(57)【要約】本発明は、医薬としての使用のための新規の複製効率の高い免疫調節ワクシニアウイルス株（ＩＯＶＡ）及びその誘導体に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節ワクシニアウイルスであって、前記ウイルスが哺乳動物細胞で複製能力があり、感染細胞の膜へのカルレティキュリン移動を引き起こし、それによって免疫原性細胞死を促進する、前記免疫調節ワクシニアウイルス。
【請求項２】
前記ウイルスがＡ５６Ｒ陰性であるか、または前記ウイルスがＡ２６Ｒ陰性及びＡ５６Ｒ陰性である、請求項１に記載の免疫調節ワクシナウイルス。
【請求項３】
前記ウイルス及び／またはその任意の誘導体が、前記ウイルスゲノムの一部である配列番号１で定義された変異したＣ２−Ｃ１−Ｎ１−Ｎ２領域のヌクレオチド配列上の１つのＢｓｔＸＩ制限酵素部位の存在によって定義される、請求項１または２に記載の免疫調節ワクシナウイルス。
【請求項４】
前記ウイルスがＫ１Ｌ陽性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシニアウイルス。
【請求項５】
前記ウイルスが、Ｂ２１Ｒ、Ｃ１０Ｌ、Ｃ９Ｌ、Ｃ４Ｌ、Ｃ２Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ａ５１Ｒ、Ａ５２Ｒ、Ａ５５Ｒ、及びＢ１３Ｒ／Ｂ１４Ｒからなるオープンリーディングフレームの群から選択される機能的に不活性化された免疫回避遺伝子の１つ以上をさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス。
【請求項６】
前記ウイルスが、Ｊ２Ｒ、Ｃ１１Ｒ、及びＦ４Ｌからなる群から選択される機能的に不活性化されるか、部分的に欠失したか、または完全に欠失した遺伝子の少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス。
【請求項７】
前記ウイルスが、細胞周期活性化細胞及び／または腫瘍細胞において複製能力のある及び溶解性である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシニアウイルス。
【請求項８】
前記ウイルスが感染の際に合胞体形成を引き起こす、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシニアウイルス。
【請求項９】
請求項１〜８に記載の免疫調節ワクシニアウイルスをコードする核酸配列またはそのフラグメント。
【請求項１０】
請求項９に記載の核酸配列またはその実質的な部分を含む、ウイルスベクターまたは免疫調節ワクシニアウイルスの誘導体。
【請求項１１】
１つ以上の組換え導入遺伝子の少なくとも１つの挿入を有する１つ以上の挿入部位を担持することを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス、請求項１０に記載のベクター及び免疫調節ワクシナウイルスの誘導体。
【請求項１２】
前記導入遺伝子が、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、疾患関連抗原、及び病原体由来抗原をコードする遺伝子を含む群から選択される、請求項１１に記載の組換え免疫調節ワクシナウイルスまたはベクター。
【請求項１３】
医薬における使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス、請求項１０に記載のベクター、または請求項１２に記載の組換え免疫調節ワクシナウイルス。
【請求項１４】
がんの治療における使用、及び／またはがんワクチンとしての使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス、請求項１０に記載のベクター、または請求項１２に記載の組換え免疫調節ワクシナウイルス。
【請求項１５】
請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス、請求項１０に記載のベクター、または請求項１２に記載の組換え免疫調節ワクシナウイルスと、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む医薬組成物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、医薬としての使用のための新規の複製効率の高い免疫調節ワクシニアウイルス株（ＩＯＶＡ）及びその誘導体に関する。
【背景技術】
【０００２】
近年、ウイルスが初めてヒトのがんの治療における腫瘍溶解性ウイルスとして使用するための市場承認を得た。このような成功は、一般的には、ウイルスに対して、及び、がんの治療のためにワクシニアウイルスの使用にも対して、科学的関心を再度フォーカスした。ワクシニアウイルスの使用は、例えば、ヒトにおけるポックスウイルス感染に対して予防する、ワクチン接種アプローチだけでなく、例えば、腫瘍ワクチンに対する、他の多くの医療や臨床試験にも適用されてきた。
【０００３】
科学界は、腫瘍溶解性ウイルスの最初の臨床研究で得られたデータから、これらのウイルスまたは設計されたウイルスベクターががん細胞において選択的に複製し、感染したがん細胞の溶解を積極的に促進できることを知っている。しかしながら、そのような感染したがん細胞の直接溶解は、かさばる腫瘍を根絶するのに十分であることがまれであり、転移性疾患を治癒することもまれである。これらの結果は、疾患の再発を避けるために、より強力かつ選択的なウイルスに対するものだけでなく、腫瘍破壊の代替メカニズムに対する増加した必要性をも示す。
【０００４】
より最近には、ワクシニアウイルスに基づくウイルス及びウイルスベクターが腫瘍溶解剤として試験されており、腫瘍細胞の直接溶解とは異なるメカニズムを介して腫瘍を破壊する能力があるため、最も有望であるらしい（Ｋｉｒｎ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００９）。一方で、腫瘍関連内皮細胞におけるウイルスの複製は、腫瘍血流の破壊、低酸素症、及び大規模な腫瘍壊死をもたらすことが実証され（Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．  ２０１３）；他方、腫瘍内のワクシニアウイルスの複製は、溶解後の腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）の放出と、腫瘍内に存在する局所免疫抑制の克服により、抗腫瘍免疫応答を誘発することができる（Ｔｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１０）。
【０００５】
これらの代替メカニズムは、臨床評価で重要であることが証明され、免疫系が腫瘍溶解性ベクターの活性を決定する上で果たすという非常に重要な役割を強調した。無作為化臨床試験において、最も効果的なウイルスは、細胞性免疫応答の活性化を最適化するために免疫活性化サイトカインを発現するウイルスであることが証明された（Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１１；Ｈｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。しかしながら、これらのより強力なサイトカイン発現ウイルスによってされ、一部の患者は、腫瘍に対する有効な免疫応答を誘発しない。効果的な抗腫瘍免疫応答の生成には、免疫細胞のさらに多くの異なる系統の活性化と共同作業が必要であり、単一のサイトカインの発現は、ウイルスによって誘発される全体的な免疫をほとんど変更できない。したがって、強力な免疫応答を活性化するより高い能力を持つ新規株の生成に関する研究が依然として必要とされる。
【発明の概要】
【０００６】
したがって、本発明の課題は、ヒトの疾患の治療に有用な、新たに適合した、及び／またはより強力なウイルス、及び／またはウイルスベクターを提供することであり、感染の際にウイルスまたはベクターは、追加のより強力であるが、安全上の理由から、そのような治療を必要とする患者における非常に特異的な免疫応答を誘発及び／または活性化する。
【０００７】
この課題は、本出願の請求項１に明記されているような、新たに同定された複製効率の高い免疫調節ワクシニアウイルス株によって解決された。さらなる実施形態は、この新たに同定及び／または適合された免疫調節ワクシニアウイルスならびにベクターのバリエーションに言及し、新たに同定及び／または適合されたワクシニアウイルス株を含む好ましい使用及び組成物は、従属請求項に記載される。
【０００８】
既知のワクシニアウイルス株に対する免疫応答を研究している間、特によく特性評価されたワクシニアウイルス株（Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｒｅｓｅｒｖｅ（ＷＲ））と比較して、本発明者らは新規のワクシニアウイルス株を分離、生成、及び特性評価することができた。この新規株は明らかに改善された免疫学的プロファイルを示す。理論に拘束されることなく、新規株は腫瘍細胞の感染の際に免疫原性細胞死の増加の強力な促進を示し、それによって免疫反応を感染した及びまだ感染していない腫瘍細胞に対して向け直すと考えられる。
【０００９】
ワクシニアウイルスＷＲ株は、腫瘍細胞におけるその高い複製能力のために腫瘍溶解性として試験され、腫瘍に対する免疫応答を増加するためのＧＭ−ＣＳＦの送達に使用された明確に定義されたウイルス株である。腫瘍選択性を有するベクターを提供するために、感染細胞の新陳代謝の活性化に関与する異なるワクシニアウイルス遺伝子の欠失に成功し、得られたウイルスベクターの複製が高複製指数を有する細胞に制限された。チミジンキナーゼまたはウイルス増殖因子などの遺伝子の欠失は、臨床試験で試験されたウイルス候補にすでに含まれている（Ｚｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１５）。
【００１０】
ＷＯ２０１５０２７１６３は、典型的なウイルスの免疫回避遺伝子の一部におけるゲノム欠失を含む腫瘍溶解性ワクシニアウイルスが記載されている一例である。この特定の場合に腫瘍溶解性ウイルスは、例えば、Ｂ８Ｒ、Ｂ１８Ｒ、及びＡ３５Ｒ遺伝子内の欠失を含む。
【００１１】
ＥＰ２１３６６３３は別の例であり、腫瘍溶解治療アプローチにおけるＧＭ−ＣＳＦ発現ワクシニアウイルスの治療的使用を記載している。
【００１２】
これらの腫瘍学のアプローチでは、ワクシニアウイルスＷＲ株は、新規に開発された腫瘍溶解性ワクシニアウイルスの開発及び比較のための、現在のゴールドスタンダードと考えられている。
【００１３】
しかしながら、この主張された成功に加えて、重症のがん患者における治療アプローチの基礎としてワクシニアウイルスＷＲを検討すると、いくつかの懸念がいまだ存在する。ワクシニアウイルスＷＲは、マウスの脳で複数回継代した後、ｉｎ  ｖｉｖｏで選択されたため、実際にはマウス細胞で複製能力の高いウイルスが得られたが、がん患者のがん患者の治療における安全な使用を妨げる可能性がある神経向性と神経毒性により、病原性が警告されている。
【００１４】
それにもかかわらず、本出願の文脈において、ワクシニアウイルスＷＲは、本発明の新規に開発されたワクシニアウイルス株との比較として選択され、本発明の主な目的は、大幅に改善された免疫学的プロファイルと高い溶解及び／または腫瘍溶解能力を有する、新規の複製能力のある免疫調節ワクシニアウイルス株を提供することである。
【００１５】
ＭＶＡ（修飾されたワクシニアアンカラ）は、そのホスト範囲制限、換言すると哺乳動物宿主由来の細胞におけるその複製欠陥を特徴とするので、高度に弱毒化されたＭＶＡ株による追加の比較は、有用ではないように見える。ＭＶＡは、病原体に対するワクチン接種のための抗原の送達に広く使用されており（総説についてＶｏｌｚ  ＆  Ｓｕｔｔｅｒ，  ２０１７を参照されたい）、その生物学的及び免疫学的プロファイルに関して特性評価されている（Ｍｅｙｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，  １９９１）。さらに、ＭＶＡは哺乳動物細胞で複製できない高度に改変されたワクシニアウイルスであり、以前は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を送達することにより腫瘍に対するワクチン接種に使用されていた（Ｚｈａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１２）。このウイルスは理想的な安全性プロファイルを示しているようであり、発現した腫瘍抗原に対する免疫応答をｉｎ  ｖｉｖｏで効果的に生成することが証明されたという事実に関係なく、ほとんどの患者は検証可能な抗腫瘍応答を全く示さず、誘発された免疫は、腫瘍内で局所的に発生する免疫抑制によって妨げられ、無効な抗腫瘍応答をもたらすように見える（Ｍａｒｉｇｏ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００８）。
【００１６】
したがって、進歩は改善された免疫療法に向けて述べられているかもしれないが、がんを根絶することができる効果的な免疫応答を確立するために、がんのウイルス療法で使用されるより効果的なワクシニアウイルス株への必要性が依然として存在する。
【００１７】
本発明は、ここで、この目標に向けたさらなるステップを記載し、ヒト及びマウス細胞において複製能力があり、本発明者らの最良の知識によれば、免疫学的に関連したカルレティキュリン（ＣＲＴ）の外膜への転座により、感染細胞の外細胞膜でのカルレティキュリンの露出をもたらし、これにより強力で改善された免疫応答が開始される、概して最初のワクシニアウイルスさえである新規ワクシニアウイルス株を開示する。
【００１８】
カルレティキュリン（ＣＲＴ）は多機能タンパク質であると見られ、ホルモン応答性ＤＮＡエレメントの転写調節及びＭＨＣクラスＩタンパク質の成熟に関与すると記載されており、また、小胞体内のＣａ２＋イオンまたは誤って折りたたまれたタンパク質を結合して不活性化し、主に小胞体（ＥＲ）の貯蔵コンパートメントに位置しているとも記載されている。ＣＲＴはＥＲ内腔の最も豊富なタンパク質を表すが、細胞死の場合、タンパク質の画分がＥＲ内腔から細胞表面に移動する可能性があり、より具体的には、ＣＲＴが細胞表面で「ｅａｔ−ｍｅ」シグナルとして機能し（Ｇａｒｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２００５）、ＣＤ９１陽性細胞（主にマクロファージ及び樹状細胞（ＤＣ））による貪食を仲介することが示唆されている。
【００１９】
新規ワクシニアウイルス株は、哺乳動物細胞中で複製能力があると記載されている。この理論に束縛されることなく、この特性は、とりわけ、ウイルス骨格におけるＫ１Ｌ遺伝子の存在及び機能的活性に依存すると考えられている。特に、新規な株は、哺乳動物、特にヒト及びマウス細胞株、例えば、ＨｅＬａ細胞、１４３Ｂ細胞、ＣＴ２６細胞、ＬＬＣ１細胞、またはＭＣＦ−７細胞などのがん細胞においてよく複製することが示されている。これらの結果との比較では、ＭＶＡが、これらの細胞内または哺乳動物起源の他の細胞内で複製しないことが知られていることに留意すべきである。
【００２０】
さらに、新規のクシニアウイルス株は、他のワクシニアウイルス株の全て及び／または少なくとも一部と、いくつかのハウスキーピング遺伝子を共有している。それは、しかしながら、その免疫学的プロファイルではかなり異なり、本出願の文脈において、ＩＯＶＡ（免疫腫瘍溶解性ワクシニア）と命名された。
【００２１】
ワクシニアウイルスゲノムの多くの遺伝子は、さまざまなウイルス株の免疫学的プロファイルを形成及び決定する免疫回避遺伝子であると記載されている（Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１３）。長年にわたり、研究は、そのような免疫回避遺伝子の潜在的な作用機序を同定するために行われてきた。得られた結果によれば、これらの免疫回避遺伝子は、とりわけ、天然受容体と競合し、サイトカイン誘導性免疫応答の効力を低下させる、サイトカインの可溶性受容体を発現する。他の遺伝子は、さまざまな免疫活性化遺伝子を活性化するための細胞内経路を遮断し、したがって、ウイルス特異的免疫応答を妨害及び低減する。
【００２２】
要約については、表１が、ワクシニアウイルスの現在同定されている免疫回避遺伝子、及びさまざまなワクシニア株におけるその存在または不在について列挙する。それはまた、対応する遺伝子産物の潜在的な機能または作用機序を示す。
【表１】
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【００２３】
表１において使用されるオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の命名法は、（ワクシニアウイルスコペンハーゲン（ＣＯＰ）株について確立された命名システムを指し（Ｇｏｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．  １９９０）、制限エンドヌクレアーゼＨｉｎｄＩＩＩによってサイズが減少するウイルスゲノムのＤＮＡフラグメントに割り当てられたアルファベットの文字によって同定される。例外は、ワクシニアウイルスＣＯＰ株に存在しないため、牛痘ウイルスＣＰＸＶ−ＧＲＩゲノム中のＤＮＡフラグメントを参照する文字を含むＯＲＦ  Ｃ８Ｌ及びＢ２１Ｒである。このようなＨｉｎｄＩＩＩフラグメントのさまざまなＯＲＦは番号で同定される。末尾の文字は、転記の方向を示す：Ｒは右、Ｌは左である。
【００２４】
さらに、表１は、これまでに同定された免疫回避遺伝子と、よく特性評価されているワクシニアウイルス株ＣＯＰ、ＷＲ、ＭＶＡ、及びＭＶＡ祖先株ＣＶＡとの機能性に関する比較を提供する。表１において、さまざまな遺伝子がさまざまなウイルスゲノムにおいて機能的（「＋」で示される）、部分的／完全に欠失し、機能的に不活性（「−」で示される）かどうかを示す。
【００２５】
本明細書において記載され、及び以下ＩＯＶＡとして同定される、新規のワクシニアウイルス株は、それ自身の免疫学的プロファイルを有する。これは、機能的に発現する遺伝子の一部をＣＶＡまたはＷＲと共有し、機能的に不活性な遺伝子の一部をＭＶＡと共有する。これは、新規のワクシニアウイルスＩＯＶＡの１つの分離株の全長配列を、公開されているＷＲ、ＣＯＰ、ＣＶＡ、ＭＶＡの配列と比較して、配列レベルでも本発明者らによって確認されている。
【００２６】
本発明者らはまた、新規ＩＯＶＡ株を簡単に同定するためのＰＣＲアッセイを開発した。このため、試験される任意のワクシニアウイルスのＤＮＡフラグメントは、一方のＣ２Ｌ  ＯＲＦ（オープンリーディングフレーム）の領域または配列と、Ｎ２Ｌ  ＯＲＦの領域または配列とにおいて特異的に結合するＰＣＲオリゴヌクレオチド（プライマー）で増幅できる。標準パラメーターで実行されるＰＣＲは、ほとんどのワクシニアウイルスに対して、ＯＲＦ  Ｃ２Ｌ−Ｃ１Ｌ−Ｎ１Ｌ−Ｎ２Ｌの配列を含む増幅フラグメントを生成する。これらのＰＣＲ産物は二本鎖ＤＮＡフラグメントであるため、制限エンドヌクレアーゼＢｓｔＸＩによる酵素処理を受ける。結果として、例えば、ワクシニア株ＷＲ、ＣＯＰ、及びＣＶＡにおいて得られる特異的なＤＮＡ産物は切断されず、アガロースゲル電気泳動の際に３２８０ｂｐ（分子量）周辺の単一のバンドを示す。対照的に、特異的なＩＯＶＡ  ＤＮＡ産物は、ＢｓｔＸＩによって切断され、アガロースゲルで約２３６０ｂｐと約９２０ｂｐの分子量を有する二つのバンドを示す。その理由は、新規ＩＯＶＡウイルスがＮ１Ｌ  ＯＲＦに非常に特異的な変異を有し、機能的な不活性Ｎ１Ｌと新しいＢｓｔＸＩ制限部位をもたらすことである。ＭＶＡの場合には、Ｃ２Ｌ遺伝子配列は、ＭＶＡゲノム内で欠失し、したがって、この特異的なＰＣＲによるＤＮＡ産物の全く増幅が存在しないであろう。
【００２７】
表１及び本出願で提示されるデータから分かるように、ＩＯＶＡ自体ならびにその全ての誘導体は、それが多くの遺伝子及び／または機能的欠失をＣＶＡ、ＷＲ、及びＭＶＡと共有しているが、その安全性の特徴だけでなく、その免疫学的プロファイルに関しても独特である。
【００２８】
本発明の本質的な中心である、この免疫学的プロファイルは、とりわけ、ウイルス感染細胞の外膜上のカルレティキュリンの提示と相関している。
【００２９】
したがって、新規な株の免疫学的プロファイルは、とりわけ、ウイルス感染細胞の外膜上の測定可能なカルレティキュリンの提示を誘発すると記載される。この理論に拘束されることなく、この特性は、機能的不活性、ウイルス骨格内のＢ２１Ｒ＊、Ｃ１０Ｌ、Ｃ９Ｌ、Ｃ４Ｌ、Ｃ２Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ａ２６Ｒ、Ａ５１Ｒ、Ａ５２Ｒ、Ａ５５Ｒ、Ａ５６Ｒ、及びＢ１３Ｒ／Ｂ１４Ｒ（ＣＰＸＶ−ＧＲＩ命名法に対応する＊を除いてワクシニアウイルスＣｏｐ株の命名法）からなる群から選択される少なくとも１つの免疫回避遺伝子の部分的または完全な欠失に依存すると考えられている。
【００３０】
これらの機能的に不活性な、部分的または完全に欠失した遺伝子の結果として、新しく生成されたウイルスは宿主の免疫応答を回避するために、その機能の一部を失っただけでなく、免疫回避戦略における変化までもがさらに導入されている。
【表２】
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【００３１】
この文脈で特に興味深いのは、通常は厳密に内部にあり、小胞体に位置するカルレティキュリンタンパク質であるが、新規ワクシニアウイルス株に感染した後、がん細胞の細胞表面に移動すると、ウイルス感染細胞に対する特異的な免疫反応を開始及び強化することができるという効果である。カルレティキュリンは、外膜に提示されるときに「ｅａｔ−ｍｅ」シグナルとして作用すると記載されている危険関連分子パターン（ＤＡＭＰｓ）であり、免疫原性細胞死のマーカーとして使用し得る。ワクシニアウイルスＷＲと比較して、新たに生成されたワクシニアウイルス株ＩＯＶＡは、はるかに低い用量で、したがってはるかに効率的に、がん細胞を溶解または殺傷する（図３Ａ）。
【００３２】
発明者らは、ヒトとマウスの両方の細胞株において、ＷＲが培養腫瘍細胞の７０〜８０％しか殺傷することができず；細胞の約２０〜３０％がウイルス媒介の破壊を回避し、感染多重度が大幅に増加した場合でも代謝活性を維持したことを示した。
【００３３】
対照的に、新規ＩＯＶＡウイルスの誘導体は、試験した全ての細胞株で少なくとも９５％以上、及び９５％を超えてさえも細胞を破壊し、驚くべきことに、ヒト細胞株ＨｅＬａにおいて、新規ＩＯＶＡ誘導体は、ワクシニアウイルスＷＲよりも少なくとも４０倍効率的である非常に改善された細胞毒性を実証したが、ＨｅＬａにおけるＩＯＶＡの増殖能力に関しては、ワクシニアウイルスＷＲと非常に類似していた。ウイルス感染細胞を殺傷するためのこのより完全な効率は、特に腫瘍寛解のリスクを低減し、したがって、非常に有利である。
【００３４】
したがって、細胞周期活性化細胞及び／または腫瘍細胞の感染のため、ならびにこの文脈において、特に腫瘍溶解性ウイルスとしての使用またはがんの治療における使用のためだけでなく、ワクチン接種の目的及びより一般的な免疫刺激の目的のため、したがって一般的な医薬での使用のためにも、新規ワクシニアウイルス株を使用することは非常に有利である。
さらに、更なる実施形態によれば、新規ワクシニアウイルス株ＩＯＶＡは機能的に不活性なＡ５６Ｒ遺伝子を含む。この遺伝子産物の発現の欠如は、感染細胞を隣接した細胞に融合させる能力、すなわち、哺乳動物細胞及び腫瘍細胞の感染の際に合胞体を形成するウイルスの能力と相関する。
【００３５】
合胞体形成は、多くのウイルス感染症で記載されており、これらの感染症のほとんどでは、その形成は細胞変性効果によって引き起こされる膜不安定化の結果であるが、他の一部のウイルスは、この合胞体形成を促進するタンパク質をコードしており、中和抗体の標的にならずに感染を拡大するメカニズムとして機能する。興味深いことに、Ａ５６Ｒ遺伝子産物は、そのような合胞体形成を阻害するために、ワクシニアウイルスＷＲによって発現する（図１）。
【００３６】
合胞体細胞死は非常に免疫原性であると記載されているため、新規ワクシニアウイルスＩＯＶＡががん細胞で合胞体形成を引き起こすという発見は、腫瘍溶解性ウイルスの潜在的に興味深い表現型と考えられている：腫瘍細胞の融合は、樹状細胞によって効率的に取り込まれ、したがって非常に特異的な免疫反応を向上することができる腫瘍抗原の効果的な放出に関連するエキソソーム様小胞の放出を誘発する。
【００３７】
さらに、更なる実施形態によれば、新規ワクシニアウイルス株ＩＯＶＡは機能的に不活性なＡ２６Ｒ及びＡ５６Ｒ遺伝子を含む。これらの遺伝子産物の発現の欠如は、哺乳動物細胞及び腫瘍細胞の感染の際の向上した合胞体形成と相関し、したがって、感染細胞を隣接細胞と融合させるウイルスの能力とも相関する。
【００３８】
ＩＯＶＡウイルス特異的抗腫瘍効果の可能性のあるメディエーターとしてのシンシチウム形成及びそのような融合におけるＡ５６Ｒ単独の、またはＡ２６Ｒの欠失と組み合わせての欠失の効果を調査するために、単一のＡ５６＋ＩＯＶＡウイルスバリアントを、変異したＡ５６Ｒ遺伝子を置き換えて、ＩＯＶＡ／Ａ５６＋を作成することによって改変した（図１及び図６）。Ａ５６Ｒ遺伝子発現が回復すると、ＩＯＶＡ／Ａ５６＋ウイルスは腫瘍細胞を融合する一定の能力を維持するが、ＩＯＶＡ／Ａ２６−／Ａ５６−ウイルスと比較して融合細胞の数は減少する（図６）。これは、両方の遺伝子が相互作用して感染細胞の融合を完全に阻害する可能性があることを示す。
【００３９】
合胞体形成は、例えば、麻疹ウイルスまたはアデノウイルスに由来する他の候補腫瘍溶解性ウイルスの生産的複製に負の影響を持つことが知られている。驚くべきことに、ＩＯＶＡウイルスとの関連での合胞体形成は複製能力への影響が最小限であることが実証されており、ＩＯＶＡ／Ａ５６−及びＩＯＶＡ／Ａ５６＋に感染した細胞から非常に類似したウイルス収量が得られた（図２）。
【００４０】
驚くべきことに、合胞体の形成は、本発明によるがん細胞の細胞毒性に顕著な正の影響を及ぼした。試験した全ての細胞株において、合胞体形成ウイルスは、特に１４３Ｂ及びＭＣＦ−７がん細胞株において、がん細胞のより効果的な殺傷を行い、ＩＯＶＡ／Ａ５６＋は培養がん細胞の殺傷が減少しているワクシニアウイルスＷＲと同様に機能した（図３）。したがって、ＩＯＶＡ／Ａ５６−及びＩＯＶＡ／Ａ５６−／Ａ２６−が仲介する合胞体形成は、増強したがん細胞の破壊に寄与する。
【００４１】
がん細胞の感染後に大きなプラークの表現型が観察された。ＩＯＶＡ／Ａ５６−とＩＯＶＡ／Ａ５６＋のウイルスの両方とも、単一のがん細胞の感染後に生成されるプラークの直径の増加によって示されるように、がん細胞を殺傷し、がん細胞において拡散する増強した能力を示す（図７）。
【００４２】
免疫原性細胞死の誘導に関して、合胞体形成は、ＣＲＴ移動の誘導からも独立しており、ＨＭＧＢ１及びＡＴＰなどの更なるＤＡＭＰの追加の分泌からも独立しており、Ａ５６−ウイルスとＡ５６＋ウイルスの両方で非常に類似していた（図４ａ〜ｃ）。
【００４３】
興味深いことに、本発明の文脈において、感染細胞の外膜上のカルレティキュリンの独立した露出に加えて、それ自体ですでにがん細胞において増強された細胞変性効果を有する同胞体形成の表現型が、本明細書に記載の免疫調節ワクシナウイルス株ＩＯＶＡの抗腫瘍効果をさらに高めたことが示されている。
【００４４】
したがって、新規ワクシニアウイルス株は、さらに機能的に不活性なＡ５６Ｒ及び／またはＡ２６Ｒ遺伝子が含まれていてもよく、したがって、合胞体形成の原因となり、腫瘍細胞の融合を誘導する。感染細胞の膜上のカルレティキュリンの強化された提示と組み合わせて、これはさらに大きな溶菌、したがって抗腫瘍活性をもたらし、結果としてがん細胞、腫瘍塊、の増強した破壊をもたらし、最終的には腫瘍に対するより強い免疫応答の生成をもたらす。
【００４５】
新規ＩＯＶＡウイルス、その誘導体、及び／またはそのウイルスベクターの安全性を高めるために、複製を特定の細胞範囲のみに制限するために追加の改変が導入されたか、または導入され得る。
【００４６】
したがって、別の実施形態によれば、新規ワクシニアウイルス株、ＩＯＶＡは、宿主範囲、換言すると、複製細胞及び／またはがん細胞における細胞範囲制限された複製能力を有するように改変される。
【００４７】
この文脈において、「複製細胞」という用語は、活性化された細胞周期を有し、高い指数で複製する細胞を含む。この定義に該当する細胞は、がん細胞などの継続的に複製している細胞だけでなく、例えば、活性化された免疫系に属する細胞及び必要に応じて腫瘍に浸潤する可能性を有する細胞をも含む。
【００４８】
さらに、以下で使用される「がん細胞」という用語は、容赦なく、制御不能に分裂し、例えば、固形腫瘍塊を形成することによってか、または異常な細胞で血液及び／または他の体腔をあふれさせることによって、正常組織に取って代わるか、または廃棄する能力を有する細胞を含む。さらに、「がん細胞」という用語は、必要に応じて、それらの、既知の腫瘍マーカー遺伝子産物を発現し、それらの発現によって同定され得る細胞も指す。
【００４９】
新規ワクシニアウイルス株の細胞範囲特異性を改善するために、Ｆ４Ｌ、Ｊ２Ｒ、及びＣ１１Ｒからなる群から選択されるいわゆるハウスキーピング遺伝子の１つ以上を不活性化することにより、細胞範囲制限された複製能力を得ることができる。例えば、不活性化または変異したＪ２Ｒ遺伝子を持つウイルスは、ウイルスのチミジンキナーゼを発現しないため、その効果的な複製は、細胞周期が継続的に活性化されている細胞、または代替的に腫瘍細胞に限定される。本発明によれば、そのような不活性化は、ワクシニアの命名法ではＪ２Ｒと呼ばれるＴＫ遺伝子の位置に代替的な発現カセット（トレーサー色を発現する）を挿入することによって例示的に行われた。
【００５０】
同様に、Ｃ１１Ｒ、Ｆ４Ｌの機能的不活性化、欠失、または変異も、単独で、またはお互いもしくはＪ２Ｒと組み合わせて、本発明によるワクシニアウイルス株の複製能力を細胞周期活性化細胞及び／または腫瘍細胞に制限する。したがって、上記の宿主範囲制限の結果を有するＦ４Ｌ、Ｊ２Ｒ、及びＣ１１Ｒからなる群の１つ以上の遺伝子を機能的に不活性化するためのウイルスゲノムへのそのような変異または欠失の追加は、新規ウイルス株の安全性特徴を明らかに改善する。
したがって、細胞範囲が制限されたワクシニアウイルス株ＩＯＶＡは、改善した安全性特徴のため、医薬での使用に特に有利である。
【００５１】
本発明の新規ワクシニアウイルス株は、ワクシニアウイルスＷＲと比較して、驚くべきことに、感染の際に免疫原性細胞死を誘導することができることが本発明者らによってさらに示された。
【００５２】
この文脈において、「免疫原性細胞死」という用語は、死にかけている細胞に対する免疫応答を開始及び活性化することができ、微生物と発がん性の両方のネオ抗原に対する免疫応答を引き起こすことができる損傷に関連する分子パターン（ＤＡＭＰ）分子の放出または露出を特徴とする細胞死の一形態として理解されるべきである（Ｇａｌｌｕｚｚｉ  ｅｔ  ａｌ．，  ２０１７）。腫瘍細胞に対する免疫応答を媒介し得る死にかけている細胞によって放出または暴露されるＤＡＭＰの長いリストの中で、細胞の細胞表面でのカルレティキュリンの暴露、及び独立した、細胞外空間への高移動度グループボックス１タンパク質（ＨＭＧＢ１）またはＡＴＰの放出が記載されている。
【００５３】
免疫原性細胞死はさらに、樹状細胞（ＤＣ）を活性化し、その結果、死にかけている細胞に存在する抗原に対して特異的なＴ細胞を活性化するために、異なるＤＡＭＰを露出または放出する細胞死の一形態として記載できる。アポトーシスは、例えば非免疫原性及び寛容原性の細胞死としても定義され、同一のＤＡＭＰによって定義することはできないので、これは、外部からは誘発されない。
【００５４】
そのようなマーカーの背景知識により、本発明者らは、ウイルスによって引き起こされる細胞死のタイプを実際に記載及び分類することが可能であった。その結果、ワクシニアウイルスＷＲと比較して、新規ワクシニアウイルス株であるＩＯＶＡは、感染の際に溶解作用と殺細胞作用の増加を引き起こすだけでなく、一部のＤＡＭＰ、すなわち、ＨＭＧＢ１とＡＴＰを測定することで、及び免疫原性細胞死のために死んだ感染細胞の細胞外膜に提示されたＣＲＴの量を測定することによって、示すこともできることが明らかに実証された。
【００５５】
これは、哺乳動物細胞、特に腫瘍細胞または細胞周期活性化細胞で複製する新規ワクシニアウイルス株が、ワクチン接種目的のワクチンまたはアジュバントとしてだけでなく、さらなる免疫療法または免疫腫瘍治療、特にがんの治療に使用する腫瘍溶解性ウイルスとしての状況でも非常に有用であることを印象的に証明する。
【００５６】
要約すると、新規ワクシニアウイルス株ＩＯＶＡとその誘導体、ベクター、及び組換え体は、哺乳動物のがん株で複製する能力を持ち、ゴールドスタンダードのワクシニアウイルスＷＲと比較して、細胞周期活性化細胞及び／または腫瘍細胞を破壊する向上した能力を誘発するため、溶解性、またはがん細胞の場合は腫瘍溶解性であると説明できる。
【００５７】
重要なことに、ＩＯＶＡ及びその誘導体または組換え体は、細胞の感染の際に免疫原性細胞死を誘導するのに特に適しており、それによって免疫療法アプローチにおいて使用されるのに非常に期待されている。それらは、安全で効率的な免疫療法または免疫腫瘍治療のための新規プラットフォームウイルスとして特に適している。
【００５８】
さらなる実施形態によれば、本出願はまた、その核酸配列を特徴とする単離されたＩＯＶＡウイルスを提供する。単離されたＩＯＶＡの配列情報は、塩基対改変を含むことができるが、ＩＯＶＡの免疫学的プロファイルに影響を与えない。したがって、ＩＯＶＡウイルスは、配列解析とＪ２Ｒ、Ｃ１１Ｒ、Ｆ４Ｌ、Ｂ２１Ｒ＊、Ｃ１０Ｌ、Ｃ９Ｌ、Ｃ４Ｌ、Ｃ２Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ａ２６Ｒ、Ａ５１Ｒ、Ａ５２Ｒ、Ａ５５Ｒ、Ａ５６Ｒ、及びＢ１３Ｒ／Ｂ１４Ｒからなる群から選択されるうちの少なくとも一つ以上の機能的に非活性化または欠失したＯＲＦの存在とによって同定され得る。
【００５９】
さらなる一実施形態によれば、ＩＯＶＡ及びその誘導体は、Ｎ１Ｌ  ＯＲＦに新たに生成されたＢｓｔＸＩ制限酵素部位を導入する、Ｃ２Ｌ−Ｃ１Ｌ−Ｎ１Ｌ−Ｎ２Ｌ（配列番号１）の独自のヌクレオチド配列ストレッチの存在によって同定され得る。この配列では、Ｃ２Ｌは３個の微小欠失に分布する５１個のヌクレオチドの欠失を組み込む。Ｎ１Ｌは、早期終止コドンを組み込んだ２個のヌクレオチドの欠失を組み込む。Ｎ２Ｌは、短いＮ２Ｌバージョンをコードする１５個のヌクレオチドの欠失を組み込む。したがって、配列番号１に示す配列がＩＯＶＡの独自の配列であり、ＯＲＦの一部に微小欠失を組み込むＩＯＶＡのＣ２Ｌ−Ｃ１Ｌ−Ｎ１Ｌ−Ｎ２Ｌ領域の独自のストレッチを表すが、このような遺伝子の完全な欠失ではなく、機能的であるＣ１Ｌ  ＯＲＦの微小欠失はない。
【００６０】
さらに、単離されたＩＯＶＡは、１つの実施形態によれば、プラットフォームテクノロジーとみなされ、前述のＰＣＲ分析、またはウイルスのハウスキーピング、もしくはＫ１Ｌ、Ａ５６Ｒ、Ａ２６Ｒ、Ｊ２Ｒ、Ｃ１１Ｒ、Ｆ４Ｌ、Ｂ２１Ｒ＊、Ｃ１０Ｌ、Ｃ９Ｌ、Ｃ４Ｌ、Ｃ２Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ａ５１Ｒ、Ａ５２Ｒ、Ａ５５Ｒ、及びＢ１３Ｒ／Ｂ１４ＲからなるＯＲＦの群から選択された機能的に不活性な免疫回避遺伝子のうちの少なくとも１つ以上の直接の配列比較によって同定される、関連する誘導体または組換え体の生成を可能にする。
【００６１】
さらなる実施形態によれば、本出願はまた、ＩＯＶＡに由来するウイルスベクターを提供する。このウイルスベクターはＩＯＶＡとして機能的に活性と機能的に不活性な遺伝子の同じセットを含む。本出願の文脈における用語「ウイルスベクター」はまた、細胞をトランスフェクトしてそのような細胞からのＩＯＶＡの産生を可能にするために協調して働くＩＯＶＡの機能的に活性及び機能的に不活性な遺伝子のセットの一部または範囲をそれぞれ含むかまたは担持する２つ以上のベクター分子を含む。
【００６２】
ＩＯＶＡ自体、単離されたウイルス、ＩＯＶＡの核酸配列、及びＩＯＶＡ特異的核酸配列を含むウイルスベクターは、プラットフォーム技術とみなされる。
【００６３】
前記ＩＯＶＡプラットフォームはまた、ＩＯＶＡの誘導体を含み、これはＰＣＲ及びＢｓｔＸＩ酵素による制限酵素消化によって同定することができ、なおＩＯＶＡと同じ機能的特徴及び特性、特に哺乳動物細胞周期活性化細胞における複製能力、特に感染細胞におけるカルレティキュリンの外膜への移動及び／または独立した合胞体形成の誘導を利用する。
【００６４】
前記ＩＯＶＡプラットフォームは、ＩＯＶＡの組換え体をさらに含む。ＩＯＶＡの骨格には、そのゲノムにトランスジェニック挿入するための、よく記載されているワクシニアウイルス挿入部位がいくつか含まれている。ワクシニアウイルスとの密接な関係により、熟練した開業医は、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、疾患関連抗原、及び／または病原体由来抗原をコードする遺伝子などの導入遺伝子の挿入のための１つまたはいくつかの場所を知っており、それらを使用することができる。
【００６５】
したがって、さらなる実施形態によれば、本発明は、組換えまたはトランスジェニックのＩＯＶＡまたはその誘導体もしくはウイルスベクターを提供する。全てのプラットフォーム技術と同様に、十分に記載された挿入部位への追加の遺伝子または遺伝情報の導入は、特許請求されたプラットフォームメンバーの主な特性に影響を与えず、これらは独立して（ｉ）感染細胞の融合または合胞体形成の誘導、（ｉｉ）ＤＡＭＰ、特にカルレティキュリンの顕著な放出または露出の誘導、及び／または（ｉｉｉ）感染細胞の免疫原性細胞死の誘導であり、これは、さらに大きな免疫学的効果、または腫瘍細胞の感染の場合には腫瘍細胞の増強された破壊によるより効果的な抗腫瘍活性に寄与する可能性がある。
理論に拘束されることなく、より効果的な抗腫瘍活性は、特にカルレティキュリンの提示及び／または他のＨＭＧＢ１またはＡＴＰなどのＤＡＭＰの増加した放出によって引き起こされる可能性のある、そのような感染細胞に対するより強い免疫応答に起因すると考えられている。放出されたＨＭＧＢ１はＴＬＲ４及びＲＡＧＥに結合し、炎症性応答を引き起こすことができるが、放出されたＡＴＰは免疫細胞に対する「ｆｉｎｄ−ｍｅ」シグナルとしても機能するらしい。
【００６６】
要約すると、新規ワクシニアウイルス株ＩＯＶＡとその誘導体、ベクター、及び組換え体は、哺乳動物のがん株で複製する能力を持ち、ゴールドスタンダードのワクシニアウイルスＷＲと比較して、細胞周期活性化細胞及び／または腫瘍細胞を破壊する向上した能力を誘発するため、溶解性、またはがん細胞の場合は腫瘍溶解性であると説明できる。
【００６７】
ＩＯＶＡまたはその誘導体は、独自の免疫学的プロファイルとその安全性特徴により、すでに確立されているワクシニアウイルス株に匹敵するか、それよりも優れているため、医薬において、特に腫瘍学的アプローチにおいて、または腫瘍溶解薬としてもしくはがんまたは他の病原体に対するワクチンとして使用することができる。
【００６８】
重要なことに、ＩＯＶＡウイルス及びその誘導体または組換え体は、細胞の感染の際に免疫原性細胞死を誘導するのに特に適しており、それによって免疫療法アプローチにおいて使用されるのに非常に推奨されている。それらは、安全で効率的な免疫療法または免疫腫瘍治療のための新規ウイルスプラットフォームとして特に適している。
【図面の簡単な説明】
【００６９】
【図１Ａ】ＩＯＶＡウイルス感染後のがん細胞における合胞体形成。蛍光顕微鏡写真（４０倍）がヒトのがん細胞株の感染後（感染の２４時間後）に示される。ＨｅＬａ及びＣＴ２６細胞を０．５のＭＯＩで感染させた。１４３Ｂ、ＭＣＦ−７、及びＬＬＣ１を、５のＭＯＩで感染させた。ｍＣｈｅｒｒｙは、Ｐ１１プロモーターの下で全てのウイルスから発現する。細胞をＩＯＶＡ／Ａ５６−で感染させたとき、細胞の大規模な融合（合胞体）を観察することができる。
【図１Ｂ】ＩＯＶＡウイルス感染後のがん細胞における合胞体形成。蛍光顕微鏡写真（４０倍）がマウスのがん細胞株の感染後（感染の２４時間後）に示される。ＨｅＬａ及びＣＴ２６細胞を０．５のＭＯＩで感染させた。１４３Ｂ、ＭＣＦ−７、及びＬＬＣ１を、５のＭＯＩで感染させた。ｍＣｈｅｒｒｙは、Ｐ１１プロモーターの下で全てのウイルスから発現する。細胞をＩＯＶＡ／Ａ５６−で感染させたとき、細胞の大規模な融合（合胞体）を観察することができる。
【図２Ａ−１】ヒト及びマウスの腫瘍細胞におけるＩＯＶＡウイルスのウイルス生成。ヒトの腫瘍細胞株をＷＲ／ＴＫ−、ＩＯＶＡ／Ａ５６−、またはＩＯＶＡ／Ａ５６＋で、５のＭＯＩで感染させ、子孫をさまざまな時点でのプラークアッセイによって測定した。ウイルス収量は、２つの独立した実験を実施することによって、各細胞株について四重で評価した。平均＋ＳＤがプロットされる。＊、ＷＲ／ＴＫ−と比較して有意ｐ＜０．０５。＃、ＩＯＶＡ／Ａ５６＋と比較して有意ｐ＜０．０５。
【図２Ａ−２】図２Ａ−１の続きである。
【図２Ｂ】ヒト及びマウスの腫瘍細胞におけるＩＯＶＡウイルスのウイルス生成。マウスの腫瘍細胞株をＷＲ／ＴＫ−、ＩＯＶＡ／Ａ５６−、またはＩＯＶＡ／Ａ５６＋で、５のＭＯＩで感染させ、子孫をさまざまな時点でのプラークアッセイによって測定した。ウイルス収量は、２つの独立した実験を実施することによって、各細胞株について四重で評価した。平均＋ＳＤがプロットされる。＊、ＷＲ／ＴＫ−と比較して有意ｐ＜０．０５。＃、ＩＯＶＡ／Ａ５６＋と比較して有意ｐ＜０．０５。
【図３Ａ−１】ＩＯＶＡウイルス存在は、腫瘍細胞に対して増加した細胞毒性を示す。がん細胞は、ＷＲ／ＴＫ−、ＩＯＶＡ／Ａ５６−、またはＩＯＶＡ／Ａ５６＋で、１００から０．０００５ＰＦＵ／細胞の範囲の用量で感染させた。感染後３日目に、細胞の生存率を決定した。ヒトのがん細胞を試験した。４つの異なる反復を、細胞株について定量し、各ＭＯＩの平均±ＳＤが示される。
【図３Ａ−２】図３Ａ−１の続きである。
【図３Ｂ−１】ＩＯＶＡウイルス存在は、腫瘍細胞に対して増加した細胞毒性を示す。がん細胞は、ＷＲ／ＴＫ−、ＩＯＶＡ／Ａ５６−、またはＩＯＶＡ／Ａ５６＋で、１００から０．０００５ＰＦＵ／細胞の範囲の用量で感染させた。感染後３日目に、細胞の生存率を決定した。マウスのがん細胞を試験した。４つの異なる反復を、細胞株について定量し、各ＭＯＩの平均±ＳＤが示される。
【図３Ｂ−２】図３Ｂ−１の続きである。
【図４Ａ−１】ＩＯＶＡウイルスによる免疫原性細胞死の誘導。（Ａ）感染細胞の表面上のカルレティキュリンの発現の分析。示された腫瘍細胞株をＷＲ／ＴＫ−、ＩＯＶＡ／Ａ５６−、またはＩＯＶＡ／Ａ５６＋で、５のＭＯＩで感染させ、感染後２４時間のカルレティキュリン＋細胞集団を、フローサイトメトリーによって決定した。非感染細胞（モック）及びスタウロスポリン１μＭは、それぞれ、陰性及び陽性の対照として使用した。（Ａ）カルレティキュリン＋細胞のパーセンテージ。さまざまな治療の個々の反復の値と手段±ＳＥＭがプロットされる。ＥＬＩＳＡアッセイ及びＥＮＬＩＴＥＮ  ＡＴＰアッセイ系が、示された腫瘍細胞株の感染（５のＭＯＩ）後２４時間でそのような濃度を決定するために、それぞれ使用された。データは、四重に得られ、ＷＲ／ＴＫ−に対する倍率変化＋ＳＤとしてプロットされる。＊、ＷＲ／ＴＫ−と比較して有意ｐ＜０．０５。＃、モックと比較して有意ｐ＜０．０５。
【図４Ａ−２】図４Ａ−１の続きである。
【図４Ｂ】ＩＯＶＡウイルスによる感染後の細胞上清中のＨＭＧＢ１の濃度。ＥＬＩＳＡアッセイ及びＥＮＬＩＴＥＮ  ＡＴＰアッセイ系が、示された腫瘍細胞株の感染（５のＭＯＩ）後２４時間でそのような濃度を決定するために、それぞれ使用された。データは、四重に得られ、ＷＲ／ＴＫ−に対する倍率変化＋ＳＤとしてプロットされる。＊、ＷＲ／ＴＫ−と比較して有意ｐ＜０．０５。＃、モックと比較して有意ｐ＜０．０５。
【図４Ｃ】ＩＯＶＡウイルスによる感染後の細胞上清中のＡＴＰの濃度。ＥＬＩＳＡアッセイ及びＥＮＬＩＴＥＮ  ＡＴＰアッセイ系が、示された腫瘍細胞株の感染（５のＭＯＩ）後２４時間でそのような濃度を決定するために、それぞれ使用された。データは、四重に得られ、ＷＲ／ＴＫ−に対する倍率変化＋ＳＤとしてプロットされる。＊、ＷＲ／ＴＫ−と比較して有意ｐ＜０．０５。＃、モックと比較して有意ｐ＜０．０５。
【図５Ａ−１】ウイルス同定のためのＰＣＲアッセイ。図５Ａ：ＰＣＲアッセイに用いたＰＣＲ産物の配列。
【図５Ａ−２】図５Ａ−１の続きである。
【図５Ｂ】ウイルス同定のためのＰＣＲアッセイ。図５Ｂ：このアッセイは、ＷＲ、ＣＯＰ、及びＣＶＡに対して３３００ｂｐの単一のバンドを示す全ての他のワクシニアウイルス株とは対照的に、ＩＯＶＡに対して２つのバンド（２３２０及び９２０ｂｐ）の独自のパターンを生成するので、ＰＣＲアッセイの結果は、ＩＯＶＡ株の配列を明確に同定する。ＭＶＡ株はＣ２Ｌの欠失のために増幅産物をまったく生成しない。
【図６】ＩＯＶＡウイルス感染後の合胞体中の核の数。ヒト腫瘍細胞株をＷＲ／ＴＫ−、ＩＯＶＡ／Ａ５６−／Ａ２６−、またはＩＯＶＡ／Ａ５６＋／Ａ２６−で、５のＭＯＩで感染させた。感染後１６時間で、培養物を、ヘキスト３３３４２で染色し、１つの合胞体中の核の数を顕微鏡下で計数した。個々の反復及び平均±ＳＥＭの値がプロットされる。＊＊＊、ＷＲ／ＴＫ−と比べて有意ｐ＜０．０００１。
【図７Ａ】がん細胞におけるプラークのサイズ。がん細胞単層は、０．０００１のＭＯＩで１時間、示されたウイルスで感染し、培養培地と１％カルボキシメチルセルロースの１：１混合物で覆って４日間培養した。固定及びクリスタルバイオレット染色の後、プラークの直径を測定した。個々の反復の値と平均±ＳＥＭがプロットされる。＊、ＷＲ／ＴＫ−と比較して有意ｐ＜０．０５。＃、ＩＯＶＡ／Ａ５６−と比較して有意ｐ＜０．０５。
【図７Ｂ】図７Ａの続きである。
【図７Ｃ】図７Ａの続きである。
【実施例】
【００７０】
実施例１：ＩＯＶＡゲノムにおける欠失
新規の免疫腫瘍溶解性ワクシニアウイルス（ＩＯＶＡ）株は、チミジンキナーゼ（ＴＫ、Ｊ２Ｒ）遺伝子に欠失を組み込んで生成され、がん細胞における選択的複製を付与する。また、ｍＣｈｅｒｒｙ遺伝子は、ウイルス複製をモニターするために、ワクシニアウイルス特異的プロモーターＰ１１の制御下のＴＫ部位にクローン化されている。
【００７１】
さらに、新たに生成されたＩＯＶＡには、免疫調節因子とみなされ、Ｂ２１Ｒ＊、Ｃ１０Ｌ、Ｃ９Ｌ、Ｃ４Ｌ、Ｃ２Ｌ、Ｎ１Ｌ、Ｎ２Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ａ２６Ｒ、Ａ５１Ｒ、Ａ５２Ｒ、Ａ５５Ｒ、Ａ５６Ｒ、及びＢ１３Ｒ／Ｂ１４ＲのＯＲＦから選択された遺伝子の中の、いくつかの欠失または機能的不活性化が含まれる。これらの遺伝子をコードするタンパク質の機能は、上記の表１に要約されている。
【００７２】
ＩＯＶＡゲノムはさらに、Ａ２６Ｒ及び／またはＡ５６Ｒ遺伝子の変異バージョンを含むことを特徴とする。ビリオンにおけるＡ２６タンパク質の存在は、直接的なウイルス−細胞融合メカニズムを妨げ、その欠失は合胞体の誘導と関連している。Ａ５６Ｒは、赤血球凝集活性を持つウイルス調節タンパク質をコードしており、ワクシニアウイルスにおけるその不活化は、融合性の表現型を持つウイルスをもたらすと考えられている。全ての遺伝子の欠失または部分的欠失、及び全ての機能的不活性化または遺伝子の挿入は、配列決定により確認されている。
【００７３】
実施例２：ＩＯＶＡにより誘導される合胞体形成
腫瘍破壊についての合胞体形成の長所と短所を評価するために、本発明者らは、相同組換えにより、新規ＩＯＶＡゲノムにおける野生型ワクシニアウイルスＡ５６Ｒ遺伝子配列を回復した。得られたウイルスは、ＩＯＶＡ／Ａ５６−という名前の短縮型Ａ５６ＲバージョンのＩＯＶＡと比較して、ＩＯＶＡ／Ａ５６＋と名付けられた。
【００７４】
感染の際、ＩＯＶＡ／Ａ５６−ウイルスに感染した細胞が隣接する細胞と融合することが観察され（図１）、巨大な合胞体の形成がｍＣｈｅｒｒｙ発現によって追跡されたヒトとマウスの腫瘍細胞株の両方で明確に観察できた。仮説どおり、ＩＯＶＡ／Ａ５６＋での野生型Ａ５６の発現は、ワクシニアウイルスＷＲ株と非常によく似た表現型を回復し、合胞体形成をもたらさなかった。
【００７５】
さらに、ＩＯＶＡ／Ａ５６＋／Ａ２６−への感染後も最大１０細胞の融合が観察される可能性があるため、ＩＯＶＡ／Ａ５６−／Ａ２６−における野生型Ａ５６の発現は、合胞体の形成を部分的にのみブロックしていると説明し得ることが観察された（図６）。
【００７６】
実施例３：ＩＯＶＡの複製能力
ヒト及びマウスのがん細胞株の幅広いパネルで、標準株ワクシニアウイルスＷＲと比較したＩＯＶＡの複製能力を試験した。
【００７７】
新しく生成されたＩＯＶＡの複製をモニターするため、２つのＩＯＶＡウイルス分離株（Ａ５６−及びＡ５６＋）と、対照としてのＷＲ／ＴＫ−との複製能力を、いくつかのヒト及びマウスのがん細胞株で試験した。
【００７８】
このために、ヒト及びマウスの腫瘍細胞株をＷＲ／ＴＫ−、ＩＯＶＡ／Ａ５６−、またはＩＯＶＡ／Ａ５６＋で、５のＭＯＩで感染させ、子孫をさまざまな時点でのプラークアッセイによって測定した。ウイルス収量は、２つの独立した実験を実施することによって、各細胞株について四重で評価した（これまでに、Ｒｏｊａｓ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．２０１６に記載されている）。
【００７９】
図２に示すように、両方のＩＯＶＡウイルス（Ａ５６−とＡ５６＋）は、試験したほとんどの細胞株において、対照株ＷＲ／ＴＫ−と非常に類似した増殖曲線を示し、合胞体形成ＩＯＶＡの初期の時点で収量がわずかに減少しただけであった。
【００８０】
実施例４：ＩＯＶＡの細胞毒性
ヒト及びマウスのがん細胞株の幅広いパネルで、標準株ワクシニアウイルスＷＲと比較したＩＯＶＡ感染の細胞毒性効果を試験した。
【００８１】
このために、種々のがん細胞株は、ＷＲ／ＴＫ−、ＩＯＶＡ／Ａ５６−、またはＩＯＶＡ／Ａ５６＋で、１００から０．０００５ＰＦＵ／細胞の範囲の用量で感染させた。感染後３日目に、細胞の生存率を決定した。ヒトとマウスの両方のがん細胞を試験した。４つの異なる反復を、細胞株について定量し、各ＭＯＩの平均±ＳＤが示される。
【００８２】
興味深いことに、ＩＯＶＡウイルスによる感染は、ワクシニアウイルスＷＲに比べてがん細胞における細胞毒性の明確に増強されたレベルをもたらした（図３）。ワクシニアウイルスＷＲは、最高の感染多重度（ＭＯＩ）であっても、培養中のがん細胞の約７０〜８０％を殺傷することができた。逆に、ＩＯＶＡ／Ａ５６−ウイルスは培養腫瘍細胞の９５〜１００％を殺傷することができ、ＥＣ５０（細胞の５０％を殺傷するのに必要なウイルスの量）を低減した。
【００８３】
驚くべきことに、ＩＯＶＡ／Ａ５６−は、ＨｅＬａ細胞の細胞培養生存率を５０％減少させるのに必要なウイルスの量を、ワクシニアウイルスＷＲ（ＷＲ／ＴＫ−）と比較して、４０倍以上で低減した。ＩＯＶＡ／Ａ５６＋はまた、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのがん細胞に対する増強した細胞毒性の表現型を示したが、Ａ５６で回復したウイルスは、ＨｅＬＡ、ＣＴ−２６、及びＬＬＣ１細胞をＩＯＶＡ／Ａ５６−と同様の率で殺傷した。それにもかかわらず、１４３Ｂ及びＭＣＦ−７細胞において、細胞毒性はＷＲ／ＴＫ−感染で得られたものと非常に類似しており、ウイルス媒介の大きな合胞体形成が増強された腫瘍の破壊に寄与している可能性があることを示唆する。
【００８４】
実施例５：がん細胞におけるＩＯＶＡウイルスの大きなプラークの表現型
がん細胞におけるプラークの増加したサイズは、腫瘍全体へのウイルスのより良好な拡散、及びより高い抗腫瘍活性と関連していた。ＩＯＶＡウイルスのプラークサイズを試験するために、がん細胞株のパネルを０．０００１のＭＯＩで感染させ、感染の１時間後、感染細胞をカルボキシメチルセルロースで覆って培養した。感染後４時間で、培養物を固定し、クリスタルバイオレットで染色し、プラークの直径を決定した。
図７に示すように、ＩＯＶＡ／Ａ５６−とＩＯＶＡ／Ａ５６＋の両方は、ＷＲ／ＴＫ−ウイルス対照と比較して、試験した全てのがん細胞株でより大きなプラークを誘導した。ＨｅＬａ細胞において、ＩＯＶＡウイルスでの感染後のプラークは、ＷＲ／ＴＫ−と比べて、平均４０％大きかった。印象的なことに、非常に大きなプラークが、ＩＯＶＡウイルスによる感染後の１４３Ｂ及びＭＣＦ−７で観察され、１４３Ｂ細胞の場合はＷＲ／ＴＫ−によって生成されたプラークの直径の２倍のプラークとであり、ＭＣＦ−７の場合は２．６倍大きなプラークであった。
プラークのサイズに関して、ＩＯＶＡ／Ａ５６−による大きな合胞体の生成は、ＭＣＦ−７乳癌細胞株の場合を除いて顕著な影響はなく、ＩＯＶＡ／Ａ５６−と比較して、ＩＯＶＡ／Ａ５６＋ウイルスで生成されたプラークが１．４倍小さかった。
【００８５】
実施例６：ＩＯＶＡウイルスは、がん細胞の細胞膜上のカルレティキュリンの提示と免疫原性細胞死とを誘導する。
ＩＯＶＡウイルスががん細胞に対する免疫応答を誘発及び増強できる可能性があるかどうかを試験するために、本発明者らは最初に、ＩＯＶＡ／Ａ５６−、もしくはＩＯＶＡ／Ａ５６＋、または対照ウイルスＷＲ／ＴＫ−による感染後のヒトがん細胞の表面上のカルレティキュリン（ＣＲＴ）の露出をフローサイトメトリーにより分析した。
【００８６】
このために、細胞を５のＭＯＩで感染させ、ウイルス感染の２４時間後に、非酵素的細胞解離溶液を使用して剥離した。カルレティキュリンは、ヒト抗カルレティキュリン−ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４０５抗体（Ａｂｃａｍ，  Ｒｅｆ  Ｎ°  ａｂ２１０４３１）で４℃で１時間インキュベートすることによって検出された。非感染細胞及びスタウロスポリン（１μＭ）は、それぞれ、陰性及び陽性の対照として使用した。
【００８７】
ＨｅＬａ細胞の感染の際に、ＷＲ／ＴＫ−は、約１５％の細胞でＣＲＴの表面露出を誘導し（図４ａ）；逆に、両方のＩＯＶＡウイルスに感染の際に、８０％を超える驚くほど高いレベルの細胞がＣＲＴを表面に発現した。同様に、ＣＲＴの露出は、１４３Ｂ細胞では約３５％（ＷＲ／ＴＫ−の場合）から約９０％（ＩＯＶＡウイルスの場合）に増加し、ＭＣＦ−７細胞では３％から７２％以上に増加した。
【００８８】
ＩＯＶＡウイルスに感染した際の顕著な免疫原性細胞死の起こり得る誘導をさらに調査するために、ＨＭＧＢ１及びＡＴＰの放出は、ＥＬＩＳＡアッセイ及びルシフェラーゼ媒介ＡＴＰアッセイシステムをそれぞれ使用して決定された。
【００８９】
試験した全ての細胞株で、ＩＯＶＡ／Ａ５６−とＩＯＶＡ／Ａ５６＋の両方で、ＷＲ／ＴＫ−に感染した細胞と比較して、感染細胞の上清に著しく高い濃度のＨＭＧＢ１が検出され（図４ｂ）、１．２３倍（１４３Ｂ細胞、ＩＯＶＡ／Ａ５６−）〜１．６８倍（ＭＣＦ−７細胞、ＩＯＶＡ／Ａ５６＋）の範囲の増加であった。感染細胞の上清のＡＴＰ濃度も、ＩＯＶＡウイルスに感染すると、ＷＲ／ＴＫ−感染後のレベルと比較して増加し（図４ｃ）、１．１２倍（１４３Ｂ細胞、ＩＯＶＡ／Ａ５６＋）〜２．２７倍（ＨｅＬａ、ＩＯＶＡ／Ａ５６−）の範囲の増加であった。
【００９０】
これらの結果は、ワクシニアウイルスＷＲではなくＩＯＶＡウイルスが、感染したヒトがん細胞の免疫原性細胞死を誘導することを示す。したがって、ＩＯＶＡは、臨床試験における抗腫瘍活性の点で大きな利益を表す可能性のある、特に有望な候補ウイルスとして提案できる。
【００９１】
実施例７：ＩＯＶＡウイルスまたはそれらの誘導体の同定のためのＰＣＲアッセイ
ＩＯＶＡ株を同定するために、ウイルスのＤＮＡは、感染細胞の細胞抽出物をプロテイナーゼＫで消化し、製造者の指示に従って、ＱＩＡａｍｐゲノムＤＮＡキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて単離される。Ｃ２Ｌ−Ｃ１Ｌ−Ｎ１Ｌ−Ｎ２Ｌフラグメント（図５ａ；配列番号１）をカバーするＩＯＶＡの独自の配列は、次のオリゴを使用してＰＣＲによって増幅される：フォワード５’−ＡＴＧＴＴＡＴＣＣＴＧＧＡＣＡＴＣＧＴＡＣ−３’（配列番号２）及びリバース５’−ＴＣＡＴＧＡＣＧＴＣＣＴＣＴＧＣＡＡＴＧＧ−３’（配列番号３）。これら２つのプライマーを使用したＰＣＲ産物は、独自の配列番号１よりも５０ｂｐ大きくなり、安定性の理由から、ＰＣＲ反応の設計にはさらに５０ｂｐが含まれていた。ＰＣＲ産物（配列番号４）をＱＩＡｑｕｉｃｋ  ＰＣＲ精製キットを用いて精製し、ＢｓｔＸＩ制限酵素で消化する。
【００９２】
このアッセイを使用することにより、３３８４ｂｐの単一のバンドを示す全ての他のワクシニア株と対照的に、ＩＯＶＡ株は、１％アガロース中の電気泳動によって可視化される、２つのＤＮＡバンド（２３６１及び９２３ｂｐ）特異的かつ独自のパターンを生成するので、ＩＯＶＡ株を明確に同定することができる。ＭＶＡゲノムＤＮＡのＰＣＲは、Ｃ２Ｌ配列の不存在のために、ＰＣＲ産物をまったく生成しない（図５ｂ）。
【００９３】
参考文献
Ｄ．  Ｋｉｒｎ，  Ｔ．  Ｈｅｒｍｉｓｔｏｎ，  Ｆ．  ＭｃＣｏｒｍｉｃｋ，  ＯＮＹＸ−０１５：  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｄａｔａ  ａｒｅ  ｅｎｃｏｕｒａｇｉｎｇ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ４，  １３４１  （Ｄｅｃ，  １９９８）．
Ｃ．  Ｊ．  Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｄｉｓｒｕｐｔｓ  ｔｕｍｏｕｒ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ  ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  ｒｅｓｅａｒｃｈ  ７３，  １２６５  （Ｆｅｂ  １５，  ２０１３）．
Ｓ．  Ｈ．  Ｔｈｏｒｎｅ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ  ｌｏｃａｌｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｗｉｔｈｉｎ  ｔｈｅ  ｔｕｍｏｕｒ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｒｅｐｅａｔ  ｃｙｃｌｅｓ  ｏｆ  ｉｍｍｕｎｅ  ｃｅｌｌ−ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖｉｒｕｓ  ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ  ｔｈｅｒａｐｙ．  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ：  ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １８，  １６９８  （Ｓｅｐ，  ２０１０）．
Ｃ．  Ｊ．  Ｂｒｅｉｔｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｉｎｔｒａｖｅｎｏｕｓ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｏｆ  ａ  ｍｕｌｔｉ−ｍｅｃｈａｎｉｓｔｉｃ  ｃａｎｃｅｒ−ｔａｒｇｅｔｅｄ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｐｏｘｖｉｒｕｓ  ｉｎ  ｈｕｍａｎｓ．  Ｎａｔｕｒｅ  ４７７，  ９９  （Ｓｅｐ  １，  ２０１１）．
Ｊ．  Ｈｅｏ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ  ｄｏｓｅ−ｆｉｎｄｉｎｇ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｔｒｉａｌ  ｏｆ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ＪＸ−５９４  ｉｎ  ｌｉｖｅｒ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｎａｔｕｒｅ  ｍｅｄｉｃｉｎｅ  １９，  ３２９  （Ｍａｒ，  ２０１３）．
Ｈ．  Ｊ．  Ｚｅｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｆｉｒｓｔ−ｉｎ−ｍａｎ  ｓｔｕｄｙ  ｏｆ  ｗｅｓｔｅｒｎ  ｒｅｓｅｒｖｅ  ｓｔｒａｉｎ  ｏｎｃｏｌｙｔｉｃ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ：  ｓａｆｅｔｙ，  ｓｙｓｔｅｍｉｃ  ｓｐｒｅａｄ，  ａｎｄ  ａｎｔｉｔｕｍｏｕｒ  ａｃｔｉｖｉｔｙ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｈｅｒａｐｙ  ：  ｔｈｅ  ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｓｏｃｉｅｔｙ  ｏｆ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  ２３，  ２０２  （Ｊａｎ，  ２０１５）．
Ａ．  Ｖｏｌｚ，  Ｇ．  Ｓｕｔｔｅｒ，  Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  ｅｆｆｉｃａｃｙ  ｏｆ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  Ａｎｋａｒａ  ｉｎ  ｐｒｅｃｌｉｎｉｃａｌ  ｓｔｕｄｉｅｓ．  Ｖａｃｃｉｎｅ  ３１，  ４２３５  （Ｓｅｐ  ６，  ２０１３）．
Ｈ．  Ｍｅｙｅｒ，  Ｇ．  Ｓｕｔｔｅｒ，  Ａ．  Ｍａｙｒ，  Ｍａｐｐｉｎｇ  ｏｆ  ｄｅｌｅｔｉｏｎｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｇｅｎｏｍｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｈｉｇｈｌｙ  ａｔｔｅｎｕａｔｅｄ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ＭＶＡ  ａｎｄ  ｔｈｅｉｒ  ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ  ｏｎ  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ７２  （  Ｐｔ  ５），  １０３１  （Ｍａｙ，  １９９１）．
Ｒ．  Ｔ．  Ｚｈａｎｇ，  Ｓ．  Ｄ．  Ｂｉｎｅｓ，  Ｃ．  Ｒｕｂｙ，  Ｈ．  Ｌ．  Ｋａｕｆｍａｎ，  ＴｒｏＶａｘ（（Ｒ））  ｖａｃｃｉｎｅ  ｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｒｅｎａｌ  ｃｅｌｌ  ｃａｒｃｉｎｏｍａ．  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ４，  ２７  （Ｊａｎ，  ２０１２）．
Ｉ．  Ｍａｒｉｇｏ，  Ｌ．  Ｄｏｌｃｅｔｔｉ，  Ｐ．  Ｓｅｒａｆｉｎｉ，  Ｐ．  Ｚａｎｏｖｅｌｌｏ，  Ｖ．  Ｂｒｏｎｔｅ，  Ｔｕｍｏｕｒ−ｉｎｄｕｃｅｄ  ｔｏｌｅｒａｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｅ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｂｙ  ｍｙｅｌｏｉｄ  ｄｅｒｉｖｅｄ  ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒ  ｃｅｌｌｓ．  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｖ  ２２２，  １６２  （Ａｐｒ，  ２００８）．
Ｓ．  Ｊ．  Ｇａｒｄａｉ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｃｅｌｌ−ｓｕｒｆａｃｅ  ｃａｌｒｅｔｉｃｕｌｉｎ  ｉｎｉｔｉａｔｅｓ  ｃｌｅａｒａｎｃｅ  ｏｆ  ｖｉａｂｌｅ  ｏｒ  ａｐｏｐｔｏｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｒａｎｓ−ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  ｏｆ  ＬＲＰ  ｏｎ  ｔｈｅ  ｐｈａｇｏｃｙｔｅ．Ｃｅｌｌ  １２３，  ３２１  （Ｏｃｔ  ２１，  ２００５）．
Ｇ．  Ｌ．  Ｓｍｉｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ  ｉｍｍｕｎｅ  ｅｖａｓｉｏｎ：  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ，  ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ  ａｎｄ  ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ．Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｇｅｎｅｒａｌ  ｖｉｒｏｌｏｇｙ  ９４，  ２３６７  （Ｎｏｖ，  ２０１３）．
Ｇｏｅｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｃｏｍｐｌｅｔｅ  ＤＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｏｆ  ｖａｃｃｉｎｉａ  ｖｉｒｕｓ．  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，  １９９０  Ｎｏｖ；１７９（１）：  ２４７−６６，  ５１７−６３．
Ｌ．  Ｇａｌｌｕｚｚｉ，  Ａ．  Ｂｕｑｕｅ，  Ｏ．  Ｋｅｐｐ，  Ｌ．  Ｚｉｔｖｏｇｅｌ，  Ｇ．  Ｋｒｏｅｍｅｒ，  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  ｃｅｌｌ  ｄｅａｔｈ  ｉｎ  ｃａｎｃｅｒ  ａｎｄ  ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  ｄｉｓｅａｓｅ．  Ｎａｔ  Ｒｅｖ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  １７，  ９７  （Ｆｅｂ，  ２０１７）．
Ｒｏｊａｓ  ＪＪ  ｅｔ  ａｌ．，  Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｎｇ  ＴＬＲ  ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｉｎｃｒｅａｓｅｓ  ｔｈｅ  ａｎｔｉ−ｔｕｍｏｕｒ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｓｐｏｎｓｅ  ｉｎｄｕｃｅｄ  ｂｙ  ｖｉｒａｌ  ｃａｎｃｅｒ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ．  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｐ．，  ２０１６  Ａｐｒ  １２；１５（２）：  ２６４−７３．
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２Ａ−１】
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【図２Ａ−２】
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【図２Ｂ】
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【図３Ａ−１】
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【図３Ａ−２】
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【図３Ｂ−１】
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【図３Ｂ−２】
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【図４Ａ−１】
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【図４Ａ−２】
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【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図５Ａ−１】
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【図５Ａ−２】
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【図５Ｂ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
2021503965.tif 000023
【図７Ｃ】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和1年10月1日(2019.10.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
免疫調節ウイルスであって、前記ウイルス及び／またはその誘導体が配列番号１の存在によって同定され、機能的に活性なＫ１Ｌを有し、哺乳動物細胞で複製能力があり、感染したＨｅＬａ細胞の膜へのカルレティキュリン移動を引き起こす、前記免疫調節ウイルス。
【請求項２】
前記ウイルスが機能的に不活性化されたＡ５６Ｒをさらに有する、請求項１に記載の免疫調節ワクシニアウイルス。
【請求項３】
前記ウイルス及び／または任意の誘導体が機能的に不活性化されたＡ２６Ｒを有する、請求項１または２に記載の免疫調節ワクシニアウイルス。
【請求項４】
前記ウイルスが、Ｂ２１Ｒ、Ｃ１０Ｌ、Ｃ９Ｌ、Ｃ４Ｌ、Ｍ１Ｌ、Ａ５１Ｒ、Ａ５２Ｒ、Ａ５５Ｒ、及びＢ１３Ｒ／Ｂ１４Ｒからなるオープンリーディングフレームの群から選択される機能的に不活性化された免疫回避遺伝子の１つ以上をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス。
【請求項５】
前記ウイルスが、Ｊ２Ｒ、Ｃ１１Ｒ、及びＦ４Ｌからなる群から選択される機能的に不活性化されるか、部分的に欠失したか、または完全に欠失した遺伝子の少なくとも１つをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス。
【請求項６】
前記ウイルスが、細胞周期活性化細胞及び／または腫瘍細胞において複製能力のある及び溶解性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシニアウイルス。
【請求項７】
前記ウイルスが感染の際に合胞体形成を引き起こす、請求項１〜６のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシニアウイルス。
【請求項８】
請求項１〜７に記載の免疫調節ワクシニアウイルス及び／またはその誘導体をコードする核酸配列またはそのフラグメント。
【請求項９】
請求項８に記載の核酸配列を含む、ウイルスベクターまたは免疫調節ワクシニアウイルスの誘導体。
【請求項１０】
１つ以上の導入遺伝子の少なくとも１つの挿入を有する１つ以上の挿入部位を担持することを特徴とする、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス、請求項９に記載のベクター及び免疫調節ワクシナウイルスの誘導体。
【請求項１１】
前記導入遺伝子が、腫瘍抗原、腫瘍関連抗原、疾患関連抗原、及び病原体由来抗原をコードする遺伝子を含む群から選択される、請求項１０に記載の組換え免疫調節ワクシナウイルスまたはベクター。
【請求項１２】
医薬における使用のための、請求項１〜８のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス、請求項９に記載のベクター、または請求項１１に記載の組換え免疫調節ワクシナウイルス。
【請求項１３】
がんの治療における使用、及び／またはがんワクチンとしての使用のための、請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス、請求項９に記載のベクター、または請求項１１に記載の組換え免疫調節ワクシナウイルス。
【請求項１４】
請求項１〜７のいずれか１項に記載の免疫調節ワクシナウイルス、請求項９に記載のベクター、または請求項１１に記載の組換え免疫調節ワクシナウイルスと、薬学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と、を含む医薬組成物。
【国際調査報告】
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