(57)【要約】  ＲＸＲαタンパク質を安定して低発現するＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株が提供される。この細胞株はＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株であり、ノックアウトされた塩基の数は３の整数倍ではなく、細胞内のＲＸＲαタンパク質の発現が有意に低下し、かつ遺伝子型が安定して継代可能である。この細胞株の製造方法が提供される。ＲＸＲα遺伝子配列情報に基づいてＣＲＩＳＰＲノックアウトｇＲＮＡ配列を設計し、ｇＲＮＡ発現ベクターを構築し、インビトロ細胞レベルでｇＲＮＡ切断活性を測定し、その後、ヌクレオフェクションの方法により、ｃａｓ９とｇＲＮＡ発現ベクターをヒト神経芽細胞腫の不死化細胞であるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞にコトランスフェクションし、Ｇ４１８試薬でスクリーニングして安定した細胞クローンを得、ＰＣＲ及び遺伝子シーケンシングによりＲＸＲα遺伝子の３の整数倍ではない塩基が欠失した遺伝子ノックアウト細胞クローンであることを同定し、ＲＸＲαタンパク質を安定して低発現するＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株を得る。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＲＸＲαタンパク質を安定して低発現するＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株であって、
前記細胞株は、ヒト神経芽細胞腫から採取した不死化細胞であるＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞に対して、ＣＲＩＳＰＲ  ＤＥＳＩＧＮソフトウェアによりノックアウト標的部位を設計し、遺伝子ノックアウトして得られた細胞クローンであり、
遺伝子のノックアウト標的部位はＲＸＲα遺伝子の第４エキソンの第１−１８０塩基であることを特徴とする、ＲＸＲαタンパク質を安定して低発現するＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株。
【請求項２】
前記細胞株は、それぞれＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃（又はＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−３５＃）及びＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−１５＃であり、
ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃（又はＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−３５＃）は、ＲＸＲα対立遺伝子ノックアウトホモ接合体であり、ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−１５＃は、ＲＸＲα遺伝子ダブルノックアウト細胞株であり、それぞれ第６１−１２２（６２ｂｐ）及び第６１−１２２（６２ｂｐ）、６１−７０（１０ｂｐ）、１１４−１４１（２８ｂｐ）塩基が欠失し、ノックアウトされた配列はそれぞれ配列番号１及び配列番号２、配列番号３であることを特徴とする、請求項１に記載のＲＸＲαタンパク質を安定して低発現するＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株。
【請求項３】
請求項１に記載のＲＸＲαタンパク質を安定して低発現するＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株の製造方法であって、
ＲＸＲα遺伝子配列情報に基づいてＣＲＩＳＰＲノックアウトｇＲＮＡを設計し、ｇＲＮＡ発現ベクターを構築し、ｇＲＮＡ発現ベクターとｃａｓ９発現ベクターをＰＫ１５ブタ腎臓細胞にコトランスフェクションし、インビトロ細胞レベルでｇＲＮＡ切断活性を測定するステップ（１）と、
ヌクレオフェクションによりｇＲＮＡ発現ベクターとｃａｓ９発現ベクターを神経芽細胞腫細胞ＳＫ−Ｎ−ＳＨにコトランスフェクションし、Ｇ４１８試薬でスクリーニングして安定した細胞クローンを得、ＰＣＲ及び遺伝子シーケンシングによりＲＸＲα遺伝子の３の整数倍ではない塩基が欠失した遺伝子ノックアウト細胞クローンであるか否かを同定し、最後に、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによりそのＲＸＲαタンパク質の発現レベルを測定し、遺伝子型が安定して遺伝可能なＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株を得るステップ（２）と、
を含むことを特徴とする、製造方法。
【請求項４】
ＲＸＲα遺伝子のノックアウト標的部位を設定し、ｇＲＮＡを設計するステップ（１）と、
ｇＲＮＡ発現ベクターを構築するステップ（２）と、
ｇＲＮＡ切断活性の測定：リポフェクションし、Ｔ７Ｅ１酵素切断によりｇＲＮＡ切断活性を測定するステップ（３）と、
ＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株のスクリーニング：ｇＲＮＡ発現ベクターとｃａｓ９発現ベクターをヌクレオフェクションによりＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞にコトランスフェクションし、Ｇ４１８を加え、スクリーニング、クローン、培養を行うステップ（４）と、
ＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株を同定するステップ（５）と、
を含むことを特徴とする、請求項３に記載の製造方法。
【請求項５】
前記ステップ（１）において、ＲＸＲα遺伝子配列に基づいて、ＲＸＲα−ａ／ｂ／ｃが共有するエキソン４をノックアウト部位として選択し、ＣＲＩＳＰＲノックアウト標的部位を設計し、選択されたノックアウト標的部位はＲＸＲα遺伝子の第４エキソンの第１−１８０の塩基であり、それぞれＲＸＲα遺伝子の第４エキソンの第４４−６６（ＣＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＣＧＧＴＧＣＧＣＡＡＧＧ）、７９−１０１（ＣＣＴＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣ）、１０６−１２８（ＴＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧ）塩基を用いてＤＮＡオリゴプライマーを設計し、二本鎖ｇＲＮＡを合成し、
オンラインソフトウェアＣＲＩＳＰＲ  ＤＥＳＩＧＮを用いてＣＲＩＳＰＲノックアウトｇＲＮＡを設計し、相補的なＤＮＡオリゴプライマーを合成することを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
【請求項６】
前記ステップ（２）はｇＲＮＡベクターの構築であり、具体的には、
ｇＲＮＡを合成した後、９５℃１０分間、室温３０分間の条件下で、上流プライマー１０μＬと下流プライマー１０μＬを１０μＭとなるように水でプライマーを溶解した後、Ｕ６プロモーターとｇＲＮＡテールが結合されたＴベクターであって、酵素切断部位がＢｓａＩである骨格を作製し、その後、Ｔ４リガーゼにより１６℃で前記骨格を４時間結合することを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
【請求項７】
前記ステップ（３）は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の方法を採用し、細胞を一過性トランスフェクションし、標的遺伝子の完全性をテストすることによりプラスミドの切断活性を検証するステップであり、
ＰＫ１５ブタ腎臓細胞を２４ウェルプレートの４つのウェルで蘇生させ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ  ２０００のマニュアルに従って細胞を一過性トランスフェクションし、前記４つのウェルのうちの１つのウェルにＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクションしてトランスフェクション効率を観察し、他の３つのウェルにそれぞれｇＲＮＡベクタープラスミドをコトランスフェクションするステップ（３．１）と、
ＰＫ１５ブタ腎臓細胞にＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクションした１７時間後の蛍光強度に基づいて、目的プラスミドのトランスフェクション状況を確認するステップ（３．２）と、
細胞トランスフェクションの４８時間後に細胞を収集してＤＮＡを抽出し、Ｔ７エンドヌクレアーゼ法により活性を測定するステップ（３．３）と、
を含み、
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反応プログラムは、３７℃で酵素により６０分間切断することであることを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
【請求項８】
前記ステップ（４）は、細胞トランスフェクションであり、
検証した結果、３本のｇＲＮＡはいずれも遺伝子切断活性を有し、遺伝子ノックアウト細胞株の構築に使用でき、ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を８０％−９０％コンフルエンスに培養した後、プラスミドをｇＲＮＡ１：ｇＲＮＡ２：ｇＲＮＡ３：ｃａｓ９：ｐｃＤＮＡ３．１＝１：１：１：２：１の比率でヌクレオフェクターを用いてヌクレオフェクションし、細胞継代数はＰ３であり、トランスフェクションの２４時間後に細胞トランスフェクション状況を観察し、コンフルエンスが８０％−９０％に達したらプレートに分け、翌日にＧ４１８を加えてスクリーニングし、７日後、クローンを得、モノクローンを選択して９６ウェルプレートに移して培養し、満杯に増殖した後、４８ウェルプレートに拡張して引き続き培養し、コンフルエンスが８０％−９０％に達したら、消化し、半分の細胞を取り、溶解液をＰＣＲで検出し、残りの細胞を元のウェルで培養することを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
【請求項９】
前記ステップ（５）は以下の通りであり、
（５．１）Ｔ７ＥＩ酵素切断による細胞クローンの同定
Ｔ７酵素切断により細胞が遺伝子ノックアウト細胞クローンであるか否かを同定し、ＰＣＲ増幅及びＴ７酵素切断を行い、２０μｌ反応系のＰＣＲ増幅を採用し、ＰＣＲ生成物を２μｌ取り、スポッティングし、残りの１８μｌを２群に分け、そのうちの９μｌを水と１：１で混合し、他の９μｌを野生型ＰＣＲ生成物と１：１で混合し、変性、アニーリングした後、Ｔ７酵素で切断し、直接切断で切断できる場合、ヘテロ接合ノックアウトであることを示し、直接切断で切断できず、混合切断で切断できる場合、ホモ接合ノックアウトを示し、このバッチの同定により１つの疑陽性クローンＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−３５＃が得られ、もう１バッチの同定により、２つの疑陽性クローンが得られ、それぞれＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃、ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−１５＃であり、
（５．２）疑陽性クローン細胞遺伝子のシーケンシング
７＃、１５＃、３５＃疑陽性クローン細胞溶解液のＰＣＲ生成物をＴベクターに結合させてシークエンシングした結果、７＃、３５＃の遺伝子型はＲＸＲα対立遺伝子ノックアウトのホモ接合体であり、１５＃はＲＸＲα遺伝子ダブルノックアウト細胞株であり、それぞれＲＸＲα遺伝子の第４エキソンの第６１−１２２（６２ｂｐ）及び第６１−１２２（６２ｂｐ）、第６１−７０（１０ｂｐ）、１１４−１４１（２８ｂｐ）塩基が欠失し、
（５．３）陽性クローン細胞タンパク質の発現レベルの測定
Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔ測定により、本発明で構築されたＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株は、ＲＸＲα遺伝子がノックアウトされた後、細胞内ＲＸＲαタンパク質の発現レベルが低下することを示すことを特徴とする、請求項４に記載の製造方法。
【請求項１０】
ＲＸＲαタンパク質を安定して低発現するＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株であって、
前記細胞株はそれぞれＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃又はＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−３５＃、ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−１５＃であり、請求項３から９のいずれか１項に記載の製造方法により製造されることを特徴とする、ＲＸＲαタンパク質を安定して低発現するＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、バイオ製造技術の分野に属し、特に、ＲＸＲαタンパク質を安定して低発現するＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＸＲ（Ｈｏｍｏ  ｓａｐｉｅｎｓ  ｒｅｔｉｎｏｉｄ  Ｘ  ｒｅｃｅｐｔｏｒ、ホモサピエンスレチノイドＸ受容体）遺伝子のｍＲＮＡは、主にＲＸＲα（ＮＭ＿００２９５７．５）、ＲＸＲβ（ＮＭ＿００１２９１９２０．１）、ＲＸＲγ（ＮＭ＿００１２９１９２１．１）の３種類のスプライセオソームを含む。
【０００３】
細胞内ＲＸＲα受容体は様々な薬剤と結合することができ、腫瘍、糖尿病、神経変性疾患、脂肪性肝炎を含むがこれらに限定されない多くのヒトの疾患と密接に関連している。ＲＸＲαタンパク質が高発現及び低発現する細胞株の構築は、ＲＸＲα受容体関連疾患の病因を調査し、疾患標的に対する効果的な薬剤を開発するのに役立つ。ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ技術は、配列特異的なガイドＲＮＡ分子（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ）を使用してエンドヌクレアーゼｃａｓ９タンパク質を標的部位で切断するように誘導し、ＤＮＡ二本鎖切断（Ｄｏｕｂｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ  Ｂｒｅａｋ，ＤＳＢ）を形成することである。このようなＤＮＡ損傷は、細胞内の修復メカニズムを開始することができる。主に以下の２つの経路を含む。一つは、忠実度が低い非相同末端結合経路（ＮＨＥＪ，Ｎｏｎ−ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ  ｅｎｄ  ｊｏｉｎｉｎｇ）である。ＮＨＥＪは、細胞内の主要なＤＮＡ破壊損傷修復メカニズムである。この修復メカニズムはエラーが発生しやすく、修復後に塩基の欠失又は挿入が発生し、フレームシフト突然変異が発生し、最終的に遺伝子ノックアウトの目的が達成される。もう一つは、相同配列指向性修復（ＨＲ，ｈｏｍｏｌｏｇｙ−ｄｉｒｅｃｔｅｄｒｅｐａｉｒ）である。この相同組換えに基づくこの修復メカニズムは、忠実度が高いが発生の可能性が低い。
【０００４】
上記のように、ＲＸＲαタンパク質を安定して低発現する細胞株を効果的に構築することは、ＲＸＲαタンパク質の生体内での生物学効果についての研究及び関連疾患の薬物の開発に対して不可欠であり、本発明はこの問題を解決することを目的とする。
【発明の概要】
【０００５】
従来技術に存在する問題に鑑み、本発明は、ＲＸＲαタンパク質を安定して低発現するＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株を提出することを目的とする。この細胞株は、ヒト神経芽細胞腫から採取した不死化細胞（ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）に対して設計された遺伝子配列をノックアウトして得られた細胞株（ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞）であり、ノックアウトの部位はＲＸＲα遺伝子の第４エキソンの第１−１８０塩基である。
【０００６】
具体的には、上記細胞株は、それぞれＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃（又はＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−３５＃）及びＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−１５＃である。ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃（又はＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−３５＃）は、ＲＸＲα対立遺伝子ノックアウトホモ接合体細胞株である。ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−１５＃は、ＲＸＲα遺伝子ダブルノックアウト細胞株である。ノックアウトされた配列はそれぞれＲＸＲαの第４エキソンの第６１−１２２（６２ｂｐ）及び６１−１２２（６２ｂｐ）、６１−７０（１０ｂｐ）、１１４−１４１（２８ｂｐ）塩基であり、配列はそれぞれ配列番号１、配列番号２及び配列番号３である。
【０００７】
遺伝子シーケンシング、Ｗｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔにより分析した結果、本発明で構築された細胞株はいずれもＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株であり、かつＲＸＲαタンパク質の発現レベルは有意に低下し、この細胞株ＲＸＲαタンパク質の発現量は、野生型ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の１３％、１７％（Ｐ＜０．０１）である。この細胞株は、それぞれＲＸＲα対立遺伝子ノックアウトホモ接合体及びＲＸＲα遺伝子ダブルノックアウト細胞株である。この細胞株の遺伝子型は安定しており、細胞内でＲＸＲα受容体のｍＲＮＡ及びタンパク質を安定して低発現することができ、試薬によるスクリーニング及びタンパク質発現レベルの測定を定期的に行う必要がないため、細胞構築のプロセスが簡素化され、ＲＸＲαタンパク質に関連する機能の研究試験材料の信頼性、安定性及び研究効率が大幅に向上するとともに、野生型細胞の混入がないため、ＲＸＲαタンパク質低発現細胞の増殖培養が容易になる。本発明で得られた細胞株には野生型の混入がなく、現在国際的に知られている「リポフェクション技術」と比較して明らかな利点がある。
【０００８】
本発明の他の目的は、上記細胞株の製造方法を提供することである。
【０００９】
上記方法は、以下のステップを含む。
（１）ＲＸＲα遺伝子配列情報に基づいてＣＲＩＳＰＲノックアウトｇＲＮＡ（３本）を設計し、ｇＲＮＡ発現ベクターを構築し、ｇＲＮＡ発現ベクターとｃａｓ９発現ベクターをＰＫ１５ブタ腎臓細胞にコトランスフェクションし、インビトロ細胞レベルでｇＲＮＡ切断活性を測定する。
【００１０】
（２）ヌクレオフェクションによりｇＲＮＡ発現ベクターとｃａｓ９発現ベクターを神経芽細胞腫細胞ＳＫ−Ｎ−ＳＨにコトランスフェクションし、Ｇ４１８試薬でスクリーニングして安定した細胞クローンを得、ＰＣＲ及び遺伝子シーケンシングによりＲＸＲα遺伝子の３の整数倍ではない塩基が欠失した遺伝子ノックアウト細胞クローンであるか否かを同定し、最後に、Ｗｅｓｔｅｒｎ  ｂｌｏｔによりそのＲＸＲαタンパク質の発現レベルを測定し、遺伝子型が安定して遺伝可能なＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株を得る。
【００１１】
具体的には、上記製造方法は、
（１）ＲＸＲα遺伝子のノックアウト標的部位を設定し、ｇＲＮＡを設計するステップ（１）と、
【００１２】
ｇＲＮＡ発現ベクターを構築するステップ（２）と、
【００１３】
ｇＲＮＡ切断活性の測定：ＰＫ１５ブタ腎臓細胞にリポフェクションし、Ｔ７Ｅ１酵素切断によりｇＲＮＡ切断活性を測定するステップ（３）と、
【００１４】
ＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株のスクリーニング：ｇＲＮＡ発現ベクターとｃａｓ９発現ベクターをヌクレオフェクションによりＳＫ−Ｎ−ＳＨ神経芽細胞腫細胞にコトランスフェクションし、Ｇ４１８を加え、スクリーニング、クローン、培養を行うステップ（４）と、
【００１５】
ＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株を同定するステップ（５）と、を含む。
上記ステップ（１）では、好ましくは、ＲＸＲα遺伝子配列に基づいてＲＸＲα−ａ／ｂ／ｃが共有するエキソン４をノックアウト標的部位として選択し、オンラインソフトウェアであるＣＲＩＳＰＲ  ＤＥＳＩＧＮソフトウェアを用いてＣＲＩＳＰＲノックアウトｇＲＮＡを設計し、相補的なＤＮＡオリゴプライマーを合成する。
【００１６】
本発明は、従来技術と比較して以下の有益な効果を有する。
【００１７】
（１）本発明によれば、ＲＸＲαタンパク質を安定して低発現する細胞株が効果的に構築される。この細胞株ＲＸＲαタンパク質の発現量は、野生型ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞の１３％、１７％（Ｐ＜０．０１）である。この細胞株は、それぞれＲＸＲα対立遺伝子ノックアウトホモ接合体及びＲＸＲα遺伝子ダブルノックアウト細胞株である。この細胞株の遺伝子型は安定しており、細胞内でＲＸＲα受容体のｍＲＮＡ及びタンパク質を安定して低発現することができ、試薬によるスクリーニング及びタンパク質発現レベルの測定を定期的に行う必要がないため、ＲＸＲαタンパク質に関連する機能の研究試験材料の信頼性及び研究効率が大幅に向上し、ＲＸＲαタンパク質低発現細胞の増殖培養が容易になる。
【００１８】
（２）本発明で得られた細胞株には野生型の混入がなく、現在国際的に知られている「リポフェクション技術」と比較して明らかな利点がある。
【００１９】
（３）この製造方法は、細胞構築のプロセスが簡素化され、操作しやすく、再現性が良好で、産業化の応用に有利である。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】ノックアウト部位選択の模式図である。
【図２】ｇＲＮＡ配列設計の模式図である。
【図３】ＰＫ１５ブタ腎臓細胞にＥＧＦＰをトランスフェクションした１７時間後の細胞形態の模式図である。
【図４】ＰＫ１５ブタ腎臓細胞にＥＧＦＰをトランスフェクションした１７時間後のＥＧＦＰ緑色蛍光タンパク質の発現状況である。
【図５】ｇＲＮＡプラスミドの酵素切断活性の測定フローチャートである。
【図６】３本のｇＲＮＡの活性測定結果の模式図である。
【図７】１バッチ目の細胞クローンをＴ７酵素で混合切断した結果の模式図である。図７（ａ）−７（ｃ）は、異なる番号の細胞クローンをＴ７酵素で混合切断した結果の模式図である。
【図８】１バッチ目の細胞クローンをＴ７酵素で直接切断した結果の模式図である。
【図９】２バッチ目の細胞クローンをＴ７酵素で切断した結果の模式図である。
【図１０】本発明のＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株ＲＸＲαタンパク質の相対発現の測定の模式図である。同図において、１−３は野生型細胞、４−６はＲＸＲα遺伝子ノックアウト７＃細胞、７−１０はＲＸＲα遺伝子ノックアウト１５＃細胞である。
【図１１】本発明のＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株ＲＸＲαタンパク質の相対発現量の測定の模式図である。同図において、ＳＫ−Ｎ−ＳＨは野生型細胞、ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃はＲＸＲα遺伝子ノックアウト７＃細胞、ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−１５＃はＲＸＲα遺伝子ノックアウト１５＃細胞である。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
以下、実施例及び図面により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明の実施形態はこれに限定されない。
【００２２】
実施例１
（１）ＲＸＲα遺伝子ノックアウト標的部位の設定、ｇＲＮＡの設計
ＲＸＲα遺伝子配列に基づいて、ＲＸＲα−ａ／ｂ／ｃが共有するエキソン４をノックアウト標的配列として選択し、ＣＲＩＳＰＲ標的部位を設計し、図１の矢印が指す位置のようにノックアウト部位の選択を行った。
選択されたノックアウト標的部位は、ＲＸＲα遺伝子の第４エキソンの第１−１８０塩基であった。二本鎖ｇＲＮＡを合成するために、それぞれ第４４−６６（ＣＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＣＧＧＴＧＣＧＣＡＡＧＧ）、７９−１０１（ＣＣＴＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣ）、１０６−１２８（ＴＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＣＧＧ）塩基でＤＮＡオリゴプライマーを設計した。
【００２３】
オンラインソフトウェアによりＣＲＩＳＰＲノックアウトｇＲＮＡを設計し、相補的なＤＮＡオリゴプライマーを合成した。図２に示すｇＲＮＡ配列設計を参照されたい。
【００２４】
図２において、Ｇｕｉｄ＃１−＃５は、それぞれソフトウェアにより設計して選択されたスコアが比較的高いノックアウト標的部位である。本項目では、Ｇｕｉｄ＃１、＃２、＃５を選択してｇＲＮＡ合成プライマーを設計した。対応するプライマー配列は、それぞれ以下のＲＸＲα−ｇＲＮＡ−Ｆ１／Ｒ１、ＲＸＲα−ｇＲＮＡ−Ｆ２／Ｒ２、ＲＸＲα−ｇＲＮＡ−Ｆ３／Ｒ３であった。
ＲＸＲα−ｇＲＮＡ−Ｆ１：ＡＣＣＧ  ＣＴＴＣＡＡＧＣＧＧＡＣＧＧＴＧＣＧＣＡ  Ｇ
ＲＸＲα−ｇＲＮＡ−Ｒ１：ＡＡＡＡＣ  ＴＧＣＧＣＡＣＣＧＴＣＣＧＣＴＴＧＡＡＧ；
ＲＸＲα−ｇＲＮＡ−Ｆ２：ＡＣＣＧ  ＧＣＡＧＴＣＣＴＴＧＴＴＧＴＣＧＣＧＧＣ  Ｇ
ＲＸＲα−ｇＲＮＡ−Ｒ２：ＡＡＡＡＣ  ＧＣＣＧＣＧＡＣＡＡＣＡＡＧＧＡＣＴＧＣ；
ＲＸＲα−ｇＲＮＡ−Ｆ３：ＡＣＣＧ  ＴＴＧＡＣＡＡＧＣＧＧＣＡＧＣＧＧＡＡＣＧ
ＲＸＲα−ｇＲＮＡ−Ｒ３：ＡＡＡＡＣＧＴＴＣＣＧＣＴＧＣＣＧＣＴＴＧＴＣＡＡ。
【００２５】
ｇＲＮＡの活性を測定したときのＲＸＲα遺伝子増幅プライマーは、ＲＸＲα−ｉｄｅｎ−Ｆ１：ＡＧＧＣＣＡＴＴＣＣＡＧＧＧＴＴＣＴＣ、ＲＸＲα−ｉｄｅｎ−Ｒ１：ＣＴＧＴＴＧＴＣＣＡＴＣＴＣＧＧＧＴＧＴであった。このプライマーにより増幅したＲＸＲα配列の全長は７４８ｂｐであった。ｇＲＮＡが活性を有しない場合、アガロースゲル電気泳動後に、１本の全長７４８ｂｐの配列しかなかった。ｇＲＮＡが切断活性を有する場合、遺伝子の欠失又は挿入が引き起こされた可能性があり、そのＰＣＲ生成物は、Ｔ７酵素により切断され、アガロースゲル電気泳動後に複数本のバンドがあった。
【００２６】
（２）ｇＲＮＡ発現ベクターの構築
ｇＲＮＡを合成した後、９５℃１０分間、室温３０分間の条件下で、上流プライマー１０μＬと下流プライマー１０μＬを１０μＭとなるように水でプライマーを溶解した。その後、Ｕ６プロモーターとｇＲＮＡテールが結合されたＴベクターであって、酵素切断部位がＢｓａＩである骨格を作製した後、Ｔ４リガーゼ（Ｌｉｇａｓｅ）により１６℃で上記骨格を４時間結合した。
【００２７】
2021531035.tif 000003
【００２８】
結合した後、形質転換してプレートに塗布し、単一のプラスミドクローンを選択し、シークエンシングすることでプラスミドクローンコア配列の精度を検出し、シェイクして大量のプラスミドを抽出し、凍結保存した。
【００２９】
（３）リポフェクション
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の方法により、細胞を一過性トランスフェクションし、標的遺伝子の完全性をテストすることによりプラスミドの切断活性を検証した。
【００３０】
（３．１）２４ウェルプレート（４ウェル）中でＰＫ１５ブタ腎臓細胞を蘇生させ、ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ  ２０００のマニュアルに従って、細胞を一過性トランスフェクションした。トランスフェクション効率を観察するために、そのうちの１つのウェルに、ＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクションした。他の３つのウェルに、それぞれプラスミドをコトランスフェクションした。トランスフェクションパラメータは以下の通りである。
【００３１】
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【００３２】
Ｂ液：ｌｉｐｏ２０００（１．５μｌ）＋Ｏｐｔｉ−Ｍｅｍ（２３．５μｌ）＝２５μｌ
Ａ液とＢ液を混合した後、４つのウェルの細胞にトランスフェクションした。
【００３３】
（３．２）ＰＫ１５ブタ腎臓細胞にＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクションした１７時間後の蛍光強度に基づいて、目的プラスミドのトランスフェクション状況を確認した。ＰＫ１５ブタ腎臓細胞にＥＧＦＰプラスミドをトランスフェクションした１７時間後、蛍光顕微鏡で撮影した。細胞内のＥＧＦＰ発現状況を図３、４に示す。図３は、ＰＫ１５ブタ腎臓細胞をトランスフェクションした１７時間後に、蛍光顕微鏡を用いて自然光下で撮影した細胞の元の状態である。図３では、リポフェクションした後の細胞の輪郭が明確であり、リポフェクションが細胞活性に対して明らかな影響を与えないことを示している。図４と図３は、顕微鏡の視野が同じであり、ＥＧＦＰ緑色蛍光タンパク質の励起波長での蛍光状態を示し、蛍光強度を観察することにより、実験群のリポフェクション効率を確定し、実験群細胞が後の活性測定に適用できるか否かを判断する。図３と図４を比較すると、トランスフェクション効率は８０％以上となり、ＰＫ１５ブタ腎臓細胞が活性測定のテンプレートとして使用できることを示している。
【００３４】
（３．３）ｇＲＮＡ切断活性の測定
図５に示すプロセスを参照して行った。細胞トランスフェクションの４８時間後に細胞を収集してＤＮＡを抽出し、Ｔ７エンドヌクレアーゼ法により活性を測定した。Ｔ７酵素切断によるｇＲＮＡベクター活性測定の原理は以下の通りである。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系内の特異的ガイドＲＮＡ分子（ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ  ｇｕｉｄｅ  ＲＮＡ，ｇＲＮＡ）はＲＸＲα遺伝子ノックアウト部位の配列を特異的に識別し、エンドヌクレアーゼｃａｓ９タンパク質を標的部位で切断するようにガイドし、一部の塩基を欠失又は変化させる。この部分の配列を増幅した後、変性−復元させる。ＰＣＲ生成物中の野生型配列及び変異型配列は、アニーリングして二本鎖を形成する。切断部位の塩基が変化するので、相補的な塩基対は形成されず、泡状のＤＮＡ構造が形成される。Ｔ７エンドヌクレアーゼは、泡状一本鎖を特異的に切断し、ＰＣＲ生成物を２つに切断する。そのため、Ｔ７酵素で切断した後に、複数本の電気泳動バンドが示されている。
【００３５】
（３．３．１）プライマー情報
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【００３６】
（３．３．２）ＰＣＲ反応系
注：ＴＡＫＡＲＡ社のＰｒｅｍｉｘ  ＥＸＴａｑ酵素を使用した。
2021531035.tif 000006
【００３７】
（３．３．３）ＰＣＲ反応条件
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【００３８】
酵素切断した後のバンドのサイズを図６に示す。ｇＲＮＡ酵素切断した後の３本のバンドのサイズはそれぞれ５３６＋２１２、５６６＋１８２、６０２＋１４６であった。
【００３９】
この過程はＰＣＲ増幅プログラムである。具体的には、９８℃で５分間予備変性させ、９８℃で１０秒変性させた。５５℃で３０秒アニーリングし、７２℃で１分間伸長し、この２つの段階を３５回サイクルした。完全な伸長を保証し、ＰＣＲ増幅の完全性を確保するために７２℃で５分間伸長した。ＰＣＲ生成物の安定性を向上させるために、２０℃、２分間で降温して保存した。
【００４０】
（４）ＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株のスクリーニング
検証した結果、３本のｇＲＮＡはいずれも遺伝子切断活性を有し、遺伝子ノックアウト細胞株の構築に使用できる。ＳＫ−Ｎ−ＳＨ細胞を８０％−９０％コンフルエンスに培養した後、プラスミドをｇＲＮＡ１：ｇＲＮＡ２：ｇＲＮＡ３：ｃａｓ９：ｐｃＤＮＡ３．１＝１：１：１：２：１の比率でヌクレオフェクターを用いてヌクレオフェクションした。細胞継代数はＰ３であった。トランスフェクションの２４時間後に細胞トランスフェクション状況を観察した。コンフルエンスが８０％−９０％に達したらプレートに分け、翌日にＧ４１８を加えてスクリーニングし、７日後、クローンを得た。モノクローンを選択して９６ウェルプレートに移して培養し、満杯に増殖した後、４８ウェルプレートに拡張して引き続き培養し、コンフルエンスが８０％−９０％に達したら、消化し、半分の細胞を取り、溶解液をＰＣＲで検出し、残りの細胞を元のウェルで培養した。
【００４１】
（５）ＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株の同定
（５．１）Ｔ７酵素切断による細胞クローンの同定
Ｔ７酵素切断により細胞が遺伝子ノックアウト細胞クローンであるか否かを同定するためには、ＰＣＲ増幅及びＴ７酵素切断を行う必要がある。２０μｌ反応系のＰＣＲ増幅を採用し、ＰＣＲ生成物を２μｌ取り、スポッティングした。残りの１８μｌを２群に分けた。そのうちの９μｌを水と１：１で混合し、他の９μｌを野生型ＰＣＲ生成物と１：１で混合し、変性、アニーリングした後、Ｔ７酵素で切断した。直接切断で切断できる場合、ヘテロ接合ノックアウトであることを示す。直接切断で切断できず、混合切断で切断できる場合、ホモ接合ノックアウトを示す。直接切断も混合切断も切断できない場合、陰性であることを示す。
【００４２】
本実験では、合計２５０＋の細胞クローンを選択し、１４０個の細胞株を同定した。数が多いため、まず混合切断を行い、混合切断で切断されたものに対して直接切断を行った。ここで、１バッチ目の細胞クローンをＴ７酵素により混合切断した結果を図７に示す。１バッチ目の細胞クローンをＴ７酵素により直接切断した結果を図８に示す。
【００４３】
以上のＴ７酵素切断による同定結果から分かるように、番号３５のクローン細胞は、Ｔ７酵素による混合切断で切断できるが直接切断で切断できないので、一応ホモ接合ノックアウトとして同定することができ、ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−３５＃と命名された。
【００４４】
１バッチの同定により、１つの疑陽性クローンＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−３５＃が得られた。もう１バッチの同定により、２つの疑陽性クローンが得られ、それぞれ番号７及び番号１５であり、それぞれＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃及びＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−１５＃と命名された。Ｔ７酵素の切断結果を図９に示す。
【００４５】
（５．２）疑陽性クローン遺伝子のシーケンシング
７＃、１５＃、３５＃疑陽性クローン細胞溶解液のＰＣＲ生成物をＴベクターに結合させてシークエンシングした。７＃、３５＃の遺伝子型は、いずれもＲＸＲα対立遺伝子の第４エキソンの第６１−１２２（６２ｂｐ）塩基が欠失した遺伝子ノックアウトであり、ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃、ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−３５＃は、ＲＸＲα対立遺伝子ノックアウトホモ接合体であり、１５＃は、ＲＸＲα遺伝子ダブルノックアウト細胞株であり、それぞれＲＸＲαの第４エキソンの第６１−１２２（６２ｂｐ）及び第６１−７０（１０ｂｐ）、１１４−１４１（２８ｂｐ）の塩基が欠失していた。３つの細胞株はいずれも３の整数倍ではない塩基のノックアウトであり、いずれも有効なフレームシフト突然変異を引き起し、最終的に遺伝子ノックアウトの効果を奏することができる。
【００４６】
（５．３）ＲＸＲα遺伝子ノックアウト陽性クローンＲＸＲαタンパク質の発現レベルの測定
遺伝子シーケンシングから分かるように、ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃とＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−３５＃は遺伝子型が同じであるため、ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃及びＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−１５＃の２つの細胞株に対してＷｅｓｔｅｒｎ  Ｂｌｏｔにより測定した。測定結果を図１０、１１に示す。７＃、１５＃の細胞内ＲＸＲαタンパク質の発現レベルはいずれも有意に低下し、７＃、１５＃細胞株のＲＸＲαタンパク質の発現量はＷＴ細胞の１３％、１７％（Ｐ＜０．０１）であった。
【００４７】
以上の実験結果から分かるように、本発明によれば、ＲＸＲαタンパク質を安定して低発現するＲＸＲα遺伝子ノックアウト細胞株の構築に成功した。この細胞株は、それぞれＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−７＃（又はＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−３５＃）、ＲＸＲ／ＫＯ−ＳＫ−Ｎ−ＳＨ−１５＃であり、次の試験にＲＸＲαタンパク質が低発現する研究の試験材料を提供することができる。
【００４８】
以上の実施例は本発明の好ましい実施形態であるが、本発明の実施形態は、上記実施例に制限されない。本発明の思想及び原理から逸脱しない範囲で行われる変更、修飾、置換、組み合わせ及び簡素化は、いずれも同等の交換であり、本発明の保護範囲に含まれる。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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