(57)【要約】  本発明は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）および／またはイヌ変性性脊髄症（ＤＭ）を治療するために使用し得るＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドをコードするＡＡＶに関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）間に配置された核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、前記核酸配列は、発現されると、細胞におけるＳＯＤ１の遺伝子発現を阻害または抑制し、前記核酸配列は、センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含み、前記センス鎖配列は、表３に挙げられる配列のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、および前記アンチセンス鎖配列は、表２に挙げられる配列のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、ならびに前記センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列は、少なくとも４ヌクレオチド長の相補性の領域を共有する、ＡＡＶベクター。
【請求項２】
前記核酸配列は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項３】
前記ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ｓｉＲＮＡ二重鎖ＩＤ番号Ｄ−４０００〜Ｄ−４０２５からなる群から選択される、請求項２に記載のＡＡＶベクター。
【請求項４】
前記相補性の領域は、少なくとも１７ヌクレオチド長である、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項５】
前記相補性の領域は、１９〜２１ヌクレオチド長である、請求項４に記載のＡＡＶベクター。
【請求項６】
前記相補性の領域は、１９ヌクレオチド長である、請求項５に記載のＡＡＶベクター。
【請求項７】
前記センス鎖配列および前記アンチセンス鎖は、独立して３０ヌクレオチド以下である、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項８】
前記センス鎖配列および前記アンチセンス鎖配列の少なくとも１つは、少なくとも１ヌクレオチドの３’オーバハングを含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項９】
前記センス鎖配列および前記アンチセンス鎖配列の少なくとも１つは、少なくとも２ヌクレオチドの３’オーバハングを含む、請求項８に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１０】
ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３−３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４−４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２−１ｂ、ＡＡＶ４２−２、ＡＡＶ４２−３ａ、ＡＡＶ４２−３ｂ、ＡＡＶ４２−４、ＡＡＶ４２−５ａ、ＡＡＶ４２−５ｂ、ＡＡＶ４２−６ｂ、ＡＡＶ４２−８、ＡＡＶ４２−１０、ＡＡＶ４２−１１、ＡＡＶ４２−１２、ＡＡＶ４２−１３、ＡＡＶ４２−１５、ＡＡＶ４２−ａａ、ＡＡＶ４３−１、ＡＡＶ４３−１２、ＡＡＶ４３−２０、ＡＡＶ４３−２１、ＡＡＶ４３−２３、ＡＡＶ４３−２５、ＡＡＶ４３−５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１−７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１−８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２−１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２−３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２−４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２−５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３−９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３−１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４−９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４−１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５−３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５−２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ−１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ−５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ−１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ−４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１−８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ  １９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ、ＡＡＶ−ＬＫ０１、ＡＡＶ−ＬＫ０２、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０４、ＡＡＶ−ＬＫ０５、ＡＡＶ−ＬＫ０６、ＡＡＶ−ＬＫ０７、ＡＡＶ−ＬＫ０８、ＡＡＶ−ＬＫ０９、ＡＡＶ−ＬＫ１０、ＡＡＶ−ＬＫ１１、ＡＡＶ−ＬＫ１２、ＡＡＶ−ＬＫ１３、ＡＡＶ−ＬＫ１４、ＡＡＶ−ＬＫ１５、ＡＡＶ−ＬＫ１６、ＡＡＶ−ＬＫ１７、ＡＡＶ−ＬＫ１８、ＡＡＶ−ＬＫ１９、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ−２−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１０１、ＡＡＶ−８ｈ、ＡＡＶ−８ｂ、ＡＡＶ−ｈ、ＡＡＶ−ｂ、ＡＡＶ  ＳＭ  １０−２、ＡＡＶシャッフル１００−１、ＡＡＶシャッフル１００−３、ＡＡＶシャッフル１００−７、ＡＡＶシャッフル１０−２、ＡＡＶシャッフル１０−６、ＡＡＶシャッフル１０−８、ＡＡＶシャッフル１００−２、ＡＡＶ  ＳＭ１０−１、ＡＡＶ  ＳＭ１０−８、ＡＡＶ  ＳＭ１００−３、ＡＡＶ  ＳＭ１００−１０、ＢＮＰ６１  ＡＡＶ、ＢＮＰ６２  ＡＡＶ、ＢＮＰ６３  ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ  ＡＡＶ１０、ジャパニーズＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．１、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．１０、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．２、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．７、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．８、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｂ７．３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｂ７．４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ１、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ２、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−ｅ５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ６、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ７、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−２、ＡＡＶ  ＣＨｔ−３、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．１０、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．５、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．６、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．７、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ２、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ５、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ９、ＡＡＶ  ＣＫｄ−１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−１０、ＡＡＶ  ＣＫｄ−２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−７、ＡＡＶ  ＣＫｄ−８、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ５、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ７、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ８、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ５、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ９、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ���、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ２、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ３、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ４、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ５、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ６、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ７、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−１、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−１０、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１２、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１３、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−４、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−７、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−８、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−９、ＡＡＶ  ＣＬｖ−２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｅ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ１１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ９、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ９、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１０、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１１、ＡＡＶ  ＣＳｐ−２、ＡＡＶ  ＣＳｐ−３、ＡＡＶ  ＣＳｐ−４、ＡＡＶ  ＣＳｐ−６、ＡＡＶ  ＣＳｐ−７、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．１０、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．２、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．４、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．５、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．６、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．７、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．８、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．９、ＡＡＶ  ＣＳｐ−９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ−３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶ
Ｆ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ、Ｇ２Ｂ−２６、Ｇ２Ｂ−１３、ＴＨ１．１−３２、ＴＨ１．１−３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、ＡＡＶＧ２Ｂ５、およびこれらのバリアントからなる群から選択されるカプシド血清型を含む、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１１】
前記プロモータは、ＣＭＶ、ＣＢＡおよびＨ１からなる群から選択される、請求項１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１２】
前記プロモータはＣＭＶである、請求項１１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１３】
前記プロモータはＣＢＡである、請求項１１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１４】
前記プロモータはＨ１である、請求項１１に記載のＡＡＶベクター。
【請求項１５】
細胞におけるＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害する方法であって、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物を前記細胞に投与することを含む方法。
【請求項１６】
治療を必要としている対象の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療および／または改善する方法であって、前記対象に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＡＡＶウイルスゲノムを含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項１７】
ＳＯＤ１の発現が阻害または抑制される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記ＳＯＤ１は、野生型ＳＯＤ１、少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１、または野生型ＳＯＤ１および少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１の両方である、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
ＳＯＤ１の発現が約２０％〜約１００％阻害または抑制される、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
細胞においてＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害する方法であって、ＳＯＤ１遺伝子は、前記細胞内で機能獲得効果を引き起こす突然変異を含み、前記方法は、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物を前記細胞に投与することを含む、方法。
【請求項２１】
治療を必要としている対象のイヌ変性性脊髄症（ＤＭ）を治療および／または改善する方法であって、前記対象に、請求項１〜１４のいずれか一項に記載のＡＡＶベクターを含む組成物の治療有効量を投与することを含む方法。
【請求項２２】
ＳＯＤ１の発現が阻害または抑制される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ＳＯＤ１は、野生型ＳＯＤ１、少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１、または野生型ＳＯＤ１および少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１の両方である、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
ＳＯＤ１の発現は、約２０％〜約１００％阻害または抑制される、請求項２１に記載の方法。
【請求項２５】
対象のリン酸化ニューロフィラメント重鎖（ｐＮＦ−Ｈ）のレベルを低下させる方法であって、細胞におけるＳＯＤ１の発現を阻害または抑制するための、２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）間に配置された核酸配列を含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを含む組成物を、前記対象に投与することを含み、前記核酸配列は、センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含み、前記センス鎖配列は、表３に挙げられる配列のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、および前記アンチセンス鎖配列は、表２に挙げられる配列のヌクレオチド配列と３ヌクレオチド以下が異なる少なくとも１５連続ヌクレオチドを含み、ならびに前記センス鎖配列およびアンチセンス鎖配列は、少なくとも４ヌクレオチド長の相補性の領域を共有する、方法。
【請求項２６】
前記核酸配列は、ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖配列およびアンチセンス鎖配列を含む、請求項２５に記載の方法。
【請求項２７】
前記ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ｓｉＲＮＡ二重鎖ＩＤ番号Ｄ−４０００〜Ｄ−４０２５からなる群から選択される、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
対象におけるｐＮＦ−Ｈの低下は、治療を必要としている前記対象の筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療および／または改善する、請求項２５〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、ＳＯＤ１遺伝子発現および／またはＳＯＤ１酵素産生に干渉するために、スーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）遺伝子を標的とするか、またはＳＯＤ１を標的とする分子をコードするＡＡＶベクター、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはそれらの前駆体を含むポリヌクレオチドを設計、調製、製造および／または製剤化するための組成物、方法およびプロセスに関する。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターに挿入される。神経変性疾患を有する対象のＳＯＤ１遺伝子発現を阻害する方法も開示される。本方法は、任意選択で、神経変性疾患を有する対象に少なくとも１つのポリヌクレオチドを導入する。特に、疾患は、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）である。
【背景技術】
【０００２】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、ルー・ゲーリッグ病としても知られており、一次運動皮質、脳幹、および脊髄における運動ニューロン（ＭＮ）の顕著な喪失により特徴付けられる致死性の進行性神経変性疾患である。運動ニューロンの喪失は、呼吸などの基礎的で基本的な運動を壊滅し、典型的には、診断の２〜５年後内の患者に死を引き起こす。患者の運動機能悪化が進行すると、患者の呼吸能力が重度に破壊され、患者を生存させるために、何らかの形態の呼吸支援が必要になる。他の症状としては、手、腕、脚、または嚥下筋肉の筋力低下も挙げられる。また、一部の患者（例えば、ＦＴＤ−ＡＬＳ）は、前頭側頭型認知症も発症する場合がある。
【０００３】
ＡＬＳ協会によれば、アメリカ合衆国では、毎年約５，６００人がＡＬＳと診断される。ＡＬＳの発症率は、１００，０００人当たり２人であり、任意の所与の時点において、３０，０００人ものアメリカ人が、この疾患を有し得ると推測される。
【０００４】
２つの形態のＡＬＳが記載されている。１つは孤発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）であり、アメリカ合衆国において最も一般的な形態ＡＬＳであり、診断された全症例の９０〜９５％を占める。もう１つは、家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）であり、主に優性遺伝で家系に生じ、アメリカ合衆国における全症例の約５〜１０％を占めるに過ぎない。ｓＡＬＳおよびｆＡＬＳは、臨床的に判別不能である。
【０００５】
病理学研究により、特に運動ニューロン（ＭＮ）において、ＥＲストレスの増加、フリーラジカル（すなわち活性酸素種（ＲＯＳ））の生成、ミトコンドリア機能障害、タンパク質凝集、アポトーシス、炎症およびグルタミン酸興奮毒性を含む、一部の細胞課程が、疾患発症後に生じることが示されている。
【０００６】
ＡＬＳの原因は、複雑かつ多様である。一般に、ＡＬＳは、環境曝露と相まって複数の遺伝子が組み合わされて個人を感受性にする複雑な遺伝障害であると考えられる。ＡＬＳに関連する遺伝子は十数個よりも多くが発見されており、それらには、ＳＯＤ−１（Ｃｕ２＋／Ｚｎ２＋スーパーオキシドジスムターゼ）、ＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ、ＴＡＲ  ＤＮＡ結合タンパク質−４３）、ＦＵＳ（サルコーマ融合／サルコーマ転移（Ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  Ｓａｒｃｏｍａ／Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｄ  ｉｎ  Ｓａｒｃｏｍａ））、ＡＮＧ（アンジオゲニン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン−２）、バロシン含有タンパク質（ＶＣＰ）、ＯＰＴＮ（オプチニューリン）、および染色体９、オープンリーディングフレーム７２（Ｃ９ＯＲＦ７２）における非コードＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチドリピートの伸長が挙げられる。しかしながら、運動ニューロン変性の正確な機構は依然として解明されていない。
【０００７】
現在、ＡＬＳの治癒的治療は存在しない。リルゾールは、唯一のＦＤＡ認可薬であり、グルタミン酸反応をアンタゴナイズして、ＡＬＳの病態進展を低減する。しかしながら、初期のＡＬＳ患者で約３カ月の寿命延長が報告されているに過ぎず、末期のＡＬＳ患者には治療利益は観察されておらず、こうした患者には治療選択肢が欠如していることが示されている（非特許文献１）。したがって、疾患進行を効果的に予防することができる新しい治療戦略には、依然として需要がある。
【０００８】
Ｃｕ２＋／Ｚｎ２＋スーパーオキシドジスムターゼＩ型（ＳＯＤ１）の遺伝子における突然変異は、ｆＡＬＳの最も一般的な原因であり、全ｆＡＬＳ症例の約２０〜３０％を占める。最近の報告書は、ＳＯＤ１突然変異が、全ｓＡＬＳ症例の約４％に結び付けられ得ることも示している（非特許文献２）。ＳＯＤ１関連ｆＡＬＳは、正常なＳＯＤ１活性の喪失によって引き起こされるのではなく、むしろ毒性機能の獲得によって引き起こされる可能性が最も高い。突然変異ＳＯＤ１関連ｆＡＬＳ毒性の仮説の１つは、異常なＳＯＤ１酵素が、ペルオキシナイトライトまたは過酸化水素などの小分子による有害フリーラジカルの産生を引き起こすことを提唱する。突然変異ＳＯＤ１神経毒性の他の仮説としては、プロテアソーム活性の阻害、ミトコンドリア損傷、ＲＮＡプロセシングの破壊、および細胞内凝集体の形成が挙げられる。ＡＬＳにおける突然変異ＳＯＤ１変異体および／または野生型ＳＯＤ１の異常蓄積は、病理学的封入体として同定される不溶性線維性凝集体を形成する。凝集したＳＯＤ１タンパク質は、ミトコンドリアストレス（非特許文献３）および細胞、特に運動ニューロンに対する他の毒性を誘導し得る。
【０００９】
これらの知見は、ＳＯＤ１が、家族性および孤発性ＡＬＳの両方の潜在的な治療標的であり得ることを示す。ＡＬＳ患者の中枢神経系で産生されるＳＯＤ１タンパク質を、野生型であるかまたは突然変異体であるかに関わらず低減することができる療法は、運動ニューロン変性ならびに筋力低下および萎縮などの、患者のＡＬＳの症状を改善し得る。野生型および／または突然変異ＳＯＤ１タンパク質凝集の形成を予防するための作用剤および方法は、疾患進行を防止し、ＡＬＳ症状の改善を可能にし得る。近年、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）媒介性遺伝子サイレンシングが、研究者の関心を引いている。当該技術分野では、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする小型二本鎖ＲＮＡ（低分子干渉ＲＮＡ）分子が、ＡＬＳの治療におけるそれらの能力について教示されている（例えば、特許文献１および特許文献２を参照のこと）。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１０】
【特許文献１】米国特許第７，６３２，９３８号明細書
【特許文献２】米国特許出願公開第２００６０２２９２６８号明細書
【非特許文献】
【００１１】
【非特許文献１】ベシモン  Ｇ（Ｂｅｎｓｉｍｏｎ  Ｇ）ら著、ジャーナル・オブ・ニューロロジー（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ．）  ２００２年、２４９巻、ｐ．６０９〜６１５
【非特許文献２】ロベレヒト（Ｒｏｂｂｅｒｅｃｈｔ）およびフィリップ（Ｐｈｉｌｉｐ）著、ネイチャー・レビュー・ニューロバイオロジー（Ｎａｔ．  Ｒｅｖ．  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）、２０１３年、１４巻、ｐ．２４８〜２６４
【非特許文献３】ペビライネン  Ｐ（Ｖｅｈｖｉｌａｉｎｅｎ  Ｐ）ら著、フロンティア・イン・セルラー・ニューロサイエンス（Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．）、２０１４年、８巻、ｐ．１２６
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１２】
本発明は、ＡＬＳ患者においてこの疾患を治療するためにＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害または防止するためのＲＮＡ干渉またはノックダウンに基づく手法を開発する。
本発明は、二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）コンストラクトおよび／またはｓｉＲＮＡコンストラクト、ｓｈＲＮＡコンストラクトおよび／またはマイクロＲＮＡコンストラクトを含む新規のポリヌクレオチド、ならびにそれらの設計方法を提供する。加えて、これらのｓｉＲＮＡコンストラクトは、細胞送達用の発現ベクター（一方または両方の鎖）にコードされた合成分子であってもよい。かかるベクターとしては、限定はされないが、いずれかのＡＡＶ血清型のベクターゲノムなど、アデノ随伴ウイルスベクター、またはレンチウイルスなどの他のウイルス送達媒体が挙げられる。
【課題を解決するための手段】
【００１３】
本発明は、ＳＯＤ１遺伝子発現および／またはＳＯＤ１タンパク質産生に干渉するためのＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドをコードするＡＡＶベクター、ならびにそれらの使用方法を提供する。筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン変性疾患を治療する方法も、本発明に含まれる。
【００１４】
一実施形態において、ＳＯＤ１は、未治療対象と比較して、ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドをコードするＡＡＶで治療された対象では３０％抑制される。対象には、所定の用量レベルのＡＡＶを注入でまたはボーラスとして投与し得る。非限定的な例として、抑制は、Ｃ１〜Ｌ７前角領域で見られる。
【００１５】
本発明は、遺伝子発現およびタンパク質産生のＲＮＡ分子媒介性遺伝子特異的干渉に関する。筋萎縮性側索硬化症などの運動ニューロン変性疾患を治療する方法も、本発明に含まれる。本明細書で取り上げられる組成物に含まれるｓｉＲＮＡは、ＳＯＤ１遺伝子のｍＲＮＡ転写物の少なくとも一部と実質的に相補的な、３０ヌクレオチド以下、概して１９〜２４ヌクレオチド長である領域を有するアンチセンス鎖（アンチセンス鎖）を有するｄｓＲＮＡを包含する。
【００１６】
本発明は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡを標的として、ＳＯＤ１遺伝子発現および／またはＳＯＤ１タンパク質産生に干渉する低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖などの短鎖二本鎖ＲＮＡ分子を提供する。本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖は、ＳＯＤ１遺伝子におけるいかなる特定の突然変異にも関わりなく、ＳＯＤ１遺伝子の両対立遺伝子に干渉することができ、特に、ＡＬＳ疾患に見出されるものと相互作用することができる。
【００１７】
一部の実施形態において、かかるｓｉＲＮＡ分子、またはｓｉＲＮＡ分子の単一鎖は、細胞、具体的には、中枢神経系における運動ニューロンおよび／または他の周囲細胞に導入されることになるアデノ随伴ウイルスベクターに挿入される。
【００１８】
本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖は、共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含み、ここでアンチセンス鎖は、標的ＳＯＤ１遺伝子の核酸配列に相補的であり、センス鎖は標的ＳＯＤ１遺伝子の核酸配列に相同性である。一部の態様において、アンチセンス鎖の５’末端は５’リン酸基を有し、センス鎖の３’末端は３’ヒドロキシル基を含む。他の態様において、各鎖の３’末端にはヌクレオチドオーバハングがない、１つある、または２つある。
【００１９】
本発明によれば、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖の各鎖は約１９〜２５ヌクレオチド長、好ましくは約１９ヌクレオチド、２０ヌクレオチド、２１ヌクレオチド、２２ヌクレオチド、２３ヌクレオチド、２４ヌクレオチド、または２５ヌクレオチド長である。一部の態様において、ｓｉＲＮＡは非修飾ＲＮＡ分子であってもよい。
【００２０】
他の態様において、ｓｉＲＮＡは、塩基、糖または骨格修飾などの少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有し得る。
一実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む。ｄｓＲＮＡは、第１の配列を有するセンス鎖と、第２の配列を有するアンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は、ＳＯＤ１をコードするｍＲＮＡの少なくとも一部と実質的に相補的なヌクレオチド配列を含み、相補性領域は３０ヌクレオチド以下、および少なくとも１５ヌクレオチド長である。概して、ｄｓＲＮＡは１９〜２４、例えば１９〜２１ヌクレオチド長である。一部の実施形態においてｄｓＲＮＡは約１５〜約２５ヌクレオチド長であり、他の実施形態においてｄｓＲＮＡは約２５〜約３０ヌクレオチド長である。
【００２１】
ｄｓＲＮＡは、ＳＯＤ１を発現する細胞との接触時またはＳＯＤ１を発現する細胞内での転写時のいずれかの際に、本明細書に記載されるとおりの方法などによって評価したときなど、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％またはそれ以上、ＳＯＤ１遺伝子の発現を阻害または抑制する。
【００２２】
本発明によれば、ｓｉＲＮＡ二重鎖、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはＳＯＤ１遺伝子を標的とするｄｓＲＮＡの一方の鎖をコードする核酸を含むＡＡＶベクターが作製され、ＡＡＶベクター血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３−３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４−４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２−１ｂ、ＡＡＶ４２−２、ＡＡＶ４２−３ａ、ＡＡＶ４２−３ｂ、ＡＡＶ４２−４、ＡＡＶ４２−５ａ、ＡＡＶ４２−５ｂ、ＡＡＶ４２−６ｂ、ＡＡＶ４２−８、ＡＡＶ４２−１０、ＡＡＶ４２−１１、ＡＡＶ４２−１２、ＡＡＶ４２−１３、ＡＡＶ４２−１５、ＡＡＶ４２−ａａ、ＡＡＶ４３−１、ＡＡＶ４３−１２、ＡＡＶ４３−２０、ＡＡＶ４３−２１、ＡＡＶ４３−２３、ＡＡＶ４３−２５、ＡＡＶ４３−５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１−７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１−８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２−１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２−３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２−４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２−５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３−９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３−１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４−９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４−１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５−３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５−２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ−１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ−５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ−１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ−４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１−８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ１９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ａ５８６Ｒ突然変異体、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ｒ５３３Ａ突然変異体、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ヤギＡＡＶ、ウシＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥｒ１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２��４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ、ＡＡＶ−ＬＫ０１、ＡＡＶ−ＬＫ０２、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０４、ＡＡＶ−ＬＫ０５、ＡＡＶ−ＬＫ０６、ＡＡＶ−ＬＫ０７、ＡＡＶ−ＬＫ０８、ＡＡＶ−ＬＫ０９、ＡＡＶ−ＬＫ１０、ＡＡＶ−ＬＫ１１、ＡＡＶ−ＬＫ１２、ＡＡＶ−ＬＫ１３、ＡＡＶ−ＬＫ１４、ＡＡＶ−ＬＫ１５、ＡＡＶ−ＬＫ１６、ＡＡＶ−ＬＫ１７、ＡＡＶ−ＬＫ１８、ＡＡＶ−ＬＫ１９、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ−２−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１０１、ＡＡＶ−８ｈ、ＡＡＶ−８ｂ、ＡＡＶ−ｈ、ＡＡＶ−ｂ、ＡＡＶ  ＳＭ１０−２、ＡＡＶシャッフル１００−１、ＡＡＶシャッフル１００−３、ＡＡＶシャッフル１００−７、ＡＡＶシャッフル１０−２、ＡＡＶシャッフル１０−６、ＡＡＶシャッフル１０−８、ＡＡＶシャッフル１００−２、ＡＡＶ  ＳＭ１０−１、ＡＡＶ  ＳＭ１０−８、ＡＡＶ  ＳＭ１００−３、ＡＡＶ  ＳＭ１００−１０、ＢＮＰ６１  ＡＡＶ、ＢＮＰ６２  ＡＡＶ、ＢＮＰ６３  ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、トゥルータイプＡＡＶ（ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ  ＡＡＶ１０、ジャパニーズＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．１、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．１０、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．２、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．７、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．８、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｂ７．３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｂ７．４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ１、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ２、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−ｅ５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ６、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ７、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−２、ＡＡＶ  ＣＨｔ−３、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．１０、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．５、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．６、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．７、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ２、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ５、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ９、ＡＡＶ  ＣＫｄ−１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−１０、ＡＡＶ  ＣＫｄ−２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−７、ＡＡＶ  ＣＫｄ−８、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ５、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ７、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ８、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ５、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ９、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ１、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ２、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ３、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ４、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ５、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ６、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ７、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−１、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−１０、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１２、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１３、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−４、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−７、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−８、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−９、ＡＡＶ  ＣＬｖ−２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｅ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ１１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ９、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ９、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１０、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１１、ＡＡＶ  ＣＳｐ−２、ＡＡＶ  ＣＳｐ−３、ＡＡＶ  ＣＳｐ−４、ＡＡＶ  ＣＳｐ−６、ＡＡＶ  ＣＳｐ−７、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．１０、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．２、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．４、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．５、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．６、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．７、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．８、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．９、ＡＡＶ  ＣＳｐ−９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ−３５５、ＡＡＶ３Ｂ、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５
、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ、Ｇ２Ｂ−２６、Ｇ２Ｂ−１３、ＴＨ１．１−３２、ＴＨ１．１−３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、ＡＡＶＧ２Ｂ５、およびそれらのバリアントであってもよい。
【００２３】
本発明によれば、ＡＬＳにおいてＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、表４に挙げられるｓｉＲＮＡ二重鎖から選択される。好ましくは、ＡＬＳにおいてＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、ｓｉＲＮＡ二重鎖：Ｄ−４０００〜Ｄ−４０２５からなる群から選択される。
【００２４】
本発明はまた、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖と薬学的に許容可能な担体とを含む医薬組成物も提供する。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖をコードする核酸配列はＡＡＶベクターに挿入される。
【００２５】
一部の実施形態において、本発明は、細胞におけるＳＯＤ１遺伝子発現を阻害／サイレンシングする方法を提供する。したがって、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを使用して、細胞、詳細には運動ニューロンにおけるＳＯＤ１遺伝子発現を実質的に阻害することができる。一部の態様において、ＳＯＤ１遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％の阻害を指す。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％阻害され得る。ＳＯＤ１遺伝子は、野生型遺伝子、または少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１遺伝子のいずれであってもよい。したがって、ＳＯＤ１タンパク質は、野生型タンパク質、または少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ポリペプチドのいずれかである。
【００２６】
一部の実施形態において、本発明は、治療を必要としている対象の、異常なＳＯＤ１遺伝子および／またはＳＯＤ１タンパク質に関連する筋萎縮性側索硬化症を治療または改善する方法であって、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖の薬学的有効量を対象に投与すること、上記ｓｉＲＮＡ二重鎖を標的細胞に送達すること、ＳＯＤ１遺伝子発現およびタンパク質産生を阻害すること、および対象のＡＬＳの症状を改善することを含む方法を提供する。
【００２７】
一部の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖をコードする核酸配列を含むＡＡＶベクターは、ＡＬＳの治療および／または改善を必要としている対象に投与される。ＡＡＶベクター血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ２Ｇ９、ＡＡＶ３、ＡＡＶ３ａ、ＡＡＶ３ｂ、ＡＡＶ３−３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ４−４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ６．１、ＡＡＶ６．２、ＡＡＶ６．１．２、ＡＡＶ７、ＡＡＶ７．２、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．１１、ＡＡＶ９．１３、ＡＡＶ９．１６、ＡＡＶ９．２４、ＡＡＶ９．４５、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９．６１、ＡＡＶ９．６８、ＡＡＶ９．８４、ＡＡＶ９．９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１６．３、ＡＡＶ２４．１、ＡＡＶ２７．３、ＡＡＶ４２．１２、ＡＡＶ４２−１ｂ、ＡＡＶ４２−２、ＡＡＶ４２−３ａ、ＡＡＶ４２−３ｂ、ＡＡＶ４２−４、ＡＡＶ４２−５ａ、ＡＡＶ４２−５ｂ、ＡＡＶ４２−６ｂ、ＡＡＶ４２−８、ＡＡＶ４２−１０、ＡＡＶ４２−１１、ＡＡＶ４２−１２、ＡＡＶ４２−１３、ＡＡＶ４２−１５、ＡＡＶ４２−ａａ、ＡＡＶ４３−１、ＡＡＶ４３−１２、ＡＡＶ４３−２０、ＡＡＶ４３−２１、ＡＡＶ４３−２３、ＡＡＶ４３−２５、ＡＡＶ４３−５、ＡＡＶ４４．１、ＡＡＶ４４．２、ＡＡＶ４４．５、ＡＡＶ２２３．１、ＡＡＶ２２３．２、ＡＡＶ２２３．４、ＡＡＶ２２３．５、ＡＡＶ２２３．６、ＡＡＶ２２３．７、ＡＡＶ１−７／ｒｈ．４８、ＡＡＶ１−８／ｒｈ．４９、ＡＡＶ２−１５／ｒｈ．６２、ＡＡＶ２−３／ｒｈ．６１、ＡＡＶ２−４／ｒｈ．５０、ＡＡＶ２−５／ｒｈ．５１、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．６、ＡＡＶ３．１／ｈｕ．９、ＡＡＶ３−９／ｒｈ．５２、ＡＡＶ３−１１／ｒｈ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒ１１．６４、ＡＡＶ４−９／ｒｈ．５４、ＡＡＶ４−１９／ｒｈ．５５、ＡＡＶ５−３／ｒｈ．５７、ＡＡＶ５−２２／ｒｈ．５８、ＡＡＶ７．３／ｈｕ．７、ＡＡＶ１６．８／ｈｕ．１０、ＡＡＶ１６．１２／ｈｕ．１１、ＡＡＶ２９．３／ｂｂ．１、ＡＡＶ２９．５／ｂｂ．２、ＡＡＶ１０６．１／ｈｕ．３７、ＡＡＶ１１４．３／ｈｕ．４０、ＡＡＶ１２７．２／ｈｕ．４１、ＡＡＶ１２７．５／ｈｕ．４２、ＡＡＶ１２８．３／ｈｕ．４４、ＡＡＶ１３０．４／ｈｕ．４８、ＡＡＶ１４５．１／ｈｕ．５３、ＡＡＶ１４５．５／ｈｕ．５４、ＡＡＶ１４５．６／ｈｕ．５５、ＡＡＶ１６１．１０／ｈｕ．６０、ＡＡＶ１６１．６／ｈｕ．６１、ＡＡＶ３３．１２／ｈｕ．１７、ＡＡＶ３３．４／ｈｕ．１５、ＡＡＶ３３．８／ｈｕ．１６、ＡＡＶ５２／ｈｕ．１９、ＡＡＶ５２．１／ｈｕ．２０、ＡＡＶ５８．２／ｈｕ．２５、ＡＡＶＡ３．３、ＡＡＶＡ３．４、ＡＡＶＡ３．５、ＡＡＶＡ３．７、ＡＡＶＣ１、ＡＡＶＣ２、ＡＡＶＣ５、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶＦ３、ＡＡＶＦ５、ＡＡＶＨ２、ＡＡＶｒｈ．７２、ＡＡＶｈｕ．８、ＡＡＶｒｈ．６８、ＡＡＶｒｈ．７０、ＡＡＶｐｉ．１、ＡＡＶｐｉ．３、ＡＡＶｐｉ．２、ＡＡＶｒｈ．６０、ＡＡＶｒｈ．４４、ＡＡＶｒｈ．６５、ＡＡＶｒｈ．５５、ＡＡＶｒｈ．４７、ＡＡＶｒｈ．６９、ＡＡＶｒｈ．４５、ＡＡＶｒｈ．５９、ＡＡＶｈｕ．１２、ＡＡＶＨ６、ＡＡＶＬＫ０３、ＡＡＶＨ−１／ｈｕ．１、ＡＡＶＨ−５／ｈｕ．３、ＡＡＶＬＧ−１０／ｒｈ．４０、ＡＡＶＬＧ−４／ｒｈ．３８、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶＮ７２１−８／ｒｈ．４３、ＡＡＶＣｈ．５、ＡＡＶＣｈ．５Ｒ１、ＡＡＶｃｙ．２、ＡＡＶｃｙ．３、ＡＡＶｃｙ．４、ＡＡＶｃｙ．５、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ１、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ２、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ３、ＡＡＶＣｙ．５Ｒ４、ＡＡＶｃｙ．６、ＡＡＶｈｕ．１、ＡＡＶｈｕ．２、ＡＡＶｈｕ．３、ＡＡＶｈｕ．４、ＡＡＶｈｕ．５、ＡＡＶｈｕ．６、ＡＡＶｈｕ．７、ＡＡＶｈｕ．９、ＡＡＶｈｕ．１０、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．１３、ＡＡＶｈｕ．１５、ＡＡＶｈｕ．１６、ＡＡＶｈｕ．１７、ＡＡＶｈｕ．１８、ＡＡＶｈｕ．２０、ＡＡＶｈｕ．２１、ＡＡＶｈｕ．２２、ＡＡＶｈｕ．２３．２、ＡＡＶｈｕ．２４、ＡＡＶｈｕ．２５、ＡＡＶｈｕ．２７、ＡＡＶｈｕ．２８、ＡＡＶｈｕ．２９、ＡＡＶｈｕ．２９Ｒ、ＡＡＶｈｕ．３１、ＡＡＶｈｕ．３２、ＡＡＶｈｕ．３４、ＡＡＶｈｕ．３５、ＡＡＶｈｕ．３７、ＡＡＶｈｕ．３９、ＡＡＶｈｕ．４０、ＡＡＶｈｕ．４１、ＡＡＶｈｕ．４２、ＡＡＶｈｕ．４３、ＡＡＶｈｕ．４４、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４４Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４５、ＡＡＶｈｕ．４６、ＡＡＶｈｕ．４７、ＡＡＶｈｕ．４８、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ１、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ２、ＡＡＶｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶｈｕ．４９、ＡＡＶｈｕ．５１、ＡＡＶｈｕ．５２、ＡＡＶｈｕ．５４、ＡＡＶｈｕ．５５、ＡＡＶｈｕ．５６、ＡＡＶｈｕ．５７、ＡＡＶｈｕ．５８、ＡＡＶｈｕ．６０、ＡＡＶｈｕ．６１、ＡＡＶｈｕ．６３、ＡＡＶｈｕ．６４、ＡＡＶｈｕ．６６、ＡＡＶｈｕ．６７、ＡＡＶｈｕ．１４／９、ＡＡＶｈｕ．ｔ  １９、ＡＡＶｒｈ．２、ＡＡＶｒｈ．２Ｒ、ＡＡＶｒｈ．８、ＡＡＶｒｈ．８Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１０、ＡＡＶｒｈ．１２、ＡＡＶｒｈ．１３、ＡＡＶｒｈ．１３Ｒ、ＡＡＶｒｈ．１４、ＡＡＶｒｈ．１７、ＡＡＶｒｈ．１８、ＡＡＶｒｈ．１９、ＡＡＶｒｈ．２０、ＡＡＶｒｈ．２１、ＡＡＶｒｈ．２２、ＡＡＶｒｈ．２３、ＡＡＶｒｈ．２４、ＡＡＶｒｈ．２５、ＡＡＶｒｈ．３１、ＡＡＶｒｈ．３２、ＡＡＶｒｈ．３３、ＡＡＶｒｈ．３４、ＡＡＶｒｈ．３５、ＡＡＶｒｈ．３６、ＡＡＶｒｈ．３７、ＡＡＶｒｈ．３７Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．３８、ＡＡＶｒｈ．３９、ＡＡＶｒｈ．４０、ＡＡＶｒｈ．４６、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｒｈ．４８．１、ＡＡＶｒｈ．４８．１．２、ＡＡＶｒｈ．４８．２、ＡＡＶｒｈ．４９、ＡＡＶｒｈ．５１、ＡＡＶｒｈ．５２、ＡＡＶｒｈ．５３、ＡＡＶｒｈ．５４、ＡＡＶｒｈ．５６、ＡＡＶｒｈ．５７、ＡＡＶｒｈ．５８、ＡＡＶｒｈ．６１、ＡＡＶｒｈ．６４、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ１、ＡＡＶｒｈ．６４Ｒ２、ＡＡＶｒｈ．６７、ＡＡＶｒｈ．７３、ＡＡＶｒｈ．７４、ＡＡＶｒｈ８Ｒ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ａ５８６Ｒ  ｍｕｔａｎｔ、ＡＡＶｒｈ８Ｒ  Ｒ５３３Ａ  ｍｕｔａｎｔ、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ｃａｐｒｉｎｅ  ＡＡＶ、ｂｏｖｉｎｅ  ＡＡＶ、ＡＡＶｈＥ１．１、ＡＡＶｈＥｒ１．５、ＡＡＶｈＥＲ１．１４、ＡＡＶｈＥｒ１．８、ＡＡＶｈＥｒ１．１６、ＡＡＶｈＥｒ１．１８、ＡＡＶｈＥｒ１．３５、ＡＡＶｈＥ���１．７、ＡＡＶｈＥｒ１．３６、ＡＡＶｈＥｒ２．２９、ＡＡＶｈＥｒ２．４、ＡＡＶｈＥｒ２．１６、ＡＡＶｈＥｒ２．３０、ＡＡＶｈＥｒ２．３１、ＡＡＶｈＥｒ２．３６、ＡＡＶｈＥＲ１．２３、ＡＡＶｈＥｒ３．１、ＡＡＶ２．５Ｔ、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ、ＡＡＶ−ＬＫ０１、ＡＡＶ−ＬＫ０２、ＡＡＶ−ＬＫ０３、ＡＡＶ−ＬＫ０４、ＡＡＶ−ＬＫ０５、ＡＡＶ−ＬＫ０６、ＡＡＶ−ＬＫ０７、ＡＡＶ−ＬＫ０８、ＡＡＶ−ＬＫ０９、ＡＡＶ−ＬＫ１０、ＡＡＶ−ＬＫ１１、ＡＡＶ−ＬＫ１２、ＡＡＶ−ＬＫ１３、ＡＡＶ−ＬＫ１４、ＡＡＶ−ＬＫ１５、  ＡＡＶ−ＬＫ１６、ＡＡＶ−ＬＫ１７、ＡＡＶ−ＬＫ１８、ＡＡＶ−ＬＫ１９、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ２、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ４、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ６、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ７、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ８、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１１、ＡＡＶ−ＰＡＥＣ１２、ＡＡＶ−２−ｐｒｅ−ｍｉＲＮＡ−１０１、ＡＡＶ−８ｈ、ＡＡＶ−８ｂ、ＡＡＶ−ｈ、ＡＡＶ−ｂ、ＡＡＶ  ＳＭ  １０−２、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １００−１、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １００−３、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １００−７、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １０−２、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １０−６、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １０−８、ＡＡＶ  Ｓｈｕｆｆｌｅ  １００−２、ＡＡＶ  ＳＭ  １０−１、ＡＡＶ  ＳＭ  １０−８、ＡＡＶ  ＳＭ  １００−３、ＡＡＶ  ＳＭ  １００−１０、ＢＮＰ６１  ＡＡＶ、ＢＮＰ６２  ＡＡＶ、ＢＮＰ６３  ＡＡＶ、ＡＡＶｒｈ．５０、ＡＡＶｒｈ．４３、ＡＡＶｒｈ．６２、ＡＡＶｒｈ．４８、ＡＡＶｈｕ．１９、ＡＡＶｈｕ．１１、ＡＡＶｈｕ．５３、ＡＡＶ４−８／ｒｈ．６４、ＡＡＶＬＧ−９／ｈｕ．３９、ＡＡＶ５４．５／ｈｕ．２３、ＡＡＶ５４．２／ｈｕ．２２、ＡＡＶ５４．７／ｈｕ．２４、ＡＡＶ５４．１／ｈｕ．２１、ＡＡＶ５４．４Ｒ／ｈｕ．２７、ＡＡＶ４６．２／ｈｕ．２８、ＡＡＶ４６．６／ｈｕ．２９、ＡＡＶ１２８．１／ｈｕ．４３、ｔｒｕｅ  ｔｙｐｅ  ＡＡＶ  （ｔｔＡＡＶ）、ＵＰＥＮＮ  ＡＡＶ  １０、Ｊａｐａｎｅｓｅ  ＡＡＶ  １０  ｓｅｒｏｔｙｐｅｓ、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．１、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．１０、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．２、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．７、ＡＡＶ  ＣＢｒ−７．８、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｂ７．３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｂ７．４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ１、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ２、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ３、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ４、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−ｅ５、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ６、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ７、ＡＡＶ  ＣＢｒ−Ｅ８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−２、ＡＡＶ  ＣＨｔ−３、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．１０、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．５、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．６、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．７、ＡＡＶ  ＣＨｔ−６．８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ１、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ２、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ５、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ６、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ８、ＡＡＶ  ＣＨｔ−Ｐ９、ＡＡＶ  ＣＫｄ−１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−１０、ＡＡＶ  ＣＫｄ−２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−７、ＡＡＶ  ＣＫｄ−８、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−���３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ５、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ７、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｂ８、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ１、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ２、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ５、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｈ６、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ３、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ４、ＡＡＶ  ＣＫｄ−Ｎ９、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ１、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ２、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ３、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ４、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ５、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ６、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ７、ＡＡＶ  ＣＬｇ−Ｆ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−１、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−１０、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１２、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−１３、ＡＡＶ  ＣＬｖ１−４、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−７、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−８、ＡＡＶ  Ｃｌｖ１−９、ＡＡＶ  ＣＬｖ−２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｄ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｅ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｋ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｌ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ１１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｍ９、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ１、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ２、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ３、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ４、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ５、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ６、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ７、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ８、ＡＡＶ  ＣＬｖ−Ｒ９、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１０、ＡＡＶ  ＣＳｐ−１１、ＡＡＶ  ＣＳｐ−２、ＡＡＶ  ＣＳｐ−３、ＡＡＶ  ＣＳｐ−４、ＡＡＶ  ＣＳｐ−６、ＡＡＶ  ＣＳｐ−７、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．１０、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．２、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．４、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．５、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．６、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．７、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．８、ＡＡＶ  ＣＳｐ−８．９、ＡＡＶ  ＣＳｐ−９、ＡＡＶ．ｈｕ．４８Ｒ３、ＡＡＶ．ＶＲ−３５５、ＡＡＶ３Ｂ
、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶＦ１／ＨＳＣ１、ＡＡＶＦ１１／ＨＳＣ１１、ＡＡＶＦ１２／ＨＳＣ１２、ＡＡＶＦ１３／ＨＳＣ１３、ＡＡＶＦ１４／ＨＳＣ１４、ＡＡＶＦ１５／ＨＳＣ１５、ＡＡＶＦ１６／ＨＳＣ１６、ＡＡＶＦ１７／ＨＳＣ１７、ＡＡＶＦ２／ＨＳＣ２、ＡＡＶＦ３／ＨＳＣ３、ＡＡＶＦ４／ＨＳＣ４、ＡＡＶＦ５／ＨＳＣ５、ＡＡＶＦ６／ＨＳＣ６、ＡＡＶＦ７／ＨＳＣ７、ＡＡＶＦ８／ＨＳＣ８、ＡＡＶＦ９／ＨＳＣ９、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ、Ｇ２Ｂ−２６、Ｇ２Ｂ−１３、ＴＨ１．１−３２、ＴＨ１．１−３５、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、ＡＡＶＧ２Ｂ５、およびこれらのバリアントからなる群から選択されてもよい。
【００２８】
一部の態様において、ＡＬＳは、ＳＯＤ１突然変異に結び付けられる家族性ＡＬＳである。他の態様において、必ずしも遺伝子突然変異の結果ではないが、ＡＬＳは、ＳＯＤ１タンパク質の異常凝集またはＳＯＤ１タンパク質機能若しくは局在化の混乱により特徴付けられる孤発性ＡＬＳである。本方法によって改善されるＡＬＳの症状としては、運動ニューロン変性、筋力低下、筋肉の硬直、不明瞭発語および／または呼吸困難を挙げることができる。
【００２９】
一部の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖若しくはｄｓＲＮＡまたはかかるｓｉＲＮＡコード分子を含むＡＡＶベクターは、対象の中枢神経系に直接、例えば頭蓋内注射によって導入されてもよい。
【００３０】
一部の実施形態において、本発明の医薬組成物は単独療法として使用される。他の実施形態において、本発明の医薬組成物は併用療法で使用される。併用療法は、運動ニューロン変性に対するそれらの神経保護効果に関して試験済みの、小分子化合物、成長因子およびホルモンなどの１つ以上の神経保護剤との併用であってもよい。
【００３１】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるプラスミドまたはＡＡＶベクターの治療有効量をそれを必要としている対象に投与することによって筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療または改善する方法を提供する。ＡＬＳは、家族性ＡＬＳまたは孤発性ＡＬＳであってもよい。
【００３２】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるプラスミドまたはＡＡＶベクターの治療有効量をそれを必要としている対象に投与することによって、イヌ変性性脊髄症（ＤＭ）を治療または改善する方法を提供する。
【００３３】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるプラスミドまたはＡＡＶベクターの治療有効量をそれを必要としている対象に投与して、対象のニューロフィラメント軽鎖（ＮＦ−Ｌ）レベルを低下させることによって、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療または改善する方法を提供する。
【００３４】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるプラスミドまたはＡＡＶベクターの治療有効量をそれを必要としている対象に投与して、対象のニューロフィラメント軽鎖（ＮＦ−Ｌ）レベルを低下させることによって、イヌ変性性脊髄症（ＤＭ）を治療または改善する方法を提供する。
【００３５】
一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されるプラスミドまたはＡＡＶベクターの治療有効量をそれを必要としている対象に投与することによって、対象のニューロフィラメント軽鎖（ＮＦ−Ｌ）レベルを低下させる方法を提供する。
【００３６】
前出の目的、特徴、および利点ならびに他の目的、特徴、および利点は、付属の図面において例示される、本発明の特定の実施形態についての以下の説明から明らかになるであろう。図面は、必ずしも縮尺通りではなく、本発明の多様な実施形態についての原理を例示することに強調を置いている。
【図面の簡単な説明】
【００３７】
【図１】クアンテリックス（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）社製Ｓｉｍｏａ  ｈＮＦ−Ｌ（ベータ）アッセイのためのＮＦ−Ｌの検量線を示す図。
【図２Ａ】正常イヌのＣＳＦにおけるＮＦ−Ｌの安定性を示す図。ｐｇ／ｍｌでのＮＦ−Ｌの安定性を示す。
【図２Ｂ】正常イヌのＣＳＦにおけるＮＦ−Ｌの安定性を示す図。−８０℃対照のパーセントとしての安定性を示す。
【図３Ａ】正常イヌの血清におけるＮＦ−Ｌの安定性を示す図。ｐｇ／ｍｌでのＮＦ−Ｌの安定性を示す。
【図３Ｂ】正常イヌの血清におけるＮＦ−Ｌの安定性を示す図。−８０℃対照のパーセントとしての安定性を示す。
【図４Ａ】ＤＭイヌにおけるＮＦ−Ｌレベルを示すヒストグラム。ＣＳＦにおけるＮＦ−Ｌレベルを示す。
【図４Ｂ】ＤＭイヌにおけるＮＦ−Ｌレベルを示すヒストグラム。血清におけるＮＦ−Ｌレベルを示す。
【図５Ａ】ＤＭイヌにおけるｐＮＦ−Ｈレベルを示すヒストグラム。ｐＮＦ−Ｈレベルが、ＤＭイヌのＣＳＦにおいて増加することを示す。
【図５Ｂ】ＤＭイヌにおけるｐＮＦ−Ｈレベルを示すヒストグラム。ＣＳＦにおけるｐＮＦ−Ｈレベルが疾患重症度と相関しないことを示す。
【図５Ｃ】ＤＭイヌにおけるｐＮＦ−Ｈレベルを示すヒストグラム。ＣＳＦにおけるｐＮＦ−ＨがＤＭに特異的であることを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３８】
本発明は、治療剤としてのＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドに関する。ＲＮＡ干渉媒介性遺伝子サイレンシングは、遺伝子発現を特異的に阻害することができる。したがって、本発明は、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）分子（低分子干渉ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡおよびそれらの前駆体などのポリヌクレオチド、かかるポリヌクレオチドを包含する医薬組成物、ならびにそれらの設計プロセスを提供する。また、本発明は、神経変性疾患、特に筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療するための、ＳＯＤ１遺伝子発現およびタンパク質産生を阻害するためのそれらの使用方法を提供する。
【００３９】
本発明の１つ以上の実施形態の詳細が下記の添付の説明に示される。本発明の実施または試験においては本明細書に記載されるものと同様のまたは等価な任意の材料および方法を使用し得るが、ここで好ましい材料および方法について説明する。本発明の他の特徴、目的および利点が、この説明から明らかになるであろう。説明においては、文脈上特に明確に指示されない限り、単数形に複数形も含まれる。特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が属する技術分野の当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。矛盾が生じた場合、本説明が優先するものとする。
【００４０】
筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）およびＳＯＤ１
成人発症型神経変性障害である筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）とは、運動皮質、脳幹、および脊髄における運動ニューロンの選択的死を特徴とする、進行性かつ致死性の疾患である。ＡＬＳと診断された患者は、痙縮、反射亢進または反射低下、線維束性攣縮、筋肉萎縮、および麻痺を特徴とする、進行性の筋肉表現型を発現する。これらの運動機能障害は、運動ニューロンの喪失に起因する、筋肉の除神経により引き起こされる。ＡＬＳの、主要な病理学的特徴は、皮質脊髄路の変性および下位運動ニューロン（ＬＭＮ）または前角細胞の広範囲にわたる喪失（ガタクら（Ｇｈａｔａｋ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ  Ｅｘｐ  Ｎｅｕｒｏｌ．、１９８６、４５、３８５〜３９５）、一次運動野内のベッツ細胞および他の錐体細胞の変性および喪失（宇高ら（Ｕｄａｋａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ、１９８６、７０、２８９〜２９５；前川ら（Ｍａｅｋａｗａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｂｒａｉｎ、２００４、１２７、１２３７〜１２５１）、ならびに運動皮質および脊髄における反応性のグリオーシス（川又ら（Ｋａｗａｍａｔａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｍ  Ｊ  Ｐａｔｈｏｌ．、１９９２、１４０、６９１〜７０７；およびシッファーら（Ｓｃｈｉｆｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．、１９９６、１３９、２７〜３３）を含む。ＡＬＳは通例、呼吸器の不全および／または炎症に起因する診断後３〜５年以内に致死性となる（ローランドＬＰおよびシュナイダーＮＡ（Ｒｏｗｌａｎｄ  ＬＰおよびＳｈｎｅｉｂｄｅｒ  ＮＡ）、Ｎ  Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．、２００１、３４４、１６８８〜１７００）。
【００４１】
ＡＬＳの細胞の特徴は、変性しつつある運動ニューロンおよび周囲の細胞（例えば、アストロサイト）における、タンパク質性封入体、ユビキチン化封入体、細胞質性封入体の存在である。ユビキチン化封入体（すなわち、レビー小体様封入体または糸くず様封入体）は、ＡＬＳにおいて、最も一般的かつ特異的なタイプの封入体であり、脊髄および脳幹のＬＭＮ内、ならびに皮質脊髄の上位運動ニューロン（ＵＭＮ）内において見出される（松本ら（Ｍａｔｓｕｍｏｔｏ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｓｃｉ．、１９９３、１１５、２０８〜２１３；および佐々木および丸山（Ｓａｓａｋ  ａｎｄ  Ｍａｒｕｙａｍａ）、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、１９９４、８７、５７８〜５８５）。ユビキチン、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１）、ペリフェリン、およびドルフィンを含む、少数のタンパク質が、封入体の構成要素であると同定されている。神経フィラメント性封入体は、ＡＬＳの脊髄運動ニューロン内の、集塊状ヒアリン封入体（ＨＣＩ）および軸索「スフェロイド」において見出されることが多い。他のタイプの、それほど特殊ではない封入体は、皮質の上層における、ブニナ小体（シスタチンＣ含有封入体）および三日月形封入体（ＳＣＩ）を含む。ＡＬＳにおいて見られる、他の神経病理学的特徴は、ゴルジ装置の断片化、ミトコンドリア空胞変性、およびシナプス末端の超構造的異常を含む（藤田ら（Ｆｕｊｉｔａ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｃｔａ  Ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌ．、２００２、１０３、２４３〜２４７）。
【００４２】
加えて、前頭側頭型認知症性ＡＬＳ（ＦＴＤ−ＡＬＳ）において、ＦＴＤ−ＡＬＳ患者において、認知機能障害を引き起こし得る皮質萎縮（前頭葉および側頭葉を含む）もまた観察される。
【００４３】
ＡＬＳは、複雑かつ多因子性の疾患であり、ＡＬＳの発症機序の一因となると仮定された複数の機構は、タンパク質分解の機能不全、グルタミン酸興奮毒性、ミトコンドリアの機能不全、アポトーシス、酸化ストレス、炎症、タンパク質のミスフォールディングおよび凝集、ＲＮＡ代謝の異常、および遺伝子発現の変更を含む。
【００４４】
ＡＬＳ症例のうちの約１０％は、疾患の家族歴を有し、これらの患者を、一般に、メンデルの優性遺伝方式および高浸透度を伴う、家族性ＡＬＳ（ｆＡＬＳ）患者または遺伝性患者と称する。残り（約９０％〜９５％）は、家族歴の記録と関連せず、環境因子、遺伝子的多型、体細胞の突然変異、および、おそらく、遺伝子−環境相互作用を含む、他の危険性因子に起因すると考えられるので、孤発性ＡＬＳ（ｓＡＬＳ）として分類される。大半の症例において、家族性（または遺伝性）ＡＬＳは、常染色体優性疾患として、遺伝性であるが、常染色体劣性遺伝およびＸ連鎖遺伝ならびに不完全な浸透度を伴う家系も存在する。孤発性形態と家族性形態とは、臨床的に識別不可能であることから、共通の発症機序が示唆される。ＡＬＳにおける、運動ニューロンの選択的死の正確な原因は、理解しがたいままである。ｆＡＬＳにおける遺伝的因子の理解が進むと、疾患の両方の形態に対して、光を投げかけ得る。
【００４５】
近年、ＡＬＳの遺伝的原因に対する探索は、ｆＡＬＳを引き起こすことが公知の、１０超の、異なる遺伝子における突然変異を発見した。最も一般的な突然変異は、Ｃｕ／Ｚｎスーパーオキシドジスムターゼ１（ＳＯＤ１；約２０％）（ローゼンＤＲら（Ｒｏｓｅｎ  ＤＲ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔｕｒｅ、１９９３、３６２、５９〜６２）、ＦＵＳ／ＴＬＳ（ｆｕｓｅｄ  ｉｎ  ｓａｒｃｏｍａ／ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ  ｉｎ  ｌｉｐｏｓａｒｃｏｍａ；１〜５％）、およびＴＤＰ−４３（ＴＡＲＤＢＰ；１〜５％）をコードする遺伝子内に見出される。近年、Ｃ９ｏｒＦ７２遺伝子内の、ヘキサヌクレオチドリピート（ＧＧＧＧＣＣ）ｎの伸長が、欧米人口において、ｆＡＬＳの最も高頻度（約４０％）の原因として同定された（レントンら（Ｒｅｎｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔ．Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１４、１７、１７〜２３により総説されている）。ＡＬＳにおいて突然変異している他の遺伝子は、アルシン（ＡＬＳ２）、セナタキシン（ＳＥＴＸ）、小胞関連膜タンパク質（ＶＡＰＢ）、アンギオゲニン（ＡＮＧ）を含む。ｆＡＬＳ遺伝子は、異なる細胞機構を制御することから、ＡＬＳの発症機序が、複雑であり、最終的に、運動ニューロン変性をもたらす、幾つかの異なる過程に関し得ることが示唆される。
【００４６】
ＳＯＤ１は、哺乳動物において同定され、特徴付けられた、３つのヒトスーパーオキシドジスムターゼ：銅−亜鉛スーパーオキシドジスムターゼ（Ｃｕ／ＺｎＳＯＤまたはＳＯＤ１）、マンガンスーパーオキシドジスムターゼ（ＭｎＳＯＤまたはＳＯＤ２）、および細胞外スーパーオキシドジスムターゼ（ＥＣＳＯＤまたはＳＯＤ３）のうちの１つである。ＳＯＤ１は、ヒト第２１染色体上のＳＯＤ１遺伝子（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００４５４．４；配列番号１）によりコードされる、サブユニット１つ当たり１つの銅結合部位と、１つの亜鉛結合部位とを伴う、３２ｋＤａのホモ二量体による、１５３残基のポリペプチドである（表１０を参照のこと）。ＳＯＤ１は、結合した銅イオンにおける、スーパーオキシドアニオン（Ｏ２−）の、酸素分子（Ｏ２）および過酸化水素（Ｈ２Ｏ２）への反応を触媒する。ＳＯＤ１の細胞内濃度は、高濃度（１０〜１００μＭの範囲）であり、中枢神経系（ＣＮＳ）内の全タンパク質含量のうちの１％を占める。タンパク質は、真核細胞内の細胞質だけでなく、また、核、リソソーム、ペルオキシソーム、およびミトコンドリア膜間腔においても局在化する（リンデナウ  Ｊら（Ｌｉｎｄｅｎａｕ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｇｌｉａ、２０００、２９、２５〜３４）。
【００４７】
ＳＯＤ１遺伝子内の突然変異は、ｆＡＬＳ患者のうちの１５〜２０％および、全てのＡＬＳ症例のうちの１〜２％により保有されている。現在のところ、１５３アミノ酸のＳＯＤ１ポリペプチド全体にわたって分布する、少なくとも１７０の異なる突然変異が、ＡＬＳを引き起こすことが見出されており、ＡＬＳ  Ｏｎｌｉｎｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｄａｔａｂａｓｅにおいて、最新のリストを見出すことができる（ＡＬＳＯＤ）（ローＲら（Ｗｒｏｅ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．）、Ａｍｙｏｔｒｏｐｈ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ．、２００８、９、２４９〜２５０）。表１は、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１内の突然変異の一部の例を列挙する。これらの突然変異は、欠失、挿入、およびＣ末端の切断もまた生じるが、主に、単一のアミノ酸置換（すなわち、ミスセンス突然変異）である。異なるＳＯＤ１突然変異は、異なる領域的分布パターンを提示する。例えば、ＳＯＤ１遺伝子の突然変異により引き起こされるＡＬＳを伴う、全ての米国人のうちの約半分は、特定の突然変異であるＡｌａ４Ｖａｌ（またはＡ４Ｖ）を有する。Ａ４Ｖ突然変異は、典型的に、より重度の徴候および症状と関連する。Ｉ１１３Ｔ突然変異は、英国において、極めて一般的な突然変異である。欧州において最も蔓延する突然変異は、Ｄ９０Ａ置換である。
【００４８】
【表１】
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ＳＯＤ１遺伝子の欠損と関連するニューロン死の機構について研究するため、当技術分野では、ＳＯＤ１と連関するＡＬＳについての幾つかの齧歯動物モデルであって、ミスセンス突然変異、小規模な欠失、または挿入を含む、様々な突然変異を伴うヒトＳＯＤ１遺伝子を発現する齧歯動物モデルが開発された。ＡＬＳマウスモデルの一部の例は、ＳＯＤ１Ｇ９３Ａ、ＳＯＤ１Ａ４Ｖ、ＳＯＤ１Ｇ３７Ｒ、ＳＯＤ１Ｇ８５Ｒ、ＳＯＤ１Ｄ９０Ａ、ＳＯＤ１Ｌ８４Ｖ、ＳＯＤ１Ｉ１１３Ｔ、ＳＯＤ１Ｈ３６Ｒ／Ｈ４８Ｑ、ＳＯＤ１Ｇ１２７Ｘ、ＳＯＤ１Ｌ１２６Ｘ、およびＳＯＤ１Ｌ１２６ｄｅｌＴＴを含む。２つの異なるヒトＳＯＤ１突然変異：ＳＯＤ１Ｈ４６ＲおよびＳＯＤ１Ｇ９３Ｒを保有する、２つのトランス遺伝子ラットモデルが存在する。これらの齧歯動物ＡＬＳモデルは、ヒトＡＬＳ患者と同様の筋力低下、およびヒト疾患の幾つかの特徴、特に、脊髄運動ニューロンの選択的死、タンパク質封入体の、運動ニューロン内の凝集、およびマイクログリアの活性化を反映する、他の病原性の特徴を発症し得る。当技術分野では、トランスジェニック齧歯動物が、ヒトＳＯＤ１関連ＡＬＳ疾患の良好なモデルであり、疾患の発症機序について研究し、疾患の治療を開発するためのモデルをもたらすことが周知である。
【００４９】
動物モデルおよび細胞モデルにおける研究は、ＳＯＤ１の病原性バリアントが、機能獲得により、ＡＬＳを引き起こすことを示した。すなわち、スーパーオキシドジスムターゼ酵素は、ＳＯＤ１突然変異により変更されると、新規であるが有害な特性を獲得する。例えば、ＡＬＳにおける、一部のＳＯＤ１突然変異バリアントは、レドックスサイクルの破壊により、酸化ストレスを増大させる（例えば、毒性スーパーオキシドラジカルの蓄積の増大）。他の研究はまた、ＡＬＳにおける、一部のＳＯＤ１突然変異バリアントが、その正常な生理学的機能から独立した毒性特性（ミスフォールディングしたＳＯＤ１バリアントの異常な凝集など）を獲得し得ることも指し示す。異常レドックス化学反応モデルにおいて、突然変異体ＳＯＤ１は、不安定であり、異常化学反応を介して、通常とは異なる基質と相互作用し、反応性酸素分子種（ＲＯＳ）の過剰産生を引き起こす。タンパク質毒性モデルにおいて、不安定な、ミスフォールディングＳＯＤ１は、細胞質性封入体へと凝集し、細胞過程に重要なタンパク質を隔離してしまう。これらの２つの仮説は、相互に排除的ではない。活性部位内の金属に結合する、選択されたヒスチジン残基の酸化が、ＳＯＤ１の凝集を媒介することが示されている。
【００５０】
凝集した突然変異体ＳＯＤ１タンパク質はまた、ミトコンドリア機能不全（ベービライネンら（Ｖｅｈｖｉｌａｉｎｅｎ  Ｐ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１４、８、１２６）、軸索輸送の機能障害、ＲＮＡ代謝の異常、グリア細胞病態、およびグルタミン酸興奮毒性も誘導し得る。一部の孤発性ＡＬＳ症例において、ミスフォールディングした野生型ＳＯＤ１タンパク質は、家族性ＡＬＳと連関するＳＯＤ１バリアントと同様の「毒性コンフォメーション」を形成する、罹患運動ニューロン内に見出される（ロトゥンノＭＳおよびボスコＤＡ（Ｒｏｔｕｎｎｏ  ＭＳ  ａｎｄ  Ｂｏｓｃｏ  ＤＡ）、Ｆｒｏｎｔ  Ｃｅｌｌ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２０１３、１６、７、２５３）。このような証拠は、ＡＬＳが、アルツハイマー病およびパーキンソン病など、他の神経変性疾患と類似する、タンパク質フォールディングの疾患であることを示唆する。
【００５１】
現在のところ、ＡＬＳを患う患者には、治癒的治療が利用可能でない。グルタミン酸放出の阻害剤である、唯一のＦＤＡ承認薬のリルゾール（リルテックとも呼ばれる）は、ＡＬＳに対して、中程度の効果を及ぼすが、１８カ月間にわたり服用した場合に、生存を、２〜３カ月間延長するに過ぎない。残念ながら、リルゾールを服用する患者は、疾患進行の緩徐化または筋肉機能の改善を一切経ない。したがって、リルゾールは、治癒も、有効な治療すらも提示しない。研究者らは、より良好な治療剤の探求を続けている。
【００５２】
異常なＳＯＤ１タンパク質凝集を阻害するための１つの手法は、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１遺伝子の発現をサイレンシングする／阻害することである。突然変異対立遺伝子の特異的な遺伝子サイレンシングのための低分子干渉ＲＮＡが、ＡＬＳの治療に治療的に有益であることが報告されている（例えば、それらの各々の内容が、参照によりそれらの全体において本明細書に援用される、ラルフＧＳら（Ｒａｌｇｈ  ＧＳ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００５、１１（４）、４２９〜４３３；およびラウールＣら（Ｒａｏｕｌ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎａｔ．Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００５、１１（４）、４２３〜４２８；およびマックスウェルＭＭら（Ｍａｘｗｅｌｌ  ＭＭ  ｅｔ  ａｌ．）、ＰＮＡＳ、２００４、１０１（９）、３１７８〜３１８３；およびディング  Ｈら（Ｄｉｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｃｈｉｎｅｓｅ  Ｍｅｄｉｃａｌ  Ｊ．、２０１１、１２４（１）、１０６〜１１０；およびシュワルツＤＳら（Ｓｃｈａｒｚ  ＤＳ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｐｌｏｓ  Ｇｅｎｅｔ．、２００６、２（９）、ｅ１４０）。
【００５３】
当技術分野では、ＳＯＤ１遺伝子を標的とし、ＡＬＳにおけるＳＯＤ１の発現を調節する他の多くのＲＮＡ治療剤も教示されており、のようなＲＮＡベースの薬剤は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよび二本鎖低分子干渉ＲＮＡを含む。例えば、それらの各々の内容が、参照によりその全体において本明細書に援用される、ワンＨら（Ｗａｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２００８、２８３（２３）、１５８４５〜１５８５２；米国特許第７，４９８，３１６号明細書；同第７，６３２，９３８号明細書；同第７，６７８，８９５号明細書；同第７，９５１，７８４号明細書；同第７，９７７，３１４号明細書；同第８，１８３，２１９号明細書；同第８，３０９，５３３号明細書および同第８，５８６，５５４号明細書；および米国特許出願公開第２００６／０２２９２６８号明細書および同第２０１１／０２６３６８０号明細書を参照されたい。
【００５４】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターなどのウイルスベクターを用いて、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを高効率で細胞に送達する。ＲＮＡｉ分子、例えば本発明のｓｉＲＮＡ分子を含むＡＡＶベクターは、運動ニューロンへの活性薬剤の送達を増加させ得る。ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは、細胞内のＳＯＤ１遺伝子の発現（例えば、ｍＲＮＡレベル）を、著明に阻害することが可能であってもよく；したがって、タンパク質の凝集および封入体の形成、フリーラジカルの増大、ミトコンドリア機能不全、ならびにＲＮＡ代謝など、ＳＯＤ１の発現に誘導される、細胞内のストレスを改善する。
【００５５】
かかるＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチド阻害は、ＡＬＳの治療のために使用され得る。本発明によれば、患者のＡＬＳを治療および／または改善する方法であって、患者に対して、１つ以上のｓｉＲＮＡ二重鎖をコードする少なくとも１つのＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドの有効量を細胞に投与すること、およびＳＯＤ１遺伝子発現の阻害／サイレンシングを可能にすることを含む方法が提供される。
【００５６】
本発明の組成物
ベクター
一部の実施形態において、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ分子は、プラスミドまたはウイルスベクターなどのベクターに挿入されてもよくまたはコードされてもよい。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、ウイルスベクターに挿入またはコードされる。
【００５７】
ウイルスベクターは、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ベクター、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、およびレンチウイルスベクターなどであってもよい。一部の特定の実施形態において、ウイルスベクターはＡＡＶベクターである。
【００５８】
レトロウイルスベクター
一部の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖は、レトロウイルスベクターよりコードされてもよい（例えば、米国特許第５，３９９，３４６号明細書；同第５，１２４，２６３号明細書；同第４，６５０，７６４号明細書および同第４，９８０，２８９号明細書を参照のこと；これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
【００５９】
アデノウイルスベクター
アデノウイルスは、インビボで核酸を様々な細胞タイプへと効率的に送達するように修飾することができる真核生物ＤＮＡウイルスであり、遺伝子を神経細胞へと標的化するためのものを含む遺伝子治療プロトコールにて広範に使用されている。種々の複製欠損アデノウイルスおよび最小アデノウイルスベクターが、核酸療法剤に関して記載されている（例えば、国際公開第１９９４２６９１４号パンフレット、国際公開第１９９５０２６９７号パンフレット、国際公開第１９９４２８１５２号パンフレット、国際公開第１９９４１２６４９号パンフレット、国際公開第１９９５０２６９７号パンフレット、国際公開第１９９６２２３７８号パンフレットを参照のこと；これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）。かかるアデノウイルスベクターも、本発明のｓｉＲＮＡ分子の細胞への送達に使用し得る。
【００６０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター
ＡＡＶは、依存性パルボウイルスである。他のパルボウイルスと同様に、ＡＡＶは、複製に関与するタンパク質（Ｒｅｐ）およびカプシドの構造タンパク質（Ｃａｐ）をコードする２つのオープンリーディングフレームを含有する約５０００ヌクレオチド長のゲノムを有する一本鎖非エンベロープＤＮＡウイルスである。オープンリーディングフレームは、ウイルスゲノムの複製開始点としての役目を果たす２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）配列により隣接される。更に、ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶカプシドへのウイルスゲノムのパッケージングを可能にするパッケージング配列を含有する。ＡＡＶベクターには、感染細胞にて増殖性感染を起こすためのコヘルパー（例えば、アデノウイルス）が必要である。かかるヘルパー機能の非存在下では、ＡＡＶビリオンは、本質的に、宿主細胞に侵入し、細胞のゲノムに組み込まれる。
【００６１】
ＡＡＶベクターは、幾つかの固有特徴を有するため、ｓｉＲＮＡ送達について調査されている。これらの特徴としては、（ｉ）分裂細胞および非分裂細胞の両方に感染する能力；（ｉｉ）ヒト細胞を含む幅広い範囲の宿主に対する感染力；（ｉｉｉ）野生型ＡＡＶはいかなる疾患にもまったく関連付けられておらず、感染細胞で複製することができないこと；（ｉｖ）ベクターに対する細胞媒介性免疫応答の欠如および（ｖ）宿主染色体に組み込まれるかまたはエピゾーム的に存続し、それにより長期発現能力をもたらすことができることが挙げられる。更に、ＡＡＶベクターによる感染は、細胞遺伝子発現パターンの変化に及ぼす影響が最小限である（スティルウェル（Ｓｔｉｌｗｅｌｌ）およびサムルスキら（Ｓａｍｕｌｓｋｉ  ｅｔ  ａｌ．）著、バイオテクニックス（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ）、２００３年、第３４巻、ｐ．１４８）。
【００６２】
典型的には、ｓｉＲＮＡ送達用のＡＡＶベクターは、ウイルスゲノム内に機能的ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質をコードする配列を欠如するため複製欠損である組換えウイルスベクターであってもよい。ある場合には、欠損ＡＡＶベクターは、ほとんどのすべてのコード配列を欠如してもよく、本質的に、１つまたは２つのＡＡＶ  ＩＴＲ配列およびパッケージング配列のみを含有する。
【００６３】
また、ＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ）を含んでいてもよい。ｓｃＡＡＶベクターは、共にアニーリングして二本鎖ＤＮＡを形成する両方のＤＮＡ鎖を含有する。第２鎖の合成をスキップすることにより、ｓｃＡＡＶは、細胞において迅速に発現することが可能である。
【００６４】
ＡＡＶ粒子を作製および／または修飾する方法は、シュードタイプＡＡＶベクターなど、当該技術分野において開示されている（国際公開第２０００２８００４号パンフレット、同第２００１２３００１号パンフレット、同第２００４１１２７２７号パンフレット、同第２００５００５６１０号パンフレットおよび同第２００５０７２３６４号パンフレット、これらの各々の内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
【００６５】
ｓｉＲＮＡ分子を哺乳類細胞に送達するためのＡＡＶベクターは、限定はされないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８およびＡＡＶ−ＤＪを含む、ＡＡＶの種々の血清型から調製されてもよく、またはそれらに由来してもよい。ある場合には、異なるＡＡＶ血清型が共に、または他のタイプのウイルスと混合されることにより、キメラＡＡＶベクターが作製されてもよい。
【００６６】
ｓｉＲＮＡ送達用のＡＡＶベクターは、送達の効率を増強するように修飾されてもよい。ｓｉＲＮＡ発現カセットを含有するかかる修飾ＡＡＶベクターは、効率的にパッケージングすることができ、高頻度でおよび最低限の毒性で標的細胞への感染を成功させるために使用することができる。
【００６７】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖を送達するためのＡＡＶベクターは、ヒト血清型ＡＡＶベクターであってもよい。かかるヒトＡＡＶベクターは、任意の公知の血清型、例えば、血清型ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１１のいずれか１つに由来し得る。非限定的な例として、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１由来カプシドにＡＡＶ１由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ２由来ゲノムにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ４由来カプシドにＡＡＶ４由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ６由来カプシドにＡＡＶ６由来ゲノムを含むベクターまたはＡＡＶ９由来カプシドにＡＡＶ９由来ゲノムを含むベクターであってもよい。
【００６８】
他の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖を送達するためのＡＡＶベクターは、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型を起源とする配列および／または成分を含有するシュードタイプＡＡＶベクターであってもよい。シュードタイプＡＡＶベクターは、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノムと、少なくとも一部が異なるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質とを含むベクターであってもよい。非限定的な例として、かかるシュードタイプＡＡＶベクターは、ＡＡＶ１由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；またはＡＡＶ６由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；またはＡＡＶ４由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノム；もしくはＡＡＶ９由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクターであってもよい。
【００６９】
他の実施形態において、ＡＡＶベクターは、ｓｉＲＮＡ分子を中枢神経系に送達するために使用し得る（例えば、米国特許第６，１８０，６１３号明細書；この内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
【００７０】
一部の態様において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖を送達するためのＡＡＶベクターは、非ウイルス起源のペプチドを含む修飾カプシドを更に含んでもよい。他の態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖の脳および脊髄への送達を促進するため、ＡＡＶベクターはＣＮＳ特異的キメラカプシドを含んでもよい。例えば、ＣＮＳ向性を呈するＡＡＶバリアントからのｃａｐヌクレオチド配列のアラインメントを作成することにより可変領域（ＶＲ）配列および構造を同定してもよい。
【００７１】
ウイルスゲノム
一実施形態において、に示されるように、ＡＡＶ粒子は、ペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。
【００７２】
ウイルスゲノムサイズ
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、一本鎖または二本鎖ウイルスゲノムであってもよい。ウイルスゲノムのサイズは、小型、中型、大型または最大サイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【００７３】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、小型一本鎖ウイルスゲノムであってもよい。小型一本鎖ウイルスゲノムは、約２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、および３．５ｋｂサイズなど、２．７〜３．５ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、小型一本鎖ウイルスゲノムは３．２ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【００７４】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、小型二本鎖ウイルスゲノムであってもよい。小型二本鎖ウイルスゲノムは、約１．３、１．４、１．５、１．６、および１．７ｋｂサイズなど、１．３〜１．７ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、小型二本鎖ウイルスゲノムは１．６ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【００７５】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、中型一本鎖ウイルスゲノムであってもよい。中型一本鎖ウイルスゲノムは、約３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２および４．３ｋｂサイズなど、３．６〜４．３ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、中型一本鎖ウイルスゲノムは４．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【００７６】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、中型二本鎖ウイルスゲノムであってもよい。中型二本鎖ウイルスゲノムは、約１．８、１．９、２．０、および２．１ｋｂサイズなど、１．８〜２．１ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、中型二本鎖ウイルスゲノムは２．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【００７７】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、大型一本鎖ウイルスゲノムであってもよい。大型一本鎖ウイルスゲノムは、約４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、５．０、５．１、５．２、５．３、５．４、５．５、５．６、５．７、５．８、５．９および６．０ｋｂサイズなど、４．４〜６．０ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、大型一本鎖ウイルスゲノムは４．７ｋｂサイズであってもよい。別の非限定的な例として、大型一本鎖ウイルスゲノムは４．８ｋｂサイズであってもよい。更に別の非限定的な例として、大型一本鎖ウイルスゲノムは６．０ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【００７８】
一実施形態において、本明細書に記載されるペイロードを含むウイルスゲノムは、大型二本鎖ウイルスゲノムであってもよい。大型二本鎖ベクターゲノムは、約２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９および３．０ｋｂサイズなど、２．２〜３．０ｋｂサイズであってもよい。非限定的な例として、大型二本鎖ウイルスゲノムは２．４ｋｂサイズであってもよい。加えて、ウイルスゲノムはプロモータおよびポリＡテールを含み得る。
【００７９】
ウイルスゲノム成分：末端逆位配列（ＩＴＲ）
本発明のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのＩＴＲ領域とペイロード領域とを有するウイルスゲノムを含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは２つのＩＴＲを有する。これらの２つのＩＴＲは５’末端および３’末端でペイロード領域に隣接する。ＩＴＲは、複製のための認識部位を含む複製起点として働く。ＩＴＲは、相補的でかつ対称に配置され得る配列領域を含む。本発明のウイルスゲノムに組み込まれるＩＴＲは、天然に存在するポリヌクレオチド配列または組換え的に誘導されたポリヌクレオチド配列を含み得る。
【００８０】
ＩＴＲは、本明細書の血清型のいずれか、またはその誘導体から選択される、カプシドと同じ血清型に由来してもよい。ＩＴＲはカプシドと異なる血清型であってもよい。一実施形態において、ＡＡＶ粒子は２つ以上のＩＴＲを有する。非限定的な例では、ＡＡＶ粒子は、２つのＩＴＲを含むウイルスゲノムを有する。一実施形態において、ＩＴＲは互いに同じ血清型である。別の実施形態において、ＩＴＲは異なる血清型である。非限定的な例としては、ＩＴＲのうちゼロ個、一方または両方がカプシドと同じ血清型を有することが挙げられる。一実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムの両方のＩＴＲがＡＡＶ２  ＩＴＲである。
【００８１】
独立に、各ＩＴＲは約１００〜約１５０ヌクレオチド長であってもよい。ＩＴＲは、約１００〜１０５ヌクレオチド長、１０６〜１１０ヌクレオチド長、１１１〜１１５ヌクレオチド長、１１６〜１２０ヌクレオチド長、１２１〜１２５ヌクレオチド長、１２６〜１３０ヌクレオチド長、１３１〜１３５ヌクレオチド長、１３６〜１４０ヌクレオチド長、１４１〜１４５ヌクレオチド長または１４６〜１５０ヌクレオチド長であってもよい。一実施形態において、ＩＴＲは１４０〜１４２ヌクレオチド長である。ＩＴＲ長さの非限定的な例は、１０２、１４０、１４１、１４２、１４５ヌクレオチド長、およびそれと少なくとも９５％の同一性を有するものである。
【００８２】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフリップＩＴＲの５’末端の近傍に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフリップＩＴＲの３’末端の近傍に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。更に別の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフロップＩＴＲの５’末端の近傍に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。更に別の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフロップＩＴＲの３’末端の近傍に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてフリップＩＴＲの３’末端とフリップＩＴＲの５’末端との間に（例えば、フリップＩＴＲの５’末端とフロップＩＴＲの３’末端との間またはフロップＩＴＲの３’末端とフリップＩＴＲの５’末端との間の中間に）位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチド超以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチド超以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流に１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０ヌクレオチド以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流に１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から上流にあるヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％または２５％超以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてＩＴＲ（例えばフリップまたはフロップＩＴＲ）の５’または３’末端から下流に最初の１〜５％、１〜１０％、１〜１５％、１〜２０％、１〜２５％、５〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、１０〜１５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１５〜２０％、１５〜２５％、または２０〜２５％で位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。
【００８３】
ウイルスゲノム成分：プロモータ
一実施形態において、ウイルスゲノムのペイロード領域は、トランス遺伝子標的特異性および発現を増強する少なくとも１つのエレメントを含む（例えば、パウエル（Ｐｏｗｅｌｌ）ら著、「遺伝子療法におけるトランス遺伝子標的特異性および発現を増強するウイルス発現カセットエレメント（Ｖｉｒａｌ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  Ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｔｏ  Ｅｎｈａｎｃｅ  Ｔｒａｎｓｇｅｎｅ  Ｔａｒｇｅｔ  Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ  ａｎｄ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）」、２０１５年を参照のこと；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。トランス遺伝子標的特異性および発現を増強するエレメントの非限定的な例としては、プロモータ、内因性ｍｉＲＮＡ、転写後調節エレメント（ＰＲＥ）、ポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列および上流エンハンサー（ＵＳＥ）、ＣＭＶエンハンサーおよびイントロンが挙げられる。
【００８４】
当業者であれば、標的細胞中での本発明のポリペプチドの発現には、限定はされないが、種特異的な、誘導可能な、組織特異的な、または細胞周期特異的なプロモータを含む、特異的なプロモータが必要とされ得ることを認識し得る（パー（Ｐａｒｒ）ら著、ネイチャー・メディシン（Ｎａｔ．Ｍｅｄ．）、第３巻、ｐ．１１４５〜９（１９９７年）；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
【００８５】
一実施形態において、プロモータは、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムのペイロード領域にコードされたポリペプチドの発現をドライブする場合、有効と見なされる。
一実施形態において、プロモータは、調節性ポリヌクレオチドの発現をドライブするのに有効と見なされるプロモータである。
【００８６】
一実施形態において、プロモータは、標的とされている細胞中で発現をドライブする場合、有効と見なされるプロモータである。
一実施形態において、プロモータは、標的組織においてペイロードの発現をある期間ドライブする。プロモータによりドライブされた発現は、１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、１３時間、１４時間、１５時間、１６時間、１７時間、１８時間、１９時間、２０時間、２１時間、２２時間、２３時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、１週間、８日、９日、１０日、１１日、１２日、１３日、２週間、１５日、１６日、１７日、１８日、１９日、２０日、３週間、２２日、２３日、２４日、２５日、２６日、２７日、２８日、２９日、３０日、３１日、１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、１３カ月、１４カ月、１５カ月、１６カ月、１７カ月、１８カ月、１９カ月、２０カ月、２１カ月、２２カ月、２３カ月、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年または１０年超の期間であってもよい。発現は、１〜５時間、１〜１２時間、１〜２日、１〜５日、１〜２週間、１〜３週間、１〜４週間、１〜２カ月、１〜４カ月、１〜６カ月、２〜６カ月、３〜６カ月、３〜９カ月、４〜８カ月、６〜１２カ月、１〜２年、１〜５年、２〜５年、３〜６年、３〜８年、４〜８年または５〜１０年であってもよい。
【００８７】
一実施形態において、プロモータは、少なくとも１カ月、２カ月、３カ月、４カ月、５カ月、６カ月、７カ月、８カ月、９カ月、１０カ月、１１カ月、１年、２年、３年、４年、５年、６年、７年、８年、９年、１０年、１１年、１２年、１３年、１４年、１５年、１６年、１７年、１８年、１９年、２０年、２１年、２２年、２３年、２４年、２５年、２６年、２７年、２８年、２９年、３０年、３１年、３２年、３３年、３４年、３５年、３６年、３７年、３８年、３９年、４０年、４１年、４２年、４３年、４４年、４５年、４６年、４７年、４８年、４９年、５０年、５５年、６０年、６５年、または６５年超にわたって、ペイロードの発現をドライブする。
【００８８】
プロモータは、天然に存在してもよくまたは天然に存在しなくともよい。プロモータの非限定的な例としては、ウイルスプロモータ、植物プロモータおよび哺乳類プロモータが挙げられる。一部の実施形態において、プロモータは、ヒトプロモータであってもよい。一部の実施形態において、プロモータは、トランケート型であってもよい。
【００８９】
ほとんどの組織で発現をドライブまたは促進するプロモータとしては、限定はされないが、ヒト伸長因子１α−サブユニット（ＥＦ１α）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期エンハンサーおよび／もしくはプロモータ、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）およびその誘導体ＣＡＧ、βグルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）、またはユビキチンＣ（ＵＢＣ）が挙げられる。限定はされないが、筋肉特異的プロモータ、Ｂ細胞プロモータ、単球プロモータ、白血球プロモータ、マクロファージプロモータ、膵腺房細胞プロモータ、内皮細胞プロモータ、肺組織プロモータ、アストロサイトプロモータ、またはニューロン、アストロサイト、もしくはオリゴデンドロサイトに発現を制限するために使用することができる神経系プロモータなど、組織特異的発現エレメントを使用して、発現を特定の細胞型に限定することができる。
【００９０】
筋肉特異的プロモータの非限定的な例としては、哺乳類筋肉クレアチンキナーゼ（ＭＣＫ）プロモータ、哺乳類デスミン（ＤＥＳ）プロモータ、哺乳類トロポニンＩ（ＴＮＮＩ２）プロモータ、および哺乳類骨格筋型アルファ−アクチン（ＡＳＫＡ）プロモータ（例えば、米国特許出願公開第２０１１０２１２５２９号明細書を参照。その内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
【００９１】
ニューロンの組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、ニューロン特異的エノラーゼ（ＮＳＥ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、血小板由来増殖因子Ｂ鎖（ＰＤＧＦ−β）、シナプシン（Ｓｙｎ）、メチル−ＣｐＧ結合タンパク質（ＭｅＣＰ２）、Ｃａ２＋／カルモジュリン依存性プロテインキナーゼＩＩ（ＣａＭＫＩＩ）、代謝調節型グルタミン酸受容体２（ｍＧｌｕＲ２）、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）または重鎖（ＮＦＨ）、β−グロビンミニ遺伝子ｎβ２、プレプロエンケファリン（ＰＰＥ）、エンケファリン（Ｅｎｋ）および興奮性アミノ酸トランスポーター２（ＥＡＡＴ２）プロモータが挙げられる。アストロサイトに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、グリア線維性酸性タンパク質（ＧＦＡＰ）およびＥＡＡＴ２プロモータが挙げられる。オリゴデンドロサイトに対する組織特異的発現エレメントの非限定的な例としては、ミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）プロモータが挙げられる。
【００９２】
一実施形態において、プロモータは、１ｋｂ未満であってもよい。プロモータは、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００または８００ヌクレオチド超の長さを有してもよい。プロモータは、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００〜８００、３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００、３００〜８００、４００〜５００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、６００〜７００、６００〜８００または７００〜８００の長さを有してもよい。
【００９３】
一実施形態において、プロモータは、限定はされないが、ＣＭＶおよびＣＢＡなど、同じまたは異なる開始または親プロモータの２つ以上の成分の組合せであってもよい。各成分は、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０、５００、５１０、５２０、５３０、５４０、５５０、５６０、５７０、５８０、５９０、６００、６１０、６２０、６３０、６４０、６５０、６６０、６７０、６８０、６９０、７００、７１０、７２０、７３０、７４０、７５０、７６０、７７０、７８０、７９０、８００または８００超の長さを有してもよい。各成分は、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、２００〜６００、２００〜７００、２００〜８００、３００〜４００、３００〜５００、３００〜６００、３００〜７００、３００〜８００、４００〜５００、４００〜６００、４００〜７００、４００〜８００、５００〜６００、５００〜７００、５００〜８００、６００〜７００、６００〜８００または７００〜８００の長さを有してもよい。一実施形態において、プロモータは、３８２ヌクレオチドＣＭＶエンハンサー配列と２６０ヌクレオチドＣＢＡプロモータ配列との組合せである。
【００９４】
一実施形態において、ウイルスゲノムはユビキタスプロモータを含む。ユビキタスプロモータの非限定的な例としては、ＣＭＶ、ＣＢＡ（誘導体ＣＡＧ、ＣＢｈ等を含む）、ＥＦ−１α、ＰＧＫ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ（ｈＧＢｐ）、およびＵＣＯＥ（ＨＮＲＰＡ２Ｂ１−ＣＢＸ３のプロモータ）が挙げられる。
【００９５】
ユー（Ｙｕ）ら（モレキュラー・ペイン（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｐａｉｎ）、２０１１年、第７巻、ｐ．６３；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、レンチウイルスベクターを使用してラットＤＲＧ細胞および初代ＤＲＧ細胞におけるＣＡＧ、ＥＦＩα、ＰＧＫおよびＵＢＣプロモータ下のｅＧＦＰの発現を評価し、ＵＢＣが他の３つのプロモータよりも弱い発現を示し、全てのプロモータについて僅か１０〜１２％のグリア細胞発現しか見られなかったことを見出した。セーデルブロム（Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ）ら（イー・ニューロ（Ｅ．Ｎｅｕｒｏ）、２０１５年；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、運動皮質における注射後のＣＭＶおよびＵＢＣプロモータを含むＡＡＶ８およびＣＭＶプロモータを含むＡＡＶ２におけるｅＧＦＰの発現を評価した。ＵＢＣまたはＥＦＩαプロモータを含むプラスミドの鼻腔内投与は、ＣＭＶプロモータによる発現よりも高い持続的気道発現を示した（例えば、ギル（Ｇｉｌｌ）ら著、ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００１年、第８巻、ｐ．１５３９〜１５４６（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）を参照のこと）。フセイン（Ｈｕｓａｉｎ）ら（ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００９年；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、ｈＧＵＳＢプロモータ、ＨＳＶ−１ＬＡＴプロモータおよびＮＳＥプロモータを含むＨβＨコンストラクトを評価し、このＨβＨコンストラクトがマウス脳においてＮＳＥよりも弱い発現を示したことを見出した。パッシーニ（Ｐａｓｓｉｎｉ）およびウォルフ（Ｗｏｌｆｅ）（ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．）、２００１年、ｐ．１２３８２〜１２３９２、これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）は、新生仔マウスにおける脳室内注射後のＨβＨベクターの長期効果を評価し、少なくとも１年間にわたり持続的発現があったことを見出した。スー（Ｘｕ）ら（ジーン・セラピー（Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ）、２００１年、第８巻、ｐ．１３２３〜１３３２；これらの内容は本明細書において全体として参照により援用される）により、ＮＦＬおよびＮＦＨプロモータを使用したとき、ＣＭＶ−ｌａｃＺ、ＣＭＶ−ｌｕｃ、ＥＦ、ＧＦＡＰ、ｈＥＮＫ、ｎＡＣｈＲ、ＰＰＥ、ＰＰＥ＋ｗｐｒｅ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）およびＮＳＥ（１．８ｋｂ＋ｗｐｒｅ）と比較して全ての脳領域で低発現が見出された。スー（Ｘｕ）らは、プロモータ活性が、降順に、ＮＳＥ（１．８ｋｂ）、ＥＦ、ＮＳＥ（０．３ｋｂ）、ＧＦＡＰ、ＣＭＶ、ｈＥＮＫ、ＰＰＥ、ＮＦＬおよびＮＦＨであることを見出した。ＮＦＬは６５０−ヌクレオチドプロモータであり、ＮＦＨは９２０ヌクレオチドプロモータであり、両方とも肝臓には存在しないが、ＮＦＨは固有受容感覚ニューロン、脳および脊髄に豊富にあり、ＮＦＨは心臓に存在する。Ｓｃｎ８ａは、ＤＲＧ、脊髄および脳全体にわたって発現する４７０ヌクレオチドプロモータであり、特に海馬ニューロンおよび小脳プルキンエ細胞、皮質、視床および視床下部に高発現が見られる（例えば、ドレウス（Ｄｒｅｗｓ）ら著、「ナトリウムチャネル遺伝子ＳＣＮ８Ａにおける、進化的に保存された機能性非コードエレメントの同定」（Ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎａｒｙ  ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ，ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｎｏｎｃｏｄｉｎｇ  ｅｌｅｍｅｎｔｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｐｒｏｍｏｔｅｒ  ｒｅｇｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｓｏｄｉｕｍ  ｃｈａｎｎｅｌ  ｇｅｎｅ  ＳＣＮ８Ａ）、マンマリアン・ゲノム（Ｍａｍｍ  Ｇｅｎｏｍｅ）（２００７年）、第１８巻、ｐ．７２３〜７３１；およびレイモンド（Ｒａｙｍｏｎｄ）ら著、「選択的スプライスによるナトリウムチャネルα−サブユニット遺伝子」の発現（Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ  Ｓｐｌｉｃｅｄ  Ｓｏｄｉｕｍ  Ｃｈａｎｎｅｌ  α−ｓｕｂｕｎｉｔ  ｇｅｎｅｓ）、ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）２００４年、２７９（４４）、ｐ．４６２３４〜４６２４１を参照のこと；この各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
【００９６】
前述のユー（Ｙｕ）、セーデルブロム（Ｓｏｄｅｒｂｌｏｍ）、ギル（Ｇｉｌｌ）、フセイン（Ｈｕｓａｉｎ）、パッシーニ（Ｐａｓｓｉｎｉ）、スー（Ｘｕ）、ドレウス（Ｄｒｅｗｓ）またはレイモンド（Ｒａｙｍｏｎｄ）によって教示されるプロモータはいずれも、本発明に使用することができる。
【００９７】
一実施形態において、プロモータは細胞特異的ではない。
一実施形態において、プロモータはユビキチンｃ（ＵＢＣ）プロモータである。ＵＢＣプロモータは、３００〜３５０ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な例として、ＵＢＣプロモータは３３２ヌクレオチドである。
【００９８】
一実施形態において、プロモータは、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳＢ）プロモータである。ＧＵＳＢプロモータは、３５０〜４００ヌクレオチドのサイズを有し得る。非限定的な例として、ＧＵＳＢプロモータは３７８ヌクレオチドである。
【００９９】
一実施形態において、プロモータはニューロフィラメント軽鎖（ＮＦＬ）プロモータである。ＮＦＬプロモータはサイズが６００〜７００ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ＮＦＬプロモータは６５０ヌクレオチドである。非限定的な例として、コンストラクトはＡＡＶ−プロモータ−ＣＭＶ／グロビンイントロン−調節性ポリヌクレオチド−ＲＢＧであってもよく、ここでＡＡＶは自己相補的であってもよく、およびＡＡＶはＤＪ血清型であってもよい。
【０１００】
一実施形態において、プロモータはニューロフィラメント重鎖（ＮＦＨ）プロモータである。ＮＦＨプロモータはサイズが９００〜９５０ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ＮＦＨプロモータは９２０ヌクレオチドである。非限定的な例として、コンストラクトはＡＡＶ−プロモータ−ＣＭＶ／グロビンイントロン−調節性ポリヌクレオチド−ＲＢＧであってもよく、ここでＡＡＶは自己相補的であってもよく、およびＡＡＶはＤＪ血清型であってもよい。
【０１０１】
一実施形態において、プロモータはｓｃｎ８ａプロモータである。ｓｃｎ８ａプロモータはサイズが４５０〜５００ヌクレオチドであり得る。非限定的な例として、ｓｃｎ８ａプロモータは４７０ヌクレオチドである。非限定的な例として、コンストラクトはＡＡＶ−プロモータ−ＣＭＶ／グロビンイントロン−調節性ポリヌクレオチド−ＲＢＧであってもよく、ここでＡＡＶは自己相補的であってもよく、およびＡＡＶはＤＪ血清型であってもよい。
【０１０２】
一実施形態において、ウイルスゲノムはＰｏｌ  ＩＩＩプロモータを含む。
一実施形態において、ウイルスゲノムはＰ１プロモータを含む。
一実施形態において、ウイルスゲノムはＦＸＮプロモータを含む。
【０１０３】
一実施形態において、プロモータは、ホスホグリセリン酸キナーゼ１（ＰＧＫ）プロモータである。
一実施形態において、プロモータは、ニワトリβ−アクチン（ＣＢＡ）プロモータである。
【０１０４】
一実施形態において、プロモータは、ニワトリベータ−アクチン（ＣＢＡ）プロモータに融合されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）エンハンサーを含むコンストラクトであるＣＡＧプロモータである。
【０１０５】
一実施形態において、プロモータは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータである。
一実施形態において、ウイルスゲノムは、Ｈ１プロモータを含む。
【０１０６】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、Ｕ６プロモータを含む。
一実施形態において、プロモータは、肝臓または骨格筋プロモータである。肝臓プロモータの非限定的な例としては、ヒトα−１−抗トリプシン（ｈＡＡＴ）およびチロキシン結合グロブリン（ＴＢＧ）が挙げられる。骨格筋プロモータの非限定的な例としては、デスミン、ＭＣＫまたは合成Ｃ５−１２が挙げられる。
【０１０７】
一実施形態において、プロモータは、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータである。非限定的な例として、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータはＵ６である。非限定的な例として、ＲＮＡ  ｐｏｌ  ＩＩＩプロモータはＨ１である。
【０１０８】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、２つのプロモータを含む。非限定的な例として、プロモータは、ＥＦ１αプロモータおよびＣＭＶプロモータである。
一実施形態において、ウイルスゲノムは、エンハンサーエレメント、プロモータおよび／または５’ＵＴＲイントロンを含む。また、エンハンサーエレメントは、本明細書では「エンハンサー」とも称され、限定はされないが、ＣＭＶエンハンサーであってもよく、プロモータは、限定はされないが、ＣＭＶ、ＣＢＡ、ＵＢＣ、ＧＵＳＢ、ＮＳＥ、シナプシン、ＭｅＣＰ２、およびＧＦＡＰプロモータであってもよく、および５’ＵＴＲ／イントロンは、限定はされないが、ＳＶ４０およびＣＢＡ−ＭＶＭであってもよい。非限定的な例として、組合せで使用されるエンハンサー、プロモータおよび／またはイントロンは、（１）ＣＭＶエンハンサー、ＣＭＶプロモータ、ＳＶ４０  ５’ＵＴＲイントロン；（２）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモータ、ＳＶ４０  ５’ＵＴＲイントロン；（３）ＣＭＶエンハンサー、ＣＢＡプロモータ、ＣＢＡ−ＭＶＭ  ５’ＵＴＲイントロン；（４）ＵＢＣプロモータ；（５）ＧＵＳＢプロモータ；（６）ＮＳＥプロモータ；（７）シナプシンプロモータ；（８）ＭｅＣＰ２プロモータ、（９）ＧＦＡＰプロモータ、（１０）Ｈ１プロモータ；および（１１）Ｕ６プロモータであってもよい。
【０１０９】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、操作されたプロモータを含む。
別の実施形態において、ウイルスゲノムは、天然に発現されるタンパク質のプロモータを含む。
【０１１０】
ウイルスゲノム成分：非翻訳領域（ＵＴＲ）
定義上、遺伝子の野生型非翻訳領域（ＵＴＲ）は、転写されるが翻訳されない。一般的には、５’ＵＴＲは、転写開始部位から始まり、開始コドンで終了し、３’ＵＴＲは、終止コドンの直後から始まり、転写の終結シグナルまで継続する。
【０１１１】
特定の標的臓器の、豊富に発現される遺伝子に典型的に見出される特徴を、ＵＴＲ内に操作して、安定性およびタンパク質産生を増強することができる。非限定的な例として、肝臓において通常発現されるｍＲＮＡ（例えば、アルブミン、血清アミロイドＡ、アポリポタンパク質Ａ／Ｂ／Ｅ、トランスフェリン、アルファフェトプロテイン、エリスロポエチン、または第ＶＩＩＩ因子）に由来する５’ＵＴＲを、本発明のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに使用して、肝細胞株または肝臓での発現を増強することができる。
【０１１２】
理論によって束縛されることを望むものではないが、野生型５’非翻訳領域（ＵＴＲ）は、翻訳開始に役割を果たす特徴を含む。コザック配列は、リボソームが多数の遺伝子の翻訳を開始させる過程に関与することが広く知られており、通常は５’ＵＴＲに含まれている。コザック配列は、コンセンサスＣＣＲ（Ａ／Ｇ）ＣＣＡＵＧＧを有し、式中Ｒは、開始コドン（ＡＴＧ）の３塩基上流にあるプリン（アデニンまたはグアニン）であり、別の「Ｇ」がその後に続く。
【０１１３】
一実施形態において、ウイルスゲノムの５’ＵＴＲは、コザック配列を含む。
一実施形態において、ウイルスゲノムの５’ＵＴＲは、コザック配列を含まない。
理論によって束縛されることを望むものではないが、野生型３’ＵＴＲは、アデノシンおよびウリジンのストレッチがそこに埋め込まれていることが知られている。これらのＡＵリッチシグネチャーは、高いターンオーバー率を有する遺伝子において特に広く見受けられる。それらの配列特徴および機能的特性に基づき、ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）は、３つのクラスに分離することができる（チェン（Ｃｈｅｎ）ら著、１９９５年。その内容は本明細書において全体として参照により援用される）：限定はされないが、ｃ−ＭｙｃおよびＭｙｏＤなどのクラスＩ  ＡＲＥは、Ｕリッチ領域内にＡＵＵＵＡモチーフの幾つかの分散コピーを含有する。限定はされないが、ＧＭ−ＣＳＦおよびＴＮＦ−ａなどのクラスＩＩ  ＡＲＥは、２つ以上のオーバーラップＵＵＡＵＵＵＡ（Ｕ／Ａ）（Ｕ／Ａ）ノナマーを有する。限定はされないが、ｃ−ＪｕｎおよびミオゲニンなどのクラスＩＩＩ  ＡＲＥＳは、それほど十分に規定されていない。これらのＵリッチ領域は、ＡＵＵＵＡモチーフを含有しない。ＡＲＥに結合するほとんどのタンパク質は、メッセンジャーを不安定化することが知られているが、ＥＬＡＶファミリーのメンバーである最も顕著にはＨｕＲは、ｍＲＮＡの安定性を増加させることが実証されている。ＨｕＲは、３つ全てのクラスのＡＲＥに結合する。ＨｕＲ特異的結合部位を核酸分子の３’ＵＴＲ内に、操作により加えることは、インビボにて、ＨｕＲ結合を、したがってメッセージの安定化をもたらすことになる。
【０１１４】
３’ＵＴＲ  ＡＵリッチエレメント（ＡＲＥ）の導入、除去または修飾を使用して、ポリヌクレオチドの安定性を調節することができる。特異的なポリヌクレオチド、例えばウイルスゲノムのペイロード領域を操作する場合、ＡＲＥの１つ以上のコピーを導入して、ポリヌクレオチドをより不安定にし、それにより、翻訳を減らし、結果として生じるタンパク質の産生を減少させることができる。同様に、ＡＲＥを、同定および除去または突然変異させて、細胞内安定性を増加させ、したがって結果として生じるタンパク質の翻訳および産生を増加させることができる。
【０１１５】
一実施形態において、ウイルスゲノムの３’ＵＴＲは、ポリＡテールを鋳型付加するためのオリゴ（ｄＴ）配列を含み得る。
一実施形態において、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡシード、結合部位または完全な配列を含み得る。ｍｉｃｒｏＲＮＡ（またはｍｉＲＮＡまたはｍｉＲ）は、核酸標的の部位に結合し、核酸分子安定性を低減することまたは翻訳を阻害することのいずれかによって遺伝子発現を下方制御する１９〜２５ヌクレオチド非コードＲＮＡである。ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列は、「シード」領域、すなわち成熟ｍｉｃｒｏＲＮＡの２〜８位の領域の配列を含む。この配列は、核酸のｍｉＲＮＡ標的配列に対して完全なワトソンクリック型相補性を有する。
【０１１６】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ結合部位、配列またはシード領域を含む、変更するまたは除去するように操作されていてもよい。
当該技術分野で公知の任意の遺伝子に由来する任意のＵＴＲを、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに組み込むことができる。これらのＵＴＲまたはそれらの部分は、それらが選択されたかまたはそれらの配向性もしくは位置が変更され得る遺伝子と同じ配向性に配置され得る。一実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムに使用されるＵＴＲは、逆位化、短縮化、延長化、当該技術分野で公知の１つ以上の他の５’ＵＴＲまたは３’ＵＴＲで作製され得る。本明細書で使用されるとき、用語「変更される」は、ＵＴＲに関する場合、ＵＴＲが、参照配列に対して何らかの点で変化していることを意味する。例えば、３’または５’ＵＴＲは、上記で教示されるような配向性または位置の変化によって野生型または天然ＵＴＲに対して変更されていてもよく、または追加ヌクレオチドの介在、ヌクレオチドの欠失、ヌクレオチドの交換もしくは転位によって変更されていてもよい。
【０１１７】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、野生型ＵＴＲの変異体でない少なくとも１つの人工ＵＴＲを含む。
一実施形態において、ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、そのタンパク質が、共通の機能、構造、特徴、または特性を共有する転写物のファミリーから選択されているＵＴＲを含む。
【０１１８】
ウイルスゲノム成分：ポリアデニル化配列
一実施形態において、本発明のＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは少なくとも１つのポリアデニル化配列を含む。ＡＡＶ粒子のウイルスゲノムは、ペイロードコード配列の３’末端と３’ＩＴＲの５’末端との間にポリアデニル化配列を含み得る。
【０１１９】
一実施形態において、ポリアデニル化配列または「ポリＡ配列」は、存在しない〜約５００ヌクレオチド長の範囲であってもよい。ポリアデニル化配列は、限定はされないが、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、および５００ヌクレオチド長であってもよい。
【０１２０】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜１００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜１５０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜１６０ヌクレオチド長である。
【０１２１】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は５０〜２００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜１００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜１５０ヌクレオチド長である。
【０１２２】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜１６０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は６０〜２００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜１００ヌクレオチド長である。
【０１２３】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜１５０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜１６０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は７０〜２００ヌクレオチド長である。
【０１２４】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜１００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜１５０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜１６０ヌクレオチド長である。
【０１２５】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は８０〜２００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜１００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜１５０ヌクレオチド長である。
【０１２６】
一実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜１６０ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ポリアデニル化配列は９０〜２００ヌクレオチド長である。
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてポリアデニル化配列の上流に位置してもよい、ｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。更に、ＡＡＶ粒子は、限定はされないが、ＣＭＶ、Ｕ６、ＣＡＧ、ＣＢＡ、またはＳＶ４０イントロンもしくはヒトβグロビンイントロンを伴うＣＢＡプロモータなど、発現ベクターにおいてプロモータの下流に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチド超以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０ヌクレオチド以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流にあるヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％または２５％超以内に位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に最初の１〜５％、１〜１０％、１〜１５％、１〜２０％、１〜２５％、５〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、１０〜１５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１５〜２０％、１５〜２５％、または２０〜２５％で位置してもよいｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む。
【０１２７】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ウサギグロビンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を含む。
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ヒト成長ホルモンポリアデニル化（ポリＡ）シグナル配列を含む。
【０１２８】
ウイルスゲノム成分：イントロン
一実施形態において、ペイロード領域は、１つ以上のイントロンまたはそれらの部分など、発現を増強するための少なくとも１つのエレメントを含む。イントロンの非限定的な例としては、ＭＶＭ（６７〜９７ｂｐｓ）、Ｆ．ＩＸトランケート型イントロン１（３００ｂｐ）、β−グロビンＳＤ／免疫グロブリン重鎖スプライスアクセプター（２５０ｂｐ）、アデノウイルススプライスドナー／イムノグロビンスプライスアクセプター（５００ｂｐ）、ＳＶ４０後期スプライスドナー／スプライスアクセプター（１９Ｓ／１６Ｓ）（１８０ｂｐ）およびハイブリッドアデノウイルススプライスドナー／ＩｇＧスプライスアクセプター（２３０ｂｐ）が挙げられる。
【０１２９】
一実施形態において、イントロンまたはイントロン部分は１００〜５００ヌクレオチド長であってもよい。イントロンは、８０、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１９０、２００、２１０、２２０、２３０、２４０、２５０、２６０、２７０、２８０、２９０、３００、３１０、３２０、３３０、３４０、３５０、３６０、３７０、３８０、３９０、４００、４１０、４２０、４３０、４４０、４５０、４６０、４７０、４８０、４９０または５００の長さを有してもよい。イントロンは、８０〜１００、８０〜１２０、８０〜１４０、８０〜１６０、８０〜１８０、８０〜２００、８０〜２５０、８０〜３００、８０〜３５０、８０〜４００、８０〜４５０、８０〜５００、２００〜３００、２００〜４００、２００〜５００、３００〜４００、３００〜５００、または４００〜５００の長さを有してもよい。
【０１３０】
一実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムは、限定はされないが、ＣＭＶまたはＵ６などのプロモータを含み得る。非限定的な例として、本発明のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むＡＡＶのプロモータは、ＣＭＶプロモータである。別の非限定的な例として、本発明のｓｉＲＮＡ分子の核酸配列を含むＡＡＶのプロモータは、Ｕ６プロモータである。
【０１３１】
一実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムはＣＭＶプロモータを含み得る。
一実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムはＵ６プロモータを含み得る。
一実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムはＣＭＶおよびＵ６プロモータを含み得る。
【０１３２】
一実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムは、Ｈ１プロモータを含み得る。
一実施形態において、ＡＡＶウイルスゲノムはＣＢＡプロモータを含み得る。
一実施形態において、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、限定はされないが、ＣＭＶ、Ｕ６、Ｈ１、ＣＢＡ、ＣＡＧ、またはＳＶ４０もしくは当該技術分野において公知の他のものなどのイントロンを伴うＣＢＡプロモータなど、発現ベクターにおいてプロモータの下流に位置してもよい。更に、コード化ｓｉＲＮＡ分子はまた、発現ベクターにおいてポリアデニル化配列の上流に位置してもよい。非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０ヌクレオチドまたは３０ヌクレオチド超以内に位置してもよい。別の非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、２０〜２５、２０〜３０または２５〜３０ヌクレオチド以内に位置してもよい。非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流にあるヌクレオチドの最初の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％または２５％超以内に位置してもよい。別の非限定的な例として、コード化ｓｉＲＮＡ分子は、発現ベクターにおいてプロモータから下流および／またはポリアデニル化配列の上流に最初の１〜５％、１〜１０％、１〜１５％、１〜２０％、１〜２５％、５〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、１０〜１５％、１０〜２０％、１０〜２５％、１５〜２０％、１５〜２５％、または２０〜２５％で位置してもよい。
【０１３３】
ウイルスゲノム成分：フィラー配列
一実施形態において、ウイルスゲノムは、１つ以上のフィラー配列を含む。
一実施形態において、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さをパッケージングに最適なサイズにするために、１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約２．３ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約４．６ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。
【０１３４】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、ベクターゲノムのヘアピン構造（例えば、本明細書に記載される調節性ポリヌクレオチド）が、発現および／またはパッケージング中に末端逆位配列（ＩＴＲ）として読み取られ得る可能性を低減させるために、１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約２．３ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの長さを約４．６ｋｂにするために、少なくとも１つのフィラー配列を含む。
【０１３５】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ウイルスゲノムであり、限定はされないが、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、１．５ｋｂ、１．６ｋｂ、１．７ｋｂ、１．８ｋｂ、１．９ｋｂ、２ｋｂ、２．１ｋｂ、２．２ｋｂ、２．３ｋｂ、２．４ｋｂ、２．５ｋｂ、２．６ｋｂ、２．７ｋｂ、２．８ｋｂ、２．９ｋｂ、３ｋｂ、３．１ｋｂ、３．２ｋｂ、３．３ｋｂ、３．４ｋｂ、３．５ｋｂ、３．６ｋｂ、３．７ｋｂ、または３．８ｋｂなどの、約０．１ｋｂ〜３．８ｋｂの長さを有する１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、３．１ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、２．７ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．４ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．４ｋｂである。
【０１３６】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、自己相補的（ｓｃ）ウイルスゲノムであり、限定はされないが、０．１ｋｂ、０．２ｋｂ、０．３ｋｂ、０．４ｋｂ、０．５ｋｂ、０．６ｋｂ、０．７ｋｂ、０．８ｋｂ、０．９ｋｂ、１ｋｂ、１．１ｋｂ、１．２ｋｂ、１．３ｋｂ、１．４ｋｂ、または１．５ｋｂなどの、約０．１ｋｂ〜１．５ｋｂの長さを有する１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中のフィラー配列の合計長は、０．４ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．８ｋｂである。非限定的な例として、ベクターゲノム中の各フィラー配列の長さは、０．４ｋｂである。
【０１３７】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、フィラー配列の任意の部分を含む。ウイルスゲノムは、フィラー配列の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を含んでいてもよい。
【０１３８】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、一本鎖（ｓｓ）ウイルスゲノムであり、ウイルスゲノムの長さを約４．６ｋｂにするために、１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、３’ＩＴＲ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、２つのイントロン配列間に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、イントロン配列内に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の５’に位置する。
【０１３９】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、自己相補的（ｓｃ）ウイルスゲノムであり、ウイルスゲノムの長さを約２．３ｋｂにするために、１つ以上のフィラー配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、３’ＩＴＲ配列の５’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、２つのイントロン配列間に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、少なくとも１つのフィラー配列を含み、フィラー配列は、イントロン配列内に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、プロモータ配列の５’に位置し、第２のフィラー配列は、ポリアデニル化シグナル配列の３’に位置する。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、２つのフィラー配列を含み、第１のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の３’に位置し、第２のフィラー配列は、５’ＩＴＲ配列の５’に位置する。
【０１４０】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムのより多くの領域の１つの間に１つ以上のフィラー配列を含み得る。一実施形態において、フィラー領域は、限定はされないが、ペイロード領域、末端逆位配列（ＩＴＲ）、プロモータ領域、イントロン領域、エンハンサー領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、および／またはエクソン領域などの領域の前に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー領域は、限定はされないが、ペイロード領域、末端逆位配列（ＩＴＲ）、プロモータ領域、イントロン領域、エンハンサー領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、および／またはエクソン領域などの領域の後に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー領域は、限定はされないが、ペイロード領域、末端逆位配列（ＩＴＲ）、プロモータ領域、イントロン領域、エンハンサー領域、ポリアデニル化シグナル配列領域、および／またはエクソン領域などの領域の前および後に位置していてもよい。
【０１４１】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、ウイルスゲノムの少なくとも１つの領域を二分する（ｂｉｆｕｒｃａｔｅ）１つ以上のフィラー配列を含み得る。ウイルスゲノムの二分された領域は、フィラー配列領域の５’にある領域の１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を含んでいてもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の１０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の９０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の２０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の８０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の３０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の７０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の４０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の６０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の５０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の５０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の６０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の４０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の７０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の３０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の８０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の２０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。非限定的な例として、フィラー配列は、領域の９０％がフィラー配列の５’に位置し、領域の１０％がフィラー配列の３’に位置するように、少なくとも１つの領域を二分してもよい。
【０１４２】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、５’ＩＴＲの後にフィラー配列を含む。
一実施形態において、ウイルスゲノムは、プロモータ領域の後にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、ペイロード領域の後にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、イントロン領域の後にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、エンハンサー領域の後にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列領域の後にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、エクソン領域の後にフィラー配列を含む。
【０１４３】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、プロモータ領域の前にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、ペイロード領域の前にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、イントロン領域の前にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、エンハンサー領域の前にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、ポリアデニル化シグナル配列領域の前にフィラー配列を含む。一実施形態において、ウイルスゲノムは、エクソン領域の前にフィラー配列を含む。
【０１４４】
一実施形態において、ウイルスゲノムは、３’ＩＴＲの前にフィラー配列を含む。
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびプロモータ領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびペイロード領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびイントロン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。
【０１４５】
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、５’ＩＴＲおよびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびペイロード領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびイントロン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、プロモータ領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
【０１４６】
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびイントロン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。
【０１４７】
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ペイロード領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域およびエンハンサー領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、イントロン領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エンハンサー領域およびポリアデニル化シグナル配列領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エンハンサー領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エンハンサー領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
【０１４８】
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ポリアデニル化シグナル配列領域およびエクソン領域などの、２つの領域間に位置していてもよい。一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、ポリアデニル化シグナル配列領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
【０１４９】
一実施形態において、フィラー配列は、限定はされないが、エクソン領域および３’ＩＴＲなどの、２つの領域間に位置していてもよい。
本発明のペイロード
本開示のＡＡＶ粒子は、少なくとも１つのペイロード領域を含む。本明細書で使用されるとき、「ペイロード」または「ペイロード領域」は、ウイルスゲノムによりもしくはその内にコードされる１つ以上のポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、またはかかるポリヌクレオチドもしくはポリヌクレオチド領域、例えばトランス遺伝子、ポリペプチドもしくはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの発現産物、または調節性核酸もしくは制御性核酸を指す。本発明のペイロードは、典型的には、調節性ポリヌクレオチドまたはその断片もしくは変異体をコードする。
【０１５０】
ペイロード領域は、ｍＲＮＡの天然構成と同様のまたは反映した領域を再現するように構築され得る。
ペイロード領域は、コードおよび非コード核酸配列の組合せを含み得る。
【０１５１】
一部の実施形態では、ＡＡＶペイロード領域は、コードまたは非コードＲＮＡをコードし得る。
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤をコードする核酸配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。かかる実施形態において、２つ以上のポリペプチドをコードするウイルスゲノムが、ウイルス粒子へと複製およびパッケージングされ得る。ウイルス粒子で形質導入された標的細胞は、単一細胞内部において、コード化ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤を発現し得る。
【０１５２】
調節性ポリヌクレオチド
一実施形態において、調節性ポリヌクレオチド、例えばＲＮＡまたはＤＮＡ分子を使用して、神経変性疾患、詳細には筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）を治療することができる。本明細書で使用されるとき、「調節性ポリヌクレオチド」は、標的遺伝子のレベルまたは量、例えばｍＲＮＡまたはタンパク質レベルを調節する（増加させるかまたは減少させるかのいずれか）働きをする任意の核酸配列である。
【０１５３】
一実施形態において、調節性ポリヌクレオチドは、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子をコードする少なくとも１つの核酸配列を含み得る。核酸は、２つ以上ある場合には独立して、１、２、３、４、５、６、７、８、９個、または９個超のｓｉＲＮＡ分子をコードし得る。
【０１５４】
一実施形態において、分子足場は、ＣＭＶプロモータ、その断片または変異体の下流に位置してもよい。
一実施形態において、分子足場は、ＣＢＡプロモータ、その断片または変異体の下流に位置してもよい。
【０１５５】
一実施形態において、分子足場は、ＣＭＶプロモータの下流に位置する天然ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場であってもよい。非限定的な例として、天然ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場はヒトｍｉＲ１５５足場に由来する。
【０１５６】
一実施形態において、分子足場は、ＣＢＡプロモータの下流に位置する天然ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場であってもよい。
一実施形態において、分子足場および調節性ポリヌクレオチドの選択は、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ内での調節性ポリヌクレオチドを比較する方法によって決定される（例えば、ミニアリコバ（Ｍｉｎｉａｒｉｋｏｖａ）ら著、「ハンチントン病に対する遺伝子療法を開発するためのハンチンチンを標的とする治療用ｍｉＲＮＡの設計、特徴付け、およびリード選択（Ｄｅｓｉｇｎ，Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｌｅａｄ  Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｉＲＮＡｓ  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｉｎ  ｆｏｒ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  Ｈｕｎｔｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｄｉｓｅａｓｅ）」、モレキュラー・セラピー−ヌクレイック・アシッド（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ）、２０１６年、第５巻、ｐ．ｅ２９７および国際公開第２０１６１０２６６４号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）により記載される方法を参照のこと）。調節性ポリヌクレオチドの活性を評価するため、使用し得る使用される分子足場は、ヒトｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場（例えば、ｍｉＲ１５５足場）であり、プロモータはＣＭＶであってもよい。活性はインビトロでＨＥＫ２９３Ｔ細胞およびレポータ（例えばルシフェラーゼ）を用いて決定されてもよい。
【０１５７】
調節性ポリヌクレオチドに最適な分子足場を評価するため、調節性ポリヌクレオチドがｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場においてＣＡＧプロモータと共に使用される。このコンストラクトには５０ｎｇのレポータ（例えば、ルシフェラーゼレポータ）がコトランスフェクトされる。５０ｎｇコトランスフェクションで８０％より高いノックダウンのコンストラクトが有効と見なされる。一態様では、強力なガイド鎖活性を有するコンストラクトが好ましい。分子足場をＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＮＧＳによって処理して、ガイド−パッセンジャー比、およびプロセシング変動性を決定することができる。
【０１５８】
インビボでの分子足場および調節性ポリヌクレオチドの評価には、調節性ポリヌクレオチドを含む分子足場がＡＡＶにパッケージングされて（例えば、血清型はＡＡＶ５であってもよい（例えば、国際公開第２０１５０６０７２２号パンフレットに記載される方法およびコンストラクトを参照のこと、この内容は本明細書において全体として参照により援用される））、インビボモデルに投与され、モデルの種々の範囲（例えば、組織領域）においてガイド−パッセンジャー比、５’および３’末端プロセシング、ガイド鎖のパッセンジャー鎖に対する比、およびノックダウンを決定することができる。
【０１５９】
一実施形態において、分子足場および調節性ポリヌクレオチドの選択は、天然ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡおよび合成ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡでの調節性ポリヌクレオチドを比較する方法によって決定される。調節性ポリヌクレオチドは、限定はされないが、エクソン１以外のエクソンを標的とし得る。調節性ポリヌクレオチドの活性の評価には、分子足場がＣＢＡプロモータと共に使用される。一態様では、活性はインビトロでＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞およびレポータ（例えば、ルシフェラーゼ）を用いて決定されてもよく、およびノックダウン効率的な調節性ポリヌクレオチドは、試験した細胞において少なくとも８０％のＳＯＤ１ノックダウンを示した。加えて、最も効率的と見なされる調節性ポリヌクレオチドは有意なパッセンジャー鎖（ｐ鎖）活性が低い乃至全くないことを示した。別の態様では、内因性ＳＯＤ１ノックダウン有効性はインビトロでＨＥＫ２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞およびレポータを用いてトランスフェクションにより評価される。効率的な調節性ポリヌクレオチドは５０％より高い内因性ＳＯＤ１ノックダウンを示す。更に別の態様では、内因性ＳＯＤ１ノックダウン有効性は、種々の細胞型（例えば、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、初代アストロサイト、Ｕ２５１アストロサイト、ＳＨ−ＳＹ５Ｙニューロン細胞およびＡＬＳ患者に由来する線維芽細胞）において感染（例えば、ＡＡＶ２）によって評価される。効率的な調節性ポリヌクレオチドは６０％より高い内因性ＳＯＤ１ノックダウンを示す。
【０１６０】
インビボでの分子足場および調節性ポリヌクレオチドの評価には、調節性ポリヌクレオチドを含む分子足場がＡＡＶにパッケージングされてインビボモデルに投与され、モデルの種々の範囲（例えば組織領域）においてガイド−パッセンジャー比、５’および３’末端プロセシング、ガイド鎖のパッセンジャー鎖に対する比、およびノックダウンを決定することができる。分子足場をＮＧＳによってインビボ試料から処理して、ガイド−パッセンジャー比、およびプロセシング変動性を決定することができる。
【０１６１】
一実施形態において、調節性ポリヌクレオチドは以下の特性のうちの少なくとも１つを用いて設計される：ループ変異体、シードミスマッチ／バルジ／ゆらぎ変異体、ステムミスマッチ、ループ変異体およびヴァッサルステム（ｖａｓｓａｌ  ｓｔｅｍ）ミスマッチ変異体、シードミスマッチおよびベーサルステム（ｂａｓａｌ  ｓｔｅｍ）ミスマッチ変異体、ステムミスマッチおよびベーサルステム（ｂａｓａｌ  ｓｔｅｍ）ミスマッチ変異体、シードゆらぎおよびベーサルステム（ｂａｓａｌ  ｓｔｅｍ）ゆらぎ変異体、またはステム配列変異体。
【０１６２】
本発明は、部分的に、神経変性障害を治療するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導性の遺伝子発現阻害に関する。ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡが提供される。かかるｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、細胞、例えば運動ニューロンにおいてＳＯＤ１遺伝子発現をサイレンシングし、したがって運動死および筋萎縮などのＡＬＳの症状を改善することができる。ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡは、組換えＡＡＶベクターのポリヌクレオチドにコードされてもよい。
【０１６３】
特定のｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを、標的ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドの一部としてインビトロで設計および合成して、ＲＮＡｉ過程を活性化させるため細胞に導入してもよい。
【０１６４】
ｓｉＲＮＡ分子
本発明は、神経変性障害を治療するためのＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）誘導性の遺伝子発現阻害に関する。本明細書には、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡ（本明細書では、まとめて「ｓｉＲＮＡ分子」と称される）が提供される。そのようなｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、限定はされないが、中型有棘ニューロン、皮質ニューロンおよび／またはアストロサイトなどの細胞の遺伝子発現を軽減またはサイレンシングすることができる。
【０１６５】
ＲＮＡｉ（転写後遺伝子サイレンシング（ＰＴＧＳ）、クエリング、または共抑制としても知られる）は、ＲＮＡ分子が典型的には特異的ｍＲＮＡ分子の破壊を引き起こすことにより遺伝子発現を配列特異的に阻害する転写後遺伝子サイレンシング過程である。ＲＮＡｉの活性成分は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる短鎖／低分子二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）であり、これは典型的には１５〜３０ヌクレオチド（例えば、１９〜２５、１９〜２４または１９〜２１ヌクレオチド）および２−ヌクレオチドの３’オーバハングを含有し、かつ標的遺伝子の核酸配列と一致する。これらの低分子ＲＮＡ種は、天然ではインビボでより大きいｄｓＲＮＡのダイサー媒介性切断によって産生されることができ、および哺乳類細胞で機能性である。
【０１６６】
ｍｉｃｒｏＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）と称される、天然で発現する低分子ＲＮＡ分子は、ｍＲＮＡの発現を調節することにより遺伝子サイレンシングを誘発する。ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を含有するｍｉＲＮＡは、シード領域と呼ばれるｍｉＲＮＡの５’領域におけるヌクレオチド２〜７と完全な配列相補性を呈し、かつその３’領域と他の塩基対を呈するｍＲＮＡを標的とする。ｍｉＲＮＡ媒介性の遺伝子発現下方制御は、標的ｍＲＮＡの切断、標的ｍＲＮＡの翻訳阻害、またはｍＲＮＡ崩壊によって引き起こされ得る。ｍｉＲＮＡターゲティング配列は、通常、標的ｍＲＮＡの３’−ＵＴＲに位置する。単一のｍｉＲＮＡが様々な遺伝子の１００より多くの転写物を標的とすることができ、および１つのｍＲＮＡが異なるｍｉＲＮＡの標的となることができる。
【０１６７】
特異的ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡがインビトロで設計および合成されて、ＲＮＡｉ過程を活性化させるため細胞に導入されてもよい。エルバシール（Ｅｌｂａｓｈｉｒ）らは、２１ヌクレオチドｓｉＲＮＡ二重鎖（低分子干渉ＲＮＡと称される）が哺乳類細胞において免疫応答を誘導することなく強力かつ特異的な遺伝子ノックダウンを生じさせる能力を有したことを実証した（エルバシール・ＳＭ（Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ＳＭ）ら著、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）、２００１年、第４１１巻、ｐ．４９４〜４９８）。この最初の報告以来、ｓｉＲＮＡによる転写後遺伝子サイレンシングは哺乳類細胞における強力な遺伝子解析ツールとして急速に浮上しており、新規療法を生み出す可能性を秘めている。
【０１６８】
ハンチントン病などのポリグルタミン伸長疾患を引き起こすポリグルタミンリピートタンパク質をコードする核酸配列を標的とするように設計されたＲＮＡｉ分子が、米国特許第９，１６９，４８３号明細書および同第９，１８１，５４４号明細書ならびに国際公開第２０１５１７９５２５号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載されている。米国特許第９，１６９，４８３号明細書および同第９，１８１，５４４号明細書ならびに国際公開第２０１５１７９５２５号パンフレットは、各々が、第１のＲＮＡ鎖（例えば、１５連続ヌクレオチド）と第２のＲＮＡ鎖（例えば、第１の鎖の少なくとも１２連続ヌクレオチドと相補的）とを含む単離ＲＮＡ二重鎖を提供し、ここでＲＮＡ二重鎖は約１５〜３０塩基対長である。第１のＲＮＡ鎖と第２のＲＮＡ鎖とはＲＮＡループ（約４〜５０ヌクレオチド）により作動可能に連結されてヘアピン構造を形成してもよく、これが発現カセットに挿入され得る。ループ部分の非限定的な例としては、米国特許第９，１６９，４８３号明細書の配列番号９〜１４（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。完全配列または配列の一部のいずれかの、ＲＮＡ二重鎖の形成に使用し得るＲＮＡ鎖の非限定的な例としては、米国特許第９，１６９，４８３号明細書の配列番号１〜８ならびに米国特許第９，１８１，５４４号明細書の配列番号１〜１１、３３〜５９、２０８〜２１０、２１３〜２１５および２１８〜２２１（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。ＲＮＡｉ分子の非限定的な例としては、米国特許第９，１６９，４８３号明細書の配列番号１〜８、米国特許第９，１８１，５４４号明細書の配列番号１〜１１、３３〜５９、２０８〜２１０、２１３〜２１５および２１８〜２２１ならびに国際公開第２０１５１７９５２５号パンフレットの配列番号１、６、７、および３５〜３８（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）が挙げられる。
【０１６９】
ＲＮＡｉを活性化させるため、インビトロ合成したｓｉＲＮＡ分子が細胞に導入されてもよい。外因性ｓｉＲＮＡ二重鎖は、細胞に導入されると、内因性ｄｓＲＮＡと同様にアセンブルして、ｓｉＲＮＡ二重鎖の２本の鎖のうちの一方（すなわちアンチセンス鎖）に相補的なＲＮＡ配列と相互作用する多ユニット複合体であるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）を形成することができる。この過程でｓｉＲＮＡのセンス鎖（またはパッセンジャー鎖）が複合体から失われ、一方でｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖（またはガイド鎖）はその相補ＲＮＡとマッチする。詳細には、ｓｉＲＮＡを含有するＲＩＳＣの標的は、完全な配列相補性を呈するｍＲＮＡである。次に、標的の切断、放出および分解によってｓｉＲＮＡ媒介性遺伝子サイレンシングが起こる。
【０１７０】
標的ｍＲＮＡに相同なセンス鎖と標的ｍＲＮＡに相補的なアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ二重鎖は、標的ＲＮＡの破壊効率の点で、一本鎖（ｓｓ）−ｓｉＲＮＡ（例えばアンチセンス鎖ＲＮＡまたはアンチセンスオリゴヌクレオチド）の使用と比較してはるかに大きい利点をもたらす。多くの場合に、ｓｓ−ｓｉＲＮＡの使用は、対応する二重鎖の有効な遺伝子サイレンシング効力を達成するのに、より高い濃度のｓｓ−ｓｉＲＮＡを必要とする。
【０１７１】
前述の分子のいずれも、ウイルスゲノムによってコードされてもよい。
目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖の設計および配列
本発明は、遺伝子発現および／またはタンパク質産生に干渉するためにｍＲＮＡを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖（およびそれらをコードする調節性ポリヌクレオチド）を提供する。
【０１７２】
本発明のコード化ｓｉＲＮＡ二重鎖は、共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するアンチセンス鎖およびセンス鎖を含有し、ここでアンチセンス鎖は標的遺伝子の核酸配列に相補的であり、センス鎖は標的遺伝子の核酸配列と相同である。一部の態様において、アンチセンス鎖の５’末端は５’リン酸基を有し、センス鎖の３’末端は３’ヒドロキシル基を含む。他の態様において、各鎖の３’末端にはヌクレオチドオーバハングがない、１つある、または２つある。
【０１７３】
当該技術分野では、ｓｉＲＮＡの設計に関して幾つかの指針が提案されている。これらの指針は、概して、サイレンシングしようとする遺伝子中の領域を標的とする１９ヌクレオチド二重鎖形成領域、対称２〜３ヌクレオチド３’オーバハング、５’−リン酸基および３’−ヒドロキシル基を作成することを推奨している。ｓｉＲＮＡ配列の好ましさを左右し得る他の規則としては、限定はされないが、（ｉ）アンチセンス鎖の５’末端におけるＡ／Ｕ；（ｉｉ）センス鎖の５’末端におけるＧ／Ｃ；（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’端側３分の１にある少なくとも５個のＡ／Ｕ残基；および（ｉｖ）９ヌクレオチド長より長いいかなるＧＣストレッチも存在しないことが挙げられる。標的遺伝子の具体的な配列と合わせて、かかる考慮点に従い、哺乳類標的遺伝子発現の抑制に不可欠な極めて有効なｓｉＲＮＡ分子を容易に設計し得る。
【０１７４】
本発明によれば、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡ）が設計される。かかるｓｉＲＮＡ分子は、特異的に遺伝子発現およびタンパク質産生を抑制することができる。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞の遺伝子変異体、すなわち突然変異型転写物を選択的に「ノックアウト」するように設計および使用される。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞の遺伝子変異体を選択的に「ノックダウン」するように設計および使用される。他の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、目的の遺伝子の野生型および突然変異型の両方を阻害または抑制することが可能である。
【０１７５】
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、両方の鎖が共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するセンス鎖と相補的アンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は、標的ｍＲＮＡ配列に対して標的特異的ＲＮＡｉを導くのに十分な相補性を有し、すなわちｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ機構または過程による標的ｍＲＮＡの破壊を惹起するのに十分な配列を有する。
【０１７６】
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、両方の鎖が共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するセンス鎖と相補的アンチセンス鎖とを含み、ここでｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの開始部位は、標的ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド１０〜１０００にある。非限定的な例として、開始部位は、標的ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド１０〜２０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００にあってもよい。更に別の非限定的な例として、開始部位は、標的ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、および１０００にあってもよい。
【０１７７】
一部の実施形態において、アンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡ配列とは１００％の相補性を有する。アンチセンス鎖は標的ｍＲＮＡ配列の任意の一部と相補的であってもよい。
他の実施形態において、アンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡ配列とは少なくとも１つのミスマッチを含む。非限定的な例として、アンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡ配列とは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％の相補性を有する。
【０１７８】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む。
本発明によれば、ｓｉＲＮＡ分子は長さが約１０〜５０ヌクレオチドまたはそれ以上であり、すなわち、各鎖が１０〜５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は長さが各鎖約１５〜３０、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドであり、ここで鎖の一方は標的領域と十分に相補的である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は、約１９〜２５、１９〜２４または１９〜２１ヌクレオチドの長さを有する。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、１９ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２０ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２１ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２２ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２３ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２４ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２５ヌクレオチド長である。
【０１７９】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、および３’末端に２オーバハングヌクレオチドを含む合成ＲＮＡ二重鎖であり得る。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は非修飾ＲＮＡ分子であってもよい。他の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、塩基、糖または骨格修飾などの少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有し得る。
【０１８０】
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、アンチセンス配列およびセンス配列またはその断片もしくは変異体を含み得る。非限定的な例として、アンチセンス配列およびセンス配列は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％の相補性を有する。
【０１８１】
他の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、細胞への送達用のプラスミドベクター、ＡＡＶ粒子、ウイルスゲノムまたは他の核酸発現ベクターにコードすることができる。
【０１８２】
ＤＮＡ発現プラスミドを使用して本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを細胞で安定に発現させ、標的遺伝子発現の長期阻害を実現することができる。一態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖とは、典型的には短いスペーサ配列によって連結され、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれるステム−ループ構造の発現をもたらす。ヘアピンはダイサーによって認識および切断され、そのようにして成熟ｓｉＲＮＡ分子が生じる。
【０１８３】
本発明によれば、ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＡＡＶ粒子が産生され、ＡＡＶ血清型は、本明細書に挙げられる血清型のいずれであってもよい。ＡＡＶ血清型の非限定的な例としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、ＡＡＶＧ２Ｂ５およびそれらのバリアントが挙げられる。
【０１８４】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは標的ｍＲＮＡを抑制（または分解）する。したがって、本ｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡを使用して、細胞、例えばニューロンにおける遺伝子発現を実質的に阻害することができる。一部の態様において、遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、３５〜４５％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、５５〜６５％、５７〜６８％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、８５〜９９％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％の阻害を指す。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物が少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、３５〜４５％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、５５〜６５％、５７〜６８％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、８５〜９９％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％阻害され得る。非限定的な例として、抑制は、３０〜４０％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、３０〜４５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、３５〜４５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、５０％を超えてもよい。非限定的な例として、阻害は、５０〜６０％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、６０％を超えてもよい。非限定的な例として、阻害は、５５〜６５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、５７〜６８％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、７０〜８０％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、８５〜９９％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、３５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、３６％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、４０％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、４１％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、４３％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、４５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、４９％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、６２％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、６４％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、７４％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、７７％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、８４％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、８７％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、９５％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、９９％であってもよい。非限定的な例として、阻害は、１００％であってもよい。
【０１８５】
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、脊髄運動ニューロンにおいて標的ｍＲＮＡを抑制（または分解）する。一部の態様において、遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、３５〜４５％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、５５〜６５％、５７〜６８％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、８５〜９９％、９０〜９５％、９０〜１００％若しくは９５〜１００％の抑制を指す。したがって、標的遺伝子発現のタンパク質産生は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、３１％、３２％、３３％、３４％、３５％、３６％、３７％、３８％、３９％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％、９９％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜４５％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、３５〜４５％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、５５〜６５％、５７〜６８％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、８５〜９９％、９０〜９５％、９０〜１００％若しくは９５〜１００％阻害され得る。非限定的な例として、抑制は、３０〜４５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、３５〜４５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、５０％を超えてもよい。非限定的な例として、抑制は、６０％を超えてもよい。非限定的な例として、抑制は、５０〜６０％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、５５〜６５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、５７〜６８％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、７０〜８０％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、８５〜９９％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、３５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、３６％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、４０％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、４１％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、４３％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、４５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、４９％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、６２％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、６４％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、７４％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、７７％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、８４％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、８７％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、９５％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、９９％であってもよい。非限定的な例として、抑制は、１００％であってもよい。
【０１８６】
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、脊髄運動ニューロンにおいて標的ｍＲＮＡを７８％抑制（または分解）する。
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、脊髄運動ニューロンにおいて標的ｍＲＮＡを４５〜５５％抑制（または分解）する。
【０１８７】
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、運動ニューロン形態学的特徴のｖｇ＋  細胞において標的ｍＲＮＡを抑制（または分解）する。一部の態様において、遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％若しくは９５〜１００％の阻害を指す。したがって、標的遺伝子発現のタンパク質産生は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、４１％、４２％、４３％、４４％、４５％、４６％、４７％、４８％、４９％、５０％、５１％、５２％、５３％、５４％、５５％、５６％、５７％、５８％、５９％、６０％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、４５〜５０％、４５〜５５％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％若しくは９５〜１００％阻害され得る。
【０１８８】
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、運動ニューロン形態学的特徴のｖｇ＋  細胞において標的ｍＲＮＡを５３％抑制（または分解）する。
【０１８９】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、ガイド鎖に位置する標的に対するｍｉＲＮＡシードマッチを含む。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、パッセンジャー鎖に位置する標的に対するｍｉＲＮＡシードマッチを含む。更に別の実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖に位置する標的に対するシードマッチを含まない。
【０１９０】
一実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖について有意な完全長オフターゲット効果をほぼ有しないものであり得る。別の実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、パッセンジャー鎖について有意な完全長オフターゲット効果をほぼ有しないものであり得る。目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、パッセンジャー鎖について１％未満、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１〜５％、２〜６％、３〜７％、４〜８％、５〜９％、５〜１０％、６〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜４０％、１０〜５０％、１５〜３０％、１５〜４０％、１５〜４５％、２０〜４０％、２０〜５０％、２５〜５０％、３０〜４０％、３０〜５０％、３５〜５０％、４０〜５０％、４５〜５０％の完全長オフターゲット効果を有し得る。更に別の実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖について有意な完全長オフターゲット効果をほぼ有しないものであり得る。目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖について１％未満、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１〜５％、２〜６％、３〜７％、４〜８％、５〜９％、５〜１０％、６〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％、５〜３０％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜４０％、１０〜５０％、１５〜３０％、１５〜４０％、１５〜４５％、２０〜４０％、２０〜５０％、２５〜５０％、３０〜４０％、３０〜５０％、３５〜５０％、４０〜５０％、４５〜５０％の完全長オフターゲット効果を有し得る。
【０１９１】
一実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡはインビトロで高い活性を有し得る。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子はインビトロで低い活性を有し得る。更に別の実施形態において、目的の遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡはインビトロで高いガイド鎖活性および低いパッセンジャー鎖活性を有し得る。
【０１９２】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子はインビトロで高いガイド鎖活性および低いパッセンジャー鎖活性を有する。ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％または１００％であり得る。ガイド鎖による標的ノックダウンは４０〜５０％、４５〜５０％、５０〜５５％、５０〜６０％、６０〜６５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、６０〜９９．５％、６０〜１００％、６５〜７０％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、６５〜９９％、６５〜９９．５％、６５〜１００％、７０〜７５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、７０〜９９．５％、７０〜１００％、７５〜８０％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、７５〜９９％、７５〜９９．５％、７５〜１００％、８０〜８５％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、８０〜９９．５％、８０〜１００％、８５〜９０％、８５〜９５％、８５〜９９％、８５〜９９．５％、８５〜１００％、９０〜９５％、９０〜９９％、９０〜９９．５％、９０〜１００％、９５〜９９％、９５〜９９．５％、９５〜１００％、９９〜９９．５％、９９〜１００％または９９．５〜１００％であり得る。非限定的な例として、ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は７０％より高い。非限定的な例として、ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は６０％より高い。
【０１９３】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、センス配列またはアンチセンス配列について、目的の遺伝子ではない配列に対するｍｉＲＮＡシードマッチがないように設計される。
【０１９４】
一実施形態において、最も近いオフターゲットに対するガイド鎖のＩＣ５０は、オンターゲット遺伝子に対するガイド鎖のＩＣ５０の１００倍よりも高い。非限定的な例として、最も近いオフターゲットに対するガイド鎖のＩＣ５０が標的に対するガイド鎖のＩＣ５０の１００倍よりも高い場合、そのｓｉＲＮＡ分子は、インビトロでの目的の遺伝子の阻害に高いガイド鎖選択性を有すると言われる。
【０１９５】
一実施形態において、ガイド鎖の５’プロセシングは、インビトロまたはインビボで少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも９９％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも９９％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも９０％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも９０％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも８５％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも８５％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。
【０１９６】
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は、インビトロまたはインビボで１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１；１、２：１０、２：９、２：８、２：７、２：６、２：５、２：４、２：３、２：２、２：１、３：１０、３：９、３：８、３：７、３：６、３：５、３：４、３：３、３：２、３：１、４：１０、４：９、４：８、４：７、４：６、４：５、４：４、４：３、４：２、４：１、５：１０、５：９、５：８、５：７、５：６、５：５、５：４、５：３、５：２、５：１、６：１０、６：９、６：８、６：７、６：６、６：５、６：４、６：３、６：２、６：１、７：１０、７：９、７：８、７：７、７：６、７：５、７：４、７：３、７：２、７：１、８：１０、８：９、８：８、８：７、８：６、８：５、８：４、８：３、８：２、８：１、９：１０、９：９、９：８、９：７、９：６、９：５、９：４、９：３、９：２、９：１、１０：１０、１０：９、１０：８、１０：７、１０：６、１０：５、１０：４、１０：３、１０：２、１０：１、１：９９、５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５、または９９：１である。ガイド対パッセンジャー比とは、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏＲＮＡの細胞内プロセシング後のガイド鎖対パッセンジャー鎖の比を指す。例えば、８０：２０のガイド対パッセンジャー比であれば、前駆体からプロセシングされるパッセンジャー鎖２つにつき８つのガイド鎖を有し得る。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比はインビトロで８：２である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比はインビボで８：２である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比はインビトロで９：１である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比はインビボで９：１である。
【０１９７】
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）比は、１〜９９、１．３〜９９、５〜９９、１０〜９９、１５〜９９、２０〜９９、２５〜９９、３０〜９９、３５〜９９、４０〜９９、４５〜９９、５０〜９９、５５〜９９、６０〜９９、６５〜９９、７０〜９９、７５〜９９、８０〜９９、８５〜９９、９０〜９９、９５〜９９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜５５、１〜６０、１〜６５、１〜７０、１〜７５、１〜８０、１〜８５、１〜９０、１〜９５、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、１０〜６０、１０〜６５、１０〜７０、１０〜７５、１０〜８０、１０〜８５、１０〜９０、１０〜９５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜４５、１５〜５０、１５〜５５、１５〜６０、１５〜６５、１５〜７０、１５〜７５、１５〜８０、１５〜８５、１５〜９０、１５〜９５、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、２０〜６０、２０〜６５、２０〜７０、２０〜７５、２０〜８０、２０〜８５、２０〜９０、２０〜９５、２５〜３０、２５〜３５、２５〜４０、２５〜４５、２５〜５０、２５〜５５、２５〜６０、２５〜６５、２５〜７０、２５〜７５、２５〜８０、２５〜８５、２５〜９０、２５〜９５、３０〜３５、３０〜４０、３０〜４５、３０〜５０、３０〜５５、３０〜６０、３０〜６５、３０〜７０、３０〜７５、３０〜８０、３０〜８５、３０〜９０、３０〜９５、３５〜４０、３５〜４５、３５〜５０、３５〜５５、３５〜６０、３５〜６５、３５〜７０、３５〜７５、３５〜８０、３５〜８５、３５〜９０、３５〜９５、４０〜４５、４０〜５０、４０〜５５、４０〜６０、４０〜６５、４０〜７０、４０〜７５、４０〜８０、４０〜８５、４０〜９０、４０〜９５、４５〜５０、４５〜５５、４５〜６０、４５〜６５、４５〜７０、４５〜７５、４５〜８０、４５〜８５、４５〜９０、４５〜９５、５０〜５５、５０〜６０、５０〜６５、５０〜７０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５、５５〜６０、５５〜６５、５５〜７０、５５〜７５、５５〜８０、５５〜８５、５５〜９０、５５〜９５、６０〜６５、６０〜７０、６０〜７５、６０〜８０、６０〜８５、６０〜９０、６０〜９５、６５〜７０、６５〜７５、６５〜８０、６５〜８５、６５〜９０、６５〜９５、７０〜７５、７０〜８０、７０〜８５、７０〜９０、７０〜９５、７５〜８０、７５〜８５、７５〜９０、７５〜９５、８０〜８５、８０〜９０、８０〜９５、８５〜９０、８５〜９５、または９０〜９５の範囲である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比は、１．３〜９９の範囲である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖比は、１０〜９９の範囲である。
【０１９８】
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）比は、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５、５１、５１．５、５２、５２．５、５３、５３．５、５４、５４．５、５５、５５．５、５６、５６．５、５７、５７．５、５８、５８．５、５９、５９．５、６０、６０．５、６１、６１．５、６２、６２．５、６３、６３．５、６４、６４．５、６５、６５．５、６６、６６．５、６７、６７．５、６８、６８．５、６９、６９．５、７０、７０．５、７１、７１．５、７２、７２．５、７３、７３．５、７４、７４．５、７５、７５．５、７６、７６．５、７７、７７．５、７８、７８．５、７９、７９．５、８０、８０．５、８１、８１．５、８２、８２．５、８３、８３．５、８４、８４．５、８５、８５．５、８６、８６．５、８７、８７．５、８８、８８．５、８９、８９．５、９０、９０．５、９１、９１．５、９２、９２．５、９３、９３．５、９４、９４．５、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、または９９である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）比は１１．５である。非限定的な例として、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）比は、９９である。
【０１９９】
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は１より大きい。
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は２より大きい。
【０２００】
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は５より大きい。
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は１０より大きい。
【０２０１】
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は２０より大きい。
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は５０より大きい。
【０２０２】
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は３００より大きい。
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は３１４である。
【０２０３】
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は４００より大きい。
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は４３４である。
【０２０４】
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は少なくとも３：１である。
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は少なくとも５：１である。
【０２０５】
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は少なくとも１０：１である。
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は少なくとも２０：１である。
【０２０６】
一実施形態において、ガイド鎖対パッセンジャー鎖（Ｇ：Ｐ）（アンチセンス鎖対センス鎖とも称される）の発現比は少なくとも５０：１である。
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は、インビトロまたはインビボで１：１０、１：９、１：８、１：７、１：６、１：５、１：４、１：３、１：２、１；１、２：１０、２：９、２：８、２：７、２：６、２：５、２：４、２：３、２：２、２：１、３：１０、３：９、３：８、３：７、３：６、３：５、３：４、３：３、３：２、３：１、４：１０、４：９、４：８、４：７、４：６、４：５、４：４、４：３、４：２、４：１、５：１０、５：９、５：８、５：７、５：６、５：５、５：４、５：３、５：２、５：１、６：１０、６：９、６：８、６：７、６：６、６：５、６：４、６：３、６：２、６：１、７：１０、７：９、７：８、７：７、７：６、７：５、７：４、７：３、７：２、７：１、８：１０、８：９、８：８、８：７、８：６、８：５、８：４、８：３、８：２、８：１、９：１０、９：９、９：８、９：７、９：６、９：５、９：４、９：３、９：２、９：１、１０：１０、１０：９、１０：８、１０：７、１０：６、１０：５、１０：４、１０：３、１０：２、１０：１、１：９９、５：９５、１０：９０、１５：８５、２０：８０、２５：７５、３０：７０、３５：６５、４０：６０、４５：５５、５０：５０、５５：４５、６０：４０、６５：３５、７０：３０、７５：２５、８０：２０、８５：１５、９０：１０、９５：５、または９９：１である。パッセンジャー対ガイド比とは、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏＲＮＡの細胞内プロセシング後の、ガイド鎖に対するパッセンジャー鎖の比を指す。例えば、８０：２０のパッセンジャー対ガイド比であれば、前駆体からプロセシングされるガイド鎖２つにつき８つのパッセンジャー鎖を有し得る。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビトロで８０：２０である。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビボで８０：２０である。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビトロで８：２である。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビボで８：２である。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビトロで９：１である。非限定的な例として、パッセンジャー鎖対ガイド鎖比はインビボで９：１である。
【０２０７】
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）比は、１〜９９、１．３〜９９、５〜９９、１０〜９９、１５〜９９、２０〜９９、２５〜９９、３０〜９９、３５〜９９、４０〜９９、４５〜９９、５０〜９９、５５〜９９、６０〜９９、６５〜９９、７０〜９９、７５〜９９、８０〜９９、８５〜９９、９０〜９９、９５〜９９、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜２５、１〜３０、１〜３５、１〜４０、１〜４５、１〜５０、１〜５５、１〜６０、１〜６５、１〜７０、１〜７５、１〜８０、１〜８５、１〜９０、１〜９５、５〜１０、５〜１５、５〜２０、５〜２５、５〜３０、５〜３５、５〜４０、５〜４５、５〜５０、５〜５５、５〜６０、５〜６５、５〜７０、５〜７５、５〜８０、５〜８５、５〜９０、５〜９５、１０〜１５、１０〜２０、１０〜２５、１０〜３０、１０〜３５、１０〜４０、１０〜４５、１０〜５０、１０〜５５、１０〜６０、１０〜６５、１０〜７０、１０〜７５、１０〜８０、１０〜８５、１０〜９０、１０〜９５、１５〜２０、１５〜２５、１５〜３０、１５〜３５、１５〜４０、１５〜４５、１５〜５０、１５〜５５、１５〜６０、１５〜６５、１５〜７０、１５〜７５、１５〜８０、１５〜８５、１５〜９０、１５〜９５、２０〜２５、２０〜３０、２０〜３５、２０〜４０、２０〜４５、２０〜５０、２０〜５５、２０〜６０、２０〜６５、２０〜７０、２０〜７５、２０〜８０、２０〜８５、２０〜９０、２０〜９５、２５〜３０、２５〜３５、２５〜４０、２５〜４５、２５〜５０、２５〜５５、２５〜６０、２５〜６５、２５〜７０、２５〜７５、２５〜８０、２５〜８５、２５〜９０、２５〜９５、３０〜３５、３０〜４０、３０〜４５、３０〜５０、３０〜５５、３０〜６０、３０〜６５、３０〜７０、３０〜７５、３０〜８０、３０〜８５、３０〜９０、３０〜９５、３５〜４０、３５〜４５、３５〜５０、３５〜５５、３５〜６０、３５〜６５、３５〜７０、３５〜７５、３５〜８０、３５〜８５、３５〜９０、３５〜９５、４０〜４５、４０〜５０、４０〜５５、４０〜６０、４０〜６５、４０〜７０、４０〜７５、４０〜８０、４０〜８５、４０〜９０、４０〜９５、４５〜５０、４５〜５５、４５〜６０、４５〜６５、４５〜７０、４５〜７５、４５〜８０、４５〜８５、４５〜９０、４５〜９５、５０〜５５、５０〜６０、５０〜６５、５０〜７０、５０〜７５、５０〜８０、５０〜８５、５０〜９０、５０〜９５、５５〜６０、５５〜６５、５５〜７０、５５〜７５、５５〜８０、５５〜８５、５５〜９０、５５〜９５、６０〜６５、６０〜７０、６０〜７５、６０〜８０、６０〜８５、６０〜９０、６０〜９５、６５〜７０、６５〜７５、６５〜８０、６５〜８５、６５〜９０、６５〜９５、７０〜７５、７０〜８０、７０〜８５、７０〜９０、７０〜９５、７５〜８０、７５〜８５、７５〜９０、７５〜９５、８０〜８５、８０〜９０、８０〜９５、８５〜９０、８５〜９５、または９０〜９５の範囲である。
【０２０８】
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）比は、１０、１０．５、１１、１１．５、１２、１２．５、１３、１３．５、１４、１４．５、１５、１５．５、１６、１６．５、１７、１７．５、１８、１８．５、１９、１９．５、２０、２０．５、２１、２１．５、２２、２２．５、２３、２３．５、２４、２４．５、２５、２５．５、２６、２６．５、２７、２７．５、２８、２８．５、２９、２９．５、３０、３０．５、３１、３１．５、３２、３２．５、３３、３３．５、３４、３４．５、３５、３５．５、３６、３６．５、３７、３７．５、３８、３８．５、３９、３９．５、４０、４０．５、４１、４１．５、４２、４２．５、４３、４３．５、４４、４４．５、４５、４５．５、４６、４６．５、４７、４７．５、４８、４８．５、４９、４９．５、５０、５０．５、５１、５１．５、５２、５２．５、５３、５３．５、５４、５４．５、５５、５５．５、５６、５６．５、５７、５７．５、５８、５８．５、５９、５９．５、６０、６０．５、６１、６１．５、６２、６２．５、６３、６３．５、６４、６４．５、６５、６５．５、６６、６６．５、６７、６７．５、６８、６８．５、６９、６９．５、７０、７０．５、７１、７１．５、７２、７２．５、７３、７３．５、７４、７４．５、７５、７５．５、７６、７６．５、７７、７７．５、７８、７８．５、７９、７９．５、８０、８０．５、８１、８１．５、８２、８２．５、８３、８３．５、８４、８４．５、８５、８５．５、８６、８６．５、８７、８７．５、８８、８８．５、８９、８９．５、９０、９０．５、９１、９１．５、９２、９２．５、９３、９３．５、９４、９４．５、９５、９５．５、９６、９６．５、９７、９７．５、９８、９８．５、または９９である。
【０２０９】
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は１より大きい。
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は２より大きい。
【０２１０】
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は５より大きい。
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は１０より大きい。
【０２１１】
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は２０より大きい。
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は５０より大きい。
【０２１２】
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は少なくとも３：１である。
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は少なくとも５：１である。
【０２１３】
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は少なくとも１０：１である。
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は少なくとも２０：１である。
【０２１４】
一実施形態において、パッセンジャー鎖対ガイド鎖（Ｐ：Ｇ）（センス鎖対アンチセンス鎖とも称される）の発現比は少なくとも５０：１である。
一実施形態において、パッセンジャー鎖−ガイド鎖二重鎖は、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏまたはｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡが、しかし当該技術分野において公知のおよび本明細書に記載される方法、プロセシングを測定したとき２倍より高いガイド鎖対パッセンジャー鎖比を示す場合に有効と見なされる。非限定的な例として、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏまたはｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡは、プロセシングを測定したとき、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍より高い、または２〜５倍、２〜１０倍、２〜１５倍、３〜５倍、３〜１０倍、３〜１５倍、４〜５倍、４〜１０倍、４〜１５倍、５〜１０倍、５〜１５倍、６〜１０倍、６〜１５倍、７〜１０倍、７〜１５倍、８〜１０倍、８〜１５倍、９〜１０倍、９〜１５倍、１０〜１５倍、１１〜１５倍、１２〜１５倍、１３〜１５倍、または１４〜１５倍のガイド鎖対パッセンジャー鎖比を示す。
【０２１５】
一実施形態において、ｄｓＲＮＡをコードするベクターゲノムは、コンストラクトの完全長の少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９％超である配列を含む。非限定的な例として、ベクターゲノムは、コンストラクトの完全長配列の少なくとも８０％である配列を含む。
【０２１６】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子を使用して、目的の遺伝子配列上の少なくとも１つのエクソンを標的とすることにより、目的の遺伝子の野生型または突然変異バージョンをサイレンシングすることができる。エクソンは、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、および／またはエクソン６７であってもよい。
【０２１７】
ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖の設計および配列
本発明は、ＳＯＤ１遺伝子発現および／またはＳＯＤ１タンパク質産生に干渉するためＳＯＤ１  ｍＲＮＡを標的とする低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）二重鎖（およびそれらをコードする調節性ポリヌクレオチド）を提供する。
【０２１８】
本発明のコード化ｓｉＲＮＡ二重鎖は、共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するアンチセンス鎖とセンス鎖とを含有し、ここでアンチセンス鎖は、標的ＳＯＤ１遺伝子の核酸配列に相補的であり、センス鎖は標的ＳＯＤ１遺伝子の核酸配列に相同である。一部の態様において、アンチセンス鎖の５’末端は５’リン酸基を有し、センス鎖の３’末端は３’ヒドロキシル基を含有する。他の態様において、各鎖の３’末端にはヌクレオチドオーバハングがない、１つある、または２つある。
【０２１９】
当該技術分野では、ｓｉＲＮＡの設計に関して幾つかの指針が提案されている。これらの指針は、概して、サイレンシングしようとする遺伝子中の領域を標的とする１９ヌクレオチド二重鎖形成領域、対称２〜３ヌクレオチド３’オーバハング、５’−リン酸基および３’−ヒドロキシル基を作成することを推奨している。ｓｉＲＮＡ配列の好ましさを左右し得る他の規則としては、限定はされないが、（ｉ）アンチセンス鎖の５’末端におけるＡ／Ｕ；（ｉｉ）センス鎖の５’末端におけるＧ／Ｃ；（ｉｉｉ）アンチセンス鎖の５’端側３分の１にある少なくとも５個のＡ／Ｕ残基；および（ｉｖ）９ヌクレオチド長より長いいかなるＧＣストレッチも存在しないことが挙げられる。標的遺伝子の具体的な配列と合わせて、かかる考慮点に従い、ＳＯＤ１遺伝子発現の抑制に不可欠な極めて有効なｓｉＲＮＡ分子を容易に設計し得る。
【０２２０】
本発明によれば、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ分子（例えば、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡ）が設計される。かかるｓｉＲＮＡ分子は、特異的にＳＯＤ１遺伝子発現およびタンパク質産生を抑制することができる。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞のＳＯＤ１遺伝子変異体、すなわちＡＬＳ疾患を有する患者に同定される突然変異型ＳＯＤ１転写物を選択的に「ノックアウト」するように設計および使用される。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、細胞のＳＯＤ１遺伝子変異体を選択的に「ノックダウン」するように設計および使用される。他の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、野生型および突然変異型の両方のＳＯＤ１遺伝子を阻害または抑制することが可能である。
【０２２１】
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、両方の鎖が共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するセンス鎖と相補的アンチセンス鎖とを含む。アンチセンス鎖は標的特異的ＲＮＡｉを導くのに十分な、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ配列との相補性を有し、すなわちｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ機構または過程による標的ｍＲＮＡの破壊を惹起するのに十分な配列を有する。
【０２２２】
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、両方の鎖が共にハイブリダイズして二重鎖構造を形成するセンス鎖と相補的アンチセンス鎖とを含み、ここでＳＯＤ１  ｍＲＮＡとのハイブリダイゼーションの開始部位は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド１５〜１０００である。非限定的な例として、開始部位は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド１５〜２５、１５〜５０、１５〜７５、１５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０および９５０〜１０００であってもよい。更に別の非限定的な例として、開始部位は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ配列上のヌクレオチド２６、２７、２８、２９、３０、３２、３３、３４、３５、３６、３７、７４、７６、７７、７８、１４９、１５３、１５７、１６０、１７７、１９２、１９３、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２０６、２０９、２１０、２３９、２４１、２６１、２６３、２６４、２６８、２６９、２７６、２７８、２８１、２８４、２９０、２９１、２９５、２９６、３１６、３１７、３２９、３３０、３３７、３５０、３５１、３５２、３５４、３５７、３５８、３６４、３７５、３７８、３８３、３８４、３９０、３９２、３９５、４０４、４０６、４１７、４１８、４６９、４７０、４７５、４７６、４８０、４８７、４９４、４９６、４９７、５０１、５０４、５１５、５１８、５２２、５２３、５２４、５５２、５５４、５５５、５６２、５７６、５７７、５７８、５７９、５８１、５８３、５８４、５８５、５８７、５８８、５８９、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６０２、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１６、６２１、６３３、６３５、６３６、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６５４、６６０、６６１、６６６、６６７、６６８、６６９、６７３、６７７、６９２、６９８、６９９、７００、７０１、７０６、７４９、７７０、７７２、７７５、７８１、８００、８０４、８１９、８２９、８３２、８３３、８５１、８５４、８５５、８５７、８５８、８５９、８６１、８６９、８９１、８９２、９０６、９０７、９１２、９１３、９３４、９４４、および９４７であってもよい。
【０２２３】
一部の実施形態において、アンチセンス鎖と標的ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ配列とは１００％の相補性を有する。アンチセンス鎖は標的ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ配列の任意の一部と相補的であってもよい。
【０２２４】
他の実施形態において、アンチセンス鎖と標的ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ配列とは少なくとも１つのミスマッチを含む。非限定的な例として、アンチセンス鎖と標的ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ配列とは、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％の相補性を有する。
【０２２５】
一実施形態において、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡまたはｄｓＲＮＡは、互いに相補的な少なくとも２つの配列を含む。
本発明によれば、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子は長さが約１０〜５０ヌクレオチドまたはそれ以上であり、すなわち、各鎖が１０〜５０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含む。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は長さが各鎖約１５〜３０、例えば、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０ヌクレオチドであり、ここで鎖の一方は標的領域と十分に相補的である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の各鎖は長さが約１９〜２５、１９〜２４または１９〜２１ヌクレオチドである。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、１９ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２０ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２１ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２２ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２３ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２４ヌクレオチド長である。一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子の少なくとも一方の鎖は、２５ヌクレオチド長である。
【０２２６】
一部の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本発明のｓｉＲＮＡ分子は、約１９ヌクレオチド〜約２５ヌクレオチド、および３’末端に２オーバハングヌクレオチドを含む合成ＲＮＡ二重鎖であり得る。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は非修飾ＲＮＡ分子であってもよい。他の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、塩基、糖または骨格修飾などの少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含有し得る。
【０２２７】
一実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本発明のｓｉＲＮＡ分子は、限定はされないが、表２のアンチセンス（ガイド）配列またはそれらの断片もしくは変異体などのヌクレオチド配列を含み得る。非限定的な例として、本発明のｓｉＲＮＡ分子に使用されるアンチセンス配列は、表２のヌクレオチド配列の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％である。別の非限定的な例として、本発明のｓｉＲＮＡ分子に使用されるアンチセンス配列は、表２のヌクレオチド配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２１超の連続ヌクレオチドを含む。更に別の非限定的な例として、本発明のｓｉＲＮＡ分子に使用されるアンチセンス配列は、表２の配列のヌクレオチド１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、２〜１４、２〜１３、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、６〜２２、６〜２１、６〜２０、６〜１９、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、７〜２２、７〜２１、７〜２０、７〜１９、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、８〜２２、８〜２１、８〜２０、８〜１９、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、９〜２２、９〜２１、９〜２０、９〜１９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、９〜１４、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１１〜２２、１１〜２１、１１〜２０、１１〜１９、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１１〜１４、１２〜２２、１２〜２１、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１３〜２２、１３〜２１、１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２２、１４〜２１、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２２、１６〜２１、１６〜２０、１７〜２２、１７〜２１、または１８〜２２を含む。
【０２２８】
【表２】
2021502060.tif 000003
一実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本発明のｓｉＲＮＡ分子は、限定はされないが、表３のセンス（パッセンジャー）配列またはそれらの断片もしくは変異体などのヌクレオチド配列を含み得る。非限定的な例として、本発明のｓｉＲＮＡ分子に使用されるセンス配列は、表３のヌクレオチド配列の少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％である。別の非限定的な例として、本発明のｓｉＲＮＡ分子に使用されるセンス配列は、表３のヌクレオチド配列の少なくとも３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１または２１超の連続ヌクレオチドを含む。更に別の非限定的な例として、本発明のｓｉＲＮＡ分子に使用されるセンス配列は、表３の配列のヌクレオチド１〜２２、１〜２１、１〜２０、１〜１９、１〜１８、１〜１７、１〜１６、１〜１５、１〜１４、１〜１３、１〜１２、１〜１１、１〜１０、１〜９、１〜８、２〜２２、２〜２１、２〜２０、２〜１９、２〜１８、２〜１７、２〜１６、２〜１５、２〜１４、２〜１３、２〜１２、２〜１１、２〜１０、２〜９、２〜８、３〜２２、３〜２１、３〜２０、３〜１９、３〜１８、３〜１７、３〜１６、３〜１５、３〜１４、３〜１３、３〜１２、３〜１１、３〜１０、３〜９、３〜８、４〜２２、４〜２１、４〜２０、４〜１９、４〜１８、４〜１７、４〜１６、４〜１５、４〜１４、４〜１３、４〜１２、４〜１１、４〜１０、４〜９、４〜８、５〜２２、５〜２１、５〜２０、５〜１９、５〜１８、５〜１７、５〜１６、５〜１５、５〜１４、５〜１３、５〜１２、５〜１１、５〜１０、５〜９、５〜８、６〜２２、６〜２１、６〜２０、６〜１９、６〜１８、６〜１７、６〜１６、６〜１５、６〜１４、６〜１３、６〜１２、６〜１１、６〜１０、７〜２２、７〜２１、７〜２０、７〜１９、７〜１８、７〜１７、７〜１６、７〜１５、７〜１４、７〜１３、７〜１２、８〜２２、８〜２１、８〜２０、８〜１９、８〜１８、８〜１７、８〜１６、８〜１５、８〜１４、８〜１３、８〜１２、９〜２２、９〜２１、９〜２０、９〜１９、９〜１８、９〜１７、９〜１６、９〜１５、９〜１４、１０〜２２、１０〜２１、１０〜２０、１０〜１９、１０〜１８、１０〜１７、１０〜１６、１０〜１５、１０〜１４、１１〜２２、１１〜２１、１１〜２０、１１〜１９、１１〜１８、１１〜１７、１１〜１６、１１〜１５、１１〜１４、１２〜２２、１２〜２１、１２〜２０、１２〜１９、１２〜１８、１２〜１７、１２〜１６、１３〜２２、１３〜２１、１３〜２０、１３〜１９、１３〜１８、１３〜１７、１３〜１６、１４〜２２、１４〜２１、１４〜２０、１４〜１９、１４〜１８、１４〜１７、１５〜２２、１５〜２１、１５〜２０、１５〜１９、１５〜１８、１６〜２２、１６〜２１、１６〜２０、１７〜２２、１７〜２１、または１８〜２２を含む。
【０２２９】
【表３】
2021502060.tif 000004
一実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本発明のｓｉＲＮＡ分子は、表２からのアンチセンス配列および表３からのセンス配列、またはそれらの断片もしくは変異体を含み得る。非限定的な例として、アンチセンス配列およびセンス配列は、少なくとも３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜９９％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜９９％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜９９％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜９９％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、９０〜９５％、９０〜９９％または９５〜９９％の相補性を有する。
【０２３０】
一実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本発明のｓｉＲＮＡ分子は、表４に記載されるとおりのセンスおよびアンチセンスｓｉＲＮＡ二重鎖を含み得る。非限定的な例として、これらのｓｉＲＮＡ二重鎖は、内因性ＳＯＤ１遺伝子発現に対するインビトロ阻害活性に関して試験されてもよい。
【０２３１】
【表４】
2021502060.tif 000005
他の実施形態において、ＳＯＤ１を標的とする本発明のｓｉＲＮＡ分子は、細胞への送達用のプラスミドベクター、ＡＡＶ粒子、ウイルウゲノムまたは他の核酸発現ベクターにコードすることができる。
【０２３２】
ＤＮＡ発現プラスミドを使用して、ＳＯＤ１を標的とする本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを細胞内で安定的に発現させ、標的遺伝子発現の長期阻害を実現することができる。一態様において、ｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖とは、典型的には、短いスペーサ配列によって連結され、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれるステム−ループ構造の発現をもたらす。ヘアピンはダイサーによって認識および切断され、そのようにして成熟ｓｉＲＮＡ分子が生じる。
【０２３３】
本発明によれば、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸を含むＡＡＶ粒子が産生され、ＡＡＶ血清型は、本明細書に挙げられる血清型のいずれであってもよい。ＡＡＶ血清型の非限定的な例としては、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８、ＡＡＶ−ＤＪ、ＡＡＶ−ＰＨＰ．Ａ、および／またはＡＡＶ−ＰＨＰ．Ｂ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ２、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ３、ＡＡＶＰＨＰ．Ｎ／ＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＴＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＧＧＴ−Ｔ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＡＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ（３）、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＮＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＮＱＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＳ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＧＮ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＥＧＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＤＳＴ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＰＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＳＱＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＱＬＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＭＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｂ−ＴＴＰ、ＡＡＶＰＨＰ．Ｓ／Ｇ２Ａ１２、ＡＡＶＧ２Ａ１５／Ｇ２Ａ３、ＡＡＶＧ２Ｂ４、ＡＡＶＧ２Ｂ５およびそれらのバリアントが挙げられる。
【０２３４】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡを抑制（または分解）する。したがって、本ｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡを使用して、細胞におけるＳＯＤ１遺伝子発現を実質的に阻害することができる。一部の態様において、ＳＯＤ１遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％の阻害を指す。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％、または少なくとも２０〜３０％、２０〜４０％、２０〜５０％、２０〜６０％、２０〜７０％、２０〜８０％、２０〜９０％、２０〜９５％、２０〜１００％、３０〜４０％、３０〜５０％、３０〜６０％、３０〜７０％、３０〜８０％、３０〜９０％、３０〜９５％、３０〜１００％、４０〜５０％、４０〜６０％、４０〜７０％、４０〜８０％、４０〜９０％、４０〜９５％、４０〜１００％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９５％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜１００％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜１００％または９５〜１００％阻害され得る。
【０２３５】
本発明によれば、ｓｉＲＮＡ分子は、培養細胞でのＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを低下させるように設計され、それらの能力に関して試験される。かかるｓｉＲＮＡ分子は、限定はされないが、表４に挙げられるものなどが挙げられ、二重鎖を形成し得る。非限定的な例として、ｓｉＲＮＡ二重鎖はｓｉＲＮＡ二重鎖ＩＤ：Ｄ−４０００〜Ｄ−４０２５であってもよい。
【０２３６】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、ガイド鎖に位置するＳＯＤ１に対するｍｉＲＮＡシードマッチを含む。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、パッセンジャー鎖に位置するＳＯＤ１に対するｍｉＲＮＡシードマッチを含む。更に別の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖に位置するＳＯＤ１に対するシードマッチを含まない。
【０２３７】
一実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖について有意な完全長オフターゲット効果をほぼ有しないものであり得る。別の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、パッセンジャー鎖について有意な完全長オフターゲット効果をほぼ有しないものであり得る。ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、パッセンジャー鎖について１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１〜５％、２〜６％、３〜７％、４〜８％、５〜９％、５〜１０％、６〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％  ５〜３０％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜４０％、１０〜５０％、１５〜３０％、１５〜４０％、１５〜４５％、２０〜４０％、２０〜５０％、２５〜５０％、３０〜４０％、３０〜５０％、３５〜５０％、４０〜５０％、４５〜５０％未満の完全長オフターゲット効果を有し得る。更に別の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖について有意な完全長オフターゲットをほぼ有しないものであり得る。ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、ガイド鎖またはパッセンジャー鎖について、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、１〜５％、２〜６％、３〜７％、４〜８％、５〜９％、５〜１０％、６〜１０％、５〜１５％、５〜２０％、５〜２５％  ５〜３０％、１０〜２０％、１０〜３０％、１０〜４０％、１０〜５０％、１５〜３０％、１５〜４０％、１５〜４５％、２０〜４０％、２０〜５０％、２５〜５０％、３０〜４０％、３０〜５０％、３５〜５０％、４０〜５０％、４５〜５０％未満の完全長オフターゲット効果を有し得る。
【０２３８】
一実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはコード化ｄｓＲＮＡは、インビトロで高い活性を有し得る。別の実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、インビトロで低い活性を有し得る。更に別の実施形態において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、インビトロで高いガイド鎖活性および低いパッセンジャー鎖活性を有し得る。
【０２３９】
一実施形態において、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子はインビトロで高いガイド鎖活性および低いパッセンジャー鎖活性を有する。ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は、少なくとも４０％、５０％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％、９９．５％または１００％であり得る。ガイド鎖による標的ノックダウンは、４０〜５０％、４５〜５０％、５０〜５５％、５０〜６０％、６０〜６５％、６０〜７０％、６０〜７５％、６０〜８０％、６０〜８５％、６０〜９０％、６０〜９５％、６０〜９９％、６０〜９９．５％、６０〜１００％、６５〜７０％、６５〜７５％、６５〜８０％、６５〜８５％、６５〜９０％、６５〜９５％、６５〜９９％、６５〜９９．５％、６５〜１００％、７０〜７５％、７０〜８０％、７０〜８５％、７０〜９０％、７０〜９５％、７０〜９９％、７０〜９９．５％、７０〜１００％、７５〜８０％、７５〜８５％、７５〜９０％、７５〜９５％、７５〜９９％、７５〜９９．５％、７５〜１００％、８０〜８５％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、８０〜９９．５％、８０〜１００％、８５〜９０％、８５〜９５％、８５〜９９％、８５〜９９．５％、８５〜１００％、９０〜９５％、９０〜９９％、９０〜９９．５％、９０〜１００％、９５〜９９％、９５〜９９．５％、９５〜１００％、９９〜９９．５％、９９〜１００％または９９．５〜１００％であり得る。非限定的な例として、ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は、７０％よりも大きい。非限定的な例として、ガイド鎖による標的ノックダウン（ＫＤ）は、６０％よりも大きい。
【０２４０】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ二重鎖標的ＳＯＤ１は、センス配列またはアンチセンス配列について非ＳＯＤ１配列に対するｍｉＲＮＡシードマッチがないように設計される。
【０２４１】
一実施形態において、最も近いオフターゲットに対する、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖のＩＣ５０は、オンターゲット遺伝子、ＳＯＤ１に対するガイド鎖のＩＣ５０の１００倍よりも高い。非限定的な例として、最も近いオフターゲットに対するガイド鎖のＩＣ５０が標的に対するガイド鎖のＩＣ５０の１００倍よりも高い場合、そのｓｉＲＮＡ分子は、インビトロでのＳＯＤ１の阻害に高いガイド鎖選択性を有すると言われる。
【０２４２】
一実施形態において、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、インビトロまたはインビボで、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも９９％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも９９％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも９０％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも９０％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビトロで少なくとも８５％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ガイド鎖の５’プロセシングは正確であり、インビボで少なくとも８５％の確率で５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。
【０２４３】
一実施形態において、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、７５〜９５％、７５〜９０％、７５〜８５％、７５〜８０％、８０〜９５％、８０〜９０％、８０〜８５％、８５〜９５％、８５〜９０％、または９０〜９５％の範囲の５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、７５〜９５％の範囲の５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。
【０２４４】
一実施形態において、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、発現されたコンストラクトの７５％、７５．１％、７５．２％、７５．３％、７５．４％、７５．５％、７５．６％、７５．７％、７５．８％、７５．９％、７６％、７６．１％、７６．２％、７６．３％、７６．４％、７６．５％、７６．６％、７６．７％、７６．８％、７６．９％、７７％、７７．１％、７７．２％、７７．３％、７７．４％、７７．５％、７７．６％、７７．７％、７７．８％、７７．９％、７８％、７８．１％、７８．２％、７８．３％、７８．４％、７８．５％、７８．６％、７８．７％、７８．８％、７８．９％、７９％、７９．１％、７９．２％、７９．３％、７９．４％、７９．５％、７９．６％、７９．７％、７９．８％、７９．９％、８０％、８０．１％、８０．２％、８０．３％、８０．４％、８０．５％、８０．６％、８０．７％、８０．８％、８０．９％、８１％、８１．１％、８１．２％、８１．３％、８１．４％、８１．５％、８１．６％、８１．７％、８１．８％、８１．９％、８２％、８２．１％、８２．２％、８２．３％、８２．４％、８２．５％、８２．６％、８２．７％、８２．８％、８２．９％、８３％、８３．１％、８３．２％、８３．３％、８３．４％、８３．５％、８３．６％、８３．７％、８３．８％、８３．９％、８４％、８４．１％、８４．２％、８４．３％、８４．４％、８４．５％、８４．６％、８４．７％、８４．８％、８４．９％、８５％、８５．１％、８５．２％、８５．３％、８５．４％、８５．５％、８５．６％、８５．７％、８５．８％、８５．９％、８６％、８６．１％、８６．２％、８６．３％、８６．４％、８６．５％、８６．６％、８６．７％、８６．８％、８６．９％、８７％、８７．１％、８７．２％、８７．３％、８７．４％、８７．５％、８７．６％、８７．７％、８７．８％、８７．９％、８８％、８８．１％、８８．２％、８８．３％、８８．４％、８８．５％、８８．６％、８８．７％、８８．８％、８８．９％、８９％、８９．１％、８９．２％、８９．３％、８９．４％、８９．５％、８９．６％、８９．７％、８９．８％、８９．９％、９０％、９０．１％、９０．２％、９０．３％、９０．４％、９０．５％、９０．６％、９０．７％、９０．８％、９０．９％、９１％、９１．１％、９１．２％、９１．３％、９１．４％、９１．５％、９１．６％、９１．７％、９１．８％、９１．９％、９２％、９２．１％、９２．２％、９２．３％、９２．４％、９２．５％、９２．６％、９２．７％、９２．８％、９２．９％、９３％、９３．１％、９３．２％、９３．３％、９３．４％、９３．５％、９３．６％、９３．７％、９３．８％、９３．９％、９４％、９４．１％、９４．２％、９４．３％、９４．４％、９４．５％、９４．６％、９４．７％、９４．８％、９４．９％、または９５％の５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、発現されたコンストラクトの８１％の５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。非限定的な例として、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖のガイド鎖の５’プロセシングは、発現されたコンストラクトの９０％の５’末端に正しい開始（ｎ）を有する。
【０２４５】
一実施形態において、ＳＯＤ１に対するパッセンジャー鎖−ガイド鎖二重鎖は、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏまたはｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡが、当該技術分野において公知のおよび本明細書に記載される方法により、プロセシングを測定したとき２倍より高いガイド鎖対パッセンジャー鎖比を示す場合に有効と見なされる。非限定的な例として、ｐｒｉ−ｍｉｃｒｏまたはｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡは、プロセシングを測定したとき、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍より高い、または２〜５倍、２〜１０倍、２〜１５倍、３〜５倍、３〜１０倍、３〜１５倍、４〜５倍、４〜１０倍、４〜１５倍、５〜１０倍、５〜１５倍、６〜１０倍、６〜１５倍、７〜１０倍、７〜１５倍、８〜１０倍、８〜１５倍、９〜１０倍、９〜１５倍、１０〜１５倍、１１〜１５倍、１２〜１５倍、１３〜１５倍、または１４〜１５倍のガイド鎖対パッセンジャー鎖比を示す。
【０２４６】
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子を使用して、ＳＯＤ１配列上の少なくとも１つのエクソンを標的とすることにより野生型または突然変異型ＳＯＤ１をサイレンシングすることができる。エクソンは、エクソン１、エクソン２、エクソン３、エクソン４、エクソン５、エクソン６、エクソン７、エクソン８、エクソン９、エクソン１０、エクソン１１、エクソン１２、エクソン１３、エクソン１４、エクソン１５、エクソン１６、エクソン１７、エクソン１８、エクソン１９、エクソン２０、エクソン２１、エクソン２２、エクソン２３、エクソン２４、エクソン２５、エクソン２６、エクソン２７、エクソン２８、エクソン２９、エクソン３０、エクソン３１、エクソン３２、エクソン３３、エクソン３４、エクソン３５、エクソン３６、エクソン３７、エクソン３８、エクソン３９、エクソン４０、エクソン４１、エクソン４２、エクソン４３、エクソン４４、エクソン４５、エクソン４６、エクソン４７、エクソン４８、エクソン４９、エクソン５０、エクソン５１、エクソン５２、エクソン５３、エクソン５４、エクソン５５、エクソン５６、エクソン５７、エクソン５８、エクソン５９、エクソン６０、エクソン６１、エクソン６２、エクソン６３、エクソン６４、エクソン６５、エクソン６６、および／またはエクソン６７であってもよい。
【０２４７】
一実施形態において、全内因性ｍｉＲＮＡプールのガイド鎖の範囲は、０．００１〜０．６％、０．００５〜０．６％、０．０１〜０．６％、０．０１５〜０．６％、０．０２〜０．６％、０．０２５〜０．６％、０．０３〜０．６％、０．０３５〜０．６％、０．０４〜０．６％、０．０４５〜０．６％、０．０５〜０．６％、０．０５５〜０．６％、０．０６〜０．６％、０．０６５〜０．６％、０．０７〜０．６％、０．０７５〜０．６％、０．０８〜０．６％、０．０８５〜０．６％、０．０９〜０．６％、０．０９５〜０．６％、０．１〜０．６％、０．１５〜０．６％、０．２〜０．６％、０．２５〜０．６％、０．３〜０．６％、０．３５〜０．６％、０．４〜０．６％、０．４５〜０．６％、０．５〜０．６％、０．５５〜０．６％、０．００１〜０．５％、０．００５〜０．５％、０．０１〜０．５％、０．０１５〜０．５％、０．０２〜０．５％、０．０２５〜０．５％、０．０３〜０．５％、０．０３５〜０．５％、０．０４〜０．５％、０．０４５〜０．５％、０．０５〜０．５％、０．０５５〜０．５％、０．０６〜０．５％、０．０６５〜０．５％、０．０７〜０．５％、０．０７５〜０．５％、０．０８〜０．５％、０．０８５〜０．５％、０．０９〜０．５％、０．０９５〜０．５％、０．１〜０．５％、０．１５〜０．５％、０．２〜０．５％、０．２５〜０．５％、０．３〜０．５％、０．３５〜０．５％、０．４〜０．５％、０．４５〜０．５％、０．００１〜０．４％、０．００５〜０．４％、０．０１〜０．４％、０．０１５〜０．４％、０．０２〜０．４％、０．０２５〜０．４％、０．０３〜０．４％、０．０３５〜０．４％、０．０４〜０．４％、０．０４５〜０．４％、０．０５〜０．４％、０．０５５〜０．４％、０．０６〜０．４％、０．０６５〜０．４％、０．０７〜０．４％、０．０７５〜０．４％、０．０８〜０．４％、０．０８５〜０．４％、０．０９〜０．４％、０．０９５〜０．４％、０．１〜０．４％、０．１５〜０．４％、０．２〜０．４％、０．２５〜０．４％、０．３〜０．４％、０．３５〜０．４％、０．００１〜０．３％、０．００５〜０．３％、０．０１〜０．３％、０．０１５〜０．３％、０．０２〜０．３％、０．０２５〜０．３％、０．０３〜０．３％、０．０３５〜０．３％、０．０４〜０．３％、０．０４５〜０．３％、０．０５〜０．３％、０．０５５〜０．３％、０．０６〜０．３％、０．０６５〜０．３％、０．０７〜０．３％、０．０７５〜０．３％、０．０８〜０．３％、０．０８５〜０．３％、０．０９〜０．３％、０．０９５〜０．３％、０．１〜０．３％、０．１５〜０．３％、０．２〜０．３％、０．２５〜０．３％、０．００１〜０．２％、０．００５〜０．２％、０．０１〜０．２％、０．０１５〜０．２％、０．０２〜０．２％、０．０２５〜０．２％、０．０３〜０．２％、０．０３５〜０．２％、０．０４〜０．２％、０．０４５〜０．２％、０．０５〜０．２％、０．０５５〜０．２％、０．０６〜０．２％、０．０６５〜０．２％、０．０７〜０．２％、０．０７５〜０．２％、０．０８〜０．２％、０．０８５〜０．２％、０．０９〜０．２％、０．０９５〜０．２％、０．１〜０．２％、０．１５〜０．２％、０．００１〜０．１％、０．００５〜０．１％、０．０１〜０．１％、０．０１５〜０．１％、０．０２〜０．１％、０．０２５〜０．１％、０．０３〜０．１％、０．０３５〜０．１％、０．０４〜０．１％、０．０４５〜０．１％、０．０５〜０．１％、０．０５５〜０．１％、０．０６〜０．１％、０．０６５〜０．１％、０．０７〜０．１％、０．０７５〜０．１％、０．０８〜０．１％、０．０８５〜０．１％、０．０９〜０．１％、または０．０９５〜０．１％である。非限定的な例として、範囲は０．０６〜０．６％である。非限定的な例として、範囲は０．４〜０．５％である。
【０２４８】
一実施形態において、全内因性ｍｉＲＮＡプールに対するガイド鎖のパーセントは、０．００１％、０．００２％、０．００３％、０．００４％、０．００５％、０．００６％、０．００７％、０．００８％、０．００９％、０．０１％、０．０２％、０．０３％、０．０４％、０．０５％、０．０６％、０．０７％、０．０８％、０．０９％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、または０．６％である。非限定的な例として、パーセントは０．０６％である。非限定的な例として、パーセントは０．４％である。非限定的な例として、パーセントは０．５％である。
【０２４９】
ｓｉＲＮＡ修飾
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、前駆体またはＤＮＡとして送達されるのでない場合、限定はされないがインビボでのｓｉＲＮＡの安定性の増加など、ＲＮＡ分子の幾つかの特徴を調節するように化学的に修飾されてもよい。化学的に修飾されたｓｉＲＮＡ分子はヒトの治療適用において使用することができ、ｓｉＲＮＡ分子のＲＮＡｉ活性を損なうことなく改良される。非限定的な例として、センス鎖およびアンチセンス鎖の両方の３’末端および５’末端の両方で修飾されたｓｉＲＮＡ分子。
【０２５０】
一部の態様において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖は、限定はされないが、糖修飾ヌクレオチド、核酸塩基修飾および／または骨格修飾など、１つ以上の修飾ヌクレオチドを含み得る。一部の態様において、ｓｉＲＮＡ分子は、組合せの修飾、例えば組合せの核酸塩基および骨格修飾を含み得る。
【０２５１】
一実施形態において、修飾ヌクレオチドは糖修飾ヌクレオチドであってもよい。糖修飾ヌクレオチドとしては、限定はされないが、２’−フルオロ、２’−アミノおよび２’−チオ修飾リボヌクレオチド、例えば２’−フルオロ修飾リボヌクレオチドが挙げられる。修飾ヌクレオチドは糖部分、ならびにリボシルでない糖類またはその類似体を有するヌクレオチドが修飾されてもよい。例えば、糖部分は、マンノース、アラビノース、グルコピラノース、ガラクトピラノース、４’−チオリボース、および他の糖類、複素環、または炭素環であってもよく、またはそれをベースとしてもよい。
【０２５２】
一実施形態において、修飾ヌクレオチドは核酸塩基修飾ヌクレオチドであってもよい。
一実施形態において、修飾ヌクレオチドは骨格修飾ヌクレオチドであってもよい。一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖は骨格に他の修飾を更に含み得る。通常の「骨格」は、本明細書で使用されるとき、ＤＮＡまたはＲＮＡ分子における交互に繰り返す糖−リン酸配列を指す。デオキシリボース／リボース糖が３’−ヒドロキシル基および５’−ヒドロキシル基の両方においてエステル結合でリン酸基につなぎ合わされ、これは「リン酸ジエステル」結合／リンカーとしても知られる（ＰＯ連結）。ＰＯ骨格は「ホスホロチオエート骨格」として修飾されてもよい（ＰＳ連結）。ある場合には、天然のリン酸ジエステル結合がアミド結合によって置き換えられてもよく、但し２つの糖単位間の４つの原子は保たれる。かかるアミド修飾は、オリゴヌクレオチドの固相合成を促進し、ｓｉＲＮＡ相補体と形成された二重鎖の熱力学的安定性を増加させることができる。例えばメスマエカー（Ｍｅｓｍａｅｋｅｒ）ら著、ピュア・アンド・アプライド・ケミストリー（Ｐｕｒｅ  ＆  Ａｐｐｌ．Ｃｈｅｍ．）、１９９７年、第３巻、ｐ．４３７〜４４０を参照のこと；この内容は全体として参照により本明細書に援用される。
【０２５３】
修飾塩基とは、１つ以上の原子または基の置換または付加によって修飾された、例えば、アデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシル、キサンチン、イノシン、およびキューオシンなどのヌクレオチド塩基を指す。核酸塩基部分に対する修飾の幾つかの例としては、限定はされないが、アルキル化、ハロゲン化、チオール化、アミノ化、アミド化、またはアセチル化塩基が、個別にまたは組合せで挙げられる。より具体的な例としては、例えば、５−プロピニルウリジン、５−プロピニルシチジン、６−メチルアデニン、６−メチルグアニン、Ｎ，Ｎ，−ジメチルアデニン、２−プロピルアデニン、２−プロピルグアニン、２−アミノアデニン、１−メチルイノシン、３−メチルウリジン、５−メチルシチジン、５−メチルウリジンおよび５位に修飾を有する他のヌクレオチド、５−（２−アミノ）プロピルウリジン、５−ハロシチジン、５−ハロウリジン、４−アセチルシチジン、１−メチルアデノシン、２−メチルアデノシン、３−メチルシチジン、６−メチルウリジン、２−メチルグアノシン、７−メチルグアノシン、２，２−ジメチルグアノシン、５−メチルアミノエチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、デアザヌクレオチド、例えば７−デアザアデノシン、６−アゾウリジン、６−アゾシチジン、６−アゾチミジン、５−メチル−２−チオウリジン、他のチオ塩基、例えば２−チオウリジンおよび４−チオウリジンおよび２−チオシチジン、ジヒドロウリジン、プソイドウリジン、キューオシン、アーケオシン、ナフチルおよび置換ナフチル基、任意のＯ−およびＮ−アルキル化プリンおよびピリミジン、例えばＮ６−メチルアデノシン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、ウリジン５−オキシ酢酸、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニルおよび修飾フェニル基、例えばアミノフェノールまたは２，４，６−トリメトキシベンゼン、Ｇクランプヌクレオチドとして働く修飾シトシン、８−置換アデニンおよびグアニン、５−置換ウラシルおよびチミン、アザピリミジン、カルボキシヒドロキシアルキルヌクレオチド、カルボキシアルキルアミノアルキルヌクレオチド、およびアルキルカルボニルアルキル化ヌクレオチドが挙げられる。
【０２５４】
一実施形態において、修飾ヌクレオチドはセンス鎖上にだけあってもよい。
別の実施形態において、修飾ヌクレオチドはアンチセンス鎖上にだけあってもよい。
一部の実施形態において、修飾ヌクレオチドはセンス鎖およびアンチセンス鎖の両方にあってもよい。
【０２５５】
一部の実施形態において、化学的に修飾されたヌクレオチドは、アンチセンス鎖が標的ｍＲＮＡ配列と対を形成する能力に影響を及ぼさない。
一実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、ポリシストロン性分子であるｓｉＲＮＡ分子をコードし得る。加えてｓｉＲＮＡ分子はｓｉＲＮＡ分子の領域間に１つ以上のリンカーを含んでもよい。
【０２５６】
分子足場
一実施形態において、ｓｉＲＮＡ分子は、分子足場もまた含む調節性ポリヌクレオチドにコードされてもよい。本明細書で使用されるとき「分子足場」は、それに対して後続の分子を設計または作製する配列または構造基盤を形成するフレームワークまたは出発分子である。
【０２５７】
一実施形態において、分子足場は少なくとも１つの５’フランキング領域を含む。非限定的な例として、５’フランキング領域は、任意の長さであってよい、かつ全体または一部が野生型ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列に由来し得るか、または完全に人工的な配列であり得る５’フランキング配列を含み得る。
【０２５８】
一実施形態において、分子足場は少なくとも１つの３’フランキング領域を含む。非限定的な例として、３’フランキング領域は、任意の長さであってよい、かつ全体または一部が野生型ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列に由来し得るか、または完全に人工的な配列であり得る３’フランキング配列を含み得る。
【０２５９】
一実施形態において、分子足場は少なくとも１つのループモチーフ領域を含む。非限定的な例として、ループモチーフ領域は、任意の長さであってよい配列を含み得る。
一実施形態において、分子足場は、５’フランキング領域、ループモチーフ領域および／または３’フランキング領域を含む。
【０２６０】
一実施形態において、本明細書に記載される少なくとも１つのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤は、少なくとも１つの分子足場もまた含む調節性ポリヌクレオチドによってコードされてもよい。分子足場は、任意の長さであってよい、かつ全体または一部が野生型ｍｉｃｒｏＲＮＡ配列に由来し得るか、または完全に人工的な配列であり得る５’フランキング配列を含み得る。３’フランキング配列はサイズおよび由来の点で５’フランキング配列および／またはある３’フランキング配列を反映し得る。いずれのフランキング配列も存在しないこともある。３’フランキング配列は任意選択で１つ以上のＣＮＮＣモチーフ（式中、「Ｎ」は任意のヌクレオチドを表す）を含有し得る。
【０２６１】
ステムループ構造のステムを形成することが、本明細書に記載される少なくとも１つのｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤をコードする調節性ポリヌクレオチドの最低条件（ｍｉｎｉｍｕｍ）である。一部の実施形態において、本明細書に記載されるｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたは他のＲＮＡｉ剤は、標的配列に部分的に相補性であるかまたはハイブリダイズすることになる少なくとも１つの核酸配列を含む。一部の実施形態において、ペイロードはｓｉＲＮＡ分子またはｓｉＲＮＡ分子の断片である。
【０２６２】
一部の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドのステムループ構造の５’アームは、センス配列をコードする核酸配列を含む。調節性ポリヌクレオチドによってコードされ得るセンス配列、またはその断片もしくは変異体の非限定的な例は表３に記載する。
【０２６３】
一部の実施形態において、調節性ポリヌクレオチドのステムループの３’アームは、アンチセンス配列をコードする核酸配列を含む。アンチセンス配列は、一部の例では、最も５’側の末端に「Ｇ」ヌクレオチドを含む。調節性ポリヌクレオチドによってコードされ得るアンチセンス配列、またはその断片もしくは変異体の非限定的な例は表２に記載する。
【０２６４】
他の実施形態では、センス配列が調節性ポリヌクレオチドのステムループ構造のステムの３’アームにあってもよく、一方アンチセンス配列が５’アームにある。調節性ポリヌクレオチドによってコードされ得るセンス配列およびアンチセンス配列の非限定的な例は表２および表３に記載する。
【０２６５】
一実施形態において、センス配列とアンチセンス配列とは、それらの長さの実質的な部分にわたって完全に相補的であってもよい。他の実施形態においてセンス配列とアンチセンス配列とは、独立にそれらの鎖の長さの少なくとも５０、６０、７０、８０、８５、９０、９５、または９９％にわたって少なくとも７０、８０、９０、９５または９９％相補的であってもよい。
【０２６６】
センス配列の同一性も、アンチセンス配列の相同性も、標的配列と１００％相補的である必要はない。
一実施形態において、調節性ポリヌクレオチドのステムループ構造のセンス配列とアンチセンス配列とをループ配列（ループモチーフ、リンカーまたはリンカーモチーフとしても知られる）が分離している。ループ配列は、任意の長さ、４〜３０ヌクレオチド、４〜２０ヌクレオチド、４〜１５ヌクレオチド、５〜１５ヌクレオチド、６〜１２ヌクレオチド、６ヌクレオチド、７ヌクレオチド、８ヌクレオチド、９ヌクレオチド、１０ヌクレオチド、１１ヌクレオチド、１２ヌクレオチド、１３ヌクレオチド、１４ヌクレオチド、および／または１５ヌクレオチドであってもよい。
【０２６７】
一部の実施形態において、ループ配列は、少なくとも１つのＵＧＵＧモチーフをコードする核酸配列を含む。一部の実施形態において、ＵＧＵＧモチーフをコードする核酸配列は、ループ配列の５’末端に位置する。
【０２６８】
一実施形態において、調節性ポリヌクレオチドには、１つ以上のモジュール（例えば、５’フランキング領域、ループモチーフ領域、３’フランキング領域、センス配列、アンチセンス配列）を互いに分離するスペーサ領域が存在してもよい。かかるスペーサ領域は１つ以上存在してもよい。
【０２６９】
一実施形態において、センス配列とフランキング領域配列との間には、８〜２０、すなわち、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドのスペーサ領域が存在してもよい。
【０２７０】
一実施形態において、スペーサ領域の長さは１３ヌクレオチドであり、センス配列の５’末端とフランキング配列の３’末端との間に位置する。一実施形態において、スペーサは配列の約１ヘリカルターンを形成するのに十分な長さである。
【０２７１】
一実施形態において、アンチセンス配列とフランキング配列との間には、８〜２０、すなわち、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、または２０ヌクレオチドのスペーサ領域が存在してもよい。
【０２７２】
一実施形態において、スペーサ配列は１０〜１３、すなわち、１０、１１、１２または１３ヌクレオチドであり、アンチセンス配列の３’末端とフランキング配列の５’末端との間に位置する。一実施形態において、スペーサは配列の約１ヘリカルターンを形成するのに十分な長さである。
【０２７３】
一実施形態において、調節性ポリヌクレオチドの分子足場は、５’から３’方向に、５’フランキング配列、５’アーム、ループモチーフ、３’アームおよび３’フランキング配列を含む。非限定的な例として、５’アームが、センス配列をコードする核酸配列を含んでいてもよく、３’アームが、アンチセンス配列をコードする核酸配列を含む。別の非限定的な例では、５’アームがアンチセンス配列をコードする核酸配列を含み、３’アームがセンス配列をコードする核酸配列を含む。
【０２７４】
一実施形態において、５’アーム、センスおよび／またはアンチセンス配列、ループモチーフおよび／または３’アーム配列は改変されてもよい（例えば、１ヌクレオチド以上の置換、ヌクレオチドの付加および／またはヌクレオチドの欠失）。改変はコンストラクトの機能に有益な変化を生じさせ得る（例えば、標的配列のノックダウンを増加させ、コンストラクトの分解を低減し、オフターゲット効果を低減し、ペイロードの効率を増加させ、およびペイロードの分解を低減し得る）。
【０２７５】
一実施形態において、ガイド鎖（本明細書ではアンチセンス鎖とも称される）の切出し率をパッセンジャー鎖（本明細書ではセンス鎖とも称される）の切出し率よりも高くするため、調節性ポリヌクレオチドの分子足場が配列される。ガイド鎖またはパッセンジャー鎖の切出し率は、独立に、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９％超であり得る。非限定的な例として、ガイド鎖の切出し率は少なくとも８０％である。別の非限定的な例として、ガイド鎖の切出し率は少なくとも９０％である。
【０２７６】
一実施形態において、ガイド鎖の切出し率はパッセンジャー鎖の切出し率よりも高い。一態様において、ガイド鎖の切出し率は、パッセンジャー鎖よりも少なくとも１％、２％、３％、４％、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９％超高くてもよい。
【０２７７】
一実施形態において、ガイド鎖の切出し効率は、少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または９９％超である。非限定的な例として、ガイド鎖の切出し効率は８０％よりも高い。
【０２７８】
一実施形態において、分子足場からのガイド鎖の切出し効率はパッセンジャー鎖の切出しよりも高い。分子足場からのガイド鎖の切出しは、パッセンジャー鎖の切出しよりも２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍または１０倍超高効率であり得る。
【０２７９】
一実施形態において、分子足場は二重機能ターゲティング調節性ポリヌクレオチドを含む。本明細書で使用されるとき、「二重機能ターゲティング」調節性ポリヌクレオチドは、ガイド鎖およびパッセンジャー鎖の両方が同じ標的をノックダウンするポリヌクレオチド、またはガイド鎖およびパッセンジャー鎖が異なる標的をノックダウンするポリヌクレオチドである。
【０２８０】
一実施形態において、本明細書に記載される調節性ポリヌクレオチドの分子足場は、５’フランキング領域、ループモチーフ領域および３’フランキング領域を含み得る。本明細書に記載される調節性ポリヌクレオチドに使用され得るまたは使用されるそれらの断片であり得る５’フランキング領域、ループモチーフ領域（リンカー領域とも称され得る）および３’フランキング領域の配列の非限定的な例は、表５〜表７に示される。
【０２８１】
【表５】
2021502060.tif 000006
【０２８２】
【表６】
2021502060.tif 000007
【０２８３】
【表７】
2021502060.tif 000008
一実施形態において、分子足場は、表５に挙げられる少なくとも１つの５’フランキング領域、断片、またはその変異体を含み得る。非限定的な例として、５’フランキング領域は、５Ｆ１、５Ｆ２、または５Ｆ３であってもよい。
【０２８４】
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つの５Ｆ１フランキング領域を含み得る。
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つの５Ｆ２フランキング領域を含み得る。
【０２８５】
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つの５Ｆ３フランキング領域を含み得る。
一実施形態において、分子足場は、表６に挙げられる少なくとも１つのループモチーフ領域、その断片または変異体を含み得る。非限定的な例として、ループモチーフ領域は、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３、またはＬ４であってもよい。
【０２８６】
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つのＬ１ループモチーフ領域を含み得る。
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つのＬ２ループモチーフ領域を含み得る。
【０２８７】
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つのＬ３ループモチーフ領域を含み得る。
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つのＬ４ループモチーフ領域を含み得る。
【０２８８】
一実施形態において、分子足場は、表７に挙げられる少なくとも１つの３’フランキング領域、断片、またはその変異体を含み得る。非限定的な例として、３’フランキング領域は、３Ｆ１、３Ｆ２、３Ｆ３、３Ｆ４、または３Ｆ５であってもよい。
【０２８９】
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つの３Ｆ１フランキング領域を含み得る。
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つの３Ｆ２フランキング領域を含み得る。
【０２９０】
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つの３Ｆ３フランキング領域を含み得る。
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つの３Ｆ４フランキング領域を含み得る。
【０２９１】
一実施形態において、分子足場は、少なくとも１つの３Ｆ５フランキング領域を含み得る。
一実施形態において、分子足場は、表５および表６に記載されるとおりの、少なくとも１つの５’フランキング領域、その断片または変異体と、少なくとも１つのループモチーフ領域、その断片または変異体とを含み得る。非限定的な例として、５’フランキング領域およびループモチーフ領域は、５Ｆ１およびＬ１、５Ｆ１およびＬ２、５Ｆ１およびＬ３、５Ｆ１およびＬ４、５Ｆ２およびＬ１、５Ｆ２およびＬ２、５Ｆ２およびＬ３、５Ｆ２およびＬ４、５Ｆ３およびＬ１、５Ｆ３およびＬ２、５Ｆ３およびＬ３、ならびに５Ｆ３およびＬ４であってもよい。
【０２９２】
一実施形態において、分子足場は、表６および表７に記載されるとおりの、少なくとも１つの３’フランキング領域、その断片または変異体と、少なくとも１つのループモチーフ領域、その断片または変異体とを含み得る。非限定的な例として、３’フランキング領域およびループモチーフ領域は、３Ｆ１およびＬ１、３Ｆ１およびＬ２、３Ｆ１およびＬ３、３Ｆ１およびＬ４、３Ｆ２およびＬ１、３Ｆ２およびＬ２、３Ｆ２およびＬ３、３Ｆ２およびＬ４、３Ｆ３およびＬ１、３Ｆ３およびＬ２、３Ｆ３およびＬ３、３Ｆ３およびＬ４、３Ｆ４およびＬ１、３Ｆ４およびＬ２、３Ｆ４およびＬ３、３Ｆ４およびＬ４、３Ｆ５およびＬ１、３Ｆ５およびＬ２、３Ｆ５およびＬ３、ならびに３Ｆ５およびＬ４であってもよい。
【０２９３】
一実施形態において、分子足場は、表５および表７に記載されるとおりの、少なくとも１つの５’フランキング領域、その断片または変異体と、少なくとも１つの３’フランキング領域、その断片または変異体とを含み得る。非限定的な例として、フランキング領域は、５Ｆ１および３Ｆ１、５Ｆ１および３Ｆ２、５Ｆ１および３Ｆ３、５Ｆ１および３Ｆ４、５Ｆ１および３Ｆ５、５Ｆ２および３Ｆ１、５Ｆ２および３Ｆ２、５Ｆ２および３Ｆ３、５Ｆ２および３Ｆ４、５Ｆ２および３Ｆ５、５Ｆ３および３Ｆ１、５Ｆ３および３Ｆ２、５Ｆ３および３Ｆ３、５Ｆ３および３Ｆ４、５Ｆ３および３Ｆ５であってもよい。
【０２９４】
一実施形態において、分子足場は、表５〜表７に記載されるとおりの、少なくとも１つの５’フランキング領域、その断片または変異体と、少なくとも１つのループモチーフ領域、その断片または変異体と、少なくとも１つの３’フランキング領域、その断片または変異体とを含み得る。非限定的な例として、フランキング領域およびループモチーフ領域は、５Ｆ１、Ｌ１および３Ｆ１；５Ｆ１、Ｌ１および３Ｆ２；５Ｆ１、Ｌ１および３Ｆ３；５Ｆ１、Ｌ１および３Ｆ４；５Ｆ２、Ｌ１および３Ｆ１；５Ｆ２、Ｌ１および３Ｆ２；５Ｆ２、Ｌ１および３Ｆ３；５Ｆ２、Ｌ１および３Ｆ４；５Ｆ２、Ｌ１および３Ｆ５；５Ｆ３、Ｌ１および３Ｆ１；５Ｆ３、Ｌ１および３Ｆ２；５Ｆ３、Ｌ１および３Ｆ３；５Ｆ３、Ｌ１および３Ｆ４；５Ｆ３、Ｌ１および３Ｆ５；５Ｆ１、Ｌ２および３Ｆ１；５Ｆ１、Ｌ２および３Ｆ２；５Ｆ１、Ｌ２および３Ｆ３；５Ｆ１、Ｌ２および３Ｆ４；５Ｆ１、Ｌ２および３Ｆ５；５Ｆ２、Ｌ２および３Ｆ１；５Ｆ２、Ｌ２および３Ｆ２；５Ｆ２、Ｌ２および３Ｆ３；５Ｆ２、Ｌ２および３Ｆ４；５Ｆ２、Ｌ２および３Ｆ５；５Ｆ３、Ｌ２および３Ｆ１；５Ｆ３、Ｌ２および３Ｆ２；５Ｆ３、Ｌ２および３Ｆ３；５Ｆ３、Ｌ２および３Ｆ４；５Ｆ３、Ｌ２および３Ｆ５；５Ｆ３；５Ｆ１、Ｌ３および３Ｆ１；５Ｆ１、Ｌ３および３Ｆ２；５Ｆ１、Ｌ３および３Ｆ３；５Ｆ１、Ｌ３および３Ｆ４；５Ｆ１、Ｌ３および３Ｆ５；５Ｆ２、Ｌ３および３Ｆ１；５Ｆ２、Ｌ３および３Ｆ２；５Ｆ２、Ｌ３および３Ｆ３；５Ｆ２、Ｌ３および３Ｆ４；５Ｆ２、Ｌ３および３Ｆ５；５Ｆ３、Ｌ３および３Ｆ１；５Ｆ３、Ｌ３および３Ｆ２；５Ｆ３、Ｌ３および３Ｆ３；５Ｆ３、Ｌ３および３Ｆ４；５Ｆ３、Ｌ３および３Ｆ５；５Ｆ１、Ｌ４および３Ｆ１；５Ｆ１、Ｌ４および３Ｆ２；５Ｆ１、Ｌ４および３Ｆ３；５Ｆ１、Ｌ４および３Ｆ４；５Ｆ１、Ｌ４および３Ｆ５；５Ｆ２、Ｌ４および３Ｆ１；５Ｆ２、Ｌ４および３Ｆ２；５Ｆ２、Ｌ４および３Ｆ３；５Ｆ２、Ｌ４および３Ｆ４；５Ｆ２、Ｌ４および３Ｆ５；５Ｆ３、Ｌ４および３Ｆ１；５Ｆ３、Ｌ４および３Ｆ２；５Ｆ３、Ｌ４および３Ｆ３；５Ｆ３、Ｌ４および３Ｆ４；５Ｆ３、Ｌ４および３Ｆ５であってもよい。
【０２９５】
一実施形態において、分子足場は天然のｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ足場であってもよい。非限定的な例として、分子足場は、ヒトｍｉＲ１５５足場に由来する足場であってもよい。
一実施形態において、分子足場は当該技術分野において公知の１つ以上のリンカーを含み得る。リンカーは、領域間を、または１つの分子足場を別の分子足場と分離し得る。非限定的な例として、分子足場はポリシストロン性であってもよい。
【０２９６】
分子足場と、ＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡ分子とを含む調節性ポリヌクレオチド
一実施形態において、調節性ポリヌクレオチドは、表８に記載されるとおりの、５’および３’フランキング領域と、ループモチーフ領域と、センス配列およびアンチセンス配列をコードする核酸配列とを含み得る。表８には、パッセンジャー鎖およびガイド鎖ならびに５’および３’フランキング領域およびループ領域（リンカー領域とも称される）のＤＮＡ配列識別名が記載される。表８において、配列名の「ｍｉＲ」成分は、必ずしもｍｉＲＮＡ遺伝子の配列付番に対応するわけではない（例えば、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ−１０２は配列名であるが、必ずしもｍｉＲ−１０２がその配列の一部であることを意味するわけではない）。
【０２９７】
【表８】
2021502060.tif 000009
調節性ポリヌクレオチドを含むＡＡＶ粒子
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、調節性ポリヌクレオチド配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含む。かかる実施形態において、２つ以上のポリペプチドをコードするウイルスゲノムが、ウイルス粒子へと複製またはパッケージングされ得る。調節性ポリヌクレオチドを含むウイルス粒子で形質導入された標的細胞は、単一細胞中でコード化センスおよび／またはアンチセンス配列を発現し得る。
【０２９８】
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子は、神経学的疾患および／または障害を治療、予防、緩和、または改善するための医学分野に有用である。
一実施形態において、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含む調節性ポリヌクレオチド配列を含むＡＡＶ粒子を、哺乳類細胞に導入し得る。
【０２９９】
ＡＡＶ粒子ペイロード領域が調節性ポリヌクレオチドを含む場合、調節性ポリヌクレオチドは、標的遺伝子をノックダウンするためのセンス配列および／またはアンチセンス配列を含み得る。本明細書に記載される調節性ポリヌクレオチドをコードするＡＡＶウイルスゲノムは、ヒト疾患、ウイルス、感染症、獣医学的応用の分野、ならびに様々なインビボおよびインビトロ設定において有用であり得る。
【０３００】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つの末端逆位配列（ＩＴＲ）領域を含み得る。ＩＴＲ領域は、独立に、限定はされないが、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、および１７５ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのＩＴＲ領域の長さは、７５〜８０、７５〜８５、７５〜１００、８０〜８５、８０〜９０、８０〜１０５、８５〜９０、８５〜９５、８５〜１１０、９０〜９５、９０〜１００、９０〜１１５、９５〜１００、９５〜１０５、９５〜１２０、１００〜１０５、１００〜１１０、１００〜１２５、１０５〜１１０、１０５〜１１５、１０５〜１３０、１１０〜１１５、１１０〜１２０、１１０〜１３５、１１５〜１２０、１１５〜１２５、１１５〜１４０、１２０〜１２５、１２０〜１３０、１２０〜１４５、１２５〜１３０、１２５〜１３５、１２５〜１５０、１３０〜１３５、１３０〜１４０、１３０〜１５５、１３５〜１４０、１３５〜１４５、１３５〜１６０、１４０〜１４５、１４０〜１５０、１４０〜１６５、１４５〜１５０、１４５〜１５５、１４５〜１７０、１５０〜１５５、１５０〜１６０、１５０〜１７５、１５５〜１６０、１５５〜１６５、１６０〜１６５、１６０〜１７０、１６５〜１７０、１６５〜１７５、および１７０〜１７５ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０５ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１４１ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１３０ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。
【０３０１】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、２つの末端逆位配列（ＩＴＲ）領域を含み得る。ＩＴＲ領域の各々は、独立に、限定はされないが、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、および１７５ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのＩＴＲ領域の長さは、７５〜８０、７５〜８５、７５〜１００、８０〜８５、８０〜９０、８０〜１０５、８５〜９０、８５〜９５、８５〜１１０、９０〜９５、９０〜１００、９０〜１１５、９５〜１００、９５〜１０５、９５〜１２０、１００〜１０５、１００〜１１０、１００〜１２５、１０５〜１１０、１０５〜１１５、１０５〜１３０、１１０〜１１５、１１０〜１２０、１１０〜１３５、１１５〜１２０、１１５〜１２５、１１５〜１４０、１２０〜１２５、１２０〜１３０、１２０〜１４５、１２５〜１３０、１２５〜１３５、１２５〜１５０、１３０〜１３５、１３０〜１４０、１３０〜１５５、１３５〜１４０、１３５〜１４５、１３５〜１６０、１４０〜１４５、１４０〜１５０、１４０〜１６５、１４５〜１５０、１４５〜１５５、１４５〜１７０、１５０〜１５５、１５０〜１６０、１５０〜１７５、１５５〜１６０、１５５〜１６５、１６０〜１６５、１６０〜１７０、１６５〜１７０、１６５〜１７５、および１７０〜１７５ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０５ヌクレオチド長および１４１ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０５ヌクレオチド長および１３０ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１３０ヌクレオチド長および１４１ヌクレオチド長であるＩＴＲを含む。
【０３０２】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、２つのＩＴＲ配列領域を含む。
一実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つの多重フィラー配列領域を含み得る。フィラー領域は、独立に、限定はされないが、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、１０００、１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、１０２４、１０２５、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１０５６、１０５７、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６５、１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７１、１０７２、１０７３、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、１０８０、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８５、１０８６、１０８７、１０８８、１０８９、１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、１０９７、１０９８、１０９９、１１００、１１０１、１１０２、１１０３、１１０４、１１０５、１１０６、１１０７、１１０８、１１０９、１１１０、１１１１、１１１２、１１１３、１１１４、１１１５、１１１６、１１１７、１１１８、１１１９、１１２０、１１２１、１１２２、１１２３、１１２４、１１２５、１１２６、１１２７、１１２８、１１２９、１１３０、１１３１、１１３２、１１３３、１１３４、１１３５、１１３６、１１３７、１１３８、１１３９、１１４０、１１４１、１１４２、１１４３、１１４４、１１４５、１１４６、１１４７、１１４８、１１４９、１１５０、１１５１、１１５２、１１５３、１１５４、１１５５、１１５６、１１５７、１１５８、１１５９、１１６０、１１６１、１１６２、１１６３、１１６４、１１６５、１１６６、１１６７、１１６８、１１６９、１１７０、１１７１、１１７２、１１７３、１１７４、１１７５、１１７６、１１７７、１１７８、１１７９、１１８０、１１８１、１１８２、１１８３、１１８４、１１８５、１１８６、１１８７、１１８８、１１８９、１１９０、１１９１、１１９２、１１９３、１１９４、１１９５、１１９６、１１９７、１１９８、１１９９、１２００、１２０１、１２０２、１２０３、１２０４、１２０５、１２０６、１２０７、１２０８、１２０９、１２１０、１２１１、１２１２、１２１３、１２１４、１２１５、１２１６、１２１７、１２１８、１２１９、１２２０、１２２１、１２２２、１２２３、１２２４、１２２５、１２２６、１２２７、１２２８、１２２９、１２３０、１２３１、１２３２、１２３３、１２３４、１２３５、１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８４、２２８５、２２８６、２２８７、２２８８、２２８９、２２９０、２２９１、２２９２、２２９３、２２９４、２２９５、２２９６、２２９７、２２９８、２２９９、２３００、２３０１、２３０２、２３０３、２３０４、２３０５、２３０６、２３０７、２３０８、２３０９、２３１０、２３１１、２３１２、２３１３、２３１４、２３１５、２３１６、２３１７、２３１８、２３１９、２３２０、２３２１、２３２２、２３２３、２３２４、２３２５、２３２６、２３２７、２３２８、２３２９、２３３０、２３３１、２３３２、２３３３、２３３４、２３３５、２３３６、２３３７、２３３８、２３３９、２３４０、２３４１、２３４２、２３４３、２３４４、２３４５、２３４６、２３４７、２３４８、２３４９、２３５０、２３５１、２３５２、２３５３、２３５４、２３５５、２３５６、２３５７、２３５８、２３５９、２３６０、２３６１、２３６２、２３６３、２３６４、２３６５、２３６６、２３６７、２３６８、２３６９、２３７０、２３７１、２３７２、２３７３、２３７４、２３７５、２３７６、２３７７、２３７８、２３７９、２３８０、２３８１、２３８２、２３８３、２３８４、２３８５、２３８６、２３８７、２３８８、２３８９、２３９０、２３９１、２３９２、２３９３、２３９４、２３９５、２３９６、２３９７、２３９８、２３９９、２４００、２４０１、２４０２、２４０３、２４０４、２４０５、２４０６、２４０７、２４０８、２４０９、２４１０、２４１１、２４１２、２４１３、２４１４、２４１５、２４１６、２４１７、２４１８、２４１９、２４２０、２４２１、２４２２、２４２３、２４２４、２４２５、２４２６、２４２７、２４２８、２４２９、２４３０、２４３１、２４３２、２４３３、２４３４、２４３５、２４３６、２４３７、２４３８、２４３９、２４４０、２４４１、２４４２、２４４３、２４４４、２４４５、２４４６、２４４７、２４４８、２４４９、２４５０、２４５１、２４５２、２４５３、２４５４、２４５５、２４５６、２４５７、２４５８、２４５９、２４６０、２４６１、２４６２、２４６３、２４６４、２４６５、２４６６、２４６７、２４６８、２４６９、２４７０、２４７１、２４７２、２４７３、２４７４、２４７５、２４７６、２４７７、２４７８、２４７９、２４８０、２４８１、２４８２、２４８３、２４８４、２４８５、２４８６、２４８７、２４８８、２４８９、２４９０、２４９１、２４９２、２４９３、２４９４、２４９５、２４９６、２４９７、２４９８、２４９９、２５００、２５０１、２５０２、２５０３、２５０４、２５０５、２５０６、２５０７、２５０８、２５０９、２５１０、２５１１、２５１２、２５１３、２５１４、２５１５、２５１６、２５１７、２５１８、２５１９、２５２０、２５２１、２５２２、２５２３、２５２４、２５２５、２５２６、２５２７、２５２８、２５２９、２５３０、２５３１、２５３２、２５３３、２５３４、２５３５、２５３６、２５３７、２５３８、２５３９、２５４０、２５４１、２５４２、２５４３、２５４４、２５４５、２５４６、２５４７、２５４８、２５４９、２５５０、２５５１、２５５２、２５５３、２５５４、２５５５、２５５６、２５５７、２５５８、２５５９、２５６０、２５６１、２５６２、２５６３、２５６４、２５６５、２５６６、２５６７、２５６８、２５６９、２５７０、２５７１、２５７２、２５７３、２５７４、２５７５、２５７６、２５７７、２５７８、２５７９、２５８０、２５８１、２５８２、２５８３、２５８４、２５８５、２５８６、２５８７、２５８８、２５８９、２５９０、２５９１、２５９２、２５９３、２５９４、２５９５、２５９６、２５９７、２５９８、２５９９、２６００、２６０１、２６０２、２６０３、２６０４、２６０５、２６０６、２６０７、２６０８、２６０９、２６１０、２６１１、２６１２、２６１３、２６１４、２６１５、２６１６、２６１７、２６１８、２６１９、２６２０、２６２１、２６２２、２６２３、２６２４、２６２５、２６２６、２６２７、２６２８、２６２９、２６３０、２６３１、２６３２、２６３３、２６３４、２６３５、２６３６、２６３７、２６３８、２６３９、２６４０、２６４１、２６４２、２６４３、２６４４、２６４５、２６４６、２６４７、２６４８、２６４９、２６５０、２６５１、２６５２、２６５３、２６５４、２６５５、２６５６、２６５７、２６５８、２６５９、２６６０、２６６１、２６６２、２６６３、２６６４、２６６５、２６６６、２６６７、２６６８、２６６９、２６７０、２６７１、２６７２、２６７３、２６７４、２６７５、２６７６、２６７７、２６７８、２６７９、２６８０、２６８１、２６８２、２６８３、２６８４、２６８５、２６８６、２６８７、２６８８、２６８９、２６９０、２６９１、２６９２、２６９３、２６９４、２６９５、２６９６、２６９７、２６９８、２６９９、２７００、２７０１、２７０２、２７０３、２７０４、２７０５、２７０６、２７０７、２７０８、２７０９、２７１０、２７１１、２７１２、２７１３、２７１４、２７１５、２７１６、２７１７、２７１８、２７１９、２７２０、２７２１、２７２２、２７２３、２７２４、２７２５、２７２６、２７２７、２７２８、２７２９、２７３０、２７３１、２７３２、２７３３、２７３４、２７３５、２７３６、２７３７、２７３８、２７３９、２７４０、２７４１、２７４２、２７４３、２７４４、２７４５、２７４６、２７４７、２７４８、２７４９、２７５０、２７５１、２７５２、２７５３、２７５４、２７５５、２７５６、２７５７、２７５８、２７５９、２７６０、２７６１、２７６２、２７６３、２７６４、２７６５、２７６６、２７６７、２７６８、２７６９、２７７０、２７７１、２７７２、２７７３、２７７４、２７７５、２７７６、２７７７、２７７８、２７７９、２７８０、２７８１、２７８２、２７８３、２７８４、２７８５、２７８６、２７８７、２７８８、２７８９、２７９０、２７９１、２７９２、２７９３、２７９４、２７９５、２７９６、２７９７、２７９８、２７９９、２８００、２８０１、２８０２、２８０３、２８０４、２８０５、２８０６、２８０７、２８０８、２８０９、２８１０、２８１１、２８１２、２８１３、２８１４、２８１５、２８１６、２８１７、２８１８、２８１９、２８２０、２８２１、２８２２、２８２３、２８２４、２８２５、２８２６、２８２７、２８２８、２８２９、２８３０、２８３１、２８３２、２８３３、２８３４、２８３５、２８３６、２８３７、２８３８、２８３９、２８４０、２８４１、２８４２、２８４３、２８４４、２８４５、２８４６、２８４７、２８４８、２８４９、２８５０、２８５１、２８５２、２８５３、２８５４、２８５５、２８５６、２８５７、２８５８、２８５９、２８６０、２８６１、２８６２、２８６３、２８６４、２８６５、２８６６、２８６７、２８６８、２８６９、２８７０、２８７１、２８７２、２８７３、２８７４、２８７５、２８７６、２８７７、２８７８、２８７９、２８８０、２８８１、２８８２、２８８３、２８８４、２８８５、２８８６、２８８７、２８８８、２８８９、２８９０、２８９１、２８９２、２８９３、２８９４、２８９５、２８９６、２８９７、２８９８、２８９９、２９００、２９０１、２９０２、２９０３、２９０４、２９０５、２９０６、２９０７、２９０８、２９０９、２９１０、２９１１、２９１２、２９１３、２９１４、２９１５、２９１６、２９１７、２９１８、２９１９、２９２０、２９２１、２９２２、２９２３、２９２４、２９２５、２９２６、２９２７、２９２８、２９２９、２９３０、２９３１、２９３２、２９３３、２９３４、２９３５、２９３６、２９３７、２９３８、２９３９、２９４０、２９４１、２９４２、２９４３、２９４４、２９４５、２９４６、２９４７、２９４８、２９４９、２９５０、２９５１、２９５２、２９５３、２９５４、２９５５、２９５６、２９５７、２９５８、２９５９、２９６０、２９６１、２９６２、２９６３、２９６４、２９６５、２９６６、２９６７、２９６８、２９６９、２９７０、２９７１、２９７２、２９７３、２９７４、２９７５、２９７６、２９７７、２９７８、２９７９、２９８０、２９８１、２９８２、２９８３、２９８４、２９８５、２９８６、２９８７、２９８８、２９８９、２９９０、２９９１、２９９２、２９９３、２９９４、２９９５、２９９６、２９９７、２９９８、２９９９、３０００、３００１、３００２、３００３、３００４、３００５、３００６、３００７、３００８、３００９、３０１０、３０１１、３０１２、３０１３、３０１４、３０１５、３０１６、３０１７、３０１８、３０１９、３０２０、３０２１、３０２２、３０２３、３０２４、３０２５、３０２６、３０２７、３０２８、３０２９、３０３０、３０３１、３０３２、３０３３、３０３４、３０３５、３０３６、３０３７、３０３８、３０３９、３０４０、３０４１、３０４２、３０４３、３０４４、３０４５、３０４６、３０４７、３０４８、３０４９、３０５０、３０５１、３０５２、３０５３、３０５４、３０５５、３０５６、３０５７、３０５８、３０５９、３０６０、３０６１、３０６２、３０６３、３０６４、３０６５、３０６６、３０６７、３０６８、３０６９、３０７０、３０７１、３０７２、３０７３、３０７４、３０７５、３０７６、３０７７、３０７８、３０７９、３０８０、３０８１、３０８２、３０８３、３０８４、３０８５、３０８６、３０８７、３０８８、３０８９、３０９０、３０９１、３０９２、３０９３、３０９４、３０９５、３０９６、３０９７、３０９８、３０９９、３１００、３１０１、３１０２、３１０３、３１０４、３１０５、３１０６、３１０７、３１０８、３１０９、３１１０、３１１１、３１１２、３１１３、３１１４、３１１５、３１１６、３１１７、３１１８、３１１９、３１２０、３１２１、３１２２、３１２３、３１２４、３１２５、３１２６、３１２７、３１２８、３１２９、３１３０、３１３１、３１３２、３１３３、３１３４、３１３５、３１３６、３１３７、３１３８、３１３９、３１４０、３１４１、３１４２、３１４３、３１４４、３１４５、３１４６、３１４７、３１４８、３１４９、３１５０、３１５１、３１５２、３１５３、３１５４、３１５５、３１５６、３１５７、３１５８、３１５９、３１６０、３１６１、３１６２、３１６３、３１６４、３１６５、３１６６、３１６７、３１６８、３１６９、３１７０、３１７１、３１７２、３１７３、３１７４、３１７５、３１７６、３１７７、３１７８、３１７９、３１８０、３１８１、３１８２、３１８３、３１８４、３１８５、３１８６、３１８７、３１８８、３１８９、３１９０、３１９１、３１９２、３１９３、３１９４、３１９５、３１９６、３１９７、３１９８、３１９９、３２００、３２０１、３２０２、３２０３、３２０４、３２０５、３２０６、３２０７、３２０８、３２０９、３２１０、３２１１、３２１２、３２１３、３２１４、３２１５、３２１６、３２１７、３２１８、３２１９、３２２０、３２２１、３２２２、３２２３、３２２４、３２２５、３２２６、３２２７、３２２８、３２２９、３２３０、３２３１、３２３２、３２３３、３２３４、３２３５、３２３６、３２３７、３２３８、３２３９、３２４０、３２４１、３２４２、３２４３、３２４４、３２４５、３２４６、３２４７、３２４８、３２４９、および３２５０ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムの任意のフィラー領域の長さは、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１０５０、１０５０〜１１００、１１００〜１１５０、１１５０〜１２００、１２００〜１２５０、１２５０〜１３００、１３００〜１３５０、１３５０〜１４００、１４００〜１４５０、１
４５０〜１５００、１５００〜１５５０、１５５０〜１６００、１６００〜１６５０、１６５０〜１７００、１７００〜１７５０、１７５０〜１８００、１８００〜１８５０、１８５０〜１９００、１９００〜１９５０、１９５０〜２０００、２０００〜２０５０、２０５０〜２１００、２１００〜２１５０、２１５０〜２２００、２２００〜２２５０、２２５０〜２３００、２３００〜２３５０、２３５０〜２４００、２４００〜２４５０、２４５０〜２５００、２５００〜２５５０、２５５０〜２６００、２６００〜２６５０、２６５０〜２７００、２７００〜２７５０、２７５０〜２８００、２８００〜２８５０、２８５０〜２９００、２９００〜２９５０、２９５０〜３０００、３０００〜３０５０、３０５０〜３１００、３１００〜３１５０、３１５０〜３２００、および３２００〜３２５０ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５６ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約９７ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３５７ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３６３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約７１２ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約７１４ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１２０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１２０９ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１５１２ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１５１９ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２３９５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２４０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を・ワむ。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２４０５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０１３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０２１ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。
【０３０３】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つの多重フィラー配列領域を含み得る。フィラー領域は、独立に、限定はされないが、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、６００、６０１、６０２、６０３、６０４、６０５、６０６、６０７、６０８、６０９、６１０、６１１、６１２、６１３、６１４、６１５、６１６、６１７、６１８、６１９、６２０、６２１、６２２、６２３、６２４、６２５、６２６、６２７、６２８、６２９、６３０、６３１、６３２、６３３、６３４、６３５、６３６、６３７、６３８、６３９、６４０、６４１、６４２、６４３、６４４、６４５、６４６、６４７、６４８、６４９、６５０、６５１、６５２、６５３、６５４、６５５、６５６、６５７、６５８、６５９、６６０、６６１、６６２、６６３、６６４、６６５、６６６、６６７、６６８、６６９、６７０、６７１、６７２、６７３、６７４、６７５、６７６、６７７、６７８、６７９、６８０、６８１、６８２、６８３、６８４、６８５、６８６、６８７、６８８、６８９、６９０、６９１、６９２、６９３、６９４、６９５、６９６、６９７、６９８、６９９、７００、７０１、７０２、７０３、７０４、７０５、７０６、７０７、７０８、７０９、７１０、７１１、７１２、７１３、７１４、７１５、７１６、７１７、７１８、７１９、７２０、７２１、７２２、７２３、７２４、７２５、７２６、７２７、７２８、７２９、７３０、７３１、７３２、７３３、７３４、７３５、７３６、７３７、７３８、７３９、７４０、７４１、７４２、７４３、７４４、７４５、７４６、７４７、７４８、７４９、７５０、７５１、７５２、７５３、７５４、７５５、７５６、７５７、７５８、７５９、７６０、７６１、７６２、７６３、７６４、７６５、７６６、７６７、７６８、７６９、７７０、７７１、７７２、７７３、７７４、７７５、７７６、７７７、７７８、７７９、７８０、７８１、７８２、７８３、７８４、７８５、７８６、７８７、７８８、７８９、７９０、７９１、７９２、７９３、７９４、７９５、７９６、７９７、７９８、７９９、８００、８０１、８０２、８０３、８０４、８０５、８０６、８０７、８０８、８０９、８１０、８１１、８１２、８１３、８１４、８１５、８１６、８１７、８１８、８１９、８２０、８２１、８２２、８２３、８２４、８２５、８２６、８２７、８２８、８２９、８３０、８３１、８３２、８３３、８３４、８３５、８３６、８３７、８３８、８３９、８４０、８４１、８４２、８４３、８４４、８４５、８４６、８４７、８４８、８４９、８５０、８５１、８５２、８５３、８５４、８５５、８５６、８５７、８５８、８５９、８６０、８６１、８６２、８６３、８６４、８６５、８６６、８６７、８６８、８６９、８７０、８７１、８７２、８７３、８７４、８７５、８７６、８７７、８７８、８７９、８８０、８８１、８８２、８８３、８８４、８８５、８８６、８８７、８８８、８８９、８９０、８９１、８９２、８９３、８９４、８９５、８９６、８９７、８９８、８９９、９００、９０１、９０２、９０３、９０４、９０５、９０６、９０７、９０８、９０９、９１０、９１１、９１２、９１３、９１４、９１５、９１６、９１７、９１８、９１９、９２０、９２１、９２２、９２３、９２４、９２５、９２６、９２７、９２８、９２９、９３０、９３１、９３２、９３３、９３４、９３５、９３６、９３７、９３８、９３９、９４０、９４１、９４２、９４３、９４４、９４５、９４６、９４７、９４８、９４９、９５０、９５１、９５２、９５３、９５４、９５５、９５６、９５７、９５８、９５９、９６０、９６１、９６２、９６３、９６４、９６５、９６６、９６７、９６８、９６９、９７０、９７１、９７２、９７３、９７４、９７５、９７６、９７７、９７８、９７９、９８０、９８１、９８２、９８３、９８４、９８５、９８６、９８７、９８８、９８９、９９０、９９１、９９２、９９３、９９４、９９５、９９６、９９７、９９８、９９９、１０００、１００１、１００２、１００３、１００４、１００５、１００６、１００７、１００８、１００９、１０１０、１０１１、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５、１０１６、１０１７、１０１８、１０１９、１０２０、１０２１、１０２２、１０２３、１０２４、１０２５、１０２６、１０２７、１０２８、１０２９、１０３０、１０３１、１０３２、１０３３、１０３４、１０３５、１０３６、１０３７、１０３８、１０３９、１０４０、１０４１、１０４２、１０４３、１０４４、１０４５、１０４６、１０４７、１０４８、１０４９、１０５０、１０５１、１０５２、１０５３、１０５４、１０５５、１０５６、１０５７、１０５８、１０５９、１０６０、１０６１、１０６２、１０６３、１０６４、１０６５、１０６６、１０６７、１０６８、１０６９、１０７０、１０７１、１０７２、１０７３、１０７４、１０７５、１０７６、１０７７、１０７８、１０７９、１０８０、１０８１、１０８２、１０８３、１０８４、１０８５、１０８６、１０８７、１０８８、１０８９、１０９０、１０９１、１０９２、１０９３、１０９４、１０９５、１０９６、１０９７、１０９８、１０９９、１１００、１１０１、１１０２、１１０３、１１０４、１１０５、１１０６、１１０７、１１０８、１１０９、１１１０、１１１１、１１１２、１１１３、１１１４、１１１５、１１１６、１１１７、１１１８、１１１９、１１２０、１１２１、１１２２、１１２３、１１２４、１１２５、１１２６、１１２７、１１２８、１１２９、１１３０、１１３１、１１３２、１１３３、１１３４、１１３５、１１３６、１１３７、１１３８、１１３９、１１４０、１１４１、１１４２、１１４３、１１４４、１１４５、１１４６、１１４７、１１４８、１１４９、１１５０、１１５１、１１５２、１１５３、１１５４、１１５５、１１５６、１１５７、１１５８、１１５９、１１６０、１１６１、１１６２、１１６３、１１６４、１１６５、１１６６、１１６７、１１６８、１１６９、１１７０、１１７１、１１７２、１１７３、１１７４、１１７５、１１７６、１１７７、１１７８、１１７９、１１８０、１１８１、１１８２、１１８３、１１８４、１１８５、１１８６、１１８７、１１８８、１１８９、１１９０、１１９１、１１９２、１１９３、１１９４、１１９５、１１９６、１１９７、１１９８、１１９９、１２００、１２０１、１２０２、１２０３、１２０４、１２０５、１２０６、１２０７、１２０８、１２０９、１２１０、１２１１、１２１２、１２１３、１２１４、１２１５、１２１６、１２１７、１２１８、１２１９、１２２０、１２２１、１２２２、１２２３、１２２４、１２２５、１２２６、１２２７、１２２８、１２２９、１２３０、１２３１、１２３２、１２３３、１２３４、１２３５、１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８４、２２８５、２２８６、２２８７、２２８８、２２８９、２２９０、２２９１、２２９２、２２９３、２２９４、２２９５、２２９６、２２９７、２２９８、２２９９、２３００、２３０１、２３０２、２３０３、２３０４、２３０５、２３０６、２３０７、２３０８、２３０９、２３１０、２３１１、２３１２、２３１３、２３１４、２３１５、２３１６、２３１７、２３１８、２３１９、２３２０、２３２１、２３２２、２３２３、２３２４、２３２５、２３２６、２３２７、２３２８、２３２９、２３３０、２３３１、２３３２、２３３３、２３３４、２３３５、２３３６、２３３７、２３３８、２３３９、２３４０、２３４１、２３４２、２３４３、２３４４、２３４５、２３４６、２３４７、２３４８、２３４９、２３５０、２３５１、２３５２、２３５３、２３５４、２３５５、２３５６、２３５７、２３５８、２３５９、２３６０、２３６１、２３６２、２３６３、２３６４、２３６５、２３６６、２３６７、２３６８、２３６９、２３７０、２３７１、２３７２、２３７３、２３７４、２３７５、２３７６、２３７７、２３７８、２３７９、２３８０、２３８１、２３８２、２３８３、２３８４、２３８５、２３８６、２３８７、２３８８、２３８９、２３９０、２３９１、２３９２、２３９３、２３９４、２３９５、２３９６、２３９７、２３９８、２３９９、２４００、２４０１、２４０２、２４０３、２４０４、２４０５、２４０６、２４０７、２４０８、２４０９、２４１０、２４１１、２４１２、２４１３、２４１４、２４１５、２４１６、２４１７、２４１８、２４１９、２４２０、２４２１、２４２２、２４２３、２４２４、２４２５、２４２６、２４２７、２４２８、２４２９、２４３０、２４３１、２４３２、２４３３、２４３４、２４３５、２４３６、２４３７、２４３８、２４３９、２４４０、２４４１、２４４２、２４４３、２４４４、２４４５、２４４６、２４４７、２４４８、２４４９、２４５０、２４５１、２４５２、２４５３、２４５４、２４５５、２４５６、２４５７、２４５８、２４５９、２４６０、２４６１、２４６２、２４６３、２４６４、２４６５、２４６６、２４６７、２４６８、２４６９、２４７０、２４７１、２４７２、２４７３、２４７４、２４７５、２４７６、２４７７、２４７８、２４７９、２４８０、２４８１、２４８２、２４８３、２４８４、２４８５、２４８６、２４８７、２４８８、２４８９、２４９０、２４９１、２４９２、２４９３、２４９４、２４９５、２４９６、２４９７、２４９８、２４９９、２５００、２５０１、２５０２、２５０３、２５０４、２５０５、２５０６、２５０７、２５０８、２５０９、２５１０、２５１１、２５１２、２５１３、２５１４、２５１５、２５１６、２５１７、２５１８、２５１９、２５２０、２５２１、２５２２、２５２３、２５２４、２５２５、２５２６、２５２７、２５２８、２５２９、２５３０、２５３１、２５３２、２５３３、２５３４、２５３５、２５３６、２５３７、２５３８、２５３９、２５４０、２５４１、２５４２、２５４３、２５４４、２５４５、２５４６、２５４７、２５４８、２５４９、２５５０、２５５１、２５５２、２５５３、２５５４、２５５５、２５５６、２５５７、２５５８、２５５９、２５６０、２５６１、２５６２、２５６３、２５６４、２５６５、２５６６、２５６７、２５６８、２５６９、２５７０、２５７１、２５７２、２５７３、２５７４、２５７５、２５７６、２５７７、２５７８、２５７９、２５８０、２５８１、２５８２、２５８３、２５８４、２５８５、２５８６、２５８７、２５８８、２５８９、２５９０、２５９１、２５９２、２５９３、２５９４、２５９５、２５９６、２５９７、２５９８、２５９９、２６００、２６０１、２６０２、２６０３、２６０４、２６０５、２６０６、２６０７、２６０８、２６０９、２６１０、２６１１、２６１２、２６１３、２６１４、２６１５、２６１６、２６１７、２６１８、２６１９、２６２０、２６２１、２６２２、２６２３、２６２４、２６２５、２６２６、２６２７、２６２８、２６２９、２６３０、２６３１、２６３２、２６３３、２６３４、２６３５、２６３６、２６３７、２６３８、２６３９、２６４０、２６４１、２６４２、２６４３、２６４４、２６４５、２６４６、２６４７、２６４８、２６４９、２６５０、２６５１、２６５２、２６５３、２６５４、２６５５、２６５６、２６５７、２６５８、２６５９、２６６０、２６６１、２６６２、２６６３、２６６４、２６６５、２６６６、２６６７、２６６８、２６６９、２６７０、２６７１、２６７２、２６７３、２６７４、２６７５、２６７６、２６７７、２６７８、２６７９、２６８０、２６８１、２６８２、２６８３、２６８４、２６８５、２６８６、２６８７、２６８８、２６８９、２６９０、２６９１、２６９２、２６９３、２６９４、２６９５、２６９６、２６９７、２６９８、２６９９、２７００、２７０１、２７０２、２７０３、２７０４、２７０５、２７０６、２７０７、２７０８、２７０９、２７１０、２７１１、２７１２、２７１３、２７１４、２７１５、２７１６、２７１７、２７１８、２７１９、２７２０、２７２１、２７２２、２７２３、２７２４、２７２５、２７２６、２７２７、２７２８、２７２９、２７３０、２７３１、２７３２、２７３３、２７３４、２７３５、２７３６、２７３７、２７３８、２７３９、２７４０、２７４１、２７４２、２７４３、２７４４、２７４５、２７４６、２７４７、２７４８、２７４９、２７５０、２７５１、２７５２、２７５３、２７５４、２７５５、２７５６、２７５７、２７５８、２７５９、２７６０、２７６１、２７６２、２７６３、２７６４、２７６５、２７６６、２７６７、２７６８、２７６９、２７７０、２７７１、２７７２、２７７３、２７７４、２７７５、２７７６、２７７７、２７７８、２７７９、２７８０、２７８１、２７８２、２７８３、２７８４、２７８５、２７８６、２７８７、２７８８、２７８９、２７９０、２７９１、２７９２、２７９３、２７９４、２７９５、２７９６、２７９７、２７９８、２７９９、２８００、２８０１、２８０２、２８０３、２８０４、２８０５、２８０６、２８０７、２８０８、２８０９、２８１０、２８１１、２８１２、２８１３、２８１４、２８１５、２８１６、２８１７、２８１８、２８１９、２８２０、２８２１、２８２２、２８２３、２８２４、２８２５、２８２６、２８２７、２８２８、２８２９、２８３０、２８３１、２８３２、２８３３、２８３４、２８３５、２８３６、２８３７、２８３８、２８３９、２８４０、２８４１、２８４２、２８４３、２８４４、２８４５、２８４６、２８４７、２８４８、２８４９、２８５０、２８５１、２８５２、２８５３、２８５４、２８５５、２８５６、２８５７、２８５８、２８５９、２８６０、２８６１、２８６２、２８６３、２８６４、２８６５、２８６６、２８６７、２８６８、２８６９、２８７０、２８７１、２８７２、２８７３、２８７４、２８７５、２８７６、２８７７、２８７８、２８７９、２８８０、２８８１、２８８２、２８８３、２８８４、２８８５、２８８６、２８８７、２８８８、２８８９、２８９０、２８９１、２８９２、２８９３、２８９４、２８９５、２８９６、２８９７、２８９８、２８９９、２９００、２９０１、２９０２、２９０３、２９０４、２９０５、２９０６、２９０７、２９０８、２９０９、２９１０、２９１１、２９１２、２９１３、２９１４、２９１５、２９１６、２９１７、２９１８、２９１９、２９２０、２９２１、２９２２、２９２３、２９２４、２９２５、２９２６、２９２７、２９２８、２９２９、２９３０、２９３１、２９３２、２９３３、２９３４、２９３５、２９３６、２９３７、２９３８、２９３９、２９４０、２９４１、２９４２、２９４３、２９４４、２９４５、２９４６、２９４７、２９４８、２９４９、２９５０、２９５１、２９５２、２９５３、２９５４、２９５５、２９５６、２９５７、２９５８、２９５９、２９６０、２９６１、２９６２、２９６３、２９６４、２９６５、２９６６、２９６７、２９６８、２９６９、２９７０、２９７１、２９７２、２９７３、２９７４、２９７５、２９７６、２９７７、２９７８、２９７９、２９８０、２９８１、２９８２、２９８３、２９８４、２９８５、２９８６、２９８７、２９８８、２９８９、２９９０、２９９１、２９９２、２９９３、２９９４、２９９５、２９９６、２９９７、２９９８、２９９９、３０００、３００１、３００２、３００３、３００４、３００５、３００６、３００７、３００８、３００９、３０１０、３０１１、３０１２、３０１３、３０１４、３０１５、３０１６、３０１７、３０１８、３０１９、３０２０、３０２１、３０２２、３０２３、３０２４、３０２５、３０２６、３０２７、３０２８、３０２９、３０３０、３０３１、３０３２、３０３３、３０３４、３０３５、３０３６、３０３７、３０３８、３０３９、３０４０、３０４１、３０４２、３０４３、３０４４、３０４５、３０４６、３０４７、３０４８、３０４９、３０５０、３０５１、３０５２、３０５３、３０５４、３０５５、３０５６、３０５７、３０５８、３０５９、３０６０、３０６１、３０６２、３０６３、３０６４、３０６５、３０６６、３０６７、３０６８、３０６９、３０７０、３０７１、３０７２、３０７３、３０７４、３０７５、３０７６、３０７７、３０７８、３０７９、３０８０、３０８１、３０８２、３０８３、３０８４、３０８５、３０８６、３０８７、３０８８、３０８９、３０９０、３０９１、３０９２、３０９３、３０９４、３０９５、３０９６、３０９７、３０９８、３０９９、３１００、３１０１、３１０２、３１０３、３１０４、３１０５、３１０６、３１０７、３１０８、３１０９、３１１０、３１１１、３１１２、３１１３、３１１４、３１１５、３１１６、３１１７、３１１８、３１１９、３１２０、３１２１、３１２２、３１２３、３１２４、３１２５、３１２６、３１２７、３１２８、３１２９、３１３０、３１３１、３１３２、３１３３、３１３４、３１３５、３１３６、３１３７、３１３８、３１３９、３１４０、３１４１、３１４２、３１４３、３１４４、３１４５、３１４６、３１４７、３１４８、３１４９、３１５０、３１５１、３１５２、３１５３、３１５４、３１５５、３１５６、３１５７、３１５８、３１５９、３１６０、３１６１、３１６２、３１６３、３１６４、３１６５、３１６６、３１６７、３１６８、３１６９、３１７０、３１７１、３１７２、３１７３、３１７４、３１７５、３１７６、３１７７、３１７８、３１７９、３１８０、３１８１、３１８２、３１８３、３１８４、３１８５、３１８６、３１８７、３１８８、３１８９、３１９０、３１９１、３１９２、３１９３、３１９４、３１９５、３１９６、３１９７、３１９８、３１９９、３２００、３２０１、３２０２、３２０３、３２０４、３２０５、３２０６、３２０７、３２０８、３２０９、３２１０、３２１１、３２１２、３２１３、３２１４、３２１５、３２１６、３２１７、３２１８、３２１９、３２２０、３２２１、３２２２、３２２３、３２２４、３２２５、３２２６、３２２７、３２２８、３２２９、３２３０、３２３１、３２３２、３２３３、３２３４、３２３５、３２３６、３２３７、３２３８、３２３９、３２４０、３２４１、３２４２、３２４３、３２４４、３２４５、３２４６、３２４７、３２４８、３２４９、および３２５０ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムの任意のフィラー領域の長さは、５０〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜２５０、２５０〜３００、３００〜３５０、３５０〜４００、４００〜４５０、４５０〜５００、５００〜５５０、５５０〜６００、６００〜６５０、６５０〜７００、７００〜７５０、７５０〜８００、８００〜８５０、８５０〜９００、９００〜９５０、９５０〜１０００、１０００〜１０５０、１０５０〜１１００、１１００〜１１５０、１１５０〜１２００、１２００〜１２５０、１２５０〜１３００、１３００〜１３５０、１３５０〜１４００、１４００〜１４５０、１
４５０〜１５００、１５００〜１５５０、１５５０〜１６００、１６００〜１６５０、１６５０〜１７００、１７００〜１７５０、１７５０〜１８００、１８００〜１８５０、１８５０〜１９００、１９００〜１９５０、１９５０〜２０００、２０００〜２０５０、２０５０〜２１００、２１００〜２１５０、２１５０〜２２００、２２００〜２２５０、２２５０〜２３００、２３００〜２３５０、２３５０〜２４００、２４００〜２４５０、２４５０〜２５００、２５００〜２５５０、２５５０〜２６００、２６００〜２６５０、２６５０〜２７００、２７００〜２７５０、２７５０〜２８００、２８００〜２８５０、２８５０〜２９００、２９００〜２９５０、２９５０〜３０００、３０００〜３０５０、３０５０〜３１００、３１００〜３１５０、３１５０〜３２００、および３２００〜３２５０ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５６ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約９７ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１０５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３５７ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３６３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約７１２ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約７１４ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１２０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１２０９ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１５１２ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１５１９ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２３９５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２４０３ヌクレオチド長であるフィラー領域を・ワむ。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２４０５ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０１３ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０２１ヌクレオチド長であるフィラー領域を含む。
【０３０４】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つのエンハンサー配列領域を含み得る。エンハンサー配列領域は、独立に、限定はされないが、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、および４００ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのエンハンサー領域の長さは、３００〜３１０、３００〜３２５、３０５〜３１５、３１０〜３２０、３１５〜３２５、３２０〜３３０、３２５〜３３５、３２５〜３５０、３３０〜３４０、３３５〜３４５、３４０〜３５０、３４５〜３５５、３５０〜３６０、３５０〜３７５、３５５〜３６５、３６０〜３７０、３６５〜３７５、３７０〜３８０、３７５〜３８５、３７５〜４００、３８０〜３９０、３８５〜３９５、および３９０〜４００ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０３ヌクレオチド長であるエンハンサー領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３８２ヌクレオチド長であるエンハンサー領域を含む。
【０３０５】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つのプロモータ配列領域を含み得る。プロモータ配列領域は、独立に、限定はされないが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、および６００ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのプロモータ領域の長さは、４〜１０、１０〜２０、１０〜５０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜１００、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１００〜１５０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１５０〜２００、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２００〜２５０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２５０〜３００、２６０〜２７０、２７０〜２８０、２８０〜２９０、２９０〜３００、３００〜３１０、３００〜３５０、３１０〜３２０、３２０〜３３０、３３０〜３４０、３４０〜３５０、３５０〜３６０、３５０〜４００、３６０〜３７０、３７０〜３８０、３８０〜３９０、３９０〜４００、４００〜４１０、４００〜４５０、４１０〜４２０、４２０〜４３０、４３０〜４４０、４４０〜４５０、４５０〜４６０、４５０〜５００、４６０〜４７０、４７０〜４８０、４８０〜４９０、４９０〜５００、５００〜５１０、５００〜５５０、５１０〜５２０、５２０〜５３０、５３０〜５４０、５４０〜５５０、５５０〜５６０、５５０〜６００、５６０〜５７０、５７０〜５８０、５８０〜５９０、および５９０〜６００ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約４ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１７ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２０４ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２１９ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２６０ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３０３ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３８２ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５８８ヌクレオチド長であるプロモータ領域を含む。
【０３０６】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つのエクソン配列領域を含み得る。エクソン領域は、独立に、限定はされないが、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、および１５０ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのエクソン領域の長さは、２〜１０、５〜１０、５〜１５、１０〜２０、１０〜３０、１０〜４０、１５〜２０、１５〜２５、２０〜３０、２０〜４０、２０〜５０、２５〜３０、２５〜３５、３０〜４０、３０〜５０、３０〜６０、３５〜４０、３５〜４５、４０〜５０、４０〜６０、４０〜７０、４５〜５０、４５〜５５、５０〜６０、５０〜７０、５０〜８０、５５〜６０、５５〜６５、６０〜７０、６０〜８０、６０〜９０、６５〜７０、６５〜７５、７０〜８０、７０〜９０、７０〜１００、７５〜８０、７５〜８５、８０〜９０、８０〜１００、８０〜１１０、８５〜９０、８５〜９５、９０〜１００、９０〜１１０、９０〜１２０、９５〜１００、９５〜１０５、１００〜１１０、１００〜１２０、１００〜１３０、１０５〜１１０、１０５〜１１５、１１０〜１２０、１１０〜１３０、１１０〜１４０、１１５〜１２０、１１５〜１２５、１２０〜１３０、１２０〜１４０、１２０〜１５０、１２５〜１３０、１２５〜１３５、１３０〜１４０、１３０〜１５０、１３５〜１４０、１３５〜１４５、１４０〜１５０、および１４５〜１５０ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約５３ヌクレオチド長であるエクソン領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１３４ヌクレオチド長であるエクソン領域を含む。
【０３０７】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つのイントロン配列領域を含み得る。イントロン領域は、独立に、限定はされないが、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、および３５０ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのイントロン領域の長さは、２５〜３５、２５〜５０、３５〜４５、４５〜５５、５０〜７５、５５〜６５、６５〜７５、７５〜８５、７５〜１００、８５〜９５、９５〜１０５、１００〜１２５、１０５〜１１５、１１５〜１２５、１２５〜１３５、１２５〜１５０、１３５〜１４５、１４５〜１５５、１５０〜１７５、１５５〜１６５、１６５〜１７５、１７５〜１８５、１７５〜２００、１８５〜１９５、１９５〜２０５、２００〜２２５、２０５〜２１５、２１５〜２２５、２２５〜２３５、２２５〜２５０、２３５〜２４５、２４５〜２５５、２５０〜２７５、２５５〜２６５、２６５〜２７５、２７５〜２８５、２７５〜３００、２８５〜２９５、２９５〜３０５、３００〜３２５、３０５〜３１５、３１５〜３２５、３２５〜３３５、３２５〜３５０、および３３５〜３４５ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３２ヌクレオチド長であるイントロン領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１７２ヌクレオチド長であるイントロン領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２０１ヌクレオチド長であるイントロン領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約３４７ヌクレオチド長であるイントロン領域を含む。
【０３０８】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、少なくとも１つのポリアデニル化シグナル配列領域を含み得る。ポリアデニル化シグナル領域配列領域は、独立に、限定はされないが、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、１００、１０１、１０２、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１１０、１１１、１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、１１８、１１９、１２０、１２１、１２２、１２３、１２４、１２５、１２６、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３５、１３６、１３７、１３８、１３９、１４０、１４１、１４２、１４３、１４４、１４５、１４６、１４７、１４８、１４９、１５０、１５１、１５２、１５３、１５４、１５５、１５６、１５７、１５８、１５９、１６０、１６１、１６２、１６３、１６４、１６５、１６６、１６７、１６８、１６９、１７０、１７１、１７２、１７３、１７４、１７５、１７６、１７７、１７８、１７９、１８０、１８１、１８２、１８３、１８４、１８５、１８６、１８７、１８８、１８９、１９０、１９１、１９２、１９３、１９４、１９５、１９６、１９７、１９８、１９９、２００、２０１、２０２、２０３、２０４、２０５、２０６、２０７、２０８、２０９、２１０、２１１、２１２、２１３、２１４、２１５、２１６、２１７、２１８、２１９、２２０、２２１、２２２、２２３、２２４、２２５、２２６、２２７、２２８、２２９、２３０、２３１、２３２、２３３、２３４、２３５、２３６、２３７、２３８、２３９、２４０、２４１、２４２、２４３、２４４、２４５、２４６、２４７、２４８、２４９、２５０、２５１、２５２、２５３、２５４、２５５、２５６、２５７、２５８、２５９、２６０、２６１、２６２、２６３、２６４、２６５、２６６、２６７、２６８、２６９、２７０、２７１、２７２、２７３、２７４、２７５、２７６、２７７、２７８、２７９、２８０、２８１、２８２、２８３、２８４、２８５、２８６、２８７、２８８、２８９、２９０、２９１、２９２、２９３、２９４、２９５、２９６、２９７、２９８、２９９、３００、３０１、３０２、３０３、３０４、３０５、３０６、３０７、３０８、３０９、３１０、３１１、３１２、３１３、３１４、３１５、３１６、３１７、３１８、３１９、３２０、３２１、３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７、３２８、３２９、３３０、３３１、３３２、３３３、３３４、３３５、３３６、３３７、３３８、３３９、３４０、３４１、３４２、３４３、３４４、３４５、３４６、３４７、３４８、３４９、３５０、３５１、３５２、３５３、３５４、３５５、３５６、３５７、３５８、３５９、３６０、３６１、３６２、３６３、３６４、３６５、３６６、３６７、３６８、３６９、３７０、３７１、３７２、３７３、３７４、３７５、３７６、３７７、３７８、３７９、３８０、３８１、３８２、３８３、３８４、３８５、３８６、３８７、３８８、３８９、３９０、３９１、３９２、３９３、３９４、３９５、３９６、３９７、３９８、３９９、４００、４０１、４０２、４０３、４０４、４０５、４０６、４０７、４０８、４０９、４１０、４１１、４１２、４１３、４１４、４１５、４１６、４１７、４１８、４１９、４２０、４２１、４２２、４２３、４２４、４２５、４２６、４２７、４２８、４２９、４３０、４３１、４３２、４３３、４３４、４３５、４３６、４３７、４３８、４３９、４４０、４４１、４４２、４４３、４４４、４４５、４４６、４４７、４４８、４４９、４５０、４５１、４５２、４５３、４５４、４５５、４５６、４５７、４５８、４５９、４６０、４６１、４６２、４６３、４６４、４６５、４６６、４６７、４６８、４６９、４７０、４７１、４７２、４７３、４７４、４７５、４７６、４７７、４７８、４７９、４８０、４８１、４８２、４８３、４８４、４８５、４８６、４８７、４８８、４８９、４９０、４９１、４９２、４９３、４９４、４９５、４９６、４９７、４９８、４９９、５００、５０１、５０２、５０３、５０４、５０５、５０６、５０７、５０８、５０９、５１０、５１１、５１２、５１３、５１４、５１５、５１６、５１７、５１８、５１９、５２０、５２１、５２２、５２３、５２４、５２５、５２６、５２７、５２８、５２９、５３０、５３１、５３２、５３３、５３４、５３５、５３６、５３７、５３８、５３９、５４０、５４１、５４２、５４３、５４４、５４５、５４６、５４７、５４８、５４９、５５０、５５１、５５２、５５３、５５４、５５５、５５６、５５７、５５８、５５９、５６０、５６１、５６２、５６３、５６４、５６５、５６６、５６７、５６８、５６９、５７０、５７１、５７２、５７３、５７４、５７５、５７６、５７７、５７８、５７９、５８０、５８１、５８２、５８３、５８４、５８５、５８６、５８７、５８８、５８９、５９０、５９１、５９２、５９３、５９４、５９５、５９６、５９７、５９８、５９９、および６００ヌクレオチドなどの長さを有していてもよい。ウイルスゲノムのポリアデニル化シグナル配列領域の長さは、４〜１０、１０〜２０、１０〜５０、２０〜３０、３０〜４０、４０〜５０、５０〜６０、５０〜１００、６０〜７０、７０〜８０、８０〜９０、９０〜１００、１００〜１１０、１００〜１５０、１１０〜１２０、１２０〜１３０、１３０〜１４０、１４０〜１５０、１５０〜１６０、１５０〜２００、１６０〜１７０、１７０〜１８０、１８０〜１９０、１９０〜２００、２００〜２１０、２００〜２５０、２１０〜２２０、２２０〜２３０、２３０〜２４０、２４０〜２５０、２５０〜２６０、２５０〜３００、２６０〜２７０、２７０〜２８０、２８０〜２９０、２９０〜３００、３００〜３１０、３００〜３５０、３１０〜３２０、３２０〜３３０、３３０〜３４０、３４０〜３５０、３５０〜３６０、３５０〜４００、３６０〜３７０、３７０〜３８０、３８０〜３９０、３９０〜４００、４００〜４１０、４００〜４５０、４１０〜４２０、４２０〜４３０、４３０〜４４０、４４０〜４５０、４５０〜４６０、４５０〜５００、４６０〜４７０、４７０〜４８０、４８０〜４９０、４９０〜５００、５００〜５１０、５００〜５５０、５１０〜５２０、５２０〜５３０、５３０〜５４０、５４０〜５５０、５５０〜５６０、５５０〜６００、５６０〜５７０、５７０〜５８０、５８０〜５９０、および５９０〜６００ヌクレオチドであってもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約１２７ヌクレオチド長であるポリアデニル化シグナル配列領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約２２５ヌクレオチド長であるポリアデニル化シグナル配列領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約４７６ヌクレオチド長であるポリアデニル化シグナル配列領域を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、約４７７ヌクレオチド長であるポリアデニル化シグナル配列領域を含む。
【０３０９】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子ウイルスゲノムは、２つ以上のポリＡシグナル配列領域を含む。
調節性ポリヌクレオチド配列を含むペイロード領域を有するウイルスゲノムを含むＡＡＶ粒子のＩＴＲ〜ＩＴＲ配列の非限定的な例は、表９に記載される。
【０３１０】
【表９】
2021502060.tif 000010
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、配列番号１２２〜１４６のいずれかに対して同一性パーセントを有する配列を含むウイルスゲノムを含む。ウイルスゲノムは、配列番号１２２〜１４６のいずれかに対して１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％または１００％同一性を有してもよい。ウイルスゲノムは、配列番号１２２〜１４６のいずれかに対して１〜１０％、１０〜２０％、３０〜４０％、５０〜６０％、５０〜７０％、５０〜８０％、５０〜９０％、５０〜９９％、５０〜１００％、６０〜７０％、６０〜８０％、６０〜９０％、６０〜９９％、６０〜１００％、７０〜８０％、７０〜９０％、７０〜９９％、７０〜１００％、８０〜８５％、８０〜９０％、８０〜９５％、８０〜９９％、８０〜１００％、９０〜９５％、９０〜９９％、または９０〜１００％を有してもよい。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号１２２〜１４６のいずれかに対して８０％同一性である配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号１２２〜１４６のいずれかに対して８５％同一性である配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号１２２〜１４６のいずれかに対して９０％同一性である配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号１２２〜１４６のいずれかに対して９５％同一性である配列を含む。非限定的な例として、ウイルスゲノムは、配列番号１２２〜１４６のいずれかに対して９９％同一性である配列を含む。
【０３１１】
ＡＡＶ粒子は、送達効率が増強されるように修飾されてもよい。本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むかかる修飾ＡＡＶベクターは、効率的にパッケージングすることができ、高頻度でおよび最低限の毒性でおよび標的細胞への感染を成功させるために使用することができる。
【０３１２】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、ヒト血清型ＡＡＶ粒子であってもよい。かかるヒトＡＡＶ粒子は、任意の既知の血清型、例えば血清型ＡＡＶ１〜ＡＡＶ１１のいずれか１つに由来し得る。非限定的な例として、ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１由来カプシドにＡＡＶ１由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ２由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ４由来カプシドにＡＡＶ４由来ゲノムを含むベクター；ＡＡＶ６由来カプシドにＡＡＶ６由来ゲノムを含むベクターまたはＡＡＶ９由来カプシドにＡＡＶ９由来ゲノムを含むベクターであってもよい。
【０３１３】
他の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、少なくとも２つの異なるＡＡＶ血清型を起源とする配列および／または成分を含有するシュードタイプハイブリッドまたはキメラＡＡＶ粒子であってもよい。シュードタイプＡＡＶ粒子は、あるＡＡＶ血清型に由来するＡＡＶゲノムと、少なくとも一部が異なるＡＡＶ血清型に由来するカプシドタンパク質とを含むベクターであってもよい。非限定的な例として、かかるシュードタイプＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ１由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；またはＡＡＶ６由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクター；またはＡＡＶ４由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノム；もしくはＡＡＶ９由来カプシドにＡＡＶ２由来ゲノムを含むベクターであってもよい。同様に、本発明は、任意のハイブリッドまたはキメラＡＡＶ粒子を企図する。
【０３１４】
他の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、中枢神経系へのｓｉＲＮＡ分子の送達に使用されてもよい（例えば、米国特許第６，１８０，６１３号明細書；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
【０３１５】
一部の態様において、本発明のｓｉＲＮＡ分子をコードする核酸配列を含むＡＡＶ粒子は、非ウイルス起源のペプチドを含む修飾カプシドを更に含み得る。他の態様において、コード化ｓｉＲＮＡ二重鎖の脳および脊髄への送達を促進するため、ＡＡＶ粒子はＣＮＳ特異的キメラカプシドを含んでもよい。例えば、ＣＮＳ向性を呈するＡＡＶバリアントからのｃａｐヌクレオチド配列のアラインメントを作成することにより可変領域（ＶＲ）配列および構造を同定してもよい。
【０３１６】
他の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、細胞への送達用のプラスミドベクター、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）、ゲノムまたは他の核酸発現ベクターにコードすることができる。
【０３１７】
ＤＮＡ発現プラスミドを使用して、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを細胞で安定に発現させ、標的遺伝子の長期阻害を実現することができる。
一態様において、ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドによってコードされるｓｉＲＮＡ二重鎖のセンス鎖とアンチセンス鎖とは、典型的には、短いスペーサ配列によって連結され、低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）と呼ばれるステム−ループ構造の発現をもたらす。ヘアピンはダイサーによって認識および切断され、そのようにして成熟ｓｉＲＮＡ分子が生じる。
【０３１８】
本発明によれば、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子の核酸を含むＡＡＶベクターが作製され、ＡＡＶベクター血清型は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ９．４７、ＡＡＶ９（ｈｕ１４）、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶｒｈ８、ＡＡＶｒｈ１０、ＡＡＶ−ＤＪ８およびＡＡＶ−ＤＪ、およびこれらのバリアントであってもよい。
【０３１９】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡは、発現されると、標的ｍＲＮＡ（つまり、ＳＯＤ１）を抑制（または分解）する。したがって、ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドによってコードされるｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡを使用して、細胞、例えば運動ニューロンにおけるＳＯＤ１遺伝子発現を実質的に阻害することができる。一部の態様において、ＳＯＤ１遺伝子発現の阻害とは、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％の阻害を指す。したがって、標的遺伝子のタンパク質産物は、少なくとも約２０％、好ましくは少なくとも約３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％阻害され得る。ＳＯＤ１遺伝子は、野生型遺伝子、または少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ＳＯＤ１遺伝子のいずれであってもよい。したがって、タンパク質は、野生型タンパク質、または少なくとも１つの突然変異を有する突然変異ポリペプチドのいずれかである。
【０３２０】
ウイルス作製
本開示は、ウイルス複製細胞をＡＡＶポリヌクレオチドまたはＡＡＶゲノムに接触させることを含む、ウイルス複製細胞におけるウイルスゲノム複製によるパルボウイルス粒子、例えばＡＡＶ粒子の作成方法を提供する。
【０３２１】
本開示は、１）コンピテント細菌細胞にバクミドベクターおよびウイルスコンストラクトベクターおよび／またはＡＡＶペイロードコンストラクトベクターのいずれかをコトランスフェクトする工程、２）得られたウイルスコンストラクト発現ベクターおよびＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターを単離し、ウイルス複製細胞に個別にトランスフェクトする工程、３）ウイルスコンストラクト発現ベクターまたはＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターを含む得られたペイロードおよびウイルスコンストラクト粒子を単離および精製する工程、４）ウイルス複製細胞に、ウイルスコンストラクト発現ベクターまたはＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターを含むＡＡＶペイロードおよびウイルスコンストラクト粒子の両方を共感染させる工程、５）パルボウイルスゲノムを含むウイルス粒子を回収および精製する工程を含む、形質導入効率が増強された（増加した、向上した）ＡＡＶ粒子の作製方法を提供する。
【０３２２】
一実施形態において、本発明は、１）限定はされないがＨＥＫ２９３細胞などの哺乳類細胞にペイロード領域、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するコンストラクトならびにヘルパーコンストラクトを同時にコトランスフェクトする工程、２）ウイルスゲノムを含むＡＡＶ粒子を回収および精製する工程を含む、ＡＡＶ粒子の作製方法を提供する。
【０３２３】
細胞
本開示は、ＡＡＶポリヌクレオチドおよび／またはＡＡＶゲノムを含む細胞を提供する。
【０３２４】
本明細書に開示されるウイルス作製は、ペイロード分子をコードするポリヌクレオチド配列を含むペイロードコンストラクト、例えば組換えウイルスコンストラクトを送達するため標的細胞に接触するＡＡＶ粒子の作製プロセスおよび方法を記載する。
【０３２５】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、昆虫細胞を含むウイルス複製細胞で作製されてもよい。
培養下の昆虫細胞の成長条件、および培養下の昆虫細胞における異種産物の産生は当該技術分野において周知であり、米国特許第６，２０４，０５９号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）を参照されたい。
【０３２６】
本発明においては、パルボウイルスの複製を可能にする、かつ培養下に維持することのできる任意の昆虫細胞を使用することができる。細胞株は、限定はされないがＳｆ９またはＳｆ２１細胞株を含めたスポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）からの細胞株、ショウジョウバエ属（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）細胞株、またはヒトスジシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ）由来細胞株などの蚊細胞株が用いられてもよい。異種タンパク質を発現させるための昆虫細胞の使用については、ベクター、例えば昆虫細胞適合性ベクターなどの核酸をかかる細胞に導入する方法、および培養下のかかる細胞を維持する方法と同様に、十分に実証されている。例えば、「分子生物学の方法（Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ）」、リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄ）編、ヒューマナ・プレス（Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ）、ニュージャージー州、１９９５年；オライリー（Ｏ’Ｒｅｉｌｌｙ）ら著、「バキュロウイルス発現ベクター、実験マニュアル（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ  Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  Ｖｅｃｔｏｒｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ）」、オックスフォード大学出版局（Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖ．Ｐｒｅｓｓ）、１９９４年；サムルスキ（Ｓａｍｕｌｓｋｉ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒ．）、第６３巻、ｐ．３８２２〜８、１９８９年；カジガヤ（Ｋａｊｉｇａｙａ）ら著、米国科学アカデミー紀要（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ’ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ）、第８８巻、ｐ．４６４６〜５０、１９９１年；ラフィング（Ｒｕｆｆｉｎｇ）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ．Ｖｉｒ．）、第６６巻、ｐ．６９２２〜３０、１９９２年；キムバウアー（Ｋｉｍｂａｕｅｒ）ら著、バイロロジー（Ｖｉｒ．）、第２１９巻、ｐ．３７〜４４、１９９６年；チャオ（Ｚｈａｏ）ら著、バイロロジー（Ｖｉｒ．）、第２７２巻、ｐ．３８２〜９３、２０００年；およびサムルスキ（Ｓａｍｕｌｓｋｉ）ら著、米国特許第６，２０４，０５９号明細書を参照されたく、これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される。
【０３２７】
ウイルス複製細胞は、原核生物（例えば細菌）細胞、ならびに昆虫細胞、酵母細胞および哺乳類細胞を含めた真核細胞を含め、任意の生物学的有機体から選択されてもよい。ウイルス複製細胞には、Ａ５４９、ＷＥＨ１、３Ｔ３、１０Ｔ１／２、ＢＨＫ、ＭＤＣＫ、ＣＯＳ  １、ＣＯＳ  ７、ＢＳＣ  １、ＢＳＣ  ４０、ＢＭＴ  １０、ＶＥＲＯ、Ｗ１３８、ＨｅＬａ、ＨＥＫ２９３、Ｓａｏｓ、Ｃ２Ｃ１２、Ｌ細胞、ＨＴ１０８０、ＨｅｐＧ２ならびに哺乳類に由来する初代線維芽細胞、ヘパトサイトおよび筋芽細胞など、哺乳類細胞が含まれ得る。ウイルス複製細胞には、限定はされないが、ヒト、サル、マウス、ラット、ウサギ、およびハムスターを含めた哺乳類種、または限定はされないが、線維芽細胞、ヘパトサイト、腫瘍細胞、細胞株形質転換細胞等を含めた細胞型に由来する細胞が含まれる。
【０３２８】
哺乳類細部の（小規模）作製
本明細書に開示されるウイルス作製は、ペイロードをコードするポリヌクレオチド配列を含むペイロード、例えば組換えウイルスコンストラクトを送達するため標的細胞に接触するＡＡＶ粒子の作製プロセスおよび方法を記載する。
【０３２９】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は、哺乳類細胞を含むウイルス複製細胞で作製されてもよい。
組換えＡＡＶ粒子の作製に一般的に使用されるウイルス複製細胞としては、限定はされないが、米国特許第６，１５６，３０３号明細書、同第５，３８７，４８４号明細書、同第５，７４１，６８３号明細書、同第５，６９１，１７６号明細書、および同第５，６８８，６７６号明細書；米国特許出願公開第２００２／００８１７２１号明細書、および国際公開第００／４７７５７号パンフレット、同第００／２４９１６号パンフレット、および同第９６／１７９４７号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載されるとおりの、２９３細胞、ＣＯＳ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＫＢ細胞、および他の哺乳類細胞株が挙げられる。
【０３３０】
一実施形態において、ＡＡＶ粒子は哺乳類細胞で作製され、ここでは３つ全てのＶＰタンパク質が１：１：１０（ＶＰ１：ＶＰ２：ＶＰ３）に近い化学量論で発現する。この制御された発現レベルを実現する調節機構には、差次的スプライシングによって作製される、一方がＶＰ１用、および他方がＶＰ２およびＶＰ３用の２つのｍＲＮＡの作製が含まれる。
【０３３１】
別の実施形態において、ＡＡＶ粒子はトリプルトランスフェクション方法を用いて哺乳類細胞で作製され、ここではペイロードコンストラクトとパルボウイルスＲｅｐおよびパルボウイルスＣａｐとヘルパーコンストラクトとが３つの異なるコンストラクト内に含まれる。ＡＡＶ粒子作製の３成分のトリプルトランスフェクション方法を利用して、形質導入効率、標的組織（向性）評価、および安定性を含めたアッセイ用の小規模ロットのウイルスを作製し得る。
【０３３２】
バキュロウイルス
本明細書に開示される粒子作製は、ペイロードをコードするポリヌクレオチド配列を含むペイロードコンストラクトを送達するため標的細胞に接触するＡＡＶ粒子の作製プロセスおよび方法を記載する。
【０３３３】
簡潔に言えば、ウイルスコンストラクトベクターおよびＡＡＶペイロードコンストラクトベクターが、各々、公知の、当業者によって実施されている標準的な分子生物学的技術により、トランスポゾンドナー／アクセプターシステムによってバキュロウイルスプラスミドとしても知られるバクミドに取り込まれる。別個のウイルス複製細胞集団のトランスフェクションにより２つのバキュロウイルスが生じ、一方はウイルスコンストラクト発現ベクターを含み、もう一方はＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターを含む。これらの２つのバキュロウイルスを使用して単一のウイルス複製細胞集団を感染させて、ＡＡＶ粒子を作製し得る。
【０３３４】
限定はされないが、スポドプテラ・フルギペルダ（Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａ  ｆｒｕｇｉｐｅｒｄａ）（Ｓｆ９）細胞を含め、昆虫細胞においてウイルス粒子を作製するためのバキュロウイルス発現ベクターは、高力価のウイルス粒子産物を提供する。ウイルスコンストラクト発現ベクターおよびＡＡＶペイロードコンストラクト発現ベクターをコードする組換えバキュロウイルスは、ウイルス複製細胞の増殖性感染を惹起する。初感染から放出された感染性バキュロウイルス粒子は培養物中の更なる細胞に二次感染し、初期感染多重度の関数である所定回数の感染サイクルで細胞培養物集団全体に指数関数的に感染する。ウラベ・Ｍ（Ｕｒａｂｅ，Ｍ．）ら著、ジャーナル・オブ・バイロロジー（Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．）、２００６年２月、第８０巻、第４号、ｐ．１８７４〜８５（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）を参照されたい。
【０３３５】
昆虫細胞系におけるバキュロウイルスによるＡＡＶ粒子の作製は、公知のバキュロウイルスの遺伝的および物理的不安定性に対処し得る。一実施形態において、この作製システムは、タイターレス感染細胞保存およびスケールアップシステムを利用することにより複数継代をかけてバキュロウイルスの不安定性に対処する。ウイルス作製細胞の小規模シード培養物に、ウイルス粒子の構造、非構造成分をコードするウイルス発現コンストラクトがトランスフェクトされる。バキュロウイルス感染ウイルス作製細胞がアリコートに回収され、それが液体窒素で凍結保存され得る；アリコートは、大規模ウイルス作製細胞培養物の感染のための生存能力および感染力を維持している。ワシルコ・ＤＪ（Ｗａｓｉｌｋｏ  ＤＪ）ら著、プロテイン・エクスプレッション・アンド・ピュリフィケーション（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｘｐｒ  Ｐｕｒｉｆ．）、２００９年６月、第６５巻、第２号、ｐ．１２２〜３２、この内容は本明細書において全体として参照により援用される。
【０３３６】
遺伝的に安定したバキュロウイルスを使用して、無脊椎動物細胞においてＡＡＶ粒子を作製するための成分のうちの１つ以上の供給源を作製してもよい。一実施形態において、欠損バキュロウイルス発現ベクターが昆虫細胞のエピソームに保持されてもよい。かかる実施形態においてバクミドベクターは、限定はされないが、プロモータ、エンハンサー、および／または細胞周期調節性複製エレメントを含め、複製制御エレメントで操作される。
【０３３７】
一実施形態において、バキュロウイルスは、キチナーゼ／カテプシン遺伝子座への組換えのため（非）選択可能マーカで操作されてもよい。組織培養におけるバキュロウイルスの増殖にｃｈｉａ／ｖ−ｃａｔｈ遺伝子座は非必須であり、Ｖ−ｃａｔｈ（ＥＣ  ３．４．２２．５０）は、Ａｒｇ−Ａｒｇジペプチド含有基質上で最も活性が高いシステインエンドプロテアーゼである。Ａｒｇ−Ａｒｇジペプチドはデンソウイルスおよびパルボウイルスカプシド構造タンパク質に存在するが、ディペンドウイルスＶＰ１にはまれにしか見られない。
【０３３８】
一実施形態において、バキュロウイルス感染に許容的な安定ウイルス複製細胞は、限定はされないが、ＡＡＶゲノム全体、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子、Ｒｅｐ遺伝子、Ｃａｐ遺伝子、別個の転写カセットとしての各Ｒｅｐタンパク質、別個の転写カセットとしての各ＶＰタンパク質、ＡＡＰ（アセンブリ活性化タンパク質）、または天然もしくは非天然プロモータを有するバキュロウイルスヘルパー遺伝子のうちの少なくとも１つを含め、ＡＡＶ複製およびウイルス粒子産生に必要なエレメントのいずれかの少なくとも１つの安定に組み込まれたコピーで操作される。
【０３３９】
本明細書に記載されるＡＡＶ粒子は、トリプルトランスフェクション、またはバキュロウイルス媒介性ウイルス産生、または当該技術分野で公知の任意の他の方法によって作製してもよい。当該技術分野で公知の任意の好適な許容細胞またはパッケージング細胞を用いて、ベクターを作製してもよい。哺乳類細胞が好ましいことが多い。複製欠損ヘルパーウイルスから欠失されている機能を提供するトランス補完パッケージング細胞株、例えば２９３細胞または他のＥ１ａトランス補完細胞も好ましい。
【０３４０】
遺伝子カセットは、パルボウイルス（例えば、ＡＡＶ）ｃａｐおよびｒｅｐ遺伝子の一部またはすべてを含んでもよい。しかしながら、好ましくは、ｃａｐおよびｒｅｐ機能の一部またはすべては、カプシドおよび／またはＲｅｐタンパク質をコードするパッケージングベクターを細胞に導入することによって、トランスで提供される。最も好ましくは、遺伝子カセットは、カプシドまたはＲｅｐタンパク質をコードしない。あるいは、安定して形質転換されてｃａｐおよび／またはｒｅｐ遺伝子を発現するパッケージング細胞株が使用される。
【０３４１】
組換えＡＡＶウイルス粒子は、ある場合には、米国特許出願公開第２０１６００３２２５４号明細書に記載される通りの手順に従って培養上清から作製および精製されており、この内容は参照により援用される。また、作製には、２９３Ｔ細胞、ｓｆ９昆虫細胞、トリプルトランスフェクションまたは任意の好適な作製方法を使用するものを含む、当該技術分野で公知の方法が関与してもよい。
【０３４２】
ある場合には、２９３Ｔ細胞（接着／懸濁）に、ＡＡＶ、すなわちＡＡＶ２  ｒｅｐ、アデノウイルスヘルパーコンストラクトおよびＩＴＲ隣接トランス遺伝子カセットの作製に必要なプラスミドを、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いてトランスフェクトする。また、ＡＡＶ２  ｒｅｐプラスミドは、研究されている特定のウイルスのｃａｐ配列を含有する。血清有り／無しのＤＭＥＭ／Ｆ１７で生じるトランスフェクションの２４時間後（懸濁の場合は培地を変更しない）、培地を、血清有りまたは無しの新鮮な培地と取り替える。トランスフェクションの３（三）日後、２９３接着細胞の培養培地から試料を得る。続いて、細胞を擦り取るか、または懸濁細胞をペレットにし、容器へと移す。接着細胞の場合は、遠心分離後に細胞ペレットを除去し、擦り取った後の上清から第２の試料を得る。次に、連続３回の凍結融解サイクル（−８０℃〜３７℃）または界面活性剤ｔｒｉｔｏｎの添加によって、細胞溶解を達成する。遠心分離または深層ろ過によって細胞残屑を除去し、培地から試料３を得る。ＤＮＡ  ｑＰＣＲによるＤＮａｓｅ耐性ゲノム滴定（ＤＮａｓｅ  ｒｅｓｉｓｔａｎｔ  ｇｅｎｏｍｅ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ）によって、試料をＡＡＶ粒子について定量化する。かかるトランスフェクションの総産生収率は、試料３の粒子濃度と等しい。
【０３４３】
ＡＡＶ粒子力価を、ゲノムコピー数（１ミリリットル当たりのゲノム粒子）により測定する。ゲノム粒子濃度は、以前に報告されている通りの、ベクターＤＮＡのＤＮＡ  ｑＰＣＲに基づく（クラークら（Ｃｌａｒｋ  ｅｔ  ａｌ．）著、（１９９９年）、ヒューマン・ジーン・セラピー（Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．）、第１０巻：ｐ．１０３１〜１０３９；フェルトワイクら（Ｖｅｌｄｗｉｊｋ  ｅｔ  ａｌ．）著、（２００２年）、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第６巻：ｐ．２７２〜２７８）。
【０３４４】
大規模作製
一部の実施形態において、ＡＡＶ粒子作製は、作製規模を増加させるように改良されてもよい。本開示に係る大規模ウイルス作製方法には、米国特許第５，７５６，２８３号明細書、同第６，２５８，５９５号明細書、同第６，２６１，５５１号明細書、同第６，２７０，９９６号明細書、同第６，２８１，０１０号明細書、同第６，３６５，３９４号明細書、同第６，４７５，７６９号明細書、同第６，４８２，６３４号明細書、同第６，４８５，９６６号明細書、同第６，９４３，０１９号明細書、同第６，９５３，６９０号明細書、同第７，０２２，５１９号明細書、同第７，２３８，５２６号明細書、同第７，２９１，４９８号明細書および同第７，４９１，５０８号明細書または国際公開第１９９６０３９５３０号パンフレット、同第１９９８０１００８８号パンフレット、同第１９９９０１４３５４号パンフレット、同第１９９９０１５６８５号パンフレット、同第１９９９０４７６９１号パンフレット、同第２００００５５３４２号パンフレット、同第２００００７５３５３号パンフレットおよび同第２００１０２３５９７号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるもののいずれかが含まれてもよい。ウイルス粒子作製規模を増加させる方法は、典型的には、ウイルス複製細胞の数を増加させることを含む。一部の実施形態において、ウイルス複製細胞は接着細胞を含む。接着ウイルス複製細胞によるウイルス粒子作製規模の増加には、より大きい細胞培養表面が必要である。ある場合には、大規模作製方法は、細胞培養表面を増加させるためのローラボトルの使用を含む。表面積が増加した他の細胞培養基材が当該技術分野において公知である。表面積が増加した更なる接着細胞培養製品の例としては、限定はされないが、セルスタック（登録商標）（ＣＥＬＬＳＴＡＣＫ（登録商標））、セルキューブ（登録商標）（ＣＥＬＬＣＵＢＥ（登録商標））（コーニング社（Ｃｏｒｎｉｎｇ  Ｃｏｒｐ．）、ニューヨーク州コーニング（Ｃｏｒｎｉｎｇ））およびヌンク（商標）（ＮＵＮＣ（商標））セル・ファクトリー（商標）（ＣＥＬＬ  ＦＡＣＴＯＲＹ（商標））（サーモ・サイエンティフィック（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、マサチューセッツ州ウォルサム（Ｗａｌｔｈａｍ））が挙げられる。ある場合には、大規模接着細胞表面は約１，０００ｃｍ２〜約１００，０００ｃｍ２を含み得る。ある場合には、大規模接着細胞培養物は、約１０７〜約１０９細胞、約１０８〜約１０１０細胞、約１０９〜約１０１２細胞または少なくとも１０１２細胞を含み得る。ある場合には、大規模接着培養物は、約１０９〜約１０１２、約１０１０〜約１０１３、約１０１１〜約１０１４、約１０１２〜約１０１５または少なくとも１０１５ウイルス粒子を作製し得る。
【０３４５】
一部の実施形態において、本開示の大規模ウイルス作製方法は浮遊細胞培養の使用を含み得る。浮遊細胞培養は細胞数の大幅な増加を可能にする。典型的には、約１０〜５０ｃｍ２の表面積で成長させることのできる接着細胞数を懸濁液中では約１ｃｍ３の体積で成長させることができる。
【０３４６】
大規模培養フォーマットでの複製細胞のトランスフェクションは、当該技術分野において公知の任意の方法により行われてもよい。大規模接着細胞培養には、トランスフェクション方法として、限定はされないが、無機化合物（例えばリン酸カルシウム）、有機化合物［例えばポリエチレンイミン（ＰＥＩ）］の使用または非化学的方法（例えば電気穿孔）の使用を挙げることができる。懸濁液中で成長させる細胞では、トランスフェクション方法として、限定はされないが、リン酸カルシウムの使用およびＰＥＩの使用を挙げることができる。ある場合には、大規模浮遊培養物のトランスフェクションは、Ｆｅｎｇ．Ｌ．ら２００８年、バイオテクノロジー・アンド・アプライド・バイオケミストリー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．）、第５０巻、ｐ．１２１〜３２（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される「トランスフェクション手順（Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）」と題される節に従い行われてもよい。かかる実施形態によれば、トランスフェクトしようとするプラスミドの導入用にＰＥＩ−ＤＮＡ複合体が形成され得る。ある場合には、ＰＥＩ−ＤＮＡ複合体をトランスフェクトされる細胞に、トランスフェクション前に「ショック」が与えられてもよい。これは、細胞培養物温度を約１時間にわたって４℃に下げることを含む。ある場合には、約１０分〜約５時間の時間にわたって細胞培養物にショックが与えられてもよい。ある場合には、約０℃〜約２０℃の温度で細胞培養物にショックが与えられてもよい。
【０３４７】
ある場合には、トランスフェクションは、１つ以上のＡＡＶペイロードコンストラクトからの核酸の発現を低下させるため１つ以上のＲＮＡエフェクター分子発現ベクターを含み得る。かかる方法は、ペイロードコンストラクトの発現に浪費される細胞リソースを減少させることによりウイルス粒子の産生を増強し得る。ある場合には、かかる方法は、米国特許出願公開第２０１４／００９９６６６号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるものに従い行われてもよい。
【０３４８】
バイオリアクター
一部の実施形態において、大規模ウイルス作製には細胞培養バイオリアクターが用いられ得る。ある場合には、バイオリアクターは撹拌槽型リアクターを含む。かかるリアクターは、概して、典型的には円筒形状の、撹拌機（例えばインペラ）を備えたベッセルを含む。一部の実施形態において、かかるバイオリアクターベッセルは、ベッセル温度を制御し、および／または周囲温度の変化による影響を最小限に抑えるため、ウォータジャケット内に置かれ得る。バイオリアクターベッセル容積は、サイズが約５００ｍｌ〜約２Ｌ、約１Ｌ〜約５Ｌ、約２．５Ｌ〜約２０Ｌ、約１０Ｌ〜約５０Ｌ、約２５Ｌ〜約１００Ｌ、約７５Ｌ〜約５００Ｌ、約２５０Ｌ〜約２，０００Ｌ、約１，０００Ｌ〜約１０，０００Ｌ、約５，０００Ｌ〜約５０，０００Ｌまたは少なくとも５０，０００Ｌの範囲であり得る。ベッセルの底は丸底または平底であり得る。ある場合には、動物細胞培養物が丸底ベッセルのバイオリアクターに維持され得る。
【０３４９】
ある場合には、バイオリアクターベッセルはサーモサーキュレータを用いて温められてもよい。サーモサーキュレータは熱水をウォータジャケットの周りに圧送する。ある場合には、熱水は、バイオリアクターベッセル内に存在する管（例えばコイル管）を通じて圧送されてもよい。ある場合には、限定はされないが、培養培地の真上にある空気層を含め、バイオリアクターの周りに温風が循環してもよい。加えて、細胞生存が最適となるようにｐＨおよびＣＯ２レベルが維持され得る。
【０３５０】
ある場合には、バイオリアクターは中空糸リアクターを含み得る。中空糸バイオリアクターは、足場依存性および足場非依存性の両方の細胞の培養を支持し得る。更なるバイオリアクターとしては、限定はされないが、充填床または固定床バイオリアクターを挙げることができる。かかるバイオリアクターは、接着細胞の付着用ガラスビーズを有するベッセルを含み得る。更なる充填床リアクターはセラミックビーズを含み得る。
【０３５１】
ある場合には、ウイルス粒子は使い捨てバイオリアクターを用いて作製される。一部の実施形態において、かかるバイオリアクターとしては、ウェーブ（商標）（ＷＡＶＥ（商標））使い捨てバイオリアクターを挙げることができる。
【０３５２】
一部の実施形態において、動物細胞バイオリアクター培養物におけるＡＡＶ粒子作製は、米国特許第５，０６４７６４号明細書、同第６，１９４，１９１号明細書、同第６，５６６，１１８号明細書、同第８，１３７，９４８号明細書または米国特許出願公開第２０１１／０２２９９７１号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示される方法により行われてもよい。
【０３５３】
細胞溶解
本発明の細胞は、限定はされないがウイルス作製細胞を含め、当該技術分野において公知の任意の方法により細胞溶解に供されてもよい。細胞溶解は、本発明の任意の細胞内に存在する１つ以上の薬剤（例えばウイルス粒子）を入手するために行われ得る。一部の実施形態において、細胞溶解は、米国特許第７，３２６，５５５号明細書、同第７，５７９，１８１号明細書、同第７，０４８，９２０号明細書、同第６，４１０，３００号明細書、同第６，４３６，３９４号明細書、同第７，７３２，１２９号明細書、同第７，５１０，８７５号明細書、同第７，４４５，９３０号明細書、同第６，７２６，９０７号明細書、同第６，１９４，１９１号明細書、同第７，１２５，７０６号明細書、同第６，９９５，００６号明細書、同第６，６７６，９３５号明細書、同第７，９６８，３３３号明細書、同第５，７５６，２８３号明細書、同第６，２５８，５９５号明細書、同第６，２６１，５５１号明細書、同第６，２７０，９９６号明細書、同第６，２８１，０１０号明細書、同第６，３６５，３９４号明細書、同第６，４７５，７６９号明細書、同第６，４８２，６３４号明細書、同第６，４８５，９６６号明細書、同第６，９４３，０１９号明細書、同第６，９５３，６９０号明細書、同第７，０２２，５１９号明細書、同第７，２３８，５２６号明細書、同第７，２９１，４９８号明細書および同第７，４９１，５０８号明細書または国際公開第１９９６０３９５３０号パンフレット、同第１９９８０１００８８号パンフレット、同第１９９９０１４３５４号パンフレット、同第１９９９０１５６８５号パンフレット、同第１９９９０４７６９１号パンフレット、同第２００００５５３４２号パンフレット、同第２００００７５３５３号パンフレットおよび同第２００１０２３５９７号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に挙げられる方法のいずれかにより行われてもよい。細胞溶解方法は化学的または機械的であってもよい。化学的細胞溶解は、典型的には、１つ以上の細胞を１つ以上の溶解剤と接触させることを含む。機械的溶解は、典型的には、１つ以上の細胞を１つ以上の溶解条件および／または１つ以上の溶解力に供することを含む。
【０３５４】
一部の実施形態では、化学的溶解を用いて細胞が溶解されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「溶解剤」は、細胞の破壊を助け得る任意の薬剤を指す。ある場合には、溶解剤は溶液中に導入され、溶解溶液または溶解緩衝液と呼ばれる。本明細書で使用されるとき、用語「溶解溶液」は、１つ以上の溶解剤を含む溶液（典型的には水性）を指す。溶解剤に加えて、溶解溶液は、１つ以上の緩衝剤、可溶化剤、界面活性剤、保存剤、凍結保護物質、酵素、酵素阻害薬および／またはキレータを含み得る。溶解緩衝液は、１つ以上の緩衝剤を含む溶解溶液である。溶解溶液の更なる成分としては、１つ以上の可溶化剤を挙げることができる。本明細書で使用されるとき、用語「可溶化剤」は、溶液の１つ以上の成分の溶解度および／または溶液が適用される１つ以上の実体の溶解度を増強する化合物を指す。ある場合には、可溶化剤はタンパク質溶解度を増強する。ある場合には、可溶化剤は、タンパク質のコンフォメーションおよび／または活性を維持しながらもタンパク質溶解度を増強するその能力に基づき選択される。
【０３５５】
例示的溶解剤としては、米国特許第８，６８５，７３４号明細書、同第７，９０１，９２１号明細書、同第７，７３２，１２９号明細書、同第７，２２３，５８５号明細書、同第７，１２５，７０６号明細書、同第８，２３６，４９５号明細書、同第８，１１０，３５１号明細書、同第７，４１９，９５６号明細書、同第７，３００，７９７号明細書、同第６，６９９，７０６号明細書および同第６，１４３，５６７号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載されるもののいずれかを挙げることができる。ある場合には、溶解剤は、溶解塩、両性薬剤、カチオン性薬剤、イオン性界面活性剤および非イオン性界面活性剤から選択され得る。溶解塩としては、限定はされないが、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）および塩化カリウム（ＫＣｌ）を挙げることができる。更なる溶解塩としては、米国特許第８，６１４，１０１号明細書、同第７，３２６，５５５号明細書、同第７，５７９，１８１号明細書、同第７，０４８，９２０号明細書、同第６，４１０，３００号明細書、同第６，４３６，３９４号明細書、同第７，７３２，１２９号明細書、同第７，５１０，８７５号明細書、同第７，４４５，９３０号明細書、同第６，７２６，９０７号明細書、同第６，１９４，１９１号明細書、同第７，１２５，７０６号明細書、同第６，９９５，００６号明細書、同第６，６７６，９３５号明細書および同第７，９６８，３３３号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載されるもののいずれかを挙げることができる。塩の濃度は、細胞膜を破裂させる有効濃度が得られるように増加または減少させてもよい。両性薬剤とは、本明細書において参照されるとき、酸または塩基として反応する能力を有する化合物である。両性薬剤としては、限定はされないが、リゾホスファチジルコリン、３−（（３−コラミドプロピル）ジメチルアンモニウム）−１−プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、ツヴィッタージェント（登録商標）（ＺＷＩＴＴＥＲＧＥＮＴ（登録商標））などを挙げることができる。カチオン性薬剤としては、限定はされないが、臭化セチルトリメチルアンモニウム（Ｃ（１６）ＴＡＢ）および塩化ベンザルコニウムを挙げることができる。界面活性剤を含む溶解剤には、イオン性界面活性剤または非イオン性界面活性剤が含まれ得る。界面活性剤は、限定はされないが、細胞膜、細胞壁、脂質、炭水化物、リポタンパク質および糖タンパク質を含めた細胞構造を分解するまたは溶解させる働きをし得る。例示的イオン性界面活性剤としては、米国特許第７，６２５，５７０号明細書および同第６，５９３，１２３号明細書または米国特許出願公開第２０１４／００８７３６１号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるもののいずれかが挙げられる。幾つかのイオン性界面活性剤としては、限定はされないが、ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、コール酸塩およびデオキシコール酸塩を挙げることができる。ある場合には、イオン性界面活性剤は溶解溶液中に可溶化剤として含まれてもよい。非イオン性界面活性剤としては、限定はされないが、オクチルグルコシド、ジギトニン、ルブロール、Ｃ１２Ｅ８、ツイーン（登録商標）−２０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−２０）、ツイーン（登録商標）−８０（ＴＷＥＥＮ（登録商標）−８０）、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）およびノニデットＰ−４０（Ｎｏｎｉｏｄｅｔ  Ｐ−４０）を挙げることができる。非イオン性界面活性剤は、典型的には弱溶解剤であるが、細胞性および／またはウイルス性タンパク質を可溶化するための可溶化剤として含まれてもよい。更なる溶解剤としては、酵素および尿素を挙げることができる。ある場合には、細胞溶解およびタンパク質溶解度のうちの１つ以上を増強するため、１つ以上の溶解剤が溶解溶液中に組み合わされてもよい。ある場合には、細胞膜破壊によって引き起こされ得るタンパク質分解を防ぐため、酵素阻害薬が溶解溶液中に含まれてもよい。
【０３５６】
一部の実施形態において、機械的細胞溶解が行われる。機械的細胞溶解方法としては、１つ以上の溶解条件および／または１つ以上の溶解力の使用を挙げることができる。本明細書で使用されるとき、用語「溶解条件」とは、細胞破壊を促進する状態または状況を指す。溶解条件には、特定の温度、圧力、浸透圧純度、塩分などが含まれ得る。ある場合には、溶解条件には温度の増加または低下が含まれる。一部の実施形態によれば、溶解条件には、細胞破壊を促進する温度の変化が含まれる。かかる実施形態により行われる細胞溶解には、凍結融解溶解が含まれ得る。本明細書で使用されるとき、用語「凍結融解溶解」とは、細胞溶液が１回以上の凍結融解サイクルに供される細胞溶解を指す。凍結融解溶解方法によれば、溶液中の細胞が凍結されて、氷の結晶の形成および拡大によって引き起こされる細胞膜の機械的破壊が誘導される。凍結融解溶解方法により用いられる細胞溶液としては、１つ以上の溶解剤、可溶化剤、緩衝剤、凍結保護物質、界面活性剤、保存剤、酵素、酵素阻害薬および／またはキレータを更に挙げることができる。凍結に供した細胞溶液を解凍すると、かかる成分が所望の細胞産物の回収を増強し得る。ある場合には、凍結融解溶解を受ける細胞溶液中に１つ以上の凍結保護物質が含まれる。本明細書で使用されるとき、用語「凍結保護物質」は、１つ以上の物質を凍結に起因する損傷から保護するために使用される薬剤を指す。凍結保護物質としては、米国特許出願公開第２０１３／０３２３３０２号明細書または米国特許第６，５０３，８８８号明細書、同第６，１８０，６１３号明細書、同第７，８８８，０９６号明細書、同第７，０９１，０３０号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるもののいずれかを挙げることができる。ある場合には、凍結保護物質としては、限定はされないが、ジメチルスルホキシド、１，２−プロパンジオール、２，３−ブタンジオール、ホルムアミド、グリセロール、エチレングリコール、１，３−プロパンジオールおよびｎ−ジメチルホルムアミド、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシエチルデンプン、アガロース、デキストラン類、イノシトール、グルコース、ヒドロキシエチルデンプン、ラクトース、ソルビトール、メチルグルコース、スクロースおよび尿素を挙げることができる。一部の実施形態において、凍結融解溶解は、米国特許第７，７０４，７２１号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法のいずれかにより行われてもよい。
【０３５７】
本明細書で使用されるとき、用語「溶解力」は、細胞を破壊するために用いられる物理的活性を指す。溶解力としては、限定はされないが、機械的力、音波的力、重力、光学的力、電気的力などを挙げることができる。機械的力によって行われる細胞溶解は、本明細書では「機械的溶解」と称される。機械的溶解により用いられ得る機械的力としては、高剪断流体力を挙げることができる。かかる機械的溶解方法によれば、マイクロフルイダイザーが使用されてもよい。マイクロフルイダイザーは、典型的には、細胞溶液が適用され得る入力リザーバを含む。次に細胞溶液がポンプ（例えば高圧ポンプ）によって高速および／または高圧で相互作用チャンバに圧送されることにより剪断流体力が生じ得る。次に得られたライセートが１つ以上の出力リザーバに収集され得る。ポンプ速度および／または圧力を調整することにより、細胞溶解を調節し、および産物（例えばウイルス粒子）の回収を増強し得る。他の機械的溶解方法としては、スクレイピングすることによる細胞の物理的破壊を挙げることができる。
【０３５８】
細胞溶解方法は、溶解させる細胞の細胞培養フォーマットに基づき選択されてもよい。例えば、接着細胞培養物では、幾つかの化学的および機械的溶解方法が用いられてもよい。かかる機械的溶解方法としては、凍結融解溶解またはスクレイピングを挙げることができる。別の例では、トリトンＸ−１００（Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ−１００）などの界面活性剤を含む溶解溶液とのインキュベーションによって接着細胞培養物の化学的溶解が行われてもよい。ある場合には、遊離ＤＮＡによって生じるライセートの粘度を低下させるため、接着細胞培養物から生成された細胞ライセートがもう一つのヌクレアーゼで処理されてもよい。
【０３５９】
一実施形態において、効率的で規模を調整可能なＡＡＶ粒子作製に、溶解のないＡＡＶ粒子の回収方法が用いられてもよい。非限定的な例では、ＡＡＶ粒子は、米国特許出願公開第２００９０２７５１０７号明細書（この内容は全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり、ヘパリン結合部位を欠くＡＡＶ粒子を培養し、それによりＡＡＶ粒子を細胞培養物の上清中に移らせて、培養物から上清を収集し；および上清からＡＡＶ粒子を単離することにより作製されてもよい。
【０３６０】
清澄化
ウイルス粒子を含む細胞ライセートは清澄化に供され得る。清澄化とは、細胞ライセートからのウイルス粒子の精製において行われる最初の工程を指す。清澄化は、より大きい不溶性のデブリを除去することにより更なる精製にかけるためのライセートを調製する働きをする。清澄化工程としては、限定はされないが、遠心およびろ過を挙げることができる。清澄化において、遠心は、より大きいデブリのみを除去するため低速で行われてもよい。同様に、ろ過は、より大きいデブリのみが除去されるように、より大きい孔径のフィルタを使用して行われてもよい。ある場合には、清澄化の間にタンジェンシャルフローろ過が用いられてもよい。ウイルス清澄化の目的には、細胞ライセートのハイスループット処理および最終的なウイルス回収率の最適化が含まれる。清澄化工程を含める利点には、更に大容積のライセートを処理するため規模を調整可能であることが含まれる。一部の実施形態において、清澄化は、米国特許第８，５２４，４４６号明細書、同第５，７５６，２８３号明細書、同第６，２５８，５９５号明細書、同第６，２６１，５５１号明細書、同第６，２７０，９９６号明細書、同第６，２８１，０１０号明細書、同第６，３６５，３９４号明細書、同第６，４７５，７６９号明細書、同第６，４８２，６３４号明細書、同第６，４８５，９６６号明細書、同第６，９４３，０１９号明細書、同第６，９５３，６９０号明細書、同第７，０２２，５１９号明細書、同第７，２３８，５２６号明細書、同第７，２９１，４９８号明細書、同第７，４９１，５０８号明細書、米国特許出願公開第２０１３／００４５１８６号明細書、同第２０１１／０２６３０２７号明細書、同第２０１１／０１５１４３４号明細書、同第２００３／０１３８７７２号明細書、および国際公開第２００２０１２４５５号パンフレット、同第１９９６０３９５３０号パンフレット、同第１９９８０１００８８号パンフレット、同第１９９９０１４３５４号パンフレット、同第１９９９０１５６８５号パンフレット、同第１９９９０４７６９１号パンフレット、同第２００００５５３４２号パンフレット、同第２００００７５３５３号パンフレットおよび同第２００１０２３５９７号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に提示される方法のいずれかにより行われてもよい。
【０３６１】
ろ過による細胞ライセート清澄化方法は当該技術分野において十分に理解されており、限定はされないが、受動ろ過およびフローろ過を含め、種々の利用可能な方法により行われてもよい。使用されるフィルタは種々の材料および孔径を含み得る。例えば、細胞ライセートフィルタは、約１μＭ〜約５μＭ、約０．５μＭ〜約２μＭ、約０．１μＭ〜約１μＭ、約０．０５μＭ〜約０．０５μＭおよび約０．００１μＭ〜約０．１μＭの孔径を含み得る。細胞ライセートフィルタの例示的孔径としては、限定はされないが、２．０、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．９５、０．９、０．８５、０．８、０．７５、０．７、０．６５、０．６、０．５５、０．５、０．４５、０．４、０．３５、０．３、０．２５、０．２、０．１５、０．１、０．０５、０．２２、０．２１、０．２０、０．１９、０．１８、０．１７、０．１６、０．１５、０．１４、０．１３、０．１２、０．１１、０．１、０．０９、０．０８、０．０７、０．０６、０．０５、０．０４、０．０３、０．０２、０．０１、０．０２、０．０１９、０．０１８、０．０１７、０．０１６、０．０１５、０．０１４、０．０１３、０．０１２、０．０１１、０．０１、０．００９、０．００８、０．００７、０．００６、０．００５、０．００４、０．００３、０．００２、０．００１および０．００１μＭを挙げることができる。一実施形態において、清澄化は、大きいデブリを除去するための２．０μＭ孔径のフィルタによるろ過と、続くインタクトな細胞を除去するための０．４５μＭ孔径のフィルタへの通過を含み得る。
【０３６２】
フィルタ材料は種々の材料を含み得る。かかる材料としては、限定はされないが、ポリマー材料および金属材料（例えば焼結金属および有孔アルミニウム）を挙げることができる。例示的材料としては、限定はされないが、ナイロン、セルロース材料（例えば酢酸セルロース）、ポリフッ化ビニリデン（ＰＶＤＦ）、ポリエーテルスルホン、ポリアミド、ポリスルホン、ポリプロピレン、およびポリエチレンテレフタレートを挙げることができる。ある場合には、細胞ライセートの清澄化に有用なフィルタとしては、限定はされないが、ウルチプリーツ・プロフィール（商標）（ＵＬＴＩＰＬＥＡＴ  ＰＲＯＦＩＬＥ（商標））フィルタ（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニューヨーク州ポートワシントン）、スポー（商標）（ＳＵＰＯＲ（商標））メンブレンフィルタ（ポール・コーポレーション（Ｐａｌｌ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）、ニューヨーク州ポートワシントン）を挙げることができる。
【０３６３】
ある場合には、ろ過速度および／または有効性を増加させるためフローろ過が行われてもよい。ある場合には、フローろ過は真空ろ過を含み得る。かかる方法によれば、フィルタのうちろ過される細胞ライセートと反対側に真空が作り出される。ある場合には、細胞ライセートを遠心力によってフィルタに通過させてもよい。ある場合には、ポンプを使用して細胞ライセートが清澄化フィルタに押し通される。１つ以上のフィルタを通る細胞ライセートのフロー速度は、チャネルサイズおよび／または流圧の一方を調整することにより調節し得る。
【０３６４】
一部の実施形態によれば、細胞ライセートは遠心によって清澄化されてもよい。遠心を用いると、ライセート中の不溶性粒子をペレット化し得る。清澄化の間、遠心強度［標準重力の倍数を表す重力単位（ｇ）で表される］は続く精製工程よりも低くてよい。ある場合には、遠心は細胞ライセートに対して約２００ｇ〜約８００ｇ、約５００ｇ〜約１５００ｇ、約１０００ｇ〜約５０００ｇ、約１２００ｇ〜約１００００ｇまたは約８０００ｇ〜約１５０００ｇで行われてもよい。一部の実施形態において、細胞ライセートの遠心は８０００ｇで１５分間行われる。ある場合には、細胞ライセート中の粒子状物質を沈降速度によって分配するため密度勾配遠心法が行われてもよい。本開示の方法により用いられる勾配としては、限定はされないが、塩化セシウム勾配およびイオジキサノール段階勾配を挙げることができる。
【０３６５】
精製：クロマトグラフィー
ある場合には、ＡＡＶ粒子は、清澄化細胞ライセートから１つ以上のクロマトグラフィー方法によって精製されてもよい。クロマトグラフィーとは、混合物から１つ以上の要素を取り分けるための当該技術分野において公知のあらゆる方法を指す。かかる方法としては、限定はされないが、イオン交換クロマトグラフィー（例えば陽イオン交換クロマトグラフィーおよび陰イオン交換クロマトグラフィー）、イムノアフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーを挙げることができる。一部の実施形態において、ウイルスクロマトグラフィー方法としては、米国特許第５，７５６，２８３号明細書、同第６，２５８，５９５号明細書、同第６，２６１，５５１号明細書、同第６，２７０，９９６号明細書、同第６，２８１，０１０号明細書、同第６，３６５，３９４号明細書、同第６，４７５，７６９号明細書、同第６，４８２，６３４号明細書、同第６，４８５，９６６号明細書、同第６，９４３，０１９号明細書、同第６，９５３，６９０号明細書、同第７，０２２，５１９号明細書、同第７，２３８，５２６号明細書、同第７，２９１，４９８号明細書および同第７，４９１，５０８号明細書または国際公開第１９９６０３９５３０号パンフレット、同第１９９８０１００８８号パンフレット、同第１９９９０１４３５４号パンフレット、同第１９９９０１５６８５号パンフレット、同第１９９９０４７６９１号パンフレット、同第２００００５５３４２号パンフレット、同第２００００７５３５３号パンフレットおよび同第２００１０２３５９７号パンフレット（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるもののいずれかを挙げることができる。
【０３６６】
一部の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーを用いてウイルス粒子が単離されてもよい。イオン交換クロマトグラフィーを用いると、カプシドタンパク質と、固定相、典型的にはウイルス調製物（例えば清澄化ライセート）を通過させるカラムに存在する荷電部位との間の電荷間相互作用に基づきウイルス粒子が結合する。ウイルス調製物を加えた後、次に溶出溶液を加えることにより電荷間相互作用が破壊されて、結合したウイルス粒子が溶出し得る。溶出溶液は、結合したウイルス粒子の回収が促進されるように塩濃度および／またはｐＨを調整することにより最適化されてもよい。単離されるウイルスカプシドの電荷に応じて、陽イオンまたは陰イオン交換クロマトグラフィー方法が選択され得る。イオン交換クロマトグラフィー方法としては、限定はされないが、米国特許第７，４１９，８１７号明細書、同第６，１４３，５４８号明細書、同第７，０９４，６０４号明細書、同第６，５９３，１２３号明細書、同第７，０１５，０２６号明細書および同第８，１３７，９４８号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示されるもののいずれかを挙げることができる。
【０３６７】
一部の実施形態において、イムノアフィニティークロマトグラフィーが用いられてもよい。イムノアフィニティークロマトグラフィーは、１つ以上の免疫化合物（例えば抗体または抗体関連構造）を利用してウイルス粒子を保持するクロマトグラフィーの一形態である。免疫化合物は、限定はされないが、１つ以上のウイルスコートタンパク質を含め、ウイルス粒子表面上の１つ以上の構造に特異的に結合し得る。ある場合には、免疫化合物は特定のウイルス変種に特異的であってもよい。ある場合には、免疫化合物は複数のウイルス変種に結合してもよい。一部の実施形態において、免疫化合物は組換え一本鎖抗体を含んでもよい。かかる組換え一本鎖抗体としては、スミス・Ｒ・Ｈ（Ｓｍｉｔｈ，Ｒ．Ｈ．）ら著、２００９年、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．）、第１７巻、第１１号、ｐ．１８８８〜９６（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載されるものを挙げることができる。かかる免疫化合物は、限定はされないが、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ６およびＡＡＶ８を含め、幾つかのＡＡＶカプシド変種への結合能を有する。
【０３６８】
一部の実施形態において、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）が用いられてもよい。ＳＥＣは、ゲルを使用したサイズによる粒子の分離を含み得る。ウイルス粒子精製では、ＳＥＣろ過は時に「ポリッシング」と称されることもある。ある場合には、ＳＥＣは、ほぼ均一な最終産物を生じさせるために行われ得る。かかる最終産物は、ある場合には、前臨床試験および／または臨床試験で使用され得る（コーチン・Ｒ・Ｍ（Ｋｏｔｉｎ，Ｒ．Ｍ．）、２０１１年、ヒューマン・モレキュラー・ジェネティクス（Ｈｕｍａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）、第２０巻、第１号、ｐ．Ｒ２〜Ｒ６、この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。ある場合には、ＳＥＣは、米国特許第６，１４３，５４８号明細書、同第７，０１５，０２６号明細書、同第８，４７６，４１８号明細書、同第６，４１０，３００号明細書、同第８，４７６，４１８号明細書、同第７，４１９，８１７号明細書、同第７，０９４，６０４号明細書、同第６，５９３，１２３号明細書、および同第８，１３７，９４８号明細書（これらの各々の内容は本明細書において全体として参照により援用される）に教示される方法のいずれかにより行われてもよい。
【０３６９】
一実施形態において、少なくとも１つのＡＡＶ粒子を含む組成物は、米国特許第６１４６８７４号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法を用いて単離または精製されてもよい。
【０３７０】
一実施形態において、少なくとも１つのＡＡＶ粒子を含む組成物は、米国特許第６６６０５１４号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法を用いて単離または精製されてもよい。
【０３７１】
一実施形態において、少なくとも１つのＡＡＶ粒子を含む組成物は、米国特許第８２８３１５１号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法を用いて単離または精製されてもよい。
【０３７２】
一実施形態において、少なくとも１つのＡＡＶ粒子を含む組成物は、米国特許第８５２４４４６号明細書（この内容は本明細書において全体として参照により援用される）に記載される方法を用いて単離または精製されてもよい。
【０３７３】
細胞への導入
ｓｉＲＮＡ二重鎖の化学的および生物学的安定性を確保するためには、ｓｉＲＮＡをコードするポリヌクレオチドを標的細胞の内部に送達することが重要である。本発明のポリヌクレオチドは、様々な手法のいずれかを使用して、細胞へと導入することができる。
【０３７４】
一部の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、細胞をポリヌクレオチドと接触させることによって細胞へと導入される。一部の実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞を、ポリヌクレオチドおよび親油性担体を含む組成物と接触させることによって細胞へと導入される。他の実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞において転写されるとｓｉＲＮＡ二重鎖を産生する能力を有する核酸配列を含むベクターを細胞にトランスフェクトするかまたは感染させることによって細胞へと導入される。
【０３７５】
一部の実施形態において、ｓｉＲＮＡ二重鎖は、細胞において転写されるとｓｉＲＮＡ二重鎖を産生する能力を有する核酸配列を含むベクターを細胞に注入することによって細胞へと導入される。
【０３７６】
他の実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、電気穿孔によって細胞に送達されてもよい（例えば米国特許出願公開第２００５００１４２６４号明細書；この内容は本明細書において全体として参照により援用される）。
【０３７７】
加えて、ウイルスベクター（例えば、ＡＡＶベクター）に挿入されたｓｉＲＮＡ分子を、ウイルス感染によって細胞へと送達してもよい。これらのウイルスベクターは、トランスフェクションに容易には適さない細胞へのｓｉＲＮＡ分子の侵入を促進するように操作および最適化される。また、幾つかの合成ウイルスベクターはｓｈＲＮＡを細胞ゲノムに組み込む能力を有し、それにより安定したｓｉＲＮＡ発現および標的遺伝子の長期ノックダウンがもたらされる。このように、ウイルスベクターは、野生型ウイルスに見られる有害な複製および／または組込み特徴を欠きながらも、特異的送達媒体として操作される。
【０３７８】
一部の実施形態において、細胞としては、限定はされないが、哺乳類起源の細胞、ヒト起源の細胞、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、神経幹細胞、および神経前駆細胞を挙げることができる。
【０３７９】
医薬組成物および製剤
医薬組成物に加えて、例えば、本明細書で提供される、送達しようとするｓｉＲＮＡ二重鎖（ウイルス、例えばＡＡＶなどのコードプラスミドまたは発現ベクターを含む）は、原理的にヒトへの投与に好適な医薬組成物に関し、当業者であれば、かかる組成物は、一般に、任意の他の動物への、例えば非ヒト動物、例えば非ヒト哺乳類への投与に好適であることを理解するであろう。組成物を種々の動物への投与に好適にするための、ヒトへの投与に好適な医薬組成物の修飾については十分に理解されており、獣医薬理学の当業者は、あったとしても通常どおりに過ぎない実験をもって、かかる修飾を設計および／または実施することができる。医薬組成物の投与が企図される対象としては、限定はされないが、ヒトおよび／または他の霊長類；ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、ネコ、イヌ、マウス、および／またはラットなど、商業的に関連性のある哺乳類を含めた哺乳類；および／または、家禽、ニワトリ、アヒル、ガチョウ、および／またはシチメンチョウなど、商業的に関連性のある鳥類を含めた鳥類が挙げられる。
【０３８０】
一部の実施形態において、組成物は、ヒト、ヒト患者または対象に投与される。本開示の目的では、「活性成分」という語句は一般に、合成ｓｉＲＮＡ二重鎖、またはｓｉＲＮＡ二重鎖を保持するウイルスベクター、または本明細書に記載されるとおりのウイルスベクターによって送達されるｓｉＲＮＡ分子のいずれかを指す。
【０３８１】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製されてもよい。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と合わせる工程、および次に、必要であればおよび／または望ましい場合には、生成物を所望の単回または複数回用量単位に分割、付形および／または包装する工程を含む。
【０３８２】
本発明に係る医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加成分の相対量は、治療対象のアイデンティティ、サイズ、および／または状態に応じて、更には組成物が投与される経路に応じて異なることになる。
【０３８３】
それらをコードするｓｉＲＮＡ二重鎖またはウイルスベクターは、１つ以上の賦形剤を使用して製剤化することにより、（１）安定性を増加させる；（２）細胞トランスフェクションまたは形質導入を増加させる；（３）持続または遅延放出を可能にする；または（４）体内分布を変化させる（例えば、ウイルスベクターを脳および運動ニューロンなどの特異的組織または細胞型に標的化する）ことができる。
【０３８４】
本発明の製剤は、限定なしに、生理食塩水、リピドイド、リポソーム、脂質ナノ粒子、ポリマー、リポプレックス、コア−シェルナノ粒子、ペプチド、タンパク質、ウイルスベクターをトランスフェクトした細胞（例えば、対象への移植用）、ナノ粒子模倣体およびこれらの組合せを含むことができる。更に、本発明のウイルスベクターは、自己集合性核酸ナノ粒子を使用して製剤化されてもよい。
【０３８５】
本明細書に記載される医薬組成物の製剤は、薬理学の技術分野において公知のまたは今後開発される任意の方法によって調製されてもよい。一般に、かかる調製方法は、活性成分を賦形剤および／または１つ以上の他の補助成分と合わせる工程を含む。
【０３８６】
本開示に係る医薬組成物は、バルクで、単回単位用量として、および／または複数の単回単位用量として調製、包装、および／または販売されてもよい。本明細書で使用されるとき、「単位用量」は、所定量の活性成分を含む医薬組成物の個別的な量を指す。活性成分の量は、概して対象に投与されるであろう活性成分の投薬量に等しく、および／またはかかる投薬量の好都合な一部、例えばかかる投薬量の２分の１または３分の１である。
【０３８７】
本開示に係る医薬組成物中の活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、および／または任意の追加成分の相対量は、治療下の対象のアイデンティティ、サイズ、および／または状態に応じて、更には組成物が投与される経路に応じて異なり得る。例えば、組成物は、０．１％〜９９％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。例として、組成物は、０．１％〜１００％、例えば０．５〜５０％、１〜３０％、５〜８０％、少なくとも８０％（ｗ／ｗ）の活性成分を含み得る。
【０３８８】
一部の実施形態において、本明細書に記載される製剤は、少なくとも１つのＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを含んでもよい。非限定的な例として、製剤は、ＳＯＤ１遺伝子を異なる部位に標的化する１つ、２つ、３つ、４つまたは５つのポリヌクレオチドを含んでもよい。
【０３８９】
一部の実施形態において、薬学的に許容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の純度であってもよい。一部の実施形態において、賦形剤はヒトへの使用および動物への使用が承認されている。一部の実施形態において、賦形剤は米国食品医薬品局によって承認されていてもよい。一部の実施形態において、賦形剤は医薬品グレードであってもよい。一部の実施形態において、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、および／または国際薬局方の規格に適合し得る。
【０３９０】
賦形剤には、本明細書で使用されるとき、限定はされないが、所望の特定の剤形に適するとおりのあらゆる溶媒、分散媒、希釈剤、または他の液体媒体、分散液または懸濁液助剤、表面活性剤、等張剤、増粘剤または乳化剤、保存剤などが含まれる。医薬組成物を製剤化するための種々の賦形剤および組成物の調製技法は当該技術分野において公知である（「レミントン：薬学の科学と実践（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ）」、第２１版、Ａ・Ｒ・ジェンナロ（Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ）著、リッピンコット・ウィリアムズ・アンド・ウィルキンス（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ）、メリーランド州ボルチモア（Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ）、２００６年を参照のこと；全体として参照により本明細書に援用される）。従来の賦形剤媒体の使用は本開示の範囲内に企図され得るが、但し、任意の望ましくない生物学的効果を生じたり、またはその他、医薬組成物の任意の他の１つまたは複数の成分と有害な形で相互作用したりするなどにより、任意の従来の賦形剤媒体が物質またはその誘導体と不適合である場合は除く。
【０３９１】
例示的希釈剤としては、限定はされないが、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム、硫酸カルシウム、リン酸水素カルシウム、リン酸ナトリウム  ラクトース、スクロース、セルロース、微結晶性セルロース、カオリン、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、塩化ナトリウム、乾燥デンプン、コーンスターチ、粉末糖等、および／またはこれらの組合せが挙げられる。
【０３９２】
一部の実施形態において、製剤は少なくとも１つの非活性成分を含み得る。本明細書で使用されるとき、用語「非活性成分」は、製剤に含まれる１つ以上の非活性薬剤を指す。一部の実施形態において、本発明の製剤に使用し得る非活性成分は、全てが米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されているか、いずれも承認されていないか、または一部が承認されているものであり得る。
【０３９３】
本明細書で開示されるＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを保持するウイルスベクターの製剤としては、カチオンまたはアニオンを挙げることができる。一実施形態において、製剤は、限定はされないが、Ｚｎ２＋、Ｃａ２＋、Ｃｕ２＋、Ｍｇ＋およびこれらの組合せなど、金属カチオンを含む。
【０３９４】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容可能な塩」は、開示される化合物の誘導体を指し、ここで親化合物は、既存の酸または塩基部分からその塩形態への変換（例えば、遊離塩基基を好適な有機酸と反応させることによる）によって修飾される。薬学的に許容可能な塩の例としては、限定はされないが、アミン類などの塩基性残基の鉱酸塩または有機酸塩；カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩などが挙げられる。代表的な酸付加塩としては、酢酸塩、酢酸、アジピン酸塩、アルギン酸塩、アスコルビン酸塩、アスパラギン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸、安息香酸塩、重硫酸塩、ホウ酸塩、酪酸塩、カンファー酸塩、カンファースルホン酸塩、クエン酸塩、シクロペンタンプロピオン酸塩、ジグルコン酸塩、ドデシル硫酸塩、エタンスルホン酸塩、フマル酸塩、グルコヘプトン酸塩、グリセロリン酸塩、ヘミ硫酸塩、ヘプトン酸塩、ヘキサン酸塩、臭化水素酸塩、塩酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシエタンスルホン酸塩、ラクトビオン酸塩、乳酸塩、ラウリン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、メタンスルホン酸塩、２−ナフタレンスルホン酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、ペクチン酸塩、過硫酸塩、３−フェニルプロピオン酸塩、リン酸塩、ピクリン酸塩、ピバル酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、硫酸塩、酒石酸塩、チオシアン酸塩、トルエンスルホン酸塩、ウンデカン酸塩、吉草酸塩などが挙げられる。代表的なアルカリまたはアルカリ土類金属塩としては、ナトリウム、リチウム、カリウム、カルシウム、マグネシウムなど、ならびに非毒性アンモニウム、第四級アンモニウム、およびアミン陽イオン、例えば、限定はされないが、アンモニウム、テトラメチルアンモニウム、テトラエチルアンモニウム、メチルアミン、ジメチルアミン、トリメチルアミン、トリエチルアミン、エチルアミンなどが挙げられる。本開示の薬学的に許容可能な塩には、例えば非毒性無機酸または有機酸から形成される親化合物の従来の非毒性塩が含まれる。本開示の薬学的に許容可能な塩は、従来の化学的方法により塩基または酸部分を含有する親化合物から合成することができる。概して、かかる塩は、遊離酸または塩基形態のこれらの化合物と、水中または有機溶媒中、またはこれら２つの混合物中（概して、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルなどの非水性媒体が好ましい）にある化学量論量の適切な塩基または酸とを反応させることにより調製し得る。好適な塩の一覧については、「レミントンの薬学科学（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）」、第１７版、マック・パブリッシング・カンパニー（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ）、ペンシルベニア州イーストン（Ｅａｓｔｏｎ）、１９８５年、ｐ．１４１８、「薬学的塩：特性、選択、および使用（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓａｌｔｓ：Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ  Ｕｓｅ）」、Ｐ・Ｈ・シュタール（Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ）およびＣ・Ｇ・ウェルムス（Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ）編、ワイリー−ブイシーエイチ（Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ）、２００８年、およびベルジュ（Ｂｅｒｇｅ）ら著、ジャーナル・オブ・ファーマシューティカル・サイエンス（Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅ）、第６６巻、ｐ．１〜１９、１９７７年が参照される；この各々の内容は全体として参照により本明細書に援用される。
【０３９５】
用語「薬学的に許容可能な溶媒和物」は、本明細書で使用されるとき、好適な溶媒の分子が結晶格子に取り込まれている本発明の化合物を意味する。好適な溶媒は、投与される投薬量で生理学的に忍容可能である。例えば、溶媒和物は、有機溶媒、水、またはこれらの混合物を含む溶液から結晶化、再結晶化、または沈殿によって調製されてもよい。好適な溶媒の例は、エタノール、水（例えば、一水和物、二水和物、および三水和物）、Ｎ−メチルピロリジノン（ＮＭＰ）、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）、Ｎ，Ｎ’−ジメチルアセトアミド（ＤＭＡＣ）、１，３−ジメチル−２−イミダゾリジノン（ＤＭＥＵ）、１，３−ジメチル−３，４，５，６−テトラヒドロ−２−（１Ｈ）−ピリミジノン（ＤＭＰＵ）、アセトニトリル（ＡＣＮ）、プロピレングリコール、酢酸エチル、ベンジルアルコール、２−ピロリドン、安息香酸ベンジルなどである。水が溶媒であるとき、その溶媒和物は「水和物」と称される。
【０３９６】
本発明によれば、ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドまたはそれを含むＡＡＶベクターは、ＣＮＳ送達用に製剤化されてもよい。脳血液関門を通過する薬剤が使用されてもよい。例えば、脳血液関門内皮をｓｉＲＮＡ分子の標的とし得る、一部の細胞透過性ペプチドを使用して、ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖を製剤化してもよい（例えば、マスパラ（Ｍａｔｈｕｐａｌａ）著、エクスパート・オピニオン・オン・セラピュティック・パテント（Ｅｘｐｅｒｔ  Ｏｐｉｎ  Ｔｈｅｒ  Ｐａｔ．）、２００９年、第１９巻、ｐ．１３７〜１４０；この内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
【０３９７】
投与
本発明のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは、治療上有効な結果をもたらす任意の経路によって投与し得る。それらとしては、限定はされないが、経腸（腸の中）、胃腸、硬膜上（硬膜の中）、経口（口を介して）、経皮、硬膜外、大脳内（大脳の中）、脳室内（脳室の中）、皮膚上（皮膚への塗布）、皮内（皮膚それ自体の中）、皮下（皮膚の下）、鼻腔投与（鼻を通じて）、静脈内（静脈の中）、静脈内ボーラス、静脈内点滴、動脈内（動脈の中）、筋肉内（筋肉の中）、心臓内（心臓の中）、骨内注入（骨髄の中）、髄腔内（脊柱管の中）、腹腔内（腹膜への注入または注射）、膀胱内注入、硝子体内（眼を通じて）、海綿体内注射（病的腔の中）、腔内（陰茎の基部の中）、腟内投与、子宮内、羊膜外投与、経皮（全身分布のためのインタクトな皮膚を通じた拡散）、経粘膜（粘膜を通じた拡散）、経腟、インサフレーション（鼻から吸い込む）、舌下、唇下、浣腸、点眼薬（結膜上）、点耳薬で、耳介（耳内または耳を介して）、頬側（頬の方に向けて）、結膜、皮膚、歯（１本または複数の歯に対して）、電気浸透、子宮頚管内、副鼻腔内、気管内、体外、血液透析、浸潤、間質内、腹腔内、羊膜内、関節内、胆管内、気管支内、嚢内、軟骨内（軟骨の範囲内）、仙骨内（馬尾（ｃａｕｄａ  ｅｑｕｉｎｅ）の範囲内）、大槽内（大槽小脳延髄槽の範囲内）、角膜内（角膜の範囲内）、歯冠内、冠内（冠動脈の範囲内）、海綿体内（ｉｎｔｒａｃｏｒｐｏｒｕｓ  ｃａｖｅｒｎｏｓｕｍ）（陰茎海綿体（ｃｏｒｐｏｒｕｓ  ｃａｖｅｒｎｏｓａ）の可膨張性腔の範囲内）、椎間板内（椎間板の範囲内）、管内（腺管の範囲内）、十二指腸内（十二指腸の範囲内）、硬膜内（硬膜の範囲内または真下）、表皮内（表皮に対して）、食道内（食道に対して）、胃内（胃の範囲内）、歯肉内（歯肉の範囲内）、回腸内（小腸の遠位部分の範囲内）、病巣内（局所病変の範囲内、またはそこに直接導入される）、管腔内（管の管腔の範囲内）、リンパ内（リンパの範囲内）、髄内（骨の髄腔の範囲内）、髄膜内（髄膜の範囲内）、眼内（眼の範囲内）、卵巣内（卵巣の範囲内）、心膜内（心膜の範囲内）、胸膜内（胸膜の範囲内）、前立腺内（前立腺の範囲内）、肺内（肺、またはその気管支の範囲内）、洞内（鼻洞または眼窩周囲洞の範囲内）、脊髄内（脊柱の範囲内）、滑液嚢内（関節の滑膜腔の範囲内）、腱内（腱の範囲内）、精巣内（精巣の範囲内）、髄腔内（脳脊髄軸の任意のレベルにおける脳脊髄液の範囲内）、胸腔内（胸郭の範囲内）、細管内（臓器の細管の範囲内）、腫瘍内（腫瘍の範囲内）、鼓室内（中耳（ａｕｒｕｓ  ｍｅｄｉａ）の範囲内）、血管内（１つまたは複数の血管の範囲内）、脳室内（脳室の範囲内）、イオントフォレシス（電流を用いるもので、可溶性塩のイオンが体の組織に移動する）、潅注（開放創または体腔を浸すまたはフラッシュする）、喉頭（喉頭に対して直接）、経鼻胃（鼻を通じて胃の中に）、密封包帯療法（局所経路投与、これは次に包帯で覆われ、包帯がその範囲を閉塞する）、眼（外眼部に対して）、中咽頭（口および咽頭に対して直接）、非経口、経皮、関節周囲、硬膜外、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器（局所または全身作用のため経口的または鼻腔的に吸入���ることにより気道の範囲内に）、球後（橋の後ろまたは眼球の後ろ）、軟部組織、くも膜下、結膜下、粘膜下、局所、経胎盤（胎盤を通じてまたは越えて）、経気管（気管の壁を通じて）、経鼓室（鼓室を越えてまたは通じて）、尿管（尿管に対して）、尿道（尿道に対して）、腟、仙骨ブロック、診断的、神経ブロック、胆管灌流、心灌流、フォトフェレーシスまたは脊髄が挙げられる。
【０３９８】
具体的な実施形態において、少なくとも１つのＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを含むＡＡＶベクターを含む組成物は、それらが中枢神経系に侵入し、運動ニューロンに入り込むことが可能になるように投与してもよい。
【０３９９】
一部の実施形態において、本発明の療法剤は、筋肉注射によって投与してもよい。リズバノブら（Ｒｉｚｖａｎｏｖ  ｅｔ  ａｌ．）は、突然変異体ヒトＳＯＤ１  ｍＲＮＡを標的とするｓｉＲＮＡ分子は、ＳＯＤ１Ｇ９３ＡトランスジェニックＡＬＳマウスでは、坐骨神経によって取り込まれ、運動ニューロンの周核体に逆行的に輸送され、突然変異体ＳＯＤ１  ｍＲＮＡを阻害することを初めて示した（リズバノブ  エーエーら（Ｒｉｚｖａｎｏｖ  ＡＡ  ｅｔ  ａｌ．）著、エクスペリメンタル・ブレイン・リサーチ（Ｅｘｐ．Ｂｒａｉｎ  Ｒｅｓ．）、２００９年、第１９５巻（１号）、ｐ．１〜４；この内容は全体として参照により本明細書に援用される）。また、別の研究は、突然変異体ＳＯＤ１遺伝子に対する低分子ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡｓ）を発現するＡＡＶの筋肉送達が、筋肉ならびに神経支配運動ニューロンにおける著しい突然変異体ＳＯＤ１ノックダウンに結び付いたことを示した（タウン  シーら（Ｔｏｗｎｅ  Ｃ  ｅｔ  ａｌ．）著、モレキュラー・セラピー（Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．）、２０１１年；第１９巻（２号）：ｐ．２７４〜２８３；この内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
【０４００】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖を発現するＡＡＶベクターは、末梢注射および／または鼻腔内送達によって対象に投与されてもよい。当該技術分野では、ｓｉＲＮＡ二重鎖のＡＡＶベクターの末梢投与が中枢神経系まで、例えば運動ニューロンまで輸送され得ることが開示された（例えば、米国特許出願公開第２０１００２４０７３９号明細書；および同第２０１００１３０５９４号明細書；この各々の内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
【０４０１】
他の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖を含む組成物は、頭蓋内送達によって対象に投与されてもよい（例えば、米国特許第８，１１９，６１１号明細書を参照のこと；この内容は全体として参照により本明細書に援用される）。
【０４０２】
本発明のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは任意の好適な形態で、液体溶液または懸濁液、液体溶液または液体溶液中の懸濁液に好適な固体形態のいずれとして投与されてもよい。ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは、任意の適切なかつ薬学的に許容可能な賦形剤と共に製剤化されてもよい。
【０４０３】
本発明のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドは、「治療上有効な」量、すなわち、疾患に関連する少なくとも１つの症状を軽減および／または予防するのに十分な、または対象の状態の改善をもたらすのに十分な量で投与されてもよい。
【０４０４】
用量設定
本発明の医薬組成物は、ＳＯＤ１関連の障害（例えば、ＡＬＳ）を予防および治療するのに有効な任意の量を用いて対象に投与されてもよい。必要となる正確な量は、対象の種、年齢、および全身状態、疾患の重症度、詳細な組成物、その投与様式、その活性様式などに応じて対象毎に異なることになる。
【０４０５】
本発明の組成物は典型的には、投与の簡便性および投薬量の均一性のため、単位剤形で製剤化される。しかしながら、本発明の組成物の１日の総使用量は主治医が妥当な医学的判断の範囲内で決定し得ることは理解されるであろう。任意の特定の患者に対する具体的な治療有効性は、治療下の障害および障害の重症度；用いられる具体的な化合物の活性；用いられる具体的な組成物；患者の年齢、体重、全般的な健康、性別および食事；投与時間、および投与経路；治療継続期間；用いられる具体的な化合物と併用してまたは同時に使用される薬物；および医学分野で周知の同様の要因を含めた種々の要因に依存することになる。
【０４０６】
一部の具体的な実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖を送達するためのＡＡＶベクターの用量は、疾患の状態、対象および治療戦略などに応じて適合され得る。典型的には、１用量当たり約１０５、１０６、１０１２、１０１３、１０１４、１０１５〜１０１６ウイルスゲノム（単位）が投与されてもよい。
【０４０７】
所望の投薬量は、１日３回、１日２回、１日１回、１日おき、３日に１回、週１回、２週に１回、３週に１回または４週に１回送達されてもよい。
特定の実施形態において、所望の投薬量は、複数回の投与（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４回、またはそれ以上の投与）を用いて送達されてもよい。複数回の投与が利用される場合、本明細書に記載されるような分割用量投与レジメンが用いられてもよい。本明細書で使用されるとき、「分割用量」は、単一単位用量または総１日用量を２つ以上の用量に分割するもの、例えば単一単位用量の２回以上の投与である。本明細書で使用されるとき、「単一単位用量」は、１用量／１回／単一の経路／単一の接触点、すなわち単一の投与イベントで投与される任意の調節性ポリヌクレオチド治療薬の用量である。本明細書で使用されるとき、「総１日用量」は、２４時間に与えられるまたは処方される量である。これは単一単位用量として投与されてもよい。一実施形態において、本発明のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを含むウイルスベクターは分割用量で対象に投与される。それらの用量は、緩衝液のみに、または本明細書に記載される製剤に製剤化されてもよい。
【０４０８】
ＡＬＳおよび／またはイヌ変性性脊髄症（ＤＭ）の治療法
本発明では、本明細書に記載されるＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを細胞へと導入する方法であって、ポリヌクレオチドのいずれかを、標的ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの分解が生じるのに十分な量で前記細胞へと導入することを含む方法が提供される。一部の態様において、細胞は、幹細胞、運動ニューロンなどのニューロン、筋細胞、およびアストロサイトなどのグリア細胞であり得る。
【０４０９】
本発明において、治療を必要とする対象における、ＳＯＤ１機能の異常と関連するＡＬＳを治療するための方法も開示される。本方法は、任意選択で、対象に、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖を含むかまたはコードする組成物の治療有効量を投与することを含む。前記ｓｉＲＮＡ二重鎖は、ＡＬＳを治療的に処置するように、対象におけるＳＯＤ１遺伝子の発現をサイレンシングし、ＳＯＤ１タンパク質の産生を阻害し、ＡＬＳの１つ以上の症状を軽減するであろう。
【０４１０】
一部の実施形態において、本発明のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドまたはこのポリヌクレオチドを含むかもしくはコードする組成物は、対象の中枢神経系に投与される。他の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ二重鎖またはそれを含む組成物は、対象の筋肉に投与される。
【０４１１】
特に、ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドを、運動ニューロンを含む特定のタイプの標的細胞；オリゴデンドロサイト、アストロサイト、およびミクログリアを含むグリア細胞；ならびに／またはＴ細胞など、ニューロンを取り囲む他の細胞へと送達してもよい。ヒトＡＬＳ患者および動物ＳＯＤ１  ＡＬＳモデルにおける研究は、グリア細胞を、ＡＬＳニューロンの機能不全および死において、早期の役割を果たすものとして示唆する。突然変異体のＳＯＤ１が、運動ニューロン内に存在してもなお、周囲の保護的グリア細胞内の正常なＳＯＤ１は、運動ニューロンが、死滅することを防止し得る（例えば、その内容が、参照によりその全体において本明細書に援用される、フィリップスおよびロートシュタイン（Ｐｈｉｌｉｐｓ  ａｎｄ  Ｒｏｔｈｓｔｅｉｎ）、Ｅｘｐ．Ｎｅｕｒｏｌ．、２０１４、Ｍａｙ  ２２．ｐｉｉ：Ｓ００１４−４８８６（１４）００１５７−５により総説されている）。
【０４１２】
一部の具体的な実施形態において、ＡＬＳの療法として使用される、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖は、ＡＡＶベクターなどのウイルスベクターに挿入される。
【０４１３】
一部の実施形態において、本組成物は、ＡＬＳを治療するための単剤療法剤または組合せ療法剤として投与される。
ＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖を含むかまたはコードするウイルスベクターは、１つ以上の他の治療剤と組み合わせて使用され得る。「〜と組み合わせて」とは、その薬剤を同時に投与しなければならず、かつ／または併せた送達のために製剤化されなければならないことを含意するように意図するものではないが、これらの送達方法も、本開示の範囲内にある。組成物は、１つ以上の他の所望の治療剤または医療手技と共時的に、この前に、またはこの後で投与することができる。一般に、各薬剤は、この薬剤について決定された用量および／またはタイムスケジュールで投与されることになる。
【０４１４】
本発明のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドと組み合わせて使用され得る治療剤は、抗酸化剤である低分子化合物、抗炎症性薬剤、抗アポトーシス薬剤、カルシウム調節剤、抗グルタミン酸作動性薬剤、構造的タンパク質阻害剤、および金属イオンの調節に関与する化合物であり得る。
【０４１５】
ＡＬＳを治療するために組み合わせて使用される化合物としては、限定はされないが、以下のものを挙げることができる：フリーラジカルスカベンジャーおよび／またはラジカヴァ（エダラボン）などの酸化ストレスを低減する薬剤、抗グルタミン作動剤：リルゾール、トピラマート、タランパネル、ラモトリジン、デキストロメトルファン、ガバペンチンおよびＡＭＰＡアンタゴニスト；抗アポトーシス剤：ミノサイクリン、フェニル酪酸ナトリウムおよびアリモクロモール；抗炎症剤：ガングリオシド、セレコキシブ、シクロスポリン、アザチオプリン、シクロホスファミド、血漿分離交換法、酢酸グラチラメールおよびサリドマイド；セフトリアキソン（ベリーら（Ｂｅｒｒｙ  ｅｔ  ａｌ．）著、プロス・ワン（Ｐｌｏｓ  Ｏｎｅ）、２０１３年、第８巻（４号））；ベータ−ラクタム抗生物質；プラミペキソール（ドーパミンアゴニスト）（ワンら（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）著、アミトオトロフィック・レタラル・スクレオシス（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  Ｌａｔｅｒａｌ  Ｓｃｌｅｒ．）、２００８年、第９巻（１号）、ｐ．５０〜５８）；米国特許出願公開第２００６００７４９９１号明細書におけるニメスリド；米国特許出願公開第２０１３０１４３８７３号明細書において開示されているジアゾキシド；米国特許出願公開第２００８０１６１３７８号明細書において開示されているピラゾロン誘導体；ブロモクリプチンなど、酸化ストレス誘導性細胞死を阻害するフリーラジカルスカベンジャー（米国特許出願公開第２０１１０１０５５１７号明細書）；国際公開第２０１３１００５７１号パンフレットにおいて論じられているフェニルカルバメート化合物；米国特許第６，９３３，３１０号明細書および同第８，３９９，５１４号明細書ならびに米国特許出願公開第２０１１０２３７９０７号明細書および同第２０１４００３８９２７号明細書において開示されている神経保護化合物；ならびに米国特許出願公開第２００７０１８５０１２号明細書において教示されている糖ペプチド；それらの各々の内容は、参照により全体として本明細書に援用される。
【０４１６】
本発明のＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖との組合せ療法において使用され得る治療剤は、副腎皮質刺激ホルモン（ＡＣＴＨ）またはその断片など、ニューロンの喪失を保護し得るホルモンまたはバリアント（例えば、米国特許出願公開第２０１３０２５９８７５号明細書）；エストロゲン（例えば、米国特許第６，３３４，９９８号明細書および同第６，５９２，８４５号明細書）であり得る。これらの各々の内容は、参照により全体として本明細書に援用される。
【０４１７】
ＡＬＳを治療するために、本発明のＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡ二重鎖との組合せ療法において、神経栄養因子を使用してもよい。一般に、神経栄養因子は、ニューロンの生存、成長、分化、増殖、および／もしくは成熟を促進するか、またはニューロンの活性の増大を刺激する物質として規定される。一部の実施形態において、本発明の方法は、１つ以上の栄養因子の、治療を必要とする対象への送達を更に含む。栄養因子は、限定はされないが、ＩＧＦ−Ｉ、ＧＤＮＦ、ＢＤＮＦ、ＣＴＮＦ、ＶＥＧＦ、コリベリン、キサリプロデン、サイロトロフィン放出ホルモン、およびＡＤＮＦ、ならびにこれらのバリアントを含み得る。
【０４１８】
一態様において、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする、少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖を含むＡＡＶベクターを、ＡＡＶ−ＩＧＦ−Ｉ（その内容が、参照によりその全体において本明細書に援用される、ビンセントら（Ｖｉｎｃｅｎｔ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｎｅｕｒｏｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ、２００４、６、７９〜８５）およびＡＡＶ−ＧＤＮＦ（その内容が、参照によりその全体において本明細書に援用される、ワンら（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｊ  Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．、２００２、２２、６９２０〜６９２８）などの神経栄養因子を発現させるＡＡＶベクターと共に共投与してもよい。
【０４１９】
一部の実施形態において、ＡＬＳを治療するための本発明の組成物を、それを必要とする対象に、静脈内投与、筋内投与、皮下投与、腹腔内投与、髄腔内投与、および／または脳室内投与し、ｓｉＲＮＡ二重鎖またはｓｉＲＮＡ二重鎖を含むベクターが、血液脳関門および血液脊髄関門の一方または両方を通過することを可能とする。一部の態様において、本方法は、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖、またはＡＬＳが治療的に処置されるように、対象においてＳＯＤ１遺伝子を標的とし、ＳＯＤ１遺伝子発現をサイレンシング／抑制し、およびＡＬＳの１つ以上の症状を軽減する少なくとも１つのｓｉＲＮＡ二重鎖を含むＡＡＶベクターを含む組成物の治療有効量を、対象の中枢神経系（ＣＮＳ）に（例えば、注入ポンプおよび／または送達足場を使用して）直接投与（例えば、脳室内投与および／または髄腔内投与）することを含む。
【０４２０】
ある特定の態様において、運動ニューロンの変性、筋力低下、筋萎縮、筋肉の硬直、呼吸困難、発話の不明瞭、線維束性攣縮の発症、前頭側頭型認知症、および／または若年死を含むＡＬＳの症状は、治療される対象において改善される。他の態様において、本発明の組成物を、脳および脊髄の一方または両方へと適用する。他の態様において、筋肉の協調運動および筋肉の機能の一方または両方を改善する。他の態様において、対象の生存を延長する。
【０４２１】
本明細書に記載される組成物は、動物モデルで試験することができる。非限定的な例として、動物は、げっ歯動物（例えば、ラットまたはマウス）、または哺乳類（例えば、非ヒト霊長類またはイヌ）であってもよい。一実施形態において、動物モデルは、イヌ変性性脊髄症（ＤＭ）を有するイヌである。イヌは、同等の神経系サイズおよび複雑さを有し、運動ニューロン喪失および類似のＳＯＤ１化学レベルを患うため、イヌＤＭはＡＬＳのモデルであり得る。イヌＤＭは、ＳＯＤ１突然変異（Ｅ４０Ｋ、Ｔ１８Ｓ）の結果として晩年期発症疾患（８〜１４歳）であり、現在、利用可能な治療は存在しない。ＡＬＳの疾患モデルとしてイヌＤＭを使用する幾つかの利益としては、限定はしないが、投与および療法薬物動力学を種にわたって共有することができること、およびトランスジェニックげっ歯動物ＡＬＳモデルとヒトＡＬＳとの間で共有される疾患尺度をイヌＤＭにおいて再現することができることが挙げられる。
【０４２２】
イヌＤＭには、４つのステージがある。ＤＭイヌのステージ１（初期ステージ）神経学的徴候としては、限定はしないが、進行性全身固有受容運動失調、非対称痙性不全対麻痺、および／または正常脊髄反射が挙げられる。ＤＭイヌのステージ２（初期ステージ）神経学的徴候としては、限定はしないが、軽度から中程度の筋量喪失、骨盤肢における脊髄反射の低減から非存在、ならびに／または尿および大便失禁が挙げられる。ＤＭイヌのステージ３（後期ステージ）神経学的徴候としては、限定はしないが、胸肢麻痺の徴候、弛緩性対麻痺、骨盤肢の重度筋量喪失、ならびに／または尿および大便失禁が挙げられる。ＤＭイヌのステージ４（後期ステージ）神経学的徴候としては、限定はしないが、弛緩性四肢麻痺、嚥下および舌運動困難、体幹皮筋反射（ｃｕｔａｎｅｏｕｓ  ｔｒｕｎｃｉ  ｒｅｆｌｅｘ）の低減から非存在、筋量の全身性および重度喪失、ならびに／または尿および大便失禁が挙げられる。
【０４２３】
種々の測定を使用して、動物研究で使用されるイヌＤＭイヌおよび正常イヌを追跡することができる。これらの測定としては、限定はしないが、以下のものが挙げられる：神経生理学検査（例えば、運動および感覚神経伝達研究（ＮＣＳ）、運動単位数推定（ＭＵＮＥ）、複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）、および電気インピーダンス筋電図（ＥＩＭ））、ニューロパシー、神経画像法（例えば、ＭＲＳ、ＤＴＩ、ＰＥＴ／ＣＴ）、ゲノミクス（例えば、遺伝的修飾因子を使用して）、試料のプロファイリング（例えば、ＳＯＤ１、ＮＦ−Ｈ、および／またはＮＦ−Ｌについては血清およびＣＳＦ）、自然史メトリックス（ｎａｔｕｒａｌ  ｈｉｓｔｏｒｙ  ｍｅｔｒｉｃｓ）、および／または重症度評価スケール（例えば、オルビー自発運動スケール；オルビー  エヌジェイら（Ｏｌｂｙ  ＮＪ  ｅｔ  ａｌ．）著、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリ・リサーチ（Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ）、２００１年を参照のこと；この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。
【０４２４】
一実施形態において、構造タンパク質をバイオマーカーとして使用して、疾患進行および／または治療効果と相関させてもよい。対象の血液および／またはＣＳＦ中の構造タンパク質のレベルを使用して、疾患進行および／または療法効果を決定してもよい。
【０４２５】
一実施形態において、ニューロフィラメントタンパク質をバイオマーカーとして使用して、疾患進行および／または治療効果と相関させてもよい。対象の血液および／またはＣＳＦ中のニューロフィラメントタンパク質のレベルを使用して、疾患進行および／または療法効果を決定してもよい。非限定的な例として、ニューロフィラメントタンパク質は、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦ−Ｌ）である。非限定的な例として、ニューロフィラメントタンパク質は、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ−Ｈ）である。
【０４２６】
一実施形態において、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦ−Ｌ）をバイオマーカーとして使用して、疾患進行および／または治療効果と相関させてもよい。対象の血液および／またはＣＳＦ中のＮＦ−Ｌのレベルを使用して、疾患進行および／または療法効果を決定してもよい。
【０４２７】
一実施形態において、ニューロフィラメント重鎖（ＮＦ−Ｈ）をバイオマーカーとして使用して、疾患進行および／または治療効果と相関させてもよい。対象の血液および／またはＣＳＦ中のＮＦ−Ｈのレベルを使用して、疾患進行および／または療法効果を決定してもよい。
【０４２８】
Ｖ．定義
特に明記しない限り、以下の用語および語句は以下に説明する意味を有する。これらの定義は、本質的に限定するよう意図するものでなく、本発明の特定の態様のより明確な理解を提供するために供される。
【０４２９】
本明細書で使用されるとき、用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」は、ポリデオキシリボヌクレオチド（２−デオキシ−Ｄ−リボースを含有する）、またはポリリボヌクレオチド（Ｄ−リボースを含有する）のいずれか、またはプリンもしくはピリミジン塩基、または修飾プリンもしくはピリミジン塩基のＮグリコシドである任意の他のタイプのポリヌクレオチドで構成される任意の核酸ポリマーを指す。用語「核酸」、「ポリヌクレオチド」および「オリゴヌクレオチド」の間で長さに意図される違いはなく、これらの用語は同義的に用いられ得る。これらの用語は分子の一次構造のみを指す。したがって、これらの用語には、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡが含まれる。
【０４３０】
本明細書で使用されるとき、用語「ＲＮＡ」または「ＲＮＡ分子」または「リボ核酸分子」は、リボヌクレオチドのポリマーを指す；用語「ＤＮＡ」または「ＤＮＡ分子」または「デオキシリボ核酸分子」は、デオキシリボヌクレオチドのポリマーを指す。ＤＮＡおよびＲＮＡは、例えばそれぞれＤＮＡ複製およびＤＮＡの転写により、天然で合成されることもでき；または化学的に合成されることもできる。ＤＮＡおよびＲＮＡは、一本鎖（すなわち、それぞれｓｓＲＮＡまたはｓｓＤＮＡ）または多重鎖（例えば、二本鎖、すなわち、それぞれｄｓＲＮＡおよびｄｓＤＮＡ）であり得る。用語「ｍＲＮＡ」または「メッセンジャーＲＮＡ」は、本明細書で使用されるとき、１つ以上のポリペプチド鎖のアミノ酸配列をコードする一本鎖ＲＮＡを指す。
【０４３１】
本明細書で使用されるとき、用語「ＲＮＡ干渉」または「ＲＮＡｉ」は、対応するタンパク質コード遺伝子の発現の阻害または干渉または「サイレンシング」をもたらすＲＮＡ分子によって媒介される配列特異的調節機構を指す。ＲＮＡｉは、植物、動物および真菌を含めた多くの種類の生物で観察されている。ＲＮＡｉは細胞において天然で外来性ＲＮＡ（例えばウイルスＲＮＡ）を除去するために起こる。天然ＲＮＡｉは、遊離ｄｓＲＮＡから切断された、分解機構を他の類似のＲＮＡ配列に仕向ける断片によって進行する。ＲＮＡｉはＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）によって制御され、細胞質において短鎖／低分子ｄｓＲＮＡ分子によって開始され、そこでｄｓＲＮＡ分子は触媒ＲＩＳＣ成分アルゴノートと相互作用する。ｄｓＲＮＡ分子は細胞に外因的に導入されることができる。外因性ｄｓＲＮＡはリボヌクレアーゼタンパク質ダイサーを活性化させることによってＲＮＡｉを開始し、ダイサーはｄｓＲＮＡに結合してそれを切断することにより、数個の対を成さないオーバハング塩基を各末端に有する２１〜２５塩基対の二本鎖断片を生じさせる。これらの短鎖二本鎖断片は低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）と呼ばれる。
【０４３２】
本明細書で使用されるとき、用語「短鎖／低分子干渉性ＲＮＡ」または「ｓｉＲＮＡ」は、ＲＮＡｉを誘導または媒介する能力を有する約５〜６０ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）を含むＲＮＡ分子（またはＲＮＡ類似体）を指す。好ましくは、ｓｉＲＮＡ分子は、約１５〜３０ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体、より好ましくは約１６〜２５ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、更により好ましくは約１８〜２３ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、および更により好ましくは約１９〜２２ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）（例えば、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドまたはヌクレオチド類似体）を含む。用語「短鎖」ｓｉＲＮＡは、５〜２３ヌクレオチド、好ましくは２１ヌクレオチド（またはヌクレオチド類似体）、例えば、１９、２０、２１または２２ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。用語「長鎖」ｓｉＲＮＡは、２４〜６０ヌクレオチド、好ましくは約２４〜２５ヌクレオチド、例えば、２３、２４、２５または２６ヌクレオチドを含むｓｉＲＮＡを指す。短鎖ｓｉＲＮＡは、一部の例では、１９ヌクレオチド未満、例えば、１６、１７または１８ヌクレオチド、または僅か５ヌクレオチドを含んでもよく、但し、これらの短いｓｉＲＮＡはＲＮＡｉを媒介する能力を保持しているものとする。同様に、長鎖ｓｉＲＮＡは、一部の例では、２６ヌクレオチド超、例えば、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、または更には６０ヌクレオチドを含んでもよく、但し、これらの長いｓｉＲＮＡは、短鎖ｓｉＲＮＡへの更なるプロセシング、例えば酵素的プロセシングがない限りＲＮＡｉまたは翻訳抑制を媒介する能力を保持しているものとする。ｓｉＲＮＡは、一本鎖ＲＮＡ分子（ｓｓ−ｓｉＲＮＡ）またはハイブリダイズしてｓｉＲＮＡ二重鎖と呼ばれる二重鎖構造を形成するセンス鎖およびアンチセンス鎖を含む二本鎖ＲＮＡ分子（ｄｓ−ｓｉＲＮＡ）であってもよい。本発明によれば、組換えＡＡＶベクターは、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、マイクロＲＮＡまたはそれらの前駆体など、１つ以上のＲＮＡｉ分子をコードし得る。
【０４３３】
本明細書で使用されるとき、ｓｉＲＮＡ分子の「アンチセンス鎖」または「第１鎖」または「ガイド鎖」という用語は、サイレンシングの標的となる遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０ヌクレオチド、例えば、約１５〜３０、１６〜２５、１８〜２３または１９〜２２ヌクレオチドの一部分と実質的に相補的な鎖を指す。アンチセンス鎖または第１鎖は、標的特異的サイレンシングを誘導するのに所望の標的ｍＲＮＡ配列と十分に相補的な、例えば、ＲＮＡｉ機構または過程によって所望の標的ｍＲＮＡの破壊を引き起こすのに十分に相補的な配列を有する。
【０４３４】
本明細書で使用されるとき、ｓｉＲＮＡ分子の「センス鎖」または「第２鎖」または「パッセンジャー鎖」という用語は、アンチセンス鎖または第１鎖と相補的な鎖を指す。ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖とセンス鎖とはハイブリダイズして二重鎖構造を形成する。本明細書で使用されるとき、「ｓｉＲＮＡ二重鎖」は、サイレンシングの標的となる遺伝子のｍＲＮＡの約１０〜５０ヌクレオチドの一部分と十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖と、ｓｉＲＮＡ鎖と二重鎖を形成するのに十分な相補性を有するｓｉＲＮＡ鎖とを含む。本発明によれば、組換えＡＡＶベクターは、センス鎖および／またはアンチセンス鎖をコードし得る。
【０４３５】
本明細書で使用されるとき、用語「相補」は、ポリヌクレオチドが互いに塩基対を形成する能力を指す。塩基対は、典型的には逆平行ポリヌクレオチド鎖におけるヌクレオチド単位間の水素結合によって形成される。相補ポリヌクレオチド鎖は、ワトソン・クリック方式（例えば、ＡとＴ、ＡとＵ、ＣとＧ）、または二重鎖の形成を可能にする任意の他の方式で塩基対を形成することができる。当業者は認識しているとおり、ＤＮＡと対照的にＲＮＡを使用するとき、チミンでなくウラシルがアデノシンと相補的と見なされる塩基である。しかしながら、本発明の文脈でＵと表記されるとき、特に指定されない限り、Ｔに置き換え可能であることが含意される。完全な相補性または１００％の相補性とは、一方のポリヌクレオチド鎖の各ヌクレオチド単位が第２のポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド単位と水素結合を形成することができる状況を指す。完全でない相補性とは、２本の鎖の全てではないものの一部のヌクレオチド単位が互いに水素結合を形成することができる状況を指す。例えば、２本の２０ｍｅｒについて、各鎖の２個の塩基対のみが互いに水素結合を形成することができる場合、このポリヌクレオチド鎖は１０％の相補性を呈する。同じ例で、各鎖の１８個の塩基対が互いに水素結合を形成することができる場合、このポリヌクレオチド鎖は９０％の相補性を呈する。
【０４３６】
本明細書で使用されるとき、「ターゲティング」は、標的核酸にハイブリダイズして所望の効果を誘導するであろう核酸配列の設計および選択過程を意味する。
用語「遺伝子発現」は、核酸配列が首尾よく転写およびほとんどの場合に翻訳を受けてタンパク質またはペプチドを産生する過程を指す。明確にするため、「遺伝子発現」の測定に言及するとき、それは、測定が核酸転写産物、例えばＲＮＡもしくはｍＲＮＡの測定またはアミノ酸翻訳産物、例えばポリペプチドもしくはペプチドの測定であり得ることを意味するものと理解されなければならない。ＲＮＡ、ｍＲＮＡ、ポリペプチドおよびペプチドの量またはレベルの測定方法は当該技術分野において周知である。
【０４３７】
本明細書で使用されるとき、用語「突然変異」は、後続の世代に伝達され得る変異型（「突然変異型」とも称される）をもたらす遺伝子の構造の任意の変化を指す。遺伝子の突然変異は、ＤＮＡにおける一塩基の変化、または遺伝子もしくは染色体のより大きい一部分の欠失、挿入、もしくは再配列によって引き起こされ得る。
【０４３８】
本明細書で使用されるとき、用語「ベクター」は、本発明のＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチドなどの異種分子を輸送し、形質導入し、またはその他担体として働く任意の分子または部分を意味する。「ウイルスベクター」は、目的の分子、例えば、トランス遺伝子をコードするか、もしくは含む、１つ以上のポリヌクレオチド領域、ポリペプチドもしくはマルチポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、または低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）などの調節性核酸を含むベクターである。ウイルスベクターは一般に、遺伝物質を細胞に送達するのに使用される。ウイルスベクターは、具体的適用のために修飾されることが多い。ウイルスベクターの種類は、レトロウイルスのベクター、レンチウイルスのベクター、アデノウイルスのベクター、およびアデノ随伴ウイルスのベクターを含む。
【０４３９】
用語「アデノ随伴ウイルス」または「ＡＡＶ」もしくは「ＡＡＶベクター」は、本明細書で使用されるとき、アデノ随伴ベクターの成分を含む、またはそれに由来する任意のベクターを指し、哺乳類細胞、好ましくはヒト細胞を感染させるのに好適である。用語ＡＡＶベクターは、典型的には、ｓｉＲＮＡ二重鎖をコードする核酸分子を含むＡＡＶ型ウイルス粒子またはビリオンを意味する。ＡＡＶベクターは、血清型の組合せ（すなわち「シュードタイプ」ＡＡＶ）を含めた様々な血清型または様々なゲノム（例えば一本鎖または自己相補的）に由来し得る。加えて、ＡＡＶベクターは複製欠損型および／またはターゲット型であってもよい。
【０４４０】
本明細書で使用されるとき、語句「遺伝子の発現を阻害する」は、遺伝子の発現産物量の減少を生じさせることを意味する。発現産物は、遺伝子から転写されたＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）または遺伝子から転写されたｍＲＮＡから翻訳されたポリペプチドであり得る。典型的には、ｍＲＮＡのレベルが減少することにより、そこから翻訳されるポリペプチドのレベルが減少することになる。発現レベルは標準的なｍＲＮＡまたはタンパク質測定技法を用いて決定し得る。
【０４４１】
本明細書で使用されるとき、用語「インビトロ」は、生物（例えば、動物、植物、または微生物）の中でなく、むしろ人工環境、例えば試験管または反応槽、細胞培養物、ペトリ皿等で起こるイベントを指す。
【０４４２】
本明細書で使用されるとき、用語「インビボ」は、生物（例えば、動物、植物、または微生物またはその細胞もしくは組織）の中で起こるイベントを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「修飾された」は、本発明の分子の変化した状態または構造を指す。分子は、化学的、構造的、および機能的に修飾することを含め、多くの方法で修飾し得る。
【０４４３】
本明細書で使用されるとき、用語「合成」は、人間の手で作製、調製、および／または製造されることを意味する。本発明のポリヌクレオチドまたはポリペプチドまたは他の分子の合成は化学的または酵素的であってもよい。
【０４４４】
本明細書で使用されるとき、用語「トランスフェクション」は、外因性核酸を細胞に導入する方法を指す。トランスフェクション方法としては、限定はされないが、化学的方法、物理的処理およびカチオン性脂質または混合が挙げられる。細胞にトランスフェクトし得る薬剤の一覧は広範であり、限定はされないが、ｓｉＲＮＡ、センスおよび／またはアンチセンス配列、ＡＡＶベクターまたはＡＡＶ粒子、１つ以上の遺伝子をコードし、かつ発現プラスミドに編成されるＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片などが含まれる。
【０４４５】
本明細書で使用されるとき、「オフターゲット」は、任意の１つ以上の標的、遺伝子、または細胞転写物に対する任意の意図しない効果を指す。
本明細書で使用されるとき、語句「薬学的に許容可能」は、本明細書では、妥当な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激作用、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症のない、妥当なリスク対効果比に相応の、ヒトおよび動物の組織との接触における使用に好適な化合物、材料、組成物、および／または剤形を指して用いられる。
【０４４６】
本明細書で使用されるとき、薬剤の「有効量」という用語は、有益なまたは所望の結果、例えば臨床結果を生じさせるのに十分な量であり、そのため「有効量」は、それが適用されるコンテクストに依存する。例えば、ＡＬＳを治療する薬剤を投与する文脈では、薬剤の有効量は、例えば、薬剤の投与を伴わずに得られる応答と比較して、本明細書に規定される、ＡＬＳの治療を達成するのに十分な量である。
【０４４７】
本明細書で使用されるとき、用語「治療有効量」は、送達される薬剤（例えば、核酸、薬物、治療用薬剤、診断用薬剤、予防用薬剤等）についての、感染、疾患、障害、および／または病態に罹患しているまたはそれに罹り易い対象に投与したとき感染、疾患、障害、および／または病態を治療し、その症状を改善し、それを診断し、予防し、および／またはその発症を遅延させるのに十分な量を意味する。
【０４４８】
本明細書で使用されるとき、用語「対象」または「患者」は、例えば実験的、診断的、予防的、および／または治療的目的で本発明に係る組成物を投与し得る任意の生物を指す。典型的な対象としては、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、チンパンジーならびに他の類人猿およびサル種などの非ヒト霊長類、およびヒトなど、哺乳類）および／または植物が挙げられる。
【０４４９】
本明細書で使用されるとき、用語「予防する」または「予防」は、数週間、数カ月間、または数年間を含めたある期間にわたり病態または疾患の発生、展開または進行を遅延させるまたは未然に防ぐことを指す。
【０４５０】
用語「治療」または「治療する」は、本明細書で使用されるとき、疾患の治癒または改善に用いられる１つ以上の特定の手順の適用を指す。特定の実施形態において、特定の手順は１つ以上の医薬品の投与である。本発明の文脈では、特定の手順は、ＳＯＤ１遺伝子を標的とする１つ以上のｓｉＲＮＡ二重鎖またはｄｓＲＮＡの投与である。
【０４５１】
本明細書で使用されるとき、用語「改善」または「改善する」は、病態または疾患の少なくとも１つの指標の重症度を低下させることを指す。例えば、神経変性障害のコンテクストでは、改善には、ニューロン喪失の低減が含まれる。
【０４５２】
本明細書で使用されるとき、用語「投与する」は、対象に医薬品または組成物を提供することを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「神経変性」は、神経細胞死をもたらす病的状態を指す。多数の神経障害が共通の病的状態として神経変性を共有する。例えば、アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）は、いずれも慢性神経変性を引き起こし、慢性神経変性は数年の期間にわたる緩慢な進行性の神経細胞死によって特徴付けられる一方、急性神経変性は、脳卒中などの虚血、または外傷性脳傷害などの外傷の結果としての、または例えば脊髄損傷もしくは多発性硬化症によって引き起こされる脱髄または外傷による軸索切断の結果としての、神経細胞死の突発的な発生によって特徴付けられる。一部の神経障害では、例えばＡＬＳにおける運動ニューロン変性など、主に１つのタイプのニューロン細胞が変性する。
【０４５３】
（実施例）
実施例１．ＳＯＤ１ターゲティングポリヌクレオチド設計（ｓｉＲＮＡ）
ｓｉＲＮＡ設計を実施して、ヒトＳＯＤ１遺伝子を標的とするｓｉＲＮＡを同定する。設計には、それぞれ、ヒト（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿０００４５４．４；配列番号１）、カニクイザル（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１２８５４０６．１；配列番号２）、アカゲザル（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１０３２８０４．１；配列番号２）、およびカニス・ルプス・ファミリアーリス（ｃａｎｉｓ  ｌｕｐｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）（ＮＣＢＩ参照配列ＮＭ＿００１３０３５；配列番号４）からのＳＯＤ１転写物を使用する（表１０）。アンチセンス鎖の２〜１８位についてヒトＳＯＤ１転写物と１００％同一性を有し、およびアンチセンス鎖の２〜１８位について非ヒト霊長類ＳＯＤ１転写物と部分的にまたは１００％同一性であるｓｉＲＮＡ二重鎖が設計される。全てのｓｉＲＮＡ二重鎖において、アンチセンス鎖の１位は、Ｕを有するように操作し、センス鎖の１９位は、この位置で二重鎖と対合しないためにＣを有するように操作する。
【０４５４】
【表１０−１】
2021502060.tif 000011
【０４５５】
【表１０−２】
2021502060.tif 000012
実施例２．ＡＬＳ動物モデル
イヌを使用して、ＡＬＳを治療するための、ＳＯＤ１を標的とするＡＡＶ遺伝子治療の有効性を研究することができる。イヌ変性性脊髄症（ＤＭ）は、理想的な疾患モデルである。それは、イヌＤＭの原因は、天然に存在するＳＯＤ１突然変異（Ｅ４０Ｋ）であり、イヌは、比較的大きな脊髄／脳を有し、ＤＭ罹患イヌは、同質なパターンの疾患進行および組織病理学的所見を示し、ＤＭにおける機能的欠陥は、ヒトＡＬＳの上位運動ニューロン発症のある形態と類似点を共有するためである（アワノら（Ａｗａｎｏ  ｅｔ  ａｌ．）著、「ゲノムワイド関連分析は、イヌ変性性脊髄症には筋萎縮性側索硬化症と類似したＳＯＤ１突然変異があることを明らかにする（Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ  ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ａｎａｌｙｓｉｓ  ｒｅｖｅａｌｓ  ａ  ＳＯＤ１  ｍｕｔａｔｉｏｎ  ｉｎ  ｃａｎｉｎｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ  ｔｈａｔ  ｒｅｓｅｍｂｌｅｓ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」；ＰＮＡＳ  ２００９年２月；第１０６巻（８号）；ｐ．２７９４〜２７９９、この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。
【０４５６】
イヌＤＭは、ＡＬＳと同様に麻痺および死に結び付く天然に存在する成体発症型進行性疾患である（アベリル，ディージェイ．（Ａｖｅｒｉｌｌ，ＤＪ．）著、「高齢シェパードイヌの変性性脊髄症：臨床および病理学的所見（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  ｔｈｅ  ａｇｉｎｇ  Ｇｅｒｍａｎ  Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ｄｏｇ：  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ａｎｄ  ｐａｔｈｏｌｏｇｉｃ  ｆｉｎｄｉｎｇｓ．）」、ジャーナル・オブ・アメリカン・ベテリナリ・メディカル・アソシエーション（Ｊ  Ａｍ  Ｖｅｔ  Ｍｅｄ  Ａｓｓｏｃ）  １９７３年；第１６２巻：ｐ．１０４５〜１０５１；この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。最初期の臨床徴候は、イヌが８歳以上になると始まる。ＤＭは、多くの犬種に影響を及ぼし、全体的な有病率は０．１９％である。疾患発症および臨床進行は、全犬種にわたって同質であり、感覚ニューロンならびに上位および下位運動ニューロンの変性を示す。臨床像は、４つの臨床疾患ステージに分類されている（コーツ  ジェイアール（Ｃｏａｔｅｓ  ＪＲ）、ウィニンガー  エフエー（Ｗｉｎｉｎｇｅｒ  ＦＡ）著、「イヌ変性性脊髄症（Ｃａｎｉｎｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）」、ベテリナリ・クリニクス・オブ・ノース・アメリカ・スモール・アニマル・プラクティス（Ｖｅｔ  Ｃｌｉｎ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍ  Ｓｍａｌｌ  Ａｎｉｍ  Ｐｒａｃｔ）、２０１０年；第４０巻：ｐ．９２９〜９５０およびカナゾノ  エス（Ｋａｎａｚｏｎｏ  Ｓ）、ピツア  ピー（Ｐｉｔｈｕａ  Ｐ）、ジョンソン  ジーシーら（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＧＣ  ｅｔ  ａｌ．）著、「イヌ変性性脊髄症の臨床進行（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）」、２０１３年、アメリカン・カレッジ・オブ・ベテリナリ・インターナル・メディシン・アニュアル・フォーラム（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｎｎｕａｌ  Ｆｏｒｕｍ）、シアトル、ワシントン州、６月１６〜１８日、２０１３年、ジャーナル・オブ・インターナル・メディシン（Ｊ  Ｖｅｔ  Ｉｎｔ  Ｍｅｄ）、２０１３年；第２４巻（３号）：ｐ．６９９；これらの各々の内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。臨床徴候は、非対称痙性不全対麻痺および全身性固有受容運動失調として出現し（ステージＩ）、疾患発症から１年以内に、骨盤肢下位運動ニューロン徴候を有する歩行不能不全対麻痺／対麻痺へと進行する（ステージＩＩ）。イヌ所有者は、イヌが骨盤肢歩行不能になると安楽死を選ぶことが多い。神経学的欠陥は進行して、胸肢虚弱（ステージＩＩＩ）を含み、続いて弛緩性四肢麻痺、全身性筋萎縮および脳幹機能障害（ステージＩＶ）を含む。
【０４５７】
ＤＭの病理学的特徴は、ＡＬＳの病理学的特徴と類似しており、側索の背側部分でおよび胸郭下部〜中間領域の脊髄後柱で最も重度である軸索喪失、二次性脱髄およびアストログリア増殖（硬化症）が挙げられる。ＤＭを有する伴侶イヌの所有者は、疾患進行の様々なステージでペットを安楽死させるので、安楽死の時点で収集したこれらのイヌに由来する組織を検査することによって、すべての進行ステージにおいてこの疾患を研究し、それにより脊髄、末梢神経、および筋肉で発生する病理間の経時的関係性のより良好な理解を獲得することが可能である。また、著しい感覚ニューロン変性は、運動ニューロン病理のあらゆる証拠に先行する。したがって、ＤＭにおける病変の分布および臨床疾患進行は、ＵＭＮ発症ＡＬＳで報告されたものに類似し、ＤＭ罹患イヌにおけるＵＭＮ徴候は、後にＬＭＮ徴候へと進行する。
【０４５８】
予備的データは、ステージ１（歩行可能、徴候の発症）からステージ２（歩行不能）までの疾患進行の期間中央値は１０カ月である（９５％ＣＩ、９〜１２カ月）（カナゾノ  エス（Ｋａｎａｚｏｎｏ  Ｓ）、ピツア  ピー（Ｐｉｔｈｕａ  Ｐ）、ジョンソン  ジーシーら（Ｊｏｈｎｓｏｎ  ＧＣ  ｅｔ  ａｌ．）著、「イヌ変性性脊髄症の臨床進行（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ  ｏｆ  ｃａｎｉｎｅ  ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ）」、２０１３年、アメリカン・カレッジ・オブ・ベテリナリ・インターナル・メディシン・アニュアル・フォーラム（Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｉｎｔｅｒｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  Ａｎｎｕａｌ  Ｆｏｒｕｍ）、シアトル、ワシントン州、６月１６〜１８日、２０１３年、ジャーナル・オブ・インターナル・メディシン（Ｊ  Ｖｅｔ  Ｉｎｔ  Ｍｅｄ）、２０１３年；第２４巻（３号）：ｐ．６９９；この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。ステージ１からステージ２へと移行する時間には、犬種間で有意差はなかった。したがって、ＤＭの疾患進行が同質であることは、治療有効性の縦断的尺度および検出を容易にするであろう。ＡＬＳ治療を動物からヒトへとまたはその逆に橋渡しする場合、治療有効性が正確であり得るように疾患進行を診断およびモニターするための、種にわたって共有される高感度で客観的な疾患マーカーが必要である。
【０４５９】
本明細書に記載されるＳＯＤ１を標的とするＡＡＶはいずれも、イヌＤＭモデルを使用して研究され得る。
実施例３．イヌＤＭを測定する方法
概要
上位（脳および脊髄）および下位（筋肉および神経）運動ニューロンに対する損傷の進行を測定するための信頼できる方法は、ＤＭの早期診断を提供し、臨床症候群に対する病変の寄与を決定し、治療治験における疾患進行の客観的機能性尺度またはバイオマーカーとしての役割を果たすであろう。更に、これらの技法は、ＡＬＳ患者の療法治験と同様の療法治験において疾患進行をモニターするための結果評価を提供することができた。本発明者らの研究では、疾患進行を遅延させるためのＩＴ送達ＡＡＶ．ｉＳＯＤ１を評価することになる。治療群と未治療群との縦断的疾患の有意差は、ＤＭ罹患イヌにおけるＬＭＮおよびＵＭＮ保存の定量可能な尺度を提供するであろう。下記は、進行を縦断的にモニタリングするための、イヌＤＭにおける機能性疾患マーカー研究の簡単な要約である。
【０４６０】
ニューロフィラメントタンパク質（ＮＦ）
ニューロフィラメントタンパク質（ＮＦ）は、有鞘軸索の最も豊富な細胞骨格タンパク質であり、微小管よりも数が５〜１０倍多い。ＮＦは、ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦ−Ｌ）、中鎖（ＮＦＭ）および重鎖（ＮＦ−Ｈ）タンパク質の不可避的ヘテロポリマーである。インビボでは、ＮＦは、髄鞘形成に付随して生じる軸索直径の大幅な増加に必要である。血液およびＣＳＦにおけるＮＦ−ＬおよびＮＦ−Ｈレベルは、様々な疾患のバイオマーカーとしてアッセイされている。具体的には、ヒトＡＬＳの場合、血液およびＣＳＦ中のＮＦのアッセイは、ＮＦ−Ｈのリン酸化形態（ｐＮＦ−Ｈ）に着目している。ＡＬＳの確定症例から単離されたＣＳＦ中のｐＮＦ−Ｈレベルは生存と逆相関し、ＮＦ−Ｈが疾患ステージの信頼できるマーカーであることを示唆した。更に、ＡＬＳの疾患進行では、神経学的減退の速度および生存を反映する、縦断的に評価された血漿ＮＦ−Ｈレベルが、定まった経路を辿る。
【０４６１】
凍結血清およびＣＳＦ試料を解凍し、希釈緩衝液で３倍に希釈する。ヒトｐＮＦ−Ｈ抗体（バイオベンダー・リサーチ・アンド・ダイアゴノスティック・プロダクツ社（ＢｉｏＶｅｎｄｏｒ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）、チェコ共和国モドリス（Ｍｏｄｒｉｃｅ））を使用して、ショー（Ｓｈａｗ）博士の研究室プロトコールに従って市販のＥＬＩＳＡキットでｐＮＦ−Ｈのアッセイを実施する。既知濃度に対する標準物質の平均吸光度を対数スケールでプロッティングすることによって標準曲線を作成する。
【０４６２】
ＣＳＦおよび血液ｐＮＦ−Ｈは、イヌにおいてＤＭの信頼できるバイオマーカーであるはずであり、ＡＡＶ−ｉＳＯＤ１薬物動力学の最も侵襲性が低い縦断的尺度として使用し得る。
【０４６３】
磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）
拡散テンソル画像法（ＤＴＩ）およびプロトン磁気共鳴分光法（ＭＲＳ）を含む高性能磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）は、ＡＬＳの分析においてＵＭＮ系の定量的評価の技法としての能力を有する。ＤＴＩは、水分子の拡散特性をインビボで特徴付けることができる。ＤＴＩは、局所微細構造における拡散異方性を、部分的異方性によってインビボで定量化することができる。２つのＤＴＩに基づくスカラー指標：みかけの拡散係数（ＡＤＣ）および部分的異方性（ＦＡ）を使用して、局所脳組織の微細構造を特徴付けることが多い。ＡＤＣは、方向的に平均された拡散強度の尺度であり、局所脳組織の完全性に関係する。ＦＡは、拡散異方性の度合いを表し、細胞組織の整列度合いを反映する。異方性の減少は、末梢神経系および中枢神経系の両方において軸索線維変性およびミエリン分解を反映し得ることが示唆されている。異方性の減少は、ＡＬＳを有する患者の皮質脊髄路（ＣＳＴ）および脳梁で見られ、疾患経過の初期に生じ、疾患重症度に関係することが以前に報告されている。ＡＬＳの病理学的固有特徴としてのＣＳＴ変性は、ＤＭ罹患イヌで見られる側索変性と同様である。側索および後索変性は、後根神経節変性（つまり、脊髄小脳路変性）と同様である（マーチ  ピーエー（Ｍａｒｃｈ  ＰＡ）、コーツ  ジェイアール（Ｃｏａｔｅｓ  ＪＲ）、アビヤド  アールら（Ａｂｙａｄ  Ｒ  ｅｔ  ａｌ．）著、「１８匹のペンブルック・ウェルシュ・コーギ犬における変性性脊髄症（Ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ  Ｍｙｅｌｏｐａｔｈｙ  ｉｎ  １８  Ｐｅｍｂｒｏｋｅ  Ｗｅｌｓｈ  Ｃｏｒｇｉ  Ｄｏｇｓ）」、ベテリナリ・パソロジー（Ｖｅｔ  Ｐａｔｈｏｌ）、２００９年；ｐ．２４１〜２５０；この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。
【０４６４】
ＭＲＳは、脳の特定領域の神経化学的プロファイルのインビボでの測定を可能にし、典型的には、ＮＡＡ対クレアチン（Ｃｒ）の比として現される、ニューロン完全性のマーカーであるＮ−アセチル化合物共鳴（主に、Ｎ−アセチルアスパルテート（ＮＡＡ））の測定に依存する。幾つかの研究は、ＡＬＳを有する患者の運動皮質のレベルにおいてＮＡＡおよびＮＡＡ／Ｃｒ比が減少することを示している（ピオロ  イーピー（Ｐｉｏｒｏ  ＥＰ）、マヨール  エーダブリュー（Ｍａｊｏｒｓ  ＡＷ）、ミツモト  エイチら（Ｍｉｔｓｕｍｏｔｏ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．）著、「ＡＬＳ延髄における神経変性および過剰グルタメート＋グルタミンのＨ−ＭＲＳ証拠（Ｈ−ＭＲＳ  ｅｖｉｄｅｎｃｅ  ｏｆ  ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｅｘｃｅｓｓ  ｇｌｕｔａｍａｔｅ  ＋  ｇｌｕｔａｍｉｎｅ  ｉｎ  ＡＬＳ  ｍｅｄｕｌｌａ）」、ニューロロジー（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）、１９９９年；第５３巻：ｐ．７１〜７９およびルーニー  ダブリューディー（Ｒｏｏｎｅｙ  ＷＤ）、ミラー  アールジー（Ｍｉｌｌｅｒ  ＲＧ）、ゲリナス  ディーら（Ｇｅｌｉｎａｓ  Ｄ  ｅｔ  ａｌ．）著、「ＡＬＳの運動皮質および皮質脊髄路におけるＮ−アセチルアスパルテートの減少（Ｄｅｃｒｅａｓｅｄ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌａｓｐａｒｔａｔｅ  ｉｎ  ｍｏｔｏｒ  ｃｏｒｔｅｘ  ａｎｄ  ｃｏｒｔｉｃｏｓｐｉｎａｌ  ｔｒａｃｔ  ｉｎ  ＡＬＳ）」、ニューロロジー（Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ）、１９９８年；第５０巻：ｐ．１８００〜１８０５；これらの各々の内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。ＤＭは、主に脊髄疾患であると考えられているが、それを除けばＡＬＳとの高い類似性を有するため、脳に生じつつあり得る神経化学的変化の存在も調査に値する。これらの神経化学的変化は、組織病理に同定可能な他の微細構造変化が無くとも存在することがありえる。
【０４６５】
ＭＲＩを使用することにより、治療ＤＭ罹患イヌおよび未治療ＤＭ罹患イヌ間の、ＤＴＩにおける異方性レベル低下および目的のＣＮＳ領域でのＮＡＡレベル低下の減退の違いを含む、ＡＡＶ−ｉＳＯ１のＩＴ投与の効果を研究することができる。
【０４６６】
運動単位数推定法（ＭＵＮＥ）
運動単位数推定法（ＭＵＮＥ）は、ＬＭＮの喪失または運動単位を定量化するための非侵襲性電気生理学的技法である。ＭＵＮＥは、臨床徴候の発症前のＬＭＮ機能の喪失を示すために、およびＡＬＳ進行の予測因子として使用されている。ＭＵＮＥは、過最大（ｓｕｐｒａｍａｘｉｍａｌ）複合筋活動電位（ＣＭＡＰ）を、平均単一運動単位電位（ＳＭＵＰ）で除算することによって決定される（マコーマス  エージェイ（ＭｃＣｏｍａｓ  ＡＪ）、フォーセット  ピーアール（Ｆａｗｃｅｔｔ  ＰＲ）、キャンベル  エムジェイ（Ｃａｍｐｂｅｌｌ  ＭＪ）、シーカ  アールイーピー（Ｓｉｃａ  ＲＥＰ）著、「ヒト筋肉内の運動単位数の電気生理学的推定（Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃａｌ  ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｎｕｍｂｅｒ  ｏｆ  ｍｏｔｏｒ  ｕｎｉｔｓ  ｗｉｔｈｉｎ  ａ  ｈｕｍａｎ  ｍｕｓｃｌｅ）」、ジャーナル・オブ・ニューロロジー・ニューロサージ・サイカイアトリー（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｌ  Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ  Ｐｓｙｃｈｉａｔｒｙ）、１９７１年；第３４巻：ｐ．１２１〜１３１；この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。負のピーク面積または振幅を使用して、ＳＭＵＰおよびＣＭＡＰを計算し得る。計算は、その筋肉群を神経支配する運動軸索の数を推定する、単位のない数をもたらす。研究は、ＭＵＮＥ計数の減少が、ＡＬＳ患者の疾患進行と良好に相関することを示している（シェフナー  ジェイエム（Ｓｈｅｆｎｅｒ  ＪＭ）、クドコウィクズ  エムイー（Ｃｕｄｋｏｗｉｃｚ  ＭＥ）、チャン  エイチら（Ｚｈａｎｇ  Ｈ  ｅｔ  ａｌ．）著、「多施設臨床治験における統計ＭＵＮＥの使用（Ｔｈｅ  ｕｓｅ  ｏｆ  ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ  ＭＵＮＥ  ｉｎ  ａ  ｍｕｌｔｉｃｅｎｔｅｒ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ）」、マッスル・ナーブ（Ｍｕｓｃｌｅ  Ｎｅｒｖｅ）、２００４年；第３０巻：ｐ．４６３〜４６９；この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。ＡＬＳの初期徴候を有する患者の縦断的モニタリングの値は、経時的な変化率であり、したがって連続測定を必要とし得る。ＭＵＮＥ技法は、平均ＳＭＵＰの取得方法が異なる。改変型増分刺激では、刺激電極は同じ場所に位置したままであり、段階的な電気刺激を末梢神経に適用して、連続的な増分誘発電位を得る（マコーマスら（ＭｃＣｏｍａｓ  ｅｔ  ａｌ．）、１９７１年）。ＤＭ罹患イヌの縦断的研究に、短指伸筋の改変型増分刺激ＭＵＮＥ技法を使用し得る。ＤＭの動態研究における他の臨床基準を用いてＭＵＮＥをイヌＤＭに使用することにより、ＬＭＮの疾患進行だけでなく、ＡＬＳ患者で使用される代用マーカーと同様の療法に対する応答の、高感度で特異的な尺度（マーカー）が提供されるであろう。
【０４６７】
半定量的自発運動スケール
半定量的手順は、序数的自発運動評価スケールに沿って動物の機能をスコア化し得る。オルビーら（Ｏｌｂｙ  ｅｔ  ａｌ．）は、げっ歯動物で使用される拡張型自発運動スケールであるＢＢＢスケールを適合させた（オルビー  エヌジェイ（Ｏｌｂｙ  ＮＪ）、デ・リシオ  エル（Ｄｅ  Ｒｉｓｉｏ  Ｌ）、ムニャナ  ケイアールら（Ｍｕｎａｎａ  ＫＲ  ｅｔ  ａｌ．）著、「急性脊髄損傷を有するイヌにおける機能性スコア化方式の開発（Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  ａ  ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｓｃｏｒｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｗｉｔｈ  ａｃｕｔｅ  ｓｐｉｎａｌ  ｃｏｒｄ  ｉｎｊｕｒｉｅｓ）」、アメリカン・ジャーナル・オブ・ベテリナリ・リサーチ（Ａｍ  Ｊ  Ｖｅｔ  Ｒｅｓ．）、２００１年；第６２巻：ｐ．１６２４〜１６２８；この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。このスケールは、急性脊髄損傷後の麻痺イヌにおける骨盤肢および尾部機能（運動および感覚）の回復を評価するために検証された（オルビー  エヌジェイ（Ｏｌｂｙ  ＮＪ）、ハリス  ティー（Ｈａｒｒｉｓ  Ｔ）、バー  ジェイら（Ｂｕｒｒ  Ｊ  ｅｔ  ａｌ．）著、「急性椎間板ヘルニア後のイヌにおける骨盤肢機能の回復（Ｒｅｃｏｖｅｒｙ  ｏｆ  ｐｅｌｖｉｃ  ｌｉｍｂ  ｆｕｎｃｔｉｏｎ  ｉｎ  ｄｏｇｓ  ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ  ａｃｕｔｅ  ｉｎｔｅｒｖｅｒｔｅｂｒａｌ  ｄｉｓｃ  ｈｅｒｎｉａｔｉｏｎｓ）」、ジャーナル・オブ・ニューロトラウマ（Ｊ  Ｎｅｕｒｏｔｒａｕｍａ）、２００４年；第２１巻：ｐ．４９〜５９；この内容は、参照により全体として本明細書に援用される）。回復は、１４個の異なるグレードに分割された。オルビー自発運動スケールは、ＤＭ罹患イヌの歩行状態を評価するために、改変することができる。観察者内信頼性のために、反復観察間に少なくとも４８時間の時間をおいて２週間の期間にわたって各々３回セグメントをスコア化した５人の観察者によってビデオを検討した。各イヌに割り当てられたスコアの平均およびＳＤを使用し、フライスカッパ統計学（Ｆｌｅｉｓｓ  Ｋａｐｐａ−ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ）を使用することによって観察者内および観察者間の変動性係数を算出した。カテゴリー１および２への評価には中程度の一致が存在し、カテゴリー３〜５ではかなりの一致が存在した［バイアス補正値：カッパ（９５％ＣＩ）＝０．６７０（０．５３〜０．７９６）］。この改変型自発運動評価スケールは、歩行可能状態（ステージ１）から歩行不能状態（ステージ２）への歩調をより高感度な様式で縦断的に評価する役目を果たすであろう。この評価スケールを使用することにより、歩行運動の重症度をより細かくモニターすることができる。例えば、９のスコアは、イヌが歩行不能になる１０カ月の時点と等しい。
【０４６８】
電気インピーダンス筋運動描記法（ＥＩＭ）
電気インピーダンス筋運動描記法（ＥＩＭ）は、局所的組織インピーダンスを測定する非侵襲性電気生理学的技法である。インピーダンス法はすべて、高周波数および低強度の交流電流を物質に適用すると、交流電流が物質を移動すると共にエネルギーが消散するため、測定可能な電圧が生じることになるという基本原理に基づく。したがって、電気インピーダンスを使用することにより、適用した電流に対する組織の影響を測定することができる。インピーダンスは、オームの法則Ｖｖｏｌｔａｇｅ＝Ｉｃｕｒｒｅｎｔ×ＲｒｅｓｉｓｔａｎｃｅまたはＶ＝Ｉ×Ｚに基づいて数学的に記述することができる。式中、Ｚは、回路の複素インピーダンスを表し、その固有抵抗およびそのリアクタンス（Ｘ）の組合せであり、後者は、回路中のコンデンサーおよび／または誘導子の存在によって生み出される電流の流れの妨害である。骨格筋は、電流の流れに対する強い異方性または方向依存性という固有の特徴を有する。筋細胞は、円柱状であり、電流がそれ全体にわたって容易に流れることが可能であり、電流の方向に応じてインピーダンス値が異なる。筋細胞膜の脂質二分子膜は、リアクタンス（Ｘ）の発生源であるコンデンサーとして作用し、細胞内および細胞外流体は、抵抗（Ｒ）の発生源である抵抗器として作用する。主要なＥＩＭ出力変数は、θ＝ａｒｃｔａｎ（Ｘ／Ｒ）という関係性を使用した位相角（θ）である。測定は、目的の領域全体に及ぶ複数の電極を使用して得られるか、または空間的に平均された主出力値／変数であるθａｖｇ値を使用して得られる。
【０４６９】
疾患筋肉では、構造および組成の変化は、筋肉の局所的インピーダンスの変更に反映されるであろう。疾患筋肉は、筋線維の萎縮、筋内膜結合組織および脂肪の増加、ならびに浮腫によって顕性となり得る。これらはすべて、抵抗およびリアクタンスに影響を及ぼし得る。主にＡＬＳ患者およびＤＭ患者の組織の死後検査に基づくと、ＡＬＳの筋萎縮特徴は、運動ニューロンの変性に対する二次的なものであると広く考えられている。しかしながら、筋萎縮は、ＡＬＳおよびＤＭの両方において、運動ニューロン変性に関わりなく、およびその前でさえ、かなりの程度生じている可能性がある。疾患変化のパターンを同定するため、ＥＩＭパラメーターは、疾患進行のマーカーおよび結果尺度としての役目を果たすことができる。神経根障害および炎症性ミオパシーの研究に基づくと、より低いθａｖｇ値は、より重度の疾患を反映する。ＡＬＳ患者およびトランスジェニックＡＬＳラットの長期研究は、θａｖｇ値の漸減（ワン  エルエル（Ｗａｎｇ  ＬＬ）、スピーカー  エージェイ（Ｓｐｉｅｋｅｒ  ＡＪ）、リー  ジェイ（Ｌｉ  Ｊ）、ルトコブ  エスビー（Ｒｕｔｋｏｖｅ  ＳＢ）著、「ＳＯＤ１  Ｇ９３Ａ筋萎縮性側索硬化症ラットの運動ニューロン喪失をモニターするための電気インピーダンス筋運動描記法（Ｅｌｅｃｔｒｉｃａｌ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ｍｙｏｇｒａｐｈｙ  ｆｏｒ  ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｍｏｔｏｒ  ｎｅｕｒｏｎ  ｌｏｓｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ＳＯＤ１  Ｇ９３Ａ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ  ｒａｔ）」、クリニカル・ニューロフィジオリジー（Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｐｈｙｓｉｏｌ）、２０１１年１２月；第１２２巻（１２号）：ｐ．２５０５〜１１；タルリ  エーダブリュー（Ｔａｒｕｌｌｉ  ＡＷ）、ガーミリアン  エルピー（Ｇａｒｍｉｒｉａｎ  ＬＰ）、フォガーソン  ピーエム（Ｆｏｇｅｒｓｏｎ  ＰＭ）、ルトコブ  エスビー（Ｒｕｔｋｏｖｅ  ＳＢ）著、「筋萎縮性側索硬化症における局所的筋肉インピーダンス異常（Ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｍｕｓｃｌｅ  ｉｍｐｅｄａｎｃｅ  ａｂｎｏｒｍａｌｉｔｉｅｓ  ｉｎ  ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｌａｔｅｒａｌ  ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）」、ジャーナル・オブ・ニューロマスキュラー・ディジーズ（Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｎｅｕｒｏｍｕｓｃｕｌ  Ｄｉｓ．）、２００９年；第１０巻（３号）：ｐ．９０〜６；これらの各々の内容は、参照により全体として本明細書に援用される）、ならびに生存および他の従来の尺度、つまり努力肺活量およびＡＬＳ機能性評価スケールとの相関性を示している。現在、ＥＩＭの使用に関するかかるデータは、ＤＭ罹患イヌには欠けている。ＥＩＭの応用は、覚醒動物で容易に実施されるという大きな利点を有するが、これまで考察されているほとんどの他の診断マーカーは、全身麻酔を必要とする。ＤＭを罹患しているイヌは、ヒトＡＬＳ患者に類似したＥＩＭ値の変化を示すはずであり、ＡＡＶ．ｉＳＯＤ１による治療は、これらの値に影響を及ぼすであろう。
【０４７０】
実施例４．ＡＬＳ治療のためのＳＯＤ１の標的化
概要
ＡＬＳを治療するためのＳＯＤ１を標的とするＡＡＶ遺伝子治療を、ある形態のＡＬＳに類似している伴侶イヌの天然に存在する疾患であるイヌ変性性脊髄症（ＤＭ）に対する遺伝子治療手法を使用して研究することになる。研究は、標的領域への遺伝子移入の均一な分布を決定するために、投薬パラダイムを評価するであろう。ＡＡＶの髄腔内（ＩＴ）投与は、運動ニューロンの顕著な形質導入を含むより良好なＣＮＳ分布、より少ない末梢組織曝露および全身投薬よりも低減された免疫応答を以前に示している。ＩＴ投与によるＳＯＤ１を標的とするＡＡＶ遺伝子治療の正常イヌにおける安全性、薬理学（分布を含む）および有効性ならびにＡＬＳの天然に存在する動物モデルであるイヌＤＭを評価することができる。
【０４７１】
コンストラクト、カプシドおよび投薬パラダイムの選択
最適なＲＮＡｉ配列を同定するため、ＳＯＤ１を選択的に標的とする１６９個の配列を設計し、合成し、ＨｅＬａ細胞にてインビトロで試験した。１００ｐＭでは、およそ２５個の配列が、８０％を超えてＳＯＤ１  ｍＲＮＡを阻害した。
【０４７２】
投薬
ＡＡＶは、ＣＮＳの吻側−尾側軸に沿った遺伝子移入の比較的均一な分布を提供する投薬パラダイムで送達される必要がある。この分布は、ヒトＡＬＳを治療するための治療橋渡しを示すはずである。注入の容積、速度および継続期間などのパラメーターは、ＡＬＳを治療するためのトランス遺伝子発現の最適な分布を有するように変えることができる。
【０４７３】
実施例５．正常イヌにおけるＳＯＤ１を標的とするＡＡＶの薬理学研究
投薬レジメン
ＳＯＤ１を標的とするＡＡＶ（ＡＡＶ．ｉＳＯＤ１）を、ＨＥＫ２９３細胞でのトリプルトランスフェクションを使用して作製する。イヌを試験する前に、ＡＡＶ．ｉＳＯＤ１を、直接ＣＮＳ投与後のｈＳＯＤ１トランスジェニックマウス（Ｔｇ（ＳＯＤ１）３Ｃｊｅ／Ｊ；ジャクソン・ラボラトリー社（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））におけるＳＯＤ１抑制を評価することにより試験して、インビボで薬理学的に活性であることを確認する。
【０４７４】
インビトロ中和抗体アッセイで血清試料を評価することによって、最大およそ８０匹の雄雑種イヌ（マーシャル・バイオリソーシス社（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）、アメリカ合衆国ニューヨーク州ノース・ローズ（Ｎｏｒｔｈ  Ｒｏｓｅ）所在）を、ＡＡＶカプシドに対する既存免疫についてスクリーニングすることになる。＜１：１０の抗体力価を有する動物が、研究の候補であろう。１６匹の雄雑種イヌ（２匹の代替を含む）に、カテーテルを外科的に埋め込むことになる。表１１に示されるように、イヌを４つの治療群に分割し、ＡＡＶ．ｉＳＯＤ１または媒体をＩＴ投薬によって投与することになる。部位は、腰椎または小脳延髄槽のいずれかであろう。
【０４７５】
【表１１】
2021502060.tif 000013
所定の間隔後、イヌを、ＣＳＦにおける臨床観察、体重、機能観察総合評価（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎａｌ  ｂａｔｔｅｒｉｅｓ）、神経学的検査、臨床病理、臓器重量、肉眼的病理、組織病理（Ｈ＆Ｅ、拡張ニューロパシーパネル（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ  ｐａｎｅｌ））、脊髄および他の組織におけるＳＯＤ１抑制およびベクターゲノムの分布ならびに潜在的バイオマーカーについて評価することになる。
【０４７６】
安全性および薬理学
注射時に体重が１５〜３０ｋｇの雄雑種イヌ（マーシャル・バイオリソーシス社（Ｍａｒｓｈａｌｌ  ＢｉｏＲｅｓｏｕｒｃｅｓ）、アメリカ合衆国ニューヨーク州ノース・ローズ（Ｎｏｒｔｈ  Ｒｏｓｅ））を使用することになる。投薬後、全身外観および挙動の変化について各イヌをモニターすることになる。罹患率および死亡率について、投薬の初日から開始して少なくとも１日２回動物を観察することになる。臨床徴候を、研究期間の全体にわたって手術後少なくとも１日２回記録することになる。研究期間中に瀕死であると決定された動物はすべて犠牲にすることになる。包括的な神経学的検査を毎週実施することになる。すべての動物について、体重を、手術前、手術の当日、研究中は毎週および検死時に記録することになる。食餌消費を、手術前から開始して治療期間の全体にわたって継続的に毎日収集することになる。
【０４７７】
臨床病理（１日目の投薬前、３日目および２８日目の検死直前）、血清抗体分析（１日目の投薬前、３日目および２８日目の検死直前）およびサイトカイン分析（１日目の投薬前および２８日目の検死直前）のために、血液試料および尿試料を絶食動物から収集することになる。抗体分析および潜在的なバイオマーカーアッセイにために、ＣＳＦ試料を投薬直前および２８日目に収集することになる。ＡＡＶ投与の４週間後、動物をすべて安楽死させ、生理食塩水で灌流した後、脳、脊髄、後根神経節、肝臓、心臓、脾臓、腎臓および他の臓器を含む組織を収集することになる。臓器重量および肉眼的病理を記録することになる。
【０４７８】
安楽死時に、脳を切断して、３ｍｍの冠状切片厚さの脳マトリックスにすることになる。左半球脳切片を瞬間凍結し、発送まで−６０℃以下で保管することになる。脊髄は、頚部、胸部、腰部および仙骨分節を含むおよそ２５個の分節に切断されるであろう。選択した分節を瞬間凍結し、発送まで−６０℃以下で保管することになる。脊髄神経根および後根神経節（ＤＲＧ）も収集することになる。右半球脳切片ならびに選択した脊髄分節（例えば、Ｃ１、Ｃ７、Ｔ８およびＬ６／７）ならびにＣ１、Ｃ７、Ｔ８、Ｌ６およびＳ２に対応する脊髄神経を有するＤＲＧの対を、冷却４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で浸漬固定し、１〜８℃で７２時間撹拌しながら維持することになる。次に、組織を０．１Ｍリン酸緩衝生理食塩水中３０％スクロースに移し、発送まで冷蔵することになる（２〜８℃）。新鮮凍結組織を、ベクターゲノム、ｍＲＮＡおよび／またはトランス遺伝子発現の定量化を含み得る分析に使用することになる。後固定した組織を、ヘマトキシリン−エオジン（Ｈ＆Ｅ）染色を含む組織病理および拡張神経病理パネル（ｅｘｐａｎｄｅｄ  ｎｅｕｒｏｐａｔｈｏｌｏｇｙ  ｐａｎｅｌ）に使用することになる。
【０４７９】
臨床病理
実施されることになる臨床病理は、血液学、血清生化学、ＣＳＦ分析、尿検査および凝固評価を含むであろう。基準範囲外のあらゆるパラメーターに留意することになるが、平均肝酵素ＡＬＴ、ＧＧＴおよびＡＬＰ、肝臓機能の指標（アルブミン、グルコース、コレステロール、ビリルビン、血中尿素窒素（ＢＵＮ））、およびクレアチンを、ＡＮＯＶＡを使用して統計的に比較することになる。任意の肝酵素が、実験室で確立された基準範囲の外側である場合、空腹時血中アンモニア濃度をアッセイして、そのイヌの肝機能を評価することになる。ＢＵＮおよびクレアチニンに加えて、尿比重、尿タンパク質および尿キャストを使用して、腎機能を評価することになる。極微量よりも多くのタンパク尿が検出される場合、タンパク質：クレアチン比を実施することになる。凝固異常については、プロトロンビン時間、部分的トロンボプラスチン時間および頬側粘膜出血時間を評価することになる。タンパク質濃度、細胞充実性および細胞タイプについては、ＣＳＦを評価することになる。
【０４８０】
抗体分析
レポータを使用してＡＡＶによる形質導入の機能的阻害について血清試料またはＣＳＦ試料を評価するために、インビトロの細胞に基づくアッセイを使用して、中和抗体に関する血清およびＣＳＦの分析を実施することになる。
【０４８１】
サイトカイン分析
イヌ特異的アッセイを使用して、血液およびＣＳＦのサイトカイン分析を実施することになる。評価されることになるサイトカインとしては、ＩＬ−１ベータ、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−ガンマおよびＴＮＦ−アルファが挙げられる。
【０４８２】
組織学的手順
組織学的手順および評価を実施することになる。脊髄試料および他の組織試料をトリムし、パラフィンに包埋し、切片化し（およそ５ミクロン）、Ｈ＆Ｅで染色し、拡張神経病理パネルを行うことになる。全身組織病理変化を評価するためにＨ＆Ｅ染色を使用し、神経病理変化を評価するために、細胞タイプ特異的マーカー（例えば、ＮｅｕＮ、ＧＦＡＰ、Ｉｂａ１）のＦｌｕｏｒｏ−Ｊａｄｅ  Ｂおよび免疫組織化学を使用することになる。
【０４８３】
ＳＯＤ１  ｍＲＮＡ定量化
脊髄、ＤＲＧおよび他の組織試料中のＳＯＤ１抑制は、ｍＲＮＡレベルを測定するための定量ＲＴ−ＰＣＲを使用して評価することになる。簡潔に言えば、ＳＯＤ１のｍＲＮＡレベル、ならびに内因性ＧＡＰＤＨおよび／またはベータ−アクチンｍＲＮＡを、標準的方法を使用してｑＲＴ−ＰＣＲによって決定することになる。ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの平均レベルを、試料毎に内因性対照ｍＲＮＡの平均レベルに対して正規化することになる。試料としては、脊髄および全ＤＲＧの断面切片、ならびにコリンアセチルトランスフェラーゼ、ＧＦＡＰおよびパルブアルブミンなどの形態学的および免疫組織化学的マーカーによってそれぞれ同定され、次にレーザキャプチャマイクロダイセクションによって収集される運動ニューロン、アストロサイトおよび大型感覚ニューロンが挙げられるであろう。
【０４８４】
ＳＯＤ１タンパク質アッセイ
ウエスタンブロット分析を使用して、脊髄および他の組織試料中のＳＯＤ１抑制を評価することになる。標準的方法が使用されるであろう。
【０４８５】
ベクターゲノム定量化
定量ＰＣＲを使用して、脊髄および他の組織試料中のベクターゲノムを評価することになる。簡潔に言えば、ベクターゲノムおよび宿主二倍体ゲノムのコピー数を、標準的方法を使用して定量ＰＣＲによって決定することになる。ベクターゲノムのコピー数の平均レベルを、試料毎に宿主二倍体ゲノムのコピー数に対して正規化することになる。
【０４８６】
バイオマーカーアッセイ
ＣＳＦ試料中のバイオマーカーを評価してもよい。ＣＳＦエキソソームのその後の単離のために、試料を遠心分離およびろ過によって処理し、続いて直ちに収集し、次に瞬間凍結し、発送まで−６０℃以下で保管することになる。
【０４８７】
実施例６．ＤＭ罹患イヌにおけるＳＯＤ１を標的とするＡＡＶの有効性研究
研究用動物の選択
軽度の全身性固有受容運動失調の徴候に基づき、ＤＭの初期ステージ１のＤＭ罹患伴侶イヌ（ｎ＝２０）を、研究用に選択することになる。ＤＭの診断は、臨床徴候、脊髄全体の正常ＭＲＩおよびＣＳＦ分析、電気生理学的異常の欠如およびＳＯＤ１：ｃ．１１８Ａ対立遺伝子の同型接合性に基づくであろう。他の主要な身体的疾患についてもイヌをスクリーニングすることになる。
【０４８８】
投薬レジメン
ＳＯＤ１（ＡＡＶ．ｉＳＯＤ１）を標的とするＡＡＶを、ＨＥＫ２９３細胞法にてｂａｃｕｌｏ／Ｓｆ９系またはトリプルトランスフェクションのいずれかによって作製する。イヌで試験する前に、ＡＡＶ．ｉＳＯＤ１を、直接ＣＮＳ投与後のｈＳＯＤ１トランスジェニックマウス（Ｔｇ（ＳＯＤ１）３Ｃｊｅ／Ｊ；ジャクソン・ラボラトリー社（Ｊａｃｋｓｏｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ））におけるＳＯＤ１抑制を評価することにより試験して、インビボで薬理学的に活性であることを確認する。
【０４８９】
インビトロ中和抗体アッセイで血清試料を評価することによって、ＤＭ罹患イヌを、ＡＡＶカプシドに対する既存免疫についてスクリーニングすることになる。＜１：１０の抗体力価を有する動物が、研究の候補であろう。イヌを、２つの治療群に分割し、正常イヌ研究（実施例５を参照）において安全であり、薬理学的に活性であることが示されたＩＴ投薬パラダイム（速度、用量および容積）を使用して、ＡＡＶ．ｉＳＯＤ１または媒体のいずれかを投与することになる。表１２は、ＤＭ罹患イヌの研究設計を示す。部位は、腰椎または小脳延髄槽のいずれかであろう。
【０４９０】
【表１２】
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所定の間隔後、イヌを、神経学的欠陥、臨床徴候の発症から歩行不能不全対麻痺に至るまでの時間、歩調評価スケール、神経伝達研究、筋電図検査、運動単位数推定法（ＭＵＮＥ）、電気インピーダンス筋運動描記法（ＥＩＭ）、磁気共鳴画像法（ＭＲＩ）、臨床病理研究、潜在的ＣＳＦバイオマーカーおよび組織病理について評価することになる。
【０４９１】
ＤＭ罹患イヌのモニタリング
身体的および神経学的検査、血液検査、ＣＳＦ試料採取および尿検査については、および縦断的評価については、動物を２〜３カ月（ベースラインおよび最大４回）評価することになり、動物の歩調は毎月検討することになる。評価の時間は、下記の表１３に概説されている。
【０４９２】
【表１３】
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歩調および神経学的結果のモニタリング
疾患進行を、ステージ１（歩行可能、徴候の発症）からステージ２（歩行不能）までモニターすることになる。未治療ＤＭ罹患イヌは、１０カ月までにステージ１からステージ２へと進行する可能性が高いであろう（９５％ＣＩ、９〜１２）。カプラン−マイヤー（ＫＭ）プロットを使用して、コホートにわたるＤＭの進行、および恐らくはＤＭステージ１からステージ２へのコホート移行の割合を追跡することになる。したがって、ステージ２に進行しないイヌの割合（および関連する片側９５％ＣＩ）を算出することになる。疾患ステージ１および２間のイヌの歩調をビデオ撮影し、改変型オルビー評価スケールを使用して２人の経験を積んだ観察者によって段階分けをすることになる。更に、イヌを、安楽死まで疾患経過全体にわたってモニターすることになる。
【０４９３】
ｐＮＦ−Ｈ
治療または未治療ＤＭ罹患イヌの血清およびＣＳＦ中のｐＮＦ−Ｈをモニターすることになる。血清試料およびＣＳＦ試料を、指定の時点および安楽死の時点で収集することになる。試料はすべて、ひとまとめにして、アッセイおよび分析のためにＥｎＣｏｒ社（米国フロリダ州ゲインズヴィル（Ｇａｉｎｅｓｖｉｌｌｅ））に送ることになる。治療群間の比較は、反復測定ＡＮＯＶＡ、その後のホルム−シダック（Ｈｏｌｍ−Ｓｉｄａｋ）対比較によってなされるであろう。
【０４９４】
サイトカイン分析
イヌ特異的アッセイを使用して、血液およびＣＳＦのサイトカイン分析を実施することになる。評価されることになるサイトカインとしては、ＩＬ−１β、ＩＬ−１ＲＡ、ＩＬ−６、ＩＦＮ−γ、およびＴＮＦ−αが挙げられる。
【０４９５】
ＤＴＩおよびＭＲＳ
３つの時点で、ＡＡＶ．ｉＳＯＤ１治療イヌに対してＭＲＩを実施することになる。脳のＭＲＩ研究はすべて、以前に確立されているイヌパラメーターを用いて、３テスラの東芝スキャナーを使用して実施することになる。ＤＴＩは、優れた分解能のために３０通りの方向で実施することになる。ＭＰＲＡＧＥシーケンスを使用した標準的３Ｄ  Ｔ１解剖画像法に加えて、データ分析のためにＦＡ、ＡＤＣおよびカラーマップを生成することになる。目的の領域としての視床、赤核および尾状核に焦点を当て、以前に確立されているプロトコールを用いて、すべてのイヌの脳に対してシングルおよびマルチボクセルＭＲＳ取得を実施することになる。
【０４９６】
ＡＤＣ、ＦＡ、ＮＡＡ濃度およびＮＡＡ／Ｃｒの平均、中央値および標準偏差の記述統計を算出することになる。ＤＭ罹患イヌ対ＤＭ未罹患イヌにおけるこれらの値間の差異を、対応スチューデントｔ検定（Ｐ＜０．０５）で評価することになる。ＭＲ値を疾患重症度と比較するための相関係数を確立することになる。
【０４９７】
電気診断試験およびＭＵＮＥ
前向き電気診断評価を、指定の時点で実施することになる。試験は、キャドウェル（Ｃａｄｗｅｌｌ）社製ＳＩＥＲＲＡ−ＷＡＶＥ（商標）電気診断機を使用して行うことになる。疾患発症は非対称性であることが多いため、ＥＤＢ筋肉の改変型増分刺激ＭＵＮＥ技法（ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｉｎｃｒｅｍｅｎｔａｌ  ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ  ＭＵＮＥ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）を両骨盤肢に適用することになる。サブ閾値レベルが確立されたら、様々な誘発電位が観察されるまで刺激増分を適用することになる。１０個の誘発電位を記録し、単一運動単位電位（ＳＭＵＰ）として使用することになる。過最大複合筋活動電位へと除算された平均ＳＭＵＰは、ＭＵＮＥをもたらすことになる。１セッション当たり２回の連続試行を実施し、平均してばらつきを減少させることになる。日常的な全身ＥＭＧならびに尺骨神経および座骨−腓骨神経の神経伝達研究（Ｆ波を含む）も実施することになる。
【０４９８】
度数分布プロットを生成して、疾患ステージ１および２のＤＭ罹患治療および未治療イヌのＭＵＮＥデータの正規性を調べ、年齢一致正常イヌと比較することになる。各肢のＭＵＮＥの縦断的衰退を評価することになる。正規分布しない生データは、対数変換することになる。各疾患ステージ（１〜２）内の平均ＭＵＮＥを算出し、２つの試料ｔ検定を使用して、群（治療イヌ対未治療イヌ）と疾患ステージ（１〜２）との差異を比較することになる。ＤＭステージ間の推定ＭＵＮＥ平均の多重比較を考慮するために、ボンフェローニの補正を適用することになる。各臨床ステージに対応する平均値は、ＤＭ罹患イヌの疾患進行の定量的マーカーを構成するであろう。
【０４９９】
電気インピーダンス筋運動描記法（ＥＩＭ）
当該技術分野に記載される通りの、およびデバイス（ＤＦ５０（インペディメッド・インク社（Ｉｍｐｅｄｉｍｅｄ，Ｉｎｃ）、米国カリフォルニア州サンディエゴ）のプロトコールに記載される通りの技法によってＥＩＭ測定を実施することになる。このインピーダンス測定システムは、０．５〜１０００ｋＨｚのデータを提供する非常に低キャパシタンスのアクティブプローブとカップリングされた多周波数ロックイン増幅器で構成される。選択される筋肉としては、骨盤肢の前脛骨筋および大腿二頭筋、胸肢の橈側手根伸筋および三頭筋、ならびに舌が挙げられるであろう。各肢筋肉の目的の領域を覆う毛を除去することになる。目的の筋肉に対して電圧および電流電極が評価時点間で同様に位置決めされること保証するため、ピンポイントの入れ墨を基準点として施すことになる。得られる値としては、抵抗（Ｒ）およびリアクタンス（Ｘ）が挙げられ、これらから第３のパラメーターである位相（θ）が得られるであろう。リアクタンスの傾き、位相の傾きおよび抵抗ｌｏｇの傾きを、異なる周波数で算出することになる。この手順を指定の時点で実施し、徴候発症の時間を、歩行不能状態、歩調スコア化およびＭＵＮＥ値と相関させることになる。
【０５００】
度数分布プロットを生成して、データの正規性を評価することになる。生データが正規分布しない場合、ｌｏｇ変換を使用してデータを正規化することになる。したがって、各疾患ステージ（１〜２）内の全体的平均ＭＵＮＥ定量化結果を算出し、２つの試料ｔ検定を使用して、疾患ステージ（１〜２）と正常イヌとの差異を比較することになる。ＤＭステージ間のＭＵＮＥ平均およびＥＩＭ平均の多重比較により起こり得る問題を考慮するために、ボンフェローニの補正を行うことになる。ＥＩＭデータおよびＭＵＮＥデータを、互いに、ならびに徴候の発症から歩行不能状態までの時間および歩調スコアと比較することになる。相関性分析ではすべて、スピアマン順位相関を実施することになる。マン−ホイットニー検定を使用して２群間比較を行うことになる。統計的有意差は、ｐ＜０．０５であるであろう実験の終了時に検出力分析を実施して、有意性に必要な追加試料の数および将来の研究のための群サイズを決定することになる。ルトコブ（Ｒｕｔｋｏｖｅ）博士が、データ解釈および統計比較を支援することになる。
【０５０１】
実施例７．イヌＳＯＤ１を標的とするコンストラクトのインビトロ研究
Ａ．イヌＳＯＤ１を標的とするｓｉＲＮＡのスクリーニング
イヌＳＯＤ１（ｄＳＯＤ１）を標的とする７つのｓｉＲＮＡコンストラクト（１０ｎＭ）および媒体（陰性対照）を、Ｄ−１７細胞（ＡＴＣＣ  ｃａｔ＃  ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４３０（商標））またはｃｆ２Ｔｈ細胞（ＡＴＣＣ  ｃａｔ＃  ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１８３（商標））にトランスフェクトした。両タイプの細胞の細胞培養培地は、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補完剤、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２だった（試薬はすべてライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から）。
【０５０２】
２４時間後、ＲＴ−ｑＰＣＲによってＳＯＤ１およびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを測定するために、培養を回収した。ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、次に正規化したＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを、媒体（陰性対照）群と比べて表した。ＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＯＤ１）による治療後の両細胞タイプの相対的ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルは、表１４に示される。
【０５０３】
【表１４】
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二重鎖ＩＤ  Ｄ−４０００、Ｄ−４００１、Ｄ−４００４およびＤ−４００５を有するＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡコンストラクトによる処置は、Ｄ−１７細胞およびｃｆ２Ｔｈ細胞の両方においてｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルの５０％を超える抑制をもたらした。
【０５０４】
Ｂ．自己相補的ベクターの薬理学的評価
この研究では、イヌＳＯＤ１（ｄＳＯＤ１）を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクトをコードする自己相補的ベクターを、ＡＡＶ２にパッケージングした。この研究では、変性性脊髄症（ＤＭ）イヌ一次アストロサイト、ＤＭイヌ一次脊髄アストロサイト、およびＤ−１７細胞（ＡＴＣＣ  ｃａｔ＃  ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１４３０（商標））を使用して、コンストラクトを試験した。Ｄ−１７細胞の細胞培養培地は、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補完剤、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２だった（試薬はすべてライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から）。一次アストロサイトの細胞培養培地は、ＡＧＭ（商標）アストロサイト増殖培地（ｃａｔ＃：ＣＣ−３１８６、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ））だった。細胞を９６ウェルプレートに播種し、ＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲＮＡベクターに三重重複で感染させた（２００ｕｌ細胞培養培地中１〜２×１０４細胞／ウェル）。
【０５０５】
ベクターによる感染の４８時間後、イヌＳＯＤ１およびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、次に陰性対照群と比べて表した。
【０５０６】
表１５は、１×１０５のＭＯＩのｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターによる感染後の、ＤＭイヌ一次脳アストロサイト、ＤＭイヌ一次脊髄アストロサイト、およびＤ−１７細胞の相対的ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０５０７】
【表１５】
2021502060.tif 000017
ＡＡＶ２にパッケージングされたコンストラクトＶＯＹＳＯＤ１ｍｉｒ１０４−７８８．２、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８２９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８．２、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８３０、およびＶＯＹＳＯＤ１ｍｉｒ１２７−７８８による処置は、３つの細胞タイプすべてにおいてｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡの少なくとも４５％抑制に有効だった。
【０５０８】
表１６は、コンストラクトＶＯＹＳＯＤ１ｍｉｒ１０４−７８８．２、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８．２、またはＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８３０を含有する異なるＭＯＩ（１×１０２、１×１０３、１×１０４、または１×１０５）のｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターによる感染後の、ＤＭイヌ一次脊髄アストロサイトにおける相対的ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを示す。対照ＡＡＶ２．ｅＧＦＰベクターも、これらのＭＯＩで評価した。
【０５０９】
【表１６】
2021502060.tif 000018
Ｃ．  ＳＯＤ１コンストラクトのスクリーニング
イヌＳＯＤ１を標的とする４つのｓｉＲＮＡコンストラクト（Ｄ−４０００、Ｄ−４００７、Ｄ−４００８、Ｄ−４００２）を、ｃｆ２Ｔｈ細胞（ＡＴＣＣ  ｃａｔ＃  ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ−１８３（商標））にトランスフェクトした（９６ウェルプレートの２×１０４細胞／ウェル、各条件で三重重複）。細胞培養培地は、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補完剤、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２だった（試薬はすべてライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から）。
【０５１０】
４８時間後、ＳＯＤ１およびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを測定するために、培養を回収した。ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、次に陰性対照群と比べて表した。これらの相対的ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルは、表１７に示される。
【０５１１】
【表１７】
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Ｄ−４０００、Ｄ−４００７、Ｄ−４００８またはＤ−４００２のトランスフェクションは、ｃｆ２Ｔｈ細胞において用量依存的ＳＯＤ１サイレンシングを引き起こした。Ｄ−４０００は、ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡの最大抑制をもたらした（約６４％抑制）。
【０５１２】
イヌＳＯＤ１（ｄＳＯＤ１）を標的とする７つのｓｉＲＮＡコンストラクトおよび対照を、ＨＥＫ２９３Ｔ、ｃｆ２Ｔｈ、Ｄ−１７、およびイヌ一次脊髄アストロサイト細胞にトランスフェクトした（１０ｎＭ）。２４時間後、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを測定するために、培養を回収した。相対的ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルは、表１８に示される。
【０５１３】
【表１８】
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ＨＥＫ２９３Ｔ細胞では、イヌＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ（１０ｎＭ）はすべて、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルのロバストな抑制に結び付いた（７５〜９５％抑制）。ｃｆ２Ｔｈ細胞では、１０ｎＭでのイヌＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ（Ｄ−４０００、Ｄ−４００５、Ｄ−４００４、Ｄ−４００１）のトランスフェクションは、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルの５０〜６０％抑制に結び付いた。Ｄ−１７細胞では、１０ｎＭでのイヌＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ（Ｄ−４０００、Ｄ−４００５、Ｄ−４００４、Ｄ−４００１）のトランスフェクションは、ＳＯＤ１の５５〜６５％ノックダウンに結び付いた。イヌ一次脊髄アストロサイトでは、１０ｎＭでのイヌＳＯＤ１  ｓｉＲＮＡ（Ｄ−４０００、Ｄ−４００４、Ｄ−４００１）のトランスフェクションは、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルの３０〜４５％抑制に結び付いた。二重鎖Ｄ−４０００、Ｄ−４００１、Ｄ−４００４、およびＤ−４００５を、更なる研究のために選択した。
【０５１４】
Ｄ．ＨＥＫ２９３ＴにおけるＡＡＶ２ベクターの評価
この研究では、イヌＳＯＤ１（ｄＳＯＤ１）を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクトを有するＡＡＶベクターをＡＡＶ２にパッケージングした。ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、９６ウェルプレートに播種し、１×１０５、１×１０４のＭＯＩのＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲＮＡベクターでまたは対照で三重重複にて感染させた（２００ｕｌ細胞培養培地中４×１０４細胞／ウェル）。
【０５１５】
ベクターによる感染の４８時間後、イヌＳＯＤ１およびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、次に陰性対照群と比べて表した
表１９は、１×１０５のＭＯＩでのｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターによる感染後の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での相対的ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０５１６】
【表１９】
2021502060.tif 000021
表２０は、１×１０４のＭＯＩでのｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターによる感染後の、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞での相対的ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを示す。ベクターによる感染の４８時間後、イヌＳＯＤ１およびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、次に陰性対照群と比べて表した。
【０５１７】
【表２０】
2021502060.tif 000022
１×１０５のＭＯＩでは、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−８０５ｃ、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１１６−７８８、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１１４−７８８、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０２−７８８、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０９−７８８、およびＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８は、ＨＥＫ２９３細胞におけるＳＯＤ１  ｍＲＮＡの少なくとも６０％低減をもたらした。ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８は、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞においてＳＯＤ１  ｍＲＮＡの９９％低減に結び付いた。ＩＥ４のＭＯＩでは、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８９およびＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−８２９は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの５７〜６８％低減に結び付き、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８８−２、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８２９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８３０、およびＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−８３０は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの８５〜９９％低減に結び付く。
【０５１８】
Ｅ．ＡＡＶ２にパッケージングしたコンストラクトの評価
イヌＳＯＤ１（ｄＳＯＤ１）を標的とするｓｉＲＮＡコンストラクトを、ＡＡＶ２にパッケージングし、ｃｆ２Ｔｈ、Ｄ−１７細胞、イヌ脊髄アストロサイトおよび線維芽細胞に感染させた。Ｄ−１７細胞およびｃｆ２Ｔｈ細胞の細胞培養培地は、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補完剤、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０％ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２だった（試薬はすべてライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から）。一次アストロサイトの細胞培養培地は、ＡＧＭ（商標）アストロサイト増殖培地（ｃａｔ＃：ＣＣ−３１８６、ロンザ社（Ｌｏｎｚａ））だった。線維芽細胞の細胞培養培地は、２ｍＭ  ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）補完剤、１×ＭＥＭ非必須アミノ酸溶液、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳおよび１０％ＦＢＳ、２ｎｇ／ｍｌヒトＦＧＦ−２および５ｕｇ／ｍｌヒトインスリンを含有するＤＭＥＭ／Ｆ−１２だった（試薬はすべてライフ・テクノロジーズ社（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）から）。細胞を９６ウェルプレートに播種し、ＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲＮＡベクターに三重重複で感染させた（２００ｕｌ細胞培養培地中１〜２Ｅ４細胞／ウェル）。
【０５１９】
１×１０５または１×１０６のＭＯＩでのベクターによる感染の４８時間後、イヌＳＯＤ１およびＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡを、ＲＴ−ｑＰＣＲによって測定した。ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡレベルに対して正規化し、次に陰性対照群と比べて表した。
【０５２０】
表２１および表２２は、１×１０５のＭＯＩでのｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターによる感染後の、相対的ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０５２１】
【表２１】
2021502060.tif 000023
ｃｆ２Ｔｈ細胞およびＤ１７細胞では、１×１０５のＭＯＩでの、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８８、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１１４−７８８、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−８０５ｃ、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０９−７８８、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０２−７８８、またはＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１１６−７８８を含有するｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターによる感染は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルの約３０〜４５％抑制をもたらした。しかしながら、１×１０５のＭＯＩでの、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８を含有するｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１ｍｉＲベクターによる感染は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルの約７０〜８０％抑制をもたらした。イヌ一次細胞（脊髄アストロサイトおよび線維芽細胞）では、１×１０５のＭＯＩのＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの約３５〜４５％ノックダウンに結び付いた。
【０５２２】
【表２２】
2021502060.tif 000024
イヌ脳アストロサイト、イヌ脊髄アストロサイト、イヌ線維芽細胞、およびＤ−１７細胞では、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８２９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８．２、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８３０、またはＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８８．２を含有するｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターによる感染は、少なくともおよそ５０％のＳＯＤ１  ｍＲＮＡ抑制を示した。
【０５２３】
表２３は、１×１０６のＭＯＩでのｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターによる感染後の相対的ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを示す。
【０５２４】
【表２３】
2021502060.tif 000025
Ｄ１７細胞では、１×１０６のＭＯＩでの、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８を含有するｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターによる感染は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの最大抑制（約９０％抑制）をもたらした。イヌ一次細胞では、１×１０６のＭＯＩのＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８は、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの４４〜６７％抑制に結び付いた。
【０５２５】
用量応答研究を、脊髄アストロサイトおよびＤ−１７細胞における、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、および１×１０６のＭＯＩでの、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８８．２、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８２９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８３０、またはＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８．２を含有するｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターによる感染で実施した。ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８８．２、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８２９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８３０およびＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８．２を含有するｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターを用いた、Ｄ−１７細胞および脊髄アストロサイトにおける用量依存的ＳＯＤ１  ｍＲＮＡサイレンシングおよび５０％ＳＯＤ１  ｍＲＮＡノックダウンを、両細胞タイプに１×１０２および１×１０３のＭＯＩのＡＡＶ  ＳＯＤ１  ｍｉＲＮＡベクターを感染させることによって達成した。
【０５２６】
更なる用量応答研究を、イヌ脳アストロサイト、脊髄アストロサイト、ｃｆ２Ｔｈ細胞、およびＤ−１７細胞において、１×１０２、１×１０３、１×１０４、１×１０５、および１×１０６のＭＯＩにて、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８を含有するｓｃＡＡＶ２−ｄＳＯＤ１  ｍｉＲベクターで実施した。ｃｆ２Ｔｈ細胞、Ｄ−１７細胞および脊髄アストロサイトでは、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの５０％のノックダウンは、１×１０３および１×１０４のＭＯＩで達成された。イヌ脳アストロサイトでは、ＳＯＤ１  ｍＲＮＡの５０％ノックダウンは、少なくとも１×１０５のＭＯＩで達成された。
【０５２７】
実施例８．コンストラクトのインビボ研究
Ａ．マウスにおけるインビボ選択研究
ヒト野生型ＳＯＤ１を発現するトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６−Ｔｇ（ＳＯＤ１）３Ｃｊｅ／Ｊ）に、ＡＡＶＤＪにパッケージングした６つの候補（ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８２９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８９、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８．２、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８８．２、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８３０、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１２７−７８８）の１つまたは媒体を、０．５ｕＬ／分での５ｕＬ試験物質の線条体内注入によって投与した。ベクター濃度は、１．５×１０１２ｖｇ／ｍＬであり、これは７．５×１０９ｖｇの総投与用量に対応した。
【０５２８】
投薬の４週間後に、投与部位に由来する線条体組織を、媒体群と比べたＲＴ−ｑＰＣＲによってＳＯＤ１  ｍＲＮＡ抑制について、およびディープシーケンシングによってｐｒｉ−ｍｉＲＮＡについて評価した。
【０５２９】
表２４には、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）に対して正規化し、次に媒体群と比べて表したＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルが示される（１群当たりｎ＝５）。
【０５３０】
【表２４】
2021502060.tif 000026
また、次世代シーケンシングを使用して、ＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−７８８．２およびＶＯＹＳＯＤ１ｍｉＲ１０４−８２９を評価して、ｐｒｉ−ｍｉＲＮＡ処理の精度および効率を評価した。結果は表２５に示される。表２５のＧ／Ｐ比は、ガイド鎖／パッセンジャー鎖比を意味する。
【０５３１】
【表２５】
2021502060.tif 000027
Ｂ．正常イヌにおけるインビボ薬理学および安全試験
これらの研究のためのＡＡＶベクターを、ＨＥＫ２９３細胞でのトリプルトランスフェクション法を使用して生成した。
【０５３２】
正常イヌに、２×１０１３ｖｇまたは６×１０１３ｖｇの用量のｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉＲ１０４−７８８．２（配列番号１４５として提供されるＩＴＲ〜ＩＴＲ配列）またはｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉＲ１０４−８２９（配列番号１４６として提供されるＩＴＲ〜ＩＴＲ配列）または媒体を髄腔内に投薬した（１群当たりｎ＝４）。４週間後、動物を安楽死させ、更なる分析のために試料を収集した。
【０５３３】
Ｌ５、Ｔ７またはＣ４に由来する後根神経節（ＤＲＧ）を、イヌＳＯＤ１（ｄＳＯＤ１）ｍＲＮＡ、ＧＡＰＤＨ  ｍＲＮＡ、アラニルｔＲＮＡ合成酵素（ＡＡＲＳ）ｍＲＮＡおよびＸ−プロリルアミノペプチダーゼ１（ＸＰＮＰＥＰ１）ｍＲＮＡのレベルについて、ＲＴ−ｑＰＣＲによって評価した。ｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング遺伝子（ＧＡＰＤＨ、ＡＡＲＳ、およびＸＰＮＰＥＰ１）の幾何平均に対して正規化し、次に媒体対照群と比べて表した。表２６には、免疫抑制を示すまたは示さないｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉＲ１０４−７８８．２の、ＤＲＧにおける相対的ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルが示される。表２７には、免疫抑制を示すｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉＲ１０４−８２９の、ＤＲＧにおける相対的ＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルが示される。
【０５３４】
【表２６】
2021502060.tif 000028
【０５３５】
【表２７】
2021502060.tif 000029
肝臓におけるｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡのレベルを評価した。ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉＲ１０４−７８８．２の結果は、表２８に示される。
【０５３６】
【表２８】
2021502060.tif 000030
脊髄におけるｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡレベルの場合、６×１０１３ｖｇの用量のｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉＲ１０４−７８８．２（免疫抑制を示す）は、媒体と比べて４１±９％（平均±標準偏差）の抑制をもたらした（ｄＳＯＤ１の脊髄前角ｍＲＮＡレベルを、ＧＡＰＤＨ、ＡＡＲＳ、およびＸＰＮＰＥＰ１の幾何平均に対して正規化した）。
【０５３７】
脊髄の前角においてｖｇおよびｄＳＯＤ１  ｍＲＮＡを同時検出するために二重鎖ＲＮＡｓｃｏｐｅインサイツハイブリダイゼーションを使用したところ、６×１０１３ｖｇの用量のｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉＲ１０４−７８８．２の場合、前角では、媒体群に比べてｖｇ＋細胞のＳＯＤ１  ｍＲＮＡの低減が見られた。
【０５３８】
６×１０１３ｖｇの用量のｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉＲ１０４−７８８．２は、高いガイド鎖／パッセンジャー鎖比（ＤＲＧでは１７０および脊髄前角では３７３）、ガイド鎖の５’末端での正確なプロセシング（＞９０％）、ならびにｍＲＮＡの全内因性プールと比べて低レベルのガイド鎖およびパッセンジャー鎖（ＤＲＧでは６．７＋／−５．１％および脊髄前角では０．９＋／−０．６％）も示した。
【０５３９】
免疫抑制を示すおよび示さないｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉＲ１０４−７８８．２は、すべての動物において耐容性が良好だった。体重、臨床徴候、臨床病理（１５日目および２９日目）、脳脊髄液（ＣＳＦ）化学（２９日目）またはＣＳＦ総細胞数（２９日目）に対する著しいベクター関連効果はなかった。著しいベクター関連所見を示したＤＲＧ、脊髄および脳の肉眼的病変および組織病理はなかった。
【０５４０】
ｓｃＡＡＶｒｈ１０．Ｈ１．ｍｉＲ１０４−７８８．２は、インビトロでの安全な用量依存的ノックダウン、ヒト野生型ＳＯＤ１トランスジェニックマウスにおけるＳＯＤ１  ｍＲＮＡの６２％ノックダウン、ならびにＤＲＧでは最大７４％のおよび脊髄では最大４１％の正常イヌにおけるＳＯＤ１ノックダウンを示したため、追加研究のために選択した。
【０５４１】
実施例９．正常イヌにおけるＡＡＶの耐容性および分布
ＡＡＶｒｈ１０カプシドの分布は、それまで報告されていなかった。したがって、ＡＡＶｒｈ１０が、他の種における場合と同様に、イヌの運動ニューロンおよびＤＲＧニューロンに分布することを確認するための研究を実施する必要があった。この試験的研究の主な目的は、イヌモデルにおけるＡＡＶ腰椎ＩＴ送達の急性耐容性を評価することだった。神経病理または臨床病理／毒性分析は実施しなかった。
【０５４２】
１３月齢（１０〜１３ｋｇ）の６匹の成体雄ビーグル犬を、ＡＡＶｒｈ１０およびＡＡＶ９に対する血清中和抗体力価についてプレスクリーニングした。６匹の動物に、先端が上部腰椎に位置し、皮下アクセスポートまで続く髄腔内（ＩＴ）カテーテルを埋め込んだ。投薬前に、シクロスポリンおよびミコフェノレートを使用して動物を免疫抑制した。麻酔をかけたまま、およそ２．５時間の合計時間にわたって１時間間隔で、３回の１ｍＬ注射液（１ｍＬ／分）の試験物質（用量２．７×１０１３ｖｇ）を動物に投与した。６番目の動物（群４）を、対照組織の収集に使用した。表２９は研究設計を示す。表２９では、試験物質の下の「ｓｃ」は自己相補性を意味し、ＣＢＡはＣＢＡプロモータであり、ｈＦＸＮはヒトフラタキシンであり、ＨＡはＨＡタグである。
【０５４３】
【表２９】
2021502060.tif 000031
動物に、ＡＡＶ９カプシドまたはＡＡＶｒｈ１０カプシドのいずれかを使用してＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶｘ−ＣＢＡ−ｈＦＸＮ−ＨＡ）を注射した。２．５週間後に、動物を生理食塩水で灌流し、脊髄、ＤＲＧおよび脳を分析のために処理した。試料の半分を４％パラホルムアルデヒドで７２〜９６時間後固定したが、他の半分は新鮮凍結した。
【０５４４】
群１〜３の動物の生存中の観察および測定は、体重、食餌消費、および臨床観察を含んでいた。この研究中、試験物質関連の臨床徴候はなかった。体重または食餌消費に試験物質関連の変化はなかった。検死で観察された試験物質関連の肉眼的病変はなかった。
【０５４５】
ＨＡ免疫組織化学による脊髄およびＤＲＧの組織学的評価は、すべての動物のＬ５脊髄で最も顕著だった運動ニューロン形質導入を示した。吻側レベルがより少ない運動ニューロン染色を示す勾配パターン（Ｃ１＜Ｔ４＜Ｌ５）が、治療群とは無関係に観察された。両治療群において、全レベル（頚部、胸部、腰部）のＤＲＧにて感覚ニューロン形質導入が観察された。要約すると、ＡＡＶ９コンストラクトおよびＡＡＶｒｈ１０コンストラクトのＩＴ送達は両方とも、脊髄ニューロンおよびＤＲＧニューロンの両方で陽性抗ＨＡ免疫反応性をもたらした。これらの結果は、１時間毎に３回の１ｍＬ腰椎注射で構成されるＩＴ投薬パラダイムが、標的レベルの形質導入を達成し、特に、脊髄のより尾部側の領域で多く、脊髄のより吻側の領域でより少なかったことを示した。
【０５４６】
実施例１０．バイオマーカーとしてのＣＳＦおよび血清ニューロフィラメント軽鎖レベル
背景
イヌ変性性脊髄症（ＤＭ）は、多くの純血イヌおよび雑種イヌに影響を及ぼす遅発症型進行性神経変性疾患である。臨床徴候は、中枢神経系および末梢神経系が関与する他系統神経変性の結果である。ＤＭは、初期には、痙性上位運動ニューロン不全対麻痺および全身性固有受容運動失調として顕性となる（ステージ１）。進行性神経変性は、歩行不能不全対麻痺／対麻痺（ステージ２）および胸肢不全麻痺（ステージ３）をもたらす。最終ステージの疾患は、弛緩性四肢麻痺、広範な筋萎縮および延髄機能障害（ステージ４）で終わりを迎える。スーパーオキシドジスムターゼ１遺伝子（ＳＯＤ１）突然変異（ＳＯＤ１：ｃ．１１８Ａ、ＳＯＤ１：ｃ．５２Ｔ）は、ＤＭのリスク因子であり、ほとんどの場合で常染色体劣性遺伝に起因する。この疾患は、原因、進行、および予後が、ある形態のヒト筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と類似すると考えられている。診断は、他の類似疾患を排除することに基づき、ＤＭの確定診断は、現時点では、脊髄の組織病理学的検査によって死後に行うことができるに過ぎない。ニューロフィラメント軽鎖（ＮＦ−Ｌ）は有髄運動軸索の豊富な構造タンパク質であり、ＡＬＳを含む動物およびヒト運動ニューロン疾患の有望な流体バイオマーカーである。血液およびＣＳＦのＮＦ−Ｌレベルは、ＡＬＳでは診断価値を有し、疾患進行と関連する場合があり、それにより治療効果のバイオマーカーとしての役目を果たし得る。研究を実施して、血清およびＣＳＦのＮＦ−Ｌレベルを、ＤＭイヌの診断および疾患進行の潜在的なバイオマーカーとして評価した。
【０５４７】
研究設計
この研究では、３つのタイプのイヌに由来する血清試料およびＣＳＦ試料を分析した。群１は、若年（１〜５歳）および高齢（＞９歳）正常イヌ（ｎ＝１３〜１７）を含み、群２は、ステージ１〜４のＤＭ罹患イヌ（ＳＯＤ１ｃ．１１８Ａ対立遺伝子が同型接合性）（ｎ＝２２〜２５）を含み、群３は、高齢無症候イヌ（ＳＯＤ１ｃ．１１８Ａ対立遺伝子が同型接合性）を含んでいた。
【０５４８】
分析および結果：正常イヌ
試料試験の前に、デジタルＥＬＩＳＡで、正常イヌのＣＳＦおよび血清のＮＦＬの希釈線形性、安定性およびスパイクリカバリー（ｓｐｉｋｅ  ｒｅｃｏｖｅｒｙ）を評価した。ヒトＮＦ−Ｌ（イヌＮＦＬと９８％が保存されている）の市販デジタルＥＬＩＳＡ（クアンテリックス社（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ））を分析に使用した。図１は、クアンテリックス（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）社製Ｓｉｍｏａ  ｈＮＦ−Ｌ（ベータ）アッセイのためのＮＦ−Ｌ検量線を示す。検出限界（ＬＯＤ）を、ゼロ較正物質の平均＋２．５ＳＤと等しい１ビーズ当たりの平均酵素（ＡＥＢ）のＮＦ−Ｌレベルとして算出した。
【０５４９】
ＮＦ−ＬのデジタルＥＬＩＳＡの希釈線形性を、８匹の正常イヌのＣＳＦで試験した。表３０に示されるように、１：４０と比較して±２０％以内の濃度を１：１００の希釈液で観察した。イヌＣＳＦの場合、１：１００の最小希釈液でその後アッセイを実施した。表３０では、Ｎ／Ａは、数値が利用可能ではないことを意味し、＊は、標準曲線範囲の外側の測定値を有する試料を示す。
【０５５０】
【表３０】
2021502060.tif 000032
ＮＦＬのデジタルＥＬＩＳＡの希釈線形性を、３匹の正常イヌの血清で試験した。表３１に示されるように、１：１００と比較して±２０％以内の濃度を１：２００の希釈液で観察した。イヌ血清の場合、１：２００の最小希釈液でその後アッセイを実施した。
【０５５１】
【表３１】
2021502060.tif 000033
ＮＦ−Ｌの試料安定性を、４匹の正常イヌのＣＳＦ（データは図２Ａおよび図２Ｂに示される）および血清（データは図３Ａおよび図３Ｂに示される）で試験した。試料を、−８０℃、４℃で一晩、室温で４時間、または３回の凍結／解凍サイクルを含む異なる処理条件に供した。図２Ａ、図２Ｂ、図３Ａ、および図３Ｂでは、Ｏ／Ｎ＝一晩、ＲＴ＝室温、Ｆ／Ｔ＝凍結／解凍サイクル。ＮＦＬ濃度を、デジタルＥＬＩＳＡ（クアンテリックス社（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ））によって重複して決定した。３回のＦ／Ｔサイクルは、試料ＮＦ−Ｌ濃度にわずかな影響しか及ぼさなかった。図２Ｂは−８０℃対照のパーセントとして表された図２Ａのデータを示し、図３Ｂは−８０℃対照のパーセントとして表された図３Ａのデータを示す。試料は、氷上で保管される限り、実験手順の継続期間にわたって安定であると思われた。
【０５５２】
緩衝液対照、２匹の正常イヌのＣＳＦまたは血清を、漸増濃度の組換えヒトＮＦ−Ｌで補完することにより、ＮＦ−Ｌのスパイクリカバリーを試験した。ＣＳＦ試料を１：１００希釈でアッセイし、血清試料を１：４００でアッセイした。表３２に示されるように、平均スパイクリカバリーは、許容基準付近または許容基準内だったが、スパイクレベル間には著しいばらつきが観察された。表３２では、ＮＦ−Ｌ試料欄の「ＣＳＦ」はＣＳＦ試料を指し、「Ｓ」は血清試料を指す。
【０５５３】
【表３２】
2021502060.tif 000034
分析および結果：ＤＭイヌ
ＤＭイヌおよび対照イヌのＣＳＦにおけるＮＦ−Ｌ濃度を比較した。結果（各動物の平均）は図４Ａに示される。試料を、１：５００希釈で重複して分析した（％ＣＶ値は０〜１０％の範囲だった；誤差はＳＥＭ；チューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ；＊ｐ＜０．０５、＊＊ｐ＜０．０１、高齢対照に対して）。
【０５５４】
全ステージのＤＭイヌは、高齢（＞９歳）および若年（１〜５歳）対照群と比較して、ＣＳＦ  ＮＦ−Ｌの強力な増加を示した。混合ＤＭコホートは、高齢対照群の６，８６４ｐｇ／ｍｌと比較して、４７，０６８ｐｇ／ｍｌの平均ＮＦ−Ｌ濃度を提示する（ヒトＣＳＦは約２１００ｐｇ／ｍｌである）。ＮＦ−Ｌの増加は、初期疾患ステージで最も顕著であると思われ、重症度に伴って増加が見られた。群ＤＭ２は、群ＤＭ１と比較してＮＦ−Ｌレベルの増加を示す傾向があった（ｐ＝０．１）。加えて、イヌ高齢対照群は、若年対照群と比較してより高いレベルのＮＦ−Ｌを示し（６８６４ｐｇ／ｍｌ対３０５３ｐｇ／ｍ）、正常イヌのＣＳＦにおける年齢依存性ＮＦ−Ｌ増加を示唆した。
【０５５５】
ＤＭイヌおよび対照イヌの血清におけるＮＦ−Ｌ濃度を比較した。結果（各動物の平均）は図４Ｂに示される。試料を、１：２００希釈で重複して分析した（誤差はＳＥＭ；チューキーの多重比較検定による一元配置ＡＮＯＶＡ）。
【０５５６】
若年対照群（７２ｐｇ／ｍｌ）と比較して、高齢対照群（２９７ｐｇ／ｍｌ）の血清ＮＦ−Ｌには明白な増加があり、正常イヌにおける年齢依存性増加を示唆した。ＣＳＦとは異なり、いずれのステージのＤＭイヌの血清も、高齢対照群と比較してＮＦ−Ｌの有意な増加を示さなかった。しかしながら、平均ＮＦ−Ｌレベルは、混合ＤＭ１／２ステージ（３０２ｐｇ／ｍｌ）から混合ＤＭ３／４ステージ（５７２ｐｇ／ｍｌ）へと増加する可能性があった。若年対照群ＮＦ−Ｌレベルは、正常ヒト血清ＮＦ−Ｌよりも約１０倍高いため（７２ｐｇ／ｍｌ対約８ｐｇ／ｍｌ）、イヌと比較してヒトにおいて低い血清ＮＦ−Ｌレベルは、検出が難しいであろう。
【０５５７】
対照イヌおよびＤＭイヌの血清およびＣＳＦにおけるＮＦ−Ｌの相関性プロットは、群をすべて混合すると明白な線形相関性がなかったことを示したが、若年対照群および高齢対照群に由来する混合データは、血清およびＣＳＦ  ＮＦ−Ｌレベルの線形相関性を示唆した。
【０５５８】
要約
ｈＮＦＬのデジタルＥＬＩＳＡアッセイ（クアンテリックス（Ｑｕａｎｔｅｒｉｘ）社製Ｓｉｍｏａプラットフォーム）を、正常イヌのＣＳＦおよび血清の希釈線形性、安定性およびｈＮＦＬスパイクリカバリーの予め規定された許容基準を満たすように最適化した。このＥＬＩＳＡアッセイを使用して、正常イヌおよびＤＭイヌのＣＳＦおよび血清レベルを分析した。
【０５５９】
ＣＳＦ  ＮＦ−Ｌレベルは、高齢対照と比較してステージ１〜４のＤＭ罹患イヌで実質的に上昇し、ＣＳＦ  ＮＦ−Ｌ増加は、初期疾患ステージで最も顕著だった。
ＣＳＦとは異なり、いずれのステージのＤＭイヌの血清も、高齢対照群と比較してＮＦ−Ｌの有意な増加を示さなかった。血清ＮＦ−Ｌの実質的な増加は、若年対照群よりも高齢対照群で観察され、正常イヌにおける年齢依存性増加を示唆した。同様の相対的増加がＣＳＦで示された。対照イヌでは、ＣＳＦおよび血清ＮＦＬレベルは、線形的に相関する可能性があった。
【０５６０】
したがって、血清およびＣＳＦ中のＮＦ−Ｌ濃度は年齢と共に増加し、高齢対照イヌと比較してＤＭイヌで上昇する可能性が高い。ＣＳＦ  ＮＦＬ濃度も、初期疾患進行のバイオマーカーであり得る。
【０５６１】
実施例１１．バイオマーカーとしてのリン酸化ニューロフィラメント重鎖レベル
ＤＭは、初期には、痙性上位運動ニューロン不全対麻痺および全身性固有受容運動失調として顕性となる（ステージ１）。進行性神経変性は、歩行不能不全対麻痺／対麻痺（ステージ２）および胸肢不全麻痺（ステージ３）をもたらす。最終ステージの疾患は、弛緩性四肢麻痺、広範な筋萎縮および延髄機能障害（ステージ４）で終わりを迎える。この疾患は、原因、進行、および予後が、ある形態のヒト筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）と類似すると考えられている。リン酸化ニューロフィラメント重鎖（ｐＮＦ−Ｈ）は、ＤＭおよびＡＬＳの種間バイオマーカーとしての可能性を有する。血液およびＣＳＦ中のｐＮＦ−Ｈ濃度の増加は、高い診断能力およびＡＬＳであると診断された患者の疾患進行との関連性を示している。ＤＭ罹患イヌでは、ＣＳＦ  ｐＮＦ−Ｈは、高い特異性を有する高感度の診断用バイオマーカーであり、決定されたカットオフ値は＞２０．２５ｎｇ／ｍＬであり、感度は＞８０．４％であり（ＣＩ  ６６．０９〜９０．６４％）、特異性は９３．６％である（ＣＩ  ７８．５〜９９．２１％）。
【０５６２】
図５Ａ、図５Ｂ、および図５Ｃに示されるように、ｐＮＦ−Ｈは、ＤＭ罹患イヌのＣＳＦで増加する。図５Ａは、ＣＳＦ  ｐＮＦ−Ｈ中央値が、正常イヌと比較して全疾患ステージのＤＭ罹患イヌで増加することを示す（ステージ１、ｎ＝１０、ｐ＜０．０５；ステージ２、ｎ＝１３、ｐ＜０．０００１；ステージ３、ｎ＝１４、ｐ＜０．００１；ステージ４  ｎ＝９、ｐ＜０．０１）（事後のダンの方法（ｐｏｓｔ  ｈｏｃ  Ｄｕｎｎ’ｓ  ｍｅｔｈｏｄ）による順位に対するクラスカル−ワリスＡＮＯＶＡ（Ｋｒｕｓｋａｌ−Ｗａｌｌｉｓ  ＡＮＯＶＡ  ｏｎ  Ｒａｎｋｓ）に基づく比較；バーは、群中央値および四分位範囲を表す）。図５Ｂは、単一時点のＣＳＦ  ｐＮＦ−Ｈ濃度とＤＭ疾患ステージとの間に相関性がないことを示す（ｐ＝０．４０５０）。図５Ｃは、ＣＳＦ  ｐＮＦ−Ｈ濃度がＤＭ罹患イヌに由来する縦断的な対の試料において経時的増加するため、ｐＮＦ−Ｈが疾患進行の有用なバイオマーカーであり得ることを示唆する。
【０５６３】
治療群と未治療群との間でｐＮＦ−Ｈ結果に有意差があることは、ＤＭ罹患イヌにおける定量可能な尺度を提供するであろう。
実施例１２．ＤＭ罹患イヌにおけるインビボ研究
ＳＯＤ１を標的とするＡＡＶの治療有効性を研究するために、ＤＭイヌに、バキュロウイルス作製法またはトリプルトランスフェクション作製法のいずれかによって作製されるＡＡＶ  ＳＯＤ１コンストラクトを髄腔内（ＣＭおよび腰椎）に投薬する。この研究には、５匹のイヌの群を使用することになる（ＡＡＶによる投薬はｎ＝２、および媒体はｎ＝３）。この研究に含めるためには、動物は、初期ステージのＤＭであり、ＮＳＦ健康スクリーニングを受け、正常ＣＳＦレベル、正常ＥＭＧを有し、ＮＳＦ  Ｔ−Ｌ脊髄ＭＲＩを受け、Ａ／Ａ遺伝子型を有し、および／または１：１０未満のＡＡＶ自然抗体を有する必要があるであろう。ＡＡＶまたは媒体のみを投与する前に、ベースライン流体サンプルを収集することになり、動物には免疫抑制剤を投与することになる。
【０５６４】
毒性研究および縦断的研究を、およそ１２カ月間実施することになり（延長することができる）、次に動物を安楽死させることになる。毒性研究は、限定はされないが、身体的検査、ＣＢＣレベル、血液生化学分析、尿検査、および／またはＣＳＦ分析を含むであろう。縦断的研究は、限定はされないが、神経学的検査、ビデオ歩調スコア化、ＣＳＦ  ｐＮＦ−Ｈレベル、ＣＳＦ、血清および尿試料の収集および保管（−８０℃が最適）を含むであろう。例示的なスクリーニングチャートは、下記の表３３に示される。
【０５６５】
【表３３】
2021502060.tif 000035
ＡＡＶ治療動物は、発症から歩行不能状態までの時間の中央値の延長を示し、より低いＣＳＦ  ｐＮＦ−Ｈレベルで安定することになることが予想される。
【０５６６】
均等物および範囲
当業者は、本明細書に記載される本発明に係る具体的な実施形態の多くの均等物を認識し、またはルーチンに過ぎない実験を用いて確かめることが可能であろう。本発明の範囲が上記の説明に限定されることは意図されず、それはむしろ添付の特許請求の範囲に示されるとおりである。
【０５６７】
特許請求の範囲では、「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」などの冠詞は、反する旨が示されない限り、または文脈上特に明らかでない限り、１つまたは２つ以上を意味し得る。ある群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含むクレームまたは説明は、反する旨が示されない限り、または文脈上特に明らかでない限り、その群メンバーの１つ、２つ以上、または全てが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する場合に満たされるものと見なされる。本発明は、群の正確に１つのメンバーが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する実施形態を含む。本発明は、２つ以上の、または全部の群メンバーが所与の製品または方法に存在する、それに用いられる、または他の形でそれに関連する実施形態を含む。
【０５６８】
また、用語「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は非限定的（ｏｐｅｎ）であることが意図され、追加の要素または工程の包含を許容するが必須ではないことも注記される。用語「〜を含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」が本明細書で使用されるとき、したがって用語「〜からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」もまた包含され、開示される。
【０５６９】
範囲が提供されるとき、端点は含まれる。更に、特に指示されない限り、または文脈および当業者の理解から特に明らかでない限り、範囲として表される値は、文脈上特に明確に指示されない限り、その範囲の下限の単位の１０分の１に至るまでの、本発明の種々の実施形態において明示される範囲内にある任意の具体的な値または部分的範囲を想定し得ることが理解されるべきである。
【０５７０】
加えて、先行技術に含まれる本発明の任意の特定の実施形態は、クレームの任意の１つ以上から明示的に除外され得ることが理解されるべきである。かかる実施形態は当業者に公知であると見なされるため、除外が本明細書に明示的に示されないとしても、それらは除外され得る。本発明の組成物の任意の詳細な実施形態（例えば、任意の抗生物質、治療薬または活性成分；任意の作製方法；任意の使用方法等）が、先行技術の存在に関係するか否かに関わらず、何らかの理由で任意の１つ以上のクレームから除外されることがある。
【０５７１】
使用した文言は、限定でなく、むしろ説明の文言であること、およびその広義の態様における本発明の真の範囲および趣旨から逸脱することなく、添付の特許請求の範囲内で変更が行われ得ることが理解されるべきである。
【０５７２】
本発明をかなり詳しく、幾つかの説明される実施形態に関するある具体性をもって説明したが、それが任意のかかる具体例もしくは実施形態または任意の具体的な実施形態に限定されるべきであることを意図するものではなく、しかし先行技術を考慮してかかる特許請求の範囲の最も広義の可能な解釈を提供し、したがって本発明の意図される範囲を有効に包含するように添付の特許請求の範囲を参照して解釈されるべきである。
【０５７３】
引用された情報源、例えば本明細書で引用された参考文献、刊行物、データベース、データベースエントリー、および技術はすべて、たとえ引用において明示的に記載されていなくとも、参照により本出願に援用される。引用された情報源の記載と本出願の記載が矛盾する場合、本出願の記載が優先するものとする。
【０５７４】
セクションおよび表の見出しは、限定を意図しない。
【図１】
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【図２Ａ】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４Ａ】
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【図４Ｂ】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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