(57)【要約】本発明は、馴化培地（ＣＣＭ）組成物から細胞外小胞組成物を生成する方法に向けられている。本方法は、細胞を、インビトロにて、生体適合性の表面上で、低酸素条件下で培養することを含む。本培養法では、可溶性画分（ＣＣＭ）および非可溶性画分の両方が生成される。細胞外小胞は、低酸素条件下で培養された細胞によって生成された可溶性画分（ＣＣＭ）に由来するものであり、様々な医療用途および治療用途に使用することができる。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質、またはそれらの生物活性断片を含む、ＣＤ９、ＣＤ６３、および／またはＣＤ８１陽性細胞外小胞（ＥＣＶ）。
【請求項２】
線維芽細胞を、好適な増殖培地中、マイクロキャリアビーズ上で、または３次元表面上で、低酸素条件下、少なくとも２週間、１〜５％の酸素下で、培養することであって、それにより、ＥＣＶを生成し且つ該ＥＣＶを該培養培地中へと分泌する多能性幹細胞を生成し、且つ該ＥＣＶを収集する、該培養すること
によって生成される、請求項１に記載のＥＣＶ。
【請求項３】
前記Ｗｎｔタンパク質が、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａ、および／またはＷｎｔ７ｂから選択される、請求項１に記載のＥＣＶ。
【請求項４】
線維芽細胞を、好適な増殖培地中、マイクロキャリアビーズ上で、または３次元表面上で、低酸素条件下、少なくとも２週間、１〜５％の酸素下で、培養することであって、それにより、細胞外小胞を生成し且つ該細胞外小胞を該培養培地中に分泌する多能性幹細胞を生成する、該培養すること
を含む、少なくともＷｎｔタンパク質とフォリスタチンタンパク質とを含むＥＣＶを生成する方法。
【請求項５】
請求項１に記載の細胞外小胞と担体とを含む、組成物。
【請求項６】
前記担体が医薬的に許容される担体である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
その必要がある対象に、請求項１に記載のＥＣＶを投与することであって、それにより、毛髪成長を刺激する、該投与すること
を含む、毛髪成長を刺激するための方法。
【請求項８】
その必要がある対象に、請求項１に記載のＥＣＶを投与することであって、それにより、皮膚の若返りおよび／または再生を刺激する、該投与すること
を含む、皮膚の若返りおよび／または再生を刺激する方法。
【請求項９】
毛髪成長を刺激するための薬剤の調製のための、請求項１に記載のＥＣＶの使用。
【請求項１０】
皮膚の若返りおよび／または再生を刺激するための薬剤の調製のための、請求項１に記載のＥＣＶの使用。
【請求項１１】
その必要がある対象に、請求項１に記載のＥＣＶを投与することであって、それにより、組織を修復する、該投与すること
を含む、修復を必要とする組織を治療する方法。
【請求項１２】
エキソソームである、請求項１に記載のＥＣＶ。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、米国特許法第１１９条（ｅ）の定めにより、２０１８年１月３０日に出願された米国特許出願第６２／６２３，８５１号の優先権の恩典を主張するものであり、該文献の全容は、その全体が本明細書において参照により援用されている。
【０００２】
発明の分野
本発明は、概して、細胞外小胞組成物の製造および使用に関し、より具体的には、好適な増殖培地中、低酸素条件下にて細胞を培養することにより得られる細胞外小胞組成物に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景情報
細胞外マトリックス（ＥＣＭ）は、細胞を取り囲み且つ支持する、複合的な構造の実体であり、インビボにて哺乳動物の組織内に見られる。ＥＣＭはしばしば結合組織と呼称されている。ＥＣＭは、コラーゲンおよびエラスチンのような構造タンパク質、フィブリリン、フィブロネクチン、およびラミニンのような特殊タンパク質、ならびにプロテオグリカンを含む、３つの主要クラスの生体分子から主に構成される。
【０００４】
ＥＣＭ組成物のインビトロでの増大、ならびに様々な治療および医療用途におけるそれらの使用は、当該技術分野において記載されてきた。このようなＥＣＭ組成物の治療用途の１つとしては、シワおよび瘢痕などの軟組織ならびに皮膚の欠損に対する、治療および修復が挙げられる。
【０００５】
にきび、外科的瘢痕もしくは老化などの欠損に起因する軟部組織の欠損を修復または増強するのは、極めて困難であることが、立証されてきた。軟部組織の欠損を矯正する目的に使用されてきた材料は多数に及んでおり、その成功度は多様であるが、完全に安全でしかも効果的な材料は皆無であった。例えば、シリコンは、結節、再発性蜂巣炎および皮膚潰瘍などの長期的副作用をはじめとする、様々な生理学的ならびに臨床的問題を引き起こす。
【０００６】
同様に、軟組織の増強を目的に、注射可能材料として使用されてきたものとしては、コラーゲン組成物も挙げられる。コラーゲンは結合組織の主要タンパク質であり、哺乳動物において最も豊富なタンパク質でもあり、全タンパク質含有量の約２５％を占める。文献に記載されてきたコラーゲンは、現在２８種類にも及んでいる（詳細なリストについては、例えば、下掲の表１および表２を参照）。ただし、体内のコラーゲンの９０％超はコラーゲンＩ、ＩＩ、ＩＩＩ、およびＩＶとされている。
【０００７】
軟組織欠損の治療に使用されてきたコラーゲン材料には、再構成済み注射可能ウシコラーゲン、架橋コラーゲン、または他の異種コラーゲンなど、様々な種類がある。しかしながら、そのようなコラーゲンには問題がいくつか存在する。よくある問題としては、対象のアレルギー反応を回避する目的で、免疫原性の可能性のある物質を除去すべく、インプラント材料を製造する際の複雑さおよび高コストが挙げられる。加えて、そのようなコラーゲンを使用した治療は、長期間にわたって持続することが立証されていない。
【０００８】
他の材料で、軟部組織の修復または増強に使用できるものとしては、例えば、水性ゲル中の生体適合性セラミック粒子（米国特許第５，２０４，３８２号（特許文献１））、熱可塑性および／または熱硬化性材料（米国特許第５，２７８，２０２号（特許文献２））、ならびに乳酸ベースのポリマーブレンド（米国特許第４，２３５，３１２号（特許文献３））も記載されてきた。更に、天然に分泌されるＥＣＭ組成物の使用も記載されてきた（米国特許第６，２８４，２８４号（特許文献４））。その一方で、そのような材料はいずれも制限を伴うことが立証されてきた。
【０００９】
したがって、軟部組織の修復および増強を用途とし、従来の材料の欠陥を克服する、新規な材料に対するニーズが存在する。このニーズが存在している理由は、軟組織を修復し且つ増強する生体吸収性の材料で、安全でしかも注射可能で、長期にわたって持続するものを提供することを期してのことである。
【００１０】
更に、インビトロで培養されたＥＣＭ組成物を使用して、損傷した心筋および関連組織などの損傷した組織を治療することも可能である。本組成物は、植込み型デバイス（例えば、ステント）上のインプラントまたは生物学的コーティングとして、臓器（例えば、心臓および関連組織）の血管新生を促進する血管補綴物として、ならびにヘルニア修復、骨盤底修復、創傷修復、および回旋腱板修復に有用なデバイス（例えば、パッチなど）として役立つ。
【００１１】
冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）は、冠状動脈疾患（ＣＡＤ）、虚血性心疾患、およびアテローム性動脈硬化症とも呼称されており、心臓に血液および酸素を供給する細い血管が狭小になることを特徴としている。冠状動脈性心臓病は、動脈壁に脂肪性物質およびプラークが蓄積して動脈が狭窄化されると発呈する（アテローム性動脈硬化症と呼称される）病態によって引き起こされるのが、通例である。冠状動脈が狭窄化されると、心臓への血流が遅延する、あるいは停止するなどして、胸痛（安定狭心症）、息切れ、心臓発作などの症状を引き起こす恐れがある。
【００１２】
冠状動脈性心臓病（ＣＨＤ）は、米国内で男性および女性の死因の首位を占めている。アメリカ心臓協会（American Heart Association）によれば、何らかの形態の病態を有する人は、１５００万例を突破している。冠状動脈性心臓病の症状および徴候は、疾患が進行した状態においては明白であるが、冠状動脈性心臓病に罹患する人のほとんどは、何十年もの間にわたって疾患の証拠が見られず、病気が進行した後で、突然の心臓発作が起こる。この疾患は、突然死の原因としてごく一般的であり、また、２０歳を超える男性および女性の死亡事由としてもごく一般的とされている。現今の米国の動向によれば、将来的にＣＨＤを発呈する人は、４０歳の健常な男性では半数を占め、４０歳の健常な女性では３人中１人とされるものと、見込まれている。
【００１３】
疾患に罹患したかまたは別段の損傷を受けた心臓における血流を改善するための方法としては、昨今では、侵襲的外科技術、例えば、冠状動脈バイパス手術、血管形成術、および動脈内膜切除術が挙げられる。そのような手技は、当然ながら、手術中および手術後に高度な固有のリスクを伴うものであり、あくまで心虚血に対する一時的な治療を提供するにすぎないこともしばしばである。したがって、現在利用可能な技術の成功度を高めるのに必要とされているのが、ＣＨＤおよび関連する症状を治療するための、新規な治療選択肢である。
【００１４】
損傷した細胞もしくは組織、例えば、軟骨および骨軟骨細胞を、修復および／または再生する場合は、インビトロ培養ＥＣＭ組成物も、更に使用できる。骨軟骨組織とは、骨もしくは軟骨に関連するかまたは骨もしくは軟骨を含有している、任意の組織をいう。本発明の組成物は、骨軟骨欠損（例えば、リウマチ性および／または変形性関節症のような変形性結合組織疾患）、ならびに外傷による軟骨欠損を有する患者における欠損の治療に有用である。
【００１５】
生体適合性および生分解性のヒドロゲル移植片に対しヒト軟骨細胞を移植することによって、関節軟骨病変を修復する可能性を向上させようという試みは、骨軟骨欠損を修復する昨今の試みとして挙げられる。加えて、アルギネートビーズまたはポリ硫酸化アルギネートを含むマトリックス内での軟骨細胞培養物の技術に関しては、ガラス様の軟骨組織を生成するものであるという記載もある。しかしながら、ヒトの自家軟骨細胞の移植により関節軟骨の軟内膜病変を修復する試みにおける成功は、限られてきた。したがって、現在利用可能な技術の成功度を高めるのに必要とされているのが、骨軟骨欠損を治療するための、新規な治療選択肢である。
【００１６】
また、インビトロで培養されたＥＣＭ組成物は、人工組織インプラントを生成する組織培養系においても有用とされる。組織工学の分野は、細胞培養技術を使用して新しい生物組織を生成すること、または損傷した組織を修復することを含む。組織工学技術は、幾分かは幹細胞革命によって活気づけられてきており、外傷または変性疾患の治療後の組織再生および置換を有望なものとしている。組織工学技術はまた、美容手技との関連において使用され得る。
【００１７】
組織工学技術の利用は、様々な種類の細胞および培養技術を用いて、自家組織および異種組織または細胞の両方を生成することを可能としている。自家インプラントを作成する際には、ドナー組織を採取し、個々の細胞に分離して、続いて、機能する組織の所望の部位に移植される基質上に付着させ培養してもよい。多くの単離された細胞型は、細胞培養技術を使用してインビトロで増殖させることができるが、足場依存性細胞には特定の環境が必要とされる。３次元足場を介在させて、成長の鋳型として機能させる必要のあることもしばしばである。
【００１８】
現今の組織工学技術は、人工インプラントを提供するものが、ごく一般的である。細胞移植療法が奏功するかどうかは、インビトロおよびインビボの両方の組織培養に好適な基質の開発に依存する。それゆえ、天然物質のみを含むＥＣＭの開発を、移植に好適なものとするには、内因性組織の特徴の多くを含ませればよいだろう。したがって、天然のＥＣＭ物質を生成することは、組織工学の分野における目下の課題とされている。
【００１９】
アポトーシス中に細胞が小胞を細胞外環境に放出することが知られるようになってから、久しい。一方、健常細胞もまた小胞を細胞外環境に放出するという事実が理解されたのは、つい最近のことである。細胞外小胞（ＥＣＶ）またはエキソソームは、細胞由来の４０〜１００ｎｍの膜小胞であり、多くの、そしておそらく全ての真核生物の体液（例えば、血液、尿、および細胞培養物の培養培地）において存在する。ＥＣＶには、起源の細胞の様々な分子成分（タンパク質およびＲＮＡなど）が含有されている。ＥＣＶは細胞間シグナル伝達における役割を果たし得る。その具体的な理由は、ＥＣＶが内容物をマージし、その内容物を元の細胞から離れた細胞へと放出して、レシピエント細胞のプロセスに影響を与える可能性があるからである。ＥＣＶの単離および検出は、複雑であることが立証されてきた。体液が複雑であるという理由から、細胞および同様のサイズの粒子からＥＣＶを物理的に分離することは困難となっている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２０】
【特許文献１】米国特許第５，２０４，３８２号
【特許文献２】米国特許第５，２７８，２０２号
【特許文献３】米国特許第４，２３５，３１２号
【特許文献４】米国特許第６，２８４，２８４号
【発明の概要】
【００２１】
本発明は、初期の胚環境を刺激する条件（低酸素および低重力など）下にて表面（２次元または３次元など）上で培養された細胞が、胎児性特性を有するＥＣＭ組成物および馴化培地（ＣＣＭ）組成物を生成する、という独創的な発見に一部基づいている。１つ以上の胚性タンパク質を含む表面上で低酸素条件下にて細胞を培養することによって生成されるＥＣＭ組成物には、様々な有益な用途がある。また、これまで発見されてきたように、低酸素条件下にて増殖した細胞に由来する馴化培地（ＣＣＭ）組成物から単離された細胞外小胞（ＥＣＶ）には、有益な用途を有するタンパク質が含有されている。最近では、このようなＥＣＶが、様々な医療および治療用途に役立つ可能性のあることも、明らかにされてきた。これらの細胞外小胞組成物は、具体的には、毛髪成長の刺激、組織の刺激および／または再生、ならびに皮膚の若返りのために使用することができる。
【００２２】
一実施形態において、本発明は、１つ以上の胚性タンパク質を含有するＥＣＭ組成物を作製する方法を提供する。本方法は、好適な増殖培地中、表面（例えば、２次元または３次元）上で低酸素条件下にて細胞を培養して、可溶性画分および非可溶性画分を生成することを含む。様々な態様において、本組成物は、可溶性または不溶性画分を別々に含み、ならびに可溶性画分と不溶性画分との組み合わせを含む。様々な態様において、生成された組成物は、ラミニン、コラーゲンおよびＷｎｔ因子の、遺伝子発現および生成の上方制御を含む。他の態様において、生成された組成物は、ラミニン、コラーゲンおよびＷｎｔ因子の遺伝子発現の下方制御を含む。他の態様において、本組成物は種特異的であり、単一の動物種に由来する細胞および／または生物学的物質を含む。インビトロで培養されたＥＣＭ組成物は、ヒトの治療に有用であるが、そのような組成物は他の種の動物に適用される場合もある。したがって、そのような組成物は、獣医学的用途に非常に適している。
【００２３】
別の実施形態において、本発明は、Ｗｎｔタンパク質および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を産生する方法を提供する。本方法は、好適な増殖培地中、表面（例えば、２次元または３次元）上で低酸素条件下にて細胞を培養することであって、それにより、Ｗｎｔタンパク質およびＶＥＧＦを生成する、該培養することを含む。様々な態様では、増殖培地を血清不含とし、低酸素条件を酸素１〜５％としている。関連する態様では、約１５〜２０％の酸素の酸素条件にて生産された培地と比較して、Ｗｎｔ種が上方制御されている。例示的な態様において、Ｗｎｔ種は、ｗｎｔ３ａ、ｗｎｔ７ａ、ｗｎｔ７ｂおよびｗｎｔ１１である。他の実施形態において、馴化培地は、本明細書中に記載されているような様々なタンパク質を含む組成物として単離される。
【００２４】
別の実施形態において、本発明は、修復もしくは再生対象となる細胞を本明細書に記載のＥＣＭ組成物と接触させることによって、細胞を修復および／または再生する方法を含む。一態様において、細胞は骨軟骨細胞である。したがって、本方法では、骨軟骨欠損を修復することが企図される。
【００２５】
別の実施形態において、ＥＣＭ組成物は、植込み型デバイス上のインプラントまたは生物学的コーティングとして有用である。様々な態様において、本発明の組成物は、インプラント中に配合されるか、または植込み型デバイス（例えば、ステント）上の生物学的コーティングとして利用されるほか、臓器（心臓および関連組織など）の血管新生を促進するための血管補綴物としても利用される。関連する態様において、本組成物は、組織再生パッチまたはインプラントに含まれ、ヘルニア修復、骨盤底修復、創傷修復、回旋腱板修復およびそれらに類するものに有用である。
【００２６】
更に別の実施形態において、本発明は、対象のシワ部位に本明細書に記載のＥＣＭ組成物を投与することを含む、対象の皮膚表面を改善する方法を含む。更に別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＥＣＭ組成物または馴化培地を、対象のシワ部位に投与することを含む、対象における軟組織を修復または増強する方法を含む。
【００２７】
別の実施形態において、本発明は、組織培養系を含む。様々な態様において、培養系は、本明細書に記載のＥＣＭ組成物または培養培地（２次元もしくは３次元の支持材料に含まれるものなど）から構成される。別の態様において、本明細書中に記載されているＥＣＭ組成物は、様々な細胞型を増殖するための支持体または２次元もしくは３次元支持体として有用である。例えば、培養系を使用することで、幹細胞の成長を支持することが可能となる。一態様において、幹細胞は胚性幹細胞、間葉系幹細胞または神経幹細胞である。
【００２８】
別の実施形態において、本発明は、細胞（例えば、低酸素条件下の線維芽細胞）を培養することによって幹細胞を生成し、それにより、正常酸素条件下で成長した場合よりも少なくとも３倍高いレベルにて幹細胞の遺伝子特性を発現する細胞を生成することを含む。そのような遺伝子としては、例えば、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧおよびｃＭｙｃを挙げることができる。
【００２９】
本発明の方法により生成される幹細胞は、分化万能性であることが、好ましい。任意の間質細胞または非幹細胞を、出発細胞型として使用できる。
【００３０】
別の実施形態では、損傷した組織を治療する方法を提供するために、本発明の組成物を使用することができる。本方法は、損傷した組織の治療を可能にする条件下にて、１つ以上の胚性タンパク質を含む２次元または３次元表面上で低酸素条件下にて細胞を培養することにより生成された組成物と、損傷した組織とを接触させることを含む。
【００３１】
別の実施形態において、本発明は、毛髪成長を刺激または促進するための方法を提供する。本方法は、細胞を、本明細書に記載のＥＣＭ組成物または馴化培地と接触させることを含む。例示的な態様において、細胞は毛髪毛包細胞である。様々な態様において、細胞は、インビボまたはエクスビボで接触を受け得る。
【００３２】
一実施形態において、本発明は、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性細胞外小胞（ＥＣＶ）を提供する。一態様において、ＥＣＶは、線維芽細胞を、好適な増殖培地中、マイクロキャリアビーズ上で、または３次元表面上で、低酸素条件下、少なくとも２週間、１〜５％の酸素下で、培養することであって、それにより、ＥＣＶを生成し且つ該ＥＣＶを該培養培地中へと分泌する多能性幹細胞を生成し、且つ該ＥＣＶを収集する、該培養することによって生成される。追加的な態様において、Ｗｎｔタンパク質はＷｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａおよび／またはＷｎｔ７ｂである。
【００３３】
追加的な実施形態において、本発明は、線維芽細胞を、好適な増殖培地中、マイクロキャリアビーズ上で、または３次元表面上で、低酸素条件下、少なくとも２週間、１〜５％の酸素下で、培養することであって、それにより、細胞外小胞を生成し且つ該細胞外小胞を該培養培地中に分泌する多能性幹細胞を生成する、該培養することを含む、少なくともＷｎｔタンパク質とフォリスタチンタンパク質とを含むＥＣＶを生成する方法を提供する。
【００３４】
更なる実施形態において、本発明は、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質、またはそれらの生物活性断片と担体とを含む、ＣＤ９、ＣＤ６３および／またはＣＤ８１陽性ＥＣＶを含む組成物を提供する。一態様において、担体とは、医薬的に許容される担体である。
【００３５】
別の実施形態において、本発明は、毛髪成長を刺激するための方法を提供するものであり、本方法は、その必要がある対象に、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶを投与することであって、それにより、毛髪成長を刺激する、該投与することを含む。
【００３６】
追加的な実施形態において、本発明は、皮膚の若返りおよび／または再生を刺激する方法を提供するものであり、本方法は、その必要がある対象に、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶを投与することであって、それにより、皮膚の若返りおよび／または再生を刺激する、該投与することを含む。
【００３７】
更なる実施形態において、本発明は、毛髪成長を刺激するための薬剤の調製のための、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶの使用を提供する。
【００３８】
一実施形態において、本発明は、皮膚の若返りおよび／または再生を刺激するための薬剤の調製のための、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶの使用を提供する。
【００３９】
別の実施形態において、本発明は、修復を必要とする組織を治療する方法を提供するものであり、本方法は、その必要がある対象に、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶを投与することであって、それにより、組織を修復する、該投与することを含む。
【００４０】
追加的な実施形態において、本発明は、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶを提供するものであり、ここで、該ＥＣＶはエキソソームである。
【図面の簡単な説明】
【００４１】
【図１】本発明のＥＣＶを単離するための例示的なステップを図示したものである。
【図２】ウエスタンブロットにより得られたＥＣＶ組成物におけるＣＤ９タンパク質の発現プロファイルを図示したものである。Ｍ：タンパク質標準；Ａ：エンジニアリングラン（１０×）；Ｂ：臨床ロット４．２０．１１（１０×）；Ｃ：製造（ＳＶ）ロット（１０×）；Ｄ：エンジニアリング＋ＢＣＳ４．１０．１２（１×）。
【図３】ナノ粒子データを図示したものである。Ａ）２つのサンプルにおいて分析されたＥＣＶパラメーターの説明である。Ｂ）２つのＣＣＭサンプルのＥＣＶ濃度を図示したものである。
【図４】４つのＥＣＶサンプルから抽出されたタンパク質含有量を図示したものである。
【図５Ａ】図５Ａ〜図５Ｃは、ＥＣＶ組成物におけるＷｎｔタンパク質の発現プロファイルを図示したものである。Ａ）Ｗｎｔ７ａタンパク質の発現プロファイルである。Ｂ）Ｗｎｔ７ｂタンパク質の発現プロファイルである。Ｃ）Ｗｎｔ３ａタンパク質の発現プロファイルである。Ｍ：染色済みタンパク質標準；７ａ：Ｗｎｔ７ａ陽性細胞溶解物；７ｂ：Ｗｎｔ７ｂ陽性細胞溶解物；Ｅ：ＥＣＶサンプル。
【図５Ｂ】図5Aの説明を参照のこと。
【図５Ｃ】図5Aの説明を参照のこと。
【図６】ＦＳＴバイオアッセイで測定されたＥＣＶ組成物のＦＳＴ生物活性を図示したものである。
【発明を実施するための形態】
【００４２】
発明の詳細な説明
本発明は、１つ以上の胚性タンパク質を含むＥＣＭ、馴化培地および細胞外小胞（ＥＣＶ）組成物を作製するための方法に関する。特に、本組成物は、好適な増殖培地中の表面（例えば、２次元または３次元）上で低酸素条件下にて細胞を培養することによって、生成される。本培養法では、可溶性画分と非可溶性画分の両方が生成される。これらの画分を個別に使用するかまたは組み合わせて使用することで、用途が多岐に及ぶ生理学的に許容される組成物を得ることができる。加えて、可溶性画分に由来するＥＣＶには、様々な医療および治療用途において有用なタンパク質が含有されている。
【００４３】
幹細胞および多能性前駆細胞の分裂、分化、および機能は、酸素の利用可能性を含む、微小環境における複雑なシグナルの影響を受ける。例えば、急速な細胞分裂および異常な血管形成が原因で、重篤な酸素不足（低酸素状態）の領域が、腫瘍内に発生する。低酸素誘導因子（ＨＩＦ）は、正常組織および癌における限局性低酸素に対する転写応答を媒介し、細胞代謝を変化させ、血管新生を刺激することにより、腫瘍の進行を促進し得る。最近になって、特定のシグナル伝達経路（Ｎｏｔｃｈなど）ならびに転写因子（幹細胞の自己複製および多能性を制御するＯｃｔ４など）の発現が、ＨＩＦによって活性化されることが明らかにされてきた。癌の多くは、少数の形質転換された自己再生型の多能性「癌幹細胞」から発生すると考えられていることから、これらの結果は、腫瘍の進行におけるＨＩＦの新たな役割を示唆している。本実施例に示すデータは、低酸素条件下にて培養された細胞が、例えば、Ｏｃｔ４、ＮＡＮＯＧ、Ｓｏｘ２、ＫＬＦ４、およびｃＭｙｃなどの分化万能性細胞に通常関連する遺伝子を発現することを示している。
【００４４】
本発明の組成物は、用途が多岐に及んでいる。例えば、限定されるものではないが、損傷した細胞もしくは組織の修復および／または再生を促進すること、パッチおよびインプラントでの使用により、組織の再生（ヘルニアの修復、骨盤底の修復、腱板の修復、創傷の修復など）を促進すること、組織培養系での使用により、細胞（幹細胞など）を培養すること、植込み型デバイス（例えば、ペースメーカー、ステント、ステントグラフト、人工血管、心臓弁、シャント、薬物送達ポートもしくはカテーテル、ヘルニアおよび骨盤床修復パッチ）に関連して用いられる表面コーティングで使用すること、シワなどの皮膚表面の軟組織の修復、増強、および／または改善を促進すること、レーザー後などの外傷後の皮膚に適用すること、皮膚の若返り、毛髪成長、生物学的癒着防止剤として、または細胞送達もしくは送達部位での維持のための生物学的ビヒクルとして使用することが挙げられる。
【００４５】
本発明は、血管新生の前の初期胚環境を刺激する条件（低酸素および低重力）下にて、ビーズまたは３次元表面上で培養された細胞が、胚タンパク質の生成を含む胎児性特性を有するＥＣＭ組成物を生成するという発見に一部基づいている。低酸素条件下にて細胞が成長することから実証されるように、独特なＥＣＭおよび馴化培地が胎児性特性を含み、成長因子を発現させている。従来の培養条件下におけるＥＣＭの培養とは異なり、低酸素条件下にて培養されたＥＣＭにおいては、５０００を超える遺伝子が差次的に発現する。このため、培養されたＥＣＭの特性、および生物学的組成もそれぞれ異なるという結果になる。例えば、低酸素条件下で生成されたＥＣＭは、ＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶ型コラーゲンだけでなく、フィブロネクチン、ＳＰＡＲＣ、トロンボスポンジンおよびヒアルロン酸のような糖タンパク質類も比較的豊富であるという点で、胎児間葉組織と類似している。
【００４６】
また、低酸素状態は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−７、およびＴＧＦ−βなどの創傷治癒および器官形成を調節する因子の発現、ならびに複数のＷｎｔ因子（ｗｎｔ２ｂ、４、７ａ、１０ａ、および１１など）の発現も増大させる。また、培養された胚性ヒトＥＣＭは、酵素活性の増加によって測定されるように、インビトロでのヒト線維芽細胞における代謝活性の増加を刺激する。加えて、培養胚性ＥＣＭに応じて、細胞数が増加する。
【００４７】
本組成物および方法について説明する前に、本発明は、記載されている特定の組成物、方法、および実験条件に限定されるものではなく、寧ろそのような組成物、方法、および条件が変化し得ることを、理解すべきである。また、本明細書中に用いられている用語は、もっぱら特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであって、本発明の範囲が、添付の特許請求の範囲においてのみ限定されるため、限定することを意図したものではないことも、理解されたい。
【００４８】
本明細書および添付の特許請求の範囲において、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」が使用されている場合、文脈から他の意味に解釈されることが明白でない限り、複数の指示対象を含む。それゆえ、例えば、「本方法」に言及されている場合、１つ以上の方法、および／または本明細書に記載されているタイプのステップを含む。このことは、本開示などを読むことによって、当業者に明らかになるであろう。
【００４９】
様々な実施形態において、本発明は、１つ以上の胚性タンパク質を含むＥＣＭ組成物を作製する方法、およびその用途を含む。特に、本組成物は、好適な増殖培地中、２次元または３次元表面上で低酸素条件下にて、細胞を培養することによって、生成される。本組成物は、３次元フレームワーク上で細胞を成長させることにより得られ、その結果、多層細胞培養系となる。本発明によれば、３次元フレームワーク支持体上で成長した細胞は、多層にて成長し、細胞マトリックスを形成する。低酸素条件下にて培養細胞を成長させた場合、ＥＣＭおよび馴化培地での従来の培養に対する低酸素培養条件の結果として、差次的に遺伝子が発現する。
【００５０】
ＥＣＭとは、細胞の培養によって生成される組織を実質的に構成するタンパク質と生体高分子とからなる、組成物である。線維芽細胞などの間質細胞は、細胞培養に好適な材料および表面に付着しながらの増殖を必要とする、足場依存性の細胞タイプである。培養細胞によって生成されたＥＣＭ物質は、組織様構造を形成するための空間を提供する３次元配置にて堆積する。
【００５１】
３次元構造を提供する培養材料は、足場と呼称される。ＥＣＭの堆積のための空間は、例えば、織布メッシュ空間または間隙空間内の開口部の形態であり、これらの空間は、マイクロキャリアと呼称される球状ビーズのコンパクト構成で作製されている。
【００５２】
本明細書において、「細胞外マトリックス組成物」は、可溶性画分および非可溶性画分の両方、またはそれらの任意の部分を含む。不溶性画分には、分泌されたＥＣＭタンパク質と生物学的成分とが含まれており、これらの成分は、支持体上または足場上に堆積される。可溶性画分には、細胞が培養されている培養培地または馴化培地が含まれ、この培地には細胞によって活性物質が分泌されている。また、この可溶性画分には、足場上に堆積していないタンパク質および生物学的成分も含まれる。両方の画分は、収集してもよいし、任意で更に処理し、本明細書に記載の様々な用途において個別に使用してもよいし、または組み合わせて使用してもよい。
【００５３】
間質細胞の培養に用いられる３次元支持体または足場は、材料および／または形状を問わず、（ａ）細胞を付着させることができ（または細胞を付着させるように修正され得）、且つ（ｂ）細胞を２つ以上の層に成長させる（すなわち、３次元組織を形成させる）ことができる。他の実施形態では、実質的に２次元のシートまたは膜またはビーズを使用して、十分に３次元形態である細胞を、培養してもよい。
【００５４】
生体適合性材料は、３次元構造または足場に形成される。これらの構造には、細胞が付着して３次元組織に成長するための、間隙空間が設けられている。いくつかの実施形態において、フレームワークの開口部および／または間隙空間は、細胞が開口部または空間をまたがって延伸することを可能にするうえで適切なサイズのものとされる。活発に成長している細胞を、フレームワーク全体に延伸した状態に維持することは、本明細書に記載されている活動に関与する成長因子のレパートリーの生成を増強するものであると思われる。開口部が小さすぎる場合、細胞は急速にコンフルエンスに達し得るが、メッシュから簡単には脱け出せない。これらのトラップされた細胞には接触阻害が見られる場合があり、増殖を支持し且つ長期培養を維持するうえで必要とされる適切な因子の産生を中断してしまう可能性がある。開口部が大きすぎると、細胞が開口部をまたがって延伸することができなくなる可能性があり、これが原因で、増殖を支持し且つ長期培養を維持するうえで必要とされる適切な因子の間質細胞産生の減少につながる恐れがある。間隙空間は、少なくとも約１００μｍ、少なくとも１４０μｍ、少なくとも約１５０μｍ、少なくとも約１８０μｍ、少なくとも約２００μｍ、または少なくとも約２２０μｍであるのが、典型的である。発明者らが発見したところによれば、メッシュタイプのマトリックスを使用した場合、本明細書中に例示されているように、約１００μｍ〜約２２０μｍの範囲の開口部が問題なく機能する。ただし、フレームワークの３次元構造および複雑度によっては、他のサイズも許容される可能性がある。細胞を延伸させ、複製し、長期間にわたって成長し続けることを可能にする任意の形状または構造が機能するものと考えられ、本明細書中では本方法に従う細胞因子について詳述する。
【００５５】
いくつかの態様において、３次元フレームワークを形成するポリマーまたは糸は、編組、織布、ニットまたはその他の方法で配置され、メッシュまたはファブリックのようなフレームワークを形成している。また、材料または製作物を、発泡体、マトリックスまたはスポンジ状の足場へと製作することによって、材料類を形成してもよい。他の態様において、３次元フレームワークは、もつれた繊維の形態をしている。これらのもつれた繊維は、ポリマーまたは他の繊維を一体的に押圧して、間隙空間を有する材料を生成することによって作製されたものである。３次元フレームワークは、培養中の細胞の成長に対応した任意の形態または形状を取リ得る。ゆえに、更に後述するように、フレームワークの他の形態は、適切な馴化培地を生成するのに十分であると考えられる。
【００５６】
いくつかの異なる材料を使用して、足場またはフレームワークを形成してもよい。これらの材料には、非ポリマーおよびポリマー材料が包含される。ポリマーを使用する場合、ホモポリマー、ランダムポリマー、コポリマー、ブロックポリマー、コブロックポリマー（例えば、ジ、トリなど）、線状または分岐ポリマー、および架橋または非架橋ポリマーといったような、任意のタイプのポリマーとして差し支えない。足場またはフレームワークとして使用される材料の例としては、限定されるものではないが、とりわけ、ガラス繊維、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアミド（例えば、ナイロン）、ポリエステル（ダクロンなど）、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル化合物（ポリ塩化ビニル、ＰＶＣなど）、ポリカーボネート、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ、ＴＥＦＬＯＮ）、サーマノックス（ｔｈｅｒｍａｎｏｘ）（ＴＰＸ）、ニトロセルロース、ポリサッカライド（セルロース、キトサン、アガロースなど）、ポリペプチド（例えば、絹、ゼラチン、コラーゲン）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、およびデキストランが挙げられる。
【００５７】
いくつかの態様において、フレームワークまたはビーズは、使用条件下にて時間の経過に伴って劣化する材料で製作される場合がある。また、生分解性とは、インビボ条件下にてまたはインビトロ条件下にて投与された化合物もしくは組成物の、吸収性または分解も指す。生物分解は、直接的または間接的のいずれかにて、生物学的因子の作用を通して起こる場合もある。生分解性材料の例としては、限定されるものではないが、とりわけ、ポリラクチド、ポリグリコリド、ポリ（トリメチレンカーボネート）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（すなわち、ＰＬＧＡ）、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリカプロラクトン、腸縫合糸材料、コラーゲン（例えば、ウマコラーゲンフォーム）、ポリ乳酸、またはヒアルロン酸が挙げられる。例えば、これらの材料は、コラーゲンスポンジまたはコラーゲンゲルのような３次元フレームワークに織り込まれている場合もある。
【００５８】
他の態様において、培養物を長期間にわたって維持し、凍結保存する必要のある場合、且つ／あるいは更なる構造的完全性が所望される場合、３次元フレームワークを、非生分解性材料から構成してもよい。本明細書において、非生分解性材料とは、培地中の条件下にて著しく劣化または分解することのない材料を指す。例示的な非分解性材料の例としては、限定されるものではないが、ナイロン、ダクロン、ポリスチレン、ポリアクリレート、ポリビニル、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、延伸ＰＴＦＥ（ｅＰＴＦＥ）、およびセルロースが包含される。例示的な非劣化３次元フレームワークは、Nitex（登録商標）という商品名で入手可能なナイロンメッシュと、平均孔径を１４０μｍとし且つ平均ナイロン繊維径を９０μｍとしたナイロン濾過メッシュ（#3-210／36, ニューヨークのテトコ社（Tetko, Inc.,））とを含む。
【００５９】
他の態様において、ビーズ、足場またはフレームワークは、生分解性材料と非生分解性材料との組み合わせとされる。非生分解性材料は、培養中に３次元足場に安定性を提供している。一方、生分解性材料は、治療用途において十分な細胞因子を生成する細胞ネットワークを生成するのに十分な間隙空間の形成を可能にしている。生分解性材料は、非生分解性材料上にコーティングされる場合もあれば、あるいは織布されるか、編組みされるか、またはメッシュに形成される場合もある。生分解性材料および非生分解性材料の様々な組み合わせを使用してもよい。例示的な組み合わせは、極性構造を得ることを目的に、ポリ（エチレンテレフタレート）（ＰＥＴ）ファブリックを、ポリ［Ｄ−Ｌ−乳酸−コ−グリコール酸）という薄い生分解性ポリマーフィルムでコーティングしたものである。
【００６０】
様々な態様において、足場またはフレームワーク材料は、細胞を接種するのに先立って前処理して、細胞付着を増大させる場合もある。例えば、細胞を接種するのに先立って、いくつかの実施形態ではナイロンスクリーンを、０．１Ｍ酢酸で処理し、ポリリジン、ウシ胎児血清、および／またはコラーゲン中でインキュベートして、ナイロンをコーティングする。硫酸を使用すれば、ポリスチレンを同様に処理できる。他の実施形態では、３次元支持フレームワークの存在下にて細胞の成長を更に増大できるように、タンパク質（例えば、コラーゲン、エラスチン線維、細網線維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパラン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸など）、フィブロネクチン、および／または糖ポリマー（ポリ［Ｎ−ｐ−ビニルベンジル−Ｄ−ラクトアミド］、ＰＶＬＡ）をフレームワークに追加するかまたはそれらでフレームワークをコーティングして、細胞付着を向上させる場合もある。材料が細胞を付着させる基質としては貧弱な場合、足場またはフレームワークを処置することが役立つ。
【００６１】
一態様において、ＥＣＭの生産には、メッシュが使用される。本メッシュは、開口部をおよそ１００μｍとし、厚さをおよそ１２５μｍとした、平織りのナイロン６素材である。線維芽細胞は、培養中に、荷電タンパク質の相互作用を介してナイロンに付着し、ＥＣＭタンパク質を生成し堆積させながら、メッシュの空隙中に成長する。メッシュの開口部が過度に大きいか、または小さい場合、大した効果が得られない可能性がある。ただし、ＥＣＭを生成するまたは堆積させる能力を実質的に改変することなしに、上記のものとは異なったものにできる場合がある。別の態様では、ＥＣＭの生産に、他の織物材料（織布構成のポリオレフィンなど）を使用することによって、細胞増殖およびＥＣＭ堆積に好適な形状を与えている。
【００６２】
例えば、ナイロンメッシュを、本発明の任意の工程で培養用に調製する場合、所望のサイズに切断し、０．１〜０．５Ｍ酢酸で洗浄した後、高純度水ですすいでから、蒸気滅菌する。ＥＣＭ生産用の３次元足場として使用する場合には、メッシュサイズをおよそ１０ｃｍ×１０ｃｍの正方形とするが、メッシュを、意図された用途に好適な任意のサイズとして、本発明の任意の方法（例えば、接種、細胞増殖およびＥＣＭ産生ならびに最終形態の調製に対応した、培養方法）にて使用してもよい。
【００６３】
他の態様において、培養組織を生成するための足場はマイクロキャリアで構成され、このマイクロキャリアはビーズまたは粒子とされる。ビーズは微視的としてもよいし巨視的としてもよい。更には、組織への侵入を可能にするような寸法とされる場合もあれば、または特定のジオメトリーが形成されるように圧縮される場合もある。組織侵入のいくつかの実施形態において、細胞培養物のフレームワークは、細胞と組み合わさって３次元組織を形成する粒子を含む。細胞が粒子に付着するだけでなく、細胞どうしが相互に付着し合って、３次元組織を形成する。粒子および細胞の複合体は、注射またはカテーテルなどを介して組織または臓器に投与するのに十分なサイズとされる。ビーズまたはマイクロキャリアは、通例、２次元系または足場と見なされる。
【００６４】
本明細書において、「マイクロキャリア」とは、サイズがナノメートルからマイクロメートルである粒子で、不規則、非球形、球形、または楕円体である、任意の形状であり得る粒子を指す。
【００６５】
マイクロキャリアのサイズは、本明細書の目的に合わせて好適とされるように、特定の用途に好適な任意のサイズとすることができる。いくつかの実施形態では、３次元組織に好適なマイクロキャリアのサイズを、注射により投与可能なサイズとする場合がある。いくつかの実施形態では、マイクロキャリアの粒子サイズ範囲は、少なくとも約１μｍ、少なくとも約１０μｍ、少なくとも約２５μｍ、少なくとも約５０μｍ、少なくとも約１００μｍ、少なくとも約２００μｍ、少なくとも約３００μｍ、少なくとも約４００μｍ、少なくとも約５００μｍ、少なくとも約６００μｍ、少なくとも約７００μｍ、少なくとも約８００μｍ、少なくとも約９００μｍ、少なくとも約１０００μｍである。
【００６６】
いくつかの態様において、マイクロキャリアは生分解性材料を原料としている。いくつかの態様において、異なる生分解性ポリマーの層を２つ以上含むマイクロキャリアを使用してもよい。いくつかの実施形態では、少なくとも外側の第１層は、培養で３次元組織を形成するための生分解性の特性を備える。一方、少なくとも第１層とは異なる特性を含む生分解性の内部第２層は、組織または臓器に投与されたときに侵食される。
【００６７】
いくつかの態様において、マイクロキャリアは、多孔性マイクロキャリアである。多孔性マイクロキャリアは、マイクロ粒子の内外に分子を拡散できる隙間を有する、マイクロキャリアを指す。他の実施形態では、マイクロキャリアは、非多孔性マイクロキャリアである。非多孔性マイクロ粒子は、選択されたサイズの分子をマイクロ粒子の内外に拡散しない、マイクロ粒子を指す。
【００６８】
本組成物中に使用するためのマイクロキャリアは、生体適合性であり、細胞に対する毒性が低いか、または毒性が全くない。適切なマイクロキャリアは、治療の対象となる組織、治療の対象となる損傷のタイプ、所望される治療期間、インビボでの細胞培養物の寿命、および３次元組織形成の所要時間に応じて選択してもよい。マイクロキャリアは、天然もしくは合成、荷電（すなわち、アニオン性もしくはカチオン性）または非荷電、生分解性もしくは非生分解性の、様々なポリマーを含む場合がある。ポリマーを、ホモポリマー、ランダムコポリマー、ブロックコポリマー、グラフトコポリマー、および分岐ポリマーとしてもよい。
【００６９】
いくつかの態様において、マイクロキャリアは非生分解性マイクロキャリアを含む。非生分解性マイクロカプセルおよびマイクロキャリアとしては、例えば、限定されるものではないが、ポリスルホン、ポリ（アクリロニトリル−コ−塩化ビニル）、エチレン−酢酸ビニル、ヒドロキシエチルメタクリレート−メチル−メタクリレートのコポリマーを原料としたものが挙げられる。これらは、組織バルキング特性を提供する場合、またはマイクロキャリアが身体によって排除される実施形態において、有用とされる。
【００７０】
いくつかの態様において、マイクロキャリアは、分解可能な足場を含む。これらには、天然に存在するポリマーから作製されたマイクロキャリアが包含され、その例としては、限定されるものではないが、とりわけ、フィブリン、カゼイン、血清アルブミン、コラーゲン、ゼラチン、レシチン、キトサン、アルギネート、またはポリリジンなどのポリアミノ酸が挙げられる。他の態様では、分解性マイクロキャリアは合成ポリマーを原料としており、その例としては、限定されるものではないが、とりわけ、ポリラクチド（ＰＬＡ）、ポリグリコリド（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、ポリ（カプロラクトン）、ポリジオキサノントリメチレンカーボネート、ポリヒドロキシアルコナート（例えば、ポリ（ヒドロキシブチレート）、ポリ（エチルグルタメート）、ポリ（ＤＴＨイミノカルボニル（ビスフェノールＡ）イミノカーボネート）、ポリ（オルトエステル）、およびポリシアノアクリレートが挙げられる。
【００７１】
いくつかの態様において、マイクロキャリアは、典型的には水で充填された親水性ポリマーネットワークである、ヒドロゲルを含む。ヒドロゲルには、ポリマーの膨潤を選択的に誘発するという利点がある。微粒子の膨潤を誘発させる刺激としては、ポリマーネットワークの構成に応じて、ｐＨ、イオン強度、熱、電気、超音波、および酵素活性など、様々な種類があり得る。ヒドロゲル組成物に有用なポリマーの例としては、限定されるものではないが、とりわけ、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）；ポリ（Ｎ−イソプロピルアクリルアミド）；ポリ（メタクリル酸−ｇ−ポリエチレングリコール）；ポリアクリル酸、およびポリ（オキシプロピレン−コ−オキシエチレン）グリコールのポリマーから形成されたもの、ならびに硫酸クロンドロイタン（ｃｈｒｏｎｄｒｏｉｔａｎ）、キトサン、ゼラチン、フィブリノゲンなどの天然化合物、または合成ポリマーと天然ポリマーとの混合物、例えばキトサン−ポリ（エチレンオキシド）が挙げられる。ポリマーは、可逆的または不可逆的に架橋して、３次元組織の形成に適合可能なゲルを形成する場合がある。
【００７２】
例示的な態様において、本発明において用いられるマイクロキャリアまたはビーズは、全体または一部がデキストランで構成される。
【００７３】
本発明によれば、培養方法は、線維芽細胞などの間質細胞、特に初代ヒト新生児包皮線維芽細胞といったような、様々な種類の細胞の増殖に適用してもよい。様々な態様において、足場またはフレームワークに接種した細胞は、更に後述されているように、線維芽細胞を含み、ただし他の細胞を含むかまたは含まない、間質細胞であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、結合組織に典型的に由来する間質細胞である。この間質細胞としては、例えば、限定されるものではないが、（１）骨、（２）コラーゲンとエラスチンとを含む疎性結合組織（３）靭帯および腱を形成する線維性結合組織、（４）軟骨、（５）血液のＥＣＭ、（６）脂肪細胞を含む脂肪組織、および（７）線維芽細胞が挙げられる。
【００７４】
間質細胞の由来する組織または臓器には、皮膚、心臓、血管、骨髄、骨格筋、肝臓、膵臓、脳、包皮といったような様々な種類があり、これらは、生検（適切な場合）または剖検によって採取される場合がある。一態様において、胎児線維芽細胞は、新生児包皮などの包皮から大量に採取される場合がある。
【００７５】
いくつかの態様において、細胞は線維芽細胞を含み、この線維芽細胞は胎児、新生児、成人起源、またはそれらの組み合わせに由来し得る。いくつかの態様において、間質細胞は、胎児線維芽細胞を含み、この胎児線維芽細胞は、様々な異なる細胞および／または組織の成長を支持し得る。本明細書において、胎児線維芽細胞とは、胎児由来の線維芽細胞をいう。本明細書において、新生児線維芽細胞とは、新生児由来の線維芽細胞を指す。適切な条件下にて、線維芽細胞は、骨細胞、脂肪細胞、平滑筋細胞、および中胚葉起源の他の細胞といったような、他の細胞を発生させる可能性がある。いくつかの実施形態では、線維芽細胞は、皮膚由来の線維芽細胞である皮膚線維芽細胞を含む。正常なヒト皮膚線維芽細胞は、新生児包皮から単離できる。これらの細胞は通例、初代培養の最後に凍結保存される。
【００７６】
他の態様において、３次元組織は、幹細胞または前駆細胞を単独で使用して作製される場合もあれば、または本明細書中で考察されている細胞型のいずれかと組み合わせて使用して作製される場合もある。幹細胞および前駆細胞としては、限定されるものではないが、例えば、胚性幹細胞、造血幹細胞、神経幹細胞、表皮幹細胞、および間葉系幹細胞が挙げられる。
【００７７】
いくつかの実施形態では、「特定の」３次元組織は、３次元足場に、特定の器官（すなわち、皮膚、心臓）に由来する細胞、および／または、本明細書に記載の方法に従って培養で増殖した細胞および／または組織を後に投与される特定の個体に由来する細胞を、接種することによって調製してもよい。
【００７８】
或る特定のインビボ用途では、患者自身の組織から間質細胞を採取することが好ましい。３次元間質支持フレームワークの存在下での細胞の成長を更に増大できるように、タンパク質、例えばコラーゲン、ラミニン、弾性線維、細網線維、糖タンパク質、グリコサミノグリカン、例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラタン硫酸など；細胞マトリックス、および／または他の材料をフレームワークに追加するかまたはそれらでフレームワーク支持体をコーティングする場合もある。
【００７９】
ゆえに、本明細書に記載されている２次元または３次元培養系は、多様な細胞型および組織の成長に好適であり、培養される組織および所望のコラーゲン型に応じて、好適な間質細胞を選択してフレームワークに接種することができる。
【００８０】
本発明の方法および用途は、本明細書中で考察されているように、異なる細胞タイプ（組織特異的細胞など）または様々な種類の間質細胞に使用するのに好適である一方で、本発明において用いられる細胞の誘導はまた、種特異的とされる場合もある。したがって、種特異的なＥＣＭ組成物を生成してもよい。例えば、本発明において用いられる細胞としては、ヒト細胞を挙げることができる。例えば、本細胞は、ヒト線維芽細胞であり得る。同様に、細胞は、ウマ科（ウマ）、イヌ科（イヌ）、またはネコ科（ネコ）などの、別の動物種に由来する。加えて、或る種または種の株に由来する細胞を使用して、他の種または関連株（例えば、同種異系、同系および異種）に用いられるＥＣＭ組成物を生成してもよい。また、様々な種に由来する細胞を組み合わせて、多種ＥＣＭ組成物を生成しても差し支えないことを、理解すべきである。
【００８１】
したがって、本発明の方法および組成物は、非ヒト動物が関与する用途に好適とされる。本明細書において、「獣医学的」とは、動物、特に家畜の医学的もしくは外科的治療に関連するまたは関係のある、医学を指す。一般的な獣医学的動物としては、哺乳動物、両生類、鳥類、爬虫類、および魚類を挙げることができる。例えば、典型的な哺乳動物としては、イヌ、ネコ、ウマ、ウサギ、霊長類、齧歯類、ならびにウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジおよびブタなどの家畜類を挙げることができる。
【００８２】
上記で考察したように、培養物中には、間質細胞と共に、追加的な細胞が存在する可能性がある。これらの追加的な細胞には、とりわけ、培養中の長期的な成長の支持、成長因子の合成の増大、および細胞の足場への付着の促進を含む、いくつかの有益な効果を有し得る。追加的な細胞型料の例としては、限定されるものではないが、平滑筋細胞、心筋細胞、内皮細胞、骨格筋細胞、内皮細胞、周皮細胞、マクロファージ、単球、および脂肪細胞が挙げられる。そのような細胞は、線維芽細胞と共に、またはいくつかの態様では、線維芽細胞の非存在下にて、フレームワークに接種される場合がある。これらの間質細胞は、限定されるものではないが、例えば、皮膚、心臓、血管、骨髄、骨格筋、肝臓、膵臓、および脳を含む、適切な組織または器官に由来する場合がある。他の態様において、線維芽細胞を除く１つ以上の他の細胞型が、足場に接種される。更に他の態様において、足場は、線維芽細胞単独で接種される。
【００８３】
線維芽細胞は、線維芽細胞の供給源として機能すべき適切な器官または組織を脱凝集することによって、容易に単離することが可能である。例えば、組織または臓器を機械的に脱凝集させ、且つ／あるいは隣接する細胞間の結合を弱める消化酵素および／またはキレート剤で処理することによって、多大な細胞破壊なしに、組織を個々の細胞の懸濁液に分散させることを可能にし得る。組織を細かく切り刻み、切り刻まれた組織を、いくつかの消化酵素のいずれかを単独でまたは組み合わせて用いて処理することによって、酵素的解離を達成することが可能である。これらは、例えば、限定されるものではないが、トリプシン、キモトリプシン、コラゲナーゼ、エラスターゼ、ヒアルロニダーゼ、ＤＮアーゼ、プロナーゼまたはディスパーゼなどが挙げられる。また、機械的破壊は、例えば、限定されるものではないが、ほんの数例を挙げれば、グラインダー、ブレンダー、篩過、ホモジナイザー、圧力セル、またはインソネーターの使用を含むいくつかの方法で達成できる。一態様では、切除された包皮組織を、消化酵素、通例はコラゲナーゼおよび／またはトリプシナーゼを使用して処理することによって、細胞を被包構造から分離する。
【００８４】
例えば、線維芽細胞の単離を遂行するには、新鮮な組織サンプルを十分に洗浄し、ハンクスの平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）中で細かく刻んで、血清を取り除く。細かく切り刻まれた組織を、新しく調製されたトリプシンなどの解離酵素溶液中で、１〜１２時間インキュベートする。このようなインキュベーションの後、解離した細胞を懸濁し、遠心分離によりペレット化し、培養皿に播く。全ての線維芽細胞は、他の細胞の前に付着させ、それにより、適切な間質細胞を選択的に単離して、成長させることが可能である。単離された線維芽細胞はその後、コンフルエントに達するまで成長させ、コンフルエントな培養物から取り出し、３次元フレームワークに接種してもよい。Naughton et al., 1987, J. Med. 18(3&4):219-250を参照のこと。高濃度の間質細胞、例えば、およそ１０６〜５×１０７細胞／ｍｌを、３次元フレームワークに接種することによって、結果として、３次元間質支持の確立される期間が短縮される。
【００８５】
いったん組織が個々の細胞の懸濁液に希釈されたら、その懸濁液を、亜集団に分画してもよい。これらの亜集団からは、線維芽細胞および／または他の間質細胞および／または要素を、採取することが可能である。また、この採取を達成できるように、細胞分離のための標準的手法が使用され得る。これらの標準的手法としては、例えば、限定されるものではないが、特定の細胞タイプのクローニングと選択、不必要な細胞の選択的破壊（陰性選択）、混合集団における細胞凝集能の差異に基づく分離、凍結融解手順、混合集団における細胞の付着特性の差異、濾過、従来型遠心分離およびゾーン遠心分離、遠心分離（カウンターストリーミング遠心分離）、単位重力分離、向流分配、電気泳動および蛍光活性化セルソーティングが挙げられる。クローン選択と細胞分離技術の総評については、Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, 2d Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11 and 12, pp. 137-168を参照のこと。
【００８６】
一態様では、単離された線維芽細胞を成長させて、細胞バンクを生成することが可能である。細胞バンクを作成することによって、様々な量の培養バッチおよびタイミングの開始を可能にし、汚染物質および特定の細胞特性に関する細胞の先制試験が可能となる。その後、細胞バンクからの線維芽細胞を成長させて、細胞数を、足場に播種するための適切なレベルまで増加させる。細胞および細胞接触物質の環境曝露を伴う操作を、無菌の手法によって実施することによって、異物または所望されない微生物による汚染の可能性が低減する。
【００８７】
本発明の別の態様では、細胞を、単離後に、いくつかの継代を通して、マスター細胞バンクを構築するうえで好適な量まで増殖させる場合がある。次いで、細胞バンクを採取し、適切な容器に充填して、極低温環境で保存してもよい。マスター細胞バンクからの凍結バイアル内の細胞を、追加的な通路（通常は２つ以上）を介して解凍し、成長させてもよい。続いて、細胞を使用して、凍結保存されたワーキング細胞バンクを調製することが可能である。
【００８８】
細胞増殖ステップでは、ワーキング細胞バンクの段階で細胞のバイアルを使用して、３次元足場または支持体（例えば、メッシュもしくはマイクロキャリア）に接種するための細胞数を、更に増やす。各継代は、細胞増殖表面への接種、インキュベーション、細胞への栄養補給、および採取を含む、一連の継代培養ステップである。
【００８９】
細胞バンクおよび細胞増殖のための培養は、培養容器（培養フラスコ、ローラーボトル、またはマイクロキャリアなど）に接種することによって、実施できる。線維芽細胞などの間質細胞は、意図された成長表面に付着し、培地の存在下にて成長する。培養フラスコ、ローラーボトルおよびマイクロキャリアなどの培養容器は、細胞培養用に特別に構成されており、意図された用途に適格な様々なプラスチック材料から作製されるのが、一般的である。マイクロキャリアは通例、微視的または巨視的なビーズであり、その原料とされるプラスチック材料には、概ね様々な種類がある。ただし、それらマイクロキャリアは、他の材料（ガラスなど）もしくは固体／半固体の生物学ベースの材料（コラーゲンなど）または他の材料（デキストランなど）、上記の修飾糖複合体から作製される場合もある。
【００９０】
培養の間中、細胞増殖の過程では、消費された培地を定期的に新鮮な培地と交換することによって、栄養素の十分な利用可能性を維持し、培養物の阻害物質を除去する。培養フラスコおよびローラーボトルは、細胞が成長する表面を提供するものであり、典型的には足場依存性細胞の培養に使用される。
【００９１】
一態様では、３７℃に加熱したチャンバー内でインキュベーションを行う。培地とチャンバー環境との通信を要する培養トポロジーでは、チャンバーガス空間内で５％ＣＯ２ｖ／ｖを空気と共に使用して、ｐＨの調整を支援する。代替的に、培養温度およびｐＨが維持されるように装備された容器を、細胞増殖およびＥＣＭ生産操作の両方に使用してもよい。温度を３５℃未満または３８℃超とし、且つＣＯ２濃度を３％未満または１２％超とすることは、適切でない場合がある。
【００９２】
付着表面から細胞を採取できるように、増殖培地を除去し、細胞を緩衝塩類溶液ですすいで酵素競合タンパク質を低減させ、解離酵素を適用して、細胞剥離後に酵素を中和させる。採取した細胞懸濁液を回収し、その採取液を遠心分離により分離させる。継代培養採取物由来の細胞懸濁液をサンプリングし、回収された細胞の量および他の細胞属性を評価し、その後、新鮮な培地と組み合わせて接種材料として適用してもよい。許容可能なＥＣＭ特性を達成するには、細胞バンクおよび足場接種材料の調製に使用される継代数が、決定的に重要とされる。
【００９３】
適切な３次元足場が調製された後は、その３次元足場に、調製された間質細胞を播種することによって接種する。足場への接種の実施を可能にする方法としては、沈降など、様々な種類のものがある。好気性条件下でＥＣＭを培養する目的に調製されるメッシュの調製は、低酸素条件を生じさせるための嫌気性チャンバーを使用しないことを除き、低酸素成長メッシュの場合と同様な方法で行う。
【００９４】
例えば、好気性および低酸素性の両方の条件下にてＥＣＭの培養用に調製された両方のメッシュ用に、調製済み且つ滅菌済みメッシュを、直径１５０ｍｍ×深さ１５ｍｍの滅菌済みペトリ皿に収容し、およそ１０個の厚さに積み重ねる。その後、メッシュのスタックに、沈降によって接種する。細胞を新鮮な培地に添加し、接種用の適切な細胞濃度を得る。接種材料をメッシュのスタックに追加する。これらのメッシュのスタック内では、細胞がナイロン繊維上に定着し、インキュベート条件下で付着する。適当な時間の経過後、個別に播種されたメッシュシートを無菌でスタックから分離させ、およそ５０ｍｌの増殖培地を含有した別々の１５０ｍｍ×１５ｍｍのペトリ皿に個別に収容してもよい。
【００９５】
接種された培養物のインキュベーションを、低酸素条件下で行う。この場合、通常の培養条件下で生成されたＥＣＭと比較して、ＥＣＭおよび周辺の培地が、独特な特性にて生成されることが発見されている。本明細書において、低酸素条件は、周囲空気の酸素濃度と比較して、酸素濃度が低いこと（およそ酸素１５％〜２０％）を特徴としている。一態様において、低酸素条件は、酸素濃度が約１０％未満であることを特徴としている。別の態様において、低酸素条件は、酸素濃度が約１％〜１０％、１％〜９％、１％〜８％、１％〜７％、１％〜６％、１％〜５％、１％〜４％、１％〜３％、または１％〜２％であることを特徴としている。或る特定の態様において、本系は、培養容器内で約１〜３％の酸素を維持する。周囲ガス濃度を制御できる培養装置、例えば、嫌気性チャンバーを使用することによって、低酸素条件を生じ、且つ維持することが可能である。
【００９６】
細胞培養物のインキュベーションは通例、増殖および播種用の１５〜２０％の酸素と５％のＣＯ２とを含む通常の大気中で行い、その時点で、低酸素培養物を、９５％窒素／５％ＣＯ２で充填された気密チャンバーに分割して、培地内に低酸素環境を生じさせる。
【００９７】
例えば、低酸素条件下でＥＣＭを生成する目的でメッシュ培養されたペトリ皿を、３７℃、９５％空気／５％ＣＯ２にて２〜３週間インキュベートする。大気圧近傍培養期間の経過後、メッシュのペトリ皿を、嫌気性培養用に設計されたチャンバー内でインキュベートする。このチャンバーは、およそ９５％の窒素と５％のＣＯ２との混合ガスでパージされている。消費された増殖培地を、培養期間全体を通して、大気中の酸素レベルの新鮮な培地と交換する。培地を交換した後、メッシュで充填されたペトリ皿を嫌気性チャンバーに入れ、チャンバーを９５％窒素／５％ＣＯ２でパージし、３７℃でインキュベートする。培養されたメッシュが採取されるのは、所望されるサイズに達した際、または所望される生物学的成分を含有するようになった場合である。
【００９８】
インキュベーション期間中に、間質細胞は直線的に成長し、３次元フレームワークを覆い、その後、フレームワークの開口部中への成長を開始する。成長を続けている細胞は、無数の成長因子、調節因子、およびタンパク質を生成し、これらのいくつかは周辺の培地に分泌され、その他は支持体上に堆積して、ＥＣＭを構成する。これに関しては、以下に詳述する。培養物に対し成長因子および調節因子を添加してもよいが、必須ではない。間質細胞を培養することにより、不溶性画分および可溶性画分の両方が、生成される。細胞を、ＥＣＭタンパク質を適切に堆積させるのに適切な程度まで成長させる。
【００９９】
３次元組織の培養中に、増殖を続けている細胞がフレームワークから離れて、培養容器の壁に付着する場合がある。この培養容器中では、細胞が増殖し続け、コンフルエントな単層を形成する。こうした発生は、細胞の成長に影響を与える可能性がある。これを最小限に抑えるため、離れた細胞を、栄養補給中に、または３次元細胞培養物を新しい培養容器に移すことによって、除去する場合がある。コンフルエントな単層を除去するか、または新しい容器内の新鮮な培地に培養組織を移すことによって、３次元培養物の増殖活動が維持または回復されるようにする。いくつかの態様において、除去または移送を培養容器で行う場合がある。この培養容器中の培養細胞の単層は、コンフルエンシーが２５％を超える。代替的に、いくつかの実施形態では、培養物を攪拌することによって、離れた細胞が付着するのを防ぐ。他の実施形態では、新鮮な培地を、本系を通して継続的に注入する。いくつかの態様では、２つ以上の細胞タイプを同時に培養する場合もあれば、最初に１つ目を培養し、次いで２つ目を培養する（例えば、線維芽細胞を培養してから、平滑筋細胞または内皮細胞を培養する）場合もある。
【０１００】
３次元足場への接種の後、細胞培養物を、細胞が３次元組織へと成長するのを支持する適切な栄養培地および培養条件でインキュベートする。市販培地の多くは、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＲＰＭＩ  １６４０、フィッシャー、イスコーブ、およびマッコイは、細胞培養物の成長を支持するうえで好適であり得る。この培地に対し、追加的な塩、炭素源、アミノ酸、血清および血清成分、ビタミン、ミネラル、還元剤、緩衝剤、脂質、ヌクレオシド、抗生物質、付着因子、および成長因子を補充する場合もある。多様な種類の培地用の製剤は、当業者に利用可能な様々な参考文献（例えば、Methods for Preparation of Media, Supplements and Substrates for Seram Free Animal Cell Cultures, Alan R. Liss, New York (1984); Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley & Sons, Chichester, England (1996); Culture of Animal Cells, A Manual of Basic Techniques, 4 th Ed., Wiley-Liss (2000)）に記載されている。
【０１０１】
本発明の培養工程のいずれかにおいて使用される増殖培地または培養培地は、好気性もしくは低酸素性条件下のいずれであっても、血清含有のものとしてもよいし、または血清不含のものとしてもよい。一態様において、培地は、４．５ｇ／Ｌグルコース、２ｍＭ相当量のアラニル−Ｌ−グルタミンを含有し、名目上１０％ウシ胎児血清が補充された、ダルベッコ改変イーグル培地とされる。別の態様において、培地は無血清培地であるダルベッコのイーグル培地、およびGlutamax（登録商標）を含む４．５ｇ／Ｌグルコースベース培地とされる。この培地には、０．５％の血清アルブミン、２μｇ／ｍｌヘパリン、１μｇ／ｍｌ組換え塩基性ＦＧＦ、１μｇ／ｍｌ大豆トリプシン阻害剤、１×ＩＴＳサプリメント（インスリン−トランスフェリン−セレン、Sigmaカタログ番号I3146）、１：１０００希釈脂肪酸サプリメント（Sigmaカタログ番号7050）、および１：１０００希釈コレステロールが補充されている。加えて、低酸素培養および好気培養の両方に対し、同じ培地を使用してもよい。一態様では、播種および増殖後の第１週目に、増殖培地を、血清ベースの培地から無血清培地に交換する。
【０１０２】
培養条件を、ｐＨ、温度、およびガス（例えば、Ｏ２、ＣＯ２など）の適切な条件下で行うことによって、低酸素の増殖状態を維持させる。いくつかの実施形態では、３次元細胞培養物を、インキュベーション期間中に、培地中に懸濁させる場合がある。そうすることによって、増殖活性を最大限に高め、画分の望ましい生物学的活性を促進する因子の生成を、可能にしている。加えて、培養液を定期的に「供給」し、使用済みの培地を除去し、離れた細胞の数を低減させ、新しい栄養源を添加する。インキュベーション期間中に、培養された細胞は直線的に成長し、３次元足場のフィラメントを覆い、その後、足場の開口部中への成長を開始する。
【０１０３】
低酸素条件下でのインキュベーション中には、通常の大気中酸素濃度を約１５〜２０％とした場合と比較して、数千もの遺伝子が差次的に発現する。いくつかの遺伝子、とりわけ、特定のラミニン種、コラーゲン種およびＷｎｔ因子のような組成物は、上方制御または下方制御されていることが見出されてきた。様々な態様において、３次元ＥＣＭは、正常な状態での成長と比較して、低酸素条件での成長に起因する細胞によって生成される特徴的な指紋または一連の細胞産物によって定義され得る。本明細書中で具体的に例示されているＥＣＭ組成物において、３次元組織および周辺の培地は、様々な因子を発現することおよび／または分泌することを特徴としている。
【０１０４】
本明細書中に記載されている３次元組織および組成物の場合、足場またはフレームワーク上にＥＣＭが存在する。いくつかの態様では、低酸素条件下での成長、および支持体上で成長した細胞の選択に起因する多様な種類のラミニンおよびコラーゲンが、ＥＣＭ中に含有されている。堆積したＥＣＭタンパク質の比率を操作または増大できるように、特定のラミニンとコラーゲン種の発現を上方制御または下方制御する低酸素条件下にて細胞を成長させるだけでなく、適切なコラーゲン型を生成する線維芽細胞を選択する。
【０１０５】
線維芽細胞の選択は、特定のコラーゲン型を定義する適切なアイソタイプまたはサブクラスのモノクローナル抗体を使用して、いくつかの態様において達成することが可能である。他の態様では、磁気ビーズなどの固体基板を使用して、抗体に結合された細胞を選択または排除する場合がある。これらの抗体の組み合わせを使用して、所望されるコラーゲン型を発現する線維芽細胞を（陽性または陰性）選択してもよい。代替的に、フレームワークに接種する目的に使用される間質を、所望されるコラーゲン型を合成する細胞の混合物としてもよい。例示的なコラーゲン型の分布および起源は、表１に示す通りである。
【０１０６】
（表１）様々なコラーゲン型の分布および起源
2021511833.tif 000002
【０１０７】
ＥＣＭ組成物中に存在する可能性のある追加的なコラーゲン型は、表２に示す通りである。
【０１０８】
（表２）コラーゲンの種類および対応する遺伝子
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【０１０９】
上記で考察したように、本明細書に記載のＥＣＭ組成物中に含有されるコラーゲンには、様々な種類がある。実施例１の表３に示すように、いくつかのコラーゲン種の発現は、低酸素培養されたＥＣＭ組成物において上方制御されることが見出されてきた。したがって、本発明の一態様において、１つ以上の胚性タンパク質を含むＥＣＭ組成物は、約１５〜２０％の酸素という酸素条件で生成されるものと比較した、コラーゲン種の上方制御を含む。別の態様において、上方制御されたコラーゲン種は、Ｖ型α１、ＩＸ型α１、ＩＸ型α２、ＶＩ型α２、ＶＩＩＩ型α１、ＩＶ、型α５、ＶＩＩ型α１、ＸＶＩＩＩ型α１、およびＸＩＩ型α１である。
【０１１０】
本明細書中に記載されているＥＣＭ組成物は、様々なコラーゲン類だけでなく、様々なラミニン類をも含む。ラミニンは糖タンパク質ヘテロ三量体のファミリーであり、コイルドコイルドメインを介して結合されたα鎖、β鎖、およびγ鎖サブユニットで構成されている。現在に至るまで、５種類のαラミニン鎖、４種類のβラミニン鎖、および３種類のγラミニン鎖が同定されてきており、これらを組み合わせて１５種類の異なるアイソフォームを形成することが可能である。この構造の内部には、他のラミニンおよび基底層分子、ならびに膜結合受容体に対して結合活性を有する、同定可能なドメインが存在する。ドメインＶＩ、ＩＶｂ、およびＩＶａは、球状構造を形成しているのに対し、ドメインＶ、ＩＩＩｂ、およびＩＩＩａ（システインに富むＥＧＦ様要素を含有するドメイン）は、棒状の構造を形成している。三本鎖のドメインＩおよびＩＩは、三本鎖コイルドコイル構造（長腕）の形成に関与している。
【０１１１】
ラミニン鎖は、共有された独特な機能を有し、特定の時間的（発達的）および空間的（組織部位特異的）パターンで表現される。ラミニンのα鎖は、組織固有の分布パターンを呈すること、および主要細胞相互作用部位が含まれていることから、ヘテロ三量体の機能的に重要な部分であると見なされている。血管内皮は、２種類のラミニンアイソフォームを発現することが知られており、発生段階、血管の種類、および内皮の活性化状態に応じて発現様式が異なる。
【０１１２】
したがって、本発明の一態様において、１つ以上の胚性タンパク質を含むＥＣＭ組成物は、約１５〜２０％の酸素という酸素条件で生成されるものと比較して、多様なラミニン種の上方制御または下方制御を含む。
【０１１３】
ラミニン８は、α４、β１、およびγ１ラミニン鎖で構成されている。ラミニンのα４鎖は、成人において、および発達中にも、広範に分布している。成人において、α４鎖は、心臓、骨格、平滑筋の線維を取り巻く基底膜内、ならびに肺胞中隔内で同定される場合がある。また、α４鎖は、毛細血管内およびそれより大きい血管の両方の内皮基底膜内、および末梢神経の神経周囲膜内、ならびに骨髄の類洞間腔内のほか、大動脈内、および小動脈内にも存在することが、知られている。ラミニン８は、血小板を介して発現し、付着する、血管内皮内にある主要ラミニンアイソフォームであり、３Ｔ３−Ｌ１脂肪細胞で合成され、その合成レベルは細胞の脂肪変換時に増加することが、明らかにされている。ラミニン８は、通常は間葉系細胞の系統で発現し、微小血管を結合組織内へと誘導する、ラミニンアイソフォームであると考えられている。また、ラミニン８は、マウスの骨髄初代培養細胞、細動脈壁、および類洞間腔において、発達段階にある骨髄内の主要ラミニンアイソフォームとして同定されてきている。α４鎖を含有するラミニンアイソフォームは、造血細胞に隣接する成体骨髄内に局在することから、造血細胞の発達と生物学的に関連する相互作用を有する可能性がある。
【０１１４】
したがって、本発明の別の態様において、ＥＣＭは、ラミニン８などのラミニン種の上方制御を含む。別の態様において、本発明の３次元組織によって生成されるラミニンは、本組成物中に存在するラミニンタンパク質の特徴またはシグネチャーを定義する、少なくともラミニン８を含む。
【０１１５】
本明細書に記載のＥＣＭ組成物中に含有されるＷｎｔ因子には、様々な種類があり得る。Ｗｎｔファミリー因子は、シグナル伝達分子であり、無数の細胞経路および細胞間相互作用プロセスにおいて役割を果たしている。Ｗｎｔシグナル伝達は、腫瘍形成、初期の胚の中胚葉性パターン形成、脳および腎臓の形態形成、乳腺増殖の調節、ならびにアルツハイマー病に関与している。実施例１の表４に示すように、いくつかの種のＷｎｔタンパク質の発現は、低酸素培養されたＥＣＭ組成物において上方制御されることが見出されてきた。したがって、本発明の一態様において、１つ以上の胚性タンパク質を含むＥＣＭ組成物は、約１５〜２０％の酸素という酸素条件で生成されるものと比較した、Ｗｎｔ種の上方制御を含む。別の態様において、上方制御の対象となるＷｎｔ種は、ｗｎｔ７ａおよびｗｎｔ１１である。別の態様において、本発明の３次元組織によって生成されるＷｎｔ因子は、本組成物中に存在するＷｎｔタンパク質の特徴またはシグネチャーを定義する、少なくともｗｎｔ７ａおよびｗｎｔ１１を含む。
【０１１６】
本明細書に記載の培養方法は、低酸素条件下で培養することを含むものであり、様々な成長因子の発現を上方制御することもまた、明らかにされてきた。したがって、本明細書に記載のＥＣＭ組成物は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの様々な成長因子を含む場合がある。本明細書において、ＶＥＧＦは、公知の全てのＶＥＧＦファミリーメンバーを含むことを、意図したものである。ＶＥＧＦは、成長因子のサブファミリーであり、より具体的には、シスチンノット成長因子の血小板由来成長因子ファミリーのサブファミリーである。ＶＥＧＦは、血管新生および血管新生の両方において周知の役割を有する。公知のＶＥＧＦには、いくつかの種類があり、例えば、他のＶＥＧＦ種が発見される以前はＶＥＧＦとして知られていたＶＥＧＦ−Ａが挙げられる。他のＶＥＧＦ種としては、胎盤成長因子（Ｐ１ＧＦ）、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−ＣおよびＶＥＧＦ−Ｄが挙げられ、加えて、ヒトＶＥＧＦのいくつかのアイソフォームが周知である。
【０１１７】
本明細書に記載の低酸素条件下で培養することによる、Ｗｎｔタンパク質および成長因子の生産の増加に従い、本発明は更に、Ｗｎｔタンパク質および血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）を生成する方法を提供する。この方法は、本明細書中に記載されているような低酸素条件下にて、好適な増殖培地中の３次元表面上で細胞を培養し、Ｗｎｔタンパク質およびＶＥＧＦを生成することを含み得る。例示的な態様では、Ｗｎｔ種はｗｎｔ７ａおよびｗｎｔ１１であり、ＶＥＧＦはＶＥＧＦ−Ａである。本明細書に更に記載されるように、または当該技術分野において公知の方法により、タンパク質を更に処理または収集してもよい。
【０１１８】
全体を通して考察されているように、本発明のＥＣＭ組成物は、可溶性画分および非可溶性画分の両方、またはそれらの任意の部分を含む。本発明の組成物は、一方または両方の画分、ならびにそれらの任意の組み合わせを含み得ることを、理解すべきである。加えて、個別に使用される画分から、または他の単離物または公知の組成物と組み合わせて使用される画分から、個々の成分を単離してもよい。
【０１１９】
したがって、様々な態様において、本発明の方法を使用して製造されたＥＣＭ組成物は、直接使用してもよいし、または様々な方法で処理してもよい。その方法は、不溶性画分および可溶性画分の両方に対し適用可能であると考えられる。無細胞上清と培地とを含む可溶性画分を、因子の保存および／または濃縮に備えて、凍結乾燥してもよい。必要に応じて、様々な生体適合性の防腐剤、凍結保護剤、および安定剤を使用して、活性を維持してもよい。生体適合剤の例としては、とりわけ、グリセロール、ジメチルスルホキシド、およびトレハロースが挙げられる。また、凍結乾燥物は、緩衝液、増量剤、および張度調整剤を含む、１つ以上の賦形剤を有し得る。更に後述されているように、凍結乾燥された培地は、好適な溶液または医薬的希釈剤を添加することによって再構成される場合もある。
【０１２０】
他の態様では、可溶性画分を透析する。透析は、多孔質膜全域にわたる選択的拡散に基づいてサンプル成分を分離することを目的に、最も一般的に使用されている手法の１つである。膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、孔径に基づいて算定される。このＭＷＣＯは、溶質の９０％が膜に保持されるときの分子量を特徴としている。或る特定の態様では、所望のカットオフに応じて任意の孔径を有する膜が、企図される。典型的なカットオフは、５，０００ダルトン、１０，０００ダルトン、３０，０００ダルトン、および１００，０００ダルトンであるが、全てのサイズが企図される。
【０１２１】
いくつかの態様では、培地中の活性成分（例えば、成長因子）を沈殿させることによって、可溶性画分を処理する場合がある。沈殿に使用できる手順には、硫酸アンモニウムによる塩析、または親水性ポリマー、例えば、ポリエチレングリコールの使用など、多様な種類がある。
【０１２２】
他の態様では、可溶性画分を、様々な選択的フィルターを用いた濾過に供する。濾過による可溶性画分の処理は、画分に存在する因子を濃縮し、可溶性画分に用いられている小分子または溶質を除去する用途においてもまた、有用とされる。指定された分子量に対して選択性を有するフィルターとしては、５０００ダルトン未満、１０，０００ダルトン未満、および１５，０００ダルトン未満が挙げられる。本明細書中に記載されているように、他のフィルターを使用して、処理された培地の治療活性に関してアッセイを行ってもよい。例示的なフィルターおよび濃縮器系としては、とりわけ、中空繊維フィルター、フィルターディスク、およびフィルタープローブベースのものが挙げられる（例えば、アミコン攪拌限外濾過セル（Amicon Stirred Ultrafiltration Cells）を参照）。
【０１２３】
更に他の態様では、塩もしくは不純物を除去すること、または培地の様々な成分を分画することを目的に、可溶性画分をクロマトグラフィーに供する。使用できるクロマトグラフィー技術としては、分子篩過、イオン交換、逆相、およびアフィニティークロマトグラフィー技術のような、様々なものが挙げられる。生物活性を顕著に損なうことなく馴化培地が処理されるように、穏やかなクロマトグラフィー媒体を使用する場合もある。例としては、限定されるものではないが、とりわけ、デキストラン、アガロース、ポリアクリルアミドベースの分離媒体（例えば、セファデックス、セファロース、およびセファクリルなどの様々な商品名で入手可能なもの）が挙げられる。
【０１２４】
更に他の態様では、馴化培地をリポソームとして処方する。活性因子の送達、および寿命延長を目的に、成長因子をリポソームの内腔に導入またはカプセル化してもよい。当該技術分野において知られているように、リポソームは、マルチラメラ（ＭＬＶ）、安定したプルラメラ（ＳＰＬＶ）、小型ユニラメラ（ＳＵＶ）、または大型ユニラメラ（ＬＵＶ）の小胞など、様々なタイプに範疇分けできる。リポソームは様々な脂質化合物から調製できる。これらの脂質化合物は、合成物とされる場合もあれば、または天然物とされる場合もある。例としては、ホスファチジルエーテル類またはエステル類（例えばホスホチジルセリン、ホスホチジルコリン、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジルイノシトール、ジミリストイルホスファチジルコリン）；コレステロールなどのステロイド類；セレブロシド類；スフィンゴミエリン；グリセロ脂質類；およびその他の脂質が挙げられる（例えば、米国特許第５，８３３，９４８号を参照）。
【０１２５】
可溶性画分を、追加的な添加剤なしで直接的に使用してもよいし、様々な医薬的に許容される賦形剤、ビヒクルまたは担体を含む医薬組成物として調製してもよい。「医薬組成物」とは、可溶性および／または不溶性画分の形態、ならびに少なくとも１つの医薬的に許容されるビヒクル、担体、または賦形剤を指す。皮内、皮下もしくは筋肉内投与用の組成物は、水性もしくは油性ビヒクル中にＥＣＭ組成物を溶かした無菌懸濁液、溶液または乳濁液中で調製できる。また、本組成物は、懸濁剤、安定剤または分散剤などの配合剤を含有する場合がある。注射用の製剤は、防腐剤の有無にかかわらず、単位剤形にて、複数回投与用容器に収容されたアンプルで提供される場合もある。代替的に、本組成物は、好適なビヒクルで再構成されるように、粉末形態で提供される場合がある。その例としては、限定されるものではないが、発熱物質を含まない滅菌水、生理食塩水、緩衝液、またはブドウ糖溶液が挙げられる。
【０１２６】
他の態様では、３次元組織は、凍結保存された調製物であり、使用前に解凍される。医薬的に許容される凍結保存剤としては、とりわけ、グリセロール、糖類、ポリオール、メチルセルロース、およびジメチルスルホキシドが挙げられる。糖剤には、単糖、二糖、および他のオリゴ糖が含まれ、最大凍結濃縮溶液のガラス転移温度（Ｔｇ）は少なくとも−６０℃、−５０℃、−４０℃、−３０℃、−２０℃、−１０℃、または０℃とされる。凍結保存における使用のための例示的な糖は、トレハロースである。
【０１２７】
いくつかの態様では、３次元組織を使用する際は事前に、細胞の殺滅処理を行う。いくつかの態様では、足場上に堆積したＥＣＭを収集し、投与用に処置する場合もある（米国特許第５，８３０，７０８号および同第６，２８０，２８４号を参照。これらの文献は、本明細書において参照により援用されている）。
【０１２８】
他の実施形態では、３次元組織を濃縮し、医薬的に許容される媒体で洗浄して投与する場合もある。遠心分離または濾過などの、本組成物を濃縮するための様々な技術が、当該技術分野において利用可能である。例としては、デキストラン沈降および分画遠心分離が挙げられる。また、３次元組織の処方は、懸濁液のイオン強度を等張性（すなわち、約０．１〜０．２）および生理学的ｐＨ（すなわち、ｐＨ６．８〜７．５）に調整することを含み得る。また、製剤は、細胞懸濁液の投与または安定性の補助を目的とした、潤滑剤または他の賦形剤を含有する場合がある。これらには、とりわけ、糖類（例えば、マルトース）と、ポリエチレングリコールおよびヒアルロン酸などの有機高分子と、が含まれる。様々な製剤の調製に関する追加的な詳細は、米国特許出願公開第２００２／００３８１５２号に記載されている。これらの文献は、本明細書において参照により援用されている。
【０１２９】
上記のように、本発明のＥＣＭ組成物は、予期される用途およびＥＣＭ組成物の適切な送達または投与に応じて、いくつかの方法で処理してもよい。例えば、本組成物は、３次元足場またはインプラントとして送達してもよいし、または組成物は上記のように注射用に処方してもよい。「投与」または「投与する」という用語は、本発明の化合物または医薬組成物を、治療を必要とする対象に提供する行為を含むものとして定義される。本明細書中に使用されている「非経口投与」および「非経口的に投与する」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射ならびに注入が挙げられる。本明細書中に用いられている「全身投与」、「全身に投与する」、「末梢投与」および「末梢投与」という語句は、中枢神経系に直接投与されるもの以外の化合物、薬物、またはその他の物質（例えば、対象の系に投入されるもの）を投与することを意味する。それゆえ、代謝および他の同様のプロセス、例えば皮下投与に供される。
【０１３０】
本明細書中に用いられている「対象」という用語は、標記（subject）方法が実行される対象となる任意の個体または患者を指す。対象はヒトとされるのが一般的であるが、当業者に理解されるように、対象を動物としてもよい。ゆえに、齧歯類（例えば、マウス、ラット、ハムスター、およびモルモット）、ネコ、イヌ、ウサギ、家畜類（例えば、ウシ、ウマ、ヤギ、ヒツジ、およびブタ）などのその他の動物、ならびに霊長類（例えば、サル、チンパンジー、オランウータン、およびゴリラ）も、対象の定義に包含される。
【０１３１】
本発明のＥＣＭ組成物は、用途が多岐に及んでいる。例えば、限定されるものではないが、損傷した細胞もしくは組織の修復および／または再生を促進すること、パッチでの使用により、組織の再生を促進すること、組織培養系での使用により、細胞（幹細胞など）を培養すること、植込み型デバイス（例えば、ペースメーカー、ステント、ステントグラフト、人工血管、心臓弁、シャント、薬物送達ポートもしくはカテーテル）に関連して用いられる表面コーティングで使用すること、シワなどの皮膚表面の軟組織の修復、増強、および／または改善を促進すること、生物学的癒着防止剤として、または細胞送達もしくは送達部位での維持のための生物学的ビヒクルとして使用することが挙げられる。
【０１３２】
加えて、本明細書中の任意の方法に記載されている細胞の培養に由来するＥＣＭ組成物は、本発明の任意の他の用途または方法で使用できる。例えば、本発明の組織培養系を使用して細胞を培養することにより生成されるＥＣＭ組成物の用途として考えられるのは、例えば、細胞の修復および／または再生、パッチでの使用により、組織の再生を促進すること、組織培養系での使用により、細胞（幹細胞など）を培養すること、植込み型デバイス（例えば、ペースメーカー、ステント、ステントグラフト、人工血管、心臓弁、シャント、薬物送達ポートもしくはカテーテル）に関連して用いられる表面コーティングで使用すること、シワなどの皮膚表面の軟組織の修復、増強、および／または改善を促進すること、生物学的癒着防止剤として、または細胞送達もしくは送達部位での維持のための生物学的ビヒクルとして使用することが挙げられる。
【０１３３】
様々な実施形態において、本発明は、細胞もしくは組織の修復および／または再生のための、ならびに軟組織修復を促進するための方法を含む。一実施形態は、修復もしくは再生の対象となる細胞を、本発明のＥＣＭ組成物と接触させることによる、細胞の修復および／または再生の方法を含む。本方法は、骨軟骨細胞を含む、本明細書中で考察されているような様々な細胞の修復および／または再生に使用され得る。
【０１３４】
一態様において、本方法では、骨軟骨欠損を修復することが企図される。本明細書において、「骨軟骨細胞」は、軟骨形成または骨形成系統のいずれかに属する細胞、あるいは環境シグナルに応じて軟骨形成系統または骨形成系統のいずれかに分化し得る細胞を指す。この可能性は、公知の手法によりインビトロまたはインビボで試験できる。ゆえに、一態様において、本発明のＥＣＭ組成物は、軟骨形成細胞、例えば、軟骨を生成できる細胞、または軟骨細胞およびそれら自体が軟骨細胞に分化する細胞を含む、軟骨を生成する細胞（例えば、軟骨細胞前駆細胞）に分化する細胞を修復および／または再生する目的に使用される。ゆえに、別の態様において、本発明の組成物は、結合組織の修復および／または再生に有用である。本明細書において、「結合組織」とは、哺乳動物の体内の多くの構造組織のいずれかを指す。その例としては、限定されるものではないが、骨、軟骨、靭帯、腱、半月板、真皮、皮下組織、筋肉、脂肪組織、関節包が挙げられる。
【０１３５】
本発明のＥＣＭ組成物は、可動関節、例えば、膝、足首、肘、腰、手首のほか、手指もしくは足指の指関節、または顎関節の骨軟骨欠損を治療する目的に、使用され得る。そのような骨軟骨欠損は、外傷（例えば、スポーツ傷害もしくは過度の摩耗）、または変形性関節症のような疾患の結果としてもたらされる場合もある。特定の態様は、変形性関節症軟骨の表在性病変の治療または予防における本発明のマトリックスの使用に関する。加えて、本発明は、老化もしくは出産に起因する骨軟骨欠損の治療または予防に有用である。本発明の文脈における骨軟骨欠損は、外科手術との関連において、軟骨および／または骨を修復することが必要とされる病態を含むことも理解すべきである。例えば、限定されるものではないが、美容整形（例えば、鼻、耳）が、挙げられる。ゆえに、そのような欠損は、軟骨もしくは骨の形成が破壊されている部位、または軟骨もしくは骨が損傷しているか存在しない部位等、体の任意の部位に発生する可能性がある。
【０１３６】
上記で考察されているように、特定の細胞の成長を誘導もしくは刺激する成長因子または他の生物学的因子が、本発明のＥＣＭ組成物中に含まれる場合がある。成長因子の種類は、本組成物が対象とする細胞の種類および用途に依存する。例えば、骨軟骨細胞の場合、細胞成長因子（例えば、ＴＧＦ−β）などの追加的な生物活性剤、軟骨形成を刺激する物質（例えば、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−１２、およびＢＭＰ−１３のような、軟骨形成を刺激するＢＭＰ）、間質細胞の足場への遊走を刺激する因子、マトリックス沈着を刺激する因子、抗炎症薬（例えば、非ステロイド系抗炎症薬）、免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン）が存在し得る。他のタンパク質、例えば血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、インスリン様成長因子（ＩＧＦ）、線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、ヒト内皮細胞成長因子（ＥＣＧＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）などの他の成長因子、軟骨由来形態形成タンパク質（ＣＤＭＰ）、ＯＰ−１、ＯＰ−２、ＢＭＰ３、ＢＭＰ４、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１１、ＢＭＰ１４、ＤＰＰ、Ｖｇ−ｌ、６０Ａ、およびＶｇｒ−ｌなどの他の骨形成タンパク質、コラーゲン、弾性線維、細網線維、糖タンパク質、またはグリコサミノグリカン、例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸なども含まれ得る。例えば、ＴＧＦ−βなどの成長因子は、アスコルビン酸とともに、軟骨細胞の分化および軟骨細胞による軟骨形成を誘発することが分かっている。更に、ヒアルロン酸は軟骨細胞や他の間質細胞の付着に好適な基質であり、足場の一部として組み込まれる場合もあれば、足場上にコーティングされる場合もある。
【０１３７】
加えて、特定の細胞の成長および／または活性に影響を与える他の因子もまた、使用され得る。例えば、軟骨細胞の場合、軟骨細胞による軟骨産生を刺激するコンドロイチナーゼなどの因子を、マトリックスに追加することによって、軟骨細胞を肥大状態に維持することが可能となる。これは、米国特許出願第２００２／０１２２７９０号に記載されており、これらの文献は、本明細書において参照により援用されている。別の態様において、本発明の方法は、ポリ硫酸化アルギネートもしくは他のポリ硫酸化多糖、例えばポリ硫酸化シクロデキストリンおよび／またはポリ硫酸化イヌリン、または結合組織細胞内でＥＣＭの産生を刺激し得る他の成分の存在を含む。これは、国際特許出願公開（国際公開）第２００５／０５４４４６号に記載されている通りであり、これらの文献は、本明細書において参照により援用されている。
【０１３８】
修復および／もしくは再生の対象となる細胞または組織は、本明細書中に記載されている方法のいずれかによって、インビボまたはインビトロで接触を受け得る。例えば、ＥＣＭ組成物は、（例えば、本発明のＥＣＭ組織、パッチまたはコーティング付きデバイスを介して）対象に注入または移植してもよい。別の態様において、修復および／もしくは再生された組織または細胞を、対象から採取し、インビトロで培養して、その後、公知の外科技術を使用して対象に移植または投与する場合もある。
【０１３９】
上記で考察したように、本発明のＥＣＭ組成物は、様々な方法で処理される場合もある。したがって、一実施形態において、本発明は、組織培養系を含む。様々な態様において、培養系は、本明細書に記載されているＥＣＭ組成物で構成される。本発明のＥＣＭ組成物は、様々な方法で組織培養系に組み込むことができる。例えば、本組成物は、本明細書に記載の３次元足場材料を含浸させることによってコーティングとして組み込むことも可能であるし、または細胞を培養するための培地への添加剤として組み込むことも可能である。したがって、一態様において、培養系には、成長因子または胚性タンパク質などの、本明細書に記載の任意のＥＣＭ組成物を含浸させた、３次元支持材料を含める場合がある。
【０１４０】
本明細書中に記載されているＥＣＭ組成物は、様々な細胞型を増殖するための支持体または３次元支持体として役立つと考えられる。細胞培養が可能な任意の細胞型が、企図される。一態様では、培養系を使用することで、幹細胞の成長を支持することを可能にしている。別の態様において、幹細胞は胚性幹細胞、間葉系幹細胞または神経幹細胞である。
【０１４１】
植込み可能な組織などの追加的なＥＣＭ組成物を生成する目的に、組織培養系が使用され得る。したがって、本発明の組織培養系を用いた細胞の培養を、インビボまたはインビトロで実施する場合もある。例えば、本発明の組織培養系を使用して、対象に注射または移植されるＥＣＭ組成物を生成してもよい。組織培養系によって生成されたＥＣＭ組成物の処理および使用は、本明細書に記載されている任意の方法で行うことができる。
【０１４２】
本発明のＥＣＭ組成物は、細胞送達用の生物学的ビヒクルとして使用され得る。本明細書中に記載されているように、ＥＣＭ組成物には、可溶性画分および／または不溶性画分の両方を含めてもよい。したがって、本発明の別の実施形態では、本発明のＥＣＭ組成物を含む、細胞送達または送達部位での維持のための生物学的ビヒクルが記載されている。細胞および３次元組織組成物を含む、本発明のＥＣＭ組成物は、インビボでの細胞の増殖を促進および／または支持する目的に使用され得る。ビヒクルは、例えば、幹細胞などの細胞の、損傷した心筋への注入を支援すること、または上記のような腱および靭帯を修復することを目的とした、任意の適切な用途で使用され得る。
【０１４３】
ＥＣＭ組成物の移植または投与前、後もしくはその際中には、適切な細胞組成物（例えば、本発明の単離されたＥＣＭ細胞および／または追加的な生物学的薬剤）を投与する場合もある。例えば、培養系または生物学的送達ビヒクルを対象に移植する前に、投与、欠損、および／または移植の部位に対し、細胞を接種する場合もある。代替的に、（例えば、部位への注射によって）適切な細胞組成物を後で投与してもよい。当該の部位にて細胞が作用して、組織再生および／または細胞修復を誘導する。例えば注射により、欠損部位への細胞の投与を可能にする任意の手段によって、細胞を接種してもよい。細胞の注入は、細胞の生存能力を維持する任意の手段、例えば、シリンジまたは関節鏡を介して行ってもよい。
【０１４４】
臓器および組織における血管新生の促進に関して記載されてきたのが、ＥＣＭ組成物である。そのような組成物を投与することによって、心臓および関連組織における内皮化および血管新生が促進される。したがって、更に別の実施形態において、本発明は、対象へのデバイスの移植に関連して使用される表面コーティングを含み、この表面コーティングは、本明細書に記載されているＥＣＭ組成物を含む。対象への移植または侵入に使用される任意のデバイス（ペースメーカー、ステント、ステントグラフト、人工血管、心臓弁、シャント、ドラッグデリバリーポート、またはカテーテルなど）に対し、コーティングを塗布する場合もある。或る特定の態様では、創傷治癒の改変、炎症の改変、線維性被膜形成の改変、組織の内方成長の改変、または細胞の内方成長の改変に、コーティングを使用する場合がある。別の実施形態において、本発明は、心臓、腸、梗塞または虚血組織などの損傷した組織を治療するためのものを含む。そのような用途に対応するように企図されるＥＣＭ組成物の生成に関して考察した実施例は、以下に提示する通りである。通常の酸素条件下で増大させたＥＣＭ組成物の調製および使用は、米国特許出願公開第２００４／０２１９１３４号に記載されており、これらの文献は、本明細書において参照により援用されている。
【０１４５】
別の実施形態では、本発明には、本明細書に記載のＥＣＭ組成物を含む、様々な植込み型デバイスおよび組織再生パッチが包含されており、これにより、組織の内方成長などの利点を可能にしている。本明細書中で考察されているように、ＥＣＭ組成物は、パッチまたは他の植込み型デバイスなどの医療デバイス上のコーティングとして役立つと考えられる。様々な態様において、このようなデバイスは、創傷の修復、ヘルニアの修復、骨盤底の修復（例えば、骨盤臓器脱）、回旋筋腱板修復、およびそれらに類するものに対し有用とされる。関連する態様において、コーティングは、整形外科用インプラント、心臓血管用インプラント、泌尿器スリング、およびペースメーカースリングに有用である。
【０１４６】
例えば、ヘルニアの基本的な症状は、筋膜内欠損部への腹腔内容物の突出である。ヘルニア修復への外科的アプローチは、ヘルニア内容物を腹腔にまで戻し、補綴、同種または自家材料を使用して筋膜欠損部を確実に閉鎖することに焦点を当てている。この閉鎖を行うための技術がいくつか使用されてきた。しかしながら、現行の製品および手順には欠点があることから、ヘルニアの再発を伴い、閉鎖が再び弱まり、腹腔内容物が欠損部に出てしまう。ヘルニアの場合、ＥＣＭ組成物でコーティングされた生体吸収性または合成メッシュなどの矯正組織再生パッチが、使用され得る。
【０１４７】
本発明において利用できる医療装置表面に生物学的コーティングを塗布するための、様々な技術が当該技術分野において公知である。例えば、ＥＣＭ組成物を、光反応性架橋剤を使用してコーティングしてもよい。紫外線を照射することにより、架橋剤の活性化時に、デバイス表面に対する永続的な共有結合が可能となる。例示的な架橋剤が、TriLite（商標）架橋剤である。この架橋剤は、細胞毒性がなく、生体組織を刺激せず、しかも感作性のないことが、明らかにされてきた。ＥＣＭ物質は、様々な植込み型デバイスへのコーティング前または組み込み前に、分離されていない場合もあれば、個別の成分（ヒトのコラーゲン、ヒアルロン酸（ＨＡ）、フィブロネクチン、およびそれらに類するもの）に分離されている場合もある。更に、追加的な成長因子およびそれに類するものを組み込むことによって、細胞浸潤の向上などの有益な移植特性を可能にし得る。
【０１４８】
関連する様々な実施形態において、本発明は、美容／化粧品用途に適用可能な方法およびデバイス、例えば、限定されるものではないが、アンチエイジング、アンチリンクル、皮膚充填剤、保湿剤、色素沈着の増強、皮膚の引き締め、およびそれらに類するものを提供する。したがって、一実施形態において、本発明は、対象のシワ部位に本明細書に記載のＥＣＭ組成物を投与することを含む、対象の皮膚表面を改善する方法を含む。関連する実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＥＣＭ組成物を、対象のシワ部位に投与することを含む、対象における軟組織を修復または増強する方法を含む。様々な美容用途では、適宜、本組成物を、注射可能製剤および局所的製剤などに製剤化する場合もある。本明細書中に記載の実施例で更に考察されているように、局所用として配合されたＥＣＭ組成物は、アンチリンクル、アンチエイジング用途、および切除レーザー手術の補助などの、様々な皮膚審美的用途において効果的であることが、明らかにされてきた。局所を含めたＥＣＭのいくつかの有益な特徴が、明らかにされている。このような利点としては、１）リサーフェシング後の再上皮化の促進、２）非切除および切除フラクショナルレーザーリサーフェシング症状（例えば、紅斑、浮腫、痂皮、および不快感）の軽減、３）滑らかで均一な肌理の皮膚の生成、４）皮膚の保湿生成、５）小ジワ／縮緬ジワの出現の低減、６）皮膚のハリおよび柔軟性の増強、７）皮膚の色素沈着異常の減少、８）皮膚の赤み／シミの減少が挙げられる。
【０１４９】
本発明の組成物は、本明細書中に記載される革新的な培養方法（例えば、低酸素条件下での培養）を用いることを除き、当該技術分野において公知のように調製することが可能である。細胞の修復および／または再生、皮膚表面の改善、ならびに軟組織修復に好適な通常の酸素培養条件下で生成されたＥＣＭ組成物の調製および使用については、米国特許第５，８３０，７０８号、米国特許第６，２８４，２８４号、米国特許出願公開第２００２／００１９３３９号および米国特許出願公開第２００２／００３８１５２号に記載されており、これらの文献は、本明細書において参照により援用されている。
【０１５０】
別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載のＥＣＭ組成物を含む生物学的抗癒着剤を含む。この薬剤は、腸または血管の吻合の作成後に使用される癒着防止パッチなどの用途において使用してもよい。
【０１５１】
本明細書中に用いられている組成物または活性成分は、治療の対象となる特定の疾患を、治療または予防するのに有効な量で使用されるのが、一般的である。本組成物は治療的に投与することによって治療効果を達成することを可能とし、あるいは、予防的に投与することによって予防的利益を達成することを可能とするものである。治療的利益とは、治療の対象となる根本的な病態もしくは障害を根絶または寛解することを意味する。治療的利益には、改善が実現されるかどうかに関係なく、疾患の進行を停止または遅延させることも含まれる。
【０１５２】
投与される組成物の量は、例えば、組成物の種類、治療対象となる特定の適応症、投与方法、所望の利益が予防的または治療的であるかどうか、治療対象となる適応症の重篤度のほか、患者の年齢および体重、ならびに剤形の有効性を含む、様々な要因に依存するであろう。効果的な投与量を判別することは、優に当業者の能力の範囲内に含まれる。
【０１５３】
初期投与量は、まずインビトロアッセイにより推定してもよい。初期投与量を、動物モデルなどのインビボデータから推定してもよい。毛髪成長を促進する組成物の有効性を試験するうえで有用な動物モデルとしては、とりわけ、齧歯類、霊長類、およびその他の哺乳類が挙げられる。当業者であれば、インビトロデータおよび動物データを基に外挿することによって、ヒト投与に好適な用量を判別することができる。
【０１５４】
投与量を左右する要因としては、ほかにも、馴化培地の活性、投与方法、治療対象となる病態、および上記に考察されているような様々なものが挙げられる。投薬量および投薬間隔を個別に調整することによって、治療効果または予防効果を維持するのに十分なレベルを実現することが可能となる。
【０１５５】
一実施形態において、本発明は、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９、ＣＤ６３および／またはＣＤ８１陽性細胞外小胞（ＥＣＶ）を提供する。一態様において、ＥＣＶは、線維芽細胞を、好適な増殖培地中、マイクロキャリアビーズ上で、または３次元表面上で、低酸素条件下、少なくとも２週間、１〜５％の酸素下で、培養することであって、それにより、ＥＣＶを生成し且つ該ＥＣＶを該培養培地中へと分泌する多能性幹細胞を生成し、且つ該ＥＣＶを収集する、該培養することによって生成される。追加的な態様において、Ｗｎｔタンパク質はＷｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａおよび／またはＷｎｔ７ｂである。いくつかの態様において、ＥＣＶは、可溶性画分から収集される。或る特定の態様において、ＥＣＶは、ＣＤ６３に対して陽性である。
【０１５６】
本明細書において、「細胞外小胞」および「ＥＣＶ」という用語は、同義に用いられ、タンパク質を含む細胞由来の小胞を指す。エキソソームは、ＥＣＶの一部である。本発明のＥＣＶは、Ｗｎｔタンパク質および／またはフォリスタチンまたはフォリスタチン様タンパク質（例えば、フォリスタチン活性を有する）、ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１を含有し得る。Ｗｎｔおよびフォリスタチンタンパク質は、前述されている通りである。ＣＤ９、ＣＤ６３およびＣＤ８１は、エキソソームの細胞表面マーカーである。
【０１５７】
ＣＤ９は、細胞表面の糖タンパク質の一種であり、インテグリンおよび他の膜貫通４スーパーファミリーのタンパク質と一緒になって複合体を形成することが知られており、エキソソームの表面上に見出される。ＣＤ９は細胞の接着および遊走を調節している。また、血小板の活性化および凝集を誘発し、筋肉細胞の融合を促進し、筋管の維持を支持している。
【０１５８】
ＣＤ６３は、膜貫通４スーパーファミリーのメンバーであり、テトラスパニンファミリーとしても知られている。これらのメンバーのほとんどは、４つの疎水性ドメインが存在することを特徴とする、細胞表面タンパク質である。タンパク質は、細胞発生、活性化、成長および運動性の調節において役割を果たすシグナル伝達イベントを仲介する。ＣＤ６３は、インテグリンと一緒になって複合体を形成することが知られている細胞表面糖タンパク質である。
【０１５９】
ＣＤ８１は、膜貫通４スーパーファミリーのメンバーであり、４つの疎水性ドメインが存在することを特徴とする細胞表面タンパク質である。このファミリーのタンパク質は、細胞発生、活性化、成長および運動性の調節において役割を果たすシグナル伝達イベントを仲介する。ＣＤ８１は、細胞表面の糖タンパク質の一種であり、インテグリンと一緒になって複合体を形成し、筋細胞の融合を促進し、筋管の維持を支持し、シグナル伝達に関与している可能性のあることが知られている。
【０１６０】
本明細書中に用いられている「生物活性断片」という用語は、タンパク質完全体（例えば、フォリスタチンまたはＷｎｔタンパク質）に関連する生物学的活性を保持する、タンパク質の断片である。
【０１６１】
前述されているように、可溶性画分には、細胞が培養されている培養培地または馴化培地が含まれ、この培地には細胞によって活性物質が分泌されている。また、この可溶性画分には、足場上に堆積していないタンパク質および生物学的成分も含まれる。或る特定の態様において、ＥＣＶ、またはエキソソームは、可溶性画分から単離および／または収集される。
【０１６２】
追加的な実施形態において、本発明は、線維芽細胞を、好適な増殖培地中、マイクロキャリアビーズ上で、または３次元表面上で、低酸素条件下、少なくとも２週間、１〜５％の酸素下で、培養することであって、それにより、細胞外小胞を生成し且つ該細胞外小胞を該培養液中に分泌する多能性幹細胞を生成する、該培養することを含む、少なくともＷｎｔおよび／またはフォリスタチンタンパク質を含むＥＣＶを生成する方法を提供する。或る特定の態様において、Ｗｎｔタンパク質は、ＷＮＴ３ａ、７ａおよび／または７ｂである。
【０１６３】
更なる実施形態において、本発明は、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質、またはそれらの生物活性断片と担体とを含む、ＣＤ９陽性ＥＣＶを含む組成物を提供する。一態様において、担体とは、医薬的に許容される担体である。
【０１６４】
「医薬的に許容される」とは、担体、希釈剤または賦形剤が製剤の他の成分に対し適合性があり、そのレシピエントに対し有害であってはならないことを意味する。医薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤は、当該技術分野において、例えばRemington's Pharmaceutical Sciences, l6th edition, Osol, A. Ed. (1980)において周知である。医薬的に許容される担体、賦形剤または安定剤は、使用された用量および濃度ではレシピエントに対し無害であり、リン酸、クエン酸、および他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール、メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾール）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンなど）；ＥＤＴＡなどのキレート剤；ショ糖、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Ｚｎ−タンパク質錯体）；および／または非イオン性界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を含み得る。
【０１６５】
別の実施形態において、本発明は、毛髪成長を刺激するための方法を提供するものであり、本方法は、その必要がある対象に、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶを投与することであって、それにより、毛髪成長を刺激する、該投与することを含む。或る特定の態様では、毛髪の毛包をＥＣＶと接触させる。特定の態様では、毛髪の毛包を、インビボまたはエクスビボで接触させる。他の態様において、Ｗｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａおよび／またはＷｎｔ７ｂである。
【０１６６】
「投与」または「投与する」という用語は、本発明のＥＣＶ組成物を、治療を必要とする対象に提供する行為を含むものとして定義される。本明細書中に使用されている「非経口投与」および「非経口的に投与する」という語句は、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方法を意味し、限定されるものではないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内および胸骨内の注射ならびに注入が挙げられる。
【０１６７】
ＥＣＶ組成物が投与された後の毛髪毛包数、総毛髪数、総硬毛数、および／または毛幹の太さを、ベースラインとの比較により判別することによって、毛髪成長の刺激を測定することが可能である。
【０１６８】
追加的な実施形態において、本発明は、皮膚の若返りおよび／または再生を刺激する方法を提供するものであり、本方法は、その必要がある対象に、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶを投与することであって、それにより、皮膚の若返りおよび／または再生を刺激する、該投与することを含む。或る特定の態様では、投与を、局所投与としている。或る特定の態様において、Ｗｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａおよび／またはＷｎｔ７ｂである。
【０１６９】
皮膚の若返りおよび／または再生の刺激は、リサーフェシング後の再上皮化促進；非切除および切除フラクショナルレーザーリサーフェシング症状（例えば、紅斑、浮腫、痂皮、および不快感）の軽減；滑らかで均一な肌理の皮膚の生成；皮膚の保湿生成；小ジワ／縮緬ジワの出現の低減；皮膚のハリおよび柔軟性の増強；皮膚の色素沈着異常の減少；皮膚の赤み／シミの減少により判別される場合がある。
【０１７０】
更なる実施形態において、本発明は、毛髪成長を刺激するための薬剤の調製のための、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶの使用を提供する。
【０１７１】
一実施形態において、本発明は、皮膚の若返りおよび／または再生を刺激するための薬剤の調製のための、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶの使用を提供する。
【０１７２】
実施形態において、本発明は、修復を必要とする組織を治療する方法を提供するものであり、本方法は、その必要がある対象に、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶを投与することであって、それにより、組織を修復する、該投与することを含む。
【０１７３】
実施形態において、本発明は、Ｗｎｔおよび／もしくはフォリスタチンタンパク質またはそれらの生物活性断片を含むＣＤ９陽性ＥＣＶを提供するものであり、ここで、該ＥＣＶはエキソソームである。或る特定の態様において、Ｗｎｔタンパク質は、Ｗｎｔ３ａ、Ｗｎｔ７ａおよび／またはＷｎｔ７ｂである。
【０１７４】
考察されている用途に対応するように企図されるＥＣＭ組成物の生成に関して考察した実施例は、以下に提示する通りである。下掲の実施例は、本発明の実施形態を更に例証することを目的に提供されたものであって、本発明の範囲を限定することを意図したものではない。それらは使用される可能性のあるものの典型例であるが、代替的に、当業者に公知である他の手順、方法論、および技法を使用して差し支えない。
【実施例】
【０１７５】
実施例１
低酸素条件下で増大させたＥＣＭ組成物における差次的遺伝子発現
初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を、組織培養フラスコ内で標準的な単層として培養し、天然に堆積された胎児様ＥＣＭ内の３次元線維芽細胞培養物と比較した。培養物を、本明細書中に開示されているようにして増殖させた。遺伝子の差次的発現を評価するため、製造元のプロトコールに従い、網羅的遺伝子発現（４０，０００個未満の遺伝子を含む）についてAgilent Whole Human Genome Oligo Microarrays（登録商標）を使用して、全ＲＮＡのサンプルを完成させた。
【０１７６】
比較を行った際に、線維芽細胞が、低酸素培養で天然に分泌されたＥＣＭ内の３次元培養物中で、コラーゲンおよびＥＣＭ遺伝子発現を調節することが見出された。様々なコラーゲンおよびＥＣＭ遺伝子の発現の上方制御ならびに下方制御は、表３において明示されている通りである。
【０１７７】
（表３）低酸素３次元線維芽細胞培養物における差次的コラーゲンおよびＥＣＭ発現
2021511833.tif 000004
【０１７８】
比較を行った際に、線維芽細胞が、低酸素培養で天然に分泌されたＥＣＭ内の３次元培養物中で、Ｗｎｔ経路遺伝子の遺伝子発現を調節することが見出された。様々なＷｎｔ経路遺伝子の発現の上方制御ならびに下方制御は、表４において明示されている通りである。
【０１７９】
（表４）低酸素の３次元線維芽細胞培養物における差次的Ｗｎｔ発現
2021511833.tif 000005
【０１８０】
比較を行った際に、線維芽細胞が、低酸素培養で天然に分泌されたＥＣＭ内の３次元培養物中で、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）経路遺伝子の遺伝子発現を調節することが見出された。様々なＢＭＰ経路遺伝子の発現の上方制御ならびに下方制御は、表５において明示されている通りである。
【０１８１】
（表５）低酸素の３次元線維芽細胞培養物における差次的ＢＭＰ発現
2021511833.tif 000006
【０１８２】
比較を行った際に、線維芽細胞が、低酸素培養で天然に分泌されたＥＣＭ内の３次元培養物中で、追加的な遺伝子の発現を調節することが見出された。追加的な遺伝子の発現の上方制御ならびに下方制御は、表６において明示されている通りである。結果から、低酸素培養条件は、低酸素誘導因子（ＨＩＦ  １Ａ）のｍＲＮＡ発現において１４．７８倍の増加、それぞれの阻害剤において４．９倍の減少をもたらすことが示される。このことは、タンパク質の翻訳をコードするＨＩＦ  １ＡのメッセンジャーＲＮＡが上方制御される一方、その阻害剤は下方制御されることから、低酸素培養馴化培地は、低酸素圧環境（低酸素状態）に遭遇していることを示唆している。更に、ＶＥＧＦＢ（４．３３倍の増加）、ＫＧＦ（１１．５１倍の増加）、およびＩＬ−８（５．８１倍の増加）レベルはまた、低酸素培養条件下にて上方制御された。
【０１８３】
（表６）インビボでの線維芽細胞ＥＣＭの低酸素培養に起因する追加的な遺伝子発現変化
2021511833.tif 000007
2021511833.tif 000008
【０１８４】
幹細胞関連遺伝子発現
2021511833.tif 000009
【０１８５】
実施例２
初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を用いた低酸素ＥＣＭの生産
初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を用いたＥＣＭの低酸素培養について２つの実施例を示す。
【０１８６】
初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有の９０％高グルコースＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）の存在下にて組織培養フラスコ内で増殖させた。０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用して、細胞を第３継代まで継代培養し、その時点で、Cytodex-1デキストランビーズ０．０４ｍｇ乾燥ビーズ／培地１ｍｌ（１００〜１２０ｍｌで充填された１２５ｍｌスピナーフラスコにおいて、５×１０６細胞／１０ｍｇビーズ）、またはナイロンメッシュ（２５×１０６細胞／６×１００ｃｍ２ナイロン）のいずれかに細胞を播種した。全ての培養物を、増殖および播種用に、通常の大気および５％ＣＯ２で維持した。その時点で、低酸素培養物を、９５％窒素／５％ＣＯ２で充填された気密チャンバーに分割して、低酸素環境が培地内に生じ得るようにした。この系では、培養容器内の酸素が約１〜５％に維持される。播種用のナイロンまたはビーズを覆うのに必要な最小量において細胞をよく混合し、その後３０分後に１回混合し、加湿した３７℃のインキュベーター内に一晩静置した。培養物に１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを２〜４週間与え、２〜３日ごとに５０〜７０％の培地交換を行った。同時に、細胞が増殖し、その後ＥＣＭが堆積し始めた。ＦＢＳの代わりに、鉄サプリメント含有の１０％ウシ胎仔血清および２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を、培養物に更に４〜６週間与えた。スピナーフラスコを最初は１５〜２５ｒｐｍで、約２〜４週間混合し、その時点で４５ｒｐｍに上げ、以後は、この速度で維持した。ビーズ培養物は、４週間後に幅と直径が０．５〜１．０ｃｍのＥＣＭを含有する大型不定形構造を形成した。それゆえ、これらの培養物は、ガス拡散および高代謝要件に起因して低酸素状態であった。
【０１８７】
追加的な実施例では、初代ヒト新生児包皮線維芽細胞を単層フラスコ内で増殖させ、次いで、ナイロンメッシュ足場上で培養し、ＥＣＭのインビトロでの発達を支持した。線維芽細胞を、高グルコース、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン、および１０％（ｖ／ｖ）ウシ胎児血清含有のＤＭＥＭで増殖させた。また、培養物に２０μｇ／ｍｌのアスコルビン酸を補充した。周囲酸素（およそ１６％〜２０％の酸素）で、３週間後、９５％窒素／５％二酸化炭素（カタログ番号MC-101、カリフォルニア州デルマーのビルアップ・ローゼンバーグ社（Billups-Rothenberg, Inc.）製）を用いて広範囲にフラッシュされる気密チャンバー内で、二連のＥＣＭ含有培養物を低酸素培養条件（１％〜５％の酸素）に切り替えた。２〜３時間後に培地中の酸素含有率がおよそ１〜３％となるように大気を交換して、培地から大気酸素が確実に枯渇されるようにした。ＥＣＭ含有培養物の両方のセットを、週に２回の栄養補給で更に４週間増殖させ、培養物をＲＮＡ単離用に調製した。全細胞ＲＮＡの単離は、メーカーの指示書に従い、市販のキット（カタログ番号Z3100、プロメガ社（Promega, Inc.））を使用して行った。精製されたＲＮＡサンプルを−８０℃で保存した。次いで、Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays（登録商標）を使用して、遺伝子発現のマイクロアレイ解析の処理を行った。
【０１８８】
結果を分析した際、Agilent Whole Human Genome Oligo Microarrays（登録商標）を使用した低酸素培養のプローブと比較して、周囲酸素から調製されたプローブから、およそ５，５００の差次的に発現された転写産物が検出された。これらのうち、約半分（２，５００）は低酸素により２．０倍超増加し、約半分（２，５００）は低酸素下で２．０分の１未満に減少した。このことは、低酸素によって、インビトロ遺伝子発現において顕著な変化が生じたことを示している。特に興味深いのは、ＥＣＭタンパク質についての転写産物、特に多数のコラーゲン遺伝子が上方制御された一方、マトリックス分解酵素についての多数の遺伝子が下方制御されたことである。
【０１８９】
実施例３
治療用途のための組織工学的ヒト胚性細胞外マトリックス
胚性ＥＣＭは、瘢痕および癒着を形成することなく、急速な細胞増殖および治癒につながる環境を作り出す。血管新生に先立って初期胚環境をシミュレートする条件（低酸素および低重力）下にてヒト新生児線維芽細胞を３次元で成長させた場合、胎児性特性を備えるＥＣＭが生成されるという仮説が立てられた。遺伝子チップアレイ分析では、従来の組織培養条件と比較して、低酸素条件下で５０００を超える遺伝子の差次的発現が明らかにされた。生成されたＥＣＭは、ＩＩＩ型、ＩＶ型およびＶ型コラーゲンだけでなく、フィブロネクチン、ＳＰＡＲＣ、トロンボスポンジンおよびヒアルロン酸のような糖タンパク質類も比較的豊富であるという点で、胎児間葉組織と類似していた。ＥＣＭはまた、重要な成長因子を有する再生幹細胞集団を支持する推定ニッチにおいて成長因子を結合し提示する際に重要な調節的役割を果たす。このため、培養における胎児様ＥＣＭの発達の間の成長因子発現に対する低酸素の影響を評価した。また、低酸素状態は、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−７、およびＴＧＦ−βなどの創傷治癒および器官形成を調節する因子の発現、ならびにｗｎｔ２ｂ、４、７ａ、１０ａおよび１１を含む複数のｗｎｔの発現も、増大させる可能性がある。また、胚性ヒトＥＣＭは、ＭＴＴアッセイを使用した酵素活性の増加によって測定されたように、インビトロでのヒト線維芽細胞における代謝活性の増加を刺激する。加えて、我々は、ヒトＥＣＭに応答した細胞数の増加を検出した。このヒトＥＣＭは、瘢痕または癒着を生ずることなしに新たな組織を成長させ且つ治癒させる様々な治療用途において、生体表面コーティングおよび組織充填治療薬として使用することができる。
【０１９０】
実施例４
再生医療用途のための、天然に可溶性のＷＮＴの活性の生成
皮膚または血液のような成人組織を再生できる幹細胞または前駆細胞は、胚発生を或る程度まで再現して、この再生を達成する。幾多の研究が為され続ける中で明らかにされてきたように、胚形成中に活性な幹細胞の分化万能性および系統特異的な分化の主要調節因子は、成人において或る特定の状況下で再発現する。分泌された形態形成成長因子および発達因子であるＷＮＴファミリーは、価値ある研究ツールを提供し、最終的には診療所での治療処置を提供し得る成長因子の１つとされる。しかしながら、Ｗｎｔは、現在に至るまで商業的規模での標準的な組換え発現および精製技術に耐えられないことが証明されてきており、ＷＮＴベースの製品の臨床開発を可能にする大規模ＷＮＴタンパク質生産の報告はなかった。培養中の様々な足場で新生児ヒト皮膚線維芽細胞を使用して培養で胎児様ＥＣＭを増大させ、３次元組織相当物を生成するための手法が開発されてきた。この過程において、これらの培養物は、ＥＣＭ生産に使用される無血清馴化培地に含まれる生物活性ＷＮＴの商業規模の供給源を提供し得ることが発見された。このＷＮＴ製品候補に関するデータは、以下に提示する通りである。
【０１９１】
細胞の遺伝子発現分析によって実証されたように、少なくとも３つのＷＮＴ遺伝子が発現され（ｗｎｔ５ａ、ｗｎｔ７ａおよびｗｎｔ１１）、ｗｎｔシグナル伝達に関連する少数の遺伝子も発現された。ただし、それらの機能は完全には理解されていない。遺伝子発現データを、ｗｎｔシグナル伝達（初代ヒト表皮ケラチノサイトにおけるβカテニンの核移行）についてのインビトロバイオアッセイに拡張し、血液幹細胞に対するｗｎｔ活性を評価した。両方のアッセイによって、標準的なｗｎｔ活性と一致する活性が、実証された。更になお、これらの培養物からの馴化培地をマウスの皮膚に注入した場合に、ｗｎｔ活性が見られ、毛髪毛包幹細胞が成長期に入り、それにより毛髪成長がもたらされた。このことは、規定された無血清馴化培地中での安定したＷＮＴ活性は、精製を必要としなかったことを示している。この製品は、毛髪毛包再生に使用することができ、様々なヒト幹細胞を培養するための価値ある研究ツールとして使用することができる。
【０１９２】
実施例５
低酸素線維芽細胞による、独特なＥＣＭ生産および成長因子発現の実証
ヒト新生児皮膚線維芽細胞をインビトロで培養した場合、真皮によく似たＥＣＭが生成される。このＥＣＭは、創傷治癒などの再生医療用途において損傷した真皮に取って代わることが可能である。また、創傷治癒のプロセスによって、胚発生が再現されることから、胚環境をシミュレートすることにより、生成されたＥＣＭが、組織再生用途のための改善されたＥＣＭを提供するものであると、我々は仮定している。それゆえ、血管新生に先立って初期胚に存在する低酸素状態をシミュレートするために、培養中、低酸素条件下にてヒト新生児線維芽細胞由来ＥＣＭを増大させた。目標は、培養液中で組織が発達している間、低酸素条件を用いて、胎児性特性を有するＥＣＭを生成することであった。
【０１９３】
これらの低酸素培養で生成されたＥＣＭは、ＩＩＩ型およびＶ型コラーゲンだけでなく、フィブロネクチン、ＳＰＡＲＣ、トロンボスポンジンおよびヒアルロン酸のような糖タンパク質類も比較的豊富であるという点で、胎児間葉組織と類似していた。ＥＣＭはまた、重要な成長因子を有する再生幹細胞集団を支持する推定ニッチにおいて成長因子を結合し提示する際に重要な調節的役割を果たす。このため、培養における胎児様ＥＣＭの発達の間の成長因子発現に対する低酸素の影響を評価した。低酸素状態はまた、ＶＥＧＦ、ＦＧＦ−７、およびＴＧＦ−βなどの創傷治癒および器官形成を調節する因子の発現を増強し得ることが示された。
【０１９４】
また、ヒトＥＣＭは、ＭＴＴアッセイを使用した酵素活性の増加によって測定されたように、インビトロでのヒト線維芽細胞における代謝活性の増加を刺激する。加えて、ヒトＥＣＭに応答した胞数の増加が検出された。これらの結果は、このヒトＥＣＭが、胚細胞培養物においてはコーティング／足場として、および様々な治療用途または医療デバイスにおいては生体表面コーティング／充填剤として有用であることを裏付けている。
【０１９５】
実施例６
ヒト細胞外マトリックス（ｈＥＣＭ）コーティング付き生体材料
ＥＣＭは、瘢痕および癒着を形成することなく、急速な細胞増殖および治癒につながる環境を作り出すことが、報告されてきた。本明細書に記載の方法を使用して、新生児線維芽細胞を低酸素および比重で培養することによって、独特な胚様ヒトＥＣＭ（ｈＥＣＭ）を生成した。結果として挙げられるのは、ｈＥＣＭを漿尿膜上に配置した場合に血管が新生されること、およびｈＥＣＭをナイロンメッシュ上にコーティングし、ＳＣＩＤマウスの皮下領域の側腹部に移植した場合に炎症細胞遊走が低減することであった。これらの結果に基づいて、ポリプロピレンメッシュ上にｈＥＣＭをコーティングすると、ＳＣＩＤマウスの皮下領域の物質−生物学的界面での炎症細胞の遊走および線維性被包が低減するという仮説が立てられた。
【０１９６】
ヒト由来物質を使用して生成されたＥＣＭ組成物（ｈＥＣＭ）を、光活性架橋剤を使用してプロピレンメッシュ上にコーティングした。ＵＶ共有結合機序（Innovative Surface Technologies（ISurTec）TriLite（商標）架橋剤）によって、６ｍｍの生検パンチポリプロピレン上にｈＥＣＭをコーティングした。ｈＥＣＭコーティング付きおよびコーティング無しのポリプロピレン製６ｍｍ生検パンチを、E-Beam（商標）（BeamOne LLC E-BEAM（商標））またはエチレンオキシド（ETO）（ETO Flagstaff Medical Centerによって記載）を使用して滅菌した。次いで、各６ｍｍポリプロピレンディスクを、２つの対称半円形インサートに分割した。最後に、無菌技術を利用して、ポリプロピレン製インプラントを、皮下領域の側腹部の両側に配置した。２週間および５週間のエンドポイントの時点で、組織構造分析用にサンプルを外植した。
【０１９７】
抗フィブロネクチン免疫蛍光染色ｈＥＣＭコーティング付きポリプロピレンメッシュは、ＥＣＭ物質が、コーティング無しのメッシュと比較して、メッシュの繊維に結合して均一なコーティングを形成することを明らかにした。ＨＥＣＭコーティング付きメッシュは、医療用途（ヘルニア修復および骨盤底修復など）の植込み型パッチに好適である。フィブロネクチン抗体を用いた免疫蛍光染色を介して示されているように、ＥＣＭ物質は、メッシュの個々の繊維を被覆することが明らかにされた。これは細胞の内方成長の改善を可能にする。
【０１９８】
ｈＥＣＭを、ニワトリ漿尿膜（ＣＡＭ）に移植した際、微小血管応答が刺激された。このことは、新たな微小血管系が成長したことによって証明された。加えて、４週間マウスに皮下移植されたｈＥＣＭコーティング付きナイロンメッシュは、コーティング無しのナイロンメッシュと比較して、生体適合性を向上させたことが実証された。具体的には、ｈＥＣＭコーティング付きナイロン繊維では、炎症細胞が少なく、線維性被膜が薄いことが観察された。
【０１９９】
生体適合性評価は、ヘマトキシリンおよびエオシン染色サンプルを使用して、ｈＥＣＭコーティング付きポリプロピレンメッシュの移植後２週間および５週間の時点で行った。ＦＢＧＣ分析では、サンプルをブラインドコードし、形態計測を使用して評価し、群化して、統計的に評価してからデコードした。異物巨細胞（ＦＢＧＣ）の数を調べた。ｈＥＣＭコーティング付きポリプロピレンメッシュの場合、コーティング無しのメッシュと比較して、ＦＢＧＣの低減が明らかである。２週間の時点で、サンプル当たりの平均ＦＢＧＣ数は、コーティング無しポリプロピレン（９．２０＋／−２．０３）対ｈＥＣＭコーティング付きポリプロピレン（４．５３＋／−０．８９）で統計的に高値である（ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後分析ｐ ＜０．０５）と判定された。５週間の時点で、コーティング無しポリプロピレン（１０．９５＋／−２．１５）対ｈＥＣＭコーティング付きポリプロピレン（８．１７＋／−１．４１）の場合、サンプル当たりの平均ＦＢＧＣ数は統計的に有意ではないにしても、統計的に高値であると判定された。
【０２００】
結果から、ｈＥＣＭコーティング付きポリプロピレンは、線維性被膜を減少させ得ることが示された。２週間および５週間の時点で、トリクローム染色サンプルを使用して、線維性被包を評価した。被膜分析では、サンプルをブラインドコードし、形態計測を使用して評価し、群に分類して、統計的に評価してからデコードした。２週間の時点で、ｈＥＣＭコーティング付きポリプロピレン（２３．７０＋／−２．７０ｕＭ）対コーティング無しポリプロピレン（１９．７０＋／−３．００ｕＭ）の平均線維性被膜厚さは統計的に高値であるとは判定されなかった（ＡＮＯＶＡボンフェローニ事後分析ｐ＜０．０５）。５週間の時点で、ｈＥＣＭコーティング無しポリプロピレン（１２．３０＋／−１．２０ｕＭ）に対して、ｈＥＣＭコーティング付きポリプロピレンの平均線維性被膜厚は（１０．４０＋／−１．１０ｕＭ）であると判定された。この場合も、ｈＥＣＭコーティング無しポリプロピレンとｈＥＣＭコーティング付きポリプロピレンとの差異は、統計的に有意であるとは判定されなかった。ただし、２〜５週間の時点で線維性被包の平均パーセンテージの差を評価した際に、重要な観察結果が見出された。２週間〜５週間の時点での線維性被包の平均減少率は、ｈＥＣＭコーティング無しポリプロピレンでは３７．６％であったのに対し、ｈＥＣＭコーティング付きポリプロピレンでは５６．１％であった。
【０２０１】
ＦＢＧＣが形成される機序は、ポリプロピレンなどの植込み型生体材料に対する免疫応答中に、マクロファージが融合した結果とされる。これら大型の多核細胞は、植込み型生体材料に対する炎症反応を定量的に評価するための、効果的な手段を提供するものである。２週間の時点で、ヒトＥＣＭコーティング付きポリプロピレンは、コーティング無しのポリプロピレンに対し、サンプル当たりのＦＢＧＣ数が顕著に減少したことが観察された。このデータは、ヒトＥＣＭ表面コーティングが、様々な植込み型デバイスに対する用途として機能し得ることを示唆している。
【０２０２】
歴史的には、植込み型デバイスの有効性および寿命は、ＦＢＧＣおよび線維性被膜形成を含む特定の免疫応答によって攻撃を受けてきた。具体的には、ＦＢＧＣは、スーパーオキシドおよびフリーラジカルなどの分解性物質、ならびに他の分解性物質を排出することがあり、これがデバイスの有効性および寿命に対して攻撃する。これらの負の影響がとりわけ顕著である理由は、インプラントの存在している間中、ＦＢＧＣがインプラントのすぐ近くに局在し続けることが、公知であるからである。線維性被膜形成は、インプラントを取り囲む血管コラーゲンの強固な被包として生起されるものであり、宿主または宿主組織から外来性の植込み型物体を隔離するように意図されている。この反応は、或る特定の症例の患者に対し不快感を与えるだけでなく、デバイスの稼動可能期間を短縮させてしまい、デバイスの有効性を低下させてしまう可能性さえある。それゆえ、ＦＢＧＣおよび線維性被包を低減するコーティングは、植込み型デバイスの寿命および機能にとって非常に望ましい成果となる。
【０２０３】
ポリプロピレンにｈＥＣＭをコーティングすることによってＦＢＧＣの存在が減少し、物質−生物学的界面での線維性被包が減少する可能性があるという所見は、更なる実験の必要性を裏付けるものである。将来の評価には、ｈＥＣＭコーティング付きおよびコーティング無しの生体材料を用いた場合の線維性被包の厚さの変化を観察するための、より長期間の時点を含めてもよい。加えて、ダクロン、ナイロン、ステンレス鋼およびチタンなどの生体材料の連続体を用いた様々なインビボ環境における評価によって、更に望ましいｈＥＣＭコーティング付き生体材料の成果を解明することが可能となる。
【０２０４】
実施例7
毛髪成長の刺激のための細胞外マトリックス組成物の使用
ＥＣＭ組成物を投与することによる毛髪成長の刺激については、本実施例において例証されている通りである。
【０２０５】
ヒト毛髪毛包細胞および毛髪毛包から採取された細胞を入手して、本明細書に記載のＥＣＭ組成物の、毛髪形成能力を刺激および維持する能力を算定した。毛髪毛包細胞は、アルデランス・リサーチ・インターナショナル社（Alderans Research International）から入手されたものである。細胞を、ＥＣＭの存在下で培養した。培養の４週間および８週間の時点で細胞を分析した結果、毛髪毛包に類似した構造、および毛幹に類似した構造が明らかになった。２か月間の連続培養を経た後も、細胞は生存および増殖を続けた。
【０２０６】
ＥＣＭ組成物の存在下で４週間培養された細胞を、マウスに移植した。移植の４週間後、培養されたヒト毛髪毛包は、対照細胞と比較して、多数の大型毛髪毛包を形成した。この対照細胞では、通常数の小型休止毛髪毛包だけが見られることが、顕微鏡画像分析を使用して観察された。
【０２０７】
これらの調査結果に基づいて、ヒト対象を用いてインビボでの毛髪成長試験を実施し、新たに毛包が再生されるかどうかを判別した。本研究には、男性型脱毛症（ＭＰＨＬ）の１８歳から４５歳までの男性２４例が登録されていた。研究群の全てのメンバーは、以前に侵襲性もしくは最小侵襲性局所頭皮手術も、ミノキシジル（商標）またはフィナステリド（商標）による局所治療も受けていなかった。Palomar Starluz 550pレーザー（1540非切除および2940切除）が使用された。研究期間は、フォローアップ、ベースライン、および５か月間（単回皮下注射後）で、最長１２か月間にわたるように設計された。注射後に、３日間のウォッシュアウト期間が観察され、研究期間全体を通して対象が使用したシャンプーは、Cetaphil（商標）のものに限定された。レージングおよびマイクロ皮膚切除術の併用後に、注射を行った。
【０２０８】
対象に対し、ｗｎｔタンパク質活性を有し且つｗｎｔ７ａを含むものであることが判別されたｈＥＣＭと混合されたビヒクルを経皮的に投与した一方、対照ビヒクルおよび生理食塩水も投与した。本研究の評価項目には、７ポイントの臨床評価方式（盲検化された毛髪移植外科医３名）、臨床マクロ写真（毛包数）、２ｍｍパンチ生検、および対象の自己評価アンケート、が含まれていた。
【０２０９】
対象の個々の毛包単位を分析した。１２週間目に毛包を計数し、本研究の開始時に同じ個体において観察されたベースラインと比較した。動揺なしでｈＥＣＭを投与された対象において、毛包単位の増加が観察された。例えば、対象１例では、治療を経て１２週間目の時点で見かけの毛髪毛包数が、ベースラインの２１７から２６５へと増加した。対象の総毛髪数は、３０７本から３６０本に増加し、全体としておよそ２０％増加した。毛包数の増加は、以下の通り、他の対象において観察された：対象００９（ベースラインの毛髪数１７９本、１２週間目の毛髪数１９３本、５か月目の毛髪数２０１本）；対象０１３（ベースラインの毛髪数２６６．５本、１２週間目の毛髪数２６７本、５か月目の毛髪数２９４本）；対象０２４（ベースラインの毛髪数３３５．５本、１２週間目の毛髪数４１５本、５か月目の毛髪数４３３本）。更に、本試験においてｈＥＣＭを投与された患者１３例中１２例（９２．３％）が、１２週間目に奏効したことが明らかにされた。３か月目に、追加的な毛髪成長測定値を算定した。
【０２１０】
本研究期間全体を通じて、追加的な髪毛パラメーターを分析した。１２週間目および２０週間目の時点で、ベースライン（０週間目）と比較して相対毛髪数を分析し、ベースラインと比較して硬毛を分析し、ベースラインと比較して髪毛の太さを分析した。例えば、対象１例では、治療を経て１２週間目に、毛髪数、硬毛、および毛包厚さがベースラインと比較してそれぞれ２２．４％、２７．８％、および２３．９％増加した。別の対象では、治療を経て１２週間目に、毛髪数、硬毛、および毛包厚さがベースラインと比較してそれぞれ２３．７％、２４．２％、および２２．２％増加した。対象００９（上記のように、ベースラインの毛髪数１７９本、１２週間目の毛髪数１９３本、５か月目の毛髪数２０１本）では、治療を経て１２週間目に、毛髪数、硬毛、および毛包厚さがベースラインと比較してそれぞれ７．８％、４８．５％、および１９．２％増加し、２０週目にそれぞれ１２．９％、３３．０％、および２１．１％増加した。対象０１３（上記のように、ベースラインの毛髪数２６６．５本、１２週間目の毛髪数２６７本、５か月目の毛髪数２９４本）では、治療を経て１２週間目に、毛髪数、硬毛、および毛包厚さがベースラインと比較してそれぞれ０．２％、２５．０％、および８．３％増加し、２０週目にそれぞれ１０．３％、４１．４％、および２３．０％増加した。対象０２４（上記のように、ベースラインの毛髪数３３５．５本、１２週間目の毛髪数４１５本、５か月目の毛髪数４３３本）では、治療を経て１２週間目に、毛髪数、硬毛、および毛包厚さがベースラインと比較してそれぞれ２３．７％、２４．２％、および２２．２％増加し、２０週目にそれぞれ２９．１％、５．９％、および１７．３％増加した。
【０２１１】
注目すべきことに、治療を受けた本研究メンバーに、３か月目の時点で硬毛の数の顕著な増加および厚さ密度の増加（患者の８４．６％）が見られた。加えて、副作用は全く観察されず、通常の組織構造分析が観察され、且つ過誤腫は観察されなかった。
【０２１２】
その結果は、移植後の患者の毛髪が失われるのを予防するという目的、ならびに眉毛およびまつ毛を成長させるという目的などの、追加的な用途におけるｈＥＣＭの使用を指し示している。毛髪移植患者では、毛髪が抜けることが知られており、毛髪が元通りに復活するまでに通常４〜５か月を要する。それゆえ、そのような個体において移植後に毛髪が失われるのを、ｈＥＣＭでの治療によって予防する。
【０２１３】
実施例８
ヒト細胞外マトリックス組成物（ｈＥＣＭ）の生成
ヒトＥＣＭ組成物を、新生児ヒト線維芽細胞を使用して生成した。液体培地で調整されたビーズ状構造に、線維芽細胞を播種した。培養条件を、ウシ胎児血清を必要とせずに最適化した。本明細書に記載されている胚培養条件下にて、数日以内に、細胞が高密度の胚様ＥＣＭを生成した。Ｗｎｔファミリータンパク質およびいくつかの成長因子の分泌を観察した。
【０２１４】
培養物をコンフルエントに達するように成長させた。続いて培養物を滅菌水に曝して、細胞の均一な溶解を誘導した。次いで、無細胞ｈＥＣＭを洗浄し、全ての生細胞および細胞破片を確実に除去し、顕微鏡で検査して、細胞破片が除去されたことを確証した。次いで、ヒト線維芽細胞を、ｈＥＣＭでコーティングした培養フラスコに曝露し、あるいは未処理のフラスコに播いて、マトリックスの厚い層で被覆した。ｈＥＣＭにおいて同定されたＥＣＭタンパク質は、表７に示す通りである。
【０２１５】
（表７）ｈＥＣＭにおいて観察された細胞外マトリックスタンパク質
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【０２１６】
ＭＴＴアッセイを使用した酵素活性の増加によって測定されたように、ｈＥＣＭは細胞の代謝活性の増加を誘発することが、観察された。ヒトＥＣＭは、マウスＥＣＭとは異なり、ＭＴＴアッセイで測定すると、細胞代謝活性の用量依存的な増加を誘発した。細胞は、ｈＥＣＭオーバーレイ材料に迅速且つ均一に浸潤することが、観察された。加えて、ピコグリーンアッセイで測定すると、ｈＥＣＭに応答して細胞数が用量依存的に増加した。
【０２１７】
公知のコーティング、注射剤、および植込み型マトリックス製品は、ウシコラーゲン、ブタの腸もしくは膀胱に由来するマトリックスタンパク質、ヒアルロン酸、または死体皮膚に由来するヒトＥＣＭのいずれかとされるのが、通例である。これらの製品は、より生理学的に同等な環境を生ずることによって恩恵をもたらす可能性があるが、完全にヒト由来の製品は皆無であるし、且つ若い発達中の組織に見られるあらゆる範囲のマトリックスタンパク質を含有する製品も皆無である。生成されたｈＥＣＭには、若い健常組織において見られるのと同じＥＣＭ物質が含有されている。また、ヒト細胞の活発な増殖および細胞の迅速な内方成長を支持することも、観察された。ヒト対象が関与する用途においてｈＥＣＭを使用することには、いくつかの利点がある。例えば、ｈＥＣＭは、宿主細胞が迅速に統合され且つ治癒が良好となるのを促進する（宿主細胞および以後のリモデリングのための通常の足場として機能する）。加えて、ｈＥＣＭは、非ヒト動物およびヒト組織からのウイルス感染（特にウシ組織由来のＢＳＥおよびヒト組織由来のＴＳＥ）に関する懸念を排除するものである。更に、生物学的製品、とりわけヒトの真皮および大腿筋膜と比較して、ｈＥＣＭでは一貫した製品組成および性能が観察される。加えて、ｈＥＣＭは、合成インプラントと比較して、宿主組織の侵食を低減する。
【０２１８】
実施例９
医学審美的用途のための、低酸素で調整されたヒト線維芽細胞由来細胞外マトリックス
顔面に対するレーザー除去手術後の局所ｈＥＣＭ投与の二重盲検無作為化試験を、実施した。本研究には、４０歳から６０歳までの対象４１例が登録された。本研究群の全てのメンバーは、過去１２か月以内に、先行する侵襲性もしくは最小侵襲性外科手術も、局所的なアンチエイジング治療も受けていなかった。レーザー手技には、完全なフラクショナル切除レーザー手技、目周囲、口腔周囲、および顔面全体が含まれていた。Palomar Starluz 550pレーザー（1540非切除および2940切除）が使用された。対象は、１４日間、局所ｈＥＣＭ組成物を１日１回（異なる濃度で）投与されたか、またはプラセボビヒクルを投与された。本研究の評価項目には、臨床写真（盲検評価の皮膚科医３名）、経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）、パンチ生検、紅斑、浮腫、および痂皮の評価が含まれていた。
【０２１９】
１０倍の強度のｈＥＣＭ組成物は、ビヒクル対照と比較して、症状を最も臨床的に改善させた（評価は、臨床研究の実施とは無関係の美容皮膚科医２名によって「盲検的に」実施された）。また、写真による評価によって示唆されたように、３日目、７日目、および１４日目に、数例の患者において紅斑重篤度が低下した。
【０２２０】
また、レーザー治療後３日目、７日目、および１４日目に、対象４１例全員を対象として、経皮水分蒸散量（ＴＥＷＬ）の値を評価した。１０倍の強度のｈＥＣＭ組成物は、ビヒクル対照と比較して、３日目および７日目に、上記角質層バリア機能の改善を実現した。７日目には、ｈＥＣＭ組成物が、ビヒクル対照と比較して統計的に有意（ｐ＜０．０５にて）である。この観察は、切除フラクショナルレーザー治療後７日目に再上皮化が見られる対象がいたという事実と一致している。
【０２２１】
アンチエイジング（シワの減少など）向けの局所ｈＥＣＭ投与の二重盲検無作為化試験もまた、実施した。本研究には、４０歳から６５歳までの対象２６例が登録された。本研究群の全てのメンバーは、過去１２か月以内に、先行する侵襲性もしくは最小侵襲性外科手術も、局所的なアンチエイジング治療も受けていなかった。対象は、１０週間、局所ｈＥＣＭ組成物を１日２回投与されたか、またはプラセボビヒクルを投与された。本研究の評価項目には、臨床写真（盲検化された美容皮膚科医２名）、コルネオメーター（角層表層水分量）、キュートメーター（皮膚粘弾性）、パンチ生検、分子評価（表皮遺伝情報検索（ＥＧＩＲ））が含まれていた。
【０２２２】
顔領域の写真評価から、ｈＥＣＭを１０週間投与することによって、色素沈着が軽減され、皮膚の肌理がより滑らかになり、皮膚の色がより均一化され、且つ縮緬ジワおよび小ジワの発生が低減することが示された。
【０２２３】
また、対象２６例中２２例を対象に、眼球周囲領域のシリコンレプリカの３次元形状測定画像分析を実施した。分析を実施するために、コリメートされた光源をレプリカの平面から２５°の角度で配向させた。レプリカのタブ位置の方向を固定するホルダー内にレプリカを配置して、レプリカを回転させてタブの方向を入射光の方向に対し垂直または平行に位置合わせできるようにした。レプリカは、各々の眼に隣接する目尻のシワの領域から得られたものであり、タブの配向は耳に向かう方向を指している。通常のサンプリング配向によって、深刻な表情ジワ（目尻のシワ）に対し感応する肌理測定を行った。並行サンプリング配向によって、深刻でない小ジワに対し感応する肌理測定を行った。
【０２２４】
顔面に対するレーザー除去手術後の局所ｈＥＣＭ投与の二重盲検無作為化試験を、実施した。本研究には、４０歳から６０歳までの対象４９例が登録された。本研究群の全てのメンバーは、過去１２か月以内に、先行する侵襲性もしくは最小侵襲性外科手術も、局所的なアンチエイジング治療も受けていなかった。レーザー手技には、完全なフラクショナル切除レーザー手技、眼周囲、口腔周囲、および顔面全体が含まれていた。Palomar Starluz 550pレーザー（1540非切除および2940切除）が使用された。対象は、１４日間、局所ｈＥＣＭ組成物を１日２回投与されたか、またはプラセボビヒクルを投与された。本研究の評価項目には、臨床写真（盲検評価の皮膚科医３名）、メグザメーター、および対象の評価が含まれていた。
【０２２５】
術後１日目、３日目、５日目、７日目、および１４日目における顔領域の写真評価によって、プラセボと比較して、あらゆる時点での紅斑が明らかに減少したことが、判明した。
【０２２６】
術後のワセリン使用日数を評価した。
【０２２７】
本研究の結果から、ｈＥＣＭを含有する局所のいくつかの有益な特性が示された。このような利点には、１）リサーフェシング後の再上皮化の促進、２）非切除および切除フラクショナルレーザーリサーフェシング症状（例えば、紅斑、浮腫、痂皮、および不快感）の軽減、３）滑らかで均一な肌理の皮膚の生成、４）皮膚の保湿生成、５）小ジワ／縮緬ジワの出現の低減、６）皮膚のハリおよび柔軟性の増強、７）皮膚の色素沈着異常の減少、８）皮膚の赤み／シミの減少が含まれていた。
【０２２８】
実施例１０
馴化培養培地の可溶性画分からのＥＣＶの単離
実施例２に記載されているように、初期胚環境を刺激する条件下で培養すると、ヒト皮膚線維芽細胞（ＨＤＦ）または初代新生児線維芽細胞などの線維芽細胞は、可溶性画分および不溶性画分を含む組成物を生成する。可溶性画分は、馴化培地である。ＣＣＭがＥＣＶの供給源であることが発見された。ＣＣＭからのＥＣＶの単離および特性評価は、以下に提示する通りである。
【０２２９】
実施例２に記載されているようにして、馴化培地（ＣＣＭ）を調製した。簡単に言えば、初代ヒト新生児包皮線維芽細胞またはヒト皮膚線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭ  Ｌ−グルタミン含有の９０％高グルコースＤＭＥＭ（１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ）の存在下にて組織培養フラスコ内で増殖させた。０．０５％トリプシン／ＥＤＴＡ溶液を使用して、細胞を第３継代まで継代培養し、その時点で、Cytodex-1デキストランビーズ０．０４ｍｇ乾燥ビーズ／培地１ｍｌ（１００〜１２０ｍｌ充填された１２５ｍｌスピナーフラスコにおいて、５×１０６細胞／１０ｍｇビーズ）、またはナイロンメッシュ（２５×１０６細胞／６×１００ｃｍ２ナイロン）のいずれかに細胞を播種した。全ての培養物を、増殖および播種用に、通常の大気および５％ＣＯ２で維持した。その時点で、低酸素培養物を、９５％窒素／５％ＣＯ２で充填された気密チャンバーに分割して、低酸素環境が培地内に生じ得るようにした。この方式では、培養容器中の酸素含有率が約１〜５％に維持される。播種用のナイロンまたはビーズを覆うのに必要な最小量において細胞をよく混合し、その後３０分後に１回混合し、加湿した３７℃のインキュベーター内に一晩静置した。培養物に１０％ＦＢＳ／ＤＭＥＭを２〜４週間与え、２〜３日ごとに５０〜７０％の培地交換を行った。同時に、細胞が増殖し、その後ＥＣＭが堆積し始めた。ＦＢＳの代わりに、鉄サプリメント含有の１０％ウシ胎仔血清および２０μｇ／ｍｌアスコルビン酸を、培養物に更に４〜６週間与えた。スピナーフラスコを最初は１５〜２５ｒｐｍで、約２〜４週間混合し、その時点で４５ｒｐｍに上げ、以後は、この速度で維持した。この方法によって、可溶性ＣＣＭ画分と非可溶性画分とを含む組成物が生成された。
【０２３０】
次いで、ＥＣＶをＣＣＭから単離させた。馴化培地のサンプルを３，０００×ｇで１５分間遠心分離することによって、まず細胞および細胞破片を事前除去した。システムズバイオサイエンス社（Systems BioScience Inc., SBI）製のオリジナルExoQuick（商標）を使用して、馴化培地サンプルからＥＣＶを単離させた。図１に図示されているように、５ｍｌの馴化培地を、４℃で一晩のインキュベーションの間、オリジナルExoQuick（商標）溶液１ｍｌによって沈殿させ、この間、チューブは、攪拌または回転せずに直立させた。ＥＣＶは、３，０００×ｇで３０分間遠心分離して分離させた（図１）。微量の液体を全て取り除き、ＥＣＶペレットを、ＰＢＳ中に再懸濁させた。
【０２３１】
実施例１１
単離されたＥＣＶの定量化および特性評価
単離されたＥＣＶを、NanoSight（商標）を使用したナノ粒子分析に供し、サイズ分布プロファイルを提供し、１ミリリットル当たりの総粒子数および粒子濃度を評価し、液体懸濁液中のナノ粒子を明視化した。データは、図３Ａ〜図３Ｂに図示されている通りである。
【０２３２】
タンパク質濃度を算定するために、ＥＣＶペレットを、新たに添加されたプロテアーゼ阻害剤カクテルを含有する２００μｌの氷冷ＲＩＰＡタンパク質抽出バッファーで処理した。ＢＣＡアッセイ（ＢＣＡタンパク質アッセイキット、Pierce（商標））を使用して、製造元の指示書に従い、エキソソーム内のタンパク質の総濃度を算定した。４つのサンプル（エンジニアリングラン、臨床ロット４．２０．１１、製造ロット、およびエンジニアリング＋ＢＣＳ  ４．１０．１２）のタンパク質濃度は、図４に図示されている通りである。
【０２３３】
ナノ粒子分析とＢＣＡタンパク質アッセイ測定とを併用して、各サンプルの粒子／タンパク質の比率を算定した。これについては、図３Ａに図示されている通りである。
【０２３４】
ＣＤ９を検出するウエスタンブロットおよび免疫蛍光分析によって、各抽出物中にＥＣＶが存在することが、確証した。ＥＣＶサンプルをＳＤＳ−ＰＡＧＥに供した後、抗ＣＤ９抗体（SantaCruz sc-9148）を使用してウエスタンブロット分析を実施した（図２）。ＣＤ９の免疫蛍光検出は、様々な条件（無血清培地、ＲＰＭＩ、ＥＰＩＬ、真皮乳頭細胞（ＤＰＣ）、および毛髪刺激複合体（ＨＳＣ））にて培養されたＨＤＦ細胞を使用して行った。結果は、細胞のＥＣＶ含有量を培養条件によって調整できることを示している。
【０２３５】
ＥＬＩＳＡによりＣＤ６３の発現を検出することによって、ＥＣＶが存在することもまた、検証された。ExoElisa Complete Kit（ＣＤ６３検出）（SBI EXOEL-CD63A）を使用して、サンプルをＥＬＩＳＡに供した。結果から、ＥＣＶが存在していることが実証された。
【０２３６】
実施例１２
ＥＣＶ組成物の評価
約１〜５％の低酸素条件下で培養されたＨＤＦによって生成された可溶性ＣＣＭに由来するヒトＥＣＶ組成物の特定のタンパク質組成を、ウエスタンブロット分析で調べた。抗Ｗｎｔ３ａ抗体（Santa Cruz＃26358）、抗Ｗｎｔ７ａ抗体（Santa Cruz＃26361-P）、および抗Ｗｎｔ７ｂ抗体（Santa Cruz＃sc-26363）を使用したウエスタンブロット分析によって、ＥＣＶにＷｎｔ３ａが存在する一方で、Ｗｎｔ７ａおよびＷｎｔ７ｂが存在しないことが、実証された（図５Ａ〜図５Ｃ）。このデータは、Ｗｎｔ３ａがＣＣＭ中に分泌されること、およびＷｎｔ３ａがまた、ＥＣＶ内に貯蔵されるか、またはＥＣＶ内へと含められ、放出されることを示唆している。
【０２３７】
ＥＣＶサンプルを、フォリスタチン（ＦＳＴ）およびフォリスタチン関連タンパク質−１（ＦＳＴＬ１）タンパク質の発現ならびに活性について評価した。ＥＣＶサンプルをＳＤＳ ＰＡＧＥに供し、続いてＦＳＴ（R＆D Systems AF669）およびＦＳＴＬ１（R＆D Systems＃1694）の存在についてウエスタンブロット分析を実施した。結果から、ＦＳＴレベルが低いことが示唆された。次いで、ＥＣＶサンプルを細胞ベースのＦＳＴ活性アッセイに供した。まず、様々な濃度に希釈した試験品（ＦＳＴ標準またはＨＳＣ）とアクチビンを９６ウェル組織培養プレートで３７℃で１時間インキュベートし、続いてＫ５６２細胞を５０００細胞／ウェルの濃度で添加した。細胞を４日間インキュベートし、その時点で、該細胞中のヘモグロビンの量を、生化学的手法を使用して測定する。ＦＳＴまたはＦＳＴ含有ＨＳＣの存在に起因して、用量−反応関係がアクチビン阻害活性の量に直接的に相関することが、観察され得る。Ｋ５６２細胞によるヘモグロビン産生の減少は、ＥＣＶサンプルのＦＳＴ活性を示す（図６）。
【０２３８】
上記の実施例を参照しながら本発明を説明してきたが、修正態様および変形態様が本発明の趣旨および範囲内に包含されることが理解されるであろう。したがって、本発明は、添付の特許請求の範囲によってのみ限定される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【国際調査報告】
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