(57)【要約】  本発明は、医薬として用いるための脂肪組織由来再生細胞（ADRC）に由来する単離されたCD31+細胞に関する。さらに、本発明は、脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団の再生能をスクリーニングする方法に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
医薬として使用するための、脂肪組織由来再生細胞（ADRC）に由来する単離されたCD31+細胞。
【請求項２】
勃起不全（ED）、リンパ浮腫、クローン病、1型糖尿病、2型糖尿病、心臓および大動脈瘤の血行再建および再生を含む心血管における血管再生の促進、皮膚の傷の再生、骨および軟骨障害、不妊障害、リウマチ性強皮症、括約筋再生を含む筋肉疾患、胃腸管修復、および中枢および抹消神経系疾患からなる群から選ばれる障害の治療および／または軽減に用い、好ましくは勃起不全（ED）、クローン病またはリンパ浮腫の治療および／または軽減に用いる、単離されたCD31+細胞。
【請求項３】
勃起不全が根治的前立腺全摘除術（RP）後の勃起不全であり、たとえば根治的前立腺全摘除術（RP）後の神経損傷に悩む被験者または失禁である被験者における勃起不全である、請求項１または２に記載の使用のための単離されたCD31+細胞。
【請求項４】
勃起不全の治療および／または軽減に用いる、請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離されたCD31+細胞。
【請求項５】
リンパ浮腫の治療および／または軽減に用いる、請求項１または２に記載の単離されたCD31+細胞。
【請求項６】
クローン病の治療および／または軽減に用いる、請求項１または２に記載の単離されたCD31+細胞。
【請求項７】
細胞が使用の24時間以内、たとえば12時間以内、たとえば6時間以内、たとえば3時間以内に被験者から得られたものである、請求項１〜６のいずれか１項に記載の単離されたCD31+細胞。
【請求項８】
細胞が非増殖細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離されたCD31+細胞。
【請求項９】
細胞が増殖細胞である、請求項１〜７のいずれか１項に記載の単離されたCD31+細胞。
【請求項１０】
CD31+細胞が自家移植としての使用のためである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離されたCD31+細胞。
【請求項１１】
細胞がCD34+でもある、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の単離されたCD31+細胞。
【請求項１２】
細胞がCD235a-および／またはCD45-である、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の単離されたCD31+細胞。
【請求項１３】
医薬として使用するための、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞集団を含む組成物。
【請求項１４】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞の量が組成物中の脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の少なくとも5％、たとえば組成物中の生きている脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の少なくとも8％、たとえば少なくとも10％、たとえば少なくとも20％、たとえば少なくとも30％、たとえば少なくとも50％、たとえば少なくとも70％、たとえば少なくとも80％、たとえば少なくとも90％、たとえば少なくとも95％、あるいはたとえば少なくとも99％を構成する、またはCD31+細胞の量は8‐80％の範囲、たとえば8−50％の範囲、あるいはたとえば8−30％を構成する、請求項１３に記載の使用のための組成物。
【請求項１５】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞の量が組成物中の脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の少なくとも80％、たとえば少なくとも90％、たとえば少なくとも95％、たとえば少なくとも99％、あるいはたとえば100％を構成する、請求項１３または１４に記載の使用のための組成物。
【請求項１６】
勃起不全（ED）、リンパ浮腫、クローン病、1型糖尿病、2型糖尿病、心臓および大動脈瘤の血行再建および再生を含む心血管における血管再生の促進、皮膚の傷の再生、骨および軟骨障害、不妊障害、リウマチ性強皮症、括約筋再生を含む筋肉疾患、胃腸管修復、および中枢および抹消神経系疾患からなる群から選ばれる障害の治療および／または軽減に用い、好ましくは勃起不全（ED）、クローン病またはリンパ浮腫の治療および／または軽減に用いるための、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
【請求項１７】
勃起不全が根治的前立腺全摘除術（RP）後の勃起不全である、請求項１６に記載の使用のための組成物。
【請求項１８】
勃起不全の治療および／または軽減に用いる、請求項１３〜１７のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項１９】
リンパ浮腫、好ましくは乳癌関連のリンパ浮腫の治療および／または軽減に用いる、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２０】
クローン病の治療および／または軽減に用いる、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２１】
請求項１〜１２のいずれか１項に記載の細胞の少なくとも1.5x 106の細胞を被験者に投与し、たとえば請求項１から１２のいずれか１項に記載の細胞の少なくとも2x 106の細胞、たとえば少なくとも3x 106の細胞、たとえば少なくとも4x 106の細胞、たとえば少なくとも4.5x 106の細胞を投与する、請求項１３〜２０のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２２】
請求項１から１２のいずれか１項に記載の細胞を2x 106 から 5x 106 の範囲のCD31+ 細胞で被験者に投与し、たとえば2.5x 106 から 4.5x 106の範囲で被験者に投与する、請求項１３〜２１のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２３】
CD34+である細胞の量が、組成物中の脂肪組織由来再生細胞（ADRC）細胞の少なくとも50％を構成し、組成物中の生きている脂肪組織由来再生細胞（ADRC）細胞のたとえば少なくとも60％、たとえば少なくとも70％を構成し、またはCD34+細胞の量が50‐900％の範囲、たとえば50−80％の範囲、あるいはたとえば60−80％を構成する、請求項１３〜２２のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２４】
少なくとも1x 106のCD34+である細胞、たとえば少なくとも5x 106 の細胞、たとえば少なくとも6x 106の細胞、たとえば少なくとも1x 107 の細胞が被験者に投与される、請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の使用のための組成物。
【請求項２５】
以下のものを含むキット：
ｉ．請求項１〜１２のいずれか１項に記載の単離された細胞、および／または請求項１３〜２３のいずれか１項に記載の組成物；および
ｉｉ．疾患、たとえば勃起不全（ED）、リンパ浮腫、クローン病、1型糖尿病、2型糖尿病、心臓および大動脈瘤の血行再建および再生を含む心血管における血管再生の促進、皮膚の傷の再生、骨および軟骨障害、不妊障害、リウマチ性強皮症、括約筋再生を含む筋肉疾患、胃腸管修復、および中枢および抹消神経系疾患からなる群から選ばれる障害の治療および／または軽減に用い、好ましくは勃起不全（ED）、クローン病またはリンパ浮腫の治療および／または軽減に用いるための指示書。
【請求項２６】
以下の工程：
・新しく回収した脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の（予め得た）第1集団を提供すること；そして
Ｉ．CD34+細胞を陽性に選択することにより、前記第1集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第1亜集団を提供すること；そして
ＩＩ．CD31+細胞を陽性に選択することにより、前記第1亜集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第2亜集団を提供し；これによって生きている細胞のCD31+／CD34+亜集団を提供すること；
または
Ｉ．CD31+細胞を陽性に選択することにより、前記第1集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第1亜集団を提供すること；そして
ＩＩ．CD34+細胞を陽性に選択することにより、前記第2亜集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第2亜集団を提供し；これによって生きている細胞のCD31+／CD34+亜集団を提供すること；
または
Ｉ．CD31+／CD34+細胞を陽性に選択することにより、前記第1集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第1亜集団を提供し；これによって生きている細胞のCD31+／CD34+亜集団を提供すること；
または
Ｉ．CD31+細胞を陽性に選択することにより、前記第1集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第1亜集団を提供し；これによって生きている細胞のCD31+亜集団を提供すること、
の各工程を含む、生きているADRC細胞の単離された細胞集団を調製する方法。
【請求項２７】
CD31+細胞を陽性に選択することにより、前記第1集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第1亜集団を提供し；これによって生きている細胞のCD31+亜集団を提供することを含む、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記亜集団の選択はFACSのようなセルソーティングで行う、請求項２６または２７に記載の方法。
【請求項２９】
医薬としての使用について請求項２６〜２８のいずれか１項に記載の方法で得られた／得られる、脂肪組織由来再生細胞（ADRC）脂肪組織に由来する、単離された生きている脂肪組織由来再生細胞（ADRC）。
【請求項３０】
被験者からの脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団の再生能をスクリーニングする方法であって：
・被験者からの単離された脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団を提供すること；
・CD31+である集団中の（生きている）細胞数を決定すること；
・その数を第1の参照レベルと比較すること；そして
・−もしそのCD31+細胞数が第1の参照レベルよりも大きいときには、その脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団が高い再生能をもつことを示す、あるいは
−もしそのCD31+細胞数が第1の参照レベルと同等あるいはそれよりも小さいときには、その脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団が低い再生能をもつことを示す、ことを決定する、
各工程を含む、前記被験者からの脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団の再生能をスクリーニングする方法。
【請求項３１】
もしそのCD31+細胞数が第1の参照レベルよりも小さいときには、そのレベルをより大きい数／濃度に調整することをさらに含む、請求項３０に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、脂肪組織由来間質血管細胞群（SVF）ともよくいわれる、特定の単離された脂肪組織由来再生細胞（adipose-derived regenerative cells: ADRC）に関する。特に、本発明はCD31+  ADRCの医薬用途に関する。さらに、本発明はADRC集団の再生能をスクリーニングする方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
脂肪組織由来再生細胞（ADRC）は脂肪組織から、最も多くは脂肪吸引後の脂肪吸引物から得られる。ADRCは異種の成分からなり、in vivo で血管周囲スペースに由来し、その結果、とりわけ血管構造の強い再生能を有することが示されている間葉系幹細胞を含む、多くの細胞タイプを含む。ADRCは、損傷後の修復を可能にするホルモン、成長因子やサイトカイン（＋非コード低分子RNA）を含む分子を分泌することによって再生の微小環境を作り出し、したがって、in vivo で部位制御された「ドラッグストア」としても作用し、これは血管系となりうる幹細胞に限らない。その治療上の可能性はごく最近になって理解され始め、異なる系統の経路に容易に分化して、骨、軟骨、筋肉、血管やその他の間葉系組織における細胞を生じうる。さらに、ADRCは、内分泌膵臓細胞、肝細胞および種々の神経細胞タイプを含む外胚葉および内胚葉系統へと分化転換することができる。
【０００３】
細胞移植および宿主の双方視点からのADRC生成の作用メカニズムは完全には理解されていない。移植されたADRC移植片の生着が損傷された組織を新しい細胞で再生するのか、またはADRCと組織細胞の直接の相互作用によって、あるいは組織細胞を調節する再生分子を分泌することによる間接作用によって一時的に有益な役割を果たすのかが議論されている。これは極めて重要な問題であり、ADRCが注入される組織に依存すると思われる。また、3つのシナリオの全てが、異種のADRC集団中にある異なるタイプの細胞から同時にまた相乗的に起きるということもおおいにありうる。ADRCは、移植後にたとえば勃起不全やリンパ浮腫に見られるように、大きな再生能を有している。たとえば、Haahrら(EBioMedicine 5 (2016) 204-210)は、根治的前立腺全摘除術後の勃起不全をもつ患者への自家の脂肪組織由来再生細胞の海綿体内注入を開示する。HaahrらはCD31および／またはCD34陽性をもつ細胞については記載していない。Toyserkaniら(Stem Cells Translational Medicine 2016;5:857-859)は、単離された脂肪組織由来の間質細胞を用いるリンパ浮腫の治療を開示する。ToyserkaniらはCD31および／またはCD34陽性をもつ細胞については記載していない。
【０００４】
WO 2014/138793は血管内皮前駆細胞（endothelial progenitor cell: EPC）の単離方法を開示する。より特定すると、自己再生と分化能を示す血管内皮前駆細胞の単離方法を開示する。さらに、最大の内皮幹細胞能はCD31-細胞にあり、一方CD31+細胞は限られたコロニー形成能を示すのみであることも開示する。
【先行技術文献】
【特許文献】
【０００５】
【特許文献１】WO 2014/138793
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Haahrら(EBioMedicine 5 (2016) 204-210)
【非特許文献２】Toyserkaniら(Stem Cells Translational Medicine 2016;5:857-859)
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
したがって、再生特性をもつ改良された単離ADRC集団が有利であり、特にこのようなADRCによるより効率的および／または信頼できる治療プロトコルが有利である。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
たとえば勃起不全やリンパ浮腫に及ぼすADRCの効果にとっては、注入される幹細胞懸濁液が再生プロセスを可能にする、異なる細胞タイプおよび物質の最適混合物を含むことが必須である。
【０００９】
ADRC溶液はBおよびTリンパ球、内皮細胞、線維芽細胞、マクロファージ、周皮細胞、前脂肪細胞およびその他の細胞からなる相対的に異種の細胞集団を含む。本明細書で、ADRC懸濁液にはCD31およびCD34陽性細胞、特にCD31陽性細胞が存在することが重要であることを開示する。これらは血管細胞および幹細胞を血液や間質細胞などの他の細胞から区別するためによく用いられる2つのマーカーである。本発明者らは、CD31+／CD34+、CD31+／CD34-、CD31-／CD34-、CD31-／CD34+ ADRCを区別するためにフローサイトメトリー活性化セルソーティングを用いた。注入されるADRCの数も血管新生、リンパ管新生および臨床効率に及ぼす効果にとって重要であると思われる。
【００１０】
したがって、本発明の目的は再生性質をもつ単離されたADRC集団を提供することである。重要なことに、実施例4は、自家のヒトADRCを単回海綿体内注入することで、根治的前立腺全摘除術後の勃起不全（ED）の男性の勃起を改善する第1相の臨床試験を示す。さらに、ADRC中のCD31+細胞の量を増加することによって治療を改良する。
【００１１】
実施例5は、乳癌関連性リンパ浮腫（BCRL）の女性に自家のADRCを単回注入する第1相の臨床試験を示す。さらに、ADRC中のCD31+細胞の量を増加することによって治療を改良する。
【００１２】
実施例7は、CD31+のヒトADRC亜集団が対応するCD31-よりも管形成を大きく刺激することを示す。特に、CD31+ ADRCは未分画のADRCと比べて優れた血管新生性質を有する。
【００１３】
さらに、実施例8は、新たに単離した自家の脂肪組織由来再生細胞がクローン病関連の瘻孔を有効に治療する第1相の臨床試験を示す。ここでも、多い量のCD31発現細胞を受けた患者で最高の治療効果があるとの相関性があると思われる。
【００１４】
本発明の一面は、医薬用途に用いるための、脂肪組織由来再生細胞（ADRC）に由来する単離された（生きている）CD31+細胞の集団を含む組成物に関する。好ましくは、脂肪組織由来再生細胞（ADRC）に由来する単離された（生きている）CD31+細胞は組成物中の脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の少なくとも80％、たとえば少なくとも90％、たとえば少なくとも95％、たとえば少なくとも99％またはたとえば100％を構成する。
【００１５】
本発明の別の面は、医薬用途に用いるための、脂肪組織由来再生細胞（ADRC）に由来する単離されたCD31+細胞に関する。
【００１６】
本発明のさらに別の面は、以下のものを含むキットに関する：
ｉ．本発明の単離された細胞、および／または本発明の組成物；ならびに
ｉｉ．疾患の治療および／または軽減に用いるための指示書。
好ましくは、キットは本発明の組成物を含む。
【００１７】
本発明のさらに別の面は、被験者からの脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団の再生能をスクリーニングする方法を提供することであり、該方法は以下の工程を含む：
・被験者からの単離された脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団を提供する；
・CD31+である集団中の（生きている）細胞数を決定する；
・その数を第1の参照レベルと比較する；
・−もしそのCD31+細胞数が第1の参照レベルよりも大きいときには、その脂肪組織由来の再生細胞（ADRC）集団が高い再生能をもつことを示す、あるいは
−もしそのCD31+細胞数が第1の参照レベルと同等あるいはそれよりも小さいときには、その脂肪組織由来の再生細胞（ADRC）集団が低い再生能をもつことを示す、
ことを決定する。
既に説明したように、実施例4、5および8は（第1相の臨床試験において）、多数のCD31+細胞をもつADRCは、再生能に関して医薬としてより効率がよいことを示している。実施例7においても、これは確認された。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】図1は、ASC（培養ADRC／SVF細胞）とADRC／SVF細胞の表現型を示す。ASC（黒）とADRC／SVF（白）細胞の間葉系幹細胞マーカーのレベルをフローサイトメトリーで評価し、細胞の2つの群間で顕著な違いが見られた（****p<0.0001）。データは平均±SD、n=3で示し、統計的有意性を2元配置分散分析(ANOVA test)と多重比較検討(Bonferroni post test)を用いて試験した。***p<0.001, ****p<0.0001.
【図２−１】図2は、ヒト人工多能性幹細胞（human induced Pluripotent Stem Cells: hiPSC）が血管分化の過程でCD31およびCD34を共発現することを示す。中胚葉仕様とさらなる血管分化に次いで、iPS細胞の分画がCD31およびCD34を同時に発現し始める。フローサイトメトリーは、全てとはいわないまでも、ほとんどの血管前駆細胞が2つの膜マーカーを共発現することを明らかにした（2A）。各四半部における集団のパーセンテージを示す（平均±SD、n=3）。集団はFMO対照を用いてゲート解析した（2Bおよび2C）。
【図２−２】図2は、ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）が血管分化の過程でCD31およびCD34を共発現することを示す。中胚葉仕様とさらなる血管分化に次いで、iPS細胞の分画がCD31およびCD34を同時に発現し始める。フローサイトメトリーは、全てとはいわないまでも、ほとんどの血管前駆細胞が2つの膜マーカーを共発現することを明らかにした（2A）。各四半部における集団のパーセンテージを示す（平均±SD、n=3）。集団はFMO対照を用いてゲート解析した（2Bおよび2C）。
【図３−１】図3は、勃起不全に悩む被験者に異なる集団のADRCを注入した効果を示す。Y軸−上：IIEF-5スコアで評価した勃起不全。Y軸−下：EHSスコアで評価した勃起不全。X軸：A:注入したADRCの数。B:注入したCD31＋細胞の数。C:注入したCD34＋細胞の数。D:ADRC集団中のCD31+細胞のパーセンテージ。E:ADRC集団中のCD34+細胞のパーセンテージ。このデータは、0から4.2x106までの増加する注入したCD31 (CD31+)発現ADRCの数が勃起不全の回復と強く関連することを示す。
【図３−２】図3は、勃起不全に悩む被験者に異なる集団のADRCを注入した効果を示す。Y軸−上：IIEF-5スコアで評価した勃起不全。Y軸−下：EHSスコアで評価した勃起不全。X軸：A:注入したADRCの数。B:注入したCD31＋細胞の数。C:注入したCD34＋細胞の数。D:ADRC集団中のCD31+細胞のパーセンテージ。E:ADRC集団中のCD34+細胞のパーセンテージ。このデータは、0から4.2x106までの増加する注入したCD31 (CD31+)発現ADRCの数が勃起不全の回復と強く関連することを示す。
【図３−３】図3は、勃起不全に悩む被験者に異なる集団のADRCを注入した効果を示す。Y軸−上：IIEF-5スコアで評価した勃起不全。Y軸−下：EHSスコアで評価した勃起不全。X軸：A:注入したADRCの数。B:注入したCD31＋細胞の数。C:注入したCD34＋細胞の数。D:ADRC集団中のCD31+細胞のパーセンテージ。E:ADRC集団中のCD34+細胞のパーセンテージ。このデータは、0から4.2x106までの増加する注入したCD31 (CD31+)発現ADRCの数が勃起不全の回復と強く関連することを示す。
【図３−４】図3は、勃起不全に悩む被験者に異なる集団のADRCを注入した効果を示す。Y軸−上：IIEF-5スコアで評価した勃起不全。Y軸−下：EHSスコアで評価した勃起不全。X軸：A:注入したADRCの数。B:注入したCD31＋細胞の数。C:注入したCD34＋細胞の数。D:ADRC集団中のCD31+細胞のパーセンテージ。E:ADRC集団中のCD34+細胞のパーセンテージ。このデータは、0から4.2x106までの増加する注入したCD31 (CD31+)発現ADRCの数が勃起不全の回復と強く関連することを示す。
【図３−５】図3は、勃起不全に悩む被験者に異なる集団のADRCを注入した効果を示す。Y軸−上：IIEF-5スコアで評価した勃起不全。Y軸−下：EHSスコアで評価した勃起不全。X軸：A:注入したADRCの数。B:注入したCD31＋細胞の数。C:注入したCD34＋細胞の数。D:ADRC集団中のCD31+細胞のパーセンテージ。E:ADRC集団中のCD34+細胞のパーセンテージ。このデータは、0から4.2x106 までの増加する注入したCD31 (CD31+)発現ADRCの数が勃起不全の回復と強く関連することを示す。
【図４−１】図4は、リンパ浮腫に悩む患者に異なる集団のADRCを注入した効果に関する9名のリンパ浮腫患者の6カ月のデータを示す。データは0から6カ月のスコアの減少％で示す(((スコア, t=0 − スコア, t=6 月)/スコア, t=0) x 100))。高いほどよい。Y軸−上：DASHスコアで評価した。Y軸−中：重さスコアで評価した。Y軸−下：張力スコアで評価した。X軸−A: 注入したADRCの数。B：注入したCD31+細胞のパーセント。C：注入したCD31+細胞の数。D:注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞のパーセント。E: 注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞の数。
【図４−２】図4は、リンパ浮腫に悩む患者に異なる集団のADRCを注入した効果に関する9名のリンパ浮腫患者の6カ月のデータを示す。データは0から6カ月のスコアの減少％で示す(((スコア, t=0 − スコア, t=6 月)/スコア, t=0) x 100))。高いほどよい。Y軸−上：DASHスコアで評価した。Y軸−中：重さスコアで評価した。Y軸−下：張力スコアで評価した。X軸−A: 注入したADRCの数。B：注入したCD31+細胞のパーセント。C：注入したCD31+細胞の数。D:注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞のパーセント。E: 注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞の数。
【図４−３】図4は、リンパ浮腫に悩む患者に異なる集団のADRCを注入した効果に関する9名のリンパ浮腫患者の6カ月のデータを示す。データは0から6カ月のスコアの減少％で示す(((スコア, t=0 − スコア, t=6 月)/スコア, t=0) x 100))。高いほどよい。Y軸−上：DASHスコアで評価した。Y軸−中：重さスコアで評価した。Y軸−下：張力スコアで評価した。X軸−A: 注入したADRCの数。B：注入したCD31+細胞のパーセント。C：注入したCD31+細胞の数。D:注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞のパーセント。E: 注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞の数。
【図４−４】図4は、リンパ浮腫に悩む患者に異なる集団のADRCを注入した効果に関する9名のリンパ浮腫患者の6カ月のデータを示す。データは0から6カ月のスコアの減少％で示す(((スコア, t=0 − スコア, t=6 月)/スコア, t=0) x 100))。高いほどよい。Y軸−上：DASHスコアで評価した。Y軸−中：重さスコアで評価した。Y軸−下：張力スコアで評価した。X軸−A: 注入したADRCの数。B：注入したCD31+細胞のパーセント。C：注入したCD31+細胞の数。D:注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞のパーセント。E: 注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞の数。
【図４−５】図4は、リンパ浮腫に悩む患者に異なる集団のADRCを注入した効果に関する9名のリンパ浮腫患者の6カ月のデータを示す。データは0から6カ月のスコアの減少％で示す(((スコア, t=0 − スコア, t=6 月)/スコア, t=0) x 100))。高いほどよい。Y軸−上：DASHスコアで評価した。Y軸−中：重さスコアで評価した。Y軸−下：張力スコアで評価した。X軸−A: 注入したADRCの数。B：注入したCD31+細胞のパーセント。C：注入したCD31+細胞の数。D:注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞のパーセント。E: 注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞の数。
【図５−１】図５は、リンパ浮腫に悩む患者に異なる集団のADRCを注入した効果に関する9名のリンパ浮腫患者の12カ月のデータを示す。データは0から6月のスコアにおける減少パーセントで表す(((スコア, t=0 − スコア, t=6 月)/スコア, t=0) x 100))。高いほどよい。Y軸−上：DASHスコアで評価した。Y軸−中：重さスコアで評価した。Y軸−下：張力スコアで評価した。X軸−A: 注入したADRCの数。B：注入したCD31+細胞のパーセント。C：注入したCD31+細胞の数。D:注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞のパーセント。E: 注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞の数。
【図５−２】図５は、リンパ浮腫に悩む患者に異なる集団のADRCを注入した効果に関する9名のリンパ浮腫患者の12カ月のデータを示す。データは0から6月のスコアにおける減少パーセントで表す(((スコア, t=0 − スコア, t=6 月)/スコア, t=0) x 100))。高いほどよい。Y軸−上：DASHスコアで評価した。Y軸−中：重さスコアで評価した。Y軸−下：張力スコアで評価した。X軸−A: 注入したADRCの数。B：注入したCD31+細胞のパーセント。C：注入したCD31+細胞の数。D:注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞のパーセント。E: 注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞の数。
【図５−３】図５は、リンパ浮腫に悩む患者に異なる集団のADRCを注入した効果に関する9名のリンパ浮腫患者の12カ月のデータを示す。データは0から6月のスコアにおける減少パーセントで表す(((スコア, t=0 − スコア, t=6 月)/スコア, t=0) x 100))。高いほどよい。Y軸−上：DASHスコアで評価した。Y軸−中：重さスコアで評価した。Y軸−下：張力スコアで評価した。X軸−A: 注入したADRCの数。B：注入したCD31+細胞のパーセント。C：注入したCD31+細胞の数。D:注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞のパーセント。E: 注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞の数。
【図５−４】図５は、リンパ浮腫に悩む患者に異なる集団のADRCを注入した効果に関する9名のリンパ浮腫患者の12カ月のデータを示す。データは0から6月のスコアにおける減少パーセントで表す(((スコア, t=0 − スコア, t=6 月)/スコア, t=0) x 100))。高いほどよい。Y軸−上：DASHスコアで評価した。Y軸−中：重さスコアで評価した。Y軸−下：張力スコアで評価した。X軸−A: 注入したADRCの数。B：注入したCD31+細胞のパーセント。C：注入したCD31+細胞の数。D:注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞のパーセント。E: 注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞の数。
【図５−５】図５は、リンパ浮腫に悩む患者に異なる集団のADRCを注入した効果に関する9名のリンパ浮腫患者の12カ月のデータを示す。データは0から6月のスコアにおける減少パーセントで表す(((スコア, t=0 − スコア, t=6 月)/スコア, t=0) x 100))。高いほどよい。Y軸−上：DASHスコアで評価した。Y軸−中：重さスコアで評価した。Y軸−下：張力スコアで評価した。X軸−A: 注入したADRCの数。B：注入したCD31+細胞のパーセント。C：注入したCD31+細胞の数。D:注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞のパーセント。E: 注入したCD235a-CD45-CD31+CD34+細胞の数。
【図６】図6は、異種ADRC懸濁液中のCD31陽性細胞をフローサイトメトリーとAPC標識抗体(APC conjugated antibodies)を用いて同定することを示す。APC標識同位体対照を用いて全CD31陰性集団をマーク（左の散布図）すると、CD31＋ゲートには1％より少なかった。この図において、APC−CD31染色試料（右）はADRCの20.55％（21.4−0.85）がCD31＋であった。
【図７】図7は、ADRC由来CD31＋細胞がex vivoで管形成できることを示す。A−E）海綿体組織外植片から生長した管の位相差顕微鏡像である。A）＋VEGF。B）通常の培地。C）単離ADRC。D）CD31＋ADRC細胞。E）CD31-ADRC細胞。F）管の数。値は、n=4の独立した実験の平均＋SEMで表し；1元配置分散分析とTukeyの多重比較検定を用いてCD31陽性細胞とCD31陰性細胞の違いを試験した；*p=0.0126.
【発明を実施するための形態】
【００１９】
以下に本発明をさらに詳細に説明する。
定義
本発明をさらに詳細に議論する前に、以下の用語と慣例をまず定義する：
CD31
CD31としても知られる血小板内皮細胞接着分子（PECAM-1）は、ヒトではPECAM-1遺伝子でコードされるタンパク質である。CD31は血小板、単球、好中球およびいくつかの型のT細胞の表面に見られ、内皮細胞の細胞間接合部の大きな部分を構成する。コードされるタンパク質は免疫グロブリンスーパーファミリーの一員であり、白血球の移動、血管形成、およびインテグリンの活性化に関与していると
思われる。CD31は通常内皮細胞、血小板、マクロファージ、クッパー細胞、顆粒球、T／NK細胞、リンパ球、巨核球、破骨細胞および好中球に見られる。
【００２０】
CD34
CD34は細胞表面糖タンパク質で、細胞−細胞の接着因子として機能する。また、幹細胞の骨髄細胞外マトリックスへの接着、あるいは間質細胞への直接の接着を仲介するらしい。CD34はまた該タンパク質をコードするヒト遺伝子の名前でもある。CD34タンパク質は、初期の造血や血管関連組織に発現を示す1回膜貫通シアロムチンタンパク質ファミリーの一員である。CD34を発現する細胞は通常へその緒および造血細胞としての骨髄、間葉系幹細胞のサブセット、内皮前駆細胞、リンパ管（胸膜リンパ管を除く）ではない血管の内皮細胞、肥満細胞、間質や真皮周辺にある樹状細胞の亜集団（XIIIa因子陰性である）、ならびにDFSP、GIST、SFT、HPCなどの軟部組織腫瘍の細胞に見られる。
【００２１】
発現レベル
本明細書の文脈で（CD31を例にとると）、用語「CD31＋」または「CD31+」または「CD31陽性」は、バックグラウンドレベルよりも上のあらゆるレベルのCD31を発現する細胞をいうと理解される。したがって、この用語はCD31の発現レベルをいい、この細胞表面マーカーの発現レベルが、分析する細胞集団全体中のそのマーカーの発現レベルと比較することによって、バックグラウンドレベルよりも大きいことをいう。
【００２２】
発現レベルに関して、用語「＋」および「−」は当業界で公知であり、問題となる細胞マーカーの発現レベルをいい、「＋」に対応する細胞マーカーの発現レベルは高い、中程度あるいは低いであり、「−」に対応する細胞マーカーの発現レベルはゼロ、あるいは少なくともバックグラウンドレベルよりも高くないことをいう。
【００２３】
脂肪組織由来再生細胞（ADRC）
間質血管細胞（SVF）ともいわれる脂肪組織由来再生細胞（ADRC）は、in vitroで血管細胞やニューロンに分化でき、前臨床試験の多くは海綿体内へのADRC注入が驚くほど良好な効果を示す。
【００２４】
リンパ浮腫
リンパ浮腫（lymphedema）は、「lymphoedema」や「lymphatc edema」としても知られ、リンパ系の障害によって引き起こされる局在的な体液保持と組織の腫れの症状であり、通常は胸管に、次いで血流に間質液は戻る。この症状は遺伝されるか、生誕時の欠陥で起きるが、乳癌治療などの、手術や放射線を含む癌治療によってしばしば引き起こされる。
【００２５】
クローン病
クローン病（Morbus Crohn）（またはCrohn’s disease）は、口から肛門までのあらゆる部分の胃腸管に影響を及ぼす炎症性腸疾患（inflammatory bowel disease: IBD）である。
【００２６】
皮弁手術
皮弁手術は、あらゆる型の組織がドナーから採られ、完全な血液供給とともにレシピエントに移される、可塑性で再構築できる手術技法である。これは、完全な血液供給を伴わない移植と似ているが、異なるものであり、したがって、新しい血管の成長に依存する。
【００２７】
勃起不全
勃起不全（ED）はインポテンツとしても知られ、性行為中に陰茎の勃起を起こしたり、維持できないことを特徴とする型の性機能障害である。前立腺癌は男性で最もよくある癌であり、根治的前立腺全摘除術（RP）はしばしば勃起不全（ED）を起こし、実質的に生活の質を減じる。その他の原因は、心臓血管病や糖尿病、神経学的問題（たとえば前立腺全摘除術によるトラウマ）、ホルモン不足（性腺機能低下症）、下部尿路感染および薬の副作用である。さらに、年齢はEDにとっての別のリスクである。
【００２８】
IIEF-5スコア
IIEF-5スコア（勃起不全の国際的指標）は様々に定義された項目への通常の応答の合計である。
・22-25：勃起不全なし
・17-21：軽度の勃起不全
・12-16：軽度から中程度の勃起不全
・8-11：中程度の勃起不全
・5-7：重度の勃起不全
したがって、本明細書の文脈では、用語「勃起不全の治療」とはIIEF-5スコアを22-25に改善することをいい、用語「勃起不全の軽減」とはIIEF-5スコアを1ポイント以上改善するか、あるいはIIEF-5スコアを別のカテゴリーに改善することをいう。
【００２９】
勃起硬度スコア（EHS）
勃起硬度スコア（EHS）は勃起不全（ED）−男性が性交に十分な硬さの勃起を起こし、あるいは維持できない−を評価するための有用なツールである。1998年に開発され、EHSは男性が自身で使用できる単項目のリッカート尺度である。このツールは男性に、「あなたの勃起の硬さをどう評価するか」を考える質問をして、以下の選択肢の1つを選ぶものである：
・0−陰茎は大きくならない。
・1−陰茎は大きくなるが、硬くない。
・2−陰茎は硬いが、挿入に十分な硬さではない。
・3−陰茎は挿入に十分な硬さであるが、完全に硬くはない。
・4−陰茎は完全に硬く、十分に硬直する。
したがって、本明細書の文脈では、用語「勃起不全の治療」とはEHSスコアを4に改善することをいい、用語「勃起不全の軽減」とはEHSスコアを1ポイント以上改善することをいう。
【００３０】
脂肪組織由来再生細胞に由来するCD31+細胞の医薬用途
実施例の部に示すように、脂肪組織由来再生細胞（ADRC）に由来するCD31+細胞の細胞集団がADRCの再生能にとって重要であることが本発明で見出された。したがって、本発明の一面は、脂肪組織由来再生細胞（ADRC）に由来する単離されたCD31+細胞を医薬として用いることに関する。
【００３１】
医薬症状の治療および／または軽減にADRCを用いることが知られている。したがって、一態様において、単離されたCD31+細胞を勃起不全（ED）、リンパ浮腫、クローン病、1型糖尿病、2型糖尿病、心臓および大動脈瘤の血行再建および再生を含む心血管における血管再生の促進、皮膚の傷の再生、骨および軟骨障害、不妊障害、リウマチ性強皮症、括約筋再生を含む筋肉疾患、胃腸管修復、および中枢および抹消神経系疾患からなる群から選ばれる障害の治療および／または軽減に用い、好ましくは勃起不全（ED）、クローン病またはリンパ浮腫の治療および／または軽減に用いる。
【００３２】
別の一態様では、単離されたCD31+細胞を豊胸、一般的な傷、火傷および外傷、顔の若返り、再建、男性型脱毛症、外陰部硬化症苔癬、ペロニー病、尿失禁、便失禁、痔瘻、多発性硬化症、重症下肢虚血、糖尿病性足潰瘍、および変形性関節症からなる群から選ばれる障害の治療および／または軽減に用いる。これらのSVFおよびADRCに基づく治療の主用途は、Bora および Majumdar (Stem Cell Research & Therapy (2017) 8:145)にもレビューされている。
【００３３】
別の一態様では、勃起不全は根治的前立腺全摘除術（RP）後の勃起不全、たとえば根治的前立腺全摘除術（RP）後に神経損傷に悩んだ被験者や失禁の被験者における勃起不全である。実施例4は根治的前立腺全摘除術（RP）後の勃起不全の治療に関するデータを示す。さらに、前立腺全摘除術後のEDについての共通の理解は、血管の損傷によるものであるが、末梢神経の損傷によるものでもあるかも知れない。したがって、さらに別の一態様では、本発明のCD31+細胞は神経、好ましくは末梢神経の再生に用いる。神経の損傷は幻肢痛も引き起こすかも知れない。したがって、さらに別の一態様では、本発明のCD31+細胞は幻肢痛の治療または軽減に用いる。
【００３４】
さらなる一態様では、単離されたCD31+細胞はクローン病、特にクローン病に関連する瘻孔の治療および／または軽減に用いる。実施例8はそのようなクローン病関連性瘻孔の治療を示す。
【００３５】
さらなる一態様では、単離されたCD31+細胞は血管分化の改善に用いる。さらに別の一態様では、単離されたCD31+細胞は血管新生の改善に用いる。
【００３６】
さらに別の一態様では、単離されたCD31+細胞は、脈管形成／血管新生を直接含む以外の組織の再生／修復／改造、たとえば炎症の調節や線維症の解消の促進に用いる。
【００３７】
ADRCを用いる有利な点は、被験者から提供された後、極めて迅速に前記細胞を用いることができることである。したがって、さらなる一態様では、使用の24時間以内、たとえば12時間以内、たとえば6時間以内、たとえば3時間以内に被験者から前記細胞が得られる。別の一態様では、前記細胞は非増殖細胞である。
【００３８】
効率のよい亜集団は既に同定されているので、同様な増殖細胞の亜集団の使用も予測することができる。したがって、一態様では、前記細胞は増殖細胞である。
【００３９】
細胞は以前に得られたのと同じ被験者から得られた細胞を使用するのが有利である。したがって、さらに別の一態様では、CD31+細胞は自家移植として用いられる。
【００４０】
しかし、他の被験者に前記細胞を用いることも有用かも知れない。したがって、一態様では、CD31+細胞（またはCD31+細胞を含む組成物）は自家移植または同系移植として用いられる。
【００４１】
さらに別の一態様では、単離されたCD31+細胞は哺乳動物、好ましくはヒトの治療または軽減に用いる。
【００４２】
さらに追加の一態様では、該細胞はCD34＋である。別の一態様では、該細胞はCD235a-および／またはCD45-である。
【００４３】
脂肪組織由来再生細胞（ADRC）に由来するCD31+細胞を含む組成物
CD31+細胞（または細胞集団）は他の細胞または細胞型集団中に含まれる。したがって、本発明の別の面は、本発明細胞集団を含む組成物を医薬として用いることに関する。
【００４４】
一態様において、組成物は勃起不全（ED）、リンパ浮腫、クローン病、1型糖尿病、2型糖尿病、心臓および大動脈瘤の血行再建および再生を含む心血管における血管再生の促進、皮膚の傷の再生、骨および軟骨障害、不妊障害、リウマチ性強皮症、括約筋再生を含む筋肉疾患、胃腸管修復、および中枢および抹消神経系疾患からなる群から選ばれる障害の治療または軽減に用い、好ましくは勃起不全（ED）、クローン病またはリンパ浮腫の治療および／または軽減に用いる。
【００４５】
別の態様では、勃起不全は根治的前立腺全摘除術（RP）後の勃起不全である。関連する態様では、被験者は失禁ではない。したがって、好ましい態様では、組成物は勃起不全の治療および／または軽減に用いる。実施例4はCD31+細胞の量がED治療に重要であることを示す。
【００４６】
またある態様では、組成物はリンパ浮腫、好ましくは乳癌関連のリンパ浮腫の治療および／または軽減に用いる。実施例5はCD31+細胞の量が乳癌関連のリンパ浮腫治療に重要であることを示す。
【００４７】
さらなる一態様では、組成物はクローン病の治療および／または軽減に用いる。実施例8はクローン病関連性瘻孔の治療を示す。さらに、実施例8のデータは多量のCD31+細胞をもつADRCが最良の治療をもたらすことを示す。さらなる一態様では、組成物は肛門周囲瘻で複雑化したクローン病の治療および／または軽減に用いる。さらなる一態様では、組成物は瘻孔、たとえばクローン病の結果としての瘻孔の治療および／または軽減に用いる。さらなる一態様では、ADRCは瘻孔および／または瘻孔周辺に、たとえば脂肪組織と一緒に投与／注入される。
【００４８】
組成物中のCD31+細胞の量は変化し得る。したがって、本発明の細胞（CD31＋）の量は組成物中の脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の少なくとも5％、たとえば組成物中の生きている脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の少なくとも8％、たとえば少なくとも10％、たとえば少なくとも20％、たとえば少なくとも30％、たとえば少なくとも50％、たとえば少なくとも70％、たとえば少なくとも80％、たとえば少なくとも90％、たとえば少なくとも95％、あるいはたとえば少なくとも99％、またはCD31+細胞の量は8‐80％の範囲、たとえば8−50％、あるいは8−30％を構成する。
【００４９】
好ましい態様では、本発明の細胞（CD31+）の量は、組成物中の脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の少なくとも80％、たとえば少なくとも90％、より好ましくはたとえば少なくとも95％、そしてさらに好ましくはたとえば少なくとも99％、あるいはたとえば100％を構成する。実施例4、5および8に示すように、CD31+細胞の量が増加するとADRCによる治療が改善する。さらに、実施例7に示すように、CD31を陽性に選択したADRCの亜集団は、全集団よりも効率的であり、そしてCD31を陰性に選択した集団よりも優位に効率的である。
【００５０】
さらなる一態様では、CD34+である細胞の量は、組成物中の脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の少なくとも30％、たとえば組成物中の生きている脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の少なくとも40％、好ましくは少なくとも50％、たとえば少なくとも60％、たとえば少なくとも70％を構成し、またはCD34+細胞の量は50‐90％の範囲、たとえば50−80％の範囲、あるいはたとえば60−80％を構成する。別の態様では、少なくとも1x 106 のCD34+である細胞が被験者に投与され、たとえば少なくとも5x 106 の細胞、たとえば少なくとも6x 106の細胞、たとえば少なくとも1x 107 の細胞が投与される。
【００５１】
理論に拘束されるものではないが、CD31+である細胞のほとんどはCD34+でもあるが、CD34+である細胞の全てがCD31陽性でもあるわけではない。
【００５２】
別の態様では、組成物は医薬組成物の形態である。
【００５３】
さらなる態様では、組成物は海綿体への注入（海綿体内注射）による投与に用いられ、ただしこれは勃起不全の治療および／または軽減のために用いるものである。
【００５４】
さらに別の態様では、組成物は皮下コンパートメント（たとえば脇の下や上腕領域）への注入による投与に用いられ、ただしこれは（乳癌関連の）リンパ浮腫の治療および／または軽減のために用いるものである。
【００５５】
さらに別の態様では、組成物は瘻孔および／または瘻孔周辺に、たとえば脂肪組織と一緒に注入による投与に用いられ、ただしこれはクローン病（関連の瘻孔）の治療および／または軽減のために用いるものである。
【００５６】
組成物中のCD31＋細胞の量が治療を成功させるために重要であることが見出された（実施例4、5、7および8参照）。したがって、一態様では、本発明の少なくとも1.5x 106 の細胞が被験者に投与され、たとえば請求項1‐9のいずれかに記載の少なくとも2x 106の細胞、たとえば少なくとも3x 106の細胞、たとえば少なくとも4x 106の細胞、たとえば少なくとも4.5x 106の細胞を被験者に投与する。別の態様では、300万−1500万のCD31+ ADRC、たとえば500万−1500万、あるいはたとえば775万−1230万のCD31+ ADRCを投与する。
【００５７】
有効である治療のために組成物中のCD31＋細胞の量には上限があるらしいことも見出された（実施例4参照）。したがって、さらなる態様では、2x 106 から 5x 106 の本発明のCD31+ 細胞を被験者に投与し、たとえば2.5x 106 から 4.5x 106の範囲で被験者に投与する。しかし、実施例7のデータは陽性にCD31発現を選択した細胞が非常に効率的であることを示す。
【００５８】
部品キット
本発明の細胞および／または組成物はキットまたは部品キットの一部を形成することもできる。したがって、本発明の一面は以下のものを含むキットに関する：
ｉ．本発明の単離された細胞、および／または本発明の組成物；ならびに
ｉｉ．疾患、たとえば勃起不全（ED）、リンパ浮腫、クローン病、1型糖尿病、2型糖尿病、心臓および大動脈瘤の血行再建および再生を含む心血管における血管再生の促進、皮膚の傷の再生、骨および軟骨障害、不妊障害、リウマチ性強皮症、括約筋再生を含む筋肉疾患、胃腸管修復、および中枢および抹消神経系疾患からなる群から選ばれる障害の治療および／または軽減に用いる、好ましくは勃起不全（ED）、クローン病またはリンパ浮腫の治療および／または軽減に用いるための指示書。
【００５９】
単離された細胞集団を調製する方法
本発明は単離された細胞集団を調製する方法にも関する。したがって、一面は生きているADRC細胞の単離された細胞集団を調製する方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
・新しく回収した脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の（予め得た）第1集団を提供する；そして
Ｉ．CD34+細胞を陽性に選択することにより、前記第1集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第1亜集団を提供する；そして
ＩＩ．CD31+細胞を陽性に選択することにより、前記第1亜集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第2亜集団を提供し；これによって生きている細胞のCD31+／CD34+亜集団を提供する；
または
Ｉ．CD31+細胞を陽性に選択することにより、前記第1集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第1亜集団を提供する； 
ＩＩ．CD34+細胞を陽性に選択することにより、前記第2亜集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第2亜集団を提供し；これによって生きている細胞のCD31+／CD34+亜集団を提供する；
または
Ｉ．CD31+／CD34+細胞を陽性に選択することにより、前記第1集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第1亜集団を提供し；これによって生きている細胞のCD31+／CD34+亜集団を提供する；
または
Ｉ．CD31+細胞を陽性に選択することにより、前記第1集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第1亜集団を提供し；これによって生きている細胞のCD31+亜集団を提供する。
【００６０】
好ましい態様では、該方法はCD31+細胞を陽性に選択することにより、前記第1集団から脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の第1亜集団を提供し；これによって生きている細胞のCD31+亜集団を提供することを含む。
【００６１】
一態様では、前記亜集団の選択はFACSのような細胞分類（セルソーティング:cell sorting）で行う。
【００６２】
関連面において、本発明は、医薬としての使用について本発明で記載した方法で得られた／得られる、脂肪組織由来再生細胞（ADRC）脂肪組織由来の単離された生きている脂肪組織由来再生細胞（ADRC）に関する。
【００６３】
一態様では、本発明で記載した方法で得られた／得られる、単離された生きている脂肪組織由来再生細胞（ADRC）は、勃起不全（ED）、リンパ浮腫、クローン病、1型糖尿病、2型糖尿病、心臓および大動脈瘤の血行再建および再生を含む心血管における血管再生の促進、皮膚の傷の再生、骨および軟骨障害、不妊障害、リウマチ性強皮症、括約筋再生を含む筋肉疾患、胃腸管修復、および中枢および抹消神経系疾患からなる群から選ばれる障害の治療および／または軽減に用い、好ましくは勃起不全（ED）、クローン病またはリンパ浮腫の治療および／または軽減に用いる。
【００６４】
脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団の再生能をスクリーニングする方法
ADRC集団中のCD31+細胞の量が細胞集団の再生能にとって重要であることが見出された。したがって、本発明のさらに別の面は、被験者からの脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団の再生能をスクリーニングする方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
・被験者からの単離された脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団を提供する（予め得たものを提供する）；
・CD31+である集団中の（生きている）細胞数を決定する；
・その数を第1の参照レベルと比較する；
・−もしそのCD31+細胞数が第1の参照レベルよりも大きいときには、その脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団が高い再生能をもつことを示す、あるいは
−もしそのCD31+細胞数が第1の参照レベルと同等あるいはそれよりも小さいときには、その脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団が低い再生能をもつことを示す、
ことを決定する。
【００６５】
一態様では、該方法は前記CD31+である集団中の（生きている）細胞数を第2の参照レベルと比較する工程をさらに含み；
・−もしそのCD31+細胞数が第2の参照レベルよりも小さいときには、その脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団が高い再生能をもつことを示す、あるいは
−もしそのCD31+細胞数が第2の参照レベルと同等あるいはそれよりも大きいときには、その脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団が低い再生能をもつことを示す、ただし第2の参照レベルは第1の参照レベルよりも大きいことを条件とする、
ことを決定する。
【００６６】
もし集団中のCD31+細胞数が第1および／または第2の参照レベルから外れてしまったら、レベルを調整することも可能である。したがって、一態様では、該方法は、もしそのCD31+細胞数が第1の参照レベルよりも小さいときには、そのレベルをより大きい数／濃度に調整することをさらに含む。同様の態様では、該方法は、もしそのCD31+細胞数が第2の参照レベルと同等あるいはそれよりも大きいときには、そのレベルをより小さい数／濃度に調整または希釈することをさらに含む。しかし、実施例7は多数のCD31+細胞数が好ましいことを示す。
【００６７】
細胞集団中のCD31+細胞数のパーセンテージも重要である。したがって、さらなる態様では、該方法は、（生きている）単離された脂肪組織由来再生細胞（ADRC）の全集団中の生きているCD31+細胞のパーセンテージを決定することをさらに含み；
・前記数を第3の参照レベルと比較する；
・−もしそのCD31+細胞数のパーセンテージが第3の参照レベルよりも大きいときは、その脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団の高い再生能を示す、あるいは
−もしそのCD31+細胞数のパーセンテージが第3の参照レベルと同等あるいはそれよりも小さいときには、その脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団の低い再生能を示す、
ことを決定する。
【００６８】
さらなる態様では、さらに以下の工程を含む：
・CD31+である集団中の（生きている）細胞のパーセンテージを第4の参照レベルと比較する；
・−もしCD31+細胞のパーセンテージが第4の参照レベルよりも小さいときは、その脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団の高い再生能を示す、あるいは
−もしCD31+細胞のパーセンテージが第2の参照レベルと同等あるいはそれよりも大きいときには、その脂肪組織由来再生細胞（ADRC）集団の低い再生能を示す、ただし第4の参照レベルは第1の参照レベルよりも大きいことを条件とする、
ことを決定する。
【００６９】
もし集団中のCD31+細胞のパーセンテージが第3および／または第4の参照レベルから外れてしまったら、パーセンテージを調整することも可能である。したがって、一態様では、該方法は、もしそのCD31+細胞のパーセンテージが第3の参照レベルよりも小さいときには、そのパーセンテージをより大きいパーセンテージに調整することをさらに含む。同様の態様では、該方法は、もしそのCD31+細胞のパーセンテージが第4の参照レベルと同等あるいはそれよりも大きいときには、そのレベルをより小さいパーセンテージに調整または希釈することをさらに含む。
【００７０】
病状を治療する方法
別の面において、本発明は、本発明の（医薬）組成物を被験者の病状を治療または軽減するのに有効な量で投与することを含む、治療を必要とする被験者の病状を治療する方法に関する。
【００７１】
本発明の態様および種々の面についての文脈において記載する特徴は本発明の他の面にも適用されることに注意すべきである。
【００７２】
本出願で引用した全ての特許文献および非特許文献はその全体を参照することによりここに含まれる。
【００７３】
本発明を以下の非限定的な実施例においてさらに詳細に説明する。
【実施例】
【００７４】
（実施例1）CD31およびCD34を発現する、新たに単離されたが、培養されていない脂肪組織由来再生細胞
目的
脂肪組織は2つの幹細胞集団を生じうる：新たに単離された間質血管細胞群（SVF）／脂肪組織由来再生細胞（ADRC細胞）およびその培養物である脂肪組織由来間質／幹細胞（ASC）。SVF／ADRCとASCはどちらも再生効果を示し、臨床応用に適しているが、細胞マーカーおよび再生能を含むそれらの違いをさらに特徴付けることが重要である。
【００７５】
材料および方法
フローサイトメトリー(Flow Cytometry)
2つの集団における異なる細胞マーカーの存在が特徴付けられた。単離SVF/ADRC細胞または収穫ASC（4代継代）をHBSS/1% PS/5% FBSで洗浄し、HBSS/5% FBS/1% PS/1% NBF中4℃で一晩固定した。次いで細胞を2回洗浄し、分析までHBSS/1%PS/5% FBS/0.05%アジ化ナトリウム中、4℃で貯蔵した。固定した細胞をHBSS/1% PS/5% FBSで洗浄し、氷上で振とうしながら1次抗体と一緒に60分インキュベートした。2回洗浄後、細胞を氷上で振とうしながら2次抗体と一緒に30分インキュベートし、最後に2回洗浄した。
データ収集と分析
データ収集と分析はFACSCalibur 装置 (Becton Dickinson, CA, USA) および Flowjo 10.0.6 ソフトウェア (Tree Star Inc, OR, USA)をそれぞれ用いて行った。1次抗体はラットCD45, CD90, CD44 (BD bioscience, それぞれ554875 (1:100), 554895 (1:50);および554869 (1:100)), CD29 (abcam, ab52971 (1:100)), CD34 (R&D systems, MN, USA, AF6518 (1:72)), PDGFRα (セルシグナリング、3164 (1:200) および CD31 (Santa Cruz, sc-1506 (1:100))に特異的であった。アイソタイプはヒツジIgG (R&D systems, 5-001-A), ウサギポリクローナルIgG, ウサギモノクローナルIgG (abcam, ab37415, ab125938), マウスIgG2a,k, およびマウスIgG1,k (Sigma-Aldrich, M 5409, M 5284)を含んでいた。ウサギIgG, マウスIgG, ヒツジIgG (全てInvitrogenで購入, 1:200)に特異的なAlexa 488 または647 を結合した2次ロバ抗体を可視化に用いた。
【００７６】
結果
2つの細胞集団群の免疫表現型をいくつかの間葉系幹細胞マーカーのフローサイトメトリー分析で試験した（図1）。ADRC/SVF細胞は全体的にCD34+/CD31-/CD29+/CD44+/CD90+/CD45+/PDGFRα+の表現型であったが、ASC群は全体的にCD34-/CD31-/CD29+/CD44+/CD90+/CD45-/PDGFRα+の表現型を示した。これらの結果は既に記載されているASC およびADRC/SVFのマーカー分析結果と一致する。ADRC/SVF と ASC 群では試験したマーカーのレベルで有意に異なっていた(ANOVA, p<0.0001, 図1)。特に、CD34 (p=0.0002) および CD45 (p<0.0001)のレベルはASCと比較してADRC/SVF 集団で有意に高かった。CD31レベルもADRC/SVF集団で高かったが、本研究ではそのレベルは統計的有意差にはいたらなかった（図1および表1）。これとは対照的に、CD29 (p<0.0001), CD44 (p<0.0001), CD90 (p<0.0001) およびPDGFRα (p=0.0003)のレベルはSVF集団と比較してASCで高かった。
【００７７】
【表１】
2021520217.tif 000002
【００７８】
結論
要約すると、新たに単離された細胞（ADRC/SVF）は培養幹細胞（ASC）よりも高いCD31およびCD34発現を示した。
【００７９】
（実施例2）  ヒトの新たに単離された脂肪組織由来間質細胞（ADRC/SVF）は、培養した脂肪組織由来幹細胞（ASC）よりもげっ歯類モデルで高い皮弁の生存を示す
形成外科では、その他の再構築の可能性が不十分な場合に欠点を補うために皮弁がよく用いられる。皮弁手術のよくある合併症は、血流の供給が不十分なために虚血や組織壊死にいたることである。皮弁の使用は生得の血液供給に限られ、幹細胞が皮弁中で血管新生を促進して皮弁の生存を増すと仮説が立てられている。げっ歯類の虚血性皮弁が幹細胞研究で広く用いられており、in vivo の状況で幹細胞が実際に血管新生を促進する有効性を研究する最良モデルの1つとして一般に受け入れられている。このモデルは血管新生のin vivo アッセイとみなせるので、皮弁手術と関連する。さらにいうと、該モデルが血管新生のモデルとみなせるので、再生医療にとってこのモデルの意味するところはずっと広い。このモデルでは、生存皮膚と壊死皮膚は明らかに区別され、壊死皮膚は黒く硬いのに対し、生存皮膚は正常な肌に見える。
【００８０】
結果
平均生存率±SDは、ADRC/SVF、ASCおよび対照群でそれぞれ、55.0±7.2%, 50.4±9.1% および 45.7±9.5%であった。ADRC/SVFはASCよりも皮弁の生存を改善したが、差は統計的有意差ではなかった。ADRC/SVFと対照群との差は統計的に有意であった(p<0.05)。
血管密度を免疫組織化学で評価した。各ラットからの切片をCD31 およびαSMAで染色して皮弁の血管密度を決定した。αSMAによる染色ではどの群にも差は見られなかった。CD31染色は対照群(10.32±1.39)と比較して、hSVF/ADRC (13.67±2.54, p<0.01)でのみ増加した。溶解物群はその間で、有意ではなかった(11.75±2.47)。
【００８１】
議論
SVF/ADRCとASCの有効性をin vivo研究で直接比べた研究は極めて少ない。Haradaらは、免疫不全マウスの後肢虚血モデルでSVFとASCの有効性を比較し、ここで彼らは、SVF/ADRCが後肢の血流を増加する結果になるという我々と同様の結果を見出した。さらに、彼らはin vitro血管新生アッセイを行い、SVFが内皮細胞の出芽促進に優れていることを示した(Biomed Res. (2013) 34:23-9)。全く異なる種類のモデルで、Semonらは、免疫不全マウスにおける実験的自己免疫性脳炎の改善にSVF/ADRCはASCよりも優れていることを示した (Stem Cells Transl Med. (2013) 2:789-96)。これらの知見は心筋虚血を用いたとき、Baiらによっては確認されず、SVF/ADRC とASCは同様に良好であった((Eur Heart J (2010) 31:489-501)。
【００８２】
結論
SVF/ADRCはASCよりも皮弁の生存を改善し、SVF/ADRCがCD31 および CD34の発現を増加したので、これらの2つの分子マーカーがSVF/ADRC幹細胞の生物学的有効性の増加に介在する役割を果たすことを示す。
【００８３】
（実施例3）  ヒト人工多能性幹細胞（iPS細胞）は血管平滑筋細胞に分化するときCD31 および CD34を発現する
材料および方法
ヒト人工多能性幹細胞（hiPSC）が中胚葉へ、そして血管前駆細胞へと分化する初期分化ステージを以下の分化プロトコルを用いて試験した。簡単に述べると、6 μM CHIR99021 および 100 μg/mlアスコルビン酸を補充したウルトラグルタミンDMEM中、ECMマトリゲル(Thermo Scientific)被覆プレート上で、血管平滑筋細胞をiPS細胞から単層で誘導した。分化の48時間後に、CHIR99021を分化培地から取り去り、さらに6日目まで分化させた。分化中に血管平滑筋細胞マーカー(CD31 および CD34)の発現を調べる経時試験を行った。VSMC分化中に0、2、4および6日目に細胞を分析した。
【００８４】
結果
図2に示すように、血管の分化状態に応じて内皮および幹細胞マーカーであるCD31 および CD34が増加した。
【００８５】
結論
データはCD31+／CD34+細胞が血管分化にとって重要であることを示す。
【００８６】
（実施例4）  CD31+ヒトADRCの量を増加することが根治的前立腺全摘除術後の勃起不全（ED）の男性の勃起を改善する
本実施例では、根治的前立腺全摘除術（RP）後のED患者における自家ADRCの単回の海綿体内注入の安全性と効果を試験する第1相臨床試験のデータを示す。この背景と方法は既に詳細に記載されている(Haahr ら)。簡単に述べると、慣用の治療では回復しなかったRP後のEDに悩む21人の男性を、非盲検単一群の前向き(prospective)第1相臨床試験に登録した。全ての被験者は登録の5-18カ月前にRPを受けており、海綿体内移植後12カ月追跡した。勃起機能はIIEF-5スコアで評価した。ADRCは患者自身から一般的な麻酔下に脂肪吸引した後、自動化Celution 800/CRSシステムを用いて単離した。ADRCは、収率、コロニー形成活性およびCD31の発現やその他の分析などについてフローサイトメトリーで特性化した。
【００８７】
結果
図3Aは、注入したADRC細胞の数に基づいてEDの効果には明らかな相関はないことを示す。図3Bは、IIEF-5スコアで評価するとき、0から4.2x106 までの増加する注入したCD31 発現ADRCの数が勃起不全の回復と強く関連したことを示す（図3、左、明かるいドット）。しかしながら、5x106 細胞以上の注入は効果がなかった（図3、左、黒ドット）。EHSスコアで評価したときも同様の効果が見られた。EHSスコアではCD31細胞数の上限のマイナス効果は見られなかったことが注目される。図3Cは、CD34の注入量を増加してもこのような関連は見られなかったことを示す。CD73およびCD90についても同様であった（データ示さず）。図3Dは、IIEF-5スコアとEHSスコアの両方で明瞭なプラス効果を観察するためには、注入細胞の少なくとも9％がCD31+であるべきことを示す。図3Eは、細胞のおよそ少なくとも50％がCD34陽性であるべきことを示す。
【００８８】
結論
これらのデータは、勃起機能の回復は、少なくとも注入されるCD31発現細胞の量によって用量依存的に制御されることを示す。CD34＋陽性細胞も関連しているらしい。
【００８９】
（実施例5）   CD31+ヒトADRCの量を増加することが乳癌関連のリンパ浮腫を減少する
本実施例では、乳癌関連のリンパ浮腫（BCRL）の女性における自家ADRCの単回注入の安全性と効果を試験する第1相臨床試験のデータを示す。この背景と方法は既に詳細に記載されている(Toyserkani ら、脂肪組織由来再生細胞および脂肪移植による乳癌関連のリンパ浮腫治療：実現可能性と安全性試験、Stem Cells Transl Med. 2017;6(8):1666-1672)。
【００９０】
材料および方法
簡単に述べると、以前の乳癌治療によってリンパ節を伴う上端部リンパ浮腫ISLステージIまたはIIと診断された10名の女性を含めた。全ての女性は最低1年間再発しておらず、影響を受けている腕の周囲は健康な腕よりも最小で2cm大きかった。
ADRC：
ADRCは患者自身の脂肪組織から一般的な麻酔下に脂肪吸引した後、自動化Celution 800/IVシステムを用いて単離した。ADRCは、収率、コロニー形成活性およびCD31、CD34、CD235aおよびCD45の発現などについてフローサイトメトリーで特性化した。
評価：
リンパ浮腫の軽減は患者報告アウトカム(Patient-Reported Outcome)で評価した。
評価：リンパ浮腫の腕の重さと張力をどちらも0から10の数値スケールで評価し、10は想像できる最悪の重さと張力を意味する。さらに、”the Disabilities of the Arm, Shoulder and Hand (DASH)”結果の質問を用いた。また、データは0から6カ月のスコアの減少パーセントで表した(((スコア, t=0 − スコア, t=6 月)/スコア, t=0) x 100))。高いほど結果は良い(図4 および 5)。
【００９１】
結果
図4 および 5に見られるように、0 から4.2x106までのCD31 (CD31+)発現ADRCの増加する数の注入がリンパ浮腫の回復と強く関連したことをデータは示す。したがって、注入ADRCの数をただ見るのと比較して、注入CD31+細胞（パーセントと絶対数の両方で）と患者の改善との間に明瞭な関連性がある。
【００９２】
結論
これらのデータは、リンパ浮腫の軽減は注入されるCD31発現細胞の量によって用量依存的に制御されることを明瞭に示す。
【００９３】
（実施例6）  CD31陽性集団の決定
異種ADRC懸濁液中のCD31陽性細胞をフローサイトメトリーとAPC標識抗体(APC conjugated antibodies)を用いて同定した。APC標識同位体対照を用いて全CD31陰性集団をマーク（図6、左の散布図）すると、CD31＋ゲートには1％より少なかった。本実施例において、APC−CD31染色試料（図6、右）はADRCの20.55％（21.4−0.85）がCD31＋であった。
【００９４】
（実施例7）  ADRC由来CD31＋細胞はex vivoの陰茎組織で管形成できる
実施例の目的
新たに単離したADRC、CD31陽性、またはCD31陰性細胞の血管形成を誘導する能力を評価する。
材料および方法
ex vivo血管新生モデル系として成体マウスからの海綿体組織外植片を用いて、新たに単離した未培養のヒトADRC、CD31陽性ADRC、またはCD31陰性ADRCの、陰茎由来細胞中の血管形成を誘導する能力を比較した。
1日目にマウス陰茎組織の解剖の後、海綿体組織外植片培養物を樹立した。海綿体組織を小片に切断し、次の使用前に24時間培養状態に維持した。0日目にヒトADRCを脂肪吸引物からCytori Celution IV装置を用いて単離し、その試料をさらに磁気細胞分離(ヒトCD31 MicroBeads, Miltenyi Biotech)によってCD31陽性ADRC、およびCD31陰性ADRCに分画した。その直後に、元のADRC集団またはCD31陽性ADRC、およびCD31陰性ADRC集団からの細胞を培養挿入物中に同じ密度で播き（細胞の移動を制限する小孔サイズで）、次に既に樹立した陰茎組織外植片と一緒に7日間共培養した。各実験の設定において、VEGF（血管内皮増殖因子−血管新生の強力な刺激剤）および通常の培地を、それぞれ挿入物中、細胞を含まない陽性および陰性の対照（Ctrl）として用いた。海綿体組織外植片から生長した管の位相差顕微鏡像をImageJ を用いて2成分形に変換した。外植片から生長した管の数をImageJ plugin Tubeness によって定量した。値は独立した4回の実験の平均±SEMを意味し、1元配置分散分析(One-way ANOVA)とTukeyの多重比較検定を用いてCD31陽性細胞とCD31陰性細胞群の違いを試験した；*p=0.0126。
【００９５】
結果および結論
4つの実験全てについて図7にまとめた代表的な像に見られるように、CD31陽性ヒトADRC亜集団は対応のCD31陰性よりも高度に管形成を刺激する。注目すべきは、D31陽性ADRCは未分画のADRCと比べてより優れた血管新生性質をもっているらしいことである。これとは対照的に、CD31陰性細胞は明らかに阻害効果を有している。これらのデータは、より強力な細胞集団が多くなったことと、同時に阻害集団（CD31陰性細胞）が除外されたこととによって、CD31陽性ADRCが元の集団による治療よりも優れていることを強く示唆する。
【００９６】
（実施例8）  新たに単離された自家の脂肪組織由来再生細胞はクローン病関連性瘻孔を効率よく治療する
試験の目的
肛門周囲瘻の合併症をもつクローン病の患者に自家ADRCを単回ボーラス投与することの安全性と効果を試験する第1相臨床試験のデータを記載する。
【００９７】
材料および方法
簡単に述べると、クローン病と診断され、肛門周囲瘻の合併症に悩む5名の患者を、瘻孔のMRI検査の後に試験に含めた。1名の患者は2つの瘻孔を治療し、残る4名は1つの瘻孔を治療した。
ADRC：
ADRCは患者自身の脂肪組織から一般的な麻酔下に脂肪吸引した後、自動化Celution 800/IVシステムを用いて単離した。ADRCは、収率（n＝5）およびCD31の発現についてフローサイトメトリーで特性つけた（n＝4）。細胞は少量の脂肪組織と共に瘻孔周辺に注入した。
評価：
瘻孔の消散は治癒への時間として、2週間、12週間および6カ月における臨床試験、再発およびWexnerスコアの変化で評価した。最終のMRI検査を6カ月対照試験で行った（現在までで3−5名の患者）。
【００９８】
結果
患者は2500万−3800万のADRCを受け、そのうち17−56％がフローサイトメトリーでCD31+であると同定された。これは、患者が650万−1230万のCD31+ADRCを注入されたことを意味する。MRIおよび／または臨床試験によって、5名の患者のうち4名（6つの処置瘻孔のうち5つ）で完全に瘻孔が消散し、試験期間中に再発はなかったことが明らかになった。2つの瘻孔をもつ患者では、1つは閉じたが、他方は開いたままだった。このことは、この患者が最も少ないパーセントのCD31+ADRC（17％）を受け、さらにその数を両方の瘻孔を治療するために2つに分けたことと一致する。
【００９９】
結論
これらのデータは、ADRCのCD関連肛門周囲瘻を治癒する優れた能力を明瞭に示し、有効性は注入するCD31発現細胞の数によって制御されることも示す。この場合、335万が臨界的な数であると思われるが、一方、7.75−12.3の範囲が治療的に関連すると思われる。
【図１】
2021520217.tif 000003
【図２−１】
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【図２−２】
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【図３−１】
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【図３−２】
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【図３−３】
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【図３−４】
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【図３−５】
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【図４−１】
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【図４−２】
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【図４−３】
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【図４−４】
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【図４−５】
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【図５−１】
2021520217.tif 000016
【図５−２】
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【図５−３】
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【図５−４】
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【図５−５】
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【図６】
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【図７】
2021520217.tif 000022
【国際調査報告】
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2021520217.tif 000024
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2021520217.tif 000026
2021520217.tif 000027
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