(57)【要約】  本開示は、ワクチンおよび免疫原性組成物に使用され得る、ジカウイルスを不活化する方法に関する。本開示はまた、アルボウイルス調製物の不活化の完全性を決定するための方法にも関する。
2021502075.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ジカウイルス調製物を不活化する方法であって：
（ａ）インビトロで培養された１つ以上の細胞から前記ジカウイルス調製物を単離することであって、前記細胞が前記ジカウイルス調製物を産生するために使用される前記単離すること；及び
（ｂ）前記ジカウイルス調製物を０．００５％〜０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理すること、を含む前記方法。
【請求項２】
前記細胞が非ヒト細胞である、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ジカウイルス調製物が、０．０１％ホルムアルデヒドで処理される、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記ジカウイルス調製物が８〜１２日間処理される、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項５】
前記ジカウイルス調製物が１０日間処理される、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ジカウイルス調製物が１５℃〜３０℃の温度で処理される、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項７】
前記ジカウイルス調製物が２２℃の温度で処理される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
不活化の完全性を判定するステップ（ｃ）をさらに含む、先行請求項いずれか１項に記載の方法。
【請求項９】
請求項８に記載の方法であって、ステップ（ｃ）が以下：
（ｉ）培養昆虫細胞にステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それによって昆虫細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）培養哺乳動物細胞に、（ｉ）で生成された昆虫細胞上清を接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）前記ジカウイルス調製物に、前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスが含まれているか否かを判断すること、を含む、前記方法。
【請求項１０】
請求項９に記載の方法であって、前記昆虫細胞が、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞、及びＴＲＡ−１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される、前記方法。
【請求項１１】
前記第１の期間が３〜７日である、請求項９または１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記哺乳動物細胞が、ＶＥＲＯ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載されている寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ＶＥＲＯ細胞から選択される、請求項９〜１１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１３】
前記第２の期間が３〜１４日である、請求項９〜１２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１４】
ホルムアルデヒド処理ジカウイルス調製物をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ（ｄ）をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ホルムアルデヒド処理ジカウイルス調製物が、ホルムアルデヒド処理後少なくとも５日、少なくとも７日、少なくとも９日、少なくとも１１日、または少なくとも１４日で中和される、請求項１４に記載の方法。
【請求項１６】
前記不活化ジカウイルス調製物を含む薬学的組成物を調製するステップ（ｅ）をさらに含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１７】
前記ジカウイルス調製物がアジュバントと混合される、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記アジュバントが、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルジョン、ヴィロソーム、渦巻状物、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）、及びフロイント不完全アジュバント（ＩＦＡ）からなる群より選択される、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記アジュバントが、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ８５などのアルミニウム塩である、請求項１７に記載の方法。
【請求項２０】
前記ジカウイルス調製物中の１つ以上の抗原の少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％が前記アジュバントに吸着されている、請求項１７〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
前記ジカウイルスが、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置に変異を含む、先行請求項のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２２】
前記変異が配列番号１のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異である、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記ジカウイルスがエンベロープタンパク質（Ｅ）に変異を含まない、請求項２１または２２記載の方法。
【請求項２４】
前記エンベロープタンパク質をコードする配列が、配列番号２の対応する配列と同じである、請求項２３に記載の方法。
【請求項２５】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法により取得可能な不活化ジカウイルスを含む薬学的組成物。
【請求項２６】
不活化ジカウイルスを含み、かつ０．５μｇ／ｍｌ未満の残留ホルマリン含量を有する薬学的組成物。
【請求項２７】
請求項１〜２４のいずれか１項に記載の方法により取得可能である、請求項２６に記載の薬学的組成物。
【請求項２８】
アルボウイルス調製物の不活化の完全性を決定する方法であって、以下のステップ：
（ｉ）培養昆虫細胞に不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を接種し、前記昆虫細胞を第１の期間インキュベートして、それによって昆虫細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）（ｉ）で生産された前記昆虫細胞上清を培養哺乳動物細胞に接種し、前記哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；
（ｉｉｉ）前記アルボウイルス調製物が前記哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること、を含む、前記方法。
【請求項２９】
前記アルボウイルスがフラビウイルスまたはアルファウイルスである、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記アルボウイルスが、ジカウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、デング熱ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、チクングニアウイルス、オニョンニョンウイルスまたはマヤロウイルスである、請求項２８または２９に記載の方法。
【請求項３１】
前記アルボウイルス調製物が、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、またはソラレンでの処理を受けた、請求項２８〜３０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３２】
前記昆虫細胞が、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞、及びＴＲＡ−１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される、請求項２８〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の期間が３から７日である、請求項２８〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記哺乳動物細胞が、ＶＥＲＯ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載されている寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ＶＥＲＯ細胞から選択される、請求項２８〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第２の期間が３〜１４日である、請求項２８〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
前記方法が、１．０ＴＣＩＤ５０未満の前記アルボウイルスを検出し得る、請求項２８〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
連邦政府支援の研究に関する声明文
本発明は、保健医療福祉省、準備および対応担当秘書室、生物医学先端研究開発局（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｏｆｆｉｃｅ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｓｓｉｓｔａｎｔ  Ｓｅｃｒｅｔａｒｙ  ｆｏｒ  Ｐｒｅｐａｒｅｄｎｅｓｓ  ａｎｄ  Ｒｅｓｐｏｎｓｅ，Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ  Ａｄｖａｎｃｅｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ａｕｔｈｏｒｉｔｙ）との契約番号ＨＨＳＯ１００２０１６０００１５Ｃの下で政府の支援を受けてなされた。本発明は、保健社会福祉省の機関（Ａｇｅｎｃｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ）である疾病管理予防センター（Ｃｅｎｔｅｒｓ  ｆｏｒ  Ｄｉｓｅａｓｅ  Ｃｏｎｔｒｏｌ  ａｎｄ  Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）との共同研究開発契約（Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ａｎｄ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  Ａｇｒｅｅｍｅｎｔ）の履行で作成された。米国政府は、本発明に一定の権利を有する。
【０００２】
発明の分野
本開示は、ワクチンおよび免疫原性組成物に使用され得る、ジカウイルスを不活化する方法に関する。本開示はまた、アルボウイルス調製物の不活化の完全性を決定するための方法にも関する。
【背景技術】
【０００３】
ジカウイルスは、フラビウイルス科内の他の蚊媒介ウイルス（例えば、黄熱病、デング熱、西ナイル、および日本脳炎ウイルス）に分類されるフラビウイルスであり、ウイルスが２０１３年にブラジルに導入されて以来、半球規模の流行で急速に伝播している。ウイルスは米国の領地を含めて、中南米に到達し、その結果、現在米国本土を脅かしている。実際、ジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９株は、２０１５年にプエルトリコに旅行した人の血清から分離された。この株のゲノムは、少なくとも３回配列決定されている（Ｌａｎｃｉｏｔｔｉ  ｅｔ  ａｌ．Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｅｍｅｒｇ．２０１６  Ｍａｙ；２２（５）：９３３−５およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＸ０８７１０１．３；およびＹｕｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎｎｏｕｎｃ．２０１６  Ａｕｇ  １８；４（４）およびＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＡＮＫ５７８９７．１を参照のこと）。
【０００４】
１９４７年にウガンダで最初に分離されたウイルスは、１９５２年に初めてヒトの疾患に関連付けられ、アフリカおよび東南アジアにおける軽度の自己限定熱性疾患の原因として散発的に認識された（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．１３０：６９−８０；Ｆａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５２（６２８３）：３４５−３４９）。しかし、２００７年に北太平洋のヤップ島で大流行が出現し、次いで、太平洋を渡って島から島へと広がり、２０１３年〜２０１４年のフランス領ポリネシアでの大規模な大流行につながり、その後クック諸島のニューカレドニアへ、そして最終的に、イースター島へ広がった。その後、アジア系統のウイルスは未知の経路で西半球に伝達された（Ｆａｒｉａ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｓｃｉｅｎｃｅ．３５２（６２８３）：３４５−３４９）。このウイルスは、ネッタイシマカ（Ａｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ）、Ａ．ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓによって、ならびにおそらくＡ．ｈｅｎｓｉｌｌｉおよびＡ．ｐｏｌｙｎｉｅｓｅｉｎｓｉｓによって動物性に伝達され得る（Ｗｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ａｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｒｅｓ．１３０：６９−８０）。さらに、このウイルスを伝播するための他のベクターが存在し得、このウイルスは輸血、経胎盤によって、および／または性感染を介して伝播され得ると考えられている。
【０００５】
２０１５年後半に、広範囲のジカウイルス感染の領域における胎児異常（例えば、小頭症）およびギランバレー症候群（ＧＢＳ）の有意な増大は、ジカウイルスが当初考えられていたよりもはるかに毒性であり、世界保健機関（ＷＨＯ）が国際的に懸念される公衆衛生上の緊急事態（ＰＨＥＩＣ）を宣言するようにさせる（Ｈｅｙｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）Ｌａｎｃｅｔ  ３８７（１００２０）：７１９−２１）。ジカウイルスは公衆衛生上の大きな脅威となっているが、ＦＤＡが承認したワクチンも治療法も現在は存在せず、ジカウイルスを制御する唯一の予防的手段は、蚊の個体数の管理を伴う。
【０００６】
潜在的なワクチンの開発のために組換えジカウイルスを特徴付けるための最近の努力において、３３０位のウイルスエンベロープタンパク質に変異を保有する非ヒト細胞適応ジカウイルスが同定された（Ｗｅｇｅｒ−Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１７．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。この研究の著者は、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９の全長感染性ｃＤＮＡクローンが、クローニング中に増幅されると遺伝的に不安定であることを発見し、ウイルスゲノムを分割して、観察された不安定性に対処し、２つのプラスミド系を開発および適用することを選択した。しかし、ジカワクチンの開発のための２つのプラスミド系はあまり望ましいものではない。
【０００７】
発明の概要
したがって、遺伝子的に安定なジカウイルスを利用するジカウイルス感染を治療および／または予防するためのワクチンおよび免疫原性組成物を開発する必要がある。ワクチン開発のオプションの１つは、ホールウイルスを不活化し、この不活化ホールウイルスを対象のワクチン接種に使用することである。しかし、不活化ウイルスワクチンの開発中の重要な安全性保証は、製剤または原薬に感染性ウイルスが残っていないことを確認することである。感染性ビリオンが残っているか否かを測定および決定するための効果的な不活化プロセス及び高感度分析の開発は、野生型ウイルスに由来するが、胎児の異常を引き起こす可能性のある病原性／脳炎ウイルスも確実に含む、精製不活化ウイルスの開発にとっては重要な安全面である。
【０００８】
本開示は、少なくとも部分的には、室温で比較的短時間ウイルスに適用される低濃度のホルムアルデヒドでジカウイルスを効率的に不活化できるという驚くべき発見に基づいている。さらに、不活化後に感染性ビリオンがまだ存在するか否かを高感度で決定可能であるアッセイが開発された。
【０００９】
従って、本開示の特定の態様は、以下を含むジカウイルス調製物を不活化するための方法に関する：
（ａ）インビトロで培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、ここで、細胞がウイルス調製物を産生するために使用されること；及び
（ｂ）ジカウイルス調製物を０．００５％〜０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理すること。
【００１０】
いくつかの実施形態では、この細胞は、非ヒト細胞である。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は０．０１％のホルムアルデヒドで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、１０日間など、８〜１２日間処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度などの１５℃〜３０℃の温度で処理される。
【００１１】
この方法は、不活化の完全性を判定するステップ（ｃ）をさらに含んでもよい。いくつかの実施形態では、ステップ（ｃ）は以下を含む：
（ｉ）０．００５％〜０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理したジカウイルス調製物を培養昆虫細胞に接種し、その昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それによって昆虫細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）（ｉ）で生産された昆虫細胞上清を培養哺乳動物細胞に接種し、この哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、この哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを判断すること。
【００１２】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞及びＴＲＡ−１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される。
【００１３】
いくつかの実施形態では、この第１の期間は３〜７日である。
【００１４】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ＶＥＲＯ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ＶＥＲＯ細胞から選択される。
【００１５】
いくつかの実施形態では、この第２の期間は３〜１４日である。
【００１６】
この方法は、ホルムアルデヒド処理ジカウイルス調製物を、ホルムアルデヒド処理後少なくとも５、少なくとも７、少なくとも９、少なくとも１１、または少なくとも１４日で中和するなど、ホルムアルデヒド処理ジカウイルス調製物をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップ（ｄ）をさらに含んでもよい。
【００１７】
この方法は、不活化ジカウイルスを含む医薬組成物を調製するステップ（ｅ）をさらに含んでもよい。
【００１８】
いくつかの実施形態では、この処理されたジカウイルス調製物をアジュバントと混合する。アジュバントは、アルミニウム塩、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、合成リピドＡ、リピドＡ模倣物または類似体、ＭＬＡ誘導体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルジョン、ビロゾーム、渦巻状物、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、およびフロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）からなる群より選択され得る。
【００１９】
いくつかの実施形態では、アジュバントは、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムカリウム、およびＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ８５などのアルミニウム塩である。
【００２０】
いくつかの実施形態では、処理されたウイルス調製物中の１つ以上の抗原のうち少なくとも７５％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％がアジュバントに吸着される。
【００２１】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異など、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置に変異を含む。
【００２２】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、エンベロープタンパク質（Ｅ）に変異を含まない。いくつかの実施形態では、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。
【００２３】
本開示のいくつかの態様は、本明細書に開示される方法のいずれかにより得られる不活化ジカウイルスを含む医薬組成物に関する。
【００２４】
本開示のいくつかの態様は、不活化ジカウイルスを含み、０．５μｇ／ｍｌ未満の残留ホルマリン含量を有する薬学的組成物に関する。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に開示されている方法のいずれかによって入手可能である。
【００２５】
本開示のいくつかの態様は、不活化ウイルスを含む薬学的組成物中の残留ホルマリン含量を決定する方法に関し、以下のステップを含む：
（ａ）ホルムアルデヒドで処理されたウイルスを含む薬学的組成物を提供すること；
（ｂ）（ａ）の薬学的組成物をリン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）と混合し、それにより混合物を提供すること；
（ｃ）適切な条件下で（ｂ）の混合物をインキュベートすること；及び
（ｄ）残留ホルマリンの存在について混合物を分析すること。
【００２６】
いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、アジュバントを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、アジュバントとして水酸化アルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、アジュバントとして０．１ｍｇ／ｍｌ〜１．０ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。いくつかの実施形態では、この薬学的組成物は、アジュバントとして０．４ｍｇ／ｍｌの水酸化アルミニウムを含む。
【００２７】
いくつかの実施形態では、容積１ｍｌの（ａ）の薬学的組成物を、２０μｌの１５〜２５（ｖ／ｖ）％リン酸及び５０μｌの０．９〜１．１ｍｇ／ｍｌのＤＮＰＨと混合する。いくつかの実施形態では、容積１ｍｌの（ａ）の薬学的組成物を、２０μｌの２０（ｖ／ｖ）％リン酸及び５０μｌの１．０ｍｇ／ｍｌ  ＤＮＰＨと混合する。
【００２８】
いくつかの実施形態では、（ａ）の薬学的組成物とリン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との混合物を室温でインキュベートする。いくつかの実施形態では、（ａ）の薬学的組成物とリン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との混合物を、１０〜３０分間インキュベートする。いくつかの実施形態では、（ａ）の薬学的組成物とリン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との混合物を、室温で２０分間インキュベートする。
【００２９】
いくつかの実施形態では、（ａ）の薬学的組成物とリン酸及び２，４−ジニトロフェニルヒドラジン（ＤＮＰＨ）との混合物をＨＰＬＣにより分析する。いくつかの実施形態では、ＨＰＬＣは逆相ＨＰＬＣである。いくつかの実施形態では、水とアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）をＨＰＬＣの移動相として使用する。いくつかの実施形態では、検出波長は３６０ｎｍである。
【００３０】
いくつかの実施形態では、ウイルスは不活化ジカウイルスである。いくつかの実施形態では、この不活化ジカウイルスは、２２℃で１０日間、０．０１％（ｗ／ｖ）ホルムアルデヒドで処理されている。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異など、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置に変異を含む。
【００３１】
本開示のいくつかの態様は、アルボウイルス調製物の不活化の完全性を判定する方法に関し、この方法は以下のステップを含む：
（ｉ）培養昆虫細胞に不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間インキュベートして、それによって昆虫細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）培養哺乳動物細胞に（ｉ）で生産されたこの昆虫細胞上清を接種し、その哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；ならびに；
（ｉｉｉ）このアルボウイルス調製物が哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること。
【００３２】
いくつかの実施形態では、このアルボウイルスは、フラビウイルス又はアルファウイルスである。いくつかの実施形態では、このアルボウイルスは、ジカウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、ダニ媒介性脳炎ウイルス、デングウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、チクングンヤ熱ウイルス、オニョンニョンウイルス、またはマヤロウイルスである。
【００３３】
いくつかの実施形態では、アルボウイルス調製物を、界面活性剤、ホルマリン、過酸化水素、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、メチレンブルー、またはソラレンによる不活化ステップに供した。
【００３４】
いくつかの実施形態では、昆虫細胞は、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞及び  ＴＲＡ−１７１細胞、例えば、Ｃ６／３６細胞から選択される。
【００３５】
いくつかの実施形態では、第１の期間は３〜７日である。
【００３６】
いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、ＶＥＲＯ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、およびチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）、例えば、ＶＥＲＯ細胞から選択される。
【００３７】
いくつかの実施形態では、第２の期間は３〜１４日である。
【００３８】
いくつかの実施形態では、この方法は、１．０ＴＣＩＤ５０未満のアルボウイルスを検出し得る。
【図面の簡単な説明】
【００３９】
【図１】ニセ感染（上）またはＺＩＫＡＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９に感染した（下）Ｖｅｒｏ細胞単層の明視野顕微鏡画像を示している。
【図２】ＴＣＩＤ５０により決定される、Ｖｅｒｏ細胞単層上のＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ１の増殖動態を示す。
【図３】ジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ５クローンａ〜ｆの効力アッセイ試験（ＴＣＩＤ５０）を示す。
【図４】Ｖｅｒｏ細胞単層上のジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンａ〜ｆの増殖の細胞変性効果（ＣＰＥ）を示す明視野顕微鏡画像を示す。
【図５】ジカウイルスＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンａ〜ｆの効力アッセイ試験（ＴＣＩＤ５０）を示す。
【図６】ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅ（配列番号８）及びＰＲＶＡＢＣ５９（配列番号９）由来の残基３３０付近のジカウイルスのエンベロープ糖タンパク質配列をいくつかの他のフラビウイルス（ＷＮＶ（配列番号１０）；ＪＥＶ（配列番号１１）；ＳＬＥＶ（配列番号１２）；ＹＦＶ（配列番号１３）；ＤＥＮＶ  １  １６００７（配列番号１４）；ＤＥＮＶ  ２  １６６８１（配列番号１５）；ＤＥＮＶ  ３  １６５６２（配列番号１６）；及びＤＥＮＶ  ４  １０３６（配列番号１７））と比較するアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図７】ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅ（配列番号１８）及びＰＲＶＡＢＣ５９（配列番号１９）由来の残基９８付近のジカウイルスのＮＳ１タンパク質配列を、いくつかの他のフラビウイルス（ＷＮＶ（配列番号２０）；ＪＥＶ（配列番号２１）；ＳＬＥＶ（配列番号２２）；ＹＦＶ（配列番号２３）；ＤＥＮＶ  １  １６００７（配列番号２４）；ＤＥＮＶ  ２  １６６８１（配列番号２５）；ＤＥＮＶ  ３  １６５６２（配列番号２６）；及びＤＥＮＶ  ４  １０３６（配列番号２７））と比較するアミノ酸配列アラインメントを示す。
【図８】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ１ウイルスと比較したＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ウイルスクローンａ〜ｆのプラーク表現型を示す。
【図９】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ１ウイルスと比較したＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ウイルスクローンの平均プラークサイズを示す。
【図１０】無血清成長条件下でのＶｅｒｏ細胞におけるＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンａ〜ｆの増殖動態を示す。
【図１１】免疫実験のためにＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ製剤化製剤を調製するためにとられるステップの概略図を示す。
【図１２Ａ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤をＣＤ−１マウスに投与するスケジュールを示す。ＰＢＳを、プラセボとして使用した。
【図１２Ｂ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を使用した、図１２Ａに記載されるように免疫化されたＣＤ−１マウスの血清ＺＩＫＡＶ中和抗体力価を示す。ＺＩＫＡＶ中和抗体力価は、レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）中和アッセイにより決定された。実線は、群の幾何平均を表す。検出限界（１．９３ｌｏｇ１０）は破線で表されている。
【図１３Ａ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤をＡＧ１２９マウスに投与するスケジュールを示す。ＰＢＳをプラセボとして使用した。
【図１３Ｂ】ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂ及びＰ６ｅクローンに由来するワクチン製剤を使用した図１３Ａに記載されるように免疫されたＡＧ１２９マウスの血清ＺＩＫＡＶ中和抗体力価を示す。実線は、群の幾何平均を表す。検出限界（１．３０  ｌｏｇ１０）は破線で表されている。力価が検出できない動物（１．３０未満）には力価０．５を割り当てた。
【図１４】チャレンジ後のＡＧ１２９試験群の平均重量を、開始重量のパーセントとして示している。エラーバーは標準偏差を表す。
【図１５】ＰＦＵ／ｍＬとして報告される、チャレンジの２日後の個々のＡＧ１２９マウスの血清ウイルス血症を示す。実線は群の平均を表す。検出限界（２．０  ｌｏｇ１０）は、破線で表されている。
【図１６】チャレンジ後のＡＧ１２９試験群の生存分析を示す。
【図１７】ワクチン接種及びチャレンジされたＡＧ１２９マウス由来のプールされた血清の受身伝達後のチャレンジ前の血清循環ＺＩＫＡＶ中和抗体（Ｎａｂ）力価を示す。
【図１８】ジカウイルスをチャレンジされた、受身伝達および対照マウスの平均体重を示す。
【図１９】、ＰＦＵ／ｍＬとして報告される、チャレンジの３日後の個々のＡＧ１２９マウスの血清ウイルス血症を示す。
【図２０】ジカウイルスをチャレンジされた受身伝達及び対照マウスの生存分析を示す。
【図２１】ＺＩＫＡＶ中和抗体力価と受身伝達マウスで観察されたウイルス血症との間の相関関係を示している。
【図２２】カプランマイヤー生存曲線を使用した、Ｐ６ａ及びＰ６ｅのジカウイルスｐｒｅＭＶＳ系統による感染後のＡＧ１２９マウスの生存分析を示す。
【図２３】Ｐ６ａ及びＰ６ｅのジカウイルスのｐｒｅＭＶＳ系統による感染後の発明の時点での出発重量のパーセンテージで表される平均体重を示す。破線は、参照の開始重量の１００％を表す。
【図２４】ＰＦＵ／ｍＬとして報告される、Ｐ６ａ及びＰ６ｅのジカウイルスｐｒｅＭＶＳ系統による感染の３日後の個々のＡＧ１２９マウスの血清ウイルス血症を示す。破線は、アッセイの検出限界を表す。
【図２５】不活化データのコンパイルされた動態を示す。データは、感染力（ＴＣＩＤ５０）とＲＮＡコピーを比較し、４つの毒物学ロットのサンプルの不活化の完全性（ｃｏｍｐｌｅｔｅｎｅｓｓ  ｏｆ  ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ：ＣＯＩ）を比較する。これらのデータは、ＣＯＩアッセイの感度がＴＣＩＤ５０より大きいことを示している。
【図２６】０．３１ＴＣＩＤ５０という投入ウイルス力価で実証されたアッセイにおけるＣ６／３６及びＶｅｒｏの感度の比較を示す。
【図２７】０．０１ＴＣＩＤ５０／ウェル（−２ｌｏｇＴＣＩＤ５０／ウェル）という目標値の周りに９９％の信頼区間を含むＣ６／３６細胞部位を用いたＣＰＥ対ｌｏｇＴＣＩＤ５０のロジスティック回帰分析を示す；このモデルでは、ウェルの０．８５％が陽性になると予測している。
【図２８】ＰＢＳ（ａ）及び０．０４９μｇ／ｍＬ（ｂ）、０．０９８μｇ／ｍＬ（ｃ）、０．１９６μｇ／ｍＬ（ｄ）、０．４９１μｇ／ｍＬ（ｅ）、０．９８２μｇ／ｍＬ（ｆ）、及び１．９６４μｇ／ｍＬ（ｇ）ホルムアルデヒドを含むＰＢＳ溶液のクロマトグラムを示している。
【発明を実施するための形態】
【００４０】
一般的技術
本明細書に記載または参照される技術及び手順は、一般によく理解されており、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ  ３ｄ  ｅｄｉｔｉｏｎ（２００１）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，（２００３））；ｔｈｅ  ｓｅｒｉｅｓ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ  ２：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ  ａｎｄ  Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ  ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，ａｎｄ  Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９９８）Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ  Ｃｅｌｌ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ），ｅｄ．，１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｔｏ  Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ  ａｎｄ  Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ  ａｎｄ  Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ  Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，１９９３−８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ；Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ  ａｎｄ  Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  Ｖｅｃｔｏｒｓ  ｆｏｒ  Ｍａｍｍａｌｉａｎ  Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ  ａｎｄ  Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ  Ｃｈａｉｎ  Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ  ａｎｄ  Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，１９８８−１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ  ａｎｄ  ���．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；及び  Ｔｈｅ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ  ａｎｄ  Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．，Ｈａｒｗｏｏｄ  Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）に記載の広範に利用される方法論など、当業者による従来の方法論を用いて、通常使用される。
【００４１】
ジカウイルス
本開示の特定の態様は、ワクチン及び／または免疫原性組成物に有用であり得る精製不活化ホールジカウイルスに関する。
【００４２】
ジカウイルス（ＺＩＫＶ）は、１９４７年にウガンダのジカ森林のセンチネルアカゲザルから初めて分離された蚊媒介フラビウイルスである。それ以来、アフリカとアジアの両方で、及び最近では、アメリカ大陸でヒトから分離が行われた。ＺＩＫＶは、２つの（おそらく３つの）系統で見出される；アフリカの系統（おそらく東アフリカと西アフリカの系統に分かれる）及びアジアの系統である。したがって、本開示の適切なジカウイルスの例としては、限定するものではないが、アフリカ系統及び／またはアジア系統のウイルスが挙げられる。いくつかの実施形態では、ジカウイルスはアフリカ系統のウイルスである。いくつかの実施形態では、ジカウイルスはアジア系統のウイルスである。さらに、アフリカ及びアジア系統のジカウイルスの複数の株が以前に同定されている。例えば、Ｍｒ  ７６６、ＡｒＤ  ４１５１９、ＩｂＨ  ３０６５６、Ｐ６−７４０、ＥＣ  Ｙａｐ、ＦＳＳ１３０２５、ＡｒＤ  ７１１７、ＡｒＤ  ９９５７、ＡｒＤ  ３０１０１、ＡｒＤ  ３０１５６、ＡｒＤ  ３０３３２、ＨＤ  ７８７８８、ＡｒＤ  １２７７０７、ＡｒＤ  １２７７１０、ＡｒＤ  １２７９８４、ＡｒＤ  １２７９８８、ＡｒＤ  １２７９９４、ＡｒＤ  １２８０００、ＡｒＤ  １３２９１２、１３２９１５、ＡｒＤ  １４１１７０、ＡｒＤ  １４２６２３、ＡｒＤ  １４９９１７、ＡｒＤ  １４９８１０、ＡｒＤ  １４９９３８、ＡｒＤ  １５７９９５、ＡｒＤ  １５８０８４、ＡｒＤ  １６５５２２、ＡｒＤ  １６５５３１、ＡｒＡ  １４６５、ＡｒＡ  ２７１０１、ＡｒＡ  ２７２９０、ＡｒＡ  ２７１０６、ＡｒＡ  ２７０９６、ＡｒＡ  ２７４０７、ＡｒＡ  ２７４３３、ＡｒＡ  ５０６／９６、ＡｒＡ  ９７５−９９、Ａｒａ  ９８２−９９、ＡｒＡ  ９８６−９９、ＡｒＡ  ２７１８、ＡｒＢ  １３６２、Ｎｉｇｅｒｉａ６８、Ｍａｌａｙｓｉａ６６、Ｋｅｄｏｕｇｏｕ８４、Ｓｕｒｉｎａｍｅ、ＭＲ１４２９、ＰＲＶＡＢＣ５９、ＥＣＭＮ２００７、ＤａｋＡｒ４１５２４、Ｈ／ＰＦ／２０１３、Ｒ１０３４５１、１０３３４４、８３７５、ＪＭＢ−１８５、ＺＩＫＶ／Ｈ、ｓａｐｉｅｎｓ／Ｂｒａｚｉｌ／Ｎａｔａｌ／２０１５、ＳＰＨ２０１５、ＺＩＫＶ／Ｈｕ／Ｃｈｉｂａ／Ｓ３６／２０１６、及び／またはＣｕｂａ２０１７などの当技術分野で知られているジカウイルスの任意の１つ以上の適切な株を本開示で使用し得る。いくつかの実施形態では、ＰＲＶＡＢＣ５９株が本開示で使用される。
【００４３】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスゲノム配列の例は、配列番号２として下に示される：
【数１】
2021502075.tif 000003
【数２】
2021502075.tif 000004
【数３】
2021502075.tif 000005
【数４】
2021502075.tif 000006
【数５】
2021502075.tif 000007
【数６】
2021502075.tif 000008
【００４４】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１のゲノム配列を含み得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルスはＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１のゲノム配列は、配列番号２の配列を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列と、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するゲノム配列を含み得る。
【００４５】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列によってコードされる少なくとも１つのポリペプチドを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号２の配列によってコードされるアミノ酸配列と少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を有する少なくとも１つのポリペプチドを含んでもよい。
【００４６】
したがって、いくつかの実施形態では、本開示の不活化ジカウイルスは、本明細書に開示されるワクチン及び／または免疫原性組成物のいずれにも使用され得る。例えば、本開示の不活化ジカウイルスを使用して、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染を処置もしくは予防するために、及び／またはそれを必要とする対象におけるジカウイルスに対する、防御免疫応答などの免疫応答を誘導するために有用な１つ以上の抗原を提供し得る。
【００４７】
本開示で使用されるジカウイルスは、細胞培養物中の１つ以上の細胞から（例えば、プラーク精製により）得てもよい。ジカウイルスを生成するための当技術分野で公知の任意の適切な細胞、例えば、昆虫細胞（例えば、蚊の細胞、例えば、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞、ＴＲＡ−１７１、細胞、及びＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ、Ａｅｄｅｓ  ａｌｂｏｐｉｃｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ  ｐｓｅｕｄｏｓｃｕｔｅｌｌａｒｉｓ、Ａｅｄｅｓ  ｔｒｉｓｅｒｉａｔｕｓ、Ａｅｄｅｓ  ｖｅｘａｎｓ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｇａｍｂｉａｅ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ｓｔｅｐｈｅｎｓｉ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ  ａｌｂｉｍｕｓ、Ｃｕｌｅｘ  ｑｕｉｎｑｕｅｆａｓｃｉａｔｕｓ、Ｃｕｌｅｘ  ｔｈｅｉｌｅｒｉ、Ｃｕｌｅｘ  ｔｒｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、Ｃｕｌｅｘ  ｂｉｔａｅｎｉｏｒｈｙｎｃｈｕｓ、及び／またはＴｏｘｏｒｈｙｎｃｈｉｔｅｓ  ａｍｂｏｉｎｅｎｓｉｓなどの蚊の種に由来する追加の細胞または細胞株）、ならびに哺乳動物細胞（例えば、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞（サル腎臓由来）、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）など）を含む細胞が使用され得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン単離物）は、非ヒト細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン単離物）は昆虫細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン単離物）は、蚊細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン単離物）は、哺乳動物細胞から産生される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス（例えば、ジカウイルスクローン単離物）は、ＶＥＲＯ細胞から産生される。
【００４８】
ジカウイルスは、構造的ポリペプチドと非構造的ポリペプチドの両方をコードするポジティブセンスの一本鎖ＲＮＡゲノムを保有している。ゲノムには、ウイルス複製で役割を果たす５’及び３’末端領域の両方に非コード配列も含まれている。これらのウイルスによってコードされる構造的ポリペプチドとしては、限定するものではないが、キャプシド（Ｃ）、前駆体膜（ｐｒＭ）、及びエンベロープ（Ｅ）が挙げられる。これらのウイルスによってコードされる非構造（ＮＳ）ポリペプチドとしては、限定するものではないが、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５が挙げられる。
【００４９】
特定の実施形態では、ジカウイルスは、ジカウイルスの非構造タンパク質１（ＮＳ１）に変異を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、この変異はＮＳ１ポリペプチド内にある。例示的なジカウイルス株由来の野生型ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、以下のように示される：
【数７】
2021502075.tif 000009
【００５１】
いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１の配列と、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％の配列同一性を有する。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１の配列（配列番号２）の配列によってコードされるアミノ酸配列由来であってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＫＵ５０１２１５．１の配列によってコードされるアミノ酸配列の７９５位〜１１４５位のアミノ酸であってもよい。いくつかの実施形態では、ＮＳ１ポリペプチドのアミノ酸配列は、ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９に由来してもよい。
【００５２】
「配列同一性」、「配列同一性％」、「同一性％」、「同一％」または「配列アラインメント」とは、第１のアミノ酸配列と第２のアミノ酸配列の比較、または第１の核酸配列と第２の核酸配列の比較を意味し、その比較に基づいてパーセンテージとして計算される。この計算の結果は、「パーセント同一」または「パーセントＩＤ」として説明され得る。
【００５３】
一般に、配列アラインメントを使用して、２つの異なるアプローチの１つによって配列同一性を計算してもよい。最初のアプローチでは、単一の位置でのミスマッチと単一の位置でのギャップの両方が、最終的な配列同一性計算で非同一の位置としてカウントされる。第２のアプローチでは、単一の位置での不一致は、最終的な配列同一性計算で非同一の位置としてカウントされる；ただし、単一の位置のギャップは、最終的な配列同一性の計算では同一でない位置としてカウントされない（無視される）。言い換えれば、第２のアプローチでは、ギャップは最終的な配列同一性の計算では無視される。これら２つのアプローチ間の相違、すなわち、単一の位置でギャップを無視することに対して、ギャップを単一の位置で非同一の位置としてカウントすることにより、２つの配列間の配列同一性値にばらつきが生じる場合がある。
【００５４】
いくつかの実施形態では、配列同一性は、アラインメントを生成し、単一位置でのミスマッチと単一配列でのギャップの両方を最終配列同一性計算の非同一位置としてカウントする同一性を計算するプログラムによって決定される。例えば、プログラムＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳ）は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈのアルゴリズムを実装しており（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈ，１９７０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３−４５３）、これは、第１の配列と第２の配列との間に最初にアラインメントを作成して、次いでそのアラインメントの長さにわたって同一の位置の数をカウントし、次いでアラインメントの長さで同一残基の数を除算し、次いでこの数に１００を掛けて配列同一性％を生成することによって、デフォルト設定ごとに配列同一性を計算する［配列同一性％＝（同一残基数／アラインメントの長さ）×１００）］。
【００５５】
配列同一性は、全長にわたり両方の配列を示すペアワイズアラインメントから計算し得るため、第１配列及び第２配列をその全長で示す（「グローバル配列同一性」）。例えば、プログラムＮｅｅｄｌｅ（ＥＭＢＯＳＳ）は、そのようなアラインメントを生成する；配列同一性％＝（同一残基数／アラインメントの長さ）×１００）］。
【００５６】
配列同一性は、第１配列または第２配列の局所領域のみを示すペアワイズアラインメントから計算し得る（「局所同一性」）。例えば、プログラムＢｌａｓｔ（ＮＣＢＩ）は、そのようなアラインメントを生成する；配列同一性％＝（同一残基数／アラインメントの長さ）×１００）］。
【００５７】
配列アラインメントは好ましくは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズムを使用することにより生成される（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（１９７９）４８、ｐ．４４３−４５３）。好ましくは、プログラム「ＮＥＥＤＬＥ」（Ｅｕｒｏｐｅａｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ  Ｏｐｅｎ  Ｓｏｆｔｗａｒｅ  Ｓｕｉｔｅ（ＥＭＢＯＳＳ））は、プログラムのデフォルトパラメータ（ギャップオープン＝１０．０、ギャップ伸長＝０．５、及びマトリックス＝ＥＢＬＯＳＵＭ６２（タンパク質の場合）、及びマトリックス＝ＥＤＮＡＦＵＬＬ（ヌクレオチドの場合））によって使用する。次に、配列同一性は、全長にわたって両方の配列を示すアラインメントから計算できるため、最初の配列と第２の配列をその完全な長さで示す（「グローバル配列同一性」）。例えば：配列同一性％＝（同一残基数／アラインメントの長さ）×１００）］。
【００５８】
いくつかの実施形態では、変異は、ＮＳ１ポリペプチド内の１つ以上のアミノ酸位置で起こる。いくつかの実施形態では、変異は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して配列番号１にアラインメントされる場合、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に相当する位置で生じる。いくつかの実施形態では、位置９８の変異はトリプトファンからグリシンへの置換である。
【００５９】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に相当する位置に変異を含む。配列番号１の位置９８に相当する位置は、ペアワイズアラインメントアルゴリズムを使用して、ＮＳ−１タンパク質のアミノ酸配列を配列番号１にアラインメントすることにより決定され得る。配列番号１の位置９８のトリプトファン残基に対応するジカウイルス以外のウイルス中のアミノ酸残基は、これらの残基が囲われている本出願の図７に示されている。いくつかの実施形態では、位置９８の変異は、トリプトファンからグリシンへの置換である。いくつかの実施形態では、位置９８の変異は、配列番号１の位置９８のトリプトファンからグリシンへの置換である。
【００６０】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ＮＳ１タンパク質内の変異、ならびにＣ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５ウイルスタンパク質のうち１つ以上の内に少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ＮＳ１タンパク質内に１つ以上の変異を含み、Ｃ、ｐｒＭ、Ｅ、ＮＳ１、ＮＳ２Ａ、ＮＳ２Ｂ、ＮＳ３、ＮＳ４Ａ、ＮＳ４Ｂ、及びＮＳ５ウイルスタンパク質のうち１つ以上の内に少なくとも１つの変異を含まない。いくつかの実施形態では、ジカウイルスはＮＳ１タンパク質内に変異を含み、エンベロープタンパク質Ｅ内に少なくとも１つの変異を含まない。いくつかの実施形態では、全体として、不活化ウイルスは、ジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に少なくとも１つの変異を含み、及びジカウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）の変異は含まない。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置に変異を含み、エンベロープタンパク質Ｅ内に変異を含まない。いくつかの実施形態では、全体として、不活化ジカウイルスは、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置に変異を含み、ジカウイルスエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）に変異を含まない。いくつかの実施形態では、全体として、不活化ウイルスはジカウイルス非構造タンパク質１（ＮＳ１）に少なくとも１つの変異を含み、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置に変異を含み、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。いくつかの実施形態では、全体として、不活化ジカウイルスは、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置に変異を含み、エンベロープタンパク質をコードする配列は、配列番号２の対応する配列と同じである。
【００６１】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、少なくとも１つの変異を欠くジカウイルスと比較して、遺伝的安定性を高める少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、少なくとも１つの変異を欠くジカウイルスと比較して、ウイルス複製を増強する少なくとも１つの変異を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、ジカウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）内などの望ましくない変異の発生を低減するか、そうでなければ阻害する少なくとも１つの変異を含む。
【００６２】
本開示の上記の実施形態では、例示的なペアワイズアラインメントアルゴリズムは、デフォルトパラメータを使用するＮｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈグローバルアラインメントアルゴリズムである（例えば、ギャップ開放ペナルティ＝１０．０使用、及びギャップ拡張ペナルティ＝０．５使用、ＥＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックスを使用）。このアルゴリズムは、ＥＭＢＯＳＳパッケージのニードルツールに便利に実装されている。
【００６３】
いくつかの実施形態では、不活化ジカウイルスは、ワクチン及び免疫原性組成物に使用され得る。例えば、不活化ジカウイルスは、それを必要とする対象のジカウイルス感染を治療するか、もしくは予防するか、及び／またはそれを必要とする対象のジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導するのに有用であり得る。
【００６４】
ワクチンおよび免疫原性組成物の生成
本開示の他の態様は、本明細書に記載の配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置で、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの精製不活化ホールウイルスを含む、ジカウイルスワクチン、及び免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態では、このワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置に、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、このジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株由来である。いくつかの実施形態では、このワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、ここでこのジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株由来である。一実施形態では、このワクチン及び免疫原性組成物は、プラーク精製されたクローンジカウイルス単離物を含む。そのようなワクチン及び免疫原性組成物は、例えば、それを必要とする対象のジカウイルス感染を治療もしくは予防するか、及び／またはそれを必要とする対象のジカウイルスに対する防御免疫応答などの免疫応答を誘導するのに有用であり得る。
【００６５】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の生成には、ジカウイルスの増殖が含まれる。細胞培養における増殖が、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を調製する方法である。ウイルス増殖のための細胞は、懸濁状態で培養されても、または付着状態で培養されてもよい。
【００６６】
本開示の少なくとも１つのウイルスの増殖に適した細胞株は、好ましくは哺乳動物起源であり、これには、限定するものではないが、以下：昆虫細胞（例えば、本明細書に記載の蚊細胞、ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（イヌの腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＭＤＣＫ  ３３０１６、ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ネコ、及びげっ歯類（例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）などのハムスター細胞）が挙げられ、及び、例えば、成体、新生児、胎児、及び胚を含む多種多様な発達段階から得られてもよい。特定の実施形態では、細胞は不死化されている（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記載され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０として寄託されたＰＥＲＣ．６細胞）。好ましい実施形態では、哺乳動物細胞が利用され、そして以下の非限定的な細胞タイプから選択されるか、及び／またはその１つ以上に由来し得る：線維芽細胞（例えば、真皮、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠動脈、肺、血管、真皮微小血管、臍帯）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠状動脈、動脈、子宮、気管支、子宮頸部、網膜周皮細胞）、メラニン細胞、神経細胞（例えば、星状細胞）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨格細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋肉細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑筋、気管支）、肝細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液及び無血清培地で増殖され得、かつウイルスの産生及び複製に有用な、動物細胞及び細胞株の産生を記載している。
【００６７】
上記の細胞型のための培養条件は公知であり、種々の刊行物に記載されている。あるいは、例えば、Ｃａｍｂｒｅｘ  Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｅａｓｔ  Ｒｕｔｈｅｒｆｏｒｄ、Ｎ．Ｊ．）のカタログ及び追加の文献に記載されているように、培養培地、サプリメント、及び条件は商業的に購入され得る。
【００６８】
特定の実施形態では、本明細書に記載の方法で使用される細胞は、無血清及び／または無タンパク質培地で培養される。培地は、ヒトまたは動物起源の血清由来の添加物を含まない場合、本開示の文脈において無血清培地と呼ばれる。無タンパク質とは、タンパク質、成長因子、他のタンパク質添加物、及び非血清タンパク質を排除して細胞の増殖が起こるが、ウイルスの増殖に必要であり得るトリプシンまたは他のプロテアーゼなどのタンパク質を必要に応じて含み得る培養を意味すると理解される。そのような培養で増殖する細胞は、当然タンパク質自体を含んでいる。
【００６９】
公知の無血清培地としては、Ｉｓｃｏｖｅ’ｓ培地、Ｕｌｔｒａ−ＣＨＯ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＥＸ−ＣＥＬＬ（ＪＲＨ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）が挙げられる。通常の血清含有培地としては、Ｅａｇｌｅ’ｓ  Ｂａｓａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＢＭＥ）またはＭｉｎｉｍｕｍ  Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）が挙げられ、これは通常、最大で１０％ウシ胎児血清または同様の添加物とともに用いられる。必要に応じて、最小必須培地（ＭＥＭ）（Ｅａｇｌｅ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，１３０，４３２（１９５９））またはＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ  Ｍｏｄｉｆｉｅｄ  Ｅａｇｌｅ  Ｍｅｄｉｕｍ（ＤＭＥＭまたはＥＤＭ）を、血清を含むサプリメントなしで使用してもよい。ＰＦ−ＣＨＯ（ＪＨＲ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）などの無タンパク質培地、ＰｒｏＣＨＯ  ４ＣＤＭ（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ）またはＳＭＩＦ  ７（Ｇｉｂｃｏ／ＢＲＬ  Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）などの化学的に定義された培地、及びＰｒｉｍａｃｔｏｎｅ、ＰｅｐｔｉｃａｓｅまたはＨｙＰｅｐ．ＴＭなどのマイトジェンペプチド（全てＱｕｅｓｔ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから）またはラクトアルブミン加水分解物（Ｇｉｂｃｏ及び他の製造業者）も、先行技術において十分に公知である。植物加水分解物に基づく培地添加物には、ウイルス、マイコプラズマまたは未知の感染性因子による汚染を排除できるという特別な利点がある。
【００７０】
細胞培養条件（温度、細胞密度、ｐＨ値など）は、本開示に従って使用される細胞株の適合性のために非常に広範囲にわたって可変であり、特定のウイルス株の要件に適合され得る。
【００７１】
培養細胞においてウイルスを増殖させる方法は、一般に、培養される株を培養細胞に接種するステップ、例えばウイルス力価または抗原発現によって決定されるように、ウイルス増殖のための所望の期間（例えば、接種後２４〜１６８時間）、感染細胞を培養すること、及び増殖したウイルスを収集することを含む。いくつかの実施形態では、ウイルスはプラーク精製により収集される。培養細胞にウイルス（ＰＦＵまたはＴＣＩＤ５０で測定）と細胞の比を１：５００〜１：１、好ましくは１：１００〜１：５で接種する。ウイルスは細胞の懸濁液に加えられるか、または細胞の単層に適用され、このウイルスは少なくとも１０分間、少なくとも２０分間、少なくとも３０分間、少なくとも４０分間、少なくとも５０分間、少なくとも６０分間、ただし通常は、３００分未満、２５℃〜４０℃、好ましくは２８℃〜３８℃で細胞に吸収される。感染した細胞培養物（例えば、単層）は、上清（細胞を含まない）の収集、凍結融解によって、または収集した培養上清のウイルス含有量を増大させる酵素作用によって、除去され得る。次いで、収集された液体は、不活化されるか、冷凍保存される。培養細胞は、約０．０００１〜１０、好ましくは０．００２〜５、より好ましくは０．００１〜２という感染多重度（「ＭＯＩ」）で感染され得る。さらにより好ましくは、細胞は約０．０１というＭＯＩで感染される。感染中、細胞培養容器の面積に対する培地の比率は、細胞の培養中よりも低くなる場合がある。この比率を低く保つと、ウイルスが細胞に感染する可能性が最大になる。感染した細胞の上清は、感染後３０〜６０時間、または感染後３〜１０日で収集され得る。特定の好ましい実施形態では、感染細胞の上清は、感染後３〜７日で収集される。より好ましくは、感染細胞の上清は、感染の３〜５日後に収集される。いくつかの実施形態では、プロテアーゼ（例えば、トリプシン）を細胞培養中に添加してウイルス放出を可能にし、プロテアーゼを培養中の任意の適切な段階で添加してもよい。あるいは、特定の実施形態では、感染細胞培養物の上清を収集してもよく、ウイルスを上清から単離してもよいし、または別の方法で精製してもよい。
【００７２】
ウイルス接種物及びウイルス培養物は、好ましくは、単純ヘルペスウイルス、呼吸器合胞体ウイルス、パラインフルエンザウイルス３、ＳＡＲＳコロナウイルス、アデノウイルス、ライノウイルス、レオウイルス、ポリオーマウイルス、ビルナウイルス、サーコウイルス、及び／またはパルボウイルス（ＷＯ２００６／０２７６９８）を含まない（すなわち、試験したところ、それらの混入について陰性結果が得られる）。
【００７３】
ウイルスが細胞株で増殖した場合、宿主細胞ＤＮＡの発癌活性を最小限に抑えるために、最終ワクチン中の残留細胞株ＤＮＡの量を最小限にすることが標準的な慣行である。混入しているＤＮＡは、標準的な精製手順、例えば、クロマトグラフィーなどを使用して、ワクチンの準備中に除去され得る。残留宿主細胞ＤＮＡの除去は、ヌクレアーゼ処理によって、例えば、ＤＮａｓｅを使用することによって増強され得る。参考文献に開示されている宿主細胞のＤＮＡ混入を低減する便利な方法（Ｌｕｎｄｂｌａｄ（２００１）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ３４：１９５−１９７，Ｇｕｉｄａｎｃｅ  ｆｏｒ  Ｉｎｄｕｓｔｒｙ：Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｍｅｔｈｏｄ  Ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ  ａｎｄ  Ｈｕｍａｎ  Ｓｅｒｖｉｃｅｓ  Ｆｏｏｄ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｄｒｕｇ  Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ（ＣＤＥＲ）Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ（ＣＶＭ）．Ｍａｙ  ２００１．）は、２段階の処理を含み、その最初は、ウイルス増殖の間に使用され得るＤＮａｓｅ（例えば、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ）を使用し、次いで、ビリオンの破壊中に使用され得る陽イオン性界面活性剤（例えば、ＣＴＡＢ）を用いる。β−プロピオラクトン処理による除去も使用され得る。一実施形態では、混入しているＤＮＡは、培養上清のベンゾナーゼ処理により除去される。
【００７４】
抗原の生成
ジカウイルスは、当技術分野で公知である任意の適切な方法によって生成及び／もしくは精製またはそうでなければ単離され得る。一実施形態では、本開示の抗原は、精製された不活化ホールジカウイルスである。
【００７５】
いくつかの実施形態では、不活化ウイルスは、「ワクチン及び免疫原性組成物の生成（Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  Ｖａｃｃｉｎｅｓ  ａｎｄ  Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ  Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎｓ）」という表題の上記セクションに記載されているように生成してもよい。
【００７６】
特定の実施形態では、本開示のジカウイルスは、非ヒト細胞を培養することにより産生され得る。本開示のジカウイルスの産生に適した細胞株には、昆虫細胞（例えば、本明細書に記載の蚊細胞のいずれか）が含まれ得る。本開示のジカウイルスの産生に適した細胞株はまた、哺乳動物起源の細胞であってもよく、これには、限定するものではないが、以下：ＶＥＲＯ細胞（サル腎臓由来）、ウマ、ウシ（例えば、ＭＤＢＫ細胞）、ヒツジ、イヌ（例えば、犬の腎臓由来のＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）またはＭＤＣＫ  ３３０１６、ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）、ネコ、及びげっ歯類（例えば、ハムスター細胞、例えば、ＢＨＫ２１−Ｆ、ＨＫＣＣ細胞、またはチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞））が挙げられ、及び、例えば、成人、新生児、胎児、及び胚を含む、多種多様な発達段階から得られ得る。特定の実施形態では、細胞は不死化されている（例えば、ＷＯ０１／３８３６２及びＷＯ０２／４０６６５に記載され、ＥＣＡＣＣ寄託番号９６０２２９４０で寄託されたＰＥＲＣ．６細胞）。好ましい実施形態では、哺乳動物細胞が利用され、以下の非限定的な細胞型のうちの１つ以上から選択されるか、及び／または誘導され得る：線維芽細胞（例えば、真皮、肺）、内皮細胞（例えば、大動脈、冠動脈、肺、血管、真皮微小血管、臍帯）、肝細胞、ケラチノサイト、免疫細胞（例えば、Ｔ細胞、Ｂ細胞、マクロファージ、ＮＫ、樹状細胞）、乳腺細胞（例えば、上皮）、平滑筋細胞（例えば、血管、大動脈、冠動脈、動脈、子宮、気管支、子宮頸部、網膜周皮細胞）、メラノサイト、神経細胞（例えば、アストロサイト）、前立腺細胞（例えば、上皮、平滑筋）、腎細胞（例えば、上皮、メサンギウム、近位尿細管）、骨格細胞（例えば、軟骨細胞、破骨細胞、骨芽細胞）、筋肉細胞（例えば、筋芽細胞、骨格、平滑、気管支）、肝細胞、網膜芽細胞、及び間質細胞。ＷＯ９７／３７０００及びＷＯ９７／３７００１は、懸濁液及び無血清培地で増殖し得、かつウイルス抗原の産生に有用である、動物細胞及び細胞株の産生を記載している。特定の実施形態では、非ヒト細胞は無血清培地で培養される。
【００７７】
ウイルス不活化
本開示の特定の実施形態は、ジカウイルスワクチン及び／または精製された不活化ジカウイルスを含む免疫原性組成物に関する。本明細書で使用される「不活化ジカウイルス」という用語は、有効量のホルマリンでの処理などの不活化方法で処理されたジカウイルスを含むことを意図している。特に、不活化ジカウイルスは、２０℃〜２４℃の温度で１０日間、約０．０１％ｗ／ｖの量のホルムアルデヒドを用いてジカウイルスを処理する方法から取得可能／取得される。不活化されたジカウイルスは、不活化されていないジカウイルスであれば感染し得る宿主細胞に、もはや感染し得ない。一実施形態では、不活化ジカウイルスはもはやＶＥＲＯ細胞に感染できず、ＶＥＲＯ細胞に細胞変性効果を及ぼすことができない。
【００７８】
「精製ジカウイルス」という用語は、ジカウイルスが以下に記載される精製プロセスに供されたことを意味する。精製されたジカウイルスは、非精製ジカウイルスよりも、Ｖｅｒｏ細胞タンパク質などの宿主細胞タンパク質、及びＶｅｒｏ細胞ＤＮＡなどの宿主細胞ＤＮＡの含有量が低い。精製ジカウイルスの純度は、サイズ排除クロマトグラフィーによって決定され得る。サイズ排除クロマトグラフィーで精製されたジカウイルスの主なピークは、サイズ排除クロマトグラフィーでの曲線下総面積の８５％以上であっても、またはサイズ排除クロマトグラフィーでの曲線下総面積の９０％以上であっても、またはサイズ排除クロマトグラフィーの曲線下総面積の９５％以上であってもよい。そのような結果は、「精製された」ジカウイルスと見なされる。
【００７９】
したがって、「精製不活化ホールジカウイルス」という用語は、精製ジカウイルスを２０℃〜２４℃の温度で１０日間０．０１％ｗ／ｖの量のホルムアルデヒドで処理して、サイズ排除クロマトグラフィーの曲線下総面積の少なくとも８５％のメインピークを提供する方法から入手可能／得られたジカウイルスを指す。特定の実施形態では、精製された不活化ホールジカウイルスは、プラーク精製により得られた／入手可能なクローン分離株である。
【００８０】
ウイルスを不活化または殺傷して哺乳動物細胞に感染する能力を破壊するが、ウイルスの二次、三次または四次構造及び免疫原性エピトープを破壊しない方法は、当技術分野で公知である。そのような方法としては、化学的手段と物理的手段の両方が挙げられる。ウイルスを不活化するための適切な手段としては、限定するものではないが、界面活性剤、ホルマリン（本明細書では「ホルムアルデヒド」とも呼ばれる）、過酸化水素、ベータプロピオラクトン（ＢＰＬ）、バイナリーエチルアミン（ＢＥＩ）、アセチルエチレンイミン、熱、電磁放射、Ｘ線放射、ガンマ放射、紫外線（ＵＶ放射）、ＵＶ−Ａ放射、ＵＶ−Ｂ放射、ＵＶ−Ｃ放射、メチレンブルー、ソラレン、カルボキシフラーレン（Ｃ６０）、過酸化水素及びそれらのいずれかの組み合わせから選択される１つ以上の因子の有効量での処理が挙げられる。すでに上で述べたように、本出願の目的に関して、用語「ホルマリン」と「ホルムアルデヒド」とは互換的に使用される。
【００８１】
本開示の特定の実施形態では、少なくとも１つのウイルスは化学的に不活化されている。化学的不活化のための薬剤及び化学的不活化の方法は、当技術分野で周知であり、本明細書に記載されている。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのウイルスは、１つ以上のＢＰＬ、過酸化水素、ホルマリン、またはＢＥＩで化学的に不活化される。少なくとも１つのウイルスがＢＰＬで化学的に不活化される特定の実施形態では、ウイルスは１つ以上の改変を含んでもよい。いくつかの実施形態では、この１つ以上の改変は、改変された核酸を含み得る。いくつかの実施形態では、改変核酸はアルキル化核酸である。他の実施形態では、この１つ以上の改変は、改変されたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、改変ポリペプチドは、改変システイン、メチオニン、ヒスチジン、アスパラギン酸、グルタミン酸、チロシン、リジン、セリン、及びトレオニンのうちの１つ以上を含む改変アミノ酸残基を含む。
【００８２】
少なくとも１つのウイルスがホルマリンで化学的に不活化される特定の実施形態では、不活化されたウイルスは１つ以上の改変を含んでもよい。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変は、改変されたポリペプチドを含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変は、架橋ポリペプチドを含み得る。少なくとも１つのウイルスがホルマリンで化学的に不活化されるいくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物はさらにホルマリンを含む。少なくとも１つのウイルスがＢＥＩで化学的に不活化される特定の実施形態では、ウイルスは１つ以上の改変を含み得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の改変は、改変された核酸を含み得る。いくつかの態様において、改変核酸はアルキル化核酸である。
【００８３】
少なくとも１つのウイルスがホルマリンで化学的に不活化されるいくつかの実施形態では、残存する未反応ホルマリンは、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和してもよいし、透析してもよいし、及び／またはバッファー交換して残存する未反応ホルマリンを除去してもよい。いくつかの実施形態では、メタ重亜硫酸ナトリウムを過剰に添加する。いくつかの実施形態では、インライン静的ミキサーなどのミキサーを使用して溶液を混合し、その後ろ過またはさらに精製してもよい（例えば、クロスフローろ過システムを使用）。
【００８４】
本開示の特定の実施形態は、ジカウイルス調製物を不活化する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）ウイルス調製物を産生するために使用されるインビトロで培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離すること、及び（ｂ）約０．００５％〜約０．０２％ｖ／ｖホルムアルデヒドを用いてウイルス調製物を処理すること、を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態では、細胞は非ヒト細胞である。適切な非ヒト哺乳動物細胞としては、限定するものではないが、ＶＥＲＯ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が挙げられる。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｖｅｒｏ細胞である。
【００８６】
本方法の特定の実施形態では、ジカウイルス調製物は、約２℃〜約４２℃の範囲の温度で、ホルマリンで処理される。例えば、ジカウイルス調製物は、約２℃〜約４２℃、約２℃〜約８℃、約１５℃〜約３７℃、約１７℃〜約２７℃、約２０℃〜約２５℃の範囲の温度で、または約２℃、約４℃、約８℃、約１０℃、約１５℃、約１７℃、約１８℃、約１９℃、約２０℃、約２１℃、約２２℃、約２３℃、約２４℃、約２５℃、約２６℃、約２７℃、約２８℃、約２９℃、約３０℃、約３７℃、もしくは約４２℃の温度で、ホルマリンで処理され得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、１５℃〜３０℃の温度で、ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、１８℃〜２５℃の温度で、ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、室温で、ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、２２℃の温度で、ホルマリンで処理される。
【００８７】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約１日間ホルマリンで処理される。例えば、ジカウイルス調製物は、少なくとも約１日間、少なくとも約２日間、少なくとも約３日間、少なくとも約４日間、少なくとも約５日間、少なくとも約６日間、少なくとも約７日間、少なくとも約８日間、少なくとも約９日間、少なくとも約１０日間、少なくとも約１１日間、少なくとも約１２日間、少なくとも約１３日間、少なくとも約１４日間、少なくとも約１５日間、少なくとも約１６日間、少なくとも約１７日間、少なくとも約１８日間、少なくとも約１９日間、少なくとも約２０日間、少なくとも約２１日間、少なくとも約２２日間、少なくとも約２３日間、少なくとも約２４日間、少なくとも約２５日間、少なくとも約２６日間、少なくとも約２７日間、少なくとも約２８日間、少なくとも約２９日間、少なくとも約３０日間、またはそれ以上ホルマリンで処理され得る。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約９日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約１１日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は少なくとも約１４日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約２０日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、少なくとも約３０日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、８〜１２日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、９〜１１日間ホルマリンで処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、１０日間ホルマリンで処理される。
【００８８】
不活化処理期間の途中で、ウイルス調製物とホルマリンの混合物をろ過して凝集物を除去してもよい。ろ過後、ウイルス調製物とホルマリンの混合物を新しい容器に移し、不活化処理期間が終了するまでホルマリンでさらに処理する。いくつかの実施形態では、全体のホルマリン治療期間が８〜１２日である場合、ホルマリン治療の４〜６日後にウイルス調製物とホルマリンの混合物を濾過する。いくつかの実施形態では、全体のホルマリン治療期間が９〜１１日である場合、５〜６日間のホルマリン治療後にウイルス調製物とホルマリンの混合物を濾過する。いくつかの実施形態では、全体のホルマリン治療期間が１０日間である場合、５日間のホルマリン治療後にウイルス調製物とホルマリンの混合物を濾過する。このステップに適したフィルターは０．２μｍフィルターである。
【００８９】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物を、１５℃〜３０℃の温度で８〜１２日間、０．００５〜０．０２％（ｗ／ｖ）ホルマリンで処理する。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物を、１８℃〜２５℃の温度で９〜１１日間、０．００８〜０．０１５％（ｗ／ｖ）ホルマリンで処理する。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物を、２２℃の温度で１０日間０．０１％（ｗ／ｖ）ホルマリンで処理する。
【００９０】
不活化ホールジカウイルス調製物は、２２℃の温度で１４日間、約０．０２％ｗ／ｖの範囲の量のホルムアルデヒドを用いて、ジカウイルスを処理する方法から入手可能／得られると考えられる。いくつかの実施形態では、不活化ホールジカウイルス調製物は、ジカウイルスを２２℃の温度で１０日間、約０．０１％ｗ／ｖの量のホルムアルデヒドを用いて処理する方法から入手可能／得られると考えられる。
【００９１】
いくつかの実施形態では、この方法は、未反応ホルマリンを有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムで中和することをさらに含む。いくつかの実施形態では、メタ重亜硫酸ナトリウムの有効量は、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭの範囲である。例えば、メタ重亜硫酸ナトリウムは、約０．０１ｍＭ〜約１００ｍＭ、約０．１ｍＭ〜約５０ｍＭ、約０．５ｍＭ〜約２０ｍＭ、もしくは約１ｍＭ〜約１０ｍＭの有効濃度で，または約０．０１ｍＭ、約０．０５ｍＭ、約０．１ｍＭ、約０．２５ｍＭ、約０．５ｍＭ、約０．７５ｍＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、約５ｍＭ、約６ｍＭ、約７ｍＭ、約８ｍＭ、約９ｍＭ、約１０ｍＭ、約２０ｍＭ、約３０ｍＭ、約４０ｍＭ、約５０ｍＭ、約７５ｍＭまたは約１００ｍＭの濃度で加えてもよい。いくつかの実施形態では、ホルマリンは約２ｍＭのメタ重亜硫酸ナトリウムで中和される。
【００９２】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、過酸化水素で処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、２０℃から３０℃の任意の温度で、５〜１２０分間、０．１〜３％、または０．１〜１％の範囲の濃度の過酸化水素で処理される。いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物は、０．０１％の最終濃度の過酸化水素で、６０分以内で処理される。
【００９３】
いくつかの実施形態では、この方法は、（ａ）ウイルス調製物を産生するために使用される、インビトロで培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離すること；（ｂ）１つ以上の精製ステップでウイルス調製物を精製すること；（ｃ）ウイルス調製物を有効量のホルマリンで処理すること；（ｄ）有効量のメタ重亜硫酸ナトリウムでウイルス調製物を中和すること；及び（ｅ）不活化ジカウイルスを含む薬学的組成物を調製すること、を含む。ジカウイルスを単離するために、クロスフローろ過（ＣＦＦ）、マルチモーダルクロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、陽イオン交換クロマトグラフィー、及び／または陰イオン交換クロマトグラフィーの使用を含むがこれらに限定されない、当該分野で公知のウイルス調製物を精製する任意の方法を使用してもよい。いくつかの実施形態では、このウイルス調製物は、クロスフローろ過（ＣＦＦ）によって単離される。いくつかの実施形態では、このウイルス調製物は、約７０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、またはそれ以上の量で高度に精製される。
【００９４】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、株Ｍｒ  ７６６、ＡｒＤ  ４１５１９、ＩｂＨ  ３０６５６、Ｐ６−７４０、ＥＣ  Ｙａｐ、ＦＳＳ１３０２５、ＡｒＤ  ７１１７、ＡｒＤ  ９９５７、ＡｒＤ  ３０１０１、ＡｒＤ  ３０１５６、ＡｒＤ  ３０３３２、ＨＤ  ７８７８８、ＡｒＤ  １２７７０７、ＡｒＤ  １２７７１０、ＡｒＤ  １２７９８４、ＡｒＤ  １２７９８８、ＡｒＤ  １２７９９４、ＡｒＤ  １２８０００、ＡｒＤ  １３２９１２、１３２９１５、ＡｒＤ  １４１１７０、ＡｒＤ  １４２６２３、ＡｒＤ  １４９９１７、ＡｒＤ  １４９８１０、ＡｒＤ  １４９９３８、ＡｒＤ  １５７９９５、ＡｒＤ  １５８０８４、ＡｒＤ  １６５５２２、ＡｒＤ  １６５５３１、ＡｒＡ  １４６５、ＡｒＡ  ２７１０１、ＡｒＡ  ２７２９０、ＡｒＡ  ２７１０６、ＡｒＡ  ２７０９６、ＡｒＡ  ２７４０７、ＡｒＡ  ２７４３３、ＡｒＡ  ５０６／９６、ＡｒＡ  ９７５−９９、Ａｒａ  ９８２−９９、ＡｒＡ  ９８６−９９、ＡｒＡ  ２７１８、ＡｒＢ  １３６２、Ｎｉｇｅｒｉａ６８、Ｍａｌａｙｓｉａ６６、Ｋｅｄｏｕｇｏｕ８４、Ｓｕｒｉｎａｍｅ、ＭＲ１４２９、ＰＲＶＡＢＣ５９、ＥＣＭＮ２００７、ＤａｋＡｒ４１５２４、Ｈ／ＰＦ／２０１３、Ｒ１０３４５１、１０３３４４、８３７５、ＪＭＢ−１８５、ＺＩＫＶ／Ｈ、ｓａｐｉｅｎｓ／Ｂｒａｚｉｌ／Ｎａｔａｌ／２０１５、ＳＰＨ２０１５、ＺＩＫＶ／Ｈｕ／Ｃｈｉｂａ／Ｓ３６／２０１６、ＴｈａｉｌａｎｄＳＶＯ１２７／１４、Ｐｈｉｌｌｉｐｐｉｎｅ  ＣＯＣ  Ｃ０７４０、Ｂｒａｚｉｌ  Ｆｏｒｔａｌｅｚａ  ２０１５及びＣｕｂａ２０１７という株からなる株の群から選択され得る。
【００９５】
特定の実施形態では、ジカウイルスは、ジカウイルスの非構造タンパク質１（ＮＳ１）に変異を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、このジカウイルスはＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、このジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株由来である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異においてＰＲＶＡＢＣ５９株とは異なる精製不活化ホールジカウイルスを含む。
【００９６】
少なくとも１つの不活化ジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含む本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染の治療もしくは予防、及び／またはそれを必要とする対象におけるジカウイルスに対する、防御免疫応答などの免疫応答の誘導に有用であり得る。
【００９７】
不活化の完全性の決定
本開示の他の態様は、２つの異なる細胞型の連続感染を使用することにより、アルボウイルス調製物の不活化の完全性を決定する方法に関する。この方法は、１つの細胞タイプのみを使用するアッセイ、またＴＣＩＤ５０方法などの他の方法と比較しても、驚くほど低い検出限界（ＬＯＤ）を有する。さらに、この方法では、動物を使用して不活化ウイルスの感染性を判定する必要がない。
【００９８】
アルボウイルス調製物の不活化の完全性を決定する方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）培養昆虫細胞に不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間インキュベートして、それによって昆虫細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）（ｉ）で生成された昆虫細胞上清を培養哺乳動物細胞に接種し、この哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
【００９９】
アルボウイルスは、節足動物によってヒトに伝播されるウイルスである。それらとしては、フラビウイルス、トガウイルス、及びブニヤウイルス属由来のウイルスが挙げられる。本明細書に開示の方法により調べたアルボウイルス調製物は、哺乳動物細胞に、特にＶｅｒｏ細胞に感染し得、これらの細胞に細胞変性効果を引き起こし得るアルボウイルスを含む。いくつかの実施形態では、このアルボウイルスは、ジカウイルス、西ナイルウイルス、黄熱病ウイルス、日本脳炎ウイルス、デングウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、ダニ媒介脳炎ウイルス、チクングンヤ熱ウイルス、オニョンニョンウイルス、またはマヤロウイルスから選択される。いくつかの実施形態では、このアルボウイルスはジカウイルスである。
【０１００】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、株Ｍｒ  ７６６、ＡｒＤ  ４１５１９、ＩｂＨ  ３０６５６、Ｐ６−７４０、ＥＣ  Ｙａｐ、ＦＳＳ１３０２５、ＡｒＤ  ７１１７、ＡｒＤ  ９９５７、ＡｒＤ  ３０１０１、ＡｒＤ  ３０１５６、ＡｒＤ  ３０３３２、ＨＤ  ７８７８８、ＡｒＤ  １２７７０７、ＡｒＤ  １２７７１０、ＡｒＤ  １２７９８４、ＡｒＤ  １２７９８８、ＡｒＤ  １２７９９４、ＡｒＤ  １２８０００、ＡｒＤ  １３２９１２、１３２９１５、ＡｒＤ  １４１１７０、ＡｒＤ  １４２６２３、ＡｒＤ  １４９９１７、ＡｒＤ  １４９８１０、ＡｒＤ  １４９９３８、ＡｒＤ  １５７９９５、ＡｒＤ  １５８０８４、ＡｒＤ  １６５５２２、ＡｒＤ  １６５５３１、ＡｒＡ  １４６５、ＡｒＡ  ２７１０１、ＡｒＡ  ２７２９０、ＡｒＡ  ２７１０６、ＡｒＡ  ２７０９６、ＡｒＡ  ２７４０７、ＡｒＡ  ２７４３３、ＡｒＡ  ５０６／９６、ＡｒＡ  ９７５−９９、Ａｒａ  ９８２−９９、ＡｒＡ  ９８６−９９、ＡｒＡ  ２７１８、ＡｒＢ  １３６２、Ｎｉｇｅｒｉａ６８、Ｍａｌａｙｓｉａ６６、Ｋｅｄｏｕｇｏｕ８４、Ｓｕｒｉｎａｍｅ、ＭＲ１４２９、ＰＲＶＡＢＣ５９、ＥＣＭＮ２００７、ＤａｋＡｒ４１５２４、Ｈ／ＰＦ／２０１３、Ｒ１０３４５１、１０３３４４、８３７５、ＪＭＢ−１８５、ＺＩＫＶ／Ｈ、ｓａｐｉｅｎｓ／Ｂｒａｚｉｌ／Ｎａｔａｌ／２０１５、ＳＰＨ２０１５、ＺＩＫＶ／Ｈｕ／Ｃｈｉｂａ／Ｓ３６／２０１６、ＴｈａｉｌａｎｄＳＶＯ１２７／１４、Ｐｈｉｌｌｉｐｐｉｎｅ  ＣＯＣ  Ｃ０７４０、Ｂｒａｚｉｌ  Ｆｏｒｔａｌｅｚａ  ２０１５及びＣｕｂａ２０１７という株からなる株の群から選択され得る。
【０１０１】
特定の実施形態では、ジカウイルスは、ジカウイルスの非構造タンパク質１（ＮＳ１）に変異を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、このジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、このワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、このジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株由来である。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の９８位のＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異においてＰＲＶＡＢＣ５９株とは異なる精製不活化ホールジカウイルスを含む。
【０１０２】
培養昆虫細胞は、昆虫細胞および増殖培地を含有する昆虫細胞培養物にアルボウイルス調製物を添加することにより、アルボウイルス調製物を接種する。接種された昆虫細胞を、次いで、適切な条件下でアルボウイルス調製物と第１の期間インキュベートする。いくつかの実施形態では、この第１の期間は３〜７日である。いくつかの実施形態では、この第１の期間は５〜７日である。いくつかの実施形態では、この第１の期間は６日である。したがって、いくつかの実施形態では、接種昆虫細胞を、３〜７日間、アルボウイルス調製物と共にインキュベートする。いくつかの実施形態では、接種昆虫細胞を、５〜７日間、アルボウイルス調製物と共にインキュベートする。いくつかの実施形態では、接種昆虫細胞を、６日間、アルボウイルス調製物と共にインキュベートする。インキュベーションの間、任意の生きたウイルスが、昆虫細胞上清中に分泌される。
【０１０３】
使用される昆虫細胞は、調査されるアルボウイルスに感染され得、その生存率がウイルス感染によって変化しない任意の昆虫細胞であってもよい。昆虫細胞は、ウイルスが細胞に対して細胞変性効果を持たないように選択される。適切な昆虫細胞としては、限定するものではないが、ＣＣＬ−１２５細胞、Ａａｇ−２細胞、ＲＭＬ−１２細胞、Ｃ６／３６細胞、Ｃ７−１０細胞、ＡＰ−６１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−１細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−２細胞、Ａ．ｔ．ＧＲＩＰ−３細胞、ＵＭ−ＡＶＥ１細胞、Ｍｏｓ．５５細胞、Ｓｕａ１Ｂ細胞、４ａ−３Ｂ細胞、Ｍｏｓ．４２細胞、ＭＳＱ４３細胞、ＬＳＢ−ＡＡ６９５ＢＢ細胞、ＮＩＩＤ−ＣＴＲ細胞及びＴＲＡ−１７１細胞が挙げられる。いくつかの実施形態では、昆虫細胞はＣ６／３６細胞である。
【０１０４】
次いで、昆虫細胞をアルボウイルス調製物とインキュベートすることにより生成された昆虫細胞上清を使用して、培養哺乳動物細胞に接種する。接種のために、昆虫細胞上清を哺乳動物細胞に移し、哺乳動物細胞とともに６０〜１２０分間または８０〜１００分間または９０分間インキュベートする。接種細胞培養培地を加えた後、哺乳動物細胞を昆虫細胞上清とともに適切な条件下で第２の期間インキュベートする。いくつかの実施形態では、第２の期間は３〜１４日である。いくつかの実施形態では、第２の期間は５〜１２日である。いくつかの実施形態では、第２の期間は６〜１０日である。いくつかの実施形態では、第２の期間は７〜９日である。いくつかの実施形態では、第２の期間は８日である。したがって、いくつかの実施形態では、接種された哺乳動物細胞は、昆虫細胞上清とともに３〜１４日間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、接種された哺乳動物細胞は、昆虫細胞上清とともに５〜１２日間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、接種された哺乳動物細胞は、昆虫細胞上清とともに７〜９日間インキュベートされる。いくつかの実施形態では、接種された哺乳動物細胞は、昆虫細胞上清とともに８日間インキュベートされる。インキュベーション中、生ウイルスが哺乳動物細胞に細胞変性効果を及ぼす。インキュベーション中、残留複製ウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞などの哺乳動物細胞に細胞変性効果を及ぼす。
【０１０５】
使用される哺乳動物細胞は、調査されるアルボウイルスに感染し得、そのウイルスが細胞変性効果を発揮する任意の哺乳動物細胞であり得る。適切な哺乳動物細胞としては、限定するものではないが、ＶＥＲＯ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が挙げられる。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｖｅｒｏ細胞である。
【０１０６】
いくつかの実施形態では、アルボウイルス調製物の不活化の完全性を判定する方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）Ｃ６／３６細胞に、不活化ステップを施したアルボウイルス製剤を接種し、昆虫細胞を第１の期間インキュベートして、それによってＣ６／３６細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）培養哺乳動物細胞に、（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清を接種し、この哺乳動物細胞を第２期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
【０１０７】
いくつかの実施形態では、アルボウイルス調製物の不活化の完全性を判定する方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）培養昆虫細胞に不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間インキュベートして、それによって昆虫細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）（ｉ）で生成された昆虫細胞上清をＶｅｒｏ細胞に接種し、哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
【０１０８】
いくつかの実施形態では、アルボウイルス調製物の不活化の完全性を判定する方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、Ｃ６／３６細胞に接種し、昆虫細胞を第１の期間インキュベートして、それによってＣ６／３６細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）Ｖｅｒｏ細胞に、（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
【０１０９】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物の不活化の完全性を判定する方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、Ｃ６／３６細胞に接種し、昆虫細胞を第１の期間インキュベートして、それによってＣ６／３６細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）Ｖｅｒｏ細胞に、（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物の不活化の完全性を判定する方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、Ｃ６／３６細胞に接種し、昆虫細胞を３〜７日間インキュベートして、それによってＣ６／３６細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）Ｖｅｒｏ細胞に、（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
【０１１１】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物の不活化の完全性を判定する方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、Ｃ６／３６細胞に接種し、昆虫細胞を第１の期間インキュベートして、それによってＣ６／３６細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）Ｖｅｒｏ細胞に、（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を３〜１４日間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
【０１１２】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物の不活化の完全性を判定する方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、Ｃ６／３６細胞に接種し、昆虫細胞を３〜７日間インキュベートして、それによってＣ６／３６細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）Ｖｅｒｏ細胞に、（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を３〜１４日間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
【０１１３】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物の不活化の完全性を判定する方法は、以下のステップを含む：
（ｉ）不活化ステップを施したアルボウイルス調製物を、Ｃ６／３６細胞に接種し、昆虫細胞を６日間インキュベートして、それによってＣ６／３６細胞上清を生成すること；
（ｉｉ）Ｖｅｒｏ細胞に、（ｉ）で生成されたＣ６／３６細胞上清を接種し、哺乳動物細胞を８日間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
【０１１４】
第２の期間の終わりに、ウイルス調製物が哺乳動物細胞に対して細胞変性効果を有するか否かを決定する。細胞変性効果とは、ウイルスの侵入、感染、及びウイルス複製中の細胞からの出芽によって引き起こされる細胞構造の変化である。本開示の方法において、細胞変性効果は、細胞がフェノールレッドを含む培地で培養される場合、ピンクからオレンジもしくは黄色への培地の色の変化によって、または哺乳動物細胞の顕微鏡検査によって、決定される。哺乳動物細胞の顕微鏡検査で、細胞が丸くなり、組織培養容器（プレート、ウェル、またはフラスコ）から引き離され始めるか、または組織培養プレート／フラスコから離れることが示された場合、細胞変性効果が存在すると見なされる。細胞変性効果の他の兆候としては、シンシチウムを形成するための隣接細胞の融合及び核または細胞質封入体の出現が含まれる。
【０１１５】
上述のように、本明細書に開示された方法は、極めて低い検出限界を有する。この方法では、１．０  ＴＣＩＤ５０未満のウイルス含量が検出され得る。いくつかの実施形態では、０．８  ＴＣＩＤ５０未満のウイルス含有量が検出され得る。いくつかの実施形態では、０．５  ＴＣＩＤ５０未満のウイルス含有量が検出され得る。いくつかの実施形態では、０．２  ＴＣＩＤ５０未満のウイルス含有量が検出され得る。いくつかの実施形態では、０．１  ＴＣＩＤ５０未満のウイルス含有量が検出され得る。
【０１１６】
不活化の完全性を決定するための上記方法は、アルボウイルスを不活化する任意の方法で使用され得る。一実施形態では、アルボウイルス調製物を不活化するための方法は以下を含む：
（ａ）インビトロで培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞がアルボウイルス調製物を生成するために使用されること；
（ｂ）アルボウイルス調製物を０．００５％〜０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理すること；
（ｃ）不活化の完全性を、以下によって決定すること：
（ｉ）培養昆虫細胞にステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、この昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること；
（ｉｉ）培養哺乳動物細胞に（ｉ）で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）アルボウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること。
【０１１７】
いくつかの実施形態では、アルボウイルス調製物を不活化する方法は以下を含む：
（ａ）インビトロで培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞がアルボウイルス調製物を生成するために使用されること；
（ｂ）２０〜３０℃の温度で５〜１２０分間、０．１〜３％の過酸化水素でアルボウイルス製剤を処理すること；
（ｃ）不活化の完全性を、以下によって決定すること：
（ｉ）培養昆虫細胞にステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること；
（ｉｉ）培養哺乳動物細胞に（ｉ）で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）このアルボウイルス調製物が哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること。
【０１１８】
いくつかの実施形態では、アルボウイルス調製物を不活化する方法は以下を含む：
（ａ）インビトロで培養された１つ以上の細胞からアルボウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞がアルボウイルス調製物を生成するために使用されること；
（ｂ）２０〜３０℃の温度で６０分間、０．０１％の過酸化水素でアルボウイルス調製物を処理すること；
（ｃ）不活化の完全性を、以下によって決定すること：
（ｉ）培養昆虫細胞にステップ（ｂ）に従って処理されたウイルス調製物を接種し、この昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること；
（ｉｉ）培養哺乳動物細胞に（ｉ）で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）このアルボウイルス調製物が哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含むか否かを決定すること。
【０１１９】
不活化の完全性を決定するための上記方法は、ジカウイルスを不活化する任意の方法で使用され得る。一実施形態では、ジカウイルス調製物を不活化するための方法は以下を含む：
（ａ）インビトロで培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞がジカウイルス調製物を産生するために使用されること；
（ｂ）ジカウイルス調製物を０．００５％〜０．０２％ｗ／ｖのホルムアルデヒドで処理すること；
（ｃ）不活化の完全性を、以下によって決定すること：
（ｉ）培養昆虫細胞にステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、この昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること；
（ｉｉ）培養哺乳動物細胞に（ｉ）で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物に、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスが含まれているか否かを判断すること。
【０１２０】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物を不活化する方法は以下を含む：
（ａ）インビトロで培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞はジカウイルス調製物を産生するために使用されること；
（ｂ）２０〜３０℃の温度で５〜１２０分間、０．１〜３％の過酸化水素でジカウイルス調製物を処理すること；
（ｃ）不活化の完全性を、以下によって決定すること：
（ｉ）培養昆虫細胞にステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、この昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること；
（ｉｉ）培養哺乳動物細胞に（ｉ）で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ジカウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを判断すること。
【０１２１】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物を不活化する方法は以下を含む：
（ａ）インビトロで培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞はジカウイルス調製物を産生するために使用されること；
（ｂ）２０℃〜３０℃の温度で６０分間、０．０１％の過酸化水素でジカウイルス調製物を処理すること；
（ｃ）不活化の完全性を、以下によって決定すること：
（ｉ）ステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を昆虫細胞に接種し、この昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること；
（ｉｉ）哺乳動物細胞に（ｉ）で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスが、ジカウイルス調製物に含まれているか否かを判断すること。
【０１２２】
いくつかの実施形態では、ジカウイルス調製物を不活化する方法は以下を含む：
（ａ）インビトロで培養された１つ以上の細胞からジカウイルス調製物を単離することであって、ここで、この細胞がジカウイルス調製物を産生するために使用されること；
（ｂ）ジカウイルス調製物を、２０℃〜３０℃の温度で、例えば、２２℃で７日間、０．０５％ホルマリンで処理すること；
（ｃ）不活化の完全性を、以下によって決定すること：
（ｉ）培養昆虫細胞にステップ（ｂ）に従って処理されたジカウイルス調製物を接種し、この昆虫細胞を第１の期間インキュベートし、それによって上清を生成すること；
（ｉｉ）培養哺乳動物細胞に（ｉ）で生成した上清を接種し、その哺乳動物細胞を第２の期間インキュベートすること；及び
（ｉｉｉ）ウイルス調製物が、哺乳動物細胞に細胞変性効果をもたらす残留複製ウイルスを含んでいるか否かを決定すること。
【０１２３】
いくつかの実施形態では、細胞は、非ヒト細胞である。適切な非ヒト哺乳動物細胞としては、限定するものではないが、ＶＥＲＯ細胞、ＬＬＣ−ＭＫ２細胞、ＭＤＢＫ細胞、ＭＤＣＫ細胞、ＡＴＣＣ  ＣＣＬ３４  ＭＤＣＫ（ＮＢＬ２）細胞、ＭＤＣＫ  ３３０１６（ＷＯ９７／３７００１に記載の寄託番号ＤＳＭ  ＡＣＣ  ２２１９）細胞、ＢＨＫ２１−Ｆ細胞、ＨＫＣＣ細胞、及びチャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ細胞）が挙げられる。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞は、Ｖｅｒｏ細胞である。
【０１２４】
アジュバント
本開示の他の態様は、本明細書に記載の少なくとも１つのジカウイルス由来の１つ以上の抗原を、１つ以上のアジュバントと組み合わせて含むジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物に関する。いくつかの実施形態では、ワクチン及び／または免疫原性組成物は、１つ以上のアジュバントと組み合わせて、本明細書に記載されるように、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置に、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの精製不活化ホールジカウイルスを含む。いくつかの実施形態では、ワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、ここで、このジカウイルスは、１つ以上のアジュバントと組み合わせた株ＰＲＶＡＢＣ５９に由来する。いくつかの実施形態では、このワクチンまたは免疫原性組成物は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製不活化ホールジカウイルスを含み、このジカウイルスは１つ以上のアジュバントと組み合わせて配列番号２のゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。一実施形態では、ワクチン及び免疫原性組成物は、１つ以上のアジュバントと組み合わせて、プラーク精製クローンジカウイルス単離物を含む。本開示のそのようなアジュバント化ワクチン及び／または免疫原性組成物は、それを必要とする対象のジカウイルス感染を治療または予防するか、及び／またはそれを必要とする対象のジカウイルスに対する免疫応答、例えば防御免疫応答を誘導するのに有用であり得る。
【０１２５】
ワクチンのアジュバント効果を達成する様々な方法が知られており、本明細書に開示されるジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物と組み合わせて使用され得る。一般的な原則及び方法は、「Ｔｈｅ  Ｔｈｅｏｒｙ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ  ｏｆ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」，１９９５，Ｄｕｎｃａｎ  Ｅ．Ｓ．Ｓｔｅｗａｒｔ−Ｔｕｌｌ（ｅｄ．），Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ  Ｌｔｄ，ＩＳＢＮ  ０−４７１−９５１７０−６，に、及びまた「Ｖａｃｃｉｎｅｓ：Ｎｅｗ  Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ａｄｊｕｖａｎｔｓ」，１９９５，Ｇｒｅｇｏｒｉａｄｉｓ  Ｇ  ｅｔ  ａｌ．（ｅｄｓ．），Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＩＳＢＮ  ０−３０６−４５２８３−９にも詳述されている。
【０１２６】
例示的なアジュバントとしては、限定するものではないが、アルミニウム塩、リン酸カルシウム、トール様受容体（ＴＬＲ）アゴニスト、モノホスホリルリピドＡ（ＭＬＡ）、ＭＬＡ誘導体、合成リピドＡ、リピドＡ模倣物または類似体、サイトカイン、サポニン、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）誘導体、ＣｐＧオリゴ、グラム陰性菌のリポ多糖（ＬＰＳ）、ポリホスファゼン、エマルジョン（オイルエマルジョン）、キトサン、ビタミンＤ、ステアリルまたはオクタデシルチロシン、ヴィロソーム、渦巻状物、ポリ（ラクチド−ｃｏ−グリコリド）（ＰＬＧ）微粒子、ポロキサマー粒子、微粒子、リポソーム、完全フロイントアジュバント（ＣＦＡ）、及び不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）が挙げられる。いくつかの実施形態では、アジュバントはアルミニウム塩である。
【０１２７】
いくつかの実施形態では、アジュバントとしては、アラム（ａｌｕｍ、ミョウバン）、リン酸アルミニウム、水酸化アルミニウム、硫酸カリウムアルミニウム、及びＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ  ８５のうち少なくとも１つを含む。いくつかの実施形態では、本開示のアルミニウム塩アジュバントは、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の抗原の吸着を増大させることが見出された。したがって、いくつかの実施形態では、抗原のうち少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％がアルミニウム塩アジュバントに吸着される。
【０１２８】
本開示の特定の実施形態は、アジュバント添加ジカウイルスワクチンまたは免疫原性組成物を調製する方法を含み、これは、（ａ）ワクチンまたは免疫原性組成物をアルミニウム塩アジュバントと混合することであって、このワクチンまたは免疫原性組成物は、本明細書に記載の少なくとも１つのジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含むこと、及び（ｂ）適切な条件下で約１時間〜約２４時間の範囲の期間（例えば、約１６時間〜約２４時間）この混合物をインキュベートすることであって、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、または約１００％の抗原がアルミニウム塩アジュバントに吸着されていること、を含む。本方法の特定の実施形態では、少なくとも１つのジカウイルスは、非ヒト細胞適応変異（例えば、Ｔｒｐ９８Ｇｌｙ変異などのタンパク質ＮＳ１における非ヒト細胞適応変異）を含むジカウイルスである。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製不活化ホールジカウイルスであり、ここでこのジカウイルスはＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、このジカウイルスは、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む精製不活化ホールジカウイルスであり、このジカウイルスは配列番号２のゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０１２９】
ウイルス精製
本開示のさらなる態様はジカウイルスを精製する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、ジカウイルスの集団を含有する接種材料を複数の細胞に接種すること、及び接種した細胞の１つ以上から、プラーク精製によって、ジカウイルスクローン単離物を得ることを含む。いくつかの実施形態では、この細胞は非ヒト細胞（例えば、昆虫細胞、哺乳動物細胞）である。いくつかの実施形態では、この細胞は昆虫細胞（例えば、本明細書に記載の蚊細胞／細胞株のいずれか）である。いくつかの実施形態では、この細胞は哺乳動物細胞（例えば、本明細書に記載の哺乳動物細胞／細胞株のいずれか）である。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞はサル細胞である。
【０１３０】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は不均質である（例えば、２つ以上の遺伝子型を含む）。いくつかの実施形態では、ジカウイルスの集団は、ジカウイルス臨床分離株（例えば、ＰＲＶＡＢＣ５９株由来）及び／または以前に細胞培養で継代された１つ以上のジカウイルスを含む。いくつかの実施形態では、プラーク精製（例えば、本明細書に記載される）によって、不均一なウイルス集団からの（遺伝的に均一な）クローン単離物の実質的及び／または完全な分離が可能になる。いくつかの実施形態では、サル細胞は、ＶＥＲＯ細胞系（例えば、ＶＥＲＯ  １０−８７細胞）に由来する。いくつかの実施形態では、接種物はヒト血清を含む。いくつかの実施形態では、接種物は、１つ以上の外来性因子（例えば、１つ以上の混入ウイルス）を含む。いくつかの実施形態では、プラーク精製（例えば、本明細書に記載される）によって、１つ以上の外来性因子から離れた（遺伝的に均質な）クローン単離物の実質的及び／または完全な精製が可能になる。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローンを単離及び／または精製するために記載される方法は、ジカウイルスクローン単離物の１回以上（例えば、１回以上、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上など）の追加のプラーク精製を含む。いくつかの実施形態では、ジカウイルスクローン単離物を単離及び／または精製するために記載される方法は、ジカウイルスクローン単離物を、細胞培養において（例えば、蚊の細胞株などの昆虫細胞において、及び／またはＶＥＲＯ細胞株などの哺乳動物細胞において）、１回以上（例えば、１回以上、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上など）継代することを含む。
【０１３２】
本開示のさらなる態様は、ワクチンまたは免疫原性組成物の調製のためにジカウイルスを精製する方法に関する。いくつかの実施形態では、この方法は、１回以上（例えば、１回以上、２回以上、３回以上、４回以上、５回以上、または６回）の以下のステップ（以下の順序を含む任意の順序）を含む：ジカウイルスを含むサンプルまたは調製物の深層ろ過；ジカウイルスを含むサンプルを緩衝液交換及び／または希釈して（例えば、クロスフローろ過（ＣＦＦ）による）保持液を生成すること；ジカウイルスを含む試料をイオン交換膜（例えば、陰イオン交換膜、陽イオン交換膜）に結合して、結合画分を生成することであって、この結合画分はジカウイルスを含むこと、及びこの結合画分をイオン交換膜から溶出すること；ジカウイルスを含む試料を、本明細書に記載の有効量の任意の化学的不活化剤で処理すること；化学的に不活化されたジカウイルスを含むサンプルをメタ重亜硫酸ナトリウムで中和すること；及び／または化学的に不活化されたジカウイルスを含む中和サンプルを精製すること（例えば、クロスフローろ過（ＣＦＦ）による）。いくつかの実施形態では、この方法は、以下のステップを含む、（ａ）ジカウイルスを含むサンプルを第１デプスフィルターに通して第１溶出液を生成するステップであって、この第１溶出液はジカウイルスを含むステップと；（ｂ）クロスフローろ過（ＣＦＦ）によって第１の溶出液を緩衝液交換及び／または希釈して、第１の保持液を生成するステップであって、ここで、第１の保持液にはジカウイルスが含まれているステップと；（ｃ）第１の保持液をイオン交換膜に結合して、第１の結合画分を生成するステップであって、この第１の結合画分にジカウイルスが含まれるステップ、及び第１の結合画分をイオン交換膜から溶出させて、第２の溶出液を生成するステップであって、この第２の溶出液にジカウイルスが含まれているステップと；（ｄ）第２溶出液を第２デプスフィルターに通して、第２保持液を生成するステップであって、ここで、この第２保持液はジカウイルスを含むステップと；（ｅ）有効量の化学的不活化剤で第２保持液を処理するステップであって；（ｆ）処理された第２保持液をメタ重亜硫酸ナトリウムで中和するステップと；（ｇ）クロスフローろ過（ＣＦＦ）によりこの中和された第２保持液を精製するステップと。
【０１３３】
ワクチン及び／または免疫原性組成物の製剤
本開示のさらなる態様は、本明細書に記載のジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含む本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の製剤に関する。いくつかの実施形態では、ジカウイルスは、精製された不活化ホールジカウイルスである。いくつかの実施形態では、精製不活化ホールジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の位置９８に相当する位置に変異を含む。いくつかの実施形態では、精製不活化ホールジカウイルスは、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含む。いくつかの実施形態では、精製不活化ホールジカウイルスは、配列番号１の位置９８、または配列番号１の９８位に対応する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含み、ここでジカウイルスはＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。いくつかの実施形態では、精製された不活化ホールジカウイルスは、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にＴｒｐ９８Ｇｌｙ変異を含み、ここでこのジカウイルスは配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０１３４】
本明細書に記載のジカウイルス由来の１つ以上の抗原を含む本開示のそのようなワクチン及び／または免疫原性組成物は、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染の治療もしくは予防、及び／またはそれを必要とする対象のジカウイルスに対する、防御免疫応答などの免疫応答の誘導に有用であり得る。
【０１３５】
典型的には、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、液体溶液または懸濁液のいずれかとして注射剤として調製される；注射前の液体の溶液または懸濁液に適した固体形態も調製してもよい。そのような調製物はまた、乳化してもよいし、または乾燥粉末として生成してもよい。活性免疫原性成分は、薬学的に許容され、活性成分と適合性のある賦形剤と混合される場合が多い。適切な賦形剤は、例えば、水、生理食塩水、デキストロース、スクロース、グリセロール、エタノールなど、及びそれらの組み合わせである。さらに、必要に応じて、ワクチンまたは免疫原性組成物は、湿潤剤または乳化剤、ｐＨ緩衝剤、またはワクチンもしくは免疫原性組成物の有効性を高めるアジュバントなどの補助物質を含んでもよい。
【０１３６】
ワクチンまたは免疫原性組成物は、慣習的には、注射により、非経口的に、例えば、皮下（ｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、経皮、皮内、皮下（ｓｕｂｄｅｒｍａｌｌｙ）または筋肉内注射によって、非経口的に投与されてもよい。他の投与様式に適した追加の製剤としては、坐剤が挙げられ、場合によっては、経口、経口、鼻腔内、頬側、舌下、腹腔内、膣内、肛門及び頭蓋内製剤が挙げられる。坐剤の場合、伝統的な結合剤及び担体には、例えば、ポリアルカレングリコールまたはトリグリセリドが含まれてもよい；そのような坐剤は、０．５％〜１０％、または１〜２％の範囲の活性成分を含む混合物から形成されてもよい。特定の実施形態では、脂肪酸グリセリドまたはココアバターの混合物などの低融点ワックスが最初に溶融され、本明細書に記載のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物は、例えば撹拌することにより均一に分散される。次いで、溶融した均質混合物を、好都合なサイズの型に注ぎ、冷却させ及び固化させる。
【０１３７】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、投与製剤に適合する方法で、及び治療有効かつ免疫原性であるような量で投与されてもよい。投与される量は、例えば、免疫応答を開始する個体の免疫系の能力、及び望まれる防御の程度を含む、治療される対象に依存する。適切な用量範囲としては、例えば、約０．１μｇ〜約１００μｇの精製不活化ホールジカウイルスが含まれ得る。精製不活化ジカウイルスの量は、Ｂｒａｄｆｏｒｄアッセイ（Ｂｒａｄｆｏｒｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９７６）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４）によって、規定量の組換えジカ（Ｚｉｋａ）エンベロープタンパク質を使用して標準曲線を確立することによって決定され得る。
【０１３８】
初回投与及び追加接種のための適切なレジメンもまた可変であるが、初回投与に続く接種または他の投与によって代表される。
【０１３９】
アプリケーションの方法は、広く変化され得る。ワクチンまたは免疫原性組成物の投与のための任意の従来の方法も適用可能である。これらとしては、固体の生理学的に許容される基剤でのまたは生理学的に許容される分散液中での非経口的、注射などによる経口投与が挙げられる。ワクチンまたは免疫原性組成物の投与量は、投与経路に依存し、ワクチン接種される人の年齢及び抗原の製剤に応じて変化し得る。ワクチンまたは免疫原性組成物は、本明細書に記載されるように、０．５ｍＬを超える、０．５ｍＬまたは０．５ｍＬ未満の単位投与量を有し得る。例えば、これは、０．２５ｍＬの容量で投与されてもよい。
【０１４０】
張性を制御するために、ナトリウム塩などの生理的塩を含めることが好ましい。塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）が好ましく、１〜２０ｍｇ／ｍｌで存在し得る。存在し得る他の塩としては、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム二水和物、塩化マグネシウム、塩化カルシウムなどが挙げられる。
【０１４１】
本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、１つ以上の緩衝液を含んでもよい。典型的な緩衝液としては以下が挙げられる；リン酸塩緩衝液；Ｔｒｉｓ緩衝液、ホウ酸塩緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に水酸化アルミニウムアジュバントを含む）；またはクエン酸緩衝液。緩衝液は、通常５〜２０ｍＭの範囲に含まれる。
【０１４２】
ワクチンまたは免疫原性組成物のｐＨは、一般に５．０〜８．５または５．０〜８．１、より典型的には６．０〜８．５、例えば、６．０〜８．０、６．５〜８．０、６．５〜７．５、７．０〜８．５、７．０〜８．０、または７．０〜７．８である。したがって、本開示の製造プロセスは、包装の前にバルクワクチンのｐＨを調整するステップを含み得る。
【０１４３】
ワクチンまたは免疫原性組成物は、好ましくは無菌である。これは、好ましくは、非発熱性であり、例えば、１用量あたり＜１  ＥＵ（内毒素単位、標準測定値）、及び好ましくは１用量あたり＜０．１  ＥＵを含む。これは、グルテンを含まないことが好ましい。
【０１４４】
特定の実施形態では、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物は、有効濃度の界面活性剤を含み得る。いくつかの実施形態では、界面活性剤の有効量は、約０．００００５％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖまたは約０．０００１％ｖ／ｖ〜約１％ｖ／ｖを含むがこれらに限定されない。特定の実施形態では、界面活性剤の有効量は、約０．００１％ｖ／ｖ、約０．００２％ｖ／ｖ、約０．００３％ｖ／ｖ、約０．００４％ｖ／ｖ、約０．００５％ｖ／ｖ、約０．００６％ｖ／ｖ、約０．００７％ｖ／ｖ、約０．００８％ｖ／ｖ、約０．００９％ｖ／ｖ、または約０．０１％ｖ／ｖである。理論に拘束されることを望まないが、界面活性剤は、本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物を溶液中に維持し、このワクチン及び／または免疫原性組成物が凝集するのを防ぐのに役立つ。
【０１４５】
適切な界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ類」として公知である）、オクトキシノール（オクトキシノール−９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ  １００）またはｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（「ＣＴＡＢ」）、及びデオキシコール酸ナトリウムが挙げられる。界面活性剤は微量でのみ存在する場合がある。微量の他の残留成分は、抗生物質（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミキシンＢ）であり得る。いくつかの実施形態では、この界面活性剤にはポリソルベートを含む。いくつかの実施形態では、界面活性剤の有効濃度は、約０．００００５％ｖ／ｖ〜約５％ｖ／ｖの範囲を含む。
【０１４６】
ワクチン及び／または免疫原性組成物は、好ましくは２℃〜８℃で保管される。理想的には、直射日光を避けるべきである。抗原とエマルジョンとは典型的には混合物であるが、それらは、最初は即時混合用の別個の成分のキットの形で与えられてもよい。ワクチン及び／または免疫原性組成物は、一般に、対象に投与される場合、水性形態にあるだろう。
【０１４７】
本開示の方法
本開示のさらなる態様は、それを必要とする対象においてジカウイルスを治療もしくは予防するか、及び／またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに対する免疫応答を誘導するために、本明細書に記載のような配列番号１の位置９８または本明細書に記載の配列番号１の位置９８に相当する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である、変異を有するジカウイルスなどの精製不活化ホールジカウイルスを含む、本明細書に記載のワクチン及び／または免疫原性組成物の使用方法に関する。本開示のさらなる態様は、それを必要とする対象においてジカウイルスを治療もしくは予防するか、及び／またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに対する免疫応答を誘導するために、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置に、トリプトファンからグリシンへの置換である、変異を有する精製不活化ホールジカウイルスを含む、本明細書に記載のワクチン及び／または免疫原性組成物の使用方法に関する。本開示のさらなる態様は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置に、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製不活化ホールジカウイルスを含む、本明細書に記載のワクチン及び／または免疫原性組成物の使用方法に関し、このジカウイルスは、それを必要とする対象においてジカウイルスを治療もしくは予防するため、及び／またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに対する免疫応答を誘導するために、ＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。本開示のさらなる態様は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置でトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製不活化ホールジカウイルスを含む、本明細書に記載のワクチン及び／または免疫原性組成物の使用方法に関し、このジカウイルスは、それを必要とする対象においてジカウイルスを治療もしくは予防するため、及び／またはそれを必要とする対象においてジカウイルスに対する免疫応答を誘導するために、配列番号２に記載のゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０１４８】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載のように配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置にトリプトファンからグリシン置換である変異を有するジカウイルスなどの、精製不活化ホールジカウイルスを対象に投与することにより、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染を治療または予防する方法に関する。
【０１４９】
いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置でのトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する、精製不活化ホールジカウイルスを含む本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の治療有効量を対象に投与することにより、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染を治療または予防する方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置で、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製不活化ホールジカウイルスを含む本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の治療有効量を対象に投与することにより、それを必要とする対象におけるジカウイルス感染を治療または予防する方法に関し、このジカウイルスは、ＰＲＶＡＢＣ５９株由来である。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置でトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製不活化ホールジカウイルスを含む本開示の治療有効量のワクチン及び／または免疫原性組成物の治療有効量を対象に投与することにより、それを必要とする対象のジカウイルス感染を治療または予防する方法に関し、ここでこのジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０１５０】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載の配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置で、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有するジカウイルスなどの精製不活化ホールジカウイルスを含む、本開示の治療有効量のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することにより、それを必要とする対象においてジカウイルスに対する免疫応答を誘導する方法に関する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置で、トリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製不活化ホールジカウイルスを含む、本開示の治療有効量のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することにより、それを必要とする対象においてジカウイルスに対する免疫応答を誘導する方法に関し、ここでこのジカウイルスは株ＰＲＶＡＢＣ５９に由来する。いくつかの実施形態では、本開示は、配列番号１の位置９８または配列番号１の位置９８に相当する位置でトリプトファンからグリシンへの置換である変異を有する精製不活化ホールジカウイルスを含む本開示の治療有効量のワクチン及び／または免疫原性組成物を対象に投与することにより、それを必要とする対象のジカウイルスに対する免疫応答を誘導するための方法に関し、ここでこのジカウイルスは、配列番号２によるゲノム配列を含むＰＲＶＡＢＣ５９株に由来する。
【０１５１】
いくつかの実施形態では、投与ステップは、対象におけるジカウイルスに対する防御免疫応答を誘導する。いくつかの実施形態では、対象はヒトである。いくつかの実施形態において、対象は、妊娠しているか、妊娠する意図がある。
【０１５２】
いくつかの実施形態では、投与ステップは、１回以上の投与を含む。投与は、単回投与スケジュールによって行っても、または複数回投与（プライムーブースト（初回−追加））スケジュールによって行ってもよい。複数回投与スケジュールでは、さまざまな投与量を同じ経路で与えても、または異なる経路、例えば、非経口初回接種（プライム）と粘膜追加免疫（ブースト）、粘膜初回接種と非経口追加免疫などで与えてもよい。通常、それらは同じ経路で投与される。複数回投与は、通常、少なくとも１週間間隔（例えば、約２週間、約３週間、約４週間、約５週間、約６週間、約７週間、約８週間、約９週間、約１０週間、約１１週間、約１２週間、約１６週間など）で投与される。２５〜３０日（例えば２８日）の間隔を空けて２回投与することが特に有用である。
【０１５３】
本開示の方法は、本開示のジカウイルスワクチン及び／または免疫原性組成物の治療有効量または免疫原性量の投与を含む。治療有効量または免疫原性量とは、それが投与される非感染、感染または非曝露の対象において、防御免疫応答を誘導する本開示のワクチン及び／または免疫原性組成物の量であり得る。そのような応答は一般に、ワクチンに対する分泌性、細胞性、及び／または抗体媒介性の免疫応答を対象に生じさせる。通常、このような応答としては、限定するものではないが、以下の１つ以上の効果が挙げられる：免疫グロブリンＡ、Ｄ、Ｅ、ＧまたはＭなどの免疫学的クラスのいずれかからの抗体の産生；Ｂ及びＴリンパ球の増殖；免疫細胞への活性化、増殖、及び分化シグナルの提供；ヘルパーＴ細胞、サプレッサーＴ細胞、及び／または細胞傷害性Ｔ細胞の増殖。
【０１５４】
好ましくは、治療有効量または免疫原性量は、疾患症状の治療または予防をもたらすのに十分である。必要な正確な量は、他の要因の中でも、治療される対象；治療される対象の年齢及び全身状態；対象の免疫系が抗体を合成する能力；望ましい防御の程度；治療されている状態の重症度；選択された特定のジカウイルス抗原及びその投与方法によって異なる。適切な治療有効量または免疫原性量は、当業者により容易に決定され得る。治療有効量または免疫原性量は、通常の試験を通じて決定できる比較的広い範囲に収まる。
【０１５５】
本開示は、以下の実施例を参照することにより、より完全に理解されるであろう。しかし、それらは、決して開示の態様または範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１５６】
実施例１：クローンジカウイルス株の生成
本実施例では、研究歴が知られているジカウイルス（ＺＩＫＡＶ）株の生成が記載されている。
【０１５７】
材料及び方法
Ｖｅｒｏ細胞の維持
ＷＨＯ  Ｖｅｒｏ  １０−８７細胞の１つのバイアルを水浴で急速に解凍し、３６℃＋／２℃、５％ＣＯ２のＴ−７５ｃｍ２フラスコ中にペニシリン−ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン４０ｍＭ、及び１０％ＦＢＳを含む１９ｍＬの予熱ＤＭＥＭ（ダルベッコの改変最小必須培地）に直接接種した。細胞をコンフルエンシーになるまで増殖させ、ＴｒｙｐｌＥを使用して継代培養した。このフラスコを２つのＴ−１８５ｃｍ２フラスコに拡大し、コンフルエンシーになるまで成長させ、３１ｘＴ−１８５ｃｍ２フラスコに継代培養し、細胞が１００％コンフルエンシーに達するまで増殖させた。細胞をトリプシン処理により回収し、８００×ｇで１０分間遠心分離し、１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭに、濃度１．９×１０７細胞／ｍＬの濃度で再懸濁した。Ｖｅｒｏ細胞の１つのバイアルを急速に解凍し、上記のようにＴ−７５ｃｍ２フラスコ中に蘇生させた。これらを２回継代し、１３×Ｔ−１８５ｃｍ２フラスコに細胞バンクを作成した。トリプシン処理後、細胞を８００×ｇで遠心分離し、４．６８ｘ１０５細胞／ｍＬの濃度で凍結培地（１０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯを含むＤＭＥＭ）に再懸濁した。この細胞バンクを、クリオバイアルにアリコートした。
【０１５８】
Ｖｅｒｏ細胞は、ペニシリン−ストレプトマイシン、Ｌ−グルタミン及び１０％ＦＢＳを含むＤＭＥＭ（ｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ）で増殖及び維持された。ＴｒｙｐｌＥｘｐｒｅｓｓを使用して、細胞を維持及びトリプシン処理した。ウイルス吸着の２日前、６ウェルプレートに、３ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ中で４−５×１０５細胞／ウェルを、または５ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ中でＴ−２５ｃｍ２フラスコ中に７×１０５細胞を、または０．１ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳ中で９６ウェルプレート中に１×１０４細胞／ウェルを、播種した。インキュベーターを、表示された温度を維持するために毎日モニターした。Ｖｅｒｏ細胞株を、液体窒素で保存した。
【０１５９】
プラークアッセイ
ウイルス力価は、６ウェルプレートで増殖させたＶｅｒｏ細胞の新鮮にコンフルエントな単層でのプラーク滴定により決定した。凍結したアリコートを解凍し、９６ウェルプレートのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳでそのアリコートの１０倍希釈系列を作成した。希釈したウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞単層の接種前、氷上で維持した。アッセイ時に、増殖培地を６ウェルプレートから吸引し、各ウイルス希釈液１００μＬをウェルに加えた。ウイルスを、細胞シートの乾燥を防ぐためにプレートを頻繁に（１０分ごとに）揺らしながら、３６℃±２℃で、５％ＣＯ２で６０分間吸着させた。ウイルス吸着後、４０〜４１℃に維持された４ｍＬの最初のアガロース積層（１Ｘ  ｃＤＭＥＭ−２％−ＦＢＳ＋０．８％アガロース）を各ウェルに加えた。アガロースを、室温で３０分間固化させた後、そのプレートを上下逆さまにして、３６℃＋／２℃、５％ＣＯ２で４〜６日間インキュベートした。４日目に１６０μｇ／ｍＬのニュートラルレッドバイタル染料を含む２ｍＬの第２のアガロース積層を追加した。５日目と６日目にプラークを視覚化した。
【０１６０】
ＴＣＩＤ５０アッセイによるウイルスの定量化
ウイルス力価はまた、９６ウェルプレートで増殖したＶｅｒｏ細胞の新鮮にコンフルエントな単層での滴定により決定した。凍結したアリコートを解凍し、９６ウェルプレートのｃＤＭＥＭ−２％−ＦＢＳ希釈液で１０倍連続希釈したアリコートを作成した。希釈したウイルスは、Ｖｅｒｏ細胞単層の接種前、氷上で維持した。アッセイの時点で、増殖培地を９６ウェルプレートから吸引し、各ウイルス希釈液１００μＬをウェルに加えた。プレートを、５％ＣＯ２で、３６℃＋／２℃で５日間インキュベートした。Ｒｅｅｄ／Ｍｕｅｎｃｈ計算機を使用して、５０％組織培養感染量（Ｔｉｓｓｕｅ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｉｎｆｅｃｔｉｖｅ  Ｄｏｓｅ）（ＴＣＩＤ５０）の力価を計算した。
【０１６１】
試験物
ジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９（ドライアイス上の１つの０．５ｍＬバイアル）を疾病管理予防センター（ＣＤＣ）から受け取り、ジカウイルスの同定は、ＲＴ−ＰＣＲにより確認した。この株を試験したところ、ＰＣＲによってアルファウイルス及びマイコプラズマの混入が陰性であった。この情報を表１に要約する。
【表１】
2021502075.tif 000010
【０１６２】
配列決定
ＱＩＡａｍｐＶｉｒａｌ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｓｐｉｎキットを使用して、製造業者のプロトコールに従って各単離物の安定化されたウイルス収穫物からＲＮＡを抽出した。各分離株から抽出したＲＮＡを使用して、ジカウイルスゲノム全体を含む６つのｃＤＮＡ断片を作成及び増幅した。増幅されたｃＤＮＡ断片のサイズ及び純度を１％アガロース／ＴＢＥゲルで分析し、その後Ｑｉａｇｅｎ  Ｑｕｉｃｋ  Ｇｅｌ  Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ  Ｋｉｔを使用してゲル精製した。ＡＢＩ  ３１３０ＸＬ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ａｎａｌｙｚｅｒシーケンサーを使用して、自動配列決定反応を実施した。Ｌａｓｅｒｇｅｎｅ  ＳｅｑＭａｎソフトウェアを使用して、配列決定データを分析した。
【０１６３】
結果
アメリカにおける現在のＺＩＫＡＶの激増に関連する研究歴が既知であるＺＩＫＡＶ株を求めた。この理由のため、ＺＩＫＡＶ株ＰＲＶＡＢＣ５９を選択した。Ｖｅｒｏ細胞での増殖に適した十分に特徴づけられたウイルスを生成するために、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９を、最初にＶｅｒｏ細胞で増幅した（Ｐ１）。
【０１６４】
１００％コンフルエントな、Ｖｅｒｏ細胞のフラスコ（Ｔ−１７５ｃｍ２）を、４ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳ中の０．０１のＭＯＩで感染させた。５％ＣＯ２で、３６℃±２℃で６０分間、ウイルスを単層に吸着させた後、５％ＣＯ２、３６℃±２℃で２０ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳをウイルス増幅に適用した。接種後の細胞変性効果（ＣＰＥ）について細胞層を毎日モニターした（図１）。９６時間後、培地を回収し、遠心分離（６００×ｇ、４℃、１０分）で清澄化することにより、上清を回収した。トレハロースを１８％ｗ／ｖの最終濃度まで添加することにより、収穫物を安定化した。そのバルクを０．５ｍＬのクリオバイアルに分注し、−８０℃で保管した。
【０１６５】
安定化されたＰ１収穫物は、ＴＣＩＤ５０アッセイによりＶｅｒｏ細胞単層上の感染性ウイルスの存在について分析した。０時間目から開始して毎日アリコートを採取することにより、増殖動態をモニターした。７２時間目までにピーク力価に達した（図２）。
【０１６６】
Ｖｅｒｏ細胞の６ウェル単層上で３日目からの収穫物を滴定することにより、Ｐ１材料をプラーク精製した。６日目にプラークを視覚化し、プラスチックプレートの底にある別個のプラークの周りに円を描くことにより、分離する１０個のプラークを単離した。ウェルの底を掻き取り、ｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳですすぎながら、滅菌した大口径ピペットを使用してアガロースのプラグを抽出することにより、プラークを採取した。アガロースプラグを０．５ｍＬのｃＤＭＥＭ−１０％−ＦＢＳに加え、ボルテックスし、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ２ａ−ｊとラベル付けし、５％ＣＯ２、３６℃±２℃で一晩インキュベーターに入れた。
【０１６７】
三個のプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ２ａ−ｃ）を、さらに精製するために持ち越した。各単離株をＶｅｒｏ細胞の新鮮な６ウェル単層上に、２連で、ニートでプレートした。このＰ２／Ｐ３遷移をプラーク精製し、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ３ａ−ｊと表示した。
【０１６８】
最終回の精製のために、６つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ３ａ−ｆ）を繰り越した。各単離株をＶｅｒｏ細胞の新鮮な６ウェル単層上に、２連で、ニートでプレートした。このＰ３／Ｐ４遷移をプラーク精製し、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ４ａ−ｊと表示した。
【０１６９】
Ｐ４プラーク精製由来の６つのプラーク（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ４ａ−ｆ）を、Ｔ−２５ｃｍ２フラスコ内のＶｅｒｏ細胞の単層上で、遮光で継代した。各プラーク採取は、２ｍＬ  ｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳ−で希釈し１ｍＬが、５％ＣＯ２で、３６℃±２℃で１時間吸着された；他の１ｍＬはトレハロースで安定化し（１８％ｖ／ｖ最終）、−６０℃未満で貯蔵された。ウイルスの吸着後、ｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳを各フラスコに加え、３６℃±２℃で、５％ＣＯ２で４日間増殖させた。ウイルス上清を回収し、遠心分離（６００×ｇ、４℃、１０分間）で清澄化し、１８％トレハロースで安定化し、アリコートに分けて＜−６０℃で貯蔵した。このＰ５シードを、ジカウイルスの効力についてＴＣＩＤ５０により試験した（図３）。
【０１７０】
Ｖｅｒｏ細胞のＴ−１７５ｃｍ２フラスコのコンフルエントな単層に、４ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳ中で０．０１のＭＯＩで、ＰＲＶＡＢＣ５９（Ｐ５ａ−ｆ）の６つのクローンのそれぞれを感染させた。ウイルスを、５％ＣＯ２、３６℃＋／２℃で６０分間吸着させた後、２０ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳを各フラスコに添加し、３６℃＋／２℃、で、５％ＣＯ２で増殖させた。Ｖｅｒｏ細胞単層の健康状態及びＣＰＥを毎日モニターした。示されるように、ウイルスを３日目及び５日目に回収した（図４）。３日目と５日目から採取したＰ６株をプールし、１８％トレハロースで安定化し、アリコートに分けて＜−６０℃で貯蔵した。
【０１７１】
ＰＲＶＡＢＣ５９の６つのクローン（Ｐ６ａ−ｆ）のそれぞれを、ジカウイルスのインビトロ効力について試験した（図５）。この効力は、２つの異なる方法、ＴＣＩＤ５０及びプラーク滴定によって決定した。ＴＣＩＤ５０は、ＣＰＥの目視検査（顕微鏡）によって、及び赤（ＣＰＥなし）と比較してＣＰＥ（黄色）を表示するウェルの吸光度の差（Ａ５６０−Ａ４２０）を測定することによって計算した。このプレートを、プレートリーダーで読み取り、顕微鏡で読み取ったプレート（吸光度）と同じ計算機に適用した。２つのスコアリング技術の間のＴＣＩＤ５０の値は非常に似ているが、プラーク滴定で得られる値は低くなっている。
【０１７２】
Ｐ６ウイルスの生成及び特徴付けの概要を以下の表２に示す。
【表２】
2021502075.tif 000011
【０１７３】
フラビウイルスのエンベロープタンパク質はウイルスの主要な免疫原性部分であるので、元の分離株のエンベロープ糖タンパク質配列に非常に類似した分離ジカウイルスクローンが求められた。ＰＲＶＡＢＣ５９クローンＰ６ａ、Ｐ６ｃ、Ｐ６ｄ、及びＰ６ｆは、エンベロープ領域（Ｇ９９０Ｔ）のヌクレオチド９９０にＧ→Ｔ変異を含み、その結果、エンベロープ残基３３０でＶａｌ→Ｌｅｕのアミノ酸変異が生じたが、ＰＲＶＡＢＣ５９クローンＰ６ｂ及びＰ６ｅのエンベロープ遺伝子は、参照株（ＧｅｎＢａｎｋ  ｒｅｆ  ＫＵ５０１２１５．１）と比較して同一であった（表３及び図６）。
【表３】
2021502075.tif 000012
【０１７４】
次いで、ジカエンベロープ配列に変異を欠く２つのクローンを、完全なゲノム配列決定に供した。配列決定の結果を、上記の表３に要約する。配列分析により、両方のクローンのＮＳ１領域のヌクレオチド２９２でのＴ→Ｇ置換が明らかになり、ＮＳ１残基９８でのＴｒｐ→Ｇｌｙ変異が生じた。この変異はまた、ディープシーケンシングによって後で確認された。ＮＳ１  Ｗ９８Ｇ変異は、ＺＩＫＡＶ  ＮＳ１のウィングドメインの絡み合ったループに位置しており、膜結合、エンベロープタンパク質との相互作用、及び潜在的に六量体のＮＳ１形成に関与している。他のトリプトファン残基（Ｗ１１５、Ｗ１１８）はフラビウイルス間で高度に保存されているが、Ｗ９８は保存されていない（図７）。しかし、興味深いことに、Ｗ９８残留物の１００％の保存は、アフリカ系及びアジア系由来の系統を含む１１の異なるＺＩＫＡＶ系統にまたがって観察されている。各株で同定された変異を表４に要約する。
【表４】
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【０１７５】
ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６株の表現型分析を実施して、ＺＩＫＡＶクローンを特徴付けた。図８に示すように、及び図９に定量するように、各クローン分離株は、大きなプラークと小さなプラークの混合集団を有するＰ１ウイルスと比較して、大きなサイズのプラークの比較的均一な集団で構成されていた。これらのデータは、単一ＺＩＫＡＶクローンの正常な分離を示唆している。
【０１７６】
次に、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６クローンのＶｅｒｏ細胞における増殖動態分析を分析した。Ｖｅｒｏ細胞に、無血清増殖培地中の各ＺＩＫＡＶ  Ｐ６クローンの０．０１  ＴＣＩＤ５０／細胞を感染させた。ウイルス上清試料を毎日採取し、同時にＴＣＩＤ５０アッセイにより感染力価をアッセイした。全てのＰ６クローンについて、３日目から４日目にピーク力価が生じた（約９．０  ｌｏｇ１０ＴＣＩＤ５０／ｍＬ）。様々なＰ６クローンの増殖動態に有意差はなかった（図１０）。
【０１７７】
まとめると、この結果により、ジカウイルスシードが正常に生成されたことが示される。このシードの選択には、ウイルスの増殖履歴、動態、収量、遺伝子型、及び表現型の理解が必要であった。重要なことに、ジカウイルス株のクローン分離により、汚染物質（例えば、親のヒト分離株に存在し得る外来物質）からウイルスを首尾よく精製することが可能になった。興味深いことに、３つの連続したプラーク精製により、Ｖｅｒｏ細胞適合ウイルス（Ｐ６ａ−ｆ株）を迅速に選択することに成功し、これらの株は、無血清Ｖｅｒｏ細胞培養で良好に複製できて、株Ｐ６ａ、ｃ、ｄ、ｆは、ウイルスエンベロープタンパク質の変異を保有したが、ｐ６ｂ及びｐ６ｅ株は、ウイルスＮＳ１タンパク質の変異を獲得した（ウイルスエンベロープへの改変なし）。さらに、Ｖｅｒｏに適応した株により、これらの株から増殖した後続のウイルス継代の効率的かつ再現可能な増殖及び製造が可能になった。理論に拘束されることを望まないが、Ｖｅｒｏ細胞での継代時にＥｎｖ  ３３０の変異も観察されたため、株Ｐ６ａ、ｃ、ｄ、及びｆで観察されたＥｎｖ−Ｖ３３０Ｌ変異は、インビトロ適応の結果である可能性がある（Ｗｅｇｅｒ−Ｌｕｃａｒｅｌｌｉ  ｅｔ  ａｌ．２０１７．Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｖｉｒｏｌｏｇｙ）。エンベロープタンパク質は、ジカウイルスの主要な免疫原性エピトープであるため、ＥｎｖにＶｅｒｏ適応変異を含む株は、ワクチンの免疫原性に悪影響を与え得る。理論に縛られることを望まないが、タンパク質ＮＳ１の適応変異は、ウイルスの複製を促進するだけでなく、ジカウイルスのエンベロープタンパク質Ｅ（Ｅｎｖ）などの望ましくない変異の発生を低減または阻害する場合もある。さらに、ＮＳ１は、ウイルスのライフサイクル中にＥｎｖｅｌｏｐｅタンパク質に結合することが公知であり得る。この変異（ＮＳ１  Ｗ９８Ｇ）は、ダウンストリーム処理中にＮＳ１がウイルスと結合し、場合によっては同時精製する能力の変化に関係している場合がある。ＮＳ１は、免疫原性があることも公知であり、ワクチンに対する免疫応答に関与している場合がある。
【０１７８】
実施例２：Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株に由来する精製不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）の前臨床免疫原性及び有効性
以下の実施例は、Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株に由来する不活化ジカウイルスワクチン（ＰＩＺＶ）のＣＤ１及びＡＧ１２９マウスにおける、前臨床免疫原性及び効力を記載する。実施例１に記載されているように、６つのクローンが伝染病関連ＰＲＶＡＢＣ５９株から生成され、２つ（Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ）を、さらなる前臨床免疫原性及び有効性研究のために選択した。
【０１７９】
材料及び方法
ジカウイルスワクチンの精製、不活化および製剤
前臨床免疫原性及び有効性の研究での使用に適した多くの不活化ＺＩＫＡＶワクチンを生成し、特徴付けた。０．０１というＭＯＩでコンフルエントなＶｅｒｏ細胞のフラスコに感染させることにより、Ｐ６ｂ及びＰ６ｅ株からウイルスを増幅した。ウイルスは、３６℃±２℃／５％ＣＯ２で１時間吸着させた。吸着後、２０ｍＬのｃＤＭＥＭ−０％−ＦＢＳを各フラスコに加え、３６℃±２℃／５％ＣＯ２で５日間インキュベートした。感染後３日目及び５日目に細胞上清を回収し、細胞破片を遠心分離により清澄化した。
【０１８０】
各単離物について、清澄化された上清をプールし、１８％トレハロースを含むＤＭＥＭで安定化し、＜−６０℃で保存した。プールし、清澄化したウイルス上清を３７℃の水浴で解凍し、４℃で一晩、ベンゾナーゼで処理した。ベンゾナーゼ処理後、各試料を、ＳａｒｔｏｒｉｕｓＰＰ３デプスフィルターにアプライした。深層ろ過の後、各試料を、Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０接線流ろ過（ＴＦＦ）デバイスにアプライした。保持液を緩衝液交換し、希釈し、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ  ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ  ＩＥＸＮａｎｏにアプライした。各試料を第２のＳａｒｔｏｒｉｕｓ  ＳａｒｔｏｂｉｎｄＱ  ＩＥＸＮａｎｏに適用し、２５０ｍＭ、５００ｍＭ、及び７５０ｍＭ  ＮａＣｌの３段階溶出プロセスを使用して溶出した。ＭｏｎｏＱクロマトグラフィー及び希釈の後、各２５０ｍＭ溶出液を、緩衝液交換のためにＣｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０クロスフローろ過（ＣＦＦ）デバイスに適用し、ＰＢＳで３５ｍＬに希釈し、２〜８℃で保管した。
【０１８１】
ホルマリン不活化のために、新鮮に調製された１％ホルムアルデヒドを、各精製試料に穏やかに旋回しながら滴下して加え、０．０２％の最終ホルムアルデヒド濃度を得た。試料を室温（約２２℃）で１４日間、毎日反転させながらインキュベートした。Ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ  Ｐｌｕｓ−７０接線流ろ過（ＴＦＦ）デバイスにアプライする前に、ホルムアルデヒドを室温で１５分間、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和した。５０ｍＬの薬物緩衝液（１０ｍＭ  ＮａＨ２ＰＯ４、５０ｍＭ  ＮａＣｌ、６％スクロース、ｐＨ  ７．４）を加えて、緩衝液交換を４回行った。次に、各試料を薬物緩衝液（Ｄｒｕｇ  Ｓｕｂｓｔａｎｃｅ  Ｂｕｆｆｅｒ）で１５ｍＬに希釈し、０．２  ｍシリンジフィルターを使用して滅菌し、滅菌栓付きガラスバイアル（バイアルあたり０．５ｍＬ）にアリコートし、−６０℃未満で凍結した。
【０１８２】
ウイルスの不活化は、ＴＣＩＤ５０アッセイおよび二重感染性アッセイによって確認された。簡単に言えば、原薬試料をＣ６／３６細胞に適用し、６日間増幅させた。Ｃ６／３６細胞由来の上清をＶｅｒｏ細胞に適用し、ＣＰＥを８日間モニターした。薬物の製剤については、ＰＩＺＶ原薬のバイアルを解凍し、試料の種類に応じてプールし、Ａｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（Ｂｒｅｎｎｔａｇ、最終０．５ｍｇ／ｍＬ、０．０５０ｍｇ／用量）の有無のＰＢＳで１μｇ／ｍＬまたは１０μｇ／ｍＬに希釈し、２−８℃で穏やかに攪拌しながら一晩インキュベートした。次いで、得られた製剤ロットを、滅菌栓付きガラスバイアルにアリコートし、使用するまで２〜８℃で保存した。図１１は、製剤の調製に使用されるステップの概要を示している。
【０１８３】
マウスの免疫化及びチャレンジ
免疫原性研究のために、６週齢の雄性及び雌性のＳｗｉｓｓ−ＩＣＲ（ＣＤ−１）マウスを６つの群に分けた（ｎ＝１０／群）。０日目に、群１〜５のマウスに筋肉内（ｉ．ｍ．）経路（２×０．０５ｍＬ注射）で０．１ｍＬのワクチンを接種した。第６群のマウスには、プラセボ対照としてＰＢＳを接種した。マウスは、０日目と同じ用量及びワクチンタイプを使用して２８日目と５６日目に追加免疫した。血液試料は、−１日目（免疫前）、２７日目（初回免疫（プライム））、４２日目（追加免疫（ブースト）１）、７０日目（追加免疫２）に採取した。
【０１８４】
免疫原性及び有効性の研究のために、４週齢の雄性及び雌性のＡＧ１２９マウスを７つの群に分けた（ｎ＝５／群）。０日目に、群１〜６のマウスに筋肉内（ｉ．ｍ．）経路（２×０．０５ｍＬ注射）によって０．１ｍＬのワクチンを接種した。群７のマウスには、プラセボ対照としてＰＢＳを接種した。マウスには２８日目に０日目と同じ用量とワクチンタイプを使用して追加免疫した。血液試料は、−１日目（免疫前）、２７日目（初回免疫）、５５日目（追加免疫）に尾静脈から採取した。安楽死の時点で、イソフルランによる深い麻酔下で心臓穿刺を介してマウスを採血した（末端）。５６日目に、マウスに１０４個のプラーク形成単位（ＰＦＵ）のＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９を腹腔内投与した。
【０１８５】
血清移入
血清を、ＰＩＺＶワクチン接種及びチャレンジしたＡＧ１２９マウスから収集し、プール後に凍結した（表６の群１、２、４、及び５）。血清プールを解凍し、ＰＢＳで血清プールを３倍希釈することにより、試験品を作成した。ＰＢＳ中のＡＧ１２９正常マウス血清の３倍希釈を使用して、プラセボを生成した。
【０１８６】
試験品は、０．１ｍＬの腹腔内注射としてＡＧ１２９マウスに投与した（等価容積のプラセボ品を対照マウスに投与した）。次いで、動物に、１００μＬ中のジカウイルス株ＰＲＶＡＢＣ５９の１０４プラーク形成単位を腹腔内でチャレンジした。
【０１８７】
体重あたりの許容血液容積は、−１１日目（免疫前）の１０匹のマウスからの尾部採血により全血として収集した。１日目（一次、循環Ｎａｂ）及び４日目（ウイルス血症）に尾採血により各マウスから全血を採取した。頸椎脱臼による安楽死の前に、致死的チャレンジ後の最終採血を、より大きな容積のために深部麻酔下で心臓穿刺により実施した。血液試料を、マイクロテイナーＳＳＴ血清分離ゲルチューブに収集し、少なくとも３０分間凝固させた後、遠心分離（１０，０００×ｇで２分間）により血清を分離し、−８０℃で凍結した。
【０１８８】
プラーク減少中和試験
中和抗体力価は、前述のプラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）により決定された（例えば、Ｏｓｏｒｉｏ  ｅｔ  ａｌ．Ｌａｎｃｅｔ  Ｉｎｆｅｃｔ  Ｄｉｓ．２０１４  Ｓｅｐ；１４（９）：８３０−８を参照のこと）。
【０１８９】
レポーターウイルス粒子（ＲＶＰ）中和アッセイ
中和抗体力価は、９６ウェルプレートで増殖したＶｅｒｏ細胞における一定量のジカＲＶＰによる血清試料の滴定により分析した。ＲＶＰには、Ｚｉｋａ（ＳＰＨ２０１２株）のｐｒＭＥタンパク質及びデング熱ベースのウミシイタケル（Ｒｅｎｉｌｌａ）シフェラーゼレポーターが含まれていた。要するに、血清を５６℃で３０分間熱失活させ、希釈した後、ＲＶＰと３７℃でインキュベートした。次に、血清／ＲＶＰ混合物を、Ｖｅｒｏ細胞と混合し、３７℃±２℃／５％ＣＯ２で７２時間インキュベートした後に、ルシフェラーゼ基質で検出した。ＪＭＰ１１非線形４パラメータ分析を使用してデータを分析し、ポジティブトラッキング対照に正規化し、有効５０％用量（ＥＣ５０）を報告した。
【０１９０】
反対に示されない限り、全ての追加の実験方法は、上記の実施例１に記載されるように実施された。
【０１９１】
結果
６週齢の雄性及び雌性のＣＤ−１マウスにおけるＰＩＺＶ候補の免疫原性を評価するために、ＣＤ−１マウスの群（Ｎ＝１０／群）を、ｉ．ｍ．経路によって、ＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ６９  Ｐ６ｂまたはＰ６ｅウイルス株由来のワクチンを０．１μｇ（＋アラム）、１．０μｇ（＋アラム）のいずれかの用量で用いて免疫した。アジュバントの必要性を評価するために、Ｐ６ｅ由来であり、アラムアジュバントを含まない０．１μｇのワクチンを用いて動物群にワクチン接種した。０、２８、及び５６日にワクチン接種を行い、第６群にはプラセボ対照としてＰＢＳを投与した（図１２Ａ及び表５）。
【表５】
2021502075.tif 000014
【０１９２】
ワクチン接種後、一次（２７日）、二次（４０日）及び三次（７０日）免疫後に収集された血清試料を、ＲＶＰ中和アッセイによりＺＩＫＡＶ特異的中和抗体について試験した（図１２Ｂ）。最初の投与を受けてから２７日後、ＰＢＳプラセボ対照群と比較して、アラムを含むいずれかのクローンに由来するＰＩＺＶをワクチン接種したマウスでわずかな中和抗体反応が観察された。重要なことに、この反応は第２の免疫化（４０日目）で有意に増大したが、第３投与（７０日目）の免疫化の際にはさらに増強はされなかった。非アジュバント化ワクチンをワクチン接種したマウスでは、中和抗体反応は観察されなかった（図１２Ｂ）。
【０１９３】
ＰＩＺＶ候補の免疫原性及び防御効力を評価するために、４週齢のＡＧ１２９マウスの群（ｎ＝５／群）を、ｉ．ｍ．経路によって、１日目及び２８日目にＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｂまたはＰ６ｅ株のいずれかに由来するワクチンの０．１μｇ用量（＋アラム）、１．０μｇ用量（＋アラム）または０．１μｇ用量（−アラム）のいずれかを用いて免疫した（図１３Ａ及び表６）。
【表６】
2021502075.tif 000015
【０１９４】
ワクチン接種後、ワクチン接種マウス及び対照マウスを、１０４ＰＦＵのＺＩＫＡＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９（低継代）を用いて５６日に腹腔内チャレンジした。一次（Ｄ２７）及び二次（Ｄ５５）免疫後に収集された血清試料を、ＺＩＫＡＶ特異的中和抗体反応について試験した（図１３Ｂ及び表７）。高用量のアラムアジュバントワクチンを投与された群（群２及び５）のみが、１回の免疫後に中和抗体反応を誘発し、これは追加免疫後に劇的に増大した。対照的に、低用量または高用量のいずれかのアラムアジュバントワクチンを投与された群は、２回目の投与後に高い中和抗体反応を引き起こした。２回のワクチン接種を受けた場合、Ｐ６クローンの投与量にも由来にも関係なく、アラムアジュバントワクチンを接種したマウスの群間で統計的な相違はなかった。
【表７】
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【０１９５】
全ての群をまた、チャレンジ後２１日間の死亡率、罹患率及び体重減少についてモニターした。チャレンジ後のウイルス血症を検出し、プラーク滴定により定量した。アラムを配合した低用量または高用量のＰＩＺＶ候補（群１、２、４、５）をワクチン接種したマウスは、プラーク減少中和試験（ＰＲＮＴ）アッセイ及び同等の二次中和アッセイによって評価されるように、致死的ＺＩＫＡＶチャレンジから完全に保護された（表８）。ワクチン接種したマウスでは、体重減少または疾病の臨床徴候は観察されず、チャレンジ後３日目に感染性ウイルス血症は検出されず、低用量または高用量の抗原＋アラムアジュバントでワクチン接種したマウスは全て、チャレンジ後２１日まで生存した（図１４−１６）。対照的に、全てのナイーブマウスのチャレンジは、チャレンジ後２日目に高いウイルス血症を引き起こし、チャレンジ後１０〜１８日の間で罹患率／死亡率をもたらした（生存期間中央値＝Ｄ１３）。さらに、Ｐ６ｂ株由来の非アラムアジュバント低用量ワクチンをワクチン接種したマウスのチャレンジは、チャレンジ後２日目に高ウイルス血症を引き起こし、プラセボ対照群と同様の中央生存日であったが、クローンｅ由来の非アラムアジュバントを低用量でワクチン接種されたマウスは、１９日という中央生存で部分的に保護されたままであった。これらの結果により、アラムでは免疫化がより効果的であり、二次的な免疫化が必要であり得、低用量は高用量と同程度に有効であることが示されている。
【表８】
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【０１９６】
さらに、ホール不活化Ｐ７ｂ及びＰ７ｅウイルス（それぞれＰ６ｂ及びＰ６ｅ株由来の１つの追加継代）から生成されたワクチン原薬（ＤＳ）中のＮＳ１の存在を試験した。サンドイッチＥＬＩＳＡは、ジカウイルスＮＳ１のアジア系及びアフリカ系の両方に反応するが、デング熱ＮＳ１には非交差反応性のモノクローナル抗体でプレコートされたプレートを使用して、実施した。ＤＳの二重の２倍、４倍、８倍、１６倍、及び３２倍の希釈液を調製し、０〜８ｎｇ／ｍＬの濃度で二重に組換え精製ＮＳ１を使用して標準曲線と比較した。ＤＳ緩衝液のみの二重希釈液を陰性対照として調製した。結合したＮＳ１を、抗ＮＳ１  ＨＲＰコンジュゲートで検出し、ＤＳ緩衝液のみのウェルの吸光度（Ａ４５０−Ａ６３０）を、一致するＤＳ試料を含むウェルで測定された吸光度から差し引いた。サンドイッチＥＬＩＳＡの結果を以下の表９に示す。興味深いことに、ＮＳ１はワクチン原薬調製物と共精製することが観察され、ウイルスＮＳ１がホール不活化ウイルスワクチンの免疫原性成分であり得ることが示唆された。
【表９】
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【０１９７】
抗体の受身伝達を次に試験した後、野生型ジカウイルスチャレンジからの防御を付与するために必要な中和抗体（Ｎａｂ）の閾値。（表１０Ａ及びＢ）。
【表１０】
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【０１９８】
ワクチン接種及びチャレンジしたＡＧ１２９マウスからのプール血清を、ＰＢＳで３倍に連続希釈し、５〜６週齢のＡＧ１２９マウスの７群（Ｎ＝５／群）に腹腔内注射した。免疫前のＡＧ１２９マウス血清を、プラセボ対照として使用した（群８）。受身伝達後（〜１６〜１９時間後）、循環中和抗体力価の測定のためのウイルスチャレンジの前に、全血を収集し、血清を各マウスから遠心分離により分離した（図１７）。ウイルスチャレンジの直前に、マウスの群（群１、２、３、４、５、６、７、８と指定）の平均ｌｏｇ１０中和抗体力価は、それぞれ２．６９、２．２６、１．７２、１．３０、＜１．３０、＜１．３０、＜１．３０、＜１．３０であった。
【０１９９】
ＺＩＫＶ  ｎＡｂｓの受身伝達の２４時間後、マウスに、１０４ｐｆｕのＺＩＫＶ  ＰＲＶＡＢＣ５９を腹腔内にチャレンジした。チャレンジ後、動物の体重を毎日秤量し、疾病の徴候について２８日間１日１〜３回モニターした。症状に基づいて各動物に臨床スコアを与えた（表１１）。瀕死になったか、及び／または明らかな神経学的徴候（臨床スコア≧２）を示した動物を、人道的に安楽死させ、非生存者としてカウントした。
【表１１】
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【０２００】
対照群（群８）及び群５〜７では、チャレンジの９日後に疾患の徴候が現れ始め、対応する体重減少があった（図１８）。全血を収集し、チャレンジの３日後に各動物から遠心分離により血清を分離した。プラーク滴定アッセイを使用して、感染性ＺＩＫＶの存在について血清試料を分析した（図１９）。群１〜８のマウスの平均感染力価（ｌｏｇ１０ｐｆｕ／ｍＬ）は、それぞれ１．６６、２．７４、４．７０、４．９２、７．２４、７．５４、７．５４及び７．４６であった。重要なことに、検出可能なレベルのＺＩＫＶ中和抗体（１．３０ｌｏｇ１０以上）を有する群１〜４のマウスでは、ウイルス血症は、対照マウスよりも統計的に有意に低いレベル（１０２．５〜１０６．０倍低い力価）であった（ｐ＝０．０００１、０．０００３、０．０００７及び０．０３７４）。これらの結果により、検出可能なレベルのＺＩＫＶ中和抗体（１．３０ｌｏｇ１０以上）が用量依存的にウイルス血症を低減させることが示唆された。
【０２０１】
群１〜８のマウスの生存日数の中央値は、それぞれ、未決定、１７日目、１７日目、１３日目、１１日目、１１日目、１１日目、及び１０日目であった（図２０）。重要なことに、検出可能なＺＩＫＶ中和抗体力価を持つマウスの群（群１〜４）の生存曲線は、対照群（群８）と比較して統計的に異なっていた（それぞれｐ＝０．００１９、０．００１９、０．００１９、０．０１５３）。これらの結果、ＺＩＫＶ中和抗体の検出可能なレベル（１．３０ｌｏｇ１０以上）が用量依存的に疾患の発症を遅らせることが示唆された。
【０２０２】
最終的に、各動物のＺＩＫＶ中和抗体力価を、その対応するウイルス血症力価に対してグラフ化し、線形回帰分析を実施した。ＺＩＫＶ中和抗体力価とチャレンジ後３日目のウイルス血症レベルとの間に非常に逆相関の関係が観察された（図２１）。受身伝達研究の結果の要約を、以下の表１２に示す。
【表１２】
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【０２０３】
この実験では、ＺＩＫＡＶ中和抗体を投与されたマウスの群は致死的なＺＩＫＡＶチャレンジから完全には防御されなかったが、ウイルス血症レベルを低下させ、循環ＺＩＫＡＶ中和抗体力価の検出可能なレベルを有するマウスの群間で用量依存的な発症の遅延が示された。
【０２０４】
総合すると、ＣＤ−１及びＡＧ１２９マウス研究の両方からの前臨床データにより、別個の十分に特徴付けられたウイルスクローンに由来するＰＩＺＶが、免疫原性であり、野生型ＺＩＫＡＶによるチャレンジに対する防御を提供できることが示される。重要なことに、低及び高ワクチン用量は、２回の投与後に同様の中和抗体反応を誘発し、致死的なＺＩＫＡＶチャレンジに対して同様のレベルの防御を提供した。興味深いことに、アジュバント化されていないＰＩＺＶ候補をワクチン接種したマウスも、ＺＩＫＡＶチャレンジからの部分的な防御を示した。ワクチン抗血清は、受動免疫されたＡＧ１２９マウスのウイルス血症を有意に減少させ、致死的なＺＩＫＡＶチャレンジに対する生存期間を延長した。これらの結果によって、よく特徴付けられたＰＩＺＶ候補が、高度にＺＩＫＡＶ感受性のＡＧ１２９マウスモデルでＺＩＫＡＶ感染に対して非常に有効であることも示されている。
【０２０５】
さらに、継代７でのＰＲＶＡＢＣ５９（ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅ由来）の配列は、継代６の配列と遺伝的に同一であることが見出された。これは、フラビウイルスが一般に遺伝的に不安定であると見なされることを考えると驚くべきことであった。ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ｅは、７継代での遺伝的安定性が一部原因で、プレマスターのウイルスシードとして選択された。理論に縛られることを望まないが、この強化された遺伝的安定性は、これがＶｅｒｏ細胞に適応したＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ゲノムで観察された唯一の変異であったので、ＮＳ１のウィングドメインの単一アミノ酸置換（Ｗ９８Ｇ）に起因し得ると考えられている。さらに、遺伝的安定性及び均一性は、ワクチン製剤に使用され得る後続株の変動を減らし、再現性のある生産を増大させるという点で有利である。
【０２０６】
実施例３：Ｐ６ａ及びＰ６ｅ株の表現型の前臨床評価
材料及び方法
ＡＧ１２９マウス（インターフェロンα／β及びγ受容体を欠く）は、脳内の重篤な病状を含むＺＩＫＶ感染及び疾患の影響を受けやすい。１４週齢のＡＧ１２９マウスに１０４及び１０３ｐｆｕのＺＩＫＶの継代６のクローンａ及びｅを腹腔内感染させた。
【０２０７】
マウスを秤量し、疾病の臨床的徴候（体重減少、波打った毛皮、体を曲げた姿勢、嗜眠、手足の衰弱、部分的／完全麻痺）について毎日（最大２８日）モニターした。さらに、ウイルス血症の分析は、実施例１に記載されているように、チャレンジの３日後に収集された血清試料のプラーク滴定により実施した。
【０２０８】
結果
ｐｒｅＭＶＳ  Ｐ６ｅによる感染は１００％の死亡率（生存期間中央値＝１２．５日）をもたらしたが、ｐｒｅＭＶＳ  Ｐ６ａの感染では死亡率（生存期間中央値＝未定）は３３％に過ぎなかった（図２２）。これと一致して、ｐｒｅＭＶＳ  Ｐ６ｅ感染マウスは、ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ａ感染マウスと比較してより大きな体重減少を示した（３）。ＰＲＶＡＢＣ５９  Ｐ６ａまたはＰ６ｅに感染したマウスの群間で、群の平均ウイルス血症レベルに統計的な差は見られなかった（図２４）。これらのデータによって、増殖動態だけが重要な決定要因ではないかもしれないこと（両方の株がインビトロで同様のウイルス血症、及び同様のピーク力価を生じたため）、ならびにエンベロープタンパク質の特性が毒性（野生型株の）及び免疫原性（不活化された候補の）にとって重要であり得ることが示唆される。
【０２０９】
実施例４：不活化の有効性を決定するための不活化アッセイの完全性
不活化の完全性（ＣＯＩ）アッセイとも呼ばれる二重感染性アッセイは、ホルマリン不活化（０．０１％ホルムアルデヒド）の有効性、及び精製不活化ジカウイルス（ＰＩＺＶ）バルク原薬（ＢＤＳ）の潜在的な残留感染性ウイルス活性を決定するために開発された。
【０２１０】
試料調製：上記のクローンｅの４つの精製不活化ジカワクチン（ＰＩＺＶ）ロット（Ｔｏｘロット１〜４）は、Ｖｅｒｏ細胞での増殖により製造した。毎日４回採取した上清（合計約４０００ｍＬ）をクロマトグラフィーで精製した後、ホルムアルデヒドを最終濃度０．０１％（ｗ／ｖ）まで添加した。不活化は、２２℃で１０日間進行させた。Ｉｎ  Ｐｒｏｃｅｓｓ  Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＩＰＣ）の試料は、特性評価と分析のために不活化中にバルク原薬（ＢＤＳ）から毎日除去した。毎日のＩＰＣ試料を、メタ重亜硫酸ナトリウムで中和し、ＤＭＥＭ（ウイルス増殖培地）に透析した。この試料には、精製された不活化ジカウイルスが含まれている。不活化の最終日に、ＢＤＳ試料の残りの量は中和されなかったが、ＴＦＦで処理して、ホルムアルデヒドを除去し、ＰＢＳに緩衝液交換した。
【０２１１】
不活化アッセイの完全性（ＣＯＩ）：不活化の動態及び最終的なＢＤＳを理解するために、毎日のＩＰＣ試料における不活化の有効性の分析のためにＣＯＩアッセイを使用した。最大の感度を得るために、ＩＰＣ及びＤＳ試料の潜在的な生ウイルスを検出するために、このアッセイでは最初に２つの細胞株Ｖｅｒｏ及びＣ６／３６を利用した。ジカウイルスが、フェノールレッドを含む増殖培地の存在下でＶｅｒｏ細胞に感染すると、細胞死の副産物によりｐＨが低下する。その結果、培地の色が赤／ピンクから黄色に変わり、培地のｐＨのこの酸性のシフトを示す。この現象は、アポトーシスと細胞変性効果（ＣＰＥ）によって引き起こされ、これは、ウイルスの侵入、感染、及びウイルス複製中の細胞からの出芽によって引き起こされる、宿主細胞の細胞構造の変化の観察を指す。最終的に、Ｃ６／３６の蚊及びＶｅｒｏの細胞は、両方とも感染の許容される細胞株であるが、ジカウイルス感染はインビトロでＶｅｒｏの細胞のみを殺傷する。したがって、Ｖｅｒｏ細胞をアッセイの指標細胞株として使用した。対照的に、ジカウイルスの天然の宿主ベクターに由来するＣ６／３６細胞は、ジカ感染時にＣＰＥを示さず、溶解しない。培地は色を変えず、Ｃ６／３６細胞の生存率は変化しない。
【０２１２】
したがって、アッセイは２つの部分に分割される：アッセイの第１の部分は、６日間、２つの感受性細胞株の９６ウェルプレート上で可能性としては生きているウイルス粒子の並行増幅を可能にする。アッセイの第２のステップでは、９６ウェルプレートの上清（可能性としては増幅された粒子を含む）をＶｅｒｏ細胞の単層を含む６ウェルプレートに移し、さらに８日間インキュベートしてＶｅｒｏ細胞でのウイルス感染及び細胞変性効果を生じさせることを含む。観察されたＣＰＥは、光学顕微鏡を使用して確認された。
【０２１３】
アッセイの第１の部分、すなわちＣ６／３６細胞の培養における９６ウェルプレートの使用、及びアッセイの第２の部分、すなわちＶｅｒｏの培養における６ウェルプレートの使用に関して、細胞毒性効果を観察するために、詳細に説明したが、アッセイは、以下の表に従ってアッセイを簡単にスケールアップ可能である：
【表１３】
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スケールアップ中、容器１ｃｍ２あたりの試料容積はパート１で一定のままであり、同じウイルス感染状態がパート２で維持されることは明らかである。
【０２１４】
ＣＯＩアッセイ対照：このアッセイの力価及び逆滴定対照は、Ｖｅｒｏ指示細胞を使用して実施され、ＴＣＩＤ５０９６ウェルフォーマットでスコア付けされ、ウェルは、細胞死、またはＣＰＥの存在についての代用として、ピンクから黄色への培地色変化に基づいて陽性スコア付けされた。
ウイルス力価対照試験：既知の力価の対照ウイルス（ＰＲＶＡＢＣ５９）の２つの独立した複製を、２％ＦＢＳを含む培地で１０倍連続希釈にかけ、各希釈液１００μＬを、Ｖｅｒｏ細胞を含む９６ウェルプレートの４ウェルに添加した。プレートを５日間インキュベートした後、ＣＰＥを含むウェルを記録し、Ｒｅｅｄ−Ｍｅｕｎｃｈ計算機を使用してウイルス力価を計算した。
ウイルス逆滴定対照試験：既知の力価の対照ウイルスを２００  ＴＣＩＤ５０まで連続希釈した。２００  ＴＣＩＤ５０対照ウイルスの２つの独立した複製を、２％ＦＢＳを含む培地で２倍希釈系列にかけ、各希釈液１００μＬを、Ｖｅｒｏ細胞を含む９６ウェルプレートの４つのウェルに加えた。細胞を５日間インキュベートした後、ＣＰＥを含むウェルを記録し、Ｒｅｅｄ−Ｍｅｕｎｃｈ計算機を使用してウイルス力価を計算した。
【０２１５】
詳細なＣＯＩプロトコール
１．アッセイの第１部分：Ｖｅｒｏ（１．４Ｅ＋０５細胞／ｍＬ）及びＡｅｄｅｓ  ａｅｇｙｐｔｉ  ｍｏｓｑｕｉｔｏ  Ｃ６／３６（４Ｅ＋０５細胞／ｍＬ）細胞を、試料の添加の２日前に９６ウェルプレートに播種した。Ｖｅｒｏ細胞は、ＤＭＥＭ＋１０％最終ＦＢＳ＋２％Ｌ−グルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシンで、３７℃で培養した。Ｃ６／３６細胞は、２８℃で、ＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ＋２％Ｌ−グルタミン＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン＋１％非必須アミノ酸中で培養した。
２．２００  ＴＣＩＤ５０対照ウイルス（ウイルス逆滴定対照試験で調製）またはＤＳ試料の３つの独立した複製物を、２％ＦＢＳを含む培地に希釈した（５倍及び１０倍希釈）。
３．９６ウェルプレートの細胞に試料を接種した。９６ウェルプレートの細胞単層に感染する前に、試料をボルテックスして、潜在的な凝集を破壊した。各希釈液１００μＬを５つのウェルのそれぞれに適用し、それぞれＶｅｒｏ及びＣ６／３６細胞を含む２つの独立した９６ウェルプレートに入れた。
４．陰性ＣＰＥ対照として、培地単独を各細胞型のために別のウェルに含めた。
５．プレートは、細胞株のための適切な温度で６日間インキュベートした。
６．アッセイの第２部分：許容細胞株でＣＰＥにより、生ウイルスをさらに増幅及び可視化できるように、Ｖｅｒｏ及びＣ６／３６細胞の両方由来の各９６ウェル上清の全容積をＶｅｒｏ細胞の６ウェルプレートの個々のウェルに移した。接種は、１５分間隔で揺り動かしながら、９０分間進行された。
７．２％ＦＢＳを含む培地をウェルに加え、ＣＰＥの関数として増幅試料を検出引き続き検出するために、プレートをさらに８日間インキュベートした。８日目の終わりにＤＳの複製のいずれかがＣＰＥを示した場合、不活化は不完全であると見なされた。
７．生／複製ビリオンの存在は、６ウェルプレートに移し、ウイルス複製を可能にするために８日間インキュベートした後、感受性細胞単層上のプラークまたはＣＰＥの形成によって可視化された。アッセイ終了時の６ウェルプレートのＣＰＥスコア％は、以下のように計算された。
−Ｖｅｒｏ細胞の各６ウェルプレートは、比色変化の視覚化によりＣＰＥを検査し、その後、倒立光学顕微鏡下での検査によりＣＰＥを確認した。
−各６ウェルプレートは、上記の５倍及び１０倍希釈で調製したＤＳ希釈の複製の１つに相当した（５ウェルに加えて培地のみを含む１ウェル）。
したがって、各複製のＣＰＥ％は、１試料あたり合計５つのウェルのうちＣＰＥを含むウェルの数を反映した（１アッセイごとに合計１２０のウェルを使用する）。平均ＣＰＥ％及び標準偏差は、各希釈の３回の繰り返しに基づいて計算された。
【０２１６】
結果：以下の表に示すように、Ｔｏｘロット＃１−４のそれぞれで毎日の試料を分析した。
【表１４−１】
2021502075.tif 000023
【表１４−２】
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【表１４−３】
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【表１４−４】
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【０２１７】
不活化データのコンパイルされた動態学：４つの毒物学ロットからの試料のＣＯＩデータを、上記のように決定された感染力価（ＴＣＩＤ５０）及びＲＮＡコピーと比較した。ＲＮＡコピーは、試料から核酸を精製し、ＲＴ−ＰＣＲキットを使用して血清型特異的プライマーでジカ（Ｚｉｋａ）ＲＮＡを増幅することにより決定された。図２５に示す結果、ＣＯＩアッセイの感度がＴＣＩＤ５０の感度よりも有意に高いことが示されている。
【０２１８】
ＣＯＩアッセイの性能特性−精度：標的希釈（ＴＣＩＤ５０／ウェル）及びＣＰＥのそれぞれの割合を使用して、相対精度を決定した。Ｖｅｒｏ細胞については、陽性ＣＰＥの観察された割合と期待された割合の間に統計的に有意な線形関係があった。観察された結果と期待される結果を関係付ける線の勾配は０．９２であり、０．８３〜１．０１という９５％信頼区間（ＣＩ）であり、１と重複すると１００％の精度を示す。Ｃ６／３６細胞の場合、陽性ＣＰＥの観察された割合と期待された割合との間に統計的に有意な線形関係がある。観察された結果と期待される結果を関連付ける線の勾配は０．８８であり、０．８０〜０．９５という９５％信頼区間（ＣＩ）は、この細胞株でわずかなバイアス（５−２０％）が見られたことを示す。両方の細胞株とも満足のいく精度を示している（相対的）。
【０２１９】
ＣＯＩアッセイの性能特性−検出限界（ＬｏＤ）：アッセイの感度は、Ｃ６／３６からＶｅｒｏへ、及びＶｅｒｏからＶｅｒｏへの両方のプレートについて評価した。上記のように、このデータは、１０．００ＴＣＩＤ５０／ウェルから開始して０．０８  ＴＣＩＤ５０というより低い力価までプレートされた力価希釈でプレートされた総ウェルごとに観察された＋ｖｅ  ＣＰＥの割合の最小二乗回帰を使用して適合された。さらに、プレート内の希釈ごとに陰性対照（０．００  ＴＣＩＤ５０／ウェル）が含まれていた。Ｃ６／３６からＶｅｒｏへのプレートとＶｅｒｏからＶｅｒｏへのプレートの両方にまたがって、各希釈ごとにＣＰＥスコアリングを実施した。ＣＰＥとログ入力ウイルス力価との間に明確な関係が見られた。これにより、９９％の信頼限界の上限及び下限とともにＴＣＩＤ５０／ウェルのｌｏｇ１０濃度に対するＣＰＥ陽性ウェルの割合の間のロジスティック（シグモイド）関係が表示される。−２ｌｏｇ１０濃度（＝０．０１  ＴＣＩＤ５０／ウェル）で、資格データの全ての固定及びランダムソース変動に基づき、かつそれからなるモデルによって、０．８５％、または０．０１（ＴＣＩＤ５０／ウェルで切り上げた場合は）が予想され、０．４２％という低い９９％信頼限界であった。９９％の信頼限界の下限にはゼロが含まれていないため、０．８５％のＣＰＥウェルが０  ＴＣＩＤ５０／ウェル（すなわち、ノイズが原因）から発生した可能性のある確率は非常に小さい（＜１％）。これにより、少なくとも０．０１  ＴＣＩＤ５０／ウェル（すなわち、検出可能な試料中の生きたジカ粒子の最低量）のアッセイの検出限界が確立される。すなわち、切り上げた場合、６０個のウェルのうち１個がＣＰＥ陽性になるか、これらのパラメータが与えられると、６０個のウェルで検出できるＣＰＥ＋ｖｅの理論上の最低割合は１．６７％、すなわち０．０１６７になる。
【０２２０】
細胞タイプ（Ｃ３６３及びＶｅｒｏ）を、相対感度について比較し、Ｃ６／３６によって、図２６に示されるように、Ｖｅｒｏ細胞と比較して、より低い希釈のウイルス力価を検出できることが実証された；同じウイルス入力レベル（０．３１  ＴＣＩＤ５０）で、ＣＰＥ陽性ウェルの割合は、Ｖｅｒｏ細胞と比較してＣ６／３６の方が高くなっている。
【０２２１】
このアッセイの認定中に使用された最低のウイルス入力値は、０．０２  ＴＣＩＤ５０（−１．６１  ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０）であった。Ｃ６／３６細胞の適合曲線を使用すると、これにより０．０３５または３．５％のウェルがＣＰＥ陽性（２８ウェルに１つ）と評価される。曲線が０．１６７または１．６％という最低実用レベルに向かって外挿されるならば、これは０．０１５  ＴＣＩＤ５０（−１．８２  ｌｏｇ  ＴＣＩＤ５０）というウイルス入力レベルに相当する。しかし、＋ｖｅ  ＣＰＥの結果に反映されるとして検出され得る感染性ウイルスの最低レベルを決定する際には、伝達されたアッセイのばらつきの影響を考慮する必要がある。このノイズは、入力ウイルスのワーキングストックの生成から発生する。標的ＴＣＩＤ５０と逆滴定計算の比較によって、ワーキングストックウイルスのＴＣＩＤ５０は、２００というストックＴＣＩＤ５０／ｍＬ濃度を標的にした場合の平均２１３から誘導される、８５  ＴＣＩＤ５０／ｍＬという標準偏差（ＳＤ）を示したことが示される。ＣＶ％は、約＋７％のバイアスで約４０％に計算される。このノイズは、ウイルス希釈の目標値の周りの信頼区間を生成するために、ロジスティック回帰モデルに組み込まれた。０．０１  ＴＣＩＤ５０／ウェルという目標値では、２つのサイトにわたる適格性データの変動の全ての固定ソース及びランダムソースに基づき、かつそれからなるモデルは、ウェルの０．８６％がＣＰＥ陽性になると予測している（６０ウェルに１つ）。９９％の信頼限界の下限にはゼロが含まれていないため、０．８５％のＣＰＥ陽性ウェルはノイズに起因して０  ＴＣＩＤ５０／ウェルから生じた可能性が非常に小さい（１％未満）可能性がある（図２７）。これにより、アッセイの検出限界が確立される。０．０１ＴＣＩＤ５０／ウェルが、検出可能な試料中の生きたジカ粒子の最低量である。
【０２２２】
ＣＯＩアッセイの性能特性−範囲：アッセイの範囲は、０．０１ＴＣＩＤ５０／ウェル〜４．５ＴＣＩＤ５０／ウェルであり、０％を超えるが１００％未満であるＣＰＥ＋ｖｅ比率スコアリングをもたらす投入ウイルスの範囲として定義される。
【０２２３】
結論：４つの毒性（Ｔｏｘ）の分析により、室温で１０日間、０．０１％のホルムアルデヒド中でインキュベートした後、不活化が完了したことが明らかになった。ＣＯＩアッセイで測定した場合、生産された全てのロットで３〜４日目までに不活化が達成された。ＣＯＩアッセイは、ＴＣＩＤ５０の効力またはＲＮＡ測定よりも感度が高くなり；感度の向上はＬｏＤでも観察されている。
【０２２４】
実施例５：薬学的組成物中の残留ホルマリン含量の決定
１．材料及び方法
１．１  材料
ホルムアルデヒド標準溶液（メタノール中）（９８２μｇ／ｍＬ）、ＤＮＰＨ、ＨＰＬＣグレードのアセトニトリル、及びリン酸は、和光純薬株式会社（東京、日本）から購入した。リン酸の希釈に使用する蒸留水は、大塚製薬（徳島、日本）から入手した。水酸化アルミニウムゲルとして使用されるＡｌｈｙｄｒｏｇｅｌ（登録商標）２％（１０ｍｇ／ｍＬアルミニウムに相当）は、Ｂｒｅｎｎｔａｇ（Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）から入手した。ＰＢＳは社内で調製し、水酸化アルミニウムゲルを含むジカワクチン製剤は以下に説明するように製造した。ジカウイルスは、収穫後にさまざまな手法で精製した。ホルムアルデヒドで不活化した後、ウイルスを濃縮し、ろ過により緩衝液をＰＢＳと交換した。バルク原薬をＰＢＳで希釈し、水酸化アルミニウムゲル（０．４ｍｇ／ｍＬアルミニウム）で製剤化して、最終製剤を形成した。
【０２２５】
１．２  ＨＰＬＣ条件
ＵＶ検出器（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＵＳＡ）及び逆相カラム（ＹＭＣ−Ｐａｃｋ  ＯＤＳ−Ａ、４．６ｍｍ×２５０ｍｍ、５μｍ（京都、日本））を装備したＷａｔｅｒｓ  ＨＰＬＣアライアンスシステムを使用した。水とアセトニトリルの混合物（１：１、ｖ／ｖ）を、移動相として使用し、検出波長を３６０ｎｍに設定し、その流速は１．０ｍＬ／分であった。カラム温度及び注入量は、それぞれ２５℃及び５０μＬであった。
【０２２６】
１．３  試料調製
ワクチン製剤（１．２ｍＬ）を、１５０００ｒｐｍで１０分間遠心分離し、上清（１ｍＬ）を、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＵＳＡ）から購入した２ｍＬ  ＨＰＬＣガラスバイアルに移した。次に、２０μＬの２０（ｖ／ｖ）％リン酸、及びアセトニトリル中５０μＬの１．０ｍｇ／ｍＬのＤＮＰＨ溶液を加え、その混合物を攪拌し、注入前に室温で２０分間放置した。
【０２２７】
１．４  方法の検証
ＩＣＨ  Ｑ２ガイドラインによれば、この方法を、試料の特異性、直線性、精度、再現性、中間精度、堅牢性、及び安定性に関して検証した。精度の研究では、ジカ（Ｚｉｋａ）ワクチン製剤と水酸化アルミニウムゲル溶液に、特定量のホルムアルデヒドをスパイクし、試料をボルテックスでよく混合した後、セクション２．３で説明した手順に従った。
【０２２８】
２．結果及び考察
２．１  直線性及び特異性
ホルムアルデヒドの６つの標準溶液（０．０４９、０．０９８、０．１９６、０．４９１、０．９８２、及び１．９６４μｇ／ｍＬ）を、ＰＢＳで希釈することにより調製した。次に、２０（ｖ／ｖ）％リン酸及びアセトニトリル中の１ｍｇ／ｍＬ  ＤＮＰＨ溶液を、各溶液に添加し、対応するクロマトグラムを図２８に示す。明らかに、１０．４分のピーク面積は、以下の回帰方程式で直線性を示した：ｙ＝１０７５７３０ｘ＋１１７３１（ここでｙは１０．４分のピークの面積であり、ｘはμｇ／ｍＬ単位のホルムアルデヒドの濃度である）（相関係数：０．９９９８）、これによって、ＨＣＨＯ−ＤＮＰＨ（すなわち、ＤＮＰＨで誘導体化されたホルムアルデヒド）に起因するものであることが示された。さらに、５．８分でのピークはＤＮＰＨを添加した全ての試料で検出されたため、ＤＮＰＨに起因していた。したがって、ＨＣＨＯ−ＤＮＰＨピーク面積を、ＰＢＳのバックグラウンドピーク面積を差し引いた後の直線性と精度の評価に使用した。
【０２２９】
２．２  正確性及び精度（再現性）
水酸化アルミニウムアジュバントの効果を回収研究により評価し、これは、ワクチン原薬の非存在下で０．０５μｇ／ｍＬのホルムアルデヒドを含むＰＢＳ中の水酸化アルミニウムの３つの試料（０．１、０．４、及び１．０ｍｇ／ｍＬアルミニウム）をスパイクすることにより行った。平均回収率は、それぞれ１０２％（ｎ＝３）、１００％（ｎ＝３）、及び１００％（ｎ＝３）であり、相対標準偏差（ＲＳＤ）の値は低かった（表１３）。再現性を評価するために精度データのＲＳＤを計算し、１．０％であることがわかり、これによって、最大１．０ｍｇ／ｍＬのアルミニウム量がホルムアルデヒドの回収を妨げないことが示されている。
【表１５】
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【０２３０】
この方法の正確性を、水酸化アルミニウムアジュバントを含むジカワクチン製剤を３つの濃度のホルムアルデヒド（０．０５、０．１０、及び１．００μｇ／ｍＬ）でスパイクすることにより実施された、回収研究により評価し、及びその平均回収結果を表１４に示す。再現性を評価するために精度データのＲＳＤを計算し、３．７％であることがわかり、これは、水酸化アルミニウムを配合したジカ（Ｚｉｋａ）ワクチン製剤が０．０５〜１．００μｇ／ｍＬのホルムアルデヒドの回収を妨げないことを示している。
【表１６】
2021502075.tif 000028
【０２３１】
２．４  ロバスト性
この方法のロバスト性を評価して、試料調製中の実験パラメータの変動が試料中のホルムアルデヒド濃度にどのように影響するかを決定した。誘導体化の有効性への影響を考慮して、ＤＮＰＨとリン酸の濃度を、この研究においてモニターされたパラメータとして選択した。ＤＮＰＨ及びリン酸の濃度をそれぞれ±０．１ｍｇ／ｍＬ及び±５％変化させることにより、効果を調べた。ホルムアルデヒドは、各条件下で２つの開発医薬品製品ロットで決定され、表１５に示す結果により、ＤＮＰＨ及びリン酸濃度の変動が、ホルムアルデヒドの決定に有意な影響を及ぼさないことが示唆されている。
【表１７】
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（＊）この方法の定義された条件
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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