(57)【要約】  本開示は、例えば、位置情報を取得するための反復近接ライゲーションまたはスプリットアンドプール法による、分子の分子近傍検出のための方法を提供する。2021531750.tif 000005
2021531750.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
反復近接ライゲーション（ＩＰＬ）のための方法であって、
（ａ）少なくとも１つのオリゴヌクレオチドタグをサンプルの少なくとも１つの分子に取り付けることであって、前記オリゴヌクレオチドタグは、（１）前記少なくとも１つの分子への取り付けのための官能基、（２）プライマー部位、（３）固有のバーコード、および（４）５’切断ハーフ部位または３’切断ハーフ部位を含む、ことと、
（ｂ）５’切断ハーフ部位を有する前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドタグを、３’切断ハーフ部位を有する前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドタグにライゲーションし、それによって１つまたは複数のバーコードペアを生成させることと、
（ｃ）前記１つまたは複数のバーコードペアの前記オリゴヌクレオチドタグのうちの少なくとも１つにおいてプライマーを伸長させて前記バーコードペアの複製物を生成させることと、
（ｄ）前記１つまたは複数のバーコードペアを切断するための触媒を添加し、それによって前記少なくとも１つのオリゴヌクレオチドタグを再形成することと
を含む、前記方法。
【請求項２】
前記オリゴヌクレオチドタグが一本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記オリゴヌクレオチドタグが二本鎖である、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記官能基が、スクシンイミジルエステル、ヨードアセトアミド、マレイミド、アミン、４−フェニル−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３，５（４Ｈ）−ジオン（ＰＴＡＤ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルクロリド、およびチオールからなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
ライゲーションすることが可逆的である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記タグが蛍光標識にコンジュゲートされていない、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
ライゲーションすることが、タンパク質リガーゼおよび架橋オリゴヌクレオチドを付加することを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項８】
前記タンパク質リガーゼが平滑末端リガーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記タンパク質リガーゼが、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、またはＴ７  ＤＮＡリガーゼである、請求項７に記載の方法。
【請求項１０】
ライゲーションすることが化学ライゲーションを含む、請求項４に記載の方法。
【請求項１１】
化学ライゲーションが、クリックケミストリー、カルボジイミド、またはホスホロチオエート−ヨウ化物カップリングを使用することを含む、請求項１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記架橋オリゴヌクレオチドが、前記５’切断ハーフ部位を有する前記タグに対する第１の相補性領域、および前記３’切断ハーフ部位を有する前記タグに対する第２の相補性領域を含む、請求項７に記載の方法。
【請求項１３】
前記切断のための触媒が配列特異的エンドヌクレアーゼである、請求項１に記載の方法。
【請求項１４】
前記配列特異的エンドヌクレアーゼが、制限酵素、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、配列特異的リボザイム、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記切断のための触媒が、化学的切断試薬で修飾されたオリゴヌクレオチドである、請求項１に記載の方法。
【請求項１６】
前記化学的切断試薬が鉄：ＥＤＴＡである、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
（ａ）の前に、前記５’切断ハーフ部位を有する前記オリゴヌクレオチドタグおよび前記３’切断ハーフ部位を有する前記オリゴヌクレオチドタグが１：１の比率で前記サンプルに付加される、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
（ａ）〜（ｄ）を含む１ラウンドのＩＰＬが複数のバーコードペアを生成する、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
各ラウンドのＩＰＬが、少なくとも２×１０１０個の複製バーコードペアを生成する、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記サンプルに対して（ａ）〜（ｄ）を含む少なくとも１回の追加のラウンドのＩＰＬを実施して、複数の複製バーコードペアを取得することをさらに含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２１】
２、３、４、５、またはそれ以上のラウンドのＩＰＬが実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２２】
（ａ）〜（ｄ）が単一の反応管内で実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２３】
前記分子が、タンパク質、タンパク質複合体、ペプチド、抗体、炭水化物、核酸、細胞または受容体である、請求項１８に記載の方法。
【請求項２４】
（ａ）〜（ｄ）が分子表面上で実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２５】
（ａ）〜（ｄ）が溶液中で実施される、請求項１８に記載の方法。
【請求項２６】
前記分子表面が有機である、請求項２４に記載の方法。
【請求項２７】
前記分子表面が無機である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記分子表面が、結晶、プラスチック、または金属を含む、請求項２４に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞が、哺乳動物細胞、癌細胞、または感染性因子に感染した細胞である、請求項２３に記載の方法。
【請求項３０】
前記感染性因子がＨＩＶである、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記複製バーコードペアを増幅することをさらに含む、請求項１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
増幅することがＰＣＲを実施することを含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３３】
前記複製バーコードペアに対してＤＮＡ配列決定を実施することをさらに含む、請求項３１に記載の方法。
【請求項３４】
前記サンプル中の１つ以上の分子を同定および定量することをさらに含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
同定および定量することが、前記複製されたバーコードペアの配列からグラフを生成することを含む、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
グラフを生成することは、各バーコードをノードとして解釈し、各バーコードペアをエッジとして解釈することを含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記グラフが、前記サンプル中の前記分子をナノメートルまたはマイクロメートルスケールで配置する、請求項３５に記載の方法。
【請求項３８】
Ｅｒｄｏｓ−Ｒｅｎｙｉランダムグラフ接続性、ランダム幾何学的グラフ接続性、またはスプリングレイアウトアルゴリズムをシミュレートして、前記サンプル中の１つ以上の分子の空間情報を回復することをさらに含む、請求項３５に記載の方法。
【請求項３９】
前記スプリングレイアウトアルゴリズムにＫａｍａｄａ−ＫａｗａｉアルゴリズムのＧｒａｐｈｖｉｚ  Ｎｅａｔｏ実装を適用することをさらに含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
前記Ｋａｍａｄａ−Ｋａｗａｉアルゴリズムは、局所のみのスプリングエネルギー最小化を実施する修正されたバリアントである、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記Ｋａｍａｄａ−Ｋａｗａｉアルゴリズムが適用され、続いて、修正されたＫａｍａｄａ−Ｋａｗａｉアルゴリズムを使用する第２のラウンドが適用される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
（１）分子への取り付けのための官能基、（２）プライマー部位、（３）固有のバーコード、および（４）３’制限ハーフ部位を含む、オリゴヌクレオチドタグ
にライゲーションされた、
（１）分子への取り付けのための官能基、（２）プライマー部位、（３）固有のバーコード、および（４）５’制限ハーフ部位
を含む、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドタグ
を含む、組成物。
【請求項４３】
前記オリゴヌクレオチドタグの各々が分子に取り付けられている、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
個々の分子の空間位置を決定する方法であって、
（ａ）複数の個々の分子を含むサンプルを取得することと、
（ｂ）請求項１に記載の複数ラウンドのＩＰＬを前記サンプルに適用して、複数の複製バーコードペアを生成させることと、
（ｃ）前記複数の複製バーコードペアに対して次世代配列決定を実施することと、
（ｄ）ペアワイズ近接を適用して、前記個々の分子の前記空間位置を決定することと
を含む、前記方法。
【請求項４５】
前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
前記生物学的サンプルが、唾液、尿、血液、または全組織である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４７】
顕微鏡法を使用することを含まない、請求項４４に記載の方法。
【請求項４８】
前記個々の分子が固体支持体に結合されていない、請求項４４に記載の方法。
【請求項４９】
前記分子が、タンパク質、タンパク質複合体、ペプチド、抗体、炭水化物、核酸、細胞、シグナル伝達ドメイン、または受容体である、請求項４４に記載の方法。
【請求項５０】
前記抗体が別の抗体またはリガンドに結合されている、請求項４４に記載の方法。
【請求項５１】
前記分子がタンパク質またはペプチドである、請求項４４に記載の方法。
【請求項５２】
前記タンパク質またはペプチドが癌または感染症のバイオマーカーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項５３】
前記タンパク質またはペプチドが溶液中にある、請求項５１に記載の方法。
【請求項５４】
前記タンパク質またはペプチド中のアミノ酸が、それぞれが固有のバーコードを含むアミノ酸特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグで標識されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項５５】
前記アミノ酸が、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
前記アミノ酸が、翻訳後修飾された側鎖を含む、請求項５４に記載の方法。
【請求項５７】
前記翻訳後修飾された側鎖が、リン酸化、グリコシル化、メチル化、シトルリン化、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項５６に記載の方法。
【請求項５８】
前記タンパク質またはペプチドの同一性および量を決定することをさらに含む、請求項５１に記載の方法。
【請求項５９】
前記タンパク質またはペプチドの前記同一性を決定することは、前記次世代配列決定からアミノ酸パターンを取得すること、および、前記アミノ酸パターンを生物のプロテオームと比較して前記タンパク質またはペプチドを同定することを含む、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
（ｂ）が単一の反応管内で実施される、請求項４４に記載の方法。
【請求項６１】
前記サンプルが２〜１０１２個のタンパク質を含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項６２】
（ｃ）における配列決定の前に前記サンプルが希釈される、請求項４４に記載の方法。
【請求項６３】
前記タンパク質を酵素で消化することをさらに含む、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
前記酵素が前記タンパク質を部位特異的に消化する、請求項６３に記載の方法。
【請求項６５】
前記酵素がトリプシンである、請求項６４に記載の方法。
【請求項６６】
前記消化によりＮ末端アミノ酸が除去されない、請求項６３に記載の方法。
【請求項６７】
前記消化されたタンパク質に第２のセットのＩＰＬラウンドを適用することをさらに含む、請求項６３に記載の方法。
【請求項６８】
ＩＰＬラウンドの各セットからの前記複製バーコードペアを照合して前記タンパク質を同定することをさらに含む、請求項６７に記載の方法。
【請求項６９】
前記分子がナノビーズである、請求項４４に記載の方法。
【請求項７０】
前記ナノビーズの形状、サイズ、またはそれらの組み合わせを決定することをさらに含む、請求項６９に記載の方法。
【請求項７１】
タンパク質またはペプチドの同一性を決定する方法であって、
（ａ）複数のタンパク質、ペプチド、またはそれらの組み合わせを含むサンプルを取得することと、
（ｂ）請求項１に記載の複数ラウンドのＩＰＬを前記サンプルに適用して、複数の複製バーコードペアを生成させることと、
（ｃ）前記複数の複製バーコードペアに対して次世代配列決定を実施することと、
（ｄ）前記次世代配列決定から単一のタンパク質またはペプチドのアミノ酸パターンを取得すること、および、前記アミノ酸パターンを生物のプロテオームと比較して前記タンパク質またはペプチドを同定することと
を含む、前記方法。
【請求項７２】
前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項７１に記載の方法。
【請求項７３】
前記生物学的サンプルが、唾液、尿、血液、または全組織である、請求項７３に記載の方法。
【請求項７４】
顕微鏡法を使用することを含まない、請求項７１に記載の方法。
【請求項７５】
個々の分子が固体支持体に結合されていない、請求項７１に記載の方法。
【請求項７６】
前記タンパク質またはペプチドが癌または感染症のバイオマーカーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項７７】
前記タンパク質またはペプチドが溶液中にある、請求項５１に記載の方法。
【請求項７８】
前記タンパク質またはペプチド中のアミノ酸が、それぞれが固有のバーコードを含むアミノ酸特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグで標識されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項７９】
前記アミノ酸が、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、またはそれらの任意の組み合わせである、請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記アミノ酸が、翻訳後修飾された側鎖を含む、請求項７８に記載の方法。
【請求項８１】
前記翻訳後修飾された側鎖が、リン酸化、グリコシル化、メチル化、シトルリン化、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項８０に記載の方法。
【請求項８２】
（ｂ）が単一の反応管内で実施される、請求項７１に記載の方法。
【請求項８３】
前記サンプルが２〜１０１２個のタンパク質を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項８４】
（ｃ）におけるオリゴヌクレオチド配列決定の前に前記サンプルが希釈される、請求項７１に記載の方法。
【請求項８５】
前記タンパク質を酵素で消化することをさらに含む、請求項８４に記載の方法。
【請求項８６】
前記酵素が前記タンパク質を部位特異的に消化する、請求項８５に記載の方法。
【請求項８７】
前記酵素がトリプシンである、請求項８６に記載の方法。
【請求項８８】
前記消化によりＮ末端アミノ酸が除去されない、請求項８５に記載の方法。
【請求項８９】
前記消化されたタンパク質に第２のセットのＩＰＬラウンドを適用することをさらに含む、請求項８５に記載の方法。
【請求項９０】
ＩＰＬラウンドの各セットからの前記複製バーコードペアを照合して前記タンパク質を同定することをさらに含む、請求項８９に記載の方法。
【請求項９１】
タンパク質を固有に標識するための方法であって、
（ａ）複数のタンパク質を含むサンプルを取得することと、
（ｂ）固有のアミノ酸特異的バーコードを含むオリゴヌクレオチドタグを前記複数のタンパク質に取り付けることと、
（ｃ）前記サンプルを３つ以上のコンパートメントに分割することと、
（ｄ）コンパートメント特異的オリゴヌクレオチドタグで前記複数のタンパク質を標識することと、
（ｅ）前記３つ以上のコンパートメントから前記サンプルをプールすること、および、前記サンプルを３つ以上のコンパートメントに再分割することと、
（ｆ）第２のコンパートメント特異的オリゴヌクレオチドタグを前記複数のタンパク質に取り付け、それにより、固有に標識されたタンパク質を取得することと
を含む、前記方法。
【請求項９２】
前記サンプルをプールすること、前記サンプルを分割すること、および、追加のコンパートメント特異的オリゴヌクレオチドタグを取り付けて、固有に標識されたタンパク質を取得すること
である１回以上のラウンドをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記アミノ酸特異的バーコードが、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、トリプトファン、またはヒスチジンに特異的である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記複数のタンパク質中のアミノ酸が、翻訳後修飾された側鎖を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９５】
前記翻訳後修飾された側鎖が、リン酸化、グリコシル化、メチル化、シトルリン化、またはそれらの任意の組み合わせを含む、請求項９３に記載の方法。
【請求項９６】
前記アミノ酸特異的バーコードが、前記バーコードをアミノ酸に取り付けるための官能基を含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９７】
前記官能基が、スクシンイミジルエステル、ヨードアセトアミド、マレイミド、アミン、４−フェニル−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３，５（４Ｈ）−ジオン（ＰＴＡＤ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルクロリド、およびチオールからなる群から選択される、請求項９６に記載の方法。
【請求項９８】
前記タンパク質を酵素で消化することをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項９９】
前記酵素が前記タンパク質を部位特異的に消化する、請求項９１に記載の方法。
【請求項１００】
前記酵素がトリプシンである、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０１】
消化によりＮ末端アミノ酸が除去されない、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０２】
前記消化されたタンパク質に第２のセットのＩＰＬラウンドを適用することをさらに含む、請求項９１に記載の方法。
【請求項１０３】
タンパク質の同一性を決定する方法であって、
（ａ）請求項９１〜９７のいずれか１項に記載の複数の固有に標識されたタンパク質を含むサンプルを取得することと、
（ｂ）複数の複製バーコードペアに対して次世代配列決定を実施することと、
（ｃ）前記次世代配列決定から単一のタンパク質またはペプチドのアミノ酸パターンを取得すること、および、前記アミノ酸パターンを生物のプロテオームと比較して前記タンパク質またはペプチドを同定することと
を含む、前記方法。
【請求項１０４】
前記サンプルが生物学的サンプルである、請求項７１に記載の方法。
【請求項１０５】
前記生物学的サンプルが、唾液、尿、血液、または全組織である、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
顕微鏡法を使用することを含まない、請求項７１に記載の方法。
【請求項１０７】
個々の分子が固体支持体に結合されていない、請求項７１に記載の方法。
【請求項１０８】
前記タンパク質またはペプチドが癌または感染症のバイオマーカーである、請求項５１に記載の方法。
【請求項１０９】
前記タンパク質またはペプチドが溶液中に遊離している、請求項５１に記載の方法。
【請求項１１０】
前記タンパク質またはペプチド中のアミノ酸が、それぞれが固有のバーコードを含むアミノ酸特異的ＤＮＡオリゴヌクレオチドタグで標識されている、請求項５１に記載の方法。
【請求項１１１】
前記サンプルが約２〜１０１２個のタンパク質を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項１１２】
前記サンプルが少なくとも約１０１０個のタンパク質を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項１１３】
前記サンプルが少なくとも約１０１１個のタンパク質を含む、請求項７１に記載の方法。
【請求項１１４】
（ｃ）におけるオリゴヌクレオチド配列決定の前に前記サンプルが希釈される、請求項７１に記載の方法。
【請求項１１５】
前記タンパク質を酵素で消化することをさらに含む、請求項１１４に記載の方法。
【請求項１１６】
前記酵素が前記タンパク質を部位特異的に消化する、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記酵素がトリプシンである、請求項１１６に記載の方法。
【請求項１１８】
前記消化によりＮ末端アミノ酸が除去されない、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１９】
分子近傍を検出する方法であって、
（ａ）タンパク質の希釈溶液を取得することと、
（ｂ）マルチラウンド技術を使用してアミノ酸の位置情報を生成することと、
（ｃ）前記位置情報を分析して分子近傍を取得することと
を含む、前記方法。
【請求項１２０】
互いに近接したアミノ酸を含むタンパク質またはタンパク質複合体を同定することをさらに含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２１】
少なくとも第２のタンパク質またはタンパク質複合体を同定することをさらに含む、請求項１２０に記載の方法。
【請求項１２２】
２ラウンド技術がＩＰＬまたはスプリットアンドプールラベリングである、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２３】
前記マルチラウンド技術が、請求項１〜４１または４４〜１１８のいずれか１項に記載の方法である、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２４】
前記マルチラウンド技術が、第１のラウンドと第２のラウンドとの間のタンパク質分解を含む、請求項１１９に記載の方法。
【請求項１２５】
前記マルチラウンド技術が２ラウンド技術である、請求項１１９に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１８年７月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６９７，１７９号の利益を主張し、これはその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
配列表の組み込み
２０１９年７月１２日に作成された２ＫＢ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ  Ｗｉｎｄｏｗｓで測定）の「ＵＴＦＢＰ１１９５ＷＯ．ｔｘｔ」という名前のファイルに含まれている配列表は、電子提出によって添付して提出され、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００３】
本発明は、Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈによって授与された助成金番号ＯＤ００９５７２およびＲ３５ＧＭ１２２４８０ならびにＳｐａｃｅ  ａｎｄ  Ｎａｖａｌ  Ｗａｒｆａｒｅ  Ｓｙｓｔｅｍｓ  Ｃｅｎｔｅｒ，Ｐａｃｉｆｉｃから授与された助成金番号Ｎ６６００１−１４−２−４０５１の下で政府の支援を受けてなされた。政府は本発明に関して一定の権利を有する。
【０００４】
１．分野
本開示は、一般に、化学および分子生物学の分野に関する。より具体的には、本開示は、どの分子が空間内の同じ近傍を共有するかを同定するための方法、および空間内のこれらの分子の位置をマッピングすること、または他のバリエーションではオリゴヌクレオチドを使用して分子を検出および識別することを可能にする、結果として生じるアプローチに関する。
【背景技術】
【０００５】
２．関連技術の説明
ＤＮＡは、生物の遺伝子情報を運ぶだけでなく、幅広い用途の分野で有用であることが証明されている。ＤＮＡを操作するための化学と酵素の習得が深まるにつれて、その有用性の幅も広がっている。この傾向に寄与する最も強力な開発の１つは、ハイスループットＤＮＡ配列決定の急速な成長であり（Ｓｈｅｎｄｕｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）、現在、この世界に関する驚くべき新しい情報の流れを提供している。
【０００６】
ＤＮＡバーコーディング−実験全体にわたって分子またはそれらのコピーを同定するためのアプローチとして、特定の事前に設計されたＤＮＡ配列を分子に組み込むこと−は、配列決定のスループットを加速するための重要な革新であり（ＢｕｓｃｈｍａｎｎおよびＢｙｓｔｒｙｋｈ、２０１３）、生物学と情報理論の興味深い交差点に位置している。ＤＮＡバーコーディングの最も基本的な用途は、個々の分子が操作されるときにラベルを付け、ひいては追跡することである。この概念は、粒子の同一性を追跡することを超えた情報を取得するために拡張され、例えば、相互作用パートナー（Ｓｏｄｅｒｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）および空間位置（Ｓｃｈａｕｓ  ｅｔ  ａｌ．，２０１７）。しかし、分子の空間位置を使用することによって、タンパク質またはペプチドなどの単一分子を検出する改善された方法に対する満たされていない必要性が存在する。
【発明の概要】
【０００７】
特定の実施形態において、本開示は、分子近傍を問い合わせる方法を提供する。希薄タンパク質のサンプルは、オリゴヌクレオチドプローブを使用して、反復近接ライゲーション（ＩＰＬ）またはスプリットアンドプールラベリングを含む２ラウンド技術などによって位置情報を問い合わせることができる。ＩＰＬ法は、オリゴヌクレオチドプローブが到達できるどの場所によっても近傍を定義するために使用できるのに対して、スプリットアンドプール法は、物理的中間体を介して相互にリンクされたオリゴヌクレオチドのセットによって近傍を定義するために使用できる。
【０００８】
一実施形態では、反復近接ライゲーション（ＩＰＬ）を実施するための方法が提供され、この方法は、オリゴヌクレオチドタグ（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）タグ）をサンプルの複数の分子に取り付けることであって、前記オリゴヌクレオチドタグは、（１）分子への取り付けのための官能基、（２）プライマー部位、（３）固有のバーコード、および（４）５’切断ハーフ部位または３’切断ハーフ部位を含む、ことと、５’切断ハーフ部位を有する前記オリゴヌクレオチドタグを、近接して保持され３’切断ハーフ部位を有する前記オリゴヌクレオチドタグにライゲーションし、それによって１つまたは複数のバーコードペアを生成させることと、前記１つ以上のバーコードペアの前記オリゴヌクレオチドタグの１つにおいてプライマーを伸長させてバーコードペアの複製物を生成させることと、切断用の触媒を添加してオリゴヌクレオチドタグを分離することとを含む。
【０００９】
いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドタグは一本鎖または二本鎖である。特定の態様において、官能基は、スクシンイミジルエステル、ヨードアセトアミド、マレイミド、アミン、４−フェニル−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３，５（４Ｈ）−ジオン（ＰＴＡＤ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルクロリド、およびチオールからなる群から選択される。
【００１０】
いくつかの態様では、ライゲーションすることは可逆的である。特定の態様において、タグは蛍光標識にコンジュゲートされていない。特定の態様において、ライゲーションすることは、タンパク質リガーゼおよび架橋オリゴヌクレオチドを付加することを含む。いくつかの態様において、タンパク質リガーゼは平滑末端リガーゼである。特定の態様において、タンパク質リガーゼは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、またはＴ７ＤＮＡリガーゼである。いくつかの態様において、ライゲーションは化学ライゲーションを含む。特定の態様において、化学ライゲーションは、クリックケミストリー、カルボジイミド、またはホスホロチオエート−ヨウ化物カップリングを使用することを含む。
【００１１】
特定の態様において、架橋オリゴヌクレオチドは、５’切断ハーフ部位を有するタグに対する第１の相補性領域、および３’切断ハーフ部位を有するタグに対する第２の相補性領域を含む。いくつかの態様において、切断のための触媒は配列特異的エンドヌクレアーゼである。特定の態様において、配列特異的エンドヌクレアーゼは、制限酵素、ジンクフィンガーヌクレアーゼ、配列特異的リボザイム、またはＣＲＩＳＰＲ関連エンドヌクレアーゼである。いくつかの態様において、切断のための触媒は、化学的切断試薬で修飾されたオリゴヌクレオチドである。特定の態様において、化学的切断試薬は鉄：ＥＤＴＡである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドタグを取り付ける前に、５’切断ハーフ部位を有するオリゴヌクレオチドタグおよび３’切断ハーフ部位を有するオリゴヌクレオチドタグは、１：１の比率でサンプルに付加される。
【００１２】
いくつかの態様では、１ラウンドのＩＰＬは複数のバーコードペアを生成する。特定の態様において、各ラウンドのＩＰＬは、少なくとも２×１０１０（例えば、少なくとも２×１０１１、２×１０１２、２×１０１３、または２×１０１４）個の複製バーコードペアを生成する。
【００１３】
追加の態様では、この方法は、サンプルに対して少なくとも１回の追加のＩＰＬラウンドを実施して、複数の複製バーコードペアを取得することをさらに含む。特定の態様では、２、３、４、５、またはそれ以上のラウンドのＩＰＬが実施される。特定の態様では、１回以上のＩＰＬは、単一の反応管内で実施される。
【００１４】
いくつかの態様において、分子は、タンパク質、タンパク質複合体、ペプチド、抗体、炭水化物、核酸、細胞または受容体である。特定の態様では、ＩＰＬは、分子表面上または溶液中で実施される。いくつかの態様において、分子表面は有機または無機である。特定の態様では、分子表面は、結晶、プラスチック、または金属を含む。特定の態様では、細胞は哺乳動物細胞、癌細胞、または感染性因子に感染した細胞である。特定の態様では、感染性因子はＨＩＶである。
【００１５】
追加の態様では、この方法は、複製バーコードペアを増幅することをさらに含む。いくつかの態様において、増幅することは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施することを含む。いくつかの態様において、この方法は、複製バーコードペアに対して配列決定を実施することをさらに含む。特定の態様では、この方法は、サンプル中の１つ以上の分子を同定および定量することをさらに含む。特定の態様では、同定および定量化は、複製バーコードペアの配列からグラフを生成することを含む。いくつかの態様では、グラフを生成することは、各バーコードをノードとして解釈し、各バーコードペアをエッジとして解釈することを含む。いくつかの態様において、グラフは、サンプル中の分子をナノメートルまたはマイクロメートルスケールで配置する。特定の態様では、この方法は、Ｅｒｄｏｓ−Ｒｅｎｙｉランダムグラフ接続性、ランダム幾何学的グラフ接続性、またはスプリングレイアウトアルゴリズムをシミュレートして、サンプル中の１つ以上の分子の空間情報を回復することをさらに含む。特定の態様では、この方法は、スプリングレイアウトアルゴリズムにＫａｍａｄａ−ＫａｗａｉアルゴリズムのＧｒａｐｈｖｉｚ  Ｎｅａｔｏ実装を適用することをさらに含む。いくつかの態様では、Ｋａｍａｄａ−Ｋａｗａｉアルゴリズムは、局所のみのスプリングエネルギー最小化を実施する修正されたバリアントである。特定の態様では、Ｋａｍａｄａ−Ｋａｗａｉアルゴリズムが適用され、続いて、修正されたＫａｍａｄａ−Ｋａｗａｉアルゴリズムを使用する第２のラウンドが適用される。
【００１６】
別の実施形態では、
（１）分子への取り付けのための官能基、（２）プライマー部位、（３）固有のバーコード、および（４）３’制限ハーフ部位を含む、オリゴヌクレオチドタグ
にライゲーションされた、
（１）分子への取り付けのための官能基、（２）プライマー部位、（３）固有のバーコード、および（４）５’制限ハーフ部位を含む、オリゴヌクレオチドタグ
を含む、組成物が提供される。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドタグのそれぞれは、分子に取り付けられている。
【００１７】
さらに別の実施形態では、個々の分子の空間位置を決定する方法であって、複数の個々の分子を含むサンプルを取得することと、請求項１に記載の複数ラウンドのＩＰＬをサンプルに適用して、複数の複製バーコードペアを生成させることと、複数の複製バーコードペアに対して次世代配列決定を実施することと、ペアワイズ近接を適用して、個々の分子の空間位置を決定することと、を含む方法が提供される。
【００１８】
いくつかの態様において、サンプルは生物学的サンプルである。特定の態様において、生物学的サンプルは、唾液、尿、血液、または全組織である。特定の態様では、この方法は、顕微鏡法を使用することを含まない。特定の態様において、個々の分子は、固体支持体に結合されていない。
【００１９】
いくつかの態様において、分子は、タンパク質、タンパク質複合体、ペプチド、抗体、炭水化物、核酸、細胞、シグナル伝達ドメイン、または受容体である。特定の態様において、抗体は、別の抗体またはリガンドに結合されている。特定の態様において、分子はタンパク質またはペプチドである。特定の態様において、タンパク質またはペプチドは、癌または感染症のバイオマーカーである。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドは溶液中にある。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチド中のアミノ酸は、それぞれが固有のバーコードを含むアミノ酸特異的オリゴヌクレオチドタグで標識されている。特定の態様において、アミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの態様において、アミノ酸は、翻訳後修飾された側鎖を含む。特定の態様では、翻訳後修飾された側鎖は、リン酸化、グリコシル化、メチル化、シトルリン化、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
【００２０】
追加の態様では、この方法は、タンパク質またはペプチドの同一性および量を決定することをさらに含む。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチドの同一性を決定することは、次世代配列決定からアミノ酸パターンを取得すること、および、アミノ酸パターンを生物のプロテオームと比較してタンパク質またはペプチドを同定することを含む。
【００２１】
特定の態様では、第２の工程は、単一の反応管内で実施される。いくつかの態様において、サンプルは、少なくとも３、４、５、１０、１５、２０、５０、１００、５００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、１０１２個以上のタンパク質などの２〜１０１２個のタンパク質を含む。いくつかの態様において、サンプルは、ＤＮＡ配列決定の前に希釈される。
【００２２】
追加の態様では、この方法は、タンパク質を酵素で消化することをさらに含む。特定の態様において、酵素は、タンパク質を部位特異的に消化する。特定の態様において、酵素はトリプシンである。いくつかの態様において、消化によりＮ末端アミノ酸は除去されない。
【００２３】
いくつかの態様において、この方法は、消化されたタンパク質に第２のセットのＩＰＬラウンドを適用することをさらに含む。特定の態様では、この方法は、ＩＰＬラウンドの各セットからの複製バーコードペアを照合して前記タンパク質を同定することをさらに含む。
【００２４】
いくつかの態様において、分子はナノビーズである。特定の態様では、この方法は、ナノビーズの形状およびサイズを決定することをさらに含む。
【００２５】
さらなる実施形態は、タンパク質またはペプチドの同一性を決定する方法であって、複数のタンパク質、ペプチド、またはそれらの組み合わせを含むサンプルを取得することと、請求項１に記載の複数ラウンドのＩＰＬを前記サンプルに適用して、複数の複製バーコードペアを生成させることと、複数の複製バーコードペアに対して次世代配列決定を実施することと、次世代配列決定から単一のタンパク質またはペプチドのアミノ酸パターンを取得すること、および、アミノ酸パターンを生物のプロテオームと比較してタンパク質またはペプチドを同定することと、を含む方法を提供する。
【００２６】
いくつかの態様において、サンプルは生物学的サンプルである。特定の態様において、生物学的サンプルは、唾液、尿、血液、または全組織である。特定の態様において、タンパク質またはペプチドは、癌または感染症のバイオマーカーである。
【００２７】
特定の態様では、この方法は、顕微鏡法を使用することを含まない。いくつかの態様において、個々の分子は、固体支持体に結合されていない。特定の態様において、タンパク質またはペプチドは溶液中にある。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチド中のアミノ酸は、それぞれが固有のバーコードを含むアミノ酸特異的オリゴヌクレオチドタグで標識されている。特定の態様において、アミノ酸は、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、またはそれらの組み合わせである。特定の態様において、アミノ酸は、翻訳後修飾された側鎖を含む。いくつかの態様において、翻訳後修飾された側鎖は、リン酸化、グリコシル化、メチル化、シトルリン化、またはそれらの組み合わせを含む。
【００２８】
いくつかの態様において、第２の工程は、単一の反応管内で実施される。いくつかの態様において、サンプルは、少なくとも３、４、５、１０、１５、２０、５０、１００、５００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２個のタンパク質などの約２〜約１０１２個のタンパク質を含む。サンプルは配列決定の前に希釈される。
【００２９】
追加の態様では、この方法は、タンパク質を酵素で消化することをさらに含む。いくつかの態様において、酵素は、タンパク質を部位特異的に消化する。特定の態様において、酵素はトリプシンである。いくつかの態様において、消化によりＮ末端アミノ酸は除去されない。
【００３０】
いくつかの態様において、この方法は、消化されたタンパク質に第２のセットのＩＰＬラウンドを適用することをさらに含む。特定の態様では、この方法は、ＩＰＬラウンドの各セットからの複製バーコードペアを照合して前記タンパク質を同定することをさらに含む。
【００３１】
別の実施形態では、タンパク質を固有に標識するための方法であって、複数のタンパク質を含むサンプルを取得することと、固有のアミノ酸特異的バーコードを含むオリゴヌクレオチドタグを複数のタンパク質に取り付けることと、サンプルを３つ以上のコンパートメントに分割することと、コンパートメント特異的オリゴヌクレオチドタグで前記複数のタンパク質を標識することと、前記３つ以上のコンパートメントからサンプルをプールすること、および、前記サンプルを３つ以上のコンパートメントに再分割することと、第２のコンパートメント特異的オリゴヌクレオチドタグを前記複数のタンパク質に取り付け、それにより、固有に標識されたタンパク質を取得することと、を含む方法が提供される。
【００３２】
追加の態様では、この方法は、サンプルをプールすること、サンプルを分割すること、および、追加のコンパートメント特異的オリゴヌクレオチドタグを取り付けて、固有に標識されたタンパク質を取得することである１回以上のラウンドをさらに含む。いくつかの態様において、アミノ酸特異的バーコードは、リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、トリプトファン、またはヒスチジンに特異的である。特定の態様において、複数のタンパク質中のアミノ酸は、翻訳後修飾された側鎖を含む。いくつかの態様において、翻訳後修飾された側鎖は、リン酸化、グリコシル化、メチル化、シトルリン化、またはそれらの組み合わせを含む。特定の態様において、アミノ酸特異的バーコードは、バーコードをアミノ酸に取り付けるための官能基を含む。いくつかの態様において、官能基は、スクシンイミジルエステル、ヨードアセトアミド、マレイミド、アミン、４−フェニル−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３，５（４Ｈ）−ジオン（ＰＴＡＤ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルクロリド、およびチオールからなる群から選択される。
【００３３】
いくつかの態様において、この方法は、タンパク質を酵素で消化することをさらに含む。特定の態様において、酵素は、タンパク質を部位特異的に消化する。特定の態様において、酵素はトリプシンである。いくつかの態様において、消化によりＮ末端アミノ酸は除去されない。
【００３４】
いくつかの態様において、この方法は、消化されたタンパク質に第２のセットのＩＰＬラウンドを適用することをさらに含む。
【００３５】
さらに別の実施形態では、本実施形態およびその態様による、複数の固有に標識されたタンパク質を含むサンプルを取得することと、複数の複製バーコードペアに対して次世代配列決定を実施することと、次世代配列決定から単一のタンパク質またはペプチドのアミノ酸パターンを取得すること、および、アミノ酸パターンを生物のプロテオームと比較してタンパク質またはペプチドを同定することと、を含む方法が提供される。
【００３６】
特定の態様において、サンプルは生物学的サンプルである。特定の態様において、生物学的サンプルは、唾液、尿、血液、または全組織である。
【００３７】
特定の態様では、この方法は、顕微鏡法を使用することを含まない。いくつかの態様において、個々の分子は、固体支持体に結合されていない。特定の態様において、タンパク質またはペプチドは、癌または感染症のバイオマーカーである。特定の態様において、タンパク質またはペプチドは、溶液中に遊離している。いくつかの態様において、タンパク質またはペプチド中のアミノ酸は、それぞれが固有のバーコードを含むアミノ酸特異的オリゴヌクレオチドタグで標識されている。いくつかの態様において、サンプルは、少なくとも３、４、５、１０、１５、２０、５０、１００、５００、１０３、１０４、１０５、１０６、１０７、１０８、１０９、１０１０、１０１１、または１０１２個のタンパク質などの約２〜約１０１２個のタンパク質を含む。特定の態様において、サンプルは、配列決定の前に希釈される。
【００３８】
追加の態様では、この方法は、タンパク質を酵素で消化することをさらに含む。いくつかの態様において、酵素は、タンパク質を部位特異的に消化する。いくつかの態様において、酵素はトリプシンである。特定の態様において、消化によりＮ末端アミノ酸は除去されない。
【００３９】
さらなる実施形態は、分子近傍を検出する方法であって、タンパク質の希釈溶液を取得することと、２ラウンド技術を使用してアミノ酸の位置情報を生成させることと、位置情報を分析して分子近傍を取得することと、を含む方法を提供する。特定の態様では、この方法は、互いに近接したアミノ酸を含むタンパク質またはタンパク質複合体を同定することをさらに含む。いくつかの態様において、この方法は、少なくとも第２のタンパク質またはタンパク質複合体を同定することをさらに含む。特定の側面では、２ラウンド手法はＩＰＬまたはスプリットアンドプールラベリングである。特定の態様では、２ラウンド技術は、本実施形態およびその態様による方法である。いくつかの態様において、２ラウンド技術は、第１のラウンドと第２のラウンドとの間のタンパク質分解を含む。
【００４０】
本明細書で使用される場合、特定の成分に関して「本質的に含まない」は、本明細書では、特定の成分のいずれも意図的に組成物に配合されていないか、または汚染物質としてもしくは痕跡量で存在することを意味するために使用される。したがって、組成物の何らかの意図しない汚染に起因する特定の成分の総量は、０．０５％をはるかに下回り、好ましくは０．０１％を下回る。別の実施形態において、特定の成分の量が標準的な分析方法で検出され得ない組成物である。
【００４１】
本明細書で使用される場合、本明細書では、「ａ」または「ａｎ」は、１つ以上を意味し得る。本明細書で特許請求の範囲で使用される場合、「含む」という単語と併せて使用される場合、「ａ」または「ａｎ」という単語は、１つ以上を意味し得る。
【００４２】
本明細書で使用される場合、「別の」は、少なくとも第２のまたはそれ以上のものを意味し得る。
【００４３】
本明細書全体を通して、「約」という用語は、値が、値を決定するために使用されるデバイス、方法の固有の誤差の変動、または研究対象間に存在する変動を含むことを示すために使用される。
【００４４】
本開示の他の目的、特徴および利点は、以下の詳細な説明から明らかになるであろう。本開示の趣旨および範囲内の様々な変更および修正がこの詳細な説明から当業者に明らかになるので、詳細な説明および特定の実施例は、本開示の好ましい実施形態を示す一方で、例示として与えられる。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本開示の特定の態様をさらに実証するために含まれている。本開示は、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて、これらの図面の１つ以上を参照することによってよりよく理解され得る。
【００４６】
【図１】図１Ａ〜１Ｄ：反復近接ライゲーションスキームの概要。Ａ、上：各反復近接ライゲーション（ＩＰＬ）オリゴヌクレオチドは、取り付け用の官能基、プライマー部位、固有のバーコード配列、および制限ハーフ部位の４つのコンポーネントを含むように合成された一本鎖デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）である。Ａ、下：オリゴヌクレオチド集団は、架橋オリゴの存在下で、例えば、Ｔ４リガーゼを使用してライゲーションできるように、２つの反対の極性の１：１混合物（Ａ、下）の約１：１混合物である。プライマーおよび制限部位の配列は、各極性で共有され、バーコードは全体集団で固有である。（Ｂ）１ラウンドのＩＰＬは、反対の極性の２つのオリゴヌクレオチドをライゲーションすること、プライマーの１つを伸長させてバーコードペアを溶液中で複製すること、および両方のオリゴヌクレオチドをライゲーションされていない状態に戻す制限を含む。（Ｃ）複数の隣接するオリゴヌクレオチドの存在が、各ラウンドで異なるバーコードペアを記録することを可能にする。ＩＰＬは、オリゴヌクレオチドのバルク集団に並行して作用し、各ラウンドで一度に多くのバーコードペアが記録される。（Ｄ）複数のＩＰＬラウンドの後、記録されたすべてのバーコードペアは、次世代ＤＮＡ配列決定によって配列決定される。配列決定されたペアのグラフとしての解釈−各個々のバーコードがノードとして扱われ、各ペアがエッジとして扱われる−は、豊富な用途空間につながる。
【図２】図２Ａ〜２Ｄ：回復される可能なノードと可能なエッジの数は、ＩＰＬラウンドの数と各ラウンド中のライゲーション効率に伴って増加する。ＩＰＬラウンドとライゲーション効率パラメーターの各組み合わせについて、ポアソン過程を介してランダムな「Ｗ」形状をパターン化する１００の独立した複製をシミュレートした後、堆積したオリゴヌクレオチド間のライゲーションを反復シミュレーションした。次に、理想的なシナリオ（すなわち、２つの相補的なオリゴヌクレオチドの到達範囲内にあるならば、すべてのノードが確実にライゲーションするシナリオ）の下で、すべての可能な関与しているノードのパーセントとして、最大のＩＰＬグラフコンポーネントに関与している、ノードおよびエッジの数を追尾した。（Ａ）最大のコンポーネントに参加しているノードのパーセント、１００回のシミュレーションで平均化されている。（Ｂ）Ａにおける１００回のシミュレーションにわたる相対標準偏差。（Ｃ）１００回のシミュレーションにわたって平均した、最大のコンポーネントに関与する可能性のあるエッジのパーセント。（Ｄ）Ｃにおける１００回のシミュレーションにわたる相対標準偏差。正方形はシミュレーションに使用されるパラメーターを示し、ノードの平均９８％と可能なエッジの４４％が最大のコンポーネントに関与している。
【図３】ライゲーション効率が０．３の６回のＩＰＬラウンドでも、全体的に元のパターンが回復する。最大のグラフコンポーネントに接続されていないノードは、接続されているピアの大部分に関連するノードの位置を確認できないため、表示されないことに留意されたい。
【図４】図４Ａ〜４Ｂ：ＩＰＬ単一分子プロテオミクスラベリングスキーム。（Ａ）システイン、リジン、トリプトファン、およびカルボキシレートは、各アミノ酸の側鎖に特異的なハンドルを介して、バーコード付きオリゴヌクレオチドで選択的に標識できる。オリゴヌクレオチドは、それらの標的アミノ酸種の同一性と、タンパク質の大きな混合物の中で各個々のアミノ酸に固有のランダム配列をコードする。（注：わかりやすくするために、プライマーおよびハーフ制限部位は図から省略されている。）（Ｂ）この化学物質は、バルク溶液中でタンパク質混合物に適用され、各タンパク質を変性させ、そのアミノ酸をバーコード化する。
【図５】図５Ａ〜５Ｃ：タンパク質を固有に同定するためには、部分的なアミノ酸組成で十分である。Ａ：標識タンパク質の希釈集団に対してＩＰＬを実行すると、各タンパク質の標識アミノ酸の集計が得られる。この部分的な組成情報は、３つのラベルの組み合わせを使用して、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびホモ・サピエンス（Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ）プロテオームのかなりの部分を特定するために十分である。「［Ｄ｜Ｅ］」は、Ａｓｐ／Ｇｌｕラベルを示す。同定されたタンパク質の数は、各バーの上にある。Ｅ．ｃｏｌｉおよびＨ．ｓａｐｉｅｎｓプロテオームには、それぞれ４２９７個および１９９８８個のタンパク質が含まれている。Ｂ：タンパク質全体にＩＰＬラウンドの最初の配列決定を適用した後、それらをトリプシンで消化することができ、トリプシンペプチドに対してＩＰＬラウンドの別の配列決定を反復することができる。すべてのバーコードはタンパク質集団全体にわたって固有であるため、ＩＰＬラウンドの第１のセットおよび第２のセットのオリゴヌクレオチドペアを調整できる。第２段階のトリプシンサブ配列決定に関する追加の組成情報は、同定を大幅に向上させる。Ｃ：ラベル効率が低下した場合でさえ、プロテオームのかなりの割合を特定できる。ＣｙｓおよびＡｓｐ／Ｇｌｕの標識効率は、実験的に定量的であることが示されている。
【図６】固体支持体上の可逆的ライゲーションのテスト。左右のプローブ（表１）は約１：１の比率で混合され、次いで磁性ストレプトアビジンビーズとともにインキュベートされる。最初のライゲーション後、ビーズを十分に混合し、ｑＰＣＲ用にピペットでランダムにサンプリングした。残りのビーズを洗浄し、制限酵素とともにインキュベートし、再度サンプリングした。２回目のライゲーションを行い、サンプリングした。すべてのライゲーションと制限は、制限／ライゲーション部位を補完するコネクターの追加を必要とした（表１）。
【図７】図７Ａ〜７Ｃ：ライゲーションおよび制限後のライゲーションプローブの定量。Ａ：プローブが取り付けられたビーズは、６回の反復のそれぞれについて、第１のライゲーション、制限、および第２のライゲーションの後にサンプリングされた。ライゲーションされたプローブの数は、ｑＰＣＲを使用して各反応後にそれぞれで定量された。Ｂ：各複製のＣｑは制限後に大幅に増加し、残りのライゲーションペアが大幅に減少したことを暗示する。Ｃ：すべてのｑＰＣＲ反応はサイズマーカー付きのＰＡＧＥゲルで実行され、オリゴヌクレオチド配列から予想される６５ｂｐの生成物サイズを確認した（表１）。
【図８】タンパク質内のアミノ酸をバーコード化および同定するためのスプリット配列決定単一分子プロテオミクス法を示す概略図。
【図９】Ｋａｍａｄａ−Ｋａｗａｉアルゴリズムは、２つのノード間のグラフ距離をそれらの間の望ましいユークリッド距離とみなす。凹型のジオメトリは、ノードがグラフ空間（破線）よりもユークリッド空間（矢印の付いた実線）においてはるかに近くなる。この不一致により、グラフのレイアウト中にノードが強制的に分離される。この問題は、回復されたレイアウトを取得し、グローバル最小化ではなく局所のみのスプリングエネルギー最小化を実施するＫＫアルゴリズムの修正されたバリアントに再フィードすることで補正された。これにより、大規模な歪みが大幅に減少した。
【図１０Ａ−１】図１０Ａ〜１０Ｂ：様々なフォトリシグラフ形状の表面に沈着する可能性のあるＤＮＡ。（図１０Ｂ）不完全な条件下で回復されたアナログの写真リソグラフィー形状。
【図１０Ａ−２】図１０Ａ−１の説明を参照されたい。
【図１０Ａ−３】図１０Ａ−１の説明を参照されたい。
【図１０Ｂ−１】図１０Ａ−１の説明を参照されたい。
【図１０Ｂ−２】図１０Ａ−１の説明を参照されたい。
【図１０Ｂ−３】図１０Ａ−１の説明を参照されたい。
【図１１Ａ】二重標識アジドリジンペプチド設計。
【図１１Ｂ】コンジュゲートされたオリゴを有する二重標識アジドリジンペプチド。
【図１２Ａ】対照（非スプリットアンドプール）標識およびライゲーション実験の概要。（工程１）ＣｕＡＡＣを介してダブルＡｚＫペプチドをヘキシニルオリゴで標識する。ＰＡＧＥにより二重標識ペプチドを単離する。（工程２）標識ペプチドに３ラウンドのバーコードライゲーションを実施し、生成物を分離する。（工程３）ライゲーションされたバーコードをＰＣＲ増幅し、配列を確認する。
【図１２Ｂ】対照（非スプリットアンドプール）オリゴヌクレオチド設計。
【図１２Ｃ】ＰＡＧＥによって単離された二重標識ペプチド。
【図１２Ｄ】ストレプトアビジンゲルシフトによるペプチドの存在の確認。
【図１３Ａ】ＰＡＧＥゲル分析による各ラウンドのライゲーション。
【図１３Ｂ】二重標識ペプチドのＰＣＲ。
【図１４Ａ】スプリットアンドプール法のためのバーコード。「Ｎ」はＵＭＩを表す。
【図１４Ｂ】ＰＡＧＥによって単離されたスプリットアンドプールライゲーション生成物。
【図１４Ｃ】チオール／マレイミド反応を使用したシステインの標識。
【図１４Ｄ】チオール／マレイミド反応を使用したシステインの標識。
【図１４Ｅ】チオール／マレイミド標識された生成物に対するライゲーションおよびＰＣＲ。
【図１５Ａ】精製された生成物の段階希釈ｑＰＣＲ。
【図１５Ｂ】精製された生成物の増幅およびサンガー配列決定。
【図１５Ｃ】配列品質曲線。
【図１６】図１６Ａ〜１６Ｄ：（Ａ）アラインメントスコアの分布。（Ｂ）組み合わせのアライメントスコア。（Ｃ）スコアが２６０以上の代表的なアライメント（すなわち生成物の完全なアライメントスコア）。（Ｄ）スコアが２４０〜２５０の代表的なアラインメント（すなわち準最適アラインメント）。
【発明を実施するための形態】
【００４７】
特定の実施形態において、本開示は、分子特異的核酸バーコードを、複数回連続して実施するように設計された近接ライゲーションアッセイと組み合わせることによって測定されるような、核酸分子（例えば、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）分子）の相対的空間分布について報告するために核酸配列決定を使用するための新規アプローチを提供する。そのような核酸バーコードは、ＤＮＡまたはリボ核酸（ＲＮＡ）バーコードであり得る。そのような核酸バーコードは、少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２０、３０、４０、５０、またはそれ以上の核酸塩基の長さを有するオリゴヌクレオチドであり得る。重要なことに、本発明の方法は、分子を検出または同定するために顕微鏡法の使用を必要としない。視覚情報に依存しないことにより、本発明の方法は、従来の顕微鏡法の制限を回避して、数百万の分子を並行してなど、個々の分子に関する情報を並行して取得することができる。さらに、本発明の方法は、粒子追跡、閉塞、または混合物の複雑さに依存しない。
【００４８】
本研究は、ＤＮＡ配列情報を使用して、どのように多くのＤＮＡ分子の空間位置を同時に回復できるかを、コンピュータシミュレーションを使用して実証した。本明細書で提供される方法は、オブジェクトの形状（例えば、マイクロメートル（またはミクロン）スケールで）および単一分子プロテオミクスを決定するために使用され得る。特に、本研究は、単純なモデルシステムに対する原理実証の反復ライゲーションを実験的に実証している。
【００４９】
本発明の方法は、オリゴヌクレオチド対ごとの単一の読み出しから、同じオリゴヌクレオチド分子を再利用する複数の可逆的で反復的なライゲーションまでのＤＮＡ（またはＲＮＡなどの他の核酸）近接ライゲーションを利用する。したがって、本開示の特定の実施形態は、反復近接ライゲーション（ＩＰＬ）を使用して、各オリゴヌクレオチドおよびその様々な隣接物についての複数のライゲーションイベントを捕捉する方法を提供する。したがって、本発明の方法は、単一の不可逆的なライゲーションイベントと比較して、分子の相対的な位置についてのより詳細な知識を提供することができる。固有のＤＮＡバーコードを各関与するオリゴヌクレオチドに統合することにより、これらのライゲーションイベントの読み出しを取得でき、したがって、次世代ＤＮＡ配列決定を使用してハイスループット様式でそこに含まれる位置情報を提供する。
【００５０】
グラフ理論は、ＩＰＬ配列決定の結果に適用できる。これは、本明細書で説明するように、複数の用途に適用することができる。１つの方法において、本研究は、ＤＮＡによって標識されたオブジェクトの幾何学的パターンを取得することができ、そして単一分子プロテオミクスを実施できることを示している。特に、スライド表面にフォトリソグラフィーされた文字パターンは、ＩＰＬ配列決定データを使用して回復できることが実証され、このことは、現在の手法が複雑な空間構成をいかにしてＤＮＡ配列にマッピングするか、次いで、−この配列情報を使用すること−がいかにしてこれらを回復するかを例証した。別の用途では、ＩＰＬが、準最適な化学的および酵素的反応性の下でさえも、単一分子分解能で、Ｅ．ｃｏｌｉプロテオームの大部分を同定および定量できることが示された。
【００５１】
したがって、バーコード付きＤＮＡ分子を使用して個々の分子または物理的位置に同一性を割り当てるための方法が本明細書で提供される。反復近接ライゲーションによってペアワイズ近接を記録すると、ラベル付けされたオブジェクトの特性を明らかにできる。具体的には、反復近接ライゲーションは、空間位置と配列情報との間に直接的な関係を確立する。近接検出のためのＩＰＬの一例では、反復的なＤＮＡライゲーションおよび消化を含むＩＰＬが、分子の集団に適用され得る。ＩＰＬオリゴヌクレオチドの集団は、各工程の効率を定量するｑＰＣＲを用いて、ライゲーション、制限、および再度ライゲーションすることができる。
【００５２】
ＩＰＬの１つの用途では、グラフ理論を使用して、スプリングレイアウトアルゴリズムを使用することなどにより、オリゴヌクレオチドの位置を回復できる。現在の方法は、位置回復におけるエラー率が低い。例えば、近傍（例えば、直径約１μｍ）は、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドペアの長さよりも短い平均オリゴヌクレオチド位置誤差で回復できる。個々のオリゴヌクレオチドよりも実質的に大きいスケールでは、ＤＮＡ配列決定を使用して三次元形状を回復できる。
【００５３】
本明細書で提供されるＩＰＬの別の用途は、単一分子プロテオミクスを含む。これは、細胞からペプチドまたはタンパク質を同定するために使用することができる。ペプチドはポリペプチドであり得る。この場合、オリゴヌクレオチド標識アミノ酸の近接性は、それらがポリペプチド鎖を共有することを意味し、ＩＰＬがタンパク質組成情報を捕捉できるようにするため、空間的近接性は有益である。本研究は、そのような組成情報が、不完全なラベリング化学下でさえも、Ｅ．ｃｏｌｉプロテオームの大部分を固有に同定するために十分であることを示した。本明細書で提供されるさらなる方法は、抗体または他のタグ付けメカニズムを介して個々のタンパク質を標識することによるタンパク質複合体の検出に関する。したがって、タンパク質複合体の組成は、単一分子の解像度で回復することができる。
【００５４】
Ｉ．分子近傍検出
タンパク質の十分に希釈された溶液では、タンパク質は十分に離れているため、各タンパク質のアミノ酸が他のタンパク質分子に属するアミノ酸の近傍にある可能性は低くなる。したがって、分子近傍検出技術は、どのアミノ酸が同じタンパク質に属しているかを、それらの互いに対する近接性から推測できる−それらが同じ分子すなわち、同じ近傍を含み、同時に他の分子のアミノ酸から遠く離れているからである。各近傍（各分子）のアミノ酸を検出することにより、その分子に属する各アミノ酸（例えば、Ｌｙｓ、Ｃｙｓなど）の数を計数することができる。図５に示されるように、この組成情報は、例えば、ヒトおよびＥ．ｃｏｌｉプロテオームにおけるタンパク質の大部分を固有に同定するために十分である。したがって、特定の実施形態では、分子近傍検出のための方法が提供される。この方法は、ペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体などの分子の希釈溶液を取得すること、互いに近接するアミノ酸の位置情報を取得すること、および上記アミノ酸を含む分子を同定することを含むことができる。したがって、単一分子分解能でタンパク質または他の分子を同定するために使用することができるアミノ酸の分子近傍を検出するための方法が本明細書に提供される。本発明の方法は、組成情報が存在する他の分子に拡張することができる。例えば、同じ方法をタンパク質複合体に適用して、個々のタンパク質を標識および計数し、したがって、その複合体の化学量論を取得することができる。
【００５５】
分子近傍を検出するために、具体的には組成情報を取得するために本明細書で提供される１つのアプローチは、オリゴプローブが読み取ることができるところならどこでも近傍を定義することができるＩＰＬである。本明細書で提供されるスプリットアンドプールと呼ばれる別の方法では、物理的中間体を介して互いに連結されたオリゴのセットとして近傍を定義するために使用することができる。ＩＰＬまたはスプリットアンドプールのどちらで取得した場合でも、２ラウンドの組成情報を近隣検出に使用できる。
【００５６】
次に、ＩＰＬまたはスプリットアンドプール法から取得した組成情報を、バイオインフォマティクスを使用して分析し、プロテオミクス分析などのために、サンプル中のペプチド、タンパク質、またはタンパク質複合体などの１つ以上の分子を同定できる。
【００５７】
「対象」および「患者」は、霊長類、哺乳動物、および脊椎動物などのヒトまたは非ヒトのいずれかを指す。特定の実施形態では、対象はヒトである。
【００５８】
「サンプル」は、一般に、目的の分子を含む、新鮮なまたは保存された生物学的サンプルまたは合成的に作成された供給源から取得されたかまたは単離された材料を指す。サンプルには、少なくとも１つの細胞、胎児細胞、細胞培養、組織試料、血液、血清、血漿、唾液、尿、涙、膣分泌物、汗、リンパ液、脳脊髄液、粘膜分泌物、腹水（ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ  ｆｌｕｉｄ）、腹水（ａｓｃｉｔｅｓ  ｆｌｕｉｄ）、糞便物質、体の滲出液、臍帯血、絨毛膜絨毛、羊膜液、胚組織、多細胞胚、溶解物、抽出物、溶液、または目的の免疫核酸を含む疑いのある反応混合物が含まれ得る。サンプルには、非ヒト霊長類、げっ歯類、およびその他の哺乳動物などの非ヒト供給源も含まれ得る。
【００５９】
サンプルには、例えば、胎児を取り巻く羊水、房水、胆汁、血液および血漿、セルメン（耳垢）、カウパー液または尿道球腺液、乳び（ｃｈｙｌｅ）、乳び（ｃｈｙｍｅ）、女性の射精液、間質液、リンパ液、月経、乳汁、粘液（鼻水および痰を含む）、胸膜液、膿、唾液、皮脂（皮膚油）、精液、血清、汗、涙、尿、膣潤滑、嘔吐物、糞便、脳と脊髄を取り巻く脳脊髄液を含む内部体液、骨関節を取り巻く滑液、細胞内液（細胞内部の液）、および硝子体液（眼球内液）などの体液を含む、対象からの体液が含まれ得る。特定の態様では、サンプルは、末梢全血サンプルまたはその一部などの血液サンプルである。サンプルは、完全な未分画の血液であり得る。血液サンプルは、少なくとも約０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０ミリリットル（ｍＬ）、またはそれ以上であり得る。サンプルは、医療提供者、例えば、医師、医師助手、看護師、獣医、皮膚科医、リウマチ専門医、歯科医、救急医療員、または外科医によって入手することができる。サンプルは、研究技術者によって入手することができる。対象から複数のサンプルを入手できる。
【００６０】
Ａ．組成情報
現在の方法の組成情報は、ＩＰＬの反復ＤＮＡライゲーションと消化を使用して取得できる。この方法は、反復ライゲーションおよび制限と、それに続くオリゴヌクレオチドのＤＮＡ配列決定を含み得る。ＤＮＡオリゴヌクレオチドを単一分子に取り付けることができ、次に十分に近接した２つのオリゴヌクレオチドを互いにライゲーションすることができる。次に、オリゴヌクレオチドのペアを溶液中で複製し、切断して、２つのオリゴヌクレオチドをライゲーション解除または分離することができる。次のラウンドでは、他の隣接するオリゴヌクレオチドをペアにして複製し、ライゲーション解除することができる。このＩＰＬ法の複数のラウンドを実施して、個々の分子に関する空間情報を取得できる。
【００６１】
いくつかの態様において、組成情報は、分子がスプリットアンドプール法においてタグで標識され得るスプリットアンドプール法によって取得できる。例えば、分子は、サンプル中のアミノ酸識別子と固有の識別子の両方で標識されたタンパク質またはペプチドであり得る。この方法では、サンプルをいくつかのウェルなどのコンパートメントに分割し、追加のウェル特異的な識別子にライゲーションする。コンパートメントは、ウェル、マイクロウェル、またはマイクロ流体液滴であり得る。次に、サンプルをプールして再分割した後、コンジュゲートしたすべてのオリゴヌクレオチドに、さらなる十分に特異的なバーコードを追加する。次に、サンプルをプールして、別のウェルに再割り当てし、第２のウェル特異的なバーコードを付加する。各タンパク質またはペプチドに固有のコンビナトリアルライゲーションバーコードが存在する点まで、コンビナトリアルライゲーションバーコードをさらに多様化するために、追加のラウンドのプール、分割、およびライゲーションを行うことができる。重要な結果は、各タンパク質がそれ自体の固有のバーコードを有し、このバーコードのコピーがタンパク質のラベル付けされた各残基に追加されていることである。ウェルコード（下線付き）を読み取ると、２つのタンパク質が区別され、したがって、これらのタンパク質でどの残基が一緒になるかも示している。各タンパク質の個々の残基は、「固有のバーコード」配列によって区別できるため、タンパク質に含まれる各種類のアミノ酸（すなわち、システインまたはリジン）の数を計数することができる。
【００６２】
「バーコード」、「固有のタグ」または「固有の識別子」という用語は、本明細書では互換的に使用され、単一の分子または分子の集団を同定するために使用される固有のヌクレオチド配列を指す。バーコードは、対象の標的分子に連結して、アンプリコンをトレースバックするために使用できる。バーコードは、５〜４０ヌクレオチド、特に８〜１２ヌクレオチド、例えば８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドであり得る。特定の態様において、バーコードは、ランダムな（例えば、縮重した）ヌクレオチドから構成される。
【００６３】
バーコードまたは固有のタグを個々の分子に割り当て、次いで操作して、タグが互いに近接しているかどうかを判断することができる。ＤＮＡオリゴヌクレオチドは、官能基、プライマー部位、固有のバーコード、および制限酵素ハーフ部位などの切断ハーフ部位を含み得る。切断ハーフ部位は、オリゴヌクレオチドの５’または３’末端にあり得る。切断部位は、ＡａｎＩ、Ａｃｃ１６Ｉ、ＡｃｃＢＳＩ、ＡｃｃＩＩ、ＡｃｖＩ、ＡｆａＩ、ＡｆｅＩ、ＡｊｉＩ、ＡｌｅＩ、ＡｌｕＢＩ、ＡｌｕＩ、Ａｏｒ５１ＨＩ、Ａｓｐ７００Ｉ、ＢａｌＩ、ＢｂｒＰＩ、ＢｍｃＡＩ、ＢｍｇＢＩ、ＢｍｉＩ、ＢｏｘＩ、ＢｓａＡＩ、ＢｓａＢＩ、Ｂｓｅ８Ｉ、ＢｓｅＪＩ、Ｂｓｈ１２３６Ｉ、ＢｓｈＦＩ、ＢｓｎＩ、Ｂｓｐ６８Ｉ、ＢｓｐＡＮＩ、ＢｓｐＦＮＩ、ＢｓｐＬＩ、ＢｓｒＢＩ、ＢｓｓＮＡＩ、Ｂｓｔ１１０７Ｉ、ＢｓｔＢＡＩ、ＢｓｔＣ８Ｉ、ＢｓｔＦＮＩ、ＢｓｔＰＡＩ、ＢｓｔＳＮＩ、ＢｓｔＵＩ、ＢｓｔＺ１７Ｉ−ＨＦ、ＢｓｕＲＩ、ＢｔｒＩ、ＢｔｕＭＩ、Ｃａｃ８Ｉ、ＣｖｉＪＩ、ＣｖｉＫＩ−１、ＤｉｎＩ、ＤｐｎＩ、ＤｒａＩ、Ｅｃｌ１３６ＩＩ、Ｅｃｏ１０５Ｉ、Ｅｃｏ１４７Ｉ、Ｅｃｏ３２Ｉ、Ｅｃｏ４７ＩＩＩ、Ｅｃｏ５３ｋＩ、Ｅｃｏ７２Ｉ、ＥｃｏＩＣＲＩ、ＥｃｏＲＶ、ＥｃｏＲＶ−ＨＦ、ＥｇｅＩ、ＥｈｅＩ、ＦａｉＩ、ＦｓｐＡＩ、ＦｓｐＩ、ＧｌａＩ、ＨａｅＩＩＩ、ＨｉｎｃＩＩ、ＨｉｎｄＩＩ、ＨｐａＩ、Ｈｐｙ１６６ＩＩ、Ｈｐｙ８Ｉ、ＨｐｙＣＨ４Ｖ、ＫｓｐＡＩ、ＭａｌＩ、ＭｂｉＩ、ＭｌｓＩ、ＭｌｕＮＩ、ＭｌｙＩ、Ｍｏｘ２０Ｉ、ＭｒｏＸＩ、ＭｓｃＩ、ＭｓｌＩ、Ｍｓｐ２０Ｉ、ＭｓｐＡ１Ｉ、ＭｓｓＩ、ＭｖｎＩ、ＮａｅＩ、ＮｌａＩＶ、ＮｒｕＩ、ＮｒｕＩ−ＨＦ、ＮｓｂＩ、ＯｌｉＩ、ＰｃｅＩ、ＰｄｉＩ、ＰｄｍＩ、ＰｍａＣＩ、ＰｍｅＩ、ＰｍｌＩ、Ｐｐｕ２１Ｉ、ＰｓｈＡＩ、ＰｓｉＩ、ＰｓｐＣＩ、ＰｓｐＮ４Ｉ、ＰｖｕＩＩ、ＰｖｕＩＩ−ＨＦ、ＲｒｕＩ、ＲｓａＩ、ＲｓｅＩ、ＳｃａＩ、ＳｃａＩ−ＨＦ、ＳｃｈＩ、ＳｆｏＩ、ＳｍａＩ、ＳｍｉＩ、ＳｍｉＭＩ、ＳｎａＢＩ、ＳｒｆＩ、ＳｓｅＢＩ、ＳｓｐＩ、ＳｓｐＩ−ＨＦ、ＳｔｕＩ、ＳｗａＩ、ＸｍｎＩ、ＺｒａＩ、およびＺｒｍＩを含むがこれらに限定されない平滑末端酵素などのエンドヌクレアーゼのためのものであり得る。
【００６４】
官能基は、スクシンイミジルエステル、ヨードアセトアミド、マレイミド、アミン、４−フェニル−３Ｈ−１，２，４−トリアゾール−３，５（４Ｈ）−ジオン（ＰＴＡＤ）、２，４−ジニトロベンゼンスルフェニルクロリド、チオール、またはそれらの任意の組み合わせであり得る。反対の極性（すなわち５’および３）の切断部位を有するオリゴヌクレオチドは、Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ４  ＲＮＡリガーゼ、Ｔａｑ  ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３  ＤＮＡリガーゼ、またはＴ７  ＤＮＡリガーゼなどのタンパク質リガーゼによってライゲーションすることができる。
【００６５】
本発明の方法は、分子の集団内の単一分子などの個々の分子の空間位置および同一性を決定するために使用され得る。分子は、タンパク質、タンパク質複合体、ペプチド、抗体、炭水化物、核酸、細胞、シグナル伝達ドメイン、脂質、炭水化物、または受容体を含み得る。個々の分子は、分子の集団を有するサンプルからなど、大規模に同定できる。
【００６６】
タンパク質またはペプチドは、システイン、アスパラギン酸、またはグルタミン酸などのアミノ酸残基で標識することができる。リジン、システイン、グルタミン酸、アスパラギン酸、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン、またはそれらの任意の組み合わせを含むがこれらに限定されない他の残基を標識することができる。アミノ酸は、リン酸化、グリコシル化、メチル化、シトルリン化、またはそれらの任意の組み合わせで修飾することができる。
【００６７】
Ａ．配列決定
本明細書で使用される「プライマー」または「オリゴヌクレオチドプライマー」という用語は、核酸のテンプレート鎖にハイブリダイズし、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下に置かれたときに、すなわち、ヌクレオチドおよびＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼなどの重合誘導剤の存在下で、適切な温度、ｐＨ、金属濃度、および塩濃度において、テンプレート鎖に相補的な核酸鎖の合成を開始するオリゴヌクレオチドを指す。プライマーは一般に、増幅の効率を最大にするために一本鎖であるが、代替的には二本鎖であってもよい。二本鎖の場合、伸長産物を調製するために使用する前に、プライマーを最初に処理してその鎖を分離することができる。この変性は通常、熱の影響を受けるが、代替的にはアルカリを使用して実行し、続いて中和することもできる。したがって、「プライマー」はテンプレートに相補的であり、テンプレートとの水素結合またはハイブリダイゼーションによって複合体を形成し、ポリメラーゼによる合成の開始のためのプライマー／テンプレート複合体を与え、これは、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成のプロセスにおいてテンプレートに相補的な３’末端において連結された共有結合塩基の付加によって伸長される。
【００６８】
「ポリメラーゼ連鎖反応」または「ＰＣＲ」は、一般に、ＤＮＡの相補鎖の同時プライマー伸長による特定のＤＮＡ配列のインビトロ増幅のための反応を指す。言い換えれば、ＰＣＲは、プライマー結合部位に隣接する標的核酸の複数のコピーまたは複製を作製するための反応であり、そのような反応は、以下のプロセスの１回または複数の繰り返しを含む：（ｉ）標的核酸の変性、（ｉｉ）プライマー結合部位へのプライマーのアニーリング、および（ｉｉｉ）ヌクレオシド三リン酸の存在下での核酸ポリメラーゼによるプライマーの伸長。通常、反応はサーマルサイクラー機器において各プロセスに最適化された様々な温度で循環する。特定の温度、各プロセスでの期間、およびプロセス間の変化率は、多くの要因に依存し、これは、例えば、参考文献、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．編，ＰＣＲ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ  ａｎｄ  ＰＣＲ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，それぞれ１９９１および１９９５）によって例示される。
【００６９】
核酸を配列決定するための任意の技術を、本開示の方法で使用することができる。ＤＮＡ配列決定技術には、標識ターミネーターまたはプライマーを使用するジデオキシ配列決定反応（サンガー法）およびスラブまたはキャピラリーでのゲル分離、可逆的に終結した標識ヌクレオチドを使用する合成による配列決定、パイロ配列決定、４５４配列決定、ラベル付きオリゴヌクレオチドプローブのライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーション、ラベル付きクローンのライブラリーへの対立遺伝子特異的ハイブリダイゼーションを使用する合成とそれに続くライゲーションによる配列決定、重合中の標識ヌクレオチドの取り込みのリアルタイムモニタリング、ならびにＳＯＬｉＤ配列決定が挙げられる。入力ＲＮＡは１０％、１５％、３０％、またはそれ以上である可能性がある。
【００７０】
特定の実施形態では、提供される開示の方法で使用される配列決定技術は、実行あたり少なくとも１００読み取り、実行あたり少なくとも２００読み取り、実行あたり少なくとも３００読み取り、実行あたり少なくとも４００読み取り、実行あたり少なくとも５００読み取り、実行あたり少なくとも６００読み取り、実行あたり少なくとも７００読み取り、実行あたり少なくとも８００読み取り、実行あたり少なくとも９００読み取り、実行あたり少なくとも１０００読み取り、実行あたり少なくとも５，０００読み取り、実行あたり少なくとも１０，０００読み取り、実行あたり少なくとも５０，０００読み取り、実行あたり少なくとも１００，０００読み取り、実行あたり少なくとも５００，０００読み取り、実行あたり少なくとも１，０００，０００読み取り、実行あたり少なくとも２，０００，０００読み取り、実行あたり少なくとも３，０００，０００読み取り、実行あたり少なくとも４，０００，０００読み取り、実行あたり５，０００，０００読み取り  実行あたり少なくとも６，０００，０００読み取り  実行あたり少なくとも７，０００，０００読み取り  実行あたり少なくとも８，０００，０００読み取り  実行あたり少なくとも９，０００，０００読み取り、実行あたり少なくとも１０，０００，０００読み取り、またはそれ以上を生成する。
【００７１】
特定の実施形態では、提供される開示の方法において使用される配列決定技術は、読み取りあたり、少なくとも約３０ｂｐ、約４０ｂｐ、約５０ｂｐ、約６０ｂｐ、約７０ｂｐ、約８０ｂｐ、約９０ｂｐ、約１００ｂｐ、約１１０、約１２０、読み取りあたり、約１５０ｂｐ、約２００ｂｐ、約２５０ｂｐ、約３００ｂｐ、約３５０ｂｐ、約４００ｂｐ、約４５０ｂｐ、約５００ｂｐ、約５５０ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１，０００ｂｐ、またはそれ以上を生成することができる。例えば、提供される開示の方法で使用される配列決定技術は、読み取りあたり、少なくとも約３０ｂｐ、４０ｂｐ、５０ｂｐ、６０ｂｐ、７０ｂｐ、８０ｂｐ、９０ｂｐ、１００ｂｐ、１１０ｂｐ、１２０ｂｐ、１５０ｂｐ、２００ｂｐ、２５０ｂｐ、３００ｂｐ、３５０ｂｐ、４００ｂｐ、４５０ｂｐ、５００ｂｐ、５５０ｂｐ、６００ｂｐ、６５０ｂｐ、７００ｂｐ、７５０ｂｐ、８００ｂｐ、８５０ｂｐ、９００ｂｐ、９５０ｂｐ、１，０００ｂｐ、またはそれ以上を生成することができる。
【００７２】
１．ＨｉＳｅｑ（商標）およびＭｉＳｅｑ（商標）配列決定
特定の態様において、本開示の方法で使用される配列決定技術には、ＨｉＳＥＱ（商標）システム（例えば、ＨｉＳＥＱ２０００（商標）およびＨｉＳＥＱＩＯＯＯ（商標））およびＩｌｌｕｍｉｎａ，Ｉｎｃ．のＭｉＳＥＱ（商標）システムが挙げられる。ＨｉＳＥＱ（商標）システムは、ランダムに断片化されたゲノムＤＮＡの、平面の光学的に透明な表面への取り付け、および固相増幅を使用して、それぞれが１平方ｃｍあたり約１，０００コピーのテンプレートを含む数百万のクラスターを有する高密度配列決定フローセルを作製する、数百万の断片の大規模並列配列決定に基づく。これらのテンプレートは、合成技術による４色のＤＮＡ配列決定技術を使用して配列決定される。ＭｉＳＥＱ（商標）システムは、Ｉｌｌｕｍｉｎａの可逆的ターミネーターベースの合成による配列決定であるＴｒｕＳｅｑを使用する。
【００７３】
２．真の単一分子配列決定
最近の開示の方法で使用することができる配列決定技術には、例えば、Ｈｅｌｉｃｏｓ  Ｔｒｕｅ  Ｓｉｎｇｌｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（ｔＳＭＳ）が挙げられる（Ｈａｒｒｉｓ  Ｔ．Ｄ．ｅｔ  ａｌ．（２００８）Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２０：１０６−１０９）。ｔＳＭＳ技術では、ＤＮＡサンプルが約１００〜２００ヌクレオチドの鎖に切断され、ｐｏｌｙＡ配列が各ＤＮＡ鎖の３’末端に付加される。各鎖は、蛍光標識されたアデノシンヌクレオチドの付加によって標識される。次に、ＤＮＡ鎖はフローセルにハイブリダイズされ、フローセルには、フローセル表面に固定化された数百万のオリゴＴ捕捉部位が含まれている。テンプレートは、約１億テンプレート／ｃｍ２の密度にすることができる。次に、フローセルが機器、例えば、ＨｅｌｉＳｃｏｐｅ（商標）配列決定装置にロードされ、レーザーがフローセルの表面を照らし、各テンプレートの位置を明らかにする。ＣＣＤカメラは、フローセル表面上のテンプレートの位置をマッピングできる。次に、テンプレート蛍光標識が切断され、洗い流される。配列決定反応は、ＤＮＡポリメラーゼおよび蛍光標識ヌクレオチドを導入することによって開始する。オリゴＴ核酸はプライマーとして機能する。ポリメラーゼは、テンプレートに向けられた様式で、標識されたヌクレオチドをプライマーに組み込む。ポリメラーゼおよび組み込まれていないヌクレオチドが削除される。蛍光標識ヌクレオチドの取り込みを指示したテンプレートは、フローセル表面を画像化することによって検出される。画像化後、切断により蛍光標識が除去され、特定の読み取り長が達成されるまで、他の蛍光標識ヌクレオチドを用いてこのプロセスが反復される。配列情報は、ヌクレオチドを付加するたびに収集される。
【００７４】
３．４５４配列決定
本開示の方法で使用することができるＤＮＡ配列決定技術の別の例は、４５４配列決定（Ｒｏｃｈｅ）である（Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ  ｅｔ  ａｌ．，２００５）。４５４配列決定には２つのプロセスが含まれる。最初のプロセスでは、ＤＮＡは約３００〜８００塩基対の断片に剪断され、断片は平滑末端化される。次に、オリゴヌクレオチドアダプターが断片の末端にライゲーションされる。アダプターは、断片の増幅と配列決定のためのプライマーとして機能する。断片は、例えば、５’−ビオチンタグを含むアダプターＢを使用して、ＤＮＡ捕捉ビーズ、例えば、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズに取り付けることができる。ビーズに取り付けられた断片は、油水エマルジョンの液滴内でＰＣＲ増幅される。その結果は、各ビーズにクローン増幅されたＤＮＡ断片の複数のコピーである。第２のプロセスでは、ビーズがウェル（ピコリットルサイズ）に捕捉される。パイロ配列決定は、各ＤＮＡ断片に対して並行して実施される。１つ以上のヌクレオチドを追加すると、光信号が生成され、これは配列決定機器のＣＣＤカメラによって記録される。信号強度は、取り込まれたヌクレオチドの数に比例する。
【００７５】
パイロ配列決定は、ヌクレオチドの付加時に放出されるピロリン酸（ＰＰｉ）を利用する。ＰＰｉは、アデノシン５’ホスホ硫酸の存在下でＡＴＰスルフリラーゼによってＡＴＰに変換される。ルシフェラーゼはＡＴＰを使用してルシフェリンをオキシルシフェリンに変換し、この反応によって光が生成され、これが検出および分析される。
【００７６】
４．ゲノム配列決定装置ＦＬＸ（商標）
本発明の方法で使用することができるＤＮＡ配列決定技術の別の例は、ゲノム配列決定装置ＦＬＸシステム（Ｒｏｃｈｅ／４５４）である。Ｇｅｎｏｍｅ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ＦＬＸシステム（例えば、ＧＳ  ＦＬＸ／ＦＬＸ＋、ＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ）は、実行ごとに１００万を超える高品質の読み取りを提供し、読み取り長は４００塩基である。これらのシステムは、あらゆるサイズの全ゲノムおよびトランスクリプトームのデノボ配列決定、複雑なサンプルのメタゲノム特性評価、または再配列決定研究のために最適である。
【００７７】
５．ＳＯＬｉＤ（商標）配列決定
本開示の方法で使用することができるＤＮＡ配列決定技術の別の例は、ＳＯＬｉＤ技術（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）である。ＳＯＬｉＤ配列決定では、ゲノムＤＮＡが断片に断片化され、アダプターが断片の５’および３’末端に取り付けられ、断片ライブラリーを生成する。あるいは、内部アダプターは、アダプターを断片の５’および３’末端にライゲーションし、断片を環状化し、環状化された断片を消化して内部アダプターを生成させ、得られた断片の５’および３’末端にアダプターを取り付けてメイトペアライブラリーを生成させることによって導入できる。次に、クローンビーズ集団は、ビーズ、プライマー、テンプレート、およびＰＣＲコンポーネントを含むマイクロリアクターにおいて調製される。ＰＣＲに続いて、テンプレートが変性され、ビーズは濃縮されて、拡張テンプレートでビーズを分離する。選択したビーズのテンプレートは、スライドガラスへの結合を可能にする３’修飾を受ける。
【００７８】
配列は、特異的フルオロフォアによって同定される中央の決定された塩基（または塩基の対）との部分的にランダムなオリゴヌクレオチドの連続的なハイブリダイゼーションおよびライゲーションによって決定することができる。色が記録された後、ライゲーションされたオリゴヌクレオチドは切断されて除去され、このプロセスが反復される。
【００７９】
６．Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔ（商標）配列決定
本開示の方法で使用することができるＤＮＡ配列決定技術の別の例は、ＩｏｎＴｏｒｒｅｎｔシステム（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）である。Ｉｏｎ  Ｔｏｒｒｅｎｔは、微細加工されたウェルの高密度アレイを使用して、この生化学的プロセスを超並列方式で実施する。各ウェルは異なるＤＮＡテンプレートを保持している。ウェルの下にはイオン感受性層があり、その下には独自のイオンセンサーがある。ヌクレオチド、例えば、ＣがＤＮＡテンプレートに追加され、次にＤＮＡの鎖に組み込まれると、水素イオンが放出される。そのイオンからの電荷は、溶液のｐＨを変化させ、これは、独自のイオンセンサーで検出できる。配列決定装置は塩基を呼び出し、化学情報からデジタル情報に直接移動する。次に、Ｉｏｎ  Ｐｅｒｓｏｎａｌ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｍａｃｈｉｎｅ（ＰＧＭ（商標））配列決定装置は、チップに次々とヌクレオチドを逐次的に流し込む。チップに流し込む次のヌクレオチドが一致しない場合、電圧変化は記録されず、塩基は呼び出されない。ＤＮＡ鎖に２つの同一の塩基がある場合、電圧は２倍になり、チップは呼び出される２つの同一の塩基を記録する。これは直接検出であるため−スキャンなし、カメラなし、光なし−、各ヌクレオチドの取り込みは数秒で記録される。
【００８０】
７．ＳＯＬＥＸＡ（商標）配列決定
本開示の方法で使用することができる配列決定技術の別の例は、ＳＯＬＥＸＡ配列決定（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）である。ＳＯＬＥＸＡ配列決定は、フォールドバックＰＣＲおよびアンカープライマーを使用する固体表面でのＤＮＡの増幅に基づく。ゲノムＤＮＡが断片化され、断片の５’および３’末端にアダプターが追加される。フローセルチャネルの表面に取り付けられているＤＮＡ断片は伸長され、架橋が増幅される。断片は二本鎖になり、二本鎖分子は変性される。固相増幅とそれに続く変性の複数のサイクルにより、フローセルの各チャネルに同じテンプレートの一本鎖ＤＮＡ分子の約１，０００コピーの数百万のクラスターが作製できる。プライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、および４つのフルオロフォア標識された可逆的に終結するヌクレオチドが使用されて、逐次配列決定を実施する。ヌクレオチドの取り込み後、レーザーが使用されてフルオロフォアを励起し、画像をキャプチャして、最初の塩基の同一性が記録される。取り込まれた各塩基から３’ターミネーターおよびフルオロフォアが除去され、取り込み、検出、および同定が反復される。
【００８１】
８．ＳＭＲＴ（商標）配列決定
本開示の方法で使用することができる配列決定技術の別の例には、Ｐａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓの単一分子リアルタイム（ＳＭＲＴ（商標））技術が含まれる。ＳＭＲＴ（商標）では、４つのＤＮＡ塩基のそれぞれが４つの異なる蛍光色素のうちの１つに取り付けられている。これらの色素はリン連結されている。単一のＤＮＡポリメラーゼは、ゼロモード導波路（ＺＭＷ）の下部にあるテンプレート一本鎖ＤＮＡの単一分子で固定化されている。ＺＭＷは、ＺＭＷの内外に急速に拡散する蛍光ヌクレオチドのバックグラウンドに対して（マイクロ秒単位で）ＤＮＡポリメラーゼによる単一ヌクレオチドの取り込みの観察を可能にする閉じ込め構造である。ヌクレオチドを成長中の鎖に取り込むには数ミリ秒かかる。この時間の間、蛍光標識が励起されて蛍光シグナルを生成し、蛍光タグが切断される。色素の対応する蛍光の検出は、どの塩基が取り込まれたかを示す。このプロセスが反復される。
【００８２】
９．ナノポア配列決定
使用できる配列決定技術の別の例は、ナノポア配列決定である（ＳｏｎｉおよびＭｅｌｌｅｒ、２００７）。ナノポアは、直径１ナノメートルのオーダーの小さな穴である。導電性流体へのナノポアの浸漬およびそれを横切る電位の印加は、ナノポアを通るイオンの伝導のためにわずかな電流をもたらす。流れる電流の量は、ナノポアのサイズに対して感受性である。ＤＮＡ分子がナノポアを通過するとき、ＤＮＡ分子の各ヌクレオチドがナノポアを様々な程度で妨害する。したがって、ＤＮＡ分子がナノポアを通過するときにナノポアを通過する電流の変化は、ＤＮＡ配列の読み取りを表す。
【００８３】
Ｂ．配列決定の分析
配列決定結果の分析は、ＩＰＬ出力の分析などのグラフ理論を使用して実施できる。読み出しは、バーコード付きオリゴヌクレオチドがノードであり、観察されたライゲーションがエッジであるグラフとして解釈され得る（図１）。ＩＰＬグラフは、オープンソースとして利用可能なＧｒａｐｈｖｉｚおよびｎｅｔｗｏｒｋｘによって実装されたＫａｍａ−Ｋａｗａｉアルゴリズムの変更に基づいてモデル化できる。
【００８４】
ＩＰＬグラフは、Ｅｒｄｏｓ−Ｒｅｎｙｉ（ＥＲ）ランダムグラフでモデル化できる。簡単に述べると、ＥＲランダムグラフは、ノードのペアをランダムに接続することで作成でき、各ペアは、他のすべての可能なノードペアとは無関係に、確率ｐでエッジによって接続できる。ＩＰＬレジームが、互いに空間的に近接しているすべてのオリゴヌクレオチドを有し、任意のオリゴヌクレオチドペアが各ラウンド中に他のペアと同じ確率でライゲーションする場合、複数のラウンドの後、各オリゴヌクレオチドペアは等しく、ほとんど独立しているライゲーションする機会を有していた。１回の単一ＩＰＬラウンドの間、オリゴヌクレオチドペア間のライゲーションは相互に排他的であり−すなわち、各オリゴヌクレオチドは一度に１つの他のオリゴヌクレオチドにライゲーションでき−したがって、全く独立的ではなく、多くのラウンドで、任意のラウンド中に任意のペアがライゲーションする累積確率は独立に近づく。
【００８５】
ランダム幾何学的グラフを使用して、ＩＰＬグラフをモデル化できる。簡単に述べると、グラフが、互いにｒの距離内にある場合に、点を接続するエッジを有する表面全体に分散された点を含むと仮定する。オリゴヌクレオチドが、いくつかの定義された幾何学的形状内で、均質なポアソン点過程（Ｐｅｎｒｏｓｅ，２００３）に従って分布されたと想定してもよい。このような形状は、例えば、フォトリソグラフィー（Ｐｉｒｒｕｎｇ，２００２）または他の様々な方法を使用してスライド表面全体にパターン化することができる１４。上記のＥＲグラフの場合とは異なり、ＲＧシナリオでの接続性は、関係する形状の特定のジオメトリに自然に依存するため、一般的な保証を行うことはより困難である。
【００８６】
Ｃ．使用方法
本発明の方法は、診断および治療を含む研究および臨床用途を含む様々な用途のための単一分子を検出するために使用され得る。診断は、癌、およびＨＩＶなどの感染症を含む様々な疾患に適用できる。
【００８７】
これらの方法は、タンパク質混合物中の各個々のアミノ酸に固有にタグ付けすることにより、単一分子プロテオミクスプラットフォームとして使用できる。プロテオミクスは、農業、医薬品開発、診断、および研究に使用できる。
【００８８】
さらなる用途には、癌および感染症を含む疾患に関連するバイオマーカーの同定が含まれる。サンプルは、生検などの侵襲性サンプルと比較して、唾液、血液、または尿の収集などの非侵襲的手順からのものであってもよい。プロテオミクス法は、アミノ酸残基を標識し、標識を使用して、連続するペプチド中のアミノ酸のパターンまたは化学量論を取得することを含み得る。このパターンをプロテオームに対して検索して、タンパク質を特定することができる。本発明の方法は、ペプチド配列を十分に反映するパターンを生成するために使用して、種（例えば、酵母およびヒトプロテオーム）からのタンパク質の大部分の固有の同定を可能にすることができる。したがって、いくつかの実施形態では、本方法は、血液、尿、または唾液を含む非侵襲的サンプルからなどのタンパク質またはペプチド（例えば、ホルモン）診断に使用することができる。
【００８９】
他の用途には、細胞機能および疾患状態を理解するために、様々な細胞型の受容体の分布を決定することが含まれる。これらの方法は、細胞受容体の二量体化受容体またはシグナル伝達ドメインを検出するために使用することができる。これらの方法は、他の細胞型または炭水化物などの分子にも適用することができる。
【００９０】
さらなる用途では、分子の形状を決定することができる。例えば、ナノビーズをＩＰＬオリゴヌクレオチドでコーティングして、ビーズの形状とサイズを高解像度で回復することができる。
【実施例】
【００９１】
ＩＩ．実施例
以下の実施例は、本開示のいくつかの実施形態を実証するために含まれている。以下の実施例に開示される技術は、本開示の実施においてうまく機能するために発明者によって発見された技術を表すことが理解され得る。しかし、当業者は、本開示に照らして、開示される特定の実施形態において多くの変更を行うことができ、それでも開示の趣旨および範囲から逸脱することなく同様のまたは類似の結果を得ることができることを理解することができる。
【００９２】
実施例１−反復近接ライゲーション
ＤＮＡ配列決定によって空間情報を回復するための戦略としての反復近接ライゲーション：
反復近接ライゲーション（ＩＰＬ）は、酵素ライゲーションとＤＮＡの消化のプロセスが（理想的には）メモリレスであり、したがって同じ鎖に複数回反復適用できるという観察に基づく。この観察は、オリゴヌクレオチドごとに複数のライゲーションを可能にするために、近接ライゲーションアッセイ−これは通常、オリゴヌクレオチドペアごとに１つのライゲーションイベントに制限される８−の概念を拡張するために使用された。したがって、１つの情報のピース、すなわち２つの特定のオリゴヌクレオチドがライゲーションするために十分に互いに近接しているという情報を取得することができる代わりに、オリゴヌクレオチドおよびその近傍物についての近接情報の多くの読み出しを得ることができる（図１）。これらの読み取り値は、バーコード付きオリゴヌクレオチドがノードであり、観察されたライゲーションがエッジであるグラフとして解釈できる。
【００９３】
特に、オリゴヌクレオチドが一緒にライゲーションされるために、それらは、ライゲーションされた分子の長さによって制限される距離内で空間的に近接している。したがって、ＩＰＬグラフは、グラフ内に表されている分子間の距離関係を本質的に捕捉する。ペアワイズ距離の十分な測定値が与えられた場合、各分子が保持されている位置を三角測量して決定し、観察された配列ペアを生成できることが示された。
【００９４】
多くの分子間の空間的関係を同時に決定するためのＤＮＡ配列決定の実現可能性を決定するために計算シミュレーションが実施された。固定化されたＤＮＡ分子から配列ペアへ、そしてＤＮＡ分子の暗黙の位置に戻る完全な経路があり、オリゴヌクレオチド鎖長のオーダーの位置誤差があることが確認された。ＩＰＬグラフのいくつかのバリアントに共通するグラフ理論的特性が議論され、これは、２つの潜在的な用途、ＤＮＡ配列決定を経由するナノからマイクロメートルスケールの顕微鏡法、および単一分子プロテオミクスに適用できるが、これらに限定されない。
【００９５】
ＩＰＬは、非常に大きなオリゴヌクレオチドプールの場合でさえも完全グラフを回復する：ランダムグラフ理論およびシミュレーション：
オリゴヌクレオチドの母集団全体にわたる接続性は、ＩＰＬから得られる主要な読み取り値であり、ＩＰＬグラフで求められる最も重要な特性は、接続が絶たれたコンポーネントが相互に情報を提供することがあまりないため、それらを接続することである。すべてのＩＰＬスキームに共通するエラーの主な原因は、隣接するオリゴヌクレオチドのライゲーションの失敗であると予想され、これは、実際に接続されているオリゴヌクレオチド集団を多くの切断されたグラフに断片化するリスクがある。幸いなことに、ランダムグラフ理論およびシミュレーションの結果は、数回のＩＰＬラウンドの後、接続が絶たれたグラフが急速に発生する可能性が非常に低くなることを示す。
【００９６】
２つの特定のランダムグラフモデルが使用された。第１のモデルは、すべてのオリゴヌクレオチドが互いに近接しており、すべてのペアが各ＩＰＬラウンド中にライゲーションの可能性が等しいＩＰＬレジームに関するものであり、第２のモデルは、オリゴヌクレオチドの空間分布が各オリゴヌクレオチドに隣接するものをライゲーションするように制限するＩＰＬレジームに関するものであった。これらのモデルは容易に一般化できる。各モデルの仮定は、現在の研究で明示的に提案されているもの以外の、幅広い潜在的なＩＰＬ用途をカバーしている。
【００９７】
ＩＰＬグラフの最初のバリアントは、Ｅｒｄｏ−Ｒｅｎｙｉ（ＥＲ）ランダムグラフによって適切にモデル化された（ＥｒｄｏｓおよびＲｅｎｙｉ、１９６４）。簡単に述べると、ＥＲランダムグラフは、ノードのペアをランダムに接続することによって作成され、各ペアは、他のすべての可能なノードペアとは独立して、確率ｐでエッジによって接続された。ＩＰＬレジームが、互いに空間的に近接しているすべてのオリゴヌクレオチドを有し、任意のオリゴヌクレオチドペアが各ラウンド中に他のペアと同じ確率でライゲーションする場合、複数のラウンドの後、各オリゴヌクレオチドペアは等しく、ほとんど独立しているライゲーションする機会を有していた。１回の単一ＩＰＬラウンドの間、オリゴヌクレオチドペア間のライゲーションは相互に排他的であり−すなわち、各オリゴヌクレオチドは一度に１つの他のオリゴヌクレオチドにライゲーションでき−したがって、全く独立しているわけではなく、多くのラウンドで、任意のラウンド中に任意のペアがライゲーションする累積確率は独立に近づく。ＩＰＬスキームは、ノードが極性を有するという点でＥＲの仮定からさらに逸脱している。５’ノードは３’ノードにライゲーションでき、その逆も可能である。しかし、各極性のオリゴヌクレオチドが、２回のＩＰＬラウンド−反対の極性のプローブが中間体として機能するための追加ラウンド−の後にメンバーが互いにランダムに「ライゲーション」される別個の集団とみなされる場合、これらの方法はＥＲに近い仮定に戻り、最悪の場合、ラウンドの２倍のペナルティが必要とされる。
【００９８】
ＩＰＬラウンドは、相互にアクセス可能な１０００個のノードを有する大きなグラフでシミュレートされ、各ノードは５’または３’の極性と、５’と３’のノード間で可能なライゲーションを有するようにランダムに選択された。シミュレーションは、そのような大きなグラフであり、オリゴヌクレオチドペアあたりのライゲーション確率がラウンドあたり１０−２であっても、完全なグラフを５ラウンド以内に非常に高い確率で回復できることを示した（図２、上）。
【００９９】
グラフ理論は、ノードの数が多い場合でさえも、それにも関わらず接続されたグラフが回復される可能性が非常に高いというさらなる再確認を提供した。ＥｒｄｏｓおよびＲｅｎｙｉ９による結果とは、ＥＲグラフの接続性にしきい値または「相転移」特性があることである：ｎがグラフ内のノードの数であり、ｐ＝ｃｌｏｇｎｎ（ここで、ｃは定数である）の場合、ｎ→∞で、グラフは、ｃ＜１の場合ほぼ確実に接続を絶たれ、ｃ＞１の場合ほぼ確実に接続される。ＥｒｄｏｓおよびＲｅｎｙは、ＥＲ接続しきい値の追加の特性を提供している：ｐ＝ｌｏｇｎ＋ｃｎ（ここで、ｃは定数である）の場合、ｎ→∞で、グラフが接続される確率は、ｅ−ｅ−ｃである。
【０１００】
ＩＰＬグラフの第２のバリアントは、ランダム幾何学的グラフによって適切にモデル化された（Ｐｅｎｒｏｓｅ，２００３）（ＲＧ）。現在の研究は、二次元表面全体にわたって分布するオリゴヌクレオチドに限定されていたが、より高い次元についても同様の結果が存在する。簡単に述べると、グラフが、互いにｒの距離内にある場合に、点を接続するエッジを有する表面全体に分散された点を含むと仮定する。現在のシナリオでは、オリゴヌクレオチドは、いくつかの定義された幾何学的形状内で、均質なポアソン点過程に従って分布していると想定されていた。このような形状は、例えば、フォトリソグラフィーまたは他の様々な方法を使用して、スライド表面全体にわたってパターン化することができる１４上記のＥＲグラフの場合とは異なり、ＲＧシナリオでの接続性は、関係する形状の特定のジオメトリに自然に依存するため、一般的な保証を行うことはより困難である。エッジ効果などの追加の複雑な関係があり、ここでは、幾何分布のエッジに近いノードは、形状の十分内側にあるピアと比較して接続の機会が異なり、極性の不一致が、離れたところにあるオリゴヌクレオチドが接続することを防止する可能性があるため、この効果はＩＰＬシナリオで悪化する可能性がある。
【０１０１】
しかし、オリゴヌクレオチド密度が十分に増加していれば、これらの懸念は容易に解消される（Ｂａｌｉｓｔｅｒ，２００８）。簡単に述べると、オリゴヌクレオチドの各局所的近傍は、他のすべての近傍とは独立して堆積され、十分なオリゴヌクレオチド密度ですべての近傍が接続されることがほぼ確実になるため（いくつかの可能な異常を除く）、対象領域内のほぼすべてのオリゴヌクレオチドが同じＩＰＬグラフに属する。様々な仮定の下で必要な密度の推定値は存在するが、オリゴヌクレオチドの極性の制約を組み込んだモデルは存在しない。したがって、シミュレーションを使用して、特定のオリゴヌクレオチド密度を超えると、すべてのノードを含む接続されたＩＰＬグラフを回復できることを実証した（図２、下）。
【０１０２】
実施例２−反復近接ライゲーションの用途
ＤＮＡ配列決定およびスプリンググラフレイアウトによる位置情報の回復：
ＩＰＬを使用すると、使用する分子よりもはるかに大きい形状に関する空間情報を取得できる。本研究は、シミュレーションによって、スプリングレイアウトアルゴリズムをＩＰＬグラフに適用することによって二次元パターンを回復できることを実証した。
【０１０３】
最初に、平らなガラススライド上へのＤＮＡオリゴヌクレオチドの沈着が、ポアソン点過程としてシミュレートされた（Ｋｉｎｇｍａｎ、１９９３）。各オリゴヌクレオチドには、等しい確率で５’または３’の極性がランダムに割り当てられた。オリゴヌクレオチドが形状内に共有結合的に取り付けられていると仮定した（図３Ａ）。複数ラウンドのＩＰＬ後、互いに十分に近接している任意のプローブは、少なくとも１回は確実にライゲーションすると想定されていた。このようにして得られたバーコードペアのリストを使用してレイアウトを回復し、オリゴヌクレオチドの位置に関する追加の知識は何も使用されなかった。
【０１０４】
Ｋａｍａｄａ−Ｋａｗａｉ（ＫＫ）アルゴリズムのＧｒａｐｈｖｉｚ  Ｎｅａｔｏ実装（Ｋａｍａｄａ  ａｎｄ  Ｋａｗａｉ，１９８９）を使用して、レイアウトを回復した（図３Ｂ）。このアルゴリズムはノード位置をランダムに初期化するため、トポロジー的にねじれたレイアウトを引き起こす可能性があり（図９）、したがって、階層化されたレイアウト戦略が追求された。グラフの中心（グラフの離心率がグラフの半径に等しいノードのセットとして定義される（Ｈａｒａｒｙ，２００１））が同定され、ランダムに選択された中心ノードがシードとして使用され、その周囲に半径１の近傍がレイアウトされた。このレイアウト中のノードの位置は、半径２の近傍のレイアウトを初期化するために使用された。このサイクルは、すべてのノードが配置されるまで反復した。回復されたレイアウトのオリゴヌクレオチド間の距離の中央値が元の形状の距離の中央値と等しくなるように、回復された形状をスケーリングした。ポアソン点過程の性質により、この中央値は、病理学的な場合を除いて、ポアソンパラメーターλに依存しているため、異なる形状間で高度に保存されていることに留意のこと。実際のオリゴヌクレオチド位置に対するレイアウトの大規模な形状の歪みを測定するために、元の形状と回復されたレイアウトをアラインした。最初に、実際の形状の図心に最も近いノードを座標原点として選択した。レイアウト中の同じノード（図３Ｂの赤いスポット）を座標原点にアラインし、ノードの元の位置と回復された位置の間のユークリッド距離の合計を最小化する最適な回転（０．１°の解像度内）を見い出した。各ノードについて、元の位置と回復された位置との間のユークリッド距離が測定された（図３Ｂ、ヒートマップ）。
【０１０５】
歪みの主な原因は、ＫＫアルゴリズムの基本的な仮定と凹型の形状との間の不一致であった（図１０）。これを補正するために、回復されたレイアウトが取得され、グローバル最小化ではなく局所のみのスプリングエネルギー最小化を実施するＫＫアルゴリズムの修正されたバリアントに再フィードした。これにより、大規模な歪みが大幅に減少した。
【０１０６】
このアプローチを使用して、メッセージ「ＨＥＬＬＯ  ＷＯＲＬＤ」のすべての文字（図１１）を回復した。いくつかの文字の向きが逆になっており、これは提供された情報と同等に一致しており、このあいまいさは、基準マーカーまたは文字にまたがる接続などの追加情報なしでは解決できないことに留意のこと。
【０１０７】
二次元パターンのＫＫレイアウトは大規模構造だけでなく（図３Ｃ）だけでなく、より細かい構造の詳細もまた回復した（図３Ａ’−Ｃ’）。レイアウトの忠実度をより小さなスケールで定量するために、「ＨＥＬＬＯ  ＷＯＲＬＤ」の各文字から５０ノード（オリゴヌクレオチド）をランダムにサンプリングし、サンプリングされたノードから約５９７＋／−８２ｎｍ（平均＋／−標準偏差）の物理的距離に対応するグラフ半径１０のこれらの近傍を調べた。この近傍の各オリゴヌクレオチドについて、元の位置と回復された位置の間の距離を、局所比較のための共通の座標原点として機能するサンプリングされたノードと比較した。すべてのノードの位置の違いは４８＋／−３３ｎｍで、中央値は４２ｎｍであった。サンプリングされたノードからグラフのさらに上のノードでは、より大きなエラーがあると予想され、サンプリングされたノードから１０ホップ離れたノードを見ると、位置の差は５２＋／３６ｎｍで、中央値は４６ｎｍであった。半径０．５マイクロメートルの円内で回復されたオリゴヌクレオチドの位置は、実際の位置からその直径の５％ずれている。各オリゴヌクレオチドは約３４ｎｍの長さであることに留意されたく、これは、回復した位置の平均誤差がオリゴヌクレオチドペアの最大到達距離よりも小さいことを意味する。図３Ａ’−Ｃ’の「穴」の周りで観察できるように、局所的な歪みの主な原因は、より大規模スケールの構造に影響を与える上記と同じ凹状の形状の問題である。
【０１０８】
単一分子プロテオミクス：
タンパク質をオリゴヌクレオチドで標識することにより、ＩＰＬは単一分子プロテオミクスのための方法として適用できる。この技術を使用して、単一細胞のプロテオームの大部分を確実に検出および定量化できることが、シミュレーションにより実証された。
【０１０９】
タンパク質標識スキーム（Ｈｅｒｎａｎｄｅｚ，２０１７）は、単一分子ペプチド配列決定技術に使用された（Ｓｗａｎｉｎａｔｈａｎ，２０１５）。このスキームは、各オリゴヌクレオチドが、タンパク質の大きなプールの中でさえも、その標的アミノ酸種の同一性および個々のアミノ酸に固有の分子バーコードをコードするように、ＩＰＬオリゴヌクレオチドの変異体でアミノ酸を選択的にタグ付けするように適合された（図４）。タンパク質が標識されると、それらは希釈され、ＩＰＬが溶液全体にまとめて適用される。タンパク質が十分に希釈されている場合、同じタンパク質上のオリゴヌクレオチドはライゲーションして分子内オリゴヌクレオチドペアを生成するが、別個のタンパク質上のオリゴヌクレオチドはライゲーションする可能性が非常に低いため、分子間ペアを生成しない。タンパク質は標識時に変性するため、単一のタンパク質上のすべてのオリゴヌクレオチドペアが同等にライゲーションする可能性が高く、したがって、上記のグラフ理論上の考慮事項によれば、タンパク質のＩＰＬグラフは、数ラウンド後の接続性が非常に高いＥｒｄｏｓ−Ｒｅｎｙｉランダムグラフとして適切にモデル化されている。したがって、各タンパク質は、ノードがその標識アミノ酸を表す、独自の接続されたＩＰＬグラフを生成する。グラフからアミノ酸を集計すると、タンパク質の部分的な組成情報が回復し、これは、プロテオームのかなりの割合を同定するために十分である（図５Ａ）。
【０１１０】
ＩＰＬラウンドのこの最初の配列の後、タンパク質が例えば、トリプシンをして部位特異的に消化される場合、タンパク質の同定は大幅に促進され、ＩＰＬラウンドの第２の配列が消化されたペプチドに適用される。各アミノ酸のバーコードは母集団全体で固有であるため、両方のラウンドから取得したバーコードペアを調整するために使用できる。第２段階からの追加情報により、各断片に関する組成情報が生じ、タンパク質分解酵素の特異性が部分的な配列情報に寄与する。この追加情報により、２つのラベルスキームでさえ、プロテオーム内のタンパク質の大部分を解決することを可能にする（図５Ｂ）。
【０１１１】
システインおよびカルボキシレートの標識効率は定量的である（Ｓｃｈｎａｔｂａｕｍ  ｅｔ  ａｌ．，２０１６）。それにもかかわらず、ラベリングの失敗に対する方法の堅牢性を特徴づけるために、シミュレートされたタンパク質同定は、徐々に低いラベリング効率の下でシミュレートした。このアプローチは、単一分子タンパク質配列決定技術の実現可能性を計算で評価するための戦略に類似している。簡単に述べると、Ｅ．ｃｏｌｉプロテオームにおける１０４コピーの各タンパク質は、所定の確率論的な可能性で、それらのＣｙｓおよび／またはＡｓｐ／Ｇｌｕ残基で標識を受けるようにシミュレートされ、各アミノ酸標識イベントは独立したＢｅｒｎｏｕｌｌｉランダム変数としてモデル化された。すべてのタンパク質がすべての標識アミノ酸を取り込んだ完全なＩＰＬグラフを生成し、２段階の戦略が各タンパク質のすべてのトリプシンペプチドのアミノ酸組成を生成すると想定した。したがって、トリプシンペプチドのアミノ酸組成の組み合わせは、各タンパク質の組成シグネチャとして得た。タンパク質が少なくとも１０回（１０４のうち）組成シグネチャを生成し、他のすべてのタンパク質がそのシグネチャの合計発生数の最大１０％を占める場合、そのタンパク質は同定可能であるとみなした。結果は、９０％効率的な標識レジームの下でさえ、２段階ＩＰＬ戦略が依然としてプロテオームのかなりの部分を同定できることを示した（図５Ｃ）。
【０１１２】
反復近接ライゲーション（ＩＰＬ）の初期インスタンス化：
反復近接ライゲーション（ＩＰＬ）の実現可能性を実証するために、ストレプトアビジンを使用して、互いに隣接するビオチン化オリゴヌクレオチドを固定化した。オリゴヌクレオチドは、制限エンドヌクレアーゼの添加によってそれらのライゲーションを逆転させ、ライゲーション、切断、および再ライゲーションの潜在的なラウンドをもたらすことができるように設計した（表１）。各反応後のライゲーション生成物の割合を定量化するためにｑＰＣＲを使用して、１つのそのようなラウンドを実施した（図６）。これらの実験の６つの複製を実施した。
【０１１３】
最初に、ビオチン化された左プローブと右プローブ（それぞれ２．５μＬの１０μＭストック）を混合し、１×Ｂ＆Ｗバッファー中の２μＬストレプトアビジンビーズとインキュベートし、プローブとビーズの濃度を調整して、プローブとストレプトアビジン結合部位の数がほぼ等モルになることを確実にした。Ｔ４リガーゼおよび１ｍＭ  ＡＴＰを添加し、３７℃でさらに５分間インキュベートし、ｑＰＣＲ用に１０μＬのサンプルを採取し、平均Ｃｑ（シグナルまでの時間）は４．６±１．０になった。（６回の繰り返しにわたる平均±標準偏差）（図７Ｂ）。次に、ビーズを洗浄し、ＥｃｏＲＶ−ＨＦ酵素とともに３７℃で２時間インキュベートして、アンプリコンを生成したテンプレートを切断し、ｑＰＣＲ分析用に別の１０μＬサンプル（最初のサンプルと同等の濃度）を採取した。消化されたサンプルのＣｑの平均増加は６．３±２．０であり、ライゲーションされたプローブのかなりの部分が実際に消化されたことを示した。テンプレートを再生するために、ビーズを再度洗浄して制限エンドヌクレアーゼを除去し、次に、より濃縮されたＴ４リガーゼとともに３７℃で１５分間インキュベートした。１０μＬのサンプルは、７．１±１．２のＣｑの減少を示し、これは、切断されたプローブが再ライゲーションされていることを示している（図７Ａ、Ｂ）。全体として、Ｃｑ値は、切断時の４．６±１．０〜１０．９±１．４から、再結合時の３．８±０．３１になった。すべてのｑＰＣＲ生成物は、１０％ＰＡＧＥによって設計（表１）から予想される正しいサイズに対応することを確認した（図７Ｃ）。
【０１１４】
（表１）オリゴヌクレオチド配列
2021531750.tif 000003
【０１１５】
実施例３−スプリット配列単一分子プロテオミクス
ＩＰＬを使用して同じタンパク質内のアミノ酸特異的アンプリコンを特定することに加えて、タンパク質内のアミノ酸をバーコード化および同定するための別個の方法を提案した。
【０１１６】
ＩＰＬと同様に、アミノ酸識別子と固有の識別子の両方を有するオリゴヌクレオチドは、個々のタンパク質内の個々のアミノ酸にコンジュゲートする。次に、サンプルをいくつかのウェルに分割し（すなわち、９６ウェルプレート内）、すべてのコンジュゲートオリゴヌクレオチドに対する追加のウェル特異的なバーコードにライゲーションする。次に、サンプルがプールされ、異なるウェルに再割り当てされ、第２のウェル特異的なバーコードを追加し、これにより、個々のサンプルの様々なバーコードの組み合わせの数が約９６×９６≒１０，０００（例えば）に多様化する。各タンパク質またはペプチドに固有のコンビナトリアルライゲーションバーコードが存在する点まで、コンビナトリアルライゲーションバーコードをさらに多様化するために、追加のプール、分割、およびライゲーションを実行する。重要な結果は、各タンパク質がそれ自体の固有のバーコードを有し、このバーコードのコピーがタンパク質のラベル付けされた各残基に追加されていることである。
【０１１７】
例えば、２つのシステイン残基と１つのリジン残基を含んだ単一のタンパク質またはペプチドは、３ラウンドのスプリットアンドプールライゲーションの後に、次の配列が付加されている場合がある。
システイン識別子−固有のバーコード−ウェルコード１−ウェルコード２−ウェルコード３
システイン識別子−固有のバーコード−ウェルコード１−ウェルコード２−ウェルコード３
リジン識別子−固有のバーコード−ウェルコード１−ウェルコード２−ウェルコード３
【０１１８】
対照的に、２つのリジンおよび１つのシステインを有する異なる単一タンパク質には、次の配列が追加されている可能性がある。
システイン識別子−固有のバーコード−ウェルコード１−ウェルコード４−ウェルコード５
リジン識別子−固有のバーコード−ウェルコード１−ウェルコード４−ウェルコード５
リジン識別子−固有のバーコード−ウェルコード１−ウェルコード４−ウェルコード５
【０１１９】
見られるように、ウェルコードを読み取ることは、２つのタンパク質を区別し、したがって、これらのタンパク質でどの残基が一緒になるかもまた示す。各タンパク質の個々の残基は、「固有のバーコード」配列（イタリック体）の数によって区別され、したがってタンパク質が含む各種類のアミノ酸（すなわち、システインまたはリジン）の数を数えることができる。これにより、事実上、ＩＰＬによって提供されるものと同じ構成情報が得られる。
【０１２０】
プロテオームの大部分が準最適なラベリング効率下（実際に観察されたものよりも低い）でさえも解決できることを実証するＩＰＬシミュレーションは、この技術に直接適用できることに留意のこと。
【０１２１】
この方法を使用すると、１０１２個以上のタンパク質を混合物中でバーコード化できる。これには、９６ウェルプレートに対して最大６ラウンドのスプリットアンドプールバーコードの追加が必要になる。使用するウェルコードの数に依存して、同定のために潜在的に少ないラウンドが存在し、例えば、３８４ウェルプレートでの５ラウンドは、約１０１１個の固有のタンパク質タグを生成する。このような数値は、現在のＮｅｘｔＧｅｎ  ＤＮＡ配列決定方法の範囲内であり、単一分子タンパク質組成の同定をＮｅｘｔＧｅｎＤＮＡ配列決定に効果的に変換する。より多くのアミノ酸タグが使用されるにつれて、個々のタンパク質のますます正確な組成により、それらの同定を可能にする（例えば、生物のルックアップテーブルを介して）。
【０１２２】
実施例４−材料および方法
Ｅｒｄｏｓ−Ｒｅｎｙｉ（ＥＲ）ランダムグラフ接続性のシミュレーション：
ＩＰＬライゲーションは、様々なライゲーション確率で１０００ノードのグラフに対してシミュレートされた。各ノードは、５’または３’の極性を有するようにランダムに選択され、反対の極性間でライゲーションが可能である。各ラウンド中に、すべての可能なオリゴヌクレオチドペアがランダムな順序で反復され、それぞれが所定の確率で潜在的にライゲーションされた。各オリゴヌクレオチドは、ラウンドごとに１つのパートナーにライゲーションでき、反復中の任意の時点でオリゴヌクレオチドペアが正常にライゲーションされた場合、そのメンバーはそのラウンド中のいかなる後続のペアリングにも関与できない。各ライゲーション確率について１００回のシミュレーション複製を実施し、各ラウンド後に最大コンポーネントのサイズを測定した。
【０１２３】
ランダム幾何グラフ（ＲＧ）接続性のシミュレーション：
長さ３４ｎｍ（約１００塩基）のＩＰＬオリゴヌクレオチドは、シミュレーションにより、Ｐｏｉｓｓｏｎ点プロセスとして（６８ｎｍ×１５）２＝１．０４μｍ２サイズの平坦な表面上の正方形パターンに堆積され、強度パラメーターλ＝５オリゴヌクレオチド／（６８ｎｍ×６８ｎｍ）であった。各オリゴヌクレオチドには、３’または５’の極性がランダムに割り当てられた。各ラウンド中に、互いに２×３４ｎｍ＝６８ｎｍ以内で、相補的な極性を持つすべてのオリゴヌクレオチドペアがランダムな順序で反復され、それぞれが所定の確率で潜在的にライゲーションされた。各オリゴヌクレオチドは、ラウンドごとに最大で１つのライゲーションに関与できる。各ライゲーション確率について１００回のシミュレーション複製を実施し、最大コンポーネントのサイズをラウンドごとに測定した。各ライゲーション確率について新しいグラフが生成され、それらの合計ノード数が異なるため、最大コンポーネントのサイズは、それに属するグラフの合計ノードのパーセンテージとして表された。
【０１２４】
スプリングレイアウトアルゴリズムを使用するＤＮＡ配列からの空間情報（文字パターン）の回復のシミュレーション：
長さ３４ｎｍ（約１００塩基）のＩＰＬオリゴヌクレオチドは、シミュレーションによって、強度パラメーターλ＝５オリゴヌクレオチド／（６８ｎｍ×６８ｎｍ）のＰｏｉｓｓｏｎ点プロセスとして平面上の文字形状パターンに堆積された。各オリゴヌクレオチドには、３’または５’の極性がランダムに割り当てられた。互いに２×３４ｎｍ＝６８ｎｍ以内にあり、相補的な極性を持つすべてのオリゴヌクレオチドが、少なくとも１回のＩＰＬラウンド中のある時点でライゲーションされたと想定された。
【０１２５】
各ＩＰＬオリゴヌクレオチドをノードとして、各ライゲーションペアをエッジとして表して、上記で得られた可能なオリゴ−オリゴライゲーションを使用してグラフを作成した。最大の連結成分に属していないあらゆるノードは破棄され、最大の連結成分は、さらなる分析のために保持された。実際には、これは＜１％のノードが破棄されたことを意味した。
【０１２６】
ＧｒａｐｈｖｉｚによるＫａｍａｄａ−Ｋａｗａｉ（ＫＫ）アルゴリズムの実装は、元の文字の形状を回復させるするために反復適用された。グラフの中心−グラフの偏心がグラフの半径に等しいノードのセットとして定義−が同定され、ランダムに選択された中央ノードをシードとして使用して、半径１の近傍をその周囲にレイアウトした。次に、このレイアウトのノードの位置を使用して、半径２の近傍のレイアウトを初期化した。このサイクルは、すべてのノードが配置されるまで反復した。回復されたレイアウトのオリゴヌクレオチド間の距離の中央値が元の形状の距離の中央値と等しくなるように、回復された形状をスケーリングした。
【０１２７】
補正されたＫＫレイアウトを取得するために、ＫＫアルゴリズムのｎｅｔｗｏｒｋｘのＰｙｔｈｏｎ実装２７が実装され、グラフ半径５の外側のノード間スプリング相互作用を無視した。反復Ｇｒａｐｈｖｉｚ  ＫＫレイアウトのこのラウンドから取得されたレイアウトは、補正されたレイアウトを取得するために、この変更された関数にフィードした。
【０１２８】
補正されたバリアントと補正されていないバリアントの両方について、レイアウト内のノード−ノードユークリッド距離の中央値がＰｏｉｓｓｏｎ堆積オリゴヌクレオチド間のオリゴヌクレオチド−オリゴヌクレオチド距離の中央値に等しくなるように、ノード座標をスケーリングした。
【０１２９】
回復されたレイアウトの歪みを特徴づけるために、すべてのオリゴヌクレオチド位置の図心に最も近い元のレイアウトのノードをアンカーノードとして選択した。元のレイアウトと回復されたレイアウトのアンカーノードをアラインし、回復されたレイアウトをその周りで回転させて（０．１°の解像度で）、元のノードと回復されたノードの位置の間のユークリッド距離の合計を最小化した。回復された形状が元の形状のミラー反転である可能性があることを説明するために、これを両方の方向で反復し、この合計を最小化する方向を選択した。一旦最適なアラインメントの方向および角度を選択すると、次いで、各ノードのユークリッド距離を元の位置と回復された位置の間で計算した。
【０１３０】
単一分子プロテオームカバレッジのシミュレーション：
ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ完全Ｅ．ｃｏｌｉおよびＨ．ｓａｐｉｅｎｓプロテオーム（マニュアルレビュー）は２０１６年５月１６日にダウンロードされ、すべてのシミュレーションに使用され、それぞれ４２９７および１９９８８注釈付きタンパク質それぞれ含んだ。選択的スプライシングされたアイソフォームは無視した。
【０１３１】
完全な標識効率でトリプシン処理していないタンパク質の同定：  各標識スキームについて、各タンパク質中の標識アミノ酸の数を集計し、この結果を順序付けられたタプルとして表した。例えば、３つのリジンおよび５つのシスチンを持つタンパク質は（３、５）として表される。他のタンパク質の組成が同じタプルで表されていない場合、そのタンパク質は固有であった。
【０１３２】
完全な標識効率でトリプシン処理を使用したタンパク質の同定：  各タンパク質の配列は、各リジンとアルギニンの後に切断された。各タンパク質断片のアミノ酸組成はタプルとして表され、各タンパク質の組成は断片タプルのマルチセットとして表された。同じマルチセットのタプルによって他のタンパク質の組成が表されていなかった場合、そのタンパク質は固有であった。
【０１３３】
準最適な標識効率でトリプシン処理を使用したタンパク質の同定：  １０４分子複製は、モンテカルロ方式で各タンパク質についてシミュレートした。各タンパク質の配列は、各リジンとアルギニンの後に切断された。各複製について、各アミノ酸は、与えられた確率論的標識可能性で標識された。個々の複製の組成は、上記のようにマルチセットによって表されたが、しかし、首尾よく標識されたアミノ酸を計数した。各タンパク質について、観察されたマルチセットは、すべての１０４複製から照合された。タンパク質は、少なくとも１０回発生するマルチセットが少なくとも１つあり、他のすべてのタンパク質で観察されたそのマルチセットの例の数が、プロテオーム全体でのすべての発生の最大１０％を占める場合に固有であった。
【０１３４】
磁性ストレプトアビジンビーズ上での反復近接ライゲーション
材料およびビーズの調製：  ２×結合および洗浄（Ｂ＆Ｗ）バッファーは、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎに従って、１０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２Ｍ  ＮａＣｌとして調製した。ビオチン化された左右のプローブ（１０μＭ；表１）を１×Ｂ＆Ｗバッファーで、総量３０μＬでそれぞれ０．７８ｕＭの濃度に混合した。この混合物を２μＬのストックＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  Ｄｙｎａｂｅａｄｓ  Ｍ−２７０ストレプトアビジン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎカタログ＃６５３０５）と室温で２０分間インキュベートして、固定化させた。結合後、ビーズを２００μＬの１×Ｂ＆Ｗバッファーで洗浄し、２００μＬのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏに再懸濁した。
【０１３５】
反復近接ライゲーション：  約２２μＬの再懸濁ビーズを２２μＬの１００ｎＭコネクターと合わせた（表１）。ライゲーションは、５μＬの１０ｘライゲーションバッファー（ＮＥＢ  Ｂ０２０２Ｓ）および１μＬのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ  Ｍ０２０２Ｓ）を１×ライゲーションバッファーで４０Ｕ／μＬに希釈し、３７℃で５分間インキュベートすることにより行った。
【０１３６】
ライゲーション後、２００μＬの１ＸＢ＆Ｗバッファーを使用してビーズを洗浄し、５０μＬのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏに再懸濁した。１０μＬの再懸濁ビーズをｑＰＣＲ用に分注し、４℃で保存した。
【０１３７】
再懸濁したビーズの残りの４０μＬを消化に供した。１μＬの１０μＭコネクター、５μＬの１０×ＣｕｔＳｍａｒｔバッファー（ＮＥＢ  Ｂ２７０４Ｓ）、および４μＬのＥｃｏＲＶ−ＨＦをビーズに添加し、３７℃で２時間インキュベートした。
【０１３８】
２００μＬの１×Ｂ＆Ｗバッファーを使用して反応液を洗浄し、４０μＬのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏに再懸濁した。１０μＬの再懸濁ビーズをｑＰＣＲ用に分注し、４℃で保存した。
【０１３９】
１４μＬの１００ｎＭコネクター、１μＬの４００Ｕ／μＬリガーゼを使用し、３７℃で１５分間インキュベートすることを除いて、上記のように残りの３０μＬのビーズでライゲーションを反復した。
【０１４０】
ライゲーション後、２００μＬの１ＸＢ＆Ｗバッファーを使用してビーズを洗浄し、３０μＬのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏに再懸濁した。１０μＬの再懸濁ビーズをｑＰＣＲ用に分注し、４℃で保存した。
【０１４１】
磁気ビーズからのｑＰＣＲ：  すべてのアリコートのｑＰＣＲを同時に実施した。各１０μＬアリコートからの３μＬを、３．６μＬのヌクレアーゼフリーＨ２Ｏ、１．２μＬのフォワードおよびリバースプライマー（それぞれ、１０μＬ；表１）、１μＬのＥｖａｇｒｅｅｎ色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ  ＃３１０００）、および１０μＬ  ２×ＦａｓｔＳｔａｒｔ  ＤＮＡプローブエッセンシャルマスターミックス（Ｒｏｃｈｅ＃０６  ４０２  ６８２  ００１）と合わせた。
【０１４２】
ｑＰＣＲは、９５℃で６００秒間の初期酵素活性化から開始し、続いて、９５℃で１０秒間の融解、６２℃で１秒間のアニーリング、および７２℃で１秒間の伸長を４０サイクル行った。Ｅｖａｇｒｅｅｎの融解曲線を取得するための３つのプロセスは、９５℃で１０秒間、６０℃で６０秒間、および９７℃で１秒であった。
【０１４３】
ｑＰＣＲ反応のゲル電気泳動：  １０％ポリアクリルアミドゲルは、１２．５ｍＬの２０％アクリルアミド（７Ｍ尿素中）、１２．５ｍＬのＴＢＥ希釈バッファー（７Ｍ尿素中）、１００μＬの１０％ＡＰＳ、および２５μＬのＴＥＭＥＤを組み合わせて作製した。２０μＬの各ｑＰＣＲ反応物を２０μＬの２×ローディング色素（９５％ホルムアミド、１０ｍＭ  ＥＤＴＡ、０．０２５％ＢＢ）と完全に混合し、９５℃で５分間変性させた。変性後、温度を０．１℃／ｓの速度で２５℃まで下げた。変性生成物をゲルにロードし、４００Ｖの電圧で２時間泳動した。泳動後、ゲルを１００ｍＬ  Ｈ２Ｏで希釈した１０μＬの１００００Ｘ  ＳｙｂｒＧｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｓ１１４９４）で染色した。Ｂｈａｄｒａ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ（Ｂｈａｄｒａ  ａｎｄ  Ｅｌｌｉｎｇｔｏｎ、２０１４）からのオリゴヌクレオチド断片をＤＮＡラダーとして使用した  。
【０１４４】
実施例５−スプリットアンドプール法
スプリットアンドプール法を実施するために、二重標識アジドリジンペプチドを設計し、オリゴヌクレオチドにコンジュゲートさせた（図１１）。ペプチドがオリゴヌクレオチドで標識され、バーコードが付けられることができることを実証するための対照（非スプリットアンドプール）標識およびライゲーション法を取得するために、二重標識ペプチドをＰＡＧＥによって単離した（図１２Ｃ）。ストレプトアビジンシフトアッセイを使用して、ペプチドの存在を確認した（図１２Ｄ）。標識されたペプチドに対して３ラウンドのバーコードライゲーション（図１２Ｂのバーコードデザイン）を実施し、生成物を単離した（図１３Ａ）。個々のライゲーションは、各ライゲーション後にサンプルをアリコートとすることによって図１３Ａにおいて見ることができる。次に、ＰＣＲを実施して、ライゲーションされたバーコードを増幅し、配列を確認した（図１３Ｂ）。この生成物は、３つのバーコードすべてが正しくライゲーションされていることを確認するためにサンガー配列決定された。
【０１４５】
より詳細には、ライゲーションプロトコルは、各ラウンドのリンカー＋バーコードの事前アニーリング、Ｔ４リガーゼによる事前アニーリングされたラウンド１リンカー−バーコードペアのヘキシニルオリゴへのライゲーション、ラウンド１ブロッカーとのインキュベーション、ラウンド２および３についてのライゲーションおよびブロッキングの反復、ならびにリガーゼの非活性化を含んだ。バーコード、リンカー、およびブロッカーの設計は図１２Ｂにある。
【０１４６】
上記の実験は、ラウンドごとに１０個のバーコードを用いて、３ラウンドのスプリットアンドプールを使用して反復した。バーコードの設計は図１４Ａにあり、実験のすべてのリンカー、ブロッカー、およびプライマー成分は、図１２Ｂと同一のままであった。その後、３ラウンドのスプリットアンドプールライゲーションは、精製された二重標識ペプチドと、個別に、単一標識コントロールとしてのヘキシニルオリゴに対して実施した。１０×１０×１０スプリットプールとともに二重標識ペプチドを使用することは、最大１０３＝１０００の異なるペプチドが同定されることを可能にする。両方のスプリットアンドプールライゲーションからの生成物をＰＡＧＥゲルで泳動してサイズを確認し（図１４Ｂ）そしてＰＡＧＥ精製した。正確な二重にラベル付けされ、完全にバーコード化されたペプチド≒２×４６＋２×２×４５＋２×４８＝３６８塩基。１５０塩基の周りの太いバンドは、ペプチドに取り付けられていない３つのライゲーションされたバーコード＝４５＋４５＋４８＝１３８に対応する。上のバンドは精製した。図１５Ａは、精製された生成物の連続希釈されたｑＰＣＲを示す。連続希釈は、バーコードの配列決定が可能な数百の標識ペプチドを単離する。線形Ｃｑ曲線は、意図したとおりに段階希釈が行われたことを示す。
【０１４７】
図１５Ｂは、ペプチドに取り付けられたコンビナトリアルバーコードを示す、精製された生成物の増幅およびサンガー配列決定を示す。サンガー配列のバーコード／ＵＭＩ領域に挿入された余分なＮは、予期しないアーティファクトである。次に、個々の分子をＩｌｌｕｍｉｎａプラットフォームで配列決定し、良好な読み取りが得られた。すなわちバーコードがラベル付きペプチドからキャプチャされた。配列決定の曲線は良好で、読み取りの大部分はバーコードテンプレートに本質的に完全に一致している。
【０１４８】
バーコードは読み取りに対してアラインされた。逆相補物の読み取りは逆相補された。図１６Ａは、アラインメントスコアの分布を示しており、スコアが高いほど良い。図１６Ｂは、各組み合わせに対する最良のアラインメントを示している。
【０１４９】
実施例６−システイン標識
システイン含有ペプチドは、マレイミド修飾オリゴヌクレオチドで標識できることが実証された（図１４Ｄ）。これらの生成物を精製した後、上記のように３ラウンドのライゲーションを実施し（非スプリットアンドプール）、これらの成功したライゲーションをＰＣＲによって確認した（図１４Ｅ）。
【０１５０】
本明細書で開示および特許請求される方法はすべて、本開示に照らして過度の実験を行うことなく、作成および実行され得る。本開示の組成物および方法は、好ましい実施形態の観点から説明されてきたが、本開示の概念、趣旨、および範囲から逸脱することなく、本明細書に記載の方法およびプロセスまたはプロセスの順序にバリエーションを適用できることは明らかである。より具体的には、同じまたは類似の結果が達成される場合、化学的および生理学的の両方に関連する特定の薬剤が、本明細書に記載の薬剤の代わりになり得ることは明らかであろう。当業者に明らかなそのようなすべての同様の代替物および修正は、添付の特許請求の範囲によって定義される開示の趣旨、範囲および概念の範囲内にあるとみなされる。
【０１５１】
参考文献
以下の参考文献は、本明細書に記載されているものに手順の、またはその他詳細の補足を提供する範囲で、参照により本明細書に具体的に組み込まれる。
2021531750.tif 000004
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０Ａ−１】
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【図１０Ａ−２】
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【図１０Ａ−３】
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【図１０Ｂ−１】
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【図１０Ｂ−２】
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【図１０Ｂ−３】
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【図１１Ａ】
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【図１１Ｂ】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１２Ｃ】
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【図１２Ｄ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【図１４Ｃ】
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【図１４Ｄ】
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【図１４Ｅ】
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【図１５Ａ】
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【図１５Ｂ】
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【図１５Ｃ】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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