(57)【要約】プラスミドコピー数の調節因子として、変異体ｉｎｃコード鎖を含む核酸分子が開示されている。上記核酸分子、プロモーター、及び複製開始点を含むレプリコンも開示されている。上記レプリコンを含むベクターも開示されている。上記ベクターを含む組換え微生物も開示されている。
2021532813.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
配列番号１５を含む変異体ｉｎｃコード鎖を含む核酸分子であって、
変異体ｉｎｃコード鎖は変異体ｉｎｃＲＮＡをコードし、
変異体ｉｎｃＲＮＡはプラスミドコピー数の調節因子である、核酸分子。
【請求項２】
変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項３】
変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項４】
変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７を含む、請求項１に記載の核酸分子。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか一項に記載の核酸分子、プロモーター、及び複製開始点を含むレプリコンであって、
プロモーターは、変異体ｉｎｃコード鎖に作動可能に連結されており、
変異体ｉｎｃＲＮＡはレプリコンのコピー数を調節する、レプリコン。
【請求項６】
変異体ｒｅｐＦＩＣレプリコンを含み、前記核酸分子は変異体ｒｅｐＦＩＣレプリコンの一部である、請求項５に記載のレプリコン。
【請求項７】
請求項５に記載のレプリコンを含むベクター。
【請求項８】
プラスミドを含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項９】
標的産物を作製するための標的遺伝子をさらに含む、請求項７に記載のベクター。
【請求項１０】
標的産物は、（ｉ）標的ＲＮＡ、（ｉｉ）標的タンパク質、（ｉｉｉ）標的生体材料、（ｉｖ）標的ポリマー、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖ）標的甘味料、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉ）標的油、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉｉ）標的脂肪、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉｉｉ）標的多糖類、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｉｘ）標的アミノ酸、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｘ）標的ヌクレオチド、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｘｉ）標的ワクチン、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、又は（ｘｉｉ）標的医薬品、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素のうちの１つ以上を含む、請求項９に記載のベクター。
【請求項１１】
請求項５又は６に記載のレプリコンを含む、組換え微生物。
【請求項１２】
請求項７〜１０のいずれか一項に記載のベクターを含む、組換え微生物。
【請求項１３】
組換え微生物は、形質転換、接合、又は形質導入のうちの１つ以上によって、ベクターを前駆体微生物に導入することにより調製される、請求項１２に記載の組換え微生物。
【請求項１４】
組換え微生物は、エシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌又は大腸菌種の細菌のうちの１つ以上から調製されたものである、請求項１２に記載の組換え微生物。
【請求項１５】
組換え微生物における請求項７〜１０のいずれか一項に記載のベクターのコピー数を調節する方法であって、
（１）ベクターを前駆体微生物に導入することにより組換え微生物を得るステップ、及び
（２）ベクターの複製に十分な条件下において培養培地中で前記組換え微生物を培養することによりベクターのコピー数を調節するステップ
を含む方法。
【請求項１６】
組換え微生物において請求項７〜１０のいずれか一項に記載のベクターを使用することにより標的産物を作製する方法であって、ベクターは、標的産物を作製するための標的遺伝子をさらに含み、前記方法は、
（１）ベクターを前駆微生物に導入することにより組換え微生物を得るステップ、
（２）組換え微生物が標的遺伝子を発現する条件下において培養培地中で組換え微生物を培養することにより、標的産物を作製するステップ、及び
（３）組換え微生物及び／又は培養培地から標的産物を回収するステップ
を含む方法。
【請求項１７】
標的産物は、（ｉ）標的ＲＮＡ、（ｉｉ）標的タンパク質、（ｉｉｉ）標的生体材料、（ｉｖ）標的ポリマー、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖ）標的甘味料、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉ）標的油、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉｉ）標的脂肪、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉｉｉ）標的多糖類、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｉｘ）標的アミノ酸、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｘ）標的ヌクレオチド、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｘｉ）標的ワクチン、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、又は（ｘｉｉ）標的医薬品、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素のうちの１つ以上を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
組換え微生物は、変異体ｒｐｏＣ  ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質コード配列（変異体ｒｐｏＣコード配列）を含む別の核酸分子を含み、
変異体ｒｐｏＣコード配列は、変異体ＲｐｏＣ  ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質（変異体ＲｐｏＣ）をコードし、
変異体ＲｐｏＣはＲ４７Ｃ置換を含み、Ｒ４７Ｃ置換の番号付けは、大腸菌の野生型ＲｐｏＣ  ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質（野生型ＲｐｏＣ）に基づいて定義される、請求項１２に記載の組換え微生物。
【請求項１９】
組換え微生物は、変異体ｒｐｏＣコード配列を含む別の核酸分子を含み、
変異体ｒｐｏＣコード配列は、変異体ＲｐｏＣをコードし、
変異体ＲｐｏＣはＲ４７Ｃ置換を含み、Ｒ４７Ｃ置換の番号付けは、大腸菌の野生型ＲｐｏＣに基づいて定義される、請求項１５に記載の方法。
【請求項２０】
組換え微生物は、変異体ｒｐｏＣコード配列を含む別の核酸分子を含み、
変異体ｒｐｏＣコード配列は、変異体ＲｐｏＣをコードし、
変異体ＲｐｏＣはＲ４７Ｃ置換を含み、Ｒ４７Ｃ置換の番号付けは、大腸菌の野生型ＲｐｏＣに基づいて定義される、請求項１６に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、変異体ｉｎｃコード鎖を含む核酸分子に関する。ここで、変異体ｉｎｃコード鎖は、変異体ｉｎｃＲＮＡをコードし、変異体ｉｎｃＲＮＡは、プラスミドコピー数の調節因子である。
【背景技術】
【０００２】
プラスミドはバイオテクノロジーにおいて重要な役割を果たし、微生物に対し標的遺伝子を導入、修飾、及び除去し、標的遺伝子によってコードされる対応するタンパク質を生成する手段を提供する。プラスミドは、細菌、古細菌、真核生物のドメインの多様な微生物に自然に存在する核酸分子であり、それらが発生する微生物の染色体から物理的に分離されており、染色体とは独立して複製される。プラスミドは通常、二本鎖環状ＤＮＡ分子であるが、線状ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子もあり得る。プラスミドは、約１ｋｂから２Ｍｂ超までの様々なサイズ範囲で生じる。例えば、最近の総説である非特許文献１によれば、ＧｅｎＢａｎｋデータベースに見られる４６０２個のプラスミドの間でサイズの幅広い変動が観察され、プラスミドのサイズは７４４ｂｐ〜２．５８Ｍｂの範囲であり、平均サイズは８０ｋｂである。プラスミドはまた、細胞あたり様々なコピー数で発生する。例えば、プラスミドは一般に、細胞あたり１〜２０コピーなどの低コピー、細胞あたり２０〜１００コピーなどの中コピー、細胞あたり５００〜７００コピー以上などの高コピーとして特徴付けられる。プラスミドは、標的遺伝子を含むように改変することができる。
【０００３】
バイオテクノロジーでのプラスミドの使用に関連する課題は、バイオテクノロジーへの応用では一般に微生物への標的遺伝子の安定した取り込みと、培養中の標的遺伝子及びそれに対応するタンパク質産物の収率の注意深い制御が必要であるが、一方を達成するための努力は他方の達成にとって反対に作用することがある。標的遺伝子を有するプラスミドを含む微生物の培養中、微生物の細胞が成長及び分裂するときにプラスミドを安定して分離させることが一般に有利であり、その結果、微生物の細胞の高い割合が培養全体を通して標的遺伝子を含むようになる。目的の産物のみの生産を確実にするために、標的遺伝子を構造的に安定に保ち、一定のヌクレオチド配列を維持することも一般に有利である。所望の結果、例えば、対応するタンパク質産物の十分な量及び活性型での産生を達成するのに十分に高いレベルで標的遺伝子を発現させることも一般に有利である。残念ながら、プラスミドを複製し、プラスミドから標的遺伝子を、特に高レベルで発現させるための技術は、細胞に代謝負荷を及ぼす。これにより、プラスミドが細胞から失われたり、変異によって発現レベルや標的遺伝子の同一性が変化したりする可能性がある。これはまた、対応するタンパク質産物の凝集及び不活性につながる可能性がある。したがって、生物工学的用途でのプラスミドの使用中の安定した取り込みと収率の制御のバランスをとることは、一般に、試行錯誤を伴う経験的プロセスである。
【０００４】
プラスミドのコピー数は、安定した取り込みと収率の制御の両方に関して重要な考慮事項である。プラスミドのコピー数は、一般に、プラスミドの複製開始点、プラスミドのサイズ（プラスミドに含まれる標的遺伝子を含む）、及び培養条件の３つの要因によって決定される。複製開始点に関して、プラスミドは、それらの複製、特にそれらの複製開始点の特徴に基づいて、非互換性グループに分類することができる。具体的には、プラスミドは一般に、単一の複製開始点から複製するプラスミドの領域に相当するレプリコンを含む。プラスミドはまた、一般に、プラスミドの複製開始点を認識し、そこで複製を開始させるタンパク質をコードする遺伝子を含む。プラスミドのタンパク質と複製開始点の間の相互作用は、複製の特異性及びレプリコンのコピー数、つまりはプラスミドのコピー数を決定する。同一の複製開始点を有するプラスミドは、分離安定性に関して互いに非互換性であるプラスミドに基づいて、同じ非互換性グループに分類される。複製開始点が異なるプラスミドは、プラスミドが互いに互換性がある場合、異なる非互換性グループに分類され得る。プラスミドのサイズに関しては、サイズが大きくなると、一般に、プラスミドの複製及びプラスミドからの標的遺伝子の発現に関連する代謝負荷が増大し、したがって、プラスミドのコピー数が減少する。培養条件に関しても、これらは代謝負荷に影響を及ぼし、特定の条件によっては、コピー数の増減をもたらし得る。
【０００５】
上記３つの要因のうち、複製開始点はコピー数のベースラインを確立するため、特定用途のためにプラスミドを選択する際には、大抵の場合、複製開始点が最重要考慮事項である。残念ながら、プラスミドの複製開始点を変更することによってプラスミドのコピー数のベースラインを予測可能に変更するための一般的なアプローチは存在しない。特定の複製開始点を変更してコピー数を変更できるかどうか、またどの程度変更できるかを判断することも、経験的なプロセスである。
【０００６】
ＲｅｐＦＩＣは例示的なレプリコンである。非特許文献２に説明されているように、ＲｅｐＦＩＣはＩｎｃＦＩプラスミドのレプリコンである。ＲｅｐＦＩＣはプラスミドＰ３０７に完全な形で存在する。ＲｅｐＦＩＣは、プラスミドＦにもトランケート型で存在する。ＲｅｐＦＩＣは、ｉｎｃＲＮＡと呼ばれるＲＮＡをコードする。ＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡは、その配列及び構造に基づいてＲｅｐＦＩＣレプリコンの非互換性を決定する。
【０００７】
ｉｎｃＲＮＡのＲＮＡ配列は、ＲｅｐＦＩＣレプリコンのＤＮＡ配列から推測されている。ＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡの推定配列は、ＲｅｐＦＩＣレプリコンのソースによって異なる。推定配列は、ｉｎｃＲＮＡについて予測される５’末端及び３’末端によっても異なる。
【０００８】
例えば、プラスミドＰ３０７のＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡは、非特許文献２に開示されているように、ＲｅｐＦＩＣレプリコンの一部のヌクレオチド５７５〜６６５位の逆相補体に相当するＤＮＡコード鎖によってコードされている。このコード鎖は、配列番号２３内に提供される９１ヌクレオチドの配列、具体的には配列番号２３のヌクレオチド８〜９８位に相当する。また、非特許文献２によれば、プラスミドＦのＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡは、プラスミドＰ３０７のＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡとは２つの塩基が置換されて異なるＤＮＡコード鎖によってコードされている。このコード鎖は、配列番号２１内に提供される９１ヌクレオチドの配列、具体的には配列番号２１のヌクレオチド８〜９８位に相当する。また、例えば、ＧｅｎＢａｎｋによると、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）株Ｋ−１２のＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡは、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＰ００１９１８．１、３７４７〜３８３９位の逆相補体に相当するＤＮＡコード鎖によってコードされている。このコード鎖は、配列番号２１内に提供される９３ヌクレオチドの配列、具体的には配列番号２１のヌクレオチド１〜９３位に相当する。また、ＧｅｎＢａｎｋによると、ｃｏｐＡと呼ばれる、ｉｎｃＲＮＡに相当する大腸菌株ｔｏｌＣの非コードＲＮＡ配列は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＣＰ０１８８０１．１、３，４６３，９７７〜３，４６４，０６７位に相当するＤＮＡコード鎖によってコードされている。このコード鎖は、配列番号２１内に提供される９１ヌクレオチドの配列、具体的には配列番号２１のヌクレオチド８〜９８位に相当する。また、ＧｅｎＢａｎｋによれば、大腸菌株ＮＣＭ３７２２  Ｆ−様プラスミドの配列は、明らかにｉｎｃＲＮＡに相当し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＣＰ０１１４９６．１、３７７６５〜３７８６２位の逆相補体に相当するＤＮＡコード鎖によってコードされている。このコード鎖は、配列番号１９に提供される９８ヌクレオチドの配列に相当する。
【０００９】
ＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡはステム−ループ構造を持っていると予測されている。非特許文献２によれば、この構造はｉｎｃＲＮＡの機能にとって重要であると考えられている。
【００１０】
非特許文献２によれば、ＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡは、別のレプリコンであるＲｅｐＦＩＩＡのｉｎｃＲＮＡとは９塩基対が異なる。この違いに基づいて、ＲｅｐＦＩＣレプリコンとＲｅｐＦＩＩＡレプリコンは互換性がある。対照的に、前述のように、同じく非特許文献２によれば、プラスミドＦのｉｎｃＲＮＡ配列はプラスミドＰ３０７のｉｎｃＲＮＡ配列とは２塩基が異なる。非特許文献２によれば、この違いは非互換性に明白な影響を与えない。つまり、プラスミドＦのｉｎｃＲＮＡ配列を発現するプラスミドは、プラスミドＰ３０７のｉｎｃＲＮＡ配列を発現するプラスミドと互換性がない。
【００１１】
非特許文献２は、ＲｅｐＦＩＣレプリコンを含むプラスミドのコピー数については開示していない。非特許文献２は、バイオテクノロジーへの応用のためのそのようなプラスミドの使用についても開示していない。
【００１２】
変異体ＲＮＡポリメラーゼの使用は、プラスミドのコピー数を変更するもう１つの潜在的なアプローチである。ＲＮＡポリメラーゼは転写に関与する。ＲＮＡポリメラーゼは、染色体及びプラスミドの複製にも関与する。ＲＮＡポリメラーゼ配列は多くの細菌で決定されており、ＲＮＡポリメラーゼ内の保存領域を同定するための基礎を提供する。例えば、非特許文献３は、２１種の株からのＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットのＣ末端ドメインのアラインメントを提供している。細菌のＲＮＡポリメラーゼの構造も決定されている。例えば、非特許文献４は、ＲＮＡポリメラーゼの構造は、寸法が約１５０オングストローム×約１００オングストローム×約１００オングストロームであり、カニのはさみを連想させる形状であることが分かったと報告している。ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットは、「クランプ」と呼ばれるペンチと、活性な中央の裂け目の一部を構成する。
【００１３】
ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットをコードする大腸菌のｒｐｏＣ遺伝子の２つの変異は、ＣｏｌＥ１型プラスミドのコピー数の減少を引き起こすことが報告されている。具体的には、非特許文献５は、単一のアミノ酸置換（Ｇ１１６１Ｒ）及び４１位のアミノ酸欠失を特定した。どちらもｒｐｏＣ遺伝子の３’末端領域の近くにある。これら２つの変異により、ＣｏｌＥ１プラスミドのコピー数がそれぞれ１０分の１以下及び２０分の１以下に減少する（おそらく、それぞれ９０％以上及び９５％以上の減少に相当する）。非特許文献５は、ＤＮＡポリメラーゼＩのプレプライマー及びプレプライマーのアンチセンスインヒビターをコードするＲＮＡＩＩ及びＲＮＡＩのプロモーターからの発現の変化が、減少を引き起こす可能性があることを提示した。
【００１４】
ｒｐｏＣの変異は、プラスミドｐＢＲ３２２のコピー数の増加を引き起こすことも報告されている。具体的には、非特許文献６は、単一のアミノ酸置換（Ｇ１０３３Ｄ）を特定した。これも、ｒｐｏＣ遺伝子の３’末端領域付近にあり、３９℃の半許容成長温度でのｐＢＲ３２２コピー数の増加を引き起こす。非特許文献６は、突然変異は染色体のコピー数の増加も引き起こすと述べている。
【００１５】
残念ながら、ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットを予測可能に改変して、プラスミドのコピー数を変化させるさらなる変異体を得るための一般的なアプローチは存在しない。特定の突然変異がプラスミドのコピー数を変える可能性があるかどうか、またどの程度変化するかを判断することも、経験的なプロセスである。また、ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットを予測可能に改変して、染色体コピー数の対応する変化を引き起こさないような変異体を得るための一般的なアプローチは存在しない。
【００１６】
上記のように、プラスミドのコピー数は、生物工学的用途でのプラスミドの使用中の安定した取り込みと収率の制御とのバランス調整に関して重要な考慮事項になる傾向があるが、プラスミドの複製開始点を改変することによってプラスミドのコピー数のベースラインを予測可能に変更するための一般的なアプローチは存在しない。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【００１７】
【非特許文献１】Ｓｈｉｎｔａｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ６：２４２（２０１５）
【非特許文献２】Ｓａａｄｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １６９：１８３６−１８４６（１９８７）
【非特許文献３】Ｌｅｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ  Ａｇｅｎｔｓ  ａｎｄ  Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ  ５７：５６−６５（２０１３）
【非特許文献４】Ｍｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｅｌｌ  １３５：２９５−３０７（２００８）
【非特許文献５】Ｅｄｅｒｔｈ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ  ２６７：５８７−５９２（２００２）
【非特許文献６】Ｐｅｔｅｒｓｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ  １７３：５２００−５２０６（１９９１）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１８】
したがって、改変された複製開始点を含むプラスミドのコピー数のベースラインを変更するために改変される複製開始点の必要性が存在する。理想的には染色体のコピー数に対応する変化を引き起こさずに、プラスミドのコピー数を変化させるように改変されるＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットのさらなる変異体の必要性も存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１９】
本開示の一態様によれば、配列番号１５を含む変異体ｉｎｃコード鎖を含む核酸分子が開示されている。変異体ｉｎｃコード鎖は変異体ｉｎｃＲＮＡをコードする。変異体ｉｎｃＲＮＡはプラスミドコピー数の調節因子である。
【００２０】
いくつかの例において、変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。
【００２１】
また、いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。
また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７を含む。
【００２２】
本開示の別の態様によれば、上記核酸分子、プロモーター、及び複製開始点を含むレプリコンが開示されている。プロモーターは、変異体ｉｎｃコード鎖に作動可能に連結されている。変異体ｉｎｃＲＮＡはレプリコンのコピー数を調節する。
【００２３】
本開示の別の態様によれば、レプリコンを含むベクターが開示される。
本開示の別の態様によれば、レプリコンを含む組換え微生物が開示される。
本開示の別の態様によれば、上記ベクターを含む組換え微生物が開示される。
【００２４】
本開示の別の態様によれば、組換え微生物におけるベクターのコピー数を調節する方法が開示される。この方法は、（１）ベクターを前駆体微生物に導入することにより組換え微生物を得るステップ、及び（２）ベクターの複製に十分な条件下において培養培地中で上記組換え微生物を培養することによりベクターのコピー数を調節するステップを含む。
【００２５】
本開示の別の態様によれば、組換え微生物において上記ベクターを使用することにより標的産物を作製する方法が開示される。ベクターは、標的産物を作製するための標的遺伝子をさらに含む。この方法は、（１）ベクターを前駆微生物に導入することにより組換え微生物を得るステップ、（２）組換え微生物が標的遺伝子を発現する条件下において培養培地中で組換え微生物を培養することにより、標的産物を作製するステップ、及び（３）組換え微生物及び／又は培養培地から標的産物を回収するステップを含む。
【００２６】
本開示の別の態様によれば、上記ベクター及び別の核酸分子を含む組換え微生物が開示される。他の核酸分子は、変異体ｒｐｏＣ  ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質コード配列（「変異体ｒｐｏＣコード配列」とも呼ばれる）を含む。変異体ｒｐｏＣコード配列は、変異体ＲｐｏＣ  ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質（「変異体ＲｐｏＣ」とも呼ばれる）をコードする。変異体ＲｐｏＣはＲ４７Ｃ置換を含み、Ｒ４７Ｃ置換の番号付けは、大腸菌の野生型ＲｐｏＣ  ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質（「野生型ＲｐｏＣ」とも呼ばれる；配列番号４４）に基づいて定義されている。
【００２７】
本開示の別の態様によれば、組換え微生物におけるベクターのコピー数を調節するための方法が開示される。この方法は、（１）ベクターを前駆体微生物に導入することにより組換え微生物を得るステップ、及び（２）ベクターの複製に十分な条件下において培養培地中で組換え微生物を培養することによりベクターのコピー数を調節するステップを含む。組換え微生物は、変異体ｒｐｏＣコード配列を含む他の核酸分子を含む。変異体ｒｐｏＣコード配列は、変異体ＲｐｏＣをコードする。変異体ＲｐｏＣはＲ４７Ｃ置換を含み、Ｒ４７Ｃ置換の番号付けは、大腸菌の野生型ＲｐｏＣに基づいて定義されている。
【００２８】
本開示の別の態様によれば、組換え微生物において上記ベクターを使用することにより標的産物を作製する方法が開示される。ベクターは、標的産物を作製するための標的遺伝子をさらに含む。この方法は、（１）ベクターを前駆微生物に導入することにより組換え微生物を得るステップ、（２）組換え微生物が標的遺伝子を発現する条件下において培養培地中で組換え微生物を培養することにより、標的産物を作製するステップ、及び（３）組換え微生物及び／又は培養培地から標的産物を回収するステップを含む。組換え微生物は、変異体ｒｐｏＣコード配列を含む別の核酸分子を含む。変異体ｒｐｏＣコード配列は、変異体ＲｐｏＣをコードする。変異体ＲｐｏＣはＲ４７Ｃ置換を含み、Ｒ４７Ｃ置換の番号付けは、大腸菌の野生型ＲｐｏＣに基づいて定義されている。
【発明の効果】
【００２９】
本明細書に開示される配列番号１５を含む変異体ｉｎｃコード鎖を含む核酸分子は、その核酸分子を含むレプリコンを含むプラスミドなどのベクターのコピー数を調節するために、特にベクターのコピー数を増加させるために有用であり、したがって、ベクターを使用することにより、標的産物の商業生産を改善するのに有用である。
【図面の簡単な説明】
【００３０】
【図１】以下のコード鎖のＤＮＡ配列の多重配列アラインメントを示す：（１）Ｓａａｄｉらによって開示されているように、ＲｅｐＦＩＣレプリコンの一部のヌクレオチド５７５〜６６５位の逆相補体に相当するＤＮＡコード鎖によってコードされるプラスミドＰ３０７のＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡ（配列番号２３、ヌクレオチド８〜９８位）；（２）Ｓａａｄｉらによって開示されているように、プラスミドＰ３０７のＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡのそれとは２つの塩基が置換されて異なるＤＮＡコード鎖によってコードされるプラスミドＦのＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡ（配列番号２１、ヌクレオチド８〜９８位）；（３）ｃｏｐＡと称される大腸菌株ｔｏｌＣの非コードＲＮＡ配列。これはｉｎｃＲＮＡに相当し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＣＰ０１８８０１．１、３，４６３，９７７〜３，４６４，０６７位に相当するＤＮＡコード鎖によってコードされる（配列番号２１、ヌクレオチド８〜９８位）；（４）ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＡＰ００１９１８．１、３７４７〜３８３９位の逆相補体に相当するＤＮＡコード鎖によってコードされる大腸菌株Ｋ−１２のＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡ（配列番号２１、ヌクレオチド１−９３）；及び（５）大腸菌株ＮＣＭ３７２２  Ｆ−様プラスミドの配列。これは明らかにｉｎｃＲＮＡに相当し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＣＰ０１１４９６．１、３７７６５〜３７８６２位の逆相補体に相当するＤＮＡコード鎖によってコードされる（配列番号１９）。
【図２】図１に示される配列に相当するコード鎖のアラインメントしたＤＮＡ配列の違いを示す。プラスミドＰ３０７のＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡのコード鎖の全長が提供され、提供された他の配列のコード鎖が違いを示し、野生型ｉｎｃＲＮＡのコード鎖の中央ドメイン（配列番号２３、ヌクレオチド４３〜６５位も全長で示されている）。
【図３】以下のコード鎖のＤＮＡ配列の配列アラインメントを示す：（１）大腸菌株ＮＣＭ３７２２Ｆ−様プラスミドの配列。これは明らかにｉｎｃＲＮＡに相当し、ＧｅｎＢａｎｋアクセッションＣＰ０１１４９６．１、３７７６５〜３７８６２位の逆相補体に相当するＤＮＡコード鎖によってコードされる（配列番号１９）；及び（２）中央ドメインにおけるＣからＴへの置換を含み、したがって配列番号１５を含む変異体ｉｎｃコード鎖の配列（配列番号１７）。
【図４】図３に示される配列に相当するコード鎖のアラインメントされたＤＮＡ配列の違いを示す。大腸菌株ＮＣＭ３７２２  Ｆ−様プラスミドの配列のコード鎖の全長が提供され、提供された変異体ｉｎｃコード鎖が違いを示し、変異体ｉｎｃＲＮＡのコード鎖の中央ドメイン（配列番号１５）も全長で示されている。
【図５Ａ】大腸菌株ＮＣＭ３７２２  Ｆ−様プラスミド（配列番号１９）のものと同一の野生型ＲｅｐＦＩＣを含む、ｐＪＳＬ４０と呼ばれる組換えプラスミドを構築するプロセスを示す。
【図５Ｂ】大腸菌株ＮＣＭ３７２２  Ｆ−様プラスミド（配列番号１９）のものと同一の野生型ＲｅｐＦＩＣを含む、ｐＪＳＬ４０と呼ばれる組換えプラスミドを構築するプロセスを示す。
【図６Ａ】中央ドメインにおけるＣからＴへの置換を含む変異体ｉｎｃコード鎖（配列番号１７）の配列に相当する、ＲｅｐＦＩＣの改変されたＤＮＡ配列を含み、したがって配列番号１５を含む、ｐＪＳＬ４１と呼ばれる組換えプラスミドを構築するプロセスを示す。
【図６Ｂ】中央ドメインにおけるＣからＴへの置換を含む変異体ｉｎｃコード鎖（配列番号１７）の配列に相当する、ＲｅｐＦＩＣの改変されたＤＮＡ配列を含み、したがって配列番号１５を含む、ｐＪＳＬ４１と呼ばれる組換えプラスミドを構築するプロセスを示す。
【図７】高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＲｐｏＣ（Ｑ８ＲＱＥ８）（配列番号３４）、アセトバクター属酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）ＲｐｏＣ（ＢＡＨ９９０７５．１）（配列番号３５）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）ＲｐｏＣ（Ｑ５Ｆ５Ｒ６）（配列番号３６）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）ＲｐｏＣ（Ｑ５Ｘ８６５）（配列番号３７）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）ＲｐｏＣ（Ｑ９ＨＷＣ９）（配列番号３８）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）ＲｐｏＣ（Ｑ９ＫＶ２９）（配列番号３９）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）（Ｐ０Ａ８Ｔ７）（配列番号２６）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）ＲｐｏＣ（Ｐ０Ａ２Ｒ４）（配列番号４０）、アクチノマイセス・オドントリティカス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ）ＲｐｏＣ（ＥＤＮ７９９２７．１）（配列番号４１）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）ＲｐｏＣ（Ｑ８ＣＪＴ１）（配列番号４２）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）ＲｐｏＣ（Ｑ６ＮＪＦ６）（配列番号４３）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）ＲｐｏＣ（Ａ５Ｕ０５３）（配列番号４４）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）ＲｐｏＣ（ＣＢＨ４９６５６．１）（配列番号４５）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）ＲｐｏＣ（Ｏ８４３１６）（配列番号４６）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）ＲｐｏＣ（Ａ７ＦＺ７６）（配列番号４７）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＲｐｏＣ（Ｐ３７８７１）（配列番号４８）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）ＲｐｏＣ（Ｑ９７ＮＱ８）（配列番号４９）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）ＲｐｏＣ（Ｑ８２Ｚ４１）（配列番号５０）、及びラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）ＲｐｏＣ（Ｑ０３ＰＶ０）（配列番号５１）のＮ末端ドメインのＣＬＵＳＴＡＬ  Ｏ（１．２．４）による多重配列アラインメントを示す。
【図８】図７に示されるようなＲｐｏＣタンパク質の中央ドメインのＣＬＵＳＴＡＬ  Ｏ（１．２．４）による多重配列アラインメントを示す（それぞれ配列番号３４〜３９、２６、及び４０〜５１）。
【図９Ａ】図７に示されるようなＲｐｏＣタンパク質のＣ末端ドメインのＣＬＵＳＴＡＬＯ（１．２．４）による多重配列アラインメントを示す（それぞれ配列番号３４〜３９、２６、及び４０〜５１）。
【図９Ｂ】図７に示されるようなＲｐｏＣタンパク質のＣ末端ドメインのＣＬＵＳＴＡＬＯ（１．２．４）による多重配列アラインメントを示す（それぞれ配列番号３４〜３９、２６、及び４０〜５１）。
【図１０】大腸菌のＲｐｏＣタンパク質（配列番号２６）及び変異体ＲｐｏＣ（配列番号２７）のＮ末端ドメインの配列アラインメントを示す。
【図１１】大腸菌のＲｐｏＣタンパク質（配列番号２６）及び変異体ＲｐｏＣ（配列番号２７）のアラインメントされたＮ末端ドメインの違いを示し、大腸菌のＲｐｏＣのＮ末端ドメインの配列は全長で示され、変異体ＲｐｏＣの配列に違いが示されている。
【図１２Ａ】染色体上のｒｐｏＣ配列を置換するためのものである、ｐＪＳＬ４７と呼ばれる組換えプラスミドを構築するプロセスを示す。
【図１２Ｂ】染色体上のｒｐｏＣ配列を置換するためのものである、ｐＪＳＬ４７と呼ばれる組換えプラスミドを構築するプロセスを示す。
【図１３Ａ】野生型ＲｅｐＦＩＣレプリコンを含む、ｐＪＳＬ４８と呼ばれる組換えプラスミドを構築するプロセスを示す。
【図１３Ｂ】野生型ＲｅｐＦＩＣレプリコンを含む、ｐＪＳＬ４８と呼ばれる組換えプラスミドを構築するプロセスを示す。
【図１４Ａ】改変されたＲｅｐＦＩＣレプリコンを含む、ｐＪＳＬ４９と呼ばれる組換えプラスミドを構築するプロセスを示す。
【図１４Ｂ】改変されたＲｅｐＦＩＣレプリコンを含む、ｐＪＳＬ４９と呼ばれる組換えプラスミドを構築するプロセスを示す。
【発明を実施するための形態】
【００３１】
配列番号１５を含む変異体ｉｎｃコード鎖を含む核酸分子が開示される。変異体ｉｎｃコード鎖は変異体ｉｎｃＲＮＡをコードする。変異体ｉｎｃＲＮＡはプラスミドコピー数の調節因子である。
【００３２】
驚くべきことに、配列番号１５を含む変異体ｉｎｃコード鎖を含む核酸分子であって、変異体ｉｎｃコード鎖が変異体ｉｎｃＲＮＡをコードし、変異体ｉｎｃＲＮＡがプラスミドコピー数の調節因子である核酸分子を使用して、この核酸分子を含むプラスミドのコピー数の実質的な増加を達成できることが分かった。
【００３３】
理論に束縛されることを望まないが、ｉｎｃＲＮＡのコード鎖は野生型配列間で保存されている中央ドメインを含むと考えられる。野生型中央ドメインは、配列番号１９のヌクレオチド４３〜６５位に相当する。図１及び図２に示すように、この配列は、以前に開示された５つのｉｎｃＲＮＡのコード鎖のそれぞれ、すなわち、Ｓａａｄｉらによって開示されたプラスミドＰ３０７のＲｅｐＦＩＣ、プラスミドＦのＲｅｐＦＩＣ、大腸菌株ｔｏｌＣのｃｏｐＡ、大腸菌株Ｋ−１２のＲｅｐＦＩＣ、及び大腸菌株ＮＣＭ３７２２のＦ−様プラスミドの間で保存されている。図１及び図２に示すように、コード鎖は、それらの配列に関して、例えばヌクレオチド４２位（Ｃ又はＴ）、６６位（Ｃ又はＡ）、及び８９位（Ｔ又はＧ）で変化することがあり、番号付けは配列番号１９に従ってなされている。上記のように、Ｓａａｄｉらによれば、プラスミドＦのｉｎｃＲＮＡのコード鎖の配列はプラスミドＰ３０７のｉｎｃＲＮＡのコード鎖とは２塩基が異なり、この違いは非互換性に明らかな影響を与えない。したがって、コード鎖は、そのような変化にもかかわらず、非互換性を維持することもできる。また、見て分かるように、ＳａａｄｉらによるプラスミドＦのｉｎｃＲＮＡのコード配列は、大腸菌株ＮＣＭ３７２２のＦ−様プラスミドのコード配列とは１つの置換で異なる。これは、この置換にも明らかな影響がないことを示唆している。図２に示すように、中央ドメインは、ヌクレオチド４３位からヌクレオチド６５位までの２３ヌクレオチド配列に相当し、位置の番号付けは配列番号１９に従ってなされている。中央ドメインは、変化する可能性のある２つのヌクレオチド位置、つまりヌクレオチド４２位と６６位の間に位置している。中央ドメインの配列が、以前に開示されたｉｎｃＲＮＡの５つのコード鎖のそれぞれの間で保存されており、コード鎖の他の場所での変異に明らかな影響がないように見えることを考えると、配列番号１９のヌクレオチド４３〜６５位に相当する中央ドメイン配列は野生型と見なされ得る。
【００３４】
また、理論に拘束されることを望まないが、ｉｎｃＲＮＡの中央ドメインは、ＲｅｐＦＩＣレプリコンを含むプラスミドのコピー数を決定する上で重要な役割を果たすと考えられる。図３及び図４に示すように、変異体ｉｎｃコード鎖は、中央ドメインであって、配列番号１５を含み、ヌクレオチド６０位（番号付けは配列番号１７に従ってなされている）のＣからＴへの１つの置換によって野生型中央ドメインとは異なる中央ドメインを含む。この置換を含み、大腸菌ＮＣＭ３７２２のｉｎｃＲＮＡのコード鎖と他の点では同一である変異体ｉｎｃコード鎖は、プラスミドのコピー数が例えば約５〜１５倍増加し、正確な増加は明らかにプラスミドのサイズ及び系統などの要因に依存する。中央ドメインのＣからＴへの置換は、大腸菌ＮＣＭ３７２２の変異体ｉｎｃコード鎖とｉｎｃＲＮＡのコード鎖との唯一の違いであるため、また、中央ドメインは、明らかな影響なく変化し得る２つのヌクレオチド位置の間に位置するため、またさらに、以前に開示された５つのｉｎｃＲＮＡのコード鎖の間で中央ドメイン内で他の置換が発生しないため、中央ドメインはプラスミドのコピー数を決定する上で重要であるように思われる。
【００３５】
本明細書で使用される場合、核酸分子という用語は、ＤＮＡ及び／又はＲＮＡの分子を意味し、核酸分子の構造がＤＮＡ配列、ＲＮＡ配列、又はその両方を含むか否かに応じて、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子、一本鎖ＤＮＡ分子、二本鎖ＲＮＡ分子、一本鎖ＲＮＡ分子、又は、ＤＮＡ／ＲＮＡハイブリッド分子を含む。
【００３６】
本明細書で使用される場合、ｉｎｃＲＮＡという用語は、ｉｎｃＲＮＡの配列及び構造に基づいてＩｎｃＦＩプラスミドのＲｅｐＦＩＣレプリコンの非互換性を決定するＲＮＡ分子を意味する。ＩｎｃＦＩプラスミドのＲｅｐＦＩＣレプリコンの非互換性は、例えば、例えばＳａａｄｉらによって議論されているように、微生物の中に入ってくるプラスミドの導入による微生物からの常在プラスミドの喪失を測定することによって測定することができる。
【００３７】
本明細書で使用される場合、ｉｎｃコード鎖という用語は、ｉｎｃＲＮＡの配列をコードするＤＮＡ分子鎖、又はＤＮＡ分子鎖の一部を意味する。
本明細書で使用される場合、変異体ｉｎｃＲＮＡという用語は、野生型ｉｎｃＲＮＡの配列に対する少なくとも１つのヌクレオチドの付加、欠失、及び／又は置換に基づいて野生型ｉｎｃＲＮＡの配列とは異なるヌクレオチド配列を有するｉｎｃＲＮＡを意味する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、変異体ｉｎｃコード鎖という用語は、変異体ｉｎｃＲＮＡの配列をコードするＤＮＡ分子を意味する。
本明細書で使用される場合、レプリコンという用語は、単一の複製開始点から複製するＤＮＡ分子の領域を意味する。
【００３９】
本明細書で使用される場合、ベクターという用語は、自然に、又はプラスミド、ウイルスベクター、コスミド、又は人工染色体などの微生物への導入によって微生物中に存在し得る核酸分子を意味する。
【００４０】
本明細書で使用される場合、プラスミドという用語は、微生物内で自然に又は微生物への導入によって存在し得、微生物の染色体から物理的に分離しており、染色体とは独立して複製する核酸分子を意味する。上記で論じたように、プラスミドは典型的には二本鎖環状ＤＮＡ分子であるが、線状ＤＮＡ分子及び／又はＲＮＡ分子でもあり得る。プラスミドは、約１ｋｂから２Ｍｂを超えるサイズの範囲で存在する。プラスミドはまた、低コピー数から高コピー数まで、細胞あたり様々なコピー数の範囲で存在する。プラスミドは、標的遺伝子を含むように改変することができる。
【００４１】
本明細書で使用される場合、プラスミドコピー数という用語は、微生物の細胞におけるプラスミドのコピー数を意味する。微生物中の１つのプラスミドについてのプラスミドコピー数は、数あるアプローチの中でも特に、例えばリアルタイムＰＣＲを使用して、プラスミド上に単一コピーで存在する遺伝子のコピー数を、その微生物の染色体上に単一コピーで存在する遺伝子に対して比較することによって測定できる。
【００４２】
本明細書で使用される場合、プラスミドコピー数の調節因子という用語は、その因子が微生物に存在しない場合に対し、その因子が微生物に存在する場合に、微生物中のプラスミドのコピー数の変化、例えば、増加又は減少を引き起こす、ＲＮＡ分子又はタンパク質などの因子を意味する。プラスミドコピー数を調節することにより、プラスミドを安定して発現させることが可能であり、それによりプラスミドを含む微生物の安定した増殖を可能にする。
【００４３】
記載したように、配列番号１５を含む変異体ｉｎｃコード鎖を含む核酸分子が開示されている。また、記載したように、配列番号１５は、ＤＮＡ配列に相当する。核酸分子は、例えば、二本鎖ＤＮＡ分子、一本鎖ＤＮＡ分子、又はそれらの組み合わせであり得る。
【００４４】
変異体ｉｎｃコード鎖は変異体ｉｎｃＲＮＡをコードする。変異体ｉｎｃＲＮＡのＲＮＡ配列は、変異体ｉｎｃコード鎖のＤＮＡ配列から推測できる。上記のように、変異体ｉｎｃコード鎖は、１つの置換、すなわちヌクレオチド６０位でのＣからＴによって野生型中央ドメインとは異なる中央ドメインを含み、位置の番号付けは配列番号１７に従ってなされている。したがって、変異体ｉｎｃＲＮＡの推定配列には、この位置に対応するＣからＵへの置換が含まれる。以前に開示されたｉｎｃＲＮＡの５つのコード鎖と同様に、変異体ｉｎｃＲＮＡの推定配列も、変異体ｉｎｃコード鎖のソースに応じて変化し得る。推定配列は、ｉｎｃＲＮＡについて予測される５’末端及び３’末端によっても変化し得る。したがって、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、ヌクレオチド６０位のＣからＴへの置換を含み得、それ以外は、大腸菌ＮＣＭ３７２２のｉｎｃＲＮＡのコード鎖と同一であり得る。また、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、図２に示されるように、ｉｎｃＲＮＡについて以前に開示された５つのコード鎖間で観察される１つ以上の、つまりはヌクレオチド４２位（Ｃ又はＴ）、６６位（Ｃ又はＡ）、及び８９位（Ｔ又はＧ）の置換を含み得、位置の番号付けは配列番号１７に従ってなされている。また、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、変異体ｉｎｃコード鎖によってコードされる変異体ｉｎｃＲＮＡの実際の５’末端及び実際の３’末端に応じて、その５’末端及びその３’末端で変化し得る。
【００４５】
いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。参考までに、配列番号１７は、ヌクレオチド６０位のＣからＴへの置換を含み、それ以外は大腸菌ＮＣＭ３７２２のｉｎｃＲＮＡのコード鎖と同一である変異体ｉｎｃコード鎖に相当する。また、参考までに、変異体ｉｎｃコード鎖のヌクレオチド配列と配列番号１７との間の配列同一性のパーセンテージは、ペアワイズ配列アラインメントを行うことにより決定することができる。これは、デフォルト設定（マトリックス：ＤＮＡｆｕｌｌ；ギャップオープン：１０；ギャップ拡張：０．５；出力フォーマット：ペア；エンドギャップペナルティ：ｆａｌｓｅ；エンドギャップオープン：１０；エンドギャップ拡張：０．５）を使用したＥＭＢＯＳＳニードルペアワイズシーケンスアラインメント（ＮＵＣＬＥＯＴＩＤＥ）ツールを使用して実行できる（ウェブサイト：ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．ｈｔｍｌ）。これは、同様の他のペアワイズ配列アラインメントツールを使用して行うこともできる。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。
【００４６】
いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７の少なくとも９０ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７の少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は９８ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００４７】
いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７を含む。いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７からなる。
いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、以下のような１つ以上の置換を含む配列番号１７の変異体を含む：ヌクレオチド４２位のＴからＣ、ヌクレオチド６６位のＡからＣ、又はヌクレオチド８９位のＧからＴ、ここで、位置の番号付けは配列番号１７に従ってなされている。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、以下のような１つの置換を含む配列番号１７の変異体を含むことができる：ヌクレオチド４２位のＴからＣ、ヌクレオチド６６位のＡからＣ、又はヌクレオチド８９位のＧからＴ、ここで、位置の番号付けは配列番号１７に従ってなされている。また、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、これらの置換の任意の２つの組み合わせを含む配列番号１７の変異体を含むことができる。また、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、これらの３つの置換すべてを含む配列番号１７の変異体を含むことができる。また、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、以下のような１つの置換を含む配列番号１７の変異体からなり得る：ヌクレオチド４２位のＴからＣ、ヌクレオチド６６位のＡからＣ、又はヌクレオチド８９位のＧからＴ、ここで、位置の番号付けは配列番号１７に従ってなされている。また、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、これらの置換の任意の２つの組み合わせを含む配列番号１７の変異体からなり得る。また、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、これらの３つの置換すべてを含む配列番号１７の変異体からなり得る。
【００４８】
いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７のヌクレオチド１〜７位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７のヌクレオチド１位、１位及び２位、１〜３位、１〜４位、１〜５位、１〜６位、又は１〜７位のヌクレオチドを欠く配列番号１７の変異体を含み得る。また、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７のヌクレオチド１位、１位及び２位、１〜３位、１〜４位、１〜５位、１〜６位、又は１〜７位のヌクレオチドを欠く配列番号１７の変異体からなり得る。
【００４９】
いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７のヌクレオチド９４〜９８位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７のヌクレオチド９４〜９８位、９５〜９８位、９６〜９８位、９７〜９８位、又は９８位を欠く配列番号１７の変異体を含み得る。また、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、配列番号１７のヌクレオチド９４〜９８位、９５〜９８位、９６〜９８位、９７〜９８位、又は９８位を欠く配列番号１７の変異体からなり得る。
【００５０】
いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、ヌクレオチド４２位、６６位、及び８９位に加えて、又はそれら以外の、１つ以上の他の置換を含む配列番号１７の変異体を含む。例えば、上記のように、ＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡは、ｉｎｃＲＮＡの機能に重要であると考えられているステム−ループ構造を持っていると予測されている。したがって、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、ステム−ループ構造を破壊しない追加の置換、例えばステム−ループ構造を維持する置換のペアを含むことができる。
【００５１】
変異体ｉｎｃＲＮＡはプラスミドコピー数の調節因子である。より広義には、変異体ｉｎｃＲＮＡはレプリコンコピー数とベクターコピー数の調節因子である。プラスミドに関して上で論じたように、レプリコンは、単一の複製開始点から複製するＤＮＡ分子の領域に相当する。ＤＮＡ分子は、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、又は人工染色体などのベクターであり得る。上記のように、ＲｅｐＦＩＣはＩｎｃＦＩプラスミドのレプリコンである。また、説明したように、ＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡは、その配列及び構造に基づいてＲｅｐＦＩＣレプリコンの非互換性を決定する。また、説明したように、ＣからＴへの置換を含み、それ以外は大腸菌ＮＣＭ３７２２のｉｎｃＲＮＡのコード鎖と同一である変異体ｉｎｃコード鎖は、プラスミドコピー数の増加を示す。
【００５２】
したがって、変異体ｉｎｃＲＮＡは、変異体ｉｎｃＲＮＡをコードするレプリコンの非互換性の決定に基づくプラスミドコピー数の調節因子となり得る。例えば、変異体ｉｎｃＲＮＡは、プラスミド及び非互換性の別のプラスミドを含む株において、プラスミドの分離安定性に影響を与える可能性があり、したがってプラスミドのコピー数に影響を与える可能性がある。また、変異体ｉｎｃＲＮＡは、ＣからＴへの置換を含むことに基づくコピー数の調節因子となり得、それにより、ＣからＴへの置換を含まないｉｎｃＲＮＡのコード鎖を含むレプリコンを含むプラスミドを含む株と比較して、プラスミドを含む株におけるプラスミドコピー数の増加を示すことができる。例えば、変異体ｉｎｃＲＮＡは、例えば５〜１５倍のプラスミドコピー数の増加を示し得る。
【００５３】
より一般化すると、変異体ｉｎｃＲＮＡは、レプリコンコピー数及びベクターコピー数の調節因子となり得る。したがって、プラスミドコピー数の調節因子であることに加えて、例えば、プラスミドに相当するベクターの場合、変異体ｉｎｃＲＮＡは、例えば、ウイルスベクター、コスミド、及び／又は人工染色体に相当するベクターのウイルスベクター、コスミド、及び／又は人工染色体のコピー数の調節因子にもなり得る。
【００５４】
いくつかの例において、変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。例えば、変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、大腸菌ＮＣＭ３７２２のｉｎｃＲＮＡのコード鎖によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる可能性がある。いくつかの例では、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、又は人工染色体のうちの１つ以上に相当する。いくつかの例において、変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を１〜５０倍、例えば２〜４０倍、３〜３０倍、４〜２０倍、１〜１０倍、５〜１５倍、１０〜２０倍、１５〜２５倍、２０〜３０倍、２５〜３５倍、３０〜４０倍、３５〜４５倍、又は４０〜５０倍増加させる。
【００５５】
核酸分子、プロモーター、及び複製開始点を含むレプリコンも開示されている。プロモーターは、変異体ｉｎｃコード鎖に作動可能に連結されている。変異体ｉｎｃＲＮＡはレプリコンのコピー数を調節する。
【００５６】
核酸分子は上記の通りとすることができる。したがって、いくつかの例では、変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、上記のように、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７を含む。
【００５７】
参考までに、プロモーターは、遺伝子の転写を開始するためにＲＮＡポリメラーゼが結合する短い配列要素の組み合わせである。プロモーターが変異体ｉｎｃコード鎖に作動可能に連結されていることにより、プロモーターが変異体ｉｎｃコード鎖のプロモーターであることを意味する。複製開始点は、複製が開始される特定の配列である。
【００５８】
いくつかの例では、レプリコンは変異体ＲｅｐＦＩＣレプリコンを含み、核酸分子は変異体ＲｅｐＦＩＣレプリコンの一部である。上記のように、ＲｅｐＦＩＣはＩｎｃＦＩプラスミドのレプリコンであり、プラスミドＰ３０７に完全な形で存在し、プラスミドＦにトランケート型で存在する。また、上記のように、ＲｅｐＦＩＣのｉｎｃＲＮＡの推定配列は、ソース及び予測される末端によって異なる。変異体ＲｅｐＦＩＣレプリコンは、上記のように、１つのＣからＴへの置換によって野生型中央ドメインとは異なる中央ドメインを含むことに基づく変異体である。したがって、変異体ＲｅｐＦＩＣレプリコンは、完全な形で存在する別のＲｅｐＦＩＣレプリコン、又はトランケート型で存在するＲｅｐＦＩＣレプリコンに対する変異体であり得、変異体ＲｅｐＦＩＣレプリコンは、１つのＣからＴへの置換によって野生型中央ドメインとは異なり、１つのＣからＴへの置換を含まないその他のＲｅｐＦＩＣレプリコンとも異なる中央ドメインを含む。また、変異体ＲｅｐＦＩＣレプリコンは、上記の他の置換のいずれか、又は他の追加の置換を含む別のＲｅｐＦＩＣレプリコンに対する変異体であり得、変異体ＲｅｐＦＩＣレプリコンは、１つのＣからＴへの置換によって野生型中央ドメインとは異なり、１つのＣからＴへの置換を含まないその他のＲｅｐＦＩＣレプリコンとも異なる中央ドメインを含む。
【００５９】
レプリコンを含むベクターも開示されている。レプリコンは上記のものとすることができる。したがって、いくつかの例では、レプリコンは変異体ｒｅｐＦＩＣレプリコンを含み、核酸分子は、上記のように、変異体ｒｅｐＦＩＣレプリコンの一部である。
【００６０】
いくつかの例では、変異体ｉｎｃＲＮＡは、上記のように、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。
【００６１】
いくつかの例では、ベクターはプラスミドを含む。上記のように、ベクターは、プラスミド、ウイルスベクター、コスミド、又は人工染色体のうちの１つ以上に相当し得る。したがって、いくつかの例では、ベクターはプラスミドに相当し得る。
【００６２】
いくつかの例では、ベクターは、標的産物を作製するための標的遺伝子をさらに含む。ベクターは、例えば、数ある生物の中でもとりわけ、細菌、古細菌、真核生物のドメインの微生物、動物、及び／又は植物などの生物からの標的遺伝子を含む組換えプラスミドであり得る。特に細菌ドメインの微生物に関して、標的遺伝子はとりわけ、例えば、大腸菌などのエシェリキア（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）属の細菌、コリネバクテリウム・グルタミカム（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｇｌｕｔａｍｉｃｕｍ）などのコリネバクテリウム属の細菌、又は枯草菌などのバチルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属の細菌に由来し得る。遺伝子工学のための多くの技術が開発されており、細菌、古細菌、真核生物のドメインの微生物、動物や植物などの、様々な生物の遺伝子の組換え発現が可能になっている。このような技術は、当業者に明らかであるように、本開示に従って、組換え微生物において多様な生物からの標的遺伝子をクローニング及び発現するために適用することができる。
【００６３】
いくつかの例では、標的産物は、（ｉ）標的ＲＮＡ、（ｉｉ）標的タンパク質、（ｉｉｉ）標的生体材料、（ｉｖ）標的ポリマー、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖ）標的甘味料、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉ）標的油、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉｉ）標的脂肪、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉｉｉ）標的多糖類、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｉｘ）標的アミノ酸、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｘ）標的ヌクレオチド、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｘｉ）標的ワクチン、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、又は（ｘｉｉ）標的医薬品、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素のうちの１つ以上を含む。したがって、いくつかの例では、標的遺伝子は標的ＲＮＡをコードし、標的産物は標的ＲＮＡに相当する。また、いくつかの例では、標的遺伝子は標的タンパク質をコードし、標的産物は標的タンパク質に相当する。また、いくつかの例では、標的遺伝子は、標的ＲＮＡ及び／又は標的タンパク質をコードし、その標的ＲＮＡ及び／又は標的タンパク質は、標的生体材料、標的ポリマー、それらの前駆体、及び／又はそれらの生産のための酵素、標的甘味料、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、標的油、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、標的脂肪、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、標的多糖類、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、標的アミノ酸、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、標的ヌクレオチド、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、標的ワクチン、その前駆体及び／又はその生産のための酵素、又は標的医薬品、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素の生産に関与する。例えば、標的ポリマー、標的甘味料、標的油、標的脂肪、標的多糖、標的アミノ酸、及び／又は標的ヌクレオチドに関して、標的遺伝子は、その標的ポリマー、標的甘味料、標的油、標的脂肪、標的多糖、標的アミノ酸、及び／又は標的ヌクレオチドを、直接または前駆体を介して生産する酵素に相当する標的タンパク質をコードすることができる。また、例えば、ワクチンに関して、標的遺伝子は、病原性微生物に対するワクチンの成分として使用することができる、病原性微生物のタンパク質サブユニット、受容体、又は他のタンパク質、又はそれらの断片などの、抗原又は抗原フラグメントに相当する標的タンパク質をコードすることができる。また、例えば、標的医薬品に関して、標的遺伝子は、医薬品の成分として使用することができる抗体、受容体、又はホルモンなどの標的タンパク質をコードすることができる。
【００６４】
いくつかの例では、ベクターは、複数の標的遺伝子、例えば、特定の生物からの複数の標的遺伝子、及び／又は複数の生物のそれぞれからの１つ以上の標的遺伝子を含む。また、いくつかの例において、標的遺伝子は、複数の標的産物を作製するためのものである。
【００６５】
いくつかの例では、ベクター、例えばプラスミドは、３〜１２０ｋｂのサイズを有する。組換えベクターは、３〜１２０ｋｂのサイズで存在することが多く、これらは標的遺伝子がクローニングされたベクターの典型的なサイズである。上記のように、ＣからＴへの置換を含み、それ以外は大腸菌ＮＣＭ３７２２のｉｎｃＲＮＡのコード鎖と同一である変異体ｉｎｃコード鎖は、例えば、約５〜１５倍のプラスミドコピー数の増加を示す。以下に論じられるように、そして図５及び図６に示されるように、プラスミドコピー数の増加が観察された対応するプラスミド、及び対応するＲｅｐＦＩＣレプリコンが得られた大腸菌ＮＣＭ３７２２のＦ−様プラスミドは、３〜１２０ｋｂの範囲内のサイズで生じ、変異体ｉｎｃコード鎖と、この範囲内のサイズのプラスミド、つまりはベクターのコピー数の調節との関連性を示している。
【００６６】
レプリコンを含む組換え微生物も開示されている。レプリコンは上記のものとすることができる。
ベクターを含む組換え微生物も開示されている。ベクターは上記のものとすることができる。したがって、いくつかの例において、変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。また、いくつかの例では、ベクターはプラスミドを含む。また、いくつかの例では、ベクターは、標的産物を作製するための標的遺伝子をさらに含む。また、いくつかの例では、標的産物は、上記のような１つ以上の標的産物を含む。
【００６７】
いくつかの例において、組換え微生物における変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、対照微生物における配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。対照微生物は、例えば、組換え微生物と同じ属、種、及び／又は株に由来することができ、類似又は同一のプラスミド及び／又は標的遺伝子を含むことができ、したがって、系統発生的に類似し、近縁であり、及び／又は組換え微生物の変異体ｉｎｃコード配列と対照微生物の対応するｉｎｃ配列との間の違いに関するもの以外は遺伝的に同一であり得る。同様に、上記のように、増加は１〜５０倍、例えば２〜４０倍、３〜３０倍、４〜２０倍、１〜１０倍、５〜１５倍、１０〜２０倍、１５〜２５倍、２０〜３０倍、２５〜３５倍、３０〜４０倍、３５〜４５倍、又は４０〜５０倍になり得る。
【００６８】
いくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９０ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は９８ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。
【００６９】
いくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７を含む。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、以下のような１つ以上の置換を含む配列番号１７の変異体を含む：ヌクレオチド４２位でのＴからＣ、ヌクレオチド６６位でのＡからＣ、又はヌクレオチド８９位でのＧからＴ。説明したように、位置の番号付けは配列番号１７に従ってなされている。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド１〜７位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド９４〜９８位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、ヌクレオチド４２位、６６位、及び８９位に加えて、又はこれらのヌクレオチド位置以外に、１つ以上の他の置換を含む配列番号１７の変異体を含む。
【００７０】
いくつかの例において、組換え微生物は、形質転換、接合、又は形質導入のうちの１つ以上によって、ベクターを前駆体微生物に導入することにより調製することができる。前駆体微生物は、組換え微生物がベクターを含むことを除いて、組換え微生物が前駆体微生物と遺伝的に同一であるように、ベクターが直接導入される微生物であり得る。形質転換は、単離された形態のベクターを、例えば、化学的技術によって、例えば、塩化カルシウム形質転換、又は物理的手法、例えばエレクトロポレーションによって前駆体微生物の細胞内に移すことによって実施できる。接合は、線毛を合成するための遺伝子を含むベクターに基づいて行うことができ、ベクターを含むドナー微生物の細胞を、ベクターを受け取る前駆体微生物の細胞と接触させる。形質導入は、ウイルスの使用に基づいて実施して、前駆体微生物の細胞へのベクターの移入を達成することができる。それぞれ、分子生物学の標準的な技術によって実施することができる。
【００７１】
いくつかの例において、組換え微生物は、エシェリキア属の細菌又は大腸菌種の細菌のうちの１つ以上から調製することができる。上記のように、ＲｅｐＦＩＣはＩｎｃＦＩプラスミドのレプリコンである。これらのプラスミドは大腸菌で自然に発生する。ＲｅｐＦＩＣレプリコンは大腸菌で機能する。したがって、変異体ｉｎｃコード鎖を含む核酸分子は、エシェリキア属の細菌、特に大腸菌種の細菌におけるプラスミドコピー数を調節することができる。また、いくつかの例において、組換え微生物は、別の細菌、すなわち、エシェリキア属又は大腸菌種以外の細菌から調製することができる。
【００７２】
組換え微生物におけるベクターのコピー数を調節する方法も開示されている。組換え微生物におけるベクターのコピー数を調節するための変異体ｉｎｃコード鎖の使用も開示されている。
【００７３】
ベクターは上記のものとすることができる。したがって、再びいくつかの例において、変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。また、いくつかの例では、ベクターはプラスミドを含む。また、いくつかの例では、ベクターは、標的産物を作製するための標的遺伝子をさらに含む。また、いくつかの例では、標的産物は、上記のような１つ以上の標的産物を含む。
【００７４】
組換え微生物もまた、上記のものとすることができる。したがって、再びいくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。この場合も、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９０ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は９８ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。またさらに、いくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７を含む。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、以下のような１つ以上の置換を含む配列番号１７の変異体を含む：ヌクレオチド４２位でのＴからＣ、ヌクレオチド６６位でのＡからＣ、又はヌクレオチド８９位でのＧからＴ、ここで、説明したように、位置の番号付けは配列番号１７に従ってなされている。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド１〜７位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド９４〜９８位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、ヌクレオチド４２位、６６位、及び８９位に加えて、又はこれらのヌクレオチド位置以外に、１つ以上の他の置換を含む配列番号１７の変異体を含む。
【００７５】
この方法は、（１）ベクターを前駆体微生物に導入することにより組換え微生物を得るステップを含む。ベクターは、例えば、上記のように、形質転換、接合、又は形質導入のうちの１つ以上によって導入することができる。組換え微生物は、説明したように、例えば、エシェリキア属の細菌又は大腸菌種の細菌のうちの１つ以上から調製することができる。
【００７６】
この方法はまた、（２）ベクターの複製に十分な条件下で培養培地中で組換え微生物を培養することにより、ベクターのコピー数を調節するステップを含む。培養は、微生物学の標準的な技術によって、例えば、培養管、フラスコ、及び／又はバイオリアクターにおいて実施することができ、その詳細は、当業者には明らかであろう。培養は、適切な培養培地、例えば、栄養豊富な培地又は最小培地で実施することができ、これらの詳細も当業者には明らかであろう。培養は、適切なインキュベーション温度、例えば約２５〜３８℃、２８〜３７℃、又は３７℃で実施することができ、これらの詳細も当業者には明らかであろう。組換え微生物が増殖し、培養中に分裂するにつれて、ベクターが複製される。したがって、例えば、大腸菌から調製された組換え微生物に関して、組換え微生物は、バイオリアクター内でバッチ式又は連続的に、発酵技術によって培養することができる。培養は、最小培地、例えば、Ｍ９最小塩培地などの定義された量の塩、及び１つ以上の炭素源、とりわけ、グルコース、スクロース、又はリグノセルロース材料を含む培地で行うことができる。培養は約３７℃で行うことができる。このような条件は、大腸菌の成長及び分裂を助け、したがってベクターの複製を助ける。大腸菌から調製された組換え微生物の培養に適した他の条件は、他の微生物と同様に知られており、当業者には明らかであろう。
【００７７】
いくつかの例において、組換え微生物における変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、上記のように、対照微生物における配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。したがって、対照微生物は、例えば、組換え微生物と同じ属、種、及び／又は株に由来することができ、類似又は同一のプラスミド及び／又は標的遺伝子を含むことができる。
【００７８】
組換え微生物においてベクターを使用することにより標的産物を作製するための方法も開示される。標的産物を作製するための組換え微生物におけるベクターの使用も開示されている。
【００７９】
ベクターは上記のものとすることができる。したがって、再びいくつかの例において、変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。また、いくつかの例では、ベクターはプラスミドを含む。
【００８０】
組換え微生物もまた、上記のものとすることができる。したがって、再びいくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。この場合も、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９０ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は９８ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。またさらに、いくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７を含む。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、以下のような１つ以上の置換を含む配列番号１７の変異体を含む：ヌクレオチド４２位でのＴからＣ、ヌクレオチド６６位でのＡからＣ、又はヌクレオチド８９位でのＧからＴ、ここで、説明したように、位置の番号付けは配列番号１７に従ってなされている。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド１〜７位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド９４〜９８位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、ヌクレオチド４２位、６６位、及び８９位に加えて、又はこれらのヌクレオチド位置以外に、１つ以上の他の置換を含む配列番号１７の変異体を含む。
【００８１】
標的産物も上記のものとすることができる。例えば、標的産物は、（ｉ）標的ＲＮＡ、（ｉｉ）標的タンパク質、（ｉｉｉ）標的生体材料、（ｉｖ）標的ポリマー、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖ）標的甘味料、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉ）標的油、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉｉ）標的脂肪、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｖｉｉｉ）標的多糖類、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｉｘ）標的アミノ酸、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｘ）標的ヌクレオチド、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、（ｘｉ）標的ワクチン、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素、又は（ｘｉｉ）標的医薬品、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素のうちの１つ以上を含み得る。
【００８２】
ベクターは、上記のように、標的産物を作製するための標的遺伝子をさらに含む。
この方法は、上記のように、（１）ベクターを前駆体微生物に導入することにより組換え微生物を得るステップを含む。ここでも、ベクターは、例えば、上記のように、形質転換、接合、又は形質導入のうちの１つ以上によって導入することができる。組換え微生物は、説明したように、例えば、エシェリキア属の細菌又は大腸菌種の細菌のうちの１つ以上から調製することができる。
【００８３】
この方法はまた、（２）組換え微生物が標的遺伝子を発現する条件下で培養培地中で組換え微生物を培養することにより、上記のように標的産物を作製するステップを含む。
この方法はまた、（３）組換え微生物及び／又は培養培地から標的産物を回収するステップを含む。標的産物を回収するための適切なアプローチは、標的産物の詳細、とりわけ、標的タンパク質に相当する標的産物のタンパク質精製の標準技術、又は標的ポリマーに相当する標的産物のポリマー抽出及び沈殿の標準技術に基づいて開発することができ、これらの詳細は、例えば標的産物の種類（例えば、ＲＮＡ、タンパク質、ポリマーなど）、標的産物の特定の詳細（例えば、化学構造、分子量、アフィニティータグなど）、及び必要な純度（例えば、低から高まで）に応じて、当業者に明らかであろう。例えば、標的ＲＮＡに相当する標的産物に関して、組換え微生物の培養後、当技術分野で知られている方法の中でも特に、Ｓｔｅａｄら、Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  ４０（２０）、ｅ１５６：１−９（２０１２）に記載されているように、ＲＮＡｓｎａｐ（商標）法を使用することにより、又はＴＲＩｚｏｌ（商標）Ｍａｘ（商標）バクテリアＲＮＡ分離キット（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、ＲＮｅａｓｙ（商標）Ｐｒｏｔｅｃｔバクテリア分離キット（Ｑｉａｇｅｎ）などの市販の方法により、又はＲｉｂｏＰｕｒｅ（商標）バクテリアＲＮＡ分離（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、標的ＲＮＡを組換え微生物から回収することができる。標的タンパク質に相当する標的産物について、標的タンパク質は、当技術分野で周知の手順に従って、抽出、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、及び／又は沈殿による濃縮により、組換え微生物から回収することができる。標的ポリマーに相当する標的産物について、標的ポリマーは、化学構造及び分子量に基づいて選択された洗浄用の組成物及び沈殿剤での抽出、洗浄、及び濃縮によって回収することができ、これも当技術分野で周知の手順に従う。標的甘味料、標的油、標的脂肪、標的多糖類、標的アミノ酸、又は標的ヌクレオチドに相当する標的産物について、標的産物が組換え微生物内に蓄積する場合も、同様のアプローチを使用することができる。一方、標的産物が細胞外に蓄積する場合、標的産物は、例えば培養培地からの沈殿により、やはり当技術分野で周知の手順に従って回収することができる。標的ワクチン又は標的医薬品に相当する標的産物の場合、例えば、標的タンパク質について上記で説明したように、数あるアプローチの中でも特に、例えば抗原又は抗原フラグメントに相当する標的ワクチンのイオン交換クロマトグラフィーに基づき、又はモノクローナル抗体に相当する医薬品のアフィニティークロマトグラフィーに基づき、やはり当技術分野で周知の手順に従って標的産物を回収することができる。
【００８４】
いくつかの例において、組換え微生物における変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、上記のように、対照微生物における配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。この場合も、対照微生物は、例えば、組換え微生物と同じ属、種、及び／又は株に由来することができ、類似又は同一のプラスミド及び／又は標的遺伝子を含むことができる。
【００８５】
標的産物をより詳細に検討すると、いくつかの例では、標的産物は、（ｉ）標的ポリマー、その前駆体、及び／又はその産生のための酵素、又は（ｉｉ）標的生体高分子、その前駆体、及び／又はその生産のための酵素のうちの１つ以上を含む。生体高分子を含むポリマーの生物学的生産は、特に複雑な化学構造を有するモノマー及び／又は２種以上のモノマーを含むコポリマーに基づくポリマーの場合、組換え微生物における複数の標的遺伝子の協調的な導入及び発現が必要なために、困難な場合がある。上記の他の標的産物、特に標的甘味料、標的脂肪、標的多糖類、標的アミノ酸、標的ヌクレオチド、標的ワクチン、及び標的医薬品に関しても同様の考慮事項が適用される。
【００８６】
この方法は、例えば、標的ポリマー、標的生体高分子、標的甘味料、標的脂肪、標的多糖、標的アミノ酸、又は標的ヌクレオチドの生産において、組換え微生物へのベクターの安定した取り込みと標的遺伝子の産物の収率の制御とのバランスをとるために、複数の標的遺伝子を含むベクターの適切なコピー数をより迅速に決定するのに有用であり得る。野生型中央ドメインを含むＲｅｐＦＩＣレプリコンを含み、少数から多数までの（例えば、比較的大きいサイズから小さいサイズまでのベクターサイズに基づく）ベクターコピー数の第１の範囲をカバーするベクターの第１のセットを調製することができる。ベクターの第２のセットであって、変異体中央ドメインを含み、したがって第２のより多い範囲のベクターコピー数をカバーすること以外は第１のセットと同一であるベクターの第２のセットを調製することができる。標的遺伝子のセットを各ベクターにクローニングすることができる。この方法は、各ベクターを使用して実施することができ、（１）ベクターを導入するステップ、（２）対応する組換え微生物を培養するステップ、及び（３）対応する標的産物を回収するステップを含む。コピー数は培養中にベクターごとに決定することができる。標的産物の収率又はその他の関連する特性は、回収中に決定することができる。このアプローチは、ベクターの第１のセットで達成できるコピー数の上限を大幅に増やすことができる。これは、標的遺伝子の過剰発現が十分に許容される場合に収率を最大化するのに有利である。このアプローチは、標的産物の収率に対するベクターコピー数の影響をテストすることに関して、サンプルサイズを効果的に２倍にすることもできる。このアプローチは、３〜１２０ｋｂのサイズのプラスミドを含む、及び／又は複数の標的遺伝子を含むプラスミドに相当するベクターに特に使用することができる。
【００８７】
ベクターを含み、この場合、変異体ｒｐｏＣＲＮＡ−ポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質コード配列（「変異体ｒｐｏＣコード配列」とも呼ばれる）も含む核酸分子を含む別の組換え微生物も開示されている。
【００８８】
ベクターは上記のものとすることができる。したがって、やはりいくつかの例において、変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。また、いくつかの例では、ベクターはプラスミドを含む。
【００８９】
組換え微生物はまた、上記のものとすることができる。したがって、再びいくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。この場合も、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９０ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は９８ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。また同じく、いくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７を含む。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、以下のような１つ以上の置換を含む配列番号１７の変異体を含む：ヌクレオチド４２位でのＴからＣ、ヌクレオチド６６位でのＡからＣ、又はヌクレオチド８９位でのＧからＴ、ここで、説明したように、位置の番号付けは配列番号１７に従ってなされている。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド１〜７位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド９４〜９８位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、ヌクレオチド４２位、６６位、及び８９位に加えて、又はこれらのヌクレオチド位置以外に、１つ以上の他の置換を含む配列番号１７の変異体を含む。
【００９０】
前述のように、この場合、組換え微生物は、ベクターとともに、変異体ｒｐｏＣコード配列を含む別の核酸分子を含む。変異体ｒｐｏＣコード配列は、変異体ＲｐｏＣ  ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質（「変異体ＲｐｏＣ」とも呼ばれる）をコードする。変異体ＲｐｏＣはＲ４７Ｃ置換を含み、Ｒ４７Ｃ置換の番号付けは、大腸菌の野生型ＲｐｏＣＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質（野生型ＲｐｏＣ）に基づいて定義されている。
【００９１】
驚くべきことに、変異体ｒｐｏＣコード配列が変異体ＲｐｏＣをコードし、変異体ＲｐｏＣがＲ４７Ｃ置換を含む、変異体ｒｐｏＣコード配列を含む核酸分子を使用すると、そのヌクレオチド配列を含む組換え微生物において、対応する染色体コピー数の減少は引き起こさずに、プラスミドのコピー数の実質的な減少を引き起こすことができることが分かった。Ｅｄｅｒｔｈら及びＰｅｔｅｒｓｅｎらによって説明されているように、単一の置換を含む大腸菌ＲｐｏＣの変異体は、ｒｐｏＣ遺伝子の３’末端領付近にのみ、つまりＲｐｏＣのＣ末端ドメイン配列にのみ変異を含んでいたのに対し、本明細書に開示されるＲ４７Ｃ置換は、ＲｐｏＣのＮ末端ドメイン配列内で生じることを考えると、これは特に驚くべきことである。Ｅｄｅｒｔｈら及びＰｅｔｅｒｓｅｎらによって説明されているような大腸菌ＲｐｏＣの変異体における単一の置換は、保存された残基に囲まれていないＲｐｏＣ配列内の位置で発生し、保存された配列内では発生しないのに対し、本明細書に開示されるＲ４７Ｃ置換は、通常は多様な細菌のＲｐｏＣ間で厳密に保存されている９アミノ酸残基のＮ末端ドメイン配列内で生じることからも、これは驚くべきことである。
【００９２】
理論に拘束されることを望まないが、多様な細菌由来の野生型ＲｐｏＣは、野生型ＲｐｏＣ間で厳密に保存されている、配列番号４４の残基４０〜４８に相当するＮ末端ドメイン配列を含むと考えられる。図７に示すように、この配列は、多様な系統発生、代謝、及び環境を代表する１９種類の多様な細菌、すなわち高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アセトバクター属酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、アクチノマイセス・オドントリティカス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、及びラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）の間で厳密に保存されている。参考までに、これらの配列は、Ｌｅｅらによって提供された２１系統のＲｐｏＣのＣ末端ドメインのアラインメントから得られる完全長のＲｐｏＣ配列に相当する。また、多様な細菌からの野生型ＲｐｏＣには、配列番号４７に相当する中央ドメイン配列も含まれると考えられ、これも野生型ＲｐｏＣ間で厳密に保存されている。図８に示すように、この配列はまた、上記の１９種類の多様な細菌の間で厳密に保存されている。多様な範囲の細菌由来の野生型ＲｐｏＣには、同じく野生型ＲｐｏＣ間で厳密に保存されている配列番号４８に相当するＣ末端ドメイン配列も含まれていると考えられる。図９Ａ〜Ｂに示すように、この配列はまた、上記１９種類の多様な細菌の間で厳密に保存されている。
【００９３】
さらに、それぞれ厳密に保存されたＮ末端ドメイン配列、中央ドメイン配列、及びＣ末端ドメイン配列を含む、配列番号４４の残基３３〜５７に相当するより長いＮ末端ドメイン配列、配列番号５０に相当するより長い中央ドメイン配列、及び配列番号５１に相当するより長いＣ末端ドメイン配列は、上記１９種類の多様な細菌のＲｐｏＣ間で概ね保存されている多数の残基を含むと考えられる。図７、図８、及び図９Ａ〜Ｂに示すように、大腸菌ＲｐｏＣは、これらの長い配列を含む。また、他の細菌からのＲｐｏＣには、これらの長い配列と非常に類似した配列が含まれている。
【００９４】
多様な細菌由来の野生型ＲｐｏＣは、厳密に保存されたＮ末端、中央、及びＣ末端ドメイン配列を含むため、これらの配列は他の細菌の野生型ＲｐｏＣ間でも厳密に保存されていると考えられる。背景として、表１に示すように、他の１８種類の多様な細菌のＲｐｏＣと比較した大腸菌のＲｐｏＣのペアワイズ配列アラインメントの結果は、大腸菌とは系統発生学的、代謝的、及び環境的に遠い極端な好熱性の高度好熱菌などの細菌のＲｐｏＣでも、比較的高い配列同一性及び類似性を示している。これは、ＲｐｏＣが転写及び複製で果たす基本的な役割と一致している。
【００９５】
【表１−１】
2021532813.tif 000003
【００９６】
【表１−２】
2021532813.tif 000004
【００９７】
【表１−３】
2021532813.tif 000005
【００９８】
＊ペアワイズ配列アラインメントは、デフォルト設定（マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ拡張：０．５；出力フォーマット：ペア；エンドギャップペナルティ：ｆａｌｓｅ；エンドギャップオープン：１０；エンドギャップ拡張：０．５）を使用したＥＭＢＯＳＳニードルペアワイズシーケンスアラインメント（ＰＲＯＴＥＩＮ）ツールを使用して行った（ウェブサイト：ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）。
【００９９】
また、多様な細菌由来の野生型ＲｐｏＣは、より長いＮ末端、中央、及びＣ末端ドメイン配列と非常に類似した配列を含むため、他の細菌の野生型ＲｐｏＣもこれらの配列に非常に類似した配列を含むと考えられる。さらに、厳密に又は概ね保存されている様々な配列に基づいて、対応するＮ末端、中央、及びＣ末端ドメイン配列は、ＲｐｏＣが転写及び染色体とプラスミドの複製において果たす役割において、構造的及び／又は機能的に重要な貢献をすると考えられる。
【０１００】
また、理論に拘束されることを望まないが、ＲｐｏＣでは特にＮ末端ドメインがプラスミドのコピー数を決定する上で重要な役割を果たすと考えられる。図１０及び図１１に示すように、変異体ｒｐｏＣコード配列は、配列番号４６を含むＮ末端ドメインを含み、これは、野生型Ｎ末端ドメインの厳密に保存された配列とは１つの置換、すなわちアミノ酸４７位のＲ（すなわちアルギニン）からＣ（すなわちシステイン）への置換（「Ｒ４７Ｃ」とも呼ばれる）によって異なる。ここで、番号付けは大腸菌の野生型ＲｐｏＣに基づいて定義されている。このＲ４７Ｃ置換を含み、それ以外は大腸菌の野生型ＲｐｏＣと同一である変異体ＲｐｏＣは、例えば、約２５％〜７５％のプラスミドコピー数の減少を示す。Ｎ末端ドメインのＲ４７Ｃ置換は、大腸菌の変異体ＲｐｏＣと野生型ＲｐｏＣの唯一の違いであるため、ならびに、Ｒ４７Ｃ置換は、上記１９種類の多様な細菌の間で概ね保存されている多数の残基を含む長いＮ末端ドメイン配列内に位置しているため、さらには、上記１９種類の多様な細菌の野生型ＲｐｏＣの中で配列番号４４の残基４０〜４８に相当する厳密に保存されたＮ末端ドメイン配列内で他の置換が生じないため、Ｎ末端ドメインはプラスミドコピー数の決定において重要であるように思われる。
【０１０１】
本明細書で使用される場合、ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質という用語は、ＲＮＡポリメラーゼのＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットを意味する。上記のように、ＲＮＡポリメラーゼは転写に関与する。ＲＮＡポリメラーゼは、染色体及びプラスミドの複製にも関与する。ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質は、既知のＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質との構造的及び／又は機能的類似性に基づいて、例えば、Ｌｅｅらによって示されるような配列アラインメント、及び／又はＭｕｋｈｏｐａｄｈｙａｙらによって論じられているような構造的特徴に基づいて同定することができる。ＲＮＡポリメラーゼ活性は、例えば、Ｃｈａｍｂｅｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ２５４（２０）：１００６１１−１００６９（１９７９）に記載されているように測定することができる。
【０１０２】
本明細書で使用される場合、ｒｐｏＣ  ＲＮＡ−ポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質コード配列という用語は、ＲＮＡ−ポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質の配列をコードするＤＮＡ分子鎖又はＤＮＡ分子鎖の一部を意味する。
【０１０３】
本明細書で使用される場合、野生型ＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質という用語は、自然条件下において同じ種の個体に共通して生じるＲＮＡポリメラーゼβ’サブユニットタンパク質を意味する。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、Ｎ末端ドメインという用語は、タンパク質のＮ末端又はその付近、例えばタンパク質のアミノ酸配列の最初の３分の１内に存在するタンパク質の一部を意味する。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、中央ドメインという用語は、タンパク質の中央又はその付近、例えばタンパク質のアミノ酸配列の中央３分の１内に存在するタンパク質の一部を意味する。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、Ｃ末端ドメインという用語は、タンパク質のＣ末端又はその付近、例えばタンパク質のアミノ酸配列の最後の３分の１内に存在するタンパク質の一部を意味する。
【０１０７】
前述のように、変異体ｒｐｏＣコード配列を含む核酸分子が開示されている。核酸分子は、例えば、変異体ｒｐｏＣコード配列が導入された染色体ＤＮＡなどの二本鎖ＤＮＡ分子、又は変異体ｒｐｏＣコード配列がクローニングされたプラスミドであり得る。
【０１０８】
また、前述のように、変異体ｒｐｏＣコード配列は変異体ＲｐｏＣをコードする。変異体ＲｐｏＣは、Ｒ４７Ｃ置換を含むことに基づく変異体であり、Ｒ４７Ｃ置換の番号付けは、大腸菌の野生型ＲｐｏＣに基づいて定義されている。変異体ＲｐｏＣは１種のＲｐｏＣであるため、転写、染色体の複製、及びプラスミドの複製において役割を果たす。上記１９種類の多様な細菌の野生型ＲｐｏＣが、例えば保存されていないアミノ酸位置で互いに異なるのと同様に、変異体ＲｐｏＣも変異体ｒｐｏＣコード配列のソースに応じて変化し得る。したがって、例えば、変異体ＲｐｏＣは、Ｒ４７Ｃ置換を含み得、それ以外は大腸菌の野生型ＲｐｏＣと少なくとも９０％同一であり得る。また、例えば、変異体ＲｐｏＣはＲ４７Ｃ置換を含み、それ以外は他の１８種類の多様な細菌、すなわち、高度好熱菌（Ｔｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、アセトバクター属酢酸菌（Ａｃｅｔｏｂａｃｔｅｒ  ｐａｓｔｅｕｒｉａｎｕｓ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ  ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）、レジオネラ・ニューモフィラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ  ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、コレラ菌（Ｖｉｂｒｉｏ  ｃｈｏｌｅｒａｅ）、サルモネラ・ティフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｅｎｔｅｒｉｃａ  ｓｅｒｏｖａｒ  Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ）、アクチノマイセス・オドントリティカス（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｓ  ｏｄｏｎｔｏｌｙｔｉｃｕｓ）、ストレプトマイセス・セリカラー（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ  ｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒ）、ジフテリア菌（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｄｉｐｈｔｈｅｒｉａｅ）、結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ロドコッカス・エクイ（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ  ｅｑｕｉ）、クラミジア・トラコマチス（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ  ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ）、ボツリヌス菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ  ｂｏｔｕｌｉｎｕｍ）、枯草菌（Ｂａｃｉｌｌｕｓ  ｓｕｂｔｉｌｉｓ）、肺炎レンサ球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ  ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、エンテロコッカス・ファエカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ  ｆａｅｃａｌｉｓ）、又はラクトバチルス・ブレビス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ  ｂｒｅｖｉｓ）のいずれかの野生型ＲｐｏＣと少なくとも９０％同一であってもよい。また、例えば、変異体ＲｐｏＣは、Ｒ４７Ｃ置換、及び、大腸菌又は他の１８種類の多様な細菌の１つ以上の野生型ＲｐｏＣの１つ以上の部分を含み得る。
【０１０９】
いくつかの例では、変異体ＲｐｏＣは、（１）配列番号４６を含むＮ末端ドメイン、（２）配列番号４７を含む中央ドメイン、及び（３）配列番号４８を含むＣ末端ドメインをさらに含み、Ｒ４７Ｃ置換はＮ末端ドメイン内に存在する。これらの例では、変異体ＲｐｏＣは、Ｒ４７Ｃ置換を含む、配列番号４６に相当するＮ末端ドメイン配列を含む。変異体ＲｐｏＣはまた、配列番号４７に相当する厳密に保存された中央ドメイン配列及び配列番号４８に相当する厳密に保存されたＣ末端ドメイン配列を含み、ＲｐｏＣが転写ならびに染色体及びプラスミドの複製において果たす役割と一致する。
【０１１０】
いくつかの例では、変異体ＲｐｏＣは、（１）配列番号４９を含むＮ末端ドメイン、（２）配列番号５０を含む中央ドメイン、及び（３）配列番号５１を含むＣ末端ドメインをさらに含み、Ｒ４７Ｃ置換はＮ末端ドメイン内に存在する。これらの例では、変異体ＲｐｏＣは、Ｒ４７Ｃ置換を含む、配列番号４９に相当するＮ末端ドメイン配列を含む。変異体ＲｐｏＣはまた、配列番号５０に相当する概ね保存されたより長い中央ドメイン配列及び配列番号５１に相当する概ね保存されたより長いＣ末端ドメイン配列を含み、これも転写及び染色体とプラスミドの複製においてＲｐｏＣが果たす役割と一致する。
【０１１１】
いくつかの例において、変異体ＲｐｏＣは、配列番号４５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。参考までに、配列番号４５は、Ｒ４７Ｃ置換を含み、それ以外は大腸菌の野生型ＲｐｏＣと同一である変異体ＲｐｏＣに相当する。また、参考のために、変異体ＲｐｏＣのアミノ酸配列と配列番号４５との間の配列同一性のパーセンテージは、ペアワイズ配列アラインメントを行うことによって決定することができる。これは、デフォルト設定（マトリックス：ＢＬＯＳＵＭ６２；ギャップオープン：１０；ギャップ拡張：０．５；出力フォーマット：ペア；エンドギャップペナルティ：ｆａｌｓｅ；エンドギャップオープン：１０；エンドギャップ拡張：０．５）を使用したＥＭＢＯＳＳニードルペアワイズシーケンスアラインメント（ＰＲＯＴＥＩＮ）ツールを使用して行うことができる（ウェブサイト：ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ／Ｔｏｏｌｓ／ｐｓａ／ｅｍｂｏｓｓ＿ｎｅｅｄｌｅ／）。これは、同様の他のペアワイズ配列アラインメントツールを使用して行うこともできる。
【０１１２】
変異体ＲｐｏＣのアミノ酸配列は、例えば、主に又は完全に、大腸菌の野生型ＲｐｏＣと他の１８種類の多様な細菌のＲｐｏＣとの間で保存されていないアミノ酸残基の置換に基づいて、配列番号４５とは異なり得る。表１を参照すると、他の１８種類の多様な細菌のＲｐｏＣと比較した大腸菌のＲｐｏＣのペアワイズ配列アラインメントの結果は、比較的高い配列同一性及び類似性を示しているが、この結果は、多様な細菌のうち１７種類のＲｐｏＣが、大腸菌の野生型ＲｐｏＣと比較して３６．１％〜８２．４％の範囲の、つまり９０％を大きく下回る配列同一性を有することも示している。類似のタンパク質間で保存されていないアミノ酸残基の置換は、保存されているアミノ酸残基の置換と比較して、一般に許容されやすく、例えば、構造及び／又は機能を破壊しない可能性が高い。表１の結果は、ＲｐｏＣが保存されていない多くのアミノ酸残基を含むため、置換を受け入れやすい可能性があることを示している。
【０１１３】
変異体ＲｐｏＣのアミノ酸配列はまた、例えばいくつか又は多くの保存的置換を含むことに基づいて、配列番号４５とは異なり得る。これは、配列番号４５と比較して、アミノ酸残基を別の構造的に類似したアミノ酸残基で置換することを意味する。保存的置換には、通常、次のグループ内の置換が含まれる：（１）グリシン及びアラニン、（２）バリン、イソロイシン、及びロイシン、（３）アスパラギン酸及びグルタミン酸、（４）アスパラギン及びグルタミン、（５）セリン及びスレオニン、（６）リジン及びアルギニン、ならびに（７）フェニルアラニン及びチロシン。一般に、保存的置換は、保存的でない置換と比較して許容されやすい。
【０１１４】
したがって、これらの例では、変異体ＲｐｏＣはＲ４７Ｃ置換を含む。変異体ＲｐｏＣはまた、配列番号４５と少なくとも９０％同一であるアミノ酸配列を含む。例えば、変異体ＲｐｏＣは、配列番号４５と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含むことができる。
【０１１５】
いくつかの例において、変異体ＲｐｏＣは配列番号４５を含む。
いくつかの例において、変異体ＲｐｏＣの発現は、配列番号４４を含む野生型ＲｐｏＣの発現と比較して、プラスミドのコピー数を減少させる。参考までに、配列番号４４は大腸菌の野生型ＲｐｏＣに相当する。上記のように、変異体ＲｐｏＣは１種のＲｐｏＣであるため、転写、染色体の複製、及びプラスミドの複製において役割を果たす。また、上記のように、Ｒ４７Ｃ置換を含み、それ以外は大腸菌の野生型ＲｐｏＣと同一である変異体ＲｐｏＣは、プラスミドコピー数を、例えば、約２５％〜７５％減少させる。
【０１１６】
重要なことに、上述したような、配列番号１５を含む変異体ｉｎｃコード鎖を含むベクターも含む組換え微生物の状況において、変異体ＲｐｏＣの存在は、ベクターのコピー数の減少を引き起こし得る。減少は、例えば、（ｉ）野生型ＲｐｏＣを発現している微生物にも存在する、１つのＣからＴへの置換によって野生型中央ドメインとは異なる中央ドメインを含む変異体ＲｅｐＦＩＣレプリコンを含むベクターのコピー数と、（ｉｉ）同じく野生型ＲｐｏＣを発現している微生物にも存在する、１つのＣからＴへの置換を含まないＲｅｐＦＩＣレプリコンを含む対応するベクターのコピー数との中間のコピー数になり得る。したがって、変異体ＲｐｏＣの存在は、プラスミドコピー数を、例えば変異体ｉｎｃコード鎖で取得できるレベルと、野生型ｉｎｃコード鎖で取得できるレベルとの間で調節するために使用することができる。
【０１１７】
いくつかの例において、変異体ＲｐｏＣの発現は、配列番号４４を含む野生型ＲｐｏＣの発現と比較して、プラスミドのコピー数を１０％〜８０％、２５％〜７５％、３０％〜７０％、３５％〜６５％、４０％〜６０％、４５％〜５５％、１０％〜４０％、２０％〜５０％、３０％〜６０％、４０％〜７０％、又は５０％〜８０％減少させる。
【０１１８】
変異体ｒｐｏＣコード配列を含む核酸分子を含む組換え微生物は、組換え微生物を取得するために、例えば、ベクターにクローニングされた完全な変異体ｒｐｏＣコード配列を、前駆体微生物に、例えば形質転換、接合、又は形質導入により導入し、続いて、例えばベクターの選択により、完全な変異体ｒｐｏＣコード配列を組換え微生物中に維持することによって得ることができる。これは、分子生物学の標準的な技術によって達成することができる。いくつかの例では、組換え微生物は、核酸配列を含むｒｐｏＣコード配列ベクター、例えばプラスミドを、形質転換、接合、又は形質導入のうちの１つ以上によって前駆体微生物に導入することにより調製することができる。
【０１１９】
変異体ｒｐｏＣコード配列を含む核酸分子を含む組換え微生物はまた、例えば、変異体ｒｐｏＣコード配列の一部を導入することによって、例えば、ベクターにクローニングし、その部分を使用して、内因性染色体の野生型ｒｐｏＣコード配列の対応する部分を、例えばｓａｃＢベクターを使用した、例えば相同組換えによる遺伝子置換によって置換することにより得ることができる。これは、分子生物学の標準的な技術によっても達成できる。したがって、いくつかの例では、組換え微生物は染色体を含み、変異体ｒｐｏＣコード配列は、変異体ｒｐｏＣコード配列による内因性ｒｐｏＣコード配列の置換に基づいて染色体に存在する。
【０１２０】
上記のように、Ｒ４７Ｃ置換を含み、それ以外は大腸菌の野生型ＲｐｏＣと同一である変異体ＲｐｏＣは、例えば、プラスミドコピー数を約２５％〜７５％減少させる。以下で説明するように、これは様々な大腸菌株で達成された。したがって、変異体ｒｐｏＣコード鎖を含む核酸分子は、特にエシェリキア属の細菌、特に大腸菌種の細菌においてプラスミドコピー数を調節することができる。
【０１２１】
組換え微生物におけるベクターのコピー数を調節するための別の方法も開示されており、この場合、上記のような変異体ｒｐｏＣコード配列を含む核酸分子を含む組換え微生物を用いている。
【０１２２】
ベクターは上記のものとすることができる。したがって、やはりいくつかの例において、変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。また、いくつかの例では、ベクターはプラスミドを含む。
【０１２３】
組換え微生物はまた、上記のものとすることができる。したがって、やはりいくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。この場合も、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９０ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は９８ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。また、やはりいくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７を含む。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、以下のような１つ以上の置換を含む配列番号１７の変異体を含む：ヌクレオチド４２位でのＴからＣ、ヌクレオチド６６位でのＡからＣ、又はヌクレオチド８９位でのＧからＴ、ここで、位置の番号付けは、説明したように、配列番号１７に従ってなされている。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド１〜７位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド９４〜９８位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、ヌクレオチド４２位、６６位、及び８９位に加えて、又はこれらのヌクレオチド位置以外に、１つ以上の他の置換を含む配列番号１７の変異体を含む。
【０１２４】
この方法は、（１）ベクターを前駆体微生物に導入することによって組換え微生物を得るステップを含む。
この方法はまた、（２）ベクターの複製に十分な条件下で培養培地中で組換え微生物を培養することにより、ベクターのコピー数を調節するステップを含む。この場合も、培養は、微生物学の標準的な技術によって、例えば、培養管、フラスコ、及び／又はバイオリアクターにおいて、適切な培養培地、例えば、栄養豊富な培地又は最小培地で、適切なインキュベーション温度、例えば約２５〜３８℃、２８〜３７℃、又は３７℃で実施することができ、その詳細は、当業者には明らかであろう。
【０１２５】
上記のように、組換え微生物はまた、上述したような変異体ｒｐｏＣコード配列を含む核酸分子を含む。この場合も、変異体ｒｐｏＣコード配列は変異体ＲｐｏＣをコードする。変異体ＲｐｏＣは、Ｒ４７Ｃ置換を含み、Ｒ４７Ｃ置換の番号付けは、大腸菌の野生型ＲｐｏＣに基づいて定義されている。したがって、いくつかの例では、変異体ＲｐｏＣは、（１）配列番号４６を含むＮ末端ドメイン、（２）配列番号４７を含む中央ドメイン、及び（３）配列番号４８を含むＣ末端ドメインをさらに含み、Ｒ４７Ｃ置換は、Ｎ末端ドメイン内に存在する。いくつかの例では、変異体ＲｐｏＣは、（１）配列番号４９を含むＮ末端ドメイン、（２）配列番号５０を含む中央ドメイン、及び（３）配列番号５１を含むＣ末端ドメインをさらに含み、Ｒ４７Ｃ置換は、Ｎ末端ドメイン内に存在する。いくつかの例では、変異体ＲｐｏＣは、配列番号４５と少なくとも９０％同一である、例えば、配列番号４５と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、変異体ＲｐｏＣは、配列番号４５を含む。いくつかの例において、変異体ＲｐｏＣの発現は、配列番号４４を含む野生型ＲｐｏＣの発現と比較して、プラスミドのコピー数を例えば１０％〜８０％、例えば２５％〜７５％、３０％〜７０％、３５％〜６５％、４０％〜６０％、４５％〜５５％、１０％〜４０％、２０％〜５０％、３０％〜６０％、４０％〜７０％、又は５０％〜８０％減少させる。
【０１２６】
組換え微生物においてベクターを使用することによって標的産物を作製する別の方法も開示され、この場合は、上記のような変異体ｒｐｏＣコード配列を含む核酸分子を含む組換え微生物を用いる。
【０１２７】
ベクターは上記のものとすることができる。したがって、やはりいくつかの例において、変異体ｉｎｃＲＮＡの発現は、配列番号１９を含むｉｎｃ配列によってコードされる野生型ｉｎｃＲＮＡの発現と比較して、ベクターのコピー数を増加させる。また、いくつかの例では、ベクターはプラスミドを含む。
【０１２８】
組換え微生物はまた、上記のものとすることができる。したがって、再びいくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７と少なくとも９０％同一であるヌクレオチド配列を含む。この場合も、例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるヌクレオチド配列を含み得る。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９０ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含む。例えば、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７の少なくとも９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、又は９８ヌクレオチドに関して配列番号１７と同一であるヌクレオチド配列を含むことができる。また、やはりいくつかの例において、組換え微生物の変異体ｉｎｃコード鎖は、上記のように、配列番号１７を含む。また、いくつかの例では、変異体ｉｎｃコード鎖は、以下のような１つの置換を含む配列番号１７の変異体を含むことができる：ヌクレオチド４２位のＴからＣ、ヌクレオチド６６位のＡからＣ、又はヌクレオチド８９位のＧからＴ、ここで、位置の番号付けは、説明したように、配列番号１７に従ってなされている。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド１〜７位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、配列番号１７のヌクレオチド９４〜９８位のうちの１つ以上を欠く配列番号１７の変異体を含む。いくつかの例において、変異体ｉｎｃコード鎖は、説明したように、ヌクレオチド４２位、６６位、及び８９位に加えて、又はこれらのヌクレオチド位置以外に、１つ以上の他の置換を含む配列番号１７の変異体を含む。
【０１２９】
この方法によれば、ベクターは、上記のように、標的産物を作製するための標的遺伝子をさらに含む。
この方法は、（１）ベクターを前駆体微生物に導入することによって組換え微生物を得るステップを含む。この方法はまた、（２）組換え微生物が標的遺伝子を発現する条件下、培養培地中で組換え微生物を培養することにより、標的産物を作製するステップを含む。この方法はまた、（３）組換え微生物及び／又は培養培地から標的産物を回収するステップを含む。
【０１３０】
上記のように、組換え微生物はまた、上述したような変異体ｒｐｏＣコード配列を含む核酸分子を含む。この場合も、変異体ｒｐｏＣコード配列は変異体ＲｐｏＣをコードする。変異体ＲｐｏＣは、Ｒ４７Ｃ置換を含み、Ｒ４７Ｃ置換の番号付けは、大腸菌の野生型ＲｐｏＣに基づいて定義されている。したがって、いくつかの例では、変異体ＲｐｏＣは、（１）配列番号４６を含むＮ末端ドメイン、（２）配列番号４７を含む中央ドメイン、及び（３）配列番号４８を含むＣ末端ドメインをさらに含み、Ｒ４７Ｃ置換は、Ｎ末端ドメイン内に存在する。いくつかの例では、変異体ＲｐｏＣは、（１）配列番号４９を含むＮ末端ドメイン、（２）配列番号５０を含む中央ドメイン、及び（３）配列番号５１を含むＣ末端ドメインをさらに含み、Ｒ４７Ｃ置換は、Ｎ末端ドメイン内に存在する。いくつかの例では、変異体ＲｐｏＣは、配列番号４５と少なくとも９０％同一である、例えば、配列番号４５と少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、又は１００％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの例において、変異体ＲｐｏＣは、配列番号４５を含む。いくつかの例において、変異体ＲｐｏＣの発現は、配列番号４４を含む野生型ＲｐｏＣの発現と比較して、プラスミドのコピー数を例えば１０％〜８０％、例えば２５％〜７５％、３０％〜７０％、３５％〜６５％、４０％〜６０％、４５％〜５５％、１０％〜４０％、２０％〜５０％、３０％〜６０％、４０％〜７０％、又は５０％〜８０％減少させる。
【０１３１】
この方法は、例えば、標的ポリマー、標的生体高分子、標的甘味料、標的脂肪、標的多糖、標的アミノ酸、標的ヌクレオチド、標的ワクチン、又は標的医薬品の生産において、組換え微生物へのベクターの安定した取り込みと標的遺伝子の産物の収率の制御とのバランスをとるために、複数の標的遺伝子を含むベクターの適切なコピー数を迅速に決定するのに有用であり得る。上記のように、野生型中央ドメインを含むＲｅｐＦＩＣレプリコンを含み、少数から多数までの（例えば、比較的大きいサイズから小さいサイズまでのベクターサイズに基づく）ベクターコピー数の第１の範囲をカバーするベクターの第１のセットを調製することができる。ベクターの第２のセットであって、変異体中央ドメインを含み、したがって第２のより多い範囲のベクターコピー数をカバーすること以外は第１のセットと同一であるベクターの第２のセットを調製することができる。標的遺伝子のセットを各ベクターにクローニングすることができる。ベクターの第１及び第２のセットを、野生型ｒｐｏＣコード配列を含み、したがって野生型ＲｐｏＣを発現する第１の細菌株、例えば大腸菌株に導入することで、ベクターの第１及び第２のセットを含み、野生型ＲｐｏＣを発現する大腸菌株の第１のセットを得ることができる。また、ベクターの第１及び第２のセットを、Ｒ４７Ｃ置換を含む変異体ＲｐｏＣをコードする変異体ｒｐｏＣコード配列を含む、対応する第２の組換え細菌株であって、その他は第１の株と同じである第２の組換え細菌株、例えば組換え大腸菌株に導入することで、ベクターの第１及び第２のセットを含み、変異体ＲｐｏＣを発現する対応する大腸菌株の第２のセットを得ることができる。この方法は、各ベクターを使用して実施することができ、（１）ベクターを導入するステップ、（２）対応する組換え微生物を培養するステップ、及び（３）対応する標的産物を回収するステップを含む。コピー数は培養中にベクターごとに決定することができる。標的産物の収率又はその他の関連する特性は、回収中に決定することができる。上記のように、ＲｅｐＦＩＣレプリコンの変異体中央ドメインの使用に関連してベクターの第１のセットで達成できるコピー数の上限を実質的に増やすことに加えて、このアプローチは、変異体ＲｐｏＣの発現に基づいてベクターの第１のセットで達成できるコピー数の下限を実質的に減らすこともでき、これは、標的遺伝子の発現が有害である場合、例えば、細胞内で特定のレベルを超えて発現した場合に細胞に対して毒性のある標的ＲＮＡ及び／又は標的タンパク質をコードする標的遺伝子の場合に株の細胞の生存率を維持するのに有利であり得る。このアプローチはまた、標的産物の収率に対するベクターコピー数の影響を試験することに関して、サンプルサイズを効果的に４倍にすることができる。この場合も、このアプローチは、３〜１２０ｋｂのサイズのプラスミドを含む、及び／又は複数の標的遺伝子を含むプラスミドに相当するベクターに特に使用することができる。
【０１３２】
実施例
実施例１．ＲｅｐＦＩＣレプリコンの改変されたＤＮＡ配列を含むプラスミドの構築
（１）ＲｅｐＦＩＣフラグメント及びカナマイシン耐性遺伝子フラグメントの調製。
【０１３３】
ＲｅｐＦＩＣレプリコン（配列番号１）を含む５．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅するために、原栄養性Ｋ−１２株であり、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）（株１２３５５）から入手した大腸菌株ＮＣＭ３７２２のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐシステムを使用して抽出し、上記ｇＤＮＡをテンプレートとして用い、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。ＰＣＲは、配列番号２及び配列番号３のプライマーを使用して、９５℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で５分間の伸長を３０サイクル行った。
【０１３４】
カナマイシン耐性遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅するために、プラスミドｐＫＤ４をテンプレートとして用い、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲは、配列番号４及び配列番号５のプライマーを使用して、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で１分３０秒間の伸長を３０サイクル行った。
【０１３５】
ＰＣＲ反応が完了した後、１．３ｍＬのＤｐｎＩ及び５．７ｍｌのＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃの１０×バッファーＴａｎｇｏ（カタログ番号ＥＲ１７０１）を５０μＬのＰＣＲ混合物に加え、３７℃で１時間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを除去した。混合物をＱＩＡＧＥＮ精製キットで精製し、次に溶出して、５．２ｋｂのＤＮＡフラグメント（「ＲｅｐＦＩＣフラグメント」とも呼ばれる）及び１．４ｋｂのＤＮＡフラグメント（「ＫａｎＲフラグメント」とも呼ばれる）を得た。
【０１３６】
（２）改変された配列を含むＲｅｐＦＩＣフラグメントの調製。
改変された配列（配列番号１７、逆相補鎖は配列番号６）を有するＲｅｐＦＩＣレプリコンを含む５．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅するために、大腸菌ＮＣＭ３７２２のｇＤＮＡをテンプレートとして用い、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲは、配列番号２及び配列番号７のプライマーを使用して、９５℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、７２℃で３分間の伸長を３０サイクル行った。配列番号８及び配列番号３のプライマーを使用して、７２℃で２分３０秒間伸長するために別のＰＣＲを行った。
【０１３７】
ＰＣＲ反応が完了した後、１．３ｍＬのＤｐｎＩ及び５．７ｍｌの１０×バッファーＴａｎｇｏを５０μＬのＰＣＲ反応混合物に加え、３７℃で１時間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを除去した。混合物をＱＩＡＧＥＮ精製キットで精製し、次に溶出して、２．８ｋｂのＤＮＡフラグメント及び２．４ｋｂのＤＮＡフラグメントを得た。
【０１３８】
（３）ＲｅｐＦＩＣレプリコンの野生型又は改変配列を含むプラスミドの構築。
実施例１−（１）に記載のＲｅｐＦＩＣフラグメント及びＫａｎＲフラグメントを、図５Ａ〜Ｂに示すように、ｐＪＳＬ４０と呼ばれるプラスミドの構築に使用した。ｐＪＳＬ４０プラスミドは、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ製）を使用して構築された。
【０１３９】
実施例：１−（２）に記載の２．８ｋｂ及び２．４ｋｂのＤＮＡフラグメント及び実施例：１−（１）に記載のＫａｎＲフラグメントを、図６Ａ〜Ｂに示すように、ｐＪＳＬ４１と呼ばれる別のプラスミドの構築に使用した。３つのフラグメントのギブソンアセンブリは、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して実施された。
【０１４０】
（４）ＲｅｐＦＩＣレプリコンの改変配列を含むＦ−様プラスミドの構築。
ＲｅｐＦＩＣレプリコンの改変配列が１万塩基対から１００キロベース（ｋｂ）以上のサイズの大きなプラスミドのコピー数に及ぼす影響を調べるために、大腸菌ＮＣＭ３７２２のＦ−様プラスミドのＲｅｐＦＩＣ配列を既知のワンステップ不活化法（Ｗａｒｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７（１２）：６６４０−６６４５、（２０００））を使用することにより、上記の改変配列（配列番号６）で置換した。最初に、Ｃｒｅ−ｌｏｘＰリコンビナーゼシステムを使用してＲｅｐＦＩＣの改変配列を導入するための線状ＤＮＡフラグメントを、プラスミドｐＫＤ３をテンプレートとする、配列番号９及び配列番号１０のプライマーを使用して次のように実施したＰＣＲによって調製した。９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分間の伸長を３０サイクル行い、１．２ｋｂのＰＣＲフラグメントを取得する。ＰＣＲ混合物を上記のようにＤｐｎＩで処理し、増幅されたＤＮＡフラグメントをＱＩＡＧＥＮ精製キットで精製した。
【０１４１】
線状ＤＮＡフラグメントを、エレクトロポレーションによって大腸菌ＮＣＭ３７２２／ｐＫＤ４６に導入した。これは、ｐＫＤ４６プラスミドを大腸菌ＮＣＭ３７２２（Ｗａｒｎｅｒら）に導入することによって構築された。次に、単一コロニーを１５μｇ／ｍＬのクロラムフェニコールを含むルリア−ベルターニ（ＬＢ）プレート上で単離した。単離した株のＲｅｐＦＩＣ領域を配列決定し、Ｆ−様プラスミドの野生型配列を置換したＲｅｐＦＩＣの改変配列を含む株を選択した。プラスミドｐＪＷ１６８（ＢＭＧ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２００１；１：７．Ｅｐｕｂ  ２００１年９月２６日）を選択した株に導入して、野生型ＲｅｐＦＩＣがＲｅｐＦＩＣの改変配列に置換された組換えｐＪＳＬ４２を調製した。ｐＪＳＬ４２プラスミドを含む大腸菌ＮＣＭ３７２２分離株を、大腸菌株ＣＣ０６−９６１２と命名した。
【０１４２】
実施例２：プラスミドコピー数の測定
プラスミドコピー数を測定するために、プラスミドｐＪＳＬ４０及びｐＪＳＬ４１を、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ  Ｎｏ．６３００）から入手した大腸菌株ＭＧ１６５５に導入した。ｐＪＳＬ４０及びｐＪＳＬ４１を保有する構築された株ＭＧ１６５５を、それぞれ大腸菌株ＣＣ０６−９６１４及びＣＣ０６−９６１５と命名した。
【０１４３】
大腸菌株ＣＣ０６−９６１４、ＣＣ０６−９６１５、ＮＣＭ３７２２、及びＣＣ０６−９６１２のプラスミドのコピー数を、リアルタイムＰＣＲ（「ｑＰＣＲ」とも呼ばれる）法を使用して測定した。この方法では、ＳＹＢＲ（Ｒ）ＧｒｅｅｎＩ色素を使用して、ＰＣＲ中に形成された二本鎖ＤＮＡに結合させることによりＰＣＲ産物を検出する。このプロトコルでは、Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔ（ＴＭ）キットを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムで「ワンポット」で細胞溶解及びＰＣＲ反応を実施する。
【０１４４】
細胞溶解物を調製するために、ＬＢブロスでの各株の一晩培養物を低温（４℃）の１×ＰＢＳバッファーで希釈した後、溶解溶液、停止溶液（Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔ（ＴＭ）キット、カタログ番号４４０２９５６）及びＲＮａｓｅ  Ａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２０９１−０２１、２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。
【０１４５】
ｑＰＣＲ反応混合物は、４μＬの細胞溶解物を１６μＬのＰＣＲカクテルに添加することによって調製した。その組成を表２に示す。
【０１４６】
【表２】
2021532813.tif 000006
【０１４７】
細胞サンプル中のプラスミドのコピー数を、プラスミド上のマーカーＤＮＡ配列、ＲｅｐＦＩＣの相対的な存在量から、β−ガラクトシダーゼをコードする１コピーの染色体遺伝子ｌａｃＺのコピー数と比較して推定した。ＲｅｐＦＩＣに使用したプライマーは配列番号１１及び配列番号１２であり、ｌａｃＺについては配列番号１３及び配列番号１４であった。各サンプルの内部対照として、１６Ｓ  ｒＤＮＡ（ｒｒｓＨ）のコピー数をｌａｃＺと比較して測定した。ｒｒｓＨは染色体コピー数７で存在するため、ｒｒｓＨのｌａｃＺに対する相対的な存在量は約７であると予測される。ｒｒｓＨに使用したプライマーは、配列番号２５及び配列番号２６であった。
【０１４８】
リアルタイムＰＣＲ反応は、７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲのデフォルトプログラムを使用して、次のように行った：９５℃で２０秒間の酵素活性化を１サイクル、９５℃で３秒間の変性を４０サイクル、６０℃で３０秒間のアニーリング及び伸長、及び解離曲線。
【０１４９】
プラスミドのコピー数は、２ＤＣｔを計算することによって測定した。ここで、ＤＣｔは、ｌａｃＺ遺伝子Ｃｔ値からＲｅｐＦＩＣ  Ｃｔ値を差し引くことによって計算した（ＤＣｔ＝Ｃｔ＿ｌａｃＺ−Ｃｔ＿ｒｅｐＦＩＣ）。
【０１５０】
【表３】
2021532813.tif 000007
【０１５１】
表３に示すように、大腸菌株ＣＣ０６−９６１５のプラスミドコピー数は、対照株ＣＣ０６−９６１４の約１４倍多かった。また、大腸菌株ＣＣ０６−９６１２のプラスミドコピー数は、ＮＣＭ３７２２株のＦ−様プラスミドコピー数よりも約１０倍多かった。したがって、ＲｅｐＦＩＣの改変された配列は、プラスミドのサイズとは無関係に、例えば、小さいプラスミド及び大きいプラスミドの両方で、また、大腸菌バックグラウンド株とは無関係に、例えば、ＭＧ１６５５及びＮＣＭ３７２２の両方で、プラスミドコピー数の増加をもたらすことが確認された。
【０１５２】
実施例３：大腸菌ＬＳ５２１８にＦ−様プラスミドを含む改変ＲｅｐＦＩＣレプリコンの構築及びプラスミドコピー数の測定
プラスミドコピー数に対するＲｅｐＦＩＣレプリコンの改変配列の効果を再検討し、また、大腸菌の異なる株での効果を試験するために、大腸菌ＬＳ５２１８（ＣＧＳＣ株＃６９６６）のＦ−様プラスミド上のＲｅｐＦＩＣ配列を、実施例１−（４）に記載したものと同じ方法及び材料を使用することにより、上記の改変配列（配列番号６）に置換した。大腸菌ＬＳ５２１８のＲｅｐＦＩＣ配列は、大腸菌ＮＣＭ３７２２の配列と同じである。野生型ＲｅｐＦＩＣをＲｅｐＦＩＣの改変配列で置換した組換えプラスミドｐＪＳＬ３３を作成して、改変ＲｅｐＦＩＣの効果を再検討した。ｐＪＳＬ３３プラスミドを含む大腸菌株ＬＳ５２１８を大腸菌株ＣＣ０６−９６６７と命名した。
【０１５３】
大腸菌株ＬＳ５２１８及びＣＣ０６−９６６７のプラスミドのコピー数を、実施例２で説明したように、リアルタイムＰＣＲを使用して測定した。プラスミドコピー数の増加を明らかにするためにｑＰＣＲを実施した。ＲｅｐＦＩＡは、プラスミド上に存在するもう１つのレプリコンである。ＲｅｐＦＩＡに使用したプライマーは、配列番号２７及び配列番号２８であった。この場合も、各サンプルの内部対照として、１６Ｓ  ｒＤＮＡ（ｒｒｓＨ）のコピー数をｌａｃＺと比較して測定した。
【０１５４】
【表４】
2021532813.tif 000008
【０１５５】
表４に示すように、大腸菌株ＣＣ０６−９６６７のプラスミドコピー数は、ＬＳ５２１８株のＦ−様プラスミドコピー数よりも約５．５倍多かった。したがって、ＲｅｐＦＩＣの改変された配列が、どのバックグラウンド株が使用されたかに関係なく、プラスミドコピー数の増加をもたらすことが再確認された。
【０１５６】
実施例４：染色体上のｒｐｏＣ配列を置換するためのプラスミドの構築
（１）ｒｐｏＣフラグメント及びｓａｃＢベクターの調製。
改変された配列（配列番号３３）を有する部分的変異体ｐｏＣ配列を含む２つの０．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅するために、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）（６９６６株）から入手した大腸菌株ＬＳ５２１８のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐシステムを使用して抽出し、上記ｇＤＮＡをテンプレートとして用い、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。ヌクレオチド配列から推定される、対応する改変ＲｐｏＣタンパク質は、配列番号４５である。改変ＲｐｏＣタンパク質配列は、ｒｐｏＣヌクレオチド配列がＡＴＧの代わりに代替の開始コドンＧＴＧを含むことを考慮に入れている。ＧＴＧは一般にバリンをコードするが、代替の開始コドンとしてのＧＴＧはメチオニンをコードする。配列番号３５及び配列番号３６のプライマーを使用して、以下のようにＰＣＲを行った：９５℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３０秒間の伸長を３０サイクル。配列番号５及び配列番号６のプライマーを使用して、７２℃で３０秒間伸長するために別のＰＣＲを行った。混合物をＱＩＡＧＥＮ精製キットで精製し、続いて溶出して、２つの異なる０．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを得た。
【０１５７】
ｓａｃＢ遺伝子及びＲ６Ｋ起点を含む遺伝子置換ベクター（図１２Ａ〜Ｂ）を調製するために、ｐＳＫＨ１３０を制限酵素ＥｃｏＲＶで消化した。ＰＣＲ混合物及びＥｃｏＲＶ消化の反応混合物をＱＩＡＧＥＮ精製キットで精製し、続いて溶出して、第１の０．５ｋｂＤＮＡフラグメント、第２の０．５ｋｂＤＮＡフラグメント、及び４．７ｋｂベクターＤＮＡフラグメント（「ｓａｃＢベクターカット」とも呼ばれる）を得た。
【０１５８】
（２）ｒｐｏＣ配列を置換するためのプラスミドの構築。
実施例：４−（１）に記載の第１の０．５ｋｂＤＮＡフラグメント、第２の０．５ｋｂＤＮＡフラグメント、及びｓａｃＢベクターカットを、ｐＪＳＬ４７の構築に使用した。ｐＪＳＬ４７プラスミドは、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ製）及びＣｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）の７６３６株であるＢＷ２５１１３を使用して構築された。
【０１５９】
（３）組換え大腸菌ＣＣ０６−９６４２の調製。
大腸菌ＬＳ５２１８の染色体上のｒｐｏＣ（配列番号３９）を変異体ｐｏＣ配列（配列番号３３）で置換するために、ｐＪＳＬ４７プラスミドをエレクトロポレーションにより大腸菌株ＬＳ５２１８に導入し、続いて５０ｍｇ／Ｌのカナマイシンを含むルリア−ベルターニ（ＬＢ）寒天プレート上で増殖した単一コロニーを選択した。選択したコロニーの染色体へのｐＪＳＬ４７の挿入を、配列番号４０及び配列番号４１のプライマーを使用するＰＣＲによって確認した。ｓａｃＢ遺伝子及びＲ６Ｋ起点を二次選択（「ｐｏｐ−ｏｕｔ」）するために、選択した株を、ＮａＣｌを含まないが、１０％スクロースを含むＬＢ寒天プレート上で増殖させた。形質転換体を、ＬＳ５２１８ｒｐｏＣ（配列番号３９）が変異体ｐｏＣ配列（配列番号３３）に置換されているかについて、ＰＣＲ及び配列確認によって確かめた。正しい遺伝子型を有する得られた株を大腸菌ＣＣ０６−９６４２と命名した。
【０１６０】
実施例５：プラスミドコピー数の測定
野生型株であるＬＳ５２１８及び株ＣＣ０６−９６４２の両方には、Ｆ−様プラスミド（６７，５０２ｂｐ）が含まれている。ＣＣ０６−９６４２を作出した後、Ｆ−様プラスミドの存在をＰＣＲ法で確認した。使用したプライマーは、例えば、配列番号１１及び１２のものであった。ＣＣ０６−９６４２が作出されたとき、ＣＣ０６−９６３７も作出された。これらの違いは、ＣＣ０６−９６４２にはＦ−様プラスミドが含まれるのに対し、ＣＣ０６−９６３７には含まれないことである。ＣＣ０６−９６３７のＲｐｏＣも変異体ｒｐｏＣである。
【０１６１】
これら２つの株のプラスミドコピー数を、リアルタイムＰＣＲ（「ｑＰＣＲ」とも呼ばれる）法を使用して測定した。この方法では、ＳＹＢＲ（Ｒ）ＧｒｅｅｎＩ色素を使用して、ＰＣＲ中に形成された二本鎖ＤＮＡに結合させることによりＰＣＲ産物を検出した。このプロトコルでは、Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔ（ＴＭ）キットを使用して、Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ  ７５００  ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲシステムで「ワンポット」で細胞溶解及びＰＣＲ反応を実施した。
【０１６２】
細胞溶解物を調製するために、ＬＢブロスでの各株の一晩培養物を低温（４℃）の１×ＰＢＳバッファーで希釈した後、溶解溶液、停止溶液（Ｆａｓｔ  ＳＹＢＲ（Ｒ）Ｇｒｅｅｎ  Ｃｅｌｌｓ−ｔｏ−Ｃｔ（ＴＭ）キット、カタログ番号４４０２９５６）及びＲＮａｓｅ  Ａ（Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、カタログ番号１２０９１−０２１、２０ｍｇ／ｍｌ）を添加した。ｑＰＣＲ反応混合物は、４μＬの細胞溶解物を１６μＬのＰＣＲカクテルに添加することによって調製した。その組成を表５に示す。
【０１６３】
【表５】
2021532813.tif 000009
【０１６４】
ＬＳ５２１８及びＣＣ０６−９６４２細胞サンプル中のＦ−様プラスミドのコピー数を、プラスミド上のマーカーＤＮＡ配列、具体的にはＲｅｐＦＩＡ及びＲｅｐＦＩＣの相対的な存在量から、β−ガラクトシダーゼをコードする１コピーの染色体ｌａｃＺ遺伝子のコピー数と比較して推定した。ＲｅｐＦＩＡに使用したプライマーは配列番号２７及び配列番号２８であった。ＲｅｐＦＩＣに使用したプライマーは配列番号１１及び配列番号１２であった。ｌａｃＺに使用したプライマーは配列番号１３及び配列番号１４であった。
【０１６５】
リアルタイムＰＣＲ反応は、７５００ＦａｓｔリアルタイムＰＣＲのデフォルトプログラムを使用して、次のように行った：９５℃で２０秒間の酵素活性化を１サイクル、９５℃で３秒間の変性を４０サイクル、６０℃で３０秒間のアニーリング及び伸長、及び解離曲線。
【０１６６】
プラスミドのコピー数は、２ＤＣｔを計算することによって測定した。ここで、ＤＣｔは、ｌａｃＺ遺伝子Ｃｔ値からＲｅｐＦＩＣ  Ｃｔ値を差し引くことによって計算した（ＤＣｔ＝Ｃｔ＿ｌａｃＺ−Ｃｔ＿ｒｅｐＦＩＣ）。
【０１６７】
【表６】
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【０１６８】
表６に示すように、ＣＣ０６−９６４２のＦ−様プラスミドのコピー数は、対照ＬＳ５２１８のコピー数よりも小さかった。このように、変異体ｒｐｏＣ配列はＦ−様プラスミドのコピー数の減少をもたらすことが確認された。プラスミドのコピー数が多すぎると、微生物の細胞に代謝負荷がかかる可能性がある。以上の結果は、変異体ｒｐｏＣがプラスミドコピー数を調節する機能を有することを示しており、したがって上記の結果から、株を安定して増殖させ、プラスミドを安定して発現させることができることがわかる。
【０１６９】
実施例６：ＲｅｐＦＩＣレプリコンの改変されたＤＮＡ配列を含むプラスミドの構築
（１）ＲｅｐＦＩＣフラグメント及びカナマイシン耐性遺伝子フラグメントの調製。
ＲｅｐＦＩＣレプリコン（配列番号１）を含む５．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅するために、原栄養性Ｋ−１２株であり、Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒ（ＣＧＳＣ）（株１２３５５）から入手した大腸菌株ＬＳ５２１８のゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）を、ＱＩＡＧＥＮ  Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐシステムを使用して抽出し、上記ｇＤＮＡをテンプレートとして用い、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼ（Ａｇｉｌｅｎｔ社製）を使用してポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を実施した。ＰＣＲは、配列番号２及び配列番号３のプライマーを使用して、９５℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で５分間の伸長を３０サイクル行った。
【０１７０】
カナマイシン耐性遺伝子を含む１．４ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅するために、プラスミドｐＫＤ４をテンプレートとして用い、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲは、配列番号４及び配列番号５のプライマーを使用して、９４℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で１分３０秒間の伸長を３０サイクル行った。
【０１７１】
ＰＣＲ反応が完了し、混合した後、１．３ｍＬのＤｐｎＩ及び５．７ｍｌの１０×バッファーＴａｎｇｏを５０μＬのＰＣＲ混合物それぞれに加え、３７℃で１時間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを除去した。混合物をＱＩＡＧＥＮ精製キットで精製し、次に溶出して、５．２ｋｂのＤＮＡフラグメント（「ＲｅｐＦＩＣフラグメント」とも呼ばれる）及び１．４ｋｂのＤＮＡフラグメント（「ＫａｎＲフラグメント」とも呼ばれる）を得た。
【０１７２】
（２）改変された配列を含むＲｅｐＦＩＣフラグメントの調製。
改変された配列（配列番号６）を有するＲｅｐＦＩＣレプリコンを含む５．２ｋｂのＤＮＡフラグメントを増幅するために、大腸菌ＮＣＭ３７２２のｇＤＮＡをテンプレートとして用い、ＰｆｕＵｌｔｒａ  ＩＩ  Ｆｕｓｉｏｎ  ＨＳ  ＤＮＡポリメラーゼを使用してＰＣＲを行った。ＰＣＲは、配列番号２及び配列番号７のプライマーを使用して、９５℃で３０秒間の変性、５６℃で３０秒間のアニーリング、及び７２℃で３分間の伸長を３０サイクル行った。配列番号８及び配列番号３のプライマーを使用して、７２℃で２分３０秒間伸長するために別のＰＣＲを行った。
【０１７３】
ＰＣＲ反応が完了した後、１．３ｍＬのＤｐｎＩ及び５．７ｍｌの１０×バッファーＴａｎｇｏを５０μＬのＰＣＲ反応混合物に加え、３７℃で１時間インキュベートしてテンプレートＤＮＡを除去した。混合物をＱＩＡＧＥＮ精製キットで精製し、次に溶出して、２．８ｋｂのＤＮＡフラグメント及び２．４ｋｂのＤＮＡフラグメントを得た。
【０１７４】
（３）ＲｅｐＦＩＣレプリコンの野生型又は改変配列を含むプラスミドの構築。
実施例６−（１）に記載のＲｅｐＦＩＣフラグメント及びＫａｎＲフラグメントを、ｐＪＳＬ４８と呼ばれるプラスミドの構築に使用した。ｐＪＳＬ４８プラスミドは、図１３Ａ〜Ｂに示すように、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘ（ＮＥＢ製）を使用して構築された。
【０１７５】
実施例：６−（２）に記載の２．８ｋｂ及び２．４ｋｂのＤＮＡフラグメント及び実施例：６−（１）に記載のＫａｎＲフラグメントを、ｐＪＳＬ４９と呼ばれる別のプラスミドの構築に使用した。３つのフラグメントのギブソンアセンブリは、図１４Ａ〜Ｂに示すように、ＮＥＢｕｉｌｄｅｒ  ＨｉＦｉ  ＤＮＡ  Ａｓｓｅｍｂｌｙ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して実施された。
【０１７６】
実施例７：プラスミドコピー数の測定
プラスミドコピー数を測定するために、プラスミドｐＪＳＬ４８及びｐＪＳＬ４９を大腸菌ＬＳ５２１８に導入し、大腸菌株ＣＣ０６−９６６５及びＣＣ０６−９６６６を得た。プラスミドｐＪＳＬ４８及びｐＪＳＬ４９をＣＣ０６−９６４２にも導入し、それぞれ大腸菌株ＣＣ０６−９６３８及びＣＣ０６−９６３９を得た。
【０１７７】
大腸菌株ＣＣ０６−９６６５、９６６６、９６３８、及び９６３９のプラスミドのコピー数を、実施例５に記載されているように、リアルタイムＰＣＲ法を使用して測定した。
細胞サンプル中のプラスミドのコピー数を、プラスミド上のマーカーＤＮＡ配列、ＲｅｐＦＩＣレプリコンの相対的な存在量から、β−ガラクトシダーゼをコードする１コピーの染色体遺伝子ｌａｃＺのコピー数と比較して推定した。ＲｅｐＦＩＣに使用したプライマーは配列番号１１及び配列番号１２であった。ｌａｃＺに使用したプライマーは配列番号１３及び配列番号１４であった。カナマイシン耐性遺伝子に使用したプライマーは配列番号４２及び配列番号４３であった。
【０１７８】
【表７】
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【０１７９】
表７に示すように、プラスミドｐＪＳＬ４９に導入された変異体ＲｅｐＦＩＣ配列を含む株である株ＣＣ０６−９６６６及び９６３９のプラスミドコピー数は、株ＣＣ０６−９６６５及び９６３８のものよりも多かった。ＣＣ０６−９６６５株のプラスミドコピー数はＣＣ０６−９６３８よりも多く、ＣＣ０６−９６６６株のプラスミドコピー数はＣＣ０６−９６３９よりも多かった。したがって、置換されたｒｐｏＣ配列は、野生型又は変異体のどちらのＲｅｐＦＩＣレプリコンが使用されたかに関係なく、プラスミドコピー数の減少をもたらすことが確認された。
【産業上の利用可能性】
【０１８０】
本明細書に開示される配列番号１５を含む変異体ｉｎｃコード鎖を含む核酸分子は、その核酸分子を含むレプリコンを含むプラスミドなどのベクターのコピー数を調節するために、特にベクターのコピー数を増加させるために有用であり、したがって、ベクターを使用することにより、標的産物の商業的生産を改善するのに有用である。
【０１８１】
生物寄託に関する情報
変異体ｉｎｃコード鎖（配列番号６）を含む核酸分子を含むように形質転換された大腸菌株を上記のように調製し、大腸菌ＣＣ０６−９６１２と命名したものを、２０１８年６月１５日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関である韓国微生物保存センター（Ｋｏｒｅａｎ  Ｃｕｌｔｕｒｅ  Ｃｅｎｔｅｒ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ）に、アクセッション番号ＫＣＣＭ１２２７５Ｐとして寄託した。この株は、ブダペスト条約の下で国際寄託機関によって寄託されている。
【０１８２】
Ｒ４７Ｃ置換を含む変異体ＲｐｏＣをコードする変異体ｒｐｏＣコード鎖を含む核酸分子を含むように形質転換された大腸菌株を上記のように調製し、大腸菌ＣＣ０６−９６３７と命名したものを、２０１８年６月１５日に、ブダペスト条約に基づく国際寄託機関である韓国微生物保存センターに、アクセッション番号ＫＣＣＭ１２２７６Ｐとして寄託した。この株は、ブダペスト条約の下で国際寄託機関によって寄託されている。
【０１８３】
【表８】
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【０１８４】
【表９】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２Ａ】
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【図１２Ｂ】
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【図１３Ａ】
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【図１３Ｂ】
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【図１４Ａ】
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【図１４Ｂ】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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