(57)【要約】  本出願は、デジタルＰＣＲ検出器、デジタルＰＣＲ定量検出方法、異なる体積のデジタルＰＣＲの定量解析方法、デジタルＰＣＲ検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、試薬キット及びハイスループット核酸検出方法を提供する。【選択図】図1
2021511074.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するように配置される微小液滴生成装置と、
前記微小液滴生成装置にレールを介して接続され、前記複数の微小液滴を前記温度制御装置に移転し、温度の循環で核酸増幅を実現するように配置される温度制御装置と、
前記温度制御装置に対向配置され、核酸増幅された前記複数の微小液滴を撮影して検出するように配置され、微小液滴に複数の蛍光チャネルでイメージングを行い、かつ、明視野・暗視野でイメージングし、そのうち、複数の蛍光チャネルによるイメージングは、微小液滴の反応信号を検知するように配置され、明視野・暗視野によるイメージングは、微小液滴を形成するサイズの情報を検出し、反応工程において液滴の状態をモニターするように配置される、蛍光信号検出装置と、
前記蛍光信号検出装置にデータ線を介して接続され、前記複数の微小液滴の蛍光情報を送信し、定量解析するように配置される定量解析装置と、
前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置、蛍光信号検出装置及び定量解析装置にそれぞれ接続され、前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置、前記蛍光信号検出装置及び前記定量解析装置を制御するように配置される制御器と、を含む、デジタルＰＣＲ検出器。
【請求項２】
前記微小液滴生成装置は、
出口端及び入口端を有し、第一の液体を貯留するための液体吐出ピペットチップと、
前記液体吐出ピペットチップの入口端に接続され、前記液体吐出ピペットチップの内部に貯留されている第一の液体を前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出するための流体駆動機構と、
前記液体吐出ピペットチップの出口端が第二の液体に対して、所定軌跡、所定速度又は所定加速度で、対向運動し、前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出された第一の液体が表面張力及び付着力に打ち勝ち、微小液滴を形成するように制御するための運動制御機構と、
前記流体駆動機構及び前記運動制御機構にそれぞれ接続され、前記流体駆動機構及び前記運動制御機構の稼働を制御するための第一の制御器と、を含むことを特徴とする請求項１に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項３】
前記流体駆動機構は、
液体入出口を有し駆動液体を貯留するシリンジ及び押しロッドを含み、前記押しロッドは、前記シリンジの内壁と可動に協働され、前記液体入出口が第一の液体を貯留する液体吐出ピペットチップの入口端に連通される容積可変アセンブリと、
前記押しロッドに伝動可能に接続され、前記押しロッドが前記シリンジの伸長方向に沿って摺動するように駆動するパワーアセンブリと、
駆動液体を貯留する貯液タンクと、
前記液体吐出ピペットチップの入口端、前記液体入出口及び前記貯液タンクに、それぞれ連通される第一のポート、第二のポート及び第三のポートを有する、三方切替弁と、ことを特徴とする請求項２に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項４】
前記液体吐出ピペットチップは、中空のキャビティを有する針軸、及び、前記針軸の一方端に配置される出口端を含む、ことを特徴とする請求項２に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項５】
前記運動制御機構は、
支持フレームと、
液体吐出ピペットチップに接続されるための接続手段と、
前記支持フレームに固定され、前記接続手段に伝動可能に接続される駆動素子と、を含み、
液体吐出ピペットチップの出口端が、前記駆動素子の駆動により、第二の液体に対して正弦波状に変位し、又は、方形波状に変化する速度で、対向運動を行う、ことを特徴とする請求項２に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項６】
前記温度制御装置は、
フレキシブル回路基板と、
対向配置される第一の表面及び第二の表面を含み、前記フレキシブル回路基板と間隔配置される加熱基板と、
前記フレキシブル回路基板と前記第一の表面との間に配置され、前記複数の半導体熱電対が互いに直列接続され、並列接続、又は、直並列接続される複数の半導体熱電対と、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項７】
前記温度制御装置は、
前記複数の半導体熱電対に電気接続され、電流の大きさを制御するための第二の制御器と、
前記加熱基板の表面に配置され、前記第二の制御器に電気接続され、前記加熱基板の温度を検出して前記第二の制御器に送信するための温度センサーと、をさらに含むことを特徴とする請求項６に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項８】
前記蛍光信号検出装置は、
前記微小液滴容器の検出領域の上方に配置され、前記微小液滴容器の検出領域に傾斜して照射して、傾斜照射光路を形成する励起光源と、
前記微小液滴容器の検出領域の直上に配置され、前記複数の微小液滴の蛍光画像及び明視野・暗視野の画像を採集するための蛍光検知アセンブリと、
前記励起光源及び前記蛍光検知アセンブリにそれぞれ接続され、前記励起光源及び前記蛍光検知アセンブリを制御するための第三の制御器と、を含むことを特徴とする請求項１に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項９】
前記励起光源は、
各先端に、それぞれ、コリメータミラー及び第一の光学フィルターが順次に設けられる複数の異なる色のＬＥＤ光源と、
前記第一の光学フィルターの先端に傾斜配置され、各前記ＬＥＤ光源から放射された光を一つの光路に屈折するためのダイクロイックミラーと、
屈折された前記光路の均一性を向上させるための複眼レンズと、
前記複眼レンズの先端に配置され、照明スポットを集光して形成するための集光レンズと、ことを特徴とする請求項８に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項１０】
前記蛍光検知アセンブリは、対物レンズ、カメラ及び第二の光学フィルターを含み、前記対物レンズは、前記カメラと前記第二の光学フィルターとの間に配置されることを特徴とする請求項８に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項１１】
前記制御器は、前記第一の制御器、前記第二の制御器及び前記第三の制御器にそれぞれ接続され、前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置、前記蛍光信号検出装置及び前記定量解析装置の稼働を制御するために用いられる、ことを特徴とする請求項１に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項１２】
検出すべき核酸増幅反応液を製造するステップＳ１０と、
前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するステップＳ２０と、
前記複数の微小液滴に核酸を増幅し、前記複数の微小液滴の蛍光情報をリアルタイムで取得するステップＳ３０と、
前記複数の微小液滴の蛍光情報に基づいて、前記複数の微小液滴を定量解析するステップＳ４０と、を含む、デジタルＰＣＲ検出器の解析方法。
【請求項１３】
微小液滴の全てについて、複数の蛍光画像をリアルタイムで取得し、前記リアルタイムの複数の蛍光画像に基づいて、核酸増幅すべき微小液滴に蛍光曲線をリアルタイムで取得するステップＳ４１１０と、
前記リアルタイムの蛍光曲線に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全てについてＣｔ値を取得するステップＳ４１２０と、
前記Ｃｔ値と核酸増幅された微小液滴の核酸初期コピー数との関係に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全てについて核酸初期コピー数を取得するステップＳ４１３０と、
前記核酸増幅された微小液滴の全てについて、核酸初期コピー数に基づいて、前記核酸初期コピー数の度数分布を取得するステップＳ４１４０と、
前記核酸初期コピー数の度数分布に基づいて、ポアソン分布のパラメータλを計算するステップＳ４１５０と、を含む、デジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項１４】
前記ステップＳ４１１０には、
リアルタイムの各蛍光画像に基づいて、核酸増幅された各微小液滴に蛍光強度値を取得するステップＳ４１１１と、
前記核酸増幅された各微小液滴の蛍光強度値に基づいて、核酸増幅された各微小液滴の蛍光曲線をリアルタイムで取得するステップＳ４１１３と、
前記核酸増幅された各微小液滴の蛍光曲線に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てについて、蛍光曲線をリアルタイムで取得するステップＳ４１１５と、を含む、ことを特徴とする請求項１３に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項１５】
前記ステップＳ４１２０には、
核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線に導関数を導出し、前記核酸増幅された各微小液滴にリアルタイムの蛍光曲線の傾きを取得するステップＳ４１２１と、
前記核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線の傾きに基づいて、前記核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線の傾きのうち、数値の変化しない傾きを取得するステップＳ４１２３と、
前記数値の変化しない傾きに基づいて、その対応するものであって、核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値である初期巡回数を取得するステップＳ４１２５と、
前記核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てについてＣｔ値を取得するステップＳ４１２７と、を含む、ことを特徴とする請求項１３に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項１６】
前記ステップＳ４１２０には、
核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線に基づいて、核酸増幅された各微小液滴の蛍光閾値の欠失値を取得するステップＳ４１２２と、
核酸増幅された各微小液滴の蛍光閾値の欠失値に基づいて、その対応するものであって、核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値である巡回数を取得するステップＳ４１２４と、
前記核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てについて、Ｃｔ値を取得するステップＳ４１２６とを、さらに含むことを特徴とする請求項１３に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項１７】
前記ステップＳ４１４０には、
前記核酸増幅された微小液滴の全てについての核酸初期コピー数に基づいて、前記核酸増幅の微小液滴の全てについて核酸初期コピー数のうちの最大値及び最小値を取得するステップＳ４１４１と、
前記最大値及び前記最小値に基づいて、階級幅と階級数を選択し、前記核酸初期コピー数の度数分布を取得するステップＳ４１４３と、を含む、ことを特徴とする請求項１３に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項１８】
前記ステップＳ４１５０では、ポアソン分布のパラメータλを計算する時に、最尤推定法が使用される、ことを特徴とする請求項１３に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項１９】
微小液滴の全てについて、複数の蛍光画像をリアルタイムで取得し、リアルタイムの前記複数の蛍光画像に基づいて、核酸増幅された微小液滴の蛍光曲線をリアルタイムで取得するステップＳ４２１０と、
前記リアルタイムの蛍光曲線に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全てについて、Ｃｔ値を取得するステップＳ４２２０と、
前記Ｃｔ値と核酸増幅された微小液滴の核酸初期コピー数との関係に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全てについて、核酸初期コピー数を取得するステップＳ４２３０と、
前記核酸増幅された微小液滴の全ての核酸初期コピー数に基づいて、核酸初期コピー数の一部を選択するステップＳ４２４０と、
前記一部の核酸初期コピー数に基づいて、前記一部の核酸初期コピー数の度数分布を取得するステップＳ４２５０と、
前記一部の核酸初期コピー数の度数分布に基づいて、ポアソン分布を点推定し、ポアソン分布のパラメータλを取得するステップＳ４２６０と、を含む、デジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項２０】
2021511074.tif 000034
【請求項２１】
前記ステップＳ４２６０には、ポアソン分布を点推定する方法が  モーメント推定法、順序統計量法、又は、最尤推定法、をさらに含むことを特徴とする請求項１９に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項２２】
前記ステップＳ４２６０における前記残差平方和ｅｒｒは、
2021511074.tif 000035
ただし、各微小液滴におけるＤＮＡ初期コピー数は、確率変数ｘである、一部の微小液滴のＤＮＡ初期コピー数に対応する度数値は、ｎｋであり、Ｎは、前記複数の微小液滴の総数である、ことを特徴とする請求項１９に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項２３】
微小液滴の全てについて、体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍを取得し、ただし、前記体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍと順次に対応する微小液滴の数量は、ｎ１、ｎ２、…、ｎｍであり、前記体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍと順次に対応する微小液滴の核酸増幅された陰性微小液滴の数量は、ｂ１、ｂ２、…、ｂｍであるステップＳ４３１０と、
微小液滴の全てについて、核酸増幅された関連パラメータｖ１、ｖ２、．．．ｖｍ、ｎ１、ｎ２、…、ｎｍ、ｂ１、ｂ２、…、ｂｍに基づいて、検出すべき核酸増幅反応液の濃度ｃについての結合二項分布関数ｆ（ｃ）を構築するステップＳ４３２０と、
結合二項分布関数ｆ（ｃ）に基づいて、前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）に極値点を取る時のｃの値を算出するステップＳ４３３０と、
前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）をｌｎ（ｃ）についての結合二項分布関数Ｆ（Λ）に転換し、ｌｎ（ｃ）についての標準偏差及び信頼区間を取得するステップＳ４３４０と、
ｌｎ（ｃ）についての標準偏差及び信頼区間に基づいて、前記検出すべき核酸増幅反応液の濃度ｃの標準偏差及び信頼区間を取得するステップＳ４３５０を含む、異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法。
【請求項２４】
前記ステップＳ４３１０には、
標的核酸を含む試料溶液を微滴化し、複数の異なる体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍの微小液滴を取得し、ただし、前記微小液滴体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍと順次に対応する微小液滴の数量はｎ１、ｎ２、…、ｎｍであるステップＳ４３１１と、
微小液滴の全てに核酸を増幅し、撮影により前記微小液滴の全ての蛍光画像を検出して取得するステップＳ４３１３と、
前記微小液滴の全ての蛍光画像に基づいて、前記微小液滴の全ての体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍと順次に対応する核酸増幅された陰性の微小液滴の数量ｂ１、ｂ２、…、ｂｍを取得するステップＳ４３１５と、を含むことを特徴とする請求項２３に記載の異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法。
【請求項２５】
前記Ｓ４３１０には、
標的核酸を含む試料溶液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するステップＳ４３１２と、
前記複数の微小液滴を核酸増幅し、撮影により、核酸増幅された微小液滴の全ての蛍光画像を検出して取得するステップＳ４３１４と、
前記蛍光画像に基づいて、核酸増幅された前記微小液滴の全ての体積を取得し、ただし、前記体積は、それぞれｖ１、ｖ２、．．．ｖｍであり、前記体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍとそれぞれ順次に対応する核酸増幅された微小液滴の数量は、ｎ１、ｎ２、…、ｎｍであり、前記体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍと順次に対応する核酸増幅された陰性微小液滴の数量は、ｂ１、ｂ２、…、ｂｍである、ステップＳ４３１６と、をさらに含むことを特徴とする請求項２３に記載の異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法。
【請求項２６】
前記ステップＳ４３２０に、検出すべき核酸増幅反応液についての濃度ｃを構築する結合二項分布関数ｆ（ｃ）は、
2021511074.tif 000036
である、ことを特徴とする請求項２３に記載の異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法。
【請求項２７】
前記ステップＳ４３３０には、
前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）に導関数を導出し、前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）の導関数を取得するステップＳ４３３１と、
前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）の導関数を０にして、前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）に極値点を取る時の検出すべき核酸増幅反応液の濃度ｃの値を取得する、ステップＳ４３３２と、を含む、ことを特徴とする請求項２３に記載の異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法。
【請求項２８】
前記ステップＳ４３４０に、前記ｌｎ（ｃ）についての結合二項分布関数Ｆ（Λ）は、
2021511074.tif 000037
である、ことを特徴とする請求項２３に記載の異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法。
【請求項２９】
前記ステップＳ４３４０には、
前記関数Ｆ（Λ）に対数を取り、関数Ｌ（Λ）  を取得するステップＳ４３４１と、
前記関数Ｌ（Λ）に一次導関数を導出し、関数Ｌ（Λ）の一次導関数を０にするステップＳ４３４２と、
ｌｎ（ｃ）に対応する標準偏差σを取得するステップＳ４３４３と、
ｌｎ（ｃ）に対応する標準偏差σに基づいて、ｌｎ（ｃ）の信頼区間を取得するステップＳ４３４４と、を含む、ことを特徴とする請求項２３に記載の異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法。
【請求項３０】
前記ステップＳ４３４３に、ｌｎ（ｃ）のＦｉｓｈｅｒ情報量Ｉ（Λ）に基づいて、標準偏差σを取得する、ことを特徴とする請求項２７に記載の異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法。
【請求項３１】
ｌｎ（ｃ）のＦｉｓｈｅｒ情報量Ｉ（Λ）は、
2021511074.tif 000038
である、ことを特徴とする請求項３０に記載の異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法。
【請求項３２】
前記ｌｎ（ｃ）に対応する標準偏差σ及び信頼区間は、それぞれ、
2021511074.tif 000039
である、ことを特徴とする請求項２９に記載の異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法。
【請求項３３】
検出すべき核酸増幅反応液を製造するステップＳ１０と、
前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、微小液滴のマトリックスを形成するステップＳ２０と、
前記微小液滴のマトリックスをポリメラーゼ連鎖反応させ、前記微小液滴のマトリックスにおける各微小液滴の蛍光曲線及び各微小液滴の溶解曲線を取得するステップＳ３０と、
前記微小液滴のマトリックスにおける各微小液滴の蛍光曲線及び各微小液滴の溶解曲線に基づいて、前記微小液滴のマトリックスを解析し、前記検出すべき核酸情報を取得するステップＳ４０と、を含むデジタルＰＣＲ検出方法。
【請求項３４】
前記ステップＳ３０には、
ポリメラーゼ連鎖反応について、温度パラメータ、時間パラメータ、及び、循環回数を配置するステップＳ３１０と、
前記温度パラメータ及び前記時間パラメータに基づいて、順次に前記循環回数だけ、前記微小液滴のマトリックスをポリメラーゼ連鎖反応させ、循環工程毎に各前記微小液滴の蛍光曲線を取得するステップＳ３２０と、
ポリメラーゼ連鎖反応で増幅された前記微小液滴のマトリックスを降温させ、一定の温度間隔で昇温させることにより、各前記微小液滴の溶解曲線を取得するステップＳ３３０と、を含むことを特徴とする請求項３３に記載のデジタルＰＣＲ検出方法。
【請求項３５】
前記ステップＳ３２０には、
前記温度パラメータ及び前記時間パラメータに基づいて、前記微小液滴のマトリックスをポリメラーゼ連鎖反応させ、前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像を取得するステップＳ３２１と、
前記循環回数だけ順次に循環を行い、ポリメラーゼ連鎖反応の工程において、前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像の全てを取得するステップＳ３２２と、
前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像の全てに基づいて、循環工程毎に各前記微小液滴の蛍光情報を取得するステップＳ３２３と、
循環工程毎に各前記微小液滴の蛍光情報に基づいて、各前記微小液滴の蛍光曲線を取得し、前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線を取得するステップＳ３２４と、を含む、ことを特徴とする請求項３４に記載のデジタルＰＣＲ検出方法。
【請求項３６】
前記ステップＳ３３０には、
ポリメラーゼ連鎖反応で増幅された前記微小液滴のマトリックスを４０℃以下まで降温するステップＳ３３１と、
４０℃以下まで降温された前記微小液滴のマトリックスを一定の温度間隔で昇温し、前記温度間隔に対応する前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像を取得するステップＳ３３２と、
前記温度間隔に対応する前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像に基づいて、前記温度間隔に対応する各前記微小液滴の蛍光情報を取得するステップＳ３３３と、
前記温度間隔に対応する各前記微小液滴の蛍光情報に基づいて、各前記微小液滴の溶解曲線を取得し、前記微小液滴のマトリックスの溶解曲線を取得するステップＳ３３４と、を含むことを特徴とする請求項３４に記載のデジタルＰＣＲ検出方法。
【請求項３７】
前記ステップＳ４０には、
前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線に基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を取得するステップＳ４１０と、
前記微小液滴のマトリックスの溶解曲線に基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸情報を取得するステップＳ４２０と、を含むことを特徴とする請求項３３に記載のデジタルＰＣＲ検出方法。
【請求項３８】
前記ステップＳ４１０には、
前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線に基づいて、各前記微小液滴の前記蛍光曲線と対応するＣｔ値を取得するステップＳ４１１と、
各前記微小液滴の前記蛍光曲線のＣｔ値をクラスタリングすることにより、順次に大きい順でソートし、ｘ１、ｘ２、…、ｘｎの類別を取得するステップＳ４１２と、
前記ｘ１、ｘ２、…、ｘｎの類別に基づいて、類別毎に対応する前記微小液滴の数ｙ１、ｙ２、…、ｙｎを取得するステップＳ４１３と、
類別毎に対応する前記微小液滴の数ｙ１、ｙ２、…．  ｙｎに基づいて、前記ｘ１、ｘ２、…、ｘｎの類別毎に対応する前記微小液滴の数ｙ１、ｙ２、…、ｙｎの度数分布を取得するステップＳ４１４と
前記度数分布に基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を計算するステップＳ４１５と、ことを特徴とする請求項３７に記載のデジタルＰＣＲ検出方法。
【請求項３９】
前記ステップＳ４１５には、前記ｘ１の類別の前記微小液滴の数ｙ１が特徴値ｍ以上である時に、前記度数分布に基づいて、ポアソン分布で当てはめ、ポアソン分布のパラメータλを取得し、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を取得する、ことを特徴とする請求項３８に記載のデジタルＰＣＲ検出方法。
【請求項４０】
前記ステップＳ４１５には、前記ｘ１の類別の前記微小液滴の数ｙ１が特徴値ｍよりも小さい時に、
前記ｘ２、…、ｘｎの類別毎に対応する前記微小液滴の数ｙ２、…、ｙｎの一部の度数分布に基づいて、順次に前記ｘ２の類別と対応する前記核酸初期コピー数として、ポアソン分布で当てはめ、各ポアソン分布の対応するパラメータλｊ（ｊ＝０、１、２…．）を取得するステップＳ４１５１と、
2021511074.tif 000040
前記最適なλｏｐｔｉｍａｌに基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を計算するステップＳ４１５３と、を含む、ことを特徴とする請求項３８に記載のデジタルＰＣＲ検出方法。
【請求項４１】
前記ステップＳ４２０には、
前記微小液滴のマトリックスの溶解曲線に基づいて、各前記微小液滴の前記溶解曲線と対応する溶解温度を取得する、ステップＳ４２１と、
前記溶解温度に基づいて、前記微小液滴のマトリックスを分類し、前記微小液滴のマトリックスの核酸情報を取得し、前記検出すべき核酸の核酸情報を取得するステップＳ４２２と、を含む、ことを特徴とする請求項３７に記載のデジタルＰＣＲ検出方法。
【請求項４２】
前記微小液滴のマトリックスの高分解能の溶解曲線を取得し、前記微小液滴のマトリックスを分類し、前記微小液滴のマトリックスにジェノタイピング、突然変異検出などの核酸情報を取得する、ステップＳ５０をさらに含む、ことを特徴とする請求項３３に記載のデジタルＰＣＲ検出方法。
【請求項４３】
蛍光コード情報を有する核小体と、被覆層と、を含み、
前記被覆層は、前記核小体を被覆し、基体とプライマーとを含み、
前記プライマーは、前記基体に分散され、前記核小体と一意に対応する、核酸検出微小球。
【請求項４４】
前記被覆層は、プローブをさらに含み、
前記プローブ及び前記プライマーは、前記基体に分散され、前記核小体と一意に対応する、ことを特徴とする請求項４３に記載の核酸検出微小球。
【請求項４５】
前記基体は、アガロースのゲルである、ことを特徴とする請求項４３に記載の核酸検出微小球。
【請求項４６】
前記核小体は、蛍光染料を含むソリッド球体である、ことを特徴とする請求項４３に記載の核酸検出微小球。
【請求項４７】
前記核小体は、その直径が１０ミクロン〜１００ミクロンである、ことを特徴とする請求項４３に記載の核酸検出微小球。
【請求項４８】
前記被覆層は、その厚さが１０ミクロン〜１００ミクロンである、ことを特徴とする請求項４３に記載の核酸検出微小球。
【請求項４９】
複数の核小体及びプライマーの溶液を提供するステップＳ１１０と、
ゲル粉末を提供し、前記ゲル粉末を再蒸留水に添加し、ゲル粉末溶液を取得し、前記ゲル粉溶液を、澄むまで、加熱し、被覆層の製造液を取得するステップＳ１２０と、
ゲル溶解温度で、前記複数の核小体、前記プライマー溶液及び前記被覆層の製造液を混合し、核酸検出の微小球の製造溶液を取得するステップＳ１３０と、
前記ゲル溶解温度で、前記核酸検出微小球の製造溶液を微滴化し、複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップＳ１４０と、
前記複数の核酸検出微小球の液滴を冷却し、フローサイトメトリーにより、複数の核酸検出微小球を取得するステップＳ１５０と、を含む、核酸検出微小球の製造方法。
【請求項５０】
前記ステップＳ１５０には、前記核酸検出微小球は、単一の前記核小体を含む核酸検出微小球である、ことを特徴とする請求項４９に記載の核酸検出微小球の製造方法。
【請求項５１】
前記ステップＳ１２０には、前記ゲル粉末がカンテン末、又は、ポリエチレングリコールジアクリレートなどである、ことを特徴とする請求項４９に記載の核酸検出微小球の製造方法。
【請求項５２】
前記ステップＳ１４０には、
出口端を有し、前記核酸検出微小球の製造溶液を貯留している液体吐出ピペットチップを提供し、疎水性油を貯留している開口容器を提供するステップＳ１４１と、
前記ゲル溶解温度で、前記液体吐出ピペットチップの出口端を前記疎水性油の液面に挿入するステップＳ１４２と、
前記液体吐出ピペットチップの出口端が前記疎水性油の液面下に瞬間加速度運動を行い、又は、周期的に変化する速度で運動を行い、前記核酸検出微小球の製造溶液を前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出し、前記疎水性油の液面下に前記複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップＳ１４３と、を含む、ことを特徴とする請求項４９に記載の核酸検出微小球の製造方法。
【請求項５３】
プライマー溶液、プローブ溶液、及び、複数の核小体を提供するステップＳ２１０と、
ゲル粉末を提供し、前記ゲル粉末を再蒸留水に添加し、ゲル粉末溶液を取得し、前記ゲル粉溶液を、澄むまで、加熱し、被覆層の製造液を取得するステップＳ２２０と、
ゲル溶解温度で、前記複数の核小体と、前記プライマーとプローブ溶液とを前記被覆層の製造液に混合し、核酸検出微小球の製造溶液を取得するステップＳ２３０と、
前記ゲル溶解温度で、前記核酸検出微小球の製造溶液を微滴化し、複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップＳ２４０と、
前記複数の核酸検出微小球の液滴を冷却し、フローサイトメトリーにより、複数の核酸検出微小球を取得するステップＳ２５０と、を含む、核酸検出微小球の製造方法。
【請求項５４】
前記ステップＳ２５０には、前記核酸検出微小球は、単一の前記核小体を含む核酸検出微小球である、ことを特徴とする請求項５３に記載の核酸検出微小球の製造方法。
【請求項５５】
ハイスループットで核酸への検出と解析に用いられる試薬キットであって、請求項４３から４８のいずれか一つに記載の核酸検出微小球与核酸反応液を含む、ことを特徴とする、試薬キット。
【請求項５６】
核酸増幅反応液、及び、多種類の異なる種類の核酸検出微小球を提供し、前記核酸検出微小球は、核小体及び被覆層を含み、前記核小体は、コード情報を有し、前記被覆層は、前記核小体を被覆し、前記被覆層は、基体と前記基体に分散されるプライマーとを含み、前記プライマーが前記核小体に一意に対応し、前記核小体は、蛍光染料を含むソリッド球体である、ステップＳ３１０と、
前記多種類の異なる種類の核酸検出微小球と前記核酸増幅反応液とを混合し、核酸検出液を取得するステップＳ３２０と、
前記核酸検出液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するステップＳ３３０と、
前記複数の微小液滴に核酸を増幅し、増幅された前記複数の微小液滴を取得するステップＳ３４０と、
増幅された前記複数の微小液滴に基づいて、各前記微小液滴中の前記核小体を検出し、一つの前記核小体しかを含まない前記微小液滴をスクリーニングし、第一の効果的な微小液滴を取得するステップＳ３５０と、
前記第一の効果的な微小液滴に基づいて、前記第一の効果的な微小液滴における前記核小体の蛍光コード信号を検出し、前記核小体と対応する前記プライマーを取得し、核酸増幅反応された報告蛍光信号を読み取り、前記第一の効果的な微小液滴に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップＳ３６０と、を含む、ハイスループット核酸検出方法。
【請求項５７】
前記ステップＳ３１０には、前記核酸増幅反応液は、デオキシリボ核酸を鋳型とする核酸増幅反応液、リボ核酸を鋳型とする逆転写核酸増幅反応液、又は、ループ介在等温増幅反応液であり、前記核酸増幅反応液に蛍光染料を含む、ことを特徴とする請求項５６に記載のハイスループット核酸検出方法。
【請求項５８】
前記ステップＳ３６０は、
コード蛍光チャネル及び蛍光染料検出チャネルを含み、コード蛍光チャネルに基づいて、前記効果的な微小液滴における前記核小体の蛍光コード信号を識別する蛍光信号検出装置を提供するステップＳ３６１と、
前記核小体の蛍光コード信号に基づいて、前記核小体と対応する前記プライマーを取得するステップＳ３６２と、
前記蛍光染料検出チャネルに基づいて、前記第一の効果的な微小液滴における核酸増幅反応された報告蛍光信号を検出し、前記第一の効果的な微小液滴に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップＳ３６３と、を含む、ことを特徴とする請求項５６に記載のハイスループット核酸検出方法。
【請求項５９】
核酸増幅反応液及び多種類の異なる種類の核酸検出微小球を提供し、前記核酸検出微小球は、核小体及び被覆層を含み、前記核小体は、コード情報を有し、前記被覆層は、前記核小体を被覆し、前記被覆層は、基体、及び、前記基体に分散されるプライマーとプローブとを含み、前記プライマーと前記プローブとが前記核小体に一意に対応し、前記核小体は、蛍光コード情報を有するソリッド球体であるステップＳ４１０と、
前記多種類の異なる種類の核酸検出微小球と前記核酸増幅反応液とを混合し、核酸検出液を取得するステップＳ４２０と、
前記核酸検出液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するステップＳ４３０と、
前記複数の微小液滴に核酸を増幅し、増幅された前記複数の微小液滴を取得するステップＳ４４０と、
増幅された前記複数の微小液滴に基づいて、各前記微小液滴における前記核小体を検出し、一つの前記核小体しかを含まない前記微小液滴をスクリーニングし、第二の効果的な微小液滴を取得するステップＳ４５０と、
前記第二の効果的な微小液滴に基づいて、前記第二の効果的な微小液滴における前記核小体の蛍光コード信号を検出し、前記核小体と対応する前記プライマーと前記プローブとを取得し、核酸増幅反応された報告蛍光信号を読み取り、前記第二の効果的な微小液滴に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップＳ４６０とを含む、ハイスループット核酸検出方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願】
【０００１】
本出願は、２０１８年１月２４日に出願された「デジタルＰＣＲ定量検出方法」という第２０１８１００７０３７７．２号、２０１８年８月１６日に出願された「デジタルＰＣＲ検出方法」という第２０１８１０９３２９５０．６号、及び、２０１８年１１月２１日に出願された「核酸検出微小球、製造方法、試薬キット及びハイスループット核酸検出方法」という第２０１８１１３９２２７８．２号の中国特許出願を優先権として主張し、それらのすべてをここで参照として援用する。
【技術分野】
【０００２】
本出願は、核酸検出解析の分野に関し、特に、デジタルＰＣＲ検出器、デジタルＰＣＲ定量検出方法、異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法、デジタルＰＣＲ検出方法、核酸検出微小球、核酸検出微小球製造方法、核酸検出微小球試薬キット及びハイスループット核酸検出方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
デジタルＰＣＲ（Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ、ｄＰＣＲ）は、核酸分子の絶対定量に係る技術である。デジタルＰＣＲは、ｑＰＣＲに比べると、ＤＮＡ分子の個数を直接に数えるため、初期試料のコピー数に対する絶対定量である。定量ＰＣＲは、標準曲線又は参照遺伝子に従って核酸量を検出する一方、デジタルＰＣＲは、ＤＮＡ分子の個数を直接に数えるため、初期試料のコピー数に対する絶対定量である。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、デジタルＰＣＲは、液滴式ＰＣＲ検出方法及びチップ式検出方法が含まれる。チップ式検出方法では、単一のチップに効果的な反応チャンバーが数千個だけ含まれているため、液滴式のほうよりも遥かに少ない。故に、チップ式デジタルＰＣＲは、動的範囲が液滴式のほうよりも比較的狭い。液滴式ＰＣＲ検出方法は、試料を「油中水」の反応セルに分散させてから、各反応セルをリアルタイムで解析したり、エンドポイントで蛍光解析したりする。しかしながら、従来のデジタルＰＣＲ機器における効果的な反応チャンバーは、その数が少ないため、現在のデジタルＰＣＲの動的範囲が比較的狭く、その作業の効率が低い。従来の液滴デジタルＰＣＲのエンドポイント検出方法は、制約性が存在し、検出に精度が低い。デジタルＰＣＲ検出解析の工程では、数千万のナノリットルの微小液滴のマトリックスについて、従来のデジタルＰＣＲ検出方法により、多種類の標的配列を同時に検出しようとすると、多種類のプライマーを設計して順次に検出することが必要となり、複数の検出が継続して繰り返されると作業量が膨大になり、時間が掛かり、作業効率が低い。しかも、従来のＰＣＲ検出技術によれば、限られた標的配列だけを検出できる。ＰＣＲの検出により、十数、数十又は数百の種類の標的配列を検出しようとすると、複数の検出を繰り返すことが必要となり、作業量が膨大になり、多量の試料が消耗されてしまい、しかも、時間あたりの作業効率が低い。
【課題を解決するための手段】
【０００５】
このことに鑑み、本出願は、微小液滴生成装置、温度制御装置、蛍光信号検出装置及び定量解析装置を含むデジタルＰＣＲ検出器を提供する。前記微小液滴生成装置は、核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するために用いられる。前記温度制御装置は、前記微小液滴生成装置にレールを介して接続され、前記複数の微小液滴を前記温度制御装置に移転し、温度の循環で核酸増幅を実現するために用いられる。前記蛍光信号検出装置は、前記温度制御装置に対向配置され、核酸増幅された前記複数の微小液滴を撮影して検出するために用いられる。前記蛍光信号検出装置は、微小液滴に複数の蛍光チャネルでイメージングを行い、明視野・暗視野でイメージングを行うことができる。そのうち、複数の蛍光チャネルによるイメージングは、微小液滴の反応信号を検知するために用いられ、明視野・暗視野によるイメージングは、微小液滴を形成するサイズの情報を検出し、反応の工程において液滴の状態をモニターするために用いられる。定量解析装置については、前記定量解析装置が前記蛍光信号検出装置にデータ線を介して接続され、前記複数の微小液滴の蛍光情報の送信、及び、定量解析を実現するために用いられる。制御器については、前記制御器が、それぞれ、前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置、蛍光信号検出装置及び定量解析装置に接続され、前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置、前記蛍光信号検出装置及び前記定量解析装置を制御するために用いられる。前記デジタルＰＣＲ検出器は、前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置、前記蛍光信号検出装置及び前記定量解析装置を集積化するため、一体化とされるデジタルＰＣＲ検出機器により、前記操作員に自動化で操作を実現し、前記デジタルＰＣＲ検出器に作業効率を高めることができる。
【０００６】
このことに鑑み、本出願が提供するデジタルＰＣＲ定量検出方法は、微小液滴の全てについて複数のリアルタイム蛍光画像を取得し、前記複数のリアルタイム蛍光画像に基づいて、核酸増幅すべき微小液滴のリアルタイム蛍光曲線を取得するステップＳ４１１０と、前記リアルタイム蛍光曲線に基づいて、核酸増幅すべき微小液滴の全てのＣｔ値を取得するステップＳ４１２０と、前記Ｃｔ値と核酸増幅すべき微小液滴の核酸初期コピー数との関係に基づいて、核酸増幅すべき微小液滴の全ての核酸初期コピー数を取得するステップＳ４１３０と、前記核酸増幅すべき微小液滴の全ての核酸初期コピー数に基づいて、前記核酸初期コピー数の度数分布を取得するステップＳ４１４０と、前記核酸初期コピー数の度数分布に基づいて、ポアソン分布のパラメータλを計算するステップＳ４１５０と、を含む。デジタルＰＣＲ定量検出方法によれば、前記複数の微小液滴の動的追跡を実現することができると共に、前記複数の微小液滴に温度循環を実行する工程に、各微小液滴の対応する具体的な位置を発見することができ、核酸増幅を行う工程全体に渡ってモニターを実現することができる。
【０００７】
前記デジタルＰＣＲ定量検出方法によれば、標準曲線に対する依頼を脱出できるに加えて、標準曲線により定量結果が確定でないという課題も解決できると共に、液滴式デジタルＰＣＲにエンドポイント検出方式による制限を解決でき、また、一つのｐ（χ=０）のデータだけを用いて検出すべき試料の全体についてパラメータを推量する制約性を破ることができる。同時に、前記複数の微小液滴に蛍光曲線を処理し、均一性の仮設によらずなされる統計・修正を行うことにより、デジタルＰＣＲの定量検出に正確性が向上する。
【０００８】
このことに鑑み、本出願は、異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法を提供する。異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法によれば、ｌｎ（ｃ）に対応する標準偏差σ及び信頼区間を取得することができる。ｌｎ（ｃ）に対応する標準偏差σ及び信頼区間により、検出すべき核酸増幅反応液の核酸濃度ｃを取得することができるため、前記検出すべき核酸増幅反応液に含まれているＤＮＡ初期コピーの数が分かる。前記異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法は、２００個未満の微小液滴により五つのオーダーの動的検出範囲が実現可能であり、デジタルＰＣＲ検出器の動的検出範囲が向上する。しかも、その性能は、１２，０００個の微小液滴を有し、体積が単一となるデジタルＰＣＲのほうと同じく優れており、機器にコストが削減され、消耗品としてのコストも低下する。
【０００９】
このことに鑑み、本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出方法は、検出すべき核酸増幅反応液を製造するステップＳ１０と、前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、微小液滴のマトリックスを形成するステップＳ２０と、前記微小液滴のマトリックスをポリメラーゼ連鎖反応させ、前記微小液滴のマトリックスにおける各微小液滴の蛍光曲線と各微小液滴の溶解曲線を取得するステップＳ３０と、前記微小液滴のマトリックスにおける各微小液滴の蛍光曲線と各微小液滴の溶解曲線に基づいて、前記微小液滴のマトリックスを解析し、前記検出すべき核酸情報を取得するステップＳ４０と、を含む。
【００１０】
本出願が提供する前記デジタルＰＣＲ検出方法は、検出すべき核酸増幅反応液を製造する時に、一つの染料だけを用いると、ジェノタイピング、突然変異の走査、メチル化の研究などを実現することができ、高い分解能と感度を有し、検出にコストが低下する。しかも、前記デジタルＰＣＲ検出方法によれば、前記微小液滴のマトリックスは、高度で集積化する同一のデジタルＰＣＲ検出器に、ポリメラーゼ連鎖反応が済むと共に、前記微小液滴のマトリックスがＰＣＲ増幅されてから、ＰＣＲ産物に溶解曲線を解析するようにすることができる。同時に、前記デジタルＰＣＲ検出方法によれば、前記微小液滴のマトリックスについて蛍光曲線及び溶解曲線を取得することにより、ＰＣＲ増幅を工程全体に渡ってリアルタイムでモニターすること、及び、ＰＣＲ産物の溶解曲線を解析すること、の両方を、シームレスに実行するように、実現することができる。そして、前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線及び溶解曲線に基づいて、異なる形状の溶解曲線によるジェノタイピングや分類を実現し、前記微小液滴のマトリックスに対する定性及び定量の解析を実現し、より全面的、簡便的、高い効率に、デジタルＰＣＲの検出を済ませることができる。
【００１１】
このことに鑑み、本出願は、核酸検出微小球、製造方法、試薬キット及びハイスループット核酸検出方法を提供する。そのうち、前記被覆層は、前記核小体を被覆し、前記核酸検出微小球を形成する。前記基体は、疎水性油に形成された含水高分子ゲルであり、流動性がなく、しかも、形状や体積も変化し易くない。含水高分子ゲルは、室温でゲルの状態となり、室温のほうよりも高い温度で溶解し、酵素や反応液などの拡散・活性に影響を与えることがない。同時に、前記基体に分散された前記プライマーは、標的検出核酸を定性解析して識別することができる。前記核小体は、高温に耐えられる材料であり、特殊なマーク機能を有し、前記核小体ごとに、一つの前記プライマーと一意に対応していることから、追跡して検出するように、前記核小体により前記核酸検出微小球をマークすることができる。ＰＣＲ検出を実行する時に、複数かつ多種類の前記核酸検出微小球を検出すべき核酸増幅反応液に混合すると、核酸検出液を取得することができる。前記核酸検出液を微滴化すると、複数の微小液滴を形成して、複数の微小液滴にＰＣＲの反応を行わせることができる。ＰＣＲの反応工程では、二本鎖ＤＮＡを９０℃〜９５℃で変性させ、再び、５０℃〜６０℃まで急速に冷却させ、プライマーがアニーリングして標的配列に結合した後に、急速に７０℃〜７５℃まで昇温させ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる作用で、プライマーの鎖を鋳型に沿って伸長させ、適当な温度の範囲で核酸を増幅させる。複数の微小液滴にＰＣＲの温度を制御する工程では、前記被覆層が溶解して分解される。そして、前記被覆層に付けられた前記プライマーは、対応する微小液滴に解放して微小液滴に含まれている標的核酸分子と反応することになる。最終的に、前記核小体を、位置決め、追跡して識別し、前記核小体の対応する前記プライマーにより、標的核酸分子が分かると、ハイスループットでＰＣＲ検出を実現することができる。
【００１２】
実際の応用工程では、多種類の前記核酸検出微小球をバッチ処理で製造することが可能である。多種類の前記核酸検出微小球を、実際に検出標的とされる核酸のニーズに合わせて、一定の比で混合させ、検出すべき核酸増幅反応液と混合させると、核酸検出液を取得することにより、標的核酸を検出することができ、一回だけで多種類の標的核酸分子が検出可能であり、複数回繰り返して検出する必要が無くなり、作業量が小さく、検出時間が短く、感度が高い。
【図面の簡単な説明】
【００１３】
本出願における実施例、又は、従来技術における技術的手段をより明確に説明するように、以下に実施例又は従来技術を説明するに必要な図面を簡単に説明しておく。下記説明における図面は、本出願の実施例に過ぎず、創造的労働をしない前提で、提供する図面に基づいて他の図面を取得することも当業者にとって自明である。
【００１４】
【図１】本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出器の全体構造の模式図である。
【図２】本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出器の微小液滴生成装置を示す図である。
【図３】本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端が運動する時に力を受ける液滴の模式図である。
【図４】本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端の速度変化の模式図である。
【図５】本出願の一実施例が提供する液体吐出ピペットチップの出口端が運動する時に微小液滴の生成工程の模式図である。
【図６】本出願に係る蛍光信号検出装置の構造の模式図である。
【図７】本出願に係る温度制御装置の構造の模式図である。
【図８】本出願に係る温度制御装置の構造の断面構造の模式図である。
【図９】本出願に係る温度制御装置の半導体熱電対における電極の接続構造の模式図である。
【図１０】本出願に係る温度制御装置による瞬間的な性能テストの模式図である。
【図１１】本出願に係る温度制御装置による定常的な性能テストの模式図である。
【図１２】本出願に係るデジタルＰＣＲ検出器の解析方法のフローチャートである。
【図１３】本出願に係る微小液滴の敷き詰め方法のフローチャートである。
【図１４】本出願に係る微小液滴容器の底板に微小液滴が積み重ねられる模式図である。
【図１５】本出願に係る完全なサンプリングのデジタルＰＣＲ定量検出方法のフローチャートである。
【図１６】本出願に係る一部サンプリングのデジタルＰＣＲ定量検出方法のフローチャートである。
【図１７】一部サンプリングのデジタルＰＣＲ定量検出方法と他の方法ＣＰＤの標準偏差との対比図である。
【図１８】異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法のフローチャートである。
【図１９】本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出方法全体のステップのフローチャートである。
【図２０】本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出方法により取得された微小液滴のマトリックスの模式図である。
【図２１】本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出方法により取得された微小液滴のマトリックスの蛍光画像の模式図である。
【図２２】本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出方法により取得されたリアルタイムの蛍光曲線の模式図である。
【図２３】本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出方法により取得された一部サンプリングのデジタルＰＣＲ定量検出方法と他の方法ＣＰＤの標準偏差とを対比する対比図である。
【図２４】本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出方法により取得された溶解曲線の模式図である。
【図２５】本出願が提供する核酸検出微小球の構造の模式図である。
【図２６】本出願が提供する被覆層の構造の模式図である。
【図２７】本出願が提供する核小体の構造の模式図である。
【図２８】本出願が提供する一実施例の被覆層の構造の模式図である。
【図２９】本出願が提供する一実施例の核酸検出微小球の構造の模式図である。
【図３０】本出願が提供する微小液滴生成装置の構造の模式図である。
【図３１】本出願が提供する異なる種類のマイクロ流体制御チップの構造の模式図である。
【図３２】本出願が提供する第一の効果的な微小液滴の構造の模式図である。
【図３３】本出願が提供する微小液滴生成装置の構造の模式図である。
【図３４】本出願が提供する異なる種類のマイクロ流体制御チップの構造の模式図である。
【図３５】本出願が提供する第二の効果的な微小液滴の構造の模式図である。
【発明を実施するための形態】
【００１５】
以下では、本出願の実施例の添付図面を参照しながら、本出願の実施例の技術的解決手段を明確かつ完全に説明する。当然のことながら、ここで説明する実施例は、本願の実施例の全てではなく一部にすぎない。当業者にとって創造的な作業なしに本願の実施例に基づいて得られる全ての他の実施例は、本願の保護範囲に含まれるべきである。
【００１６】
本出願の目的、技術的手段及び利点をさらに明らかにするために、以下に、実施例及び図面を参照しながら、本出願をさらに詳細に説明する。ここで述べた具体的な実施例は本出願を解釈するために用いられ、本出願を限定するためのものではないことを理解するべきである。
【００１７】
従来のデジタルＰＣＲ機器に、効果的な反応用のセルが少なく、消耗品としてコストが高く、動的範囲が比較的狭く、作業の効率が低く、また、集積化の度合いが高くないという課題について、デジタルＰＣＲ検出器を提供する。
【００１８】
図１を参照すると、本出願は、微小液滴生成装置１０、温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０、定量解析装置４０、及び、制御器５０を含む、デジタルＰＣＲ検出器１を提供する。前記微小液滴生成装置１０は、核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するために用いられる。前記温度制御装置２０は、前記微小液滴生成装置１０にレールを介して接続され、前記複数の微小液滴を前記温度制御装置２０に移転し、温度の循環で核酸増幅を実現するために用いられる。前記蛍光信号検出装置３０は、前記温度制御装置２０に対向配置され、核酸増幅された前記複数の微小液滴を撮影して検出するために用いられる。前記定量解析装置４０は、前記蛍光信号検出装置３０にデータ線を介して接続され、前記複数の微小液滴の蛍光情報を送信して定量解析を行うために用いられる。前記制御器５０は、前記微小液滴生成装置１０、前記温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０、及び、定量解析装置４０にそれぞれ接続され、前記微小液滴生成装置１０、前記温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０及び定量解析装置４０を制御するために用いられる。
【００１９】
前記デジタルＰＣＲ検出器１は、前記微小液滴生成装置１０、前記温度制御装置２０、前記蛍光信号検出装置３０、及び、前記定量解析装置４０を集積化するため、操作員に自動で操作を実現することができる。前記デジタルＰＣＲ検出器１は、比較的高い作業効率を有する。
【００２０】
前記デジタルＰＣＲ検出器１が稼働している時に、前記微小液滴生成装置１０は、前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成することができる。前記温度制御装置２０は、前記複数の微小液滴に、核酸を増幅する。前記蛍光信号検出装置３０は、前記複数の微小液滴に、変化する蛍光のイメージをリアルタイムで撮影する。前記複数の微小液滴に係る変化する蛍光のイメージに基づいて、前記複数の微小液滴に、変化する蛍光曲線を取得することができる。前記変化する蛍光曲線に基づいて、前記複数の微小液滴のＣｔ値を取得することができ、Ｃｔ値と初期コピー数との関係に基づいて、初期ＤＮＡの濃度を定量解析することができる。ただし、Ｃｔ値とは、各微小液滴の蛍光信号が所定閾値になるまで、経過した巡回数である。
【００２１】
前記温度制御装置２０は、前記複数の微小液滴を核酸増幅反応させ、前記蛍光信号検出装置３０により、核酸増幅反応された前記複数の微小液滴の産物の信号（例えば、蛍光、紫外線吸収や濁度などの信号）を採集する。前記複数の増幅された微小液滴と増幅されなかった微小液滴との構成の相違により、標的配列増幅が得られた液滴数を解析して、核酸分子への定量解析を最終的に実現することができる。前記複数の微小液滴に係る変化する蛍光のイメージをリアルタイムでモニターすることにより、検出結果に直接性を持っているため、前記複数の微小液滴における偽陽性と偽陰性という問題を解決することができる。
【００２２】
前記デジタルＰＣＲ検出器１は、前記微小液滴生成装置１０、前記温度制御装置２０、前記蛍光信号検出装置３０、及び、前記定量解析装置４０を集積化するため、前記操作員に自動で操作を実現するだけではなく、作業効率が高まり、反応が急速となり、再度利用性がよく、感度が高く、特異性が強く、また、結果が明確であるという利点を持っている。
【００２３】
一実施例では、微小液滴が急速に生成され、体積に均一性が高い、微小液滴生成方法及び装置を提供する。
【００２４】
図２を参照すると、一実施例では、前記微小液滴生成装置１０が、液体吐出ピペットチップ１１０、流体駆動機構１２０、運動制御機構１３０及び第一の制御器１７０を含む。前記液体吐出ピペットチップ１１０は、出口端及び入口端を有し、第一の液体を貯留するために用いられる。微小液滴生成装置１０は、微小液滴容器と協働して使用される。前記微小液滴容器は、第二の液体が貯留されており、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端が前記第二の液体の液面下に挿入される。
【００２５】
前記第一の液体と前記第二の液体とは、互いに非相溶を持ち、又は、界面反応を有する。第一の液体と第二の液体は、互いに非相溶を持ち、又は、界面反応を有する任意の二つの液体とされてもよい。本出願の一実施例では、前記第一の液体が水溶液であり、前記第二の液体が、水と互いに非相溶を持つ油性液体、例えば、鉱油（テトラデカンなどを含み）、植物油、シリコーンオイルやパーフルオロアルカンオイルなどであり、生成された液滴が水溶液の液滴となる。又は、前記第一の液体は、鉱油、例えば、テトラデカンとｎ−ヘキサンなどの有機相であり、前記第二の液体は、鉱油と互いに非相溶を持つパーフルオロアルカンオイルである。前記第一の液体と第二の液体は、互いに非相溶を持つ水性両相であってもよい。本出願の他の実施例では、前記第一の液体が水溶液であり、前記第二の液体は、水と互いに非相溶を持つ水性液体であり、例えば、第一の液体は、デキストラン溶液であり、第二の液体は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）  水溶液であり、生成された液滴は、デキストラン溶液の液滴となる。
【００２６】
前記第一の液体と第二の液体は、界面反応を有する二つの液体であってもよい。本出願の一実施例では、前記第一の液体は、アルギン酸ナトリウム水溶液であり、前記第二の液体は、例えば、質量濃度が１％の酸化カルシウムの水溶液である酸化カルシウム水溶液であり、両者に界面反応を有し、生成された液滴は、アルギン酸カルシウムゲルの微小球となる。本出願では、液体吐出ピペットチップ、又は、液体吐出ピペットチップから流れた第一の液体の成分を交換することにより、順次に、開口とされた容器に複数の異なる成分や体積の液滴を形成してもよい。そして、バッチ処理で微小体積にハイスループットでスクリーニングを実現できると共に、複数のステップにより生化学での超微量反応・検出を実現できるので、幅広い応用の見通しを持っている。
【００２７】
前記流体駆動機構１２０は、前記液体吐出ピペットチップ１１０の入口端に接続され、前記液体吐出ピペットチップ１１０の内部に貯留されている前記第一の液体を前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端から排出するために用いられる。前記運動制御機構１３０は、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端が前記第二の液体に対して所定軌跡、所定速度、又は、所定加速度に従って対向運動し、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端から排出された第一の液体が、表面張力、及び、前記液体吐出ピペットチップ１１０から受けられた付着力に打ち勝ち、微小液滴を形成するように制御するために用いられる。前記第一の制御器１７０は、前記流体駆動機構１２０及び前記運動制御機構１３０にそれぞれ接続され、前記流体駆動機構１２０及び前記運動制御機構１３０が協調して稼働するように制御するために用いられる。
【００２８】
一実施例では、微小液滴の生成工程が安定である微小液滴生成方法を提供する。
【００２９】
図３に示されるように、本出願に係る一実施例では、運動制御機構１３０の連動により、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に、瞬間加速度運動を含む運動を行うことができ、ただし、加速度をa1とする。第一の液体は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出されてから、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５を形成する。液滴１９５は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をする瞬間に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離され、微小液滴を形成する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離されるまで受けられた微小液滴の作用力は、それぞれ、重力Ｇ、第二の液体の浮力f1、第二の液体の粘性抵抗f2、及び、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との間の最大付着力f3である。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離されるまでの微小液滴の質量をｍとし、加速度をa2とすると、ニュートン運動の第２法則により、
2021511074.tif 000003
【００３０】
液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との間の付着力の最大値f3は、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー、液滴１９５の表面張力、及び、液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法に関連されている。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をする時に、液滴１９５に対する液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の付着力の方向及び加速度の方向は、同じである。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５を球状として簡略化する。ストークス（Ｓｔｏｋｅｓ）の式により、第二の液体において運動する時に受けられた液滴１９５の粘性抵抗がf2=6πηｒｖとなり、そのうち、ηが第二の液体の粘性係数であり、ｒが液滴１９５の半径であり、ｖが液滴１９５の運動速度である。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をするまで、液滴１９５の速度がゼロであることから、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をする瞬間で、第二の液体に受けられた液滴１９５の粘性抵抗f2は、ゼロ又は極めて小さい。微小液滴の生成工程では、一般的に、液滴１９５の直径範囲がピコリットルからマイクロリットルのオーダーにあり、しかも、液滴１９５の重力Ｇと第二の液体の浮力f1との方向が反対であることから、液滴１９５の重力Ｇと第二の液体の浮力f1のベクトルの和がほぼゼロとなる。粘性抵抗f2が、ゼロ又は極めて小さく、しかも、重力Ｇと浮力f1のベクトルの和がほぼゼロであることから、
2021511074.tif 000004
【００３１】
運動制御機構１３０は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をする加速度の大きさを正確に制御することができる。従って、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が各瞬間加速度運動をする加速度の値を比較的大きくするように制御すれば、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をすることにより、液滴１９５を効果的に生成することができる。
【００３２】
このことに基づいて、本出願がさらに提供する微小液滴生成方法は、
出口端１１２を有し、第一の液体を貯留している液体吐出ピペットチップ１１０を提供し、開口を有し第二の液体を貯留している微小液滴容器を提供し、そのうち、第一の液体と第二の液体は、互いに非相溶を持ち、又は、界面反応を有する任意の二つの液体とされるステップＳ２０１と、
液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２を、微小液滴容器の開口より、第二の液体の液面下に挿入するステップＳ２０２と、
液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に、瞬間加速度運動を含む運動を行いながら、第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出し、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出された第一の液体により、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着される液滴１９５を形成し、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をしている過程において、液滴１９５を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離して第二の液体の液面下に、微小液滴を形成するステップＳ２０３と、を含む。
【００３３】
本出願に係る一実施例では、ステップＳ２０３に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に、瞬間加速度運動を含む運動を周期的に行う。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に周期的に運動することは、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の変位、速度又は加速度がいずれも周期性に変化するということを意味している。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、瞬間加速度運動を含む運動を周期的に行い、第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２により一定の流速で排出するように協働し、微小液滴を等時間間隔で生成することを実現することができる。又は、第一の液体吐出液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の流速は、変化しているものの、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２による一つの運動周期に、第一の液体吐出液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の体積が同じく保持される。そして、体積の一致する微小液滴を生成するように、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が各瞬間加速度運動を行う前に、液滴１９５の体積が同じであることを確保する。
【００３４】
液体吐出ピペットチップ１１０又は第一の液体が交換されない場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー、液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法、及び、液滴１９５の表面張力は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との間の最大付着力f3に影響を与える二つの要素として、変化しない。従って、液体吐出ピペットチップ１１０又は第一の液体が交換されない場合に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との間の付着力の最大値f3は、変化しない。流体駆動機構１２０の連動により、第一の液体が均一な流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から連続して排出される。運動制御機構１３０は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度a1に従って加速度運動するタイミング、及び、瞬間加速度a1の大きさを正確に制御することができる。流体駆動機構１２０と運動制御機構１３０とが互いに協働することは、液滴１９５の体積が一定値になる瞬間で、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に加速度がa1となる瞬間加速度運動を生じさせるように駆動して、体積の一致する微小液滴を形成するということを容易に実現することができる。流体駆動機構１２０は、第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から均一かつ連続で排出するように制御することができれば、運動制御機構１３０駆動液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が等時間に瞬間加速度運動を行うように駆動するということだけで、体積の一致する微小液滴を生成することができる。
【００３５】
複数の液体吐出ピペットチップ１１０を用いて微小液滴を同時又は順次に生成する時に、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー及び液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との間の最大付着力f3に影響を与える二つの要素として、変化する。しかしながら、バッチ処理の加工によれば、液体吐出ピペットチップ１１０の表面自由エネルギー及び液体吐出ピペットチップ１１０の幾何学的寸法が一定の区間で変化するように制御することができる。液滴１９５の表面張力は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との間の最大付着力f3に影響を与えるもう一つの要素として、極めて小さい範囲だけに変化する。従って、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２と液滴１９５との間の付着力の最大値f3も、極めて小さい空間だけに波動する。流体駆動機構１２０は、第一の液体が均一な流速で連続して液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出されるように駆動することができる。運動制御機構１３０は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度a1に従って加速度運動するタイミング及び瞬間加速度a1の大きさを正確に制御することができる。流体駆動機構１２０と運動制御機構１３０が互いに協働すると、液滴１９５の体積が一定値になる瞬間に、駆動液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が、a1という加速度で、瞬間加速度運動を行い、体積の一致する微小液滴を生成することを容易に実現することができる。流体駆動機構１２０は、第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から均一かつ連続で排出するように制御することができれば、運動制御機構１３０により、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が等時間間隔に瞬間加速度度運動を行うように駆動するということだけで、体積の一致する微小液滴を生成することができる。
【００３６】
流体駆動機構１２０は、第一の液体を均一な速度で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出しながら、運動制御機構１３０が、液滴１９５の体積が所定値になる瞬間に、比較的大きい加速度に従って、瞬間加速度運動をするように協働する。本出願が提供する微小液滴生成方法は、一つの液体吐出ピペットチップ１１０だけにより、体積が均一な液滴１９５を生成することができると共に、複数の液体吐出ピペットチップ１１０により同時又は順次に生成された微小液滴の体積も均一性を持っていることを確保することができる。本実施例が提供する微小液滴生成方法は、微小液滴の体積の均一性を確保することができると共に、複数の液体吐出ピペットチップ１１０により同時に微小液滴を生成することができることから、微小液滴の生成効率が向上する。
【００３７】
さらに、運動制御機構１３０の制御により、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、一つの周期性運動に複数の瞬間加速度運動が含まれており、複数の瞬間加速度運動の加速度の大きさが同じ、しかも、複数の瞬間加速度運動のタイミングを介して液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２による一つの運動周期が均一に分けられる。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、一つの周期性運動に複数の瞬間加速度運動が含まれることは、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２により一つの運動周期内に複数の微小液滴を生成することに役立つ。好ましくは、ステップＳ２０３に、第二の液体の液面下に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動軌跡は、直線セグメント、円弧セグメントや多角形形状などの多種類の軌跡の一つ又は複数の組み合わせが含まれる。一つの実施可能な形態として、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は一つの周期性運動に二つの瞬間加速度運動が含まれると、液体吐出ピペットチップ１１０の運動軌跡は、直線又は円弧とされる。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は一つの周期性運動に二つ以上の瞬間加速度運動が含まれると、第二の液体における液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の軌跡は、正三角形、正方形、正五角形や正六角形などを含む正多角形の形状とされる。
【００３８】
一つの実施可能な形態として、ステップＳ２０３に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に周期的に運動する工程では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が矩形波状に変化する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が矩形波状に変化し、加速の段階が完了した直後に、均一な速度の段階に移行するということは、運動制御機構１３０により、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動状態を正確に制御することに役立つ。好ましくは、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度の変化を示す矩形波状のハイレベルタイミング及びローレベルタイミングは、同等でもよく、相違でもよい。さらに、ステップＳ２０３では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に周期的に運動する工程は、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度が方形波状に変化する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度の変化を示す矩形波状のハイレベルタイミング及びローレベルタイミングは、同等である。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動速度の変化を示す矩形波状がローレベルに位置する時に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度がゼロであり、又は、ハイレベルに位置する時の方向と反対方向の速度を有する。図４に示されるように、さらに、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が周期的に運動する周期の前半及び後半において、前記液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度は、それらの大きさが同じであり、それらの方向が反対である。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の一つの運動周期に、二つの反対方向に、瞬間加速度運動が含まれる。
【００３９】
本実施例では、第二の液体の液面下に液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動軌跡は、直線セグメントとされ、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が、直線セグメントの一つの端点から、瞬間加速度運動を行い始め、直線セグメントの他の端点から反対方向に瞬間加速度運動を行う。二つの瞬間加速度運動の加速度は、共にa1とされる。他の実施例では、第二の液体の液面下に液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動軌跡は、円弧セグメント又は多角形形状とされる。さらに、ステップＳ２０３に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に周期的に運動する頻度は、０．１Ｈｚ乃至２００Ｈｚにある。そうすると、プロジェクトでは、実現されやすい。
【００４０】
図４及び図５に示されるように、本出願の一つの具体的な実施例では、流体駆動機構１２０は、第一の液体を一定の流速で液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出するように制御する。運動制御機構１３０は、液体吐出ピペットチップ１１０の出力端が、直線とされる運動軌跡で、方形波状に変化する速度で、周期的に運動するように制御する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の速度方向が変化する時に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をする加速度が最大値になる。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２に付着された液滴１９５も、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が瞬間加速度運動をする加速度が最大値になった時に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱離して、微小液滴１９９を形成する。第一の液体が、一定流速で、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から排出されることから、液滴１９５が液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から脱落する時に、新たな液滴１９５が生成状態に移行する。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が再度、反対方向に加速度運動を行う時に、新たに生成された液滴１９５も液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２から落下して新たな微小液滴１９９を形成する。
【００４１】
本実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、一つの運動周期に二つの微小液滴１９９を生成することができ、方形波状がプロジェクトで実現されやすい。他の実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、一つの運動周期に、一つの微小液滴１９９を生成する。好ましくは、実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、第二の液体６９９において、任意方向に、直線とされる軌跡で方形波状に運動を行う。この運動は、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向と垂直する平面内に、直線とされる軌跡による方形波状の運動、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向に対して任意角度とされる平面に、直線とされる軌跡による方形波状の運動、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向に、直線とされる軌跡による方形波状の運動などが含まれる。本出願の他の実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動軌跡が円弧セグメント又は多角形の形状とされる時に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体６９９において任意方向に、直線とされる軌跡による方形波状の運動は、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向と垂直する平面に、直線とされる軌跡による方形波状の運動、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向に対して任意角度とされる平面に、直線とされる軌跡による方形波状の運動、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向に直線とされる軌跡による方形波状の運動などが含まれる。
【００４２】
一実施例では、前記微小液滴１９９は、検出すべき核酸増幅反応液であり、前記微小液滴生成装置１０により、前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成し、前記デジタルＰＣＲ検出器１により検出を行うために用いられる。前記検出すべき核酸増幅反応液は、一体式とされるデジタルＰＣＲ検出器１の微小液滴生成装置１０により、微滴化という処理を介して、複数の微小液滴１９９に転換され、検出すべき試料における検出すべき断片が多量で複雑な背景から分離され、微小液滴容器６０に置かれて、検出を待機される。微小液滴生成装置１０により、複数の大きさが均一な微小液滴１９９を生成することができる。各前記微小液滴１９９の大きさがミクロンオーダであり、しかも、各前記微小液滴１９９が、独立する一つの反応器として取り扱われるため、生化学反応に、よく使われる試験管と相当できる。観察を便宜にするように、前記複数の微小液滴１９９を微小液滴容器６０に置く。同時に、前記微小液滴生成装置１０により、複数の異なる体積となる微小液滴を生成することができるため、医学臨床の検出に適用されてもよい。前記複数の微小液滴１９９は、体積が小さく、数が多いことから、数多くの普通な試験管にない優位性を有している。前記微小液滴生成装置１０により、微小液滴１９９を多量に生成できるので、前記デジタルＰＣＲ検出器１にスループットが高く、消耗品としてコストが低く、背景にノイズが低い、という利点を有し、より良い工業化の見通しが存在している。
【００４３】
一実施例では、昇降温の速度が早く、耐用年数が長い温度制御装置を提供する。
【００４４】
図７、８に示されるように、本出願がさらに提供する温度制御装置２０は、フレキシブル回路基板２２０と、前記フレキシブル回路基板２２０と間隔配置される加熱基板２４０と、複数の半導体熱電対２３０とを含む。前記加熱基板２４０は、対向配置される第一の表面２４１及び第二の表面２４２を含む。前記複数の半導体熱電対２３０は、前記フレキシブル回路基板２２０と前記第一の表面２４１との間に配置される。前記複数の半導体熱電対２３０が互いに直列接続され、並列接続され、又は、直列列接続されている。
【００４５】
前記温度制御装置２０は、一般的に、高低温の循環の環境に応用されており、温度を急速に昇降させる必要があるため、前記温度制御装置２０に対する要求が極めて高い。前記温度制御装置２０に応用のニーズを満たせるように、前記温度制御装置２０に、前記フレキシブル回路基板２２０が用いられる。前記フレキシブル回路基板２２０は、配線の密度が高く、重さが軽く、厚さが薄く、折り曲げ性がよい、という利点を有している。前記フレキシブル回路基板２２０は、昇降温の工程において自体の変形により熱応力を解消できる。前記フレキシブル回路基板２２０により、昇降温の工程に存在する熱応力が低減可能であるため、前記温度制御装置２０の耐用年数を延ばすことができる。同時に、前記フレキシブル回路基板２２０により、温度分布が均一でないという問題を解決することができる。前記複数の微小液滴に、異なる温度範囲に核酸を増幅する時に、前記フレキシブル回路基板２２０、加熱基板２４０及び複数の半導体熱電対２３０により、僅か数秒時間に切り替えを急速に実現することができる。そして、前記温度制御装置２０は、瞬間に昇降温を実現することができ、昇降温の工程が短縮化し、高低温の循環が実現され、前記デジタルＰＣＲ検出器１の検出時間が短縮化し、検出に効率が向上する。
【００４６】
前記フレキシブル回路基板２２０（Ｆｌｅｘｉｂｌｅ  Ｐｒｉｎｔｅｄ  Ｃｉｒｃｕｉｔ  、ＦＰＣ）は、ポリイミド（Ｐｏｌｙｉｍｉｄｅ）又はポリエステルフィルムを素材として形成され、高度な確実性、特に優れる可撓性を有する印刷回路基板であってもよい。前記フレキシブル回路基板は、配線の密度が高く、重さが軽く、厚さが薄く、折り曲げ性がよいという利点を有している。前記フレキシブル回路基板は、重さが軽く、厚さが薄く、製品に体積を効果的に省くことができる。そのうち、前記サーモエレクトリック・クーラ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｅｌｅｃｔｒｉｃ  Ｃｏｏｌｅｒ、ＴＥＣ）は、半導体材料によりペルチェ効果により製造されたものである。いわゆるペルチェ効果とは、直流電流が二つの半導体材料からなる熱電対を流す時に、その一方端が吸熱し他方端が放熱するという現象である。前記フレキシブル回路基板２２０により、従来のサーモエレクトリック・クーラの一つの基板に代えて、前記サーモエレクトリック・クーラの熱伝導の性能をより良くすることができる。
【００４７】
温度が変わったときに、物体に、外部からの制限、及び、内部における各部分間の互いの制限により、完全に自在膨張・収縮できず、応力が生じる。熱応力は、温度変化による応力とも称する。熱応力とゼロの外部負荷との高度なバランスは、熱変形が約束されて、自体に生じたバランスとなる応力であり、高い温度に圧縮が生じ、低い温度に伸長という変形が生じる。ある条件では、応力を制御することにより、合理的な分布を取り、部品に機械性能や耐用年数を延ばし、有害なものを、利益的なものに変えることができる。
【００４８】
一実施例では、前記加熱基板２４０は、アルミニウム超伝導基板回路であってもよい。
【００４９】
アルミニウム基板は、良い放熱性能を持つ金属基材銅張り板であり、一般的に、片面板は、回路層（銅箔）、絶縁層及び金属基層という三つの層からなる構造である。前記アルミニウム超伝導基板回路は、配線回路板の材料がアルミニウム合金とされ、熱伝導が速い。アルミニウム基板は、熱抵抗が最も低く、極めて優れる熱伝導性能を持ち、膜が厚いセラミック回路に比べると、その機械性能も極めて優れる。
【００５０】
図９に示されるように、一実施例では、前記半導体熱電対２３０は、一つのＰ型の熱電素子２３１と、前記Ｐ型の熱電素子２３１に間隔配置される一つのＮ型の熱電素子２３２と、を含む。
【００５１】
前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２とは、前記フレキシブル回路基板２２０と前記基板２４０との間に溶接される。前記半導体熱電対２３０は、複数の前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２とで形成された、対となる熱電対を含み、複数の対となる前記半導体熱電対２３０の間に電極が接続され、前記フレキシブル回路基板２２０と前記第一の表面２４１との間に介在される。電流が流れると、「熱」側及び「冷」側が生じる。冷却するか加熱するか、及び、冷却や加熱の速度についても、その電流方向及び大きさにより決められている。対となる前記半導体熱電対２３０により生成した熱電效応が非常に小さいことから、実際に、生じる熱電效応を大きくするように、数百対の前記半導体熱電対２３０を直列接続することが多い。
【００５２】
一実施例では、前記第一の表面２４１は、間隔配置されている複数の第一の電極片２４３を含み、一つの前記第一の電極片２４３が一つの前記半導体熱電対２３０に対応し、前記半導体熱電対２３０における前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２とは、前記第一の電極片２４３を介して直列接続される。
【００５３】
一実施例では、前記フレキシブル回路基板２２０は、間隔配置され、かつ、互いに直列接続される複数の第二の電極片２２１を含み、隣接する二つの前記半導体熱電対２３０は、一つの前記第二の電極片２２１と直列接続される。
【００５４】
前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２とが結合された前記半導体熱電対２３０に電流が流れると、両端間に熱量が移転され、熱量が一方端から他方端に移転することにより生じた温度差により冷却・発熱端が形成される。しかしながら、前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２は、自体に存在する電気抵抗により、電流が前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２とを流れると、熱量が生じることから、熱伝導に影響を与えてしまう。さらに、前記フレキシブル回路基板２２０と前記加熱基板２４０との間の熱量は、空気、及び、前記Ｐ型の熱電素子２３１と前記Ｎ型の熱電素子２３２との材料自体を介して反対方向に熱伝導をすることもある。冷却・発熱端が一定の温度差になり、この二つの熱伝導量が等しくなると、一つのバランスポイントで、順方向及び逆方向の熱伝導が互いに相殺することになる。この時、冷却・発発熱端の温度がこれ以上に変化しない。また、より低い温度を得るために、放熱などの方式で発熱端の温度を低くさせてもよい。
【００５５】
一実施例では、前記温度制御装置２０は、前記第二の表面２４２に配置される熱伝導強化層２５０をさらに含む。
【００５６】
前記熱伝導強化層２５０は、特によい強度、柔軟、電気伝導、熱伝導や光学特性を有している。前記熱伝導強化層２５０は、前記微小液滴容器６０に直接接触することにより、前記複数の微小液滴への熱伝導を均一にするように、温度を制御して核酸を増幅することが実現される。前記熱伝導強化層２５０は、グラファイト熱伝導層又はシリコーングリース熱伝導層であってもよい。そうすると、熱伝導が速く、前記加熱基板２４０の前記第二の表面２４２に温度の均一性が向上し、前記微小液滴容器６０に近い表面に温度が均一となるということを確保でき、前記複数の微小液滴への熱伝導を均一することができる。また、核酸の増幅が完了し、検出効率が向上し、時間が短縮化する。
【００５７】
一実施例では、前記熱伝導強化層２５０は、その材料にグラフェンが含まれる。前記グラフェンは、平面の薄膜であり、特に良い熱伝導の性能を有し、横方向に均一な熱伝導がされる。
【００５８】
一実施例では、前記温度制御装置２０は、前記フレキシブル回路基板２２０に電気接続され、電流を制御するための第二の制御器２１０をさらに含む。
【００５９】
一実施例では、前記温度制御装置２０は、前記第二の表面２４２に配置され、前記第二の制御器２１０に電気接続され、前記第二の表面２４２の温度を検出して前記第二の制御器２１０に送信するための温度センサー２６０をさらに含む。
【００６０】
前記温度センサー２６０は、前記熱伝導強化層２５０の前記第二の表面２４２に配置され、前記第二の表面２４２のリアルタイムの温度を検出し、温度の情報を前記第二の制御器２１０にフィードバックすることにより、前記複数の微小液滴に対する加熱温度を制御することができる。前記温度センサー２６０は、金属の電気抵抗の変化を検出することにより、前記微小液滴容器６０の温度を測量し、また、前記複数の微小液滴に核酸を増幅する工程において温度の変化をリアルタイムで検出し、温度の情報を前記第二の制御器２１０にフィードバックすることにより、前記制御回路により温度を調整するように制御し、温度制御を実現することができ、より良い核酸の増幅を目指すことが可能である。
【００６１】
一実施例では、前記第二の制御器２１０は、温度制御手段２１２及び制御回路２１４を含む。前記温度制御手段２１２は、前記温度センサー２６０に接続され、前記第二の表面２４２の温度をリアルタイムで検出するために用いられる。前記制御回路２１４は、前記フレキシブル回路基板２２０に接続され、前記複数の半導体熱電対２３０の温度の変化を調整して制御するために用いられる。
【００６２】
前記温度制御手段２１２と前記制御回路２１４とは、一つの回路基板に配置される。前記温度制御手段２１２と前記制御回路２１４との関係は、内部のアルゴリズムの論理演算の関係であり、ＰＩＤクローズループ制御アルゴリズムというＰａｃｋｅｔ  Ｉｄｅｎｔｉｆｉｅｒのクローズループ制御アルゴリズムが採用されてもよい。前記温度制御手段２１２により検出された温度が内部アルゴリズムの入力として、核酸増幅の温度フィードバックであり、前記制御回路２１４により計算された結果が内部アルゴリズムの出力とされることにより、クローズループという関係が形成される。回路部分の温度フィードバックは、実際に、一つのサンプリング回路とされる。採集されたのは白金抵抗による電気信号であり、温度値に変換されてから制御回路の入力端に送信される。前記温度センサー２６０は、前記温度制御手段２１２に標準化する白金抵抗三線式で接続される。
【００６３】
一実施例では、前記フレキシブル回路基板２２０は、第一の電極２２２及び第二の電極２２３が配置されている。前記複数の第二の電極片２２１は、直列接続されてから前記第一の電極２２２及び前記第二の電極２２３に直列接続される。前記第一の電極２２２及び前記第二の電極２２３は、前記制御回路にそれぞれ接続される。
【００６４】
前記制御回路２１４と前記フレキシブル回路基板２２０とは、前記第一の電極２２２及び前記第二の電極２２３に、二つの配線を介して、それぞれ接続される。
【００６５】
一実施例では、前記温度制御装置２０は、放熱装置２７０をさらに含み、前記放熱装置２７０は、基板２７１、及び、前記基板２７１に接続される放熱フィン２７２を含む。前記フレキシブル回路基板２２０は、前記基板２７１の表面に配置される。
【００６６】
前記放熱フィン２７２は、前記基板２７１の表面に配置されていることから、前記基板２７１の面積を少なくしないが熱交換の面積をさらに増加してきたため、前記基板２７１の表面に作用する涼しい風の時間を延ばし、複数の放熱ダクトを形成し、熱交換を速く行うことに役立つに加えて、より多い熱量を前記基板２７１の表面から逃がして、より理想な放熱効果を達することができる。
【００６７】
一実施例では、前記温度制御装置は、前記放熱フィン２７３の周りを囲むように配置されるファン２７３を含む。
【００６８】
前記ファン２７３により、前記放熱装置２７０による放熱を支援してもよい。そのうち、前記ファン２７３は、前記放熱フィン２７３の周りに複数配置されてもよい。そうすると、より優れた放熱の効果が実現され、前記温度制御装置２０への昇降温をより急速に行うことができる。
【００６９】
一実施例では、前記温度制御装置２０に交流電力を流すと、前記第二の制御器２１０により電流の大きさを調節することにより、前記温度制御装置２０を冷却させるか加熱させるか、及び、この冷却や加熱の速度を制御することができる。同時に、前記温度センサー２６０により、前記微小液滴容器６０の加熱温度をリアルタイムで検出し、温度の情報を前記温度制御手段２１２にフィードバックする。前記温度制御手段２１２は、温度が変化した旨を前記制御回路２１４にフィードバックし、前記複数の微小液滴の温度を制御する。前記温度制御装置２０により、前記複数の微小液滴に核酸を増幅することができる。ＰＣＲには、三つのステップの原理を元に、変性−アニーリング−伸長という三つの温度点を配置する。標準反応に三つの温度点法を用いることにより、二本鎖ＤＮＡを９０〜９５℃で変性させ、再度急速に４０〜６０℃まで冷却し、プライマーをアニーリングして標的配列と結合し、次に、急速に７０〜７５℃まで昇温し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの作用により、プライマーの鎖を鋳型に沿って延ばして、適宜な温度範囲に、核酸を増幅する。同時に、核酸を増幅する工程では、前記微小液滴容器６０の底部が前記温度制御装置２０にぴったりと貼り合わせられ、両者間に隙間が無くなると、前記デジタルＰＣＲ検出器１に正確性が向上する。
【００７０】
図１０を参照すると、前記温度制御装置２０については、一般的な場合に、温度制御の性能をテストする主な二つの指標として、それぞれ、瞬間状態と安定状態で、前記温度制御装置２０の昇降温度の変化を検出するということである。前記複数の微小液滴の加熱工程をモニターすることにより、前記温度制御装置２０が前記複数の微小液滴を温度昇降する時に、昇降温の速度が最大で１３．３４４４８℃／ｓとなり、制御の精度が０．０２７２２℃となる。しかも、前記温度制御装置２０の昇温が安定状態になるまで測量された速度が最速で１８．９５３８９４℃／ｓとなることもある。従って、前記温度制御装置２０は、その瞬間的なレスポンスが良く、前記温度制御装置２０により、瞬間に昇降温を実現でき、時間が短縮化し、検出の効率が向上する。
【００７１】
図１１を参照すると、前記温度制御装置２０が安定状態にある時に、つまり、安定になった後に、温度が浮動する場合を示す。前記温度制御装置２０が安定状態にある時に、温度の変化が比較的安定し、温度の浮動が比較的小さい。従って、前記温度制御装置２０は、急速に昇降温による循環を実現でき、しかも、安定された後に温度の浮動が比較的小さいことから、デジタルＰＣＲで溶液試料を検出する時間を省いて、作業効率が向上する。このような昇降温の速度により、核酸に増幅を済ませる必要な時間を省いて、核酸増幅の効率が向上すると共に、デジタルＰＣＲによる検出システムに正確性が向上する。
【００７２】
図６を参照すると、一実施例では、前記蛍光信号検出装置３０は、励起光源３４０、蛍光検知アセンブリ３３０及び第三の制御器３１０を含む。前記励起光源３４０は、前記微小液滴容器６０の検出領域の上方に配置され、前記微小液滴容器６０の検出領域に対して傾斜角度で照射し、傾斜照射光路を形成する。前記蛍光検知アセンブリ３３０は、前記微小液滴容器６０の検出領域の直上に配置され、前記複数の微小液滴に蛍光画像を採集するために用いられる。前記第三の制御器３１０は、前記励起光源３４０及び前記蛍光検知アセンブリ３３０にそれぞれ接続され、前記励起光源３４０及び前記蛍光検知アセンブリ３３０を制御するために用いられる。前記蛍光信号検出装置は、微小液滴に複数の蛍光チャネルでイメージングを行い、明視野・暗視野でイメージングを行うことができる。そのうち、複数の蛍光チャネルによるイメージングは、微小液滴の反応信号を検知するためのものであり、明視野・暗視野によるイメージングは、微小液滴を形成するサイズの情報を検出し、反応工程において液滴状態をモニターするために用いられる。
【００７３】
一実施例では、前記第三の制御器３１０は、前記励起光源３４０の移動を制御しているが、この時に、前記蛍光検知アセンブリ３３０と前記微小液滴容器６０とが移動しない。言い換えると、この時、前記励起光源３４０の移動により、前記複数の微小液滴を蛍光検出する。又は、前記第三の制御器３１０は、前記蛍光検知アセンブリ３３０の移動を制御しているが、この時に、前記微小液滴容器６０と前記励起光源３４０とが移動しないように、前記複数の微小液滴を蛍光検出する。又は、前記第三の制御器３１０は、前記微小液滴容器６０の移動を制御しているが、前記蛍光検知アセンブリ３３０と前記励起光源３４０とが移動しないように、前記複数の微小液滴を蛍光検出する。前記第三の制御器３１０は、前記励起光源３４０、前記蛍光検知アセンブリ３３０、及び、前記微小液滴容器６０の位置移動を調節し、対向運動が生じると、検出領域における前記微小液滴容器６０と前記蛍光検知アセンブリ３３０とが合わせられ、撮影により蛍光検出する工程全体が済む。
【００７４】
前記励起光源３４０の放射する光路を、前記複数の微小液滴に傾斜照射することにより、前記微小液滴容器６０に蛍光物質を含んでいる微小液滴に蛍光を生じさせる。前記蛍光検知アセンブリ３３０により、前記蛍光物質を含んでいる微小液滴に蛍光情報を採集し、前記蛍光物質を含んでいる微小液滴を蛍光情報として蛍光画像の形式で前記定量解析装置４０に送信し、定量解析を行う。
【００７５】
前記微小液滴容器６０上方から、傾斜角度で前記微小液滴容器６０に照射する。前記蛍光信号検出装置３０により、前記複数の微小液滴に周期性に二次元走査を行いながら、リアルタイムで撮影する。傾斜照射光路により、効果的に、励起光の散乱の背景を低減し、蛍光検出の感度を上がることができる。前記微小液滴容器６０における前記複数の微小液滴の内部の蛍光が励起され、前記蛍光検知アセンブリ３３０により、前記複数の微小液滴に蛍光画像を採集する。
【００７６】
前記励起光源３４０は、前記複数の微小液滴に、蒸発、原子化や励起を行うに必要なエネルギーを提供する。前記励起光源３４０は、スペクトルバンド幅が狭く、周波数スペクトルの純度が高く、波長の安定性が良く、効率が高く、耐用年数が長く、確実性が良く、光束の品質が良いなどの利点を有していることから、検出結果に正確性や安定性が確保されえる。
【００７７】
一実施例では、前記励起光源３４０は、複数の異なる色のＬＥＤ光源３４１、ダイクロイックミラー３４４、複眼レンズ３４５及び集光レンズ３４６を含む。各前記ＬＥＤ光源３４１は、それらの先端に、順次にコリメータミラー３４２及び第一の光学フィルター３４３が設けられる。前記ダイクロイックミラー３４４は、前記第一の光学フィルター３４３の先端に傾斜配置され、各前記ＬＥＤ光源３４１の放射した光を一つの光路に屈折するために用いられる。前記複眼レンズ３４５は、屈折された前記光路の均一性を高めるために用いられる。前記集光レンズ３４６は、前記複眼レンズ３４５の先端に配置され、集光してイメージングするために用いられる。
【００７８】
前記複数の異なる色のＬＥＤ光源３４１は、励起光源３４０として、異なる色の蛍光を生成し、検出チャネルを増やし、異なる種類の微小液滴を検出することができる。各前記ＬＥＤ光源３４１は、その先端に、順次に、前記コリメータミラー３４２及び前記第一の光学フィルター３４３が設けられる。前記コリメータミラー３４２は、光束が導くシステムに用いられ、レーザ共振チャンバーと集光光学素子との光束のコリメーションを維持するために用いられる。しかも、前記ＬＥＤ光源３４１は、前記第一の光学フィルター３４３により、必要な周波数帯の光を励起光として分離することができる。前記ダイクロイックミラー３４４、前記複眼レンズ３４５及び前記集光レンズ３４６などの光学鏡を利用して、励起光を、平行又は集光の光束に変えて、チップにおける複数の液滴が含まれている領域に照射して、励起の領域を形成すると共に、励起光を、前記微小液滴容器６０における前記複数の微小液滴に励起する。
【００７９】
一実施例では、前記励起光源３４０と前記蛍光検知アセンブリ３３０とは、一体形成とされてもよく、個別に形成されてもよい。
【００８０】
前記蛍光信号検出装置３０を傾斜角度で前記微小液滴容器６０に照射する時に、前記蛍光信号検出装置３０は、前記複数の微小液滴に周期性に二次元走査を行いながら、リアルタイムで撮影することができる。前記蛍光信号検出装置３０を傾斜角度で前記微小液滴容器６０に照射することにより、効果的に励起光の散乱の背景を低減させ、蛍光検出の感度を上がることができる。前記微小液滴容器６０内の前記複数の微小液滴の内部蛍光は、励起されると、前記第二の光学フィルター３３３を通過し、上方の前記対物レンズ３３２に集められてから、前記カメラ３３１に進入し、前記カメラ３３１により前記複数の微小液滴に蛍光画像を採集する。
【００８１】
前記集光レンズ３４６の光路を前記複数の微小液滴に傾斜照射することにより、前記微小液滴容器６０に含まれている蛍光物質の微小液滴に、蛍光を生じさせる。前記蛍光検知アセンブリ３３０により、前記蛍光物質を含んでいる微小液滴に蛍光情報を採集すると共に、前記蛍光物質を含んでいる微小液滴について、蛍光情報を蛍光画像の形式で前記定量解析装置４０に送信し、定量解析を行う。
【００８２】
一実施例では、前記第三の制御器３１０により、前記複数の異なる色のＬＥＤ光源３４１及び前記カメラ３３１を同期に起動してもよい。
【００８３】
前記第一の光学フィルター３４３は、必要な放射周波数帯の光学器件を選択することに用いられる。前記第一の光学フィルター３４３は、プラスチック又はガラス片に、特別な種類の染料を添加してなされたものであり、赤色光学フィルターは、赤色光のみを通過する。このように、類推する。ガラス片の透過率は、そもそも、空気とほぼ同じであり、すべての色を通過できるわけではないため、透明であり、しかし、染料により着色された後に、分子の構造が変化し、屈折率も変化した。ある種類の光を通過することも、併せて変化する。例えば、一つの白光が青色光学フィルターを通過すると、射出されたのは青色光となり、含まれている緑色光や赤色光が極めて少なく、数多くの光は光学フィルターに吸収された。前記ダイクロイックミラー３４４は、前記第一の光学フィルター３４３の先端に傾斜配置され、各前記ＬＥＤ光源３４１の放射した光を一つの光路に屈折する。前記複眼レンズ３４５は、屈折された前記光路の均一性を高めるために用いられる。前記集光レンズ３４６は、前記複眼レンズ３４５の先端に配置され、集光してイメージングするために用いられる。前記集光レンズ３４６は、屈折率分布型レンズに該当し、端面で集光とイメージングの特性を有し、また、円柱状とされる見かけの特徴を有することから、多種類の異なるマイクロ式光学システムに適用されえる。
【００８４】
前記第三の制御器３１０により、前記複数の異なる色のＬＥＤ光源３４１間に切り替えを制御して、異なる蛍光検出チャネルを構成することができる。前記複数の異なる色のＬＥＤ光源３４１は、交替で作業してもよく、個別に配置する交替リング（交替用部材）が必要とされない。
【００８５】
前記コリメータミラー３４２は、反射式コリメータミラーと透過式コリメータミラーに分けられる。反射式コリメータミラーと透過式コリメータミラーは、光束を導くシステムに用いられ、レーザ共振チャンバーと集光光学素子との光束のコリメーションを維持するために用いられる。反射式コリメータミラーは、一般的に、銅製全反射ミラーが用いられる一方、透過式コリメータミラーは、セレン化亜鉛レンズが用いられる。
【００８６】
一実施例では、前記蛍光検知アセンブリ３３０は、対物レンズ３３２、カメラ３３１、及び、第二の光学フィルター３３３を含み、前記対物レンズ３３２が前記カメラ３３１と前記第二の光学フィルター３３３との間に配置される。
【００８７】
前記第二の光学フィルター３３３は、マルチバンドパスフィルタが用いられる。前記マルチバンドパスフィルタは、ある種類の染料とそれぞれ対応する複数の周波数帯の光を同時に通過することができる。バイオメディシンに蛍光による検査・解析システムでは、物質の励起光や放射蛍光の特徴の周波数帯のスペクトルを分離して選択する。分子は、吸収帯に、励起スペクトルを吸収してから、放射帯に長波の放射スペクトルを放射し、即ち、蛍光スペクトルを形成する。
【００８８】
前記複数の微小液滴に蛍光画像を生成することは、主に、前記カメラ３３１によりなされる。前記カメラ３３１は、光学映像をデジタル信号に変換することができる。前記カメラ３３１に、数多くの揃った容量が配列されているので、光線を励起して、映像をデジタル信号に変換することができる。各小容量は、外部回路の制御により、その電荷を、隣接する他の容量に転送することができる。前記カメラ３３１により、前記複数の微小液滴に蛍光を採集することから、直観的に視認できる蛍光画像を提供し、蛍光検出の速度が向上し、検出結果がより正確になる。
【００８９】
前記蛍光信号検出装置３０により、前記複数の微小液滴を蛍光でイメージングし、一回だけ、一定数の前記複数の微小液滴に蛍光画像を撮影し、画像処理の技術に基づいて、画像における液滴の蛍光を自動識別して液滴の蛍光情報を取得することができる。
【００９０】
前記蛍光信号検出装置３０により、前記複数の微小液滴を蛍光でイメージングし、一回だけ、一定数の前記複数の微小液滴に蛍光画像を撮影し、画像処理の技術に基づいて、画像における液滴の蛍光を自動識別して液滴の蛍光情報を取得することができる。
前記微小液滴容器６０の上方から、傾斜角度で、前記微小液滴容器６０に照射する。前記蛍光信号検出装置３０により、前記複数の微小液滴に、周期性に、二次元走査を行いながら、リアルタイムで撮影する。傾斜照射光路は、効果的に、励起光の散乱の背景を低下させ、蛍光検出の感度を上がることができる。
【００９１】
前記微小液滴容器６０における前記複数の微小液滴の内部の蛍光は、励起されると、前記第二の光学フィルター３３３を通過し、上方の前記対物レンズ３３２に集められ、前記カメラ３３１に進入し、前記カメラ３３１により、前記複数の微小液滴に蛍光イメージを採集する。
【００９２】
前記励起光源３４０は、前記複数の微小液滴に、蒸発、原子化又は励起を行うに必要なエネルギーを提供する。前記励起光源３４０は、スペクトルバンド幅が窄く、周波数スペクトルの純度が高く、波長の安定性がよく、効率が高く、耐用年数が長く、確実性が良く、光束品質がよい、などの利点を有し、検出結果に正確性及び安定性が確保される。
【００９３】
一実施例では、連続照射による蛍光の退色を避けるように、コンピューターにより、前記ＬＥＤ光源３４１の起動と前記カメラ３３１の採集とを同期に行わせる。採集されていない状態では、前記ＬＥＤ光源３４１が、そのまま、閉じた状態を維持する。
【００９４】
前記第三の制御器３１０は、前記複数の異なる色のＬＥＤ光源３４１間に切り替えを制御して、異なる蛍光の検出チャネルを構成することができる。前記複数の異なる色のＬＥＤ光源３４１は、交替で作業してもよく、個別に配置される交替リング（交替用部材）が必要とされない。各前記ＬＥＤ光源３４１は、その先端に順次にコリメータミラー３４２及び第一の光学フィルター３４３が設けられる。
【００９５】
前記コリメータミラー３４２は、反射式コリメータミラーと透過式コリメータミラーとに分けられる。反射式コリメータミラーと透過式コリメータミラーとは、光束を導くシステムに用いられ、レーザ共振チャンバーと集光光学素子との光束のコリメーションを維持するために用いられる。反射式コリメータミラーは、一般的に、銅製全反射ミラーが用いられる一方、透過式コリメータミラーは、セレン化亜鉛レンズ用いられる。
【００９６】
前記第一の光学フィルター３４３は、必要な放射周波数帯の光学器件を選択するために用いられる。光学フィルターは、プラスチック又はガラス片に特別な種類の染料を添加してなされるものであり、赤色光学フィルターは、赤色光のみを通過する。このように類推する。光学フィルターという製品は、主に、スペクトル周波数帯、スペクトル特性、膜層の材料、応用の特徴などの方式に従って分類される。
【００９７】
前記ダイクロイックミラー３４４は、前記第一の光学フィルター３４３の先端に傾斜設置され、各前記ＬＥＤ光源３４１の放射した光を一つの光路に屈折するために用いられる。前記ダイクロイックミラー３４４の原理とは、その内部に透明な方解石（Ｉｃｅｌａｎｄ  ｓｐａｒ）を置いて、光線を二つの垂直する振動光に分解して、ダイクロイックミラーを介して、それぞれ、この二つの光線の色を観察するということである。
【００９８】
前記複眼レンズ３４５は、屈折された前記光路に均一性を高めるために用いられる。前記複眼レンズ３４５は、一連の小レンズにより組み合わせて形成され、二つの配列の複眼レンズマトリックスを照明システムに適用すると、高い光エネルギーの利用率及び大きい面積に均一な照明を取得することができる。複眼レンズは、マイクロディスプレイ及びプロジェクションディスプレイの分野で、幅広い応用の見通しが存在している。二つの配列の複眼レンズマトリックスによれば、均一な照明を実現でき、複数の異なる色の前記ＬＥＤ光源に均一性及び照明の輝度が向上し、自体と、観察される物体との方位や距離を効果的に算出し、より正確な蛍光イメージを取得することができる。前記複眼レンズマトリックスにより均一な照明を実現するには、二つの配列の複眼レンズマトリックスが平行して配列され、第一の列複眼レンズマトリックスにおける各個の小単位としてのレンズの焦点が第二の列の複眼レンズマトリックスにおける対応する小単位レンズの中心と一致しており、二つの配列の複眼レンズの光軸が互いに平行し、第二の列複眼レンズの後方に集光鏡を設置し、集光鏡の焦平面に照明スクリーンを設置して均一な照明システムを形成することが必要となる。
【００９９】
前記複眼レンズマトリックスは、均一な照明を実現する原理が以下の通りである。光軸と平行する光束は、第一のレンズを通過して第二のレンズの中心に集光され、第一の配列の複眼レンズのクロス光源が複数の光源像を形成して照明を行い、第二の配列の複眼レンズの各小レンズが第一の配列の複眼レンズにおける対応する小レンズを照明面に重ねてイメージングする。第一の配列の複眼レンズは、光源の広い光束全体を複数の細かい光束に分けて照明を行い、しかも、各細かい光束の範囲内に垂泪の不均一性について、対称位置に位置する細かい光束が互いに重なり合うことから、細かい光束の垂泪の不均一性が補償され、アパーチャ全体内の光エネルギーを効果的に用いることが可能である。第二の配列の複眼レンズから出射されたスポットは、集光鏡を介して、照明スクリーンに集光されることから、照明スクリーンにおいて各スポットが、いずれも、光源における各点から放射された光線により照射され、同時に、光源における各点から放射された光束も、さらに、いずれも、照明スポットによる同一の視野範囲に重なれることから、一つの均一な方形スポットが得られる。
【０１００】
前記集光レンズ３４６は、前記複眼レンズ３４５の先端に配置され、集光してイメージングを行うために用いられる。前記集光レンズ３４６は、屈折率分布型レンズに該当し、端面に集光と成象の特性を有し、円柱状とされる外形の特性を有することから、多種類の異なるマイクロ式光学システムに適用される。
【０１０１】
一実施例では、前記蛍光検知アセンブリ３３０は、対物レンズ３３２、カメラ３３１及び第二の光学フィルター３３３を含み、前記対物レンズ３３２は、前記カメラ３３１と前記第二の光学フィルター３３３との間に配置される。
【０１０２】
前記第三の制御器３１０により、前記複数の異なる色のＬＥＤ光源３４１間に切り替えを制御することができる。前記第三の制御器３１０は、前記複数の異なる色のＬＥＤ光源３４１及び前記カメラ３３１を同期に起動する。前記複数の微小液滴の蛍光画像を生成することは、主に、前記カメラ３３１によりなされる。前記カメラ３３１は、光学映像をデジタル信号に変換可能である。前記カメラ３３１には、数多くの揃った容量が配列され、光線が励起され、映像をデジタル信号に変換する。各小容量は、外部回路の制御により、その電荷を、隣接する他の容量に転送することができる。前記カメラ３３１により前記複数の微小液滴の蛍光を採集することにより、直観的に視認できる蛍光の画像を提供し、蛍光検出の速度を上がり、検出結果をより正確にすることができる。
【０１０３】
前記第二の光学フィルター３３３は、マルチバンドパスフィルタが用いられる。前記マルチバンドパスフィルタは、ある種類の染料とそれぞれ対応する複数の周波数帯の光を同時に通過することができる。バイオメディシンに蛍光による検査・解析システムでは、物質の励起光や放射蛍光の特徴の周波数帯のスペクトルを分離して選択する。分子は、吸収帯に、励起スペクトルを吸収してから、放射帯に長波の放射スペクトルを放射し、即ち、蛍光スペクトルを形成する。
【０１０４】
図６を参照すると、一実施例では、前記励起光源３４０は、五つの異なる色のＬＥＤ光源３４１、五つの前記コリメータミラー３４２、五つの前記第一の光学フィルター３４３、四つの前記ダイクロイックミラー３４４、一つの前記複眼レンズ３４５及び一つの集光レンズ３４６を含む。前記五つの異なる色のＬＥＤ光源３４１は、異なる色の光を生成し、前記複数の微小液滴に照射することができる。前記五つの異なる色のＬＥＤ光源３４１を選択することにより、異なる蛍光色の照射を取得することができる。前記五つの異なる色のＬＥＤ光源３４１は、交替で作業する。各ＬＥＤ光源から放射された光路は、直前に、前記コリメータミラー、前記第一の光学フィルター３４３及びダイクロイックミラー３４４が順次に配置される。前記コリメータミラー３４２及び前記第一の光学フィルター３４３は、光路に対して垂直角度で配置（９０°という角度で配置）される。前記ダイクロイックミラー３４４は、光路角度に対して０°〜４５°で配置される。前記ダイクロイックミラー３４４により形成された一つの光路により、前記光路の直前に、前記複眼レンズ３４５及び前記集光レンズ３４６が順次配置される。前記複眼レンズ３４５は、前記集光レンズ３４６と光路に対して垂直角度で配置（９０°という角度で配置）される。
【０１０５】
前記集光レンズ３４６の光路は、前記複数の微小液滴に傾斜照射されることにより、前記微小液滴容器における蛍光物質を含んでいる微小液滴に蛍光が生成される。前記蛍光検知アセンブリ３３０により、前記蛍光物質を含んでいる微小液滴に蛍光情報を採集し、前記蛍光物質を含んでいる微小液滴について蛍光情報を蛍光画像の形式でコンピューターに送信し、定量解析を行う。
【０１０６】
一実施例では、前記励起光源３４０においては、前記ＬＥＤ光源３４１、前記コリメータミラー３４２、前記第一の光学フィルター３４３、前記ダイクロイックミラー３４４、前記複眼レンズ３４５及び前記集光レンズ３４６について、それらの数が限定されない。
【０１０７】
前記励起光源３４０は、前記微小液滴容器６０に傾斜照射され、前記複数の微小液滴に照射するために用いられる。前記励起光源３４０により形成された傾斜照射光路は、励起光の散乱の背景を効果的に低降することができる。同時に、前記微小液滴容器６０の前記微小液滴容器６０の側壁の高さを下げることにより、励起光を側方から照射すると発生した影を排除することに役立ち、前記カメラ３３１により微小液滴の全ての蛍光情報を取得し、前記蛍光信号検出装置３０に感度を上がるようにすることができる。
【０１０８】
一実施例では、前記定量解析装置４０は、コンピューターである。前記蛍光信号検出装置３０により、前記複数の微小液滴の蛍光情報の写真を取得することができる。前記コンピューターには、取得された前記複数の微小液滴の蛍光情報を定量解析することを実現するために用いられる、例えば、ｍａｔｌａｂ、ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  ｏｆｆｉｃｅ、ｏｒｉｇｉｎ及びＭｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｏｆｆｉｃｅ  ｖｉｓｕａｌ．ｃ  ＋＋などの解析ソフトウェアがインストールされている。
【０１０９】
一実施例では、前記制御器５０は、前記第一の制御器１７０、前記第二の制御器２１０及び前記第三の制御器３１０にそれぞれ接続され、前記微小液滴生成装置１０、前記温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０及び定量解析装置４０の稼働を制御するために用いられる。
【０１１０】
前記微小液滴生成装置１０は、前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成する。そして、前記温度制御装置２０により前記複数の微小液滴を加熱する工程では、前記蛍光信号検出装置３０を用いて前記複数の微小液滴に蛍光の変化画像をリアルタイムで撮影する。前記定量解析装置４０により、前記複数の微小液滴に蛍光の変化画像を解析して、前記複数の微小液滴のＣｔ値を取得し、Ｃｔ値と初期コピー数との関係に基づいて、初期核酸の濃度を定量解析する。
【０１１１】
前記デジタルＰＣＲ検出器１は、前記微小液滴生成装置１０、前記温度制御装置２０、前記蛍光信号検出装置３０及び前記定量解析装置４０を集積化するため、前記操作員に一体式とされるデジタルＰＣＲ検出器１を介して自動で操作を実現し、前記デジタルＰＣＲ検出器１の作業効率が向上する。
【０１１２】
前記微小液滴生成装置１０は、前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成する。そして、前記温度制御装置２０により、前記複数の微小液滴に核酸増幅を行う。同時に、前記蛍光信号検出装置３０を使用して、前記複数の微小液滴に蛍光変化イメージをリアルタイムで撮影する。前記複数の微小液滴の蛍光変化イメージに基づいて、前記複数の微小液滴に蛍光の変化曲線を取得する。前記蛍光の変化曲線に基づいて、前記複数の微小液滴のＣｔ値を取得し、Ｃｔ値と初期コピー数との関係に基づいて初期ＤＮＡの濃度を定量解析する。ただし、Ｃｔ値とは、各微小液滴の蛍光信号が所定の閾値になるまで経過した巡回数を指す。
【０１１３】
前記微小液滴生成装置２０により生成されたのは、均一な大きさの微小液滴であり、温度制御装置３０により、前記複数の微小液滴を核酸増幅反応させ、例えば、蛍光、紫外線吸収、濁度などの産物信号を採集する。前記複数の増幅された微小液滴と増幅されなかった微小液滴との構成の相違により、標的配列増幅が得られた液滴数を解析して、核酸分子への定量解析を最終的に実現することができる。前記複数の微小液滴に係る変化する蛍光のイメージをリアルタイムでモニターすることにより、検出結果に直接性を持っているため、前記複数の微小液滴における偽陽性と偽陰性という問題を解決することができる。
【０１１４】
前記デジタルＰＣＲ検出器は、前記微小液滴生成装置１０、前記温度制御装置２０、前記蛍光信号検出装置３０及び前記定量解析装置４０を集積化するため、前記操作員に、一体式とされるデジタルＰＣＲ検出器１を介して自動で操作を実現し、作業効率を上がり、反応が急速となり、再度利用性がよく、感度が高く、特異性が強く、また、結果が明確である。
【０１１５】
一実施例では、前記微小液滴生成装置１０は、前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成する。ただし、前記微小液滴生成装置１０により生成された微小液滴は、その大きさが均一である。そして、前記温度制御装置２０により、前記複数の微小液滴に核酸増幅を行う。それと同時に、前記蛍光信号検出装置３０を用いて、前記複数の微小液滴に蛍光の変化画像をリアルタイムで撮影する。前記複数の微小液滴の蛍光の変化画像に基づいて、前記複数の微小液滴に蛍光の変化曲線を取得する。前記蛍光の変化曲線に基づいて、前記複数の微小液滴のＣｔ値を取得することが可能である。そして、Ｃｔ値と初期コピー数との関係に基づいて、初期核酸の濃度を定量解析する。
【０１１６】
そのうち、Ｃｔ値において、ＣがＣｙｃｌｅを示し、ｔがｔｈｒｅｓｈｏｌｄを示し、Ｃｔ値とは、各前記微小液滴内に蛍光信号が所定の閾値になるまで経過した巡回数を意味している。リアルタイムの蛍光ＰＣＲにおいて、Ｃｔ値とは、各前記微小液滴内に蛍光信号が所定の閾値になるまで経過した巡回数を指し、つまり、Ｃｔ値とは、各微小液滴の蛍光信号が所定の閾値になる時に経過した巡回数を意味している。
【０１１７】
ＰＣＲ循環は、Ｃｔ値が所在する巡回数になる時に、真の指数増幅期（対数期）に移行したばかりであるため、この時に微小誤差がまだ拡大されていないため、Ｃｔ値の再現性が極めて良く、即ち、同一の核酸鋳型において異なる時間で増幅したり、又は、同一時間で異なる微小液滴の容器内に増幅したりすることにより得られたＣｔ値は、一定となる。前記微小液滴に対応する蛍光曲線が増幅曲線である場合に、前記微小液滴に標的遺伝子成分を含むことが表れる。前記微小液滴に対応する蛍光曲線が一つの直線である場合に、前記微小液滴に標的遺伝子成分を含まないことが表れる。取得されたリアルタイムの蛍光曲線に基づいて、Ｃｔ値を取得し、各微小液滴にＣｔ値が取得される時に、前記リアルタイムの蛍光曲線に導関数を導出して、前記リアルタイムの蛍光曲線に傾きが一定である蛍光曲線の初期循環回数は、必要なＣｔ値である。
【０１１８】
前記微小液滴生成装置１０により生成されたのは、均一な大きさの微小液滴であり、温度制御装置２０により、前記複数の微小液滴に核酸増幅反応させ、例えば、蛍光、紫外線吸収、濁度などの産物信号を採集する。前記デジタルＰＣＲ検出器１は、前記微小液滴生成装置１０、前記温度制御装置２０、前記蛍光信号検出装置３０及び前記定量解析装置４０を集積化するため、前記操作員に、一体式とされるデジタルＰＣＲ検出器１を介して自動で操作を実現し、作業効率を上がり、反応が急速となり、再度利用性がよく、感度が高く、特異性が強く、また、結果が明確である。
【０１１９】
前記デジタルＰＣＲ検出器１による検出工程は、主に、検出すべき核酸増幅反応液の製造、検出すべき核酸増幅反応液の微滴化、核酸増幅、蛍光情報の採集及び定量解析という五つの工程が含まれる。図１２を参照すると、一実施例では、デジタルＰＣＲ検出器による解析方法は、検出すべき核酸増幅反応液を製造するステップＳ１０と、前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するステップＳ２０と、前記複数の微小液滴に核酸増幅を行い、前記複数の微小液滴に蛍光情報をリアルタイムで取得するステップＳ３０と、前記複数の微小液滴の蛍光情報に基づいて、前記複数の微小液滴を定量解析するステップＳ４０と、を含む。一実施例では、前記ステップＳ１０には、検出すべき核酸増幅反応液を製造することを含む。前記核酸増幅反応液に、検出すべき核酸の鋳型、反応緩衝水溶液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、プライマー、ポリメラーゼ及び産物マーク物質などが含まれている。
【０１２０】
そのうち、核酸増幅反応液は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を鋳型とする核酸増幅反応液（ＤＮＡ増幅反応液とも呼ばれる）であってもよく、リボ核酸（ＲＮＡ）を鋳型とする逆転写核酸増幅反応液（ＲＮＡ逆転写反応液とも呼ばれる）であってもよく、例えば、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）反応液である他の核酸増幅反応液であってもよい。そのうち、前記ＤＮＡ増幅反応液の特徴としては、ＤＮＡを増幅させるに必要なｄＮＴＰ、緩衝液、無機塩イオン、ポリメラーゼ、プライマー、検出すべきＤＮＡ鋳型及び蛍光染料又は蛍光プローブなどを含んでいるということである。反応液における蛍光染料又は蛍光プローブは、核酸の増幅を示すことができ、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎなどのＤＮＡと結合される蛍光染料であってもよく、例えばＴａｑＭａｎ蛍光プローブなどの蛍光基とクエンチ基との両方を含むオリゴ糖ヌクレオチドプローブでもよい。
【０１２１】
一実施例では、デジタルＰＣＲにのみ用いられ、セットとなる試薬及び溶液を用意して、鋳型ＤＮＡの試料に対する外来ＤＮＡの潜在的な汚染を減少し又は回避する。使用される機器及び消耗品の全ては、高温で殺菌され、高温乾燥で処理されるべきである。前記待検出核酸増幅反応液は、その成分が、増幅すべき鋳型ＤＮＡ、鋳型を増幅させる特異性のオリゴヌクレオチドプライマー、耐熱性のＤＮＡポリメラーゼ、四つの種類のデオキシリボヌクレオチド三リン酸基質、２価金属カチオンＭｇ２＋、Ｔａｑｍａｎプローブ又は蛍光染料及びＰＣＲ緩衝液などを含む。
【０１２２】
一実施例では、前記検出すべき核酸増幅反応液を製造する時に、Ｔａｑｍａｎプローブにより、前記検出すべき核酸増幅反応液をマークしてもよい。一実施例では、前記検出すべき核酸増幅反応液を製造する時に、ＳＹＢＲの蛍光染料により、前記検出すべき核酸増幅反応液をマークする。一実施例では、前記ステップＳ２０では、前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するということは、瞬間加速度運動による微小液滴生成方法、及び、周期的に変化する速度による微小液滴生成方法という二つの微小液滴生成方法を含む。前記微小液滴生成装置１０により、前記検出すべき核酸増幅反応液に微滴化処理を行うことにより、バッチで生産された微小液滴を取得し、前記デジタルＰＣＲ検出器１による検出に用いられる。そのうち、前記駆動液体は、前記検出すべき核酸増幅反応液と互いに非相溶性を持ち、しかも、互いに影響しない、液体である。前記第一の液体１９０は、前記検出すべき核酸増幅反応液であり、前記第二の液体６９９が油相混合物である。
【０１２３】
製造された核酸増幅反応液が前記微小液滴生成装置を通過すると、バッチ生産で微小液滴を製造することができる。前記複数の微小液滴を製造する工程では、前記複数の微小液滴の検出を便宜にするように、前記複数の微小液滴を前記微小液滴容器内に置く。一実施例では、前記微小液滴生成装置１０により、前記第二の液体に多量の微小液滴を生成し、前記複数の微小液滴間に互いに溶解されないということを保持することができる。
【０１２４】
一実施例では、前記ステップＳ３０には、前記複数の微小液滴を前記微小液滴容器に平らに敷き詰めるステップＳ３１０と、敷き詰められた前記複数の微小液滴に核酸増幅を行うステップＳ３２０と、前記複数の微小液滴が核酸増幅されている時に、前記複数の微小液滴をリアルタイムで撮影検出するステップＳ３３０と、を含む。
【０１２５】
図１３を参照すると、一実施例では、前記ステップＳ３１０には、微小液滴敷き詰め方法を含む。前記微小液滴敷き詰め方法は、開口６３１を有し第二の液体６９９を貯留している微小液滴容器６０を提供するステップＳ３１１と、密度が前記第二の液体６９９のほうよりも大きく、しかも、前記第二の液体６９９と互い非相溶性を持ち第一の液体１９０を提供し、前記第一の液体１９０により生成された複数の微小液滴を前記微小液滴容器の底板６１０に積み重ねるステップＳ３１２と、前記複数の微小液滴が前記容器底板６１０に敷き詰められるまで、前記複数の微小液滴に高低温で循環を行うステップＳ３１３と、を含む。
【０１２６】
複数の微小液滴は、前記微小液滴容器６０に生成され、前記微小液滴容器６０の前記容器底板６１０に落下して、不規則に積み重なる。多量の微小液滴が前記容器底板６１０に落下した場合に、前記容器底板６１０に多層の微小液滴が形成されることになる。しかも、微小液滴生成装置で製造された複数の微小液滴は、下向きに降下する工程において、微小液滴容器の中央の箇所に集まられてしまうため、観察されにくい。
【０１２７】
図１４を参照すると、前記ステップＳ１０では、複数の微小液滴が微小液滴容器６０に落下し、前記複数の微小液滴が前記微小液滴容器の底板６１０に積み重なると、前記複数の微小液滴が前記微小液滴容器の底板６１０に多層の微小液滴を形成する。蛍光信号を検出する工程では、前記複数の微小液滴を撮影する時に、多層間に互いに影響が存在しており、前記複数の微小液滴への撮影・検出に影響を与えてしまう。従って、前記複数の微小液滴を貯蔵している前記微小液滴容器６０に、高低温で循環を行う。前記複数の微小液滴が前記微小液滴容器の底板６１０に敷き詰められ、バッチ生産で前記微小液滴が前記反応セル６１２に敷き詰められるまで、多量の液滴を大規模で平行観測できるように、前記複数の微小液滴に複数回だけ高低温で循環を行う。
【０１２８】
前記温度制御装置２０により、高低温で循環を行い、熱膨張収縮の原理に基づいて、敷き詰めを行う。物体は、温度が上がる時に、分子の運動エネルギーが増加し、分子の平均自由行程が増加していることから、熱膨張と表現される。同様に、物体は、温度が下がる時に、分子の運動エネルギーが減少し、分子の平均自由行程が減少していることから、収縮と表現される。温度が変化するのに伴い、温度が上がると、試料の液滴の粘度が低くなり、体積が收縮される。同時に、温度が高いほど粘度が低い。温度が６０℃程度となる時に、試料の液滴の形状が最も柔らかく、この時に、形状が概ね六角形を呈ている一方、他の温度の場合に、試料の液滴の形状が変化しにくく、液滴容器における敷き詰めが形成されにくい。
【０１２９】
一実施例では、前記温度制御装置２０により高低温で循環を行うステップは、以下の通りである。まず、前記複数の微小液滴が９０℃〜９５℃まで昇温するように加熱し、５分〜１０分だけ加熱する。そして、前記複数の微小液滴が４０℃〜６０℃まで降温するように、３０ｓ〜６０ｓだけアニーリングして伸長する。最後に、複数の、０℃〜１０℃まで降温するように順次に複数回だけ循環を行い、前記複数の微小液滴を保存する。
【０１３０】
一実施例では、前記温度制御装置２０により、高低温で循環を行うステップは、さらに、まず、前記複数の微小液滴が昇温するように加熱し、９５℃の温度まで加熱し、１０分だけ加熱すること（前記複数の微液を９５℃まで加熱し、１０分だけ加熱するということは、前記複数の微小液滴中の酵素をホットスタートさせるためである）、次に、前記複数の微小液滴について、酵素へのホットスタートが完了した時に、前記複数の微小液滴を３０ｓだけ変性させること、次に、前記複数の微液が変性された後に、５５℃まで降温し、４５ｓだけアニーリングして伸長し、前記複数の微小液滴を撮影し、４５回だけ循環を行うこと、最後に、４５回だけ循環を行った後に、４℃まで降温し、前記複数の微液を長時間に渡って保存する、ことを含む。
【０１３１】
前記検出すべき核酸増幅反応液は、前記微小液滴生成装置１０により、複数の微小液滴を生成し、検出を行うために用いられる。前記微小液滴生成装置１０により製造された前記複数の微小液滴は、下向きに降下する工程において、前記微小液滴容器６０における中央の箇所に集められてしまうため、観察されにくい。従って、前記複数の微小液滴について核酸増幅反応と関連する情報をより正確に取得するように、前記複数の微小液滴を前記微小液滴容器に敷き詰めることが必要となる。前記複数の微小液滴を前記微小液滴容器に敷き詰め、一層だけ形成することにより、多層の微小液滴間に相互影響が避けられ、前記蛍光信号検出装置３０により、より正確な蛍光情報を撮影して検出して、定量解析を便宜にすることができる。
【０１３２】
ＰＣＲ反応条件は、温度、時間及び循環回数である。
【０１３３】
温度と時間の配置については、ＰＣＲの原理を元に、三つのステップにより、変性−アニーリング−伸長という三つの温度点を配置する。標準反応に三つの温度点法を用いると、二本鎖ＤＮＡが９０〜９５℃で変性し、再び、４０〜６０℃まで迅速に冷却され、プライマーアニーリングと共に、標的配列に結合されてから、急速に７０〜７５℃まで昇温され、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる作用で、プライマーの鎖が鋳型に沿って延ばされる。一方、比較的短い標的遺伝子（長さが１００〜３００ｂｐであるとき）について、二つの温度点法を用いてもよい。変性温度以外に、アニーリングと伸長温度とを両者で一つに統合し、一般的に、９４℃で変性し、６５℃程度でアニーリングと伸長（この温度では、Ｔａｑ  ＤＮＡ酵素が依然として比較的高い触媒の活性を持っている）を行う。
【０１３４】
変性温度と時間については、変性温度が低いことによる不完全な解鎖が、ＰＣＲが失敗となってしまうということにとって主な原因であり。一般的に、場合によって、鋳型とされるＤＮＡを変性させるために９３℃〜９４℃が十分であり、９３℃よりも低いと時間を延長することが必要となる。また、温度が高すぎるようにならない。それは、高温の環境において、酵素の活性に影響を与えたからである。このステップでは、標的とされる遺伝子の鋳型、又は、ＰＣＲの産物を完全に変性させないと、ＰＣＲの失敗が招致されてしまうことになる。
【０１３５】
アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）温度と時間について、アニーリング温度が、ＰＣＲの特異性に影響を与える比較的重要な要素である。変性された後に、急速に温度４０℃〜６０℃まで冷却するということにより、プライマーと鋳型とを結合させることができる。鋳型ＤＮＡがプライマーのほうよりも遥かに複雑であるため、プライマーと鋳型との間の衝突結合のチャンスが遥かに鋳型の相補鎖間の衝突のほうよりも高い。アニーリング温度と時間は、プライマーの長さ、塩基組成とその濃度、ひいては、標的基の配列の長さにより決められている。２０個のヌクレオチドを含み、Ｇ＋Ｃ含量が約５０％のプライマーについて、５５℃を最適なアニーリング温度の起点として選択すると、比較的理想なものである。
【０１３６】
許容範囲には、比較的高いアニーリング温度を選択すると、プライマーと鋳型との間に非特異性の結合を可及的に減少すると共に、ＰＣＲ反応に特異性を向上させることができる。アニーリング時間は、一般的に、３０ｓｅｃ〜６０ｓｅｃとされると、プライマーと鋳型との間に完全に結合させることができる。
【０１３７】
伸長温度と時間については、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼの生物学的活性は、７０〜８０℃で１５０個のヌクレオチド／Ｓ／酵素分子となり、７０℃で、６０個のヌクレオチド／Ｓ／酵素分子となり、５５℃で、２４個のヌクレオチド／Ｓ／酵素分子となり、９０℃以上である場合に、ＤＮＡがほぼ、合成されない。
【０１３８】
故に、ＰＣＲ反応の伸長温度は、一般的に、７０〜７５℃という範囲に選択され、よく使われる温度が７２℃とされ、高すぎる伸長温度がプライマーと鋳型との結合に役立たない。ＰＣＲ伸長反応の時間は、増幅すべき断片の長さにより選択されてもよい。一般的に、１Ｋｂ以内のＤＮＡ断片について、伸長時間を１分とすると、十分である。３〜４ｋｂの標的配列は、３分〜４分とされ、１０Ｋｂだけ増幅しようとすると、１５分まで延長される必要がある。伸長時間は、長すぎると、非特異性を持つ増幅帯の現れがある。低濃度とされる鋳型の増幅については、伸長時間を少々長くする必要がある。
【０１３９】
一実施例では、前記ステップＳ３２０において、前記複数の微小液滴に核酸を増幅するステップは、以下の通りである。まず、前記微小液滴容器６０を前記温度制御装置２０の前記加熱基板２４０に置く。そして、前記複数の微小液滴が昇温するように加熱し、温度９５℃まで上がり、１０分だけ加熱する。前記複数の微液を９５℃まで加熱し、１０分だけ加熱するということは、前記複数の微小液滴中の酵素にホットスタートを行わせるためである。次に、前記複数の微小液滴に、酵素へのホットスタートが完了した後に、前記複数の微小液滴を３０ｓだけ変性させる。前記複数の微液が変性した後に、再度、５５℃まで降温し、４５ｓだけアニーリングして伸長し、４５回だけ循環を行う。最後に、４５回だけ循環を行った後に、４℃まで降温し、前記複数の微液を長時間に渡って保存する。
【０１４０】
前記温度制御装置２０は、前記フレキシブル回路基板２２０と前記熱伝導強化層２５０とにより、前記微小液滴容器６０に温度分布が均一となり、前記サーモエレクトリック・クーラが、熱伝導の性能を向上させるようにする。前記複数の微小液滴は、異なる温度範囲に、核酸の増幅が行われる時に、前記熱伝導強化層２５０の表面に配置された温度センサー２６０が前記第二の制御器２１０に接続されると、前記微小液滴容器６０の温度をリアルタイムで検出し、温度の情報を前記第二の制御器２１０にフィードバックし、前記複数の微小液滴を加熱する温度を制御し、また、迅速に僅か数秒の時間に切り替えることが実現される。前記温度制御装置２０は、瞬間に昇降温を実現できるため、昇降温の工程が短くなり、高低温で循環が実現でき、前記デジタルＰＣＲ検出器１による検出時間が短くなり、検出の効率が向上する。
【０１４１】
前記温度制御装置２０により、前記複数の微小液滴に核酸を増幅することができる。ＰＣＲの原理を元に、三つのステップにより変性−アニーリング−伸長という三つの温度点を配置する。標準反応に三つの温度点法を用いると、二本鎖ＤＮＡが９０〜９５℃で変性し、再び、４０〜６０℃まで迅速に冷却され、プライマーアニーリングと共に、標的配列に結合されてから、急速に７０〜７５℃まで昇温され、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる作用で、プライマーの鎖が鋳型に沿って延ばされ、適宜な温度範囲に核酸を増幅することができる。同時に、核酸を増幅する工程では、前記微小液滴容器の底板６１０と前記温度制御装置２０の前記熱伝導強化層２５０とがぴったりと貼り付けされ、両者に隙間がなく、加熱が均一となり、前記デジタルＰＣＲ検出器１に正確性が向上する。
【０１４２】
一実施例では、前記複数の微小液滴に核酸を増幅する工程では、前記蛍光信号検出装置３０により、前記複数の微小液滴を撮影して検出する。
【０１４３】
前記蛍光信号検出装置３０により、前記複数の微小液滴を撮影する。そのうち、前記励起光源３４０は、前記複数の微小液滴に、蒸発、原子化や励起を行うに必要なエネルギーを提供し、前記微小液滴容器６０の上方から傾斜角度で前記微小液滴容器６０に照射する。前記蛍光信号検出装置３０により、前記複数の微小液滴に周期性に二次元走査を行いながら、リアルタイムで撮影する。前記微小液滴容器６０において、前記複数の微小液滴の内部蛍光は、励起され、前記第二の光学フィルター３３３を通過して、上方の前記対物レンズ３３２に集められ、前記カメラ３３１に進入し、前記カメラ３３１により前記複数の微小液滴に蛍光画像を採集する。前記第三の制御器３１０は、前記複数の異なる色のＬＥＤ光源３４１と前記カメラ３３１を同期に起動することができる。
【０１４４】
前記蛍光信号検出装置３０により、前記複数の微小液滴に蛍光をイメージングし、一回だけ、一定数の前記複数の微小液滴に蛍光画像を撮影し、画像処理の技術に基づいて、画像における液滴蛍光を自動で識別して、液滴の蛍光情報を取得することができる。
【０１４５】
一実施例では、前記蛍光信号検出装置３０が撮影するステップにより、前記微小液滴容器６０において各微小液滴について、４５個の蛍光イメージが取得されて定量解析に用いられる。
【０１４６】
一実施例では、前記ステップＳ３３０に、前記複数の微小液滴に核酸を増幅する時にリアルタイムで前記複数の微小液滴を撮影して検出するステップは、以下の通りである。
【０１４７】
前記複数の微小液滴が昇温するように加熱し、９５℃の温度まで加熱し、１０分だけ加熱する。前記複数の微液を９５℃まで加熱し、１０分だけ加熱するということは、前記複数の微小液滴中の酵素をホットスタートさせるためである。次に、前記複数の微小液滴について、酵素へのホットスタートが完了した時に、前記複数の微小液滴を３０ｓだけ変性させる。次に、前記複数の微液が変性された後に、５５℃まで降温し、４５ｓだけアニーリングして伸長し、前記複数の微小液滴を撮影し、４５回だけ循環を行う。最後に、４５回だけ循環を行った後に、４℃まで降温し、前記複数の微液を長時間に渡って保存する、こと。
【０１４８】
前記集光レンズ３４６の光路を前記複数の微小液滴に傾斜照射することにより、前記微小液滴容器６０に含まれる蛍光物質の微小液滴に蛍光が生じるようにする。前記蛍光検知アセンブリ３３０により、前記蛍光物質を含んでいる微小液滴について蛍光情報を採集すると共に、前記蛍光物質を含んでいる微小液滴について、その蛍光情報を蛍光画像の形式でコンピューターに送信して、定量で解析を行う。
【０１４９】
前記蛍光イメージングの検出方法によれば、一回だけ、一定数の前記微小液滴に蛍光画像を撮影し、次に、画像処理技術に基づいて、画像における液滴蛍光に自動で識別を行い、液滴の蛍光情報を取得することができる。前記蛍光イメージングの検出方法によるイメージング範囲は、大きいことから、検出の場合に、前記微小液滴が位置する検出環境に対する要求が比較的低い。
【０１５０】
一実施例では、前記核酸検出すべき試料は、ＤＮＡを含有する検出すべき試料である。前記微小液滴生成装置１０により生成された均一な大きさの微小液滴は、温度制御装置２０により、前記複数の微小液滴を核酸増幅反応させ、例えば、蛍光、紫外線吸収や濁度などの産物信号を採集する。前記複数の増幅された微小液滴と増幅されなかった微小液滴との構成の相違により、標的配列増幅が得られた液滴数を解析して、核酸分子への定量解析を最終的に実現することができる。微小液滴を加熱する工程では、前記複数の微小液滴に蛍光変化イメージをリアルタイムで撮影して、複数の微小液滴のＣｔ値を取得して、Ｃｔ値と初期コピー数との関係に基づいて初期ＤＮＡの濃度に定量解析を行う。
【０１５１】
標的とされるＤＮＡを含んでいる微小液滴が増幅された後に、その蛍光信号の強度が一定のレベルに達すると、陽性と示され、ＤＮＡの含量がゼロである微小液滴に、蛍光信号がほぼ検出されなかった場合に、陰性と見なされている。
【０１５２】
デジタルＰＣＲにおける微小液滴に含まれている初期ＤＮＡコピー数をｘとすると、数理統計学の理論によれば、ｘ＝ｋ（ｋ＝０、１、２、３．．．．．）の確率分布関数Ｐがポアソン分布の確率モデルに該当しており、そのうち、λが微小液滴に含まれている平均の分子コピー数である。
2021511074.tif 000005
【０１５３】
従って、前記ポアソン分布モデルの期待値μと分散σ２によれば、期待値μがλであり、分散σ２がλであると分かる。従って、デジタルＰＣＲにおいて、各微小液滴に含まれる標的ＤＮＡ分子のコピー数がλであることから、求められたλ値により核酸を定量で検出することが実現されえる。
【０１５４】
前記検出すべき核酸増幅反応液については、その総体積をＶ（各微小液滴の体積がｖ）とすると、前記検出すべき核酸増幅反応液の濃度ｃ（ｃｏｐｙ／μＬ）が、
2021511074.tif 000006
【０１５５】
故に、λの値を取得できれば、ＤＮＡを定量で検出することができる。
【０１５６】
そのうち、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲに内部標準の付与を必要としないということは、Ｃｔ値の再現性、及び、Ｃｔ値と初期ＤＮＡ濃度との線形の関係による。ＰＣＲ循環は、Ｃｔ値が位置する巡回数になると、真の指数増幅期（対数期）に入ったばかりであり、この時に、微小誤差がまだ拡大されないことから、Ｃｔ値の再現性が極めてよく、即ち、同一ＤＮＡ鋳型を異なる時間で増幅したり、同一時間で異なる微小液滴容器内に増幅したりすることにより得られるＣｔ値が一定である。
【０１５７】
前記微小液滴と対応する蛍光曲線が増幅曲線である時に、前記微小液滴に標的遺伝子成分を含むと表現される。前記微小液滴と対応する蛍光曲線が直線である時に、前記微小液滴に標的遺伝子成分を含まないと表現される。
【０１５８】
取得されたリアルタイムの蛍光曲線に基づいて、Ｃｔ値を取得し、各微小液滴のＣｔ値を取得する時に、前記リアルタイムの蛍光曲線に導関数を導出して、前記リアルタイムの蛍光曲線の傾きが一定となる蛍光曲線の初期循環回数は、必要なＣｔ値となる。
【０１５９】
一実施例では、微小液滴生成装置１０により、複数の体積が均一な微小液滴を生成することができる。各前記微小液滴の大きさは、ミクロンレベルにある。前記複数の微小液滴の体積が均一になる場合に、前記複数の微小液滴の蛍光情報に基づいて、前記複数の微小液滴を定量で解析する。
【０１６０】
図１５を参照すると、前記ステップＳ４０は、デジタルＰＣＲ定量検出方法を含む。前記デジタルＰＣＲ定量検出方法は、微小液滴の全てについて複数のリアルタイムの蛍光画像を取得し、前記複数のリアルタイムの蛍光画像に基づいて、核酸増幅された微小液滴にリアルタイムの蛍光曲線を取得するステップＳ４１１０と、前記リアルタイムの蛍光曲線に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全てのＣｔ値を取得するステップＳ４１２０と、前記Ｃｔ値と核酸増幅された微小液滴の核酸初期コピー数との関係に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全ての核酸初期コピー数を取得するステップＳ４１３０と、前記核酸増幅された微小液滴の全ての核酸初期コピー数に基づいて、前記核酸初期コピー数の度数分布を取得するステップＳ４１４０と、前記核酸初期コピー数の度数分布に基づいて、ポアソン分布のパラメータλを計算するステップＳ４１５０と、を含む。
【０１６１】
前記デジタルＰＣＲ定量検出方法により、その結果が偽陽性や偽陰性であるという問題が解決される。シークエンシングプラットフォームの試料は、ハイスループット性を持っているため、数百個の試料を同時に検出することができる。また、異なる種類の蛍光により、複数のローカスを検出することができ、そして、検出に速度が速く、試験するためのコストが低下する。デジタルＰＣＲ検出器を用いて微滴化処理を行うと、希有な検出断片を多量の複雑な背景から分離させ、大幅に操作手間を簡単にして、効果的に用意時間や検出時間を省いて、しかも、結果の読み取りにも直観的で確実であり、安定で実施できるという利点を持ち、検出に感度や正確性が共に正確で、定量の要求が満たされており、検出に感度や正確性が向上する。
【０１６２】
一実施例では、前記ステップＳ４１１０は、
各リアルタイムの蛍光画像に基づいて、核酸増幅された各微小液滴の蛍光強度値を取得するステップＳ４１１１と、
前記核酸増幅された各微小液滴の蛍光強度値に基づいて、核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線を取得するステップＳ４１１３と、
前記核酸増幅された各微小液滴の蛍光曲線に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てのリアルタイムの蛍光曲線を取得するステップＳ４１１５と、を含む。
【０１６３】
一実施例では、前記ステップでは、前記複数の微小液滴の蛍光画像を採集し、画像追跡を行う。各微小液滴にリアルタイムの蛍光曲線を取得する時に、各画像における各微小液滴について、それぞれ、位置決め、各微小液滴の蛍光強度を取得する必要がある。前記デジタルＰＣＲ検出器では、イメージングシステムに、前記蛍光画像の各画素と対応する実際的な比が何であるかについて定められる。前記蛍光画像に基づいて、前記微小液滴の直径と対応する数の画素を抽出し、直径と対応するミクロンを取得すると、前記微小液滴の直径が何であるかについて算出することができる。
【０１６４】
一実施例では、各微小液滴を追跡する時に、各温度循環工程に撮影された写真に基づいて、ＮＣＡＳＴ画像の差分とクラスタリングの演算を行い、各微小液滴の位置を識別して、前記複数の微小液滴に蛍光強度を取得してもよい。
【０１６５】
一実施例では、一つの温度循環工程になされた微小液滴の移動距離は、一つの微小液滴の直径以下である場合に、以下方法で微小液滴に追跡を行う。
【０１６６】
そのうち、各微小液滴に追跡を行う時に、各微小液滴の画像を追跡するステップは、まず、温度循環工程毎に撮影された写真を識別し、各微小液滴の円心位置を取得し、次に、現在に識別される各微小液滴の円心位置と、前回循環工程における各微小液滴の円心位置とを比較し、最後に、現在に識別される各微小液滴の円心位置と前回循環工程中の各微小液滴の円心位置の円心との距離が一つの微小液滴直径よりも小さい場合に、同一の微小液滴と示される。
【０１６７】
一実施例では、各温度循環工程における各微小液滴の蛍光強度値に基づいて、各微小液滴の蛍光曲線を取得する。温度循環工程毎に各微小液滴の各箇所の蛍光強度値に、和を算出することにより、それを、所定のタイミングでの各微小液滴の蛍光強度値として取得する。
【０１６８】
一実施例では、隣接する各微小液滴のエッジ箇所に互いに影響を与えないように、所定のタイミングでの各微小液滴の蛍光強度値について、その一部を加算する方式を用いてもよい。温度循環工程毎に、前記複数の微小液滴の蛍光強度値に基づいて、前記複数の微小液滴が循環工程全体に渡って変化する事情を取得して、各微小液滴の蛍光曲線を取得する。
【０１６９】
一実施例では、微小液滴について４５回だけ循環を行い、４５個の蛍光イメージを取得する。この４５個の蛍光イメージにおける各微小液滴に、位置決めて、各微小液滴の４５個の蛍光強度値を取得して、各微小液滴の蛍光曲線を取得する。
【０１７０】
一実施例では、前記ステップＳ４１２０は、
核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線に導関数を導出し、前記核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線の傾きを取得するステップＳ４１２１と、
前記核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線の傾きに基づいて、前記核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線の傾きのうち、数値が変化しない傾きを取得するステップＳ４１２３と、
前記傾きが変化しない数値に基づいて、その対応する初期巡回数を核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値として取得する、ステップＳ４１２５と、
前記核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てのＣｔ値を取得するステップＳ４１２７と、を含む。
【０１７１】
一実施例では、前記ステップＳ４１２０は、
核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線に基づいて、核酸増幅された各微小液滴の蛍光閾値の欠失値を取得するステップＳ４１２２と、
核酸増幅された各微小液滴の蛍光閾値の欠失値に基づいて、その対応する巡回数を、核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値として取得するステップＳ４１２４と、
前記核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てのＣｔ値を取得するステップＳ４１２６と、をさらに含む。
【０１７２】
そのうち、Ｃｔ値において、ＣがＣｙｃｌｅを示し、ｔがｔｈｒｅｓｈｏｌｄを示し、Ｃｔ値とは、各反応管内に蛍光信号が所定の閾値になるまで経過した巡回数を意味している。リアルタイム蛍光ＰＣＲでは、Ｃｔ値とは各反応管内に蛍光信号が所定の閾値になるまで経過した巡回数を意味している。ＰＣＲ反応が行われる際に先の１５個の循環される蛍光信号を蛍光バックグラウンド信号として、また、３−１５個の循環される蛍光信号の標準偏差の１０倍を蛍光閾値の欠失配置とし、即ち、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ＝１０×ＳＤｃｙｃｌｅ  ３−１５となる。
【０１７３】
一実施例では、ＰＣＲ反応が行われる際に先の１５個の循環される蛍光信号を蛍光バックグラウンド信号として、また、３−１５個の循環される蛍光信号の標準偏差の１０倍を蛍光閾値の欠失配置とし、即ち、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ＝１０×ＳＤｃｙｃｌｅ  ３−１５となる。前記蛍光閾値の欠失値ｔｈｒｅｓｈｏｌｄによれば、対応する巡回数を、前記Ｃｔ値として取得する。
【０１７４】
一実施例では、前記Ｓ４１３０では、前記各微小液滴のＣｔ値と前記各微小液滴のＤＮＡ初期コピー数の対数との間に、線形の関係が存在している。
【０１７５】
一実施例では、各鋳型（ＤＮＡ）のＣｔ値と該鋳型（ＤＮＡ）の初期コピー数の対数との間に、線形の関係が存在している。前記線形の関係は、
2021511074.tif 000007
として示される。
そのうち、ｘ０は、初期の鋳型（ＤＮＡ）量であり、Ｅｘが増幅の効率であり、Ｎが、蛍光増幅信号が、閾値の強度になるまで増幅産物の量である。
【０１７６】
初期コピーの数が多いほど、Ｃｔ値が小さい。既知されている初期コピー数の標準品によれば、標準曲線が作成可能であり、そのうち、横座標が初期コピー数の対数を示し、縦座標がＣｔ値を示す。従って、未知の試料のＣｔ値を取得できれば、標準曲線からこの試料の初期コピー数を算出することができる。
2021511074.tif 000008
【０１７７】
Ｃｔ値と初期ＤＮＡ濃度との関係は、各ＤＮＡ鋳型のＣｔ値とＤＮＡ鋳型の初期コピー数の対数との間に、線形の関係が存在している。初期コピー数が多いほど、Ｃｔ値が小さい。
【０１７８】
一実施例では、前記ステップＳ４１４０は、前記核酸増幅された微小液滴の全ての核酸の初期コピー数に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全ての核酸の初期コピー数における最大値及び最小値を取得するステップＳ４１４１と、前記最大値、前記最小値、階級の幅及び階級数を選択して、前記核酸初期コピー数の度数分布を取得するステップＳ４１４３と、を含む。
【０１７９】
そのうち、頻数とは、異なる区間に位置するデータ個数を指す。異なる区間の頻数の和は、この組のデータの総数と等しい。
【０１８０】
一実施例では、前記Ｓ４１５０に、ポアソン分布のパラメータλを計算する時に、最尤推定法が使用される。
【０１８１】
そのうち、液滴式ＰＣＲについて、単一の液滴に含まれている初期コピー数は、Ｐｏｉｓｓｏｎ分布を満たしている。
2021511074.tif 000009
そのうち、λは、前記微小液滴に平均して含まれる初期ＤＮＡコピー数である。各液滴に含まれる平均初期コピー数は、ＣＰＤ（ｃｏｐｉｅｓ  ｐｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔ）により表される。
【０１８２】
一実施例では、Ｃｔ値により、初期に、ｋ（ｋ＝０、１、２、３…）個のＤＮＡ初期コピー数を有する液滴数ｎｋ、がそれぞれ取得可能であり、最尤推定法を用いると、
2021511074.tif 000010
を取得する。
【０１８３】
そのうち、前記微小液滴のＤＮＡ初期コピー数の対応する度数値はｎｋであり、言い換えると、ｋ＝０個のＤＮＡ初期コピー数である時に、対応して表される前記微小液滴の個数は、ｎ０個となり、ｋ＝一つのＤＮＡ初期コピー数である時に、対応して表される前記微小液滴の個数は、ｎ１となり、ｋ＝２個のＤＮＡ初期コピー数である時に、対応して表される前記微小液滴の個数は、ｎ２個となり、ｋ＝３個のＤＮＡ初期コピー数である時に、対応して表される前記微小液滴の個数は、ｎ３個となる。このように、類似に類推する。この方法によれば、陰性とされる暗い液滴の数を確保する必要がなくなる。また、完全な度数分布データにより、全体に対して最適パラメータを推量することは、単独に一つの度数を用いて推量するほうよりも、精度や安定性が遥かに高い。
【０１８４】
図１６を参照すると、一実施例では、デジタルＰＣＲ定量検出方法は、
微小液滴の全てについて、複数のリアルタイムの蛍光画像を取得し、前記複数のリアルタイムの蛍光画像に基づいて、核酸増幅された微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線を取得するステップＳ４２１０と、
前記リアルタイムの蛍光曲線に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全てのＣｔ値を取得するステップＳ４２２０と、
前記Ｃｔ値と核酸増幅された微小液滴の核酸初期コピー数との関係に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全ての核酸初期コピー数を取得するステップＳ４２３０と、
前記核酸増幅された微小液滴の全ての核酸初期コピー数に基づいて、一部の核酸初期コピー数を選択するステップＳ４２４０と、
前記一部の核酸初期コピー数に基づいて、前記一部の核酸初期コピー数の度数分布を取得するステップＳ４２５０と、
前記一部の核酸初期コピー数の度数分布に基づいて、ポアソン分布について点推定を行い、ポアソン分布のパラメータλを取得するステップＳ４２６０と、を含む。
【０１８５】
そのうち、一実施例では、複数の微小液滴の全てについて、それらの初期ＤＮＡの濃度の不完全な試料に基づいて、最小二乗法によりポアソン分布に点推定を行う。
【０１８６】
複数の微小液滴全体について、初期ＤＮＡの濃度の不完全なサンプリングによって、ＥＭアルゴリズム（Ｅｘｐｅｃｔａｔｉｏｎ  Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ  Ａｌｇｏｒｉｔｈｍ，ＥＭ）、マルコフ連鎖モンテカルロ法（Ｍａｒｋｏｖ  ｃｈａｉｎ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ，ＭＣＭＣ）法を介して、ポアソン分布に点推定を行う。前記マルコフ連鎖モンテカルロ法（Ｍａｒｋｏｖ  ｃｈａｉｎ  Ｍｏｎｔｅ  Ｃａｒｌｏ、ＭＣＭＣ）は、ベイズ法の一つである。
【０１８７】
一実施例では、前記Ｓ４２６０は、前記一部の核酸初期コピー数の度数値の残差平方和ｅｒｒが最小になるように、一つの空間[λmin，λmax]内にλを照会することを含む。
【０１８８】
一実施例では、前記初期ＤＮＡの濃度が比較的小さい場合に、五つ以上のコピーを含む液滴の数は非常に少ない（又は、無視してもよい）。Ｂｉｏｒａｄシステムは、２０，０００個の液滴システムである場合に、一般的に、試料のＤＮＡの濃度を６ＣＰＤ以下にするということが推薦される。実際の試験工程では、ｋ＞４時に、Ｃｔ値の区分が小さくなり、Ｃｔ値により一つの液滴の初期コピー数が４であるか５であるかについて区分しにくいことから、ｘ０、ｘ１、ｘ２、ｘ３の不完全なサンプルだけを用いて、Ｐｏｉｓｓｏｎの分布に、点推定を実行する。不完全な試料に基づいて、Ｐｏｉｓｓｏｎに点推定するアルゴリズムが数多くあり、操作可能性を持つアルゴリズム（最小二乗法）を挙げて、ここで説明する。
【０１８９】
一実施例では、一つの空間[λmin，λmax]を設置し、λを[λmin，λmax]空間に照会し、誤差の平方和を計算して、残差平方和が最小になるように、適合なλを選択する。
2021511074.tif 000011
そのうち、各微小液滴に含まれるＤＮＡ初期コピー数は、確率変数ｘであり、一部の微小液滴のＤＮＡ初期コピー数と対応する度数値がｎｋであり、Ｎが前記複数の微小液滴の総数である。
【０１９０】
一実施例では、前記Ｓ４２６０に、ポアソン分布に点推定を行う方法は、モーメント法、順序統計量法又は最尤推定法がさらに含まれる。
【０１９１】
そのうち、点推定の方法は、さらに、サンプルモーメントにより母集団に対応するパラメータを推量するというモーメント法を含む。
【０１９２】
まず、気になるパラメータに係る母集団モーメント（即ち、考えられる確率の変数の冪の期待値）の方程式を推定する。次に、一つのサンプルを取出してこのサンプルから母集団モーメントを推量する。次に、サンプルモーメントを用いて（未知）母集団モーメントに代えて、気になるパラメータを求め、それらのパラメータの推量を取得する。
【０１９３】
順序統計量法は、サンプルの中央値を用いて母集団の数学期望を推量する方法である。順序統計量推量法の利点としては、計算が簡便であり、しかも、個別な異常データからの影響を受けることが難しい。一群のサンプル値に、あるデータに異常がある（例えば、小さく過ぎる、或いは、大きすぎる）と、この異常のデータが母集団にランダムに生成されたものであるか、外部からの干渉により生成されたものであるか（例えば、作業人員の不始末や、記載にエラーによるか）と推測してもよい。その原因が後者に該当すると、サンプルの平均値によりＥ（ｘ）を推量すると、明らかに影響がある。しかしながら、サンプルの中央値によりＥ（ｘ）を推量すると、一つの（ひいては、複数の）異常のデータは、中央値を容易に変更することがないため、推量値に影響を与えることが難しい。
【０１９４】
最尤推定法（Ｍａｘｉｍｕｍ  Ｌｉｋｅｌｉｈｏｏｄ、ＭＬ）は、最尤推定とも呼ばれ、最尤法とも呼ばれ、理論性を持つ点推定法である。前記最尤推定法は、その基本思想として、モデル母集団からランダムにｎ組のサンプルの観測値を抽出した後に、最も合理的なパラメータ推定量について、モデルからこのｎ組のサンプルの観測値を抽出する確率が最大となるべきであるということであり、最小二乗推量法のような、モデルが一番よくサンプルのデータのパラメータ推定量に当てはめるものではない。
【０１９５】
実際の工程では、前記デジタルＰＣＲ定量検出方法は、標準曲線によらず、高い精度で前記複数の微小液滴に初期ＤＮＡの濃度を検出することができる。前記デジタルＰＣＲ検出器では、イメージングシステムに、前記蛍光画像の各画素と対応する実際的な比が何であるかについて定められる。前記蛍光画像に基づいて、前記微小液滴の直径と対応する数の画素を抽出し、直径と対応するミクロンを取得すると、前記微小液滴の直径が何であるかについて算出することができる。
【０１９６】
デジタルＰＣＲ定量検出方法により、前記複数の微小液滴を動的に追跡することができる。前記複数の微小液滴に温度循環を行わせる工程では、各微小液滴と対応する具体的な位置を求めることができ、核酸を増幅する工程全体をモニターすることができる。従って、前記デジタルＰＣＲ定量検出方法により、前記複数の微小液滴に偽陽性が存在する課題を解決することができる。また、前記複数の微小液滴に、蛍光曲線を処理することは、仮に均一性により行われる統計修正によらず、真の絶対定量を取得することができる。
【０１９７】
標準曲線に対する依頼を排除できるに加えて、標準曲線による定量結果が確定でないという問題を解消し、液滴式デジタルＰＣＲのエンドポイント検出方式による制限を解消して、一つのP（x=0）のデータのみにより、検出すべき試料全体をパラメータ推量する制約性を破ることができる。前記リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ検出方法を用いると、デジタルＰＣＲの定量検出に正確性が向上する。
【０１９８】
前記デジタルＰＣＲ定量検出方法を用いると、陰性とされる空液滴（核酸がふくまれていない液滴）の数を確保する必要が無くなる。また、多次元の度数分布データを用いると、全体に対して最適パラメータを推量することは、単独に、一つのP（x=0）のデータを用いて推量するほうよりも、その精度と安定性が遥かに高い。
【０１９９】
各蛍光曲線は、一つの有用な情報の曲線の変化過程を示し、リアルタイムでモニターするように、液滴の試料に参加した情報（価値持ち情報）であり、所定のアルゴリズムで、隣接する液滴間における互いの影響を取り除くことができる。
【０２００】
前記デジタルＰＣＲ定量検出方法は、抽象化した数学モデルにより、再現性と高感度が実現でき、しかも、動的範囲が大きくなり、少量の液滴でモニターが実現できる。小量のデータにより数多くの情報をカバーすることができる。また、前記デジタルＰＣＲ定量検出方法は、前記ポアソン分布の確率モデルの誤差を回避して絶対定量を実現し、より直観的になる。すべてのデータを総合して、ランダム性の誤差を取り除く。液滴の試料の蛍光曲線を取得し、液滴試料の蛍光輝度の変化をリアルタイムでモニターし、偽陽性を除去し、隣接する液滴間に互いの影響を取り除き、その後、定量解析モデルにより正確なデータ源を提供する。
【０２０１】
図１７を参照すると、前記一部の核酸初期コピー数がそれぞれ０、１、２、３である場合に取得されたポアソン分布に基づいて当てはめる。そのうち、横座標が各液滴に含まれる平均初期コピー数（ｃｏｐｉｅｓ  ｐｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔ、ＣＰＤ）である。縦座標は、各液滴に含まれる平均初期コピー数の標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ、Ｓｔｄ  Ｄｅｖ  、ＳＴＤ）である。各液滴に含まれる平均初期コピー数は、ＣＰＤ（ｃｏｐｉｅｓ  ｐｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔ）により表示される。そして、前記一部の核酸初期コピー数により取得された各液滴に含まれる平均初期コピー数用のＣＰＤの標準偏差は、他のアルゴリズムで取得された平均初期コピー数用のＣＰＤの標準偏差よりも小さいと分かる。従って、このアルゴリズムで取得された各液滴に含まれる平均初期コピー数用のＣＰＤの値は、より正確になる。２００００個の液滴を１０００回だけシミュレーションした結果が示される。単点による推量方法だけを用いると、限られる濃度範囲だけをカバーし、推量の精度も、試料の濃度が上がるのに伴い、急速に悪くなる。しかしながら、不完全なポアソン分布により当てはめアルゴリズム（Ｎ＝０、１、２、３）を用いると、試料の濃度の増加に伴い、推量精度が明らかに変化せず、検出すべき核酸増幅反応液の濃度を二倍拡大することも可能である。液滴数が比較的小さい場合には、不完全なポアソン分布で当てはめアルゴリズム（一部サンプリングポアソン分布の当てはめのアルゴリズム）が依然として、よい確実性を持っている。
【０２０２】
シミュレーションの結果からわかるように、デジタルＰＣＲ定量検出方法を用いると、２００個の液滴による試験のシステムは、その精度が、従来の単点の推定アルゴリズム（ｕＣｏｕｎｔ  ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）のほうよりも良い。液滴数が近い場合に、ポアソン当てはめアルゴリズムの安定性、精度、及び、用いられる動的範囲も、共に、従来の単点の推定アルゴリズムのほうよりも遥かに良い。同様な検出精度を実現する場合には、ポアソン当てはめアルゴリズムを用いるに必要な液滴数は、従来の単点の推定アルゴリズムで、必要な液滴数のほうよりも２桁だけ低い。従って、デジタルＰＣＲ検出器１は、その検出精度が高く、検出範囲が大きく、少数の液滴だけで複数の異なる種類の核酸を検出でき、使用効率が向上する。
【０２０３】
一実施例では、前記微小液滴生成装置１０が生成した前記複数の均一な微小液滴は、体積に特殊性を有する場合に、前記微小液滴の体積が変更されると、体積が均一でないことがある。また、前記微小液滴生成装置１０により、医学臨床の検出に用いられるように、複数の異なる体積の微小液滴を生成てもよい。
【０２０４】
ミクロ細孔式であれ液滴式デジタルＰＣＲ技術であれ、その反応セルの体積は、一致として高度に保持されることが多く、単一の体積とされるデジタルＰＣＲの技術と見なされてもよい。単一体積とされるデジタルＰＣＲの定量限界は、主に、反応セルの体積と数により決められており、検出の下限が試料の総体積に関連されている。単一体積デジタルＰＣＲの技術は、その分解能と動的範囲を独立して調節することができない。また、検出すべき試料を連続して希釈すると、その動的範囲を拡大できるものの、検出に感度を向上させることができない。また、連続して希釈する方法には、試薬の消費量が増加し、クロスして汚染するリスクが増加し、操作の手間が複雑になる。
【０２０５】
多重体積デジタルＰＣＲ（ｍｕｌｔｉｖｏｌｕｍｅ  ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ、ＭＶｄＰＣＲ）によれば、連続して希釈することによる弊害を避けると共に、研究者が独立して動的範囲と分解能を調節することができる。
【０２０６】
多重体積デジタルＰＣＲの微小液滴容器には、一連の異なる体積の反応セルを含み、小体積の反応セルにより、高濃度の試料に対して定量を行い、大体積の反応セルについて十分な容積により、高感度で検出することが実現される。多重体積デジタルＰＣＲは、多量の反応セルを必要としないが、単一体積デジタルＰＣＲによる動的範囲に達することが可能である。従って、前記微小液滴容器により、数多くの試料に解析を済ませると共に、その試薬の消費量を効果的に低減することができる。
【０２０７】
前記デジタルＰＣＲ検出器では、イメージングシステムに、前記蛍光画像の各画素と対応する実際的な比が何であるかについて定められる。前記蛍光画像に基づいて、前記微小液滴の直径と対応する数の画素を抽出し、直径と対応するミクロンを取得すると、前記微小液滴の直径が何であるかについて算出することができる。
【０２０８】
一実施例では、前記試料溶液は、デジタルＰＣＲ検出器の定量解析方法に用いられる核酸増幅反応液である。
【０２０９】
図１８を参照すると、以上の場合について提出する異なる体積デジタルＰＣＲの定量解析方法は、
微小液滴の全ての体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍを取得し、ただし、前記体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍと順次に対応する微小液滴の数量をｎ１、ｎ２、…、ｎｍとし、前記体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍと順次に対応する微小液滴における核酸増幅された陰性の微小液滴の数量をｂ１、ｂ２、…、ｂｍとする、ステップＳ４３１０と、
微小液滴の全てについて核酸増幅された関連のパラメータｖ１、ｖ２、．．．ｖｍ、ｎ１、ｎ２、…、ｎｍ、ｂ１、ｂ２、…、ｂｍに基づいて、核酸増幅反応液の濃度ｃについての結合二項分布関数ｆ（ｃ）を構築するステップＳ４３２０と、
結合二項分布関数ｆ（ｃ）に基づいて、前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）に極値点を取った時のｃの値を求めるステップＳ４３３０と、
前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）をｌｎ（ｃ）についての結合二項分布関数Ｆ（Λ）に転換して、ｌｎ（ｃ）についての標準偏差及び信頼区間を取得するステップＳ４３４０と、
ｌｎ（ｃ）についての標準偏差及び信頼区間に基づいて、前記核酸増幅反応液の濃度ｃの標準偏差及び信頼区間を取得するステップＳ４３５０を含む。
【０２１０】
標的ＤＮＡを含む微小液滴が増幅された後に、その蛍光信号の強度が一定レベルになると、陽性と示され、ＤＮＡの含量がゼロである微小液滴について、蛍光信号をほぼ検出できず、陰性と見なされる。
【０２１１】
デジタルＰＣＲにおける微小液滴に含まれる初期ＤＮＡコピー数をｘとすると、数理統計の理論により、ｘ＝ｋ（ｋ＝０、１、２、３．．．．．）の確率分布関数Ｐがポアソン確率モデルに該当し、そのうち、λが微小液滴に含まれる平均分子コピー数である。
2021511074.tif 000012
従って、前記ポアソン分布モデルの期待値μと分散σ２により、期待値μがλであり、分散σ２がλであると分かる。従って、デジタルＰＣＲにおける各微小液滴に含まれる標的ＤＮＡ分子のコピー数がλであるので、求められるλ値により、核酸を定量で検出することが実現される。
【０２１２】
前記検出すべき核酸増幅反応液の総体積をＶ（各微小液滴の体積がｖであり）とすると、前記検出すべき核酸増幅反応液の濃度ｃ（ｃｏｐｙ／μＬ）は、
2021511074.tif 000013
故に、λの値を求めると、ＤＮＡを定量で検出することが実現される。
【０２１３】
そのうち、リアルタイム蛍光定量ＰＣＲに内部標準の付与を必要としないということは、Ｃｔ値の再現性、及び、Ｃｔ値と初期ＤＮＡ濃度との線形の関係による。ＰＣＲ循環は、Ｃｔ値が位置する巡回数になると、真の指数増幅期（対数期）に入ったばかりであり、この時に、微小誤差がまだ拡大されないことから、Ｃｔ値の再現性が極めてよく、即ち、同一ＤＮＡ鋳型を異なる時間で増幅したり、同一時間で異なる微小液滴容器内に増幅したりすることにより得られるＣｔ値が一定である。
【０２１４】
前記微小液滴と対応する蛍光曲線が増幅曲線である時に、前記微小液滴に標的遺伝子成分を含むと表現される。前記微小液滴と対応する蛍光曲線が直線である時に、前記微小液滴に標的遺伝子成分を含まないと表現される。
【０２１５】
取得されたリアルタイムの蛍光曲線に基づいて、Ｃｔ値を取得し、各微小液滴のＣｔ値を取得する時に、前記リアルタイムの蛍光曲線に導関数を導出して、前記リアルタイムの蛍光曲線の傾きが一定となる蛍光曲線の初期循環回数は、必要なＣｔ値となる。
【０２１６】
一実施例では、前記ステップＳ４３１０は、
標的核酸を含んでいる試料溶液を微滴化し、複数の異なる体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍの微小液滴を取得し、ただし、前記微小液滴体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍと順次に対応する微小液滴の数量をｎ１、ｎ２、…、ｎｍとするステップＳ４３１１と、
微小液滴の全てについて核酸増幅を行い、撮影により検出し、前記微小液滴の全てに蛍光画像を取得するステップＳ４３１３と、
前記微小液滴の全ての蛍光画像に基づいて、前記微小液滴の全ての体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍと順次に対応する核酸増幅された陰性微小液滴数量ｂ１、ｂ２、…、ｂｍを取得するステップＳ４３１５と、を含む。
【０２１７】
一実施例では、前記ステップＳ４３１０は、
標的核酸を含んでいる試料溶液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するステップＳ４３１２と、
前記複数の微小液滴に核酸を増幅し、撮影により検出し、核酸増幅された微小液滴の全ての蛍光画像を取得するステップＳ４３１４と、
前記蛍光画像に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全ての体積を取得し、ただし、前記体積をそれぞれｖ１、ｖ２、．．．ｖｍとして、前記体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍと順次に対応する核酸増幅された微小液滴の数量をｎ１、ｎ２、…、ｎｍとして、前記体積ｖ１、ｖ２、．．．ｖｍと順次に対応する核酸増幅された陰性微小液滴数量をｂ１、ｂ２、…、ｂｍとするステップＳ４３１６をさらに含む。
【０２１８】
一実施例では、前記ステップに、前記複数の微小液滴に蛍光画像を採集し、画像追跡を行う。各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線を取得する時に、各画像における各微小液滴をそれぞれ位置決め、各微小液滴の蛍光強度を取得する必要がある。前記デジタルＰＣＲ検出器では、イメージングシステムに、前記蛍光画像の各画素と対応する実際的な比が何であるかについて定められる。前記蛍光画像に基づいて、前記微小液滴の直径と対応する数の画素を抽出し、直径と対応するミクロンを取得すると、前記微小液滴の直径が何であるかについて算出することができる。
【０２１９】
一実施例では、各微小液滴を追跡する時に、各温度循環工程に撮影された写真に基づいて、ＮＣＡＳＴ画像の差分とクラスタリングの演算を行い、各微小液滴の位置を識別して、前記複数の微小液滴に蛍光強度を取得してもよい。
【０２２０】
一実施例では、各温度循環工程における各微小液滴の蛍光強度値に基づいて、各微小液滴の蛍光曲線を取得する。各蛍光曲線は、一つの有用な情報の曲線の変化過程を示し、リアルタイムでモニターするように、液滴の試料に参加した情報であり、所定のアルゴリズムで、隣接する液滴間における互いの影響を取り除くことができる。温度循環工程毎に各微小液滴の各箇所の蛍光強度値に、和を算出することにより、それを、所定のタイミングでの各微小液滴の蛍光強度値として取得する。
【０２２１】
一実施例では、隣接する各微小液滴の辺縁の箇所に互いに影響を与えないように、所定のタイミングでの各微小液滴の蛍光強度値について、その一部を加算する方式を用いてもよい。温度循環工程毎に、前記複数の微小液滴の蛍光強度値に基づいて、前記複数の微小液滴が全部循環工程に変化する事情を取得して、各微小液滴の蛍光曲線を取得する。一実施例では、微小液滴について４５回だけ循環を行い、４５個の蛍光イメージを取得する。この４５個の蛍光イメージにおける各微小液滴に、位置決めて、各微小液滴の４５個の蛍光強度値を取得して、各微小液滴の蛍光曲線を取得する。
【０２２２】
一実施例では、前記Ｓ４３２０に、検出すべき核酸増幅反応液の濃度ｃについての結合二項分布関数ｆ（ｃ）を構築すると、
2021511074.tif 000014
【０２２３】
単一体積デジタルＰＣＲに、各微小液滴の体積をｖとし、検出すべき核酸増幅反応液の核酸濃度をｃとすると、各微小液滴に含まれる平均ＤＮＡの数量がｖｃとなる。各微小液滴に含まれる分子数をｋとすると、ポアソン分布の確率モデルによりｋの確率分布Ｐを推定すると、
2021511074.tif 000015
【０２２４】
ｋ＝０について、即ち、標的ＤＮＡ分子を含まない陰性微小液滴について、上式を書き直すと、
2021511074.tif 000016
【０２２５】
単一体積デジタルＰＣＲ解析には、微小液滴の総数ｎ及び陰性の微小液滴ｂにより、陰性の微小液滴の確率を推量することができる。
従って、
2021511074.tif 000017
【０２２６】
特定の試験結果について、陰性の微小液滴の数量ｂ及び総数ｎが既知である。従って、二項方程式を構築すると、
2021511074.tif 000018
単一体積デジタルＰＣＲの解析工程に基づいて、各微小液滴の体積のそれぞれをｖ１、ｖ２、．．．ｖｍとすると、各微小液滴の体積とそれぞれ対応する数量が順次にｎ１、ｎ２、…、ｎｍである。ｃについての結合二項分布関数を構築すると
2021511074.tif 000019
【０２２７】
一実施例では、前記ステップＳ４３３０は、
前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）に導関数を導出し、前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）の導関数を取得するステップＳ４３３１と、
前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）の導関数を０にし、前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）に極値点を取った時の核酸増幅反応液濃度ｃの値を取得するステップＳ４３３２と、を含む。
【０２２８】
通常に、関数の導関数が０である時に、関数値を極大値又は極小値として取る。二項分布に、一つの極大値しかを含まないことから、関数の導関数を０にする時の解は、最も可能な濃度値となる。前記結合二項分布関数ｆ（ｃ）に最大値を取る時に、対応するｃの最も可能数を取得する。
【０２２９】
一実施例では、前記ステップＳ４３４０における前記ｌｎ（ｃ）についての結合二項分布関数Ｆ（Λ）は、
2021511074.tif 000020
【０２３０】
Ｐ関数は、ｌｎ（ｃ）について、ｃのほうよりも、より対称性を持っていることから、ｌｎ（ｃ）の標準偏差σは、より、統計学で意味を持っている。濃度が正値となる約束条件を強化させることにより、低濃度で試料を解析する時に、比較的よい正確度を有することになる。計算を簡単にするように、計算ｌｎ（ｃ）と対応する標準偏差σを算出する時に、対応するパラメータを切り替える必要がある。
【０２３１】
一実施例では、前記ステップＳ４３４０には、
前記関数Ｆ（Λ）に対数を取り、関数Ｌ（Λ）を取得するステップＳ４３４１と、
前記関数Ｌ（Λ）に一次導関数を導出し、関数Ｌ（Λ）の一次導関数を０にするステップＳ４３４２と、
ｌｎ（ｃ）に対応する標準偏差σを取得するステップＳ４３４３と、
ｌｎ（ｃ）に対応する標準偏差σに基づいて、ｌｎ（ｃ）の信頼区間を取得するステップＳ４３４４と、を含む。
【０２３２】
前記関数Ｆ（Λ）に対数を取り、以下のように変換すると、
2021511074.tif 000021
となり、
前記関数Ｆ（Λ）に自然対数を取ることにより、対応する乗法関係を、独立する加法関係に変更して、対応する導関数をより容易に処理することができる。
【０２３３】
前記Ｌ（Λ）に一次導関数を導出すると、
2021511074.tif 000022
が得られる。
【０２３４】
ｌｎ（θｉ）を−ｖｉに代えて、ｔｉにより第ｉ重体積における陽性の微小液滴の数を示すと、ｂｉ＝ｎｉ−ｔｉとなり、ステップ４の式が
2021511074.tif 000023
になる。
【０２３５】
2021511074.tif 000024
【０２３６】
一実施例では、前記Ｓ４３４３に、ｌｎ（ｃ）のＦｉｓｈｅｒ情報量Ｉ（Λ）に基づいて、標準偏差σを取得する。
【０２３７】
2021511074.tif 000025
【０２３８】
標準偏差σについて、ｌｎ（ｃ）のＦｉｓｈｅｒ情報量Ｉ（Ｘ）を組み合わせて取得し、対応するＦｉｓｈｅｒ情報量は、以下の式で示されており、そのうち、Ｅ［］が対応パラメータの期待値を示す。
2021511074.tif 000026
【０２３９】
一実施例では、前記ｌｎ（ｃ）に対応する標準偏差σ及び信頼区間は、それぞれ
2021511074.tif 000027
【０２４０】
2021511074.tif 000028
【０２４１】
上記の式から、ｌｎ（ｃ）に対応する標準偏差σ及び信頼区間を取得することができる。
2021511074.tif 000029
そのうち、Ｚが標準正規分布の最大の臨界値である。
【０２４２】
取得されたｌｎ（ｃ）と対応する標準偏差σ及び信頼区間に基づいて、検出すべき核酸増幅反応液の核酸濃度ｃを取得することができる。標準正規分布表から、対応する数値を取得し、そして、ｌｎ（ｃ）の信頼区間を取得し、さらに、検出すべき核酸増幅反応液の核酸濃度がｃであるため、前記検出すべき核酸増幅反応液に含まれるＤＮＡ初期コピー数量を取得することができる。
【０２４３】
そのうち、信頼区間とは、サンプルの統計量により構成される母集団のパラメータの推量空間である。統計学では、一つの確率のサンプルの信頼区間（Ｃｏｎｆｉｄｅｎｃｅ  ｉｎｔｅｒｖａｌ、ＣＩ）は、このサンプルのある母集団パラメータに対する空間推量である。信頼区間に示されるのは、このパラメータの真の値がある確率で測量結果の周囲に位置する度合いである。信頼区間により示されるのは、測量されるパラメータの測量値の信頼程度、即ち、上記の必要な「一つの確率」である。
【０２４４】
デジタルＰＣＲの定量結果は、通常に、信頼区間と信頼水平とを組み合わせて示される必要がある。デジタルＰＣＲでは、信頼区間に示されるのは試料の真の濃度が、一定の確率で測量結果λの周囲の空間に位置する度合いを示し、この確率は、信頼レベルと呼ばれる。信頼区間の両端は、信頼限界と呼ばれる。
【０２４５】
単一体積デジタルＰＣＲに比べると、異なる体積デジタルＰＣＲのほうは、２００個未満の微小液滴により、五つのオーダーの動的検出範囲を実現でき、その性能は、１２０００個の微小液滴を有する単一体積デジタルＰＣＲのほうと同様に優れるため、機器のコストを削減して、消耗品としてコストが低下する。また、前記デジタルＰＣＲ検出器１による検出の精度が向上するように、前記微小液滴に均一な体積が存在する特殊な事情を修正してもよい。
【０２４６】
前記デジタルＰＣＲ定量検出方法により、その結果が偽陽性や偽陰性であるという問題が解決される。シークエンシングプラットフォームの試料は、ハイスループット性を持っているため、数百個の試料を同時に検出することができる。また、異なる種類の蛍光により、複数のローカスを検出することができ、そして、検出に速度が速く、試験するためのコストが低下する。デジタルＰＣＲ検出器を用いて微滴化処理を行うと、希有な検出断片を多量の複雑な背景から分離させ、大幅に操作のステップを簡単にして、効果的に用意時間や検出時間を省いて、しかも、結果の読み取りにも直観的で確実であり、安定で実施できるという利点を持ち、検出に感度や正確性が共に正確で、定量要求を満たしており、検出に感度や正確性が向上する。
【０２４７】
実際の工程では、前記異なる体積デジタルＰＣＲ定量解析方法は、標準曲線によらず、高精度で前記複数の微小液滴に初期ＤＮＡの濃度を検出することができる。前記デジタルＰＣＲ検出器１は、イメージングシステムに、前記蛍光画像の各画素と対応する実際的な比が何であるかについて定められる。前記蛍光画像に基づいて、前記微小液滴の直径と対応する数の画素を抽出し、直径と対応するミクロンを取得すると、前記微小液滴の直径が何であるかについて算出することができる。
【０２４８】
デジタルＰＣＲ定量検出方法により、前記複数の微小液滴を動的に追跡することができる。前記複数の微小液滴に温度循環を行わせる工程では、各微小液滴と対応する具体的な位置を求めることができ、核酸を増幅する工程全体をモニターすることができる。従って、前記デジタルＰＣＲ定量検出方法により、前記複数の微小液滴に偽陽性が存在する課題を解決することができる。また、前記複数の微小液滴に、蛍光曲線を処理することは、仮に均一性により行われる統計修正によらず、真の絶対定量を取得することができる。
【０２４９】
標準曲線に対する依頼を脱出できるに加えて、標準曲線により定量結果が確定でないという課題も解決できると共に、液滴式デジタルＰＣＲにエンドポイント検出方式による制限を解決でき、また、一つのP（x=0）のデータだけを用いて検出すべき試料の全体についてパラメータを推量する制約性を破ることができる。前記リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ検出方法により、デジタルＰＣＲ定量検出に正確性が向上する。
【０２５０】
前記デジタルＰＣＲ定量検出方法は、抽象化の数学モデルにより、再現性と高感度が実現でき、しかも、動的範囲が大きくなり、少量の液滴でモニターが実現できる。小量のデータにより数多くの情報をカバーすることができる。また、前記デジタルＰＣＲ定量検出方法は、前記のポアソン分布の確率モデルの誤差を回避して絶対定量を実現し、より直観的になる。すべてのデータを総合して、ランダム性の誤差を取り除く。液滴の試料の蛍光曲線を取得し、液滴試料の蛍光輝度の変化をリアルタイムでモニターし、偽陽性を除去し、隣接する液滴間に互いの影響を取り除き、その後、定量解析モデルにより正確なデータ源を提供する。
【０２５１】
一実施例では、検出すべきＤＮＡは、ヒトサイトメガロウイルスＤＮＡである。
【０２５２】
検出すべき試料ＤＮＡを鋳型として、検出すべき試料ＤＮＡと対応する検出プライマー及びそのプローブを添加する。前記リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ検出方法に用いられるのはＴａｑｍａｎ蛍光プローブである。
【０２５３】
ヒトサイトメガロウイルスの核酸の定量検出の試薬キットを取得する。前記検出試薬キットには、ヒトサイトメガロウイルスＤＮＡのリアルタイムの蛍光の定量検出のプライマー及びそのプローブを含む。
【０２５４】
試薬キットにおける１０＾６  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬという濃度の陽性品質制御品（非標準の濃度）を、比例で希釈して、１０＾６  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、１０＾５  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、１０＾４  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、０．５×１０＾４  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬという濃度を取得する。また、２×１０＾６  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、１０＾６  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、１０＾５  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、１０＾４  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ及び０．５×１０＾４  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬという五つの試料の濃度を製造する。そのうち、前記検出すべき試料の試薬を配置する比は、１ｕｌの試料（２×１０＾６  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬに２ｕｌの試料を添加し）、１ｕｌのＤＮＡポリメラーゼ、２０ｕｌのＢｕｆｆｅｒ、合計すると、２２ｕｌとなる。
【０２５５】
２×１０＾６  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、１０＾６  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、１０＾５  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ、１０＾４  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬ及び０．５×１０＾４  ｃｏｐｉｅｓ／ｍＬという前記試料濃度の試料を、それぞれ、本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出器、ＱＸ２００デジタルＰＣＲ検出器及びｑＰＣＲデジタルＰＣＲ検出器により、検出し、表１に示されるように、各個機器による五つの核酸増幅反応液初期コピー数の検出値と真の値の関連係数との対比表を取得する。
【０２５６】
2021511074.tif 000030
【０２５７】
関連係数Ｒとは、パラメータ間に関連関係の強さを示す統計的指標であり、二つのパラメータ間に線形の関係を測るものである。表１からみれば、本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出器により検出された五つの核酸増幅反応液の初期コピー数の検出値と真の値との関連係数が最大であり、最も１に近接したと分かる。従って、本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出器により検出された五つの核酸増幅反応液の初期コピー数の検出値と真の値との関連係数が最大であり、最も１に近接する。故に、本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出器１は、検出精度がより高く、精度がより高い。
【０２５８】
前記デジタルＰＣＲ検出器１は、前記微小液滴生成装置１０、前記温度制御装置２０、前記蛍光信号検出装置３０及び前記定量解析装置４０を集積化するため、制御器５０により、一体式とされるデジタルＰＣＲ検出器１により、前記操作員に自動で操作を実現し、作業効率が向上し、反応が急速となり、再現性が良く、感度が高く、特異性が強く、結果が明確となる。
【０２５９】
従来のデジタルＰＣＲ検出方法は、その作業量が重く、時間が掛かり、効率が低いというの課題について、簡便で効率が高いデジタルＰＣＲ検出方法を提供する。
【０２６０】
図１９を参照すると、本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出方法は、
検出すべき核酸増幅反応液を製造するステップＳ１０と、
前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、微小液滴のマトリックスを形成するステップＳ２０と、
前記微小液滴のマトリックスをポリメラーゼ連鎖反応させ、前記微小液滴のマトリックスにおける各微小液滴の蛍光曲線及び各微小液滴の溶解曲線を取得するステップＳ３０と、
前記微小液滴のマトリックスにおける各微小液滴の蛍光曲線及び各微小液滴の溶解曲線に基づいて、前記微小液滴のマトリックスを解析し、前記検出すべき核酸情報を取得するステップＳ４０と、を含む。
【０２６１】
検出すべき核酸増幅の反応液を製造する時に、飽和の蛍光染料を用いると、異なる種類の変異を分類して、高い分解能と感度を持たせ、デジタルＰＣＲ検出器による検出にコストを低減することができる。しかも、前記デジタルＰＣＲ検出方法により、前記微小液滴のマトリックスに、一つの高度で集積化するデジタルＰＣＲ検出器でポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ）を済ませ、前記微小液滴のマトリックスＰＣＲが増幅された後に、ＰＣＲ産物を溶解曲線で解析する。前記微小液滴のマトリックスにポリメラーゼ連鎖反応を行う工程では、各前記微小液滴の蛍光曲線を取得する。前記微小液滴のマトリックスは、ＰＣＲ増幅が完了した後に、再度、高低温で循環を行いながら、循環工程における各前記微小液滴の溶解曲線を取得する。前記デジタルＰＣＲ検出方法によれば、前記微小液滴のマトリックスについて蛍光曲線及び溶解曲線を取得することにより、ＰＣＲ増幅を工程全体に渡ってリアルタイムでモニターすること、及び、ＰＣＲ産物の溶解曲線を解析すること、の両方を、シームレスに実行するように、実現することができる。そして、前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線及び溶解曲線に基づいて、異なる形状の溶解曲線によるジェノタイピングや分類を実現し、前記微小液滴のマトリックスに対する定性及び定量の解析を実現し、より全面的、簡便的、高い効率に、デジタルＰＣＲの検出を済ませることができる。
【０２６２】
一実施例では、前記ステップＳ１０に、前記核酸増幅反応液に、検出すべき核酸の鋳型、反応緩衝水溶液、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、プライマー、ポリメラーゼ及び産物マーク物質などが含まれている。耐熱性のＤＮＡポリメラーゼは、ＦａｓｔＳｔａｒｔ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼ、Ｅｘ  Ｔａｑ、Ｚ−Ｔａｑ、ＡｃｃｕＰｒｉｍｅ  Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼとＨＳ  ＴａｑＤＮＡポリメラーゼなどであってもよい。
【０２６３】
そのうち、核酸増幅反応液は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を鋳型とする核酸増幅反応液（ＤＮＡ増幅反応液とも呼ばれる）であってもよく、相補デオキシリボ核酸（ｃＤＮＡ）、即ち、リボ核酸（ＲＮＡ）を鋳型とする逆転写核酸増幅反応液（ＲＮＡ逆転写反応液とも呼ばれる）であってもよく、さらに、例えば、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）反応液の他の核酸増幅反応液であってもよく、そのうち、前記ＤＮＡ増幅反応液の特徴としては、ＤＮＡを増幅させるに必要なｄＮＴＰ、緩衝液、無機塩イオン、ポリメラーゼ、プライマー、検出すべきＤＮＡ鋳型及び染料などを含んでいるということである。反応液における染料は、核酸増幅を示すことができ、ＳＹＢＲ  ＧｒｅｅｎなどのＤＮＡと結合される蛍光染料であってもよい。
【０２６４】
一実施例では、デジタルＰＣＲにのみ用いられ、セットとなる試薬及び溶液を用意して、鋳型ＤＮＡの試料に対する外来ＤＮＡの潜在的な汚染を減少し又は回避する。使用される機器及び消耗品の全ては、高温で殺菌され、高温で乾燥処理されるべきである。
【０２６５】
一実施例では、前記検出すべき核酸増幅反応液を製造する時に、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光染料により、前記検出すべき核酸増幅反応液をマークする。ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光染料がすべての二本鎖ＤＮＡと結合できることから、鋳型を選択する必要がなく、しかも、価格が低く、多種類の産物を検出するに適用される。溶解曲線により解析するということ、一般的に、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎを蛍光染料とする時に使用される。これは、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎの染料が特異性なしの染料であり、増幅があれば、染料が二本鎖ＤＮＡと結合することから、蛍光が大幅に増強される。蛍光信号を変更し、温度図を作成して、溶解曲線を形成することは、増幅により蛍光を発する断片がデジタルＰＣＲ検出時に必要な検出の標的遺伝子であるかどうかを観察するためのことである。もし、作成された溶解曲線が単一のピークしかを有さないと、ピップ位置がアニーリング温度となり、しかも、狭いピークに該当すると、産物が、ＰＣＲ増幅の特異性の産物である。一方、ピーク位置が正しくない又は広いピークに該当すると、産物が特異性を有さず、又は、対応する産物が設計されていない。また、溶解曲線のピークの先に小さいピークが存在すると、プライマーダイマーであるかもしれないため、プライマーなどを設計し直すことが必要となる。高分解能の溶解曲線は、温度又は曲線の形状が僅かに変化すると、ヌクレオチドに変化があったと表現される。多量の微小液滴についてマトリックスの溶解曲線を繰り返して解析することにより、集中的な曲線解析のマッチングプログラムに基づいて、核酸配列へのタイピングなどが自動に実現される。
【０２６６】
図２０を参照すると、一実施例では、前記ステップＳ２０では、前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、微小液滴のマトリックスを形成する。前記微小液滴のマトリックスは、多量の複数の微小液滴が含まれる。
【０２６７】
一実施例では、微小液滴生成装置１０、温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０、定量解析装置４０、及び、制御器５０を含む、デジタルＰＣＲ検出器１を提供する。
【０２６８】
前記微小液滴生成装置１０は、核酸増幅反応液を微滴化し、前記微小液滴のマトリックスを形成し、微小液滴容器に微小液滴のマトリックスを形成し、多種類の標的配列を同時に検出するために用いられる。前記温度制御装置２０は、温度循環で核酸を増幅させるために用いられる。前記蛍光信号検出装置３０は、前記温度制御装置２０に対向して配置され、核酸が増幅された前記微小液滴にマトリックスの信号を採集するために用いられる。前記定量解析装置４０は、前記蛍光信号検出装置３０にデータ線を介して接続され、前記微小液滴のマトリックス蛍光情報を送信して定量解析するために用いられる。前記制御器５０は、それぞれ、前記微小液滴生成装置１０、前記温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０及び定量解析装置４０に接続され、前記微小液滴生成装置１０、前記温度制御装置２０、蛍光信号検出装置３０及び定量解析装置４０を制御するために用いられる。
【０２６９】
前記デジタルＰＣＲ検出器が稼働している時に、前記微小液滴生成装置１０は、前記検出すべき核酸増幅反応液を微滴化し、前記微小液滴のマトリックスを形成することができる。前記微小液滴のマトリックスは、複数の多量の微小液滴が含まれる。前記温度制御装置２０は、前記微小液滴のマトリックスに核酸増幅を行う。前記蛍光信号検出装置３０は、前記微小液滴のマトリックスの蛍光変化画像をリアルタイムで採集する。前記温度制御装置２０は、前記微小液滴のマトリックスを核酸増幅反応させ、前記蛍光信号検出装置３０により核酸増幅反応された前記微小液滴のマトリックスの産物信号、例えば、蛍光、紫外線吸収、濁度などの信号を採集する。前記複数の増幅された微小液滴と増幅されなかった微小液滴との構成の相違により、標的配列増幅が得られた液滴数を解析して、核酸分子への定量解析を最終的に実現することができる。前記微小液滴にマトリックスの信号の変化をリアルタイムでモニターすることにより、検出結果に直接性を持たせ、前記微小液滴のマトリックスの偽陽性と偽陰性という問題を解決することができる。
【０２７０】
前記微小液滴生成装置１０により、微小液滴容器に前記微小液滴のマトリックスを生成して、微小液滴容器の底部に落下して、不規則に積み重なる。前記微小液滴生成装置１０により製造された前記微小液滴のマトリックスは、下向きに降下する工程では、微小液滴容器の中央の箇所に集中的に集まる。この時に、前記微小液滴のマトリックスの信号を採集する前に、複数の前記微小液滴のマトリックスを微小液滴容器の底部に敷き詰めることが必要となる。
【０２７１】
一実施例では、複数の前記微小液滴のマトリックスの信号を採集する前に、前記温度制御装置２０により高低温を行い、複数の前記微小液滴のマトリックスを微小液滴容器の底部に敷き詰める。まず、前記微小液滴のマトリックスを昇温させる。次に、前記微小液滴のマトリックスを降温させる。再度、前記微小液滴のマトリックスを前記微小液滴容器の底板に敷き詰めるまで、前記微小液滴のマトリックスに高低温で循環を行う。最後に、前記微小液滴のマトリックスを微小液滴容器に敷き詰め、敷き詰められた前記微小液滴のマトリックスにＰＣＲ増幅を行うと共に、撮影により検出を実行する。
【０２７２】
一実施例では、微小液滴生成装置１０により複数の均一な体積の微小液滴を生成することができる。各前記微小液滴の大きさは、ミクロンオーダである。複数の前記微小液滴体積が均一である場合に、複数の前記微小液滴の蛍光情報により、複数の前記微小液滴を定量で解析することができる。
【０２７３】
一実施例では、前記ステップＳ３０には、
ポリメラーゼ連鎖反応の温度パラメータ、時間パラメータ及び循環回数を配置するステップＳ３１０と、
前記温度パラメータ及び前記時間パラメータに基づいて、前記微小液滴のマトリックスをポリメラーゼ連鎖反応させ、順次に前記循環回数だけ循環を行い、循環工程ごとに各前記微小液滴に蛍光曲線を取得するステップＳ３２０と、
ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された前記微小液滴のマトリックスを降温させ、一定の温度間隔で昇温し、各前記微小液滴の溶解曲線を取得するステップＳ３３０と、を含む。
【０２７４】
ＰＣＲは、変性−−アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）−−伸長という三つの基本反応のステップからなる。鋳型ＤＮＡの変性とは、鋳型ＤＮＡを９０℃〜９５℃まで一定時間加熱してから、それがプライマーと結合して、次回の反応に備えるように、鋳型ＤＮＡの二本鎖、又は、ＰＣＲ増幅を経て形成された二本鎖ＤＮＡを単鎖として解離するということである。鋳型ＤＮＡとプライマーのアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）とは、鋳型ＤＮＡを加熱して単鎖に変性した後に、温度を５０〜６０℃まで低下させ、プライマーと鋳型ＤＮＡ単鎖の相補配列配対とが結合するようにするということである。プライマーの伸長とは、ＤＮＡ鋳型とプライマー結合物がＤＮＡポリメラーゼの作用により、７０〜７５℃でｄＮＴＰを反応原料として、標的配列を鋳型として、塩基配列対と半保存的複製という原理で、一つの新しい鋳型ＤＮＡ鎖と相補される半保存的複製の鎖を合成するということである。変性−−アニーリング−−伸長という三つの工程を循環すると、数多くの「半保存的複製の鎖」を取得でき、しかも、このような新しい鎖を、次回の循環に鋳型としてもよい。一つの循環を済ませると、２〜４分かかるので、２〜３時間で、増幅すべき標的遺伝子を数百万倍増幅させることができる。
【０２７５】
そのうち、アニーリング温度は、ＰＣＲの特異性に影響を与える比較的重要な要素である。変性後の温度について、急速に４０℃〜６０℃まで冷却すると、プライマーと鋳型とを結合させることができる。鋳型ＤＮＡは、プライマーよりも遥かに複雑であるため、プライマーと鋳型が衝突して結合するチャンスは、鋳型相補鎖のほうよりも遥かに多い。アニーリング温度と時間は、プライマーの長さ、塩基組成及びその濃度、ひいては、標的基配列の長さにより決められる。
【０２７６】
前記ステップＳ３１０では、前記微小液滴のマトリックスは、プライマー、検出すべきＤＮＡ試料及び耐熱性のＤＮＡポリメラーゼが存在している場合に、変性、アニーリングと伸長という三つのステップを、約３０回〜５０回だけ繰り返して循環することにより、ＰＣＲが実行される。前記循環の回数は、一般的に、３０回〜５０回だけ、変性、アニーリング及び伸長という三つのステップを繰り返して循環するように配置される。前記温度パラメータは、一般的に、４０℃〜９５℃に配置され、前記時間パラメータは、具体的な工程により決められてもよい。
【０２７７】
一実施例では、前記ステップＳ３２０には、
前記温度パラメータ及び前記時間パラメータに基づいて、前記微小液滴のマトリックスをポリメラーゼ連鎖反応させ、前記微小液滴にマトリックスの蛍光画像を取得するステップＳ３２１と
前記循環回数だけ順次に循環を行い、ポリメラーゼ連鎖反応の工程における前記微小液滴についてマトリックスの蛍光画像の全てを取得するステップＳ３２２と、
前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像の全てに基づいて、循環工程毎に各前記微小液滴の蛍光情報を取得するステップＳ３２３と、
毎次循環工程毎に各前記微小液滴の蛍光情報に基づいて、各前記微小液滴の蛍光曲線を取得し、前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線を取得するステップＳ３２４と、を含む。
【０２７８】
前記ステップＳ３２１には、
まず、前記微小液滴のマトリックスの酵素がホットスタートするように、前記微小液滴のマトリックスを９５℃まで加熱し、４分だけ加熱し、前記微小液滴のマトリックスの酵素がホットスタートされた後に、１分だけ前記微小液滴のマトリックスを変性させること、
次に、前記微小液滴のマトリックスが変性した後に、プライマーとＤＮＡ鋳型とが結合して一部の二本鎖を形成するように、５５℃まで降温し、１分だけアニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）すると、前記蛍光信号検出装置３０により、前記微小液滴のマトリックスを撮影し、一回目の循環の前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像を取得すること、
さらに次に、前記微小液滴のマトリックスを７０℃まで昇温し、７分だけ伸長すること、
最後に、前記循環回数に従って、順次に上記の変性−アニーリング（ａｎｎｅａｌｉｎｇ）−伸長という三つのステップを、４５回だけ循環し、４５回だけ循環が完了すると、４℃まで降温し、前記複数の微液を保存することを含む。
【０２７９】
一実施例では、前記温度制御装置２０によれば、前記微小液滴のマトリックスを昇降温させ、前記循環回数を４５回として配置すると、各微小液滴について、４５回の循環工程において４５個の蛍光画像を取得することができる。各前記微小液滴について４５回だけ循環を行い、４５個の蛍光画像を取得する。４５個の蛍光画像における各前記微小液滴を位置決め、各前記微小液滴に４５個の蛍光強度値を取得して、各前記微小液滴の蛍光曲線を取得する。
【０２８０】
一実施例では、前記ステップＳ３２３には、まず、各蛍光画像に基づいて、ＰＣＲ増幅された各前記微小液滴の蛍光強度値を取得し、次に、前記ＰＣＲ増幅された各微小液滴の蛍光強度値に基づいて、ＰＣＲ増幅された各微小液滴の蛍光曲線を取得し、最後に、前記ＰＣＲ増幅された各微小液滴の蛍光曲線に基づいて、前記ＰＣＲ増幅された微小液滴の全ての蛍光曲線、即ち、前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線を取得する。
【０２８１】
図２１を参照すると、一実施例では、前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像を採集し、画像追跡を行う。各前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線を取得する時に、各画像における各前記微小液滴を位置決め、各前記微小液滴の蛍光強度を取得することが必要となる。前記デジタルＰＣＲ検出器では、イメージングシステムに、前記蛍光画像の各画素と対応する実際的な比が何であるかについて定められる。前記蛍光画像に基づいて、前記微小液滴の直径と対応する数の画素を抽出し、直径と対応するミクロンを取得すると、前記微小液滴の直径が何であるかについて算出することができる。
【０２８２】
一実施例では、各前記微小液滴を追跡する時に、各温度循環工程に採集された画像に基づいて、ＮＣＡＳＴ画像の差分とクラスタリングの演算を行い、各前記微小液滴の位置を識別して、前記微小液滴のマトリックスの蛍光強度を取得してもよい。
【０２８３】
一実施例では、一つの温度循環工程になされた微小液滴の移動距離は、一つの微小液滴の直径以下である場合に、以下の方法で微小液滴に追跡を行う。
そのうち、各前記微小液滴を追跡する時に、各前記微小液滴の画像を追跡するステップは、
まず、温度循環工程ごとに撮影された写真を識別し、各微小液滴の円心位置を取得すること、
次に、現在に識別される各微小液滴の円心位置と、前回循環工程における各微小液滴の円心位置と、を比較すること、
最後に、現在に識別される各微小液滴の円心位置と前回循環工程中の各微小液滴の円心位置の円心との距離が一つの微小液滴直径よりも小さい場合に、同一の微小液滴と示されること、を含む。
【０２８４】
図２２を参照すると、一実施例では、各温度循環工程における各前記微小液滴の蛍光強度値に基づいて、前記各微小液滴の蛍光曲線を取得する。温度循環工程ごとに各前記微小液滴の各箇所の蛍光強度値に対して、その和を算出することにより、それを、所定のタイミングでの各微小液滴の蛍光強度値として取得する。
【０２８５】
一実施例では、隣接する各微小液滴の辺縁の箇所に互いに影響を与えないように、所定のタイミングでの各微小液滴の蛍光強度値について、その一部を加算する方式を用いてもよい。温度循環工程毎に、前記複数の微小液滴の蛍光強度値に基づいて、前記複数の微小液滴が全部循環工程に変化する事情を取得して、各微小液滴の蛍光曲線を取得する。
【０２８６】
一実施例では、前記ステップＳ３３０には、
ポリメラーゼ連鎖反応により増幅された前記微小液滴のマトリックスを４０℃以下まで降温させるステップＳ３３と、
４０℃以下まで降温された前記微小液滴のマトリックスを一定の温度間隔で昇温させ、前記温度間隔に対応する前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像を取得するステップＳ３３２と、
前記温度間隔に対応する前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像に基づいて、前記温度間隔に対応する各前記微小液滴の蛍光情報を取得するステップＳ３３３と、
前記温度間隔に対応する各前記微小液滴の蛍光情報に基づいて、各前記微小液滴の溶解曲線を取得し、前記微小液滴のマトリックスの溶解曲線を取得するステップＳ３３４と、を含む。
【０２８７】
ＰＣＲ増幅の反応が完了した後に、持続に温度を上がると共に、ステップ毎に蛍光信号をモニターして溶解曲線を生成する。異なるＤＮＡが異なる温度溶解線を有するため、反応に二本鎖ＤＮＡの変性により、蛍光染料が遊離状態に回復されて、蛍光信号が低下することになる。そして、蛍光信号が温度の変化と伴い変化する図を作成する。増幅産物染料法には、溶解曲線を形成することが必要である。それは、染料法に特異性が悪いため、溶解曲線により、増幅産物が標的産物であるかどうかについて確認するためである。溶解温度に特徴的なピークが存在しており、この特徴的なピークにより、特異性の産物を他の産物、例えば、プライマーダイマー又は非特異性の産物から分離することができる。
【０２８８】
前記ステップＳ３３２では、ＰＣＲ増幅された後に、ＰＣＲ産物の溶解曲線を解析して、ＰＣＲ増幅とＰＣＲ産物の溶解曲線の解析とをシームレスに実行する。前記ステップＳ３３２では、前記温度制御装置２０により、温度が４０℃以下に低下するようにして、前記温度間隔について０．１℃毎に順次に９５℃まで昇温し、各間隔に０．１℃ごとに、９５℃まで昇温するように、前記蛍光信号検出装置３０により、一回ずつ撮影する。そして、撮影が完了した後に、前記微小液滴のマトリックスを４℃まで降温し、前記微小液滴のマトリックスを保存する。
【０２８９】
一実施例では、各前記微小液滴の蛍光曲線を取得する時に蛍光画像を処理する方法は、各前記微小液滴の溶解曲線を取得する時に蛍光画像を処理する方法と同じである。
【０２９０】
前記ステップＳ３３３では、各間隔について０．１℃ごとに採集して取得された蛍光画像に基づいて、各前記微小液滴と対応する蛍光強度を取得して、温度と蛍光強度に係る曲線を描いて一次微分でピークを含むピーク図を取得する。
【０２９１】
溶解曲線（Ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）とは、温度が高くなるのに伴い、ＤＮＡの二重らせんの構造が生分解する程度の曲線である。溶解曲線への解析により、非特異性の産物を含む、異なる反応産物を特定することができる。ＤＮＡの二重らせんの構造全体が半分生分解する温度を溶解温度（Ｔｍ）と呼ばれ、異なる配列についてＤＮＡ、Ｔｍ値が異なる。言い換えれば、一つのＤＮＡの溶解曲線を、一つのＤＮＡの指紋とも言え、一つの特定のＤＮＡと対応している。溶解曲線図に基づいて、そのピークが位置する温度は、二本鎖ＤＮＡ分子のＴｍ値（溶解温度）を示す。増幅産物のＴｍ値に基づいて、その遺伝子型を判断することができる。ＤＮＡ断片のＴｍは、その長さ、Ｇ＋Ｃ組成、配列、鎖相補性、濃度と緩衝領域の成分（例えば、塩、染料やＰＣＲエンハンサー）により決められる。
【０２９２】
各溶解曲線は、各前記微小液滴に産物が単一である場合を示し、一つの溶解曲線が単一のピークであり、しかも、一定の合理的な温度範囲に位置する（一般的に、８０〜９０℃）と、正常と見なされる。一方、溶解曲線がダブルピークである場合に、非特異性の増幅に該当するかもしれない。そして、産物が標的遺伝子でありか、単一であるかどうかについて判断することができる。参照遺伝子について参照遺伝子の曲線を有しており、同一の溶解曲線に二つの遺伝子のピークが存在することはない。
【０２９３】
前記微小液滴のマトリックスの各高分解能の溶解曲線の解析について、一塩基多型や走査型突然変異を検出することができる。
【０２９４】
一実施例では、デジタルＰＣＲ検出工程に、前記蛍光信号検出装置３０により、前記微小液滴のマトリックスの画像を採集する。
【０２９５】
前記蛍光信号検出装置３０により、前記微小液滴のマトリックスの画像を採集する。そのうち、微小液滴容器の上方から傾斜角度で微小液滴容器に照射する。前記蛍光信号検出装置３０により、前記微小液滴のマトリックスに周期性に二次元走査を行いながら、リアルタイムで画像を採集する。微小液滴容器内の前記微小液滴のマトリックスの内部蛍光は、励起され、前記蛍光信号検出装置３０の対物レンズに集められ、カメラに進入され、カメラにより、前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像を採集する。
【０２９６】
前記蛍光信号検出装置３０により、前記微小液滴のマトリックス蛍光をイメージングし、一回だけ一定数の前記微小液滴の蛍光画像を撮影してから、画像処理技術に基づいて、画像における液滴蛍光を自動に識別し、液滴の蛍光情報を取得する。
【０２９７】
前記蛍光信号検出装置の蛍光検知アセンブリにより、蛍光物質を含む前記微小液滴のマトリックスに蛍光情報を採集し、検出された蛍光情報を蛍光画像の形式でコンピューターに送信し、定量を解析する。蛍光イメージングの検出方法により、一回だけ一定数の前記微小液滴の蛍光画像を撮影し、画像処理の技術に基づいて、画像中の液滴蛍光を自動に識別し、液滴の蛍光情報を取得する。前記蛍光イメージングの検出方法によるイメージング範囲が大きいため、検出する際に、前記微小液滴のマトリックスが所在する検出環境に対する要求が比較に低い。
【０２９８】
一実施例では、前記ステップＳ４０には、
前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線に基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を取得するステップＳ４１０と、
前記微小液滴のマトリックスの溶解曲線に基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸情報を取得するステップＳ４２０と、を含む。
【０２９９】
一実施例では、前記ステップＳ４１０は、
前記微小液滴のマトリックスの蛍光曲線に基づいて、各前記微小液滴の前記蛍光曲線と対応するＣｔ値を取得するステップＳ４１１と、
各前記微小液滴の前記蛍光曲線のＣｔ値をクラスタリングすることにより、順次に大きい順で、ｘ１、ｘ２、…、ｘｎの類別を取得するステップＳ４１２と、
前記ｘ１、ｘ２、…、ｘｎの類別に基づいて、類別毎に対応する前記微小液滴の数ｙ１、ｙ２、…、ｙｎを取得するステップＳ４１３と、
各類別に対応する前記微小液滴の数ｙ１、ｙ２、…、ｙｎに基づいて、前記ｘ１、ｘ２、…、ｘｎの類別毎に対応する前記微小液滴の数ｙ１、ｙ２、…、ｙｎの度数分布を取得するステップＳ４１４と、
前記度数分布に基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を計算するステップＳ４１５と、を含む。
【０３００】
ＰＣＲ循環は、Ｃｔ値が所在する巡回数になる時に、真の指数増幅期（対数期）に移行したばかりであるため、この時に微小誤差がまだ拡大されていないため、Ｃｔ値の再現性が極めて良く、即ち、同一の核酸鋳型において異なる時間で増幅したり、又は、同一時間で異なる微小液滴の容器内に増幅したりすることにより得られたＣｔ値は、一定となる。前記微小液滴に対応する蛍光曲線が増幅曲線である場合に、前記微小液滴に標的遺伝子成分を含むことが表れる。前記微小液滴に対応する蛍光曲線が一つの直線である場合に、前記微小液滴に標的遺伝子成分を含まないことが表れる。
【０３０１】
取得されたリアルタイムの蛍光曲線に基づいて、Ｃｔ値を取得し、各微小液滴にＣｔ値が取得される時に、前記リアルタイムの蛍光曲線に導関数を導出して、前記リアルタイムの蛍光曲線に傾きが一定である蛍光曲線の初期循環回数は、必要なＣｔ値である。
【０３０２】
一実施例では、前記ステップＳ４１１に、まず、ＰＣＲ増幅された各微小液滴の蛍光曲線に導関数を導出し、前記ＰＣＲ増幅された各微小液滴の蛍光曲線の傾きを取得する。次に、前記ＰＣＲ増幅された各微小液滴の蛍光曲線の傾きにより、前記ＰＣＲ増幅された各微小液滴の蛍光曲線の傾きから、数値の変化しない数値を取得する。さらに、次に、前記傾きの変化しない数値により、それの対応する初期巡回数をＰＣＲ増幅された各微小液滴のＣｔ値として取得する。最後に、前記ＰＣＲ増幅された各微小液滴のＣｔ値により、前記ＰＣＲ増幅された微小液滴の全てのＣｔ値を取得する。
【０３０３】
一実施例では、前記ステップＳ４１１に、まず、ＰＣＲ増幅された各微小液滴の蛍光曲線により、ＰＣＲ増幅された各微小液滴の蛍光閾値の欠失値を取得する。次に、ＰＣＲ増幅された各微小液滴の蛍光閾値の欠失値により、それと対応する巡回数をＰＣＲ増幅された各微小液滴のＣｔ値ｔとして取得する。さらに、次に、前記ＰＣＲ増幅された各微小液滴のＣｔ値により、前記ＰＣＲ増幅された微小液滴の全てのＣｔ値を取得する。
【０３０４】
そのうち、Ｃｔ値において、ＣがＣｙｃｌｅを示し、ｔがｔｈｒｅｓｈｏｌｄを示し、Ｃｔ値とは、各反応管内に蛍光信号が所定の閾値になるまで経過した巡回数を意味している。リアルタイム蛍光ＰＣＲでは、Ｃｔ値とは各反応管内に蛍光信号が所定の閾値になるまで経過した巡回数を意味している。ＰＣＲ反応が行われる際に先の１５個の循環される蛍光信号を蛍光バックグラウンド信号として、また、３−１５個の循環される蛍光信号の標準偏差の１０倍を蛍光閾値の欠失配置とし、即ち、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ＝  １０×ＳＤｃｙｃｌｅ  ３−１５となる。
【０３０５】
一実施例では、ＰＣＲ反応が行われる際に前の１５個の循環される蛍光信号を蛍光バックグラウンド信号として、また、３−１５個の循環される蛍光信号の標準偏差の１０倍を蛍光閾値の欠失配置とし、即ち、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ＝  １０×ＳＤｃｙｃｌｅ  ３−１５となる。前記蛍光閾値の欠失値ｔｈｒｅｓｈｏｌｄによれば、対応する巡回数を、前記Ｃｔ値として取得する。Ｃｔ値と初期ＤＮＡ濃度との関係は、初期コピー数が多いいほど、Ｃｔ値が小さい。
【０３０６】
前記ステップＳ４１２に、各前記微小液滴の前記蛍光曲線のＣｔ値に基づいて、クラスタリングを行い、順次に大きい順でソートし、ｘ２、…、ｘｎの類別を取得する。そのうち、前記微小液滴のマトリックスに、暗い液滴と対応する類別がｘ１であり、つまり、前記微小液滴のマトリックスに核酸初期コピー数を含まない液滴と対応する類別は、ｘ１の類別である。核酸初期コピー数が多いほど、Ｃｔ値が小さいことから、この時、暗い液滴（陰性とされる液滴）と対応するＣｔ値が無限大であり、つまり、前記ｘ１類別と対応するＣｔ値も無限大である。このように類推すると、前記ｘ２類別と対応する核酸初期コピー数は１であり、前記ｘ３類別と対応する核酸初期コピー数は２であり、前記ｘ４類別と対応する核酸初期コピー数は３であり、前記ｘ５類別と対応する核酸初期コピー数は４である。
【０３０７】
一実施例では、前記ステップＳ４１５では、前記ｘ１の類別の前記微小液滴の数ｙ１が特徴値ｍ以上である時に、前記度数分布により、ポアソン分布で当てはめ、ポアソン分布のパラメータλを取得し、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を取得する。
【０３０８】
そのうち、前記特徴値ｍの範囲は、前記微小液滴のマトリックスにおける前記微小液滴の総数の０．５％−１０％に位置する。
【０３０９】
一実施例では、前記特徴値ｍは、前記微小液滴の総数の５％であってもよい。
【０３１０】
前記ｘ１の類別の前記微小液滴の数ｙ１が特徴値ｍ以上である時に、前記微小液滴のマトリックスにおける暗い液滴の数ｙ１が特徴値ｍ以上である。この時、前記微小液滴のマトリックスにおける暗い液滴の数は、全体として前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を計算するときに一定の役割を持っていることから、前記微小液滴の数ｙ１、ｙ２、…、ｙｎ度数分布をポアソン分布で当てはめ、対応するポアソン分布のパラメータλを取得する。
【０３１１】
デジタルＰＣＲには、微小液滴に含まれる初期ＤＮＡコピー数をｘとすると、数理統計理論に基づいて、ｘ＝ｋ（ｋ＝０、１、２、３．．．．．）の確率分布関数Ｐがポアソン確率モデルを満たし、そのうち、λが微小液滴に含まれる平均の分子コピー数である。
2021511074.tif 000031
【０３１２】
従って、前記ポアソン分布モデルにおける期待値μと分散σ２とにより、期待値μがλであり、分散がσ２であるλと分かる。従って、デジタルＰＣＲにおける各微小液滴に標的ＤＮＡ分子を含むコピー数がλであることから、λ値を求めると核酸を定量で検出するのを実現できると分かる。
【０３１３】
そのうち、液滴式ＰＣＲについて、一個の液滴に含まれる初期コピー数は、Ｐｏｉｓｓｏｎ分布を満たしている。
2021511074.tif 000032
そのうち、λは、前記微小液滴に平均して含まれる初期ＤＮＡコピー数である。各液滴に含まれる平均初期コピー数は、ＣＰＤ（ｃｏｐｉｅｓ  ｐｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔ）により示される。
【０３１４】
この時に、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数は、λを前記微小液滴のマトリックスの前記微小液滴の数に掛けたものである。
【０３１５】
前記検出すべき核酸増幅反応液について、その総体積をＶ（各微小液滴の体積がｖ）とすると、前記検出すべき核酸増幅反応液の濃度ｃ（ｃｏｐｙ／μＬ）は、
2021511074.tif 000033
従って、λの値を求めたと、ＤＮＡの定量検出も実現される。
【０３１６】
一実施例では、前記ステップＳ４１５に、前記ｘ１の類別の前記微小液滴の数ｙ１が特徴値ｍよりも小さい時に、
前記ｘ２、…、ｘｎ個の類別毎に対応する前記微小液滴の数ｙ２、…、ｙｎの一部の度数分布に基づいて、順次に前記ｘ２の類別と対応する前記核酸初期コピー数として、ポアソン分布で当てはめ、各ポアソン分布の対応するパラメータλｊ（ｊ＝０、１、２…．）を取得するステップＳ４１５１と、
度数値の残差平方和ｅｒｒが最小になり、λｏｐｔｉｍａｌを最適に取得するように、一つの空間[λmin, λmax]にλｊを照会する、ステップＳ４１５２と、
前記最適λｏｐｔｉｍａｌに基づいて、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数を計算するステップＳ４１５３と、を含む。
【０３１７】
前記ｘ１類別の前記微小液滴の数ｙ１が特徴値ｍよりも小さい時に、前記微小液滴のマトリックスにおける暗い液滴の数は、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数の全体を計算するのに役立たず、無視しても構わない。
【０３１８】
Ｂｉｏｒａｄシステムは、２０，０００個の液滴システムである場合に、一般的に、試料のＤＮＡの濃度を６ＣＰＤ以下にするということが推薦される。
【０３１９】
実際の試験工程では、ｋ＞４という時に、Ｃｔ値の区分が小さくなり、Ｃｔ値により一つの液滴の初期コピー数が４であるか５であるかについて区分しにくいことから、前記ｘ２、…、ｘｎの類別により不完全なサンプリングを行い、Ｐｏｉｓｓｏｎの分布に当てはめを行う。
【０３２０】
一実施例では、一つの空間[λmin, λmax]を設置し、計算誤差の平方和ｅｒｒが最小になるように、[λmin, λmax]空間に照会して最適なλｏｐｔｉｍａｌを選択して、残差平方和が最小になる。
【０３２１】
一実施例では、ポアソン分布のパラメータλを取得する時に、最尤推定法を使用してパラメータλを推量する。
【０３２２】
一実施例では、パラメータλを推量する方法は、モーメント法、順序統計量法又は最尤推定法であってもよい。
【０３２３】
この方法を用いると、陰性とされる暗い液滴の数を確保する必要がなく、単独に一つの度数を用いて推量するほうよりも、精度や安定性が遥かに高い。
【０３２４】
前記ステップＳ４１５３に、前記微小液滴のマトリックスの核酸初期コピー数は、前記最適λｏｐｔｉｍａｌを前記微小液滴のマトリックスの前記微小液滴の数に掛けたものである。
【０３２５】
一実施例では、不完全な試料により、最小二乗法を用いてポアソン分布のパラメータλを点推定する。
【０３２６】
実際の工程では、前記デジタルＰＣＲ定量検出方法は、標準曲線によらず、高い精度で前記複数の微小液滴に初期ＤＮＡの濃度を検出することができる。
【０３２７】
また、前記デジタルＰＣＲ定量検出方法により、前記複数の微小液滴に偽陽性が存在する課題を解決することができる。また、前記複数の微小液滴に、蛍光曲線を処理することは、仮に均一性により行われる統計修正によらず、真の絶対定量を取得することができる。
【０３２８】
標準曲線に対する依頼を排除できるに加えて、標準曲線による定量結果が確定でないという問題を解除し、液滴式デジタルＰＣＲのエンドポイント検出方式による制限を解消して、一つのP(x=0)のデータのみにより、検出すべき試料全体をパラメータ推量する制約性を破ることができる。前記リアルタイム蛍光定量ＰＣＲ検出方法を用いると、デジタルＰＣＲの定量検出に正確性が向上する。
【０３２９】
前記デジタルＰＣＲ定量検出方法を用いると、陰性とされる空液滴の数を確保する必要が無くなる。また、多次元の度数分布データを用いると、全体に対して最適パラメータを推量することは、単独に、一つのP(x=0)のデータを用いて推量するほうよりも、その精度と安定性が遥かに高い。
【０３３０】
各蛍光曲線は、一つの有用な情報の曲線の変化過程を示し、リアルタイムでモニターするように、液滴の試料に参加した情報であり、所定のアルゴリズムで、隣接する液滴間における互いの影響を取り除くことができる。
【０３３１】
前記デジタルＰＣＲ定量検出方法は、抽象化の数学モデルにより、再現性と高感度が実現でき、しかも、動的範囲が大きくなり、少量の液滴でモニターが実現できる。小量のデータにより数多くの情報をカバーすることができる。また、前記デジタルＰＣＲ定量検出方法は、前記ポアソン分布の確率モデルの誤差を回避して絶対定量を実現し、より直観的になる。すべてのデータを総合して、ランダム性の誤差を取り除く。液滴の試料の蛍光曲線を取得し、液滴試料の蛍光輝度の変化をリアルタイムでモニターし、偽陽性を除去し、隣接する液滴間に互いの影響を取り除き、その後、定量解析モデルにより正確なデータ源を提供する。
【０３３２】
図２３を参照すると、前記一部の核酸初期コピー数がそれぞれ０、１、２、３である場合に取得されたポアソン分布に基づいて当てはめる。そのうち、横座標が各液滴に含まれる平均初期コピー数（ｃｏｐｉｅｓ  ｐｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔ、ＣＰＤ）である。縦座標は、各液滴に含まれる平均初期コピー数の標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ、Ｓｔｄ  Ｄｅｖ  、ＳＴＤ）である。各液滴に含まれる平均初期コピー数は、ＣＰＤ（ｃｏｐｉｅｓ  ｐｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔ）により表示される。そして、前記一部の核酸初期コピー数により取得された各液滴に含まれる平均初期コピー数用のＣＰＤの標準偏差は、他のアルゴリズムで取得された平均初期コピー数用のＣＰＤの標準偏差よりも小さいと分かる。従って、前記デジタルＰＣＲ検出方法により取得された各前記微小液滴に含まれる平均初期コピー数用のＣＰＤの値は、より正確になる。２００００個の液滴を１０００回だけシミュレーションした結果が示される。単点による推量方法だけを用いると、限られる濃度範囲だけをカバーし、推量精度も、試料の濃度が上がるのに伴い、急速に悪くなる。しかしながら、不完全なポアソン分布により当てはめアルゴリズムを用いると、試料濃度の増加に伴い、推量精度が明らかに変化せず、検出すべき核酸増幅反応液の濃度を二倍拡大することも可能である。液滴数が比較的小さい場合には、不完全なポアソン分布で当てはめアルゴリズム（一部サンプリングポアソン分布の当てはめのアルゴリズム）が依然として、よい確実性を持っている。
【０３３３】
前記デジタルＰＣＲ定量検出方法により、その結果が偽陽性や偽陰性であるという問題が解決される。シークエンシングプラットフォームの試料は、ハイスループット性を持っているため、数百個の試料を同時に検出することができる。また、異なる種類の蛍光により、複数のローカスを検出することができ、そして、検出に速度が速く、試験するためのコストが低下する。デジタルＰＣＲ検出器を用いて微滴化処理を行うと、希有な検出断片を多量の複雑な背景から分離させ、大幅に操作手間を簡単にして、効果的に用意時間や検出時間を省き、しかも、結果の読み取りにも直観的で確実であり、安定で実施できるという利点を持ち、検出に感度や正確性が共に正確で、定量要求を満たしており、検出に感度や正確性が向上する。
【０３３４】
一実施例では、前記ステップＳ４２０には、前記微小液滴のマトリックスの溶解曲線に基づいて、各前記微小液滴の前記溶解曲線と対応する溶解温度を取得するステップＳ４２１と、前記溶解温度に基づいて、前記微小液滴のマトリックスを分類し、前記微小液滴のマトリックスの核酸情報を取得し、前記検出すべき核酸の核酸情報を取得するステップＳ４２２と、を含む。
【０３３５】
異なる配列についてＤＮＡ、Ｔｍ値が異なる。言い換えれば、一つのＤＮＡの溶解曲線を、一つのＤＮＡの指紋とも言え、一つの特定のＤＮＡと対応している。溶解曲線図に基づいて、そのピークが位置する温度は、二本鎖ＤＮＡ分子のＴｍ値（溶解温度Melting Temperature）を示す。増幅産物のＴｍ値に基づいて、その遺伝子型を判断することができる。同様な溶解曲線を分類し分けて、異なる形状溶解曲線をジェノタイピングし、又は分類し、標的遺伝子の溶解曲線と比較すると、非特異性に偽陽性を排除し、標的遺伝子と異なる配列を排除することができる。
【０３３６】
一実施例では、溶解曲線により、前記微小液滴のマトリックスを分類する時に、決定木、ベイジアン、人工ニューラルネットワーク、Ｋ−近傍法、サポートベクトルマシンおよび相関規則に基づく分類、Ｂａｇｇｉｎｇ及びＢｏｏｓｔｉｎｇなどのアルゴリズムを用いてもよい。
【０３３７】
一実施例では、前記デジタルＰＣＲ検出方法は、前記微小液滴のマトリックスの高分解能溶解曲線を取得し、前記微小液滴のマトリックスを分類し、前記微小液滴のマトリックスに、ジェノタイピングや突然変異の検出などの核酸情報を取得するステップＳ５０をさらに含む。
【０３３８】
前記溶解曲線により、前記微小液滴のマトリックスの核酸増幅の特異性、及び、核酸増幅層の工程にプライマーダイマーという現象の有無などを取得することができる。
【０３３９】
前記微小液滴のマトリックスにより、ｄｓＤＮＡ溶解の工程に、蛍光信号値の変化をリアルタイムで検出することにより、前記微小液滴のマトリックスの高分解能の溶解曲線を取得する。高分解能の溶解曲線とは、モノヌクレオチドの溶解温度が異なることにより、異なる形態の溶解曲線を形成する遺伝子解析の新技術であり、極めて高い感度を有し、一個の塩基の相違を検出でき、コストが低く、スループットが高く、速度が速く、結果が正確であり、検出ローカスによる制限がなく、真の「閉管（検出管が閉じられる状態）」の操作を実現できる。突然変異走査、一塩基多型解析、メチル化研究、ジェノタイピング、配列をマッチングするなどの場合には、ＨＲＭ解析技術が、重要な役割を奏している。二本鎖ヌクレオチドは、その熱安定性が長さと塩基組成に影響されており、配列の変化が昇温の工程にｄｓＤＮＡの解鎖の行為に変化をもたらす。用いられる蛍光染料は、ｄｓＤＮＡのみに嵌入して結合されるため、リアルタイムのＰＣＲ技術を用いて、ｄｓＤＮＡ溶解工程に、蛍光信号値の変化をリアルタイムで検出すると、異なる形状の溶解曲線を生成する形態でＰＣＲ産物に存在している相違を直観的に表すことができる。また、専門的な解析ソフトウェアを介して、テスト群に、異なる形状溶解曲線によるジェノタイピング又は分類を実現することができる。
【０３４０】
一実施例では、前記ステップＳ２０に、前記微小液滴のマトリックスを形成する時に、瞬間加速度運動による微小液滴生成方法、又は、周期的に変化する速度による微小液滴生成方法が用いられてもよい。
【０３４１】
一実施例では、前記ステップＳ１０に、前記検出すべき核酸増幅反応液に、飽和染料を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応の産物を解析する。
【０３４２】
一実施例では、複数の前記微小液滴を定性で分類し解析する時に、高分解能溶解曲線解析（ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ、ＨＲＭ）を用いてもよく、配列特異性プローブを用いる必要がなく、飽和染料により  ＰＣＲ反応産物を解析してもよい。二本鎖ヌクレオチドは、その熱安定性が長さと塩基組成に影響されており、配列の変化が昇温の工程にｄｓＤＮＡ  の解鎖の行為に変化をもたらす。用いられる蛍光染料は、ｄｓＤＮＡのみに嵌入して結合されるため、リアルタイムＰＣＲ  技術を用いて、ｄｓＤＮＡ  溶解工程に、蛍光信号値の変化をリアルタイムで検出すると、異なる形状の溶解曲線を生成する形態でＰＣＲ産物に存在している相違を直観的に表すことができる。また、専門的な解析ソフトウェアを介して、テスト群に、異なる形状溶解曲線によるジェノタイピング又は分類を実現することができる。
【０３４３】
一実施例では、プライマーの設計に三つの基本原則がある。まず、プライマーと鋳型の配列とが緊密に相補すること。次に、プライマーとプライマーとの間に、安定なダイマーやバレッタ構造の形成を避けること。また、プライマーは、鋳型の非標的ローカスでＤＮＡ重合反応（即ち、誤って重合反応する）が発生してならないこと。具体的に、この三つの基本原則を実現するには、多くの要素、例えば、プライマーの長さ、産物の長さ、配列Ｔｍの値、プライマーと鋳型とにより形成された二本鎖の内部の安定性、プライマーダイマー及びバレッタ構造を形成するエネルギーの値、誤って重合反応されたローカスでの発生効率、プライマー及び産物のＧＣ含量などを考慮する必要がある。また、特殊な検出について、プライマーを修飾してもよく、例えば、制限エンドヌクレアーゼのローカスを増やして、突然変異を誘導するなどしてもよい。
【０３４４】
プライマーが対応する鋳型位置配列のＴｍ値は、７２℃程度で、アニーリングの条件が最適になる。Ｔｍ値の計算には、例えば、Ｔｍ＝４（Ｇ＋Ｃ）＋２（Ａ＋Ｔ）という式により、Ｏｌｉｇｏというソフトウェアに使用されるのは、ｋ近傍法という多種類方法が存在する。
【０３４５】
図２４を参照すると、一実施例では、前記デジタルＰＣＲ検出方法により取得された前記微小液滴のマトリックスの溶解曲線図であり、蛍光信号の負の一次導関数が温度の変化と伴い変化する図を作成し、そのピークが所在する温度は、二本鎖ＤＮＡ分子のＴｍ値（溶解点温度）を示す。増幅産物のＴｍ値だけによれば、その遺伝子型を判断できる。故に、二つの溶解温度Ｔｍ１及びＴｍ２が存在すると分かる。溶解温度Ｔｍ１と溶解温度Ｔｍ２は、それぞれ、二つの異なる類別のＤＮＡと対応していることから、前記微小液滴のマトリックスにおける標的ＤＮＡを区分できる。
【０３４６】
従来のＰＣＲ検出技術において、複数回だけ繰り返して検出することにより、作業量が膨大となり、時間が掛かるという課題について、ハイスループット、感度が高く、検出時間が短いということを実現可能なハイスループット核酸検出解析に用いられる核酸検出微小球、製造方法、試薬キット、及び、ハイスループット核酸検出方法を提供する。
【０３４７】
図２５−２７を参照すると、本出願が提供する核酸検出微小球７００は、ハイスループットで核酸を検出して解析するのに用いられる。前記核酸検出微小球７００は、核小体７３０及び被覆層７１０を含む。前記核小体７３０は、蛍光コード情報を有する。前記被覆層７１０は、前記核小体７３０を被覆し、前記被覆層７１０は、基体７１１及び前記基体７１１に分散されるプライマー７１２を含み、しかも、前記プライマー７１２が前記核小体７３０と一意に対応する。
【０３４８】
そのうち、前記被覆層７１０は、前記核小体７３０を被覆し、前記前記核酸検出微小球７００を形成する。前記基体７１１は、疎水性油に形成される含水高分子ゲルであり、流動性がなく、形状と体積が変更し難しい。含水高分子ゲルは、室温にゲルの状態となり、室温よりも高い温度下に溶解し、酵素、反応液などの拡散及び活性に影響することがない。同時に、前記基体７１１に分散された前記プライマー７１２により、標的検出核酸に定性解析して識別する。前記核小体７３０は耐熱材料であり、蛍光コード情報を有する。前記蛍光コード情報は、前記核小体７３０の蛍光コード信号により示されることから、蛍光コード信号により特殊なマーク機能を実現する。しかも、各前記核小体７３０は、前記プライマー７１２と一意に対応することから、前記核小体７３０により、前記核酸検出微小球７００をマークし、追跡して検出を行う。
【０３４９】
ＰＣＲ検出を行う時に、複数且つ多種類の前記核酸検出微小球７００と検出すべき核酸増幅反応液とを混合させると、核酸検出液を取得する。前記核酸検出液を微滴化して複数の微小液滴を形成し、複数の微小液滴にＰＣＲ反応を行う。ＰＣＲ反応工程では、二本鎖ＤＮＡが９０℃〜９５℃で変性し、再度、迅速に５０℃〜６０℃まで冷却し、プライマーがアニーリングして標的配列と結合し、そして、急速に７０℃〜７５℃まで昇温し、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる作用で、プライマーの鎖を鋳型に沿って伸ばして、適宜な温度範囲に核酸を増幅する。複数の微小液滴にＰＣＲ温度を制御する工程では、前記被覆層７１０が溶解して分解し、前記被覆層７１０に含まれている前記プライマー７１２を対応する微小液滴に解放し、微小液滴に含まれる標的核酸分子と反応して、最終的に、前記核小体７３０を位置決め、追跡して識別し、前記核小体７３０と対応する前記プライマー７１２により、標的核酸分子が分かり、ＰＣＲハイスループット検出を実現する。
【０３５０】
実際の応用工程では、バッチ処理で複数の多種類前記核酸検出微小球７００を製造してもよい。多種類の前記核酸検出微小球７００を、標的核酸を検出する実際のニーズに応じて一定の比に従って、検出すべき核酸増幅反応液に混合させ、核酸検出液を取得することにより、標的核酸を検出し、一回だけ多種類の標的核酸の分子を検出することができ、繰り返して複数検出を行う必要が無くなり、作業量が小さく、検出時間が短く、感度が高い。
【０３５１】
図２８−２９を参照すると、そのうち、一実施例では、前記被覆層７１０は、プローブ７１３をさらに含み、前記プローブ７１３及び前記プライマー７１２は、前記基体７１１に分散され、前記核小体７３０と一意に対応する。
【０３５２】
そのうち、前記プローブ７１３は、核酸の増幅を示す蛍光プローブであってもよく、例えば、ＴａｑＭａｎ蛍光プローブなどの蛍光基とクエンチ基を同時に含むオリゴ糖ヌクレオチドプローブであってもよい。前記プローブ７１３は、前記基体７１１に分散されており、標的検出核酸の分子を定性解析して識別するために用いられる。複数の微小液滴をＰＣＲ温度で制御する工程には、前記被覆層７１０は、溶解して分解し、前記被覆層７１０に含まれている前記プライマー７１２と前記プローブ７１３を、対応する微小液滴へ解放して微小液滴に含まれている標的検出核酸分子と反応し、最終的に、前記核小体７３０を位置決め、追跡して識別することが実現される。また、前記核小体７３０と対応する前記プライマー７１２及び前記プローブ７１３により、標的核酸分子を見出して、ハイスループットでＰＣＲの検出を実現する。
【０３５３】
一実施例では、前記プライマー７１２は、異なる種類のプライマーとして配置されてもよい。バッチ処理で検出する時に、多種類の前記プライマー７１２を、異なる種類のプライマーとして配置してもよい。そして、異なる種類の標的核酸分子を検出することができる。また、ある種類の前記プライマー７１２は、ある種類の前記核小体７３０と対応し、言い換えれば、各前記プライマー７１２が、前記核小体７３０という、対応する代表的な番号を有しているため、前記核小体７３０の検出により識別されえる。
【０３５４】
一実施例では、１００個の前記核酸検出微小球７００を挙げると、１００個の前記核酸検出微小球７００が１００種類の異なる前記プライマー７１２に対応し、つまり、１００個の前記核酸検出微小球７００が１００種類の異なる前記核小体７３０に対応する。即ち、１００種類の異なる前記プライマー７１２は、１００種類の異なる前記核小体７３０に対応する。１００個の前記核酸検出微小球７００を含んでいる複数の微小液滴についてＰＣＲの昇温を行う工程では、各前記核酸検出微小球７００における前記被覆層７１０は、溶解し分解して、前記被覆層７１０に含まれている前記プライマー７１２を、対応する微小液滴に解放し、ＰＣＲ増幅を行う。この時、一部の前記微小液滴に含まれている一つの前記核小体７３０について、前記核小体７３０により前記微小液滴に含まれている前記プライマー７１２を見出すことにより、前記プライマー７１２により前記微小液滴中の標的核酸分子を見出して、ＰＣＲ検出を実現する。
【０３５５】
そのうち、一実施例では、前記基体がアガロースゲルとされる。アガロースゲルは、アガロースを支持媒体として製造されたゲルであり、アガロースの溶解点が６２℃〜６５℃にあり、溶解されたと３７℃で液体状態が数時間維持され、３０℃でゲルに凝固される。複数の微小液滴にＰＣＲの温度を制御する工程では、前記被覆層７１０は、溶解し分解して、前記被覆層７１０に含まれている前記プライマー７１２と前記プローブ７１３を、対応する微小液滴に解放し、前記プライマー７１２と微小液滴に含まれている標的核酸分子とをＰＣＲ反応させ、蛍光染料又は前記プローブ７１３により核酸が増幅されたかどうかについて示す。
【０３５６】
そのうち、一実施例では、前記核小体７３０は、蛍光染料を含んでいるソリッド球体（ｓｏｌｉｄ  ｓｐｈｅｒｅ）である。
【０３５７】
そのうち、前記核小体７３０は、その材料が耐熱材料であって、例えば、ポリイミド、ポリテトラフルオロエチレン、ポリフェニレンサルファイド又はポリアミドなどであってもよい。まは、前記核小体７３０に蛍光染料を有することにより、蛍光信号を放射することができる。異なる種類の蛍光染料及び蛍光の強度の大きさによって、前記核小体７３０をコードして、多量の異なる種類の前記核小体７３０を取得し、前記核小体７３０が蛍光コード信号を有するようにして、複数の前記核酸検出微小球７００へのコードを実現する。
【０３５８】
一実施例では、本出願に、二つの異なる種類の蛍光染料を用いて、各蛍光染料に１０個の異なるレベルの蛍光信号の強度を用いると、１０×１０＝１００個の異なるマークの前記核小体７３０を取得し、前記核小体７３０に蛍光コード情報を有すると、１０×１０＝１００個の異なるマークの前記核酸検出微小球７００を取得する。そのうち、各前記核酸検出微小球７００は、それぞれ、一つの前記核小体７３０に対応し、各前記核小体７３０は、それぞれ、前記プライマー７１２に対応し、各前記核小体７３０は、それぞれ、前記プローブ７１３に対応する。複数の前記核酸検出微小球７００により、一回だけ、複数の異なる種類の標的核酸分子をＰＣＲ検出することができ、繰り返して複数検出を行う必要がなく、作業量が小さく、検出時間が短く、ハイスループット及び感度が高いという利点を持っている。
【０３５９】
そのうち、一実施例では、前記核小体７３０は、その直径が１０ミクロン〜１００ミクロンである。前記被覆層は、その厚さが１０ミクロン〜１００ミクロンである。
【０３６０】
前記核酸検出微小球７００は、その直径の大きさが一般的に、２０ミクロン〜１５０ミクロンであってもよい。そうすると、画像を採集する時に十分な微小液滴を採集することができる。そのうち、前記核小体７３０は、その直径が１０ミクロン〜１００ミクロンであてもよい。前記被覆層は、その厚さが１０ミクロン〜１００ミクロンであってもよい。前記核酸検出微小球７００は、大き過ぎ、又は、小さ過ぎると良くない。小さ過ぎると識別され難く、大き過ぎると、複数の微小液滴を生成する時に、微小液滴生成装置の出口端を塞いで、複数の微小液滴の生成を妨げてしまうことが多い。前記核酸検出微小球７００の直径の大きさを配置することにより、再度複数の微小液滴を生成する時に蛍光信号検出装置３０により識別されえるのに加えて、画像を便宜に採集するように、数多くの微小液滴を可及的にカバーすることができ、また、微小液滴生成装置の出口端で複数の微小液滴を生成することを妨げることがない。
【０３６１】
そのうち、一実施例では、核酸検出微小球の製造方法には、
複数の核小体７３０及びプライマー溶液を提供するステップＳ１１０と、
ゲル粉末を提供し、前記ゲル粉末を再蒸留水に添加し、ゲル粉溶液を取得し、前記ゲル粉溶液を、澄むまで、加熱し、被覆層の製造液を取得するステップＳ１２０と、
ゲル溶解温度で、前記複数の核小体７３０、前記プライマー溶液及び前記被覆層の製造液を混合し、核酸検出微小球の製造溶液を取得するステップＳ１３０と、
前記ゲル溶解温度で、前記核酸検出微小球の製造溶液を微滴化し、複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップＳ１４０と、
前記複数の核酸検出微小球の液滴を冷却し、フローサイトメトリーにより、複数の核酸検出微小球７００を取得するステップＳ１５０と、を含む。
【０３６２】
前記ステップＳ１１０において、複数の前記核小体７３０が同一種類の蛍光染料を含んでいるソリッド球体である。そして、前記核酸検出微小球７００を製造し、ただし、前記核酸検出微小球７００が前記核小体７３０と一意に対応し、前記プライマー７１２も前記核小体７３０と一意に対応する。
【０３６３】
また、前記プライマー溶液は、前記プライマー７１２を含む。殺菌済みの超純水により、干し粉末プライマー７１２を希釈する時に、プライマー濃度が１００μＭとなるまで、言い換えれば、１００μｍｏｌ／Ｌまで希釈する。そして、濃度が１００μＭのプライマー溶液１００ｕｌを前記被覆層の製造液９００ｕｌに置いて、プライマー濃度を１０μＭ（μｍｏｌ／Ｌ）とするように配置する。
【０３６４】
前記ステップＳ１２０では、前記ゲル粉末は、カンテン末又はジエチレングリコールジアクリレートなどのゲルを製作できる物質であってもよい。そのうち、前記被覆層の製造液は、カンテン末溶液であってもよく、質量比が１．５％〜４．５％のカンテン末と１０ｍｌの再蒸留水を提供し、前記カンテン末を前記再蒸留水に添加して高温で澄むまで溶解し、前記被覆層の製造液を取得する。そのうち、前記被覆層の製造液は、カンテン末溶液である。
【０３６５】
前記ステップＳ１３０では、前記プライマー溶液に含まれる複数の前記プライマー７１２は、同一の種類型のプライマーであり、複数の前記核小体７３０が同一の種類の蛍光系の核小体である。前記ゲルの溶解温度は、ゲルを液体溶液に転換する温度である。そのうち、前記アガロースの溶解点は、６２℃〜６５℃であり、３０℃時で凝固してゲルとなる。そして、高温環境の６２℃〜６５℃で、複数の前記プライマー７１２と複数の前記核小体７３０とを前記被覆層の製造液（前記被覆層の製造液は、カンテン末溶液とされる）に添加して、前記核酸検出微小球の製造溶液を取得する。
【０３６６】
一実施例では、前記ステップＳ１３０に、前記プライマー７１２と前記核小体７３０とを前記アガロース溶液に添加する時、一般的に、前記核酸検出微小球７００を生成する大きさにより、前記核小体７３０の濃度を選定する。
【０３６７】
図３０−３１を参照すると、前記ステップＳ１４０には、高温環境で、マイクロ流体制御チップ、マイクロ流体発生器、又は、微小液滴生成装置により、疎水性油に複数の前記核酸検出微小球の液滴を形成する。
【０３６８】
図３０を参照すると、そのうち、一実施例では、前記ステップＳ１４０には、
出口端を有し前記核酸検出微小球の製造溶液を貯留している液体吐出ピペットチップを提供し、疎水性油を貯留している開口容器を提供するステップＳ１４１と、
前記ゲル溶解温度で、前記液体吐出ピペットチップの出口端を前記疎水性油の液面下に挿入するステップＳ１４２と、
前記液体吐出ピペットチップの出口端が前記疎水性油の液面下に瞬間加速度運動を行い、又は、周期的に変化する速度で運動を行い、前記核酸検出微小球の製造溶液を前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出し、前記疎水性油の液面下に前記複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップＳ１４３と、を含む。
【０３６９】
本出願は、液体吐出ピペットチップ、流体駆動機構及び運動制御機構を含む微小液滴生成装置を提供する。前記液体吐出ピペットチップは、出口端及び入口端を有し、前記流体駆動機構は、前記液体吐出ピペットチップを駆動して、入口端を介して、核酸検出微小球の製造溶液を前記液体吐出ピペットチップに吸入し、前記液体吐出ピペットチップの出口端を、油性液体を貯留している容器に、挿入し、前記液体吐出ピペットチップの出口端が油性液体の液面下に挿入するようにする。また、前記運動制御機構が前記油性液体の液面下に瞬間加速度運動を行い又は周期的に変化する速度で運動を行うことにより、前記核酸検出微小球の製造溶液を前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出し、前記油性液体の液面下に前記複数の核酸検出微小球の液滴を形成する。そのうち、前記油性液体と前記核酸検出微小球の製造溶液とは、互いに非相溶を持ち、又は、界面反応を有する二つの液体であり、前記油性液体は、鉱油（テトラデカンなどを含み）、植物油、シリコーンオイル又はパーフルオロアルカンオイルなどであってもよい。
【０３７０】
前記ステップＳ１５０では、複数の前記核酸検出微小球の液滴を常温の３０℃程度まで冷却すると、複数の前記核酸検出微小球が凝固してゲルとなり、フローサイトメトリーにより複数の前記核酸検出微小球７００を選択する。前記フローサイトメトリーは、高いエネルギーのレーザを、高速で流動する状態における複数の前記核酸検出微小球の液滴を照射する。複数の前記核酸検出微小球の液滴に０個、一つの又は複数の前記核小体７３０を含み、前記核小体７３０が蛍光染料を含むソリッド球体であることから、生じた散乱光と放射蛍光の強度を検出し、スクリーニングを行い、一個の前記核小体７３０しかを含まない核酸検出微小球７００を取得する。
【０３７１】
この時、冷却された複数の前記核酸検出微小球７００は、ゲルの状態となり、常温環境に、貯留と搬送がされ易く、バッチ処理で搬送されてＰＣＲ検出に用いられる。
【０３７２】
そのうち、一実施例では、核酸検出微小球の製造方法は、
プライマー溶液、プローブ溶液、及び、複数の核小体７３０を提供するステップＳ２１０と、
ゲル粉末を提供し、前記ゲル粉末を再蒸留水に添加し、ゲル粉溶液を取得し、前記ゲル粉溶液を、澄むまで、加熱し、被覆層の製造液を取得するステップＳ２２０と、
ゲル溶解温度で、将前記複数の核小体７３０と、前記プライマー溶液と、前記プローブ溶液とを、前記被覆層の製造液に混合し、核酸検出微小球の製造溶液を取得するステップＳ２３０と、
前記ゲル溶解温度で、前記核酸検出微小球を製造する溶液を微滴化し、複数の核酸検出微小球の液滴を形成するステップＳ２４０と、
前記複数の核酸検出微小球の液滴を冷却し、フローサイトメトリーにより、複数の核酸検出微小球ステップを選択するＳ２５０と、を含む。
【０３７３】
前記ステップＳ２１０に、前記プローブ溶液は、核酸が増幅されたかどうかを検出するための前記プローブ７１３を含み、ＴａｑＭａｎ蛍光プローブなどの蛍光基及びクエンチ基を同時に含むオリゴ糖ヌクレオチドプローブであってもよい。複数の微小液滴によりＰＣＲの温度を制御する工程では、前記被覆層７１０が溶解して分解し、前記被覆層７１０に含まれている前記プライマー７１２及び前記プローブ７１３が対応する微小液滴に解放され、微小液滴に含まれている標的検出核酸分子と反応し、最終的に、前記核小体７３０を位置決め、追跡して識別し、前記核小体７３０と対応する前記プライマー７１２及び前記プローブ７１３により、標的核酸分子が分かり、ＰＣＲハイスループットの検出を実現することができる。
【０３７４】
そのうち、複数の前記核小体７３０は、同じ種類の蛍光染料を含んでいるソリッド球体でありる。そして、前記核酸検出微小球７００を製造し、ただし、前記核酸検出微小球７００が前記核小体７３０と一意に対応し、前記プライマー７１２が前記核小体７３０と一意に対応し、前記プローブ７１３が前記プライマー７１２と一意に対応する。
【０３７５】
前記ステップＳ２２０では、前記被覆層の製造液の製造方法は、前記ステップ１２０の製造方法と同じであってもよい。
【０３７６】
前記ステップＳ２４０では、複数の前記核酸検出微小球の液滴を形成する製造方法は、前記ステップＳ１４０方法と同じであってもよい。
【０３７７】
前記ステップＳ２５０では、複数の前記複数の核酸検出微小球７００を取得する方法は、前記ステップ１５０方法と同じであってもよい。
【０３７８】
そのうち一実施例では、前記ステップＳ２５０に、前記核酸検出微小球は、一個の前記核小体を含む核酸検出微小球であってもよい。
【０３７９】
そのうち一実施例では、前記ステップＳ２２０に、前記ゲル粉末は、カンテン末又はポリエチレングリコールジアクリレートなどであってもよい。
【０３８０】
そのうち一実施例では、試薬キットは、ハイスループットで核酸検出解析に用いられる。前記試薬キットは、上記実施例のいずれもに記載の核酸検出微小球と核酸反応液とを含む。
【０３８１】
そのうち、前記核酸反応液は、ＰＣＲ増幅に必要な酵素、ｄＮＴＰ、蛍光染料及びイオンなどを含む。例えば、前記核酸検出微小球７００に前記プローブ７１３を含むと、前記核酸反応液に蛍光染料を含まなくてもよい。
【０３８２】
前記試薬キットは、多種類の異なる前記核酸検出微小球７００を貯蔵・搬送するために用いられる。そのうち、前記核酸検出微小球７００は、グリセリンに保存されてもよい。
【０３８３】
一実施例では、デジタルＰＣＲにのみ用いられ、セットとなる試薬及び溶液を用意して、鋳型ＤＮＡの試料に対する外来ＤＮＡの潜在的な汚染を減少し又は回避する。使用される機器及び消耗品の全ては、高温で殺菌され、高温で乾燥処理されるべきである。
【０３８４】
図３２を参照すると、そのうち、一実施例では、ハイスループット核酸検出方法は、
核酸増幅反応液と多種類の異なる種類の核酸検出微小球７００を提供し、前記核酸検出微小球７００は、核小体７３０及び被覆層７１０を含み、前記核小体７３０は、コード情報を有し、前記被覆層７１０は、前記核小体７３０を被覆し、前記被覆層７１０は、基体７１１及び前記基体７１１に分散されるプライマー７１２を含み、前記プライマー７１２が前記核小体７３０と一意に対応し、前記核小体７３０は、蛍光染料を含んでいるソリッド球体であるステップＳ３１０と、
前記多種類の異なる種類の核酸検出微小球７００と前記核酸増幅反応液とを混合し、核酸検出液を取得するステップＳ３２０と、
前記核酸検出液を微滴化し、複数の微小液滴８００を形成するステップＳ３３０と、
前記複数の微小液滴８００に核酸を増幅し、増幅された前記複数の微小液滴８００を取得するステップＳ３４０と、
増幅された前記複数の微小液滴８００に基づいて、各前記微小液滴８００における前記核小体７３０を検出し、一つの前記核小体７３０しかを含まない前記微小液滴８００をスクリーニングし、第一の効果的な微小液滴８１０を取得するステップＳ３５０と、
前記第一の効果的な微小液滴８１０に基づいて、前記第一の効果的な微小液滴８１０における前記核小体７３０の蛍光信号を検出し、前記核小体７３０と対応する前記プライマー７１２を取得し、核酸増幅反応された報告蛍光信号を読み取り、前記第一の効果的な微小液滴８１０に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップＳ３６０と、を含む。
【０３８５】
前記ステップＳ３１０では、前記核酸増幅反応液は、デオキシリボ核酸を鋳型とする核酸増幅反応液、リボ核酸を鋳型とする逆転写核酸増幅反応液、又は、ループ介在等温増幅反応液である。また、前記核酸増幅反応液に蛍光染料を含む。前記核酸増幅反応液は、核酸の鋳型、反応緩衝液、デオキシグアノシン三リン酸、ポリメラーゼ及び二価金属陽イオンなどを含み、前記被覆層７１０に前記プローブ７１３がないと、前記反応緩衝液に蛍光染料を含む。
【０３８６】
そのうち、前記核酸増幅反応液は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）を鋳型とする核酸増幅反応液（ＤＮＡ増幅反応液とも呼ばれる）であってもよく、リボ核酸（ＲＮＡ）を鋳型とする逆転写核酸増幅反応液（ＲＮＡ逆転写反応液とも呼ばれる）であってもよく、例えば、ループ介在等温増幅（ＬＡＭＰ）反応液である他の核酸増幅反応液であってもよい。そのうち、前記ＤＮＡ増幅反応液の特徴としては、ＤＮＡを増幅させるに必要なｄＮＴＰ、緩衝液、無機塩イオン、ポリメラーゼ、  プライマー、検出すべきＤＮＡ鋳型及び蛍光染料又は蛍光プローブなどを含んでいるということである。
【０３８７】
ＰＣＲ反応システムでは、遊離の状態に、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光染料を添加すると弱い蛍光が発生するが、一旦二本鎖ＤＮＡと結合すると、蛍光が大きく強化し、蛍光信号を生じて、蛍光信号の増加とＰＣＲ産物の増加を完全に同期することを確保することができる。この時、ＳＹＢＲ  Ｇｒｅｅｎ蛍光染料により発生した蛍光信号を検出することにより、核酸増幅反応された報告蛍光信号を取得し、前記第一の有効な微小液滴８１０に、対応する標的核酸分子を含んでいるかどうかが分かる。
【０３８８】
そのうち、前記多種類の異なる種類の前記核酸検出微小球７００における前記核酸検出微小球７００の大きさ、形状、及び、含まれている前記プライマー７１２は、同じでもよく異なってもよい。複数の前記核酸検出微小球７００には、異なる種類の前記標的核酸分子を検出するための異なる種類の前記プライマー７１２を含んでもよい。
【０３８９】
前記ステップＳ３２０では、前記多種類の異なる種類の核酸検出微小球７００と前記核酸増幅反応液混合とを混合して前記核酸検出液を形成する場合に、前記複数の微小液滴８００を生成する時に被覆数が最大になり、微小球の分布がポアソン分布理論のモデルに該当するように、前記核酸検出液における前記核酸検出微小球７００の濃度を調整してもよい。この時、各前記微小液滴８００に含まれている一つの前記核小体７３０の確率をｐ（ｘ＝１）＝λｅ−λ、ｐ’（ｘ＝１）＝ｅ−λ−λｅ−λ＝０として計算し、この時、λ＝１、即ち、各前記微小液滴８００に含まれている一つの前記核小体７３０を平均すると、一個の前記核小体７３０による被覆の確率が最大となる。この時、各前記微小液滴８００に含まれている一つの前記核小体７３０の確率は、ｐ（ｘ＝１）＝  ｅ−１＝０．３６８となる。
【０３９０】
図１を参照すると、前記ステップＳ３３０において、一実施例では、本出願が提供する核酸ハイスループット検出器は、微小液滴生成装置、温度制御装置、蛍光信号検出装置、解析装置及び制御器を含む。前記微小液滴生成装置は、前記核酸検出液を微滴化し、前記複数の微小液滴８００を形成するために用いられる。前記温度制御装置は、前記微小液滴生成装置にレールを介して接続され、前記複数の微小液滴を前記温度制御装置に移転し、前記温度制御装置により温度循環で核酸増幅を実現するために用いられる。前記複数の微小液滴増幅が完了するまで、前記蛍光信号検出装置により、核酸増幅された前記複数の微小液滴を蛍光検出する。前記制御器は、前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置及び前記蛍光信号検出装置にそれぞれ接続され、前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置及び前記蛍光信号検出装置を制御するために用いられる。
【０３９１】
そのうち、前記微小液滴生成装置は、液体吐出ピペットチップ、流体駆動機構及び運動制御機構を含む。前記液体吐出ピペットチップは、出口端及び入口端を有し、前記流体駆動機構は、前記液体吐出ピペットチップを駆動して、入口端により、前記核酸検出液を前記液体吐出ピペットチップに吸入し、前記液体吐出ピペットチップの出口端を、油性液体を貯留している容器に挿入し、前記液体吐出ピペットチップの出口端が油性液体の液面下に進入するようにする。同時に、前記運動制御機構が前記油性液体の液面下に瞬間加速度運動とする運動又は周期的に変速する運動により、前記核酸検出液を前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出して、前記油性液体の液面下に前記複数の微小液滴８００を形成する。そのうち、前記油性液体と前記核酸検出液とは、互いに非相溶性を持ち又は界面反応を有する二つの液体であり、前記油性液体は、鉱油（テトラデカンなどを含み）、植物油、シリコーンオイルとパーフルオロアルカンオイルなどであってもよい。
【０３９２】
図３３−３４を参照すると、一実施例では、前記ステップＳ３３０に前記核酸検出液を微滴化し、複数の微小液滴８００を形成する時に、マイクロ流体制御チップ、微流体発生器又は微小液滴生成装置などが用いられてもよい。また、前記複数の微小液滴８００を製造する方法は、前記装置に限らず、前記複数の微小液滴８００を製造する他の装置を使ってもよい。
【０３９３】
そのうち、各前記微小液滴８００に、ゼロ個か、一つの又は複数の前記核酸検出微小球７００を含み、しかも、各前記微小液滴８００に、核酸を増幅するための前記核酸増幅反応液を含む。
【０３９４】
一実施例では、前記ステップＳ３３０に、前記核酸検出液を微滴化して形成された前記複数の微小液滴８００は、その大きさが同じであってもよく、異なってもよい。
【０３９５】
一実施例では、前記ステップＳ３３０に、前記核酸検出液を微滴化する時に、マイクロ流体制御チップが用いられてもよい。
【０３９６】
前記核酸検出液を微滴化する時に、各前記微小液滴８００に、ゼロ個、一つ又は複数の前記核酸検出微小球７００を含むかもしれない。前記複数の微小液滴８００に核酸を増幅する温度が、前記アガロースの溶解点よりも高い場合に、前記被覆層７１０が溶解し前記プライマー７１２を解放し、前記プライマー７１２と前記微小液滴８００中の核酸分子とを同時にＰＣＲ増幅させ、この時、前記微小液滴８００における対応する前記核小体７３０を識別することにより、前記プライマー７１２の種類が分かり、そして標的核酸分子が分かる。
【０３９７】
一実施例では、前記ステップＳ３５０に、前記第一の効果的な微小液滴８１０が一つの前記核小体７３０を含む。ゼロ個、又は一つ以上のの前記微小液滴８００を無効な微小液滴として見なす。そのうち、前記第一の効果的な微小液滴８１０には、蛍光染料及び前記プライマー７１２を含む。前記プライマー７１２と前記第一の効果的な微小液滴８１０における核酸分子とにＰＣＲ増幅を行う工程では、前記蛍光染料と二本鎖ＤＮＡとが結合し、蛍光が大きく強化すると、比較的強い蛍光信号を放射し、前記第一の効果的な微小液滴８１０に比較的強い蛍光信号を持たせることにより、前記核小体７３０及び前記プライマー７１２により、前記第一の効果的な微小液滴８１０における対応する標的核酸分子の種類を取得することができる。
【０３９８】
そのうち、一実施例では、前記ステップＳ３６０は、
コード蛍光チャネル及び蛍光染料検出チャネルを含み、コード蛍光チャネルに基づいて、前記効果的な微小液滴における前記核小体７３０の蛍光信号を識別する蛍光信号検出装置を提供する、ステップＳ３６１と、
前記核小体７３０の蛍光信号に基づいて、前記７３０と対応する前記プライマー７１２を取得するステップＳ３６２と、
前記蛍光染料検出チャネルに基づいて、前記第一の効果的な微小液滴８１０における核酸増幅反応された報告蛍光信号を検出し、前記第一の効果的な微小液滴８１０に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップＳ３６３と、を含む。
【０３９９】
前記核小体７３０は、蛍光染料を含むソリッド球体であり、異なる種類の蛍光染料及び蛍光の強度の大きさにより、前記核小体７３０をマークしてもよい。種類毎の蛍光は、ある種類の前記核小体７３０に対応し、種類毎の前記核小体７３０がある種類の前記プライマー７１２と対応するということは、各種類に前記７１２にそれと対応する代表番号を有し、即ち、前記核小体７３０を有するということに相当する。
【０４００】
前記ステップＳ３６０には、報告蛍光信号検出の有無により出標的核酸分子の有無を検出して、定性で検出を実現する。そのうち、スクリーニング工程では、同一種類の前記核小体７３０を有する前記第一の効果的な微小液滴８１０を同一の組に分けてもよい。また、検出報告蛍光の有無により、この類別の前記核小体７３０において、前記第一の効果的な微小液滴８１０に報告蛍光信号を有さない微小液滴数がこの類別の微小液滴の総数に占めている比を取得し、ポアソン分布により同一の種類の前記核小体７３０と対応する標的核酸分子の濃度を計算して取得する。
【０４０１】
図３５を参照すると、そのうち、一実施例では、ハイスループット核酸検出方法は、
核酸増幅の反応液及び多種類の異なる種類の核酸検出微小球７００を提供し、ただし、前記核酸検出微小球７００は、核小体７３０及び被覆層７１０を含み、前記核小体７３０は、コード情報を有し、前記被覆層７１０は、前記核小体７３０を被覆し、前記被覆層７１０は、基体７１１、及び、前記基体７１１に分散されるプライマー７１２及びプローブ７１３を含み、前記プライマー７１２と前記プローブ７１３とが前記核小体７３０と一意に対応し、前記核小体７３０は、蛍光コード情報を有するソリッド球体であるステップＳ４１０と、
前記多種類の異なる種類の核酸検出微小球７００と前記核酸増幅反応液とを混合し、核酸検出液を取得するステップＳ４２０と、
前記核酸検出液を微滴化し、複数の微小液滴８００を形成するステップＳ４３０と、
前記複数の微小液滴８００に核酸を増幅し、増幅された前記複数の微小液滴８００を取得するステップＳ４４０と、
増幅された前記複数の微小液滴８００に基づいて、各前記微小液滴８００における前記核小体７３０を検出し、一つの前記核小体７３０しかを含まない前記微小液滴８００をスクリーニングし、第二の効果的な微小液滴８２０を取得するステップＳ４５０と、
前記第二の効果的な微小液滴８２０に基づいて、前記第二の効果的な微小液滴８２０における前記核小体７３０の蛍光信号を検出し、前記核小体７３０と対応する前記プライマー７１２及び前記プローブ７１３を取得し、核酸増幅反応された報告蛍光信号を読み取り、前記第二の効果的な微小液滴８２０に、対応する標的核酸分子が存在するかどうかについて取得するステップＳ４６０、とを含む。
【０４０２】
前記核酸検出液を微滴化する時に、各前記微小液滴８００に、ゼロ個、一つ又は複数の前記核酸検出微小球７００を含むかもしれない。前記複数の微小液滴８００に核酸を増幅する温度が、前記アガロースの溶解点よりも高い場合に、前記被覆層７１０が溶解し前記プライマー７１２を解放し、前記プライマー７１２と前記微小液滴８００中の核酸分子とを同時にＰＣＲ増幅させ、この時、前記微小液滴８００における対応する前記核小体７３０を識別することにより、前記プライマー７１２の種類が分かり、そして標的核酸分子が分かる。
【０４０３】
前記ステップＳ４５０では、前記第二の効果的な微小液滴８２０に、一つの前記核小体７３０を含む。ゼロ個、又は、一つ以上の前記核小体７３０を含む前記微小液滴８００を無効な微小液滴として見なす。また、前記第二の効果的な微小液滴８２０は、さらに、前記プローブ７１３及び前記プライマー７１２を含む。前記第二の効果的な微小液滴８２０に前記プローブ７１３を含むと、前記第二の効果的な微小液滴８２０に蛍光染料を含まなくてもよく、この時、前記プローブ７１３が蛍光マークとして機能する。前記プライマー７１２と前記第二の効果的な微小液滴８２０における核酸分子とにＰＣＲ増幅を行う工程に、前記プローブ７１３が二本鎖ＤＮＡと結合すると、対応する標的核酸分子を含む前記第二の効果的な微小液滴８２０を識別することができる。
【０４０４】
前記プライマー７１２と前記第二の効果的な微小液滴８２０における核酸分子とにＰＣＲ増幅を行う工程では、前記プローブ７１３が二本鎖ＤＮＡと結合する後に、前記プローブ７１３を識別することにより、前記第二の効果的な微小液滴８２０に、対応する標的核酸分子を含んでいるかどうか判断することができる。そして、前記核小体７３０及び前記プライマー７１２により、前記第一の効果的な微小液滴８１０における対応する標的核酸分子の種類を取得することができる。
【０４０５】
一実施例では、前記ステップＳ４３０には、前記ステップＳ３３０に前記核酸検出液を微滴化する方法と同じである。
【０４０６】
図６を参照すると、一実施例では、本出願が蛍光信号検出装置３０を提供する。前記蛍光信号検出装置３０は、励起光源３４０、蛍光検知アセンブリ３３０及び第三の制御器３１０を含む。前記励起光源３４０は、前記複数の微小液滴８００の検出領域の上方に配置され、前記複数の微小液滴８００検出領域に対して傾斜角度で照射を行い、傾斜照射光路を形成する。前記蛍光検知アセンブリ３３０は、前記複数の微小液滴８００検出領域の直上に配置され、前記複数の微小液滴８００の蛍光画像を採集するために用いられる。前記第三の制御器３１０は、前記励起光源３４０及び前記蛍光検知アセンブリ３３０にそれぞれ接続され、前記励起光源３４０及び前記蛍光検知アセンブリ３３０を制御するために用いられる。前記蛍光信号検出装置３０は、微小液滴に対して、複数の蛍光チャネルイメージング及び明視野・暗視野イメージングを行うことができる。そのうち、複数の蛍光チャネルイメージングは、微小液滴の反応信号を検知するためのものであり、明視野・暗視野イメージングは、微小液滴を形成するサイズ情報を検出し、反応工程において液滴の状態をモニターするために用いられる。
【０４０７】
前記励起光源３４０は、異なる色のＬＥＤ光源３４１、コリメータミラー３４２、第一の光学フィルター３４３、ダイクロイックミラー３４４、複眼レンズ３４５、及び、集光レンズ３４６を含む。前記異なる色のＬＥＤ光源３４１は、異なる色の光を生成して前記複数の微小液滴８００に照射することができる。前記異なる色のＬＥＤ光源３４１を選択することにより、異なる蛍光色を照射し、前記異なる色のＬＥＤ光源３４１が交替に作業するようにすることができる。各ＬＥＤ光源放射の光路は、その直前に、前記コリメータミラー３４２、前記第一の光学フィルター３４３及びダイクロイックミラー３４４が順次に配置されている。前記コリメータミラー３４２及び前記第一の光学フィルター３４３は、光路に対して垂直角度で配置されている（９０°角度で配置される）。前記ダイクロイックミラー３４４は、光路に対して０°〜４５°角度で配置される。前記ダイクロイックミラー３４４により形成された一つの光路において、その直前に、前記複眼レンズ３４５及び前記集光レンズ３４６が順次に配置されている。前記複眼レンズ３４５及び前記集光レンズ３４６は、光路に対して垂直角度で配置される（９０°角度で配置される）。前記複数の微小液滴８００の内部蛍光は、励起され、前記第二の光学フィルター３３３を介して、上方の前記対物レンズ３３２に集光され、カメラ３３１に入られ、前記カメラ３３１に前記複数の微小液滴の蛍光画像が採集される。
【０４０８】
前記励起光源３４０の放射する光路を、前記複数の微小液滴８００に傾斜照射することにより、前記複数の微小液滴８００に含まれている蛍光物質の微小液滴に蛍光を生じさせる。前記蛍光検知アセンブリ３３０により、前記蛍光物質を含んでいる微小液滴に対して、蛍光情報を採集し、前記蛍光物質を含んでいる微小液滴についての蛍光情報を蛍光画像の形式で解析装置（コンピューター）に送信して解析を行う。
【０４０９】
前記第二の制御器３１０は、異なる蛍光検出チャネルを構成するように、異なる光学フィルターを切り替えるために用いられる。前記蛍光信号検出装置は、コード蛍光チャネル、蛍光染料検出チャネル、蛍光プローブ検出チャネル、微小液滴識別チャネル及び複数の候補チャネルなどを含む。
【０４１０】
そのうち、複数の前記微小液滴８００を生成する時に、前記核酸検出液にＲＯＸ参照染料を添加する。前記ＲＯＸ参照染料は、ＰＣＲ反応に参加せず、複数の前記微小液滴８００の具体的な位置、輪郭と数などの情報を識別することができる。前記微小液滴識別チャネルは、ＲＯＸ参照染料の蛍光を識別し、正確に各前記微小液滴８００を位置決めることに用いられる。前記コード蛍光チャネルは、前記核小体７３０の蛍光信号及び蛍光信号強度を識別し、一つの前記核小体７３０を含む前記第一の効果的な微小液滴８１０を取得することができる。前記蛍光染料検出チャネル又は蛍光プローブ検出チャネルは、前記第一の効果的な微小液滴８１０における核酸増幅反応された報告蛍光信号を識別し、前記報告蛍光信号に基づいて前記プライマー７１２又は前記プライマー７１２と前記プローブ７１３と標的核酸分子にＰＣＲ増幅が実行されたかどうかについて判断する。
【０４１１】
前記ステップＳ４６０では、報告蛍光信号の有無により、標的核酸分子の有無を検出し、定性で検出を実現できる。そのうち、スクリーニング工程に、同一の種類の前記核小体７３０を含む前記第二の効果的な微小液滴８２０を一組に分けることができる。それと同時に、報告蛍光の有無を検出することにより、この類別の前記核小体７３０における前記第二の効果的な微小液滴８２０に、報告されない報告蛍光信号の微小液滴数がこの類別の微小液滴の総数に占めている比を取得でき、ポアソン分布により同一種類の前記核小体７３０と対応する標的核酸分子の濃度を計算することができる。
【０４１２】
前記コード蛍光チャネルにより、複数の前記微小液滴８００における前記核小体７３０の蛍光信号を検出すると、複数の前記微小液滴８００から前記第一の効果的な微小液滴８１０をスクリーニングすることができる。そのうち、前記第一の効果的な微小液滴８１０に一つの前記核小体７３０を含む。そして、前記蛍光染料検出チャネルにより、前記第一の効果的な微小液滴８１０を検出し、核酸増幅反応された報告蛍光信号を読み取り、前記第一の効果的な微小液滴８１０に、対応する標的核酸分子を含んでいるかどうかについて判断する。前記第一の効果的な微小液滴８１０に標的核酸分子を含むと、前記第一の効果的な微小液滴８１０における前記核小体７３０と対応する前記プライマー７１２により、対応する標的核酸分子の種類が分かる。
【０４１３】
同様に、前記コード蛍光チャネルが複数の前記微小液滴８００における前記核小体７３０の蛍光信号を検出することにより、複数の前記微小液滴８００から前記第二の効果的な微小液滴８１０をスクリーニングすることができる。そのうち、前記第二の効果的な微小液滴８２０には、一つの前記核小体７３０が含まれている。そして、前記蛍光プローブ検出チャネルにより、前記第二の効果的な微小液滴８２０を検出し、核酸増幅反応された報告蛍光信号を読み取り、対応する標的核酸分子が前記第二の効果的な微小液滴８２０に含まれているかどうかについて判断する。前記第二の効果的な微小液滴８２０に、対応する標的核酸分子が含まれている場合に、前記第二の効果的な微小液滴８２０における前記核小体７３０の対応する前記プライマー７１２又は前記プローブ７１３により、対応する標的核酸分子の種類が分かる。
【０４１４】
一実施例では、前記蛍光信号検出装置は、多種類の異なる蛍光マークの前記核小体７３０を識別するための複数の前記コード蛍光チャネルを含む。具体的に、第一のコード蛍光チャネルを蛍光Ａとして配置し、１０個の勾配の濃度を配置し、第二のコード蛍光チャネルを蛍光Ｂとして配置し、同様に１０個の勾配の濃度を配置すると、前記蛍光信号検出装置により、１０×１０＝１００種類の異なる蛍光チャネル及び強度マークの前記核小体７３０を識別することができ、言い換えれば、１００種類の蛍光マークの前記核小体７３０により、１００種類の異なる種類の前記プライマー７１２又は前記プライマー７１２や前記プローブ７１３をマークすることができる。このように類推すると、多量の異なる種類の前記核小体７３０を取得して、ひいては、多量の異なる種類の前記核酸検出微小球７００をマークすることができる。
【０４１５】
前記核酸検出微小球７００は、蛍光コード情報を有する前記核小体７３０、前記プライマー７１２、前記プローブ７１３の前記被覆層７１０からなる。多種類の前記核酸検出微小球７００は、前記核酸増幅反応液に、ランダム分布されており、前記核酸検出液を混合して取得し、前記核酸検出液を再度、微小液滴化して前記複数の微小液滴８００を生成する。温度が６０℃以上に高まると、前記被覆層７１０が溶解し、前記プライマー７１２、前記プローブ７１３を前記微小液滴８００に解放して、完全な核酸増幅反応のシステムを構成し、前記核小体７３０が前記微小液滴８００に残されており、前記微小液滴８００を示す蛍光記号とする。増幅が完了した後に、前記微小液滴８００に標的核酸分子を含むと、増幅工程に、蛍光染料又は前記プローブ７１３が二本鎖ＤＮＡと結合し、蛍光信号が強化し、蛍光信号の生成が報告される。
【０４１６】
次に、複数の前記微小液滴８００における蛍光コード情報を有する前記核小体７３０を検出することにより、一つの蛍光コード情報しかを有さない前記核小体７３０の前記微小液滴８００を効果的な微小液滴としてスクリーニングして、引き続き解析に移行する。取得された効果的な微小液滴（効果的な微小液滴とは、上記実施例において、前記第一の効果的な微小液滴８１０、又は、前記第二の効果的な微小液滴８２０である）に基づいて、効果的な微小液滴における前記核小体７３０の蛍光信号を検出し、併せて、前記プライマー７１２、前記プローブ７１３の類別を取得する。次に、効果的な微小液滴における核酸増幅反応された報告蛍光信号を取得し、前記報告蛍光信号に基づいて、効果的な微小液滴に、対応する標的核酸分子を含んでいるかどうかについて判断する。従って、前記核酸検出微小球７００、製造方法、試薬キット及びハイスループット核酸検出方法によれば、多種類の前記核酸検出微小球７００を一回だけ添加することにより、一度、複数の標的核酸分子の有無を検出でき、しかも、ポアソン分布に基づいて各検出標的核酸の濃度を取得することができる。
【０４１７】
従って、多量の異なる種類の前記核酸検出微小球７００と、検出すべき核酸増幅反応液とを混合して標的核酸を検出すると、一回だけ、多種類の標的核酸を検出でき、複数繰り返して検出を行う必要が無くなり、作業量が小さく、時間が短縮化し、感度が高い。
【０４１８】
以上の前記実施例の各技術的特徴は、任意に組み合わせることができ、記述を簡潔にするために、上記実施例における各技術的特徴のすべての可能な組合せを記述していないが、これらの技術的特徴の組合せは矛盾しない限り、本明細書に記載されている範囲に属すると考えられる。
【０４１９】
以上の実施例は、本出願の幾つかの実施形態だけを詳細且つ具体的な的に示しているが、本出願の保護範囲を限定するものではないと理解すべきである。当業者にとって、本出願の創造的構想から逸脱しない前提で、幾つかの変形や改良を行うことができ、これらはすべて本出願の保護範囲に属するべきであると理解しなければならない。従って、本出願の保護範囲は、特許請求の範囲に記載された内容を基準とする。
【０４２０】
最後に、本明細書では、部材の番号自体、例えば、「第一」、「第二」などは、説明対象を区別するためのみに使用され、順序や技術的な意味がない。また、本出願における「接続」や「連結」には、特に指定のない限り、直接接続と間接接続（連結）の両方が含まれる本出願の説明では、「上」、「下」、「前」、「後」、「左」、「右」、「垂直」、「水平」、「頂」、「底」、「内」、「外」、「時計回り」、「反時計回り」などの用語で示される方位又は位置関係は、図面で示される方位又は位置関係に基づいて、本出願の説明を容易にして説明を簡単にするためのものに過ぎず、言及された装置又は部品が必ず一定の方位を有し一定の方位で構造及び操作されることを指示又は示唆するものではないため、本発明を制限するものではないと理解されるべきある。
【０４２１】
本明細書では、特に明示的に規定及び限定されていない限り、第一特徴が第二特徴の「上」又は「下」であるとは、第一特徴が第二特徴と直接接触するか、又は第一特徴が第二特徴と中間媒体を介して間接的に接触することを意味し得る。また、第一特徴が第二特徴の「上」、「上方」及び「上側」であるとは、第一特徴が第二特徴の真上方又は斜め上方であるか、又は単に第二特徴と比較すると第一特徴の水平高さが高いことを意味する。第一特徴が第二特徴の「下」、「下方」及び「下側」であるとは、第一特徴が第二特徴の真下方又は斜め下方であるか、又は単に第二特徴と比較すると第一特徴の水平高さが低いことを意味する。
【０４２２】
本明細書に、例えば、「第一」、「第二」などという関係に係る技術的な表現が、一つのもの又は操作ともう一つのもの又は操作を区別するためにのみ使用されており、これらのもの又は操作の間に如何なる実際の関係又は順番を要求したり、暗示に示唆したりすることが必ず存在していない。しかも、「含み」や「含む」などの技術的表現又は他の如何なる変形も、非排他的に含まれるという意味を指しており、一連の要素からなる工程、方法、物品又は設備がこれらの要素だけでなく、明確に挙げられない他の要素、並びに、この工程、方法、物品又は設備が固有する要素も含まれているわけである。その以上の限定がない限り、「一つの……を含む」というセンテンスにより限定された要素は、前記要素を含む工程、方法、物品又は設備に存在している他の同様な要素を排除するものではない。
【０４２３】
本明細書の各実施例では、段階的に説明を行い、他の実施形態との相違点に着目して、実施例間で同じ又は類似の部分について互いに参照されてもよい。
【０４２４】
当業者は、開示された実施例の上記説明により、本出願を実施又は実現することができる。これらの実施例に対する様々な変更は、当業者にとって自明である。本明細書で定義された一般的な原理は、本出願の趣旨又は範囲を逸脱しない限り、他の実施例でも実施することができる。そのため、本出願は、本明細書に開示された実施例に限定されず、本明細書で開示された原理及び新たな特徴と合致している最も広い範囲に適合するべきである。
【図１】
2021511074.tif 000041
【図２】
2021511074.tif 000042
【図３】
2021511074.tif 000043
【図４】
2021511074.tif 000044
【図５】
2021511074.tif 000045
【図６】
2021511074.tif 000046
【図７】
2021511074.tif 000047
【図８】
2021511074.tif 000048
【図９】
2021511074.tif 000049
【図１０】
2021511074.tif 000050
【図１１】
2021511074.tif 000051
【図１２】
2021511074.tif 000052
【図１３】
2021511074.tif 000053
【図１４】
2021511074.tif 000054
【図１５】
2021511074.tif 000055
【図１６】
2021511074.tif 000056
【図１７】
2021511074.tif 000057
【図１８】
2021511074.tif 000058
【図１９】
2021511074.tif 000059
【図２０】
2021511074.tif 000060
【図２１】
2021511074.tif 000061
【図２２】
2021511074.tif 000062
【図２３】
2021511074.tif 000063
【図２４】
2021511074.tif 000064
【図２５】
2021511074.tif 000065
【図２６】
2021511074.tif 000066
【図２７】
2021511074.tif 000067
【図２８】
2021511074.tif 000068
【図２９】
2021511074.tif 000069
【図３０】
2021511074.tif 000070
【図３１】
2021511074.tif 000071
【図３２】
2021511074.tif 000072
【図３３】
2021511074.tif 000073
【図３４】
2021511074.tif 000074
【図３５】
2021511074.tif 000075
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月17日(2020.9.17)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０００３】
デジタルＰＣＲ（Ｄｉｇｉｔａｌ  ＰＣＲ、ｄＰＣＲ）は、核酸分子の絶対定量に係る技術である。デジタルＰＣＲは、ｑＰＣＲに比べると、ＤＮＡ分子の個数を直接に数えるため、初期試料のコピー数に対する絶対定量である。定量ＰＣＲは、標準曲線又は参照遺伝子に従って核酸量を検出する。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００１１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００１１】
このことに鑑み、本出願は、核酸検出微小球、製造方法、試薬キット及びハイスループット核酸検出方法を提供する。そのうち、前記被覆層は、前記核小体を被覆し、前記核酸検出微小球を形成する。前記基体は、疎水性油に形成された含水高分子ゲルであり、流動性がなく、しかも、形状や体積も変化し易くない。含水高分子ゲルは、室温でゲルの状態となり、室温のほうよりも高い温度で溶解し、酵素や反応液などの拡散・活性に影響を与えることがない。同時に、前記基体に分散された前記プライマーは、標的検出核酸を定性解析して識別することができる。前記核小体は、高温に耐えられる材料であり、特殊なマーク機能を有し、前記核小体ごとに、一つの前記プライマーと一意に対応していることから、追跡して検出するように、前記核小体により前記核酸検出微小球をマークすることができる。ＰＣＲ検出を実行する時に、複数かつ多種類の前記核酸検出微小球を検出すべき核酸増幅反応液に混合すると、核酸検出液を取得することができる。前記核酸検出液を微滴化すると、複数の微小液滴を形成して、複数の微小液滴にＰＣＲの反応を行わせることができる。ＰＣＲの反応工程では、二本鎖ＤＮＡを９０℃〜９５℃で変性させ、再び、５０℃〜６０℃まで急速に冷却させ、プライマーがアニーリングして標的配列に結合した後に、急速に７０℃〜７５℃まで昇温させ、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼによる作用で、プライマーの鎖を鋳型に沿って伸長させ、適当な温度の範囲で核酸を増幅させる。複数の微小液滴にＰＣＲの温度を制御する工程では、前記被覆層が溶解して分解される。そして、前記被覆層に付けられた前記プライマーは、対応する微小液滴に解放して微小液滴に含まれている標的核酸分子と反応することになる。最終的に、前記核小体を、位置決め、追跡して識別し、前記核小体の対応する前記プライマーにより、標的核酸分子が分かると、ハイスループットでＰＣＲ検出を実現することができる。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００３３】
本出願に係る一実施例では、ステップＳ２０３に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に、瞬間加速度運動を含む運動を周期的に行う。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体の液面下に周期的に運動することは、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の変位、速度又は加速度がいずれも周期性に変化するということを意味している。液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、瞬間加速度運動を含む運動を周期的に行い、第一の液体を液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２により一定の流速で排出するように協働し、微小液滴を等時間間隔で生成することを実現することができる。又は、第一の液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の流速は、変化しているものの、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２による一つの運動周期に、第一の液体吐出液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の体積が同じく保持される。そして、体積の一致する微小液滴を生成するように、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が各瞬間加速度運動を行う前に、液滴１９５の体積が同じであることを確保する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００４１】
本実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、一つの運動周期に二つの微小液滴１９９を生成することができ、方形波状がプロジェクトで実現されやすい。他の実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、一つの運動周期に、一つの微小液滴１９９を生成する。好ましくは、実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２は、第二の液体６９９において、任意方向に、直線とされる軌跡で速度が方形波状で変化する運動を行う。この運動は、例えば、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向と垂直する平面内に、直線とされる軌跡で速度が方形波状で変化する運動、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向に対して任意角度とされる平面に、直線とされる軌跡で速度が方形波状で変化する運動、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向に、直線とされる軌跡で速度が方形波状で変化する運動などが含まれる。本出願の他の実施例では、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２の運動軌跡が円弧セグメント又は多角形の形状とされる時に、液体吐出ピペットチップ１１０の出口端１１２が第二の液体６９９において任意方向に、円弧セグメント又は多角形の形状とされる軌跡で速度が方形波状で変化する運動は、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向と垂直する平面に、円弧セグメント又は多角形の形状とされる軌跡で速度が方形波状で変化する運動、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向に対して任意角度とされる平面に、円弧セグメント又は多角形の形状とされる軌跡で速度が方形波状で変化する運動、液体吐出ピペットチップ１１０の伸長方向に直線とされる軌跡で速度が方形波状で変化する運動などが含まれる。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００８２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９０
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９２
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９５
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９６
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９８】
前記複眼レンズ３４５は、屈折された前記光路に均一性を高めるために用いられる。前記複眼レンズ３４５は、一連の小レンズにより組み合わせて形成され、二つの配列の複眼レンズマトリックスを照明システムに適用すると、高い光エネルギーの利用率及び大きい面積に均一な照明を取得することができる。二つの配列の複眼レンズマトリックスによれば、均一な照明を実現でき、複数の異なる色の前記ＬＥＤ光源に均一性及び照明の輝度が向上し、自体と、観察される物体との方位や距離を効果的に算出し、より正確な蛍光イメージを取得することができる。前記複眼レンズマトリックスにより均一な照明を実現するには、二つの配列の複眼レンズマトリックスが平行して配列され、第一の列複眼レンズマトリックスにおける各個の小単位としてのレンズの焦点が第二の列の複眼レンズマトリックスにおける対応する小単位レンズの中心と一致しており、二つの配列の複眼レンズの光軸が互いに平行し、第二の列複眼レンズの後方に集光鏡を設置し、集光鏡の焦平面に照明スクリーンを設置して均一な照明システムを形成することが必要となる。
【手続補正１３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００９９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【００９９】
前記複眼レンズマトリックスは、均一な照明を実現する原理が以下の通りである。光軸と平行する光束は、第一のレンズを通過して第二のレンズの中心に集光され、第一の配列の複眼レンズにより光源を複数の光源像として形成して照明を行い、第二の配列の複眼レンズの各小レンズが第一の配列の複眼レンズにおける対応する小レンズを照明面に重ねてイメージングする。第一の配列の複眼レンズは、光源の広い光束全体を複数の細かい光束に分けて照明を行い、しかも、各細かい光束の範囲内に不均一性について、対称位置に位置する細かい光束が互いに重なり合うことから、細かい光束の不均一性が補償され、アパーチャ全体内の光エネルギーを効果的に用いることが可能である。第二の配列の複眼レンズから出射されたスポットは、集光鏡を介して、照明スクリーンに集光されることから、照明スクリーンにおいて各スポットが、いずれも、光源における各点から放射された光線により照射され、同時に、光源における各点から放射された光束も、さらに、いずれも、照明スポットによる同一の視野範囲に重なれることから、一つの均一な方形スポットが得られる。
【手続補正１４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１００
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１０３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１３
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１３】
前記微小液滴生成装置１０により生成されたのは、均一な大きさの微小液滴であり、温度制御装置２０により、前記複数の微小液滴を核酸増幅反応させ、例えば、蛍光、紫外線吸収、濁度などの産物信号を採集する。前記複数の増幅された微小液滴と増幅されなかった微小液滴との構成の相違により、標的配列増幅が得られた液滴数を解析して、核酸分子への定量解析を最終的に実現することができる。前記複数の微小液滴に係る変化する蛍光のイメージをリアルタイムでモニターすることにより、検出結果に直接性を持っているため、前記複数の微小液滴における偽陽性と偽陰性という問題を解決することができる。
【手続補正１８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１４
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正１９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１１６】
そのうち、Ｃｔ値において、ＣがＣｙｃｌｅを示す。リアルタイムの蛍光ＰＣＲにおいて、Ｃｔ値とは、各前記微小液滴内に蛍光信号が所定の閾値になるまで経過した巡回数を指す。
【手続補正２０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１１８
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１４３
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１７２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１７２】
そのうち、Ｃｔ値において、ＣがＣｙｃｌｅを示し、ｔがｔｈｒｅｓｈｏｌｄを示し、Ｃｔ値とは、各反応管内に蛍光信号が所定の閾値になるまで経過した巡回数を意味している。
【手続補正２４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１８８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１８８】
一実施例では、前記初期ＤＮＡの濃度が比較的小さい場合に、五つ以上のコピーを含む液滴の数は非常に少ない（又は、無視してもよい）。システムは、２０，０００個の液滴システムである場合に、一般的に、試料のＤＮＡの濃度を６ＣＰＤ以下にするということが推薦される。実際の試験工程では、ｋ＞４時に、Ｃｔ値の区分が小さくなり、Ｃｔ値により一つの液滴の初期コピー数が４であるか５であるかについて区分しにくいことから、ｘ０、ｘ１、ｘ２、ｘ３の不完全なサンプルだけを用いて、Ｐｏｉｓｓｏｎの分布に、点推定を実行する。不完全な試料に基づいて、Ｐｏｉｓｓｏｎに点推定するアルゴリズムが数多くあり、操作可能性を持つアルゴリズム（最小二乗法）を挙げて、ここで説明する。
【手続補正２５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２０１
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２０１】
図１７を参照すると、前記一部の核酸初期コピー数がそれぞれ０、１、２、３である場合に取得されたポアソン分布に基づいて当てはめる。そのうち、横座標が各液滴に含まれる平均初期コピー数（ｃｏｐｉｅｓ  ｐｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔ、ＣＰＤ）である。縦座標は、各液滴に含まれる平均初期コピー数の標準偏差（ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ、Ｓｔｄ  Ｄｅｖ  、ＳＴＤ）である。各液滴に含まれる平均初期コピー数は、ＣＰＤ（ｃｏｐｉｅｓ  ｐｅｒ  ｄｒｏｐｌｅｔ）により表示される。そして、前記一部の核酸初期コピー数により取得された各液滴に含まれる平均初期コピー数のＣＰＤの標準偏差は、他のアルゴリズムで取得された平均初期コピー数のＣＰＤの標準偏差よりも小さいと分かる。従って、このアルゴリズムで取得された各液滴に含まれる平均初期コピー数のＣＰＤの値は、より正確になる。２００００個の液滴を１０００回だけシミュレーションした結果が示される。単点による推量方法だけを用いると、限られる濃度範囲だけをカバーし、推量の精度も、試料の濃度が上がるのに伴い、急速に悪くなる。しかしながら、不完全なポアソン分布により当てはめアルゴリズム（Ｎ＝０、１、２、３）を用いると、試料の濃度の増加に伴い、推量精度が明らかに変化せず、検出すべき核酸増幅反応液の濃度を二倍拡大することも可能である。液滴数が比較的小さい場合には、不完全なポアソン分布で当てはめアルゴリズム（一部サンプリングポアソン分布の当てはめのアルゴリズム）が依然として、よい確実性を持っている。
【手続補正２６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５１
【補正方法】削除
【補正の内容】
【手続補正２７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５６
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５６】
2021511074.tif 000076
【手続補正２８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２５７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２５７】
関連係数Ｒとは、パラメータ間に関連関係の強さを示す統計的指標であり、二つのパラメータ間に線形の関係を測るものである。表１からみれば、本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出器により検出された五つの核酸増幅反応液の初期コピー数の検出値と真の値との関連係数が最大であり、最も１に近接したと分かる。故に、本出願が提供するデジタルＰＣＲ検出器１は、検出精度がより高く、精度がより高い。
【手続補正２９】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９２】
各溶解曲線は、各前記微小液滴に産物が単一である場合を示し、一つの溶解曲線が単一のピークであり、しかも、一定の合理的な温度範囲に位置する（一般的に、８０〜９０℃）と、正常と見なされる。一方、溶解曲線がダブルピークである場合に、非特異性の増幅に該当するかもしれない。そして、産物が標的遺伝子でありか、単一であるかどうかについて判断することができる。
【手続補正３０】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９５】
そのうち、微小液滴容器の上方から傾斜角度で微小液滴容器に照射する。前記蛍光信号検出装置３０により、前記微小液滴のマトリックスに周期性に二次元走査を行いながら、リアルタイムで画像を採集する。微小液滴容器内の前記微小液滴のマトリックスの内部蛍光は、励起され、前記蛍光信号検出装置３０の対物レンズに集められ、カメラに進入され、カメラにより、前記微小液滴のマトリックスの蛍光画像を採集する。
【手続補正３１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２９７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２９７】
前記蛍光信号検出装置の蛍光検知アセンブリにより、蛍光物質を含む前記微小液滴のマトリックスに蛍光情報を採集し、検出された蛍光情報を蛍光画像の形式でコンピューターに送信し、定量を解析する。
【手続補正３２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０４】
そのうち、Ｃｔ値において、ＣがＣｙｃｌｅを示し、ｔがｔｈｒｅｓｈｏｌｄを示し、Ｃｔ値とは、各反応管内に蛍光信号が所定の閾値になるまで経過した巡回数を意味している。
【手続補正３３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０５
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０５】
一実施例では、ＰＣＲ反応が行われる際に前の１５個の循環される蛍光信号を蛍光バックグラウンド信号として、また、３−１５個の循環される蛍光信号の標準偏差（ＳＤ）の１０倍を蛍光閾値の欠失配置とし、即ち、ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ  ＝  １０×ＳＤｃｙｃｌｅ  ３−１５となる。前記蛍光閾値の欠失値ｔｈｒｅｓｈｏｌｄによれば、対応する巡回数を、前記Ｃｔ値として取得する。Ｃｔ値と初期ＤＮＡ濃度との関係は、初期コピー数が多いいほど、Ｃｔ値が小さい。
【手続補正３４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３１８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３１８】
システムは、２０，０００個の液滴システムである場合に、一般的に、試料のＤＮＡの濃度を６ＣＰＤ以下にするということが推薦される。
【手続補正３５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３４
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３４】
一実施例では、前記ステップＳ４２０には、前記微小液滴のマトリックスの溶解曲線に基づいて、各前記微小液滴の前記溶解曲線と対応する溶解温度を取得するステップＳ４２１と、前記溶解温度に基づいて、前記微小液滴のマトリックスの微小液滴を分類し、前記微小液滴のマトリックスの核酸情報を取得し、前記検出すべき核酸の核酸情報を取得するステップＳ４２２と、を含む。
【手続補正３６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３３７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３３７】
一実施例では、前記デジタルＰＣＲ検出方法は、前記微小液滴のマトリックスの高分解能溶解曲線を取得し、前記微小液滴のマトリックスの微小液滴を分類し、前記微小液滴のマトリックスに、ジェノタイピングや突然変異の検出などの核酸情報を取得するステップＳ５０をさらに含む。
【手続補正３７】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３４２
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３４２】
一実施例では、複数の前記微小液滴を定性で分類し解析する時に、高分解能溶解曲線解析（ｈｉｇｈ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｍｅｌｔｉｎｇ  ａｎａｌｙｓｉｓ、ＨＲＭ）を用いてもよく、配列特異性プローブを用いる必要がなく、飽和染料により  ＰＣＲ反応産物を解析してもよい。
【手続補正３８】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３９０
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３９０】
図１を参照すると、一実施例では、本出願が提供する核酸ハイスループット検出器は、微小液滴生成装置、温度制御装置、蛍光信号検出装置、解析装置及び制御器を含む。前記微小液滴生成装置は、前記核酸検出液を微滴化し、前記複数の微小液滴８００を形成するために用いられる。前記温度制御装置は、前記微小液滴生成装置にレールを介して接続され、前記複数の微小液滴を前記温度制御装置に移転し、前記温度制御装置により温度循環で核酸増幅を実現するために用いられる。前記複数の微小液滴増幅が完了するまで、前記蛍光信号検出装置により、核酸増幅された前記複数の微小液滴を蛍光検出する。前記制御器は、前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置及び前記蛍光信号検出装置にそれぞれ接続され、前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置及び前記蛍光信号検出装置を制御するために用いられる。
【手続補正３９】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
微小液滴の全てについて、複数の蛍光画像をリアルタイムで取得し、前記リアルタイムの複数の蛍光画像に基づいて、核酸増幅すべき微小液滴に蛍光曲線をリアルタイムで取得するステップＳ４１１０と、
前記リアルタイムの蛍光曲線に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全てについてＣｔ値を取得するステップＳ４１２０と、
前記Ｃｔ値と核酸増幅された微小液滴の核酸初期コピー数との関係に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全てについて核酸初期コピー数を取得するステップＳ４１３０と、
前記核酸増幅された微小液滴の全てについて、核酸初期コピー数に基づいて、前記核酸初期コピー数の度数分布を取得するステップＳ４１４０と、
前記核酸初期コピー数の度数分布に基づいて、ポアソン分布のパラメータλを計算するステップＳ４１５０と、を含む、デジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項２】
前記ステップＳ４１１０には、
リアルタイムの各蛍光画像に基づいて、核酸増幅された各微小液滴に蛍光強度値を取得するステップＳ４１１１と、
前記核酸増幅された各微小液滴の蛍光強度値に基づいて、核酸増幅された各微小液滴の蛍光曲線をリアルタイムで取得するステップＳ４１１３と、
前記核酸増幅された各微小液滴の蛍光曲線に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てについて、蛍光曲線をリアルタイムで取得するステップＳ４１１５と、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項３】
前記ステップＳ４１２０には、
核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線に導関数を導出し、前記核酸増幅された各微小液滴にリアルタイムの蛍光曲線の傾きを取得するステップＳ４１２１と、
前記核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線の傾きに基づいて、前記核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線の傾きのうち、数値の変化しない傾きを取得するステップＳ４１２３と、
前記数値の変化しない傾きに基づいて、その対応するものであって、核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値である初期巡回数を取得するステップＳ４１２５と、
前記核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てについてＣｔ値を取得するステップＳ４１２７と、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項４】
前記ステップＳ４１２０には、
核酸増幅された各微小液滴のリアルタイムの蛍光曲線に基づいて、核酸増幅された各微小液滴の蛍光閾値の欠失値を取得するステップＳ４１２２と、
核酸増幅された各微小液滴の蛍光閾値の欠失値に基づいて、その対応するものであって、核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値である巡回数を取得するステップＳ４１２４と、
前記核酸増幅された各微小液滴のＣｔ値に基づいて、前記核酸増幅された微小液滴の全てについて、Ｃｔ値を取得するステップＳ４１２６とを、さらに含むことを特徴とする請求項１に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項５】
前記ステップＳ４１４０には、
前記核酸増幅された微小液滴の全てについての核酸初期コピー数に基づいて、前記核酸増幅の微小液滴の全てについて核酸初期コピー数のうちの最大値及び最小値を取得するステップＳ４１４１と、
前記最大値及び前記最小値に基づいて、階級幅と階級数を選択し、前記核酸初期コピー数の度数分布を取得するステップＳ４１４３と、を含む、ことを特徴とする請求項１に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項６】
前記ステップＳ４１５０では、ポアソン分布のパラメータλを計算する時に、最尤推定法が使用される、ことを特徴とする請求項１に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項７】
微小液滴の全てについて、複数の蛍光画像をリアルタイムで取得し、リアルタイムの前記複数の蛍光画像に基づいて、核酸増幅された微小液滴の蛍光曲線をリアルタイムで取得するステップＳ４２１０と、
前記リアルタイムの蛍光曲線に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全てについて、Ｃｔ値を取得するステップＳ４２２０と、
前記Ｃｔ値と核酸増幅された微小液滴の核酸初期コピー数との関係に基づいて、核酸増幅された微小液滴の全てについて、核酸初期コピー数を取得するステップＳ４２３０と、
前記核酸増幅された微小液滴の全ての核酸初期コピー数に基づいて、核酸初期コピー数の一部を選択するステップＳ４２４０と、
前記一部の核酸初期コピー数に基づいて、前記一部の核酸初期コピー数の度数分布を取得するステップＳ４２５０と、
前記一部の核酸初期コピー数の度数分布に基づいて、ポアソン分布を点推定し、ポアソン分布のパラメータλを取得するステップＳ４２６０と、を含む、デジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項８】
前記ステップＳ４２６０には、前記一部の核酸初期コピー数の度数値の残差平方和ｅｒｒを最小にするように、一つの空間[λmin, λmax]にλを照会する、ことを含むことを特徴とする請求項７に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項９】
前記ステップＳ４２６０には、ポアソン分布を点推定する方法が  モーメント推定法、順序統計量法、又は、最尤推定法、をさらに含むことを特徴とする請求項７に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項１０】
前記ステップＳ４２６０における前記残差平方和ｅｒｒは、
2021511074.tif 000077
ただし、各微小液滴におけるＤＮＡ初期コピー数は、確率変数ｘである、一部の微小液滴のＤＮＡ初期コピー数に対応する度数値は、ｎｋであり、Ｎは、前記複数の微小液滴の総数である、ことを特徴とする請求項８に記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法。
【請求項１１】
請求項１から１０のいずれかの一つに記載のデジタルＰＣＲ定量検出方法に用いられるデジタルＰＣＲ検出器であって、
核酸増幅反応液を微滴化し、複数の微小液滴を形成するように配置される微小液滴生成装置と、
前記微小液滴生成装置にレールを介して接続された温度制御装置であって、前記複数の微小液滴を当該温度制御装置に移転し、温度の循環で核酸増幅を実現するように配置される温度制御装置と、
前記温度制御装置に対向配置され、核酸増幅された前記複数の微小液滴を撮影して検出するように配置され、微小液滴に複数の蛍光チャネルでイメージングを行い、かつ、明視野・暗視野でイメージングし、そのうち、複数の蛍光チャネルによるイメージングは、微小液滴の反応信号を検知するように配置され、明視野・暗視野によるイメージングは、微小液滴を形成するサイズの情報を検出し、反応工程において液滴の状態をモニターするように配置される、蛍光信号検出装置と、
前記蛍光信号検出装置にデータ線を介して接続され、前記複数の微小液滴の蛍光情報を送信し、定量解析するように配置される定量解析装置と、
前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置、蛍光信号検出装置及び定量解析装置にそれぞれ接続され、前記微小液滴生成装置、前記温度制御装置、前記蛍光信号検出装置及び前記定量解析装置を制御するように配置される制御器と、を含む、デジタルＰＣＲ検出器。
【請求項１２】
前記微小液滴生成装置は、
出口端及び入口端を有し、第一の液体を貯留するための液体吐出ピペットチップと、
前記液体吐出ピペットチップの入口端に接続され、前記液体吐出ピペットチップの内部に貯留されている第一の液体を前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出するための流体駆動機構と、
前記液体吐出ピペットチップの出口端が第二の液体に対して、所定軌跡、所定速度又は所定加速度で、対向運動し、前記液体吐出ピペットチップの出口端から排出された第一の液体が表面張力及び付着力に打ち勝ち、微小液滴を形成するように制御するための運動制御機構と、
前記流体駆動機構及び前記運動制御機構にそれぞれ接続され、前記流体駆動機構及び前記運動制御機構の稼働を制御するための第一の制御器と、を含むことを特徴とする請求項１１に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項１３】
前記温度制御装置は、
フレキシブル回路基板と、
対向配置される第一の表面及び第二の表面を含み、前記フレキシブル回路基板と間隔配置される加熱基板と、
前記フレキシブル回路基板と前記第一の表面との間に配置された前記複数の半導体熱電対であって、互いに直列接続され、並列接続、又は、直並列接続される複数の半導体熱電対と、を含む、ことを特徴とする請求項１１に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項１４】
前記蛍光信号検出装置は、
前記微小液滴の微小液滴容器の検出領域の上方に配置され、前記微小液滴容器の検出領域に傾斜して照射して、傾斜照射光路を形成する励起光源と、
前記微小液滴容器の検出領域の直上に配置され、前記複数の微小液滴の蛍光画像及び明視野・暗視野の画像を採集するための蛍光検知アセンブリと、
前記励起光源及び前記蛍光検知アセンブリにそれぞれ接続され、前記励起光源及び前記蛍光検知アセンブリを制御するための第三の制御器と、を含むことを特徴とする請求項１１に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【請求項１５】
前記励起光源は、
各先端に、それぞれ、コリメータミラー及び第一の光学フィルターが順次に設けられる複数の異なる色のＬＥＤ光源と、
前記第一の光学フィルターの先端に傾斜配置され、各前記ＬＥＤ光源から放射された光を一つの光路に屈折するためのダイクロイックミラーと、
屈折された前記光路の均一性を向上させるための複眼レンズと、
前記複眼レンズの先端に配置され、照明スポットを集光して形成するための集光レンズと、ことを特徴とする請求項１４に記載のデジタルＰＣＲ検出器。
【国際調査報告】
2021511074.tif 000078
2021511074.tif 000079
2021511074.tif 000080
2021511074.tif 000081
2021511074.tif 000082
2021511074.tif 000083