(57)【要約】  本出願は、ＮＫＧ２Ｄを標的とするキメラ受容体、およびＮＫＧ２ＤドメインとＩＬ−３ドメインなどの第２の抗原結合ドメインとを含む多重特異性キメラ受容体を提供する。さらに提供されるのは、ＮＫＧ２Ｄドメインを有する第１のキメラ受容体、およびＩＬ−３ドメインなどの第２の抗原結合ドメインを有する第２のキメラ受容体を備える、二重キメラ受容体系である。さらに提供されるのは、改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）、医薬組成物、キット、およびがんを治療する方法である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
ポリペプチド鎖を有するキメラ受容体であって、前記ポリペプチド鎖は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、
を含む、
キメラ受容体。
【請求項２】
ポリペプチド鎖を有する多重特異性キメラ受容体であって、前記ポリペプチド鎖は、
（ａ）第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、第２のＮＫＧ２Ｄドメイン、および第２の抗原結合ドメインを含む、細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、
を含む、
多重特異性キメラ受容体。
【請求項３】
前記細胞外ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、前記第２の抗原結合ドメイン、前記第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、および前記第２のＮＫＧ２Ｄドメインを含む、請求項２に記載の多重特異性キメラ受容体。
【請求項４】
前記第２の抗原結合ドメインは、ペプチドリンカを介して前記第１のＮＫＧ２Ｄドメインに融合される、請求項１から３のいずれか一項に記載のキメラ受容体。
【請求項５】
第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖を有する多重特異性キメラ受容体であって、それぞれのポリペプチド鎖は、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメイン、および第２の抗原結合ドメインを含む、細胞外ドメインと、
（ｂ）膜貫通ドメインと、
（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインと、を含む、
多重特異性キメラ受容体。
【請求項６】
それぞれの細胞外ドメインは、二量体化モチーフをさらに含む、請求項５に記載の多重特異性キメラ受容体。
【請求項７】
前記二量体化モチーフは、前記ＮＫＧ２Ｄドメインと前記第２の抗原結合ドメインとの間に配置される、請求項６に記載の多重特異性キメラ受容体。
【請求項８】
前記二量体化モチーフは、ロイシンジッパである、請求項６または７に記載の多重特異性キメラ受容体。
【請求項９】
前記第２の抗原結合ドメインは、ペプチドリンカを介して前記ＮＫＧ２Ｄドメインに融合される、
請求項８に記載の多重特異性キメラ受容体。
【請求項１０】
前記第１のポリペプチド鎖および前記第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、前記第２の抗原結合ドメイン、前記ＮＫＧ２Ｄドメイン、前記膜貫通ドメイン、および前記細胞内シグナル伝達ドメインを含む、
請求項５〜９のいずれか１項に記載の多重特異性キメラ受容体。
【請求項１１】
二重キメラ受容体系であって、
（ｉ）第１のキメラ受容体であって、
（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む第１の細胞外ドメインと、
（ｂ）第１の膜貫通ドメインと、
（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインとを有する、
受容体と、
（ｉｉ）第２のキメラ受容体であって、
（ａ）第２の抗原結合ドメインを含む、第２の細胞外ドメインと、
（ｂ）第２の膜貫通ドメインとを有する、
受容体と、
を備える、
二重キメラ受容体系。
【請求項１２】
前記第２のキメラ受容体は、第２の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む、請求項１１に記載の二重キメラ受容体系。
【請求項１３】
前記第２の抗原結合ドメインは、抗体断片である、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の多重特異性キメラ受容体、または請求項１１もしくは１２に記載の二重キメラ受容体系。
【請求項１４】
前記抗体断片は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、および糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される抗原に特異的に結合する、請求項１３に記載の多重特異性キメラ受容体または二重キメラ受容体系。
【請求項１５】
前記第２の抗原結合ドメインは、リガンドまたはリガンド結合ドメインである、請求項２〜１０のいずれか１項に記載の多重特異性キメラ受容体、または請求項１１もしくは１２に記載の二重キメラ受容体系。
【請求項１６】
前記リガンドまたはリガンド結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０からなる群より選択される分子に由来する、請求項１５に記載の多重特異性キメラ受容体または二重キメラ受容体系。
【請求項１７】
前記第２の抗原結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインである、請求項１６に記載の多重特異性キメラ受容体または二重キメラ受容体系。
【請求項１８】
前記ＮＫＧ２Ｄドメイン（または前記第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび／もしくは前記第２のＮＫＧ２Ｄドメイン）は、配列番号７または８のアミノ酸配列を含む、請求項１〜１０および１３〜１７のいずれか１項に記載の多重特異性キメラ受容体、または請求項１１〜１７のいずれか１項に記載の二重キメラ受容体系。
【請求項１９】
前記膜貫通ドメイン（または前記第１の膜貫通ドメインおよび／もしくは前記第２の膜貫通ドメイン）は、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する、請求項１〜１０および１３〜１８のいずれか１項に記載のキメラ受容体、または請求項１１〜１８のいずれか１項に記載の二重キメラ受容体系。
【請求項２０】
前記細胞内シグナル伝達ドメイン（または前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または前記第２の細胞内シグナル伝達ドメイン）は、免疫エフェクタ細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１０および１３〜１９のいずれか１項に記載のキメラ受容体、または請求項１１〜１９のいずれか１項に記載の二重キメラ受容体系。
【請求項２１】
前記細胞内シグナル伝達ドメイン（または前記第１の細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または前記第２の細胞内シグナル伝達ドメイン）は、共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項１〜１０および１３〜２０のいずれか１項に記載のキメラ受容体、または請求項１１〜２０のいずれか１項に記載の二重キメラ受容体系。
【請求項２２】
前記共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する、請求項２１に記載のキメラ受容体または二重キメラ受容体系。
【請求項２３】
配列番号１６〜２０および３３〜３５からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラ受容体。
【請求項２４】
配列番号３６または３７のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチド。
【請求項２５】
請求項１〜１０および１３〜２３のいずれか１項に記載のキメラ受容体をコードする核酸配列を含む、単離核酸。
【請求項２６】
前記第１のキメラ受容体をコードする第１の核酸配列と、前記第２のキメラ受容体をコードする第２の核酸配列とを含む、請求項１１〜２２のいずれか１項に記載の二重キメラ受容体系をコードする単離核酸であって、前記第１の核酸配列は、自己開裂ペプチドをコードする第３の核酸配列を介して前記第２の核酸配列に動作可能に連結される、単離核酸。
【請求項２７】
配列番号２１〜２７および配列番号３８〜４０からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも約８５％の配列同一性を有する核酸配列を含む単離核酸。
【請求項２８】
請求項１〜２３のいずれか１項に記載のキメラ受容体もしくは二重キメラ受容体系、または請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の単離された核酸を含む改変免疫エフェクタ細胞。
【請求項２９】
請求項２８に記載の改変免疫エフェクタ細胞および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物。
【請求項３０】
請求項２９に記載の医薬組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体におけるがんを治療する方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年１２月２８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＣＮ２０１７／１１９３９７号の優先権の利益を主張し、この内容は、その全体が参照により、本明細書に引用される。ＡＳＣＩＩテキストファイルでの配列表の提出
【０００２】
ＡＳＣＩＩテキストファイルでの以下の提出の内容は、その全体が参照により本明細書に引用される：配列表のコンピューターで読み取り可能な形態（ＣＲＦ）（ファイル名：７６１４２２０００９４１ＳＥＱＬＩＳＴＩＮＧ．ｔｘｔ、記録日：２０１８年１２月２８日、サイズ：８５ＫＢ）。
【０００３】
本発明は、キメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、二重キメラ受容体系、改変免疫エフェクタ細胞、およびそれらの使用法に関する。
【背景技術】
【０００４】
急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）は、骨髄および血液を優位に占める骨髄前駆体の異常なクローン増殖によって特徴付けられ、この異常なクローン増殖は、正常な造血を極度に損なう。ＡＭＬは、最も一般的な種類の急性白血病であり、西欧諸国において、成人発症の白血病全体のおよそ２５％を占める。ＡＭＬは、成人で年間１００，０００人あたり３〜５人の発症率であり、すべての白血病の中で死亡率が最も高い（ＤｉＮａｒｄｏ  ａｎｄ  Ｃｏｒｔｅｓ  ２０１６）。この４０年間、ＡＭＬ患者の５年相対全生存率は、１９７５〜１９８０年の間の、ひどく低い６．３％から、２００７〜２０１２年の間の２３．９％まで、僅かに増加した（Ｍａｒｄｉｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【０００５】
ＡＭＬの標準的な一次治療は、導入療法として、シタラビンをアントラサイクリンと組み合わせて使用する化学療法であり、導入療法後に完全寛解（ＣＲ）に至った患者に対して、高用量シタラビンおよび／または同種幹細胞移植（ａｌｌｏＳＣＴ）の反復サイクルが続く。最初のＣＲは、現行の導入化学療法によって、若年成人患者の約７０％において達成できるが、患者の４３％は後に再発し、１８％は一次治療法を用いてＣＲを達成することはない（Ｆｏｒｍａｎ  ａｎｄ  Ｒｏｗｅ  ２０１３）。ａｌｌｏＳＣＴは、２回目の寛解後の好ましい治療法である。ａｌｌｏＳＣＴを受けた患者中の５年無病生存率は４０〜５０％であり、これはＡＭＬの免疫ベースの治療に対する感受性を示す。しかしながら、原発性の難治性疾患を有するか、または最初のＣＲの継続が６ヵ月より短い患者は、ａｌｌｏＳＣＴ治療からほとんど恩恵を受けない（Ｍａｒｄｉｒｏｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。さらに、従来の救援化学療法による、患者の器官への細胞傷害性の損傷は、ａｌｌｏＳＣＴが成功する可能性をさらに減ずる。したがって、再発または導入失敗後のＡＭＬ患者のための、より有効で傷害性の低い治療法が必要とされている。
【０００６】
Ｔ細胞は、腫瘍、特に新抗原の原因となる高い遺伝子変異数を有するものを攻撃し、絶滅させる潜在能力を有する。しかしながら、Ｔ細胞の抗腫瘍能力は、免疫抑制性の腫瘍微小環境（ＴＭＥ）によって活発に阻害されることが多い（ＭｃＧｒａｎａｈａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ）は、腫瘍細胞上の抗原に向けられる細胞外抗原結合ドメインと、ヒンジ領域と、抗原結合時にＴ細胞活性化を誘発するためのＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の細胞内シグナル伝達ドメインを含む融合タンパク質をコードする遺伝子を形質導入することによって構成されている。腫瘍抗原認識を天然のＴＣＲに依存する従来のＴ細胞とは異なって、ＣＡＲ−Ｔ細胞は未処理抗原に向け直され、それによって、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）抗原の発現から独立して、腫瘍細胞を殺傷する。したがって、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、免疫療法に特有の多くの制限を克服する能力を有する。２０年の前臨床研究および臨床試験の後、ＣＡＲ−Ｔベースの治療の安全性および実現可能性は確認されており、血液悪性腫瘍において、前例のない臨床結果が得られてきた（Ｋｏｃｈｅｎｄｅｒｆｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１５；Ｌｏｕｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１１）。
【０００７】
本明細書において言及される、すべての公報、特許、出願特許、および公開出願特許の開示は、ここで、その全体を参照により本明細書に引用するものとする。
【発明の概要】
【０００８】
本出願は、ＮＫＧ２Ｄリガンド、および腫瘍抗原、たとえばＣＤ１２３、などの第２の抗原を標的とする、多重特異性キメラ受容体および二重キメラ受容体系を提供する。ＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とするキメラ受容体も提供される。
【０００９】
本出願の一態様は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを有するキメラ受容体を提供する。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび第２のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。
【００１０】
本出願の一態様は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインと第２の抗原結合ドメインとを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを有する、多重特異性キメラ受容体を提供する。
【００１１】
本出願の一態様は、（ａ）第１のＮＫＧ２Ｄドメインと、第２のＮＫＧ２Ｄドメインと、第２の抗原結合ドメインとを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを有するポリペプチド鎖を備える、多重特異性キメラ受容体を提供する。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の抗原結合ドメイン、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、および第２のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ペプチドリンカを介して第１のＮＫＧ２Ｄドメインに融合される。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカは、約５０アミノ酸長以下である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカは、配列番号１２〜１５から選択されるアミノ酸配列を含む。
【００１２】
本出願の一態様は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを備える多重特異性キメラ受容体を提供し、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインと第２の抗原結合ドメインとを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを有する。いくつかの実施形態において、各細胞外ドメインは、二量体化モチーフをさらに含む。いくつかの実施形態において、二量体化モチーフは、ＮＫＧ２Ｄドメインと第２の抗原結合ドメインとの間に移される。いくつかの実施形態において、二量体化モチーフは、ロイシンジッパまたはシステインジッパである。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ペプチドリンカを介してＮＫＧ２Ｄドメインに融合される。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカは、約５０アミノ酸長以下である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカは、配列番号１２〜１５から選択されるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって、第２のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の抗原結合ドメイン、ＮＫＧ２Ｄドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００１３】
上述の多重特異性キメラ受容体のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、多重特異性キメラ受容体は、二重特異性キメラ受容体である。
【００１４】
上述の多重特異性キメラ受容体のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、抗体断片である。いくつかの実施形態において、抗体断片は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、および糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、リガンドまたはリガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、リガンドまたはリガンド結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−３ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列、または、配列番号９のアミノ酸配列に対して、少なくとも約８５％（たとえば、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する、そのバリアントを含む。
【００１５】
上述のキメラ受容体または多重特異性キメラ受容体のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメイン、または第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび／もしくは第２のＮＫＧ２Ｄドメインは、配列番号７もしくは８のアミノ酸配列、または、配列番号７もしくは８のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（たとえば、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する、それのバリアントを含む。
【００１６】
上述のキメラ受容体または多重特異性キメラ受容体のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号４または４５のアミノ酸配列を含む。
【００１７】
上述のキメラ受容体または多重特異性キメラ受容体のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【００１８】
上述のキメラ受容体または多重特異性キメラ受容体のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞質ドメインおよび／または４−１ＢＢの細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００１９】
上述のキメラ受容体または多重特異性キメラ受容体のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、キメラ受容体または多重特異性キメラ受容体は、細胞外ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００２０】
いくつかの実施形態において、上述のキメラ受容体または多重特異性キメラ受容体のうちのいずれか１つにおける、ポリペプチド鎖の１つまたは複数をコードする核酸配列を含む、１つまたは複数の単離された核酸が提供される。
【００２１】
本出願の一態様は、（ｉ）第１のキメラ受容体と（ｉｉ）第２のキメラ受容体とを備える二重キメラ受容体系を提供し、（ｉ）第１のキメラ受容体は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを有し、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖はそれぞれ、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、（ｉｉ）第２のキメラ受容体は、（ａ）第２の抗原結合ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、および（ｂ）第２の膜貫通ドメインを含む、第３のポリペプチド鎖を有する。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、第２の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【００２２】
本出願の一態様は、（ｉ）第１のキメラ受容体と（ｉｉ）第２のキメラ受容体とを備える二重キメラ受容体系を提供し、（ｉ）第１のキメラ受容体は、（ａ）第１のＮＫＧ２Ｄドメインと第２のＮＫＧ２Ｄドメインとを含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第１のポリペプチド鎖を有し、（ｉｉ）第２のキメラ受容体は、（ａ）第２の抗原結合ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、および（ｂ）第２の膜貫通ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖を有する。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、第２の細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。
【００２３】
上述の二重キメラ受容体系のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、抗体断片である。いくつかの実施形態において、抗体断片は、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、および糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、リガンドまたはリガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、リガンドまたはリガンド結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−３ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列、または、配列番号９のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（たとえば、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する、それのバリアントを含む。
【００２４】
上述の二重キメラ受容体系のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメイン、または第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび／もしくは第２のＮＫＧ２Ｄドメインは、配列番号７もしくは８のアミノ酸配列、または、配列番号７もしくは８のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（たとえば、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する、それのバリアントを含む。
【００２５】
上述の二重キメラ受容体系のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、第１のかつ／または第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、第１のかつ／または第２の膜貫通ドメインは、配列番号４または４５のアミノ酸配列を含む。
【００２６】
上述の二重キメラ受容体系のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、第１のかつ／または第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
【００２７】
上述の二重キメラ受容体系のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、第１のかつ／または第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の細胞質ドメインおよび／または４−１ＢＢの細胞質ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む。
【００２８】
上述の二重キメラ受容体系のうちのいずれか１つによるいくつかの実施形態において、第１のかつ／または第２のキメラ受容体は、細胞外ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域をさらに含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【００２９】
いくつかの実施形態において、上述の二重キメラ受容体系のうちのいずれか１つにおける、１つまたは複数のポリペプチド鎖をコードする核酸配列を含む、１つまたは複数の単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体をコードする第１の核酸配列と、第２のキメラ受容体をコードする第２の核酸配列とを含む単離された核酸が提供され、ここで、第１の核酸配列は、自己開裂ペプチドをコードする第３の核酸配列を介して第２の核酸配列に動作可能に連結される。いくつかの実施形態において、自己開裂ペプチドは、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、またはＦ２Ａペプチドである。
【００３０】
いくつかの実施形態において、配列番号１６〜２０および配列番号３３〜３５からなる群より選択されるアミノ酸配列、または、配列番号１６〜２０および３３〜３５からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（たとえば、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する、それらのバリアントを含むキメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体と第２のキメラ受容体とを含む二重キメラ受容体系が提供され、第１のキメラ受容体は、配列番号３４のアミノ酸配列、または、配列番号３４のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（たとえば、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する、そのバリアントを含み、第２のキメラ受容体は、配列番号４１のアミノ酸配列、または、配列番号４１のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（たとえば、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する、そのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体と第２のキメラ受容体とを含む二重キメラ受容体系が提供され、第１のキメラ受容体は、配列番号３５のアミノ酸配列、または、配列番号３５のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（たとえば、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する、そのバリアントを含み、第２のキメラ受容体は、配列番号４２のアミノ酸配列、または、配列番号４２のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（たとえば、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する、そのバリアントを含む。いくつかの実施形態において、配列番号３６または３７のアミノ酸配列、または、配列番号３６または３７のアミノ酸配列に対して少なくとも約８５％（たとえば、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する、それのバリアントを含む、ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、配列番号２１〜２７および配列番号３８〜４０からなる群より選択される核酸配列、または、配列番号２１〜２７および３８〜４０からなる群より選択される核酸配列に対して少なくとも約８５％（たとえば、少なくとも約９０％、９２％、９５％、９８％、または９９％）の配列同一性を有する、それらのバリアントを含む単離された核酸が提供される。
【００３１】
いくつかの実施形態において、上述の単離された核酸のうちのいずれか１つまたは複数をコードする、１つまたは複数のベクタが提供される。いくつかの実施形態において、ベクタは、レンチウイルスベクタである。
【００３２】
本出願の別の態様は、上述のキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系、単離された核酸、またはベクタのうちのいずれか１つを含む、改変免疫エフェクタ細胞を提供する。いくつかの実施形態において、免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、造血幹細胞、多能性幹細胞、または胚性幹細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞である。
【００３３】
いくつかの実施形態において、上述の改変免疫エフェクタ細胞のうちのいずれか１つ、および医薬的に許容される担体を含む、医薬組成物が提供される。
【００３４】
本出願の別の態様は、上述の医薬組成物のうちのいずれか１つの有効量を個体に投与する段階を含む、個体のがんを治療する方法を提供する。いくつかの実施形態において、がんは、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ球性白血病である。
【００３５】
さらに提供されるのは、上述のキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、二重キメラ受容体系、改変免疫エフェクタ細胞、単離された核酸、またはベクタのうちのいずれか１つを含む使用法、キット、製造物品である。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１Ａ】ＩＬ−３ドメインおよび２つのＮＫＧ２Ｄドメインを含む単一のポリペプチド鎖を含む例示的な二重特異性キメラ受容体（ＬＩＣ２００１）の概略図を示す。正に帯電した残基（Ｒ）は、第１のＮＫＧ２ＤドメインのＮ末端にて操作され（たとえば、逆方向ＮＫＧ２Ｄドメイン）、負に帯電した残基（Ｄ）は、第２のＮＫＧ２ＤドメインのＣ末端にて操作されている（たとえば、順方向ＮＫＧ２Ｄドメイン）。操作されたＲ残基およびＤ残基は、互いと塩橋を形成して二量体形成を促進する。
【００３７】
【図１Ｂ】ＩＬ−３ドメインおよび２つのＮＫＧ２Ｄドメインを含む単一のポリペプチド鎖を含む例示的な二重特異性キメラ受容体（ＬＩＣ２００１−１）の概略図を示す。
【００３８】
【図１Ｃ】ＩＬ−３ドメイン、ロイシンジッパモチーフ、およびＮＫＧ２Ｄドメインをそれぞれが含む２つのポリペプチド鎖を含む例示的な二重特異性キメラ受容体の概略図を示す。各ポリペプチド鎖のロイシンジッパモチーフは、二量体形成を促進する。さらに、ＮＫＧ２Ｄドメインは、ジスルフィド結合によって互いに架橋され得る。ＬＩＣ２００２は、ＩＬ−３ドメイン、ロイシンジッパモチーフ、および逆方向ＮＫＧ２Ｄドメインを含む。ＬＩＣ２００２−２は、ＩＬ−３ドメイン、ロイシンジッパモチーフ、および順方向ＮＫＧ２Ｄドメインを含む。
【００３９】
【図１Ｄ】ＩＬ−３ドメインおよびＮＫＧ２Ｄドメインをそれぞれが含む２つのポリペプチド鎖を含む例示的な二重特異性キメラ受容体（ＬＩＣ２００２−１）の概略図を示す。ＮＫＧ２Ｄドメインは、ジスルフィド結合によって互いに架橋される。
【００４０】
【図１Ｅ】ＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とする第１のキメラ受容体と、ＣＤ１２３を標的とする第２のキメラ受容体とを含む例示的な二重キメラ受容体系（ＬＩＣ２００３）の概略図を示す。第１のキメラ受容体は、２つのＮＫＧ２Ｄドメインを含むポリペプチド鎖を含み、２つのＮＫＧ２Ｄドメインは、ジスルフィド結合によって互いに架橋され得る。第２のキメラ受容体は、ＩＬ−３ドメインを含む。第２のキメラ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含有しても含有しなくてもよい。
【００４１】
【図１Ｆ】ＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とする第１のキメラ受容体と、ＣＤ１２３を標的とする第２のキメラ受容体とを含む例示的な二重キメラ受容体系（ＬＩＣ２００４）の概略図を示す。第１のキメラ受容体は、単一のＮＫＧ２Ｄドメインをそれぞれが含む２つのポリペプチド鎖を含み、ここで、ＮＫＧ２Ｄドメインは、ジスルフィド結合によって互いに架橋される。第２のキメラ受容体は、ＩＬ−３ドメインを含む。第２のキメラ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含有しても含有しなくてもよい。本図は、細胞内シグナル伝達ドメインを有さない、例示的な第２のＩＬ−３キメラ受容体を示す。
【００４２】
【図２】フローサイトメトリによって測定された、操作されたＴ細胞におけるＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体構築物（ＬＩＣ２００４およびＬＩＣ２００２−２）の発現を示す。
【００４３】
【図３Ａ】様々なＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体構築物を発現する操作されたＴ細胞の、腫瘍細胞Ｋ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃに対するインビトロ細胞傷害活性を示す。
【図３Ｂ】様々なＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体構築物を発現する操作されたＴ細胞の、腫瘍細胞Ｋ５６２−Ｌｕｃに対するインビトロ細胞傷害活性を示す。
【図３Ｃ】様々なＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体構築物を発現する操作されたＴ細胞の、腫瘍細胞ＫＧ１−Ｌｕｃに対するインビトロ細胞傷害活性を示す。
【００４４】
【図４】Ｋ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃに対する、様々なキメラ受容体構築物を発現する操作されたＴ細胞の、用量依存性の細胞傷害活性を比較するプロットを示す。
【００４５】
【図５Ａ】様々な構築物を発現する操作されたＴ細胞の、腫瘍細胞Ｋ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃに対する細胞傷害活性を示す。
【図５Ｂ】様々な構築物を発現する操作されたＴ細胞の、腫瘍細胞Ｋ５６２−Ｌｕｃに対する細胞傷害活性を示す。「ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１２３バインダ」は、ＬＩＣ２００４二重キメラ受容体系を発現する操作されたＴ細胞を指す。「ＮＫＧ２Ｄ」は、ＬＩＣ２００４二重キメラ受容体系の、ＮＫＧ２Ｄドメインを含むキメラ受容体（すなわち、ＬＩＣ２００４−１）のみを発現する操作されたＴ細胞を指す。「ＣＤ１２３バインダ」は、ＬＩＣ２００４二重キメラ受容体系の、ＩＬ−３ドメインを含むキメラ受容体のみを発現する操作されたＴ細胞を指す。
【００４６】
【図６Ａ】ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体構築物を発現する操作されたＴ細胞によるＫ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃ細胞およびＫ５６２−Ｌｕｃ細胞の殺傷に及ぼすＭＩＣＡ（ＮＫＧ２Ｄの同族リガンド）の阻害効果を示す。
【図６Ｂ】ＢＳＡが、ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体構築物を発現する操作されたＴ細胞によるＫ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃ細胞およびＫ５６２−Ｌｕｃ細胞の殺傷に有意な阻害効果を及ぼさないことを示す。
【００４７】
【図７】Ｋ５６２およびＫ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃ腫瘍細胞に対する、ＬＩＣ２００４およびＬＩＣ２００２−２構築物を発現する操作されたＴ細胞の細胞傷害活性を示す。
【００４８】
【図８Ａ】ＬＩＣ２００２−２、ＬＩＣ２００４、およびＬＩＣ２００４−１構築物を発現する操作されたＴ細胞の、Ｋ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃ細胞株との共培養によるＩＦＮγの分泌レベルを示す。
【図８Ｂ】ＬＩＣ２００２−２、ＬＩＣ２００４、およびＬＩＣ２００４−１構築物を発現する操作されたＴ細胞の、Ｋ５６２−Ｌｕｃ細胞株との共培養によるＩＦＮγの分泌レベルを示す。
【図８Ｃ】ＬＩＣ２００２−２、ＬＩＣ２００４、およびＬＩＣ２００４−１構築物を発現する操作されたＴ細胞の、ＫＧ１−Ｌｕｃ細胞株との共培養によるＩＦＮγの分泌レベルを示す。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
本出願は、ＮＫＧ２Ｄリガンド、およびＣＤ１２３などの第２の抗原を標的とする（たとえば、ＩＬ−３ドメイン）、多重特異性（たとえば二重特異性）キメラ受容体、および二重キメラ受容体系を提供する。いくつかの実施形態において、抗体ベースＣＡＲとは異なり、本明細書において説明されるキメラ受容体および二重キメラ受容体系は、リガンドとＴ細胞上のその同族受容体との間の高親和性および特異性を利用する。ＮＫＧ２Ｄリガンドは、ストレスを受けた細胞、特に腫瘍細胞上のみで発現される。本明細書で説明されるＮＫＧ２Ｄキメラ受容体および二重キメラ受容体系を発現する操作された免疫細胞は、抗腫瘍能力を向上させてきており、抗がん治療のための有用な治療剤を提供する。
【００５０】
したがって、本出願の一態様は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインと第２の抗原結合ドメイン（たとえば、ＣＤ１２３を標的とする結合ドメイン）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、多重特異性キメラ受容体を提供する。
【００５１】
いくつかの実施形態において、（ａ）第２の抗原結合ドメイン（たとえば、ＩＬ−３ドメイン）と、第１のＮＫＧ２Ｄドメインと、第２のＮＫＧ２Ｄドメインとを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド鎖を含む、多重特異性キメラ受容体が提供される。
【００５２】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性キメラ受容体が提供され、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインと第２の抗原結合ドメイン（たとえば、ＩＬ−３ドメイン）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、ロイシンジッパなどの二量体化モチーフをさらに含む。
【００５３】
別の態様において、（ｉ）第１のキメラ受容体と（ｉｉ）第２のキメラ受容体とを備える二重キメラ受容体系が提供され、（ｉ）第１のキメラ受容体は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、（ｉｉ）第２のキメラ受容体は、（ａ）第２の抗原結合ドメイン（たとえば、ＩＬ−３ドメイン）を含む第２の細胞外ドメイン、（ｂ）第２の膜貫通ドメイン、および任意選択で（ｃ）第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体は、単一のポリペプチド鎖を含み、ここで、第１の細胞外ドメインは、第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび第２のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含み、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００５４】
キメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系を含む改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）、医薬組成物、キット、製造物品、および改変免疫エフェクタ細胞を使用してがんを治療する方法も本明細書で説明される。
Ｉ．定義
【００５５】
本明細書で用いられる「キメラ受容体」は、遺伝子操作された受容体を指し、抗原−抗体相互作用またはリガンド−受容体結合によって、１つまたは複数の特異的なポリペプチド相互作用をＴ細胞などの免疫エフェクタ細胞に移植するために使用され得る。いくつかのキメラ受容体は、「キメラ抗原受容体」、「人工Ｔ細胞受容体」、「キメラＴ細胞受容体」、または「キメラ免疫受容体」としても公知である。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、１つまたは複数の抗原（たとえば腫瘍抗原）に特異的な細胞外抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、ならびにＴ細胞および／または他の受容体の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外抗原結合ドメインは、リガンドに由来する少なくとも１つのドメイン、または受容体の細胞外ドメインを含み、ここで、リガンドまたは受容体は、腫瘍抗原などの細胞表面抗原である。
【００５６】
「ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体」は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的な１つまたは複数の結合ドメイン（たとえば、ＮＫＧ２Ｄドメイン）を含む細胞外ドメインを有するキメラ受容体を指す。「ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体」は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的な結合ドメイン（たとえば、ＮＫＧ２Ｄドメイン）とＣＤ１２３に特異的な結合ドメイン（たとえば、ＩＬ−３ドメイン）とを含む細胞外ドメインを有するキメラ受容体を指す。
【００５７】
本明細書で用いられるように、「ＮＫＧ２Ｄドメイン」は、ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメインにおける機能性断片を指し、機能性断片は、ＮＫＧ２Ｄドメインの二量体化時に１つまたは複数のＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的に結合し得る。例示的なヒトＮＫＧ２Ｄリガンドとしては、これらに限定されないが、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、およびＵＬＢＰ分子が挙げられる。
【００５８】
本明細書で用いられるように、「ＩＬ−３ドメイン」は、ＩＬ−３の機能性断片（完全長ＩＬ−３を含む）を指し、機能性断片は、ＣＤ１２３、たとえば、ＩＬ−３Ｒ複合体および／またはＩＬ−３ＲＡサブユニットに特異的に結合し得る。
【００５９】
本明細書で用いられるように、「標的にする」、「特異的に結合する」、「特異的に認識する」、または「に特異的な」という用語は、標的と抗原結合タンパク質（たとえば、抗原結合ドメイン、リガンド、またはキメラ受容体）との間の結合などの測定可能で再現可能な相互作用を指し、相互作用は、生体分子を含む分子の不均一集団の存在における標的の存在を決定する。たとえば、標的に特異的に結合する抗原結合タンパク質は、この標的に、他の標的に結合するより高い親和性、結合力で、より容易に、かつ／またはより長い期間で結合する抗原結合タンパク質である。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質の関連しない標的への結合の度合いは、たとえば放射免疫測定法（ＲＩＡ）によって測定された、標的への抗原結合タンパク質の結合の約１０％より小さい。いくつかの実施形態において、標的を特異的に結合する抗原結合タンパク質は、≦１μＭ、≦１００ｎＭ、≦１０ｎＭ、≦１ｎＭ、または≦０．１ｎＭの解離定数（Ｋｄ）を有する。いくつかの実施形態において、抗原結合タンパク質は、異種由来のタンパク質中に保存されたタンパク質上のエピトープを特異的に結合する。いくつかの実施形態において、特異的な結合は、排他的結合を含み得るが、必要とはしない。
【００６０】
「特異性」という用語は、抗原結合タンパク質（たとえば、抗原結合ドメイン、リガンド、またはキメラ受容体）の、抗原の特定のエピトープに対する選択的な認識を指す。本明細書で用いられる「多重特異性」という用語は、抗原結合タンパク質（たとえばキメラ受容体）が、そのうち少なくとも２つが異なる抗原を結合する、２つ以上の抗原結合部位を有することを意味する。本明細書で用いられる「二重特異性」という用語は、抗原結合タンパク質（たとえばキメラ受容体）が、２つの異なる抗原結合特異性を有することを意味する。
【００６１】
「結合親和性」は一般に、分子の単一の結合部位（たとえば、抗原結合ドメイン、リガンド、またはキメラ受容体）とその結合パートナー（たとえば、抗原）との間の非共有結合相互作用の総和の強さを指す。別段の指示がない限り、本明細書で用いられるように、「結合親和性」は、結合対（たとえば、抗原結合ドメインおよび抗原）のメンバ間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を指す。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（Ｋｄ）によって表すことができる。親和性は、本明細書で説明されるものを含む、当技術分野で公知の一般的な方法によって測定することができる。低親和性の抗体は一般に、抗原を緩慢に結合し、容易に解離する傾向があるが、高親和性の抗体は一般に、抗原をより迅速に結合し、より長く結合したままである傾向がある。結合親和性を測定する様々な方法が当技術分野で公知であり、そのうちのいずれも本出願の目的のために用いることができる。
【００６２】
「抗体」という用語は、モノクローナル抗体（完全長４鎖抗体、または免疫グロブリンＦｃ領域を有する完全長重鎖のみ抗体を含む）、ポリエピトープの特異性を有する抗体組成物、多重特異性抗体（たとえば、二重特異性抗体、二特異性抗体、単鎖分子）、ならびに抗体断片（たとえば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ′）２、およびＦｖ）を含む。本明細書において企図される抗体は、重鎖のみ抗体などの単一ドメイン抗体を含む。
【００６３】
「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部、好ましくはインタクトな抗体の抗原結合領域および／または可変領域を含む。抗体断片の例としては、Ｆａｂ、Ｆａｂ′、Ｆ（ａｂ′）２、およびＦｖ断片；二特異性抗体；直鎖抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書、実施例２；Ｚａｐａｔａ  ｅｔ  ａｌ．、Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７−１０６２［１９９５］を参照されたい）；単鎖抗体分子；単一ドメイン抗体（たとえばＶＨＨ）、ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が挙げられる。
【００６４】
「ｓＦｖ」または「ｓｃＦｖ」とも略記される「単鎖Ｆｖ」は、単一ポリペプチド鎖に接続されたＶＨおよびＶＬ抗体ドメインを含む抗体断片である。好ましくは、ｓＦｖポリペプチドは、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間に、ｓＦｖが抗原結合のために望ましい構造を形成することを可能にするポリペプチドリンカをさらに含む。ｓＦｖの検討に関しては、Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ  ｉｎ  Ｔｈｅ  Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ  ｏｆ  Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ  Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ、ｖｏｌ．１１３、Ｒｏｓｅｎｂｕｒｇ  ａｎｄ  Ｍｏｏｒｅ  ｅｄｓ．、Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、ｐｐ．２６９−３１５（１９９４）を参照されたい。
【００６５】
ペプチド、ポリペプチド、または抗体配列に対する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」および「相同性」は、最大パーセント配列同一性を達成するために、配列を整列させ、必要であればギャップを導入した後、いかなる保存的置換も配列同一性の部分と見なさずに、特定のペプチドまたはポリペプチドの配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージと定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的での整列は、当技術分野の範囲内である様々なやり方、たとえば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮ、またはＭＥＧＡＬＩＧＮ（商標）（ＤＮＡＳＴＡＲ社）ソフトウェアなどの公に入手可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成することができる。当業者は、比較される配列の完全長にわたって最大限の整列を達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、整列を測定するための適切なパラメータを決定することができる。
【００６６】
本明細書で説明されるキメラ受容体または二重キメラ受容体系をコードする「単離された」核酸分子とは、それが産生された環境において通常関連付けられる少なくとも１つのコンタミ核酸分子から識別され分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸は、産生環境に関連付けられるすべての成分と関連がない。本明細書におけるポリペプチドおよび抗体をコードする単離された核酸分子は、天然に見られる形態または設定以外の形態である。したがって、単離された核酸分子は、細胞内に天然に存在する、本明細書におけるポリペプチドおよび抗体をコードする核酸から区別される。
【００６７】
「制御配列」という用語は、特定の宿主生物における動作可能に連結されたコード配列の発現のために必要なＤＮＡ配列を指す。原核生物に好適な制御配列としては、たとえば、プロモータ、任意選択でオペレータ配列、およびリボソーム結合部位が挙げられる。真核細胞は、プロモータ、ポリアデニル化シグナル、およびエンハンサを利用することが公知である。
【００６８】
核酸は、別の核酸配列との機能的な関係に置かれるとき、「動作可能に連結される」。たとえば、プレ配列または分泌リーダのＤＮＡは、ポリペプチドの分泌に関与する前タンパク質として発現される場合、ポリペプチドのＤＮＡに動作可能に連結される；プロモータまたはエンハンサは、配列の転写に影響を与える場合、コード配列に動作可能に連結される；またはリボソーム結合部位は、翻訳を促進するように位置付けられる場合、コード配列に動作可能に連結される。一般に、「動作可能に連結される」は、結合されるＤＮＡ配列が近接しており、分泌リーダの場合、近接し、解読段階にあることを意味する。しかしながら、エンハンサは近接している必要はない。連結は、好都合な制限部位でのライゲーションによって達成される。そのような部位が存在しない場合、合成オリゴヌクレオチドアダプタまたはリンカが従来の実践に従って、使用される。
【００６９】
本明細書で用いられる「ベクタ」という用語は、それが連結された別の核酸を伝播させることができる核酸分子を指す。この用語は、それが導入されている宿主細胞のゲノムに組み込まれたベクタだけでなく、自己複製核酸構造としてのベクタを含む。ある特定のベクタは、それらが動作可能に結合された核酸の発現を指示することができる。そのようなベクタは、本明細書において「発現ベクタ」と呼ばれる。
【００７０】
本明細書で用いられるように、「自家の」という用語は、それが後にその個体に再導入されることになる同じ個体に由来する任意の物質を指すことを意図される。
【００７１】
「同種の」は、同じ種の異なる個体に由来するグラフトを指す。
【００７２】
本明細書で用いられる「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」という用語は、外因性核酸が宿主細胞にトランスファまたは導入されるプロセスを指す。「トランスフェクションされた」または「形質転換された」または「形質導入された」細胞は、外因性核酸をトランスフェクションされた、形質転換された、または形質導入された細胞である。この細胞は、一次対象細胞およびその子孫を含む。
【００７３】
本明細書で用いられるように、「細胞」、「細胞株」、および「細胞培養物」という表現は、交換可能に使用され、すべてのそのような名称は子孫を含む。したがって、「トランスフェクタント」および「トランスフェクションされた細胞」という語は、トランスファの数に関係なく、一次対象細胞、およびそれに由来する培養物を含む。すべての子孫は、意図的なまたは偶発性の変異に起因して、ＤＮＡ内容物が厳密に同一でない場合があることも理解される。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングされたものと同じ機能または生物活性を有するバリアント子孫が含まれる。
【００７４】
本明細書で用いられるように、「治療」または「治療する」は、臨床結果を含む、有益なまたは望ましい結果を得るための手法である。本発明の目的のために、有益なまたは望ましい臨床結果としては、以下のうちの１つまたは複数が挙げられるが、これらに限定されない：疾患に起因する１つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の低減、疾患の安定化（たとえば、疾患の悪化を予防するまたは遅延させる）、疾患の拡散（たとえば、転移）の予防または遅延、疾患の再発の予防または遅延、疾患の進行の遅延または緩慢化、病状の寛解、疾患の（一部または完全な）寛解の提供、疾患を治療するために必要な１種または複数種の薬剤の用量の低減、疾患の進行の遅延、生活の質の向上、および／または生存期間の延長。「治療」によってさらに包含されるのは、がんの病理的結果の低減である。本出願の方法は、治療のこれらの態様のうちのいずれか１つまたは複数を企図する。
【００７５】
本明細書で用いられるように、「個体」または「対象」は、ヒト、ウシ亜科の動物、ウマ科の動物、ネコ科の動物、イヌ科の動物、げっ歯類、または霊長類を含むが、これらに限定されない哺乳類を指す。いくつかの実施形態において、個体は、ヒトである。
【００７６】
本明細書において用いられる「有効量」という用語は、改変免疫エフェクタ細胞またはその医薬組成物などの剤の、特定された障害、状態、または疾患を治療する（たとえば、その症状のうちの１つまたは複数を寛解、緩和、軽減、および／または遅延する）のに十分な量を指す。がんに関連しては、有効量は、腫瘍を縮小させる、かつ／または腫瘍の成長速度を減少させる（たとえば、腫瘍成長を抑制する）、または他の望ましくない細胞増殖を阻止または遅延させるのに十分な量を含む。いくつかの実施形態において、有効量は、発達を遅延させるのに十分な量である。いくつかの実施形態において、有効量は、再発を予防または遅延させるのに十分な量である。有効量は、１回または複数回の投与において投与され得る。有効量の薬物または組成物は、（ｉ）がん細胞の数を低減し得る、（ｉｉ）腫瘍サイズを低減し得る、（ｉｉｉ）がん細胞の末梢器官への浸潤を、ある程度阻害、遅延、緩慢化し得る、好ましくは止め得る、（ｉｖ）腫瘍転移を阻害し得る（すなわち、ある程度緩慢化し得る、好ましくは止め得る）、（ｖ）腫瘍成長を阻害し得る、（ｖｉ）腫瘍の発生および／または再発を予防または遅延し得る、かつ／または（ｖｉｉ）がんに関連付けられる症状のうちの１つまたは複数を、ある程度緩和し得る。
【００７７】
本明細書で用いられるように、がんの発達を「遅延させる」は、疾患の発達を、延期する、妨害する、緩慢化させる、遅れさせる、安定化させる、かつ／または延ばすことを意味する。この遅延は、疾患および／または治療される個体の履歴に応じて、時間の長さが変動し得る。当業者には明らかなように、十分なまたは著しい遅延は、個体が疾患を発達させないという点で、事実上、予防を包含し得る。がんの発達を「遅延する」方法は、この方法を用いない場合と比較して、所与の時間枠において疾患発達の可能性を低減する、かつ／または所与の時間枠において疾患の程度を低減する方法である。このような比較は典型的に、統計学的に有意な個体数を用いた臨床研究に基づいている。がんの発達は、コンピュータ体軸断層撮影（ＣＡＴスキャン）、磁気共鳴画像（ＭＲＩ）、腹部超音波、凝固検査、動脈造影法、または生検を含むが、これらに限定されない標準的な方法を用いて検出可能であり得る。発達はまた、病初では検出不可能な場合があるがんの進行を指してもよく、発生、再発、および発症を含む。
【００７８】
本明細書で説明される本出願の実施形態は、「からなる」および／または「本質的に、からなる」実施形態を含むことが理解される。
【００７９】
本明細書における、「約」のついた値またはパラメータへの言及は、その値またはパラメータ自体を対象とする変形を含む（かつ説明する）。たとえば、「約Ｘ」に言及する説明は、「Ｘ」の説明を含む。
【００８０】
本明細書で用いられるように、「ない」のついた値またはパラメータへの言及は一般に、値またはパラメータ「以外の」を意味し、説明する。たとえば、方法はＸタイプのがんを治療するために用いられない、は、方法はＸ以外のタイプのがんを治療するために用いられる、を意味する。
【００８１】
本明細書において用いられる「約Ｘ〜Ｙ」という用語は、「約Ｘ〜約Ｙ」と同じ意味を有する。
【００８２】
本明細書および添付した請求項において用いられるように、文脈上明確に別段の指示がない限り、単数形の「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、複数の指示対象を含む。
ＩＩ．多重特異性キメラ受容体および二重キメラ受容体系
【００８３】
本出願は、ＮＫＧ２Ｄリガンドを標的とするキメラ受容体およびキメラ受容体系を提供する。本出願の一態様は、ＮＫＧ２Ｄドメインと、ＣＤ１２３結合ドメインなどの第２の抗原結合ドメイン、たとえばＩＬ−３ドメイン、とを含む細胞外ドメインを含む多重特異性キメラ受容体を提供する。
【００８４】
いくつかの実施形態において、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、キメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、細胞外ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、ペプチドリンカ、第２のＮＫＧ２Ｄドメイン、膜貫通ドメイン（ＣＤ８α）、４−１ＢＢに由来する共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。
【００８５】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含むキメラ受容体が提供され、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインと二量体化モチーフ（たとえば、ロイシンジッパまたはシステインジッパ）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって、第２のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、第１の細胞外ドメインのＣ末端と第１の膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、各ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。
【００８６】
いくつかの実施形態において、（ａ）第１のＮＫＧ２Ｄドメインと第２のＮＫＧ２Ｄドメインとを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、細胞外ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、ペプチドリンカ、第２のＮＫＧ２Ｄドメイン、膜貫通ドメイン（ＣＤ８α）、４−１ＢＢに由来する共刺激ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメインは、配列番号８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号３３のアミノ酸配列に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３８の核酸配列に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有する核酸配列を含む、単離された核酸配列が提供される。
【００８７】
いくつかの実施形態において、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインと第２の抗原結合ドメイン（たとえば、ＩＬ−３ドメイン）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、多重特異性（たとえば、二重特異性）キメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、および糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０からなる群より選択される分子に由来するリガンドまたはリガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、多重特異性キメラ受容体は、細胞外ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。
【００８８】
キメラ受容体（たとえば、多重特異性キメラ受容体）は、１つまたは複数のポリペプチド鎖を含んでもよい。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、単量体である。いくつかの実施形態において、単量体キメラ受容体は、第１のＮＫＧ２Ｄドメインと第２のＮＫＧ２Ｄドメインとを含む細胞外ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の抗原結合ドメイン（たとえば、ＩＬ−３ドメイン）、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、および第２のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、第２のＮＫＧ２Ｄドメイン、および第２の抗原結合ドメイン（たとえば、ＩＬ−３ドメイン）を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＫＧ２Ｄドメインは、第２のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、第１のＮＫＧ２Ｄドメインは、第１の操作された残基をＮ末端にて含み、第２のＮＫＧ２Ｄドメインは、第２の操作された残基をＣ末端にて含み、ここで、第１の操作された残基は、たとえば、ジスルフィド結合または塩橋によって、第２の操作された残基に関連付けられる。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、約５０アミノ酸長以下のペプチドリンカなどのペプチドリンカ、たとえば、配列番号１２〜１５から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカ、を介して、第１のＮＫＧ２Ｄドメインに融合される。
【００８９】
いくつかの実施形態において、キメラ受容体（たとえば、多重特異性キメラ受容体）は、ホモ二量体またはヘテロ二量体などの二量体である。いくつかの実施形態において、二量体キメラ受容体は、単一のＮＫＧ２Ｄドメインをそれぞれが含む２つのポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、二量体キメラ受容体は、２つの同一のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、二量体キメラ受容体は、２つの異なるポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の抗原結合ドメイン、ＮＫＧ２Ｄドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＮＫＧ２Ｄドメイン、第２の抗原結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、二量体キメラ受容体の各ポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、非共有結合的に互いと結合して二量体を形成する。いくつかの実施形態において、二量体キメラ受容体の各ポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、細胞外ドメインにおいて、たとえば、ジスルフィド結合によって、かつ／または二量体化モチーフ（たとえば、ロイシンジッパまたはシステインジッパ）を介して、共有結合的に互いと結合して二量体を形成する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、約５０アミノ酸長以下のペプチドリンカなどのペプチドリンカ、たとえば、配列番号１２〜１５から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカ、を介してＮＫＧ２Ｄドメインに融合される。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ロイシンジッパまたはシステインジッパなどの二量体化モチーフを介して、ＮＫＧ２Ｄドメインに融合される。
【００９０】
したがって、いくつかの実施形態において、（ａ）第１のＮＫＧ２Ｄドメインと、第２のＮＫＧ２Ｄドメインと、第２の抗原結合ドメインとを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド鎖を含む、多重特異性（たとえば二重特異性）キメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、および糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０からなる群より選択される分子に由来するリガンドまたはリガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、約５０アミノ酸長以下のペプチドリンカなどのペプチドリンカ、たとえば、配列番号１２〜１５から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカ、を介して、第１のＮＫＧ２Ｄドメインまたは第２のＮＫＧ２Ｄドメインに融合される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、多重特異性キメラ受容体は、細胞外ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、多重特異性キメラ受容体は、ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の抗原結合ドメイン（たとえば、ＩＬ−３ドメイン）、第１のペプチドリンカ、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、第２のペプチドリンカ、第２のＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００９１】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性（たとえば二重特異性）キメラ受容体が提供され、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインと第２の抗原結合ドメインとを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって、第２のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、および糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０からなる群より選択される分子に由来するリガンドまたはリガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、約５０アミノ酸長以下のペプチドリンカなどのペプチドリンカ、たとえば、配列番号１２〜１５から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカ、を介してＮＫＧ２Ｄドメインに融合される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、第１の細胞外ドメインのＣ末端と第１の膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、各ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の抗原結合ドメイン（たとえば、ＩＬ−３ドメイン）、ペプチドリンカ、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメイン��含む。
【００９２】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性（たとえば二重特異性）キメラ受容体が提供され、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインと、二量体化モチーフ（たとえば、ロイシンジッパまたはシステインジッパ）と、第２の抗原結合ドメインとを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって、第２のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、および糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０からなる群より選択される分子に由来するリガンドまたはリガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、第１の細胞外ドメインのＣ末端と第１の膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、各ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２の抗原結合ドメイン（たとえば、ＩＬ−３ドメイン）、ロイシンジッパ、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【００９３】
いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、腫瘍抗原などの細胞表面抗原に特異的に結合する。例示的な腫瘍抗原としては、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、および糖脂質Ｆ７７が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、単鎖抗体（たとえば、ｓｃＦｖ）または単一ドメイン抗体（たとえば、ＶＨＨ）などの抗体断片である。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１２３（たとえば、ＩＬ−３ＲまたはＩＬ−３ＲＡサブユニット）に特異的に結合する抗体断片（たとえば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ）である。
【００９４】
いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、リガンドである。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、受容体の細胞外ドメインなどのリガンド結合ドメインである。例示的なリガンドおよび受容体としては、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインである。
【００９５】
したがって、いくつかの実施形態において、（ａ）第１のＮＫＧ２Ｄドメインと、第２のＮＫＧ２Ｄドメインと、ＣＤ１２３結合ドメイン（たとえばＩＬ−３ドメイン）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド鎖を含む、多重特異性（たとえば二重特異性）キメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、約５０アミノ酸長以下のペプチドリンカなどのペプチドリンカ、たとえば、配列番号１２〜１５から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカ、を介して、第１のＮＫＧ２Ｄドメインまたは第２のＮＫＧ２Ｄドメインに融合される。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、抗ＣＤ１２３抗体断片（たとえば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ）である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、多重特異性キメラ受容体は、細胞外ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、多重特異性キメラ受容体は、ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、第１のペプチドリンカ、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、第２のペプチドリンカ、第２のＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な多重特異性キメラ受容体を図１Ａ〜図１Ｂに示す。
【００９６】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性（たとえば二重特異性）キメラ受容体が提供され、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２ＤドメインとＣＤ１２３結合ドメイン（たとえばＩＬ−３ドメイン）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって、第２のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、約５０アミノ酸長以下のペプチドリンカなどのペプチドリンカ、たとえば、配列番号１２〜１５から選択されるアミノ酸配列を含むペプチドリンカ、を介してＮＫＧ２Ｄドメインに融合される。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、抗ＣＤ１２３抗体断片（たとえば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ）である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、第１の細胞外ドメインのＣ末端と第１の膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、各ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、ペプチドリンカ、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な多重特異性キメラ受容体を図１Ｄに示す。
【００９７】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含む多重特異性（たとえば二重特異性）キメラ受容体が提供され、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインと、二量体化モチーフ（たとえば、ロイシンジッパまたはシステインジッパ）と、ＣＤ１２３結合ドメイン（たとえばＩＬ−３ドメイン）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって、第２のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、抗ＣＤ１２３抗体断片（たとえば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ）である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインである。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、第１の細胞外ドメインのＣ末端と第１の膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、各ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、ロイシンジッパ、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な多重特異性キメラ受容体を図１Ｃに示す。
【００９８】
例示的なＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体およびそれらの配列を、表１に示す。同一の２つのポリペプチド鎖を有する二量体キメラ受容体に関しては、単量体サブユニットのアミノ酸配列を示す。いくつかの実施形態において、配列番号１６〜２０からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して、約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号１６〜２０からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３３のアミノ酸配列に対して、約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するポリペプチドを含む、ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号３３のアミノ酸配列を含む、ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体が提供される。配列番号１６〜２０および３３からなる群より選択されるアミノ酸配列を含む、ポリペプチドも提供される。
【００９９】
いくつかの実施形態において、本明細書において提供されるキメラ受容体または多重特異性キメラ受容体のうちのいずれかをコードする１つまたは複数の単離された核酸が提供される。キメラ受容体が同一の２つのポリペプチド鎖を有する二量体キメラ受容体である、いくつかの実施形態において、キメラ受容体の単量体サブユニット、すなわちポリペプチド鎖の単一コピーをコードする単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号２１〜２５および３８からなる群より選択される核酸配列に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有する単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、上述のキメラ受容体または多重特異性キメラ受容体をコードする核酸のうちのいずれか１つを含む１つまたは複数のベクタが提供される。いくつかの実施形態において、ベクタは、発現ベクタである。いくつかの実施形態において、ベクタは、レンチウイルスベクタなどのウイルスベクタである。いくつかの実施形態において、ベクタは、非ウイルス性ベクタである。
表１  例示的なＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体。
【表１】
2021508463.tif 000002
二重キメラ受容体系
【０１００】
本出願の一態様は、（ｉ）第１のキメラ受容体と（ｉｉ）第２のキメラ受容体とを備える二重キメラ受容体系を提供し、（ｉ）第１のキメラ受容体は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、（ｉｉ）第２のキメラ受容体は、（ａ）第２の抗原結合ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、（ｂ）第２の膜貫通ドメイン、および任意選択で（ｃ）第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。第１のキメラ受容体は、ＮＫＧ２Ｄリガンドに特異的に結合し、第２のキメラ受容体は、腫瘍抗原、たとえばＣＤ１２３、などの第２の抗原に特異的に結合する。
【０１０１】
第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体のそれぞれは、１つまたは複数のポリペプチド鎖を含んでもよい。二重キメラ受容体系は、本明細書で説明される第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体の任意の組み合わせを含んでもよい。
【０１０２】
いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体は、（ａ）第１のＮＫＧ２Ｄドメインと第２のＮＫＧ２Ｄドメインとを含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、単一のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＫＧ２Ｄドメインは、第２のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、第１のＮＫＧ２Ｄドメインは、第１の操作された残基をＮ末端にて含み、第２のＮＫＧ２Ｄドメインは、第２の操作された残基をＣ末端にて含み、ここで、第１の操作された残基は、たとえば、ジスルフィド結合または塩橋によって、第２の操作された残基に関連付けられる。いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体は、第１の細胞外ドメインのＣ末端と第１の膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体は、ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、ペプチドリンカ、第２のＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。例示的な第１のキメラ受容体を図１Ｅに示す。
【０１０３】
いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含み、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって、第２のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、第１の細胞外ドメインのＣ末端と第１の膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、各ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。例示的な第１のキメラ受容体を図１Ｆに示す。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含み、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインと二量体化ドメイン（たとえば、ロイシンジッパまたはシステインジッパ）を含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、二量体化ドメインは、ＮＫＧ２ＤドメインのＮ末端に位置される。いくつかの実施形態において、二量体化ドメインは、ＮＫＧ２ＤドメインのＣ末端に位置される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインはさらに、１つまたは複数のジスルフィド結合によって、第２のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、第１の細胞外ドメインのＣ末端と第１の膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、各ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、ロイシンジッパ、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、（ａ）第２の抗原結合ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、および（ｂ）第２の膜貫通ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。いくつかの実施形態において、第２の細胞外ドメインは、ＮＫＧ２Ｄドメインをさらに含み、たとえば、第２の細胞外ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＮＫＧ２Ｄドメインと第２の抗原結合ドメインとを、または第２の抗原結合ドメインとＮＫＧ２Ｄドメインとを含む。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、および糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０からなる群より選択される分子に由来するリガンドまたはリガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインなどのＣＤ１２３結合ドメインである。いくつかの実施形態において、第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、第２の細胞外ドメインのＣ末端と第２の膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、およびＣＤ８α膜貫通ドメインを含むポリペプチドを含む。例示的な第２のキメラ受容体を、図１Ｅおよび図１Ｆに示す。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、（ａ）第２の抗原結合ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、（ｂ）第２の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、第２の細胞外ドメインは、ＮＫＧ２Ｄドメインをさらに含み、たとえば、第２の細胞外ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＮＫＧ２Ｄドメインおよび第２の抗原結合ドメインを、または第２の抗原結合ドメインおよびＮＫＧ２Ｄドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、および糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される抗原に特異的に結合する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０からなる群より選択される分子に由来するリガンドまたはリガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインなどのＣＤ１２３結合ドメインである。いくつかの実施形態において、第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、第２の細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、細胞外ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、および４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。
【０１０７】
いくつかの実施形態において、（ｉ）第１のキメラ受容体と（ｉｉ）第２のキメラ受容体とを備える二重キメラ受容体系が提供され、（ｉ）第１のキメラ受容体は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを有し、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖はそれぞれ、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、（ｉｉ）第２のキメラ受容体は、（ａ）第２の抗原結合ドメイン（たとえばＩＬ−３ドメイン）を含む第２の細胞外ドメイン、（ｂ）第２の膜貫通ドメイン、および任意選択で（ｃ）第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第３のポリペプチド鎖を有する。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって、第２のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、第１の膜貫通ドメインおよび／または第２の膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、第１の細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、第１の細胞内シグナル伝達ドメインおよび／または第２の細胞内ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、第１の細胞外ドメインのＣ末端と第１の膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、各ポリペプチド鎖は、各ポリペプチド鎖のＮ末端に位置されるシグナルペプチド（たとえばＣＤ８αシグナルペプチド）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第３のポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、およびＣＤ８α膜貫通ドメインを含む。例示的な二重キメラ受容体系を図１Ｆに示す。
【０１０８】
いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体のポリペプチドおよび第２のキメラ受容体のポリペプチドは、ポリシストロン性核酸構築物によって発現される。たとえば、第１のキメラ受容体のポリペプチドは、自己開裂ペプチドによって第２のキメラ受容体のポリペプチドに融合される。例示的な自己開裂ペプチドとしては、Ｔ２Ａ、Ｐ２Ａ、およびＦ２Ａペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。Ｔ２Ａペプチドは説明されており、たとえば、Ｓｚｙｍｃｚａｋ  ＡＬ．ｅｔ  ａｌ．，Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｕｌｔｉ−ｇｅｎｅ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｕｓｉｎｇ  ａ  "ｓｅｌｆ−ｃｌｅａｖｉｎｇ"  ２Ａ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｂａｓｅｄ  ｒｅｔｒｏｖｉｒａｌ  ｖｅｃｔｏｒ．Ｎａｔ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ  ２００４；２２（５）５８９−５９４を参照されたい。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明される二重キメラ受容体系のうちのいずれか１つをコードする、１つまたは複数の単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体をコードする第１の核酸配列と、第２のキメラ受容体をコードする第２の核酸配列とを含む単離された核酸が提供され、ここで、第１の核酸配列は、自己開裂ペプチド（たとえばＴ２Ａ）をコードする第３の核酸配列を介して第２の核酸配列に動作可能に連結される。第１のキメラ受容体が同一の２つのポリペプチド鎖を有する二量体キメラ受容体である、いくつかの実施形態において、第１の核酸は、第１のキメラ受容体の単量体サブユニット、すなわちポリペプチド鎖の単一コピーをコードする。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、配列番号３４〜３５および４１〜４２からなる群より選択されるアミノ酸配列に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体と第２のキメラ受容体とを含むＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３二重キメラ受容体系が提供され、第１のキメラ受容体は、配列番号３４のアミノ酸配列に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のキメラ受容体は、配列番号４１のアミノ酸配列に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体と第２のキメラ受容体とを含むＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３二重キメラ受容体系が提供され、第１のキメラ受容体は、配列番号３５のアミノ酸配列に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、第２のキメラ受容体は、配列番号４２のアミノ酸配列に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、配列番号３６または３７のアミノ酸配列に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態において、配列番号２６〜２７、３９〜４０、および４３〜４４からなる群より選択される核酸配列に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有する単離された核酸が提供される。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、ＤＮＡである。いくつかの実施形態において、単離された核酸は、ＲＮＡ（たとえばｍＲＮＡ）である。いくつかの実施形態において、上述の二重キメラ受容体系またはキメラ受容体をコードする核酸のうちのいずれか１つまたは複数を含む１つまたは複数のベクタが提供される。いくつかの実施形態において、ベクタは、発現ベクタである。いくつかの実施形態において、ベクタは、レンチウイルスベクタなどのウイルスベクタである。いくつかの実施形態にお��て、ベクタは、非ウイルス性ベクタである。例示的な二重キメラ受容体系を以下に示す。
表２  例示的なＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３二重キメラ受容体系。
【表２】
2021508463.tif 000003
細胞外ドメイン
【０１１１】
本明細書で説明される、多重特異性キメラ受容体、二重キメラ受容体系の第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体を含むキメラ受容体は、１つまたは複数のＮＫＧ２Ｄドメインおよび／または第２の抗原結合ドメインを含む１つまたは複数（たとえば、１、２、３、４、５、６またはより多いのいずれか１つ）の抗原結合ドメインを有する、細胞外ドメインを備える。ＮＫＧ２Ｄドメインおよび第２の抗原結合ドメインは、ペプチド結合を介して、ペプチドリンカを介して、またはロイシンジッパもしくはシステインジッパなどの二量体化モチーフを介して、互いに対して直接的に融合されてもよい。
ＮＫＧ２Ｄドメイン
【０１１２】
キメラ受容体の細胞外ドメインは、１つまたは複数のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体の細胞外ドメインは、単一のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび第２のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび第２のＮＫＧ２Ｄドメインは、同一である。いくつかの実施形態において、第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび第２のＮＫＧ２Ｄドメインは、異なる。いくつかの実施形態において、第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび第２のＮＫＧ２Ｄドメインは、ペプチド結合によって直接的に、またはペプチドリンカを介して、互いに対して融合される。
【０１１３】
いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメインは、ヒトＮＫＧ２Ｄ分子に由来する。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメインは、ＮＫＧ２Ｄ、たとえばヒトＮＫＧ２Ｄの、細胞外ドメインに由来する。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメインは、順方向ＮＫＧ２Ｄドメイン、すなわち、野性型ＮＫＧ２Ｄドメインと同じ順序のアミノ酸配列を有するドメインである。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメインは、野性型ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメイン由来の少なくとも約１００、１０５、１１０、１１５、１２０、１２５、１３０、１３５、１４０、１５０またはそれより多いアミノ酸のうちのいずれか１つを含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメインは、逆方向ＮＫＧ２Ｄドメイン、すなわち、野性型ＮＫＧ２Ｄドメインと逆方向の配列を有するドメインである。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメイン（第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび／または第２のＮＫＧ２Ｄドメインを含む）は、配列番号７または８に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメインは、対応するＮＫＧ２Ｄの野性型配列と比較して、少なくとも１、２、３、４、５またはそれより多いアミノ酸置換（たとえば保存的アミノ酸置換）を含む。
【０１１４】
ＮＫＧ２Ｄは、ＮＫ細胞の細胞傷害活性を刺激または阻害するＣ型レクチン受容体であるＮＫＧ２ファミリの固有のメンバである。ＮＫＧ２Ｄは、タイプＩＩ膜貫通−アンカー型糖タンパク質であり、主にＮＫ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞（たとえば、αβＴ細胞およびγδＴ細胞）の表面で発現される。ＮＫＧ２Ｄは複数の種にわたって、高度に保存されており、７０％の配列同一性がヒトとマウスの受容体との間で共有される。ＣＤ９４とヘテロ二量体を形成し、非古典的ＭＨＣ糖タンパク質クラスＩに結合する他のＮＫＧ２受容体と異なり、ＮＫＧ２Ｄは、ホモ二量体を形成し、細胞ストレス誘導分子に結合する。蓄積されるエビデンスにより、ＮＫＧ２Ｄは、自家腫瘍細胞およびウイルス感染した細胞などの、ストレスを受けた、または異常な細胞に対する免疫監視において、重大な役割を果たすことが示されている。
【０１１５】
ＭＨＣファミリの遺伝子によってコードされるＭＩＣ分子（ＭＨＣクラスＩ鎖関連タンパク質ＡおよびＢ、すなわちＭＩＣＡおよびＭＩＣＢ）、ヒト染色体６上にクラスタ形成されるＵＬＢＰ分子（ＵＬ１６結合タンパク質、ＲＡＥＴ１タンパク質としても公知である）を含む、様々なＮＫＧ２Ｄリガンドがヒトにおいて同定されている（Ｂａｈｒａｍ  ｅｔ  ａｌ．２００５）。すべてのＮＫＧ２Ｄリガンドは、ＭＨＣクラスＩ分子に相同性があり、かなりの対立遺伝子の多様性を示す。ＮＫＧ２ＤリガンドＲＮＡは、体のすべての組織および器官において広く発現されるが、ＮＫＧ２Ｄリガンドは一般に、正常な成人細胞の表面には不在である（Ｌｅ  Ｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｇａｓｓｅｒ  ２０１４）。しかしながら、ＮＫＧ２Ｄリガンドの発現は、ヒートショック、ＤＮＡ損傷、および失速したＤＮＡ複製を含む細胞ストレスに応答して、主に上皮由来の組織において誘発されるか、または上方調節される。細胞上のＮＫＧ２Ｄリガンドの存在により、ＮＫ細胞による標的指向および潜在的な排除のために、細胞に目印が付けられる（Ｌｅ  Ｂｅｒｔ  ａｎｄ  Ｇａｓｓｅｒ  ２０１４）。興味深いことに、様々な血液腫瘍および固形腫瘍にわたって、形質転換した細胞におけるＤＮＡ修復経路の高い活性により、ＮＫＧ２Ｄリガンドが発現し、これにより、これらの細胞をＮＫ媒介の溶解に対して感受性にする（Ｓｅｎｔｍａｎ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。
【０１１６】
ＮＫＧ２Ｄは、ＫＬＲＫ１遺伝子によってコードされる。ＮＫＧ２Ｄは、３つのドメイン：細胞質ドメイン（ヒトＮＫＧ２Ｄの残基１〜５１）、膜貫通ドメイン（ヒトＮＫＧ２Ｄの残基５２〜７２）、および細胞外ドメイン（ヒトＮＫＧ２Ｄの残基７３〜２１６）を含む、膜貫通受容体タンパク質である。ＮＫＧ２Ｄの細胞外ドメインは、Ｃ型レクチンドメイン（ヒトＮＫＧ２Ｄの残基９８〜２１３）を含有する。
第２の抗原結合ドメイン
【０１１７】
第２の抗原結合ドメインは、細胞表面分子に特異的に結合する。第２の抗原結合ドメインは、特定の病状に関連付けられる標的細胞上で細胞表面マーカとして作用する抗原を認識するように選択されてもよい。第２の抗原結合ドメインによって標的とされる抗原は、疾患に直接的に、または間接的に関与していてもよい。いくつかの実施形態において、抗原は、腫瘍抗原である。いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、Ｂ細胞悪性腫瘍に関連付けられている。
【０１１８】
腫瘍抗原は、免疫応答、特にＴ細胞媒介性免疫応答を誘発し得る腫瘍細胞によって産生されるタンパク質である。本発明の標的抗原の選択は、治療されるがんの特定の種類に依存することになる。例示的な腫瘍抗原としては、たとえば、神経膠腫関連抗原、がん胎児性抗原（ＣＥＡ）、βヒト絨毛性性腺刺激ホルモン、アルファフェトプロテイン（ＡＦＰ）、レクチン反応性ＡＦＰ、チログロブリン、ＲＡＧＥ−１、ＭＮ−ＣＡＩＸ、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、ＲＵ１、ＲＵ２（ＡＳ）、腸カルボキシルエステラーゼ、ｍｕｔ  ｈｓｐ７０−２、Ｍ−ＣＳＦ、プロスターゼ、前立腺特異的抗原（ＰＳＡ）、ＰＡＰ、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＬＡＧＥ−ｌａ、ｐ５３、プロステイン、ＰＳＭＡ、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、サバイビンおよびテロメラーゼ、前立腺がん腫瘍抗原−１（ＰＣＴＡ−１）、ＭＡＧＥ、ＥＬＦ２Ｍ、好中球エラスターゼ、エフリンＢ２、ＣＤ２２、インスリン成長因子（ＩＧＦ）−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＧＦ−Ｉ受容体、およびメソテリンが挙げられる。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原（ＴＳＡ）、または腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）である。ＴＳＡは、腫瘍細胞に特有であり、体の他の細胞上で発生しない。ＴＡＡ関連抗原は、腫瘍細胞に特有ではなく、それよりむしろ、抗原に対する免疫寛容の状態を誘発できない条件下で正常細胞上でも発現される。腫瘍上の抗原の発現は、免疫系が抗原に応答できる条件下で生じる場合がある。ＴＡＡは、免疫系が未成熟であり、応答できない胎児発生の間に正常細胞上で発現される抗原であってもよく、または、ＴＡＡは、正常細胞上に極めて低いレベルで通常存在するが、腫瘍細胞上でずっと高いレベルで発現される抗原であってもよい。
【０１２０】
ＴＳＡまたはＴＡＡ抗原の非限定的な例として、以下が挙げられる：ＭＡＲＴ−１／ＭｅｌａｎＡ（ＭＡＲＴ−Ｉ）、ｇｐ１００（Ｐｍｅｌ１７）、チロシナーゼ、ＴＲＰ−１、ＴＲＰ−２などの分化抗原、およびＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１、ＧＡＧＥ−２、ｐｌ５などの腫瘍特異的多系列抗原；ＣＥＡなどの過剰発現胚性抗原；ｐ５３、Ｒａｓ、ＨＥＲ２／ｎｅｕなどの過剰発現がん遺伝子および変異腫瘍抑制遺伝子；ＢＣＲ−ＡＢＬ、Ｅ２Ａ−ＰＲＬ、Ｈ４−ＲＥＴ、ＩＧＨ−ＩＧＫ、ＭＹＬ−ＲＡＲなどの染色体転座に起因する特有の腫瘍抗原；ならびにエプスタイン・バーウイルス抗原ＥＢＶＡおよびヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）抗原Ｅ６およびＥ７などのウイルス性抗原。他の大型のタンパク質ベース抗原としては、ＴＳＰ−１８０、ＭＡＧＥ−４、ＭＡＧＥ−５、ＭＡＧＥ−６、ＲＡＧＥ、ＮＹ−ＥＳＯ、ｐｌ８５ｅｒｂＢ２、ｐｌ８０ｅｒｂＢ−３、ｃ−ｍｅｔ、ｎｍ−２３ＨＩ、ＰＳＡ、ＴＡＧ−７２、ＣＡ１９−９、ＣＡ７２−４、ＣＡＭ１７．１、ＮｕＭａ、Ｋ−ｒａｓ、ベータカテニン、ＣＤＫ４、Ｍｕｍ−１、ｐ１５、ｐ１６、４３−９Ｆ、５Ｔ４、７９１Ｔｇｐ７２、アルファフェトプロテイン、ベータ−ＨＣＧ、ＢＣＡ２２５、ＢＴＡＡ、ＣＡ１２５、ＣＡ１５−３＼ＣＡ２７．２９＼ＢＣＡＡ、ＣＡ１９５、ＣＡ２４２、ＣＡ−５０、ＣＡＭ４３、ＣＤ６８＼Ｐ１、ＣＯ−０２９、ＦＧＦ−５、Ｇ２５０、Ｇａ７３３＼ＥｐＣＡＭ、ＨＴｇｐ−１７５、Ｍ３４４、ＭＡ−５０、ＭＧ７−Ａｇ、ＭＯＶ１８、ＮＢ／７０Ｋ、ＮＹ−ＣＯ−１、ＲＣＡＳ１、ＳＤＣＣＡＧ１６、ＴＡ−９０＼Ｍａｃ−２結合タンパク質＼シクロフィリンＣ関連タンパク質、ＴＡＡＬ６、ＴＡＧ７２、ＴＬＰ、およびＴＰＳが挙げられる。
【０１２１】
第２の抗原結合ドメインは、任意の好適な型式であり得る。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、４鎖抗体などの抗体、または重鎖のみ抗体などの単一ドメイン抗体に由来する。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｓｃＦｖ、またはＶＨＨなどの抗体断片である。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１９、ＣＤ２０、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３８、ＢＣＭＡ、ＣＳ１、ＲＯＲ１、ＧＰＣ３、ＣＤ１２３、ＩＬ−１３Ｒ、ＣＤ１３８、ｃ−Ｍｅｔ、ＥＧＦＲ、ＥＧＦＲｖＩＩＩ、ＧＤ−２、ＮＹ−ＥＳＯ−１、ＭＡＧＥ  Ａ３、および糖脂質Ｆ７７からなる群より選択される抗原に特異的に結合する抗体断片である。
【０１２２】
いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、リガンドまたは受容体のリガンド結合ドメインである。いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｆ、ＩＬ−３、ＩＬ−１３、ＬＬＴ１、ＡＩＣＬ、ＤＮＡＭ−１、およびＮＫｐ８０からなる群より選択される分子に由来するリガンドまたはリガンド結合ドメインである。
ＣＤ１２３結合ドメイン
【０１２３】
いくつかの実施形態において、第２の抗原結合ドメインは、ＣＤ１２３結合ドメインである。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、抗ＣＤ１２３抗体の抗体断片（たとえば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ）である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、ＣＤ１２３のリガンドまたはＩＬ−３ドメインである。いくつかの実施形態において、ＩＬ−３ドメインは、ヒトＩＬ−３の完全長または機能性断片などのヒトＩＬ−３に由来する。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、配列番号９に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
いくつかの実施形態において、（ａ）ＣＤ１２３結合ドメインを含む細胞外ドメイン、および（ｂ）膜貫通ドメイン含むキメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、ＣＤ１３７、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインをさらに含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、一次シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含まない。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインからなる（または、本質的に、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインからなる）。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＩＣＯＳ、ＣＤ４０、ＣＤ３、ＬＦＡ−１、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、ＣＤ８３のリガンド、およびそれらの組み合わせからなる群より選択される共刺激分子に由来する。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、細胞外ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間に位置されるヒンジ領域（たとえばＣＤ８αヒンジ領域）をさらに含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ１２３結合ドメイン、および膜貫通ドメイン（ＣＤ８α）を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインである。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、配列番号９のアミノ酸配列を含む。
【０１２５】
いくつかの実施形態において、配列番号４１または４２に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、キメラ受容体が提供される。いくつかの実施形態において、配列番号４３または４４に対して約８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、または１００％のうちの少なくともいずれか１つの配列同一性を有する核酸配列を含む、単離された核酸が提供される。
【０１２６】
ＩＬ−３（インターロイキン３）遺伝子は、染色体５に位置付けられ、１５２アミノ酸長であるタンパク質をコードする。ＩＬ−３は、細胞の成長、分化、およびアポトーシスなどの広範な細胞活動を支えることができるサイトカインである。ＩＬ−３は、ＣＤ１２３抗原としても公知のインターロイキン３受容体（ＩＬ−３Ｒ）に結合することによって作用する。ＩＬ−３Ｒは、リガンド特異的アルファサブユニットおよびシグナル伝達ベータサブユニットを含む、ＩＬ−３、コロニー刺激因子２（ＣＳＦ２／ＧＭ−ＣＳＦ）、およびインターロイキン５（ＩＬ５）の受容体によって共有される、ヘテロ二量体化受容体である。ＩＬ−３Ｒの活性化は、βｃ鎖のリン酸化、Ｖａｖ１などのＳＨ２含有アダプタ分子の漸増、ならびにＪａｋ２／ＳＴＡＴ５およびＲａｓ／ＭＡＰＫ経路を介した下流シグナル伝達をもたらす。
【０１２７】
ＩＬ−３Ｒは、７５ｋＤの糖タンパク質であり、Ｎ−グリコシダーゼによって加水分解されると４３ｋＤとなる。ＩＬ−３Ｒは、ＩＬ−３への特異的な結合を担う３つの細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達に不可欠の短い細胞間ドメインを有する（Ｓａｔｏ  ｅｔ  ａｌ．１９９３）。ＩＬ−３Ｒは、ＩＬ−３への低い親和性および高い特異性を有するヘテロ二量体化受容体である。ＩＬ−３Ｒは、ＩＬ−３に結合すると、活性化され、細胞増殖および生存を促進する（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１５）。
【０１２８】
ＣＤ１２３は、ＡＭＬ芽球（すなわち骨髄芽球）上で過剰発現される。ＡＭＬ患者の７５〜８９％におけるＡＭＬ芽球および白血病幹細胞（ＬＳＣ）は、ＣＤ１２３を発現する。際立って対照的に、正常造血幹細胞（ＨＳＣ）上では、ＣＤ１２３の発現は低いか、検出不能である（Ｆｒａｎｋｅｌ  ｅｔ  ａｌ．２０１４、Ｊｏｒｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００）。ＡＭＬを別にすると、ＣＤ１２３は、Ｂ細胞系列急性リンパ芽球性白血病、慢性骨髄性白血病、形質細胞様樹状細胞新生物、および有毛細胞白血病を含む、様々な血液悪性腫瘍においても過剰発現される（Ｍｕｎｏｚ  ｅｔ  ａｌ．２００１）。この発現プロファイルにより、ＣＤ１２３は疾患の臨床診断、予後、および介入における貴重なバイオマーカとなる。これまでのところ、初期段階の臨床試験では、ＣＤ１２３標的治療は安全であり、造血への大きな悪影響がないことが実証されている。ヒトにおけるＣＤ１２３標的治療の抗白血病活性は、まだ検討されているところである。
二量体化モチーフ
【０１２９】
いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、二量体化モチーフおよび単一のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、第２の抗原結合ドメイン、単一のＮＫＧ２Ｄドメイン、およびそれらの間に配置される二量体化モチーフを含む。二量体化モチーフは、キメラ受容体における２つのポリペプチド鎖の二量体化を促進し、それによってＮＫＧ２Ｄホモ二量体の形成およびＮＫＧ２Ｄホモ二量体のＮＫＧ２Ｄリガンドへの結合を促進する。好適な二量体化モチーフは、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、二量体化モチーフは、ロイシンジッパである。いくつかの実施形態において、ロイシンジッパは、配列番号１０のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、二量体化モチーフは、システインジッパである。例示的なシステインジッパは、当技術分野で公知である。たとえば、Ｇｕｉｌａｕｍｅ  ｅｔ  ａｌ．（２０１５）ＰＬｏＳ  ＯＮＥ  １０（６）：ｅ０１２８７７９を参照されたい。
ペプチドリンカ
【０１３０】
いくつかの実施形態において、ＮＫＧ２Ｄドメインおよび第２の抗原結合ドメイン（たとえばＩＬ−３ドメイン）は、ペプチドリンカを介して互いに対して融合される。いくつかの実施形態において、第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび第２のＮＫＧ２Ｄドメインは、ペプチドリンカを介して互いに対して融合される。キメラ受容体の異なるドメインはまた、ペプチドリンカを介して互いに対して融合されてもよい。異なるドメインを接続するペプチドリンカは同じであっても、異なっていてもよい。
【０１３１】
キメラ受容体における各ペプチドリンカは、様々なドメインの構造的かつ／または機能的特徴に依存して、同じまたは異なる長さおよび／または配列を有してもよい。各ペプチドリンカは、独立して、選択および最適化されてもよい。キメラ受容体において使用されるペプチドリンカの長さ、可動性、および／または他の特性は、１つまたは複数の特定の抗原またはエピトープに対する親和性、特異性、または結合力を含むがこれらに限定されない特性に対し、いくらかの影響を有してもよい。たとえば、より長いペプチドリンカは、２つの隣接するドメインが、互いを立体的に障害しないことを確実にするように選択されてもよい。いくつかの実施形態において、短いペプチドリンカは、キメラ受容体の膜貫通ドメインと細胞内シグナル伝達ドメインとの間に配置されてもよい。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカは、隣接するドメインが互いに対して自由に動くことができるように、可動性の残基（たとえばグリシンおよびセリン）を含む。たとえば、グリシン−セリンの対は、好適なペプチドリンカであり得る。
【０１３２】
ペプチドリンカは、任意の好適な長さであり得る。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカは、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、５０、７５、１００、またはそれより長いアミノ酸長のうちの少なくともいずれかである。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカは、約１００、７５、５０、４０、３５、３０、２５、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、またはそれより短いアミノ酸長のうちのいずれか以下である。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカの長さは、約１アミノ酸〜約１０アミノ酸、約１アミノ酸〜約２０アミノ酸、約１アミノ酸〜約３０アミノ酸、約５アミノ酸〜約１５アミノ酸、約１０アミノ酸〜約２５アミノ酸、約５アミノ酸〜約３０アミノ酸、約１０アミノ酸〜約３０アミノ酸長、約３０アミノ酸〜約５０アミノ酸、約５０アミノ酸〜約１００アミノ酸、または約１アミノ酸〜約１００アミノ酸のうちのいずれかである。
【０１３３】
ペプチドリンカは、天然に存在する配列、または天然に存在しない配列を有してもよい。たとえば、重鎖のみ抗体のヒンジ領域に由来する配列を、リンカとして使用してもよい。たとえば、国際公開公報第１９９６／３４１０３号を参照されたい。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカは、可動性リンカである。例示的な可動性リンカとしては、グリシンポリマ（Ｇ）ｎ（配列番号２８）、グリシン−セリンポリマ（たとえば、（ＧＳ）ｎ（配列番号２９）を含む）、（ＧＳＧＧＳ）ｎ（配列番号３０）、（ＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３１）、および（ＧＧＧＧＳ）ｎ（配列番号３２）、ここで、ｎは少なくとも１の整数である）、グリシン−アラニンポリマ、アラニン−セリンポリマ、および当技術分野で公知の他の可動性リンカが挙げられる。いくつかの実施形態において、ペプチドリンカは、配列番号１２〜１５から選択されるアミノ酸配列を含む。
膜貫通ドメイン
【０１３４】
本出願の、多重特異性キメラ受容体、二重キメラ受容体系の第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体を含むキメラ受容体は、直接的にまたは間接的に細胞外抗原結合ドメインに融合され得る膜貫通ドメインを含む。膜貫通ドメインは、天然の供給源から、または合成の供給源からの、いずれかに由来してもよい。本明細書で用いられるように、「膜貫通ドメイン」は、細胞膜、好ましくは真核細胞膜中で熱力学的に安定である任意のタンパク質構造を指す。本明細書で説明されるキメラ受容体における使用に適した膜貫通ドメインは、天然に存在するタンパク質から得てもよい。代替的には、膜貫通ドメインは、合成の、天然に存在しないタンパク質セグメント、たとえば、細胞膜中で熱力学的に安定な疎水性タンパク質セグメントであり得る。
【０１３５】
膜貫通ドメインは、膜貫通ドメインの３次元構造に基づいて分類される。たとえば、膜貫通ドメインは、アルファヘリックス、１つより多いアルファヘリックスからなる複合体、ベータバレル、または細胞のリン脂質二重層をまたぐことができる他の任意の安定な構造を形成してもよい。さらに、膜貫通ドメインはまた、または代替的に、膜貫通ドメインが膜を通過する数、およびタンパク質の配向を含む、膜貫通ドメインのトポロジに基づいて分類されてもよい。たとえば、単回通過の膜タンパク質は細胞膜を１回横断し、多回通過膜タンパク質は、細胞膜を少なくとも２回（たとえば、２回、３回、４回、５回、６回、７回、それより多い回数）、横断する。膜タンパク質は、細胞の内側および外側に対する、その末端および膜−通過セグメントのトポロジに応じて、Ｉ型、ＩＩ型、またはＩＩＩ型と定義されてもよい。Ｉ型膜タンパク質は、単一膜貫通領域を有し、タンパク質のＮ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、かつタンパク質のＣ末端が細胞質側に存在するように配向される。ＩＩ型膜タンパク質も単一膜貫通領域を有するが、タンパク質のＣ末端が細胞の脂質二重層の細胞外側に存在し、かつタンパク質のＮ末端が細胞質側に存在するように配向される。ＩＩＩ型膜タンパク質は、多重膜貫通セグメントを有し、膜貫通セグメントの数ならびにＮ末端およびＣ末端の位置に基づいて、さらに下位分類されてもよい。
【０１３６】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるキメラ受容体の膜貫通ドメインは、Ｉ型単回通過膜タンパク質に由来する。いくつかの実施形態において、多回通過膜タンパク質由来の膜貫通ドメインも、本明細書で説明されるキメラ受容体における使用に適する場合がある。多回通過膜タンパク質は、複合の（少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、またはそれより多い）アルファヘリックス、またはベータシート構造を含んでもよい。好ましくは、多回通過膜タンパク質のＮ末端およびＣ末端は、脂質二重層の両側に存在し、たとえば、タンパク質のＮ末端は、脂質二重層の細胞質側に存在し、タンパク質のＣ末端は、細胞外側に存在する。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、キメラ受容体の膜貫通ドメインは、Ｔ細胞受容体のアルファ鎖、ベータ鎖、もしくはゼータ鎖、ＣＤ２８、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ４５、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ９、ＣＤ１６、ＣＤ２２、ＣＤ３３、ＣＤ３７、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１３４、ＣＤ１５４、ＫＩＲＤＳ２、ＯＸ４０、ＣＤ２、ＣＤ２７、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８）、ＩＣＯＳ（ＣＤ２７８）、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＧＩＴＲ、ＣＤ４０、ＢＡＦＦＲ、ＨＶＥＭ（ＬＩＧＨＴＲ）、ＳＬＡＭＦ７、ＮＫｐ８０（ＫＬＲＦｌ）、ＣＤ１６０、ＣＤ１９、ＩＬ−２Ｒベータ、ＩＬ−２Ｒガンマ、ＩＬ−７Ｒａ、ＩＴＧＡ１、ＶＬＡ１、ＣＤ４９ａ、ＩＴＧＡ４、ＩＡ４、ＣＤ４９Ｄ、ＩＴＧＡ６、ＶＬＡ−６、ＣＤ４９ｆ、ＩＴＧＡＤ、ＣＤ１１ｄ、ＩＴＧＡＥ、ＣＤ１０３、ＩＴＧＡＬ、ＣＤ１１ａ、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＡＭ、ＣＤ１１ｂ、ＩＴＧＡＸ、ＣＤ１１ｃ、ＩＴＧＢ１、ＣＤ２９、ＩＴＧＢ２、ＣＤ１８、ＬＦＡ−１、ＩＴＧＢ７、ＴＮＦＲ２、ＤＮＡＭ１（ＣＤ２２６）、ＳＬＡＭＦ４（ＣＤ２４４、２Ｂ４）、ＣＤ８４、ＣＤ９６（Ｔａｃｔｉｌｅ）、ＣＥＡＣＡＭ１、ＣＲＴ  ＡＭ、Ｌｙ９（ＣＤ２２９）、ＣＤ１６０（ＢＹ５５）、ＰＳＧＬ１、ＣＤＩＯＯ（ＳＥＭＡ４Ｄ）、ＳＬＡＭＦ６（ＮＴＢ−Ａ、Ｌｙｌ０８）、ＳＬＡＭ（ＳＬＡＭＦ１、ＣＤ１５０、ＩＰＯ−３）、ＢＬＡＭＥ（ＳＬＡＭＦ８）、ＳＥＬＰＬＧ（ＣＤ１６２）、ＬＴＢＲ、ＰＡＧ／Ｃｂｐ、ＮＫｐ４４、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４６、ＮＫＧ２Ｄ、および／またはＮＫＧ２Ｃの膜貫通ドメインから選択される膜貫通ドメインを含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８α、ＣＤ４、ＣＤ２８、４−１ＢＢ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ１５２、およびＰＤ１からなる群より選択される分子に由来する。
【０１３８】
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８に由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αの完全長膜貫通ドメインに由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、ＣＤ８αの切断された膜貫通ドメインに由来する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、配列番号４または４５のアミノ酸配列を含むＣＤ８αの膜貫通ドメインである。
【０１３９】
本明細書で説明されるキメラ受容体における使用のための膜貫通ドメインはまた、天然に存在しない合成のタンパク質セグメントの少なくとも一部を含み得る。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインは、天然に存在しない合成のアルファヘリックスまたはベータシートである。いくつかの実施形態において、タンパク質セグメントは、少なくともおよそ２０アミノ酸、たとえば、少なくとも１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、またはそれより長いアミノ酸である。合成膜貫通ドメインの例は、当技術分野で、たとえば、米国特許第Ｎｏ．７，０５２，９０６Ｂ１号明細書、およびＰＣＴ公報国際公開第２０００／０３２７７６Ａ２号において公知であり、これらの関連開示は、本明細書において参照により引用される。
【０１４０】
膜貫通ドメインは、膜貫通領域および膜貫通ドメインのＣ末端側に位置される細胞質領域を含んでもよい。膜貫通ドメインの細胞質領域は、３つ以上のアミノ酸を含んでもよく、いくつかの実施形態において、脂質二重層において膜貫通ドメインを配向することを助ける。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のシステイン残基は、膜貫通ドメインの膜貫通領域に存在する。いくつかの実施形態において、１つまたは複数のシステイン残基は、膜貫通ドメインの細胞質領域に存在する。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、正に帯電したアミノ酸を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの細胞質領域は、アミノ酸のアルギニン、セリン、およびリジンを含む。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、膜貫通ドメインの膜貫通領域は、疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体の膜貫通ドメインは、人工疎水性配列を含む。たとえば、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンの３つ組が、膜貫通ドメインのＣ末端に存在してもよい。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は大部分が、アラニン、ロイシン、イソロイシ、メチオニン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはバリンなどの疎水性アミノ酸残基を含む。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、疎水性である。いくつかの実施形態において、膜貫通領域は、ポリ−ロイシン−アラニン配列を含む。タンパク質またはタンパク質セグメントのヒドロパシ、または疎水性親水性指標は、当技術分野で公知の任意の方法、たとえば、ＫｙｔｅおよびＤｏｏｌｉｔｔｌｅヒドロパシ解析（Ｋｙｔｅ  ａｎｄ  Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅ  ｈｙｄｒｏｐａｔｈｙ  ａｎａｌｙｓｉｓ）によって評価することができる。
細胞内シグナル伝達ドメイン
【０１４２】
本出願の、多重特異性キメラ受容体、二重キメラ受容体系の第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体を含むキメラ受容体は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。細胞内シグナル伝達ドメインは、キメラ受容体を発現する免疫エフェクタ細胞の正常エフェクタ機能のうちの少なくとも１つの活性化を担う。「エフェクタ機能」という用語は、細胞の特殊化した機能を指す。Ｔ細胞のエフェクタ機能は、たとえば、細胞溶解活性またはサイトカインの分泌を含むヘルパ活性であってもよい。したがって、「細胞質シグナル伝達ドメイン」という用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達し、特殊化した機能を実行させるように細胞に指示を出す、タンパク質の部分を指す。通常は、細胞質シグナル伝達ドメイン全体が用いられ得るが、多くの場合で、鎖全体を使用する必要がない。細胞質シグナル伝達ドメインの切断された部分が使用される範囲について、そのような切断された部分は、エフェクタ機能シグナルを伝達する限り、インタクトな鎖の代わりに使用されてもよい。したがって、細胞質シグナル伝達ドメインという用語は、エフェクタ機能シグナルを伝達するのに十分な、細胞質シグナル伝達ドメインの切断された任意の部分を含むことが意図される。
【０１４３】
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫エフェクタ細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、本質的に、免疫エフェクタ細胞の一次細胞内シグナル伝達ドメインからなる細胞内シグナル伝達ドメインを含む。「一次細胞内シグナル伝達ドメイン」は、免疫エフェクタ機能を誘発するように刺激するやり方で作用する細胞質シグナル伝達配列を指す。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫受容体活性化チロシンモチーフまたはＩＴＡＭとして公知の、シグナル伝達モチーフを含有する。本明細書で用いられる「ＩＴＡＭ」は、一般に、多くの免疫細胞において発現されるシグナル伝達分子の尾部に存在する、保存タンパク質モチーフである。このモチーフは、６〜８つのアミノ酸によって区切られるアミノ酸配列ＹｘｘＬ／Ｉの反復２つを含んでもよく、ここで、各ｘは独立して任意のアミノ酸であり、保存モチーフＹｘｘＬ／Ｉｘ（６〜８）ＹｘｘＬ／Ｉを生成する。シグナル伝達分子内のＩＴＡＭは、細胞内のシグナル伝達にとって重要であり、シグナル伝達は、少なくとも部分的には、シグナル伝達分子の活性化後の、ＩＴＡＭにおけるチロシン残基のリン酸化によって、媒介される。ＩＴＡＭはまた、シグナル伝達経路に関与する他のタンパク質のドッキング部位として機能してもよい。例示的なＩＴＡＭを含有する一次細胞質シグナル伝達配列としては、ＣＤ３ζ、ＦｃＲガンマ（ＦＣＥＲ１Ｇ）、ＦｃＲベータ（ＦｃイプシロンＲｉｂ）、ＣＤ３ガンマ、ＣＤ３デルタ、ＣＤ３イプシロン、ＣＤ５、ＣＤ２２、ＣＤ７９ａ、ＣＤ７９ｂ、およびＣＤ６６ｄに由来するものが挙げられる。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζに由来する。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインからなる。いくつかの実施形態において、一次細胞内シグナル伝達ドメインは、野性型ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインである。いくつかの実施形態において、野性型ＣＤ３ζの一次細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号６のアミノ酸配列を含む。
共刺激シグナル伝達ドメイン
【０１４５】
多くの免疫エフェクタ細胞は、細胞のエフェクタ機能を活性化するためだけでなく、細胞増殖、分化、および生存を促進するために、抗原特異的シグナルの刺激に加えて、共刺激を必要とする。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、少なくとも１つの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。本明細書で用いられる「共刺激シグナル伝達ドメイン」という用語は、細胞内のシグナル伝達を媒介してエフェクタ機能などの免疫応答を誘発するタンパク質の少なくとも一部を指す。本明細書で説明されるキメラ受容体の共刺激シグナル伝達ドメインは、共刺激タンパク質由来の細胞質シグナル伝達ドメインであり得、共刺激タンパク質は、シグナルを伝達し、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球などの免疫細胞によって媒介される応答を調節する。「共刺激シグナル伝達ドメイン」は、共刺激分子の細胞質部分であり得る。「共刺激分子」という用語は、免疫細胞（たとえばＴ細胞）上の同族結合パートナーを指し、同族結合パートナーは、共刺激リガンドと特異的に結合し、それによって、これらに限定されないが増殖および生存などの、免疫細胞による共刺激応答を媒介する。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、単一の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、２つ以上（たとえば、約２つ、３つ、４つ、またはそれより多いのうちのいずれか）の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、同じ共刺激シグナル伝達ドメインのうちの２つ以上を、たとえば、２コピーのＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、本明細書で説明される、任意の２つ以上の共刺激タンパク質などの、異なる共刺激タンパク質由来の２つ以上の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次細胞内シグナル伝達ドメイン（たとえば、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン）、および１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインおよび一次細胞内シグナル伝達ドメイン（たとえば、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン）は、任意選択のペプチドリンカを介して互いに融合される。一次細胞内シグナル伝達ドメインおよび１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、任意の好適な順序で配置されてもよい。いくつかの実施形態において、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、膜貫通ドメインと一次細胞内シグナル伝達ドメイン（たとえば、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン）との間に位置される。複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、追加の、または相乗的な刺激効果を与えてもよい。
【０１４７】
宿主細胞（たとえば免疫細胞）における共刺激シグナル伝達ドメインの活性化は、細胞が、サイトカインの産生および分泌、食作用特性、増殖、分化、生存、および／または細胞傷害性を増大または減少するように誘導してもよい。任意の共刺激分子の共刺激シグナル伝達ドメインは、本明細書で説明されるキメラ受容体における使用に適している場合がある。共刺激シグナル伝達ドメインの種類は、エフェクタ分子が発現される免疫エフェクタ細胞の種類（たとえば、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、マクロファージ、好中球、または好酸球）、および望ましい免疫エフェクタ機能（たとえばＡＤＣＣ効果）などの因子に基づいて選択される。キメラ受容体における使用のための共刺激シグナル伝達ドメインの例は、限定することなく、Ｂ７／ＣＤ２８ファミリ（たとえば、Ｂ７−１／ＣＤ８０、Ｂ７−２／ＣＤ８６、Ｂ７−Ｈ１／ＰＤ−Ｌ１、Ｂ７−Ｈ２、Ｂ７−Ｈ３、Ｂ７−Ｈ４、Ｂ７−Ｈ６、Ｂ７−Ｈ７、ＢＴＬＡ／ＣＤ２７２、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ−４、Ｇｉ２４／ＶＩＳＴＡ／Ｂ７−Ｈ５、ＩＣＯＳ／ＣＤ２７８、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ２／Ｂ７−ＤＣ、およびＰＤＣＤ６）のメンバ；ＴＮＦスーパーファミリ（たとえば、４−１ＢＢ／ＴＮＦＳＦ９／ＣＤ１３７、４−１ＢＢリガンド／ＴＮＦＳＦ９、ＢＡＦＦ／ＢＬｙＳ／ＴＮＦＳＦ１３Ｂ、ＢＡＦＦ  Ｒ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｃ、ＣＤ２７／ＴＮＦＲＳＦ７、ＣＤ２７リガンド／ＴＮＦＳＦ７、ＣＤ３０／ＴＮＦＲＳＦ８、ＣＤ３０リガンド／ＴＮＦＳＦ８、ＣＤ４０／ＴＮＦＲＳＦ５、ＣＤ４０／ＴＮＦＳＦ５、ＣＤ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ５、ＤＲ３／ＴＮＦＲＳＦ２５、ＧＩＴＲ／ＴＮＦＲＳＦ１８、ＧＩＴＲリガンド／ＴＮＦＳＦ１８、ＨＶＥＭ／ＴＮＦＲＳＦ１４、ＬＩＧＨＴ／ＴＮＦＳＦ１４、リンホトキシンアルファ／ＴＮＦベータ、ＯＸ４０／ＴＮＦＲＳＦ４、ＯＸ４０リガンド／ＴＮＦＳＦ４、ＲＥＬＴ／ＴＮＦＲＳＦ１９Ｌ、ＴＡＣＩ／ＴＮＦＲＳＦ１３Ｂ、ＴＬ１Ａ／ＴＮＦＳＦ１５、ＴＮＦアルファ、およびＴＮＦ  ＲＩＩ／ＴＮＦＲＳＦ１Ｂ）のメンバ；ＳＬＡＭファミリ（たとえば、２Ｂ４／ＣＤ２４４／ＳＬＡＭＦ４、ＢＬＡＭＥ／ＳＬＡＭＦ８、ＣＤ２、ＣＤ２Ｆ−１０／ＳＬＡＭＦ９、ＣＤ４８／ＳＬＡＭＦ２、ＣＤ５８／ＬＦＡ−３、ＣＤ８４／ＳＬＡＭＦ５、ＣＤ２２９／ＳＬＡＭＦ３、ＣＲＡＣＣ／ＳＬＡＭＦ７、ＮＴＢ−Ａ／ＳＬＡＭＦ６、およびＳＬＡＭ／ＣＤ１５０）のメンバ；ならびにＣＤ２、ＣＤ７、ＣＤ５３、ＣＤ８２／Ｋａｉ−１、ＣＤ９０／Ｔｈｙ１、ＣＤ９６、ＣＤ１６０、ＣＤ２００、ＣＤ３００ａ／ＬＭＩＲ１、ＨＬＡクラスＩ、ＨＬＡ−ＤＲ、イカロス、インテグリンアルファ４／ＣＤ４９ｄ、インテグリンアルファ４ベータ１、インテグリンアルファ４ベータ７／ＬＰＡＭ−１、ＬＡＧ−３、ＴＣＬ１Ａ、ＴＣＬ１Ｂ、ＣＲＴＡＭ、ＤＡＰ１２、デクチン１／ＣＬＥＣ７Ａ、ＤＰＰＩＶ／ＣＤ２６、ＥｐｈＢ６、ＴＩＭ−１／ＫＩＭ−１／ＨＡＶＣＲ、ＴＩＭ−４、ＴＳＬＰ、ＴＳＬＰ  Ｒ、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、およびＮＫＧ２Ｃなどの、他の任意の共刺激分子を含む、共刺激タンパク質の細胞質シグナル伝達ドメインであり得る。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、１つまたは複数の共刺激シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２７、ＣＤ２８、４−１ＢＢ（すなわちＣＤ１３７）、ＩＣＯＳ、ＯＸ４０、ＣＤ３０、ＣＤ４０、ＣＤ３、リンパ球機能関連抗原１（ＬＦＡ−１）、ＣＤ２、ＣＤ７、ＬＩＧＨＴ、ＮＫＧ２Ｃ、Ｂ７−Ｈ３、およびＣＤ８３に特に結合するリガンドからなる群より選択される。
【０１４９】
いくつかの実施形態において、本出願のキメラ受容体における細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、本出願のキメラ受容体における細胞内シグナル伝達ドメインは、４−１ＢＢ（すなわちＣＤ１３７）に由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、および４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、配列番号５のアミノ酸配列を含む４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。
【０１５０】
いくつかの実施形態において、本出願のキメラ受容体における細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメインおよび４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、ＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメイン、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメイン、および４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞内シグナル伝達ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ２８の共刺激シグナル伝達ドメイン、４−１ＢＢの共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζの細胞質シグナル伝達ドメインを含む、ポリペプチドを含む。
【０１５１】
さらに本開示の範囲内であるのは、共刺激シグナル伝達ドメインが免疫細胞の免疫応答を調節することができるような、本明細書で説明される共刺激シグナル伝達ドメインのうちのいずれかの、バリアントである。いくつかの実施形態において、共刺激シグナル伝達ドメインは、野性型対応物と比較して、最大１０個まで（たとえば、１個、２個、３個、４個、５個、または８個）のアミノ酸残基の変形を含む。１つまたは複数のアミノ酸変形を含む、そのような共刺激シグナル伝達ドメインは、バリアントと呼ばれる場合がある。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異により、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比べて、シグナルの伝達が増大し、免疫応答の刺激が強化される場合がある。共刺激シグナル伝達ドメインのアミノ酸残基の変異により、変異を含まない共刺激シグナル伝達ドメインと比べて、シグナルの伝達が減少し、免疫応答の刺激が低減される場合がある。
ヒンジ領域
【０１５２】
本出願の、多重特異性キメラ受容体、二重キメラ受容体系の第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体を含むキメラ受容体は、細胞外抗原結合ドメインと膜貫通ドメインとの間に位置されるヒンジ領域を含んでもよい。ヒンジ領域は、一般に、タンパク質の２つのドメイン間に見られるアミノ酸セグメントであり、タンパク質の可動性、およびドメインのうちの一方または両方の、互いに対する動きを可能にする場合がある。エフェクタ分子の膜貫通ドメインに対する、細胞外抗原結合ドメインのそのような可動性および動きを提供する任意のアミノ酸配列を使用することができる。
【０１５３】
ヒンジ領域は、約１０〜１００アミノ酸、たとえば、約１５〜７５アミノ酸、２０〜５０アミノ酸、または３０〜６０アミノ酸のうちのいずれか１つを含有してもよい。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は長さが、約１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、または７５アミノ酸のうちの少なくともいずれか１つであってもよい。
【０１５４】
いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、天然に存在するタンパク質のヒンジ領域である。ヒンジ領域を含むことが当技術分野で公知である任意のタンパク質のヒンジ領域は、本明細書で説明されるキメラ受容体における使用に適している。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、天然に存在するタンパク質のヒンジ領域の少なくとも一部であり、キメラ受容体に可動性を与える。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ＣＤ８αのヒンジ領域の一部、たとえば、ＣＤ８αのヒンジ領域の、少なくとも１５（たとえば、２０、２５、３０、３５、または４０）の連続したアミノ酸を含有する断片である。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αのヒンジ領域は、配列番号３のアミノ酸配列を含む。
【０１５５】
ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、またはＩｇＤ抗体などの抗体のヒンジ領域も、本明細書で説明されるキメラ受容体における使用に適している。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、抗体の定常ドメインであるＣＨ１およびＣＨ２を結合するヒンジ領域である。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、抗体のものであり、抗体のヒンジ領域、およびその抗体の１つまたは複数の定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、抗体のヒンジ領域、およびその抗体のＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、抗体のヒンジ領域、およびその抗体のＣＨ２定常領域およびＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体、ＩｇＡ抗体、ＩｇＭ抗体、ＩｇＥ抗体、またはＩｇＤ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ抗体である。いくつかの実施形態において、抗体は、ＩｇＧ１抗体、ＩｇＧ２抗体、ＩｇＧ３抗体、またはＩｇＧ４抗体である。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域およびＣＨ２定常領域およびＣＨ３定常領域を含む。いくつかの実施形態において、ヒンジ領域は、ＩｇＧ１抗体のヒンジ領域およびＣＨ３定常領域を含む。
【０１５６】
天然に存在しないペプチドも、本明細書で説明されるキメラ受容体のヒンジ領域として使用してもよい。いくつかの実施形態において、Ｆｃ受容体の細胞外リガンド結合ドメインのＣ末端と膜貫通ドメインのＮ末端との間のヒンジ領域は、（ＧｘＳ）ｎリンカ（ここで、ｘおよびｎは独立して、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、またはそれより大きいを含む、３と１２との間の整数であり得る）などのペプチドリンカである。
シグナルペプチド
【０１５７】
本出願の多重特異性キメラ受容体、二重キメラ受容体系の第１のキメラ受容体および第２のキメラ受容体を含むキメラ受容体は、シグナルペプチド（シグナル配列としても公知である）をポリペプチドのＮ末端で含んでもよい。一般に、シグナルペプチドは、ポリペプチドを、細胞における望ましい部位に標的指向させるペプチド配列である。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、エフェクタ分子を細胞の分泌経路に標的指向させ、エフェクタ分子の脂質二重層への組み込みおよび固定を可能にする。本明細書で説明されるキメラ受容体における使用に適した、天然に存在するタンパク質のシグナル配列、または天然に存在しない合成シグナル配列を含むシグナルペプチドは、当業者には明らかであろう。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＣＤ８α、ＧＭ−ＣＳＦ受容体、ＩＬ−３、およびＩｇＧ１重鎖からなる群より選択される分子に由来する。いくつかの実施形態において、シグナルペプチドは、ＣＤ８αに由来する。いくつかの実施形態において、ＩＬ−３のシグナルペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ８αのシグナルペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。
ＩＩＩ．改変免疫エフェクタ細胞
【０１５８】
本出願でさらに提供されるのは、本明細書で説明されるキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系のうちのいずれか１つを含む、宿主細胞（たとえば、改変免疫エフェクタ細胞）である。
【０１５９】
したがって、いくつかの実施形態において、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを有するキメラ受容体を備える、改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）が提供される。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、第１のＮＫＧ２Ｄドメインおよび第２のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。
【０１６０】
いくつかの実施形態において、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインと第２の抗原結合ドメイン（たとえばＩＬ−３ドメイン）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを有する、多重特異性（たとえば二重特異性）キメラ受容体を備える、改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）が提供される。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、（ａ）第１のＮＫＧ２Ｄドメインと、第２のＮＫＧ２Ｄドメインと、ＣＤ１２３結合ドメイン（たとえばＩＬ−３ドメイン）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド鎖を有する多重特異性（たとえば二重特異性）キメラ受容体を備える、改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）が提供される。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、抗ＣＤ１２３抗体断片（たとえば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ）である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインである。いくつかの実施形態において、ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、第１のペプチドリンカ、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、第２のペプチドリンカ、第２のＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０１６２】
いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを有する多重特異性（たとえば二重特異性）キメラ受容体を備える、改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）が提供され、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２ＤドメインとＣＤ１２３結合ドメイン（たとえばＩＬ−３ドメイン）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって、第２のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、ペプチドリンカ、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、ＮＫＧ２ＤドメインとＣＤ１２３結合ドメインとの間に配置された二量体化モチーフ（たとえば、ロイシンジッパまたはシステインジッパ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、ロイシンジッパ、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０１６３】
いくつかの実施形態において、（ｉ）第１のキメラ受容体と（ｉｉ）第２のキメラ受容体とを有する二重キメラ受容体系を備える改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）が提供され、（ｉ）第１のキメラ受容体は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含み、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖はそれぞれ、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、（ｉｉ）第２のキメラ受容体は、（ａ）第２の抗原結合ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、（ｂ）第２の膜貫通ドメイン、および任意選択で（ｃ）第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第３のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、および任意選択で、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドを含む。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、（ｉ）第１のキメラ受容体と（ｉｉ）第２のキメラ受容体とを有する二重キメラ受容体系を備える改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）が提供され、（ｉ）第１のキメラ受容体は、（ａ）第１のＮＫＧ２Ｄドメインと第２のＮＫＧ２Ｄドメインとを含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含む第１のポリペプチド鎖を含み、（ｉｉ）第２のキメラ受容体は、（ａ）第２の抗原結合ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、（ｂ）第２の膜貫通ドメイン、および任意選択で（ｃ）第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第２のポリペプチド鎖を含む。いくつかの実施形態において、第１のキメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、第２のＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドを含む。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、および任意選択で、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドを含む。
【０１６５】
いくつかの実施形態において、改変免疫エフェクタ細胞は、１つまたは複数の免疫調節物質を発現する。いくつかの実施形態において、操作された哺乳類細胞は、免疫調節物質をコードする異種性の核酸を含む。いくつかの実施形態において、免疫調節物質をコードする異種性の核酸は、本明細書で説明されるキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系をコードするベクタに存在する。いくつかの実施形態において、免疫調節物質は、Ｒｕｎｘ３の調節因子である。いくつかの実施形態において、調節因子は、Ｒｕｎｘ３またはＭＩＴＦに由来するポリペプチドなどのポリペプチドである。いくつかの実施形態において、調節因子は、ｍｉＲＮＡまたはｓｉＲＮＡなどのＲＮＡである。Ｒｕｎｘ３は、Ｔ細胞が、固形腫瘍に向い、浸潤することを助ける場合があり、これはＴ細胞媒介性免疫療法の成功において重要な要因である。
ベクタ
【０１６６】
本出願は、本明細書で説明されるキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系のうちのいずれか１つをクローニングし、発現するためのベクタを提供する。いくつかの実施形態において、ベクタは、哺乳類細胞などの真核細胞における複製および組み込みに好適である。いくつかの実施形態において、ベクタは、ウイルスベクタである。ウイルスベクタの例としては、アデノウイルスベクタ、アデノ随伴ウイルスベクタ、レンチウイルスベクタ、レトロウイルスベクタ、ワクシニアベクタ、単純ヘルペスウイルスベクタ、およびそれらの誘導体が挙げられるが、これらに限定されない。ウイルスベクタ技術は、当技術分野で周知であり、たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）、および他のウイルス学および分子生物学の便覧に説明されている。
【０１６７】
多くのウイルスベースシステムが、哺乳類細胞への遺伝子導入のために開発されてきている。たとえば、レトロウイルスは、遺伝子送達システムのための簡便なプラットフォームを提供する。当技術分野で公知の手法を用いて、異種性の核酸を、ベクタに挿入し、レトロウイルス粒子にパッケージングすることができる。次に、組換えウイルスを単離し、インビトロまたはエクスビボで操作された哺乳類細胞に送達することができる。多くのレトロウイルスシステムが、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、アデノウイルスベクタが使用される。多くのアデノウイルスベクタが、当技術分野で公知である。いくつかの実施形態において、レンチウイルスベクタが使用される。いくつかの実施形態において、自己不活型レンチウイルスベクタが使用される。たとえば、キメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系を担持する自己不活型レンチウイルスベクタは、当技術分野で公知のプロトコールでパッケージングすることができる。当技術分野で公知の方法を使用して、得られるレンチウイルスベクタを使用して哺乳類細胞（たとえば一次ヒトＴ細胞）に形質導入することができる。レンチウイルスなどのレトロウイルスに由来するベクタは、導入遺伝子の長期安定的な組み込み、および子孫細胞におけるそれの増殖を可能にするため、長期遺伝子導入を達成するために好適なツールである。レンチウイルスベクタはまた、低い免疫原性を有し、非増殖性細胞を形質導入することができる。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、ベクタは、本明細書で説明されるキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系をコードする核酸のうちのいずれか１つを含む。核酸は、たとえば、制限エンドヌクレアーゼ部位、および１つまたは複数の選択可能マーカを用いることを含む、当技術分野で公知の任意の分子クローニング法を用いて、ベクタにクローニングすることができる。いくつかの実施形態において、核酸は、プロモータに動作可能に連結される。様々なプロモータが、哺乳類細胞における遺伝子発現に関して研究されてきており、当技術分野で公知のプロモータのうちのいずれかを、本発明において使用してもよい。プロモータは、構成性プロモータ、または誘導性プロモータなどの調節されたプロモータに大きく分類されてもよい。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、キメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系をコードする核酸は、構成性プロモータに動作可能に連結される。構成性プロモータは、異種性遺伝子（導入遺伝子とも呼ばれる）が宿主細胞において構成的に発現されることを可能にする。本明細書において企図される、例示的な構成性プロモータとしては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモータ、ヒト伸長因子１アルファ（ｈＥＦ１α）、ユビキチンＣプロモータ（ＵｂｉＣ、）、ホスホグリセロキナーゼプロモータ（ＰＧＫ）、サルウイルス４０初期プロモータ（ＳＶ４０）、およびＣＭＶ初期エンハンサと結合されたトリβアクチンプロモータ（ＣＡＧＧ）が挙げられるが、これらに限定されない。このような構成性プロモータの導入遺伝子発現を活発にする効率は、多数の研究において広く比較されている。たとえば、Ｍｉｃｈａｅｌ  Ｃ．Ｍｉｌｏｎｅ  ｅｔ  ａｌは、ＣＭＶ、ｈＥＦ１α、ＵｂｉＣ、およびＰＧＫが、一次ヒトＴ細胞におけるキメラ受容体発現を活発にする効率を比較し、ｈＥＦ１αプロモータが、導入遺伝子発現を最も多く誘導するだけでなく、ＣＤ４およびＣＤ８ヒトＴ細胞において最適に維持されることを結論付けた（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｔｈｅｒａｐｙ，１７（８）：１４５３−１４６４（２００９））。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、キメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系をコードする核酸は、誘導性プロモータに動作可能に連結される。誘導性プロモータは、調節されたプロモータのカテゴリに属する。誘導性プロモータは、物理的条件、改変免疫エフェクタ細胞の微小環境、または改変免疫エフェクタ細胞の生理的状態、誘導物質（すなわち誘導剤）、またはそれらの組み合わせなどの、１つまたは複数の条件によって誘導され得る。いくつかの実施形態において、誘導条件は、操作された哺乳類細胞の、かつ／または医薬組成物を受け取る対象の、内因性遺伝子の発現を誘導しない。いくつかの実施形態において、誘導条件は、誘導剤、照射（たとえば電離放射線、光）、温度（たとえば熱）、酸化還元状態、腫瘍環境、および操作された哺乳類細胞の活性化状態からなる群より選択される。
【０１７１】
いくつかの実施形態において、ベクタはまた、キメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系を発現する細胞を、レンチウイルスベクタを介してトランスフェクションされた宿主細胞の集団から選択するための選択可能マーカ遺伝子またはレポータ遺伝子を含有する。選択可能マーカおよびレポータ遺伝子はともに、宿主細胞における発現を可能にするために、適切な調節配列が側面に配置されていてもよい。たとえば、ベクタは、転写ターミネータ、翻訳ターミネータ、開始配列、および核酸配列の発現を調節するのに有用なプロモータを含有してもよい。
免疫エフェクタ細胞
【０１７２】
「免疫エフェクタ細胞」は、免疫エフェクタ機能を実行できる免疫細胞である。いくつかの実施形態において、免疫エフェクタ細胞は、少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクタ機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介する免疫エフェクタ細胞の例としては、末梢血単核球（ＰＢＭＣ）、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、単球、細胞傷害性Ｔ細胞、好中球、および好酸球が挙げられる。
【０１７３】
いくつかの実施形態において、免疫エフェクタ細胞は、Ｔ細胞である。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋／ＣＤ８−、ＣＤ４−／ＣＤ８＋、ＣＤ４＋／ＣＤ８＋、ＣＤ４−／ＣＤ８−、またはそれらの組み合わせである。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、キメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系を発現し、ＣＤ２０＋またはＣＤ１９＋腫瘍細胞などの標的細胞に結合するときに、ＩＬ−２、ＴＦＮ、および／またはＴＮＦを産生する。いくつかの実施形態において、ＣＤ８＋Ｔ細胞は、キメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系を発現し、標的細胞に結合するときに、抗原特異的標的細胞を溶解する。
【０１７４】
いくつかの実施形態において、免疫エフェクタ細胞は、ＮＫ細胞である。他の実施形態において、免疫エフェクタ細胞は、樹立細胞株、たとえば、ＮＫ−９２細胞であり得る。
【０１７５】
いくつかの実施形態において、免疫エフェクタ細胞は、造血幹細胞、多能性幹細胞、ｉＰＳ、または胚性幹細胞などの幹細胞から分化される。
【０１７６】
改変免疫エフェクタ細胞は、キメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系を、Ｔ細胞などの免疫エフェクタ細胞に導入することによって調製される。いくつかの実施形態において、キメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系は、本明細書で説明される、単離された核酸のうちのいずれか１つまたはベクタのうちのいずれか１つをトランスフェクションすることによって、免疫エフェクタ細胞に導入される。いくつかの実施形態において、キメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系は、ＣＥＬＬ  ＳＱＵＥＥＺＥ（登録商標）などのマイクロ流体システムに細胞を通過させながらタンパク質を細胞膜に挿入することによって、免疫エフェクタ細胞に導入される（たとえば、米国特許出願公開第２０１４０２８７５０９号明細書を参照されたい）。
【０１７７】
ベクタまたは単離された核酸を哺乳類細胞に導入する方法は、当技術分野で公知である。説明されるベクタは、物理的、化学的、または生物学的方法によって、免疫エフェクタ細胞にトランスファすることができる。
【０１７８】
ベクタを免疫エフェクタ細胞に導入する物理的方法としては、リン酸カルシウム沈殿法、リポフェクション法、微粒子銃、マイクロインジェクション法、エレクトロポレーション法などが挙げられる。ベクタおよび／または外因性核酸を含む細胞を作製する方法は、当技術分野で周知である。たとえば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．（２００１）  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋを参照されたい。いくつかの実施形態において、ベクタは、エレクトロポレーション法によって、細胞に導入される。
【０１７９】
ベクタを免疫エフェクタ細胞に導入する生物学的方法としては、ＤＮＡベクタおよびＲＮＡベクタの使用が挙げられる。ウイルスベクタは、哺乳類の、たとえばヒトの細胞に遺伝子を挿入するための、最も広く用いられる方法となっている。
【０１８０】
ベクタを免疫エフェクタ細胞に導入する化学的手段としては、巨大分子複合体、ナノカプセル、マイクロスフェア、ビーズ、ならびに水中油エマルジョン、ミセル、混合ミセル、およびリポソームを含む脂質ベース系などのコロイド分散システムが挙げられる。インビトロで送達媒体として使用するための例示的なコロイド系は、リポソーム（たとえば、人工膜小胞）である。
【０１８１】
いくつかの実施形態において、本明細書で説明されるキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系のうちのいずれかをコードするＲＮＡ分子は、従来の方法（たとえば、インビトロ転写法）によって調製され、次いで、ｍＲＮＡエレクトロポレーション法などの公知の方法によって免疫エフェクタ細胞に導入されてもよい。たとえば、Ｒａｂｉｎｏｖｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍａｎ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒａｐｙ  １７：１０２７−１０３５を参照されたい。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、形質導入された、またはトランスフェクションされた免疫エフェクタ細胞は、ベクタまたは単離された核酸の導入後、エクスビボで増殖される。いくつかの実施形態において、形質導入された、またはトランスフェクションされた免疫エフェクタ細胞は、約１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、１０日、１２日、または１４日のうちの少なくともいずれか１つの間、増殖するために培養される。いくつかの実施形態において、形質導入された、またはトランスフェクションされた免疫エフェクタ細胞は、操作された哺乳類細胞を選択するために、さらに評価またはスクリーニングされる。
【０１８３】
レポータ遺伝子を使用して、トランスフェクションされる可能性のある細胞を同定し、調節配列の機能性を評価してもよい。一般に、リポータ遺伝子は、レシピエント生物または組織に存在しない、またはそれらによって発現されない、かつ、なんらかの容易に検出可能な特性、たとえば酵素活性によって、その発現が示されるポリペプチドをコードする、遺伝子である。レポータ遺伝子の発現は、ＤＮＡがレシピエント細胞に導入された後、適切な時間でアッセイされる。好適なレポータ遺伝子として、ルシフェラーゼ、ベータガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、分泌型アルカリホスファターゼをコードする遺伝子、または緑色蛍光性タンパク質遺伝子が挙げられてもよい（たとえば、Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ  ａｌ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔｅｒｓ  ４７９：  ７９−８２（２０００））。好適な発現システムは、周知であり、公知の手法を用いて調製してもよく、または市販のものから得てもよい。
【０１８４】
改変免疫エフェクタ細胞におけるキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系をコードする核酸の存在を確認するための他の方法としては、たとえば、サザンブロット法、ノーザンブロット法、ＲＴ−ＰＣＲ、およびＰＣＲなどの当業者に周知の分子生物学的アッセイ；たとえば、免疫学的方法（たとえばＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット法）によって、特定のペプチドの有無を検出するなどの生化学的アッセイが挙げられる。
Ｔ細胞の供給源
【０１８５】
Ｔ細胞の拡大および遺伝的修飾の前に、Ｔ細胞の供給源を個体から得る。Ｔ細胞は、末梢血単核球、骨髄、リンパ節組織、臍帯血、胸腺組織、感染部位の組織、腹水、胸水液、脾臓組織、および腫瘍を含む、多くの供給源から得ることができる。いくつかの実施形態において、当技術分野で入手可能な、任意の数のＴ細胞株を使用してもよい。いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、ＦＩＣＯＬＬ（商標）分離法などの当業者に公知の、任意の数の手法を用いて対象から採取した１単位の血液から得ることができる。いくつかの実施形態において、個体の循環する血液由来の細胞は、アフェレーシスによって得られる。アフェレーシス生成物は典型的に、Ｔ細胞、単核球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球、赤血球、および血小板を含むリンパ球を含有する。いくつかの実施形態において、アフェレーシスによって採取された細胞は、次の処理工程のために、血しょう画分を除去するために洗浄され、適切な緩衝液または培地に入れられてもよい。いくつかの実施形態において、細胞は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄される。いくつかの実施形態において、洗浄溶液は、カルシウムを欠いており、マグネシウムを欠いていてもよく、または、すべてではないにしても、多くの二価カチオンを欠いていてもよい。さらに、驚いたことに、カルシウム非存在下での最初の活性化工程により、活性化の拡大が起こる。当業者には、洗浄工程は、半自動化「フロースルー」遠心分離（たとえば、Ｃｏｂｅ  ２９９１  ｃｅｌｌ  ｐｒｏｃｅｓｓｏｒ、Ｂａｘｔｅｒ  ＣｙｔｏＭａｔｅ、またはＨａｅｍｏｎｅｔｉｃｓ  Ｃｅｌｌ  Ｓａｖｅｒ  ５）を製造者の指示に従って用いることによるなどの、当技術分野で公知の方法によって達成されてもよいことが容易に理解されるであろう。洗浄後、細胞は、たとえば、Ｃａ２＋を含有せずＭｇ２＋を含有しないＰＢＳ、ＰｌａｓｍａＬｙｔｅ  Ａ、または、緩衝液を含むもしくは含まない他の生理食塩水溶液などの、様々な生体適合性緩衝液中で再懸濁されてもよい。代替的には、アフェレーシス試料の望ましくない成分は除去されてもよく、細胞は、培養液中に直接再懸濁される。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、赤血球を溶解し、単球を枯渇させることによって、たとえば、ＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配による遠心分離、または対向流遠心溶出法（ｃｏｕｎｔｅｒｆｌｏｗ  ｃｅｎｔｒｉｆｕｇａｌ  ｅｌｕｔｒｉａｔｉｏｎ）によって、末梢血リンパ球から単離される。ＣＤ３＋、ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、およびＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などのＴ細胞の特異的亜集団は、正の選択または負の選択手法によって、さらに単離され得る。たとえば、いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、望ましいＴ細胞の正の選択に十分な時間期間の間、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０ＣＤ３／ＣＤ２８Ｔなどの抗ＣＤ３／抗ＣＤ２８（すなわち、３×２８）共役ビーズとインキュベーションすることによって単離される。いくつかの実施形態において、時間期間は、約３０分である。さらなる実施形態において、時間期間は、３０分〜３６時間またはそれより長い、およびその間のすべての整数値の範囲である。さらなる実施形態において、時間期間は、少なくとも１、２、３、４、５、または６時間である。いくつかの実施形態において、時間期間は、１０〜２４時間である。いくつかの実施形態において、インキュベーション時間期間は、２４時間である。白血病患者からのＴ細胞の単離に関して、２４時間などの、より長いインキュベーション時間を使用すると、細胞収率が増大し得る。腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を腫瘍組織から、または免疫不全の個体から単離するときなど、他の細胞の種類と比較してＴ細胞が少ない任意の状況において、より長いインキュベーション時間を使用して、Ｔ細胞を単離してもよい。さらに、より長いインキュベーション時間の使用により、ＣＤ８＋Ｔ細胞捕獲の効率を高めることができる。したがって、Ｔ細胞がＣＤ３／ＣＤ２８ビーズに結合することができる時間を、単純に、短くする、もしくは長くすることによって、かつ／または、ビーズのＴ細胞に対する比を大きくする、もしくは小さくすることによって（本明細書において、さらに説明される）、培養開始において、または処理中の他の時間点において、Ｔ細胞の亜集団を優先的に選択する、またはしないことができる。さらに、ビーズまたは他の表面上の抗ＣＤ３抗体および／または抗ＣＤ２８抗体の割合を大きくする、または小さくすることによって、培養開始において、または他の望ましい時間点において、Ｔ細胞の亜集団を優先的に選択する、またはしないことができる。当業者には、複数回の選択も使用できることが認識されるであろう。いくつかの実施形態において、選択手順を実行し、活性化および拡大プロセスにおいて、「選択されない」細胞を使用することが望ましい場合がある。「選択されない」細胞は、さらなる回数の選択に供され得る。
【０１８７】
負の選択によるＴ細胞集団の濃縮は、負に選択される細胞に特有の表面マーカを対象とする抗体の組み合わせで達成することができる。一方法は、負に選択される細胞上に存在する細胞表面マーカを対象とするモノクローナル抗体の混合物を使用する、陰性磁気免疫接着（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｉｍｍｕｎｏａｄｈｅｒｅｎｃｅ）またはフローサイトメトリによる細胞の選別および／または選択である。たとえば、負の選択によってＣＤ４＋細胞を濃縮するためには、モノクローナル抗体混合物は典型的に、ＣＤ１４、ＣＤ２０、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１６、ＨＬＡ−ＤＲ、およびＣＤ８に対する抗体を含む。特定の実施形態において、典型的にＣＤ４＋、ＣＤ２５＋、ＣＤ６２Ｌｈｉ、ＧＩＴＲ＋、およびＦｏｘＰ３＋を発現する調節性Ｔ細胞のために、濃縮または正の選択をすることは望ましい場合がある。代替的には、特定の実施形態において、Ｔ調節性細胞は、抗Ｃ２５共役ビーズまたは他の類似の選択法によって、枯渇される。
【０１８８】
正または負の選択による、望ましい細胞集団の単離に関して、細胞および表面（たとえば、ビーズなどの粒子）の濃度は、変動し得る。特定の実施形態において、細胞およびビーズの接触を確実に最大にするために、ビーズおよび細胞が一緒に混合されている体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増大させる）ことは望ましい場合がある。たとえば、一実施形態において、２０憶個細胞／ｍＬの濃度が用いられる。一実施形態において、１０憶個細胞／ｍＬの濃度が用いられる。さらなる実施形態において、１億個細胞／ｍＬより大きいが用いられる。さらなる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個細胞／ｍＬの細胞の濃度が用いられる。さらに別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個細胞／ｍＬからの細胞の濃度が用いられる。さらなる実施形態において、１億２５００万または１億５０００万個細胞／ｍＬの濃度が用いられ得る。高濃度を用いると、細胞収率、細胞活性化、および細胞拡大の増大をもたらし得る。さらに、高い細胞濃度を用いると、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの、関心対象の標的抗原を弱く発現している場合がある細胞、または多くの腫瘍細胞が存在する試料（すなわち、白血病血液、腫瘍組織など）からの細胞をより効率的に捕獲することが可能になる。このような細胞集団は、治療的価値を有する場合があり、得ることが望ましいであろう。たとえば、高濃度の細胞を用いると、通常ではより弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を、より効率的に選択することができる。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、より低い濃度の細胞を用いることが望ましい場合がある。Ｔ細胞および表面（たとえば、ビーズなどの粒子）の混合物を著しく希釈することによって、粒子と細胞との間の相互作用が最小化される。これにより、粒子に結合される望ましい抗原を大量に発現する細胞が選択される。たとえば、希釈濃度において、ＣＤ４＋Ｔ細胞は、より高いレベルのＣＤ２８を発現し、ＣＤ８＋Ｔ細胞より効率的に捕獲される。いくつかの実施形態において、用いられる細胞濃度は、５×１０６／ｍＬである。いくつかの実施形態において、用いられる濃度は、約１×１０５／ｍＬから１×１０６／ｍＬまで、およびその間の任意の整数値であり得る。
【０１９０】
いくつかの実施形態において、細胞は、２〜１０℃または室温のいずれかで、変動する速度で、変動する時間の長さの間、ローテータ上でインキュベートされてもよい。
【０１９１】
刺激のためのＴ細胞はまた、洗浄工程後、凍結され得る。理論に束縛されることを望むものではないが、凍結およびそれに続く解凍の工程は、細胞集団における顆粒球、およびある程度は単球を除去することによって、より均一の生成物を提供する。血しょうおよび血小板を除去する洗浄工程後、細胞は、凍結溶液中に懸濁させてもよい。多くの凍結溶液およびパラメータが、当技術分野で公知であり、この文脈において有用であるが、一方法は、２０％ＤＭＳＯおよび８％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ、または１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯ、もしくは３１．２５％Ｐｌａｓｍａｌｙｔｅ−Ａ、３１．２５％デキストロース５％、０．４５％ＮａＣｌ、１０％デキストラン４０および５％デキストロース、２０％ヒト血清アルブミン、および７．５％ＤＭＳＯを含有する培養培地、またはたとえば、ＨｅｓｐａｎおよびＰｌａｓｍａＬｙｔｅＡを含有する他の適切な細胞凍結培地を使用することを含み、次いで細胞を毎分１℃の速度で−８０℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相で保管する。制御された凍結の他の方法、および−２０℃での、または液体窒素中での即時の制御されない凍結が用いられてもよい。
【０１９２】
いくつかの実施形態において、凍結保存された細胞を解凍し、本明細書で説明されるように洗浄し、活性化前に、室温にて１時間、静置させる。
【０１９３】
本出願においてさらに企図されるのは、本明細書で説明される拡大した細胞が必要となる可能性がある前の時間期間に、対象から血液試料またはアフェレーシス生成物を採取することである。したがって、拡大される細胞の供給源は、必要な任意の時間点において採取され得、Ｔ細胞などの望ましい細胞は、本明細書で説明されるものなどの、Ｔ細胞療法から恩恵を受けるであろう任意の数の疾患または状態のためのＴ細胞療法で後に使用するために単離され凍結される。一実施形態において、血液試料またはアフェレーシスは、概して健康な対象から採取する。特定の実施形態において、血液試料またはアフェレーシスは、疾患を発症するリスクがあるが、疾患をまだ発症していない、概して健康な対象から採取され、関心対象の細胞は、後の使用のために単離され凍結される。特定の実施形態において、Ｔ細胞は拡大され、凍結され、後に使用されてもよい。特定の実施形態において、試料は、本明細書で説明される特定の疾患であると診断された直後であるが、いかなる治療も受ける前の患者から採取される。さらなる実施形態において、細胞は、ナタリズマブ、エファリズマブなどの薬剤、抗ウイルス剤、化学療法、放射線照射、シクロスポリン、アザチオプリン、メソトレキセート、ミコフェノール酸、およびＦＫ５０６などの免疫抑制剤、抗体、または、キャンパスなどの他の免疫除去剤、抗ＣＤ３抗体、シトキサン、フルダラビン、シクロスポリン、ＦＫ５０６、ラパマイシン、ミコフェノール酸、ステロイド剤、ＦＲ９０１２２８、ならびに照射での治療を含むが、これらに限定されない、任意の数の関連性のある治療法の前の対象からの血液試料またはアフェレーシスから単離される。これらの薬物は、カルシウム依存ホスファターゼ、カルシニューリンを阻害する（シクロスポリンおよびＦＫ５０６）か、または成長因子誘導シグナル伝達に重要であるｐ７０Ｓ６キナーゼを阻害する（ラパマイシン）のいずれかである（（Ｌｉｕ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  ６６：８０７−８１５，１９９１；Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｉｍｍｕｎ  ７３：３１６−３２１，１９９１；Ｂｉｅｒｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎ．５：７６３−７７３，１９９３）。さらなる実施形態において、細胞は、患者のために単離され、骨髄移植または幹細胞移植、化学療法剤（たとえばフルダラビン、外照射療法（ＸＲＴ）、シクロホスファミド）もしくは抗体（たとえばＯＫＴ３またはキャンパス）のいずれかを使用するＴ細胞除去療法と（たとえば、前に、同時に、または後に）併せた、後の使用のために凍結される。別の実施形態において、細胞は、ＣＤ２０に反応する薬剤（たとえばリツキサン）などのＢ細胞除去療法にの前に単離され、その療法後の治療のための後の使用のために凍結することができる。
【０１９４】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、治療後直接に、患者から得られる。この関連で、ある特定のがん治療、特に免疫系を損傷する薬物による治療の後、治療直後に患者がその治療から正常に回復している期間中、得られるＴ細胞の質は、エクスビボで拡大する能力に関して、最適であるか、または向上してる場合があることが観察された。同様に、本明細書で説明される方法を用いたエクスビボ操作の後、これらの細胞は、生着の向上およびインビボでの拡大に関して、好ましい状態である場合がある。したがって、本発明の文脈内で、この回復段階中に、Ｔ細胞、樹状細胞、または造血系の他の細胞を含む血液細胞を採取することが企図される。さらに、特定の実施形態において、動員（たとえば、ＧＭ−ＣＳＦによる動員）および前処置レジメンを用いて、特定の細胞タイプの再増殖、再循環、再生、および／または拡大が好ましい状態を、特に、療法後の規定された期間中に、対象において作り出すことができる。例証的な細胞タイプとしては、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹状細胞、および免疫系の他の細胞が挙げられる。
Ｔ細胞の活性化および拡大
【０１９５】
本明細書で説明されるキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系による、Ｔ細胞の遺伝的改変の前であっても後であっても、一般に、たとえば、米国特許第６，３５２，６９４号明細書、同第６，５３４，０５５号明細書、同第６，９０５，６８０号明細書、同第６，６９２，９６４号明細書、同第５，８５８，３５８号明細書、同第６，８８７，４６６号明細書、同第６，９０５，６８１号明細書、同第７，１４４，５７５号明細書、同第７，０６７，３１８号明細書、同第７，１７２，８６９号明細書、同第７，２３２，５６６号明細書、同第７，１７５，８４３号明細書、同第５，８８３，２２３号明細書、同第６，９０５，８７４号明細書、同第６，７９７，５１４号明細書、同第６，８６７，０４１号明細書、および米国特許出願公開第２００６０１２１００５号明細書に説明される方法を用いて、Ｔ細胞は、活性化され、拡大され得る。
【０１９６】
一般に、Ｔ細胞は、それに、ＣＤ３／ＴＣＲ複合体関連シグナルを刺激する薬剤、およびＴ細胞の表面上の共刺激分子を刺激するリガンドを結合させている表面への接触によって拡大することができる。具体的には、Ｔ細胞集団は、抗ＣＤ３抗体、もしくはその抗原結合断片、もしくは表面上で動員された抗ＣＤ２抗体との接触によって、またはカルシウムイオノフォアと併せた、プロテインキナーゼＣ活性化因子（たとえばブリオスタチン）との接触によってなど、本明細書で説明されるように刺激されてもよい。Ｔ細胞の表面上のアクセサリ分子の共刺激に関して、アクセサリ分子を結合するリガンドが使用される。たとえば、Ｔ細胞の集団は、Ｔ細胞の増殖を刺激するのに適切な条件下で、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体に接触され得る。ＣＤ４＋Ｔ細胞またはＣＤ８＋Ｔ細胞のいずれかの集団を刺激するために、抗ＣＤ３抗体および抗ＣＤ２８抗体。抗ＣＤ２８抗体の例としては、９．３、Ｂ−Ｔ３、ＸＲ−ＣＤ２８（Ｄｉａｃｌｏｎｅ社、Ｂｅｓａｎｃｏｎ、フランス）が挙げられ、当技術分野で公知である他の方法（Ｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ  Ｐｒｏｃ．３０（８）：３９７５−３９７７，１９９８；Ｈａａｎｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９０（９）：１３１９１３２８，１９９９；Ｇａｒｌａｎｄ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ  Ｍｅｔｈ．２２７（１−２）：５３−６３，１９９９）でできるように使用することができる。
【０１９７】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞に対する一次刺激シグナルおよび共刺激シグナルは、異なるプロトコールによって提供されてもよい。たとえば、各シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあってもよく、または表面に結合されていてもよい。薬剤は、表面に結合されている場合、同じ表面に（すなわち、「シス」形態）、または別々の表面に（すなわち、「トランス」形態）結合されていてもよい。代替的には、一方の薬剤が表面に結合され、他方の薬剤が溶液中にあってもよい。一実施形態において、共刺激シグナルを提供する薬剤は細胞表面に結合され、一次活性化シグナルを提供する薬剤は、溶液中にあるか、または表面に結合される。特定の実施形態において、両方の薬剤は、溶液中にあり得る。別の実施形態において、薬剤は、可溶性であってもよく、その場合、Ｆｃ受容体を発現する細胞などの表面または抗体または薬剤に結合する結合剤に架橋されてもよい。この関連で、本発明においてＴ細胞の活性化および拡大における使用のために企図される人工抗原提示細胞（ａＡＰＣ）に関して、たとえば、米国特許出願公開第２００４０１０１５１９号明細書、および同第２００６００３４８１０号明細書を参照されたい。
【０１９８】
いくつかの実施形態において、Ｔ細胞は、薬剤コートされたビーズと組み合わされ、続いて、ビーズおよび細胞は分離され、次に細胞は培養される。代替的な実施形態において、薬剤コートされたビーズおよび細胞は、培養前に分離されないが、一緒に培養される。さらなる実施形態において、ビーズおよび細胞は、最初に磁力などの力の適用によって濃縮され、細胞表面マーカのライゲーションの増大がもたらされ、それによって細胞刺激が誘発される。
【０１９９】
例として、細胞表面タンパク質は、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８が結合されている常磁性ビーズ（３×２８ビーズ）をＴ細胞に接触させることによって、ライゲーションされてもよい。一実施形態において、細胞（たとえば、１０４〜１０９個のＴ細胞）およびビーズ（たとえば、ＤＹＮＡＢＥＡＤＳ（登録商標）Ｍ−４５０、１：１比のＣＤ３／ＣＤ２８Ｔ常磁性ビーズ）を、緩衝液、好ましくはＰＢＳ（カルシウムおよびマグネシウムなどの二価カチオンを含まない）中で混ぜ合せる。この場合も、当業者には、任意の細胞濃度を使用してもよいことが容易に理解され得る。たとえば、標的細胞は、試料中にはほとんどなく、試料の０．０１％のみを含んでもよく、または試料全体（すなわち、１００％）が、関心対象の標的細胞を含んでもよい。したがって、任意の細胞数は、本発明の文脈内にある。特定の実施形態において、細胞および粒子の接触を確実に最大にするために、粒子および細胞が一緒に混合されている体積を著しく減少させる（すなわち、細胞の濃度を増大させる）ことは望ましい場合がある。たとえば、一実施形態において、約２０憶個細胞／ｍｌの濃度が用いられる。別の実施形態において、１億個細胞／ｍＬより大きいが用いられる。さらなる実施形態において、１０００万、１５００万、２０００万、２５００万、３０００万、３５００万、４０００万、４５００万、または５０００万個細胞／ｍＬの細胞の濃度が用いられる。さらに別の実施形態において、７５００万、８０００万、８５００万、９０００万、９５００万、または１億個細胞／ｍＬからの細胞の濃度が用いられる。さらなる実施形態において、１億２５００万または１億５０００万個細胞／ｍＬの濃度が用いられ得る。高濃度を用いると、細胞収率、細胞活性化、および細胞拡大の増大をもたらし得る。さらに、高い細胞濃度を用いると、ＣＤ２８陰性Ｔ細胞などの、関心対象の標的抗原を弱く発現している場合がある細胞を、より効率的に捕獲することが可能になる。このような細胞集団は、治療的価値を有する場合があり、特定の実施形態において、得ることが望ましいであろう。たとえば、高濃度の細胞を用いると、通常ではより弱いＣＤ２８発現を有するＣＤ８＋Ｔ細胞を、より効率的に選択することができる。
【０２００】
いくつかの実施形態において、混合物は、数時間（約３時間）から約１４日、またはその間の任意の時間の整数値の間、培養されてもよい。別の実施形態において、混合物は、２１日間、培養されてもよい。本発明の一実施形態において、ビーズおよびＴ細胞は、約８日間、一緒に培養される。別の実施形態において、ビーズおよびＴ細胞は、２〜３日間、一緒に培養される。Ｔ細胞の培養時間が６０日以上であり得るような、刺激の数サイクルも、望ましい場合がある。Ｔ細胞培養に適切な条件としては、増殖および生存率に必要な因子（血清（たとえば、ウシ胎仔またはヒト血清）、インターロイキン２（ＩＬ−２）、インスリン、ＩＦＮ−γ、ＩＬ−４、ＩＬ−７、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−１０、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＴＧＦβ、およびＴＮＦ−α、または当業者に公知の細胞の成長のための任意の他の添加剤を含む）を含有してもよい適切な培地（たとえば、最小必須培地、またはＲＰＭＩ培地１６４０、またはＸ−ｖｉｖｏ１５（Ｌｏｎｚａ社））が挙げられる。細胞の成長のための他の添加剤としては、表面活性剤、プラズマネート、ならびにＮ−アセチル−システインおよび２−メルカプトエタノールなどの還元剤が挙げられるが、これらに限定されない。培地としては、ＲＰＭＩ１６４０、ＡＩＭ−Ｖ、ＤＭＥＭ、ＭＥＭ、α−ＭＥＭ、Ｆ−１２、Ｘ−Ｖｉｖｏ１５、およびＸ−Ｖｉｖｏ２０、アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、およびビタミン類が添加され、血清を含まないか、または適量の血清（または血漿）、もしくは規定された一組のホルモン、および／もしくはＴ細胞の成長および拡大に十分な量のサイトカインで補われているかのいずれかのＯｐｔｉｍｉｚｅｒを挙げることができる。抗生物質、たとえば、ペニシリンおよびストレプトマイシンは、実験的な培養物にのみ含まれ、対象に注入されることになる細胞の培養物には含まれない。標的細胞は、成長を支持するのに必要な条件下、たとえば、適切な温度（たとえば３７℃）および雰囲気（たとえば、プラス５％ＣＯ２の空気）で、維持される。変動する刺激時間に暴露されたＴ細胞は、異なる特性を示す場合がある。たとえば、典型的な血液、またはアフェレーシスされた末梢血単核球生成物は、細胞傷害性または抑制Ｔ細胞の集団（ＴＣ、ＣＤ８）より大きいヘルパＴ細胞集団（ＴＨ、ＣＤ４＋）を有する。ＣＤ３受容体およびＣＤ２８受容体を刺激することによるＴ細胞のエクスビボでの拡大は、約８〜９日目前に、主にＴＨ細胞からなるＴ細胞の集団を産生するものの、約８〜９日目後、Ｔ細胞の集団は、ＴＣ細胞のより大きくなりつつある集団を含む。したがって、治療の目的に応じて、主にＴＨ細胞からなるＴ細胞集団を対象に注入することは、有利である場合がある。同様に、ＴＣ細胞の抗原特異的サブセットが単離されている場合、このサブセットをより大きく拡大することが有益である場合がある。
【０２０１】
さらに、ＣＤ４マーカおよびＣＤ８マーカに加えて、他の表現型マーカは、細胞の拡大プロセスの進行中、著しく、しかし大部分では再現可能に、変化する。したがって、そのような再現性により、活性化されたＴ細胞生成物を特定の目的のために合わせて作る能力が可能になる。
ＩＶ．医薬組成物
【０２０２】
本出願でさらに提供されるのは、本明細書で説明されるキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、または二重キメラ受容体系のうちのいずれか１つを含む改変免疫エフェクタ細胞のうちのいずれか１つを含む医薬組成物、および医薬的に許容される担体である。医薬組成物は、望ましい程度の純度を有する複数の改変免疫エフェクタ細胞を、任意選択の医薬的に許容される担体、賦形剤、または安定剤と、（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ  １６ｔｈ  ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｏｓｏｌ，Ａ．Ｅｄ．（１９８０））凍結乾燥製剤または水溶液の状態で混合することによって、調製することができる。
【０２０３】
許容される担体、賦形剤、または安定剤は、用いられる投薬量および濃度においてレシピエントに対して無毒であり、緩衝液、アスコルビン酸、メチオニン、ビタミンＥ、メタ重亜硫酸ナトリウムを含む抗酸化剤；防腐剤、等張化剤、安定剤、金属錯体（たとえば、Ｚｎタンパク質複合体）；ＥＤＴＡおよび／または非イオン性表面活性剤などのキレート化剤が挙げられる。
【０２０４】
緩衝液は、特に、安定性がｐＨ依存性である場合に、治療有効性を最適化する範囲にｐＨを制御するために使用される。緩衝液は、約５０ｍＭから約２５０ｍＭまでの範囲である濃度で存在することが好ましい。本発明と共に使用するために好適な緩衝剤としては、有機酸および無機酸の両方、ならびにそれらの塩が挙げられる。たとえば、クエン酸、リン酸、コハク酸、酒石酸、フマル酸、グルコン酸、シュウ酸、乳酸、酢酸。さらに、緩衝液は、ヒスチジン、およびトリスなどのトリメチルアミン塩を含んでもよい。
【０２０５】
防腐剤は、微生物増殖を遅延させるために添加され、典型的に、０．２％〜１．０％（ｗ／ｖ）の範囲で存在する。本発明と共に使用するために好適な保存剤としては、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；ハロゲン化ベンザルコニウム（たとえば、塩化、臭化、ヨウ化）、塩化ベンゼトニウム；チメロサール、フェノール、ブチルアルコールまたはベンジルアルコール；メチルパラベンまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール、３−ペンタノール、およびｍ−クレゾールが挙げられる。
【０２０６】
「安定剤」として公知であることもある等張化剤は、組成物中の液体の浸透圧を調整または維持するために存在する。等張化剤は、タンパク質および抗体などの大きい、荷電した生体分子と共に使用される場合、アミノ酸側鎖の荷電基と相互作用し、それによって、分子間および分子内の相互作用の電位を下げることができるため、「安定剤」と呼ばれることがよくある。等張化剤は、他の材料の相対的な量を考慮して、重量比で０．１％〜２５％、好ましくは１〜５％との間の任意の量で存在し得る。好ましい等張化剤としては、多価糖アルコール類、好ましくは、グリセリン、エリスリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトールおよびマンニトールなどの三価以上の糖アルコール類が挙げられる。
【０２０７】
追加の賦形剤としては、以下のうちの１つまたは複数として働き得る剤が挙げられる：（１）充填剤、（２）溶解度向上剤、（３）安定剤、および（４）変性または容器の壁への付着を防止する剤。そのような賦形剤としては、多価糖アルコール（上に列記される）；たとえば、アラニン、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、リジン、オルニチン、ロイシン、２−フェニルアラニン、グルタミン酸、スレオニンなどのアミノ酸；スクロース、ラクトース、ラクチトール、トレハロース、スタキオース、マンノース、ソルボース、キシロース、リボース、リビトール、ミオイニシトース（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｓｅ）、ミオイニシトール（ｍｙｏｉｎｉｓｉｔｏｌ）、ガラクトース、ガラクチトール、グリセロール、シクリトール類（たとえばイノシトール）、ポリエチレングリコールなどの有機糖または糖アルコール；尿素、グルタチオン、チオクト酸、チオグリコール酸ナトリウム、チオグリセロール、αモノチオグリセロール、およびチオ硫酸ナトリウムなどの含硫還元剤；ヒト血清アルブミン、ウシ血清アルブミン、ゼラチン、または他の免疫グロブリンなどの低分子量タンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；単糖類（たとえば、キシロース、マンノース、フルクトース、グルコース）；二糖類（たとえば、ラクトース、マルトース、スクロース）；ラフィノースなどの三糖類；ならびにデキストリンまたはデキストランなどの多糖類が挙げられる。
【０２０８】
非イオン性表面活性剤または界面活性剤（「湿潤剤」としても公知である）は、攪拌誘発凝集に対して治療タンパク質を保護するためだけでなく、治療剤の可溶化を助けるために存在し、これはまた、活性の治療タンパク質または抗体の変性を引き起こさずに、製剤がせん断表面応力に暴露されることを可能にする。非イオン性表面活性剤は、約０．０５ｍｇ／ｍＬ〜約１．０ｍｇ／ｍＬ、好ましくは約０．０７ｍｇ／ｍＬ〜約０．２ｍｇ／ｍＬの範囲で存在する。
【０２０９】
好適な非イオン性表面活性剤としては、ポリソルベート（２０、４０、６０、６５、８０など）、ポロキサマ（ｐｏｌｙｏｘａｍｅｒ）（１８４、１８８など）、プルロニック（登録商標）ポリオール、トリトン（登録商標）、ポリオキシエチレンソルビタンモノエーテル（ツイーン（登録商標）−２０、ツイーン（登録商標）−８０など）、ラウロマクロゴール４００、ステアリン酸ポリオキシル４０、ポリオキシエチレン水素化ヒマシ油１０、５０および６０、モノステアリン酸グリセロール、スクロース脂肪酸エステル、メチルセルロース、ならびにカルボキシメチルセルロースが挙げられる。使用され得るアニオン性界面活性剤としては、ラウリル硫酸ナトリウム、スルホコハク酸ジオクチルナトリウム、およびスルホン酸ジオクチルナトリウムが挙げられる。カチオン性界面活性剤としては、塩化ベンザルコニウムまたは塩化ベンゼトニウムが挙げられる。
【０２１０】
医薬組成物は、インビボ投与において使用されるためには、無菌でなければならない。医薬組成物は、無菌ろ過膜を通してろ過することによって、無菌にしてもよい。本明細書における医薬組成物は一般に、無菌アクセスポートを有する容器、たとえば、静注溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルに載置される。
【０２１１】
投与経路は、適切なやり方（たとえば、皮下、静脈内、腹腔内、筋肉内、動脈内、病巣内、もしくは関節内経路による注射または点滴、局所投与、吸入、または徐放もしくは持続放出手段によって）で、長い時間期間にわたる、単一のもしくは複数の急速投与または点滴によるなどの、公知であり許容される方法に従う。
【０２１２】
本明細書で説明される医薬組成物はまた、治療される特定の適応症のために必要に応じて、１つより多い活性化合物または薬剤、好ましくは、互いに悪影響を及ぼさない相補的な活性を有するものを、含有してもよい。代替的には、または加えて、組成物は、細胞傷害性薬剤、化学療法剤、サイトカイン、免疫抑制剤、または成長阻害剤を含んでもよい。そのような分子は、意図される目的のために有効である量で組み合わされて、好適に存在する。
Ｖ．がん治療法
【０２１３】
本出願は、さらに、細胞免疫療法において使用するための方法および組成物に関する。いくつかの実施形態において、細胞免疫療法は、血液系腫瘍および固形腫瘍を含むがこれらに限定されない、がんを治療するためのものである。本明細書で説明されるキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、二重キメラ受容体系、および改変免疫エフェクタ細胞（たとえば操作されたＴ細胞）のうちのいずれかは、がんを治療する方法において使用されてもよい。
【０２１４】
いくつかの実施形態において、医薬組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体（たとえばヒト個体）のがん（たとえば、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ球性白血病）を治療する方法が提供され、医薬組成物は、（１）（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを有するキメラ受容体を備える、改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）、ならびに（２）医薬的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態において、キメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、第２のＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチドを含む。
【０２１５】
いくつかの実施形態において、医薬組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体（たとえばヒト個体）のがん（たとえば、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ球性白血病）を治療する方法が提供され、医薬組成物は、（１）（ａ）第１のＮＫＧ２Ｄドメインと、第２のＮＫＧ２Ｄドメインと、ＣＤ１２３結合ドメイン（たとえばＩＬ−３ドメイン）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド鎖を有する多重特異性キメラ受容体を備える、改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）、ならびに（２）医薬的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、抗ＣＤ１２３抗体断片（たとえば、ｓｃＦｖまたはＶＨＨ）である。いくつかの実施形態において、ＣＤ１２３結合ドメインは、ＩＬ−３ドメインである。いくつかの実施形態において、ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、第１のペプチドリンカ、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、第２のペプチドリンカ、第２のＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２１６】
いくつかの実施形態において、医薬組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体（たとえばヒト個体）のがん（たとえば、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ球性白血病）を治療する方法が提供され、医薬組成物は、（１）第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを有する多重特異性キメラ受容体を備える、改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）であって、それぞれのポリペプチド鎖は、（ａ）ＮＫＧ２ＤドメインとＣＤ１２３結合ドメイン（たとえばＩＬ−３ドメイン）とを含む細胞外ドメイン、（ｂ）膜貫通ドメイン、および（ｃ）細胞内シグナル伝達ドメインを含む、細胞、ならびに（２）医薬的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインは、１つまたは複数のジスルフィド結合によって、第２のポリペプチド鎖のＮＫＧ２Ｄドメインに架橋される。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、ペプチドリンカ、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、細胞外ドメインは、ＮＫＧ２ＤドメインとＣＤ１２３結合ドメインとの間に配置された二量体化モチーフ（たとえば、ロイシンジッパまたはシステインジッパ）をさらに含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、ロイシンジッパ、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。
【０２１７】
いくつかの実施形態において、医薬組成物の有効量を個体に投与する段階を含む、個体（たとえばヒト個体）のがん（たとえば、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ球性白血病）を治療する方法が提供され、医薬組成物は、（１）（ｉ）第１のキメラ受容体と（ｉｉ）第２のキメラ受容体とを有する二重キメラ受容体系を備える改変免疫エフェクタ細胞（たとえばＴ細胞）であって、第１のキメラ受容体は、第１のポリペプチド鎖と第２のポリペプチド鎖とを含み、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖はそれぞれ、（ａ）ＮＫＧ２Ｄドメインを含む第１の細胞外ドメイン、（ｂ）第１の膜貫通ドメイン、および（ｃ）第１の細胞内シグナル伝達ドメインを含み、（ｉｉ）第２のキメラ受容体は、（ａ）第２の抗原結合ドメインを含む第２の細胞外ドメイン、（ｂ）第２の膜貫通ドメイン、および任意選択で（ｃ）第２の細胞内シグナル伝達ドメインを含む、第３のポリペプチド鎖を含む、細胞、ならびに（２）医薬的に許容される担体を含む。いくつかの実施形態において、第１のポリペプチド鎖および第２のポリペプチド鎖のそれぞれは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメイン、およびＣＤ３ζに由来する一次細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの実施形態において、第２のキメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、ＩＬ−３ドメイン、ＣＤ８αヒンジ領域、ＣＤ８α膜貫通ドメイン、および任意選択で、４−１ＢＢに由来する共刺激シグナル伝達ドメインを含むポリペプチド鎖を含む。
【０２１８】
本明細書で説明される方法は、固形がんおよび液状がん両方を含む、様々ながんを治療するのに好適である。いくつかの実施形態において、がんは、多発性骨髄腫、急性リンパ芽球性白血病、または慢性リンパ球性白血病である。いくつかの実施形態において、がんは、難治性または再発性のがんである。本明細書で説明される方法は、第１の治療法、第２の治療法、第３の治療法として、または、たとえば、化学療法、外科手術、放射線照射、遺伝子療法、免疫療法、骨髄移植、幹細胞移植、標的療法、寒冷療法、超音波療法、光線力学的療法、高周波アブレーションなど、当技術分野で公知の他の種類のがん療法との併用療法として、アジュバンド設定またはネオアジュバンド設定において、用いられてもよい。
【０２１９】
医薬組成物の投与は、注射、輸注、注入、または移植などの任意の簡便なやり方で行ってもよい。組成物は、患者に、経動脈的に、皮下的に、真皮内に、腫瘍内に、節内に、髄内、筋肉内に、静脈内に、または腹腔内に、投与されてもよい。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、全身投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、静脈点滴などの点滴によって、個体に投与される。免疫療法のための点滴技法は、当技術分野で公知である（たとえば、Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｅｗ  Ｅｎｇ．Ｊ．ｏｆ  Ｍｅｄ．３１９：  １６７６（１９８８）を参照されたい）。いくつかの実施形態において、組成物は、静脈内注射によって投与される。
【０２２０】
本発明の医薬組成物の投与量および望ましい薬物濃度は、想定される特定の使用に応じて変動してもよい。適切な投与量または投与経路の決定は、十分に当業者の技術範囲内である。動物実験は、ヒト治療のための有効量を決定するための信頼性のある指標を提供する。有効量の種間調整は、Ｍｏｒｄｅｎｔｉ，Ｊ．ａｎｄ  Ｃｈａｐｐｅｌｌ，Ｗ．"Ｔｈｅ  Ｕｓｅ  ｏｆ  Ｉｎｔｅｒｓｐｅｃｉｅｓ  Ｓｃａｌｉｎｇ  ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ，"  Ｉｎ  Ｔｏｘｉｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｎｅｗ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，Ｙａｃｏｂｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｅｄｓ，Ｐｅｒｇａｍｏｎ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ  １９８９，ｐｐ．４２−４６によって定められた原理に従って実行することができる。異なる治療法および異なる疾患に対しては、異なる製剤が有効となること、ならびに、特定の器官または組織を治療するように意図された投与には、別の器官または組織への投与とは異なるやり方で送達することが必要となる場合があることは、本出願の範囲内である。
【０２２１】
いくつかの実施形態において、医薬組成物の量は、個体における客観的な臨床応答をもたらすのに有効である。いくつかの実施形態において、医薬組成物の量は、個体における疾患寛解（部分的または完全）をもたらすのに有効である。いくつかの実施形態において、医薬組成物の量は、個体におけるがんの再発または疾患進行を予防するのに有効である。いくつかの実施形態において、医薬組成物の量は、個体の生存期間（たとえば無病生存期間）を延長するのに有効である。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、個体の生活の質を向上するのに有効である。
【０２２２】
いくつかの実施形態において、医薬組成物の量は、固形腫瘍またはリンパ系腫瘍の成長を阻害するのに、またはそれらのサイズを低減するのに有効である。いくつかの実施形態において、固形腫瘍またはリンパ系腫瘍のサイズは、少なくとも約１０％（たとえば、約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちの少なくともいずれかを含む）、低減される。
【０２２３】
いくつかの実施形態において、医薬組成物の量は、個体における腫瘍転移を阻害するのに有効である。いくつかの実施形態において、少なくとも約１０％（たとえば、約２０％、３０％、４０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％のうちの少なくともいずれかを含む）の転移が、阻害される。いくつかの実施形態において、リンパ節への転移を阻害する方法が提供される。いくつかの実施形態において、肺への転移を阻害する方法が提供される。転移は、血液検査、骨スキャン、Ｘ線スキャン、ＣＴスキャン、ＰＥＴスキャン、および生検によるなどの、当技術分野で公知の任意の方法によって評価することができる。
ＶＩ．キットおよび製造物品
【０２２４】
さらに提供されるのは、本明細書で説明されるキメラ受容体、多重特異性キメラ受容体、二重キメラ受容体系、または改変免疫エフェクタ細胞のうちのいずれかを含む、キット、単位投与量、および製造物品である。いくつかの実施形態において、本明細書で説明される医薬組成物のうちのいずれか１つを含有し、好ましくは、その使用のための指示書を提供する、キットが提供される。
【０２２５】
本出願のキットは、好適なパッケージに入っている。好適なパッケージとしては、バイアル、瓶、広口瓶、可撓性パッケージ（たとえば、密閉マイラー、または合成樹脂袋）などが挙げられるが、これらに限定されない。キットは、任意選択で、緩衝剤および説明情報などの、さらなる構成品を提供する。したがって、本出願はまた、製造物品を提供し、製造物品は、バイアル（たとえば密閉バイアル）、瓶、広口瓶、可撓性パッケージなどを含む。
【０２２６】
製造物品は、容器、および容器に付けられた、または関連付けられた、ラベルまたはパッケージ挿入物を含み得る。好適な容器としては、たとえば、瓶、バイアル、シリンジなどが挙げられる。容器は、ガラスまたは合成樹脂などの、様々な材料から形成されてもよい。一般に、容器は、本明細書で説明される疾病または疾患（たとえば、がん）を治療するのに有効な組成物を保持し、無菌アクセスポートを有してもよい（たとえば、容器は、静注溶液バッグ、または皮下注射針によって貫通可能な栓を有するバイアルであってもよい）。ラベルまたはパッケージ挿入物は、組成物が個体の特定の状態を治療するために使用されることを示す。ラベルまたはパッケージ挿入物は、個体への組成物の投与のための指示書をさらに含む。ラベルは、再構成および／または使用のための指示を示してもよい。医薬組成物を保持する容器は、多用途バイアルであってもよく、これにより、再構成した製剤の反復投与（たとえば、２〜６回投与）が可能になる。パッケージ挿入物は、治療用製品の商用パッケージに習慣的に含まれる指示書を指し、指示書は、適応症、用法、用量、投与、禁忌、および／またはそのような治療用製品の使用に関する警告についての情報を含む。さらに、製造物品は、注射用静菌水（ＢＷＦＩ）、リン酸緩衝食塩水、リンゲル液、およびデキストロース溶液などの医薬的に許容される緩衝液を含む、第２の容器をさらに含んでもよい。製造物品は、他の緩衝液、希釈液、フィルタ、針、およびシリンジを含む、商業および使用者の観点から望ましい他の材料をさらに含んでもよい。
【０２２７】
キットまたは製造物品は、薬局（たとえば、病院、薬局、および調剤薬局）での保管および使用に十分な量でパッケージされた、複数の単位投与量の医薬組成物および使用指示書を含んでもよい。
【実施例】
【０２２８】
以下の実施例は、本出願を純粋に例示することを意図するものであり、したがって、決して本発明を限定するものと見なされるべきではない。以下の実施例および詳細な説明は、実例として提示され、限定として提示されるものではない。
実施例１  ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体および二重ＮＫＧ２Ｄ／ＩＬ−３キメラ受容体系の調製
【０２２９】
この実施例は、例示的な二重特異性キメラ受容体、二重キメラ受容体系、および操作されたＴ細胞の設計および調製を説明する。二重特異性キメラ受容体および二重キメラ受容体系構築物の設計
【０２３０】
表１および表２は、７つの構築物および対応する配列の成分を示す。
【０２３１】
構築物１：単量体ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体（ＬＩＣ２００１）。この二重特異性キメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを有する単一のポリペプチド鎖を備え、ここで、細胞外ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ１２３結合に特異的なＩＬ−３ドメイン、第１のペプチドリンカ、そのＮ末端にて操作されたアルギニン残基を有する第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、第２のペプチドリンカ、およびそのＣ末端にて操作されたアスパラギン酸残基を有する第２のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。ＮＫＧ２Ｄドメインは、二量体化するとき、ＮＫＧ２Ｄリガンド結合を担う。操作されたアルギニン残基およびアスパラギン酸残基は互いに関連して、腫瘍細胞に結合していない遊離ＮＫＧ２ＤリガンドにＮＫＧ２Ｄ二量体が結合することを阻止し得る。核酸構築物は、単一のポリペプチド鎖をコードする。
【０２３２】
構築物２：単量体のＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体（ＬＩＣ２００１−１）。この二重特異性キメラ受容体は、Ｎ末端からＣ末端まで、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを有する単一のポリペプチド鎖を備え、ここで、細胞外ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ１２３結合に特異的なＩＬ−３ドメイン、第１のペプチドリンカ、第１のＮＫＧ２Ｄドメイン、第２のペプチドリンカ、および第２のＮＫＧ２Ｄドメインを含む。ＮＫＧ２Ｄドメインは、二量体化するとき、ＮＫＧ２Ｄリガンド結合を担う。核酸構築物は、単一のポリペプチド鎖をコードする。比較のために、第１の順方向ＮＫＧ２Ｄドメイン、ペプチドリンカ、および第２の順方向ＮＫＧ２Ｄドメインを含む細胞外ドメイン；膜貫通ドメイン（ＣＤ８α）、および細胞内シグナル伝達ドメイン（４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ）を、Ｎ末端からＣ末端まで含む、単一特異性ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体（ＬＩＣ２００１−２）を構築した。ＬＩＣ２００１−２のアミノ酸配列は配列番号３３であり、ＬＩＣ２００１−２の核酸配列は配列番号３８である。
【０２３３】
構築物３：ロイシンジッパモチーフを有する、二量体ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体（ＬＩＣ２００２）。この二重特異性キメラ受容体は、２つの同一なポリペプチド鎖を備え、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを有し、ここで、細胞外ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ１２３結合に特異的なＩＬ−３ドメイン、ロイシンジッパモチーフ、およびホモ二量体化のときにＮＫＧ２Ｄリガンド結合を担う逆方向ＮＫＧ２Ｄドメインを含む。核酸構築物は、ポリペプチド鎖の単一コピーをコードする。
【０２３４】
構築物４：ロイシンジッパモチーフを有しない、二量体ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体（ＬＩＣ２００２−１）。この二重特異性キメラ受容体は、２つの同一なポリペプチド鎖を備え、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを有し、ここで、細胞外ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ１２３結合に特異的なＩＬ−３ドメイン、ペプチドリンカ、およびホモ二量体化のときにＮＫＧ２Ｄリガンド結合を担う逆方向ＮＫＧ２Ｄドメインを含む。核酸構築物は、ポリペプチド鎖の単一コピーをコードする。
【０２３５】
構築物５：ロイシンジッパモチーフを有する、二量体ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体（ＬＩＣ２００２−２）。この二重特異性キメラ受容体は、２つの同一なポリペプチド鎖を備え、各ポリペプチド鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメインを有し、ここで、細胞外ドメインは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ１２３結合に特異的なＩＬ−３ドメイン、ロイシンジッパモチーフ、およびホモ二量体化のときにＮＫＧ２Ｄリガンド結合を担う順方向ＮＫＧ２Ｄドメインを含む。核酸構築物は、ポリペプチド鎖の単一コピーをコードする。
【０２３６】
構築物６：二重ＮＫＧ２Ｄ／ＩＬ−３キメラ受容体系（ＬＩＣ２００３）。二重ＮＫＧ２Ｄ／ＩＬ−３キメラ受容体系のためのポリシストロン性核酸構築物が設計される。構築物は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのためにコードし、第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ホモ二量体化のときにＮＫＧ２Ｄリガンド結合を担う逆方向ＮＫＧ２Ｄドメインと順方向ＮＫＧ２Ｄドメインとを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン、続いてＴ２Ａ自己開裂ペプチドを含み、第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ１２３結合に特異的なＩＬ−３ドメイン、続いて細胞内シグナル伝達ドメインを有しない膜貫通ドメインを含む。構築物が発現すると、第１のポリペプチドは、第１のキメラ受容体を形成し、第２のポリペプチドは、第２のキメラ受容体を形成する。
【０２３７】
構築物７：二重ＮＫＧ２Ｄ／ＩＬ−３キメラ受容体系（ＬＩＣ２００４）。二重ＮＫＧ２Ｄ／ＩＬ−３キメラ受容体系のためのポリシストロン性核酸構築物が設計される。構築物は、第１のポリペプチドおよび第２のポリペプチドのためにコードし、第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ホモ二量体化のときにＮＫＧ２Ｄリガンド結合を担う順方向ＮＫＧ２Ｄドメインを含む細胞外ドメイン、膜貫通ドメイン、および細胞内シグナル伝達ドメイン、続いてＴ２Ａ自己開裂ペプチドを含み、第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、ＣＤ１２３結合に特異的なＩＬ−３ドメイン、続いて細胞内シグナル伝達ドメインを有しない膜貫通ドメインを含む。構築物が発現すると、第１のポリペプチドの２コピーは、二量体である第１のキメラ受容体を形成し、第２のポリペプチドは、第２のキメラ受容体を形成する。Ｎ末端からＣ末端まで、順方向ＮＫＧ２Ｄドメイン、ＣＤ８αヒンジドメインを含む細胞外ドメイン；膜貫通ドメイン（ＣＤ８α）、および細胞内シグナル伝達ドメイン（４−１ＢＢおよびＣＤ３ζ）を含む、単一特異性ＮＫＧ２Ｄキメラ受容体（ＬＩＣ２００４−１）を構築した。ＬＩＣ２００４−１のアミノ酸配列は配列番号３５であり、ＬＩＣ２００４−１の核酸配列は配列番号４０である。  レンチウイルス発現ベクタの生成
【０２３８】
簡潔には、ｐＬＶＸ−Ｐｕｒｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ社＃６３２１６４）を使用して、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によるＥｃｏＲＩおよびＸｂａＩを用いて元のプロモータをヒト伸長因子１αプロモータ（ｈＥＦ１α）遺伝子と置き換えることによって、レンチウイルスベクタを改変した。ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによってＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体遺伝子またはＮＫＧ２Ｄ／ＩＬ−３二重キメラ受容体系遺伝子を構築し、ＥｃｏＲＩ／ＨｐａＩによってベクタにクローニングして、組換えレンチウイルス発現プラスミドを得、組換えレンチウイルス発現プラスミドをレンチウイルスパッケージング手順にさらに供した。
【０２３９】
ｐＭＤＬｇ／ｐＲＲＥ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５１）、ｐＲＳＶ−Ｒｅｖ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５３）、およびｐＭＤ２．Ｇ（Ａｄｄｇｅｎｅ＃１２２５９）を含む、レンチウイルスパッケージングプラスミド混合物を、ポリエーテルイミド（ＰＥＩ）との事前最適化した比で、ｐＬＶＸ−ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体／二重キメラ受容体系−Ｐｕｒｏ発現プラスミドと事前混合し、次いで、適切に混合し、５分間、室温にてインキュベートした。次いで、トランスフェクション混合物を２９３ＦＴ細胞に滴下し、穏やかに混合した。その後、細胞を、３７℃、５％ＣＯ２細胞インキュベータで一晩インキュベートした。４℃で１０分間、５００ｇで遠心分離後、上清を回収した。上清を０．４５μｍＰＥＳフィルタによってろ過した後、ウイルス上清を２０％スクロース勾配超遠心分離法で濃縮した。遠心分離後、上清を注意深く捨て、ウイルスペレットを事前冷却したＤＰＢＳで慎重にリンスした。次いで、ウイルスの濃度を測定した。ウイルスを適切にアリコートし、次いで−８０℃で即時に保管した。ウイルス力価を、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社によって開発されたＨＴＲＦキットに基づいて、ｐ２４によって特定した。上述の７つの構築物のそれぞれに対応する、以下の組換えレンチウイルス発現プラスミドを調製した：ｐＬＬＶ−ＬＩＣ２００１、ｐＬＬＶ−ＬＩＣ２００１−１、ｐＬＬＶ−ＬＩＣ２００２、ｐＬＬＶ−ＬＩＣ２００２−１、ｐＬＬＶ−ＬＩＣ２００２−２、ｐＬＬＶ−ＬＩＣ２００３、およびｐＬＬＶ−ＬＩＣ２００４、ならびにｐＬＬＶ−ＬＩＣ２００１−２およびｐＬＬＶ−ＬＩＣ２００４−１。  ＰＢＭＣ調製
【０２４０】
白血球を採取し、細胞濃度を、Ｒ１０培地中で５ｘ１０６個細胞／ｍＬに調整した。次いで、白血球を、０．９％ＮａＣｌ溶液と１：１（ｖ／ｖ）の比で混合した。３ｍＬのｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ培地を、１５ｍＬ遠心分離管に加え、ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐの上に、６ｍＬの希釈したリンパ球混合物をゆっくりと重層した。リンパ球混合物を、２０℃で３０分間、８００ｇで、ブレーキをかけずに遠心分離した。次いで、リンパ球のバフィーコートを２００μＬピペットで回収した。回収した画分を、少なくとも６倍の０．９％ＮａＣｌまたはＲ１０で希釈して、溶液の密度を低減させた。次いで、回収した画分を２０℃で１０分間、２５０ｇで遠心分離した。上清を完全に吸引し、１０ｍＬのＲ１０を細胞ペレットに加えた。混合物を、２０℃で１０分間、２５０ｇでさらに遠心分離した。次いで、上清を吸引した。１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２を含む、３７℃にあらかじめ温めた２ｍＬのＲ１０を細胞ペレットに加え、細胞ペレットを穏やかに再懸濁した。次いで、細胞数を計数し、後の実験のためにＰＢＭＣ試料を準備した。  Ｔ細胞精製
【０２４１】
Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｐａｎ  Ｔ  ｃｅｌｌ  ｉｓｏｌａｔｉｏｎ  ｋｉｔ（Ｃａｔ＃１３０−０９６−５３５）を用いて、製造者が提供するプロトコールに従って、以下のようにＰＢＭＣからヒトＴ細胞を精製した。細胞数を最初に測定した。細胞懸濁物を１０分間、３００ｇで遠心分離した。次いで、上清を完全に吸引し、細胞ペレットを１０７個の全細胞あたり４０μＬの緩衝液中に再懸濁した。１０７個の全細胞あたり１０μＬのＰａｎ  ＴＣｅｌｌ  Ｂｉｏｔｉｎ−ＡｎｔｉｂｏｄｙＣｏｃｋｔａｉｌを加え、十分に混合し、約５分間冷蔵庫内（２〜８℃）でインキュベートした。次いで、１０７個の細胞あたり３０μＬの緩衝液加えた。１０７個の細胞あたり２０μＬのＰａｎ  ＴＣｅｌｌ  ＭｉｃｒｏＢｅａｄ  Ｃｏｃｋｔａｉｌを加えた。混合物をよく混合し、冷蔵庫内（２〜８℃）でさらに１０分間インキュベートした。最小で５００μＬが磁気分離に必要であった。ＬＳカラムを適したＭＡＣＳ分離装置の磁場に設置した。３ｍＬの緩衝液でリンスすることでカラムを準備した。次いで、細胞懸濁物をカラム上にアプライし、濃縮されたＴ細胞画分に相当する非標識細胞を含むフロースルーを回収した。次いで、３ｍＬの緩衝液でカラムを洗浄することにより、Ｔ細胞を回収し、濃縮されたＴ細胞に相当する通過する非標識細胞を回収して、先の工程のフロースルーと合わせた。次いで、Ｔ細胞をＲ１０＋１００ＩＵ／ｍＬのＩＬ−２中に再懸濁した。次いで、ｈｕｍａｎＴＣｅｌｌＡｃｔｉｖａｔｉｏｎ／ＥｘｐａｎｓｉｏｎＫｉｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ＃１３０−０９１−４４１）を用いて、一次Ｔ細胞を形質導入前の３日間、プレ活性化した。
【０２４２】
精製したＴ細胞に、組換えレンチウイルスベクタのそれぞれをトランスフェクションするか、またはキメラ受容体構築物のそれぞれをコードするｍＲＮＡをエレクトロポレーション法によってトランスフェクションし、次に、３７℃の５％ＣＯ２インキュベータにて一晩インキュベートした。この実施例において説明する７つの構築物のそれぞれを発現する操作されたＴ細胞を調製した。
操作されたＴ細胞上でのキメラ受容体の発現
【０２４３】
エレクトロポレーション法によって、ＬＩＣ２００２−２およびＬＩＣ２００４キメラ受容体構築物をコードするｍＲＮＡ分子を、それぞれＴ細胞に送達した。フローサイトメトリアッセイを用いて、キメラ受容体の発現を検出した。簡潔には、エレクトロポレーションしたＴ細胞を回収してＤＰＢＳでリンスし、次いで、ＮＫＧ２Ｄドメイン検出のために２μＬのＰＥ共役ＣＤ３１４タンパク質（ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣ社、１３０−１１１−６４５）を、またはＩＬ−３ドメイン検出のために１０μｌのＰＥ共役抗ＩＬ−３抗体（ＭＩＬＴＥＮＹＩ  ＢＩＯＴＥＣ社、１３０−０９６−０８４）を含有する１００μＬのＤＰＢＳ中に再懸濁した。反応混合物を、４℃で２０分間、インキュベートした。続いて、細胞を、２００μＬのＤＰＢＳで洗浄し、ＤＰＢＳ中に再懸濁し、フローサイトメトリによって分析した。図２に示すように、操作されたＴ細胞は、ＮＫＧ２ＤドメインおよびＩＬ−３ドメインの両方を有するキメラ受容体を発現した。
インビトロ細胞傷害性アッセイ
【０２４４】
操作されたＴ細胞を回収し、３８４ウェル反応プレートに接種した。標的細胞は、ヒト慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）細胞株Ｋ５６２−ＬｕｃおよびＫ５６２−ＣＤ１２３Ｌｕｃ（ＣＤ１２３を組換えで発現する）であった。すべての細胞株は、ホタルルシフェラーゼを発現するように自家操作された。操作されたＴ細胞の、腫瘍細胞に対する細胞傷害性をアッセイするために、エフェクタ（操作されたＴ細胞）の標的細胞に対する比（「Ｅ：Ｔ比」）２０：１で２０時間、操作されたＴ細胞を標的細胞と共インキュベートした。ＯＮＥ−ＧＬＯ（商標）発光ルシフェラーゼアッセイ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ社＃Ｅ６１１０）を製造者のプロトコールに従って調製し、共培養した細胞に加えて、各ウェルにおける残存ルシフェラーゼ活性を検出した。ルシフェラーゼは標的細胞にのみ発現されたため、ウェル中の残存ルシフェラーゼ活性は、ウェル中の生存標的細胞の数に直接的に相関した。エフェクタ細胞非存在下で培養培地を標的細胞に加えることによって、最大ルシフェラーゼ活性を得た。陽性コントロールとして最終濃度１％でトリトンＸ−１００を加えることによって、最小ルシフェラーゼ活性を特定した。比溶解／細胞傷害性を、式：比溶解／細胞傷害性％＝１００％×［１−（ＬＵＣｓａｍｐｌｅ−ＬＵＣｍｉｎ）／（ＬＵＣｍａｘ−ＬＵＣｍｉｎ）］に従って算出した。ルシフェラーゼ値（「ＬＵＣ」または発光）は、各反応ウェルにおける生存細胞の量に比例する。
【０２４５】
図３Ａに示すように、ＬＩＣ２００１−１発現Ｔ細胞（７６．６３±４．５８％）、ＬＩＣ２００２−２発現Ｔ細胞（９６．５２±１．６８％）、およびＬＩＣ２００４発現Ｔ細胞（９６．８９±０．７０％）は、Ｋ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃに対して著しい殺傷効果を示した。図３Ｂに示すように、殺傷効果は、Ｋ５６２−Ｌｕｃ細胞に対しても観察された：ＬＩＣ２００１−１発現Ｔ細胞（３５．９８±６．０８％）、ＬＩＣ２００２−２発現Ｔ細胞（９４．４２±２．６６％）、ＬＩＣ２００４発現Ｔ細胞（９５．８７±１．６１％）。しかしながら、様々なＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体構築物を発現する操作されたＴ細胞は、Ｋ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃ細胞に対してＫ５６２−Ｌｕｃ細胞より高い細胞傷害性を示した。
【０２４６】
ＬＩＣ２００２−２発現Ｔ細胞およびＬＩＣ２００４発現Ｔ細胞を、エフェクタ（操作されたＴ細胞）の標的細胞に対する比１０：１、５：１、または２．５：１で、ヒト急性骨髄性白血病（ＡＭＬ）細胞株ＫＧ１−Ｌｕｃと共インキュベートし、ＫＧ１−Ｌｕｃに対するインビトロ細胞傷害性を評価した。図３Ｃに示すように、ＬＩＣ２００２−２発現Ｔ細胞（８３．６８±７％、７８．５５±４％、および６０．８７±１０％）およびＬＩＣ２００４発現Ｔ細胞（８５．６±３％、７６．８９±４％、および７５．５３±１％）の両方に関して、強力で用量依存的な細胞傷害効果が観察された。
【０２４７】
ＬＩＣ２００２−２発現Ｔ、ＬＩＣ２００４発現Ｔ、およびＬＩＣ２００４−１発現Ｔの、Ｋ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃに対する細胞傷害活性を、様々なエフェクタ：標的の比で比較した。ＬＩＣ２００４−１構築物は、ＬＩＣ２００４二重キメラ受容体系中のＮＫＧ２Ｄキメラ受容体である。結果を図４に示す。Ｙ軸は比殺傷のパーセンテージを示し、Ｘ軸はエフェクタ：標的比（すなわち、操作されたＴ細胞：Ｋ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃ細胞）の自然対数を示す。Ｅ：Ｔ比の対数は、比殺傷のパーセンテージに対してプロットされており、線形回帰によって点線にフィットされている。フィットさせた線の傾斜が小さいほど、より強い殺傷能を示す。結果は、ＬＩＣ２００４二重キメラ受容体系が、対応するＮＫＧ２Ｄキメラ受容体単独（すなわち、ＬＩＣ２００４−１）より高い有効性を有することを示した(ｐ＝０．０３１)。二重特異性キメラ受容体構築物ＬＩＣ２００２−２とＬＩＣ２００４の有効性の間に有意な相違はない（ｐ＝０．２７７）。統計的分析はＧｒａｐｈｐａｄ  Ｐｒｉｓｍ６を使用して行った。
作用の機序
【０２４８】
ＮＫＧ２Ｄ×ＩＬ−３キメラ受容体構築物を発現する操作されたＴ細胞の機序を調べるために、一連のインビトロ細胞傷害性アッセイを実施した。第一に、「ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１２３Ｔ細胞」（ＬＩＣ２００４発現Ｔ細胞）、「ＮＫＧ２Ｄ  Ｔ細胞」（ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８ＴＭ−４−１ＢＢ−ＣＤ３ζを発現するＴ細胞）、および「ＣＤ１２３バインダＴ細胞」（ＩＬ３−ＣＤ８ヒンジ−ＣＤ８ＴＭを発現するＴ細胞）を、標的のＫ５６２−ＣＤ１２３−ｌｕｃ細胞およびＫ５６２−ｌｕｃ細胞と、それぞれ２０：１のＥ：Ｔ比で共培養した。
【０２４９】
図５Ａに示すように、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１２３  Ｔ細胞は、著しい腫瘍殺傷効果（７０．５９±１．５％）を示した一方、ＮＫＧ２Ｄ  Ｔ細胞の腫瘍殺傷効果（４２．１４±８．４％）はずっと弱く、ＣＤ１２３バインダＴ細胞は、標的腫瘍細胞に対して細胞傷害性を示さなかった。図５Ｂにおいて、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１２３  Ｔ細胞はまた、Ｋ５６２−ｌｕｃ細胞に対して著しい細胞傷害性（８８．２８±６．５８％）を示した一方、ＮＫＧ２Ｄ  Ｔ細胞は、より低い細胞傷害性（６６．６８±２．８７％）を示し、ＣＤ１２３バインダＴ細胞は、Ｋ５６２−ｌｕｃ細胞に対して細胞傷害性を有しなかった（−４６．９８±１１．２２％）。これらの結果は、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１２３  Ｔ細胞が、ＮＫＧ２Ｄ  Ｔ細胞より有効であることを示す。
【０２５０】
さらに、ＮＫＧ２Ｄの同族リガンド、可溶性ＭＩＣＡの存在下または非存在下で細胞傷害性アッセイを行った。ＮＫＧ２Ｄ−ＣＤ１２３  Ｔ細胞（ＬＩＣ２００２−２またはＬＩＣ２００４）を、標的細胞（Ｋ５６２−ＬｕｃまたはＫ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃ）と２０：１のＥ：Ｔ比で共培養したとき、組換えＭＩＣＡタンパク質またはＢＳＡタンパク質でそれぞれブロックした。０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、または１０００ｎｇ／ｍＬの濃度で、ＭＩＣＡまたはＢＳＡを共培養に加えた。ｍＲＮＡなしでエレクトロポレーションしたＴ細胞を陰性コントロールとした。
【０２５１】
図６Ａ〜図６Ｂに示すように、試験された最も高い濃度のＭＩＣＡでの処理において、ＮＫＧ２Ｄドメインがブロックされ、ＬＩＣ２００２−２発現Ｔ細胞およびＬＩＣ２００４発現Ｔ細胞の細胞傷害活性が低減され得た。非特異的なＢＳＡでの処理は、操作されたＴ細胞の腫瘍細胞に対する細胞傷害性に著しく影響しなかった。
【０２５２】
図７に示すように、ＬＩＣ２００２−２発現Ｔ細胞およびＬＩＣ２００４発現Ｔ細胞を、エフェクタ（操作されたＴ細胞）の標的細胞に対する比２０：１、１０：１、５：１、２．５：１、１．２５：１、または０．６２５：１で、Ｋ５６２−ＣＤ１２３−ＬｕｃまたはＫ５６２−Ｌｕｃの細胞株と共インキュベートした。結果は、ＬＩＣ２００４およびＬＩＣ２００２−２の、Ｋ５６２細胞株への用量依存的な殺傷効果を示す。ＮＫＧ２Ｄを単独で発現するＫ５６２細胞株よりＮＫＧ２ＤおよびＣＤ１２３の両方を発現するＫ５６２細胞株に対して、より強い殺傷効果が観察された。
ＩＦＮγ放出
【０２５３】
ＬＩＣ２００２−２、ＬＩＣ２００４、またはＬＩＣ２００４−１構築物を発現する操作されたＴ細胞を、Ｋ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃ、Ｋ５６２−Ｌｕｃ、またはＫＧ１−Ｌｕｃの細胞株と２０時間、それぞれ共インキュベートした。共培養からの上清を回収し、サイトカイン放出（たとえば、インターフェロンガンマ、ＩＦＮγ放出）のレベルを特定するために評価した。
【０２５４】
図８Ａは、操作されたＴ細胞をＣＤ１２３陽性Ｋ５６２−ＣＤ１２３−Ｌｕｃと２０時間共培養した後の、細胞を含まない上清中のＩＦＮγのレベルを示す。分泌されたＩＦＮγのレベルは、１５２６．５１±９２．１３ｐｇ／ｍＬ（ＬＩＣ２００２−２）、１０８９．３６±８．０６ｐｇ／ｍＬ（ＬＩＣ２００４）、６８７．６２±３１．６５ｐｇ／ｍＬ（ＬＩＣ２００４−１）、および６４．１５±１６．５６ｐｇ／ｍＬ（ＲＮＡなしコントロール）であった。ＩＦＮγはＴ細胞なしコントロールにおいて検出可能ではなかった。
【０２５５】
図８Ｂは、操作されたＴ細胞をＫ５６２−Ｌｕｃと２０時間共培養した後の、細胞を含まない上清中のＩＦＮγのレベルを示す。分泌されたＩＦＮγのレベルは、３４１６．６７±７１．１５ｐｇ／ｍＬ（ＬＩＣ２００２−２）、３０６３．４６±１１９．４６ｐｇ／ｍＬ（ＬＩＣ２００４）、１８４１．４１±２２２．１８ｐｇ／ｍＬ（ＬＩＣ２００４−１）、および３．９９±１１．５７ｐｇ／ｍＬ（ＲＮＡなしコントロール）であった。ＩＦＮγはＴ細胞なしコントロールにおいて検出可能ではなかった。
【０２５６】
図８Ｃは、操作されたＴ細胞をＫＧ１−Ｌｕｃと２０時間共培養した後の、細胞を含まない上清中のＩＦＮγのレベルを示す。分泌されたＩＦＮγのレベルは、２６７．７５±３４．３３ｐｇ／ｍＬ（ＬＩＣ２００２−２）、２６５．８７±１２．１９ｐｇ／ｍＬ（ＬＩＣ２００４）、２３６．５６±１６．４５ｐｇ／ｍＬ（ＬＩＣ２００４−１）、および２２０．５６±８０．５ｐｇ／ｍＬ（ＲＮＡなしコントロール）であった。ＩＦＮγはＴ細胞なしコントロールにおいて検出可能ではなかった。
【０２５７】
【図１Ａ】
2021508463.tif 000004
【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図１Ｆ】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図８Ｃ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021508463.tif 000024
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