(57)【要約】本開示は一般に、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖のための核酸ベクター及びパッケージング細胞株に関する。より具体的には、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍浸潤リンパ球の形質導入及び薬剤媒介増殖のために適合されたレンチウイルスベクターの直接腫瘍内注射に関する。一態様では、本開示は、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体をコードする核酸配列に動作可能に連結されたＴ細胞及び／またはＮＫ細胞特異的プロモーターを含む核酸ベクターであって、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、小分子によって活性化することが可能である、核酸ベクターを提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｔ細胞を活性化し、効率的に形質導入するためのレンチウイルス粒子であって、小分子で制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体をコードする核酸配列を含み、前記核酸配列は、プロモーターに動作可能に連結されており、前記Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、小分子によって活性化することが可能である、前記レンチウイルス粒子。
【請求項２】
前記レンチウイルス粒子は、Ｔ細胞活性化または共刺激分子を含む表面改変されたレンチウイルス粒子である、請求項１に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項３】
前記Ｔ細胞活性化または共刺激分子は、抗ＣＤ３抗体、ＣＤ２８リガンド、及び４１ｂｂリガンドのうちの１つ以上を含む、請求項２に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項４】
前記Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、（ｉ）サイトカイン受容体シグナル伝達ドメイン、（ｉｉ）共刺激受容体シグナル伝達ドメイン、（ｉｉｉ）Ｔ細胞受容体サブユニットシグナル伝達ドメイン、（ｉｖ）ＮＫ細胞受容体サブユニットシグナル伝達ドメイン、及び（ｖ）成長因子受容体シグナル伝達ドメインからなる群から選択されるシグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項５】
前記シグナル伝達ドメインは、共通サイトカイン受容体ガンマ鎖のサイトカイン受容体シグナル伝達ドメインを含む、請求項４に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項６】
前記シグナル伝達ドメインは、共通サイトカイン受容体ベータ鎖のサイトカイン受容体シグナル伝達ドメインを含む、請求項４または請求項５に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項７】
前記シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭを含む、請求項４〜６のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項８】
前記シグナル伝達ドメインは、チロシンがリン酸化された場合にＳＨ２ドメインに結合することが可能な前記チロシンを含む、請求項４〜７のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項９】
前記Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＰＢ）またはその機能性ホモログを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１０】
前記Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）タンパク質またはその機能性ホモログを含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１１】
前記レンチウイルス粒子は、チェックポイント阻害リガンドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１２】
前記チェックポイント阻害リガンドは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイントを遮断することが可能である、請求項１１に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１３】
前記チェックポイント阻害リガンドは、Ｔｉｍ−３チェックポイントを遮断することが可能である、請求項１１または請求項１２に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１４】
免疫抑制薬に対する抵抗性を提供するタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１５】
前記免疫抑制薬は、メトトレキサート、ラパマイシン、ラパログ、タクロリムス、及びシクロスポリンからなる群から選択される、請求項１４に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１６】
２Ａペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１７】
ｗＰＲＥ核酸配列をさらに含む、請求項１〜１６のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１８】
ＴＧＦベータドミナント・ネガティブ阻害受容体をコードする核酸配列をさらに含む、請求項１〜１７のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項１９】
前記プロモーターは、ＭＮＤプロモーター、Ｔ細胞特異的プロモーター、ＣＤ４  Ｔ細胞特異的プロモーター、ＣＤ８  Ｔ細胞特異的プロモーター、ＮＫ細胞特異的プロモーター、Ｔ細胞及びＮＫ細胞特異的プロモーター、ＣＤ４  Ｔ細胞及びＮＫ細胞特異的プロモーター、ならびにＣＤ８  Ｔ細胞及びＮＫ細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項１〜１８のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項２０】
前記プロモーターの配列は、配列番号１〜４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項２１】
がんに罹患している対象を治療するための方法であって、
ａ）請求項１〜２０のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子を前記対象に投与することと、
ｂ）前記対象に小分子を投与することと、を含み、
前記がんが、前記対象において治療される、前記方法。
【請求項２２】
腫瘍細胞を認識し、殺傷することが可能なＴ細胞の増殖を、それを必要とする対象において行うための方法であって、
ｉ）請求項１〜２０のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子を前記対象に投与することと、
ｂ）前記対象に小分子を投与することと、を含み、
前記対象において腫瘍細胞を認識し、殺傷することが可能なＴ細胞が増殖される、前記方法。
【請求項２３】
前記レンチウイルス粒子は、静脈内注射によって投与される、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記レンチウイルス粒子は、腫瘍内注射によって投与される、請求項２１または請求項２２に記載の方法。
【請求項２５】
前記小分子は、静脈内注射によって投与される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
前記小分子は、経口投与される、請求項２１〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
前記小分子は、前記Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体を活性化するのに十分な濃度で投与される、請求項２１〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
前記小分子は、ラパマイシンである、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２９】
ラパマイシンは、０．１ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭを超えるラパマイシンの血清濃度を維持するのに十分な濃度で投与される、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
前記小分子は、ラパログである、請求項２１〜２７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
前記ラパログは、０．１ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭを超える前記ラパログの血清濃度を維持するのに十分な濃度で投与される、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記小分子は、細胞活性化シグナルをもたらす前記Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体の二量体化を引き起こす、請求項２１〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ｉ）前記小分子は、前記レンチウイルス粒子と同時に投与されるか、または
ｉｉ）前記小分子は、前記レンチウイルス粒子が投与される約３０分前または後、約１時間前または後、約２時間前または後、約４時間前または後、約５時間前または後、または約１０時間前または後に投与される、請求項２１〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
前記対象に免疫抑制剤を投与することをさらに含む、請求項２１〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
前記免疫抑制剤は、タクロリムスである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３６】
タクロリムスは、０．１ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭを超えるタクロリムスの血清濃度を維持するのに十分な濃度で投与される、請求項３５に記載の方法。
【請求項３７】
前記免疫抑制剤は、シクロスポリンである、請求項３４に記載の方法。
【請求項３８】
シクロスポリンは、０．１ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭを超えるシクロスポリンの血清濃度を維持するのに十分な濃度で投与される、請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＴ細胞及びＮＫ細胞に特異的なプロモーターを含む核酸であって、前記核酸の配列は、配列番号１〜４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である、前記核酸。
【請求項４０】
Ｔ細胞を活性化し、効率的に形質導入することが可能なレンチウイルス粒子を生成するためのパッケージング細胞株であって、レンチウイルスベクターをパッケージングすることが可能な培養細胞を含み、前記培養細胞は、Ｔ細胞活性化または共刺激分子を発現するように遺伝子改変されている、前記パッケージング細胞株。
【請求項４１】
前記Ｔ細胞活性化または共刺激分子は、抗ＣＤ３抗体、ＣＤ２８リガンド、及び４１ｂｂリガンドからなる群から選択される、請求項４０に記載のパッケージング細胞株。
【請求項４２】
前記パッケージング細胞株は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株である、請求項４０または請求項４１に記載のパッケージング細胞株。
【請求項４３】
前記パッケージング細胞株は、ＭＨＣクラスＩの発現を欠くように遺伝子修飾されている、請求項４０〜４２のいずれか１項に記載のパッケージング細胞株。
【請求項４４】
前記パッケージング細胞株は、ＭＨＣクラスＩＩの発現を欠くように遺伝子修飾されている、請求項４０〜４３のいずれかに記載のパッケージング細胞株。
【請求項４５】
前記パッケージング細胞株は、阻害性受容体リガンドの発現を欠くように遺伝子修飾されている、請求項４０〜４４のいずれかに記載のパッケージング細胞株。
【請求項４６】
前記阻害性受容体リガンドは、ＰＤ−Ｌ１リガンドまたはＴｉｍ３リガンドである、請求項４５に記載のパッケージング細胞株。
【請求項４７】
Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体をコードする核酸配列に動作可能に連結されたＴ細胞及び／またはＮＫ細胞特異的プロモーターを含む核酸ベクターであって、前記Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞活性化受容体は、小分子によって活性化することが可能である、前記核酸ベクター。
【請求項４８】
Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体をコードする核酸配列に動作可能に連結された強力プロモーターを含む核酸ベクターであって、前記Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、小分子によって活性化することが可能である、前記核酸ベクター。
【請求項４９】
前記プロモーターは、ＭＮＤプロモーター、Ｔ細胞特異的プロモーター、ＣＤ４  Ｔ細胞特異的プロモーター、ＣＤ８  Ｔ細胞特異的プロモーター、ＮＫ細胞特異的プロモーター、Ｔ細胞及びＮＫ細胞特異的プロモーター、ＣＤ４  Ｔ細胞及びＮＫ細胞特異的プロモーター、ならびにＣＤ８  Ｔ細胞及びＮＫ細胞特異的プロモーターからなる群から選択される、請求項４８に記載の核酸ベクター。
【請求項５０】
前記プロモーターの配列は、配列番号１〜４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である、請求項４７〜４９のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項５１】
前記Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、サイトカイン受容体シグナル伝達ドメイン、共刺激受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞受容体サブユニットシグナル伝達ドメイン、ＮＫ細胞受容体サブユニットシグナル伝達ドメイン、及び成長因子受容体シグナル伝達ドメインからなる群から選択されるシグナル伝達ドメインを含む、請求項４７〜５０のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項５２】
前記シグナル伝達ドメインは、共通サイトカイン受容体ガンマ鎖のサイトカイン受容体シグナル伝達ドメインを含む、請求項５１に記載の核酸ベクター。
【請求項５３】
前記シグナル伝達ドメインは、共通サイトカイン受容体ベータ鎖のサイトカイン受容体シグナル伝達ドメインを含む、請求項５１または請求項５２に記載の核酸ベクター。
【請求項５４】
前記シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭを含む、請求項５１〜５３のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項５５】
前記シグナル伝達ドメインは、チロシンがリン酸化された場合にＳＨ２ドメインに結合することが可能な前記チロシンを含む、請求項５１〜５４のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項５６】
チェックポイント阻害リガンドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項４７〜５５のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項５７】
前記チェックポイント阻害リガンドは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイントを遮断することが可能である、請求項５６に記載の核酸ベクター。
【請求項５８】
前記チェックポイント阻害リガンドは、Ｔｉｍ−３チェックポイントを遮断することが可能である、請求項５６に記載の核酸ベクター。
【請求項５９】
免疫抑制薬に対する抵抗性を提供するタンパク質をコードする核酸配列をさらに含む、請求項４７〜５８のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項６０】
前記免疫抑制薬は、メトトレキサート、ラパマイシン、ラパログ、タクロリムス、及びシクロスポリンからなる群から選択される、請求項５９に記載の核酸ベクター。
【請求項６１】
ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＰＢ）またはその機能性ホモログ、及びＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）タンパク質またはその機能性ホモログのいずれかまたは両方をコードする１つ以上の核酸配列をさらに含む、請求項４７〜６０のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項６２】
２Ａペプチドをコードする核酸配列をさらに含む、請求項４７〜６１のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項６３】
ｗＰＲＥ核酸配列をさらに含む、請求項４７〜６２のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項６４】
ＴＧＦベータドミナント・ネガティブ阻害受容体をコードする核酸配列をさらに含む、請求項４７〜６２のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項６５】
前記核酸ベクターは、レンチウイルスベクターである、請求項４７〜６３のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項６６】
前記核酸ベクターは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターである、請求項４７〜６４のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項６７】
前記核酸ベクターは、アデノウイルスベクターである、請求項４７〜６４のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項６８】
配列番号６〜１１から選択される配列と少なくとも７０％、８０％、９０％、９５％、または９９％同一の配列を含む核酸ベクター。
【請求項６９】
請求項６７に記載の核酸ベクターでパッケージング細胞株をトランスフェクションすることによって生成されるレンチウイルス粒子。
【請求項７０】
Ｔ細胞活性化または共刺激分子をさらに含む、請求項６８に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項７１】
前記Ｔ細胞活性化または共刺激分子は、抗ＣＤ３抗体、ＣＤ２８リガンド、及び４１ｂｂリガンドからなる群から選択される、請求項６９に記載のレンチウイルス粒子。
【請求項７２】
前記Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、
（ａ）（ｉ）配列番号１３と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する機能性ＦＫＰＢドメイン、及び（ｉｉ）配列番号１４と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する機能性ＩＬ２Ｒｂドメインのいずれかまたは両方を含む第１の鎖；及び／または
（ｂ）（ｉ）配列番号１６と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する機能性ＦＲＢドメイン、及び（ｉｉ）配列番号１７と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する機能性ＩＬ２Ｒｇドメインのいずれかまたは両方を含む第２の鎖
を含む、請求項１〜２０もしくは６８〜７０のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載の方法、または請求項４７〜６７のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【請求項７３】
前記Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、
（ａ）機能性ＦＫＰＢドメイン及び機能性ＩＬ２Ｒｂドメインを含む第１の鎖であって、配列番号１２と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する、前記第１の鎖；及び／または
（ｂ）機能性ＦＲＢドメイン及び機能性ＩＬ２Ｒｇドメインを含む第２の鎖であって、配列番号１５と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する、前記第２の鎖
を含む、請求項１〜２０もしくは６８〜７０のいずれか１項に記載のレンチウイルス粒子、請求項２１〜３８のいずれか１項に記載の方法、または請求項４７〜６７のいずれか１項に記載の核酸ベクター。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年４月１２日に出願された米国仮特許出願第６２／６５６，８２３号の優先権を主張し、その開示は、すべての目的のためにその全体が参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
電子的に提出されたテキストファイルの説明
本出願に関連する配列表は、紙のコピーの代わりにテキスト形式で提供され、本明細書への参照により本明細書に組み込まれる。配列表を含有するテキストファイルの名前は、ＶＩＴＩ＿００１＿０１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔである。テキストファイルは９４ＫＢであり、２０１９年４月１１日に作成され、ＥＦＳ−Ｗｅｂを介して電子的に提出されている。
【０００３】
本開示は一般に、ウイルスベクター、パッケージング細胞株、及び関連する使用方法、特に疾患病態の治療のためのｉｎ  ｖｉｖｏでの免疫細胞集団の増殖のための使用方法に関する。
【背景技術】
【０００４】
がん免疫療法は、腫瘍に対する免疫反応の治療的誘導に基づく治療手法である。養子Ｔ細胞療法（ＡＣＴ）は、がん免疫療法の一形態である。リンパ球、特に腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）は、身体から単離され、ｅｘ  ｖｉｖｏで培養され、増殖され、次いで再注入される。増殖工程は、ＴＩＬの抗原特異的増殖または遺伝子改変を含み得る。ＡＣＴは、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｓ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３４８：６２−８（２０１５）で概説されている。
【０００５】
本発明者は、ＡＣＴの代替手段として、ＴＩＬ、または他の免疫細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入が、ｅｘ  ｖｉｖｏではなくｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の増殖を促進し得ることに気づいた。さらに、本発明者は、ＴＩＬ、または他の免疫細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの形質導入は、ＡＣＴによって必要とされるコストが高く、時間がかかり、リスクのある処置を伴わずに、がんまたは他の疾患病態の治療を可能にするであろうことに気づいた。
【０００６】
したがって、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＩＬまたは他の免疫細胞の集団を増殖させる手段が必要とされている。特に、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＩＬまたは他の免疫細胞の所望の集団を選択的に増殖させることが可能な治療剤が必要とされている。本開示は、疾患病態の治療のためのｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＩＬまたは他の免疫細胞の増殖のためのウイルスベクター、パッケージング細胞株、及び関連する使用方法を提供する。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００７】
【非特許文献１】Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．  Ａｄｏｐｔｉｖｅ  ｃｅｌｌ  ｔｒａｎｓｆｅｒ  ａｓ  ｐｅｒｓｏｎａｌｉｚｅｄ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｃａｎｃｅｒ．  Ｓｃｉｅｎｃｅ．  ３４８：６２−８（２０１５）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本開示は、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体（及び任意に他のエフェクタータンパク質）を発現するように設計されたレンチウイルスベクター及びパッケージング細胞株が、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖に有用であるという発見に部分的に基づいている。本開示のレンチウイルスベクター及びパッケージング細胞株は、例えば、レンチウイルスベクターがパッケージング細胞株を使用してレンチウイルス粒子にパッケージングされ、得られたレンチウイルス粒子が対象の体内に送達される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍浸潤リンパ球の形質導入及び薬物媒介増殖のために適合され得る。本開示によるレンチウイルス粒子の腫瘍内注射は、腫瘍浸潤リンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏ増殖をもたらす。腫瘍浸潤リンパ球の増殖は、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体が小分子によって活性化（または不活性化）することが可能である場合に、そのような小分子の使用によって制御可能である。任意に、パッケージング細胞株は、Ｔ細胞活性化または共刺激分子を発現し、外因性活性化剤の非存在下でパッケージング細胞株に由来するレンチウイルス粒子によるＴ細胞形質導入を促進する。任意に、レンチウイルスベクターは、免疫抑制薬（複数可）に対する抵抗性を付与し、標的細胞の選択的増殖を促進する。
【０００９】
一態様では、本開示は、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体をコードする核酸配列に動作可能に連結されたＴ細胞及び／またはＮＫ細胞特異的プロモーターを含む核酸ベクターであって、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、小分子によって活性化することが可能である、核酸ベクターを提供する。一実施形態では、核酸ベクターは、レンチウイルスベクターである。一実施形態では、核酸ベクターは、配列番号６〜１１またはそのフラグメントと少なくとも部分的に同一の配列を含む。
【００１０】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体をコードする核酸配列に動作可能に連結された強力プロモーターを含む核酸ベクターであって、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、小分子によって活性化することが可能である、核酸ベクターを提供する。一実施形態では、強力プロモーターは、配列番号１〜５から選択される。
【００１１】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化し、効率的に形質導入することが可能なレンチウイルス粒子を生成するためのパッケージング細胞株であって、レンチウイルスベクターをパッケージングすることが可能な培養細胞を含み、その培養細胞は、Ｔ細胞活性化または共刺激分子を発現するように遺伝子改変されている、パッケージング細胞株を提供する。
【００１２】
別の態様では、本開示は、本開示の核酸ベクターのいずれかなどの核酸ベクターを含むレンチウイルス粒子を提供する。一実施形態では、レンチウイルス粒子は、Ｔ細胞活性化または共刺激分子、例えば、抗ＣＤ３抗体、ＣＤ２８リガンド、または４１ｂｂリガンドを含む。
【００１３】
別の態様では、本開示は、請求項１９に記載の核酸ベクターを、Ｔ細胞活性化または共刺激分子を発現するように遺伝的改変された培養細胞に形質導入することによって調製された、Ｔ細胞を活性化し、効率的に形質導入するためのレンチウイルス粒子を提供する。
【００１４】
別の態様では、本開示は、がんに罹患している対象を治療するための方法であって、本開示のレンチウイルス粒子のいずれかを対象に投与することと、小分子（レンチウイルス粒子のＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は小分子によって活性化することが可能である）を対象に投与することとを含み、がんが対象において治療される、方法を提供する。
【００１５】
別の態様では、本開示は、腫瘍細胞を認識し、殺傷することが可能なＴ細胞の増殖を、それを必要とする対象において行うための方法であって、本開示のレンチウイルス粒子のいずれかを対象に投与することと、小分子（レンチウイルス粒子のＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は小分子によって活性化することが可能である）を対象に投与することとを含み、対象において腫瘍細胞を認識し、殺傷することが可能なＴ細胞が増殖される、方法を提供する。
【００１６】
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＴ細胞及びＮＫ細胞に特異的なプロモーターを含む核酸であって、その核酸の配列は、配列番号１〜４からなる群から選択される配列と少なくとも９０％同一である、核酸を提供する。
【００１７】
本開示の追加の態様及び実施形態は、以下の詳細な説明から明らかになる。
【図面の簡単な説明】
【００１８】
【図１】Ａ及びＢは、レンチウイルス粒子を示している。Ａは、Ｂに示されたレンチウイルス粒子には存在しない表面発現した抗ＣＤ３及びＴ細胞共刺激分子を含む、表面改変されたレンチウイルス粒子の実施形態の図である。
【図２】抗ＣＤ３  ｓｃＦＶ、ＣＤ８６、及びＣＤ１３７Ｌをコードするレンチウイルスベクターで形質導入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に由来するＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株を生成するために使用された実験プロトコルを示している。ＣＤ８６＋ＣＤ１３７Ｌ＋を蛍光活性化セルソーティングによって単離し、増殖させ、長期保存及び使用のために凍結した。
【図３Ａ】ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現（ＨＡＴＳＥ−２９３細胞株でのみ予期された発現）についての親２９３細胞及びＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株のＦＡＣＳ分析を示している。ＣＤ４６（予期された構成的発現）、及びＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ発現（予期された発現なし）についての親ＨＥＫ−２９３細胞株の分析を示している。染色されていない（モック）サンプルでは検出可能な蛍光標識は観察されなかった（図３Ａ）。抗ＣＤ４６抗体染色によってＣＤ４６の高度な発現が検出され（図３Ａ〜Ｂ；ＰＥ抗ヒトＣＤ４６）、ＣＤ８６（図３Ｅ；パシフィックブルー抗ヒトＣＤ８６）またはＣＤ１３７Ｌ（図３Ｄ；ＰＥ抗ヒト４−１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ））のいずれの発現も、それぞれＣＤ８６及びＣＤ１３７Ｌのための特異的染色によって検出されなかった。
【図３Ｂ】ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現（ＨＡＴＳＥ−２９３細胞株でのみ予期された発現）についての親２９３細胞及びＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株のＦＡＣＳ分析を示している。ＣＤ４６（予期された構成的発現）、及びＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ発現（予期された発現なし）についての親ＨＥＫ−２９３細胞株の分析を示している。抗ＣＤ４６抗体染色によってＣＤ４６の高度な発現が検出され（図３Ａ〜Ｂ；ＰＥ抗ヒトＣＤ４６）、ＣＤ８６（図３Ｅ；パシフィックブルー抗ヒトＣＤ８６）またはＣＤ１３７Ｌ（図３Ｄ；ＰＥ抗ヒト４−１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ））のいずれの発現も、それぞれＣＤ８６及びＣＤ１３７Ｌのための特異的染色によって検出されなかった。
【図３Ｃ】ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現（ＨＡＴＳＥ−２９３細胞株でのみ予期された発現）についての親２９３細胞及びＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株のＦＡＣＳ分析を示している。ＣＤ４６（予期された構成的発現）、及びＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ発現（予期された発現なし）についての親ＨＥＫ−２９３細胞株の分析を示している。
【図３Ｄ】ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現（ＨＡＴＳＥ−２９３細胞株でのみ予期された発現）についての親２９３細胞及びＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株のＦＡＣＳ分析を示している。ＣＤ４６（予期された構成的発現）、及びＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ発現（予期された発現なし）についての親ＨＥＫ−２９３細胞株の分析を示している。抗ＣＤ４６抗体染色によってＣＤ４６の高度な発現が検出され（図３Ａ〜Ｂ；ＰＥ抗ヒトＣＤ４６）、ＣＤ８６（図３Ｅ；パシフィックブルー抗ヒトＣＤ８６）またはＣＤ１３７Ｌ（図３Ｄ；ＰＥ抗ヒト４−１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ））のいずれの発現も、それぞれＣＤ８６及びＣＤ１３７Ｌのための特異的染色によって検出されなかった。
【図３Ｅ】ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現（ＨＡＴＳＥ−２９３細胞株でのみ予期された発現）についての親２９３細胞及びＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株のＦＡＣＳ分析を示している。ＣＤ４６（予期された構成的発現）、及びＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ発現（予期された発現なし）についての親ＨＥＫ−２９３細胞株の分析を示している。抗ＣＤ４６抗体染色によってＣＤ４６の高度な発現が検出され（図３Ａ〜Ｂ；ＰＥ抗ヒトＣＤ４６）、ＣＤ８６（図３Ｅ；パシフィックブルー抗ヒトＣＤ８６）またはＣＤ１３７Ｌ（図３Ｄ；ＰＥ抗ヒト４−１ＢＢリガンド（ＣＤ１３７Ｌ））のいずれの発現も、それぞれＣＤ８６及びＣＤ１３７Ｌのための特異的染色によって検出されなかった。
【図３Ｆ】ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現（ＨＡＴＳＥ−２９３細胞株でのみ予期された発現）についての親２９３細胞及びＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株のＦＡＣＳ分析を示している。ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ発現（予期されたＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現）についてのＨＡＴＳＥ−２９３細胞株の分析を示している。図３Ｆ及び図３Ｇは、染色されていない（モック）サンプルにおいて検出可能な蛍光標識はないことを実証する。
【図３Ｇ】ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現（ＨＡＴＳＥ−２９３細胞株でのみ予期された発現）についての親２９３細胞及びＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株のＦＡＣＳ分析を示している。ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ発現（予期されたＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現）についてのＨＡＴＳＥ−２９３細胞株の分析を示している。図３Ｆ及び図３Ｇは、染色されていない（モック）サンプルにおいて検出可能な蛍光標識はないことを実証する。
【図３Ｈ】ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現（ＨＡＴＳＥ−２９３細胞株でのみ予期された発現）についての親２９３細胞及びＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株のＦＡＣＳ分析を示している。ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ発現（予期されたＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現）についてのＨＡＴＳＥ−２９３細胞株の分析を示している。図３Ｈ及び図３Ｉは、抗ＣＤ４６抗体染色（ＰＥ抗ヒトＣＤ４６）によって検出されたＣＤ４６の均一な高発現を実証する。
【図３Ｉ】ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現（ＨＡＴＳＥ−２９３細胞株でのみ予期された発現）についての親２９３細胞及びＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株のＦＡＣＳ分析を示している。ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ発現（予期されたＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現）についてのＨＡＴＳＥ−２９３細胞株の分析を示している。図３Ｈ及び図３Ｉは、抗ＣＤ４６抗体染色（ＰＥ抗ヒトＣＤ４６）によって検出されたＣＤ４６の均一な高発現を実証する。
【図３Ｊ】ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現（ＨＡＴＳＥ−２９３細胞株でのみ予期された発現）についての親２９３細胞及びＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株のＦＡＣＳ分析を示している。ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ発現（予期されたＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現）についてのＨＡＴＳＥ−２９３細胞株の分析を示している。図３Ｊ及び図３Ｋは、ＣＤ８６またはＣＤ１３７Ｌのいずれかの低量及び高量を発現する２つの集団が、抗ＣＤ８６（図３Ｊ）及び抗ＣＤ１３７Ｌ（図３Ｋ）抗体をそれぞれ使用して検出されることを実証する。
【図３Ｋ】ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現（ＨＡＴＳＥ−２９３細胞株でのみ予期された発現）についての親２９３細胞及びＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株のＦＡＣＳ分析を示している。ＣＤ４６（両方の細胞株で予期された構成的発現）、及びＣＤ８６／ＣＤ１３７Ｌ発現（予期されたＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋発現）についてのＨＡＴＳＥ−２９３細胞株の分析を示している。図３Ｊ及び図３Ｋは、ＣＤ８６またはＣＤ１３７Ｌのいずれかの低量及び高量を発現する２つの集団が、抗ＣＤ８６（図３Ｊ）及び抗ＣＤ１３７Ｌ（図３Ｋ）抗体をそれぞれ使用して検出されることを実証する。
【図４】対照レンチウイルス粒子または以下の定義及び実施例に記載のＨＡＴＳＥ細胞株から生成されたレンチウイルス粒子によって形質導入されたＴ細胞の成長曲線を示している。陽性対照として、Ｔ細胞を、刺激ビーズの存在下で対照レンチウイルス粒子で形質導入した。「形質導入後の日数」は、細胞が粒子に曝露された日（０日目）から経過した日数を指す。
【図５】２９３Ｔ対照粒子［２９３Ｔ無刺激］；２９３Ｔ対照粒子及び刺激ビーズ［２９３Ｔ刺激］；１回ソーティングされたＨＡＴＳＥ粒子［１回ソーティングされたＨＡＴＳＥ（無刺激）］；または２回ソーティングされたＨＡＴＳＥ粒子［２回ソーティングされたＨＡＴＳＥ（無刺激）］に曝露された細胞の蛍光顕微鏡写真を示している。
【図６】ｖｉｖｏ−ＴＩＬ  １０４  ＬＮＧＦＲ（配列番号６）についてのベクターマップを示している。
【図７】ｖｉｖｏ−ＴＩＬ  １０５  ＴＣＰ１（配列番号７）についてのベクターマップを示している。
【図８】ｖｉｖｏ−ＴＩＬ  １０６  ＴＣＰ２（配列番号８）についてのベクターマップを示している。
【図９】ｖｉｖｏ−ＴＩＬ  １０７  ＴＣＰ３（配列番号９）についてのベクターマップを示している。
【図１０】ｖｉｖｏ−ＴＩＬ  １０８  ＴＣＰ４（配列番号１０）についてのベクターマップを示している。
【図１１】ｖｉｖｏ−ＴＩＬ  １０９  ｈＰｅｒｆＰ（配列番号１１）についてのベクターマップを示している。
【図１２Ａ】例示的な小分子で制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体（ＲＡＣＣＲと称される）についての結果を示している。例示されたＲＡＣＣＲ分子の設計を示している。ＧＦＰを発現する対照レンチウイルス粒子で形質導入された細胞を示している。
【図１２Ｂ】例示的な小分子で制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体（ＲＡＣＣＲと称される）についての結果を示している。ｍＣｈｅｒｒｙを発現する表面改変された粒子で形質導入された細胞を示している。
【図１２Ｃ】例示的な小分子で制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体（ＲＡＣＣＲと称される）についての結果を示している。ＲＡＣＣＲを発現する表面改変された粒子で形質導入された細胞を示している。
【図１２Ｄ】例示的な小分子で制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体（ＲＡＣＣＲと称される）についての結果を示している。
【図１２Ｅ】例示的な小分子で制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体（ＲＡＣＣＲと称される）についての結果を示している。ＩＬ−２またはラパマイシンの存在下で、ＲＡＣＣＲを発現するＳＥ−ＬＶＰを含む様々な表面改変されたレンチウイルス粒子（ＳＥ−ＬＶＰ）で形質導入されたＴ細胞のＴ細胞増殖のグラフを示している。
【図１２Ｆ】例示的な小分子で制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体（ＲＡＣＣＲと称される）についての結果を示している。ＲＡＣＣＲによって駆動されるＴ細胞の増殖が、ラパマイシンで制御可能であることを確認するデータを示している。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
本発明者は、ＡＣＴの代替手段として、ＴＩＬ、または他の免疫細胞のｉｎ  ｖｉｖｏ形質導入が、ｅｘ  ｖｉｖｏではなくｉｎ  ｖｉｖｏでの細胞の増殖を促進し得ることに気づいた。さらに、本発明者は、ＴＩＬ、または他の免疫細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの形質導入により、免疫細胞のｅｘ  ｖｉｖｏでの増殖の欠点を伴わずにがんまたは他の疾患病態の治療が可能になることに気づいた。
【００２０】
よって、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＩＬまたは他の免疫細胞の集団を増殖させる手段を提供する。特に、本開示は、ｉｎ  ｖｉｖｏでＴＩＬまたは他の免疫細胞の所望の集団を選択的に増殖させることが可能な治療剤を提供する。本開示は、疾患病態の治療のためのｉｎ  ｖｉｖｏでのＴＩＬまたは他の免疫細胞の増殖のためのウイルスベクター及び関連する使用方法を提供する。
【００２１】
本開示は、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体（及び任意に他のエフェクタータンパク質）を発現するように設計されたレンチウイルスベクター及びパッケージング細胞株が、Ｔ細胞のｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖に有用であるという発見に部分的に基づいている。本開示のレンチウイルスベクター及びパッケージング細胞株は、例えば、レンチウイルスベクターがパッケージング細胞株を使用してレンチウイルス粒子にパッケージングされ、得られたレンチウイルス粒子が対象の体内に、例えば、固形腫瘍に罹患している患者に送達される場合、ｉｎ  ｖｉｖｏでの腫瘍浸潤リンパ球の形質導入及び薬物媒介増殖のために適合され得る。開示されるレンチウイルスベクター及び粒子は、自己または同種のＴ細胞または他の免疫細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの形質導入によるＡＣＴに使用され得る。いくつかの場合では、本開示のレンチウイルスベクター及び粒子は、ｉｎ  ｖｉｖｏでの使用のために構成される。レンチウイルスベクターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏまたはｉｎ  ｖｉｖｏで形質導入された標的細胞に細胞分裂シグナルを提供することが可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体の発現を提供するように構成されているので、レンチウイルス粒子の腫瘍内注射は、腫瘍浸潤リンパ球のｉｎ  ｖｉｖｏでの増殖をもたらす。
【００２２】
１．１  核酸ベクター
本明細書で使用される場合、用語「核酸ベクター」は、対象となる核酸を運ぶ、保持する、または発現するように機能する任意の核酸を意味することが意図されている。核酸ベクターは、発現、パッケージング、シュードタイプ化、または形質導入などの特殊な機能を有し得る。核酸ベクターはまた、クローニングまたはシャトルベクターとしての使用のために適合されている場合、操作機能を有し得る。ベクターの構造は、作製することが可能であり、かつ特定の使用のために望ましい任意の望ましい形態を含み得る。そのような形態には、例えば、プラスミド及びファージミドなどの円形形態、及び線状または分枝状形態が含まれる。核酸ベクターは、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡから構成され、部分的にまたは完全に、ヌクレオチド誘導体、アナログ及び模倣物を含有し得る。そのような核酸ベクターは、天然源から得られ得るか、組換えで生成され得るか、または化学的に合成され得る。
【００２３】
本開示のベクター系の非限定的な例には、レトロウイルス、レンチウイルス、泡沫状ウイルス、及びスリーピングビューティートランスポゾンが含まれる。
【００２４】
１．１．１  レンチウイルスベクター
レンチウイルスは、複雑なレトロウイルスであり、一般的なレトロウイルス遺伝子であるｇａｇ、ｐｏｌ、及びｅｎｖに加えて、制御または構造的機能を有する他の遺伝子を含有する。より高い複雑性により、ウイルスは、潜伏感染の過程のように、そのライフサイクルを調節することが可能となる。レンチウイルスの例には、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２）及びシミアン免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれる。レンチウイルスベクターは、ＨＩＶの病原性遺伝子を複合的に減衰させることによって生成されており、例えば、遺伝子ｅｎｖ、ｖｉｆ、ｖｐｒ、ｖｐｕ及びｎｅｆが欠失することにより、生物学的に安全なベクターとなっている。
【００２５】
レンチウイルスベクターは、遺伝子療法に多大な利点を提供する。非統合型に改変されていない限り、レンチウイルスベクターは、標的細胞の染色体に安定して統合し、送達された導入遺伝子の長期発現を可能する。さらに、それらはウイルス遺伝子を移行させないので、細胞傷害性Ｔ細胞によって破壊され得る形質導入された細胞を生成するという問題を回避する。さらに、それらは、ほとんどの想定される臨床適用にとって十分な比較的大きなクローニング能力を有する。また、レンチウイルスは、他のレトロウイルスとは対照的に、非分裂細胞を形質導入することが可能である。これは、造血系、脳、肝臓、肺及び筋肉などの組織のための遺伝子療法という意味で非常に重要である。例えば、ＨＩＶ−１由来のベクターは、ｉｎ  ｖｉｖｏ及びｅｘ  ｖｉｖｏでの効率的な送達、導入遺伝子の細胞、例えば、ニューロン、肝細胞、及び筋細胞への統合及び安定な発現を可能にする（Ｂｌｏｍｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｋａｆｒｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７；Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９６；Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８）。
【００２６】
レンチウイルスベクターは、当該技術分野で知られており、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９６）Ｓｃｉｅｎｃｅ２７２：２６３−７；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：９８７３−９８８０；Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−８４７１；米国特許第６，０１３，５１６号；及び米国特許第５，９９４，１３６号（これらはそれぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。一般に、これらのベクターは、ベクターを含有する細胞の選択のための、レンチウイルス粒子に外来核酸を組み込むための、及び標的細胞への核酸の移行のための必須配列を保有するように構成される。
【００２７】
一般的に使用されるレンチウイルスベクター系は、いわゆる第三世代系である。第三世代のレンチウイルスベクター系は、４つのプラスミドを含む。「トランスファープラスミド」は、レンチウイルスベクター系によって標的細胞に送達されるポリヌクレオチド配列をコードする。トランスファープラスミドは一般に、トランスファープラスミド配列の宿主ゲノムへの統合を促進する長い末端リピート（ＬＴＲ）配列の隣に対象となる１つ以上の導入遺伝子配列を有する。安全上の理由から、トランスファープラスミドは一般に、生じるベクターの複製が無効になるように設計される。例えば、トランスファープラスミドは、宿主細胞内での感染性粒子の生成に必要な遺伝子要素を欠いている。また、トランスファープラスミドは、３’ＬＴＲを欠失させて、ウイルスを「自己不活性化」（ＳＩＮ）させるように設計され得る。Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８４６３−７１；Ｍｉｙｏｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７２：８１５０−５７を参照されたい。
【００２８】
第三世代系はまた一般に、２つの「パッケージングプラスミド」及び「エンベローププラスミド」を含む。「エンベローププラスミド」は一般に、プロモーターに動作可能に連結されたＥｎｖ遺伝子をコードする。例示的な第三世代系において、Ｅｎｖ遺伝子はＶＳＶ−Ｇであり、プロモーターはＣＭＶプロモーターである。第三世代系は、２つのパッケージングプラスミドを使用し、一方はｇａｇ及びｐｏｌをコードし、他方は、さらなる安全的特徴、すなわち、いわゆる第二世代系の単一パッケージングプラスミドに対する改善としてｒｅｖをコードする。第三世代系は、より安全ではあるものの、使用するのがより煩雑であり、追加のプラスミドの追加により、より低いウイルス力価をもたらす。例示的なパッケージングプラスミドには、限定されないが、ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＲＳＶ−ｒｅｖ、ｐＭＤＬＧ−ｐＲＲＥ、及びｐＲＲＬ−ＧＯＩが含まれる。
【００２９】
レンチウイルスベクター系は、「パッケージング細胞株」の使用に依存する。一般に、パッケージング細胞株は、トランスファープラスミド、パッケージングプラスミド（複数可）、及びエンベローププラスミド（複数可）が細胞内に導入された場合に細胞が感染性レンチウイルス粒子を生成することが可能な細胞株である。トランスフェクションまたはエレクトロポレーションを含む、プラスミドを細胞内に導入する様々な方法が使用され得る。いくつかの場合では、パッケージング細胞株は、レンチウイルスベクター系をレンチウイルス粒子内に高効率でパッケージングするために適合される。
【００３０】
本明細書で使用される場合、用語「レンチウイルスベクター」は、ゲノムパッケージングに必要とされるレンチウイルスシス核酸配列をコードする核酸を意味することが意図される。レンチウイルスベクターはまた、例えば、逆転写、プロウイルス統合またはゲノム転写に必要とされるシス配列を含む、遺伝子送達に有益な他のシス核酸配列をコードし得る。レンチウイルスベクターは、レンチウイルスベクターの形質導入機能を実施する。このように、ベクターゲノムの正確な構成は、標的細胞に導入することが望まれる遺伝性物質に依存する。それ故、ベクターゲノムは、例えば、パッケージング、逆転写、統合、または転写に必要とされるもの以外の追加のポリペプチドまたは機能をコードし得る。そのような機能は一般に、対象となる核酸の発現に必要とされるシスエレメントをコードすることを含む。レンチウイルスベクターゲノムがパッケージング細胞株によってレンチウイルス粒子にパッケージングされ、標的細胞に導入され得る限り、レンチウイルスのシス配列またはエレメントは、レンチウイルスゲノムまたは他のウイルスもしくはベクターゲノムに由来し得る。
【００３１】
レンチウイルスベクターの非限定的な例には、配列番号６〜１１が含まれ、これらは図６〜１１に示されている。
【００３２】
生成されるレンチウイルス粒子は一般に、ＲＮＡゲノム（トランスファープラスミドに由来する）、Ｅｎｖタンパク質が埋め込まれた脂質多層エンベロープ、ならびにインテグラーゼ、プロテアーゼ、及びマトリックスタンパク質を含む他の付随タンパク質を含む（図１Ｂを参照されたい）。本明細書で使用される場合、用語「レンチウイルス粒子」は、エンベロープを含み、レンチウイルスの１つ以上の特性を有し、標的宿主細胞に侵入することが可能なウイルス粒子を意味することが意図されている。そのような特性には、例えば、非分裂宿主細胞に感染すること、非分裂宿主細胞を形質導入すること、宿主免疫細胞に感染するかもしくはそれを形質導入すること、ｇａｇ構造ポリペプチドｐ７、ｐ２４、及びｐ１７のうちの１つ以上を含むレンチウイルスビリオンを含有すること、ｅｎｖがコードする糖タンパク質ｐ４１、ｐ１２０、及びｐ１６０のうちの１つ以上を含むレンチウイルスエンベロープを含有すること、複製、プロウイルス統合もしくは転写において機能する１つ以上のレンチウイルス性シス作用配列を含むゲノムを含有すること、レンチウイルスプロテアーゼ、逆転写酵素もしくはインテグラーゼをコードするゲノムを含有すること、またはＴａｔもしくはＲｅｖなどの調節活性をコードするゲノムを含有することが含まれる。トランスファープラスミドは、米国特許第８，０９３，０４２に記載されているように、ｃＰＰＴ配列を含み得る。
【００３３】
系の効率は、ベクター工学において重要な関心事である。レンチウイルスベクター系の効率は、定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）などによるベクターコピー数（ＶＣＮ）またはベクターゲノム（ｖｇ）の測定、またはミリリットル当たりの感染単位（ＩＵ／ｍＬ）でのウイルスの力価の測定を含む、当該技術分野で知られている様々な方法で評価され得る。例えば、力価は、Ｈｕｍｂｅｒｔ  ｅｔ  ａｌ．  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ  ｏｆ  Ｔｈｉｒｄ−ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ  Ｃｏｃａｌ  Ｅｎｖｅｌｏｐｅ  Ｐｒｏｄｕｃｅｒ  Ｃｅｌｌ  Ｌｉｎｅｓ  ｆｏｒ  Ｒｏｂｕｓｔ  Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  Ｇｅｎｅ  Ｔｒａｎｓｆｅｒ  ｉｎｔｏ  Ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  ａｎｄ  Ｔ−ｃｅｌｌｓ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ２４：１２３７−１２４６（２０１６）に記載されているように、培養された腫瘍細胞株ＨＴ１０８０で実施される機能性アッセイを使用して評価され得る。継続的に分裂している培養細胞株で力価が評価される場合、刺激は必要とされないので、測定される力価は、レンチウイルス粒子の表面改変によって影響を受けない。レンチウイルスベクター系の効率を評価するための他の方法は、Ｇａｅｒｅｒｔｓ  ｅｔ  ａｌ．  Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ  ｏｆ  ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｔｉｔｒａｔｉｏｎ  ｍｅｔｈｏｄｓ．ＢＭＣ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  ６：３４（２００６）で提供されている。
【００３４】
レンチウイルスベクター系が限られた効率を有すること、及びレンチウイルスベクター系を改変しようとする試みがしばしば効率の低下をもたらすことは広く知られている。本発明者は、驚くべきことに、レンチウイルスベクター系（例えば、第三世代系）のエンベローププラスミドが、融合糖タンパク質またはその機能性バリアントに加えて複数のポリペプチドをコードするように修飾され得ることを発見した。
【００３５】
いくつかの場合では、本開示のベクター及びパッケージング細胞株は、少なくとも約１×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約２×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約３×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約４×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約５×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約６×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約７×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約８×１０６ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約９×１０６ＩＵ／ｍＬ、または少なくとも約１×１０７ＩＵ／ｍＬの力価で表面改変されたレンチウイルス粒子を生成することが可能である。いくつかの場合では、本開示の多シストロン性ベクターは、少なくとも約１×１０７ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約２×１０７ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約３×１０７ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約４×１０７ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約５×１０７ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約６×１０７ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約７×１０７ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約８×１０７ＩＵ／ｍＬ、少なくとも約９×１０７ＩＵ／ｍＬ、または少なくとも約１×１０８ＩＵ／ｍＬの力価で表面改変されたレンチウイルス粒子を生成することが可能である。
【００３６】
１．２  Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体
本開示は、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体をコードする核酸ベクター、レンチウイルスベクター、及びＡＡＶベクターを企図している。本明細書で使用される場合、用語「Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体」は、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体が細胞分裂シグナルを形質導入された細胞に提供するように、形質導入された細胞の細胞表面上で発現するように構成された１つ以上の膜貫通タンパク質を指す。Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、標的細胞がほとんどの場合、Ｔ細胞またはＮＫ細胞であるため使用される。本方法は、別の細胞型で活性を保持する活性化受容体の使用によって他の細胞型での使用に適合され得る。本明細書で有用なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、サイトカイン受容体シグナル伝達ドメイン、共刺激受容体シグナル伝達ドメイン、Ｔ細胞受容体サブユニットシグナル伝達ドメイン、ＮＫ細胞受容体サブユニットシグナル伝達ドメイン、成長因子受容体シグナル伝達ドメインなどのシグナル伝達ドメインを含み得る。
【００３７】
１．２．１  Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体の非限定的な例
使用されるシグナル伝達ドメインは、共通サイトカイン受容体ガンマ鎖のものまたは共通サイトカイン受容体ベータ鎖のものであり得る。シグナル伝達ドメインは、ＩＴＡＭ、またはチロシンがリン酸化された場合にＳＨ２ドメインに結合することが可能なチロシンを含み得る。いくつかの場合では、シグナル伝達は、活性化受容体のホモまたはヘテロ二量体化によって引き起こされ得る。活性化受容体の細胞内ドメイン上の１つ以上のチロシン残基のリン酸化は、いくつかの場合では、ＳＨ２ドメインとの二量体化をもたらし、それによって細胞分裂シグナル伝達カスケードを開始させ得る。いくつかの場合では、本開示のシグナル伝達ドメインは、チロシン残基上でリン酸化され、その後、別の分子上のＳＨ２ドメインに結合することが可能であり得る。
【００３８】
いくつかの場合では、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、天然に存在する活性化受容体である。代替的に、当該技術分野で知られている異なる活性化受容体から得られる１つ以上の遺伝子要素の複合体。本発明において有用な改変されたＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体の例には、限定されないが、Ｈｕｎｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ  γｃ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ  ｃｏｎｆｅｒ  ｃｙｔｏｋｉｎｅ  ｉｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔ  ｅｎｇｒａｆｔｍｅｎｔ  ｏｆ  ｈｕｍａｎ  Ｔ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｍｏｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．  ２０１３  Ｎｏｖ；５６（１−２）：１−１１．；Ｓｈｕｍ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ  Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ  ｆｒｏｍ  ａｎ  Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ  ＩＬ７  Ｒｅｃｅｐｔｏｒ  Ｐｒｏｍｏｔｅｓ  Ｄｕｒａｂｌｅ  Ｔｕｍｏｒ  Ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ  ｂｙ  Ｔｕｍｏｒ−Ｒｅｄｉｒｅｃｔｅｄ  Ｔ  Ｃｅｌｌｓ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｄｉｓｃｏｖ．  ２０１７  Ｎｏｖ；７（１１）：１２３８−１２４７に記載されているように、構成的活性化ＩＬ２受容体またはＩＬ７受容体が含まれる。
【００３９】
１．２．２  小分子で制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体
いくつかの場合では、体内で形質導入された細胞の増殖を制御するための手段を提供することが有利であり得る。いくつかの場合では、これは、細胞の再度の過剰な増殖をガードするためのフェイルセーフとして機能し得る。他の場合では、治療目的のために形質導入された細胞の増殖を制御し得る。よって、本開示は、小分子の使用によって制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体を提供する。レンチウイルスベクターがそのような制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体をコードする場合、小分子の投与により活性化受容体が活性化して細胞分裂シグナルを形質導入された細胞に提供することが可能となる一方で、小分子の投与の中止は、活性化受容体が、細胞分裂シグナルを形質導入された細胞に提供することを妨げる。このようにして、レンチウイルス粒子を対象に投与することによって生成されたｉｎ  ｖｉｖｏＴＩＬは、小分子が対象に存在する間のみ増殖する。小分子は、レンチウイルス粒子の投与と同時に、または投与後の期間中に、全身的または局所的に提供され得る。ＴＩＬの増殖は、血液サンプル、生検、または医用画像化によりモニターされ得、過剰な増殖が観察された場合に小分子は取りやめられ得る。いくつかの場合では、治療プロトコルを最適化するために、小分子のパルスまたは間欠投与が使用され得る。いくつかの場合では、小分子は、ＴＩＬ増殖を調整するために漸増される。いくつかの場合では、小分子は、腫瘍の寛解または再発に応答して、または他の治療上の理由のために、取りやめられ得るか、または投与され得る。
【００４０】
いくつかの場合では、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、小分子の存在下で誘導的に二量体化するか、または小分子の非存在下で誘導的に二量体化し、小分子を除去、分解、または希釈すると単量体状態に戻るタンパク質サブユニットで二量体Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体の細胞外ドメインを置換することによって、小分子によって制御可能となるように構成され得る。ヘテロ二量体Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体の場合、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体の一方のユニットの細胞外ドメインが、誘導的に二量体化するタンパク質サブユニットの一方の単量体を含み、かつＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体の他方のユニットの細胞外ドメインが、誘導的に二量体化するタンパク質サブユニットの他方の単量体を含むように、修飾され得ることが企図される。ヘテロ二量体Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、誘導的に二量体化するホモ二量体タンパク質サブユニットまたは誘導的に二量体化するヘテロ二量体タンパク質サブユニットのいずれかを使用してこのように修飾され得る。他の場合では、ホモ二量体Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、誘導的に二量体化するホモ二量体タンパク質サブユニットまたは誘導的に二量体化するヘテロ二量体タンパク質サブユニットのいずれかを使用してこのように修飾され得る。小分子で制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、ホモ二量体である場合は単一の導入遺伝子によってコードされ、ヘテロ二量体である場合には２つの導入遺伝子によってコードされ得る。
【００４１】
誘導的に二量体化するタンパク質サブユニットの例には、限定されないが、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインが含まれる。ＦＫ５０６結合タンパク質は、タクロリムス（ＦＫ５０６）の存在下で二量体化する。ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインは、ラパマイシンの存在下で二量体化する。よって、本開示による小分子は、タクロリムス、ラパマイシン、またはラパログ（ラパマイシンアナログ）のいずれかであり得る。小分子で制御可能な受容体が制御され得る小分子のさらなる例には、限定されないが、ラパマイシン、ラパログ、クーママイシン、ジベレリン、アブシジン酸（ＡＢＡ）、メトトレキサート、シクロスポリンＡ、ＦＫＣｓＡ、トリメトプリム（Ｔｍｐ）−ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ）、またはそれらの任意の誘導体が含まれる。本開示の受容体における融合タンパク質として好適な例示的なドメインの対には、限定されないが、ＦＫＢＰとＦＲＢ、ＦＫＢＰとカルシニューリン、ＦＫＢＰとシクロフィリン、ＦＫＢＰと細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリンとシクロフィリン、ＰＹＬ１とＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１とＧＡＩ、またはそれらのバリアントから選択される対が含まれる。
【００４２】
いくつかの場合では、小分子で制御可能な受容体は、１つ以上の小分子結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む。細胞外ドメイン（複数可）への小分子の結合は、受容体分子の分子内相互作用（例えば、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化）を引き起こし、これにより細胞内ドメイン（複数可）からの下流シグナルを活性化する。小分子で制御可能な受容体の細胞内ドメイン（複数可）は、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死−１（ＰＤ−１）、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１、ＣＤ１−１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ−１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ−２Ｒべータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＬ−２１Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１  ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１  ｌａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１  ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１  ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、ＴＧＦｂＲ１、ＴＧＦｂＲＩＩ、ｍｙｄ８８、ＣＤ４０及び任意の他のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、ならびにそれらの組み合わせのドメインまたはフラグメントから選択される１つ以上のドメインを含み得る。
【００４３】
ＦＫＢＰまたはＦＲＢなどの対象となるタンパク質の「ホモログ」には、そのタンパク質のアミノ酸配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有するアミノ酸配列を含むか、またはそれからなるタンパク質が含まれる。ホモログはまた、ヌクレオチド配列と少なくとも約７０％、８０％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する核酸によってコードされるタンパク質であり得る。
【００４４】
対象となるタンパク質の「機能性ホモログ」は、タンパク質の少なくとも１つの生物学的活性を有するタンパク質のホモログを指す。例えば、ＦＫＰＢの機能性ホモログは、ラパマイシン（または関連するラパログ）の存在下でＦＲＢとヘテロ二量体化するか、またはＡＰ１９０３などの分子の存在下でホモ二量体化するＦＫＰＢのホモログを指し、ＦＲＢの機能性ホモログは、ラパマイシン（または関連するラパログ）の存在下でＦＫＰＢとヘテロ二量体化するＦＲＢのホモログを指す。
【００４５】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、（ａ）（ｉ）配列番号１３と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する機能性ＦＫＰＢドメイン、及び（ｉｉ）配列番号１４と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する機能性ＩＬ２Ｒｂドメインのいずれかまたは両方を含む第１の鎖；及び／または（ｂ）（ｉ）配列番号１６と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する機能性ＦＲＢドメイン、及び（ｉｉ）配列番号１７と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する機能性ＩＬ２Ｒｇドメインのいずれかまたは両方を含む第２の鎖を含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、（ａ）機能性ＦＫＰＢドメイン及び機能性ＩＬ２Ｒｂドメインを含む第１の鎖であって、配列番号１２と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する、第１の鎖；及び／または（ｂ）機能性ＦＲＢドメイン及び機能性ＩＬ２Ｒｇドメインを含む第２の鎖であって、配列番号１５と少なくとも９５％、９９％、または１００％の配列同一性を共有する、第２の鎖を含む。
【００４７】
１．２．３  キメラ抗原受容体
いくつかの場合では、形質導入された細胞を特定の細胞または組織に標的化するための手段を提供することが有利であり得る。いくつかの場合では、レンチウイルスベクターは、（他の遺伝子の代わりに、またはそれに加えて）キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードするポリヌクレオチドを含む。当該技術分野で知られている様々なＣＡＲが採用され得る。代替的に、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）融合物が使用され得る。ベクターがＣＡＲをコードする場合、ＣＡＲは、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死−１（ＰＤ−１）、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１、ＣＤ１−１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ−１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ−２Ｒべータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＬ−２１Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１  ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１  ｌａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１  ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１  ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、ＴＧＦｂＲ１、ＴＧＦｂＲＩＩ、ｍｙｄ８８、まだ列挙されていない他のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、ならびにそれらの組み合わせのドメインまたはフラグメントから選択される１つ以上のドメインを含み得る。
１．２．４  小分子で制御可能なキメラ抗原受容体
【００４８】
いくつかの場合では、形質導入された細胞の標的化を制御するための手段を提供することが有利であり得る。いくつかの場合では、これは、細胞の再度の過剰な活性をガードするためのフェイルセーフとして機能し得る。他の場合では、治療目的のために形質導入された細胞の活性を制御し得る。よって、本開示は、ＣＡＲ、または同様の標的化受容体、例えば、小分子の使用によって制御可能なＴＣＲ融合物を提供する。レンチウイルスベクターがそのような制御可能な標的化受容体をコードする場合、小分子の投与により標的化受容体が活性化して形質導入された細胞を標的細胞に標的化することが可能となる一方で、小分子の投与の中止は、その受容体が、形質導入された細胞を標的細胞に標的化することを妨げる。このようにして、レンチウイルス粒子を対象に投与することによって生成されたｉｎ  ｖｉｖｏ  ＴＩＬは、小分子が対象に存在する間のみ活性化する。小分子は、レンチウイルス粒子の投与と同時に、または投与後の期間中に、全身的または局所的に提供され得る。ＴＩＬの活性は、血液サンプル、生検、または医用画像化によりモニターされ得、過剰な活性が観察された場合に小分子は取りやめられ得る。いくつかの場合では、治療プロトコルを最適化するために、小分子のパルスまたは間欠投与が使用され得る。いくつかの場合では、小分子は、ＴＩＬ活性を調整するために漸増される。いくつかの場合では、小分子は、腫瘍の寛解または再発に応答して、または他の治療上の理由のために、取りやめられ得るか、または投与され得る。
【００４９】
いくつかの場合では、標的化受容体（例えば、ＣＡＲ）は、小分子の存在下で誘導的に二量体化するか、または小分子の非存在下で誘導的に二量体化し、小分子を除去、分解、または希釈すると単量体状態に戻るタンパク質サブユニットへの融合によって、小分子によって制御可能となるように構成され得る。ヘテロ二量体標的化受容体の場合、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、標的化受容体の一方のユニットの細胞外ドメインが、誘導的に二量体化するタンパク質サブユニットの一方の単量体を含み、かつ標的化受容体の他方のユニットの細胞外ドメインが、誘導的に二量体化するタンパク質サブユニットの他方の単量体を含むように、修飾され得ることが企図される。ヘテロ二量体標的化受容体は、誘導的に二量体化するホモ二量体タンパク質サブユニットまたは誘導的に二量体化するヘテロ二量体タンパク質サブユニットのいずれかを使用してこのように修飾され得る。他の場合では、ホモ二量体標的化受容体は、誘導的に二量体化するホモ二量体タンパク質サブユニットまたは誘導的に二量体化するヘテロ二量体タンパク質サブユニットのいずれかを使用してこのように修飾され得る。小分子で制御可能な標的化受容体は、ホモ二量体である場合は単一の導入遺伝子によってコードされ、ヘテロ二量体である場合には２つの導入遺伝子によってコードされ得る。
【００５０】
誘導的に二量体化するタンパク質サブユニットの例には、限定されないが、ＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）及びＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインが含まれる。ＦＫ５０６結合タンパク質は、タクロリムス（ＦＫ５０６）の存在下で二量体化する。ＦＫＢＰ１２−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインは、ラパマイシンの存在下で二量体化する。よって、本開示による小分子は、タクロリムス、ラパマイシン、またはラパログ（ラパマイシンアナログ）のいずれかであり得る。小分子で制御可能な受容体が制御され得る小分子のさらなる例には、限定されないが、ラパマイシン、ラパログ、クーママイシン、ジベレリン、アブシジン酸（ＡＢＡ）、メトトレキサート、シクロスポリンＡ、ＦＫＣｓＡ、トリメトプリム（Ｔｍｐ）−ＦＫＢＰの合成リガンド（ＳＬＦ）、またはそれらの任意の誘導体が含まれる。本開示の受容体における融合タンパク質として好適な例示的なドメインの対には、限定されないが、ＦＫＢＰとＦＲＢ、ＦＫＢＰとカルシニューリン、ＦＫＢＰとシクロフィリン、ＦＫＢＰと細菌性ＤＨＦＲ、カルシニューリンとシクロフィリン、ＰＹＬ１とＡＢＩ１、もしくはＧＩＢ１とＧＡＩ、またはそれらのバリアントから選択される対が含まれる。
【００５１】
いくつかの場合では、小分子で制御可能な標的化受容体は、１つ以上の小分子結合ドメインを含む細胞外ドメインを含む。細胞外ドメイン（複数可）への小分子の結合は、受容体分子の分子内相互作用（例えば、ホモ二量体化またはヘテロ二量体化）を引き起こし、これにより標的細胞への結合及び／または細胞内ドメイン（複数可）からの下流シグナルを活性化する。小分子で制御可能な受容体の細胞内ドメイン（複数可）は、ＣＤ２８、ＯＸ−４０、４−１ＢＢ／ＣＤ１３７、ＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＣＤ４０、プログラム死−１（ＰＤ−１）、誘導性Ｔ細胞共刺激分子（ＩＣＯＳ）、リンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１、ＣＤ１−１ａ／ＣＤ１８）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ３ゼータ、ＣＤ２４７、ＣＤ２７６（Ｂ７−Ｈ３）、ＬＩＧＨＴ、（ＴＮＦＳＦ１４）、ＮＫＧ２Ｃ、Ｉｇアルファ（ＣＤ７９ａ）、ＤＡＰ−１０、Ｆｃガンマ受容体、ＭＨＣクラス１分子、ＴＮＦ受容体タンパク質、免疫グロブリンタンパク質、サイトカイン受容体、インテグリン、シグナル伝達リンパ球活性化分子（ＳＬＡＭタンパク質）、活性化ＮＫ細胞受容体、ＢＴＬＡ、Ｔｏｌｌリガンド受容体、ＩＣＡＭ−１、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤＳ、ＩＣＡＭ−１、ＧＩＴＲ、ＢＡＦＦＲ、ＬＩＧＨＴ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＫＩＲＤＳ２、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦ１）、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ８アルファ、ＣＤ８ベータ、ＩＬ−２Ｒべータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒアルファ、ＩＬ−２１Ｒアルファ、ＩＴＧＡ４、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１  ｌｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１  ｌａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１  ｌｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１  ｌｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＮＫＧ２Ｄ、ＴＮＦＲ２、ＴＲＡＮＣＥ／ＲＡＮＫＬ、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤ１００（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＣＤ６９、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙ１０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＬＡＴ、ＧＡＤＳ、ＳＬＰ−７６、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＣＤ１９ａ、ＣＤ８３と特異的に結合するリガンド、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＩＣＯＳ、４−１ＢＢ、ＣＤ４０、ＲＡＮＫ／ＴＲＡＮＣＥ−Ｒ、ＯＸ４０、ＴＧＦｂＲ１、ＴＧＦｂＲＩＩ、ｍｙｄ８８、ＣＤ４０及び任意の他のＴＮＦ受容体スーパーファミリーメンバー、ならびにそれらの組み合わせのドメインまたはフラグメントから選択される１つ以上のドメインを含み得る。さらなる例示的な制御可能なＣＡＲは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，１９６，４４４号によって提供される。
【００５２】
いくつかの実施形態では、誘導的に二量体化する２つのタンパク質サブユニットはそれぞれ、シグナル伝達ドメイン（複数可）を含む膜貫通タンパク質及び結合因子（例えば、一本鎖可変フラグメント、ｓｃＦｖ）に融合される。結合因子は、対象となる標的に特異的に結合することが可能である。小分子で誘導される二量体化は、膜貫通タンパク質の膜貫通領域を介して二量体化タンパク質サブユニットにより結合因子から細胞内シグナル伝達ドメイン（複数可）まで及ぶ二量体ユニットを再構成する。いくつかの実施形態では、２つの膜貫通タンパク質が採用され、１つまたは２つの小分子に応答して、互いに及び結合因子融合タンパク質に誘導的に二量体化する。いくつかの実施形態では、小分子で制御可能なＣＡＲは、シグナル伝達ドメイン（複数可）を含む膜貫通タンパク質にそれぞれ個々に二量体化する２つ以上の結合因子融合タンパク質を含む。
【００５３】
１．４  プロモーター及び遺伝子制御要素
本開示は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、またはＴ細胞及びＮＫ細胞に特異的なプロモーター及び／またはエンハンサーを含むレンチウイルスベクターをさらに企図している。本開示は、Ｔ細胞及び／またはＮＫ細胞特異的プロモーターの核酸配列（配列番号１〜４）を提供する。これらは、一般にレンチウイルスベクターによってコードされる遺伝子にプロモーター配列５’を挿入することによってＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体に動作可能に連結され得る。使用されるプロモーターは、配列番号１〜４に示される配列と同一であり得るか、またはプロモーターがＴ及び／またはＮＫ細胞においてプロモーター活性を保持する限り、配列番号１〜４に示される配列と８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％同一であり得る。
【００５４】
いくつかの場合では、他のプロモーターが、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体の発現を制御するために使用され得る。本開示で有用なプロモーターの例には、限定されないが、ＭＮＤプロモーター、Ｔ細胞特異的プロモーター、ＣＤ４  Ｔ細胞特異的プロモーター、ＣＤ８  Ｔ細胞特異的プロモーター、ＮＫ細胞特異的プロモーター、Ｔ細胞及びＮＫ細胞特異的プロモーター、ＣＤ４  Ｔ細胞及びＮＫ細胞特異的プロモーター、ならびにＣＤ８  Ｔ細胞及びＮＫ細胞特異的プロモーターが含まれる。
【００５５】
いくつかの場合では、「強力」プロモーターが使用される。プロモーターの強さは、それが機能する細胞の特質によって部分的に決定されることが理解される。いくつかの場合では、本開示の強力プロモーターは、ＴＩＬなどの標的細胞においてそれが動作可能に連結されている遺伝子要素の高レベルの発現をもたらす。強力プロモーターには、限定されないが、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及びマウス幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）、ホスホグリセリン酸キナーゼ（ＰＧＫ）、ＣＭＶエンハンサー及びニワトリベータ−アクチンプロモーター及びウサギベータ−グロビン遺伝子の一部から構成されるプロモーター配列（ＣＡＧ）、ＳＶ４０プロモーター及びＣＤ４３プロモーターの一部から構成されるプロモーター配列（ＳＶ４０／ＣＤ４３）、ならびに骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する修飾ＭｏＭｕＬＶ  ＬＴＲのＵ３領域を含有する合成プロモーター（ＭＮＤ）が含まれる。本開示の組成物及び方法で有用な例示的な強力プロモーターは、Ｊｏｎｅｓ  ｅｔ  ａｌ．Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ  ｄｅｓｉｇｎ  ｆｏｒ  ｏｐｔｉｍａｌ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ  ａｎｄ  ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｉｎｇ  ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ．  Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．  ２００９  Ｊｕｎ；２０（６）：６３０−４０によって提供される。
【００５６】
いくつかの場合では、強力プロモーターは、合成強力プロモーターであり得る。例示的な合成強力プロモーターは、Ｓｃｈｌａｂａｃｈ  ｅｔ  ａｌ．（２０１０）Ｐｒｏｃ  Ｎａｔｌ  Ａｃａｄ  Ｓｃｉ  ＵＳＡ．１０：２５３８−２５４３によって提供される。いくつかの場合では、他のプロモーターが使用される。いくつかの場合では、パッケージング細胞株において活性な任意のプロモーターが使用される。いくつかの場合では、誘導性プロモーター、例えば、薬物誘導性プロモーターが使用される。
【００５７】
いくつかの場合では、本開示のベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ｗＰＲＥ）またはｗＰＲＥと実質的に同一の核酸配列を含み得る。米国特許第６，１３６，５９７号；Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．（２００５）Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．９０：３３−７を参照されたい。縮小したサイズを有するｗＰＲＥエレメントのバリアントは当該技術分野で知られている。ｗＰＲＥ−Ｏは、中間サイズを有するｗＰＲＥのバリアントを指す。
【００５８】
いくつかの場合では、本開示のレンチウイルスベクターは、２Ａペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。用語「２Ａペプチド」は、単一のオープンリーディングフレームから２つ以上のタンパク質を生成するように構成された自己切断ペプチドを指す。２Ａペプチドは、真核細胞において翻訳中のポリペプチドの「切断」を媒介する１８〜２２残基長のウイルス性オリゴペプチドである。「２Ａペプチド」は、様々なアミノ酸配列を有するペプチドを指す場合がある。本開示において、レンチウイルスベクターが２つ以上の２Ａペプチドを含む場合、２Ａペプチドは互いに同一または異なり得ることが理解される。２Ａペプチドの設計及び使用のための詳細な方法論は、Ｓｚｙｍｃｚａｋ−Ｗｏｒｋｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１２）Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂ．  Ｐｒｏｔｏｃ．  ２０１２：１９９−２０４によって提供される。その文献において、２Ａペプチドはしばしば自己切断ペプチドと称されているが、機械学的研究では、観察される「自己切断」は、実際にはリボソームが２ＡペプチドのＣ末端でグリシルプロリルペプチド結合の形成をスキップした結果であることが示されている。Ｄｏｎｎｅｌｌｙ  ｅｔ  ａｌ．  （２００１）Ｊ  Ｇｅｎ  Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−４１。
【００５９】
いくつかの場合では、本開示のレンチウイルスベクターは、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ｗＰＲＥ）またはｗＰＲＥと実質的に同一の核酸配列を含み得る。Ｌｅｅ  ｅｔ  ａｌ．  Ｏｐｔｉｍｉｚｉｎｇ  ｒｅｇｕｌａｔａｂｌｅ  ｇｅｎｅ  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｕｓｉｎｇ  ａｄｅｎｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒｓ．  Ｅｘｐ  Ｐｈｙｓｉｏｌ．  ９０（１）：  ３３−７（２００５）を参照されたい。本開示のウイルスベクターにおいて、ｗＰＲＥ配列は、前記ウイルスベクターによって送達される遺伝子の発現を増加させる。
【００６０】
１．５  融合糖タンパク質
様々な融合糖タンパク質は、レンチウイルスベクターをシュードタイプ化するために使用され得る。最も一般的に使用されている例は、水胞性口炎ウイルスからのエンベロープ糖タンパク質（ＶＳＶＧ）であるが、他の多くのウイルスタンパク質もレンチウイルスベクターのシュードタイプ化に使用されてきた。Ｊｏｇｌｅｋａｒ  ｅｔ  ａｌ．（２０１７）Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ２８：２９１−３０１を参照されたい。本開示は、様々な融合糖タンパク質の置換を企図している。注目すべきことに、いくつかの融合糖タンパク質は、より高いベクター効率をもたらす。
【００６１】
いくつかの実施形態では、融合糖タンパク質またはその機能性バリアントをシュードタイプ化することは、Ｔ細胞またはＮＫ細胞を含むがこれらに限定されない特定の細胞型の標的化された形質導入を促進する。いくつかの実施形態では、融合糖タンパク質またはその機能性バリアントは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）ｇｐ１６０、マウス白血病ウイルス（ＭＬＶ）ｇｐ７０、ギボン猿白血病ウイルス（ＧＡＬＶ）ｇｐ７０、ネコ白血病ウイルス（ＲＤ１１４）ｇｐ７０、両種指向性レトロウイルス（Ａｍｐｈｏ）ｇｐ７０、１０Ａ１  ＭＬＶ（１０Ａ１）ｇｐ７０、エコトロピックレトロウイルス（Ｅｃｏ）ｇｐ７０、ヒヒ猿白血病ウイルス（ＢａＥＶ）ｇｐ７０、麻疹ウイルス（ＭＶ）Ｈ及びＦ、ニパウイルス（ＮｉＶ）Ｈ及びＦ、狂犬病ウイルス（ＲａｂＶ）Ｇ、モコラウイルス（ＭＯＫＶ）Ｇ、エボラザイールウイルス（ＥｂｏＺ）Ｇ、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）ＧＰ１及びＧＰ２、バキュロウイルスＧＰ６４、チクングニアウイルス（ＣＨＩＫＶ）Ｅ１及びＥ２、ロスリバーウイルス（ＲＲＶ）Ｅ１及びＥ２、セムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）Ｅ１及びＥ２、シンドビスウイルス（ＳＶ）Ｅ１及びＥ２、ベネズエラ馬脳炎ウイルス（ＶＥＥＶ）Ｅ１及びＥ２、西部馬脳炎ウイルス（ＷＥＥＶ）Ｅ１及びＥ２、インフルエンザＡ、Ｂ、ＣまたはＤのＨＡ、家禽ペストウイルス（ＦＰＶ）ＨＡ、水胞性口炎ウイルスＶＳＶ−Ｇ、またはチャンディプラウイルス及びピリーウイルスＣＮＶ−Ｇ及びＰＲＶ−Ｇの完全長ポリペプチド（複数可）、機能性フラグメント（複数可）、ホモログ（複数可）、または機能性バリアント（複数可）である。いくつかの場合では、融合糖タンパク質またはその機能性バリアントは、水胞性口炎アラゴアスウイルス（ＶＳＡＶ）、カラジャスベシキュロウイルス（ＣＪＳＶ）、チャンディプラベシキュロウイルス（ＣＨＰＶ）、コカルベシキュロウイルス（ＣＯＣＶ）、水胞性口炎インディアナウイルス（ＶＳＩＶ）、イスファハンベシキュロウイルス（ＩＳＦＶ）、マラバベシキュロウイルス（ＭＡＲＡＶ）、水胞性口炎ニュージャージーウイルス（ＶＳＮＪＶ）、バス・コンゴウイルス（ＢＡＳＶ）のＧタンパク質の完全長ポリペプチド、機能性フラグメント、ホモログ、または機能性バリアントである。いくつかの実施形態では、融合糖タンパク質またはその機能性バリアントは、コカルウイルスＧタンパク質である。
【００６２】
１．６  チェックポイント阻害リガンド
いくつかの場合では、本開示のレンチウイルスベクターは、チェックポイント阻害リガンドをコードする核酸配列をさらに含み得る。任意に、チェックポイント阻害リガンドは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイントを遮断することが可能である。任意に、チェックポイント阻害リガンドは、Ｔｉｍ−３チェックポイントを遮断することが可能である。
【００６３】
チェックポイント阻害剤療法は、免疫チェックポイントを刺激または阻害するための薬剤を使用し、それによって免疫反応を調節するがん治療の形態である。腫瘍は、対象の免疫系からまたはがん免疫療法で使用される治薬剤からそれらを保護するためのチェックポイントを使用し得る。本開示は、チェックポイント阻害リガンドをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターであって、レンチウイルスベクターから生成されたレンチウイルス粒子が、それらの表面にチェックポイント阻害リガンドを提示し、それ故、レンチウイルス粒子の投与が、治療的使用の部位においてチェックポイント阻害リガンドの対象への送達をもたらす、レンチウイルスベクターを提供する。本開示は、チェックポイント阻害リガンドをコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターであって、レンチウイルスベクターから生成されたレンチウイルス粒子の投与が、標的細胞にポリヌクレオチド配列を送達し、次いでその標的細胞が、治療的使用の部位においてチェックポイント阻害リガンドを発現する、レンチウイルスベクターをさらに提供する。
【００６４】
本開示によって提供されるチェックポイント阻害性リガンドの例には、限定されないが、抗ＣＴＬＡ−４抗体、抗ＰＤ−１抗体、及び抗ＰＤ−Ｌ１抗体またはＣＴＬＡ４、ＰＤ−１、もしくはＰＤ−Ｌ１とそれぞれ相互作用する任意の非抗体リガンド（例えば、ナノボディ、ＤＡＲＰｉｎ）が含まれる。いくつかの場合では、チェックポイント阻害リガンドは、ＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１チェックポイント及び／またはＴｉｍ−３チェックポイント及び／またはＣＴＬＡ−４チェックポイントを遮断することが可能である。チェックポイント阻害の使用は、例えば、Ａｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．  Ｔｉｍ−３：  ａｎ  ｅｍｅｒｇｉｎｇ  ｔａｒｇｅｔ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃａｎｃｅｒ  ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒａｐｙ  ｌａｎｄｓｃａｐｅ．  Ｃａｎｃｅｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｒｅｓ．  ２０１４  Ｍａｙ；２（５）：３９３−８で概説されている。
【００６５】
１．５  免疫抑制薬に対する抵抗性
いくつかの場合では、本開示のレンチウイルスベクターは、免疫抑制薬に対する抵抗性を提供する核酸配列を（例えば、トランスファープラスミド上に）さらに含む。免疫抑制薬に対する抵抗性を提供する核酸配列は、いくつかの場合、対象を治療するための方法のいずれか、または本開示によって提供される腫瘍細胞を認識し、殺傷することが可能なＴ細胞の増殖をそれを必要とする対象において行うための方法のいずれかの間に免疫抑制薬が患者に投与された場合に、標的細胞の選択的増殖を促進する。いくつかの場合では、免疫抑制薬は、メトトレキサート、ラパマイシン、ラパログ、タクロリムス、シクロスポリン、またはそれらの任意の組み合わせである。免疫抑制薬は、小分子と同じであり得るか、または異なり得る。すなわち、レンチウイルスベクターは、免疫抑制薬が対象に投与されるときはいつでも形質導入された細胞の増殖が引き起こされるように、小分子で制御可能なＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体が免疫抑制薬によって誘導されるように設計され得る。代替的に、免疫抑制に依存しない形質導入された細胞の増殖の制御を可能にするようにレンチウイルスベクターを設計することが有利な場合があり得る。
【００６６】
いくつかの場合では、レンチウイルスベクターは、免疫抑制薬に対する抵抗性を形質導入された細胞に付与することによって標的細胞の選択的増殖を促進し、標的細胞の選択的増殖を促進する。本開示は、当該技術分野で知られている免疫抑制薬に対する抵抗性を付与する核酸配列のいずれかを含むレンチウイルスベクターを提供する。免疫抑制薬の例には、限定されないが、ラパマイシンまたはその誘導体、ラパログまたはその誘導体、タクロリムスまたはその誘導体、シクロスポリンまたはその誘導体、メトトレキサートまたはその誘導体、及びミコフェノレートモフェチル（ＭＭＦ）またはその誘導体が含まれる。様々な抵抗性遺伝子が当該技術分野で知られている。ラパマイシンに対する抵抗性は、ｍＴＯＲドメインに見られ、かつＦＫＢＰ−ラパマイシン複合体の標的であることが知られているタンパク質ドメインＦＲｂをコードするポリヌクレオチド配列によって付与され得る。タクロリムスに対する抵抗性は、カルシニューリン変異体ＣＮａ２２またはカルシニューリン変異体ＣＮｂ３０をコードするポリヌクレオチド配列によって付与され得る。シクロスポリンに対する抵抗性は、カルシニューリン変異体ＣＮａ１２またはカルシニューリン変異体ＣＮｂ３０をコードするポリヌクレオチド配列によって付与され得る。これらのカルシニューリン変異体は、Ｂｒｅｗｉｎ  ｅｔ  ａｌ．（２００９）Ｂｌｏｏｄ  １１４：４７９２−８０３に記載されている。メトトレキサートに対する抵抗性は、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の様々な変異体形態によって提供され得（Ｖｏｌｐａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．（２０１１）  Ｊ  Ｍｏｌ  Ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ  ２４：１８８−１９８を参照されたい）、ＭＭＦに対する抵抗性は、イノシン一リン酸デヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）の様々な変異体形態によって提供され得る（Ｙａｍ  ｅｔ  ａｌ．（２００６）Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ  １４：２３６−２４４を参照されたい）。
【００６７】
免疫抑制薬は一般的に、ＡＣＴの前、その間、及び／またはその後に使用される。いくつかの場合では、免疫抑制薬の使用は、治療結果を改善し得る。いくつかの場合では、免疫抑制薬の使用は、限定されないが、急性移植片対宿主病、慢性移植片対宿主病、及び移植後リンパ増殖性疾患などの治療の副作用を減弱し得る。本開示は、限定されないが、レンチウイルスベクターが免疫抑制薬に対する抵抗性を形質導入された細胞に付与する本開示の方法が含む、本開示の疾患または病態を治療または予防する方法のいずれかで免疫抑制薬を使用することを企図している。
【００６８】
２．１  パッケージング細胞株
別の態様では、本開示は、Ｔ細胞を活性化し、効率的に形質導入することが可能なレンチウイルス粒子を生成するためのパッケージング細胞株であって、レンチウイルスベクターをパッケージングすることが可能な培養細胞を含み、その培養細胞は、Ｔ細胞活性化または共刺激分子を発現するように遺伝子改変されているか、または一過性トランスフェクションを介してＴ細胞活性化または共刺激分子を一過性に発現するように誘導されている、パッケージング細胞株を提供する。本開示のパッケージング細胞株は、前述されたものを含むがこれらに限定されない任意のレンチウイルスベクターと共に使用され得る。いくつかの場合では、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体をコードする核酸配列を含むレンチウイルスベクターを有するパッケージング細胞株を使用することが有利である。いくつかの場合では、そのＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体は、小分子によって活性化することが可能であることが有利である。しかし、開示されるパッケージング細胞株は、他のレンチウイルスベクターと共に同様に使用され得る。
【００６９】
いくつかの場合では、パッケージング細胞株は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株である。同様の結果は、限定されないが、Ｂ２Ｍまたは他の免疫学的に活性な表面タンパク質を欠損するように改変されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞株を含む他の細胞株で達成され得る。ｉｎ  ｖｉｔｒｏでトランスフェクション可能であり、かつ高力価レンチウイルスベクター生成が可能である他の細胞株（例えば、プロモーターに動作可能に連結されたポリオーマウイルスラージＴ抗原の遺伝子配列を含む細胞株）が使用され得る。
【００７０】
パッケージング細胞株は、いくつかの場合では、ＭＨＣクラスＩの発現、ＭＨＣクラスＩＩの発現、またはＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１リガンド）などの阻害性チェックポイントリガンド、もしくはＴＩＭ３に対するリガンドの発現を欠くように遺伝子修飾され得る。パッケージング細胞株による阻害性リガンドの発現は、レンチウイルス粒子によるＴ細胞の活性化を制限し得るので、これらの遺伝子修飾は、いくつかの場合、そのような阻害性シグナルを除去する機能をし、レンチウイルス粒子によるＴ細胞の活性化及び形質導入をさらに促進する。
【００７１】
いくつかの場合では、パッケージング細胞株は、レンチウイルスベクターをレンチウイルス粒子にパッキングするのに有用な１つ以上の遺伝子を含むように遺伝子改変されている。いくつかの場合では、パッケージング細胞株は、遺伝子ｇａｇ−ｐｏｌ、ｅｎｖ、及びｒｅｖをコードするポリヌクレオチド配列を含み得る。本発明の典型的なレンチウイルスベクターにおいて、ｇａｇ−ｐｏｌ及びｅｎｖタンパク質をコードする領域の１つ以上の少なくとも一部は、レンチウイルスベクターから除去され、パッケージング細胞株によって提供され得る。レンチウイルスベクターは、Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．（１９９８）Ｊ  Ｖｉｒｏｌ  ７２：８４６３−７１（その全体が本明細書に組み込まれる）で提供されている方法に従ってパッケージングされ得る。例示的なパッケージング細胞株は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｕｓｅｓ．  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｕｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  （Ｃｏｆｆｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄｓ）（１９９７）で提供されている。
【００７２】
本開示は、限定されないが、遺伝子の追加、遺伝子の削除、及び遺伝子への点変異の導入を含む他の方法で本開示のレンチウイルスベクター及び粒子の免疫学的特質を改善するためにパッケージング細胞株を遺伝子改変することをさらに提供する。
【００７３】
２．２  Ｔ細胞活性化または共刺激分子
従来、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのレンチウイルス形質導入には、「刺激ビーズ」、例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ−活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８などの外因性活性化剤の添加を必要とする。本開示のパッケージング細胞株を使用して作製されるレンチウイルス粒子は、パッケージング細胞株によって発現されるＴ細胞活性化または共刺激分子の１つ以上のコピーをレンチウイルス粒子に組み込み；レンチウイルス粒子におけるＴ細胞活性化または共刺激分子（複数可）の組み込みにより、レンチウイルス粒子は、外因性活性化剤の非存在下で、すなわち、刺激ビーズも同等の薬剤も用いずに、Ｔ細胞を活性化し、効率的に形質導入することが可能となる。これにより、活性化剤の外因性送達が非実用的であり得る場合、これらのパッケージング細胞株から作製されたレンチウイルス粒子をｉｎ  ｖｉｖｏで使用することが可能となる。
【００７４】
いくつかの場合では、Ｔ細胞活性化または共刺激分子は、抗ＣＤ３抗体、ＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）、及び４１ｂｂリガンド（４１ＢＢＬまたはＣＤ１３７Ｌ）からなる群から選択され得る。様々なＴ細胞活性化または共刺激分子が当該技術分野で知られており、これには、限定されないが、Ｔ細胞発現タンパク質ＣＤ３、ＣＤ２８、ＯＸ４０としても知られるＣＤ１３４、または４−１ＢＢもしくはＣＤ１３７もしくはＴＮＦＲＳＦ９としても知られる４１ｂｂのいずれかに特異的に結合する薬剤が含まれる。例えば、ＣＤ３に特異的に結合する薬剤は、抗ＣＤ３抗体（例えば、ＯＫＴ３、ＣＲＩＳ−７またはＩ２Ｃ）または抗ＣＤ３抗体の抗原結合フラグメントであり得る。いくつかの態様では、ＣＤ３に特異的に結合する薬剤は、抗ＣＤ３抗体の一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）である。いくつかの場合では、本開示は、Ｔ細胞活性化または共刺激分子が、抗ＣＤ３抗体、ＣＤ２８リガンド（ＣＤ２８Ｌ）、及び４１ｂｂリガンド（４１ＢＢＬまたはＣＤ１３７Ｌ）からなる群から選択されることを企図している。Ｂ７−２としても知られるＣＤ８６は、ＣＤ２８及びＣＴＬＡ−４の両方のリガンドである。いくつかの場合では、ＣＤ２８Ｌは、ＣＤ８６であり得る。ＣＤ８０は、ＣＤ２８の追加リガンドである。いくつかの場合では、ＣＤ２８のリガンドは、ＣＤ８０である。いくつかの場合では、ＣＤ２８のリガンドは、レンチウイルス粒子の表面上に提示するための膜貫通ドメインに融合した抗ＣＤ２８抗体または抗ＣＤ２８  ｓｃＦｖである。１つ以上のＴ細胞活性化または共刺激分子を含むレンチウイルス粒子は、ＷＯ２０１６／１３９４６３によって提供されている方法によって作製され得る。
【００７５】
３  レンチウイルス粒子
別の態様では、本開示は、本開示のレンチウイルスベクターのいずれかを含むレンチウイルス粒子をさらに提供する。本開示のレンチウイルス粒子は、本開示のパッケージング細胞株を用いて、もしくは別のパッケージング細胞株を用いて、またはレンチウイルスベクター及びヘルパープラスミドで培養細胞、例えば、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞をコトランスフェクションすることによって作製され得る。本開示のレンチウイルス粒子は、例えば、本開示のレンチウイルスベクターのいずれかを、Ｔ細胞活性化または共刺激分子を発現するように遺伝子改変された培養細胞に形質導入することによって調製され得る。いくつかの場合では、レンチウイルスベクター、選択されたパッケージング細胞株、またはコトランスフェクションされたヘルパープラスミドにより、レンチウイルス粒子は、限定されないが、分子が抗ＣＤ３抗体、ＣＤ２８リガンド、または４１ｂｂリガンドであり得るＴ細胞活性化または共刺激分子を含むことになる。Ｔ細胞活性化または共刺激分子を発現するように遺伝子改変された培養細胞は、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞であり得る。いくつかの場合では、培養細胞は、ＭＨＣクラスＩの発現、ＭＨＣクラスＩＩの発現、またはＰＤ−Ｌ１（ＰＤ−１リガンド）などの阻害性チェックポイントリガンド、もしくはＴＩＭ３に対するリガンドの発現を欠くように遺伝子修飾される。
【００７６】
４  使用方法
別の態様では、本開示は、がんに罹患している対象を治療するための方法であって、本開示の任意のレンチウイルス粒子を対象に投与することと、小分子を対象に投与することとを含み、がんが対象において治療される、方法を提供する。
【００７７】
いくつかの実施形態では、本開示は、治療に使用するための表面改変されたレンチウイルス粒子を提供する。他の実施形態では、本開示は、がんを治療する方法で使用するための表面改変されたレンチウイルス粒子を提供する。さらなる実施形態では、本開示は、がんを治療するための薬剤の製造において使用するための表面改変されたレンチウイルス粒子を提供する。
【００７８】
いくつかの場合では、がんは、黒色腫、非小細胞肺癌、または乳癌などの固形腫瘍であり得る。本開示の方法は、限定されないが、急性顆粒球性白血病、急性リンパ性白血病、急性骨髄性白血病、腺癌、腺肉腫、副腎癌、副腎皮質癌、肛門癌、未分化星細胞腫、血管肉腫、虫垂癌、星細胞腫、基底細胞癌、Ｂ細胞リンパ腫、胆管癌、膀胱癌、骨癌、骨髄癌、腸癌、脳癌、脳幹グリオーマ、脳腫瘍、乳癌、カルチノイド腫瘍、子宮頸癌、胆管癌、軟骨肉腫、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、結腸癌、大腸癌、頭蓋咽頭腫、皮膚リンパ腫、皮膚黒色腫、びまん性星細胞腫、上皮内腺管癌、子宮内膜癌、上衣腫、類上皮肉腫、食道癌、ユーイング肉腫、肝外胆管癌、眼癌、卵管癌、線維肉腫、胆嚢癌、胃癌、消化管癌、消化管カルチノイド癌、消化管間質腫瘍、一般、生殖細胞腫瘍、妊娠性絨毛性疾患、多形性膠芽腫、神経膠腫、有毛細胞白血病、頭頸部癌、血管内皮腫、ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、ホジキン病、下咽頭癌、浸潤性腺管癌、浸潤性小葉癌、炎症性乳癌、腸癌、肝内胆管癌、侵襲性／浸潤性乳癌、島細胞癌、顎癌、カポシ肉腫、腎臓癌、喉頭癌、平滑筋肉腫、軟膜転移、白血病、口唇癌、脂肪肉腫、肝臓癌、上皮内小葉癌、低悪性度星細胞腫、肺癌、リンパ節癌、リンパ腫、男性乳癌、髄様癌、髄芽腫、黒色腫、髄膜腫、メルケル細胞癌、間葉性軟骨肉腫、間葉性（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍｏｕｓ）、中皮腫、転移性乳癌、転移性黒色腫、転移性扁平頚部癌、混合性神経膠腫、口腔癌、粘液性癌、粘膜黒色腫、多発性骨髄腫、菌状息肉症、骨髄異形成症候群、鼻腔癌、鼻咽頭癌、頸部癌、神経芽腫、神経内分泌腫瘍、非ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、非小細胞肺癌、燕麦細胞癌、眼癌、眼黒色腫、乏突起膠腫、口癌、口腔癌、口腔咽頭癌、骨原性肉腫、骨肉腫、卵巣癌、卵巣上皮癌、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣原発性腹膜癌、卵巣性索間質腫瘍、パジェット病、膵臓癌、乳頭癌、副鼻腔癌、副甲状腺癌、骨盤癌、陰茎癌、末梢神経癌、腹膜癌、咽頭癌、褐色細胞腫、毛様細胞性星細胞腫、松果体部腫瘍、松果体芽細胞腫、下垂体腫瘍、原発性中枢神経系、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌、腎骨盤癌、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫、肉腫、骨、肉腫、軟部組織、肉腫、子宮、副鼻腔癌、皮膚癌、小細胞肺癌、小腸癌、軟部組織肉腫、脊椎癌、脊柱癌、脊髄癌、脊椎腫瘍、扁平上皮癌、胃癌、滑膜肉腫、Ｔ細胞リンパ腫、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫／胸腺癌、甲状腺癌、舌癌、扁桃腺癌、移行細胞癌、移行細胞癌、移行細胞癌、トリプルネガティブ乳癌、卵管癌、管状癌、未診断癌、尿管癌、尿管癌、尿道癌、子宮腺癌、子宮癌、子宮肉腫、腟癌、外陰癌を含む任意のがんを治療することを含み得る。
【００７９】
別の態様では、本開示は、腫瘍細胞を認識し、殺傷することが可能なＴ細胞の増殖を、それを必要とする対象において行うための方法であって、対象において腫瘍細胞を認識し、殺傷することが可能なＴ細胞が、レンチウイルス粒子によって形質導入され、増殖するように、本開示のレンチウイルス粒子を対象に投与する工程を含む、方法を提供する。いくつかの実施形態では、レンチウイルス粒子は、静脈内注射によってまたは腫瘍内注射によって投与される。
【００８０】
いくつかの場合では、レンチウイルス粒子は標的化因子を含むか、または核酸ベクターが標的化因子をコードする。例示的な標的化因子は、抗体及びキメラ抗原受容体（「ＣＡＲ」）を含む。用語「抗体」は、任意の種類の無傷の抗原結合免疫グロブリン、またはそれ自体が抗体の標的抗原に特異的に結合するそのフラグメントを指し、例えば、キメラ、ヒト化、完全ヒト、及び二重特異的抗体を含む。本開示で使用されるＣＡＲは、いくつかの場合では、Ｂ細胞に特異的な、例えば、ＣＤ１９、ＣＤ２２、ＣＤ２０またはＣＤ７９ａ（ＣＤ１９が好ましい）などの、Ｂ細胞リンパ腫に見られ得るＣＤマーカーに特異的な結合ドメインを含む。ＣＡＲを発現するように遺伝子改変されたＴ細胞（例えば、Ｔ細胞ＣＡＲ）は、ＷＯ２００７／１３１０９２に例示されている。標的化因子は、いくつかの場合では、腫瘍細胞などの他の特定の細胞型に対して細胞媒介免疫を誘導する機能をする。
【００８１】
別の態様では、本開示は、腫瘍細胞を認識し、殺傷することが可能なＴ細胞の増殖を、それを必要とする対象において行うための方法であって、本開示の任意のレンチウイルス粒子を対象に投与することと、小分子を対象に投与することとを含み、対象において腫瘍細胞を認識し、殺傷することが可能なＴ細胞が増殖される、方法を提供する。
【００８２】
所定の実施形態では、本明細書に記載の方法によって治療される対象は、哺乳動物であり得る。いくつかの場合では、対象は、ヒト、非ヒト霊長類、ブタ、ウマ、ウシ、イヌ、ネコ、ウサギ、マウスまたはラットである。対象は、ヒトの女性もしくはヒトの男性であり得る。
【００８３】
併用療法もまた、本発明によって企図される。本明細書で使用されるような併用は、同時治療または逐次治療を含む。本発明の方法と標準的な医学的治療（例えば、コルチコステロイド）との併用は、新規な療法との併用と同様に、特に企図される。いくつかの場合では、対象は、本明細書に記載のレンチウイルス粒子の投与に対する免疫反応を防止または低減するために、ステロイド（例えば、プレドニゾン、プレドニゾロン、デフラザコート）で治療され得る。所定の場合では、対象が本明細書に記載のレンチウイルス粒子に対する抗体を発現している場合、対象は、アフェレシスまたは別の免疫調節剤を受けてもよい。いくつかの場合では、特に免疫抑制剤（例えば、タクロリムスまたはシロリムス）が投与される場合、そのような免疫調節剤は不要であり得る。いくつかの場合では、リツキサンは、レンチウイルス粒子を用いた治療と同時にまたは逐次投与される。リツキサンは、いくつかの場合、レンチウイルス粒子に対する免疫反応を遮断する機能を有し得る。
【００８４】
本開示のレンチウイルス粒子、小分子、及び免疫抑制薬は、経口、経鼻、静脈内、動脈内、筋肉内、または腹腔内経路を含む任意の経路によって投与され得る。いくつかの場合では、レンチウイルス粒子は、静脈内注射によってまたは腫瘍内注射によって投与される。いくつかの場合では、小分子は、静脈内注射によって投与されるか、または経口投与される。いくつかの場合では、小分子は、Ｔ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体を活性化するのに十分な濃度で投与される。いくつかの場合では、小分子は、０．１ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭを超えるラパマイシンの血清濃度を維持するのに十分な濃度で任意に投与されるラパマイシンである。いくつかの場合では、小分子は、０．１ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭを超えるラパログの血清濃度を維持するのに十分な濃度で任意に投与されるラパログである。いくつかの場合では、小分子は、細胞活性化シグナルをもたらすＴ細胞／ＮＫ細胞活性化受容体の二量体化を引き起こすことが可能である。
【００８５】
いくつかの場合では、小分子は、レンチウイルス粒子と同時に投与されるか、または小分子は、レンチウイルス粒子が投与される約３０分前または後、約１時間前または後、約２時間前または後、約４時間前または後、約５時間前または後、または約１０時間前または後に投与される。いくつかの場合では、方法は、免疫抑制剤を対象に投与することをさらに含む。いくつかの場合では、免疫抑制剤は、０．１ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭを超えるタクロリムスの血清濃度を維持するのに十分な濃度で任意に投与されるタクロリムスである。いくつかの場合では、免疫抑制剤は、０．１ｎＭ、１ｎＭ、または１０ｎＭを超えるシクロスポリンの血清濃度を維持するのに十分な濃度で任意に投与されるシクロスポリンである。いくつかの場合では、免疫抑制剤は、免疫抑制薬である。いくつかの場合では、免疫抑制剤は、免疫抑制薬であり、レンチウイルスベクターは、前記免疫抑制薬に対する抵抗性を提供するタンパク質をコードする核酸配列を含む。
【００８６】
注射用の使用に好適な薬学的形態には、無菌水溶液または分散体及び無菌注射用溶液または分散体の即席調製のための無菌粉末が含まれる。すべての場合において、その形態は、無菌でなければならず、容易な注射可能性が存在する程度に流動的でなければならない。それは製造及び保存の条件で安定でなければならず、細菌及び真菌などの微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、それらの好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒または分散媒体であり得る。適切な流動性は、例えば、レシチンなどのコーティングの使用によって、分散体の場合には必要とされる粒子サイズの維持によって、及び界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の防止は、様々な抗細菌及び抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによってもたらされ得る。多くの場合において、等張化剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの使用によってもたらされ得る。
【００８７】
無菌注射用溶液は、必要に応じて、上記で列挙した様々な他の成分を有する適切な溶媒中に必要量のｒＡＡＶを組み込むことによって調製される。注射用溶液は、無菌で調製され得るか、または濾過滅菌され得る。
【００８８】
５  定義
別段定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術的及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。本発明の目的のため、以下の用語を以下に定義する。
【００８９】
本明細書で使用される場合、「２９３Ｔ対照粒子」または「モック（２９３Ｔベクター）」は、２９３Ｔ細胞をレンチウイルスベクターで形質導入することによって生成されたレンチウイルス粒子を指す。本明細書で使用される場合、「刺激ビーズ（ｓｔｉｍｂｅａｄ）」は、形質導入中にＴ細胞を刺激するために使用されるビーズベースの試薬を指す。ラベル「＋対照（ベクター＋刺激ビーズ）」は、刺激ビーズを用いた２９３Ｔ対照粒子での形質導入を指す。
【００９０】
本明細書で使用される場合、用語「ＨＡＴＳＥ細胞」または「ＨＡＴＳＥ細胞株」または「ＨＡＴＳＥ−２９３」は、２９３Ｔ細胞をＣＤ８６及びＣＤ１３７Ｌをコードするレンチウイルスベクター（複数可）で形質導入することによって作成され、ＣＤ８６及びＣＤ１３７Ｌの両方を高度に発現した細胞のために蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）に１回以上供されたパッケージング細胞株を指す。ラベル「（１回ソーティングされた）ＨＡＴＳＥ細胞ベクター」は、ＨＡＴＳＥ細胞をＣＤ８６＋／ＣＤ１７３Ｌ＋二重陽性細胞について１回ＦＡＣＳソーティングした後、レンチウイルスベクターでＨＡＴＳＥ細胞を形質導入することによって生成されたレンチウイルス粒子を指す。ラベル「（２回ソーティングされた）ＨＡＴＳＥ細胞ベクター」は、ＨＡＴＳＥ細胞をＣＤ８６＋／ＣＤ１７３Ｌ＋二重陽性細胞について１回ＦＡＣＳソーティングした後、レンチウイルスベクターでＨＡＴＳＥ細胞を形質導入することによって生成されたレンチウイルス粒子を指す。
【００９１】
冠詞「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、冠詞の文法的目的語の１つまたは複数（すなわち、少なくとも１つ）を指すために本明細書で使用される。例として、「要素（ａｎ  ｅｌｅｍｅｎｔ）」は、１つの要素または複数の要素を意味する。
【００９２】
代替手段（例えば、「または」）の使用は、代替手段の一方、両方、またはそれらの任意の組み合わせのいずれかを意味すると理解されるべきである。
【００９３】
用語「及び／または」は、代替手段の一方、または両方のいずれかを意味すると理解されるべきである。
【００９４】
本明細書で使用される場合、用語「約」または「およそ」は、参照量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量または長さに対して１５％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％または１％と同じ程度に変化する量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量または長さを指す。一実施形態では、用語「約」または「およそ」は、参照量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量または長さについて±１５％、±１０％、±９％、±８％、±７％、±６％、±５％、±４％、±３％、±２％、または±１％の量、レベル、値、数、頻度、割合、寸法、サイズ、量、重量または長さの範囲を指す。
【００９５】
濃度範囲、割合範囲、比の範囲、または整数範囲は、別段示されない限り、記述された範囲内の任意の整数の値、及び適切な場合には、その分数（整数の１０分の１及び１００分の１など）を含むものと理解されたい。用語「約」は、数または数字の直前にある場合、その数または数字がプラスまたはマイナス１０％の範囲であることを意味する。
【００９６】
本明細書を通して、文脈が別段必要としない限り、単語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記述された工程もしくは要素または工程もしくは要素の群を含むことを意味するが、任意の他の工程もしくは要素または工程もしくは要素の群を除外することを意味しないと理解される。特定の実施形態では、用語「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「有する」、「含有する」、及び「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」は同義的に使用される。
【００９７】
「からなる」は、語句「からなる」に続くものは何でも含むことを意味し、それに限定される。よって、語句「からなる」は、列挙された要素が必要とされるか、または必須であり、他の要素が存在しない場合があることを示す。
【００９８】
「から本質的になる」は、その語句の後に列挙された任意の要素を含むことを意味し、列挙された要素について本開示で特定された活性または作用と干渉せず、それに寄与もしない他の要素に限定される。
【００９９】
本明細書を通して「一実施形態」、「実施形態」、「特定の実施形態」、「関連する実施形態」、「所定の実施形態」、「追加の実施形態」、もしくは「さらなる実施形態」またはそれらの組み合わせに対する言及は、実施形態に関連して記載された特定の特徴、構造、または特性が、本発明の少なくとも１つの実施形態に含まれることを意味する。よって、本明細書を通して様々な場所での前述の語句の出現は、必ずしもすべてが同じ実施形態を指しているわけではない。さらに、特定の特徴、構造、または特性は、１つ以上の実施形態において、任意の好適な手法で組み合わされ得る。
【０１００】
本明細書で使用される場合、用語「単離された」は、その本来の状態で通常それに付随する成分を実質的にまたは本質的に含まない物質を意味する。特定の実施形態では、用語「得られた」または「誘導された」は、単離されたと同義的に使用される。
【０１０１】
「対象」、「患者」または「個体」は、本明細書で使用される場合、本明細書で企図されるベクター、組成物、及び方法を用いて治療され得る疼痛を示す任意の動物を含む。好適な対象（例えば、患者）には、実験動物（マウス、ラット、ウサギ、またはモルモットなど）、農場動物、及び家畜またはペット（ネコまたはイヌなど）が含まれる。非ヒト霊長類及び、好ましくは、ヒト患者が含まれる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、「治療」または「治療すること」には、治療に関連する任意の有益なまたは望ましい効果が含まれる。「治療」は、疾患もしくは病態、またはそれに関連する症状の完全な根絶または治癒を必ずしも示すものではない。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、「予防する」及び「予防された」、「予防すること」などの同様の単語は、障害の発生または再発の可能性を予防、阻害、または減少させるためのアプローチを示す。本明細書で使用される場合、「予防」及び同様の単語はまた、発症または再発前の疾患または障害の強度、作用、症状及び／または負担を減少させることを含む。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、ウイルスまたはレンチウイルス粒子の「治療的有効量」または「有効な量」または「有効量」は、臨床結果を含む、有益なまたは所望の予防的または治療的結果を達成するために必要とされるウイルスまたはレンチウイルス粒子の量を指す。
【０１０５】
「予防的有効量」は、所望の予防的結果を達成するために有効なウイルスまたはレンチウイルス粒子の量を指す。典型的には、しかし必ずしもそうではないが、予防的用量は、疾患の前またはより早い段階の対象において使用されるので、予防的有効量は、治療的有効量よりも少ない。
【０１０６】
ウイルスまたはレンチウイルス粒子の「治療的有効量」は、疾患病態、個体の年齢、性別、及び体重、ならびに個体における所望の反応を誘発させるための幹細胞及び前駆細胞の能力などの要因に応じて変化し得る。治療的有効量はまた、治療的に有益な効果がウイルスの任意の毒性または有害な効果を上回るものである。用語「治療的有効量」は、対象（例えば、患者）を「治療する」のに有効な量を含む。
【０１０７】
生理学的反応、例えば、電気生理学的活性または細胞活性の「増加した」または「向上した」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、未処置対象における活性のレベルの１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上（例えば、５００、１０００倍）（それらの間で１を超えるすべての整数及び小数点を含む、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）の増加を含み得る。
【０１０８】
生理学的反応、例えば、電気生理学的活性または細胞活性の「低下」または「減少した」量は、典型的には、「統計的に有意な」量であり、未処置対象における活性のレベルの１．１、１．２、１．５、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、３０倍以上（例えば、５００、１０００倍）（それらの間で１を超えるすべての整数及び小数点を含む、例えば、１．５、１．６、１．７、１．８など）の低下を含み得る。
【０１０９】
「維持する」、または「保存する」、または「維持」、または「変化なし」、または「実質的に変化なし」、または「実質的に低下なし」は一般に、ビヒクル、または対照分子／組成物のいずれかによって引き起こされる反応に匹敵する生理学的反応を指す。匹敵する反応は、参照反応と有意に異なっておらず、測定可能に異なってもいないものである。
【０１１０】
「受容体−リガンド結合」、「リガンド結合」、及び「結合」は、受容体とリガンドまたは合成リガンドとの間の物理的相互作用を意味するために互換的に本明細書で使用される。リガンド結合は、当該技術分野で知られている様々な方法（例えば、放射性標識されたリガンドとの関連性の検出）によって測定され得る。
【０１１１】
本明細書で使用される場合、用語「特異的結合親和性」または「特異的に結合する」または「特異的に結合した」または「特異的結合」は、本明細書及び特許請求の範囲を通して互換的に使用され、対になった分子種、例えば、受容体とリガンドの間で生じる結合を指す。２つの種の相互作用が非共有結合で結合した複合体を生成する場合、生じる結合は典型的には、静電的、水素結合、または親油性相互作用の結果である。様々な実施形態では、１つ以上の種間の特異的結合は、直接的である。一実施形態では、特異的結合の親和性は、バックグラウンド結合（非特異的結合）の約２倍を超え、バックグラウンド結合の約５倍を超え、バックグラウンド結合の約１０倍を超え、バックグラウンド結合の約２０倍を超え、バックグラウンド結合の約５０倍を超え、バックグラウンド結合の約１００倍を超え、もしくはバックグラウンド結合の約１０００倍を超え、またはそれ以上である。
【０１１２】
一般に、「配列同一性」または「配列相同性」は、２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列のそれぞれのヌクレオチド対ヌクレオチドまたはアミノ酸対アミノ酸の正確な対応を指す。典型的には、配列同一性を決定するための技術は、ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列を決定すること、及び／またはそれによってコードされるアミノ酸配列を決定すること、及びこれらの配列を第２のヌクレオチドまたはアミノ酸配列と比較することを含む。２つ以上の配列（ポリヌクレオチドまたはアミノ酸）は、それらの「同一率」を決定することによって比較され得る。２つの配列の同一率は、核酸配列であるかアミノ酸配列であるかにかかわらず、２つの整列した配列間の完全一致の数を短い方の配列の長さで除算し、１００で乗算したものである。同一率はまた、例えば、国立衛生研究所から入手可能なバージョン２．２．９を含む高度なＢＬＡＳＴコンピュータプログラムを使用して配列情報を比較することによって決定され得る。ＢＬＡＳＴプログラムは、Ｋａｒｌｉｎ  ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ８７：２２６４−２２６８（１９９０）のアライメント方法に基づき、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．  Ｂｉｏｌ．  ２１５：４０３−４１０（１９９０）；Ｋａｒｌｉｎ  Ａｎｄ  Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．  Ｎａｔｌ．  Ａｃａｄ．  Ｓｃｉ．  ＵＳＡ  ９０：５８７３−５８７７（１９９３）；及びＡｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）で論述されている。簡潔には、ＢＬＡＳＴプログラムは、同一の整列された記号（通常はヌクレオチドまたはアミノ酸）の数を２つの配列のうちの短いほうの記号の総数で除算したものとして同一性を定義する。そのプログラムは、比較されているタンパク質の全長にわたって同一率を決定するために使用され得る。短いクエリー配列、例えば、ｂｌａｓｔｐプログラムで検索を最適化するためにデフォルトパラメータが提供される。そのプログラムはまた、Ｗｏｏｔｔｏｎ  ａｎｄ  Ｆｅｄｅｒｈｅｎ，Ｃｏｍｐｕｔｅｒｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  １７：１４９−１６３（１９９３）のＳＥＧプログラムによって決定されるクエリー配列のセグメントをマスクオフするためにＳＥＧフィルターの使用を可能にする。配列同一性の所望の程度の範囲は、およそ８０％〜１００％、及びこれらの間の整数値である。典型的には、開示される配列と、特許請求される配列との間の同一率は、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％である。
【０１１３】
用語「外因性」は、生命体外に由来する核酸、タンパク質またはペプチド、小分子化合物などを含む任意の分子を指すために本明細書で使用される。対照的に、用語「内因性」は、生命体内に由来する（すなわち、生命体によって自然に生成される）任意の分子を指す。
【０１１４】
用語「ＭＯＩ」は、感染標的（例えば、細胞）に対する薬剤（例えば、ウイルス粒子）の比である感染多重度を指すために本明細書で使用される。
【０１１５】
本明細書で挙げられたすべての刊行物及び特許は、各々の個々の刊行物または特許が参照により組み込まれることが具体的かつ個々に示されているかのようにそれらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。矛盾する場合は、本明細書の任意の定義を含む本出願が優先する。しかしながら、本明細書で引用された任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、及び特許出願の言及は、それらが有効な先行技術を構成するか、または世界の任意の国における一般的知識の一部を形成するという認識、または示唆の任意の形態ではなく、そのように受け取られるべきではない。
【０１１６】
本明細書で使用された項の見出しは、組織的な目的のためのものにすぎず、記載された主題を限定するものとして解釈されるものではない。
【０１１７】
本発明を以下の実施例においてさらに説明するが、これは特許請求の範囲に記載された発明の範囲を限定しない。
【実施例】
【０１１８】
実施例１：ＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株
Ｔ細胞を活性化し、効率的に形質導入することが可能なレンチウイルス粒子を生成するためのパッケージング細胞株（ＨＡＴＳＥ−２９３と称される）を以下のように生成した。ＭＮＤプロモーターならびにモノクローナル抗体ＯＫＴ３の抗ＣＤ３一本鎖Ｆｖフラグメント（ｓｃＦｖ）；ＣＤ８６；及びＣＤ１３７Ｌをコードする２Ａペプチドが連結された多シストロン性オープンリーディングフレーム（抗ＣＤ３  ｓｃＦＶ−２Ａ−ＣＤ８６−２Ａ−ＣＤ１３７Ｌ）を含むレンチウイルスベクターを構築した。レンチウイルスベクターを細胞培養で成長したＨＥＫ−２９３Ｔ細胞に形質導入した結果、ＭＮＤプロモーター及び多シストロン性オープンリーディングフレームが宿主細胞のゲノムに安定に統合した。形質導入されたＨＥＫ−２９３Ｔ細胞を、ＣＤ８６及びＣＤ１３７Ｌの両方を高度に発現した細胞のための蛍光活性化セルソーティング（ＦＡＣＳ）に供した（図２）。多シストロン性オープンリーディングフレームの構造により、ＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋細胞はまた、抗ＣＤ３  ｓｃＦｖ＋を必然的に発現する。ＣＤ８６＋／ＣＤ１３７Ｌ＋細胞集団を培養して増殖させて、ＨＡＴＳＥ−２９３パッケージング細胞株を生成し、アリコートを長期保存及び使用のために凍結した。ＣＤ８６及びＣＤ１３７の発現をフローサイトメトリーによって確認した（図３）。
【０１１９】
ＨＡＴＳＥ−２９３細胞にｐＭＮＤ−ＧＦＰレンチウイルスベクター及び４つのレンチウイルスパッケージングプラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＲＳＶ−ｒｅｖ、ｐＭＤＬＧ−ｐＲＲＥ、及びｐＲＲＬ−ＧＯＩ）をコトランスフェクションし、ウイルス粒子を細胞上清から採取してレンチウイルス粒子（ＨＡＴＳＥ粒子と称される）を生成した。対照として、ＨＥＫ−２９３Ｔ細胞にｐＭＮＤ−ＧＦＰレンチウイルスベクター及び４つのレンチウイルスパッケージングプラスミド（ｐＭＤ２．Ｇ、ｐＲＳＶ−ｒｅｖ、ｐＭＤＬＧ−ｐＲＲＥ、及びｐＲＲＬ−ＧＯＩ）をコトランスフェクションし、ウイルス粒子を細胞上清から採取してレンチウイルス粒子（２９３Ｔ対照粒子）を生成した。
【０１２０】
ヒト初代Ｔ細胞（２．５×１０５細胞）を外因性Ｔ細胞活性化刺激剤（Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（商標）ヒトＴ−活性化因子ＣＤ３／ＣＤ２８−「刺激ビーズ」）の存在下または非存在下で、ＭＯＩ５またはＭＯＩ２０で、ＨＡＴＳＥ粒子または２９３Ｔ粒子のいずれかに二連で曝露した。細胞の成長を自動化細胞カウンター（Ｃｏｕｎｔｅｓｓ（商標）ＩＩ、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）によって７日間にわたって評価した（図３）。ＨＡＴＳＥ粒子に曝露した細胞の成長は、対照粒子で形質導入されたビーズ刺激Ｔ細胞と同様であり、２９３Ｔ対照粒子よりも７日目でおよそ２倍大きかった。ＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡によって評価した（図４）。ＨＡＴＳＥ粒子に曝露された細胞は噴出を示し、対照粒子で形質導入されたビーズ刺激Ｔ細胞と同様の高いＧＦＰ発現を示し、このことは、異種Ｔ細胞活性化刺激（すなわち、刺激ビーズ）への曝露の欠如にもかかわらず、ＨＡＴＳＥ粒子に曝露されたＴ細胞の効率的な形質導入を確認している。
【０１２１】
実施例２：レンチ−ＲＡＣＣＲ
レンチ−ＲＡＣＣＲは、ラパマイシン活性化キメラ細胞表面受容体（ＲＡＣＣＲ）をコードする導入遺伝子を含有するレンチウイルスベクターである。具体的には、この例示的なＲＡＣＣＲは、ラパマイシンの存在下で二量体化し、それによってシグナル伝達を活性化するように設計された２つの融合タンパク質から作製される（図１２Ａ）。第１の融合タンパク質は、ＦＫＢＰが融合タンパク質の細胞外ドメインを形成するように、ＩＬ−２受容体ベータ鎖（ＩＬ２Ｒｂ）の細胞質ドメインをＦＫ５０６結合タンパク質（ＦＫＢＰ）に融合させた結果物である。第２の融合タンパク質は、ＦＲＢが融合タンパク質の細胞外ドメインを形成するように、ＩＬ−２受容体ガンマ鎖（ＩＬ２Ｒｇ）の細胞質ドメインをラパマイシンの哺乳類標的（ｍＴＯＲ）のＦＫＢＰ−ラパマイシン結合（ＦＲＢ）ドメインに融合した結果物である。細胞外ドメインは、ラパマイシンの存在下で三量体複合体を形成し、その結果、受容体サブユニットが二量体化して、能動的にシグナル伝達する受容体複合体を形成することが知られている。
【０１２２】
２Ａペプチド（イタリック体）を有し、シグナルペプチド（括弧内）を有するＲＡＣＣＲ−ベータ−ＦＫＢＰ−ＩＬ２Ｒｂ融合タンパク質：
【化１】
2021520853.tif 000002
（配列番号１２）。
【０１２３】
ＦＫＢＰドメインは、以下の配列を有する：
【化２】
2021520853.tif 000003
（配列番号１３）。
【０１２４】
ＩＬ２Ｒｂドメインは、以下の配列を有する：
【化３】
2021520853.tif 000004
（配列番号１４）。
【０１２５】
２Ａペプチド（イタリック体）を有し、シグナルペプチド（括弧内）を有するＲＡＣＣＲ−ガンマ−ＦＲＢ−ＩＬ２Ｒｇ融合タンパク質
【化４】
2021520853.tif 000005
（配列番号１５）。
【０１２６】
ＦＲＢドメインは、以下の配列を有する：
【化５】
2021520853.tif 000006
（配列番号１６）。
【０１２７】
ＩＬ２Ｒｇドメインは、以下の配列を有する：
【化６】
2021520853.tif 000007
（配列番号１７）。
【０１２８】
緑色蛍光タンパク質をコードするレンチウイルストランスファープラスミドは、標準的なパッケージングプラスミドｐＭＤ２．Ｇを使用してレンチウイルス粒子にパッケージングされ、得られたレンチウイルス粒子は、対照実験としてヒト初代Ｔ細胞を形質導入するために使用される。低レベルの形質導入のみが観察される（図１２Ｂ）。
【０１２９】
ｍＣｈｅｒｒｙをコードするレンチウイルストランスファープラスミドは、Ｔ細胞活性化及び共刺激分子をコードするプラスミドを使用してレンチウイルス粒子にパッケージングされ、それによって表面改変されたレンチウイルス粒子（ＳＥ−ＬＶＰ）を生成する。得られたレンチウイルス粒子（ｍＣｈｅｒｒｙ：ＳＥ−ＬＶＰ）は、対照実験としてヒト初代Ｔ細胞を形質導入するために使用される。高レベルの形質導入が観察される（図１２Ｃ）。
【０１３０】
ＲＡＣＣＲをコードするレンチウイルストランスファープラスミドは、Ｔ細胞活性化及び共刺激分子をコードするプラスミドを使用してレンチウイルス粒子にパッケージングされ、それによって表面改変されたレンチウイルス粒子（ＳＥ−ＬＶＰ）を生成する。得られたレンチウイルス粒子（ＲＡＣＣＲ：ＳＥ−ＬＶＰ）は、ヒト初代Ｔ細胞を形質導入するために使用される。高レベルの形質導入が観察される（図１２Ｄ）。
【０１３１】
ｍＣｈｅｒｒｙ：ＳＥ−ＬＶＰまたはＲＡＣＣＲ：ＳＥ−ＬＶＰで形質導入されたヒト初代Ｔ細胞をＩＬ−２（「ＩＬ２」）、ラパマイシン（「ラパ」）、または無処置（「ＮＴ」）の存在下で培養する。対照として、標準的なパッケージングプラスミドｐＭＤ２．Ｇを使用してパッケージングされたｍＣｈｅｒｒｙコンストラクトもＩＬ−２で試験する。ＲＡＣＣＲ：ＳＥ−ＬＶＰは、ラパマイシンの存在下で、しかし外因性ＩＬ−２を用いずに、１８日間にわたってＴ細胞の持続的増殖を媒介する（図１２Ｅ）。Ｔ細胞の増殖は、ラパマイシンまたはＩＬ−２の存在に依存する（図１２Ｆ）。これは、表面改変粒子が成長刺激受容体ペイロードを送達し、初代ヒトＴ細胞を増殖させ得るという概念のｉｎ  ｖｉｔｒｏでの証拠を構成する。形質導入のためにレンチウイルス粒子のスピノキュレーションまたは他の操作は必要とされない。１０の感染多重度（ＭＯＩ）での細胞の形質導入は、およそ２０％の形質導入効率を提供した。
【０１３２】
当業者は、慣用の実験を超えるものを使用せずに、本明細書に記載の本発明の特定の実施形態と均等の多くのものを認識し、確認することが可能である。そのような均等物は、以下の特許請求の範囲によって包含されることが意図されている。
【図１】
2021520853.tif 000008
【図２】
2021520853.tif 000009
【図３Ａ】
2021520853.tif 000010
【図３Ｂ】
2021520853.tif 000011
【図３Ｃ】
2021520853.tif 000012
【図３Ｄ】
2021520853.tif 000013
【図３Ｅ】
2021520853.tif 000014
【図３Ｆ】
2021520853.tif 000015
【図３Ｇ】
2021520853.tif 000016
【図３Ｈ】
2021520853.tif 000017
【図３Ｉ】
2021520853.tif 000018
【図３Ｊ】
2021520853.tif 000019
【図３Ｋ】
2021520853.tif 000020
【図４】
2021520853.tif 000021
【図５】
2021520853.tif 000022
【図６】
2021520853.tif 000023
【図７】
2021520853.tif 000024
【図８】
2021520853.tif 000025
【図９】
2021520853.tif 000026
【図１０】
2021520853.tif 000027
【図１１】
2021520853.tif 000028
【図１２Ａ】
2021520853.tif 000029
【図１２Ｂ】
2021520853.tif 000030
【図１２Ｃ】
2021520853.tif 000031
【図１２Ｄ】
2021520853.tif 000032
【図１２Ｅ】
2021520853.tif 000033
【図１２Ｆ】
2021520853.tif 000034
【配列表】
2021520853000001.app
【国際調査報告】
2021520853.tif 000035
2021520853.tif 000036
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