(57)【要約】本発明は山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の葉抽出物を溶媒分画して得た分画物が含まれた痛症用組成物に関するものである。より詳しくは、山椒葉から分離された溶媒分画物は痛症誘導動物モデル、炎症誘導モデル及び関節炎誘導モデルに対して痛症、炎症及び関節炎のいずれも抑制し、これに対する分子的指標でも非常に優れた発現及び抑制様相を示すので、痛症及び炎症を基にする関節炎の治療に非常に有効な薬学組成物として使うことができる。【選択図】  図１４
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉のアルコール抽出物を溶媒分画して得たエチルアセテート分画物が含有されている痛症治療及び予防用薬剤組成物。
【請求項２】
前記エチルアセテート分画物は、４’−ヒドロキシ−アセトフェノン、２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール及び１，２−ベンゼンジカルボン酸、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド及びケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドからなる群から選択される１種以上の化合物が活性成分として含まれていることを特徴とする、請求項１に記載の痛症治療及び予防用薬剤組成物。
【請求項３】
ａ）山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉をＣ1〜Ｃ4アルコール及びＣ1〜Ｃ4アルコール水溶液から選択される１種以上の溶媒で抽出してアルコール抽出物を得る段階と、
ｂ）前記アルコール抽出物を水に懸濁した後、ノルマルヘキサン、ジクロロメタン、エチルアセテート及びノルマルブタノールの順に分画して、エチルアセテート分画物を得る段階と、
ｃ）前記エチルアセテート分画物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーして活性分画物を得る段階とを行って得た活性分画物が含有されている痛症治療及び予防用薬剤組成物。
【請求項４】
前記活性分画物は、４’−ヒドロキシ−アセトフェノン、２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール及び１，２−ベンゼンジカルボン酸、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド及びケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドからなる群から選択される１種以上の化合物が活性成分として含まれていることを特徴とする、請求項３に記載の痛症治療及び予防用薬剤組成物。
【請求項５】
前記抽出に使用された溶媒は９０〜９５％エタノール水溶液であることを特徴とする、請求項３に記載の痛症治療及び予防用薬剤組成物。
【請求項６】
前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、エチルアセテート／メタノールの体積比を９０／１０から６０／４０まで変化させながら溶出することを特徴とする、請求項３に記載の痛症治療及び予防用薬剤組成物。
【請求項７】
錠剤形態に剤形化されたことを特徴とする、請求項１又は３のいずれか一項に記載の痛症治療及び予防用薬剤組成物。
【請求項８】
山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉のアルコール抽出物を溶媒分画して得たエチルアセテート分画物が含有されている痛症改善用健康食品組成物。
【請求項９】
前記エチルアセテート分画物は、４’−ヒドロキシ−アセトフェノン、２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール及び１，２−ベンゼンジカルボン酸、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド及びケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドからなる群から選択される１種以上の化合物が活性成分として含まれていることを特徴とする、請求項８に記載の痛症改善用健康食品組成物。
【請求項１０】
ａ）山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉をＣ1〜Ｃ4アルコール及びＣ1〜Ｃ4アルコール水溶液から選択される１種以上の溶媒で抽出してアルコール抽出物を得る段階と、
ｂ）前記アルコール抽出物を水に懸濁した後、ノルマルヘキサン、ジクロロメタン、エチルアセテート及びノルマルブタノールの順に分画して、エチルアセテート分画物を得る段階と、
ｃ）前記エチルアセテート分画物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーして活性分画物を得る段階とを含む分画工程を行って得た活性分画物が含有されている痛症改善用健康食品組成物。
【請求項１１】
前記活性分画物は、４’−ヒドロキシ−アセトフェノン、２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール及び１，２−ベンゼンジカルボン酸、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド及びケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドからなる群から選択される１種以上の化合物が活性成分として含まれていることを特徴とする、請求項１０に記載の痛症改善用健康食品組成物。
【請求項１２】
前記抽出に使用された溶媒は９０〜９５％エタノール水溶液であることを特徴とする、請求項１０に記載の痛症改善用健康食品組成物。
【請求項１３】
前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーは、エチルアセテート／メタノールの体積比を９０／１０から６０／４０まで変化させながら溶出することを特徴とする、請求項１０に記載の痛症改善用健康食品組成物。
【請求項１４】
錠剤形態に剤形化されたことを特徴とする、請求項８又は１０のいずれか一項に記載の痛症改善用健康食品組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉抽出物の分画物が含有されている鎮痛に有効な組成物に関するものである。
【背景技術】
【０００２】
痛症は、刺激に対して即刻の反応を示す１次痛症と、徐々に感じる２次痛症とに分類することができる。このような痛症は皮膚や組織に分布されている受容体を介して感知され、主に物理的な刺激や熱による刺激及び化学物質による刺激を担当する受容体が刺激を受け取れば、中枢神経系に伝達されて痛症を感じることになる。このような痛症は、他の感覚とは違い、持続するほど段々敏感になり、弱い痛症にも感覚反応はもっと高くなる。痛症を治療する既存の鎮痛剤は、大別して非麻痺性鎮痛剤と麻薬性鎮痛剤とに分類される。麻薬性鎮痛剤としては、コデイン、モルヒネ、フェンタニルなどがあり、非麻薬性鎮痛剤としては、アセトアミノフェン、アスピリン、イブプロフェン、ナプロキセン、ケトプロフェンなどが属している。非麻薬性鎮痛剤は、主にアラキドン酸からプロスタグランジンが生成される段階を抑制し、一般的な痛症と関節炎に伴う痛症、解熱及び炎症に対する治療効果も持っているので、鎮痛及び消炎剤として使われている。主に使われている非麻薬性鎮痛剤は、一般的に鎮痛及び解熱作用をするアセトアミノフェンとプロスタグランジンを抑制して鎮痛及び解熱、消炎作用を示す非ステロイド性消炎鎮痛剤（ＮＳＡＩＤｓ）とに分類される。アセトアミノフェンのような薬物は、アメリカリウマチ学会の指針によって、胃腸に対する副作用が少ないため、炎症を伴わない骨関節炎患者に優先的に使うように勧奨されている。非ステロイド性消炎鎮痛剤は消炎作用があるので、主に炎症を伴う関節炎に使うように勧告しているが、このような非ステロイド性薬物は胃潰瘍及び消化器官出血などの副作用を現すことができるから、気を付けて摂取しなければならない。
【０００３】
一方、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）はミカン科の落葉潅木であり、たいてい実皮（果皮）を香辛料と薬として使っており、種子、幼葉、木、幹も多様な用途に使われる。山椒の実は漢方で解毒、駆虫、鎮痛剤として使われており、主に韓国、日本、中国に分布している。
【０００４】
山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）に関連して多数の特許が公開されている。従来の発明では、主に山椒の実皮、根、木質部をターゲットとして研究が進んできた。これを抽出した抽出物が抗菌、抗ウイルス、殺虫、坑がん、抗炎症、動脈硬化、高脂血症、糖尿、骨粗鬆症、皮膚美白に有効な活性を示すと知られている。
【０００５】
しかし、現在まで発表された何の文献にも山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の葉抽出物が鎮痛改善に有効であると開示されたことがない。
【０００６】
特に、山椒の葉抽出物はケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドとケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドが指標物質を兼ねた活性化合物として含まれている。この点のみ見ても、従来の山椒の実皮、根、木質部の抽出物とは違いがある。また、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド又はケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドが鎮痛に有効であることについては何の文献にも開示されたことがない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、本発明者は、従来に知られた消炎鎮痛に基づく関節炎治療剤より効果が優れるとともに毒性及び副作用がほとんどない天然物質を捜そうと研究を繰り返えした結果、山椒葉抽出物、その分画物及びこれから分離した活性化合物が痛症誘導動物モデル、炎症誘導モデル、関節炎誘導モデルで優れた活性効果を示すことを確認することによって本発明を完成することになった。特に、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の葉抽出物は、犬山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｓｃｈｉｎｉｆｏｌｉｕｍ）抽出物に比べ、含有成分の差が著しく、また鎮痛抑制能が格段に優れることを明かすことによって本発明の進歩性を確保した。［下記実施例の参考例参照］
【０００８】
したがって、本発明は、山椒葉抽出物、その分画物又はこれから分離した活性化合物を有効成分として含む痛症治療及び予防用薬剤組成物を提供することにその目的がある。
【０００９】
また、本発明は、山椒葉抽出物、その分画物又はこれから分離した活性化合物を有効成分として含む痛症改善用健康食品組成物を提供することにその目的がある。
【００１０】
また、本発明は、山椒葉から活性化合物を分離する方法を提供することにその目的がある。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
前述した課題の解決のために、本発明は、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉をＣ1〜Ｃ4アルコール及びＣ1〜Ｃ4アルコール水溶液から選択される１種以上の溶媒で抽出して得た山椒抽出物であり、下記化学式１で表示されるケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド又は下記化学式２で表示されるケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド又はこれらの混合物が活性成分として含有されている痛症治療及び予防用薬剤組成物を提供する。
【化１−１】
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【化２−１】
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また、本発明の他の態様は、前述した山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）抽出物をエチルアセテートで抽出して得たエチルアセテート分画物を含む痛症治療及び予防用薬剤組成物を提供することである。
また、本発明の他の態様は、（Ａ）ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド、（Ｂ）ケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド、（Ｃ）４’−ヒドロキシ−アセトフェノン、（Ｄ）２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、及び（Ｅ）１，２−ベンゼンジカルボン酸からなる群から選択される１種以上の化合物が含まれている痛症治療及び予防用薬剤組成物を提供することである。
また、本発明の他の態様は、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉をＣ1〜Ｃ4アルコール及びＣ1〜Ｃ4アルコール水溶液から選択される１種以上の溶媒で抽出して得た山椒抽出物であり、前記化学式１で表示されるケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド又は前記化学式２で表示されるケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド又はこれらの混合物が活性成分として含有されている痛症改善用健康食品組成物を提供する。
また、本発明の他の態様は、前述した山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）抽出物をエチルアセテートで抽出して得たエチルアセテート分画物を含む痛症改善用健康食品組成物を提供する。
また、本発明の他の態様は、（Ａ）ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド、（Ｂ）ケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド、（Ｃ）４’−ヒドロキシ−アセトフェノン、（Ｄ）２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、及び（Ｅ）１，２−ベンゼンジカルボン酸からなる群から選択される１種以上の化合物が含まれている痛症改善用健康食品組成物を提供する。
また、本発明の他の態様は、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）から活性化合物を分離する方法であって、
イ）山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の葉をＣ1〜Ｃ4アルコール及びＣ1〜Ｃ4アルコール水溶液から選択される１種以上の抽出溶媒で抽出してアルコール抽出物を得る段階と、
ロ）前記アルコール抽出物を水に懸濁した後、ノルマルヘキサン、ジクロロメタン、エチルアセテート及びノルマルブタノールの順に分画してエチルアセテート分画物を得る段階と、
ハ）前記エチルアセテート分画物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーと中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を行って、前記化学式１で表示されるケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド又は前記化学式２で表示されるケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドをそれぞれ収得する段階とを含む工程を行って活性化合物を分離する方法を提供する。
【発明の効果】
【００１２】
本発明が提供する山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉抽出物、その分画物又はこれから分離した活性化合物であり、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド及び／又はケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドは痛症誘導動物モデル、炎症誘導モデル又は関節炎誘導モデルの実験で優れた治療効能を示した。
【００１３】
したがって、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉抽出物、その分画物又はこれから分離した活性化合物は、痛症疾患の治療、予防又は改善のための薬剤又は健康食品に有効性成分として使われることができる。
【図面の簡単な説明】
【００１４】
【図１】山椒葉抽出物から溶媒分画物及び活性化合物を収得する過程を示す工程図である。
【図２】（Ａ）ＺＰＥ６Ａと（Ｂ）ＺＰＥ６Ｃ小分画物のＧＣ−ＭＳスペクトラムである。
【図３】ＺＰＥ６Ａ又はＺＰＥ６Ｃ分画物から分離した４’−ヒドロキシアセトフェノン、２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、１，２−ベンゼンジカルボン酸に対して痛症抑制効能を確認したグラフである。
【図４】（Ａ）テイルフリック試験法、（Ｂ）熱板試験法、（Ｃ）ホルマリン試験法によって山椒葉抽出物の痛症抑制効能を確認したグラフである。
【図５】山椒葉抽出物のＢＶ−２小グリア細胞で測定されたＢＤＮＦ発現様相を酵素免疫測定法を用いて測定したものである。
【図６】（Ａ）逆転写−ＰＣＲ分析法、（Ｂ）免疫ブロット分析法によって山椒葉抽出物に対する炎症指標因子ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６の発現抑制効果を確認したグラフである。
【図７】亜慢性耳腫脹モデルの山椒葉抽出物の抗炎症効果を確認した結果である。
【図８】コラーゲン誘導リウマチ関節炎モデル（ＣＩＡ）で確認された山椒葉抽出物のリウマチ関節炎治療効果を確認した３Ｄイメージである。
【図９】コラゲナーゼ誘導骨関節炎モデルで確認された山椒葉抽出物の骨関節炎治療効果を確認したＨ＆Ｅ染色イメージである。
【図１０】骨関節炎モデルで確認された山椒葉抽出物、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド及びケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドのそれぞれに対して（Ａ）ＭＭＰ−２、（Ｂ）ＭＭＰ−３、（Ｃ）ＴＩＭＰ−１及び（Ｄ）ＴＩＭＰ−２の生化学的指標変化を確認したグラフである。
【図１１】ＢＶ−２小グリア細胞で山椒葉抽出物、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド又はケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドを処置した後、Ｋ+開閉調節タンパク質（ＫＣＮＪ６）の発現程度を確認したグラフである。
【図１２】ＢＶ−２小グリア細胞でポタシウム（Ｋ+）電流密度を測定したグラフである。
【図１３】コラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）における山椒葉抽出物、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドとケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド処置後、ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ発現量を測定したグラフである。
【図１４】コラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）における山椒葉抽出物、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドとケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド処置後、Ｔ細胞及びＴＨ１７細胞で炎症促進性サイトカイン（Ａ：ＩＬ−６、Ｂ：ＩＬ−１７、Ｃ：ＩＬ−２１及びＤ：ＩＬ−２２）の発現量を測定したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
このような本発明をより詳細に説明すれば次のようである。
【００１６】
本発明は、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉抽出物、前記抽出物を有機溶媒で抽出した溶媒分画物及びこれから分離したケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドとケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドを有効成分として含む痛症の改善、予防及び治療用組成物に関するものである。
【００１７】
また、本発明は、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）から抽出物、分画物及び活性化合物を分離するための一連の方法を特徴とし、具体的に下記の段階を含む：
イ）山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の葉をＣ1〜Ｃ4アルコール及びＣ1〜Ｃ4アルコール水溶液から選択される１種以上の抽出溶媒で抽出してアルコール抽出物を得る段階；
ロ）前記アルコール抽出物を水に懸濁した後、ノルマルヘキサン、ジクロロメタン、エチルアセテート及びノルマルブタノールの順に分画してエチルアセテート分画物を得る段階；及び
ハ）前記エチルアセテート分画物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーと中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を行って、前記化学式１で表示されるケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド又は前記化学式２で表示されるケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドをそれぞれ収得する段階。
【００１８】
図１の工程図を参照して、山椒葉から抽出物、溶媒分画物又は活性化合物の分離方法をより具体的に説明すれば下記のようである。
【００１９】
イ）段階は、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉抽出物を収得する段階である。
【００２０】
山椒は、葉、幹、枝、根などの植物全体を用いることもできる。本発明者の実験結果によれば、山椒の部位別に痛症抑制能で格段な差を示した。山椒葉抽出物は根抽出物に比べておよそ７００％の優れた痛症抑制率を示し、実抽出物に比べてもおよそ２６％の優れた痛症抑制率を示すことを確認した［下記実施例１参照］。よって、本発明は、山椒植物の多くの部位の中でも葉（ｌｅａｆ）部位を選択して使うことを特徴とする。
【００２１】
山椒の葉は水できれいに洗浄して乾燥させた後、陰干し細切した。そして、Ｃ1〜Ｃ4アルコール及びＣ1〜Ｃ4アルコール水溶液から選択される１種以上の抽出溶媒に浸漬して抽出する。前記抽出溶媒は、メタノール、エタノール、イソプロパノール、プロパノール、ブタノール及びこれらの水溶液から選択されることができ、好ましくはエタノール又はエタノール水溶液を使い、より好ましくは９０〜９５％濃度のエタノール水溶液を使う。前記抽出溶媒の量は山椒葉の乾燥重量に対して１：１〜３０重量倍で使うことが好ましく、より好ましくは１：１０〜２０重量倍で使用するが、本発明が抽出溶媒の使用量を限定するものではない。抽出時の温度は常温乃至抽出溶媒の還流温度範囲であることができ、具体的には２０〜８０℃の温度条件で抽出することができる。前記抽出時間は１〜１０日であることが好ましいが、これに限定されない。また、抽出回数は１回以上実施することができるが、抽出が繰り返されるほど活性成分の収得量が著しく減少するので、５回以上繰り返し実施することは経済的でないこともあるので、抽出は２〜５回繰り返し実施することが好ましい。
【００２２】
前記抽出方法は当該分野で通常に知られた方法であり、例えば超臨界抽出、亜臨海抽出、高温抽出、高圧抽出又は超音波抽出法などの抽出装置を用いる方法又はＸＡＤ及びＨＰ−２０を含む吸着樹脂を用いる方法などを用いることができる。
【００２３】
また、抽出液は、真空回転蒸発器などで減圧濃縮してエキスを得る。また、得られたエキスは、必要によって、減圧乾燥、真空乾燥、沸騰乾燥、噴霧乾燥、常温乾燥又は凍結乾燥などを実施することもできる。
【００２４】
ロ）段階は、山椒抽出物を有機溶媒で抽出してエチルアセテート分画物を得る段階である。
【００２５】
具体的に、前記イ）段階で収得した山椒葉のエタノール抽出物を水に懸濁させた後、ノルマルヘキサン、ジクロロメタン、エチルアセテート及びノルマルブタノールで順次系統分画して得た分画物のうち、最も活性に優れたエチルアセテート分画物を収得する。前記分画は１回〜５回、好ましくは３回繰り返して収得することができ、分画後、減圧濃縮及び乾燥することができるが、本発明はこれに限定しない。
【００２６】
ハ）段階は、前記エチルアセテート分画物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーと中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を行って活性化合物を分離収得する段階である。
【００２７】
具体的に、前記ロ）段階で収得したエチルアセテート分画物をシリカビード（Ｓｉｌｉｃａ  ｂｅａｄｓ）が充填されたガラスカラム（５×５０ｃｍ）に充填させてシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施する。ここで、溶出液としてはエチルアセテートとメタノールの混合溶液を使い、エチルアセテート／メタノール体積比を９０／１０から６０／４０まで変化させながら溶出する。前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーを遂行した結果、７個の分画を得た。得られた分画物は、ＺＰＥ１、ＺＰＥ２、ＺＰＥ３、ＺＰＥ４、ＺＰＥ５、ＺＰＥ６、ＺＰＥ７と名付けた。前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って得た７個の分画の中でもＺＰＥ６が最も優れた活性を示した。分画ＺＰＥ６を選択して中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を後で実施した。
【００２８】
選択された分画ＺＰＥ６はｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムに充填させて中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を実施する。ここで、溶出液としてはメタノール単独溶液を使って溶出する。前記中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を遂行した結果、３個の小分画を得た。得られた小分画物は、ＺＰＥ６Ａ、ＺＰＥ６Ｂ、ＺＰＥ６Ｃと名付けた。前記中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を実施して得た３個の小分画の中でもＺＰＥ６Ｂが最も優れた活性を示し、小分画ＺＰＥ６Ｂを選択して活性化合物を分離する。
【００２９】
小分画ＺＰＥ６Ｂから活性化合物を分離するために、オクタデシル化シリカが充填された逆相カラムを用いる高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を遂行する。ここで、溶出液としてはメタノールと水の混合溶液を使い、好ましくはメタノールと水が同量で含まれた５０％メタノール水溶液を使う。
【００３０】
前記ＨＰＬＣを介して分離された活性化合物は、核磁気共鳴分光分析によって、下記化学式１で表示されるケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（クエルシトリン、Ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）と下記化学式２で表示されるケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（アフゼリン（Ａｆｚｅｌｉｎ））と確認された。
【００３１】
前記分離した活性成分１と活性成分２はそれぞれ核磁気共鳴分光分析によって化学構造を求めた。
【００３２】
【化１−２】
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【００３３】
【化２−２】
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【００３４】
以上の分離方法によって収得される山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉抽出物、前記抽出物を有機溶媒で抽出した溶媒分画物及びこれから分離したケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（化学式１）とケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（化学式２）は痛症誘導動物モデル、炎症誘導動物モデル及び関節炎誘導動物モデルで有意な結果を示していることを確認することができた。よって、山椒葉抽出物、その分画物及び／又はこれから分離した活性化合物として化学式１又は２で表示される化合物は痛症疾患及び炎症疾患の改善、予防、治療を目的とする薬剤組成物又は健康食品組成物に有効成分として含まれることができる。
【００３５】
本発明による薬剤組成物は、山椒葉抽出物、その分画物及び／又はこれから分離した活性化合物を有効成分として含み、組成物の総重量に対して前記有効成分は０．１〜５０重量％で含まれることができるが、本発明はこれに限定されない。
【００３６】
本発明の薬剤組成物は、通常の方法によって、散剤、顆粒剤、錠剤、カプセル剤、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エアロゾルなどの経口型剤形、外用剤、坐剤及び滅菌注射溶液の形態に剤形化して使われることができる。したがって、本発明の薬剤組成物は、薬剤の製造に通常に使用する適切な担体、賦形剤及び希釈剤をさらに含むことができる。
【００３７】
本発明の薬剤組成物に含まれることができる担体、賦形剤及び希釈剤としては、ラクトース、デキストロース、スクロース、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、エリトリトール、マルチトール、澱粉、アカシアゴム、アルギネート、ゼラチン、リン酸カルシウム、珪酸カルシウム、セルロース、メチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロース、微結晶セルロース、ケイ素化微結晶セルロース、ポビドン、クロスポビドン、クロスカルメロースナトリウム、ポリビニルピロリドン、水、メチルヒドロキシベンゾエート、プロピルヒドロキシベンゾエート、ノイシリン、コロイドシリコンジオキシド、乳糖、タルク、ステアリン酸マグネシウム、コロイドステアリルマグネシウム、及び鉱物油などから選択される１種以上が含まれることができる。
【００３８】
製剤化する場合には、普通使用する充填剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤などの希釈剤又は賦形剤を使って調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、トローチ剤、ロジン油、カプセル剤などが含まれる。このような固形製剤は、本発明の組成物に少なくとも１種以上の賦形剤、例えばラクトース、サッカロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アミロペクチン、セルロース、炭酸カルシウム、ゼラチンなどを交ぜて調剤される。また、単純な賦形剤の他に、ステアリン酸マグネシウム、タルクのような潤滑剤も使われる。経口投与のための液状製剤としては、懸濁剤、内用液剤、乳剤、エリクシール剤、シロップ剤などが当たり、よく使われる単純希釈剤である水、流動パラフィン以外に、さまざまな賦形剤、例えば湿潤剤、甘味剤、芳香剤、保存剤などが含まれることができる。非経口投与のための製剤には、滅菌水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤、坐剤が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール（ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）、ポリエチレングリコール、オリーブオイルのような植物性油、オレイン酸エチルのような注射可能なエステルなどが使われることができる。坐剤の基剤としては、ウィテプゾール（ｗｉｔｅｐｓｏｌ）、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、グリセロールゼラチンなどが使われることができる。非経口投与は、皮下注射、静脈注射、筋肉内注射又は胸部内注射の注入方式が一般的であり得る。
【００３９】
本発明の薬剤組成物は経口又は非経口で投与されることができ、非経口投与法であればどれでも使用可能であり、全身投与又は局所投与が可能であるが、全身投与がさらに好ましく、静脈内投与が最も好ましい。
【００４０】
本発明の薬剤組成物の好適な投与量は、患者の状態及び体重、疾病の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって違うが、当業者によって適切に選択されることができる。しかし、好ましい効果のために、本発明の薬剤組成物は、１日０．０００１〜１０００ｍｇ／ｋｇで、好ましくは１０〜３００ｍｇ／ｋｇ（体重）で投与することが良い。投与は一日一回投与することもでき、数回に分けて投与することもできる。前記投与量はどの面でも本発明の範囲を限定するものではない。
【００４１】
また、本発明による健康食品組成物は、山椒葉抽出物、その分画物及び／又はこれから分離した活性化合物を有効成分として含み、食品、飲料などの健康補助食品に添加されることができる。
【００４２】
前記食品の種類には特に制限はない。前記有効成分を添加することができる食品の例としては、ドリンク剤、肉類、ソーセージ、パン、ビスケット、餠、チョコレート、キャンデー類、スナック類、お菓子類、ピザ、ラーメン、その他の麺類、ガム類、アイスクリーム類を含む酪農製品、各種のスープ、飲料、アルコール飲料及びビタミン複合剤、乳製品及び油加工製品などがあり、通常的な意味の健康機能食品のいずれも含む。前記有効成分は食品にそのまま添加されるか他の食品又は食品成分とともに使われることができ、通常の方法によって適切に使われることができる。有効成分の含有量はその使用目的（予防又は改善用）によって適宜決定されることができる。一般に、健康食品組成物内に有効成分は０．１〜９０重量％含まれることができる。しかし、健康及び衛生を目的とするか又は健康調節を目的とする長期間の摂取の場合には、前記量は前記範囲以下であってもよく、安全性の面で何らの問題がないから、有効成分は前記範囲以上の量でも使われることができる。
【００４３】
本発明の健康食品組成物を用いて飲料に製造することができる。飲料に含まれる成分として、有効成分以外の成分の選択に特別な制限がなく、通常の飲料のようにさまざまな香味剤又は天然炭水化物などを追加成分として含むことができる。上述した天然炭水化物の例は、単糖類、例えば葡萄糖、果糖など；二糖類、例えばマルトース、スクロースなど；及び多糖類、例えばデキストリン、シクロデキストリンなどの通常の糖、及びキシリトール、ソルビトール、エリトリトールなどの糖アルコールである。上述したもの以外の香味剤として、天然香味剤（タウマチン、ステビア抽出物（例えば、レバウジオシドＡ、グリシルリジンなど）及び合成香味剤（サッカリン、アスパルテームなど）を有利に使うことができる。前記天然炭水化物の比率は、本発明の組成物１００ｍｌ当たり、一般的に約１〜２０ｇ、好ましくは約５〜１２ｇである。
【００４４】
また、本発明の健康食品組成物は、有効成分以外にも、さまざまな栄養剤、ビタミン、鉱物（電解質）、合成風味剤及び天然風味剤などの風味剤、着色剤及び中和剤（チーズ、チョコレートなど）、ペクチン酸及びその塩、アルギン酸及びその塩、有機酸、保護性コロイド増粘剤、ｐＨ調節剤、安定化剤、防腐剤、グリセリン、アルコール、炭酸飲料に使われる炭酸化剤などを添加剤として含むことができる。その他にも、天然果物ジュース及び果物ジュース飲料及び野菜飲料の製造のための果肉を含むことができる。このような成分は単独で又は組み合わせて使うことができる。このような添加剤の比率はそれほど重要ではないが、本発明の健康食品組成物に対して０．１〜２０重量％の範囲で選択されることが一般的である。
【００４５】
発明の実施のための形態
以上で説明したような本発明を次の実施例に基づいてより詳細に説明するが、本発明がこれに限定されるものではない。
【００４６】
［実施例］
［痛症抑制効能及び抗炎症効能測定方法］
本発明で収得した山椒葉抽出物、分画物又は活性化合物の痛症抑制効能及び抗炎症効能は下記の方法で測定した。
【００４７】
１．痛症抑制効能確認方法
（１）酢酸誘導痛症モデルによる鎮痛効果
酢酸誘導痛症モデル（Ａｃｅｔｉｃ  ａｃｉｄ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｗｒｉｔｈｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ  ｔｅｓｔ）は鎮痛効果を調べるための動物モデルであり、末梢神経系に作用する鎮痛剤の効力試験に主に使われる。実験動物は、５週齢ＩＣＲマウス（中央実験動物、ソウル）を購入し、湿度５０％、温度２４〜２６℃で１週間維持される飼育場で純化させ、飼料及び水は自由に摂取するように供給した。刺激物（ｉｒｒｉｔａｎｔｓ）として１．５％酢酸をマウスの腹腔に注入すれば、これにより腹腔内で痛症を誘発して、身をよじるか、後足をのびのびと伸ばす動作などの苦悶症状（ｗｒｉｔｈｉｎｇ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）反応を示すことになる。ここで、実験物質を痛症誘発６０分前に予め経口投与して鎮痛効果程度を測定した。
【００４８】
（２）テイルフリック試験法による鎮痛効果
テイルフリック試験法（Ｔａｉｌ−ｆｌｉｃｋ  ｔｅｓｔ）は、急性痛症モデルを用いて中枢神経系に作用する鎮痛剤の効力試験に主に使われる。実験物質を痛症誘発３０分と６０分前に経口投与した後、熱板上にマウスのしっぽを載せてしっぽの回避反応を測定した。
【００４９】
（３）熱板試験法による鎮痛効果
熱板試験法（Ｈｏｔ  ｐｌａｔｅ  ｔｅｓｔ）は中枢神経系に作用する鎮痛剤を検索するときに使用する方法であり、マウスの足裏が熱に非常に敏感であるので、我慢のできない程度の熱が感知されれば、マウスが飛ぶか、足裏を窄めるか、又はなめる行為をする。実験物質を痛症誘発６０分前に経口投与した後、熱板に接触するときから後ろ足をはたくかなめるときまでの時間（ｓｅｃ）を測定した。
【００５０】
（４）ホルマリン試験法による鎮痛効果
ホルマリン試験法は、痛症刺激と反応が一時的ではなくて持続的な晩成痛症モデルを対象として薬物の鎮痛作用を測定するのに主に用いられる。ホルマリンによって誘導された痛症反応は１及び２相段階を経ることになり、この二つの段階は薬物学的に区別されることができる。実験物質と陽性対照群であるアセトアミノフェン又はアスピリンを痛症誘発６０分前に経口投与した後、ラットの後ろ足に１０％ホルマリンを皮下注射し、３分単位で痛症に対する行動数を測定した。痛症に対する行動は１相（０〜１２分）と２相（２４〜３９分）に分けて測定した。
【００５１】
２．抗炎症効能確認方法
（１）酵素免疫測定法（Ｅｎｚｙｍｅ−Ｌｉｎｋｅｄ  ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ  Ａｓｓａｙ）
ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ  ｄｅｒｉｖａｔｅｄ  ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ  ｆａｃｔｏｒ）は主に脳に存在する神経栄養因子であり、トロポミオシン関連キナーゼＢ（ＴｒｋＢ）及びｐ７５などの受容体と結合し、これらとの相互作用によって痛症を誘発する。実験物質によるＢＤＮＦ発現様相を測定するために、ＥＬＩＳＡキット（Ｕｓｃｎ、中国）を使ってＢＶ−２小グリア細胞のＢＤＮＦ発現量を調査した。
【００５２】
（２）逆転写−ＰＣＲ分析法
ＲＮＡは製造社の指示に従ってＴＲＩｚｏｌ  Ｒｅａｇｅｎｔ  ｋｉｔ（Ｇｉｂｃｏ  ＢＲＬ）を使って溶解させた。ＲＮＡ  １μｇを１０，０００Ｕの逆転写酵素と０．５ｇ／Ｌ  ｏｌｉ−（ｄＴ）１５プライマーとともに逆転写させた。合成されたｃＤＮＡ  １μＬはｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６プライマーを使ってＰＣＲを介して増幅させた。ＰＣＲ生成物は１％アガロースゲル上で分離し、ＵＶとともに視覚化した。
【００５３】
（２）免疫ブロット分析法（Ｉｍｍｕｎｏｂｌｏｔ  ａｎａｌｙｓｉｓ）
細胞溶解物をバッファー溶液４０μＬに入れ、４℃で３０分間保管した後、タンパク質３０μｇを１０％ＳＤＳポリアクリルアミドゲル上で電気泳動法で分離した。その後、タンパク質をニトロセルロース細胞膜に移し、１時間の間に脱脂粉乳で遮断した。ＴＢＳＴ緩衝溶液で１０分ずつ３回洗った後、１次抗体を処理した。細胞膜はＨＲＰ（ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ  ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）に結合された２次抗体とともに保管した。免疫反応性バンドは製造社の指示に従ってＥＣＬ蛍光（ｅｎｈａｎｃｅｄ  ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）試薬によって検出した。
【００５４】
（４）亜慢性耳腫脹モデルの抗炎症効果
１２−Ｏ−テトラデカノイルホルボル−１３−アセテート（ＴＰＡ）によって耳腫脹が誘発されたマウス耳腫脹モデルで測定した。１週間の純化過程を経た５週齢ＩＣＲマウスに実験物質を経口投与し、１時間後にＴＰＡを１μｇ／耳で右側耳に塗布した。このような過程を３日間繰り返した後、４日目にマウス耳の厚さを測定し、耳組織の面積当たり重さを測定した。
【００５５】
［製造例］
製造例１．山椒葉の抽出物、分画物及び活性化合物の分離
図１に示した工程図に基づき、山椒葉から抽出物、分画物及び活性化合物を分離する過程を説明すれば次のようである。
【００５６】
山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）は我が国の南部地方で採取した国産の山椒を入手した。山椒の葉を洗浄及び乾燥させた後、陰干し細切した。山椒の葉を９０％エタノール水溶液に浸漬し、室温で２〜５回繰り返し抽出した。抽出液を減圧蒸溜して山椒葉のエタノール抽出物を得た。
【００５７】
山椒葉のエタノール抽出物６８．８ｇを蒸溜水２Ｌに懸濁した後、同量のノルマルヘキサン、ジクロロメタン、エチルアセテート、ノルマルブタノール及び水で順に分画した後、減圧濃縮して各溶媒分画物を得た。得られた各溶媒分画物のそれぞれに対して抗炎症及び痛症抑制効能を確認し、その中で最も優れた活性を示すエチルアセテート分画物を選択した。
【００５８】
エチルアセテート分画物はシリカビード（Ｓｉｌｉｃａ  ｂｅａｄｓ）の充填されたガラスカラム（５５０ｃｍ）に充填してシリカゲルカラムクロマトグラフィーを実施した。ここで、溶出液としては、エチルアセテートとメタノールの混合溶液を使い、エチルアセテート／メタノールの体積比を９０／１０から６０／４０まで変化させながら溶出した。前記シリカゲルカラムクロマトグラフィーを行って７個の分画（ＺＰＥ１、ＺＰＥ２、ＺＰＥ３、ＺＰＥ４、ＺＰＥ５、ＺＰＥ６、ＺＰＥ７）を得た。収得した７個分画の分画時間（２分間隔で溶出）によるＲｆ値が同一である成分が現れる時間（ＭＰＬＣ、溶出溶液エチルアセテート／メタノール体積比９０：１０〜６０：４０）と収得量をまとめれば下記表１の通りである。
【００５９】
【表１】
2021503489.tif 000007
【００６０】
前記７個の分画のそれぞれに対して抗炎症及び痛症抑制効能を確認し、その中で最も優れた活性を示す分画ＺＰＥ６を選択した。分画ＺＰＥ６を減圧濃縮し、完全に乾燥させた後、ｓｅｐｈａｄｅｘ  ＬＨ−２０カラムに充填させて中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を実施した。ここで、溶出液としてはメタノール単独溶液を使って溶出し、１０分間隔で溶出液を受け、ＴＬＣで確認して同じＲｆ値を有する点が形成される部分のみ合わせ小分画を獲得した。前記中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）を実施して３個の小分画（ＺＰＥ６Ａ、ＺＰＥ６Ｂ、ＺＰＥ６Ｃ）を得た。収得した３個分画の分画時間と収得量をまとめれば下記表２の通りである。
【００６１】
【表２】
2021503489.tif 000008
【００６２】
前記３個の小分画のそれぞれに対して抗炎症及び痛症抑制効能を確認し、その中で最も優れた活性を示す小分画ＺＰＥ６Ｂを選択した。
【００６３】
小分画ＺＰＥ６Ｂはオクタデシル化シリカが充填された逆相カラムを用いるＨＰＬＣ（溶出液：メタノール／水＝５０／５０）を実施して活性成分１と活性成分２を分類した。
【００６４】
前記分離した活性成分１と活性成分２はそれぞれ核磁気共鳴分光分析で化学構造を求めた。
【００６５】
活性成分１：
1H-NMR (300 MHz, DMSO- d6) δ 0.9 (d, J = 6 Hz, CH3), 5.2 (d, J = 1.5 Hz, H-1"), 6.15 (d, J = 2.2 Hz, H-6), 6.36 (d, J = 2.2 Hz, H-8), 6.95 (d, J = 8.2 Hz, H-5'), 7.25 (dd, J = 2.2 Hz and J = 8.2 Hz, H-6'), 7.35 (d, J = 2.2 Hz, H-2'); 13C-NMR (75 MHz, DMSO- d6) δ 17.5 (C-6"), 70.0 (C-5"), 70.2 (C-3"), 70.5 (C-2"), 71.1 (C-4"), 93.6 (C-8), 98.6 (C-6), 101.8 (C-1"), 104.0 (C-10), 115.4 (C-2'), 115.6 (C-5'), 120.7 (C-6'), 121.1 (C-1'), 134.2 (C-3), 145.1 (C-3'), 148.3 (C-4'), 156.4 (C-2), 157.2 (C-9), 161.3 (C-5), 164.2 (C-7), 177.7 (C-4)
以上の分光分析結果に基づき、活性成分１は下記化学式１で表示されるケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドと確認された。活性成分１の分光分析結果はケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（クエルシトリン、Ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）の文献値とよく一致した。
【００６６】
【化１−３】
2021503489.tif 000009
【００６７】
活性成分２：
1H-NMR (300 MHz, DMSO- d6) δ 0.9 (d, J = 6 Hz, CH3), 5.29 (1H, d, J = 1.5 Hz, H-1"), 6.21 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), 6.42 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-1"), 6.21 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), 6.42 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-8), 6.91 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3' and H-5'), 7.74 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2' and H-6'); 13C-NMR (75 MHz, DMSO- d6) δ 17.4 (C-6"), 70.0 (C-5"), 70.2 (C-2"), 70.6 (C-3"), 71.0 (C-4"), 93.7 (C-8), 98.7 (C-6), 101.7 (C-1"), 104.0 (C-10), 115.3 (C-3', C-5'), 120.5 (C-1), 130.6 (C-2', C-6'), 134.2 (C-3), 156.5 (C-9), 157.2 (C-2), 159.9 (C-4'), 161.2 (C-5), 164.3 (C-4), 177.7 (C-7)
以上の分光分析結果に基づき、活性成分２は下記化学式２で表示されるケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドと確認された。活性成分２の分光分析結果はケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（アフゼリン、Ａｆｚｅｌｉｎ）の文献値とよく一致した。
【００６８】
【化２−３】
2021503489.tif 000010
【００６９】
実施例１．山椒部位別痛症抑制効能比較
山椒葉、幼い枝、実、幹、根の部位別に抽出物の痛症抑制効能を比較するために、前記製造例１による抽出方法で実施して９０％エタノール抽出物をそれぞれ得た。各抽出物に対しては酢酸誘導痛症モデルを用いて痛症抑制効能を測定し、その結果は下記表３に示した。
【００７０】
【表３】
2021503489.tif 000011
【００７１】
前記表３の結果によれば、山椒部位別に痛症抑制効能で格段な差を示しており、葉抽出物の効能が最も卓越した。葉抽出物の場合、実抽出物に比べて痛症抑制率が約２５．８％優れることが分かる。
【００７２】
実施例２．エタノール水溶液の濃度別痛症抑制効能比較
抽出溶液の濃度による山椒葉抽出物の痛症抑制効能を比較した。すなわち、０〜１００％濃度のエタノール水溶液を使い、前記製造例１による抽出方法で実施して山椒葉のエタノール抽出物をそれぞれ得た。そして、各抽出物に対しては、酢酸誘導痛症モデルを用いて痛症抑制効能を測定し、その結果は下記表４に示した。
【００７３】
【表４】
2021503489.tif 000012
【００７４】
前記表４の結果によれば、抽出に使用されたエタノール水溶液の濃度が増加するほど山椒葉抽出物の痛症抑制率が増加する傾向を示した。痛症抑制効能の面で見るとき、エタノール水溶液の濃度は５０％以上であることが好ましく、より好ましくは９０％以上のエタノール水溶液を使うことである。
【００７５】
実施例３．山椒葉分画物の痛症抑制効能比較
前記製造例１によって山椒葉エタノール抽出物を溶媒分画して収得した各溶媒分画物に対して痛症抑制効能を比較した。すなわち、９０％エタノール抽出物をノルマルヘキサン、ジクロロメタン、エチルアセテート、ノルマルブタノール及び水で順に分画して得た各分画物に対して酢酸誘導痛症モデルを用いて痛症抑制効能を測定し、その結果は下記表５に示した。
【００７６】
【表５】
2021503489.tif 000013
【００７７】
前記表５によれば、多くの溶媒分画物の中でエチルアセテート分画物が最も優れた痛症抑制効果を示した。
【００７８】
実施例４．エチルアセテート小分画物の痛症抑制効能比較
前記製造例１によってエチルアセテート分画物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーして収得した７個の小分画に対して痛症抑制効能を比較した。すなわち、ＺＰＥ１、ＺＰＥ２、ＺＰＥ３、ＺＰＥ４、ＺＰＥ５、ＺＰＥ６、ＺＰＥ７に分類された小分画に対しては酢酸誘導痛症モデルを用いて痛症抑制効能を測定し、その結果は下記表６に示した。
【００７９】
【表６】
2021503489.tif 000014
【００８０】
前記表６によれば、エチルアセテート小分画物の中でも６番目の小分画物（ＺＰＥ６）が最も優れた痛症抑制効果を示した。
【００８１】
実施例５．ＺＰＥ６小分画物の痛症抑制効能比較
前記製造例１で収得したＺＰＥ６分画を中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）で分離して収得した３個の小分画物に対して痛症抑制効能を比較した。すなわち、ＺＰＥ６Ａ、ＺＰＥ６Ｂ、ＺＰＥ６Ｃに分類された小分画に対しては酢酸誘導痛症モデルを用いて痛症抑制効能を測定し、その結果は下記表７に示した。
【００８２】
【表７】
2021503489.tif 000015
【００８３】
前記表７によれば、ＺＰＥ６の小分画物の中でも２番目の小分画物（ＺＰＥ６Ｂ）が最も優れた痛症抑制効果を示した。
【００８４】
実施例６．ＺＰＥ６Ｂ小分画物から分離した有効成分の痛症抑制効能比較
前記製造例１で収得したＺＰＥ６Ｂ分画から化学式１及び２で表示される２個の活性成分ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（クエルシトリン、Ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）とケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（アフゼリン、Ａｆｚｅｌｉｎ）を分離し、これに対して痛症抑制効能を比較した。すなわち、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（クエルシトリン、Ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）とケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（アフゼリン、Ａｆｚｅｌｉｎ）に対して酢酸誘導痛症モデルを用いて痛症抑制効能を測定し、その結果は下記表８に示した。
【００８５】
【表８】
2021503489.tif 000016
【００８６】
前記表８によれば、化学式１及び２で表示される活性成分であるケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（クエルシトリン、Ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）とケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド（アフゼリン、Ａｆｚｅｌｉｎ）はいずれも酢酸誘導痛症モデルで優れた痛症抑制率を示した。特に、小分画物ＺＰＥ６Ｂから分離されたアフゼリンは痛症抑制率が非常に優れた。
【００８７】
前記表８の結果によれば、前記製造例１で中圧液体クロマトグラフィー（ＭＰＬＣ）で分離した３個の小分画物の中でＺＰＥ６Ｂが鎮痛効果で優れた。これは、ＺＰＥ６Ｂにはアフゼリンなどの痛症抑制活性の優れた化合物が多量含まれていることにその理由があると判断される。
【００８８】
実施例７．ＺＰＥ６Ａ及びＺＰＥ６Ｃ小分画物のＧＣ−ＭＳ分析比較
前記製造例１で分離した３個の小分画物の中でＺＰＥ６Ａ及びＺＰＥ６Ｃの場合はＺＰＥ６Ｂより鎮痛効果が低く現れたが、他の分画物又は対照群と比較すれば鎮痛効能が優れると判断される。下記表９には小分画ＺＰＥ６Ａ及びＺＰＥ６Ｃに含まれた活性成分を分析するために、ＧＣ−ＭＳ分析結果を示した。
【００８９】
【表９】
2021503489.tif 000017
【００９０】
前記表９のＧＣ−ＭＳ分析結果によれば、ＺＰＥ６Ａ又はＺＰＥ６Ｃ分画物中には下記化学式３で表示される４’−ヒドロキシアセトフェノン、下記化学式４で表示される２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、下記化学式５で表示される１，２−ベンゼンジカルボン酸が含有されていることが確認される。
【００９１】
【化３】
2021503489.tif 000018
【００９２】
【化４】
2021503489.tif 000019
【００９３】
【化５】
2021503489.tif 000020
【００９４】
また、ＺＰＥ６Ａ又はＺＰＥ６Ｃ分画物から分離した４’−ヒドロキシアセトフェノン、２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、１，２−ベンゼンジカルボン酸に対して酢酸誘導痛症モデルを用いて痛症抑制効能を測定し、その結果は図３に示した。
【００９５】
図３によれば、４’−ヒドロキシアセトフェノン、２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール及び１，２−ベンゼンジカルボン酸も痛症抑制効能が優れることを確認することができ、その中でも４’−ヒドロキシアセトフェノンは痛症抑制効能が非常に優れることを確認することができる。
【００９６】
実施例８．抽出条件による活性化合物の含量比較
前記製造例１による山椒葉の抽出物を収得する過程で、抽出溶媒と温度条件を変化させながらそれぞれの抽出物を得た。そして、各抽出物に対しては活性化合物（クエルシトリン、アフゼリン）の含量をＨＰＬＣに分析し、酢酸誘導痛症モデルを用いて痛症抑制率を測定し、その結果は下記表１０に示した。
【００９７】
［抽出条件］
条件１）９０％エタノール抽出物（非加熱）、
条件２）９０％エタノール抽出物（加熱）、
条件３）加熱方式を用いた９０％エタノール抽出物を遠心分離してエマルジョンを除去した物質。
条件４）９０％エタノール抽出物をジクロロメタンで分画した分画物、
条件５）９０％エタノール抽出物をジクロロメタンで分画した分画物を除いた残留物、
条件６）ノルマルヘキサン抽出物、
条件７）ノルマルヘキサン抽出物を９０％エタノールで抽出したエタノール抽出物、
条件８）ジクロロメタン抽出物、
条件９）ジクロロメタン抽出物を９０％エタノールで抽出したエタノール抽出物。
【００９８】
【表１０】
2021503489.tif 000021
【００９９】
前記表１０によれば、抽出条件によっては活性化合物の含量が変わることができることが分かる。本発明が提案するように、条件１、２及び３によって抽出して得たアルコール抽出物は活性化合物の含量が非常に高くて痛症抑制率も効果的に抑制した。
【０１００】
実施例９．山椒葉抽出物の鎮痛効果
前記製造例１で収得した山椒葉の９０％エタノール抽出物に対して、多くの動物モデルを用いて鎮痛効能を測定した。
【０１０１】
図４には（Ａ）テイルフリック試験法、（Ｂ）熱板試験法、（Ｃ）ホルマリン試験法によって山椒葉抽出物の鎮痛効果を測定した結果が示されている。図４によれば、本発明による山椒葉抽出物は鎮痛抑制効能に優れることが分かる。痛症は痛症を誘発する刺激が感覚を担当する神経を介して脊椎と脳に伝達されて痛みを感じさせるものであり、皮膚、筋肉、骨に係わる体性痛、内部臓器に係わる内蔵痛、及び該当臓器を支配する神経と同一の脊椎神経節に入る感覚神経部位に痛症が感じられる神経障害性の痛みなどに区分される。よって、図４に提示された試験法は、急性痛症、晩成痛症、中枢神経系に作用する痛症、末梢神経系に作用する痛症のいずれにも山椒葉抽出物の鎮痛効果があり、炎症による治療効果に限定されない皮膚、筋肉、骨、臓器などの物理的損傷、圧迫、ストレスによる痛症に対する抑制効果があることを意味する。
【０１０２】
実施例１０．山椒葉抽出物の抗炎症効果
前記製造例１で収得した山椒葉の９５％エタノール抽出物に対して、酵素免疫測定法、逆転写−ＰＣＲ分析法、免疫ブロット分析法を用いて抗炎症効能を測定した。
【０１０３】
図５には、免疫測定法によって山椒葉抽出物の処置量０、２５、５０、１００μｇ／ｍＬでＢＤＮＦ発現量を調査した結果が示されている。山椒葉抽出物の処理量が増加するほどＢＤＮＦ発現量が減少する傾向を示した。その結果、山椒葉抽出物１００μｇ／ｍＬで最高の抗炎症活性を示すことを確認することができた。
【０１０４】
図６には、（Ａ）逆転写−ＰＣＲ分析法と（Ｂ）免疫ブロット分析法を用いて測定した炎症指標因子の発現抑制効果を測定した結果が示されている。図６によれば、山椒葉抽出物を処理した群では、リポ多糖類（ＬＰＳ）によって過発現したｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６の炎症指標因子の発現抑制が効果的になされたことが分かる。
【０１０５】
実施例１１．山椒葉抽出物の亜慢性耳腫脹モデルの抗炎症効果
ＴＰＡによって耳腫脹が誘導されたマウスモデルに山椒葉抽出物を２５、５０、１００ｍｇ／ｋｇ濃度で経口投与した後、抗炎症効能を測定した結果が図７に示されている。
【０１０６】
ＴＰＡによって耳の厚さ及び重さが共に確実に増加し、山椒葉抽出物を経口投与することにより耳腫脹の厚さ及び重さが効果的に減少したことを確認することができた。このような抗炎症効果は山椒葉抽出物の処理量が増加するほどその効能も増加する傾向を示した。免疫化学染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）による組織免疫学的分析結果を調べたとき、山椒葉抽出物は免疫細胞の組織内への浸透を効果的に抑制することを確認することができる。
【０１０７】
実施例１２：山椒葉抽出物のリウマチ関節炎治療効果
リウマチ関節炎治療効能を調べるための方法の一つによって、コラーゲンで誘導された関節炎動物モデルにおいて各試験物質の抗リウマチ効能を測定した。実験動物は５週齢ＤＢＡ／１Ｊマウス（中央実験動物、ソウル）を購入し、湿度５０％、温度２４〜２６℃で１週間維持される飼育場で純化させ、飼料及び水は自由に摂取するように供給した。関節炎を誘導するために、第２型コラーゲンとＣＦＡ（ｃｏｍｐｌｅｔｅ  Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ  ａｄｊｕｖａｎｔ）を混合して乳状液を得た。ＤＢＡ／１Ｊマウスの胴体から２〜３ｃｍ離れたしっぽの下側部に２００μＬの乳状液を皮下（ｉｄ）注射し、１次抗原露出から２１日後、同量の乳状液を最初の注射と同一の方法でしっぽの下側部に１５０μＬの２次注射で実施した。最初抗原露出２２日後から陽性対照群はデキサメタゾン（Ｄｅｘａｍｅｔｈａｓｏｎｅ）を１ｍｇ／ｋｇ容量で経口投与し、山椒葉抽出物投与群は１００ｍｇ／ｋｇで３週間経口投与した後、リウマチ関節炎病変を肉眼で観察して等級化し、これに対する関節炎改善効能を臨床点数（Ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｃｏｒｅ）で測定した。
【０１０８】
前記方法で測定した肉眼臨床点数は下記表１１に示した。
【０１０９】
【表１１】
2021503489.tif 000022
【０１１０】
前記表１１に示したように、対照群の平均点数が１１．８であるのに対し、山椒葉抽出物投与群の平均点数は８点と非常に低いことが分かる。陽性対照群であるデキサメタゾン投与群の平均点数が６．３点である点を勘案すれば、山椒葉抽出物はリウマチ関節炎治療剤として有効であることが分かる。
【０１１１】
また、図８には、マイクロＣＴを用いて後ろ足の足首関節を３Ｄイメージ上で分析した結果が示されている。対照群は、関節の骨形状が不規則に変わって炎症による骨の破壊がよほど進んだことを確認することができる。これに対し、山椒葉抽出物投与群は骨の破壊や変形が著しく減少したことを３Ｄイメージ上で観察することができ、デキサメタゾン投与群に比べても関節炎治療効能がほとんど同一であることを確認することができる。
【０１１２】
実施例１３．骨関節炎誘導された動物モデルの治療効果
骨関節炎治療効能を調べるための方法の一つによって、コラゲナーゼで誘導された関節炎に対する試験物質の改善効能を測定した。実験動物は５週齢ＳＤラット（中央実験動物、ソウル）を購入し、湿度５０％、温度２４〜２６℃で１週間維持される飼育場で純化させ、飼料及び水は自由に摂取するように供給した。関節炎を誘導するために、４ｍｇ／ｍＬの第２型コラゲナーゼをラットの右側関節の関節包に０．０５ｍＬ注射し（０ｄａｙ）４日後に始めた。コラゲナーゼ注射後に蒸溜水を投与した正常対照群、骨関節炎誘導対照群、陽性対照群にセレコクシブ（１０ｍｇ／ｋｇ）、山椒葉抽出物（３００ｍｇ／ｋｇ）を毎日１回経口投与した。７週後、関節部分を組織病理して観察した結果は図９に示した。
【０１１３】
図９によれば、山椒葉抽出物投与群は７週後に炎症部位が格段に減少し、セレコクシブ投与群に比べてその効果が卓越することを確認することができる。
【０１１４】
実施例１４．骨関節炎誘導された動物モデルの治療効果
骨関節炎は軟骨細胞の代謝異常によって発生し、軟骨損傷に関与する酵素は、代表的にマトリックスメタロプロテイナーゼ（ｍａｔｒｉｘ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；ＭＭＰｓ）、メタロプロテイナーゼ組織阻害剤（ｔｉｓｓｕｅ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ  ｏｆ  ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ；ＴＩＭＰｓ）がある。ＭＩＡ（Ｍｏｎｏｓｏｄｉｕｍ  Ｉｏｄｏａｃｅｔａｔｅ）投与によって誘発された骨関節炎動物モデルは軟骨細胞の代謝を妨げて膝関節の軟骨損傷を誘導したものであり、骨関節炎と類似した症状が現れる。
【０１１５】
図１０には、ＭＩＡによって誘発された骨関節炎動物モデルにおいてＭＭＰ−２、ＭＭＰ−３、ＴＩＭＰ−１及びＴＩＭＰ−２の生化学的指標変化を確認した結果が示されている。図１０によれば、山椒葉抽出物と活性化合物（クエルシトリン、アフゼリン）は骨関節炎治療効果に優れたことが分かり、特にアフゼリンは骨関節炎治療効果に卓越することを確認することができる。
【０１１６】
実施例１５．山椒葉抽出物と活性物質の痛症抑制作用機序の解明
関節炎など各種の炎症及び痛症の抑制作用機序を解明するために脳小グリア細胞であるＢＶ−２細胞を用いてＰＣＲ配列を観察した。実験群は山椒葉抽出物と活性化合物であるクエルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）、アフゼリン（ａｆｚｅｌｉｎ）に分けて実施した。
【０１１７】
図１１には、脳小グリア細胞であるＢＶ−２細胞に対して山椒葉抽出物、クエルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）及びアフゼリン（ａｆｚｅｌｉｎ）で処理した後、タンパク質ＫＣＮＪ６の発現程度を確認したグラフが示されている。また、図１２には、脳小グリア細胞であるＢＶ−２細胞のポタシウム（Ｋ+）電流密度を測定したグラフが示されている。
【０１１８】
前記図１１及び図１２の結果によれば、Ｋ+開閉調節タンパク質であるＫＣＮＪ６の発現程度が増加するにつれてＫ+電流密度も増加する傾向を示すことを確認することができる。すなわち、ポタシウム（Ｋ+）電流密度を減少させることによって誘発された痛症疾患は、山椒葉抽出物、クエルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）又はアフゼリン（ａｆｚｅｌｉｎ）を処理してポタシウム（Ｋ+）電流密度が増加することによって治療されることを確認することができる。
【０１１９】
実施例１６．コラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）のリウマチ関節炎改善効果
コラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）に対して山椒葉抽出物又は活性化合物（クエルシトリン、アフゼリン）を処置した後、ＮＫ細胞（自然殺害細胞）を分離し、ＩＦＮ−γ細胞の発現量を測定してリウマチ関節炎の治療効果を確認した。
【０１２０】
ＩＦＮ−γは免疫刺激によってＴ細胞又はＮＫ細胞で生成されるサイトカインであり、コラーゲン誘導動物はＩＦＮ−γ細胞の発現が増加する傾向を示す。図１３はコラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）に対して山椒葉抽出物又は活性化合物（クエルシトリン、アフゼリン）を処置した後に測定されたＮＫ細胞のＩＦＮ−γ生成量を示すグラフである。図１３によれば、コラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）に比べ、山椒葉抽出物又は活性化合物（クエルシトリン、アフゼリン）を処置した実験群はＮＫ細胞のＩＦＮ−γの発現量が著しく減少したことを確認することができる。
【０１２１】
実施例１７．コラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）のリウマチ関節炎改善効果
コラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）に対して山椒葉抽出物又は活性化合物（クエルシトリン、アフゼリン）を処置した後、Ｔ細胞のＩＬ−６、ＴＨ１７細胞のＩＬ−１７、ＩＬ−２１及びＩＬ−２２の発現量を測定してリウマチ関節炎の治療効果を確認した。
【０１２２】
リウマチ関節炎は人体の多くの関節でひどい痛症を伴う炎症性疾患であり、リウマチ関節炎患者の関節部位には炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１及びＩＬ−２２）が多量存在する。図１４はコラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）に山椒葉抽出物又は活性化合物（クエルシトリン、アフゼリン）を処置した後に測定された炎症促進性サイトカイン（ＩＬ−６、ＩＬ−１７、ＩＬ−２１及びＩＬ−２２）の発現量を示すグラフである。図１４によれば、コラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）に比べ、山椒葉抽出物又は活性化合物（クエルシトリン、アフゼリン）を処置した実験群はＴ細胞から分泌されるＩＬ−６の発現量が減少し、ＴＨ１７細胞から分泌されるＩＬ−１７、ＩＬ−２１及びＩＬ−２２の発現量が著しく減少したことを確認することができる。
【０１２３】
実施例１８．自己免疫治療効果
炎症促進性サイトカインを抑制する場合、アトピーなどの自己免疫疾患が抑制されることが報告されている。したがって、本実施例は、肥満細胞ＲＢＬ−２Ｈ３を対象として山椒葉抽出物又は活性化合物（クエルシトリン、アフゼリン）を処理してβ−ヘキソサミニダーゼ（β−ｈｅｘｏｓａｍｉｎｉｄａｓｅ）の分泌抑制能を確認した。すなわち、山椒葉抽出物又は活性化合物（クエルシトリン、アフゼリン）に対して肥満細胞脱顆粒化抑制効能を確認した。その結果は下記表１２に示した。
【０１２４】
【表１２】
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【０１２５】
前記表１２によれば、抗ヒスタミン剤として知られたケトチフェン（ｋｅｔｏｔｉｆｅｎ）薬物に比べ、ＲＢＬ−２Ｈ３細胞に対する脱顆粒化抑制効果に優れることが分かる。処置容量１００μｇ／ｍＬで、ケトチフェン薬物に比べ、山椒葉抽出物は約７０％、クェシトリンは約５０％、アフゼリンは９３％の脱顆粒化抑制能を示した。そして、処置容量２５μｇ／ｍＬで、ケトチフェン薬物に比べ、山椒葉抽出物は約６３％、クェシトリンは約７０％、アフゼリンは１９５％の脱顆粒化抑制能を示した。
【０１２６】
［参考例］
本発明は山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）葉抽出物の痛症抑制及び抗炎症効能を基にする薬剤組成物又は健康食品組成物を特徴とする発明である。また、従来の発明として、韓国登録特許第１０−１３６３３１１号には、犬山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｓｃｈｉｎｉｆｏｌｉｕｍ）抽出物の潰瘍性大腸炎の治療及び予防効能が開示されている。
【０１２７】
山椒と犬山椒は山椒属（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｓｐ．）に属する植物であり、同一乃至類似の植物として取り扱われることもできると判断される。したがって、本参考例では、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の葉抽出物と犬山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｓｃｈｉｎｉｆｏｌｉｕｍ）の実抽出物の含有成分が実質的に明らかに異なる別個の抽出物であることを多くの分析結果に基づいて立証する。
【０１２８】
（１）山椒の葉抽出物と犬山椒の実抽出物のＧＣ−ＭＳ分析比較
山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の葉と犬山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｓｃｈｉｎｉｆｏｌｉｕｍ）の実を９０％エタノール水溶液で抽出し、得られた各抽出物に対してＧＣ−ＭＳ分析を行った。下記表１３には、山椒の葉抽出物と犬山椒の実抽出物に対してＧＣ−ＭＳ分析を行った結果をまとめて示した。
【０１２９】
【表１３】
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【０１３０】
前記表１３に示したように、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の葉抽出物と犬山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｓｃｈｉｎｉｆｏｌｉｕｍ）の実抽出物は共通の含有成分がほとんどなく、含有成分の構成が明らかに異なることを確認することができる。
【０１３１】
また、山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｐｉｐｅｒｉｔｕｍ）の葉抽出物及び実抽出物と犬山椒（Ｚａｎｔｈｏｘｙｌｕｍ  ｓｃｈｉｎｉｆｏｌｉｕｍ）の実抽出物に対して末梢神経系と中枢神経系の鎮痛効果を同時に調べるために、ホルマリン試験法で鎮痛効能を測定し、その結果は下記表１４に示した。
【０１３２】
【表１４】
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【０１３３】
下記表１４によれば、山椒葉抽出物は山椒実抽出物又は犬山椒実抽出物よりその効果が明らかに優れることを確認することができる。
【０１３４】
［製剤例］
下記製剤例では、本発明の抽出物、分画物又は活性化合物（クェルシトリン（ｑｕｅｒｃｉｔｒｉｎ）とアフゼリン（ａｆｚｅｌｉｎ）又はその混合物）を有効成分として含む薬学的組成物又は健康食品組成物の製造例を説明した。下記製剤例は本発明を具体的に説明するためのものであり、これによって本発明が限定されるものではない。
【０１３５】
製剤例１．薬学的組成物の製造
（１）錠剤の製造
エタノール５０ｇにポビドン１０ｇを溶かして結合液を調剤した後、有効成分１５０ｇを結合液に入れ、均質に撹拌した。ケイ素化微結晶セルロース１３０ｇ、クロスカルメロースナトリウム１５ｇ、コロイドシリコンジオキシド２０ｇを混合した後、有効成分と均質に撹拌させた結合液を投入して顆粒工程を進めた後、顆粒物を乾燥及び整粒した。製造された顆粒物にクロスポビドン１５ｇを入れて混合し、コロイドシリコンジオキシド３．５ｇとステアリン酸マグネシウム６．５ｇを入れ、滑沢工程を進めた後、錠剤に作った。
【０１３６】
（２）錠剤の製造
エタノール５０ｇにポビドン１９ｇを溶かして結合液を調剤した後、有効成分１５０ｇを結合液に入れて均質に撹拌した。ケイ素化微結晶セルロース１４３ｇ、クロスカルメロースナトリウム１５ｇ、ノイシリン２０ｇを混合した後、有効成分と均質に撹拌させた結合液を投入して顆粒工程を進めた後、顆粒物を乾燥及び整粒した。製造された顆粒物にクロスポビドン１５ｇを入れて混合し、コロイドシリコンジオキシド５ｇとステアリン酸マグネシウム８ｇを入れ、滑沢工程を進めた後、錠剤に作った。
【０１３７】
（３）錠剤の製造
エタノール５０ｇにポビドン１２．５ｇを溶かして結合液を調剤した後、有効成分１５０ｇを結合液に入れて均質に撹拌した。ケイ素化微結晶セルロース６２．５ｇ、乳糖水和物６５ｇ、クロスカルメロースナトリウム１５ｇ、コロイドシリコンジオキシド２０ｇを混合した後、有効成分と均質に撹拌させた結合液を投入して顆粒工程を進めた後、顆粒物を乾燥及び整粒した。製造された顆粒物にクロスポビドン１５ｇを入れて混合し、コロイドシリコンジオキシド３．５ｇとステアリン酸マグネシウム６．５ｇを入れ、滑沢工程を進めた後、錠剤に作った。
【０１３８】
（４）錠剤の製造
エタノール３３．５ｇにポビドン１９ｇを溶かして結合液を調剤した後、有効成分１５０ｇを結合液に入れて均質に撹拌した。ケイ素化微結晶セルロース１０５ｇ（主成分が含んでいるエタノールの量だけケイ素化微結晶セルロースの量を追加する）、クロスカルメロースナトリウム１７．５ｇ、ノイシリン２０ｇを混合した後、有効成分と均質に撹拌させた結合液を投入して顆粒工程を進めた後、顆粒物を乾燥及び整粒した。製造された顆粒物にクロスポビドン１７．５ｇとケイ素化微結晶セルロース３３ｇを入れて混合し、コロイドシリコンジオキシド７．５ｇとステアリン酸マグネシウム８ｇを入れ、滑沢工程を進めた後、錠剤に作った。
【０１３９】
（５）コーティング錠の製造
前記製剤例１〜４で製造した錠剤７５５ｍｇ（有効成分３００ｍｇ含む）を通常のペンコーティングシステム（ＯｐａｄｒｙTM、Ｏｐａｄｒｙ２００TM又はＯｐａｇｌｏｓTM）を用いてコーティング錠を製造した
製剤例２．健康食品の製造
（１）飲料の製造
有効成分１０００ｍｇ、クエン酸１０００ｍｇ、オリゴ糖１００ｇ、タウリン１ｇを混合し、これに精製水を加えて総体積が９００ｍｌになるようにした。約１時間の間に８５℃で撹拌加熱した後、作られた溶液を濾過し、滅菌された２ｌリットル容器にいれ、密封滅菌して飲料を製造した。
【０１４０】
［実験例］
実験例１．錠剤の崩壊度測定
前記製剤例１の（５）で製造した錠剤７５５ｍｇ（有効成分３００ｍｇ含む）を１２個準備した。薬典の崩壊試験法によって試験し、５分間隔で崩壊された精製の個数を確認して下記表１５に示した。１２個の錠剤が完全に崩壊されるまで試験を実施した。
【０１４１】
【表１５】
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【０１４２】
実験例２．打錠の摩損度測定
前記製剤例１の（５）で製造した錠剤７５５ｍｇ（有効成分３００ｍｇ含む）を硬度１０〜１２ｋｐ、１２〜１４ｋｐ、１４ｋｐ以上で打錠した。打錠の摩損度を測定した結果、１０ｋｐ以上の硬度で摩損度０．１％以下の数値を示した。
【０１４３】
実験例３．錠剤の物性測定
前記製剤例１の（５）で製造した錠剤７５５ｍｇ（有効成分３００ｍｇ含む）の流動性を確認するために、嵩密度（ｂｕｌｋ  ｄｅｎｓｉｔｙ）、タップ密度（Ｔａｐｐｅｄ  ｄｅｎｓｉｔｙ）、ハウスナー比（Ｈａｕｓｎｅｒ  ｒａｔｉｏ）、圧縮性指数（Ｃｏｍｐｒｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ  ｉｎｄｅｘ）、安息角（Ａｎｇｌｅ  ｏｆ  ｒｅｐｏｓｅ）をそれぞれ測定した。その結果は下記表１６に示した。
【０１４４】
【表１６】
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【０１４５】
【図１】
2021503489.tif 000030
【図２】
2021503489.tif 000031
【図３】
2021503489.tif 000032
【図４ａ】
2021503489.tif 000033
【図４ｂ】
2021503489.tif 000034
【図４ｃ】
2021503489.tif 000035
【図５】
2021503489.tif 000036
【図６】
2021503489.tif 000037
【図７】
2021503489.tif 000038
【図８】
2021503489.tif 000039
【図９】
2021503489.tif 000040
【図１０】
2021503489.tif 000041
【図１１】
2021503489.tif 000042
【図１２】
2021503489.tif 000043
【図１３】
2021503489.tif 000044
【図１４】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年4月24日(2020.4.24)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１４】
【図１】山椒葉抽出物から溶媒分画物及び活性化合物を収得する過程を示す工程図である。
【図２】（Ａ）ＺＰＥ６Ａと（Ｂ）ＺＰＥ６Ｃ小分画物のＧＣ−ＭＳスペクトラムである。
【図３】ＺＰＥ６Ａ又はＺＰＥ６Ｃ分画物から分離した４’−ヒドロキシアセトフェノン、２，４−ジ−ｔｅｒｔ−ブチルフェノール、１，２−ベンゼンジカルボン酸に対して痛症抑制効能を確認したグラフである。
【図４】（Ａ）テイルフリック試験法、（Ｂ）熱板試験法、（Ｃ）ホルマリン試験法によって山椒葉抽出物の痛症抑制効能を確認したグラフである。
【図５】山椒葉抽出物のＢＶ−２小グリア細胞で測定されたＢＤＮＦ発現様相を酵素免疫測定法を用いて測定したものである。
【図６】（Ａ）逆転写−ＰＣＲ分析法、（Ｂ）免疫ブロット分析法によって山椒葉抽出物に対する炎症指標因子ｉＮＯＳ、ＣＯＸ−２、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６の発現抑制効果を確認したグラフである。
【図７】亜慢性耳腫脹モデルの山椒葉抽出物の抗炎症効果を確認した結果であり、(ａ)：厚さ、(ｂ)：打ち抜き物の平均重量、(ｃ)：Ｈ＆Ｅ染色イメージ、である。
【図８】コラーゲン誘導リウマチ関節炎モデル（ＣＩＡ）で確認された山椒葉抽出物のリウマチ関節炎治療効果を確認した３Ｄイメージである。
【図９】コラゲナーゼ誘導骨関節炎モデルで確認された山椒葉抽出物の骨関節炎治療効果を確認したＨ＆Ｅ染色イメージである。
【図１０】骨関節炎モデルで確認された山椒葉抽出物、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド及びケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドのそれぞれに対して（Ａ）ＭＭＰ−２、（Ｂ）ＭＭＰ−３、（Ｃ）ＴＩＭＰ−１及び（Ｄ）ＴＩＭＰ−２の生化学的指標変化を確認したグラフである。
【図１１】ＢＶ−２小グリア細胞で山椒葉抽出物、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド又はケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドを処置した後、Ｋ＋開閉調節タンパク質（ＫＣＮＪ６）の発現程度を確認したグラフである。
【図１２】ＢＶ−２小グリア細胞でポタシウム（Ｋ＋）電流密度を測定したグラフである。
【図１３】コラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）における山椒葉抽出物、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドとケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド処置後、ＮＫ細胞のＩＦＮ−γ発現量を測定したグラフである。
【図１４】コラーゲン誘導動物モデル（ＣＩＡ）における山椒葉抽出物、ケルセチン−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシドとケンペロール−３−Ｏ−アルファ−Ｌ−ラムノシド処置後、Ｔ細胞及びＴＨ１７細胞で炎症促進性サイトカイン（Ａ：ＩＬ−６、Ｂ：ＩＬ−１７、Ｃ：ＩＬ−２１及びＤ：ＩＬ−２２）の発現量を測定したグラフである。
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４ｃ
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図４ｃ】
2021503489.tif 000046
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図７】
2021503489.tif 000047
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【図１３】
2021503489.tif 000048
【国際調査報告】
2021503489.tif 000049
2021503489.tif 000050
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