(57)【要約】ある実施形態では、本発明は、結合パートナーと結合を形成する1以上のペプチドタグを含む外部表面を備えるアデノ関連ウイルス（AAV）を提供し、AAVは生ウイルスである。別の実施形態では、本発明は、少なくとも1つのこのようなAAVと、タグの結合パートナーである第1のドメイン及び生物活性ポリペプチドである第2のドメインを含む少なくとも1つのポリペプチドと、を含むコンジュゲートを提供する。別の実施形態では、本発明が少なくとも1つのこのようなAAV（第1のAAV）と少なくとも1つの第2のAAVとを含むコンジュゲートを提供する。前記第2のAAVは第2の外部表面を備え、この第2の外部表面は前記タグに対する又は第3のリンカー分子に対する、少なくとも1つの結合パートナーを含み、少なくとも1つの第1のAAV及び少なくとも1つの第2のAAVが結合している。【選択図】図１
2021516048.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
外部表面を備えるアデノ随伴ウイルス（AAV）であって、外部表面が、結合パートナーとの結合を形成する1以上のペプチドタグを含み、AAVが生ウイルスである、AAV。
【請求項２】
請求項１に記載のAAV及び、タグに対する結合パートナーを含む第1のドメインと、生物活性ポリペプチドを含む第2のドメインとを含む、少なくとも1つのポリペプチド、を含むコンジュゲートであって、AAV及びポリペプチドが結合している、コンジュゲート。
【請求項３】
第2のドメインがCas9を含む、請求項２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
少なくとも1つの請求項１に記載のAAV（第1のAAV）及び少なくとも1つの第2のAAVを含むコンジュゲートであって、第2のAAVは、第2の外部表面を備え、第2の外部表面はタグ又は第3のリンカー分子に対する少なくとも1つの結合パートナーを含み、少なくとも1つの第1のAAV及び少なくとも1つの第2のAAVは結合しており、少なくとも1つの第2のAAVが生ウイルスである、コンジュゲート。
【請求項５】
コンジュゲート内の第1のAAV及び第2のAAVが、導入遺伝子の別々の部分を含むゲノムをそれぞれ含み、細胞がコンジュゲートに感染した際に完全な導入遺伝子が組み立てられ得る、請求項4に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
少なくとも1つの第1のAAVの外部表面が、結合パートナーとの結合を形成するペプチドタグに対する少なくとも1つの結合パートナーを含む、請求項４又は5に記載のコンジュゲート。
【請求項７】
第2のAAVの第2の外部表面が、結合パートナーとの結合を形成する1以上のペプチドタグを含む、請求項４〜6のいずれか1項に記載のコンジュゲート。
【請求項８】
2以上の前記第1のAAVを含む、請求項４〜７のいずれか1項に記載のコンジュゲート。
【請求項９】
2以上の前記第2のAAVを含む、請求項４〜８のいずれか1項に記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
第3のリンカー分子を含み、第3のリンカー分子はAAV同士を架橋する、請求項４〜９のいずれか1項に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
結合が、共有結合である、請求項１〜１０のいずれか1項に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
細胞と、請求項１〜１１のいずれか1項に記載のAAV又はコンジュゲートと、を含み、細胞はAAV又はコンジュゲートに感染している、組成物。
【請求項１３】
前記細胞はインビボである、請求項１２の組成物。
【請求項１４】
前記細胞はヒト細胞である、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項１５】
前記細胞は、ウシ、イヌ、ヤギ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタ、又は霊長類の細胞である、請求項１２又は１３に記載の組成物。
【請求項１６】
請求項１〜１１のいずれか1項に記載のAAV又はコンジュゲートと、薬学的に許容可能な担体と、を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の参照
本出願は、2018年2月28日に出願された同時係属中の米国特許出願第62/636,638号の利益を主張し、その全内容を本明細書に組み込む。
【０００２】
電子的に提出された資料の参照による組み込み
本明細書には、同時に提出され、下記のように識別されるコンピュータで読み取り可能なヌクレオチド／アミノ酸配列リストが、参照により全体が組み込まれる：2019年2月28日付の「741805_ST25.TXT」と名付けられた36,315バイトのASCII（テキスト）ファイル。
【背景技術】
【０００３】
現在、アデノ随伴ウイルス（AAV）のようなウイルスは、インビボ（in vivo）遺伝子導入のための最も効率的な様式であるが、タンパク質発現の一過性の制御が不可能なことが多い。その代わり、ウイルスベクターを介して送達される遺伝子は、恒久的に発現されることが多く、このことは持続的な発現が標的外の効果につながるCas9等を使用する場合においては重大な欠点である。誘導性プロモーターによりある程度の一過性を実現し得るが、多くは、遺漏があるか、非効率的である。
【０００４】
AAVはインビボでの遺伝子送達のための非常に効率的な非病原性ベクターであり、神経細胞に対して強い指向性を有し、実験室環境での製造及び作業が容易である。しかし、AAVベクターのサイズは、4.7kBに厳しく制限されており、大きな遺伝子又は複数の遺伝子の送達ができない。したがって、単一のAAVビリオンに適応可能なサイズよりも大きな導入遺伝子の送達を可能にする、改良されたAAVベースのベクターシステムが必要とされる。また、一過性発現が重要なCas9などのタンパク質を送達することができる、AAVベースのベクターが必要とされる。
【発明の概要】
【０００５】
発明の概要
本発明は、インビボでの遺伝子送達に対するこれらの主要な障害を克服する、AAVの安全性及び効率に基づいて構築された、革新的な遺伝子及びタンパク質送達システムを提供する。パッケージングサイズの制限と恒久的なタンパク質の発現を克服するために、本発明は、小さな球状タンパク質と、生理学的に関連する条件下で切断不能な結合（非限定的な例としては、共有結合であり得る）を自発的に形成するペプチドタグを使用する、モジュラーAAVベースの遺伝子及びタンパク質送達システムを提供する。AAVビリオンの表面にこのペプチドタグを発現させ、別のAAV又は別のタンパク質に結合パートナーを発現させることで、本発明のAAVベクターは、カプシドを互いに及び／又はタンパク質に連結（例えば、共有的な連結）し、より大きな感染性単位を産生することができる。遺伝子及びタンパク質を細胞内に送達するための、この高度にフレキシブルで拡張可能なモジュラーシステムは、遺伝子及びタンパク質送達のためのAAVの可能性を大幅に広げる。
【０００６】
AAVカプシドを連結してコンジュゲートを形成することによって、本発明はAAVベクターの運搬能力を2倍（又は2倍以上）にすることができ、偏性AAVの重感染を介して、大きな遺伝子及び複数の遺伝子の送達を可能にする。さらに、タンパク質をAAVカプシドの外側につなぐことによって、本発明は、一過性の発言が不可欠なCas9などの生物学的活性を有するタンパク質を送達する間、ウイルスの指向性及び感染性を利用する。
【０００７】
本発明は、これらの2つのアプローチを組み合わせるように拡張されてもよく、遺伝子及びタンパク質の群の同時送達を可能にする。総合すると、このアプローチはインビボでの遺伝子及びタンパク質の送達に対する最も顕著な障壁のいくつかを克服し、生物学的研究及び遺伝子治療のためのAAVを介した遺伝子送達及び遺伝子編集の有用性を拡大する。重要なことに、本発明のこのシステムはモジュール式であり、高度にフレキシブルであり、広範囲の実験目的のために修正することができる。本発明のこのシステムの開発は、生物学のすべての分野に広範な意義を有し、大きな遺伝子が関与するか、又は一過性の発現を必要とする、疾患に対する新しい治療の道を開き、インビボでの遺伝子発現、遺伝子編集、及びタンパク質送達の正確かつ効率的な制御のための、カスタマイズ可能なツールを提供することによって、複数の学問領域にわたる科学者のための新しい研究の道を開く。なお、本明細書に記載の概念と方法は、拡張可能であり、他のタイプのウイルスにも適用することができる。
【０００８】
ある実施形態において、本発明は、外部表面を備えたアデノ随伴ウイルス（AAV）であって、その外部表面が、結合パートナーとの結合（非限定的な例として、共有結合であり得る）を形成する1つ以上のペプチドタグを含み、生ウイルスである、AAVを提供する。別の実施形態では、本発明は、少なくとも1つのこのようなAAVと、タグに対する結合パートナーである第1のドメインと生物活性（bioactive）ポリペプチドである第2のドメインを含む少なくとも1つのポリペプチドと、を含むコンジュゲートを提供する。ここで、AAV及びポリペプチドは結合（例えば、共有結合）している。別の実施形態において、本発明は、少なくとも1つのこのようなAAV（第1のAAV）及び少なくとも1つの第2のAAVを含むコンジュゲートを提供する。第2のAAVは、第2の外部表面を備え、第2の外部表面は、タグ又は第3のリンカー分子に対する少なくとも1つの結合パートナーを含み、少なくとも1つの第1のAAV及び少なくとも1つの第2のAAVは結合（例えば、共有結合）しており、少なくとも1つの第2のAAVは生ウイルスである。
【０００９】
また、本発明は、本発明のAAV及びコンジュゲートで細胞を感染させる方法、ならびに本発明のAAV及びコンジュゲート及び細胞を含む組成物を提供し、組成物において、細胞は、本発明のAAV又はコンジュゲートに感染する。本発明はまた、本発明のAAV又はコンジュゲート及び薬学的に許容される担体を含む医薬組成物を提供する。
【００１０】
図面の一部の視点に関する簡単な説明
カラー図面に関連する37 C.F.R§1.84に対する明細書の目的
本特許又は特許出願は, カラーを付して作成された少なくとも1の図面を含んでいる。カラー図面を伴う本特許又は公開特許公報の写しは, 申請及び必要な手数料の納付によって、特許商標庁から提供される。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】図1は、本発明のアプローチの概略図を示す。Ａ列は連鎖ウイルス（AAV）に関するものである。ペプチドタグはAAVカプシドの表面上に発現し、タンパク質結合パートナーは別のウイルス（第2のAAV）上に発現する。これらの2つのウイルス種を混合すると、リンカー対は生理学的条件下で恒久的に安定な結合（その非限定的な例は共有結合であり得る）を自発的に形成し、コンジュゲート（Ａ列においてウイルス二量体として示される）の形成をもたらし、ベクターの運搬能力を増加させ、送達される遺伝子の比率の正確な制御を可能にする。このコンジュゲートは、偏性の共感染とそれに続く組換えを介して複数の遺伝子の同じ細胞への送達や、大きな遺伝子の送達を可能にする。Ｂ列は、第3のリンカー分子を介した2つのウイルスカプシドの連結に関する。リンカーは両方のウイルス上のリンカーに結合し、2つのベクターを架橋する分子から構成される。Ｃ列は、コンジュゲートを形成するためにウイルスに連結されたタンパク質に関する。タンパク質をカプシドの外側につなげることにより、AAVの指向性及び感染性を利用して、Cas9のような治療用タンパク質を非恒久的に送達することができる。Cas9の一過性発現は、オフターゲット効果を減少させるために必須である。連結した機能性タンパク質は核内に送達され、作用した後、分解される。Ｄ列は、本発明のアプローチをどのように拡張できるかを表す。これらのアプローチを組み合わせることで、すべてのDNAを含むウイルス粒子及びタンパク質は、多量体連結コンジュゲートユニットとして、まとめて送達できる。
【図２】図2は、連結されたベクター（AAVコンジュゲート）の電子顕微鏡画像を示す。パネルＡは、対照としてのAAV2ベクターを示す。パネルBは、AAV2-SnoopTagベクターと連結してマルチウイルスコンジュゲートを形成するAAV2-SpyTagベクターを実証するデータを示す。コンジュゲートは、AAVビリオンの二量体又は三量体として現れる。パネルCはSpyTag/SnoopTagリンカーの過剰発現が、AAVカプシドの凝集塊の形成を引き起こし、多くのAAVベクターがつながれることを示す。
【図３】図3は、AAVカプシドの連結を示すウェスタンブロット画像である。最後の2つのレーンの上のバンドは、連結されたVP3サブユニットを示す。この特定の実施形態において、AAVカプシドは、第3の連結分子（VP3SpyTag-Linker-VP3SnoopTag）（図1のB列）を介して連結された。
【図４】図4は、機能性タンパク質に連結するAAVを含むコンジュゲートを画像で示す。パネルAは、AAV-SpyTagに連結するGFP-SpyCatcherの量が増加していることを示す。パネルBはtdTomato（AAV2にパッケージされた導入遺伝子によってコードされる）の発現を示し、AAV-SpyTag-GFP-SpyCatcherが感染性であることを実証する。パネルCは、AAV-SpyTag-GFPSpyCatcher粒子が、超解像共焦点顕微鏡によって追跡することができることを実証し、機能性タンパク質の組み込みの成功を実証するデータを提示する。
【図５】図5は、Cas9-SpyCatcherがAAV2-SpyTagに共有結合したAAV-ポリペプチドコンジュゲートに関するデータを示す。パネルAは、Cas9-Spycatcherとロドプシンを標的とするガイドRNAでトランスフェクトされたHEK293T細胞に関する。CRISPR/Cas9で誘導される突然変異をT7アッセイにより試験した。最初の2つのレーンは、1）未処理、及び2）T7エンドヌクレアーゼで処理した未トランスフェクトサンプルを示す。最後の2つのレーンは、トランスフェクトした試料を、3）未処理、及び4）T7エンドヌクレアーゼで処理したものとして示す。Cas9-Spycatcherの切断による生成物は、第4レーンに見られる。パネルBは、Cas9-SpyCatcherへのAAV2-SpyTagの結合を示すウェスタンブロット画像を提示する。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
発明の詳細な説明
ある実施形態では、本発明は、結合パートナーと結合（非限定的な例として、共有結合であり得る）を形成する1つ以上のペプチドタグを含む外部表面を備えるAAVを提供する。本発明の文脈において、AAVは、好ましくは、ウイルス様粒子（VLP）とは対照的に、生ウイルスである。
【００１３】
ペプチドタグは、結合パートナーと結合を形成することができるポリペプチドである。これは、本発明のAAVがそのような結合を形成すると、結合は安定的で、かつ、生理学的に関連する条件下で一般的には破壊不能であることから、AAVが、感染時にタグ結合パートナーの結合を介して細胞につながれるもの（例えば、第2のAAV、生物活性ポリペプチドなど）を送達することを確実にする。
【００１４】
本発明の文脈において、「タグ」は、AAVの外部表面上で発現する場合、特異的な結合パートナーへの結合（非限定的な例として、共有結合であり得る）を形成し得る、任意の適切なポリペプチドであり得る。適切なタグの例としては、SpyTag及びその結合パートナーSpyCatcher、又はSnoopTag及びその結合パートナーSnoopCatcher、又はSpyTag002及びその結合パートナーSpyCatcher002（例えば、Zakeri, B. et al. Peptide tag forming a rapid covalent bond to a protein, through engineering a bacterial adhesin. Proceedings of the National Academy of Sciences 109, E690-7 (2012) （参照により本明細書に全体が取り込まれる）及びVeggiani, G. et al. Programmable polyproteins built using twin peptide superglues. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 113, 1202-1207 (2016) （参照により本明細書に全体が取り込まれる）及びKeeble et al. Evolving Accelerated Amidation by SpyTag/SpyCatcher to Analyze Membrane Dynamics. Angew Chem Int Ed Engl. (2017) （参照により本明細書に全体が取り込まれる）を参照のこと）が挙げられるが、これらに限定されない。通常、結合（つながり（tether））は共有結合であるが、他のつながりも使用できる。使用可能な他の分子的つながりとしては、例えば、スプリットインテイン（split intein）（例えば、Wu et al. Protein trans-splicing by a split intein encoded in a split DnaE gene of Synechocystis sp. PCC6803. PNAS (1998)（参照により本明細書に全体が取り込まれる）を参照のこと）、ソルターゼ（sortase）（例えば、Kobashigawa et al., Attachment of an NMR-invisible solubility enhancement tag using a sortase-mediated protein ligation method. J Biomol NMR. (2009)（参照により本明細書に全体が取り込まれる）を参照のこと）、スプリットGFP（split GFP）（例えば、Feinberg, E. H. et al. GFP reconstitution across synaptic partners (GRASP) defines cell contacts and synapses in living nervous systems. Neuron 57, 353-363 (2008)（参照により本明細書に全体が取り込まれる）を参照のこと）、又は他の同様のリンカー分子が挙げられる。
【００１５】
タグは、細胞外ドメインを有するAAVポリペプチドをコードする遺伝子配列をこのようなタグを包接するように変異させることによって、本発明のAAVの表面上で発現されるように産生することができる。例えば、AAV VP2及びVP3ポリペプチドは、このようなタグドメインを包接するように突然変異させるのに適したポリペプチドである。タグの包接のための適切な部位としては、AAV2 VP3の453位、588位（及び他のAAV血清型上の類似の部位）、ならびにAAV2及び他の血清型におけるAAV VP2のN末端及びC末端が挙げられる。また、タグ付き及びタグなしカプシドタンパク質（例えば、VP3蛋白質の50%がタグドメインを担持し、カプシド蛋白質の50%がタグドメインを担持しないAAVカプシド）を組み合わせてキメラウイルスを構築してもよい。
【００１６】
AAV-ポリペプチドコンジュゲート
ある実施形態では、本発明は、外部表面を備える本発明のAAVを含むコンジュゲートを提供し、AAVの表面は、結合パートナーとの結合（その非限定的な例は共有結合であり得る）を形成する1以上のペプチドタグと、タグの結合パートナーである第1のドメイン及び生物活性ポリペプチドである第2のドメインを含む少なくとも1つのポリペプチドとを含み、AAVとポリペプチドは結合している（必須ではないが、例えば、共有結合している）。この実施形態は図1のC列に概略的に示される。この実施形態では、少なくとも1つのポリペプチドは、生物活性ポリペプチドをコードするドメインがタグ（例えば、上記のSpyCatcher、SnoopCatcher、SpyCatcher002など）の特異的結合パートナーをコードする配列とインフレームで融合されるコード配列を用いて、組換えで構築することができる。
【００１７】
本発明のAAV-ポリペプチドコンジュゲートは、タグ付き及びタグなしカプシドタンパク質をコードするプラスミドの混合物をパッケージング細胞株（例えば、 293細胞）にトランスフェクトすることで、本発明のAAVの表面に発現されるタグの数を変えることによって、任意の所望の数の結合生物活性ポリペプチドを組み込むことができる。したがって、タグなしカプシドタンパク質に対するタグ付きプラスミドの比率によって、カプシド表面上のタグの数をカプシドあたり1から60まで変化させることができる（AAVカプシドを形成する60のポリペプチドがある）。最大数のタグ（60タグ）付きAAVを産生するには、タグなしカプシドタンパク質をコードするプラスミドを使用する必要はない。例えば、ある実施形態において、本発明のAAV-ポリペプチドコンジュゲートは、ただ1つの連結した（その非限定的な例として、共有的な連結であり得る）生物活性ポリペプチドを有し得る。他の実施形態では本発明のAAV-ポリペプチドコンジュゲートは、3以上、5以上、10以上、20以上（又は「約」3、5、10又は20の共有結合した生物活性分子）といった、複数の連結した生物活性ポリペプチドを有し得る。本発明のAAV-ポリペプチドコンジュゲート中のそのような連結した生物活性ポリペプチドの数は、所望の用途に応じて、30まで、又は50まで、又は60まで（又は「約」30、50又は60の結合した生物活性分子）とすることができる。
【００１８】
産生後、得られたAAVは、精製して、タグの結合パートナーである第1のドメイン及び生物活性ポリペプチドである第2のドメインを含むポリペプチドと混合することができる（通常はPBS中であるが、必ずしもPBS中である必要はない）。ここで、AAV及びポリペプチドは結合している（その非限定的な例は共有結合を含む）。このようなパッケージング細胞株からのAAVの精製は日常的に実施されており、当業者にとって公知である。
【００１９】
本発明のAAV-ポリペプチドコンジュゲートは、細胞をコンジュゲートに感染させて、結合した生物活性ポリペプチドを細胞に送達するために使用することができる。このアプローチは、望ましくは細胞内に一過性に存在する生物活性ポリペプチドを細胞へ送達するのに特に適している。これは、AAVベクターゲノム内に導入遺伝子として所望のポリペプチドをコードする遺伝子（コード配列）を含めることによってポリペプチドが細胞に送達される、AAVを使用する細胞へのポリペプチドの通常の送達とは対照的である。感染後、AAVベクターゲノムは非分裂細胞内に保持され、その結果、AAVゲノム内の導入遺伝子は特に構成的プロモーターの制御下であれば、細胞内で恒久的に発現される。しかし、特定のポリペプチドについては、このようなポリペプチドの構成的、恒久的な産生は望ましくない。その一例は、使用可能な最も強力な研究ツールの1つに急速になっているCRISPR/Cas9システムに関連する、Cas9である。インビボ送達は、いまだにCRISPR/Cas9に基づくアプローチの成功に対する最大の障害である。Cas9の長期過剰発現は、意図しないゲノム部位でのオフターゲット切断のリスクを実質的に増加させる。したがって、遺伝子編集アプローチの重要な目標は、Cas9の効率的な送達を一過性に提供することである。本発明はAAV-ポリペプチドコンジュゲートを提供することによって、細胞に、恒久的に発現される導入遺伝子ではなく、Cas9ポリペプチドを送達することができ、したがって、これらの課題の両方を満たす。AAV表面に連結されたタンパク質形態でCas9を送達すると、一過性の活性が得られ、AAVゲノム内に導入遺伝子（CRISPR/Cas9に基づくアプローチのためのドナーDNA、蛍光マーカーをコードする遺伝子、又は他の所望の導入遺伝子など）のためのスペースが空けられる。Cas9は遺伝的にコードされていないので、本発明のコンジュゲートを介して送達されるタンパク質は、時間の経過とともに細胞によって分解され、潜在的に有害な長期オフターゲット効果を減少させる。
【００２０】
また、生物活性ポリペプチドドメインは、細胞へのコンジュゲートの送達で感染の追跡を促進できるように、緑色蛍光ペプチド（GFP）のような蛍光ポリペプチドとすることができる。これは、例えば、図4のパネルCに示されている。
【００２１】
また、生物活性ポリペプチドドメインは、コレラ毒素のβサブユニット（CTB）又は狂犬病ウイルスGタンパク質（RVGP） のようなポリペプチドであり得る。その発現は、ウイルスの指向性をシフトする。例えば、理論に束縛されることを望むものではないが、CTB及びRVGPをカプシドの表面に付着させることにより、末梢神経により効率的に感染させることができる、及び/又は逆行性輸送を改善することができる。
【００２２】
第1のAAV-第2のAAVコンジュゲート
ある一実施形態において、本発明は、結合パートナーとの結合（非限定的な例は共有結合である）を形成する1以上のペプチドタグを含む外部表面を備える本発明のAAV（「第1のAAV」）と、少なくとも1つの第2のAAVを含むコンジュゲートを提供し、第2のAAVは第2の外部表面を備え、第2の外部表面は、タグ又は別個のリンカー分子のための少なくとも1つの結合パートナーを含む。コンジュゲート内で、少なくとも1つの第1のAAV及び少なくとも1つの第2のAAVが結合する。また、第1のAAVと同様に（上記のように）、コンジュゲート内の少なくとも1つの第2のAAVは、好ましくは生ウイルスである。
【００２３】
この実施形態（第1のAAV-第2のAAVコンジュゲート）では、第1のAAVがタグ（例えば、突然変異VP2ポリペプチド又は他の表面ポリペプチドに組み込まれる）を発現するのと同様に、第2のAAVは、第2の表面上で結合パートナーを発現することができる。
【００２４】
この実施形態（第1のAAV-第2のAAVコンジュゲート）では、第1の及び第2のAAVは両方とも、結合パートナータグ（SpyTag及びSnoopTagなど）を発現することができ、次いで、これらは別個のリンカー分子（SpyCatcher-SnoopCatcher融合タンパク質など）を介して共に結合され、3ピース凝集塊を形成する。例えば、SpyTag/SnoopTag/SpyTag002及びVP2のためのLA…Aリンカー、剛性リンカー、長い柔軟性リンカー、及びより短いリンカー等の他のリンカー配列を、SpyTag/SpyCatcher挿入部位に使用してもよい。図1のA列は、コンジュゲート内のAAVが、ペプチドタグ/タンパク質結合パートナー相互作用を介して、コンジュゲート内の別のAAVに直接結合する実施形態を示す。図1のB列は、AAVが第3のリンカー分子を介して結合し、第3のリンカー分子が複数のAAVベクターを架橋する実施形態を示す。
【００２５】
本発明の第1のAAV-第2のAAVコンジュゲートは上記のように、パッケージング細胞株においてタグを発現するカプシドタンパク質の比率を変化させることで、第1の及び第2のAAVの表面上に発現されるタグ及び結合パートナーの数を変化させ、任意の所望の数のAAVを組み込み得る。その後、第1のAAV-第2のAAVコンジュゲートは、例えば、サイズ排除親和性、イオン交換FPLCクロマトグラフィー、又は所望の数のAAV（例えば、一量体又は三量体とは対照的な二量体など）を有するコンジュゲートを精製し得る他の方法によって精製され得る。例えば、ある実施形態では、コンジュゲートがAAVの二量体を含むことができる（例えば、図1 のA列を参照）。他の実施形態では、第1のAAV-第2のAAVコンジュゲートが三量体、四量体、五量体、十量体などであり得る。したがって、第1のAAV-第2のAAVコンジュゲートは、第1のAAV（タグを含む）の2以上、第2のAAV（タグに対する特異的結合パートナーを含む）の2以上、又はその両方を含むことができる。第1のAAV-第2のAAVコンジュゲート内のAAVの数に対する実際的な限界は、コンジュゲート内のAAVに細胞が感染し、AAVが細胞の核に入る必要があるため、その物理的サイズである。
【００２６】
本発明の第1のAAV-第2のAAVコンジュゲートの1つの使用は、単一のAAVベクターの4.7kBの限界よりも大きな導入遺伝子を効果的に送達することである。したがって、この実施形態の好ましい構成は、導入遺伝子のそれぞれ別個のセグメントを含むゲノムを含むコンジュゲート内のAAVを含み、その結果、細胞が第1のAAV-第2のAAVコンジュゲートに感染した際に完全な導入遺伝子を組み立てることができる。
【００２７】
例えば、AAVが遺伝子治療のために有効に使用され得る多くの疾患の治療は、単一のAAVベクターの4.7kBの限界を超える大きな遺伝子の送達を必要とする。AAVベクターの効率と発現の安定性を維持しつつ、AAVベクターの収容力を高めることは、遺伝子治療の分野における主要な目標である。大きな遺伝子を送達するための1つの有望なアプローチはオープンリーディングフレームを複数のベクターに分割することであり、これは、両方の（又は複数の）ベクターを有する細胞のウイルス感染後の相同組換えを通して組換えられる。しかし、別々のウイルスを使用して、大きな遺伝子の別々の部分が同じ比率で、同じ細胞に送達されることは、極めてあり得ないことである。これは、タンパク質の発現効率の低下、及び切断されたタンパク質産物の形成を引き起こす。本発明のこの態様（第1のAAV-第2のAAVコンジュゲート）では、複数のAAVベクターがコンジュゲート内で連結され、高い効率（100％に近い）での同時送達と、感染性ユニットの２倍（又は、コンジュゲート内のAAVの数によっては、3倍、4倍など）の運搬能力が実現される。
【００２８】
第1のAAV-第2のAAVコンジュゲートは、シュタルガルト病（導入遺伝子としてのABCA4）、神経線維腫症（導入遺伝子としてのNF1）、血友病、レーバー先天性黒内障（導入遺伝子としてのCEP290）、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、嚢胞性線維症、アッシャー症候群I型、II型及びIII型などの疾患の治療のために、複数のAAVカプシドに分割された大きな遺伝子を送達するために使用することができる。また、このアプローチは、複数の遺伝子を細胞に送達するために使用することができ、その産物は細胞内で相互作用するか、又は互いに補完することができる。例えば、このアプローチはRdCVFの錐体生存特性及びRdCVFLの抗酸化特性の両方の利益を得るために、RdCVF及びRdCVFLの両方を送達するために使用できる（例えば、Byrne et al, Viral-mediated RdCVF and RdCVFL expression protects cone and rod photoreceptors in retinal degeneration J Clin Invest (2015) （参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。又は、PDE6BとXIAPのような栄養因子と置換遺伝子 （Yae et al., Caspase Inhibition with XIAP as an Adjunct to AAV Vector Gene-Replacement Therapy: Improving Efficacy and Prolonging the Treatment Window PLOS ONE (2012) （参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））を送達するためにも使用できる。又は、治療的遺伝子及びレポーター遺伝子を送達するために使用でき、治療的処置のパターンのより良好な分析を可能にする。又は、ゲノム編集の特異性及び効率を高めるためのCas9に基づく2つの相補的ニッカ―ゼの送達などにも使用できる。例えば、このアプローチは、栄養因子と置換遺伝子の同時送達による視覚の効率的な機能的救済（rescue）に使用することができる。このアプローチはまた、ベクターの指向性を拡大するために、AAVの2つの血清型を連結するために使用され得る。
【００２９】
本発明のAAVの表面は、タグ（複数のタイプのタグを含む）又はタグ（複数のタグを含む）に対する特異的結合パートナーのいずれかもしくは両方、又は1以上のタグ及び1以上の特異的結合パートナーの両方を有し得ることが観察される。したがって、第1の及び第2のAAVを含むコンジュゲート内で、1以上の第1のAAVは、結合パートナーと結合を形成するペプチドタグに対する少なくとも1つの結合パートナーも含むことができる。同様に、このようなコンジュゲート内で、少なくとも1つの第2のAAVの第2の外部表面は、結合パートナーと結合を形成する1以上のペプチドタグを含むことができる。これにより、このようなコンジュゲート内のAAVの多量体化が促進され得ることが観察される。図1のD列を参照のこと。
【００３０】
さらに、本発明の第1のAAV-第2のAAVコンジュゲート（図1のA列及びB列）及び本発明のAAV-生物活性ポリペプチドコンジュゲート（図1のC列）のアプローチを、同時に用いることができる。この意味で、本発明は、任意の一連のDNAを含むウイルス粒子及びタンパクが、多量体コンジュゲート単位として、細胞又は細胞集団に同時に送達されることを許容する。
【００３１】
本発明のAAV及びコンジュゲートは、細胞を感染させるために使用され、それによって、導入遺伝子及び/又は連結された（例えば、共有的な連結であるが、これに限定されない）生物活性ポリペプチドを、このような細胞に送達することが観察される。したがって、本発明は、細胞に1以上の本発明のAAV又はコンジュゲートを感染させることによって、細胞に導入遺伝子を送達する方法を提供し、ここで、AAV又はコンジュゲートは、1以上の導入遺伝子を含む。上記のように、大きな（4.7kBより大きい）導入遺伝子については、第1のAAV-第2のAAVコンジュゲートは、細胞を感染させるために使用でき、それによって、導入遺伝子は第1のAAV-第2のAAVコンジュゲートを構成するAAVのうちの少なくとも2つの間で分割される。次いで、細胞内で、導入遺伝子のこれらの断片を再構築して、導入遺伝子の完全なコード配列を生成することができる。
【００３２】
同様に、本発明は、本明細書中に記載される1以上の本発明のAAV-生物活性ポリペプチドコンジュゲートに細胞を感染させることによって、生物活性ポリペプチドを細胞に送達するための方法を提供する。感染の際に、コンジュゲート内のAAVの外部表面上のタグに連結された（例えば、共有的な連結であるが、これに限定されない）生物活性ポリペプチドは、恒久的に発現される導入遺伝子の産物としてではなく、一過性に細胞に送達される。上記の通り、これは、細胞内のタンパク質のオフターゲット効果を防ぐため、Cas9のような生物活性タンパク質に好適である。
【００３３】
本発明の方法は、当業者にとって公知の、AAVが指向性を示す任意の細胞を感染させるために使用することができる。例えば、細胞は、外分泌細胞（例えば、唾液腺細胞、乳腺細胞、汗腺細胞、消化腺細胞などの腺細胞）、ホルモン分泌腺細胞（例えば、下垂体細胞、甲状腺細胞、副甲状腺細胞、副腎細胞など）、外胚葉由来細胞（例えば、角化上皮細胞（例えば、皮膚及び毛髪を構成する）、湿潤な層状のバリア上皮細胞（例えば、角膜、舌、口腔、消化管、尿道、膣などの細胞）、神経系の細胞（例えば、末梢及び中枢ニューロン、グリアなど））、中胚葉由来細胞、多くの内臓（腎臓、肝臓、膵臓、心臓、肺など）の細胞、骨髄細胞、及び腫瘍内外のいずれかの癌性細胞などであり得る。本発明のAAV及びコンジュゲートの感染に適した細胞の好ましい非限定的な例としては、末梢及び中枢神経系のニューロン、光受容細胞、網膜神経節細胞、網膜色素上皮細胞、蝸牛細胞、ミュラーグリア、網膜双極細胞、アマクリン細胞、及び水平細胞が挙げられるが、これらに限定されない。細胞はインビトロ（in vitro）であってもインビボであってもよく、実験動物（ラット、マウスなど）、農業又は獣医学関連の動物（例えば、ウシ、イヌ、ヤギ、ウマ、ネコ、ヒツジ、ブタなど）又は霊長類、例えばサル、大型類人猿、又は、好ましくはヒト患者内の細胞を含むヒト等の、任意の所望の哺乳動物宿主からのものであり得る。
【００３４】
同時に、本発明は細胞と、上記のAAV、AAV-生物活性コンジュゲート又はAAV-AAVコンジュゲートのうちの1以上とを含む組成物を提供し、ここで、細胞は、AAV又はコンジュゲートに感染している。細胞は、インビボであってもインビトロであってもよく、上記の通り、AAV又はコンジュゲートが指向性及び感染性を示す任意の所望の型であり得る。当然ながら、細胞がインビトロである場合、組成物は、組成物内で感染細胞を維持及び増殖させるための適切な培地も含む。このような培地は当業者に公知であり、組成物内の細胞の型に応じて適切な培地が選択され得る。
【００３５】
インビボ、特にヒト患者での使用を容易にするために、本発明は、上記のAAV、AAV-ポリペプチドコンジュゲート、又はAAV-AAVコンジュゲートの1以上、及び担体（好ましくは、生理学的に受容可能な担体）を含む医薬組成物も提供する。組成物の担体は、ベクターのための任意の適切な担体であり得る。担体は通常は液体であるが、固体であってもよく、又は液体成分と固体成分との組み合わせであってもよい。担体は望ましくは薬学的に許容される（例えば、生理学的に又は薬理学的に許容される）担体である（例えば、賦形剤又は希釈剤）。薬学的に許容される担体は周知であり、容易に使用可能である。どの担体を選択するかは、少なくとも部分的には、その特定のベクター及び組成物を投与するために使用されるその特定の方法に応じて決定される。組成物は、特に組成物の安定性及び/又はその最終的な使用を促進するために、任意の他の適切な成分をさらに含むことができる。したがって、本発明の組成物には、多種多様の適切な製剤が存在する。以下の製剤及び方法は、単に例示的なものであり、決して限定的なものではない。
【００３６】
非経口投与に適した製剤は、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び、製剤を対象とする受容者の血液又は他の組織と等張にする溶質を含有することができる水性及び非水性の等張性滅菌注射溶液、並びに、懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定化剤、及び保存剤を含みうる水性及び非水性の滅菌懸濁液を含む。通常は、このような担体は生理食塩水であり、皮膚への穿刺、又は皮下、筋肉内、腫瘍内もしくは非経口注射、又は所望の組織もしくは器官への直接注射による投与を容易にする。しかし、他の担体（例えば、経皮投与のための軟膏、クリーム、パッチなど）も使用することができる。
【００３７】
製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量又は複数用量の密封容器中で提供することができ、使用直前に注射用の滅菌液体賦形剤、例えば水の添加のみを必要とする凍結乾燥状態で保存することができる。
【００３８】
また、組成物は、追加の治療剤又は生物活性剤を含むことができる。例えば、特定の適応症の治療に有用な治療因子が存在し得る。イブプロフェン又はステロイドのような炎症を制御する因子は、ベクターのインビボ投与に関連する腫脹及び炎症ならびに生理的苦痛を減少させるため、組成物の一成分とすることができる。免疫系抑制剤は、ベクター自体に対する、又は疾患に関連する、任意の免疫応答を減少させるために、組成物の方法と共に投与できる。あるいは、免疫促進剤（immune enhancer）は、疾患に対する身体由来の防御を上方制御するために組成物に含まれ得る。抗生物質（すなわち、殺菌剤及び殺真菌剤）は、遺伝子導入の手順及び他の疾患に関連する感染のリスクを減少させるために存在し得る。
【実施例】
【００３９】
以下の実施例は本発明をさらに説明するが、当然ながら、その範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。実施例1〜4の基礎となる実験では、以下の方法を用いた。
【００４０】
パッケージングのためのプラスミドのクローニング及び調製
SpyTag/SnoopTag、SpyCatcher、SnoopCatcher、SpyTag002又はSnoopTag002を組み込むAAVベクターを産生するために、挿入領域をPCR増幅し、Gibson Assembly(New England Biolabs）でアニーリングして、AAVカプシドの表面露出領域上にリンカーペプチドを生成した。リンカーペプチドを、AAVのVP3サブユニットの453又は588位と、VP2サブユニットのN末端又はC末端に挿入した（配列については付録を参照のこと）。
【００４１】
ウイルスベクターの産生
GFP又はmCherryをコードし、SpyTag又はSnoopTagをカプシドタンパク質上に担持するゲノムを担持するAAVベクターを、3つ又は4つのプラスミドを用いるプラスミドコトランスフェクション法（Grieger et. al., Production and characterization of adeno-associated viral vectors. Nat Protoc. 2006;1(3):1412-28（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））により生成した。組換えAAVは、イオジキサノール勾配超遠心分離を行い、次いでバッファー交換を行い、Amicon Ultra-15遠心フィルターユニットとPBS + 0.001% Pluronic F-68を用いて濃縮して精製した。力価は、標準曲線に対する定量的PCRによって決定した（Aurnhammer et al, Hum. Gene Ther. Methods. 23(1):18-28 (2012)（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる））。
【００４２】
ウェスタンブロット
緑色蛍光タンパク質（GFP）、Cas9タンパク質、又はコレラ毒素のβサブユニットの各タンパク質のコード配列の開始コドン又は停止コドンを突然変異させ、Gibsonクローニングを通して、各タンパク質のN末端又はC末端にSpyCatcherのコード配列をフレーム内に挿入して、SpyCatcherタンパク質を各タンパク質と融合させた。タンパク質を細菌細胞で発現させ、精製した。AAV-SpyTagベクターを、10μgのGFP-SpyCatcher又は10μgのCas9-SpyCatcherタンパク質と混合した。AAV-SnoopTagベクターを43.5μgのSpyCatcher / SnoopCatcher融合タンパク質リンカー分子と混合した。AAVベクターを共に連結するために、AAV-SnoopTag及びAAV-SpyTagベクターを、Spycatcher / SnoopCatcher融合タンパク質リンカー分子と混合した。これらを室温で1時間インキュベートし、続いて4℃で一晩インキュベートした。
【００４３】
混合物を、翌日、6~8%トリス-グリシンゲル上で泳動した。タンパク質をPVDF膜に移し、5%ミルク中で1時間ブロックした。次いで、膜をTBSTで3×5分間洗浄し、一次抗体中で4℃で一晩インキュベートした：VP1、2及び3に対するマウスモノクローナル抗体（Progen社）（1:100希釈）。膜をTBST中で15分間、続いて4×5分間洗浄した。抗マウス二次抗体（Li-Cor社、1:2000希釈）に室温で1時間反応させた後、洗浄して、Odyssey CLx Imaging System（Li-cor社）を用いて可視化した。
【００４４】
CRISPR/Cas9トランスフェクション
Cas9-SpyCatcher融合タンパク質の編集能力について試験した。ヒトロドプシン遺伝子を標的とする4つの異なるgRNAを設計し、GeneArt Precision gRNA Synthesis Kit（Thermo Fisher Scientific社）を用いて合成した。Cas9-SpyCatcherはgRNAとともに、Lipofectamine CRISPRMAX Transfection Reagent （Thermo Fisher Scientific社）を用いて、HEK293細胞にトランスフェクトした。Cas9-SpyCatcher及びgRNAの濃度を、Lipofectamine CRISPRMAX Transfectionの手順に従って測定した。編集効率を試験する前に、細胞を72時間インキュベートした。
【００４５】
AAV-SpyTag-Cas9-SpyCatcher-RNPアセンブリ
Cas9 RNP複合体を調製するために、Cas9-SpyCatcherタンパク質を、2:1又は4:1のモル比でsgRNAと共にインキュベートした。ある方法では、Cas9-SpyCatcherタンパク質を、細胞に感染させる1日前にAAV-SpyTagベクターと混合した。実験の直前に、sgRNAを混合物に添加し、室温で10又は20分間インキュベートした。別の方法では、AAV-SpyTagベクター、Cas9-SpyCatcherタンパク質及びsgRNAを混合し、室温で30分間インキュベートした。HEK293細胞を構築物に感染させ、72時間インキュベートした後、編集効率を試験した。
【００４６】
CRISPR/Cas9編集効率の試験
所望のゲノム遺伝子座での編集能力を定量するために、ロドプシン遺伝子に対するゲノム編集を指示するガイドRNA UAGAGCGUGAGGAAGUUGAU（配列番号12）を使用して、T7エンドヌクレアーゼIアッセイをHEK293T細胞で行った。T7エンドヌクレアーゼIアッセイのために、ゲノムDNAを、Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kitを使用して、トランスフェクションの約72時間後に抽出した。標的部位を含む約1kbの領域を増幅するようにプライマーを設計し（hRHO 1 Fw: AGGCCTTCGCAGCATTCTT （配列番号13）及びhRHO 1 Rv: GCAGCACCCCATCTGTTTTC（配列番号14））、Q5 High-Fidelity DNA Polymeraseを用いて増幅した。PCR反応物をZymo DNA Clean and Concentratorで精製し、続いてT7エンドヌクレアーゼIで消化した。T7エンドヌクレアーゼで処理した試料を、未消化試料と共にアガロースゲル上で泳動した。
【００４７】
実施例1
この実施例は、結合パートナーと共有結合を形成する1以上のペプチドタグを含む外部表面を含むAAVの生成、安定性、及び感染性を実証する。ここで、AAVは生ウイルスである。
【００４８】
リンカーペプチド（タグ）であるSpyTag及びSnoopTag、ならびに特異的結合パートナーであるSnoopCatcherを、VP3の453位、588位、及びVP2サブユニットのC又はN末端を含むAAVカプシドの表面露出領域に構築した。
【００４９】
リンカー分子を用いたQPCR（Aurnhammer et al., Universal real-time PCR for detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences.Hum.Gene.Ther.Methods.23(1):18-28(2012)（参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）に記載される）を使用してウイルス力価を測定することにより、本発明のAAVが、ウイルスの安定性及び感染性に影響を与えることなく、これらのリンカー（タグ及び特異的結合パートナー）を担持し得ることが実証された。この結果を表1に示す。
【００５０】
【表１】
2021516048.tif 000003
【００５１】
表１：イオジキサノール精製ウイルス由来の高いウイルス力価は、VP2及びVP3の表面露出領域にリンカー分子を挿入した後のAAVカプシドの安定性を示す。「TG_GLS」は、フレキシビリティーを提供して効率的なウイルスパッケージングを可能にするために、TG及びGLS配列がSpyTagインサートのN末端及びC末端に隣接するように含まれたことを示す（例えば、TG-SpyTag-GLS）。
【００５２】
実施例２
本実施例は、本明細書中に記載される第1のAAV-第2のAAVのコンジュゲートの生成を実証する。
【００５３】
AAV種（実施例1を参照）を混合し、電子顕微鏡で観察した。図2に示すように、対のAAVウイルスコンジュゲートが観察された。図２のパネルＡ：対照としてのAAV2ベクター。図２のパネルＢ:SpyCatcher/SnoopCatcherリンカータンパク質によって連結された、AAV2-SnoopTagベクターに連結したAAV2-SpyTagベクター。ウイルスは二量体又は三量体として現れる。図２のパネルＣ：SpyTag/SnoopTagリンカーの過剰発現は、AAVカプシドの凝集塊の形成を引き起こし、多くのAAVベクターがつながれる。
【００５４】
タグ発現（第1のAAV）及び結合パートナー発現（第2のAAV）が連結するコンジュゲートを形成し得るかについても、ウェスタンブロットを用いて評価した。図３は、SpyCatcher-SnoopCatcher融合タンパク質からなるリンカー分子を介して結合したSpyTag発現及びSnoopTag発現AAVカプシドの連結を実証するデータを示す。
【００５５】
実施例３
本実施例は、本明細書中に記載されるAAV-ポリペプチドコンジュゲートの生成を実証する。
【００５６】
AAV2-SpyTagを、SpyCatcherに緑色蛍光タンパク質（GFP又はmClover）を連結させたポリペプチド（GFP-SpyCatcher）に結合させた（図4のパネルA）。GFP結合ウイルス粒子を、293細胞の超解像顕微鏡法で追跡した。ウイルス粒子が感染性であり、連結されたタンパク質が機能的であることが結果として示された（図4のパネルC）。
【００５７】
実施例４
この実施例は、本明細書中に記載されるAAV-ポリペプチドコンジュゲートの生成を実証する。
【００５８】
Cas9をSpyCatcherに融合させ、AAV-SpyTagベクターへの結合を可能にした。まず、ヒトロドプシン（Rhodopsin）を標的とするガイドRNAを用いて、Cas9-SpyCatcher融合タンパク質の切断効率をHEK293T細胞で試験した。結果を図5のパネルAに示す。結果は、AAVCas9-SpyCatcherコンジュゲートの感染によって送達されたCas9-SpyCatcherポリペプチドが標的（ロドプシン）を首尾よく切断したことを示す。
【００５９】
AAV2-SpyTagに対するCas9-SpyCatcherの結合能力もまた、ウェスタンブロットの解析によって評価した。結果を図5のパネルBに示す。結果は、Cas9-SpyCatcherへのAAV2-SpyTagの結合を実証する。
【００６０】
本明細書で引用される刊行物、特許出願、及び特許を含むすべての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれることが個別にかつ具体的に示され、その全体が本明細書に記載される場合と同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。
【００６１】
本発明を説明する文脈（特に、以下の特許請求の範囲の文脈）における用語「a」及び「an」及び「The」ならびに同様の指示対象の使用は、本明細書中で別段の指示がない限り、又は文脈において明らかに矛盾しない限り、単数形及び複数形の両方を包含すると解釈されるべきである。用語「含む（comprising）」、「有する（having）」、「含む（including）」、及び「含む（containing）」は、別段の指示がない限り、限定されない用語（すなわち、「含むが限定されない」を意味する）として解釈されるべきである。本明細書中の数値範囲の記載は本明細書中で特に指摘しない限り、単にその範囲内に該当する各値を個々に言及するための略記法としての役割を果たすことだけを意図しており、各値は本明細書中で個々に列挙されるのと同様に明細書に組み込まれる。本明細書に記載した全ての方法は、本明細書に別段の指示がない限り、或いは明らかに文脈に矛盾しない限り、任意の適切な順序で実行され得る。本明細書中で使用する、あらゆる例又は例示的な表現（例えば「など（such as）」）は、特に主張しない限り、単に本発明をよりよく説明することだけを意図し、本発明の範囲に対する制限を設けるものではない。本明細書中の表現は、主張されていない如何なる要素も本発明の実施に不可欠であることを指示していると解釈されない。
【００６２】
本発明の好ましい実施態様は、発明者らの知る本発明を実施するための最良の形態を含めて本明細書に記載されている。これらの好ましい実施態様の変形は、上述の記載を参照した当業者にとって明白となり得る。本発明者は、当業者が適宜このような変形を適用することを予測しており、本明細書中で具体的に説明される以外の方法で本発明が実施されることを予定している。従って、本発明は準拠法で認められる通り、本明細書に添付された請求項に記載の内容の改変物及び均等物をすべて含む。さらに、上述の要素のあらゆる可能な変形でのあらゆる組み合わせが、本明細書に別段の指示がない限り、又は明らかに文脈に矛盾しない限り、本発明に包含される。
【００６３】
付録−  配列表
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【図１】
2021516048.tif 000016
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
2021516048.tif 000021
2021516048.tif 000022