(57)【要約】本発明は、キューカミスメロ種の植物から得られるウドンコ病付与ＱＴＬ又はそのウドンコ病付与部分若しくはバリアントを含む遺伝的エレメントに関する。本発明は、前記ＱＴＬを同定するためのマーカー、その使用、及びウドンコ病に対する抵抗性を増大させた植物を作製する方法、及びそれにより得られた植物にも関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＱＴＬ−ＶＩが、キューカミスメロ種の植物ゲノム中に存在する場合に、ウドンコ病に対する抵抗性をもたらし、マーカーが：
公開メロンゲノムの物理的位置５，３３０，６４５ｂｐに対応する配列番号１の２３位の「Ｇ」；
公開メロンゲノムの物理的位置６，００６，４５６ｂｐに対応する配列番号２の２３位の「Ａ」；
公開メロンゲノムの物理的位置５，４１４，５０６ｂｐに対応する配列番号３の２３位の「Ｔ」；及び
公開メロンゲノムの物理的位置５，７３８，９２０ｂｐに対応する配列番号４の２３位の「Ｃ」
からなる群から選択される、ＱＴＬ−ＶＩを同定するためのマーカー。
【請求項２】
配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の群から選択される配列を含む、請求項１に記載のマーカー。
【請求項３】
ＱＴＬ−ＸＩＩが、ＱＴＬ−ＶＩと一緒に前記キューカミスメロ種の前記植物ゲノム中に存在する場合にウドンコ病に対する抵抗性をもたらし、
マーカーが：
公開メロンゲノムの物理的位置２２，６７５，８７７ｂｐに対応する配列番号５の２３位の「Ｔ」；
公開メロンゲノムの物理的位置２２，９２３，８４２ｂｐに対応する配列番号６の２３位の「Ｔ」；
公開メロンゲノムの物理的位置２２，７８１，８８９ｂｐに対応する配列番号７の２３位の「Ｃ」；及び
公開メロンゲノムの物理的位置２２，７８８，５８８ｂｐに対応する配列番号８の２３位の「Ｇ」
からなる群から選択される、ＱＴＬ−ＸＩＩを同定するためのマーカー。
【請求項４】
配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の群から選択される配列を含む、請求項３に記載のマーカー。
【請求項５】
請求項１又は２に記載のマーカーと請求項３又は４に記載のマーカーの組み合わせ。
【請求項６】
ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第６染色体上で配列番号１及び配列番号２によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる領域内に位置するＱＴＬ−ＶＩ、又はウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントを含む核酸又は構築物。
【請求項７】
ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる領域内に位置するＱＴＬ−ＸＩＩ、又はウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントを含む核酸又は構築物。
【請求項８】
ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第６染色体上で配列番号１及び配列番号２によって区切られる前記染色体領域内、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる前記領域内に位置するＱＴＬ−ＶＩ、又はウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントと、前記ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる前記染色体領域内、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる前記領域内に位置するＱＴＬ−ＸＩＩ、又はウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントの両方を含む核酸又は構築物。
【請求項９】
前記キューカミスメロ種の前記植物ゲノム中のＱＴＬ−ＶＩを同定するための請求項１又は２に記載のマーカーの使用。
【請求項１０】
前記キューカミスメロ種の前記植物ゲノム中のＱＴＬ−ＸＩＩを同定するための請求項３又は４に記載のマーカーの使用。
【請求項１１】
前記キューカミスメロ種の前記植物ゲノム中のＱＴＬ−ＶＩとＱＴＬ−ＸＩＩの組み合わせを同定するための請求項１又は２に記載のマーカーと請求項３又は４に記載のマーカーの組み合わせの使用。
【請求項１２】
請求項１又は２に記載の少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップを含み、任意選択で、請求項３又は４に記載の少なくとも１つマーカーの存在を検出するステップを更に含む、ウドンコ病抵抗性植物を選抜する方法。
【請求項１３】
ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第６染色体上で配列番号１及び配列番号２によって区切られる前記染色体領域内、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる前記領域内に位置するＱＴＬ−ＶＩを植物に遺伝子移入するステップを含む、キューカミスメロ種のウドンコ病抵抗性植物を作製する方法。
【請求項１４】
前記方法が、請求項６に記載の核酸を植物に移入するステップを含み、前記移入が、トランスフォーメーション又はプロトプラスト融合によって任意選択で実行される、キューカミスメロ種のウドンコ病抵抗性植物を作製する方法。
【請求項１５】
ＮＣＩＭＢ  ４２９９１の前記ゲノムに含まれ、第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる前記染色体領域内、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる前記領域内に位置するＱＴＬ−ＸＩＩ、又は請求項７に記載の核酸を前記植物に遺伝子移入若しくは移入するステップを更に含む、請求項１３又は１４に記載の方法。
【請求項１６】
ゲノムに遺伝子移入された、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムにおいて第６染色体上で配列番号１及び配列番号２によって区切られる、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる前記染色体領域内に含まれるＱＴＬ−ＶＩを含み、好ましくは前記植物が栽培品種である、ウドンコ病抵抗性キューカミスメロ植物。
【請求項１７】
ゲノムに遺伝子移入された、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムにおいて第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる前記染色体領域内に含まれるＱＴＬ−ＸＩＩを更に含む、請求項１６に記載のウドンコ病抵抗性キューカミスメロ植物。
【請求項１８】
前記ウドンコ病病原体が、真菌ポドスファエラキサンチイである、請求項１〜４のいずれか一項に記載のマーカー、請求項５に記載のマーカーの組み合わせ、請求項６〜８のいずれか一項に記載の核酸、請求項９〜１１のいずれか一項に記載の使用、請求項１２〜１５のいずれか一項に記載の方法又は請求項１６若しくは１７に記載の植物。
【発明の詳細な説明】
【背景技術】
【０００１】
メロンは、早くに栽培品種化され、アフリカ及びアジアの国々において数千年にわたり栽培されてきた一年生の草本、顕花植物種である。メロンは現在世界的に栽培されており、美味しく栄養価が非常に高い果実を提供している。メロンは、サラダとしていて生で一般に消費され、又はデザート、前菜若しくは飲料に調理され、そのために他の様々な成分と組み合わせられ得る。
【０００２】
キューカミスメロ（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ）種のメロン植物は、科学的にウリ科と呼ばれるウリ科植物ファミリーに属する。重要な食用作物であるキュウリ、ククミスサティブス（Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｓａｔｉｖｕｓ）と一緒に、キューカミスメロはキュウリ属に属する。キューカミスメロ種は、亜種メロ及びアグレスティス（ａｇｒｅｓｔｉｓ）への分割を例えば使用して、変種への更なる分類を伴って分類学的に分類され、栽培されるメロンは基本的に全て亜種メロに属する。
【０００３】
メロンは、１２対の染色体を持つ２倍体植物種である。キューカミスメロ種のメロン植物は、原則自家受粉植物であるが、他家受粉もしばしば起こる。ほとんどの作物のように、商業的なメロン栽培品種は、最初は自然受粉であったが、今日では、多くの高収性ハイブリッド変種が利用可能である。
【０００４】
メロン生産は、比較的乾燥し、長く温暖で日が当たる季節の気候で最も成功する。メロンは世界中で育てられている。栽培は、露地及び保護環境条件（例えば温室）下の両方である。栽培されるメロンの基本的に全ては亜種メロに属するので、交雑障壁は全く存在せず、異なる型のメロン間の組み合わせが、育種プログラムの対象とされてきた。
【０００５】
いくつかのウイルス、細菌及び真菌の病気を含めて、いくつかの害虫並びに病気が、メロン生産に影響を及ぼす場合がある。ウイルス感染によって引き起こされる典型的な病気には、メロン壊疽斑点ウイルス（ＭＮＳＶ）、メロンモザイクウイルス（ＷＭＶ）及びウリ科黄化萎縮病ウイルス（ＣＹＳＤＶ）による感染症がある。真菌感染によって引き起こされる典型的な病気には、べと病、ウドンコ病及びつる枯病がある。
【０００６】
上述の病気のうち、ウドンコ病（以下で「ＰＭ」とも呼ぶ）は、キューカミスメロを含めたキュウリ属における主要な真菌病のうちの１つである。この病気は、圃場及び温室の両方で観察される。
【０００７】
真菌感染の徴候は非常に特徴的なので、ウドンコ病は容易に同定され得る。感染した植物は、葉及び茎に白い粉状の斑点を示す。特に、より低い葉が影響を受けるが、ウドンコ病菌は地上に曝露されている植物のあらゆる部分に発生し得る。病気が進行するにつれて、粉状の斑点はサイズが増大し、大量の数の胞子が形成されるにつれてより厚くなる。その際、ウドンコ病菌は植物全体を覆って広がり、茎及び果実をも感染させ得る。激しく罹患した植物部分、特に葉は、乾燥して脆性になる場合があり、又は萎えて枯れる場合がある。真菌感染の結果として、メロン果実は、より小さいサイズ、少ない数、貯蔵できない、日焼け、不完全な成熟、弱い風味がしばしば観察される。ウドンコ病は、植物が他の病原体に対してより脆弱になる素因を作り得ることも示唆されてきた。最終的に、植物は枯れ得る。
【０００８】
感染と徴候出現の間の時間は通常わずか３〜７日間であり、多数の分生胞子（無性胞子）が短時間で生成され得るので、ウドンコ病は好ましい条件下で速やかに発達する。適した条件には、密集した植物生長及び低光度がある。乾燥がコロニー形成、胞子形成及び散布に有利であるのに対して、高い相対湿度は感染及び分生子生存に有利である。昼間温度が少なくとも摂氏３８℃であれば、ウドンコ病の発達は阻止される。
【０００９】
殺真菌剤処置を使用して、メロンにおけるウドンコ病の（更なる）発達を防止し得る。例えば、硫黄は、数百年間も使用されてきた処置である。しかしながら、真菌は葉の下面及び植物被の低い葉において最もよく発達するので適当な防除を得るには殺真菌剤はこれらの表面に必要であり、毎週の噴霧プログラムが一般に必要とされる。殺真菌剤抵抗性の発達及びそれに伴う防除失敗は常に、移動性殺真菌剤に伴う懸念である。実際、そのような殺真菌剤に対して抵抗性（非感受性）のウドンコ病真菌株が見いだされている。
【００１０】
ウドンコ病は、異なる種のウドンコカビ目の子嚢菌真菌によって一般に引き起こされる。メロンではウドンコ病の２つの病原体：ポドスファエラキサンチイ（Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｘａｎｔｈｉｉ）（オイジウムエリシフォイデス［Ｏｉｄｉｕｍ  ｅｒｙｓｉｐｈｏｉｄｅｓ］；以前はスファエロテカフリジネア［Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ  ｆｕｌｉｇｉｎｅａ］とも指定される）及びゴロビノミセスシュラセアラム（Ｇｏｌｏｖｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ）（オイジウムクリサンセミ［Ｏｉｄｉｕｍｃｈｒｙｓａｎｔｈｅｍｉ］；以前はエリシフェシュラセアラム［Ｅｒｙｓｉｐｈｅ  ｃｉｃｈｏｒａｃｅａｒｕｍ］とも指定される）が、同定されている。
【００１１】
ウドンコ病に対して抵抗性を示すキューカミスメロ種の植物について記載されている。例えば、メロン（キューカミスメロＬ．）ＰＩ  ３１３９７０は、スファエロテカフリジネア（Ｓｃｈｌｅｃｈｔ  ｅｘ  Ｆｒ．）Ｐｏｌｌ．レース２によって刺激されるウドンコ病に対して抵抗性を呈した。また、ＰＩ  １２４１１１は、温室においてレース２に対して抵抗性であった（ＭｃＣｒｅｉｇｈｔ［２００１年］Ｃｕｃｕｒｂｉｔ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  Ｃｏｏｐｅｒａｔｉｖｅ  Ｒｅｐｏｒｔ  ２４：２２；ＭｃＣｒｅｉｇｈｔら［２０１１年］ＨｏｒｔＳｃｉｅｎｃｅ  ４６［６］：８３８〜８４０頁）。また、Ｐｉｔｒａｔらは、メロン株「９０６２５」（Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ  ２００８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＸｔｈ  ＥＵＣＡＲＰＩＡ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ［Ｐｉｔｒａｔ  Ｍ編］、ＩＮＲＡ、Ａｖｉｇｎｏｎ［フランス］、２００８年５月２１〜２４日、１３５〜１４２頁）におけるウドンコ病に対する遺伝抵抗性について記載した。国際公開第２０１２／１１６９３８号は、キュウリ属ファミリー、特にキューカミスメロの遺伝子を提供するウドンコ病抵抗性について開示しており、前記抵抗性は遺伝子の機能障害によって生じる。
【００１２】
既に上で議論した通り、ウドンコ病を防除する殺真菌剤処置はかなり手間がかかり、環境に負の影響を及ぼし、そのような殺真菌剤に対してウドンコ病真菌抵抗性（非感受性）の発達を引き起こし得る。したがって、キュウリ属植物種、特にキューカミスメロの経済的重要性を考慮すると、キュウリ属植物種においてウドンコ病を克服する非化学的代替物を提供する継続的な必要性が当業者に存在し、特にウドンコ病抵抗性植物、ウドンコ病抵抗性付与ＱＴＬを含む遺伝的エレメント及び前記ＱＴＬを同定するためのマーカー、その使用並びにウドンコ病に対する抵抗性を増大させた植物を生産する方法の継続した必要性が当業者に存在する。
【発明の概要】
【００１３】
当業者における上記必要性を考慮すると、他の目的の中で、この必要性を満たすことが本発明の目的である。したがって、本発明の根底にある技術的問題は、上述した必要性のいずれかに応えるためのそのような産物、組成物、方法及び使用の提供に見ることができる。技術的問題は、特許請求の範囲及び以下の本明細書で特徴付けられる実施形態によって解決される。
【００１４】
説明
本発明の実施形態は、付随する図面を参照して以下で更に記載される：
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】抵抗性スコアと共に葉片の外見を示す図解である。
【図２】遺伝子型と表現型の間の相関（９５％信頼域）を示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
定義
本開示の一部は、著作権保護の対象となる資料（著作権保護が任意の支配権において利用できる又はでき得る線図、装置の写真又は本提出物の他の任意の態様など）を含有する。著作権者は、特許庁の特許ファイル又は記録に記載されている特許文書若しくは特許開示物を誰かが複製することに異議を唱えることはないが、それ以外の場合全ての著作権を留保する。
【００１７】
本発明の方法、組成物、使用及び他の態様に関する様々な用語は、本明細書及び請求項の全体を通じて使用される。そのような用語は、特に明記しない限り、本発明が属する当業者において通常の意味を与えられる。他の特別に定義された用語は、本明細書において提供される定義と整合する様式で解釈される。本明細書に記述される方法及び材料と類似の又は等価の任意の方法及び材料が、本発明の試験を実践するために使用され得るが、好ましい材料及び方法が本明細書に記載される。
【００１８】
本発明のために、以下の用語が下で定義される。
【００１９】
本明細書では、単数形、「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、文脈に別段の明確な指図がない限り複数の指示対象を含む。例えば、薬物を投与する方法は、複数の分子（例えば数十、数百、数千、数万、数十万、数百万、又はより多くの分子）を投与するステップを含む。
【００２０】
本明細書では、用語「及び／又は」は、記載される事例のうちの１つ又は複数が、単独で若しくは記載される事例のうちの少なくとも１つ、記載される事例の最大全部と組み合わさって起こり得ることを示す。例えば、語法「ＱＴＬ−ＶＩ及び／又はＱＴＬ−ＸＩＩ」は、「ＱＴＬ−ＶＩ、ＱＴＬ−ＸＩＩ又はＱＴＬ−ＶＩとＱＴＬ−ＸＩＩの組み合わせ」を示す。
【００２１】
本明細書では、「含む（ｔｏ  ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及びその活用形は、単語に続く項目が含まれるが、特に言及されていない項目が除外されないことを意味する非限定的な意識で使用される。「含む」は、より限定な「からなる（ｔｏ  ｃｏｎｓｉｓｔ  ｏｆ）」を包含する。
【００２２】
本明細書では、用語「構築物」若しくは「核酸構築物」又は「ベクター」とは、組換えＤＮＡ技術の使用の結果得られる人工核酸分子のことを指し、しばしば、構築物上に含まれるＤＮＡ領域を宿主細胞において発現させる目的でその人工核酸分子を使用して宿主細胞に外来性ＤＮＡが送達されてもよい。ベクター骨格は、例えば当業者に公知の及び本明細書において他で記載されるバイナリ若しくは超バイナリベクター（例えば米国特許第５５９１６１６号、米国特許第２００２１３８８７９号及び国際公開第ＷＯ９５／０６７２２号を参照のこと）、同時組み込みベクター又はＴ−ＤＮＡベクターであってもよく、その中にキメラ遺伝子が組み込まれ、又は適切な転写調節配列が既に存在する場合には所望の核酸配列（例えばコード配列、アンチセンス又は逆位反復配列）だけが転写調節配列の下流に組み込まれる。構築物のベクター骨格は、例えば、（キメラ）遺伝子が組み込まれるプラスミドでもよく、又は適切な転写調節配列が既に存在する場合、所望の核酸（例えばコーディング部分）だけが組み込まれる。ベクターは、例えば選択可能なマーカー、多重クローニング部位、等などの分子クローニングにおける使用を容易にするために更なる遺伝的エレメントを含んでもよい。
【００２３】
「配列同一性」及び「配列類似性」は、２つの配列の長さに応じてグローバル若しくはローカルアラインメントアルゴリズムを使用して２つのペプチド又は２つのヌクレオチド配列を整列化することによって決定され得る。類似した長さの配列は、全長にわたって最適に配列を整列させるグローバルアライメントアルゴリズム（例えばＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈ）を使用して好ましくは整列され、実質的に異なる長さの配列は、ローカルアラインメントアルゴリズム（例えばＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎ）を使用して好ましくは整列される。配列が少なくとも特定の最小のパーセンテージの配列同一性（下で定義される）を共有している場合（例えば、初期値のパラメータを使用してプログラムＧＡＰ又はＢＥＳＴＦＩＴによって最適に整列された場合）、配列は、「実質的に同一である」又は「本質的に類似している」と次いで呼ばれてもよい。ＧＡＰは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｗｕｎｓｃｈグローバルアライメントアルゴリズムを使用して２つの配列をその全長（完全長）にわたって整列させ、一致の数を最大化し、ギャップの数を最小化する。２つの配列が類似の長さを有する場合、グローバルアライメントを適切に使用して配列同一性を決定する。一般に、ギャップ作成罰則＝５０（ヌクレオチド）／８（タンパク質）、及びギャップ伸長罰則＝３（ヌクレオチド）／２（タンパク質）であるＧＡＰ初期値パラメータが使用される。ヌクレオチドの場合、使用される初期値のスコア行列はｎｗｓｇａｐｄｎａであり、タンパク質の場合、初期値のスコア行列はＢｌｏｓｕｍ６２（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆ、１９９２年、ＰＮＡＳ  ８９、９１５〜９１９頁）である。配列整列化及びパーセンテージ配列同一性のスコアは、Ａｃｃｅｌｒｙｓ  Ｉｎｃ．、９６８５  Ｓｃｒａｎｔｏｎ  Ｒｏａｄ、Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ  ９２１２１−３７５２  ＵＳＡから市販されているＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、Ｖｅｒｓｉｏｎ  １０．３などのコンピュータプログラムを使用して、或は上記のＧＡＰの場合と同じパラメータを使用し、又は初期値設定（ｎｅｅｄｌｅとｗａｔｅｒの両方について及びタンパク質とＤＮＡ整列化の両方について、初期値ギャップ開始罰則は１０．０、初期値ギャップ伸長罰則は０．５であり；初期値スコアマトリックスは、タンパク質の場合Ｂｌｏｓｓｕｍ６２、ＤＮＡの場合ＤＮＡＦｕｌｌである）を使用してＥｍｂｏｓｓＷＩＮバージョン２．１０．０内のプログラム「ｎｅｅｄｌｅ」（グローバルＮｅｅｄｌｅｍａｎ  Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズムを使用する）若しくは「ｗａｔｅｒ」（ローカルＳｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用する）などのオープンソースソフトウェアを使用して決定されてもよい。配列の全体長が実質的に異なる場合、Ｓｍｉｔｈ  Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズムを使用するなどのローカルアラインメントが好ましい。別法として、パーセンテージ類似性又は同一性は、ＦＡＳＴＡ、ＢＬＡＳＴ等などのアルゴリズムを使用して公開データベースに対して検索することによって決定されてもよい。したがって、本発明の核酸及びタンパク質配列を「問い合わせ配列」として更に使用して、公開データベースに対す��検索を実行し、それにより、例えば、他のファミリーメンバー又は関連配列を同定することができる。そのような検索は、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９０年）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜１０頁のＢＬＡＳＴｎ及びＢＬＡＳＴｘプログラム（バージョン２．０）を使用して実行され得る。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を、ＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２で実行して、本発明の酸化還元酵素核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＢＬＡＳＴｘプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３で実行して、本発明のタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ有の整列化を得るために、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴが、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、（１９９７年）Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２頁に記載の通り利用され得る。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ＢＬＡＳＴｘ及びＢＬＡＳＴｎ）の初期値のパラメータが使用され得る。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／で米国バイオテクノロジー情報センターのホームページを参照のこと。
【００２４】
本明細書では、用語「連鎖群」とは、同じ染色体上に位置する遺伝子又は遺伝形質全てのことを指す。連鎖群内で、十分近い座は、遺伝的交雑において連鎖を共に呈することになる。交差の確率は、染色体上の遺伝子間の物理的距離に伴って増大するので、場所が連鎖群内で互いに遠く離れている遺伝子は、直接遺伝子試験においてどんな検出可能な連鎖も呈しない可能性がある。用語「連鎖群」は、染色体の割り当てがまだ行われていない遺伝子系において連鎖している挙動を呈する遺伝子座を指すために主に使用される。
【００２５】
本明細書では、用語「分子マーカー」又は「マーカー」とは、特定の遺伝子及び染色体場所を定義する、即ち染色体上の特定の位置に印をつける指標のことを指す。当業者に公知である周知の例には、増幅断片長多型（ＡＦＬＰ）マーカー、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）マーカー、単一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）、配列特性化増幅領域（ＳＣＡＲ）、切断増幅多形性配列（ｃｌｅａｖｅｄ  ａｍｐｌｉｆｉｅｄ  ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ）（ＣＡＰＳ）マーカー若しくはアイソザイムマーカー又は本明細書に記載されるマーカーの組み合わせがある。分子マーカーがＱＴＬと密接に連鎖している場合、そのマーカーは、ＱＴＬが見られるＤＮＡに「印をつけ」、したがって、例えばマーカー利用育種／選抜（ＭＡＳ）方法においてＱＴＬの存在について又はそれに対して選抜するための（分子）マーカーアッセイに使用され得る。「ＱＴＬと連鎖している（分子）マーカー」又は「ＱＴＬを同定するための（分子）マーカー」とは、したがって、例えば、圃場において使用されるＱＴＬに連鎖しているＳＮＰ又は他の任意の型のマーカーを指し得る。換言すれば、「ウドンコ病に対する抵抗性をもたらすＱＴＬを同定するためのマーカー」とは、ウドンコ病抵抗性に関連するＱＴＬを正に同定するために使用され得るマーカーのことを指す。
【００２６】
本明細書では、用語「メロン」は、キューカミスメロ種Ｌ．のことを指す。メロン又は「マスクメロン」、キューカミスメロは、Ｃ．メロカンタロペンシス（Ｃ．ｍｅｌｏ  ｃａｎｔａｌｕｐｅｎｓｉｓ）、Ｃ．メロインオドラス（Ｃ．ｍｅｌｏ  ｉｎｏｄｏｒｕｓ）及びＣ．メロレティキュラタス（Ｃ．ｍｅｌｏ  ｒｅｔｉｃｕｌａｔｕｓ）に分類され得る。用語は、野生系統及び栽培品種を含む。キューカミスメロは、亜種キューカミスメロ亜種アグレスティス及びキューカミスメロ亜種メロからなると一部考えられている。メロン及びメロンの野生近縁種は２倍体であり、第１〜第１２と付番された１２対の相同染色体を有する。「メロン第６染色体」とは、Ｃ．メロ第６染色体のことを指す（Ａｒｇｙｉｓら、ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ［２０１５年］１６：４頁）。
【００２７】
参照ゲノムは、本明細書ではＤＨＬ９２メロン株の公開偽分子配列である（Ｊａｓｏｎ  Ｍ  Ａｒｇｙｒｉｓら  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＳＮＰ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｌｏｎ［Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ  Ｌ．］ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ．２０１５年１月２２日；１６：４頁；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｃｕｇｉ．ｏｒｇ／ｏｒｇａｎｉｓｍ／３に記載のＷＧＳ  ｖ３．５．１）。
【００２８】
本明細書において、メロン第６染色体は、ＬＧ  ＶＩ又は連鎖群ＶＩ及び偽分子６と同等である。本明細書において、メロン第１２染色体は、ＬＧ  ＸＩＩ又は連鎖群ＸＩＩ及び偽分子１２と同等である。
【００２９】
本明細書では「栽培品種」とは、「野生」状態ではない生物学的状態を有する植物を意味する。「野生」状態とは、植物又は系統の元の若しくは天然の状態を示す。栽培品種の例には、いくつかの植物学的変種、例えば、ベドランタイス（Ｖｅｄｒａｎｔａｉｓ）（変種、カンタロペンシス）、ピエルデサポ（Ｐｉｅｌ  ｄｅ  Ｓａｐｏ）（変種、インオドラス）及びダルシー（Ｄｕｌｃｅ）（変種、レティキュラタス）由来のキューカミスメロ亜種メロ栽培品種がある。したがって、本発明の植物は、好ましくはメロン植物学的変種ベドランタイス（変種、カンタロペンシス）、ピエルデサポ（変種、インオドラス）及びダルシー（変種、レティキュラタス）の植物である。したがって「栽培品種」は、構造又は遺伝子の特徴によって同じ種内の他の栽培変種と区別され得る類似植物の群も示す。本発明の植物は、好ましくはキューカミスメロ変種アグレスティス植物ではなく、好ましくはメロン系統ＰＩ  ３１３９７０でもない。
【００３０】
用語「ウドンコ病」は、当業者に一般的な及び公知の意味で本明細書において使用される。ウドンコ病は、周知のウドンコ病病因菌、例えばポドスファエラキサンチイ及び／又はゴロビノミセスシュラセアラムによって引き起こされる。本明細書では、文脈において用語「抵抗性の」及び「抵抗性」は、感染に対する、特にウドンコ病病因菌による感染に対する部分的及び完全な両方の抵抗性を本明細書では包含する。特に、「抵抗性」とは、類似の環境条件及び害虫若しくは病原体圧下で罹病性植物と比較した場合に、指定された害虫若しくは病原体の成長及び発達並びに／又は指定された害虫若しくは病原体が引き起こす損傷を制限する植物の能力のことを指す。抵抗性変種は、大量の害虫又は病原体圧下で若干の病徴を呈し得る。罹病性とは、植物が、特定の害虫又は病原体の成長及び発達を制限できないことを指す。したがって、用語「ウドンコ病抵抗性の」又は「ウドンコ病抵抗性」とは、ウドンコ病病因菌、例えばポドスファエラキサンチイ及び／又はゴロビノミセスシュラセアラムによる感染に対する部分的又は完全な抵抗性のことを指す。ウドンコ病に抵抗性の表現型の存在は、本明細書の実施例の節において詳細に記載されるなどのバイオアッセイを使用して試験することができる。ウドンコ病罹病性のメロン植物は、前記ウドンコ病病因菌による感染に対して抵抗性がない、又は低レベルの抵抗性しか有し得ない。抵抗性をもたらす又は抵抗性の増大をもたらすＱＴＬ若しくはＱＴＬの組み合わせは、対照植物と比較して試験植物にＰＭ抵抗性を付与するＱＴＬ若しくはＱＴＬの組み合わせとして本明細書において理解され、対照植物は、好ましくは本明細書の実施例の節において詳述されるバイオアッセイを使用して定量化される前記ＱＴＬ又はＱＴＬの前記組み合わせを保有しないという点だけで試験植物と好ましくは異なり、好ましくは、前記試験植物は、対照植物と比較して抵抗性スコアが少なくとも１、１．５、２、２．５、３、３．５又は少なくとも４ポイント低く得点する。
【００３１】
本明細書では、用語「ヘテロ接合性」とは、遺伝的状況を意味し、異なる対立遺伝子が相同染色体上の対応する座に存在する。本明細書では、用語「ホモ接合性」とは、遺伝的状況を意味し、同一の対立遺伝子が相同染色体上の対応する座に存在する。
【００３２】
本明細書では、用語「遺伝子移入」、「遺伝子移入した」及び「遺伝子移入する」は、１つの種、変種又は栽培品種の遺伝子が、それらの種を交雑することによって、別の種、変種又は栽培品種のゲノムに持ち込まれる過程に関する。過程は、反復親へ戻し交配することを任意選択で含んでもよい。
【００３３】
本明細書では、用語「マーカー利用選抜（ＭＡＳ）」とは、（精鋭）育種株へのマーカーを含むＤＮＡ領域（隣接領域を任意選択で欠く）の移入を迅速化するために、植物が１つ若しくは複数の遺伝子及び／若しくは表現型マーカーの存在並びに／又は不在についてスクリーニングされる過程のことを指す。換言すれば、「ＭＡＳ」は、特定の座又は特定の染色体領域（例えば遺伝子移入断片）に遺伝的に連鎖している分子マーカーの存在を使用して、特定の座又は領域（遺伝子移入断片）の存在について植物を選抜する過程である。例えば、ウドンコ病抵抗性ＱＴＬと遺伝的に連鎖している分子マーカーを使用して、ウドンコ病抵抗性ＱＴＬを含むメロン植物を検出及び／又は選抜することができる。
【００３４】
本明細書では、用語「分子マーカーアッセイ」（又は試験）とは、植物又は植物部分において対象、例えばＱＴＬの対立遺伝子の有無を（直接又は間接的に）示す任意の（ＤＮＡに基づく）アッセイのことを指す。そのような試験は、当業者に公知である。
【００３５】
本明細書では、用語「核酸」とは、それぞれピリミジン及びプリン塩基、好ましくはシトシン、チミン及びウラシル、並びにアデニン及びグアニンの任意のポリマー又はオリゴマーのことを指す（Ａｌｂｅｒｔ  Ｌ．Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ  ｏｆ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ７９３〜８００頁［Ｗｏｒｔｈ出版１９８２年］を参照のこと、全ての目的のためにその全体を参照により本明細書に組み込む）。ポリマー又はオリゴマー（ポリヌクレオチド又はオリゴヌクレオチド）は、組成物中で不均一でも均質でもよく、天然に存在する供給源から単離されてもよく、又は人工的若しくは合成によって作製されてもよい。核酸は、ＤＮＡ若しくはＲＮＡ又はその混合物でもよく、ホモ二本鎖、ヘテロ二本鎖及びハイブリッド状態を含めた一本鎖若しくは二本鎖形態で永久に又は過渡的に存在してもよい。本明細書では、用語「単離された核酸」とは、核酸分子に天然に付随する他の細胞成分から実質的に分離された核酸のことを指す。その用語は、天然に存在する環境から取り出された核酸（配列）を包含し、組換え若しくはクローニングされた核酸単離物及び化学的に合成された類似体又は異種系によって生物学的に合成された類似体を含む。
【００３６】
本明細書では、用語「表現型」とは、形態、発達、生化学若しくは生理的特性、生物季節学、挙動及び挙動の産物など、生物の観察可能な特徴又は形質のことを指す。表現型は、遺伝子の発現、又はその欠如並びに環境因子の影響及びその２つの間の相互作用の結果生じる。表現型は、生物によって示される観察可能な特徴の集合であるが、フェノームという単語は、形質の集合体のことを指すために時折使用され、それらの同時研究は、フェノミクスと称される。例えば、１つの表現型はウドンコ病抵抗性であるが、別の表現型はウドンコ病罹病性である。
【００３７】
「プロモーター」とは、１つ又は複数の核酸の転写を制御するために機能する核酸断片のことを指す。プロモーター断片は、遺伝子の転写開始部位の転写の方向に対して上流（５’）に位置し、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼの結合部位、（１つ又は複数の）転写開始部位の存在によって構造的に同定され、転写因子結合部位、リプレッサー及び活性化タンパク質結合部位並びにプロモーターからの転写の量を調節するために直接又は間接的に作用する当業者に公知の他の任意のヌクレオチド配列を含むがこれに限らない他の任意のＤＮＡ配列を更に含み得る。任意選択で、用語「プロモーター」は、５’ＵＴＲ領域（５’非翻訳領域）を含んでもよい（例えば、ＵＴＲ領域は転写及び／又は翻訳を調節する役割を有し得るので、本明細書においてプロモーターは、転写された領域の翻訳開始コドンの上流に１つ又は複数の部分を含んでもよい）。「構成的」プロモーターは、大部分の生理的及び発達条件下で大部分の組織において活性を示すプロモーターである。「誘導可能な」プロモーターは、生理的に（例えば特定の化合物の外的適用による）又は発達上調節されるプロモーターである。「組織特異的」プロモーターは、特定の型の組織又は細胞においてのみ活性を示す。
【００３８】
本明細書では、用語「量的形質遺伝子座」又は「ＱＴＬ」は、当業者によって認識される意味で使用される。用語「ウドンコ病抵抗性に関連するＱＴＬ（キューカミスメロにおける）」又は「植物キューカミスメロ種の植物のゲノム中に存在する場合に、ウドンコ病に対する抵抗性をもたらすＱＴＬ」とは、ウドンコ病抵抗性を付与する少なくとも１つの遺伝子、又はウドンコ病抵抗性に関係する１つ若しくは複数の遺伝子の発現を制御する染色体の少なくとも１つの調節領域に関連するキューカミスメロ種の植物の特定の染色体上に位置する領域のことを指す。ＱＴＬは、産物が抵抗性を付与する１つ又は複数の遺伝子を例えば含んでもよい。ＱＴＬは、１つ又は複数の機能障害のある遺伝子、即ち変異遺伝子を例えば含んでもよく、前記遺伝子の機能障害が、ウドンコ病に対する抵抗性を引き起こす（即ち、例えば野生型と比較して、ウドンコ病罹病性付与遺伝子）。そのような突然変異は、異なる機序によって機能障害をもたらし得る。例えば、タンパク質をコードしているＤＮＡ配列における突然変異は、突然変異し、短縮され又は機能を持たないタンパク質をもたらし得る。非コードＤＮＡ配列における突然変異は、選択的なスプライシング、翻訳又はタンパク質輸送を引き起こし得る。別の場合には、遺伝子の転写活性の改変をもたらす突然変異は、タンパク質の低いレベル又は不在をもたらす場合がある。別の場合には、ＱＴＬは、産物がゲノム内の他の座にある遺伝子の発現に影響を及ぼし、それによりウドンコ病抵抗性を付与する調節遺伝子又は配列を含んでもよい。
【００３９】
本明細書では「核酸の移入」は、単離された核酸、例えば核酸構築物若しくはベクターに含まれる核酸を、生物、通常は前記生物のＤＮＡ、通常染色体ＤＮＡ又はゲノムへ移入することに関する。
【００４０】
詳細な説明
本明細書に記載される任意の方法、使用又は組成物は、本明細書に記載される他の任意の方法、使用又は組成物に対して実現され得ると考えられる。本発明の方法、使用及び／又は組成物の文脈において議論される実施形態は、本明細書に記載される他の任意の方法、使用又は組成物に対して利用され得る。したがって、１つの方法、使用又は組成物に関連する実施形態は、本発明の他の方法、使用及び組成物にも同様に適用され得る。
【００４１】
本明細書において体現され、広く記載されているように、本発明は、キューカミスメロにおけるウドンコ病抵抗性と連鎖するこれまで未知の遺伝子領域の驚くべき同定を対象とする。本発明者らによって同定され、ウドンコ病抵抗性と連鎖している量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）、換言すれば、ウドンコ病付与量的形質遺伝子座は、本明細書において「ＱＴＬ−ＶＩ」と命名される。ＱＴＬ−ＶＩは、寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４２９９１でＮＣＩＭＢに寄託されているメロン植物の代表的な種子（寄託日：２０１８年３月２８日、寄託者：Ｖｉｌｍｏｒｉｎ及びＣｉｅ、４  ｑｕａｉ  ｄｅ  ｌａ  Ｍｅｇｉｓｓｅｒｉｅ、７５００１、パリ、フランス）の第６染色体上で、本明細書で以下に記載される対応するマーカーを使用して同定され得る位置の間（即ち配列番号１及び配列番号２によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる染色体領域内）に同定された（ＡｒｇｙｒｉｓらＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ［２０１５年］１６：４頁）。本発明者らは、ＱＴＬ−ＶＩの同定に使用され得る、即ち、ウドンコ病抵抗性ＱＴＬ  ＱＴＬ−ＶＩの同定に使用され得るこれまで未知の分子マーカー、例えばＳＮＰマーカーを同定した。
【００４２】
したがって、本発明の態様は、ウドンコ病抵抗性に関係する、即ちキューカミスメロ種の植物ゲノム中に好ましくはホモ接合性形態で存在する場合にウドンコ病抵抗性の増大をもたらすＱＴＬとしてＱＴＬ−ＶＩを同定することである。更なる態様は、ＱＴＬ−ＶＩを同定するために単独で又は組み合わせて使用できる（１つ又は複数の）マーカーを見いだすことである。
【００４３】
それに加えて、本発明者らは、キューカミスメロにおけるウドンコ病抵抗性と連鎖する第２の遺伝子領域を同定した。同定され、ウドンコ病抵抗性と連鎖している第２の量的形質遺伝子座（ＱＴＬ）は、本明細書において「ＱＴＬ−ＸＩＩ」と命名される。ＱＴＬ−ＸＩＩは、寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４２９９１でＮＣＩＭＢに寄託されているメロン植物の代表的な種子の第１２染色体上で、本明細書で以下に記載される対応するマーカーを使用して同定され得る位置の間（即ち配列番号５及び配列番号６によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる染色体領域内）に同定された（ＡｒｇｙｒｉｓらＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ［２０１５年］１６：４頁）。本発明者らは、ＱＴＬ−ＸＩＩの同定に使用され得る、即ち、第２のウドンコ病抵抗性ＱＴＬ  ＱＴＬ−ＸＩＩの同定に使用され得るこれまで未知の分子マーカー、例えばＳＮＰマーカーを同定した。
【００４４】
したがって、本発明の態様は、ウドンコ病抵抗性に関係する、即ちキューカミスメロ種の植物ゲノム中に好ましくはホモ接合性形態で存在する場合にウドンコ病抵抗性をもたらすＱＴＬとしてＱＴＬ−ＸＩＩを同定することである。更なる態様は、ＱＴＬ−ＸＩＩを同定するために単独で又は組み合わせて使用できる（１つ又は複数の）マーカーを見いだすことである。
【００４５】
本発明の更なる態様は、ウドンコ病抵抗性に一緒に関係する、即ちキューカミスメロ種の植物ゲノム中に好ましくはホモ接合性形態で存在する場合にウドンコ病抵抗性をもたらす、ＱＴＬとしてＱＴＬ−ＶＩ及びＱＴＬ−ＸＩＩの組み合わせを同定することである。更なる態様は、ＱＴＬ−ＶＩ及びＱＴＬ−ＸＩＩの両方を同定するために組み合せて使用できる（１つ又は複数の）マーカーを見いだすことである。
【００４６】
これ及び本発明の他の態様も、付随する（１つ又は複数の）実施例において例示される。
したがって、実施形態において、本発明はＱＴＬ−ＶＩを同定するためのマーカーに関し、前記ＱＴＬ−ＶＩは、キューカミスメロ種の植物ゲノム中に存在する場合に、ウドンコ病に対する抵抗性の増大をもたらし、マーカーは、分子マーカーアッセイによって検出可能であり、
公開メロンゲノムの物理的位置５，３３０，６４５ｂｐに対応する配列番号１の２３位の「Ｇ」；
公開メロンゲノムの物理的位置６，００６，４５６ｂｐに対応する配列番号２の２３位の「Ａ」；
公開メロンゲノムの物理的位置５，４１４，５０６ｂｐに対応する配列番号３の２３位の「Ｔ」；及び
公開メロンゲノムの物理的位置５，７３８，９２０ｂｐに対応する配列番号４の２３位の「Ｃ」；
からなる群から選択される。
【００４７】
本発明者らによって実行される実験の経過において、及び特にキューカミスメロ種の植物においてウドンコ病抵抗性に関係するＱＴＬとして第６染色体上にＱＴＬ−ＶＩを同定する間に、遺伝子型判定により、ＱＴＬ−ＶＩの同定に使用され得る様々なＳＮＰマーカーのマッピングを得られた。
【００４８】
これらのマーカーが、ＤＨＬ９２メロン株（参照ゲノムは、ＤＨＬ９２メロン株の公開偽分子配列である［Ｊａｓｏｎ  Ｍ  Ａｒｇｙｒｉｓら  Ｕｓｅ  ｏｆ  ｔａｒｇｅｔｅｄ  ＳＮＰ  ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ  ｆｏｒ  ａｎ  ｉｍｐｒｏｖｅｄ  ａｎｃｈｏｒｉｎｇ  ｏｆ  ｔｈｅ  ｍｅｌｏｎ｛Ｃｕｃｕｍｉｓ  ｍｅｌｏ  Ｌ．、参照により本明細書に組み込む｝ｓｃａｆｆｏｌｄ  ｇｅｎｏｍｅ  ａｓｓｅｍｂｌｙ．  ＢＭＣ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２０１５年  １６：４頁．ＤＯＩ：１０．１１８６／ｓ１２８６４−０１４−１１９６−３］）に基づいて、キューカミスメロの公開メロンゲノム上に位置付けられる場合、配列番号１の２３位における指示マーカー「Ｇ」は、物理的位置５，３３０，６４５ｂｐに対応し；配列番号２の２３位における指示マーカー「Ａ」は、公開メロンゲノムの物理的位置６，００６，４５６ｂｐに対応し；配列番号３の２３位における指示マーカー「Ｔ」は、公開メロンゲノムの物理的位置５，４１４，５０６ｂｐに対応し；及び配列番号４の２３位における指示マーカー「Ｃ」は、公開メロンゲノムの物理的位置５，７３８，９２０ｂｐに対応する。ＱＴＬ−ＶＩの位置も公開ゲノム配列から導き出すことができ、前記物理的位置と関連することは、当業者により理解されよう。
【００４９】
ＳＮＰマーカーは配列番号１〜４で表され、表１に示される。表１は、ＱＴＬ−ＶＩ（抵抗性）の様々なマーカーを示す。
【００５０】
【表１】
2021516955.tif 000002
ＱＴＬ−ＶＩを含まず、付随する実施例に使用されるキューカミスメロ種の植物において同じ位置に存在するヌクレオチドも表１に示される。当業者には当然のことながら、これらのマーカー（感受性）を使用して、ＱＴＬ−ＶＩを含まないキューカミスメロ種の植物を同定することができる。ＳＮＰマーカーは配列番号９〜１２で表される。
ＱＴＬ−ＶＩの同定に使用できるマーカーに関して、前記ＱＴＬ−ＶＩは、キューカミスメロ種の植物ゲノム中に存在する場合、ウドンコ病に対する抵抗性をもたらし、配列番号１〜４で表される：
公開メロンゲノムの物理的位置５，３３０，６４５ｂｐに対応する配列番号１の２３位に、Ｇが存在し、即ちＧはＱＴＬ−ＶＩの存在の指標となる。
【００５１】
公開メロンゲノムの物理的位置６，００６，４５６ｂｐに対応する配列番号２の２３位に、Ａが存在し、即ちＡはＱＴＬ−ＶＩの存在の指標となる。
【００５２】
公開メロンゲノムの物理的位置５，４１４，５０６ｂｐに対応する配列番号３の２３位に、Ｔが存在し、即ちＴはＱＴＬ−ＶＩの存在の指標となる。
【００５３】
公開メロンゲノムの物理的位置５，７３８，９２０ｂｐに対応する配列番号４の２３位に、Ｃが存在し、即ちＣはＱＴＬ−ＶＩの存在の指標となる。
【００５４】
当業者には当然のことながら、上で同定されたマーカーのうちの１つ又は複数を使用して、例えば本明細書に記載のＱＴＬ−ＶＩを同定してもよい。したがって、一実施形態において、ＱＴＬ−ＶＩを同定するための（１つ又は複数の）マーカーは、配列番号１の２３位の「Ｇ」；配列番号２の２３位の「Ａ」；配列番号３の２３位の「Ｔ」及び配列番号４の２３位の「Ｃ」（によって表されるマーカー）のうちの１つ又は複数である。同様に、ＱＴＬ−ＶＩの不在を同定するためのマーカーも本発明により考察され、そのマーカーは、配列番号１の２３位上の「Ｃ」、「Ｔ」又は「Ａ」、好ましくは「Ａ」；配列番号２の２３位上の「Ｃ」、「Ｔ」又は「Ｇ」、好ましくは「Ｇ」；配列番号３の２３位上の「Ｃ」、「Ａ」又は「Ｇ」、好ましくは「Ｃ」；配列番号４の２３位上の「Ｔ」、「Ａ」又は「Ｇ」、好ましくは「Ｔ」（によって表されるマーカー）のうちの１つ又は複数である。
【００５５】
本明細書に記載の通り、示されるマーカーは、植物中の特定の表現型形質の存在に相関するだけでなく、ＱＴＬ−ＶＩの場所も示す。一般に、ＱＴＬの場所は、表現型形質と統計的相関を呈するマーカーの連続する列によって示され得る。マーカーがその列の外側に一旦見いだされたら、ＱＴＬの境界が設定される。したがって、指定された領域内に位置する他のマーカーによってＱＴＬの場所を示すことも可能である。換言すれば、ＱＴＬ−ＶＩの場所は、配列番号１及び配列番号２によって区切られ、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる染色体領域に対応する。表１において、前記配列番号によって区切られる長さ（ｂｐ）も示される。
【００５６】
本発明によるマーカーは、好ましくは分子マーカーアッセイによって検出可能なマーカーである。分子マーカーアッセイは当業者に公知であり、例えば、ＲＦＬＰ、ＳＳＲ、ＳＮＰ及びＡＦＬＰに基づくアッセイがある。
【００５７】
当業者にとって当然のことながら、マーカーは、本明細書に開示されるマーカーを同定し、それに加えてＱＴＬ−ＶＩを同定するために最適に使用される分子マーカーアッセイによって許容可能である任意の長さのものでもよい。本発明の実施形態において、ＱＴＬ−ＶＩを同定するためのマーカーは、配列番号１、配列番号２、配列番号３及び配列番号４の群から選択される配列を含む。
【００５８】
本発明者らによって実行された実験の過程において、第２のＱＴＬが同定され、ＱＴＬ−ＸＩＩと指定された。第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる染色体領域内に位置付けられた前記ＱＴＬ−ＸＩＩは、ＱＴＬ−ＶＩと一緒にキューカミスメロ種の植物のゲノム中に存在する場合にウドンコ病に対する抵抗性をもたらす。更に、ＱＴＬ−ＶＩを含む植物におけるＱＴＬ−ＸＩＩの存在は、ＱＴＬ−ＶＩを含むがＱＴＬ−ＸＩＩを欠いている対照植物と比較してウドンコ病に対する抵抗性の増大をもたらす。
【００５９】
またここで、更なる遺伝子型判定により、ＱＴＬ−ＸＩＩの同定に使用され得る様々なＳＮＰマーカーのマッピングを得られた。したがって、実施形態において、本発明はＱＴＬ−ＸＩＩを同定するためのマーカーに関し、前記ＱＴＬ−ＸＩＩは、ＱＴＬ−ＶＩと一緒にキューカミスメロ種の植物ゲノム中に存在する場合にウドンコ病に対する抵抗性をもたらし、マーカーは分子マーカーアッセイにより検出可能であり、
公開メロンゲノムの物理的位置２２，６７５，８７７ｂｐに対応する配列番号５の２３位の「Ｔ」；
公開メロンゲノムの物理的位置２２，９２３，８４２ｂｐに対応する配列番号６の２３位の「Ｔ」；
公開メロンゲノムの物理的位置２２，７８１，８８９ｂｐに対応する配列番号７の２３位の「Ｃ」；及び
公開メロンゲノムの物理的位置２２，７８８，５８８ｂｐに対応する配列番号８の２３位の「Ｇ」；
からなる群から選択される。
【００６０】
上述の通り、これらのマーカーが、キューカミスメロの公開メロンゲノム上に位置付けられる場合、配列番号５の２３位における指示マーカー「Ｔ」は、物理的位置２２，６７５，８７７ｂｐに対応し；配列番号６の２３位における指示マーカー「Ｔ」は、公開メロンゲノムの物理的位置２２，９２３，８４２ｂｐに対応し；配列番号７の２３位における指示マーカー「Ｃ」は、公開メロンゲノムの物理的位置２２，７８１，８８９ｂｐに対応し；及び配列番号８の２３位における指示マーカー「Ｇ」は、公開メロンゲノムの物理的位置２２，７８８，５８８ｂｐに対応する。ＱＴＬ−ＸＩＩの位置も公開ゲノム配列から導き出すことができ、前記物理的位置と関連することは、当業者により理解されよう。
【００６１】
ＳＮＰマーカーは配列番号５〜８で表され、表２に示される。表２は、ＱＴＬ−ＸＩＩ（抵抗性）の様々なマーカーを示す。
【００６２】
【表２】
2021516955.tif 000003
ＱＴＬ−ＸＩＩを含まず、付随する実施例に使用されるキューカミスメロ種の植物において同じ位置に存在するヌクレオチドも表２に示される。当業者にとって当然のことながら、これらのマーカー（感受性）を使用して、ＱＴＬ−ＸＩＩを含まないキューカミスメロ種の植物を同定することができる。ＳＮＰマーカーは配列番号１３〜１６で表される。
【００６３】
ＱＴＬ−ＸＩＩの同定に使用できるマーカーに関して、前記ＱＴＬ−ＸＩＩは、ＱＴＬ−ＶＩと一緒にキューカミスメロ種の植物ゲノム中に存在する場合にウドンコ病に対する抵抗性をもたらし、配列番号５〜８で表される：
公開メロンゲノムの物理的位置２２，６７５，８７７ｂｐに対応する配列番号５の２３位に、Ｔが存在し、即ちＴはＱＴＬ−ＸＩＩの存在の指標となる。
【００６４】
公開メロンゲノムの物理的位置２２，９２３，８４２ｂｐに対応する配列番号６の２３位に、Ｔが存在し、即ちＴはＱＴＬ−ＸＩＩの存在の指標となる。
【００６５】
公開メロンゲノムの物理的位置２２，７８１，８８９ｂｐに対応する配列番号７の２３位に、Ｃが存在し、即ちＣはＱＴＬ−ＸＩＩの存在の指標となる。
【００６６】
公開メロンゲノムの物理的位置２２，７８８，５８８ｂｐに対応する配列番号８の２３位に、Ｇが存在し、即ちＧはＱＴＬ−ＸＩＩの存在の指標となる。
【００６７】
当業者には当然のことながら、上で同定されたマーカーのうちの１つ又は複数を使用して、例えば本明細書に記載のＱＴＬ−ＸＩＩを同定してもよい。したがって、一実施形態において、ＱＴＬ−ＸＩＩを同定するための（１つ又は複数の）マーカーは、配列番号５の２３位の「Ｔ」；配列番号６の２３位の「Ｔ」；配列番号７の２３位の「Ｃ」及び配列番号８の２３位の「Ｇ」（によって表されるマーカー）のうちの１つ又は複数である。同様に、ＱＴＬ−ＸＩＩの不在を同定するためのマーカーも本発明により考察され、そのマーカーは、配列番号５の２３位上の「Ｃ」、「Ｇ」又は「Ａ」、好ましくは「Ｇ」；配列番号６の２３位上の「Ｃ」、「Ａ」又は「Ｇ」、好ましくは「Ｃ」；配列番号７の２３位上の「Ｇ」、「Ａ」又は「Ｔ」、好ましくは「Ａ」；配列番号８の２３位上の「Ｔ」、「Ａ」又は「Ｃ」、好ましくは「Ａ」（によって表されるマーカー）のうちの１つ又は複数である。
【００６８】
本明細書に記載の通り、示されるＱＴＬ−ＸＩＩのマーカーは、特にＱＴＬ−ＶＩが同じキューカミスメロ種の植物ゲノム中に含まれ、好ましくはホモ接合性形態である場合、植物中の特定の表現型形質の存在に相関するだけでなく、ＱＴＬ−ＸＩＩの場所も示す。当業者には当然のことながら、指定された領域内に位置する他のマーカーによってＱＴＬの場所を示すことも可能である。換言すれば、ＱＴＬ−ＸＩＩの場所は、配列番号５及び配列番号６によって区切られ、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる染色体領域に対応する。表２において、前記配列番号によって区切られる長さ（ｂｐ）も、示される。
【００６９】
当業者には当然のことながら、ＱＴＬ−ＸＩＩのマーカーは、本明細書に開示されるマーカーを同定し、それに加えてＱＴＬ−ＸＩＩを同定するために最適に使用される分子マーカーアッセイによって許容可能である任意の長さのものでもよい。本発明の実施形態において、ＱＴＬ−ＶＩを同定するためのマーカーは、配列番号５、配列番号６、配列番号７及び配列番号８の群から選択される配列を含む。
【００７０】
好ましい実施形態において、本発明は、ＱＴＬ−ＶＩを同定するための本明細書に記載の１つ又は複数のマーカー及びＱＴＬ−ＸＩＩを同定するための本明細書に記載の１つ又は複数のマーカーに関する。本発明は、ＱＴＬ−ＸＩＩを同定するための本明細書に記載の１つ又は複数のマーカーと組み合わせるＱＴＬ−ＶＩを同定するための本明細書に記載の１つ又は複数のマーカーにも関する。
【００７１】
上で指示した通り、第６染色体上のＱＴＬ−ＶＩの場所は、配列番号１及び配列番号２によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる染色体領域内であり、寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４２９９１でＮＣＩＭＢに寄託されているメロン植物の代表的な種子に含まれる。したがって、メロン系統ＮＣＩＭＢ  ４２９９１は、本発明のＱＴＬの天然の遺伝的背景を表す。
【００７２】
本発明のＱＴＬ−ＶＩの核酸配列は、当業者に公知の方法により決定されてもよい。例えば、ＱＴＬ−ＶＩ又はその抵抗性付与部分若しくはバリアントを含む核酸配列は、ドナー植物から単離されてもよい。これは、例えば前記植物のゲノムを断片化し、ＱＴＬ−ＶＩの指標となる１つ又は複数のマーカーを含む、例えば配列番号１〜４のいずれかで表されるマーカー、又はその少なくとも２つの組み合わせを含む断片を選択することによって行われてもよい。例えばマーカーは、配列番号１及び配列番号２、又は配列番号３及び４によって表される。またマーカー配列を増幅プライマーとして使用して、ＱＴＬ−ＶＩを含む核酸配列を増幅してもよい。増幅した配列を次いで精製して、単離されたＱＴＬ−ＶＩ又はその部分若しくはバリアントを得てもよい。ＱＴＬ−ＶＩのヌクレオチド配列は、当業者に公知の標準的な配列決定方法によって次いで得られてもよい。
【００７３】
したがって、本発明の実施形態において、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第６染色体上で配列番号１及び配列番号２によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる領域内に位置するＱＴＬ−ＶＩ、又はウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントを含む（単離した）核酸（又は構築物）が提供される。
【００７４】
換言すれば、本発明のＱＴＬ−ＶＩ又はそのウドンコ病抵抗性付与部分若しくはバリアントを含むそのような核酸を含む単離した核酸、若しくはベクター若しくは構築物が提供される。したがって、本明細書に記載のＱＴＬ−ＶＩのマーカーを使用して、ＱＴＬ−ＶＩに含まれ、ウドンコ病抵抗性を付与する１つ若しくは複数の遺伝子を同定し、単離してもよい。
【００７５】
上で指示した通り、第１２染色体上のＱＴＬ−ＸＩＩの場所は、配列番号５及び配列番号６によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる染色体領域内であり、寄託番号ＮＣＩＭＢ  ４２９９１でＮＣＩＭＢに寄託されているメロン植物の代表的な種子に含まれる。したがって、メロン系統ＮＣＩＭＢ  ４２９９１は、ＱＴＬ−ＸＩＩを含めて、本発明のＱＴＬの天然の遺伝的背景を表す。
【００７６】
本発明のＱＴＬ−ＸＩＩの核酸配列は、ＱＴＬ−ＶＩについて上述した類似の様式で決定されてもよい。
【００７７】
したがって、本発明の実施形態において、好ましくはホモ接合性形態でＱＴＬ−ＶＩを更に含む植物中に存在する場合にＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる領域内に位置するＱＴＬ−ＸＩＩ、又はウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントを含む（単離した）核酸（又は構築物）が提供される。
【００７８】
換言すれば、本発明のＱＴＬ−ＸＩＩ又はそのウドンコ病抵抗性付与部分若しくはバリアントを含むそのような核酸を含む単離した核酸、若しくはベクター若しくは構築物が提供される。したがって、本明細書に記載のＱＴＬ−ＸＩＩのマーカーを使用して、特にＱＴＬ−ＶＩ又はＱＴＬ−ＶＩに含まれウドンコ病抵抗性を付与する１つ若しくは複数の遺伝子と組み合わせて、ＱＴＬ−ＸＩＩに含まれ、ウドンコ病抵抗性を付与する１つ若しくは複数の遺伝子を同定し、単離してもよい。
【００７９】
本明細書において理解されるべきＱＴＬ−ＶＩの部分又はバリアントは、ＱＴＬ−ＶＩと実質的に同程度にウドンコ病抵抗性を付与する能力がある部分又はバリアントであり、前記部分又はバリアントは、ＱＴＬ−ＶＩに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を好ましくは含む。同様に、本明細書において理解されるべきＱＴＬ−ＸＩＩの部分又はバリアントは、ＱＴＬ−ＶＩと実質的に同程度にウドンコ病抵抗性を付与する能力がある部分又はバリアントであり、前記部分又はバリアントは、ＱＴＬ−ＸＩＩに対して少なくとも６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％の配列同一性を有する配列を好ましくは含む。
【００８０】
任意選択で、本発明の核酸、ベクター又は構築物又は構築物は、天然に存在していない、例えば、天然において作動的に連結されていない配列を含んでもよい。例えば、そのような核酸、ベクター又は構築物は、本明細書において定義される少なくとも１つのマーカー及び天然に存在しないプライマー結合配列並びに／又は検出に役立つバーコード化若しくは索引付けのための配列を含む検出用のプローブでもよい。核酸、ベクター又は構築物はまた発現用であってもよく、ウドンコ病抵抗性を付与するための本明細書に定義されるＱＴＬ−ＶＩ、又はその部分若しくはバリアント、及び／又はウドンコ病抵抗性を付与するための本明細書に定義されるＱＴＬ−ＸＩＩ、又はその部分若しくはバリアントのうちの１つ若しくは複数含み、非天然のプロモーター、即ち前記ＱＴＬに通常は作動的に連結されていないプロモーター配列に作動的に連結されてもよい。任意選択で、前記構築物は、ウドンコ病抵抗性を付与する本明細書に定義されるＱＴＬ−ＶＩ又はその部分及びバリアントとウドンコ病抵抗性を付与する本明細書に定義されるＱＴＬ−ＸＩＩ又はその部分若しくはバリアントの両方を含む。
【００８１】
好ましくは、前記プロモーターは、植物細胞、好ましくはキューカミスメロ種の植物における発現に適したプロモーターである。植物細胞における発現のためのプロモーターは、構成的プロモーター、誘導可能なプロモーター又は組織特異的プロモーターであり得る。好ましくは、プロモーターは構成的プロモーターである。
【００８２】
上で説明した通り、ＱＴＬ−ＶＩを同定するための本明細書に記述されるマーカーは、キューカミスメロ種の植物のゲノム中のＱＴＬ−ＶＩの存在を同定するのに特に有用である。したがって、本発明の実施形態は、キューカミスメロ種の植物のゲノム中のＱＴＬ−ＶＩを同定するための本明細書に記載のＱＴＬ−ＶＩのマーカーの使用に関する。
【００８３】
上で説明した通り、ＱＴＬ−ＸＩＩを同定するための本明細書に記述されるマーカーは、キューカミスメロ種の植物のゲノム中のＱＴＬ−ＸＩＩの存在を同定するのに特に有用である。したがって、本発明の実施形態は、キューカミスメロ種の植物のゲノム中のＱＴＬ−ＸＩＩを同定するための本明細書に記載のＱＴＬ−ＸＩＩのマーカーの使用に関する。
【００８４】
当業者は理解するであろうように、ＱＴＬ−ＶＩ及び／又はＱＴＬ−ＸＩＩに対して本明細書において同定されたマーカーを使用して、ＱＴＬ−ＶＩ及び／又はＱＴＬ−ＸＩＩ（ひいては関連するウドンコ病抵抗性表現型）の存在を示すことができる。ＱＴＬ−ＶＩ及びＱＴＬ−ＸＩＩに対して本明細書において同定されたマーカーの組み合わせを使用して、ＱＴＬ−ＶＩ及びＱＴＬ−ＸＩＩの組み合わせの存在を示すことができる。これは個々の植物又は多くの植物において行うことができ、したがってそれらはマーカー利用選抜（ＭＡＳ）手順、例えば、ウドンコ病に対する抵抗性が改善されたキューカミスメロ種の植物を提供することを意図する育種プログラムにおいて使用され得る。
【００８５】
ＱＴＬと連鎖している任意のマーカー、例えば、ＱＴＬのそれぞれのマーカー間のゲノム領域の区切りに含まれるマーカーは、マーカー利用選抜に使用され得ると考えられる。ウドンコ病感染を確定するための信頼性が高く、再現性がある表現型アッセイは時間を要するので、本明細書において同定されるＱＴＬと連鎖しているマーカーの使用が、キューカミスメロ種の植物におけるウドンコ病抵抗性の育種において望ましい。当業者には当然のことながら、マーカー利用選抜は、本明細書に記載のマーカーを使用する方法を含めた公知の方法を使用して実行され得る。
【００８６】
したがって、本発明の実施形態は、ウドンコ病抵抗性植物、好ましくはキューカミスメロ種を選抜する方法に関し、本方法は、ＱＴＬ−ＶＩに対する本明細書に記載の少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップを含み、任意選択で、ＱＴＬ−ＸＩＩに対する本明細書に記載の少なくとも１つマーカーの存在を検出するステップを更に含む。好ましくは、選抜した植物は、ホモ接合性形態のＱＴＬ−ＶＩを含み、任意選択でヘテロ接合性又はホモ接合性形態で存在するＱＴＬ−ＸＩＩと組み合わせて含む植物である。
【００８７】
更なる実施形態において、本発明は、ウドンコ病抵抗性を増大させた植物、好ましくはキューカミスメロ種の植物を選抜する方法に関し、その方法は、ＱＴＬ−ＸＩＩに対する本明細書に記載の少なくとも１つのマーカーの存在を検出するステップを含む。選抜は、ヘテロ接合性又はホモ接合性形態でＱＴＬ−ＸＩＩを含む植物に対するものであってもよい。ＱＴＬ−ＸＩＩを含む植物のウドンコ病抵抗性の増大は、ＱＴＬ−ＸＩＩを保有しない対照植物と比較してバイオアッセイにおいて少なくとも１、１．５、２、２．５又は３ポイント低いスコアを示すと本明細書において理解され、好ましくは前記植物及び対照植物の両方が、本明細書において定義されるＱＴＬ−ＶＩを含む。
【００８８】
本発明の別の実施形態は、キューカミスメロ種のウドンコ病抵抗性植物を作製する方法に関し、本方法は、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第６染色体上で配列番号１及び配列番号２によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる領域内に位置するＱＴＬ−ＶＩを植物に導入するステップを、任意選択で、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる領域内に位置するＱＴＬ−ＸＩＩを植物に導入するステップと組み合わせて含む。
【００８９】
本発明の別の実施形態は、ウドンコ病抵抗性を増大させた植物を作製する方法に関し、本方法は、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる染色体領域内に位置するＱＴＬ−ＸＩＩを植物に導入するステップを含む。
【００９０】
別の植物、好ましくはキューカミスメロ種の植物、更により好ましくはウドンコ病感染に対して感染性のキューカミスメロ種の植物へのＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ、又はＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩを含む単離した核酸、又はそのウドンコ病抵抗性付与部分若しくはバリアントの導入は、当業者に公知の任意の方法によって実行され得る。一実施形態において、ウドンコ病抵抗性植物、好ましくは、キューカミスメロ種は、遺伝子移入（交雑）によってＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ、又はそのウドンコ病抵抗性付与部分若しくはバリアントを導入することによって作製される。遺伝子移入は、メロン系統ＮＣＩＭＢ  ４２９９１の植物、又は本明細書において詳述されるＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ若しくはその部分若しくはバリアントを含む他の任意のキューカミスメロ種の植物、或はそのウドンコ病抵抗性付与部分若しくはバリアントをウドンコ病罹病性植物、好ましくはＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ又はそのウドンコ病抵抗性付与部分若しくはバリアントを含まないキューカミスメロ種の植物と交雑することによって実行されてもよい。当業者は、本明細書に記載される本発明による交雑／遺伝子移入の適切な方法についてよく承知している。一部の実施形態において、例えば、最初の交雑から得られた植物集団（Ｆ１集団を表す）は自家授粉されてもよく、種子を播いてもよい（Ｆ２種子）。Ｆ２種子から育てられたＦ２植物は、ウドンコ病に対する抵抗性について並びに／又はＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩの存在について若しくは本明細書に記載のＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩを同定するためのマーカーについて次いでスクリーニングされてもよい。したがって後代（例えばＦ１若しくはＦ２又はより後の世代）におけるＱＴＬ−ＶＩ及び／又はＱＴＬ−ＸＩＩの存在は、ゲノム中のＱＴＬ−ＶＩ及び／又はＱＴＬ−ＸＩＩに連鎖している前記後代マーカー、好ましくは本明細書に開示されるマーカーの存在を検出することによって確認され得る。
【００９１】
本発明の実施形態は、キューカミスメロ種のウドンコ病抵抗性植物を作製する方法に関し、その方法は、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第６染色体上で配列番号１及び配列番号２によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる領域内に位置するＱＴＬ−ＶＩ、又はウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントを含む（単離した）核酸（又は構築物）を植物、好ましくはウドンコ病感染に感染性であるキューカミスメロ種の植物へ移入するステップを含み、前記移入は、任意選択で、トランスフォーメーション、プロトプラスト融合、倍加半数体技術又は胚救出によって実行される。好ましくは、本方法によりホモ接合性形態のＱＴＬ−ＶＩの存在を得られる。
【００９２】
本方法は、単独で又は前に述べた実施形態と組み合わせて、キューカミスメロ種のウドンコ病抵抗性植物を作製する方法も包含し、その方法は、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ、第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる領域内に位置するＱＴＬ−ＸＩＩ、又はウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントを含む（単離した）核酸（又は構築物）を植物、好ましくはウドンコ病感染に感染性であるキューカミスメロ種の植物へ移入するステップを含み、前記移入は、任意選択で、トランスフォーメーション、プロトプラスト融合、倍加半数体技術又は胚救出によって実行される。好ましくは、本方法により、ヘテロ接合性又はホモ接合性形態のＱＴＬ−ＸＩＩの存在を得られる。本方法は、植物に本明細書に詳述されるＱＴＬ−ＶＩを好ましくはホモ接合性形態で移入するステップを更に含んでもよい。
【００９３】
本方法は、キューカミスメロ種のウドンコ病抵抗性植物を作製する方法も包含し、本方法は、植物、好ましくはウドンコ病感染に感染性であるキューカミスメロ種の植物に、ＱＴＬ−ＶＩ又はウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントとＱＴＬ−ＸＩＩ又はウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントの両方を含む（単離した）核酸（又は構築物）を移入するステップを含み、ＱＴＬ−ＶＩが、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ第６染色体上で配列番号１及び配列番号２によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる領域内に位置し、ＱＴＬ−ＸＩＩが、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムに含まれ第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる染色体領域内、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる領域内に位置し、前記移入は、任意選択で、トランスフォーメーション、プロトプラスト融合、倍加半数体技術又は胚救出によって実行される。好ましくは、本方法により、ホモ接合性形態のＱＴＬ−ＶＩの存在及びヘテロ接合性又はホモ接合性形態のＱＴＬ−ＸＩＩの存在を得られる。
【００９４】
本明細書に記載の通り、ＱＴＬ−ＶＩ及びＱＴＬ−ＸＩＩは、メロン系統ＮＣＩＭＢ  ４２９９１において最初に認識されたが、当業者であれば承知しているであろうように、ＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ又はそのウドンコ病抵抗性付与部分若しくはバリアントを含む他の任意のキューカミスメロ種の植物は、本明細書に記載のマーカーを使用して同定され得るので、ＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ、若しくはウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントを含む核酸の単離並びに／又は構築物の調製に使用され得る。一度単離されたら、ＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ、又はそのウドンコ病抵抗性付与部分若しくはバリアントは、当業者が利用可能な任意の方法によって適切な植物又は生物に移入されてもよい。好ましくは、前記植物は、ウドンコ病感染に感染性であり、好ましくはキューカミスメロ種の植物である。
【００９５】
しかしながら、一部の実施形態において、上述の遺伝子移入、並びに／又は遺伝学的手段（即ち、交雑を伴わない）を使用するＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ若しくはウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントを含む（単離した）核酸（又は構築物）の移入の両方に関連して、アクセプター植物はウドンコ病抵抗性に関連する他の遺伝子又はＱＴＬを既に含む植物であってもよいことに留意されたい。そのような実施形態において、ウドンコ病抵抗性と連鎖しているいくつかの独立した又は相互依存している遺伝子領域が１つの及び同じ植物において組み合わせられて、ウドンコ病感染に対する抵抗性を増大させる。
【００９６】
上述の通り、メロン植物へのＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ又はウドンコ病抵抗性をもたらすその部分若しくはバリアントを含む単離した核酸の移入は、当業者に公知の任意の方法によって実行されてもよい。そのような方法の非限定的な例には、トランスフォーメーション及びプロトプラスト融合がある。しかしながら、他の任意の適切な核酸移入系が、使用されてもよい。一部の実施形態において、移入した後、ＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ又はそのウドンコ病付与部分若しくはバリアントを含む子孫植物の選抜が続く。移入は、植物細胞を使用して実行されてもよい。一部の方法の場合、単離した核酸は、例えば生殖子又は他の任意の適切な移入エレメント中のベクターによってレシピエント植物へ移入されてもよい。植物へ発現ベクターを導入する１つの周知の方法は、アグロバクテリウムのトランスフォーメーション系に基づく（例えばＨｏｒｓｃｈら、１９８５年を参照のこと）。
【００９７】
ゲノムに遺伝子移入された、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムにおいて第６染色体上で配列番号１及び配列番号２によって区切られる、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる染色体領域内に含まれるＱＴＬ−ＶＩを含むウドンコ病抵抗性キューカミスメロ植物も提供される。好ましくは、前記植物は、栽培品種、より好ましくは、いくつかの植物学的変種、例えばベドランタイス（変種、カンタロペンシス）、ピエルデサポ（変種、インオドラス）及びダルシー（変種、レティキュラタス）由来のキューカミスメロ亜種メロ栽培品種である。
【００９８】
上述したウドンコ病抵抗性キューカミスメロ植物も提供され、植物は、ゲノムに遺伝子移入された、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムにおいて第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる染色体領域内に含まれるＱＴＬ−ＸＩＩを更に含む。したがって、本発明はウドンコ病抵抗性キューカミスメロ植物も提供し、植物は、ゲノムに遺伝子移入された、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムにおいて第６染色体上で配列番号１及び配列番号２によって区切られる、好ましくは配列番号３及び配列番号４によって区切られる染色体領域内に含まれるＱＴＬ−ＶＩとＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムにおいて第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる染色体領域内に含まれるＱＴＬ−ＸＩＩの両方を含む。好ましくは、前記植物は、栽培品種、より好ましくは、いくつかの植物学的変種、例えばベドランタイス（変種、カンタロペンシス）、ピエルデサポ（変種、インオドラス）及びダルシー（変種、レティキュラタス）由来のキューカミスメロ亜種メロ栽培品種である。
【００９９】
ゲノムに遺伝子移入された、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１のゲノムにおいて第１２染色体上で配列番号５及び配列番号６によって区切られる、好ましくは配列番号７及び配列番号８によって区切られる染色体領域内に含まれるＱＴＬ−ＸＩＩを含むウドンコ病抵抗性キューカミスメロ植物も提供される。好ましくは、前記植物は、栽培品種、より好ましくは、いくつかの植物学的変種、例えばベドランタイス（変種、カンタロペンシス）、ピエルデサポ（変種、インオドラス）及びダルシー（変種、レティキュラタス）由来のキューカミスメロ亜種メロ栽培品種である。
【０１００】
最後に、本明細書に記載のマーカー、本明細書に記載の（単離した）核酸、本明細書に記載の使用、又は本明細書に記載の方法若しくは植物が提供され、ウドンコ病病原体は、特に真菌ポドスファエラキサンチイであり、ウドンコ病病原体は、真菌ポドスファエラキサンチイレース３．５（Ｓｆ３．５）（Ｍ．Ｐｉｔｒａｔ及びＤ．Ｂｅｓｏｍｂｅｓ．Ｉｎｈｅｒｉｔａｎｃｅ  ｏｆ  Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ  ｘａｎｔｈｉｉ  ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ  ｉｎ  ｍｅｌｏｎ  ｌｉｎｅ「９０６２５」−Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ  ２００８年、Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ  ｏｆ  ｔｈｅ  ＩＸｔｈ  ＥＵＣＡＲＰＩＡ  ｍｅｅｔｉｎｇ  ｏｎ  ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  ｂｒｅｅｄｉｎｇ  ｏｆ  Ｃｕｃｕｒｂｉｔａｃｅａｅ［Ｐｉｔｒａｔ  Ｍ編］、ＩＮＲＡ、Ａｖｉｇｎｏｎ［フランス］、２００８年５月２１〜２４日、１３５〜１４２頁）、更に特に、Ｓｆ３．５Ａ又はＳｆ３．５Ｂである。
【０１０１】
本植物の利益、即ち、メロン植物にウドンコ病抵抗性を与えることを考慮すれば、本発明はウドンコ病抵抗性メロン植物を得ることができる種子、植物部分又は伝播材料にも関し、その種子、植物部分又は伝播材料は、本明細書に記載の本ウドンコ病抵抗性ＱＴＬ、又はその部分のうちの１つ若しくは複数を含む。本発明は、本発明のウドンコ病抵抗性メロン植物、種子又は植物部分、即ち飲料、果汁、タンパク質、糖などから得られる非伝播材料にも関する。好ましくは、前記伝播材料及び／又は非伝播材料は、本明細書に定義されるＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ又はウドンコ病抵抗性を付与するその部分若しくはバリアントを含むことを特徴とする。任意選択で、前記伝播材料及び／又は非伝播材料は、本明細書に定義されるＱＴＬ−ＶＩ及び／又はＱＴＬ−ＸＩＩを含む天然に存在しない配列を含むことを特徴とする。
【０１０２】
本発明は、伝播材料の供給源としてのＱＴＬ−ＶＩ、ＱＴＬ−ＸＩＩ又はＱＴＬ−ＶＩとＱＴＬ−ＸＩＩの組み合わせを含む本発明の植物の使用にも関する。本発明は、植物育種におけるＱＴＬ−ＶＩ、ＱＴＬ−ＸＩＩ又はＱＴＬ−ＶＩとＱＴＬ−ＸＩＩの組み合わせを含む本発明の植物の使用にも関する。
【０１０３】
請求の通り、本発明は植物の細胞にも関する。そのような細胞は、ウドンコ病に対する抵抗性をもたらす遺伝情報（ＱＴＬ−ＶＩ及び／若しくはＱＴＬ−ＸＩＩ又はウドンコ病を付与する［１つ又は複数の］その部分）を含む又はそれが備わっている。本発明は、本発明の植物、細胞、組織及び種子の後代にも関する。
【０１０４】
本発明の実施形態の一態様に関して議論された詳細、実施形態及び優先権の全ては、本発明の他の任意の態様又は実施形態に同様に適用でき、したがって、全ての態様についてそのような詳細、実施形態及び優先権の全てを別々詳述する必要性がないことは理解されよう。
【０１０５】
本発明について一般に記載してきたが、同じことが実例として提供され、本発明を限定することを意図しない以下の例への言及によってより容易に理解されよう。
【実施例】
【０１０６】
実施例
Ｓｆ３．５Ａ及びＳｆ３．５Ｂ増殖
８〜１０日齢メロンベドランタイスの分離した子葉を使用して、Ｓｆ３．５Ａ又はＳｆ３．５Ｂを増殖させた。１０日後、これらの植菌された子葉を植菌に使用した。
【０１０７】
ウドンコ病に対する抵抗性の表現型判定（Ｓｆ３．５Ａ及びＳｆ３．５Ｂ）
試験しようとする種子を、芝で満たしたプラスチックトレイに植え、３葉期まで温室内で育てた。その後、試験しようとする植物が入ったプラスチックトレイをクリーンルームの床に置き、メロンベドランタイスのＳｆ３．５Ａ又はＳｆ３．５Ｂで植菌した子葉の胞子を、空気圧縮機を用いて最上部で穏やかに吹きつけることによって、メロンベドランタイスの植菌した子葉を使用して植物に植菌した。胞子の濃度は、１００〜４００胞子／ｃｍ２であった。その後、植物が入ったプラスチックトレイを、２０℃で、１２時間照明で１０〜１２日間気候セル（ｃｌｉｍａｔｅ  ｃｅｌｌ）内に置いた。１０〜１２日間のインキュベーション期間後に、植物を抵抗性について表現型判定した。表現型判定の場合、植物当たり１枚の葉片を植物の最も若い葉からサンプル採取する。抵抗性を表３にしたがってスコアした。図１は葉片を例示し、その葉片を抵抗性スコア３、４、６及び８としてそれぞれ記録した。
【０１０８】
【表３】
2021516955.tif 000004
【０１０９】
ウドンコ病に対する抵抗性の遺伝子移入した表現型判定の抵抗性スコアリング（Ｓｆ３．５Ａ及びＳｆ３．５Ｂ）
選抜したＲＩＬ（組換え近交株、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１で寄託されている）から得られたＦ３植物をウドンコ病抵抗性について表現型判定した。ウドンコ病抵抗性を２つの系統Ｓｆ３．５（Ｓｆ３．５Ａ及びＳｆ３．５Ｂ）について２つの複製でスコアした。第１の複製において、２６４９個のＦ３植物をＳｆ３．５Ａ抵抗性について試験し、２６５４個のＦ３植物をＳｆ３．５Ｂ抵抗性について試験した。第２の複製において、１９５２個のＦ３植物をＳｆ３．５Ａ抵抗性について試験し、１９６１個のＦ３植物をＳｆ３．５Ｂ抵抗性について試験した。これら植物において、遺伝子型判定をＱＴＬ−ＶＩの場合配列番号３及び４並びにＱＴＬ−ＸＩＩの場合配列番号７及び８で表されるマーカーを使用して表現型判定の日に実行し、これらマーカーの存在は、ＮＣＩＭＢ  ４２９９１から得られるこれらＱＴＬの抵抗性対立遺伝子の存在を同定する。組み合わせたＱＴＬ遺伝子型クラス当たりの観察数を表４に与える。
【０１１０】
【表４】
2021516955.tif 000005
【０１１１】
９５％信頼域を、遺伝子型と表現型の間の相関について決定した（ＬＯＤ−ｄｒｏｐ  ２、ベイジアン信頼区間及びブートストラップ信頼区間）。スコアしたＳｆ３．５Ｂ抵抗性と相関する遺伝子型ＢＡ、ＡＢ、ＢＢ及びＢＨの結果（１文字目は表４によるＱＴＬ−ＶＩの遺伝子型に関し、２文字目は表４によるＱＴＬ−ＸＩＩの遺伝子型に関する）を図２に示す。遺伝子型ＨＢは、遺伝子型ＡＢと同程度の罹病性表現型を生じた（データ不掲載）。類似の結果が、Ｓｆ３．５Ａに対する抵抗性で得られた（データ不掲載）。
【０１１２】
今、本発明について完全に記載してきたが、同じことが、本発明の精神と範囲から逸脱することなく並びに必要以上の実験なしに広範な同等のパラメータ、濃度及び条件の中で実行され得ることは当業技術者によって認められよう。
【０１１３】
本発明についてその特定の実施形態に関連して記載してきたが、更なる修正が可能であることは理解されよう。本出願は、一般に、本発明の原理にしたがう本発明のあらゆる変形、使用又は適応を網羅することを意図し、本開示からのそのような逸脱は、本発明が属する技術範囲内の公知の又は慣習的な実践の範囲にあり、添付の特許請求の範囲において以下の通り先に説明した本質的な特徴に適用され得るものを含む。
【０１１４】
学術論文若しくは要約、発表されている若しくは対応する特許出願、特許又は他の任意の参照を含めた本明細書に引用されている全ての参照は、引用した参照に存在するデータ、表、図及び文字列の全てを含めて、参照により本明細書に全体的に組み込まれる。加えて、本明細書の引用文献内の引用文献の全体の内容は、参照により全対的に組み込まれ。公知の方法ステップ、従来方法ステップ、公知の方法又は従来方法に対する参照は、本発明の任意の態様、説明又は実施形態が、関連技術において開示、教示又は示唆されることを決して承認しない。
【０１１５】
特定の実施形態の前述の説明は、他者が当業者の技術範囲内にある知見（本明細書に引用される参照の内容を含む）を適用することによって、本発明の一般的な概念を逸脱することなく、必要以上の実験なしに、様々な適用をそのような特定の実施形態に対して容易に修正及び／又は適応させ得る本発明の一般的な性質をそうして完全に明らかにすることになる。したがって、そのような適応及び修正は、本明細書に提示される教示及びガイダンスに基づいて、開示される実施形態と同等の意味及び範囲内であることを意図する。本明細書における表現又は専門語は、本明細書の専門語又は表現が、本明細書に提示される教示及びガイダンスに照らして、当業者の知見と組み合わせて当業者によって解釈されるような説明を目的とするものであり、制限するものではないことを理解すべきである。
【図１】
2021516955.tif 000006
【図２】
2021516955.tif 000007
【配列表】
2021516955000001.app
【国際調査報告】
2021516955.tif 000008
2021516955.tif 000009
2021516955.tif 000010
2021516955.tif 000011