(57)【要約】  対象における疾患または障害の治療のために、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）、ＣＳＲを含む細胞組成物、その作製方法、およびその使用方法が、開示される。【特許請求の範囲】
【請求項１】
非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、
（ａ）活性化成分を含むエクトドメインであって、前記活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、前記少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、
前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）。
【請求項２】
前記活性化成分が、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分、ＴＣＲ複合体の成分、ＴＣＲ共受容体の成分、ＴＣＲ共刺激タンパク質の成分、ＴＣＲ阻害タンパク質の成分、サイトカイン受容体、および前記活性化成分のアゴニストが結合するケモカイン受容体のうちの１つ以上の一部分を含む、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項３】
前記活性化成分が、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分を含む、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項４】
前記シグナル変換ドメインが、ヒトシグナル変換ドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分、ＴＣＲ複合体の成分、ＴＣＲ共受容体の成分、ＴＣＲ共刺激タンパク質の成分、ＴＣＲ阻害タンパク質の成分、サイトカイン受容体、およびケモカイン受容体のうちの１つ以上を含む、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項５】
前記シグナル変換ドメインが、ＣＤ３タンパク質またはその一部分を含む、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項６】
前記ＣＤ３タンパク質が、ＣＤ３ζタンパク質またはその一部分を含む、請求項５に記載のＣＳＲ。
【請求項７】
前記エンドドメインが、細胞質ドメインをさらに含む、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項８】
前記細胞質ドメインが、第３のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、請求項７に記載のＣＳＲ。
【請求項９】
前記第１のタンパク質および前記第３のタンパク質が、同一である、請求項８に記載のＣＳＲ。
【請求項１０】
前記エクトドメインが、シグナルペプチドをさらに含む、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項１１】
前記シグナルペプチドが、第４のタンパク質に由来する、請求項１０に記載のＣＳＲ。
【請求項１２】
前記第１のタンパク質および前記第４のタンパク質が、同一である、請求項１１に記載のＣＳＲ。
【請求項１３】
前記膜貫通ドメインが、第５のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項１４】
前記第１のタンパク質および前記第５のタンパク質が、同一である、請求項１３に記載のＣＳＲ。
【請求項１５】
前記活性化成分が、自然発生分子と結合しない、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項１６】
前記ＣＳＲが、自然発生分子への前記活性化成分の結合の際に、シグナルを変換しない、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項１７】
前記活性化成分が、非自然発生分子と結合する、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項１８】
前記ＣＳＲが、非自然発生分子への前記活性化成分の結合の際に、シグナルを選択的に変換する、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項１９】
非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、
（ａ）シグナルペプチドおよび活性化成分を含むエクトドメインであって、前記シグナルペプチドが、ＣＤ２シグナルペプチドまたはその一部分を含み、前記活性化成分が、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分を含む、エクトドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインであって、ＣＤ２膜貫通ドメインまたはその一部分を含む、膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞質ドメインおよび少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、前記細胞質ドメインが、ＣＤ２細胞質ドメインまたはその一部分を含み、前記少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、ＣＤ３ζタンパク質またはその一部分を含む、エンドドメインと、を含む、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）。
【請求項２０】
配列番号１７０６２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のＣＳＲ。
【請求項２１】
配列番号１７０６２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のＣＳＲ。
【請求項２２】
配列番号１７０６２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のＣＳＲ。
【請求項２３】
配列番号１７０６２と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のＣＳＲ。
【請求項２４】
配列番号１７０６２のアミノ酸配列を含む、請求項１９に記載のＣＳＲ。
【請求項２５】
前記エクトドメインが、改変を含む、請求項１に記載のＣＳＲ。
【請求項２６】
前記改変が、前記活性化成分または前記第１のタンパク質の野生型配列と比較するとき、前記活性化成分または前記第１のタンパク質の前記アミノ酸配列の変異または切断を含む、請求項２５に記載のＣＳＲ。
【請求項２７】
前記活性化成分の前記アミノ酸配列の変異または切断は、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分の変異または切断を含む、請求項２６に記載のＣＳＲ。
【請求項２８】
アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分の変異または切断を含む前記ＣＳＲが、ＣＤ５８と結合しない、請求項２７に記載のＣＳＲ。
【請求項２９】
前記変異または切断を含む前記ＣＤ２細胞外細胞ドメインが、配列番号１７１１９と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のＣＳＲ。
【請求項３０】
前記変異または切断を含む前記ＣＤ２細胞外細胞ドメインが、配列番号１７１１９と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のＣＳＲ。
【請求項３１】
前記変異または切断を含む前記ＣＤ２細胞外細胞ドメインが、配列番号１７１１９と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のＣＳＲ。
【請求項３２】
前記変異または切断を含む前記ＣＤ２細胞外細胞ドメインが、配列番号１７１１９と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のＣＳＲ。
【請求項３３】
前記変異または切断を含む前記ＣＤ２細胞外細胞ドメインが、配列番号１７１１９のアミノ酸配列を含む、請求項２７に記載のＣＳＲ。
【請求項３４】
非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、
（ａ）シグナルペプチドおよび活性化成分を含むエクトドメインであって、前記シグナルペプチドが、ＣＤ２シグナルペプチドまたはその一部分を含み、前記活性化成分は、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分を含み、アゴニストが結合する前記ＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分が、変異または切断を含む、エクトドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインであって、ＣＤ２膜貫通ドメインまたはその一部分を含む、膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞質ドメインおよび少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、前記細胞質ドメインが、ＣＤ２細胞質ドメインまたはその一部分を含み、前記少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、ＣＤ３ζタンパク質またはその一部分を含む、エンドドメインと、を含む、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）。
【請求項３５】
配列番号１７１１８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のＣＳＲ。
【請求項３６】
配列番号１７１１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のＣＳＲ。
【請求項３７】
配列番号１７１１８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のＣＳＲ。
【請求項３８】
配列番号１７１１８と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のＣＳＲ。
【請求項３９】
配列番号１７１１８のアミノ酸配列を含む、請求項３４に記載のＣＳＲ。
【請求項４０】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載のＣＳＲをコードする、核酸配列。
【請求項４１】
請求項４０に記載の核酸配列を含む、ベクター。
【請求項４２】
請求項４０に記載の核酸配列を含む、トランスポゾン。
【請求項４３】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載のＣＳＲを含む、細胞。
【請求項４４】
請求項４０に記載の核酸を含む、細胞。
【請求項４５】
請求項４１に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項４６】
請求項４２に記載のトランスポゾンを含む、細胞。
【請求項４７】
前記細胞が、同種異系細胞である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４８】
前記細胞が、自己細胞である、請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の細胞。
【請求項４９】
請求項１〜３９のいずれか一項に記載のＣＳＲを含む、組成物。
【請求項５０】
請求項４０に記載の核酸配列を含む、組成物。
【請求項５１】
請求項４１に記載のベクターを含む、組成物。
【請求項５２】
請求項４２に記載のトランスポゾンを含む、組成物。
【請求項５３】
請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の細胞を含む、組成物。
【請求項５４】
請求項４３〜４６のいずれか一項に記載の複数の細胞を含む、組成物。
【請求項５５】
改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）であって、
（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、前記ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、
（ｂ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、
（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、前記活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、
（ｉｉ）膜貫通ドメインと、
（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、前記少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、前記第１のタンパク質および前記第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、を含む、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）。
【請求項５６】
誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをさらに含む、請求項５５に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項５７】
ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の改変をさらに含み、前記改変が、主要組織性適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現または活性のレベルを低減または排除する、請求項５５に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項５８】
ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）ポリペプチドを含む非自然発生ポリペプチドをさらに含む、請求項５５に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項５９】
ＨＬＡ−Ｅを含む前記非自然発生ポリペプチドが、Ｂ２Ｍシグナルペプチドをさらに含む、請求項５８に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項６０】
ＨＬＡ−Ｅを含む前記非自然発生ポリペプチドが、Ｂ２Ｍポリペプチドをさらに含む、請求項５９に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項６１】
ＨＬＡ−Ｅを含む前記非自然発生ポリペプチドが、リンカーをさらに含み、前記リンカーが、前記Ｂ２Ｍポリペプチドと前記ＨＬＡ−Ｅポリペプチドとの間に位置する、請求項６０に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項６２】
ＨＬＡ−Ｅを含む前記非自然発生ポリペプチドが、ペプチドおよびＢ２Ｍポリペプチドをさらに含む、請求項６１に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項６３】
ＨＬＡ−Ｅを含む前記非自然発生ポリペプチドが、
前記Ｂ２Ｍシグナルペプチドと前記ペプチドとの間に位置する、第１のリンカーと、
前記ＨＬＡ−Ｅをコードする前記Ｂ２Ｍポリペプチドと前記ペプチドとの間に位置する、第２のリンカーと、をさらに含む、請求項６２に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項６４】
非自然発生抗原受容体、治療用ポリペプチドをコードする配列、またはそれらの組み合わせをさらに含む、請求項５５に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項６５】
前記非自然発生抗原受容体が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む、請求項６４に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項６６】
前記ＣＳＲが、前記改変されたＴ細胞内で一時的に発現される、請求項５５に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項６７】
前記ＣＳＲが、前記改変されたＴ細胞内で安定的に発現される、請求項５５に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項６８】
前記ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含む前記ポリペプチドが、前記改変されたＴ細胞内で一時的に発現される、請求項５８に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項６９】
前記ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含む前記ポリペプチドが、前記改変されたＴ細胞内で安定的に発現される、請求項５８に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項７０】
前記誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドが、前記改変されたＴ細胞内で安定的に発現される、請求項５６に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項７１】
前記非自然発生抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列が、前記改変されたＴ細胞内で安定的に発現される、請求項６４に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項７２】
前記改変されたＴ細胞が、同種異系細胞である、請求項５５に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項７３】
前記改変されたＴ細胞が、自己細胞である、請求項５５に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項７４】
前記改変されたＴ細胞が、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）、または幹細胞様Ｔ細胞である、請求項５５に記載の改変されたＴ細胞。
【請求項７５】
請求項５５〜７４のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞を含む、組成物。
【請求項７６】
改変されたＴ細胞の集団を含む組成物であって、複数の前記改変されたＴ細胞の集団が、請求項１〜３９のいずれか一項に記載のＣＳＲを含む、組成物。
【請求項７７】
改変されたＴ細胞の集団を含む組成物であって、複数の前記改変されたＴ細胞の集団が、請求項５５〜７４のいずれか一項に記載の改変されたＴ細胞を含む、組成物。
【請求項７８】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも２５％が、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）またはＴSCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項７６または７７に記載の組成物。
【請求項７９】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも５０％が、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項７６または７７に記載の組成物。
【請求項８０】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも７５％が、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項７６または７７に記載の組成物。
【請求項８１】
疾患または障害の治療に使用するための、請求項７６または７７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８２】
疾患または障害の治療のための、請求項７６または７７のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項８３】
疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の請求項７６または７７のいずれか一項に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項８４】
疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の請求項７６または７７のいずれかに記載の組成物と、前記ＣＳＲに結合する少なくとも１つの非自然発生分子と、を投与することを含む、方法。
【請求項８５】
改変されたＴ細胞の集団を産生する方法であって、複数の改変されたＴ細胞内で前記ＣＳＲを安定的に発現し、かつ前記複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、請求項１〜３９に記載のＣＳＲまたはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、前記複数の改変されたＴ細胞を産生することを含む、方法。
【請求項８６】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも２５％が、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）またはＴSCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも５０％が、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８８】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも７５％が、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
請求項８５に記載の方法によって産生された改変されたＴ細胞の集団を含む、組成物。
【請求項９０】
疾患または障害の治療に使用するための、請求項８９に記載の組成物。
【請求項９１】
疾患または障害の治療のための、請求項８９に記載の組成物の使用。
【請求項９２】
疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の請求項８９に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項９３】
インビボで改変されたＴ細胞の集団を活性化するために、インビボで改変されたＴ細胞の集団の細胞分裂を誘導するために、またはそれらの組み合わせのために、前記対象に、活性化因子組成物を投与することをさらに含む、請求項９２に記載の方法。
【請求項９４】
改変されたＴ細胞の集団を産生する方法であって、複数の改変されたＴ細胞内でＣＳＲを一時的に発現し、かつ前記複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、請求項１〜３９に記載のＣＳＲまたはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、前記複数の改変されたＴ細胞を産生することを含む、方法。
【請求項９５】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも２５％が、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）またはＴSCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも５０％が、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカー（を発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも７５％が、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
請求項９４に記載の方法によって産生された改変されたＴ細胞の集団を含む、組成物。
【請求項９９】
疾患または障害の治療に使用するための、請求項９８に記載の組成物。
【請求項１００】
疾患または障害の治療のための、請求項９８に記載の組成物の使用。
【請求項１０１】
疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の請求項９８に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１０２】
前記対象に投与された前記改変されたＴ細胞の集団内の前記改変されたＴ細胞が、もはや前記ＣＳＲを発現しない、請求項１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
改変されたＴ細胞の集団を増大させる方法であって、複数の改変されたＴ細胞内で前記ＣＳＲを安定的に発現し、かつ前記複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、請求項１〜３９に記載のＣＳＲまたはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、前記複数の改変されたＴ細胞を産生することと、前記細胞を活性化因子組成物と接触させて、複数の活性化された改変されたＴ細胞を産生することと、を含み、前記複数の改変されたＴ細胞の増大が、同じ条件下で、前記ＣＳＲを安定的に発現しない複数の野生型Ｔ細胞の増大よりも少なくとも２倍高い、方法。
【請求項１０４】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも２５％が、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）またはＴSCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０５】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも５０％が、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０６】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも７５％が、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項１０３に記載の方法。
【請求項１０７】
請求項１０３に記載の方法によって増大された改変されたＴ細胞の集団を含む、組成物。
【請求項１０８】
疾患または障害の治療に使用するための、請求項１０７に記載の組成物。
【請求項１０９】
疾患または障害の治療のための、請求項１０７に記載の組成物の使用。
【請求項１１０】
疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の請求項１０７に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１１１】
インビボで改変されたＴ細胞の集団を活性化するために、インビボで改変されたＴ細胞の集団の細胞分裂を誘導するために、またはそれらの組み合わせのために、前記対象に、活性化因子組成物を投与することをさらに含む、請求項１１０に記載の方法。
【請求項１１２】
改変されたＴ細胞の集団を増大させる方法であって、複数の改変されたＴ細胞内で前記ＣＳＲを一時的に発現し、かつ前記複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、請求項１〜３９に記載のＣＳＲまたはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、前記複数の改変されたＴ細胞を産生することと、前記細胞を活性化因子組成物と接触させて、複数の活性化された改変されたＴ細胞を産生することと、を含み、前記複数の改変されたＴ細胞の増大が、同じ条件下で、前記ＣＳＲを一時的に発現しない複数の野生型Ｔ細胞の増大よりも少なくとも２倍高い、方法。
【請求項１１３】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも２５％が、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）またはＴSCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも５０％が、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１５】
前記複数の改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも７５％が、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞の１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ前記１つ以上の細胞表面マーカーが、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む、請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１６】
請求項１１２に記載の方法によって増大された改変されたＴ細胞の集団を含む、組成物。
【請求項１１７】
疾患または障害の治療に使用するための、請求項１１６に記載の組成物。
【請求項１１８】
疾患または障害の治療のための、請求項１１６に記載の組成物の使用。
【請求項１１９】
疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の請求項１１６に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項１２０】
前記対象に投与された前記改変されたＴ細胞の集団内の前記改変されたＴ細胞が、もはや前記ＣＳＲを発現しない、請求項１１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年９月５日に出願された米国仮特許出願第６２／７２７，４９８号、２０１８年１０月１０日に出願された米国仮特許出願第６２／７４４，０７３号、２０１９年３月７日に出願された米国仮特許出願第６２／８１５，３３４号、および２０１９年３月８日に出願された米国仮特許出願第６２／８１５，８８０号に対する優先権および利益を主張する。これらの出願の各々の内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、分子生物学、より具体的には、キメラ受容体、同種異系細胞組成物、その作製方法、およびその使用方法を対象とする。
【０００３】
配列表の参照による組み込み
２０１９年９月５日に作成され、５５．７ＭＢのサイズである「ＰＯＴＨ−０４６＿００１ＷＯ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ」という名前のファイルの内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【背景技術】
【０００４】
移植片対宿主応答および宿主対移植片応答に関与する遺伝子を排除することによって提示される課題を克服する同種異系細胞組成物に対する当該技術分野での長い間感じられてきたが満たされていない必要性が存在する。本開示は、環境刺激に対する同種異系細胞の応答性を回復し、かつナチュラルキラー細胞媒介性細胞毒性による拒絶を低減または防止するための非自然発生構造の改善を含む、同種異系細胞組成物、これらの組成物の作製方法、および使用方法を提供する。
【発明の概要】
【０００５】
本開示は、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ａ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。
【０００６】
活性化成分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分、ＴＣＲ複合体の成分、ＴＣＲ共受容体の成分、ＴＣＲ共刺激タンパク質の成分、ＴＣＲ阻害タンパク質の成分、サイトカイン受容体、および活性化成分のアゴニストが結合するケモカイン受容体のうちの１つ以上の一部分を含むことができる。活性化成分は、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分を含むことができる。
【０００７】
シグナル変換ドメインは、ヒトシグナル変換ドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分、ＴＣＲ複合体の成分、ＴＣＲ共受容体の成分、ＴＣＲ共刺激タンパク質の成分、ＴＣＲ阻害タンパク質の成分、サイトカイン受容体、およびケモカイン受容体のうちの１つ以上を含むことができる。シグナル変換ドメインは、ＣＤ３タンパク質またはその一部分を含むことができる。ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３ζタンパク質またはその一部分を含むことができる。
【０００８】
エンドドメインは、細胞質ドメインをさらに含むことができる。細胞質ドメインは、第３のタンパク質から単離され得るか、またはそれに由来し得る。第１のタンパク質および第３のタンパク質は、同一であり得る。エクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含むことができる。シグナルペプチドは、第４のタンパク質に由来し得る。第１のタンパク質および第４のタンパク質は、同一であり得る。膜貫通ドメインは、第５のタンパク質から単離され得るか、またはそれに由来し得る。第１のタンパク質および第５のタンパク質は、同一であり得る。
【０００９】
いくつかの態様において、活性化成分は、自然発生分子に結合しない。いくつかの態様において、活性化成分は、自然発生分子に結合するが、ＣＳＲは、自然発生分子への活性化成分の結合の際に、シグナルを変換しない。いくつかの態様において、活性化成分は、非自然発生分子と結合する。いくつかの態様において、活性化成分は、自然発生分子に結合しないが、非自然発生分子に結合する。ＣＳＲは、非自然発生分子への活性化成分の結合の際に、シグナルを選択的に変換することができる。
好ましい態様において、本開示は、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ａ）シグナルペプチドおよび活性化成分を含むエクトドメインであって、シグナルペプチドが、ＣＤ２シグナルペプチドまたはその一部分を含み、活性化成分が、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分を含む、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインであって、ＣＤ２膜貫通ドメインまたはその一部分を含む、膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞質ドメインおよび少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、細胞質ドメインが、ＣＤ２細胞質ドメインまたはその一部分を含み、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、ＣＤ３ζタンパク質またはその一部分を含むエンドドメインと、を含む、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。いくつかの態様において、非自然発生ＣＳＲは、配列番号１７０６２と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、非自然発生ＣＳＲは、配列番号１７０６２のアミノ酸配列を含む。
【００１０】
本開示はまた、エクトドメインが、改変を含む、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）も提供する。改変は、活性化成分または第１のタンパク質の野生型配列と比較するとき、活性化成分または第１のタンパク質のアミノ酸配列の変異または切断を含むことができる。活性化成分のアミノ酸配列の変異または切断は、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分の変異または切断を含むことができる。ＣＤ２細胞外ドメインの変異または切断は、自然発生ＣＤ５８との結合を低減または排除することができる。いくつかの態様において、変異または切断を含むＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１７１１９と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、変異または切断を含むＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１７１１９のアミノ酸配列を含む。
【００１１】
好ましい態様において、本開示は、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ａ）シグナルペプチドおよび活性化成分を含むエクトドメインであって、シグナルペプチドが、ＣＤ２シグナルペプチドまたはその一部分を含み、活性化成分が、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分を含み、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分が、変異または切断を含む、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインであって、ＣＤ２膜貫通ドメインまたはその一部分を含む、膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞質ドメインおよび少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、細胞質ドメインが、ＣＤ２細胞質ドメインまたはその一部分を含み、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、ＣＤ３ζタンパク質またはその一部分を含むエンドドメインと、を含む、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。いくつかの態様において、非自然発生ＣＳＲは、配列番号１７１１８と少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい態様において、非自然発生ＣＳＲは、配列番号１７１１８のアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本開示は、本明細書に開示される任意のＣＳＲをコードする核酸配列を提供する。本開示は、本明細書に開示される任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むベクターを提供する。本開示は、本明細書に開示される任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを提供する。
【００１３】
本開示は、本明細書に開示される任意のＣＳＲを含む細胞を提供する。本開示は、本明細書に開示される任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含む細胞を提供する。本開示は、本明細書に開示される任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む細胞を提供する。本開示は、本明細書に開示される任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む細胞を提供する。
【００１４】
本明細書に開示される改変された細胞は、同種異系細胞または自己細胞であり得る。いくつかの好ましい態様において、改変された細胞は、同種異系細胞である。いくつかの好ましい態様において、改変された細胞は、同種異系Ｔ細胞または改変された同種異系ＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【００１５】
本開示は、本明細書に開示される任意のＣＳＲを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示される任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示される任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むベクターを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示される任意のＣＳＲをコードする核酸配列を含むトランスポゾンを含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示される改変された細胞を含む組成物、または本明細書に開示される複数の改変された細胞を含む組成物を提供する。
【００１６】
本開示は、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）であって、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｂ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、を含む、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）を提供する。
【００１７】
改変されたＴ細胞は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをさらに含むことができる。改変されたＴ細胞は、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の改変をさらに含むことができ、この改変は、主要組織性適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現または活性のレベルを低減または排除する。
【００１８】
改変されたＴ細胞は、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）ポリペプチドを含む非自然発生ポリペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含む非自然発生ポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含む非自然発生ポリペプチドは、Ｂ２Ｍポリペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含む非自然発生ポリペプチドは、リンカーをさらに含むことができ、このリンカーは、Ｂ２ＭポリペプチドとＨＬＡ−Ｅポリペプチドとの間に位置する。ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含む非自然発生ポリペプチドは、ペプチドおよびＢ２Ｍポリペプチドをさらに含むことができる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、Ｂ２Ｍポリペプチドとペプチドとの間に位置する、第１のリンカーと、ＨＬＡ−ＥをコードするＢ２Ｍポリペプチドとペプチドとの間に位置する、第２のリンカーと、をさらに含むことができる。
【００１９】
改変されたＴ細胞は、非自然発生抗原受容体、治療用ポリペプチドをコードする配列、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。非自然発生抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むことができる。
【００２０】
ＣＳＲは、改変されたＴ細胞内で一時的に発現され得る。ＣＳＲは、改変されたＴ細胞内で安定的に発現され得る。ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含むポリペプチドは、改変されたＴ細胞内で一時的に発現され得る。ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含むポリペプチドは、改変されたＴ細胞内で安定的に発現され得る。誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、改変されたＴ細胞内で一時的に発現され得る。誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、改変されたＴ細胞内で安定的に発現され得る。非自然発生抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、改変されたＴ細胞内で一時的に発現され得る。非自然発生抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、改変されたＴ細胞内で安定的に発現され得る。
【００２１】
改変されたＴ細胞は、自己細胞であり得る。改変されたＴ細胞は、同種異系細胞であり得る。改変されたＴ細胞は、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）、または幹細胞様Ｔ細胞であり得る。
【００２２】
本開示は、本明細書に開示される任意の改変されたＴ細胞を含む組成物を提供する。本開示はまた、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）の集団を含む組成物であって、複数の改変されたＴ細胞の集団は、本明細書に開示されるＣＳＲを含む、組成物も提供する。本開示はまた、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の集団を含む組成物であって、複数のＴ細胞の集団は、本明細書に開示される改変されたＴ細胞を含む、組成物も提供する。
【００２３】
本開示は、疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の、本明細書に開示される任意の組成物、または疾患もしくは障害の治療に使用するための組成物を投与することを含む、方法を提供する。一態様において、組成物は、本明細書に開示される改変されたＴ細胞または改変されたＴ細胞の集団である。本開示はまた、疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の本明細書に開示される組成物と、ＣＳＲに結合する少なくとも１つの非自然発生分子と、を投与することを含む、方法。
【００２４】
本開示は、改変されたＴ細胞の集団を産生する方法であって、複数の改変されたＴ細胞内でＣＳＲを安定的に発現し、かつ複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、本開示のＣＳＲまたはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、複数の改変されたＴ細胞を産生することを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、方法を提供する。本開示は、この方法によって産生された改変されたＴ細胞の集団を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ＣＳＲを含む集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）またはＴSCM様細胞のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを含む。いくつかの態様では、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む。本組成物は、疾患または障害の治療に使用するためのものであり得る。本開示はまた、疾患または障害の治療のための方法によって産生された組成物の使用も提供する。本開示はさらに、疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の本方法によって産生される組成物を投与することを含む、方法を提供する。治療方法は、インビボで改変されたＴ細胞の集団を活性化するために、インビボで改変されたＴ細胞の集団の細胞分裂を誘導するために、またはそれらの組み合わせのために、対象に、活性化因子組成物を投与することをさらに含むことができる。
【００２５】
本開示は、改変されたＴ細胞の集団を産生する方法であって、複数の改変されたＴ細胞内でＣＳＲを一時的に発現し、かつ複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、本開示のＣＳＲまたはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、複数の改変されたＴ細胞を産生することを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、方法を提供する。本開示は、この方法によって産生された改変されたＴ細胞の集団を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ＣＳＲを含む集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）またはＴSCM様細胞のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを含む。いくつかの態様では、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む。本組成物は、疾患または障害の治療に使用するためのものであり得る。本開示はまた、疾患または障害の治療のための方法によって産生された組成物の使用も提供する。本開示はさらに、疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の本方法によって産生される組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、対象に投与された改変されたＴ細胞の集団内の改変されたＴ細胞は、もはやＣＳＲを発現しない。
【００２６】
本開示は、改変されたＴ細胞の集団を増大させる方法であって、複数の改変されたＴ細胞内でＣＳＲを安定的に発現し、かつ複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、本開示のＣＳＲまたはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、複数の改変されたＴ細胞を産生することと、細胞を活性化因子組成物と接触させて、複数の活性化された改変されたＴ細胞を産生することと、を含み、複数の改変されたＴ細胞の増大が、同じ条件下で、ＣＳＲを安定的に発現しない複数の野生型Ｔ細胞の増大よりも少なくとも２倍高い、方法を提供する。いくつかの態様において、ＣＳＲを含む集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）またはＴSCM様細胞のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを含む。いくつかの態様では、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む。本開示は、本方法によって増大された改変されたＴ細胞の集団を含む組成物を提供する。本組成物は、疾患または障害の治療に使用するためのものであり得る。本開示はまた、疾患または障害の治療のための方法によって増大された組成物の使用も提供する。本開示はさらに、疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の本方法によって増大された組成物を投与することを含む、方法を提供する。治療方法は、インビボで改変されたＴ細胞の集団を活性化するために、インビボで改変されたＴ細胞の集団の細胞分裂を誘導するために、またはそれらの組み合わせのために、対象に、活性化因子組成物を投与することをさらに含むことができる。
【００２７】
本開示は、改変されたＴ細胞の集団を増大させる方法であって、複数の改変されたＴ細胞内でＣＳＲを一時的に発現し、かつ複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、本開示のＣＳＲまたはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、複数の改変されたＴ細胞を産生することと、細胞を活性化因子組成物と接触させて、複数の活性化された改変されたＴ細胞を産生することと、を含み、複数の改変されたＴ細胞の増大が、同じ条件下で、ＣＳＲを一時的に発現しない複数の野生型Ｔ細胞の増大よりも少なくとも２倍高い、方法を提供する。本開示は、本方法によって増大された改変されたＴ細胞の集団を含む組成物を提供する。いくつかの態様において、ＣＳＲを含む集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）またはＴSCM様細胞のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを含む。いくつかの態様では、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様細胞のうちのうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、かつ１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む。本組成物は、疾患または障害の治療に使用するためのものであり得る。本開示はまた、疾患または障害の治療のための方法によって増大された組成物の使用も提供する。本開示はさらに、疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の本方法によって増大された組成物を投与することを含む、方法を提供する。いくつかの態様において、対象に投与された改変されたＴ細胞の集団内の改変されたＴ細胞は、もはやＣＳＲを発現しない。
【００２８】
上記の態様のうちのいずれも、任意の他の態様と組み合わせることができる。
【００２９】
別途定義されない限り、本明細書において使用されるすべての技術用語および科学用語は、本発明に属する技術分野における当業者によって一般に理解されるものと同一の意味を有する。本明細書において、別途文脈が明確に指示しない限り、単数形には複数形も含み得、例として、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、単数形または複数形であると理解され、「または（ｏｒ）」という用語は、包括的であると理解される。例として、「エレメント（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つ以上のエレメントを意味する。本明細書全体を通して、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という単語、または「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」または「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの変形は、記述されたエレメント、整数、もしくはステップ、またはエレメント、整数またはステップの群を含むことを意味するが、任意の他のエレメント、整数、もしくはステップ、またはエレメント、整数、もしくはステップの群を除外するものではないことを意味することを理解されたい。約は、記述された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、または０．０１％以内であると理解され得る。別途文脈から明らかでない限り、本明細書で提供されるすべての数値は、「約」という用語によって変更される。
【００３０】
本明細書に記載される方法および材料と類似または同等の方法および材料が、本開示の実施または試験に使用され得るが、好適な方法および材料が、以下に記載される。本明細書において言及されるすべての刊行物、特許出願、特許、および他の参考文献は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。本明細書において引用される参考文献は、特許請求される本発明に対する先行技術であるとは認められない。矛盾が生じた場合、定義を含む本明細書が優先するものとする。加えて、材料、方法、および実施例は、例示的であるにすぎず、限定的であることは意図されない。本開示の他の特徴および利点は、以下の発明を実施するための形態、および特許請求の範囲から明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３１】
特許または出願ファイルには、カラーで作成された図面を少なくとも１つ含む。カラーの図面を伴う本特許および特許出願公開のコピーは、要請に応じておよび必要な費用の支払いによって特許庁によって提供されるであろう。
【００３２】
【図１】Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）ならびに補助受容体ＣＤ２８およびＣＤ２を示す概略図である。
【図２】一次および二次共刺激が、アゴニストｍＡｂ（抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、および抗ＣＤ２）の結合を介してＴ細胞に送達されることを示す、概略図である。完全なＴ細胞の活性化は、免疫応答を促進する共刺激受容体による第２のシグナルと組み合わせたＴＣＲの関与に大きく依存する。一次および二次共刺激は、アゴニストｍＡｂ（例えば、抗ＣＤ３、抗ＣＤ２８、および抗ＣＤ２）による処理、ならびにそれらとの表面受容体の関与を介してＴ細胞に送達することができる。
【図３】ＴＣＲの不在下で、二次共刺激のみが、アゴニストｍＡｂの結合を介してＴ細胞に送達されることを示す、概略図である。完全なＴ細胞の活性化は、共刺激受容体による第２のシグナルと併せてＣＤ３ζを介した一次刺激に大きく依存しているため、Ｔ細胞の活性化および増大は、準最適であり、したがって低減される。
【図４】ＴＣＲの不在下で、刺激がキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）の発現により増強されることを示す、概略図である。ＴＣＲの不在下であるが、表面に発現するＣＳＲ／ｓの存在下では、Ｔ細胞が標準的なアゴニストｍＡｂで処理されるとき、一次および二次共刺激シグナルが、伝達される。より完全なＴ細胞の活性化は、ＣＳＲを介した刺激シグナルを介して達成されるため、Ｔ細胞の活性化および増大が、増強される。
【図５】本開示の例示的なＣＳＲ  ＣＤ２８ｚを示す、概略図である。
【図６】本開示の例示的なＣＳＲ  ＣＤ２ｚを示す、概略図である。
【図７】天然リガンド（ＣＤ５８）の結合を排除するためのＣＳＲ  ＣＤ２ｚの変異のための戦略の概略図である。ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ変異体のパネルは、ＣＤ２の細胞外ドメイン内で設計された。このパネルの目的は、もはやＣＤ５８に結合しないが、抗ＣＤ２アクチベーター試薬による結合に対する感受性を保持している変異体を識別することであった。これは、１）活性化Ｔ細胞によるＣＤ５８発現が野生型（ＷＴ）ＣＤ２ｚ  ＣＳＲと相互作用し、ＣＳＲの最適性能を妨げる可能性がある、および２）ＷＴ  ＣＤ２ｚ  ＣＳＲが天然のリガンドＣＡＲとして作用し得るため、ＣＳＲを発現するＴ細胞が、活性化Ｔ細胞を含むＣＤ５８を発現する細胞に対する細胞毒性活性を媒介し得る、という２つの主な理由により望ましくあり得る。したがって、ＣＤ５８と相互作用することはできないが、最適な細胞の増大のために活性化抗ＣＤ２試薬に結合する能力を保持する変異体ＣＤ２ｚ  ＣＳＲが、所望される。
【図８】本開示の例示的なＣＳＲ  ＣＤ２ｚ−Ｄ１１１Ｈを示す、概略図である。Ｄ１１１Ｈ変異は、ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ−Ｄ１１１Ｈ構築物のＣＤ２細胞外ドメイン内にある。
【図９Ａ】ＣＳＲのｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）送達が、ＴＣＲｂ／ｂ２ＭダブルノックアウトＣＡＲ−Ｔ細胞の増大を増強することを示す、一連のプロットである。正常ドナーの血液から単離された汎Ｔ細胞は、ＣＡＳ−ＣＬＯＶＥＲ（商標）遺伝子編集システムとの組み合わせてｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）ＤＮＡ改変システムを使用して遺伝的に改変された。細胞は、ＣＡＲをコードするトランスポゾン、選択遺伝子、およびＣＳＲ（ＣＤ２８ｚまたはＣＤ２ｚのいずれか）、ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素をコードするｍＲＮＡ、Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲ（商標）をコードするｍＲＮＡ、ならびにＴＣＲおよびＭＨＣＩをノックアウト（ダブルノックアウト；ＤＫＯ）するために、ＴＣＲｂおよびｂ２Ｍを標的とする複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を用いて単一反応でエレクトロポレーションされた。続いて、細胞を、アゴニストｍＡｂ、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８で刺激し、その後、１６日間の培養期間にわたって遺伝子改変のために選択した。最初の培養期間の終了時に、すべてのＴ細胞がＣＡＲを発現し、遺伝子改変された細胞の選択が成功したことを示す（データは示さず）。ＣＤ２ｚまたはＣＤ２８ｚ  ＣＳＲのいずれかを発現するサンプルでは、ＤＫＯ細胞のより大きな増大が、ＣＡＲのみのＤＫＯ細胞のより高い頻度として観察された（図９Ａおよび９Ｂ）。ＣＤ２ｚまたはＣＤ２８ｚ  ＣＳＲのいずれかを発現するＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞サンプルでは、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のみと比較して、細胞の少なくとも２倍の増大が観察された。
【図９Ｂ】図９Ａの説明に同じ。
【図１０Ａ】精製されたＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のＣＳＲ  ＣＤ２ｚまたはＣＤ２８ｚが、再刺激時に増強された増大をもたらすことを示す、一連のプロットである。最初の遺伝子改変および第１ラウンドの刺激および増大後、各群からの細胞（偽（ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞）、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２ｚ  ＣＳＲ、およびＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２８ｚ  ＣＳＲ）を、磁気ビーズを使用してＴＣＲ-ＭＨＣＩ-細胞のために精製した。次いで、精製した細胞を、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８アゴニストｍＡｂを使用して再刺激した。１４日間の培養期間の終了時に、ＴＣＲおよびＭＨＣＩの発現（Ａ）、ならびに細胞集団の増大の大きさ（Ｂ）を、判定した。この二次増大後、ＣＤ２ｚまたはＣＤ２８ｚ  ＣＳＲのいずれかを発現する細胞を含むすべての精製したＤＫＯ細胞は、ＤＫＯ細胞に対して依然として非常に純粋であった（９８．８％超のＤＫＯ）。ＣＤ２ｚまたはＣＤ２８ｚ  ＣＳＲのいずれかを発現するＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、いずれのＣＳＲも発現しない細胞と比較したとき、増強した増大をもたらした。
【図１０Ｂ】図１０Ａの説明に同じ。
【図１１】サイトカイン補充は、再刺激時にＣＳＲを発現する精製ＤＫＯＣＡＲ−Ｔ細胞をさらに増大させることをできることを示す、グラフである。初期の遺伝子改変および第１ラウンドの刺激および増大後、ＣＳＲを発現する細胞を、磁気ビーズを使用してＤＫＯ細胞のために精製した。次いで、精製した細胞を、外因性の精製した組換えＩＬ７およびＩＬ１５の存在下で、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８アゴニストｍＡｂを使用して再刺激した。１４日間の培養期間の終了時に、細胞集団の増大の大きさを、判定した。二次増大後、ＣＤ２ｚ  ＣＳＲまたはＣＤ２８ｚ  ＣＳＲのいずれかを発現する細胞を含むすべての精製したＤＫＯ細胞は、ＴＣＲ-ＭＨＣＩ-細胞に対して依然として非常に純粋であった（９８．８％超のダブルノックアウト（データは示さず））。加えて、細胞は、ＩＬ７およびＩＬ１５の存在下で、堅牢に増殖し、これは補充なしの場合よりも大きかった。これらのデータは、外因性サイトカインが、ＣＳＲを発現するＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞をさらに増大させるために添加され得ることを示す。
【図１２】ＣＡＲの表面発現が、ＤＫＯ細胞中のＣＳＲの共発現によって有意に影響を受けていないことを示す、グラフである。二次増大後、細胞（偽（ＷＴ  Ｔ細胞）、ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２ｚ  ＣＳＲ、およびＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２８ｚ  ＣＳＲ）を、ＣＡＲの表面発現について染色し、対照ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞および偽Ｔ細胞と比較した。ＣＤ２ｚまたはＣＤ２８ｚ  ＣＳＲの発現は、Ｔ細胞表面上でのＣＡＲ分子の発現に有意に影響を受けていない。
【図１３】ＣＳＲの発現が、インビトロでのＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性に有意な影響を受けていないことを示す、グラフである。二次増大後、細胞（偽（ＷＴ  Ｔ細胞）、ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２ｚ  ＣＳＲ、およびＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２８ｚ  ＣＳＲ）を、操作されたＫ５６２−ＢＣＭＡ−ルシフェラーゼ（ｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＢＣＭＡ）または陰性対照株Ｋ５６２−ＰＳＭＡ−ルシフェラーゼ（ｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＰＳＭＡ）と、１０：１、３：１、または１：１のＥ：Ｔ比で４８時間共培養した。ルシフェラーゼシグナルを測定して、細胞毒性を判定した。ｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＰＳＭＡの死滅を、点線で示し、一方、ｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＢＣＭＡの死滅を、実線で示す。すべてのＣＡＲ+Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現した。ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＷＴ  ＣＡＲ−ＴＣＲ細胞と同様のインビトロ細胞毒性を示す。この活性は、ＣＤ２ｚまたはＣＤ２８ｚ  ＣＳＲの共発現による有意な影響を受けていない。
【図１４】ＣＳＲの発現が、インビトロでのＩＦＮｇのＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞分泌に有意な影響を与えていないことを示す、グラフである。４８時間死滅アッセイからの上清を、ＢＣＭＡ  ＣＡＲＴ細胞の抗原特異的機能の尺度として分泌されたＩＦＮｇについてアッセイした。ＣＤ２ｚまたはＣＤ２８ｚ  ＣＳＲ発現の有無にかかわらず、すべてのＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＢＣＭＡを発現する標的細胞（ｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＢＣＭＡ）との共培養に応答してＩＦＮｇを分泌するが、無関連標的を発現する細胞（ｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＰＳＭＡ）は、ＩＦＮｇを分泌しない。
【図１５】ＣＳＲの発現が、インビトロでのＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖に有意な影響を与えていないことを示す、一連のプロットである。偽（ＷＴ  Ｔ細胞）、ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＤＫＯＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２ｚ  ＣＳＲ、およびＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２８ｚ  ＣＳＲ細胞は、Ｃｅｌｌ  Ｔｒａｃｅ  Ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識し、細胞が増殖するにつれて希釈される。細胞を、ｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＰＳＭＡまたはｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＢＣＭＡ細胞と１：２のＥ：Ｔ比で５日間共培養した。ＣＤ２ｚまたはＣＤ２８ｚの有無にかかわらず、すべてのＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＢＣＭＡを発現する標的細胞（ｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＢＣＭＡ）に応答して増殖するが、無関連抗原を発現する細胞（ｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＰＳＭＡ）では増殖しない。
【図１６】ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔの記憶表現型が、ＣＤ２ｚ  ＣＳＲ共発現に有意な影響を受けていないことを示す、一対のグラフである。ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＤＫＯＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２ｚ、およびＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２８ｚを、表面ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ６２Ｌの発現に対して染色して、Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｆｆ細胞；Ｔｓｃｍ（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ４５ＲＯ-ＣＤ６２Ｌ+）、Ｔｃｍ（ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ４５ＲＯ+ＣＤ６２Ｌ+）、Ｔｅｍ（ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ４５ＲＯ+ＣＤ６２Ｌ-）、Ｔｅｆｆ（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ４５ＲＯ-ＣＤ６２Ｌ-）を画定した。ＣＤ２ｚの有無にかかわらず、ＷＴおよびＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、主に非常に高いレベルの好ましいＴｓｃｍおよびＴｃｍ細胞からなる。しかしながら、ＣＤ２８ｚがＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞内で発現するとき、この表現型は、大幅により分化し、ＴｃｍおよびＴｅｍ細胞に有利に働く。この表現型は、これらのＣＡＲ  Ｔ細胞がより分化しているように思われるため、これらのＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボでの機能に悪影響を与え得る。
【図１７】ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔにおける活性化／枯渇マーカーの発現が、ＣＤ２ｚ  ＣＳＲ共発現に有意な影響を受けていないことを示す、一連のグラフである。偽（ＷＴ  Ｔ細胞）、ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２ｚ、およびＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞＋ＣＤ２８ｚを、重要な枯渇分子Ｌａｇ３、ＰＤ１、およびＴｉｍ３の発現についてフローサイトメトリーによって検査した。ＣＤ２ｚの有無にかかわらず、ＷＴおよびＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、偽Ｔ細胞と比較したとき、枯渇分子の発現がほとんどまたはまったくない。しかしながら、増大プロセス中のＤＫＯ  ＣＡＲ−ＴにおけるＣＤ２８ｚ  ＣＳＲの発現は、枯渇マーカーＬａｇ３、ＰＤ１、およびＴｉｍ３の有意な上方調節をもたらす。この表現型は、これらのＣＡＲ  Ｔ細胞がより枯渇しているように思われるため、これらのＣＡＲ  Ｔ細胞のインビボでの機能に悪影響を与え得る。対照的に、ＣＤ２ｚの発現は、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の枯渇表現型にほとんどまたはまったく影響を与えないが、細胞の増大能力を有意に増強する。
【図１８】ＣＳＲ送達は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増大を増強することを示す、グラフである。ＣＳＲは、ｍＲＮＡによって一時的に、またはｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）によって安定的にかのいずれでＣＡＲ−Ｔ細胞に送達された。正常ドナーの血液から単離された汎Ｔ細胞は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）ＤＮＡ改変システムおよび標準Ｐｏｓｅｉｄａプロセスを使用して遺伝的に改変された。細胞は、ＣＳＲ（ＣＤ２８ｚもしくはＣＤ２ｚのいずれか；一時的発現をもたらす）をコードするさらなるｍＲＮＡ、またはＣＤ１９  ｍＲＮＡ対照、またはＢＣＭＡ  ＣＡＲ、選択遺伝子、およびＣＳＲ（ＣＤ２８ｚまたはＣＤ２ｚのいずれか；安定的発現をもたらす）をコードするトランスポゾン、とともに、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素（ＳＰＢ）をコードするｍＲＮＡ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするトランスポゾン、および選択遺伝子を用いて単一反応でエレクトロポレーションされた。続いて、細胞を、アゴニストｍＡｂ、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８で刺激し、その後、１９日間の培養期間にわたって遺伝子改変のために選択した。最初の培養期間の終了時に、すべてのＴ細胞がＣＡＲを発現し、遺伝子改変された細胞の選択が成功したことを示す（データは示さず）。棒は、ウェル内の全生ＣＡＲ−Ｔ細胞を表し、数字は、ＣＳＲまたはＣＤ１９  ｍＲＮＡ対照の不在下で産生されたＣＡＲ−Ｔ細胞を超える増大の倍率増強を示す。ＣＤ２ｚまたはＣＤ２８ｚ  ＣＳＲのいずれかを一時的または安定的にかのいずれかで発現するサンプルでは、ＣＡＲ−Ｔ細胞のより大きな増大の度合い。
【図１９】ＣＳＲの発現が、ＣＡＲ−Ｔ細胞の細胞毒性に有意な影響を受けていないことを示す、棒グラフである。ＣＳＲは、ｍＲＮＡによって一時的に、またはｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）によって安定的のいずれかでＣＡＲ−Ｔ細胞に送達された。正常ドナーの血液から単離された汎Ｔ細胞は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）ＤＮＡ改変システムおよび標準Ｐｏｓｅｉｄａプロセスを使用して遺伝的に改変された。細胞は、ＣＳＲ（ＣＤ２８ｚもしくはＣＤ２ｚのいずれか；一時的発現をもたらす）をコードするさらなるｍＲＮＡ、またはＢＣＭＡ  ＣＡＲ、選択遺伝子、およびＣＳＲ（ＣＤ２８ｚまたはＣＤ２ｚのいずれか；安定的発現をもたらす）をコードするトランスポゾン、とともに、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素（ＳＰＢ）をコードするｍＲＮＡ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲをコードするトランスポゾン、および選択遺伝子を用いて単一反応で同時エレクトロポレーションした。続いて、細胞を、アゴニストｍＡｂ、抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８で刺激し、その後、１９日間の培養期間にわたって遺伝子改変のために選択した。最初の培養期間の終了時に、すべてのＴ細胞がＣＡＲを発現し、遺伝子改変された細胞の選択が成功したことを示す（データは示さず）。ＣＡＲ−Ｔ細胞の死滅能力を評価するために、細胞を、操作されたＫ５６２−ＢＣＭＡ−ルシフェラーゼ（ｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＢＣＭＡ）または陰性対照株Ｋ５６２−ルシフェラーゼ（ｅＫ５６２−Ｌｕｃ）と、１０：１、３：１、または１：１のＥ：Ｔ比で４８時間共培養した。ルシフェラーゼシグナルを測定して、細胞毒性を判定した。ｅＫ５６２−Ｌｕｃの死滅を、左側の棒グラフに示し、ｅＫ５６２−Ｌｕｃ．ＢＣＭＡ死滅を、右側の棒グラフに示す。すべてのＣＡＲ+  Ｔ細胞は、抗ＢＣＭＡ特異的ＣＡＲを発現し、ＢＣＭＡ＋標的細胞に対して同様のインビトロでの細胞毒性を示した。要約すると、この活性は、一時的または安定的にＣＳＲ共発現によって有意に影響を受けていなかった。
【図２０】ＴＣＲの存在下で、刺激がキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）の発現により増強されることを示す、概略図である。表面に発現するＣＳＲ／ｓの存在下で、一時的または安定的のいずれかで発現され、かつＴ細胞がアゴニストｍＡｂを示す試薬で処理されるとき、増強された一次および二次共刺激シグナルが送達される。一態様において、この概略図は、自己細胞を表す。より完全なＴ細胞の活性化は、ＣＳＲを介した刺激シグナルを介して達成されるため、Ｔ細胞の活性化および増大が、増強される。
【図２１】ＣＳＲがＴ細胞の表面上に発現しており、外因性刺激の不在下で、細胞活性化を引き起こさないことを示す一連のグラフである。正常な献血者からの汎Ｔ細胞は、標準的なＴ細胞培養培地で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、その後休止された。次いで、これらの細胞に、ＣＤ２８  ＣＳＲ、ＣＤ２  ＣＳＲ、または野生型ＣＤ１９対照のいずれかをコードする１０μｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションした（５００Ｖ、７００μｓでのＢＴＸ  ＥＣＭ８３０エレクトロポレーター）。２日後、電気穿孔した細胞を、フローサイトメトリーによって各分子の表面発現を調べ、データを積み重ねヒストグラムとして表示する。加えて、細胞サイズ（ＦＳＣ−Ａ）およびＣＤ６９発現は、偽エレクトロポレーションした対照細胞を超える細胞活性化の可能な指標として評価された。ＣＤ２８、ＣＤ２、およびＣＤ１９の表面発現の増加は、それぞれ、ＣＤ２８ｚ  ＣＳＲ、ＣＤ２ｚ  ＣＳＲ、またはＣＤ１９のいずれかでエレクトロポレーションしたＴ細胞で検出された。Ｔ細胞の表面上でのこれらの分子の発現は、外因性刺激の不在下で、細胞を本質的に活性化しなかった。
【図２２】ＣＳＲ分子が、増強したＣＡＲ−Ｔ細胞の増大のために、製造中に一時的に送達することができることを示す、一連の折れ線グラフである。健常なドナーの血液から単離された汎Ｔ細胞は、同種異系（Ａｌｌｏ）ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生のためにＣａｓ−ＣＬＯＶＥＲ（商標）遺伝子編集システム（ＣＣ）と組み合わせたｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）ＤＮＡ改変システムを用いて、または自己（Ａｕｔｏ）ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生のためにＣＣ遺伝子編集を用いないで、遺伝的に改変され、自己ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポザーゼ酵素（ＳＰＢ）をコードするｍＲＮＡ、およびＣＡＲをコードするトランスポゾン、選択遺伝子、および安全スイッチのヌクレオフェクションによって産生された。Ａｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔの産生のために、細胞は、ＳＰＢ酵素をコードするｍＲＮＡ、ＣＣをコードするｍＲＮＡ、ＴＣＲおよびＭＨＣＩをノックアウトするために、ＴＣＲｂおよびｂ２Ｍを標的とする複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびにＣＡＲ、選択遺伝子、およびＣＳＲ  ＣＤ２ｚのいずれかをコードするトランスポゾン、またはＣＡＲ、選択遺伝子、およびＣＳＲをコードしなかった安全スイッチをコードするトランスポゾンを用いて単一反応でエレクトロポレーション（ＥＰ）した。安定した統合のためにトランスポゾンにコードされたＣＳＲを受け取らなかったＣＡＲ−Ｔ細胞の場合、ＣＤ２ｚ  ＣＳＲは、１００μｌのＥＰ反応で５μｇ、１０μｇ、および２０μｇの様々な量のｍＲＮＡで、最初のＥＰ反応で１回のみｍＲＮＡとして一時的に細胞に提供された。ＥＰ後、すべての細胞は、その後、アゴニストｍＡｂ抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８のカクテルで刺激され、その後、選択遺伝子を使用して１９日間の培養期間にわたって遺伝子改変のために選択された。最初の培養期間の終了時に、すべてのＴ細胞がＣＡＲを発現し、遺伝子改変された細胞の選択が成功したことを示す（データは示さず）。各々のデータを、様々な製造日で折れ線グラフに表示する。ＣＤ２ｚ  ＣＳＲが安定的に（トランスポゾンにコードされるように（安定した））または一時的に（ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にコードされるように）提供されたサンプルでは、ＣＳＲを用いずに産生されたＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、ＣＡＲ−Ｔ細胞の増大のより大きな度合いが、観察された。これらのデータは、自己および同種異系のＣＡＲ−Ｔ生成物の両方の増大を増強するために、製造中にｍＲＮＡとして、ＣＳＲを一時的に送達することができることを示す。
【図２３Ａ】ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ変異体染色データを示す棒グラフである。ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ変異体のパネルを、設計し、構築し、表面発現およびいくつかの抗ＣＤ２抗体試薬への結合について試験した。そうするために、各変異体を合成し、社内のｍＲＮＡ生成ベクターにサブクローニングし、次いで、各々に対して高品質のｍＲＮＡを生成した。Ｋ５６２細胞に、９μｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、各分子の表面発現を、翌日フローサイトメトリーによって分析し、データを棒グラフで示す。各分子は、抗ＣＤ２アクチベーター試薬、抗ＣＤ２モノクローナル抗体（クローンＴＳ１／８）、または抗ＣＤ２ポリクローナル抗体試薬（ヤギ抗ヒトＣＤ２）で染色された。各構築物について可変結合が観察され、データを図２３Ｃに要約する。
【図２３Ｂ】ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ変異体脱顆粒データを示す一連の棒グラフである。ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ変異体のパネルを、ＣＤ５８陽性細胞標的に対する脱顆粒を媒介する能力について試験した。Ｔ細胞の脱顆粒は、Ｔ細胞の死滅の代理であり、標的抗原を発現する標的細胞株との共培養後の細胞内ＣＤ１０７ａ発現のＦＡＣＳ染色によって測定することができる。具体的には、正常な献血者からの汎Ｔ細胞は、標準的なＴ細胞培養培地で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、その後休止された。次いで、これらの細胞に、ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ変異体を発現する９μｇのｍＲＮＡをエレクトロポレーションし（５００Ｖ、７００μｓでのＢＴＸ  ＥＣＭ８３０エレクトロポレーター）、一晩培養した。翌日、細胞を、様々な標的細胞株の存在下で４〜６時間共培養した。陽性の標的細胞株は、それぞれ、ヒトＣＤ５８をコードするｍＲＮＡで、電気穿孔またはリポフェクトしたＫ５６２細胞またはＲａｔ２細胞を含み、陰性対照は、エレクトロポレーションされていないＲａｔ２細胞またはＴ細胞のみを発現するＣＳＲ  ＣＤ２ｚ変異体のいずれかであった。表面発現したヒトＣＤ５８を認識したＣＳＲ  ＣＤ２ｚ変異体を発現するＴ細胞のみが、バックグラウンドを超えるレベルで脱顆粒することができた。Ｄ１１１Ｈ、Ｋ６７Ｒ／Ｙ１１０Ｄ、Ｋ６７Ｒ／Ｑ７０Ｋ／Ｙ１１０Ｄ／Ｄ１１１Ｈ、デルタＫ１０６−１２０、ＣＤ３ｚ欠失、および偽対照についてはほとんど反応性が観察されず、データを図２３Ｃに要約する。
【図２３Ｃ】染色および脱顆粒データの要約である。表面発現および結合研究からのデータ、ならびに各ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ変異体の脱顆粒実験からのデータを、表に要約する。表面上に発現する、および／または抗ＣＤ５８脱顆粒活性を媒介しない抗ＣＤ２アクチベーター試薬への結合を保持する２つの候補は、Ｄ１１１ＨおよびＫ６７Ｒ／Ｙ１１０Ｄ  ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ変異体である。Ｄ１１１Ｈ変異体のみが、細胞表面上のすべての染色試薬に強く結合し、抗ＣＤ５８脱顆粒活性を完全に無効にする。
【図２３Ｄ】Ｋ５６２およびＲａｔ２細胞におけるＣＤ４８、ＣＤ５８、またはＣＤ５９の発現を示す一連のフローサイトメトリープロットである。ＣＳＲ  ＷＴ  ＣＤ２ｚ分子の可能なリガンドを確認するために、ヒトＣＤ４８、ＣＤ５８、およびＣＤ５９を含む既知および疑わしいリガンドのパネルを、試験した。操作されたＴ細胞の脱顆粒は、標的リガンドを過剰発現するように作られた細胞株Ｋ５６２およびＲａｔ２に対して評価され、ＦＡＣＳ染色によって発現が確認された。赤色ヒストグラムは、染色されていない細胞であり、青色ヒストグラムは、ｍＲＮＡでエレクトロポレーション／リポフェクトし、ＦＡＣＳによってそれぞれのマーカーの発現に対して染色した細胞である。
【図２３Ｅ】ＣＳＲ  ＣＤ２ｚが人間のＣＤ５８を認識し、ＣＤ４８またはＣＤ５９を認識しないことを示す棒グラフである。ＣＳＲ  ＷＴ  ＣＤ２ｚ分子の可能なリガンドを確認するために、ヒトＣＤ４８、ＣＤ５８、およびＣＤ５９を含む既知および疑わしいリガンドのパネルを、試験した。操作されたＴ細胞の脱顆粒は、標的リガンドを過剰発現するように作られた細胞株Ｋ５６２およびＲａｔ２に対して評価され、ＦＡＣＳ染色によって発現が確認された。細胞を、ｍＲＮＡでエレクトロポレーション／リポフェクトし、ＦＡＣＳによってそれぞれのマーカーの発現に対して染色した。対照として、ＢＣＭＡ  ＣＡＲが、ＢＣＭＡを過剰発現するＫ５６２細胞株と同様に、含まれた。加えて、ＧＦＰでトランスフェクトされたＴ細胞も、対照として含まれた。Ｔ細胞の脱顆粒は、Ｔ細胞の死滅の代理であり、標的抗原を発現する標的細胞株との共培養後の細胞内ＣＤ１０７ａ発現のＦＡＣＳ染色によって測定することができる。正常な献血者からの汎Ｔ細胞は、標準的なＴ細胞培養培地で抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８ビーズで刺激され、その後休止された。次いで、これらのＴ細胞に、ＣＳＲ  ＷＴ  ＣＤ２ｚ、ＢＣＭＡ  ＣＡＲ、またはＧＦＰを発現するｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、一晩培養した。翌日、細胞は、ヒトＣＤ４８、ＣＤ５８、またはＣＤ５９をコードするｍＲＮＡで電気穿孔／リポフェクトした様々な標的細胞株の存在下で４〜６時間共培養したが、陰性対照は、電気穿孔／リポフェクトしなかったＫ５６２もしくはＲａｔ２細胞のいずれか、またはエレクトロポレーションしたＴ細胞の各々のみであった。ＣＳＲ  ＷＴ  ＣＤ２ｚまたはＢＣＭＡ  ＣＡＲのいずれかを発現するＴ細胞は、それぞれ、ヒトＣＤ５８またはＢＣＭＡを過剰発現する細胞株と共培養するとき、バックグラウンドを超えるレベルで脱顆粒することができたが、ヒトＣＤ４８またはＣＤ５９に対して脱顆粒することができなかった。ＧＦＰを発現するＴ細胞では、反応性はほとんど観察されなかった。
【図２４Ａ】ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ−Ｄ１１１Ｈ変異体の送達が、Ａｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の増大を増強することを示す、棒グラフである。健常なドナーの血液から単離された汎Ｔ細胞は、同種異系（Ａｌｌｏ）ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生のためにＣａｓ−ＣＬＯＶＥＲ（商標）遺伝子編集システム（ＣＣ）と組み合わせたｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）ＤＮＡ改変システムを用いて、またはＣＳＲを用いずに（ＣＳＲなし）自己（Ａｕｔｏ）ＣＡＲ−Ｔ細胞の産生のために、対照としてＣＣ遺伝子編集を用いないで、遺伝的に改変され、ａｕｔｏ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポザーゼ酵素（ＳＰＢ）をコードするｍＲＮＡ、およびＣＡＲをコードするトランスポゾン、選択遺伝子、および安全スイッチのヌクレオフェクションによって産生された。Ａｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔの産生のために、細胞は、ＳＰＢ酵素をコードするｍＲＮＡ、ＣＣをコードするｍＲＮＡ、ＴＣＲおよびＭＨＣＩをノックアウトするために、ＴＣＲｂおよびｂ２Ｍを標的とする複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびにＣＡＲ、選択遺伝子、およびＣＳＲ  ＣＤ２ｚのいずれか、ならびにＷＴまたは変異体（Ｄ１１１Ｈ）ＣＳＲ  ＣＤ２ｚのいずれかをコードするトランスポゾン、またはＣＡＲ、選択遺伝子、およびＣＳＲをコードしなかった安全スイッチをコードするトランスポゾンを用いて単一反応でエレクトロポレーション（ＥＰ）した。後者の、安定した統合のためにトランスポゾンにコードされたＣＳＲを受け取らなかったＡｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の場合、ＷＴまたは変異体（Ｄ１１１Ｈ）ＣＳＲ  ＣＤ２ｚは、最初のＥＰ反応で１回のみｍＲＮＡとして一時的に細胞に提供された。ＥＰ後、すべての細胞は、その後、アゴニストｍＡｂ抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８のカクテルで刺激され、その後、選択遺伝子を使用して最長１５日間の培養期間にわたって遺伝子改変のために選択された。最初の培養期間の終了時に、すべてのＴ細胞がＣＡＲを発現し、遺伝子改変された細胞の選択が成功したことを示し（データは示さず）、次いで、すべての編集されなかったＴＣＲ陽性細胞を、陰性選択を介して枯渇して、９９％超のＴＣＲ陰性であったＡｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の集団を得た（データは示さず）。Ａｕｔｏ（ＣＳＲなし）対照を除いて、すべてのサンプルが重複して実行され、各々（ピーク増大の日を表示する）のピーク増大のデータを、エラーバーが標準偏差を表す、棒グラフに示す。ＷＴまたは変異体（Ｄ１１１Ｈ）ＣＤ２ｚが安定的に（トランスポゾンにコードされているように（安定した））または一時的に（ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にコードされるように）提供されたサンプルでは、ＣＳＲを用いずに産生されたＡｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、Ａｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の増大のより大きな度合いが、観察された。
【図２４Ｂ】ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ−Ｄ１１１Ｈ変異体の送達が、遺伝子編集を阻害しないことを示す一連の棒グラフである。健常なドナーの血液から単離された汎Ｔ細胞は、ＣＡＳ−ＣＬＯＶＥＲ（商標）遺伝子編集システム（ＣＣ）との組み合わせてｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）ＤＮＡ改変システムを使用して遺伝的に改変されて、同種異系（Ａｌｌｏ）ＣＡＲ−Ｔ細胞を産生した。細胞は、ＳＰＢ酵素をコードするｍＲＮＡ、ＣＣをコードするｍＲＮＡ、ＴＣＲおよびＭＨＣＩをノックアウトするために、ＴＣＲｂおよびｂ２Ｍを標的とする複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、ならびにＣＡＲ、選択遺伝子のいずれか、ならびにＷＴまたは変異体（Ｄ１１１Ｈ）ＣＳＲ  ＣＤ２ｚのいずれかをコードするトランスポゾン、またはＣＡＲ、選択遺伝子、およびＣＳＲをコードしなかった安全スイッチをコードするトランスポゾンを用いて単一反応でエレクトロポレーション（ＥＰ）した。後者の、安定した統合のためにトランスポゾンにコードされたＣＳＲを受け取らなかった細胞の場合、ＷＴまたは変異体（Ｄ１１１Ｈ）ＣＳＲ  ＣＤ２ｚは、最初のＥＰ反応で１回のみｍＲＮＡとして一時的に提供された。ＥＰ後、すべての細胞は、その後、アゴニストｍＡｂ抗ＣＤ２、抗ＣＤ３、および抗ＣＤ２８のカクテルで刺激され、その後、選択遺伝子を使用して最長１５日間の培養期間にわたって遺伝子改変のために選択された。最初の培養期間の終了時に、すべてのＴ細胞がＣＡＲを発現し、遺伝子改変された細胞の選択が成功したことを示す（データは示さず）。すべてのサンプルが重複して実行され、データを、エラーバーが標準偏差を表す棒グラフに示す。ＷＴまたは変異体（Ｄ１１１Ｈ）ＣＤ２ｚが安定的に（トランスポゾンにコードされているように（安定した））または一時的に（ｍＲＮＡ（ｍＲＮＡ）にコードされるように）提供されたサンプルでは、ＣＳＲを用いずに産生されたＡｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔ細胞と比較して、Ａｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の遺伝子編集と類似したまたはより大きな度合いが、観察された。
【図２４Ｃ】Ａｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔの記憶表現型が、ＣＤ２ｚ  ＣＳＲの送達によって有意な影響を受けていないことを示す棒グラフである。ＣＳＲを含まないＡｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔ細胞、および安定的または一時的のいずれかで送達されたＣＳＲを含むＡｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔを、表面ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、およびＣＤ６２Ｌの発現に対して染色して、Ｔｓｃｍ、Ｔｃｍ、Ｔｅｍ、およびＴｅｆｆ細胞；ＴＳＣＭ（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ４５ＲＯ-ＣＤ６２Ｌ+）、Ｔｃｍ（ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ４５ＲＯ+ＣＤ６２Ｌ+）、Ｔｅｍ（ＣＤ４５ＲＡ-ＣＤ４５ＲＯ+ＣＤ６２Ｌ-）、Ｔｅｆｆ（ＣＤ４５ＲＡ+ＣＤ４５ＲＯ-ＣＤ６２Ｌ-）を画定した。すべてのサンプルが重複して実行され、データを、エラーバーが標準偏差を表す棒グラフに示す。ＣＳＲの送達は、生成物内の好ましいＴｓｃｍおよびＴｃｍ細胞のレベルに劇的な影響を与えなかった。
【図２５】本開示の例示的なＨＬＡ−ｂＧＢＥ組成物を示す概略図である。
【図２６】本開示の例示的なＨＬＡ−ｇＢＥ組成物を示す概略図である。
【図２７】一本鎖ＨＬＡ−Ｅの発現が、ＨＬＡ欠損Ｔ細胞に対するＮＫ細胞を介した細胞毒性を減少させることを示す、一対のグラフである。Ｂ２ＭおよびＴＣＲαβは、ＣＲＩＳＰＲを使用してＴ細胞（Ｊｕｒｋａｔ）からノックアウトされた。Ｂ２Ｍ／ＴＣＲαβダブルノックアウト（ＤＫＯ）Ｔ細胞に、ＨＬＡ−Ｅ分子（ＨＬＡ−ｂＧＢＥ）をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、Ｂ２ＭおよびペプチドＶＭＡＰＲＥＴＬＩＬ（配列番号１７１２７）（Ｂ２Ｍ／ペプチド／ＨＬＡ−Ｅ）を用いて一本鎖に発現した。一本鎖ＨＬＡ−Ｅをコードする様々な量のｍＲＮＡをエレクトロポレーションしたＤＫＯＴ細胞を、３時間の共培養で人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を増大されたＮＫ細胞の標的として使用した。細胞毒性の割合（％）は、標的細胞のみと比較した、３時間後に残っている標的細胞の数に基づいて計算した。これらのデータは、ＤＫＯ  Ｔ細胞におけるＨＬＡ−Ｅの表面発現が、用量依存的な様式でＮＫ細胞による細胞死滅の総レベルを低下させることを示す。
【図２８】ｇＲＮＡ配列（上から下）およびプライマー配列（上から下）の一覧である。
【図２９】ＨＬＡ−Ｅではなく、内因性ＨＬＡ−ＡＢＣの標的ノックアウトを示す、一連のフローサイトメトリープロットである。ＭＨＣＩ  ＫＯ  Ｔ細胞におけるＨＬＡ−Ｅの表面発現が、ＮＫ細胞を媒介した細胞毒性に対する耐性を高め得ることを示したため、一本鎖ＨＬＡ−Ｅ遺伝子の導入を超えるさらなる戦略を検討した。そうするために、複数のガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）は、内因性ＨＬＡ−Ｅの破壊を最小限に抑えながら、宿主対移植片（ＨｖＧ）、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃの主な標的の発現を破壊するように設計された。具体的には、ガイドは、３つのＭＨＣＩタンパク質標的すべてで生じるが、ＨＬＡ−Ｅでは生じない保存領域を標的とするように設計された。汎ヒトＴ細胞に、様々なｇＲＮＡと組み合わせてＣＲＩＳＰＲ  Ｃａｓ９をコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーションし、ＭＨＣＩノックアウトの効率を、表面ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｅ発現によって測定した。ＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｅ発現のＦＡＣＳ分析は、１ラウンドのＴ細胞増大の後に実行され、データを、以下に表示する。これらのデータは、遺伝子編集技術を使用して、遺伝子編集されたＴ細胞の表面上にある内因性ＨＬＡ−Ｅのレベルを維持しながら、ＭＨＣＩの破壊を標的とすることができることを示す。
【図３０】ＭＨＣＩ−ＫＯ細胞に対するナチュラルキラー細胞を媒介した毒性の自己喪失仮説の概略図である。
【図３１】Ｃｓｙ４−Ｔ２Ａ−Ｃｌｏ０５１−Ｇ４Ｓｌｉｎｋｅｒ−ｄＣａｓ９構築物マップ（実施形態２）の概略説明である。
【図３２】ｐＲＴ１−Ｃｌｏ０５１−ｄＣａｓ９ダブルＮＬＳ構築物マップ（実施形態１）の概略説明である。
【図３３】本開示の同種異系ＣＡＲ−Ｔを産生するための例示的な方法を示す、概略図である。
【図３４Ａ】Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲ（商標）（ｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１を含むＲＮＡ誘導型融合タンパク質）を使用した同種異系および普遍的ＣＡＲ−Ｔの産生のための例示的な方法として増殖するＪｕｒｋａｔ細胞およびを休止する初代ヒト汎Ｔ細胞における内因性ＴＣＲａの高効率の遺伝子編入を示す、グラフである。Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲ系は、比較的高いレベルで、急速に増殖するＪｕｒｋａｔ  Ｔ細胞および分裂しない休止Ｔ細胞におけるＴＣＲαの発現を中断した。
【図３４Ｂ】Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲ（商標）を使用した休止する初代ヒト汎Ｔ細胞における内因性ＴＣＲａ、ＴＣＲｂ、およびＢ２Ｍの効率的な遺伝子編集を示す、一連のフローサイトメトリーグラフである。同種反応性を媒介する重要な標的ＴＣＲａ、ＴＣＲＢ、およびＢ２Ｍは、休止するヒトＴ細胞におけるＣａｓ−ＣＬＯＶＥＲによって効率的に編集された。
【図３５】Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲが、ＴＣＲβおよびβ２Ｍの試薬を初代ヒトＴ細胞に同時送達することによって多重化することをできることを示す、一連のフローサイトメトリープロットである。ＴＣＲβ／β２Ｍダブルノックアウト（ＤＫＯ）細胞は、抗体ビーズベースの精製を使用してさらに濃縮され、精製された細胞は、表面発現したＣＤ３およびβ２Ｍの下方調節についてＦＡＣＳによって分析された。
【図３６】ＴＣＲおよびＭＨＣＩのＫＯ後の同種反応性の低下を示す、一連のグラフである。ＷＴまたはＤＫＯ（ＴＣＲおよびＭＨＣＩ）ＣＡＲ−Ｔ細胞の同種反応性は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）およびＥＬＩＳｐｏｔアッセイによるＩＦＮγによって分析された。左側では、ＷＴ細胞または遺伝子編集されたＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ｃｅｌｌｔｒａｃｅ  ｖｉｏｌｅｔ（ＣＴＶ）で標識し、照射された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）と１：１の比で混合し、それぞれ、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによるＩＦＮγの増殖または活性化誘発性分泌の分析前に１２日間または２０時間インキュベートした。ＷＴまたはＤＫＯＣＡＲ−Ｔ細胞を、同種（ドナー＃１  ＰＢＭＣおよびドナー＃２  ＰＢＭＣ）または自己（自己ＰＢＭＣ）ドナーのいずれかからのＰＢＭＣと１：１の比率でインキュベートしました。１２日後、ＣＴＶ色素希釈を、ＦＡＣＳによって評価し、これらの結果は、同種異系ＰＢＭＣとインキュベートしたときに、ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞の有意な増殖を示し、ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞が自己ＰＢＭＣとインキュベートされた場合のわずか２％と比較して、ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞による４０％および３９％の増殖率が２人の異なるドナーからの同種異系ＰＢＭＣとともに培養された場合に観察された。一方、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、同種異系ＰＢＭＣとインキュベートしたときに増殖せず、ＴＣＲおよびＭＨＣＩのＫＯが移植片対宿主の同種異系反応の排除をもたらしたことを示す。これはまた、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイ（左下）による短期ＩＦＮγにも当てはまり、同種異系ＰＢＭＣとインキュベートされたときに、ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のみが活性化され、ＩＦＮγを分泌したが、ＤＫＯＣＡＲ−Ｔ細胞は分泌されなかったことを示した。右側では、照射されたＷＴ細胞またはＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を、ＣＦＳＥで標識されたＰＢＭＣと１：１の比で混合し、それぞれ、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによるＩＦＮγの増殖または活性化誘導分泌の分析前に１２日間または２０時間インキュベートした。１２日後、ＣＦＳＥ色素希釈を、ＦＡＣＳによって評価し、これらの結果は、同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞とインキュベートしたときに、ＰＢＭＣ（たいがい、Ｔ細胞）の有意な増殖を示し、自己ＣＡＲ−Ｔ細胞とインキュベートされたときのわずか２％と比較して、３７％および９％のＰＢＭＣが増殖した。一方、ＰＢＭＣは、同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞とインキュベートしたとき、バックグラウンドを超えて増殖せず、ＴＣＲおよびＭＨＣＩのＫＯが、宿主対移植片の同種異系反応の排除をもたらしたことを示す。これは、ＥＬＩＳｐｏｔアッセイによる短期ＩＦＮγ（左下）にも当てはまり、同種異系ＣＡＲ−Ｔとインキュベートされたときに、ＷＴ  ＣＡＲ−Ｔ細胞のみがＰＢＭＣによるＩＦＮγの活性化および分泌されたが、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は分泌されなかったことを示した。
【図３７】ＤＫＯおよびＷＴ  ＣＡＲ−Ｔが同様のＣＡＲ発現および幹様表現型を有することを示す、一連のグラフである。遺伝子編集は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の表現型に影響を与えない。ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴＣＲβ／β２ＭＤＫＯおよびＷＴ  Ｔ細胞を、表現型について分析した。ＣＡＲの発現は、ＷＴおよびＤＫＯにおいて同等であった。ＷＴおよびＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｔ幹細胞記憶（ＴＳＣＭ）のマーカーであるＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌの発現についてＦＡＣＳによって分析された。これらのデータは、ａｌｌｏ  ＣＡＲ−Ｔの遺伝子編集が、記憶ＣＡＲ−Ｔ細胞の組成を大幅に減少させず、非常に高く、主にＴｓｃｍ表現型を保持していることを示す。
【図３８】ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔが高機能であることを示す、一連のグラフである。遺伝子編集は、ＣＡＲ−Ｔ細胞の機能性に影響を与えない。ＢＣＭＡ  ＣＡＲを発現するＴＣＲβ／β２Ｍ  ＤＫＯおよびＷＴ  Ｔ細胞を、機能について分析した。Ｈ９２９（ＢＣＭＡ＋）腫瘍株に対する増殖は、ＣＡＲ−Ｔ細胞をＨ９２９細胞と混合することによって評価され、７日間インキュベートされ、ＦＡＣＳによって腫瘍特異的増殖について分析された。Ｈ９２９（ＢＣＭＡ＋）腫瘍株に対する細胞毒性およびＩＦＮｇ分泌は、ＣＡＲ−Ｔ細胞をＨ９２９細胞と様々な比率で混合し、２４時間インキュベートし、ＦＡＣＳによって腫瘍特異的死滅について分析することによって評価した。細胞毒性データは、腫瘍細胞のみのサンプルに対して正規化される。これらのデータは、ＤＫＯ  ＣＡＲ−Ｔ細胞を産生するための遺伝子編集がそれらの機能的能力に大きな影響を与えないことを示す。
【図３９Ａ】マウス異種移植モデルを用いた「ストレス」用量での完全長プラスミド（ＦＬＰ）対ナノトランスポゾン（ＮＴ）によって送達されたときのＰ−ＰＳＭＡ−１０１トランスポゾンの前臨床評価を示す、概略図である。ＮＳＧマウスに皮下（ＳＣ）注射されたルシフェラーゼ発現ＬＮＣａＰ細胞株（ＬＮＣａＰ．ｌｕｃ）を使用したマウス異種移植モデルを利用して、２つの異なる正常なドナーからの総ＣＡＲ−Ｔ細胞の２つの異なる「ストレス」用量（２．５×１０＾６または４×１０＾６）での完全長プラスミド（ＦＬＰ）またはナノトランスポゾン（ＮＴ）によって送達されるように、Ｐ−ＰＳＭＡ−１０１トランスポゾンのインビボでの抗腫瘍効果を評価した。すべてのＣＡＲ−Ｔ細胞は、ＦＬＰまたはＮＴ送達のいずれかを使用してＰ−ＰＳＭＡ−１０１トランスポゾンのｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）送達を使用して産生された。マウスに、ＬＮＣａＰを腋窩に注射し、腫瘍を構築したとき（キャリパー測定によって１００〜２００ｍｍ3）に処置した。マウスを、ＦＬＰによるトランスポゾン送達とＮＴとの間の有効性における可能性がある機能差を検出する際により多くの解像度のためのＩＶ注射によるＰ−ＰＳＭＡ−１０１  ＣＡＲ−Ｔの２つの異なる「ストレス」用量（２．５×１０＾６または４×１０＾６）で処置した。
【図３９Ｂ】図３４Ａに記載されるように処置されたマウスの腫瘍体積評価を示す、一連のグラフである。エラーバー（上）および個々のマウス（下）とともにグループ平均として表示されるように、対照マウス（黒色）、ドナー＃１  ＦＬＰマウス（赤色）、ドナー＃１  ＮＴマウス（青色）、ドナー＃２  ＦＬＰマウス（橙色）、およびドナー＃２  ＮＴマウス（緑色）のキャリパー測定による腫瘍体積評価。ｙ軸は、キャリパー測定によって評価された腫瘍体積（ｍｍ3）を示す。ｘ軸は、Ｔ細胞処置後の日数を示す。ＮＴによって送達された「ストレス」用量のＰ−ＰＳＭＡ−１０１トランスポゾンは、構築されたＳＣ  ＬＮＣａＰ．ｌｕｃ固形腫瘍に対するＦＬＰおよび対照マウスと比較してキャリパーによって測定されるように、増強された抗腫瘍効果を示した。
【発明を実施するための形態】
【００３３】
本開示は、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ａ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含むか、本質的にそれからなる、またはそれからなる、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。
【００３４】
活性化成分は、ヒト膜貫通受容体、ヒト細胞表面受容体、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分、ＴＣＲ複合体の成分、ＴＣＲ共受容体の成分、ＴＣＲ共刺激タンパク質の成分、ＴＣＲ阻害タンパク質の成分、サイトカイン受容体、またはケモカイン受容体のうちの１つ以上を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。活性化成分は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分、ＴＣＲ複合体の成分、ＴＣＲ共受容体の成分、ＴＣＲ共刺激タンパク質の成分、ＴＣＲ阻害タンパク質の成分、サイトカイン受容体、または活性化成分のアゴニストが結合するケモカイン受容体のうちの１つ以上の一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【００３５】
エクトドメインは、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができるか、あるいはエクトドメインは、アゴニストが結合するＣＤ２８細胞外ドメインまたはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。活性化成分は、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができるか、あるいは活性化成分は、アゴニストが結合するＣＤ２８細胞外ドメインまたはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１７１１１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１７１１１のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１７１１１のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。アゴニストが結合するＣＤ２８細胞外ドメインは、配列番号１７０９９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。アゴニストが結合するＣＤ２８細胞外ドメインは、配列番号１７０９９のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。アゴニストが結合するＣＤ２８細胞外ドメインは、配列番号１７０９９のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００３６】
シグナル変換ドメインは、ヒトシグナル変換ドメイン、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の成分、ＴＣＲ複合体の成分、ＴＣＲ共受容体の成分、ＴＣＲ共刺激タンパク質の成分、ＴＣＲ阻害タンパク質の成分、サイトカイン受容体、またはケモカイン受容体のうちの１つ以上を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。第２のタンパク質は、ＣＤ３タンパク質またはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。シグナル変換ドメインは、ＣＤ３タンパク質またはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ＣＤ３タンパク質は、ＣＤ３ζタンパク質またはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ＣＤ３ζタンパク質は、配列番号１７１０２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ３ζタンパク質は、配列番号１７１０２のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ３ζタンパク質は、配列番号１７１０２のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００３７】
本開示のＣＳＲのエンドドメインは、細胞質ドメインをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。細胞質ドメインは、第３のタンパク質から単離され得るか、またはそれに由来し得る。いくつかの態様において、本開示のＣＳＲの第１のタンパク質および第３のタンパク質は、同一である。細胞質ドメインは、ＣＤ２細胞質ドメインまたはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができるか、あるいは細胞質ドメインは、ＣＤ２８細胞質ドメインまたはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【００３８】
ＣＤ２細胞質ドメインは、配列番号１７１１３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２細胞質ドメインは、配列番号１７１１３のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２細胞質ドメインは、配列番号１７１１３のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２８細胞質ドメインは、配列番号１７１０１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２８細胞質ドメインは、配列番号１７１０１のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２８細胞質ドメインは、配列番号１７１０１のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００３９】
本開示のＣＳＲのエンドドメインは、シグナルペプチドをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。シグナルペプチドは、第４のタンパク質から単離され得るか、またはそれに由来し得る。いくつかの態様において、本開示のＣＳＲの第１のタンパク質および第４のタンパク質は、同一である。シグナルペプチドは、ＣＤ２シグナルペプチドまたはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができ、シグナルペプチドは、ＣＤ２８シグナルペプチドまたはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができるか、あるいはシグナルペプチドは、ＣＤ８ａシグナルペプチドまたはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ＣＤ２シグナルペプチドは、配列番号１７１１０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２シグナルペプチドは、配列番号１７１１０のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２シグナルペプチドは、配列番号１７１１０のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２８シグナルペプチドは、配列番号１７０９８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２８シグナルペプチドは、配列番号１７０９８のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２８シグナルペプチドは、配列番号１７０９８のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ８ａシグナルペプチドは、配列番号１７０３７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ８ａシグナルペプチドは、配列番号１７０３７のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ８ａシグナルペプチドは、配列番号１７０３７のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００４０】
本開示のＣＳＲの膜貫通ドメインは、第５のタンパク質から単離され得るか、またはそれに由来し得る。いくつかの態様において、本開示のＣＳＲの第１のタンパク質および第５のタンパク質は、同一である。膜貫通ドメインは、ＣＤ２膜貫通ドメインまたはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができるか、あるいは膜貫通ドメインは、ＣＤ２８膜貫通ドメインまたはその一部分を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ＣＤ２膜貫通ドメインは、配列番号１７１１２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２膜貫通ドメインは、配列番号１７１１２のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２膜貫通ドメインは、配列番号１７１１２のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１７１００のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１７１００のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＤ２８膜貫通ドメインは、配列番号１７１００のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００４１】
いくつかの態様において、本開示のＣＳＲの活性化成分は、自然発生分子に結合しないか、または結合することができない。いくつかの態様において、本開示のＣＳＲの活性化成分は、自然発生分子に結合するか、または結合することができ、ＣＳＲは、自然発生分子への活性化成分の結合の際に、シグナルを変換する。他の態様において、本開示のＣＳＲの活性化成分は、自然発生分子に結合することができるが、ＣＳＲは、自然発生分子への活性化成分の結合の際に、シグナルを変換しない。好ましい態様において、本開示のＣＳＲの活性化成分は、非自然発生分子に結合するか、または結合することができる。本開示のＣＳＲの活性化成分は、活性化成分への非自然発生分子の結合の際にシグナルを選択的に変換する。一態様において、自然発生分子は、ＣＳＲの活性化成分のための自然発生アゴニスト／活性化剤である。ＣＳＲ活性化成分に結合することができる自然発生アゴニスト／活性化剤は、任意の自然発生抗体または抗体断片であり得る。自然発生抗体または抗体断片は、自然発生抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、抗ＣＤ２抗体もしくはその断片、抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様において、ＣＳＲ活性化成分に結合することができる自然発生アゴニスト／活性化剤は、抗ヒトＣＤ３単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異性四量体抗体複合体、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上であり得る。一態様において、非自然発生分子は、ＣＳＲの活性化成分のための非自然発生アゴニスト／活性化剤である。ＣＳＲ活性化成分に結合することができる非自然発生アゴニスト／活性化剤は、任意の非自然発生抗体または抗体断片であり得る。非自然発生抗体または抗体断片は、非自然発生抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、抗ＣＤ２抗体もしくはその断片、抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様において、ＣＳＲ活性化成分に結合することができる非自然発生アゴニスト／活性化剤は、抗ヒトＣＤ３単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異性四量体抗体複合体、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上であり得る。いくつかの態様において、ＣＳＲ活性化成分に結合することができる非自然発生アゴニスト／活性化剤は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体、ＢＴＩ−３２２（（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９２（１１）：４０６６−４０７１，１９９８）、およびヒト化抗ＣＤ２モノクローナル抗体クローンＡＦＣ−ＴＡＢ−１０４（シプリズマブ）（Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．３０１（６）：４２９−４４２，２００９）からなる群から選択され得る。
【００４２】
いくつかの態様において、本開示のＣＳＲのエクトドメインは、改変を含むことができる。改変は、活性化成分または第１のタンパク質の野生型配列と比較するとき、活性化成分または第１のタンパク質のアミノ酸配列の変異または切断を含むことができる。活性化成分または第１のタンパク質のアミノ酸配列の変異または切断は、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分の変異または切断を含むことができる。ＣＤ２細胞外ドメインの変異または切断は、自然発生ＣＤ５８との結合を低減または排除する。
【００４３】
結合の低減は、変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインの結合能力の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が、自然発生野生型の対応物と比較したときに低減する。結合の排除は、変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインの結合能力の１００％が、自然発生野生型ＣＤ２細胞外ドメインと比較したときに低減する。
【００４４】
変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインは、抗ＣＤ２活性化アゴニストおよび抗ＣＤ２活性化分子に結合するが、自然発生ＣＤ５８には結合しない。変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１７１１９のアミノ酸配列と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１７１１９のアミノ酸配列と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１７１１９のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１７１１９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１７１１９のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインは、配列番号１７１１９のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインを含むＣＳＲは、配列番号１７１１８のアミノ酸配列と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインを含むＣＳＲは、配列番号１７１１８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインを含むＣＳＲは、配列番号１７１１８のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインを含むＣＳＲは、配列番号１７１１８のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００４５】
本開示はまた、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ａ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、活性化成分が、非自然発生分子と結合するが、自然発生分子とは結合しない、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）も提供する。
【００４６】
本開示はまた、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ａ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではなく、ＣＳＲが、活性化成分への自然発生分子の結合の際にシグナルを変換しない、エンドドメインと、を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）も提供する。
【００４７】
本開示はまた、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ａ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではなく、ＣＳＲが、活性化成分への非自然発生分子の結合の際にシグナルを変換する、エンドドメインと、を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）も提供する。
【００４８】
本開示はまた、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ａ）シグナルペプチドおよび活性化成分を含むエクトドメインであって、シグナルペプチドが、ＣＤ２シグナルペプチドまたはその一部分を含み、活性化成分が、アゴニストが結合するＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分を含む、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインであって、ＣＤ２膜貫通ドメインまたはその一部分を含む、膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞質ドメインおよび少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、細胞質ドメインが、ＣＤ２細胞質ドメインまたはその一部分を含み、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、ＣＤ３ζタンパク質またはその一部分を含む、エンドドメインと、を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）も提供する。
【００４９】
本開示はまた、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ａ）エクトドメインであって、配列番号１７１１０のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドおよび配列番号１７１１１のアミノ酸配列を含む活性化成分を含む、エクトドメインと、（ｂ）配列番号１７１１２の膜貫通ドメインと、（ｃ）エンドドメインであって、配列番号１７１１３のアミノ酸配列を含む細胞質ドメインおよび配列番号１７１０２のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含む、エンドドメインと、を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）も提供する。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７０６２と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７０６２と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７０６２と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７０６２と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７０６２と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７０６２のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【００５０】
本開示はさらに、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ａ）シグナルペプチドおよび活性化成分を含むエクトドメインであって、シグナルペプチドが、ＣＤ２シグナルペプチドまたはその一部分を含み、活性化成分が、アゴニストが結合する野生型ＣＤ２細胞外ドメインまたはその一部分を含む、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインであって、ＣＤ２膜貫通ドメインまたはその一部分を含む、膜貫通ドメインと、（ｃ）細胞質ドメインおよび少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、細胞質ドメインが、ＣＤ２細胞質ドメインまたはその一部分を含み、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、ＣＤ３ζタンパク質またはその一部分を含む、エンドドメインと、を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。一態様において、ＣＤ２細胞外ドメインの変異または切断は、自然発生ＣＤ５８との結合を低減または排除する。別の態様において、変異または切断型ＣＤ２細胞外ドメインは、抗ＣＤ２活性化アゴニストおよび抗ＣＤ２活性化分子に結合するが、自然発生ＣＤ５８には結合しない。
【００５１】
本開示はさらに、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ａ）エクトドメインであって、配列番号１７１１０のアミノ酸配列を含むシグナルペプチドおよび配列番号１７１１９のアミノ酸配列を含む活性化成分を含む、エクトドメインと、（ｂ）配列番号１７１１２の膜貫通ドメインと、（ｃ）エンドドメインであって、配列番号１７１１３のアミノ酸配列を含む細胞質ドメインおよび配列番号１７１０２のアミノ酸配列を含む少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含む、エンドドメインと、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７１１８と少なくとも８０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７１１８と少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７１１８と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７１１８と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７１１８と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、配列番号１７１１８のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【００５２】
本開示はまた、本明細書に開示される任意のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列も提供する。本開示はまた、本明細書に開示される任意のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、トランスポゾン、ベクター、ドナー配列、またはドナープラスミドも提供する。一態様において、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。一態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはキメラウイルスベクターであり得る。
【００５３】
本開示はまた、本明細書に開示される任意のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、細胞も提供する。本開示はまた、本明細書に開示される任意のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、細胞も提供する。本開示はまた、本明細書に開示される任意のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、トランスポゾン、ベクター、ドナー配列、またはドナープラスミドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、細胞も提供する。一態様において、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。一態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはキメラウイルスベクターであり得る。本明細書に開示される任意のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、本開示の細胞は、同種異系細胞または自己細胞であり得る。いくつかの好ましい実施形態において、細胞は、同種異系細胞である。
【００５４】
本開示はまた、本明細書に開示される任意のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、組成物も提供する。本開示はまた、本明細書に開示される任意のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、組成物も提供する。本開示はまた、本明細書に開示される任意のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）のアミノ酸配列をコードする核酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、トランスポゾン、ベクター、ドナー配列、またはドナープラスミドを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、組成物も提供する。一態様において、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。一態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはキメラウイルスベクターであり得る。本開示はまた、本明細書に開示される任意のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、細胞または複数の細胞を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、組成物も提供する。
【００５５】
本開示は、改変された細胞であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、改変された細胞を提供する。
【００５６】
本開示はまた、改変された細胞であって、（ａ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、（ｂ）誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドと、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変された細胞も提供する。
【００５７】
本開示はまた、改変された細胞であって、（ａ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、（ｂ）誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをコードし、かつこの細胞がＴ細胞である、配列と、（ｃ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、改変がＴＣＲの発現または活性のレベルを低減するかまたは排除する、改変と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変された細胞も提供する。
【００５８】
本開示は、改変された細胞であって、（ａ）ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の改変であって、主要組織性適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｂ）ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原であるアルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）ポリペプチドを含む非自然発生配列と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変された細胞を提供する。
【００５９】
本開示は、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）であって、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｂ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）を提供する。
【００６０】
本開示は、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）であって、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｂ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、（ｃ）非自然発生キメラ抗体受容体と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）を提供する。
【００６１】
本開示は、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）であって、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｂ）ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の改変であって、主要組織性適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｃ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）を提供する。
【００６２】
本開示は、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）であって、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｂ）ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の改変であって、主要組織性適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｃ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、（ｄ）非自然発生キメラ抗原受容体と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）を提供する。
【００６３】
本開示はまた、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）であって、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｂ）ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の改変であって、主要組織性適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｃ）ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原であるアルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）を含む非自然発生配列と、（ｄ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）も提供する。
【００６４】
本開示はまた、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）であって、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｂ）ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の改変であって、主要組織性適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｃ）ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原であるアルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）を含む非自然発生配列と、（ｄ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、（ｅ）非自然発生キメラ抗原受容体と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）も提供する。
【００６５】
本開示はまた、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）であって、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｂ）ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原であるアルファ鎖Ａ（ＨＬＡ−Ａ）、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原であるアルファ鎖Ｂ（ＨＬＡ−Ｂ）、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原であるアルファ鎖Ｃ（ＨＬＡ−Ｃ）、またはそれらの組み合わせの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｃ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）も提供する。
【００６６】
本開示はまた、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）であって、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｂ）ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原であるアルファ鎖Ａ（ＨＬＡ−Ａ）、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原であるアルファ鎖Ｂ（ＨＬＡ−Ｂ）、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原であるアルファ鎖Ｃ（ＨＬＡ−Ｃ）、またはそれらの組み合わせの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｃ）ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原であるアルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）を含む非自然発生配列と、（ｄ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）も提供する。
【００６７】
本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、配列番号１４６４１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなる、またはそれからなる。誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、配列番号１４６４１のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなる、またはそれからなる。誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、配列番号１４６４１のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００６８】
本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）は、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の改変であって、主要組織性適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現または活性のレベルを低減または排除する、改変、をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。発現または活性のレベルの低減は、細胞中のＭＨＣ−Ｉの発現または細胞中のＭＨＣ−Ｉの機能的活性の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％が、細胞の自然発生野生型の対応物と比較したときに低減するときである。発現または活性のレベルの低減は、Ｔ細胞中のＭＨＣ−Ｉの発現またはＴ細胞中のＭＨＣ−Ｉの機能的活性の少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、もしくは少なくとも９９％が、細胞の自然発生野生型Ｔ細胞と比較したときに低減するときである。発現または活性のレベルの排除は、細胞中のＭＨＣ−Ｉの発現または細胞中のＭＨＣ−Ｉの機能的活性の１００％が、細胞の自然発生野生型の対応物と比較したときに低減するときである。発現または活性のレベルの排除は、Ｔ細胞中のＭＨＣ−Ｉの発現またはＴ細胞中のＭＨＣ−Ｉの機能的活性の１００％が、自然発生野生型Ｔ細胞と比較したときに低減するときである。
【００６９】
本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）は、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原であるアルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）を含む非自然発生ポリペプチドをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ＨＬＡ−Ｅポリペプチドは、配列番号１７１３１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＨＬＡ−Ｅポリペプチドは、配列番号１７１３１のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＨＬＡ−Ｅポリペプチドは、配列番号１７１３１のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００７０】
ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。Ｂ２Ｍシグナルペプチドは、配列番号１７１２６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。Ｂ２Ｍシグナルペプチドは、配列番号１７１３１のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。Ｂ２Ｍシグナルペプチドは、配列番号１７１３１のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００７１】
ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、Ｂ２Ｍポリペプチドをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。Ｂ２Ｍポリペプチドは、配列番号１７１２９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。Ｂ２Ｍポリペプチドは、配列番号１７１２９のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。Ｂ２Ｍポリペプチドは、配列番号１７１２９のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００７２】
ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、リンカー分子（本明細書においてリンカーと称される）をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、リンカーをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができ、リンカーは、Ｂ２ＭポリペプチドとＨＬＡ−Ｅポリペプチドとの間に位置する。リンカーは、配列番号１７１３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなる、またはそれからなる。リンカーは、配列番号１７１３０のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。リンカーは、配列番号１７１３０のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００７３】
ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、ペプチドおよびＢ２Ｍポリペプチドをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ペプチドは、配列番号１７１２７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ペプチドは、配列番号１７１２７のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ペプチドは、配列番号１７１２７のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００７４】
ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドとペプチドとの間に位置する、第１のリンカーと、Ｂ２ＭポリペプチドとＨＬＡ−Ｅポリペプチドとの間に位置する、第２のリンカーと、をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。第１のリンカーは、配列番号１７１２８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。第１のリンカーは、配列番号１７１２８のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。第１のリンカーは、配列番号１７１２８のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。第２のリンカーは、配列番号１７１３０のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。第２のリンカーは、配列番号１７１３０のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。第２のリンカーは、配列番号１７１３０のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。
【００７５】
一態様において、ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチド、ペプチド、第１のリンカー、Ｂ２Ｍポリペプチド、第２のリンカー、およびＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。ペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドと第１のリンカーとの間に位置することができ、Ｂ２Ｍポリペプチドは、第１のリンカーと第２のリンカーとの間に位置することができ、第２のリンカーは、Ｂ２ＭポリペプチドとＨＬＡ−Ｅポリペプチドとの間に位置することができる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６４のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６４のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６４のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６５の配列を有する核酸によってコードされ得る。
【００７６】
一態様において、ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチド、Ｂ２Ｍポリペプチド、リンカー、およびＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。Ｂ２Ｍポリペプチドは、Ｂ２Ｍシグナルペプチドとリンカーとの間に位置することができ、リンカーは、Ｂ２ＭポリペプチドとＨＬＡ−Ｅポリペプチドとの間に位置することができる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６６のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６６のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６６のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６７の配列を有する核酸によってコードされ得る。
【００７７】
一態様において、ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、Ｂ２ＭシグナルペプチドおよびＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。Ｂ２Ｍシグナルペプチドは、ＨＬＡ−Ｅポリペプチドの前（例えば、核酸配列の文脈では５’、またはアミノ酸配列の文脈ではアミノ末端）に位置することができる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６８のアミノ酸配列と少なくとも９９％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６８のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、配列番号１７０６９の配列を有する核酸によってコードされ得る。
【００７８】
本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）は、非自然発生抗原受容体、治療用ポリペプチドをコードする配列、またはそれらの組み合わせをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。好ましい態様において、非自然発生抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる。ＣＡＲは、（ａ）抗原認識領域を含むエクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインと、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。ＣＡＲのエクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ＣＡＲのエクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインとの間のヒンジをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ＣＡＲのエンドドメインは、ヒトＣＤ３ζエンドドメインをさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ＣＡＲの少なくとも１つの共刺激ドメインは、ヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内セグメント、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。好ましい態様において、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ヒトＣＤ２８および／または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。
【００７９】
本開示の改変された細胞は、免疫細胞または免疫細胞前駆体であり得る。免疫細胞は、リンパ系前駆細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり得る。好ましい態様において、免疫細胞は、Ｔ細胞、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）、または幹細胞様Ｔ細胞である。免疫細胞前駆体は、造血幹細胞（ＨＳＣ）であり得る。改変された細胞は、幹細胞、分化細胞、体細胞、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）であり得る。改変された細胞は、自己細胞または同種異系細胞であり得る。一態様において、細胞は、改変された同種異系Ｔ細胞である。別の態様において、細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、ＣＡＲ  Ｔ細胞を発現する改変された同種異系Ｔ細胞である。
【００８０】
本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）は、本開示のＣＳＲを一時的または安定的に発現することができる。一態様において、本開示のＣＳＲは、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で一時的に発現される。一態様において、本開示のＣＳＲは、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で安定的に発現される。
【００８１】
本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）は、本開示のＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドを一時的または安定的に発現することができる。一態様において、本開示のＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で一時的に発現される。一態様において、本開示のＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で安定的に発現される。
【００８２】
本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）は、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを一時的または安定的に発現することができる。一態様において、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で一時的に発現される。好ましい態様において、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で安定的に発現される。
【００８３】
本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）は、非自然発生抗原受容体または本開示の治療用タンパク質をコードする配列を一時的または安定的に発現することができる。一態様において、非自然発生抗原受容体または本開示の治療用タンパク質をコードする配列は、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で一時的に発現される。好ましい態様において、非自然発生抗原受容体または本開示の治療用タンパク質をコードする配列は、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で安定的に発現される。
【００８４】
一態様において、本開示のＣＳＲは、安定的に発現され、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、安定的に発現され、非自然発生抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で安定的に発現される。
【００８５】
一態様において、本開示のＣＳＲは、安定的に発現され、本開示のＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、安定的に発現され、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、安定的に発現され、非自然発生抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で安定的に発現される。
【００８６】
一態様において、本開示のＣＳＲは、安定的に発現され、本開示のＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、一時的に発現され、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、安定的に発現され、非自然発生抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で安定的に発現される。
【００８７】
一態様において、本開示のＣＳＲは、一時的に発現され、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、安定的に発現され、非自然発生抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で安定的に発現される。
【００８８】
一態様において、本開示のＣＳＲは、一時的に発現され、本開示のＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、一時的に発現され、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、安定的に発現され、非自然発生抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で安定的に発現される。
【００８９】
一態様において、本開示のＣＳＲは、一時的に発現され、本開示のＨＬＡ−Ｅを含む非自然発生ポリペプチドは、安定的に発現され、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、安定的に発現され、非自然発生抗原受容体または治療用タンパク質をコードする配列は、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）内で安定的に発現される。
【００９０】
本開示は、改変された細胞（好ましくは改変されたＴ細胞であって、（ａ）Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変と、（ｂ）キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）をコードする配列であって、（ｉ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｉｉ）膜貫通ドメインと、（ｉｉｉ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含む、キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）をコードする配列と、を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる、改変された細胞（好ましくは改変されたＴ細胞を提供する。
【００９１】
改変された細胞は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする配列をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。改変された細胞は、非自然発生抗原受容体をコードする配列、治療用ポリペプチドをコードする配列、またはそれらの組み合わせをさらに含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなることができる。非自然発生抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【００９２】
トランスポゾン、ベクター、ドナー配列、またはドナープラスミドは、ＣＳＲをコードする配列、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする配列、またはそれらの組み合わせを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。トランスポゾン、ベクター、ドナー配列、またはドナープラスミドは、非自然発生抗原受容体をコードする配列または治療用タンパク質をコードする配列をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。トランスポゾン、ベクター、ドナー配列、またはドナープラスミドは、選択マーカーをコードする配列をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾン、ｐｉｇｇｙ−Ｂａｃ（登録商標）様トランスポゾン、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾン、Ｔｏｌ２トランスポゾン、またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンであり得る。ＣＳＲをコードする配列は、細胞内で一時的に発現され得る。ＣＳＲをコードする配列は、細胞内で安定的に発現され得る。誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする配列は、細胞内で安定的に発現され得る。非自然発生抗原受容体をコードする配列または治療用タンパク質をコードする配列は、細胞内で安定的に発現される。いくつかの態様において、ＣＳＲをコードする配列は、細胞内で一時的に発現され得、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする配列は、細胞内で安定的に発現され得る。いくつかの態様において、ＣＳＲをコードする配列は、細胞内で安定的に発現され得、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする配列は、細胞内で安定的に発現され得る。いくつかの態様において、ＣＳＲをコードする配列は、細胞内で一時的に発現され得、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする配列は、細胞内で安定的に発現され得、非自然発生抗原受容体をコードする配列または治療用タンパク質をコードする配列は、細胞内で安定的に発現される。いくつかの態様において、ＣＳＲをコードする配列は、細胞内で安定して発現され得、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする配列は、細胞内で安定的に発現され得、非自然発生抗原受容体をコードする配列または治療用タンパク質をコードする配列は、細胞内で安定的に発現される。一態様において、ベクターは、ウイルスベクターであり得る。一態様において、ウイルスベクターは、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、またはキメラウイルスベクターであり得る。
【００９３】
第１のトランスポゾン、第１のベクター、第１のドナー配列、または第１のドナープラスミドは、ＣＳＲをコードする配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。第１のトランスポゾン、第１のベクター、第１のドナー配列、または第１のドナープラスミドは、第１の選択マーカーをコードする配列をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【００９４】
第２のトランスポゾン、第２のベクター、第２のドナー配列、または第２のドナープラスミドは、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをコードする配列、非自然発生抗原受容体をコードする配列、および治療用タンパク質をコードする配列のうちの１つ以上を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。第２のトランスポゾン、第２のベクター、第２のドナー配列、または第２のドナープラスミドは、第２の選択マーカーをコードする配列をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。第１の選択マーカーおよび第２の選択マーカーは、同一である。第１の選択マーカーおよび第２の選択マーカーは、同一ではない。選択マーカーは、細胞表面マーカーを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。選択マーカーは、分裂細胞内では活性であり、非分裂細胞では活性ではないタンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。選択マーカーは、代謝マーカーを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【００９５】
一態様において、選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ムテイン酵素を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ＤＨＦＲムテイン酵素は、配列番号１７０１２のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【００９６】
配列番号１７０１２のＤＨＦＲムテイン酵素は、８０位、１１３位、または１５３位のうちの１つ以上での変異をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。配列番号１７０１２のＤＨＦＲムテイン酵素のアミノ酸配列は、８０位のフェニルアラニン（Ｆ）またはロイシン（Ｌ）の置換、１１３位のロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ）の置換、および１５３位のバリン（Ｖ）またはアスパラギン酸（Ｄ）の置換のうちの１つ以上をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【００９７】
本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）は、遺伝子編集組成物をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。遺伝子編集組成物は、ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列、およびヌクレアーゼタンパク質またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。遺伝子編集組成物は、改変された細胞によって一時的に発現され得る。遺伝子編集組成物は、改変された細胞によって安定的に発現され得る。
【００９８】
遺伝子編集組成物は、ヌクレアーゼタンパク質をコードする配列またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ヌクレアーゼタンパク質をコードする配列またはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列は、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはそれらの組み合わせを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインは、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質、転写アクチベーター様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、およびエンドヌクレアーゼのうちの１つ以上を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓタンパク質は、ヌクレアーゼ不活化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインは、ヌクレアーゼ不活化Ｃａｓ（ｄＣａｓ）タンパク質およびエンドヌクレアーゼを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。エンドヌクレアーゼは、融合タンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。遺伝子編集組成物は、融合タンパク質を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。融合タンパク質は、ヌクレアーゼ不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）タンパク質およびＣｌｏ０５１ヌクレアーゼまたはＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。融合タンパク質は、配列番号１７０１３のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。融合タンパク質は、配列番号１７０１４のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる核酸によってコードされる。融合タンパク質は、配列番号１７０５８のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。融合タンパク質は、配列番号１７０５９の配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる核酸によってコードされる。
【００９９】
遺伝子編集組成物は、ガイド配列をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ガイド配列は、ＲＮＡ配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。改変された細胞がＴ細胞であるときの態様において、ガイドＲＮＡは、内因性ＴＣＲをコードする標的配列に相補的な配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ガイドＲＮＡは、Ｂ２Ｍポリペプチドをコードする標的配列に相補的な配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。ガイドＲＮＡは、ゲノムＤＮＡ配列のセーフハーバー部位内の標的配列に相補的な配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【０１００】
トランスポゾン、ベクター、ドナー配列、またはドナープラスミドは、ガイド配列、ならびに不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をコードする配列およびＣｌｏ０５１ヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む融合タンパク質をコードする配列を含む遺伝子編集組成物をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【０１０１】
第１のトランスポゾン、第１のベクター、第１のドナー配列、または第１のドナープラスミドは、ガイド配列、ならびに不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をコードする配列およびＣｌｏ０５１ヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む融合タンパク質をコードする配列を含む遺伝子編集組成物をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【０１０２】
第２のトランスポゾン、第２のベクター、第２のドナー配列、または第２のドナープラスミドは、ガイド配列、ならびに不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をコードする配列およびＣｌｏ０５１ヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む融合タンパク質をコードする配列を含む遺伝子編集組成物をさらに含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【０１０３】
第３のトランスポゾン、第３のベクター、第３のドナー配列、または第３のドナープラスミドは、ガイド配列、ならびに不活性化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）をコードする配列およびＣｌｏ０５１ヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む融合タンパク質をコードする配列を含む遺伝子編集組成物を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【０１０４】
Ｃｌｏ０５１ヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインは、標的配列において一本鎖または二本鎖切断を誘導することができる。ドナー配列またはドナープラスミドは、一本鎖もしくは二本鎖切断の位置、または標的配列内の細胞修復の位置、またはそれらの組み合わせで組み込むことができる。
【０１０５】
本開示は、本開示の改変された細胞（好ましくは、本開示の改変されたＴ細胞）を含む、本質的からなる、またはそれからなる組成物を提供する。
【０１０６】
本開示は、本明細書に開示される任意の非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を含む複数の改変された細胞を提供し、本明細書に開示される任意の改変された細胞を含む複数の改変された細胞を提供する。複数の改変された細胞は、免疫細胞または免疫細胞前駆体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。複数の免疫細胞は、リンパ系前駆細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。
【０１０７】
本開示は、改変された細胞の集団を含む組成物であって、複数の改変された細胞の集団は、本明細書に開示される任意の非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を含む、組成物を提供し、かつ改変された細胞の集団を含む組成物であって、複数の改変された細胞の集団は、本明細書に開示される任意の改変された細胞を含む、組成物を提供する。改変された細胞の集団は、免疫細胞または免疫細胞前駆体を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。免疫細胞の集団は、リンパ系前駆細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、または抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。
【０１０８】
本開示は、改変されたＴリンパ球（Ｔ細胞）の集団を含む組成物であって、複数の改変されたＴ細胞の集団は、本明細書に開示される任意の非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を含む、組成物を提供し、かつＴリンパ球（Ｔ細胞）の集団を含む組成物であって、複数のＴ細胞の集団は、本明細書に開示される任意の改変されたＴ細胞を含む、組成物を提供する。組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。
【０１０９】
好ましくは、本開示は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の集団を含む組成物を提供し、複数のＴ細胞の集団は、（ａ）活性化成分を含むエクトドメインであって、活性化成分が、第１のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来する、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つのシグナル変換ドメインを含むエンドドメインであって、少なくとも１つのシグナル変換ドメインが、第２のタンパク質から単離されるか、またはそれに由来し、第１のタンパク質および第２のタンパク質が、同一ではない、エンドドメインと、を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を含む。組成物は、薬学的に許容される担体を含むことができる。いくつかの態様において、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、ＣＳＲを含む。
【０１１０】
複数のＴ細胞の集団は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドをさらに含むことができる。いくつかの態様において、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む。
【０１１１】
複数のＴ細胞の集団は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変をさらに含むことができ、改変は、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する。いくつかの態様において、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、ＴＣＲをコードする内因性配列の改変を含み、改変は、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する。
【０１１２】
複数のＴ細胞の集団は、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の改変をさらに含むことができ、改変は、主要組織性適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現または活性のレベルを低減または排除する。いくつかの態様において、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、Ｂ２Ｍをコードする内因性配列の改変を含み、改変は、ＭＨＣ−Ｉの発現または活性のレベルを低減または排除する。
【０１１３】
複数のＴ細胞の集団は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変、ならびにベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の改変であって、主要組織性適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−Ｉ）の発現または活性のレベルを低減または排除する、改変をさらに含むことができる。
【０１１４】
いくつかの態様において、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、ＴＣＲをコードする内因性配列の改変であって、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変、ならびにＢ２Ｍをコードする内因性配列の改変であって、ＭＨＣ−Ｉの発現または活性のレベルを低減または排除する、改変、の両方を含む。
【０１１５】
複数のＴ細胞の集団は、ＨＬＡクラスＩ組織適合性抗原、アルファ鎖Ｅ（ＨＬＡ−Ｅ）ポリペプチドを含む非自然発生配列をさらに含むことができる。いくつかの態様において、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、ＨＬＡ−Ｅポリペプチドを含む非自然発生配列を含む。
【０１１６】
複数のＴ細胞の集団は、非自然発生抗原受容体、治療用ポリペプチドをコードする配列、またはそれらの組み合わせをさらに含むことができる。いくつかの態様において、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、非自然発生抗原受容体、治療用ポリペプチドをコードする配列、またはそれらの組み合わせを含む。好ましい態様において、非自然発生抗原受容体は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【０１１７】
複数のＴ細胞の集団は、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）、または幹細胞様Ｔ細胞を含むことができる。いくつかの態様において、幹細胞様Ｔ細胞、幹細胞記憶Ｔ細胞（ＴSCM）、および中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）のうちの１つ以上は、改変されたＴ細胞の集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％を含む。
【０１１８】
いくつかの態様において、ＣＳＲを含む集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）またはＴSCM様細胞のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡおよびＣＤ６２Ｌを含む。
【０１１９】
いくつかの態様において、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）またはＴCM様集団のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現し、１つ以上の細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯおよびＣＤ６２Ｌを含む。
【０１２０】
いくつかの態様において、集団のうちの少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも１５％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％、少なくとも４５％、少なくとも５０％、少なくとも５５％、少なくとも６０％、少なくとも６５％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％は、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβ細胞表面マーカーのうちの１つ以上を発現する。
【０１２１】
本開示は、本明細書に開示される疾患または障害の治療に使用するための組成物、または本明細書に開示される任意の疾患または障害の治療のための組成物の使用を提供する。本開示はまた、疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の本明細書に開示される組成物を投与することを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、方法も提供する。本組成物は、本明細書に開示される改変された細胞または改変された細胞の集団のうちのいずれかを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。好ましくは、本明細書に開示される改変されたＴ細胞またはＣＡＲ  Ｔ細胞のうちのいずれか。
【０１２２】
本開示は、改変されたＴ細胞を産生する方法であって、改変されたＴ細胞内でＣＳＲを安定的に発現し、かつ改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、初代ヒトＴ細胞に、本開示のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）またはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、改変されたＴ細胞を産生することを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、方法を提供する。初代ヒトＴ細胞は、休止中の初代ヒトＴ細胞であり得る。本開示は、開示された方法によって産生された改変されたＴ細胞を提供する。本開示は、開示された方法によって産生された安定的に発現されたＣＳＲを含む改変されたＴ細胞を投与する方法を提供する。本開示は、疾患または障害を治療するために、開示された方法によって産生された安定的に発現されたＣＳＲを含む、改変されたＴ細胞を投与する方法を提供する。
【０１２３】
本開示は、改変されたＴ細胞の集団を産生する方法であって、複数の改変されたＴ細胞内でＣＳＲを安定的に発現し、かつ複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、本開示のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）またはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、複数の改変されたＴ細胞を産生することを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、方法を提供する。初代ヒトＴ細胞は、休止中の初代ヒトＴ細胞であり得る。本開示は、開示された方法によって産生された改変されたＴ細胞の集団を提供する。本開示は、開示された方法によって産生された安定的に発現されたＣＳＲを含む改変されたＴ細胞の集団を投与する方法を提供する。本開示は、疾患または障害を治療するために、開示された方法によって産生された安定的に発現されたＣＳＲを含む改変されたＴ細胞の集団を投与する方法を提供する。
【０１２４】
本開示は、改変されたＴ細胞を産生する方法であって、改変されたＴ細胞内でＣＳＲを一時的に発現し、かつ改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、初代ヒトＴ細胞に、本開示のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）またはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、改変されたＴ細胞を産生することを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、方法を提供する。初代ヒトＴ細胞は、休止中の初代ヒトＴ細胞であり得る。本開示は、開示された方法によって産生された改変されたＴ細胞を提供する。本開示は、開示された方法によって産生された一時的に発現されたＣＳＲを含む改変されたＴ細胞を投与する方法を提供する。一態様において、本開示は、改変されたＴ細胞がもはやＣＳＲを発現しなくなった後に、開示された方法によって産生された改変されたＴ細胞を投与する方法を提供する。本開示は、疾患または障害を治療するために、開示された方法によって産生された一時的に発現されたＣＳＲを含む改変されたＴ細胞を投与する方法を提供する。一態様において、本開示は、疾患または障害を治療するために、改変されたＴ細胞がもはやＣＳＲを発現しなくなった後に、開示された方法によって産生された改変されたＴ細胞を投与する方法を提供する。
【０１２５】
本開示は、改変されたＴ細胞の集団を産生する方法であって、複数の改変されたＴ細胞内でＣＳＲを一時的に発現し、かつ複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、本開示のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）またはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、複数の改変されたＴ細胞を産生することを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、方法を提供する。初代ヒトＴ細胞は、休止中の初代ヒトＴ細胞であり得る。本開示は、開示された方法によって産生された改変されたＴ細胞の集団を提供する。本開示は、開示された方法によって産生された一時的に発現されたＣＳＲを含む改変されたＴ細胞の集団を投与する方法を提供する。一態様において、本開示は、複数のＴ細胞がもはやＣＳＲを発現しなくなった後に、開示された方法によって産生された改変されたＴ細胞の集団を投与する方法を提供する。本開示は、疾患または障害を治療するために、開示された方法によって産生された一時的に発現されたＣＳＲを含む改変されたＴ細胞の集団を投与する方法を提供する。一態様において、本開示は、疾患または障害を治療するために、複数のＴ細胞がもはやＣＳＲを発現しなくなった後に、開示された方法によって産生された改変されたＴ細胞の集団を投与する方法を提供する。
【０１２６】
改変されたＴ細胞を産生するか、または改変されたＴ細胞の集団を産生する方法は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）をコードする内因性配列の改変を導入することをさらに含むことができ、改変は、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する。改変されたＴ細胞を産生するか、または改変されたＴ細胞の集団を産生する方法は、ベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）をコードする内因性配列の改変を導入することをさらに含むことができ、改変は、主要組織性適合性複合体（ＭＨＣ）クラスＩ（ＭＨＣ−１）の発現または活性のレベルを低減または排除する。いくつかの態様において、改変されたＴ細胞を産生するか、または改変されたＴ細胞の集団を産生する方法は、ＴＣＲをコードする内因性配列の改変を導入することであって、改変は、ＴＣＲの発現または活性のレベルを低減または排除する、導入することと、Ｂ２Ｍをコードする内因性配列の改変を導入することであって、改変は、ＭＨＣ−１の発現または活性のレベルを低減または排除する、導入することと、の両方をさらに含むことができる。
【０１２７】
改変されたＴ細胞を産生するか、または改変されたＴ細胞の集団を産生する方法は、初代ヒトＴ細胞または複数の初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体、治療用タンパク質、またはそれをコードする配列を含む組成物を導入することをさらに含むことができる。一態様において、抗原受容体は、非自然発生抗原受容体である。好ましい態様において、改変されたＴ細胞を産生するか、または改変されたＴ細胞の集団を産生する方法は、初代ヒトＴ細胞または複数の初代ヒトＴ細胞に、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）またはそれをコードする配列を含む組成物を導入することをさらに含むことができる。本方法は、初代ヒトＴ細胞または複数の初代ヒトＴ細胞に、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドまたはそれをコードする配列を含む組成物を導入することをさらに含むことができる。改変されたＴ細胞を産生するか、または改変されたＴ細胞の集団を産生する方法は、初代ヒトＴ細胞または複数の初代ヒトＴ細胞に、抗原受容体、治療用タンパク質、またはそれをコードする配列を含む組成物、ならびに誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドまたはそれをコードする配列を含む組成物を導入することをさらに含むことができる。
【０１２８】
改変されたＴ細胞を産生するか、または改変されたＴ細胞の集団を産生する方法は、改変されたＴ細胞または改変されたＴ細胞の集団を活性化因子組成物と接触させることをさらに含むことができる。活性化因子組成物は、改変されたＴ細胞または複数の改変されたＴ細胞のＣＳＲ活性化成分に結合することができる１つ以上のアゴニストまたは活性化剤を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。アゴニスト／活性化剤は、自然発生であり得るか、または非自然発生であり得る。好ましい態様において、アゴニスト／活性化剤は、抗体または抗体断片である。アゴニスト／活性化剤は、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、抗ＣＤ２抗体もしくはその断片、抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上であり得る。いくつかの態様において、抗ヒトＣＤ３単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異性四量体抗体複合体、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上であり得るアゴニスト／活性化剤。アゴニスト／活性化は、インビトロ、エクスビボ、またはインビボで改変されたＴ細胞または改変されたＴ細胞の集団に接触させることができる。好ましい態様において、アゴニスト／活性化は、改変されたＴ細胞または改変されたＴ細胞の集団を活性化し、改変されたＴ細胞または改変されたＴ細胞の集団において細胞分裂を誘導し、改変されたＴ細胞または改変されたＴ細胞の集団において細胞分裂（例えば、細胞倍加時間）を増加させ、改変されたＴ細胞または改変されたＴ細胞の集団、あるいはそれらの任意の組み合わせにおける倍数増大を増加させる。
【０１２９】
本開示は、改変されたＴ細胞の集団を増大させる方法であって、複数の改変されたＴ細胞内でＣＳＲを安定的に発現し、かつ複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、本開示のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）またはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、複数の改変されたＴ細胞を産生することと、細胞を活性化因子組成物と接触させて、複数の活性化された改変されたＴ細胞を産生することと、を含み、複数の改変されたＴ細胞の増大が、同じ条件下で、本開示のＣＳＲを安定的に発現しない複数の野生型Ｔ細胞の増大よりも少なくとも２倍高い、方法を提供する。複数の改変されたＴ細胞の増大が、同じ条件下で、本開示のＣＳＲを安定的に発現しない複数の野生型Ｔ細胞の増大よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い、方法。
【０１３０】
本開示は、改変されたＴ細胞の集団を増大させる方法であって、複数の改変されたＴ細胞内でＣＳＲを一時的に発現し、かつ複数の改変されたＴ細胞の望ましい幹様特性を維持する条件下で、複数の初代ヒトＴ細胞に、本開示のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）またはそれをコードする配列を含む組成物を導入して、複数の改変されたＴ細胞を産生することと、細胞を活性化因子組成物と接触させて、複数の活性化された改変されたＴ細胞を産生することと、を含み、複数の改変されたＴ細胞の増大が、同じ条件下で、本開示のＣＳＲを一時的に発現しない複数の野生型Ｔ細胞の増大よりも少なくとも２倍高い、方法を提供する。複数の改変されたＴ細胞の増大が、同じ条件下で、本開示のＣＳＲを一時的に発現しない複数の野生型Ｔ細胞の増大よりも少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い、方法。
【０１３１】
集団を増大させる方法の活性化因子組成物は、改変されたＴ細胞または複数の改変されたＴ細胞のＣＳＲ活性化成分に結合することができる１つ以上のアゴニストまたは活性化剤を含む、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなることができる。アゴニスト／活性化剤は、自然発生であり得るか、または非自然発生であり得る。好ましい態様において、アゴニスト／活性化剤は、抗体または抗体断片である。アゴニスト／活性化剤は、抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、抗ＣＤ２抗体もしくはその断片、抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上であり得る。いくつかの態様において、抗ヒトＣＤ３単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異性四量体抗体複合体、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上であり得るアゴニスト／活性化剤。
【０１３２】
条件は、ステロール；アルカン；リン、ならびにオクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、およびオレイン酸のうちの１つ以上を含む培地中で改変されたＴ細胞または複数の改変されたＴ細胞を培養することを含むことができる。培養は、インビボまたはエクスビボであり得る。改変されたＴ細胞は、同種異系細胞であり得るか、または複数の改変されたＴ細胞は、同種異系細胞であり得る。改変されたＴ細胞は、自己Ｔ細胞であり得るか、または複数の改変されたＴ細胞は、自己Ｔ細胞であり得る。
【０１３３】
いくつかの態様において、培地は、エンドポイントを含む０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、およびエンドポイントを含む約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールのうちの１つ以上を含むことができる。
【０１３４】
いくつかの態様において、培地は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールのうちの１つ以上を含むことができる。
【０１３５】
いくつかの態様において、培地は、エンドポイントを含む６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、エンドポイントを含む０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、エンドポイントを含む０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、エンドポイントを含む０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、およびエンドポイントを含む０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールのうちの１つ以上を含むことができる。
【０１３６】
いくつかの態様において、培地は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つ以上を含むことができる。
【０１３７】
本開示は、本明細書に開示される方法によって産生された任意の改変されたＴ細胞を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示された方法によって産生された任意の改変されたＴ細胞の集団を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示される方法によって増大された任意の改変されたＴ細胞を含む組成物を提供する。本開示は、本明細書に開示される方法によって増大された任意の改変されたＴ細胞の集団を含む組成物を提供する。
【０１３８】
本開示は、本明細書に開示される疾患または障害の治療に使用するための組成物、または本明細書に開示される任意の疾患または障害の治療のための組成物の使用を提供する。本開示はまた、疾患または障害を治療する方法であって、治療を必要とする対象に、治療上有効量の本明細書に開示される組成物および本明細書に開示されるＣＳＲの活性化成分に結合する少なくとも１つの非自然発生分子を投与することを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、方法も提供する。本組成物は、本明細書に開示される改変された細胞または改変された細胞の集団のうちのいずれかを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなることができる。好ましくは、本明細書に開示される改変されたＴ細胞またはＣＡＲ  Ｔ細胞のうちのいずれか。本開示のＣＳＲの活性化成分に結合することができ、結合時にシグナルを選択的に変換することができる任意の非自然発生分子が、投与され得る。好ましくは、非自然発生分子は、活性化成分のための非自然発生ＣＳＲアゴニスト／活性化剤である。ＣＳＲ活性化成分に結合することができる非自然発生アゴニスト／活性化剤は、任意の非自然発生抗体または抗体断片であり得る。非自然発生抗体または抗体断片は、非自然発生抗ＣＤ３抗体もしくはその断片、抗ＣＤ２抗体もしくはその断片、抗ＣＤ２８抗体もしくはその断片、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。いくつかの態様において、ＣＳＲ活性化成分に結合することができる非自然発生アゴニスト／活性化剤は、抗ヒトＣＤ３単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２単一特異性四量体抗体複合体、抗ヒトＣＤ２８単一特異性四量体抗体複合体、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上であり得る。いくつかの態様において、活性化成分に結合することができる非自然発生アゴニスト／活性化剤は、抗ＣＤ２モノクローナル抗体、ＢＴＩ−３２２（Ｐｒｚｅｐｉｏｒｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ  ９２（１１）：４０６６−４０７１，１９９８）、およびヒト化抗ＣＤ２モノクローナル抗体クローンＡＦＣ−ＴＡＢ−１０４（シプリズマブ）（Ｂｉｓｓｏｎｎｅｔｔｅ  ｅｔ  ａｌ．Ａｒｃｈ．Ｄｅｒｍａｔｏｌ．Ｒｅｓ．３０１（６）：４２９−４４２，２００９）からなる群から選択され得る。いくつかの態様において、ＣＳＲの活性化成分に結合することができる非自然発生分子の投与は、インビボで改変された細胞の細胞分裂を刺激する。したがって、本開示は、本開示の改変された細胞を保有する対象に、活性化成分に対する非自然発生ＣＳＲアゴニスト／活性化剤を投与することによって、インビボで本開示の改変された細胞の細胞分裂を刺激する方法を提供する。
【０１３９】
いくつかの態様において、疾患または障害は、細胞増殖疾患または障害である。いくつかの態様において、細胞増殖疾患または障害は、癌である。癌は、固形腫瘍癌または血液学的癌であり得る。いくつかの態様において、固形腫瘍は、前立腺癌または乳癌である。好ましい態様において、前立腺癌は、去勢抵抗性前立腺癌である。いくつかの態様において、血液学的癌は、多発性骨髄腫である。
【０１４０】
開示された組成物内に含まれる改変された細胞または改変された細胞の集団は、投与を必要とする対象に投与する前に、インビトロまたはエクスビボで培養され得る。改変された細胞は、同種異系の改変された細胞または自己の改変された細胞であり得る。いくつかの態様において、細胞は、同種異系の改変されたＴ細胞または自己の改変されたＴ細胞である。いくつかの態様において、細胞は、同種異系の改変されたＣＡＲ  Ｔ細胞または自己の改変されたＣＡＲ  Ｔ細胞である。いくつかの態様において、細胞は、本開示のＣＳＲを含む同種異系の改変されたＣＡＲ  Ｔ細胞、または本開示のＣＳＲを含む自己の改変されたＣＡＲ  Ｔ細胞である。
【０１４１】
改変された細胞組成物または改変された細胞の集団を含む組成物は、患者に、当該技術分野において既知である任意の手段によって投与され得る。いくつかの態様において、組成物は、全身投与によって投与される。いくつかの態様において、組成物は、静脈内投与によって投与される。静脈内投与は、静脈内注射または静脈内注入で投与され得る。いくつかの態様において、組成物は、局所投与によって投与される。いくつかの態様において、組成物は、髄腔内、脳室内、眼内、または骨内注射または注入によって投与される。
【０１４２】
治療有効量は、改変された細胞組成物または改変された細胞の集団を含む組成物の単回投与または複数回投与であり得る。いくつかの態様において、治療有効用量は、単回用量であり、組成物の同種異系細胞は、疾患または障害を治療するのに十分な時間生着および／または持続する。いくつかの態様において、単回投与は、同時に製造されるその間の少なくとも２、５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、または任意の数の用量のうちの１つである。
【０１４３】
いくつかの態様において、疾患または障害の治療のための使用および方法は、本明細書に開示される改変された細胞組成物または本明細書に開示される改変された細胞の集団を含む組成物の投与後に、対象が移植片対宿主（ＧｖＨ）疾患、宿主対移植片（ＨｖＧ）疾患、またはそれらの組み合わせを発症しないことをさらに提供する。
【０１４４】
本開示の同種異系細胞は、対象への投与後の生着に対する有害反応を防ぐように操作される。同種異系細胞は、任意のタイプの細胞であり得る。
【０１４５】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、同種異系細胞は、幹細胞である。いくつかの実施形態において、同種異系細胞は、幹細胞に由来する。例示的な幹細胞には、胚性幹細胞、成体幹細胞、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）、多能性幹細胞、多能性幹細胞、および造血幹細胞（ＨＳＣ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４６】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、同種異系細胞は、分化した体細胞である。
【０１４７】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、同種異系細胞は、免疫細胞である。いくつかの実施形態において、同種異系細胞は、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）である。いくつかの実施形態において、同種異系細胞は、自然発生Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）のうちの１つ以上の成分を発現しないＴ細胞である。いくつかの実施形態において、同種異系細胞は、非自然発生抗原受容体を発現するＴ細胞である。あるいは、または加えて、いくつかの実施形態において、同種異系細胞は、非自然発生キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を発現するＴ細胞である。いくつかの実施形態において、非自然発生ＣＳＲは、スイッチ受容体を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、スイッチ受容体は、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。いくつかの実施形態において、スイッチ受容体の細胞外ドメインは、ＴＣＲ共刺激分子に結合し、ＴＣＲシグナル伝達またはＴＣＲ共刺激シグナル伝達を再現する同種異系細胞の細胞内空間にシグナルを変換する。
キメラ刺激受容体（ＣＳＲ）
【０１４８】
あらゆる患者への投与に対して「普遍的に」安全である養子細胞組成物は、同種反応性の有意な減少または削除を必要とする。
【０１４９】
この目的に向けて、本開示の同種異系細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）および／または主要組織性適合性遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスの発現または機能を妨害するように改変される。ＴＣＲは、移植片対宿主（ＧｖＨ）反応を媒介し、一方、ＭＨＣは、宿主対移植片（ＨｖＧ）反応を媒介する。好ましい実施形態において、ＴＣＲの任意の発現および／または機能は、対象に死を引き起こし得るＴ細胞媒介性ＧｖＨを防止するために、本開示の同種異系細胞において削減される。したがって、特に好ましい実施形態において、本開示は、純粋なＴＣＲ陰性同種異系Ｔ細胞組成物を提供する（例えば、組成物の各細胞は、検出できないかまたは存在しないかのいずれかになるほど低いレベルで発現する）。
【０１５０】
好ましい実施形態において、ＭＨＣクラスＩ（ＭＨＣ−１、具体的には、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、およびＨＬＡ−Ｃ）の発現および／または機能は、ＨｖＧを防止するために、その結果として、対象における本開示の同種異系細胞の生着を改善するために、本開示の同種異系細胞において減少または削減される。本開示の同種異系細胞の改善された生着は、細胞のより長い持続性をもたらし、したがって、対象にとってより大きな治療濃度域をもたらす。具体的には、本開示の同種異系細胞において、ＭＨＣ−１の構造要素であるベータ−２−ミクログロブリン（Ｂ２Ｍ）の発現および／または機能は、本開示の同種異系細胞において低減または排除される。
【０１５１】
本開示の同種異系細胞を生成するための上記の戦略は、さらなる課題を誘発する。Ｔ細胞におけるＴ細胞受容体（ＴＣＲ）ノックアウト（ＫＯ）により、ＴＣＲ複合体の一部であるＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ｚまたはＣＤ３ζ）の発現の欠失をもたらす。ＴＣＲ−ＫＯ  Ｔ細胞におけるＣＤ３ζの喪失は、アゴニスト抗ＣＤ３  ｍＡｂを含むが、これに限定されない標準的な刺激／アクチベーター試薬を使用して、これらの細胞を最適に活性化および増大させる能力を劇的に減少させる。ＴＣＲ複合体のいずれか１つの成分の発現または機能が中断されると、ＴＣＲ−アルファ（ＴＣＲα）、ＴＣＲ−ベータ（ＴＣＲβ）、ＣＤ３−ガンマ（ＣＤ３γ）、ＣＤ３−イプシロン（ＣＤ３ε）、ＣＤ３−デルタ（ＣＤ３δ）、およびＣＤ３−ゼータ（ＣＤ３ζ）を含む複合体のすべての成分が、失われる。ＣＤ３εおよびＣＤ３ζの両方が、Ｔ細胞の活性化および増大に必要である。アゴニスト抗ＣＤ３  ｍＡｂは、典型的には、ＣＤ３ε、および場合により、同様にＣＤ３ζにシグナルを送る複合体内の別のタンパク質を認識する。ＣＤ３ζは、最適な活性化および増大のために、Ｔ細胞活性化のための一次刺激を（二次共刺激シグナルとともに）提供する。通常の条件下では、完全なＴ細胞の活性化は、免疫応答を促進する１つ以上の共刺激受容体（例えば、ＣＤ２８、ＣＤ２、４−１ＢＢＬなど）による第２のシグナルと組み合わせたＴＣＲの関与に依存する。しかしながら、ＴＣＲが存在しないとき、アゴニスト抗ＣＤ３  ｍＡｂを含む標準的な活性化／刺激試薬を使用して刺激するとき、Ｔ細胞の増大が大幅に低減する。実際、アゴニスト抗ＣＤ３  ｍＡｂを含む標準的な活性化／刺激試薬を使用して刺激するとき、Ｔ細胞の増大は、通常の増大レベルのわずか２０〜４０％に低減する。
【０１５２】
本開示は、アゴニスト抗ＣＤ３  ｍＡｂを含む標準的な活性化／刺激試薬を使用して刺激するとき、内因性ＴＣＲ（およびその結果として内因性ＣＤ３ζ）の不在下で、同種異系Ｔ細胞にＣＤ３ｚ一次刺激を送達するキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）を提供する。
【０１５３】
内因性ＴＣＲの不在下で、本開示のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、同種異系Ｔ細胞の活性化および増大を増強するためのＣＤ３ζ刺激を提供する。換言すれば、内因性ＴＣＲの不在下で、本開示のキメラ刺激受容体（ＣＳＲ）は、内因性ＴＣＲを発現する非同種異系Ｔ細胞と比較したとき、同種異系細胞を活性化に基づく不利益から救済する。いくつかの実施形態において、本開示のＣＳＲは、細胞外にアゴニストｍＡｂエピトープおよび細胞内にＣＤ３ζ刺激ドメインを含み、機能的に、表面上の抗ＣＤ２８または抗ＣＤ２結合事象を、ＣＳＲを発現するように改変された同種異系Ｔ細胞中のＣＤ３ｚシグナル伝達事象に変換する。いくつかの実施形態において、ＣＳＲは、野生型ＣＤ２８またはＣＤ２タンパク質およびＣＤ３ｚ細胞内刺激ドメインを含み、それぞれ、ＣＤ２８ｚ  ＣＳＲおよびＣＤ２ｚ  ＣＳＲを生成する。好ましい実施形態において、ＣＤ２８ｚ  ＣＳＲおよび／またはＣＤ２ｚ  ＣＳＲは、非自然発生抗原受容体および／または治療用タンパク質をさらに発現する。好ましい実施形態において、非自然発生抗原受容体は、キメラ抗原受容体を含む。
【０１５４】
本明細書で提供されるデータは、本開示のＣＳＲを含む／発現する本開示の改変された同種異系Ｔ細胞が、本開示のＣＳＲを含まない／発現しない細胞と比較したときに、もはや内因性ＴＣＲを発現しない同種異系Ｔ細胞の増大を改善または助けることを実証する。
【０１５５】
野生型／天然ヒトＣＤ２８タンパク質（ＮＣＢＩ：ＣＤ２８＿ＨＵＭＡＮ；ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１０７４７．１）は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号１７０９６）
【０１５６】
野生型／天然ＣＤ２８タンパク質（ＮＣＢＩ：ＣＣＤＳ２３６１．１）をコードするヌクレオチド配列は、以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ＡＴＧＣＴＣＡＧＧＣＴＧＣＴＣＴＴＧＧＣＴＣＴＣＡＡＣＴＴＡＴＴＣＣＣＴＴＣＡＡＴＴＣＡＡＧＴＡＡＣＡＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＴＴＴＴＧＧＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣＧＣＣＣＡＴＧＣＴＴＧＴＡＧＣＧＴＡＣＧＡＣＡＡＴＧＣＧＧＴＣＡＡＣＣＴＴＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＴＴＣＣＴＡＣＡＡＴＣＴＣＴＴＣＴＣＡＡＧＧＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＡＴＣＣＣＴＴＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＡＧＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴＣＴＧＴＧＴＴＧＴＡＴＡＴＧＧＧＡＡＴＴＡＣＴＣＣＣＡＧＣＡＧＣＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＡＡＡＡＣＧＧＧＧＴＴＣＡＡＣＴＧＴＧＡＴＧＧＧＡＡＡＴＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＡＴＣＡＧＴＧＡＣＡＴＴＣＴＡＣＣＴＣＣＡＧＡＡＴＴＴＧＴＡＴＧＴＴＡＡＣＣＡＡＡＣＡＧＡＴＡＴＴＴＡＣＴＴＣＴＧＣＡＡＡＡＴＴＧＡＡＧＴＴＡＴＧＴＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＡＧＡＣＡＡＴＧＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＴＧＧＡＡＣＣＡＴＴＡＴＣＣＡＴＧＴＧＡＡＡＧＧＧＡＡＡＣＡＣＣＴＴＴＧＴＣＣＡＡＧＴＣＣＣＣＴＡＴＴＴＣＣＣＧＧＡＣＣＴＴＣＴＡＡＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＧＴＧＣＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣＣＴＧＧＣＴＴＧＣＴＡＴＡＧＣＴＴＧＣＴＡＧＴＡＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＴＡＴＴＡＴＴＴＴＣＴＧＧＧＴＧＡＧＧＡＧＴＡＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＧＣＴＣＣＴＧＣＡＣＡＧＴＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＴＣＣＣＣＧＣＣＧＣＣＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＣＣＧＣＡＡＧＣＡＴＴＡＣＣＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＣＣＣＡＣＣＡＣＧＣＧＡＣＴＴＣＧＣＡＧＣＣＴＡＴＣＧＣＴＣＣＴＧＡ（配列番号１７０９７）
【０１５７】
本開示の例示的なＣＳＲ  ＣＤ２８ｚタンパク質は、（ＣＤ２８シグナルペプチド、ＣＤ２８細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞質ドメイン、ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１】
2021536249.tif 000002
ＣＤ２８シグナルペプチド：
ＭＬＲＬＬＬＡＬＮＬＦＰＳＩＱＶＴＧ（配列番号１７０９８）
ＣＤ２８細胞外ドメイン：ＮＫＩＬＶＫＱＳＰＭＬＶＡＹＤＮＡＶＮＬＳＣＫＹＳＹＮＬＦＳＲＥＦＲＡＳＬＨＫＧＬＤＳＡＶＥＶＣＶＶＹＧＮＹＳＱＱＬＱＶＹＳＫＴＧＦＮＣＤＧＫＬＧＮＥＳＶＴＦＹＬＱＮＬＹＶＮＱＴＤＩＹＦＣＫＩＥＶＭＹＰＰＰＹＬＤＮＥＫＳＮＧＴＩＩＨＶＫＧＫＨＬＣＰＳＰＬＦＰＧＰＳＫＰ（配列番号１７０９９）
ＣＤ２８膜貫通ドメイン：
ＦＷＶＬＶＶＶＧＧＶＬＡＣＹＳＬＬＶＴＶＡＦＩＩＦＷＶ（配列番号１７１００）
ＣＤ２８細胞質ドメイン：
ＲＳＫＲＳＲＬＬＨＳＤＹＭＮＭＴＰＲＲＰＧＰＴＲＫＨＹＱＰＹＡＰＰＲＤＦＡＡＹＲＳ（配列番号１７１０１）
ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１７１０２）
【０１５８】
本開示のＣＳＲ  ＣＤ２８ｚタンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、（ＣＤ２８シグナルペプチド、ＣＤ２８細胞外ドメイン、ＣＤ２８膜貫通ドメイン、ＣＤ２８細胞質ドメイン、ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【化２】
2021536249.tif 000003
ＣＤ２８シグナルペプチド：
ＡＴＧＣＴＧＡＧＡＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＡＡＴＣＴＧＴＴＣＣＣＣＡＧＣＡＴＣＣＡＡＧＴＧＡＣＣＧＧＣ（配列番号１７１０３）
ＣＤ２８細胞外ドメイン：
ＡＡＣＡＡＧＡＴＣＣＴＧＧＴＣＡＡＧＣＡＧＡＧＣＣＣＴＡＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＣＴＡＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＣＴＧＣＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＡＣＡＡＣＣＴＧＴＴＣＡＧＣＡＧＡＧＡＧＴＴＣＣＧＧＧＣＣＡＧＣＣＴＧＣＡＣＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＴＴＣＴＧＣＴＧＴＧＧＡＡＧＴＧＴＧＣＧＴＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＡＡＣＴＡＣＡＧＣＣＡＧＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＴＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＡＣＣＧＧＣＴＴＣＡＡＣＴＧＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＣＴＧＧＧＣＡＡＴＧＡＧＡＧＣＧＴＧＡＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＣＡＡＡＡＣＣＴＧＴＡＣＧＴＧＡＡＣＣＡＧＡＣＣＧＡＣＡＴＣＴＡＴＴＴＣＴＧＣＡＡＧＡＴＣＧＡＡＧＴＧＡＴＧＴＡＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＴＡＣＣＴＧＧＡＣＡＡＣＧＡＧＡＡＧＴＣＣＡＡＣＧＧＣＡＣＣＡＴＣＡＴＣＣＡＣＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＴＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＣＴＧＴＴＣＣＣＣＧＧＡＣＣＴＡＧＣＡＡＧＣＣＴ（配列番号１７１０４）
ＣＤ２８膜貫通ドメイン：
ＴＴＣＴＧＧＧＴＧＣＴＣＧＴＴＧＴＴＧＴＴＧＧＣＧＧＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＴＴＡＴＡＧＣＣＴＧＣＴＧＧＴＴＡＣＡＧＴＧＧＣＣＴＴＣＡＴＣＡＴＣＴＴＴＴＧＧＧＴＣ（配列番号１７１０５）
ＣＤ２８細胞質ドメイン：
ＣＧＡＡＧＣＡＡＧＣＧＧＡＧＣＣＧＧＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡＧＣＧＡＣＴＡＣＡＴＧＡＡＣＡＴＧＡＣＣＣＣＴＡＧＡＣＧＧＣＣＣＧＧＡＣＣＡＡＣＣＡＧＡＡＡＧＣＡＣＴＡＣＣＡＧＣＣＴＴＡＣＧＣＴＣＣＴＣＣＴＡＧＡＧＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＴＡＣＣＧＧＴＣＣ
（配列番号１７１０６）
ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン：
ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＴＣＣＡＧＡＴＣＣＧＣＣＧＡＴＧＣＴＣＣＣＧＣＣＴＡＴＡＡＧＣＡＧＧＧＣＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＡＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＣＡＡＴＧＡＡＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＡＧＡ（配列番号１７１０７）
【０１５９】
野生型／天然ヒトＣＤ２タンパク質（ＮＣＢＩ：ＣＤ２＿ＨＵＭＡＮ；ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ０６７２９．２）は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
ＭＳＦＰＣＫＦＶＡＳＦＬＬＩＦＮＶＳＳＫＧＡＶＳＫＥＩＴＮＡＬＥＴＷＧＡＬＧＱＤＩＮＬＤＩＰＳＦＱＭＳＤＤＩＤＤＩＫＷＥＫＴＳＤＫＫＫＩＡＱＦＲＫＥＫＥＴＦＫＥＫＤＴＹＫＬＦＫＮＧＴＬＫＩＫＨＬＫＴＤＤＱＤＩＹＫＶＳＩＹＤＴＫＧＫＮＶＬＥＫＩＦＤＬＫＩＱＥＲＶＳＫＰＫＩＳＷＴＣＩＮＴＴＬＴＣＥＶＭＮＧＴＤＰＥＬＮＬＹＱＤＧＫＨＬＫＬＳＱＲＶＩＴＨＫＷＴＴＳＬＳＡＫＦＫＣＴＡＧＮＫＶＳＫＥＳＳＶＥＰＶＳＣＰＥＫＧＬＤＩＹＬＩＩＧＩＣＧＧＧＳＬＬＭＶＦＶＡＬＬＶＦＹＩＴＫＲＫＫＱＲＳＲＲＮＤＥＥＬＥＴＲＡＨＲＶＡＴＥＥＲＧＲＫＰＨＱＩＰＡＳＴＰＱＮＰＡＴＳＱＨＰＰＰＰＰＧＨＲＳＱＡＰＳＨＲＰＰＰＰＧＨＲＶＱＨＱＰＱＫＲＰＰＡＰＳＧＴＱＶＨＱＱＫＧＰＰＬＰＲＰＲＶＱＰＫＰＰＨＧＡＡＥＮＳＬＳＰＳＳＮ（配列番号１７１０８）
【０１６０】
野生型／天然ＣＤ２タンパク質（ＮＣＢＩ：ＣＣＤＳ８８９．１）をコードするヌクレオチド配列は、以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ＡＴＧＡＧＣＴＴＴＣＣＡＴＧＴＡＡＡＴＴＴＧＴＡＧＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＴＣＴＧＡＴＴＴＴＣＡＡＴＧＴＴＴＣＴＴＣＣＡＡＡＧＧＴＧＣＡＧＴＣＴＣＣＡＡＡＧＡＧＡＴＴＡＣＧＡＡＴＧＣＣＴＴＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＧＧＴＧＣＣＴＴＧＧＧＴＣＡＧＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＴＧＧＡＣＡＴＴＣＣＴＡＧＴＴＴＴＣＡＡＡＴＧＡＧＴＧＡＴＧＡＴＡＴＴＧＡＣＧＡＴＡＴＡＡＡＡＴＧＧＧＡＡＡＡＡＡＣＴＴＣＡＧＡＣＡＡＧＡＡＡＡＡＧＡＴＴＧＣＡＣＡＡＴＴＣＡＧＡＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＴＴＴＣＡＡＧＧＡＡＡＡＡＧＡＴＡＣＡＴＡＴＡＡＧＣＴＡＴＴＴＡＡＡＡＡＴＧＧＡＡＣＴＣＴＧＡＡＡＡＴＴＡＡＧＣＡＴＣＴＧＡＡＧＡＣＣＧＡＴＧＡＴＣＡＧＧＡＴＡＴＣＴＡＣＡＡＧＧＴＡＴＣＡＡＴＡＴＡＴＧＡＴＡＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＴＧＴＧＴＴＧＧＡＡＡＡＡＡＴＡＴＴＴＧＡＴＴＴＧＡＡＧＡＴＴＣＡＡＧＡＧＡＧＧＧＴＣＴＣＡＡＡＡＣＣＡＡＡＧＡＴＣＴＣＣＴＧＧＡＣＴＴＧＴＡＴＣＡＡＣＡＣＡＡＣＣＣＴＧＡＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＡＡＴＧＡＡＴＧＧＡＡＣＴＧＡＣＣＣＣＧＡＡＴＴＡＡＡＣＣＴＧＴＡＴＣＡＡＧＡＴＧＧＧＡＡＡＣＡＴＣＴＡＡＡＡＣＴＴＴＣＴＣＡＧＡＧＧＧＴＣＡＴＣＡＣＡＣＡＣＡＡＧＴＧＧＡＣＣＡＣＣＡＧＣＣＴＧＡＧＴＧＣＡＡＡＡＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＣＡＧＣＡＧＧＧＡＡＣＡＡＡＧＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＡＴＣＣＡＧＴＧＴＣＧＡＧＣＣＴＧＴＣＡＧＣＴＧＴＣＣＡＧＡＧＡＡＡＧＧＴＣＴＧＧＡＣＡＴＣＴＡＴＣＴＣＡＴＣＡＴＴＧＧＣＡＴＡＴＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＣＴＣＴＴＧＡＴＧＧＴＣＴＴＴＧＴＧＧＣＡＣＴＧＣＴＣＧＴＴＴＴＣＴＡＴＡＴＣＡＣＣＡＡＡＡＧＧＡＡＡＡＡＡＣＡＧＡＧＧＡＧＴＣＧＧＡＧＡＡＡＴＧＡＴＧＡＧＧＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＡＡＧＡＧＣＣＣＡＣＡＧＡＧＴＡＧＣＴＡＣＴＧＡＡＧＡＡＡＧＧＧＧＣＣＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＡＡＴＴＣＣＡＧＣＴＴＣＡＡＣＣＣＣＴＣＡＧＡＡＴＣＣＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＣＡＡＣＡＴＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＧＴＴＣＣＣＡＧＧＣＡＣＣＴＡＧＴＣＡＴＣＧＴＣＣＣＣＣＧＣＣＴＣＣＴＧＧＡＣＡＣＣＧＴＧＴＴＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＧＴＣＧＧＧＣＡＣＡＣＡＡＧＴＴＣＡＣＣＡＧＣＡＧＡＡＡＧＧＣＣＣＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＡＧＡＣＣＴＣＧＡＧＴＴＣＡＧＣＣＡＡＡＡＣＣＴＣＣＣＣＡＴＧＧＧＧＣＡＧＣＡＧＡＡＡＡＣＴＣＡＴＴＧＴＣＣＣＣＴＴＣＣＴＣＴＡＡＴＴＡＡ（配列番号１７１０９）
【０１６１】
本開示の例示的なＣＳＲ  ＣＤ２ｚタンパク質は、（ＣＤ２シグナルペプチド、ＣＤ２細胞外ドメイン、ＣＤ２膜貫通ドメイン、ＣＤ２細胞質ドメイン、ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化３】
2021536249.tif 000004
ＣＤ２シグナルペプチド：ＭＳＦＰＣＫＦＶＡＳＦＬＬＩＦＮＶＳＳＫＧＡＶＳ（配列番号１７１１０）
ＣＤ２細胞外ドメイン：ＫＥＩＴＮＡＬＥＴＷＧＡＬＧＱＤＩＮＬＤＩＰＳＦＱＭＳＤＤＩＤＤＩＫＷＥＫＴＳＤＫＫＫＩＡＱＦＲＫＥＫＥＴＦＫＥＫＤＴＹＫＬＦＫＮＧＴＬＫＩＫＨＬＫＴＤＤＱＤＩＹＫＶＳＩＹＤＴＫＧＫＮＶＬＥＫＩＦＤＬＫＩＱＥＲＶＳＫＰＫＩＳＷＴＣＩＮＴＴＬＴＣＥＶＭＮＧＴＤＰＥＬＮＬＹＱＤＧＫＨＬＫＬＳＱＲＶＩＴＨＫＷＴＴＳＬＳＡＫＦＫＣＴＡＧＮＫＶＳＫＥＳＳＶＥＰＶＳＣＰＥＫＧＬＤ（配列番号１７１１１）
ＣＤ２膜貫通ドメイン：ＩＹＬＩＩＧＩＣＧＧＧＳＬＬＭＶＦＶＡＬＬＶＦＹＩＴ（配列番号１７１１２）
ＣＤ２細胞質ドメイン：
ＫＲＫＫＱＲＳＲＲＮＤＥＥＬＥＴＲＡＨＲＶＡＴＥＥＲＧＲＫＰＨＱＩＰＡＳＴＰＱＮＰＡＴＳＱＨＰＰＰＰＰＧＨＲＳＱＡＰＳＨＲＰＰＰＰＧＨＲＶＱＨＱＰＱＫＲＰＰＡＰＳＧＴＱＶＨＱＱＫＧＰＰＬＰＲＰＲＶＱＰＫＰＰＨＧＡＡＥＮＳＬＳＰＳＳＮ（配列番号１７１１３）
ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１７１０２）
【０１６２】
本開示は、配列番号１７０６２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、非自然発生ＣＳＲ  ＣＤ２タンパク質を提供する。本開示は、配列番号１７１１０と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ＣＤ２シグナルペプチドを提供する。本開示は、配列番号１７１１１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ＣＤ２細胞外ドメインを提供する。本開示は、配列番号１７１１２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ＣＤ２膜貫通ドメインを提供する。本開示は、配列番号１７１１３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ＣＤ２細胞質ドメインを提供する。本開示は、配列番号１７１０２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ＣＤ３ｚ細胞内ドメインを提供する。
【０１６３】
本開示のＣＳＲ  ＣＤ２ｚタンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、（ＣＤ２シグナルペプチド、ＣＤ２細胞外ドメイン、ＣＤ２膜貫通ドメイン、ＣＤ２細胞質ドメイン、ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化４】
2021536249.tif 000005
ＣＤ２シグナルペプチド：ＡＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＴＴＧＣＡＡＧＴＴＣＧＴＧＧＣＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＴＧＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＴＧＴＣＣＴＣＴＡＡＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＴＣＣ（配列番号１７１１４）
ＣＤ２細胞外ドメイン：ＡＡＡＧＡＧＡＴＣＡＣＡＡＡＣＧＣＣＣＴＧＧＡＡＡＣＣＴＧＧＧＧＡＧＣＣＣＴＣＧＧＣＣＡＧＧＡＴＡＴＴＡＡＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＣＣＣＡＧＣＴＴＣＣＡＧＡＴＧＡＧＣＧＡＣＧＡＣＡＴＣＧＡＴＧＡＣＡＴＣＡＡＧＴＧＧＧＡＧＡＡＡＡＣＣＡＧＣＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡＡＧＡＴＣＧＣＣＣＡＧＴＴＣＣＧＧＡＡＡＧＡＧＡＡＡＧＡＧＡＣＡＴＴＣＡＡＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＡＣＣＴＡＣＡＡＧＣＴＧＴＴＣＡＡＧＡＡＣＧＧＣＡＣＣＣＴＧＡＡＧＡＴＣＡＡＧＣＡＣＣＴＧＡＡＡＡＣＣＧＡＣＧＡＣＣＡＧＧＡＣＡＴＣＴＡＴＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＴＣＴＡＣＧＡＣＡＣＣＡＡＧＧＧＣＡＡＧＡＡＣＧＴＧＣＴＧＧＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＣＧＡＣＣＴＣＡＡＧＡＴＣＣＡＡＧＡＧＣＧＧＧＴＧＴＣＣＡＡＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＡＧＣＴＧＧＡＣＣＴＧＣＡＴＣＡＡＣＡＣＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＧＡＴＧＡＡＣＧＧＣＡＣＡＧＡＣＣＣＣＧＡＧＣＴＧＡＡＣＣＴＧＴＡＣＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＡＡＣＡＣＣＴＧＡＡＧＣＴＧＡＧＣＣＡＧＣＧＣＧＴＧＡＴＣＡＣＣＣＡＣＡＡＧＴＧＧＡＣＡＡＣＡＡＧＣＣＴＧＡＧＣＧＣＣＡＡＧＴＴＣＡＡＧＴＧＣＡＣＣＧＣＣＧＧＡＡＡＣＡＡＡＧＴＧＴＣＴＡＡＡＧＡＧＴＣＣＡＧＣＧＴＣＧＡＧＣＣＣＧＴＧＴＣＴＴＧＣＣＣＴＧＡＡＡＡＡＧＧＡＣＴＧＧＡＣ（配列番号１７１１５）
ＣＤ２膜貫通ドメイン：
ＡＴＣＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣ（配列番号１７１１６）
ＣＤ２細胞質ドメイン：
ＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＧＧＧＣＣＣＡＴＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＣＣＡＴＣＴＣＡＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＧＣＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＡＧＡＧＴＧＣＡＧＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＣＧＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣ（配列番号１７１１７）
ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン：
ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＡＴＡＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＡＧＡ（配列番号１７１０７）
【０１６４】
本開示の例示的な変異体ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ−Ｄ１１１Ｈタンパク質は、（ＣＤ２シグナルペプチド、ＣＤ２細胞外ドメイン内にＤ１１１Ｈ変異を有するＣＤ２細胞外ドメイン、ＣＤ２膜貫通ドメイン、ＣＤ２細胞質ドメイン、ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化５】
2021536249.tif 000006
ＣＤ２シグナルペプチド：ＭＳＦＰＣＫＦＶＡＳＦＬＬＩＦＮＶＳＳＫＧＡＶＳ（配列番号１７１１０）
ＣＤ２細胞外ドメイン内にＤ１１１Ｈ変異を有するＣＤ２細胞外ドメイン：
ＫＥＩＴＮＡＬＥＴＷＧＡＬＧＱＤＩＮＬＤＩＰＳＦＱＭＳＤＤＩＤＤＩＫＷＥＫＴＳＤＫＫＫＩＡＱＦＲＫＥＫＥＴＦＫＥＫＤＴＹＫＬＦＫＮＧＴＬＫＩＫＨＬＫＴＤＤＱＤＩＹＫＶＳＩＹＨＴＫＧＫＮＶＬＥＫＩＦＤＬＫＩＱＥＲＶＳＫＰＫＩＳＷＴＣＩＮＴＴＬＴＣＥＶＭＮＧＴＤＰＥＬＮＬＹＱＤＧＫＨＬＫＬＳＱＲＶＩＴＨＫＷＴＴＳＬＳＡＫＦＫＣＴＡＧＮＫＶＳＫＥＳＳＶＥＰＶＳＣＰＥＫＧＬ（配列番号１７１１９）
ＣＤ２膜貫通ドメイン：
ＩＹＬＩＩＧＩＣＧＧＧＳＬＬＭＶＦＶＡＬＬＶＦＹＩＴ（配列番号１７１１２）
ＣＤ２細胞質ドメイン：
ＫＲＫＫＱＲＳＲＲＮＤＥＥＬＥＴＲＡＨＲＶＡＴＥＥＲＧＲＫＰＨＱＩＰＡＳＴＰＱＮＰＡＴＳＱＨＰＰＰＰＰＧＨＲＳＱＡＰＳＨＲＰＰＰＰＧＨＲＶＱＨＱＰＱＫＲＰＰＡＰＳＧＴＱＶＨＱＱＫＧＰＰＬＰＲＰＲＶＱＰＫＰＰＨＧＡＡＥＮＳＬＳＰＳＳＮ（配列番号１７１１３）
ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン：
ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１７１０２）
【０１６５】
本開示は、配列番号１７１１８と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、非自然発生ＣＳＲ  ＣＤ２タンパク質を提供する。本開示は、配列番号１７１１９と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％同一であるアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ＣＤ２細胞外ドメインを提供する。
【０１６６】
本開示の変異体ＣＳＲ  ＣＤ２ｚ−Ｄ１１１Ｈタンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、（ＣＤ２シグナルペプチド、ＣＤ２細胞外ドメイン内にＤ１１１Ｈ変異を有するＣＤ２細胞外ドメイン、ＣＤ２膜貫通ドメイン、ＣＤ２細胞質ドメイン、ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化６】
2021536249.tif 000007
ＣＤ２細胞外ドメイン内にＤ１１１Ｈ変異を有するＣＤ２細胞外ドメイン：
【化７】
2021536249.tif 000008
ＣＤ２膜貫通ドメイン：
ＡＴＣＴＡＣＣＴＧＡＴＣＡＴＣＧＧＣＡＴＣＴＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＴＧＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＴＴＣＴＡＣＡＴＣＡＣＣ（配列番号１７１１６）
ＣＤ２細胞質ドメイン：
ＡＡＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＡＣＧＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＧＡＡＣＴＧＧＡＡＡＣＡＣＧＧＧＣＣＣＡＴＡＧＡＧＴＧＧＣＣＡＣＣＧＡＧＧＡＡＡＧＡＧＧＣＡＧＡＡＡＧＣＣＣＣＡＣＣＡＧＡＴＴＣＣＡＧＣＣＡＧＣＡＣＡＣＣＣＣＡＧＡＡＴＣＣＴＧＣＣＡＣＣＴＣＴＣＡＡＣＡＣＣＣＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡＣＣＴＧＧＡＣＡＣＡＧＡＴＣＴＣＡＧＧＣＣＣＣＡＴＣＴＣＡＣＡＧＡＣＣＴＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＧＴＣＡＴＣＧＧＧＴＧＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＴＣＡＧＡＡＡＡＧＡＣＣＴＣＣＴＧＣＴＣＣＴＡＧＣＧＧＣＡＣＡＣＡＧＧＴＧＣＡＣＣＡＧＣＡＡＡＡＡＧＧＡＣＣＴＣＣＡＣＴＧＣＣＴＣＧＧＣＣＴＡＧＡＧＴＧＣＡＧＣＣＴＡＡＡＣＣＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＣＧＣＴＧＡＧＡＡＣＡＧＣＣＴＧＴＣＴＣＣＡＡＧＣＡＧＣＡＡＣ（配列番号１７１１７）
ＣＤ３ｚ細胞内ドメイン：ＡＧＡＧＴＧＡＡＧＴＴＣＡＧＣＣＧＣＡＧＣＧＣＣＧＡＴＧＣＴＣＣＴＧＣＣＴＡＴＡＡＧＣＡＧＧＧＡＣＡＧＡＡＣＣＡＧＣＴＧＴＡＣＡＡＣＧＡＧＣＴＧＡＡＴＣＴＧＧＧＧＣＧＣＡＧＡＧＡＡＧＡＧＴＡＣＧＡＴＧＴＧＣＴＧＧＡＣＡＡＧＣＧＧＡＧＡＧＧＣＡＧＡＧＡＴＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＧＣＧＧＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＣＧＧＡＡＧＡＡＴＣＣＴＣＡＡＧＡＧＧＧＣＣＴＧＴＡＴＡＡＴＧＡＧＣＴＧＣＡＧＡＡＡＧＡＣＡＡＧＡＴＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＴＡＣＡＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＡＡＴＧＡＡＧＧＧＣＧＡＧＣＧＣＡＧＡＡＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＣＡＣＧＡＴＧＧＡＣＴＧＴＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＡＣＣＧＣＣＡＣＣＡＡＧＧＡＴＡＣＣＴＡＴＧＡＴＧＣＣＣＴＧＣＡＣＡＴＧＣＡＧＧＣＣＣＴＧＣＣＴＣＣＡＡＧＡ（配列番号１７１０７）
【０１６７】
内因性ＴＣＲノックアウト
ｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１を含むＲＮＡ誘導融合タンパク質を含むが、これに限定されない、本開示の遺伝子編集組成物を使用して、本開示の同種異系細胞の内因性Ｔ細胞受容体の発現を標的とし、減少または削除することができる。好ましい実施形態において、本開示の遺伝子編集組成物は、本開示の同種異系細胞の内因性Ｔ細胞受容体をコードする遺伝子、遺伝子の一部、または遺伝子の調節要素（プロモーターなど）を標的とし、欠失する。
【０１６８】
ＴＣＲ−アルファ（ＴＣＲ−α）を標的とし、欠失するためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）鋳型を生成するためのプライマー（Ｔ７プロモーター、ゲノム標的配列、およびｇＲＮＡ足場を含む）の非限定的な例を、表１０に提供する。
【０１６９】
【表１−１】
2021536249.tif 000009
【表１−２】
2021536249.tif 000010
【０１７０】
ＴＣＲ−ベータ（ＴＣＲ−β）を標的とし、欠失するためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）鋳型を生成するためのプライマーの非限定的な例を、表１１に示す。
【０１７１】
【表２−１】
2021536249.tif 000011
【表２−２】
2021536249.tif 000012
【０１７２】
ベータ−２−ミクログロブリン（β２Ｍ）を標的とし、欠失するためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）鋳型を生成するためのプライマーの非限定的な例を、表１２に提供する。
【０１７３】
【表３】
2021536249.tif 000013
【０１７４】
内因性ＭＨＣノックアウト
ｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１を含むＲＮＡ誘導融合タンパク質を含むが、これに限定されない、本開示の遺伝子編集組成物を使用して、本開示の同種異系細胞の内因性ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、またはＭＨＣ活性化因子の発現を標的とし、減少または削除することができる。好ましい実施形態において、本開示の遺伝子編集組成物は、本開示の同種異系細胞の内因性ＭＨＣＩ、ＭＨＣＩＩ、またはＭＨＣ活性化因子のうちの１つ以上の成分をコードする遺伝子、遺伝子の一部、または遺伝子の調節要素（プロモーターなど）を標的とし、欠失する。
【０１７５】
ＭＨＣ活性化因子を標的とし、欠失するためのガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）の非限定的な例を、表１３および１４に提供する。
【０１７６】
【表４】
2021536249.tif 000014
【０１７７】
【表５−１】
2021536249.tif 000015
【表５−２】
2021536249.tif 000016
【表５−３】
2021536249.tif 000017
【表５−４】
2021536249.tif 000018
【０１７８】
遺伝子操作されたＨＬＡ−Ｅ組成物
ＭＨＣＩノックアウト（ＫＯ）は、細胞をＴ細胞による死滅に対して耐性にするだけでなく、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を介した細胞毒性）の影響を受けやすくする（「ミッシングセルフ仮説」（図３０を参照）。ＮＫ拒絶は、同種異系（ａｌｌｏ）ＣＡＲ−Ｔ療法などの治療環境において、これらのＫＯ細胞のインビボでの有効性および／または持続性を低下させ得ると仮定される。同種異系ＣＡＲ−Ｔ細胞の表面上にＭＨＣＩが保持されると、古典的な混合型リンパ球反応（ＭＬＲ）実験で観察されるように、宿主Ｔ細胞による死滅の影響を受けやすくなり得る。人のＴ細胞の最大１０％が外来ＭＨＣに特異的であり、外来細胞および組織の拒絶反応を媒介し得ると推定される。ＭＨＣＩの標的ＫＯ、特にＨＬＡ−Ａ、Ｂ、およびＣは、Ｂ２Ｍの標的ＫＯによって達成することができ、ＨＬＡ−Ｅを含む追加のＨＬＡ分子の喪失をもたらす。例えば、ＨＬＡ−Ｅが喪失すると、「ミッシングセルフ仮説」により、ＫＯ細胞がＮＫ細胞を媒介した細胞毒性の影響を受けやすくなる。ミッシングセルフ細胞に対するＮＫを媒介した細胞毒性は、感染細胞の表面上でＭＨＣを下方調節して、適応免疫系の細胞による検出および死滅を回避する病原体に対する防御機序である。
【０１７９】
ＮＫ細胞を媒介した細胞毒性に対してより耐性のある同種異系（ＭＨＣＩ陰性）Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞を含む）を遺伝子操作するための開示によって、２つの戦略が企図される。いくつかの実施形態において、ＮＫ死滅を減少または防止する分子（一本鎖ＨＬＡ−Ｅなど）をコードする配列が、同種異系細胞に導入または送達される。あるいは、または加えて、本開示の遺伝子編集方法は、ある特定の内因性ＨＬＡ分子（内因性ＨＬＡ−Ｅなど）を保持する。例えば、第１のアプローチは、Ｂ２Ｍ  ＫＯ  Ｔ細胞への一本鎖（ＳＣ）ＨＬＡ−Ｅ分子のｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）の送達を伴う。
【０１８０】
第２のアプローチは、ＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−Ｂ、ＨＬＡ−Ｃに対して選択的なガイドＲＮＡを含む遺伝子編集組成物を使用するが、例えば、ＨＬＡ−ＥまたはＭＨＣＩ  ＫＯのナチュラルキラー細胞を媒介した細胞毒性から保護するその他の分子は使用しない。
【０１８１】
ＮＫ細胞を媒介した細胞毒性に対して保護するＨＬＡ−Ｅへの代替または追加の分子には、ＣＤ４７、インターフェロンアルファ／ベータ受容体１（ＩＦＮＡＲ１）、ヒトＩＦＮＡＲ１、インターフェロンアルファ／ベータ受容体２（ＩＦＮＡＲ２）、ヒトＩＦＮＡＲ２、ＨＬＡ−Ｇ１、ＨＬＡ−Ｇ２、ＨＬＡ−Ｇ３、ＨＬＡ−Ｇ４、ＨＬＡ−Ｇ５、ＨＬＡ−Ｇ６、ＨＬＡ−Ｇ７、ヒト癌胚性抗原関連細胞接着分子１（ＣＥＡＣＡＭ１）、ウイルス血球凝集素、ＣＤ４８、ＬＬＴ１（Ｃ型レクチンドメインファミリー２メンバー（ＣＬＣ２Ｄ）とも称される）、ＵＬＢＰ２、ＵＬＢＰ３、およびｓＭＩＣＡまたはそれらのバリアントが含まれるが、これらに限定されない。
【０１８２】
本開示の例示的なＣＤ４７タンパク質は、（シグナルペプチド、細胞外、ＴＭ、細胞質）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化８】
2021536249.tif 000019
【０１８３】
本開示の例示的なＩＮＦＡＲ１タンパク質は、（シグナルペプチド、細胞外、ＴＭ、細胞質）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化９】
2021536249.tif 000020
【０１８４】
本開示の例示的なＩＮＦＡＲ２タンパク質は、（シグナルペプチド、細胞外、ＴＭ、細胞質）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１０】
2021536249.tif 000021
【０１８５】
本開示の例示的なＨＬＡ−Ｇ１タンパク質は、（アルファ鎖１、アルファ鎖２、アルファ鎖３）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１１】
2021536249.tif 000022
【０１８６】
本開示の例示的なＨＬＡ−Ｇ２タンパク質は、（アルファ鎖１、アルファ鎖２、アルファ鎖３）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１２】
2021536249.tif 000023
【０１８７】
本開示の例示的なＨＬＡ−Ｇ３タンパク質は、（アルファ鎖１、アルファ鎖２、アルファ鎖３）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１３】
2021536249.tif 000024
【０１８８】
本開示の例示的なＨＬＡ−Ｇ４タンパク質は、（アルファ鎖１、アルファ鎖２、アルファ鎖３）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１４】
2021536249.tif 000025
【０１８９】
本開示の例示的なＨＬＡ−Ｇ５タンパク質は、（アルファ鎖１、アルファ鎖２、アルファ鎖３、イントロン４）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１５】
2021536249.tif 000026
【０１９０】
本開示の例示的なＨＬＡ−Ｇ５タンパク質は、（アルファ鎖１、アルファ鎖２、アルファ鎖３、イントロン４）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１６】
2021536249.tif 000027
【０１９１】
本開示の例示的なＨＬＡ−Ｇ５タンパク質は、（アルファ鎖１、アルファ鎖２、アルファ鎖３、イントロン２）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１７】
2021536249.tif 000028
【０１９２】
本開示の例示的なＣＥＡＣＡＭ１タンパク質は、（細胞外、ＴＭ、細胞質）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１８】
2021536249.tif 000029
【０１９３】
本開示の例示的なウイルス血球凝集素タンパク質は、（インフルエンザＡウイルスのＨＡ（Ａ／ＮｅｗＣａｌｅｄｏｎｉａ／２０／１９９９（Ｈ１Ｎ１）；ＴＭ）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１９】
2021536249.tif 000030
【０１９４】
本開示の例示的なＣＤ４８タンパク質は、（シグナルペプチド、鎖、成熟形態で除去されたプロペプチド）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化２０】
2021536249.tif 000031
【０１９５】
本開示の例示的なＬＬＴ１タンパク質は、（細胞質、ＴＭ、細胞外）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化２１】
2021536249.tif 000032
【０１９６】
本開示の例示的なＵＬＢＰ２タンパク質は、（ＮＫＧ２Ｄリガンドとしても知られている；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＡＡＱ８９０２８）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化２２】
2021536249.tif 000033
【０１９７】
本開示の例示的なＵＬＢＰ３タンパク質は、（ＮＫＧ２Ｄリガンドとしても知られている；Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿０７８７９４）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化２３】
2021536249.tif 000034
【０１９８】
本開示の例示的なｓＭＩＣＡタンパク質は、（シグナルペプチド、細胞外ドメインの一部分、ＴＭおよび細胞質ドメイン）（Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｑ２９９８３）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化２４】
2021536249.tif 000035
【０１９９】
本開示の例示的なｓＭＩＣＡタンパク質は、（アルファ−１、アルファ−２、アルファ−３）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化２５】
2021536249.tif 000036
【０２００】
本開示の例示的なｓＭＩＣＡタンパク質は、（シグナルペプチド；アルファ−１、アルファ−２、アルファ−３）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化２６】
2021536249.tif 000037
【０２０１】
本開示の例示的なｓＭＩＣＡタンパク質は、（シグナルペプチド）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化２７】
2021536249.tif 000038
【０２０２】
本開示の例示的なｂＧＢＥ三量体（２７０Ｇおよび４８４Ｓ）タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化２８】
2021536249.tif 000039
【０２０３】
本開示の例示的なｂＧＢＥ三量体（２７０Ｇおよび４８４Ｓ）タンパク質は、以下の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化２９】
2021536249.tif 000040
【０２０４】
本開示の例示的なｂＧＢＥ三量体（２７０Ｒおよび４８４Ｓ）タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化３０】
2021536249.tif 000041
【０２０５】
本開示の例示的なｂＧＢＥ三量体（２７０Ｒおよび４８４Ｓ）タンパク質は、以下の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化３１】
2021536249.tif 000042
【０２０６】
本開示の例示的なｇＢＥ二量体（ＲおよびＳ）タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化３２】
2021536249.tif 000043
【０２０７】
本開示の例示的なｇＢＥ二量体（ＲおよびＳ）タンパク質は、以下の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化３３】
2021536249.tif 000044
【０２０８】
本開示の例示的なｇＢＥ二量体（ＧおよびＳ）タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化３４】
2021536249.tif 000045
【０２０９】
本開示の例示的なｇＢＥ二量体（ＧおよびＳ）タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化３５】
2021536249.tif 000046
【０２１０】
野生型／天然ヒトＨＬＡ−Ｅタンパク質（ＮＣＢＩ：ＨＬＡＥ＿ＨＵＭＡＮ；ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ１３７４７．４）は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
ＭＶＤＧＴＬＬＬＬＬＳＥＡＬＡＬＴＱＴＷＡＧＳＨＳＬＫＹＦＨＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＮＤＡＡＳＰＲＭＶＰＲＡＰＷＭＥＱＥＧＳＥＹＷＤＲＥＴＲＳＡＲＤＴＡＱＩＦＲＶＮＬＲＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＬＱＷＭＨＧＣＥＬＧＰＤＧＲＦＬＲＧＹＥＱＦＡＹＤＧＫＤＹＬＴＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＶＤＴＡＡＱＩＳＥＱＫＳＮＤＡＳＥＡＥＨＱＲＡＹＬＥＤＴＣＶＥＷＬＨＫＬＥＫＧＫＥＴＬＬＨＬＥＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＱＤＧＥＧＨＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＥＰＶＴＬＲＷＫＰＡＳＱＰＴＩＰＩＶＧＩＩＡＧＬＶＬＬＧＳＶＶＳＧＡＶＶＡＡＶＩＷＲＫＫＳＳＧＧＫＧＧＳＹＳＫＡＥＷＳＤＳＡＱＧＳＥＳＨＳＬ（配列番号１７１２２）
【０２１１】
野生型／天然ＨＬＡ−Ｅタンパク質（ＮＣＢＩ：ＣＣＤＳ３４３７９．１）をコードするヌクレオチド配列は、以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ＡＴＧＧＴＡＧＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＣＣＴＴＴＴＡＣＴＣＣＴＣＴＣＧＧＡＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＣＴＴＡＣＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＧＣＧＧＧＣＴＣＣＣＡＣＴＣＣＴＴＧＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＴＴＣＣＧＴＧＴＣＣＣＧＧＣＣＣＧＧＣＣＧＣＧＧＧＧＡＧＣＣＣＣＧＣＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＧＡＧＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＴＧＣＣＧＣＧＧＧＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＧＴＣＡＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＡＣＡＣＧＧＡＧＣＧＣＣＡＧＧＧＡＣＡＣＣＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＧＡＧＴＧＡＡＴＣＴＧＣＧＧＡＣＧＣＴＧＣＧＣＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＧＧＴＣＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＴＧＧＣＴＧＣＧＡＧＣＴＧＧＧＧＣＣＣＧＡＣＧＧＧＣＧＣＴＴＣＣＴＣＣＧＣＧＧＧＴＡＴＧＡＡＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＴＴＡＴＣＴＣＡＣＣＣＴＧＡＡＴＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＧＧＴＧＧＡＣＡＣＧＧＣＧＧＣＴＣＡＧＡＴＣＴＣＣＧＡＧＣＡＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＧＡＴＧＣＣＴＣＴＧＡＧＧＣＧＧＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＡＣＣＴＧＧＡＡＧＡＣＡＣＡＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＣＣＡＣＡＡＡＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＧＡＡＧＧＡＧＡＣＧＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＣＧＴＧＡＣＴＣＡＣＣＡＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＡＣＣＡＴＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＣＴＧＣＧＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＧＧＧＡＧＧＧＣＣＡＴＡＣＣＣＡＧＧＡＣＡＣＧＧＡＧＣＴＣＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＡＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＡＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣＴＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＧＴＧＣＣＡＴＧＴＧＣＡＧＣＡＴＧＡＧＧＧＧＣＴＡＣＣＣＧＡＧＣＣＣＧＴＣＡＣＣＣＴＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＧＧＣＴＴＣＣＣＡＧＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＡＴＣＧＴＧＧＧＣＡＴＣＡＴＴＧＣＴＧＧＣＣＴＧＧＴＴＣＴＣＣＴＴＧＧＡＴＣＴＧＴＧＧＴＣＴＣＴＧＧＡＧＣＴＧＴＧＧＴＴＧＣＴＧＣＴＧＴＧＡＴＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＧＧＴＧＧＡＡＡＡＧＧＡＧＧＧＡＧＣＴＡＣＴＣＴＡＡＧＧＣＴＧＡＧＴＧＧＡＧＣＧＡＣＡＧＴＧＣＣＣＡＧＧＧＧＴＣＴＧＡＧＴＣＴＣＡＣＡＧＣＴＴＧＴＡＡ（配列番号１７１２３）
【０２１２】
本開示の例示的なＷＴ  ＨＬＡ−Ｅ単量体（ＲおよびＳ）タンパク質は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化３６】
2021536249.tif 000047
【０２１３】
本開示の例示的なＷＴ  ＨＬＡ−Ｅ単量体（ＲおよびＳ）タンパク質は、以下の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化３７】
2021536249.tif 000048
【０２１４】
本開示の例示的なＷＴ  ＨＬＡ−Ｅ単量体（ＧおよびＳ）タンパク質は、以下の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化３８】
2021536249.tif 000049
【０２１５】
本開示の例示的なＷＴ  ＨＬＡ−Ｅ単量体（ＧおよびＳ）タンパク質は、以下の核酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化３９】
2021536249.tif 000050
【０２１６】
野生型／天然ヒトＢ２Ｍタンパク質（ＮＣＢＩ：Ｂ２ＭＧ＿ＨＵＭＡＮ；ＵｎｉＰｒｏｔ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ：Ｐ６１７６９．１）は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
ＭＳＲＳＶＡＬＡＶＬＡＬＬＳＬＳＧＬＥＡＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮＦＬＮＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶＫＷＤＲＤＭ（配列番号１７１２４）
【０２１７】
野生型／天然Ｂ２Ｍタンパク質（ＮＣＢＩ：ＣＣＤＳ１０１１３．１）をコードするヌクレオチド配列は、以下のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
ＡＴＧＴＣＴＣＧＣＴＣＣＧＴＧＧＣＣＴＴＡＧＣＴＧＴＧＣＴＣＧＣＧＣＴＡＣＴＣＴＣＴＣＴＴＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＣＣＡＧＣＧＴＡＣＴＣＣＡＡＡＧＡＴＴＣＡＧＧＴＴＴＡＣＴＣＡＣＧＴＣＡＴＣＣＡＧＣＡＧＡＧＡＡＴＧＧＡＡＡＧＴＣＡＡＡＴＴＴＣＣＴＧＡＡＴＴＧＣＴＡＴＧＴＧＴＣＴＧＧＧＴＴＴＣＡＴＣＣＡＴＣＣＧＡＣＡＴＴＧＡＡＧＴＴＧＡＣＴＴＡＣＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＡＧＡＧＡＧＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＧＴＧＧＡＧＣＡＴＴＣＡＧＡＣＴＴＧＴＣＴＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＧＧＴＣＴＴＴＣＴＡＴＣＴＣＴＴＧＴＡＣＴＡＣＡＣＴＧＡＡＴＴＣＡＣＣＣＣＣＡＣＴＧＡＡＡＡＡＧＡＴＧＡＧＴＡＴＧＣＣＴＧＣＣＧＴＧＴＧＡＡＣＣＡＴＧＴＧＡＣＴＴＴＧＴＣＡＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＴＡＧＴＴＡＡＧＴＧＧＧＡＴＣＧＡＧＡＣＡＴＧＴＡＡ（配列番号１７１２５）
【０２１８】
本開示の例示的なＨＬＡ−ｂＧＢＥ（一本鎖三量体）タンパク質は、（Ｂ２Ｍシグナルペプチド、ペプチド、リンカー、Ｂ２Ｍドメイン、リンカー、ＨＬＡ−Ｅペプチド）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化４０】
2021536249.tif 000051
Ｂ２Ｍシグナルペプチド：ＭＳＲＳＶＡＬＡＶＬＡＬＬＳＬＳＧＬＥＡ（配列番号１７１２６）
ペプチド：ＶＭＡＰＲＴＬＩＬ（配列番号１７１２７）
リンカー：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７１２８）
Ｂ２Ｍドメイン：ＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮＦＬＮＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶＫＷＤＲＤＭ（配列番号１７１２９）
リンカー：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７１３０）
ＨＬＡ−Ｅペプチド：ＧＳＨＳＬＫＹＦＨＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＮＤＡＡＳＰＲＭＶＰＲＡＰＷＭＥＱＥＧＳＥＹＷＤＲＥＴＲＳＡＲＤＴＡＱＩＦＲＶＮＬＲＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＬＱＷＭＨＧＣＥＬＧＰＤＧＲＦＬＲＧＹＥＱＦＡＹＤＧＫＤＹＬＴＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＶＤＴＡＡＱＩＳＥＱＫＳＮＤＡＳＥＡＥＨＱＲＡＹＬＥＤＴＣＶＥＷＬＨＫＹＬＥＫＧＫＥＴＬＬＨＬＥＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＱＤＧＥＧＨＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＥＰＶＴＬＲＷＫＰＡＳＱＰＴＩＰＩＶＧＩＩＡＧＬＶＬＬＧＳＶＶＳＧＡＶＶＡＡＶＩＷＲＫＫＳＳＧＧＫＧＧＳＹＳＫＡＥＷＳＤＳＡＱＧＳＥＳＨＳＬ（配列番号１７１３１）
【０２１９】
本開示のＨＬＡ−ｂＧＢＥ（一本鎖三量体）タンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、（Ｂ２Ｍシグナルペプチド、ペプチド、リンカー、Ｂ２Ｍドメイン、リンカー、ＨＬＡ−Ｅペプチド）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【化４１】
2021536249.tif 000052
Ｂ２Ｍシグナルペプチド：ＡＴＧＴＣＴＣＧＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣ（配列番号１７１３２）
ペプチド：ＧＴＧＡＴＧＧＣＣＣＣＣＣＧＧＡＣＣＣＴＧＡＴＣＣＴＧ（配列番号１７１３３）
リンカー：ＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴ（配列番号１７１３４）
Ｂ２Ｍドメイン：ＡＴＣＣＡＧＣＧＣＡＣＡＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＴＡＴＴＣＴＣＧＧＣＡＣＣＣＡＧＣＣＧＡＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＴＴＧＣＴＡＣＧＴＧＡＧＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＣＣＴＴＣＣＧＡＣＡＴＣＧＡＧＧＴＧＧＡＴＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＴＧＧＣＧＡＧＡＧＡＡＴＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＧＣＡＣＴＣＣＧＡＣＣＴＧＡＧＣＴＴＣＴＣＣＡＡＧＧＡＴＴＧＧＴＣＴＴＴＴＴＡＴＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＡＴＡＣＣＧＡＧＴＴＴＡＣＣＣＣＴＡＣＡＧＡＧＡＡＧＧＡＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＧＴＣＧＣＧＴＧＡＡＣＣＡＣＧＴＧＡＣＡＣＴＧＴＣＣＣＡＧＣＣＡＡＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＴＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＴＡＴＧ（配列番号１７１３５）
リンカー：ＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＧＧＣＴＣＣＧＧＡＧＧＡＧＧＣＧＧＣＴＣＴ（配列番号１７１３６）
ＨＬＡ−Ｅペプチド：ＧＧＣＡＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＣＡＣＧＧＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＴＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＡＴＣＡＧＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＣＧＧＡＴＧＣＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＴＧＧＣＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＡＡＴＧＡＣＧＣＡＴＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＴＧＡＣＡＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＴＣＡＧＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＧＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡＣＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＣＡＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＡＴＣＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＴＣＧＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＣＣＡＡＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＣＧＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＴＧＡＧＡＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＴＧＡ（配列番号１７１３７）
【０２２０】
本開示の例示的なＨＬＡ−ｇＢＥ（一本鎖二量体）タンパク質は、（Ｂ２Ｍシグナルペプチド、Ｂ２Ｍドメイン、リンカー、ＨＬＡ−Ｅペプチド）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化４２】
2021536249.tif 000053
Ｂ２Ｍシグナルペプチド：ＭＳＲＳＶＡＬＡＶＬＡＬＬＳＬＳＧＬＥＡ（配列番号１７１２６）
Ｂ２Ｍドメイン：ＩＱＲＴＰＫＩＱＶＹＳＲＨＰＡＥＮＧＫＳＮＦＬＮＣＹＶＳＧＦＨＰＳＤＩＥＶＤＬＬＫＮＧＥＲＩＥＫＶＥＨＳＤＬＳＦＳＫＤＷＳＦＹＬＬＹＹＴＥＦＴＰＴＥＫＤＥＹＡＣＲＶＮＨＶＴＬＳＱＰＫＩＶＫＷＤＲＤＭ（配列番号１７１２９）
リンカー：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１７１３０）
ＨＬＡ−Ｅペプチド：ＧＳＨＳＬＫＹＦＨＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＮＤＡＡＳＰＲＭＶＰＲＡＰＷＭＥＱＥＧＳＥＹＷＤＲＥＴＲＳＡＲＤＴＡＱＩＦＲＶＮＬＲＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＬＱＷＭＨＧＣＥＬＧＰＤＲＲＦＬＲＧＹＥＱＦＡＹＤＧＫＤＹＬＴＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＶＤＴＡＡＱＩＳＥＱＫＳＮＤＡＳＥＡＥＨＱＲＡＹＬＥＤＴＣＶＥＷＬＨＫＹＬＥＫＧＫＥＴＬＬＨＬＥＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＱＤＧＥＧＨＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＥＰＶＴＬＲＷＫＰＡＳＱＰＴＩＰＩＶＧＩＩＡＧＬＶＬＬＧＳＶＶＳＧＡＶＶＡＡＶＩＷＲＫＫＳＳＧＧＫＧＧＳＹＹＫＡＥＷＳＤＳＡＱＧＳＥＳＨＳＬ（配列番号１７１３１）
【０２２１】
本開示のＨＬＡ−ｇＢＥ（一本鎖二量体）タンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、（Ｂ２Ｍシグナルペプチド、Ｂ２Ｍドメイン、リンカー、ＨＬＡ−Ｅペプチド）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【化４３】
2021536249.tif 000054
Ｂ２Ｍシグナルペプチド：ＡＴＧＡＧＣＡＧＡＴＣＴＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧＣＴＣＴＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＡＧＣＣ（配列番号１７１３２）
Ｂ２Ｍドメイン：ＡＴＣＣＡＧＣＧＧＡＣＣＣＣＴＡＡＧＡＴＣＣＡＧＧＴＧＴＡＣＡＧＣＡＧＡＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＡＧＡＡＣＧＧＣＡＡＧＡＧＣＡＡＣＴＴＣＣＴＧＡＡＣＴＧＣＴＡＣＧＴＧＴＣＣＧＧＣＴＴＴＣＡＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＴＴＧＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＧＧＣＧＡＧＣＧＧＡＴＣＧＡＧＡＡＧＧＴＧＧＡＡＣＡＣＡＧＣＧＡＴＣＴＧＡＧＣＴＴＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＴＧＧＴＣＣＴＴＣＴＡＣＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＡＣＡＣＣＧＡＧＴＴＣＡＣＣＣＣＴＡＣＣＧＡＧＡＡＧＧＡＣＧＡＧＴＡＣＧＣＣＴＧＣＡＧＡＧＴＧＡＡＣＣＡＣＧＴＧＡＣＡＣＴＧＡＧＣＣＡＧＣＣＴＡＡＧＡＴＣＧＴＧＡＡＧＴＧＧＧＡＣＡＧＡＧＡＴＡＴＧ（配列番号１７１３５）
リンカー：ＧＧＣＧＧＡＧＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＡＧＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＣＴ（配列番号１７１３６）
ＨＬＡ−Ｅペプチド：ＧＧＡＴＣＴＣＡＣＡＧＣＣＴＧＡＡＧＴＡＣＴＴＴＣＡＣＡＣＣＴＣＣＧＴＧＴＣＣＡＧＡＣＣＴＧＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＧＣＣＴＡＧＡＴＴＣＡＴＣＡＧＣＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＣＡＣＣＣＡＧＴＴＣＧＴＣＡＧＡＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＡＣＧＣＣＧＣＣＴＣＴＣＣＴＣＧＧＡＴＧＧＴＴＣＣＴＡＧＡＧＣＡＣＣＣＴＧＧＡＴＧＧＡＡＣＡＡＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＴＡＣＴＧＧＧＡＴＣＧＣＧＡＧＡＣＡＡＧＡＡＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＣＡＧＣＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＣＧＣＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＡＣＴＡＣＡＡＴＣＡＧＴＣＴＧＡＧＧＣＣＧＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＣＣＴＧＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＴＧＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＧＧＧＣＣＣＣＧＡＣＡＧＡＣＧＧＴＴＣＣＴＧＡＧＡＧＧＣＴＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＡＣＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＣＴＡＣＣＴＧＡＣＡＣＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＣＴＣＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＴＡＡＣＧＡＣＧＣＣＡＧＣＧＡＧＧＣＣＧＡＡＣＡＣＣＡＧＡＧＡＧＣＣＴＡＴＣＴＧＧＡＡＧＡＴＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＡＡＴＧＧＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＡＣＣＴＣＣＡＡＡＧＡＣＡＣＡＴＧＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＴＡＴＣＡＧＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＡＣＡＣＴＧＡＧＡＴＧＴＴＧＧＧＣＣＣＴＧＧＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＣＡＣＴＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＴＧＧＣＧＡＧＧＧＣＣＡＣＡＣＡＣＡＧＧＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＡＣＡＡＧＡＣＣＴＧＣＣＧＧＣＧＡＣＧＧＣＡＣＣＴＴＣＣＡＧＡＡＡＴＧＧＧＣＴＧＣＴＧＴＧＧＴＴＧＴＧＣＣＣＡＧＣＧＧＣＧＡＧＧＡＡＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＣＡＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＣＴＧＣＣＴＧＡＡＣＣＴＧＴＧＡＣＴＣＴＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＡＡＣＡＡＴＣＣＣＣＡＴＣＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＴＴＧＣＣＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＡＴＣＴＧＴＧＧＴＴＴＣＴＧＧＴＧＣＴＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＴＴＧＧＡＧＡＡＡＧＡＡＧＴＣＣＴＣＴＧＧＣＧＧＣＡＡＡＧＧＣＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＡＡＧＧＣＣＧＡＧＴＧＧＡＧＣＧＡＴＴＣＴＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＣＣＡＣＡＧＣＣＴＧＴＧＡ（配列番号１７１３７）
【０２２２】
本開示の例示的なＨＬＡ−ｂＥ（単量体）タンパク質は、（Ｂ２Ｍシグナルペプチド、ＨＬＡ−Ｅペプチド）のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化４４】
2021536249.tif 000055
Ｂ２Ｍシグナルペプチド：ＭＳＲＳＶＡＬＡＶＬＡＬＬＳＬＳＧＬＥＡ（配列番号１７１２６）
ＨＬＡ−Ｅペプチド：ＧＳＨＳＬＫＹＦＨＴＳＶＳＲＰＧＲＧＥＰＲＦＩＳＶＧＹＶＤＤＴＱＦＶＲＦＤＮＤＡＡＳＰＲＭＶＰＲＡＰＷＭＥＱＥＧＳＥＹＷＤＲＥＴＲＳＡＲＤＴＡＱＩＦＲＶＮＬＲＴＬＲＧＹＹＮＱＳＥＡＧＳＨＴＬＱＷＭＨＧＣＥＬＧＰＤＲＲＦＬＲＧＹＥＱＦＡＹＤＧＫＤＹＬＴＬＮＥＤＬＲＳＷＴＡＶＤＴＡＡＱＩＳＥＱＫＳＮＤＡＳＥＡＥＨＱＲＡＹＬＥＤＴＣＶＥＷＬＨＫＹＬＥＫＧＫＥＴＬＬＨＬＥＰＰＫＴＨＶＴＨＨＰＩＳＤＨＥＡＴＬＲＣＷＡＬＧＦＹＰＡＥＩＴＬＴＷＱＱＤＧＥＧＨＴＱＤＴＥＬＶＥＴＲＰＡＧＤＧＴＦＱＫＷＡＡＶＶＶＰＳＧＥＥＱＲＹＴＣＨＶＱＨＥＧＬＰＥＰＶＴＬＲＷＫＰＡＳＱＰＴＩＰＩＶＧＩＩＡＧＬＶＬＬＧＳＶＶＳＧＡＶＶＡＡＶＩＷＲＫＫＳＳＧＧＫＧＧＳＹＹＫＡＥＷＳＤＳＡＱＧＳＥＳＨＳＬ（配列番号１７１３１）
【０２２３】
本開示のＨＬＡ−ｂＥ（単量体）タンパク質をコードする例示的なヌクレオチド配列は、（Ｂ２Ｍシグナルペプチド、ＨＬＡ−Ｅペプチド）のヌクレオチド配列を含むか、またはそれからなる。
【化４５】
2021536249.tif 000056
Ｂ２Ｍシグナルペプチド：ＡＴＧＴＣＴＣＧＣＡＧＣＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＴＣＣＣＴＧＴＣＴＧＧＣＣＴＧＧＡＧＧＣＣ（配列番号１７１３２）
ＨＬＡ−Ｅペプチド：ＧＧＣＡＧＣＣＡＣＴＣＣＣＴＧＡＡＧＴＡＴＴＴＣＣＡＣＡＣＣＴＣＴＧＴＧＡＧＣＣＧＧＣＣＡＧＧＣＡＧＡＧＧＡＧＡＧＣＣＡＣＧＧＴＴＣＡＴＣＴＣＴＧＴＧＧＧＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＧＡＴＡＣＡＣＡＧＴＴＣＧＴＧＡＧＧＴＴＴＧＡＣＡＡＴＧＡＴＧＣＣＧＣＣＡＧＣＣＣＡＡＧＡＡＴＧＧＴＧＣＣＴＡＧＧＧＣＣＣＣＡＴＧＧＡＴＧＧＡＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＡＧＴＡＴＴＧＧＧＡＣＡＧＧＧＡＧＡＣＣＣＧＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＧＡＣＡＣＡＧＣＡＣＡＧＡＴＴＴＴＣＣＧＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＧＧＧＧＣＴＡＣＴＡＴＡＡＴＣＡＧＴＣＣＧＡＧＧＣＣＧＧＣＴＣＴＣＡＣＡＣＡＣＴＣＣＡＧＴＧＧＡＴＧＣＡＣＧＧＡＴＧＣＧＡＧＣＴＧＧＧＡＣＣＡＧＡＴＣＧＣＣＧＣＴＴＣＣＴＧＣＧＧＧＧＣＴＡＣＧＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＣＴＡＴＧＡＣＧＧＣＡＡＧＧＡＴＴＡＣＣＴＧＡＣＣＣＴＧＡＡＣＧＡＧＧＡＣＣＴＧＡＧＡＴＣＣＴＧＧＡＣＣＧＣＣＧＴＧＧＡＴＡＣＡＧＣＣＧＣＣＣＡＧＡＴＣＡＧＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＣＣＡＡＴＧＡＣＧＣＡＴＣＴＧＡＧＧＣＡＧＡＧＣＡＣＣＡＧＡＧＧＧＣＡＴＡＴＣＴＧＧＡＧＧＡＴＡＣＣＴＧＣＧＴＧＧＡＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＡＡＧＴＡＣＣＴＧＧＡＧＡＡＧＧＧＣＡＡＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＣＣＣＣＴＡＡＧＡＣＣＣＡＣＧＴＧＡＣＡＣＡＣＣＡＣＣＣＡＡＴＣＡＧＣＧＡＣＣＡＣＧＡＧＧＣＣＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＴＴＧＧＧＣＡＣＴＧＧＧＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＧＣＣＧＡＧＡＴＣＡＣＣＣＴＧＡＣＡＴＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＧＧＡＧＡＧＧＧＡＣＡＣＡＣＣＣＡＧＧＡＴＡＣＡＧＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＡＧＧＣＣＣＧＣＣＧＧＣＧＡＴＧＧＣＡＣＡＴＴＴＣＡＧＡＡＧＴＧＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＧＴＧＧＴＧＣＣＴＴＣＣＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＧＡＧＡＴＡＣＡＣＣＴＧＴＣＡＣＧＴＧＣＡＧＣＡＣＧＡＧＧＧＡＣＴＧＣＣＡＧＡＧＣＣＡＧＴＧＡＣＣＣＴＧＡＧＧＴＧＧＡＡＧＣＣＴＧＣＣＡＧＣＣＡＧＣＣＣＡＣＡＡＴＣＣＣＴＡＴＣＧＴＧＧＧＡＡＴＣＡＴＣＧＣＡＧＧＣＣＴＧＧＴＧＣＴＧＣＴＧＧＧＣＴＣＴＧＴＧＧＴＧＡＧＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＧＴＧＧＣＣＧＣＣＧＴＧＡＴＣＴＧＧＣＧＧＡＡＧＡＡＧＡＧＣＡＧＣＧＧＡＧＧＣＡＡＧＧＧＡＧＧＣＴＣＣＴＡＣＴＡＴＡＡＧＧＣＡＧＡＧＴＧＧＡＧＣＧＡＣＴＣＣＧＣＣＣＡＧＧＧＣＴＣＴＧＡ（配列番号１７１３７）
【０２２４】
免疫および免疫前駆細胞
ある特定の実施形態において、本開示の免疫細胞は、リンパ系前駆細胞、天然キラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM細胞）、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）、幹細胞様Ｔ細胞、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）、骨髄前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、マクロファージ、血小板、赤血球、赤血球（ＲＢＣ）、巨核球、または破骨細胞を含む。
【０２２５】
ある特定の実施形態において、免疫前駆細胞は、１つ以上のタイプの免疫細胞に分化することができる任意の細胞を含む。ある特定の実施形態において、免疫前駆細胞は、自己複製して、免疫細胞に発達することができる多能性幹細胞を含む。ある特定の実施形態において、免疫前駆細胞は、造血幹細胞（ＨＳＣ）またはその子孫を含む。ある特定の実施形態において、免疫前駆細胞は、免疫細胞に発達することができる前駆細胞を含む。ある特定の実施形態において、免疫前駆細胞は、造血前駆細胞（ＨＰＣ）を含む。
【０２２６】
造血幹細胞（ＨＳＣ）
造血幹細胞（ＨＳＣ）は、多能性の自己複製細胞である。リンパ系統および骨髄系統からのすべての分化した血液細胞は、ＨＳＣから生じる。ＨＳＣは、成体骨髄、末梢血、動員された末梢血、腹膜透析廃液、および臍帯血に見られ得る。
【０２２７】
本開示のＨＳＣは、初代幹細胞または培養幹細胞から単離され得るか、またはそれに由来し得る。本開示のＨＳＣは、胚幹細胞、多能性幹細胞、多能性幹細胞、成体幹細胞、または誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から単離され得るか、またはそれに由来し得る。
【０２２８】
本開示の免疫前駆細胞は、ＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞を含み得る。本開示の例示的なＨＳＣ子孫細胞には、多能性幹細胞、リンパ球前駆細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔリンパ球細胞（Ｔ細胞）、Ｂリンパ球細胞（Ｂ細胞）、骨髄性前駆細胞、好中球、好塩基球、好酸球、単球、およびマクロファージが含まれるが、これらに限定されない。
【０２２９】
本開示の方法によって産生されたＨＳＣは、成体幹細胞から単離され得るか、またはそれに由来し得、一方、単一の系統に関与している間、胚幹細胞の特徴を共有する「原始的な」幹細胞の特徴を保持し得る。例えば、本開示の方法によって生成された「原始的な」ＨＳＣは、分割後もそれらの「幹性」を保持し、分化されない。その結果、養子細胞療法として、本開示の方法によって生成された「原始的な」ＨＳＣは、それらの数を補充するだけでなく、インビボで増大する。本開示の方法によって生成された「原始的な」ＨＳＣは、単回投与として投与されたときに治療上有効であり得る。いくつかの実施形態において、本開示の原始的なＨＳＣは、ＣＤ３４＋である。いくつかの実施形態において、本開示の原始的なＨＳＣは、ＣＤ３４＋およびＣＤ３８−である。いくつかの実施形態において、本開示の原始的なＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、およびＣＤ９０＋である。いくつかの実施形態において、本開示の原始的なＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ９０＋、およびＣＤ４５ＲＡ−である。いくつかの実施形態において、本開示の原始的なＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−、およびＣＤ４９ｆ＋である。いくつかの実施形態において、本開示の最も原始的なＨＳＣは、ＣＤ３４＋、ＣＤ３８−、ＣＤ９０＋、ＣＤ４５ＲＡ−、およびＣＤ４９ｆ＋である。
【０２３０】
本開示のいくつかの実施形態において、原始的なＨＳＣ、ＨＳＣ、および／またはＨＳＣ子孫細胞は、外因性配列（例えば、キメラ抗原受容体または治療用タンパク質）を発現するように、本開示の方法に従って改変され得る。本開示のいくつかの実施形態において、改変された原始的なＨＳＣ、改変されたＨＳＣ、および／または改変されたＨＳＣ子孫細胞は、改変されたＴ細胞、改変されたナチュラルキラー細胞、および／または本開示の改変されたＢ細胞を含むが、これらに限定されない改変された免疫細胞を産生するために前方分化され得る。
【０２３１】
Ｔ細胞
本開示の改変されたＴ細胞は、改変された造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）または改変されたＨＳＣに由来し得る。
【０２３２】
従来の生物学的製剤および化学療法とは異なり、本開示の改変されたＴ細胞は、抗原が認識されると急速に再生する能力を有し、それにより、処置を繰り返す必要性が潜在的になくなる。これを達成するために、いくつかの実施形態において、本開示の改変されたＴ細胞は、初期応答を駆動するだけでなく、潜在的な再発を防ぐために患者において生存可能な記憶Ｔ細胞の安定な集団として持続される。あるいは、いくつかの実施形態において、それが望ましくないとき、本開示の改変されたＴ細胞は、患者において持続されない。
【０２３３】
抗原非依存性（トニック）シグナル伝達を通じたＴ細胞疲弊を引き起こさない抗原受容体分子、ならびに初期記憶Ｔ細胞、特に幹細胞記憶（ＴSCM）または幹細胞様Ｔ細胞を含有する改変されたＴ細胞生成物の開発に集中的な試みの焦点が当てられている。本開示の幹細胞様改変されたＴ細胞は、自己再生の最大能力ならびに中央記憶（ＴCM）Ｔ細胞またはＴCM様細胞、エフェクター記憶（ＴEM）およびエフェクターＴ細胞（ＴE）を引き出す多能性能力を示し、それにより、より良好な腫瘍の根絶および長期間にわたる改変されたＴ細胞の生着が生じる。ＴNが親前駆細胞であり、ＴSCMを直接生じさせ、次いで、今度はそれがＴCMを直接生じさせるなどの分化の直線的経路：ナイーブＴ細胞（ＴN）＞ＴSCM＞ＴCM＞ＴEM＞ＴE＞ＴTEがこれらの細胞の生成に関与し得る。本開示のＴ細胞の組成物は、各親Ｔ細胞サブセットのうちの１つ以上を含み得、ＴSCM細胞が最も豊富である（例えば、ＴSCM＞ＴCM＞ＴEM＞ＴE＞ＴTE）。
【０２３４】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞前駆体は、初期メモリＴ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＴN）、ＴSCM、ＴCM、ＴEM、ＴE、またはＴTEに分化するか、または分化することができる。いくつかの実施形態において、免疫細胞前駆体は、本開示の原始的なＨＳＣ、ＨＳＣ、またはＨＳＣ子孫細胞である。
【０２３５】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、ナイーブＴ細胞（ＴN）、ＴSCM、ＴCM、ＴEM、ＴE、またはＴTEである。
【０２３６】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、初期記憶Ｔ細胞である。
【０２３７】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、幹細胞様Ｔ細胞である。
【０２３８】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＴSCMである。
【０２３９】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、免疫細胞は、ＴCMである。
【０２４０】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本方法は、複数の改変されたＴ細胞を改変し、および／または本方法は、複数の改変されたＴ細胞を産生し、複数の改変されたＴ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージは、初期記憶Ｔ細胞のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態において、複数の改変された初期記憶Ｔ細胞は、少なくとも１つの改変された幹細胞様Ｔ細胞を含む。ある特定の実施形態において、複数の改変された初期記憶Ｔ細胞は、少なくとも１つの改変されたＴSCMを含む。ある特定の実施形態において、複数の改変された初期記憶Ｔ細胞は、少なくとも１つの改変されたＴCMを含む。
【０２４１】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本方法は、複数の改変されたＴ細胞を改変し、および／または本方法は、複数の改変されたＴ細胞を産生し、複数の改変されたＴ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージは、幹細胞様Ｔ細胞のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態において、複数の改変された幹細胞様Ｔ細胞は、少なくとも１つの改変されたＴSCMを含む。ある特定の実施形態において、複数の改変された幹細胞様Ｔ細胞は、少なくとも１つの改変されたＴCMを含む。
【０２４２】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本方法は、複数の改変されたＴ細胞を改変し、および／または本方法は、複数の改変されたＴ細胞を産生し、複数の改変されたＴ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージは、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態において、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２ＬおよびＣＤ４５ＲＡを含む。ある特定の実施形態において、細胞表面マーカーは、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ２８、ＣＣＲ７、ＣＤ１２７、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβのうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌのうちの１つ以上を含む。
【０２４３】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本方法は、複数の改変されたＴ細胞を改変し、および／または本方法は、複数の改変されたＴ細胞を産生し、複数の改変されたＴ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージは、中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態において、細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＯ、ＣＤ９５、ＩＬ−２Ｒβ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌのうちの１つ以上を含む。
【０２４４】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本方法は、複数の改変されたＴ細胞を改変し、および／または本方法は、複数の改変されたＴ細胞を産生し、複数の改変されたＴ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージは、ナイーブＴ細胞（ＴN）のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態において、細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＣＲ７、およびＣＤ６２Ｌのうちの１つ以上を含む。
【０２４５】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本方法は、複数の改変されたＴ細胞を改変し、および／または本方法は、複数の改変されたＴ細胞を産生し、複数の改変されたＴ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージは、エフェクターＴ細胞（改変されたＴEFF）のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態において、細胞表面マーカーは、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ９５、およびＩＬ−２Ｒβのうちの１つ以上を含む。
【０２４６】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本方法は、複数の改変されたＴ細胞を改変し、および／または本方法は、複数の改変されたＴ細胞を産生し、複数の改変されたＴ細胞の少なくとも２％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージは、幹細胞様Ｔ細胞、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）、または中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。
【０２４７】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、緩衝液は、免疫細胞またはその前駆体を含む。緩衝液は、Ｔ細胞を含む、免疫細胞またはその前駆体の細胞生存のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する。ある特定の実施形態において、緩衝液は、ヌクレオフェクションの前に、初代ヒトＴ細胞の細胞生存のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する。ある特定の実施形態において、緩衝液は、ヌクレオフェクション中に、初代ヒトＴ細胞の細胞生存のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する。ある特定の実施形態において、緩衝液は、ヌクレオフェクション後に、初代ヒトＴ細胞の細胞生存のレベルおよび／または幹様表現型を維持または増強する。ある特定の実施形態において、緩衝液は、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ2、ＣｌＮａ、グルコース、およびＣａ（ＮＯ3）2のうちの１つ以上を任意の絶対的または相対的存在量または濃度で含み、および任意選択的に、緩衝液は、ＨＥＰＥＳ、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、およびリン酸緩衝液からなる群から選択される補充物質をさらに含む。ある特定の実施形態において、緩衝液は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコース、および０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ3）2を含む。ある特定の実施形態において、緩衝液は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコース、および０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ3）2、ならびに２０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび７５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ含む補充物質を含む。ある特定の実施形態において、緩衝液は、５ｍＭのＫＣｌ、１５ｍＭのＭｇＣｌ2、９０ｍＭのＣｌＮａ、１０ｍＭのグルコース、および０．４ｍＭのＣａ（ＮＯ3）2、ならびに４０ｍＭのＮａ2ＨＰＯ4／ＮａＨ2ＰＯ4、ｐＨ  ７．２を含む補充物質を含む。ある特定の実施形態において、初代ヒトＴ細胞を含む組成物は、１００μｌの緩衝液および５×１０6〜２５×１０6個の細胞を含む。ある特定の実施形態において、組成物は、導入ステップの間、緩衝液または他の培地のミリリットルあたり２５０×１０6個の初代ヒトＴ細胞の測定可能な比率を含む。
【０２４８】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本方法は、本開示のＴ細胞を含む本開示の免疫細胞、およびＴ細胞増大組成物と接触することを含む。本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼを本開示の免疫細胞に導入するステップは、免疫細胞およびＴ細胞増大組成物を接触させることをさらに含み得る。方法の導入ステップが電気穿孔またはヌクレオフェクションステップを含むものを含むいくつかの実施形態において、電気穿孔またはヌクレオフェクションステップは、免疫細胞を用いた本開示のＴ細胞増大組成物との接触を実施し得る。
【０２４９】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、リン；オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、およびオレイン酸のうちの１つ以上；ステロール；ならびにアルカンを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる。
【０２５０】
本開示の改変されたＴ細胞を産生する方法のある特定の実施形態において、増大補充物質は、１つ以上のサイトカインを含む。１つ以上のサイトカインは、リンホカインを含むが、これに限定されない、任意のサイトカインを含み得る。例示的なリンポカインには、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびインターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）が含まれるが、これらに限定されない。１つ以上のサイトカインは、ＩＬ−２を含み得る。
【０２５１】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および増大補充物質を含む。本方法のある特定の実施形態において、Ｔ細胞拡大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、ジイソプロピルアジペート（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロール、およびアルカンのうちの１つ以上をさらに含む。本方法のある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、およびステロールのうちの１つ以上をさらに含む。本方法のある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、エンドポイントを含む０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、およびエンドポイントを含む約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールのうちの１つ以上をさらに含む。本方法のある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロールのうちの１つ以上をさらに含む。本方法のある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、エンドポイントを含む６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、エンドポイントを含む０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、エンドポイントを含む０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、エンドポイントを含む０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、およびエンドポイントを含む０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールのうちの１つ以上をさらに含む。本方法のある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つ以上をさらに含む。
【０２５２】
ある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および複数の増大された改変されたＴ細胞を産生するための増大補充物質のうちの１つ以上を含み、複数の改変されたＴ細胞のうちの少なくとも２％は、初期記憶Ｔ細胞、幹細胞様Ｔ細胞、幹記憶Ｔ細胞（ＴSCM）および／または中央記憶Ｔ細胞（ＴCM）のうちの１つ以上の細胞表面マーカーを発現する。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、ニコチンアミド、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）、ジイソプロピルアジペート（ＤＩＰＡ）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、ステアリン酸ヒドラジド、オレアミド、ステロール、およびアルカンのうちの１つ以上を含むか、またはそれらをさらに含む。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、およびステロール（例えばコレステロール）のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、エンドポイントを含む０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、およびエンドポイントを含む約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、約９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）のうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）を含む。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、エンドポイントを含む６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、エンドポイントを含む０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、エンドポイントを含む０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、エンドポイントを含む０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、およびエンドポイントを含む０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールのうちの１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つ以上を含む。ある特定の実施形態において、Ｔ細胞増大組成物は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールを含む。
【０２５３】
本明細書で使用される場合、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および増大補充物質のうちの１つ以上を含む、３７°Ｃでの培地と互換的に使用することができる。あるいは、または加えて、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、リン、オクタン酸脂肪酸、パルミチン酸脂肪酸、リノール酸脂肪酸、およびオレイン酸を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、培地は、例えば、イスコーブの改変ダルベッコ培地（（ＩＭＤＭ）；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃでカタログ番号１２４４００５３として入手可能）に見られ得るよりも１０倍高い量のリンを含む。
【０２５４】
本明細書で使用される場合、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコーブのＭＤＭ、および増大補充物質のうちの１つ以上を含む、３７°Ｃでの培地と互換的に使用することができる。あるいは、または加えて、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下の要素：ホウ素、ナトリウム、マグネシウム、リン、カリウム、およびカルシウムのうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、対応する平均濃度で存在する以下の要素：３．７ｍｇ／Ｌのホウ素、３０００ｍｇ／Ｌのナトリウム、１８ｍｇ／Ｌのマグネシウム、２９ｍｇ／Ｌのリン、１５ｍｇ／Ｌのカリウム、および４ｍｇ／Ｌのカルシウムのうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。
【０２５５】
本明細書で使用される場合、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および増大補充物質のうちの１つ以上を含む、３７°Ｃでの培地と互換的に使用することができる。あるいは、または加えて、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下の成分：オクタン酸（ＣＡＳ番号１２４−０７−２）、ニコチンアミド（ＣＡＳ番号９８−９２−０）、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）（ＣＡＳ番号１２６−８６−３）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）（ＣＡＳ番号６９３８−９４−９）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド（ＣＡＳ番号３６２２−８４−２）、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル（ＣＡＳ番号８４−６９−５）、パルミチン酸（ＣＡＳ番号５７−１０−３）、リノール酸（ＣＡＳ番号６０−３３−３）、オレイン酸（ＣＡＳ番号１１２−８０−１）、ステアリン酸ヒドラジド（ＣＡＳ番号４１３０−５４−５）、オレアミド（ＣＡＳ番号３３２２−６２−１）、ステロール（例えば、コレステロール）（ＣＡＳ番号５７−８８−５）、およびアルカン（例えば、ノナデカン）（ＣＡＳ番号６２９−９２−５）のうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下の成分：オクタン酸（ＣＡＳ番号１２４−０７−２）、ニコチンアミド（ＣＡＳ番号９８−９２−０）、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）（ＣＡＳ番号１２６−８６−３）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）（ＣＡＳ番号６９３８−９４−９）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド（ＣＡＳ番号３６２２−８４−２）、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル（ＣＡＳ番号８４−６９−５）、パルミチン酸（ＣＡＳ番号５７−１０−３）、リノール酸（ＣＡＳ番号６０−３３−３）、オレイン酸（ＣＡＳ番号１１２−８０−１）、ステアリン酸ヒドラジド（ＣＡＳ番号４１３０−５４−５）、オレアミド（ＣＡＳ番号３３２２−６２−１）、ステロール（例えば、コレステロール）（ＣＡＳ番号５７−８８−５）、アルカン（例えば、ノナデカン）（ＣＡＳ番号６２９−９２−５）、およびフェノールレッド（ＣＡＳ番号１４３−７４−８）のうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下の成分：オクタン酸（ＣＡＳ番号１２４−０７−２）、ニコチンアミド（ＣＡＳ番号９８−９２−０）、２，４，７，９−テトラメチル−５−デシン−４，７−ジオール（ＴＭＤＤ）（ＣＡＳ番号１２６−８６−３）、アジピン酸ジイソプロピル（ＤＩＰＡ）（ＣＡＳ番号６９３８−９４−９）、ｎ−ブチル−ベンゼンスルホンアミド（ＣＡＳ番号３６２２−８４−２）、１，２−ベンゼンジカルボン酸、ビス（２−メチルプロピル）エステル（ＣＡＳ番号８４−６９���５）、パルミチン酸（ＣＡＳ番号５７−１０−３）、リノール酸（ＣＡＳ番号６０−３３−３）、オレイン酸（ＣＡＳ番号１１２−８０−１）、ステアリン酸ヒドラジド（ＣＡＳ番号４１３０−５４−５）、オレアミド（ＣＡＳ番号３３２２−６２−１）、フェノールレッド（ＣＡＳ番号１４３−７４−８）、およびラノリンアルコールのうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。
【０２５６】
ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および増大補充物質のうちの１つ以上を含む、３７°Ｃでの培地と互換的に使用することができる。あるいは、または加えて、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下のイオン：ナトリウム、アンモニウム、カリウム、マグネシウム、カルシウム、塩化物、硫酸塩、およびリン酸塩のうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。
【０２５７】
本明細書で使用される場合、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、および増大補充物質のうちの１つ以上を含む、３７°Ｃでの培地と互換的に使用することができる。あるいは、または加えて、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、以下の遊離アミノ酸：ヒスチジン、アスパラギン、セリン、グルタミン酸塩、アルギニン、グリシン、アスパラギン酸、グルタミン酸、トレオニン、アラニン、プロリン、システイン、リシン、チロシン、メチオニン、バリン、イソロイシン、ロイシン、フェニルアラニン、およびトリプトファンのうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、対応する平均モルパーセントで以下の遊離アミノ酸：ヒスチジン（約１％）、アスパラギン（約０．５％）、セリン（約１．５％）、グルタミン（約６７％）、アルギニン（約１．５％）、グリシン（約１．５％）、アスパラギン酸（約１％）、グルタミン酸（約２％）、スレオニン（約２％）、アラニン（約１％）、プロリン（約１．５％）、システイン（約１．５％）、リシン（約３％）、チロシン（約１．５％）、メチオニン（約１％）、バリン（約３．５％）、イソロイシン（約３％）、ロイシン（約３．５％）、フェニルアラニン（約１．５％）、およびトリプトファン（約０．５％）のうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、対応する平均モルパーセントで以下の遊離アミノ酸：ヒスチジン（約０．７８％）、アスパラギン（約０．４％）、セリン（約１．６％）、グルタミン（約６７．０１％）、アルギニン（約１．６７％）、グリシン（約１．７２％）、アスパラギン酸（約１．００％）、グルタミン酸（約１．９３％）、スレオニン（約２．３８％）、アラニン（約１．１１％）、プロリン（約１．４９％）、システイン（約１．６５％）、リシン（約２．８４％）、チロシン（約１．６２％）、メチオニン（約０．８５％）、バリン（約３．４５％）、イソロイシン（約３．１４％）、ロイシン（約３．３％）、フェニルアラニン（約１．６４％）、およびトリプトファン（約０．３７％）のうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。
【０２５８】
本明細書で使用される場合、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、ヒト血清アルブミン、組換えヒトインスリン、ヒトトランスフェリン、２−メルカプトエタノール、イスコーブのＭＤＭ、および増大補充物質のうちの１つ以上を含む、３７°Ｃでの培地と互換的に使用することができる。あるいは、または加えて、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、リン、オクタン酸脂肪酸、パルミチン酸脂肪酸、リノール酸脂肪酸、およびオレイン酸を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、培地は、例えば、イスコーブの改変ダルベッコ培地（（ＩＭＤＭ）；ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃでカタログ番号１２４４００５３として入手可能）に見られ得るよりも１０倍高い量のリンを含む。
【０２５９】
ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、オクタン酸、パルミチン酸、リノール酸、オレイン酸、およびステロール（例えばコレステロール）のうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、エンドポイントを含む０．９ｍｇ／ｋｇ〜９０ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、エンドポイントを含む０．２ｍｇ／ｋｇ〜２０ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、およびエンドポイントを含む約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）のうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、約９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）のうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）のうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、９．１９ｍｇ／ｋｇの濃度のオクタン酸、１．８６ｍｇ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、２．１２ｍｇ／ｋｇの濃度のリノール酸、約２．１３ｍｇ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および１．０１ｍｇ／ｋｇの濃度のステロール（ｍｇ／ｋｇ＝百万分率）のうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、エンドポイントを含む６．４μｍｏｌ／ｋｇ〜６４０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、エンドポイントを含む０．７μｍｏｌ／ｋｇ〜７０μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、エンドポイントを含む０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、エンドポイントを含む０．７５μｍｏｌ／ｋｇ〜７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、およびエンドポイントを含む０．２５μｍｏｌ／ｋｇ〜２５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールのうちの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、約６４μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン��、および約２．５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。
【０２６０】
ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、約７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および約２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。ある特定の実施形態において、「補充されたＴ細胞増大組成物」または「Ｔ細胞増大組成物」という用語は、約６３．７５μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオクタン酸、約７．２７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のパルミチン酸、約７．５７μｍｏｌ／ｋｇの濃度のリノール酸、７．５６μｍｏｌ／ｋｇの濃度のオレイン酸、および２．６１μｍｏｌ／ｋｇの濃度のステロールの１つ以上を含む培地と互換的に使用することができる。
【０２６１】
本開示の改変されたＴ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCM、および／またはＴCM）を産生する方法のある特定の実施形態において、本方法は、改変されたＴ細胞およびＰ１３Ｋ−Ａｋｔ−ｍＴＯＲ経路の阻害剤を接触させることを含む。本開示の改変された幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCM、および／またはＴCMを含む本開示の改変されたＴ細胞は、手順の方法の任意のステップにおいて、ＰＩ３Ｋ経路の１つ以上の阻害剤成分を含む成長培地とともに、インキュベートする、培養する、成長させる、保管する、または他のやり法で合わせることができる。ＰＩ３Ｋ経路の例示的な阻害剤成分には、ＴＷＳ１１９（ＧＳＫ  ３Ｂ阻害剤ＸＩＩとしても既知；化学式Ｃ18Ｈ14Ｎ4Ｏ2を有するＣＡＳ番号６０１５１４−１９−６）などのＧＳＫ３βの阻害剤が含まれるが、これに限定されない。ＰＩ３Ｋ経路の例示的な阻害剤成分には、ｂｂ００７（ＢＬＵＥＢＩＲＤＢＩＯ（商標））が含まれるが、これに限定されない。ＰＩ３Ｋ経路のさらなる例示的な阻害剤成分には、アロステリックＡｋｔ阻害剤ＶＩＩＩ（化合物番号１０１９６４９９を有するＡｋｔｉ−１／２とも称される）、ＡＴＰ競合阻害剤（タンパク質キナーゼＢ（Ａｋｔ）のＡＴＰ結合ポケットを標的とするオルソステリック阻害剤）、イソキノリン−５−スルホンアミド（Ｈ−８、Ｈ−８９、およびＮＬ−７１−１０１）、アゼパン誘導体（（−）−バラノールに由来する一連の構造）、アミノフラザン（ＧＳＫ６９０６９３）、複素環（７−アザインドール、６−フェニルプリン誘導体、ピロロ［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体、ＣＣＴ１２８９３０、３−アミノピロリジン、アニリノトリアゾール誘導体、スピロインドリン誘導体、ＡＺＤ５３６３、イパタセルチブ（ＧＤＣ−００６８、ＲＧ７４４０）、Ａ−６７４５６３、およびＡ−４４３６５４）、フェニルピラゾール誘導体（ＡＴ７８６７およびＡＴ１３１４８）、チオフェンカルボキサミド誘導体（アフレセルチブ（ＧＳＫ２１１０１８３）、２−ピリミジル−５−アミドチオフェン誘導体（ＤＣ１２０）、アプロセルチブ（ＧＳＫ２１４１７９５））、アロステリック阻害剤（より高い特異性、減少した副作用、およびより少ない毒性を提供するオルソステリック阻害剤より優れている）、２，３−ジフェニルキノキサリン類似体（２，３−ジフェニルキノキサリン誘導体、トリアゾロ［３，４−ｆ］［１，６］ナフチリジン−３（２Ｈ）−オン誘導体（ＭＫ−２２０６））、アルキルリン脂質（エデルホシン（１−Ｏ−オクタデシル−２−Ｏ−メチル−ｒａｃ−グリセロ−３−ホスホコリン、ＥＴ−１８−ＯＣＨ3）イルモフォシン（ＢＭ４１．４４０）、ミルテフォシン（ヘキサデシルホスホコリン、ＨｅＰＣ）、ペリフォシン（Ｄ−２１２６６）、エルシルホスホコリン（ＥｒＰＣ）、エルフォシン（ＥｒＰＣ３、エルシルホスホホモコリン）、インドール−３−カルビノール類似体（インドール−３−カルビノール、３−クロロアセチルインドール、ジインドリルメタン、ジエチル６−メトキシ−５，７−ジヒドロインドロ［２，３−ｂ］カルバゾール−２，１０−ジカルボキシレート（ＳＲ１３６６８）、ＯＳＵ−Ａ９）、スルホンアミド誘導体（ＰＨ−３１６およびＰＨＴ−４２７）、チオ尿素誘導体（ＰＩＴ−１、ＰＩＴ−２、ＤＭ−ＰＩＴ−１、Ｎ−［（１−メチル−１Ｈ−ピラゾール−４−イル）カルボニル］−Ｎ’−（３−ブロモフェニル）−チオ尿素）、プリン誘導体（トリシリビン（ＴＣＮ、ＮＳＣ  １５４０２０）、トリシリビン一リン酸活性類似体（ＴＣＮ−Ｐ）、４−アミノ−ピリド［２，３−ｄ］ピリミジン誘導体ＡＰＩ−１，３−フェニル−３Ｈ−イミダゾ［４，５−ｂ］ピリジン誘導体、ＡＲＱ  ０９２）、ＢＡＹ  １１２５９７６、３−メチル−キサンチン、キノリン−４−カルボキサミドおよび２−［４−（シクロヘキサ−１，３−ジエン−１−イル）−１Ｈ−ピラゾール−３−イル］フェノール、３−オキソ−チルカル酸、３α−および３β−アセトキシ−チルカル酸、アセトキシ−チルカル酸、および不可逆的阻害剤（抗生物質、ラクトキノマイシン、フレノリシンＢ、カラファンギン、メデルマイシン、Ｂｏｃ−Ｐｈｅ−ビニルケトン、４−ヒドロキシノネナール（４−ＨＮＥ）、１，６−ナフチリジノン誘導体、およびイミダゾ−１，２−ピリジン誘導体）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６２】
本開示の改変されたＴ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCM、および／またはＴCM）を産生する方法のある特定の実施形態において、本方法は、改変されたＴ細胞およびＴ細胞エフェクター分化を接触させることを含む。Ｔ細胞エフェクター分化の例示的な阻害剤には、ＢＥＴ阻害剤（例えば、ＪＱ１、ヒエノトリアゾロジアゼピン）および／またはＢＥＴファミリーのタンパク質の阻害剤（例えば、ＢＲＤ２、ＢＲＤ３、ＢＲＤ４、およびＢＲＤＴ）が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６３】
本開示の改変されたＴ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCM、および／またはＴCM）を産生する方法のある特定の実施形態において、本方法は、改変されたＴ細胞および核−細胞質アセチル−ＣｏＡを減少させる薬剤を接触させることを含む。核−細胞質アセチル−ＣｏＡを減少させる例示的な薬剤には、２−ヒドロキシクエン酸（２−ＨＣ）ならびにＡｃｓｓ１の発現を増加させる薬剤が含まれるが、これらに限定されない。
【０２６４】
本開示の改変されたＴ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、ＴＳＣＭ、および／またはＴＣＭ）を産生する方法のある特定の実施形態において、本方法は、改変されたＴ細胞、およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む組成物を接触させることを含む。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤を含む組成物は、バルプロ酸、フェニル酪酸ナトリウム（ＮａＰＢ）、またはそれらの組み合わせを含むか、またはそれらからなる。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤を含む組成物は、バルプロ酸を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＨＤＡＣ阻害剤を含む組成物は、フェニル酪酸ナトリウム（ＮａＰＢ）を含むか、またはそれからなる。
【０２６５】
本開示の改変されたＴ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、ＴSCMおよび／またはＴCM）を産生する方法のある特定の実施形態において、活性化補充物質は、１つ以上のサイトカインを含み得る。１つ以上のサイトカインは、リンホカインを含むが、これに限定されない、任意のサイトカインを含み得る。例示的なリンポカインには、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−４（ＩＬ−４）、インターロイキン−５（ＩＬ−５）、インターロイキン−６（ＩＬ−６）、インターロイキン−７（ＩＬ−７）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、インターロイキン−２１（ＩＬ−２１）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、およびインターフェロンガンマ（ＩＮＦγ）が含まれるが、これらに限定されない。１つ以上のサイトカインは、ＩＬ−２を含み得る。
【０２６６】
本開示の改変されたＴ細胞（例えば、幹細胞様Ｔ細胞、Ｔ  SCMおよび／またはＴ  CM）を産生する方法のある特定の実施形態において、活性化補充物質は、１つ以上の活性化因子複合体を含み得る。例示的で非限定的な活性化因子複合体は、ＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ２のうちの１つ以上に結合する単量体、二量体、三量体、または四量体抗体複合体を含み得る。いくつかの実施形態において、活性化補充物質は、ヒト、ヒト化、または組換えまたはキメラ抗体を含む活性化因子複合体を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、活性化補充物質は、ＣＤ３およびＣＤ２８に結合する活性化因子複合体を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、活性化補充物質は、ＣＤ３、ＣＤ２８、およびＣＤ２に結合する活性化因子複合体を含むか、またはそれからなる。
【０２６７】
ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞
ある特定の実施形態において、本開示の改変された免疫細胞または免疫前駆細胞は、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞である。ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、リンパ系前駆細胞から分化する細胞傷害性リンパ球である。
【０２６８】
本開示の改変されたＮＫ細胞は、改変された造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）または改変されたＨＳＣに由来し得る。
【０２６９】
ある特定の実施形態において、非活性化ＮＫ細胞は、ＣＤ３枯渇白血球アフェレーシス（ＣＤ１４／ＣＤ１９／ＣＤ５６＋細胞を含む）に由来する。
【０２７０】
ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、Ｌｏｎｚａ  ４ＤヌクレオフェクターまたはＢＴＸ  ＥＣＭ  ８３０（５００Ｖ、７００ｕｓｅｃパルス長、０．２ｍｍ電極ギャップ、１パルス）を使用してエレクトロポレーションされる。すべてのＬｏｎｚａ  ４Ｄヌクレオフェクタープログラムは、本開示の方法の範囲内であると企図される。
【０２７１】
ある特定の実施形態において、５ｘ１０Ｅ６細胞は、キュベット内の１００μＬのＰ３緩衝液におけるエレクトロポレーションごとにエレクトロポレーションした。しかしながら、この体積あたりの細胞の比率は、市販の製造方法では拡張可能である。
【０２７２】
ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、追加の細胞株との共培養によって刺激された。ある特定の実施形態において、追加の細胞株は、人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）を含む。ある特定の実施形態において、刺激は、エレクトロポレーション後の１、２、３、４、５、６、または７日目に起こる。ある特定の実施形態において、刺激は、エレクトロポレーション後の２日目に起こる。
【０２７３】
ある特定の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＣＤ５６を発現する。
【０２７４】
Ｂ細胞
ある特定の実施形態において、本開示の改変された免疫細胞または免疫前駆細胞は、Ｂ細胞である。Ｂ細胞は、細胞表面上にＢ細胞受容体を発現するリンパ球の一種である。Ｂ細胞受容体は、特異性抗原に結合する。
【０２７５】
本開示の改変されたＢ細胞は、改変された造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）または改変されたＨＳＣに由来し得る。
【０２７６】
ある特定の実施形態において、ＨＳＰＣは、本開示の方法を使用して改変され、次いで、ヒトＩＬ−３、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、およびＧ−ＣＳＦの存在下で、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、少なくとも６日間、または少なくとも７日間、Ｂ細胞分化のためにプライミングされる。ある特定の実施形態において、ＨＳＰＣは、本開示の方法を使用して改変され、次いで、ヒトＩＬ−３、Ｆｌｔ３Ｌ、ＴＰＯ、ＳＣＦ、およびＧ−ＣＳＦの存在下で、５日間、Ｂ細胞分化のためにプライミングされる。
【０２７７】
ある特定の実施形態において、プライミング後、改変されたＨＳＰＣ細胞は、フィーダー細胞の層に移され、週に１回、フィーダーの新しい層に移されるとともに、隔週で供給される。ある特定の実施形態において、フィーダー細胞は、ＭＳ−５フィーダー細胞である。
【０２７８】
ある特定の実施形態において、改変されたＨＳＰＣ細胞は、ＭＳ−５フィーダー細胞とともに、少なくとも７、１４、２１、２８、３０、３３、３５、４２、または４８日間培養される。ある特定の実施形態において、改変されたＨＳＰＣ細胞は、ＭＳ−５フィーダー細胞とともに、３３日間培養された。
【０２７９】
誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドがはるかに免疫原性が低いため、既存の誘導性ポリペプチドよりも優れている。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、組換えポリペプチドであり、したがって、非自然発生が、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを産生するために再結合される配列は、宿主ヒト免疫系が「非自己」として認識し得、その結果、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む細胞、または誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む組成物、または誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含む細胞を受け取る対象において免疫応答を誘導する、非ヒト配列を含まない。
【０２８０】
本開示は、リガンド結合領域、リンカー、およびアポトーシス促進性ペプチドを含む誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドであって、その誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを提供する。ある特定の実施形態において、非ヒト配列は、制限部位を含む。ある特定の実施形態において、アポトーシス促進性ペプチドは、カスパーゼポリペプチドである。ある特定の実施形態において、カスパーゼポリペプチドは、カスパーゼ９ポリペプチドである。ある特定の実施形態において、カスパーゼ９ポリペプチドは、短縮型カスパーゼ９ポリペプチドである。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非自然発生であり得る。
【０２８１】
本開示のカスパーゼポリペプチドには、カスパーゼ１、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ４、カスパーゼ５、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、カスパーゼ１０、カスパーゼ１１、カスパーゼ１２、およびカスパーゼ１４が含まれるが、これらに限定されない。本開示のカスパーゼポリペプチドには、カスパーゼ２、カスパーゼ３、カスパーゼ６、カスパーゼ７、カスパーゼ８、カスパーゼ９、およびカスパーゼ１０を含む、アポトーシスに関連するカスパーゼポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本開示のカスパーゼポリペプチドには、カスパーゼ２、カスパーゼ８、カスパーゼ９、およびカスパーゼ１０を含む、アポトーシスを開始するカスパーゼポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。本開示のカスパーゼポリペプチドには、カスパーゼ３、カスパーゼ６、およびカスパーゼ７を含む、アポトーシスを実行するカスパーゼポリペプチドが含まれるが、これらに限定されない。
【０２８２】
本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型アミノ酸または核酸配列と比較して１つ以上の改変を有するアミノ酸または核酸配列によってコードされ得る。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、コドン最適化され得る。本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸および／または核酸配列に対する１つ以上の改変は、野生型アミノ酸または核酸配列と比較して、本開示のカスパーゼポリペプチドの相互作用、架橋、交差活性化、または活性化を増加させ得る。あるいは、または加えて、本開示のカスパーゼポリペプチドのアミノ酸および／または核酸配列に対する１つ以上の改変は、野生型アミノ酸または核酸配列と比較して、本開示のカスパーゼポリペプチドの免疫原性を減少させ得る。
【０２８３】
本開示のカスパーゼポリペプチドは、野生型カスパーゼポリペプチドと比較して短縮され得る。例えば、カスパーゼポリペプチドは、本開示の誘導性カスパーゼポリペプチドを含む細胞においてアポトーシスを開始することに加えて、局所的炎症応答を活性化する可能性を排除または最小限にするために、カスパーゼ活性化および動員ドメイン（ＣＡＲＤ）をコードする配列を排除するように短縮され得る。本開示のカスパーゼポリペプチドをコードする核酸配列は、野生型カスパーゼポリペプチドと比較して、本開示のカスパーゼポリペプチドの変異体アミノ酸配列を形成するようにスプライシングされ得る。本開示のカスパーゼポリペプチドは、組換えおよび／またはキメラ配列によってコードされ得る。本開示の組換えおよび／またはキメラカスパーゼポリペプチドは、１つ以上の異なるカスパーゼポリペプチドからの配列を含み得る。あるいは、または加えて、本開示の組換えおよび／またはキメラカスパーゼポリペプチドは、１つ以上の種からの配列（例えば、ヒト配列および非ヒト配列）を含み得る。本開示のカスパーゼポリペプチドは、非自然発生であり得る。
【０２８４】
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域は、本開示の第１の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの本開示の第２の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドとの二量体化を促進または促進する任意のポリペプチド配列を含み得、その二量体は、アポトーシス促進性ポリペプチドの架橋、および細胞におけるアポトーシスの開始を活性化または誘導する。
【０２８５】
リガンド結合（「二量体化」）領域は、内因性または非自然発生リガンド（すなわち、誘導剤）、例えば、非自然発生合成リガンドを使用する誘導を可能にする、任意のポリペプチドまたはその機能ドメインを含み得る。リガンド結合領域は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの性質およびリガンド（すなわち、誘導剤）の選択に応じて、細胞膜より内側または外側であり得る。受容体を含む多種多様なリガンド結合ポリペプチドおよびその機能ドメインが、既知である。本開示のリガンド結合領域は、受容体からの１つ以上の配列を含み得る。特に興味深いのは、リガンド（例えば、小さな有機リガンド）が既知である、または容易に生成され得る、リガンド結合領域である。これらのリガンド結合領域または受容体には、ＦＫＢＰおよびシクロフィリン受容体、ステロイド受容体、テトラサイクリン受容体など、ならびに、「非自然発生」受容体（抗体、特に、重鎖または軽鎖サブユニット、それらの変異型配列、確率論的手順、コンビナトリアル合成などにより得られたランダムアミノ酸配列から得ることができる）が含まれ得るが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫＢＰリガンド結合領域、シクロフィリン受容体リガンド結合領域、ステロイド受容体リガンド結合領域、シクロフィリン受容体リガンド結合領域、およびテトラサイクリン受容体リガンド結合領域からなる群から選択される。
【０２８６】
１つ以上の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、内因性ドメインまたはその短縮型活性部分のいずれかとして、少なくとも約５０個のアミノ酸、および約３５０個未満のアミノ酸、通常、２００個未満のアミノ酸であり得る。結合領域は、例えば、二量体化のために構成され得る、小さく（ウイルスベクターにおける効率的なトランスフェクションを可能にするために、２５ｋＤａ未満）、単量体で、非免疫原性で、合成的に入手しやすく、細胞透過性で、無毒性のリガンドであり得る。
【０２８７】
１つ以上の受容体ドメインを含むリガンド結合領域は、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの設計、および適切なリガンド（すなわち、誘導剤）の利用可能性に依存して、細胞内または細胞外であり得る。疎水性リガンドについて、結合領域は、膜のどちらの側でもあり得るが、親水性リガンド、特にタンパク質リガンドについて、結合領域は、結合のために利用可能な形態でリガンドを内部移行するための輸送系が存在しない限り、通常、細胞膜の外側である。細胞内受容体について、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、または誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含むトランスポゾンもしくはベクターは、受容体ドメイン配列の５’もしくは３’側にシグナルペプチドおよび膜貫通ドメインをコードし得るか、または受容体ドメイン配列の５’側に脂質付着シグナル配列を有し得る。受容体ドメインがシグナルペプチドと膜貫通ドメインの間にある場合、受容体ドメインは細胞外にある。
【０２８８】
抗体および抗体サブユニット、例えば、重鎖または軽鎖、具体的には断片、より具体的には、その可変領域の全部もしくは一部、または高親和性結合を生じる重鎖と軽鎖の融合体が、本開示のリガンド結合領域として使用することができる。企図される抗体には、免疫応答を引き起こさず、一般的に末梢（すなわち、ＣＮＳ／脳領域の外側）において発現していない、細胞外ドメインなどの異所性に発現したヒト産物であるものが含まれる。そのような例には、低親和性神経成長因子受容体（ＬＮＧＦＲ）、および胚性表面タンパク質（すなわち、癌胎児性抗原）が含まれるが、これらに限定されない。なおさらに、抗体は、生理学的に許容されるハプテン分子に対して調製することができ、その個々の抗体サブユニットを結合親和性についてスクリーニングすることができる。そのサブユニットをコードするｃＤＮＡは、リガンドに対する適切な親和性を有する結合タンパク質ドメインを獲得するように、単離され、定常領域、可変領域の部分の欠失、可変領域の突然変異生成などにより改変され得る。このように、ほとんどいかなる生理学的に許容されるハプテン化合物も、リガンドとして、またはリガンドに対するエピトープを提供するために、用いることができる。抗体ユニットの代わりに、結合領域またはドメインが既知であり、結合のための有用なまたは既知のリガンドが存在する、内因性受容体を用いることができる。
【０２８９】
受容体を多量体化することについて、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域／受容体ドメインに対するリガンドは、リガンドが少なくとも２つの結合部位を有し得、その結合部位の各々がリガンド受容体領域と結合する能力がある（すなわち、第１の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域を結合する能力がある第１の結合部位、および第２の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域を結合する能力がある第２の結合部位を有するリガンドであって、第１の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域および第２の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域が、同一か異なるかのいずれかである）という意味において、多量体であり得る。したがって、本明細書で使用される場合、「多量体リガンド結合領域」という用語は、多量体リガンドに結合する本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのリガンド結合領域を指す。本開示の多量体リガンドには、二量体リガンドが含まれる。本開示の二量体リガンドは、リガンド受容体ドメインと結合する能力がある２つの結合部位を有し得る。ある特定の実施形態において、本開示の多量体リガンドは、合成有機小分子の二量体またはより高い次数のオリゴマー、通常、約四量体以下であり、個々の分子は、典型的には、少なくとも約１５０Ｄａ、約５ｋＤａ未満、通常、約３ｋＤａ未満である。合成リガンドおよび受容体の様々な対を用いることができる。例えば、内因性受容体を含む実施形態において、二量体ＦＫ５０６は、ＦＫＢＰ１２受容体とともに使用することができ、二量体化シクロスポリンＡは、シクロフィリン受容体とともに使用することができ、二量体化エストロゲンはエストロゲン受容体とともに、二量体化グルココルチコイドはグルココルチコイド受容体とともに、二量体化テトラサイクリンはテトラサイクリン受容体とともに、二量体化ビタミンＤはビタミンＤ受容体とともに、など使用することができる。あるいは、より高い次数のリガンド、例えば、三量体を使用することができる。非自然発生受容体、例えば、抗体サブユニット、改変された抗体サブユニット、柔軟なリンカーによって分離された重鎖および軽鎖可変領域からなる一本鎖抗体、または改変された受容体、ならびにそれらの変異配列などを含む実施形態の場合、多種多様な化合物のいずれかを使用することができる。本開示の多量体リガンドを含むユニットの重要な特性は、各結合部位が、受容体を高親和性で結合し得ること、および好ましくは、それらが化学的に二量体化され得ることである。また、それらが、たいていの適用について、血清中に機能的レベルで溶解し、さらに、形質膜を横断して拡散することができるように、リガンドの疎水性／親水性の平衡を保つための方法が利用可能である。
【０２９０】
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの活性化は、例えば、条件的に調節されるタンパク質またはポリペプチドを生じるように、誘導剤により媒介される化学誘導二量体化（ＣＩＤ）を通して、達成され得る。本開示のアポトーシス促進性ポリペプチドは、誘導性であるだけでなく、不安定な二量体化剤の分解または単量体競合阻害剤の投与に起因して、これらのポリペプチドの誘導はまた可逆的でもある。
【０２９１】
ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含む。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む。リガンド結合領域が、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む、ある特定の実施形態において、誘導剤は、合成薬物であるＡＰ１９０３（ＣＡＳインデックス名：２−ピペリジンカルボン酸、１−［（２Ｓ）−１−オキソ−２−（３，４，５−トリメトキシフェニル）ブチル］−、１，２−エタンジイルビス［イミノ（２−オキソ−２，１−エタンジイル）オキシ−３，１−フェニレン［（１Ｒ）−３−（３，４−ジメトキシフェニル）プロピリデン］］エステル、［２Ｓ−［１（Ｒ＊），２Ｒ＊［Ｓ＊［Ｓ＊［１（Ｒ＊），２Ｒ＊］］］］］−（９Ｃｌ）ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−６３−７；分子式：Ｃ７８Ｈ９８Ｎ４Ｏ２０；分子量：１４１１．６５））を含み得る。リガンド結合領域が、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫＢＰ１２ポリペプチドを含む、ある特定の実施形態において、誘導剤は、ＡＰ２０１８７（ＣＡＳ登録番号：１９５５１４−８０−８および分子式：Ｃ８２Ｈ１０７Ｎ５Ｏ２０）を含み得る。ある特定の実施形態において、誘導剤は、ＡＰ２０１８７アナログ、例えば、ＡＰ１５１０などである。本明細書で使用される場合、誘導剤ＡＰ２０１８７、ＡＰ１９０３、およびＡＰ１５１０は、交換可能に使用され得る。
【０２９２】
ＡＰ１９０３  ＡＰＩは、Ａｌｐｈｏｒａ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｃ．によって製造され、ＡＰ１９０３注射用製剤は、Ｆｏｒｍａｔｅｃｈ  Ｉｎｃ．によって製造される。それは、非イオン性可溶化剤Ｓｏｌｕｔｏｌ  ＨＳ  １５（２５０ｍｇ／ｍＬ、ＢＡＳＦ）の２５％溶液中のＡＰ１９０３の５ｍｇ／ｍＬ溶液として製剤化される。室温では、この製剤は、透明の淡黄色の溶液である。冷蔵により、この製剤は、可逆的相転移を起こし、乳濁した溶液を生じる。この相転移は、室温へ再び温めることにより逆転する。充填は、３ｍＬガラスバイアル中に２．３３ｍＬ（バイアルあたり合計で注射用およそ１０ｍｇのＡＰ１９０３）である。ＡＰ１９０３を投与する必要性が決定したら、患者は、例えば、非ＤＥＨＰ、非酸化エチレンで滅菌された注入セットを使用して、ＩＶ注入により２時間にわたって、注射用の単一固定用量のＡＰ１９０３（０．４ｍｇ／ｋｇ）を投与され得る。ＡＰ１９０３の用量は、すべての患者について個々に計算され、体重が≧１０％、変動しない限り、再計算されない。計算された用量は、注入前に０．９％生理食塩水中の１００ｍＬに希釈される。ＡＰ１９０３の以前の第Ｉ相試験において、２４人の健常なボランティアが、２時間にわたってＩＶ注入される０．０１ｍｇ／ｋｇ、０．０５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、および１．０ｍｇ／ｋｇの用量レベルでの注射用単一用量のＡＰ１９０３で治療された。ＡＰ１９０３の血漿中レベルは、用量に正比例し、平均Ｃｍａｘ値は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇの用量範囲に対しておよそ１０〜１２７５ｎｇ／ｍＬであった。最初の注入時間後、血中濃度は、迅速な分布相を示し、血漿中レベルは、投与後０．５時間、２時間、および１０時間において、それぞれ、最大濃度のおよそ１８％、７％、および１％まで低下した。注射用ＡＰ１９０３は、すべての用量レベルにおいて安全で、かつ耐容性が良いことが示され、有利な薬物動態学的プロファイルが実証された。Ｉｕｌｉｕｃｃｉ  Ｊ  Ｄ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．４１：８７０−９，２００１。
【０２９３】
例えば、使用される注射用のＡＰ１９０３の固定用量は、２時間にわたって静脈内注入される０．４ｍｇ／ｋｇであり得る。細胞の効果的なシグナル伝達のためにインビトロで必要とされるＡＰ１９０３の量は、１０〜１００ｎＭ（１６００Ｄａ  ＭＷ）である。これは、１６〜１６０μｇ／Ｌまたは約０．０１６〜１．６μｇ／ｋｇ（１．６〜１６０μｇ／ｋｇ）に等しい。１ｍｇ／ｋｇまでの用量は、上記のＡＰ１９０３の第Ｉ相試験において耐容性が良かった。したがって、０．４ｍｇ／ｋｇは、治療用細胞と組み合わせてのこの第Ｉ相試験について、ＡＰ１９０３の安全かつ有効な用量であり得る。
【０２９４】
本開示のリガンド結合をコードするアミノ酸および／または核酸配列は、野生型アミノ酸または核酸配列と比較して、１つ以上の改変の配列を含有し得る。例えば、本開示のリガンド結合領域をコードするアミノ酸および／または核酸配列は、コドン最適化配列であり得る。１つ以上の改変は、野生型ポリペプチドと比較して、本開示のリガンド結合領域に対するリガンド（例えば誘導剤）の結合親和性を増加させ得る。あるいは、または加えて、１つ以上の改変は、野生型ポリペプチドと比較して、本開示のリガンド結合領域の免疫原性を減少させ得る。本開示のリガンド結合領域および／または本開示の誘導剤は、非自然発生であり得る。
【０２９５】
本開示の改変された細胞、トランスポゾン、および／またはベクターは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）アポトーシス促進性ポリペプチドと、を含む誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含み得、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。ある特定の実施形態において、非ヒト配列は、制限部位を含む。ある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、多量体リガンド結合領域であり得る。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、「ｉＣ９安全スイッチ」とも称され得る。ある特定の実施形態において、本開示の改変された細胞および／またはトランスポゾンは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）カスパーゼポリペプチドと、を含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含み得、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。ある特定の実施形態において、本開示の改変された細胞および／またはトランスポゾンは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）カスパーゼポリペプチドと、を含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含み得、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。ある特定の実施形態において、本開示のトランスポゾンは、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）短縮型カスパーゼ９ポリペプチドと、を含む誘導性カスパーゼポリペプチドを含み得、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、または短縮型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態において、リガンド結合領域は、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含み得る。ある特定の実施形態において、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含むリガンド結合領域のアミノ酸配列は、配列の３６位に改変を含み得る。改変は、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）であり得る。
【０２９６】
ある特定の実施形態において、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥ（配列番号１４６３５）を含むアミノ酸配列によってコードされる。
【０２９７】
ある特定の実施形態において、ＦＫＢＰ１２ポリペプチドは、ＧＧＧＧＴＣＣＡＧＧＴＣＧＡＧＡＣＴＡＴＴＴＣＡＣＣＡＧＧＧＧＡＴＧＧＧＣＧＡＡＣＡＴＴＴＣＣＡＡＡＡＡＧＧＧＧＣＣＡＧＡＣＴＴＧＣＧＴＣＧＴＧＣＡＴＴＡＣＡＣＣＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＧＡＡＧＡＡＡＧＴＧＧＡＣＡＧＣＴＣＣＡＧＧＧＡＴＣＧＣＡＡＣＡＡＧＣＣＣＴＴＣＡＡＧＴＴＣＡＴＧＣＴＧＧＧＡＡＡＧＣＡＧＧＡＡＧＴＧＡＴＣＣＧＡＧＧＡＴＧＧＧＡＧＧＡＡＧＧＣＧＴＧＧＣＡＣＡＧＡＴＧＴＣＡＧＴＣＧＧＣＣＡＧＣＧＧＧＣＣＡＡＡＣＴＧＡＣＣＡＴＴＡＧＣＣＣＴＧＡＣＴＡＣＧＣＴＴＡＴＧＧＡＧＣＡＡＣＡＧＧＣＣＡＣＣＣＡＧＧＧＡＴＣＡＴＴＣＣＣＣＣＴＣＡＴＧＣＣＡＣＣＣＴＧＧＴＣＴＴＣＧＡＴ  ＧＴＧＧＡＡＣＴＧＣＴＧＡＡＧＣＴＧＧＡＧ（配列番号１４６３６）を含む核酸配列によってコードされる。ある特定の実施形態において、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）を有するＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含み得るリガンド結合領域に特異的な誘導剤は、ＡＰ２０１８７および／またはＡＰ１９０３を含み、それらはどちらも合成薬物である。
【０２９８】
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、または短縮型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態において、リンカー領域は、ＧＧＧＧＳ（配列番号１４６３７）を含むアミノ酸またはＧＧＡＧＧＡＧＧＡＧＧＡＴＣＣ（配列番号１４６３８）を含む核酸配列によってコードされる。ある特定の実施形態において、リンカーをコードする核酸配列は、制限部位を含まない。
【０２９９】
本開示の短縮型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態において、短縮型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列の８７位においてアルギニン（Ｒ）を含まないアミノ酸配列によってコードされる。あるいは、または加えて、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、または短縮型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態において、短縮型カスパーゼ９ポリペプチドは、配列の２８２位においてアラニン（Ａ）を含まないアミノ酸配列によってコードされる。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチド、誘導性カスパーゼポリペプチド、または短縮型カスパーゼ９ポリペプチドのある特定の実施形態において、短縮型カスパーゼ９ポリペプチドは、ＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号１４６３９）を含むアミノ酸配列、またはＴＴＴＧＧＧＧＡＣＧＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＧＧＡＧＴＣＴＣＴＧＣＧＡＧＧＡＡＡＴＧＣＣＧＡＴＣＴＧＧＣＴＴＡＣＡＴＣＣＴＧＡＧＣＡＴＧＧＡＡＣＣＣＴＧＣＧＧＣＣＡＣＴＧＴＣＴＧＡＴＣＡＴＴＡＡＣＡＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＣＴＧＣＡＧＡＧＡＡＡＧＣＧＧＡＣＴＧＣＧＡＡＣＡＣＧＧＡＣＴＧＧＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＧＡＣＴＧＴＧＡＧＡＡＧＣＴＧＣＧＧＡＧＡＡＧＧＴＴＣＴＣＴＡＧＴＣＴＧＣＡＣＴＴＴＡＴＧＧＴＣＧＡＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＧＡＴＣＴＧＡＣＣＧＣＣＡＡＧＡＡＡＡＴＧＧＴＧＣＴＧＧＣＣＣＴＧＣＴＧＧＡＧＣＴＧＧＣＴＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＡＧＣＴＣＴＧＧＡＴＴＧＣＴＧＣＧＴＧＧＴＣＧＴＧＡＴＣＣＴＧＴＣＣＣＡＣＧＧＧＴＧＣＣＡＧＧＣＴＴＣＴＣＡＴＣＴＧＣＡＧＴＴＣＣＣＣＧＧＡＧＣＡＧＴＧＴＡＣＧＧＡＡＣＡＧＡＣＧＧＣＴＧＴＣＣＴＧＴＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＡＡＧＡＴＣＧＴＣＡＡＣＡＴＣＴＴＣＡＡＣＧＧＣＡＣＴＴＣＴＴＧＣＣＣＴＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＧＡＡＡＧＣＣＡＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＴＣＣＡＧＧＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＧＡＡＣＡＧＡＡＡＧＡＴＣＡＣＧＧＣＴＴＣＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＧＣＡＣＣＡＧＣＣＣＴＧＡＧＧＡＣＧＡＡＴＣＡＣＣＡＧＧＧＡＧＣＡＡＣＣＣＴＧＡＡＣＣＡＧＡＴＧＣＡＡＣＴＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＡＧＧＧＡＣＴＧＡＧＧＡＣＣＴＴＴＧＡＣＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＣＴＡＴＣＴＣＡＡＧＣＣＴＧＣＣＣＡＣＴＣＣＴＡＧＴＧＡＣＡＴＴＴＴＣＧＴＧＴＣＴＴＡＣＡＧＴＡＣＣＴＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＴＧＴＣＴＣＡＴＧＧＣＧＣＧＡＴＣＣＣＡＡＧＴＣＡＧＧＧＡＧＣＴＧＧＴＡＣＧＴＧＧＡＧＡＣＡＣＴＧＧＡＣＧＡＣＡＴＣＴＴＴＧＡＡＣＡＧＴＧＧＧＣＣＣＡＴＴＣＡＧＡＧＧＡＣＣＴＧＣＡＧＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＣＧＡＧＴＧＧＣＡＡＡＣＧＣＴＧＴＣＴＣＴＧＴＧＡＡＧＧＧＣＡＴＣＴＡＣＡＡＡＣＡＧＡＴＧＣＣＣＧＧＧＴＧＣＴＴＣＡＡＴＴＴＴＣＴＧＡＧＡＡＡＧＡＡＡＣＴＧＴＴＣＴＴＴＡＡＧＡＣＴＴＣＣ（配列番号１４６４０）を含む核酸配列によってコードされる。
【０３００】
短縮型カスパーゼ９ポリペプチドを含む、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドのある特定の実施形態において、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、ＧＶＱＶＥＴＩＳＰＧＤＧＲＴＦＰＫＲＧＱＴＣＶＶＨＹＴＧＭＬＥＤＧＫＫＶＤＳＳＲＤＲＮＫＰＦＫＦＭＬＧＫＱＥＶＩＲＧＷＥＥＧＶＡＱＭＳＶＧＱＲＡＫＬＴＩＳＰＤＹＡＹＧＡＴＧＨＰＧＩＩＰＰＨＡＴＬＶＦＤＶＥＬＬＫＬＥＧＧＧＧＳＧＦＧＤＶＧＡＬＥＳＬＲＧＮＡＤＬＡＹＩＬＳＭＥＰＣＧＨＣＬＩＩＮＮＶＮＦＣＲＥＳＧＬＲＴＲＴＧＳＮＩＤＣＥＫＬＲＲＲＦＳＳＬＨＦＭＶＥＶＫＧＤＬＴＡＫＫＭＶＬＡＬＬＥＬＡＱＱＤＨＧＡＬＤＣＣＶＶＶＩＬＳＨＧＣＱＡＳＨＬＱＦＰＧＡＶＹＧＴＤＧＣＰＶＳＶＥＫＩＶＮＩＦＮＧＴＳＣＰＳＬＧＧＫＰＫＬＦＦＩＱＡＣＧＧＥＱＫＤＨＧＦＥＶＡＳＴＳＰＥＤＥＳＰＧＳＮＰＥＰＤＡＴＰＦＱＥＧＬＲＴＦＤＱＬＤＡＩＳＳＬＰＴＰＳＤＩＦＶＳＹＳＴＦＰＧＦＶＳＷＲＤＰＫＳＧＳＷＹＶＥＴＬＤＤＩＦＥＱＷＡＨＳＥＤＬＱＳＬＬＬＲＶＡＮＡＶＳＶＫＧＩＹＫＱＭＰＧＣＦＮＦＬＲＫＫＬＦＦＫＴＳ（配列番号１４６４１）を含むアミノ酸配列、またはｇｇｇｇｔｃｃａｇｇｔｃｇａｇａｃｔａｔｔｔｃａｃｃａｇｇｇｇａｔｇｇｇｃｇａａｃａｔｔｔｃｃａａａａａｇｇｇｇｃｃａｇａｃｔｔｇｃｇｔｃｇｔｇｃａｔｔａｃａｃｃｇｇｇａｔｇｃｔｇｇａｇｇａｃｇｇｇａａｇａａａｇｔｇｇａｃａｇｃｔｃｃａｇｇｇａｔｃｇｃａａｃａａｇｃｃｃｔｔｃａａｇｔｔｃａｔｇｃｔｇｇｇａａａｇｃａｇｇａａｇｔｇａｔｃｃｇａｇｇａｔｇｇｇａｇｇａａｇｇｃｇｔｇｇｃａｃａｇａｔｇｔｃａｇｔｃｇｇｃｃａｇｃｇｇｇｃｃａａａｃｔｇａｃｃａｔｔａｇｃｃｃｔｇａｃｔａｃｇｃｔｔａｔｇｇａｇｃａａｃａｇｇｃｃａｃｃｃａｇｇｇａｔｃａｔｔｃｃｃｃｃｔｃａｔｇｃｃａｃｃｃｔｇｇｔｃｔｔｃｇａｔｇｔｇｇａａｃｔｇｃｔｇａａｇｃｔｇｇａｇｇｇａｇｇａｇｇａｇｇａｔｃｃｇｇａｔｔｔｇｇｇｇａｃｇｔｇｇｇｇｇｃｃｃｔｇｇａｇｔｃｔｃｔｇｃｇａｇｇａａａｔｇｃｃｇａｔｃｔｇｇｃｔｔａｃａｔｃｃｔｇａｇｃａｔｇｇａａｃｃｃｔｇｃｇｇｃｃａｃｔｇｔｃｔｇａｔｃａｔｔａａｃａａｔｇｔｇａａｃｔｔｃｔｇｃａｇａｇａａａｇｃｇｇａｃｔｇｃｇａａｃａｃｇｇａｃｔｇｇｃｔｃｃａａｔａｔｔｇａｃｔｇｔｇａｇａａｇｃｔｇｃｇｇａｇａａｇｇｔｔｃｔｃｔａｇｔｃｔｇｃａｃｔｔｔａｔｇｇｔｃｇａａｇｔｇａａａｇｇｇｇａｔｃｔｇａｃｃｇｃｃａａｇａａａａｔｇｇｔｇｃｔｇｇｃｃｃｔｇｃｔｇｇａｇｃｔｇｇｃｔｃａｇｃａｇｇａｃｃａｔｇｇａｇｃｔｃｔｇｇａｔｔｇｃｔｇｃｇｔｇｇｔｃｇｔｇａｔｃｃｔｇｔｃｃｃａｃｇｇｇｔｇｃｃａｇｇｃｔｔｃｔｃａｔｃｔｇｃａｇｔｔｃｃｃｃｇｇａｇｃａｇｔｇｔａｃｇｇａａｃａｇａｃｇｇｃｔｇｔｃｃｔｇｔｃａｇｃｇｔｇｇａｇａａｇａｔｃｇｔｃａａｃａｔｃｔｔｃａａｃｇｇｃａｃｔｔｃｔｔｇｃｃｃｔａｇｔｃｔｇｇｇｇｇｇａａａｇｃｃａａａａｃｔｇｔｔｃｔｔｔａｔｃｃａｇｇｃｃｔｇｔｇｇｃｇｇｇｇａａｃａｇａａａｇａｔｃａｃｇｇｃｔｔｃｇａｇｇｔｇｇｃｃａｇｃａｃｃａｇｃｃｃｔｇａｇｇａｃｇａａｔｃａｃｃａｇｇｇａｇｃａａｃｃｃｔｇａａｃｃａｇａｔｇｃａａｃｔｃｃａｔｔｃｃａｇｇａｇｇｇａｃｔｇａｇｇａｃｃｔｔｔｇａｃｃａｇｃｔｇｇａｔｇｃｔａｔｃｔｃａａｇｃｃｔｇｃｃｃａｃｔｃｃｔａｇｔｇａｃａｔｔｔｔｃｇｔｇｔｃｔｔａｃａｇｔａｃｃｔｔｃｃｃａｇｇｃｔｔｔｇｔｃｔｃａｔｇｇｃｇｃｇａｔｃｃｃａａｇｔｃａｇｇｇａｇｃｔｇｇｔａｃｇｔｇｇａｇａｃａｃｔｇｇａｃｇａｃａｔｃｔｔｔｇａａｃａｇｔｇｇｇｃｃｃａｔｔｃａｇａｇｇａｃｃｔｇｃａｇａｇｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｇａｇｔｇｇｃａａａｃｇｃｔｇｔｃｔｃｔｇｔｇａａｇｇｇｃａｔｃｔａｃａａａｃａｇａｔｇｃｃｃｇｇｇｔｇｃｔｔｃａａｔｔｔｔｃｔｇａｇａａａｇａａａｃｔｇｔｔｃｔｔｔａａｇａｃｔｔｃｃ（配列番号１４６４２）を含む核酸配列によってコードされる。
【０３０１】
本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、細胞において、その細胞における本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を開始および／または制御する能力がある任意のプロモーターの転写制御下で、発現し得る。本明細書で使用される場合、「プロモーター」という用語は、遺伝子を転写するＲＮＡポリメラーゼのための最初の結合部位として働くプロモーターを指す。例えば、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、哺乳動物細胞において、哺乳動物細胞における本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を開始および／または制御する能力がある任意のプロモーターの転写制御下で、発現し得、そのプロモーターには、天然プロモーター、内因性プロモーター、外因性プロモーター、および異種プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。好ましい哺乳動物細胞には、ヒト細胞が含まれる。したがって、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、ヒト細胞において、ヒト細胞における本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を開始および／または制御する能力がある任意のプロモーターの転写制御下で、発現し得、そのプロモーターには、ヒトプロモーターまたはウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。ヒト細胞における発現のための例示的なプロモーターには、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期遺伝子プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、Ｒｏｕｓ肉腫ウイルス長末端反復、β−アクチンプロモーター、ラットインスリンプロモーター、およびグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼプロモーターが含まれるが、これらに限定されず、それらの各々は、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの高レベルの発現を得るために使用され得る。本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの発現を達成するための、当該技術分野において周知である他のウイルスまたは哺乳動物細胞または細菌ファージのプロモーターの使用が、発現レベルが細胞においてアポトーシスを開始するのに十分であるとの条件で、同様に企図される。周知の性質を持つプロモーターを用いることにより、トランスフェクションまたは形質転換後の目的のタンパク質の発現のレベルおよびパターンを最適化することができる。
【０３０２】
特定の生理的シグナルまたは合成シグナルに応答して制御されるプロモーターの選択は、本開示の誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドの誘導性発現を可能にすることができる。エクジソンシステム（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．）は、１つのそのようなシステムである。このシステムは、哺乳類細胞において目的の遺伝子の制御された発現を可能にするように設計される。それは、導入遺伝子の基底レベルの発現が実質的にないが、２００倍を超える誘導能を可能にする厳格に制御された発現機構からなる。そのシステムは、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａのヘテロ二量体エクジソン受容体に基づいており、エクジソンまたはムリステロンＡなどのアナログがその受容体と結合したとき、その受容体は、プロモーターを活性化して、下流の導入遺伝子の発現をオンにし、高レベルのｍＲＮＡ転写物が獲得される。このシステムにおいて、目的の遺伝子の発現を駆動させるエクジソン応答性プロモーターは、別のプラスミド上にあるが、ヘテロ二量体受容体の両方の単量体は、１つのベクターから構成的に発現する。したがって、この型のシステムを目的のベクトルへと操作することは、有用であり得る。有用であり得る別の誘導性システムは、最初、ＧｏｓｓｅｎおよびＢｕｊａｒｄ（Ｇｏｓｓｅｎ  ａｎｄ  Ｂｕｊａｒｄ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：５５４７−５５５１，１９９２、Ｇｏｓｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２６８：１７６６−１７６９，１９９５）によって開発されたＴｅｔ−Ｏｆｆ（商標）またはＴｅｔ−Ｏｎ（商標）システム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ  Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）である。この系もまた、高レベルの遺伝子発現が、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンなどのテトラサイクリン誘導体に応答して制御されることを可能にする。Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）システムにおいて、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの存在下でオンにされるが、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）システムにおいて、遺伝子発現は、ドキシサイクリンの不在下でオンにされる。これらのシステムは、Ｅ．ｃｏｌｉのテトラサイクリン耐性オペロンに由来する２つの調節エレメント：テトラサイクリンオペレーター配列（テトラサイクリンリプレッサーが結合する）およびテトラサイクリンリプレッサータンパク質に基づく。目的の遺伝子は、テトラサイクリン応答性エレメントがプラスミドの中に存在するプロモーターの後ろでプラスミド中にクローニングされる。第２のプラスミドは、テトラサイクリン制御性トランス活性化因子と呼ばれる調節エレメントを含有し、その調節エレメントは、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）システムでは、単純ヘルペスウイルスからのＶＰ１６ドメインおよび野生型テトラサイクリンリプレッサーから構成される。したがって、ドキシサイクリンの不在下で、転写は、構成的にオンになる。Ｔｅｔ−Ｏｎ（商標）システムにおいて、テトラサイクリンリプレッサーは、野生型ではなく、ドキシサイクリンの存在下で、転写を活性化する。遺伝子治療ベクターを作製する場合に、Ｔｅｔ−Ｏｆｆ（商標）システムが使用され得、それにより、産生細胞は、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在下で成長し、潜在的に毒性の導入��伝子の発現を阻止することができるが、そのベクターが患者に導入されるとき、遺伝子発現は、構成的にオンになり得る。
【０３０３】
状況によっては、遺伝子治療ベクターにおける導入遺伝子の発現を調節することが望ましい。例えば、様々な活性の強度を有する異なるウイルスプロモーターが、望まれる発現レベルに依存して利用される。哺乳類細胞において、ＣＭＶ前初期プロモーターが、強力な転写活性化をもたらすために使用されることが多い。ＣＭＶプロモーターは、Ｄｏｎｎｅｌｌｙ，Ｊ．Ｊ．，ｅｔ  ａｌ．，１９９７．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５：６１７−４８に概説されている。導入遺伝子の低い発現レベルが望まれるとき、それほど強力ではない、ＣＭＶプロモーターの改変型もまた、使用されている。造血細胞における導入遺伝子の発現が望まれるとき、ＭＬＶまたはＭＭＴＶからのＬＴＲなどのレトロウイルスプロモーターがしばしば、使用される。所望の効果に依存して使用される他のウイルスプロモーターには、ＳＶ４０、ＲＳＶ  ＬＴＲ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２  ＬＴＲ、Ｅ１Ａ、Ｅ２Ａ、またはＭＬＰ領域からのようなアデノウイルスプロモーター、ＡＡＶ  ＬＴＲ、ＨＳＶ−ＴＫ、ならびにトリ肉腫ウイルスが含まれる。
【０３０４】
他の例において、発生的に調節され、特定の分化細胞において活性であるプロモーターが、選択され得る。したがって、例えば、プロモーターは、多能性幹細胞において不活性であり得るが、例えば、多能性幹細胞がより成熟した細胞へ分化する場合、そのとき、プロモーターは活性化され得る。
【０３０５】
同様に、組織特異的プロモーターは、非標的組織への潜在的毒性または望ましくない効果を低下させるために、特定の組織または細胞において転写をもたらすように使用される。これらのプロモーターは、ＣＭＶプロモーターなどのより強いプロモーターと比較して発現の低下を生じ得るが、より制限された発現および免疫原性もまた生じ得る（Ｂｏｊａｋ，Ａ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ．２０：１９７５−７９、Ｃａｚｅａｕｘ，Ｎ．，ｅｔ  ａｌ．，２００２．Ｖａｃｃｉｎｅ  ２０：３３２２−３１）。例えば、ＰＳＡ関連プロモーターなどの組織特異的プロモーターまたは前立腺特異的腺性カリクレインまたは筋肉クレアチンキナーゼ遺伝子が、必要に応じて使用され得る。
【０３０６】
組織特異的または分化特異的プロモーターの例には、Ｂ２９（Ｂ細胞）、ＣＤ１４（単球性細胞）、ＣＤ４３（白血球および血小板）、ＣＤ４５（造血細胞）、ＣＤ６８（マクロファージ）、デスミン（筋肉）、エラスターゼ−１（膵臓腺房細胞）、エンドグリン（内皮細胞）、フィブロネクチン（分化中の細胞、治癒中の組織）、ならびにＦｌｔ−１（内皮細胞）、ＧＦＡＰ（星状細胞）が含まれるが、これらに限定されない。
【０３０７】
ある特定の適応症において、遺伝子治療ベクターの投与後の特定の時点に転写を活性化することが望ましい。これは、ホルモンまたはサイトカインで調節可能なプロモーターなどのプロモーターを用いて行われる。使用することができるサイトカインおよび炎症性タンパク質応答性プロモーターには、ＫおよびＴキニノーゲン（Ｋａｇｅｙａｍａ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６２，２３４５−２３５１）、ｃ−ｆｏｓ、ＴＮＦ−アルファ、Ｃ反応性タンパク質（Ａｒｃｏｎｅ，ｅｔ  ａｌ．，（１９８８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，１６（８），３１９５−３２０７）、ハプトグロビン（Ｏｌｉｖｉｅｒｏ  ｅｔ  ａｌ．，（１９８７）ＥＭＢＯ  Ｊ．，６，１９０５−１９１２）、血清アミロイドＡ２、Ｃ／ＥＢＰアルファ、ＩＬ−１、ＩＬ−６（Ｐｏｌｉ  ａｎｄ  Ｃｏｒｔｅｓｅ，（１９８９）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ  Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８６，８２０２−８２０６）、補体Ｃ３（Ｗｉｌｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９０）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，６１８１−６１９１）、ＩＬ−８、アルファ−１酸性糖タンパク質（Ｐｒｏｗｓｅ  ａｎｄ  Ｂａｕｍａｎｎ，（１９８８）Ｍｏｌ  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ，８，４２−５１）、アルファ−１アンチトリプシン、リポタンパク質リパーゼ（Ｚｅｃｈｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２３９４−２４０１，１９８８）、アンジオテンシノーゲン（Ｒｏｎ，ｅｔ  ａｌ．，（１９９１）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，２８８７−２８９５）、フィブリノーゲン、ｃ−ｊｕｎ（ホルボールエステル、ＴＮＦ−アルファ、ＵＶ放射、レチノイン酸、および過酸化水素によって誘導可能）、コラゲナーゼ（ホルボールエステルおよびレチノイン酸によって誘導される）、メタロチオネイン（重金属およびグルココルチコイド誘導性）、ストロメライシン（ホルボールエステル、インターロイキン−１、およびＥＧＦによって誘導可能）、アルファ−２マクログロブリンおよびアルファ−１抗キモトリプシンが含まれる。他のプロモーターには、例えば、ＳＶ４０、ＭＭＴＶ、ヒト免疫不全ウイルス（ＭＶ）、モロニーウイルス、ＡＬＶ、エプスタインバーウイルス、ラウス肉腫ウイルス、ヒトアクチン、ミオシン、ヘモグロビン、およびクレアチンが含まれる。
【０３０８】
所望の作用に応じて、上記のプロモーターのいずれかを単独で、または別のプロモーターと組み合わせて有用であり得ることが想定される。プロモーターおよび他の調節エレメントは、それらが所望の細胞または組織において機能的であるように選択される。加えて、このプロモーターのリストは、網羅的または限定的である解釈されるべきではなく、他のプロモーターが、本明細書に開示されるプロモーターおよび方法とともに使用される。
【０３０９】
抗原受容体
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、本開示の改変された自己細胞は、抗原受容体を含む。
【０３１０】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ベクターは、キメラ抗原受容体またはその一部分をコードする配列を含む。本開示の例示的なベクターには、ウイルスベクター、非ウイルスベクター、プラスミド、ナノプラスミド、ミニサークル、転位系、リポソーム、ポリマーソーム、ミセル、およびナノ粒子が含まれるが、これらに限定されない。
【０３１１】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体またはその一部分をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、トランスポゾンは、トランスポザーゼによって自己細胞のゲノム配列に組み込まれる。
【０３１２】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ドナーオリゴヌクレオチドまたはドナープラスミドは、キメラ抗原受容体またはその一部分をコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、ドナーオリゴヌクレオチドまたはドナープラスミドは、一本鎖または二本鎖切断、および任意選択で細胞を媒介した修復の後に、自己細胞の染色体配列に完全にまたは部分的に組み込まれる。
【０３１３】
例示的な抗原受容体には、細胞外ドメインの部位で抗原に結合し、細胞内ドメインを介して細胞内シグナルを伝達または誘導する、非自然発生膜貫通タンパク質が含まれる。
【０３１４】
いくつかの実施形態において、非自然発生抗原受容体には、組換え、変異体、キメラ、または合成のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、変異型ＴＣＲは、野生型ＴＣＲと比較したとき、ＴＣＲをコードするヌクレオチドまたはアミノ酸配列のいずれかにおいて１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、合成ＴＣＲは、ＴＣＲをコードする少なくとも１つの合成または改変された核酸またはアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、組換えおよび／またはキメラＴＣＲは、その全長またはその一部分にわたって、配列が１つ以上のソース配列から単離されるか、またはそれらに由来するため、非自然発生である核酸またはアミノ酸配列によってコードされる。
【０３１５】
いくつかの実施形態において、非自然発生抗原受容体には、キメラ抗原受容体が含まれるが、これに限定されない。
【０３１６】
キメラ抗原受容体
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、本開示の改変された自己細胞は、キメラ抗原受容体を含む。
【０３１７】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、トランスポゾンは、キメラ抗原受容体またはその一部分をコードする配列を含む。
【０３１８】
本開示のキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、（ａ）抗原認識領域を含むエクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインと、を含み得る。ある特定の実施形態において、エクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含み得る。あるいは、または加えて、ある特定の実施形態において、エクトドメインは、抗原認識領域と膜貫通ドメインとの間のヒンジをさらに含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態において、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＧＭ−ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態において、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含み得る。ある特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする配列を含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態において、エンドドメインは、ヒトＣＤ３ζエンドドメインを含み得る。
【０３１９】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態において、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内セグメント、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態において、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ＣＤ２８および／または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態において、ヒンジは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態において、ヒンジは、ヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含み得る。
【０３２０】
ＣＤ２８共刺激ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１４４７７）を含むアミノ酸配列、またはＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１４４７７）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ＣＤ２８共刺激ドメインは、ｃｇｃｇｔｇａａｇｔｔｔａｇｔｃｇａｔｃａｇｃａｇａｔｇｃｃｃｃａｇｃｔｔａｃａａａｃａｇｇｇａｃａｇａａｃｃａｇｃｔｇｔａｔａａｃｇａｇｃｔｇａａｔｃｔｇｇｇｃｃｇｃｃｇａｇａｇｇａａｔａｔｇａｃｇｔｇｃｔｇｇａｔａａｇｃｇｇａｇａｇｇａｃｇｃｇａｃｃｃｃｇａａａｔｇｇｇａｇｇｃａａｇｃｃｃａｇｇｃｇｃａａａａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｔａａｃｇａｇｃｔｇｃａｇａａｇｇａｃａａａａｔｇｇｃａｇａａｇｃｃｔａｔｔｃｔｇａｇａｔｃｇｇｃａｔｇａａｇｇｇｇｇａｇｃｇａｃｇｇａｇａｇｇｃａａａｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｇｃｔｇｔａｃｃａｇｇｇａｃｔｇａｇｃａｃｃｇｃｃａｃａａａｇｇａｃａｃｃｔａｔｇａｔｇｃｔｃｔｇｃａｔａｔｇｃａｇｇｃａｃｔｇｃｃｔｃｃａａｇｇ（配列番号１４４７８）を含む核酸配列によってコードされ得る。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１４４７９）を含むアミノ酸配列、またはＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１４４７９）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ａａｇａｇａｇｇｃａｇｇａａｇａａａｃｔｇｃｔｇｔａｔａｔｔｔｔｃａａａｃａｇｃｃｃｔｔｃａｔｇｃｇｃｃｃｃｇｔｇｃａｇａｃｔａｃｃｃａｇｇａｇｇａａｇａｃｇｇｇｔｇｃｔｃｃｔｇｔｃｇａｔｔｃｃｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇａａｇｇｃｇｇｇｔｇｔｇａｇｃｔｇ（配列番号１４４８０）、を含む核酸配列によってコードされ得る。４−１ＢＢ共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ２８共刺激ドメインとの間に位置し得る。
【０３２１】
本開示のＣＡＲのある特定の実施形態において、ヒンジは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含み得る。本開示のＣＡＲのある特定の実施形態において、ヒンジは、ヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含み得る。ヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１４４８１）を含むヒトＣＤ８αアミノ酸配列、またはＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１４４８１）を含むアミノ酸配列に少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％の同一性を有する配列を含み得る。ヒトＣＤ８αヒンジアミノ酸配列は、ａｃｔａｃｃａｃａｃｃａｇｃａｃｃｔａｇａｃｃａｃｃａａｃｔｃｃａｇｃｔｃｃａａｃｃａｔｃｇｃｇａｇｔｃａｇｃｃｃｃｔｇａｇｔｃｔｇａｇａｃｃｔｇａｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｃｃａｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇａｇｃｔｇｔｇｃａｃａｃｃａｇｇｇｇｃｃｔｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｃｇａｃ（配列番号１４４８２）を含む核酸配列によってコードされ得る。
【０３２２】
ＳｃＦｖ
本開示は、特異的標的タンパク質を認識して結合するためにこれらの組成物を使用するための一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）組成物および方法を提供する。ＳｃＦｖ組成物は、抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を含む。ＳｃＦｖ組成物は、本開示のキメラ抗原受容体の抗原認識領域に組み込まれ得る。ＳｃＦｖは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質であり、ＶＨおよびＶＬドメインは、短ペプチドリンカーで接続される。ＳｃＦｖは、定常領域の除去およびリンカーの導入にもかかわらず、元の免疫グロブリンの特異性を保持する。例示的なリンカーは、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号１４４８３）の配列を含む。
【０３２３】
センチリン
本開示のセンチリンは、抗原に特異的に結合する。抗原に特異的に結合する１つ以上のセンチリンを含む本開示のキメラ抗原受容体を使用して、細胞（例えば、細胞毒性免疫細胞）の特異性を特異抗原に向けることができる。
【０３２４】
本開示のセンチリンは、タンパク質足場を含み得、この足場は、抗原に特異的に結合することができる。本開示のセンチリンは、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含むタンパク質足場を含み得、この足場は、抗原に特異的に結合することができる。少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインは、ヒトタンパク質に由来し得る。ヒトタンパク質は、テネイシン−Ｃであり得る。コンセンサス配列は、ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１４４８８）またはＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１４４８９）を含み得る。コンセンサス配列は、ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１４４８８）またはＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１４４８９）に少なくとも７４％同一のアミノ配列を含み得る。コンセンサス配列は、ａｔｇｃｔｇｃｃｔｇｃａｃｃａａａｇａａｃｃｔｇｇｔｇｇｔｇｔｃｔｃａｔｇｔｇａｃａｇａｇｇａｔａｇｔｇｃｃａｇａｃｔｇｔｃａｔｇｇａｃｔｇｃｔｃｃｃｇａｃｇｃａｇｃｃｔｔｃｇａｔａｇｔｔｔｔａｔｃａｔｃｇｔｇｔａｃｃｇｇｇａｇａａｃａｔｃｇａａａｃｃｇｇｃｇａｇｇｃｃａｔｔｇｔｃｃｔｇａｃａｇｔｇｃｃａｇｇｇｔｃｃｇａａｃｇｃｔｃｔｔａｔｇａｃｃｔｇａｃａｇａｔｃｔｇａａｇｃｃｃｇｇａａｃｔｇａｇｔａｃｔａｔｇｔｇｃａｇａｔｃｇｃｃｇｇｃｇｔｃａａａｇｇａｇｇｃａａｔａｔｃａｇｃｔｔｃｃｃｔｃｔｇｔｃｃｇｃａａｔｃｔｔｃａｃｃａｃａ（配列番号１４４９０）を含む核酸配列によってコードされ得る。コンセンサス配列は、（ａ）コンセンサス配列の１３〜１６位のアミノ酸残基ＴＥＤＳ（配列番号１４４９１）を含むか、またはそれからなるＡ−Ｂループ、（ｂ）コンセンサス配列の２２〜２８位のアミノ酸残基ＴＡＰＤＡＡＦ（配列番号１４４９２）を含むか、またはそれからなるＢ−Ｃループ、（ｃ）コンセンサス配列の３８〜４３位のアミノ酸残基ＳＥＫＶＧＥ（配列番号１４４９３）を含むか、またはそれからなるＣ−Ｄループ、（ｄ）コンセンサス配列の５１〜５４位のアミノ酸残基ＧＳＥＲ（配列番号１４４９４）を含むか、またはそれからなるＤ−Ｅループ、（ｅ）コンセンサス配列の６０〜６４位のアミノ酸残基ＧＬＫＰＧ（配列番号１４４９５）を含むか、またはそれからなるＥ−Ｆループ、（ｆ）コンセンサス配列の７５〜８１位のアミノ酸残基ＫＧＧＨＲＳＮ（配列番号１４４９６）を含むか、またはそれからなるＦ−Ｇループ、あるいは（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の任意の組み合わせ内の１つ以上の位置で改変され得る。本開示のセンチリンは、少なくとも５つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、少なくとも１０のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメイン、または少なくとも１５のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含み得る。足場は、１０-9Ｍ以下、１０-10Ｍ以下、１０-11Ｍ以下、１０-12Ｍ以下、１０-13Ｍ以下、１０-14Ｍ以下、および１０-15Ｍ以下のＫDから選択される少なくとも１つの親和性を有する抗原に結合し得る。ＫDは、表面プラズモン共鳴によって決定され得る。
【０３２５】
「抗体模倣物」という用語は、標的配列に特異的に結合し、かつ自然発生抗体とは異なる構造を有する有機化合物を説明することを意図する。抗体模倣物は、タンパク質、核酸、または小分子を含み得る。本開示の抗体模倣物が特異的に結合する標的配列は、抗原であり得る。抗体模倣物は、優れた溶解性、組織浸透、熱および酵素に対する安定性（例えば、酵素的分解への耐性）、ならびにより低い製造コストを含むが、これらに限定されない、抗体よりも優れた特性を提供し得る。例示的な抗体模倣物には、アフィボディ、アフリリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、およびアビマー（アビディティマルチマーとしても既知）、ＤＡＲＰｉｎ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、およびモノボディが含まれるが、これらに限定されない。
【０３２６】
本開示のアフィボディ分子は、ジスルフィド架橋が全くない１つ以上のアルファヘリックスを含むか、またはそれからなるタンパク質足場を含む。好ましくは、本開示のアフィボディ分子は、３つのアルファヘリックスを含むか、またはそれからなる。例えば、本開示の抗体分子は、免疫グロブリン結合ドメインを含み得る。本開示のアフィボディ分子は、プロテインＡのＺドメインを含み得る。
【０３２７】
本開示のアフィリン分子は、例えば、ガンマＢクリスタリンまたはユビキチンのいずれかの露出したアミノ酸の改変によって産生されるタンパク質足場を含む。アフィリン分子は、抗原に対する抗体の親和性を機能的に模倣するが、抗体を構造的には模倣しない。アフィリンを作製するために使用される任意のタンパク質足場において、適切にフォールディングされたタンパク質分子中の、溶媒または可能性のある結合パートナーにアクセス可能であるアミノ酸は、露出したアミノ酸と考えられる。これらの露出したアミノ酸のうちのいずれか１つ以上は、標的配列または抗原に特異的に結合するように改変され得る。
【０３２８】
本開示のアフィマー分子は、特異的な標的配列のための高親和性結合部位をもたらすペプチドループを提示するように遺伝子操作された、高度に安定なタンパク質を含むタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、シスタチンタンパク質またはその三次構造に基づくタンパク質足場を含む。本開示の例示的なアフィマー分子は、逆平行ベータシートの上に位置するアルファヘリックスを含む共通の三次構造を共有し得る。
【０３２９】
本開示のアフィチン分子は、人工タンパク質足場を含み、その構造は、例えば、ＤＮＡ結合タンパク質（例えば、ＤＮＡ結合タンパク質Ｓａｃ７ｄ）に由来し得る。本開示のアフィチンは、抗原の全体または一部であり得る標的配列に選択的に結合する。本開示の例示的なアフィチンは、ＤＮＡ結合タンパク質の結合表面上の１つ以上のアミノ酸配列をランダム化し、結果として生じたタンパク質をリボソームディスプレイおよび選択に供することによって製造される。本開示のアフィチンの標的配列は、例えば、ゲノム内、またはペプチド、タンパク質、ウイルス、もしくは細菌の表面上に見出され得る。本開示のある特定の実施形態において、アフィチン分子は、酵素の特異的阻害剤として使用され得る。本開示のアフィチン分子は、耐熱性タンパク質またはその誘導体を含み得る。
【０３３０】
本開示のアルファボディ分子は、細胞浸透性アルファボディ（ＣＰＡＢ）と称され得る。本開示のアルファボディ分子は、多様な標的配列（抗原を含む）に結合する小タンパク質（典型的には１０ｋＤａ未満の）を含む。アルファボディ分子は、細胞内標的配列に達し、それに結合することができる。構造的に、本開示のアルファボディ分子は、一本鎖アルファヘリックス（自然発生コイルドコイル構造に類似）を形成する人工配列を含む。本開示のアルファボディ分子は、標的タンパク質に特異的に結合するように改変されている１つ以上のアミノ酸を含むタンパク質足場を含み得る。分子の結合特異性にかかわらず、本開示のアルファボディ分子は、正しいフォールディングおよび熱安定性を維持する。
【０３３１】
本開示のアンチカリン分子は、タンパク質または小分子のいずれかにおける標的配列または部位に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアンチカリン分子は、ヒトリポカリンに由来する人工タンパク質を含み得る。本開示のアンチカリン分子は、例えば、モノクローナル抗体またはその断片の代わりに使用され得る。アンチカリン分子は、モノクローナル抗体またはその断片よりも優れた組織透過および熱安定性を示し得る。本開示の例示的なアンチカリン分子は、およそ２０ｋＤａの質量を有する約１８０アミノ酸を含み得る。構造的に、本開示のアンチカリン分子は、ループが接続し、アルファヘリックスが結合したペアワイズの逆平行ベータ鎖を含むバレル構造を含む。好ましい実施形態において、本開示のアンチカリン分子は、ループが接続し、アルファヘリックスが結合したペアワイズの８つの逆平行ベータ鎖を含むバレル構造を含む。
【０３３２】
本開示のアビマー分子は、標的配列（これは抗原でもあり得る）に特異的に結合する人工タンパク質を含む。本開示のアビマーは、同じ標的内または異なる標的内の複数の結合部位を認識し得る。本開示のアビマーが１つを超える標的を認識するとき、このアビマーは、二重特異性抗体の機能を模倣する。人工タンパク質アビマーは、各々、およそ３０〜３５アミノ酸の２つ以上のペプチド配列を含み得る。これらのペプチドは、１つ以上のリンカーペプチドを介して接続されていてもよい。アビマーのペプチドのうちの１つ以上のアミノ酸配列は、膜受容体のＡドメインに由来し得る。アビマーは、ジスルフィド結合および／またはカルシウムを任意に含み得る強固な構造を有する。本開示のアビマーは、抗体と比較してより高い熱安定性を示し得る。
【０３３３】
本開示のＤＡＲＰｉｎｓ（設計されたアンキリンリピートタンパク質）は、標的配列に対して高い特異性および高い親和性を有する遺伝子操作されたタンパク質、組換えタンパク質、またはキメラタンパク質を含む。ある特定の実施形態において、本開示のＤＡＲＰｉｎは、アンキリンタンパク質に由来し、任意選択で、アンキリンタンパク質の少なくとも３つの反復モチーフ（反復構造単位とも称される）を含む。アンキリンタンパク質は、高親和性のタンパク質間相互作用を媒介する。本開示のＤＡＲＰｉｎは、大きな標的相互作用表面を含む。
【０３３４】
本開示のＦｙｎｏｍｅｒは、ヒトＦｙｎ  ＳＨ３ドメインに由来し、抗体と等しい親和性および等しい特異性で標的配列および分子に結合するように遺伝子操作された、小さな結合タンパク質（約７ｋＤａ）を含む。
【０３３５】
本開示のＫｕｎｉｔｚドメインペプチドは、Ｋｕｎｉｔｚドメインを含むタンパク質足場を含む。Ｋｕｎｉｔｚドメインは、プロテアーゼ活性を阻害するための活性部位を含む。構造的に、本開示のＫｕｎｉｔｚドメインは、ジスルフィドに富むアルファ＋ベータフォールドを含む。この構造は、ウシ膵臓トリプシン阻害剤によって例示される。Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチドは、特異的なタンパク質構造を認識し、競合的プロテアーゼ阻害剤として働く。本開示のＫｕｎｉｔｚドメインは、エカランチド（ヒトリポタンパク質関連凝固阻害剤（ＬＡＣＩ）に由来する）を含み得る。
【０３３６】
本開示のモノボディは、サイズにおいて一本鎖抗体と同等の小タンパク質である（約９４個のアミノ酸を含み、約１０ｋＤａの質量を有する）。これらの遺伝子操作されたタンパク質は、抗原を含む標的配列に特異的に結合する。本開示のモノボディは、１つ以上の明確に異なるタンパク質または標的配列を特異的に標的とし得る。好ましい実施形態において、本開示のモノボディは、ヒトフィブロネクチンの構造を模倣し、より好ましくは、フィブロネクチンの第１０の細胞外ＩＩＩ型ドメインの構造を模倣する、タンパク質足場を含む。フィブロネクチンの第１０の細胞外ＩＩＩ型ドメイン、およびそのモノボディ模倣物には、抗体の３つの相補性決定領域（ＣＤＲ）に対応する各側面に、バレルを形成する７つのベータシートおよび３つの露出したループを含有する。抗体の可変ドメインの構造とは対照的に、モノボディは、金属イオンのための結合部位ならびに中央のジスルフィド結合を欠いている。多重特異性モノボディは、ループＢＣおよびＦＧを改変することによって最適化することができる。本開示のモノボディは、アドネクチンを含んでもよい。
【０３３７】
ＶＨＨ
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、単一ドメイン抗体（ＳｄＡｂ）を含む。ある特定の実施形態において、ＳｄＡｂは、ＶＨＨである。
【０３３８】
本開示は、少なくとも１つのＶＨＨ（ＶＣＡＲ）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。本開示のキメラ抗原受容体は、１つを超えるＶＨＨを含み得る。例えば、二重特異性ＶＣＡＲは、２つの明確に異なる抗原に特異的に結合する２つのＶＨＨを含み得る。
【０３３９】
本開示のＶＨＨタンパク質は、抗原に特異的に結合する。抗原に特異的に結合する１つ以上のＶＨＨを含む本開示のキメラ抗原受容体を使用して、細胞（例えば、細胞毒性免疫細胞）の特異性を特異抗原に向けることができる。
【０３４０】
本開示の少なくとも１つのＶＨＨタンパク質またはＶＣＡＲは、当該技術分野において周知であるように、細胞株、混合細胞株、不死化細胞、または不死化細胞のクローン集団によって任意に産生され得る。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９８７−２００１）、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．（１９８９）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ，ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，ＮＹ（１９９４−２００１）、Ｃｏｌｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，ＮＹ，Ｎ．Ｙ．，（１９９７−２００１）を参照されたい。
【０３４１】
ＶＨＨタンパク質からのアミノ酸は、当該技術分野において既知であるように、免疫原性を低下させるために、あるいは結合、親和性、オン速度、オフ速度、アビディティ、特異性、半減期、安定性、溶解性、または任意の他の好適な特性を低下させる、強化する、または改変するために、変更、追加、および／または削除され得る。
【０３４２】
任意に、ＶＨＨタンパク質は、抗原に対する高い親和性および他の好ましい生物学的特性を保持しながら操作することができる。この目標を達成するために、ＶＨＨタンパク質は、任意に、親配列および操作された配列の三次元モデルを使用して、親配列および様々な概念的な操作された産物の分析プロセスによって調製され得る。三次元モデルは、一般的に入手可能であり、当業者によく知られている。選択された候補配列の考えられる三次元立体構造を図示し、表示するコンピュータプログラムが利用可能であり、潜在的な免疫原性を計測することができる（例えば、Ｘｅｎｃｏｒ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｎｒｏｖｉａ，Ｃａｌｉｆ．）のＩｍｍｕｎｏｆｉｌｔｅｒプログラム）。これらのディスプレイの検査は、候補配列の機能における残基の可能な役割の分析、すなわち、候補ＶＨＨタンパク質がその抗原に結合する能力に影響を及ぼす残基の分析を可能にする。このように、残基は、標的抗原に対する親和性などの所望の特徴が達成されるように、親配列および参照配列から選択および組み合わされ得る。あるいは、または上記の手順に加えて、他の好適な操作方法が、使用され得る。
【０３４３】
類似のタンパク質または断片への特異的結合についてのＶＨＨのスクリーニングは、ヌクレオチド（ＤＮＡもしくはＲＮＡディスプレイ）またはペプチドディスプレイライブラリー、例えば、インビトロディスプレイを使用して都合よく達成することができる。この方法は、所望の機能または構造を有する個々のメンバーに対するペプチドの大きな集合体をスクリーニングすることを伴う。ディスプレイされたヌクレオチドまたはペプチド配列は、３〜５０００個以上のヌクレオチドまたはアミノ酸の長さ、しばしば、５〜１００個のアミノ酸の長さ、およびしばしば、約８〜２５個のアミノ酸の長さであり得る。ペプチドライブラリーを生成するための直接的な化学的合成法に加えて、いくつかの組換えＤＮＡ法が、記載されている。１つのタイプは、バクテリオファージまたは細胞の表面上のペプチド配列のディスプレイを含む。各バクテリオファージまたは細胞は、特定のディスプレイされたペプチド配列をコードするヌクレオチド配列を含む。本開示のＶＨＨタンパク質は、広範囲の親和性（ＫＤ）でヒトまたは他の哺乳動物タンパク質に結合することができる。好ましい実施形態において、本開示の少なくとも１つのＶＨＨは、当業者によって実践されるように、表面プラズモン共鳴またはＫｉｎｅｘａ法によって決定されるように、高親和性で、例えば、０．１〜９．９（またはその間のいずれかの範囲または値）×１０-8、１０-9、１０-10、１０-11、１０-12、１０-13、１０-14、１０-15などであるが、これらに限定されない、約１０-7Ｍ以下、またはその間のいずれかの範囲または値のＫＤで、標的タンパク質に任意に結合することができる。
【０３４４】
抗原に対するＶＨＨまたはＶＣＡＲの親和性またはアビディティは、任意の好適な方法を使用して実験的に決定することができる（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ，ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”Ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，Ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）、Ｋｕｂｙ，Ｊａｎｉｓ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）、および本明細書に記載の方法を参照されたい）。特定のＶＨＨ−抗原またはＶＣＡＲ−抗原相互作用の測定された親和性は、異なる条件下（例えば、塩濃度、ｐＨ）で測定された場合、変化し得る。したがって、親和性および他の抗原結合パラメーター（例えば、ＫＤ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、好ましくは、ＶＨＨまたはＶＣＡＲおよび抗原の標準化された溶液、ならびに本明細書に記載の緩衝液などの標準化された緩衝液を用いて行われる。
【０３４５】
どのタンパク質、抗体、および他のアンタゴニストが、本開示のＶＨＨもしくはＶＣＡＲと標的タンパク質への結合について競合するか、および／またはエピトープ領域を共有するかを判定するために、競合アッセイを本開示のＶＨＨまたはＶＣＡＲで実施することができる。当業者に容易に知られているこれらのアッセイは、タンパク質上の限られた数の結合部位についてのアンタゴニストまたはリガンド間の競合を評価する。タンパク質および／または抗体は、競合の前後に固定化または不溶化され、標的タンパク質に結合したサンプルは、例えば、デカンテーション（タンパク質／抗体が事前に不溶化された場合）または遠心分離（タンパク質／抗体は競合反応後に沈殿した）によって未結合サンプルから分離される。また、競合的結合は、ＶＨＨまたはＶＣＡＲの標的タンパク質への結合または結合の欠如によって機能が変化するかどうか、例えば、ＶＣＡＲ分子が、例えば、標識の酵素活性を阻害または増強するかどうかによって判定され得る。当該技術分野において周知であるように、ＥＬＩＳＡおよび他の機能アッセイを使用することができる。
【０３４６】
ＶＨ
ある特定の実施形態において、ＣＡＲは、単一ドメイン抗体（ＳｄＡｂ）を含む。ある特定の実施形態において、ＳｄＡｂは、ＶＨである。
【０３４７】
本開示は、単一ドメイン抗体（ＶＣＡＲ）を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。ある特定の実施形態において、単一ドメイン抗体は、ＶＨを含む。ある特定の実施形態において、ＶＨは、ヒト配列から単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ＶＨは、ヒトＣＤＲ配列および／またはヒトフレームワーク配列、ならびに非ヒトまたはヒト化配列（例えば、ラットＦｃドメイン）を含む。ある特定の実施形態において、ＶＨは、完全にヒト化されたＶＨである。ある特定の実施形態において、ＶＨは、自然発生抗体でも、自然発生抗体の断片でもない。ある特定の実施形態において、ＶＨは、モノクローナル抗体の断片ではない。ある特定の実施形態において、ＶＨは、ＵｎｉＤａｂ（商標）抗体（ＴｅｎｅｏＢｉｏ）である。
【０３４８】
ある特定の実施形態において、ＶＨは、ＵｎｉＲａｔ（商標）（ＴｅｎｅｏＢｉｏ）系および「ＮＧＳベースの発見」を使用して完全に操作されて、ＶＨを生成する。この方法を使用して、特異的ＶＨは、天然に存在せず、完全に操作された系を使用して生成される。ＶＨは、宿主（例えば、マウス、ラット、またはヒト）から直接、または細胞もしくは細胞株の単一クローン（ハイブリドーマ）から直接単離された、自然発生モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来しない。これらのＶＨは、その後、当該細胞株からクローン化されなかった。代わりに、ＶＨ配列は、ラットＦｃドメインを持つヒト可変領域（ＶＨドメイン）を含む導入遺伝子としてＵｎｉＲａｔ（商標）系を使用して完全に操作されているため、軽鎖のないヒト／ラットキメラであり、標準のｍＡｂ形式とは異なる。天然ラット遺伝子は、ノックアウトされており、ラットで発現する唯一の抗体は、ラットＦｃ（ＵｎｉＡｂ）に連結されたＶＨドメインを持つ導入遺伝子からのものである。これらは、ＵｎｉＲａｔで表現された排他的なＡｂである。次世代シーケンシング（ＮＧＳ）およびバイオインフォマティクスを使用して、免疫後にＵｎｉＲａｔ（商標）によって生成された重鎖抗体の完全な抗原特異的レパートリーを特定する。次いで、独自の遺伝子アセンブリ法を使用して、抗体レパートリー配列情報を、様々な機能についてインビトロでスクリーニングすることができる完全ヒト重鎖抗体の大きな集合体に変換する。ある特定の実施形態において、完全にヒト化されたＶＨは、（非自然発生組換えＶＨ抗体を生成するために）インビトロでヒトＶＨドメインをヒトＦｃと融合することによって生成される。ある特定の実施形態において、ＶＨは、完全にヒト化されているが、それらは、軽鎖のないヒト／ラットキメラ（ヒトＶＨ、ラットＦｃ）としてインビボで発現される。完全にヒト化されたＶＨは、軽鎖のないヒト／ラットキメラ（ヒトＶＨ、ラットＦｃ）が約８０ｋＤａ（対１５０ｋＤａ）であるため、インビボで発現される。
【０３４９】
本開示のＶＣＡＲは、本開示の少なくとも１つのＶＨを含み得る。ある特定の実施形態において、本開示のＶＨは、Ｆｃドメインまたはその一部分を除去するように改変され得る。ある特定の実施形態において、本開示のＶＨのフレームワーク配列は、例えば、発現を改善するために、免疫原性を低下させるために、または機能を改善するために改変され得る。
【０３５０】
本開示全体において使用されるように、単数形「ａ」、「および」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、複数のそのような方法を含み、「用量」への言及は、当業者などに知られている１つ以上の用量およびその同等物への言及を含む。
【０３５１】
「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値について、許容可能な誤差範囲内を意味し、その値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に、部分的には依存している。例えば、「約」は、１つ以上の標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、または最大１０％、または最大５％、または最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語が、仮定されるべきである。
【０３５２】
本開示は、単離された、または実質的に精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質組成物を提供する。「単離された」または「精製された」ポリヌクレオチドまたはタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、その自然発生環境に見られるようなポリヌクレオチドまたはタンパク質に通常付随または相互作用する成分を実質的または本質的に含まない。したがって、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術によって生成されるとき、他の細胞材料または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成されるとき、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチドの５’および３’末端に位置する配列）に自然に隣接する配列（最適にはタンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、様々な実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチドに自然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満（乾燥重量で）の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。本開示のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え的に産生されるとき、最適な培養培地は、化学前駆体または目的の非タンパク質化学物質の約３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満（乾燥重量で）を表す。
【０３５３】
本開示は、これらのＤＮＡ配列によってコードされる開示されたＤＮＡ配列およびタンパク質の断片および変異体を提供する。本開示全体において使用される場合、「断片」という用語は、ＤＮＡ配列の一部分またはアミノ酸配列の一部分、したがってそれによってコードされるタンパク質を指す。コード配列を含むＤＮＡ配列の断片は、天然タンパク質の生物学的活性を保持するタンパク質断片をコードし、したがって、本明細書に記載の標的ＤＮＡ配列へのＤＮＡ認識または結合活性をコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なＤＮＡ配列の断片は、一般に、生物学的活性を保持するタンパク質をコードしない、またはプロモーター活性を保持しない。したがって、ＤＮＡ配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから、本開示の完全長ポリヌクレオチドまでの範囲であり得る。
【０３５４】
本開示の核酸またはタンパク質は、後に最終的な目的のベクターへとアセンブルされ得る標的ベクターにおいて単量体単位および／または反復単位をプリアセンブルすることを含むモジュラーアプローチによって構築することができる。本開示のポリペプチドは、本開示の反復単量体を含んでもよく、後に最終的な目的のベクターへとアセンブルされ得る標的ベクターにおいて反復単位をプリアセンブルすることによるモジュラーアプローチによって構築することができる。本開示は、本方法によって産生されるポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示は、このモジュラーアプローチによって産生されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主生物および細胞を提供する。
【０３５５】
「抗体」という用語は、最も広い意味において使用され、単一モノクローナル抗体（アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体を含む）および多エピトープ特異性を有する抗体組成物を明確に網羅する。本明細書において定義される本明細書の抗体の天然または合成の類似体、変異体、バリアント、対立遺伝子、ホモログ、およびオルソログ（本明細書では集合的に「類似体」と称される）を使用することも本明細書の範囲内である。したがって、本明細書の一実施形態によれば、「本明細書の抗体」という用語は、その最も広い意味において、そのような類似体も網羅する。一般に、そのような類似体では、本明細書において定義される本明細書の抗体と比較して、１つ以上のアミノ酸残基が、置き換えられ、欠失し、かつ／または付加されてもよい。
【０３５６】
本明細書で使用される「抗体断片」、およびそのあらゆる文法的な変化形は、無傷抗体の抗原結合部位または可変領域を含む無傷抗体の一部分であって、無傷抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含まない一部分と定義される。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖ断片；ダイアボディ；（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）軽鎖可変ドメインを１つだけ含有する一本鎖ポリペプチド、または関連した重鎖部分のない軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片、および（３）重鎖可変領域を１つだけ含有する一本鎖ポリペプチド、または関連した軽鎖部分のない重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片を含むが、これらに限定されない、連続したアミノ酸残基の１つの中断されていない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書では「一本鎖抗体断片」または「一本鎖ポリペプチド」と称される）；ならびに抗体断片から形成された多特異性または多価の構造が挙げられる。１つ以上の重鎖を含む抗体断片において、重鎖は、無傷抗体の非Ｆｃ領域に見られる任意の定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧアイソタイプのＣＨＩ）を含むことができ、および／または無傷の抗体に見られる任意のヒンジ領域を含むことができ、および／または重鎖のヒンジ領域配列もしくは定常ドメイン配列に融合もしくは位置するロイシンジッパー配列を含むことができる。この用語は、一般的に（例えば、ラクダからの）単一の単量体可変抗体ドメインを有する抗体断片を指す単一のドメイン抗体（「ｓｄＡＢ」）をさらに含む。そのような抗体断片のタイプは、当業者によって容易に理解されるであろう。
【０３５７】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合の相互作用のすべての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基と接触する）。
【０３５８】
「含む」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することが意図される。組成物および方法を定義するために使用されるとき、「から本質的になる」とは、意図される目的のために使用するときの組み合わせに対してあらゆる本質的な意義のある他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書において定義されている要素から本質的になる組成物は、微量混入物質または不活性担体を除外しない。「からなるとは、他の成分の微量を超える要素および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
【０３５９】
「エピトープ」という用語は、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、エピトープに特有の空間的コンフォメーションで３つのアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも４、５、６、または７個のそのようなアミノ酸からなり、より通常は、少なくとも８、９、または１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を含む。
【０３６０】
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【０３６１】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も含まれる。
【０３６２】
遺伝子発現の「モジュレーション」または「調節」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０３６３】
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」またはその等価物（例えば、「作動可能的に連結された（ｌｉｎｋｅｄ  ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）」）は、２つ以上の分子が、１つまたは両方の分子またはその組み合わせに起因する機能に影響を与えるために相互作用することができるように互いに配置されることを意味する。
【０３６４】
非共有結合的に連結された構成成分、ならびに非共有結合的に連結された構成成分を作製および使用する方法が、開示されている。様々な構成成分は、本明細書に記載されるように、様々な異なる形態をとり得る。例えば、非共有結合的に連結された（すなわち、作動可能に連結された）タンパク質を使用して、当該技術分野における１つ以上の問題を回避する一時的な相互作用を可能にし得る。タンパク質などの非共有結合的に連結された成分が会合および解離する能力は、そのような会合が所望の活性に必要である状況下でのみ、またはそのような状況下で主に、機能的会合を可能にする。連結は、所望の効果を可能にするのに十分な持続時間のものであり得る。
【０３６５】
生物のゲノム中の特異的遺伝子座にタンパク質を指向させるための方法が、開示されている。本方法は、ＤＮＡ局在化構成成分を提供するステップと、エフェクター分子を提供するステップと、を含み得、ＤＮＡ局在化構成成分およびエフェクター分子は、非共有結合的連結を介して作動可能に連結することが可能である。
【０３６６】
「ｓｃＦｖ」という用語は、一本鎖可変断片を指す。ｓｃＦｖは、リンカーペプチドで連結された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。このリンカーペプチドは、約５〜４０アミノ酸長または約１０〜３０アミノ酸長または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０アミノ酸長であり得る。一本鎖可変断片は、完全な抗体分子に見られる定常Ｆｃ領域を欠き、したがって、抗体を精製するために使用される一般的結合部位（例えば、プロテインＧ）を欠く。この用語は、細胞の細胞質において安定であって、細胞内タンパク質に結合し得る抗体、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）であるｓｃＦｖをさらに含む。
【０３６７】
「単一ドメイン抗体」という用語は、特異的抗原に選択的に結合することができる単一の単量体可変抗体ドメインを有する抗体断片を意味する。単一ドメイン抗体は、重鎖抗体、または通常のＩｇＧの１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含む約１１０アミノ酸の長さのペプチド鎖であり、一般に、抗原に対して全抗体と同様の親和性を有するが、より耐熱性であり、洗浄剤および高濃度の尿素に対してより安定である。例は、ラクダ科または魚類抗体に由来するものである。あるいは、単一ドメイン抗体は、４つの鎖を有する一般的なマウスまたはヒトＩｇＧから作製され得る。
【０３６８】
遺伝子送達の方法
本開示の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、送達または導入ステップ中に、緩衝液または他の培地のミリリットルあたり２５０×１０6個の初代ヒトＴ細胞の測定可能な比率を含む。
【０３６９】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションによって細胞に送達または導入される。いくつかの実施形態において、送達または導入ステップは、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクションを含む。
【０３７０】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、エレクトロポレーションまたはヌクレオフェクション以外の方法によって細胞に送達または導入される。
【０３７１】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、局所送達、吸着、吸収、エレクトロポレーション、スピンフェクション、共培養、トランスフェクション、機械的送達、音波送達、振動送達、マグネトフェクションのうちの１つ以上によって、またはナノ粒子を媒介した送達によって送達または導入される。いくつかの実施形態において、送達または導入ステップは、局所送達、吸着、吸収、エレクトロポレーション、スピンフェクション、共培養、トランスフェクション、機械的送達、音波送達、振動送達、マグネトフェクションのうちの１つ以上、またはナノ粒子を媒介した送達によるものを含む。
【０３７２】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション、およびデンドリマーを媒介したトランスフェクションによって送達または導入される。いくつかの実施形態において、送達または導入ステップは、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション、およびデンドリマーを媒介したトランスフェクションのうちの１つ以上を含む。
【０３７３】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、細胞圧搾（ｃｅｌｌ  ｓｑｕｅｅｚｉｎｇ）、細胞衝撃、または遺伝子銃技術を含む機械的トランスフェクションによって送達または導入される。いくつかの実施形態において、送達または導入ステップは、細胞圧搾、細胞衝撃、または遺伝子銃技術を含む機械的トランスフェクションのうちの１つ以上を含む。
【０３７４】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、組成物は、リポソーム送達、ミセルによる送達、およびポリマーソームによる送達を含むナノ粒子を媒介したトランスフェクションによって送達または導入される。いくつかの実施形態において、送達または導入ステップは、リポソーム送達、ミセルによる送達、およびポリマーソームによる送達のうちの１つ以上を含む。
【０３７５】
核酸の構築
本開示の単離された核酸は、当該技術分野において周知であるように、（ａ）組換え法、（ｂ）合成技術、（ｃ）精製技術、および／または（ｄ）それらの組み合わせを使用して作製することができる。
【０３７６】
核酸は、本開示のポリヌクレオチドに加えて配列を便利に含むことができる。例えば、１つ以上のエンドヌクレアーゼ制限部位を含むマルチクローニング部位を核酸に挿入して、ポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。また、翻訳可能な配列を挿入して、本開示の翻訳されたポリヌクレオチドの単離に役立てることができる。例えば、ヘキサヒスチジンマーカー配列は、本開示のタンパク質を精製するための便利な手段を提供する。コード配列を除く本開示の核酸は、任意選択で、本開示のポリヌクレオチドのクローニングおよび／または発現のためのベクター、アダプター、またはリンカーである。
【０３７７】
追加の配列をそのようなクローニングおよび／または発現配列に付加して、クローニングおよび／または発現におけるそれらの機能を最適化し、ポリヌクレオチドの単離に役立てることができるか、または細胞へのポリヌクレオチドの導入を改善することができる。クローニングベクター、発現ベクター、アダプター、およびリンカーの使用は、当該技術分野において周知である（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）。
【０３７８】
核酸を構築するための組換え法
ＲＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ、またはそれらの任意の組み合わせなどの本開示の単離された核酸組成物は、当業者に既知の任意の数のクローニング方法論を使用して生物学的起源から得ることができる。いくつかの実施形態において、本開示のポリヌクレオチドに対してストリンジェントな条件下で選択的にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプローブを使用して、ｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡライブラリー中の所望の配列を同定する。ＲＮＡの単離、ならびにｃＤＮＡおよびゲノムライブラリーの構築は、当業者に周知である。（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）。
【０３７９】
核酸のスクリーニングおよび単離方法
ｃＤＮＡまたはゲノムライブラリーは、本開示のポリヌクレオチドの配列に基づいたプローブを使用してスクリーニングすることができる。プローブを使用して、同じまたは異なる生体内の相同遺伝子を単離するため、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡ配列にハイブリダイズさせることができる。当業者は、アッセイ中で様々な程度のハイブリダイゼーションのストリンジェンシーを用いることができ、ハイブリダイゼーションまたは洗浄媒質のいずれかがストリンジェントであり得るということは明らかであろう。ハイブリダイゼーションのための条件が、ストリンジェントになるほど、二重鎖形成が生じるためにプローブと標的との間にはさらに高い程度の相補性がなければならない。ストリンジェンシーの程度は、温度、イオン強度、ｐＨ、およびホルムアミドなどの部分的変性溶媒の存在のうちの１つ以上によって制御することができる。例えば、ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーは、例えば、０％〜５０％の範囲内のホルムアミドの濃度の操作を通して反応溶液の極性を変えることによって都合よく変更される。検出可能な結合のために必要な相補性（配列同一性）の程度は、ハイブリダイゼーション媒質および／または洗浄媒質のストリンジェンシーに従って変化する。相補性の程度は、最適には、１００％、または７０〜１００％、またはその間の任意の範囲もしくは値である。しかしながら、プローブおよびプライマー内のわずかな配列変動は、ハイブリダイゼーションおよび／または洗浄媒質のストリンジェンシーを低下させることによって補償することができることを理解すべきである。
【０３８０】
ＲＮＡまたはＤＮＡの増幅方法は、当該技術分野において周知であり、本明細書に提示される教示および指針に基づいて、過度の実験なしに、本開示に従って使用することができる。
【０３８１】
ＤＮＡまたはＲＮＡ増幅の既知の方法には、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）および関連する増幅プロセス（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、同第４，８００，１５９号、同第４，９６５，１８８号（Ｍｕｌｌｉｓら）、同第４，７９５，６９９号、および同第４，９２１，７９４号（Ｔａｂｏｒら）、同第５，１４２，０３３号（Ｉｎｎｉｓ）、同第５，１２２，４６４号（Ｗｉｌｓｏｎら）、同第５，０９１，３１０号（Ｉｎｎｉｓ）、同第５，０６６，５８４号（Ｇｙｌｌｅｎｓｔｅｎら）、同第４，８８９，８１８号（Ｇｅｌｆａｎｄら）、同第４，９９４，３７０号（Ｓｉｌｖｅｒら）、同第４，７６６，０６７号（Ｂｉｓｗａｓ）、同第４，６５６，１３４号（Ｒｉｎｇｏｌｄ）、および二本鎖ＤＮＡ合成のテンプレートとして標的配列に対するアンチセンスＲＮＡを用いるＲＮＡ媒介増幅（米国特許第５，１３０，２３８号（Ｍａｌｅｋら）、商標ＮＡＳＢＡ）が含まれるが、これらに限定されず、これらの参考文献の全容は参照により本明細書に組み込まれる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記；またはＳａｍｂｒｏｏｋ、上記を参照されたい）。
【０３８２】
例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）技術を用いて、ゲノムＤＮＡまたはｃＤＮＡライブラリーから直接的に、本開示のポリヌクレオチドおよび関連する遺伝子の配列を増幅することができる。ＰＣＲおよび他のインビトロ増幅方法はまた、例えば、発現すべきタンパク質をコードする核酸配列をクローン化する、サンプル中の所望のｍＲＮＡの存在を検出するため、核酸の配列決定のため、または他の目的のためのプローブとして用いるための核酸を作製するのに有用であり得る。インビトロ増幅方法を通して当業者を導くのに十分な技術の例は、Ｂｅｒｇｅｒ、上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、およびＡｕｓｕｂｅｌ、上記、ならびにＭｕｌｌｉｓらの米国特許第４，６８３，２０２号（１９８７）、およびＩｎｎｉｓらのＰＣＲ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  Ａ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｅｄｓ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ  Ｉｎｃ．，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に見られる。ゲノムＰＣＲ増幅用の市販のキットは、当該技術分野において既知である。例えば、Ａｄｖａｎｔａｇｅ−ＧＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃ  ＰＣＲ  Ｋｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）を参照されたい。加えて、例えば、Ｔ４遺伝子３２タンパク質（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ  Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、長いＰＣＲ産物の収率を改善することができる。
【０３８３】
核酸を構築するための合成方法
本開示の単離された核酸はまた、既知の方法による直接化学合成によって調製され得る（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照のこと）。化学合成は、一般に、相補的配列とのハイブリダイゼーション、または一本鎖をテンプレートとして使用するＤＮＡポリメラーゼでの重合によって、二本鎖ＤＮＡに変換され得る一本鎖オリゴヌクレオチドを生成する。当業者は、ＤＮＡの化学合成が約１００以上の塩基の配列に限定され得るが、より長い配列は、より短い配列のライゲーションによって得ることができることを認識するであろう。
【０３８４】
組換え発現カセット
本開示はさらに、本開示の核酸を含む組換え発現カセットを提供する。本開示の核酸配列、例えば、本開示のＣＡＲＴｙｒｉｎをコードするｃＤＮＡまたはゲノム配列を使用して、少なくとも１つの所望の宿主細胞に導入することができる組換え発現カセットを構築することができる。組換え発現カセットは、典型的には、意図される宿主細胞においてポリヌクレオチドの転写を導く、転写開始調節配列に作動可能に連結された本開示のポリヌクレオチドを含むであろう。異種および非異種（すなわち、内因性）プロモーターの両方を使用して、本開示の核酸の発現を導くことができる。
【０３８５】
いくつかの実施形態において、プロモーター、エンハンサー、または他のエレメントとして機能する単離された核酸を、本開示のポリヌクレオチドの発現を上方または下方調節するために、本開示のポリヌクレオチドの非異種形の適切な位置（上流、下流、またはイントロン内）に導入することができる。例えば、内因性プロモーターを、突然変異、欠失、および／または置換によってインビボまたはインビトロで変化させることができる。
【０３８６】
ベクターおよび宿主細胞
本開示はまた、本開示の単離された核酸分子を含むベクター、組換えベクターで遺伝子操作された宿主細胞、および当該技術分野において周知であるように、組換え技術による少なくとも１つの配列の産生に関する。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記を参照されたく、各々が、参照により全体が本明細書に組み込まれる。
【０３８７】
例えば、ＰＢ−ＥＦ１ａベクターを使用することができる。ベクターは、以下のヌクレオチド配列を含む：
ｔｇｔａｃａｔａｇａｔｔａａｃｃｃｔａｇａａａｇａｔａａｔｃａｔａｔｔｇｔｇａｃｇｔａｃｇｔｔａａａｇａｔａａｔｃａｔｇｃｇｔａａａａｔｔｇａｃｇｃａｔｇｔｇｔｔｔｔａｔｃｇｇｔｃｔｇｔａｔａｔｃｇａｇｇｔｔｔａｔｔｔａｔｔａａｔｔｔｇａａｔａｇａｔａｔｔａａｇｔｔｔｔａｔｔａｔａｔｔｔａｃａｃｔｔａｃａｔａｃｔａａｔａａｔａａａｔｔｃａａｃａａａｃａａｔｔｔａｔｔｔａｔｇｔｔｔａｔｔｔａｔｔｔａｔｔａａａａａａａａａｃａａａａａｃｔｃａａａａｔｔｔｃｔｔｃｔａｔａａａｇｔａａｃａａａａｃｔｔｔｔａｔｃｇａａｔａｃｃｔｇｃａｇｃｃｃｇｇｇｇｇａｔｇｃａｇａｇｇｇａｃａｇｃｃｃｃｃｃｃｃｃａａａｇｃｃｃｃｃａｇｇｇａｔｇｔａａｔｔａｃｇｔｃｃｃｔｃｃｃｃｃｇｃｔａｇｇｇｇｇｃａｇｃａｇｃｇａｇｃｃｇｃｃｃｇｇｇｇｃｔｃｃｇｃｔｃｃｇｇｔｃｃｇｇｃｇｃｔｃｃｃｃｃｃｇｃａｔｃｃｃｃｇａｇｃｃｇｇｃａｇｃｇｔｇｃｇｇｇｇａｃａｇｃｃｃｇｇｇｃａｃｇｇｇｇａａｇｇｔｇｇｃａｃｇｇｇａｔｃｇｃｔｔｔｃｃｔｃｔｇａａｃｇｃｔｔｃｔｃｇｃｔｇｃｔｃｔｔｔｇａｇｃｃｔｇｃａｇａｃａｃｃｔｇｇｇｇｇｇａｔａｃｇｇｇｇａａａａｇｔｔｇａｃｔｇｔｇｃｃｔｔｔｃｇａｔｃｇａａｃｃａｔｇｇａｃａｇｔｔａｇｃｔｔｔｇｃａａａｇａｔｇｇａｔａａａｇｔｔｔｔａａａｃａｇａｇａｇｇａａｔｃｔｔｔｇｃａｇｃｔａａｔｇｇａｃｃｔｔｃｔａｇｇｔｃｔｔｇａａａｇｇａｇｔｇｇｇａａｔｔｇｇｃｔｃｃｇｇｔｇｃｃｃｇｔｃａｇｔｇｇｇｃａｇａｇｃｇｃａｃａｔｃｇｃｃｃａｃａｇｔｃｃｃｃｇａｇａａｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｃｇｇｃａａｔｔｇａａｃｃｇｇｔｇｃｃｔａｇａｇａａｇｇｔｇｇｃｇｃｇｇｇｇｔａａａｃｔｇｇｇａａａｇｔｇａｔｇｔｃｇｔｇｔａｃｔｇｇｃｔｃｃｇｃｃｔｔｔｔｔｃｃｃｇａｇｇｇｔｇｇｇｇｇａｇａａｃｃｇｔａｔａｔａａｇｔｇｃａｇｔａｇｔｃｇｃｃｇｔｇａａｃｇｔｔｃｔｔｔｔｔｃｇｃａａｃｇｇｇｔｔｔｇｃｃｇｃｃａｇａａｃａｃａｇｇｔａａｇｔｇｃｃｇｔｇｔｇｔｇｇｔｔｃｃｃｇｃｇｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｔｔｔａｃｇｇｇｔｔａｔｇｇｃｃｃｔｔｇｃｇｔｇｃｃｔｔｇａａｔｔａｃｔｔｃｃａｃｃｔｇｇｃｔｇｃａｇｔａｃｇｔｇａｔｔｃｔｔｇａｔｃｃｃｇａｇｃｔｔｃｇｇｇｔｔｇｇａａｇｔｇｇｇｔｇｇｇａｇａｇｔｔｃｇａｇｇｃｃｔｔｇｃｇｃｔｔａａｇｇａｇｃｃｃｃｔｔｃｇｃｃｔｃｇｔｇｃｔｔｇａｇｔｔｇａｇｇｃｃｔｇｇｃｃｔｇｇｇｃｇｃｔｇｇｇｇｃｃｇｃｃｇｃｇｔｇｃｇａａｔｃｔｇｇｔｇｇｃａｃｃｔｔｃｇｃｇｃｃｔｇｔｃｔｃｇｃｔｇｃｔｔｔｃｇａｔａａｇｔｃｔｃｔａｇｃｃａｔｔｔａａａａｔｔｔｔｔｇａｔｇａｃｃｔｇｃｔｇｃｇａｃｇｃｔｔｔｔｔｔｔｃｔｇｇｃａａｇａｔａｇｔｃｔｔｇｔａａａｔｇｃｇｇｇｃｃａａｇａｔｃｔｇｃａｃａｃｔｇｇｔａｔｔｔｃｇｇｔｔｔｔｔｇｇｇｇｃｃｇｃｇｇｇｃｇｇｃｇａｃｇｇｇｇｃｃｃｇｔｇｃｇｔｃｃｃａｇｃｇｃａｃａｔｇｔｔｃｇｇｃｇａｇｇｃｇｇｇｇｃｃｔｇｃｇａｇｃｇｃｇｇｃｃａｃｃｇａｇａａｔｃｇｇａｃｇｇｇｇｇｔａｇｔｃｔｃａａｇｃｔｇｇｃｃｇｇｃｃｔｇｃｔｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇｇｃｃｔｃｇｃｇｃｃｇｃｃｇｔｇｔａｔｃｇｃｃｃｃｇｃｃｃｔｇｇｇｃｇｇｃａａｇｇｃｔｇｇｃｃｃｇｇｔｃｇｇｃａｃｃａｇｔｔｇｃｇｔｇａｇｃｇｇａａａｇａｔｇｇｃｃｇｃｔｔｃｃｃｇｇｃｃｃｔｇｃｔｇｃａｇｇｇａｇｃｔｃａａａａｔｇｇａｇｇａｃｇｃｇｇｃｇｃｔｃｇｇｇａｇａｇｃｇｇｇｃｇｇｇｔｇａｇｔｃａｃｃｃａｃａｃａａａｇｇａａａａｇｇｇｃｃｔｔｔｃｃｇｔｃｃｔｃａｇｃｃｇｔｃｇｃｔｔｃａｔｇｔｇａｃｔｃｃａｃｇｇａｇｔａｃｃｇｇｇｃｇｃｃｇｔｃｃａｇｇｃａｃｃｔｃｇａｔｔａｇｔｔｃｔｃｇａｇｃｔｔｔｔｇｇａｇｔａｃｇｔｃｇｔｃｔｔｔａｇｇｔｔｇｇｇｇｇｇａｇｇｇｇｔｔｔｔａｔｇｃｇａｔｇｇａｇｔｔｔｃｃｃｃａｃａｃｔｇａｇｔｇｇｇｔｇｇａｇａｃｔｇａａｇｔｔａｇｇｃｃａｇｃｔｔｇｇｃａｃｔｔｇａｔｇｔａａｔｔｃｔｃｃｔｔｇｇａａｔｔｔｇｃｃｃｔｔｔｔｔｇａｇｔｔｔｇｇａｔｃｔｔｇｇｔｔｃａｔｔｃｔｃａａｇｃｃｔｃａｇａｃａｇｔｇｇｔｔｃａａａｇｔｔｔｔｔｔｔｃｔｔｃｃａｔｔｔｃａｇｇｔｇｔｃｇｔｇａｇａａｔｔｃｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａｇｇｇｔｇｔｇｃｔｇｔｃｔｃａｔｃａｔｔｔｔｇｇｃａａａｇａｔｔｇｇｃｃａｃｃａａｇｃｔｔｇｔｃｃｔｇｃａｇｇａｇｇｇｔｃｇａｃｇｃｃｔｃｔａｇａｃｇｇｇｃｇｇｃｃｇｃｔｃｃｇｇａｔｃｃａｃｇｇｇｔａｃｃｇａｔｃａｃａｔａｔｇｃｃｔｔｔａａｔｔａａａｃａｃｔａｇｔｔｃｔａｔａｇｔｇｔｃａｃｃｔａａａｔｔｃｃｃｔｔｔａｇｔｇａｇｇｇｔｔａａｔｇｇｃｃｇｔａｇｇｃｃｇｃｃａｇａａｔｔｇｇｇｔｃｃａｇａｃａｔｇａｔａａｇａｔａｃａｔｔｇａｔｇａｇｔｔｔｇｇａｃａａａｃｃａｃａａｃｔａｇａａｔｇｃａｇｔｇａａａａａａａｔｇｃｔｔｔａｔｔｔｇｔｇａａａｔｔｔｇｔｇａｔｇｃｔａｔｔｇｃｔｔｔａｔｔｔｇｔａａｃｃａｔｔａｔａａｇｃｔｇｃａａｔａａａｃａａｇｔｔａａｃａａｃａａｃａａｔｔｇｃａｔｔｃａｔｔｔｔａｔｇｔｔｔｃａｇｇｔｔｃａｇｇｇｇｇａｇｇｔｇｔｇｇｇａｇｇｔｔｔｔｔｔｃｇｇａｃｔｃｔａｇｇａｃｃｔｇｃｇｃａｔｇｃｇｃｔｔｇｇｃｇｔａａｔｃａｔｇｇｔｃａｔａｇｃｔｇｔｔｔｃｃｔｇｔｔｔｔｃｃｃｃｇｔａｔｃｃｃｃｃｃａｇｇｔｇｔｃｔｇｃａｇｇｃｔｃａａａｇａｇｃａｇｃｇａｇａａｇｃｇｔｔｃａｇａｇｇａａａｇｃｇａｔｃｃｃｇｔｇｃｃａｃｃｔｔｃｃｃｃｇｔｇｃｃｃｇｇｇｃｔｇｔｃｃｃｃｇｃａｃｇｃｔｇｃｃｇｇｃｔｃｇｇｇｇａｔｇｃｇｇｇｇｇｇａｇｃｇｃｃｇｇａｃｃｇｇａｇｃｇｇａｇｃｃｃｃｇｇｇｃｇｇｃｔｃｇｃｔｇｃｔｇｃｃｃｃｃｔａｇｃｇｇｇｇｇａｇｇｇａｃｇｔａａｔｔａｃａｔｃｃｃｔｇｇｇｇｇｃｔｔｔｇｇｇｇｇｇｇｇｇｃｔｇｔｃｃｃｔｃｔｃａｃｃｇｃｇｇｔｇｇａｇｃｔｃｃａｇｃｔｔｔｔｇｔｔｃｇａａｔｔｇｇｇｇｃｃｃｃｃｃｃｔｃｇａｇｇｇｔａｔｃｇａｔｇａｔａｔｃｔａｔａａｃａａｇａａａａｔａｔａｔａｔａｔａａｔａａｇｔｔａｔｃａｃｇｔａａｇｔａｇａａｃａｔｇａａａｔａａｃａａｔａｔａａｔｔａｔｃｇｔａｔｇａｇｔｔａａａｔｃｔｔａａａａｇｔｃａｃｇｔａａａａｇａｔａａｔｃａｔｇｃｇｔｃａｔｔｔｔｇａｃｔｃａｃｇｃｇｇｔｃｇｔｔａｔａｇｔｔｃａａａａｔｃａｇｔｇａｃａｃｔｔａｃｃｇｃａｔｔｇａｃａａｇｃａｃｇｃｃｔｃａｃｇｇｇａｇｃｔｃｃａａｇｃｇｇｃｇａｃｔｇａｇａｔｇｔｃｃｔａａａｔｇｃａｃａｇｃｇａｃｇｇａｔｔｃｇｃｇｃｔａｔｔｔａｇａａａｇａｇａｇａｇｃａａｔａｔｔｔｃａａｇａａｔｇｃａｔｇｃｇｔｃａａｔｔｔｔａｃｇｃａｇａｃｔａｔｃｔｔｔｃｔａｇｇｇｔｔａａｔｃｔａｇｃｔａｇｃｃｔｔａａｇｇｇｃｇｃｃｔａｔｔｇｃｇｔｔｇｃｇｃｔｃａｃｔｇｃｃｃｇｃｔｔｔｃｃａｇｔｃｇｇｇａａａｃｃｔｇｔｃｇｔｇｃｃａｇｃｔｇｃａｔｔａａｔｇａａｔｃｇｇｃｃａａｃｇｃｇｃｇｇｇｇａｇａｇｇｃｇｇｔｔｔｇｃｇｔａｔｔｇｇｇｃｇｃｔｃｔｔｃｃｇｃｔｔｃｃｔｃｇｃｔｃａｃｔｇａｃｔｃｇｃｔｇｃｇｃｔｃｇｇｔｃｇｔｔｃｇｇｃｔｇｃｇｇｃｇａｇｃｇｇｔａｔｃａｇｃｔｃａｃｔｃａａａｇｇｃｇｇｔａａｔａｃｇｇｔｔａｔｃｃａｃａｇａａｔｃａｇｇｇｇａｔａａｃｇｃａｇｇａａａｇａａｃａｔｇａｃｃａａａａｔｃｃｃｔｔａａｃｇｔｇａｇｔｔｔｔｃｇｔｔｃｃａｃｔｇａｇｃｇｔｃａｇａｃｃｃｃｇｔａｇａａａａｇａｔｃａａａｇｇａｔｃｔｔｃｔｔｇａｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｃｔｇｃｇｃｇｔａａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｔｇｃａａａｃａａａａａａａｃｃａｃｃｇｃｔａｃｃａｇｃｇｇｔｇｇｔｔｔｇｔｔｔｇｃｃｇｇａｔｃａａｇａｇｃｔａｃｃａａｃｔｃｔｔｔｔｔｃｃｇａａｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｃａｇｃａｇａｇｃｇｃａｇａｔａｃｃａａａｔａｃｔｇｔｔｃｔｔｃｔａｇｔｇｔａｇｃｃｇｔａｇｔｔａｇｇｃｃａｃｃａｃｔｔｃａａｇａａｃｔｃｔｇｔａｇｃａｃｃｇｃｃｔａｃａｔａｃｃｔｃｇｃｔｃｔｇｃｔａａｔｃｃｔｇｔｔａｃｃａｇｔｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃａｇｔｇｇｃｇａｔａａｇｔｃｇｔｇｔｃｔｔａｃｃｇｇｇｔｔｇｇａｃｔｃａａｇａｃｇａｔａｇｔｔａｃｃｇｇａｔａａｇｇｃｇｃａｇｃｇｇｔｃｇｇｇｃｔｇａａｃｇｇｇｇｇｇｔｔｃｇｔｇｃａｃａｃａｇｃｃｃａｇｃｔｔｇｇａｇｃｇａａｃｇａｃｃｔａｃａｃｃｇａａｃｔｇａｇａｔａｃｃｔａｃａｇｃｇｔｇａｇｃｔａｔｇａｇａａａｇｃｇｃｃａｃｇｃｔｔｃｃｃｇａａｇｇｇａｇａａａｇｇｃｇｇａｃａｇｇｔａｔｃｃｇｇｔａａｇｃｇｇｃａｇｇｇｔｃｇｇａａｃａｇｇａｇａｇｃｇｃａｃｇａｇｇｇａｇｃｔｔｃｃａｇｇｇｇｇａａａｃｇｃｃｔｇｇｔａｔｃｔｔｔａｔａｇｔｃｃｔｇｔｃｇｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｃｃｔｃｔｇａｃｔｔｇａｇｃｇｔｃｇａｔｔｔｔｔｇｔｇａｔｇｃｔｃｇｔｃａｇｇｇｇｇｇｃｇｇａｇｃｃｔａｔｇｇａａａａａｃｇｃｃａｇｃａａｃｇｃｇｇｃｃｔｔｔｔｔａｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｃａｃａｔｇａｇａｔｔａｔｃａａａａａｇｇａｔｃｔｔｃａｃｃｔａｇａｔｃｃｔｔｔｔａａａｔｔａａａａａｔｇａａｇｔｔｔｔａａａｔｃａａｔｃｔａａａｇｔａｔａｔａｔｇａｇｔａａａｃｔｔｇｇｔｃｔｇａｃａｇｔｃａｇａａｇａａｃｔｃｇｔｃａａｇａａｇｇｃｇａｔａｇａａｇｇｃｇａｔｇｃｇｃｔｇｃｇａａｔｃｇｇｇａｇｃｇｇｃｇａｔａｃｃｇｔａａａｇｃａｃｇａｇｇａａｇｃｇｇｔｃａｇｃｃｃａｔｔｃｇｃｃｇｃｃａａｇｃｔｃｔｔｃａｇｃａａｔａｔｃａｃｇｇｇｔａｇｃｃａａｃｇｃｔａｔｇｔｃｃｔｇａｔａｇｃｇｇｔｃｃｇｃｃａｃａｃｃｃａｇｃｃｇｇｃｃａｃａｇｔｃｇａｔｇａａｔｃｃａｇａａａａｇｃｇｇｃｃａｔｔｔｔｃｃａｃｃａｔｇａｔａｔｔｃｇｇｃａａｇｃａｇｇｃａｔｃｇｃｃａｔｇｇｇｔｃａｃｇａｃｇａｇａｔｃｃｔｃｇｃｃｇｔｃｇｇｇｃａｔｇｃｔｃｇｃｃｔｔｇａｇｃｃｔｇｇｃｇａａｃａｇｔｔｃｇｇｃｔｇｇｃｇｃｇａｇｃｃｃｃｔｇａｔｇｃｔｃｔｔｃｇｔｃｃａｇａｔｃａｔｃｃｔｇａｔｃｇａｃａａｇａｃｃｇｇｃｔｔｃｃａｔｃｃｇａｇｔａｃｇｔｇｃｔｃｇｃｔｃｇａｔｇｃｇａｔｇｔｔｔｃｇｃｔｔｇｇｔｇｇｔｃｇａａｔｇｇｇｃａｇｇｔａｇｃｃｇｇａｔｃａａｇｃｇｔａｔｇｃａｇｃｃｇｃｃｇｃａｔｔｇｃａｔｃａｇｃｃａｔｇａｔｇｇａｔａｃｔｔｔｃｔｃｇｇｃａｇｇａｇｃａａｇｇｔｇａｇａｔｇａｃａｇｇａｇａｔｃｃｔｇｃｃｃｃｇｇｃａｃｔｔｃｇｃｃｃａａｔａｇｃａｇｃｃａｇｔｃｃｃｔｔｃｃｃｇｃｔｔｃａｇｔｇａｃａａｃｇｔｃｇａｇｃａｃａｇｃｔｇｃｇｃａａｇｇａａｃｇｃｃｃｇｔｃｇｔｇｇｃｃａｇｃｃａｃｇａｔａｇｃｃｇｃｇｃｔｇｃｃｔｃｇｔｃｔｔｇｃａｇｔｔｃａｔｔｃａｇｇｇｃａｃｃｇｇａｃａｇｇｔｃｇｇｔｃｔｔｇａｃａａａａａｇａａｃｃｇｇｇｃｇｃｃｃｃｔｇｃｇｃｔｇａｃａｇｃｃｇｇａａｃａｃｇｇｃｇｇｃａｔｃａｇａｇｃａｇｃｃｇａｔｔｇｔｃｔｇｔｔｇｔｇｃｃｃａｇｔｃａｔａｇｃｃｇａａｔａｇｃｃｔｃｔｃｃａｃｃｃａａｇｃｇｇｃｃｇｇａｇａａｃｃｔｇｃｇｔｇｃａａｔｃｃａｔｃｔｔｇｔｔｃａａｔｃａｔａａｔａｔｔａｔｔｇａａｇｃａｔｔｔａｔｃａｇｇｇｔｔｃｇｔｃｔｃｇｔｃｃｃｇｇｔｃｔｃｃｔｃｃｃａａｔｇｃａｔｇｔｃａａｔａｔｔｇｇｃｃａｔｔａｇｃｃａｔａｔｔａｔｔｃａｔｔｇｇｔｔａｔａｔａｇｃａｔａａａｔｃａａｔａｔｔｇｇｃｔａｔｔｇｇｃｃａｔｔｇｃａｔａｃｇｔｔｇｔａｔｃｔａｔａｔｃａｔａａｔａ（配列番号１７０３６）
【０３８８】
ポリヌクレオチドは、任意選択で、宿主中で増殖のための選択可能なマーカーを含むベクターに結合され得る。一般的に、プラスミドベクターは、リン酸カルシウム沈殿物などの沈殿物、または荷電した脂質との複合体に導入される。ベクターがウイルスである場合、適切なパッケージング細胞株を使用してインビトロでパッケージングし、その後、宿主細胞に形質導入することができる。
【０３８９】
ＤＮＡ挿入物は、適切なプロモーターに作動可能に連結されるべきである。発現構築物は、転写開始、終結のための部位、および転写された領域において、翻訳のためのリボソーム結合部位をさらに含むであろう。構築物によって発現される成熟転写物のコード部分は、好ましくは、翻訳されるべきｍＲＮＡの最後に適切に位置する開始および終止コドン（例えば、ＵＡＡ、ＵＧＡ、またはＵＡＧ）で始まる翻訳を含み、哺乳動物または真核生物細胞の発現では、ＵＡＡおよびＵＡＧが好ましい。
【０３９０】
発現ベクターは、好ましくは、しかし任意選択で、少なくとも１つの選択可能なマーカーを含む。そのようなマーカーには、例えば、真核細胞培養のためのアンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ  ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、ミコフェノール酸またはグルタミン合成酵素（ＧＳ、米国特許第５，１２２，４６４号、同第５，７７０，３５９号、同第５，８２７，７３９号）、ブラスチシジン（ｂｓｄ遺伝子）、耐性遺伝子、ならびにＥ．ｃｏｌｉおよび他の細菌または原核生物での培養のためのアンピシリン、ゼオシン（Ｓｈ  ｂｌａ遺伝子）、ピューロマイシン（ｐａｃ遺伝子）、ハイグロマイシンＢ（ｈｙｇＢ遺伝子）、Ｇ４１８／ジェネティシン（ｎｅｏ遺伝子）、カナマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、カルベニシリン、ブレオマイシン、エリスロマイシン、ポリミキシンＢ、またはテトラサイクリン耐性遺伝子が含まれるが、これらに限定されない（上記特許は、参照により全体が本明細書に組み込まれる）。上記の宿主細胞のための適切な培養培地および条件は、当該技術分野において既知である。好適なベクターは、当業者に容易に明らかであろう。宿主細胞へのベクター構築物の導入は、リン酸カルシウムトランスフェクション、ＤＥＡＥ−デキストランに媒介したトランスフェクション、カチオン性脂質に媒介したトランスフェクション、エレクトロポレーション、形質導入、感染または他の既知の方法によって達成され得る。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、第１〜４章および第１６〜１８章、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１、９、１３、１５、１６章などの当該技術分野において記載される。
【０３９１】
発現ベクターは、好ましくは、しかし任意選択で、本開示の組成物および方法によって改変された細胞の単離のための少なくとも１つの選択可能な細胞表面マーカーを含む。本開示の選択可能な細胞表面マーカーは、細胞または細胞のサブセットを別の定義された細胞のサブセットと区別する、表面タンパク質、糖タンパク質、またはタンパク質の群を含む。好ましくは、選択可能な細胞表面マーカーは、本開示の組成物または方法によって改変された細胞を、本開示の組成物または方法によって改変されていない細胞と区別する。そのような細胞表面マーカーには、例えば、「表面抗原分類（ｃｌｕｓｔｅｒ  ｏｆ  ｄｅｓｉｇｎａｔｉｏｎ）」、または「分類決定基（ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）」タンパク質（しばしば、「ＣＤ」と略記される）、例えば、切断型または完全長形態のＣＤ１９、ＣＤ２７１、ＣＤ３４、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、ＣＤ５２、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。細胞表面マーカーは、自殺遺伝子マーカーＲＱＲ８（Ｐｈｉｌｉｐ  Ｂ  ｅｔ  ａｌ．Ｂｌｏｏｄ．２０１４  Ａｕｇ  ２１；１２４（８）：１２７７−８７）をさらに含む。
【０３９２】
発現ベクターは、好ましくは、しかし任意選択で、本開示の組成物および方法によって改変された細胞を単離するための少なくとも１つの選択可能な薬物耐性マーカーを含むであろう。本開示の選択可能な薬物耐性マーカーは、野生型または変異型のＮｅｏ、ＴＹＭＳ、ＦＲＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＭＤＲ１、ＡＬＤＨ１、ＮＫＸ２．２、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０３９３】
本開示の少なくとも１つの配列は、融合タンパク質などの改変された形態で発現され得、分泌シグナルだけでなく、さらなる異種の機能性領域も含み得る。例えば、さらなるアミノ酸の領域、特に荷電アミノ酸の領域を、配列のＮ末端に付加させて、精製中またはその後の取り扱いおよび保管中の宿主細胞における安定性および存続を改善することができる。また、ペプチド部分を本開示の配列に付加させて、精製を助長することができる。そのような領域は、配列またはその少なくとも１つの断片の最終調製の前に除去することができる。そのような方法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、上記、第１７．２９〜１７．４２章および第１８．１〜１８．７４章、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第１６、１７、および１８章などの多くの標準的な実験室マニュアルに記載されている。
【０３９４】
当業者は、本開示のタンパク質をコードする核酸の発現に利用可能な多数の発現系を熟知している。あるいは、本開示の核酸を、本開示の内因性ＤＮＡを含む宿主細胞において（操作によって）オンにすることによって、宿主細胞において発現させることができる。そのような方法は、例えば、米国特許第５，５８０，７３４号、同第５，６４１，６７０号、同第５，７３３，７４６号、および同第５，７３３，７６１号（参照により本明細書に全体が組み込まれる）に記載されるように、当該技術分野において周知である。
【０３９５】
タンパク質、それらの特定の部分、または変異体の産生に有用な実例となる細胞培養物は、当該技術分野において既知である、細菌、酵母、および哺乳動物細胞である。哺乳動物細胞系は、しばしば、細胞の単層の形態であるが、哺乳動物細胞懸濁物またはバイオリアクターを使用することもできる。無傷のグリコシル化タンパク質を発現することができる多数の好適な宿主細胞株が、当該技術分野において開発されており、それらは、ＣＯＳ−１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６５０）、ＣＯＳ−７（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１６５１）、ＨＥＫ２９３、ＢＨＫ２１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−１０）、ＣＨＯ（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ  １６１０）およびＢＳＣ−１（例えば、ＡＴＣＣ  ＣＲＬ−２６）細胞株、Ｃｏｓ−７細胞、ＣＨＯ細胞、ｈｅｐ  Ｇ２細胞、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３、ＳＰ２／０−Ａｇ１４、２９３細胞、ＨｅＬａ細胞などを含み、これらは、例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖａ．（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）から容易に入手可能である。好ましい宿主細胞は、骨髄腫およびリンパ腫細胞などのリンパ系起源の細胞を含む。特に好ましい宿主細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｇ８．６５３細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１５８０）およびＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１８５１）である。特に好ましい実施形態において、組換え細胞は、Ｐ３Ｘ６３Ａｂ８．６５３またはＳＰ２／０−Ａｇ１４細胞である。
【０３９６】
これらの細胞の発現ベクターは、複製起点、プロモーター（例えば、後期または早期ＳＶ４０プロモーター、ＣＭＶプロモーター（米国特許第５，１６８，０６２号、同第５，３８５，８３９号）、ＨＳＶ  ｔｋプロモーター、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター（米国特許第５，２６６，４９１号）、少なくとも１つのヒトプロモーター、エンハンサー、および／またはプロセシング情報部位、例えば、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位（例えば、ＳＶ４０ラージＴ  ＡｇポリＡ付加部位）、ならびに転写終結配列などであるが、これらに限定されない、発現制御配列のうちの１つ以上を含むことができる。例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、上記、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、上記を参照されたい。本開示の核酸またはタンパク質の産生に有用な他の細胞は、既知であり、および／または例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｔｙｐｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ  Ｃａｔａｌｏｇｕｅ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ（ｗｗｗ．ａｔｃｃ．ｏｒｇ）、もしくは他の既知もしくは商業的供給源から入手可能である。
【０３９７】
真核生物の宿主細胞が用いられるとき、ポリアデニル化または転写終結配列が、通常はベクターに組み込まれる。終結配列の例は、ウシ成長ホルモン遺伝子からのポリアデニル化配列である。転写物の正確なスプライシングのための配列も含めることができる。スプライシング配列の例は、ＳＶ４０からのＶＰ１イントロンである（Ｓｐｒａｇｕｅ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．４５：７７３−７８１（１９８３））。加えて、宿主細胞における複製を制御するための遺伝子配列を、当該技術分野において既知であるように、ベクターに組み込むことができる。
【０３９８】
アミノ酸コード
本開示の組成物を構成するアミノ酸は、しばしば、短縮される。アミノ酸名は、当該技術分野において十分理解されているように、その１文字コード、その３文字コード、名称、または３つのヌクレオチドコドンによってアミノ酸を指定することによって示すことができる（Ａｌｂｅｒｔｓ，Ｂ．，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｔｈｅ  Ｃｅｌｌ，Ｔｈｉｒｄ  Ｅｄ．，Ｇａｒｌａｎｄ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９４を参照のこと）。本開示のＣＡＲＴｙｒｉｎは、本明細書で特定されるように、自発的もしくは突然変異および／またはヒトによる操作からの１つ以上のアミノ酸の置換、欠失、または付加を含むことができる。機能に不可欠である、本開示の組成物中のアミノ酸は、当該技術分野において既知の方法、例えば、部位特異的変異誘発またはアラニンスキャニング変異誘発によって同定することができる（例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ、上記、第８、１５章、Ｃｕｎｎｉｎｇｈａｍ  ａｎｄ  Ｗｅｌｌｓ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４４：１０８１−１０８５（１９８９））。後者の手順は、分子の残基ごとに単一のアラニン変異を導入する。次いで、結果として得られた変異体分子は、少なくとも１つの中和活性などであるが、これらに限定されない、生物学的活性について試験される。ＣＳＲまたはＣＡＲの結合に重要な部位は、結晶化、核磁気共鳴、または光親和性標識などの構造解析によって同定することができる（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２４：８９９−９０４（１９９２）およびｄｅ  Ｖｏｓ，ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２５５：３０６−３１２（１９９２））。
【０３９９】
当業者が理解するように、本開示は、本開示の少なくとも１つの生物学的に活性なタンパク質を含む。生物学的に活性なタンパク質は、天然（非合成）の、内因性の、または関連するおよび既知のタンパク質の比活性の少なくとも２０％、３０％、または４０％、好ましくは少なくとも５０％、６０％、または７０％、および最も好ましくは少なくとも８０％、９０％、または９５％〜９９％またはそれより高い、比活性を有する。酵素活性および基質特異性の尺度をアッセイおよび定量する方法は、当業者に周知である。
【０４００】
別の態様において、本開示は、有機部分の共有結合によって改変される、本明細書に記載のセンチリンおよび断片に関する。そのような改変は、改善された薬物動態特性（例えば、増加したインビボ血清半減期）を有するタンパク質断片を生成することができる。有機部分は、直鎖状もしくは分岐親水性ポリマー基、脂肪酸基、または脂肪酸エステル基であり得る。特定の実施形態において、親水性ポリマー基は、約８００〜約１２０，０００ダルトンの分子量を有することができ、ポリアルカングリコール（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリプロピレングリコール（ＰＰＧ））、炭水化物ポリマー、アミノ酸ポリマー、またはポリビニルピロリドンであり得、脂肪酸または脂肪酸エステル基は、約８〜約４０個の炭素原子を含むことができる。
【０４０１】
本開示の改変された配列および断片は、抗体に直接的または間接的に共有結合している１つ以上の有機部分を含むことができる。本開示の配列またはその断片に結合している各有機部分は、独立して、親水性ポリマー基、脂肪酸基、または脂肪酸エステル基であり得る。本明細書で使用される場合、「脂肪酸」という用語は、モノカルボン酸およびジカルボン酸を包含する。「親水性ポリマー基」は、この用語が本明細書で使用される場合、オクタンよりも水においてより可溶性である有機ポリマーを指す。例えば、ポリリジンは、オクタンよりも水においてより可溶性である。したがって、ポリリジンの共有結合によって改変された配列は、本開示により包含される。本開示の配列を改変するのに好適な親水性ポリマーは、直鎖状もしくは分岐であることができ、例えば、ポリアルカングリコール（例えば、ＰＥＧ、モノメトキシ−ポリエチレングリコール（ｍＰＥＧ）、ＰＰＧなど）、炭水化物（例えば、デキストラン、セルロース、オリゴ糖類、多糖類など）、親水性アミノ酸のポリマー（例えば、ポリリシン、ポリアルギニン、ポリアスパラギン酸エステル（ｐｏｌｙａｓｐａｒｔａｔｅ）など）、ポリアルカンオキシド（例えば、ポリエチレンオキシド、ポリプロピレンオキシドなど）、およびポリビニルピロリドンを含むことができる。好ましくは、本開示の配列を改変する親水性ポリマーは、別個の分子実体として約８００〜約１５０，０００ダルトンの分子量を有する。例えば、ＰＥＧ５０００およびＰＥＧ２０，０００（下付き文字は、ダルトンでのポリマーの平均分子量である）を使用することができる。親水性ポリマー基は、１〜約６個のアルキル、脂肪酸、または脂肪酸エステル基で置換することができる。脂肪酸または脂肪酸エステル基で置換された親水性ポリマーは、好適な方法を用いることによって調製することができる。例えば、アミン基を含むポリマーは、脂肪酸または脂肪酸エステルのカルボン酸塩にカップリングさせることができ、脂肪酸または脂肪酸エステル上の活性化されたカルボン酸塩（例えば、Ｎ，Ｎ−カルボニルジイミダゾールで活性化される）は、ポリマー上のヒドロキシル基にカップリングさせることができる。
【０４０２】
白血球アフェレーシス産物からのＴ細胞の分離
白血球アフェレーシス産物または血液は、閉鎖系および標準的な方法（例えば、ＣＯＢＥ  Ｓｐｅｃｔｒａ  Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ  Ｓｙｓｔｅｍ）を使用して、臨床現場で対象から収集され得る。好ましくは、産物は、標準的な白血球アフェレーシス収集バッグにおいて標準的な病院または機関の白血球アフェレーシス手順に従って採取される。例えば、本開示の方法の好ましい実施形態において、白血球アフェレーシス中に通常使用されるものに加えてさらなる抗凝固剤または血液添加物（ヘパリンなど）は含まれない。
【０４０３】
あるいは、白血球（ＷＢＣ）／末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）（Ｂｉｏｓａｆｅ  Ｓｅｐａｘ  ２（閉鎖／自動化）を使用）またはＴ細胞（ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）Ｐｒｏｄｉｇｙ（閉鎖／自動化）を使用）は、全血から直接単離することができる。しかしながら、特定の対象（例えば、癌と診断および／または癌の治療された対象）では、ＷＢＣ／ＰＢＭＣの収量は、全血から単離されたとき、白血球アフェレーシスによって単離されたときよりも著しく低くなり得る。
【０４０４】
白血球アフェレーシス手順および／または直接細胞単離手順はいずれも、本開示の任意の対象に使用することができる。
【０４０５】
白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物は、遮蔽された容器に充填され、臨床プロトコルでの使用が承認された標準的な病院または機関の血液採取手順に従って、制御された室温（＋１９℃〜＋２５℃）に維持されるべきである。白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物は、冷蔵されるべきではない。
【０４０６】
白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物の細胞濃度は、輸送中、１ｍＬ当たり０．２×１０9個の細胞を超えるべきではない。白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物の激しい混合は、避けるべきである。
【０４０７】
白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物を、例えば、一晩保管しなければならない場合、制御された室温（上記と同じ）に維持されなければならない。保管中、白血球搬出産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物の濃度は、１ｍＬあたり０．２×１０9個の細胞を超えてはならない。
【０４０８】
好ましくは、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物の細胞は、自己の血漿中で保存されるべきである。ある特定の実施形態において、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物の細胞濃度が、１ｍＬあたり０．２×１０9個の細胞よりも高い場合、産物は、自己の血漿で希釈されるべきである。
【０４０９】
好ましくは、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物は、標識および分離手順を開始するときに２４時間を過ぎてはならない。白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物は、閉鎖および／または自動化系（例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ）を使用して細胞標識のために処理および／または調製することができる。
【０４１０】
自動化系は、場合により、フィコレーション（ｆｉｃｏｌａｔｉｏｎ）、および／または細胞産物（例えば、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物）の洗浄によって、さらなるバフィーコート単離を行うことができる。おそらくフィコレーション、および／または細胞産物（例えば、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物および／またはＴ細胞組成物）の洗浄によって、さらなるバフィーコート単離を行うことができる。
【０４１１】
閉鎖および／または自動化系を使用して、Ｔ細胞単離（例えば、白血球アフェレーシス産物、血液、ＷＢＣ／ＰＢＭＣ組成物、および／またはＴ細胞組成物から）のために細胞を調製および標識することができる。
【０４１２】
ＷＢＣ／ＰＢＭＣには、直接ヌクレオフェクトしてもよいが（容易であり、追加のステップを保存する）、本開示の方法は、ヌクレオフェクションの前に最初にＴ細胞を単離するステップを含んでもよい。ＰＢＭＣに直接ヌクレオフェクトする容易な戦略は、ＣＳＲまたはＣＡＲシグナル伝達によって媒介される改変された細胞の選択的増大を必要とし、それ自体は、Ｔ細胞を機能的に消耗させることによって産物のインビボ効率を直接低減する劣った増大方法であることがわかっている。産物は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、単球、またはそれらの任意の組み合わせを含む改変された細胞の不均一な組成物であり得、これは患者ごとの産物の変動性を増加させ、投薬およびＣＲＳ管理をより困難にする。Ｔ細胞は、腫瘍抑制および死滅において主要なエフェクターであると考えられるため、自己の産物の製造のためのＴ細胞単離が、他のより不均一な組成物に優る顕著な利益をもたらし得る。
【０４１３】
Ｔ細胞は、一方向性の標識手順で標識した細胞の濃縮または標識した細胞の枯渇によって、直接単離することができるか、または二段階の標識手順で間接的に単離することができる。本開示の特定の濃縮戦略によれば、Ｔ細胞は、細胞収集バッグに、非標識細胞（非標的細胞）は、陰性画分バッグに採取することができる。本開示の濃縮戦略とは対照的に、非標識細胞（標的細胞）は、細胞収集バッグに採取され、標識細胞（非標的細胞）は、陰性画分バッグまたは非標的細胞バッグにそれぞれ採取される。選択試薬には、抗体でコーティングされたビーズが含まれ得るが、これに限定されない。抗体でコーティングされたビーズは、改変および／または増大ステップの前に除去され得るか、あるいは改変および／または増大ステップの前に細胞上に保持され得る。細胞マーカーの以下の非限定的な例のうちの１つ以上を、Ｔ細胞の単離に使用することができる：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、抗ビオチン、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３／ＣＤ１９、ＣＤ３／ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ２７１、ＣＤ３０４、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＣＲアルファ／ベータ、および／またはそれらの任意の組み合わせ。Ｔ細胞の単離のための方法は、Ｔ細胞の単離に使用することができる以下の細胞マーカーの非限定的な例のうちの１つ以上に特異的に結合するおよび／または検出可能に標識する１つ以上の試薬を含んでもよい：ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＤ２５、抗ビオチン、ＣＤ１ｃ、ＣＤ３／ＣＤ１９、ＣＤ３／ＣＤ５６、ＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ３４、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ５６、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ１３３、ＣＤ１３７、ＣＤ２７１、ＣＤ３０４、ＩＦＮ−ガンマ、ＴＣＲアルファ／ベータ、および／またはそれらの任意の組み合わせ。これらの試薬は、「適正製造基準」（「ＧＭＰ」）グレードであってもなくてもよい。試薬には、Ｔｈｅｒｍｏ  ＤｙｎａＢｅａｄｓおよびＭｉｌｔｅｎｙｉ  ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ製品を含み得るが、これらに限定されない。本開示のＴ細胞を単離する方法は、標識および／または単離ステップの複数回の反復を含んでもよい。本開示のＴ細胞を単離する方法の任意の時点で、望ましくない細胞および／または望ましくない細胞型は、望ましくない細胞および／または望ましくない細胞型の正または負に選択することによって本開示のＴ細胞産物組成物から枯渇され得る。本開示のＴ細胞産物組成物は、ＣＤ４、ＣＤ８、および／または別のＴ細胞マーカーを発現し得るさらなる細胞型を含有してもよい。
【０４１４】
Ｔ細胞のヌクレオフェクションの本開示の方法は、例えば、ヌクレオフェクション後にＴＣＲシグナル伝達を介して単離ステップまたは選択的増大ステップを含むＷＢＣ／ＰＢＭＣの集団または組成物のＴ細胞のヌクレオフェクションのプロセスにより、Ｔ細胞単離のステップを除外してもよい。
【０４１５】
ある特定の細胞集団は、Ｔ細胞の濃縮および／または分類の前または後に生または負の選択によって枯渇され得る。細胞産物組成物から枯渇され得る細胞組成物の例は、骨髄性細胞、ＣＤ２５＋調節Ｔ細胞（Ｔ  Ｒｅｇｓ）、樹状細胞、マクロファージ、赤血球、マスト細胞、ガンマ−デルタＴ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）様細胞（例えば、サイトカイン誘導キラー（ＣＩＫ）細胞）、誘導ナチュラルキラー（ｉＮＫ）Ｔ細胞、ＮＫ  Ｔ細胞、Ｂ細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。
【０４１６】
本開示のＴ細胞産物組成物は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞を含み得る。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、単離または選択手順中に別々の収集バッグに単離することができる。ＣＤ４＋  Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞は、さらに別々に処理され、または特定の比で再構成（同じ組成への組み合わせ）した後に処理することができる。
【０４１７】
ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞を再構成され得る特定の比は、使用された増大技術の型および有効性、細胞培地、および／またはＴ細胞産物組成物の増大に利用される成長条件に依存し得る。可能なＣＤ４＋：ＣＤ８＋比の例は、５０％：５０％、６０％：４０％、４０％：６０％  ７５％：２５％、および２５％：７５％を含むが、これらに限定されない。
【０４１８】
ＣＤ８＋  Ｔ細胞は、腫瘍細胞死滅に対して強力な能力を示すが、ＣＤ４＋  Ｔ細胞は、ＣＤ８＋  Ｔ細胞増殖能力および機能を支持するのに必要な多くのサイトカインを提供する。正常なドナーから単離されたＴ細胞は、主にＣＤ４＋であるため、Ｔ細胞産物の組成物は、ＣＤ４＋：ＣＤ８＋比に関してインビトロで人工的に調整され、そうでなければ、インビボで存在するであろうＣＤ８＋Ｔ細胞に対するＣＤ４＋Ｔ細胞の比が改善する。最適化された比率はまた、自己Ｔ細胞産物組成物のエクスビボ増大のためにも使用され得る。Ｔ細胞産物組成物の人工的に調整されたＣＤ４＋：ＣＤ８＋比を考慮して、本開示の産物組成物が、任意の内因的に存在するＴ細胞の集団と著しく異なり、著しくより大きな利点を提供することができることに注意することが重要である。
【０４１９】
Ｔ細胞単離のための好ましい方法は、手つかずの汎Ｔ細胞を産生する負の選択戦略を含み得、結果として得られるＴ細胞組成物は、操作されておらず、かつ内因的に存在するＴ細胞の種類／比を含有するＴ細胞を含むことを意味する。
【０４２０】
正または負の選択に使用することができる試薬には、磁性細胞分離ビーズが含まれるが、これらに限定されない。磁性細胞分離ビーズは、本開示のＴ細胞単離法の次のステップを実行する前に、ＣＤ４＋  Ｔ細胞、ＣＤ８＋  Ｔ細胞の選択された集団、、またはＣＤ４＋およびＣＤ８＋  Ｔ細胞の両方の混合された集団から除去または枯渇され得る。
【０４２１】
Ｔ細胞組成物およびＴ細胞産物組成物は、凍結保存、標準的なＴ細胞培養培地での悪寒、および／または遺伝子改変のために調製されてもよい。
【０４２２】
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物またはそれらの任意の部分は、高い回復、生存度、表現型、および／または機能的能力を有するヒト細胞を保管および回復させるのに最適化された標準的な凍結保存方法を使用して凍結保存することができる。市販の凍結保存培地および／またはプロトコルを使用することができる。本開示の凍結保存方法は、凍結関連毒性を低減するＤＭＳＯを含まない凍結保存剤（例えば、ＣｒｙｏＳＯｆｒｅｅ（商標）ＤＭＳＯ不含凍結保存培地）を含み得る。
【０４２３】
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、またはそれらの任意の部分は、培養培地中で保管され得る。本開示のＴ細胞培養培地は、細胞保管、細胞遺伝子改変、細胞表現型、および／または細胞増大のために最適化することができる。本開示のＴ細胞培養培地は、１つ以上の抗生物質を含むことができる。細胞培養培地内への抗生物質の包含が、トランスフェクション効率および／またはヌクレオフェクションによる遺伝子改変後の細胞収率を下げ得るため、特定の抗生物質（またはそれらの組み合わせ）およびこれらのそれぞれの濃度は、最適なトランスフェクション効率および／またはヌクレオフェクションによる遺伝子改変後の細胞収率のために変更することができる。
【０４２４】
本開示のＴ細胞培養培地は、血清を含むことができ、さらには、血清組成物および濃縮物は、最適な細胞結果のために変更することができる。ヒトＡＢ血清は、本開示のＴ細胞培養培地での使用のために企図されているが、ＦＢＳ／ＦＣＳは異種タンパク質を誘導し得るため、Ｔ細胞の培養のためにＦＢＳ／ＦＣＳよりも好ましい。血清は、培養物中のＴ細胞組成物が投与のために意図される対象の血液から単離されてもよく、したがって、本開示のＴ細胞培養培地は自己の血清を含むことができる。無血清培地または血清代替物もまた、本開示のＴ細胞培養培地で使用され得る。本開示のＴ細胞培養培地および方法のある特定の実施形態において、無血清培地または血清代替物は、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、および／または増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す、より健康な細胞を含むが、これらに限定されない、培地への異種血清の補充に優る利点を提供することができる。
【０４２５】
Ｔ細胞培養培地は、市販の細胞増殖培地を含むことができる。例示的な市販の細胞成長培地には、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ細胞増大培地ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ細胞増大培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ細胞増大培地、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４２６】
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、またはそれらの任意の部分は、遺伝子改変のために調製することができる。遺伝子改変のためのＴ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、またはそれらの任意の部分の調製は、細胞洗浄および／または所望のヌクレオフェクション緩衝液への再懸濁を含むことができる。凍結保存されたＴ細胞組成物は、ヌクレオフェクションによる遺伝子改変のために解凍および調製することができる。凍結保存された細胞は、標準的なまたは既知のプロトコルに従って解凍することができる。凍結保存された細胞の解凍および調製を最適化して、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、および／または増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す細胞を産生することができる。例えば、Ｇｒｉｆｏｌｓ  Ａｌｂｕｔｅｉｎ（２５％ヒトアルブミン）を解凍および／または調製プロセスで使用することができる。
【０４２７】
自己Ｔ細胞産物組成物の改変
Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、またはそれらの任意の部分は、例えば、エレクトロポレーションなどのヌクレオフェクション戦略を使用して遺伝子改変することができる。ヌクレオフェクトされる細胞の総数、ヌクレオフェクション反応の総容積、およびサンプル調製の正確なタイミングを最適化して、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、および／または増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す細胞を産生することができる。
【０４２８】
ヌクレオフェクションおよび／またはエレクトロポレーションは、例えば、Ｌｏｎｚａ  Ａｍａｘａ、ＭａｘＣｙｔｅ  ＰｕｌｓｅＡｇｉｌｅ、Ｈａｒｖａｒｄ  Ａｐｐａｒａｔｕｓ  ＢＴＸ、および／またはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｎｅｏｎを使用して達成することができる。プラスチックポリマー電極を含むが、これに限定されない、非金属電極系が、ヌクレオフェクションに好ましくあり得る。
【０４２９】
ヌクレオフェクションによる改変の前に、Ｔ細胞組成物、Ｔ細胞産物組成物、未刺激のＴ細胞組成物、休止Ｔ細胞組成物、またはそれらの任意の部分は、ヌクレオフェクション緩衝液に再懸濁されてもよい。本開示のヌクレオフェクション緩衝液は、市販のヌクレオフェクション緩衝液を含む。本開示のヌクレオフェクション緩衝液を最適化して、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、および／または増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す細胞を産生することができる。本開示のヌクレオフェクション緩衝液には、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＢＴＸｐｒｅｓ、Ａｍａｘａ  Ｎｕｃｌｅｏｆｏｃｔｅｒ、ヒトＴ細胞ヌクレオフェクション緩衝液、およびそれらの任意の組み合わせが含まれ得るが、これらに限定されない。本開示のヌクレオフェクション緩衝液は、１つ以上の補助的因子を含み、より優れた生存度を有し、より高い効率でヌクレオフェクトされ、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、および／または増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す細胞を産生することができる。例示的な補助的因子には、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的なサイトカイン、ケモカイン、およびインターロイキンには、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１ベータ／ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１２／ＩＬ−３５  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３２、ＩＬ−３２ベータ、ＩＬ−３２ガンマ、ＩＬ−３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、塩、無機物、代謝産物、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な塩、無機物、および代謝産物には、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＰＬＵＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトー��、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン−５、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ細胞増大培地ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ細胞増大培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ細胞増大培地、およびそれらの任意の組み合わせなどの培地が含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路、およびそれらの組み合わせの阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。例示的な阻害剤には、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ−７、ＮＦ−ＫＢ、１型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ−３、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、ＲＩＧ−１、ＩＰＳ−１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ−ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤（例えば、ＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、細胞送達を増強する、核送達または輸送を増強する、核への核酸の助長された輸送を増強する、染色体上の核酸の分解を増強する、および／またはＤＮＡを媒介した毒性を減少させるように、１つ以上の核酸を改変または安定化する試薬が含まれるが、これらに限定されない。１つ以上の核酸を改変または安定化する例示的な試薬には、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有するもしくは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４３０】
トランスポゾンおよびトランスポザーゼを含む転位試薬は、ヌクレオフェクション緩衝液への細胞の添加前、同時、または後に本開示のヌクレオフェクション反応に添加することができる（任意選択で、ヌクレオフェクション反応バイアルまたはキュベット内に含有される）。本開示のトランスポゾンは、プラスミドＤＮＡ、線状化プラスミドＤＮＡ、ＰＣＲ産物、ナノプラスミド、ＤＯＧＧＹＢＯＮＥ（商標）ＤＮＡ、ｍＲＮＡ鋳型、一本鎖または二本鎖ＤＮＡ、タンパク質−核酸の組み合わせ、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示のトランスポゾンは、１つ以上のＴＴＡＡ部位、１つ以上の逆方向末端反復（ＩＴＲ）、１つ以上の長い末端反復（ＬＴＲ）、１つ以上のインスレーター、１つ以上のプロモーター、１つ以上の完全長もしくは切断された遺伝子、１つ以上のポリＡシグナル、１つ以上の自己切断２Ａペプチド切断部位、１つ以上の配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、１つ以上のエンハンサー、１つ以上の調節因子、１つ以上の複製起点、およびそれらの任意の組み合わせをコードする、１つ以上の配列を含んでもよい。
【０４３１】
本開示のトランスポゾンは、１つ以上の完全長または短縮型遺伝子をコードする１つ以上の配列を含み得る。本開示のトランスポゾンによって導入される完全長および／または短縮型遺伝子は、シグナルペプチド、ヒンジ、膜貫通ドメイン、共刺激ドメイン、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、キメラＴ細胞受容体（ＣＡＲ−Ｔ、ＣＡＲＴｙｒｉｎ、もしくはＶＣＡＲ）、受容体、リガンド、サイトカイン、薬剤耐性遺伝子、腫瘍抗原、同種または自己抗原、酵素、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、蛍光タンパク質、ムテイン、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上をコードし得る。
【０４３２】
本開示のトランスポゾンは、水、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、培地、本開示の補助的因子、またはそれらの任意の組み合わせで調製され得る。
【０４３３】
本開示のトランスポゾンは、臨床的安全性を最適化し、および／または製造可能性を改善するために設計され得る。非限定的な例として、本開示のトランスポゾンは、不必要な配列または領域を除去するおよび／または非抗生物質の選択マーカーを含むことによって、臨床的安全性を最適化および／または製造可能性を改善するために設計され得る。本開示のトランスポゾンは、ＧＭＰグレードであってもなくてもよい。
【０４３４】
本開示のトランスポザーゼ酵素は、プラスミドＤＮＡ、ｍＲＮＡ、タンパク質、タンパク質−核酸の組み合わせ、またはそれらの任意の組み合わせのうちの１つ以上の配列によってコードされ得る。
【０４３５】
本開示のトランスポザーゼ酵素は、水、ＴＡＥ、ＴＢＥ、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、培地、本開示の補助的因子、またはそれらの任意の組み合わせで調製され得る。本開示のトランスポザーゼ酵素、またはそれらをコードもしくは送達する配列／構築物は、ＧＭＰグレードであってもなくてもよい。
【０４３６】
本開示のトランスポゾンおよびトランスポザーゼ酵素は、任意の手段によって細胞に送達され得る。
【０４３７】
本開示の組成物および方法は、本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼのプラスミドＤＮＡ（ｐＤＮＡ）による細胞への送達を含むが、送達のためのプラスミドの使用により、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼの細胞の染色体ＤＮＡへの組込みが可能になり、継続的なトランスポザーゼ発現をもたらすことができる。したがって、本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼ酵素は、染色体組み込みの可能性を排除するために、ｍＲＮＡまたはタンパク質のいずれかとして細胞に送達され得る。
【０４３８】
本開示のトランスポゾンおよびトランスポザーゼは、トランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼをヌクレオフェクション反応に導入する前に、単独で、または互いに組み合わせて事前にインキュベートされ得る。トランスポゾンおよびトランスポザーゼのそれぞれの絶対量、ならびに相対量、例えば、トランスポゾン対トランスポザーゼの比率を最適化することができる。
【０４３９】
任意選択で、バイアルまたはキュベット中でのヌクレオフェクション反応の調整に続いて、反応は、ヌクレオフェクター装置にロードされ、製造業者のプロトコルに従って電気パルスの送達のために活性化され得る。本開示のトランスポゾンおよび／またはトランスポザーゼ（または本開示のトランスポゾンおよび／もしくはトランスポザーゼをコードする配列）の細胞への送達に使用される電気パルス条件は、増強された生存度、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより優れた生存度、望ましい細胞表現型、および／または増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を有する細胞を産生するために最適化することができる。Ａｍａｘａヌクレオフェクター技術を使用するとき、Ａｍａｘａ  ２Ｂまたは４Ｄヌクレオフェクターの様々なヌクレオフェクションプログラムの各々が企図されている。
【０４４０】
本開示のヌクレオフェクション反応に続いて、細胞を、細胞培地に穏やかに添加することができる。例えば、Ｔ細胞がヌクレオフェクション反応を受けるとき、Ｔ細胞を、Ｔ細胞培地に添加することができる。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地は、任意の１つ以上の市販の培地を含み得る。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、より優れた生存度、より高いヌクレオフェクション効率を有し、ヌクレオフェクション後により優れた生存度を示し、より望ましい細胞表現型、および／または増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を示す細胞を産生するように最適化することができる。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒＴ細胞増大ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ細胞増大培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ細胞増大培地、およびそれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、生存度、ヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後の生存度、細胞表現型、および／または増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を増強させるために本開示の１つ以上の補助的因子を含み得る。例示的な補助的因子には、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、インターロイキン、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的なサイトカイン、ケモカイン、およびインターロイキンには、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１ベータ／ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１２／ＩＬ−３５  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３２、ＩＬ−３２ベータ、ＩＬ−３２ガンマ、ＩＬ−３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫＬ、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、塩、無機物、代謝産物、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な塩、無機物、および代謝産物には、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２��メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＰＬＵＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン−５、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｔｉＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ細胞増大培地ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ細胞増大培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ細胞増大培地、およびそれらの任意の組み合わせなどの培地が含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、アポトーシス経路、およびそれらの組み合わせの阻害剤が含まれるが、これらに限定されない。例示的な阻害剤には、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ−７、ＮＦ−ＫＢ、１型インターフェロン、炎症誘発性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ−３、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、ＲＩＧ−１、ＩＰＳ−１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ−ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤（例えば、ＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。例示的な補助的因子には、細胞送達を増強する、核送達または輸送を増強する、核への核酸の助長された輸送を増強する、染色体上の核酸の分解を増強する、および／またはＤＮＡを媒介した毒性を減少させるように、１つ以上の核酸を改変または安定化する試薬が含まれるが、これらに限定されない。１つ以上の核酸を改変または安定化する例示的な試薬には、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有するもしくは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、およびそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４４１】
本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、室温で使用され、または例えば、エンドポイントを含む３２℃〜３７℃の間まで予熱され得る。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、細胞の生存度および／または本開示のトランスポゾンもしくはその一部の発現を維持または増強する任意の温度まで予熱され得る。
【０４４２】
本開示のヌクレオフェクション後の細胞培地（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培地を含む）は、組織培養フラスコまたは皿、Ｇ−Ｒｅｘフラスコ、バイオリアクターもしくは細胞培養バッグ、または任意の他の標準的な容器中に含有され得る。本開示のヌクレオフェクション後の細胞培養物（本開示のヌクレオフェクション後のＴ細胞培養物を含む）は、静置しておいてもよく、または代わりにそれらを摂動してもよい（例えば、揺する、旋回する、または振盪する）。
【０４４３】
ヌクレオフェクション後の細胞培養物は、改変された細胞を含み得る。ヌクレオフェクション後のＴ細胞培養物は、改変されたＴ細胞を含み得る。本開示の改変された細胞は、規定した期間休止されるか、または例えばＴ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加により、増大を刺激されるかのいずれかであってもよい。ある特定の実施形態において、本開示の改変された細胞は、規定した期間休止されるか、または例えばＴ  Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加により、増大を直ちに刺激されるかのいずれかであってもよい。本開示の改変された細胞は、順応するのに十分な時間、転位が生じるのに十分な時間、および／または正もしくは負の選択のための十分な時間が与えられるように休止され得、増強された生存度、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより優れた生存度、望ましい細胞表現型、および／または増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を有する細胞を生じてもよい。本開示の改変された細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、またはそれより長い時間にわたって休止され得る。ある特定の実施形態において、本開示の遺伝的に改変された細胞は、例えば、一晩休止され得る。ある特定の態様において、一晩は、約１２時間である。本開示の改変された細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日またはそれより長い時間にわたって休止され得る。
【０４４４】
本開示の改変された細胞は、ヌクレオフェクション反応後、エキスパンダー（ｅｘｐａｎｄｅｒ）技術の追加前に選択することができる。改変された細胞を最適な選択のために、細胞は、少なくとも２〜１４日間ヌクレオフェクション後の細胞培地中で休止され、改変された細胞の同定（例えば、非改変された細胞から改変された細胞の分化）を助長することができる。
【０４４５】
本開示のトランスポゾンのヌクレオフェクションが成功した場合、ヌクレオフェクション後２４時間の早期に、ＣｅｎｔｙｒｉｎまたはＣＡＲＴｙｒｉｎおよび本開示の選択マーカーの発現は、改変されたＴ細胞で検出可能であり得る。トランスポゾンの染色体上の発現により、選択マーカーのみの発現は、非改変Ｔ細胞（トランスポゾンの組み込みが成功しなかった細胞）から改変されたＴ細胞（トランスポゾンの組み込みが成功した細胞）を区別することができない。トランスポゾンの染色体上の発現が、選択マーカーによる改変された細胞の検出をあいまいにするとき、ヌクレオフェクトされた細胞（改変および非改変細胞の両方）は、一定期間（例えば２〜１４日間）休止され、細胞の発現を終わらせ、またはすべての染色体上のトランスポゾン発現を喪失させることができる。この延長された休止期に続いて、改変されたＴ細胞のみが、選択マーカーの発現に対して陽性のままであるはずである。この延長された休止期間の長さは、各ヌクレオフェクション反応および選択プロセスに対して最適化され得る。トランスポゾンの染色体上の発現が、選択マーカーによる改変された細胞の検出をあいまいにするとき、選択は、この延長された休止期なしで行われてもよいが、追加の選択ステップが後の時点で含まれ得る（例えば、増大ステージ中または後のいずれか）。
【０４４６】
本開示の改変された細胞の選択は、任意の手段によって実施され得る。本開示の方法のある特定の実施形態において、本開示の改変された細胞の選択は、特定の選択マーカーを発現する細胞を単離することによって実施され得る。本開示の選択マーカーは、トランスポゾン内の１つ以上の配列によってコードされ得る。本開示の選択マーカーは、成功した転位の結果として改変された細胞によって発現することができる（すなわち、トランスポゾンの１つ以上の配列によってコードされていない）。ある特定の実施形態において、本開示の改変された細胞は、ヌクレオフェクション後の細胞培地の有害な化合物に対する耐性を付与する選択マーカーを含有する。有害な化合物は、例えば、改変された細胞に対して選択マーカーによって付与された耐性がなく、細胞死をもたらす抗生物質または薬物を含み得る。例示的な選択マーカーには、遺伝子：ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＡＬＤＨ、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、およびＮＫＸ２．２のうちの１つ以上の野生型（ＷＴ）または変異型が含まれるが、これらに限定されない。例示的な選択マーカーは、表面発現選択マーカーまたは表面発現タグを含むが、これらに限定されず、それぞれ、Ａｂコーティングされた磁性ビーズ技術またはカラム選択によって標的化することができる。タンパク質精製に使用されるものなどの切断可能なタグは、効率的なカラム選択、洗浄、および溶出のために本開示の選択マーカーに追加することができる。ある特定の実施形態において、本開示の選択マーカーは、改変された細胞（改変されたＴ細胞を含む）によって内因的に発現されず、したがって、改変された細胞の物理的単離（例えば、セルソーティング技術による）において有用であり得る。本開示の例示的な選択マーカーは、ＣＤ２７１、ＣＤ１９、ＣＤ５２、ＣＤ３４、ＲＱＲ８、ＣＤ２２、ＣＤ２０、ＣＤ３３、およびそれらの任意の組み合わせの完全長、変異、または短縮型を含むが、これらに限定されない、改変された細胞（改変されたＴ細胞を含む）によって内因的に発現されない。
【０４４７】
本開示の改変された細胞のいくつかの実施形態において、選択マーカーは、分裂細胞において活性であり、非分裂細胞において活性ではないタンパク質を含む。いくつかの実施形態において、選択マーカーは、代謝マーカーを含む。いくつかの実施形態において、選択マーカーは、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）ムテイン酵素を含む。いくつかの実施形態において、ＤＨＦＲムテイン酵素は、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化４６】
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いくつかの実施形態において、ＤＨＦＲムテイン酵素のアミノ酸配列は、８０位、１１３位、または１５３位のうちの１つ以上での変異をさらに含む。いくつかの実施形態において、ＤＨＦＲムテイン酵素のアミノ酸配列は、８０位におけるフェニルアラニン（Ｆ）またはロイシン（Ｌ）の置換、１１３位におけるロイシン（Ｌ）またはバリン（Ｖ）の置換、および１５３位におけるバリン（Ｖ）またはアスパラギン酸（Ｄ）の置換のうちの１つ以上を含む。
【０４４８】
本開示の改変された細胞は、ヌクレオフェクション反応後、選択的に増大させることができる。ある特定の実施形態において、ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む改変されたＴ細胞は、ＣＡＲＴｙｒｉｎ刺激によって選択的に増大させることができる。ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む改変されたＴ細胞は、標的で覆われた試薬（例えば、標的を発現する腫瘍株もしくは正常細胞株または標的において覆われているエキスパンダービーズ）との接触によって刺激することができる。あるいは、ＣＡＲＴｙｒｉｎを含む改変されたＴ細胞は、照射された腫瘍細胞、照射された同種異系正常細胞、照射された自己ＰＢＭＣとの接触によって刺激することができる。刺激に使用された標的発現細胞による本開示の細胞産物組成物の混入を最小限にするために、例えば、細胞産物組成物を対象に直接投与することができるとき、刺激は、ＣＡＲＴｙｒｉｎ標的タンパク質によってコーティングされたエキスパンダービーズを使用して実施することができる。ＣＡＲＴｙｒｉｎ刺激によるＣＡＲＴｙｒｉｎを含む改変されたＴ細胞の選択的増大は、改変されたＴ細胞の機能的枯渇を回避するために最適化することができる。
【０４４９】
本開示の選択された改変された細胞は、凍結保存され、規定した期間休止され、またはＣｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加によって増大のために刺激され得る。本開示の選択された改変された細胞は、凍結保存され、規定した期間休止され、またはＣｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加によって増大のために直ちに刺激され得る。選択された改変された細胞がＴ細胞であるとき、Ｔ細胞は、Ｔ−Ｃｅｌｌ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ技術の追加によって増大のために刺激することができる。本開示の選択された改変された細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４時間、またはそれより長い時間にわたって休止されてもよい。ある特定の実施形態において、本開示の選択された改変された細胞は、例えば、一晩休止されてもよい。ある特定の態様において、一晩は、約１２時間である。本開示の選択された改変された細胞は、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４日またはそれより長い時間にわたって休止されてもよい。本開示の選択された改変された細胞は、増強された生存度、より高いヌクレオフェクション効率、ヌクレオフェクション後のより優れた生存度、望ましい細胞表現型、および／または増大技術の追加の際に、より優れた／速い増大を有する細胞をもたらす任意の期間休止されてもよい。
【０４５０】
選択された改変された細胞（本開示の選択された改変されたＴ細胞を含む）は、高い回復、生存度、表現型、および／または機能的能力を有するヒト細胞を保管および／または回復させるのに最適化され得る任意の標準的な凍結保存方法を使用して凍結保存することができる。本開示の凍結保存方法は、市販の凍結保存培地および／またはプロトコルを含み得る。
【０４５１】
選択された改変された細胞（本開示の選択された改変されたＴ細胞を含む）の転位効率は、任意の手段によって評価され得る。例えば、エキスパンダー技術を適用する前に、選択された改変された細胞（本開示の選択された改変されたＴ細胞を含む）によるトランスポゾンの発現は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定することができる。選択された改変された細胞（本開示の選択された改変されたＴ細胞を含む）の転位効率の決定は、トランスポゾン（例えば、ＣＡＲＴｙｒｉｎ）を発現する選択された細胞のパーセンテージを決定することを含み得る。あるいは、または加えて、Ｔ細胞の純度、トランスポゾン発現（例えば、ＣＡＲＴｙｒｉｎ発現）の平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＡＲＴｙｒｉｎリガンドを発現する標的細胞の脱顆粒および／または死滅を媒介するＣＡＲＴｙｒｉｎ（トランスポゾンで送達される）の能力、および／または選択された改変された細胞（本開示の選択された改変されたＴ細胞を含む）の表現型は、任意の手段によって評価され得る。
【０４５２】
本開示の細胞産物組成物は、特定の放出基準を満たすと、対象への投与のために放出され得る。例示的な放出基準には、細胞表面上に検出可能なレベルのＣＡＲＴｙｒｉｎを発現する、特定の割合の改変、選択、および／または増大されたＴ細胞が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０４５３】
自己Ｔ細胞産物組成物の改変
本開示の改変された細胞（改変されたＴ細胞を含む）は、エキスパンダー技術を使用して増大させることができる。本開示のエキスパンダー技術は、市販のエキスパンダー技術を含み得る。本開示の例示的なエキスパンダー技術は、ＴＣＲを介した本開示の改変されたＴ細胞の刺激を含む。本開示の改変されたＴ細胞を刺激するためのすべての手段が企図されているが、ＴＣＲを介して本開示の改変されたＴ細胞を刺激することは、好ましい方法であり、優れたレベルの死滅能力を有する産物をもたらす。
【０４５４】
ＴＣＲを介して本開示の改変されたＴ細胞を刺激するために、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｘｐａｎｄｅｒ  ＤｙｎａＢｅａｄｓを３：１のビーズ対Ｔ細胞比で使用することができる。エキスパンダービーズが生分解性でない場合、ビーズは、エキスパンダー組成物から除去されてもよい。例えば、ビーズは、約５日後にエキスパンダー組成物から除去されてもよい。ＴＣＲを介して本開示の改変されたＴ細胞を刺激するために、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｔ細胞活性化／増大試薬を使用してもよい。ＴＣＲを介して本開示の改変されたＴ細胞を刺激するために、ＳｔｅｍＣｅｌｌ  ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔヒトＣＤ３／ＣＤ２８またはＣＤ３／ＣＤ２８／ＣＤ２Ｔ細胞アクチベーター試薬を使用してもよい。この技術は、可溶性の四量体抗体複合体が期間後に分解され、プロセスからの除去を必要としないため、好ましくあり得る。
【０４５５】
人工抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、標的抗原を共発現するように操作され、本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲＴｙｒｉｎにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用されてもよい。人工ＡＰＣは、腫瘍細胞株（例えば、不死化骨髄性白血病株Ｋ５６２を含む）を含む、またはそれらに由来し得、複数の共刺激分子または技術（ＣＤ２８、４−１ＢＢＬ、ＣＤ６４、ｍｂＩＬ−２１、ｍｂＩＬ−１５、ＣＡＲ標的分子など）を共発現するように操作されてもよい。本開示の人工ＡＰＣが共刺激分子と組み合わされるとき、望ましくない表現型および機能的能力、すなわち最終分化したエフェクターＴ細胞の発生または出現を防ぐために条件は、最適化されてもよい。
【０４５６】
照射されたＰＢＭＣ（自己または同種）は、ＣＤ１９などのいくつかの標的抗原を発現し得、本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲＴｙｒｉｎにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用することができる。あるいは、または加えて、照射された腫瘍細胞は、いくつかの標的抗原を発現し得、本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲＴｙｒｉｎにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用することができる。
【０４５７】
プレートに結合したおよび／または可溶性の抗ＣＤ３、抗ＣＤ２および／または抗ＣＤ２８刺激は、本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲＴｙｒｉｎにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用することができる。
【０４５８】
抗原でコーティングされたビーズは、標的タンパク質を提示することができ、本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用することができる。あるいは、または加えて、ＣＡＲＴｙｒｉｎ標的タンパク質でコーティングされたエキスパンダービーズは、本開示のＴＣＲおよび／またはＣＡＲＴｙｒｉｎにより本開示の細胞またはＴ細胞を刺激するために使用することができる。
【０４５９】
増大方法は、ＴＣＲまたはＣＡＲＴｙｒｉｎにより、および改変されたＴ細胞上の表面発現されたＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、および／または他のマーカーを介して、本開示の細胞またはＴ細胞の刺激を導く。
【０４６０】
増大技術は、ヌクレオフェクションの直後からヌクレオフェクションのおよそ２４時間後まで、本開示の細胞に適用することができる。様々な細胞培地を増大手順中に使用することができるが、本開示の望ましいＴ細胞増大培地は、例えば、より優れた生存度、細胞表現型、全増大、またはインビボでの持続、生着、および／もしくはＣＡＲを媒介した死滅のより優れた能力を有する細胞を産生することができる。本開示の細胞培地は、本開示の改変された細胞の増大、表現型、および機能を改善／増強するように最適化され得る。増大されたＴ細胞の好ましい表現型は、Ｔ幹細胞記憶、Ｔ中央、およびＴエフェクター記憶細胞の混合物を含み得る。Ｅｘｐａｎｄｅｒ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓは、主に、臨床で優れた性能をもたらし得る中央記憶Ｔ細胞を産生することができる。
【０４６１】
本開示の例示的なＴ細胞増大培地は、部分的または全体的に、ＰＢＳ、ＨＢＳＳ、ＯｐｉｔＭＥＭ、ＤＭＥＭ、ＲＰＭＩ  １６４０、ＡＩＭ−Ｖ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５、ＣｅｌｌＧｒｏ  ＤＣ培地、ＣＴＳ  ＯｐＴｉｍｉｚｅｒ  Ｔ細胞増大ＳＦＭ、ＴｅｘＭＡＣＳ培地、ＰＲＩＭＥ−ＸＶ  Ｔ細胞増大培地、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ−ＸＦ  Ｔ細胞増大培地、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。本開示のＴ細胞増大培地は、１つ以上の補助的因子をさらに含み得る。本開示のＴ細胞増大培地に含まれ得る補助的因子は、生存度、細胞表現型、全増大を増強し、またはインビボでの持続、生着、および／もしくはＣＡＲＴｙｒｉｎを媒介した死滅の能力を増加させる。本開示のＴ細胞増大培地に含まれ得る補助的因子には、組換えヒトサイトカイン、ケモカイン、および／またはインターロイキン、例えば、ＩＬ２、ＩＬ７、ＩＬ１２、ＩＬ１５、ＩＬ２１、ＩＬ１、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ８、ＣＸＣＬ８、ＩＬ９、ＩＬ１０、ＩＬ１１、ＩＬ１３、ＩＬ１４、ＩＬ１６、ＩＬ１７、ＩＬ１８、ＩＬ１９、ＩＬ２０、ＩＬ２２、ＩＬ２３、ＩＬ２５、ＩＬ２６、ＩＬ２７、ＩＬ２８、ＩＬ２９、ＩＬ３０、ＩＬ３１、ＩＬ３２、ＩＬ３３、ＩＬ３５、ＩＬ３６、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＦＮ−ガンマ、ＩＬ−１アルファ／ＩＬ−１Ｆ１、ＩＬ−１ベータ／ＩＬ−１Ｆ２、ＩＬ−１２  ｐ７０、ＩＬ−１２／ＩＬ−３５  ｐ３５、ＩＬ−１３、ＩＬ−１７／ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１７Ａ／Ｆヘテロ二量体、ＩＬ−１７Ｆ、ＩＬ−１８／ＩＬ−１Ｆ４、ＩＬ−２３、ＩＬ−２４、ＩＬ−３２、ＩＬ−３２ベータ、ＩＬ−３２ガンマ、ＩＬ−３３、ＬＡＰ（ＴＧＦ−ベータ１）、リンホトキシン−アルファ／ＴＮＦ−ベータ、ＴＧＦ−ベータ、ＴＮＦ−アルファ、ＴＲＡＮＣＥ／ＴＮＦＳＦ１１／ＲＡＮＫ  Ｌ、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本開示のＴ細胞増大培地に含まれ得る補助的因子には、塩、無機物、および／または代謝産物、例えば、ＨＥＰＥＳ、ニコチンアミド、ヘパリン、ピルビン酸ナトリウム、Ｌ−グルタミン、ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、アスコルビン酸、ヌクレオシド、ＦＢＳ／ＦＣＳ、ヒト血清、代用血清、抗生物質、ｐＨ調節剤、アール塩、２−メルカプトエタノール、ヒトトランスフェリン、組換えヒトインスリン、ヒト血清アルブミン、Ｎｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ  ＰＬＵＳ  Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ、ＫＣＬ、ＭｇＣｌ２、Ｎａ２ＨＰＯ４、ＮＡＨ２ＰＯ４、ラクトビオン酸ナトリウム、マンニトール、コハク酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ＣＩＮａ、グルコース、Ｃａ（ＮＯ３）２、Ｔｒｉｓ／ＨＣｌ、Ｋ２ＨＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ポリエチレンイミン、ポリエチレングリコール、ポロクサマー１８８、ポロクサマー１８１、ポロクサマー４０７、ポリビニルピロリドン、Ｐｏｐ３１３、クラウン−５、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。本開示のＴ細胞増大培地に含まれ得る補助的因子には、細胞のＤＮＡ感知、代謝、分化、シグナル伝達、および／またはアポトーシス経路の阻害剤、例えば、ＴＬＲ９、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＴＲＡＦ３、ＩＲＦ−７、ＮＦ−ＫＢ、１型インターフェロン、炎症促進性サイトカイン、ｃＧＡＳ、ＳＴＩＮＧ、Ｓｅｃ５、ＴＢＫ１、ＩＲＦ−３、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩ、ＲＩＧ−１、ＩＰＳ−１、ＦＡＤＤ、ＲＩＰ１、ＴＲＡＦ３、ＡＩＭ２、ＡＳＣ、カスパーゼ１、Ｐｒｏ−ＩＬ１Ｂ、ＰＩ３Ｋ、Ａｋｔ、Ｗｎｔ３Ａの阻害剤、グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３β（ＧＳＫ−３β）の阻害剤（例えば、ＴＷＳ１１９）、バフィロマイシン、クロロキン、キナクリン、ＡＣ−ＹＶＡＤ−ＣＭＫ、Ｚ−ＶＡＤ−ＦＭＫ、Ｚ−ＩＥＴＤ−ＦＭＫ、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４６２】
本開示のＴ細胞増大培地に含まれ得る補助的因子には、細胞送達を増強し、核送達もしくは輸送を増強し、核酸の核への助長された輸送を増強し、染色体上の核酸の分解を増強し、および／またはＤＮＡを媒介した毒性を減少させるように核酸を改変または安定化する試薬、例えば、ｐＨ調整剤、ＤＮＡ結合タンパク質、脂質、リン脂質、ＣａＰＯ４、ＮＬＳ配列を有するもしくは有さない正味中性電荷ＤＮＡ結合ペプチド、ＴＲＥＸ１酵素、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４６３】
本開示の改変された細胞は、選択可能な薬物または化合物の使用によって、増殖プロセス中に選択することができる。例えば、ある特定の実施形態において、本開示のトランスポゾンが、培養培地に添加される薬物への耐性を改変された細胞に付与する選択マーカーをコードすることができるとき、選択は、増殖プロセス中に起こり得、選択が起こるのにおおよそ１〜１４日の培養を必要とし得る。本開示のトランスポゾンによってコードされる選択マーカーとして使用することができる薬物耐性遺伝子の例には、遺伝子ｎｅｏ、ＤＨＦＲ、ＴＹＭＳ、ＡＬＤＨ、ＭＤＲ１、ＭＧＭＴ、ＦＡＮＣＦ、ＲＡＤ５１Ｃ、ＧＣＳ、ＮＫＸ２．２、またはそれらの任意の組み合わせの野生型（ＷＴ）または変異型が含まれるが、これらに限定されない。培養培地に添加され、選択マーカーが耐性を付与することができる、対応する薬物または化合物の例は、Ｇ４１８、ピューロマイシン、アンピシリン、カナマイシン、メトトレキサート、メファラン（Ｍｅｐｈａｌａｎ）、テモゾロミド、ビンクリスチン、エトポシド、ドキソルビシン、ベンダムスチン、フルダラビン、アレディア（パミドロン酸二ナトリウム）、ベセナム（Ｂｅｃｅｎｕｍ）（カルムスチン）、ＢｉＣＮＵ（カルムスチン）、ボルテゾミブ、カルフィルゾミブ、カルムブリス（Ｃａｒｍｕｂｒｉｓ）（カルムスチン）、カルムスチン、クラフェン（Ｃｌａｆｅｎ）（シクロホスファミド）、シクロホスファミド、シトキサン（シクロホスファミド）、ダラツムマブ、ダルザレックス（ダラツムマブ）、ドキシル（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、塩酸ドキソルビシンリポソーム、Ｄｏｘ−ＳＬ（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、エロツズマブ、エムプリシティ（エロツズマブ）、Ｅｖａｃｅｔ（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、ファリーダック（パノビノスタット）、イキサゾミブクエン酸エステル、カイプロリス（カルフィルゾミブ）、レナリドマイド、リポドックス（ＬｉｐｏＤｏｘ）（塩酸ドキソルビシンリポソーム）、モゾビル（プレリキサフォル）、ネオザール（Ｎｅｏｓａｒ）（シクロホスファミド）、ニンラーロ（イキサゾミブクエン酸エステル）、パミドロン酸二ナトリウム、パノビノスタット、プレリキサフォル、ポマリドマイド、ポマリスト（ポマリドマイド）、レブリミド（レナリドマイド）、シノビル（Ｓｙｎｏｖｉｒ）（サリドマイド）、サリドマイド、サロミド（Ｔｈａｌｏｍｉｄ）（サリドマイド）、ベルケイド（ボルテゾミブ）、ゾレドロン酸、ゾメタ（ゾレドロン酸）、またはそれらの任意の組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
【０４６４】
本開示のＴ細胞増殖プロセスは、ＷＡＶＥバイオリアクター内の細胞培養バッグ、Ｇ−Ｒｅｘフラスコ、または任意の他の好適な容器および／またはリアクター内で起こり得る。
【０４６５】
本開示の細胞またはＴ細胞培養物は、安定に維持され、揺すられ、旋回され、または振盪されてもよい。
【０４６６】
本開示の細胞またはＴ細胞増大プロセスは、培養期間、細胞濃度、Ｔ細胞培地の添加／除去のスケジュール、細胞サイズ、総細胞数、細胞表現型、細胞集団の純度、成長する細胞集団における改変された細胞のパーセンテージ、サプリメントの使用および組成、エキスパンダー技術の追加／除去、またはそれらの任意の組み合わせを含むが、これらに限定されない、ある特定の条件を最適化することができる。
【０４６７】
本開示の細胞またはＴ細胞増大プロセスは、結果として生じる増大した細胞集団の製剤前に、予め規定されたエンドポイントまで継続することができる。例えば、本開示の細胞またはＴ細胞増大プロセスは、予め決定された時間：少なくとも２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４時間；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０日間；少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２週間；少なくとも１、２、３、４、５、６カ月間、または少なくとも１年間継続することができる。本開示の細胞またはＴ細胞増大プロセスは、結果として生じる培養物が予め決定された全体細胞密度：容積（μｌ、ｍｌ、Ｌ）当たり１、１０、１００、１０００、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０個の細胞またはその間の任意の密度に達するまで継続することができる。本開示の細胞またはＴ細胞増大プロセスは、結果として生じる培養物の改変された細胞が本開示のトランスポゾンの発現の予め決定されたレベル：１％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、もしくは１００％またはその間の任意のパーセンテージの発現閾値レベル（発現の最小、最大、または平均レベルは、結果として生じる改変された細胞が臨床的に効果的であることを示している）を示すまで継続することができる。本開示の細胞またはＴ細胞増大プロセスは、非改変細胞の割合に対する結果として生じる培養物の改変された細胞の割合が予め決定された閾値：少なくとも１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１：１、２：１、２：１、４：１、５：１、６：１、７：１、８：１、９：１  １０：１、またはその間の任意の比に達するまで継続することができる。
【０４６８】
放出のための改変された自己Ｔ細胞の分析
改変された細胞のパーセンテージは、本開示の増大プロセス中またはその後に評価することができる。本開示の改変された細胞によるトランスポゾンの細胞発現は、蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）によって測定することができる。例えば、ＦＡＣＳは、本開示のＣＡＲＴｙｒｉｎを発現する細胞またはＴ細胞のパーセンテージを決定するために使用することができる。あるいは、または加えて、改変された細胞またはＴ細胞の純度、本開示の改変された細胞またはＴ細胞によって発現されたＣＡＲＴｙｒｉｎの平均蛍光強度（ＭＦＩ）、ＣＡＲＴｙｒｉｎリガンドを発現する標的細胞の脱顆粒および／または死滅を媒介するＣＡＲＴｙｒｉｎの能力、および／またはＣＡＲＴｙｒｉｎ＋Ｔ細胞の表現型を評価することができる。
【０４６９】
対象への投与を意図する本開示の組成物は、組成物が安全であり、薬学的製剤としての製剤および／または対象への投与に効果的であることを示す１つ以上の「放出基準」を満たす必要があり得る。放出基準は、本開示の組成物（例えば、本開示のＴ細胞産物）が、それらの細胞表面上に検出可能なレベルの本開示のＣＡＲＴｙｒｉｎを発現するＴ細胞の特定のパーセンテージを含むという必要条件を含み得る。
【０４７０】
増大プロセスは、特定の基準が満たされるまで継続するべきである（例えば、特定の総数の細胞を達成すること、記憶細胞の特定の集団を達成すること、特定のサイズの集団を達成すること）。
【０４７１】
ある特定の基準は、増殖プロセスを終わるべき時点で信号を送る。例えば、細胞は、細胞サイズが３００ｆＬに達すると、製剤化、再活性化、または凍結保存されるべきである（そうでなければ、この閾値を超えたサイズに達する細胞は死滅し始め得る）。細胞の集団が３００ｆＬより少ない平均細胞サイズに達してすぐの凍結保存は、細胞が凍結保存前に完全に静止した状態に達していないため、解凍および培養時により良い細胞の回復をもたらし得る（完全な静止サイズは、おおよそ１８０ｆＬである）。増殖前に、本開示のＴ細胞は、約１８０ｆＬの細胞サイズを有し得るが、増殖後３日では、それらの細胞サイズは、４倍より大きくなり、おおよそ９００ｆＬになり得る。次の６〜１２日間にわたり、Ｔ細胞の集団は、ゆっくりと細胞サイズを減少させ、１８０ｆＬで完全に静止する。
【０４７２】
製剤のための細胞集団を調製するプロセスは、細胞集団の細胞を濃縮するステップ、細胞を洗浄するステップ、および／または薬物耐性もしくは特定の表面発現マーカーに対する磁性ビーズのソーティングを介する細胞のさらなる選択のステップを含み得るが、これらに限定されない。製剤のための細胞集団を調製するためのプロセスは、最終産物の安全性および純度を確実にするためのソーティングステップをさらに含み得る。例えば、患者からの腫瘍細胞が、本開示の改変されたＴ細胞を刺激するために、または製剤のために調製されている本開示の改変されたＴ細胞を刺激するために改変されていた場合、患者からの腫瘍細胞が最終産物に含まれないことが重要である。
【０４７３】
細胞産物の注入および／または注入のための凍結保存
本開示の薬学的製剤は、注入、凍結保存、および／または保管のためにバッグに分配されてもよい。
【０４７４】
本開示の薬学的製剤は、標準的なプロトコル、および任意選択で、注入可能な凍結保存培地を使用して凍結保存することができる。例えば、ＤＭＳＯを含まない凍結保存剤（例えば、ＣｒｙｏＳＯｆｒｅｅ（商標）ＤＭＳＯ不含凍結保存培地）を使用して、凍結に関連する毒性を低減することができる。本開示の凍結保存された薬学的製剤は、後日、患者への注入のために保管することができる。有効な治療は、本開示の薬学的製剤の複数回投与を必要とすることがあり、したがって、薬学的製剤は、凍結して保管することができるが個々の用量の解凍のために分けられた予めアリコートにされた「用量」で包装されてもよい。
【０４７５】
本開示の薬学的製剤は、室温で保管してもよい。有効な治療は、本開示の薬学的製剤の複数回投与を必要とすることがあり、したがって、薬学的製剤は、一緒に保管することができるが個々の用量の投与のために分けられた予めアリコートにされた「用量」で包装されてもよい。
【０４７６】
本開示の薬学的製剤は、将来、例えば、状態の寛解および再発後、同種異系療法の場合に投与が必要であり得る同じ患者へのさらなる用量の生成のための、その後の再増殖および／または選択のために記録することができる。
【０４７７】
製剤
上記のように、本開示は、薬学的に許容される製剤中に少なくとも１つの改変された細胞を含む、好ましくはリン酸緩衝液と食塩水または選択された塩を含む安定した製剤、ならびに保存剤を含有する保存溶液および製剤、ならびに薬学的または獣医学的使用に好適な複数回使用用保存製剤を提供する。保存製剤は、少なくとも１つの既知の保存剤、または任意選択で、水性希釈剤中の少なくとも１つのフェノール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、ｏ−クレゾール、クロロクレゾール、ベンジルアルコール、亜硝酸フェニル水銀、フェノキシエタノール、ホルムアルデヒド、クロロブタノール、塩化マグネシウム（例えば、六水和物）、アルキルパラベン（メチル、エチル、プロピル、ブチルなど）、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、デヒドロ酢酸ナトリウム、およびチメロサール、ポリマーまたはこれらの混合物からなる群より選択されるものを含有する。約０．００１５％、または任意の範囲、値、もしくはその間の画分などの、当該技術分野において既知であるように、任意の好適な濃度または混合物を使用することができる。非限定的な例は、保存剤なし、約０．１〜２％ｍ−クレゾール（例えば、０．２、０．３、０．４、０．５、０．９、１．０％）、約０．１〜３％ベンジルアルコール（例えば、０．５、０．９、１．１、１．５、１．９、２．０、２．５％）、約０．００１〜０．５％チメロサール（例えば、０．００５、０．０１）、約０．００１〜２．０％フェノール（例えば、０．０５、０．２５、０．２８、０．５、０．９、１．０％）、０．０００５〜１．０％アルキルパラベン（例えば、０．０００７５、０．０００９、０．００１、０．００２、０．００５、０．００７５、０．００９、０．０１、０．０２、０．０５、０．０７５、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７５、０．９、１．０％）などを含む。
【０４７８】
上述のように、本開示は、包装材料と、任意選択で水性希釈剤中の、処方された緩衝剤および／または保存剤を有する少なくとも１つの改変された細胞の溶液を含む少なくとも１つのバイアルと、を含む製造品であって、当該包装材料が、そのような溶液を１、２、３、４、５、６、９、１２、１８、２０、２４、３０、３６、４０、４８、５４、６０、６６、７２時間またはそれより長時間の期間にわたって保持することができることを示すラベルを含む、製造品を提供する。
【０４７９】
特許請求される製造品は、即時から２４時間以上の範囲の期間にわたる投与に有用である。したがって、特許請求される製造品は、患者に重要な利点を提供する。本開示の製剤は、任意に、約２℃〜約４０℃の温度で安全に保管することができ、タンパク質の生物学的活性を長期間保持するため、溶液を６、１２、１８、２４、３６、４８、７２、または９６時間またはそれより長期間の期間にわたって保持および／または使用することができることを示す包装ラベルが可能になる。
【０４８０】
特許請求される製品には、包装材料が含まれる。包装材料は、規制当局により求められる情報に加えて、製品を使用することができる条件を提供する。
【０４８１】
治療への応用
本開示はまた、本開示の少なくとも１つの組成物を使用して、当該技術分野において既知であるように、または本明細書に記載されているように、細胞、組織、器官、動物、または患者における疾患を調節または治療するための方法であって、例えば、細胞、組織、器官、動物、または患者に治療有効量の本開示の組成物を投与して、または細胞、組織、器官、動物、または患者を治療有効量の本開示の組成物と接触させるための方法も提供する。本開示はまた、悪性疾患を含むが、これに限定されない、細胞、組織、器官、動物、または患者における疾患を調節または治療するための方法も提供する。
【０４８２】
本開示はまた、白血病、急性白血病、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、急性リンパ球性白血病、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはＦＡＢ  ＡＬＬ、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）（ＡＭＬ）、急性骨髄性白血病（ａｃｕｔｅ  ｍｙｅｌｏｇｅｎｏｕｓ  ｌｅｕｋｅｍｉａ）、慢性骨髄球性白血病（ＣＭＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、ヘアリー細胞白血病、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）、リンパ腫、ホジキン病、悪性リンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、多発性骨髄腫、カポジ肉腫、結腸直腸癌、膵臓癌、鼻咽頭癌、悪性組織球増殖症、腫瘍随伴症候群／悪性疾患に伴う高カルシウム血症、固形腫瘍、膀胱癌、乳癌、結腸直腸癌、子宮内膜癌、頭部癌、頸部癌、遺伝性非ポリポーシス癌、ホジキンリンパ腫、肝臓癌、肺癌、非小細胞肺癌、卵巣癌、膵臓癌、前立腺癌、腎細胞癌、精巣癌、腺癌、肉腫、悪性黒色腫、血管腫、転移性疾患、癌関連骨吸収、癌関連骨痛などのうちの少なくとも１つを含むが、これらに限定されない、細胞、組織、器官、動物、または患者における少なくとも１つの悪性疾患を調節または治療するための方法も提供する。
【０４８３】
本開示のいずれの方法は、有効量の組成物または薬学的組成物を、そのような調節、治療、または治療を必要とする細胞、組織、器官、動物、または患者に投与するステップを含むことができる。そのような方法は、任意に、そのような疾患または障害を治療するための共投与または併用療法であって、当該少なくとも１つの組成物の投与は、第２の治療剤のうちの少なくとも１つから選択される少なくとも１つの前に、それと同時に、および／またはその後に投与することをさらに含む。好適な投薬量は、当該技術分野において周知である。例えば、Ｗｅｌｌｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｔｈｅｒａｐｙ  Ｈａｎｄｂｏｏｋ，２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｐｐｌｅｔｏｎ  ａｎｄ  Ｌａｎｇｅ，Ｓｔａｍｆｏｒｄ，Ｃｏｎｎ．（２０００）、ＰＤＲ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｏｃｋｅｔ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａ  ２０００，Ｄｅｌｕｘｅ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｔａｒａｓｃｏｎ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ，Ｌｏｍａ  Ｌｉｎｄａ，Ｃａｌｉｆ．（２０００）、Ｎｕｒｓｉｎｇ  ２００１  Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｄｒｕｇｓ，２１ｓｔ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ  Ｃｏｒｐ．，Ｓｐｒｉｎｇｈｏｕｓｅ，Ｐａ．，２００１、Ｈｅａｌｔｈ  Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ’ｓ  Ｄｒｕｇ  Ｇｕｉｄｅ  ２００１，ｅｄ．，Ｓｈａｎｎｏｎ，Ｗｉｌｓｏｎ，Ｓｔａｎｇ，Ｐｒｅｎｔｉｃｅ−Ｈａｌｌ，Ｉｎｃ，Ｕｐｐｅｒ  Ｓａｄｄｌｅ  Ｒｉｖｅｒ，Ｎ．Ｊ．を参照されたく、これらの参照の各々は、全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０４８４】
養子細胞療法としての改変された細胞の注入
本開示は、本開示の１つ以上のＣＳＲおよび／またはＣＡＲを発現する改変された細胞であって、それを必要とする対象に投与するために選択および／または増大された、改変された細胞を提供する。本開示の改変された細胞は、室温および体温を含む任意の温度で保管するために製剤化され得る。本開示の改変された細胞は、凍結保存およびその後の解凍のために製剤化され得る。本開示の改変された細胞は、滅菌包装からの対象への直接投与のために薬学的に許容される担体中で製剤化され得る。本開示の改変された細胞は、最低レベルの細胞機能およびタンパク質発現を確実にするための細胞生存度および／またはタンパク質発現レベルの指示薬とともに薬学的に許容される担体中で製剤化され得る。本開示の改変された細胞は、さらなる増殖を阻害するため、および／または細胞死を防止するための１つ以上の試薬とともに処方された密度で薬学的に許容される担体に製剤化され得る。
【０４８５】
装甲Ｔ細胞の「ノックダウン」戦略
本開示のＴ細胞は、それらの治療可能性を高めるために改変され得る。あるいは、または加えて、本開示のＴ細胞は、それらを免疫学的および／または代謝チェックポイントに対する感受性を低下させるように改変され得る。このタイプの改変は、本開示のＴ細胞を「装甲」し、これは、改変に続いて、本明細書では「装甲」Ｔ細胞と称され得る。本開示の武装化Ｔ細胞は、例えば、腫瘍免疫抑制微小環境内のＴ細胞に送達される特定の内因性チェックポイントシグナルを遮断および／または希釈すること（すなわち、チェックポイント阻害）によって生成され得る。
【０４８６】
いくつかの実施形態において、本開示の装甲Ｔ細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、造血前駆細胞、末梢血（ＰＢ）由来のＴ細胞（Ｇ−ＣＳＦ−動員末梢血から単離またはそれに由来するＴ細胞を含む）、または臍帯血（ＵＣＢ）由来のＴ細胞に由来する。いくつかの実施形態において、本開示の装甲Ｔ細胞は、本開示のキメラリガンド受容体（タンパク質足場、抗体、ＳｃＦｖ、または抗体模倣物を含むＣＬＲ）／キメラ抗原受容体（タンパク質足場、抗体、ＳｃＦｖ、または抗体模倣物を含むＣＡＲ）、ＣＡＲＴｙｒｉｎ（センチリンを含むＣＡＲ）、および／またはＶＣＡＲ（ラクダ科ＶＨＨまたは単一ドメインＶＨを含むＣＡＲ）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、本開示の装甲Ｔ細胞は、（ａ）リガンド結合領域と、（ｂ）リンカーと、（ｃ）短縮型カスパーゼ９ポリペプチドと、を含む誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドを含み、誘導性アポトーシス促進性ポリペプチドは、非ヒト配列を含まない。いくつかの実施形態において、非ヒト配列は、制限部位である。いくつかの実施形態において、リガンド結合領域誘導性カスパーゼポリペプチドは、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、ＦＫ５０６結合タンパク質１２（ＦＫＢＰ１２）ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列の３６位における改変を含む。いくつかの実施形態において、改変は、３６位におけるフェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換（Ｆ３６Ｖ）である。いくつかの実施形態において、本開示の装甲Ｔ細胞は、外因性配列を含む。いくつかの実施形態において、外因性配列は、治療用タンパク質をコードする配列を含む。例示的な治療用タンパク質は、核、細胞質、細胞内、膜貫通、細胞表面結合、または分泌タンパク質であり得る。装甲Ｔ細胞によって発現される例示的な治療用タンパク質は、装甲Ｔ細胞の活性を改変し得るか、または第２の細胞の活性を改変し得る。いくつかの実施形態において、本開示の装甲Ｔ細胞は、選択遺伝子または選択マーカーを含む。いくつかの実施形態において、本開示の装甲Ｔ細胞は、合成遺伝子発現カセット（本明細書において、誘導性導入遺伝子構築物とも称される）を含む。
【０４８７】
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、阻害チェックポイントシグナルの受容体をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減して、本開示の装甲Ｔ細胞を生成するように改変される。阻害性チェックポイントシグナルの例には、本開示のＣＡＲ−Ｔ細胞上のＰＤ−１受容体に結合するＰＤ−Ｌ１リガンド、またはＣＡＲ−Ｔ細胞上のＴＧＦβＲＩＩ受容体に結合するＴＧＦβサイトカインが含まれるが、これらに限定されない。阻害チェックポイントシグナルの受容体は、細胞表面上またはＴ細胞の細胞質内に発現する。阻害チェックポイントシグナルの受容体をコードする遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減することは、本開示の装甲Ｔ細胞の表面上または細胞質内での阻害チェックポイント受容体のタンパク質発現が失われる。したがって、阻害チェックポイント受容体をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減した本開示の装甲Ｔ細胞は、チェックポイントシグナルに対して耐性、非受容性、または非感受性である。阻害チェックポイントシグナルに対する装甲Ｔ細胞の抵抗性または感受性の低下は、これらの阻害チェックポイントシグナルの存在下での装甲Ｔ細胞の治療可能性を高める。阻害チェックポイントシグナルには、表１に列記されている例が含まれるが、これらに限定されない。本開示の装甲Ｔ細胞においてサイレンシングされ得る例示的な阻害チェックポイントシグナルには、ＰＤ−１およびＴＧＦβＲＩＩが含まれるが、これらに限定されない。
【０４８８】
【表６−１】
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【表６−２】
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【表６−３】
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【０４８９】
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、チェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内タンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減して、本開示の装甲Ｔ細胞を産生するように改変される。本開示のＴ細胞の活性は、チェックポイントシグナル伝達経路に関与する任意の細胞内シグナル伝達タンパク質を標的とすることによって増強され、それにより、チェックポイント阻害または１つ以上のチェックポイント経路への干渉を達成し得る。チェックポイントシグナル伝達に関与する細胞内シグナル伝達タンパク質には、表２に列記されている例示的な細胞内シグナル伝達タンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【０４９０】
【表７】
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【０４９１】
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、本開示の装甲Ｔ細胞を産生するための治療法の有効性を妨げる転写因子をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減して、本開示の装甲Ｔ細胞を産生するように改変される。装甲Ｔ細胞の活性は、治療法の有効性を妨げる転写因子の発現をサイレンシングまたは低減する（または機能を抑制する）ことによって増強または調節され得る。発現をサイレンシングまたは低減するために、またはその機能を抑制するために改変され得る例示的な転写因子には、表３に列記された例示的な転写因子が含まれるが、これらに限定されない。例えば、ＦＯＸＰ３遺伝子の発現は、Ｔ制御性ＣＡＲ−Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔｒｅｇ細胞）の形成を防止または低減するために、本開示の装甲Ｔ細胞においてサイレンシングまたは低減され得、その発現または活性は、治療法の有効性を低減され得る。
【０４９２】
【表８−１】
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【表８−２】
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【表８−３】
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【表８−４】
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【表８−５】
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【表８−６】
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【表８−７】
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【表８−８】
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【表８−９】
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【表８−１０】
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【表８−１１】
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【表８−１２】
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【表８−１３】
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【表８−１４】
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【表８−１５】
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【表８−１６】
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【表８−１７】
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【表８−１８】
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【表８−１９】
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【表８−２０】
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【表８−２１】
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【表８−２２】
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【表８−２３】
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【表８−２４】
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【表８−２５】
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【表８−２６】
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【表８−２７】
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【表８−２８】
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【表８−２９】
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【表８−３０】
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【表８−３１】
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【表８−３２】
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【表８−３３】
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【表８−３４】
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【表８−３５】
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【表８−３６】
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【表８−３７】
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【表８−３８】
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【表８−３９】
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【表８−４０】
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【表８−４１】
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【表８−４２】
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【表８−４３】
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【表８−４４】
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【表８−４５】
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【表８−４６】
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【表８−４７】
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【表８−４８】
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【０４９３】
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、細胞死または細胞アポトーシス受容体をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減して、本開示の装甲Ｔ細胞を産生するように改変される。死受容体とその内因性リガンドの相互作用は、アポトーシスの開始をもたらす。細胞死および／または細胞アポトーシス受容体および／またはリガンドの発現、活性、または相互作用の破壊は、本開示の装甲Ｔ細胞を死のシグナルに対する受容性を低下させ、その結果、腫瘍環境における本開示の装甲Ｔ細胞をより効果的に作製する。本開示の装甲Ｔ細胞において改変され得る例示的な細胞死受容体は、Ｆａｓ（ＣＤ９５）である。本開示の例示的な細胞死および／または細胞アポトーシス受容体およびリガンドには、表４に提供される例示的な受容体およびリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
【０４９４】
【表９−１】
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【表９−２】
2021536249.tif 000111
【０４９５】
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、代謝センシングタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減して、本開示の装甲Ｔ細胞を生成するように改変される。本開示の装甲Ｔ細胞による免疫抑制腫瘍微小環境（低レベルの酸素、ｐＨ、グルコース、および他の分子によって特徴付けられる）の代謝センシングの破壊は、Ｔ細胞機能の延長された保持をもたらし、その結果、装甲Ｔ細胞ごとに死滅されたより多くの腫瘍細胞をもたらす。例えば、ＨＩＦ１ａおよびＶＨＬは、Ｔ細胞機能に関与し、さらに低酸素環境において関与する。本開示の装甲Ｔ細胞は、ＨＩＦ１ａまたはＶＨＬをコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低下させ得る。代謝センシングに関与する遺伝子およびタンパク質には、表５に提供される例示的な遺伝子およびタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【０４９６】
【表１０−１】
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【表１０−２】
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【０４９７】
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、モノクローナル抗体を含む癌治療に対する感受性を付与するタンパク質をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減して、本開示の装甲Ｔ細胞を産生するように改変される。したがって、本開示の装甲Ｔ細胞は、癌治療（例えば、化学療法、モノクローナル抗体療法、または別の抗腫瘍治療）の存在下であっても、優れた機能または有効性を示し得る。癌治療に対する感受性の付与に関与するタンパク質には、表６に提供される例示的なタンパク質が含まれるが、これらに限定されない。
【０４９８】
【表１１】
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【０４９９】
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、成長優位性因子をコードする１つ以上の遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減して、装甲Ｔ細胞を産生するように改変される。癌遺伝子の発現をサイレンシングまたは低減することにより、本開示の装甲Ｔ細胞に成長優位性を与えることができる。例えば、ＣＡＲ−Ｔ製造プロセス中のＴＥＴ２遺伝子の発現のサイレンシングまたは減少（例えば、発現の破壊）は、この増大能力を欠いている非装甲ＣＡＲ−Ｔと比較したとき、腫瘍の増大およびその後の根絶のための有意な能力を備えた装甲ＣＡＲ−Ｔの生成をもたらす。この戦略は、安全スイッチ（例えば、本開示のｉＣ９安全スイッチ）と結合することができ、これは、対象からの有害反応または装甲ＣＡＲの制御されない成長が生じた場合には、装甲ＣＡＲ−Ｔ細胞の標的破壊を可能にする。例示的な成長優位性因子には、表７に提供される因子が含まれるが、これらに限定されない。
【０５００】
【表１２】
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【０５０１】
装甲Ｔ細胞の「ヌルまたはスイッチ受容体」戦略
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、改変された／キメラチェックポイント受容体を発現して、本開示の装甲Ｔ細胞を産生するように改変される。
【０５０２】
いくつかの実施形態において、改変された／キメラチェックポイント受容体は、ヌル受容体、デコイ受容体、またはドミナントネガティブ受容体を含む。本開示のヌル受容体、デコイ受容体、またはドミナントネガティブ受容体は、改変された／キメラ受容体／タンパク質であり得る。本開示のヌル受容体、デコイ受容体、またはドミナントネガティブ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインの発現のために切断され得る。あるいは、または加えて、本開示のヌル受容体、デコイ受容体、またはドミナントネガティブ受容体は、決定的であるかまたは効果的なシグナル伝達に必要な１つ以上のアミノ酸位置で細胞内シグナル伝達ドメイン内で変異され得る。本開示のヌル受容体、デコイ受容体、またはドミナントネガティブ受容体の切断または突然変異は、チェックポイントシグナルを細胞または細胞内に伝達または伝達する受容体の能力の喪失をもたらし得る。
【０５０３】
例えば、腫瘍細胞の表面上に発現するＰＤ−Ｌ１受容体からの免疫抑制チェックポイントシグナルの希釈または遮断は、本開示の装甲Ｔ細胞の表面上に改変された／キメラＰＤ−１ヌル受容体を発現させることによって達成することができ、装甲Ｔ細胞の表面上にも発現する内因性（非改変）ＰＤ−１受容体と効果的に競合して、装甲Ｔ細胞の内因性ＰＤ−１受容体を介した免疫抑制チェックポイントシグナルの伝達を低減または阻害する。この例示的な実施形態において、腫瘍細胞上に発現されるＰＤ−Ｌ１に結合するための２つの異なる受容体間の競合は、有効なチェックポイントシグナル伝達のレベルを低下または低下させ、それにより、ＰＤ−１ヌル受容体を発現する装甲Ｔ細胞の治療可能性を増強する。
【０５０４】
いくつかの実施形態において、改変された／キメラチェックポイント受容体は、ヌル受容体、デコイ受容体、または膜貫通受容体であるドミナントネガティブ受容体を含む。
【０５０５】
いくつかの実施形態において、改変された／キメラチェックポイント受容体は、ヌル受容体、デコイ受容体、または膜関連もしくは膜連結受容体／タンパク質であるドミナントネガティブ受容体を含む。
【０５０６】
いくつかの実施形態において、改変された／キメラチェックポイント受容体は、ヌル受容体、デコイ受容体、または細胞内受容体／タンパク質であるドミナントネガティブ受容体を含む。
【０５０７】
いくつかの実施形態において、改変された／キメラチェックポイント受容体は、ヌル受容体、デコイ受容体、または細胞内受容体／タンパク質であるドミナントネガティブ受容体を含む。本開示の例示的なヌル、デコイ、またはドミナントネガティブ細胞内受容体／タンパク質には、阻害性チェックポイントシグナルの下流のシグナル伝達成分（例えば、表１および２に提供される）、転写因子（例えば、表３に提供される）、サイトカインまたはサイトカイン受容体、ケモカインまたはケモカイン受容体、細胞死またはアポトーシス受容体／リガンド（例えば、表４に提供される）、代謝センシング分子（例えば、表５に提供される）、癌治療に対する感受性を付与するタンパク質（例えば、表６に提供される）、ならびに癌遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、表７に提供される）が含まれるが、これらに限定されない。本開示の例示的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカインおよびケモカイン受容体には、表８に提供されるサイトカインおよびサイトカイン受容体、ならびにケモカインおよびケモカイン受容体が含まれるが、これらに限定されない。
【０５０８】
【表１３−１】
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【表１３−２】
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【表１３−３】
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【表１３−４】
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【表１３−５】
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【表１３−６】
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【０５０９】
いくつかの実施形態において、改変された／キメラのチェックポイント受容体は、スイッチ受容体を含む。例示的なスイッチ受容体は、天然または野生型の細胞内シグナル伝達ドメインが、タンパク質に対して非天然であるか、および／または野生型ドメインではない異なる細胞内シグナル伝達ドメインに切り替えられるか、または置換される、本開示の改変された／キメラ受容体／タンパク質を含み得る。例えば、阻害性シグナル伝達ドメインの刺激性シグナル伝達ドメインによる置き換えは、免疫阻害性シグナルを免疫刺激性シグナルに切り替え得る。あるいは、阻害性シグナル伝達ドメインの異なる阻害性ドメインによる置き換えは、阻害性シグナル伝達のレベルを低下させるまたは高めることができる。スイッチ受容体の発現または過剰発現は、免疫抑制腫瘍微小環境内で発現される同族チェックポイント受容体への結合について、内因性野生型チェックポイント受容体（スイッチ受容体ではない）との競合を介して同族チェックポイントシグナルの希釈および／または遮断をもたらすことができる。本開示の装甲Ｔ細胞は、本開示のスイッチ受容体をコードする配列を含み得、本開示の１つ以上のスイッチ受容体の発現をもたらし、その結果、本開示の装甲Ｔ細胞の活性を変化させる。本開示の装甲Ｔ細胞は、チェックポイント受容体、転写因子、サイトカイン受容体、死受容体、代謝センシング分子、癌治療、癌遺伝子の下流の細胞内発現タンパク質、および／または本開示の腫瘍サプレッサータンパク質もしくは遺伝子を標的とする本開示のスイッチ受容体を発現し得る。
【０５１０】
本開示の例示的なスイッチ受容体には、阻害性チェックポイントシグナルの下流のシグナル伝達成分（例えば、表１および２に提供される）、転写因子（例えば、表３に提供される）、サイトカインまたはサイトカイン受容体、ケモカインまたはケモカイン受容体、細胞死またはアポトーシス受容体／リガンド（例えば、表４に提供される）、代謝センシング分子（例えば、表５に提供される）、癌治療に対する感受性を付与するタンパク質（例えば、表６に提供される）、ならびに癌遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、表７に提供される）が含まれるが、これらに限定されないタンパク質を含み得るか、またはそれに由来し得る。本開示の例示的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカインおよびケモカイン受容体には、表８に提供されるサイトカインおよびサイトカイン受容体、ならびにケモカインおよびケモカイン受容体が含まれるが、これらに限定されない。
【０５１１】
装甲Ｔ細胞「合成遺伝子発現」戦略
いくつかの実施形態において、本開示のＴ細胞は、条件付き遺伝子発現を媒介するキメラリガンド受容体（ＣＬＲ）またはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を発現して、本開示の装甲Ｔ細胞を産生するように改変される。装甲Ｔ細胞の核におけるＣＬＲ／ＣＡＲおよび条件遺伝子発現システムの組み合わせは、同族リガンドとＣＬＲとの結合、または同族抗原とＣＡＲとの結合の際に条件付きで活性化される合成遺伝子発現システムを構成する。このシステムは、例えば腫瘍環境で、または腫瘍環境内で、リガンドまたは抗原結合の部位での合成遺伝子発現を減少または制限することによって、改変されたＴ細胞の「装甲」または治療可能性を高めるのに役立ち得る。
【０５１２】
外因性受容体
いくつかの実施形態において、装甲Ｔ細胞は、（ａ）誘導性プロモーターをコードする配列および導入遺伝子をコードする配列を含む、誘導性導入遺伝子構築物と、（ｂ）構成的プロモーターをコードする配列およびＣＬＲまたはＣＡＲなどの外因性受容体をコードする配列を含む受容体構築物と、を含む組成物を含み、（ａ）の構築物および（ｂ）の構築物の細胞のゲノム配列への統合の際に、外因性受容体が発現され、外因性受容体は、リガンドまたは抗原に結合する際に、誘導性導入遺伝子（ａ）の発現を調節する誘導性プロモーターを直接的または間接的に標的とする細胞内シグナルを伝達して、遺伝子発現を改変する。
【０５１３】
本開示の合成遺伝子発現システムのいくつかの実施形態において、組成物は、遺伝子発現を減少させることによって遺伝子発現を改変する。いくつかの実施形態において、組成物は、遺伝子発現を一時的に改変する（例えば、リガンドの外因性受容体への結合の持続時間）ことによって遺伝子発現を改変する。いくつかの実施形態において、組成物は、遺伝子発現を急激に改変する（例えば、リガンドは、外因性受容体に可逆的に結合する）。いくつかの実施形態において、組成物は、遺伝子発現を慢性的に改変する（例えば、リガンドは、外因性受容体に不可逆的に結合する）。
【０５１４】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、（ｂ）の外因性受容体は、細胞のゲノム配列に関して内因性受容体を含む。例示的な受容体には、細胞内受容体、細胞表面受容体、膜貫通受容体、リガンド依存性イオンチャネル、およびＧタンパク質共役型受容体が含まれるが、これらに限定されない。
【０５１５】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、（ｂ）の外因性受容体は、非自然発生受容体を含む。いくつかの実施形態において、非自然発生受容体は、合成、改変、組換え、突然変異、またはキメラ受容体である。いくつかの実施形態において、非自然発生受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）から単離されるか、またはそれに由来する１つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態において、非自然発生受容体は、足場タンパク質から単離されるか、またはそれに由来する１つ以上の配列を含む。非自然発生受容体が膜貫通ドメインを含まないものを含むいくつかの実施形態において、非自然発生受容体は、非自然発生との接触に続いて、細胞内シグナルを伝達する、第２の膜貫通、膜結合、および／または細胞内受容体と相互作用する。
【０５１６】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、（ｂ）の外因性受容体は、非自然発生受容体を含む。いくつかの実施形態において、非自然発生受容体は、合成、改変、組換え、突然変異、またはキメラ受容体である。いくつかの実施形態において、非自然発生受容体は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）から単離されるか、またはそれに由来する１つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態において、非自然発生受容体は、足場タンパク質から単離されるか、またはそれに由来する１つ以上の配列を含む。いくつかの実施形態において、非自然発生受容体は、膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非自然発生受容体は、細胞内シグナルを伝達する細胞内受容体と相互作用する。いくつかの実施形態において、非自然発生受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、非自然発生受容体は、キメラリガンド受容体（ＣＬＲ）である。いくつかの実施形態において、ＣＬＲは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。
【０５１７】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、（ｂ）の外因性受容体は、非自然発生受容体を含む。いくつかの実施形態において、ＣＬＲは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、キメラリガンド受容体は、（ａ）リガンド認識領域を含むエクトドメインであって、リガンド認識領域は、少なくとも足場タンパク質を含む、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインと、を含む。いくつかの実施形態において、（ａ）のエクトドメインは、シグナルペプチドをさらに含む。いくつかの実施形態において、（ａ）のエクトドメインは、リガンド認識領域と膜貫通ドメインとの間のヒンジをさらに含む。
【０５１８】
本開示のＣＬＲ／ＣＡＲのいくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＧＭ−ＣＳＦＲシグナルペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ヒトＣＤ８αシグナルペプチドをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＭＡＬＰＶＴＡＬＬＬＰＬＡＬＬＬＨＡＡＲＰ（配列番号１７０３７）を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ａｔｇｇｃａｃｔｇｃｃａｇｔｃａｃｃｇｃｃｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃｃｔｃｔｇｇｃｔｃｔｇｃｔｇｃｔｇｃａｃｇｃａｇｃｔａｇａｃｃａ（配列番号１７０３９）を含む核酸配列によってコードされる。
【０５１９】
本開示のＣＬＲ／ＣＡＲのいくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ２、ＣＤ３δ、ＣＤ３ε、ＣＤ３γ、ＣＤ３ζ、ＣＤ４、ＣＤ８α、ＣＤ１９、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、またはＧＭ−ＣＳＦＲ膜貫通ドメインをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ヒトＣＤ８α膜貫通ドメインをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＩＹＩＷＡＰＬＡＧＴＣＧＶＬＬＬＳＬＶＩＴＬＹＣ（配列番号１７０３８）を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ａｔｃｔａｃａｔｔｔｇｇｇｃａｃｃａｃｔｇｇｃｃｇｇｇａｃｃｔｇｔｇｇａｇｔｇｃｔｇｃｔｇｃｔｇａｇｃｃｔｇｇｔｃａｔｃａｃａｃｔｇｔａｃｔｇｃ（配列番号１７０４０）を含む核酸配列によってコードされる。
【０５２０】
本開示のＣＬＲ／ＣＡＲのいくつかの実施形態において、エンドドメインは、ヒトＣＤ３ζエンドドメインを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ヒト４−１ＢＢ、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＩＣＯＳ、ＭｙＤ８８、ＯＸ−４０細胞内セグメント、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの共刺激ドメインは、ヒトＣＤ２８および／または４−１ＢＢ共刺激ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ共刺激ドメインは、ＲＶＫＦＳＲＳＡＤＡＰＡＹＫＱＧＱＮＱＬＹＮＥＬＮＬＧＲＲＥＥＹＤＶＬＤＫＲＲＧＲＤＰＥＭＧＧＫＰＲＲＫＮＰＱＥＧＬＹＮＥＬＱＫＤＫＭＡＥＡＹＳＥＩＧＭＫＧＥＲＲＲＧＫＧＨＤＧＬＹＱＧＬＳＴＡＴＫＤＴＹＤＡＬＨＭＱＡＬＰＰＲ（配列番号１４４７７）を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ３ζ共刺激ドメインはｃｇｃｇｔｇａａｇｔｔｔａｇｔｃｇａｔｃａｇｃａｇａｔｇｃｃｃｃａｇｃｔｔａｃａａａｃａｇｇｇａｃａｇａａｃｃａｇｃｔｇｔａｔａａｃｇａｇｃｔｇａａｔｃｔｇｇｇｃｃｇｃｃｇａｇａｇｇａａｔａｔｇａｃｇｔｇｃｔｇｇａｔａａｇｃｇｇａｇａｇｇａｃｇｃｇａｃｃｃｃｇａａａｔｇｇｇａｇｇｃａａｇｃｃｃａｇｇｃｇｃａａａａａｃｃｃｔｃａｇｇａａｇｇｃｃｔｇｔａｔａａｃｇａｇｃｔｇｃａｇａａｇｇａｃａａａａｔｇｇｃａｇａａｇｃｃｔａｔｔｃｔｇａｇａｔｃｇｇｃａｔｇａａｇｇｇｇｇａｇｃｇａｃｇｇａｇａｇｇｃａａａｇｇｇｃａｃｇａｔｇｇｇｃｔｇｔａｃｃａｇｇｇａｃｔｇａｇｃａｃｃｇｃｃａｃａａａｇｇａｃａｃｃｔａｔｇａｔｇｃｔｃｔｇｃａｔａｔｇｃａｇｇｃａｃｔｇｃｃｔｃｃａａｇｇ（配列番号１４４７８）を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ＫＲＧＲＫＫＬＬＹＩＦＫＱＰＦＭＲＰＶＱＴＴＱＥＥＤＧＣＳＣＲＦＰＥＥＥＥＧＧＣＥＬ（配列番号１４４７９）を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、ａａｇａｇａｇｇｃａｇｇａａｇａａａｃｔｇｃｔｇｔａｔａｔｔｔｔｃａａａｃａｇｃｃｃｔｔｃａｔｇｃｇｃｃｃｃｇｔｇｃａｇａｃｔａｃｃｃａｇｇａｇｇａａｇａｃｇｇｇｔｇｃｔｃｃｔｇｔｃｇａｔｔｃｃｃｔｇａｇｇａａｇａｇｇａａｇｇｃｇｇｇｔｇｔｇａｇｃｔｇ（配列番号１４４８０）を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、４−１ＢＢ共刺激ドメインは、膜貫通ドメインとＣＤ２８共刺激ドメインとの間に位置する。
【０５２１】
本開示のＣＬＲ／ＣＡＲのいくつかの実施形態において、ヒンジは、ヒトＣＤ８α、ＩｇＧ４、および／またはＣＤ４配列に由来する配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ヒトＣＤ８α配列に由来する配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ＴＴＴＰＡＰＲＰＰＴＰＡＰＴＩＡＳＱＰＬＳＬＲＰＥＡＣＲＰＡＡＧＧＡＶＨＴＲＧＬＤＦＡＣＤ（配列番号１４４８１）を含むアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジは、ａｃｔａｃｃａｃａｃｃａｇｃａｃｃｔａｇａｃｃａｃｃａａｃｔｃｃａｇｃｔｃｃａａｃｃａｔｃｇｃｇａｇｔｃａｇｃｃｃｃｔｇａｇｔｃｔｇａｇａｃｃｔｇａｇｇｃｃｔｇｃａｇｇｃｃａｇｃｔｇｃａｇｇａｇｇａｇｃｔｇｔｇｃａｃａｃｃａｇｇｇｇｃｃｔｇｇａｃｔｔｃｇｃｃｔｇｃｇａｃ（配列番号１４４８２）またはＡＣＣＡＣＡＡＣＣＣＣＴＧＣＣＣＣＣＡＧＡＣＣＴＣＣＣＡＣＡＣＣＣＧＣＣＣＣＴＡＣＣＡＴＣＧＣＧＡＧＴＣＡＧＣＣＣＣＴＧＡＧＴＣＴＧＡＧＡＣＣＴＧＡＧＧＣＣＴＧＣＡＧＧＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＣＴＧＴＧＣＡＣＡＣＣＡＧＧＧＧＣＣＴＧＧＡＣＴＴＣＧＣＣＴＧＣＧＡＣ（配列番号１７０４７）を含む核酸配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのタンパク質足場は、リガンドに特異的に結合する。
【０５２２】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、（ｂ）の外因性受容体は、非自然発生受容体を含む。いくつかの実施形態において、ＣＬＲは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、キメラリガンド受容体は、（ａ）リガンド認識領域を含むエクトドメインであって、リガンド認識領域は、少なくとも足場タンパク質を含む、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインと、を含む。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのタンパク質足場は、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、抗体模倣物、またはセンチリン（本明細書ではＣＡＲＴｙｒｉｎと称される）を含む。いくつかの実施形態において、リガンド認識領域は、抗体、抗体断片、単一ドメイン抗体、一本鎖抗体、抗体模倣物、およびセンチリンのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、ＶＨＨまたはＶＨ（本明細書ではＶＣＡＲと称される）を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、単一ドメイン抗体は、ヒト相補性決定領域（ＣＤＲ）を含むＶＨＨまたはＶＨを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、ＶＨは、組換えまたはキメラタンパク質である。いくつかの実施形態において、ＶＨは、組換えまたはキメラヒトタンパク質である。いくつかの実施形態において、抗体模倣物は、アフィボディ、アフリリン、アフィマー、アフィチン、アルファボディ、アンチカリン、アビマー、ＤＡＲＰｉｎ、Ｆｙｎｏｍｅｒ、Ｋｕｎｉｔｚドメインペプチド、またはモノボディを含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、センチリンは、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含むか、またはそれからなる。
【０５２３】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、（ｂ）の外因性受容体は、非自然発生受容体を含む。いくつかの実施形態において、ＣＬＲは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）である。いくつかの実施形態において、キメラリガンド受容体は、（ａ）リガンド認識領域を含むエクトドメインであって、リガンド認識領域は、少なくとも足場タンパク質を含む、エクトドメインと、（ｂ）膜貫通ドメインと、（ｃ）少なくとも１つの共刺激ドメインを含むエンドドメインと、を含む。いくつかの実施形態において、センチリンは、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインは、ヒトタンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、ヒトタンパク質は、テネイシン−Ｃである。いくつかの実施形態において、コンセンサス配列は、ＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１４４８８）を含む。いくつかの実施形態において、コンセンサス配列は、ＭＬＰＡＰＫＮＬＶＶＳＥＶＴＥＤＳＬＲＬＳＷＴＡＰＤＡＡＦＤＳＦＬＩＱＹＱＥＳＥＫＶＧＥＡＩＮＬＴＶＰＧＳＥＲＳＹＤＬＴＧＬＫＰＧＴＥＹＴＶＳＩＹＧＶＫＧＧＨＲＳＮＰＬＳＡＥＦＴＴ（配列番号１４４８９）を含む。いくつかの実施形態において、コンセンサス配列は、（ａ）コンセンサス配列の１３〜１６位のアミノ酸残基ＴＥＤＳを含むか、またはそれからなるＡ−Ｂループ、（ｂ）コンセンサス配列の２２〜２８位のアミノ酸残基ＴＡＰＤＡＡＦを含むか、またはそれからなるＢ−Ｃループ、（ｃ）コンセンサス配列の３８〜４３位のアミノ酸残基ＳＥＫＶＧＥを含むか、またはそれからなるＣ−Ｄループ、（ｄ）コンセンサス配列の５１〜５４位のアミノ酸残基ＧＳＥＲを含むか、またはそれからなるＤ−Ｅループ、（ｅ）コンセンサス配列の６０〜６４位のアミノ酸残基ＧＬＫＰＧを含むか、またはそれからなるＥ−Ｆループ、（ｆ）コンセンサス配列の７５〜８１位のアミノ酸残基ＫＧＧＨＲＳＮを含むか、またはそれからなるＦ−Ｇループ、あるいは（ｇ）（ａ）〜（ｆ）の任意の組み合わせ内の１つ以上の位置で改変される。いくつかの実施形態において、センチリンは、少なくとも５つのフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態において、センチリンは、少なくとも１０のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態において、センチリンは、少なくとも１５のフィブロネクチンＩＩＩ型（ＦＮ３）ドメインのコンセンサス配列を含む。いくつかの実施形態において、足場は、１０-9Ｍ以下、１０-10Ｍ以下、１０-11Ｍ以下、１０-12Ｍ以下、１０-13Ｍ以下、１０-14Ｍ以下、および１０-15Ｍ以下のＫDから選択される少なくとも１つの親和性を有する抗原に結合する。いくつかの実施形態において、ＫDは、表面プラズモン共鳴によって決定される。
【０５２４】
誘導性プロモーター
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、（ａ）の誘導性プロモーターをコードする配列は、ＮＦκＢプロモーターをコードする配列を含む。本開示の組成物のいくつかの実施形態において、（ａ）の誘導性プロモーターをコードする配列は、インターフェロン（ＩＦＮ）プロモーターをコードする配列またはインターロイキン−２プロモーターをコードする配列を含む。いくつかの実施形態において、インターフェロン（ＩＦＮ）プロモーターは、ＩＦＮγプロモーターである。本開示の組成物のいくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、サイトカインまたはケモカインのプロモーターから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態において、サイトカインまたはケモカインは、ＩＬ２、ＩＬ３、ＩＬ４、ＩＬ５、ＩＬ６、ＩＬ１０、ＩＬ１２、ＩＬ１３、ＩＬ１７Ａ／Ｆ、ＩＬ２１、ＩＬ２２、ＩＬ２３、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦβ）、コロニー刺激因子２（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターフェロンガンマ（ＩＦＮγ）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦα）、ＬＴα、パーフォリン、グランザイムＣ（Ｇｚｍｃ）、グランザイムＢ（Ｇｚｍｂ）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド５（ＣＣＬ５）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド４（Ｃｃｌ４）、Ｃ−Ｃモチーフケモカインリガンド３（Ｃｃｌ３）、Ｘ−Ｃモチーフケモカインリガンド１（Ｘｃｌ１）、およびＬＩＦインターロイキン６ファミリーサイトカイン（Ｌｉｆ）を含む。
【０５２５】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、細胞分化、活性化、枯渇、および機能に関与する表面タンパク質を含む遺伝子のプロモーターから単離されるか、またはそれに由来する。いくつかの実施形態において、遺伝子は、ＣＤ６９、ＣＤ７１、ＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、ＴＩＧＩＴ、ＬＡＧ３、ＴＩＭ−３、ＧＩＴＲ、ＭＨＣＩＩ、ＣＯＸ−２、ＦＡＳＬ、および４−１ＢＢを含む。
【０５２６】
本開示の組成物のいくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、ＣＤ代謝および分化に関与する遺伝子のプロモーターから単離されるか、またはそれに由来する。本開示の組成物のいくつかの実施形態において、誘導性プロモーターは、Ｎｒ４ａ１、Ｎｒ４ａ３、Ｔｎｆｒｓｆ９（４−１ＢＢ）、Ｓｅｍａ７ａ、Ｚｆｐ３６ｌ２、Ｇａｄｄ４５ｂ、Ｄｕｓｐ５、Ｄｕｓｐ６、およびＮｅｔｏ２のプロモーターから単離されるか、またはそれに由来する。
【０５２７】
誘導性導入遺伝子
いくつかの実施形態において、誘導性導入遺伝子構築物は、阻害性チェックポイントシグナルの下流のシグナル伝達成分（例えば、表１および２に提供される）、転写因子（例えば、表３に提供される）、サイトカインまたはサイトカイン受容体、ケモカインまたはケモカイン受容体、細胞死またはアポトーシス受容体／リガンド（例えば、表４に提供される）、代謝センシング分子（例えば、表５に提供される）、癌治療に対する感受性を付与するタンパク質（例えば、表６および／または９に提供される）、ならびに癌遺伝子または腫瘍サプレッサー遺伝子（例えば、表７に提供される）の発現を含むか、またはそれを起動する。本開示の例示的なサイトカイン、サイトカイン受容体、ケモカインおよびケモカイン受容体には、表８に提供されるサイトカインおよびサイトカイン受容体、ならびにケモカインおよびケモカイン受容体が含まれるが、これらに限定されない。
【０５２８】
【表１４−１】
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【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【表１４−５】
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【表１４−６】
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【表１４−７】
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【表１４−８】
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【表１４−９】
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【表１４−１０】
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【表１４−１１】
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【表１４−１２】
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【表１４−１３】
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【表１４−１４】
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【表１４−１５】
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【表１４−１６】
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【表１４−１７】
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【表１４−１８】
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【表１４−１９】
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【表１４−２０】
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【表１４−２１】
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【表１４−２９】
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【表１４−３０】
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【表１４−４４】
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【表１４−６４】
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【表１４−６５】
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【表１４−６６】
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【表１４−６７】
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【表１４−６８】
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【表１４−６９】
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【表１４−７０】
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【表１４−７１】
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【表１４−７２】
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【表１４−７３】
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【表１４−７４】
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【表１４−７５】
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【表１４−７６】
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【表１４−７７】
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【表１４−７８】
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【表１４−７９】
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【表１４−８０】
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【表１４−８１】
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【表１４−８２】
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【表１４−８３】
2021536249.tif 000204
【表１４−８４】
2021536249.tif 000205
【表１４−８５】
2021536249.tif 000206
【表１４−８６】
2021536249.tif 000207
【表１４−８７】
2021536249.tif 000208
【表１４−８８】
2021536249.tif 000209
【表１４−８９】
2021536249.tif 000210
【表１４−９０】
2021536249.tif 000211
【表１４−９１】
2021536249.tif 000212
【表１４−９２】
2021536249.tif 000213
【０５２９】
Ｃａｓ−Ｃｌｏｖｅｒ
本開示は、ガイドＲＮＡおよび融合タンパク質または融合タンパク質をコードする配列を含む組成物を提供し、融合タンパク質は、ｄＣａｓ９およびＣｌｏ０５１エンドヌクレアーゼまたはそのヌクレアーゼドメインを含む。
【０５３０】
小さなＣａｓ９（ＳａＣａｓ９）
本開示は、エフェクターに作動可能に連結された小さなＣａｓ９（Ｃａｓ９）を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる融合タンパク質を提供し、エフェクターは、小さなＣａｓ９（Ｃａｓ９）を含む。ある特定の実施形態において、本開示の小さなＣａｓ９構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含み得る。
【０５３１】
活性触媒部位を持つＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ  ａｕｒｅｕｓ  Ｃａｓ９のアミノ酸配列。
【化４７】
2021536249.tif 000214
【０５３２】
不活化した小さなＣａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）
本開示は、エフェクターに作動可能に連結された不活化した小さなＣａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる融合タンパク質を提供し、このエフェクターは、小さな不活化したＣａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む。ある特定の実施形態において、本開示の小さな不活化Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含み得る。
【０５３３】
ｄＳａＣａｓ９配列：Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ突然変異（太字、大文字、下線付き）は、触媒部位を不活性化する。
【化４８】
2021536249.tif 000215
【０５３４】
不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）
本開示は、エフェクターに作動可能に連結された不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む組成物を提供する。ある特定の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ局在化成分およびエフェクター分子を含む、本質的にそれらからなる、またはそれらからなる融合タンパク質を提供し、このエフェクターは、不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）を含む。ある特定の実施形態において、本開示の不活化Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）構築物は、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むエフェクターを含み得る。
【０５３５】
ある特定の実施形態において、本開示のｄＣａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓから単離されるか、またはそれに由来するｄＣａｓ９を含む。ある特定の実施形態において、ｄＣａｓ９は、触媒部位を不活性化するｄＣａｓ９のアミノ酸配列の１０位および８４０位での置換を有するｄＣａｓ９を含む。ある特定の実施形態において、これらの置換は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａである。ある特定の実施形態において、ｄＣａｓ９のアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
【化４９】
2021536249.tif 000216
【０５３６】
ある特定の実施形態において、ｄＣａｓ９のアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
【化５０】
2021536249.tif 000217
【０５３７】
Ｃｌｏ０５１エンドヌクレアーゼ
例示的なＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインは、ＥＧＩＫＳＮＩＳＬＬＫＤＥＬＲＧＱＩＳＨＩＳＨＥＹＬＳＬＩＤＬＡＦＤＳＫＱＮＲＬＦＥＭＫＶＬＥＬＬＶＮＥＹＧＦＫＧＲＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＩＶＹＳＴＴＬＥＤＮＦＧＩＩＶＤＴＫＡＹＳＥＧＹＳＬＰＩＳＱＡＤＥＭＥＲＹＶＲＥＮＳＮＲＤＥＥＶＮＰＮＫＷＷＥＮＦＳＥＥＶＫＫＹＹＦＶＦＩＳＧＳＦＫＧＫＦＥＥＱＬＲＲＬＳＭＴＴＧＶＮＧＳＡＶＮＶＶＮＬＬＬＧＡＥＫＩＲＳＧＥＭＴＩＥＥＬＥＲＡＭＦＮＮＳＥＦＩＬＫＹ（配列番号１７０５５）のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【０５３８】
Ｃａｓ−Ｃｌｏｖｅｒ融合タンパク質
ある特定の実施形態において、例示的なｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態１）は、（Ｃｌｏ０５１配列は下線が引かれ、リンカーは太字イタリック体、ｄＣａｓ９配列（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）はイタリック体）のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなり得る。
【化５１】
2021536249.tif 000218
【０５３９】
ある特定の実施形態において、例示的なｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態１）は、（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するｄＣａｓ９配列）の核酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【化５２−１】
2021536249.tif 000219
【化５２−２】
2021536249.tif 000220
【０５４０】
ある特定の実施形態において、本開示のｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態１）をコードする核酸配列は、ＤＮＡを含み得る。ある特定の実施形態において、本開示のｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態１）をコードする核酸配列は、ＲＮＡを含み得る。
【０５４１】
ある特定の実施形態において、例示的なｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態２）は、（Ｃｌｏ０５１配列は下線が引かれ、リンカーは太字イタリック体、ｄＣａｓ９配列（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓ）はイタリック体）のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなり得る。
【化５３】
2021536249.tif 000221
【０５４２】
ある特定の実施形態において、例示的なｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態２）は、（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓに由来するｄＣａｓ９配列）の核酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【化５４−１】
2021536249.tif 000222
【化５４−２】
2021536249.tif 000223
ある特定の実施形態において、本開示のｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態２）をコードする核酸配列は、ＤＮＡを含み得る。ある特定の実施形態において、本開示のｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１融合タンパク質（実施形態２）をコードする核酸配列は、ＲＮＡを含み得る。
【０５４３】
転位システム
本開示の例示的なトランスポゾン／トランスポザーゼシステムとしては、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンおよびトランスポザーゼ、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンおよびトランスポザーゼ、Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンおよびトランスポザーゼ、ならびにＴｏｌ２トランスポゾンおよびトランスポザーゼが挙げられるが、これらに限定されない。
【０５４４】
ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポザーゼは、トランスポゾンの両末端上のトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、ＩＴＲ間の内容物をＴＴＡＡ染色体部位に移行させる。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンシステムは、ＩＴＲ間に含まれ得る目的の遺伝子についてペイロード限界がない。ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃトランスポゾンである実施形態において、このトランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。ある特定の実施形態、特に、トランスポザーゼがＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである実施形態において、トランスポザーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。
【０５４５】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化５５】
2021536249.tif 000224
【０５４６】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、以下の配列の位３０位、１６５位、２８２位、または５３８位のうちの１つ以上においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。
【化５６】
2021536249.tif 000225
【０５４７】
ある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の配列の３０位、１６５位、２８２位、または５３８位のうちの２つ以上においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ＮＯ：１４４８７。ある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の配列の３０位、１６５位、２８２位、または５３８位のうちの３つ以上においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の配列の３０位、１６５位、２８２位、および５３８位の各々においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７の配列の３０位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７の配列の１６５位におけるアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７の配列の２８２位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７の配列の５３８位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からリシン（Ｋ）への置換である。
【０５４８】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、本開示のＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポサーゼ酵素は、配列番号１４４８７の配列のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得、３０位におけるアミノ酸置換が、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換であり、１６５位におけるアミノ酸置換が、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換であり、２８２位におけるアミノ酸置換が、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換であり、５３８位におけるアミノ酸置換が、アスパラギン（Ｎ）からリジン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化５７】
2021536249.tif 000226
【０５４９】
トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、および／または５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の３位、４６位、８２位、１０３位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２５８位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８６位、５０３位、５５２位、５７０位、および５９１位のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、および／または５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、４６位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８５位、５０３位、５５２位、および５７０位のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からアスパラギン（Ｎ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４６位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４６位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からスレオニン（Ｔ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の８２位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１０３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１１９位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１２５位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１２５位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１７７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４��７または配列番号１４４８４の１７７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からヒスチジン（Ｈ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１８５位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１８７位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２００位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態において、、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２０７位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２０９位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２２６位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２３５位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２４０位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２４１位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２４３位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２５８位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からチロシン（Ｙ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ��からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３１１位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３１１位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からバリンへの置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３１５位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からリジン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３１９位におけるアミノ酸置換は、スレオニン（Ｔ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３２７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３２８位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３４０位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３４０位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４２１位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からヒスチジン（Ｈ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４３６位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４５６位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４７０位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４８５位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５０３位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５０３��におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５５２位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５７０位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のスレオニン（Ｔ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５９１位におけるアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５９１位におけるでのアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。
【０５５０】
トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、および／または５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換を含み得るか、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、および／または５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ超におけるアミノ酸置換を含み得るか、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ超におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、および／または５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位におけるアミノ酸置換を含み得るか、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１０３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１９４位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３７２位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３７５位におけるアミノ酸置換は、リジン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４５０位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５０９位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５７０位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換を含み得る。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポザーゼ酵素が、配列番号１４４８７の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換を含み得る、これらの実施形態を含む、ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の３７２位、３７５位、および４５０位におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換、配列番号１４４８７の３７２位におけるアルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換、および配列番号１４４８７の３７５位におけるリジン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換を含み得る。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換、配列番号１４４８７の３７２位におけるアルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換、配列番号１４４８７の３７５位におけるリジン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換、および配列番号１４４８７の４５０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換を含み得る。
【０５５１】
ｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポゾンは、ＩＴＲを認識するｓｌｅｅｐｉｎｇ  ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼによって標的ゲノムに転位され、ＩＴＲ間の内容物をＴＡ染色体部位に移行させる。様々な実施形態において、ＳＢトランスポゾン媒介遺伝子導入、またはいくつかの同様のトランスポゾンのうちのいずれかを使用する遺伝子導入が、本開示の組成物および方法において使用され得る。
【０５５２】
ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンが、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾンである実施形態において、このトランスポザーゼは、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼまたは高活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ（ＳＢ１００Ｘ）である。
【０５５３】
本開示の方法のある特定の実施形態において、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含む。
【化５８】
2021536249.tif 000227
【０５５４】
本開示の方法のある特定の実施形態において、高活性Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ１００Ｘ）トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含む。
【化５９】
2021536249.tif 000228
【０５５５】
Ｈｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンは、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼによって転位される。Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、約３，０００〜３，６００万年前に活動的であったコウモリゲノムからの古来のエレメントであるＨｅｌｒａｉｓｅｒトランスポゾンを動員する。本開示の例示的なＨｅｌｌａｉｓｅｒトランスポゾンは、以下を含む核酸配列を含むＨｅｌｉｂａｔ１を含む。
【化６０−１】
2021536249.tif 000229
【化６０−２】
2021536249.tif 000230
【化６０−３】
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【０５５６】
他のトランスポザーゼとは異なり、Ｈｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、ＲＮａｓｅ−Ｈ様触媒ドメインを含有しないが、その代わりに、複製開始ドメイン（Ｒｅｐ）およびＤＮＡヘリカーゼドメインで構成されるＲｅｐＨｅｌモチーフを含む。Ｒｅｐドメインは、ヌクレアーゼのＨＵＨスーパーファミリーのヌクレアーゼドメインである。
【０５５７】
本開示の例示的なＨｅｌｉｔｒｏｎトランスポザーゼは、以下を含むアミノ酸配列を含む。
【化６１】
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【０５５８】
Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転位では、トランスポゾンの３’末端の近くのヘアピンがターミネーターとして機能する。しかしながら、このヘアピンは、トランスポザーゼによって迂回され、その結果、隣接する配列の形質導入がもたらされ得る。さらに、Ｈｅｌｌａｉｓｅｒ転位により、共有結合により閉じた環状中間体が生じる。さらに、Ｈｅｌｉｔｒｏｎ転位は、標的部位重複を欠き得る。Ｈｅｌｒａｉｓｅｒ配列では、トランスポザーゼは、ＬＴＳおよびＲＴＳと称される左末端配列および右末端配列に挟まれている。これらの配列は、保存された５’−ＴＣ／ＣＴＡＧ−３’モチーフで終結する。ヘアピン終結構造が形成される潜在性がある１９ｂｐのパリンドローム配列が、ＲＴＳの１１ヌクレオチド上流に位置し、配列ＧＴＧＣＡＣＧＡＡＴＴＴＣＧＴＧＣＡＣＣＧＧＧＣＣＡＣＴＡＧ（配列番号１４５００）からなる。
【０５５９】
Ｔｏｌ２トランスポゾンは、メダカのゲノムから単離されるか、またはそれに由来し得、ｈＡＴファミリーのトランスポゾンと類似し得る。本開示の例示的なＴｏｌ２トランスポゾンは、約４．７キロベースを含む配列によってコードされ、４つのエクソンを含有するＴｏｌ２トランスポザーゼをコードする遺伝子を含有する。本開示の例示的なＴｏｌ２トランスポザーゼは、以下を含むアミノ酸配列を含む。
【化６２】
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【０５６０】
本開示の例示的なＴｏｌ２トランスポゾンは、逆方向反復、末端近くの配列、およびＴｏｌ２トランスポザーゼを含め、以下を含む核酸配列によってコードされる。
【化６３−１】
2021536249.tif 000234
【化６３−２】
2021536249.tif 000235
【化６３−３】
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【０５６１】
本開示の例示的なトランスポゾン／トランスポザーゼシステムには、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）およびｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンおよびトランスポザーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０５６２】
ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）およびｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、トランスポゾンの両末端上のトランスポゾン特異的逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）を認識し、ＩＴＲ間の内容物をＴＴＡＡまたはＴＴＡＴ染色体部位に移行させる。ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンシステムは、ＩＴＲ間に含まれ得る目的の遺伝子についてペイロード限界がない。
【０５６３】
ある特定の実施形態、特に、トランスポゾンがｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾンである実施形態において、このトランスポザーゼは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）トランスポザーゼである。ある特定の実施形態、特に、トランスポザーゼが、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）である実施形態において、トランスポザーゼをコードする配列は、ｍＲＮＡ配列である。
【０５６４】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。
【０５６５】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化６４】
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【０５６６】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、以下の配列の位３０位、１６５位、２８２位、または５３８位のうちの１つ以上においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。
【化６５】
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【０５６７】
ある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の配列の３０位、１６５位、２８２位、または５３８位のうちの２つ以上においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の配列の３０位、１６５位、２８２位、または５３８位のうちの３つ以上においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の配列の３０位、１６５位、２８２位、および５３８位の各々においてアミノ酸置換を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７の配列の３０位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７の配列の１６５位におけるアミノ酸置換は、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７の配列の２８２位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７の配列の５３８位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からリシン（Ｋ）への置換である。
【０５６８】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、本開示のＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポサーゼ酵素は、配列番号１４４８７の配列のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得、３０位におけるアミノ酸置換が、イソロイシン（Ｉ）からバリン（Ｖ）への置換であり、１６５位におけるアミノ酸置換が、グリシン（Ｇ）からセリン（Ｓ）への置換であり、２８２位におけるアミノ酸置換が、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換であり、５３８位におけるアミノ酸置換が、アスパラギン（Ｎ）からリジン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）（ＳＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化６６】
2021536249.tif 000239
【０５６９】
トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、および／または５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の３位、４６位、８２位、１０３位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２５８位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８６位、５０３位、５５２位、５７０位、および５９１位のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、および／または５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）、Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）、またはｐｉｇｇｙＢａｃ様Ｓｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、４６位、１１９位、１２５位、１７７位、１８０位、１８５位、１８７位、２００位、２０７位、２０９位、２２６位、２３５位、２４０位、２４１位、２４３位、２９６位、２９８位、３１１位、３１５位、３１９位、３２７位、３２８位、３４０位、４２１位、４３６位、４５６位、４７０位、４８５位、５０３位、５５２位、および５７０位のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からアスパラギン（Ｎ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４６位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４６位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からスレオニン（Ｔ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の８２位におけるアミノ酸置換は、イソロイシン（Ｉ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１０３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１１９位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１２５位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１２５位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１７７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１７７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からヒスチジン（Ｈ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１８０位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１８５位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１８７位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２００位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２０７位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２０９位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２２６位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２３５位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２４０位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２４１位におけるアミノ酸置換は、フェニルアラニン（Ｆ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２４３位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２５８位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からトリプトファン（Ｗ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からチロシン（Ｙ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９６位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の２９８位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３１１位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３１１位におけるアミノ酸置換は、プロリン（Ｐ）からバリンへの置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３１５位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からリジン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３１９位におけるアミノ酸置換は、スレオニン（Ｔ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３２７位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３２８位におけるアミノ酸置換は、チロシン（Ｙ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３４０位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３４０位におけるアミノ酸置換は、システイン（Ｃ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４２１位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からヒスチジン（Ｈ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４３６位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４５６位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からチロシン（Ｙ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４７０位におけるアミノ酸置換は、ロイシン（Ｌ）からフェニルアラニン（Ｆ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４８５位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５０３位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からロイシン（Ｌ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５０３位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からイソロイシン（Ｉ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５５２位におけるアミノ酸置換は、バリン（Ｖ）からリシン（Ｋ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５７０位におけるアミノ酸置換は、アラニン（Ａ）のスレオニン（Ｔ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５９１位におけるアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５９１位におけるでのアミノ酸置換は、グルタミン（Ｑ）からアルギニン（Ｒ）への置換である。
【０５７０】
トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、および／または５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換を含み得るか、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位のうちの１つ以上におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、および／または５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、本開示の方法のある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上におけるアミノ酸置換を含み得るか、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位のうちの２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、またはそれ以上におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。トランスポザーゼが、３０位、１６５位、２８２位、および／または５３８位において上記の変異を含む、これらの実施形態を含む、ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位におけるアミノ酸置換を含み得るか、またはＳｕｐｅｒ  ｐｉｇｇｙＢａｃ（商標）トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の１０３位、１９４位、３７２位、３７５位、４５０位、５０９位、および５７０位におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１０３位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からプロリン（Ｐ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の１９４位におけるアミノ酸置換は、メチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３７２位におけるアミノ酸置換は、アルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の３７５位におけるアミノ酸置換は、リジン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の４５０位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５０９位におけるアミノ酸置換は、セリン（Ｓ）からグリシン（Ｇ）への置換である。ある特定の実施形態において、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の５７０位におけるアミノ酸置換は、アスパラギン（Ｎ）からセリン（Ｓ）への置換である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換を含み得る。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素が、配列番号１４４８７の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換を含み得る、これらの実施形態を含む、ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７または配列番号１４４８４の配列の３７２位、３７５位、および４５０位におけるアミノ酸置換をさらに含み得る。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換、配列番号１４４８７の３７２位におけるアルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換、および配列番号１４４８７の３７５位におけるリジン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換を含み得る。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、配列番号１４４８７の１９４位におけるメチオニン（Ｍ）からバリン（Ｖ）への置換、配列番号１４４８７の３７２位におけるアルギニン（Ｒ）からアラニン（Ａ）への置換、配列番号１４４８７の３７５位におけるリジン（Ｋ）からアラニン（Ａ）への置換、および配列番号１４４８７の４５０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）からアスパラギン（Ｎ）への置換を含み得る。
【０５７１】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、昆虫から単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、昆虫は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＡ８７３７５；配列番号１６７９６）、Ａｒｇｙｒｏｇｒａｍｍａ  ａｇｎａｔａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＵ４７７７１３；配列番号１４５３４、配列番号１６７９７）、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿３１２６１５（配列番号１６７９８）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿３２０４１４（配列番号１６７９９）；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿３１０７２９（配列番号１６８００））、Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｓｙｐｉｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＵ３２９９１８；配列番号１６８０１、配列番号１６８０２）、Ａｃｙｒｔｈｏｓｉｐｈｏｎ  ｐｉｓｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００１９４８１３９；配列番号１６８０３）、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＵ４７７７１４；配列番号１４５３７、配列番号１６８０４）、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＤ１１１３５；配列番号１４５０５）、Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＪＸ２９４４７６；配列番号１６８０５、配列番号１６８０６）、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＡＬ３９７８４；配列番号１６８０７）、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＳ１８３９１；配列番号１４５２５）、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢＤ７６３３５；配列番号１６８０８）、Ｍａｃｄｕｎｎｏｕｇｈｉａ  ｃｒａｓｓｉｓｉｇｎａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＥＵ２８７４５１；配列番号１６８０９、配列番号１６８１０）、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＧＵ２７０３２２；配列番号１４５３０、配列番号１６８１１）、Ｔｒｉｂｏｌｉｕｍ  ｃａｓｔａｎｅｕｍ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００１８１４５６６；配列番号１６８１２）、Ｃｔｅｎｏｐｌｕｓｉａ  ａｇｎａｔａ（Ａｒｇｙｒｏｇｒａｍｍａ  ａｇｎａｔａとも呼ばれる）、Ｍｅｓｓｏｕｒ  ｂｏｕｖｉｅｒｉ、Ｍｅｇａｃｈｉｌｅ  ｒｏｔｕｎｄａｔａ、Ｂｏｍｂｕｓ  ｉｍｐａｔｉｅｎｓ、Ｍａｍｅｓｔｒａ  Ｂｒａｓｓｉｃａｅ、Ｍａｙｅｔｉｏｌａｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒ、またはＡｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａである。
【０５７２】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、昆虫から単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、昆虫は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉ（ＡＡＡ８７３７５）である。
【０５７３】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、昆虫から単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、昆虫は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉ（ＢＡＤ１１１３５）である。
【０５７４】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、甲殻類から単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、甲殻類は、Ｄａｐｈｎｉａ  ｐｕｌｉｃａｒｉａ（ＡＡＭ７６３４２、配列番号１６８１３）である。
【０５７５】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、脊椎動物から単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、脊椎動物は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＢＡＦ８２０２６；配列番号１４５１８）、Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿６８９８０８；配列番号１６８１４）、Ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＰ＿７４１９５８；配列番号１６８１５）、Ｍａｃａｃａ  ｆａｓｃｉｃｕｌａｒｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＢ１７９０１２；配列番号１６８１６、配列番号１６８１７）、Ｒａｔｔｕｓ  ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿２２０４５３；配列番号１６８１８）、またはＭｙｏｔｉｓ  ｌｕｃｉｆｕｇｕｓである。
【０５７６】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、尾索動物から単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、尾索動物は、Ｃｉｏｎａ  ｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｉｓ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＸＰ＿００２１２３６０２；配列番号１６８１９）である。
【０５７７】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、染色体部位（ＴＴＡＴ標的配列）内の配列５’−ＴＴＡＴ−３’にトランスポゾンを挿入する。
【０５７８】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、染色体部位（ＴＴＡＡ標的配列）内の配列５’−ＴＴＡＡ−３’にトランスポゾンを挿入する。
【０５７９】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの標的配列は、５’−ＣＴＡＡ−３’、５’−ＴＴＡＧ−３’、５’−ＡＴＡＡ−３’、５’−ＴＣＡＡ−３’、５’ＡＧＴＴ−３’、５’−ＡＴＴＡ−３’、５’−ＧＴＴＡ−３’、５’−ＴＴＧＡ−３’、５’−ＴＴＴＡ−３’、５’−ＴＴＡＣ−３’、５’−ＡＣＴＡ−３’、５’−ＡＧＧＧ−３’、５’−ＣＴＡＧ−３’、５’−ＴＧＡＡ−３’、５’−ＡＧＧＴ−３’、５’−ＡＴＣＡ−３’、５’−ＣＴＣＣ−３’、５’−ＴＡＡＡ−３’、５’−ＴＣＴＣ−３’、５’ＴＧＡＡ−３’、５’−ＡＡＡＴ−３’、５’−ＡＡＴＣ−３’、５’−ＡＣＡＡ−３’、５’−ＡＣＡＴ−３’、５’−ＡＣＴＣ−３’、５’−ＡＧＴＧ−３’、５’−ＡＴＡＧ−３’、５’−ＣＡＡＡ−３’、５’−ＣＡＣＡ−３’、５’−ＣＡＴＡ−３’、５’−ＣＣＡＧ−３’、５’−ＣＣＣＡ−３’、５’−ＣＧＴＡ−３’、５’−ＧＴＣＣ−３’、５’−ＴＡＡＧ−３’、５’−ＴＣＴＡ−３’、５’−ＴＧＡＧ−３’、５’−ＴＧＴＴ−３’、５’−ＴＴＣＡ−３’５’−ＴＴＣＴ−３’、および５’−ＴＴＴＴ−３’を含むか、またはそれらからなる。
【０５８０】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化６７】
2021536249.tif 000240
【０５８１】
ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化６８】
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【０５８２】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、核局在化シグナルに融合される。ある特定の実施形態において、核局在化シグナルに融合されたｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼのアミノ酸配列は、以下を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【化６９】
2021536249.tif 000242
【０５８３】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、高活性である。高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、それが由来する自然発生バリアントよりもさらに活性であるトランスポザーゼである。ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５０５の高活性バリアントである。ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下と少なくとも９０％同一である配列を含む。
【化７０】
2021536249.tif 000243
【０５８４】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５７６を含む。ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化７１】
2021536249.tif 000244
【０５８５】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化７２】
2021536249.tif 000245
【０５８６】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化７３】
2021536249.tif 000246
【０５８７】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化７４】
2021536249.tif 000247
【０５８８】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化７５】
2021536249.tif 000248
【０５８９】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５０５のトランスポザーゼよりもさらに活性である。ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５０５と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％、あるいはその間の任意のパーセンテージで同一である。
【０５９０】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、（配列番号１４５０５に対して）９２、９３、９６、９７、１６５、１７８、１８９、１９６、２００、２０１、２１１、２１５、２３５、２３８、２４６、２５３、２５８、２６１、２６３、２７１、３０３、３２１、３２４、３３０、３７３、３８９、３９９、４０２、４０３、４０４、４４８、４７３、４８４、５０７、５２３、５２７、５２８、５４３、５４９、５５０、５５７、６０１、６０５、６０７、６０９、６１０、またはそれらの組み合わせから選択される位置におけるアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、Ｑ９２Ａ、Ｖ９３Ｌ、Ｖ９３Ｍ、Ｐ９６Ｇ、Ｆ９７Ｈ、Ｆ９７Ｃ、Ｈ１６５Ｅ、Ｈ１６５Ｗ、Ｅ１７８Ｓ、Ｅ１７８Ｈ、Ｃ１８９Ｐ、Ａ１９６Ｇ、Ｌ２００Ｉ、Ａ２０１Ｑ、Ｌ２１１Ａ、Ｗ２１５Ｙ、Ｇ２１９Ｓ、Ｑ２３５Ｙ、Ｑ２３５Ｇ、Ｑ２３８Ｌ、Ｋ２４６Ｉ、Ｋ２５３Ｖ、Ｍ２５８Ｖ、Ｆ２６１Ｌ、Ｓ２６３Ｋ、Ｃ２７１Ｓ、Ｎ３０３Ｒ、Ｆ３２１Ｗ、Ｆ３２１Ｄ、Ｖ３２４Ｋ、Ｖ３２４Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｌ３７３Ｃ、Ｌ３７３Ｖ、Ｖ３８９Ｌ、Ｓ３９９Ｎ、Ｒ４０２Ｋ、Ｔ４０３Ｌ、Ｄ４０４Ｑ、Ｄ４０４Ｓ、Ｄ４０４Ｍ、Ｎ４４１Ｒ、Ｇ４４８Ｗ、Ｅ４４９Ａ、Ｖ４６９Ｔ、Ｃ４７３Ｑ、Ｒ４８４Ｋ  Ｔ５０７Ｃ、Ｇ５２３Ａ、Ｉ５２７Ｍ、Ｙ５２８Ｋ  Ｙ５４３Ｉ、Ｅ５４９Ａ、Ｋ５５０Ｍ、Ｐ５５７Ｓ、Ｅ６０１Ｖ、Ｅ６０５Ｈ、Ｅ６０５Ｗ、Ｄ６０７Ｈ、Ｓ６０９Ｈ、Ｌ６１０Ｉ、またはそれらの任意の組み合わせのアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、Ｑ９２Ａ、Ｖ９３Ｌ、Ｖ９３Ｍ、Ｐ９６Ｇ、Ｆ９７Ｈ、Ｆ９７Ｃ、Ｈ１６５Ｅ、Ｈ１６５Ｗ、Ｅ１７８Ｓ、Ｅ１７８Ｈ、Ｃ１８９Ｐ、Ａ１９６Ｇ、Ｌ２００Ｉ、Ａ２０１Ｑ、Ｌ２１１Ａ、Ｗ２１５Ｙ、Ｇ２１９Ｓ、Ｑ２３５Ｙ、Ｑ２３５Ｇ、Ｑ２３８Ｌ、Ｋ２４６Ｉ、Ｋ２５３Ｖ、Ｍ２５８Ｖ、Ｆ２６１Ｌ、Ｓ２６３Ｋ、Ｃ２７１Ｓ、Ｎ３０３Ｒ、Ｆ３２１Ｗ、Ｆ３２１Ｄ、Ｖ３２４Ｋ、Ｖ３２４Ｈ、Ａ３３０Ｖ、Ｌ３７３Ｃ、Ｌ３７３Ｖ、Ｖ３８９Ｌ、Ｓ３９９Ｎ、Ｒ４０２Ｋ、Ｔ４０３Ｌ、Ｄ４０４Ｑ、Ｄ４０４Ｓ、Ｄ４０４Ｍ、Ｎ４４１Ｒ、Ｇ４４８Ｗ、Ｅ４４９Ａ、Ｖ４６９Ｔ、Ｃ４７３Ｑ、Ｒ４８４Ｋ  Ｔ５０７Ｃ、Ｇ５２３Ａ、Ｉ５２７Ｍ、Ｙ５２８Ｋ  Ｙ５４３Ｉ、Ｅ５４９Ａ、Ｋ５５０Ｍ、Ｐ５５７Ｓ、Ｅ６０１Ｖ、Ｅ６０５Ｈ、Ｅ６０５Ｗ、Ｄ６０７Ｈ、Ｓ６０９Ｈ、およびＬ６１０Ｉのアミノ酸置換を含む。
【０５９１】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸のうちの１つ以上の置換を含み、野生型アミノ酸の１つ以上の置換は、（配列番号１４５０５に対して）Ｅ４Ｘ、Ａ１２Ｘ、Ｍ１３Ｘ、Ｌ１４Ｘ、Ｅ１５Ｘ、Ｄ２０Ｘ、Ｅ２４Ｘ、Ｓ２５Ｘ、Ｓ２６Ｘ、Ｓ２７Ｘ、Ｄ３２Ｘ、Ｈ３３Ｘ、Ｅ３６Ｘ、Ｅ４４Ｘ、Ｅ４５Ｘ、Ｅ４６Ｘ、Ｉ４８Ｘ、Ｄ４９Ｘ、Ｒ５８Ｘ、Ａ６２Ｘ、Ｎ６３Ｘ、Ａ６４Ｘ、Ｉ６５Ｘ、Ｉ６６Ｘ、Ｎ６８Ｘ、Ｅ６９Ｘ、Ｄ７１Ｘ、Ｓ７２Ｘ、Ｄ７６Ｘ、Ｐ７９Ｘ、Ｒ８４Ｘ、Ｑ８５Ｘ、Ａ８７Ｘ、Ｓ８８Ｘ、Ｑ９２Ｘ、Ｖ９３Ｘ、Ｓ９４Ｘ、Ｇ９５Ｘ、Ｐ９６Ｘ、Ｆ９７Ｘ、Ｙ９８Ｘ、Ｔ９９Ｘ、Ｉ１４５Ｘ、Ｓ１４９Ｘ、Ｄ１５０Ｘ、Ｌ１５２Ｘ、Ｅ１５４Ｘ、Ｔ１５７Ｘ、Ｎ１６０Ｘ、Ｓ１６１Ｘ、Ｓ１６２Ｘ、Ｈ１６５Ｘ、Ｒ１６６Ｘ、Ｔ１６８Ｘ、Ｋ１６９Ｘ、Ｔ１７０Ｘ、Ａ１７１Ｘ、Ｅ１７３Ｘ、Ｓ１７５Ｘ、Ｓ１７６Ｘ、Ｅ１７８Ｘ、Ｔ１７９Ｘ、Ｍ１８３Ｘ、Ｑ１８４Ｘ、Ｔ１８６Ｘ、Ｔ１８７Ｘ、Ｌ１８８Ｘ、Ｃ１８９Ｘ、Ｌ１９４Ｘ、Ｉ１９５Ｘ、Ａ１９６Ｘ、Ｌ１９８Ｘ、Ｌ２００Ｘ、Ａ２０１Ｘ、Ｌ２０３Ｘ、Ｉ２０４Ｘ、Ｋ２０５Ｘ、Ａ２０６Ｘ、Ｎ２０７Ｘ、Ｑ２０９Ｘ、Ｓ２１０Ｘ、Ｌ２１１Ｘ、Ｋ２１２Ｘ、Ｄ２１３Ｘ、Ｌ２１４Ｘ、Ｗ２１５Ｘ、Ｒ２１６Ｘ、Ｔ２１７Ｘ、Ｇ２１９Ｘ、Ｖ２２２Ｘ、Ｄ２２３Ｘ、Ｉ２２４Ｘ、Ｔ２２７Ｘ、Ｍ２２９Ｘ、Ｑ２３５Ｘ、Ｌ２３７Ｘ、Ｑ２３８Ｘ、Ｎ２３９Ｘ、Ｎ２４０Ｘ、Ｐ３０２Ｘ、Ｎ３０３Ｘ、Ｐ３０５Ｘ、Ａ３０６Ｘ、Ｋ３０７Ｘ、Ｙ３０８Ｘ、Ｉ３１０Ｘ、Ｋ３１１Ｘ、Ｉ３１２Ｘ、Ｌ３１３Ｘ、Ａ３１４Ｘ、Ｌ３１５Ｘ、Ｖ３１６Ｘ、Ｄ３１７Ｘ、Ａ３１８Ｘ、Ｋ３１９Ｘ、Ｎ３２０Ｘ、Ｆ３２１Ｘ、Ｙ３２２Ｘ、Ｖ３２３Ｘ、Ｖ３２４Ｘ、Ｌ３２６Ｘ、Ｅ３２７Ｘ、Ｖ３２８Ｘ、Ａ３３０Ｘ、Ｑ３３３Ｘ、Ｐ３３４Ｘ、Ｓ３３５Ｘ、Ｇ３３６Ｘ、Ｐ３３７Ｘ、Ａ３３９Ｘ、Ｖ３４０Ｘ、Ｓ３４１Ｘ、Ｎ３４２Ｘ、Ｒ３４３Ｘ、Ｐ３４４Ｘ、Ｆ３４５Ｘ、Ｅ３４６Ｘ、Ｖ３４７Ｘ、Ｅ３４９Ｘ、Ｉ３５２Ｘ、Ｑ３５３Ｘ、Ｖ３５５Ｘ、Ａ３５６Ｘ、Ｒ３５７Ｘ、Ｎ３６１Ｘ、Ｄ３６５Ｘ、Ｗ３６７Ｘ、Ｔ３６９Ｘ、Ｇ３７０Ｘ、Ｌ３７３Ｘ、Ｍ３７４Ｘ、Ｌ３７５Ｘ、Ｈ３７６Ｘ、Ｎ３７９Ｘ、Ｅ３８０Ｘ、Ｒ３８２Ｘ、Ｖ３８６Ｘ、Ｖ３８９Ｘ、Ｎ３９２Ｘ、Ｒ３９４Ｘ、Ｑ３９５Ｘ、Ｓ３９９Ｘ、Ｆ４００Ｘ、Ｉ４０１Ｘ、Ｒ４０２ＸＴ４０３Ｘ、Ｄ４０４Ｘ、Ｒ４０５Ｘ、Ｑ４０６Ｘ、Ｐ４０７Ｘ、Ｎ４０８Ｘ、Ｓ４０９Ｘ、Ｓ４１０Ｘ、Ｖ４１１Ｘ、Ｆ４１２Ｘ、Ｆ４１４Ｘ、Ｑ４１５Ｘ、Ｉ４１８Ｘ、Ｔ４１９Ｘ、Ｌ４２０Ｘ、Ｎ４２８ＸＶ４３２Ｘ、Ｍ４３４Ｘ、Ｄ４４０Ｘ、Ｎ４４１Ｘ、Ｓ４４２Ｘ、Ｉ４４３Ｘ、Ｄ４４４Ｘ、Ｅ４４５Ｘ、Ｇ４４８Ｘ、Ｅ４４９Ｘ、Ｑ４５１Ｘ、Ｋ４５２Ｘ、Ｍ４５５Ｘ、Ｉ４５６Ｘ、Ｔ４５７Ｘ、Ｆ４５８Ｘ、Ｓ４６１Ｘ、Ａ４６４Ｘ、Ｖ４６６Ｘ、Ｑ４６８Ｘ、Ｖ４６９Ｘ、Ｅ４７１Ｘ、Ｌ４７２Ｘ、Ｃ４７３Ｘ、Ａ４７４Ｘ、Ｋ４８３Ｘ、Ｗ４８５Ｘ、Ｔ４８８Ｘ、Ｌ４８９Ｘ、Ｙ４９１Ｘ、Ｇ４９２Ｘ、Ｖ４９３Ｘ、Ｍ４９６Ｘ、Ｉ４９９Ｘ、Ｃ５０２Ｘ、Ｉ５０３Ｘ、Ｔ５０７Ｘ、Ｋ５０９Ｘ、Ｎ５１０Ｘ、Ｖ５１１Ｘ、Ｔ５１２Ｘ、Ｉ５１３Ｘ、Ｒ５１５Ｘ、Ｅ５１７Ｘ、Ｓ５２１Ｘ、Ｇ５２３Ｘ、Ｌ５２４Ｘ、Ｓ５２５Ｘ、Ｉ５２７Ｘ、Ｙ５２８Ｘ、Ｅ５２９Ｘ、Ｈ５３２Ｘ、Ｓ５３３Ｘ、Ｎ５３５Ｘ、Ｋ５３６Ｘ、Ｋ５３７Ｘ、Ｎ５３９Ｘ、Ｉ５４０Ｘ、Ｔ５４２Ｘ、Ｙ５４３Ｘ、Ｑ５４６Ｘ、Ｅ５４９Ｘ、Ｋ５５０Ｘ、Ｑ５５１Ｘ、Ｇ５５３Ｘ、Ｅ５５４Ｘ、Ｐ５５５Ｘ、Ｓ５５６Ｘ、Ｐ５５７Ｘ、Ｒ５５８Ｘ、Ｈ５５９Ｘ、Ｖ５６０Ｘ、Ｎ５６１Ｘ、Ｖ５６２Ｘ、Ｐ５６３Ｘ、Ｇ５６４Ｘ、Ｒ５６５Ｘ、Ｙ５６６Ｘ、Ｖ５６７Ｘ、Ｑ５７０Ｘ、Ｄ５７１Ｘ、Ｐ５７３Ｘ、Ｙ５７４Ｘ、Ｋ５７６Ｘ、Ｋ５８１Ｘ、Ｓ５８３Ｘ、Ａ５８６Ｘ、Ａ５８８Ｘ、Ｅ５９４Ｘ、Ｆ５９８Ｘ、Ｌ５９９Ｘ、Ｅ６０１Ｘ、Ｎ６０２Ｘ、Ｃ６０３Ｘ、Ａ６０４Ｘ、Ｅ６０５Ｘ、Ｌ６０６Ｘ、Ｄ６０７Ｘ、Ｓ６０８Ｘ、Ｓ６０９Ｘ、またはＬ６１０Ｘの置換を含む。高活性アミノ酸置換の一覧は、米国特許第１０，０４１，０７７号に見出すことができ、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０５９２】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、組み込み欠損である。ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、その対応するトランスポゾンを切除することができるが、切除されたトランスポゾンを対応する野生型トランスポザーゼよりも低い頻度で組み込むトランスポザーゼである。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５０５の組み込み欠損バリアントである。
【０５９３】
ある特定の実施形態において、切除能力のある、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸のうちの１つ以上の置換を含み、野生型アミノ酸の１つ以上の置換は、（配列番号１４５０５に対して）Ｒ９Ｘ、Ａ１２Ｘ、Ｍ１３Ｘ、Ｄ２０Ｘ、Ｙ２１Ｋ、Ｄ２３Ｘ、Ｅ２４Ｘ、Ｓ２５Ｘ、Ｓ２６Ｘ、Ｓ２７Ｘ、Ｅ２８Ｘ、Ｅ３０Ｘ、Ｄ３２Ｘ、Ｈ３３Ｘ、Ｅ３６Ｘ、Ｈ３７Ｘ、Ａ３９Ｘ、Ｙ４１Ｘ、Ｄ４２Ｘ、Ｔ４３Ｘ、Ｅ４４Ｘ、Ｅ４５Ｘ、Ｅ４６Ｘ、Ｒ４７Ｘ、Ｄ４９Ｘ、Ｓ５０Ｘ、Ｓ５５Ｘ、Ａ６２Ｘ、Ｎ６３Ｘ、Ａ６４Ｘ、Ｉ６６Ｘ、Ａ６７Ｘ、Ｎ６８Ｘ、Ｅ６９Ｘ、Ｄ７０Ｘ、Ｄ７１Ｘ、Ｓ７２Ｘ、Ｄ７３Ｘ、Ｐ７４Ｘ、Ｄ７５Ｘ、Ｄ７６Ｘ、Ｄ７７Ｘ、Ｉ７８Ｘ、Ｓ８１Ｘ、Ｖ８３Ｘ、Ｒ８４Ｘ、Ｑ８５Ｘ、Ａ８７Ｘ、Ｓ８８Ｘ、Ａ８９Ｘ、Ｓ９０Ｘ、Ｒ９１Ｘ、Ｑ９２Ｘ、Ｖ９３Ｘ、Ｓ９４Ｘ、Ｇ９５Ｘ、Ｐ９６Ｘ、Ｆ９７Ｘ、Ｙ９８Ｘ、Ｔ９９Ｘ、Ｗ０１２Ｘ、Ｇ１０３Ｘ、Ｙ１０７Ｘ、Ｋ１０８Ｘ、Ｌ１１７Ｘ、Ｉ１２２Ｘ、Ｑ１２８Ｘ、Ｉ３１２Ｘ、Ｄ１３５Ｘ、Ｓ１３７Ｘ、Ｅ１３９Ｘ、Ｙ１４０Ｘ、Ｉ１４５Ｘ、Ｓ１４９Ｘ、Ｄ１５０Ｘ、Ｑ１５３Ｘ、Ｅ１５４Ｘ、Ｔ１５７Ｘ、Ｓ１６１Ｘ、Ｓ１６２Ｘ、Ｒ１６４Ｘ、Ｈ１６５Ｘ、Ｒ１６６Ｘ、Ｑ１６７Ｘ、Ｔ１６８Ｘ、Ｋ１６９Ｘ、Ｔ１７０Ｘ、Ａ１７１Ｘ、Ａ１７２Ｘ、Ｅ１７３Ｘ、Ｒ１７４Ｘ、Ｓ１７５Ｘ、Ｓ１７６Ｘ、Ａ１７７Ｘ、Ｅ１７８Ｘ、Ｔ１７９Ｘ、Ｓ１８０Ｘ、Ｙ１８２Ｘ、Ｑ１８４Ｘ、Ｅ１８５Ｘ、Ｔ１８７Ｘ、Ｌ１８８Ｘ、Ｃ１８９Ｘ、Ｌ１９４Ｘ、Ｉ１９５Ｘ、Ａ１９６Ｘ、Ｌ１９８Ｘ、Ｌ２００Ｘ、Ａ２０１Ｘ、Ｌ２０３Ｘ、Ｉ２０４Ｘ、Ｋ２０５Ｘ、Ｎ２０７Ｘ、Ｑ２０９Ｘ、Ｌ２１１Ｘ、Ｄ２１３Ｘ、Ｌ２１４Ｘ、Ｗ２１５Ｘ、Ｒ２１６Ｘ、Ｔ２１７Ｘ、Ｇ２１９Ｘ、Ｔ２２０Ｘ、Ｖ２２２Ｘ、Ｄ２２３Ｘ、Ｉ２２４Ｘ、Ｔ２２７Ｘ、Ｔ２２８Ｘ、Ｆ２３４Ｘ、Ｑ２３５Ｘ、Ｌ２３７Ｘ、Ｑ２３８Ｘ、Ｎ２３９Ｘ、Ｎ２４０Ｘ、Ｎ３０３Ｘ、Ｋ３０４Ｘ、Ｉ３１０Ｘ、Ｉ３１２Ｘ、Ｌ３１３Ｘ、Ａ３１４Ｘ、Ｌ３１５Ｘ、Ｖ３１６Ｘ、Ｄ３１７Ｘ、Ａ３１８Ｘ、Ｋ３１９Ｘ、Ｎ３２０Ｘ、Ｆ３２１Ｘ、Ｙ３２２Ｘ、Ｖ３２３Ｘ、Ｖ３２４Ｘ、Ｎ３２５Ｘ、Ｌ３２６Ｘ、Ｅ３２７Ｘ、Ｖ３２８Ｘ、Ａ３３０Ｘ、Ｇ３３１Ｘ、Ｋ３３２Ｘ、Ｑ３３３Ｘ、Ｓ３３５Ｘ、Ｐ３３７Ｘ、Ｐ３４４Ｘ、Ｆ３４５Ｘ、Ｅ３４９Ｘ、Ｈ３５９Ｘ、Ｎ３６１Ｘ、Ｖ３６２Ｘ、Ｄ３６５Ｘ、Ｆ３６８Ｘ、Ｙ３７１Ｘ、Ｅ３７２Ｘ、Ｌ３７３Ｘ、Ｈ３７６Ｘ、Ｅ３８０Ｘ、Ｒ３８２Ｘ、Ｒ３８２Ｘ、Ｖ３８６Ｘ、Ｇ３８７Ｘ、Ｔ３８８Ｘ、Ｖ３８９Ｘ、Ｋ３９１Ｘ、Ｎ３９２Ｘ、Ｒ３９４Ｘ、Ｑ３９５Ｘ、Ｅ３９８Ｘ、Ｓ３９９Ｘ、Ｆ４００Ｘ、Ｉ４０１Ｘ、Ｒ４０２ＸＴ４０３Ｘ、Ｄ４０４Ｘ、Ｒ４０５Ｘ、Ｑ４０６Ｘ、Ｐ４０７Ｘ、Ｎ４０８Ｘ、Ｓ４０９Ｘ、Ｓ４１０Ｘ、Ｑ４１５Ｘ、Ｋ４１６Ｘ、Ａ４２４Ｘ、Ｋ４２６Ｘ、Ｎ４２８Ｘ、Ｖ４３０Ｘ、Ｖ４３２Ｘ、Ｖ４３３Ｘ、Ｍ４３４Ｘ、Ｄ４３６Ｘ、Ｄ４４０Ｘ、Ｎ４４１Ｘ、Ｓ４４２Ｘ、Ｉ４４３Ｘ、Ｄ４４４Ｘ、Ｅ４４５Ｘ、Ｓ４４６Ｘ、Ｔ４４７Ｘ、Ｇ４４８Ｘ、Ｅ４４９Ｘ、Ｋ４５０Ｘ、Ｑ４５１Ｘ、Ｅ４５４Ｘ、Ｍ４５５Ｘ、Ｉ４５６Ｘ、Ｔ４５７Ｘ、Ｆ４５８Ｘ、Ｓ４６１Ｘ、Ａ４６４Ｘ、Ｖ４６６Ｘ、Ｑ４６８Ｘ、Ｖ４６９Ｘ、Ｃ４７３Ｘ、Ａ４７４Ｘ、Ｎ４７５Ｘ、Ｎ４７７Ｘ、Ｋ４８３Ｘ、Ｒ４８４Ｘ、Ｐ４８６Ｘ、Ｔ４８８Ｘ、Ｌ４８９Ｘ、Ｇ４９２Ｘ、Ｖ４９３Ｘ、Ｍ４９６Ｘ、Ｉ４９９Ｘ、Ｉ５０３Ｘ、Ｙ５０５Ｘ、Ｔ５０７Ｘ、Ｎ５１０Ｘ、Ｖ５１１Ｘ、Ｔ５１２Ｘ、Ｉ５１３Ｘ、Ｋ５１４Ｘ、Ｔ５１６Ｘ、Ｅ５１７Ｘ、Ｓ５２１Ｘ、Ｇ５２３Ｘ、Ｌ５２４Ｘ、Ｓ５２５Ｘ、Ｉ５２７Ｘ、Ｙ５２８Ｘ、Ｌ５３１Ｘ、Ｈ５３２Ｘ、Ｓ５３３Ｘ、Ｎ５３５Ｘ、Ｉ５４０Ｘ、Ｔ５４２Ｘ、Ｙ５４３Ｘ、Ｒ５４５Ｘ、Ｑ５４６Ｘ、Ｅ５４９Ｘ、Ｌ５５２Ｘ、Ｇ５５３Ｘ、Ｅ５５４Ｘ、Ｐ５５５Ｘ、Ｓ５５６Ｘ、Ｐ５５７Ｘ、Ｒ５５８Ｘ、Ｈ５５９Ｘ、Ｖ５６０Ｘ、Ｎ５６１Ｘ、Ｖ５６２Ｘ、Ｐ５６３Ｘ、Ｇ５６４Ｘ、Ｖ５６７Ｘ、Ｑ５７０Ｘ、Ｄ５７１Ｘ、Ｐ５７３Ｘ、Ｙ５７４Ｘ、Ｋ５７５Ｘ、Ｋ５７６Ｘ、Ｎ５８５Ｘ、Ａ５８６Ｘ、Ｍ５９３Ｘ、Ｋ５９６Ｘ、Ｅ６０１Ｘ、Ｎ６０２Ｘ、Ａ６０４Ｘ、Ｅ６０５Ｘ、Ｌ６０６Ｘ、Ｄ６０７Ｘ、Ｓ６０８Ｘ、Ｓ６０９Ｘ、またはＬ６１０Ｘの置換を含む。組み込み欠損アミノ酸置換の一覧は、米国特許第１０，０４１，０７７号に見出すことができ、その内容は、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。
【０５９４】
ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化７６】
2021536249.tif 000249
ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化７７】
2021536249.tif 000250
ある特定の実施形態において、組み込み欠損であるであるｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化７８】
2021536249.tif 000251
ある特定の実施形態において、組み込み欠損トランスポザーゼは、配列番号１４６０８と少なくとも９０％同一である配列を含む。
【０５９５】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化７９】
2021536249.tif 000252
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化８０】
2021536249.tif 000253
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化８１】
2021536249.tif 000254
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化８２】
2021536249.tif 000255
【０５９６】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０６に対応する左配列および配列番号１４５０７に対応する右配列を含む。ある特定の実施形態において、一方のｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ末端は、配列番号１４５０６と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％同一であるか、またはその間の任意のパーセンテージで同一であり、もう一方のｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ末端は、配列番号１４５０７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）)またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０６および配列番号１４５０７または配列番号１４５０９を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０８および配列番号１４５０７または配列番号１４５０９を含む。ある特定の実施形態において、左および右のトランスポゾン末端は、２つの末端で配向を反転される、５’−ＴＴＡＴ−３標的挿入部位に直接隣接するＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＡＧＧ（配列番号１４５１０）のそれらの末端で１６ｂｐの反復配列を共有する。ある特定の実施形態において、左トランスポゾン末端は、５’−ＴＴＡＴＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＡＧＧ−３（配列番号１４５１１）を含む配列で始まり、右トランスポゾン末端は、この配列と逆相補体を含む配列、すなわち、５’−ＣＣＴＣＡＴＧＣＴＣＧＣＣＧＧＧＴＴＡＴ−３’（配列番号１４５１２）で終わる。
【０５９７】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０６または配列番号１４５０８の少なくとも１４個、１６個、１８個、２０個、３０個、または４０個の連続するヌクレオチドを含む一末端を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０７または配列番号１４５０９の少なくとも１４個、１６個、１８個、２０個、３０個、または４０個の連続するヌクレオチドを含む一末端を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０６または配列番号１４５０８と少なくとも９０％の同一性を有する一末端を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０７または配列番号１４５０９と少なくとも９０％の同一性を有する一末端を含む。
【０５９８】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化８３】
2021536249.tif 000256
【０５９９】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化８４】
2021536249.tif 000257
【０６００】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＡＧＧ（配列番号１４５１０）の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５１０のＩＴＲ配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＴＴＡＴＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＡＧＧ（配列番号１４５１１）の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５１１からの少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＣＣＴＣＡＴＧＣＴＣＧＣＣＧＧＧＴＴＡＴ（配列番号１４５１２）の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５１２からの少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５１１からの少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む一末端と、配列番号１４５１２からの少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む一末端と、を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５１１および配列番号１４５１２を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＴＴＡＡＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＡＧＧ（配列番号１４５１３）の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＣＣＴＣＡＴＧＣＴＣＧＣＣＧＧＧＴＴＡＡ（配列番号１４５１４）の配列を含む。
【０６０１】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０６および配列番号１４５０７を含む末端、または配列番号１４５０６および配列番号１４５０６と少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらのいずれかまたは両方のバリアントを有し得、かつ、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０４もしくは配列番号１４５０５の配列、または配列番号１４５０４もしくは配列番号１４５０５と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一である配列を有する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、逆方向反復の対の間に挿入された異種ポリヌクレオチドを含み、このトランスポゾンは、配列番号１４５０４または配列番号１４５０５と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一性を有するｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼによって転位することができる。ある特定の実施形態において、トランスポゾンは、２つのトランスポゾン末端を含み、それらの各々は、２つのトランスポゾン末端において逆方向に配列番号１４５１０を含む。ある特定の実施形態において、各逆方向末端反復（ＩＴＲ）は、配列番号１４５１０と少なくとも９０％同一である。
【０６０２】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、標的核酸内の配列５’−ＴＴＡＴ−３で、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼによって挿入することができる。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一末端は、配列番号１４５０６からの少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含み、もう一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５０７からの少なくとも１６個の連続するヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一末端は、配列番号１４５０６からの少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２２個、少なくとも２５個、少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含み、かつ、もう一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５０７からの少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２２個、少なくとも２５個、少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含む。
【０６０３】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０６および配列番号１４５０７に対応するトランスポゾン末端（各末端はＩＴＲを含む）を含み、かつ、５’−ＴＴＡＴ３’に対応する標的配列を有する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンはまた、トランスポザーゼをコードする配列（例えば、配列番号１４５０５）も含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０６に対応する一方のトランスポゾン末端と、配列番号１４５１６に対応する第２のトランスポゾン末端と、を含む。配列番号１４５１６は、配列番号１４５０７に非常に類似しているが、ＩＴＲの少し前に大きな挿入物を有する。２つのトランスポゾン末端のＩＴＲ配列は、同一（それらはいずれも配列番号１４５１０に同一）であるが、それらは、異なる標的配列を有する。すなわち、第２のトランスポゾンは、５’−ＴＴＡＡ−３’に対応する標的配列を有し、これは、標的配列特異性を改変するためにＩＴＲ配列を変更する必要がないということの証拠である。５’−ＴＴＡＡ−３’標的部位に関連するｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ（配列番号１４５０４）は、５’−ＴＴＡＴ−３’−関連トランスポザーゼ（配列番号１４５０５）とはわずか４つのアミノ酸変化（Ｄ３２２Ｙ、Ｓ４７３Ｃ、Ａ５０７Ｔ、Ｈ５８２Ｒ）による違いしかない。ある特定の実施形態において、５’−ＴＴＡＡ−３’標的部位に関連するｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ（配列番号１４５０４）は、５’−ＴＴＡＡ−３’に関連するｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ（配列番号１４５０５）よりも５’−ＴＴＡＴ−３’末端を持つトランスポゾンに対する活性が低い。ある特定の実施形態において、５’−ＴＴＡＡ−３’標的部位を持つｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、５’−ＴＴＡＡ−３’標的部位を５’−ＴＴＡＴ−３’で置き換えることによって５’−ＴＴＡＴ−３標的部位を持つｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼに変換することができる。そのようなトランスポゾンは、５’−ＴＴＡＴ−３’標的配列を認識する配列番号１４５０４などのｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）もしくはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ、または本来５’−ＴＴＡＡ−３’トランスポゾンに関連するトランスポザーゼのバリアントのいずれかとともに使用することができる。ある特定の実施形態において、５’−ＴＴＡＡ−３’と５’−ＴＴＡＴ−３’との間のｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼの高類似性は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼのアミノ酸配列のごくわずかな変化によって標的配列特異性が変わることを示す。ある特定の実施形態において、５’−ＴＴＡＡ−３’標的配列は、５’−ＴＴＡＴ−３’−標的配列と置換されている任意のｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン−トランスポザーゼ遺伝子導入システムの改変、ＩＴＲは、同一のままであり、トランスポザーゼは、元のｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）もしくはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ、またはそのトランスポザーゼに変異を導入するために、低レベルの突然変異生成を使用してから得られたそのバリアントである。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン−トランスポザーゼ遺伝子導入システムは、５’−ＴＴＡＡ−３’標的配列は、５’−ＴＴＡＴ−３’−標的配列と置換されている５’−ＴＴＡＡ−３’活性のｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン−トランスポザーゼ遺伝子導入システムの改変によって形成され得、ＩＴＲは、同一のままであり、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）もしくはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、元のトランスポザーゼまたはそのバリアントである。
【０６０４】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｂｏｍｂｙｘ  ｍｏｒｉから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化８５】
2021536249.tif 000258
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化８６】
2021536249.tif 000259
ある特定の実施形態において、トランスポゾンは、配列番号１４５７７からの少なくとも１６個の連続する塩基および配列番号１４５８８からの少なくとも１６個の連続する塩基、ならびにＣＣＣＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＡＧＧ（配列番号１４５１０）と少なくとも８７％同一である逆方向末端反復を含む。
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化８７】
2021536249.tif 000260
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化８８】
2021536249.tif 000261
【０６０５】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４９５および配列番号１４５９６を含み、配列番号１４５０５のｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼによって転位される。ある特定の実施形態において、配列番号１４９５５および配列番号１４５９６のＩＴＲは、５’−ＴＴＡＡ−３’配列に隣接していない。ある特定の実施形態において、配列番号１４９５５および配列番号１４５９６のＩＴＲは、５’−ＴＴＡＡ−３’配列に隣接している。
【０６０６】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化８９】
2021536249.tif 000262
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化９０】
2021536249.tif 000263
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化９１】
2021536249.tif 000264
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの左末端は、配列番号１４５７７、配列番号１４５９５、または配列番号１４５９７〜１４５９９の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの左末端は、前に左標的配列がある。
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化９２】
2021536249.tif 000265
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化９３】
2021536249.tif 000266
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化９４】
2021536249.tif 000267
【０６０７】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの右端は、配列番号１４５８、配列番号１４５９６、または配列番号１４６００〜１４６０１の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの右端の後に、右の標的配列が続く。ある特定の実施形態において、トランスポゾンは、配列番号１４５０５のトランスポザーゼによって転位される。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの左末端および右末端は、逆方向で、標的配列に直接隣接する、配列番号１４５１０の１６ｂｐ反復配列を共有する。ある特定の実施形態において、左トランスポゾン末端は、配列番号１４５１０で始まり、右トランスポゾン末端は、配列番号１４１０、５’−ＣＣＴＣＡＴＧＣＴＣＧＣＣＧＧＧ−３’（配列番号１４６０３）の逆相補体で終わる。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５１０または配列番号１４６０３と少なくとも９３％、少なくとも８７％、もしくは少なくとも８１％またはその間の任意のパーセンテージで同一性を有するＩＴＲを含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、標的配列、続いて、配列番号８８、１０５、または１０７から選択される配列を含む左トランスポゾン末端と、配列番号１４５７８または１０６、続いて標的配列を含む右トランスポゾン末端と、を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５７７と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一である配列を含む一末端と、配列番号１４５７８と少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一である配列を含む一末端と、を含む。ある特定の実施形態において、一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５７７からの少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、または少なくとも２０個の連続する塩基を含み、一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５７８からの少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、または少なくとも２０個の連続する塩基を含む。
【０６０８】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、２つのトランスポゾン末端を含み、各トランスポゾン末端は、２つのトランスポゾン末端において逆方向で配列番号１４５１０と少なくとも８１％同一、少なくとも８７％同一、または少なくとも９３％同一、またはその間の任意のパーセンテージで同一である配列を含む。一末端は、配列番号１４５９９からの少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、または少なくとも２０個の連続する塩基をさらに含み得、もう一方の末端は、配列番号１４６０１からの少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、または少なくとも２０個の連続する塩基をさらに含み得る。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５０５のトランスポザーゼによって転位され得、トランスポザーゼは、任意に、核局在化シグナルに融合され得る。
【０６０９】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５９５および配列番号１４５９６を含み、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５０４または配列番号１４５０５を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５９７および配列番号１４５９６を含み、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５０４または配列番号１４５０５を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５９５および配列番号１４５７８を含み、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５０４または配列番号１４５０５を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４６０２および配列番号１４６００を含み、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５０４または配列番号１４５０５を含む。
【０６１０】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＡＴＧＡＧＧＣＡＧＧＧＴＡＴ（配列番号１４６１４）、ＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣＴＣＡＴ（配列番号１４６１５）、ＧＧＣＡＧＧＧＴＡＴ（配列番号１４６１６）、ＡＴＡＣＣＣＴＧＣＣ（配列番号１４６１７）、ＴＡＡＡＡＴＴＴＴＡ（配列番号１４６１８）、ＡＴＴＴＴＡＴＡＡＡＡＴ（配列番号１４６１９）、ＴＣＡＴＡＣＣＣＴＧ（配列番号１４６２０）、およびＴＡＡＡＴＡＡＴＡＡＴＡＡ（配列番号１４６２１）から選択される１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、または７つの配列を含む左末端を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４６１７、配列番号１４６２０、および配列番号１４６２１から選択される１つ、２つ、または３つの配列を含む右末端を含む。
【０６１１】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化９５】
2021536249.tif 000268
【０６１２】
いくつかの実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５１７の高活性バリアントである。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５１７の組み込み欠損バリアントである。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化９６】
2021536249.tif 000269
【０６１３】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼである。ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下と少なくとも９０％同一である配列を含む。
【化９７】
2021536249.tif 000270
【０６１４】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼである。高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、それが由来する自然発生バリアントよりもさらに活性であるトランスポザーゼである。ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５１７のトランスポザーゼよりもさらに活性である。ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化９８】
2021536249.tif 000271
【０６１５】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化９９】
2021536249.tif 000272
【０６１６】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化１００】
2021536249.tif 000273
【０６１７】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化１０１】
2021536249.tif 000274
【０６１８】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化１０２】
2021536249.tif 000275
【０６１９】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列を含む。
【化１０３】
2021536249.tif 000276
【０６２０】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、（配列番号１４５１７に対して）アミノ酸６、７、１６、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２８、３１、３４、６７、７３、７６、７７、８８、９１、１４１、１４５、１４６、１４８、１５０、１５７、１６２、１７９、１８２、１８９、１９２、１９３、１９６、１９８、２００、２１０、２１２、２１８、２４８、２６３、２７０、２９４、２９７、３０８、３１０、３３３、３３６、３５４、３５７、３５８、３５９、３７７、４２３、４２６、４２８、４３８、４４７、４５０、４６２、４６９、４７２、４９８、５０２、５１７、５２０、５２３、５３３、５３４、５７６、５７７、５８２、５８３、または５８７から選択される位置におけるアミノ酸置換を含む。ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、（配列番号１４５１７に対して）これらの突然変異の少なくとも１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、またはすべてを含む、Ｙ６Ｃ、Ｓ７Ｇ、Ｍ１６Ｓ、Ｓ１９Ｇ、Ｓ２０Ｑ、Ｓ２０Ｇ、Ｓ２０Ｄ、Ｅ２１Ｄ、Ｅ２２Ｑ、Ｆ２３Ｔ、Ｆ２３Ｐ、Ｓ２４Ｙ、Ｓ２６Ｖ、Ｓ２８Ｑ、Ｖ３１Ｋ、Ａ３４Ｅ、Ｌ６７Ａ、Ｇ７３Ｈ、Ａ７６Ｖ、Ｄ７７Ｎ、Ｐ８８Ａ、Ｎ９１Ｄ、Ｙ１４１Ｑ、Ｙ１４１Ａ、Ｎ１４５Ｅ、Ｎ１４５Ｖ、Ｐ１４６Ｔ、Ｐ１４６Ｖ、Ｐ１４６Ｋ、Ｐ１４８Ｔ、Ｐ１４８Ｈ、Ｙ１５０Ｇ、Ｙ１５０Ｓ、Ｙ１５０Ｃ、Ｈ１５７Ｙ、Ａ１６２Ｃ、Ａ１７９Ｋ、Ｌ１８２Ｉ、Ｌ１８２Ｖ、Ｔ１８９Ｇ、Ｌ１９２Ｈ、Ｓ１９３Ｎ、Ｓ１９３Ｋ、Ｖ１９６Ｉ、Ｓ１９８Ｇ、Ｔ２００Ｗ、Ｌ２１０Ｈ、Ｆ２１２Ｎ、Ｎ２１８Ｅ、Ａ２４８Ｎ、Ｌ２６３Ｍ、Ｑ２７０Ｌ、Ｓ２９４Ｔ、Ｔ２９７Ｍ、Ｓ３０８Ｒ、Ｌ３１０Ｒ、Ｌ３３３Ｍ、Ｑ３３６Ｍ、Ａ３５４Ｈ、Ｃ３５７Ｖ、Ｌ３５８Ｆ、Ｄ３５９Ｎ、Ｌ３７７Ｉ、Ｖ  ４２３Ｈ、Ｐ４２６Ｋ、Ｋ４２８Ｒ、Ｓ４３８Ａ、Ｔ４４７Ｇ、Ｔ４４７Ａ、Ｌ４５０Ｖ、Ａ４６２Ｈ、Ａ４６２Ｑ、Ｉ４６９Ｖ、Ｉ４７２Ｌ、Ｑ４９８Ｍ、Ｌ５０２Ｖ、Ｅ５１７１、Ｐ５２０Ｄ、Ｐ５２０Ｇ、Ｎ５２３Ｓ、Ｉ５３３Ｅ、Ｄ５３４Ａ、Ｆ５７６Ｒ、Ｆ５７６Ｅ、Ｋ５７７Ｉ、Ｉ５８２Ｒ、Ｙ５８３Ｆ、Ｌ５８７Ｙ、もしくはＬ５８７Ｗ、またはそれらの任意の組み合わせのアミノ酸置換を含む。
【０６２１】
ある特定の実施形態において、高活性ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸の１つ以上の置換を含み、野生型アミノ酸の１つ以上の置換は、（配列番号１４５１７に対して）Ａ２Ｘ、Ｋ３Ｘ、Ｒ４Ｘ、Ｆ５Ｘ、Ｙ６Ｘ、Ｓ７Ｘ、Ａ１１Ｘ、Ａ１３Ｘ、Ｃ１５Ｘ、Ｍ１６Ｘ、Ａ１７Ｘ、Ｓ１８Ｘ、Ｓ１９Ｘ、Ｓ２０Ｘ、Ｅ２１Ｘ、Ｅ２２Ｘ、Ｆ２３Ｘ、Ｓ２４Ｘ、Ｇ２５Ｘ、２６Ｘ、Ｄ２７Ｘ、Ｓ２８Ｘ、Ｅ２９Ｘ、Ｅ４２Ｘ、Ｅ４３Ｘ、Ｓ４４Ｘ、Ｃ４６Ｘ、Ｓ４７Ｘ、Ｓ４８Ｘ、Ｓ４９Ｘ、Ｔ５０Ｘ、Ｖ５１Ｘ、Ｓ５２Ｘ、Ａ５３Ｘ、Ｌ５４Ｘ、Ｅ５５Ｘ、Ｅ５６Ｘ、Ｐ５７Ｘ、Ｍ５８Ｘ、Ｅ５９Ｘ、Ｅ６２Ｘ、Ｄ６３Ｘ、Ｖ６４Ｘ、Ｄ６５Ｘ、Ｄ６６Ｘ、Ｌ６７Ｘ、Ｅ６８Ｘ、Ｄ６９Ｘ、Ｑ７０Ｘ、Ｅ７１Ｘ、Ａ７２Ｘ、Ｇ７３Ｘ、Ｄ７４Ｘ、Ｒ７５Ｘ、Ａ７６Ｘ、Ｄ７７Ｘ、Ａ７８Ｘ、Ａ７９Ｘ、Ａ８０Ｘ、Ｇ８１Ｘ、Ｇ８２Ｘ、Ｅ８３Ｘ、Ｐ８４Ｘ、Ａ８５Ｘ、Ｗ８６Ｘ、Ｇ８７Ｘ、Ｐ８８Ｘ、Ｐ８９Ｘ、Ｃ９０Ｘ、Ｎ９１Ｘ、Ｆ９２Ｘ、Ｐ９３Ｘ、Ｅ９５Ｘ、Ｉ９６Ｘ、Ｐ９７Ｘ、Ｐ９８Ｘ、Ｆ９９Ｘ、Ｔ１００Ｘ、Ｔ１０１Ｘ、Ｐ１０３Ｘ、Ｇ１０４Ｘ、Ｖ１０５Ｘ、Ｋ１０６Ｘ、Ｖ１０７Ｘ、Ｄ１０８Ｘ、Ｔ１０９Ｘ、Ｎ１１１Ｘ、Ｐ１１４Ｘ、Ｉ１１５Ｘ、Ｎ１１６Ｘ、Ｆ１１７Ｘ、Ｆ１１８Ｘ、Ｑ１１９Ｘ、Ｍ１２２Ｘ、Ｔ１２３Ｘ、Ｅ１２４Ｘ、Ａ１２５Ｘ、Ｉ１２６Ｘ、Ｌ１２７Ｘ、Ｑ１２８Ｘ、Ｄ１２９Ｘ、Ｍ１３０Ｘ、Ｌ１３２Ｘ、Ｙ１３３Ｘ、Ｖ１２６Ｘ、Ｙ１２７Ｘ、Ａ１３８Ｘ、Ｅ１３９Ｘ、Ｑ１４０Ｘ、Ｙ１４１Ｘ、Ｌ１４２Ｘ、Ｑ１４４Ｘ、Ｎ１４５Ｘ、Ｐ１４６Ｘ、Ｌ１４７Ｘ、Ｐ１４８Ｘ、Ｙ１５０Ｘ、Ａ１５１Ｘ、Ａ１５５Ｘ、Ｈ１５７Ｘ、Ｐ１５８Ｘ、Ｉ１６１Ｘ、Ａ１６２Ｘ、Ｖ１６８Ｘ、Ｔ１７１Ｘ、Ｌ１７２Ｘ、Ａ１７３Ｘ、Ｍ１７４Ｘ、Ｉ１７７Ｘ、Ａ１７９Ｘ、Ｌ１８２Ｘ、Ｄ１８７Ｘ、Ｔ１８８Ｘ、Ｔ１８９Ｘ、Ｔ１９０Ｘ、Ｌ１９２Ｘ、Ｓ１９３Ｘ、Ｉ１９４Ｘ、Ｐ１９５Ｘ、Ｖ１９６Ｘ、Ｓ１９８Ｘ、Ａ１９９Ｘ、Ｔ２００Ｘ、Ｓ２０２Ｘ、Ｌ２０８Ｘ、Ｌ２０９Ｘ、Ｌ２１０Ｘ、Ｒ２１１Ｘ、Ｆ２１２Ｘ、Ｆ２１５Ｘ、Ｎ２１７Ｘ、Ｎ２１８Ｘ、Ａ２１９Ｘ、Ｔ２２０Ｘ、Ａ２２１Ｘ、Ｖ２２２Ｘ、Ｐ２２４Ｘ、Ｄ２２５Ｘ、Ｑ２２６Ｘ、Ｐ２２７Ｘ、Ｈ２２９Ｘ、Ｒ２３１Ｘ、Ｈ２３３Ｘ、Ｌ２３５Ｘ、Ｐ２３７Ｘ、Ｉ２３９Ｘ、Ｄ２４０Ｘ、Ｌ２４２Ｘ、Ｓ２４３Ｘ、Ｅ２４４Ｘ、Ｒ２４４Ｘ、Ｆ２４６Ｘ、Ａ２４７Ｘ、Ａ２４８Ｘ、Ｖ２４９Ｘ、Ｙ２５０Ｘ、Ｔ２５１Ｘ、Ｐ２５２Ｘ、Ｃ２５３Ｘ、Ｑ２５４Ｘ、Ｉ２５６Ｘ、Ｃ２５７Ｘ、Ｉ２５８Ｘ、Ｄ２５９Ｘ、Ｅ２６０Ｘ、Ｓ２６１Ｘ、Ｌ２６２Ｘ、Ｌ２６３Ｘ、Ｌ２６４Ｘ、Ｆ２６５Ｘ、Ｋ２６６Ｘ、Ｇ２６７Ｘ、Ｒ２６８Ｘ、Ｌ２６９Ｘ、Ｑ２７０Ｘ、Ｆ２７１Ｘ、Ｒ２７２Ｘ、Ｑ２７３Ｘ、Ｙ２７４Ｘ、Ｉ２７５Ｘ、Ｐ２７６Ｘ、Ｓ２７７Ｘ、Ｋ２７８Ｘ、Ｒ２７９Ｘ、Ａ２８０Ｘ、Ｒ２８１Ｘ、Ｙ２８２Ｘ、Ｇ２８３Ｘ、Ｉ２８４Ｘ、Ｋ２８５Ｘ、Ｆ２８６Ｘ、Ｙ２８７Ｘ、Ｋ２８８Ｘ、Ｌ２８９Ｘ、Ｃ２９０Ｘ、Ｅ２９１Ｘ、Ｓ２９２Ｘ、Ｓ２９３ＸＳ２９４Ｘ、Ｇ２９５Ｘ、Ｙ２９６Ｘ、Ｔ２９７Ｘ、Ｓ２９８Ｘ、Ｙ２９９Ｘ、Ｆ３００Ｘ、Ｅ３０４Ｘ、Ｌ３１０Ｘ、Ｐ３１３Ｘ、Ｇ３１４Ｘ、Ｐ３１６Ｘ、Ｐ３１７Ｘ、Ｄ３１８Ｘ、Ｌ３１９Ｘ、Ｔ３２０Ｘ、Ｖ３２１Ｘ、Ｋ３２４Ｘ、Ｅ３２８Ｘ、Ｉ３３０Ｘ、Ｓ３３１Ｘ、Ｐ３３２Ｘ、Ｌ３３３Ｘ、Ｌ３３４Ｘ、Ｇ３３５Ｘ、Ｑ３３６Ｘ、Ｆ３３８Ｘ、Ｌ３４０Ｘ、Ｄ３４３Ｘ、Ｎ３４４Ｘ、Ｆ３４５Ｘ、Ｙ３４６Ｘ、Ｓ３４７Ｘ、Ｌ３５１Ｘ、Ｆ３５２Ｘ、Ａ３５４Ｘ、Ｌ３５５Ｘ、Ｙ３５６Ｘ、Ｃ３５７Ｘ、Ｌ３５８Ｘ、Ｄ３５９Ｘ、Ｔ３６０Ｘ、Ｒ４２２Ｘ、Ｙ４２３Ｘ、Ｇ４２４Ｘ、Ｐ４２６Ｘ、Ｋ４２８Ｘ、Ｎ４２９Ｘ、Ｋ４３０Ｘ、Ｐ４３１Ｘ、Ｌ４３２Ｘ、Ｓ４３４Ｘ、Ｋ４３５Ｘ、Ｅ４３６Ｘ、Ｓ４３８Ｘ、Ｋ４３９Ｘ、Ｙ４４０Ｘ、Ｇ４４３Ｘ、Ｒ４４６Ｘ、Ｔ４４７Ｘ、Ｌ４５０Ｘ、Ｑ４５１Ｘ、Ｎ４５５Ｘ、Ｔ４６０Ｘ、Ｒ４６１Ｘ、Ａ４６２Ｘ、Ｋ４６５Ｘ、Ｖ４６７Ｘ、Ｇ４６８Ｘ、Ｉ４６９Ｘ、Ｙ４７０Ｘ、Ｌ４７１Ｘ、Ｉ４７２Ｘ、Ｍ４７４Ｘ、Ａ４７５Ｘ、Ｌ４７６Ｘ、Ｒ４７７Ｘ、Ｓ４７９Ｘ、Ｙ４８０Ｘ、Ｖ４８２ＸＹ４８３Ｘ、Ｋ４８４Ｘ、Ａ４８５Ｘ、Ａ４８６Ｘ、Ｖ４８７Ｘ、Ｐ４８８Ｘ、Ｐ４９０Ｘ、Ｋ４９１Ｘ、Ｓ４９３Ｘ、Ｙ４９４Ｘ、Ｙ４９５Ｘ、Ｋ４９６Ｘ、Ｙ４９７Ｔ、Ｑ４９８Ｘ、Ｌ４９９Ｘ、Ｑ５００Ｘ、Ｉ５０１Ｘ、Ｌ５０２Ｘ、Ｐ５０３Ｘ、Ａ５０４Ｘ、Ｌ５０５Ｘ、Ｌ５０６Ｘ、Ｆ５０７Ｘ、Ｇ５０８Ｘ、Ｇ５０９Ｘ、Ｖ５１０Ｘ、Ｅ５１１Ｘ、Ｅ５１２Ｘ、Ｑ５１３Ｘ、Ｔ５１４Ｘ、Ｖ５１５Ｘ、Ｅ５１７Ｘ、Ｍ５１８Ｘ、Ｐ５１９Ｘ、Ｐ５２０Ｘ、Ｓ５２１Ｘ、Ｄ５２２Ｘ、Ｎ５２３Ｘ、Ｖ５２４Ｘ、Ａ５２５Ｘ、Ｌ５２７Ｘ、Ｉ５２８Ｘ、Ｋ５３０Ｘ、Ｈ５３１Ｘ、Ｆ５３２Ｘ、Ｉ５３３Ｘ、Ｄ５３４Ｘ、Ｔ５３５Ｘ、Ｌ５３６Ｘ、Ｔ５３９Ｘ、Ｐ５４０Ｘ、Ｑ５４６Ｘ、Ｋ５５０Ｘ、Ｒ５５３Ｘ、Ｋ５５４Ｘ、Ｒ５５５Ｘ、Ｇ５５６Ｘ、Ｉ５５７Ｘ、Ｒ５５８Ｘ、Ｒ５５９Ｘ、Ｄ５６０Ｘ、Ｔ５６１Ｘ、Ｙ５６４Ｘ、Ｐ５６６Ｘ、Ｋ５６７Ｘ、Ｐ５６９Ｘ、Ｒ５７０Ｘ、Ｎ５７１Ｘ、Ｌ５７４Ｘ、Ｃ５７５Ｘ、Ｆ５７６Ｘ、Ｋ５７７Ｘ、Ｐ５７８Ｘ、Ｆ５８０Ｘ、Ｅ５８１Ｘ、Ｉ５８２Ｘ、Ｙ５８３Ｘ、Ｔ５８５Ｘ、Ｑ５８６Ｘ、Ｌ５８７Ｘ、Ｈ５８８Ｘ、またはＹ５８９Ｘの置換を含む。高活性アミノ酸置換の一覧は、米国特許第１０，０４１，０７７号に見出すことができ、その内容は、参照によりその全体が組み込まれる。
【０６２２】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、組み込み欠損である。ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、その対応するトランスポゾンを切除することができるが、切除されたトランスポゾンを、対応する自然発生トランスポザーゼよりも低い頻度で組み込むトランスポザーゼである。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５１７の組み込み欠損バリアントである。ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５１７に対して欠損している。
【０６２３】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、切除に対して活性であるが、組み込みが欠損している。ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む。
【化１０４】
2021536249.tif 000277
【０６２４】
ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む。
【化１０５】
2021536249.tif 000278
【０６２５】
ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む。
【化１０６】
2021536249.tif 000279
【０６２６】
ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４６１１を含む。ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む。
【化１０７】
2021536249.tif 000280
【０６２７】
ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４６１２を含む。ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、以下の配列と少なくとも９０％同一である配列を含む。
【化１０８】
2021536249.tif 000281
【０６２８】
ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４６１３を含む。ある特定の実施形態において、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、（配列番号１４５１７に対して）２１８位のＡｓｎがＧｌｕまたはＡｓｐ（Ｎ２１８ＤまたはＮ２１８Ｅ）で置き換えられるアミノ酸置換を含む。
【０６２９】
ある特定の実施形態において、切除能力のある、組み込み欠損ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、野生型ではないアミノ酸のうちの１つ以上の置換を含み、野生型アミノ酸の１つ以上の置換は、（配列番号１４５１７に対して）Ａ２Ｘ、Ｋ３Ｘ、Ｒ４Ｘ、Ｆ５Ｘ、Ｙ６Ｘ、Ｓ７Ｘ、Ａ８Ｘ、Ｅ９Ｘ、Ｅ１０Ｘ、Ａ１１Ｘ、Ａ１２Ｘ、Ａ１３Ｘ、Ｈ１４Ｘ、Ｃ１５Ｘ、Ｍ１６Ｘ、Ａ１７Ｘ、Ｓ１８Ｘ、Ｓ１９Ｘ、Ｓ２０Ｘ、Ｅ２１Ｘ、Ｅ２２Ｘ、Ｆ２３Ｘ、Ｓ２４Ｘ、Ｇ２５Ｘ、２６Ｘ、Ｄ２７Ｘ、Ｓ２８Ｘ、Ｅ２９Ｘ、Ｖ３１Ｘ、Ｐ３２Ｘ、Ｐ３３Ｘ、Ａ３４Ｘ、Ｓ３５Ｘ、Ｅ３６Ｘ、Ｓ３７Ｘ、Ｄ３８Ｘ、Ｓ３９Ｘ、Ｓ４０Ｘ、Ｔ４１Ｘ、Ｅ４２Ｘ、Ｅ４３Ｘ、Ｓ４４Ｘ、Ｗ４５Ｘ、Ｃ４６Ｘ、Ｓ４７Ｘ、Ｓ４８Ｘ、Ｓ４９Ｘ、Ｔ５０Ｘ、Ｖ５１Ｘ、Ｓ５２Ｘ、Ａ５３Ｘ、Ｌ５４Ｘ、Ｅ５５Ｘ、Ｅ５６Ｘ、Ｐ５７Ｘ、Ｍ５８Ｘ、Ｅ５９Ｘ、Ｖ６０Ｘ、Ｍ１２２Ｘ、Ｔ１２３Ｘ、Ｅ１２４Ｘ、Ａ１２５Ｘ、Ｌ１２７Ｘ、Ｑ１２８Ｘ、Ｄ１２９Ｘ、Ｌ１３２Ｘ、Ｙ１３３Ｘ、Ｖ１２６Ｘ、Ｙ１２７Ｘ、Ｅ１３９Ｘ、Ｑ１４０Ｘ、Ｙ１４１Ｘ、Ｌ１４２Ｘ、Ｔ１４３Ｘ、Ｑ１４４Ｘ、Ｎ１４５Ｘ、Ｐ１４６Ｘ、Ｌ１４７Ｘ、Ｐ１４８Ｘ、Ｒ１４９Ｘ、Ｙ１５０Ｘ、Ａ１５１Ｘ、Ｈ１５４Ｘ、Ｈ１５７Ｘ、Ｐ１５８Ｘ、Ｔ１５９Ｘ、Ｄ１６０Ｘ、Ｉ１６１Ｘ、Ａ１６２Ｘ、Ｅ１６３Ｘ、Ｍ１６４Ｘ、Ｋ１６５Ｘ、Ｒ１６６Ｘ、Ｆ１６７Ｘ、Ｖ１６８Ｘ、Ｇ１６９Ｘ、Ｌ１７０Ｘ、Ｔ１７１Ｘ、Ｌ１７２Ｘ、Ａ１７３Ｘ、Ｍ１７４Ｘ、Ｇ１７５Ｘ、Ｌ１７６Ｘ、Ｉ１７７Ｘ、Ｋ１７８Ｘ、Ａ１７９Ｘ、Ｎ１８０Ｘ、Ｓ１８１Ｘ、Ｌ１８２Ｘ、Ｓ１８４Ｘ、Ｙ１８５Ｘ、Ｄ１８７Ｘ、Ｔ１８８Ｘ、Ｔ１８９Ｘ、Ｔ１９０Ｘ、Ｖ１９１Ｘ、Ｌ１９２Ｘ、Ｓ１９３Ｘ、Ｉ１９４Ｘ、Ｐ１９５Ｘ、Ｖ１９６Ｘ、Ｆ１９７Ｘ、Ｓ１９８Ｘ、Ａ１９９Ｘ、Ｔ２００Ｘ、Ｍ２０１Ｘ、Ｓ２０２Ｘ、Ｒ２０３Ｘ、Ｎ２０４Ｘ、Ｒ２０５Ｘ、Ｙ２０６Ｘ、Ｑ２０７Ｘ、Ｌ２０８Ｘ、Ｌ２０９Ｘ、Ｌ２１０Ｘ、Ｒ２１１Ｘ、Ｆ２１２Ｘ、Ｌ２１３Ｘ、Ｈ２４１Ｘ、Ｆ２１５Ｘ、Ｎ２１６Ｘ、Ｎ２１７Ｘ、Ｎ２１８Ｘ、Ａ２１９Ｘ、Ｔ２２０Ｘ、Ａ２２１Ｘ、Ｖ２２２Ｘ、Ｐ２２３Ｘ、Ｐ２２４Ｘ、Ｄ２２５Ｘ、Ｑ２２６Ｘ、Ｐ２２７Ｘ、Ｇ２２８Ｘ、Ｈ２２９Ｘ、Ｄ２３０Ｘ、Ｒ２３１Ｘ、Ｈ２３３Ｘ、Ｋ２３４Ｘ、Ｌ２３５Ｘ、Ｒ２３６Ｘ、Ｌ２３８Ｘ、Ｉ２３９Ｘ、Ｄ２４０Ｘ、Ｌ２４２Ｘ、Ｓ２４３Ｘ、Ｅ２４４Ｘ、Ｒ２４４Ｘ、Ｆ２４６Ｘ、Ａ２４７Ｘ、Ａ２４８Ｘ、Ｖ２４９Ｘ、Ｙ２５０Ｘ、Ｔ２５１Ｘ、Ｐ２５２Ｘ、Ｃ２５３Ｘ、Ｑ２５４Ｘ、Ｎ２５５Ｘ、Ｉ２５６Ｘ、Ｃ２５７Ｘ、Ｉ２５８Ｘ、Ｄ２５９Ｘ、Ｅ２６０Ｘ、Ｓ２６１Ｘ、Ｌ２６２Ｘ、Ｌ２６３Ｘ、Ｌ２６４Ｘ、Ｆ２６５Ｘ、Ｋ２６６Ｘ、Ｇ２６７Ｘ、Ｒ２６８Ｘ、Ｌ２６９Ｘ、Ｑ２７０Ｘ、Ｆ２７１Ｘ、Ｒ２７２Ｘ、Ｑ２７３Ｘ、Ｙ２７４Ｘ、Ｉ２７５Ｘ、Ｐ２７６Ｘ、Ｓ２７７Ｘ、Ｋ２７８Ｘ、Ｒ２７９Ｘ、Ａ２８０Ｘ、Ｒ２８１Ｘ、Ｙ２８２Ｘ、Ｇ２８３Ｘ、Ｉ２８４Ｘ、Ｋ２８５Ｘ、Ｆ２８６Ｘ、Ｙ２８７Ｘ、Ｋ２８８Ｘ、Ｌ２８９Ｘ、Ｃ２９０Ｘ、Ｅ２９１Ｘ、Ｓ２９２Ｘ、Ｓ２９３Ｘ、Ｓ２９４Ｘ、Ｇ２９５Ｘ、Ｙ２９６Ｘ、Ｔ２９７Ｘ、Ｓ２９８Ｘ、Ｙ２９９Ｘ、Ｆ３００Ｘ、Ｉ３０２Ｘ、Ｅ３０４Ｘ、Ｇ３０５Ｘ、Ｋ３０６Ｘ、Ｄ３０７Ｘ、Ｓ３０８Ｘ、Ｋ３０９Ｘ、Ｌ３１０Ｘ、Ｄ３１１Ｘ、Ｐ３１２Ｘ、Ｐ３１３Ｘ、Ｇ３１４Ｘ、Ｃ３１５Ｘ、Ｐ３１６Ｘ、Ｐ３１７Ｘ、Ｄ３１８Ｘ、Ｌ３１９Ｘ、Ｔ３２０Ｘ、Ｖ３２１Ｘ、Ｓ３２２Ｘ、Ｇ３２３Ｘ、Ｋ３２４Ｘ、Ｉ３２５Ｘ、Ｖ３２６Ｘ、Ｗ３２７Ｘ、Ｅ３２８Ｘ、Ｌ３２９Ｘ、Ｉ３３０Ｘ、Ｓ３３１Ｘ、Ｐ３３２Ｘ、Ｌ３３３Ｘ、Ｌ３３４Ｘ、Ｇ３３５Ｘ、Ｑ３３６Ｘ、Ｆ３３８Ｘ、Ｈ３３９Ｘ、Ｌ３４０Ｘ、Ｖ３４２Ｘ、Ｎ３４４Ｘ、Ｆ３４５Ｘ、Ｙ３４６Ｘ、Ｓ３４７Ｘ、Ｓ３４８Ｘ、Ｉ３４９Ｘ、Ｌ３５１Ｘ、Ｔ３５３Ｘ、Ａ３５４Ｘ、Ｙ３５６Ｘ、Ｃ３５７Ｘ、Ｌ３５８Ｘ、Ｄ３５９Ｘ、Ｔ３６０Ｘ、Ｐ３６１Ｘ、Ａ３６２Ｘ、Ｃ３６３Ｘ、Ｇ３６４Ｘ、Ｉ３６６Ｘ、Ｎ３６７Ｘ、Ｒ３６８Ｘ、Ｄ３６９Ｘ、Ｋ３７１Ｘ、Ｇ３７２Ｘ、Ｌ３７３Ｘ、Ｒ３７５Ｘ、Ａ３７６Ｘ、Ｌ３７７Ｘ、Ｌ３７８Ｘ、Ｄ３７９Ｘ、Ｋ３８０Ｘ、Ｋ３８１Ｘ、Ｌ３８２Ｘ、Ｎ３８３Ｘ、Ｒ３８４ＸＧ３８５Ｘ、Ｔ３８７Ｘ、Ｙ３８８Ｘ、Ａ３８９Ｘ、Ｌ３９０Ｘ、Ｋ３９２Ｘ、Ｎ３９３Ｘ、Ｅ３９４Ｘ、Ａ３９７Ｘ、Ｋ３９９Ｘ、Ｆ４００Ｘ、Ｆ４０１Ｘ、Ｄ４０２Ｘ、Ｎ４０５Ｘ、Ｌ４０６Ｘ、Ｌ４０９Ｘ、Ｒ４２２Ｘ、Ｙ４２３Ｘ、Ｇ４２４Ｘ、Ｅ４２５Ｘ、Ｐ４２６Ｘ、Ｋ４２８Ｘ、Ｎ４２９Ｘ、Ｋ４３０Ｘ、Ｐ４３１Ｘ、Ｌ４３２Ｘ、Ｓ４３４Ｘ、Ｋ４３５Ｘ、Ｅ４３６Ｘ、Ｓ４３８Ｘ、Ｋ４３９Ｘ、Ｙ４４０Ｘ、Ｇ４４２Ｘ、Ｇ４４３Ｘ、Ｖ４４４Ｘ、Ｒ４４６Ｘ、Ｔ４４７Ｘ、Ｌ４５０Ｘ、Ｑ４５１Ｘ、Ｈ４５２Ｘ、Ｎ４５５Ｘ、Ｔ４５７Ｘ、Ｒ４５８Ｘ、Ｔ４６０Ｘ、Ｒ４６１Ｘ、Ａ４６２Ｘ、Ｙ４６４Ｘ、Ｋ４６５Ｘ、Ｖ４６７Ｘ、Ｇ４６８Ｘ、Ｉ４６９Ｘ、Ｌ４７１Ｘ、Ｉ４７２Ｘ、Ｑ４７３Ｘ、Ｍ４７４Ｘ、Ｌ４７６Ｘ、Ｒ４７７Ｘ、Ｎ４７８Ｘ、Ｓ４７９Ｘ、Ｙ４８０Ｘ、Ｖ４８２ＸＹ３、Ｋ４８４Ｘ、Ａ４８５Ｘ、Ａ４８６Ｘ、Ｖ４８７Ｘ、Ｐ４８８Ｘ、Ｇ４８９Ｘ、Ｐ４９０Ｘ、Ｋ４９１Ｘ、Ｌ４９２Ｘ、Ｓ４９３Ｘ、Ｙ４９４Ｘ、Ｙ４９５Ｘ、Ｋ４９６Ｘ、Ｑ４９８Ｘ、Ｌ４９９Ｘ、Ｑ５００Ｘ、Ｉ５０１Ｘ、Ｌ５０２Ｘ、Ｐ５０３Ｘ、Ａ５０４Ｘ、Ｌ５０５Ｘ、Ｌ５０６Ｘ、Ｆ５０７Ｘ、Ｇ５０８Ｘ、Ｇ５０９Ｘ、Ｖ５１０Ｘ、Ｅ５１１Ｘ、Ｅ５１２Ｘ、Ｑ５１３Ｘ、Ｔ５１４Ｘ、Ｖ５１５Ｘ、Ｅ５１７Ｘ、Ｍ５１８Ｘ、Ｐ５１９Ｘ、Ｐ５２０Ｘ、Ｓ５２１Ｘ、Ｄ５２２Ｘ、Ｎ５２３Ｘ、Ｖ５２４Ｘ、Ａ５２５Ｘ、Ｌ５２７Ｘ、Ｉ５２８Ｘ、Ｇ５２９Ｘ、Ｋ５３０Ｘ、Ｆ５３２Ｘ、Ｉ５３３Ｘ、Ｄ５３４Ｘ、Ｔ５３５Ｘ、Ｌ５３６Ｘ、Ｐ５３７Ｘ、Ｐ５３８Ｘ、Ｔ５３９Ｘ、Ｐ５４０Ｘ、Ｇ５４１Ｘ、Ｆ５４２Ｘ、Ｑ５４３Ｘ、Ｒ５４４Ｘ、Ｐ５４５Ｘ、Ｑ５４６Ｘ、Ｋ５４７Ｘ、Ｇ５４８Ｘ、Ｃ５４９Ｘ、Ｋ５５０Ｘ、Ｖ５５１Ｘ、Ｃ５５２Ｘ、Ｒ５５３Ｘ、Ｋ５５４Ｘ、Ｒ５５５Ｘ、Ｇ５５６Ｘ、Ｉ５５７Ｘ、Ｒ５５８Ｘ、Ｒ５５９Ｘ、Ｄ５６０Ｘ、Ｔ５６１Ｘ、Ｒ５６２Ｘ、Ｙ５６３Ｘ、Ｙ５６４Ｘ、Ｃ５６５Ｘ、Ｐ５６６Ｘ、Ｋ５６７Ｘ、Ｃ５６８Ｘ、Ｐ５６９Ｘ、Ｒ５７０Ｘ、Ｎ５７１Ｘ、Ｐ５７２Ｘ、Ｇ５７３Ｘ、Ｌ５７４Ｘ、Ｃ５７５Ｘ、Ｆ５７６Ｘ、Ｋ５７７Ｘ、Ｐ５７８Ｘ、Ｃ５７９Ｘ、Ｆ５８０Ｘ、Ｅ５８１Ｘ、Ｉ５８２Ｘ、Ｙ５８３Ｘ、Ｈ５８４Ｘ、Ｔ５８５Ｘ、Ｑ５８６Ｘ、Ｌ５８７Ｘ、Ｈ５８８Ｘ、またはＹ５８９Ｘの置換を含む。切除能力のある、組み込み欠損アミノ酸置換の一覧は、米国特許第１０，０４１，０７７号に見出すことができ、その内容は、参照によりそれらの全体が組み込まれる。
【０６３０】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、核局在化シグナルに融合される。ある特定の実施形態において、配列番号１４５１７または配列番号１４５１８は、核局在化シグナルに融合される。ある特定の実施形態において、核局在化シグナルに融合されたｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼのアミノ酸配列は、以下を含むポリヌクレオチド配列によってコードされる。
【化１０９】
2021536249.tif 000282
【０６３１】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１１０】
2021536249.tif 000283
【０６３２】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１１１】
2021536249.tif 000284
【０６３３】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５１９および配列番号１４５２０を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１１２】
2021536249.tif 000285
【０６３４】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１１３】
2021536249.tif 000286
【０６３５】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１１４】
2021536249.tif 000287
【０６３６】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５２および配列番号１４５１９、配列番号１４５２１または配列番号１４５２３を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５２２および配列番号１４５１９、配列番号１４５２１または配列番号１４５２３を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５１９、配列番号１４５２１、または配列番号１４５２３からの少なくとも１４個、１６個、１８個、２０個、３０個、または４０個の連続するヌクレオチドを含む一末端を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５２０または配列番号１４５２２からの少なくとも１４個、１６個、１８個、２０個、３０個、または４０個の連続するヌクレオチドを含む一末端を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５１９、配列番号１４５２１、または配列番号１４５２３と少なくとも９０％の同一性を有する一末端を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５２または配列番号１４５２２と少なくとも９０％の同一性を有する一末端を含む。一実施形態において、一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５１９と少なくとも９０％同一であり、もう一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５２０と少なくとも９０％同一である。
【０６３７】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＡＣＴＧＣＣＡ（配列番号１４５２４）の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＴＴＡＡＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＣＡ（配列番号１４５２６）の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＴＴＡＡＣＣＹＴＴＴＴＡＣＴＧＣＣＡ（配列番号１４５２７）の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＴＧＧＣＡＧＴＡＡＡＡＧＧＧＴＴＡＡ（配列番号１４５２９）の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＴＴＡＡ（配列番号１４５３１）の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＴＴＡＡＣＣＹＴＴＴＫＭＣＴＧＣＣＡ（配列番号１４５３３）の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一末端は、配列番号１４５２４、配列番号１４５２６、および配列番号１４５２７から選択される配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの一末端は、配列番号１４５２９および配列番号１４５３１から選択される配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの各逆方向末端反復は、ＣＣＹＴＴＴＫＭＣＴＧＣＣＡ（配列番号１４５６３）のＩＴＲ配列の配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの各末端は、逆方向に配列番号１４５６３を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの１つのＩＴＲは、配列番号１４５２４、配列番号１４５２６、および配列番号１４５２７から選択される配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの１つのＩＴＲは、配列番号１４５２９および配列番号１４５３１から選択される配列を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、２つのトランスポゾン末端において逆方向に配列番号１４５３３を含む。
【０６３８】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５１９および配列番号１４５１９を含む末端、または配列番号１４５１９および配列番号１４５２０と少なくとも９０％の配列同一性を有するこれらのいずれかまたは両方のバリアントを有し得、かつ、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５１７の配列、または配列番号１４５１７もしくは配列番号１４５１８と少なくとも％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージの配列同一性を示すバリアントを有する。ある特定の実施形態において、一方のｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾン末端は、配列番号１４５１９、配列番号１４５２１、または配列番号１４５２３からの少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含み、もう一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５２０または配列番号１４５２２からの少なくとも１４個の連続するヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５１９、配列番号１４５２１、または配列番号１４５２３からの少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２２個、少なくとも２５個、少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含み、かつ、もう一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５２０または配列番号１４５２２からの少なくとも１５個、少なくとも１６個、少なくとも１７個、少なくとも１８個、少なくとも１９個、少なくとも２０個、少なくとも２２個、少なくとも２５個、または少なくとも３０個の連続するヌクレオチドを含む。
【０６３９】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５１９に対応する左配列、および配列番号１４５２０に対応する右配列を有するトランスポゾン末端を認識する。一方のトランスポゾン末端の左末端にある５’−ＴＴＡＡ−３’配列のＤＮＡを第２のトランスポゾン末端の右端にある５’−ＴＴＡＡ−３’に切断することによって、１つのＤＮＡ分子からトランスポゾンを切除し、それらの間に配置されたいかなる異種ＤＮＡも含み、切除された配列を第２のＤＮＡ分子に挿入する。ある特定の実施形態において、左および右トランスポゾン末端の短縮および改変されたバージョンはまた、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼによって転位され得るトランスポゾンの一部として機能する。例えば、左トランスポゾン末端は、配列番号１４５２１または配列番号１４５２３に対応する配列によって置き換えることができ、右のトランスポゾン末端は、配列番号１４５２２に対応するより短い配列によって置き換えることができる。ある特定の実施形態において、左および右のトランスポゾン末端は、５’−ＴＴＡＡ−３’挿入部位を含む、それらの末端において１８ｂｐのほぼ完全に反復される配列（５’−ＴＴＡＡＣＣＹＴＴＴＫＭＣＴＧＣＣＡ：配列番号１４５３３）を共有し、その配列は、２つの末端において配向で反転される。つまり、（配列番号１４５１９）および配列番号１４５２３にあり、左トランスポゾン末端は、配列５’−ＴＴＡＡＣＣＴＴＴＴＴＡＣＴＧＣＣＡ−３’（配列番号１４５２４）で始まるか、または（配列番号１４５２１）において、左トランスポゾン末端は、配列５’−ＴＴＡＡＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＣＡ−３’（配列番号１４５２６）で始まり、右トランスポゾンは、この配列のほぼ逆の補体で終了し、配列番号１４５２０において、それは、５’ＴＧＧＣＡＧＴＡＡＡＡＧＧＧＴＴＡＡ−３’（配列番号１４５２９）で終了し、（配列番号１４５２２）において、それは、５’−ＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧＴＴＡＡ−３’（配列番号１４５３１）で終了する。本開示の一実施形態は、各々が２つのトランスポゾン末端に逆方向で配列番号１４５３３を含む２つのトランスポゾン末端の間に挿入された異種ポリヌクレオチドを含むトランスポゾンである。ある特定の実施形態において、一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５２４、配列番号１４５２６、および配列番号１４５２７から選択される配列を含む。いくつかの実施形態において、一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５２９および配列番号１４５３１から選択される配列を含む。
【０６４０】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｔｒｏｐｉｃａｌｉｓから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１１５】
2021536249.tif 000288
【０６４１】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１１６】
2021536249.tif 000289
【０６４２】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５７３または配列番号１４５７４からの少なくとも１６個の連続する塩基と、ＣＣＹＴＴＴＢＭＣＴＧＣＣＡ（配列番号１４５７５）の逆方向末端反復と、を含む。
【０６４３】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１１７】
2021536249.tif 000290
【０６４４】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１１８】
2021536249.tif 000291
【０６４５】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
死の組
【化１１９】
2021536249.tif 000292
【０６４６】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１２０】
2021536249.tif 000293
【０６４７】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１２１】
2021536249.tif 000294
【０６４８】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１２２】
2021536249.tif 000295
【０６４９】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１２３】
2021536249.tif 000296
【０６５０】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１２４】
2021536249.tif 000297
【０６５１】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５７３および配列番号１４５７９〜１４５８５から選択される左トランスポゾン末端配列を含む。ある特定の実施形態において、左トランスポゾン末端配列は、前に左標的配列がある。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１２５】
2021536249.tif 000298
【０６５２】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１２６】
2021536249.tif 000299
【０６５３】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１２７】
2021536249.tif 000300
【０６５４】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１２８】
2021536249.tif 000301
【０６５５】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５７４および配列番号１４５８７〜１４５９０から選択される右トランスポゾン末端配列を含む。ある特定の実施形態において、右トランスポゾン末端配列は、前に右標的配列がある。ある特定の実施形態において、左および右のトランスポゾン末端は、標的配列に隣接する２つの末端で配向が反転された１４の反復配列（配列番号１４５７５）を共有する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、標的配列と配列番号１４５８２〜１４５８４および１４５７３から選択される配列とを含む左トランスポゾン末端と、配列番号１４５８８〜１４５９０および１４５７４から選択される配列とその後に右標的配列とを含む右トランスポゾン末端と、を含む。
【０６５６】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの左トランスポゾン末端は、以下の
【化１２９】
2021536249.tif 000302
（配列番号１４５９１）およびＩＴＲを含む。ある特定の実施形態において、左トランスポゾン末端は、以下の
【化１３０】
2021536249.tif 000303
およびＩＴＲを含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンの右トランスポゾン末端は、以下の
【化１３１】
2021536249.tif 000304
およびＩＴＲを含む。ある特定の実施形態において、右トランスポゾン末端は、以下の
【化１３２】
2021536249.tif 000305
およびＩＴＲを含む。
【０６５７】
ある特定の実施形態において、一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５７３と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一である配列を含み、もう一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５７４と少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一である配列を含む。ある特定の実施形態において、一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５７３からの少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個の連続するヌクレオチドを含み、一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５７４からの少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個、または少なくとも２５個の連続したヌクレオチドを含む。ある特定の実施形態において、一方のトランスポゾン末端は、配列番号１４５９１からの少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個を含み、もう一方の末端は、配列番号１４５９３からの少なくとも１４個、少なくとも１６個、少なくとも１８個、少なくとも２０個を含む。ある特定の実施形態において、各トランスポゾン末端は、逆方向で配列番号１４７５５を含む。
【０６５８】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５７３、配列番号１４５７９、配列番号１４５８１、配列番号１４５８２、配列番号１４５８３、および配列番号１４５８３から選択される配列と、配列番号１４５８７、配列番号１４５８８、配列番号１４５８９、および配列番号１４５８６から選択される配列と、を含み、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５１７または配列番号１４５１８を含む。
【０６５９】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、標的配列に隣接するＣＣＣＴＴＴＧＣＣＴＧＣＣＡ（配列番号１４６２２）（左ＩＴＲ）およびＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡＡＧＧＧ（配列番号１４６２３）（右ＩＴＲ）のＩＴＲを含む。
【０６６０】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化１３３】
2021536249.tif 000306
【０６６１】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｈｅｌｉｃｏｖｅｒｐａ  ａｒｍｉｇｅｒａから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１３４】
2021536249.tif 000307
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１３５】
2021536249.tif 000308
【０６６２】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｐｅｃｔｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｓｙｐｉｅｌｌａから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化１３６】
2021536249.tif 000309
【０６６３】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｐｅｋｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｙｐｉｅｌｌａから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１３７】
2021536249.tif 000310
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１３８】
2021536249.tif 000311
【０６６４】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｃｔｅｎｏｐｌｕｓｉａ  ａｎｇａｔａから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化１３９】
2021536249.tif 000312
【０６６５】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｃｔｅｎｏｐｌｕｓｉａ  ａｎｇａｔａから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１４０】
2021536249.tif 000313
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１４１】
2021536249.tif 000314
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＣＣＣＴＡＧＡＡＧＣＣＣＡＡＴＣ（配列番号１４５６４）のＩＴＲ配列を含む。
【０６６６】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化１４２】
2021536249.tif 000315
【０６６７】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ａｇｒｏｔｉｓ  ｉｐｓｉｌｏｎから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１４３】
2021536249.tif 000316
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１４４】
2021536249.tif 000317
【０６６８】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｍｅｇａｃｈｉｌｅ  ｒｏｔｕｎｄａｔａから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化１４５】
2021536249.tif 000318
【０６６９】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｍｅｇａｃｈｉｌｅ  ｒｏｔｕｎｄａｔａから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１４６】
2021536249.tif 000319
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１４７】
2021536249.tif 000320
【０６７０】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｂｏｍｂｕｓ  ｉｍｐａｔｉｅｎｓから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化１４８】
2021536249.tif 000321
【０６７１】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｂｏｍｂｕｓ  ｉｍｐａｔｉｅｎｓから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１４９】
2021536249.tif 000322
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１５０】
2021536249.tif 000323
【０６７２】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化１５１】
2021536249.tif 000324
【０６７３】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｍａｍｅｓｔｒａ  ｂｒａｓｓｉｃａｅから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１５２】
2021536249.tif 000325
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１５３】
2021536249.tif 000326
【０６７４】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化１５４】
2021536249.tif 000327
【０６７５】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｍａｙｅｔｉｏｌａ  ｄｅｓｔｒｕｃｔｏｒから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１５５】
2021536249.tif 000328
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１５６】
2021536249.tif 000329
【０６７６】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化１５７】
2021536249.tif 000330
【０６７７】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ａｐｉｓ  ｍｅｌｌｉｆｅｒａから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１５８】
2021536249.tif 000331
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１５９】
2021536249.tif 000332
【０６７８】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｍｅｓｓｏｒ  ｂｏｖｉｅｒｉから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化１６０】
2021536249.tif 000333
【０６７９】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｍｅｓｓｏｒ  ｂｏｕｖｉｅｒｉから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１６１】
2021536249.tif 000334
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１６２】
2021536249.tif 000335
【０６８０】
本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスポザーゼ酵素は、ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素である。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉから単離されるか、またはそれに由来する。ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）（ＰＢ）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼ酵素は、以下と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージで同一であるアミノ酸配列を含むか、またはそれからなり得る。
【化１６３】
2021536249.tif 000336
【０６８１】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ  ｎｉから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１６４】
2021536249.tif 000337
【０６８２】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１６５】
2021536249.tif 000338
【０６８３】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１６６】
2021536249.tif 000339
【０６８４】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１６７】
2021536249.tif 000340
【０６８５】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１６８】
2021536249.tif 000341
【０６８６】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、以下の配列を含む。
【化１６９】
2021536249.tif 000342
【０６８７】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５６１および配列番号１４５６２を含み、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４５５８を含む。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、配列番号１４６０９および配列番号１４６１０を含み、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポザーゼは、配列番号１４５５８を含む。
【０６８８】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ａｐｈｉｓ  ｇｏｓｙｐｉｉから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＣＣＴＴＣＣＡＧＣＧＧＧＣＧＣＧＣ（配列番号１４５６５）のＩＴＲ配列を含む。
【０６８９】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｃｈｉｌｏ  ｓｕｐｐｒｅｓｓａｌｉｓから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃまたはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＣＣＣＡＧＡＴＴＡＧＣＣＴ（配列番号１４５６６）のＩＴＲ配列を含む。
【０６９０】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｈｅｌｉｏｔｈｉｓ  ｖｉｒｅｓｃｅｎｓから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＣＣＣＴＴＡＡＴＴＡＣＴＣＧＣＧ（配列番号１４５６７）のＩＴＲ配列を含む。
【０６９１】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ｐｅｋｉｎｏｐｈｏｒａ  ｇｏｓｙｐｉｅｌｌａから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＣＣＣＴＡＧＡＴＡＡＣＴＡＡＡＣ（配列番号１４５６８）のＩＴＲ配列を含む。
【０６９２】
ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉから単離されるか、またはそれに由来する。ある特定の実施形態において、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）またはｐｉｇｇｙＢａｃ様トランスポゾンは、ＣＣＣＴＡＧＡＡＡＧＡＴＡ（配列番号１４５６９）のＩＴＲ配列を含む。
【０６９３】
ｈＡＴファミリーのＤＮＡトランスポゾンは、植物および動物に広く行き渡っている。Ｈｅｒｍｅｓトランスポゾン、Ａｃトランスポゾン、ｈｏｂｏトランスポゾン、およびＴｏｌ２トランスポゾンが含まれるが、これらに限定されない、多くの活性なｈＡＴトランスポゾンシステムが同定され、機能的であることが見出されている。ｈＡＴファミリーは、それらのトランスポザーゼの一次配列に基づいて、ＡＣサブファミリーおよびＢｕｓｔｅｒサブファミリーとして分類されている２つのファミリーで構成される。ｈＡＴファミリーのメンバーは、クラスＩＩの転移エレメントに属する。クラスＩＩの可動エレメントは、転位のカットアンドペーストメカニズムを使用する。ｈＡＴエレメントは、類似のトランスポザーゼ、短い末端逆方向反復、およびゲノム標的の８塩基対の重複を共有する。
【０６９４】
本開示の組成物および方法は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンおよび／またはＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを含み得る。
【０６９５】
本開示の組成物および方法は、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンおよび／または高活性ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼを含み得る。高活性ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの切除および／または挿入頻度と比較したとき、切除の増加および／または挿入頻度の増加を示す。高活性ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼの転位頻度と比較したとき、転位頻度の増加を示す。
【０６９６】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【化１７０】
2021536249.tif 000343
【０６９７】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、以下のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
【化１７１】
2021536249.tif 000344
【０６９８】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、以下を含むか、またはそれからなる核酸配列によってコードされる。
【化１７２】
2021536249.tif 000345
【０６９９】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、以下を含むか、それからなる核酸配列によってコードされる野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと少なくとも２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる。
【化１７３】
2021536249.tif 000346
【０７００】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、自然発生アミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０７０１】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、非自然発生アミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。
【０７０２】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、自然発生核酸配列を含むか、またはそれからなる配列によってコードされる。
【０７０３】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、非自然発生核酸配列を含むか、またはそれからなる配列によってコードされる。
【０７０４】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１７０９０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１７０９１の核酸配列を含むか、またはそれからなる配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、置換、逆位、挿入、欠失、転位、およびフレームシフトのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、改変された、合成の、人工の、または非自然発生アミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、改変された、合成の、人工の、または非自然発生核酸を含む。
【０７０５】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、ＤＮＡ結合およびオリゴマー化ドメイン、挿入ドメイン、およびＺｎ−ＢＥＤドメインのうちの１つ以上におけるアミノ酸置換を含む。
【０７０６】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、中性ｐＨで正味電荷を増加させるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１７０９０のアミノ酸配列を含むか、またはそれからなる。いくつかの実施形態において、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１７０９１の核酸配列を含むか、またはそれからなる配列によってコードされる。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０の２２３位のアスパラギン酸（Ｄ）（Ｄ２２３）、２８９位のアスパラギン酸（Ｄ）（Ｄ２８９）、および５８９位のアスパラギン酸（Ｅ）（Ｅ２８９）のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０の２２３位、２８９位、および／または２８９位の５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはその間の任意の数のアミノ酸位内のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０の２２３位、２８９位、および／または２８９位の７０個のアミノ酸位内のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０の２２３位、２８９位、および／または２８９位の８０個のアミノ酸位内のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、中性アミノ酸、リジン（Ｌ）、またはアルギニン（Ｒ）へのアスパラギン酸（Ｄ）またはアスパラギン酸（Ｅ）のアミノ酸置換を含む（例えば、配列番号１７０９０のＤ２２３Ｌ、Ｄ２２３Ｒ、Ｄ２８９Ｌ、Ｄ２８９Ｒ、Ｅ２８９Ｌ、Ｅ２８９Ｒ）。
【０７０７】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０のＱ８２Ｅ、Ｎ８５Ｓ、Ｄ９９Ａ、Ｄ１３２Ａ、Ｑ１５１Ｓ、Ｑ１５１Ａ、Ｅ１５３Ｋ、Ｅ１５３Ｒ、Ａ１５４Ｐ、Ｙ１５５Ｈ、Ｅ１５９Ａ、Ｔ１７１Ｋ、Ｔ１７１Ｒ、Ｋ１７７Ｅ、Ｄ１８３Ｋ、Ｄ１８３Ｒ、Ｄ１８９Ａ、Ｔ１９１Ｅ、Ｓ１９３Ｋ、Ｓ１９３Ｒ、Ｙ２０１Ａ、Ｆ２０２Ｄ、Ｆ２０２Ｋ、Ｃ２０３Ｉ、Ｃ２０３Ｖ、Ｑ２２１Ｔ、Ｍ２２２Ｌ、Ｉ２２３Ｑ、Ｅ２２４Ｇ、Ｓ２２５Ｗ、Ｄ２２７Ａ、Ｒ２３９Ｈ、Ｅ２４３Ａ、Ｅ２４７Ｋ、Ｐ２５７Ｋ、Ｐ２５７Ｒ、Ｑ２５８Ｔ、Ｅ２６３Ａ、Ｅ２６３Ｋ、Ｅ２６３Ｒ、Ｅ２７４Ｋ、Ｅ２７４Ｒ、Ｓ２７８Ｋ、Ｎ２８１Ｅ、Ｌ２８２Ｋ、Ｌ２８２Ｒ、Ｋ２９２Ｐ、Ｖ２９７Ｋ、Ｋ２９９Ｓ、Ａ３０３Ｔ、Ｈ３２２Ｅ、Ａ３３２Ｓ、Ａ３５８Ｅ、Ａ３５８Ｋ、Ａ３５８Ｓ、Ｄ３７６Ａ、Ｖ３７７Ｔ、Ｌ３８０Ｎ、Ｉ３９８Ｄ、Ｉ３９８Ｓ、Ｉ３９８Ｋ、Ｆ４００Ｌ、Ｖ４３１Ｌ、Ｓ４４７Ｅ、Ｎ４５０Ｋ、Ｎ４５０Ｒ、Ｉ４５２Ｆ、Ｅ４６９Ｋ、Ｋ４６９Ｋ、Ｐ５１０Ｄ、Ｐ５１０Ｎ、Ｅ５１７Ｒ、Ｒ５３６Ｓ、Ｖ５５３Ｓ、Ｐ５５４Ｔ、Ｐ５５９Ｄ、Ｐ５５９Ｓ、Ｐ５５９Ｋ、Ｋ５７３Ｅ、Ｅ５７８Ｌ、Ｋ５９０Ｔ、Ｙ５９５Ｌ、Ｖ５９６Ａ、Ｔ５９８Ｉ、Ｋ５９９Ａ、Ｑ６１５Ａ、Ｔ６１８Ｋ、Ｔ６１８Ｋ、Ｔ６１８Ｒ、Ｄ６２２Ｋ、およびＤ６２２Ｒのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０の１５４位、１５５位、１５９位、１７１位、１７７位、１８３位、１８９位、１９１位、１９３位、２０１位、２０２位、２０３位、２２１位、２２３位、２２４位、２２５位、２２７位、２３９位、２４３位、２４７位、２５７位、２５８位、２６３位、２７４位、２７８位、２８１位、２８２位、２９２位、２９７位、２９９位、３０３位、３２２位、３３２位、３５８位、３７６位、３７７位、３８０位、３９８位、４００位、４３１位、４４７位、４５０位、４５２位、４６９位、５１０位、５１７位、５３６位、５５３位、５５４位、５５９位、５７３位、５７８位、５９０位、５９５位、５９６位、５９８位、５９９位、６１５位、６１８位、および６２２位の５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはその間の任意の数のアミノ酸位内のアミノ酸置換を含む。
【０７０８】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０のＥ２４７Ｋ、Ｖ２９７Ｋ、Ａ３５８Ｋ、Ｓ２７８Ｋ、Ｅ２４７Ｒ、Ｅ２７４Ｒ、Ｖ２９７Ｒ、Ａ３５８Ｒ、Ｓ２７８Ｒ、Ｔ１７１Ｒ、Ｄ１８３Ｒ、Ｓ１９３Ｒ、Ｐ２５７Ｋ、Ｅ２６３Ｒ、Ｌ２８２Ｋ、Ｔ６１８Ｋ、Ｄ６２２Ｒ、Ｅ１５３Ｋ、Ｎ４５０Ｋ、Ｔ１７１Ｋ、Ｄ１８３Ｋ、Ｓ１９３Ｋ、Ｐ２５７Ｒ、Ｅ２６３Ｋ、Ｌ２８２Ｒ、Ｔ６１８Ｒ、Ｄ６２２Ｋ、Ｅ１５３Ｒ、およびＮ４５０Ｒのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０の１５３位、１７１位、１８３位、１９３位、２４７位、２５７位、２６３位、２７４位、２７８位、２８２位、２９７位、３５８位、４５０位、６１８位、６２２位の５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはその間の任意の数のアミノ酸位内のアミノ酸置換を含む。
【０７０９】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０のＶ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ、Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｒ５３６Ｓ、Ａ３３２Ｓ、Ｖ５５３Ｓ／Ｐ５５４Ｔ、Ｅ５１７Ｒ、Ｋ２９９Ｓ、Ｑ６１５Ａ／Ｔ６１８Ｋ、Ｓ２７８Ｋ、Ａ３０３Ｔ、Ｐ５１０Ｄ、Ｐ５１０Ｎ、Ｎ２８１Ｓ、Ｎ２８１Ｅ、Ｋ５９０Ｔ、Ｑ２５８Ｔ、Ｅ２４７Ｋ、Ｓ４４７Ｅ、Ｎ８５Ｓ、Ｖ２９７Ｋ、Ａ３５８Ｋ、Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ／Ｅ５７８Ｌ、Ｉ４５２Ｆ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｄ１８９Ａ、Ａ３５８Ｋ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ／Ｅ５７８Ｌ／Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｄ１８９Ａ、Ｔ１７１Ｒ、Ｄ１８３Ｒ、Ｓ１９３Ｒ、Ｐ２５７Ｋ、Ｅ２６３Ｒ、Ｌ２８２Ｋ、Ｔ６１８Ｋ、Ｄ６２２Ｒ、Ｅ１５３Ｋ、Ｎ４５０Ｋ、Ｔ１７１Ｋ、Ｄ１８３Ｋ、Ｓ１９３Ｋ、Ｐ２５７Ｒ、Ｅ２６３Ｋ、Ｌ２８２Ｒ、Ｔ６１８Ｒ、Ｄ６２２Ｋ、Ｅ１５３Ｒ、Ｎ４５０Ｒ、Ｅ２４７Ｋ／Ｅ２７４Ｋ／Ｖ２９７Ｋ／Ａ３５８Ｋのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０の８５位、１５３位、１７１位、１８９位、１９３位、２４７位、２５７位、２５８位、２６３位、２７４位、２７８位、２８１位、２８２位、２９７位、３０３位、３３２位、３５８位、３７７位、４５０位、４６９位、４４７位、４５２位、４６９位、５１０位、５１７位、５３６位、５５３位、５５４位、５７３位、５７８位、５９０位、６１５位、６１８位、６２２位の５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはその間の任意の数のアミノ酸位内のアミノ酸置換を含む。
【０７１０】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ、Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｒ５３６Ｓ、Ｖ５５３Ｓ／Ｐ５５４Ｔ、Ｑ６１５Ａ／Ｔ６１８Ｋ、Ｓ２７８Ｋ、Ａ３０３Ｔ、Ｐ５１０Ｄ、Ｐ５１０Ｎ、Ｎ２８１Ｓ、Ｎ２８１Ｅ、Ｋ５９０Ｔ、Ｑ２５８Ｔ、Ｅ２４７Ｋ、Ｓ４４７Ｅ、Ｎ８５Ｓ、Ｖ２９７Ｋ、Ａ３５８Ｋ、Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ／Ｅ４６９Ｋ／Ｄ１８９Ａ、およびＫ５７３Ｅ／Ｅ５７８Ｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０の８５位、１８９位、２４７位、２５８位、２７８位、２８１位、２９７位、３０３位、３５８位、３７７位、４４７位、４５２位、４６９位、５１０位、５３６位、５５３位、５５４位、５７３位、５７８位、５９０位、６１５位、６１８位の５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはその間の任意の数のアミノ酸位内のアミノ酸置換を含む。
【０７１１】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０のＱ１５１Ｓ、Ｑ１５１Ａ、Ａ１５４Ｐ、Ｑ６１５Ａ、Ｖ５５３Ｓ、Ｙ１５５Ｈ、Ｙ２０１Ａ、Ｆ２０２Ｄ、Ｆ２０２Ｋ、Ｃ２０３Ｉ、Ｃ２０３Ｖ、Ｆ４００Ｌ、Ｉ３９８Ｄ、Ｉ３９８Ｓ、Ｉ３９８Ｋ、Ｖ４３１Ｌ、Ｐ５５９Ｄ、Ｐ５５９Ｓ、Ｐ５５９Ｋ、Ｍ２２２Ｌのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０の１５１位、１５４位、６１５位、５５３位、１５５位、２０１位、２０２位、２０３位、４００位、３９８位、４３１位、５５９位、２２２位の５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、１００個、またはその間の任意の数のアミノ酸位内のアミノ酸置換を含む。
【０７１２】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０に従って番号付けられているとき、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａのうちの１つ以上を含む。
【０７１３】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１０９０に従って番号付けしたとき、Ｋ５７３ＥおよびＥ５７８Ｌのうちの１つ以上を含む。
【０７１４】
いくつかの実施形態において、変異体ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１７０９０に従って番号付けしたとき、アミノ酸置換Ｉ４５２Ｋを含む。
【０７１５】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０に従って番号付けしたとき、Ａ３５８Ｋのうちの１つ以上を含む。
【０７１６】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０に従って番号付けしたとき、Ｖ２９７Ｋのうちの１つ以上を含む。
【０７１７】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０に従って番号付けしたとき、Ｎ８５Ｓのうちの１つ以上を含む。
【０７１８】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０に従って番号付けしたとき、Ｉ４５２Ｆ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａのうちの１つ以上を含む。
【０７１９】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０に従って番号付けしたとき、Ａ３５８Ｋ、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、およびＤ１８９Ａのうちの１つ以上を含む。
【０７２０】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、変異型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、野生型ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼと比較したとき、１つ以上の配列変異を含む。いくつかの実施形態において、１つ以上の配列変異は、配列番号１７０９０に従って番号付けしたとき、Ｖ３７７Ｔ、Ｅ４６９Ｋ、Ｄ１８９Ａ、Ｋ５７３Ｅ、およびＥ５７８Ｌのうちの１つ以上を含む。
【０７２１】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、以下の配列を含むか、またはそれからなる５’逆方向反復を認識する。
【化１７４】
2021536249.tif 000347
【０７２２】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、以下の配列を含むか、またはそれからなる３’逆方向反復を認識する。
【化１７５】
2021536249.tif 000348
【０７２３】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１７０９２の配列を含むか、またはそれからなる５’逆方向反復、および配列番号１７０９３の配列を含むか、またはそれからなる３’逆方向反復を認識する。
【０７２４】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、以下の配列を含むか、またはそれからなる５’逆方向反復を認識する。
【化１７６】
2021536249.tif 000349
【０７２５】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、以下の配列を含むか、またはそれからなる３’逆方向反復を認識する。
【化１７７】
2021536249.tif 000350
【０７２６】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１７０９４の配列を含むか、またはそれからなる５’逆方向反復、および配列番号１７０９５の配列を含むか、またはそれからなる３’逆方向反復を認識する。
【０７２７】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１７０９２、１７０９３、１７０９４、または１７０９５のうちの１つ以上と少なくとも５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージの同一性を有する配列を含むか、またはそれからなる逆方向反復を認識する。
【０７２８】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、少なくともを有する配列を含むか、またはそれからなる逆方向反復を認識する本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１７０９２、１７０９３、１７０９４、もしくは１７０９５、またはそれらの任意の部分と９０〜１００％の同一性を有する少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、９７個、９９個、またはその間の任意の数の連続するヌクレオチドを有する配列を含むか、またはそれからなる逆方向反復を認識する。
【０７２９】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１７０９２、１７０９３、１７０９４、もしくは１７０９５、またはそれらの任意の部分と９０〜１００％の同一性を有する少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、９７個、９９個、またはその間の任意の数の不連続ヌクレオチドを有する配列を含むか、またはそれからなる逆方向反復を認識する。
【０７３０】
本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンは、３’逆方向反復および５’逆方向反復を含む。本開示の組成物および方法のいくつかの実施形態において、ＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポザーゼは、配列番号１７０９２、１７０９３、１７０９４、もしくは１７０９５、またはそれらの任意の部分と９０〜１００％の同一性を有する少なくとも５個、１０個、１５個、２０個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７５個、８０個、８５個、９０個、９５個、９７個、９９個、またはその間の任意の数の不連続ヌクレオチドを有する配列を含むか、またはそれからなる３’逆方向反復および５’逆方向反復を含むＴｃＢｕｓｔｅｒトランスポゾンを認識する。
【０７３１】
本開示全体において使用されるように、単数形「ａ」、「および」、および「ｔｈｅ」は、文脈がそうでないことを明確に示さない限り、複数の参照を含む。したがって、例えば、「方法」への言及は、複数のそのような方法を含み、「用量」への言及は、当業者などに知られている１つ以上の用量およびその同等物への言及を含む。
【０７３２】
「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者によって決定される特定の値について、許容可能な誤差範囲内を意味し、その値がどのように測定または決定されるか、例えば、測定システムの限界に、部分的には依存している。例えば、「約」は、１つ以上の標準偏差内を意味することができる。あるいは、「約」は、所与の値の最大２０％、または最大１０％、または最大５％、または最大１％の範囲を意味することができる。あるいは、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が本出願および特許請求の範囲に記載されている場合、特に明記しない限り、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語が、仮定されるべきである。
【０７３３】
本開示は、単離された、または実質的に精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質組成物を提供する。「単離された」または「精製された」ポリヌクレオチドまたはタンパク質、またはその生物学的に活性な部分は、その自然発生環境に見られるようなポリヌクレオチドまたはタンパク質に通常付随または相互作用する成分を実質的または本質的に含まない。したがって、単離または精製されたポリヌクレオチドまたはタンパク質は、組換え技術によって生成されるとき、他の細胞材料または培養培地を実質的に含まないか、または化学的に合成されるとき、化学前駆体または他の化学物質を実質的に含まない。最適には、「単離された」ポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する生物のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチド（すなわち、ポリヌクレオチドの５’および３’末端に位置する配列）に自然に隣接する配列（最適にはタンパク質をコードする配列）を含まない。例えば、様々な実施形態において、単離されたポリヌクレオチドは、ポリヌクレオチドが由来する細胞のゲノムＤＮＡにおいてポリヌクレオチドに自然に隣接する約５ｋｂ、４ｋｂ、３ｋｂ、２ｋｂ、１ｋｂ、０．５ｋｂ、または０．１ｋｂ未満のヌクレオチド配列を含み得る。細胞物質を実質的に含まないタンパク質には、約３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満（乾燥重量で）の汚染タンパク質を有するタンパク質の調製物が含まれる。本開示のタンパク質またはその生物学的に活性な部分が組換え的に産生されるとき、最適な培養培地は、化学前駆体または目的の非タンパク質化学物質の約３０％、２０％、１０％、５％、または１％未満（乾燥重量で）を表す。
【０７３４】
本開示は、これらのＤＮＡ配列によってコードされる開示されたＤＮＡ配列およびタンパク質の断片および変異体を提供する。本開示全体において使用される場合、「断片」という用語は、ＤＮＡ配列の一部分またはアミノ酸配列の一部分、したがってそれによってコードされるタンパク質を指す。コード配列を含むＤＮＡ配列の断片は、天然タンパク質の生物学的活性を保持するタンパク質断片をコードし、したがって、本明細書に記載の標的ＤＮＡ配列へのＤＮＡ認識または結合活性をコードし得る。あるいは、ハイブリダイゼーションプローブとして有用なＤＮＡ配列の断片は、一般に、生物学的活性を保持するタンパク質をコードしない、またはプロモーター活性を保持しない。したがって、ＤＮＡ配列の断片は、少なくとも約２０ヌクレオチド、約５０ヌクレオチド、約１００ヌクレオチドから、本開示の完全長ポリヌクレオチドまでの範囲であり得る。
【０７３５】
本開示の核酸またはタンパク質は、後に最終的な目的のベクターへとアセンブルされ得る標的ベクターにおいて単量体単位および／または反復単位をプリアセンブルすることを含むモジュラーアプローチによって構築することができる。本開示のポリペプチドは、本開示の反復単量体を含んでもよく、後に最終的な目的のベクターへとアセンブルされ得る標的ベクターにおいて反復単位をプリアセンブルすることによるモジュラーアプローチによって構築することができる。本開示は、本方法によって産生されるポリペプチド、ならびにこれらのポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。本開示は、このモジュラーアプローチによって産生されるポリペプチドをコードする核酸配列を含む宿主生物および細胞を提供する。
【０７３６】
「抗体」という用語は、最も広い意味において使用され、単一モノクローナル抗体（アゴニスト抗体およびアンタゴニスト抗体を含む）および多エピトープ特異性を有する抗体組成物を明確に網羅する。本明細書において定義される本明細書の抗体の天然または合成の類似体、変異体、バリアント、対立遺伝子、ホモログ、およびオルソログ（本明細書では集合的に「類似体」と称される）を使用することも本明細書の範囲内である。したがって、本明細書の一実施形態によれば、「本明細書の抗体」という用語は、その最も広い意味において、そのような類似体も網羅する。一般に、そのような類似体では、本明細書において定義される本明細書の抗体と比較して、１つ以上のアミノ酸残基が、置き換えられ、欠失し、かつ／または付加されてもよい。
【０７３７】
本明細書で使用される「抗体断片」、およびそのあらゆる文法的な変化形は、無傷抗体の抗原結合部位または可変領域を含む無傷抗体の一部分であって、無傷抗体のＦｃ領域の定常重鎖ドメイン（すなわち、抗体アイソタイプに応じてＣＨ２、ＣＨ３、およびＣＨ４）を含まない一部分と定義される。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆａｂ’−ＳＨ、Ｆ（ａｂ’）2、およびＦｖ断片；ダイアボディ；（１）一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）分子、（２）軽鎖可変ドメインを１つだけ含有する一本鎖ポリペプチド、または関連した重鎖部分のない軽鎖可変ドメインの３つのＣＤＲを含有するその断片、および（３）重鎖可変領域を１つだけ含有する一本鎖ポリペプチド、または関連した軽鎖部分のない重鎖可変領域の３つのＣＤＲを含有するその断片を含むが、これらに限定されない、連続したアミノ酸残基の１つの中断されていない配列からなる一次構造を有するポリペプチドである任意の抗体断片（本明細書では「一本鎖抗体断片」または「一本鎖ポリペプチド」と称される）；ならびに抗体断片から形成された多特異性または多価の構造が挙げられる。１つ以上の重鎖を含む抗体断片において、重鎖は、無傷抗体の非Ｆｃ領域に見られる任意の定常ドメイン配列（例えば、ＩｇＧアイソタイプのＣＨＩ）を含むことができ、および／または無傷の抗体に見られる配列に見られる任意のヒンジ領域を含むことができ、および／または重鎖のヒンジ領域配列もしくは定常ドメイン配列に融合もしくは位置するロイシンジッパー配列を含むことができる。この用語は、一般的に（例えば、ラクダからの）単一の単量体可変抗体ドメインを有する抗体断片を指す単一のドメイン抗体（「ｓｄＡＢ」）をさらに含む。そのような抗体断片のタイプは、当業者によって容易に理解されるであろう。
【０７３８】
「結合」とは、巨大分子間（例えば、タンパク質と核酸との間）の配列特異的な非共有相互作用を指す。相互作用が全体として配列特異的である限り、結合の相互作用のすべての成分が配列特異的である必要はない（例えば、ＤＮＡ骨格におけるリン酸残基と接触する）。
【０７３９】
「含む」という用語は、組成物および方法が、列挙された要素を含むが、他のものを除外しないことを意味することが意図される。組成物および方法を定義するために使用されるとき、「から本質的になる」とは、意図される目的のために使用するときの組み合わせに対してあらゆる本質的な意義のある他の要素を除外することを意味するものとする。したがって、本明細書において定義されている要素から本質的になる組成物は、微量混入物質または不活性担体を除外しない。「からなるとは、他の成分の微量を超える要素および実質的な方法ステップを除外することを意味するものとする。これらの移行用語の各々によって定義される実施形態は、本開示の範囲内である。
【０７４０】
「エピトープ」という用語は、ポリペプチドの抗原決定基を指す。エピトープは、エピトープに特有の空間的コンフォメーションで３つのアミノ酸を含み得る。一般に、エピトープは、少なくとも４、５、６、または７個のそのようなアミノ酸からなり、より通常は、少なくとも８、９、または１０個のそのようなアミノ酸からなる。アミノ酸の空間的コンフォメーションを決定する方法は、当該技術分野において既知であり、例えば、Ｘ線結晶学および二次元核磁気共鳴を含む。
【０７４１】
本明細書で使用される場合、「発現」は、ポリヌクレオチドがｍＲＮＡに転写されるプロセス、および／または転写されたｍＲＮＡがその後にペプチド、ポリペプチド、もしくはタンパク質に翻訳されるプロセスを指す。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。
【０７４２】
「遺伝子発現」とは、遺伝子に含まれる情報の、遺伝子産物への変換を指す。遺伝子産物は、遺伝子の直接的転写産物（例えば、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、リボザイム、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、構造ＲＮＡ、もしくは任意の他の型のＲＮＡ）またはｍＲＮＡの翻訳によって産生されるタンパク質であり得る。遺伝子産物には、キャップ形成、ポリアデニル化、メチル化、および編集などのプロセスによって改変されたＲＮＡ、ならびに例えば、メチル化、アセチル化、リン酸化、ユビキチン化、ＡＤＰ−リボシル化、ミリスチル化、およびグリコシル化によって改変されたタンパク質も含まれる。
【０７４３】
遺伝子発現の「モジュレーション」または「調節」は、遺伝子の活性における変化を指す。発現のモジュレーションには、遺伝子活性化および遺伝子抑制が含まれ得るが、これらに限定されない。
【０７４４】
「作動可能に連結された（ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ  ｌｉｎｋｅｄ）」またはその等価物（例えば、「作動可能的に連結された（ｌｉｎｋｅｄ  ｏｐｅｒａｔｉｖｅｌｙ）」）は、２つ以上の分子が、１つまたは両方の分子またはその組み合わせに起因する機能に影響を与えるために相互作用することができるように互いに配置されることを意味する。
【０７４５】
非共有結合的に連結された構成成分、ならびに非共有結合的に連結された構成成分を作製および使用する方法が、開示される。様々な構成成分は、本明細書に記載されるように、様々な異なる形態をとり得る。例えば、非共有結合的に連結された（すなわち、作動可能に連結された）タンパク質を使用して、当該技術分野における１つ以上の問題を回避する一時的な相互作用を可能にし得る。タンパク質などの非共有結合的に連結された成分が会合および解離する能力は、そのような会合が所望の活性に必要である状況下でのみ、またはそのような状況下で主に、機能的会合を可能にする。連結は、所望の効果を可能にするのに十分な持続時間のものであり得る。
【０７４６】
生物のゲノム中の特異的遺伝子座にタンパク質を指向させるための方法が、開示される。本方法は、ＤＮＡ局在化構成成分を提供するステップと、エフェクター分子を提供するステップと、を含み得、ＤＮＡ局在化構成成分およびエフェクター分子は、非共有結合的連結を介して作動可能に連結することが可能である。
【０７４７】
「ｓｃＦｖ」という用語は、一本鎖可変断片を指す。ｓｃＦｖは、リンカーペプチドで連結された、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）および軽鎖（ＶＬ）の可変領域の融合タンパク質である。このリンカーペプチドは、約５〜４０アミノ酸長または約１０〜３０アミノ酸長または約５、１０、１５、２０、２５、３０、３５、または４０アミノ酸長であり得る。一本鎖可変断片は、完全な抗体分子に見られる定常Ｆｃ領域を欠き、したがって、抗体を精製するために使用される一般的結合部位（例えば、プロテインＧ）を欠く。この用語は、細胞の細胞質において安定であって、細胞内タンパク質に結合し得る抗体、イントラボディ（ｉｎｔｒａｂｏｄｙ）であるｓｃＦｖをさらに含む。
【０７４８】
「単一ドメイン抗体」という用語は、特異的抗原に選択的に結合することができる単一の単量体可変抗体ドメインを有する抗体断片を意味する。単一ドメイン抗体は、重鎖抗体、または通常のＩｇＧの１つの可変ドメイン（ＶＨ）を含む約１１０アミノ酸の長さのペプチド鎖であり、一般に、抗原に対して全抗体と同様の親和性を有するが、より耐熱性であり、洗浄剤および高濃度の尿素に対してより安定である。例は、ラクダ科または魚類抗体に由来するものである。あるいは、単一ドメイン抗体は、４つの鎖を有する一般的なマウスまたはヒトＩｇＧから作製され得る。
【０７４９】
本明細書で使用される「特異的に結合する」および「特異的結合」という用語は、異なる抗原の均一な混合物中に存在する特定の抗原に優先的に結合する抗体、抗体断片、またはナノボディの能力を指す。ある特定の実施形態において、特異的結合相互作用は、サンプル中の望ましい抗原と望ましくない抗原とを識別する。ある特定の実施形態において、約１０倍〜１００倍以上（例えば、約１０００倍または１０，０００倍超）。「特異性」は、異なる抗原性標的と比べて１つの抗原性標的に優先的に結合する、免疫グロブリンまたは免疫グロブリン断片、例えばナノボディの能力を指すが、必ずしも高い親和性を含意しない。
【０７５０】
「標的部位」または「標的配列」は、結合のための十分条件が存在するという条件で、結合分子が結合する核酸の一部分を定義する核酸配列である。
【０７５１】
「核酸」または「オリゴヌクレオチド」または「ポリヌクレオチド」という用語は、一緒に共有結合的に連結した少なくとも２つのヌクレオチドを指す。一本鎖の描写はまた、相補鎖の配列も定義する。したがって、核酸はまた、描写される一本鎖の相補鎖も包含し得る。本開示の核酸はまた、同じ構造を保持するか、または同じタンパク質をコードする実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。
【０７５２】
本開示のプローブは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズすることができる一本鎖核酸を含み得る。したがって、本開示の核酸は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするプローブを指し得る。
【０７５３】
本開示の核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。本開示の核酸は、分子の大部分が一本鎖であるときでさえ、二本鎖配列を含有し得る。本開示の核酸は、分子の大部分が二本鎖であるときでさえ、一本鎖配列を含有し得る。本開示の核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらのハイブリッドを含み得る。本開示の核酸は、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの組み合わせを含有し得る。本開示の核酸は、ウラシル、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、イノシン、キサンチンヒポキサンチン、イソシトシン、およびイソグアニンを含む塩基の組み合わせを含有し得る。本開示の核酸は、非自然発生アミノ酸改変を含むように合成することができる。本開示の核酸は、化学合成法または組換え法によって得ることができる。
【０７５４】
本開示の核酸は、その配列全体またはその任意の一部分のいずれかが、非自然発生であり得る。本開示の核酸は、核酸配列全体を自然発生しないものにする、自然発生しない１つ以上の変異、置換、欠失、または挿入を含有し得る。本開示の核酸は、核酸配列全体を自然発生しないものにして、結果として生じるその配列が自然発生しない、１つ以上の重複配列、逆位配列、または反復配列を含有し得る。本開示の核酸は、核酸配列全体を自然発生しないものにする、自然発生しない改変ヌクレオチド、人工ヌクレオチド、または合成ヌクレオチドを含有し得る。
【０７５５】
遺伝コードにおける冗長性を考慮すると、複数のヌクレオチド配列は、いずれの特定のタンパク質をコードし得る。そのようなヌクレオチド配列はすべて、本明細書において企図されている。
【０７５６】
本開示全体において使用される場合、「作動可能に連結した」という用語は、空間的に接続しているプロモーターの制御下にある遺伝子の発現を指す。プロモーターは、その制御下にある遺伝子の５’（上流）または３’（下流）に位置し得る。プロモーターと遺伝子との間の距離は、そのプロモーターと、プロモーターが由来する遺伝子においてそれが制御する遺伝子との間の距離と、およそ同じであり得る。プロモーターと遺伝子との間の距離の変動は、プロモーター機能を損失させずに適応させることができる。
【０７５７】
本開示全体において使用される場合、「プロモーター」という用語は、細胞内の核酸の発現をもたらすか、活性化させるか、または向上させることが可能である、合成または天然由来の分子を指す。プロモーターは、発現をさらに向上させ、かつ／またはその空間的発現および／もしくは時間的発現を変更させる、１つ以上の特異的な転写調節配列を含み得る。プロモーターはまた、転写の開始部位から数千個ほどの塩基対分の位置にあり得る遠位のエンハンサーまたはリプレッサーエレメントを含むことができる。プロモーターは、ウイルス、細菌、真菌、植物、昆虫、および動物を含む供給源に由来し得る。プロモーターは、発現が生じる細胞、組織、もしくは臓器に関して、または発現が生じる発生段階に関して、または生理学的ストレス、病原体、金属イオン、もしくは誘導剤などの外的刺激に応答して、構成的または差次的に、遺伝子構成要素の発現を調節することができる。プロモーターの代表的な例には、バクテリオファージＴ７プロモーター、バクテリオファージＴ３プロモーター、ＳＰ６プロモーター、ｌａｃオペレータープロモーター、ｔａｃプロモーター、ＳＶ４０後期プロモーター、ＳＶ４０初期プロモーター、ＲＳＶ−ＬＴＲプロモーター、ＣＭＶ  ＩＥプロモーター、ＥＦ−１アルファプロモーター、ＣＡＧプロモーター、ＳＶ４０初期プロモーターまたはＳＶ４０後期プロモーター、およびＣＭＶ  ＩＥプロモーターが含まれる。
【０７５８】
本開示全体において使用される場合、「実質的に相補的な」という用語は、第１の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、もしくはそれよりも多くのヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、第２の配列の相補体と少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、もしくは９９％同一であること、または２つの配列がストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズすることを指す。
【０７５９】
本開示全体において使用される場合、「実質的に同一な」という用語は、第１および第２の配列が、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１８０、２７０、３６０、４５０、５４０、もしくはそれよりも多くのヌクレオチドもしくはアミノ酸の領域にわたって、または第１の配列が第２の配列の相補体に対して実質的に相補的である場合は核酸に関して、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、または９９％同一であることを指す。
【０７６０】
本開示全体において使用される場合、核酸を説明するために使用されるときの「バリアント」という用語は、（ｉ）参照されるヌクレオチド配列の一部分もしくは断片、（ｉｉ）参照されるヌクレオチド配列もしくはその一部分の相補体、（ｉｉｉ）参照される核酸もしくはその相補体と実質的に同一である核酸、または（ｉｖ）参照される核酸、その相補体、もしくはそれと実質的に同一な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする核酸を指す。
【０７６１】
本開示全体において使用される場合、「ベクター」という用語は、複製起点を含有する核酸配列を指す。ベクターは、ウイルスベクター、バクテリオファージ、細菌人工染色体、または酵母人工染色体であり得る。ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡベクターであり得る。ベクターは、自己複製染色体外ベクターであり得、好ましくは、ＤＮＡプラスミドである。ベクターは、ＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、またはＤＮＡおよびＲＮＡ配列の両方との、アミノ酸の組み合わせを含み得る。
【０７６２】
本開示全体において使用される場合、ペプチドまたはポリペプチドを説明するために使用されるときの「バリアント」という用語は、アミノ酸の挿入、欠失、または保存的置換によってアミノ酸配列が異なるが、少なくとも１つの生物学的活性を保持するペプチドまたはポリペプチドを指す。バリアントはまた、少なくとも１つの生物学的活性を保持するアミノ酸配列を有する参照されるタンパク質と実質的に同一であるアミノ酸配列を有するタンパク質も意味し得る。
【０７６３】
アミノ酸の保存的置換、すなわち、アミノ酸を、類似の特性（例えば、親水性、荷電領域の程度および分布）の異なるアミノ酸で置き換えることは、当該技術分野において、典型的にわずかな変化を伴うものとして認識される。これらのわずかな変化は、当該技術分野において理解されるように、部分的には、アミノ酸のヒドロパシー指数を考慮に入れることにより同定することができる。Ｋｙｔｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１５７：１０５−１３２（１９８２）。アミノ酸のハイドロパシー指数は、その疎水性および荷電の検討事項に基づく。類似のヒドロパシー指数のアミノ酸は、置換しても、タンパク質機能を保持することができる。一態様において、±２のハイドロパシー指数を有するアミノ酸が、置換される。生物学的機能を保持するタンパク質をもたらし得る置換を明らかにするためには、アミノ酸の親水性を使用することもできる。ペプチドの文脈におけるアミノ酸の親水性の検討事項は、抗原性および免疫原性とよい相関があると報告されている有用な指標である、そのペプチドの最大局所平均親水性の計算を可能にする。参照により本明細書に完全に組み込まれる、米国特許第４，５５４，１０１号。
【０７６４】
類似の親水性値を有するアミノ酸の置換は、生物学的活性、例えば免疫原性を保持するペプチドをもたらし得る。置換は、互いの±２以内の親水性値を有するアミノ酸を用いて行うことができる。アミノ酸の疎水性（ｈｙｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ）指数および親水性値はいずれも、そのアミノ酸の特定の側鎖に影響される。その観察と一致して、生物学的機能と適合性があるアミノ酸置換は、疎水性、親水性、荷電、サイズ、および他の特性により明らかにされる、アミノ酸の相対的類似性、特にこれらのアミノ酸の側鎖に依存すると理解される。
【０７６５】
本明細書で使用される場合、「保存的」アミノ酸置換は、以下の表Ａ、Ｂ、またはＣに示されるように定義され得る。いくつかの実施形態において、融合ポリペプチドおよび／またはそのような融合ポリペプチドをコードする核酸は、本開示のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの改変によって導入された保存的置換を含む。アミノ酸は、物理的特性、ならびに二次および三次タンパク質構造への寄与によって分類することができる。保存的置換は、１つのアミノ酸の、類似の特性を有する別のアミノ酸への置換である。例示的な保存的置換を表Ａに示す。
【０７６６】
【表１５】
2021536249.tif 000351
【０７６７】
あるいは、保存的アミノ酸は、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、（Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ；Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ．ＮＹ，Ｎ．Ｙ．（１９７５），ｐｐ．７１−７７）に記述されているように、表Ｂに記載のようにグループ分けすることができる。
【０７６８】
【表１６】
2021536249.tif 000352
【０７６９】
あるいは、例示的な保存的置換を表Ｃに示す。
【０７７０】
【表１７】
2021536249.tif 000353
【０７７１】
本開示のポリペプチドは、アミノ酸残基の１つ以上の挿入、欠失、もしくは置換、またはそれらの任意の組み合わせ、ならびにアミノ酸残基の挿入、欠失、または置換以外の改変を保有するポリペプチドを含むように意図されることを理解されたい。本開示のポリペプチドまたは核酸は、１つ以上の保存的置換を含有し得る。
【０７７２】
本開示全体において使用される場合、前述のアミノ酸置換の「１つより多く」という用語は、列挙されたアミノ酸置換の２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、もしくは２０個、またはそれよりも多くを指す。「１つより多く」という用語は、列挙されたアミノ酸置換の２個、３個、４個、または５個を指し得る。
【０７７３】
本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、それらの配列全体、またはその任意の一部分のいずれは、自然発生し得ない。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸配列全体を自然発生しないものにする、自然発生しない１つ以上の変異、置換、欠失、または挿入を含有し得る。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸配列全体を自然発生しないものにして、その結果として生じる配列が自然発生しない、１つ以上の重複配列、逆位配列、または反復配列を含有し得る。本開示のポリペプチドおよびタンパク質は、アミノ酸配列全体を自然発生しないものにする、自然発生しない改変アミノ酸、人工アミノ酸、または合成アミノ酸を含有し得る。
【０７７４】
本開示全体において使用されるように、「配列同一性」は、デフォルトパラメータを使用し、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ  （ＮＣＢＩ）ｆｔｐサイトから検索することができる、２つの配列をブラストするためのスタンドアロンで実行可能なＢＬＡＳＴエンジンプログラム（ｂｌ２ｓｅｑ）を使用することによって決定することができる（Ｔａｔｕｓｏｖａ  ａｎｄ  Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ  Ｌｅｔｔ．，１９９９，１７４，２４７−２５０；参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。２つ以上の核酸またはポリペプチド配列の文脈において使用されるときの「同一な」または「同一性」という用語は、各々の配列の特定された領域にわたって同じである残基の特定のパーセンテージ（ｓｐｅｃｉｆｉｅｄ  ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ）を指す。このパーセンテージは、２つの配列を最適にアラインし、特定された領域にわたって２つの配列を比較し、両方の配列において同一の残基が存在する位置の数を判定し、マッチした位置の数を得て、マッチした位置の数を特定された領域内の位置の総数で除し、結果に１００を乗じて配列同一性のパーセンテージを得ることによって計算することができる。２つの配列の長さが異なるか、またはアライメントが１つ以上の付着末端（ｓｔａｇｇｅｒｅｄ  ｅｎｄ）をもたらし、比較の特定された領域が単一の配列しか含まない場合、単一の配列の残基は、計算の分子ではなく分母内に含まれる。ＤＮＡおよびＲＮＡを比較するとき、チミン（Ｔ）およびウラシル（Ｕ）は、均等物と考えることができる。同一性は、手動で行うこともでき、ＢＬＡＳＴまたはＢＬＡＳＴ２．０などのコンピュータ配列アルゴリズムを使用することによって行うこともできる。
【０７７５】
本開示全体において使用される場合、「内因性」という用語は、標的遺伝子またはそれが導入される宿主細胞と天然に関連する核酸またはタンパク質配列を指す。
【０７７６】
本開示全体において使用される場合、「外因性」という用語は、自然発生核酸の非自然発生複数のコピー、例えば、ＤＮＡ配列、または非自然発生ゲノム位置に位置する自然発生核酸配列を含む、それが導入される標的遺伝子または宿主細胞に天然に関連しない核酸またはタンパク質配列を指す。
【０７７７】
本開示は、ＤＮＡ配列を含むポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入する方法を提供する。「導入すること」とは、構築物が宿主細胞の内部にアクセスする様式で、ポリヌクレオチド構築物を植物に提示することを意図している。本開示の方法は、ポリヌクレオチド構築物を宿主細胞に導入するための特定の方法に依存せず、ポリヌクレオチド構築物が宿主の１つの細胞の内部へのアクセスすることのみに依存する。ポリヌクレオチド構築物を細菌、植物、真菌、および動物に導入するための方法は、安定した形質転換法、一過性の形質転換法、およびウイルス媒介法を含むが、これらに限定されない、当該技術分野で既知である。
【０７７８】
相同組換え
本開示の方法のある特定の実施形態において、本開示の改変されたＣＡＲ−ＴSCMまたはＣＡＲ−ＴCMは、相同組換えによって本開示の初代ヒトＴ細胞に抗原受容体を導入することによって生成される。本開示のある特定の実施形態において、相同組換えは、本開示のゲノム編集組成物または構築物によって誘導される一本鎖または二本鎖切断によって誘導される。本開示の相同組換え法は、ゲノム編集組成物または本開示の構築物をゲノム配列に接触させて、配列に少なくとも１つの切断を誘導し、外因性ドナー配列組成物のゲノム配列にエントリーポイントを提供することを含む。本開示のドナー配列組成物は、細胞の天然のＤＮＡ修復機構によって誘導されたエントリーポイントでゲノム配列に組み込まれる。
【０７７９】
本開示の方法のある特定の実施形態において、相同組換えは、本開示の抗原受容体をコードする配列および／またはドナー配列組成物を「ゲノムセーフハーバー」部位に導入する。ある特定の実施形態において、哺乳動物ゲノム配列は、ゲノムセーフハーバー部位を含む。ある特定の実施形態において、霊長類ゲノム配列は、ゲノムセーフハーバー部位を含む。ある特定の実施形態において、ヒトゲノム配列は、ゲノムセーフハーバー部位を含む。
【０７８０】
ゲノムセーフハーバー部位は、新しい遺伝子材料の組み込みを、新しく挿入された遺伝子エレメントが確実に機能し（例えば、治療的に有効な発現のレベルで発現し）、かつ、宿主生物体に対するリスクを引き起こすような宿主ゲノムに対する有害な変更が引き起こされないことを確実にする様式で適応させることができる。潜在的なゲノムセーフハーバーには、ヒトアルブミン遺伝子、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、染色体１９上に自然発生するＡＡＶウイルスの組み込み部位、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子の部位、およびマウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログの部位のイントロン配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０７８１】
本開示の方法のある特定の実施形態において、相同組換えは、本開示の抗原受容体をコードする配列および／またはドナー配列組成物を、内因性Ｔ細胞受容体または主要組織性適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のうちの１つ以上の構成成分をコードする配列に導入する。ある特定の実施形態において、内因性Ｔ細胞受容体またはＭＨＣをコードするゲノム配列内で相同組換えを誘導することは、内因性遺伝子を破壊し、および任意選択で、内因性遺伝子のコード配列の一部分を本開示のドナー配列組成物で置き換える。ある特定の実施形態において、内因性Ｔ細胞受容体またはＭＨＣをコードするゲノム配列内で相同組換えを誘導することは、内因性遺伝子を破壊し、および任意選択で、内因性遺伝子のコード配列全体を本開示のドナー配列組成物で置き換える。本開示の方法のある特定の実施形態において、本開示の抗原受容体またはドナー配列組成物をコードする配列の相同組換えによる導入は、抗原受容体を内因性Ｔ細胞プロモーターに作動可能に連結する。本開示の方法のある特定の実施形態において、本開示の抗原受容体またはドナー配列組成物をコードする配列の相同組換えによる導入は、抗原受容体または治療用タンパク質を転写または翻訳調節エレメントに作動可能に連結する。本開示の方法のある特定の実施形態において、本開示の抗原受容体またはドナー配列組成物をコードする配列の相同組換えによる導入は、抗原受容体または治療用タンパク質を転写調節エレメントに作動可能に連結する。ある特定の実施形態において、転写調節エレメントは、内因性Ｔ細胞５’ＵＴＲを含む。
【０７８２】
相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物を、複数のＴ細胞のうちの少なくとも１つの初代Ｔ細胞のゲノム配列と接触させる。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物を、複数のＴ細胞の初代Ｔ細胞の一部のゲノム配列と接触させる。ある特定の実施形態において、初代Ｔ細胞の一部は、複数のＴ細胞内の初代Ｔ細胞の総数の少なくとも１％、２％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９９％、またはその間の任意のパーセンテージである。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物を、複数のＴ細胞の各初代Ｔ細胞のゲノム配列と接触させる。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物により、一本鎖切断が誘導される。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物により、二本鎖切断が誘導される。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、導入ステップは、ドナー配列組成物をさらに含む。ある特定の実施形態において、ドナー配列組成物は、抗原受容体をコードする配列を含む。ある特定の実施形態において、ドナー配列組成物は、抗原受容体をコードする配列、５’ゲノム配列および３’ゲノム配列を含み、５’ゲノム配列は、ゲノム編集組成物によって誘導される切断点に対して５’側にある、初代Ｔ細胞のゲノム配列と相同または同一であり、３’ゲノム配列は、ゲノム編集組成物によって誘導される切断点に対して３’側にある、初代Ｔ細胞のゲノム配列と相同または同一である。ある特定の実施形態において、５’ゲノム配列および／または３’ゲノム配列は、少なくとも５０ｂｐ、１００ｂｐ、少なくとも２００ｂｐ、少なくとも３００ｂｐ、少なくとも４００ｂｐ、少なくとも５００ｂｐ、少なくとも６００ｂｐ、少なくとも７００ｂｐ、少なくとも８００ｂｐ、少なくとも９００ｂｐ、少なくとも１０００ｂｐ、少なくとも１１００ｂｐ、少なくとも１２００ｂｐ、少なくとも１３００ｂｐ、少なくとも１４００、または少なくとも１５００ｂｐ、少なくとも１６００ｂｐ、少なくとも１７００ｂｐ、少なくとも１８００ｂｐ、少なくとも１９００ｂｐ、少なくとも２０００ｂｐの長さまたはエンドポイントを含めたその間の任意の長さの塩基対（ｂｐ）を含む。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物およびドナー配列組成物を、ゲノム配列と同時にまたは逐次的に接触させる。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物およびドナー配列組成物を、ゲノム配列と逐次的に接触させ、ゲノム編集組成物を最初にもたらす。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ＤＮＡ結合ドメインをコードする配列およびヌクレアーゼドメインをコードする配列を含む。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＴＡＬＥＮのＤＮＡ結合ドメインを含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインは、ＺＦＮのＤＮＡ結合ドメインを含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、Ｃａｓ９ヌクレアーゼまたはその配列を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、不活性なＣａｓ９（配列番号１７００９、１０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）からアラニン（Ａ）の置換（Ｄ１０Ａ）および８４０位におけるヒスチジン（Ｈ）からアラニン（Ａ）の置換（Ｈ８４０Ａ）を含む）を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、短い不活性なＣａｓ９（配列番号１７００８、１０位におけるアスパラギン酸（Ｄ）からアラニン（Ａ）の置換（Ｄ１０Ａ）および５４０位におけるアスパラギン（Ｎ）からアラニン（Ａ）の置換（Ｎ５４０Ａ）を含む）を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むか、またはそれをさらに含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態において、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩ、またはＣｌｏ０５１を含む。ある特定の実施形態において、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、Ｃｌｏ０５１を含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ＴＡＬＥＮまたはそのヌクレアーゼドメインを含むか、またはそれをさらに含む。ゲノム編集組成物のある特定の実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ＺＦＮまたはそのヌクレアーゼドメインを含むか、またはそれをさらに含む。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物は、ゲノム配列の切断を誘導し、初代Ｔ細胞の内因性ＤＮＡ修復機構を使用してドナー配列組成物を挿入する。相同組換えを含む導入ステップのある特定の実施形態において、ドナー配列組成物の挿入は、ゲノム編集組成物のＤＮＡ結合部位を排除し、それにより、ゲノム編集組成物のさらなる活性を妨げる。
【０７８３】
本開示の相同組換えの方法のある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物または構築物のヌクレアーゼドメインは、初代ヒトＴ細胞のゲノム配列内の定義された場所に切断を導入することができ、さらに、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。ある特定の実施形態において、ヌクレアーゼは、エンドヌクレアーゼである。ホモ二量体またはヘテロ二量体を含むようなエフェクター分子を含むエフェクター分子は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ９ヌクレアーゼドメイン、またはそれらの断片を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。ある特定の実施形態において、Ｃａｓ９は、触媒的に不活性なまたは「不活性化」Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）である。ある特定の実施形態において、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９の触媒的に不活性なまたは「不活性化」ヌクレアーゼドメインである。ある特定の実施形態において、ｄＣａｓ９は、本明細書において「小さな」ｄＣａｓ９またはｄＳａＣａｓ９と称される、全長の触媒的に不活性化されたＣａｓ９に由来するより短い配列によってコードされる。
【０７８４】
ある特定の実施形態において、不活化された小さなＣａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）は、活性ヌクレアーゼに作動可能に連結されている。ある特定の実施形態において、本開示は、ＤＮＡ結合ドメインおよび分子ヌクレアーゼを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなる融合タンパク質を提供し、このヌクレアーゼは、小さな不活化Ｃａｓ９（ｄＳａＣａｓ９）を含む。ある特定の実施形態において、本開示のｄＳａＣａｓ９は、触媒部位を不活性化する突然変異Ｄ１０ＡおよびＮ５８０Ａ（下線が引かれており、太字になっている）を含む。ある特定の実施形態において、本開示のｄＳａＣａｓ９は、以下のアミノ酸配列を含む。
【化１７８】
2021536249.tif 000354
【０７８５】
ある特定の実施形態において、本開示のｄＣａｓ９は、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ  ｐｙｏｇｅｎｅｓから単離されるか、またはそれに由来するｄＣａｓ９を含む。ある特定の実施形態において、ｄＣａｓ９は、触媒部位を不活性化するｄＣａｓ９のアミノ酸配列の１０位および８４０位での置換を有するｄＣａｓ９を含む。ある特定の実施形態において、これらの置換は、Ｄ１０ＡおよびＨ８４０Ａである。ある特定の実施形態において、ｄＣａｓ９のアミノ酸配列は、以下の配列を含む。
【化１７９】
2021536249.tif 000355
【０７８６】
本開示のある特定の実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ｄＣａｓ９またはｄＳａＣａｓ９およびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。本開示のある特定の実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ｄＳａＣａｓ９、および、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩ、またはＣｌｏ０５１を含むが、これらに限定されない、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼを含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。本開示のある特定の実施形態において、ヌクレアーゼドメインは、ｄＳａＣａｓ９およびＣｌｏ０５１を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。例示的なＣｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインは、以下のアミノ酸を含むか、本質的にそれらからなるか、またはそれらからなり得る。ＥＧＩＫＳＮＩＳＬＬＫＤＥＬＲＧＱＩＳＨＩＳＨＥＹＬＳＬＩＤＬＡＦＤＳＫＱＮＲＬＦＥＭＫＶＬＥＬＬＶＮＥＹＧＦＫＧＲＨＬＧＧＳＲＫＰＤＧＩＶＹＳＴＴＬＥＤＮＦＧＩＩＶＤＴＫＡＹＳＥＧＹＳＬＰＩＳＱＡＤＥＭＥＲＹＶＲＥＮＳＮＲＤＥＥＶＮＰＮＫＷＷＥＮＦＳＥＥＶＫＫＹＹＦＶＦＩＳＧＳＦＫＧＫＦＥＥＱＬＲＲＬＳＭＴＴＧＶＮＧＳＡＶＮＶＶＮＬＬＬＧＡＥＫＩＲＳＧＥＭＴＩＥＥＬＥＲＡＭＦＮＮＳＥＦＩＬＫＹ（配列番号１７０１０）。
【０７８７】
例示的なｄＣａｓ９−Ｃｌｏ０５１ヌクレアーゼドメインは、（Ｃｌｏ０５１配列は下線が引かれ、リンカーは太字イタリック体、ｄＣａｓ９配列はイタリック体）のアミノ酸配列を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれらからなり得る。
【化１８０】
2021536249.tif 000356
【０７８８】
ある特定の実施形態において、初代ヒトＴ細胞のゲノムＤＮＡ内の定義された場所に切断を導入することができるヌクレアーゼは、ホモ二量体またはヘテロ二量体を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。本開示のゲノム編集組成物または構築物のヌクレアーゼドメインは、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）から単離されるか、それに由来するか、またはそれから組換えられたヌクレアーゼドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。ＴＡＬＥＮは、所定のＤＮＡ配列または個々の核酸に結合するデザイナータンパク質を創出する手段をもたらすプログラム可能なＤＮＡ結合性ドメインを有する転写因子である。転写活性化因子様（ＴＡＬ）タンパク質、または、より具体的には、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）においてモジュラーＤＮＡ結合性ドメインが同定されており、それにより、目的のＤＮＡ配列に結合する合成転写因子の新規創出が可能になり、望ましい場合には、タンパク質またはポリペプチド上に存在する第２のドメインがＤＮＡに関連する活性を行うことも可能になる。ＴＡＬタンパク質は、生物ＸａｎｔｈｏｍｏｎａｓおよびＲａｌｓｔｏｎｉａに由来している。
【０７８９】
本開示のある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物または構築物のヌクレアーゼドメインは、ＴＡＬＥＮおよびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼから単離されるか、それに由来するか、またはそれから組換えられたヌクレアーゼドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。本開示のある特定の実施形態において、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩ、またはＣｌｏ０５１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。本開示のある特定の実施形態において、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、Ｃｌｏ０５１（配列番号１７０１０）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【０７９０】
本開示のある特定の実施形態において、ゲノム編集組成物または構築物のヌクレアーゼドメインは、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）およびＩＩＳ型エンドヌクレアーゼから単離されるか、それに由来するか、またはそれから組換えられたヌクレアーゼドメインを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。本開示のある特定の実施形態において、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、ＡｃｉＩ、Ｍｎ１Ｉ、ＡｌｗＩ、ＢｂｖＩ、ＢｃｃＩ、ＢｃｅＡＩ、ＢｓｍＡＩ、ＢｓｍＦＩ、ＢｓｐＣＮＩ、ＢｓｒＩ、ＢｔｓＣＩ、ＨｇａＩ、ＨｐｈＩ、ＨｐｙＡＶ、Ｍｂｏ１Ｉ、Ｍｙ１Ｉ、ＰｌｅＩ、ＳｆａＮＩ、ＡｃｕＩ、ＢｃｉＶＩ、ＢｆｕＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｒＩ、ＢｐｍＩ、ＢｐｕＥＩ、ＢｓａＩ、ＢｓｅＲＩ、ＢｓｇＩ、ＢｓｍＩ、ＢｓｐＭＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｒＤＩ、ＢｔｇＺＩ、ＢｔｓＩ、ＥａｒＩ、ＥｃｉＩ、ＭｍｅＩ、ＮｍｅＡＩＩＩ、ＢｂｖＣＩ、Ｂｐｕ１０Ｉ、ＢｓｐＱＩ、ＳａｐＩ、ＢａｅＩ、ＢｓａＸＩ、ＣｓｐＣＩ、ＢｆｉＩ、ＭｂｏＩＩ、Ａｃｃ３６Ｉ、ＦｏｋＩ、またはＣｌｏ０５１を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。本開示のある特定の実施形態において、ＩＩＳ型エンドヌクレアーゼは、Ｃｌｏ０５１（配列番号１７０１０）を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなり得る。
【０７９１】
本開示のゲノム編集組成物または構築物のある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインは、共有結合的に連結され得る。例えば、融合タンパク質は、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインを含み得る。本開示のゲノム編集組成物または構築物のある特定の実施形態において、ＤＮＡ結合ドメインおよびヌクレアーゼドメインは、非共有結合性の連結を介して作動可能に連結され得る。
【０７９２】
非転位ベースの改変方法
本開示の方法のいくつかの実施形態において、本開示の改変されたＨＳＣまたは改変されたＨＳＣ子孫細胞は、導入遺伝子を本開示のＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞に導入することによって生成され得る。導入ステップは、非転位送達システムを介した核酸配列および／またはゲノム編集構築物の送達を含み得る。
【０７９３】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、核酸配列および／またはゲノム編集構築物を、エクスビボ、インビボ、インビトロ、またはインサイチュでＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞に導入することは、局所送達、吸着、吸収、エレクトロポレーション、スピンフェクション、共培養、トランスフェクション、機械的送達、音波送達、振動送達、磁気フェクション、またはナノ粒子を媒介した送達による、のうちの１つ以上を含む。本開示の方法のいくつかの実施形態において、核酸配列および／またはゲノム編集構築物を、エクスビボ、インビボ、インビトロ、またはインサイチュでＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞に導入することは、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション、およびデンドリマーを媒介したトランスフェクションを含む。本開示の方法のいくつかの実施形態において、核酸配列および／またはゲノム編集構築物を、機械的トランスフェクションによるエクスビボ、インビボ、インビトロ、またはインサイチュでＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞に導入することは、細胞圧搾、細胞衝撃、または遺伝子銃技術を含む。本開示の方法のいくつかの実施形態において、核酸配列および／またはゲノム編集構築物を、ナノ粒子を媒介したトランスフェクションによるエクスビボ、インビボ、インビトロ、またはインサイチュでＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞に導入することは、リポソーム送達、ミセルによる送達、およびポリメロソーム（ｐｏｌｙｍｅｒｏｓｏｍｅ）による送達を含む。
【０７９４】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、核酸配列および／またはゲノム編集構築物を、エクスビボ、インビボ、インビトロ、またはインサイチュでＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞に導入することは、非ウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、非ウイルスベクターは、核酸を含む。いくつかの実施形態において、非ウイルスベクターは、プラスミドＤＮＡ、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ（商標）ＤＮＡ、ナノプラスミド、ミニサークルＤＮＡ、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、ＤＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、および二本鎖ｍＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）を含む。いくつかの実施形態において、非ウイルスベクターは、本開示のトランスポゾンを含む。
【０７９５】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、核酸配列および／またはゲノム編集構築物を、エクスビボ、インビボ、インビトロ、またはインサイチュでＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞に導入することは、ウイルスベクターを含む。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、非組み込み非染色体ベクターである。例示的な非組み込み非染色体ベクターには、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、およびヘルペスウイルスが含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、ウイルスベクターは、組み込み染色体ベクターである。組み込み染色体ベクターには、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルス、およびガンマレトロウイルスが含まれるが、これらに限定されない。
【０７９６】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、核酸配列および／またはゲノム編集構築物を、エクスビボ、インビボ、インビトロ、またはインサイチュでＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞に導入することは、ベクターの組み合わせを含む。例示的な非限定的なベクターの組み合わせには、ウイルスおよび非ウイルスベクター、複数の非ウイルスベクター、または複数のウイルスベクターが含まれる。例示的であるが非限定的なベクターの組み合わせには、ＤＮＡ由来およびＲＮＡ由来のベクターの組み合わせ、ＲＮＡおよび逆転写酵素の組み合わせ、トランスポゾンおよびトランスポザーゼの組み合わせ、非ウイルスベクターおよびエンドヌクレアーゼの組み合わせ、ならびにウイルスベクターおよびエンドヌクレアーゼの組み合わせが含まれる。
【０７９７】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、核酸配列および／またはゲノム編集構築物を、エクスビボ、インビボ、インビトロ、またはインサイチュでＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞に導入することを含むゲノム改変は、核酸配列を安定的に組み込むか、核酸配列を一時的に組み込むか、核酸配列の部位特異的組み込みを生成するか、または核酸配列の偏った組み込みを生成する。いくつかの実施形態において、核酸配列は、導入遺伝子である。
【０７９８】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、核酸配列および／またはゲノム編集構築物を、エクスビボ、インビボ、インビトロ、またはインサイチュでＨＳＣまたはＨＳＣ子孫細胞に導入することを含むゲノム改変は、核酸配列を安定的に組み込む。いくつかの実施形態において、安定した染色体組み込みは、ランダム組み込み、部位特異的組み込み、または偏った組み込みであり得る。いくつかの実施形態において、部位特異的組み込みは、非支援または支援され得る。いくつかの実施形態において、支援された部位特異的組み込みは、部位特異的ヌクレアーゼとともに同時送達される。いくつかの実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム組み込み部位の上流および下流領域に対するパーセンテージの相同性を含む５’および３’ヌクレオチド配列伸長を有する導入遺伝子を含む。いくつかの実施形態において、相同性ヌクレオチド伸長を有する導入遺伝子は、相同組換え、マイクロホモロジー媒介末端結合、または非相同末端結合によるゲノム組み込みを可能にする。いくつかの実施形態において、部位特異的組み込みは、セーフハーバー部位で行われる。ゲノムセーフハーバー部位は、新しい遺伝子材料の組み込みを、新しく挿入された遺伝子エレメントが確実に機能し（例えば、治療的に有効な発現のレベルで発現し）、かつ、宿主生物体に対するリスクを引き起こすような宿主ゲノムに対する有害な変更が引き起こされないことを確実にする様式で適応させることができる。潜在的なゲノムセーフハーバーには、ヒトアルブミン遺伝子、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、染色体１９上に自然発生するＡＡＶウイルスの組み込み部位、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子の部位、およびマウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログの部位のイントロン配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０７９９】
いくつかの実施形態において、部位特異的導入遺伝子の組み込みは、標的遺伝子の発現を破壊する部位で起こる。いくつかの実施形態において、標的遺伝子発現の破壊は、イントロン、エクソン、プロモーター、遺伝的エレメント、エンハンサー、サプレッサー、開始コドン、停止コドン、および応答エレメントにおける部位特異的組み込みによって起こる。いくつかの実施形態において、部位特異的組み込みによって標的化される例示的な標的遺伝子には、ＴＲＡＣ、ＴＲＡＢ、ＰＤＩ、任意の免疫抑制遺伝子、および同種拒絶に関与する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０８００】
いくつかの実施形態において、部位特異的導入遺伝子の組み込みは、標的遺伝子の発現の増強をもたらす部位で起こる。いくつかの実施形態において、標的遺伝子発現の増強は、イントロン、エクソン、プロモーター、遺伝的エレメント、エンハンサー、サプレッサー、開始コドン、停止コドン、および応答エレメントにおける部位特異的組み込みによって起こる。
【０８０１】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、酵素を使用して、宿主ゲノムに鎖切断を作成し、導入遺伝子の送達または組み込みを容易にすることができる。いくつかの実施形態において、酵素は、一本鎖切断を作り出す。いくつかの実施形態において、酵素は、二本鎖切断を作り出す。いくつかの実施形態において、切断誘導酵素の例には、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲ（商標）、およびＣＰＦ１が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、切断誘導酵素は、ＤＮＡにコードされ、ｍＲＮＡにコードされ、タンパク質として、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）との核タンパク質複合体として、細胞に送達され得る。
【０８０２】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、部位特異的導入遺伝子の組み込みは、ベクター媒介性組み込み部位バイアスによって制御される。いくつかの実施形態において、ベクター媒介性組み込み部位バイアスは、選択されたレンチウイルスベクターによって制御される。いくつかの実施形態において、ベクター媒介性組み込み部位バイアスは、選択されたガンマレトロウイルスベクターによって制御される。
【０８０３】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、部位特異的導入遺伝子組み込み部位は、不安定な染色体挿入である。いくつかの実施形態において、組み込まれた導入遺伝子は、サイレンシングされるか、除去されるか、切除されるか、またはさらに改変され得る。
【０８０４】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な組み込みである。いくつかの実施形態において、不安定な組み込みは、一時的な非染色体組み込み、半安定な非染色体組み込み、半持続的な非染色体挿入、または非安定な染色体挿入であり得る。いくつかの実施形態において、一時的な非染色体挿入は、エピ染色体または細胞質であり得る。
【０８０５】
いくつかの実施形態において、導入遺伝子の一時的な非染色体挿入は、染色体に組み込まれず、改変された遺伝物質は、細胞分裂中に複製されない。
【０８０６】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、ゲノム改変は、導入遺伝子の半安定なまたは持続的な非染色体組み込みである。いくつかの実施形態において、ＤＮＡベクターは、分裂細胞中の核における自己複製を可能にする非ウイルスベクターのエピソーム保持のために核マトリックスタンパク質に結合する足場／マトリックス結合領域（Ｓ−ＭＡＲ）モジュールをコードする。
【０８０７】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な染色体組み込みである。いくつかの実施形態において、組み込まれた導入遺伝子は、サイレンシングされるか、除去されるか、切除されるか、またはさらに改変され得る。
【０８０８】
本開示の方法のいくつかの実施形態において、導入遺伝子挿入によるゲノムへの改変は、相同組換え（ＨＲ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）、トランスポザーゼ酵素媒介改変、インテグラーゼ酵素媒介改変、エンドヌクレアーゼ酵素媒介改変、または組換え酵素媒介改変による宿主細胞指向二本鎖切断の修復（相同性指向修復）を介して起こり得る。いくつかの実施形態において、導入遺伝子挿入によるゲノムへの改変は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲ、およびｃｐｆ１を介して起こり得る。
【０８０９】
ナノ粒子の送達
ポリ（ヒスチジン）（すなわち、ポリ（Ｌ−ヒスチジン））は、不飽和窒素上に電子孤立電子対を提供するイミダゾール環のため、ｐＨ感受性ポリマーである。つまり、ポリ（ヒスチジン）は、プロトン化−脱プロトン化による両性の特性を有する。様々な実施形態は、ポリ（ヒスチジン）ベースのミセルと複合体を形成することによって、遺伝子編集ツールの細胞内送達を可能にする。特に、様々な実施形態は、親水性ブロック、疎水性ブロック、および荷電ブロックからなるトリブロックコポリマーを提供する。いくつかの実施形態において、親水性ブロックは、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）であり得、荷電ブロックは、ポリ（Ｌ−ヒスチジン）であり得る。様々な実施形態で使用することができる例示的なトリブロックコポリマーは、ＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡ−ｂ−ＰＨＩＳであり、各ブロック内の可変数の反復単位は、設計によって異なる。遺伝子編集ツールは、様々な細胞内の遺伝子を改変、修復、追加、および／またはサイレンシングすることができると認識されている様々な分子であり得る。ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）の正確かつ効率的な修復は、細胞においてゲノム安定性を維持するために重要である。ＤＮＡへの構造的損傷は、多くの細胞内因子（例えば、ヌクレアーゼ、活性酸素種など）、ならびに外力（例えば、電離放射線、紫外線（ＵＶ）放射線など）のいずれかのために、ゲノム内でランダムかつ予測不可能に起こり得る。特に、ＤＮＡにおける二本鎖切断（ＤＳＢ）の正確かつ効率的な修復は、ゲノム安定性を維持するために重要である。したがって、細胞は自然にいくつかのＤＮＡ修復機構を保有し、これは特異的部位で制御されたＤＳＢを通してＤＮＡ配列を変えるために活用することができる。したがって、遺伝子改変ツールは、ゲノムにＤＳＢを導入する、非特異的ＤＮＡヌクレアーゼを伴うプログラム可能な配列特異的ＤＮＡ結合モジュールからなることができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲは、ほとんどが細菌で発見され、短い直接反復を含有する座であり、外因性配列、例えばプラスミドおよびファージに対する抵抗性を与える、原核生物獲得免疫システムの部分である。ＲＮＡ誘導型エンドヌクレアーゼは、原核生物の先天性免疫の構成成分であるＣＲＩＳＰＲ／ＣＲＩＳＰＲ関連タンパク質９（Ｃａｓ９）システムから適合されたプログラム可能な遺伝子工学ツールである。
【０８１０】
実施形態ミセルのトリブロックコポリマーを作製するための中間体として使用することができるジブロックコポリマーは、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）（ＰＬＧＡ）、ポリ（ε−カプロラクトン）（ＰＣＬ）、およびポリ（トリメチレンカーボネート）（ＰＴＭＣ）が含まれるが、これらに限定されない、様々な疎水性脂肪族ポリ（無水物）、ポリ（核酸）、ポリ（エステル）、ポリ（オルトエステル）、ポリ（ペプチド）、ポリ（ホスファゼン）、およびポリ（単糖類）に結合したＰＥＧと化学的に同義である、親水性生体適合性ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）を有し得る。１００％ＰＥＧ化表面からなるポリマーミセルは、改善されたインビトロでの化学的安定性、増強されたインビボでのバイオアベイラビリティ、および延長された血液循環半減期を有する。例えば、ポリマーミセルの膜部分を構成する脂肪族ポリエステルは、生理学的条件下で、例えばヒト体内で、それらのエステル結合の加水分解により分解される。それらの生分解性の性質のために、脂肪族ポリエステルは、薬物送達デバイスにおける移植可能な生体材料、生体再吸収可能な縫合糸、癒着防止剤として、および組織工学による傷害修復のための足場としての使用について多くの注目を集めている。
【０８１１】
様々な実施形態において、遺伝子編集に必要とされる分子（すなわち、遺伝子編集ツール）は、ポリ（ヒスチジン）を含む自己組織化トリブロックコポリマーから形成された１つ以上のミセルを使用して細胞に送達され得る。本明細書で使用される「遺伝子編集」という用語は、遺伝子によってコードされる産物の機能を付加、破壊、または改変するための、ゲノムＤＮＡ内の核酸の挿入、欠失、または置換を指す。様々な遺伝子編集システムは、最低限、ゲノムＤＮＡを切断して遺伝子機能を破壊または活性化する切断酵素（例えば、ヌクレアーゼまたはリコンビナーゼ）の導入を必要とする。
【０８１２】
さらに、新規または既存のヌクレオチド／核酸の挿入に関する遺伝子編集システムでは、挿入ツール（例えば、ＤＮＡ鋳型ベクター、転移エレメント（トランスポゾンまたはレトロトランスポゾン）が、切断酵素（例えば、ヌクレアーゼ、リコンビナーゼ、インテグラーゼ、またはトランスポザーゼ）に加えて細胞に送達されなければならない。リコンビナーゼのためのそのような挿入ツールの例は、ＤＮＡベクターを含み得る。他の遺伝子編集システムは、インテグラーゼの送達に挿入ベクターが伴い、トランスポサーゼにトランスポゾン／レトロトランスポゾンが伴うことなどを必要とする。いくつかの実施形態において、切断酵素として使用され得るリコンビナーゼの例は、ＣＲＥリコンビナーゼである。様々な実施形態において、挿入ツールで使用され得るインテグラーゼの例には、ＡＡＶ、ガンマレトロウイルス、およびレンチウイルスを含むが、これらに限定されない、いくつかのウイルスのうちのいずれかから取られたウイルスに基づく酵素が含まれる。挿入ツールで使用され得るトランスポゾン／レトロトランスポゾンの例には、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）トランスポゾン、Ｓｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙトランスポゾン、およびＬ１レトロトランスポゾンが含まれるが、これらに限定されない。
【０８１３】
本開示の方法のある特定の実施形態において、導入遺伝子は、インビボで送達される。本開示の方法のある特定の実施形態において、インビボでの導入遺伝子送達は、局所送達、吸着、吸収、エレクトロポレーション、スピンフェクション、共培養、トランスフェクション、機械的送達、音波送達、振動送達、マグネトフェクション、またはナノ粒子を媒介した送達によって起こり得る。本開示の方法のある特定の実施形態において、トランスフェクションによるインビボでの導入遺伝子送達は、リポソームトランスフェクション、リン酸カルシウムトランスフェクション、ｆｕｇｅｎｅトランスフェクション、およびデンドリマーを媒介したトランスフェクションによって起こり得る。本開示の方法のある特定の実施形態において、インビボでの機械的導入遺伝子送達は、細胞圧搾、衝撃、または遺伝子銃によって起こり得る。本開示の方法のある特定の実施形態において、インビボでのナノ粒子媒介導入遺伝子送達は、リポソーム送達、ミセルによる送達、およびポリマーソームによる送達によって起こり得る。様々な実施形態において、切断酵素として使用され得るヌクレアーゼには、Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、および亜鉛フィンガーヌクレアーゼが含まれるが、これらに限定されない。
【０８１４】
様々な実施形態において、本明細書に記載の遺伝子編集システム、特にタンパク質および／または核酸は、ポリ（ヒスチジン）ベースのミセルであるナノ粒子と複合体を形成することができる。特に、ある特定のｐＨでは、ポリ（ヒスチジン）含有トリブロックコポリマーは、表面に正に荷電したポリ（ヒスチジン）単位を持つミセルに集合し、それによって負に荷電した遺伝子編集分子との複合体の形成を可能にする。これらのナノ粒子を使用して、タンパク質および／または核酸をｐＨ依存様式で結合および放出することにより、所望の遺伝子改変を実行するための効率的かつ選択的な機構が提供され得る。特に、このミセルベースの送達システムは、帯電した材料に関して実質的な柔軟性、ならびに大きなペイロード容量、およびナノ粒子ペイロードの標的化放出を提供する。一例では、二本鎖ＤＮＡの部位特異的切断は、ポリ（ヒスチジン）ベースのミセルを使用するヌクレアーゼの送達によって可能にされ得る。
【０８１５】
様々な実施形態は、ポリ（ヒスチジン）ベースのミセルと複合体を形成することによって、遺伝子編集ツールの細胞内送達を可能にする。特に、様々な実施形態は、親水性ブロック、疎水性ブロック、および荷電ブロックからなるトリブロックコポリマーを提供する。いくつかの実施形態において、親水性ブロックは、ポリ（エチレンオキシド）（ＰＥＯ）であり得、荷電ブロックは、ポリ（Ｌ−ヒスチジン）であり得る。様々な実施形態で使用することができる例示的なトリブロックコポリマーは、ＰＥＯ−ｂ−ＰＬＡ−ｂ−ＰＨＩＳであり、各ブロック内の可変数の反復単位は、設計によって異なる。特定の理論に拘束されることを望まないが、様々な実施形態のトリブロックコポリマーによって形成されるミセルにおいて、疎水性ブロックが凝集してコアを形成し、末端上に親水性ブロックおよびポリ（ヒスチジン）ブロックを残して、１つ以上の周囲の層を形成する。
【０８１６】
本開示の方法のある特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、導入遺伝子送達に使用される。ある特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、核酸である。ある特定の実施形態において、核酸非ウイルスベクターは、プラスミドＤＮＡ、線状二本鎖ＤＮＡ（ｄｓＤＮＡ）、線状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）、ＤｏｇｇｙＢｏｎｅ（商標）ＤＮＡ、ナノプラスミド、ミニサークルＤＮＡ、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ｓｓＯＤＮ）、ＤＤＮＡオリゴヌクレオチド、一本鎖ｍＲＮＡ（ｓｓＲＮＡ）、および二本鎖ｍＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）である。ある特定の実施形態において、非ウイルスベクターは、トランスポゾンである。ある特定の実施形態において、トランスポゾンは、ｐｉｇｇｙＢａｃ（登録商標）である。
【０８１７】
本開示の方法のある特定の実施形態において、導入遺伝子送達は、ウイルスベクターを介して起こり得る。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、非組み込み非染色体ベクターである。非組み込み非染色体ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、およびヘルペスウイルスを含み得る。ある特定の実施形態において、ウイルスベクターは、組み込み染色体ベクターである。組み込み染色体ベクターは、アデノ随伴ベクター（ＡＡＶ）、レンチウイルス、およびガンマレトロウイルスを含み得る。
【０８１８】
本開示の方法のある特定の実施形態において、導入遺伝子送達は、ベクターの組み合わせによって起こり得る。例示的であるが非限定的なベクターの組み合わせは、ウイルスおよび非ウイルスベクター、１つを超える非ウイルスベクター、または１つを超えるウイルスベクターを含み得る。例示的であるが非限定的なベクターの組み合わせは、ＤＮＡ由来およびＲＮＡ由来のベクター、ＲＮＡおよび逆転写酵素、トランスポゾンおよびトランスポザーゼ、非ウイルスベクターおよびエンドヌクレアーゼ、ならびにウイルスベクターおよびエンドヌクレアーゼを含み得る。
【０８１９】
本開示の方法のある特定の実施形態において、ゲノム改変は、導入遺伝子の安定な組み込み、導入遺伝子の一時的な組み込み、導入遺伝子の部位特異的組み込み、または導入遺伝子の偏った組み込みであり得る。
【０８２０】
本開示の方法のある特定の実施形態において、ゲノム改変は、導入遺伝子の安定な染色体組み込みであり得る。ある特定の実施形態において、安定な染色体組み込みは、ランダム組み込み、部位特異的組み込み、または偏った組み込みであり得る。ある特定の実施形態において、部位特異的組み込みは、非支援または支援され得る。ある特定の実施形態において、支援された部位特異的組み込みは、部位特異的ヌクレアーゼとともに同時送達される。ある特定の実施形態において、部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム組み込み部位の上流および下流領域に対する相同性を含む５’および３’ヌクレオチド配列伸長を有する導入遺伝子を含む。ある特定の実施形態において、相同性ヌクレオチド伸長を有する導入遺伝子は、相同組換え、マイクロホモロジー媒介末端結合、または非相同末端結合によるゲノム組み込みを可能にする。ある特定の実施形態において、部位特異的組み込みは、セーフハーバー部位で行われる。ゲノムセーフハーバー部位は、新しい遺伝子材料の組み込みを、新しく挿入された遺伝子エレメントが確実に機能し（例えば、治療的に有効な発現のレベルで発現し）、かつ、宿主生物体に対するリスクを引き起こすような宿主ゲノムに対する有害な変更が引き起こされないことを確実にする様式で適応させることができる。潜在的なゲノムセーフハーバーには、ヒトアルブミン遺伝子、アデノ随伴ウイルス部位１（ＡＡＶＳ１）、染色体１９上に自然発生するＡＡＶウイルスの組み込み部位、ケモカイン（Ｃ−Ｃモチーフ）受容体５（ＣＣＲ５）遺伝子の部位、およびマウスＲｏｓａ２６遺伝子座のヒトオルソログの部位のイントロン配列が含まれるが、これらに限定されない。
【０８２１】
ある特定の実施形態において、部位特異的導入遺伝子の組み込みは、標的遺伝子の発現を破壊する部位で起こる。ある特定の実施形態において、標的遺伝子発現の破壊は、イントロン、エクソン、プロモーター、遺伝的エレメント、エンハンサー、サプレッサー、開始コドン、停止コドン、および応答エレメントにおける部位特異的組み込みによって起こる。ある特定の実施形態において、部位特異的組み込みによって標的化される例示的な標的遺伝子には、ＴＲＡＣ、ＴＲＡＢ、ＰＤＩ、任意の免疫抑制遺伝子、および同種拒絶に関与する遺伝子が含まれるが、これらに限定されない。
【０８２２】
ある特定の実施形態において、部位特異的導入遺伝子の組み込みは、標的遺伝子の発現の増強をもたらす部位で起こる。ある特定の実施形態において、標的遺伝子発現の増強は、イントロン、エクソン、プロモーター、遺伝的エレメント、エンハンサー、サプレッサー、開始コドン、停止コドン、および応答エレメントにおける部位特異的組み込みによって起こる。
【０８２３】
本開示の方法のある特定の実施形態において、酵素を使用して、宿主ゲノムに鎖切断を作成し、導入遺伝子の送達または組み込みを容易にすることができる。ある特定の実施形態において、酵素は、一本鎖切断を作り出す。ある特定の実施形態において、酵素は、二本鎖切断を作り出す。ある特定の実施形態において、切断誘導酵素の例には、トランスポザーゼ、インテグラーゼ、エンドヌクレアーゼ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、亜鉛フィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲ（商標）、およびｃｐｆ１が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態において、切断誘導酵素は、ＤＮＡにコードされ、ｍＲＮＡにコードされ、タンパク質として、ガイドＲＮＡ（ｇＲＮＡ）との核タンパク質複合体として、細胞に送達され得る。
【０８２４】
本開示の方法のある特定の実施形態において、部位特異的導入遺伝子の組み込みは、ベクター媒介性組み込み部位バイアスによって制御される。ある特定の実施形態において、ベクター媒介性組み込み部位バイアスは、選択されたレンチウイルスベクターによって制御される。ある特定の実施形態において、ベクター媒介性組み込み部位バイアスは、選択されたガンマレトロウイルスベクターによって制御される。
【０８２５】
本開示の方法のある特定の実施形態において、部位特異的導入遺伝子組み込み部位は、不安定な染色体挿入である。ある特定の実施形態において、組み込まれた導入遺伝子は、サイレンシングされるか、除去されるか、切除されるか、またはさらに改変され得る。本開示の方法のある特定の実施形態において、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な組み込みである。ある特定の実施形態において、不安定な組み込みは、一時的な非染色体組み込み、半安定な非染色体組み込み、半持続的な染色体挿入、または非安定な染色体挿入であり得る。ある特定の実施形態において、一時的な非染色体挿入は、エピ染色体または細胞質であり得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子の一時的な非染色体挿入は、染色体に組み込まれず、改変された遺伝物質は、細胞分裂中に複製されない。
【０８２６】
本開示の方法のある特定の実施形態において、ゲノム改変は、導入遺伝子の半安定なまたは持続的な非染色体組み込みである。ある特定の実施形態において、ＤＮＡベクターは、分裂細胞中の核における自己複製を可能にする非ウイルスベクターのエピソーム保持のために核マトリックスタンパク質に結合する足場／マトリックス結合領域（Ｓ−ＭＡＲ）モジュールをコードする。
【０８２７】
本開示の方法のある特定の実施形態において、ゲノム改変は、導入遺伝子の不安定な染色体組み込みである。ある特定の実施形態において、組み込まれた導入遺伝子は、サイレンシングされるか、除去されるか、切除されるか、またはさらに改変され得る。
【０８２８】
本開示の方法のある特定の実施形態において、導入遺伝子挿入によるゲノムへの改変は、相同組換え（ＨＲ）、マイクロホモロジー媒介末端結合（ＭＭＥＪ）、非相同的末端結合（ＮＨＥＪ）、トランスポザーゼ酵素媒介改変、インテグラーゼ酵素媒介改変、エンドヌクレアーゼ酵素媒介改変、または組換え酵素媒介改変による宿主細胞指向二本鎖切断の修復（相同性指向修復）を介して起こり得る。ある特定の実施形態において、導入遺伝子挿入によるゲノムへの改変は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９、ＴＡＬＥＮ、ＺＦＮ、Ｃａｓ−ＣＬＯＶＥＲ、およびｃｐｆ１を介して起こり得る。
【０８２９】
本開示の方法のある特定の実施形態において、インビボまたはエクスビボのゲノム改変を有する細胞は、生殖系列細胞または体細胞であり得る。ある特定の実施形態において、改変された細胞は、ヒト、非ヒト、哺乳動物、ラット、マウス、またはイヌ細胞であり得る。ある特定の実施形態において、改変された細胞は、分化、未分化、または不死化され得る。ある特定の実施形態において、改変された未分化細胞は、幹細胞であり得る。ある特定の実施形態において、改変された細胞は、分化、未分化、または不死化され得る。ある特定の実施形態において、改変された未分化細胞は、人工多能性幹細胞であり得る。ある特定の実施形態において、改変された細胞は、Ｔ細胞、造血幹細胞、ナチュラルキラー細胞、マクロファージ、樹状細胞、単球、巨核球、または破骨細胞であり得る。ある特定の実施形態において、改変された細胞は、細胞が静止状態、活性化状態、休止期、中間期、前期、中期、後期、または終期にある間に改変され得る。ある特定の実施形態において、改変された細胞は、新鮮で、凍結保存され、バルクであり、亜集団に、全血から、白血球アフェレーシスから、または不死化細胞株から分類され得る。
【０８３０】
他の実施形態
本開示の特定の実施形態が例示し、説明されているが、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、様々な他の変更および修正を行うことができる。添付の特許請求の範囲の範囲は、本開示の範囲内にあるすべてのそのような変更および修正を含む。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３Ａ】
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【図２３Ｂ】
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【図２３Ｃ】
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【図２３Ｄ】
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【図２３Ｅ】
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【図２４Ａ】
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【図２４Ｂ】
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【図２４Ｃ】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
2021536249.tif 000392
【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４Ａ】
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【図３４Ｂ】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９Ａ】
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【図３９Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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