(57)【要約】  ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ分子及びその薬物組成物及び該ｓｉＲＮＡ分子またはその薬物組成物を用いてＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを低下する方法を提供する。該ｓｉＲＮＡ分子はＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患の治療／予防に応用できる。
2021503917.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制し、相補して二本鎖を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ分子であって、
前記センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、１５〜２７個のヌクレオチドを含み、または１５〜２７個のヌクレオチドから構成され、前記アンチセンス鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個の連続するヌクレオチドと相補し、且つ、
前記ｓｉＲＮＡ分子中の少なくとも一つのヌクレオチドが修飾されたものであるｓｉＲＮＡ分子。
【請求項２】
前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド配列を含む請求項１に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項３】
前記修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、２′−メトキシエチル、２′−Ｏ−アルキル、２′−Ｏ−メチル、２′−Ｏ−アリル、２′−Ｃ−アリル、２′−フルオロ、２′−デオキシ、２′−ヒドロキシ、リン酸骨格、ＤＮＡ、蛍光プローブ、リガンド修飾またはこれらの組み合わせを含み、好ましくは、２′−Ｏ−メチル、ＤＮＡ、２′−フルオロ、チオ修飾のリン酸骨格またはこれらの組み合わせである請求項１または２に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項４】
前記センス鎖とアンチセンス鎖が、鎖１と２、鎖３と５、鎖３と６、鎖３と７、鎖３と８、鎖９と４、鎖９と５、鎖９と６、鎖９と７、鎖９と８の組み合わせから選ばれる請求項３に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項５】
前記リガンド修飾は、ｓｉＲＮＡ分子の３’末端、５’末端または配列の中間で行われ、
前記リガンド部分はＸｍ（ここで、Ｘは同一のまたは異なるリガンドであり、Ｘはコレステロール、ビオチン、ビタミン、ガラクトース誘導体または類似体、ラクトース誘導体または類似体、Ｎ−アセチルガラクトサミン誘導体または類似体、Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体または類似体、及びこれらの任意の組み合わせから選ばれ、ｍはリガンドの個数であり、好ましくは、ｍ＝１〜５の中の任意の一つの整数であり、さらに好ましくは、ｍ＝２〜４の中の任意の一つの整数であり、最も好ましくは、ｍが３である。）である請求項３に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項６】
Ｘの構造はＺである請求項５に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【化１】
2021503917.tif 000033
（ここで、Ｚ構造中のＣＨ２基のｎ値は、独立して１〜１５から選ばれ、好ましくは、Ｚ構造中のｎ値は３または８であり、
さらに好ましくは、ｍが２、３または４である場合、リガンド部分はそれぞれ、（Ｚ）２、（Ｚ）３または（Ｚ）４であり、最も好ましくは、（Ｚ）２、（Ｚ）３または（Ｚ）４中の各ｎ値が等しい。）
【請求項７】
リガンド及び／または蛍光修飾をさらに含み、前記リガンド修飾部分はＸｍ（ここで、Ｘは同一のまたは異なるリガンドであり、Ｘはコレステロール、ビオチン、ビタミン、ガラクトース誘導体または類似体、ラクトース誘導体または類似体、Ｎ−アセチルガラクトサミン誘導体または類似体、Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体または類似体、及びこれらの任意の組み合わせから選ばれ、ｍはリガンドの個数であり、好ましくは、ｍ＝１〜５の中の任意の一つの整数であり、さらに好ましくは、ｍ＝２〜４の中の任意の一つの整数であり、最も好ましくは、ｍが３である。）である請求項４に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項８】
そのセンス鎖とアンチセンス鎖が、鎖１３と８、鎖１７と８、鎖１９と８、鎖２０と８、鎖１３と１０、鎖１７と１０、鎖１９と１０、鎖２０と１０、鎖１４と１０、鎖１８と１０、鎖２１と１０、鎖２２と１０の組み合わせから選ばれる請求項７に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項９】
構造が、
Ａ：ＧＡＣＧＡＵＧＣＣＵＧＣＣＵＣＵＡＣＵ−（Ｘ）ｍ；
ｆＡｍＧｆＵｆＡｆＧ（ｓ）ｄＡ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＧｆＣｆＡｆＧ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＣ（ｓ）ｄＡｆＵｆＣｍＧｆＵｆＣ（ｓ）ｍＣ（ｓ）ｍＣ；または、
Ｂ：ｍＧｍＡｍＣｆＧｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｆＵｆＧｆＣｆＣｍＵｆＣｆＵｍＡｍＣｍＵ−（Ｘ）ｍ；
ｆＡｍＧｆＵｆＡｆＧ（ｓ）ｄＡ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＧｆＣｆＡｆＧ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＣ（ｓ）ｄＡｆＵｆＣｍＧｆＵｆＣ（ｓ）ｍＣ（ｓ）ｍＣであり、
Ｘの構造はＺである請求項７に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【化２】
2021503917.tif 000034
（ここで、ｍの値は２または３または４であり、
独立して、それぞれのＺ中のＣＨ２基のｎ値は１〜１５から選ばれ、
好ましくは、ｍが２、３または４である場合、リガンド部分はそれぞれ（Ｚ）２、（Ｚ）３または（Ｚ）４であり、且つ（Ｚ）２、（Ｚ）３または（Ｚ）４中の各ｎの値が等しい。）
【請求項１０】
ｎの値が３または８である請求項９に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１１】
ヒト、猿のＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制する請求項１乃至１０のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【請求項１２】
請求項１乃至１０のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子と、薬学的に許容されるその他の成分と、を含む薬物組成物。
【請求項１３】
体内または体外細胞のＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを抑制または低下する方法であって、前記細胞に請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子、または請求項１２に記載の薬物組成物を導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％抑制または低下させることを含む方法。
【請求項１４】
請求項１〜１０のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子または請求項１２に記載の薬物組成物の、体内または体外細胞のＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを抑制または低下するための薬物の調製または被験者のＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患または症状を治療するための薬物の調製における用途。
【請求項１５】
前記ＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患または症状は、心血管疾患または腫瘍性疾患を含み、好ましくは、心血管疾患は、高脂血症、高コレステロール血症、非家族性高コレステロール血症、多遺伝子高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、ホモ接合家族性高コレステロール血症、またはヘテロ接合家族性高コレステロール血症から選ばれ、腫瘍性疾患は、黒色腫、肝細胞癌、転移性肝がんから選ばれる請求項１４に記載の用途。
【請求項１６】
請求項１乃至１１のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子を含むキット。
【請求項１７】
被験者のＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患または症状を治療する方法であって、前記被験者に請求項１乃至１１のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子または請求項１２に記載の薬物組成物を投与することを含む方法。
【請求項１８】
前記ＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患または症状は、心血管疾患または腫瘍性疾患を含み、好ましくは、心血管疾患は高脂血症、高コレステロール血症、非家族性高コレステロール血症、多遺伝子高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、ホモ接合家族性高コレステロール血症、またはヘテロ接合家族性高コレステロール血症から選ばれ、腫瘍性疾患は、黒色腫、肝細胞癌、転移性肝がんから選ばれる請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
請求項１乃至１１のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子または請求項１２に記載の薬物組成物の、体内または体外細胞のＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを抑制または低下するための薬物の調製における応用。
【請求項２０】
体内または体外細胞のＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを抑制または低下するための、請求項１乃至１１のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子または請求項１２に記載の薬物組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬分野に関し、特に、ＲＮＡ干渉技術によってＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ分子及びその応用に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）とは、進化過程に高度に保存され、二本鎖ＲＮＡによって誘発される、相同性ｍＲＮＡが効率よく特異的に分解する現象を指す。ＲＮＡｉは自然界の種に広く存在している。Ａｎｄｒｅｗ  Ｆｉｒｅ及びＣｒａｉｇ  Ｍｅｌｌｏらは、１９９８年に線虫（Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ  ｅｌｅｇａｎｓ，Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）で初めてＲＮＡｉ現象を発見した。Ｔｕｓｃｈｌ及びＰｈｉｌ  Ｓｈａｒｐらは２００１年に哺乳動物にもＲＮＡｉが存在していることを確認した。その後、ＲＮＡｉのメカニズム、遺伝子機能、臨床応用等についての研究が、一連の進展を遂げている。ＲＮＡｉは、ウイルス感染の防御、トランスポゾンジャンプの防止等の多種の生体保護機構で重要な役割を果たしている（Ｈｕｔｖａｇｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ.,２００１；Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ.,２００１；Ｚａｍｏｒｅ,２００１）。ＲＮＡｉメカニズムに基づいて開発された製品は幅広い有望な候補薬物である。
【０００３】
小干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉作用を果たすことができる。Ｅｌｂａｓｈｉｒらは、２００１年にｓｉＲＮＡｓが哺乳動物細胞中の特異的な遺伝子のサイレンシングを抑制することを発見した。研究によると、ｓｉＲＮＡが、配列が相補する標的ｍＲＮＡと特異的に結合し、それを分解させる。長鎖の二本鎖ＲＮＡがＤｉｃｅｒ酵素によって短鎖ＲＮＡに切断される。ｓｉＲＮＡ分子は２本の鎖からなり、２本の鎖中、標的ｍＲＮＡに結合する鎖はアンチセンス鎖またはガイド鎖と呼ばれ、もう一方の鎖はセンス鎖またはパッセンジャー鎖と呼ばれる。研究によると、体外（in vitro）で化学合成されたｓｉＲＮＡは、細胞に入った後も、同様にＲＮＡ干渉作用を果たすことができ、且つ、長鎖ＲＮＡによる免疫反応を効果的に低減することができる。よって、ｓｉＲＮＡはＲＮＡｉの主な工具になる。
【０００４】
プロタンパク質転換酵素サブチリシン９（Ｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ  ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ  ｓｕｂｔｉｌｉｓｉｎ／ｋｅｘｉｎ  ｔｙｐｅ  ９，ＰＣＳＫ９）は、サブチリシンセリンプロテアーゼのファミリーのメンバーであり、低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）タンパク質のレベルの調節に関与する。肝臓はＰＣＳＫ９を発現する主な部位である。ＰＣＳＫ９を発現する他の重要な部位としては、膵臓、腎臓及び腸が含まれる。低密度リポタンパク質受容体（ＬＤＬＲ）は、血液中の低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）を除去することで、アテローム性動脈硬化症及び高コレステロール血症を予防する。過剰発現の研究によると、ＰＣＳＫ９はＬＤＬＲのレベルを制御できることを示している。同時に、研究によると、マウス中のＰＣＳＫ９遺伝子ノックアウト後、血液中のコレステロールのレベルが低下し、スタチン系薬物の血液コレステロールの低下への感受性が増強されている。以上の研究は、ＰＣＳＫ９の阻害剤が、血液中のＬＤＬ−Ｃ（低密度リポタンパク質−コレステロール）濃度の低下及びＰＣＳＫ９媒介性疾患の治療に有利でありえることを示している。
【０００５】
現在、ＰＣＳＫ９を標的とする阻害剤及びそれを脂質系疾患の治療への応用が報告されているが、さらに優れた治療効果、特異性、安定性、ターゲティング性または耐性等を有するように、当該標的に対する他の阻害剤を開発する必要がある。
【発明の概要】
【０００６】
本願は、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ分子、キット及びその薬物組成物、並びに上記分子、キットまたは薬物組成物によるＰＣＳＫ９遺伝子の発現の抑制または低下、またはＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患または症状の治療における方法と応用を提供する。
【０００７】
具体的に、本願は以下の発明に関する。
【０００８】
［１］ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制し、相補して二本鎖を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖とを含むｓｉＲＮＡ分子であって、
前記センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は、１５〜２７個のヌクレオチドを含み、または１５〜２７個のヌクレオチドから構成され、前記アンチセンス鎖は、ＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１の少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個または２５個の連続するヌクレオチドと相補し、且つ
前記ｓｉＲＮＡ分子中の少なくとも一つのヌクレオチドが修飾されたものであるｓｉＲＮＡ分子。
【０００９】
［２］前記ｓｉＲＮＡ分子のセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：１のヌクレオチド配列またはＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：２のヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡ分子のアンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ：３のヌクレオチド配列を含む［１］に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【００１０】
［３］前記修飾は、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、２′−メトキシエチル、２′−Ｏ−アルキル、２′−Ｏ−メチル、２′−Ｏ−アリル、２′−Ｃ−アリル、２′−フルオロ、２′−デオキシ、２′−ヒドロキシ、リン酸骨格、ＤＮＡ、蛍光プローブ、リガンド修飾またはこれらの組み合わせを含み、好ましくは、２′−Ｏ−メチル、ＤＮＡ、２′−フルオロ、チオ修飾のリン酸骨格またはこれらの組み合わせである［１］または［２］に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【００１１】
［４］そのセンス鎖とアンチセンス鎖が、鎖１と２、鎖３と５、鎖３と６、鎖３と７、鎖３と８、鎖９と４、鎖９と５、鎖９と６、鎖９と７、鎖９と８の組み合わせから選ばれる［３］に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【００１２】
［５］前記リガンド修飾は、ｓｉＲＮＡ分子の３’末端、５’末端または配列の中間で行われ、
前記リガンド部分はＸｍであり、ここで、Ｘは同一のまたは異なるリガンドであり、Ｘはコレステロール、ビオチン、ビタミン、ガラクトース誘導体または類似体、ラクトース誘導体または類似体、Ｎ−アセチルガラクトサミン誘導体または類似体、Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体または類似体、及びこれらの任意の組み合わせから選ばれ、ｍはリガンドの個数であり、好ましくは、ｍ＝１〜５の中の任意の一つの整数であり、さらに好ましくは、ｍ＝２〜４の中の任意の一つの整数であり、最も好ましくは、ｍが３である［３］に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【００１３】
［６］Ｘの構造はＺであり、
【化１】
2021503917.tif 000003
ここで、Ｚ構造中のＣＨ２基のｎ値は、独立して１〜１５から選ばれ、好ましくは、Ｚ構造中のｎ値は３または８であり、
さらに好ましくは、ｍが２、３または４である場合、リガンド部分はそれぞれ、（Ｚ）２、（Ｚ）３または（Ｚ）４であり、最も好ましくは、（Ｚ）２、（Ｚ）３または（Ｚ）４中の各ｎ値が等しい［５］に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【００１４】
［７］リガンド及び／または蛍光修飾をさらに含み、前記リガンド修飾部分はＸｍであり、ここで、Ｘは同一のまたは異なるリガンドであり、Ｘはコレステロール、ビオチン、ビタミン、ガラクトース誘導体または類似体、ラクトース誘導体または類似体、Ｎ−アセチルガラクトサミン誘導体または類似体、Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体または類似体、及びこれらの任意の組み合わせから選ばれ、ｍはリガンドの個数であり、好ましくは、ｍ＝１〜５の中の任意の一つの整数であり、さらに好ましくは、ｍ＝２〜４の中の任意の一つの整数であり、最も好ましくは、ｍが３である［４］に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【００１５】
［８］そのセンス鎖とアンチセンス鎖が、鎖１３と８、鎖１７と８、鎖１９と８、鎖２０と８、鎖１３と１０、鎖１７と１０、鎖１９と１０、鎖２０と１０、鎖１４と１０、鎖１８と１０、鎖２１と１０、鎖２２と１０の組み合わせから選ばれる［７］に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【００１６】
［９］その構造が、
Ａ：ＧＡＣＧＡＵＧＣＣＵＧＣＣＵＣＵＡＣＵ−（Ｘ）ｍ；
ｆＡｍＧｆＵｆＡｆＧ（ｓ）ｄＡ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＧｆＣｆＡｆＧ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＣ（ｓ）ｄＡｆＵｆＣｍＧｆＵｆＣ（ｓ）ｍＣ（ｓ）ｍＣ；または、
Ｂ：ｍＧｍＡｍＣｆＧｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｆＵｆＧｆＣｆＣｍＵｆＣｆＵｍＡｍＣｍＵ−（Ｘ）ｍ；
ｆＡｍＧｆＵｆＡｆＧ（ｓ）ｄＡ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＧｆＣｆＡｆＧ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＣ（ｓ）ｄＡｆＵｆＣｍＧｆＵｆＣ（ｓ）ｍＣ（ｓ）ｍＣであり、
ここで、Ｘの構造はＺであり、
【化２】
2021503917.tif 000004
ｍの値は２または３または４であり、
それぞれのＺ中のＣＨ２基のｎ値は独立して１〜１５から選ばれ、
好ましくは、ｍが２、３または４である場合、リガンド部分はそれぞれ（Ｚ）２、（Ｚ）３または（Ｚ）４であり、且つ（Ｚ）２、（Ｚ）３または（Ｚ）４中の各ｎの値が等しい［７］に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【００１７】
［１０］ｎの値が３または８である［９］に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【００１８】
［１１］ヒト、猿のＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制する［１］乃至［１０］のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子。
【００１９】
［１２］［１］乃至［１１］のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子と、薬学的に許容されるその他の成分と、を含む薬物組成物。
【００２０】
［１３］体内または体外細胞のＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを抑制または低下する方法であって、前記細胞に［１］〜［１１］のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子、または［１２］に記載の薬物組成物を導入して、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを抑制または少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７５％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、または少なくとも５％低下させることを含む方法。
【００２１】
［１４］［１］〜［１１］のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子または［１２］に記載の薬物組成物の、体内または体外細胞のＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを抑制または低下するための薬物の調製または被験者のＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患または症状を治療するための薬物の調製における応用。
【００２２】
［１５］前記ＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患または症状は、心血管疾患または腫瘍性疾患を含み、好ましくは、心血管疾患は、高脂血症、高コレステロール血症、非家族性高コレステロール血症、多遺伝子高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、ホモ接合家族性高コレステロール血症、またはヘテロ接合家族性高コレステロール血症から選ばれ、腫瘍性疾患は、黒色腫、肝細胞癌、転移性肝がんから選ばれる［１４］に記載の応用。
【００２３】
［１６］［１］乃至［１１］のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子を含むキット。
【００２４】
［１７］被験者のＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患または症状を治療する方法であって、前記被験者に［１］乃至［１１］のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子または［１２］に記載の薬物組成物を投与することを含む方法。
【００２５】
［１８］前記ＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患または症状は、心血管疾患または腫瘍性疾患を含み、好ましくは、心血管疾患は高脂血症、高コレステロール血症、非家族性高コレステロール血症、多遺伝子高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、ホモ接合家族性高コレステロール血症、またはヘテロ接合家族性高コレステロール血症から選ばれる［１７］に記載の用途。
【００２６】
［１９］［１］乃至［１１］のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子または［１２］に記載の薬物組成物の、体内または体外細胞のＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを抑制または低下するための薬物の調製における応用。
【００２７】
［２０］体内または体外細胞のＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを抑制または低下するための、［１］乃至［１１］のうちのいずれか一項に記載のｓｉＲＮＡ分子または［１２］に記載の薬物組成物。
【００２８】
以下、図面と実施例を結合して本発明の実施形態を詳しく説明するが、以下の図面と実施例は本発明を説明するためのものであり、本発明の範囲を限定するものではないことを当業者は理解できる。本発明の様々な目的および有利な態様は、添付の図面および以下の好ましい実施形態の詳細な説明から当業者に明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１Ａ】本発明のＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡと受容体の結合を示す曲線を示す。
【図１Ｂ】本発明のＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡと受容体の結合を示す曲線を示す。
【図１Ｃ】本発明のＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡと受容体の結合を示す曲線を示す。
【図２】投与してから６時間後に安楽死した後に行われたエクスビボ臓器イメージングを示す。
【図３】投与してから６時間後に安楽死した後に行われたエクスビボ臓器イメージングを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
配列情報
本発明に係る配列の情報を以下の表で提供する。
【００３１】
基本配列（未修飾）は以下のとおりである。
【表１−１】
2021503917.tif 000005
【００３２】
本願に係る各ｓｉＲＮＡ分子中の各鎖及びその組成は以下である。
【表１−２】
2021503917.tif 000006
【００３３】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、「Ｕ」は通常、それぞれ、グアニン、シトシン、アデニン、チミン、ウラシルを塩基とするヌクレオチドである。
【００３４】
修飾：ｄ＝ＤＮＡ；ｍ＝２'−Ｏ−メチル；ｆ＝２'−フルオロ；（ｓ）＝ＰＳ骨格（すなわち、チオ修飾のリン酸骨格）；Ｌ＝Ｌ型リガンド；Ｓ＝Ｓ型リガンド；Ｃｙ５＝蛍光標識Ｃｙ５。
【００３５】
発明を実施するための形態
以下、本発明の実施形態を具体的に詳細に説明する。
【００３６】
本発明では、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制し、相補して二本鎖を形成するセンス鎖とアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡ分子であって、前記センス鎖及び／またはアンチセンス鎖は１５〜２７個のヌクレオチドを含みまたは１５〜２７個のヌクレオチドから構成され、前記アンチセンス鎖はＳＥＱ  ＩＤ  ＮＯ.：１の少なくとも１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個のまたは２５個の連続するヌクレオチドと相補し、且つ、前記ｓｉＲＮＡ分子中の少なくとも一つのヌクレオチドが修飾されたものであるｓｉＲＮＡ分子を提供する。
【００３７】
ここで使用される用語「アンチセンス鎖」とは、標的配列と完全または実質的に相補する領域を含むｓｉＲＮＡの一つの鎖である。ここで使用される用語「相補する領域」とは、アンチセンス鎖上の標的ｍＲＮＡ配列と完全または実質的に相補する領域を指す。相補する領域と標的配列とが完全に相補しない場合、ミスマッチは分子の内部または末端の領域に位置してもよい。通常、最も耐容性のあるミスマッチは末端の領域に位置する。例えば５’及び／または３’端の５、４、３、２または１個のヌクレオチド内に位置する。ミスマッチに最も敏感であるアンチセンス鎖部分は「シード領域」と呼ばれる。例えば、１９ｎｔの鎖を含むｓｉＲＮＡにおいて、第１９目の位置（５’から３’へ数える）で一部のミスマッチに耐えることができる。
【００３８】
ここで使用される用語「相補」とは、第１のポリヌクレオチドが、例えば厳格な条件などの条件で第２のポリヌクレオチドとハイブリダイズする能力を指す。例えば、厳格な条件としては、４００ｍＭ  ＮａＣｌ、４０ｍＭ  ＰＩＰＥＳ  ｐＨ  ６.４、１ｍＭ  ＥＤＴＡで５０℃または７０℃で１２〜１６時間持続することを含んでもよい。
【００３９】
ここで使用される用語「センス鎖」とは、ここで定義された用語であるアンチセンス鎖の領域と実質的に相補する領域を含むｓｉＲＮＡの一つの鎖を指す。
【００４０】
ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖とセンス鎖は、ここに記載されている且つ周知のように、同一のまたは異なる長さを有してもよい。
【００４１】
前記ｓｉＲＮＡ分子は、ＲＮＡｉ作用によって、ＰＣＳＫ９ｍＲＮＡの配列の特異的な分解を促進して、ＰＣＳＫ遺伝子の発現を抑制し、またはＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを低減させることを図る。例えばＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを９５％、９０％、８５％、８０％、７５％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％、または５％低減させる。
【００４２】
前記ｓｉＲＮＡ分子の各鎖の少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または１００％のヌクレオチドは、リボヌクレオチドであるが、例えばデオキシリボヌクレオチド等の一つまたは複数の非リボヌクレオチドを含んでもよい。
【００４３】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子中の少なくとも一つのヌクレオチドが修飾されたものである。ｓｉＲＮＡの性能を改善するために多くの修飾を試みることができるが、このような試みは通常、ＲＮＡ干渉を媒介するとともに、血清で向上された安定性を有する（例えば、ヌクレアーゼに対する耐性の増加及び／または延長された持続時間を有する）ことを解釈しにくい。本発明の修飾されたｓｉＲＮＡは、高い安定性を有するとともに、高い阻害活性を保持する。
【００４４】
本発明に適合する修飾としては、ロックド核酸（ＬＮＡ）、アンロックド核酸（ＵＮＡ）、２′−メトキシエチル、２′−Ｏ−アルキル、２′−Ｏ−メチル、２′−Ｏ−アリル、２′−Ｃ−アリル、２′−フルオロ、２′−デオキシ、２′−ヒドロキシ、リン酸骨格、蛍光プローブ、リガンド修飾またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれることができる。好適な修飾は２′−Ｏ−アルキルであり、例えば２′−Ｏ−メチル、ＤＮＡ、２′−フルオロ、チオ修飾のリン酸骨格及びその組み合わせである。
【００４５】
本発明の具体的な実施形態において、好適な修飾方式は以下を含む。すなわち、（１）アンチセンス鎖：５'端の１番目のヌクレオチドが２'−フルオロ修飾で、二番目のヌクレオチドが２'−Ｏ−メチル修飾で、中間領域がｆＮｆＮｆＮ（ｓ）ｄＮ（ｓ）ｄＮ（ｓ）ｄＮｆＮｆＮｆＮ（ｓ）ｄＮ（ｓ）ｄＮ（ｓ）ｄＮの繰り返し構造であり、３'端に５'（ｓ）ｍＮ（ｓ）ｍＮ  ３'オーバーハング構造を有し、オーバーハング構造と中間領域との間のヌクレオチドが２'−Ｏ−メチルまたは２'−フルオロによって修飾され、且つ最大で二つの連続する２'−フルオロまたは２'−Ｏ−メチル修飾を有する。（２）センス鎖は修飾されず、またはセンス鎖のすべてのヌクレオチドが修飾された：５'端１２ｎｔのヌクレオチドがｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮｍＮｍＮｍＮｆＮｆＮｆＮで修飾され、３'端の３ｎｔヌクレオチドが２'−Ｏ−メチルで修飾され、中間ヌクレオチドが２'−Ｏ−メチルまたは２'−フルオロで修飾され、且つ最大で二つの連続する２'−フルオロまたは２'−Ｏ−メチル修飾を有する。一部の実施形態において、本発明で提供されるｓｉＲＮＡ分子は、表５に示すＲＢＰ９−００５−Ｐ１Ｇ１、ＲＢＰ９−００５−Ｐ２Ｇ２、ＲＢＰ９−００５−Ｐ２Ｇ３、ＲＢＰ９−００５−Ｐ２Ｇ４、ＲＢＰ９−００５−Ｐ２Ｇ５、ＲＢＰ９−００５−Ｐ２Ｇ６、ＲＢＰ９−００５−Ｐ３Ｇ２、ＲＢＰ９−００５−Ｐ３Ｇ３、ＲＢＰ９−００５−Ｐ３Ｇ４、ＲＢＰ９−００５−Ｐ３Ｇ５、及びＲＢＰ９−００５−Ｐ３Ｇ６から選ばれる。
【００４６】
一部の実施形態において、化学修飾されたｓｉＲＮＡ分子は、ＲＢＰ９−００５−Ｐ２Ｇ６またはＲＢＰ９−００５−Ｐ３Ｇ６であることが好ましい。
【００４７】
一部の実施形態において、リガンド修飾は、ｓｉＲＮＡ分子の３′末端、５′末端または配列の中間で行われてもよい。一部の実施形態において、リガンドは、宿主細胞により取り込まれた部分であってもよい。本発明に適合するリガンドは、コレステロール、ビオチン、ビタミン、ガラクトース誘導体または類似体、ラクトース誘導体または類似体、Ｎ−アセチルガラクトサミン誘導体または類似体、Ｎ−アセチルグルコサミン誘導体または類似体またはこれらの組み合わせを含む。好ましくは、リガンド修飾がＮ−アセチルガラクトサミン誘導体または類似体修飾である。
【００４８】
リガンド修飾は、ｓｉＲＮＡ分子の細胞取り込み、細胞内ターゲティング、半減期、または薬物代謝または動態等の性能を改善することができる。一部の実施形態において、リガンド修飾されていないｓｉＲＮＡに比べ、リガンド修飾されたｓｉＲＮＡは、選択された標的（例えば、特定の組織タイプ、細胞タイプ、細胞器等）、特に肝細胞に対して補強された親和性または細胞取込性を有する。好ましいリガンドはｓｉＲＮＡの活性に干渉を及ぼすことがない。
【００４９】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡは、一つまたは複数のリガンド修飾を含んでもよく、好ましくは、１〜５個、２〜４個または３個のリガンド修飾を含み、好ましくはＮ−アセチルガラクトサミン誘導体／類似体である。
【００５０】
一部の実施形態において、Ｎ−アセチルガラクトサミン誘導体のリガンド修飾部分の構造はＺである。
【化３】
2021503917.tif 000007
【００５１】
一部の実施形態において、リガンド修飾のｓｉＲＮＡ分子は、表８に示すＰ２Ｇ６−０３Ｌ、Ｐ２Ｇ６−０３Ｓ、Ｐ３Ｇ６−０３Ｌ、及びＰ３Ｇ６−０３Ｓ、並びに表１０に示すＰ２Ｇ６−１３Ｌ、Ｐ２Ｇ６−１３Ｓ、Ｐ３Ｇ６−１３Ｌ、Ｐ３Ｇ６−１３Ｓから選ばれるいずれかのｓｉＲＮＡ分子である。
【００５２】
一部の実施形態において、リガンド修飾のｓｉＲＮＡ分子の構造は、
ＧＡＣＧＡＵＧＣＣＵＧＣＣＵＣＵＡＣＵ−ＺＺＺ；
ｆＡｍＧｆＵｆＡｆＧ（ｓ）ｄＡ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＧｆＣｆＡｆＧ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＣ（ｓ）ｄＡｆＵｆＣｍＧｆＵｆＣ（ｓ）ｍＣ（ｓ）ｍＣ；または、
ｍＧｍＡｍＣｆＧｆＡｆＵｍＧｍＣｍＣｆＵｆＧｆＣｆＣｍＵｆＣｆＵｍＡｍＣｍＵ−ＺＺＺ；
ｆＡｍＧｆＵｆＡｆＧ（ｓ）ｄＡ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＧｆＣｆＡｆＧ（ｓ）ｄＧ（ｓ）ｄＣ（ｓ）ｄＡｆＵｆＣｍＧｆＵｆＣ（ｓ）ｍＣ（ｓ）ｍＣであり、
ここで、ＺＺＺ構造はリン酸ジエステル結合によって、ｓｉＲＮＡセンス鎖３′末端のヌクレオチドに連結しており、それぞれのＺはリン酸ジエステル結合によって、隣接のＺに連結されている。ここで、ｓｉＲＮＡに連結されているＺＺＺ構造は下記の通りである。
【化４】
2021503917.tif 000008
【００５３】
それぞれのＺにおけるＣＨ２基のｎの値は、独立して１〜１５から選ばれ、好ましくは、ＺＺＺ構造中のｎの値は等しい。
【００５４】
一実施形態において、ＺＺＺ構造におけるｎの値はいずれも３である。前記ｎの値が３である場合、ＺをＬで表すことができる。
【００５５】
一実施形態において、ＺＺＺ構造におけるｎの値はいずれも８である。前記ｎの値が８である場合、ＺをＳで表すことができる。本発明のｓｉＲＮＡ分子の各鎖において０％〜１００％の修飾されたヌクレオチド、例えば５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、または９５％以上の修飾されたヌクレオチドを有してもよい。前記修飾は、オーバーハング領域または二本鎖領域で行われることができる。本発明の修飾は、例えば安定性、生体分布、阻害活性等のｓｉＲＮＡ分子の体外または体内の特性を改善するために用いられる。本発明の修飾を組み合わせて使用することができる。
【００５６】
本発明のｓｉＲＮＡ分子の各鎖はオーバーハング端または平滑末端を有する。アンチセンス鎖またはセンス鎖の任意の一つの鎖または二本鎖の５′及び／または３′端はいずれも、オーバーハング端であってもよい。オーバーハング端は１〜８個、好ましくは、２個、３個、４個、５個または６個のオーバーハングを有してもよく、その中、オーバーハングはＵ、Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、ｄＴから任意に選ばれる。
【００５７】
一部の実施形態において、本発明のｓｉＲＮＡ分子は、人または猿のＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制する。
【００５８】
一部の実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡ分子中の少なくとも１本の鎖を発現する、細胞内ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制するベクターをさらに提供する。ここで使用される用語「ベクター」とは、連結された他の核酸を増幅または発現させることができる核酸分子を指す。
【００５９】
一部の実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡ分子またはベクターを含むキットをさらに提供する。
【００６０】
一部の実施形態において、本発明は、本発明のｓｉＲＮＡ分子またはベクターと薬学的に許容されるその他の成分とを含む薬物組成物をさらに提供する。一実施形態において、本発明の組成物は、本発明のｓｉＲＮＡ分子またはベクターと薬学的に許容されるその他の成分とを薬理学的に有効量含む。ここで使用される用語「有効量」とは、所望の薬理学的な治療効果を得られるｓｉＲＮＡ分子の量を指す。「その他の成分」としては、水、塩水、ブドウ糖、緩衝液（ＰＢＳなど）、賦形剤、希釈剤、崩壊剤、結合剤、潤滑剤、甘味料、調味剤、防腐剤またはこれらの任意の組み合わせを含む。
【００６１】
一部の実施形態において、本発明は、体内または体外細胞のＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを抑制または低下する方法であって、細胞へ本発明のｓｉＲＮＡ分子、ベクター、キットまたは薬物組成物を導入することで、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルを少なくとも９５％、少なくとも９０％、少なくとも８５％、少なくとも８０％、少なくとも７０％、少なくとも６０％、少なくとも５０％、少なくとも４０％、少なくとも３０％、少なくとも２０％、少なくとも１０％、少なくとも５％抑制または低下する方法をさらに提供する。本文に使用された用語「導入」とは、非補助的拡散若しくは能動的な細胞過程、または補助試薬若しくは機器による、細胞への取り込みまたは吸収を容易にすることを指す。体内の細胞へ導入する際、ｓｉＲＮＡを標的組織に注射したりまたは全身に投与することができる。体外の細胞への導入は、例えばエレクトロポレーション法等の本分野で周知の方法を利用することができる。
【００６２】
細胞は、例えばヒト細胞のような霊長類動物細胞などの、ＰＣＳＫ９を発現する哺乳動物の細胞であることが好ましい。好ましくは、標的細胞においてＰＣＳＫ９遺伝子の発現レベルが高い。より好ましくは、細胞が脳、唾液腺、心臓、脾臓、肺、肝臓、腎臓、腸または腫瘍に由来する。さらにより好ましくは、細胞が肝がん細胞または子宮頸癌細胞である。またさらに好ましくは細胞がＨｅｐＧ２とＨｅＬａ細胞から選ばれる。
【００６３】
体外方法において、ｓｉＲＮＡ分子の細胞の終濃度は０.１〜１０００ｎＭであり、好ましくは１０〜５００ｎＭ、２５〜３００ｎＭ、または５０〜１００ｎＭである。
【００６４】
標的遺伝子、標的ＲＮＡまたは標的タンパク質レベルの検出は、ｓｉＲＮＡの活性、有効性または治療結果の予測または評価に利用される。標的遺伝子、標的ＲＮＡまたは標的タンパク質レベルの検出には本分野の周知の方法を利用することができる。
【００６５】
一部の実施形態において、本発明は、被験者のＰＣＳＫ遺伝子媒介性疾患または症状の緩和または治療を含む体内方法を提供し、前記疾患または症状は、心血管疾患、脂質異常を含む。心血管疾患はアテローム性動脈硬化性心血管疾患を含んでもよく、脂質異常は血清におけるコレステロール及び／またはトリグリセリドのレベル上昇、低密度リポタンパク質コレステロールの上昇またはアポリポタンパク質Ｂ（ＡｐｏＢ）の上昇を含んでもよい。前記疾患または症状は、高脂血症、高コレステロール血症、非家族性高コレステロール血症、多遺伝子高コレステロール血症、家族性高コレステロール血症、ホモ接合家族性高コレステロール血症、またはヘテロ接合家族性高コレステロール血症であることが好ましい。被験者は哺乳動物であってもよく、好ましくはヒトである。
【００６６】
ここで使用される用語「高コレステロール血症」とは、増加された血清コレステロールを特徴とする状況を指す。用語「高脂血症」とは、増加された血清脂質を特徴する状況を指す。用語「非家族性高コレステロール血症」とは、単一の遺伝性遺伝子変異によるものではない、増加されたコレステロールを特徴とする状況を指す。用語「多遺伝子高コレステロール血症」とは、様々な遺伝子によるものであって増加されたコレステロールを特徴とする状況を指す。用語「家族性高コレステロール血症（ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）（ＦＨ）」とは、ＬＤＬ−受容体（ＬＤＬ−Ｒ）中の変異、有意に増加されたＬＤＬ−Ｃ及びアテローム性動脈硬化の早期発生（ｐｒｅｍａｔｕｒｅ  ｏｎｓｅｔ）を特徴とする常染色体優性代謝障害を指す。用語「ホモ接合家族性高コレステロール血症（ｈｏｍｏｚｙｇｏｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）」または「ＨｏＦＨ」とは、母体及び父体のＬＤＬ−Ｒ遺伝子の変異を特徴とする状況を指す。用語「ヘテロ接合家族性高コレステロール血症（ｈｅｔｅｒｏｚｙｇｏｕｓ  ｆａｍｉｌｉａｌ  ｈｙｐｅｒｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌｅｍｉａ）」または「ＨｏＦＨ」とは、母体または父体のＬＤＬ−Ｒ遺伝子の変異を特徴とする状況を指す。
【００６７】
ＰＣＳＫ遺伝子媒介性疾患または症状は、ＰＣＳＫ９遺伝子の過剰発現、ＰＣＳＫ９タンパク質の過剰産生によって起こされ、ＰＣＳＫ９遺伝子の発現を低減することで調節することが可能である。ここで使用される用語「治療」とは、ＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患または症状の緩和、軽減または治癒を指し、例えば血清ＬＤＬ、ＬＤＬ−Ｃのレベルの低減を含む血液脂質レベルの低減を指す。一部の実施形態において、血清ＬＤＬ、血清ＬＤＬ−Ｃの含有量または濃度が、５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％減少された。
【００６８】
体内方法において、薬物組成物を例えば筋肉、静脈、動脈、腹膜または皮下注射を含む非経口投与のようなすべての適切な手段で投与することができる。投与形態は一回投与または複数回投与を含むが、これに限定されることはない。投与量範囲は、０.１ｍｇ／ｋｇ乃至１００ｍｇ／ｋｇ、０.５ｍｇ／ｋｇ乃至５０ｍｇ／ｋｇ、２.５ｍｇ／ｋｇ乃至２０ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ乃至１５ｍｇ／ｋｇであることがであってもよく、好ましくは、３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３３ｍｇ／ｋｇであり、さらに好ましくは１０ｍｇ／ｋｇであり、最も好ましくは、３３ｍｇ／ｋｇである。
【００６９】
一方、本発明においてさらに１種または複種類の本発明のｓｉＲＮＡまたはそれを含む薬物組成物と１種または複種類の他の治療剤とを併用、または他の治療方法と結合して使用することを含む併用治療の方法を提供する。他の治療剤としては、例えば高コレステロール血症、アテローム性動脈硬化または脂質異常等の脂質失調を予防、緩和または治療するための既知の薬剤、  例えばコレステロール吸収阻害剤、脂質低下薬、鎮痛剤、抗炎症剤、抗腫瘍薬等を含む。他の治療方法としては、放射線療法、免疫療法、ホルモン療法、手術療法等を含む。
【００７０】
本発明のｓｉＲＮＡ分子は、多種の有益な効果を生じる。１、修飾されたｓｉＲＮＡ分子は、高い安定性と高い阻害活性を有する。２、リガンド修飾されたｓｉＲＮＡ分子は、高い阻害活性と安定性を保持しつつ、優れた肝臓ターゲティング性及び細胞内取り込み促進能を有し、他の組織または臓器に対する影響を低減、及びｓｉＲＮＡ分子の使用量を低減することができ、毒性の軽減及びコストの低減の目的を実現できる。３、リガンド修飾されたｓｉＲＮＡ分子は、トランスフェクション試薬を必要とせず標的細胞及び標的組織に導入されることができ、細胞または組織毒性等のトランスフェクション試薬の悪影響を低減することができる。したがって、本発明のリガンド修飾されたｓｉＲＮＡ分子はターゲティング治療を可能にする。
【００７１】
略称、略語と番号説明
【００７２】
「Ｇ」、「Ｃ」、「Ａ」、「Ｔ」、「Ｕ」は通常、それぞれグアニン、シトシン、アデニン、チミン、ウラシルを塩基とするヌクレオチドを表す。
【００７３】
ＲＥＬ（Ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｅｘｐｒｓｅｅｉｏｎ  ｌｅｖｅｌ）：ｍＲＮＡ相対発現レベル。
【００７４】
ＧａｌＮＡｃ：Ｎ−アセチルガラクトサミン。
【００７５】
修飾：Ｎ＝ＲＮＡ；ｄＮ＝ＤＮＡ；ｍＮ＝２'−Ｏ−メチル修飾；ｆＮ＝２'−フルオロ修飾；（ｓ）＝ＰＳ骨格（すなわち、５'−チオ修飾のリン酸骨格）。
【００７６】
略語：ＲＢＰ９−００５−Ｐ３Ｇ６をＰ３Ｇ６と略称することができ、その他も類似する。
【００７７】
番号：Ｐ３Ｇ６折れ線後の第１位は蛍光標識の有無（０は「無し」、１は「有り」）を表し、第２位はリガンドの個数を表し、第３位はリガンドのタイプを表し、例えば、Ｐ３Ｇ６−１３ＬはＰ３Ｇ６が蛍光標識、三つのＬのリガンド修飾を経ることを表し、その他も類似する。
【００７８】
実施例
実施例１  ＰＣＳＫ９−ｓｉＲＮＡ活性スクリーニング
【００７９】
ｓｉＲＮＡの設計
ヒトのｐｃｓｋ９ｍＲＮＡ配列に基づいて、異なる部位を選択して複数対のＰＣＳＫ９−ｓｉＲＮＡを設計し、設計された全ての単一のｓｉＲＮＡはいずれも標的遺伝子（表１を参照）の全ての転写産物にターゲティングでき、これらの複数対のｓｉＲＮＡは、配列類似性ソフトウェアでアラインメントした結果、他の全ての非標的遺伝子の配列と最低の相同性を持つ。配列設計方法は、Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ.２００２；Ｐａｄｄｉｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ.２００２；Ｒｅｙｎｏｌｄｓｅｔ  ａｌ.２００４；Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ.２００４らの方法を参照することができる。
【００８０】
【表１−３】
2021503917.tif 000009
【００８１】
ｓｉＲＮＡの合成
本発明において、２’−ヒドロキシを含有するリボヌクレオチドのオリゴヌクレオチドはいずれも理論収量１ｕｍｏｌ合成仕様に応じて完成された。１ｕｍｏｌ仕様の汎用の固相サポートＣＰＧまたは３’−コレステロール修飾ＣＰＧ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓから購入した）、２’−Ｏ−ＴＢＤＭＳ保護ＲＮＡホスホロアミダイトのモノマー、ＤＮＡモノマー、２’−メトキシモノマー、及び２’−フルオロモノマー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した）を量って、無水アセトニトリル溶液に、その濃度が０.２Ｍとなるように溶解させた。リン酸骨格のチオ修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドに対して、０．２Ｍ  ＰＡＤＳ溶液をチオール試薬とした。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓから購入した）アセトニトリル溶液を活性剤（０.２５Ｍ）として配置し、０.０２Ｍヨードのピリジン／水溶液を酸化剤として、及び３％トリクロロ酢酸ジクロロメタン溶液を脱保護試薬として配置し、ＡＢＩ  ３９４型のＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機の対応する試薬指定位置に置いた。合成プログラムを設定して指定のオリゴデオキシヌクレオチド塩基配列を入力した。誤りがないとチェックした後、オリゴデオキシヌクレオチドの合成の循環を開始した。各ステップのカップリング時間は６分であり、ガラクトースリガンドの対応するＬ及びＳモノマーのカップリング時間は１０〜２０分である。自動で循環した後、オリゴデオキシヌクレオチド固相の合成を完成した。乾燥窒素でＣＰＧをブロー乾燥し、５ｍｌ  ＥＰ管に移し、アンモニア水／アルコール溶液（３／１）２ｍｌを添加して、５５℃で１６〜１８時間加熱した。１００００ｒｐｍの回転速度で１０ｍｉｎ遠心分離して上澄み液を得て、濃アンモニア水／アルコールを完全に抜き出して白色のゲル状固体が得られた。固体を２００μｌの１Ｍ  ＴＢＡＦ  ＴＨＦ溶液に溶解させて、室温で２０時間振動させた。その後、０.５ｍｌの１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ  ７.４）を添加して、室温で１５分振動させ、遠心乾燥機に加えて体積が元の１／２になるように乾燥させてＴＨＦを除去した。得られた溶液を０.５ｍｌクロロホルムで２回抽出して、１ｍｌ  ０.１Ｍ  ＴＥＡＡローディングバッファーを添加し、混合溶液を固相抽出カラムに入れて、溶液中の過剰の塩を除去した。得られたオリゴデオキシヌクレオチドの濃度をマイクロ紫外分光光度計（ＫＯ５５００）で含有量を測定した。Ｏｌｉｇｏ  ＨＴＣＳ  ＬＣ−ＭＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｔｉａ）システムで、質量分析検測を完成した。一級走査後Ｐｒｏｍａｓｓソフトウェアで核酸分子量を正規化して算出した。
【００８２】
本発明において、デオキシリボヌクレオチドまたは２’−メトキシまたは２’−フルオロまたはＬＮＡまたは２’−ＭＯＥ修飾オリゴヌクレオチドのみは理論収量１ｕｍｏｌ合成仕様で完成した。１ｕｍｏｌ仕様の汎用固相サポートＣＰＧまたは３’−コレステロール修飾ＣＰＧ（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓから購入した）、ＤＮＡモノマー、２’−メトキシモノマー、２’−フルオロモノマー（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから購入した）を量って、無水アセトニトリル溶液にその濃度が０.２Ｍとなるように溶解させた。リン酸骨格のチオ修飾されたオリゴデオキシヌクレオチドに対して、０.２Ｍ  ＰＡＤＳ溶液をチオール試薬とした。５−（エチルチオ）−１Ｈ−テトラゾール（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓから購入した）アセトニトリル溶液を活性剤（０.２５Ｍ）として配置し、０.０２Ｍヨードのピリジン／水溶液を酸化剤として、及び３％トリクロロ酢酸ジクロロメタン溶液を脱保護試薬として配置し、ＡＢＩ  ３９４型ＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機の対応する試薬指定位置に置いた。合成プログラムを設定して指定のオリゴデオキシヌクレオチド塩基配列を入力した。誤りがないとチェックした後、オリゴデオキシヌクレオチドの合成の循環を開始した。各ステップのカップリング時間は６分であり、ガラクトースリガンドの対応するモノマーのカップリング時間は６〜１０分である。自動で循環した後、オリゴヌクレオチド固相の合成を完成した。乾燥窒素でＣＰＧをブロー乾燥し、５ｍｌ  ＥＰ管に移し、アンモニア水溶液２ｍｌを添加して、５５℃で１６〜１８時間加熱した。１００００ｒｐｍの回転速度で１０ｍｉｎ遠心分離して上澄み液を得て、濃アンモニア水／アルコールを完全に抜き出して白色または黄色のゲル状固体が得られた。１ｍｌ  ０.１Ｍ  ＴＥＡＡローディングバッファーを添加し、混合溶液を固相抽出カラムに入れて、溶液中の過剰の塩を除去した。得られたオリゴデオキシヌクレオチドの濃度をマイクロ紫外分光光度計（ＫＯ５５００）で含有量を測定した。Ｏｌｉｇｏ  ＨＴＣＳ  ＬＣ−ＭＳ  ｓｙｓｔｅｍ（Ｎｏｖａｔｉａ）システムで、質量分析検測を完成した。一級走査後Ｐｒｏｍａｓｓソフトウェアで核酸分子量を正規化して算出した。
【００８３】
ＰＣＳＫ９−ｓｉＲＮＡの異なる細胞へのトランスフェクション
全ての細胞は、ＡＴＣＣから由来したが、公衆が入手可能な他の供給源から由来してもよい。他の試薬も購入可能である。
【００８４】
【表２】
2021503917.tif 000010
【００８５】
細胞は、１０％ウシ胎児血清を含むＤＭＥＭ培地中で、５％  ＣＯ２、３７℃の恒温培養器で培養した。細胞が対数増殖期であり状態が良好である時（７０％コンフルエンシー）、トランスフェクション試薬でトランスフェクションを行った。細胞濃度を１×１０６／ｍＬに調節し、６ウェルプレートの各孔にｍＬ細胞溶液及び５μＬのｒｉｂｏＦｅｃｔトランスフェクション試薬を添加した。室温で５ｍｉｎ放置してから５μＬの１００ｎＭ  ｓｉＲＮＡを添加して、３７℃、５％ＣＯ２で４８ｈインキュベートした。
【００８６】
細胞プレーティングごとに、試験グループに加え、ＮＣが陰性である対照グループ（非関連ｓｉＲＮＡ）、Ｍｏｃｋがトランスフェクション試薬である対照グループ、未処理対照グループ（ＵＴグループ、ｓｉＲＮＡを添加していない）等の対照グループも設置した。試験グループと対照グループはいずれも３回繰り返した。
【００８７】
標的ｍＲＮＡレベルのリアルタイム定量ＰＣＲ分析
１、トランスフェクションした４８ｈ後、細胞を溶解させ、Ｔｒｉｚｏｌ法で細胞全ＲＮＡを抽出した。
【００８８】
２、Ｒｅｖｅｒｓｅ  Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｍｉｘ逆転写キットは逆転写に用いられる（クワンチョウ  リボバイオ  カンパニーリミテッド）。
【００８９】
３、蛍光定量ＰＣＲ：
β−ａｃｔｉｎ遺伝子を内部参照遺伝子とし、Ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲキットＳＹＢＲ  Ｐｒｅｍｉｘ（２×）でリアルタイムに蛍光定量ＰＣＲ反応を行った。美国Ｂｉｏ−Ｒａｄ社のＣＦＸ９６蛍光定量ＰＣＲ機でＰＣＲ反応を行った。使用されたプライマーは以下である。
【００９０】
【表３】
2021503917.tif 000011
【００９１】
４、データ分析
ＰＣＲ反応終了後、一つのサンプルの九つのレピティション（サンプルあたり三つのトランスフェクションレピティション、三つのｑＰＣＲレピティション）のＣｔ誤差は±０.５であった。ＣＦＸ  ２.１で相対定量分析を行った。表４はＮＣグループに対する標的遺伝子の発現レベル平均値（ＮＣグループのｍＲＮＡ相対発現レベルは１である）である。好ましいｓｉＲＮＡのリアルタイムの定量ＰＣＲ検出結果は以下である。
【００９２】
【表４】
2021503917.tif 000012
【００９３】
ＨｅｐＧ２、ＨｅＬａで行われたＰＣＳＫ９  ｓｉＲＮＡスクリーニングでは、ＨｅＬａ及びＨｅＰＧ２細胞で活性の高いｓｉＲＮＡ分子、即ちＲＢＰ９−００５を見出した。
【００９４】
実施例２  ＰＣＳＫ９−ｓｉＲＮＡ最適化
【００９５】
ＲＢＰ９−００５に対して、異なる修飾最適化を行い、その合成、トランスフェクション、定量ＰＣＲ検出ステップは実施例１と同様である。トランスフェクション細胞はＨｅＬａ及びＨｅＰＧ２細胞であり、その結果を表５に示す（ＲＥＬ−Ｈ：ＨｅＬａ細胞中のＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ相対発現レベル；ＲＥＬ−２：ＨｅＰＧ２細胞中のＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ相対発現レベル）。表５は、ＮＣグループに対する標的遺伝子の発現レベルの平均値である（ＮＣグループのｍＲＮＡ相対発現レベルは１である）。ここで、ＮＣはｓｉＲＮＡ非関連陰性対照グループであり、Ｍｏｃｋはトランスフェクション試薬対照グループであり、ＵＴは未処理細胞対照グループである。
【００９６】
【表５−１】
2021503917.tif 000013
【００９７】
【表５−２】
2021503917.tif 000014
【００９８】
結果から、化学修飾されたＲＢＰ９−００５−Ｐ２Ｇ６、ＲＢＰ９−００５−Ｐ３Ｇ６はＨｅＬａ及びＨｅＰＧ２細胞で阻害活性が高いことが分かる。
【００９９】
実施例３  ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡ細胞ターゲティング性の検出
【０１００】
一、リガンド修飾されたｓｉＲＮＡの調製
【０１０１】
１、ガラクトース修飾モノマーＬの合成
【化５】
2021503917.tif 000015
【０１０２】
（１）化合物１の合成
１Ｌの丸底フラスコに、δ−バレロラクトン（１００ｇ、１ｍｏｌ）、水酸化ナトリウム（４０ｇ、１ｍｏｌ）及び脱イオン水４００ｍＬを混合し、７０℃で６時間反応させ、ＴＣＬで反応が終了するまでモニタリングした。反応液を回転して乾燥させ、２００ｍｌのトルエンを添加して回転して乾燥させて、白色の固体１４０ｇを得た。
【０１０３】
（２）化合物２の合成
１Ｌの丸底フラスコに、化合物１（１４０ｇ、１ｍｏｌ）、無水アセトン５００ｍＬ、臭化ベンジル（２０５.２ｇ、１.２ｍｏｌ）、及び触媒としての臭化テトラブチルアンモニウム（１６.２ｇ、０.０５ｍｏｌ）を加えて、加熱して還流させる。ＴＬＣで反応をモニタリングし、２４ｈ後に完全に反応した。反応液を室温まで冷却した後、アセトンを減圧除去した。残留物を５００ｍＬの酢酸エチルに溶解させ、順に飽和重硫酸ナトリウム２００ｍＬ、飽和重炭酸ナトリウム２００ｍＬ、飽和食塩水２００ｍＬで洗浄した。有機相は無水硫酸ナトリウムによって乾燥、濃縮され、シリカゲルカラム（石油エーテル：酢酸エチルＶ：Ｖ＝１：１）よって分離されて透明オイル状の液体１７５ｇを得て、収率は８４％であった。
【０１０４】
（３）化合物３の合成
１Ｌの丸底フラスコに、Ｄ−ガラクトース塩酸塩（１００ｇ、０.４６ｍｏｌ）と無水ピリジン４５０ｍＬを加えて、氷浴で無水酢酸３２５ｍＬ、トリエチルアミン（６４.５ｍＬ、０.４６ｍｏｌ）、及びＤＭＡＰ（２ｇ、０.０１６ｍｏｌ）を徐々に添加した。常温で一夜反応させて、大量の固体が析出した。吸引ろ過し、ろ過ケークを０.５Ｎ  ＨＣｌ溶液２００ｍＬで洗い流し、白色の固体１６２.５ｇを得、収率は９０％であった。１Ｈ
ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７.８８（ｄ,Ｊ＝９.２Ｈｚ,１Ｈ）,５.６３（ｄ,Ｊ＝８.８Ｈｚ,１Ｈ）,５.２６（ｄ,Ｊ＝３.１Ｈｚ、１Ｈ）,５.０５（ｄ,Ｊ＝１１.３,３.３Ｈｚ,１Ｈ）,４.３６（ｍ,４Ｈ）,２.１１（ｓ,３Ｈ）,２.０３（ｓ,３Ｈ）,１.９８（ｓ,３Ｈ）,１.９０（ｓ,３Ｈ）,１.７８（ｓ,３Ｈ）。
【０１０５】
（４）化合物４の合成.
２５０ｍＬの丸底フラスコに、化合物３（１０ｇ、２５.７ｍｍｏｌ）と無水ジクロロメタン１００ｍＬを加えた。１０分攪拌してから、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（７ｍＬ、３８.７ｍｍｏｌ）を添加した。その後、室温で一夜反応させ、反応液を重炭酸ナトリウム（７ｇ、７９.５ｍｍｏｌ）の水溶液（２００ｍＬ）中に徐々に注いで０.５時間攪拌した。有機相が分離され、無水硫酸ナトリウムで乾燥された。減圧濃縮して、淡黄色コロイド７.７８ｇを得て、収率は９２％であった。
【０１０６】
（５）化合物５の合成
１００ｍＬの丸底フラスコに、化合物４（５ｇ、１５.２ｍｍｏｌ）と化合物２（３.８ｇ、１８.２５ｍｍｏｌ）を無水１，２−ジクロロエタン５０ｍＬに溶解させ、１０分攪拌した後、トリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０.５５ｍＬ、３ｍｍｏｌ）を添加した。常温で一夜反応させた。反応液をジクロロメタンで抽出した。取得した有機相を飽和重炭酸ナトリウム５０ｍＬで二回洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、減圧濃縮し、シリカゲルカラム（石油エーテル：酢酸エチルＶ：Ｖ＝３：２）で分離して透明オイル状の液体６.９４ｇを得て、収率は８５％であった。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７.６９（ｄ,Ｊ＝９.３Ｈｚ,１Ｈ）,７.３３−７.１６（ｍ,５Ｈ）,５.２８（ｄ,Ｊ＝５.３Ｈｚ,１Ｈ）,４.９５（ｓ,２Ｈ）,４.９３（ｑ,Ｊ＝４.２Ｈｚ,１Ｈ）,４.４０（ｄ,Ｊ＝８.６Ｈｚ,１Ｈ）,４.００−３.８６（ｍ,３Ｈ）,３.７３−３.５６（ｍ,２Ｈ）,３.３６−３.２１（ｍ,１Ｈ）,２.５３（ｔ,Ｊ＝８.２Ｈｚ,２Ｈ）,２.１１（ｓ,３Ｈ）,１.８９（ｓ,３Ｈ）,１.８３（ｓ,３Ｈ）,１.６５（ｓ,３Ｈ）,１.５９−１.３６（ｍ,４Ｈ）.ＭＳ（ＥＳＩ）,ｍ／ｚ：５６０.２（［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０１０７】
（６）化合物６の合成
５０ｍＬの丸底フラスコに、化合物５（３.３ｇ、６.１ｍｍｍｏｌ）、Ｐｄ／Ｃ（０.３３ｇ、１０％）を５ｍＬメタノールと２０ｍＬ酢酸エチルに溶解させ、その後、水素バルーンに接続して常温で一夜反応させた。反応液を珪藻土でろ過してから、珪藻土をメタノールで洗い流した。ろ過液を減圧濃縮して回転乾燥させて、白色の固体２.８ｇを得て、収率は９５.５％であった。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１１.９８（ｓ,１Ｈ）,７.７９（ｄ,Ｊ＝８.９Ｈｚ,１Ｈ）,５.２０（ｓ,１Ｈ）,５.０−４.９５（ｑ,Ｊ＝４.２Ｈｚ,１Ｈ）,４.５１−４.４６（ｄ,Ｊ＝７.２Ｈｚ,１Ｈ）,４.１５−３.９７（ｍ,３Ｈ）,３.８９−３.７９（ｍ,１Ｈ）,３.８０−３.６９（ｍ,１Ｈ）,３.４６−３.３６（ｍ,１Ｈ）,２.２２−２.１４（ｔ,Ｊ＝７.２Ｈｚ,２Ｈ）,２.１５（ｓ,３Ｈ）,２.００（ｓ,３Ｈ）,１.９５（ｓ,３Ｈ）,１.８７（ｓ,３Ｈ）,１.５９−１.４２（ｍ,４Ｈ）.ＭＳ（ＥＳＩ）,ｍ／ｚ：４７０.５（［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０１０８】
（７）化合物７の合成
セリノールを原料として、Ｃｈｏｉ  Ｊ  Ｙ等の文献を参照して合成した。白色の固体を得て、収率は８９％であった。ＭＳ（ＥＳＩ）,ｍ／ｚ：２４８.２（［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０１０９】
（８）化合物８の合成
化合物２を原料として、ＵＳ  ２０１１／００７７３８９Ａ１文献を参照して合成した。白色の固体を得て、収率は５６％であった。１Ｈ
ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７.４１−７.３７（ｄ,Ｊ＝７.２Ｈｚ,２Ｈ）,７.３３−７.２８（ｔ,Ｊ＝６.９Ｈｚ,２Ｈ）,７.２７−７.１９（ｍ,５Ｈ）,６.９１−６.８６（ｄ,Ｊ＝８.２Ｈｚ,４Ｈ）,５.１６（ｓ,２Ｈ）,４.６３−４.５８（ｍ,１Ｈ）,４.０５−３.９７（ｍ,１Ｈ）,３.７４（ｓ,６Ｈ）,３.０４−２.９９（ｍ,２Ｈ）,２.９５−２.９０（ｍ,２Ｈ）.ＭＳ（ＥＳＩ）,ｍ／ｚ：４１６.３（［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０１１０】
（９）化合物９の合成
２５０ｍＬの丸底フラスコに、化合物６（１０ｇ、２２.３５ｍｍｏｌ）、１−エチル−（３−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ.ＨＣＬ）（５.１４ｇ、２６.８２ｍｍｏｌ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（２.８３ｇ、２４.５９ｍｍｏｌ）、及びジクロロメタン１００ｍＬを加えた。常温で０.５ｈ攪拌反応させた後、化合物８（８.７９ｇ、２２.３５ｍｍｏｌ）を添加した。ＴＬＣで反応をモニタリングし、４ｈ後に完全に反応した。反応液を順に飽和重炭酸ナトリウム５０ｍＬと飽和食塩水５０ｍＬで洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させた後、濃縮し、シリカゲルカラム（ジクロロメタン：メタノールＶ：Ｖ＝２０：１）で分離して白色の固体１５.８ｇを得て、収率は８６％であった。ＭＳ（ＥＳＩ）,ｍ／ｚ：８４５.２（［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０１１１】
（１０）化合物Ｌモノマーの合成
２５０ｍＬの２口瓶に、化合物１（５ｇ、６.０８ｍｍｏｌ）、窒素保護、無水アセトニトリル１００ｍｌ、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィン（３．６６ｇ、１２．１６ｍｍｏｌ）を添加して、攪拌しながらエチルチオテトラゾールのアセトニトリル溶液（２.５Ｍ）（１.２２ｍｌ,３.０４ｍｍｏｌ）を徐々に滴下した。０.５ｈ反応させた。ＴＬＣで反応をモニタリングし、０.５ｈ後に完全に反応された。減圧濃縮してアセトニトリルを除去した。ジクロロメタン１００ｍＬを添加して、濃縮物を溶解させ、続いて、飽和食塩水１００ｍＬで洗浄した。有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥、濃縮し、シリカゲルカラム（石油エーテル：酢酸エチルＶ：Ｖ＝１：３）で分離して白色の固体５.１６ｇを得て、収率は８３％であった。<１>Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７.８４−７.７９（ｄ,Ｊ＝８.９Ｈｚ,１Ｈ）,７.６５−７.６０（ｄ,Ｊ＝８.９Ｈｚ,１Ｈ）,７.４１−７.３７（ｄ,Ｊ＝７.２Ｈｚ,２Ｈ）,７.３３−７.２８（ｔ, Ｊ＝６.９Ｈｚ,２Ｈ）,７.２７−７.１９（ｍ,５Ｈ）,６.９１−６.８６（ｄ,Ｊ＝８.２Ｈｚ,４Ｈ）,５.２０（ｓ,１Ｈ）,５.０−４.９５（ｑ,Ｊ＝４.２Ｈｚ,１Ｈ）,４.５１−４.４６（ｄ,Ｊ＝７.２Ｈｚ,１Ｈ）,４.１５−３.９７（ｍ,３Ｈ）,４.０５−３.９６（ｍ,１Ｈ）,３.８４−３.８０（ｍ,２Ｈ）,３.８９−３.７９（ｍ,１Ｈ）,３.７４（ｓ,６Ｈ）,３.７１−３.６９（ｍ,１Ｈ）,３.４６−３.３６（ｍ,１Ｈ），３.０４−２.９９（ｍ,２Ｈ）,２.９５−２.９０（ｍ,２Ｈ），２.８８−２.８４（ｍ,２Ｈ）,２.５９−２.５４（ｍ,２Ｈ）,２.２２−２.１４（ｔ,Ｊ＝７.２Ｈｚ，２Ｈ），２.１５（ｓ,３Ｈ），２.００（ｓ,３Ｈ），１.９５（ｓ,３Ｈ），１.８７（ｓ,３Ｈ），１.７７（ｓ,１２Ｈ），１.５９−１.４２（ｍ,４Ｈ）.ＭＳ（ＥＳＩ）,ｍ／ｚ：１０４５.５（［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０１１２】
２、ガラクトースＳモノマーの合成
【化６】
2021503917.tif 000016
【０１１３】
（１）化合物１０の合成
１００ｍＬの丸底フラスコに、化合物４（５ｇ、１５.２ｍｍｏｌ）と、５０ｍｌの無水ジクロロメタンに溶解された１０−ウンデセノール（３.１ｇ、１８.２４ｍｍｏｌ）を添加した。１０分攪拌してからトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（０.５５ｍＬ、３.０ｍｍｏｌ）を添加した。常温で一夜反応させた。反応液をジクロロメタンで抽出した。得られた有機相を飽和重炭酸ナトリウム５０ｍＬで２回洗浄した後、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮し、シリカゲルカラム（石油エーテル：酢酸エチルＶ：Ｖ＝３：２）で分離して白色の固体６.５９ｇを得て、収率は８７％であった。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７.８２（ｄ,Ｊ＝３.３Ｈｚ,１Ｈ）,５.８６−５.７３（ｍ,１Ｈ）,５.２２（ｓ,１Ｈ）,５.０２−４.９（ｍ,３Ｈ）,４.５−４.９８（ｓ,Ｊ＝３.５Ｈｚ,１Ｈ）,４.０８−３.９９（ｍ,３Ｈ）,３.９−３.８８（ｍ,１Ｈ）,３.７３−３.６５（ｍ,１Ｈ）,３.４８−３.３８（ｍ,１Ｈ）,２.１２（ｓ,３Ｈ）,２.０５−２.０１（ｍ,２Ｈ）,２.００（ｓ,３Ｈ）,１.８８（ｓ,３Ｈ）,１.６６（ｓ,３Ｈ）,１.５−１.４（ｍ,２Ｈ）,１.３９−１.３（ｍ,２Ｈ）,１.２９−１.１９（ｍ,１０Ｈ）.ＭＳ（ＥＳＩ）,ｍ／ｚ：５２２.４（［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０１１４】
（２）化合物１１の合成
１００ｍＬの丸底フラスコに、化合物１０（４ｇ、８.０２ｍｍｏｌ）、ジクロロメタン５０ｍｌ、アセトニトリル５０ｍｌ、及び脱イオン水７０ｍＬを加えた。ＮａＩＯ４（６.８６ｇ、３２.１ｍｍｏｌ）を複数回に分けて添加した。常温で４８ｈ反応させた。ＴＣＬで反応が終了するまでモニタリングした。反応液に脱イオン水１００ｍＬを添加し、た後、ジクロロメタンで３回抽出した（５０ｍＬ×３）。有機相を合わせて、無水硫酸ナトリウムで乾燥、減圧濃縮して、淡褐色ゲル状産物４.１ｇを得て、収率は９９％であった。１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：１１.９９（ｓ,１Ｈ）,７.８２（ｄ,Ｊ＝３.３Ｈｚ,１Ｈ）,５.２２（ｓ,１Ｈ）,５.０２−４.９（ｍ,１Ｈ）,４.５−４.９８（ｓ,Ｊ＝３.５Ｈｚ,１Ｈ）,４.０８−３.９９（ｍ,３Ｈ）,３.９−３.８８（ｍ,１Ｈ）,３.７３−３.６５（ｍ,１Ｈ）,３.４８−３.３８（ｍ,１Ｈ）,２.１２（ｓ,３Ｈ）,２.０５−２.０１（ｍ,２Ｈ）,２.００（ｓ,３Ｈ）,１.８８（ｓ,３Ｈ）,１.６６（ｓ,３Ｈ）,１.５−１.４（ｍ,２Ｈ）,１.３９−１.３（ｍ,２Ｈ）,１.２９−１.１９（ｍ,１０Ｈ）.ＭＳ（ＥＳＩ）,ｍ／ｚ：５４０.２６（［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０１１５】
（３）化合物１２の合成
化合物１の合成を参照して、白色の固体を得て、収率は８５.６％であった。ＭＳ（ＥＳＩ）,ｍ／ｚ：９１５.５（［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０１１６】
（４）化合物Ｓの合成
化合物Ｌの合成を参照して、白色の固体を得て、収率は８２.１％であった。
１Ｈ ＮＭＲ（４００ＭＨｚ,ＤＭＳＯ−ｄ６）δ：７.８２−７.７８（ｄ,Ｊ＝７.３Ｈｚ,１Ｈ）,７.６９−７.６３（ｄ,Ｊ＝７.３Ｈｚ,１Ｈ）,７.４１−７.３７（ｄ,Ｊ＝７.２Ｈｚ,２Ｈ）,７.３３−７.２８（ｔ,Ｊ＝６.９Ｈｚ,２Ｈ）,７.２７−７.１９（ｍ,５Ｈ）,６.９１−６.８６（ｄ,Ｊ＝８.２Ｈｚ,４Ｈ）,５.２２（ｓ,１Ｈ）,５.０２−４.９（ｍ,１Ｈ）,４.５−４.９８（ｓ,Ｊ＝３.５Ｈｚ,１Ｈ）,４.０８−３.９９（ｍ,３Ｈ）,４.０５−３.９７（ｍ,１Ｈ）,３.９−３.８８（ｍ,１Ｈ）,３.８４−３.８０（ｍ,２Ｈ）,３.７４（ｓ,６Ｈ）,３.７３−３.６５（ｍ,１Ｈ）,３.４８−３.３８（ｍ,１Ｈ）,３.０４−２.９９（ｍ,２Ｈ）,２.９５−２.９０（ｍ,２Ｈ），２.８８−２.８４（ｍ,２Ｈ）,２.６１−２.５５（ｍ,２Ｈ）,２.１２（ｓ,３Ｈ）,２.０５−２.０１（ｍ,２Ｈ）,２.００（ｓ,３Ｈ）,１.８８（ｓ,３Ｈ）,１.７７（ｓ,１２Ｈ），１.６６（ｓ,３Ｈ）,１.５−１.４（ｍ,２Ｈ）,１.３９−１.３（ｍ,２Ｈ）,１.２９−１.１９（ｍ,１０Ｈ）.ＭＳ（ＥＳＩ）,ｍ／ｚ：１１１５.２（［Ｍ＋Ｎａ］＋）。
【０１１７】
３、ＧａｌＮａｃ−ｓｉＲＮＡの合成
実施例１を参照する。
【０１１８】
二、マウス初代肝細胞の単離
マウスを麻酔し、皮膚と及び筋肉層を開いて肝臓を露出させた。灌流カテーテルを門脈に挿入し、下腔の静脈に小さい開口を切り取って、肝臓への灌流を用意した。４０℃で灌流溶液Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉ（Ｈａｎｋ’ｓ，０.５ｍＭ  ＥＧＴＡ，ｐＨ  ８）と灌流溶液Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩ（低グルコースＤＭＥＭ，１００Ｕ／ｍＬ  Ｔｙｐｅ  ＩＶ，ｐＨ  ７.４）を予熱した。３７℃の灌流溶液Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  Ｉを門脈カニューレに沿って、流速７ｍＬ／ｍｉｎで、肝臓が灰白色になるまで肝臓を５ｍｉｎ灌流した。続いて、３７℃の灌流溶液Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩで、流速７ｍＬ／ｍｉｎで肝臓を７ｍｉｎ灌流した。灌流が完了した後、肝臓を取り外しＳｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＩＩ（１０％ＦＢＳの低グルコースＤＭＥＭ，４℃）に置いて消化を終了させた。ピンセットで肝包膜を切って、軽く振って肝臓細胞を放出した。７０ｕｍ細胞フィルターで肝細胞をろ過し、５０ｇで２ｍｉｎ遠心分離して上澄み液を廃棄した。Ｓｏｌｕｔｉｏｎ  ＩＶ（４０％ｐｅｒｃｏｌｌ低グルコースＤＭＥＭ，４℃）で細胞を再懸濁し、その後、１００ｇで２ｍｉｎ遠心分離して上澄み液を廃棄した。２％ＦＢＳの低グルコースＤＭＥＭを添加して細胞を再懸濁して用意した。トリパンブルー染色で細胞の活力を検定した。
【０１１９】
三、ＧａｌＮＡｃ結合曲線及びＫｄ値の測定
新たに単離したマウス初代肝細胞を９６ウェルプレートに、２×１０４個／孔、１００ｕｌ／孔で広げた。各孔にＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡをそれぞれ添加した。ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの各々は、終濃度０.９ｎＭ、８.３ｎＭ、２５ｎＭ、５０ｎＭ、１００ｎＭ、１５０ｎＭをそれぞれ設定した。４℃で２ｈインキュベートした後、５０ｇで２ｍｉｎ遠心分離して上澄み液を廃棄した。１０ｕｇ／ｍｌ  ＰＩで細胞を再懸濁して、１０ｍｉｎ染色した後、５０ｇで２ｍｉｎ遠心分離した。予冷のＰＢＳで細胞を洗浄し、５０ｇで２ｍｉｎ遠心分離して上澄み液を廃棄した。ＰＢＳで細胞を再懸濁した。フローサイトメーターで生細胞平均蛍光強度ＭＦＩを測定し、ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ５ソフトウェアで非線形フィッティング及びＫｄ値の算出を行った。表６Ａ〜Ｃ及び図１Ａ〜Ｃのデータによると、リガンド修飾されたＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡはトランスフェクション試薬を添加することなく、体外の肝細胞のエンドサイトーシス／取り込みを促進し、肝細胞の配達を実現することが分かる。同時に、ＧａｌＮａｃ構造が異なるＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡは、細胞エンドサイトーシス及び受容体との結合能に一定の差異があることが示されている。Ｂｍａｘ及びＫｄ値から、３Ｓ、４Ｓと３Ｌ、４Ｓ構造のＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡが肝細胞との親和性に優れていると判る。
【０１２０】
【表６Ａ】
2021503917.tif 000017
【０１２１】
【表６Ｂ】
2021503917.tif 000018
【０１２２】
【表６Ｃ】
2021503917.tif 000019
【０１２３】
【表７】
2021503917.tif 000020
【０１２４】
注：Ｐ２Ｇ６−１０の折れ線後の１は、蛍光標識修飾されたことを表し、折れ線後の０は、標的リガンド修飾が行われていないことを表す。Ｐ２Ｇ６−１３Ｌの折れ線後の１は蛍光標識修飾されたことを表し、折れ線後の３Ｌは標的リガンド修飾が三つのＬ（ＬＬＬ）であることを表し、その他も類似する。
【０１２５】
実施例４  ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの体外有効性試験
【０１２６】
実施例１のステップを参照して、ＨｅＰＧ２細胞中のｍＲＮＡ発現レベルを測定した。ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡトランスフェクション終濃度は５０ｎＭである。表８にその結果を示す。
【０１２７】
【表８】
2021503917.tif 000021
【０１２８】
【表９】
2021503917.tif 000022
【０１２９】
注：Ｐ２Ｇ６−０３Ｌの折れ線後の０は、蛍光標識修飾されていないことを表し、折れ線後の３Ｌは、標的リガンド修飾が三つのＬ（ＬＬＬ）であることを表し、その他も類似する。
【０１３０】
実施例５  体内肝臓のターゲティング性試験
【０１３１】
本試験は、雄性の、６〜７週齢のＳＰＦ級Ｂａｌｂ／ｃ−ｎｕマウス２４匹（北京維通利華実験動物有限会社から購入した）を用いて行った。マウスをランダムにブランク対照グループ、Ｐ２Ｇ６−１０グループ、Ｐ３Ｇ６−１０グループ、Ｐ２Ｇ６−１３Ｌグループ、Ｐ２Ｇ６−１３Ｓグループ、Ｐ３Ｇ６−１３Ｌグループ、Ｐ３Ｇ６−１３Ｓグループの７グループに分けた。各グループの動物数はそれぞれ、２、３、３、４、４、４、４匹であった。マウスに尾静脈注射投与を行い、投与量は約１０ｍｇ／ｋｇである（実験設計は表１０に示される）。投与前、投与後の１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、６ｈに、すべての動物に対して白光及びＸ線のイメージングを含む生体イメージングを行った。投与してから６時間後に安楽死した後、脳、唾液腺、心臓、脾臓、肺臓、肝臓、腎臓、腸管を取り出してエクスビボ臓器イメージング（図２と図３）の分析を行った。
【０１３２】
【表１０】
2021503917.tif 000023
【０１３３】
エクスビボイメージング分析を行って、表１１〜表１２にその結果を示した。その結果によると、投与してから６時間後に、Ｐ２Ｇ６−１３Ｌ、Ｐ２Ｇ６−１３Ｓ、Ｐ３Ｇ６−１３Ｌ、Ｐ３Ｇ６−１３Ｓグループの肝臓の蛍光強度が陰性対照グループ（ＮＣ）に比べ有意に向上され（表１２の蛍光強度比の結果を参照）、これは、Ｐ２Ｇ６−１３Ｌ、Ｐ２Ｇ６−１３Ｓ、Ｐ３Ｇ６−１３Ｌ、Ｐ３Ｇ６−１３Ｓがいずれも肝臓に対してより有意に高いターゲティング性を有することを示す。
【０１３４】
【表１１】
2021503917.tif 000024
【０１３５】
【表１２】
2021503917.tif 000025
【０１３６】
実施例６、ＧａｌＮＡｃ−ｓｉＲＮＡの体内有効性検出
【０１３７】
試験は、ＳＰＦ級の雄性の６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウス（北京維通利華実験動物有限会社）を用いて行われ、ランダムにグループに分けた。Ｃ５７／Ｂｌ６マウス尾静脈投与し、３日目と７日目にそれぞれマウスの肝臓を取って、肝臓を−８０℃で凍結保存し、肝臓組織のＰＣＳＫ９ｍＲＮＡレベルを調べた。それぞれ、３日目、７日目、１４日目、２１日目、３０日目にマウスの血液を採って（眼球後部から放血して０.２５ｍｌ血液を採集し、採集してから１ｈ内に検査を行う）、血液中のＬＤＬ−ｃ、Ｔｃ、ＴＧレベルを検査した。実験中に、すべての動物には死亡または瀕死症状がなかった。臨床的に観察したところ、いずれの動物にも有意な異常は見られなかった。
【０１３８】
一、マウス肝臓のＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルの検測
マウス２８匹をランダムに７グループに分け、グループに４匹ずつ、動物のグループ分けと投与状況を表１３に示した。凍結保存されたマウス肝臓組織を自動研磨機で研磨した。Ｔｒｉｚｏｌ法でマウス肝臓組織中の全ＲＮＡを抽出し、Ｋ５５００でＲＮＡ純度及び濃度を測定したところ、後続のｑＰＣＲ実験要求を満たした。ｑＲＴ−ＰＣＲ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ（クワンチョウ  リボバイオ  カンパニーリミテッド）でＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルを検測した。ｑＰＣＲ実験において、サンプルごとに三つの複素孔を設置し、１８ｓ  ＲＮＡを内部参照とし、２−ΔΔＣｔ法でサンプル中のＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡ相対発現量を算出した。溶媒グループは対照グループである。Ｅｘｃｅｌソフトウェアでグループ間のＰＣＳＫ９遺伝子ｍＲＮＡ相対発現量の差異を分析した。
【０１３９】
【表１３】
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【０１４０】
結果（表１４）によると、３日乃至７日間投与した後、溶媒対照グループに比べ、投与グループＣと投与グループＤにおいて、マウス肝臓組織中のＰＣＳＫ９ｍＲＮＡ発現レベルは低減され、且つ一定の投与量依存性があることが分かる。これは、目標薬物Ｃ及びＤが有効且つ安定的であり、マウス肝臓組織中のＰＣＳＫ９遺伝子のｍＲＮＡの発現レベルを低減できることを示す。
【０１４１】
【表１４】
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【０１４２】
二、マウス血清生化指標の検出
マウス１１２匹をランダムに７グループに分け、グループに１６匹の動物ずつ、動物のグループ分けと投与状況を表１３に示した。２００μＬの血液を採って、４０００ｒｐｍ遠心分離して上澄み液をとり、生化学分析装置（邁瑞ＢＳ−４９０生化学分析装置）で血清中の各生化指標のレベルを検出した。
結果を表１５〜１９に示した。
【０１４３】
【表１５】
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【０１４４】
【表１６】
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【０１４５】
【表１７】
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【０１４６】
【表１８】
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【０１４７】
【表１９】
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【０１４８】
結果（表１５〜表１９）によると、３〜３０日投与した後、投与グループＣ及びＤはともに動物体内のＬＤＬ−Ｃ、ＴＣ、ＴＧの発現を低減させ、投与量の増加に伴って、ＬＤＬ−Ｃ、ＴＣ、ＴＧの発現に対する抑制作用も徐々に増加されたことが分かる。一部の用量（例えば、中用量グループと高用量グループ）は血液脂質を低減するより顕著な作用を果たした。よって、目標薬物Ｃ及びＤに代表される本発明のＰＣＳＫ９遺伝子の発現を抑制するｓｉＲＮＡ分子は、血液脂質を著しく低減させる作用を有し、心血管疾患または腫瘍性疾患などのＰＣＳＫ９遺伝子媒介性疾患または症状の治療に有用である。
【０１４９】
本発明の具体的な実施形態を詳細に説明したが、当業者であれば、開示された全ての示唆に基づいて、細部に各種の変形及び変更を行うことができ、これらの変更はいずれも本発明の保護範囲に含まれることは理解される。本発明の保護範囲は添付の特許請求の範囲及びその任意の均等物によって与えられる。
【０１５０】
参照文献
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【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【図３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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