(57)【要約】ある実施形態において、本発明は、Ｔアームと、Ｄアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、前記Ｔアームが伸長因子１α１（ＥＦ１α）と相互作用するヌクレオチドを有するＴステムとを含む、修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を提供する。ＥＦ１αは、アミノアシルｔＲＮＡをリボソームにリクルートし、ｔＲＮＡが脱アシル化されるのを保護する。合理的なヌクレオチド置換は、リボソームへのｔＲＮＡの送達および脱アシル化からの保護を強化する調整された（ｔｕｎｅｄ）ｔＲＮＡ：ＥＦ１α相互作用をもたらす。
2021508234.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔアームと、Ｄアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、前記Ｔアームが伸長因子１−α１（ＥＦ１α）と相互作用するヌクレオチドを有するＴステムを含む、修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項２】
配列番号１〜５３８のいずれか一つからなる修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、チミジンがウラシルで置換されている、修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項３】
前記ｔＲＮＡが配列番号４からなり、チミジンがウラシルで置換されている、請求項２に記載の修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項４】
前記ｔＲＮＡが配列番号１６からなり、チミジンがウラシルで置換されている、請求項２に記載の修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項５】
前記ｔＲＮＡが配列番号２４からなり、チミジンがウラシルで置換されている、請求項２に記載の修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項６】
前記ｔＲＮＡが配列番号３３からなり、チミジンがウラシルで置換されている、請求項２に記載の修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項７】
前記ｔＲＮＡが配列番号３８からなり、チミジンがウラシルで置換されている、請求項２に記載の修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項８】
前記ｔＲＮＡが配列番号４４からなり、チミジンがウラシルで置換されている、請求項２に記載の修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項９】
前記ｔＲＮＡが配列番号４８からなり、チミジンがウラシルで置換されている、請求項２に記載の修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項１０】
前記ｔＲＮＡが配列番号５３からなり、チミジンがウラシルで置換されている、請求項２に記載の修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項１１】
配列番号５６〜６０、６２〜６６、８４〜８６、９０〜１１１、１１３、１２８〜１４３、１４７〜１４９、１５３〜１５６、１６１〜１７４、１７６、１７８、１８１、１８４〜１８６、１９２、１９６〜１９７、１９９〜２０１、２０５、２１３〜２４０、２４６、２５５〜２５６、２５８〜２８５、２９９、３０５〜３１２、３１４、３１８〜３３２、３３５〜３４４、３４６、３５０〜３５４、３５７〜３６０、３６２、３６５〜３７０、３７２〜３８３、３８８〜３９０、３９２、３９４〜４０１、４０３〜４０７、４１４〜４１６、４１８、４２２、４２５、４２８〜４３３、４３７、４４４〜４４５、４５２、４５５、４５９〜４６３、４７０、４７２〜４７４、４７６、４８７〜４９２、５２５、５３０〜５３９、５４５〜５５０、５５３〜５５５、５６１〜５６３および５６７〜５７９のいずれか１つからなる修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、チミジンがウラシルで置換されている、修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項１２】
Ｔアームと、Ｄアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、
（ａ）前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが５’−ＵＣＡ−３’であり、かつＴＧＡ終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがアルギニン、トリプトファン若しくはグリシンに作動可能に連結されており；
（ｂ）前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが５’−ＵＵＡ−３’であり、かつＴＡＡ終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがグルタミン若しくはグルタミン酸に作動可能に連結されており；または
（ｃ）前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが５’−ＣＵＡ−３’であり、かつＴＡＧ終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがトリプトファン、グルタミン酸若しくはグルタミンに作動可能に連結されている；
修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）。
【請求項１３】
前記Ｔアームが伸長因子１−α１（ＥＦ１α）との相互作用を増強しまたは調整する合理的なヌクレオチド置換を含む、請求項１２に記載の修飾されたｔＲＮＡ。
【請求項１４】
オリゴヌクレオチドが１５０ヌクレオチド未満の全長を有する、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾されたｔＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド配列。
【請求項１５】
第一のオリゴヌクレオチド配列と第二のオリゴヌクレオチド配列とを含むオリゴヌクレオチドであって、前記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列が、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾されたｔＲＮＡを独立にコードし、前記第一および第二のオリゴヌクレオチドが１５０ヌクレオチド未満の全長を独立に有し、前記２つの配列がタンデムである、オリゴヌクレオチド。
【請求項１６】
前記オリゴヌクレオチドがＤＮＡである、請求項１５に記載のオリゴヌクレオチド。
【請求項１７】
プロモーターと、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾されたｔＲＮＡをコードする核酸または請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド配列とを含む発現カセット。
【請求項１８】
請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドまたは請求項１７に記載の発現カセットを含むベクター。
【請求項１９】
前記ベクターがウイルスベクターまたはプラスミドベクターである、請求項１８に記載のベクター。
【請求項２０】
請求項１〜１３のいずれか一項に記載の修飾されたｔＲＮＡと、請求項１４〜１６のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチドと、または請求項１８若しくは１９に記載のベクターと、
薬学的に許容され得る担体と、
を含む、組成物。
【請求項２１】
前記担体がリポソームである、請求項２０に記載の組成物。
【請求項２２】
請求項１８または１９に記載のベクターを含む細胞。
【請求項２３】
終止コドン関連遺伝子疾患を処置する方法であって、終止コドン関連遺伝子疾患を処置することを必要とする患者に、請求項２０または２１に記載の組成物を投与することを含む、方法。
【請求項２４】
未成熟終止コドンと関連する前記遺伝子疾患が、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、β−サラセミアまたはリドル症候群である、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
細胞中のナンセンス変異を含むヌクレオチド配列への翻訳を回復させる方法であって、請求項２０または２１に記載の組成物を前記細胞に導入することを含み、修飾されたｔＲＮＡが、ナンセンス変異を含む前記ヌクレオチド配列への翻訳を回復させる、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１７年１１月２日に出願された米国仮出願第６２／５８０，８８７号および２０１８年６月１９日に出願された米国仮出願第６２／６８７，０１５号の優先権を主張する。上で引用されている出願の内容全体が、参照により、本明細書に組み込まれる。
連邦により資金援助された研究に関する記述
【０００２】
本発明は、国立衛生研究所によって授与されたＲ０１  ＧＭ１０６５６９の下で政府の支援を得て為された。政府は、本発明に一定の権利を有する。
【背景技術】
【０００３】
ＤＮＡ分子は、ＤＮＡポリマーを構成するヌクレオチド塩基の配列の形態で遺伝情報を保有する。ＤＮＡでは、アデニン、グアニン、シトシンおよびチミンという４種のヌクレオチド塩基のみが使用されている。この情報は、コドンという３つの連続する塩基の形態で、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次いで、転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）およびリボソームによって翻訳されて、タンパク質を形成する。ＲＮＡでは、アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルという４種のヌクレオチド塩基が使用されている。遺伝コードとは、トリプレットコドンと特定のアミノ酸の間の関係である。６４の可能なコドントリプレットが遺伝コードを形成し、３つの終止（終結とも称される）コドンは、当該コドンの箇所でタンパク質産生を停止させるように、翻訳機構（細胞のリボソーム）にシグナルを与える。コドン中の他の６１個のトリプレットは、２０の標準アミノ酸の１つに対応する。図１を参照されたい。
【０００４】
ＤＮＡはリボソームによって翻訳され、ＤＮＡによって特異的に与えられる遺伝的指令に従って各アミノ酸を１つずつ一緒に連結させてポリペプチドを形成する。リボソームが終止コドンに達すると、タンパク質の伸長が終結する。３つの終止コドンは、ＵＡＧ（アンバー）、ＵＡＡ（オーカー）およびＵＧＡ（オパール）である。アミノ酸をコードするコドンを終止コドンに変化させる変異は、「ナンセンス変異」と呼ばれる。これらのナンセンス変異はポリペプチド配列の重大なトランケーション／短縮をもたらし得、遺伝的表現型の甚大な変化を引き起こし得る。このため、リボソームが変異体終止シグナルに達すると、リボソームは翻訳を終結して未完成のタンパク質をもたらすので、たとえ発現を指示する遺伝子が存在する場合でも、極めて重要なタンパク質が産生されないことがある。
【０００５】
転移ＲＮＡは、リボソーム上でｍＲＮＡをタンパク質に翻訳する。各ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ上の相補的コドンとハイブリッドを形成する「アンチコドン」領域を含有する。その指定されたアミノ酸を運搬するｔＲＮＡは、「充填された（ｃｈａｒｇｅｄ）」ｔＲＮＡと呼ばれる。ｔＲＮＡが、６１種のアミノ酸を伴う（すなわち、終止シグナルを伴わない）ｔＲＮＡの１つである場合、通常、そのアミノ酸を成長しているペプチドに結合させる。ｔＲＮＡの構造遺伝子は約７２〜９０ヌクレオチド長であり、クローバー葉の構造へ折り畳まれる。ｔＲＮＡは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩによって転写され、成熟したｔＲＮＡコード配列の一部となるそれ自身の遺伝子内スプリットプロモーターを含有する（Ｓｈａｒｐ  Ｓ．Ｊ．，Ｓｃｈａａｃｋ  Ｊ．，Ｃｏｏｌｅｎ  Ｌ．，Ｂｕｒｋｅ  Ｄ．Ｊ．およびＳｏｌｌ  Ｄ．，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ”，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９：１０７−１４４（１９８５）；Ｇｅｉｄｕｓｃｈｅｋ  Ｅ．Ｏ．，およびＴｏｃｃｈｉｎｉ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ，”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：８７３−９１４（１９８８））。
【０００６】
「ナンセンスサプレッサー」は、「終止」シグナルの引き金を引く代わりに、終結コドンに応答してアミノ酸を挿入するように、変化されたアンチコドンを含有するｔＲＮＡ遺伝子の対立遺伝子である。例えば、オーカー変異は、ｍＲＮＡ中にＵＡＡコドンの作製をもたらす。オーカーサプレッサー遺伝子は、ＵＡＡ部位にアミノ酸を挿入するＡＵＵアンチコドンを有するｔＲＮＡを産生し、これにより、本来は翻訳の停止を引き起こすコドンが存在するにも関わらず、ｍＲＮＡの継続的な翻訳を可能にする。
【０００７】
原核生物並びに酵母およびシー・エレガンス（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ）などの真核生物中に、多数のナンセンスサプレッサーｔＲＮＡ対立遺伝子が同定されてきた。異なるサプレッサーｔＲＮＡは、抑制効率が異なる。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）および他の系では、アンバーサプレッサーが相対的により効率が高く、オーカーサプレッサーはこれより効率が低く、オパールが最も効率が低く、このことは、アンバーコドンはタンパク質合成を終結するのにあまり頻繁に使用されていないのに対して、オーカーおよびオパールコドンは、天然の終結シグナルとして、よりしばしば使用されていることを示唆する。
【０００８】
ＤＮＡブループリント中の望ましくないエラーは、疾患を引き起こし得る。例えば、ブループリントの末端よりむしろ、タンパク質の中央に予期せぬ「終止」シグナルが発生すると、変化した機能を有しまたは全く機能を有しないトランケートされたまたは短縮されたタンパク質の産生をもたらす。嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、β−サラセミアおよびリドル症候群などの多くのヒトの疾患は、それぞれ、適切な肺、血液、筋肉または腎臓機能にとって重要なタンパク質に対するＤＮＡ読み枠中の望ましくない終結シグナルに起因する。
【０００９】
したがって、対応する修飾されていないナンセンスサプレッサーｔＲＮＡと比べて安定化された新規の修飾されたナンセンスサプレッサーｔＲＮＡおよび嚢胞性線維症と関連する遺伝子の終結を抑制する増大した活性を有するナンセンスサプレッサーｔＲＮＡを提供することが必要とされる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１０】
【非特許文献１】Ｓｈａｒｐ  Ｓ．Ｊ．，Ｓｃｈａａｃｋ  Ｊ．，Ｃｏｏｌｅｎ  Ｌ．，Ｂｕｒｋｅ  Ｄ．Ｊ．およびＳｏｌｌ  Ｄ．，”Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ  ａｎｄ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｏｆ  ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ  ｔＲＮＡ  ｇｅｎｅｓ”，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ，１９：１０７−１４４（１９８５）
【非特許文献２】Ｇｅｉｄｕｓｃｈｅｋ  Ｅ．Ｏ．，およびＴｏｃｃｈｉｎｉ−Ｖａｌｅｎｔｉｎｉ，”Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ｂｙ  ＲＮＡ  ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  ＩＩＩ，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５７：８７３−９１４（１９８８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１１】
ある実施形態において、本発明は、Ｔアームと、Ｄアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、前記Ｔアームが伸長因子１α１（ＥＦ１α）と相互作用するヌクレオチドを有するＴステムとを含む、修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を提供する。ＥＦ１αは、アミノアシルｔＲＮＡをリボソームにリクルートし、ｔＲＮＡが脱アシル化されるのを保護する。合理的なヌクレオチド置換は、リボソームへのｔＲＮＡの送達および脱アシル化からの保護を強化する調整された（ｔｕｎｅｄ）ｔＲＮＡ：ＥＦ１α相互作用をもたらす。
【００１２】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４または５５の修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、チミジンがウラシルで置換されている修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を提供する。
【００１３】
ある実施形態において、本発明は、配列番号１〜５３８のいずれか一つの修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、チミジンがウラシルで置換されている、修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を提供する。
【００１４】
ある実施形態において、修飾されたｔＲＮＡは、配列番号５６〜６０、６２〜６６、８４〜８６、９０〜１１１、１１３、１２８〜１４３、１４７〜１４９、１５３〜１５６、１６１〜１７４、１７６、１７８、１８１、１８４〜１８６、１９２、１９６〜１９７、１９９〜２０１、２０５、２１３〜２４０、２４６、２５５〜２５６、２５８〜２８５、２９９、３０５〜３１２、３１４、３１８〜３３２、３３５〜３４４、３４６、３５０〜３５４、３５７〜３６０、３６２、３６５〜３７０、３７２〜３８３、３８８〜３９０、３９２、３９４〜４０１、４０３〜４０７、４１４〜４１６、４１８、４２２、４２５、４２８〜４３３、４３７、４４４〜４４５、４５２、４５５、４５９〜４６３、４７０、４７２〜４７４、４７６、４８７〜４９２、５２５、５３０〜５３９、５４５〜５５０、５５３〜５５５、５６１〜５６３および５６７〜５７９のいずれか１つであって、ここで、チミジンがウラシルで置換されている。
【００１５】
ある実施形態において、本発明は、Ｔステムと、Ｄステムと、アンチコドンループと、アクセプタステムとを含む修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）であって、（ａ）前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンとを含み、前記アンチコドンが５’−ＵＣＡ−３’であり、かつＴＧＡ終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがアルギニン、トリプトファン若しくはグリシンに作動可能に連結されており；（ｂ）前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが５’−ＵＵＡ−３’であり、かつＴＡＡ終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがグルタミン若しくはグルタミン酸に作動可能に連結されており；または（ｃ）前記アンチコドンアームがトリヌクレオチドアンチコドンを含み、前記アンチコドンが５’−ＣＵＡ−３’であり、かつＴＡＧ終止コドンを認識し、前記アクセプタアームがトリプトファン、グルタミン酸若しくはグルタミンに作動可能に連結されている、修飾された転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）を提供する。ある実施形態において、Ｔアームは、ＥＦ１αとの相互作用を調整する合理的に改変されたヌクレオチド配列を含み、その抑制活性を強化し、これにより、その治療的潜在能力を増大させる。ＥＦ１αとの調整された相互作用を有するｔＲＮＡは増大されたナンセンス抑制を有し、増大された治療特性を与える。
【００１６】
ある実施形態において、本発明は、上記の修飾されたｔＲＮＡをコードするオリゴヌクレオチド配列であって、オリゴヌクレオチドが１５０ヌクレオチド未満の全長を有するオリゴヌクレオチド配列を提供する。ある実施形態において、オリゴヌクレオチドはＤＮＡである。
【００１７】
ある実施形態において、本発明は、第一のオリゴヌクレオチド配列と第二のオリゴヌクレオチド配列を含むオリゴヌクレオチドであって、前記第一および第二のオリゴヌクレオチド配列は、上記の修飾されたｔＲＮＡを独立にコードし、前記第一および第二のオリゴヌクレオチドが１５０ヌクレオチド未満の全長を独立に有し、並びに２つの配列がタンデムである、オリゴヌクレオチドを提供する。
【００１８】
ある実施形態において、本発明は、プロモーターと、修飾されたｔＲＮＡをコードする核酸または上記オリゴヌクレオチドとを含む発現カセットを提供する。
【００１９】
ある実施形態において、本発明は、上記のオリゴヌクレオチドまたは発現カセットを含むベクターを提供する。
【００２０】
ある実施形態において、ベクターはウイルスベクターまたはプラスミドベクターである。
【００２１】
ある実施形態において、本発明は、上記の修飾されたｔＲＮＡ、オリゴヌクレオチドまたはベクターと、薬学的に許容され得る担体とを含む組成物を提供する。
【００２２】
ある実施形態において、担体はリポソームである。
【００２３】
ある実施形態において、本発明は、上記のベクターを含む細胞を提供する。
【００２４】
本発明は、終止コドン関連遺伝子疾患を処置する方法であって、終止コドン関連遺伝子疾患を処置することを必要とする患者に、上記修飾されたｔＲＮＡ組成物を投与することを含む、方法を提供する。
【００２５】
ある実施形態において、未成熟終止コドンと関連する遺伝子疾患は、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、β−サラセミアまたはリドル症候群である。
【００２６】
ある実施形態において、本発明は、細胞中のナンセンス変異を含むヌクレオチド配列への翻訳を回復させる方法であって、上記組成物を前記細胞に導入することを含む方法を提供する。
【００２７】
ある実施形態において、本発明は、ＮａｎｏＬｕｃなどのルシフェラーゼ酵素中のナンセンスコドンの抑制を用いるハイスループットクローニングおよびスクリーニングによって、アンチコドン編集（ＡＣＥ（ａｎｔｉ−ｃｏｄｏｎ  ｅｄｉｔｅｄ））ｔＲＮＡを同定する方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１。遺伝コードの表。
【００２９】
【図２】図２。ｔＲＮＡは、Ｔアームと、Ｄアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む一般的な４アーム構造を有する。これらのアームは、本明細書を通じて「ループ」とも表記される。
【００３０】
【図３】図３。ナンセンス抑制のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡ（ホモ・サピエンスｔＲＮＡＴｒｐＴＧＡ）。
【００３１】
【図４】図４。機能的ＡＣＥｔＲＮＡ配列を同定するために使用されるベクター中にコードされるアンチコドン編集（ＡＣＥ）−ｔＲＮＡ。このベクター配列は、ナノルシフェラーゼレポーター系を含む。図示されているベクターは、ＴＧＡ抑制を有するＡＣＥｔＲＮＡを同定するために使用された。適切なｔＲＮＡスクリーニングのために、ＴＡＡおよびＴＡＧバリアントを使用した（図１４〜１７参照）。
【００３２】
【図５】図５。サプレッサーｔＲＮＡを介した終止コドンを有するタンパク質およびイオンチャンネルの救出の模式図。
【００３３】
【図６】図６Ａおよび６Ｂ。ヒトＡＣＥ−ｔＲＮＡを用いたナンセンスコドン救出。図６Ａ。アンチコドン編集（ＡＣＥ）Ｔｒｐ  ｔＲＮＡおよびチェリー−ＴＧＡ−ｅＧＦＰ−ＨＡ構築物の模式図。図６Ｂ。ＡＣＥトリプトファンｔＲＮＡ＃４によるチェリーＴＧＡ  ｅＧＦＰ−ＨＡ構築物の救出。
【００３４】
【図７】図７。ヒト疾患に観察されたナンセンスコドンの原理的説明（ｒａｔｉｏｎａｌｅ）および発生頻度。２０の天然のアミノ酸コドンをヒト疾患への寄与に関して順位付し、濃い斜線模様のコドンが最も発生頻度が高く（ＴＧＧ、ＴＡＣ、ＴＡＴ、ＴＣＡおよびＴＴＡ）、点描されたコドンが最も発生頻度が低い。斜線模様のコドン配列はすべて、予定されるアミノ酸から終止コドンに転化するために単一のヌクレオチド変異を必要とする。右パネル、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）内の最も一般的な疾患原因となるナンセンスコドン。本明細書では、新規ｔＲＮＡ配列が表記変異の修復のために発見された。
【００３５】
【図８】図８。トリプトファン−ＴＧＡおよびグリシン−ＴＧＡの修復のためのｔＲＮＡ配列の同定。左の軸は、ルシフェラーゼ活性に対するバックグランドを上回る倍数を示す。変異体アンチコドンループを有するｔＲＮＡの大半はレスキュー活性を欠く。
【００３６】
【図９】図９。Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２  ＡＣＥ−ｔＲＮＡを用いたＣＦＴＲ１２８２ｘの救出。表記ｔＲＮＡとともにＨＥＫ細胞中で共発現されたＣＦＴＲ  Ｗ１２８２Ｘチャンネルの生化学的ウェスタンブロットデータ。表記ｔＲＮＡの４コピーを含有する発現ベクターは、より高いＣＦＴＲタンパク質の救出を示す。「Ｃ」バンドは、完全に成熟したグリコシル化されたＣＦＴＲタンパク質の救出を示す。使用された抗体は、Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓから得た、１：１０００希釈でのＭ３Ａ７であった。
【００３７】
【図１０−１】図１０Ａおよび図１０Ｂ。ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙの発現は、ナンセンスコドン中への同族アミノ酸の特異的取り込みをもたらす。図１０Ａ）モデルタンパク質ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＤＨ）−Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐ  Ｎ９４−ＴＧＡおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ（左）およびＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ（右）の共発現は、アフィニティー精製後の銀染色によって検出可能な完全長ＨＤＨタンパク質（アスタリスク）をもたらす。図１０Ｂ）ＷＴ  ＨＤＨ（上）、ＨＤＨ−Ｎ９４＋ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ（中央）およびＨＤＨ−Ｎ９４＋ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ（下）のスペクトル。スペクトルは、グリシン（−５７Ｄａ）およびトリプトファン（＋７２Ｄａ）と具体的に合致するＮ９４位におけるアミノ酸質量差を明らかにし、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ同族アミノ酸の挿入を示している。
【図１０−２】図１０Ａおよび図１０Ｂ。ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙの発現は、ナンセンスコドン中への同族アミノ酸の特異的取り込みをもたらす。図１０Ａ）モデルタンパク質ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＤＨ）−Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐ  Ｎ９４−ＴＧＡおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ（左）およびＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ（右）の共発現は、アフィニティー精製後の銀染色によって検出可能な完全長ＨＤＨタンパク質（アスタリスク）をもたらす。図１０Ｂ）ＷＴ  ＨＤＨ（上）、ＨＤＨ−Ｎ９４＋ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ（中央）およびＨＤＨ−Ｎ９４＋ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ（下）のスペクトル。スペクトルは、グリシン（−５７Ｄａ）およびトリプトファン（＋７２Ｄａ）と具体的に合致するＮ９４位におけるアミノ酸質量差を明らかにし、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ同族アミノ酸の挿入を示している。
【００３８】
【図１１】図１１。ｔＲＮＡライブラリーの構築のためのクローニング作業の流れ。
【００３９】
【図１２−１】図１２Ａ〜１２Ｂ。ｔステム領域内のヌクレオチドの標的化された変異は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ救出機能をさらに増強する。図１２Ａ。ｔステム領域内で、Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９を系統的に変異誘発した。これらの努力によって、ＡＣＥ  ｔＲＮＡ  ＴＳ−１０  ５２−６２  Ｇ−Ｃが同定され（図１２Ｂ）、プロットでは斜線模様のバーであり、約２５０％の生物活性の増加を示す。
【図１２−２】図１２Ａ〜１２Ｂ。ｔステム領域内のヌクレオチドの標的化された変異は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ救出機能をさらに増強する。図１２Ａ。ｔステム領域内で、Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔＲＮＡ３９を系統的に変異誘発した。これらの努力によって、ＡＣＥ  ｔＲＮＡ  ＴＳ−１０  ５２−６２  Ｇ−Ｃが同定され（図１２Ｂ）、プロットでは斜線模様のバーであり、約２５０％の生物活性の増加を示す。
【００４０】
【図１３−１】図１３Ａ〜１３Ｆ。ＡＣＥ−ｔＲＮＡはナンセンスコドンに対して選択的であり、アミノグリコシドナンセンス抑制より効率的である。図１３Ａ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ＃５および図１３Ｂ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ＃１６を、ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧナンセンスコドンを含有するＮａｎｏＬｕｃレポータープラスミド中にクローニングした。ナンセンス抑制は、形質移入後にＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡ構築物中のみで測定された。図１３Ｃおよび図１３Ｄ）ゲンチマイシン（ｇｅｎｔｉｍｉｃｉｎ）（４０μＭ）およびＧ４１８（１５０μＭ）の添加およびＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ＃５とＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ＃１６での共形質移入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によるＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡの抑制を、ＨＥＫ２９３細胞中において、図１３Ｃ）２４時間および図１３Ｄ）４８時間の時点で測定した。図１３Ｅおよび図１３Ｆ）ＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞をゲンチマイシン（４０μＭ）およびＧ４１８（１５０μＭ）で処理し、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ＃５およびＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ＃１６で形質移入した。処理後図１３Ｅ）２４時間および図１３Ｆ）４８時間の時点で、ナンセンス抑制を測定した。
【図１３−２】図１３Ａ〜１３Ｆ。ＡＣＥ−ｔＲＮＡはナンセンスコドンに対して選択的であり、アミノグリコシドナンセンス抑制より効率的である。図１３Ａ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ＃５および図１３Ｂ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ＃１６を、ＴＧＡ、ＴＡＡまたはＴＡＧナンセンスコドンを含有するＮａｎｏＬｕｃレポータープラスミド中にクローニングした。ナンセンス抑制は、形質移入後にＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡ構築物中のみで測定された。図１３Ｃおよび図１３Ｄ）ゲンチマイシン（ｇｅｎｔｉｍｉｃｉｎ）（４０μＭ）およびＧ４１８（１５０μＭ）の添加およびＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ＃５とＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ＃１６での共形質移入（ｃｏ−ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）によるＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡの抑制を、ＨＥＫ２９３細胞中において、図１３Ｃ）２４時間および図１３Ｄ）４８時間の時点で測定した。図１３Ｅおよび図１３Ｆ）ＮａｎｏＬｕｃ−ＴＧＡを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞をゲンチマイシン（４０μＭ）およびＧ４１８（１５０μＭ）で処理し、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ＃５およびＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ＃１６で形質移入した。処理後図１３Ｅ）２４時間および図１３Ｆ）４８時間の時点で、ナンセンス抑制を測定した。
【００４１】
【図１４】図１４。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ａｒｇ−ＴＧＡ。アルギニン−ＴＧＡナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡの同定。
【００４２】
【図１５】図１５。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ  ＴＡＧ。グルタミンＴＡＧナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡの同定。
【００４３】
【図１６】図１６。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ  ＴＡＡ  グルタミンＴＡＡナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡの同定。
【００４４】
【図１７】図１７。ＡＣＥ  ｔＲＮＡ−Ｇｌｕ  ＴＡＧ  グルタミン酸−ＴＡＧナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡの同定。
【００４５】
【図１８】図１８。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ  ＴＡＡ  グルタミン酸ＴＡＡナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡの同定。
【００４６】
【図１９】図１９。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ  ＴＡＧ  トリプトファンＴＡＧナンセンスコドンの修復のためのＡＣＥ  ｔＲＮＡの同定。
【００４７】
【図２０−１】図２０Ａ〜２０Ｄ。低分子ＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡの送達は、Ｇ５４２ＸおよびＷ１２８２Ｘナンセンス変異の強固な抑制を支える。図２０Ａ）Ｇ５４２ＸまたはＷ１２８２Ｘ嚢胞性線維症原因ナンセンス変異を有するＣＦＴＲ  ｃＲＮＡを、それぞれ、予め折り畳まれたＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐの系列希釈物とともに、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中に共注射した。二電極電圧クランプ法によるＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流の記録を３６時間後に行った。電流−電圧の関係性は、図２０Ｂ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐおよび図２０Ｃ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ予め折り畳まれたＲＮＡの量を増加させると、ＣＦＴＲ機能（測定されたＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流）の増加がもたらされ、ＷＴ  ＣＦＴＲとともに、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ実験において達成されることを示す。図２０Ｄ）Ｇ５４２Ｘ  ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ（黒丸）およびＷ１２８２Ｘ  ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ（白四角）救出の用量応答（＋４０ｍＶで惹起されたＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流は、＋４０ｍＶでのＷＴ  ＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流に対して正規化された。）。ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙの用量依存性（ＥＣ５０＝約２０ｎｇ；ヒル係数約１．４）はＷＴ  ＣＦＴＲレベルで明瞭な飽和を示すのに対して、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐは右方移動する（ＥＣ５０＝約９４ｎｇ；ヒル係数１．２４）。
【図２０−２】図２０Ａ〜２０Ｄ。低分子ＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡの送達は、Ｇ５４２ＸおよびＷ１２８２Ｘナンセンス変異の強固な抑制を支える。図２０Ａ）Ｇ５４２ＸまたはＷ１２８２Ｘ嚢胞性線維症原因ナンセンス変異を有するＣＦＴＲ  ｃＲＮＡを、それぞれ、予め折り畳まれたＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐの系列希釈物とともに、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞中に共注射した。二電極電圧クランプ法によるＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流の記録を３６時間後に行った。電流−電圧の関係性は、図２０Ｂ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐおよび図２０Ｃ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ予め折り畳まれたＲＮＡの量を増加させると、ＣＦＴＲ機能（測定されたＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流）の増加がもたらされ、ＷＴ  ＣＦＴＲとともに、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ実験において達成されることを示す。図２０Ｄ）Ｇ５４２Ｘ  ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ（黒丸）およびＷ１２８２Ｘ  ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ（白四角）救出の用量応答（＋４０ｍＶで惹起されたＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流は、＋４０ｍＶでのＷＴ  ＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流に対して正規化された。）。ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙの用量依存性（ＥＣ５０＝約２０ｎｇ；ヒル係数約１．４）はＷＴ  ＣＦＴＲレベルで明瞭な飽和を示すのに対して、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐは右方移動する（ＥＣ５０＝約９４ｎｇ；ヒル係数１．２４）。
【００４８】
【図２１】図２１Ａ〜２１Ｂ。候補のアンチコドン編集ｔＲＮＡ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡ）を同定するためのナンセンス変異抑制スクリーニング。図２１Ａ、模式図は、翻訳機構とのＡＣＥ−ｔＲＮＡの必須の相互作用を図解する。送達後に、ＡＣＥ−ｔＲＮＡは内在性アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によって認識され、その同族アミノ酸を充填される（アミノアシル化される）。アミノアシル化されたＡＣＥ−ｔＲＮＡは、内在性伸長因子１αによって認識され、内在性伸長因子１αはＡＣＥ−ｔＲＮＡを脱アシル化から保護し、未成熟な終結コドン（この事例ではＵＧＡ）の抑制のためにアミノアシルＡＣＥ−ｔＲＮＡをリボソームに送達する。図２１Ｂ、ＣｃｄＢネガティブセレクションと組み合わせたＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅを用いて、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｎｏｎｓｅｎｓｅ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒプラスミド中に個別のＡＣＥ−ｔＲＮＡをクローニングした。このオールインワンプラスミドは、酵素の大きな部分と必須のＣ末端の小さな部分の間に、ｐ．１６２におけるＵＧＡ、ＵＡＧまたはＵＡＡ  ＰＴＣのいずれかとともに、ＮＬｕｃルシフェラーゼレポーターを含有する。
【００４９】
【図２２】図２２。ハイスループットクローニングナンセンス変異レポータープラットフォームを用いた、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ遺伝子ファミリーのスクリーニング。内在性アンチコドン配列から１ヌクレオチド離れた各ＡＣＥ−ｔＲＮＡファミリーに対して、表記アンチコドン編集ＰＴＣ配列を試験した、図２５。各クラスに対して、複数の高性能なサプレッサーｔＲＮＡが同定された。データは、正規化されたＮＬｕｃ発光に関して、Ｌｏｇ１０尺度で示されている。各ｔＲＮＡデータセットは３つ組で取得され、表２中の対応するＡＮＯＶＡ統計解析とともに、ＳＥＭで表示されている。コードされた実体（ｃｏｄｅｄ  ｉｄｅｎｔｉｔｙ）と対応するｔＲＮＡ配列が、それぞれ、図２６および表９に示されている。
【００５０】
【図２３−１】図２３Ａ〜２３Ｃ。操作されたｔＲＮＡによる同族コード化および高忠実度抑制。図２３Ａ、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＤＨ）のトリプシン消化断片、「Ｘ」は抑制されたＰＴＣコドンを示す。ＷＴ（上）、Ｎ９４Ｇ（中央）およびＮ９４Ｗ（下）ＨＤＨに対する表記されたｙおよびｂイオンの質量を有するトリプシン消化断片のＭＳ／ＭＳスペクトル。ｂ９イオンの質量は、ＷＴアスパラギンから−５７Ｄａおよび＋７２Ｄａの予測された質量だけシフトし、それぞれ、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐによって、同族アミノ酸のグリシンおよびトリプトファンがコードされていることを示している。図２３Ｂ、ＡＣＥ−ＴＧＡ−ｔＲＮＡＧｌｙ（Ｇｌｙｃｈｒ１９．ｔ２）は、一過性に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中でＵＧＡ終止コドンを選択的に抑制する。図２３Ｃ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ形質移入は、ＮＬｕｃ−ＵＧＡを安定的に発現しているＨｅｋ２９３細胞中での４８時間のインキュベーション後に、ゲンタマイシン（４０μＭ）およびＧ４１８（１４０μＭ）の両方よりも優れている。
【図２３−２】図２３Ａ〜２３Ｃ。操作されたｔＲＮＡによる同族コード化および高忠実度抑制。図２３Ａ、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＤＨ）のトリプシン消化断片、「Ｘ」は抑制されたＰＴＣコドンを示す。ＷＴ（上）、Ｎ９４Ｇ（中央）およびＮ９４Ｗ（下）ＨＤＨに対する表記されたｙおよびｂイオンの質量を有するトリプシン消化断片のＭＳ／ＭＳスペクトル。ｂ９イオンの質量は、ＷＴアスパラギンから−５７Ｄａおよび＋７２Ｄａの予測された質量だけシフトし、それぞれ、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙおよびＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐによって、同族アミノ酸のグリシンおよびトリプトファンがコードされていることを示している。図２３Ｂ、ＡＣＥ−ＴＧＡ−ｔＲＮＡＧｌｙ（Ｇｌｙｃｈｒ１９．ｔ２）は、一過性に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞中でＵＧＡ終止コドンを選択的に抑制する。図２３Ｃ）ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ形質移入は、ＮＬｕｃ−ＵＧＡを安定的に発現しているＨｅｋ２９３細胞中での４８時間のインキュベーション後に、ゲンタマイシン（４０μＭ）およびＧ４１８（１４０μＭ）の両方よりも優れている。
【００５１】
【図２４−１】図２４Ａ〜２４Ｂ。トランスクリプトーム全体の３’ＵＴＲでのＡＣＥ−ｔＲＮＡのリボソームプロファイリング。図２４Ａ、材料と方法に記載されているように、対照（ｐｕｃ５７ＧＧ空ベクター）と比較した処理された細胞の読み取り情報に対して、ｌｏｇ２倍数変化として、３’ＵＴＲ上のリボソームフットプリント密度がプロットされている。転写物は、その内在性ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡ終止コドンによってグループ分けした。各点は、転写物に対する２つの反復の平均を表す。エラーバーは、ｌｏｇ２倍数変化の平均±標準偏差を示す。図２４Ｂ、トランスクリプトーム（１８，１０１配列）の終止コドン周囲の−５０〜＋５０ｎｔの各ヌクレオチドに対して、正規化されたリボソームフットプリント占有の平均ｌｏｇ２倍数変化をプロットした。図解は、リボソームフットプリントの５’末端からリボソームＡ部位中の終止コドンの最初の塩基位置までの約１５ヌクレオチドのオフセットを表す。
【図２４−２】図２４Ａ〜２４Ｂ。トランスクリプトーム全体の３’ＵＴＲでのＡＣＥ−ｔＲＮＡのリボソームプロファイリング。図２４Ａ、材料と方法に記載されているように、対照（ｐｕｃ５７ＧＧ空ベクター）と比較した処理された細胞の読み取り情報に対して、ｌｏｇ２倍数変化として、３’ＵＴＲ上のリボソームフットプリント密度がプロットされている。転写物は、その内在性ＴＡＡ、ＴＡＧおよびＴＧＡ終止コドンによってグループ分けした。各点は、転写物に対する２つの反復の平均を表す。エラーバーは、ｌｏｇ２倍数変化の平均±標準偏差を示す。図２４Ｂ、トランスクリプトーム（１８，１０１配列）の終止コドン周囲の−５０〜＋５０ｎｔの各ヌクレオチドに対して、正規化されたリボソームフットプリント占有の平均ｌｏｇ２倍数変化をプロットした。図解は、リボソームフットプリントの５’末端からリボソームＡ部位中の終止コドンの最初の塩基位置までの約１５ヌクレオチドのオフセットを表す。
【００５２】
【図２５】図２５。一般的なＰＴＣのコドン使用。斜線模様は、ヌクレオチド置換を通じて終止コドンに転化され得る最も一般的なコドンおよび対応するアミノ酸の種類を示す。各種類に対して、操作されたｔＲＮＡを開発した。
【００５３】
【図２６−１】図２６。番号で参照したＡＣＥ−ｔＲＮＡ活性プロット。
【図２６−２】同上。
【図２６−３】同上。
【図２６−４】同上。
【図２６−５】同上。
【図２６−６】同上。
【図２６−７】同上。
【図２６−８】同上。
【図２６−９】同上。
【図２６−１０】同上。
【図２６−１１】同上。
【図２６−１２】同上。
【図２６−１３】同上。
【図２６−１４】同上。
【００５４】
【図２７】図２７。グリシンｔＲＮＡ配列のアラインメント。２１個のｔＲＮＡＧｌｙヒト配列は、ｔＲＮＡクレード間で高い配列相同性を示す。ｔＲＮＡ図中のパターンは、配列中のパターンが付された枠に対応する。
【００５５】
【図２８】図２８。Ｎａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ中のｐ．１６２における側鎖の種類は活性に影響を及ぼさない。部位における各変異に対して、総発光活性が示されている。
【００５６】
【図２９Ａ−１】図２９Ａ〜２９Ｃ。複数の種およびサプレッサーｔＲＮＡ変異から得られるＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ配列の分析。図２９Ａ〜２９Ｂ。配列アラインメント。図２９Ｃ。ＮＬｕｃ−ＵＧＡ＋ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ／ＮＬｕｃ−ＵＧＡ。
【図２９Ａ−２】同上。
【図２９Ｂ−１】図２９Ａ〜２９Ｃ。複数の種およびサプレッサーｔＲＮＡ変異から得られるＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ配列の分析。図２９Ａ〜２９Ｂ。配列アラインメント。図２９Ｃ。ＮＬｕｃ−ＵＧＡ＋ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ／ＮＬｕｃ−ＵＧＡ。
【図２９Ｂ−２】同上。
【００５７】
【図３０】図３０Ａ〜３０Ｃ。ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＤＨ）Ｈｉｓ（８）−ストレプタクチン発現構築物は、ＨＥＫ２９３細胞からのタンパク質の効率的な一段階単離を可能にする。図３０Ａ）ＨＤＨ発現構築物のタンパク質配列。下線が付された配列は、質量分析によってカバーされた箇所を表す。太字の下線が付されたアスパラギン（アミノ酸９４位）は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡの忠実度を決定するために、ＴＧＡ  ＰＴＣへ変異された残基である。二重のアフィニティータグは、太字の斜字体で示されている。図３０Ｂ）Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９および図３０Ｃ）Ｇｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２を用いたＰＴＣ抑制後のＨＤＨタンパク質の銀染色。
【００５８】
【図３１】図３１。終止コドン特異性は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐに対して維持されている。最高の性能のＴｒｐＴＧＡサプレッサーｔＲＮＡであるｔＲＮＡ  ＴｒｐＴＧＡＴｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９、図２２、に対する抑制活性３６。表記ｐＮａｎｏ−ＳＴＯＰプラスミドとともに、このｔＲＮＡを共発現させた。
【００５９】
【図３２】図３２Ａ〜３２Ｄ。ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、アミノグリコシドＰＴＣ抑制より効率的である。ゲンタマイシン（４０μＭ）、Ｇ４１８（１５０μＭ）の添加並びにＰＴＣレポーターＮｌｕｃ−ＵＧＡを安定に発現しているＨＥＫ２９３細胞中でのＴｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２の形質移入から２４時間後に測定された図３２Ａ）生のおよび図３２Ｂ）正規化された発光。ゲンタマイシン（４０μＭ）、Ｇ４１８（１５０μＭ）の添加並びにＨＥＫ２９３細胞中でのＴｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２の共形質移入から２４時間後に測定された図３２Ｃ）生のおよび図３２Ｄ）正規化された発光。
【００６０】
【図３３】図３３。ＲＮＡまたはｃＤＮＡとしての送達後におけるＡＣＥ−ｔＲＮＡ活性の時間経過の比較。ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ｐＮａｎｏＬｕｃ−ＵＧＡを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞に送達されたが、細胞の生存性に対する形質移入試薬の影響を低減するために、５μＬの反応混合物のみを細胞に添加した。ＲＮＡ（白の記号）として送達されたＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ｃＤＮＡ構築物（黒丸）より、ＰＴＣレポーターの発現を救う上でより迅速であった。しかしながら、ｃＤＮＡから発現されると、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ活性は４８時間にわたって上昇し続け、ＲＮＡデリバリー（ＲＮＡ  ｄｅｌｉｖｅｒａｂｌｅ）としては減少した。
【発明を実施するための形態】
【００６１】
長年にわたって、研究者たちは、ヒト遺伝子中で確立されているナンセンスコドンをもたらす何百もの特有の点変異を同定してきた。これらの種類の変異は、例えば、筋ジストロフィー、色素性乾皮症、嚢胞性線維症、血友病、貧血、甲状腺機能低下症、ｐ５３扁平上皮（ｓｑｕａｍａｌ）細胞癌、ｐ５３肝細胞癌、ｐ５３卵巣癌、食道癌、骨癌、卵巣癌、食道癌、肝細胞癌、乳がん、肝細胞癌、線維性組織球腫、卵巣癌、ＳＲＹ性転換、トリオースリン酸イソメラーゼ貧血、糖尿病およびくる病をもたらす。乳がんと関連するＢＲＡＣＡ−１およびＢＲＡＣＡ−２遺伝子も類似の変異を有する。
【００６２】
数百のヒトｔＲＮＡをコードするヌクレオチド配列が知られており、Ｇｅｎｂａｎｋなどの入手先を通じて、当業者は一般に入手可能である。ｔＲＮＡの構造は高度に保存されており、ｔＲＮＡは、しばしば、種を越えて機能する。このため、細菌または他の真核生物のｔＲＮＡ配列も、本発明の安定化されたｔＲＮＡのオリゴヌクレオチドのための潜在的供給源である。特定のｔＲＮＡ配列が所望の哺乳動物細胞中で機能するかどうかの決定は、定型的な実験操作を通じて確かめることができる。未知のさらなるその他の潜在的なｔＲＮＡ配列は、定型的な実験操作を通じて、安定化するために本明細書に記載されているとおりに修飾することができる。
【００６３】
ｔＲＮＡ遺伝子は全ての細胞種内で活性である強力なプロモーターを有する。真核生物のｔＲＮＡ遺伝子に対するプロモーターは、ｔＲＮＡ分子自体をコードする構造配列内に含有される。５’上流領域内に転写活性を制御する要素が存在するが、活性な転写単位の長さは５００塩基対を大幅に下回ることがあり得、このため、送達ベクター内への収容は容易である。転写およびプロセシングが行われると、ｔＲＮＡは低い分解速度を有する。最後に、ナンセンスサプレッサーを用いた遺伝子治療は、ナンセンスコドンを含有する標的遺伝子に対する内在性の生理的調節を維持する。
ナンセンス変異
【００６４】
転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）配列のタンパク質への解読において機能するＲＮＡ分子の一種である。ｔＲＮＡは、ｍＲＮＡ分子からタンパク質を合成する翻訳の間にリボソーム中の特異的な部位で機能する。未成熟終結コドン（ＰＴＣ）とも称されるナンセンス変異は、ヒトの疾患を引き起こす単一塩基対変異の約１０〜１５％を占め、嚢胞性線維症もこれに含まれる。（Ｐｅｌｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ａｎｎｕ  Ｒｅｖ  Ｍｅｄ．，６４：４０７−２５，２０１３）。ほぼ完全な遺伝子発現および活性の喪失のため、並びにトランケートされた生成物のドミナントネガティブ効果の可能性のために、一般に、ナンセンス変異はミスセンス変異より深刻な派生結果を有する。ＰＴＣは、未成熟な翻訳終結およびナンセンス変異依存分解（ＮＭＤ）経路を通じた加速されたｍＲＮＡ転写物分解をもたらす。
【００６５】
現在の研究は、ｔＲＮＡ内のアンチコドン配列の分子編集を通じて、ｔＲＮＡがそのアミノ酸を送達するＲＮＡ転写物内の特異的部位が変更され得ることを示している。このアプローチは、未成熟終結コドン（ＰＴＣ）を元の失われたアミノ酸へ効果的かつ治療的に復帰させることを可能にした。アンチコドン編集ｔＲＮＡ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡ）は、新しいクラスの生物学的治療薬を形成する。
【００６６】
操作されたｔＲＮＡは、疾患を引き起こすナンセンスコドンの特異的なアミノ酸への「再編集」を可能にする。これらの操作されたｔＲＮＡは、ＴＡＣまたはＴＡＡよりＴＧＡなど、１種類の終止コドンのみを標的とする。ｔＲＮＡ＋プロモーターは約３００ｂｐに過ぎないので、これらのｔＲＮＡ分子のサイズが小さいことは、即座の発現（ｒｅａｄｙ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ）に適している。簡潔に述べれば、ヒト細胞中で機能するｔＲＮＡ遺伝子の構造成分を含むオリゴヌクレオチドが合成される。このオリゴヌクレオチドの配列は、特定のｔＲＮＡにナンセンスまたはその他の特異的な変異を認識させるｔＲＮＡのアンチコドン領域中になされる置換を有する既知の配列に基づいて設計される。
【００６７】
リボソームとの相互作用を通じてナンセンス終止コドンを抑制するために、いくつかの小分子のスクリーニングが行われ、最も顕著な分子はＧ４１８、ゲンタマイシンおよびＰＴＣ１２４であった。ＰＴＣ１２４またはアタルレンは、最近、嚢胞性線維症治療薬として使用するために第ＩＩＩ相臨床試験を終了した。アタルレンおよびアミノグリコシドは、近い同族アミノ酸（ｎｅａｒ−ｃｏｇｎａｔｅ  ａｍｉｎｏ  ａｃｉｄ）を取り込むことによって、３つのナンセンスコドンの各々のリードスルー（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）を促進し、ナンセンス変異をミスセンス変異に変化させる。（Ｒｏｙ  ｅｔ  ａｌ．，ＰＮＡＳ  ２０１６  Ｎｏｖ  １；１１３（４４）：１２５０８−１２５１３）。
アンチコドン編集ｔＲＮＡ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡ）
【００６８】
ｔＲＮＡは、Ｔアームと、Ｄアームと、アンチコドンアームと、アクセプタアームとを含む一般的な４アーム構造を有する（図２）。
【００６９】
Ｔアームは、「Ｔステム」と「ＴψＣループ」から構成される。ある実施形態において、ｔＲＮＡの安定性を増加させるためにＴステムが修飾される。ある実施形態において、ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、内在性Ｔステム配列と比べて終止部位を抑制する生物活性を増加させる修飾されたＴステムを有する。
【００７０】
本発明は、一実施形態において、極めて様々なナンセンス変異関連疾患を処置するために、より高い有効性をもって使用することができる、安定化されたｔＲＮＡを含む組成物を含む。表１〜８中の以下の配列は、ＤＮＡとして書かれているが、ＲＮＡ（転写されたＤＮＡ）としては、「Ｔ：チミジン」は、「Ｕ：ウラシル」である。したがって、以下の配列から転写されたｔＲＮＡは全て、チミジンの代わりにウラシルを含有する。
【００７１】
ある実施形態において、ｔＲＮＡは、以下の配列を有する（配列中、チミジンはウラシルで置き換えられる。）。
【化１】
2021508234.tif 000003
【００７２】
表１
【表１−１】
2021508234.tif 000004
【表１−２】
2021508234.tif 000005
【００７３】
表２
【表２】
2021508234.tif 000006
【００７４】
表３
【表３−１】
2021508234.tif 000007
【表３−２】
2021508234.tif 000008
【００７５】
表４
【表４】
2021508234.tif 000009
【００７６】
表５
【表５】
2021508234.tif 000010
【００７７】
表６
【表６】
2021508234.tif 000011
【００７８】
表７
【表７−１】
2021508234.tif 000012
【表７−２】
2021508234.tif 000013
【００７９】
表８
【表８】
2021508234.tif 000014
【００８０】
一実施形態において、ナンセンス抑制のためのＡＣＥ−ｔＲＮＡは、図３に図示されているとおりである（ホモ・サピエンスｔＲＮＡＴｒｐＴＧＡ）。
【００８１】
本発明にしたがって、ヒトＵＡＡ、ＵＡＧおよびＵＧＡサプレッサーｔＲＮＡが設計された。スクリーニングによって、Ｔｒｐ−ＴＧＡ、Ｔｒｐ−ＴＡＧ、Ａｒｇ−ＴＧＡ、Ｇｌｎ−ＴＡＧ、Ｇｌｎ−ＴＡ、Ｇｌｕ−ＴＡＧ、Ｇｌｕ−ＴＡＡの修復のためのコドン編集ｔＲＮＡが同定された。ｔＲＮＡは約１００ヌクレオチドの長さであり、そこに野生型アミノ酸が存在するべきナンセンスコドン変異を抑制するために細胞に導入することができる。オリゴヌクレオチドは、レシピエント細胞に直接導入することができ、またはオリゴヌクレオチドの効力を増加させるためにタンデムでライゲーションすることができる。
発現カセットおよびベクター
【００８２】
ある実施形態において、ＡＣＴ−ｔＲＮＡは、発現カセットによってコードされる。さらに別の実施形態において、本発明のサプレッサーｔＲＮＡは、ベクターの使用を通じて、標準的な従来の遺伝子操作技術を用いて細胞に導入され得る。ｔＲＮＡコード配列の内部プロモーター配列のために、ｔＲＮＡ配列は別個の転写ユニット中に含められる必要はないが、これを供してもよい。
【００８３】
本発明の一実施形態において、本発明のヌクレオチド発現系は、次いで、サプレッサーｔＲＮＡを発現するために細胞を形質導入するために使用される適切な遺伝子移入ビヒクル内に含められる。遺伝子送達ビヒクルは、本分野において既知のあらゆる送達ビヒクルとすることができ、受容体および／または脂質媒介性形質移入によって促進される裸のＤＮＡ並びに多数のベクターのいずれをも含むことができる。このようなベクターには、真核生物ベクター、原核生物ベクター（例えば、細菌ベクターなど）並びにレトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、レンチウイルスベクター（ヒトおよびブタを含む他のもの）、ヘルペスウイルスベクター、エプスタイン・バーウイルスベクター、ＳＶ４０ウイルスベクター、ポックスウイルスベクターおよび偽型ウイルスベクターを含むがこれらに限定されないウイルスベクターが含まれるが、これらに限定されない。
【００８４】
ある実施形態において、ＡＣＴ−ｔＲＮＡ（ＰＴＣ）は、ベクター中にコードされる。図４。ある実施形態において、ウイルスベクターはレトロウイルスまたはアデノウイルスベクターである。使用され得るレトロウイルスベクターの例には、モロニーマウス白血病ウイルス、脾壊死ウイルス並びにラウス肉腫ウイルス、ハーベイ肉腫ウイルス、トリ白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス、骨髄増殖性肉腫ウイルスおよび乳腺腫瘍ウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクターが含まれるが、これらに限定されない。
レトロウイルス；レトロウイルスベクター
【００８５】
「レトロウイルス」という用語は、その複製サイクルの間に逆転写酵素を使用するＲＮＡウイルスを表すために使用される。レトロウイルスのゲノムＲＮＡは、逆転写酵素によって、二本鎖ＤＮＡに転換される。ウイルスのこの二本鎖ＤＮＡ形態は、感染された細胞の染色体中に組み込まれることができ、一旦組み込まれると、「プロウイルス」と称される。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに対する鋳型としての役割を果たし、新しいウイルス粒子を産生するために必要とされる構造タンパク質および酵素をコードするＲＮＡ分子の発現を誘導する。プロウイルスの各末端には、「長い末端反復配列」または「ＬＴＲ」と称される構造が存在する。ＬＴＲは、転写調節要素、ポリアデニル化シグナル並びにウイルスゲノムの複製および組み込みのために必要とされる配列を含む多数の制御シグナルを含有する。システルナウイルスＡ（Ｃｉｓｔｅｒｎａｖｉｒｕｓ  Ａ）、オンコウイルスＡ、オンコウイルスＢ，オンコウイルスＣ、オンコウイルスＤ、レンチウイルスおよびスプマウイルスを含むレトロウイルス科の中には、いくつかの属が含まれる。レトロウイルスのいくつかは発癌性（すなわち、腫瘍原性）であるが、その他は発癌性でない。オンコウイルスは、感受性を有する種に肉腫、白血病、リンパ腫および乳癌を誘導する。レトロウイルスは、多様な種に感染し、水平および垂直に伝達され得る。レトロウイルスは宿主ＤＮＡ中に組み込まれ、宿主ＤＮＡの配列を細胞から細胞へ伝達させることができる。これにより、遺伝子治療を含む様々な目的のためのベクターとして、レトロウイルスの開発に至った。
【００８６】
ヒト泡沫状ウイルス（ＨＦＶ）およびヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）を含むレトロウイルスは、それらの標的細胞が分裂している細胞に限定されず、水疱性口内炎ウイルスＧ（ＶＳＶ−Ｇ）外被糖タンパク質によるシュードタイピングを介して、それらの限定的な宿主細胞指向性を容易に拡張できるので、近年大きな注目を集めてきた（例えば、Ｊ．Ｃ．Ｂｕｒｎｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ  ９０：８０３３−８０３７［１９９３］；Ａ．Ｍ．Ｌ．Ｌｅｖｅｒ，Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ．３：４７０−４７１「１９９６］；およびＤ．Ｒｕｓｓｅｌｌ  ａｎｄ  Ａ．Ｄ．Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７０：２１７−２２２［１９９６］参照）。
【００８７】
ベクター系は、一般的に、レトロウイルス配列の小さな部分（ウイルスの長い末端反復配列または「ＬＴＲ」およびパッケージングまたは「ｐｓｉ」シグナル）を含有するＤＮＡベクターとパッケージング細胞株とを有する。移入されるべき遺伝子は、ＤＮＡベクター中に挿入される。ＤＮＡベクター上に存在するウイルスの配列は、ウイルス粒子中へのベクターＲＮＡの挿入またはパッケージングのためにおよび挿入された遺伝子の発現のために必要なシグナルを提供する。パッケージング細胞株は、粒子の集合に必要とされるウイルスタンパク質を提供する（Ｄ．Ｍａｒｋｏｗｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１１２０［１９８８］）。本発明の一実施形態において、２９３Ｔ細胞中での３プラスミド形質移入産生法を使用するＦＩＶ系が使用された（Ｊｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．１９９９  ７３：４９９１−５０００）。複製能のないウイルスが首尾よく産生された。
【００８８】
ベクターＤＮＡは、様々な技術（例えば、リン酸カルシウム共沈、リポフェクション、電気穿孔）のいずれによっても、パッケージング細胞中に導入される。パッケージング細胞によって産生されたウイルスタンパク質は、培養上清中に流出されるウイルス粒子中へのＲＮＡの形態のベクター配列の挿入を媒介する。
【００８９】
自然に分裂している、または成長因子によって分裂するように刺激されている細胞については、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ベクターのような単純なレトロウイルスが適切な送達系である。しかしながら、遺伝子移入において一般的に使用される多くのレトロウイルスベクターの使用における主要な限界は、ベクターの多くが分裂する細胞に限定されることである。非分裂細胞が標的細胞である場合には、非分裂細胞に感染することができるレンチウイルスが使用され得る。
【００９０】
本明細書において使用される場合、「レンチウイルス」という用語は、ゆっくり発症する疾患を生じさせるレトロウイルスの群（または属）を表す。この群内に含まれるウイルスには、ヒト後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の病原因子であるＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型およびＨＩＶ２型を含む）；ヒツジに脳炎（ビスナ）または肺炎（マエディ）を引き起こすビスナ・マエディ、ヤギに免疫不全、関節炎および脳症を引き起こすヤギ関節炎脳炎ウイルス；ウマに自己免疫性溶血性貧血および脳症を引き起こすウマ伝染性貧血ウイルス；ネコに免疫不全を引き起こすネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシにリンパ節腫脹、リンパ球増加症およびおそらく中枢神経系感染を引き起こすウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；並びに類人霊長類（ｓｕｂ−ｈｕｍａｎ  ｐｒｉｍａｔｅｓ）に免疫不全および脳症を引き起こすサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。これらのウイルスによって引き起こされる疾患は、長い潜伏期間と長引く経過を特徴とする。通常、これらのウイルスは単球およびマクロファージに潜伏感染し、そこから他の細胞に広がる。ＨＩＶ、ＦＩＶおよびＳＩＶは、Ｔリンパ球（すなわち、Ｔ細胞）にも容易に感染する。
【００９１】
ＨＩＶ、ＳＩＶ、ＦＩＶおよびウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）を含むレンチウイルスは、効率的な細胞内複製のために、単純な構造的ｇａｇ−ｐｏｌ−ｅｎｖ遺伝子の他に、いくつかのウイルス制御遺伝子に依存する。このように、レンチウイルスは、遺伝子制御およびウイルス複製のために、古典的なレトロウイルスよりさらに複雑な戦略を使用し、パッケージングシグナルがウイルスゲノム全体にわたって広がっているようである。これらの追加の遺伝子は、レンチウイルスの生活環の間に制御機能網を呈する。例えば、ＨＩＶ−１感染すると、転写は、ＬＴＲ中のＲＮＡ標的（ＴＡＲ）との相互作用を通じたＴａｔの発現によって上方制御される。次いで、完全長のおよびスプライシングされたｍＲＮＡの発現は、ｇａｇ領域およびｅｎｖ領域中に存在するＲＮＡ要素（ＲＲＥ）と相互作用するＲｅｖの機能によって制御される（Ｓ．Ｓｃｈｗａｒｔｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６６：１５０−１５９［１９９２］）。ｇａｇ−ｐｏｌおよびｅｎｖ  ｍＲＮＡの核外輸送は、Ｒｅｖ機能に依存する。これら２つの不可欠な制御遺伝子の他に、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｘ、ｖｐｕおよびｎｅｆを含む一連のアクセサリー遺伝子もウイルスゲノム中に存在し、効率的なウイルス産生と感染性に対するその効果が実証されているが、それらはウイルス複製のために絶対的に必要なわけではない（Ｋ．ａｎｄ  Ｆ．Ｗｏｎｇ−Ｓｔａａｌ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，５５：１９３−２０５（１９９１］；Ｒ．Ａ．Ｓｕｂｂｒａｍａｎｉａｎ  ａｎｄ  Ｅ．Ａ．Ｃｏｈｅｎ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．６８：６８３１−６８３５［１９９４］；およびＤ．Ｔｒｏｎｏ，Ｃｅｌｌ  ８２：１８９−１９２［１９９５］）。例示的なレンチウイルスであるＨＩＶ−１の構造の詳しい説明が、米国特許第６，５３１，１２３号に与えられている。
【００９２】
「源（ｓｏｕｒｃｅ）」または「元の」レトロウイルスは、偽型レトロウイルスがそこから誘導された野生型レトロウイルスであり、またはベクターの遺伝要素の１つもしくはそれより多くの調製のために、パッケージングまたは導入遺伝子ベクターの構築の間に出発点として使用される野生型レトロウイルスである。遺伝要素は変化せずに使用してもよく、またはそれは変異されてもよい（ただし、それは元の要素と統計学的に有意な配列類似性を欠く点を越えない）。ベクターは、１を超える源レトロウイルスを有してもよく、異なる源レトロウイルスは、例えば、ＭＬＶ、ＦＩＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２またはＨＩＶおよびＳＩＶであり得る。「遺伝要素」という用語は、遺伝子を含むが、これに限定されない。
【００９３】
同族レトロウイルスは、問題のベクターが核酸レベルで最大のパーセント配列同一性を有する野生型レトロウイルスである。通常、これは、源レトロウイルスと同一であろう。しかしながら、源レトロウイルスが広範に変異されていれば、ベクターは何らかの他のレトロウイルスによりよく似ていることが考えられる。同族レトロウイルスは、構築のための物理的な出発点である必要はなく、元の要素をまず取得し、次いで、それを修飾するよりもむしろ、遺伝要素、特に変異体要素を直接合成することを選択し得る。「同族（ｃｏｇｎａｔｅ）」という用語は、タンパク質、遺伝子または遺伝要素（例えば、スプライス供与部位またはパッケージングシグナル）に同様に適用され得る。同族タンパク質に言及する場合、パーセント配列同一性はアミノ酸レベルで決定される。
【００９４】
「同族」レトロウイルスという用語は、極端な事例では、すなわち、全てのレトロウイルスの遺伝要素が代替非レンチウイルス遺伝要素で置換されている場合には、解釈することが困難であり得る。この場合には、前述した源レトロウイルス株が、任意に同族レトロウイルスであると考えられる。
【００９５】
ウイルスまたはベクターを参照して本明細書において使用される場合、「複製」という用語は、細胞複製の結果としての染色体中のプロウイルスＤＮＡの正常な複製または機能的な複製起点の存在の結果としてのプラスミドＤＮＡの自律的な複製を表さない。代わりに、「複製」は、ウイルスＲＮＡを含有する感染性ウイルス粒子が細胞内に入り、ＲＮＡがＤＮＡに逆転写され、ＤＮＡがプロウイルスとして宿主染色体中に組み込まれ、感染された細胞がビリオンタンパク質を産生し、完全長ウイルスゲノムＲＮＡでこれらを新しい同じく感染性の粒子に組み立てる完全なウイルスの生活環の完了を表す。
【００９６】
「複製能を有する」という用語は、感染した細胞中でのウイルスの複製が感染性ビリオンの産生をもたらし、この感染性ビリオンが以前には感染していない別の細胞に感染した後に、この感染していない細胞にこのような感染性ビリオンを同様に産生させるように、複製することが可能な野生型ウイルスまたは変異体ウイルスを表す。本発明は、複製欠損ウイルスの使用を想定する。
【００９７】
本明細書において使用される場合、「弱毒化されたウイルス」という用語は、予定される対象中でその病原性が実質的に低減されるように修飾されたあらゆるウイルス（例えば、弱毒化されたレンチウイルス）を表す。ウイルスは、臨床的見地からそれが非病原性である点まで弱毒化され得る、すなわち、ウイルスに曝露されたその対象は、対照の対象と比べて統計的に有意なレベルの病状の増加を呈さない。
【００９８】
本発明は、修飾されたレトロウイルスの調製および使用を想定する。いくつかの実施形態において、レトロウイルスは、マウス白血病ウイルス、ヒト免疫不全ウイルス１型、ヒト免疫不全ウイルス２型、ネコ免疫不全ウイルス、サル免疫不全ウイルス、ビスナ−マエディ、ヤギ関節炎脳炎ウイルス、ウマ伝染性貧血ウイルスおよびウシ免疫不全ウイルスまたは１つを超えるレトロウイルス種の部分から構成されるウイルス（例えば、ＭＬＶ、ＦＩＶ、ＨＩＶ−１およびＨＩＶ−２またはＨＩＶ−１および／またはＳＩＶの部分から構成されるハイブリッド）の変異体である。
【００９９】
基準ウイルスは、変異体ウイルスの構成要素を記載する際にそのゲノムが使用されるウイルスである。例えば、変異体ウイルスの特定の遺伝要素は、様々な置換、欠失または挿入によって、基準ウイルスの同族要素と異なると言い得る。変異体ウイルスは、実際に、基準ウイルスに由来する必要はない。
【０１００】
好ましい基準ＦＩＶ配列は、Ｔａｌｂｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１９８９  ８６：５７４３−７；Ｇｅｎｂａｎｋ  ａｃｃｅｓｓ＃ＮＣ＿００１４８２中に見出される。ある実施形態において複製能のない偽型レトロウイルス（例えば、ＦＩＶ）を産生するために、３プラスミド一過性形質移入法（ｔｈｒｅｅ−ｐｌａｓｍｉｄ  ｔｒａｎｓｉｅｎｔ  ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄ）を使用することができる。一般的な方法は、Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．１９９９  １０４：Ｒ５５−６２およびＪｏｈｎｓｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９９  ７３：４９９１−５０００に記載されている。
レトロウイルスベクター系
【０１０１】
本発明は、導入遺伝子ベクターと、１またはそれを超える適合的パッケージングベクターと、エンベロープベクターと、適切な宿主細胞とを含むレトロウイルス遺伝子増幅および移入系を想定する。使用されるベクターは、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）に由来し得る。レトロウイルスベクターは、（１）パッケージングベクターＲＮＡを本質的に含まないウイルス粒子を産生するパッケージング細胞株を形成するための、宿主細胞中へのパッケージングベクターおよびエンベロープベクターの形質移入、（２）パッケージング細胞株中への導入遺伝子ベクターの形質移入、（３）パッケージング細胞株による感染性ウイルス粒子中への導入遺伝子ベクターＲＮＡのパッケージングおよび（４）このような細胞が形質導入され、続いて導入遺伝子を発現するように、標的細胞への粒子の投与を可能にする。
【０１０２】
粒子は対象へインビボで直接投与されるか、または対象の細胞は取り出され、インビトロで粒子に感染され、対象の身体に戻される。
【０１０３】
本発明のパッケージングベクターおよび導入遺伝子ベクターは、複製能のないウイルスを生成する。本発明の所定のベクター系中への取り込みのために選択されるベクターは、パッケージングベクター（複数可）または導入遺伝子ベクターのさらなる変異なしに、（１または複数の）パッケージングベクター（複数可）および導入遺伝子ベクターの相同組換えのみによって、共形質移入された細胞が複製能を有するウイルスを生成することができないようなベクターである。本系で使用される外被タンパク質は、レトロウイルスの外被、合成若しくはキメラ外被またはレトロウイルスでない外被で覆われたウイルス（例えば、バキュロウイルス）からの外被であり得る。
パッケージングシグナル
【０１０４】
本明細書において使用される場合、「パッケージングシグナル」または「パッケージング配列」という用語は、ウイルスのキャプシドまたは粒子中へのウイルスＲＮＡまたはベクターＲＮＡの挿入のために必要とされる、または少なくともこれを促進するレトロウイルスのゲノムまたはベクター内に位置する配列を表す。ＲＮＡ中のパッケージングシグナルは、そのＲＮＡを、ビリオン中にパッケージングされるべきＲＮＡとして同定する。便宜上、「パッケージングシグナル」という用語は、機能的なパッケージングシグナルに転写されるベクターＤＮＡ配列を表すためにも使用される。ある特定のパッケージングシグナルは遺伝子の一部であり得るが、コードされるタンパク質のペプチド部分としてより、ＲＮＡの形態で認識される。
【０１０５】
パッケージングベクターと導入遺伝子ベクターとの重要な差異は、パッケージングベクター中において、主要なパッケージングシグナルは不活化されているのに対して、導入遺伝子ベクター中においては、主要なパッケージングシグナルは機能的であるということである。理想的には、パッケージングベクター中において、全てのパッケージングシグナルは不活化され、導入遺伝子ベクター中において、全てのパッケージングシグナルは機能的であるはずである。しかしながら、ウイルス力価を最大化することまたは相同組換えを阻害することなどの相殺検討事項（ｃｏｕｎｔｅｒｖａｉｌｉｎｇ  ｃｏｎｓｉｄｅｒａｔｉｏｎ）が、このような構築物をより望ましくないものとし得る。
パッケージング系；パッケージングベクター；パッケージング細胞株
【０１０６】
パッケージング系とは、適切なＲＮＡをキャプシドで包むことができるビリオンを産生し、ビリオンを産生する細胞からビリオンを輸送し、標的細胞にビリオンを伝達し、標的細胞内で、ＲＮＡを逆転写させ、前記ＲＮＡ中に取り込まれた導入遺伝子が発現できる様式で宿主ゲノム中に組み込ませるために必要とされる遺伝情報の全てを、発現可能な形態で集合的に提供する１つのベクターまたは複数のベクターである。しかしながら、パッケージング系は、それ自体を実質的にパッケージングできないものでなければならない。むしろ、パッケージング系は、別個の導入遺伝子ベクターをパッケージする。
【０１０７】
本発明において、パッケージングベクターは、ｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子の機能的等価物（「ＧＰ」ベクター）を提供する。ｅｎｖ遺伝子（複数可）は、エンベロープベクターによって提供される。理論的には、異なるｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を別個のベクター上に構築し、これらの相対的発現レベルが適切に調整できるように、これらを異なる制御可能なプロモーターに（または一方を制御可能なプロモーターに、他方を構成的プロモーターに）作動可能に連結することを望むのであれば、３ベクター系（「Ｇ」、「Ｐ」および「Ｅ」ベクター）が可能である。
【０１０８】
パッケージング細胞株は、達成可能な条件下で、ウイルス粒子を産生するパッケージング系によって形質移入される適切な宿主細胞である。本明細書において使用される場合、「パッケージング細胞株」という用語は、典型的には、ウイルスの構造タンパク質（例えば、ｇａｇ、ｐｏｌおよびｅｎｖ）を発現するが、パッケージングシグナルを含有しない細胞株を表すために使用される。例えば、細胞株は、そのゲノム内の１つの染色体部位に、機能的ｐｓｉ＋配列を欠く５’−ＬＴＲ−ｇａｇ−ｐｏｌ−３’−ＬＴＲ断片（Δ−ｐｓｉと表記される）と、同じく別の染色体部位に位置するΔ−ｐｓｉである５’−ＬＴＲ−ｅｎｖ−３’−ＬＴＲ断片とを有するように遺伝的に操作されている。これらのセグメントはともに構成的に転写されるが、ｐｓｉ＋領域が喪失しており、産生されるウイルスＲＮＡ分子が完全なサイズより小さいので、空のウイルス粒子が形成される。
【０１０９】
宿主細胞がパッケージングベクターのみによって形質移入されれば、完全長パッケージングベクターなしに実質的にウイルス粒子のみを産生する。１つの例では、パッケージング細胞によって産生されたウイルス粒子の１０％未満が、完全長のパッケージングベクター由来ＲＮＡを含有する。しかしながら、パッケージングベクターは機能的なプライマー結合部位を欠くので、これらの粒子は新しい細胞に感染したとしても、パッケージングベクターＲＮＡはＤＮＡに逆転写されず、したがって、新しい細胞はビリオンを産生しない。このため、単独では、パッケージングベクターは複製能のないウイルスである。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、パッケージング細胞および／または細胞株は導入遺伝子ベクターを含有する。パッケージング細胞株は、導入遺伝子ベクターを感染性粒子中にパッケージする。このような細胞株は、本明細書において、「トランスジェニックビリオン産生細胞株」と称される。
【０１１１】
パッケージングは誘導性であり得、非誘導性でもあり得ることが想定される。誘導性パッケージング細胞およびパッケージング細胞株において、レトロウイルス粒子は少なくとも１つの誘導因子に応答して産生される。非誘導性パッケージング細胞株およびパッケージング細胞において、レトロウイルス粒子産生が起きるためには、誘導因子は必要とされない。
【０１１２】
パッケージングベクターは、同族野生型ゲノムの少なくとも１つのパッケージングシグナルの不活化によって、複製能を有する野生型レトロウイルスゲノムと必ず異なる。１を超えるパッケージングシグナルが不活化され得る。一例において、パッケージングベクターによって提供されるレトロウイルス遺伝子のみが、構造タンパク質または不可欠な制御タンパク質をコードするレトロウイルス遺伝子である。
導入遺伝子ベクター
【０１１３】
導入遺伝子ベクターは、導入遺伝子ベクターがパッケージング細胞株中に形質移入された後、導入遺伝子ベクターがＲＮＡに転写され、このＲＮＡが感染性ウイルス粒子中にパッケージングされるように、目的の発現可能な非レトロウイルス遺伝子を有し、かつ少なくとも１つの機能的なレトロウイルスパッケージングシグナルを含む発現ベクターである。続いて、これらの粒子は標的細胞に感染し、そのＲＮＡはＤＮＡへ逆転写され、ＤＮＡはプロウイルスの要素として宿主細胞ゲノム中に取り込まれ、これにより、目的の遺伝子を標的細胞に伝達する。
【０１１４】
本明細書において使用される場合、「形質導入」という用語は、形質移入によってではなく、感染による、ウイルスまたはレトロウイルスベクターを使用した遺伝子の送達を表す。ある実施形態において、レトロウイルスベクターは形質導入される。このため、「形質導入された遺伝子」は、レトロウイルス感染またはベクター感染およびプロウイルス組み込みを介して細胞中に導入された遺伝子である。ある実施形態において、ウイルスベクター（例えば、「導入遺伝子ベクター」）は、遺伝子を「標的細胞」または宿主細胞中に形質導入する。本発明は、本発明での使用に適しており、いずれかの目的の遺伝子（または遺伝子の感染若しくは発現を示すために使用される「マーカー遺伝子」若しくは「レポーター遺伝子」）に連結されている導入遺伝子ベクターを包含する。
【０１１５】
本明細書において使用される場合、「長期形質導入」という用語は、他のベクターを用いて観察されるよりも長い期間、宿主細胞または標的細胞中に形質導入された状態で留まることができるベクターを表す。例えば、本発明は、少なくとも１２０日間、少なくとも１年間、または対象の生涯にわたってまたは処置の必要な期間、形質導入された状態で留まることができるレトロウイルスベクターを提供する。発現の期間は、ベクターの選択より、プロモーターの選択および標的細胞の種類の関数である。
【０１１６】
「安定な形質導入」または「安定に形質導入された」という用語は、形質導入された細胞のゲノム中への外来ＤＮＡの導入および組み込みを表す。「安定な形質導入体」という用語は、ゲノムＤＮＡ中に安定に組み込まれた外来ＤＮＡを有する細胞を表す。
【０１１７】
「一過性の形質導入」または「一過性に形質導入された」という用語は、形質導入された細胞のゲノム中に外来ＤＮＡが組み込まれていない、外来ＤＮＡの細胞中への導入を表す。外来ＤＮＡは、形質導入された細胞の核内に数日間存続する。この期間中、外来ＤＮＡは、染色体中の内在性遺伝子の発現を支配する制御的調節を受ける。「一過性形質導入体」という用語は、外来ＤＮＡを取り込んだが、このＤＮＡを組み込むことができなかった細胞を表す。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本発明の標的細胞および／または宿主細胞は、「非分裂」細胞である。これらの細胞には、通常分裂しない神経細胞などの細胞が含まれる。しかしながら、本発明は、非分裂細胞（筋肉細胞、白血球、脾臓細胞、肝細胞、眼細胞、上皮細胞を含むが、これらに限定されない。）に限定されることは意図されていない。
【０１１９】
いくつかの実施例において、ベクターおよびベクターの子孫は、少なくとも１０５ｃｆｕ／ｍｌのベクター力価を達成するために複数の標的細胞を形質導入することが可能である。感染多重度（ＭＯＩ）は、少なくとも１（すなわち、細胞当たり平均して１つ感染する）または少なくとも２でさえあり得る。
発現カセットおよびベクター
【０１２０】
本発明は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードする配列を含む発現カセットも提供する。
【０１２１】
ある実施形態において、発現カセットはプロモーターをさらに含有する。ある実施形態において、プロモーターは制御可能なプロモーターである。ある実施形態において、プロモーターは構成的プロモーターである。ある実施形態において、プロモーターはＰＧＫ、ＣＭＶ、ＲＳＶ、Ｈ１またはＵ６プロモーター（ＰｏｌＩＩおよびＰｏｌＩＩＩプロモーター）である。
【０１２２】
本発明は、上記発現カセットを含有するベクターを提供する。ある実施形態において、ベクターはウイルスベクターである。ある実施形態において、ウイルスベクターは、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、ポリオウイルス、ＨＳＶまたはマウスマロニー（Ｍａｌｏｎｅｙ）をベースとするウイルスベクターである。
【０１２３】
本明細書において使用される場合、「発現カセット」は、適切な宿主細胞中において特定のヌクレオチド配列の発現を誘導することが可能な核酸配列であって、終結シグナルへ作動可能に連結され得る目的のヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含み得る核酸配列を意味する。発現カセットは、ヌクレオチド配列の適切な翻訳のために必要とされる配列も含み得る。コード領域は、通常、目的のタンパク質をコードする。目的のヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであり得る。発現カセットは、天然に存在するが、異種発現のために有用な組換え形態で取得されたものでもあり得る。発現カセット中でのヌクレオチド配列の発現は、構成的プロモーターまたは宿主細胞が一部の特定の刺激に曝されたときのみに転写を開始する制御可能なプロモーターの調節下にあり得る。多細胞生物の場合には、プロモーターは、特定の組織若しくは器官または発達の段階に対して特異的とすることもできる。
【０１２４】
「作動可能に連結された」は、配列の１つの機能が別の配列によって影響を受けるように、単一の核酸断片上に複数の核酸配列が会合していることを表す。例えば、制御性ＤＮＡ配列がコードＤＮＡ配列の発現に影響を与えるように（すなわち、コード配列または機能的ＲＮＡがプロモーターの転写調節下にある）２つの配列が位置していれば、制御性ＤＮＡ配列が、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするＤＮＡ配列「に作動可能に連結されている」または「と会合している」と称される。コード配列は、センスまたはアンチセンス配向性で制御配列に作動可能に連結されることができる。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
【０１２５】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、パルボウイルス科の小さな非病原性ウイルスである。ＡＡＶは、複製のためにヘルパーウイルスに依存する点で、この科の他の一員と異なる。ヘルパーウイルスの非存在下では、ＡＡＶは、１９番染色体のｑアーム中に、遺伝子座特異的な様式で組み込まれ得る。ＡＡＶのおよそ５ｋｂのゲノムは、プラスまたはマイナスのいずれかの極性の一本鎖ＤＮＡの１つのセグメントからなる。ゲノムの末端は、ヘアピン構造に折り畳まれ、ウイルスＤＮＡ複製の起点としての役割を果たすことができる短い末端逆位配列である。物理的には、パルボウイルスビリオンは外被に包まれておらず、その正二十面体（ｉｃｏｓｏｈｅｄｒａｌ）のキャプシドは、直径およそ２０ｎｍである。
【０１２６】
現在まで、数多くの血清学的に異なるＡＡＶが同定されており、１２より多くがヒトまたは霊長類から単離されてきた。ＡＡＶ２のゲノムは、４６８０ヌクレオチドの長さであり、２つの読み枠（ＯＲＦ）を含有する。左のＯＲＦは、一本鎖の子孫ゲノムの産生に加えて、複製および転写の制御に関与している非構造的Ｒｅｐタンパク質、Ｒｅｐ４０、Ｒｅｐ５２、Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８をコードする。さらに、Ｒｅｐタンパク質のうち２つは、ヒト１９番染色体のｑアームの領域中へのＡＡＶゲノムの優先的な組み込みと関連付けられてきた。Ｒｅｐ６８／７８は、ＮＴＰ結合活性並びにＤＮＡおよびＲＮＡヘリカーゼ活性を有することも示されてきた。Ｒｅｐタンパク質は、核局在化シグナルの他、いくつかの潜在的リン酸化部位を有する。これらのキナーゼ部位の１つの変異は、複製活性の喪失をもたらした。
【０１２７】
ゲノムの末端は、ウイルスＤＮＡ複製の起点としての役割を果たすＴ形状のヘアピン構造に折り畳まれる潜在能力を有する短い末端逆位配列（ＩＴＲ）である。ＩＴＲ領域内には、ＩＴＲの機能にとって中心となる２つの要素、ＧＡＧＣリピートモチーフと末端分解部位（ｔｒｓ（ｔｅｒｍｉｎａｌ  ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ  ｓｉｔｅ））が記載されてきた。このリピートモチーフは、ＩＴＲが直鎖またはヘアピン立体構造のいずれかであるときに、Ｒｅｐを結合することが示されてきた。この結合は、ｔｒｓでの切断のためにＲｅｐ６８／７８を配置する役割を果たし、これは、部位特異的および鎖特異的様式で起こる。複製での役割に加えて、これらの２つの要素はウイルスの組み込みにおいて中心を成すようである。１９番染色体組み込み遺伝子座内に含有されているのは、隣接するｔｒｓを有するＲｅｐ結合部位である。これらの要素は機能的であり、遺伝子座特異的組み込みのために必要であることが示されている。
【０１２８】
ＡＡＶビリオンは、直径がおよそ２５ｎｍで、外被に包まれていない正２０面体粒子であり、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と称される３つの関連するタンパク質からなる。右のＯＲＦは、キャプシドタンパク質、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３をコードする。これらのタンパク質は、それぞれ１：１：１０の比で見出され、全て右側のＯＲＦに由来する。これらのキャプシドタンパク質は、選択的スプライシングおよび異常な開始コドンの使用によって互いに異なる。欠失解析は、選択的にスプライシングされたメッセージから翻訳されるＶＰ１の除去または改変は感染粒子の低下した産生量をもたらすことを示した。ＶＰ３コード領域内変異は、いずれの一本鎖子孫ＤＮＡまたは感染性粒子をも産生できなくする。ＡＡＶ粒子は、ＡＡＶキャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。ＡＡＶキャプシドポリペプチドは、完全なＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ポリペプチドをコードすることができる。粒子は、ＡＡＶ２と他のＡＡＶキャプシドタンパク質を含む粒子であり得る（すなわち、ＡＡＶ１とＡＡＶ２などのキメラタンパク質）。標準的な方法によって定型的に決定することができるように、得られたウイルス粒子が、ＡＡＶ２キャプシドを含み、ＡＡＶ１と抗原的にまたは免疫学的に異なった状態を保つ限り、本明細書では、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列中の変動が想定される。具体的には、例えば、ウイルス粒子が抗原的にまたは免疫学的にＡＡＶ１と異なるかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを使用することができる。さらに、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、好ましくは、ＡＡＶ１と異なる組織指向性を保持する。
【０１２９】
ＡＡＶ２粒子は、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。完全なＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３ポリペプチドをコードするＡＡＶ２キャプシドポリペプチドは、ＮＣ＿００１４０１に記載されているヌクレオチドに（ＡＡＶ２キャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列）よってコードされるアミノ酸配列を有するポリペプチドと、全体で、少なくとも約６３％の相同性（または同一性）を有することができる。キャプシドタンパク質は、ＮＣ＿００１４０１に記載されているヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質と約７０％の相同性、約７５％の相同性、８０％の相同性、８５％の相同性、９０％の相同性、９５％の相同性、９８％の相同性、９９％の相同性または１００％の相同性までも有することができる。キャプシドタンパク質は、ＮＣ＿００１４０１に記載されているヌクレオチド配列によってコードされたタンパク質と約７０％の同一性、約７５％の同一性、８０％の同一性、８５％の同一性、９０％の同一性、９５％の同一性、９８％の同一性、９９％の同一性または１００％の同一性までも有することができる。粒子は、別のＡＡＶとＡＡＶ２キャプシドタンパク質とを含む粒子、すなわち、キメラタンパク質であり得る。標準的な方法によって定型的に決定することができるように、ＡＡＶ２キャプシドを含む得られたウイルス粒子は、ＡＡＶ４と抗原的にまたは免疫学的に異なった状態を保つ限り、本明細書では、ＡＡＶ２キャプシドタンパク質のアミノ酸配列中の変動が想定される。具体的には、例えば、ウイルス粒子が抗原的にまたは免疫学的にＡＡＶ１と異なるかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを使用することができる。さらに、ＡＡＶ２ウイルス粒子は、本明細書の実施例中に例示されているものなどの、好ましくは、ＡＡＶ１と異なる組織指向性を保持するが、少なくとも１つのＡＡＶ２コートタンパク質を含むＡＡＶ２キメラ粒子は、ＡＡＶ２コートタンパク質のみからなるＡＡＶ２粒子とは異なる組織指向性を有し得る。
【０１３０】
ある実施形態において、本発明は、さらに、ＡＡＶ２末端逆位配列の対を含むベクターを含有する、すなわち、キャプシドに包むＡＡＶ２粒子を提供する。ＡＡＶ２  ＩＴＲのヌクレオチド配列は、本分野において既知である。さらに、粒子は、ＡＡＶ１とＡＡＶ２キャプシドタンパク質の両方を含む粒子、すなわち、キメラタンパク質であり得る。さらに、粒子は、他のＡＡＶ（例えば、ＡＡＶ１〜ＡＡＶ９およびＡＡＶｒｈ１０）からのＡＡＶ末端逆位配列の対を含むベクターをキャプシドに包む粒子であり得る。粒子中のキャプシドに包まれたベクターは、末端逆位配列間に挿入された外来性の核酸をさらに含むことができる。
【０１３１】
ＡＡＶの以下の特徴によって、ＡＡＶは遺伝子移入のための魅力的なベクターとなってきた。ＡＡＶベクターは、インビトロで細胞のゲノム中に安定に組み込まれること、幅広い宿主域を有すること、インビトロおよびインビボで分裂細胞および非分裂細胞の両方を形質導入すること、形質導入された遺伝子の高いレベルの発現を維持することが示されている。ウイルス粒子は熱安定性であり、溶媒、界面活性剤、ｐＨの変化、温度に対して耐性を有し、ＣｓＣｌ勾配上でまたは他の手段によって濃縮することができる。本発明は、ＡＡＶ粒子、組換えＡＡＶベクターおよび組換えＡＡＶビリオンを投与する方法を提供する。例えば、ＡＡＶ２粒子はＡＡＶ２キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子であり、またはＡＡＶ１粒子はＡＡＶ１キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。組換えＡＡＶ２ベクターは、ＡＡＶ２の少なくとも１つの特有の核酸を含む核酸構築物である。組換えＡＡＶ２ビリオンは、組換えＡＡＶ２ベクターを含有する粒子である。「ＡＡＶ２  ＩＴＲ」という用語内にあると考えられるためには、ヌクレオチド配列は、ＡＡＶ２  ＩＴＲをＡＡＶ１  ＩＴＲと区別する、ここに記載されている一方または両方の特徴を保持しなければならない。（１）（ＡＡＶ１中での４つではなく）３つの「ＧＡＧＣ」リピートおよび（２）ＡＡＶ２  ＩＴＲ  Ｒｅｐ結合部位において、最初の２つの「ＧＡＧＣ」リピート中の４番目のヌクレオチドがＴではなくＣである。
【０１３２】
送達されるべきｔＲＮＡをコードする配列の発現を誘導するためのプロモーターは、プロモーターに機能的に連結された核酸の発現のレベルおよびベクターがその中で使用されるべき細胞の種類など、既知の検討事項によって選択されるあらゆる所望のプロモーターであり得る。プロモーターは、外来性または内在性プロモーターであり得る。プロモーターには、例えば、ＳＶ４０または誘導性メタロチオネインプロモーター、またはＡＡＶｐ５プロモーターなどのＡＡＶプロモーターなどの既知の強力なプロモーターが含まれ得る。プロモーターのさらなる例には、アクチン遺伝子、免疫グロブリン遺伝子、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス、アデノウイルスの主要後期プロモーターなどのアデノウイルスのプロモーター、誘導性熱ショックプロモーター、呼吸器多核体ウイルス、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）などに由来するプロモーターが含まれる。さらなる例には、制御されたプロモーターが含まれる。
【０１３３】
ＡＡＶベクターは、プロモーターに機能的に連結された外来性（異種の）核酸をさらに含むことができる。「異種の核酸」によって、細胞、組織または生物中への移入のために、あらゆる異種または外来性の核酸がベクター中に挿入されることができることが意味される。核酸は、例えば、ｔＲＮＡをコードすることができる。「機能的に連結された」によって、異種の核酸に対するプロモーターの適切な方向性など、本分野において既知であるように、プロモーターが異種の核酸の発現を促進することができることを意味する。さらに、異種の核酸は、好ましくは、本分野において既知であるとおり、機能的にコードするために、すなわち、核酸が発現されることを可能にするために核酸の発現のための全ての適切な配列を有する。核酸は、例えば、エンハンサーなどの発現調節配列を含むことができる。核酸は、パッケージされることができる核酸のサイズによってのみ限定される、１を超える遺伝子産物をコードすることができる。
【０１３４】
ＡＡＶ１粒子は、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質を含むウイルス粒子である。標準的な方法によって定型的に決定することができるように、ＡＡＶ１キャプシドを含む得られたウイルス粒子は、他のＡＡＶキャプシドと抗原的にまたは免疫学的に異なった状態を保つ限り、本明細書では、ＡＡＶ１キャプシドタンパク質のアミノ酸配列中の変動が想定される。具体的には、例えば、ウイルス粒子が抗原的にまたは免疫学的に他のＡＡＶ血清型と異なるかどうかを決定するために、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロットを使用することができる。
【０１３５】
本明細書において使用される場合、「ポリペプチド」という用語は、アミノ酸のポリマーを表し、完全長のタンパク質およびその断片を含む。このため、「タンパク質」および「ポリペプチド」は、しばしば、本明細書において互換的に使用される。
【０１３６】
本方法は、ＡＡＶ末端逆位配列の対の間に挿入された核酸を含むベクターを含有するＡＡＶ粒子を細胞に投与すること、これにより、細胞に該核酸を送達することを含む、核酸を細胞に送達する方法を提供する。細胞への投与は、組織培養培地または緩衝化食塩溶液などの所望の液体中に必要に応じて含有された粒子を細胞と単に接触させることを含むあらゆる手段によって実現することができる。粒子は、あらゆる所望の長さの時間、細胞と接触させ続けることが可能であり、典型的には、粒子は投与され、無限に留まらせる。このようなインビトロ法のために、ウイルスは、本分野において知られているおよび本明細書に例示されているような、標準的なウイルス形質導入法によって細胞に投与することができる。投与すべきウイルスの力価は、特に細胞の種類に応じて変動し得るが、一般にＡＡＶ形質導入のために使用される力価が典型的である。さらに、本実施例において特定の細胞を形質導入するために使用された力価を使用することができる。細胞には、ヒト並びに霊長類、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタおよびイヌなどの他の大型の（非げっ歯類）哺乳動物中のあらゆる所望の細胞が含まれ得る。
【０１３７】
本発明は、さらに、ＡＡＶ末端逆位配列の対の間に挿入された核酸を含むＡＡＶ粒子を対象に投与すること、これにより、対象中の細胞に核酸を送達することを含む、核酸を対象中の細胞に送達する方法を提供する。
【０１３８】
本開示のある実施形態は、本明細書に記載されているとおりのウイルスベクターを含む細胞を提供する。
ＡＡＶベクター
【０１３９】
一実施形態において、本開示のウイルスベクターはＡＡＶベクターである。「ＡＡＶ」ベクターは、アデノ随伴ウイルスを表し、天然に存在する野生型ウイルス自体またはその誘導体を表すために使用され得る。本用語は、別段の必要がある場合を除き、全てのサブタイプ、血清型および偽型を包含し、天然に存在する形態と組換え形態の両方を包含する。本明細書において使用される場合、「血清型」という用語は、規定された抗血清とのキャプシドタンパク質の反応性に基づいて、それによって同定され、他のＡＡＶと区別されるＡＡＶを表し、例えば、霊長類ＡＡＶの８つの既知の血清型、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−９およびＡＡＶｒｈ１０が存在する。例えば、血清型ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子からコードされるキャプシドタンパク質並びに同じＡＡＶ２血清型からの５’および３’ＩＴＲ配列を含有するゲノムを含有するＡＡＶを表すために使用される。本明細書において使用される場合、例えば、ｒＡＡＶ１は、同一の血清型に由来するキャプシドタンパク質および５’−３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを表すために使用され得、またはｒＡＡＶ１は、ある血清型由来のキャプシドタンパク質および異なるＡＡＶ血清型由来の５’−３’ＩＴＲを有する、例えば、ＡＡＶ血清型２由来のキャプシドおよびＡＡＶ血清型５由来のＩＴＲを有するＡＡＶを表し得る。本明細書に例示されている各例について、ベクターの設計および作製の説明は、キャプシドと５’−３’ＩＴＲ配列の血清型を記載する。略号「ｒＡＡＶ」は、組換えアデノ随伴ウイルスを表し、組換えＡＡＶベクター（または「ｒＡＡＶベクター」）とも称される。
【０１４０】
「ＡＡＶウイルス」または「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質の全てによって）およびキャプシドに包まれたポリヌクレオチドから構成されるウイルス粒子を表す。粒子が異種のポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達されるべき導入遺伝子などの野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含む場合、通例、「ｒＡＡＶ」と表される。
【０１４１】
一実施形態において、ＡＡＶ発現ベクターは、転写、転写開始領域を含む調節要素、目的のＤＮＡおよび転写終結領域の方向に作動可能に連結された成分として少なくとも提供するために、既知の技術を用いて構築される。調節要素は、哺乳動物細胞中で機能的であるように選択される。作動可能に連結された成分を含有する得られた構築物は、機能的なＡＡＶ  ＩＴＲ配列と隣接する（５’および３’）。
【０１４２】
「アデノ随伴ウイルス末端逆位配列」または「ＡＡＶ  ＩＴＲ」によって、ＡＡＶゲノムの各末端に見出され、ＤＮＡ複製の起点としておよびウイルスのためのパッケージングシグナルとしてシスで一緒に機能する本分野で認知された領域を意味する。ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域と共に、哺乳動物細胞ゲノムからの効率的な切除および救出、並びに２つの隣接するＩＴＲ間に介在するヌクレオチド配列の哺乳動物細胞ゲノム中への組み込みを与える。
【０１４３】
ＡＡＶ  ＩＴＲ領域のヌクレオチド配列は既知である。本明細書において使用される場合、「ＡＡＶ  ＩＴＲ」は、示された野生型ヌクレオチド配列を有する必要はなく、例えば、ヌクレオチドの挿入、欠失または置換によって改変され得る。さらに、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などを含むがこれらに限定されないいくつかのＡＡＶ血清型の何れにも由来し得る。さらに、ＡＡＶベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、所期のとおりに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切除および救出を可能にするために、並びにＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在するときに、レシピエント細胞ゲノム中への異種の配列の組み込みを可能とするために、必ずしも同一である必要はなく、同一のＡＡＶ血清型若しくは分離株に由来する必要もない。
【０１４４】
一実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ７などを含むがこれらに限定されないいくつかのＡＡＶ血清型の何れにも由来することができる。さらに、ＡＡＶ発現ベクター中の選択されたヌクレオチド配列に隣接する５’および３’ＩＴＲは、所期のとおりに機能する限り、すなわち、宿主細胞ゲノムまたはベクターからの目的の配列の切除および救出を可能にするために、並びにＡＡＶ  Ｒｅｐ遺伝子産物が細胞中に存在するときに、レシピエント細胞ゲノム中へのＤＮＡ分子の組み込みを可能とするために、必ずしも同一である必要はなく、同一のＡＡＶ血清型若しくは分離株に由来する必要もない。
【０１４５】
一実施形態において、ＡＡＶキャプシドはＡＡＶ２に由来することができる。ＡＡＶベクター中で使用するための適切なＤＮＡ分子は、約５キロ塩基（ｋｂ）未満、約４．５ｋｂ未満、約４ｋｂ未満、約３．５ｋｂ未満、約３ｋｂ未満、約２．５ｋｂ未満のサイズであり、本分野において既知である。
【０１４６】
一実施形態において、選択されたヌクレオチド配列は、インビボで対象中において、その転写または発現を誘導する調節要素へ作動可能に連結される。このような調節要素は、選択された遺伝子に通常は付随する調節配列を含むことができる。または、異種の調節配列を利用することもできる。有用な異種の調節配列には、一般に、哺乳動物またはウイルスの遺伝子をコードする配列に由来するものが含まれる。例には、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳腺腫瘍ウイルスＬＴＲプロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター（Ａｄ  ＭＬＰ）；単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）プロモーター、ＣＭＶ最初期プロモーター領域（ＣＭＶＩＥ）などのサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター、ｐｏｌ  ＩＩプロモーター、ｐｏｌＩＩＩプロモーター、合成プロモーター、ハイブリッドプロモーターなどが含まれるが、これらに限定されない。さらに、マウスメタロチオネイン遺伝子などの非ウイルス遺伝子に由来する配列も、本発明において使用できる。このようなプロモーター配列は、例えば、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）から市販されている。
【０１４７】
一実施形態において、組織特異的および誘導性プロモーター、エンハンサーなど、異種のプロモーターと他の調節要素の両方が特に役立つ。異種のプロモーターの例には、ＣＭＶプロモーターが含まれる。誘導性プロモーターの例には、エクジソン、テトラサイクリン、低酸素およびオーフィン（ａｕｆｉｎ）に対するＤＮＡ応答配列（ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ  ｅｌｅｍｅｎｔ）が含まれる。
【０１４８】
一実施形態において、ＡＡＶ  ＩＴＲが境を接する目的のＤＮＡ分子を保有するＡＡＶ発現ベクターは、主要なＡＡＶ読み枠（「ＯＲＦ」）がそこから切り出されたＡＡＶゲノム中に選択された配列を直接挿入することによって構築することができる。ＩＴＲの十分な部分が複製およびパッケージング機能をなお可能にする限り、ＡＡＶゲノムの他の部分も除去することができる。このような構築物は、本分野で周知の技術を用いて設計することができる。
【０１４９】
または、ＡＡＶ  ＩＴＲは、ウイルスのゲノムからまたはＡＡＶ  ＩＴＲを含有するＡＡＶベクターから切り出し、標準的なライゲーション技術を用いて、別のベクター中に存在する選択された核酸構築物の５’および３’を融合することができる。例えば、ライゲーションは、２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−Ｃｌ  ｐＨ７．５、１０ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１０ｍＭ  ＤＴＴ、３３μｇ／ｍＬ  ＢＳＡ、１０ｍＭ〜５０ｍＭ  ＮａＣｌおよび４０μＭ  ＡＴＰ、０．０１〜０．０２（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、０℃（「粘着末端」ライゲーションのため）または１ｍＭ  ＡＴＰ、０．３〜０．６（Ｗｅｉｓｓ）単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼ、１４℃（「平滑末端」ライゲーションのため）のいずれかの中で達成することができる。分子間「粘着末端」ライゲーションは、３０〜１００μｇ／ｍＬの全ＤＮＡ濃度（５〜１００ｎＭの総最終濃度）で通常行われる。ＩＴＲを含有するＡＡＶベクター。
【０１５０】
さらに、キメラ遺伝子は、１またはそれを超える選択された核酸配列の５’および３’に配置されたＡＡＶ  ＩＴＲ配列を含むように、合成的に産生され得る。完全なキメラ配列は、標準的な方法によって調製された重複するオリゴヌクレオチドから組み立てられる。
【０１５１】
ｒＡＡＶビリオンを産生するために、ＡＡＶ発現ベクターは、公知の技術を使用して、例えば形質移入によって、適切な宿主細胞中に導入される。多数の形質移入技術が、本分野において一般に知られている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ  ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。特に適切な形質移入法には、リン酸カルシウム共沈殿、培養細胞中への直接的マイクロインジェクション、電気穿孔、リポソーム媒介性遺伝子移入、脂質媒介性形質導入、および高速度微粒子射出（ｈｉｇｈ−ｖｅｌｏｃｉｔｙ  ｍｉｃｒｏｐｒｏｊｅｃｔｉｌｅｓ）を使用する核酸送達が含まれる。
【０１５２】
一実施形態において、ｒＡＡＶビリオンを産生するための適切な宿主細胞には、異種ＤＮＡ分子のレシピエントとして使用され得るまたは使用されてきた、微生物、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が含まれる。本用語は、形質移入された元の細胞の子孫を含む。したがって、「宿主細胞」とは、本明細書で使用する場合、外来性ＤＮＡ配列で形質移入された細胞を一般に指す。安定なヒト細胞株、２９３（例えば、受託番号ＡＴＣＣ  ＣＲＬ１５７３の下で米国培養細胞系統保存機関から容易に入手可能）由来の細胞が、本開示の実施において使用され得る。特に、ヒト細胞株２９３は、アデノウイルス５型ＤＮＡ断片で形質転換されたヒト胎児由来腎臓細胞株であり、アデノウイルスＥ１ａおよびＥ１ｂ遺伝子を発現する。２９３細胞株は、容易に形質移入され、その中でｒＡＡＶビリオンを産生するための特に便利なプラットホームを提供する。
【０１５３】
「ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域」とは、複製タンパク質Ｒｅｐ７８、Ｒｅｐ６８、Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０をコードする、ＡＡＶゲノムの、当技術分野で認識された領域を意味する。これらのＲｅｐ発現産物は、ＤＮＡ複製のＡＡＶ起点の認識、結合およびニック形成、ＤＮＡヘリカーゼ活性、ならびにＡＡＶ（または他の異種）プロモーターからの転写のモジュレーションを含む、多くの機能を有することが示されている。Ｒｅｐ発現産物は、ＡＡＶゲノムを複製するために集合的に必要とされる。ＡＡＶ  ｒｅｐコード領域の適切な相同体には、同じくＡＡＶ‐２  ＤＮＡ複製を媒介することが知られているヒトヘルペスウイルス６（ＨＨＶ‐６）ｒｅｐ遺伝子が含まれる。
【０１５４】
「ＡＡＶ  ｃａｐコード領域」とは、キャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３、またはそれらの機能的相同体をコードする、ＡＡＶゲノムの、当技術分野で認識された領域を意味する。これらのＣａｐ発現産物は、ウイルスゲノムをパッケージングするために集合的に必要とされるパッケージング機能を供給する。
【０１５５】
一実施形態では、ＡＡＶヘルパー機能は、ＡＡＶ発現ベクターの形質移入の前にまたはそれと併せて、ＡＡＶヘルパー構築物で宿主細胞を形質移入することによって、宿主細胞中に導入される。したがって、ＡＡＶヘルパー構築物は、生産的なＡＡＶ感染に必要な喪失したＡＡＶ機能を補完するために、ＡＡＶ  ｒｅｐおよび／またはｃａｐ遺伝子の少なくとも一過性の発現を提供するために使用される。ＡＡＶヘルパー構築物は、ＡＡＶ  ＩＴＲを欠き、それ自体では複製もパッケージングもできない。これらの構築物は、プラスミド、ファージ、トランスポゾン、コスミド、ウイルスまたはビリオンの形態であり得る。ＲｅｐおよびＣａｐの両方の発現産物をコードする一般的に使用されるプラスミドｐＡＡＶ／ＡｄおよびｐＩＭ２９＋４５などの、多数のＡＡＶヘルパー構築物が記載されている。Ｒｅｐおよび／またはＣａｐ発現産物をコードする多数の他のベクターが記載されている。
【０１５６】
ウイルスベクターの送達の方法には、ＡＡＶを対象中に注射することが含まれる。一般に、ｒＡＡＶビリオンは、インビボまたはインビトロのいずれかの形質導入技術を使用して、細胞中に導入され得る。インビトロで形質導入される場合、所望のレシピエント細胞が、対象から取り出され、ｒＡＡＶビリオンで形質導入され、対象中に再導入される。または、同系間または異種間細胞が使用され得、これらの細胞は、対象中で不適切な免疫応答を生じない。
【０１５７】
対象中への形質導入された細胞の送達および導入のための適切な方法は、記載されている。例えば、例えば適切な培地中で組換えＡＡＶビリオンを細胞と組み合わせることによって、細胞はインビトロで形質導入することができ、目的のＤＮＡを保有する細胞についてのスクリーニングは、従来の技術、例えば、サザンブロットおよび／もしくはＰＣＲを使用して、または選択可能なマーカーを使用することによって、スクリーニングされ得る。次いで、形質導入された細胞は、以下でさらに完全に記載される薬学的組成物へと製剤化され得、この組成物は、様々な技術によって、例えば、移植、筋肉内、静脈内、皮下および腹腔内注射によって、対象中に導入され得る。
【０１５８】
一実施形態において、薬学的組成物は、目的の核酸の治療的有効量、すなわち、問題の疾患状態の症候を低減もしくは軽減させるのに十分な量、または所望の利益を付与するのに十分な量を産生するのに十分な遺伝子材料を含む。薬学的組成物は、薬学的に許容され得る賦形剤も含有する。このような賦形剤には、組成物を受けている個体にとって害になる抗体の産生をそれ自体は誘導せず、過度の毒性なしに投与され得る、任意の医薬剤（ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  ａｇｅｎｔ）が含まれる。薬学的に許容され得る賦形剤には、ソルビトール、Ｔｗｅｅｎ８０、ならびに液体、例えば、水、食塩水、グリセロールおよびエタノールが含まれるがこれらに限定されない。その中で、薬学的に許容され得る塩には、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；および有機酸の塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などが含まれ得る。さらに、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝物質などが、かかるビヒクル中に存在し得る。薬学的に許容され得る賦形剤の詳細な論述は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｍａｃｋ  Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１年）において入手可能である。
【０１５９】
１を超える導入遺伝子が、送達されたウイルスベクターによって発現され得ることを理解すべきである。または、各々１またはそれを超える異なる導入遺伝子を発現する別個のベクターも、本明細書に記載されるように対象に送達され得る。さらに、本開示の方法によって送達されるウイルスベクターは、他の適切な組成物および治療と組み合わされることも意図される。
【０１６０】
本明細書の教示に照らせば当業者に明らかなように、添加されなければならないウイルスベクターの有効量は、実験的に決定され得る。投与は、１つの用量で、処置の過程を通じて持続的にまたは間欠的に実施され得る。投与の最も有効な手段および投薬量を決定する方法は、当業者に周知であり、ウイルスベクター、治療の組成物、標的細胞および処置されている対象によって変動する。処置を行う医師によって選択される用量レベルおよびパターンで、単回および複数回の投与が実施され得る。
【０１６１】
ある実施形態において、ｒＡＡＶは、約０．３〜２ｍＬの１×１０５〜１×１０１６ｖｇ／ｍＬの用量で投与される。ある実施形態において、ｒＡＡＶは、約１〜３ｍＬの１×１０７〜１×１０１４ｖｇ／ｍＬの用量で投与される。ある実施形態において、ｒＡＡＶは、約１〜２ｍＬの１×１０８〜１×１０１３ｖｇ／ｍＬの用量で投与される。
【０１６２】
ｒＡＡＶ粒子を含有する製剤は、ビヒクル中に有効量のｒＡＡＶ粒子を含有し、有効量は、当業者によって容易に決定される。ｒＡＡＶ粒子は、典型的には、組成物の約１％〜約９５％（ｗ／ｗ）の、または、適宜、より高いもしくはより低い範囲であり得る。投与すべき量は、処置が考慮される動物またはヒト対象の齢、体重および身体的状態などの要因に依存する。有効な投薬量は、用量応答曲線を確立する定型的な試験を通じて、当業者によって確立され得る。対象は、１またはそれを超える用量でのｒＡＡＶ粒子の投与によって処置される。十分な酵素活性を維持することが必要とされる場合、複数の用量が投与され得る。
【０１６３】
水、水性食塩水、人工ＣＳＦまたは他の既知の物質を含むビヒクルが、本発明で使用され得る。製剤を調製するために、精製された組成物は、単離、凍結乾燥および安定化され得る。次いで、この組成物は、必要に応じて抗炎症剤と組み合わせて、適切な濃度に調整され得、使用のためにパッケージングされ得る。
【０１６４】
本発明は、タンパク質、または上記タンパク質をコードする核酸分子を、細胞における標的タンパク質のレベルを増加させるのに十分な量で細胞中に導入することによって、細胞における標的タンパク質のレベルを増加させる方法を提供する。ある実施形態において、標的タンパク質の蓄積は、少なくとも１０％増加される。標的タンパク質の蓄積は、少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％増加される。３９
治療剤をコードする核酸
【０１６５】
「核酸」という用語は、糖、ホスフェートおよびプリンまたはピリミジンのいずれかである塩基を含有する単量体（ヌクレオチド）から構成される、一本鎖または二本鎖形態のいずれかのデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドおよびこれらのポリマーを表す。特に限定されていなければ、本用語は、参照核酸と類似の結合特性を有し、および天然に存在するヌクレオチドに類似する様式で代謝される天然のヌクレオチドの既知の類縁体を含有する核酸を包含する。
【０１６６】
「核酸断片」は、与えられた核酸分子の一部である。ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、標準的なパラメータを用いる記載されたアラインメントプログラムの１つを用いて参照配列と比較して、あるポリヌクレオチドが、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％もしくは７９％または少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％もしくは８９％または少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％もしくは９４％または少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含むことを意味する。
遺伝子材料を細胞中に導入するための方法
【０１６７】
外来性遺伝子材料（例えば、１またはそれを超える治療用ＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードするＤＮＡ）は、遺伝子改変細胞を提供するために、形質移入または形質導入などの遺伝子移入法によって、インビボで細胞中に導入される。様々な発現ベクター（すなわち、標的細胞中への外来性遺伝子材料の送達を容易にするためのビヒクル）は当業者に既知である。
【０１６８】
本明細書において使用される場合、「細胞の形質移入」は、加えられたＤＮＡの取り込みによる、新たな遺伝子材料の細胞による獲得を表す。このため、形質移入は、物理的なまたは化学的な方法を用いた、細胞中への核酸の挿入を表す。リン酸カルシウムＤＮＡ共沈；ＤＥＡＥ−デキストラン；電気穿孔；陽イオンリポソーム媒介性形質移入およびタングステン粒子で促進される微粒子銃など、いくつかの形質移入技術が当業者に知られている。リン酸ストロンチウムＤＮＡ共沈は、別の可能な形質移入法である。
【０１６９】
これに対して、「細胞の形質導入」は、ＤＮＡまたはＲＮＡウイルスを用いて、細胞中に核酸を移入する方法を表す。細胞中に核酸を移入するためのＲＮＡウイルス（すなわち、レトロウイルス）は、本明細書では、形質導入キメラレトロウイルスと称される。レトロウイルス内に含有される外来性遺伝子材料は、形質導入された細胞のゲノム中に取り込まれる。キメラＤＮＡウイルス（例えば、治療剤をコードするｃＤＮＡを有するアデノウイルス）で形質導入された細胞は、そのゲノム中に取り込まれた外来性遺伝子材料を有しないが、細胞内の染色体外に保持されている外来性遺伝子材料を発現することができる。
【０１７０】
典型的には、外来性遺伝子材料は、プロモーターとともに、新しい遺伝子の転写を調節するための（通常、治療用タンパク質をコードするエキソンを含むｃＤＮＡの形態で）異種の遺伝子を含む。プロモーターは、転写を開始するために必要な特異的ヌクレオチド配列を特徴的に有する。必要に応じて、外来性遺伝子材料は、所望の遺伝子転写活性を得るために必要とされる追加の配列（すなわち、エンハンサー）をさらに含む。この論述において、「エンハンサー」とは、単純に、プロモーターによって決定される基礎転写レベルを変化させるために、コード配列（シスに位置する）と隣接して働くあらゆる翻訳されないＤＮＡ配列である。外来性遺伝子材料は、プロモーターおよびコード配列が作用的に連結されて、コード配列の転写を許容するように、プロモーターのすぐ下流に、細胞ゲノム中に導入され得る。レトロウイルス発現ベクターは、挿入された外来性遺伝子の転写を調節するために外来性プロモーター要素を含み得る。このような外来性プロモーターには、構成的プロモーターと誘導性プロモーターの両方が含まれる。
【０１７１】
天然に存在する構成的プロモーターは、不可欠な細胞機能の発現を調節する。その結果、構成的プロモーターの調節下にある遺伝子は、細胞成長のあらゆる条件下で発現される。例示的な構成的プロモーターには、ある特定の構成的または「ハウスキーピング」機能をコードする以下の遺伝子：ヒポキサンチンホスホリボシル転移酵素（ＨＰＲＴ）、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）、アデノシンデアミナーゼ、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルピン酸キナーゼ、ホスホグリセロールムターゼ、に対するプロモーター、アクチンプロモーターおよび当業者に既知のその他の構成的プロモーターが含まれる。さらに、多くのウイルスプロモーターは真核細胞中で構成的に機能する。これらには、とりわけ、ＳＶ４０の初期および後期プロモーター；モロニー白血病ウイルスの長い末端反復配列（ＬＴＲ）およびその他のレトロウイルス；並びに単純ヘルペスウイルスのチミジンキナーゼプロモーターが含まれる。したがって、上に引用されている構成的プロモーターのいずれもが、異種の遺伝子挿入物の転写を調節するために使用することができる。
【０１７２】
誘導性プロモーターの調節下にある遺伝子は、誘導因子の存在下でのみまたは誘導因子の存在下でより多く発現される（例えば、メタロチオネインプロモーターの調節下での転写は、ある特定の金属イオンの存在下で大幅に増加される）。誘導性プロモーターには、その誘導因子が結合したときに転写を刺激する応答配列（ＲＥ）が含まれる。例えば、血清因子、ステロイドホルモン、レチノイン酸および環状ＡＭＰに対するＲＥが存在する。誘導性応答を得るために、特定のＲＥを含有するプロモーターを選択することができ、いくつかの事例では、ＲＥ自体を異なるプロモーターに結合させ、これにより、組換え遺伝子に誘導性を付与し得る。このように、適切なプロモーター（構成的対誘導性：強い対弱い）を選択することによって、遺伝子改変された細胞中での治療剤の発現の存在およびレベルの両方を調節することが可能である。治療剤をコードする遺伝子が誘導性プロモーターの調節下にあれば、治療剤の転写を許容するための条件に原位置で（ｉｎ  ｓｉｔｕ）遺伝子改変細胞を曝露することによって、例えば、治療剤の転写を調節する誘導性プロモーターの特異的誘導因子の腹腔内注射によって、原位置での治療剤の送達が誘発される。例えば、メタロチオネインプロモーターの調節下にある遺伝子によってコードされる治療剤の、遺伝子改変細胞による原位置での発現は、遺伝子改変細胞を、適切な（すなわち、誘導する）金属イオンを含有する溶液と原位置で接触させることによって増強される。
【０１７３】
したがって、原位置で送達される治療剤の量は、以下のような要因を調節することによって制御される。（１）挿入された遺伝子の転写を誘導するために使用されるプロモーターの性質（すなわち、プロモーターが構成的であるかまたは誘導性であるか、強力であるかまたは弱いか）；（２）細胞中に挿入される外来性遺伝子のコピーの数；（３）患者に投与される（例えば、移植される）形質導入された／形質移入された細胞の数；（４）移植組織（例えば、移植片または封入された発現系）のサイズ；（５）移植組織の数；（６）形質導入された／形質移入された細胞または移植組織が留置される時間の長さ；および（７）遺伝子改変細胞による治療剤の産生速度。治療的有効用量の特定の治療剤を送達するためのこれらの要因の選択および最適化は、上に開示した要因および患者の臨床的プロファイルを考慮に入れて、過度な実験をすることなしに、当業者の技術の範疇にあると見なされる。
【０１７４】
少なくとも１つのプロモーターおよび治療剤をコードする少なくとも１つの異種の核酸に加えて、発現ベクターは、発現ベクターが形質移入または形質導入された細胞の選択を容易にするために、選択遺伝子、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子を含み得る。また、細胞は、２またはそれを超える発現ベクターで形質移入され、少なくとも１つのベクターは治療剤をコードする遺伝子を含有し、他方のベクターは選択遺伝子を含有する。適切なプロモーター、エンハンサー、選択遺伝子および／またはシグナル配列（以下に記載されている）の選択は、過度な実験をすることなしに、当業者の技術の範疇にあるとみなされる。
疾患状態および処置の方法
【０１７５】
本発明は、一実施形態において、本発明の合成オリゴヌクレオチドサプレッサーｔＲＮＡの導入を通じて、ナンセンス変異と関連する存在する変異の効果を逆転させることによって嚢胞性線維症を処置するための組成物および方法を含む。
【０１７６】
本開示のある実施形態は、本明細書に記載されている治療剤（例えば、修飾されたおよび／または安定化されたＡＣＥ−ｔＲＮＡ）をコードするタンパク質またはベクターを哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物における疾患を処置する方法を提供する。ある実施形態において、哺乳動物はヒトである。
【０１７７】
本開示のある実施形態は、哺乳動物における疾患を処置するのに有用な医薬を調製するための、治療剤または本明細書に記載されている治療剤をコードするベクターの使用を提供する。ある実施形態において、疾患は嚢胞性線維症である。
【０１７８】
本開示は、本明細書に記載されているベクターを含有する哺乳動物細胞も提供する。細胞はヒトの細胞であり得る。
【０１７９】
本開示のある態様は、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、ベクターおよび遺伝子操作された細胞（インビボで改変された）並びにこれらの使用に関する。特に、本開示は、治療的有効用量の治療剤の両全身送達が可能な遺伝子治療の方法に関する。
【０１８０】
一態様によれば、哺乳動物のレシピエント中で治療剤を発現するための細胞発現系が提供される。発現系（本明細書では、「遺伝子改変細胞」とも称される。）は、細胞および治療剤を発現するための発現ベクターを含む。発現ベクターには、ウイルス、プラスミドおよび異種の遺伝子材料を細胞に送達するための他のビヒクルが含まれるが、これらに限定されない。したがって、本明細書において使用される場合、「発現ベクター」という用語は、異種の遺伝子材料を細胞に送達するためのビヒクルを表す。特に、発現ベクターは、組換えアデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、またはレンチウイルスまたはレトロウイルスベクターである。
【０１８１】
発現ベクターは、異種の遺伝子の転写を調節するためのプロモーターをさらに含む。プロモーターは、（本明細書に記載されている）誘導性プロモーターであり得る。発現系は、哺乳動物のレシピエントへの投与に適している。発現系は、各細胞が少なくとも１つの治療剤をコードする少なくとも１つの組換え遺伝子を含有する複数の不死化されていない遺伝子改変細胞を含み得る。
【０１８２】
細胞発現系は、インビボで形成される。さらに別の態様によれば、インビボで哺乳動物のレシピエントを処置するための方法が提供される。この方法は、例えば、静脈内投与を介して、原位置で患者の細胞中に、異種の遺伝子産物を発現するための発現ベクターを導入することを含む。インビボで発現系を形成するために、治療剤を発現するための発現ベクターは、静脈内投与で、哺乳動物のレシピエント中にインビボで導入される。
【０１８３】
さらに別の態様によれば、インビボで哺乳動物のレシピエントを処置するための方法が提供される。この方法は、インビボで、標的治療剤を患者中に導入することを含む。
【０１８４】
異種の遺伝子を発現するための発現ベクターは、異種の遺伝子産物の転写を調節するための誘導性プロモーターを含み得る。したがって、原位置での治療剤の送達は、異種の遺伝子の転写を誘導する条件に、原位置で細胞を曝露することによって調節される。
【０１８５】
本開示は、発現ベクターを細胞または患者に投与することによって、哺乳動物における疾患を処置する方法を提供する。遺伝子治療法については、分子生物学および遺伝子治療の当業者は、過度な実験なしに、本開示の新規方法において使用される発現ベクターの適切な投与量および投与の経路を決定することができるはずである。
【０１８６】
一実施形態によれば、細胞は形質転換されるか、またはその他インビボで遺伝子改変される。哺乳動物のレシピエントから得た細胞は、治療剤をコードする異種の（例えば、組換え）遺伝子を発現するための外来性遺伝子材料を含有するベクターで、インビボにおいて形質転換され（すなわち、形質導入されまたは形質移入され）、治療剤は原位置に送達される。
【０１８７】
本明細書において使用される場合、「外来性遺伝子材料」は、細胞中に天然に見出されない、または細胞中に天然に見出される場合には、細胞によって生物学的に有意なレベルで転写または発現されない、天然または合成のいずれかの核酸またはオリゴヌクレオチドを表す。このため、「外来性遺伝子材料」は、例えば、ｔＲＮＡに転写されることができる天然に存在しない核酸を含む。
【０１８８】
遺伝子治療に好適な、上で開示されている治療剤および条件は単なる例示であり、本開示の範囲を限定することを意図するものではない。既知の状態を処置するための適切な治療剤の選択は、過度な実験をすることなしに、当業者の技術の範疇にあるとみなされる。
【０１８９】
ある実施形態において、この治療は、嚢胞性線維症、筋ジストロフィー、β−サラセミアおよびリドル症候群を含むがこれらに限定されない未成熟終結コドン（ＰＴＣ）によって引き起こされる疾患の処置／管理に対して潜在的な用途を有する。この治療は、改善された終止コドン抑制特異性を与える点で有利である。本発明の治療用ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、特異的終止コドン、例えばＴＧＡを標的とし、このため、疾患と無関係な終止コドンでのオフターゲット効果を低減する。本治療は、アミノ酸特異性を与える点でも有利である。発現されたｔＲＮＡは、疾患終止コドンの挿入を介して喪失されたアミノ酸を特異的に置き換えるように操作されるので、タンパク質の安定性、折り畳みおよび輸送に対するあらゆる疑似効果をなくす。
【０１９０】
ある実施形態において、本系はモジュール式であり、このため、あらゆる可能な疾患ＰＴＣに対して「個別化」することができる。例えば、Ｔｒｐ合成酵素によって認識される９個の各トリプトファンｔＲＮＡがヒトゲノム中に存在し、これらの全てがｍＲＮＡ  ＵＧＧコドンを抑制する。このため、これらの９個のＴｒｐ  ｔＲＮＡの各々が、コドン再編集耐容性（ＵＧＧ→ＵＧＡ）の機会を提供する。さらに、遺伝子コードでの終止コドンとの近接性を考慮すると、アルギニンコドンのＰＴＣナンセンスコドンへの変異が疾患において一般的である。コドン編集の耐容性および抑制効果に関して試験することができる３０超のＡｒｇ  ｔＲＮＡが存在する。
【０１９１】
本発明のさらなる利点は、系全体（ｔＲＮＡ＋プロモーター配列）がコンパクトであるため、容易な発現および細胞特異的送達を与えることである。
本発明の薬剤の投与量、製剤および投与の経路
【０１９２】
本発明の薬剤は、遺伝子疾患（例えば、嚢胞性線維症）に付随する少なくとも１つの症候の低減をもたらすために投与される。投与される量は、選択された組成物、具体的な疾患、哺乳動物の体重、身体的状態および齢並びに予防または処置が達成されるべきかどうかを含むが、これらに限定されない様々な要因に応じて変動する。このような要因は、本分野で周知である動物モデルまたはその他の試験系を用いて、臨床医によって容易に決定することができる。
【０１９３】
本発明は、本発明の薬剤、例えば、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ、発現ベクターまたはウイルス粒子の投与によって、遺伝子疾患（例えば、嚢胞性線維症）を処置することを想定する。本発明にしたがう治療剤の投与は、例えば、レシピエントの生理的状態、投与の目的が治療的かまたは予防的かどうか、および当業者に既知の他の要因に応じて、継続的または間欠的であり得る。本発明の薬剤の投与は、予め選択された期間にわたって本質的に連続的であり得、または間隔を置いた一連の投薬であり得る。局所および全身的投与の両方が想定される。
【０１９４】
以下に論述されているように、（例えば、マイクロカプセル化を用いて）必要に応じて徐放用に製剤化してもよい本発明の治療剤（複数可）を有する１またはそれを超える適切な単位剤形は、静脈内および筋肉内経路によることを含む非経口、ならびに疾患組織中への直接の注射によることを含む様々な経路によって投与することができる。製剤は、適宜、別個の単位剤形で都合よく提供してもよく、薬学に周知の方法のいずれによっても調製され得る。このような方法は、治療剤を液体担体、固体マトリックス、半固体担体、微細化固体担体またはこれらの組み合わせと一緒にするステップ、および、次いで、必要であれば、生成物を所望の送達系中に導入しまたは成形するステップを含み得る。
【０１９５】
本発明の治療剤が投与のために調製された時点で、本発明の治療剤は、医薬製剤、または単位剤形を形成するために、薬学的に許容され得る担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせてもよい。このような製剤中の全活性成分は、製剤の０．１〜９９．９重量％を含む。「薬学的に許容され得る」とは、製剤の他の成分と適合的であり、そのレシピエントに有害でない担体、希釈剤、賦形剤および／または塩である。投与のための活性成分は、粉末としてまたは顆粒として；溶液、懸濁液またはエマルジョンとして存在し得る。
【０１９６】
本発明の治療剤を含有する医薬製剤は、周知の容易に入手できる成分を用いて、本分野において既知の手法によって調製することができる。本発明の治療剤は、非経口投与、例えば、筋肉内、皮下または静脈内経路に適した液剤として製剤化することもできる。
【０１９７】
本発明の治療剤の医薬製剤は、水性もしくは無水液剤もしくは分散液剤（ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ）の形態またはエマルジョンもしくは懸濁剤の形態を取ることもできる。
【０１９８】
このため、治療剤は、（例えば、注射、例えば、ボーラス注射または持続注入による）非経口投与のために製剤化され得、アンプル、プレフィルドシリンジ、小容量注入容器に入れて単位投薬形態でまたは防腐剤が添加された複数回投与容器に入れて与え得る。活性成分は、油性または水性ビヒクル中の懸濁剤、液剤またはエマルジョンとしてこのような形態を取り得、懸濁化剤、安定化剤および／または分散剤などの製剤化剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ  ａｇｅｎｔｓ）を含有し得る。または、活性成分は、使用前に、適切なビヒクル、例えば、発熱物質を含まない無菌水を用いて構成するための、無菌固体の無菌単離によってまたは溶液からの凍結乾燥によって取得される粉末形態であり得る。
【０１９９】
必要な有効量は、複数の投薬単位の投与によって達することができるので、各剤形の個別のエアロゾル用量中に含有される１つまたは複数の活性成分の単位含量は、それ自体、特定の適応症または疾患を処置するために有効な量を構成する必要はないことが理解される。さらに、個別にまたは一連の投与のいずれかで、剤形中の用量未満を用いて有効量が達成され得る。
【０２００】
本発明の医薬製剤は、必要に応じた成分として、本分野において周知である種類の、薬学的に許容され得る、担体、希釈剤、可溶化剤または乳化剤および塩を含み得る。本発明の医薬製剤において有用である担体および／または希釈剤の非限定的な具体例には、水およびリン酸緩衝食塩溶液ｐＨ７．０〜８．０などの生理的に許容され得る緩衝食塩溶液および水が含まれる。
定義
【０２０１】
疾患状況：本発明において、「疾患状況」または「疾患表現型」は、細胞内の遺伝子のコード領域内の終止コドンに起因する（例えば、ナンセンス変異に起因する）哺乳動物細胞の特徴（ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃ）である。例えば、ますます多くのヒト遺伝疾患が、ナンセンス変異によって引き起こされると考えられている（例えば、Ａｔｋｉｎｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２２：１３２７，１９９４参照）。ほんの数例を上げると、β−サラセミア、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、色素性乾皮症、ファンコニ貧血および嚢胞性線維症は全て、同定された遺伝子中のナンセンス変異によって引き起こされ得る。
【０２０２】
内在性ｔＲＮＡ合成酵素：本発明にしたがってｔＲＮＡがその中に導入される細胞中に存在すれば、ｔＲＮＡ合成酵素は細胞に「内在性」であると考えられる。当業者に自明であるように、ｔＲＮＡ合成酵素は、該当する種類の細胞中に天然に見出されるかどうか、または当該細胞がｔＲＮＡ合成酵素を含有若しくは発現するように操作されもしくは別段、人間の手によって巧みに扱われているかどうかを問わず、これらの目的に関して内在性であると考え得る。
【０２０３】
サプレッサーｔＲＮＡ：「サプレッサーｔＲＮＡ」は、実験の条件下で検出可能なリードスルーが起こるような、そのアンチコドンが別段、翻訳を終結するコドンと相補的であるものをいう。標準的な終結コドンは、アンバー（ＵＡＧ）、オーカー（ＵＡＡ）およびオパール（ＵＧＡ）コドンである。しかしながら、非標準的な終結コドン（例えば、４ヌクレオチドコドン）も、文献中で利用されてきた（例えば、Ｍｏｏｒｅ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２９８：１９５．２０００；Ｈｏｈｓａｋａ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．１２１：１２１９４，１９９９参照）。
【０２０４】
ここで、以下の非限定的な実施例によって、本発明を例示する。
【実施例】
【０２０５】
［実施例１］
遺伝コードは、順次トリプレットコドンを形成する４つのヌクレオチドを使用し、これが、ＤＮＡのタンパク質への翻訳の基礎を成す。合計６４個のコドンが存在し、そのうち６１個がアミノ酸をコードするために使用され、そのうち３つ（ＴＡＧ、ＴＧＡおよびＴＡＡ）がタンパク質終結「終止」または「ナンセンス」コドンをコードする
【０２０６】
嚢胞性線維症の症例の５〜１０％が、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）タンパク質の未成熟なトランケーションをもたらす「ナンセンス」変異によって引き起こされる。この「クラス１」変異の例は、ｐ．Ｔｒｐ１２８２Ｘ、ＣＦＴＲ機能の喪失と重度の嚢胞性線維症表現型を引き起こす未成熟終結コドン（ＰＴＣ）である。アタルレンなどの一部の化合物は、疾患を引き起こすナンセンス変異の終止のリードスルーを促進するが、不十分な終止コドン特異性およびインビボでの予想外に低いコドンスキップ効率などのいくつかの注意（ｃａｖｅａｔ）のため、治療薬としてはわずかな成功を収めているに過ぎない。しかしながら、これらの化合物の幅広い使用および内在性終止コドンリードスルーが後生動物では一般的であるという発見から、細胞種のサブセット、すなわち、気道上皮に送達されれば、補助された抑制が実行可能であり得ることが示唆される。ただし、治療的に補助された終止コドンリードスルーが成功すると、ナンセンスコドンの位置でのアミノ酸の非選択的な取り込みが、（ＣＦＴＲ１２８２Ｘの場合のように）タンパク質の折り畳み、輸送および機能に影響を与える可能性があり、このため、さらなる治療的介入が必要とされる。このため、疾患ＰＴＣの性質および潜在的に治療的なサプレッサーおよび、一般的には、ＰＴＣ疾患のより効果的な処置を理解する差し迫った満たされていない要望が存在する。
【０２０７】
本実施例は、ＣＦＴＲ  ｐ．Ｔｒｐ１２８２Ｘチャンネルの救出のために、アンチコドン編集（ＡＣＥ）Ｔｒｐ−ｔＲＮＡの性質を決定する。このようなｔＲＮＡは、疾患を引き起こすＴＧＡ終止コドンを「抑制する」ように操作され、ｐ．Ｔｒｐ１２８２Ｘ  ＣＦＴＲにおいて、元のアミノ酸であるＴｒｐを取り込み、実際に、野生型ＣＦＴＲタンパク質を遺伝的に再構築する。データは、この一般的なアプローチ（ナンセンス抑制）が、接着細胞中でのｔＲＮＡおよびその同族合成酵素の一過性形質移入またはＡ５４９気道細胞などのより天然の気道細胞種へのウイルスをベースとしたこれらの送達を通じて、インフレームに終止コドンを保有する転写物の強固な救出をもたらすことを実証する。このアプローチは、既存の戦略を超えて、多数の著しい利益を与える。１）改善されたコドン特異性−発現されたｔＲＮＡは特異的な終止コドンに向けて誘導され得るので、疾患と無関係な終止コドンへのオフターゲット効果を低減する。２）アミノ酸特異性−発現されたｔＲＮＡおよび／または合成酵素は、疾患終止コドンの挿入を通じて失われたアミノ酸を置き換えるように操作することができるので、ＣＦＴＲの安定性、折り畳みおよび輸送に対するあらゆる疑似効果を打ち消す。３）同調性（ｔｕｎａｂｉｌｉｔｙ）−この系は、ｔＲＮＡおよびＰＴＣ変異の各種類に対して、理論的には個別化することができる。４）容易な発現−系全体がコンパクト（１ｋｂ未満）であり、容易にパッケージし、一過性にまたはｔＲＮＡのナノ粒子送達を介して発現させることができる。５）一般的な戦略に対する原理の証明−インフレーム終止コドンはヒト疾患の主要な原因であり、処置の選択肢がほとんど存在しない；ここで、ｐ．Ｔｒｐ１２８２Ｘに対して行われた実験は、他のＣＦＴＲナンセンスコドンの機序への洞察をもたらすと予想される。
【０２０８】
データは、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ終止コドンサプレッサーｔＲＮＡは、導入された終止部位を含有する転写物を「救う」のに効率的であることを示し（図６Ａおよび６Ｂ）、このようなｔＲＮＡが、疾患終止部位の治療的救出における主要な生物学的障害としてのナンセンス変異依存分解（ＮＭＤ）を妨げる能力を有していることを示唆する。このため、サプレッサーｔＲＮＡを使用して、疾患におけるＮＭＤへのより多くの分子的洞察を獲得する可能性が開かれる。
結果
【０２０９】
本発明者らは、終止部位、例えば、ＴＧＡを抑制し、その指定されたコドンを抑制しないようにアンチコドン編集真核生物のｔＲＮＡを発現することが可能であるかどうかを問題にした。これは、ＴＧＡ部位を含有するリンカーによって隔てられた、ｅＧＦＰ配列とインフレームの蛍光タンパク質（チェリー）からなる試験構築物上の５つのヒトトリプトファンｔＲＮＡにおいて試験された。完全長のタンパク質の産生を示すために、ｅＧＦＰ読み枠のＣ末端にＨＡエピトープを付加した。チェリーシグナルの外観がプラスミドの送達および発現を示し、ｅＧＦＰ救出と組み合わせて、ＴＧＡ抑制を示すので、この試験系は有用である。図６Ａおよび６Ｂ中のデータは、この試験構築物を用いて５つのアンチコドン編集Ｔｒｐ  ｔＲＮＡヒトがチェリーとｅＧＦＰ読み枠との間にある短いリンカー中のＴＧＡ終止部位を抑制する能力をアッセイしたウェスタンブロットデータを示す。これらの構築物のうち、候補１、２、３および５は、この点に関して中程度の活性を示す。これは、変異に対する構造的非耐容性によるもの、またはたった１つの塩基だけアンチコドンを変化させることが、トリプトファンを有するｔＲＮＡを認識しかつ／またはアシル化するＴｒｐ合成酵素の能力を破壊したという可能性によるものであり得る。しかしながら、これらの試験ｔＲＮＡの番号４（ｔＲＮＡ＃４）は、ＴＧＡ部位の有意な抑制活性を示し、完全長のチェリー−ｅＧＦＰ−ＨＡタンパク質を産生する（図６Ｂ）。さらに、共発現されたｔＲＮＡの非存在下ではリードスルーは全く見られなかった、最後のレーン、図６Ｂ。
方法
【０２１０】
コドン編集の耐容性（ＴＧＧ→ＴＧＡ）および一過性に形質移入されたタンデム蛍光標識試薬（ｍチェリー−ＴＧＡ−ＧＦＰ）およびＣＦＴＲ  Ｔｒｐ１２８２Ｘ中の標的とされるＴＧＡ試験部位を抑制する能力について、Ｔｒｐ  ｔＲＮＡを調べた。９個のうち５個のＴｒｐ  ｔＲＮＡの初期スクリーニングは、ＨＥＫ細胞中に一過性に形質移入され、チェリー−ＴＧＡ−ｅＧＦＰ−ＨＡ試験構築物を救うための「類のない」機能性を有するアンチコドン編集Ｔｒｐ−ｔＲＮＡを発見した、図６Ｂ。ＨＡエピトープの選択的な存在は、救出の成功ならびに単一細胞レベルでのチェリーおよびｅＧＦＰ蛍光の両方の共焦点検査を示す（図示せず）。この結果は、ａ）一部のＡＣＥ−ｔＲＮＡはアンチコドン編集を耐容することができる、ｂ）これらのｔＲＮＡは内在性トリプトファン合成酵素によって、Ｔｒｐでアシル化される能力を保持している、およびｃ）これらのｔＲＮＡはタンパク質読み枠内に埋め込まれたＴＧＡ部位を抑制できるという原理的データの証明を与える。
【０２１１】
残り４つのＴｒｐ−ｔＲＮＡは、ＴＡＡからＴＧＡサプレッサーへのアンチコドン編集の耐容性に関して機能的に調べられる。これらのアンチコドン編集ｔＲＮＡは、チェリー−ＴＧＡ−ｅＧＦＰＨＡクローンを救う能力について試験される。チェリーおよびｅＧＦＰシグナルならびにＨＡエピトープに対して、生化学的（ウェスタンブロット）データが得られる。ここで、チェリー発現は、陽性形質移入対照としての役割を果たす。共焦点画像は、単一細胞レベルでチェリーおよびｅＧＦＰ蛍光を証明する。
【０２１２】
ＡＣＥ−Ｔｒｐ  ｔＲＮＡにトリプトファンアミノ酸を導入する内在性Ｔｒｐ合成酵素の忠実度は、精製された救われたチェリー−Ｔｒｐ−ｅＧＦＰＨＡタンパク質のトリプシン消化断片の質量分析によって決定される。チェリーとｅＧＦＰ読み枠の間のリンカーから生成されるトリプシン消化断片に対して予想される質量は、以下のとおりである。１５９０．８１３５の予想質量を有する；
【化２】
2021508234.tif 000015
；太字のＷは取り込み部位を示す、図１０。このため、これは、ナンセンスコドン修復および野生型アミノ酸での置き換えの最初の例に相当し、したがって、治療に役立つアタルラン（Ａｔａｌｕｒａｎ）などの既存のアプローチに比べて著しい進歩である。後者の例では、化合物は、不正確なアミノ酸によるナンセンスコドンのリードスルーを促進し、このため、厳密な修復を提供する新しいｔＲＮＡ配列の発見および同定が重要である。
【０２１３】
上で同定されたＡＣＥ−ｔＲＮＡによる一過性に形質移入されたＣＦＴＲ１２８２Ｘチャンネルの救出は、ＢおよびＣグリコシル化ＣＦＴＲバンド２０の完全な成熟に対する標準的な生化学的方法によって評価される。このように、このチャンネルは野生型アミノ酸で修復されており、完全に機能的であり、細胞膜へ首尾よく輸送される。
【０２１４】
次の段階は、電気生理的な（単一細胞パッチクランプおよびＵｓｓｉｎｇチャンバー）および生化学的アプローチを用いて、上で同定されたＡＣＥ−ｔＲＮＡ系により救われたＣＦＴＲ  Ｔｒｐ１２８２Ｘチャンネルを機能的に特徴付けることである。１２８２Ｘ  ｍＲＮＡのナンセンス変異依存分解（ＮＭＤ）を減弱する発現されたｔＲＮＡの効力は、定量的ｒｔＰＣＲを用いて評価され得る。発現されたコドン編集Ｔｒｐ−ｔＲＮＡによる天然の１２８２Ｘ  ＣＦＴＲチャンネルの救出を試験するために、再プログラムされたヒト気道細胞が使用される。
【０２１５】
同定されたヒトＴｒｐ  ｔＲＮＡにおいて、アンチコドン編集が耐容されること、およびこの７５塩基対の転移ＲＮＡが試験構築物内のインフレームＴＧＡコドンを抑制できることが実証されている。これらの実験は、ＣＦＴＲ  １２８２ＴＧＡ  ｍＲＮＡと相互作用し、モデル細胞（ＦＲＴおよびＡ５４９）ならびにｐ．１２８２Ｘヒト再プログラムされた気道細胞中で機能的ＣＦＴＲチャンネルを産生するこのＡＣＥ−ｔＲＮＡの能力を特徴付けるために、この発見を外挿する。
【０２１６】
一過性に発現されたＣＦＴＲ１２８２Ｘチャンネル中での救出レベルおよび再プログラムされた気道細胞中での救出レベルの生化学的決定。救われたもの（エピトープはアミノ酸１３７０〜１３８０）を認識し、救われたおよび救出救われなかった全てのＣＦＴＲを検出するために、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅから入手可能なＮ末端様ＭＭ１３−４（エピトープアミノ酸２５〜３６）に結合する抗体である抗体Ｍ３Ａ７が使用される。または、Ｌ１２Ｂ４（エピトープアミノ酸３８６〜４１２、ＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）または６６０（エピトープアミノ酸５７６〜５８５）が、Ｃｙｓｔｉｃ  Ｆｉｂｒｏｓｉｓ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓを通じて入手可能である。
【０２１７】
表面の機能性は、電気生理学的アプローチであるパッチクランプおよびＵｓｓｉｎｇチャンバー記録を通じて調べられる。１２８２Ｘ  ｍＲＮＡの安定性と存在量は、一過性に発現している細胞および再プログラムされた気道細胞からのＲＮＡ抽出物の定量的ｒｔＰＣＲによってアッセイされる。
【０２１８】
ヒト気道細胞から得たＲＮＡトランスクリプトームデータのバイオインフォマティクス分析は、ＴＧＡコドンを含有する転写物の存在量、状況および同一性を特定する。その正常な終止部位に対してＴＧＡを使用している上位１０の発現転写物が、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ発現の前および後に、タンパク質生化学を用いて、個別の転写物のレベルで追跡される。細胞死におけるＡＣＥ−ｔＲＮＡの影響を調べるために、細胞のアポトーシスの生化学的および免疫組織学的プローブも使用される。
【０２１９】
結論として、このデータは、インフレーム終止部位を有するイオンチャンネル遺伝子は、この種の「救出」に適しており（図９）、系の成分は気道細胞中でウイルスにより発現され得ることを示す。さらに、この考え方の極めて単純化された形態である、ヒト起源のＡＣＥ−ｔＲＮＡは、哺乳類細胞株中でインフレームＣＦＴＲ  ＴＧＡコドンを救う「類のない」能力を実証する（図９）。このアプローチは、既存の終止コドン戦略に対して多くの利点を有しており、１）ナンセンス変異依存分解を抑止する、２）肺細胞調製物中で機能する、および３）ＣＦＴＲ１２８２Ｘを特異的に救うＡＣＥ−ｔＲＮＡの能力に関してより詳しく調べる価値がある。
［実施例２］
【０２２０】
いくつかの異なるナンセンス変異がＣＦを引き起こし、このため、全てのＣＦ疾患の概ね１０％の基礎原因となる。図７。これらの症例は、以下の１０個の特定の遺伝的病変に集約される。Ｅ６０Ｘ、Ｒ７５Ｘ、Ｇ５４２Ｘ，Ｒ５５３Ｘ、Ｑ８９０Ｘ、Ｙ１０９２Ｘ、Ｒ１１５８Ｘ、Ｒ１１６２ＸおよびＷ１２８２Ｘ。本発明者らは、適切なアプローチを用いれば、アンチコドン編集への修飾および耐容性に関して、既存のヒトｔＲＮＡ配列をスクリーニングすることは実行可能であるはずであると提案する。この目的のために、およそ１４４個のＡＣＥ−ｔＲＮＡが、疾患を引き起こすナンセンスコドンの修復と完全長タンパク質の発現を促進するために使用することができるＡＣＥ−ｔＲＮＡに対して試験するための候補であった。具体的には、図１１に記載されているスキームを用いて、上位のＣＦを引き起こすナンセンス変異を修復する能力を有するＡＣＥ  ｔＲＮＡをコードする新規ｔＲＮＡ配列を同定するために、ｔＲＮＡライブラリーを作製した。具体的には、図１１に記載されているように、１０ｎｇのＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードするアニーリングされたオリゴを、５０ｎｇのＮａｎｏＬｕｃレポータープラスミド、１μＬの１０ｘＣｕｔＳｍａｒｔ  Ｂｕｆｆｅｒ（ＮＥＢ）、１μＬのＴ４リガーゼ（ＮＥＢ）、１０ｍＭ  ＡＴＰおよび１μＬのＢｂｓＩ（ＮＥＢ）と併せて、サーモサイクラー中でサイクリングした。形質転換受容性のある大腸菌中に１μＬの反応物を形質転換し、アンピシリン寒天プレート上に形質転換体を播種した。プレート当たり１つの形質転換体を取り出して、アンピシリン選択下で１ｍＬのＬＢ中において成長させ、ミニプレップを行い、配列を確認した。
【０２２１】
トリプトファンおよびグリシンから最良のＡＣＥ−ｔＲＮＡ候補を同定するために、まず、スクリーニング研究を実施した。ＡＣＥ−ｔＲＮＡとともに、１２５ｎｇのＮａｎｏＬｕｃレポータープラスミドの配列確認されたミニプレップｃＤＮＡを、リン酸カルシウムを用いて、ＨＥＫ細胞中に形質移入した。前日に、４×１０４個のＨＥＫ細胞を９６ウェルプレート中にプレーティングした。形質移入の２４時間後に、培地を２０μＬのＰＢＳで置き換え、１５μＬのＮａｎｏＧｌｏ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ）上でプレートを読んだ。データは、３またはそれを超える反復データ（ｒｅｐｌｉｃａｔｅｓ）である。図８。データは、多くのｔＲＮＡが不十分なコドン編集耐容性を示すことを示している。しかしながら、明白な高性能ｔＲＮＡが上記スクリーニング研究から明らかとなり、バックグラウンドと比べて、２０倍〜１３０倍のナンセンスコドン含有タンパク質の救出を実証するＡＣＥ−ＴｒｐおよびＡＣＥ−Ｇｌｙ  ｔＲＮＡが同定される。
【０２２２】
これらの新規ｔＲＮＡがナンセンスコドンを保有するＣＦＴＲチャンネルを救うことができるかを評価するために、これらの新規ｔＲＮＡをＣＦＴＲ  Ｗ１２８２Ｘ  ｃＤＮＡプラスミドとともに、哺乳動物のＨＥＫ細胞中に共発現させた。ＣＦＴＲタンパク質のウェスタンブロット評価を介した標準的な生化学的アプローチによって、細胞調製物を分析した。ＣＦＴＲタンパク質は十分に確立されたマルチバンドのパターンを示すので、この方法は、この目的のために極めて有利である。具体的には、「Ｂ」および「Ｃ」バンドは、それぞれ、細胞表面にある、完全長のおよび完全に成熟した、翻訳後処理を受けたＣＦＴＲタンパク質に相当する。この事例では、Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９  ＡＣＴ−ｔＲＮＡおよびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２  ＡＣＴ−ｔＲＮＡによる両救出が、「Ｂ」および「Ｃ」ＣＦＴＲ免疫陽性（抗体ＭＡ３７）バンドの強固な集団を産生し、このことは、前記ｔＲＮＡによって、完全長の首尾よく輸送されたイオンチャンネルタンパク質が促進されることを示している。（図９）
［実施例３］
【０２２３】
ｔ−ステムの修飾は、ナンセンス抑制を有意に改善する。図１０。ここでは、本発明者らは、ナンセンスコドンを抑制し、タンパク質発現を促進する目的で、ｔＲＮＡの機能をさらに与えるために、ｔＲＮＡのさらなる修飾を提案する。この仮説は、図１０に示されている、ｔＲＮＡ「ｔ−ステム」ループ内に合理的に導入された変異が、より安定で、ナンセンスコドン抑制に関して機能的により強力なｔＲＮＡ分子をもたらす可能性に基づいている。このために、トリプトファンＴＧＡナンセンスコドンの救出に対する活性が同定されたＡＣＥ−ｔＲＮＡであるｔＲＮＡ  Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９のｔ−ステム中に、単一および二重変異を直接操作した。このようにして、３８のｔＲＮＡ  ｔ−ステムバリアントが作製され、図４に示されているナンセンス救出レポーター構築物で一過性に形質移入されたＨＥＫ細胞中でスクリーニングされた。形質移入の２４時間後に、図１０に示されているように、ルシフェラーゼ活性に関して細胞をアッセイした。データは、強い変動を示し、強化された抑制活性を有する変化したｔ−ステムループ配列を有する新規ｔＲＮＡ配列を同定する。とりわけ、１つのこのような変異体、ＴＳ−３８  ５２−６２  Ｇ−Ｃは、Ｔｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９の抑制能力をおよそ２５０％増強する（図１２）。このため、本発明者らは、これが一般化可能な修飾であること、すなわち、実施例１および２によって同定された新規ｔＲＮＡ配列の修飾は、さらなる合理的修飾を通じて（ナンセンスコドンをレスキューするそれらの能力に関して）よりよくすることができることを提案する。このようなアプローチは、低存在量の標的ＲＮＡを有するまたはｔＲＮＡ送達が限定され得る組織型に向けられるＡＣＥ−ｔＲＮＡの治療的有用性を補助する。
［実施例４］
【０２２４】
ヌクレオチド組成および新しい種類のｔＲＮＡによるナンセンスコドンを抑制する機能的能力の同定を可能とするために、Ｈｉｇｈ  Ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇのために、Ａｌｌ−Ｉｎ−Ｏｎｅ  Ｐｌａｓｍｉｄ  Ｗｉｔｈ  Ａ  Ｏｎｅ  Ｐｏｔ  Ｃｌｏｎｉｎｇ  Ｒｅａｃｔｉｏｎを発明した、図１１。このアプローチによって、標準的な９６ウェルフォーマットで、ルシフェラーゼ活性を介して、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ活性の容易な調査が可能となる。簡潔に述べると、ＮａｎｏＬｕｃ  Ｒｅｐｏｒｔｅｒプラスミド中に、ｔＲＮＡをコードする合成ヌクレオチド配列がライゲーションされており、ＴＧＡナンセンスレポータープラスミドのバリアントの一例が図１１に示されている。図１６〜１９では、ＴＡＡ（オパール）およびＴＡＧ（アンバー）終止コドン救出ベクターが首尾よく設計され、実施された。利点は、このアプローチが、ｔＲＮＡライブラリーをコードするＤＮＡオリゴを、制限酵素およびリガーゼの存在で、ＮａｎｏＬｕｃレポータープラスミド中にライゲーションすることができ、ほぼ１００％のｔＲＮＡインサートの取り込みまで反応が押し進められることであり（図１１）、このため「ワンポット」と表記される。この反応物を大腸菌中に形質転換し、得られるｃＤＮＡを標準的な方法によって精製する。発明された方法の別の利点は、ｔＲＮＡとレポーター遺伝子（ｇｅｎ）が単一の発現カセット内にあり、したがって、生物学的変動性を低下させ、ｔＲＮＡ抑制活性の得られるスクリーニングにおいて取得されるデータの質を向上させることである。次いで、精製されたｃＤＮＡプラスミドは、推測されるルシフェラーゼ活性によって、ナンセンスコドンを修復する能力に関して、ハイスループットの９６ウェルフォーマットでスクリーニングされる。このアプローチは、新規治療活性に関して、数百〜数千ものｔＲＮＡをハイスループットスクリーニングするのに適している。
【０２２５】
図１１に記載されている「ワンポット」クローニングおよび発現系は、トリプトファンおよびグリシンＡＣＥ−ｔＲＮＡ（図１３）、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ａｒｇ（図１４）、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ  ＴＡＧ（図１５）、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ  ＴＡＡ（図１６）、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｕ  ＴＡＧ（図１７）、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｇｌｎ  ＴＡＡ（図１８）およびＡＣＥ−ｔＲＮＡ−Ｔｒｐ  ＴＡＧ（図１９）の修復のための特有のｔＲＮＡ配列を同定するために首尾よく使用された。図２０Ａ〜２０Ｄは、低分子ＲＮＡとしてのＡＣＥ−ｔＲＮＡの送達が、Ｇ５４２ＸおよびＷ１２８２Ｘナンセンス変異の強固な抑制を支えることを示す。
［実施例５］
未成熟終結コドンの抑制のための操作された転移ＲＮＡ
要約
【０２２６】
未成熟終結コドン（ＰＴＣ）は、全ての遺伝的疾患の１０〜１５％の原因である。翻訳の間のＰＴＣ抑制は、様々な遺伝的障害を処置するための有望なアプローチを提供するが、ＰＴＣリードスルーを促進する小分子は、臨床試験において、一貫しない成績を与えた。インフレームのＰＴＣを効果的に抑制することができ、その同族アミノ酸を忠実にコードすることができる、アンチコドン操作された（ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）転移ＲＮＡ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡ）を同定するための、細胞をベースとしたハイスループットのアッセイが提供される。総合すると、最も一般的なヒトの疾患を引き起こすナンセンスコドンを標的とする高度の抑制活性を持ったＡＣＥ−ｔＲＮＡが同定された。ＰＴＣを修復するレベルでＡＣＥ−ｔＲＮＡを発現する細胞のゲノム全体にわたるトランスクリプトームリボソームプロファイリングは、翻訳終結コドンとの限られた相互作用が存在することを示す。これらのＡＣＥ−ｔＲＮＡは、哺乳動物細胞、アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）卵母細胞およびインビボでのマウスにおいて高い抑制能を示し、嚢胞性線維症膜コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）内の疾患を引き起こす変異を含む、複数の遺伝子中にＰＴＣ修復をもたらす。
序論
【０２２７】
未成熟終結コドン（ＰＴＣ）は、正規のトリプレットヌクレオチドコドンを３つの終止コドン、例えば、ＴＡＧ、ＴＧＡまたはＴＡＡの１つに転化する単ヌクレオチド変異から生じる。ＰＴＣは、タンパク質発現の喪失をもたらすので、しばしばミスセンス変異より有害である。さらに、ｍＲＮＡ存在量は、ナンセンス変異依存分解（ＮＭＤ）を通じて低下され、いくつかの事例では、トランケートされたタンパク質は、ドミナントネガティブ機能を有し得る１−３。したがって、ＰＴＣが、嚢胞性線維症４、デュシェンヌ型筋ジストロフィー、脊髄性筋萎縮症５、乳児神経セロイドリポフスチン沈着症（ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  ｎｅｕｒｏｎａｌ  ｃｅｒｏｉｄ  ｌｉｐｏｆｕｓｃｉｎｏｓｉｓ）６、β−サラセミア（β−ｔｈａｌｅｓｓｅｍｉａ）７、シスチン症８、Ｘ連鎖腎性尿崩症９、ハーラー症候群１０、アッシャー症候群１１および多嚢胞腎疾患を含む多くの重度の疾患表現型と関連していることは驚くべきことではない。さらに、ナンセンス変異は、腫瘍抑制遺伝子ｐ５３およびＡＴＭ１２内で発生し、疾患におけるナンセンス変異の役割をさらに示唆する。ＰＴＣ変換をもっとも受けやすいアミノ酸コドンは、終止コドンからの一塩基置換を有するアミノ酸コドン：トリプトファン、チロシン、システイン、グルタミン酸、リジン、グルタミン、セリン、ロイシン、アルギニンおよびグリシンである（図２５）。そのため、ＰＴＣは、世界中で３０００万人を超える人々を苦しめる疾患の特有の群であり、全ての遺伝的疾患の１０〜１５％を占める１３。
【０２２８】
アミノグリコシド１４、ジペプチド１５およびオキサジアゾール１６などの小分子は、ナンセンス変異の「リードスルー」または「抑制」を促進する。これらの化合物は、モデル生物１７、１８、哺乳動物の細胞株１９およびいくつかの動物疾患モデル１６、２０において有効である。しかしながら、このアプローチは、近い同族アミノ酸のコード化（ｅｎｃｏｄｉｎｇ）をもたらして２１、ＰＴＣにミスセンス変異を効果的に生じ、これ自体がタンパク質の折り畳み、輸送および機能に対して有害な影響を有し得る。さらに、アミノグリコシドは、聴覚毒性および腎毒性があり２２、画期的医薬品オキサジアゾールであるアタルレンは、患者集団で予想外に低い効果を示し（ＡＣＴ  ＤＭＤ第３相臨床試験、ＮＣＴ０１８２６４８７；ＡＣＴ  ＣＦ、ＮＣＴ０２１３９３０６）、このため、ＰＴＣ治療薬としてのその有用性を限定する。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９によって媒介されるゲノム編集における最近の進行中の進歩は、潜在的に、ナンセンス変異に起因する疾患に対する恒久的な解決策をもたらす。しかしながら、この技術の側面は、治療薬としてのその早期の使用に障害を与える２３、２４。これは、各患者の遺伝的変動性という状況に基づくそれぞれの変異に対する「精度」または「個別化された」診断薬の要件に限定されない。
【０２２９】
小分子の汎用性と遺伝子編集の精度を示すＰＴＣ修復アプローチが同定された。これらの基準を充足するために、ＵＧＡ、ＵＡＡまたはＵＡＧ  ＰＴＣコドンを認識し、抑制するための変異誘発を介してそのアンチコドンが操作されているｔＲＮＡを調べた。有効であるためには、ａｎｔｉｃｏｄｏｎ  ｅｄｉｔｅｄ  ｔＲＮＡ、別名ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ＡＣＥ−ｔＲＮＡにその同族アミノ酸を導入するためのアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素および導入されたｔＲＮＡをリボソームに送達するための真核生物伸長因子１ａ（ｅＥＦ−１α）を含む内在性翻訳細胞性機構（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ  ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｍａｃｈｉｎｅｒｙ）によって、なお認識されるべきである、図２１Ａ。このようなサプレッサーｔＲＮＡは、限定的な様式で、β−サラセミア２５、色素性乾皮症２６およびトランスジェニックＰＴＣレポーター遺伝子２７と関連するインフレーム終止コドンをレスキューことが示されている。
【０２３０】
本実施例では、アンチコドン編集アプローチは複数のｔＲＮＡ遺伝子ファミリーに一般化可能であることが示され、このことは、多くの注釈が付された（ａｎｎｏｔａｔｅｄ）ｔＲＮＡが生物学的に生存可能であることを示唆する。さらに、アンチコドン編集サプレッサーｔＲＮＡはその同族アミノ酸をコードし、終結終止コドンとの有意な相互作用を欠き、インビボでＰＴＣを抑制するのに効果的であることを実証する。全体として、このデータは、このような操作されたｔＲＮＡが疾患を引き起こすＰＴＣをカバーするための幅広い要件を満たし、このため、ＲＮＡ治療剤の有望な新しいクラスとなる可能性を支持する。
結果
【０２３１】
本研究の理論的根拠は、所定の同族アミン酸（イソアクセプター）に対して特有の配列を有する複数のｔＲＮＡ遺伝子（イソデコーダー）が存在するという観察を基礎としており、４００を超えるｔＲＮＡがヒトゲノム中で注釈付けされている（ｈｔｔｐ：ｌｏｗｅｌａｂ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ＧｔＲＮＡｄｂ／）２８，２９。まず、哺乳動物細胞中でＰＴＣの抑制効力を保持する個別のＡＣＥ−ｔＲＮＡを同定するために、ｔＲＮＡ遺伝子を調べた。カバーする配列を最大化するために、ＡＣＥ−ｔＲＮＡのハイスループットクローニング（ＨＴＣ）と哺乳動物細胞への送達後の発光を用いたＰＴＣ抑制の定量的測定を両方サポートする、オールインワンｃＤＮＡプラスミドを作製した、図２１Ｂ。ｃｃｄＢネガティブセレクション３１と組み合わせたＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング３０を用いて、ＨＴＣプラスミド中に、ＤＮＡオリゴとして、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ配列をクローニングした。この戦略は、約１００％のクローニング効率をもたらした。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ抑制効率は、別のＮａｎｏＬｕｃルシフェラーゼ（ＮＬｕｃ）ＮａｎｏＢｉＴプラットフォームから読み取られ、このプラットフォームでは、９６ウェルフォーマットを用いて、目的のＰＴＣ（ＵＧＡ、ＵＡＡまたはＵＡＧ）が大きな部分（ｌａｒｇｅ  ｂｉｔ）ドメインと小さな部分（ｓｍａｌｌ  ｂｉｔ）ドメインの間の接合部にインフレームで導入され、図２１Ｂ３２、ＮＬｕｃ−ＰＴＣを発現している細胞中で得られたバックグラウンドに対して正規化された。まず、ＵＧＡ  ＰＴＣの抑制に関して、２１個のグリシンＡＣＥ−ｔＲＮＡを評価した、図２２、上部左、列１（バイオレット）。ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ配列の大半が、ＵＧＡ  ＮＬｕｃ  ＰＴＣを抑制することができなかったが、高い抑制収量（バックグラウンドに対して約１００倍）を有する３つのＧｌｙ−ｔＲＮＡＵＧＡが同定された。アンチコドン耐容性に関してスクリーニングされたＧｌｙ−ｔＲＮＡの間での高い配列保存を考慮すると（図２７）、いずれのｔＲＮＡがアンチコドン編集に最も適しているかを新規に予測することは困難であろう。
【０２３２】
次に、実施されたスクリーニングは、疾患を引き起こすＰＴＣを生じ得る可能性のある以下の一塩基変異のそれぞれに対するコドン編集ｔＲＮＡに対して実行された。Ａｒｇ−ｔＲＮＡＵＧＡ、Ｇｌｎ−ｔＲＮＡＵＡＡ、Ｇｌｎ−ｔＲＮＡＵＡＧ  Ｔｒｐ−ｔＲＮＡＵＧＡ、Ｔｒｐ−ｔＲＮＡＵＡＧ、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡＵＡＡ、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡＵＡＧ、Ｃｙｓ−ｔＲＮＡＵＧＡ、Ｔｙｒ−ｔＲＮＡＵＡＧ、Ｔｙｒ−ｔＲＮＡＵＡＡ、Ｓｅｒ−ｔＲＮＡＵＡＧ、Ｌｅｕ−ｔＲＮＡＵＡＧ、Ｌｅｕ−ｔＲＮＡＵＡＡ、Ｌｙｓ−ｔＲＮＡＵＡＧ、Ｌｙｓ−ｔＲＮＡＵＧＡおよびＳｅｒ−ｔＲＮＡＵＡＧ。ＮＬｕｃの酵素活性は、導入されたアミノ酸によって有意には影響を受けず（図２８）、したがって、ＮＬｕｃ発光の差は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ抑制能によるものである。スクリーニングによって、アミノ酸および終止コドン種のそれぞれに対して、複数のＡＣＥ−ｔＲＮＡが同定され、３つの終止コドンの全てに対して抑制がカバーされた、図２２。これらのＡＣＥ−ｔＲＮＡの多くは、バックグラウンドの１００倍超のＰＴＣ抑制という強い活性を示し、これは、本研究で使用したアミノグリコシドより有意に高かった。興味深いことに、いくつかのＡＣＥ−ｔＲＮＡは、特定のアンチコドン編集に対して明確な選好性を示し、ｔＲＮＡアンチコドンイソアクセプター配列への変化したアミノアシルｔＲＮＡ合成酵素の結合をおそらく反映している３３。例えば、トリプトファンのＵＡＧ抑制への変換は、同じＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐのＵＧＡ編集のそれよりも１０倍高い救出をもたらした。もっとも、ＵＡＧに比べてＵＡＡに対して明確な選好性が示されたグルタミンについては、逆のことが当てはまった。とりわけ、それぞれの事例で、複数の高性能サプレッサーが同定され、このことは、ヒト疾患において特大の役割を果たすＰＴＣである、ＡｒｇＵＧＡにおいて特に明らかであり、ここでは、２０個の効率的なＡＣＥ−ＡｒｇＵＧＡサプレッサーが同定された。他の事例では、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｕなど、機能を示したもののうち、抑制効率は、ＵＡＡおよびＵＡＧに関して概ね等しかった。ＵＡＧまたはＵＧＡ抑制を介したコード化が極めて酷似していたＡＣＥ−ｔＲＮＡＬｙｓにおいても同様のパターンが見出された。Ｇｌｎ−ｔＲＮＡＵＡＡについては、抑制活性は、バックグラウンドを２，０００倍上回る抑制シグナルをもたらした。スクリーニングで同定されたＡＣＥ−ｔＲＮＡのうち、トリプトファンｔＲＮＡ遺伝子ファミリーは、ＵＧＡ  ＰＴＣに対して最も弱い抑制活性を示した。ヒトのユニークなＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ配列は６つしかスクリーニングに利用できなかったので、多様な種から得たｔＲＮＡを用いて、ＵＧＡ抑制ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐライブラリーを拡張した。ミスコードＡ９Ｃ  ｔＲＮＡＴｒｐおよび細菌のＨｉｒｓｈ  Ｔｒｐサプレッサーに加えて、酵母、ハエ、マウス、ラット、ウサギおよびカエルから得たユニークな配列を有するトリプトファンｔＲＮＡ遺伝子に対して、ＵＧＡアンチコドン編集耐容性を試験した３４，３６、図２９Ａ−２９Ｂ。この試みは、ヒトＡＣＥ  Ｔｒｐ  ｔＲＮＡの抑制活性を超えるＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐＵＧＡ  ＰＴＣ抑制活性を同定することに成���しなかった、図２９Ｃ。総合すると、ｔＲＮＡスクリーニングは、強力な抑制を示す複数の操作されたｔＲＮＡを（各アミノ酸および終止コドンの種類に対して）に対して同定し、このため、アンチコドン編集に対する一般的な耐容性を有していた。
【０２３３】
次に、スクリーニングで同定されたＡＣＥ−ｔＲＮＡが、同族アミノアシル−ｔＲＮＡ合成酵素によるアミノアシル化の厳格性を犠牲にして機能化されたかどうかを確定した。この目的のため、質量分析を使用して、モデル可溶性タンパク質、ヒスチジノール脱水素酵素（ＨＤＨ）中でのＰＴＣ抑制を調べた、図２３Ａ。ＴＧＡコドンをアスパラギン９４（Ｎ９４）に導入し（図３０Ａ〜Ｃ）、それぞれ、最高性能のグリシンおよびトリプトファンＡＣＥ−ｔＲＮＡＵＧＡである、Ｇｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２またはＴｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９  ＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードするプラスミドと、タンデムで、ＨＥＫ２９３細胞中において共発現させた。得られた完全長の抑制されたＨＤＨタンパク質を、Ｓｔｒｅｐ−Ｔａｃｔｉｎ（登録商標）Ｃ末端アフィニティータグを介して精製し、質量分析によって分析した、図２３Ａ（図２８）。その後のデータの検索によって、Ｔｒｐ  ｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９については、ＡｓｎからＴｒｐへの修飾（＋７２Ｄａ）およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２については（−５７Ｄａ）の修飾が同定され、各ＡＣＥ−ｔＲＮＡの種類に対して同族アミノ酸の忠実なコードが確認された。重要なことに、各事例で、ＨＤＨ  ｐ．Ｎ９４Ｘ部位において同定されたペプチドの９８％超が、同族のトリプトファンおよびグリシンをコードしていた。さらに、両ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ＵＡＡおよびＵＡＧを上回る、ＵＧＡ終止コドンに対する選択性を保持していた、図２３Ｂ（ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙ）および図３１（ＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐ）。最後に、一過性に発現されると、ＡＣＥ−ｔＲＮＡＧｌｙは、従来の小分子サプレッサーであるゲンタマイシン（４０μＭ）およびＧ４１８（１４０μＭ）より、ＨＥＫ２９３細胞中で安定に発現されるＮＬｕｃ−ＵＧＡを抑制する能力に関して優れていた、図２３Ｃ。より低い抑制効率を有していたＡＣＥ−ｔＲＮＡＴｒｐについてさえ同じことが当てはまり、Ｇ４１８と比較して、ＰＴＣ救出が上回っていた、図３３Ａ〜Ｄ。
【０２３４】
未成熟終止コドンの効果的な抑制を示すＡＣＥ−ｔＲＮＡは、天然の終止コドンのリードスルーも広く誘導し得るのかどうかという問題が持ち上がった。この潜在的な「オフターゲット」抑制に対処するために、外来性ＡＣＥ−ｔＲＮＡまたは対照偽プラスミド（ｐｕｃ５７ＧＧ）を発現するＨＥＫ２９３細胞からリボソームフットプリントのライブラリーを作製することによって、全ての細胞転写物に対して活動的に関与するリボソームのトランスクリプトーム全体にわたる定量的プロファイルを取得した。リードスルーの人為的影響を防ぐために、ストレプトマイシンは成長培地から除去した。比較のために、Ｇ４１８の存在下または非存在下の細胞（１５０μＭ、４８時間）からもリボソームフットプリントライブラリーを作製した。図２４Ａは、３’ＵＴＲ領域上での、対照と比較したＧ４１８および５つのＡＣＥ−ｔＲＮＡのリボソームフットプリント密度を示している（ｌｏｇ２倍数変化）。２つの複製ライブラリーにおいて、コード配列では５ＲＰＫＭ、３’ＵＴＲでは０．５ＲＰＫＭの最小閾値を有する転写物のみを定量比較のために含めた（Ｇ４１８では２５４転写物、ＡＣＥ−ｔＲＮＡでは４９５〜７４８転写物）。この系では、Ｇ４１８は、３つの内在性終止コドン群のいずれに対しても、トランスクリプトーム全体にわたる３’ＵＴＲリボソーム密度に対して観察可能な効果を有していなかった。ＡＣＥ−ｔＲＮＡアンチコドンに対して相補的な（ｃｏｍｐｌｉｍｅｎｔａｒｙ）同族終止コドンに対して、およそ２倍の３’ＵＴＲリボソーム密度の増加を誘導したＡＣＥ−ｔＲＮＡ  Ｇｌｎ−ＵＡＡおよびＡｒｇ−ＵＧＡを除き、本実施例で調べたＡＣＥ−ｔＲＮＡは、３’ＵＴＲリボソーム密度の検出可能な変化を有していなかった。タンパク質終止の２倍のリードスルーの生物学的重要性を理解するにはさらなる研究が必要であるが、この効果は、同じＡＣＥ−ｔＲＮＡに対するＰＴＣの１００倍〜１０００倍の抑制と比べて実質的に低い。
【０２３５】
遺伝子の末端には、複数のインフレーム終止コドンがしばしば見出され３７−３９、ＡＣＥ−ｔＲＮＡおよびＧ４１８処置に対して、総合的な３’ＵＴＲリボソーム密度のわずかな差を引き起こし得る。終止コドンの下流の６０ヌクレオチド領域内にある３’ＵＴＲ中の各ヌクレオチドで、リボソームの占有を調べた。図２４Ｂは、終止コドンの最初のヌクレオチドに対して−３５〜＋６５ｎｔの領域内にある各ヌクレオチドに対する天然の終止コドンの周囲でのリボソームの占有を実証する。読み取りは、合計１００万のマッピングされた読み取り当たりに正規化し、対照細胞に対して比較し、ｌｏｇ２倍数変化として、パネルＡとして報告した。５，２００を超える転写物が、目的の領域中の少なくとも１つのフットプリントにマッピングされた。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ  Ｇｌｎ−ＵＡＡおよびＡｒｇ−ＵＧＡは、初期領域中で顕著な増加したリボソームの占有を示したのみならず、特徴的な３ヌクレオチド周期性を示し、リボソームが無作為に分布されたのではなく、コドンごとの動きに従ったこと示している。ＵＧＡ−Ｔｒｐ、ＵＧＡ−ＧｌｙおよびＵＡＧ−Ｇｌｕに対するＡＣＥ−ｔＲＮＡまたはＧ４１８は、３’ＵＴＲの初期領域中でさえ、リボソーム占有の観察可能な変化を一貫して示さなかった。総合すると、リボソームプロファイリングデータは、ＡＣＥ−ｔＲＮＡによる天然の終止コドン抑制の効率は一般的に低く、ＰＴＣ抑制のレベルより顕著に低いことを示す。
考察
【０２３６】
ＰＴＣは、多数のヒト疾患を引き起こし、治療の管理のために確立された治療の選択肢は存在しない。真核生物細胞およびマウス骨格筋中で有効なＰＴＣ復帰を示すアンチコドン編集ｔＲＮＡのハイスループットクローニングおよび同定、性質決定および機能分析が本実施例に報告されている。とりわけ、スクリーニングは、全体で、既知のヒトの疾患を引き起こすＰＴＣの大半を修復する能力を有するＡＣＥ−ｔＲＮＡを同定する。操作されたｔＲＮＡは、その同族アミノ酸を忠実にコードし、このため、下流のタンパク質の安定性、折り畳みおよび輸送に対する疑似効果をなくし、その結果、タンパク質折り畳み因子または輸送因子を伴うタンデム治療（ｔａｎｄｅｍ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ）の必要性を無効にする。ｃＤＮＡとして形質移入されると、ＡＣＥ−ｔＲＮＡは、ＰＴＣ抑制を介して複数の完全長タンパク質、ＮＬｕｃルシフェラーゼレポーター、モデルタンパク質ＨＤＨおよびＣＦＴＲ中の２つの疾患ナンセンス変異をレスキューした。ＡＣＥ−ｔＲＮＡＡｒｇ  ｃＤＮＡによって、マウス骨格筋中での強力かつ安定なインビボでのＰＴＣ抑制が示され、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ活性に対する特に高いレベルの細胞の耐容性を示唆している。筋肉中でのアルギニンに対する活性なＡＣＥ−ｔＲＮＡの同定は、ナンセンス変異によって引き起こされるジストロフィン異常症の処置に適している。多くの遺伝的疾患と同様に、ジストロフィン異常症の１０％超は、ナンセンス変異によって引き起こされ４３、ＣＧＡ→ＴＧＡ変異が最もよく見られる４３。合成ＲＮＡ転写物として送達されたＡＣＥ−ｔＲＮＡによっても、効率的な抑制が達成され、これにより、ナノ粒子製剤の開発が可能となる。各組織および疾患の種類に対する理想的なｔＲＮＡ送達戦略を評価するために、将来の研究が必要とされ、おそらく、核酸送達のための急速に拡大する技術が取り組みに役立つであろう。
【０２３７】
ＰＴＣを抑制する因子は、天然の終止コドンのリードスルーを生じる潜在性も有する。本明細書に提示されているＲＮＡプロファイリングデータは、一般的には、細胞中では、および試験されたコドン編集ｔＲＮＡについては、これは当てはまらないことを示唆する。Ａｒｇ−ｔＲＮＡＵＧＡおよびＧｌｎ−ｔＲＮＡＵＡＡでは検出可能なリードスルーが見出されたが、Ｇｌｕ−ｔＲＮＡＵＡＧ、ＵＧＡ−Ｇｌｙ−ｔＲＮＡＵＧＡおよびＴｒｐ−ｔＲＮＡＵＧＡでは、広範囲にわたる翻訳終結に対して有意な効果は測定されなかった。この挙動は、明らかに、終止コドンの種類、またはｔＲＮＡの固有のＰＴＣ抑制活性によって分離しなかった。ＡＣＥ−ｔＲＮＡが本当の終止コドンのリードスルーを効果的に促進しない１つの潜在的な理由は、翻訳終結付近にある前後関係の配列ランドスケープ（ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ）を原因とするものであり得る４４。ＰＴＣにおける終結複合体の組成は天然の終止におけるものと異なるという知見によって、この可能性は裏付けられる４５、４６。しかしながら、より低いレベルのリードスルーが起こる場合には、正常な終止のリードスルーとその有害な影響の両方を制約するために、複数の細胞的機序が適切に存在する。遺伝子の末端には、複数のインフレーム終止コドンがしばしば見出され３７−３９、特殊化されたユビキチンリガーゼ４７およびリボソーム関連経路４８が、誤った翻訳終結を有するタンパク質を同定し、分解することが知られている。もっとも、哺乳動物細胞において本実施例で見られた限定的な影響にかかわらず、ＡＣＥ−ｔＲＮＡの送達および発現に関して、所望の細胞または組織型中で、類似のリボソームのプロファイリング実験が行われるべきである。
【０２３８】
以前の研究は、周囲のｍＲＮＡ配列がアミノグリコシドおよびアタルレンＰＴＣの固有の終止コドン抑制効力に影響を及ぼすことを示しているので４９−５２、ＡＣＥ−ｔＲＮＡは同様に影響を受け得る。さらに、ウイルス送達または非ウイルス送達を介した、ＰＴＣ含有遺伝子を置き換えるための遺伝子添加戦略は、いくつかの状況では短期の利益を達成しているが、導入遺伝子の発現レベルを制御することは困難であり得る。これに対して、ＡＣＥ−ｔＲＮＡ抑制を介したタンパク質救出の量は、固有の細胞ＲＮＡレベルに関連しており、このため、より上昇したレベルの発現は本質的に制御される。ヒトゲノム中の可変的なイソアクセプターｔＲＮＡ配列の大半に対して生物学的な目的は未知のままであり、これらの遺伝子のほぼ半分は転写的にサイレントな偽遺伝子であると推測されてきたが５３、個々に提示されたデータは多くの注釈付けられたｔＲＮＡが生存可能であることを示唆している。この可能性と合致して、ＳｅｒおよびＬｅｕイソアクセプターファミリー内の機能的なイソデコーダーｔＲＮＡを同定するために、抑制アプローチが使用されてきた５４。本実施例に提示されたデータは、ゲノム状況から除去されると、大半のｔＲＮＡ遺伝子配列が生存可能な活性を支持することをさらに実証し、複数のｔＲＮＡおよびコドン使用に対する生物学的必要性についての謎をさらに深める。このように、本実施例に記載したハイスループット抑制戦略は、特有の抑制特性を有する新しい種類のｔＲＮＡ配列を同定するために有用であり、このような研究は、新しいＲＮＡ試薬を製造する能力ならびにｔＲＮＡ発現および抑制の分子的理解を進歩させる能力を有する。
材料および方法
ナンセンスレポーターＨＴＣプラスミド
【０２３９】
使用した親プラスミドは、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）であった。ｐＮＬｕｃをコードするｃＤＮＡに、制限部位ＨｉｎｄＩＩＩおよびＸｈｏＩ中にＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｅｄ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、アメリカ）を行った。グリシン（コドンｇｇａ）、トリプトファン（ｔｇｃ）、アンバー（ｔａｇ）、オパール（ｔｇａ）およびオーカー（ｔａａ）を、ｃＤＮＡ  ｐｃｒの間に、アミノ酸位置１６０に付加した。ｐｃｒをベースとしたＧｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙを用いて、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）ポリＡ配列を、ＢｂｓＩ制限部位を有しないもので置き換えた。まず、その後に２つのＢｂｓＩ制限部位（太字斜字体）
【化３】
2021508234.tif 000016
が続くＴ７プロモーター配列（斜字体）
【化４】
2021508234.tif 000017
（Ｙｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００８）を上流に有するヒトｔＲＮＡＴｙｒ遺伝子（太字）の５’リーダー配列およびその後にリバースＴ３プライマー配列（斜字体）が続く３’終結配列（太字）
【化５】
2021508234.tif 000018
を挿入することによって、ハイスループットＡＣＥ−ｔＲＮＡ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅクローニング部位を作製した。
ＡＣＥ−ｔＲＮＡライブラリーのＨＴＣ
【０２４０】
ｔＲＮＡ遺伝子配列は、ｔＲＮＡデータベース、ｔＲＮＡｓｃａｎ−ＳＥ（ｈｔｔｐ：／／ｇｔｒｎａｄｂ．ｕｃｓｃ．ｅｄｕ／ｉｎｄｅｘ．ｈｔｍｌ；ＰＭＩＤ：２６６７３６９４）から得た。本研究で用いた全てのｔＲＮＡ遺伝子の配列は、図２６および表９において付番されている。ｔＲＮＡ配列は、その対応するアンチコドン（ＵＡＧ、ＵＧＡまたはＵＡＡ）を適切に変異して、２００ｐｍｏｌのスケールで、９６ウェルフォーマットで、Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ＩＤＴ、アメリカ）から得た相補的Ｕｌｔｒａｍｅｒｓとして合成した。全てのｔＲＮＡ配列は、それぞれ、フォワードおよびリバースオリゴ上にＣＧＡＣおよびＧＧＡＣ突出部（５’→３’で表記）を有するように合成した。１００ｎｇ／μＬになるようにアニーリング緩衝液（１００ｍＭ酢酸カリウム；３０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５）中に再懸濁することによって、Ｕｌｔｒａｍｅｒｓをアニールし、９６℃まで２分間加熱し、サーモサイクラー中で、１℃／分で４℃まで冷却した。９６ウェルＰＣＲプレート中では、各ウェルは、１０ｎｇの適切なＰＴＣコドンを有するＨＴＣプラスミド、２ｎｇのＡＣＥ−ｔＲＮＡ二本鎖、１ｍＭ  ＡＴＰ、１０ｍＭ  ＤＴＴ、４００単位のＴ４  ＤＮＡリガーゼおよび１０単位のＢｂｓＩ−ＨＦを含有し、ｄｄＨ２Ｏで１０μＬになるように列に並べた（ｑｕｅｕｅｄ）。９６ウェルプレートは、サーモサイクラー中で、以下のようにサイクルを行い、（［３７℃で５分、２０℃で５分］×３０サイクル、３７℃で１０分、８０℃で１０分、４℃まで冷却した。ディープウェルの９６ウェルプレート中で、１０μＬの化学的に形質転換受容性のあるＤＨ５α細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、アメリカ）に、１μＬのＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応物を添加し、４２℃で３０秒間、熱ショックを加え、１００μＬのＳｕｐｅｒ  Ｏｐｔｉｍａｌ  Ｂｒｏｔｈ（Ｓ．Ｏ．Ｃ．；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ，アメリカ）中に再懸濁した。３７℃、１時間、２５０ｒｐｍで、形質転換体を増殖させ、次いで、１００μｇ／ｍＬカルベニシリンが補充された２ｍＬのＬｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ液体培地（ＬＢ）に添加し、被覆されたディープ４８ウェルプレート中において、３７℃で２０時間、３００ｒｐｍで成長させた。大腸菌の増殖は、ディープウェルプレートおよびＥｎｚｙｓｃｒｅｅｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ．ｃｏｍ）のクランプ中で行った。大腸菌懸濁培養物を沈降させ（室温で１０分、４，０００ｇ）、プラスミドＤＮＡを調製し、１２５ｎｇ／μＬまで希釈した（ＩＢＩ  ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，アメリカ）。全てのクローンは、配列を確認した。この方法を用いて、１００％のクローニング効率が達成された。
ＡＣＥ−ｔＲＮＡライブラリーのＨＴＳ
【０２４１】
形質移入の前日に、１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンが補充されたダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、アメリカ）中、９６ウェル細胞培養物処理プレート中に、ＨＥＫ２９３細胞（４０継代未満）を１．４×１０４細胞／ウェルで播種した。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ遺伝子を有するオールインワンナンセンスレポーターを、プレート当たり３つ組で、Ｃａｌｆｅｃｔｉｎ（Ｓｉｇｎａｇｅｎ、アメリカ）を用いて形質移入した。形質移入の１６時間後に、培地を吸引し、２０μＬのＰＢＳを各ウェルに添加した。１５μＬの溶解性Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ（登録商標）Ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  Ａｓｓａｙ  Ｒｅａｇｅｎｔを各ウェルに添加した（１：５０  試薬対緩衝液；Ｐｒｏｍｅｇａ、アメリカ）。回転振盪後に、プレートを２分間インキュベーションし、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ｉ３プレートリーダーを用いて読み取った（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、アメリカ；積分時間、２００ｍ秒；全ての波長は、エンドポイントモードで収集した）。各実験に対して、３つのウェルにわたって、発光を平均し、この様式で、全てのＡＣＥ−ｔＲＮＡを３回より多く繰り返した。各プレートは、形質移入効率およびベースラインＰＴＣリードスルーに対する対照としての役割を果たすために、ＡＣＥ−ｔＲＮＡなしのオールインワンナンセンスレポーターで形質移入されたウェルも３つ組で含有した。全ての値は、ベースラインＰＴＣリードスルー発光を上回るＡＣＥ−ｔＲＮＡ発光の比±ＳＥＭとして報告されている。一元配置ＡＮＯＶＡは、所定のアミノ酸ファミリー中の全てのＡＣＥ−ｔＲＮＡにわたって、チューキーの事後分析を用いて行った。
ＣＦＴＲ、ＨＤＨ−ｈｉｓ−ｓｔｒｅｐおよび４×ＡＣＥ−ｔＲＮＡ発現プラスミド
【０２４２】
哺乳動物細胞中での発現のために、ＫｐｎＩおよびＸｂａＩ制限酵素を用いて、ヒトＣＦＴＲのコード領域および３’非翻訳領域（ＵＴＲ）の２００塩基対に対するｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（＋）（Ｐｒｏｍｅｇａ、アメリカ）中にライゲーションした。Ｇ５４２ｔｇａおよびＷ１２８２ｔｇａ変異は、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  ＩＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ、アメリカ）を用いて導入した。アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞中での発現のために、ヒトＣＦＴＲのコード領域および５’の１４０塩基対および２４４塩基対の３’ＵＴＲに対するｃＤＮＡをｐＧＥＭ−ＨＥ（Ｐｒｏｍｅｇａ、アメリカ）中にライゲーションした。Ｇ５４２ｔｇａおよびＷ１２８２ｔｇａ変異はいずれも、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  ＩＩを用いて導入した。大腸菌ヒスチジノール脱水素酵素をコードするｃＤＮＡを、ムス・ムスクルス（ｍｕｓ  ｍｕｓｃｕｌｕｓ）に対してコドン最適化し、哺乳動物細胞からのタンパク質精製のためのｃ末端８×Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐ−ｔａｇを付けて合成した（ＢｉｏＢａｓｉｃ  Ｉｎｃ、カナダ）。ＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ制限部位を用いて、合成されたｃＤＮＡをｐｃＤＮＡ３．１（＋）中にライゲーションした。ナンセンス変異ｔａｇ、ｔａａおよびｔｇａは、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ  ＸＬ  ＩＩを用いて導入した。多重化ＡＣＥ−ｔＲＮＡ発現プラスミドを作製するために、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄＩＩＩ制限部位の間に、ＢｂｓＩ「多重クローニング部位」
【化６】
2021508234.tif 000019
；方向性ＢｂｓＩ認識配列は斜字体であり、ライゲーションのためのユニークな４塩基対突出部は太字である。）を挿入することによって、新規親Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  ｐＵＣ５７（ａｍｐ）プラスミドを作製した。サイズが相対的に小さく、骨格ＢｂｓＩ制限部位ならびにＴ７およびＴ３プロモーター配列を欠くので、ｐＵＣ５７（ａｍｐ）を親プラスミドとして選択した。ＨＴＳプラスミド中に含まれる特徴は、ＡＣＥ−ｔＲＮＡカセットに隣接するＴ７およびＴ３プロモーター配列であり、ｐｃｒ増幅にとって理想的な同等の融解温度（Ｔｍ）を有するユニバーサルプライマー結合配列を与える。ＮＥＢ  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｔｏｏｌ（ｈｔｔｐｓ：／／ｇｏｌｄｅｎｇａｔｅ．ｎｅｂ．ｃｏｍ／ｅｄｉｔｏｒ）を用いて、Ｔ７およびＴ３隣接配列にアニールするｐｃｒプライマーを作製し、遠位のＢｂｓＩ認識配列の切断後に、ユニークな４塩基対突出部を作製した。最終結果は、相補的な４塩基対突出部を通じて「デイジーチェイン（ｄａｉｓｙ−ｃｈａｉｎｅｄ）」することができ、ワンポットＧｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅ反応を用いて、ｐｕｃ５７  Ｇｏｌｄｅｎ  Ｇａｔｅプラスミド中にライゲーションされ得るユニバーサルｐｃｒプライマーを用いた、４つのＡＣＥ−ｔＲＮＡ  ｐｃｒ産物の作製であった。全てのクローンは、配列を確認した。
細胞培養、タンパク質発現およびウェスタンブロット
【０２４３】
高グルコースＤＭＥＭ（Ｇｉｂｃｏ、アメリカ）中に１０％ＦＢＳ（ＨｉＣｌｏｎｅ、アメリカ）、１％Ｐｅｎ  Ｓｔｒｅｐ、１％Ｌ−Ｇｌｕｔを含有する（ｖ／ｖでの％）標準的な成長培地中において、３７℃、５％ＣＯ２で、ＨＥＫ２９３Ｔ細胞（ＡＴＣＣ、アメリカ）を成長させた。標準プロトコールにしたがって（ＳｉｇｎａＧｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、アメリカ）、Ｃａｌｆｅｃｔｉｎを用いて、７５％の集密度でｃＤＮＡを形質移入した。３６時間後に、細胞をこすり取り、０．５μｇ／ｍＬぺプスタチン、２．５μｇ／ｍＬアプロチニン、２．５μｇ／ｍＬロイペプチン、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．７５ｍＭベンズアミジンを補充されたＰＢＳ中において、７，０００ｇで、８分間、４℃でペレット化した。ＣＦＴＲ発現細胞については、１００ｍＭスクロース、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、１ｍＭ  ＤＴＴ、０．５μｇ／ｍＬぺプスタチン、２．５μｇ／ｍＬアプロチニン、２．５μｇ／ｍＬロイペプチン、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．７５ｍＭベンズアミジン、５０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣＬ  ｐｈ７．４中で、細胞ペレットを激しくダウンスホモジナイズし（ｄｏｕｎｃｅｄ）、可溶性細胞質タンパク質から全膜を分離するために１００，０００ｇで遠心した。１％ｔｒｉｔｏｎ、２５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ７．４および０．５μｇ／ｍＬぺプスタチン、２．５μｇ／ｍＬアプロチニン、２．５μｇ／ｍＬロイペプチン、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦ、０．７５ｍＭベンズアミジンを含有する緩衝液中にペレットを可溶化した。１％の２−メルカプトエタノールの存在下で４％スタッキングゲルを有する３〜１５％の分離グラジエントＳＤＳ−ｐａｇｅ上に等しい細胞溶解物をロードし、５５Ｖ  Ｏ／Ｎで分離し、０．４５μＭ  ＬＦ  ＰＶＤＦ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、アメリカ）に移入した。２％脱脂乳中の抗ＣＦＴＲ抗体Ｍ３Ａ７（１：１０００；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、アメリカ）を用いて、ＰＶＤＦをイムノブロットし、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ、アメリカ）上で画像化した。ＨＤＨ−Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐ発現細胞については、１００ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５μｇ／ｍＬぺプスタチン、２．５μｇ／ｍＬアプロチニン、２．５μｇ／ｍＬロイペプチン、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび０．７５ｍＭベンズアミジン中で細胞ペレットを激しくダウンスホモジナイズした。１００，０００ｇで３０分間、４℃で、溶解物を遠心した。１％の２−メルカプトエタノールの存在下での４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ  ＳＤＳ−ｐａｇｅアクリルアミドゲル（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、アメリカ）上で、上清（可溶性細胞タンパク質）を分離し、０．２２μＭ  ＬＦ  ＰＶＤＦ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、アメリカ）に移入し、２％脱脂乳中で抗Ｓｔｒｅｐ抗体（１：５０００；ｉｂａ、ドイツ）を用いてイムノブロットし、ＬＩ−ＣＯＲ  Ｏｄｙｓｓｅｙ  Ｉｍａｇｉｎｇ  Ｓｙｓｔｅｍ（ＬＩ−ＣＯＲ、アメリカ）上で画像化した。
質量分析
【０２４４】
精製されたＨＤＨ−Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタンパク質に対するフラグメンテーションデータは、アイオワ大学プロテオミクスファシリティーで取得した。簡潔に述べると、高速スピンの可溶性画分から得たＨＤＨ−Ｈｉｓ−Ｓｔｒｅｐタンパク質を、Ｓｔｒｅｐ  Ｔｒａｐ  ＨＰカラム（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、スウェーデン）に通過させ、５カラム容積の、１００ｍＭスクロース、１ｍＭ  ＤＴＴ、１ｍＭ  ＥＤＴＡ、２０ｍＭ  ｔｒｉｓ−ＨＣｌ  ｐＨ８．０、０．５μｇ／ｍＬぺプスタチン、２．５μｇ／ｍＬアプロチニン、２．５μｇ／ｍＬロイペプチン、０．１ｍＭ  ＰＭＳＦおよび０．７５ｍＭベンズアミジンで洗浄した。１０ｍＭ  ｄ−デスチオビオチン（ｄｅｓｔｈｂｉｏｔｉｎ）を補充した洗浄緩衝液でタンパク質を溶出し、３０ｋＤＡカットオフＡｍｉｃｏｎ−Ｕｌｔｒａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎカラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、アメリカ）中で濃縮した。濃縮されたタンパク質をＮｕＰａｇｅ４〜１２％Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプレキャストゲル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、アメリカ）上にロードし、１５０Ｖで１．５時間分離した。Ｐｉｅｒｃｅ質量分析適合性銀染色キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）を用いてゲルを染色した。
【０２４５】
ゲル内トリプシン消化。簡潔に述べると、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルからの標的としたタンパク質バンドを手作業で切り出し、１ｍｍ３片に切断し、完全な脱染を達成するために、それぞれ、１００ｍＭ重炭酸アンモニウム：アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）および２５ｍＭ重炭酸アンモニウム／アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）中で洗浄した。さらに、ＡＣＮでゲル片を処理し、ｓｐｅｅｄ  ｖａｃを用いて乾燥した。乾燥後、５０μＬの１０ｍＭ  ＤＴＴ中において、５６℃で６０分間、ゲル片を還元し、次いで、室温で３０分間、５５ｍＭ  ＩＡＭによってアルキル化した。過剰なＤＴＴおよびＩＡＭを除去するために、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム：アセトニトリル（１：１、ｖ／ｖ）で２回、ゲル片を洗浄した。乾燥後、２５ｍＭ重炭酸アンモニウム中の１０ｎｇ／μＬのトリプシン溶液５０μＬ中のゲル片を氷上に置き、氷上で６０分間、インキュベートした。次いで、３７℃で１６時間、消化を行った。１００μＬの５０％アセトニトリル／０．２％ギ酸で０．５時間、２回、ペプチド抽出を行った。約１５μＬまで、Ｓｐｅｅｄ  Ｖａｃ中で、合わせた抽出物を濃縮した。
【０２４６】
ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ。質量分析データは、Ｅｋｓｉｇｅｎｔ  Ｅｋｓｐｅｒｔ（商標）ｎａｎｏＬＣ  ４２５  Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｃｉｅｘ）に連結されたＯｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎ  Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて収集した。Ｔｒａｐ−Ｅｌｕｔｅ  Ｊｕｍｐｅｒ  Ｃｈｉｐ（製品番号：８００−００３８９）および連結された１／１６’’１０ポートＶａｌｃｏが、グラジエント１ポンプによって行われるロードおよび（グラジエント２ポンプによる）最終溶出を方向づけた。カラムの組み立ては、ｅｋｓｐｅｒｔ（商標）ｃＨｉＰＬＣシステム中に取り付けられた２つのタンデム７５μｍ×１５ｃｍカラム（ＣｈｒｏｍＸＰ  Ｃ１８−ＣＬ、３μｍ１２０Ａ、ＡＢ  ＳＣＩＥＸのＥｋｓｉｇｅｎｔ部分）としてデザインした。各注射について、概ね０．５μｇの全消化物をロードした。ペプチドは、緩衝液Ａが０．１％ギ酸およびＢが９５％ＡＣＮ、０．１％ギ酸である線形および定常セグメントから構成される１２０分グラジエントを用いて、質量分析計でインライン分離した。グラジエントは、まず３分間、４％での維持を開始し、次いで、以下の遷移（％Ｂ、分）を行う。（２６、４８）（３５、５８）、（３５、６４）、（５０、７２）、（５０、７８）、（９４、８４）、（９４、９６）、（４、１００）、（４、１２０）。
【０２４７】
ＬＵＭＯＳ  Ｏｒｂｉｔｒａｐ上でのタンデム質量分析  スキャン系列は、軸外Ｏｒｂｉｔｒａｐセグメント（ＭＳ１）中において、６０，０００の分解能で、Ｏｒｂｉｔｒａｐ  Ｆｕｓｉｏｎ  Ｌｕｍｏｓ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ）上で獲得されたフルサーベイ（ｍ／ｚ  ３５０〜１５００）から始まった。上記１２０分のグラジエントの間、３秒ごとのグラジエントＭＳ１スキャンが獲得された。２．０Ｅ５の閾値で、２〜８つの荷電状態イオンの中から、最も豊富なプリカーサーを選択した。イオンが前回の３０秒中に２回標的とされた場合には、イオンは、３０秒間、動的に除外された。ｍ／ｚ  ２に質量ウィンドウを有するマルチセグメント四極子によって、選択されたイオンを単離し、次いで、それぞれ、ＩＴおよびイオンルーティング（ｉｏｉｎ  ｒｏｕｔｉｎｇ）多重極中で、ＣＩＤおよびＨＣＤ活性化条件の両方に順次供した。ＣＩＤに対するＡＧＣターゲットは、４．０Ｅ０４、３５％衝突エネルギー、０．２５のＱ値（ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ  Ｑ）および１００ミリ秒の最大充填時間であった。標的とされたプリカーサーは、４０％衝突エネルギーおよび０．２５のＱ値で、高エネルギー衝突誘起解離（ＨＣＤ）によっても断片化された。ＨＣＤ断片イオンは、Ｏｒｂｉｔｒａｐ（ＡＧＣ  １．２Ｅ０５、最大注入時間１１０ｍ秒および分解能は４００Ｔｈで３０，０００に設定）を用いて分析した。両ＭＳ２チャンネルはセントロイドとして記録され、ＭＳ１サーベイスキャンは、プロファイルモードで記録した。
【０２４８】
プロテオミクス検索。最初のスペクトル検索は、Ｓｅｑｕｅｓｔ  ＨＴを用いて、Ｐｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒバージョン２．１．１．２１（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）によって行った。スペクトルは、Ｂｙｏｎｉｃ検索エンジン（Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｍｅｔｒｉｃｓ）バージョン２．８．２によっても検索した。検索データベースは、９２６４５配列を含有する２０１６年１０月２４日にダウンロードされた種９６０６（ヒト）に対するＵｎｉｐｒｏｔ  ＫＢおよび１００７９配列を含有する２０１６年１１月８日にダウンロードされた分類学５６２（大腸菌）に対するＵｎｉｐｒｏｔＫＢから成った。Ｂｙｏｎｉｃ検索のために、これら２つのデータベースは直接連結された。いずれの検索においても、等しい数のデコイ入力を作製し、Ｔａｒｇｅｔデータベース中で元の入力を逆転させることによって同時に検索した。
【０２４９】
インビトロｃＲＮＡ転写。１０倍過剰のＮｈｅＩ−ＨＦ制限酵素（コード領域の３’に位置する部位）（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、アメリカ）によって、３７℃で３時間、Ｇ５４２ＸＵＧＡ、Ｗ１２８２ＸＵＧＡおよびＷＴ  ＣＦＴＲ  ｐＧＥＭＨＥ（Ｍｅｎｓｅ  ｅｔ  ａｌ．，２００６；ＰＭＩＤ：１７０３０５１）プラスミドを直鎖化し、標準的なｃＤＮＡ沈殿法を用いて精製した。ｍＭｅｓｓａｇｅ  ｍＭａｃｈｉｎｅ  Ｔ７キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）を用いて、全てのｃＲＮＡを転写した。転写反応からのｃＲＮＡの精製は、ＲＮｅａｓｙ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ）から得たカラム上で行った。濃度は、２６０ｎｍでの吸光度測定によって決定され、１％アガロースゲル（ＲＮアーゼなし）上で質を確認した。全てのｃＲＮＡは、使用前に１μｇ／ｍＬの列を作り（ｑｕｅｕｅｄ）、全ての結果は、２つ以上のｃＲＮＡ調製物から得られた。
【０２５０】
インビトロｔＲＮＡ転写。ＣｅｌｌＳｃｒｉｐｔ  Ｔ７−Ｓｃｒｉｂｅ  Ｓｔａｎｄａｒｄ  ＲＮＡ  ＩＶＴ  Ｋｉｔ（ＣＥＬＬＳＣＲＩＰＴ、アメリカ）を用いて、最も性能がよいＴｒｐおよびＧｌｙ  ＡＣＥ−ｔＲＮＡであるＴｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９およびＧｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２を、インビトロで転写した。ＡＣＥ−ｔＲＮＡをコードし、Ｔ７プロモーター（斜字体）が前に置かれたＡＣＥ−ｔＲＮＡ  ＰＡＧＥ精製されたＵｌｔｒａｍｅｒ（２０μｇ；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ  ＤＮＡ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ）に、等モル濃度のＴ７オリゴ（５’−ｔａａｔａｃｇａｃｔｃａｃｔａｔａ−３’）をアニールした。重要なこととして、ＣＣＡを含有する３つの末端ヌクレオチドが含められた（太字）。
【化７】
2021508234.tif 000020
【０２５１】
総反応容量を１００μＬに調整し、キット試薬を以下の量で添加した。１０μＬの１０Ｘ  Ｔ７−Ｓｃｒｉｂｅ転写緩衝液、７．５μＬの各ヌクレオチド（１００ｍＭ原液）、１０μＬの１００ｍＭジチオスレイトール、２．５μＬＳｃｒｉｐｔＧｕａｒｄ  ＲＮアーゼ阻害剤、１０μＬのＴ７−Ｓｃｒｉｂｅ酵素溶液。３７℃で４〜５時間、反応物をインキュベーションした後、キットとともに提供された５μＬのＤＮアーゼ（１Ｕ／μＬ）で３０〜６０分間、ＤＮＡテンプレートを消化した。酸性フェノールクロロホルム（５：１、ｐＨ４．５）を用いて、ＡＣＥ−ｔＲＮＡを反応物から抽出し、エタノールで沈殿させた。沈殿物ＡＣＥ−ｔＲＮＡをペレットとし、洗浄し、乾燥し、１００μＬのＤＥＰＣ処理された水の中に再懸濁し、Ｃｈｒｏｍａ  Ｓｐｉｎ−３０カラム（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、アメリカ）でさらに精製した。この手順によって、概ね１００μＬの約５μｇ／μＬＡＣＥ−ｔＲＮＡが得られた。２０μｇのアリコートで、ＡＣＥ−ｔＲＮＡを再度ペレットとし、洗浄し、凍結乾燥し、使用まで−８０℃で保存した。全ての結果は、２つ以上のＡＣＥ−ｔＲＮＡ調製物から得られた。
【０２５２】
リボソームフットプリントプロファイリングライブラリーの調製  ＡＣＥ−ｔＲＮＡおよび対照プラスミド（ｐｕｃ５７ＧＧ）で一過性に形質移入されたＨＥＫ２９３細胞を、Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐの非存在下で４８時間、標準的な成長培地中で成長させた。少しの改変を加えて、記載されているとおりに５５、ライブラリーを調製した。簡潔に述べると、氷冷したＰＢＳの添加によって、細胞を急速に冷却し、溶解緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、１ｍＭ  ＤＴＴ、１％（ｖ／ｖ）ＴｒｉｔｏｎＸ−１００および２５Ｕｍｌ−１Ｔｕｒｂｏ  ＤＮａｓｅ  Ｉ）中で、氷上で１０分間溶解し、２６Ｇ針を１０回通してトリチュレーションを行った。４℃で１０分間、１６，０００ｇでの遠心による除去後、２００ＵのＲｉｂｏＬｏｃｋ  ＲＮアーゼ阻害剤（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を添加する前に、穏やかに撹拌しながら、室温で４５分間、Ａ２６０溶解物当たり１００ＵのＲＮアーゼＩ（Ａｍｂｉｏｎ、アメリカ）を用いて、溶解物を消化した。次いで、改変されたポリソーム緩衝液（２０ｍＭ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ／ｐＨ７．４、１５０ｍＭ  ＮａＣｌ、８．５ｍＭ  ＭｇＣｌ２、０．５ｍＭ  ＤＴＴ、２０  Ｕ  ｍｌ−１ＲｉｂｏＬｏｃｋ  ＲＮアーゼ阻害剤）中に調製された１Ｍスクロースクッション上に溶解物を載せることによって、リボソーム保護されたｍＲＮＡ断片を単離し、Ｂｅｃｋｍｅｎ  ＴＬＡ−１１０ローターを用いて、４℃で２時間、７０，０００ｒｐｍで遠心した。ＴＲＩｚｏｌを用いてｍＲＮＡフットプリントを含有するリボソームペレットを抽出し、８Ｍ尿素を含有する変性１２％ポリアクリルアミドゲル上で分離した。ＳＹＢＲ  Ｇｏｌｄ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で染色されたゲルから、２６〜３４ｎｔの範囲のサイズを有するＲＮＡ断片を手作業で切り出し、リボソーム保護された断片のライブラリーを作製するために単離した。Ｒｉｂｏ−Ｚｅｒｏキット（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いて、夾雑するｒＲＮＡ断片を枯渇させた。３’オリゴヌクレオチドアダプターライゲーション、逆転写、環状化およびビオチン化されたｒＲＮＡ枯渇オリゴ（表９）を用いた二度目のｒＲＮＡ枯渇は、記載されているとおりに行った５５。ＰＣＲ増幅の間に、各試料に対してインデックスプライマーを使用して、ライブラリーにバーコードを付けた。次いで、３％ＰｈｉＸ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）とともに、バーコードが付けられたライブラリーをプールし、典型的には、試料当たり１８００万〜２７００万の読み取り情報を生成するために、製造業者のプロトコールのとおりに、Ｉｌｌｕｍｉｎａ  ＮｅｘｔＳｅｑ５００中で配列を決定した。
【０２５３】
リボソームフットプリントデータ解析。ｒＲＮＡ夾雑物の読み取り情報を除去するために、ＨＩＳＡＴ２．０．３５６を用いて、まず、各バーコードが付けられた試料（３’末端のアダプター配列を差し引いた）に対するデータファイルを、４つのｒＲＮＡ配列（ＲＮＡ５Ｓ１；ＮＲ＿０２３３６３、ＲＮＡ５−８ＳＮ５；ＮＲ＿００３２８５、ＲＮＡ１８ＳＮ５；ＮＲ＿００３２８６およびＲＮＡ２８ＳＮ５；ＮＲ＿００３２８７）にマッピングした。各ヒト遺伝子（ＵＣＳＣ  ＲｅｆＳｅｑ  ＧＲＣｈ３８）の最も長い転写物バリアントのセンス鎖に、残りの読み取り情報を整列させた。少なくとも７５ｎｔの３’ＵＴＲ長さを有する転写物（１８，１０１配列）を配列分析のために使用した。読み取り情報の５’末端での最大２つのミスマッチを許容した。多重マッピングされた読み取り情報は全て廃棄した。２６〜３４ｎｔの長さを有する断片読み取り情報をリボソームフットプリントと定義し、分析のために使用した。各フットプリントからの５’末端ヌクレオチドに注釈を付け、各転写物上にマッピングした。各フットプリントの１６番目〜１８番目のヌクレオチドを占めるリボソームＡ部位の位置を５７，５８、各転写物上でのリボソームの位置を推測するために使用した。それぞれの個別の転写物（１８，１０１配列）上のＲＰＫＭ（合計１００万のマッピングされた読み取り情報当たりの、転写物のキロベース当たりのフットプリント読み取り情報（ｆｏｏｔｐｒｉｎｔ  Ｒｅａｄｓ  Ｐｅｒ  Ｋｉｌｏｂａｓｅ  ｏｆ  ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ  ｐｅｒ  ｔｏｔａｌ  Ｍｉｌｌｉｏｎ−ｍａｐｐｅｄ  ｒｅａｄｓ））を計算した。２つの複製ライブラリーにおいて、コード配列では５ＲＰＫＭ、３’ＵＴＲ領域では０．５ＲＰＫＭの最小閾値を有する転写物のみを（Ｇ４１８では２５４転写物、ＡＣＥ−ｔＲＮＡでは４９５〜７４８転写物）、図２４Ａにおける分析のために含めた。図２Ｂにおけるトランスクリプトーム全体のメタ遺伝子プロットについては、終止コドンの最初のヌクレオチドに対して−３５〜＋６５ｎｔの領域内にある各ヌクレオチドに対するフットプリント数は、合計１００万のマッピングされた読み取り情報当たりに正規化した。全ての転写物（１８，１０１配列）をマッピングのために使用し、５，２００を超える転写物が、関心のある領域中の少なくとも１つのフットプリントにマッピングされた。次に、本発明者らは、ＡＣＥ−ｔＲＮＡであるＧｌｙｃｈｒ１９．ｔｒｎａ２およびＴｒｐｃｈｒ１７．ｔｒｎａ３９がＰＴＣを救うインビボでの生物活性を調べた。配列決定データは、Ｇａｌａｘｙプラットフォーム５９を用いて分析した。グラフは、Ｐｒｉｓｍ  ７（ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ）を用いて作成した。
【０２５４】
安定なＮＬｕｃレポーター細胞株の作製。Ｇｉｂｓｏｎ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ（Ｎｅｗ  Ｅｎｇｌａｎｄ  Ｂｉｏｌａｂｓ、アメリカ）を用いて、レトロウイルスベクターｐＱＣＸＩＰ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ、アメリカ）の多重クローニング部位内のＡｇｅＩおよびＮｏｔＩ制限部位中に、アミノ酸位置１６０にｔａｇ、ｔａａおよびｔｇａ終止コドンを有するｐＮＬｕｃをコードするｃＤＮＡを挿入した。Ｃａｌｆｅｃｔｉｎ（ＳｉｇｎａＧｅｎ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、アメリカ）を用いて、ＰｈｏｅｎｉｘＧＰ細胞（ＰＭＩＤ：７６９０９６０）を、ｐＮＬｕｃ−ＳＴＯＰ−ｐＱＣＸＩＰおよびｃｍｖ−ＶＳＶ−Ｇ（ＶＳＶ−Ｇ外被シュードタイピング）プラスミドで共形質移入し、３３℃のＣＯ２調節された（５％）細胞恒温器中に、４８時間置いた。レトロウイルスの粒子を含有する培地（２０ｍｌｓ）を４℃に冷却し、細胞細片を除去するために１０，０００ｇで遠心し、０．４５μｍＭＣＥ膜シリンジフィルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、アメリカ）を通して、３０％の集密度で、低継代ＨＥＫ２９３細胞が播種された２つの１０ｃｍ皿上にろ過した。細胞培養皿をＰａｒａｆｉｌｍで密封し、９０分間、３，５００ｇで、２４℃で遠心し、３７℃のＣＯ２調節された（５％）細胞培養恒温器中に置いた。対照皿（感染なし）が完全な細胞死を示すまで、ピューロマイシン（１μｇ／ｍＬ）で、２４時間後に細胞を選択した。ＦＡＣＳを用いて、９６ウェルプレート中に細胞を単分散し、続いて、クローン集団を単分散した。実験操作の間、選択されたクローンを維持するために、ピューロマイシンは使用せず、全ての研究において、標準的なＤＭＥＭ培地（ＤＭＥＭ−ダルベッコ変法イーグル培地−１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンが補充された、Ｌ−グルタミンを加えた高グルコース；Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、アメリカ）を使用した。
【０２５５】
ＲＮＡ形質移入。１０％ＦＢＳ、１％Ｐｅｎ／Ｓｔｅｐおよび２ｍＭ  Ｌ−グルタミンが補充されたダルベッコ変法基本培地（ＤＭＥＭ）（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、アメリカ）中の、９６ウェル細胞培養処理されたプレート中に、ｐＮＬｕｃ−ＵＧＡを安定に発現するＨＥＫ２９３細胞を１．４×１０４細胞／ウェルで播種した。１６〜２４時間後に、リポフェクタミン２０００（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、アメリカ）を用いて、ＡＣＥ−ｔＲＮＡで細胞で形質移入した。簡潔に述べれば、１５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭ中に３μｇのＡＣＥ−ｔＲＮＡを懸濁し、１２μＬのリポフェクタミン２０００を１５０μＬのＯｐｔｉＭＥＭと混合した。この容量を合わせ、完全に混合し、室温で１０分間インキュベートした。７５μＬの形質移入複合体を各ウェルに添加した。ＡＣＥ−ｔＲＮＡ転写物によるＰＴＣ抑制は、上述のように定量した。
【０２５６】
アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ  ｌａｅｖｉｓ）卵母細胞中での発現。アフリカツメガエル卵母細胞（ステージＶおよびＶＩ）は、Ｅｃｏｃｙｔｅ（Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）から購入した。注入前に、各ＡＣＥ−ｔＲＮＡペレットを２μＬのｄｄＨ２Ｏ中に再懸濁し、細片を２１，０００×ｇ、４℃で、２５分間ペレットにした。ＣＦＴＲチャンネル救出に対するＡＣＥ−ｔＲＮＡの用量応答を測定するために、ｄｄＨ２Ｏで容量のバランスを取ったＡＣＥ−ｔＲＮＡ分割試料の系列希釈物を作製した（２００、１００、５０、２５、１２．５、６．２５、３．１２５および１．５６２ｎｇ／卵母細胞）。全ての実験において、卵母細胞当たり２５ｎｇのＣＦＴＲ  ｃＲＮＡを注入し、注入容量は５０ｎＬであった。ＡＣＥ−ｔＲＮＡなしのバックグラウンド対照実験では、ｄｄＨ２Ｏを使用した。注入後に、１８℃で３６時間、ＯＲ−３（５０％ライボヴィッツ培地、２５０ｍｇ／Ｌゲンタマイシン、１ｍＭ  Ｌ−グルタミン、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６））中に卵母細胞を保った。
【０２５７】
二電極電圧クランプ（ＴＥＶＣ）法による記録。ＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流は、以下のものを（ｍＭで）含有するＮＤ９６槽溶液中で記録した。最大ＣＦＴＲ活性化カクテル、ホルスコリン（１０μＭ；アデニル酸シクラーゼ活性化因子）および３−イソブチル−１−メチルキサンチン（１ｍＭ；ホスホジエステラーゼ阻害剤）の存在下で、９６ＮａＣｌ、２ＫＣｌ、１ＭｇＣｌ２および５ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）。３Ｍ  ＫＣｌを再充填（ｂａｃｋｆｉｌｌｅｄ）したガラス微小電極は、０．５〜２ＭΩの抵抗を有していた。データは、１ｋＨｚでフィルターをかけ、ｐＣｌａｍｐ９．２ソフトウェア（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ、アメリカ）によって調節されたＤｉｇｉｄａｔａ１３２２Ａを用いて、１０ｋＨｚでデジタル化した。ＯＣ−７２５Ｃ電圧固定増幅器（Ｗａｒｎｅｒ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ、アメリカ）を用いて、−６０から＋３５ｍＶまで、５ｍＶ電圧ステップを使用して、ＣＦＴＲ電流を誘発した。ＣＦＴＲ  Ｃｌ−電流が−２０ｍＶの正に反転した卵母細胞は廃棄した。電流分析のために、Ｃｌａｍｐｆｉｔ９．２ソフトウェアを使用した。全ての値は、平均±ＳＥＭとして表されている。
【０２５８】
動物およびインビボでの画像化。Ｎｕ／Ｊマウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ  ｌａｂｓから購入した。動物実験は、ウィスター研究所の所内動物実験委員会によって承認された（プロトコール番号：１１２７６２）。マウスは、前脛骨筋中に、３０μＬの水中に再懸濁された１０〜２０μｇのＤＮＡを注射した後に、電気穿孔によって処置された。１０μｇのｐＮａｎｏ−ＴＧＡ＋１０μｇのＡｒｇＡＣＥ−ｔＲＮＡ（右前脛骨筋（ｒｉｇｈｔ  ｔｉｂｉａｌｉｓ  ａｎｔｅｒｉｏｒ））または１０μｇのｐＮａｎｏ−ＴＧＡ＋１０μｇの空のｐＵＣ５７（左前脛骨筋）を３匹のマウス中に注射した。対照として、３匹の他のマウスに、１０μｇのｐＮａｎｏ−ＷＴ（右前脛骨筋；陽性対照）または水（左前脛骨筋；陰性対照）を注射した。ＤＮＡは、３３３ＩＵ／ｍＬのヒアルロニダーゼ（Ｓｉｇｍａ）とともに調合した。ＤＮＡ注射の１分後に、ＣＥＬＬＥＣＴＲＡ  ３Ｐ装置（Ｉｎｏｖｉｏ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）を用いた電気穿孔を行った。腹腔内に１００μＬのフリマジン（Ｎａｎｏ−Ｇｌｏ基質の４０倍希釈）を注射することによって、マウス中で、Ｎａｎｏｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ活性を画像化し、注射から５分後に、ＩＶＩＳ  Ｓｐｅｃｔｒｕｍ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）上でマウスを画像化した。画像化はオープンフィルターを用いて行い、４０秒で画像を取得した。画像は、Ｌｉｖｉｎｇ  Ｉｍａｇｅ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）を用いて分析した。
【０２５９】
表９  ＰＴＣ抑制活性に関してスクリーニングされた、ｔＲＮＡの注釈付けられた配列のライブラリー。各配列に対する斜字体の文字は、アンチコドン編集の部位を示す。太字の文字は、バックグラウンドより５倍高い抑制活性を有するｔＲＮＡを示す。ｔＲＮＡでは、チミジンはウラシルで置き換えられていることに注意されたい。
【表９−１】
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【表９−２】
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【表９−３】
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【表９−４】
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【表９−５】
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【表９−６】
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【表９−７】
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【表９−８】
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【表９−９】
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【表９−１０】
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【表９−１１】
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【表９−１２】
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【表９−１３】
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【表９−１４】
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【表９−１５】
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【表９−１６】
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【表９−１７】
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【表９−１８】
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【表９−１９】
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【表９−２０】
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【表９−２１】
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【表９−２２】
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【表９−２３】
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【表９−２４】
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【表９−２５】
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【表９−２６】
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【表９−２７】
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【０２６０】
［実施例５］
参考文献
【化８】
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【化９】
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【化１０】
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【化１１】
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【化１２】
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【０２６１】
上記明細書および実施例は本発明を完全に開示し、実施可能にするが、これらは本発明の範囲を限定することを意図するものではなく、本発明の範囲は本明細書に添付される特許請求の範囲によって定義される。
【０２６２】
全ての刊行物、特許および特許出願は、参照により、本明細書に組み込まれる。上記明細書において、本発明は、そのある特定の実施形態に関連して記載され、多くの詳細が例示の目的で記されているが、本発明にはさらなる実施形態の余地があること、および本発明の基本的な原理から逸脱することなく、本明細書に記載されている細部のいくつかは大幅に変更され得ることが当業者に自明である。
【０２６３】
本発明を記載する上での用語「ａ」および「ａｎ」および「ｔｈｅ」および類似の指示語の使用は、本明細書に別段の記載がなければまたは文脈上明確に矛盾しなければ、単数形と複数形の両方を包含するものと解釈すべきである。用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する（ｈａｖｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」は、別段の記載がなければ、非限定的な用語（すなわち、「含むが、限定されない」という意味）として解釈されなければならない。本明細書に別段の記載がなければ、本明細書における値の範囲の記述は、この範囲内に属する各個別の値を個別的に表すことの簡略な方法としての役割を果たすことが単に意図され、各個別の値は、個別的に本明細書に記載されているごとく、本明細書に組み込まれる。本明細書に別段の記載がなければ、または文脈上明らかに矛盾しなければ、本明細書に記載されている全ての方法は、任意の適切な順序で実施することができる。本明細書中に提供されるあらゆる全ての例または例示的な語句（例えば、「など（ｓｕｃｈ  ａｓ）」の使用は、本発明を単によりよく明らかにすることが意図され、別段の主張がなければ、本発明の範囲に限定を加えるものではない。本明細書中のいずれの語句も、主張されていないいずれかの要素が本発明に不可欠であることを示すものと解釈すべきではない。
【０２６４】
本発明を実施するための本発明者らが知る最良の態様を含む本発明の実施形態が本明細書に記載されている。前記記載を読めば、これらの実施形態の変形が当業者に自明なものとなり得る。本発明者らは、当業者が適宜このような変更を利用することを予期し、本発明者らは、本発明が本明細書に具体的に記載されているものとは異なって実施されることを意図する。したがって、本発明は、適用法によって許容されるところにより、本明細書に添付された特許請求の範囲に記載された主題の全ての改変および均等物を含む。さらに、本明細書に別段の記載がなければ、または文脈上明らかに矛盾しなければ、全ての可能なその変形中での上記要素のあらゆる組み合わせが本発明によって包含される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０−１】
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【図１０−２】
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【図１１】
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【図１２−１】
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【図１２−２】
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【図１３−１】
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【図１３−２】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０−１】
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【図２０−２】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３−１】
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【図２３−２】
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【図２４−１】
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【図２４−２】
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【図２５】
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【図２６−１】
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【図２６−２】
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【図２６−３】
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【図２６−４】
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【図２６−５】
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【図２６−６】
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【図２６−７】
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【図２６−８】
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【図２６−９】
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【図２６−１０】
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【図２６−１１】
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【図２６−１２】
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【図２６−１３】
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【図２６−１４】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９Ａ−１】
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【図２９Ａ−２】
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【図２９Ｂ−１】
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【図２９Ｂ−２】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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