(57)【要約】  本発明は、アルキルカルバモイルナフタレンイルオキシオクテノイルヒドロキシアミド、その誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する線維症の予防または治療用薬学組成物に関するものであって、線維性組織の増殖を効果的に抑制して、線維症の予防及び／または治療に使われる。
2021516683.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
下記化学式１の化合物、その誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む、線維症の予防または治療用の薬学組成物。
【化１】
2021516683.tif 000005
前記式において、
Ｒ１は、ハロフェニル、Ｃ１−３アルコキシ、Ｃ１−３アルコキシＣ１−３アルキル、シクロヘキサンイル、フラニル、チオフェニル、イミダゾール、イミダゾリジニルＣ１−３アルキル、Ｃ１−３アルキルアミノ、ジＣ１−３アルキルアミノ、ヒドロキシフェニル、テトラヒドロフラニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、オキソピロリジニル、Ｃ１−３アルコキシフェニル、ジＣ１−３アルキルアミノフェニル、Ｃ１−３アルキルピロリジニル、及びトリフルオロメトキシフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換体で置換または非置換のＣ１−３アルキル、
Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ３−８シクロアルキルＣ１−３アルキル、ベンジル、Ｃ１−３アルキルまたはＣ３−８シクロアルキルカボニルで置換または非置換のピロリジン、またはＣ１−３アルキルまたはＣ３−８シクロアルキルで置換されたピペリジン、フラン、またはＣ３−８シクロアルキルであり、
但し、非置換のＣ１−２アルキル及びＣ１−２アルキルピロリジニルで置換されたＣ１−２アルキルは除く。
【請求項２】
前記化学式１の化合物は、下記化合物からなる群から選択される、請求項１に記載の薬学組成物。
１）
（Ｅ）−Ｎ１−（３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）プロピル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）オクタンジアミド、
２）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（４−ヒドロキシフェネチル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
３）
（Ｅ）−Ｎ１−（３−（ジメチルアミノ）−２，２−ジメチルプロピル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）オクタンジアミド、
４）
（Ｅ）−Ｎ１−（２−（ジイソプロピルアミノ）エチル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）オクタンジアミド、
５）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（１−メトキシプロパン−２−イル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
６）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（４−メトキシベンジル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
７）
（Ｅ）−Ｎ１−（４−フルオロフェネチル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
８）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−Ｎ１−（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル）−２−オクタンジアミド、
９）
（Ｅ）−Ｎ１−（２−シクロヘキセニルエチル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１０）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−Ｎ１−（３−（２−オキソピロリジン−１−イル）プロピル）−２−オクタンジアミド、
１１）
（Ｅ）−Ｎ１−（フラン−２−イルメチル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１２）
（Ｅ）−Ｎ１−（４−（ジメチルアミノ）ベンジル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１３）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（２−メトキシエチル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１４）
（Ｅ）−Ｎ１−シクロヘキシル−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１５）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−Ｎ１−（チオフェン−２−イルメチル）−２−オクタンジアミド、
１６）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（４−メトキシフェネチル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１７）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−Ｎ１−（４−（トリフルオロメトキシ）ベンジル）−２−オクタンジアミド、
１８）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−（シクロヘキシルメチル）ピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１９）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−シクロペンチルピペリジン−４−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２０）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−ベンジルピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２１）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（１−イソプロピルピロリジン−３−イル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２２）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−（シクロヘキサンカルボニル）ピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２３）
（Ｅ）−３−（８−（ヒドロキシアミノ）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−８−オキソ−２−オクタンアミド）ピロリジン−１−カルボン酸ｔ−ブチルエステル、
２４）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−Ｎ１−（ピロリジン−３−イル）２−オクタンジアミド、
２５）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−シクロヘキシルピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−２−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２６）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−サイクロプロピルピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２７）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−シクロプロピルピペリジン−４−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２８）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−エチルピペリジン−４−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２９）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−エチルピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
３０）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、及び
３１）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド。
【請求項３】
前記化学式１の化合物は、（Ｅ）−Ｎ１−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）オクト−２−エンジアミドである、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項４】
前記線維症は、腎臓線維症である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項５】
前記線維症は、肺線維症である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項６】
前記肺線維症が、ブレオマイシン、ポリヘキサメチレングアニジン、クロロメチルイソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、及び塩化エトキシエチルグアニジンからなる群から選択される１つ以上に誘導された、請求項５に記載の薬学組成物。
【請求項７】
前記線維症は、肝線維症である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項８】
前記薬学的に許容可能な塩は、リン酸塩、酒石酸塩、ステアリン酸塩、グルコン酸塩、フマル酸塩、ナフトエ酸塩、及び１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸塩からなる群から選択される１つ以上である、請求項１に記載の薬学組成物。
【請求項９】
前記薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料の形態である、請求項１に記載の薬学組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、アルキルカルバモイルナフタレンイルオキシオクテノイルヒドロキシアミド、その誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する線維症の予防または治療用薬学組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
線維症は、線維性結合組織の高度の沈積を意味し、これは、線維性組織の増殖と分解との不均衡によるものである。このような疾病の一般的な特徴は、線維化細胞の過剰増殖で組織及び器官線維症は、よく肺線維症、肝線維症、慢性膵臓炎、皮膚硬化症、腎糸球体線維症、放射線化学療法及び組織移植などによって発生した多発性臓器線維症が含まれる。      
【０００３】
腎臓線維症は、腎臓組織に発生した炎症によって蓄積された傷痕で線維化が発生する疾病であって、腎臓の一部が固まって、その機能が喪失される。これは、慢性腎不全症に繋がり、慢性腎不全症は、貧血、血液凝固障害、高血圧、心肺及び胃腸管の各種の合併症と感染とを伴う。腎臓機能が正常人の１５％以下になれば、エリスロポエチン（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ）の腎臓内生産が低下し、これは、赤血球の生成減少に繋がる。また、尿の分泌が活発に起こらず、発病される尿毒症は、赤血球の寿命を減少させて、強力な貧血を引き起こせる。また、尿毒症発病で全身性感染が引き起こされる確率が増加し、これは、敗血症発病の主要要因になる。
【０００４】
肺線維症は、特発性肺線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ  ｐｕｌｍｏｎａｒｙ  ｆｉｂｒｏｓｉｓ、ＩＰＦ）が代表的に線維化を起こす疾病として知られている。これは、上皮細胞あるいは帯状細胞を持続的に刺激して損傷を加え、損傷部位の治癒過程異常で誘発されると知られているが、その刺激因子に対しては明らかになっていない。但し、肺の炎症が肺線維化を直接に起こすとはいえないが、先に肺の炎症が先行され、引き続き正常組織に治癒される過程で特発性肺線維症患者と正常人との差によって肺線維化が起こると知られている。線維化のさらに他の主要な機転でＴ  ｈｅｌｐｅｒ  ｔｙｐｅ  ２サイトカインによる線維芽細胞の活性化と増殖とを通じて細胞外基質（ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｔｒｉｘ）の沈着及び線維化が誘発される。
【０００５】
肝線維化は、慢性肝内炎症による細胞外基質の過多な沈着と定義され、このような細胞外基質の過多な沈着で慢性肝疾患が持続する場合、結局は肝内構造の変形と肝細胞数の減少とで肝硬変に進行する。肝線維化に関与する代表的な細胞としては、肝星状細胞（ｈｅｐａｔｉｃ  ｓｔｅｌｌａｔｅ  ｃｅｌｌ）、クッパー細胞（Ｋｕｐｆｆｅｒ  ｃｅｌｌ）、内皮細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ  ｃｅｌｌ）などがある。肝星状細胞は、細胞外基質を生産する主生産源として活性化され、膠原質を含んだ各種の細胞外基質の生成増加に関与する。クッパー細胞は、肝内洞様血管腔（ｓｉｎｕｓｏｉｄａｌ  ｓｐａｃｅ）内に存在し、活性化されたクッパー細胞から生成された物質は、周囲肝細胞、内皮細胞、そして、肝星状細胞に影響を与えて、肝線維化を促進させる。内皮細胞は、肝内血流調節に重要な役割を行う以外にも、炎症や肝線維化などによって肝星状細胞の増殖に関与する成長因子と細胞外基質の生成にも関与する。肝線維化に影響を及ぼすサイトカインとしては、トランスフォーミング増殖因子−β（ｔｒａｎｓｆｏｒｍｉｎｇ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ−β、ＴＧＦ−β）、血小板由来増殖因子（ｐｌａｔｅｌｅｔ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｇｒｏｗｔｈ  ｆａｃｔｏｒ、ＰＤＧＦ）などがある。ＴＧＦ−βは、肝星状細胞の最も強力な線維化促進サイトカインであり、肝星状細胞自体がＴＧＦ−βの主生産源である。ＰＤＧＦは、肝星状細胞の最も強力な分裂と増殖促進サイトカインである。過去長期間、肝線維化過程は、非可逆的現象として認識されたが、最近、可逆的に変化しうるという事実が報告されて、躍動的変化が可能であり、このような変化を正確に測定することが臨床的に非常に重要になった。
【０００６】
本発明者らは、特定化学式のアルキルカルバモイルナフタレンイルオキシオクテノイルヒドロキシアミド、その誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩が線維症を抑制し、改善する効果を確認して、本発明を完成した。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、アルキルカルバモイルナフタレンイルオキシオクテノイルヒドロキシアミド、その誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含有する線維症の予防または治療用薬学組成物を提供するところにある。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
前記課題を解決するために、本発明は、下記化学式１の化合物、その誘導体、またはその薬学的に許容可能な塩を有効成分として含む線維症の予防または治療用薬学組成物を提供する。
【０００９】
【化１】
2021516683.tif 000003
前記式において、Ｒ１は、ハロフェニル、Ｃ１−３アルコキシ、Ｃ１−３アルコキシＣ１−３アルキル、シクロヘキサンイル、フラニル、チオフェニル、イミダゾール、イミダゾリジニルＣ１−３アルキル、Ｃ１−３アルキルアミノ、ジＣ１−３アルキルアミノ、ヒドロキシフェニル、テトラヒドロフラニル、シクロヘキシル、シクロヘキセニル、オキソピロリジニル、Ｃ１−３アルコキシフェニル、ジＣ１−３アルキルアミノフェニル、Ｃ１−３アルキルピロリジニル、及びトリフルオロメトキシフェニルからなる群から選択された１つ以上の置換体で置換または非置換のＣ１−３アルキル、Ｃ３−８シクロアルキル、Ｃ３−８シクロアルキルＣ１−３アルキル、ベンジル、Ｃ１−３アルキルまたはＣ３−８シクロアルキルカボニルで置換または非置換のピロリジン、またはＣ１−３アルキルまたはＣ３−８シクロアルキルで置換されたピペリジン、フラン、またはＣ３−８シクロアルキルであり、但し、非置換のＣ１−２アルキル及びＣ１−２アルキルピロリジニルで置換されたＣ１−２アルキルは除く。
【００１０】
本発明の一様態において、前記化学式１の化合物は、下記化合物からなる群から選択される。
【００１１】
１）
（Ｅ）−Ｎ１−（３−（１Ｈ−イミダゾール−１−イル）プロピル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）オクタンジアミド,
２）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（４−ヒドロキシフェネチル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド,
３）
（Ｅ）−Ｎ１−（３−（ジメチルアミノ）−２，２−ジメチルプロピル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）オクタンジアミド、
４）
（Ｅ）−Ｎ１−（２−（ジイソプロピルアミノ）エチル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）オクタンジアミド、
５）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（１−メトキシプロパン−２−イル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
６）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（４−メトキシベンジル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
７）
（Ｅ）−Ｎ１−（４−フルオロフェネチル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
８）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−Ｎ１−（テトラヒドロフラン−２−イル）メチル）−２−オクタンジアミド、
９）
（Ｅ）−Ｎ１−（２−シクロヘキセニルエチル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１０）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−Ｎ１−（３−（２−オキソピロリジン−１−イル）プロピル）−２−オクタンジアミド、
１１）
（Ｅ）−Ｎ１−（フラン−２−イルメチル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１２）
（Ｅ）−Ｎ１−（４−（ジメチルアミノ）ベンジル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１３）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（２−メトキシエチル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１４）
（Ｅ）−Ｎ１−シクロヘキシル−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１５）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−Ｎ１−（チオフェン−２−イルメチル）−２−オクタンジアミド、
１６）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（４−メトキシフェネチル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１７）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−Ｎ１−（４−（トリフルオロメトキシ）ベンジル）−２−オクタンジアミド、
１８）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−（シクロヘキシルメチル）ピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
１９）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−シクロペンチルピペリジン−４−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２０）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−ベンジルピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２１）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（１−イソプロピルピロリジン−３−イル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２２）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−（シクロヘキサンカルボニル）ピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２３）
（Ｅ）−３−（８−（ヒドロキシアミノ）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−８−オキソ−２−オクタンアミド）ピロリジン−１−カルボン酸ｔ−ブチルエステル、
２４）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−Ｎ１−（ピロリジン−３−イル）２−オクタンジアミド、
２５）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−シクロヘキシルピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−２−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２６）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−サイクロプロピルピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２７）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−シクロプロピルピペリジン−４−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２８）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−エチルピペリジン−４−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
２９）
（Ｅ）−Ｎ１−（１−エチルピロリジン−３−イル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、
３０）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（２−（１−メチルピロリジン−２−イル）エチル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド、及び
３１）
（Ｅ）−Ｎ８−ヒドロキシ−Ｎ１−（１−イソプロピルピペリジン−４−イル）−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）−２−オクタンジアミド。
【００１２】
本発明の一様態において、前記化学式１の化合物は、下記化学式２で表される（Ｅ）−Ｎ１−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）オクト−２−エンジアミド（（Ｅ）−Ｎ１−（３−（ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏ）ｐｒｏｐｙｌ）−Ｎ８−ｈｙｄｒｏｘｙ−２−（（ｎａｐｈｔｈａｌｅｎ−１−ｙｌｏｘｙ）ｍｅｔｈｙｌ）ｏｃｔ−２−ｅｎｅｄｉａｍｉｄｅ）である。
【００１３】
【化２】
2021516683.tif 000004
【００１４】
本発明の一様態において、前記線維症は、腎臓線維症である。
【００１５】
本発明のさらに他の様態において、前記線維症は、肺線維症であり、前記肺線維症は、一般的なブレオマイシン（ｂｌｅｏｍｙｃｉｎ）誘導モデルだけではなく、加湿器殺菌剤成分で誘導されたものである。前記加湿器殺菌剤成分としては、ポリヘキサメチレングアニジン（ｐｏｌｙｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｕａｎｉｄｉｎｅ、ＰＨＭＧ）、クロロメチルイソチアゾリノン（ｃｈｌｏｒｏｍｅｔｈｙｌ  ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｎｅ、ＣＭＩＴ）、メチルイソチアゾリノン（ｍｅｔｈｙｌ  ｉｓｏｔｈｉａｚｏｌｉｎｏｎｅ、ＭＩＴ）、塩化エトキシエチルグアニジン（Ｏｌｉｇｏ（２−（２−ｅｔｈｏｘｙ）ｅｔｈｏｘｙｅｔｈｙｌ  ｇｕａｎｉｄｉｎｉｕｍ  ｃｈｌｏｒｉｄｅ、ＰＧＨ）などを含みうる。
【００１６】
本発明の一様態において、前記肺線維症は、ブレオマイシン、ポリヘキサメチレングアニジン（ＰＨＭＧ）、クロロメチルイソチアゾリノン（ＣＭＩＴ）、メチルイソチアゾリノン（ＭＩＴ）、及び塩化エトキシエチルグアニジン（ＰＧＨ）からなる群から選択される１つ以上を含むもので誘導されたものである。
【００１７】
本発明のさらに他の様態において、前記線維症は、肝線維症である。
【００１８】
本発明の一様態において、前記薬学的に許容可能な塩は、リン酸塩、酒石酸塩、ステアリン酸塩、グルコン酸塩、フマル酸塩、ナフトエ酸塩、及び１−ヒドロキシ−２−ナフトエ酸塩（１−Ｈｙｄｒｏｘｙ−２−ｎａｐｈｔｈｏｉｃ  ａｃｉｄ）からなる群から選択される１つ以上である。
【００１９】
本発明による薬学組成物は、カプセル、錠剤、顆粒、注射剤、軟膏剤、粉末または飲料の形態である。
【００２０】
本発明による薬学組成物は、ヒトを対象とする。
【００２１】
本発明による薬学組成物は、これらに限定されるものではないが、それぞれ通常の方法によって、散剤、顆粒剤、カプセル、錠剤、水性懸濁液などの経口型剤型、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態で剤形化して使われる。本発明の薬学組成物は、薬剤的に許容可能な担体を含みうる。薬剤学的に許容される担体は、経口投与時には、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、賦形剤、可溶化剤、分散剤、安定化剤、懸濁化剤、色素、香料などを使用し、注射剤の場合には、緩衝剤、保存剤、無痛化剤、可溶化剤、等張剤、安定化剤などを混合して使用し、局所投与用の場合には、基剤、賦形剤、潤滑剤、保存剤などを使用することができる。本発明の薬学組成物の剤型は、前述したような薬剤学的に許容される担体と混合して多様に製造可能である。例えば、経口投与時には、錠剤、トローチ、カプセル、エリクサー（ｅｌｉｘｉｒ）、サスペンション、シロップ、ウェーハなどの形態で製造し、注射剤の場合には、単位投薬アンプルまたは多数回投薬形態で製造することができる。その他、溶液、懸濁液、錠剤、カプセル、徐放型製剤などで剤形化することができる。
【００２２】
本発明による薬学組成物の投与経路は、これらに限定されるものではないが、口腔、静脈内、筋肉内、動脈内、骨髄内、硬膜内、心臓内、経皮、皮下、腹腔内、鼻腔内、腸管、局所、舌下または直腸が含まれる。経口または非経口投与が望ましい。本発明に使われた用語「非経口」は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、滑液嚢内、胸骨内、硬膜内、病巣内及び頭蓋骨内注射または注入技術を含む。本発明の薬学組成物は、また直腸投与のための坐剤の形態で投与される。
【００２３】
本発明による薬学組成物は、ラット、マウス、家畜、ヒトなどの哺乳動物に多様な経路で投与される。投与のあらゆる方式は予想されるが、例えば、経口、直腸または静脈、筋肉、皮下、気管支内吸入、子宮内軽膜または脳血管内（ｉｎｔｒａｃｅｒｅｂｒｏｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ）注射によって投与される。
【００２４】
本発明の薬学組成物は、使われた特定化合物の活性、年齢、体重、一般的な健康、性別、定食、投与時間、投与経路、排出率、薬物配合及び予防または治療される特定疾患の重症を含んだ多様な要因によって多様に変わり、前記薬学組成物の投与量は、患者の状態、体重、疾病の程度、投与経路及び期間によって異なるが、当業者によって適切に選択され、１日０．０００１〜５０ｍｇ／ｋｇまたは０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇで投与することができる。投与は、一日一回投与しても、数回分けて投与しても良い。前記投与量は、如何なる面でも本発明の範囲を限定するものではない。本発明による医薬組成物は、丸剤、糖衣錠、カプセル、液状剤、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁剤で剤形化される。
【００２５】
本発明による薬学組成物の有効成分である化学式１の化合物の使用量は、患者の年齢、性別、体重、疾患によって変わりうるが、０．０１〜１００ｍｇ／ｋｇで、望ましくは、０．１〜５０ｍｇ／ｋｇを一日１回ないし数回投与することができる。
【００２６】
また、本発明による化学式１の化合物の投与量は、投与経路、疾病の程度、性別、体重、年齢などによって増減されうる。したがって、前記投与量は、如何なる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００２７】
また、本発明による化学式１の化合物の投与量は、投与経路、疾病の程度、性別、体重、年齢などによって増減されうる。したがって、前記投与量は、如何なる面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【発明の効果】
【００２８】
本発明による薬学組成物は、急性腎不全で誘導された腎臓線維症動物モデルとブレオマイシン、ポリヘキサメチレングアニジン（ＰＨＭＧ）などで誘導された肺線維症動物モデルで細胞の線維化マーカーであるα−平滑筋アクチン（ａｌｐｈａ−ｓｍｏｏｔｈ  ｍｕｓｃｌｅ  ａｃｔｉｎ、α−ＳＭＡ、）の発現を抑制し、組織の抗線維化効果を示すことにより、臓器線維症を効果的に治療または予防することができる。
【図面の簡単な説明】
【００２９】
【図１】急性腎不全で誘導された腎臓線維症動物モデルに３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙの（Ｅ）−Ｎ１−（３−（ジメチルアミノ）プロピル）−Ｎ８−ヒドロキシ−２−（（ナフタレン−１−イルオキシ）メチル）オクト−２−エンジアミド（前記化学式２の化合物であって、以下、「ＣＧ２００７４５」と称する）を摂取したＣＧ２００７４５摂取群及び溶媒対照群の腎臓組織切片と陰性対照群として正常腎臓である動物モデルの左側腎臓組織切片とに、ヘマトキシリン＆エオシン染色を行った組織病理学的分析結果である。
【図２】急性腎不全で誘導された腎臓線維症動物モデルに３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＣＧ２００７４５を摂取したＣＧ２００７４５摂取群または溶媒対照群の腎臓組織と陰性対照群として正常腎臓である動物モデルの左側腎臓組織細胞からそれぞれ分離されたＲＮＡをリアルタイム重合効果連鎖反応を行って、α−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）発現量を比較したグラフである。
【図３】ブレオマイシンで誘導された肺線維症動物モデルで１５，３０，６０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＣＧ２００７４５を投与したＣＧ２００７４５投与群または溶媒対照群の肺組織切片とヘマトキシリン＆エオシン染色を行った組織病理学的分析結果である。
【図４】ブレオマイシンで誘導された肺線維症動物モデルで１５，３０，６０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＣＧ２００７４５を投与したＣＧ２００７４５投与群または溶媒対照群の気管支肺胞洗浄液でＳｉｒｃｏｌ  ａｓｓａｙを行って、コラーゲン（ｃｏｌｌａｇｅｎ）の濃度を比較したグラフである。
【図５】ブレオマイシンで誘導された肺線維症動物モデルで１５，３０，６０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＣＧ２００７４５を投与したＣＧ２００７４５投与群または溶媒対照群の肺組織細胞の線維症標的タンパク質発現量を確認した結果である。
【図６】ＰＨＭＧで誘導された肺線維症動物モデルで１、１５、３０、６０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＣＧ２００７４５を投与したＣＧ２００７４５投与群または溶媒対照群の肺組織切片とヘマトキシリン＆エオシン染色及びマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色を行った組織病理学的分析結果である。
【図７】ＰＨＭＧで誘導された肺線維症動物モデルで１、１５、３０、６０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＣＧ２００７４５を投与したＣＧ２００７４５投与群または溶媒対照群の気管支肺胞洗浄液（ｂｒｏｎｃｈｏａｌｖｅｏｌａｒ  ｌａｖａｇｅ  ｆｌｕｉｄ、ＢＡＬＦ）でＳｉｒｃｏｌ  ａｓｓａｙを施行して、コラーゲンの濃度を比較したグラフである。
【図８】ＰＨＭＧで誘導された肺線維症動物モデルで１、１５、３０、６０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙのＣＧ２００７４５を投与したＣＧ２００７４５投与群または溶媒対照群の肺組織細胞の線維症標的タンパク質発現量を確認した結果である。
【発明を実施するための形態】
【００３０】
本発明は、多様な変換を加え、さまざまな実施例を有することができるので、特定実施例を図面に例示し、詳細な説明で詳細に説明する。しかし、これは、本発明を特定の実施形態で限定するものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる、あらゆる変換、均等物または代替物を含むものと理解しなければならない。本発明を説明するに当って、関連した公知技術についての具体的な説明が、本発明の要旨を不明にする恐れがあると判断される場合、その詳細な説明を省略する。
【実施例】
【００３１】
＜実施例１＞片側性尿管閉塞（Ｕｎｉｌａｔｅｒａｌ  ｕｒｅｔｅｒａｌ  ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ、腎不全）マウスモデル評価
【００３２】
１−１．片側性尿管閉塞マウスモデル製作
８週齢雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスを利用した。Ｃ５７ＢＬ／６マウスの腹部開腹後、２つの尿管のうち、１つの尿管を６−０絹糸で閉鎖した。尿管閉鎖後、腹部を縫合し、消毒した。手術直後、宿主マウスを非摂取群である溶媒対照群とＣＧ２００７４５摂取群とに分類し、ＣＧ２００７４５摂取群には、蒸留水で溶かしたＣＧ２００７４５（３０ｍｇ／ｋｇ／ｄａｙ）を蒸留水に溶かして摂取させた。手術後、７日目、溶媒対照群とＣＧ２００７４５摂取群マウスとを安楽死させた後、それぞれ正常腎臓と尿管閉鎖後、急性腎不全が引き起こされた腎臓を摘出した。
【００３３】
１−２．組織病理学分析
前記摘出された正常腎臓と急性腎不全が引き起こされた腎臓とを４％パラホルムアルデヒドで固定させた後、パラフィンで覆い、３μｍの厚さに組織切片を製作した。完成された組織切片にヘマトキシリン＆エオシン染色を行って、腎臓組織病理学的分析を行った。ヘマトキシリン染色は、腎臓組織切片をＧｉｌｌ’ｓヘマトキシリンで５分間染色し、水道水で洗浄した後、９５％エタノールを処理した。エオシン染色は、エオシンとフロキシン（ｐｈｌｏｘｉｎｅ）とで１分間染色した。以後、組織切片は、エタノールとキシレン（ｘｙｌｅｎｅ）とで脱水し、カナダバルサム（Ｃａｎａｄａ  ｂａｌｓａｍ）で固定した。製作した腎臓組織切片は、光学顕微鏡で観察した。その結果、図１のように、急性腎不全が引き起こされた腎臓である溶媒対照群は、正常腎臓である陰性対照群と比較して線維化が進行した一方、ＣＧ２００７４５摂取群腎臓は、溶媒対照群と比較して線維化進行が抑制された。
【００３４】
１−３．線維症マーカーα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現確認
前記摘出された正常腎臓と急性腎不全が引き起こされた腎臓である溶媒対照群及びＣＧ２００７４５摂取群の腎臓とからＲＮＡを分離して、逆転写でｃＤＮＡを合成し、リアルタイム重合酵素連鎖反応（ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ）を行って、線維症マーカーであるα−平滑筋アクチン（α−ＳＭＡ）の発現量を比較した。
【００３５】
腎臓皮質をトリゾール（Ｔｒｉｚｏｌ）溶液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）で均質化した。該均質化した腎臓皮質からクロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）を用いてＲＮＡを抽出し、イソプロパノール（ｉｓｏｐｒｏｐａｎｏｌ）で沈積した後、７５％エタノールで洗浄した。該洗浄したＲＮＡは、蒸留水に溶かした後、２６０ｎｍ（Ｕｌｔｒａｓｐｅｃ  ２０００、Ｐｈａｒｍａｃｉａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫ）で吸光度を測定して濃度を確認した。ｃＤＮＡは、オリゴ（ｄＴ）プライマー（ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）ｐｒｉｍｅｒ）とｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ逆転写酵素（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ）ＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）とを用いて５ｍｇ  ＲＮＡを逆転写して製作した。該製作されたｃＤＮＡは、Ｓｍａｒｔ  Ｃｙｃｌｅｒ  ＩＩ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｅｐｈｅｉｄ、Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ）を用いてＳＹＢＲグリーン（Ｇｒｅｅｎ）で測定して定量した。
【００３６】
リアルタイム重合酵素連鎖反応は、１０ｍＭフォワードプライマー（ｆｏｒｗａｒｄ  ｐｒｉｍｅｒ）、１０ｍＭリバースプライマー（ｒｅｖｅｒｓｅ  ｐｒｉｍｅｒ）、２×  ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ  Ｐｒｅｍｉｘ  Ｅｘ  Ｔａｑ（ＴＡＫＡＲＡ  ＢＩＯ  ＩＮＣ、Ｓｅｔａ  ３−４−１、Ｊａｐａｎ）、０．５ｍＬ  ｃＤＮＡを混合した後、最終体積が２０ｍＬになるように蒸留水を添加した。Ｒｏｔｏｒ−ＧｅｎｅＴＭ  ３０００  Ｄｅｔｅｃｔｏｒ  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃｏｒｂｅｔｔｅ  ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｍｏｒｔｌａｋｅ、Ｎｅｗ  Ｓｏｕｔｈ  Ｗａｌｅｓ、Ａｕｓｔｒａｌｉａ）を用いてリアルタイム重合酵素連鎖反応を行い、α−ＳＭＡ  ｍＲＮＡの相対定量を比較した。
【００３７】
リアルタイム重合酵素連鎖反応は、次の段階で行った。
１）９５℃、５分
２）９５℃、２０秒
３）５８〜６２℃、２０秒
４）７２℃、３０秒
５）８５℃、６秒
そのうち、２）〜５）段階は、６４回繰り返し行い、最後のサイクル最終温度は、６０℃から９５℃に増加させて、融解曲線（ｍｅｌｔｉｎｇ  ｃｕｒｖｅ）を形成させた。ＰＣＲ発現量比較は、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ測定値で確認した。
【００３８】
次のようなプライマー配列を使用した。
ヒトα−ＳＭＡ正方向、５’−ＡＣＴＧＧＧＡＣＧＡＣＡＴＧＧＡＡＡＡＧ−３’と逆方向、５’−ＣＡＴＣＴＣＣＡＧＡＧＴＣＣＡＧＣＡＣＡ−３’、ヒトＧＡＰＤＨ正方向、５’−ＴＧＴＧＴＣＣＧＴＣＧＴＧＧＡＴＣＴＧＡ−３’と逆方向、５−ＧＡＴＧＣＣＴＧＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＴＴ−３’。
【００３９】
その結果、図２のように、尿管閉塞を通じて腎不全が引き起こされた腎臓にＣＧ２００７４５を３０ｍｇ／ｋｇを摂取したＣＧ２００７４５摂取群で非摂取対照群である溶媒対照群よりも５０％以上減少したα−ＳＭＡ発現を確認することができた。
【００４０】
＜実施例２＞ブレオマイシン誘導マウスモデル評価
【００４１】
２−１．ブレオマイシン誘導マウス製作
ブレオマイシンモデルは、７週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを使用し、ブレオマイシン投与群、ブレオマイシン投与後、ＣＧ５００７４５  １５、３０、６０ｍｇ／ｋｇと対照群として総５個群に分けて実験を進行した。マウスの気道を切開し、２ｍｇ／ｋｇのブレオマイシンを５０μｌの体積で気道内に注入した。注入後、切開部位は、５−０ナイロンで縫合した。ブレオマイシン注入後、薬物投与は、腹腔投与し、総２週間投与した。
【００４２】
２−２．ブレオマイシン誘導マウスモデルでの組織病理学的分析
マウス犠牲後、開胸した後、肺を摘出して、４％パラホルムアルデヒド（ｐａｒａｆｏｒｍａｌｄｅｈｙｄｅ）で固定した。４８時間４％パラホルムアルデヒドに浸けて置き、４℃で固定した後、パラフィンブロックを製作して、パラフィン包埋組織を４μｍに薄切して、スライドに貼り付ける。ヘマトキシリン＆エオシン染色とマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ’ｓ  ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色とを施行した。
【００４３】
ヘマトキシリン＆エオシン染色は、スライドをキシレン５分ずつ２回、エタノール１００％、９５％、７０％で各２分ずつ一回施行し、流れる蒸留水で洗浄した。洗浄後、スライドをヘマトキシリン（ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）に１分間浸けて置いた後、流れる蒸留水で数回洗浄後、エオシン（ｅｏｓｉｎ）に３０秒間浸し、流れる蒸留水で数回洗浄した。次いで、７０％、９５％、１００％エタノール（ｅｔｈａｎｏｌ）に各１分ずつ施行し、キシレンに２分ずつ２回浸けて置いた。最後に、封入剤  キシレン（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ  ｘｙｌｅｎｅ）を用いてカバースライド（ｃｏｖｅｒ−ｓｌｉｄｅ）を永久付着し、このようなサンプルを光学顕微鏡を通じて観察した。
【００４４】
マッソントリクローム染色は、コラーゲンと筋線維とを染色するために施行し、スライドをキシレン５分ずつ２回、エタノール１００％、９５％、７０％で各２分ずつ一回施行し、流れる蒸留水で洗浄した。洗浄後、スライドを恒温水槽を５６〜６４℃に合わせた後、ブアン液（Ｂｏｕｉｎ’ｓ  ｆｌｕｉｄ）に１時間反応させた後、１０分間冷却させた。流れる蒸留水で数回洗浄後、鉄ヘマトキシリン（ｉｒｏｎ  ｈｅｍａｔｏｘｙｌｉｎ）５分進行し、お湯に２分間濯いだ後、蒸留水でもう一度洗浄した。ビーブリッヒスカーレット（Ｂｉｅｂｒｉｃｈ  ｓｃａｒｌｅｔ）／酸フクシン溶液（Ａｃｉｄ  Ｆｕｃｈｓｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で５分染色させた後、蒸留水で洗浄した。リンモリブデン  リンタングステン酸溶液（Ｐｈｏｓｐｈｏｍｏｌｙｂｄｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で１５分染色後、蒸留水で洗浄した。アニリンブルー溶液（Ａｎｉｌｉｎ  Ｂｌｕｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で１０分染色させた後、蒸留水で洗浄し、１％酢酸溶液（ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で５分進行した。次いで、７０％、９５％、１００％エタノールに各１分ずつ施行し、キシレンに２分ずつ２回浸けて置いた。染色されたコラーゲンと筋線維は、光学顕微鏡で観察した。
【００４５】
その結果、図３のように、ブレオマイシン処理によって増加した線維化（ｆｉｂｒｏｓｉｓ）程度とコラーゲン蓄積が、ＣＧ２００７４５濃度依存的に減少して正常化されることを確認した。
【００４６】
２−３．ブレオマイシン誘導マウスモデルでのＳｉｒｃｏｌ  ａｓｓａｙ分析
２週間薬物投与後、マウスの気道部位皮膚を切開した後、気道を露出させ、気管内にＰＢＳ  ８００μｌを入れて洗浄して、５００μｌを再び回収して、気管支肺胞洗浄液を得た。気管支肺胞洗浄液を４℃、１，２００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上澄み液を得た。気管支肺胞洗浄液５０μｌとｓｉｒｃｏｌ  ｄｙｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  １ｍＬとを３０分間混合した。４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液は捨て、Ａｃｉｄ−ｓａｌｔ  ｗａｓｈ  ｒｅａｇｅｎｔ  ７５０μｌ入れ、洗浄した後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液は捨て、アルカリ試薬（Ａｌｋａｌｉ  ｒｅａｇｅｎｔ）を１ｍＬ入れ、溶かした後、５５５ｎｍで吸光度を測定した。
【００４７】
その結果、図４のように、ブレオマイシンによって増加したコラーゲンが、ＣＧ２００７４５濃度依存的に有意味に減少することを確認した。
【００４８】
２−４．ブレオマイシン誘導マウスモデルでの線維症マーカー発現確認
組織内肺線維症と関連マーカー（α−ＳＭＡ、コラーゲンＩ、ＰＡＩ−１、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、Ｎ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ））とアセチル化Ｈ３（Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  Ｈ３）とを確認するために、ウェスタンブロット（ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔ）を行い、マウス犠牲後、開胸した後、肺を摘出して、一日間冷凍保管し、マウス組織を磨いてタンパク質で試料を準備した。それをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行って分画されたタンパク質をＰＶＤＦ（ポリビニリデンジフルオリド膜（ｐｏｌｙｖｉｎｙｌｉｄｅｎｅ  ｄｉｆｌｕｏｒｉｄｅ  ｍｅｍｂｒａｎｅｓ））メンブレンに移した。タンパク質が移されたＰＶＤＦメンブレンを１×  ＴＢＳＴに５％スキムミルク（ｓｋｉｍ  ｍｉｌｋ）で希釈したブロッキング緩衝溶液で１時間振ってブロッキングさせた後、ウサギ由来のポリクローン１次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍希釈して、一晩中反応させた。反応済のメンブレンは、緩衝溶液で洗浄し、ＨＲＰが接合されたウサギに対する２次抗体をブロッキング緩衝溶液に２０００倍希釈して、１時間反応させた。反応済のメンブレンは、緩衝溶液で洗浄し、該洗浄されたメンブレンにＥＣＬで反応させて確認した。
【００４９】
ｃｏｎｔ二匹の平均を１と見て、相対的な数値を記録して、デンシトメトリー（ｄｅｎｓｉｔｏｍｅｔｒｙ）測定した。その結果、図５のように、ＣＧ２００７４５濃度依存的なヒストンアセチル化（ｈｉｓｔｏｎｅ  ａｃｅｔｙｌａｔｉｏｎ）増加とブレオマイシン処理によって増加した線維症マーカー（α−ＳＭＡ、コラーゲンＩ、ＰＡＩ−１）の発現減少とを確認した。
【００５０】
＜実施例３＞ポリヘキサメチレングアニジン誘導マウスモデル評価
【００５１】
３−１．ポリヘキサメチレングアニジン肺線維症マウスモデル製作
ポリヘキサメチレングアニジン（ＰＨＭＧ）モデルは、７週齢Ｃ５７ＢＬ／６雌マウスを使用し、ポリヘキサメチレングアニジン投与群、ポリヘキサメチレングアニジン投与後、ＣＧ２００７４５  １５、３０、６０ｍｇ／ｋｇと対照群として総５個群に分けて実験を進行した。マウスの気道を切開し、１ｍｇ／ｋｇのポリヘキサメチレングアニジンを５０μｌの体積で気道内に注入した。注入後、切開部位は、５−０ナイロンで縫合した。ポリヘキサメチレングアニジン注入後、薬物投与は、腹腔投与し、総２週間投与した。
【００５２】
３−２．ポリヘキサメチレングアニジン肺線維症マウスモデルでの組織病理学的評価
マウス犠牲後、開胸した後、肺を摘出して、４％パラホルムアルデヒドで固定した。４８時間４％パラホルムアルデヒドに浸けて置き、４℃で固定した後、パラフィンブロックを製作して、パラフィン包埋組織を４μｍの厚さに薄切して、スライドに貼り付けた。ヘマトキシリン＆エオシン染色とマッソントリクローム染色とを施行した。
【００５３】
ヘマトキシリン＆エオシン染色は、スライドをキシレン５分ずつ２回、エタノール１００％、９５％、７０％で各２分ずつ一回施行し、流れる蒸留水で洗浄した。洗浄後、スライドをヘマトキシリンに１分間浸けて置いた後、流れる蒸留水で数回洗浄後、エオシンに３０秒間浸し、流れる蒸留水で数回洗浄した。次いで、７０％、９５％、１００％エタノールに各１分ずつ施行し、キシレンに２分ずつ２回浸けて置いた。最後に、封入剤  キシレン（ｍｏｕｎｔｉｎｇ  ｍｅｄｉｕｍ  ｘｙｌｅｎｅ）を用いてカバースライドを永久付着し、このようなサンプルを光学顕微鏡を通じて観察した。
【００５４】
マッソントリクローム染色は、コラーゲンと筋線維とを染色するために施行し、スライドをキシレン５分ずつ２回、エタノール１００％、９５％、７０％で各２分ずつ一回施行し、流れる蒸留水で洗浄した。洗浄後、スライドを恒温水槽を５６〜６４℃に合わせた後、ブアン液に１時間反応させた後、１０分間冷却させた。流れる蒸留水で数回洗浄後、鉄ヘマトキシリン５分進行し、お湯に２分間濯いだ後、蒸留水でもう一度洗浄した。ビーブリッヒスカーレット（Ｂｉｅｂｒｉｃｈ  ｓｃａｒｌｅｔ）／酸フクシン溶液（Ａｃｉｄ  Ｆｕｃｈｓｉｎ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で５分染色させた後、蒸留水で洗浄した。リンモリブデン  リンタングステン酸溶液（Ｐｈｏｓｐｈｏｍｏｌｙｂｄｉｃ  ｐｈｏｓｐｈｏｔｕｎｇｓｔｉｃ  ａｃｉｄ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で１５分染色後、蒸留水で洗浄した。アニリンブルー溶液で１０分染色させた後、蒸留水で洗浄し、１％酢酸溶液で５分進行した。次いで、７０％、９５％、１００％エタノールに各１分ずつ施行し、キシレンに２分ずつ２回漬けて置く。染色されたコラーゲンと筋線維は、光学顕微鏡で観察した。
【００５５】
その結果、図６のように、ポリヘキサメチレングアニジンによって誘導された肺線維化が、ＣＧ２００７４５濃度依存的に抑制されることを確認した。
【００５６】
３−３．ポリヘキサメチレングアニジン肺線維症マウスモデルでのＳｉｒｃｏｌ  ａｓｓａｙ分析
２週間薬物投与後、マウスの気道部位皮膚を切開した後、気道を露出させ、気管内にＰＢＳ  ８００μｌを入れて洗浄して、５００μｌを再び回収して、気管支肺胞洗浄液を得た。気管支肺胞洗浄液を４℃、１，２００ｒｐｍ、５分間遠心分離した後、上澄み液を得た。気管支肺胞洗浄液５０μｌとＳｉｒｃｏｌ  ｄｙｅ  ｒｅａｇｅｎｔ  １ｍＬとを３０分間混合した。４℃、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、上澄み液は捨て、Ａｃｉｄ−ｓａｌｔ  ｗａｓｈ  ｒｅａｇｅｎｔ  ７５０μｌを入れ、洗浄した後、１２，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上澄み液は捨て、アルカリ試薬を１ｍＬ入れ、溶かした後、５５５ｎｍで吸光度を測定した。
【００５７】
その結果、図７のように、ポリヘキサメチレングアニジンによって増加したコラーゲンが、ＣＧ２００７４５濃度依存的に有意味に減少することを確認した。
【００５８】
３−４．ポリヘキサメチレングアニジン肺線維症マウスモデルでの線維化マーカー発現確認
組織内肺線維症と関連マーカー（α−ＳＭＡ、コラーゲンＩ、ＰＡＩ−１、Ｅ−カドヘリン（Ｅ−ｃａｄｈｅｒｉｎ）、Ｎ−カドヘリン（Ｎ−ｃａｄｈｅｒｉｎ））とアセチル化Ｈ３（Ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ  Ｈ３）とを確認するために、ウェスタンブロットを行い、マウス犠牲後、開胸した後、肺を摘出して、一日間冷凍保管し、マウス組織を磨いてタンパク質で試料を準備した。それをＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った後、分画されたタンパク質をＰＶＤＦメンブレンに移した。タンパク質が移されたＰＶＤＦメンブレンを１×  ＴＢＳＴに５％スキムミルクで希釈したブロッキング緩衝溶液で１時間振ってブロッキングさせた後、ウサギ由来のポリクローン１次抗体をブロッキング緩衝溶液に１０００倍希釈して、一晩中反応させた。反応済のメンブレンは、緩衝溶液で洗浄し、ＨＲＰが接合されたウサギに対する２次抗体をブロッキング緩衝溶液に２０００倍希釈して、１時間反応させた。反応済のメンブレンは、緩衝溶液で洗浄し、該洗浄されたメンブレンにＥＣＬで反応させて確認した。
【００５９】
ｃｏｎｔ二匹の平均を１と見て、相対的な数値を記録して、デンシトメトリー測定した。その結果、図８のように、ＣＧ２００７４５濃度依存的なヒストンアセチル化増加とポリヘキサメチレングアニジン処理によって増加した線維症マーカー（α−ＳＭＡ、コラーゲンＩ、ＰＡＩ−１）の発現減少とを確認した。
【００６０】
肺線維症モデルは、前記に記載の成分の以外に、ブレオマイシン、ポリヘキサメチレングアニジン、クロロメチルイソチアゾリノン、メチルイソチアゾリノン、及び塩化エトキシエチルグアニジンからなる群から選択される１つ以上によって誘導されたものに適用させることができる。
【００６１】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい実施形態であり、これにより、本発明の範囲が制限されないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、下記の特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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