(57)【要約】  葉酸受容体アルファ（別名、葉酸受容体１またはＦＯＬＲ１）に特異的な抗体および治療的および診断目的でのそれらの使用。また、ＦＯＬＲ１に結合する細胞外抗原結合フラグメントを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびそれを発現する免疫細胞も本明細書に提供される。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＦＯＬＲ１に結合する単離された抗体であって、参照抗体と同じヒトＦＯＬＲ１のエピトープに結合し、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１、ＦＯＬＲ１−Ａｂ４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２０、およびＦＯＬＲ１−Ａｂ２３からなる群から選択される、前記抗体。
【請求項２】
以下：
（ａ）Ｘ１ＹＴＦＴＸ２ＹＸ３として示される重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、ここで、Ｘ１は、ＧまたはＩであり、Ｘ２は、ＤまたはＳであり、およびＸ３は、Ｗ、Ｎ、またはＳである；
（ｂ）ＩＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６として示される重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、ここで、Ｘ１は、ＰまたはＴであり、Ｘ２は、Ｎ、Ｙ、またはＥであり、Ｘ３は、Ｎ、Ｄ、またはＴであり、Ｘ４は、ＧまたはＳであり、Ｘ５は、ＧまたはＥであり、およびＸ６は、ＴまたはＰである；および
（ｃ）ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０として示される重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、ここで、Ｘ１は、Ｓ、ＫまたはＭであり、Ｘ２は、ＧまたはＰであり、Ｘ３は、ＧまたはＹであり、Ｘ４は、Ｇまたは不在であり、Ｘ５は、Ｐまたは不在であり、Ｘ６は、Ａ、Ｒ、またはＫであり、Ｘ７は、Ｗ、ＹまたはＩであり、Ｘ８は、ＦまたはＭであり、Ｘ９は、ＤまたはＡであり、およびＸ１０は、ＹまたはＶである、
の１以上を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含む、請求項１に記載の単離された抗体。
【請求項３】
ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３が、集合的に、参照抗体のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３と少なくとも８５％同一であるＶＨを含む、請求項１または２に記載の単離された抗体。
【請求項４】
ＶＨが、参照抗体と同じＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３を含む、請求項３に記載の単離された抗体。
【請求項５】
ＶＨが、参照抗体のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３に対して相対的な５、４、３、２、または１までの変異を集合的に含む、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３を含む、請求項３に記載の単離された抗体。
【請求項６】
以下：
（ａ）ＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦまたはＱＳＬＬＹＳＳＳＱＫＮＹとして示される軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）；
（ｂ）Ｘ１ＡＳとして示される軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、ここで、Ｘ１は、Ｖ、Ａ、またはＷである；および
（ｃ）ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＰＸ５Ｔとして示される軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ここで、Ｘ１は、ＹまたはＳであり、Ｘ２は、ＹまたはＫであり、Ｘ３は、ＥまたはＳであり、Ｘ４は、ＹまたはＶであり、およびＸ５は、Ｗ、Ｙ、または不在である、
の１以上を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項７】
ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３が、集合的に、参照抗体のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３と少なくとも８５％同一であるＶＬを含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の単離された抗体。
【請求項８】
ＶＬが、参照抗体と同じＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３を含む、請求項７に記載の単離された抗体。
【請求項９】
ＶＬが、参照抗体のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３に対して相対的な５、４、３、２、または１までの変異を集合的に含む、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３を含む、請求項７に記載の単離された抗体。
【請求項１０】
ヒトＦＯＬＲ１に特異的に結合する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１１】
ヒトＦＯＬＲ１および非ヒトＦＯＬＲ１と交差反応する、請求項１〜９のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１２】
非ヒトＦＯＬＲ１が、齧歯類の動物のＦＯＬＲ１または霊長目の動物のＦＯＬＲ１である、請求項１１に記載の抗体。
【請求項１３】
全長抗体またはその抗原結合フラグメント、または単鎖抗体である、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１４】
ＩｇＧ分子である、請求項１３に記載の抗体。
【請求項１５】
ヒト抗体、ヒト化抗体、またはキメラ抗体である、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の抗体。
【請求項１６】
参照抗体と同じＶＨおよび／またはＶＬを含む、請求項１に記載の抗体。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体を集合的にコードする、核酸または核酸のセット。
【請求項１８】
請求項１７に記載の核酸（単数または複数）を含む、ベクターまたはベクターのセット。
【請求項１９】
ベクター（単数または複数）が、発現ベクター（単数または複数）である、請求項１８に記載のベクターまたはベクターのセット。
【請求項２０】
請求項１８または１９に記載のベクターまたはベクターのセットを含む、宿主細胞。
【請求項２１】
抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）であって、
ｉ．請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体；および
ｉｉ．少なくとも１の治療剤；
を含み、ここで、前記抗体は、少なくとも１の治療剤に共有結合的に抱合されている、前記抗体−薬物抱合体。
【請求項２２】
抗体および治療剤が、リンカーを通じて抱合されている、請求項２１に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項２３】
リンカーが、切断可能なまたは切断不可能なリンカーである、請求項２１に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項２４】
切断可能なリンカーが、プロテアーゼ感受性リンカー、ｐＨ感受性リンカー、またはグルタチオン感受性リンカーである、請求項２３に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項２５】
リンカーが、２〜５アミノ酸のペプチド配列を含むプロテアーゼ感受性リンカーである、請求項２４に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項２６】
２〜５アミノ酸が、天然に存在するアミノ酸残基、天然に存在しないアミノ酸残基、またはそれらの組み合わせを含む、請求項２５に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項２７】
ペプチド配列が、バリン−シトルリンを含む、請求項２５に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項２８】
リンカーが、任意に置換されていてもよいアルカンまたはチオエーテルを含む切断不可能なリンカーである、請求項２３に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項２９】
リンカーが、抗体およびリンカーと共有結合を形成する官能基を含む、請求項２３〜２８のいずれか一項に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項３０】
官能基が、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、ビニルスルホン基、アクリラート基、アクリルアミド基、アクリロニトリル基、またはメタクリラート基を含む、請求項２９に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項３１】
リンカーが、式Ｉ：
【化１】
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式中、
Ｒ１は、任意に置換されていてもよいＣ１〜６アルキル、任意に置換されていてもよいフェニル、任意に置換されていてもよいＣ２〜６アルキレン、任意に置換されていてもよいＣ２〜６アルケニレン、任意に置換されていてもよいＣ２〜６アルキニレン、または任意に置換されていてもよいトリアゾールであり；および
Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮである、
で表される分子スペーサーをさらに含む、請求項２４〜３０のいずれか一項に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項３２】
少なくとも１の治療剤が、細胞毒性剤である、請求項２１〜３１のいずれか一項に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項３３】
細胞毒性剤が、モノメチルアウリスタチンＥである、請求項３２に記載の抗体−薬物抱合体。
【請求項３４】
以下：
（ｉ）ＦＯＬＲ１に結合する抗原結合フラグメントを含む細胞外ドメイン、
（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および
（ｉｉｉ）１以上の細胞内刺激ドメイン
を含む、キメラ抗原受容体。
【請求項３５】
抗原結合フラグメントが、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２１７、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２１８、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２２０、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２２１、およびＦＯＬＲ１−Ａｂ２２２からなる群から選択される参照抗体と同じヒトＦＯＬＲ１のエピトープに結合する、請求項２９に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３６】
抗原結合フラグメントが、請求項２〜９のいずれか一項に記載のＨＣ ＣＤＲおよび／またはＬＣ ＣＤＲを含む、請求項３５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３７】
抗原結合フラグメントが、参照抗体と同じＶＨおよびＶＬを含む、請求項３５に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３８】
抗原結合フラグメントが、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）である、請求項３４〜３７のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項３９】
膜貫通ドメインが、ＣＤ２８またはＣＤ８受容体に由来する膜貫通ドメインを含む、請求項３３〜３８のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４０】
（ｉｉｉ）が、ＣＤ３ζからのシグナル伝達ドメインを含む、請求項３３〜３９のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４１】
（ｉｉｉ）が、共刺激シグナル伝達ドメインを含む、請求項３３〜４０のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４２】
共刺激シグナル伝達ドメインが、４−１ＢＢ、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、またはＬＦＡ−１受容体からのものである、請求項４１に記載のキメラ抗原受容体。
【請求項４３】
請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のキメラ抗原受容体をコードするヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項４４】
請求項４３に記載の核酸を含む、ベクター。
【請求項４５】
請求項３３〜４２のいずれか一項に記載のキメラ受容体を発現する、宿主細胞。
【請求項４６】
免疫細胞である、請求項４５に記載の宿主細胞。
【請求項４７】
免疫細胞が、Ｔ細胞である、請求項４６に記載の宿主細胞。
【請求項４８】
（ｉ）請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体、請求項１７〜１９のいずれか一項に記載の核酸または核酸のセット、請求項２１〜３３のいずれか一項に記載の抗体−薬物抱合体、または請求項４６または４７に記載の宿主細胞；および（ｉｉ）薬学的に許容し得る担体を含む、医薬組成物。
【請求項４９】
請求項４８に記載の医薬組成物の有効量をそれを必要とする対象へ投与することを含む、ＦＯＬＲ１＋細胞の数を減少させる方法。
【請求項５０】
対象が、がんを有するか、またはがんを有すると疑われる、請求項４９に記載の方法。
【請求項５１】
ＦＯＬＲ１＋細胞の存在を検出する方法であって、以下：
ｉ．ＦＯＬＲ１＋細胞を有すると疑われる試料を請求項１〜１６のいずれか一項に記載の抗体と接触させること、抗体は、標識化剤と抱合されている；および
ｉｉ．試料中のＦＯＬＲ１＋細胞の存在を試料中の細胞に対する抗体の結合に基づき検出すること
を含む、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明の背景
葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）としても知られる葉酸受容体アルファは、葉酸受容体ファミリーに属し、そのメンバーは、葉酸および／またはその誘導体（例として、５−メチルエトラヒドロ葉酸）に対して高い結合親和性を有する。ＦＯＬＲ１は、卵巣、乳房、腎臓、肺、結腸直腸、および脳など、数多の上皮由来腫瘍で過剰に発現していることが報告されている。したがって、この受容体は、かかる上皮由来腫瘍の処置の標的となり得る。
したがって、がんの処置および診断の両方で使用するための抗ＦＯＬＲ１抗体などの有効なＦＯＬＲ１アンタゴニストを開発することは非常に重要である。
【発明の概要】
【０００２】
本発明の概要
本開示は、少なくとも部分的に、ＦＯＬＲ１に特異的な数多の抗体の開発に基づいている。かかる抗体は、標的ＦＯＬＲ１抗原に対する高い結合親和性および／またはＦＯＬＲ１＋細胞に対する高い阻害活性を示した。
結果的に、本開示の一側面は、ＦＯＬＲ１に結合する単離された抗体（抗ＦＯＬＲ１抗体）を特徴とし、ここで抗体は、参照抗体と同じヒトＦＯＬＲ１のエピトープに結合する。これは、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１、ＦＯＬＲ１−Ａｂ４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２０、またはＦＯＬＲ１−Ａｂ２３であり、これらの各々の構造的特徴が本明細書に提供される。
【０００３】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、以下：
（ａ）Ｘ１ＹＴＦＴＸ２ＹＸ３として示される重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、ここで、Ｘ１は、ＧまたはＩであり、Ｘ２は、ＤまたはＳであり、およびＸ３は、Ｗ、Ｎ、またはＳである；
（ｂ）ＩＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６として示される重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、ここで、Ｘ１は、ＰまたはＴであり、Ｘ２は、Ｎ、Ｙ、またはＥであり、Ｘ３は、Ｎ、Ｄ、またはＴであり、Ｘ４は、ＧまたはＳであり、Ｘ５は、ＧまたはＥであり、およびＸ６は、ＴまたはＰである；および
（ｃ）ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０として示される重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、ここで、Ｘ１は、Ｓ、ＫまたはＭであり、Ｘ２は、ＧまたはＰであり、Ｘ３は、ＧまたはＹであり、Ｘ４は、Ｇまたは不在であり、Ｘ５は、Ｐまたは不在であり、Ｘ６は、Ａ、Ｒ、またはＫであり、Ｘ７は、Ｗ、ＹまたはＩであり、Ｘ８は、ＦまたはＭであり、Ｘ９は、ＤまたはＡであり、およびＸ１０は、ＹまたはＶである、の１以上を含む重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得る。
【０００４】
かかる抗ＦＯＬＲ１抗体は、ＶＨを含み得、ここで、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３は、集合的に、参照抗体のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３と少なくとも８５％（例として、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上）同一である。いくつかの場合において、抗体は、上に注記された参照抗体の１つと同じＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨを含み得る。他の態様において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、参照抗体のＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３に対して相対的な５、４、３、２、または１までの変異を集合的に含む、ＨＣ ＣＤＲ１、ＨＣ ＣＤＲ２、およびＨＣ ＣＤＲ３を含むＶＨを含み得る。
【０００５】
代替的にまたは加えて、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、以下：
（ａ）ＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦまたはＱＳＬＬＹＳＳＳＱＫＮＹとして示される軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）；
（ｂ）Ｘ１ＡＳとして示される軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、ここで、Ｘ１は、Ｖ、Ａ、またはＷである；および
（ｃ）ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＰＸ５Ｔとして示される軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ここで、Ｘ１は、ＹまたはＳであり、Ｘ２は、ＹまたはＫであり、Ｘ３は、ＥまたはＳであり、Ｘ４は、ＹまたはＶであり、およびＸ５は、Ｗ、Ｙ、または不在である、の１以上を含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み得る。
【０００６】
かかる抗体は、ＶＬを含み得、ここで、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３は、集合的に、参照抗体のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３と少なくとも８５％（例として、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％以上）同一である。いくつかの場合において、抗体は、上に注記された参照抗体の１つと同じＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３を含み得る。他の態様において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、参照抗体のＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３に対して相対的な５、４、３、２、または１までの変異を集合的に含む、ＬＣ ＣＤＲ１、ＬＣ ＣＤＲ２、およびＬＣ ＣＤＲ３を含み得る。
【０００７】
いくつかの例において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、上に注記された参照抗体の１つと同じ重鎖および／または軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの場合において、かかる抗ＦＯＬＲ１抗体は、参照抗体と同じＶＨおよび／またはＶＬを含み得る。
本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれかは、ヒトＦＯＬＲ１に特異的に結合し得る。いくつかの場合において、抗ＦＯＬＲ１抗体は、ヒトＦＯＬＲ１および齧歯類の動物のＦＯＬＲ１または霊長目の動物のＦＯＬＲ１などの非ヒトＦＯＬＲ１と交差反応し得る。抗体は、ヒト抗体またはヒト化抗体であり得る。いくつかの例において、それはキメラ抗体であり得る。
いくつかの態様において、抗ＦＯＬＲ１抗体は、全長抗体（例として、ＩｇＧ分子）またはその抗原結合フラグメントであり得る。代替的に、それは単鎖抗体であり得る。
【０００８】
別の側面において、本開示は、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれかを集合的にコードする核酸または核酸のセット（例として、２つの核酸）、および抗ＦＯＬＲ１抗体をコードする核酸（単数または複数）を含むベクターまたはベクターのセット（例として、２つのベクター）を特徴とする。いくつかの場合において、ベクターまたはベクターのセットは、発現ベクター（単数または複数）であり得る。また、核酸（単数または複数）またはベクター（単数または複数）を含む宿主細胞も本明細書に提供される。さらに、本開示は、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体を作製するための方法を提供し、該方法は、抗体のコード配列を含むベクターまたはベクターのセットを含む宿主細胞を培養すること、ここで、コード配列は、好適なプロモーターに作動可能に連結されている、およびそのように生産された抗体を、例えば、宿主細胞または培養培地から収集することを含む。
加えて、本開示は、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれか、および抗体に共有結合的に抱合されている少なくとも１の治療剤を含む抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）を提供する。いくつかの例において、治療剤は、細胞毒性剤、例えば，モノメチルアウリスタチンＥであり得る。
【０００９】
いくつかの態様において、抗体および治療剤は、リンカーを通じて抱合されたものであり得る。いくつかの例において、リンカーは、切断可能なリンカー、例えば、プロテアーゼ感受性リンカー、ｐＨ感受性リンカー、またはグルタチオン感受性リンカーであり得る。いくつかの場合において、リンカーは、２〜５のアミノ酸を有するペプチドを含み得るプロテアーゼ−感受性リンカーであり得る。ペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基、天然に存在しないアミノ酸残基、またはそれらの組み合わせを含み得る。一例において、ペプチドは、バリン−シトルリンを含み得る。他の例において、リンカーは、切断不可能なリンカーであり得る。かかる切断不可能なリンカーは、任意に置換されていてもよいアルカンまたはチオエーテルを含み得る。
【００１０】
いくつかの態様において、リンカーは、抗体とリンカーとの間に共有結合を形成する官能基を含み得る。例示の官能基は、これらに限定されないが、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、ビニルスルホン基、アクリラート基、アクリルアミド基、アクリロニトリル基、およびメタクリラート基を含む。一例において、リンカーは、式Ｉ：
【化１】
2021531825.tif 000003
式中、
Ｒ１は、任意に置換されていてもよいＣ１〜６アルキル、任意に置換されていてもよいフェニル、任意に置換されていてもよいＣ２〜６アルキレン、任意に置換されていてもよいＣ２〜６アルケニレン、任意に置換されていてもよいＣ２〜６アルキニレン、または任意に置換されていてもよいトリアゾールであり；Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮである、で表される分子スペーサーをさらに含み得る。
【００１１】
さらに、本開示は、（ｉ）ＦＯＬＲ１に結合する抗原結合フラグメントを含む細胞外ドメイン、（ｉｉ）膜貫通ドメイン、および（ｉｉｉ）１以上の細胞内刺激ドメインを含み得るキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を提供する。抗原結合フラグメントは、本明細書に記載の任意の参照抗体と同じヒトＦＯＬＲ１のエピトープに結合し得る。いくつかの例において、抗原結合フラグメントは、任意の参照抗体の同じＨＣ ＣＤＲおよび／またはＬＣ ＣＤＲを含み得る。かかる抗原結合フラグメントは、参照抗体と同じＶＨおよびＶＬを含み得る。いくつかの例において、抗原結合フラグメントは、単鎖抗体（ｓｃＦｖ）であり得る。
【００１２】
本明細書に記載のＣＡＲのいずれかにおいて、膜貫通ドメインは、ＣＤ２８またはＣＤ８に由来する膜貫通ドメインを含み得る。代替的にまたは加えて、１以上の細胞内刺激ドメインは、ＣＤ３ζからのシグナル伝達ドメイン、および任意に４−１ＢＢ、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、またはＬＦＡ−１からのものであり得る共刺激シグナル伝達ドメインを含み得る。本明細書に記載のＣＡＲのいずれかをコードする核酸、それを含むベクター、およびＣＡＲを発現する宿主細胞もまた、本開示の範囲内である。いくつかの例において、ＣＡＲを発現する宿主細胞は、Ｔ細胞などの免疫細胞である。
【００１３】
もう１つの側面において、本開示は、（ｉ）本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体の１以上、それをコードする核酸または核酸のセット、本明細書に記載の抗体−薬物抱合体、または本明細書に記載のＣＡＲ構築物のいずれかを発現する宿主細胞、および（ｉｉ）薬学的に許容し得る担体を含む医薬組成物を提供する。
その上、本開示は、ＦＯＬＲ１＋細胞の数を減少させる方法を特徴とし、該方法は、本明細書に記載の医薬組成物のいずれかの有効量を、それを必要とする対象へ投与することを含む。いくつかの態様において、対象は、がんを有するか、またはがんを有すると疑われるヒト患者であり得、例えば、がんは上皮がんである。また、本明細書にも記載の標的疾患（例として、上皮がんなどのがん）のいずれかを処置することにおける使用のための、または標的疾患の処置のための医薬を製造することにおける使用のための本明細書に記載の医薬組成物も本開示の範囲内である。
【００１４】
加えて、本開示は、ＦＯＬＲ１＋細胞の存在を検出する方法を特徴とし、該方法は、ｉ．ＦＯＬＲ１＋細胞を有すると疑われる試料を、標識化剤と抱合されている本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれかと接触させること；およびｉｉ．試料中のＦＯＬＲ１＋細胞の存在を、試料中の細胞に対する抗体の結合に基づき検出することを含む。いくつかの場合において、試料は、上皮がんなどのがんのリスクがある、または上皮がんなどのがんを有すると疑われるヒト患者に由来する。
本発明の１以上の態様の詳細は、以下の説明に記載されている。本発明の他の特徴または利点は、以下の図面およびいくつかの態様の詳細な説明から、ならびに添付の特許請求の範囲からも明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
図面の簡単な記載
【図１Ａ】図１Ａ〜１Ｅは、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１、ＦＯＬＲ１−Ａｂ４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２０、およびＦＯＬＲ１−Ａｂ２３を含む、数多の抗ＦＯＬＲ１抗体が、表面ＦＯＬＲ１を発現する細胞に結合したことを示す図を含む。
【図１Ｂ】図１Ａ〜１Ｅは、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１、ＦＯＬＲ１−Ａｂ４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２０、およびＦＯＬＲ１−Ａｂ２３を含む、数多の抗ＦＯＬＲ１抗体が、表面ＦＯＬＲ１を発現する細胞に結合したことを示す図を含む。
【図１Ｃ】図１Ａ〜１Ｅは、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１、ＦＯＬＲ１−Ａｂ４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２０、およびＦＯＬＲ１−Ａｂ２３を含む、数多の抗ＦＯＬＲ１抗体が、表面ＦＯＬＲ１を発現する細胞に結合したことを示す図を含む。
【図１Ｄ】図１Ａ〜１Ｅは、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１、ＦＯＬＲ１−Ａｂ４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２０、およびＦＯＬＲ１−Ａｂ２３を含む、数多の抗ＦＯＬＲ１抗体が、表面ＦＯＬＲ１を発現する細胞に結合したことを示す図を含む。
【図１Ｅ】図１Ａ〜１Ｅは、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１、ＦＯＬＲ１−Ａｂ４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２０、およびＦＯＬＲ１−Ａｂ２３を含む、数多の抗ＦＯＬＲ１抗体が、表面ＦＯＬＲ１を発現する細胞に結合したことを示す図を含む。
【００１６】
【図２Ａ−Ｂ】図２Ａ〜２Ｄは、ＦＯＬＲ１＋であるＳＫ−ＯＶ−３細胞に対して示される例示の抗ＦＯＬＲ１抗体の阻害効果を示す図を含む。
【図２Ｃ−Ｄ】図２Ａ〜２Ｄは、ＦＯＬＲ１＋であるＳＫ−ＯＶ−３細胞に対して示される例示の抗ＦＯＬＲ１抗体の阻害効果を示す図を含む。
【００１７】
本発明の詳細な説明
標的ＦＯＬＲ１抗原への高い結合親和性、および／またはＦＯＬＲ１＋細胞に対する高い阻害活性を含む優れた特徴を示した数多の抗ＦＯＬＲ１抗体が本明細書に開示される。
結果的に、ＦＯＬＲ１に結合可能な抗体、それをコードする核酸、抗体−薬物抱合体（ＡＤＣ）および抗ＦＯＬＲ１抗体を含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、および治療および診断目的の両方のためのそれらの使用が本明細書に提供される。また、抗体および／またはＡＤＣおよびそれを含むＣＡＲの治療的および／または診断的使用のためのキット、ならびに抗ＦＯＬＲ１抗体を生産するための方法も本明細書に提供される。
【００１８】
ＦＯＬＲ１に結合する抗体
本開示は、葉酸受容体１（ＦＯＬＲ１）としても知られている葉酸受容体アルファに結合する抗体を提供する。葉酸受容体ファミリーのメンバーとして、ＦＯＬＲ１は葉酸およびその誘導体に対して高い結合親和性を有する。ヒトでは、ＦＯＬＲ１はＦＯＬＲ１遺伝子によってコードされている。ＦＯＬＲ１は、様々な上皮腫瘍（例えば、卵巣がん）で過剰に発現していることがわかった。よって、この受容体は、標的がんの処置および診断のための標的および／またはバイオマーカーとして役立ち得る。結果的に、本明細書に開示の抗ＦＯＬＲ１抗体は、それ自体で、または他の部分に抱合されて、例えば、治療剤に抱合されて、抗体−薬物抱合体を形成するか、またはキメラ抗原受容体における細胞外抗原結合ドメインになることによって、本明細書に記載の標的がんを処置および／または診断する際に使用され得る。
【００１９】
抗体（複数形で互換的に使用される）は、炭水化物、ポリヌクレオチド、脂質、ポリペプチドなどの標的に、免疫グロブリン分子の可変領域に位置する少なくとも１の抗原認識部位を通じて特異的に結合することが可能な免疫グロブリン分子である。本明細書に使用されるとき、「抗体」という用語は、インタクトな（すなわち、全長の）ポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体だけでなく、その抗原結合フラグメント（Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｖなど）、一本鎖（ｓｃＦｖ）、その変異体、抗体部分を含む融合タンパク質、ヒト化抗体、キメラ抗体、二特異性抗体、ナノボディ、線状抗体、一本鎖抗体、多重特異性抗体（例として、二重特異性抗体）および必要な特異性の抗原認識部位を含む免疫グロブリン分子の任意の他の改変された立体配置（抗体のグリコシル化バリアントを含む）、抗体のアミノ酸配列バリアント、および共有結合的に改変された抗体も包含する。抗体は、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＡ、またはＩｇＭ（またはそのサブクラス）などの任意のクラスの抗体を含み、抗体は任意の特定のクラスである必要はない。その重鎖の定常ドメインの抗体アミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンは、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ、およびＩｇＭの５つの主要なクラスがあり、これらのいくつかはさらにサブクラス（アイソタイプ）に分類され得る（例として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１およびＩｇＡ２）。免疫グロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれアルファ、デルタ、イプシロン、ガンマ、およびミューと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブ単位構造および三次元立体配置は周知である。
【００２０】
典型的な抗体分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）および軽鎖可変領域（ＶＬ）を含み、これらは大抵、抗原結合に関与している。ＶＨおよびＶＬ領域は、「相補性決定領域」（「ＣＤＲ」）としても知られる高可変性の領域にさらに細分化でき、「フレームワーク領域」（「ＦＲ」）として知られるより保存された領域が点在する。各ＶＨおよびＶＬは典型的には、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲから構成され、アミノ末端からカルボキシ末端に次の順序で配置される：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。フレームワーク領域およびＣＤＲの範囲は、当該技術分野において知られている方法論を使用して（例えば、Kabat定義、Chothia定義、AbM定義、および／またはContact定義によって）正確に識別することができ、これらはすべて当該技術分野において周知である。例として、Kabat, E.A., et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242, Chothia et al., (1989) Nature 342:877; Chothia, C. et al. (1987) J. Mol. Biol. 196:901-917, Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948; および Almagro, J. Mol. Recognit. 17:132-143 (2004)を参照。また、hgmp.mrc.ac.uk and bioinf.org.uk/absも参照。
【００２１】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、ＦＯＬＲ１に結合し、その活性を少なくとも５０％（例として、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％以上）阻害することができる。インヒビターの効力の尺度を提供する見掛けの阻害定数（ＫｉａｐｐまたはＫｉ，ａｐｐ）は、酵素活性を減少させるために必要なインヒビターの濃度に関連しており、酵素濃度には依存しない。本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体の阻害活性は、当該技術分野において知られている定型的な方法によって決定され得る。
【００２２】
抗体のＫｉ，ａｐｐ値は、反応（例として、酵素活性）の程度に対する種々の濃度の抗体の阻害効果を測定することによって決定され得る。インヒビター濃度の関数としての疑似一次速度定数（ｖ）の変化を改変されたモリソン方程式（式１）にフィッティングすると、見掛けのＫｉ値の推定値が得られる。競合インヒビターの場合、Ｋｉａｐｐは、Ｋｉ，ａｐｐ対基質濃度のプロットの線形回帰分析から抽出されたｙ切片から得ることができる。
【数１】
2021531825.tif 000004
式中、Ａは、インヒビター（Ｉ）の非存在下での酵素反応の初速度（ｖｏ）を総酵素濃度（Ｅ）で割ったｖｏ／Ｅに相当する。
【００２３】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、ＦＯＬＲ１抗原またはその抗原性エピトープについて、１０００、９００、８００、７００、６００、５００、４００、３００、２００、１００、５０、４０、３０、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、または５ｐＭ以下のＫｉａｐｐ値を有し得る。いくつかの態様において、抗ＦＯＬＲ１抗体は、第１の標的について、第２の標的と比べてより低いＫｉａｐｐを有し得る。Ｋｉａｐｐの相違（例として、特異性または他の比較について）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００または１０５倍であり得る。
【００２４】
本明細書に記載の抗体は、マウス、ラット、ヒト、または他の任意の起源（キメラまたはヒト化抗体を含む）であり得る。かかる抗体は、天然に存在しない、すなわち、ヒトの作用なしに動物で生産されない（例として、かかる動物を所望の抗原またはそのフラグメントで免疫する）。
本明細書に記載の抗体のいずれも、モノクローナルまたはポリクローナルのいずれかであり得る。「モノクローナル抗体」は均一な抗体集団を指し、「ポリクローナル抗体」は不均一な抗体集団を指す。これらの２つの用語は、抗体の供給源またはそれが作製される方法を制限しない。
【００２５】
一例において、本明細書に記載の方法で使用される抗体は、ヒト化抗体である。ヒト化抗体は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小限の配列を含む特定のキメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖、またはそれらの抗原結合フラグメントである非ヒト（例として、マウス）抗体の形態を指す。ほとんどの場合、ヒト化抗体はヒト免疫グロブリン（レシピエント抗体）であり、ここで、レシピエントの相補性決定領域（ＣＤＲ）からの残基は、所望の特異性、親和性、および能力を有するマウス、ラット、またはウサギなどの非ヒト種（ドナー抗体）のＣＤＲからの残基によって置き換えられている。いくつかの場合において、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域（ＦＲ）残基は、対応する非ヒト残基によって置き換えられている。さらにまた、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、インポートされたＣＤＲまたはフレームワーク配列にも見られないが、抗体性能をさらに洗練および最適化するために含まれる残基を含み得る。一般に、ヒト化抗体は、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的にすべてを含み、ここで、ＣＤＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、ＦＲ領域のすべてまたは実質的にすべては、ヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである。ヒト化抗体はまた、最適には、免疫グロブリン定常領域またはドメイン（Ｆｃ）の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものを含むであろう。抗体は、ＷＯ９９／５８５７２に記載されているように改変されたＦｃ領域を有し得る。他の形態のヒト化抗体は、元の抗体に関して変更された１以上のＣＤＲ（１、２、３、４、５、および／または６）を有し、これは、元の抗体からの１以上のＣＤＲ「に由来する」１以上のＣＤＲとも呼ばれる。ヒト化抗体はまた、親和性成熟を伴うものであってもよい。
【００２６】
別の例において、本明細書に記載の抗体は、ヒト抗体からの重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含み得るキメラ抗体であり得る。キメラ抗体は、第１の種からの可変領域または可変領域の一部および第２の種からの定常領域を有する抗体を指す。典型的には、これらのキメラ抗体において、軽鎖および重鎖の両方の可変領域は、哺乳動物（例として、マウス、ウサギ、およびラットなどの非ヒト哺乳動物）の１つの種に由来する抗体の可変領域を模倣するが、定常部分はヒトなどの別の哺乳動物に由来する抗体の配列と相同である。いくつかの態様において、アミノ酸改変は、可変領域および／または定常領域においてなされ得る。
【００２７】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、対応する標的抗原またはそのエピトープに特異的に結合する。抗原またはエピトープに「特異的に結合する」抗体は、当該技術分野でよく理解されている用語である。分子は、それが代替の標的とするよりも、より頻繁に、より迅速に、より長い持続時間で、および／またはより大きな親和性で特定の標的抗原と反応する場合、「特異的な結合」を示すと言われる。抗体は、それが他の物質に結合するよりも、より大きな親和性、結合力、より容易に、および／またはより長い持続時間で結合する場合、標的抗原またはエピトープに「特異的に結合する」。例えば、ＦＯＬＲ１抗原またはその中の抗原性エピトープに特異的に（または優先的に）結合する抗体は、それが他の抗原または同じ抗原の他のエピトープに結合するよりも、より大きな親和性、結合力、より容易に、および／またはより長い持続時間でこの標的抗原に結合する抗体である。この定義により、例えば、第１の標的抗原に特異的に結合する抗体は、第２の標的抗原に特異的または優先的に結合する場合もしない場合もあることも理解される。そのため、「特異的な結合」または「優先的な結合」は、必ずしも排他的な結合を必要としない（それを含むことはできるが）。いくつかの例において、標的抗原またはそのエピトープに「特異的に結合する」抗体は、他の抗原または同じ抗原の他のエピトープに結合しない場合がある。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、ヒトＦＯＬＲ１に特異的に結合する。いくつかの例において、非ヒトＦＯＬＲ１抗原へのその結合活性は、従来のアッセイでは検出できないか、または極めて低いため、当業者に知られているような有意な生物学的重要性を有さないであろう。他の例において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、異なる種からのＦＯＬＲ１と、例えば、ヒトＦＯＬＲ１と非ヒトＦＯＬＲ１（例として、非ヒト霊長目の動物、マウス、またはラットなどの実験動物からのＦＯＬＲ１）との間で、交差反応し得る。
【００２８】
本明細書に使用されるとき、「葉酸受容体アルファ」、「葉酸受容体１」、または「ＦＯＬＲ１」という用語は、任意の好適な種、例として、ヒト、非ヒト霊長目の動物などの非ヒト哺乳動物、または齧歯類の動物（例として、マウスまたはラット）の葉酸受容体アルファを指す。ＦＯＬＲ１は、葉酸およびその誘導体に結合可能な一本鎖膜タンパク質である。例示のヒトＦＯＬＲ１のアミノ酸配列は、以下に提供される（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｐ１５３２８も参照）：
【化２】
2021531825.tif 000005
他の種からのＦＯＬＲ１分子は当該技術分野において周知であり、そのアミノ酸配列は、公的に利用可能なデータベース、例えばＧｅｎＢａｎｋから検索され得る。
【００２９】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、標的抗原（例として、ヒトＦＯＬＲ１）またはその抗原性エピトープに対して好適な結合親和性を有する。本明細書に使用されるとき、「結合親和性」は、見掛けの会合定数またはＫＡを指す。ＫＡは、解離定数（ＫＤ）の逆数である。本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、標的抗原または抗原性エピトープに対して少なくとも１０−５、１０−６、１０−７、１０−８、１０−９、または１０−１０Ｍ以下の結合親和性（ＫＤ）を有し得る。増大した結合親和性は、減少したＫＤに対応する。第２の抗原と比べて第１の抗原に対する抗体のより高い親和性結合は、第２の抗原に結合するためのＫＡ（または数値ＫＤ）よりも第１の抗原に結合するためのより高いＫＡ（またはより小さい数値ＫＤ）によって示され得る。かかるケースにおいて、抗体は、第２の抗原（例として、第２の立体配座またはその模倣体の同じ第１のタンパク質；または第２のタンパク質）と比べて、第１の抗原（例として、第１の立体配座またはその模倣体の第１のタンパク質）に対して特異性を有する。いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、異なる種のＦＯＬＲ１への結合親和性と比較して、ヒトＦＯＬＲ１に対してより高い結合親和性（より高いＫＡまたはより小さなＫＤ）を有する。結合親和性の相違（例として、特異性または他の比較のため）は、少なくとも１．５、２、３、４、５、１０、１５、２０、３７．５、５０、７０、８０、９１、１００、５００、１０００、１０，０００または１０５倍であり得る。いくつかの態様において、抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれかは、標的抗原またはその抗原性エピトープに対する抗体の結合親和性を増加させるために、さらに親和性成熟され得る。
【００３０】
結合親和性（または結合特異性）は、平衡透析、平衡結合、ゲル濾過、ＥＬＩＳＡ、表面プラズモン共鳴、または分光法（例として、蛍光アッセイを使用）を含む様々な方法によって決定され得る。結合親和性を評価するための例示の条件は、ＨＢＳ−Ｐバッファー（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ ｐＨ７．４、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．００５％（ｖ／ｖ）界面活性剤Ｐ２０）である。これらの技法は、標的タンパク質濃度の関数として結合した結合タンパク質の濃度を測定するために使用され得る。結合した結合タンパク質の濃度（［結合］）は、一般に、以下の式によって遊離の標的タンパク質の濃度（［遊離］）に関連している：
［結合］＝［遊離］／（Ｋｄ＋［遊離］）
【００３１】
しかし、ＫＡの正確な決定を行う必要は必ずしもない。なぜならば、例として、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳ分析などの方法を使用して決定され、ＫＡに比例し、よって比較に使用され得る、親和性の定量的な測定値を得ること（より高い親和性が、例として、２倍高いかどうかを決定し、親和性の定性的な測定値を得ること、または、例として、機能的アッセイ、例として、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏアッセイでの活性によって、親和性の推測を得ることなど）だけで充分な場合もあるためである。
【００３２】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、本明細書に提供される参照抗体の１つと同じＦＯＬＲ１抗原（例として、ヒトＦＯＬＲ１）のエピトープに結合するか、または参照抗体と競合してＦＯＬＲ１抗原に結合する。本明細書に提供される参照抗体は、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２１７、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２１８、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２２０、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２２１、およびＦＯＬＲ１−Ａｂ２２２を含み、これらの各々の構造上の特徴は本明細書に提供される。本明細書に記載の参照抗体と同じエピトープに結合する抗体は、参照抗体と正確に同じエピトープまたは実質的に重複するエピトープ（例として、３つ未満の非重複のアミノ酸残基、２つ未満の非重複のアミノ酸残基、または１つの非重複のアミノ酸残基のみを含む）に結合し得る。２つの抗体が互いに競合して同族の抗原に結合するかどうかは、当該技術分野において周知である競合アッセイによって決定され得る。かかる抗体は、当業者に知られているように、例として、実質的に同様の構造上の特徴（例として、相補性決定領域）を有するもの、および／または当該技術分野において知られているアッセイによって同定されたものとして同定され得る。例えば、競合アッセイは、参照抗体の１つを使用して実施して、候補抗体が参照抗体と同じエピトープに結合するかどうか、または競合してＦＯＬＲ１抗原に結合するかどうかを決定することができる。
【００３３】
本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、（ａ）Ｘ１ＹＴＦＴＸ２ＹＸ３として示される重鎖相補性決定領域１（ＨＣ ＣＤＲ１）、ここで、Ｘ１は、ＧまたはＩであり、Ｘ２は、ＤまたはＳであり、Ｘ３は、Ｗ、Ｎ、またはＳである；（ｂ）ＩＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６として示される重鎖相補性決定領域２（ＨＣ ＣＤＲ２）、ここで、Ｘ１は、ＰまたはＴであり、Ｘ２は、Ｎ、Ｙ、またはＥであり、Ｘ３は、Ｎ、Ｄ、またはＴであり、Ｘ４は、ＧまたはＳであり、Ｘ５は、ＧまたはＥであり、Ｘ６は、ＴまたはＰである；（ｃ）ＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０として示される重鎖相補性決定領域３（ＨＣ ＣＤＲ３）、ここで、Ｘ１は、Ｓ、ＫまたはＭであり、Ｘ２は、ＧまたはＰであり、Ｘ３は、ＧまたはＹであり、Ｘ４は、Ｇまたは不在であり、Ｘ５は、Ｐまたは不在であり、Ｘ６は、Ａ、Ｒ、またはＫであり、Ｘ７は、Ｗ、ＹまたはＩであり、Ｘ８は、ＦまたはＭであり、Ｘ９は、ＤまたはＡであり、およびＸ１０は、ＹまたはＶである、または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）のいずれか１つの組み合わせを含み得る重鎖可変領域（ＶＨ）を含み得る。いくつかの場合において、抗体は、（ａ）のＨＣ ＣＤＲ１、（ｂ）のＨＣ ＣＤＲ２、および（ｃ）のＨＣ ＣＤＲ３を含み得る。
【００３４】
いくつかの例において、ＨＣ ＣＤＲ１モチーフＸ１ＹＴＦＴＸ２ＹＸ３は、位置Ｘ１にＧ、位置Ｘ２にＤ、および／または位置Ｘ３にＮを含み得る。代替的にまたは加えて、ＨＣ ＣＤＲ２モチーフＩＮＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４Ｘ５Ｘ６は、位置Ｘ１にＰ、位置Ｘ２および／または位置Ｘ３にＮ、位置Ｘ４にＧ、位置Ｘ５にＧまたはＳ、および／または位置Ｘ６にＴを含み得る。代替的にまたは加えて、ＨＣ ＣＤＲ３モチーフＡＲＸ１Ｘ２Ｘ３ＹＸ４Ｘ５Ｘ６Ｘ７Ｘ８Ｘ９Ｘ１０は、位置Ｘ１にＫ、位置Ｘ２にＰまたはＧ、位置Ｘ３にＹ、位置Ｘ４にＧ、位置Ｘ５にＰ、位置Ｘ６にＫまたはＲ、位置Ｘ７にＹ、位置Ｘ８にＦ、位置Ｘ９にＤ、および／または位置Ｘ１０にＹまたはＶを含み得る。
【００３５】
表１は、例示の抗ＦＯＬＲ１抗体の重鎖ＣＤＲのアミノ酸配列（ＩＭＧＴ定義による）を提供する。それらの例示の抗ＦＯＬＲ１抗体と同じ重鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する抗体もまた、本開示の範囲内である。
【表１】
2021531825.tif 000006
【００３６】
代替的にまたは加えて、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、（ａ）ＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦまたはＱＳＬＬＹＳＳＳＱＫＮＹとして示される軽鎖相補性決定領域１（ＬＣ ＣＤＲ１）；（ｂ）Ｘ１ＡＳとして示される軽鎖相補性決定領域２（ＬＣ ＣＤＲ２）、ここで、Ｘ１は、Ｖ、Ａ、またはＷである；（ｃ）ＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＰＸ５Ｘ６として示される軽鎖相補性決定領域３（ＬＣ ＣＤＲ３）、ここで、Ｘ１は、ＹまたはＳであり、Ｘ２は、ＹまたはＫであり、Ｘ３は、ＥまたはＳであり、Ｘ４は、ＹまたはＶであり、Ｘ５は、Ｗ、Ｙ、またはＴであり、Ｘ６は、Ｔまたは不在である、または（ｄ）（ａ）〜（ｃ）の任意の組み合わせを含む軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含み得る。
【００３７】
いくつかの例において、抗ＦＯＬＲ１抗体のＬＣ ＣＤＲ１は、ＥＳＶＤＮＹＧＩＳＦである。他の例において、抗体のＬＣ ＣＤＲ１は、ＱＳＬＬＹＳＳＳＱＫＮＹである。代替的にまたは加えて、ＬＣ ＣＤＲ２モチーフＸ１ＡＳは、位置Ｘ１にＶを含有する。代替的にまたは加えて、ＬＣ ＣＤＲ３モチーフＱＱＸ１Ｘ２Ｘ３Ｘ４ＰＸ５Ｔは、位置Ｘ１にＳ、位置Ｘ２にＫ、位置Ｘ３にＥ、および／または位置Ｘ４にＶを含み、および／または位置Ｘ５に残基を含まない。
【００３８】
表２は、例示の抗ＦＯＬＲ１抗体の軽鎖ＣＤＲのアミノ酸配列を提供する。それらの例示の抗ＦＯＬＲ１抗体と同じ軽鎖ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、およびＣＤＲ３領域を有する抗体もまた、本開示の範囲内である。
【表２】
2021531825.tif 000007
【００３９】
本明細書に提供される参照抗体の重鎖および軽鎖ＣＤＲは、当該技術分野において周知であるＩＭＧＴアプローチに基づいて決定される。いくつかの場合において、本明細書に開示の抗ＦＯＬＲ１抗体は、本明細書に開示の任意の参照抗体の同じ重鎖および軽鎖ＣＤＲを含み得る。同じＶＨおよび／またはＶＬ ＣＤＲを有する２つの抗体は、それらのＣＤＲが、同じアプローチ（例として、本明細書に記載のおよび／または当該技術分野において知られているもの）によって決定されるときに同一であることを意味する。
【００４０】
いくつかの例において、本明細書に開示の抗ＦＯＬＲ１抗体は、以下に提供される参照抗体の１つと同じＶＨおよび／またはＶＬ配列を含み得る（太字はＣＤＲ）：
ＦＯＬＲ１−Ａｂ１：
【化３】
2021531825.tif 000008
ＦＯＬＲ１−Ａｂ４
【化４】
2021531825.tif 000009
【００４１】
ＦＯＬＲ１−Ａｂ１４
【化５】
2021531825.tif 000010
ＦＯＬＲ１−Ａｂ２０
【化６】
2021531825.tif 000011
ＦＯＬＲ１−Ａｂ２３
【化７】
2021531825.tif 000012
【００４２】
また、本開示の範囲内に、本明細書に開示の参照抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれかの機能的バリアント（例として、上記の表１および２に列挙されたもの）がある。機能的バリアントは、参照抗体の１以上の重鎖および軽鎖ＣＤＲ領域に５つまでの（例として、４、３、２、または１）のアミノ酸残基のバリエーションを含み、実質的に同様の親和性（例として、同じオーダーのＫＤ値を有する）でＦＯＬＲ１抗原の同じエピトープに結合することができる。いくつかの場合において、機能的バリアントの重鎖および／または軽鎖ＣＤＲの各々は、参照抗体の対応するＣＤＲに対して相対的な、２つ以下のアミノ酸残基のバリエーションを含む。いくつかの例において、機能的バリアントの重鎖および／または軽鎖ＣＤＲの各々は、参照抗体の対応するＣＤＲに対して相対的な、わずか１つのアミノ酸残基のバリエーションを含む。
【００４３】
一例において、アミノ酸残基のバリエーションは、保存的なアミノ酸残基の置換である。本明細書に使用されるとき、「保存的なアミノ酸置換」は、アミノ酸置換がなされるタンパク質の相対的な電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。バリアントは、かかる方法をまとめた参考文献に見られるような当業者に知られているポリペプチド配列を変更するための方法に従って調製され得る（例として、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989、またはCurrent Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York.）。アミノ酸の保存的な置換は、以下の群内のアミノ酸間でなされる置換を含む：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄ。
【００４４】
いくつかの態様において、抗ＦＯＬＲ１抗体は、集合的に、参照抗体の重鎖ＣＤＲと少なくとも８０％（例として、８５％、９０％、９５％、または９８％）同一である重鎖ＣＤＲ、および／または集合的に、参照抗体の軽鎖ＣＤＲと少なくとも８０％（例として、８５％、９０％、９５％、または９８％）同一である軽鎖ＣＤＲを含む。いくつかの態様において、抗ＦＯＬＲ１抗体は、任意の参照抗体の重鎖可変領域と少なくとも８０％（例として、８５％、９０％、９５％、または９８％）同一である重鎖可変領域（ＶＨ）、および／または参照抗体の軽鎖可変領域と少なくとも８０％（例として、８５％、９０％、９５％、または９８％）同一である軽鎖可変領域（ＶＬ）を含む。
【００４５】
２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990（Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993において改変）のアルゴリズムを使用して決定される。かかるアルゴリズムは、Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990のＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３でＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施し、目的のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列の間にギャップが存在する場合、ギャップ（Gapped）ＢＬＡＳＴは、Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997に記載されているように利用することができる。ＢＬＡＳＴおよびギャップＢＬＡＳＴプログラムを利用するとき、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例として、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。
【００４６】
本開示はまた、本明細書に開示の参照抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれかの生殖細胞系列バリアントを提供する。生殖細胞系列バリアントは、対応する生殖細胞系列配列に対してその親抗体に関連して、フレームワーク領域に１以上の変異を含有する。生殖細胞系列バリアントを作製するために、親抗体の重鎖または軽鎖可変領域配列またはその一部（例として、フレームワーク配列）は、抗体生殖細胞系列配列データベース（例として、bioinfo.org.uk/abs/, www.vbase2.org, or imgt.org）に対するクエリとして使用され、親抗体によって使用される対応する生殖細胞系列配列および生殖細胞系列配列と親抗体との間の１以上のフレームワーク領域のアミノ酸残基のバリエーションを特定することができる。次いで、１以上のアミノ酸置換は、生殖細胞系列配列に基づいて親抗体に導入され、生殖細胞系列バリアントを生産することができる。
【００４７】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれかの重鎖は、重鎖定常領域（ＣＨ）またはその一部（例として、ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、またはそれらの組み合わせ）をさらに含み得る。重鎖定常領域は、任意の好適な起源、例として、ヒト、マウス、ラット、またはウサギであり得る。１つの特定の例において、重鎖定常領域は、ヒトＩｇＧ（ガンマ重鎖）に由来する。必要に応じて、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、改変された定常領域を含み得る。例えば、それは、免疫学的に不活性である、例として、補体媒介性溶解を引き起こさない、または抗体依存性の細胞媒介性細胞傷害（ＡＤＣＣ）を刺激しない改変された定常領域を含み得る。ＡＤＣＣ活性は、米国特許第５，５００，３６２号に開示されている方法を使用して評価され得る。他の態様において、定常領域は、Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624；ＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９９／０１４４１；および／またはＵＫ特許出願番号９８０９９５１．８に記載されているように改変される。
【００４８】
本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれも、軽鎖可変領域および任意に軽鎖定常領域を含む軽鎖をさらに含み得、これは当該技術分野において知られている任意のＣＬであり得る。いくつかの例において、ＣＬはカッパ軽鎖である。他の例において、ＣＬはラムダ軽鎖である。抗体の重鎖および軽鎖定常領域は、当該技術分野において周知であり、例として、ＩＭＧＴデータベース（www.imgt.org）またはwww.vbase2.org/vbstat.php.で提供されるものであり、これらは両方とも参照により本明細書に組み込まれる。
【００４９】
抗ＦＯＬＲ１抗体の調製
本明細書に記載のＦＯＬＲ１に結合することが可能な抗体は、当該技術分野において知られている任意の方法によって作製され得る。例えば、Harlow and Lane, (1998) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New Yorkを参照。
いくつかの態様において、標的ＦＯＬＲ１抗原（例として、ヒトＦＯＬＲ１）に特異的な抗体は、従来のハイブリドーマ技術によって作製され得る。ＫＬＨなどの担体タンパク質に任意に結合された全長標的抗原またはそのフラグメントを使用して、その抗原に結合する抗体を生成するために宿主動物を免疫化することができる。宿主動物の免疫付与のルートおよびスケジュールは、一般に、本明細書にさらに記載されるように、抗体の刺激および産生のための確立された従来の技術と一致している。マウス、ヒト化、およびヒト抗体の産生のための一般的な技法は当該技術分野において知られており、本明細書に記載されている。ヒトを含む任意の哺乳類の動物対象またはそれに由来する抗体産生細胞は、ヒトを含む哺乳類の動物のハイブリドーマ細胞株の産生の基礎として役立つように操作され得ることが企図される。典型的には、宿主動物は、本明細書に記載のものを含む、ある量の免疫原を腹腔内、筋肉内、経口、皮下、足底内、および／または皮内に接種される。
【００５０】
ハイブリドーマは、Kohler, B. and Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497の一般的な体細胞ハイブリダイゼーション技法を使用して、またはBuck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982)によって改変されたように、リンパ球および不死化骨髄腫細胞から調製され得る。X63-Ag8.653およびSalk Institute, Cell Distribution Center, San Diego, Calif., USAからのものを含むがこれらに限定されない利用可能な骨髄腫株は、ハイブリダイゼーションに使用され得る。一般に、この技法は、ポリエチレングリコールなどの融合因子を使用して、または当業者に周知である電気的手段によって、骨髄腫細胞およびリンパ球様細胞を融合させることを含む。融合後、細胞は融合培地から分離され、ヒポキサンチン−アミノプテリン−チミジン（ＨＡＴ）培地などの選択的な増殖培地で増殖させて、ハイブリダイズしていない親細胞を排除する。血清の補充の有無に関わらず、本明細書に記載の培地のいずれも、モノクローナル抗体を分泌するハイブリドーマを培養するために使用され得る。細胞融合技法の別の代替手段として、ＥＢＶ不死化Ｂ細胞を使用して、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１モノクローナル抗体を生産することができる。ハイブリドーマは、必要に応じて拡大およびサブクローン化され、上清は、従来の免疫アッセイ手順（例として、ラジオ免疫アッセイ、酵素免疫アッセイ、または蛍光免疫アッセイ）によって抗免疫原活性についてアッセイされる。
【００５１】
抗体の供給源として使用され得るハイブリドーマは、ＦＯＬＲ１活性を妨害することが可能なモノクローナル抗体を生産する親ハイブリドーマのすべての誘導体、子孫細胞を包含する。かかる抗体を生産するハイブリドーマは、既知の手順を使用してｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで増殖させ得る。モノクローナル抗体は、必要に応じて、硫酸アンモニウム沈殿、ゲル電気泳動、透析、クロマトグラフィー、および限外濾過などの従来の免疫グロブリン精製手順によって、培養培地または体液から単離され得る。望ましくない活性は、それが存在する場合、例えば、固相に付着した免疫原で作られた吸着剤上に調製物を流し、免疫原から所望の抗体を溶出または放出することによって除去され得る。免疫される種において免疫原性であるタンパク質、例として、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、または、二官能性または誘導体化剤、例えば、マレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル（システイン残基を介した結合）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（リシン残基を介する）、グルタルアルデヒド、無水コハク酸、ＳＯＣｌ、またはＲ１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲ（ＲおよびＲ１は異なるアルキル基である）を使用する大豆トリプシンインヒビターに抱合された標的アミノ酸配列を含む標的抗原またはフラグメントによる宿主動物の免疫付与は、抗体の集団（例として、モノクローナル抗体）を生成し得る。
【００５２】
必要に応じて、目的の抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）（例として、ハイブリドーマによって生産される）は配列決定され得、次いでポリヌクレオチド配列は発現または増殖のためにベクターにクローン化され得る。目的の抗体をコードする配列は、宿主細胞中のベクターで維持され得、次いで宿主細胞は、今後の使用のために拡大および凍結され得る。代替手段において、ポリヌクレオチド配列は、抗体を「ヒト化」するため、または親和性（親和性成熟）、または抗体の他の特徴を改善するための遺伝子操作のために使用され得る。例えば、抗体がヒトでの臨床試験および処置に使用される場合、定常領域は、免疫応答を回避するために、ヒト定常領域により類似するように操作され得る。抗体配列を遺伝的に操作して、標的抗原に対するより大きな親和性およびＦＯＬＲ１の活性を阻害するより大きな有効性を得ることが望ましい場合がある。１以上のポリヌクレオチドの変化を抗体に対して行い、それでも標的抗原へのその結合特異性を維持することができることは当業者には明らかであろう。
【００５３】
他の態様において、完全ヒト抗体は、特定のヒト免疫グロブリンタンパク質を発現するように操作された市販のマウスを使用することによって得ることができる。より望ましい（例として、完全ヒト抗体）またはより確固たる免疫応答を生産するように設計されたトランスジェニック動物もまた、ヒト化またはヒト抗体の生成に使用され得る。かかる技術の例は、Amgen, Inc（Fremont, Calif.）のXenomouseRTMおよびMedarex, Inc.（Princeton, N.J.）のHuMAb-MouseRTMおよびTC MouseTMである。別の代替手段において、抗体は、ファージディスプレーまたは酵母技術によって組換え的に作製され得る。例えば、米国特許第５，５６５，３３２号；第５，５８０，７１７号；第５，７３３，７４３号；および第６，２６５，１５０号；およびWinter et al., (1994) Annu. Rev. Immunol. 12:433-455を参照。代替的に、ファージディスプレー技術（McCafferty et al., (1990) Nature 348:552-553）を使用して、免疫されていないドナーからの免疫グロブリン可変（Ｖ）ドメイン遺伝子レパートリーから、ｉｎ ｖｉｔｒｏでヒト抗体および抗体フラグメントを生産することができる。
【００５４】
いくつかの態様において、ＦＯＬＲ１抗原に結合することが可能な抗体は、抗体ライブラリー、例えば、ファージディスプレー抗体ライブラリーまたは酵母ディスプレー抗体ライブラリーから単離され得る。一例において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、例えば、ＵＳ２０１５／０１５３３５６に開示された方法に従って、モノクローナル抗体ライブラリーから単離され得、その関連する開示は、本明細書に参照される目的または主題のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００５５】
インタクトの抗体（全長抗体）の抗原結合フラグメントは、定型的な方法を介して調製され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントは、抗体分子のペプシン消化によって生産され得、Ｆａｂフラグメントは、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントのジスルフィド架橋を還元することによって生成され得る。
【００５６】
ヒト化抗体、キメラ抗体、単鎖抗体、および二重特異性抗体などの遺伝子学的に操作された抗体は、例として、従来の組換え技術を介して生産され得る。一例において、標的抗原に特異的なモノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、従来の手順を使用して（例として、モノクローナル抗体の重鎖および軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合することが可能であるオリゴヌクレオチドプローブを使用することによって）容易に単離され、配列決定され得る。ハイブリドーマ細胞は、かかるＤＮＡの好ましい供給源として役立つ。一度単離されると、ＤＮＡは、１以上の発現ベクターに配置され得、次いで、さもなければ免疫グロブリンタンパク質を生産しない、大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、または骨髄腫細胞などの宿主細胞にトランスフェクトされ、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を得る。例として、ＰＣＴ公開番号ＷＯ８７／０４４６２を参照。次いで、ＤＮＡは、例えば、相同のマウス配列の代わりにヒト重鎖および軽鎖定常ドメインのコード配列を置換すること（Morrison et al., (1984) Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851）、または非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列のすべてまたは一部を免疫グロブリンコード配列に共有結合させることによって改変され得る。そのようにして、「キメラ」または「ハイブリッド」抗体などの遺伝子学的に操作され、標的抗原の結合特異性を有する抗体は調製され得る。
【００５７】
「キメラ抗体」の産生のために開発された技法は、当該技術分野において周知である。例として、Morrison et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851；Neuberger et al. (1984) Nature 312, 604; and Takeda et al. (1984) Nature 314:452を参照。
ヒト化抗体を構築するための方法もまた、当該技術分野において周知である。例として、Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10029-10033 (1989)を参照。一例において、親非ヒト抗体のＶＨおよびＶＬの可変領域は、当該技術分野において知られている方法に従って三次元分子モデリング分析に供される。次いで、正しいＣＤＲ構造の形成に重要であると予測されるフレームワークアミノ酸残基が、同じ分子モデリング分析を使用して同定される。並行して、親非ヒト抗体のアミノ酸配列と相同であるアミノ酸配列を有するヒトＶＨおよびＶＬ鎖は、検索クエリとして親ＶＨおよびＶＬ配列を使用して、任意の抗体遺伝子データベースから同定される。次いで、ヒトＶＨおよびＶＬアクセプター遺伝子は選択される。
【００５８】
選択されたヒトアクセプター遺伝子内のＣＤＲ領域は、親非ヒト抗体またはその機能的バリアントからのＣＤＲ領域で置き換えられ得る。必要に応じて、ＣＤＲ領域との相互作用に重要であると予測される親鎖のフレームワーク領域内の残基（上記の説明を参照）を使用して、ヒトアクセプター遺伝子の対応する残基を置き換えることができる。
単鎖抗体は、重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列と軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を連結することにより、組換え技術を介して調製され得る。好ましくは、可撓性リンカーが２つの可変領域の間に組み込まれる。代替的に、単鎖抗体の産生について記載された技法（米国特許第４，９４６，７７８号および第４，７０４，６９２号）を適合させてファージまたは酵母ｓｃＦｖライブラリーを生産することができ、ＦＯＬＲ１に特異的なｓｃＦｖクローンを定型的な手順に従ってライブラリーから同定することができる。陽性クローンは、ＦＯＬＲ１活性を阻害するクローンを同定するためにさらなるスクリーニングに供することができる。
【００５９】
当該技術分野において知られ、本明細書に記載の方法に従って得られた抗体は、当該技術分野において周知である方法を使用して特徴付けられ得る。例えば、１つの方法は、抗原が結合するエピトープを同定すること、すなわち「エピトープマッピング」である。タンパク質上のエピトープの場所をマッピングおよび特徴付けるための当該技術分野において知られている多くの方法があり、これは、例えば、Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1999の１１章に記載されているように、抗体−抗原複合体の結晶構造の解明、競合アッセイ、遺伝子フラグメント発現アッセイ、および合成ペプチドベースのアッセイを含む。追加の例において、エピトープマッピングを使用して、抗体が結合する配列を決定することができる。エピトープは、線状のエピトープである（すなわち、単一の一続きのアミノ酸に含まれる）か、または必ずしも単一の一続き（一次構造の線状配列）に含まれるとは限らないアミノ酸の三次元相互作用によって形成される立体配座エピトープであり得る。様々な長さ（例として、少なくとも４〜６アミノ酸長）のペプチドを単離または合成（例として、組換え）して、抗体との結合アッセイに使用することができる。別の例において、抗体が結合するエピトープは、標的抗原配列に由来する重複ペプチドを使用し、抗体による結合を決定することにより、系統的なスクリーニングで決定され得る。遺伝子フラグメント発現アッセイに従って、標的抗原をコードするオープンリーディングフレームは、ランダムに、または特定の遺伝子構築によって断片化され、抗原の発現フラグメントと試験される抗体との反応性が決定される。遺伝子フラグメントは、例えば、ＰＣＲによって生産され、次いで、放射性アミノ酸の存在下で、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写され、タンパク質に翻訳され得る。次いで、放射性標識された抗原フラグメントに対する抗体の結合は、免疫沈澱およびゲル電気泳動によって決定される。あるエピトープは、ファージ粒子の表面に表示されるランダムペプチド配列の大きなライブラリー（ファージライブラリー）を使用することによって同定することもできる。代替的に、重複するペプチドフラグメントの定義されたライブラリーを、単純な結合アッセイで試験抗体への結合について試験することができる。追加の例において、抗原結合ドメインの変異誘発、ドメインスワッピング実験、およびアラニン系統的変異導入法（scanning mutagenesis）を実施し、エピトープ結合に必要な、充分な、および／または要される残基を同定することができる。例えば、ドメインスワッピング実験は、標的抗原の変異体を使用して実施することができ、ここで、ＦＯＬＲ１ポリペプチドの様々なフラグメントは、密接に関連しているが抗原的に別個のタンパク質からの配列で置き換えられている（交換されている）。変異体ＦＯＬＲ１に対する抗体の結合を評価することにより、抗体結合に対する特定の抗原フラグメントの重要性を評価することができる。
【００６０】
代替的に、同じ抗原に結合することが知られている他の抗体を使用して競合アッセイを実施し、抗体が他の抗体と同じエピトープに結合するかどうかを決定することができる。競合アッセイは当業者に周知である。
いくつかの例において、抗ＦＯＬＲ１抗体は、以下に例示されるような組換え技術によって調製される。
本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸は、１つの発現ベクターにクローン化することができ、各ヌクレオチド配列は、好適なプロモーターに作動可能に連結されている。一例において、重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列の各々は、別個のプロンプター（prompter）に作動可能に連結されている。代替的に、重鎖および軽鎖をコードするヌクレオチド配列は、重鎖および軽鎖の両方が同じプロモーターから発現されるように、単一のプロモーターと作動可能に連結され得る。必要に応じて、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）は、重鎖と軽鎖のコード配列の間に挿入され得る。
【００６１】
いくつかの例において、抗体の２つの鎖をコードするヌクレオチド配列は、２つのベクターにクローン化され、これは、同じまたは異なる細胞に導入され得る。２つの鎖が異なる細胞で発現される場合、それらの各々は、それを発現する宿主細胞から単離され得、単離された重鎖および軽鎖は、抗体の形成を可能にする好適な条件下で混合およびインキュベートされ得る。
一般に、抗体の１つまたはすべての鎖をコードする核酸配列は、当該技術分野において知られている方法を使用して、好適なプロモーターと作動可能に連結して好適な発現ベクターにクローン化され得る。例えば、ヌクレオチド配列およびベクターは、好適な条件下で、制限酵素と接触させて、互いに対になり、リガーゼと一緒に結合することができる各分子上に相補的末端を作製することができる。代替的に、合成核酸リンカーは遺伝子の末端に連結され得る。これらの合成リンカーは、ベクターにおける特定の制限部位に対応する核酸配列を含む。発現ベクター／プロモーターの選択は、抗体を生産することにおける使用のための宿主細胞のタイプに依存するであろう。
【００６２】
本明細書に記載の抗体の発現のために、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）中間初期プロモーター、ラウス肉腫ウイルスＬＴＲ、ＨＩＶ−ＬＴＲ、ＨＴＬＶ−１ ＬＴＲなどのウイルスＬＴＲ、サルウイルス４０（ＳＶ４０）初期プロモーター、大腸菌ｌａｃ ＵＶ５プロモーター、および単純ヘルペスｔｋウイルスプロモーターを含むが、これらに限定されない、様々なプロモーターを使用することができる。
調節可能なプロモーターも使用することができる。かかる調節可能なプロモーターは、大腸菌由来のｌａｃリプレッサーを転写モジュレーターとして使用して、ｌａｃオペレーターを有する哺乳動物細胞プロモーターからの転写を調節するもの［Brown, M. et al., Cell, 49:603-612 (1987)］、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を使用するもの［Gossen, M., and Bujard, H., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547-5551 (1992); Yao, F. et al., Human Gene Therapy, 9:1939-1950 (1998); Shockelt, P., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)］を含む。他のシステムは、ＦＫ５０６ダイマー、アストラジオールを使用したＶＰ１６またはｐ６５、ＲＵ４８６、ジフェノールムリスレロン、またはラパマイシンを含む。誘導システムは、Invitrogen、ClontechおよびAriadから入手可能である。
【００６３】
オペロンにリプレッサーを含む調節可能なプロモーターを使用することができる。一態様において、大腸菌由来のｌａｃリプレッサーは、転写モジュレーターとして機能して、ｌａｃオペレーターを有する哺乳動物細胞プロモーターからの転写を調節することができる［M. Brown et al., Cell, 49:603-612 (1987)］；Gossen and Bujard (1992)；［M. Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992)］は、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）を、転写アクチベーター（ＶＰ１６）と組み合わせて、ｔｅｔＲ−哺乳動物細胞転写アクチベーター融合タンパク質ｔＴａ（ｔｅｔＲ−ＶＰ１６）を作製し、ヒトサイトメガロウイルス（ｈＣＭＶ）主要前初期プロモーターに由来するｔｅｔＯを有する最小限のプロモーターと組み合わせ、哺乳動物の細胞における遺伝子発現を制御するためのｔｅｔＲ−ｔｅｔオペレーターシステムを作製した。一態様にいて、テトラサイクリン誘導性スイッチが使用される。テトラサイクリンオペレーターがＣＭＶＩＥプロモーターのＴＡＴＡ要素の下流に正しく配置されている場合、ｔｅｔＲ−哺乳動物細胞転写因子融合誘導体ではなく、テトラサイクリンリプレッサー（ｔｅｔＲ）が、単独で、哺乳動物細胞における遺伝子発現を調節する強力なトランスモジュレーターとして機能し得る（Yao et al., Human Gene Therapy）。このテトラサイクリン誘導性スイッチの１つの具体的な利点は、その調節可能な効果を達成するために、場合によっては細胞に対して毒性であり得るテトラサイクリンリプレッサー−哺乳動物細胞トランスアクチベーターまたはリプレッサー融合タンパク質の使用を必要としないことである（Gossen et al., Natl. Acad. Sci. USA, 89:5547-5551 (1992); Shockett et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:6522-6526 (1995)）。
【００６４】
加えて、ベクターは、例えば、以下のいくつかまたはすべてを含み得る：哺乳動物細胞における安定または一過性のトランスフェクタントの選択のためのネオマイシン遺伝子などの選択可能なマーカー遺伝子；高レベルの転写のためのヒトＣＭＶの前初期遺伝子からのエンハンサー／プロモーター配列；ｍＲＮＡの安定性のためのＳＶ４０からの転写終結およびＲＮＡプロセシングシグナル；ＳＶ４０ポリオーマ複製起点および正しいエピソーム複製のためのＣｏｌＥ１；内部リボソーム結合部位（ＩＲＥＳ）、多用途のマルチクローニングサイト；およびセンスおよびアンチセンスＲＮＡのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写用のＴ７およびＳＰ６ ＲＮＡプロモーター。導入遺伝子を含むベクターを生産するための好適なベクターおよび方法は周知であり、当該技術分野で利用可能である。
【００６５】
本明細書に記載の方法を実行するのに有用なポリアデニル化シグナルの例は、ヒトコラーゲンＩポリアデニル化シグナル、ヒトコラーゲンＩＩポリアデニル化シグナル、およびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルを含むが、これらに限定されない。
抗体のいずれかをコードする核酸を含む１以上のベクター（例として、発現ベクター）は、抗体を生産するための好適な宿主細胞に導入され得る。宿主細胞は、抗体またはその任意のポリペプチド鎖の発現に好適な条件下で培養され得る。かかる抗体またはそのポリペプチド鎖は、従来の方法、例として、アフィニティー精製を介して、培養された細胞によって（例として、細胞または培養上清から）回収され得る。必要に応じて、抗体のポリペプチド鎖は、抗体の産生を可能にする好適な条件下で好適な期間インキュベートされ得る。
【００６６】
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体を調製するための方法は、本明細書にも記載されるように、抗ＦＯＬＲ１抗体の重鎖および軽鎖の両方をコードする組換え発現ベクターを含む。組換え発現ベクターは、従来の方法、例として、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによって、好適な宿主細胞（例として、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞）に導入され得る。抗体を形成する２つのポリペプチド鎖の発現を可能にする好適な条件下で、陽性の形質転換体宿主細胞を選択および培養することができ、これは細胞または培養培地から回収することができる。必要に応じて、宿主細胞から回収された２つの鎖を、抗体の形成を可能にする好適な条件下でインキュベートすることができる。
【００６７】
一例において、２つの組換え発現ベクターが提供され、１つは抗ＦＯＬＲ１抗体の重鎖をコードし、もう１つは抗ＦＯＬＲ１抗体の軽鎖をコードする。２つの組換え発現ベクターの両方は、従来の方法、例として、リン酸カルシウム媒介性トランスフェクションによって、好適な宿主細胞（例として、ｄｈｆｒ−ＣＨＯ細胞）に導入され得る。代替的に、発現ベクターの各々は、好適な宿主細胞に導入され得る。抗体のポリペプチド鎖の発現を可能にする好適な条件下で、陽性の形質転換体を選択および培養することができる。２つの発現ベクターが同じ宿主細胞に導入される場合、そこで生産された抗体は、宿主細胞または培養培地から回収され得る。必要に応じて、ポリペプチド鎖は、宿主細胞または培養培地から回収し、次いで抗体の形成を可能にする好適な条件下でインキュベートされ得る。２つの発現ベクターが異なる宿主細胞に導入されるとき、それらの各々は、対応する宿主細胞または対応する培養培地から回収され得る。次いで、２つのポリペプチド鎖は、抗体の形成に好適な条件下でインキュベートされ得る。
【００６８】
標準的な分子生物学技法を使用して、組換え発現ベクターを調製し、宿主細胞をトランスフェクトし、形質転換体を選択し、宿主細胞を培養し、そして培養培地から抗体を回収する。例えば、いくつかの抗体は、プロテインＡまたはプロテインＧ結合マトリックスによるアフィニティークロマトグラフィーによって単離され得る。
本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体の重鎖、軽鎖、またはその両方をコードする核酸のいずれか、それを含むベクター（例として、発現ベクター）；およびベクターを含む宿主細胞は、本開示の範囲内である。
【００６９】
抗体−薬物抱合体
本開示はまた、治療剤に共有結合している、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれかを含む抗体−薬物抱合体を提供する。本明細書に使用される「抗体−薬物抱合体」または「ＡＤＣ」という用語は、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体および治療剤が共有結合している抱合体を指す。一般に、この抗体−薬物抱合体は、抗ＦＯＬＲ１抗体、治療剤、および任意に抗体と治療剤との間のリンカーを含み得る。ＡＤＳは、抗体によって標的とされるＦＯＬＲ１＋細胞、とりわけＦＯＬＲ１＋がん細胞に治療剤を送達することによって治療効果を増加させ得る。抗体−薬物抱合体は、当該技術分野において知られている抗体−薬物抱合体を調製する様々な方法によって調製され得る。
【００７０】
本明細書に記載のＡＤＣの治療剤は、毒素、化学治療剤、抗生物質、ＡＤＰ−リボシルトランスフェラーゼ、放射性同位体または核酸分解酵素であり得る。いくつかの場合において、治療剤は細胞毒性剤である。例は、アントラサイクリン、アウリスタチン（例として、アウリスタチンＥ）、カンプトテシン、コンブレタステイン（combretastain）、ドラスタチン、デュオカルマイシン、エンジイン、ゲルダナマイシン、インドリノ−ベンゾジアゼピンダイマー、メイタンシン、ピューロマイシン、ピロロベンゾジアゼピンダイマー、タキサン、ビンカアルカロイド、ツブリシン、ヘミアステリン、スプリセオスタチン、プラジエノリド、およびカリケアマイシンを含むが、これらに限定されない。
【００７１】
いくつかの態様において、抗ＦＯＬＲ１抗体および治療剤は、リンカーを介して接続されている。かかるリンカーは、切断可能なリンカー、例えば、あるｐＨ条件下で切断可能（ｐＨ感受性リンカー）、プロテアーゼによって切断可能（プロテアーゼ感受性リンカー）、またはグルタチオンの存在下で切断可能（グルタチオン感受性リンカー）であり得る。いくつかの例において、リンカーは、プロテアーゼ切断部位を含み、これは、好適なプロテアーゼによって認識可能および／または切断可能である２〜５個のアミノ酸残基を含み得る。かかるペプチドは、天然に存在するアミノ酸残基、天然に存在しないアミノ酸残基、またはそれらの組み合わせを含み得る。一例において、ペプチドリンカーは、ジペプチドリンカーであり得る。例は、バリン−シトルリン（ｖａｌ−ｃｉｔ）リンカー、フェニルアラニン−リシン（ｐｈｅ−ｌｙｓ）リンカー、またはマレイミドカプロン−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ｖｃ）リンカーを含む。代替的に、リンカーは、切断不可能であり得、例として、任意に置換されていてもよいアルカンまたはチオエーテルを含むリンカーであり得る。
【００７２】
いくつかの例において、リンカーは、抗体と共有結合を形成することができる官能基を含み得る。例示の官能基は、マレイミド基、ヨードアセトアミド基、ビニルスルホン基、アクリラート基、アクリルアミド基、アクリロニトリル基、またはメタクリラート基を含むが、これらに限定されない。いくつかの場合において、リンカーは、アセチル−リシン−バリン−シトルリン−ｐ−アミノベンジルオキシカルボニル（ＡｃＬｙｓ−ＶＣ−ＰＡＢＣ）またはアミノＰＥＧ６−プロピオニルを含むが、これらに限定されない、１以上の反応性アミンを含み得る。例として、ＷＯ２０１２／０５９８８２を参照。他の例示のリンカーは、スルホスクシンイミジル−４−［Ｎマレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシラート（ｓｍｃｃ）を含む。スルホ−ｓｍｃｃ抱合は、スルフヒドリル（チオール、−ＳＨ）と反応するマレイミド基を介して生じるが、そのスルホ−ＮＨＳエステルは第一級アミン（リシンおよびタンパク質またはペプチドのＮ末端に見られる）に対して反応性である。
【００７３】
いくつかの例において、リンカーは分子スペーサー、例えば、式Ｉ：
【化８】
2021531825.tif 000013
式中、Ｒ１は、任意に置換されていてもよいＣ１〜６アルキル（例として、Ｃ１〜３アルキル）、任意に置換されていてもよいフェニル、任意に置換されていてもよいＣ２〜６アルキレン、任意に置換されていてもよいＣ２〜６アルケニレン、任意に置換されていてもよいＣ２〜６アルキニレン、または任意に置換されていてもよいトリアゾールであり得；および／または、Ｘは、Ｏ、Ｓ、またはＮであり得る、で表される部分を含み得る。
【００７４】
細胞毒性剤または他の治療剤を抗体に抱合させるための方法は、当該技術分野において知られており、様々な刊行物に記載されている。例えば、化学的改変は、リシン側鎖アミンを通じて、または抱合反応が起こるために鎖間ジスルフィド結合を還元することによって活性化されるシステインスルフヒドリル基を通じて、抗体においてなされ得る。例として、Tanaka et al., FEBS Letters 579:2092-2096, (2005)、およびGentle et al., Bioconjug. Chem. 15:658-663, (2004)を参照。定義された化学量論による特定の薬物抱合のための抗体の特定の部位で操作された反応性システイン残基も記載されている。例として、Junutula et al., Nature Biotechnology, 26:925-932, (2008)を参照。アシルドナーグルタミン含有タグおよび／またはトランスグルタミナーゼおよびアミン、例えば、反応性アミンで改変された細胞毒性剤の存在下でポリペプチド工学によって反応性にされた内在性グルタミンを使用する抱合もまた、ＷＯ２０１２／０５９８８２、Strop et al., Chem. Biol. 20(2):161-167 (2013)、およびFarias et al., Bioconjug. Chem. 25(2):245-250 (2014)に記載されている。かかる刊行物の関係のある開示は、そこで参照される目的および主題のために参照により本明細書に組み込まれる。
【００７５】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）およびそれを発現する免疫細胞
本開示はまた、ＦＯＬＲ１およびそれを発現する免疫細胞を標的とするキメラ抗原受容体を特徴とする。本明細書に開示されるキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、上皮由来がん細胞などのＦＯＬＲ１＋細胞にそれを発現する免疫細胞（例として、Ｔ細胞）の結合特異性を向け直し、それによって、例として、免疫細胞のエフェクター活性を介して、標的疾患細胞を排除する人工細胞表面受容体である。ＣＡＲ構築物は、しばしば、少なくとも細胞内シグナル伝達ドメインに融合された細胞外抗原結合ドメインを含む。Cartellieri et al., J Biomed Biotechnol 2010:956304, 2010。単鎖抗体フラグメント（ｓｃＦｖ）であり得る細胞外抗原結合ドメインは、ＦＯＬＲ１抗原に特異的であり、細胞内シグナル伝達ドメインは、免疫細胞の活性化につながる細胞シグナル伝達を仲介し得る。そのため、ＦＯＬＲ１に特異的なＣＡＲ構築物を発現する免疫細胞は、ＦＯＬＲ１を発現する疾患細胞（例として、腫瘍細胞）に結合することができ、免疫細胞の活性化および疾患細胞の排除をもたらす。
【００７６】
本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれかを使用して、本明細書にも記載されているＣＡＲ構築物を生産することができる。例えば、抗ＦＯＬＲ１抗体のＶＨおよびＶＬドメインは、細胞内シグナル伝達ドメイン（単数または複数）に融合されて、従来の組換え技術を使用してＣＡＲ構築物を生産することができる。いくつかの例において、抗ＦＯＬＲ１のＶＨおよびＶＬドメインは、ペプチドリンカーを介して接続されて、ｓｃＦｖフラグメントを形成する。
【００７７】
本明細書に開示のＣＡＲ構築物は、１以上の細胞内シグナル伝達ドメインを含み得る。いくつかの例において、ＣＡＲは、免疫受容体チロシンベースの活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む細胞内シグナル伝達ドメインを含む。かかる細胞内シグナル伝達ドメインはＣＤ３ζに由来し得る。加えて、ＣＡＲ構築物は、１以上の共刺激シグナル伝達ドメインをさらに含み得、これは、例えば、４−１ＢＢ（ＣＤ１３７）、ＣＤ７、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ４０、ＯＸ４０、ＩＣＯＳ、ＧＩＴＲ、ＨＶＥＭ、ＴＩＭ１、またはＬＦＡ−１からの共刺激性受容体に由来し得る。
【００７８】
本明細書に開示のＣＡＲ構築物は、好適な細胞表面受容体、例えば、ＣＤ２８またはＣＤ８から得ることができる膜貫通ヒンジドメインをさらに含み得る。
本明細書に開示の抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲのいずれかをコードする単離された核酸分子およびベクター、および核酸分子またはベクターを含む宿主免疫細胞（例として、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞）などの宿主細胞も提供される。ＦＯＬＲ１特異的抗体結合フラグメントを含む抗ＦＯＬＲ１ ＣＡＲを発現する免疫細胞は、ＦＯＬＲ１を発現するがんの処置に使用され得る。よって、本明細書では、ＦＯＬＲ１を発現するがんを有する対象を選択し、ＦＯＬＲ１を標的とするＣＡＲを発現する治療的に有効な量の免疫細胞を対象に投与することにより、ＦＯＬＲ１＋がんを有する対象を処置する方法も提供される。
【００７９】
医薬組成物
抗ＦＯＬＲ１抗体、コードする核酸または核酸セット、それを含むベクター、または本明細書に記載のベクターを含む宿主細胞、ならびに抗ＦＯＬＲ１抗体を含むＡＤＣおよび／またはＦＯＬＲ１を標的とするＣＡＲを発現する免疫細胞は、薬学的に許容し得る担体（賦形剤）と混合して、標的疾患を処置することにおける使用のための医薬組成物を形成し得る。「許容し得る」は、担体が組成物の活性成分と適合性でなければならず（そして好ましくは、活性成分を安定化することが可能であり）、処置される対象に有害であってはならないことを意味する。薬学的に許容し得る賦形剤（担体）は、当該技術分野において周知であるバッファーを含む。例として、Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hooverを参照。
【００８０】
本方法で使用される医薬組成物は、凍結乾燥された製剤または水溶液の形態で、薬学的に許容し得る担体、賦形剤、または安定剤を含み得る。(Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover)。許容し得る担体、賦形剤、または安定剤は、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、以下を含み得る：ホスファート、シトラート、および他の有機酸などのバッファー；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；防腐剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム塩化物；ヘキサメトニウム塩化物；塩化ベンザルコニウム、ベンズエトニウム塩化物；フェノール、ブチルまたはベンジルアルコール；メチルまたはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、またはリシンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、またはデキストランを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロースまたはソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩を形成する対イオン；金属複合体（例として、Ｚｎ−タンパク質複合体）；および／またはＴＷＥＥＮ（商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（商標）またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの非イオン性界面活性剤。
【００８１】
いくつかの例において、本明細書に記載の医薬組成物は、抗体（またはコードする核酸、またはＡＤＣ）を含むリポソームを含み、これは、Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985)；Hwang, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030 (1980)；および米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号に記載されるような当該技術分野において知られている方法によって調製され得る。増強された循環時間を有するリポソームは、米国特許第５，０１３，５５６号に開示されている。特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロールおよびＰＥＧ誘導体化ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥＧ−ＰＥ）を含む脂質組成物を用いた逆相蒸発法によって生成され得る。リポソームは、定義された孔径のフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームを生産する。
【００８２】
抗体、コードする核酸（単数または複数）、またはＡＤＣはまた、コロイド状薬物送達システム（例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子およびナノカプセル）またはマクロエマルションにおいて、例えば、コアセルベーション技法によって、または界面重合によって調製されたマイクロカプセル（例えば、それぞれ、ヒドロキシメチルセルロースまたはゼラチン−マイクロカプセルおよびポリ−（メチルメタシレート）マイクロカプセル）に封入され得る。かかる技術は、当該技術分野において知られており、例えば、Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)を参照。
【００８３】
他の例において、本明細書に記載の医薬組成物は、徐放性フォーマットで製剤化され得る。徐放性調製物の好適な例は、抗体を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリックスを含み、このマトリックスは、成形品の形態（例として、フィルムまたはマイクロカプセル）である。徐放性マトリックスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル（例えば、ポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリラート）またはポリ（ビニルアルコール））、ポリラクチド（米国特許第３，７７３，９１９号）、Ｌ−グルタミン酸および７エチル−Ｌ−グルタマートのコポリマー、非分解性エチレン−酢酸ビニル、ＬＵＰＲＯＮ ＤＥＰＯＴ（商標）（乳酸−グリコール酸コポリマーおよびリュープロリドアセタートから構成される注射可能なミクロスフェア）などの分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、スクロースアセタートイソブチラート、およびポリ−Ｄ−（−）−３−ヒドロキシ酪酸を含む。
【００８４】
ｉｎ ｖｉｖｏ投与に使用される医薬組成物は、滅菌されていなければならない。これは、例えば、滅菌濾過膜を通じた濾過によって容易に達成される。治療用抗体組成物は、一般に、滅菌アクセスポートを有する容器、例えば、皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有する静脈内溶液バッグまたはバイアルに入れられる。
本明細書に記載の医薬組成物は、経口、非経口または直腸投与、または吸入または吹送による投与のために、錠剤、丸薬、カプセル、粉末、顆粒、溶液または懸濁液、または坐薬などの単位剤形であり得る。
【００８５】
錠剤などの固体組成物を調製するために、主要な活性成分は、医薬担体、例として、コーンスターチ、ラクトース、スクロース、ソルビトール、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、リン酸二カルシウムまたはガム、および、他の医薬希釈剤（例として、水）などの従来の錠剤成分と混合され、本発明の化合物またはその非毒性の薬学的に許容し得る塩の均一な混合物を含む固体の予備製剤組成物を形成し得る。これらの予備製剤組成物を均一であると呼ぶとき、それは、組成物が錠剤、丸薬およびカプセルなどの同等に有効な単位剤形に容易に細分され得るように、活性成分が組成物全体に均等に分散されることを意味する。次いで、この固体予備製剤組成物は、０．１〜約５００ｍｇの本発明の活性成分含む上記のタイプの単位剤形に細分される。新規組成物の錠剤または丸薬は、コーティングされるか、さもなければ配合されて、持続的な作用の利点を与える剤形を提供し得る。例えば、錠剤または丸薬は、内部投薬量および外部投薬量の構成要素を含むことができ、後者は前者を覆うエンベロープの形態である。２つの構成要素は、胃での崩壊に抵抗し、内部構成要素がインタクトで十二指腸へ通過するか、または放出が遅れることを可能にするように役立つ腸内層によって分離され得る。様々な材料は、かかる腸内層またはコーティングに使用され得、かかる材料は、数多のポリマー酸およびポリマー酸とシェラック、セチルアルコールおよびセルロースアセタートなどの材料との混合物を含む。
【００８６】
好適な界面活性剤は、とりわけ、ポリオキシエチレンソルビタン（例として、Ｔｗｅｅｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）および他のソルビタン（例として、Ｓｐａｎ（商標）２０、４０、６０、８０または８５）などの非イオン性薬剤を含む。界面活性剤を有する組成物は、便宜上、０．０５％と５％との間の界面活性剤を含み、０．１％と２．５％との間であり得る。必要に応じて、他の成分、例えばマンニトールまたは他の薬学的に許容し得るビヒクルを加えることができることが理解されよう。
【００８７】
好適なエマルションは、Ｉｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）、Ｌｉｐｏｓｙｎ（商標）、Ｉｎｆｏｎｕｔｒｏｌ（商標）、Ｌｉｐｏｆｕｎｄｉｎ（商標）およびＬｉｐｉｐｈｙｓａｎ（商標）などの市販の脂肪エマルションを使用して調製され得る。活性成分は、予め混合されたエマルション組成物に溶解され得るか、または代替的に、油（例として、大豆油、サフラワー油、綿実油、ゴマ油、トウモロコシ油または扁桃油）およびリン脂質（例として、卵リン脂質、大豆リン脂質または大豆レシチン）および水と混合時に形成されるエマルションに溶解され得る。エマルションの浸透圧を調整するために、他の成分、例えば、グリセロールまたはグルコースを加えることができることが理解されよう。好適なエマルションは、典型的には２０％まで、例えば５％と２０％との間の油を含む。
【００８８】
エマルション組成物は、抗体をＩｎｔｒａｌｉｐｉｄ（商標）またはその構成要素（大豆油、卵リン脂質、グリセロールおよび水）と混合することによって調製されたものであり得る。
吸入または吹送のための医薬組成物は、薬学的に許容し得る水性または有機溶媒、またはそれらの混合物中の溶液および懸濁液、および粉末を含む。液体または固体の組成物は、上記のような好適な薬学的に許容し得る賦形剤を含み得る。いくつかの態様において、組成物は、局所的または全身的効果のために経口または経鼻呼吸ルートによって投与される。
好ましくは滅菌された薬学的に許容し得る溶媒中の組成物は、ガスの使用によって噴霧され得る。噴霧された溶液は、噴霧デバイスから直接呼吸することができるか、または噴霧デバイスをフェイスマスク、テントまたは断続的な陽圧呼吸機に取り付けることができる。溶液、懸濁液または粉末組成物は、適切な様式で製剤を送達するデバイスから、好ましくは経口的または経鼻的に投与され得る。
【００８９】
処置および診断の方法
本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体、コードする核酸または核酸セット、それを含むベクター、抗ＦＯＬＲ１抗体を含むＡＤＣ、およびＦＯＬＲ１を標的とするＣＡＲを発現する免疫細胞（例として、Ｔ細胞またはＮＫ細胞）のいずれかは、ＦＯＬＲ１＋がん細胞などのＦＯＬＲ１＋疾患細胞を阻害および／または排除するために有用であり、それにより、ＦＯＬＲ１＋疾患細胞に関連する疾患または障害の処置に利益をもたらす。
本明細書に開示の方法を実行するために、本明細書に記載の有効量の医薬組成物は、例として、筋肉内、腹腔内、脳脊髄内、皮下、関節内、滑液嚢内、髄腔内、経口、吸入または局所ルートによる、ボーラスとして、またはある期間にわたる連続的な注入によって、静脈内投与などの好適なルートを介して処置を必要とする対象（例として、ヒト）に投与され得る。ジェット噴霧器および超音波噴霧器を含む、液体製剤用の市販の噴霧器は、投与に有用である。液体製剤は直接噴霧することができ、凍結乾燥粉末は再構成後に噴霧することができる。代替的に、本明細書に記載の抗体は、フッ化炭素製剤および定量吸入器を使用してエアロゾル化するか、または凍結乾燥および製粉された粉末として吸入することができる。
【００９０】
本明細書に記載の方法によって処置される対象は、哺乳動物、より好ましくはヒトであり得る。哺乳動物は、家畜、スポーツ動物、ペット、霊長目の動物、ウマ、イヌ、ネコ、マウスおよびラットを含むが、これらに限定されない。処置を必要とするヒト対象は、ＦＯＬＲ１＋疾患細胞に関連する標的疾患／障害を有するリスクがある、またはこれを有する疑いのあるヒト患者であり得る。いくつかの態様において、ＦＯＬＲ１＋疾患細胞は、がん細胞、例えば、上皮がん細胞（すなわち、上皮細胞に由来する）である。例は、卵巣がん細胞、乳がん細胞、腎がん細胞、肺がん細胞、結腸直腸がん細胞、および脳がん細胞を含むが、これらに限定されない。標的疾患または障害を有する対象は、定型的な健康診断、例として、臨床検査、臓器機能検査、ＣＴスキャン、または超音波によって特定され得る。かかる標的疾患／障害のいずれかを有すると疑われる対象は、疾患／障害の１以上の症状を示し得る。疾患／障害のリスクがある対象は、その疾患／障害の１以上のリスク因子を有する対象であり得る。
【００９１】
本明細書に使用されるとき、「有効量」は、単独で、または１以上の他の活性剤と組み合わせて、対象に治療的な効果を与えるのに必要な各活性剤の量を指す。いくつかの態様において、治療的な効果は、減少したＦＯＬＲ１活性またはＦＯＬＲ１＋細胞の活性である。抗体またはそれを含む他の治療剤（例として、ＡＤＣまたはＣＡＲ−Ｔ細胞）の量が治療的な効果を達成したかどうかの決定は、当業者には明らかであろう。当業者によって認識されるように、有効量は、処置される特定の状態、状態の重症度、年齢、体調、サイズ、性別および体重を含む個々の患者パラメータ、処置期間、併用治療の性質（もしあれば）、特定の投与のルート、および医療従事者の知識および専門知識内の同様の因子に応じて変わる。これらの因子は当業者に周知であり、定型的な実験法のみで対処することができる。一般に、個々の構成要素またはそれらの組み合わせの最大用量、すなわち、健全な医学的判断による最高の安全用量を使用することが好ましい。
【００９２】
半減期などの経験的考察は、一般的に投薬量の決定に貢献する。例えば、ヒト化抗体または完全ヒト抗体などのヒト免疫系に適合する抗体を使用して、抗体の半減期を延長し、抗体が宿主の免疫系によって攻撃されるのを防ぐことができる。投与の頻度は、治療の過程にわたって決定および調整することができ、一般に、必ずしもそうではないが、標的疾患／障害の処置および／または抑制および／または寛解および／または遅延に基づく。代替的に、抗体の連続的徐放性製剤が適切であり得る。徐放を達成するための様々な製剤およびデバイスは、当該技術分野において知られている。
一例において、本明細書に記載の抗体の投薬量は、抗体の１以上の投与（単数または複数）を受けた個体において経験的に決定され得る。個体には、アンタゴニストの漸増投薬量が与えられる。アンタゴニストの有効性を評価するために、疾患／障害の指標を追跡することができる。
【００９３】
一般に、抗ＦＯＬＲ１抗体または本明細書に記載のそれを含むＡＤＣのいずれかの投与の場合、初期候補投薬量は、約２ｍｇ／ｋｇであり得る。本開示の目的のために、典型的な毎日の投薬量は、上に言及された因子に応じて、およそ、０．１μｇ／ｋｇ〜３μｇ／ｋｇ〜３０μｇ／ｋｇ〜３００μｇ／ｋｇ〜３ｍｇ／ｋｇ〜３０ｍｇ／ｋｇ〜１００ｍｇ／ｋｇまたはそれより大きいもののいずれかの範囲であり得る。状態に応じて、数日以上の反復投与の場合、症状の所望の抑制が起こるまで、または標的疾患または障害、またはその症状を緩和するのに充分な治療レベルが達成されるまで、処置が持続される。例示の投薬レジメンは、約２ｍｇ／ｋｇの初期用量、これに続き約１ｍｇ／ｋｇの抗体の毎週の維持用量、またはこれに続き隔週で約１ｍｇ／ｋｇの維持用量を投与することを含む。しかしながら、従事者が達成したい薬物動態学的崩壊のパターンに応じて、他の投薬レジメンが有用であり得る。例えば、週に１〜４回の投薬が企図される。いくつかの態様において、約３μｇ／ｍｇ〜約２ｍｇ／ｋｇの範囲の投薬（約３μｇ／ｍｇ、約１０μｇ／ｍｇ、約３０μｇ／ｍｇ、約１００μｇ／ｍｇ、約３００μｇ／ｍｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、および約２ｍｇ／ｋｇなど）が使用され得る。いくつかの態様において、投薬頻度は、毎週、２週間ごと、４週間ごと、５週間ごと、６週間ごと、７週間ごと、８週間ごと、９週間ごと、または１０週間ごとに１回であるか、または、毎月、２か月ごと、または３か月ごとに１回、またはそれよりも長い期間に１回である。この治療の進行は、従来の技法およびアッセイによって容易にモニタリングされる。投薬レジメン（使用される抗体を含む）は、経時的に変化し得る。
【００９４】
本開示の目的のために、本明細書に記載の抗体の適切な投薬量は、用いる特定の抗体（単数）、抗体（複数）、および／または非抗体ペプチド（またはその組成物）、疾患／障害のタイプおよび重症度、抗体が予防または治療目的のどちらで投与されるか、以前の治療、患者の病歴およびアンタゴニストに対する応答、および主治医の裁量に依存する。典型的には、臨床医は、所望の結果を達成する投薬量に達するまで、抗体を投与する。いくつかの態様において、所望の結果は、血栓症の減少である。投薬量が所望の結果をもたらしたかどうかを決定する方法は、当業者に明らかであろう。１以上の抗体の投与は、例えば、レシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的または予防的であるかどうか、および熟練した従事者に知られている他の因子に応じて、連続的または断続的であり得る。抗体の投与は、事前に選択された期間にわたって本質的に連続的であり得るか、または一連の間隔を置いた投与であり得、例として、標的疾患または障害の発症前、発症中、または発症後のいずれかのものであり得る。
【００９５】
本明細書に使用されるとき、「処置する」という用語は、障害、疾患の症状、または疾患または障害に対する素因を治癒（cure）、治癒（heal）、緩和、軽減、変更、治療、寛解、または改善すること、またはこれに影響を与えることを目的として、標的疾患または障害、疾患／障害の症状、または疾患／障害に対する素因を有する対象への１以上の活性剤を含む組成物の適用または投与を指す。
標的疾患／障害を緩和することは、疾患の発症または進行を遅延させること、または疾患の重症度を減少させることを含む。疾患を緩和することは必ずしも治癒的な結果を必要としない。本明細書に使用されるとき、標的疾患または障害の発症を「遅延させる」とは、疾患の進行を延期（defer）、妨害、遅延（slow）、遅延（retard）、安定化、および／または延期（postpone）することを意味する。この遅延は、病歴および／または処置されている個体に応じて、様々な長さの時間のものであり得る。疾患の発症を「遅延させる」または緩和する、または疾患の発病を遅延させる方法は、該方法を使用しない場合と比較して、所与の時間枠において疾患の１以上の症状を発症する可能性を減少させ、および／または所与の時間枠において症状の程度を減少させる方法である。かかる比較は典型的には、統計的に有意な結果をもたらすのに充分な数の対象を使用した臨床研究に基づく。
【００９６】
疾患の「発症」または「進行」は、疾患の初期症状および／またはその後の進行を意味する。疾患の発症は、当該技術分野において周知である標準的な臨床技法を使用して検出および評価され得る。しかしながら、発症は、検出不可能であり得る進行も指す。本開示の目的のために、発症または進行は、症状の生物学的経過を指す。「発症」は、発生、再発、および発症を含む。本明細書に使用されるとき、標的疾患または障害の「発病」または「発生」は、初期の発病および／または再発を含む。
いくつかの態様において、本明細書に記載の抗体は、標的抗原の一方または両方の活性をｉｎ ｖｉｖｏで少なくとも２０％（例として、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上）阻害するのに充分な量で、処置を必要とする対象に投与される。他の態様において、抗体は、標的抗原の活性レベルを少なくとも２０％（例として、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、または９０％以上）減少させるのに有効な量で投与される。
【００９７】
処置される疾患のタイプまたは疾患の部位に応じて、医学の当業者に知られている従来の方法を使用して、対象に医薬組成物を投与することができる。この組成物はまた、他の従来のルート、例として、経口的に、非経口的に、吸入スプレーによって、局所的に、経直腸的に、経鼻的に、口腔内に、膣内に、または移植されたリザーバを介して投与され得る。本明細書に使用される「非経口」という用語は、皮下、皮内、静脈内、筋肉内、関節内、動脈内、滑液嚢内、胸骨内、髄腔内、病巣内、および頭蓋内の注射または注入技法を含む。加えて、それは、１ヶ月、３ヶ月、または６ヶ月のデポ注射可能または生分解性の材料および方法を使用するなどして投与の注射可能なデポルートを介して対象に投与することができる。いくつかの例において、医薬組成物は、眼内または硝子体内に投与される。
【００９８】
注射可能な組成物は、植物油、ジメチルアクタミド、ジメチルホルムアミド、エチルラクタート、エチルカーボネート、イソプロピルミリスタート、エタノール、およびポリオール（グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）などの様々な担体を含み得る。静脈内注射の場合、水溶性抗体を点滴法で投与することができ、それにより、抗体および生理学的に許容し得る賦形剤を含む医薬製剤が注入される。生理学的に許容し得る賦形剤は、例えば、５％デキストロース、０．９％生理食塩水、リンガー溶液、または他の好適な賦形剤を含み得る。筋肉内調製物、例として、抗体の好適な可溶性塩形態の滅菌製剤は、注射用水、０．９％生理食塩水、または５％グルコース溶液などの医薬賦形剤に溶解および投与することができる。
【００９９】
一態様において、抗体は、部位特異的または標的化された局部送達技法を介して投与される。部位特異的または標的化された局部送達技法の例は、抗体の様々な移植可能なデポ源、または注入カテーテル、留置カテーテル、または針カテーテルなどの局部送達カテーテル、合成グラフト、外来ラップ、シャントおよびステント、または他の移植可能なデバイス、部位特異的担体、直接注射、または直接適用を含む。例として、ＰＣＴ公開番号ＷＯ００／５３２１１および米国特許第５，９８１，５６８号を参照。
アンチセンスポリヌクレオチド、発現ベクター、またはサブゲノムポリヌクレオチドを含む治療組成物の標的化送達も使用することができる。受容体媒介性ＤＮＡ送達技法は、例えば、Findeis et al., Trends Biotechnol. (1993) 11:202; Chiou et al., Gene Therapeutics: Methods And Applications Of Direct Gene Transfer (J. A. Wolff, ed.) (1994); Wu et al., J. Biol. Chem. (1988) 263:621; Wu et al., J. Biol. Chem. (1994) 269:542; Zenke et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1990) 87:3655; Wu et al., J. Biol. Chem. (1991) 266:338に記載されている。
【０１００】
ポリヌクレオチドを含む治療組成物（例として、本明細書に記載の抗体をコードするもの）は、遺伝子治療プロトコルにおける局部投与のために、約１００ｎｇ〜約２００ｍｇの範囲で投与される。いくつかの態様において、約５００ｎｇ〜約５０ｍｇ、約１μｇ〜約２ｍｇ、約５μｇ〜約５００μｇ、および約２０μｇ〜約１００μｇまたはそれよりも大きいＤＮＡの濃度範囲もまた、遺伝子治療プロトコル中に使用され得る。
本明細書に記載の治療用ポリヌクレオチドおよびポリペプチドは、遺伝子送達ビヒクルを使用して送達することができる。遺伝子送達ビヒクルは、ウイルス起源または非ウイルス起源のものであり得る（一般に、Jolly, Cancer Gene Therapy (1994) 1:51; Kimura, Human Gene Therapy (1994) 5:845; Connelly, Human Gene Therapy (1995) 1:185; およびKaplitt, Nature Genetics (1994) 6:148を参照）。かかるコード配列の発現は、内在性の哺乳類の動物または異種のプロモーターおよび／またはエンハンサーを使用して誘導することができる。コード配列の発現は、構成的または調節的のいずれかであり得る。
【０１０１】
所望のポリヌクレオチドの送達および所望の細胞における発現のためのウイルスベースのベクターは、当該技術分野において周知である。例示のウイルスベースのビヒクルは、組換えレトロウイルス（例として、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／０７９３６；ＷＯ９４／０３６２２；ＷＯ９３／２５６９８；ＷＯ９３／２５２３４；ＷＯ９３／１１２３０；ＷＯ９３／１０２１８；ＷＯ９１／０２８０５；米国特許第５，２１９，７４０号および第４，７７７，１２７号；英国特許第２，２００，６５１号；および欧州特許第０ ３４５ ２４２号を参照）、アルファウイルスベースのベクター（例として、シンドビスウイルスベクター、セムリキフォレストウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−６７；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４７）、ロスリバーウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−３７３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２４６）およびベネズエラウマ脳炎ウイルス（ＡＴＣＣ ＶＲ−９２３；ＡＴＣＣ ＶＲ−１２５０；ＡＴＣＣ ＶＲ １２４９；ＡＴＣＣ ＶＲ−５３２））、およびアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター（例として、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９４／１２６４９、ＷＯ９３／０３７６９；ＷＯ９３／１９１９１；ＷＯ９４／２８９３８；ＷＯ９５／１１９８４およびＷＯ９５／００６５５を参照）を含むが、これに限定されない。Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147に記載されているような殺されたアデノウイルスに連結されたＤＮＡの投与もまた用いることができる。
【０１０２】
非ウイルス送達ビヒクルおよび方法も用いることができ、これは、殺されたアデノウイルス単独に連結されたまたは連結されていないポリカチオン性凝縮ＤＮＡ（例として、Curiel, Hum. Gene Ther. (1992) 3:147を参照)；リガンドに連結されたＤＮＡ（例として、Wu, J. Biol. Chem. (1989) 264:16985を参照）；真核細胞送達ビヒクル細胞（例として、米国特許第５，８１４，４８２号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／０７９９４；ＷＯ９６／１７０７２；ＷＯ９５／３０７６３；およびＷＯ９７／４２３３８を参照）および核酸電荷の中和または細胞膜との融合を含むが、これらに限定されない。ネイキッド（naked）ＤＮＡも用いられ得る。例示のネイキッドＤＮＡ導入方法は、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９０／１１０９２および米国特許第５，５８０，８５９号に記載されている。遺伝子送達ビヒクルとして作用し得るリポソームは、米国特許第５，４２２，１２０号；ＰＣＴ公開番号ＷＯ９５／１３７９６；ＷＯ９４／２３６９７；ＷＯ９１／１４４４５；および欧州特許第０５２４９６８号に記載されている。追加のアプローチは、Philip, Mol. Cell. Biol. (1994) 14:2411、およびWoffendin, Proc. Natl. Acad. Sci. (1994) 91:1581に記載されている。
【０１０３】
本明細書に記載の方法で使用される特定の投薬レジメン、すなわち、用量、タイミング、および反復は、特定の対象およびその対象の病歴に依存するであろう。
ＦＯＬＲ１を標的とするＣＡＲを発現する免疫細胞を疾患の処置に使用するとき、患者は、Ｔリンパ球またはＮＫ細胞などの治療的に有効な用量のかかる免疫細胞を体重の１キログラムあたり約１０５〜１０１０個（細胞／Ｋｇ）またはそれ以上の範囲で注入することによって処置できる。注入は、所望の応答が達成されるまで、患者が耐えることができる限り何度でも繰り返すことができる。適切な注入量およびスケジュールは患者ごとに異なるが、特定の患者の処置を行う医者によって決定され得る。典型的には、およそ１０６細胞／Ｋｇの初期用量が注入され、１０８細胞／Ｋｇ以上にまで増加する。ＩＬ−２は、注入された細胞を拡大するために同時投与され得る。ＩＬ−２の量は、体表面積１平方メートルあたり約１〜５ｘ１０６国際単位であり得る。
【０１０４】
いくつかの態様において、２以上の抗体、または抗体と別の好適な治療剤との組み合わせは、処置を必要とする対象に投与され得る。抗体、ＡＤＣおよび／またはそれを含むＣＡＲ−Ｔ細胞はまた、薬剤の有効性を増強および／または補完するのに役立つ他の薬剤と併せて使用され得る。
標的疾患／障害の処置の有効性は、当該技術分野において周知である方法によって評価され得る。
本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれも、試料中のＦＯＬＲ１＋細胞の存在またはレベルを検出するために使用することができる。かかる診断アッセイは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで実施され得る。
【０１０５】
診断用途の場合、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏのいずれかの診断目的のために、検出可能なラベル（例として、コントラスト薬剤などの造影剤）と抱合することができる。本明細書に使用されるとき、「抱合され」または「付着され」は、２つの実体が、好ましくは２つの実体間の関連付けの治療的／診断的利益が実現されるのに充分な親和性で関連付けられることを意味する。２つの実体間の関連付けは、直接、またはポリマーリンカーなどのリンカーを介したものであり得る。抱合または付着は、共有結合または非共有結合、ならびに捕捉（例として、一方の実体が他方の上または内部にあるか、またはいずれかまたは両方の実体がミセルなどの第３の実体の上または内部にあること）などの他の形態の関連付けを含み得る。
【０１０６】
一例において、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体は、検出可能なラベルに付着させることができ、これは、直接的または間接的に検出可能なシグナルを放出することが可能な化合物であり、アプタマーをｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで検出、測定、および／認定することができる。かかる「検出可能なラベル」の例は、蛍光ラベル、化学発光ラベル、比色ラベル、酵素マーカー、放射性同位体、およびビオチンなどの親和性タグを含むが、これらに限定されない。かかるラベルは、従来の方法によってアプタマーに直接的または間接的に抱合することができる。
【０１０７】
いくつかの態様において、検出可能なラベルは、ｉｎ ｖｉｖｏでＦＯＬＲ１＋細胞をイメージングするのに好適な薬剤であり、これは、放射性分子、放射性医薬品、または酸化鉄粒子であり得る。ｉｎ ｖｉｖｏイメージングに好適な放射性分子は、１２２Ｉ、１２３Ｉ，１２４Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉ、１８Ｆ、７５Ｂｒ、７６Ｂｒ、７６Ｂｒ、７７Ｂｒ、２１１Ａｔ、２２５Ａｃ、１７７Ｌｕ、１５３Ｓｍ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、６７Ｃｕ、２１３Ｂｉ、２１２Ｂｉ、２１２Ｐｂ、および６７Ｇａを含むが、これらに限定されない。ｉｎ ｖｉｖｏイメージングに好適な例示の放射性医薬品は、１１１Ｉｎオキシキノリン、１３１Ｉヨウ化ナトリウム、９９ｍＴｃメブロフェニン、および９９ｍＴｃ赤血球、１２３Ｉヨウ化ナトリウム、９９ｍＴｃエキサメタジム、９９ｍＴｃマクロアグリゲートアルブミン、９９ｍＴｃメドロネート、９９ｍＴｃメルティアチド、９９ｍＴｃオキシドロネート、９９ｍＴｃペンテテート、９９ｍＴｃ過テクネチウム酸、９９ｍＴｃセスタミビ、９９ｍＴｃ硫黄コロイド、９９ｍＴｃテトロホスミン、タリウム−２０１、およびキセノン−１３３を含む。レポート（reporting）薬剤はまた、組織試料中のＦＯＬＲ１＋細胞によって媒介される疾患を検出するのに有用である色素、例として、フルオロフォアであり得る。
【０１０８】
ｉｎ ｖｉｔｒｏで診断アッセイを実施するために、抗ＦＯＬＲ１抗体をＦＯＬＲ１＋細胞を含むと疑われる試料と接触させることができる。抗体および試料は、抗体のＦＯＬＲ１抗原に対する結合を可能にするために、好適な条件下で好適な期間インキュベートされ得る。次いで、かかる相互作用は、定型的な方法、例として、ＥＬＩＳＡまたはＦＡＣＳを介して検出され得る。ｉｎ ｖｉｖｏで診断アッセイを実施するために、ラベルで抱合された好適な量の抗ＦＯＬＲ１抗体を、検査を必要とする対象に投与することができる。ラベルされた抗体の存在は、定型的な方法によってラベルから放出されたシグナルに基づいて検出することができる。
【０１０９】
処置および診断における使用のためのキット
本開示はまた、ＦＯＬＲ１＋疾患細胞を阻害および／または排除し、よってかかる疾患細胞に関連する疾患／障害を緩和することにおける使用のためのキットを提供する。かかるキットは、抗ＦＯＬＲ１抗体、それを含むＡＤＣ、またはＦＯＬＲ１を標的とするＣＡＲポリペプチド、例として、本明細書に記載されるもののいずれかを発現する免疫細胞を含む１以上の容器を含み得る。
いくつかの態様において、キットは、本明細書に記載の方法のいずれかに従う使用のための説明書を含み得る。含まれる説明書は、本明細書に記載のもののように、標的疾患を処置する、発病を遅延させる、または標的疾患を緩和するための抗ＦＯＬＲ１抗体、ＡＤＣ、または免疫細胞の投与の記載を含み得る。キットは、その個体が標的疾患を有するかどうかを同定することに基づいて、処置に好適な個体を選択することの記載をさらに含み得る。さらに他の態様において、説明書は、標的疾患のリスクのある個体に抗体、ＡＤＣ、または免疫細胞を投与することの記載を含む。
【０１１０】
抗ＦＯＬＲ１抗体、それを含むＡＤＣ、またはＦＯＬＲ１を標的とするＣＡＲを発現する免疫細胞の使用に関する説明書は、一般に、意図される処置のための投薬量、投薬スケジュール、および投与のルートに関する情報を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例として、複数用量パッケージ）またはサブ単位用量であり得る。本発明のキットで提供される説明書は、典型的には、ラベルまたは添付文書（例として、キットに含まれる紙シート）に書かれた説明書であるが、機械可読の説明書（例として、磁気または光学記憶ディスクで運ばれる説明書）もまた許容し得る。
ラベルまたは添付文書は、組成物が、上皮がんなどのＦＯＬＲ１＋細胞に関連する疾患または障害を処置する、発病を遅延させる、および／または該疾患または障害を緩和するために使用されることを示す。説明書は、本明細書に記載の方法のいずれかを実行するために提供され得る。
【０１１１】
本発明のキットは、好適なパッケージングにある。好適なパッケージングは、バイアル、瓶、ジャー、柔軟なパッケージング（例として、密封されたマイラーまたはプラスチックバッグ）等を含むが、これらに限定されない。吸入器、経鼻投与デバイス（例として、噴霧器）またはミニポンプなどの注入デバイスなどの特定のデバイスと組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。容器はまた、滅菌アクセスポートを有し得る（例えば、容器は、静脈内溶液バッグまたは皮下注射針によって貫通可能なストッパーを有するバイアルであり得る）。組成物中の少なくとも１の活性剤は、抗ＦＯＬＲ１抗体、それを含むＡＤＣ、または本明細書に記載のもののようなＦＯＬＲ１を標的とするＣＡＲを発現する免疫細胞である。
【０１１２】
キットは、任意に、バッファーおよび解釈情報などの追加の構成要素を提供し得る。通常、キットは、容器と、容器上または容器に関連付けられたラベルまたは添付文書（単数または複数）を含む。いくつかの態様において、本発明は、上に記載のキットの内容物を含む製品を提供する。
試料中のＦＯＬＲ１＋細胞を検出することにおける使用のためのキットも本明細書に提供される。かかるキットは、本明細書に記載の抗ＦＯＬＲ１抗体のいずれかを含み得る。いくつかの場合において、抗ＦＯＬＲ１抗体は、本明細書に記載のもののような検出可能なラベルと抱合することができる。本明細書に使用されるとき、「抱合され」または「付着され」は、２つの実体が、好ましくは２つの実体間の関連付けの治療的／診断的利益が実現されるのに充分な親和性で関連付けられることを意味する。２つの実体間の関連付けは、直接、またはポリマーリンカーなどのリンカーを介したものであり得る。抱合または付着は、共有結合または非共有結合、ならびに捕捉（例として、一方の実体が他方の上または内部にあるか、またはいずれかまたは両方の実体がミセルなどの第３の実体の上または内部にあること）などの他の形態の関連付けを含み得る。
代替的に、または加えて、キットは、抗ＦＯＬＲ１抗体に結合することが可能な二次抗体を含み得る。キットは、ＦＯＬＲ１＋を検出するために抗ＦＯＬＲ１抗体を使用するための説明書をさらに含み得る。
【０１１３】
一般的な技法
本開示の実行は、他に示されない限り、当該技術分野の技能の範囲内である分子生物学（組換え技法を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技法を用いる。かかる技法は、Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introuction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985≫; Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984≫; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986≫; Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986≫; and B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)などの文献に完全に説明されている。
【０１１４】
さらなる詳細なしに、当業者は、上の記載に基づいて、本発明を最大限に利用することができると考えられる。したがって、以下の特定の態様は、単なる例示として解釈されるべきであり、いかなる方法であれ、本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書に引用されるすべての刊行物は、本明細書に参照される目的または主題のために参照により組み込まれる。
【０１１５】
例
例１：抗ＦＯＬＲ１抗体の生成
試薬および一般的な方法
ハイブリドーマ細胞培養培地（PFHM-II Protein-Free Hybridoma Medium; #12040077）をThermo Fisherから購入した。
ＲＮＡは、標準的なプロトコルおよびThermo FisherのTRIzol Reagent（#15596018）を使用して単離した。得られたｃＤＮＡ分子は、TakaraのｃＤＮＡ合成キット（PrimeScript II 1st strand cDNA synthesis kit; #6210A）を使用して生成した。TakaraのPremix Taq（#RR901A）を使用して、抗体Ｖ領域の増幅を実施した。標準的なＰＣＲプライマーセット（Ig-Primer Sets #TB326）はNovagenから得た。遺伝子は、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、ＳａｌＩ、およびＴ４リガーゼ（すべてNEBのもの）の使用を含む標準的な技法を使用して、pET28a（Novagen; #69864）にクローン化した。QIAEX II Gel Extraction Kit（QIAgen #20021）を利用して、すべてではないが一部のオリゴヌクレオチド分子を精製した。
ＳＫ−ＯＶ−３およびＤａｕｄｉ細胞培養は、５％ＣＯ２の雰囲気において３７℃で単層培養としてｉｎ ｖｉｔｒｏで維持した。必要に応じて、腫瘍細胞を定期的に継代した。
【０１１６】
抗ＦＯＬＲ１抗体を発見するための抗体ライブラリーのスクリーニング
ＵＳ２０１５／０１５３３５６において以前に記載されているように、モノクローナル抗体の大規模なライブラリー（合計＞１００，０００）をプロテオームおよびペプチド抗原の混合物を使用して生成した。がん腫瘍試料およびFDA Normal Tissue Panelに対してスクリーニングする前に、ライブラリーを一連の高密度抗体アレイに分割した。
【０１１７】
ＦＯＬＲ１−Ａｂ１、ＦＯＬＲ１−Ａｂ４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ１４、ＦＯＬＲ１−Ａｂ２０、およびＦＯＬＲ１−Ａｂ２３を含む、ライブラリーから単離した多くの抗体が、ＳＫ−ＯＶ−３細胞株を差次的に標的とすることを見出した。抗体を用いた免疫沈澱とそれに続く質量分析を介して、ＦＯＬＲ１を標的抗原として同定した。標準的なアンチセンスオリゴヌクレオチド技法を使用したＦＯＬＲ１のその後のノックダウンおよびＦＯＬＲ１の過剰発現により、ＦＯＬＲ１が、抗体が結合する標的抗原であることを確認した。
【０１１８】
抗体クローンの産生
個々のハイブリドーマクローンを、１０ｍＬハイブリドーマ細胞培養培地（PFHM-II Protein-Free Hybridoma Medium）を有するＴ２５フラスコにおいて培養した。細胞を３７℃で８０％コンフルエントになるまで増殖させた。次いで培養培地を除去し、細胞を１ｘＰＢＳで２回洗浄した。TRIzol試薬（１ｍＬ体積）をフラスコに直接加え、ピペット混合により細胞を溶解した。次いで、細胞ライセートをＴ２５フラスコから回収し、標準的な方法を使用して全ＲＮＡを単離した。続いてＲＮＡ濃度をNanodrop 2000（Thermo Fisher）で測定した。次いで、Takara PrimeScript II 1st strand cDNA synthesis kitプロトコルに従って、単離したＲＮＡからｃＤＮＡ鎖を生成した。次いで、得られたｃＤＮＡのハイブリドーマＶ領域の増幅を、NovagenユーザープロトコルTB326に従って実施した。以下の表３に示すようなプライマーペアを増幅に使用した。
【０１１９】
【表３−１】
2021531825.tif 000014
【表３−２】
2021531825.tif 000015
【０１２０】
ＰＣＲ産物を１％アガロースゲルで確認した。陽性のＰＣＲ産物をQIAgenゲル抽出キットを使用して回収し、続いてプライマー配列に対応する制限酵素（NEBのもの）を使用してｐＥＴ２８ａベクターにクローン化した。ＰＣＲ産物の挿入を有するｐＥＴ２８ａベクターをＤＨ５α細菌細胞に形質転換し、アンピシリン陽性寒天プレートで培養した。各細菌クローンを、ＭｕＩｇＧＶＨ３’−２、ＭｕＩｇｋＶＬ３’−１またはＭｕＩｇｌＶＬ３’−１プライマーを使用したサンガーシーケンシングに送った。得られた配列を整合性（consistence）について比較して、それぞれ標的ＶＨおよびＶＬ配列を確認した。次いで、ＶＨおよびＶＬ配列をＩＧＭＴデータベース（http://www.imgt.org/）で分析し、ＶＨおよびＶＬのＶ領域、フレームおよびＣＤＲ要素を提供した。
【０１２１】
例２：抗ＦＯＬＲ１抗体の評価
ＦＯＬＲ１を過剰発現するＳＫ−ＯＶ−３細胞（ＦＯＬＲ１＋ＳＫ−ＯＶ−３）およびＦＯＬＲ１の発現が陰性のＤａｕｄｉ細胞（ＦＯＬＲ１−Ｄａｕｄｉ）を、トリプシン−ＥＤＴＡ部分消化とそれに続く１０００ｒｐｍで５分間の遠心分離を使用して回収した。細胞を冷ＰＢＳに再懸濁し、等分した。抗ＦＯＬＲ１抗体をＰＢＳで希釈し、ＦＯＬＲ１＋ＳＫ−ＯＶ−３細胞またはＦＯＬＲ１−Ｄａｕｄｉ細胞のいずれかに加えた。細胞溶液を混合し、暗所で４℃でインキュベートし、ＰＢＳで洗浄した後、二次抗体抱合体を加えた（検出目的のため）。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで洗浄し、固定液で固定し、次いでＦＡＣＳ分析に供した。図１Ａ〜１Ｅに示されるように、これらの抗体は、ＦＯＬＲ１＋ＳＫ−ＯＶ−３への飽和性結合を示した。これらの抗体は、ＦＯＬＲ１−Ｄａｕｄｉへの飽和性結合を示さなかった。
【０１２２】
抗体を、ＥＬＩＳＡ滴定実験を使用した抗原結合アッセイで試験した。様々な濃度の組換えＦＯＬＲ１タンパク質（ｒＰｒｏｔｅｉｎ）とともに抗体をインキュベートした。以下の表４に示すように、試験したすべての抗体は０．３９〜１２．５ｎＭの親和性で結合した。
【０１２３】
ＳＫ−ＯＶ−３細胞に４つの抗ＦＯＬＲ１抗体クローンを投与した。この実験の目的のために、ＩｇＧ単独の投薬は対照実験として機能した。投薬後、すべての抗体クローンの間接的な細胞毒性を評価するために細胞生存率を決定した。以下の表４および図２Ａ〜２Ｄに示すように、両方の細胞株において、抗ＦＯＬＲ１抗体は、細胞生存率を２６〜３２％の総生存率まで減少させ、ＩＣ５０値は２６〜３３．７３ｐＭの間であった。ＩｇＧ対照抗体は、細胞の生存率に有意な損失をもたらさなかった。
【０１２４】
【表４】
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【０１２５】
他の態様
本明細書に開示されているすべての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書に開示されている各特徴は、同じ、同等、または同様の目的を果たす代替手段に置き換えることができる。よって、特に明記しない限り、開示されている各特徴は、同等または同様の特徴の一般的なシリーズの例にすぎない。
上記から、当業者は、本発明の不可欠な特徴を容易に確認することができ、その精神および範囲から逸脱することなく、本発明を様々な利用および条件に適合させるために様々な変更および改変を行うことができる。よって、他の態様も特許請求の範囲内にある。
【０１２６】
均等物
いくつかの発明の態様が本明細書に記載および図示されているが、当業者は、機能を実施するための、および／または結果および／または本明細書に記載の１以上の利点を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想定するであろうし、かかるバリエーションおよび／または改変の各々は、本明細書に記載の発明の態様の範囲内であると考えられる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載のすべてのパラメータ、寸法、材料、および構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、および／または構成が、発明の教示が使用される特定の用途（単数または複数）に依存するであろうことを容易に理解するであろう。当業者は、本明細書に記載の特定の発明の態様に対する多くの均等物を認識するか、または定型的な実験法のみを使用して確認することができる。したがって、上記の態様は例としてのみ提示され、添付の特許請求の範囲およびそれに対する均等物の範囲内で、発明の態様は、具体的に記載および請求される以外の方法で実行できることを理解されたい。本開示の発明の態様は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の各々を対象とする。加えて、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法が相互に矛盾しない場合、かかる特徴、システム、物品、材料、キット、および／または方法の２以上の任意の組み合わせが、本開示の発明の範囲内に含まれる。
【０１２７】
本明細書に定義および使用されるすべての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書における定義、および／または定義された用語の通常の意味を制御するように理解されるべきである。
本明細書に開示のすべての参考文献、特許、および特許出願は、各々が引用されている主題に関して参照により組み込まれ、いくつかのケースにおいて、文書の全体を包含することがある。
本明細書および特許請求の範囲において、本明細書に使用される不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１」を意味すると理解されるべきである。
【０１２８】
本明細書および特許請求の範囲において、本明細書に使用される「および／または」という句は、そのように結合された要素、すなわち、いくつかのケースにおいては結合的に存在し、他のケースにおいては分離的に存在する要素の「いずれかまたは両方」を意味すると理解されるべきである。「および／または」でリストされた複数の要素は、同じ方法で解釈するべきであり、すなわち、そのように結合された要素の「１以上」である。「および／または」節によって具体的に識別される要素以外の他の要素は、具体的に識別される要素に関連するかどうかに関わらず、任意に存在し得る。よって、非限定例として、「Ａおよび／またはＢ」への参照は、「含む」などのオープンエンドの言葉と併せて使用されるとき、一態様において、Ａのみ（任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様において、Ｂのみ（任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様において、ＡおよびＢの両方（任意に他の要素を含む）等を参照し得る。
【０１２９】
本明細書および特許請求の範囲において、本明細書に使用される「または」は、上に定義された「および／または」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リストにおける項目を区切るとき、「または」または「および／または」は包括的であると解釈されるものとする。すなわち、要素の数またはリストの少なくとも１を含むが、複数も含み、および、任意に、追加のリストされていない項目も含むものと解釈される。「１つのみ」または「正確に１つ」、または特許請求の範囲で使用されるときの「からなる」など、反対に明確に示される用語のみが、要素の数またはリストの正確に１つの要素を含むことを指すであろう。一般に、本明細書に使用される「または」という用語は、「いずれか」、「１つ」、「1つのみ」、または「正確に1つ」などの排他性の用語が先行するときにのみ、排他的代替（すなわち、「一方または他方、しかし両方ではない」）を示すと解釈されるものとする。「本質的にからなる」は、特許請求の範囲で使用されるとき、特許法の分野で使用されるその通常の意味を有するものとする。
【０１３０】
本明細書および特許請求の範囲において、本明細書に使用される、１以上の要素のリストに関連する「少なくとも１」という句は、要素のリストにおける任意の１以上の要素から選択される少なくとも１の要素を意味するが、要素のリスト内に具体的にリストされている各々およびすべての要素の少なくとも1を必ずしも含まず、要素のリストにおける要素の任意の組み合わせを除外しないと理解されるべきである。この定義はまた、「少なくとも１」という句が参照する要素のリスト内で具体的に識別される要素以外の要素が、具体的に識別されるそれらの要素に関連するかどうかに関わらず、任意に存在できることも可能にする。よって、非限定例として、「ＡおよびＢの少なくとも１」（または、同等に「ＡまたはＢの少なくとも１」、または同等に「Ａおよび／またはＢの少なくとも１」）は、一態様において、少なくとも１（任意に２以上を含む）のＡ（Ｂが存在しない）（および任意にＢ以外の要素を含む）；別の態様において、少なくとも１（任意に２以上を含む）のＢ（Ａが存在しない）（および任意にＡ以外の要素を含む）；さらに別の態様において、少なくとも１（任意に２以上を含む）のＡおよび少なくとも１（任意に２以上を含む）のＢ（および任意に他の要素を含む）等を参照し得る。
また、反対のことが明確に示されていない限り、複数のステップまたは行為を含む本明細書に記載の任意の方法において、方法のステップまたは行為の順序は、必ずしも方法のステップまたは行為が記載されている順序に限定されないことも理解されたい。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図１Ｄ】
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【図１Ｅ】
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【図２Ａ−Ｂ】
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【図２Ｃ−Ｄ】
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【国際調査報告】
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