(57)【要約】  本発明は生物分野に関し、具体的にアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価するための方法に関する。本発明によれば、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写の比率が非常に良好な相対的安定性を有することが証明され、アスペルギルス・フラバス株毒性同定モデルが確立され、すなわち、アスペルギルス・フラバス菌毒性およびアフラトキシンの収量とｎｏｒ−１遺伝子転写量の比率（ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１）の間の回帰方程式が得られ、ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１の比率を決定することにより、アスペルギルス・フラバス株毒性の迅速かつ正確な同定および評価を実現でき、アフラトキシン汚染の早期警告と防止および管理にとって非常に重要である。または、本発明は、アフラトキシンの収量とｎｏｒ−１遺伝子転写量の同期検出ＲＴ−ＰＣＲ法を確立し、同期検出ＲＴ−ＰＣＲ法に基づいて得られたＡＦＴ／Ｎｏｒ−１の比率は信頼性が高く正確であり、アスペルギルス・フラバス株毒性を判定するための同定指標とすることができる。【選択図】図６
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフラトキシンの収量およびＮｏｒ−１遺伝子転写量を測定することにより、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写の比率を取得し、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写の比率に基づき、アフラトキシン毒素産生菌株毒素産生能力を同定および評価する、ことを特徴とする、アフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項２】
前記アフラトキシンの収量を測定するための方法では、アスペルギルス・フラバス株を培養し、アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、濾液を濾過し、濾液中のアフラトキシンの濃度を測定する、ことを特徴とする、請求項１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項３】
前記アスペルギルス・フラバス株の培養に使用する培地はＣＤＡ培地であり、培養条件は、２８℃、湿度９０％で１０日間の培養であり、
前記アスペルギルス・フラバス菌の胞子の振とう培養に使用される培地は、ジャガイモデキストロース液体培地であり、培養条件は、２８℃、２００ｒｐｍで９６時間の振とう培養である、ことを特徴とする、請求項１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項４】
免疫親和性精製−高速液体クロマトグラフィーの標準的な方法では、前記アスペルギルス・フラバス菌の胞子振とう培養後の濾液中のアフラトキシンの濃度を測定する、ことを特徴とする、請求項１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項５】
前記Ｎｏｒ−１遺伝子転写量を測定するための方法では、アスペルギルス・フラバス株を培養し、アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、アスペルギルス・フラバス菌の菌糸ペレットを濾過し、乾燥後乾燥菌を取得し、従来のＮｏｒ−１遺伝子転写量を測定するための方法で、乾燥菌中Ｎｏｒ−１遺伝子転写量を測定する、ことを特徴とする、請求項１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項６】
前記アフラトキシンの収量およびＮｏｒ−１遺伝子転写量は、同期検出ＲＴ−ＰＣＲによって得られ、前記同期検出ＲＴ−ＰＣＲは、
免疫反応段階において、アフラトキシンモノクローナル抗体１Ｃ１１コーティング量が一定量である条件下で、異なる濃度のアフラトキシン標準品を使用して、アフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージと、アフラトキシンモノクローナル抗体への結合をめぐって競合し、免疫競合反応が終了すると、アフラトキシンモノクローナル抗体に結合されたアフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージが溶出し、異なる濃度のアフラトキシン標準品は異なる溶出量のアフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージに対応し、溶出液中のファージは、ＰＣＲ加熱プロセス中にＤＮＡ分子を放出し、放出されたＤＮＡ分子をＲＴ−ＰＣＲ反応中の増幅ターゲットとして、前記キットを使用して各溶出液それぞれにＲＴ−ＰＣＲ増幅反応をかけ、増幅反応が完了すると、異なるＣｔ値が得られ、アフラトキシンの濃度の対数値を横軸とし、Ｃｔ値を縦軸として回帰分析を実行し、アフラトキシンの定量Ｓタイプの標準曲線を得る、アフラトキシン定量のＳタイプの標準曲線の確立の工程（１）と、
ｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ１の既知のコピー数のサンプルを異なるコピー数に連続希釈し、そして、前記キットを使用して各コピー数Ｔｑ−ｎｏｒ１それぞれに同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応をかけ、増幅反応が完了すると、異なるＣｔ値が得られ、Ｔｑ−ｎｏｒ１コピー数の対数値を横軸とし、Ｃｔ値を縦軸として回帰分析を実行し、ｎｏｒ−１遺伝子転写量の定量標準曲線を得る、Ｎｏｒ−１遺伝子転写量のＲＴ−ＰＣＲ標準曲線の確立の工程（２）と、
アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、菌株培養液とアスペルギルス・フラバス菌糸ペレットを濾過し、菌株培養液を一定の倍数に希釈した後、工程（１）の前記免疫反応中のアフラトキシン標準品の代わりに免疫競合反応に関与し、競合反応後、１Ｃ１１に結合したファージを溶出し、溶出液中のＶ２−５ファージを同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応における定量アフラトキシンの増幅テンプレートとし、さらに、アスペルギルス・フラバス菌糸ペレットを乾燥した後、トータルＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、前記ｃＤＮＡを特定の倍数に希釈して、同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応でＮｏｒ−１遺伝子を増幅するためのテンプレートとする、アスペルギルス・フラバス株培養工程（３）と、
前記ファージから放出されたＤＮＡ分子と前記ｃＤＮＡをテンプレートとして、同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応を実行し、増幅反応が完了すると、２つのＣｔ値が取得され、２つのＣｔ値それぞれをアフラトキシンの定量Ｓタイプの標準曲線とｎｏｒ−１遺伝子転写量の定量標準曲線に代入し、換算してアフラトキシンの濃度和ｎｏｒ−１遺伝子転写量を取得し、それにより、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量の比率を決定する、工程（４）とを備える、ことを特徴とする、請求項１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項７】
前記アフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージは、ファージＶＨＨ  ２−５であり、前記アフラトキシンモノクローナル抗体はアフラトキシンモノクローナル抗体１Ｃ１１である、ことを特徴とする、請求項６に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項８】
前記同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応の反応システムにおいて、上流および下流プライマーであるＰｈ−Ｆ、Ｐｈ−Ｒ、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｆ、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｒの最終濃度は、３００〜４００ｎＭであり、蛍光プローブであるＰｈ−ｐｒｏｂｅとＴｑ−ｐｒｏｂｅの最終濃度は、２００〜４００ｎＭであり、ＤＮＡポリメラーの最終投与量は０．５Ｕ〜１．０Ｕであり、ＭｇＣｌ２の最終濃度は１ｍＭ〜２ｍＭであり、ｄＮＴＰｓの最終濃度は、２００μＭ〜４００μＭである、ことを特徴とする、請求項６に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項９】
前記同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応の反応システムには、ユニバーサルプローブｑＰＣＲプレミックス５μＬと、Ｐｈ−Ｆ  ０．１μＬ、Ｐｈ−Ｒ  ０．１μＬと、Ｐｈ−ｐｒｏｂｅ  ０．１μＬと、ファージテンプレート２μＬと、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｆ  ０．１μＬと、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｒ  ０．１μＬと、Ｔｑ−ｐｒｏｂｅ  ０．１μＬと、Ｎｏｒ−１遺伝子テンプレート１μＬと、ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２μＬと、ＭｇＣｌ２  ０．８μＬ、ｄＮＴＰｓ  ０．２μＬとが含まれ、Ｈ２Ｏを加えて１０μＬを構成する、ことを特徴とする、請求項６に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項１０】
前記アフラトキシン毒素産生菌株の毒性はＹと定義され、アフトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量（ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１）の比率はＸと定義され、アスペルギルス・フラバス株の毒性の同定が確立される方程式は、
Ｙ＝１０．１４Ｘ−１６．２０であり、
高毒素産生株によると、毒素産生量＞１５０ｎｇ／ｍＬであり、中程度の毒素産生によると、５０＜毒素産生量＜１５０ｎｇ／ｍＬであり、低毒素産生によると、毒素産生量＜５０ｎｇ／ｍＬであり、非毒素産生によると、０であり、毒性同定範囲を計算するための方程式に代入すると、高毒素産生株がＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＞１６．４であり、中程度の毒素産生株が６．５＜ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＜１６．４であり、低毒素産生株が０＜ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＜６．５であり、非毒素産生株がＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＝０である、ことを特徴とする、請求項１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物学の分野に属し、特に、アフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
アフラトキシンは、これまでに見つかったマイコトキシンの中で最も毒性の高いタイプである。アフラトキシンＢ１を例にとると、その毒性はシアン化カリウムの１０倍、ヒ素の６８倍である。アフラトキシンは国際癌機構によってクラスＩ発がん性物質に分類されている。アフラトキシンは、ピーナッツ、トウモロコシ、米などの穀物や油料作物、クルミ、ピスタチオ、漢方薬などの多くの植物製品を容易に汚染する。国内外でのアフラトキシンによる人や家畜の中毒の多くの事例がある。国際がん研究機関（ＩＡＲＣ）の最新の報告によると、開発途上国だけで約５億人がアフラトキシンに曝露するリスクがある。中国はアフラトキシンの汚染が激しい地域である。農業省の数年の国勢調査の結果によれば、中国の主要作物製品におけるアフラトキシンの汚染が増加し続けており、深刻な地域の毒素含有量は制限の数百倍を超えていることを示している。強力な毒素産生株は２０％未満であるが、それは作物の品質と安全を脅かす主要な隠れた危険になっている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
アフラトキシンは、主にアスペルギルス・フラバスやアスペルギルス寄生菌などの真菌によって産生される。さまざまなアスペルギルス・フラバス株がアフラトキシンを生成する能力、つまり毒性が数百倍も異なる可能性があることが研究で示されている。強力な毒素産生株は、高汚染の主な原因であるが、これまでのところ、特異性の強力な毒素産生株を迅速に同定する効果的な方法が欠如している。現在、アスペルギルス・フラバス株の毒性を同定するための２つの主要な方法がある。１つは、株を一定期間培養した後に生成されるアフラトキシンの量を測定することにより、株の毒素産生能力を直接評価することである。このタイプの方法は長い時間がかかり、最初に菌株を分離してから培養し、最後にアフラトキシンの含有量を検出して評価する必要がある。さらに、アフラトキシンの生合成が多くの複雑な要因の影響を受け、同じ菌株が異なる培養バッチで培養されると、アフラトキシンの収量は大きく異なる。その結果を使用して菌株の本質的に一定の自己毒素産生特性を特徴付けることは困難であり、この方法の同定と評価結果の精度と信頼性に影響を与える。別の方法は、毒素産生に関連する遺伝子の転写レベルを測定することによって菌株の毒性を評価することであり、Ｎｏｒ−１遺伝子が毒性を評価するためにテストされているという報告が文献にある。ただし、このタイプの方法の欠点は、自然状態ではＮｏｒ−１遺伝子以外の毒素産生遺伝子を欠くため、Ｎｏｒ−１遺伝子の発現が検出されても、本来、アフラトキシンは産生されないことである。これは、そのような方法の誤った結果につながる。
【０００４】
要約すると、アフラトキシン毒素産生菌株の毒性を客観的かつ正確に特定および評価することは、常に未解決の世界的な問題であった。
【０００５】
従来技術の欠点を考慮して、本発明は、アフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価するための方法を提供することを目的とする。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本発明の上記の目的を達成するために、本発明によって採用される技術的解決策は以下のとおりである。
【０００７】
本発明に係るアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法では、アフラトキシンの収量およびＮｏｒ−１遺伝子転写量を測定し、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写の比率を取得し、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写の比率に基づき、アフラトキシン毒素産生菌株の毒素産生能力を同定および評価する。
【０００８】
上記の方法によれば、前記アフラトキシンの収量を測定するための方法は、アスペルギルス・フラバス株を培養し、アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、濾液を濾過し、濾液中のアフラトキシンの濃度を測定する。
【０００９】
上記の方法によれば、前記アスペルギルス・フラバス株の培養に使用する培地はＣＤＡ培地であり、培養条件は、２８℃、湿度９０％で１０日間の培養である。
前記アスペルギルス・フラバス菌の胞子の振とう培養に使用される培地は、ジャガイモデキストロース液体培地であり、培養条件は、２８℃、２００ｒｐｍで９６時間の振とう培養である。
【００１０】
上記の方法によれば、免疫親和性精製−高速液体クロマトグラフィーの標準的な方法で前記アスペルギルス・フラバス菌の胞子振とう培養後の濾液中のアフラトキシンの濃度を測定する。
【００１１】
上記の方法によれば、前記Ｎｏｒ−１遺伝子転写量を測定するための方法では、アスペルギルス・フラバス株を培養し、アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、アスペルギルス・フラバス菌の菌糸ペレットを濾過し、乾燥後乾燥菌を取得し、従来のＮｏｒ−１遺伝子転写量を測定するための方法で、乾燥菌中Ｎｏｒ−１遺伝子転写量を測定する。
【００１２】
上記の方法によれば、前記アフラトキシンの収量およびＮｏｒ−１遺伝子転写量は、同期検出ＲＴ−ＰＣＲによっても得ることができ、詳しくは、免疫反応段階において、アフラトキシンモノクローナル抗体１Ｃ１１コーティング量が一定量である条件下で、異なる濃度のアフラトキシン標準品を使用して、Ｖ２−５ファージと競合して１Ｃ１１に結合させ、免疫反応が終了すると、１Ｃ１１に結合したファージを溶出し、異なる濃度のアフラトキシン標準品は異なる溶出量のファージに対応し、溶出液中のファージは、ＰＣＲ加熱プロセス中にＤＮＡ分子を放出し、放出されたＤＮＡ分子はＲＴ−ＰＣＲ反応中の増幅ターゲットとして、テストキットを使用して各溶出液それぞれにＲＴ−ＰＣＲ増幅反応をかけ、増幅反応が完了すると、異なるＣｔ値が得られ、アフラトキシンの濃度の対数値を横軸とし、Ｃｔ値を縦軸として回帰分析を実行し、アフラトキシンの定量Ｓタイプの標準曲線を得る、アフラトキシン定量のＳタイプの標準曲線の確立の工程（１）と、
ｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ１の既知のコピー数のサンプルを異なるコピー数に連続希釈し、そして、前記テストキットを使用して各コピー数Ｔｑ−ｎｏｒ１それぞれにＲＴ−ＰＣＲ増幅反応をかけ、増幅反応が完了すると、異なるＣｔ値が得られ、Ｔｑ−ｎｏｒ１コピー数の対数値を横軸とし、Ｃｔ値を縦軸として回帰分析を実行し、ｎｏｒ−１遺伝子転写量の定量標準曲線を得る、Ｎｏｒ−１遺伝子転写量のＲＴ−ＰＣＲ標準曲線の確立の工程（２）と、
アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、菌株培養液とアスペルギルス・フラバス菌糸ペレットを濾過し、菌株培養液を一定の倍数に希釈した後、工程（１）の前記免疫反応中のアフラトキシン標準品の代わりに免疫競合反応に関与し、競合反応後、１Ｃ１１に結合したファージを溶出し、溶出液中のＶ２−５ファージを同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応における定量アフラトキシンの増幅テンプレートとし、さらに、アスペルギルス・フラバス菌糸ペレットを乾燥した後、トータルＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、前記ｃＤＮＡを特定の倍数に希釈して、同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応でＮｏｒ−１遺伝子を増幅するためのテンプレートとする、アスペルギルス・フラバス株培養工程（３）と、
前記Ｖ２−５ファージと前記ｃＤＮＡをテンプレートとして、同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応を実行し、増幅反応が完了すると、２つのＣｔ値が取得され、２つのＣｔ値それぞれをアフラトキシンの定量Ｓタイプの標準曲線とｎｏｒ−１遺伝子転写量の定量標準曲線に代入し、換算してアフラトキシンの濃度和ｎｏｒ−１遺伝子転写量を取得し、それにより、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量の比率を決定する、工程（４）とを備える。
【００１３】
上記の方法によれば、アフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示する（ｓｕｒｆａｃｅ-ｄｉｓｐｌａｙｉｎｇ）ファージは、ファージＶＨＨ  ２−５であり、前記アフラトキシンモノクローナル抗体はアフラトキシンモノクローナル抗体１Ｃ１１である。
【００１４】
上記の方法によれば、前記同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応の反応システムにおいて、上流および下流プライマーであるＰｈ−Ｆ、Ｐｈ−Ｒ、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｆ、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｒの最終濃度は、３００〜４００ｎＭであり、蛍光プローブであるＰｈ−ｐｒｏｂｅとＴｑ−ｐｒｏｂｅの最終濃度は、２００〜４００ｎＭであり、ＤＮＡポリメラーの最終投与量は０．５Ｕ〜１．０Ｕであり、ＭｇＣｌ２の最終濃度は１ｍＭ〜２ｍＭであり、ｄＮＴＰｓの最終濃度は、２００μＭ〜４００μＭである。
【００１５】
上記の方法によれば、前記上流プライマーＰｈ−Ｆのヌクレオチド配列は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．１に示され、下流プライマーＰｈ−Ｒのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．２に示され、蛍光プローブＰｈ−ｐｒｏｂｅのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．３に示され、前記上流プライマーＴｑ−ｎｏｒ１−Ｆのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．４に示され、下流プライマーＴｑ−ｎｏｒ１−Ｒのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．５に示され、蛍光プローブＴｑ−ｐｒｏｂｅのヌクレオチド配列はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ．６に示される。
【００１６】
上記の解決策によれば、前記同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応的反応システムには、ユニバーサルプローブｑＰＣＲプレミックス５μＬと、Ｐｈ−Ｆ  ０．１μＬ、Ｐｈ−Ｒ  ０．１μＬと、Ｐｈ−ｐｒｏｂｅ  ０．１μＬと、ファージテンプレート２μＬと、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｆ  ０．１μＬと、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｒ  ０．１μＬと、Ｔｑ−ｐｒｏｂｅ  ０．１μＬと、Ｎｏｒ−１遺伝子テンプレート１μＬと、ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２μＬと、ＭｇＣｌ２  ０．８μＬ、ｄＮＴＰｓ  ０．２μＬとが含まれ、Ｈ２Ｏを加えて１０μＬを構成する。
【００１７】
上記の方法によれば、前記同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応的の条件は、９５℃で５分、９５℃で１０秒、及び６０℃で３０秒、を４０サイクルである。
【００１８】
上記の方法によれば、前記アフラトキシンの定量Ｓタイプの標準曲線におけるアフラトキシンの濃度範囲は３３．３３ｎｇ／ｍＬ〜１．６９ｐｇ／ｍＬであり、アフラトキシンの最低検出線ＬＯＤは０．０１８ｎｇ／ｍＬであり、前記ｎｏｒ−１遺伝子転写量の定量標準曲線におけるｎｏｒ−１遺伝子コピー数の範囲が１０２〜１０８である。
【００１９】
上記の方法によれば、前記アフラトキシン毒素産生菌株の毒性はＹと定義され、アフトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量（ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１）の比率はＸと定義され、アスペルギルス・フラバス株毒性の同定方程式は次のとおりであり、
Ｙ＝１０．１４Ｘ−１６．２０
高毒素産生株によると、毒素産生量＞１５０ｎｇ／ｍＬであり、中程度の毒素産生によると、５０＜毒素産生量＜１５０ｎｇ／ｍＬであり、低毒素産生によると、毒素産生量＜５０ｎｇ／ｍＬであり、非毒素産生によると、０であり、毒性同定範囲を計算するための方程式に代入すると、高毒素産生株がＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＞１６．４、中程度の毒素産生株が６．５＜ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＜１６．４、低毒素産生株が０＜ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＜６．５、非毒素産生株がＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＝０である。
【発明の効果】
【００２０】
本発明の有益な効果は以下の通りである。
（１）本発明の研究により、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写の比率が非常に良好な相対的安定性を有することが証明され、アスペルギルス・フラバス株毒性同定モデルが確立された。すなわち、アスペルギルス・フラバス菌毒性およびアフラトキシンの収量とｎｏｒ−１遺伝子転写量の比率（ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１）の間の回帰方程式が得られ、ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１の比率を決定することにより、アスペルギルス・フラバス株毒性の迅速かつ正確な同定および評価を実現でき、アフラトキシン汚染の早期警告と防止および管理にとって非常に重要である。
【００２１】
（２）本発明は、アスペルギルス・フラバス株毒素産生量とｎｏｒ−１遺伝子転写量を同期検出するための同期ＲＴ−ＰＣＲ検出法を確立する。本発明の前記同期検出ＲＴ−ＰＣＲ法で得られたアスペルギルス・フラバス株毒素産生量、ｎｏｒ−１遺伝子転写量と、ＨＰＬＣ定量アフラトキシン、Ｎａｎｏｄｒｏｐ定量Ｎｏｒ−１遺伝子転写量の結果との間には良好な線形関係があるため、同期検出ＲＴ−ＰＣＲ法に基づいて得られたＡＦＴ／Ｎｏｒ−１（アスペルギルス・フラバス株毒素産生量／ｎｏｒ−１遺伝子転写量）の比率は信頼性が高く正確であり、アスペルギルス・フラバス株毒性大小を判断するための同定指標として使用できる。
【００２２】
（３）本発明の前記アスペルギルス・フラバス株毒素産生量とｎｏｒ−１遺伝子転写量の同期検出ＲＴ−ＰＣＲ法では、試薬量が少なく、コストが低く、ハイスループット検出が可能で、前記同期検出ＲＴ−ＰＣＲ法は分析モードを合理化し、実験プロセスと構造を最適化し、アフラトキシンおよび合成経路における他の小分子の同期分析のための検出プラットフォームと理論的基盤を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２３】
【図１】同期ＲＴ−ＰＣＲ反応中ＤＮＡポリメラーゼ、ｄＮＴＰｓおよびＭｇＣｌ２濃度を最適化する。
【図２】同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅効率の評価である。
【図３】同期ＲＴ−ＰＣＲ定量アフラトキシンＢ１およびｎｏｒ−１遺伝子転写量の定量標準曲線である。
【図４】同期ＲＴ−ＰＣＲ定量：アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、Ｇ２、ＺＥＮ、ＤＯＮ、ＦＢ１交叉反応率との交差反応率を示す。
【図５】同期ＲＴ−ＰＣＲの、ＨＰＬＣとＮａｎｏｄｒｏｐ定量結果の比較を示す。
【図６】アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子発現の相関関係（Ａ）、アフラトキシンの収量とＡＦＴ／Ｎｏｒ−１の相関関係（Ｂ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２４】
本発明をよりよく理解するために、本発明の内容は、実施例と併せて以下でさらに明らかにされるが、本発明の内容は、以下の実施例に限定されない。
【００２５】
（実施例１）
Ｉ．研究により、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写の比率が非常に良好な相対的安定性を有する。
１ｇ  ＮａＮＯ３、１ｇ  Ｋ２ＨＰＯ４、０．５ｇ  ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ  ＫＣｌ、０．０１ｇ  ＦｅＳＯ４、３０ｇデキストロースおよび寒天粉末２０ｇの重さを量り、脱イオン水で総容量１０００ｍｌに希釈し、１２１℃で３０分間、高温蒸気で滅菌して、ＣＤＡ培地を調製する。アスペルギルス・フラバス株を２８℃、湿度９０％のＣＤＡ固形培地で１０日間培養した後、培養プレートを２０％Ｔｗｅｅｎ−２０で洗浄し、アスペルギルス・フラバス菌の胞子溶液を得る。血球計数板計数法を用いて、アスペルギルス・フラバス菌の胞子溶液をボルテックスオシレーターで均一に振とうし、アスペルギルス・フラバス菌の胞子溶液を顕微鏡法でカウントする。
【００２６】
１５ｍＬのジャガイモデキストロース液体培地を５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃で３０分間オートクレーブし、カウント結果に従ってアスペルギルス・フラバス菌の胞子溶液を１×１０５胞子／ｍｌの最終濃度になるように加え、２８℃、２００ｒｐｍで振とうして、９６時間培養する。培養液を二層濾紙で濾過して、濾液（後で使用するために保存）とアスペルギルス・フラバス菌の菌糸ペレットを取得する。アスペルギルス・フラバス菌の菌糸ペレットの場合、濾紙で余分な水を絞り、６５℃のオーブンで１２時間乾燥させて乾燥菌を取得する。室温まで冷却した後、−７０℃で保管し、後で使用する。濾過で得られた濾液を後で使用するために４℃で保管する。
【００２７】
アスペルギルス・フラバス菌の胞子振とう培養後に得られた濾液（上記の後で使用するために保存したもの）中のアフラトキシンの濃度を測定するために、免疫親和性精製−高速液体クロマトグラフィーの標準的な方法を使用し、従来のＮｏｒ−１遺伝子転写相対量測定方法を使用し、上記の後で使用するために保存した乾燥菌のＮｏｒ−１遺伝子転写相対量を測定する。
【００２８】
上記と同様の操作を行い、２バッチ試験の前後でアスペルギルス・フラバス７株を異なる時間で培養した結果を表１に示す。
【００２９】
【表１】
2021516553.tif 000003
【００３０】
表１の測定結果によると、２つのバッチのアフラトキシンの濃度はまったく異なるため、アフラトキシンの収量だけではアスペルギルス・フラバス株の毒性の評価を満たすことができない。一部のアスペルギルス・フラバス株のｎｏｒ−１遺伝子転写の相対量が高い場合、毒性が比較的低い場合もあるが、非毒素産生株もｎｏｒ−１遺伝子を転写する可能性があるため、ｎｏｒ−１遺伝子だけではアスペルギルス・フラバス株の毒性の評価を満たすことができない。予想外に、表１では、アフラトキシンの濃度とｎｏｒ−１遺伝子転写の相対量を除算したときに得られる比率、つまり、表１の［ＡＦＴ］／［ｎｏｒ−１］の値は、強い規則性があることがわかった。２つの培養測定バッチから得られた７つの菌株は、同じ毒性シーケンスを持っているだけでなく、各菌株の［ＡＦＴ］／［ｎｏｒ−１］値も比較的安定していたため、アスペルギルス・フラバス株の毒性評価を満たすことができる。
【００３１】
表１のデータから、アフラトキシンの濃度値とＮｏｒ−１遺伝子転写相対量値の比率を使用してアスペルギルス・フラバス株の毒性を評価すると、精度と信頼性はアフラトキシンの濃度値のみまたはｎｏｒ−１遺伝子転写相対量のみよりもはるかに優れていることがわかる。
【００３２】
（実施例２  アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量の同期検出のためのＲＴ−ＰＣＲ法の確立）
既存のアフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージＶＨＨ  ２−５とｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ１とを使用して、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量の同期検出のためのＲＴ−ＰＣＲ法を確立する。同定評価アスペルギルス・フラバス株毒性の同定と評価の科学的根拠としての上記の検出結果によれば、アスペルギルス・フラバス株毒性の迅速な同定と評価のための支援方法を提供する。これらの具体的な手順は次のとおりである。
【００３３】
前記アフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージＶＨＨ  ２−５は、中国農業科学院の油料作物研究所の品質検査センターによって開発され、ジャーナル文献「Ｙａｎｒｕ  Ｗａｎｇ；Ｐｅｉｗｕ  Ｌｉ；Ｚｕｚａｎａ  Ｍａｊｋｏｖａ；Ｃａｎｄａｃｅ  Ｒ．Ｓ．Ｂｅｖｅｒ；Ｈｅｅ  Ｊｏｏ  Ｋｉｍ；Ｑｉ  Ｚｈａｎｇ；Ｊｕｌｉｅ  Ｅ．Ｄｅｃｈａｎｔ；Ｓｈｉｒｌｅｙ  Ｊ．Ｇｅｅ；Ｂｒｕｃｅ  Ｄ．Ｈａｍｍｏｃｋ；アフラトキシンイムノアッセイ用のアルパカ抗イディオタイプ重鎖単一ドメイン抗体の分離（Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｌｐａｃａ  Ａｎｔｉ−Ｉｄｉｏｔｙｐｉｃ  Ｈｅａｖｙ−Ｃｈａｉｎ  Ｓｉｎｇｌｅ−Ｄｏｍａｉｎ  Ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｆｌａｔｏｘｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）；分析化学、２０１３，８２９８−８３０３」に掲載されている。本実施例で使用したファージは、あらかじめ実験室で大腸菌ＥＲ２７３８に保存し、増幅して得た。増幅方法は次のとおりである。
【００３４】
ナノ抗体ファージＶＨＨ  ２−５を保持しているＥＲ２７３８単一コロニープレートからランダムにモノクローナルを選び、１ｍＬのＳＢ−アンピシリンを含有液体培地に接種し、３７℃の恒温シェーカーによって２２５ｒｐｍで一晩培養する。上記の一晩培養液ＳＢ−アンピシリン液体培地１００ｍＬに加え、２ＯＤ６００＝０．５−０．６になるまで３７℃、２２５ｒｐｍで培養し、培養した細菌溶液に１．５ｍｌ  Ｍ１３ＫＯ７セカンダリファージ（滴定量１×１０１１−１×１０１２ｐｆｕ／ｍＬ）を加え、３７℃で３０分間放置し、最終濃度７０μｇ／ｍＬのカナマイシンを細菌溶液に加え、３７℃、２２５ｒｐｍで一晩培養し、振とうする。４℃、１００００ｒｐｍで一晩培養した細菌溶液を１５分間遠心分離し、上澄み液を取り、そして、きれいな遠心ボトルに移し、１／４容量のＰＥＧ／ＮａＣｌを加え、氷上で２時間放置し、４℃、１００００ｒｐｍで３０分間遠心し、２ｍＬの０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳで沈殿を再懸濁する。１２０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄み液を取り、上澄み液を０．２２μｍフィルターで濾過し、等量の滅菌グリセリンと混合し、それらを分割して、滴定量を測定する。滴定量の決定方法は次のとおりである。
【００３５】
ＥＲ２７３８単一コロニープレートからランダムにモノクローナルを選び、０．０４ｍｇ／ｍＬテトラサイクリンを含むＬＢ液体培地に接種し、３７℃、２２５ｒｐｍの恒温シェーカーで一晩培養する。上記の一晩培養液を２０μＬ取り、２ｍＬ  ＳＢ培養液に加える。２２５ｒｐｍ、３７℃でＯＤ６００≒１まで培養する。滴定量を測定する必要があるファージの勾配希釈を行うためにＬＢ液体培地を使用する。各希釈液を１０μＬ取り、ＯＤ６００≒１、３７℃のＥＲ２７３８細菌溶液１００μＬに加える。大腸菌をファージに感染させるために３７℃で２０分間放置し、感染した大腸菌溶液をＬＢ−アンピシリンプレートに広げ、３７℃の恒温インキュベーターに３０分間直立させ、培養物を一晩反転させる。単一コロニーの数を約１００個選択して、プレートカウントを行い、次の方程式に従ってファージ滴定量を計算する。
（単一コロニー数×希釈係数×１０００μｌ／ｍｌ）／加えられるファージ容量（μｌ）。
【００３６】
前記ｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ１を取得する方法として、１５ｍＬのジャガイモデキストロース液体培地を５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃で３０分間オートクレーブし、Ｎｏ．Ｎ７３  アスペルギルス・フラバス菌の胞子溶液を最終濃度１×１０５ｍｌ−１になるまで加え、２８℃、２００ｒｐｍで９６時間振とう培養した後、二層濾紙で菌糸ペレット培養液を絞り出し、６５℃で１２時間乾燥させ、液体窒素で急速凍結し、粉末に粉砕する。正確に２００ｍｇの菌糸粉末を量り、ＤＮＡをキット（ＤＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）で抽出し、キットのマニュアルに従ってＮｏ．Ｎ７３株のゲノムＤＮＡを抽出し、次のプライマーを使用して４００ｂｐのサイズのｎｏｒ−１遺伝子断片産物を増幅し、Ｅ．Ｚ．Ｎ．Ａ．ＴＭ（ＯＭＥＧＡ）ゲルを使用してキットを抽出し、マニュアルに従って４００ｂｐ  ＤＮＡフラグメントを精製して、Ｔｑ−ｎｏｒ１を入手できる。
【００３７】
Ｎｏｒ１−Ｆ：  ５’−ＡＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＧＧＣＡＣＴＣＴＣＧＧＣＡＣ−３’；
Ｎｏｒ１−Ｒ：  ５’−ＧＴＴＧＧＣＣＧＣＣＡＧＣＴＴＣＧＡＣＡＣＴＣＣＧ−３’。
【００３８】
Ｉ．アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量を同期検出するためのＲＴ−ＰＣＲ法の確立
１．アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量を同期検出するためのＲＴ−ＰＣＲのプライマーのプライマーとプローブのシーケンス設計
アフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージＶＨＨ  ２−５によって放出されたＤＮＡ断片およびｎｏｒ−１遺伝子のＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ１をテンプレートとして同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅を行い、同期ＲＴ−ＰＣＲの増幅結果によってアフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量の比率を決定する。
【００３９】
アフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージＶＨＨ  ２−５ナノ抗体をコードするシーケンスとｎｏｒ−１遺伝子シーケンス、アフラトキシンの上流および下流プライマー（Ｐｈ−Ｆ，Ｐｈ−Ｒ）プローブ（Ｐｈ−ｐｒｏｂｅ）シーケンス、Ｔｑ−ｎｏｒ−１の上流および下流プライマー（Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｆ，Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｒ）とプローブ（Ｔｑ−ｐｒｏｂｅ）シーケンスに基づいて、そして、ダブルＲＴ−ＰＣＲ反応のプライマープローブによる設計原理と注意事項に従って、Ｏｌｉｇｏ７．０プライマー分析ソフトウェアで検証する。
【００４０】
プライマーとプローブの検証原理：すべてのプライマーのＴＭ値は同じまたは近いレベルに設定する必要があり、すべてのプローブのＴＭ値はプライマーのＴＭ値にできるだけ近く、プライマーのＴＭ値よりも約５〜１０℃高くする必要がある。同じシステムの同期であるため、すべてのプライマーとプローブが二量体を容易には形成しないことが確保される。ＢＬＡＳＴ検索により、プライマーとプローブが目標ターゲットに対して特異性を有することが確保される。
【００４１】
以下のプライマーとプローブシーケンスは、表２にまとめられているように、上記の原則と要件を満たすように決定されている。
【００４２】
【表２】
2021516553.tif 000004
【００４３】
２．アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量の同期ＲＴ−ＰＣＲ検出法の反応パラメーター
反応システム間の相互作用を完全に考慮する必要があるため、同期ＲＴ−ＰＣＲ反応パラメーターは単一遺伝子増幅のＲＴ−ＰＣＲとは異なる。まず、２つの単層アフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体ファージ特異ＤＮＡ断片とｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片のＲＴ−ＰＣＲで増幅する。反応成分は、他の成分を追加せずに直接混合し、ダブルＲＴ−ＰＣＲ反応を行い、ＰＣＲ反応の結果を図１Ａに示す。図から、ＶＨＨ  ２−５ファージＤＮＡ分子の増幅が著しく阻害されていることがわかる。ダブルＲＴ−ＰＣＲ反応では、異なるアンプリコンの増幅効率とターゲットシーケンスが異なる場合がある。増幅効率が低いサンプルまたはターゲットシーケンスが少ないサンプルの増幅は、高増幅サンプルまたはターゲットシーケンスが多いターゲットシーケンスによって抑制される。
【００４４】
このため、本発明は、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量の同期検出法のＲＴ−ＰＣＲ反応条件を最適化する。本発明では、ＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰｓの濃度が最適化される。図１Ｂに示す結果は、ＶＨＨ  ２−５ファージ濃度が１０６ｐｆｕ／ｍＬの場合、ｄＮＴＰｓおよびＭｇＣｌ２をさらに追加した後、サイクルしきい値Ｃｔが前に移動し、増幅曲線はより早いサイクル数のところに現れる。これは、ＶＨＨ  ２−５ファージＤＮＡ分子の増幅増加を示している。図１Ｃは、ＤＮＡポリメラーゼが０．２５Ｕから１．０Ｕに増加すると、ファージの増幅効率も大幅に向上することを示している。したがって、しきい値サイクルＣｔがより早く現れ、増幅曲線が指数期のＳタイプにより近いという原理に基づいて、本発明のＤＮＡポリメラーゼ、ＭｇＣｌ２およびｄＮＴＰｓの好ましい投与量範囲は、ＤＮＡポリメラーゼ：０．５Ｕ〜１．０Ｕ；ＭｇＣｌ２：１ｍＭ〜２ｍＭ；ｄＮＴＰｓ：２００μＭ〜４００μＭである。
【００４５】
上記の研究結果によれば、本発明は、表３に示されるように、最終的に最適化された増幅反応パラメーターを提供する。
【００４６】
【表３】
2021516553.tif 000005
【００４７】
３．ＲＴ−ＰＣＲ法の増幅効率の検出のためのアフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量の同期検出法
図２Ａに示すように、連続希釈ファージと連続希釈ｎｏｒ−１の同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅結果は、同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅曲線（ＲＦＵ、相対蛍光単位）に表示される。図２Ｂは、増幅曲線から得られた増幅効率の標準曲線である。ファージＶＨＨ  ２−５増幅効率の標準曲線傾き−３．３７は、増幅効率Ｅの計算式（Ｅ＝［１０１／−ｓｌｏｐｅ−１］×１００％）により算出され、増幅効率Ｅが９８．０３％の場合、ＶＨＨ  ２−５ファージの検出可能な濃度範囲は１０９〜１０３ｐｆｕ／ｍＬである。当ｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ１のコピー数が１０２−１０８コピーの場合、ｎｏｒ−１遺伝子の増幅効率は９０．２５％である。増幅効率Ｅは９０％−１０５％の範囲を満たし、増幅効率標準曲線の相関係数Ｒ２＞０．９９である。したがって、最適化された同期ＲＴ−ＰＣＲシステムは、ＶＨＨ  ２−５ファージおよびｎｏｒ−１遺伝子の同期かつ効率的な増幅に使用できる。
【００４８】
ＩＩ．定量標準曲線の確立と同期ＲＴ−ＰＣＲ方法評価
１．アフラトキシン定量のためのＳタイプの標準曲線
１．１  免疫反応
（１）コーティング：市販のアフラトキシンモノクローナル抗体１Ｃ１１（寄託番号はＣＣＴＣＣ  ＮＯ：Ｃ２０１０１３のハイブリドーマ細胞株１Ｃ１１（特許出願番号ＣＮ２０１０１０２４５０９５．５に詳しい説明がある）によって分泌される）をＰＢＳで１．０μｇ／ｍＬに希釈し、マイクロピペットを使用して９６ウェルマイクロタイタープレートに追加する（ウェルあたり１００μＬ）。４℃で一晩（約１２時間）インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。ブロック：ブロック液でブロックし、ウェルあたり３００μＬ、３７℃で４５分間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
【００４９】
（２）ブロック：ブロック液でブロックし、ウェルあたり３００μＬ、３７℃で４５分間インキュベートし、プレートをＰＢＳＴで３回洗浄する。
【００５０】
（３）競合：アフラトキシンＢ１標準品を１００％純粋なメタノールで２００ｎｇ／ｍＬの濃度に希釈する。そして、アフラトキシンＢ１の標準溶液を１０％（ｖ／ｖ）メタノール／ＰＢＳの３倍勾配比で３３．３３ｎｇ／ｍＬ−１．６９ｐｇ／ｍＬの濃度範囲に希釈し、そして、５０μＬの既知濃度のＶＨＨ  ２−５ファージ（１．０×１０１０ｃｆｕ／ｍＬ）と５０μＬシリーズ濃度のアフラトキシンＢ１を混合し、１００μＬの混合物を９６−ｗｅｌｌマイクロタイタープレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした後、マイクロタイタープレートをＰＢＳＴで１０回洗浄する。
【００５１】
（４）溶出：ファージ溶出液９０μＬを各ウェルに注入し、３７℃の温浴に１５分間静置し、マイクロピペットで軽く叩き、ファージミドを含む溶出液を移す。
【００５２】
（５）中和：移出された溶液９０μＬと中和溶液１０μＬを混合して、混合物を中性にする。追加する中和溶液の容量は、溶出液と中和液の実際のｐＨ値を調整して、混合物が中性になるようにする。
【００５３】
１．２  標準曲線を確立する：免疫反応段階では、アフラトキシンモノクローナル抗体１Ｃ１１コーティング量が一定である場合、異なる濃度のアフラトキシンは、異なる量のＶＨＨ  ２−５ファージと競合して１Ｃ１１に結合する。アフラトキシンの濃度が高いほど、ファージが１Ｃ１１に結合する可能性が低くなり、結合量が低くなる。免疫応答が終了すると、１Ｃ１１に結合する溶出液中のファージが溶出し、溶出液中のファージ数はアフラトキシンの濃度に関連する。溶出液中のファージミドはＰＣＲ反応の加熱プロセス中にＤＮＡ分子を放出し、放出されたＤＮＡ分子はＲＴ−ＰＣＲ反応として使用されるターゲットを増幅する。増幅反応後、蛍光定量システムソフトウェアは、異なる量アフラトキシンに対応する異なる溶出液中の異なる数のファージ増幅のＣｔ値を取得し、および、シリーズ希釈された異なる濃度のアフラトキシン（３３．３３ｎｇ／ｍＬ〜１．６９ｐｇ／ｍＬ）で得られたＣｔ値でアフラトキシンの濃度の対数値を取得し、Ｏｒｉｇｉｎ  Ｐｒｏ  ８．０ソフトウェアを使用して、図３Ａに示すように、アフラトキシン定量のＳタイプ標準曲線として４パラメーターロジスティック回帰を実行する。
【００５４】
２．ｎｏｒ−１遺伝子転写量の定量標準曲線の確立
この例では、アスペルギルス・フラバス株を取り上げる。この例では、この研究センターで保存されている高毒素生産株であるアスペルギルス・フラバス株Ｎｏ．Ｎ７３を使用しており、この研究でのＴｑ−ｎｏｒ１の調製に用いられる。他のアスペルギルス・フラバス株の場合、４００ｂｐ  ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ１は、上記の「ｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ１の取得方法」によって増幅で得られ、ｎｏｒ−１遺伝子転写の定量化に使用できる。標準曲線の候補株。分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ  ２０００、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、米国）でＴｑ−ｎｏｒ１の濃度を検出した後、Ｔｑ−ｎｏｒ１のコピー数が計算される。Ｔｑ−ｎｏｒ１を既知量のサンプルとして連続的に希釈（１０２〜１０８コピー）し、ＲＴ−ＰＣＲで増幅する。ＯｒｉｇｉｎＰｒｏ  ８．０ソフトウェアを使用して、Ｔｑ−ｎｏｒ１標準品のシリアルコピー数の対数を横軸とし、Ｃｔ値を縦軸として、回帰分析に使用され、図３Ｂは、ｎｏｒ−１遺伝子転写の定量的標準曲線を示している。
【００５５】
アフラトキシンの定量的標準曲線は図３Ａに示される。図から、同期ＲＴ−ＰＣＲ定量的アフラトキシンＢ１の検出限界ＬＯＤ（ＩＣ１０で表される）は０．０１８ｎｇ／ｍＬであるため、確立されたアフラトキシンＢ１のＲＴ−ＰＣＲ定量的検出は高感度であることがわかる。さらに、図３Ｂは、同期ＲＴ−ＰＣＲが１０２〜１０８の範囲のｎｏｒ−１遺伝子コピー数を定量化できることを明らかにし、確立された同期ＲＴ−ＰＣＲが低レベルでのｎｏｒ−１遺伝子の絶対定量に明らかな利点を持っていることが完全に確認される。
【００５６】
３．アフラトキシン交差反応率測定の同期ＲＴ−ＰＣＲ検出
アフラトキシンＢ２、Ｇ１、Ｇ２、ゼアラレノン（ＺＥＮ）、デオキシニバレノール（ＤＯＮ）、フモニシン（ＦＢ１）の標準品をシリーズの濃度に希釈し、ファージＶＨＨ  ２−５競合免疫反応の後、ＥＬＩＳＡプレートの下部にあるモノクローナル抗体１Ｃ１１に結合したファージが溶出され、ＲＴ−ＰＣＲによってＴｑ−ｎｏｒ１で増幅される。増幅によって得られたＣｔ値は、毒素の異なる濃度の対数値に対応し、標準曲線を作成し、ＩＣ５０値を計算し、交差反応計算式％ＣＲ＝（ＩＣ５０  ＡＦＢ１／ＩＣ５０検体）×１００に従って交差反応率を計算する。図４に示すように、アフラトキシンＢ１、Ｂ２、Ｇ１、およびＧ２の交差反応率は、それぞれ１００％、１０１％、３４％、および１２％であった。この方法は、アフラトキシンの総量の測定を実現できることがわかる。その中で、アフラトキシンＧ１とＧ２の交差反応率はそれぞれ３４％と１２％であるが、アスペルギルス・フラバス株はＢグループのアフラトキシンのみを生成するため、アスペルギルス・フラバスの毒性の同定におけるこの方法の適用には影響しない。アフラトキシンＢ２の交差反応率は１０１％であり、アフラトキシンＢ２を定量化するための確立されたＲＴ−ＰＣＲ法は感度が高く、アフラトキシンの毒性を同定するための確立されたＲＴ−ＰＣＲ法の信頼性をある程度向上させる。これは、アスペルギルス・フラバス株がアフラトキシンＢ１とアフラトキシンＢ２を生成できるためである。したがって、確立されたＲＴ−ＰＣＲを使用してアスペルギルス・フラバス株の毒性を特定することは、Ｂ１およびＢ２の包括的な収量の評価である。
【００５７】
４．同期ＲＴ−ＰＣＲによる回復検証の追加
アフラトキシンＢ１標準品とｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ−１を２ｍＬのブランクのＰＤＢ培地に追加する。よく振ってよく混ぜ、均一に混合した後、混合液を４℃に置き、４日間光を避ける。４日後、混合液を２０倍に希釈し、混合液中のアフラトキシンＢ１とＴｑ−ｎｏｒ−１の含有量をＲＴ−ＰＣＲで同期検出した。同日にグループ内で３回の繰り返しを設定し、異なる日にグループ間で３回の繰り返しを設定する。回復を追加した結果を表３に示す。
【００５８】
【表４】
2021516553.tif 000006
【００５９】
アフラトキシンＢ１の追加回収率は８８．３７％〜１０３．１０％であり、ｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ−１の追加回収率は８６．１８％〜９８．１７％であり、確立された同期ＲＴ−ＰＣＲが実際のサンプルの検出と分析では、信頼性の高い重複性と再現性があることを示している。
【００６０】
５．同期ＲＴ−ＰＣＲ法を使用したアフラトキシン菌株の毒素産生量およびｎｏｒ−１遺伝子発現レベルの定量化
この研究では、毒性の異なる１７株のアスペルギルス・フラバス株を選択した。１５ｍＬのジャガイモデキストロース液体培地を５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃で３０分間オートクレーブし、アスペルギルス・フラバス菌の胞子溶液を最終濃度が１×１０５ｍｌ−１になるように加える。培養液を２８℃、２００ｒｐｍで９６時間振とうした後、培養液を２層濾紙で濾過し、得られた菌培養液とアスペルギルス・フラバス菌糸体ペレットを濾紙で絞り、余分な水分を取り除き、オーブンで６５℃この条件で１２時間乾燥し、室温まで冷却した後、液体窒素で粉末に粉砕し、サンプルあたり０．２０ｍｇの菌糸粉末を正確に計量する。ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）でマニュアルに従ってトータルＲＮＡを抽出する。そして、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ転写キットを使用してｃＤＮＡを合成する。同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅システムでＴｑ−ｎｏｒ１を置き換えるために、前記ｃＤＮＡ溶液を１００〜１０００倍に希釈し、同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅の増幅テンプレートの１つとして使用して、ｎｏｒ−１遺伝子転写の量を測定する。菌株培養液を１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳで１０倍に希釈した後、免疫反応のアフラトキシン標準品を置き換えて免疫競合反応に関与させ、競合反応後の溶出液中のファージミドを増幅システムのもう一方のテンプレートとし、同期ＲＴ−ＰＣＲによる増幅にかけられ、菌株によって産生される毒素の量が測定される。同期ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、１７のアスペルギルス・フラバス株の毒素産生量およびｎｏｒ−１遺伝子発現レベルを定量化した結果を表４に示す。
【００６１】
【表５】
2021516553.tif 000007
【００６２】
結果の正確さを検証するには、国家標準のＧＢ５００９．２２−２０１６方法を参照し、ＨＰＬＣ方法を使用してアスペルギルス・フラバス株によって生成されたアフラトキシンの量を定量化する。一方、分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を使用して、菌株のｎｏｒ−１遺伝子発現量を定量化する。定量結果は表４に示すとおり。結果を同期ＲＴ−ＰＣＲで得られた結果と比較した比較結果が図５に示されている。図５−Ａは、ＲＴ−ＰＣＲとＨＰＬＣの定量的アフラトキシンの比較結果を示している。得られた線形回帰式はＹ＝０．９４７Ｘ−３．８４であり、線形回帰分析は良好な相関を示した（Ｒ２＝０．９９９）。図５−Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲとＮａｎｏｄｒｏｐの定量的ｎｏｒ−１遺伝子転写量の比較結果を示している。この方法で得られた線形回帰式は、Ｙ＝１．０５Ｘ−１．１８、相関係数Ｒ２＝０．９８９である。異なる検出方法の比較結果は、確立された同期ＲＴ−ＰＣＲ定量結果の信頼性が高く、毒素産生量とアスペルギルス・フラバス株のｎｏｒ−１遺伝子転写量の同期分析に使用できることを示している。
【００６３】
（実施例３）
Ｉ．ｎｏｒ−１転写量とＡＦＴ／ｎｏｒ−１（毒素産生とｎｏｒ−１転写量の比率）を使用して、アスペルギルス・フラバスの毒性の比較をそれぞれ評価する。
結果の比較分析を通じて、アスペルギルス・フラバスの毒性がｎｏｒ−１転写量のみから評価された場合、同定結果は信頼できないことがわかる。たとえば、アスペルギルス・フラバス株のＰｃ１２４−２およびＰｃ３４−１では、ｎｏｒ−１遺伝子発現のコピー数の対数は、それぞれ７．８５±０．５２および６．７５±０．５８である。２つの株のｎｏｒ−１遺伝子発現レベルは同等であるが、Ｐｃ１２４−２菌株のアフラトキシンの収量は６６．５±４．９３ｎｇ／ｍＬであり、Ｐｃ３４−１によって生成されたアフラトキシンの量は１９．６９±２．２７ｎｇ／ｍＬである。さらに、ＣＹ１、ＣＹ２、Ｐｇ２８−１およびＰｃ３２１−１−３株はアフラトキシンを検出できなかった。しかし、アスペルギルス毒素産生は、Ｐｇ２８−１とＰｃ３２１−１−３で発現されたｎｏｒ−１遺伝子レベルは、アフラトキシンを産生するいくつかの菌株よりもさらに高い。
【００６４】
しかし、アスペルギルス・フラバスの毒性の結果を評価するために使用されるアフラトキシン産生量とｎｏｒ−１遺伝子発現レベルの比率はより信頼できる。アスペルギルス・フラバス株の毒性とｎｏｒ−１遺伝子発現レベル、およびＡＦＴ／ｎｏｒ−１間の相関関係をさらに調査するため、菌株毒素産生量を縦軸とし、ｎｏｒ−１遺伝子発現の対数とＡＦＴ／ｎｏｒ−１の比率を横軸として図を作成した。アフラトキシンの収量とｎｏｒ−１遺伝子発現の相関を図６−Ａに示す。線形回帰の方程式は、ｙ＝３６．３７ｘ−１９６．２１であり、相関係数Ｒ２＝０．６９３である。また、アフラトキシンの収量とＡＦＴ／ｎｏｒ−１の比率の相関関係を図６−Ｂに示す。線形回帰の方程式は、ｙ＝１０．１４ｘ−１６．２０であり、相関係数Ｒ２＝０．９７９である。アフラトキシンの収量は、ＡＦＴ／ｎｏｒ−１比と非常に良好な相関関係がある。
【００６５】
したがって、本発明は、アスペルギルス・フラバス株の毒性の同定方程式は次のとおりである。
ｙ＝１０．１４ｘ−１６．２０
ここで、ＸはＡＦＴ／ｎｏｒ−１を表し、Ｙは毒性である。
高毒素産生株によると、毒素産生量＞１５０  ｎｇ／ｍＬであり、中程度の毒素産生：５０＜毒素産生量＜１５０ｎｇ／ｍＬであり、低毒素産生：毒素産生量＜５０ｎｇ／ｍＬであり、非毒素産生：０であり、そして、次に回帰式に従って毒性同定の範囲を計算する。
高毒素産生株：ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＞１６．４；
中程度の毒素産生株：６．５＜ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＜１６．４；
低毒素産生株：０＜ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＜６．５；
非毒素産生株：ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＝０。
【００６６】
ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１（毒素産生量とｎｏｒ−１転写量の比率）による毒性の同定と安定性の検証
ＩＩ．ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１（毒素産生量とｎｏｒ−１転写量の比率）による毒性の同定結果の安定性の検証
ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１の比率による毒性の同定結果の安定性をさらに検証するため、５つのアスペルギルス・フラバス株を、グループ内およびグループ間のアフラトキシン産生量とｎｏｒ−１遺伝子転写量を実験的に分析した。グループ内の実験では、同日に５つの複製が並行して設定され、５つの複製の平均値が、前記バッチ菌株的毒素産生量およびｎｏｒ−１遺伝子転写量とする。グループ間の実験には３つの異なる日付が設定され、各日付はバッチであり、合計３つのバッチが設定された。結果を表５に示す。
【００６７】
【表６】
2021516553.tif 000008
【００６８】
表から、培養の異なるバッチによって検出されたアフラトキシン産生の量とｎｏｒ−１遺伝子転写量が異なることが分かる。２３３−１株を例にとると、３つのバッチで検出されたアフラトキシンの収量はそれぞれ１０．０７、１９．６９、および２５．３２  ｎｇ／ｍＬであり、異なるバッチのグループ間の差の係数は４２．００％である。さらに、ＩＴ−２、Ｐｇ５６−１−２、Ｎ２００および２３３−１菌株によって生成されたアフラトキシンの量は、異なるバッチのグループ間の差の係数は１７．００％を超えた。単独で生成されたアフラトキシンの量から菌株の毒性を評価することは信頼できないことがわかる。同じ分析で、異なるバッチのグループ間のｎｏｒ−１遺伝子の転写量により、ｎｏｒ−１遺伝子の転写量の差も大きいことを発見した。また、ｎｏｒ−１遺伝子の転写量のみから菌株の毒性を評価することは信頼できないことも証明した。一方、ＡＦＴ／ｎｏｒ−１比のグループ間の差異係数は１３％未満であり、安定性が向上している。
【００６９】
要約すると、アフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価するために本発明で提案された方法、すなわちＡＦＴ／ｎｏｒ−１比の同定は、アフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価するためのより正確で信頼できる方法である。
【００７０】
明らかに、上記の実施例は、明確な説明のための単なる例であり、実施形態を限定することを意図していない。当業者にとって、上記の説明に基づいて、他の変更または異なる形態の変更を行うことができる。ここにすべての実施方法を列挙する必要はなく、不可能である。したがって、導入された明らかな変更または改変は、依然として本発明の保護範囲内である。
【００７１】
（付記）
（付記１）
アフラトキシンの収量およびＮｏｒ−１遺伝子転写量を測定することにより、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写の比率を取得し、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写の比率に基づき、アフラトキシン毒素産生菌株毒素産生能力を同定および評価する、ことを特徴とする、アフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【００７２】
（付記２）
前記アフラトキシンの収量を測定するための方法では、アスペルギルス・フラバス株を培養し、アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、濾液を濾過し、濾液中のアフラトキシンの濃度を測定する、ことを特徴とする、付記１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【００７３】
（付記３）
前記アスペルギルス・フラバス株の培養に使用する培地はＣＤＡ培地であり、培養条件は、２８℃、湿度９０％で１０日間の培養であり、
前記アスペルギルス・フラバス菌の胞子の振とう培養に使用される培地は、ジャガイモデキストロース液体培地であり、培養条件は、２８℃、２００ｒｐｍで９６時間の振とう培養である、ことを特徴とする、付記１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【００７４】
（付記４）
免疫親和性精製−高速液体クロマトグラフィーの標準的な方法では、前記アスペルギルス・フラバス菌の胞子振とう培養後の濾液中のアフラトキシンの濃度を測定する、ことを特徴とする、付記１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【００７５】
（付記５）
前記Ｎｏｒ−１遺伝子転写量を測定するための方法では、アスペルギルス・フラバス株を培養し、アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、アスペルギルス・フラバス菌の菌糸ペレットを濾過し、乾燥後乾燥菌を取得し、従来のＮｏｒ−１遺伝子転写量を測定するための方法で、乾燥菌中Ｎｏｒ−１遺伝子転写量を測定する、ことを特徴とする、付記１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【００７６】
（付記６）
前記アフラトキシンの収量およびＮｏｒ−１遺伝子転写量は、同期検出ＲＴ−ＰＣＲによって得られ、前記同期検出ＲＴ−ＰＣＲは、
免疫反応段階において、アフラトキシンモノクローナル抗体１Ｃ１１コーティング量が一定量である条件下で、異なる濃度のアフラトキシン標準品を使用して、アフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージと、アフラトキシンモノクローナル抗体への結合をめぐって競合し、免疫競合反応が終了すると、アフラトキシンモノクローナル抗体に結合されたアフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージが溶出し、異なる濃度のアフラトキシン標準品は異なる溶出量のアフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージに対応し、溶出液中のファージは、ＰＣＲ加熱プロセス中にＤＮＡ分子を放出し、放出されたＤＮＡ分子をＲＴ−ＰＣＲ反応中の増幅ターゲットとして、前記キットを使用して各溶出液それぞれにＲＴ−ＰＣＲ増幅反応をかけ、増幅反応が完了すると、異なるＣｔ値が得られ、アフラトキシンの濃度の対数値を横軸とし、Ｃｔ値を縦軸として回帰分析を実行し、アフラトキシンの定量Ｓタイプの標準曲線を得る、アフラトキシン定量のＳタイプの標準曲線の確立の工程（１）と、
ｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ１の既知のコピー数のサンプルを異なるコピー数に連続希釈し、そして、前記キットを使用して各コピー数Ｔｑ−ｎｏｒ１それぞれに同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応をかけ、増幅反応が完了すると、異なるＣｔ値が得られ、Ｔｑ−ｎｏｒ１コピー数の対数値を横軸とし、Ｃｔ値を縦軸として回帰分析を実行し、ｎｏｒ−１遺伝子転写量の定量標準曲線を得る、Ｎｏｒ−１遺伝子転写量のＲＴ−ＰＣＲ標準曲線の確立の工程（２）と、
アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、菌株培養液とアスペルギルス・フラバス菌糸ペレットを濾過し、菌株培養液を一定の倍数に希釈した後、工程（１）の前記免疫反応中のアフラトキシン標準品の代わりに免疫競合反応に関与し、競合反応後、１Ｃ１１に結合したファージを溶出し、溶出液中のＶ２−５ファージを同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応における定量アフラトキシンの増幅テンプレートとし、さらに、アスペルギルス・フラバス菌糸ペレットを乾燥した後、トータルＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、前記ｃＤＮＡを特定の倍数に希釈して、同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応でＮｏｒ−１遺伝子を増幅するためのテンプレートとする、アスペルギルス・フラバス株培養工程（３）と、
前記ファージから放出されたＤＮＡ分子と前記ｃＤＮＡをテンプレートとして、同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応を実行し、増幅反応が完了すると、２つのＣｔ値が取得され、２つのＣｔ値それぞれをアフラトキシンの定量Ｓタイプの標準曲線とｎｏｒ−１遺伝子転写量の定量標準曲線に代入し、換算してアフラトキシンの濃度和ｎｏｒ−１遺伝子転写量を取得し、それにより、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量の比率を決定する、工程（４）とを備える、ことを特徴とする、付記１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【００７７】
（付記７）
前記アフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージは、ファージＶＨＨ  ２−５であり、前記アフラトキシンモノクローナル抗体はアフラトキシンモノクローナル抗体１Ｃ１１である、ことを特徴とする、付記６に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【００７８】
（付記８）
前記同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応の反応システムにおいて、上流および下流プライマーであるＰｈ−Ｆ、Ｐｈ−Ｒ、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｆ、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｒの最終濃度は、３００〜４００ｎＭであり、蛍光プローブであるＰｈ−ｐｒｏｂｅとＴｑ−ｐｒｏｂｅの最終濃度は、２００〜４００ｎＭであり、ＤＮＡポリメラーの最終投与量は０．５Ｕ〜１．０Ｕであり、ＭｇＣｌ２の最終濃度は１ｍＭ〜２ｍＭであり、ｄＮＴＰｓの最終濃度は、２００μＭ〜４００μＭである、ことを特徴とする、付記６に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【００７９】
（付記９）
前記同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応の反応システムには、ユニバーサルプローブｑＰＣＲプレミックス５μＬと、Ｐｈ−Ｆ  ０．１μＬ、Ｐｈ−Ｒ  ０．１μＬと、Ｐｈ−ｐｒｏｂｅ  ０．１μＬと、ファージテンプレート２μＬと、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｆ  ０．１μＬと、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｒ  ０．１μＬと、Ｔｑ−ｐｒｏｂｅ  ０．１μＬと、Ｎｏｒ−１遺伝子テンプレート１μＬと、ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２μＬと、ＭｇＣｌ２  ０．８μＬ、ｄＮＴＰｓ  ０．２μＬとが含まれ、Ｈ２Ｏを加えて１０μＬを構成する、ことを特徴とする、付記６に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【００８０】
（付記１０）
前記アフラトキシン毒素産生菌株の毒性はＹと定義され、アフトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量（ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１）の比率はＸと定義され、アスペルギルス・フラバス株の毒性の同定が確立される方程式は、
Ｙ＝１０．１４Ｘ−１６．２０であり、
高毒素産生株によると、毒素産生量＞１５０ｎｇ／ｍＬであり、中程度の毒素産生によると、５０＜毒素産生量＜１５０ｎｇ／ｍＬであり、低毒素産生によると、毒素産生量＜５０ｎｇ／ｍＬであり、非毒素産生によると、０であり、毒性同定範囲を計算するための方程式に代入すると、高毒素産生株がＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＞１６．４であり、中程度の毒素産生株が６．５＜ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＜１６．４であり、低毒素産生株が０＜ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＜６．５であり、非毒素産生株がＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＝０である、ことを特徴とする、付記１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【図１】
2021516553.tif 000009
【図２】
2021516553.tif 000010
【図３】
2021516553.tif 000011
【図４】
2021516553.tif 000012
【図５】
2021516553.tif 000013
【図６】
2021516553.tif 000014
【配列表】
2021516553000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月29日(2020.9.29)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
アフラトキシンの収量およびＮｏｒ−１遺伝子転写量を測定することにより、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写の比率を取得し、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写の比率に基づき、アフラトキシン毒素産生菌株毒素産生能力を同定および評価する、ことを特徴とする、アフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項２】
前記アフラトキシンの収量を測定するための方法では、アスペルギルス・フラバス株を培養し、アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、濾液を濾過し、濾液中のアフラトキシンの濃度を測定する、ことを特徴とする、請求項１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項３】
前記アスペルギルス・フラバス株の培養に使用する培地はＣＤＡ培地であり、培養条件は、２８℃、湿度９０％で１０日間の培養であり、
前記アスペルギルス・フラバス菌の胞子の振とう培養に使用される培地は、ジャガイモデキストロース液体培地であり、培養条件は、２８℃、２００ｒｐｍで９６時間の振とう培養である、ことを特徴とする、請求項２に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項４】
免疫親和性精製−高速液体クロマトグラフィーの標準的な方法では、前記アスペルギルス・フラバス菌の胞子振とう培養後の濾液中のアフラトキシンの濃度を測定する、ことを特徴とする、請求項２に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項５】
前記Ｎｏｒ−１遺伝子転写量を測定するための方法では、アスペルギルス・フラバス株を培養し、アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、アスペルギルス・フラバス菌の菌糸ペレットを濾過し、乾燥後乾燥菌を取得し、従来のＮｏｒ−１遺伝子転写量を測定するための方法で、乾燥菌中Ｎｏｒ−１遺伝子転写量を測定する、ことを特徴とする、請求項２に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項６】
前記アフラトキシンの収量およびＮｏｒ−１遺伝子転写量は、同期検出ＲＴ−ＰＣＲによって得られ、前記同期検出ＲＴ−ＰＣＲは、
免疫反応段階において、アフラトキシンモノクローナル抗体１Ｃ１１コーティング量が一定量である条件下で、異なる濃度のアフラトキシン標準品を使用して、アフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージと、アフラトキシンモノクローナル抗体への結合をめぐって競合し、免疫競合反応が終了すると、アフラトキシンモノクローナル抗体に結合されたアフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージが溶出し、異なる濃度のアフラトキシン標準品は異なる溶出量のアフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージに対応し、溶出液中のファージは、ＰＣＲ加熱プロセス中にＤＮＡ分子を放出し、放出されたＤＮＡ分子をＲＴ−ＰＣＲ反応中の増幅ターゲットとして、前記キットを使用して各溶出液それぞれにＲＴ−ＰＣＲ増幅反応をかけ、増幅反応が完了すると、異なるＣｔ値が得られ、アフラトキシンの濃度の対数値を横軸とし、Ｃｔ値を縦軸として回帰分析を実行し、アフラトキシンの定量Ｓタイプの標準曲線を得る、アフラトキシン定量のＳタイプの標準曲線の確立の工程（１）と、
ｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ１の既知のコピー数のサンプルを異なるコピー数に連続希釈し、そして、前記キットを使用して各コピー数Ｔｑ−ｎｏｒ１それぞれに同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応をかけ、増幅反応が完了すると、異なるＣｔ値が得られ、Ｔｑ−ｎｏｒ１コピー数の対数値を横軸とし、Ｃｔ値を縦軸として回帰分析を実行し、ｎｏｒ−１遺伝子転写量の定量標準曲線を得る、Ｎｏｒ−１遺伝子転写量のＲＴ−ＰＣＲ標準曲線の確立の工程（２）と、
アスペルギルス・フラバス菌の胞子を振とう培養し、培養後、菌株培養液とアスペルギルス・フラバス菌糸ペレットを濾過し、菌株培養液を一定の倍数に希釈した後、工程（１）の前記免疫反応中のアフラトキシン標準品の代わりに免疫競合反応に関与し、競合反応後、１Ｃ１１に結合したファージを溶出し、溶出液中のＶ２−５ファージを同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応における定量アフラトキシンの増幅テンプレートとし、さらに、アスペルギルス・フラバス菌糸ペレットを乾燥した後、トータルＲＮＡを抽出し、ｃＤＮＡに逆転写し、前記ｃＤＮＡを特定の倍数に希釈して、同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応でＮｏｒ−１遺伝子を増幅するためのテンプレートとする、アスペルギルス・フラバス株培養工程（３）と、
前記ファージから放出されたＤＮＡ分子と前記ｃＤＮＡをテンプレートとして、同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応を実行し、増幅反応が完了すると、２つのＣｔ値が取得され、２つのＣｔ値それぞれをアフラトキシンの定量Ｓタイプの標準曲線とｎｏｒ−１遺伝子転写量の定量標準曲線に代入し、換算してアフラトキシンの濃度和ｎｏｒ−１遺伝子転写量を取得し、それにより、アフラトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量の比率を決定する、工程（４）とを備える、ことを特徴とする、請求項２に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項７】
前記アフラトキシンに対する抗イディオタイプナノ抗体を表面に提示するファージは、ファージＶＨＨ  ２−５であり、前記アフラトキシンモノクローナル抗体はアフラトキシンモノクローナル抗体１Ｃ１１である、ことを特徴とする、請求項６に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項８】
前記同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応の反応システムにおいて、上流および下流プライマーであるＰｈ−Ｆ、Ｐｈ−Ｒ、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｆ、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｒの最終濃度は、３００〜４００ｎＭであり、蛍光プローブであるＰｈ−ｐｒｏｂｅとＴｑ−ｐｒｏｂｅの最終濃度は、２００〜４００ｎＭであり、ＤＮＡポリメラーの最終投与量は０．５Ｕ〜１．０Ｕであり、ＭｇＣｌ２の最終濃度は１ｍＭ〜２ｍＭであり、ｄＮＴＰｓの最終濃度は、２００μＭ〜４００μＭである、ことを特徴とする、請求項６に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項９】
前記同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅反応の反応システムには、ユニバーサルプローブｑＰＣＲプレミックス５μＬと、Ｐｈ−Ｆ  ０．１μＬ、Ｐｈ−Ｒ  ０．１μＬと、Ｐｈ−ｐｒｏｂｅ  ０．１μＬと、ファージテンプレート２μＬと、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｆ  ０．１μＬと、Ｔｑ−ｎｏｒ１−Ｒ  ０．１μＬと、Ｔｑ−ｐｒｏｂｅ  ０．１μＬと、Ｎｏｒ−１遺伝子テンプレート１μＬと、ＤＮＡポリメラーゼ  ０．２μＬと、ＭｇＣｌ２  ０．８μＬ、ｄＮＴＰｓ  ０．２μＬとが含まれ、Ｈ２Ｏを加えて１０μＬを構成する、ことを特徴とする、請求項６に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【請求項１０】
前記アフラトキシン毒素産生菌株の毒性はＹと定義され、アフトキシンの収量とＮｏｒ−１遺伝子転写量（ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１）の比率はＸと定義され、アスペルギルス・フラバス株の毒性の同定が確立される方程式は、
Ｙ＝１０．１４Ｘ−１６．２０であり、
高毒素産生株によると、毒素産生量＞１５０ｎｇ／ｍＬであり、中程度の毒素産生によると、５０＜毒素産生量＜１５０ｎｇ／ｍＬであり、低毒素産生によると、毒素産生量＜５０ｎｇ／ｍＬであり、非毒素産生によると、０であり、毒性同定範囲を計算するための方程式に代入すると、高毒素産生株がＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＞１６．４であり、中程度の毒素産生株が６．５＜ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＜１６．４であり、低毒素産生株が０＜ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＜６．５であり、非毒素産生株がＡＦＴ／Ｎｏｒ−１＝０である、ことを特徴とする、請求項１に記載のアフラトキシン毒素産生菌株の毒性を同定および評価する方法。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
アフラトキシンは、主にアスペルギルス・フラバスやアスペルギルス寄生菌などの真菌によって産生される。さまざまなアスペルギルス・フラバス株がアフラトキシンを生成する能力、つまり毒性が数百倍も異なる可能性があることが研究で示されている。強力な毒素産生株は、高汚染の主な原因であるが、これまでのところ、特異性の強力な毒素産生株を迅速に同定する効果的な方法が欠如している。現在、アスペルギルス・フラバス株の毒性を同定するための２つの主要な方法がある。１つは、株を一定期間培養した後に生成されるアフラトキシンの量を測定することにより、株の毒素産生能力を直接評価することである。このタイプの方法は長い時間がかかり、最初に菌株を分離してから培養し、最後にアフラトキシンの含有量を検出して評価する必要がある。さらに、アフラトキシンの生合成が多くの複雑な要因の影響を受け、同じ菌株が異なる培養バッチで培養されると、アフラトキシンの収量は大きく異なり、その結果を使用して菌株の本質的に一定の自己毒素産生特性を特徴付けることは困難であり、この方法の同定と評価結果の精度と信頼性に影響を与える。別の方法は、毒素産生に関連する遺伝子の転写レベルを測定することによって菌株の毒性を評価することであり、Ｎｏｒ−１遺伝子が毒性を評価するためにテストされているという報告が文献１（ＺＳＵＺＳＡＮＮＡ，Ｍａｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ，“Ｍｏｎｉｔｏｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｆｌａｔｏｘｉｎ  Ｂ１  ｉｎ  Ｗｈｅａｔ  ｂｙ  Ｍｅａｓｕｒｉｎｇ  ｔｈｅ  Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｎｏｒ−１  ｍＲＮＡ”，ＡＰＰＬＩＥＤ  ＡＮＤ  ＥＮＶＩＲＯＮＭＥＮＴＡＬ  ＭＩＣＲＯＢＩＯＬＯＧＹ，Ｖｏｌｕｍｅ  ６９，Ｎｏ．２，（２００３−０２−２８））にある。ただし、このタイプの方法の欠点は、自然状態ではＮｏｒ−１遺伝子以外の毒素産生遺伝子を欠くため、Ｎｏｒ−１遺伝子の発現が検出されても、本来、アフラトキシンは産生されないことである。これは、そのような方法の誤った結果につながる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００５７】
４．同期ＲＴ−ＰＣＲによる回復検証の追加
アフラトキシンＢ１標準品とｎｏｒ−１遺伝子ＤＮＡ断片Ｔｑ−ｎｏｒ−１を２ｍＬのブランクのＰＤＢ培地に追加する。よく振ってよく混ぜ、均一に混合した後、混合液を４℃に置き、４日間光を避ける。４日後、混合液を２０倍に希釈し、混合液中のアフラトキシンＢ１とＴｑ−ｎｏｒ−１の含有量をＲＴ−ＰＣＲで同期検出した。同日にグループ内で３回の繰り返しを設定し、異なる日にグループ間で３回の繰り返しを設定する。回復を追加した結果を表４に示す。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６０】
５．同期ＲＴ−ＰＣＲ法を使用したアフラトキシン菌株の毒素産生量およびｎｏｒ−１遺伝子発現レベルの定量化
この研究では、毒性の異なる１７株のアスペルギルス・フラバス株を選択した。１５ｍＬのジャガイモデキストロース液体培地を５０ｍＬの三角フラスコに入れ、１２１℃で３０分間オートクレーブし、アスペルギルス・フラバス菌の胞子溶液を最終濃度が１×１０５ｍｌ−１になるように加える。培養液を２８℃、２００ｒｐｍで９６時間振とうした後、培養液を２層濾紙で濾過し、得られた菌培養液とアスペルギルス・フラバス菌糸体ペレットを濾紙で絞り、余分な水分を取り除き、オーブンで６５℃この条件で１２時間乾燥し、室温まで冷却した後、液体窒素で粉末に粉砕し、サンプルあたり０．２０ｍｇの菌糸粉末を正確に計量する。ＲＮＡ抽出キット（ＲＮｅａｓｙ  Ｐｌａｎｔ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ）でマニュアルに従ってトータルＲＮＡを抽出する。そして、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔ転写キットを使用してｃＤＮＡを合成する。同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅システムでＴｑ−ｎｏｒ１を置き換えるために、前記ｃＤＮＡ溶液を１００〜１０００倍に希釈し、同期ＲＴ−ＰＣＲ増幅の増幅テンプレートの１つとして使用して、ｎｏｒ−１遺伝子転写の量を測定する。菌株培養液を１０％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳで１０倍に希釈した後、免疫反応のアフラトキシン標準品を置き換えて免疫競合反応に関与させ、競合反応後の溶出液中のファージミドを増幅システムのもう一方のテンプレートとし、同期ＲＴ−ＰＣＲによる増幅にかけられ、菌株によって産生される毒素の量が測定される。同期ＲＴ−ＰＣＲ法を使用して、１７のアスペルギルス・フラバス株の毒素産生量およびｎｏｒ−１遺伝子発現レベルを定量化した結果を表５に示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６２】
結果の正確さを検証するには、国家標準のＧＢ５００９．２２−２０１６方法を参照し、ＨＰＬＣ方法を使用してアスペルギルス・フラバス株によって生成されたアフラトキシンの量を定量化する。一方、分光光度計（Ｎａｎｏｄｒｏｐ）を使用して、菌株のｎｏｒ−１遺伝子発現量を定量化する。定量結果は表５に示すとおり。結果を同期ＲＴ−ＰＣＲで得られた結果と比較した比較結果が図５に示されている。図５−Ａは、ＲＴ−ＰＣＲとＨＰＬＣの定量的アフラトキシンの比較結果を示している。得られた線形回帰式はＹ＝０．９４７Ｘ−３．８４であり、線形回帰分析は良好な相関を示した（Ｒ２＝０．９９９）。図５−Ｂは、ＲＴ−ＰＣＲとＮａｎｏｄｒｏｐの定量的ｎｏｒ−１遺伝子転写量の比較結果を示している。この方法で得られた線形回帰式は、Ｙ＝１．０５Ｘ−１．１８、相関係数Ｒ２＝０．９８９である。異なる検出方法の比較結果は、確立された同期ＲＴ−ＰＣＲ定量結果の信頼性が高く、毒素産生量とアスペルギルス・フラバス株のｎｏｒ−１遺伝子転写量の同期分析に使用できることを示している。
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００６６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００６６】
ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１（毒素産生量とｎｏｒ−１転写量の比率）による毒性の同定と安定性の検証
ＩＩ．ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１（毒素産生量とｎｏｒ−１転写量の比率）による毒性の同定結果の安定性の検証
ＡＦＴ／Ｎｏｒ−１の比率による毒性の同定結果の安定性をさらに検証するため、５つのアスペルギルス・フラバス株を、グループ内およびグループ間のアフラトキシン産生量とｎｏｒ−１遺伝子転写量を実験的に分析した。グループ内の実験では、同日に５つの複製が並行して設定され、５つの複製の平均値が、前記バッチ菌株的毒素産生量およびｎｏｒ−１遺伝子転写量とする。グループ間の実験には３つの異なる日付が設定され、各日付はバッチであり、合計３つのバッチが設定された。結果を表６に示す。
【国際調査報告】
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