細胞タンパク質由来のシグナルペプチドをコードする配列を含む。ＣＡＲを発現する組換え細胞は、抗体によって指定される標的、すなわちＧＵＣＹ２Ｃを提示する細胞に結合し、かつ組換え細胞傷害性リンパ球、組換え細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、組換えナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、および組換えナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の場合、死滅させるように、ＣＡＲにより指示される。ＣＡＲは、発現したときに、細胞表面に輸送され、シグナルペプチドは、典型的には除去される。成熟したＣＡＲは、細胞受容体として機能する。ｓｃＦｖおよびヒンジドメインは、細胞表面に提示され、ここで、ｓｃＦｖ配列は、他の細胞上のタンパク質に曝され得、これらの細胞上のＧＵＣＹ２Ｃに結合する。膜貫通領域では、細胞膜にＣＡＲを固定し、細胞内配列は、シグナルドメインとして機能して、細胞内にシグナルを伝達し、その結果、ＣＡＲ発現細胞が結合しているＧＵＣＹ２Ｃ発現細胞の死をもたらす。
【００１９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば、哺乳動物または合成シグナル配列などのシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば、哺乳動物の膜結合タンパク質などの膜結合タンパク質由来のシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ４、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ２８、およびＢｉＰなどの膜結合タンパク質由来のシグナル配列を含む。シグナル配列の例はまた、あらゆる哺乳動物の膜結合シグナル配列内で見られ得る＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂ＿ｍａｍｍａｌｉａ＞。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸１〜２２を有する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列は、配列番号２のアミノ酸１〜２２を含む。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列は、本質的に配列番号２のアミノ酸１〜２２からなる。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列は、配列番号２のアミノ酸１〜２２からなる。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列を含むＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１の核酸１〜６６を含む。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列をコードする核酸配列は、配列番号１の核酸１〜６６を含む。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列をコードする核酸配列は、本質的に配列番号１の核酸１〜６６からなる。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列をコードする核酸配列は、配列番号１の核酸１〜６６からなる。
【００２０】
抗ＧＵＣＹ２Ｃ結合ドメインは、ＭＨＣに依存しない一本鎖キメラ受容体として提供される。抗原結合ドメインは、抗体に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、５Ｆ９由来の抗グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣまたはＧＵＣＹ２Ｃとも称される）一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（好ましくは、可変軽断片−（グリシン４セリン）４リンカー−可変重断片）を含む。５Ｆ９は、ヒトＧＵＣＹ２Ｃの細胞外ドメインを認識する完全ヒト化モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマである。抗体の重鎖および軽鎖のＤＮＡコード配列を使用して、ＣＡＲ実装用の新規ｓｃＦｖを作製した。これは、例えば５Ｆ９−２８ＢＢｚ  ＣＡＲなどの抗ＧＣＣ  ＣＡＲの作製に使用され、これによりＧＵＣＹ２Ｃ分子に対して向けられた抗原特異性が付与される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、５Ｆ９−２８ＢＢｚ  ＣＡＲなどの抗ＧＣＣ  ｓｃＦｖは、５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（可変軽断片−（グリシン４セリン）４リンカー−可変重断片）であってもよい。５Ｆ９  ｓｃＦｖは、配列番号２のアミノ酸２５〜２７４を含んでもよい。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖを含むＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド７３〜８２２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗ＧＣＣ  ５Ｆ９  ｓｃＦｖを含む。配列番号２のアミノ酸２５〜１３３は、５Ｆ９可変軽鎖断片に対応する。配列番号２のアミノ酸１５４〜２７４は、５Ｆ９可変重鎖断片に対応する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（グリシン４セリン）ｎリンカー（（グリシン４セリン）＝ＧＧＧＧＳ（配列番号３）およびｎ＝２〜５）により互いに結合された５Ｆ９可変軽断片および５Ｆ９可変重断片に対応する抗ＧＣＣ  ５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、リンカーは、２つの（グリシン４セリン）単位（（グリシン４セリン）２）を含み、リンカーＧ４Ｓ−２（配列番号４）として称され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、３つの（グリシン４セリン）単位（（グリシン４セリン）３）を含み、リンカーＧ４Ｓ−３（配列番号５）として称され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、４つの（グリシン４セリン）単位（（グリシン４セリン）４）を含み、リンカーＧ４Ｓ−４（配列番号６）として称され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、５つの（グリシン４セリン）単位（（グリシン４セリン）５）を含み、リンカーＧ４Ｓ−５（配列番号７）として称され得る。
【００２３】
５Ｆ９可変断片は、可変軽鎖断片−リンカー−可変重鎖断片または可変重鎖断片−リンカー−可変軽鎖断片の順序でＮ末端からＣ末端まで構成され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、［５Ｆ９可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）２−５Ｆ９可変重鎖断片］（配列番号８）、［５Ｆ９可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）３−５Ｆ９可変重鎖断片］（配列番号９）、［５Ｆ９可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）４−５Ｆ９可変重鎖断片］（配列番号１０）、または［５Ｆ９可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）５−５Ｆ９可変重鎖断片］（配列番号１１）として構成されている抗ＧＣＣ  ５Ｆ９  ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、［５Ｆ９可変重鎖断片−（グリシン４セリン）２−５Ｆ９可変軽鎖断片］（配列番号１２）、［５Ｆ９可変重鎖断片−（グリシン４セリン）３−５Ｆ９可変軽鎖断片］（配列番号１３）、［５Ｆ９可変重鎖断片−（グリシン４セリン）４−５Ｆ９可変軽鎖断片］（配列番号１４）、または［５Ｆ９可変重鎖断片−（グリシン４セリン）５−５Ｆ９可変軽鎖断片（配列番号１５）として構成されている抗ＧＣＣ  ５Ｆ９  ｓｃＦｖを含む。
【００２４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸２５〜２７４を有する抗ＧＣＣ  ５Ｆ９  ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖは、配列番号２のアミノ酸２５〜２７４を含む。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖは、本質的に配列番号２のアミノ酸２５〜２７４からなる。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖは、配列番号２のアミノ酸２５〜２７４からなる。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖをコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド７３〜８２２を含む。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖをコードする核酸配列は、本質的に配列番号１のヌクレオチド７３〜８２２からなる。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖをコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド７３〜８２２からなる。
【００２５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８α、ＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ４−Ｆｃ、またはＣＤ２８ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸２７７〜３３６を有するＣＤ８αヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２のアミノ酸２７７〜３３６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域は、本質的に配列番号２のアミノ酸２７７〜３３６からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２のアミノ酸２７７〜３３６からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド８２９〜１００８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域をコードする核酸配列は、本質的に配列番号１のヌクレオチド８２９〜１００８からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド８２９〜１００８からなる。
【００２６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、またはＳＬＡＭ膜貫通領域を含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、またはＳＬＡＭ細胞内領域を含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、またはＳＬＡＭの膜貫通および細胞内（細胞質）配列を両方とも含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８膜貫通配列および細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５を有するＣＤ２８膜貫通配列および細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通配列および細胞内配列は、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列は、本質的に配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列は、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、本質的に、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５からなる。
【００２９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３に関連するζ鎖（ＣＤ３ζ）、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９−アルファ鎖およびＣＤ７９−ベータ鎖、または特定のＦｃ受容体由来の細胞内（細胞質）配列を含む。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ａ）ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、またはＳＬＡＭ細胞内領域の１つ以上由来の細胞内（細胞質）配列と、ｂ）ＣＤ３に関連するζ鎖（ＣＤ３ζ）、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９−アルファ鎖およびＣＤ７９−ベータ鎖、または特定のＦｃ受容体由来の細胞内（細胞質）配列との組み合わせを含む。
【００３１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞内配列と組み合わせた４−１ＢＢ細胞内配列と共にＣＤ２８膜貫通および細胞内配列を含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５を有するＣＤ２８膜貫通配列および細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通配列および細胞内配列は、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列は、本質的に配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列は、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、本質的に、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５からなる。
【００３３】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４−１ＢＢ細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸４０６〜４４４を有する４−１ＢＢ細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸４０６〜４４４を含む４−１ＢＢ細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内配列は、本質的に、配列番号２のアミノ酸４０６〜４４４からなる。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内配列は、配列番号２のアミノ酸４０６〜４４４からなる。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１２１６〜１３３２を含む。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内をコードする核酸配列は、本質的に配列番号１のヌクレオチド１２１６〜１３３２からなる。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１２１６〜１３３２からなる。
【００３４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＩＴＡＭを含む細胞シグナル伝達分子由来の配列を含む。典型的には、３つのＩＴＡＭがこのような配列内に存在する。ＩＴＡＭを含む細胞シグナル伝達分子の例としては、ＣＤ３に関連するζ鎖（ＣＤ３ζ）、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９−アルファ鎖および−ベータ鎖、ならびに特定のＦｃ受容体が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζなどの細胞シグナル伝達分子、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９−アルファ鎖および−ベータ鎖、ならびにＩＴＡＭを含む特定のＦｃ受容体由来の配列を含む。ＣＡＲに含まれる配列は、１つ以上のＩＴＡＭを含むこうした分子由来の細胞内配列である。ＩＴＡＭは、４つのアミノ酸の保存配列であり、免疫系の特定の細胞表面タンパク質の細胞質尾部において２回繰り返されている。ＩＴＡＭの４つのアミノ配列の保存配列は、任意の他の２つのアミノ酸（Ｘが独立して任意のアミノ酸配列であるＹＸＸＬまたはＹＸＸＩ）によってロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンを含む。ＩＴＡＭは、約６〜８個のアミノ酸で分離された２つの４つのアミノ酸の保存配列を有する、典型的には１４〜１６個のアミノ酸の配列を含む。ＣＤ３に関連するζ鎖（ＣＤ３ζ）は、３つのＩＴＡＭを含む。配列番号２のアミノ酸４４５〜５５７は、ＣＤ３ζ細胞内配列である。ＩＴＡＭは、アミノ酸４６５〜４７９、５０４〜５１９および５３５〜５４９に位置する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸４４５〜５５７を有するＣＤ３ζ細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内配列は、配列番号２の４４５〜５５７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内配列は、本質的に配列番号２の４４５〜５５７からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内配列は、配列番号２の４４５〜５５７からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１３３３〜１６７１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内をコードする核酸配列は、本質的に配列番号１のヌクレオチド１３３３〜１６７１からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１３３３〜１６７１からなる。
【００３５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、免疫グロブリン由来の抗原結合ドメイン、抗体配列（ＧＵＣＹ２Ｃに結合する）を含み得、抗体配列は、Ｔ細胞受容体のＣＤ３ゼータシグナル伝達鎖などのＴ細胞シグナル伝達ドメインに、あるいはＣＤ３ゼータ鎖などのＴ細胞鎖またはＩｇ  Ｆｃ受容体複合体のガンマシグナル伝達サブユニットに連結されたＴ細胞共刺激シグナル伝達（例えばＣＤ２８）ドメインに融合している。
【００３６】
ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ鎖またはＣＤ３ゼータ鎖に連結されたＣＤ２８シグナルドメインなどの膜貫通および細胞質シグナル伝達ドメインに融合した、抗原結合機能をもたらす抗体可変領域の細胞外一本鎖断片を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、スペーサーまたはヒンジによって抗原結合ドメインに連結されている。抗体可変領域の断片がＧＵＣＹ２Ｃに結合したときに、シグナル伝達ドメインが免疫細胞の活性化を開始する。これらの組換えＴ細胞は、細胞外抗ＧＵＣＹ２Ｃ結合ドメイン、およびリンパ球を刺激するシグナル伝達機能を実行するＴＣＲに由来する細胞内ドメインを含む、膜結合キメラ受容体を発現する。いくつかの実施形態は、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の抗ＧＵＣＹ２Ｃ結合領域を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である抗ＧＵＣＹ２Ｃ結合ドメインを提供する。シグナル伝達ドメインには、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＳＬＡＭ）ドメインおよびＴ細胞トリガー鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ）を含み得る。
【００３７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲはアフィニティタグを含む。このようなアフィニティタグの例としては、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ；Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩ；Ｐｏｌｙ（Ｈｉｓ）；ＨＡ；Ｖ５；およびＦＬＡＧタグが挙げられる。いくつかの実施形態では、アフィニティタグは、ｓｃＦｖの前、またはｓｃＦｖとヒンジ領域との間、またはヒンジ領域の後に位置し得る。いくつかの実施形態では、アフィニティタグは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩ、Ｐｏｌｙ（Ｈｉｓ）、ＨＡ；Ｖ５、およびＦＬＡＧタグから選択され、ｓｃＦｖの前、またはｓｃＦｖとヒンジ領域との間、またはヒンジ領域の後に位置する。
【００３８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、シグナル配列、５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である抗ＧＣＣ  ｓｃＦｖ、ヒンジ領域、１つ以上のタンパク質由来の膜貫通領域および細胞内配列、ならびに細胞内配列および免疫受容体チロシン活性化モチーフと、任意によりアフィニティタグとを含む。
【００３９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ４、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ２８、ＢｉＰから選択される、シグナル配列と、（可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）２−５リンカー−可変重鎖断片）および（可変重鎖断片−（グリシン４セリン）２−５リンカー−可変軽鎖断片）から選択される５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、抗ＧＣＣ  ｓｃＦｖと、ＣＤ８α、ＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ４−ＦｃおよびＣＤ２８ヒンジ領域から選択される、ヒンジ領域と、ＣＤ８α、ＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ４−ＦｃおよびＣＤ２８膜貫通領域から選択される、膜貫通領域と、ＣＤ２８４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＳＬＡＭ細胞内配列から選択される、細胞内配列と、１つ以上のＩＴＡＭを含む、ＣＤ３ζ、ＣＤ７９−アルファ、ＣＤ７９−ベータ、およびＦｃ受容体細胞内配列から選択される配列を含む、免疫受容体チロシン活性化モチーフと、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩ、Ｐｏｌｙ（Ｈｉｓ）、ＨＡ；Ｖ５、およびＦＬＡＧタグから選択される、任意のアフィニティタグとが連結され、含まれる。
【００４０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列、［可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）２−５リンカー−可変重鎖断片］または［可変重鎖断片−（グリシン４セリン）２−５リンカー−可変軽鎖断片］から選択される５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である抗ＧＣＣ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＩｇＧ１−Ｆｃ、またはＩｇＧ４−Ｆｃヒンジ領域、ＣＤ８αまたはＣＤ２８膜貫通および細胞内配列、４−１ＢＢ細胞内配列ならびにＣＤ３ζ細胞内配列を含む。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、本質的に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列、５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（可変軽断片−（グリシン４セリン）４リンカー−可変重断片）である抗ＧＣＣ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列、４−１ＢＢ細胞内配列ならびにＣＤ３ζ細胞内配列からなる。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸１〜２２、２５〜２７４、２７７〜３３６、３３７〜４０５、４０６〜４４４および４４５〜５５７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、本質的に配列番号２のアミノ酸１〜２２、２５〜２７４、２７７〜３３６、３３７〜４０５、４０６〜４４４および４４５〜５５７からなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸１〜２２、２５〜２７４、２７７〜３３６、３３７〜４０５、４０６〜４４４および４４５〜５５７からなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜６６、７３〜８２２、８２９〜１００８、１００９〜１２１５、１２１６〜１３３２および１３３３〜１６７１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、本質的に配列番号１のヌクレオチド１〜６６、７３〜８２２、８２９〜１００８、１００９〜１２１５、１２１６〜１３３２および１３３３〜１６７１からなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜６６、７３〜８２２、８２９〜１００８、１００９〜１２１５、１２１６〜１３３２および１３３３〜１６７１からなる。いくつかの実施形態では、これらの配列は、ヒトＴ細胞などのヒト細胞におけるコード配列の発現に必要な調節エレメントに連結されている。いくつかの実施形態では、ヒトＴ細胞などのヒト細胞は、コード配列の発現に必要な調節エレメントに連結された配列により形質転換される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、新規ＤＮＡ配列ＧＭ．５Ｆ９（ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨ）−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８ｔｍ．ＩＣＤ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ．ｓｔｏｐ（５Ｆ９−２８ＢＢｚ−配列番号１）によってコードされ、これは、Ｔリンパ球によって発現され、ヒトグアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）発現悪性腫瘍の治療用処置のために注入され得る合成受容体である。ＧＭ．５Ｆ９（ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨ）−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８ｔｍ．ＩＣＤ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ．ｓｔｏｐは、配列番号２をコードする。５Ｆ９−２８ＢＢｚは、このように連結されたヒトＤＮＡコード配列を含む：（１）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列、（２）５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（可変軽断片−（グリシン４セリン）４リンカー−可変重断片）、（３）ＣＤ８αヒンジ領域、（４）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、（５）ＣＤ２８細胞内ドメイン、（６）４−１ＢＢ細胞内ドメイン、および（７）ＣＤ３ζ細胞内ドメイン。ＣＡＲは、５Ｆ９−２８ＢＢｚと称する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、本質的に配列番号２からなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２からなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１を含むヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、本質的には配列番号１からなるヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１からなるヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、これらの配列は、ヒトＴ細胞などのヒト細胞におけるコード配列の発現に必要な調節エレメントに連結されている。いくつかの実施形態では、ヒトＴ細胞などのヒト細胞は、コード配列の発現に必要な調節エレメントに連結された配列により形質転換される。
【００４４】
いくつかの実施形態では、５Ｆ９−２８ＢＢｚ−配列番号１は、ヒトＴ細胞などのヒト細胞におけるコード配列の発現に必要な調節エレメントに連結されている。ヒトＴ細胞などのヒト細胞におけるコード配列の発現に必要な調節エレメントとしては、プロモーター、ポリアデニル化部位、および５’および３’非翻訳領域内の他の配列を挙げることができる。いくつかの実施形態では、配列番号１は、ｐＶＡＸなどのプラスミドなどの発現ベクター、もしくはレンチウイルスベクターなどのレトロウイルス発現ベクター、もしくは組換えアデノウイルス、組換えＡＡＶ、もしくは組換えワクシニアウイルスなどの組換えＤＮＡウイルスベクター内に、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、もしくは他のトランスポゾン技術で使用される二本鎖ＤＮＡとして、またはメッセンジャーＲＮＡとして挿入される。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲコード配列は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋などのＴ細胞、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、および末梢リンパ球由来のＣＤ３４＋造血幹細胞などの骨髄細胞などの細胞に、ルーチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入技術およびレトロウイルスベクターなどの材料を使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏで導入される。遺伝子導入後、組換え細胞を培養して、患者に投与される組換え細胞の数を増やす。組換え細胞は、細胞外抗体由来の抗原結合ドメインによって認識される抗原を提示する細胞を認識し、その細胞に結合する。改変後、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させて、患者に投与される多数のこれらの細胞を得ることが記載されている。上記のとおり、自己とは、細胞のドナーとレシピエントが同じヒトであることを指す。同種とは、細胞のドナーとレシピエントが異なるヒトであることを指す。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養による抗原特異的Ｔ細胞の集団の単離および増殖に加えて、サイトカインなどのタンパク質、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５をコードする遺伝物質をそれらに追加することにより、集団を単離した後、増殖させる前にＴ細胞が改変され得る。
【００４６】
ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞は、細胞ドナーからＴ細胞を単離し、それを抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲをコードする核酸分子で形質転換し、形質転換細胞を培養して、形質転換Ｔ細胞の数を指数関数的に増殖させて、複数のこうした細胞を産生することにより、得ることができる。
【００４７】
細胞ドナーは、増殖させた細胞集団が投与される個体、すなわち自己細胞ドナーであり得る。あるいは、Ｔ細胞は、Ｔ細胞が投与される個体、すなわち同種Ｔ細胞とは異なる個体である細胞ドナーから得られてもよい。同種Ｔ細胞が使用される場合、細胞ドナーがタイプマッチングされることが好ましく、それはレシピエントと同じかまたはほぼ同じ白血球抗原のセットを発現するものとして識別される。
【００４８】
Ｔ細胞は、例えば、血液画分、特に末梢血単球細胞成分から、または骨髄サンプルからの単離など、ルーチン方法によって細胞ドナーから得ることができる。
【００４９】
Ｔ細胞が細胞ドナーから得られると、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の機能的結合断片およびＴ細胞などの細胞で発現したときにタンパク質を膜結合タンパク質にする部分を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲをコードする核酸により１つ以上のＴ細胞を形質転換させ得る。
【００５０】
抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲをコードする核酸分子は、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を産生するＢ細胞を、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を産生するこうしたＢ細胞を有する「抗体遺伝子ドナー」から単離することにより得ることができる。こうした抗体遺伝子ドナーは、ワクチン接種以外による免疫原への曝露から生じる免疫応答により、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を産生するＢ細胞を有し得るか、またはこうした抗体遺伝子ドナーは、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を産生するＢ細胞の産生を誘導するワクチンを受けたもの、すなわち、ワクチン接種された抗体遺伝的ドナーとして同定され得る。ワクチン接種された抗体遺伝的ドナーは、抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲをコードする核酸分子でＴ細胞を形質転換すること、細胞数を増やすこと、および形質転換Ｔ細胞を増殖させた集団を個体に投与することを含む方法において使用するために、以前にワクチン接種されている可能性があるか、または特に、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を産生するこうしたＢ細胞を生成する取り組みの一部としてワクチンを投与してもよい。
【００５１】
抗体遺伝子ドナーは、形質転換Ｔ細胞のレシピエントになる個体であっても、形質転換Ｔ細胞のレシピエントになる個体とは異なる個体であってもよい。抗体遺伝子ドナーは、細胞ドナーと同じ個体であってもよく、または抗体遺伝子ドナーは、細胞ドナーとは異なる個体であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞ドナーは、形質転換Ｔ細胞のレシピエントであり、抗体遺伝子ドナーは、異なる個体である。いくつかの実施形態では、細胞ドナーは、抗体遺伝子ドナーと同じ個体であり、形質転換Ｔ細胞のレシピエントとは異なる個体である。いくつかの実施形態では、細胞ドナーは、抗体遺伝子ドナーと同じ個体であり、形質転換Ｔ細胞のレシピエントと同じ個体である。
【００５２】
抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲをコードする核酸分子は、発現したタンパク質が膜結合タンパク質となるようにするタンパク質配列に連結されたＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の機能的結合断片をコードするコード配列を含む。コード配列は、発現される単一の産物をコードするように連結されている。
【００５３】
ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の機能的結合断片をコードするコード配列は、抗体遺伝子ドナー由来のＢ細胞から単離してもよい。こうしたＢ細胞を入手し、遺伝情報を単離してもよい。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、抗体を発現し、したがって抗体コード配列を保有しているハイブリッド細胞を生成するために使用される。抗体コード配列を決定して、これをクローン化し、ａｂｎｔｉ−ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲの作製に使用してもよい。ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の機能的結合断片は、形質転換Ｔ細胞において発現したときにＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープに対するその結合活性を保持する抗体タンパク質の一部またはすべてを含み得る。
【００５４】
発現したタンパク質が膜結合タンパク質となるようにするタンパク質配列のコード配列は、膜結合細胞タンパク質由来のものであってもよく、膜貫通ドメイン、および任意により、細胞質ドメインの少なくとも一部、および／または細胞外ドメインの一部、および発現したタンパク質を細胞膜に転位させるためのシグナル配列を含む。
【００５５】
抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲをコードする核酸分子、すなわち抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲコード配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡであり得る。本発明は、グアニリルシクラーゼＣに結合するキメラ抗原受容体およびそのようなキメラ抗原受容体をコードする核酸分子に関する。本発明はまた、そのようなキメラ抗原受容体を含む細胞、そのようなキメラ抗原受容体および細胞を作製する方法、ならびにそのような細胞を使用して、グアニリルシクラーゼＣを発現する癌細胞を有する癌を患っている個体を治療する方法およびグアニリルシクラーゼＣを発現する癌細胞を有する癌から個体を保護する方法に関する。
【００５６】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現するＴ細胞をベースとした免疫療法は、癌を治療するための新たなモダリティとなっている。ＣＡＲは、細胞表面標的分子のＨＬＡ非依存性結合を提供するように機能するドメインと、様々なタイプの宿主免疫細胞、典型的には末梢血Ｔ細胞を活性化できるシグナル伝達ドメインを含む融合受容体であり、これらには、細胞毒性リンパ球、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、ナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ）またはヘルパーＴ細胞と呼ばれる細胞の集団を含み得る。すなわち、典型的にはＴ細胞に導入されるが、ＣＡＲをコードする遺伝物質は、ＮＫ細胞などのＴ細胞ではない免疫細胞に加えられてもよい。
【００５７】
グアニリルシクラーゼＣ（同義的にＧＣＣまたはＧＵＣＹ２Ｃとも呼ばれる）は、膜結合受容体であり、ホルモンリガンドであるグアニリンまたはウログアニリンによる活性化後にセカンドメッセンジャーｃＧＭＰを産生し、腸の恒常性、腫瘍形成、および肥満を調節する。ＧＵＣＹ２Ｃ細胞表面の発現は、腸上皮の内腔表面および視床下部ニューロンのサブセットに限定されている。その発現は、９５％を超える大腸癌転移において維持され、食道癌、胃癌、口腔癌、唾液腺癌、および膵癌などの腸上皮化生から進展する腫瘍において異所的に発現する。
【００５８】
分極した上皮組織の頂端膜では、ＧＵＣＹ２Ｃの細胞内制限によりＧＵＣＹ２Ｃが到達できないことにより、腸毒性を伴うことなく、頂端−側底分極を失った結腸直腸起源の転移性病変を標的とする治療の機会となる。
【００５９】
同系の免疫担当マウスモデルは、マウスＧＵＣＹ２Ｃを標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞が、腸毒性がない場合に肺への結腸直腸癌転移に対して有効であることを示した。同様に、抗体薬物コンジュゲートおよびワクチンなど、他のＧＵＣＹ２Ｃ標的療法は、前臨床動物モデルにおいて安全であり、転移性食道癌、胃癌、膵癌、および結腸直腸癌の臨床試験において、これらのプラットフォームを利用した治療レジメンがある（ＮＣＴ０２２０２７５９、ＮＣＴ０２２０２７８５、ＮＣＴ０１９７２７３７）。
【００６０】
これらの治療レジメンの安全性は、腸の吻側−尾側軸でのＧＵＣＹ２Ｃ発現の文脈において、上皮細胞の頂端膜では多く含まれるが、側底膜では制限されている区画化されたＧＵＣＹ２Ｃの発現を反映するものである。ＧＵＣＹ２Ｃリガンドにコンジュゲートした全身放射性標識造影剤は、腸に局在することなくＧＵＣＹ２Ｃ発現転移を標的とし、これにより受容体の粘膜区画化が確認される。
【００６１】
腫瘍は、通常の上皮細胞と比較して、最大１０倍高い量のＧＵＣＹ２Ｃを発現し、側底膜にＧＵＣＹ２Ｃが少ない／存在していない腸上皮から受容体過剰発現腫瘍を区別するための定量的な治療ウィンドウを作り出し得る。
【００６２】
米国特許出願公開第２０１２０２５１５０９（Ａ１）号および米国特許出願公開第２０１４−０２９４７８４（Ａ１）号（それぞれ参照により本明細書に組み入れられる）は、グアニリルシクラーゼＣに結合するＣＡＲなどのＣＡＲ、ＧＵＣＹ２Ｃに結合するＣＡＲを含むＴ細胞などのＣＡＲを含むＴ細胞およびＧＵＣＹ２Ｃを含む標的細胞など、キメラ抗原受容体およびＴ細胞を作製する方法、ならびにＧＵＣＹ２Ｃに結合するＣＡＲを含むＴ細胞およびＧＵＣＹ２Ｃを含む標的細胞を使用して、ＧＵＣＹ２Ｃが発現する癌細胞から個体を保護するためおよび癌細胞がＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌に罹患している個体を治療するための方法について開示している。
【００６３】
ＧＵＣＹ２Ｃが発現する癌細胞から個体を保護するため、および癌細胞がＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌に罹患している個体を治療するための改善された組成物および方法が依然として必要とされている。
【００６４】
抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｃＦＶ配列を含むタンパク質が提供される。抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｃＦＶ配列は、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１、配列番号１２、配列番号１３、配列番号１４および配列番号１５からなる群から選択され得る。
【００６５】
５Ｆ９抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ｓｃＦＶ配列を含み、シグナル配列、ヒンジドメイン、膜貫通ドメイン、およびシグナル伝達ドメインをさらに含むタンパク質が提供される。
【００６６】
そのようなタンパク質をコードする核酸分子が提供される。核酸分子は、ヒトＴ細胞などのヒト細胞においてタンパク質を発現するように機能し得る調節エレメントに作動可能に連結され得る。核酸分子は、プラスミドまたは組換えウイルスベクターなどの核酸ベクターに組み込むことができ、これらを使用して、ヒト細胞をタンパク質を発現するヒト細胞に形質転換することができる。
【００６７】
核酸分子を含み、タンパク質を発現するヒト細胞が提供される。
【００６８】
そのような細胞を作製する方法が提供される。
【００６９】
ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌を有する患者を治療する方法、およびリスクが高いと特定された患者においてＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌を予防する方法が提供される。
【００７０】
図１のパネルＡ〜Ｅ。ヒトＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＡＲ−Ｔ細胞の生成。（図１パネルＡ）組換え５Ｆ９抗体は、１μｇ／ｍＬでプレーティングされたｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤまたはＢＳＡ（陰性対照）への特異的結合についてＥＬＩＳＡにより評価した。二元配置分散分析；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。（図１パネルＢ）フローサイトメトリー分析は、親ＣＴ２６マウス結腸直腸癌細胞またはｈＧＵＣＹ２Ｃ（ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ）を発現するように操作され、５Ｆ９抗体で染色されたＣＴ２６細胞で行った。（図１パネルＣ）マウス配列のＢｉＰシグナル配列、５Ｆ９  ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ２８の膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）の細胞内ドメイン、ならびにＣＤ３ζの細胞内ドメインを含む第三世代マウスＣＡＲ構築物（５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ）の概略図である。ＣＡＲ構築物は、ＭＳＣＶレトロウイルスプラスミドｐＭＩＧのＩＲＥＳ−ＧＦＰマーカー上流に挿入した。（図１パネルＤ）対照（１Ｄ３．ｍ２８ＢＢｚ）ＣＡＲまたは５Ｆ９抗体由来ＣＡＲ（５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ）を含むレトロウイルスにより形質導入されたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞は、精製された６ｘＨｉｓ−ｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ（１０μｇ／ｍＬ）で標識し、抗５ｘＨｉｓ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲートにより検出した。フロープロットは、生存ＣＤ８＋細胞でゲーティングした。（図１パネルＥ）生存ＣＤ８＋ＧＦＰ＋細胞でゲーティングした、５Ｆ９由来または対照（１Ｄ３）ＣＡＲの６ｘＨｉｓ−ｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ結合曲線（図５のデータを参照）。３つの独立した実験から組み合わせた。
【００７１】
図２パネルＡ〜Ｅ。ｈＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＡＲは、抗原依存性Ｔ細胞の活性化およびエフェクター機能を媒介する。（図２のパネルＡ〜Ｅ）マウスＣＤ８＋Ｔ細胞を非形質導入（なし）のままにするか、示されているように対照１Ｄ３．ｍ２８ＢＢｚまたは５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ構築物により形質導入した。（図２パネルＡ）図２パネルＢ〜Ｄのすべての分析のゲーティング戦略。（図２パネルＢ）ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌに基づく代表的なＣＡＲ−Ｔ細胞表現型プロット。二元配置分散分析；ＮＳ：有意でない。バー：２〜３回の独立した実験からの平均±ＳＤ。Ｔｎ／ｓｃｍ：ナイーブまたはＴメモリー幹細胞。Ｔｃｍ：セントラルメモリーＴ細胞；Ｔｅｍ：エフェクターメモリーＴ細胞；Ｔｅｍｒａ：ＣＤ４５ＲＡを発現するエフェクターメモリーＴ細胞。（Ｃ〜Ｄ）１０６のＣＡＲ−Ｔ細胞を、プレートコーティングされた抗原（ＢＳＡもしくはｈＧＵＣＹ２Ｃ）またはＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／ＩＯＮＯ）により、６時間刺激した。次に、Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９、またはＣＤ４４）および細胞内サイトカイン産生（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ２、およびＭＩＰ１α）をフローサイトメトリーによって定量化した。グラフは、３回の独立した実験からの平均±ＳＤ（図２パネルＣ）活性化マーカーのアップレギュレーション（ＭＦＩ）および（図２パネルＤ）多機能サイトカイン産生（ＣＡＲ＋細胞の％）を示している。（図２パネルＥ）Ｅ−Ｐｌａｔｅ内の親ＣＴ２６またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃマウス結腸直腸癌細胞を、ＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ比５：１）、培地、または１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（Ｔｒｉｔｏｎ）により治療し、相対電気インピーダンスを１５分ごとに１０時間定量化して、癌細胞死を定量化した（時間＝０に正規化）。特異的溶解値（％）は、正規化のために培地およびＴｒｉｔｏｎを添加後、インピーダンス値を使用して計算した（それぞれ、特異的溶解値は０％および１００％）。二元配置分散分析、Ｂ〜Ｅ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
【００７２】
図３パネルＡ〜Ｅ。ｈＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、同系の肺転移モデルにおいて長期的な保護をもたらす。（図３のパネルＡ〜Ｅ）ＢＡＬＢ／ｃマウスに５ｘ１０５ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ細胞を尾静脈から注射して、肺転移を確立した。対照（４Ｄ５．ｍ２８ＢＢｚ）または５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ構築物をマウスＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入した。（図３パネルＡ）マウスを３日後に５Ｇｙ全身照射（ＴＢＩ）で治療した後、１０６〜１０７５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ（Ｎ＝７〜８／群）または１０７対照（Ｎ＝６）ＣＡＲＴ細胞で治療した。（図３パネルＢ）マウスを３日目（Ｄ３）または７日目（Ｄ７）に５Ｇｙ  ＴＢＩで治療した後、１０７の対照（Ｎ＝１０／群）または５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ（Ｎ＝９〜１０／群）ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療した。（図３パネルＣ）マウスを７日目に５Ｇｙ  ＴＢＩで治療した後、７日目および１４日目に１０７の対照（Ｎ＝１０）または５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ（Ｎ＝１２）ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療した。（図３パネルＤ）７日目に５Ｇｙ  ＴＢＩおよびＰＢＳ、または１０７対照または５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療したマウスを、１８日目に屠殺し、肺を墨汁で染色し、腫瘍／肺を数えた。一元配置分散分析；＊ｐ＜０．０５。（図３パネルＥ）５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療されたＢおよびＣの生存マウス、またはナイーブマウスを５ｘ１０５ＣＴ２６（Ｎ＝４〜７／群）またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ（Ｎ＝７／群）細胞でチャレンジした。再チャレンジは、最初のチャレンジの１６〜４０週間後に行った。ログランクマンテル・コックス検定、図３パネルＡ〜ＣおよびＥ；＊＊ｐ＜０．０１、＊＊＊ｐ＜０．００１、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。上向き矢印は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の治療日を示している。各パネルは、独立した実験を示している。
【００７３】
図４パネルＡ〜Ｅ。ｈＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞により、ヒト結腸直腸腫瘍異種移植片が消失する。（図４パネルＡ）Ｔ８４ヒト結腸直腸癌細胞でのｈＧＵＣＹ２Ｃの発現は、組換え５Ｆ９抗体を使用したフローサイトメトリーによって定量化した。（図４のパネルＢ〜Ｅ）対照（１Ｄ３．ｍ２８ＢＢｚ）または５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ構築物をマウスＣＤ８＋Ｔ細胞に形質導入した。（図４パネルＢ）Ｅ−Ｐｌａｔｅ内のＴ８４結腸直腸癌細胞を、５Ｆ９−ｍ２８ＢＢｚまたは対照ＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ比５：１）、培地、または１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（Ｔｒｉｔｏｎ）で２回治療し、相対電気インピーダンスを１５分ごとに２０時間測定して、癌細胞死を定量化した（時間＝０に正規化）。特異的溶解値（％）は、正規化のために培地およびＴｒｉｔｏｎを添加後、インピーダンス値を使用して計算した（それぞれ、特異的溶解値は０％および１００％）。二元配置分散分析；＊＊ｐ＜０．０１；２つの独立した実験の代表値。（図４パネルＣ〜Ｅ）免疫不全ＮＳＧマウスに２．５ｘ１０６ルシフェラーゼ発現Ｔ８４結腸直腸癌細胞を腹腔内注射で注射し、１４日目に腹腔内注射により、１０７の対照（Ｎ＝５）または５Ｆ９−ｍ２８ＢＢｚ（Ｎ＝４）ＣＡＲ−Ｔ細胞で治療した。（図４のパネルＣ〜Ｄ）総腫瘍発光（光子／秒）をＴ細胞注入の直前およびその後毎週定量化した。二元配置分散分析；＊ｐ＜０．０５。（図４パネルＥ）生存に関して、マウスを追跡した。ログランクマンテル・コックス検定；＊ｐ＜０．０５。
【００７４】
図５。５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲの表面発現の検出。対照ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲまたは５Ｆ９抗体由来のＣＡＲ（５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ）をＩＲＥＳ−ＧＦＰマーカーの上流に含むレトロウイルスにより形質導入されたマウスＣＤ８＋Ｔ細胞を、精製６ｘＨｉｓｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ（０〜１４３０ｎＭ）により標識し、α５ｘＨｉｓ−Ａｌｅｘａ−６４７コンジュゲートにより検出した。フロープロットは、生存ＣＤ８＋細胞でゲーティングした。
【００７５】
図６。ｈＧＵＣＹ２Ｃ発現マウス結腸直腸癌細胞により、５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞が活性化する。１０６のＣＡＲ−Ｔ細胞を、１０６の親ＣＴ２６、ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ結腸直腸癌細胞、またはＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／ＩＯＮＯ）により、６時間刺激した。Ｔ細胞活性化マーカー（ＣＤ２５、ＣＤ６９、またはＣＤ４４）はフローサイトメトリーによって定量化した。
【００７６】
図７パネルＡおよびＢ。ｈＧＵＣＹ２Ｃ発現マウス結腸直腸癌細胞は、５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のサイトカイン産生を誘導する。１０６のＣＡＲ−Ｔ細胞を、プレートコーティングされた抗原（図７、パネルＡ；ＢＳＡもしくはｈＧＵＣＹ２Ｃ）または１０６の親ＣＴ２６またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ結腸直腸癌細胞（図７、パネルＢ）、またはＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／ＩＯＮＯ）により６時間刺激した。細胞内サイトカイン産生（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ−２またはＭＩＰ１α）はフローサイトメトリーによって定量化した。
【００７７】
図８パネルＡおよびＢ。５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｈＧＵＣＹ２Ｃを発現するマウス結腸直腸癌細胞を死滅させる。β−ガラクトシダーゼ発現ＣＴ２６またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃマウス結腸直腸癌細胞を、様々なエフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞：標的癌細胞比（Ｅ：Ｔ比）で４時間培養した。特異的溶解は、発光基質によって検出された上清へのβ−ガラクトシダーゼ放出によって決定した。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１（二元配置分散分析）。
【００７８】
図９パネルＡおよびＢ。５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｈＧＵＣＹ２Ｃ欠損ヒト結腸直腸腫瘍を死滅させない。（図９パネルＡ）ＳＷ４８０ヒト結腸直腸癌細胞でのｈＧＵＣＹ２Ｃの発現は、組換え５Ｆ９抗体を使用したフローサイトメトリーによって定量化した。（図９パネルＢ）Ｅ−Ｐｌａｔｅ内のＳＷ４８０細胞を、５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚまたは対照１Ｄ３．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ  Ｔ細胞、培地、または２．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（Ｔｒｉｔｏｎ）により治療し、相対電気インピーダンスを１５分ごとに２０時間定量化して、癌細胞死を定量化した（時間＝０に正規化）。特異的溶解値（％）は、正規化のために培地およびＴｒｉｔｏｎを添加後、インピーダンス値を使用して計算した（それぞれ、特異的溶解値は０％および１００％）。
【００７９】
図１０パネルＡ〜Ｃ。５Ｆ９．ｈ２８ＢＢｚ  ＣＡＲを発現するヒトＴ細胞は、ＧＵＣＹ２Ｃ発現結腸直腸癌細胞を認識して死滅させる。（図１０パネルＡ）ヒト５Ｆ９  ＣＡＲ構築物（５Ｆ９．ｈ２８ＢＢｚ）発現ＣＡＲ−Ｔ細胞を、プレートコーティングされた抗原（ＢＳＡまたはｈＧＵＣＹ２Ｃ）またはＰＭＡおよびイオノマイシン（ＰＭＡ／ＩＯＮＯ）により、６時間刺激した。次に、Ｔ細胞活性化マーカーＣＤ６９および細胞内サイトカイン（ＩＦＮγ、ＴＮＦα、およびＩＬ−２）をフローサイトメトリーで定量化した。（図１０パネルＢ〜Ｃ）Ｅ−Ｐｌａｔｅ内で培養した親（ＣＴ２６）、ヒトＧＵＣＹ２Ｃ発現ＣＴ２６（ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ）マウス結腸直腸癌細胞（図１０パネルＢ）、またはＴ８４ヒト結腸直腸癌細胞（図１０パネルＣ）を対照または５Ｆ９．ｈ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞（Ｅ：Ｔ比１０：１）、培地、または２．５％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００により治療し、相対電気インピーダンスを１５分ごとに定量化し、癌細胞死を定量化した（時間＝０に正規化）。特異的溶解値（％）は、正規化のために培地およびＴｒｉｔｏｎを添加後、インピーダンス値を使用して計算した（それぞれ、特異的溶解値は０％および１００％）。＊＊＊、ｐ＜０．００１（二元配置分散分析）。
【００８０】
図１１パネルＡおよびＢ。５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｍＧＵＣＹ２Ｃを発現するマウス結腸直腸癌細胞を死滅させない。β−ガラクトシダーゼおよびマウスＧＵＣＹ２Ｃ（Ａ；ＣＴ２６．ｍＧＵＣＹ２Ｃ）またはヒトＧＵＣＹ２Ｃ（Ｂ；ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ）を発現するＣＴ２６細胞を、様々なエフェクターＣＡＲ−Ｔ細胞：標的癌細胞の比（Ｅ：Ｔ比）の範囲で４時間培養した。特異的溶解は、発光基質によって検出された上清へのβ−ガラクトシダーゼ放出によって決定した。＊＊＊＊、ｐ＜０．０００１（二元配置分散分析）。
【００８１】
ヒトＧＵＣＹ２Ｃの細胞外ドメインに結合する一本鎖タンパク質配列は、ヒトＧＵＣＹ２Ｃの細胞外ドメインに結合する抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体の可変軽鎖および可変重鎖の断片を使用して生成した。リンカー配列により、可変軽鎖断片を可変重鎖断片に接続して、ヒトＧＵＣＹ２Ｃの細胞外ドメインに結合する一本鎖抗体可変断片融合タンパク質配列（ｓｃＦｖ）にする。
【００８２】
ｓｃＦｖは、より大きい融合タンパク質であるＣＡＲの構成要素である。ＣＡＲの機能構成要素としては、免疫グロブリン由来の抗原結合ドメイン、抗体配列、すなわちｓｖＦｖ（ヒトＧＵＣＹ２Ｃに結合する）、発現する細胞の細胞膜にタンパク質を固定する膜貫通ドメインにｓｃＦＶを連結させるヒンジドメイン、およびヒトＧＵＣＹ２ＣへのｓｃＦｖ結合時に細胞を活性化するシグナル伝達細胞内配列（細胞質配列とも呼ばれる）として機能するシグナルドメインが挙げられる。ＣＡＲをコードする核酸配列には、翻訳されたＣＡＲの細胞膜への輸送を容易にする細胞タンパク質由来のシグナルペプチドをコードする配列を含む。ＣＡＲを発現する組換え細胞は、抗体によって指定される標的、すなわちＧＵＣＹ２Ｃを提示する細胞に結合し、かつ組換え細胞傷害性リンパ球、組換え細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）、組換えナチュラルキラーＴ細胞（ＮＫＴ）、および組換えナチュラルキラー細胞（ＮＫ）の場合、死滅させるように、ＣＡＲにより指示される。ＣＡＲは、発現したときに、細胞表面に輸送され、シグナルペプチドは、典型的には除去される。成熟したＣＡＲは、細胞受容体として機能する。ｓｃＦｖおよびヒンジドメインは、細胞表面に提示され、ここで、ｓｃＦｖ配列は、他の細胞上のタンパク質に曝され得、これらの細胞上のＧＵＣＹ２Ｃに結合する。膜貫通領域は細胞膜にＣＡＲを固定し、細胞内配列はシグナルドメインとして機能して、細胞内にシグナルを伝達し、その結果、ＣＡＲ発現細胞が結合しているＧＵＣＹ２Ｃ発現細胞の死をもたらす。
【００８３】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば、哺乳動物または合成シグナル配列などのシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、例えば、哺乳動物の膜結合タンパク質などの膜結合タンパク質由来のシグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ４、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ２８、およびＢｉＰなどの膜結合タンパク質由来のシグナル配列を含む。シグナル配列の例はまた、あらゆる哺乳動物の膜結合シグナル配列内で見られ得る＜ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｉｇｎａｌｐｅｐｔｉｄｅ．ｄｅ／ｉｎｄｅｘ．ｐｈｐ？ｍ＝ｌｉｓｔｓｐｄｂ＿ｍａｍｍａｌｉａ＞。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸１〜２２を有する顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列を含む。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列は、配列番号２のアミノ酸１〜２２を含む。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列は、本質的に配列番号２のアミノ酸１〜２２からなる。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列は、配列番号２のアミノ酸１〜２２からなる。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列を含むＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１の核酸１〜６６を含む。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列をコードする核酸配列は、配列番号１の核酸１〜６６を含む。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列をコードする核酸配列は、本質的に配列番号１の核酸１〜６６からなる。いくつかの実施形態では、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列をコードする核酸配列は、配列番号１の核酸１〜６６からなる。
【００８４】
抗ＧＵＣＹ２Ｃ結合ドメインは、ＭＨＣに依存しない一本鎖キメラ受容体として提供される。抗原結合ドメインは、抗体に由来する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、５Ｆ９由来の抗グアニリルシクラーゼＣ（ＧＣＣまたはＧＵＣＹ２Ｃとも称される）一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（好ましくは、可変軽断片−（グリシン４セリン）４リンカー−可変重断片）を含む。５Ｆ９は、ヒトＧＵＣＹ２Ｃの細胞外ドメインを認識する完全ヒト化モノクローナル抗体を発現するハイブリドーマである。抗体の重鎖および軽鎖のＤＮＡコード配列を使用して、ＣＡＲ実装用の新規ｓｃＦｖを作製した。これは、例えば５Ｆ９−２８ＢＢｚ  ＣＡＲなどの抗ＧＣＣ  ＣＡＲの作製に使用され、これによりＧＵＣＹ２Ｃ分子に対して向けられた抗原特異性が付与される。
【００８５】
いくつかの実施形態では、５Ｆ９−２８ＢＢｚ  ＣＡＲなどの抗ＧＣＣ  ｓｃＦｖは、５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（可変軽断片−（グリシン４セリン）４リンカー−可変重断片）であってもよい。５Ｆ９  ｓｃＦｖは、配列番号２のアミノ酸２５〜２７４を含んでもよい。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖを含むＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド７３〜８２２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、抗ＧＣＣ  ５Ｆ９  ｓｃＦｖを含む。配列番号２のアミノ酸２５〜１３３は、５Ｆ９可変軽鎖断片に対応する。配列番号２のアミノ酸１５４〜２７４は、５Ｆ９可変重鎖断片に対応する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、（グリシン４セリン）ｎリンカー（（グリシン４セリン）＝ＧＧＧＧＳ（配列番号３）およびｎ＝２〜５）により互いに結合された５Ｆ９可変軽断片および５Ｆ９可変重断片に対応する抗ＧＣＣ  ５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）を含む。
【００８６】
いくつかの実施形態では、リンカーは、２つの（グリシン４セリン）単位（（グリシン４セリン）２）を含み、リンカーＧ４Ｓ−２（配列番号４）として称され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、３つの（グリシン４セリン）単位（（グリシン４セリン）３）を含み、リンカーＧ４Ｓ−３（配列番号５）として称され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、４つの（グリシン４セリン）単位（（グリシン４セリン）４）を含み、リンカーＧ４Ｓ−４（配列番号６）として称され得る。いくつかの実施形態では、リンカーは、５つの（グリシン４セリン）単位（（グリシン４セリン）５）を含み、リンカーＧ４Ｓ−５（配列番号７）として称され得る。
【００８７】
５Ｆ９可変断片は、可変軽鎖断片−リンカー−可変重鎖断片または可変重鎖断片−リンカー−可変軽鎖断片の順序でＮ末端からＣ末端まで構成され得る。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、［５Ｆ９可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）２−５Ｆ９可変重鎖断片］（配列番号８）、［５Ｆ９可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）３−５Ｆ９可変重鎖断片］（配列番号９）、［５Ｆ９可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）４−５Ｆ９可変重鎖断片］（配列番号１０）、または［５Ｆ９可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）５−５Ｆ９可変重鎖断片］（配列番号１１）として構成されている抗ＧＣＣ  ５Ｆ９  ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、［５Ｆ９可変重鎖断片−（グリシン４セリン）２−５Ｆ９可変軽鎖断片］（配列番号１２）、［５Ｆ９可変重鎖断片−（グリシン４セリン）３−５Ｆ９可変軽鎖断片］（配列番号１３）、［５Ｆ９可変重鎖断片−（グリシン４セリン）４−５Ｆ９可変軽鎖断片］（配列番号１４）、または［５Ｆ９可変重鎖断片−（グリシン４セリン）５−５Ｆ９可変軽鎖断片（配列番号１５）として構成されている抗ＧＣＣ  ５Ｆ９  ｓｃＦｖを含む。
【００８８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸２５〜２７４を有する抗ＧＣＣ  ５Ｆ９  ｓｃＦｖを含む。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖは、配列番号２のアミノ酸２５〜２７４を含む。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖは、本質的に配列番号２のアミノ酸２５〜２７４からなる。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖは、配列番号２のアミノ酸２５〜２７４からなる。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖをコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド７３〜８２２を含む。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖをコードする核酸配列は、本質的に配列番号１のヌクレオチド７３〜８２２からなる。いくつかの実施形態では、５Ｆ９  ｓｃＦｖをコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド７３〜８２２からなる。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８α、ＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ４−Ｆｃ、またはＣＤ２８ヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ８αヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸２７７〜３３６を有するＣＤ８αヒンジ領域を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２のアミノ酸２７７〜３３６を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域は、本質的に配列番号２のアミノ酸２７７〜３３６からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域は、配列番号２のアミノ酸２７７〜３３６からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド８２９〜１００８を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域をコードする核酸配列は、本質的に配列番号１のヌクレオチド８２９〜１００８からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ８αヒンジ領域をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド８２９〜１００８からなる。
【００９０】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、またはＳＬＡＭ膜貫通領域を含む。
【００９１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、またはＳＬＡＭ細胞内領域を含む。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、またはＳＬＡＭの膜貫通および細胞内（細胞質）配列を両方とも含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ２８膜貫通配列および細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５を有するＣＤ２８膜貫通配列および細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通配列および細胞内配列は、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列は、本質的に配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列は、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、本質的に、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５からなる。
【００９３】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３に関連するζ鎖（ＣＤ３ζ）、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９−アルファ鎖およびＣＤ７９−ベータ鎖、または特定のＦｃ受容体由来の細胞内（細胞質）配列を含む。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ａ）ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、またはＳＬＡＭ細胞内領域の１つ以上由来の細胞内（細胞質）配列と、ｂ）ＣＤ３に関連するζ鎖（ＣＤ３ζ）、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９−アルファ鎖およびＣＤ７９−ベータ鎖、または特定のＦｃ受容体由来の細胞内（細胞質）配列との組み合わせを含む。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞内配列と組み合わせた４−１ＢＢ細胞内配列と共にＣＤ２８膜貫通および細胞内配列を含む。
【００９６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５を有するＣＤ２８膜貫通配列および細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通配列および細胞内配列は、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列は、本質的に配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列は、配列番号２のアミノ酸３３７〜４０５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、本質的に、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１００９〜１２１５からなる。
【００９７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、４−１ＢＢ細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸４０６〜４４４を有する４−１ＢＢ細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸４０６〜４４４を含む４−１ＢＢ細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内配列は、本質的に、配列番号２のアミノ酸４０６〜４４４からなる。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内配列は、配列番号２のアミノ酸４０６〜４４４からなる。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１２１６〜１３３２を含む。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内をコードする核酸配列は、本質的に配列番号１のヌクレオチド１２１６〜１３３２からなる。いくつかの実施形態では、４−１ＢＢ細胞内をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１２１６〜１３３２からなる。
【００９８】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、少なくとも１つの免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）をコードする配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＩＴＡＭを含む細胞シグナル伝達分子由来の配列を含む。典型的には、３つのＩＴＡＭがこのような配列内に存在する。ＩＴＡＭを含む細胞シグナル伝達分子の例としては、ＣＤ３に関連するζ鎖（ＣＤ３ζ）、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９−アルファ鎖および−ベータ鎖、ならびに特定のＦｃ受容体が挙げられる。したがって、いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζなどの細胞シグナル伝達分子、Ｂ細胞受容体複合体のＣＤ７９−アルファ鎖および−ベータ鎖、ならびにＩＴＡＭを含む特定のＦｃ受容体由来の配列を含む。ＣＡＲに含まれる配列は、１つ以上のＩＴＡＭを含むこうした分子由来の細胞内配列である。ＩＴＡＭは、４つのアミノ酸の保存配列であり、免疫系の特定の細胞表面タンパク質の細胞質尾部において２回繰り返されている。ＩＴＡＭの４つのアミノ配列の保存配列は、任意の他の２つのアミノ酸（Ｘが独立して任意のアミノ酸配列であるＹＸＸＬまたはＹＸＸＩ）によってロイシンまたはイソロイシンから分離されたチロシンを含む。ＩＴＡＭは、約６〜８個のアミノ酸で分離された２つの４つのアミノ酸の保存配列を有する、典型的には１４〜１６個のアミノ酸の配列を含む。ＣＤ３に関連するζ鎖（ＣＤ３ζ）は、３つのＩＴＡＭを含む。配列番号２のアミノ酸４４５〜５５７は、ＣＤ３ζ細胞内配列である。ＩＴＡＭは、アミノ酸４６５〜４７９、５０４〜５１９および５３５〜５４９に位置する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ζ細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸４４５〜５５７を有するＣＤ３ζ細胞内配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内配列は、配列番号２の４４５〜５５７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内配列は、本質的に配列番号２の４４５〜５５７からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内配列は、配列番号２の４４５〜５５７からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１３３３〜１６７１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内をコードする核酸配列は、本質的に配列番号１のヌクレオチド１３３３〜１６７１からなる。いくつかの実施形態では、ＣＤ３ζ細胞内をコードする核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１３３３〜１６７１からなる。
【００９９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、免疫グロブリン由来の抗原結合ドメイン、抗体配列（ＧＵＣＹ２Ｃに結合する）を含み得、抗体配列は、Ｔ細胞受容体のＣＤ３ゼータシグナル伝達鎖などのＴ細胞シグナル伝達ドメインに、あるいはＣＤ３ゼータ鎖などのＴ細胞鎖またはＩｇ  Ｆｃ受容体複合体のガンマシグナル伝達サブユニットに連結されたＴ細胞共刺激シグナル伝達（例えばＣＤ２８）ドメインに融合している。
【０１００】
ＣＡＲのシグナル伝達ドメインは、ＴＣＲに由来する配列を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータ鎖またはＣＤ３ゼータ鎖に連結されたＣＤ２８シグナルドメインなどの膜貫通および細胞質シグナル伝達ドメインに融合した、抗原結合機能をもたらす抗体可変領域の細胞外一本鎖断片を含む。いくつかの実施形態では、シグナル伝達ドメインは、スペーサーまたはヒンジによって抗原結合ドメインに連結されている。抗体可変領域の断片がＧＵＣＹ２Ｃに結合したときに、シグナル伝達ドメインが免疫細胞の活性化を開始する。これらの組換えＴ細胞は、細胞外抗ＧＵＣＹ２Ｃ結合ドメイン、およびリンパ球を刺激するシグナル伝達機能を実行するＴＣＲに由来する細胞内ドメインを含む、膜結合キメラ受容体を発現する。いくつかの実施形態は、抗ＧＵＣＹ２Ｃ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の抗ＧＵＣＹ２Ｃ結合領域を含む一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である抗ＧＵＣＹ２Ｃ結合ドメインを提供する。シグナル伝達ドメインには、Ｔ細胞共刺激シグナル伝達（例えば、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＳＬＡＭ）ドメインおよびＴ細胞トリガー鎖（例えば、ＣＤ３ゼータ）を含み得る。
【０１０１】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲはアフィニティタグを含む。このようなアフィニティタグの例としては、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ；Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩ；Ｐｏｌｙ（Ｈｉｓ）；ＨＡ；Ｖ５；およびＦＬＡＧタグが挙げられる。いくつかの実施形態では、アフィニティタグは、ｓｃＦｖの前、またはｓｃＦｖとヒンジ領域との間、またはヒンジ領域の後に位置し得る。いくつかの実施形態では、アフィニティタグは、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩ、Ｐｏｌｙ（Ｈｉｓ）、ＨＡ；Ｖ５、およびＦＬＡＧタグから選択され、ｓｃＦｖの前、またはｓｃＦｖとヒンジ領域との間、またはヒンジ領域の後に位置する。
【０１０２】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、シグナル配列、５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である抗ＧＣＣ  ｓｃＦｖ、ヒンジ領域、１つ以上のタンパク質由来の膜貫通領域および細胞内配列、ならびに細胞内配列および免疫受容体チロシン活性化モチーフと、任意によりアフィニティタグとを含む。
【０１０３】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、ＧＭ−ＣＳＦ、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＣＤ４、ＴＣＲアルファ、ＴＣＲベータ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ２８、ＢｉＰから選択される、シグナル配列と、（可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）２−５リンカー−可変重鎖断片）および（可変重鎖断片−（グリシン４セリン）２−５リンカー−可変軽鎖断片）から選択される５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である、抗ＧＣＣ  ｓｃＦｖと、ＣＤ８α、ＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ４−ＦｃおよびＣＤ２８ヒンジ領域から選択される、ヒンジ領域と、ＣＤ８α、ＩｇＧ１−Ｆｃ、ＩｇＧ４−ＦｃおよびＣＤ２８膜貫通領域から選択される、膜貫通領域と、ＣＤ２８４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７９Ａ、ＣＤ７９Ｂ、ＣＤ２２６、ＤＲ３、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＩＣＯＳ、ＬＩＧＨＴ、ＯＸ４０、ＳＬＡＭ細胞内配列から選択される、細胞内配列と、１つ以上のＩＴＡＭを含む、ＣＤ３ζ、ＣＤ７９−アルファ、ＣＤ７９−ベータ、およびＦｃ受容体細胞内配列から選択される配列を含む、免疫受容体チロシン活性化モチーフと、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｇ、Ｓｔｒｅｐ−ＴａｇＩＩ、Ｐｏｌｙ（Ｈｉｓ）、ＨＡ；Ｖ５、およびＦＬＡＧタグから選択される、任意のアフィニティタグとが連結され、含まれる。
【０１０４】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列、［可変軽鎖断片−（グリシン４セリン）２−５リンカー−可変重鎖断片］または［可変重鎖断片−（グリシン４セリン）２−５リンカー−可変軽鎖断片］から選択される５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）である抗ＧＣＣ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８α、ＣＤ２８、ＩｇＧ１−Ｆｃ、またはＩｇＧ４−Ｆｃヒンジ領域、ＣＤ８αまたはＣＤ２８膜貫通および細胞内配列、４−１ＢＢ細胞内配列ならびにＣＤ３ζ細胞内配列を含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、本質的に、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列、５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（可変軽断片−（グリシン４セリン）４リンカー−可変重断片）である抗ＧＣＣ  ｓｃＦｖ、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通および細胞内配列、４−１ＢＢ細胞内配列ならびにＣＤ３ζ細胞内配列からなる。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸１〜２２、２５〜２７４、２７７〜３３６、３３７〜４０５、４０６〜４４４および４４５〜５５７を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、本質的に配列番号２のアミノ酸１〜２２、２５〜２７４、２７７〜３３６、３３７〜４０５、４０６〜４４４および４４５〜５５７からなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２のアミノ酸１〜２２、２５〜２７４、２７７〜３３６、３３７〜４０５、４０６〜４４４および４４５〜５５７からなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜６６、７３〜８２２、８２９〜１００８、１００９〜１２１５、１２１６〜１３３２および１３３３〜１６７１を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、本質的に配列番号１のヌクレオチド１〜６６、７３〜８２２、８２９〜１００８、１００９〜１２１５、１２１６〜１３３２および１３３３〜１６７１からなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１のヌクレオチド１〜６６、７３〜８２２、８２９〜１００８、１００９〜１２１５、１２１６〜１３３２および１３３３〜１６７１からなる。いくつかの実施形態では、これらの配列は、ヒトＴ細胞などのヒト細胞におけるコード配列の発現に必要な調節エレメントに連結されている。いくつかの実施形態では、ヒトＴ細胞などのヒト細胞は、コード配列の発現に必要な調節エレメントに連結された配列により形質転換される。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、新規ＤＮＡ配列ＧＭ．５Ｆ９（ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨ）−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８ｔｍ．ＩＣＤ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ．ｓｔｏｐ（５Ｆ９−２８ＢＢｚ−配列番号１）によってコードされ、これは、Ｔリンパ球によって発現され、ヒトグアニリルシクラーゼＣ（ＧＵＣＹ２Ｃ）発現悪性腫瘍の治療用処置のために注入され得る合成受容体である。ＧＭ．５Ｆ９（ＶＬ−（Ｇ４Ｓ）４−ＶＨ）−ＣＤ８ａ−ＣＤ２８ｔｍ．ＩＣＤ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ｚ．ｓｔｏｐは、配列番号２をコードする。５Ｆ９−２８ＢＢｚは、このように連結されたヒトＤＮＡコード配列を含む：（１）顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）シグナル配列、（２）５Ｆ９一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）（可変軽断片−（グリシン４セリン）４リンカー−可変重断片）、（３）ＣＤ８αヒンジ領域、（４）ＣＤ２８膜貫通ドメイン、（５）ＣＤ２８細胞内ドメイン、（６）４−１ＢＢ細胞内ドメイン、および（７）ＣＤ３ζ細胞内ドメイン。ＣＡＲは、５Ｆ９−２８ＢＢｚと称する。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２を含む。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、本質的に配列番号２からなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲは、配列番号２からなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１を含むヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、本質的には配列番号１からなるヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、ＣＡＲをコードする構築物の核酸配列は、配列番号１からなるヌクレオチドからなる。いくつかの実施形態では、これらの配列は、ヒトＴ細胞などのヒト細胞におけるコード配列の発現に必要な調節エレメントに連結されている。いくつかの実施形態では、ヒトＴ細胞などのヒト細胞は、コード配列の発現に必要な調節エレメントに連結された配列により形質転換される。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、５Ｆ９−２８ＢＢｚ−配列番号１は、ヒトＴ細胞などのヒト細胞におけるコード配列の発現に必要な調節エレメントに連結されている。ヒトＴ細胞などのヒト細胞におけるコード配列の発現に必要な調節エレメントとしては、プロモーター、ポリアデニル化部位、および５’および３’非翻訳領域内の他の配列を挙げることができる。いくつかの実施形態では、配列番号１は、ｐＶＡＸなどのプラスミドなどの発現ベクター、もしくはレンチウイルスベクターなどのレトロウイルス発現ベクター、もしくは組換えアデノウイルス、組換えＡＡＶ、もしくは組換えワクシニアウイルスなどの組換えＤＮＡウイルスベクター内に、またはＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、もしくは他のトランスポゾン技術で使用される二本鎖ＤＮＡとして、またはメッセンジャーＲＮＡとして挿入される。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ＣＡＲコード配列は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋などのＴ細胞、インバリアントナチュラルキラーＴ細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ナチュラルキラー細胞、および末梢リンパ球由来のＣＤ３４＋造血幹細胞などの骨髄細胞などの細胞に、ルーチンのｉｎ  ｖｉｔｒｏ遺伝子導入技術およびレトロウイルスベクターなどの材料を使用して、ｅｘ  ｖｉｖｏで導入される。遺伝子導入後、組換え細胞を培養して、患者に投与される組換え細胞の数を増やす。組換え細胞は、細胞外抗体由来の抗原結合ドメインによって認識される抗原を提示する細胞を認識し、その細胞に結合する。改変後、細胞をｅｘ  ｖｉｖｏで増殖させて、患者に投与される多数のこれらの細胞を得ることが記載されている。上記のとおり、自己とは、細胞のドナーとレシピエントが同じヒトであることを指す。同種とは、細胞のドナーとレシピエントが異なるヒトであることを指す。ｅｘ  ｖｉｖｏ培養による抗原特異的Ｔ細胞の集団の単離および増殖に加えて、サイトカインなどのタンパク質、例えばＩＬ−２、ＩＬ−７、およびＩＬ−１５をコードする遺伝物質をそれらに追加することにより、集団を単離した後、増殖させる前にＴ細胞が改変され得る。
【０１１０】
ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する複数のＴ細胞は、細胞ドナーからＴ細胞を単離し、それを抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲをコードする核酸分子で形質転換し、形質転換細胞を培養して、形質転換Ｔ細胞の数を指数関数的に増殖させて、複数のこうした細胞を産生することにより、得ることができる。
【０１１１】
細胞ドナーは、増殖させた細胞集団が投与される個体、すなわち自己細胞ドナーであり得る。あるいは、Ｔ細胞は、Ｔ細胞が投与される個体、すなわち同種Ｔ細胞とは異なる個体である細胞ドナーから得られてもよい。同種Ｔ細胞が使用される場合、細胞ドナーがタイプマッチングされることが好ましく、それはレシピエントと同じかまたはほぼ同じ白血球抗原のセットを発現するものとして識別される。
【０１１２】
Ｔ細胞は、例えば、血液画分、特に末梢血単球細胞成分から、または骨髄サンプルからの単離など、ルーチン方法によって細胞ドナーから得ることができる。
【０１１３】
Ｔ細胞が細胞ドナーから得られると、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープに結合する抗体の機能的結合断片およびＴ細胞などの細胞で発現したときにタンパク質を膜結合タンパク質にする部分を含む抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲをコードする核酸により１つ以上のＴ細胞を形質転換させ得る。
【０１１４】
抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲをコードする核酸分子は、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を産生するＢ細胞を、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を産生するこうしたＢ細胞を有する「抗体遺伝子ドナー」から単離することにより得ることができる。こうした抗体遺伝子ドナーは、ワクチン接種以外による免疫原への曝露から生じる免疫応答により、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を産生するＢ細胞を有し得るか、またはこうした抗体遺伝子ドナーは、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を産生するＢ細胞の産生を誘導するワクチンを受けたもの、すなわち、ワクチン接種された抗体遺伝的ドナーとして同定され得る。ワクチン接種された抗体遺伝的ドナーは、抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲをコードする核酸分子でＴ細胞を形質転換すること、細胞数を増やすこと、および形質転換Ｔ細胞を増殖させた集団を個体に投与することを含む方法において使用するために、以前にワクチン接種されている可能性があるか、または特に、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体を産生するこうしたＢ細胞を生成する取り組みの一部としてワクチンを投与してもよい。
【０１１５】
抗体遺伝子ドナーは、形質転換Ｔ細胞のレシピエントになる個体であっても、形質転換Ｔ細胞のレシピエントになる個体とは異なる個体であってもよい。抗体遺伝子ドナーは、細胞ドナーと同じ個体であってもよく、または抗体遺伝子ドナーは、細胞ドナーとは異なる個体であってもよい。いくつかの実施形態では、細胞ドナーは、形質転換Ｔ細胞のレシピエントであり、抗体遺伝子ドナーは、異なる個体である。いくつかの実施形態では、細胞ドナーは、抗体遺伝子ドナーと同じ個体であり、形質転換Ｔ細胞のレシピエントとは異なる個体である。いくつかの実施形態では、細胞ドナーは、抗体遺伝子ドナーと同じ個体であり、形質転換Ｔ細胞のレシピエントと同じ個体である。
【０１１６】
抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲをコードする核酸分子は、発現したタンパク質が膜結合タンパク質となるようにするタンパク質配列に連結されたＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の機能的結合断片をコードするコード配列を含む。コード配列は、発現される単一の産物をコードするように連結されている。
【０１１７】
ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の機能的結合断片をコードするコード配列は、抗体遺伝子ドナー由来のＢ細胞から単離してもよい。こうしたＢ細胞を入手し、遺伝情報を単離してもよい。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞は、抗体を発現し、したがって抗体コード配列を保有しているハイブリッド細胞を生成するために使用される。抗体コード配列を決定して、これをクローン化し、ａｂｎｔｉ−ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲの作製に使用してもよい。ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識する抗体の機能的結合断片は、形質転換Ｔ細胞において発現したときにＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープに対するその結合活性を保持する抗体タンパク質の一部またはすべてを含み得る。
【０１１８】
発現したタンパク質が膜結合タンパク質となるようにするタンパク質配列のコード配列は、膜結合細胞タンパク質由来のものであってもよく、膜貫通ドメイン、および任意により、細胞質ドメインの少なくとも一部、および／または細胞外ドメインの一部、および発現したタンパク質を細胞膜に転位させるためのシグナル配列を含む。
【０１１９】
分子。核酸分子は、ドナーＴ細胞におけるコード配列の発現に必要な調節エレメントに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲコード配列を含む核酸分子は、プラスミドＤＮＡ分子である。いくつかの実施形態では、抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲコード配列を含む核酸分子は、発現ベクターであるプラスミドＤＮＡ分子であり、ここで、コード配列は、ドナーＴ細胞において抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲコード配列の発現に必要なプラスミドにおいて調節エレメントに作動可能に連結されている。いくつかの実施形態では、抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲコード配列を含む核酸分子は、ドナーＴ細胞を感染させるために使用されるウイルス粒子に組み込まれ得る。そのような粒子を調製するためのパッケージング技術は知られている。粒子に組み込まれたコード配列は、ドナーＴ細胞における抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲコード配列の発現に必要なプラスミド内の調節エレメントに作動可能に連結され得る。いくつかの実施形態では、抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲコード配列を含む核酸分子は、ウイルスゲノムに組み込まれる。いくつかの実施形態では、ウイルスゲノムは、ドナーＴ細胞を感染させるために使用されるウイルス粒子に組み込まれる。核酸分子を細胞に送達するためのウイルスベクターは周知であり、これらのベクターとしては、例えば、ワクチンウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ポックスウイルス、ならびに様々なレトロウイルスに基づくウイルスベクターが挙げられる。ウイルスゲノムに組み込まれた抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲコード配列は、ドナーＴ細胞内での抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲコード配列の発現に必要なプラスミド内の調節エレメントに作動可能に連結され得る。
【０１２０】
形質転換Ｔ細胞内での核酸の発現時に、形質転換細胞を試験して、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を同定することができる。こうした形質転換Ｔ細胞は、標準技術を使用してサンプルから同定し、単離され得る。ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを含むタンパク質を固体支持体に付着させ、サンプルと接触させてもよい。次に、洗浄後に表面に残存しているＴ細胞の試験をさらに行い、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞を同定する。カラム、細胞に結合する標識タンパク質、セルソーター技術などのアフィニティー分離法も様々に使用することができる。また、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを認識するＴ細胞は、ＧＵＣＹ２Ｃの少なくとも１つのエピトープを有するタンパク質の存在下でのそれらの反応性によっても同定され得る。
【０１２１】
Ｔ細胞が少なくとも１つのエピトープＧＵＣＹ２Ｃを認識するＴ細胞として同定されると、細胞の成長および分裂を促進し、維持して指数関数的な数の同一細胞を産生する条件を用いて組織培養技術を使用して、クローン増殖させ得る。Ｔ細胞の増殖集団は、患者への投与のために収集され得る。
【０１２２】
いくつかの実施形態による少なくともＧＵＣＹ２Ｃのエピトープを認識する複数のＴ細胞は、細胞と組み合わせて薬学的に許容される担体を含む。細胞を含む医薬配合物は周知であり、当業者によって日常的に配合され得る。好適な医薬担体は、この分野の標準的な参照テキストであるＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａ．Ｏｓｏｌに記載されており、これは、参照により本明細書に組み込まれる。本発明は、注入用の医薬組成物に関する。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、例えば、複数の細胞は、薬学的に受容可能なビヒクルと関連する懸濁液として配合され得る。こうしたビヒクルの例は、水、生理食塩水、リンガー溶液、デキストロース溶液、および５％ヒト血清アルブミンである。ビヒクルは、等張性（例えば、塩化ナトリウム、マンニトール）および化学的安定性（例えば、緩衝液および保存剤）を維持する添加物を含み得る。ビヒクルは、一般的に使用される技術により細胞を加える前に滅菌される。
【０１２４】
複数の細胞は、それらが癌細胞と接触できるようにする任意の手段によって投与され得る。医薬組成物は、例えば静脈内投与されてもよい。
【０１２５】
投薬量は、複数の細胞の性質、レシピエントの年齢、健康、および体重；症状の性質および程度、同時治療の種類、治療の頻度、および望ましい効果によって異なる。一般に、１ｘ１０１０〜１ｘ１０１２のＴ細胞が投与されるが、１ｘ１０９〜１ｘ１０１３など、より多くまたはより少ない数も投与され得る。典型的には、１ｘ１０１１  Ｔ細胞が投与される。送達される細胞の数は、防御的または治療的応答を誘発するのに十分な量である。当業者は、ルーチンの方法により範囲および最適な投薬量を容易に決定することができる。
【０１２６】
抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲにより治療される患者としては、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する患者が挙げられる。いくつかの実施形態では、こうした癌は、転移性結腸直腸癌、転移性もしくは原発性胃癌、転移性もしくは原発性食道癌、転移性もしくは原発性口腔癌、転移性もしくは原発性唾液腺癌または転移性もしくは原発性膵癌またはＧＵＣＹ２Ｃ発現を有すると同定された他の任意の癌であり得る。いくつかの実施形態では、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を含む癌を有することが疑われる患者は、抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲにより治療される。いくつかの実施形態では、抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲによる治療の前に、患者は、転移性結腸直腸癌、転移性もしくは原発性胃癌、転移性もしくは原発性食道癌、転移性もしくは原発性口腔癌、転移性もしくは原発性唾液腺癌、または転移性もしくは原発性膵癌患者として同定される。いくつかの実施形態では、抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲによる治療の前に、患者からの癌のサンプルをＧＵＣＹ２Ｃ発現について試験し、ＧＵＣＹ２Ｃ発現について陽性である癌を有するそれらの患者を抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲにより治療する。いくつかの実施形態では、抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲによる治療の前に、患者は腫瘍を除去するために手術を受け、患者から除去された腫瘍のサンプルは、ＧＵＣＹ２Ｃ発現について試験され、ＧＵＣＹ２Ｃ発現について陽性である癌を有する患者は、抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲにより治療する。
【０１２７】
抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲは、転移性結腸直腸癌、転移性もしくは原発性胃癌、転移性もしくは原発性食道癌、転移性もしくは原発性口腔癌、転移性もしくは原発性唾液腺癌または転移性もしくは原発性膵癌などのＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌のリスクが高いと同定された個体において、癌を予防するのに有用であり得る。個体は、家族の病歴、遺伝的背景、または転移性結腸直腸癌、転移性もしくは原発性胃癌、転移性もしくは原発性食道癌、転移性もしくは原発性口腔癌、転移性もしくは原発性唾液腺癌または転移性もしくは原発性膵癌などのＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌の以前の診断および癌を除去する治療であるか、または明らかな寛解もしくは無癌状態となる治療に基づいて、ＧＵＣＹ２Ｃを発現する癌細胞を有する癌のリスクが高くなっていると同定され得る。
実施例
実施例１
【０１２８】
転移性結腸直腸癌、転移性または原発性胃癌、食道癌、口腔癌、唾液腺癌、膵癌、またはＧＵＣＹ２Ｃを発現する他の癌などのＧＵＣＹ２Ｃ発現悪性腫瘍の患者に使用され得るヒトＧＵＣＹ２Ｃ標的型ＣＡＲが同定されている。この抗ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲは、抗原依存性Ｔ細胞活性化、サイトカイン産生、および細胞溶解活性を誘導した。ヒトＧＵＣＹ２Ｃを標的とするＣＡＲ−Ｔ細胞は、免疫担当同系マウスモデル、およびヒト結腸直腸癌の異種移植モデルにおける転移性腫瘍に対して有効であった。
材料および方法
【０１２９】
細胞株および試薬。ＣＴ２６およびβ−ガラクトシダーゼ発現ＣＴ２６．ＣＬ２５マウス結腸直腸癌細胞株およびヒト結腸直腸癌細胞株Ｔ８４およびＳＷ４８０はＡＴＣＣから入手し、大量の低継代細胞を凍結保存した。細胞は元の供給業者によって認証され、形態、成長、抗生物質耐性（適切な場合はＧＵＣＹ２Ｃおよびβ−ガラクトシダーゼの発現）、およびｉｎ  ｖｉｖｏでの転移パターンによって通常どおり認証され、Ｕｎｉｖｅｒｓａｌ  Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ  Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔ（ＡＴＣＣ、カタログ番号、３０−１０１２Ｋ）を用いて、マイコプラズマについて通常どおりスクリーニングした。マウスに注射する前に、細胞を通常どおり２週間未満培養した。ヒトＧＵＣＹ２Ｃをコードする遺伝子をコドン最適化し、かつ合成し（Ｇｅｎｅ  Ａｒｔ、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、レトロウイルス構築物ｐＭＳＣＶｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）にクローニングした。ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２ＣおよびＣＴ２６．ＣＬ２５．ｈＧＵＣＹ２Ｃは、ＣＴ２６およびＣＴ２６．ＣＬ２５細胞にｈＧＵＣＹ２Ｃをコードするレトロウイルス上清を形質導入し、その後ピューロマイシンで選択することにより生成した。レトロウイルス上清は、ｐＭＳＣＶ−Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）またはｈＧＵＣＹ２Ｃ−ｐＭＳＣＶ  ＰｕｒｏおよびｐＣＬ−Ｅｃｏ（Ｉｍｇｅｎｅｘ）レトロウイルスパッケージングベクター（１２）を使用して、Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏレトロウイルスパッケージング細胞株（Ｇａｒｙ  Ｎｏｌａｎ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）をトランスフェクトすることによって産生した。ルシフェラーゼを含むＴ８４．ｆＬｕｃ細胞は、２９３ＦＴ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をｐＬｅｎｔｉ４−Ｖ５−ＧＷ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ．ｐｕｒｏ（Ａｎｄｒｅｗ  Ａｐｌｉｎ，Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙのご厚意により提供された）およびＶｉｒａＰｏｗｅｒ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｐａｃｋａｇｉｎｇ  Ｍｉｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によりトランスフェクトすること（製造業者の指示に準拠）によって生成したレンチウイルス上清を形質導入し、その後ピューロマイシンで選択することによって生成した。ヒトＧＵＣＹ２Ｃ特異的抗体５Ｆ９からの一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）をｐＦＵＳＥ−ｒＩｇＧ−Ｆｃ２（ＩＬ２ｓｓ）プラスミド（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ）にクローン化し、ウサギＦｃ（５Ｆ９−ｒＦｃ）との５Ｆ９  ｓｃＦｖ融合タンパク質を産生した。５Ｆ９−ｒＦｃは、トランスフェクションされた２９３Ｆ細胞（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の上清に収集され、ＢＳＡまたは組換え６ｘＨｉｓタグ付きｈＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン（６ｘＨｉｓ−ｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤ）タンパク質でコーティングされたＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ  ＰｏｌｙＳｏｒｐ）で滴定され、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによりＨＥＫ２９３−６Ｅ細胞からの契約（ｕｎｄｅｒ  ｃｏｎｔｒａｃｔ）で精製し、ＨＲＰコンジュゲートヤギ抗ウサギ（Ｊａｃｋｓｏｎ  ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ）で検出した。フローサイトメトリーでは、細胞を、ＦＡＣＳバッファー（１％熱不活化ＦＢＳを含むＰＢＳ）で希釈した５Ｆ９−ｒＦｃま���は非トランスフェクト２９３Ｆ細胞からの対照上清で染色し、その後ＦＡＣＳバッファーで二次Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８−コンジュゲート抗ウサギ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で染色した。細胞を２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ）で固定し、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターおよびＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて分析した。
【０１３０】
マウスＣＡＲ−Ｔ細胞の生成。前述のように、マウスＣＡＲ成分を使用して、第三世代のコドン最適化レトロウイルスＣＡＲ構築物を作製した。５Ｆ９ヒトＧＵＣＹ２Ｃ特異的抗体に由来するコドン最適化ｓｃＦｖ配列を、マウス配列のＢｉＰシグナルペプチド、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通ドメインおよび細胞内ドメイン、ならびに４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＣＤ３ζ細胞内ドメインを含むＣＡＲ構築物にクローニングして、５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ構築物を産生した。ヒトＥＲＢＢ２（Ｈｅｒ２）特異的抗体４Ｄ５またはマウスＣＤ１９特異的抗体１Ｄ３に由来するＣＡＲを、示されるように対照として使用した（対照ｍ２８ＢＢｚ）。ＣＡＲをｐＭＳＣＶ−ＩＲＥＳ−ＧＦＰ（ｐＭＩＧ）レトロウイルスベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ＃２７４９０）にサブクローニングした。Ｃａｌｃｉｕｍ  Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ＰｒｏｆｅｃｔｉｏｎＲ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して、Ｐｈｏｅｎｉｘ−Ｅｃｏレトロウイルスパッケージング細胞株（Ｇａｒｙ  Ｎｏｌａｎ，Ｓｔａｎｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）を、ＣＡＲ−ｐＭＩＧベクターおよびｐＣＬ−Ｅｃｏレトロウイルスパッケージングベクター（Ｉｍｇｅｎｅｘ）によりトランスフェクトした。レトロウイルスを含む上清を４８時間後に収集し、０．４５μＭフィルタで濾過し、アリコートを−８０℃で凍結した。マウスＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ８α＋Ｔ細胞分離キットＩＩおよびＬＳ磁気カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して、ＢＡＬＢ／ｃ脾細胞からネガティブに選択した。続いて、ＣＤ８＋Ｔ細胞を抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８コーティングビーズ（Ｔ  Ｃｅｌｌ  Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ／Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ  Ｋｉｔ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ）を用いて、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ２（ＮＣＩリポジトリ）を含むｃＲＰＭＩ中、１ｘ１０６細胞／ｍｌの１：１のビーズ：細胞比で刺激した。刺激の翌日、培地の１／２を、８μｇ／ｍｌポリブレン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）の存在下で等量の解凍したレトロウイルス上清と注意深く交換した。スピノキュレーションは、室温で２５００ｒｐｍで９０分間行い、その後３７℃で２．５時間インキュベートし、その時点で細胞をペレット化し、１００Ｕ／ｍＬ  ＩＬ２を含む新鮮な培地に再懸濁した。Ｔ細胞は、新鮮なｃＲＰＭＩおよびＩＬ２により１ｘ１０６細胞／ｍｌに毎日希釈することにより７〜１０日間増殖させ、その時点で機能アッセイに使用した。
【０１３１】
ヒトＣＡＲ−Ｔ細胞の生成。ヒトＴ細胞を用いた研究では、規制および制度上の要件に従って、同意したボランティアからＰＢＭＣを収集した。ＭＡＣＳ（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で精製したＣＤ８＋Ｔ細胞は、９０％を超える純度で個々の正常な健康ドナー全血からネガティブに選択した。ヒト配列を使用するＣＡＲドメインを使用して、５Ｆ９ヒトＧＵＣＹ２Ｃ特異的ｓｃＦｖと、ヒト配列のＧＭ−ＣＳＦシグナルペプチド、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ２８膜貫通および細胞内ドメイン、ならびに４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）およびＣＤ３ζ細胞内ドメインとを含む第三世代のコドン最適化レトロウイルスＣＡＲ構築物を作製して、５Ｆ９．ｈ２８ＢＢｚ（配列番号１）を産生した。ＣＡＲをコードする両種性γ−１６６レトロウイルスの産生は、マウスＴ細胞の産生と類似していたが、ｐＣＬ−ＥｃｏをｐＣＬ−Ａｍｐｈｏパッケージングプラスミド（Ｉｍｇｅｎｅｘ）に置き換えた。レトロウイルスの形質導入は、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ  ＣＤ３／ＣＤ２８  Ａｃｔｉｖａｔｏｒ（Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）による活性化後３日目または４日目に生じた。細胞は、７日目にＧＦＰ濃縮のためのフローソーティングを受け、その後１０日目に実験的に使用した。培養期間中、ヒトＣＤ８＋Ｔ細胞は、１００Ｕ／ｍＬの組換えヒトＩＬ２（ＮＣＩリポジトリ）を補充したＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ培地（Ｓｔｅｍｃｅｌｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で維持した。
【０１３２】
ＣＡＲ表面検出。ＣＡＲで形質導入したＴ細胞は、ＰＢＳ中のＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、ＰＢＳ０．５％ＢＳＡ中、様々な濃度の６ｘＨｉｓ−ｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤで１時間標識し、抗５ｘＨｉｓ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７コンジュゲート（Ｑｉａｇｅｎ）および抗ＣＤ８ｂ−ＰＥ（クローンＨ３５．１７．２、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）によりＰＢＳ０．５％ＢＳＡ中で１時間染色し、２％ＰＦＡで固定し、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターおよびＦｌｏｗＪｏソフトウェアｖ１０（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を使用して分析した。ｈＧＵＣＹ２Ｃ結合は、生ＣＤ８＋ＣＡＲ＋（ＧＦＰ＋）細胞でのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ６４７の平均蛍光強度によって決定した。非線形回帰分析（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ６）を使用して、ＧＵＣＹ２Ｃ−ＣＡＲ結合のＫａｖおよびＢｍａｘを決定した。
【０１３３】
マウスＴ細胞の表現型、活性化マーカー、および細胞内サイトカイン染色。表現型解析では、１ｘ１０６の非形質導入またはＣＡＲ形質導入マウスＴ細胞をＰＢＳ中、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、その後抗ＣＤ８α−ＢＶ５７０（クローンＲＰＡ−Ｔ８；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＣＤ４５ＲＡ−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（クローン１４．８；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および抗ＣＤ６２Ｌ−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＭＥＬ−１４；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて、ＰＢＳ  ０．５％ＢＳＡ中３０分間表面マーカーを染色した。その後細胞を固定し、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍバッファーで、４℃で２０分間透過処理し（ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｋｉｔ；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、細胞内ＧＦＰ（ａｎｔｉ−ＧＦＰ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で４５分間Ｐｅｒｍ／洗浄バッファーで染色し、ＣＡＲで形質導入された細胞を特定した。次に、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌ染色に基づいて、サブセット：Ｔｎ／ｓｃｍ（ナイーブまたはＴメモリー幹細胞；ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、Ｔｃｍ（セントラルメモリーＴ細胞；ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−）、Ｔｅｍ（エフェクターメモリーＴ細胞；ＣＤ６２Ｌ  ＣＤ４５ＲＡ−）、およびＴｅｍｒａ（ＣＤ４５ＲＡを発現するエフェクターメモリーＴ細胞；ＣＤ６２Ｌ  ＣＤ４５ＲＡ＋）を定量化した。活性化マーカーおよびサイトカインの分析のために、１ｘ１０６ＣＡＲを形質導入したマウスＴ細胞を、事前に１μｇ／ｍＬＧＵＣＹ２Ｃを含むＰＢＳを４℃で一晩コーティングした組織培養プレート、または１ｘ１０６ＣＴ２６もしくはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ細胞を含む組織培養プレートにより、６時間刺激した。陽性対照として、ＣＡＲ−Ｔ細胞を１Ｘ細胞刺激カクテル（ＰＭＡ／イオノマイシン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）とともに６時間インキュベートした。細胞内サイトカインを評価する際、インキュベーションには、１Ｘタンパク質輸送阻害剤カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含めた。細胞をＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色し、その後抗ＣＤ８α−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（クローン５３．６−７；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ６９−ＰＥ（クローンＨ１．２Ｆ３；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＣＤ２５−ＰＥ（クローンＰＣ６１．５、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、および抗ＣＤ４４−ＡＰＣ（クローンＩＭ７；Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を用いて表面マーカーを染色した。細胞内サイトカイン染色は、ＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用し、抗ＧＦＰ−Ａｌｅｘａ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＩＦＮγ−ＡＰＣ−Ｃｙ７（クローンＸＭＧ１．２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＴＮＦα−ＰＥ−Ｃｙ７（クローンＭＰ６−ＸＴ２２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、抗ＩＬ２−ＡＰＣ（クローンＪＥＳ６−５Ｈ４；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）およびαＭＩＰ１α−ＰＥ（クローン３９６２４；Ｒ��Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓ）で染色した。細胞を２％ＰＦＡで固定し、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。分析は、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて行った。
【０１３４】
ヒトＴ細胞活性化マーカーおよび細胞内サイトカイン染色。活性化マーカーおよびサイトカインの分析のために、１ｘ１０６ヒトＧＵＣＹ２Ｃ指向ＣＡＲ形質導入ヒトＴ細胞を、１０μｇ／ｍＬヒトＧＵＣＹ２ＣまたはＢＳＡ対照抗原を含むＰＢＳで４℃で一晩コーティングした組織培養プレートにより、またはＣＡＲ−Ｔ細胞のプレーティング時に添加した１Ｘ細胞刺激カクテル（ＰＭＡ／イオノマイシン、ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により、６時間刺激した。すべての状態に、インキュベーション期間の開始時に１Ｘタンパク質輸送阻害剤カクテル（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含めた。細胞は、ＬＩＶＥ／ＤＥＡＤ  Ｆｉｘａｂｌｅ  Ａｑｕａ  Ｄｅａｄ  Ｃｅｌｌ  Ｓｔａｉｎキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を含むＰＢＳで１０分間染色し、その後抗ＣＤ８−Ｑｄｏｔ  ８００（クローン３Ｂ５、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）および抗ＣＤ６９−ＡＰＣ（クローンＬ７８、ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＰＢＳ０．５％ＢＳＡを用いて２５分間表面マーカーを染色した。細胞内サイトカイン染色は、Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍバッファーでの２０分間固定、および抗ＧＦＰ−Ａｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ４８８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、抗ＩＦＮγ−ＢＶ６０５（クローン４Ｓ．Ｂ３；ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ）、抗ＴＮＦα−ＰｅｒＣＰ−Ｃｙ５．５（クローンＭａｂ１１；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）、および抗ＩＬ２−ＰＥ（クローンＭＱ１−１７Ｈ１２；ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を含むＢＤ  ｐｅｒｍ洗浄バッファーによる４５分間の染色から構成されたＢＤ  Ｃｙｔｏｆｉｘ／Ｃｙｔｏｐｅｒｍ  Ｋｉｔ（ＢＤ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して行った。細胞を２％ＰＦＡで固定し、ＢＤ  ＬＳＲ  ＩＩフローサイトメーターで分析した。分析は、ＦｌｏｗＪｏ  ｖ１０ソフトウェア（Ｔｒｅｅ  Ｓｔａｒ）を用いて行った。
【０１３５】
Ｔ細胞細胞傷害性アッセイ。ｘＣＥＬＬｉｇｅｎｃｅリアルタイム細胞性細胞毒性システム（Ａｃｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）は、前述のようにＣＡＲ  Ｔ細胞性細胞毒性の評価に利用した（１２）。簡潔に説明すると、１ｘ１０４  ＣＴ２６またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃまたは２．５ｘ１０４  Ｔ８４またはＳＷ４８０癌細胞標的を、Ｅ−Ｐｌａｔｅ  １６（Ａｃｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）の各ウェルに入れた１５０μＬの成長培地にプレーティングし、３７℃のインキュベーターで一晩成長させ、ＲＴＣＡ  ＤＰアナライザーシステムおよびＲＴＣＡソフトウェアバージョン２．０（Ａｃｅａ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ  Ｉｎｃ．）を使用して、１５分ごとに電気インピーダンスを定量化した。Ｔ細胞実験は、マウスの場合は約２４時間後、ヒトの場合は６時間後に、５０μＬのＣＡＲ−Ｔ細胞を添加する（マウスＴ細胞の場合はＥ：Ｔ比５：１、またはヒトＴ細胞の場合はＥ：Ｔ比１０：１）か、またはそれぞれ陰性対照および陽性対照として、５０μＬ培地を、または１０％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００（Ｆｉｓｈｅｒ）を最終２．５％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００となるように添加した。細胞媒介殺傷は、１５分ごとに電気インピーダンスを読み取り、次の１０〜２０時間にわたって定量化した。特異的溶解値（％）は、各時点での各複製についてＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  ｖ６を使用して、正規化のために培地およびＴｒｉｔｏｎ−Ｘ  １００を添加後、インピーダンス値を使用して計算した（それぞれ０％および１００％の特異的溶解値）。あるいは、β−ｇａｌ放出Ｔ細胞細胞傷害性アッセイは、β−ガラクトシダーゼを発現するＣＴ２６癌細胞標的（ＣＴ２６．ＣＬ２５）を利用した。癌細胞標的は、９６ウェルプレートに２ｘ１０５細胞／ウェルでプレーティングし、複数の漸増量のエフェクターＣＡＲ  Ｔ細胞と癌細胞標的の比で３７℃で４時間インキュベートした。放出されたβ−ガラクトシダーゼは、Ｇａｌａｃｔｏ−Ｌｉｇｈｔ  Ｐｌｕｓ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して培地で測定した。最大放出は、供給された溶解緩衝液で溶解された細胞の上清から決定した。２５８％特異的溶解値＝［（実験的放出−自然放出）／（最大放出−自然放出）］ｘ１００
【０１３６】
転移性腫瘍モデル。ＢＡＬＢ／ｃマウスおよびＮＳＧ（ＮＯＤ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒγｎｕｌｌ）マウスは、それぞれＮＣＩ  Ａｎｉｍａｌ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｆｒｅｄｅｒｉｃｋ，ＭＤ）およびＪａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｓ（Ｂａｒ  Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ）から入手した。動物プロトコルは、Ｔｈｏｍａｓ  Ｊｅｆｆｅｒｓｏｎ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃａｒｅ  ａｎｄ  Ｕｓｅ  Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅによって承認されたものである。同系マウスモデルでは、肺転移を確立するために、５ｘ１０５ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ細胞を含む１００μＬのＰＢＳを尾静脈注射によってＢＡＬＢ／ｃマウスに注射した。示された日に、マウスは、ＰａｎＴａｋ、３１０ｋＶｅ  Ｘ線装置で５Ｇｙの全身照射の非骨髄破壊的線量を受けた。マウスは、示された時点で、尾静脈によって、ＣＤ８＋ＢＡＬＢ／ｃ  Ｔ細胞を含む１００μＬのＰＢＳから産生された示された用量のＣＡＲ−Ｔ細胞を受けた。癌細胞注射後１８日目にマウスの生存を追跡するか、屠殺し、肺を墨汁で染色し、腫瘍を数えるためにＦｅｋｅｔｅの溶液で固定した。再チャレンジ実験では、ナイーブマウスまたはＣＡＲ−Ｔ細胞によって確立された腫瘍を取り除いたマウス（「生存マウス」と呼ばれる）に、尾静脈注射により５ｘ１０５ＣＴ２６またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃを１回投与した。生存マウスは、再チャレンジ実験の１６〜４０週間前に最初にチャレンジした。ヒト腫瘍異種移植モデルでは、ＮＳＧ（２３）マウス（ＪＡＸストック＃００５５５７）に腹腔内注射により２．５ｘ１０６Ｔ８４．ｆＬｕｃ細胞を含む１００μＬＰＢＳを注射した。マウスは、癌細胞接種後１４日目に、ＣＤ８＋ＢＡＬＢ／ｃ  Ｔ細胞を含む１００μＬＰＢＳから産生された合計１０７のＴ細胞（ＣＡＲ＋で分類されていない）の用量の腹腔内注射を受けた。腫瘍の成長は、１５ｍｇ／ｍｌ  Ｄ−ルシフェリンカリウム塩（Ｇｏｌｄ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を含む２５０μＬ  ＰＢＳ溶液の皮下注射と、Ｃａｌｉｐｅｒ  ＩＶＩＳ  Ｌｕｍｉｎａ−ＸＲ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｔａｔｉｏｎ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して、８分間の曝露後に撮像して毎週２８１回モニターした。総放射輝度（光子／秒）は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｉｎ  Ｖｉｖｏ  Ｉｍａｇｉｎｇソフトウェア（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を使用して定量化した。
結果および考察
ｈＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞
【０１３７】
ヒトＧＵＣＹ２Ｃ（ｈＧＵＣＹ２Ｃ）に特異的な組換え抗体（クローン５Ｆ９）は、精製されたｈＧＵＣＹ２Ｃ細胞外ドメイン（図１パネルＡ）およびｈＧＵＣＹ２Ｃを発現するように設計されたマウスＣＴ２６結腸直腸癌細胞に結合したが、ｈＧＵＣＹ２Ｃ欠損ＣＴ２６癌細胞には結合しなかった（図１パネルＢ）。５Ｆ９  ｓｃＦｖを使用して、ＢｉＰシグナル配列、ＣＤ８αヒンジ領域、細胞内ＣＤ２８、４−１ＢＢ、およびＣＤ３ζシグナル伝達部分を含む第三世代マウスＣＡＲ構築物（５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ）を生成し、レトロウイルス構築物に挿入した（図１パネルＣ）。対照ｍ２８ＢＢｚまたは５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲコードレトロウイルスを使用して、マウスＴ細胞をＧＦＰ形質導入マーカーによる定量化で約３５〜４５％の形質導入効率にて形質導入した（図１パネルＤ）。ｈＧＵＣＹ２Ｃ結合アビディティ（Ｋａｖ＝１１．２ｎＭ）およびＣＡＲ発現（Ｂｍａｘ＝９５７．８  ＭＦＩ）は、ＣＡＲ−Ｔ細胞を複数の漸増濃度の精製６ｘＨｉｓタグ付きｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤとインキュベートし、その後標識α５ｘＨｉｓ抗体で検出し、フローサイトメトリーで評価することにより定量化したもので、マウスＧＵＣＹ２Ｃに対して機能的反応性を示したＣＡＲと同等であった（１２）（図１パネルＤ〜Ｅおよび配列番号１）。
ｈＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲによるＴ細胞の活性化およびエフェクター機能の媒介
【０１３８】
対照ｍ２８ＢＢｚまたはｈＧＵＣＹ２Ｃ特異的５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ構築物による精製マウスＣＤ８＋Ｔ細胞の形質導入は、非形質導入細胞と比較してＴ細胞表現型に影響を与えることはなく（図２パネルＢ）、メモリーおよびエフェクターの表現型の混合物［Ｔｎ／ｓｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ＋）、Ｔｃｍ（ＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４５ＲＡ−）、Ｔｅｍ（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ−）、およびＴｅｍｒａ（ＣＤ６２Ｌ−ＣＤ４５ＲＡ＋）］を産生し、これは、ＩＬ２の存在下で産生されたＣＡＲ−Ｔ細胞の他のＣＡＲ構築物と同様であった。ｈＧＵＣＹ２Ｃ特異的であるが、対照ではないＣＡＲ−Ｔ細胞は、固定化されたｈＧＵＣＹ２ＣＥＣＤタンパク質またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ細胞（図６および図７のパネルＡおよびＢ）で刺激したときに、活性化マーカーＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＣＤ４４をアップレギュレートし（図２パネルＣ）、エフェクターサイトカインＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ２、およびＭＩＰ１αを産生した（図２パネルＤ）。５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞をＢＳＡまたはｈＧＵＣＹ２Ｃ欠損ＣＴ２６細胞で刺激した場合、活性化マーカーおよびサイトカイン応答はなく、５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲによるＴ細胞の活性化が抗原依存性であることが確認された（（図２パネルＣ〜Ｄ、図６および図７のパネルＡおよびＢ）。５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでｈＧＵＣＹ２Ｃ欠損ＣＴ２６細胞に対して不活性であったが（図２パネルＥ）、電気インピーダンスアッセイを使用して定量化させ（図２パネルＥ）、β−ガラクトシダーゼ放出Ｔ細胞細胞傷害性アッセイで確認した（図８パネルＡおよびＢ）ところ、時間依存的なＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ細胞の死滅を示した（図２パネルＥ）。
ｈＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、転移性結腸直腸癌に対抗する。
【０１３９】
内因性免疫系は、腫瘍微小環境で免疫抑制を誘発し、長期持続に必要なリソースのために養子移入Ｔ細胞と競合する可能性がある。その文脈では、低用量全身照射（ＴＢＩ）または化学療法などのリンパ球枯渇コンディショニングレジメンでは、免疫抑制細胞を排除し、ＩＬ７およびＩＬ１５などの恒常性サイトカインの競合を減少させることによって養子移入Ｔ細胞の有効性を高める。免疫担当マウスモデルおよび５Ｇｙ全身照射（ＴＢＩ）の非骨髄破壊的線量を利用して、臨床治療レジメンを模倣した。免疫担当ＢＡＬＢ／ｃマウスは、ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ細胞を尾静脈より受けて肺転移を引き起こし、３日後にＴＢＩおよび複数の漸増用量のマウスＣＡＲ−Ｔ細胞で治療した（図３パネルＡ）。ｈＧＵＣＹ２Ｃ標的５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞では（対照ではない）、用量１０７Ｔ細胞でマウスの生存が改善した（図３パネルＡ）。この用量は、癌細胞接種の７日後に投与した場合にも有効であり（図３パネルＢ）、１４日目に投与した２回目の用量は、７日目の単回投与と比較して生存期間中央値がさらに上昇した（１５０超ｖｓ９３．５日、ｐ＜０．０５；図３パネルＣ）。癌細胞接種の１８日後（治療後１１日）に収集された肺には腫瘍結節が含まれ、５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞治療により肉眼的腫瘍が消失した一方で、対照マウスは肺転移に負けたことが確認された（図３パネルＤ）。生存マウスがｈＧＵＣＹ２Ｃ発現腫瘍に対して持続的な保護を呈したかを判断するために、長期生存者（最初の癌細胞接種後１６１〜２８２日）に対して尾静脈注射によって親ＣＴ２６またはＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ細胞のいずれかでチャレンジし、ｈＧＵＣＹ２Ｃ特異的保護を調査した（図３パネルＥ）。ＣＴ２６腫瘍は、一部のワクチン接種レジメンにおいて、防御的ｇｐ７０特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を生じさせるマウス白血病ウイルスに由来するｇｐ７０エンベロープタンパク質を保有することが知られている。親ＣＴ２６癌細胞でチャレンジさせた長期生存およびナイーブマウスは、同一の死亡率を示し、長期生存マウスは、ＣＴ２６細胞において発現したｇｐ７０または他の抗原に対する防御免疫応答を生じなかったことを示している（図３パネルＥ）。逆に、長期生存マウスは、ナイーブ対照マウスと比較して、ＣＴ２６．ｈＧＵＣＹ２Ｃ癌細胞から保護されており、５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞がｈＧＵＣＹ２Ｃ発現腫瘍に対して持続的な保護をもたらすことを示している（図３パネルＥ）。
ｈＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ヒト結腸直腸腫瘍を認識する。
【０１４０】
次に、ｈＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞がヒト結腸直腸腫瘍においてネイティブｈＧＵＣＹ２Ｃを認識するかを判断した。組換えｈＧＵＣＹ２Ｃ特異的抗体５Ｆ９は、ＧＵＣＹ２Ｃ発現Ｔ８４（図４パネルＡ）の表面でｈＧＵＣＹ２Ｃを染色したが、ＧＵＣＹ２Ｃ欠損ＳＷ４８０（図９パネルＡ）、ヒト結腸直腸癌細胞は染色しなかった。これに対応して、５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、時間依存的にＴ８４（図４パネルＢ）癌細胞を溶解したが、ＳＷ４８０（図９パネルＢ）癌細胞は溶解しなかった。対照ＣＡＲ−Ｔ細胞は、いずれのタイプのヒト癌細胞も死滅させることはなく、これは、死滅が抗原依存性であることを示している（図４パネルＡおよび図９パネルＡ）。ヒト５Ｆ９  ＣＡＲ構築物（５Ｆ９．ｈ２８ＢＢｚ）を発現するヒトＴ細胞は、ＧＵＣＹ２Ｃ刺激後にエフェクターサイトカインを産生し、ｈＧＵＣＹ２Ｃを内因的に発現させるヒト結腸直腸癌細胞を死滅させた（図１０パネルＡ〜Ｃ）。対照ではないｈＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＡＲ（５Ｆ９．ｍ２８ＢＢｚ）発現マウスＴ細胞は、腹膜転移モデルにおいてＴ８４ヒト結腸直腸腫瘍異種移植片を効果的に治療した（図４パネルＣ〜Ｅ）。一緒に、これらのデータは、５Ｆ９  ｓｃＦｖを用いて産生されたｈＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＡＲ構築物が、ｈＧＵＣＹ２Ｃを内因的に発現するヒト結腸直腸腫瘍のＴ細胞媒介性殺傷を再指示できることを示した。
【０１４１】
結腸直腸腫瘍抗原を標的とする養子Ｔ細胞療法は、抗原の「オンターゲット、オフ腫瘍」毒性によって制限されている。ＧＵＣＹ２Ｃは、完全同系マウスモデルにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞治療の潜在的な標的として以前に検証を行っており、このモデルでは、マウスＧＵＣＹ２Ｃを標的とするＣＡＲが、正常なＧＵＣＹ２Ｃ発現腸上皮への毒性がない場合に抗腫瘍効果を促進した。このモデルでは、ヒトＧＵＣＹ２Ｃ特異的ＣＡＲは、ＧＵＣＹ２Ｃ発現悪性腫瘍（ＮＣＴ０２２０２７５９、ＮＣＴ０２２０２７８５）の臨床試験で抗体薬物コンジュゲートとして現在使用されている抗体から産生され、マウスＴ細胞を使用した同系およびヒト結腸直腸腫瘍異種移植マウスモデルの両方において、Ｔ細胞の活性化、エフェクター機能および抗腫瘍効果を誘導する能力を示した。５Ｆ９  ｓｃＦｖから産生されたＣＡＲは、マウスＧＵＣＹ２Ｃと交差反応しない（図１１パネルＡおよびＢ）ため、マウスモデルにおいて腸毒性の定量化ができない。本明細書に記載のＣＡＲと前述のマウスＣＡＲの抗原認識ドメインの違い、およびマウスとヒトとの固有の違いは、マウスＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の安全性データにもかかわらず、ヒトへのＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞投与の注意を示唆している。したがって、ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の使用を診療所に移す場合には、ｍＲＮＡエレクトロポレーションまたは自殺遺伝子の取り込みによる一過性のＣＡＲ発現など、適切な安全対策を検討する必要がある。それにもかかわらず、ＧＵＣＹ２Ｃ標的ＣＡＲ−Ｔ細胞は、好適な抗原標的がないことによって制限されるパラダイムであるＴ細胞療法の装備として魅力的な手段である。ヒトＴ細胞系のさらなる開発およびヒト臨床試験への変換後、ＧＵＣＹ２Ｃ  ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、米国では年間１４０，０００人を超える死亡をもたらし、治療選択肢が限られている疾患設定である転移性胃腸悪性腫瘍の治療を変える可能性がある。
実施例２
【０１４２】
移入には、サイトカイン投与（主にＩＬ−２）、ＣＭＡ指向ワクチン接種および／または抗体療法、化学療法、シクロホスファミドによる宿主の前処置（ｐｒｅｐａｒａｔｉｖｅ）リンパ球枯渇およびフルダラビン全身照射（ＴＢＩ）、他の潜在的な補助療法など、様々な治療と組み合わせてもよい。
引用文献
Ｍａｕｄｅ  ＳＬ，  Ｆｒｅｙ  Ｎ，  Ｓｈａｗ  ＰＡ，  Ａｐｌｅｎｃ  Ｒ，  Ｂａｒｒｅｔｔ  ＤＭ，  Ｂｕｎｉｎ  ＮＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｆｏｒ  ｓｕｓｔａｉｎｅｄ  ｒｅｍｉｓｓｉｏｎｓ  ｉｎ  ｌｅｕｋｅｍｉａ．  Ｎ  Ｅｎｇｌ  Ｊ  Ｍｅｄ  ２０１４；３７１（１６）：１５０７−１７  ｄｏｉ  １０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１４０７２２２．
Ｌｅｅ  ＤＷ，  Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ＪＮ，  Ｓｔｅｔｌｅｒ−Ｓｔｅｖｅｎｓｏｎ  Ｍ，  Ｃｕｉ  ＹＫ，  Ｄｅｌｂｒｏｏｋ  Ｃ，  Ｆｅｌｄｍａｎ  ＳＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ  ＣＤ１９  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｆｏｒ  ａｃｕｔｅ  ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ  ｌｅｕｋａｅｍｉａ  ｉｎ  ｃｈｉｌｄｒｅｎ  ａｎｄ  ｙｏｕｎｇ  ａｄｕｌｔｓ：  ａ  ｐｈａｓｅ  １  ｄｏｓｅ−ｅｓｃａｌａｔｉｏｎ  ｔｒｉａｌ．  Ｌａｎｃｅｔ  ２０１５；３８５（９９６７）：５１７−２８  ｄｏｉ  １０．１０１６／Ｓ０１４０−  ６７３６（１４）６１４０３−３．
Ｌｏｕｉｓ  ＣＵ，  Ｓａｖｏｌｄｏ  Ｂ，  Ｄｏｔｔｉ  Ｇ，  Ｐｕｌｅ  Ｍ，  Ｙｖｏｎ  Ｅ，  Ｍｙｅｒｓ  ＧＤ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｎｔｉｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ａｎｄ  ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ  ｆａｔｅ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｐｏｓｉｔｉｖｅ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎ  ｐａｔｉｅｎｔｓ  ｗｉｔｈ  ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｏｍａ．  Ｂｌｏｏｄ  ２０１１；１１８（２３）：６０５０−６  ｄｏｉ  １０．１１８２／ｂｌｏｏｄ−２０１１−０５−３５４４４９．
Ｐａｒｋｈｕｒｓｔ  ＭＲ，  Ｙａｎｇ  ＪＣ，  Ｌａｎｇａｎ  ＲＣ，  Ｄｕｄｌｅｙ  ＭＥ，  Ｎａｔｈａｎ  ＤＡ，  Ｆｅｌｄｍａｎ  ＳＡ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｃａｒｃｉｎｏｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｃａｎ  ｍｅｄｉａｔｅ  ｒｅｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｂｕｔ  ｉｎｄｕｃｅ  ｓｅｖｅｒｅ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｃｏｌｉｔｉｓ．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１１；１９（３）：６２０−６  ｄｏｉ  １０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２７２．
Ｍｏｒｇａｎ  ＲＡ，  Ｙａｎｇ  ＪＣ，  Ｋｉｔａｎｏ  Ｍ，  Ｄｕｄｌｅｙ  ＭＥ，  Ｌａｕｒｅｎｃｏｔ  ＣＭ，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ．  Ｃａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔ  ｏｆ  ａ  ｓｅｒｉｏｕｓ  ａｄｖｅｒｓｅ  ｅｖｅｎｔ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ｔｈｅ  ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｔｒａｎｓｄｕｃｅｄ  ｗｉｔｈ  ａ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｒｅｃｏｇｎｉｚｉｎｇ  ＥＲＢＢ２．  Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  ２０１０；１８（４）：８４３−５１  ｄｏｉ  ｍｔ２０１０２４  ［ｐｉｉ］  １０．１０３８／ｍｔ．２０１０．２４．
Ａｋａ  ＡＡ，  Ｒａｐｐａｐｏｒｔ  ＪＡ，  Ｐａｔｔｉｓｏｎ  ＡＭ，  Ｓａｔｏ  Ｔ，  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  Ｇｕａｎｙｌａｔｅ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ａｓ  ａ  ｔａｒｇｅｔ  ｆｏｒ  ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ，  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ，  ａｎｄ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｉｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｅｘｐｅｒｔ  ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ２０１７；１０（５）：５４９−５７  ｄｏｉ  １０．１０８０／１７５１２４３３．２０１７．１２９２１２４．
Ｖａｌｅｎｔｉｎｏ  ＭＡ，  Ｌｉｎ  ＪＥ，  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｌｉ  Ｐ，  Ｋｉｍ  ＧＷ，  Ｍａｒｓｚａｌｏｗｉｃｚ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａ  ｕｒｏｇｕａｎｙｌｉｎ−ＧＵＣＹ２Ｃ  ｅｎｄｏｃｒｉｎｅ  ａｘｉｓ  ｒｅｇｕｌａｔｅｓ  ｆｅｅｄｉｎｇ  ｉｎ  ｍｉｃｅ．  Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ  ２０１１；１２１（９）：３５７８−８８  ｄｏｉ  １０．１１７２／ＪＣＩ５７９２５．
Ｃａｒｒｉｔｈｅｒｓ  ＳＬ，  Ｂａｒｂｅｒ  ＭＴ，  Ｂｉｓｗａｓ  Ｓ，  Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ  ＳＪ，  Ｐａｒｋ  ＰＫ，  Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎ  ＳＤ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｉｓ  ａ  ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ｍａｒｋｅｒ  ｆｏｒ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｅｘｔｒａｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｉｓｓｕｅｓ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９６；９３（２５）：１４８２７−３２．
Ｂｉｒｂｅ  Ｒ，  Ｐａｌａｚｚｏ  ＪＰ，  Ｗａｌｔｅｒｓ  Ｒ，  Ｗｅｉｎｂｅｒｇ  Ｄ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  Ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｉｓ  ａ  ｍａｒｋｅｒ  ｏｆ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｍｅｔａｐｌａｓｉａ，  ｄｙｓｐｌａｓｉａ，  ａｎｄ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ．  Ｈｕｍ  Ｐａｔｈｏｌ  ２００５；３６（２）：１７０−９  ｄｏｉ  １０．１０１６／ｊ．ｈｕｍｐａｔｈ．２００４．１２．００２．
Ｗｏｌｆｅ  ＨＲ，  Ｍｅｎｄｉｚａｂａｌ  Ｍ，  Ｌｌｅｏｎｇ  Ｅ，  Ｃｕｔｈｂｅｒｔｓｏｎ  Ａ，  Ｄｅｓａｉ  Ｖ，  Ｐｕｌｌａｎ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｍａｇｉｎｇ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｎ  ｃａｎｃｅｒ  ｘｅｎｏｇｒａｆｔｓ  ｉｎ  ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ  ｕｓｉｎｇ  ａ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ−−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｌｉｇａｎｄ．  Ｊ  Ｎｕｃｌ  Ｍｅｄ  ２００２；４３（３）：３９２−９．
Ｃｏｒａｄｉｎｉ  Ｄ，  Ｃａｓａｒｓａ  Ｃ，  Ｏｒｉａｎａ  Ｓ．  Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ  ｐｏｌａｒｉｔｙ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒｉｇｅｎｅｓｉｓ：  ｎｅｗ  ｐｅｒｓｐｅｃｔｉｖｅｓ  ｆｏｒ  ｃａｎｃｅｒ  ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ａｃｔａ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ  Ｓｉｎ  ２０１１；３２（５）：５５２−６４  ｄｏｉ  １０．１０３８／ａｐｓ．２０１１．２０．
Ｍａｇｅｅ  ＭＳ，  Ｋｒａｆｔ  ＣＬ，  Ａｂｒａｈａｍ  ＴＳ，  Ｂａｙｂｕｔｔ  ＴＲ，  Ｍａｒｓｚａｌｏｗｉｃｚ  ＧＰ，  Ｌｉ  Ｐ，  ｅｔ  ａｌ．  ＧＵＣＹ２Ｃ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ  ＣＡＲ−Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｏｐｐｏｓｅ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ａｕｔｏｉｍｍｕｎｉｔｙ．  Ｏｎｃｏｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  ２０１６；５（１０）：ｅ１２２７８９７  ｄｏｉ  １０．１０８０／２１６２４０２ｘ．２０１６．１２２７８９７．
Ｍａｒｓｚａｌｏｗｉｃｚ  ＧＰ，  Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｍａｇｅｅ  ＭＳ，  Ｍｅｒｌｉｎｏ  Ｄ，  Ｂｅｒｍａｎ−Ｂｏｏｔｙ  ＬＤ，  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  ＧＵＣＹ２Ｃ  ｌｙｓｏｓｏｍｏｔｒｏｐｉｃ  ｅｎｄｏｃｙｔｏｓｉｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｓ  ｉｍｍｕｎｏｔｏｘｉｎ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｍｅｔａｓｔａｔｉｃ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１４；５（１９）：９４６０−７１ｄｏｉ  １０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．２４５５．
Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｌｉ  Ｐ，  Ｓｔａｆｆｏｒｄ  ＢＪ，  Ｆａｕｌ  ＥＪ，  Ｈｕａｎｇ  Ｌ，  Ｂｉｒｂｅ  ＲＣ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｌｉｎｅａｇｅ  ｓｐｅｃｉｆｉｃ  Ｔ−ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ  ｔｏ  ｃａｎｃｅｒ  ｍｕｃｏｓａ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｐｐｏｓｅ  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｗｉｔｈｏｕｔ  ｍｕｃｏｓａｌ  ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００９；６９（８）：３５３７−４４  ｄｏｉ  １０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−０８−３３８６．
Ｓｎｏｏｋ  ＡＥ，  Ｍａｇｅｅ  ＭＳ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  Ｗａｌｄｍａｎ  ＳＡ．  Ｓｅｌｅｃｔｉｖｅ  ａｎｔｉｇｅｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ４（＋）  Ｔ−ｃｅｌｌ，  ｂｕｔ  ｎｏｔ  ＣＤ８（＋）  Ｔ−  ｏｒ  Ｂ−ｃｅｌｌ，  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ｃｏｒｒｕｐｔｓ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ．  Ｅｕｒ  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２０１４；４４（７）：１９５６−６６  ｄｏｉ  １０．１００２／ｅｊｉ．２０１４４４５３９．
Ｈｏｄｓｏｎ  ＣＡ，  Ａｍｂｒｏｇｉ  ＩＧ，  Ｓｃｏｔｔ  ＲＯ，  Ｍｏｈｌｅｒ  ＰＪ，  Ｍｉｌｇｒａｍ  ＳＬ．  Ｐｏｌａｒｉｚｅｄ  ａｐｉｃａｌ  ｓｏｒｔｉｎｇ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｉｓ  ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  ｂｙ  ａ  ｃｙｔｏｓｏｌｉｃ  ｓｉｇｎａｌ．  Ｔｒａｆｆｉｃ  ２００６；７（４）：４５６−６４  ｄｏｉ  ＴＲＡ３９８  ［ｐｉｉ］  １０．１１１１／ｊ．１６００−  ０８５４．２００６．００３９８．ｘ．
Ｃｈａｒｎｅｙ  ＡＮ，  Ｅｇｎｏｒ  ＲＷ，  Ａｌｅｘａｎｄｅｒ−Ｃｈａｃｋｏ  ＪＴ，  Ｚａｈａｒｉａ  Ｖ，  Ｍａｎｎ  ＥＡ，  Ｇｉａｎｎｅｌｌａ  ＲＡ．  Ｅｆｆｅｃｔ  ｏｆ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｏｎ  ｃｏｌｏｎｉｃ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔ  ｉｎ  ｇｕａｎｙｌｙｌ  ｃｙｃｌａｓｅ  Ｃ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｍｉｃｅ．  Ａｍ  Ｊ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  Ｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔ  Ｌｉｖｅｒ  Ｐｈｙｓｉｏｌ  ２００１；２８０（２）：Ｇ２１６−２１．
Ｋｕｈｎ  Ｍ，  Ａｄｅｒｍａｎｎ  Ｋ，  Ｊａｈｎｅ  Ｊ，  Ｆｏｒｓｓｍａｎｎ  ＷＧ，  Ｒｅｃｈｋｅｍｍｅｒ  Ｇ．Ｓｅｇｍｅｎｔａｌ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｅｆｆｅｃｔｓ  ｏｆ  ｇｕａｎｙｌｉｎ  ａｎｄ  Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ  ｓｔａｂｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｏｎ  Ｃｌ−  ｓｅｃｒｅｔｉｏｎ  ｉｎ  ｈｕｍａｎ  ｇｕｔ．  Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ  １９９４；４７９  （Ｐｔ  ３）：４３３−４０．
Ｇｕａｒｉｎｏ  Ａ，  Ｃｏｈｅｎ  ＭＢ，  Ｏｖｅｒｍａｎｎ  Ｇ，  Ｔｈｏｍｐｓｏｎ  ＭＲ，  Ｇｉａｎｎｅｌｌａ  ＲＡ．  Ｂｉｎｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｅ．  ｃｏｌｉ  ｈｅａｔ−ｓｔａｂｌｅ  ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ  ｔｏ  ｒａｔ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌ  ｂｒｕｓｈ  ｂｏｒｄｅｒｓ  ａｎｄ  ｔｏ  ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ．  Ｄｉｇ  Ｄｉｓ  Ｓｃｉ  １９８７；３２（９）：１０１７−２６．
Ｗｉｔｅｋ  ＭＥ，  Ｎｉｅｌｓｅｎ  Ｋ，  Ｗａｌｔｅｒｓ  Ｒ，  Ｈｙｓｌｏｐ  Ｔ，  Ｐａｌａｚｚｏ  Ｊ，  Ｓｃｈｕｌｚ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｐｕｔａｔｉｖｅ  ｔｕｍｏｒ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  Ｃｄｘ２  ｉｓ  ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ  ｂｙ  ｈｕｍａｎ  ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ  ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｓ．  Ｃｌｉｎ  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２００５；１１（２４  Ｐｔ  １）：８５４９−５６  ｄｏｉ  １０．１１５８／１０７８−０４３２．ＣＣＲ−０５−１６２４．
Ｌｉｕ  Ｘ，  Ｊｉａｎｇ  Ｓ，  Ｆａｎｇ  Ｃ，  Ｙａｎｇ  Ｓ，  Ｏｌａｌｅｒｅ  Ｄ，  Ｐｅｑｕｉｇｎｏｔ  ＥＣ，  ｅｔ  ａｌ．  Ａｆｆｉｎｉｔｙ−  Ｔｕｎｅｄ  ＥｒｂＢ２  ｏｒ  ＥＧＦＲ  Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ  Ｅｘｈｉｂｉｔ  ａｎ  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  Ｉｎｄｅｘ  ａｇａｉｎｓｔ  Ｔｕｍｏｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ  ２０１５；７５（１７）：３５９６−６０７  ｄｏｉ  １０．１１５８／０００８−５４７２．ＣＡＮ−１５−０１５９．
Ｍｕｌｅ  ＪＪ，  Ｓｈｕ  Ｓ，  Ｓｃｈｗａｒｚ  ＳＬ，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ．  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｏｆ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｍｅｔａｓｔａｓｅｓ  ｗｉｔｈ  ＬＡＫ  ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ  ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−２．  Ｓｃｉｅｎｃｅ  １９８４；２２５（４６６９）：１４８７−９．
Ｓｈｕｌｔｚ  ＬＤ，  Ｌｙｏｎｓ  ＢＬ，  Ｂｕｒｚｅｎｓｋｉ  ＬＭ，  Ｇｏｔｔ  Ｂ，  Ｃｈｅｎ  Ｘ，  Ｃｈａｌｅｆｆ  Ｓ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｈｕｍａｎ  ｌｙｍｐｈｏｉｄ  ａｎｄ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｃｅｌｌ  ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｉｎ  ＮＯＤ／ＬｔＳｚ−ｓｃｉｄ  ＩＬ２Ｒ  ｇａｍｍａ  ｎｕｌｌ  ｍｉｃｅ  ｅｎｇｒａｆｔｅｄ  ｗｉｔｈ  ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｓｔｅｍ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  ２００５；１７４（１０）：６４７７−８９
Ｘｕ  ＸＪ，  Ｓｏｎｇ  ＤＧ，  Ｐｏｕｓｓｉｎ  Ｍ，  Ｙｅ  Ｑ，  Ｓｈａｒｍａ  Ｐ，  Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｇａｒｃｉａ  Ａ，  ｅｔ  ａｌ．    Ｍｕｌｔｉｐａｒａｍｅｔｅｒ  ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ  ｉｍｐａｃｔｓ  ｏｆ  ｖａｒｉｏｕｓ  ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ  ｏｎ  ＣＡＲＴ  ｃｅｌｌ  ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ  ａｎｄ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｅｘ  ｖｉｖｏ  ａｎｄ  ｉｎ  ｖｉｖｏ．  Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ  ２０１６  ｄｏｉ  １０．１８６３２／ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ．１０５１０．
Ｍｕｒａｎｓｋｉ  Ｐ，  Ｂｏｎｉ  Ａ，  Ｗｒｚｅｓｉｎｓｋｉ  Ｃ，  Ｃｉｔｒｉｎ  ＤＥ，  Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ，  Ｃｈｉｌｄｓ  Ｒ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｉｎｃｒｅａｓｅｄ  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ａｎｄ  ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ−ｈｏｗ  ｆａｒ  ｃａｎ  ｗｅ  ｇｏ？  Ｎａｔ  Ｃｌｉｎ  Ｐｒａｃｔ  Ｏｎｃｏｌ  ２００６；３（１２）：６６８−８１  ｄｏｉ  １０．１０３８／ｎｃｐｏｎｃ０６６６．
Ｇａｔｔｉｎｏｎｉ  Ｌ，  Ｆｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎ  ＳＥ，  Ｋｌｅｂａｎｏｆｆ  ＣＡ，  Ａｎｔｏｎｙ  ＰＡ，  Ｐａｌｍｅｒ  ＤＣ，  Ｓｐｉｅｓｓ  ＰＪ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｒｅｍｏｖａｌ  ｏｆ  ｈｏｍｅｏｓｔａｔｉｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｓｉｎｋｓ  ｂｙ  ｌｙｍｐｈｏｄｅｐｌｅｔｉｏｎ  ｅｎｈａｎｃｅｓ  ｔｈｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  ａｄｏｐｔｉｖｅｌｙ  ｔｒａｎｓｆｅｒｒｅｄ  ｔｕｍｏｒ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ＣＤ８＋  Ｔ  ｃｅｌｌｓ．  Ｊ  Ｅｘｐ  Ｍｅｄ  ２００５；２０２（７）：９０７−１２  ｄｏｉ  １０．１０８４／ｊｅｍ．２００５０７３２．
Ｈｕａｎｇ  ＡＹ，  Ｇｕｌｄｅｎ  ＰＨ，  Ｗｏｏｄｓ  ＡＳ，  Ｔｈｏｍａｓ  ＭＣ，  Ｔｏｎｇ  ＣＤ，  Ｗａｎｇ  Ｗ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｈｅ  ｉｍｍｕｎｏｄｏｍｉｎａｎｔ  ｍａｊｏｒ  ｈｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｉｌｉｔｙ  ｃｏｍｐｌｅｘ  ｃｌａｓｓ  Ｉ−ｒｅｓｔｒｉｃｔｅｄ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｏｆ  ａ  ｍｕｒｉｎｅ  ｃｏｌｏｎ  ｔｕｍｏｒ  ｄｅｒｉｖｅｓ  ｆｒｏｍ  ａｎ  ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｇｅｎｅ  ｐｒｏｄｕｃｔ．  Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  Ｕ  Ｓ  Ａ  １９９６；９３（１８）：９７３０−５．
Ｂｅａｔｔｙ  ＧＬ，  Ｈａａｓ  ＡＲ，  Ｍａｕｓ  ＭＶ，  Ｔｏｒｉｇｉａｎ  ＤＡ，  Ｓｏｕｌｅｎ  ＭＣ，  Ｐｌｅｓａ  Ｇ，  ｅｔ  ａｌ．  Ｍｅｓｏｔｈｅｌｉｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｍＲＮＡ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  Ｔ  ｃｅｌｌｓ  ｉｎｄｕｃｅ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ  ｉｎ  ｓｏｌｉｄ  ｍａｌｉｇｎａｎｃｉｅｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ  ２０１４；２（２）：１１２−２０  ｄｏｉ  １０．１１５８／２３２６−６０６６．ＣＩＲ−１３−０１７０．
Ｃａｓｕｃｃｉ  Ｍ，  Ｂｏｎｄａｎｚａ  Ａ．  Ｓｕｉｃｉｄｅ  ｇｅｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｔｏ  ｉｎｃｒｅａｓｅ  ｔｈｅ  ｓａｆｅｔｙ  ｏｆ  ｃｈｉｍｅｒｉｃ  ａｎｔｉｇｅｎ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ−ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｊ  Ｃａｎｃｅｒ  ２０１１；２：３７８−８２．
Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ＳＡ．  Ｄｅｃａｄｅ  ｉｎ  ｒｅｖｉｅｗ−ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ：  Ｅｎｔｅｒｉｎｇ  ｔｈｅ  ｍａｉｎｓｔｒｅａｍ  ｏｆ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｒｅａｔｍｅｎｔ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｒｅｖｉｅｗｓ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｏｎｃｏｌｏｇｙ  ２０１４  ｄｏｉ    １０．１０３８／ｎｒｃｌｉｎｏｎｃ．２０１４．１７４．
【図１】
2021520229.tif 000003
【図２】
2021520229.tif 000004
【図３】
2021520229.tif 000005
【図４】
2021520229.tif 000006
【図５】
2021520229.tif 000007
【図６】
2021520229.tif 000008
【図７】
2021520229.tif 000009
【図８】
2021520229.tif 000010
【図９】
2021520229.tif 000011
【図１０】
2021520229.tif 000012
【図１１】
2021520229.tif 000013
【手続補正書】
【提出日】令和2年11月17日(2020.11.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021520229000001.app
【国際調査報告】
2021520229.tif 000014
2021520229.tif 000015