(57)【要約】  本発明は、生成物および組成物およびそれらの使用に関する。特に、本発明は、冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症または脳卒中またはＬｐ（ａ）含有粒子の上昇に関連するいずれか他の障害、病態または症候群などの心臓血管疾患の治療、予防またはそれに罹患するリスクの低減の際の使用のための、ＬＰＡ遺伝子発現を妨げる、またはその発現を抑制する核酸産物に関する。【選択図】図１
2021502120.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、前記第１の鎖が、ＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、前記第１の鎖が、次の配列：配列番号９、５、１、３、７、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１または４３から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項２】
前記第１の鎖が、配列番号９のヌクレオチド配列を含み、かつ任意選択で前記第２の鎖が、配列番号１０のヌクレオチド配列を含み、または前記第１の鎖が、配列番号５のヌクレオチド配列を含み、かつ任意選択で前記第２の鎖が、配列番号６のヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸。
【請求項３】
細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および前記第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、前記第１の鎖が、ＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、前記第１の鎖が、次の配列：配列番号６３、６５、６７、６９、７１または７３から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸。
【請求項４】
前記第１の鎖および／または前記第２の鎖が、それぞれ１７〜３５ヌクレオチド長である、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸。
【請求項５】
前記少なくとも１つの二重鎖領域が、１７〜２５個の、好ましくは１９〜２５個の、連続ヌクレオチド塩基対からなる、請求項１〜４のいずれかに記載の核酸。
【請求項６】
ａ）両端で平滑末端であり；または
ｂ）一端でオーバーハングを有しかつ他端で平滑末端を有し；または
ｃ）両端でオーバーハングを有する、
請求項１〜５のいずれかに記載の核酸。
【請求項７】
前記第１および／または第２の鎖上の１個または複数のヌクレオチドが、修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成する、請求項１〜６のいずれかに記載の核酸。
【請求項８】
第１のおよび／または第２の鎖の一方または両方の末端の末端１、２または３個の３’ヌクレオチドおよび／または５’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の核酸。
【請求項９】
リガンドに結合される、請求項１〜８のいずれかに記載の核酸。
【請求項１０】
前記リガンドが、（ｉ）１個または複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分またはその誘導体、および（ｉｉ）リンカーを含み、前記リンカーが、前記核酸に少なくとも１個のＧａｌＮＡｃ部分またはその誘導体を結合する、請求項９に記載の核酸。
【請求項１１】
式（Ｉ）：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （Ｉ）
（式中、
Ｓは、サッカライドであり、好ましくは前記サッカライドは、Ｎ−アセチルガラクトサミンであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ｍは、１、２、または３であり；
Ｐは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート、好ましくはチオホスフェートであり；
Ｘ２は、式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、ｎ＝１〜６であり；
Ａは、分岐ユニットであり；
Ｘ３は、架橋ユニットであり；
請求項１〜８のいずれかで定義の核酸が、ホスフェートまたは修飾ホスフェート、好ましくはチオホスフェートを介してＸ３に結合される）
の化合物を含むリガンドに結合される、請求項９または１０に記載の核酸。
【請求項１２】
前記第１のＲＮＡ鎖が、式（Ｘ）：
【化１】
2021502120.tif 000135
の化合物であり、ｂは、０または１であり；および
第２のＲＮＡ鎖は、式（ＸＩ）：
【化２】
2021502120.tif 000136
の化合物であり、式中、
ｃおよびｄは、独立に０または１であり；
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ前記第１および第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
Ｙは、ＯまたはＳであり；
ｎは、０、１、２または３であり；および
Ｌ１は、それにリガンドが結合されるリンカーであり；かつ
ｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である、
請求項９または１０に記載の核酸。
【請求項１３】
細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および前記第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、前記第１の鎖が、ＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、前記第１の鎖が、配列番号９のヌクレオチド配列を含む、および好ましくはそれからなり、および任意選択で、前記第２の鎖が、配列番号１０のヌクレオチド配列を含む、および好ましくはそれからなる、核酸。  
【請求項１４】
リガンドに結合されかつ次の構造：
【化３】
2021502120.tif 000137
（式中、Ｚは、請求項１３に記載の核酸である）を有する、請求項１３に記載の核酸。
【請求項１５】
前記第１の鎖上の３個の末端３’ヌクレオチドのそれぞれの間および３個の末端５’ヌクレオチドのそれぞれの間の２つのホスホロチオエート結合、および前記第２の鎖の３’末端の３個の末端ヌクレオチド間の２つのホスホロチオエート結合を含みかつ前記リガンドが、前記第２の鎖の５’末端に結合される、請求項１４に記載の核酸。
【請求項１６】
リガンドに結合され、前記第１のＲＮＡ鎖が、式（ＸＶ）：
【化４】
2021502120.tif 000138
の化合物であり、ｂは、０または１であり；および
第２のＲＮＡ鎖が、式（ＸＶＩ）：
【化５】
2021502120.tif 000139
の化合物であり、ｃおよびｄは、独立に０または１であり；
式中、
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ前記第１および第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｈまたはメチルであり；
ｎは、０、１、２または３であり；および
Ｌは、式（ＸＶ）および（ＸＶＩ）中で同じであるまたは異なりかつ
−（ＣＨ２）ｑ−、ｑ＝２〜１２；
−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、ｒ＝２〜１２；
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、ｓ＝１〜５；
−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｔは、独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｕ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−ＣＯ−、ｕは、独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｖは、２〜１２である；
からなる群より選択され：末端Ｃ（Ｏ）は、存在する場合、前記ＮＨ基に結合され；
およびｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である、
請求項１３に記載の核酸。
【請求項１７】
以下に示す配列および修飾を含む、請求項１３〜１６のいずれかに記載の核酸：
【表１】
2021502120.tif 000140
式中、特定の修飾は、下記番号で示される：
１＝２’Ｆ−ｄＵ、
２＝２−Ｆ−ｄＡ、
３＝２’Ｆ−ｄＣ、
４＝２’Ｆ−ｄＧ、
５＝２’−ＯＭｅ−ｒＵ；
６＝２’−ＯＭｅ−ｒＡ；
７＝２’−ＯＭｅ−ｒＣ；
８＝２’−ＯＭｅ−ｒＧ。
【請求項１８】
前記第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが、２’フルオロ修飾により修飾され、および前記第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する前記第２の鎖上のヌクレオチドが、２’フルオロ修飾により修飾される、請求項１３〜１６のいずれかに記載の核酸。
【請求項１９】
薬物としての使用のための、好ましくは疾患または病態の予防または治療またはリスク低減のための、請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸および任意選択で送達担体および／または生理学的に許容可能な賦形剤および／またはキャリアおよび／または希釈剤および／または緩衝液および／または保存剤を含む組成物であって、前記疾患または病態が好ましくは、心臓血管疾患であり、前記心臓血管疾患が好ましくは、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症および／または高レベルのＬｐ（ａ）含有粒子に関連するいずれか他の疾患または病態である、組成物。
【請求項２０】
請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸を含みかつ送達担体、好ましくはリポソームおよび／または生理学的に許容可能な賦形剤および／またはキャリアおよび／または希釈剤をさらに含む医薬組成物。
【請求項２１】
疾患または病態の予防または治療またはリスク低減のための請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸または請求項２０に記載の医薬組成物の使用であって、前記疾患または病態が好ましくは、心臓血管疾患であり、前記心臓血管疾患が好ましくは、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症、冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症および高レベルのＬｐ（ａ）含有粒子に関連するいずれか他の疾患または病態である、使用。
【請求項２２】
治療を必要としている個体に請求項１〜１８のいずれかに記載の核酸を含む組成物または請求項１９〜２０に記載の組成物を投与することを含む疾患、障害または症候群を予防または治療する方法であって、好ましくは前記核酸または組成物が、皮下に、静脈内にまたは経口、直腸または腹腔内経路などのいずれか他の適用経路を用いて前記対象に投与される、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、産物および組成物およびそれらの使用に関する。特に、本発明は、ＬＰＡ遺伝子発現を妨げる、またはその発現を抑制する核酸産物に関する。このような治療的Ｌｐ（ａ）低下療法は、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症ならびに冠状動脈性心疾患および大動脈弁狭窄症などの心臓血管疾患または高レベルのＬｐ（ａ）含有粒子に関連するいずれかの他の障害、病態または症候群を罹患するリスクを防ぐまたは低減するように機能する。
【背景技術】
【０００２】
発現されたｍＲＮＡに相補的に結合できる二本鎖ＲＮＡ（ｄｓＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）と呼ばれている機序により遺伝子発現を阻止できることが示されている（Ｆｉｒｅ  ｅｔ  ａ．ｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ．１９９８  Ｆｅｂ  １９；３９１（６６６９）：８０６−１１  ａｎｄ  Ｅｌｂａｓｈｉｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｎａｔｕｒｅ．２００１  Ｍａｙ  ２４；４１１（６８３６）。短いｄｓＲＮＡは、脊椎動物を含む多くの生物において遺伝子特異的、転写後サイレンシングを誘導し、遺伝子機能を研究するための有用なツールとなってきた。ＲＮＡｉは、ＲＩＳＣ複合体に組み込まれたサイレンシングトリガーに相同なメッセンジャーＲＮＡを分解する、配列特異的多成分ヌクレアーゼであるＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）により媒介される。ｓｉＲＮＡ、抗二次鎖ＲＮＡ、およびミクロＲＮＡなどの干渉ＲＮＡ（本明細書ではｉＲＮＡと呼ぶ）は、遺伝子サイレンシング、すなわちｍＲＮＡ分子の分解によりタンパク質の遺伝子翻訳を阻害すること、により、タンパク質の形成を妨げるオリゴヌクレオチドである。遺伝子サイレンシング剤は、医薬の治療用途のためにますます重要になってきている。
【０００３】
ＷａｔｔｓおよびＣｏｒｅｙ、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｐａｔｈｏｌｏｇｙ（２０１２；Ｖｏｌ  ２２６，ｐ  ３６５−３７９）によると、核酸サイレンシングトリガーの設計に使用できるアルゴリズムは存在するが、これらの全てには、厳しい制約がある。アルゴリズムが標的ｍＲＮＡの三次構造またはＲＮＡ結合タンパク質の関与などの因子を考慮していないために、効力の高いｉＲＮＡを特定するために、様々な実験方法を採用し得る。従って、最小のオフターゲット効果を有する効力の高い核酸サイレンシングトリガーを見つけることは、複雑なプロセスである。これらの高度荷電分子の医薬品開発のために、それらが経済的に合成され、標的組織に送達され、細胞に入り、毒性の許容可能な制限内で機能できることが必要である。
【０００４】
Ｌｐ（ａ）は、主に肝臓で発現される不均一な低密度リポタンパク質粒子である（Ｗｉｔｚｔｕｍ  ａｎｄ  Ｇｉｎｓｂｅｒｇ，Ｊ  Ｌｉｐｉｄ  Ｒｅｓ．２０１６  Ｍａｒ；５７（３）：３３６−９）。Ｌｐ（ａ）は、ＡｐｏＢポリペプチドを介してＬＤＬに結合されるアポリポタンパク質（ａ）（ＬＰＡ遺伝子によりコードされるＡｐｏ（ａ））から構成される。遺伝的に定義された高いＬｐ（ａ）血清レベルは、食事および運動により影響されず、関連するアテローム硬化の可能性による心臓血管疾患に罹患するリスクの高まりに関連する（Ａｌｏｎｓｏ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｃｏｌｌｅｇｅ  ｏｆ  Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙ  Ｖｏｌ．６３，Ｎｏ．１９，２０１４）。診断および予防医学の観点では、患者のＬｐ（ａ）血清レベルは、冠状動脈性心疾患および大動脈弁狭窄症について高頻度にみられる独立した遺伝的リスク因子である（Ｓａｅｅｄｉ  ａｎｄ  Ｆｒｏｈｌｉｃｈ  Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  ａｎｄ  Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌｏｇｙ（２０１６）２：７）。現時点で、間接的な標準的一般ＬＤＬ低減手段を超える、承認された特定のＬｐ（ａ）低減療法は存在しない。従って、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症および冠状動脈性心疾患、大動脈弁狭窄症などの心臓血管疾患などの障害ならびにこれらに関連する障害および他の未知の関連障害、病態または症候群などの効果的な治療、予防およびこれに罹患するリスクの低減方法が、現在必要とされている。本発明は、この未充足の医療ニーズに応えるものである。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の第１の態様は、細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸に関し、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖がＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第１の鎖が次の配列から選択されるヌクレオチド配列を含む：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３。
【０００６】
一実施形態では、核酸は、第１の鎖に、基準配列：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３のいずれか１つの、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも１６個、より好ましくは少なくとも１７個、さらにより好ましくは少なくとも１８個、最も好ましくは少なくとも１９個のヌクレオチドの配列を含む。
【０００７】
一実施形態では、第１の鎖配列中に含まれる基準配列の一部に対し、第１の鎖配列中の一塩基ミスマッチの数が、最大で３つ、好ましくは最大で２つ、より好ましくは最大で１つおよび最も好ましくはゼロである。
【０００８】
第２の鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３８、４０、４２、４４、６４、６６、６８、７０、７２または７４のヌクレオチド配列を含み得る。
【０００９】
第１の鎖は配列番号５および配列番号９のヌクレオチド配列を含み得、および／または第２の鎖は配列番号６および配列番号１０のヌクレオチド配列を含み得る。
【００１０】
第１の鎖および／または第２の鎖はそれぞれ、１７〜３５個のヌクレオチド長であり、少なくとも１つの二重鎖領域は、１０〜２５個のヌクレオチド長であり得る。二本鎖は、２つの別々の鎖を含み得、または第１の鎖および第２の鎖を含む一本鎖を含み得る。
【００１１】
核酸は、ａ）両端で平滑末端であり得る；ｂ）一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し得る；またはｃ）両端でオーバーハングを有し得る。
【００１２】
第１および／または第２の鎖上の１個または複数のヌクレオチドは修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成し得る。第１の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得る。第１の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが少なくとも第２の修飾により修飾され得、少なくとも第２の修飾は、１個または複数の奇数のヌクレオチド上の修飾とは異なる。１個または複数の修飾された偶数ヌクレオチドの少なくとも１個は、１個または複数の修飾奇数ヌクレオチドの少なくとも１個に隣接し得る。
【００１３】
本発明の核酸では、第１の鎖中の複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得る。第１の鎖中の複数の偶数ヌクレオチドが第２の修飾により修飾され得る。第１の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得る。第１の鎖は、第２の異なる修飾により修飾された隣接するヌクレオチドも含み得る。
【００１４】
第２の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドは、第１の鎖上の奇数ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾により修飾され得る、および／または第２の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドは、第１の鎖の奇数ヌクレオチドの同じ修飾により修飾され得る。第２の鎖の１個または複数の修飾偶数ヌクレオチドの少なくとも１個は、１個または複数の修飾奇数ヌクレオチドに隣接し得る。第２の鎖の複数の奇数ヌクレオチドは、共通の修飾により修飾され得る、および／または複数の偶数ヌクレオチドは、第１の鎖の奇数ヌクレオチド上に存在する同じ修飾により修飾され得る。第２の鎖上の複数の奇数ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得、第２の修飾は、第１の鎖の奇数ヌクレオチドの修飾とは異なる。
【００１５】
第２の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得、これは、第１の鎖の奇数ヌクレオチドの修飾とは異なる第２の修飾であり得る。
【００１６】
本発明の核酸では、第１の鎖中のそれぞれの奇数ヌクレオチドおよび第２の鎖中のそれぞれの偶数ヌクレオチドは、共通の修飾により修飾され得、それぞれの偶数ヌクレオチドは、第２の修飾を有する第１の鎖中で修飾され得、それぞれの奇数ヌクレオチドは、第２の異なる修飾を有する第２の鎖中で修飾され得る。
【００１７】
本発明の核酸は、第２の鎖の非修飾のまたは異なって修飾されたヌクレオチドに対して、少なくとも１個のヌクレオチドだけシフトされた第１の鎖の修飾ヌクレオチドを有し得る。
【００１８】
修飾（単数または複数）はそれぞれ独立に、３’−末端デオキシチミン、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ修飾、２’−アミノ修飾、２’−アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホラミデート修飾、５’−ホスホロチオエート基修飾、５’−リン酸または５’−リン酸模倣物修飾およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群より選択され得、および／または修飾ヌクレオチドは、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチドまたは非天然塩基含有ヌクレオチドのいずれか１個であり得る。
【００１９】
少なくとも１つの修飾は、２’−Ｏ−メチルであり得、および／または少なくとも１つの修飾は２’−Ｆであり得る。
【００２０】
本発明は、第２の態様として、細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸をさらに提供し、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖がＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第１の鎖が次の配列：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３から選択されるヌクレオチド配列を含み、第１の鎖のヌクレオチドが奇数ヌクレオチド上で第１の修飾により修飾され、かつ偶数ヌクレオチド上で第２の修飾により修飾され、および第２の鎖のヌクレオチドが偶数ヌクレオチド上で第３の修飾により修飾され、かつ奇数ヌクレオチド上で第４の修飾により修飾され、少なくとも第１の修飾が第２の修飾と異なり、第３の修飾が第４の修飾とは異なる。第２の鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６４、６６、６８、７０、７２または７４のヌクレオチド配列を含み得る。第３の修飾および第１の修飾は同じであり得、および／または第２の修飾および第４の修飾は同じであり得る。
【００２１】
第１の修飾は２’ＯＭｅであり得、第２の修飾は２’Ｆであり得る。
【００２２】
第２の態様の核酸では、第１の鎖は配列番号５および配列番号９のヌクレオチド配列を含み得、および第２の鎖は配列番号６および配列番号１０のヌクレオチド配列を含み得る。
【００２３】
配列および修飾は、下表に示す通りであり得、これは、本明細書で提供される表１の抜粋に基づく好ましい配列を示す。
【表１】
2021502120.tif 000003
式中、特定の修飾は、次の番号で示される：
１＝２−Ｆ−ｄＵ、
２＝２−Ｆ−ｄＡ、
３＝２’Ｆ−ｄＣ、
４＝２’Ｆ−ｄＧ、
５＝２’−ＯＭｅ−ｒＵ；
６＝２’−ＯＭｅ−ｒＡ；
７＝２’−ＯＭｅ−ｒＣ；
８＝２’−ＯＭｅ−ｒＧ。
【００２４】
本発明の核酸は、第１のおよび／または第２の鎖の末端の１、２または３個の３’ヌクレオチド間および／または１、２または３個の５’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。これは、第１の鎖上の３個の末端３’ヌクレオチドのそれぞれの間、および３個の末端５’ヌクレオチドのそれぞれの間の２つのホスホロチオエート結合、および第２の鎖上の３個の３’末端のヌクレオチド間の２つのホスホロチオエート結合を含み得る。
【００２５】
このような核酸は、リガンドに結合され得る。
【００２６】
本発明は、第３の態様として、細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸をさらに提供し、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖がＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第１の鎖が次の配列：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３から選択されるヌクレオチド配列を含み、核酸はリガンドに結合される。
【００２７】
リガンドは、（ｉ）１個または複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分およびその誘導体、および（ｉｉ）リンカーを含み得、リンカーは、ＧａｌＮＡｃ部分を前出のいずれかの態様で定義の配列に結合する。リンカーは、二価または三価または四価の分岐構造体であり得る。ヌクレオチドは、本明細書で定義のように修飾され得る。
【００２８】
リガンドは、式Ｉ：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （Ｉ）
を含み得、式中、
Ｓは、サッカライドであり、サッカライドはＮ−アセチルガラクトサミンであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ｍは１、２、または３であり；
Ｐは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート（好ましくはチオホスフェート）であり；
Ｘ２は、式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、ｎ＝１〜６であり；
Ａは、分岐ユニットであり、
Ｘ３は、架橋ユニットであり；
本発明による核酸は、ホスフェートまたは修飾ホスフェート（好ましくはチオホスフェート）を介してＸ３に結合される。
【００２９】
従って、本発明は、次記の構造の１つを有する複合化核酸をさらに提供する。
【化１】
2021502120.tif 000004
2021502120.tif 000005
2021502120.tif 000006
2021502120.tif 000007
2021502120.tif 000008
式中、Ｚは、本明細書で定義の核酸である。
【００３０】
あるいは、本発明による核酸は、次の構造のリガンドに結合され得る。
【化２】
2021502120.tif 000009
【００３１】
本発明はまた、細胞中のＬＰＡ遺伝子の発現を抑制するための複合体に関し、上記複合体は、本発明の任意の態様の核酸を含む核酸部分およびリガンド部分を含み、上記核酸部分は、第１のＲＮＡ鎖の少なくとも一部および第１の鎖に少なくとも部分的に相補的な第２のＲＮＡ鎖の少なくとも一部を含み、上記第１の鎖が上記ＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記リガンド部分がリンカー部分、好ましくはセリノール由来リンカー部分、および細胞のインビボ標的化のための標的化リガンドを含み、一方のまたは両方のＲＮＡ鎖の３’および／または５’末端のみに結合され、第１のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されず、
（ｉ）第２のＲＮＡ鎖は、標的化リガンドに５’末端で結合され、（ａ）第２のＲＮＡ鎖はまた、標的化リガンドに３’末端でも結合され、第１のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｂ）第１のＲＮＡ鎖は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｃ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方はまた、３’末端で標的化リガンドに結合され；もしくは
（ｉｉ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されず、または
本発明は、細胞中のＬＰＡ遺伝子の発現を抑制するための複合体に関し、上記複合体は核酸部分およびリガンド部分を含み、上記核酸部分は、第１のＲＮＡ鎖の少なくとも一部および第１の鎖に少なくとも部分的に相補的な第２のＲＮＡ鎖の少なくとも一部を含み、上記第１の鎖が上記ＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記リガンド部分がリンカー部分、および細胞のインビボ標的化のための標的化リガンドを含み、一方のまたは両方のＲＮＡ鎖の３’および／または５’末端のみに結合され、第１のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されず、
（ｉ）第２のＲＮＡ鎖は、標的化リガンドに５’末端で結合され、（ａ）第２のＲＮＡ鎖はまた、標的化リガンドに３’末端でも結合され、第１のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｂ）第１のＲＮＡ鎖は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｃ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方はまた、３’末端で標的化リガンドに結合され；もしくは
（ｉｉ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されない。
【００３２】
リンカー部分は、例えば、セリノール由来リンカー部分または本明細書で記載の他のリンカータイプの１つであり得る。
【００３３】
本発明はまた、本発明のいずれかの態様の核酸または複合化核酸、および生理学的に許容できる賦形剤を含む組成物も提供する。
【００３４】
疾患、障害または症候群の治療で、および／または疾患、障害、または症候群の治療のための薬物の製造で使用するための本発明のいずれかの態様による核酸または複合化核酸も提供される。
【００３５】
本発明は、疾患、障害または症候群を治療または予防する方法を提供し、方法は、本発明のいずれかの態様による核酸または複合化核酸を含む組成物を、治療を必要としている個体に投与することを含む。核酸または複合化核酸は、皮下で、静脈内でまたは経口、直腸または腹腔内などの任意の他の適用経路を用いて対象に投与され得る。
【００３６】
皮下適用の後で、本発明の組成物は、組織特異的様式で肝臓（肝細胞）に送達され、ＬＰＡを特異的に標的にし、望ましくない副作用を低減し、所望の効果を達成するためのより少ない必要薬用量を達成する。
【００３７】
本発明または本発明の核酸もしくは複合化核酸を含む医薬組成物は、疾患、障害または症候群の治療において用いられ得る。治療は、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症または冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症などの心臓血管疾患および高レベルのＬｐ（ａ）含有粒子に関連する任意の他の疾患または病態を防止するおよびこれらに罹患するリスクを低減することであり得る。
【００３８】
本発明による核酸または複合化核酸を作製する方法も含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００３９】
本発明は、発現されたＬＰＡのＲＮＡ転写物に対する二本鎖核酸、およびその組成物に関する。これらの核酸または結合核酸は、ＬＰＡ遺伝子産物発現の低減が望ましい種々の疾患、障害および症候群の治療および予防で使用できる。
【００４０】
本発明の第１の態様は、細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸に関し、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖がＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記第１の鎖が次の配列から選択されるヌクレオチド配列を含む：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３。
【００４１】
核酸は、配列番号９のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号１０のヌクレオチド配列を含み、または配列番号５のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号６のヌクレオチド配列を含み；または配列番号１のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号２のヌクレオチド配列を含み；または配列番号４のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号４のヌクレオチド配列を含み；または配列番号７のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号８のヌクレオチド配列を含み；配列番号１１のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号１２のヌクレオチド配列を含み、または配列番号１３のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号１４のヌクレオチド配列を含み；または配列番号１５のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号１６のヌクレオチド配列を含み；または配列番号１７のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号１８のヌクレオチド配列を含み；または配列番号１９のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号２０のヌクレオチド配列を含み、または配列番号２１のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号２２のヌクレオチド配列を含み；または配列番号２３のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号２４のヌクレオチド配列を含み；または配列番号２５のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号２６のヌクレオチド配列を含み；または配列番号２７のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号２８のヌクレオチド配列を含み；または配列番号２９のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号３０のヌクレオチド配列を含み、または配列番号３１のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号３２のヌクレオチド配列を含み；または配列番号３３のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号３４のヌクレオチド配列を含み；または配列番号３５のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号３６のヌクレオチド配列を含み、または配列番号３７のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号３８のヌクレオチド配列を含み；または配列番号３９のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号４０のヌクレオチド配列を含み；または配列番号４１のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号４２のヌクレオチド配列を含み；または配列番号４３のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号４４のヌクレオチド配列を含み、または配列番号６３のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号６４のヌクレオチド配列を含み；または配列番号６５のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号６６のヌクレオチド配列を含み；または配列番号６７のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号６８のヌクレオチド配列を含み、または配列番号６９のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号７０のヌクレオチド配列を含み；または配列番号７１のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号７２のヌクレオチド配列を含み；または配列番号７３のヌクレオチド配列を含む第１の鎖を含み、任意選択で第２の鎖は配列番号７４のヌクレオチド配列を含む。
【００４２】
ＬＰＡ遺伝子は、高度反復配列を含む。極めて類似の配列を有する第１鎖核酸は従って、非常に異なるｍＲＮＡの標的部位に対し完全な配列相補性を有することができる。
【００４３】
本発明の関連態様は、細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸であり、核酸は、第１の鎖；および第２の鎖を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖は、配列番号９、５、１、３、７、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３の基準配列のいずれか１つの、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも１６個、より好ましくは少なくとも１７個、さらにより好ましくは少なくとも１８個および最も好ましくは少なくとも１９個のヌクレオチドを含み、第１の鎖配列に包含される基準配列の一部に比較して、第１の鎖配列中の一塩基ミスマッチおよび／または欠失および／または挿入の数は、最大で３つ、好ましくは最大で２つ、より好ましくは最大で１つおよび最も好ましくはゼロである。
【００４４】
一態様では、核酸の第１の鎖は、基準配列のいずれか１つの、好ましくは配列番号９および５の基準配列のいずれか１つの、少なくとも１８個のヌクレオチドの配列を含み、第１の鎖配列に包含される基準配列の一部に比較して、第１の鎖配列中の一塩基ミスマッチおよび／または欠失および／または挿入の数は、最大で１つおよび好ましくはゼロである。
【００４５】
一態様では、核酸の第１の鎖は、配列番号９および５の基準配列のいずれか１つの、少なくとも１９個のヌクレオチドの配列を含む。
【００４６】
第１の（アンチセンス）鎖と標的配列の間、または第１の鎖と第２の（センス）鎖の間の一定数のミスマッチ、欠失または挿入は、ｓｉＲＮＡとして許容でき、特定の場合では、活性を高める可能性さえあり得る。
【００４７】
核酸とは、ヌクレオチドを含む２つの鎖を含み、遺伝子発現を妨げることができる核酸を意味する。抑制は、完全でも、または部分的でもよく、標的化された様式で遺伝子発現の下方調節をもたらす。核酸は、２つの別々のポリヌクレオチド鎖を含み、第１の鎖はガイド鎖でもあり、第２の鎖はパッセンジャー鎖でもあり得る。第１の鎖および第２の鎖は、自己相補的であり折り返して二本鎖分子を形成する同じポリヌクレオチド分子の一部であり得る。核酸はｓｉＲＮＡ分子であり得る。
【００４８】
核酸は、リボヌクレオチド、修飾リボヌクレオチド、デオキシヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または標的配列または相補鎖上の対応する塩基と「対形成」し得るようにヌクレオチドを模倣できるヌクレオチド類似体非ヌクレオチドを含み得る。核酸は、第１の鎖（当該技術分野においてガイド鎖としても既知である）の全部または一部および第２の鎖（当該技術分野においてパッセンジャー鎖としても既知である）の全部または一部により形成される二本鎖核酸部分または二重鎖領域をさらに含む。二重鎖領域は、第１の鎖と第２の鎖の間で形成される最初の塩基対で始まり、第１の鎖と第２の鎖の間で形成される最後の塩基対で終わる（両端含む）として定義される。
【００４９】
二重鎖領域とは、ワトソン・クリック塩基対形成、または相補的なまたは実質的に相補的なオリゴヌクレオチド鎖間の二重鎖を可能にする任意の他の方式により相互に塩基対を形成する２つの相補的なまたは実質的に相補的なオリゴヌクレオチドにおける領域を意味する。例えば、２１個のヌクレオチド単位を有するオリゴヌクレオチド鎖は、２１個のヌクレオチド単位の別のオリゴヌクレオチドと塩基対を形成でき、しかも、各鎖の１９個のヌクレオチドのみが相補的または実質的に相補的であり、そのため「二重鎖領域」は１９個の塩基対からなる。残りの塩基対は、５’および３’オーバーハングとして、または一本鎖領域として存在し得る。さらに、二重鎖領域内で、１００％相補性は必要でなく、実質的相補性が二重鎖領域内で許容可能である。実質的相補性は、生物学的条件下でアニーリングできるような鎖間の相補性を指す。２つの鎖が生物学的条件下でアニーリング可能かどうかを実験的に決定する技術は、当該技術分野において周知である。あるいは、２つの鎖を合成し、生物学的条件下で一緒に添加して、それらが相互にアニールするかどうかを決定できる。
【００５０】
少なくとも１つの二重鎖領域を形成する第１の鎖および第２の鎖の一部は、完全に相補的であり得、および少なくとも部分的に相互に相補的である。
【００５１】
核酸の長さによっては、第１の鎖と第２の鎖の間の塩基相補性の観点からの完全一致は必ずしも必要ない。しかし、第１と第２の鎖は、生理的状態下でハイブリダイズできなければならない。
【００５２】
少なくとも１つの二重鎖領域における第１の鎖と第２の鎖の間の相補性は、どちらの鎖にもヌクレオチドミスマッチまたは付加／欠失ヌクレオチドが存在しないという点で、完全であり得る。あるいは、相補性は完全でなくてもよい。相補性は、約７０％〜約１００％であり得る。より具体的には、相補性は、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、およびこれらの中間値であり得る。
【００５３】
本発明においては、例えば、「第１の鎖の少なくとも一部を含む１つの二重鎖領域」の場合の「の一部」は、二重鎖領域が、所与の基準鎖配列の、少なくとも１０個、好ましくは少なくとも１２個、より好ましくは少なくとも１４個、さらにより好ましくは少なくとも１６個、またさらにより好ましくは少なくとも１８個および最も好ましくは全てのヌクレオチドを含むことを意味すると理解されるべきである。二重鎖領域中の基準配列の一部は、基準配列の対応する部分に、少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも１００％同一である。あるいは、基準配列の一部に比較して一塩基ミスマッチの数は、最大で３つ、好ましくは最大で２つ、より好ましくは最大で１つおよび最も好ましくはゼロである。
【００５４】
第１の鎖および第２の鎖はそれぞれ、表１に記載の配列のいずれか１つとは３個程度のヌクレオチドだけ異なる少なくとも１５個の近接ヌクレオチドを含む相補性領域を含む。
【００５５】
核酸は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６４、６６、６８、７０、７２または７４のヌクレオチド配列を含む第２の配列を含み得る。
【００５６】
本発明による核酸の使用は、第１の鎖の全てまたは一部と標的核酸の一部の間の二重鎖領域の形成を含む。第１の鎖と標的配列の間で形成される最初の塩基対で始まりかつ第１の鎖と標的配列の間で形成される最後の塩基対で終わる（両端含む）として定義される第１の鎖と二重鎖領域を形成する標的核酸の一部は、標的核酸配列、または単純に、標的配列である。第１の鎖と第２の鎖の間で形成される二重鎖領域は、第１の鎖と標的配列の間で形成される二重鎖領域と同じである必要はない。すなわち、第２の鎖は、標的配列とは異なる配列を有し得る；しかし、少なくとも生理的条件下で、第１の鎖は、第２の鎖および標的配列の両方と二重鎖構造を形成できる必要がある。
【００５７】
第１の鎖と標的配列の間の相補性は、完全であり得る（どちらの核酸にもヌクレオチドミスマッチまたは付加／欠失ヌクレオチドがない）。
【００５８】
第１の鎖と標的配列の間の相補性は、完全でなくてもよい。相補性は、約７０％〜約１００％であり得る。より具体的には、相補性は、少なくとも７０％、８０％、８５％、９０％または９５％、およびこれらの中間値であり得る。
【００５９】
第１の鎖と標的配列の相補的配列の間の同一性は、約７５％〜約１００％の範囲である。より具体的には、核酸がＬＰＡの発現を低減または抑制できる限りにおいて、相補性は、少なくとも７５％、８０％、８５％、９０％または９５％、およびこれらの中間値であり得る。
【００６０】
第１の鎖と標的配列の間の１００％未満の相補性を有する核酸は、第１の鎖と標的配列の間で完全な相補性を有する核酸と同じレベルにＬＰＡの発現を低減できる可能性がある。あるいは、それは、ＬＰＡの発現を、完全な相補性を有する核酸により達成される低減レベルの１５％〜１００％のレベルに低減できる可能性がある。
【００６１】
核酸は、それぞれ１９〜２５ヌクレオチド長の第１の鎖および第２の鎖を含み得る。第１の鎖および第２の鎖は、異なる長さであり得る。
【００６２】
核酸は、１５〜２５ヌクレオチド対の長さであり得る。核酸は、１７〜２３ヌクレオチド対の長さであり得る。核酸は、１７〜２５ヌクレオチド対の長さであり得る。核酸は、２３〜２４ヌクレオチド対の長さであり得る。核酸は、１９〜２１ヌクレオチド対の長さであり得る。核酸は、２１〜２３ヌクレオチド対の長さであり得る。
【００６３】
核酸は、１９〜２５ヌクレオチド塩基対からなる二重鎖領域を含み得る。二重鎖領域は、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４または２５塩基対からなり得、これは近接していてよい。
【００６４】
核酸は、配列番号５または配列番号９の第１の鎖配列を含み得る。核酸は、配列番号６または配列番号１０の第２の鎖配列を含み得る。
【００６５】
好ましくは、核酸はＲＮＡ干渉を媒介する。
【００６６】
一実施形態では、細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸は、第１の鎖および第１の鎖に少なくとも部分的に相補的な第２の鎖を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、上記第１の鎖は、配列番号９、５、１、３、７、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３の配列のいずれか１つに少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％、より好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％および最も好ましくは１００％の配列同一性を有する、少なくとも１５個、好ましくは少なくとも１６個、より好ましくは少なくとも１７個、さらにより好ましくは少なくとも１８個および最も好ましくは少なくとも１９個のヌクレオチドを含む。
【００６７】
さらなる態様では、記載されているように、核酸または複合化核酸は、核酸または複合化核酸の非存在下で観察される発現に比べて、ＬＰＡ発現を少なくとも１５％低減し得る。いずれかの前出の態様の全ての好ましい特徴はまた、この態様にも適用される。特に、ＬＰＡの発現は、核酸もしくは複合化核酸の非存在下でまたは非サイレンシング対照の存在下で観察される発現よりも、少なくとも次の所与％または９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％未満またはそれ未満に低減され得る。
【００６８】
核酸は、両端で平滑末端であり得る；一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し得る；または両端でオーバーハングを有し得る。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「オーバーハング」は、当該技術分野において標準的なおよび通例の意味、すなわち、二本鎖核酸中の相補鎖の末端ヌクレオチドを超えて伸びる核酸の一本鎖部分の意味を有する。用語「平滑末端」は、それにより末端ヌクレオチドが塩基対であるかどうかに関係なく両鎖が同じ位置で終わる、二本鎖核酸を含む。平滑末端での第１の鎖および第２の鎖の末端ヌクレオチドは、塩基対であり得る。平滑末端での第１の鎖および第２の鎖の末端ヌクレオチドは、対でない場合がある。平滑末端での第１の鎖および第２の鎖の末端の２つのヌクレオチドは、塩基対であり得る。平滑末端での第１の鎖および第２の鎖の末端の２つのヌクレオチドは、対でない場合がある。
【００７０】
核酸は、一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し得る。核酸は、一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し得る。核酸は、両端で平滑末端であり得る。核酸は、第１の鎖の５’−末端および第２の鎖３’−末端を有する末端で、または第１の鎖の３’−末端および第２の鎖の５’−末端を有する末端で、平滑末端であり得る。
【００７１】
核酸は、３’−または５’−末端でオーバーハングを含み得る。核酸は、第１の鎖で３’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第２の鎖で３’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖で５’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第２の鎖で５’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖の５’−末端および３’−末端の両方でオーバーハングを有し得る。核酸は、第２の鎖の５’−末端および３’−末端の両方でオーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖で５’オーバーハングを有し、第２の鎖で３’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖で３’オーバーハングを有し、第２の鎖で５’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖で３’オーバーハングを有し、第２の鎖で３’−オーバーハングを有し得る。核酸は、第１の鎖で５’オーバーハングを有し、第２の鎖で５’−オーバーハングを有し得る。
【００７２】
第２の鎖または第１の鎖の３’−末端または５’−末端でのオーバーハングは、１、２、３、４および５個のヌクレオチド長からなるものから選択され得る。任意選択で、オーバーハングは、１または２個のヌクレオチドからなり得、これは、修飾されてもまたは修飾されなくてもよい。
【００７３】
非修飾ポリヌクレオチド、特に、リボヌクレオチドは、細胞内ヌクレアーゼにより分解される傾向があり得、従って、修飾／修飾ヌクレオチドは、本発明の核酸に含まれ得る。このような修飾は、核酸をヌクレアーゼに対してより高い耐性にすることによりそれらを安定化するのを助け得る。この向上された耐性は、核酸をより長い期間にわたりＲＮＡ干渉を媒介することにおいて活性であるようにさせ、核酸が治療に使用される場合に特に望ましい。
【００７４】
本発明の核酸の第２および／または第１の鎖上の１個または複数のヌクレオチドは修飾され得る。
【００７５】
本発明の核酸の修飾は通常、限定されないが、インビトロおよびインビボ安定性および天然ＲＮＡ分子に対する固有のバイオアベイラビリティを含む潜在的制約を克服するために強力なツールを提供する。本発明による核酸は、化学修飾により修飾され得る。修飾核酸はまた、ヒトでのインターフェロン活性を誘導する可能性を最小限にできる。修飾は、標的細胞への核酸の機能的送達をさらに高め得る。本発明の修飾核酸は、第１の鎖または第２の鎖の一方または両方の１個または複数の化学修飾リボヌクレオチドを含み得る。リボヌクレオチドは、塩基、糖またはホスフェート部分の化学修飾を含み得る。リボ核酸は、核酸または塩基の類似体による置換または挿入により修飾され得る。
【００７６】
本発明の１個または複数のオリゴヌクレオチドは、修飾され得る。核酸は、少なくとも１個の修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドは、第１の鎖中に存在し得る。修飾ヌクレオチドは、第２の鎖中に存在し得る。修飾ヌクレオチドは、二重鎖領域中に存在し得る。修飾ヌクレオチドは、二重鎖領域の外側、すなわち、一本鎖領域に存在し得る。修飾ヌクレオチドは、第１の鎖上に存在し得、二重鎖領域の外側に存在し得る。修飾ヌクレオチドは、第２の鎖上に存在し得、二重鎖領域の外側に存在し得る。第１の鎖の３’−末端ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。第２の鎖の３’−末端ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。第１の鎖の５’−末端ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。第２の鎖の５’−末端ヌクレオチドは、修飾ヌクレオチドであり得る。
【００７７】
本発明の核酸は、１個の修飾ヌクレオチドを有し得、または本発明の核酸は約２〜４個の修飾ヌクレオチドを有し得、または核酸は約４〜６個の修飾ヌクレオチド、約６〜８個の修飾ヌクレオチド、約８〜１０個の修飾ヌクレオチド、約１０〜１２個の修飾ヌクレオチド、約１２〜１４個の修飾ヌクレオチド、約１４〜１６個の修飾ヌクレオチド、約１６〜１８個の修飾ヌクレオチド、約１８〜２０個の修飾ヌクレオチド、約２０〜２２個の修飾ヌクレオチド、約２２〜２４個の修飾ヌクレオチド、２４〜２６個の修飾ヌクレオチドまたは約２６〜２８個の修飾ヌクレオチドを有し得る。それぞれの場合で、上記修飾ヌクレオチドを含む核酸は、上記修飾ヌクレオチドを含まない同じ核酸と比較して、少なくとも５０％のその活性を保持する。または逆も同じ。核酸は、上記修飾ヌクレオチドを含まない同じ核酸と比較して、その活性の５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％および１００％および中間値を保持し、または上記修飾ヌクレオチドを含まない同じ核酸の１００％を超える活性を有し得る。
【００７８】
修飾ヌクレオチドは、プリンまたはピリミジンであり得る。少なくとも半分のプリンが修飾され得る。少なくとも半分のピリミジンが修飾され得る。全てのプリンが修飾され得る。全てのピリミジンが修飾され得る。修飾ヌクレオチドは、３’−末端デオキシチミン（ｄＴ）ヌクレオチド、２’−Ｏ−メチル修飾ヌクレオチド、２’修飾ヌクレオチド、２’−デオキシ修飾ヌクレオチド、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、モルホリノヌクレオチド、ホスホラミデート、非天然塩基含有ヌクレオチド、５’−ホスホロチオエート基含有ヌクレオチド、ヌクレオチド、５’−リン酸または５’−リン酸模倣物を含むヌクレオチド、およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基に結合された末端ヌクレオチドからなる群より選択され得る。
【００７９】
核酸は、修飾ヌクレオチドを含むヌクレオチドを含み得、塩基は、２−アミノアデノシン、２，６−ジアミノプリン、イノシン、ピリジン−４−オン、ピリジン−２−オン、フェニル、シュードウラシル、２，４，６−トリメトキシベンゼン、３−メチルウラシル、ジヒドロウリジン、ナフチル、アミノフェニル、５−アルキルシチジン（例えば、５−メチルシチジン）、５−アルキルウリジン（例えば、リボチミジン）、５−ハロウリジン（例えば、５−ブロモウリジン）、６−アザピリミジン、６−アルキルピリミジン（例えば、６−メチルウリジン）、プロピン、キューオシン、２−チオウリジン、４−チオウリジン、ワイブトシン、ウィブトキソシン、４−アセチルシチジン、５−（カルボキシヒドロキシメチル）ウリジン、５’−カルボキシメチルアミノメチル−２−チオウリジン、５−カルボキシメチルアミノメチルウリジン、ベータ−Ｄ−ガラクトシルクェオシン、１−メチルアデノシン、１−メチルイノシン、２，２−ジメチルグアノシン、３−メチルシチジン、２−メチルアデノシン、２−メチルグアノシン、Ｎ６−メチルアデノシン、７−メチルグアノシン、５−メトキシアミノメチル−２−チオウリジン、５−メチルアミノメチルウリジン、５−メチルカルボニルメチルウリジン、５−メチルオキシウリジン、５−メチル−２−チオウリジン、２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデノシン、ベータ−Ｄ−マンノシルクェオシン、ウリジン−５−オキシ酢酸および２−チオシチジンから選択される。
【００８０】
本明細書で考察の核酸としては、非修飾ＲＮＡならびに修飾されて効力が向上したＲＮＡ、およびヌクレオシド代用物のポリマーが挙げられる。非修飾ＲＮＡは、核酸の成分、すなわち、糖類、塩基、およびホスフェート部分が、天然で生ずるもの、例えば人体中で天然に生じるものと同じまたは実質的に同じである、分子を指す。本明細書で使用される場合、修飾ヌクレオチドは、１個または複数のヌクレオチドの成分、すなわち、糖類、塩基およびホスフェート部分が、天然で生じるものとは異なるヌクレオチドを指す。それらは、無論、修飾のために、修飾ヌクレオチドと呼ばれるが、この用語は、ヌクレオチドではない分子も含み、例えば、リボリン酸骨格が、鎖間のハイブリダイゼーションを可能にする非リボリン酸構築物で置換される、すなわちこの修飾されたヌクレオチドがリボリン酸骨格を模倣する、ポリヌクレオチド分子も含む。
【００８１】
核酸内で生じる以下に記載の多くの修飾は、塩基、もしくはホスフェート部分、またはホスフェート部分の非結合Ｏの修飾のように、ポリヌクレオチド分子内で反復されるであろう。いくつかの事例では、修飾は、ポリヌクレオチド中の全ての可能な位置／ヌクレオチドで生じるであろうが、多くの場合、そうではないであろう。修飾は、３’または５’末端位置でのみ生じ得、末端ヌクレオチド上の位置でまたは鎖の最後の２、３、４、５、または１０個のヌクレオチド中などの末端領域でのみ生じ得る。修飾は、二本鎖領域、一本鎖領域、または両方で生じ得る。修飾は、本発明の核酸の二本鎖領域中でのみ生じ得るか、または本発明の核酸の一本鎖領域中でのみ生じ得る。非結合Ｏ位置でのホスホロチオエート修飾は、一方または両方の末端でのみ生じ得、末端領域中、例えば、末端ヌクレオチド上の位置でまたは鎖の最後の２、３、４または５個のヌクレオチド中でのみ生じ得、または二本鎖中、および／または一本鎖領域中、特に末端で生じ得る。５’末端または３’末端はリン酸化され得る。
【００８２】
本発明の核酸の安定性は、オーバーハング中に特定の塩基を含むことにより、または修飾ヌクレオチドを含むために、一本鎖オーバーハング中に、例えば、５’または３’オーバーハング中、または両方中に、特定の塩基を含むことにより、高め得る。プリンヌクレオチドは、オーバーハング中に含まれ得る。３’または５’オーバーハング中の全てのまたはいくつかの塩基が修飾され得る。修飾は、リボース糖の２’ＯＨ基での修飾の使用、リボヌクレオチドではなくデオキシリボヌクレオチドの使用、およびホスホロチオエート修飾などのリン酸基中の修飾の使用を含んでよい。オーバーハングは、標的配列と相同である必要はない。
【００８３】
ヌクレアーゼは、核酸リン酸ジエステル結合を加水分解できる。しかし、核酸に対する化学修飾は、改善された特性を付与でき、ヌクレアーゼに対するより高い安定性をオリゴリボヌクレオチドに付与できる。
【００８４】
本明細書で使用される場合、修飾核酸は、下記の１種または複数を含んでよい。  （ｉ）変化、例えば、一方または両方の非結合ホスフェート酸素および／または１個または複数の結合ホスフェート酸素（本発明の核酸の５’および３’末端であっても、結合と見なされる）の置換；
（ｉｉ）変化、例えば、リボース糖の成分の置換、例えば、リボース糖上の２’ヒドロキシルの置換；
（ｉｉｉ）「デホスホ」リンカーによるホスフェート部分の置換；
（ｉｖ）天然の塩基の修飾または置換；
（ｖ）リボースホスフェート骨格の置換または修飾；
（ｖｉ）ＲＮＡの３’末端または５’末端の修飾、例えば、末端リン酸基の除去、修飾もしくは置換または部分の結合、例えば、ＲＮＡの３’または５’末端への蛍光標識部分の結合。
【００８５】
用語の置換、修飾、変化は、天然の分子からの差異を示す。
【００８６】
特定の修飾については、下でさらに詳細に考察する。
【００８７】
修飾リン酸基の例は、ホスホロチオエート、ホスホロセレン酸、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルを含む。ジチオリン酸は、硫黄により置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸基中の１つの、それぞれのまたは両方の非結合酸素は独立に、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリール）のいずれか１つであり得る。
【００８８】
ホスフェートリンカーはまた、窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホネート）による結合酸素の置換により修飾できる。置換は、末端酸素で生じ得る。窒素による非結合酸素の置換が可能である。
【００８９】
修飾ヌクレオチドは、糖基の修飾を含み得る。２’ヒドロキシル基（ＯＨ）は、多くの異なる「オキシ」または「デオキシ」置換基で修飾または置換できる。
【００９０】
「オキシ」−２’ヒドロキシル基修飾の例としては次記が挙げられる：アルコキシまたはアリールオキシ（ＯＲ、例えば、Ｒ＝Ｈ、アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）；ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、Ｏ（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２ＯＲ；内部で２’ヒドロキシルが、例えば、メチレン架橋により、同じリボース糖の４’炭素に連結される「ロックド」核酸（ＬＮＡ）；Ｏ−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）およびアミノアルコキシ、Ｏ（ＣＨ２）ｎＡＭＩＮＥ（例えば、ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ、エチレンジアミン、ポリアミノ）。
【００９１】
「デオキシ」修飾としては次記が挙げられる：水素、ハロゲン、アミノ（例えば、ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、ジヘテロアリールアミノ、またはアミノ酸）；ＮＨ（ＣＨ２ＣＨ２ＮＨ）ｎＣＨ２ＣＨ２−ＡＭＩＮＥ（ＡＭＩＮＥ＝ＮＨ２；アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、ヘテロシクリル、アリールアミノ、ジアリールアミノ、ヘテロアリールアミノ、またはジヘテロアリールアミノ）、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｒ（Ｒ＝アルキル、シクロアルキル、アリール、アラルキル、ヘテロアリールまたは糖）、シアノ；メルカプト；アルキル−チオ−アルキル；チオアルコキシ；および例えば、アミノ官能基で任意に置換されてもよいアルキル、シクロアルキル、アリール、アルケニルおよびアルキニル。特定の実施形態の他の置換基としては、２’−メトキシエチル、２’−ＯＣＨ３、２’−Ｏ−アリル、２’−Ｃ−アリル、および２’−フルオロが挙げられる。
【００９２】
糖基は、リボース中の対応する炭素と逆の立体化学的配置を有する１個または複数の炭素も含んでよい。従って、修飾ヌクレオチドは、アラビノースなどの糖を含み得る。
【００９３】
修飾ヌクレオチドはまた、Ｃ−１’の位置の核酸塩基を欠く「脱塩基」糖を含んでよい。これらの脱塩基糖は、１個または複数の構成糖原子の修飾をさらに含んでよい。
【００９４】
２’修飾を１つまたは複数のホスフェートリンカー修飾（例えば、ホスホロチオエート）と組み合わせて使用し得る。
【００９５】
リン酸基は、非リン含有コネクターにより個別に置換できる。
【００９６】
リン酸基を置換できる部分の例としては、シロキサン、カーボネート、カルボキシメチル、カルバメート、アミド、チオエーテル、エチレンオキシドリンカー、スルホネート、スルホンアミド、チオホルムアセタール、ホルムアセタール、オキシム、メチレンイミノ、メチレンメチルイミノ、メチレンヒドラゾ、メチレンジメチルヒドラゾおよびメチレンオキシメチルイミノが挙げられる。特定の実施形態では、置換は、メチレンカルボニルアミノおよびメチレンメチルイミノ基を含み得る。
【００９７】
ホスフェートリンカーおよびリボース糖は、ヌクレアーゼ耐性ヌクレオチドにより置換され得る。
例としては、モルホリノ、シクロブチル、ピロリジンおよびペプチド核酸（ＰＮＡ）ヌクレオシド代用物が挙げられる。特定の実施形態では、ＰＮＡ代用物が使用され得る。 
【００９８】
オリゴヌクレオチドの３’および５’を修飾できる。このような修飾は、分子の３’末端または５’末端または両末端の位置であり得る。それらは、全体末端ホスフェートまたはリン酸基の１個または複数の原子の修飾または置換を含んでよい。例えば、オリゴヌクレオチドの３‘および５’末端は、標識部分、例えば、フルオロフォア（例えば、ピレン、ＴＡＭＲＡ、フルオレセイン、Ｃｙ３またはＣｙ５色素）または保護基（例えば、硫黄、シリコン、ホウ素またはエステル系）などの他の機能性分子実体に結合されてよい。機能的分子実体は、リン酸基および／またはリンカーを介して糖に結合されてよい。リンカーの末端原子は、糖のリン酸基またはＣ−３’またはＣ−５’のＯ、Ｎ、ＳまたはＣ基の結合原子に連結されるまたはこれを置換できる。あるいは、リンカーは、ヌクレオチド代用物（例えば、ＰＮＡ）の末端原子に連結されるまたはこれを置換できる。これらのスペーサーまたはリンカーとしては、例えば、−（ＣＨ２）ｎ−、−（ＣＨ２）ｎＮ−、−（ＣＨ２）ｎＯ−、−（ＣＨ２）ｎＳ−、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎＣＨ２ＣＨ２Ｏ−（例えば、ｎ＝３または６）、脱塩基糖、アミド、カルボキシ、アミン、オキシアミン、オキシイミン、チオエーテル、ジスルフィド、チオ尿素、スルホンアミド、またはモルホリノ、またはビオチンおよびフルオレセイン試薬を挙げることができる。３’末端は、−ＯＨ基であり得る。
【００９９】
末端修飾の他の例としては次記が挙げられる：色素、挿入剤（例えば、アクリジン）、架橋剤（例えば、プソラレン、マイトマイシンＣ）、ポルフィリン（ＴＰＰＣ４、テキサフィリン、サフィリン）、多環式芳香族炭化水素（例えば、フェナジン、ジヒドロフェナジン）、人工エンドヌクレアーゼ、ＥＤＴＡ、親油性担体（例えば、コレステロール、コール酸、アダマンタン酢酸、１−ピレン酪酸、ジヒドロテストステロン、１，３−ビス−Ｏ（ヘキサデシル）グリセリン、ゲラニルオキシヘキシル基、ヘキサデシルグリセリン、ボルネオール、メントール、１，３−プロパンジオール、ヘプタデシル基、パルミチン酸、ミリスチン酸、Ｏ３−（オレオイル）リトコール酸、Ｏ３−（オレオイル）コレン酸、ジメトキシトリチル、またはフェノキサジン）およびペプチド複合体（例えば、アンテナペディアペプチド、Ｔａｔペプチド）、アルキル化剤、ホスフェート、アミノ、メルカプト、ＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ−４０Ｋ）、ＭＰＥＧ、［ＭＰＥＧ］２、ポリアミノ、アルキル、置換アルキル、放射標識マーカー、酵素、ハプテン（例えば、ビオチン）、輸送／吸収促進物質（例えば、アスピリン、ビタミンＥ、葉酸）、合成リボヌクレアーゼ（例えば、イミダゾール、ビスイミダゾール、ヒスタミン、イミダゾールクラスター、アクリジンイミダゾール複合体、テトラアザ大環状環のＥｕ３＋複合体）。
【０１００】
末端修飾を、活性の調節または分解に対する耐性の調節を含む、多くの理由のために付加できる。活性の調節のために有用な末端修飾は、ホスフェートまたはホスフェート類似体を用いる５’末端の修飾を含む。第１のまたは第２の鎖に基づく本発明の核酸は、５’末端で５’リン酸化され得るかまたはホスホリル類似体を含み得る。５’−ホスフェート修飾は、ＲＩＳＣ媒介遺伝子サイレンシングと適合する修飾を含む。好適な修飾は、次記を含む：５′−モノホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５′）；５′−ジホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５′）；５′−トリホスフェート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５′）；５′−グアノシンキャップ（７−メチル化または非メチル化）（７ｍ−Ｇ−Ｏ−５′−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５′）；５′−アデノシンキャップ（Ａｐｐｐ）、および任意の修飾または非修飾ヌクレオチドキャップ構造体（Ｎ−Ｏ−５′−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−（ＨＯ）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−Ｐ（ＨＯ）（Ｏ）−Ｏ−５′）；５′−モノチオホスフェート（ホスホロチオエート；（ＨＯ）２（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５′）；５′−モノジチオホスフェート（ホスホロジチオエート；（ＨＯ）（ＨＳ）（Ｓ）Ｐ−Ｏ−５′），５′−ホスホロチオレート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−Ｓ−５′）；酸素／硫黄置換モノホスフェート、ジホスフェートおよびトリホスファテスの任意の追加の組み合わせ（例えば、５′−アルファ−チオトリホスフェート、５′−ガンマ−チオトリホスフェート、など）、５′−ホスホルアミデート（（ＨＯ）２（Ｏ）Ｐ−ＮＨ−５′、（ＨＯ）（ＮＨ２）（Ｏ）Ｐ−Ｏ−５′）、５′−アルキルホスホネート（Ｒ＝アルキル＝メチル、エチル、イソプロピル、プロピル、など、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５′−、（ＯＨ）２（Ｏ）Ｐ−５′−ＣＨ２−）、５’ビニルホスホネート、５′−アルキルエテルホスホネート（Ｒ＝アルキルエーテル＝メトキシメチル（ＭｅＯＣＨ２−）、エトキシメチル、など、例えば、ＲＰ（ＯＨ）（Ｏ）−Ｏ−５′−）。
【０１０１】
本発明の修飾核酸は、第１のおよび／または第２の鎖の１つまたは複数の末端上の１つまたは複数のホスホロチオエート修飾を含み得る。任意選択で、第１の鎖のそれぞれのまたは両方の末端は、１個または２個または３個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含み得る。任意選択で、第２の鎖のそれぞれのまたは両方の末端は、１個または２個または３個のホスホロチオエート修飾ヌクレオチドを含み得る。
【０１０２】
末端修飾はまた、分布の監視のために有用であり得、このような場合、付加されるべき基としては、フルオロフォア、例えば、フルオレセインまたはＡｌｅｘａ色素が挙げられる。末端修飾はまた、取り込みを高めるために有用であり、このために有用な修飾としては、コレステロールが挙げられる。末端修飾はまた、ＲＮＡ薬剤の別の部分への架橋のために有用である。
【０１０３】
アデニン、グアニン、シトシンおよびウラシルは、ＲＮＡで認められる最もよくある塩基である。これらの塩基は、修飾または置換されて改善された特性を有するＲＮＡをもたらす。例えば、ヌクレアーゼ耐性オリゴリボヌクレオチドは、これらの塩基または合成および天然の核酸塩基（例えば、イノシン、チミン、キサンチン、ヒポキサンチン、ネブラリン、イソグアノシン、またはツベルシジン（ｔｕｂｅｒｃｉｄｉｎｅ））ならびに上記の修飾のいずれか１種を用いて調製できる。あるいは、上記塩基のいずれかの置換または修飾された類似体および「ユニバーサル塩基」を採用できる。例としては、次記が挙げられる：２−アミノアデニン、アデニンおよびグアニンの６−メチルおよび他のアルキル誘導体；アデニンおよびグアニンの２−プロピルおよび他のアルキル誘導体；５−ハロウラシルおよびシトシン；５−プロピニルウラシルおよびシトシン；６−アゾウラシル、シトシンおよびチミン；５−ウラシル（偽ウラシル）、４−チオウラシル、５−ハロウラシル、５−（２−アミノプロピル）ウラシル、５−アミノアリルウラシル；８−ハロ、アミノ、チオール、チオアルキル、ヒドロキシル、および他の８−置換アデニンおよびグアニン；５−トリフルオロメチル、および他の５−置換ウラシルおよびシトシン；７−メチルグアニン；５−置換ピリミジン；６−アザピリミジン；およびＮ−２、Ｎ−６、およびＯ−６置換プリン（２−アミノプロピルアデニンを含む）；５−プロピニルウラシルおよび５−プロピニルシトシン；ジヒドロウラシル；３−デアザ−５−アザシトシン；２−アミノプリン；５−アルキルウラシル；７−アルキルグアニン；５−アルキルシトシン；７−デアザアデニン；Ｎ６，Ｎ６−ジメチルアデニン；２，６−ジアミノプリン；５−アミノ−アリル−ウラシル；Ｎ３−メチルウラシル；置換１，２，４−トリアゾール；２−ピリジノン；５−ニトロインドール；３−ニトロピロール；５−メトキシウラシル；ウラシル−５−オキシ酢酸；５−メトキシカルボニルメチルウラシル；５−メチル−２−チオウラシル；５−メトキシカルボニルメチル−２−チオウラシル；５−メチルアミノメチル−２−チオウラシル；３−（３−アミノ−３−カルボキシプロピル）ウラシル；３−メチルシトシン；５−メチルシトシン；Ｎ４−アセチルシトシン；２−チオシトシン；Ｎ６−メチルアデニン；Ｎ６−イソペンチルアデニン；２−メチルチオ−Ｎ６−イソペンテニルアデニン；Ｎ−メチルグアニン；またはＯ−アルキル化塩基。
【０１０４】
本明細書で使用される場合、「非対形成ヌクレオチド類似体」という用語は、限定されないが、６脱アミノアデノシン（ネブラリン）、４−Ｍｅ−インドール、３−ニトロピロール、５−ニトロインドール、Ｄｓ、Ｐａ、Ｎ３−ＭｅリボＵ、Ｎ３−ＭｅリボＴ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＴ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＧ、Ｎ１−Ｍｅ−ｄＡ、Ｎ３−エチル−ｄＣ、Ｎ３−Ｍｅ−ｄＣなどの、非塩基対部分を含むヌクレオチド類似体を意味する。いくつかの実施形態では、非塩基対ヌクレオチド類似体は、リボヌクレオチドである。他の実施形態では、それはデオキシリボヌクレオチドである。
【０１０５】
本明細書で使用される場合、「末端官能基」という用語は、限定されないが、ハロゲン、アルコール、アミン、カルボン酸、エステル、アミド、アルデヒド、ケトン、エーテル基を含む。
【０１０６】
特定の部分は、第１の鎖または第２の鎖の５’末端に結合され得る。これらは、次記を含む：脱塩基リボース部分、脱塩基デオキシリボース部分、２’Ｏアルキル修飾を含む修飾脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分；逆位脱塩基リボースおよび脱塩基デオキシリボース部分およびその修飾物、Ｃ６−イミノ−Ｐｉ；ＤＮＡおよびＲＮＡを含むミラーヌクレオチド；５’ＯＭｅヌクレオチド；および４’、５’−メチレンヌクレオチドを含むヌクレオチド類似体；１−（β−Ｄ−エリスロフラノシル）ヌクレオチド；４’−チオヌクレオチド、炭素環式ヌクレオチド；５’−アミノ−リン酸アルキル；１，３−ジアミノ−２−プロピルホスフェート、３−アミノプロピルホスフェート；６−アミノヘキシルホスフェート；１２−アミノドデシルホスフェート；ヒドロキシプロピルホスフェート；１，５−アンヒドロヘキシトールヌクレオチド；アルファヌクレオチド；トレオペントフラノシルヌクレオチド；非環式３’、４’−セコヌクレオチド；３，４−ジヒドロキシブチルヌクレオチド；３，５−ジヒドロキシペンチルヌクレオチド、５，５’−逆位脱塩基部分；１，４−ブタンジオールホスフェート；５’−アミノ；および架橋または非架橋メチルホスホネートおよび５’−メルカプト部分。
【０１０７】
本発明の核酸は、１種または複数の逆位ヌクレオチド、例えば、逆位チミジンまたは逆位アデニンを含み得る（例えば、Ｔａｋｅｉ，ｅｔ  ａｌ．，２００２．ＪＢＣ  ２７７（２６）：２３８００−０６を参照）。
【０１０８】
本明細書で使用される場合、遺伝子発現に関して「抑制する」、「下方制御する」、または「低減する」という用語は、遺伝子の発現、または１種または複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットをコードするＲＮＡ分子または等価ＲＮＡ分子（例えば、ｍＲＮＡ）のレベル、または１種または複数のタンパク質またはタンパク質サブユニットの活性が、本発明の核酸または複合化核酸の非存在下で観察されるものより、またはヒト転写物に対し既知の相同性のないｓｉＲＮＡ（本明細書で非サイレンシング対照と呼ばれる）を基準にして、低いことを意味する。このような対照は、類似の方法で本発明の分子に結合または修飾され、同じ経路により標的細胞に送達され得る；例えば、発現は、９０％、８０％、７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％に、または中間値に、または本発明の核酸または複合化核酸の非存在下でまたは非サイレンシング対照の存在下で観察されるもの未満に低減され得る。
【０１０９】
本発明の核酸は、脱塩基ヌクレオチドを含み得る。本明細書で使用される場合、用語「脱塩基」は、１’位置で一つの塩基を欠くかまたは一つの塩基の代わりに他の化学基を有する部分を指し、例えば、３’、３’−結合または５‘、５’−結合デオキシ脱塩基リボース誘導体である。
【０１１０】
核酸は、修飾された第２のおよび／または第１の鎖上に１個または複数のヌクレオチドを含み得る。ヌクレオチドが交互に修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成し得る。
【０１１１】
本明細書に記載の交互は、規則的に代わる代わる交替して起こることを意味する。換言すれば、交互は、反復して交替で起こることを意味する。例えば、１個のヌクレオチドが修飾される場合、次の隣接ヌクレオチドは修飾されず、その次の隣接ヌクレオチドは修飾される、等々。第１と第２の修飾が異なる場合、１個のヌクレオチドは第１の修飾で修飾され得、次の隣接ヌクレオチドは第２の修飾により修飾され得、および次の隣接ヌクレオチドは第１の修飾により修飾される、等々。
【０１１２】
本発明の核酸の第１の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得、ここで第１の鎖は５’側から３’側へ番号が付与され、最も５’側のヌクレオチドが第１の鎖のヌクレオチド番号１である。本明細書に記載の用語「奇数」は、２で割り切れない数字を意味する。奇数の例は、１、３、５、７、９、１１などである。本発明の核酸の第１の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが修飾され得、ここで第１の鎖は、５’側から３’側へ番号が付けられる。本明細書に記載の用語「偶数」は、２で均等に割り切れる数字を意味する。偶数の例は、２、４、６、８、１０、１２、１４などである。本発明の核酸の第２の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得、ここで第２の鎖は３’側から５’側へ番号が付与され、最も３’側のヌクレオチドが第２の鎖のヌクレオチド番号１である。本発明の核酸の第２の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが修飾され得、ここで第２の鎖は、３’側から５’側へ番号が付けられる。
【０１１３】
第１および／または第２の鎖上の１個または複数のヌクレオチドが修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成し得る。第１の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得る。第１の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが少なくとも第２の修飾により修飾され得、ここで少なくとも第２の修飾は、１個または複数の奇数のヌクレオチド上の修飾とは異なる。１個または複数の修飾偶数ヌクレオチドの少なくとも１個は、１個または複数の修飾奇数ヌクレオチドの少なくとも１個に隣接し得る。
【０１１４】
本発明の核酸では、第１の鎖中の複数の奇数ヌクレオチドが修飾され得る。第１の鎖中の複数の偶数ヌクレオチドが第２の修飾により修飾され得る。第１の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得る。第１の鎖は、第２の異なる修飾により修飾された隣接するヌクレオチドも含み得る。
【０１１５】
第２の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドは、第１の鎖上の奇数ヌクレオチドの修飾とは異なる修飾により修飾され得る、および／または第２の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドは、第１の鎖の奇数ヌクレオチドの同じ修飾により修飾され得る。第２の鎖の１個または複数の修飾偶数ヌクレオチドの少なくとも１個は、１個または複数の修飾奇数ヌクレオチドに隣接し得る。第２の鎖の複数の奇数ヌクレオチドは、共通の修飾により修飾され得、および／または複数の偶数ヌクレオチドは第１の鎖の奇数ヌクレオチド上に存在する同じ修飾により修飾され得る。第２の鎖上の複数の奇数ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得、ここで第２の修飾は、第１の鎖の奇数ヌクレオチドの修飾とは異なる。
【０１１６】
第２の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得、これは、第１の鎖の奇数ヌクレオチドの修飾とは異なる第２の修飾であり得る。
【０１１７】
本発明の核酸では、第１の鎖中のそれぞれの奇数ヌクレオチドおよび第２の鎖中のそれぞれの偶数ヌクレオチドは、共通の修飾により修飾され得、それぞれの偶数ヌクレオチドは、第２の修飾を有する第１の鎖中で修飾され得、それぞれの奇数ヌクレオチドは、第２の修飾を有する第２の鎖中で修飾され得る。
【０１１８】
本発明の核酸は、第２の鎖の非修飾のまたは異なって修飾されたヌクレオチドに対して、少なくとも１個のヌクレオチドだけシフトされた第１の鎖の修飾ヌクレオチドを有し得る。
【０１１９】
１個または複数またはそれぞれの奇数ヌクレオチドは、第１の鎖中で修飾され得、１個または複数またはそれぞれの偶数ヌクレオチドは、第２の鎖中で修飾され得る。一方または両方の鎖上の１個または複数またはそれぞれの交互ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得る。１個または複数またはそれぞれの偶数ヌクレオチドは、第１の鎖中で修飾され得、１個または複数またはそれぞれの偶数ヌクレオチドは、第２の鎖中で修飾され得る。一方または両方の鎖上の１個または複数またはそれぞれの交互ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得る。１個または複数またはそれぞれの奇数ヌクレオチドは、第１の鎖中で修飾され得、１個または複数またはそれぞれの奇数ヌクレオチドは、第２の鎖中で共通の修飾により修飾され得る。一方または両方の鎖上の１個または複数またはそれぞれの交互ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得る。１個または複数またはそれぞれの偶数ヌクレオチドは、第１の鎖中で修飾され得、１個または複数またはそれぞれの奇数ヌクレオチドは、第２の鎖中で共通の修飾により修飾され得る。一方または両方の鎖上の１個または複数またはそれぞれの交互ヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得る。
【０１２０】
本発明の核酸は、１つまたは両方の鎖中で交互修飾の少なくとも２つの領域を有する一本鎖または二本鎖構築物を含み得る。これらの交互領域は、最大約１２個のヌクレオチドを含み得るが、好ましくは約３〜約１０個のヌクレオチドを含む。交互ヌクレオチドの領域は、本発明の核酸の１つまたは両方の鎖の末端に位置し得る。核酸は、各末端（３’および５’）に４〜約１０個のヌクレオチドの交互ヌクレオチドを含み得、これらの領域は、約５〜約１２個の近接した非修飾のあるいは異なってまたは共通に修飾されたヌクレオチドにより分離され得る。
【０１２１】
第１の鎖の奇数ヌクレオチドは修飾され得、偶数ヌクレオチドは第２の修飾により修飾され得る。第２の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得、これは、第１の鎖の奇数ヌクレオチドの修飾と同じであり得る。第２の鎖の１個または複数のヌクレオチドはまた、第２の修飾により修飾され得る。第２の修飾を有する１個または複数のヌクレオチドは、相互に、および第１の鎖の奇数ヌクレオチドの修飾と同じである修飾を有するヌクレオチドに隣接し得る。第１の鎖はまた、２個のヌクレオチドの３’末端および５’末端間で、ホスホロチオエート結合を含み得る。第１の鎖は、２個のヌクレオチドの５’末端間で、ホスホロチオエート結合を含み得る。第２の鎖はまた、５’末端でリガンドに結合され得る。
【０１２２】
本発明の核酸は、共通の修飾により修飾された隣接ヌクレオチドを含む第１の鎖を含み得る。１個または複数のこのようなヌクレオチドは、第２の修飾により修飾され得る１個または複数のヌクレオチドに隣接し得る。第２の修飾を有する１個または複数のヌクレオチドは、隣接し得る。第２の鎖は、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含み得、これは、第１の鎖の１個または複数ヌクレオチドの修飾の１つと同じであり得る。第２の鎖の１個または複数のヌクレオチドはまた、第２の修飾により修飾され得る。第２の修飾を有する１個または複数のヌクレオチドは、隣接し得る。第１の鎖はまた、２つのヌクレオチドの５’末端および３’末端間で、ホスホロチオエートを含み得る。第２の鎖は、２つのヌクレオチドの３’末端で、ホスホロチオエート結合を含み得る。第２の鎖はまた、５’末端でリガンドに結合され得る。
【０１２３】
第１の鎖上で５’側から３’側へ、および第２の鎖上で３’側から５’側へ番号が付されたヌクレオチド１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３および２５は、第１の鎖上の修飾により修飾され得る。２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の番号を付されたヌクレオチドは、第１の鎖上で第２の修飾により修飾され得る。１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３の番号が付されたヌクレオチドは、第２の鎖上の修飾により修飾され得る。２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の番号を付されたヌクレオチドは、第２の鎖上で第２の修飾により修飾され得る。ヌクレオチドは、本発明の核酸のために、第１の鎖上で５’側から３’側へ、および第２の鎖上で３’側から５’側へ番号が付される。
【０１２４】
２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の番号を付されたヌクレオチドは、第１の鎖上の修飾により修飾され得る。１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３の番号が付されたヌクレオチドは、第１の鎖上の第２の修飾により修飾され得る。１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３の番号が付されたヌクレオチドは、第２の鎖上の修飾により修飾され得る。２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２および２４の番号を付されたヌクレオチドは、第２の鎖上で第２の修飾により修飾され得る。
【０１２５】
明らかに、第１のおよび／または第２の鎖が１９個のヌクレオチド長などの２５個のヌクレオチド長より短い場合、修飾されるべき２０、２１、２２、２３、２４および２５の番号が付されたヌクレオチドは存在しない。当業者には、上の説明は、より短い鎖にもそれに応じて当てはまることが理解される。
【０１２６】
第１の鎖上の１個または複数の修飾ヌクレオチドは、共通の修飾を有する第２の鎖上の修飾ヌクレオチドと対形成し得る。第１の鎖上の１個または複数の修飾ヌクレオチドは、異なる修飾を有する第２の鎖上の修飾ヌクレオチドと対形成し得る。第１の鎖上の１個または複数の修飾ヌクレオチドは、第２の鎖上の非修飾ヌクレオチドと対形成し得る。第２の鎖上の１個または複数の修飾ヌクレオチドは、第１の鎖上の非修飾ヌクレオチドと対形成し得る。換言すれば、交互ヌクレオチドは、２つの鎖上で整列させることができ、例えば、第２の鎖の交互領域中の全ての修飾は、第１の鎖中の同一の修飾と対形成され、あるいは、修飾は他の鎖中で異種修飾（すなわち、第２のまたはさらなる修飾）と対形成している１つの鎖の交互領域中で共通の修飾を有する１ヌクレオチドにより補われてよい。別の選択肢は、それぞれの鎖中で異種修飾を有することである。
【０１２７】
第１の鎖上の修飾は、第２の鎖上で修飾ヌクレオチドに対して１ヌクレオチドだけシフトされ、それにより、共通修飾ヌクレオチドは相互に対形成されない。
【０１２８】
修飾（単数または複数）はそれぞれ独立に、３’−末端デオキシチミン、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ修飾、２’−アミノ修飾、２’−アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホラミデート修飾、５’−ホスホロチオエート基修飾、５’−リン酸または５’−リン酸模倣物修飾およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群より選択され得、および／または修飾ヌクレオチドは、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチドまたは非天然塩基含有ヌクレオチドのいずれか１個であり得る。
【０１２９】
少なくとも１つの修飾は、２’−Ｏ−メチルであり得、および／または少なくとも１つの修飾は２’−Ｆであり得る。本明細書に記載のさらなる修飾は、第１および／または第２の鎖上に存在し得る。
【０１３０】
本発明の核酸は、１つまたはいくつかの鎖末端に逆位ＲＮＡヌクレオチドを含み得る。このような逆位ヌクレオチドは、核酸に安定性をもたらす。好ましくは、核酸は、少なくとも１つの鎖の１つまたはいくつかの３’末端に、および／または第２の鎖の５’末端に、少なくとも１個の逆位ヌクレオチドを含む。より好ましくは、核酸は、第２の鎖の３’末端に逆位ヌクレオチドを含む。最も好ましくは、核酸は、第２の鎖の３’末端に逆位ＲＮＡヌクレオチドを含み、このヌクレオチドは、好ましくは逆位Ａである。逆位ヌクレオチドは、好ましくは、オーバーハングとしてではなく、他の鎖中の反対側の対応するヌクレオチドとして鎖の末端に存在する。このような修飾を有する核酸は安定で、合成が容易である。
【０１３１】
本発明の説明の全体を通して、「同じまたは共通の修飾」は、いずれかのヌクレオチドに対する同じ修飾を意味し、メチル基またはフルオロ基などの基で修飾されたＡ、Ｇ、ＣまたはＵがそうである。同じヌクレオチド上の同じ付加物を意味すると解釈されるべきではない。例えば、２’Ｆ−ｄＵ、２’Ｆ−ｄＡ、２’Ｆ−ｄＣ、２’Ｆ−ｄＧは全て、同じまたは共通の修飾と見なされ、２’−ＯＭｅ−ｒＵ、２’−ＯＭｅ−ｒＡ；２’−ＯＭｅ−ｒＣ；２’−ＯＭｅ−ｒＧも同様である。２’Ｆ修飾は、２’ＯＭｅ修飾とは異なる修飾である。
【０１３２】
本発明のいくつかの代表的修飾核酸配列が実施例で示される。これらの実施例は、例示を意図したものであって、限定的なものではない。
【０１３３】
好ましくは、核酸は、修飾および第２のまたはさらなる修飾を含み得、これらは、それぞれ個別に、２’−Ｏ−メチル修飾および２’−Ｆ修飾を含む群から選択される。核酸は２’−Ｏ−メチル（２’ＯＭｅ）である第１の修飾を含み、さらに、２’−Ｆである第２の修飾を含み得る。本発明の核酸はまた、ホスホロチオエート修飾および／またはデオキシ修飾を含み得、これらは、それぞれのまたは両鎖のそれぞれまたは任意の末端の末端１、２または３個のヌクレオチド中またはその間に存在し得る。
【０１３４】
本発明は、さらなる態様として、細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸を提供し、核酸は、配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３のヌクレオチド配列を含み、ここで第１の鎖のヌクレオチドが奇数番号のヌクレオチド上で第１の修飾により修飾され、さらに偶数ヌクレオチド上で第２の修飾により修飾され、および第２の鎖のヌクレオチドが偶数ヌクレオチド上で第３の修飾により修飾され、さらに奇数ヌクレオチド上で第４の修飾により修飾され、ここで少なくとも第１の修飾が第２の修飾と異なり、第３の修飾が第４の修飾とは異なる。第３および第１の修飾は同じでもまたは異なってもよく、第２の修飾および第４の修飾は同じでもまたは異なってもよい。第１と第２の修飾は、相互に異なってもよく、第３と第４の修飾は、相互に異なってもよい。
【０１３５】
第２の鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６４、６６、６８、７０、７２または７４のヌクレオチド配列を含み得る。第１の鎖のヌクレオチドは、奇数ヌクレオチド上で第１の修飾により修飾され、偶数ヌクレオチド上で第２の修飾により修飾され、および第２の鎖は、奇数ヌクレオチド上で第２の修飾により修飾され、偶数ヌクレオチド上で第１の修飾により修飾され得る。第１の修飾は２−ＯＭｅであってよくおよび第２の修飾２’Ｆであり得る。第１の鎖は配列番号５または配列番号９のヌクレオチド配列を含み得、および／または第２の鎖は配列番号６または配列番号１０のヌクレオチド配列を含み得る。修飾は、表１に記載のものであり得る。
【０１３６】
本発明の核酸は、リガンドに結合され得る。オリゴヌクレオチド、特に本発明の二本鎖核酸の、細胞への効率的インビボ送達は重要であり、特異的標的化および細胞外環境、特に血清タンパク質からの実質的保護が必要である。特異的標的化を達成する１つの方法は、リガンドを核酸に結合することである。リガンドは、必要とされる標的部位に核酸を標的化するのを助ける。結合された分子が異なる受容体依存性エンドサイトーシス経路または機能的に類似のプロセスなどの機序により標的細胞に取り込まれるように、目的の受容体分子に対する適切なリガンドを結合する必要がある。
【０１３７】
１つの例は、種々の比率の膜ＡＳＧＲ１とＡＳＧＲ２受容体マルチマーにより構成されるアシアロ糖タンパク質受容体複合体（ＡＳＧＰ−Ｒ）であり、これは、肝細胞上に極めて豊富にあり、本明細書で記載のＧａｌＮＡｃ部分に対し高い親和性を有する。結合されるリガンドとしての三分岐クラスターグリコシドの使用の最初の開示の１つは、米国特許第５，８８５，９６８号におけるものであった。３つのＧａｌＮＡｃリガンドを有し、リン酸基を含む複合体が既知であり、Ｄｕｂｂｅｒ  ｅｔ  ａｌ．（Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２００３  Ｊａｎ−Ｆｅｂ；１４（１）：２３９−４６）に記載されている。ＡＳＧＰ−Ｒ複合体は、Ｄ−Ｇａｌよりも、Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトシルアミン（ＧａｌＮＡｃ）に対し５０倍高い親和性を示す。
【０１３８】
アシアロ糖タンパク質受容体複合体（ＡＳＧＰ−Ｒ）は、グリコシル化タンパク質または他のオリゴ糖の末端β−ガラクトシルサブユニットを特異的に認識し（Ｗｅｉｇｅｌ，Ｐ．Ｈ．ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．２００２  Ｓｅｐ  １９；１５７２（２−３）：３４１−６３）、医薬品有効成分へのガラクトースまたはガラクトサミンの共有結合カップリングにより、受容体複合体を発現する肝臓の肝細胞に薬物を送達するために使用できる（Ｉｓｈｉｂａｓｈｉ，Ｓ．；ｅｔ．ａｌ．，Ｊ  Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９９４  Ｎｏｖ  １１；２６９（４５）：２７８０３−６）。さらに、結合親和性は、多価効果により大きく高めることができ、これは、ターゲティング部分の反復により達成される（Ｂｉｅｓｓｅｎ  ＥＡ，ｅｔ  ａｌ．，Ｊ  Ｍｅｄ  Ｃｈｅｍ．１９９５  Ａｐｒ  ２８；３８（９）：１５３８−４６）。
【０１３９】
ＡＳＧＰ−Ｒ複合体は、エンドソームへの末端β−ガラクトシル含有糖タンパク質の細胞の能動的取り込みのためのメディエーターである。従って、ＡＳＧＰＲは、このようなリガンドに結合された、例えば、核酸などの薬剤候補の受容体発現細胞への標的化送達に極めて好適である（Ａｋｉｎｃ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１０  Ｊｕｌ；１８（７）：１３５７−６４）。
【０１４０】
さらに一般的にリガンドは、標的細胞上の少なくとも１つのタイプの受容体に対して親和性を有するサッカライドを含んでよい。特に、受容体は、哺乳動物肝臓細胞上にあり、例えば、前に記載した肝臓アシアロ糖タンパク質受容体複合体（ＡＳＧＰ−Ｒ）である。
【０１４１】
サッカライドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、グルコサミンおよびフコースから選択され得る。サッカライドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）であり得る。
【０１４２】
従って、本発明で使用するためのリガンドは、（ｉ）１個または複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分およびその誘導体、および（ｉｉ）リンカーを含み得、ここでリンカーは、前出のいずれかの態様で定義の配列にＧａｌＮＡｃ部分を結合する。リンカーは、二価または三価または四価の分岐構造体であり得る。ヌクレオチドは、本明細書で定義のように修飾され得る。
【０１４３】
「ＧａｌＮＡｃ」は、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指し、通常、文献中では、Ｎ−アセチルガラクトサミンと呼ばれる。「ＧａｌＮＡｃ」または「Ｎ−アセチルガラクトサミン」への言及は、β−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノースの両方を含む。β−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノースの両方は、互換的に使用され得る。好ましくは、本発明の化合物は、β−型、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースを含む。
【０１４４】
従って、リガンドはＧａｌＮＡｃを含む。
リガンドは、式Ｉの化合物：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （Ｉ）
を含み得、式中、
Ｓは、サッカライドであり、ここでサッカライドはＮ−アセチルガラクトサミンであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ここでｍは１、２、または３であり；
Ｐは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート（好ましくはチオホスフェート）であり；
Ｘ２は、式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、ｎ＝１〜６であり；
Ａは、分岐ユニットであり、
Ｘ３は、架橋ユニットであり；
本発明による核酸は、ホスフェートまたは修飾ホスフェート（好ましくはチオホスフェート）を介してＸ３に結合される。
【０１４５】
式Ｉでは、分岐ユニット「Ａ」は、３つに分岐し、３個のサッカライドリガンドを収容する。分岐ユニットは、リガンドの残りの繋留部分および核酸に共有結合される。分岐ユニットは、アルキル、アミド、ジスルフィド、ポリエチレングリコール、エーテル、チオエーテルおよびヒドロキシアミノ基から選択される基を含む分岐脂肪族基を含み得る。分岐ユニットは、アルキルおよびエーテル基から選択される基を含み得る。
【０１４６】
分岐ユニットＡは、
【化３】
2021502120.tif 000010
から選択される構造を有し得、式中、各Ａ１は独立に、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり；各ｎは、独立に１〜２０の整数である。
【０１４７】
分岐ユニットは、
【化４】
2021502120.tif 000011
から選択される構造を有し得、式中、各Ａ１は独立に、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり；各ｎは、独立に１〜２０の整数である。
【０１４８】
分岐ユニットは、
【化５】
2021502120.tif 000012
から選択される構造を有し得、式中、Ａ１は、Ｏ、Ｓ、Ｃ＝ＯまたはＮＨであり；各ｎは、独立に１〜２０の整数である。
【０１４９】
分岐ユニットは、構造：
【化６】
2021502120.tif 000013
を有し得る。
【０１５０】
分岐ユニットは、構造：
【化７】
2021502120.tif 000014
を有し得る。
【０１５１】
分岐ユニットは、構造：
【化８】
2021502120.tif 000015
を有し得る。
【０１５２】
任意選択で、分岐ユニットは、炭素原子のみからなる。
【０１５３】
「Ｘ３」部分は、架橋ユニットである。架橋ユニットは直鎖であり、分岐ユニットおよび核酸に共有結合される。
Ｘ３は、−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ２−Ｃ２０アルケニレン−、式（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテル、−Ｃ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ２０アルキレン−、−Ｃ０−Ｃ４アルキレン（Ｃｙ）Ｃ０−Ｃ４アルキレン−（式中、Ｃｙは置換もしくは非置換５員もしくは６員シクロアルキレン、アリーレン、ヘテロシクリレンまたはヘテロアリーレン環である）、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＮＨＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＳＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）Ｓ−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−ＯＣ（Ｏ）−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−Ｃ（Ｏ）Ｏ−Ｃ１−Ｃ４アルキレン−、および−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−Ｓ−Ｓ−Ｃ１−Ｃ６アルキレン−から選択され得る。
Ｘ３は、式−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテルであり得る。Ｘ３は、式−（Ｃ１−Ｃ２０アルキレン）−Ｏ−（Ｃ４−Ｃ２０アルキレン）−のアルキレンエーテルであり得、上記（Ｃ４−Ｃ２０アルキレン）は、Ｚに結合される。Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ３Ｈ６−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−、特に、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択され得、それぞれの場合で、−ＣＨ２−基はＡに結合される。
【０１５４】
リガンドは、式（ＩＩ）：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （ＩＩ）
を含み得、式中、
Ｓは、サッカライドであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ここでｍは１、２、または３であり；
Ｐは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート（好ましくはチオホスフェート）であり；
Ｘ２は、Ｃ１−Ｃ８アルキレンであり；
Ａは；
【化９】
2021502120.tif 000016
から選択される分岐ユニットであり、Ｘ３は、架橋ユニットであり；
本発明による核酸は、ホスフェートまたは修飾ホスフェート（好ましくはチオホスフェート）を介してＸ３に結合される。
【０１５５】
分岐ユニットＡは、構造：
【化１０】
2021502120.tif 000017
を有し得る。
【０１５６】
分岐ユニットＡは、構造：
【化１１】
2021502120.tif 000018
を有し得、式中、Ｘ３は、窒素原子に結合される。
Ｘ３はＣ１−Ｃ２０アルキレンであり得る。好ましくは、Ｘ３は、−Ｃ３Ｈ６−、−Ｃ４Ｈ８−、−Ｃ６Ｈ１２−および  −Ｃ８Ｈ１６−、特に、−Ｃ４Ｈ８−、−Ｃ６Ｈ１２−および−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択される。
【０１５７】
リガンドは、式（ＩＩＩ）：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （ＩＩＩ）
の化合物を含み得、式中、
Ｓは、サッカライドであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ここでｍは１、２、または３であり；
Ｐは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート（好ましくはチオホスフェート）であり；
Ｘ２は、式−Ｃ３Ｈ６−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンエーテルであり；
Ａは、分岐ユニットであり、
Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ２Ｈ４−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ３Ｈ６−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ５Ｈ１０−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ７Ｈ１４−、および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択される式のアルキレンエーテルであり、それぞれの場合で、−ＣＨ２−基はＡに結合され；
Ｘ３は、ホスフェートまたは修飾ホスフェート（好ましくはチオホスフェート）により本発明による核酸に結合される。
【０１５８】
分岐ユニットは、炭素を含み得る。好ましくは、分岐ユニットは炭素である。
【０１５９】
Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ５Ｈ１０−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ７Ｈ１４−、および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群から選択され得る。好ましくは、Ｘ３は、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ４Ｈ８−、−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ６Ｈ１２−および−ＣＨ２−Ｏ−Ｃ８Ｈ１６−からなる群より選択される。
【０１６０】
上記の態様のいずれかについて、Ｐがリン酸基である場合、Ｐは、
【化１２】
2021502120.tif 000019
で表すことができ、式中、Ｙ１およびＹ２は、それぞれ独立に、＝Ｏ、＝Ｓ、−Ｏ−、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＢＨ３、−ＯＣＨ２ＣＯ２、−ＯＣＨ２ＣＯ２Ｒｘ、−ＯＣＨ２Ｃ（Ｓ）ＯＲｘ、および−ＯＲｘであり、式中、Ｒｘは、Ｃ１−Ｃ６アルキルであり、
【化１３】
2021502120.tif 000020
は、化合物の残りの部分への結合を示す。
【０１６１】
修飾ホスフェートとは、１個または複数の非結合酸素が置換されるリン酸基を意味する。修飾リン酸基の例は、ホスホロチオエート、ホスホロセレン酸、ボラノリン酸、ボラノリン酸エステル、水素ホスホネート、ホスホロアミデート、アルキルまたはアリールホスホネートおよびホスホトリエステルを含む。ジチオリン酸は、硫黄により置換された両方の非結合酸素を有する。リン酸基中の１つ、それぞれのまたは両方の非結合酸素は独立に、Ｓ、Ｓｅ、Ｂ、Ｃ、Ｈ、Ｎ、またはＯＲ（Ｒはアルキルまたはアリール）のいずれか１つであり得る。
【０１６２】
ホスフェートはまた、結合酸素の窒素（架橋ホスホロアミデート）、硫黄（架橋ホスホロチオエート）および炭素（架橋メチレンホスホネート）での置換により修飾できる。置換は、末端酸素で生じ得る。窒素での非結合酸素の置換が可能である。
例えば、Ｙ１は−ＯＨであり、Ｙ２は＝Ｏまたは＝Ｓであり得；または
Ｙ１は−Ｏ−であり、Ｙ２は＝Ｏまたは＝Ｓであり得；
Ｙ１は＝Ｏであり、Ｙ２は−ＣＨ３、−ＳＨ、−ＯＲｘ、または−ＢＨ３であり得る。
【０１６３】
Ｙ１は＝Ｓであり、Ｙ２は−ＣＨ３、−ＯＲｘまたは−ＳＨであり得る。
【０１６４】
当業者なら、特定の事例では、Ｙ１とＹ２の間で非局在化が存在することを理解するであろう。
【０１６５】
好ましくは、修飾ホスフェート基は、チオホスフェート基である。チオホスフェート基としては、ビチオホスフェート（ｂｉｔｈｉｏｐｈｏｓｐｈａｔｅ）（すなわち、Ｙ１はＳであり、Ｙ２は−Ｓ−である）およびモノチオホスフェート（すなわち、Ｙ１は−Ｏ−であり、Ｙ２は＝Ｓであるか、またはＹ１は＝Ｏであり、Ｙ２は−Ｓ−である）が挙げられる。好ましくは、Ｐはモノチオホスフェートである。発明者らは、リン酸基の代わりにチオホスフェート基を有する複合体が、改善された効力およびインビボ作用持続時間を有することを発見した。
【０１６６】
Ｐは、エチルホスフェートであってもよい（すなわち、Ｙ１は＝Ｏであり、Ｙ２はＯＣＨ２ＣＨ３である）。
【０１６７】
サッカライドは、標的細胞上の少なくとも１つのタイプの受容体に対して親和性を有するように選択され得る。特に、受容体は、哺乳動物肝臓細胞上にあり、例えば、肝臓アシアロ糖タンパク質受容体複合体（ＡＳＧＰ−Ｒ）である。
【０１６８】
上記のいずれかの態様に対し、サッカライドは、ガラクトサミン、マンノース、ガラクトース、グルコース、グルコサミンおよびフコースの１種または複数を有するＮ−アセチルから選択され得る。通常、本発明で使用されるべきリガンドは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）を含み得る。好ましくは、本発明の化合物は３つのリガンドを有し得、これらは、それぞれ、好ましくはＮ−アセチルガラクトサミンを含む。
【０１６９】
「ＧａｌＮＡｃ」は、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−Ｄ−ガラクトピラノースを指し、通常、文献中では、Ｎ−アセチルガラクトサミンと呼ばれる。「ＧａｌＮＡｃ」または「Ｎ−アセチルガラクトサミン」への言及は、β−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノースの両方を含む。特定の実施形態では、β−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースおよびα−型：２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−α−Ｄ−ガラクトピラノースの両方は、互換的に使用され得る。好ましくは、本発明の化合物は、β−型、２−（アセチルアミノ）−２−デオキシ−β−Ｄ−ガラクトピラノースを含む。
【化１４】
2021502120.tif 000021
【化１５】
2021502120.tif 000022
【化１６】
2021502120.tif 000023
【０１７０】
上記式（ＩＩＩ）の化合物のいずれかについて、Ｘ１は（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）（−ＣＨ２）２−であり得る。Ｘ１は（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２（−ＣＨ２）２−であり得る。Ｘ１は（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）３（−ＣＨ２）２−であり得る。最も好ましくは、Ｘ１は、（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）２（−ＣＨ２）２−である。あるいは、Ｘ１はＣ３−Ｃ６アルキレンである。Ｘ１はプロピレンであり得る。Ｘ１はブチレンであり得る。Ｘ１はペンチレンであり得る。Ｘ１はヘキシレンであり得る。好ましくは、アルキルは直鎖アルキレンである。特に、Ｘ１はブチレンであり得る。
【０１７１】
式（ＩＩＩ）の化合物について、Ｘ２は、式−Ｃ３Ｈ６−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンエーテル、すなわち、Ｃ３アルコキシメチレン、または−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＯＣＨ２−である。
【０１７２】
本発明は、下記の構造の１つを有する複合化核酸をさらに提供する。
【化１７】
2021502120.tif 000024
2021502120.tif 000025
2021502120.tif 000026
2021502120.tif 000027
2021502120.tif 000028
式中、Ｚは、前に本明細書で定義の核酸である。
【０１７３】
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のリガンドは、第１の（アンチセンス）鎖の３’−末端でおよび／または第２の（センス）鎖の３’−および／または５’−末端のいずれかで結合されてよい。核酸は、２個以上の式（Ｉ）、（ＩＩ）、または（ＩＩＩ）のリガンドを含んでよい。しかし、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の単一のリガンドが好ましい。理由は、単一のこのようなリガンドは、核酸を標的細胞へと効率的に標的化するために十分であるためである。
【０１７４】
好ましくは、第１の（アンチセンス）鎖の５’−末端は、この位置でのリガンドが核酸の生物活性を妨げる可能性があるために、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のリガンドに結合されない。
【０１７５】
式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）の単一リガンドを鎖の５’−末端に有する核酸は、３’−末端で同じリガンドを有する同じ核酸よりも、合成がより容易で、従ってより安価である。好ましくは従って、式（Ｉ）、（ＩＩ）または（ＩＩＩ）のいずれかの単一リガンドが、核酸の第２の鎖の５’−末端に結合される（それと複合化される）。
【０１７６】
一実施形態では、核酸は、脂質を含むリガンド、より好ましくは、コレステロールを含むリガンドに結合される。
【０１７７】
本発明の複合体は、本明細書で開示のいずれかのリガンドに結合された、本明細書で開示の任意の核酸を含んでよい。
【０１７８】
本発明はまた、細胞中のＬＰＡ遺伝子の発現を抑制するための複合体に関し、上記複合体は、本発明の任意の態様の核酸を含む核酸部分および少なくとも１つのリガンド部分を含み、上記核酸部分は、第１のＲＮＡ鎖の少なくとも一部および第１の鎖に少なくとも部分的に相補的な第２のＲＮＡ鎖の少なくとも一部を含み、ここで上記第１の鎖が上記ＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記少なくとも１つのリガンド部分がリンカー部分、好ましくはセリノール由来リンカー部分、および細胞のインビボ標的化のための標的化リガンドを含み、一方または両方のＲＮＡ鎖の３’および／または５’末端のみに結合され、ここで第１のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されず、
（ｉ）第２のＲＮＡ鎖は、標的化リガンドの５’末端に結合され、（ａ）第２のＲＮＡ鎖はまた、標的化リガンドの３’末端でも結合され、第１のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｂ）第１のＲＮＡ鎖は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｃ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方はまた、３’末端で標的化リガンドに結合され；もしくは
（ｉｉ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されない。
【０１７９】
本発明のある実施形態では、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）は、５’末端で標的化リガンドに結合され、第１のＲＮＡ鎖（すなわち、アンチセンス鎖）は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）の３’末端は、結合されず、それにより図４０Ａに示される概略構造の複合体が形成される。
【０１８０】
本発明のある実施形態では、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）は、５’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）は、３’末端でも標的化リガンドに結合され、第１のＲＮＡ鎖（すなわち、アンチセンス鎖）の３’末端は、結合されず、それにより図４０Ｂに示される概略構造の複合体が形成される。
【０１８１】
本発明のある実施形態では、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）および第１のＲＮＡ鎖（すなわち、アンチセンス鎖）の両方は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）の５’末端は結合されず、それにより図４０Ｃに示される概略構造の複合体が形成される。
【０１８２】
本発明のある実施形態では、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）は５’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖（すなわち、センス鎖）および第１のＲＮＡ鎖（すなわち、アンチセンス鎖）の両方は、３’末端で標的化リガンドに結合され、それにより図４０Ｄに示される概略構造の複合体が形成される。
【０１８３】
上記実施形態のいずれか１つでは、
【化１８】
2021502120.tif 000029
は、リンカーを示し、これは、リガンドを核酸部分の末端に結合する；リガンドは、ＧａｌＮＡｃなどのＧａｌＮＡｃ部分であり得る；図４０Ｅに示す概略構造は、核酸部分を表す。
【０１８４】
これらの概略図は、第１のまたは第２のヌクレオチドの数を限定する意図はなく、この図は、塩基の相補性に対する何らかの限定またはいずれか他の限定を示すものでもない。
【０１８５】
リガンドは、単量体または多量体（例えば、二量体、三量体、など）であり得る。
【０１８６】
適切には、リガンドは単量体であり、これにより単一標的化リガンド部分、例えば、単一ＧａｌＮＡｃ部分を含む。
【０１８７】
あるいは、リガンドは二量体リガンドであり得、このリガンド部分は、セリノール由来リンカー部分または非セリノールリンカー部分などの２つのリンカー部分を含み、それぞれが単一の標的化リガンド部分に結合される。
【０１８８】
リガンドは三量体リガンドであり得、この場合リガンドは、セリノール由来リンカー部分または非セリノールリンカー部分などの３個のリンカー部分を含み、それぞれが単一の標的化リガンド部分に結合される。
２個または３個のセリノール由来リンカー部分は、直列に、例えば以下に示すように、結合され得る：
【化１９】
2021502120.tif 000030
式中、ｎは１または２であり、ＹはＳまたはＯである。
【０１８９】
好ましくは、リガンドは単量体である。
【０１９０】
適切には、複合化ＲＮＡ鎖は、追加のリンカーを含むリンカー部分を介して標的化リガンドに結合され、ここで追加のリンカーは、飽和非分岐または分岐Ｃ１−１５アルキル鎖であるか、またはこれを含み、任意選択で１個または複数の炭素（例えば、１、２または３個の炭素、好適には１個または２個、特に１個）がＯ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）ｐから選択されるヘテロ原子により置換され、ここでｐは０、１または２であり（例えば、ＣＨ２基がＯ、またはＮＨ、またはＳ、またはＳＯ２で置換され、または鎖の末端または分岐部上の−ＣＨ３基がＯＨまたはＮＨ２で置換される）、ここで上記鎖は、１個または複数のオキソ基（例えば、１〜３個、例えば、１個の基）で任意に置換される。
【０１９１】
適切には、リンカー部分は、セリノール由来リンカー部分である。
【０１９２】
より適切には、追加のリンカーは、飽和非分岐Ｃ１−１５アルキル鎖を含み、ここで１個または複数の炭素（例えば、１、２または３個の炭素、好適には１個または２個、特に１個）が酸素原子により置換される。
【０１９３】
より好適には、追加のリンカーは、ＰＥＧ鎖を含む。
【０１９４】
より好適には、追加のリンカーは、飽和非分岐Ｃ１−１５アルキル鎖を含む。
【０１９５】
より好適には、追加のリンカーは、飽和非分岐Ｃ１−６アルキル鎖を含む。
【０１９６】
より好適には、追加のリンカーは、飽和非分岐Ｃ４またはＣ６アルキル鎖、例えば、Ｃ４アルキル鎖を含む。
【０１９７】
ある実施形態では、
【化２０】
2021502120.tif 000031
は、式（Ｖ）：
【化２１】
2021502120.tif 000032
の結合部分であり、式中、ｎ、ＹおよびＬ１は下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
【０１９８】
従って、ある実施形態では、標的化リガンド部分は、式（ＶＩ）：
【化２２】
2021502120.tif 000033
の結合部分であり、式中、ｎ、ＹおよびＬ１は下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
【０１９９】
適切には、
【化２３】
2021502120.tif 000034
は、式（ＸＩＶ）：
【化２４】
2021502120.tif 000035
の結合部分であり、式中、ｎ、Ｙ、Ｒ１およびＬは下記で定義され、Ｌは、標的化リガンド、例えば、ＧａｌＮＡｃに結合され、ホスホロ基のＯはＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
【０２００】
適切には、標的化リガンド部分は、式（ＩＶ）：
【化２５】
2021502120.tif 000036
の結合部分であり、式中、ｎ、Ｙ、Ｒ１およびＬは下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
【０２０１】
適切には、
【化２６】
2021502120.tif 000037
は、式（ＶＩＩ）：
【化２７】
2021502120.tif 000038
の結合部分であり、式中、ｎ、ＹおよびＬ２は下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
【０２０２】
適切には、標的化リガンド部分は、式（ＶＩＩＩ）：
【化２８】
2021502120.tif 000039
の結合部分であり、式中、ｎ、ＹおよびＬ２は下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
【０２０３】
適切には、
【化２９】
2021502120.tif 000040
は、式（ＩＸ）：
【化３０】
2021502120.tif 000041
の結合部分であり、式中、Ｆ、Ｙ、およびＬは下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
【０２０４】
適切には、標的化リガンド部分は、式（ＩＸａ）：
【化３１】
2021502120.tif 000042
の結合部分であり、式中、Ｆ、Ｙ、およびＬは下記で定義され、ホスホロ基のＯは、ＲＮＡ鎖の末端オリゴヌクレオシドに結合される。
【０２０５】
適切には、Ｌは、
【化３２】
2021502120.tif 000043
である。
【０２０６】
上記構造のいずれかでは、適切には、リガンドは、ＧａｌＮＡｃおよびガラクトース部分、特に、ＧａｌＮＡｃ部分から選択される。あるいは、ＧａｌＮＡｃは、別の標的化リガンド、例えば、サッカライドで置換され得る。
【０２０７】
本発明のある実施形態では、第１のＲＮＡ鎖は、式（Ｘ）：
【化３３】
2021502120.tif 000044
の化合物であり、ここでｂは０または１であり；および
第２のＲＮＡ鎖は、式（ＸＩ）：
【化３４】
2021502120.tif 000045
の化合物であり、式中、
ｃおよびｄは、独立に０または１であり；
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、第１と第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
Ｙは、ＯまたはＳであり；
ｎは、０、１、２または３であり；および
Ｌ１は、リガンドが結合されるリンカーであり；
およびｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である。
【０２０８】
適切には、第１のＲＮＡ鎖は、式（ＸＶ）：
【化３５】
2021502120.tif 000046
の化合物であり、ここでｂは０または１であり；および
第２のＲＮＡ鎖は、式（ＸＶＩ）：
【化３６】
2021502120.tif 000047
の化合物であり、式中、ｃおよびｄは、独立に０または１であり；
式中、
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、第１と第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｈまたはメチルであり；
ｎは、０、１、２または３であり；および
Ｌは、式（ＸＶ）および（ＸＶＩ）で同じまたは異なり、Ｌは、
−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、ｒ＝２〜１２；
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｓ−ＣＨ２Ｃ（Ｏ）−、ｓ＝１〜５；
−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｔは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｕ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ（Ｏ）−、ｕは独立に１〜５である；および
−（ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｖは２〜１２である；
からなる群より選択され；
末端Ｃ（Ｏ）（存在する場合）は、ＮＨ基に結合され；
ここでｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である。
【０２０９】
適切には、第１のＲＮＡ鎖は、式（ＸＩＩ）：
【化３７】
2021502120.tif 000048
の化合物であり、ここでｂは０または１であり；および
第２のＲＮＡ鎖は、式（ＸＩＩＩ）：
【化３８】
2021502120.tif 000049
の化合物であり、式中、
ｃおよびｄは、独立に０または１であり；
Ｚ１およびＺ２はそれぞれ、第１と第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
Ｙは、ＯまたはＳであり；
ｎは、０、１、２または３であり；および
Ｌ２は、式（ＸＩＩ）および（ＸＩＩＩ）で同じまたは異なり、Ｌ２は、ｂ、ｃおよびｄの括弧内の部分で同じまたは異なり、Ｌ２は、
【化３９】
2021502120.tif 000050
からなる群より選択され；または
ｎは、０であり、Ｌ２は：
【化４０】
2021502120.tif 000051
であり、末端ＯＨ基は、存在せず、その結果次の部分が形成され；
【化４１】
2021502120.tif 000052
式中、
Ｆは、飽和分枝または非分枝（例えば、非分岐）Ｃ１−８アルキル（例えば、Ｃ１−６アルキル）鎖であり、炭素原子の１個が酸素原子で任意に置換されてもよいが、但し、上記酸素原子が、少なくとも２個の炭素原子により別のヘテロ原子（例えば、ＯまたはＮ原子）から離されることが条件であり；
Ｌは、式（Ｉ）および（ＩＩ）で同じまたは異なり、Ｌは、
−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、ｒ＝２〜１２；
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、ｓ＝１〜５；
−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｔは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｕ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ（Ｏ）−、ｕは独立に１〜５である；および
−（ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｖは２〜１２である；
からなる群より選択され；
末端Ｃ（Ｏ）（存在する場合）は、ＮＨ基に結合され；
ここでｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である。
【０２１０】
ＧａｌＮＡｃが存在する上記式のいずれか１つでは、ＧａｌＮＡｃは、任意の他の標的化リガンド、例えば、本明細書で記載のもので置換されてもよい。
【０２１１】
適切には、ｂは０でありｃは１でありｄは１であり；ｂは１でありｃは０でありｄは１であり；ｂは１でありｃは１でありｄは０であり；またはｂは１でありｃは１でありｄは１である。
【０２１２】
より適切には、ｂは０でありｃは１でありｄは１であり；ｂは１でありｃは０でありｄは１であり；またはｂは１でありｃは１でありｄは１である。
【０２１３】
最も適切には、ｂは０でありｃは１でありｄは１である。
【０２１４】
一実施形態では、ＹはＯである。別の実施形態では、ＹはＳである。
【０２１５】
一実施形態では、Ｒ１はＨまたはメチルである。一実施形態では、Ｒ１はＨである。別の実施形態では、Ｒ１はメチルである。
【０２１６】
一実施形態では、ｎは０、１、２または３である。適切には、ｎは０である。
【０２１７】
一実施形態では、Ｌは、
−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、ｒ＝２〜１２；
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、ｓ＝１〜５；
−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｔは独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｕ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ（Ｏ）−、ｕは独立に１〜５である；および
−（ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｖは２〜１２である；
からなる群から選択され；
末端Ｃ（Ｏ）は、ＮＨ基に結合される。
【０２１８】
適切には、Ｌは、−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−である（ｒ＝２〜１２）。適切には、ｒ＝２〜６である。より適切には、ｒ＝４または６、例えば、４である。
【０２１９】
適切には、Ｌは、
【化４２】
2021502120.tif 000053
である。
【０２２０】
Ｆ部分の例としては、（ＣＨ２）１−６、例えば、（ＣＨ２）１−４、例えば、ＣＨ２、（ＣＨ２）４、（ＣＨ２）５、または（ＣＨ２）６、またはＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）２−３、例えば、ＣＨ２Ｏ（ＣＨ２）ＣＨ３が挙げられる。
【０２２１】
適切には、Ｌ２は、
【化４３】
2021502120.tif 000054
である。
【０２２２】
適切には、Ｌ２は、
【化４４】
2021502120.tif 000055
である。
【０２２３】
適切には、Ｌ２は、
【化４５】
2021502120.tif 000056
である。
【０２２４】
適切には、Ｌ２は、
【化４６】
2021502120.tif 000057
である。
【０２２５】
適切には、ｎは０であり、Ｌ２は：
【化４７】
2021502120.tif 000058
であり、末端ＯＨ基は、存在せず、その結果、次の部分が形成され；
【化４８】
2021502120.tif 000059
式中、Ｙは本明細書の別の箇所で定義の通りである。
【０２２６】
ｂ、ｃおよびｄの括弧で括られた部分内で、Ｌ２は通常同じである。ｂ、ｃおよびｄの括弧で括られた部分内で、Ｌ２は通常同じであり得る。ある実施形態では、ｃの括弧で括られた部分中のＬ２は、ｄで括られた括弧部分中のＬ２と同じである。ある実施形態では、ｃの括弧で括られた部分中のＬ２は、ｄで括られた括弧部分中のＬ２と同じではない。ある実施形態では、例えば、リンカー部分がセリノール由来リンカー部分である場合、ｂ、ｃおよびｄの括弧で括られた部分中のＬ２は同じである。
【０２２７】
セリノール由来リンカー部分は、任意の立体化学、すなわち、Ｌ−セリン異性体、Ｄ−セリン異性体、ラセミセリンまたは異性体の他の組み合わせ由来の立体化学のセリノールに基づいてよい。本発明の好ましい態様では、セリノール−ＧａｌＮＡｃ部分（ＳｅｒＧＮ）は、次の立体化学を有する：
【化４９】
2021502120.tif 000060
すなわち、セリン異性体由来の（Ｓ）セリノールアミダイトまたは（Ｓ）セリノールスクシネート固体担持構成単位に基づく。
【０２２８】
一実施形態では、標的細胞は肝細胞である。
【０２２９】
一般的合成スキーム：１
化合物例は、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成できる。スキームは、特定の複合体の合成を示すが、その他の請求複合体も類似の方法により調製し得ることが理解されよう。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築は、例えば、ホスホラミダイト法を適用する固相合成により実施され得る。固相合成は、塩基または修飾構成単位担持ｌｃａａ  ＣＰＧから開始し得る。ホスホラミダイト合成カップリングサイクルは、１）ＤＭＴ除去、２）必要とされるＤＭＴマスクホスホラミダイトおよびベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）であり得る活性化剤を用いる鎖延長、３）非延長オリゴヌクレオチド鎖のキャッピング、続けて、ヨウ素（リン酸ジエステル結合が望ましい場合）またはＥＤＩＴＨ（ホスホロチオエート結合が望ましい場合）によるＰ（ＩＩＩ）からｐ（Ｖ）への酸化、および再度のキャッピング（Ｃａｐ／Ｏｘ／ＣａｐまたはＣａｐ／Ｔｈｉｏ／Ｃａｐ）、からなる。ＧａｌＮＡｃ複合化は、必要な数の結合されるアミノ修飾リンカー構成単位を有する、前に構築され精製されたオリゴヌクレオチドへのＧａｌＮＡｃ−カルボン酸構成単位のペプチド結合形成により達成され得る。必要な構成単位は、商業的に入手でき、または合成については以下に記載する。全ての最終一本鎖生成物をＡＥＸ−ＨＰＬＣにより分析して、それらの純度を検査した。純度は、％ＦＬＰ（完全長生成物の％）で示し、これは、最終生成物のＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析のＵＶ出力における帰属生成物シグナル下のＵＶ面積のパーセンテージである。それぞれの一本鎖生成物の確認をＬＣ−ＭＳ分析により実施した。
【０２３０】
シントンの合成
スキーム１：ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）リンカーシントンの合成
【化５０】
2021502120.tif 000061
ｉ）トリフルオロ酢酸エチル、ＮＥｔ３、ＭｅＯＨ、０℃、１６時間、２：８６％  ５：９０％、ｉｉ）ＤＭＴＣＬ、ピリジン、０℃、１６時間、７４％、ｉｉｉ）ＬＩＢＨ４、ＥｔＯＨ／ＴＨＦ（１／１、ｖ／ｖ）、０℃、１時間、７６％、ｉｖ）２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト、ＥｔＮｉＰｒ２、ＣＨ２Ｃｌ２、５６％、ｖ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ、ピリジン、ＲＴ、１６時間、３８％、ｖｉ）ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ、アミノ−ｌｃａａ  ＣＰＧ（５００Ａ）、ＲＴ、１８時間、２９％（２６ｕｍｏｌ／ｇ担持量）。
【０２３１】
（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−ホスホラミダイト７は、文献に発表された方法により（Ｌ）セリンメチルエステルメチルエステル誘導体１から合成できる（Ｈｏｅｖｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１６，７，１２８−１３５）。
【０２３２】
（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート６は、ＤＭＡＰなどの触媒の存在下で、無水コハク酸による中間体５の変換により作製できる。
【０２３３】
気孔制御ガラス（ＣＰＧ）担体などの固体担体への６の担持は、ＨＢＴＵなどのカップリング剤を用いて、アミノ修飾天然ＣＰＧ担体（５００Ａ）などの固体担体へのペプチド結合形成により達成され得る。（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート６およびＨＢＴＵなどのカップリング剤をＣＨ３ＣＮなどの溶媒に溶解する。ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基をその溶液に加え、反応混合物を２分間撹拌する。天然アミノ−ｌｃａａ−ＣＰＧ担体（５００Ａ、３ｇ、アミン含量：１３６ｕｍｏｌ／ｇ）などの固体担体を反応混合物に加え、懸濁物が形成する。懸濁物をｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ  ｓｈａｋｅｒを用いて室温で静かに１６時間振盪させた後、濾過し、ＤＣＭおよびＥｔＯＨなどの溶媒で洗浄する。担体を減圧下で２時間乾燥させる。担体上の未反応アミンを無水酢酸／ルチジン／Ｎ−メチルイミダゾールと共に室温で撹拌することにより、キャップすることができる。担体の洗浄を上記のように繰り返し得る。固体担体を減圧下で乾燥して、固体担体１０を得た。
【０２３４】
スキーム２：ＧａｌＮＡｃシントン９の合成
【化５１】
2021502120.tif 000062
（ｖｉｉ）ＴＭＳＯＴｆ、ＤＣＭ、ヘキセノール、ｖｉｉｉ）ＲｕＣｌ３、ＮａＩＯ４、ＤＣＭ、ＣＨ３ＣＮ、Ｈ２Ｏ、２ステップで４６％。
ＧａｌＮＡｃシントン９の合成は、商業的に入手できる過アセチル化ガラクトースアミン８から出発して、Ｎａｉｒら（２０１４）に記載の方法に従って調製できる。
【０２３５】
一本鎖セリノール由来ＧａｌＮＡｃ複合体の合成
スキーム３：セリノール由来リンカーのためのオリゴヌクレオチド合成の基本手順
【化５２】
2021502120.tif 000063
【０２３６】
３’モノＧａｌＮＡｃ複合化オリゴヌクレオチド（化合物Ａ０２６４など）のオリゴヌクレオチド合成の概要を図１３に示し、スキーム３にまとめる。合成は、化合物例Ａ０２６４におけるように、（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート−ｌｃａａ−ＣＰＧ１０を用いて開始される。追加のセリノール構成単位が必要な場合には、（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）アミダイト（７）が適切な固相合成サイクルで使用される。例えば、化合物Ａ０３２９を作製するために、鎖構築は、塩基配列が完全に構築された後に、追加のセリノールアミダイトカップリングにより完了する。さらに、５’モノＧａｌＮＡｃ複合化オリゴヌクレオチドのオリゴヌクレオチド合成は、その関連する配列の適切なヌクレオシドを担持した固体担体から開始され得る。Ａ０２２０の化合物例では、これは、２’ｆＡであり得る。オリゴヌクレオチド鎖は、その配列に従って構築され、必要に応じて、構成単位（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−アミダイト（７）が使用される。鎖延長の完了時に、最後の結合アミダイト構成単位の保護ＤＭＴ基は、ホスホラミダイト合成サイクルのステップ１におけるように取り外される。
【０２３７】
最後の合成装置ステップの完了時に、一本鎖は４０％メチルアミン水溶液処理などのアミンによる処理により固体担体から切断されてよい。すべての残りの保護基も、このステップで除去され、メチルアミン処理はまた、セリノールアミノ官能基も解放する。粗生成物はその後、ＡＥＸ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣによりそれぞれ精製されて、さらなるＧａｌＮＡｃ複合化のための前駆物質オリゴヌクレオチドを得た。
【０２３８】
スキーム４：セリノール由来前駆物質オリゴヌクレオチドのＧａｌＮＡｃ複合体合成
【化５３】
2021502120.tif 000064
固相合成後、ＧａｌＮＡｃ複合化は、ＨＢＴＵなどのペプチドカップリング剤による、ＧａｌＮ（Ａｃ４）−Ｃ４−酸（９）の予備活性化により達成された。その後、予備活性化酸９を１１（例えば、Ａ０２６４）中のアミノ基と反応させて、中間体ＧａｌＮ（Ａｃ４）複合体を形成した。ＧａｌＮＡｃ部分中のヒドロキシルを保護するアセチル基は、メチルアミン処理により切断されて、目的化合物例１２（例えば、Ａ０２６８）を得て、これを、ＡＥＸ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣによりさらに精製した。
【０２３９】
一本鎖非セリノール由来ＧａｌＮＡｃ複合体の合成
セリノール以外のアミノ修飾構成単位は、種々の供給業者からから商業的に入手でき、セリノールの代わりに使用して、ＧａｌＮＡｃ複合化を可能にする反応性アミノ基を得ることができる。例えば、下表６に示す商業的に入手できる構成単位を用いて、１０−１〜１０−３などのアミノ修飾剤担持ＣＰＧを使用すること、続けて上記のような配列アセンブリングおよび最終的にアミノ修飾剤の１３−１、１３−２または１３−４などのホスホラミダイトのカップリングにより、非セリノール由来アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド１４（スキーム５Ａ）を得ることができる。
【０２４０】
例えば、１４（Ａ０６５３）を作製するために、ＧｌｙＣ３Ａｍ−ＣＰＧ（１０−２）を、ＧｌｙＣ３Ａｍ−アミダイト１３−２と組み合わせて使用した。構造的に異なる修飾剤を用いて１４を作製でき、例えば、Ａ０６５１のために、Ｃ７Ａｍ−ＣＰＧを、第２のアミノ修飾としてＣ６Ａｍ−アミダイトと組み合わせて使用した。同様にして、商業的に入手できるアミノ修飾剤担持ＣＰＧ１０−５およびアミノ修飾ホスホラミダイト１３−５を用いて、アミノ修飾前駆物質分子１４（Ａ０６５５）を合成できる。
【表２】
2021502120.tif 000065
【０２４１】
スキーム５：オリゴヌクレオチド合成のための基本手順
【化５４】
2021502120.tif 000066
2021502120.tif 000067
得られた前駆物質オリゴヌクレオチド１４は、その後、ＧａｌＮ（Ａｃ４）−Ｃ４−酸（９）と複合化されて、目的の化合物例１５（スキーム６）を与えることができる。
【０２４２】
スキーム６：前駆物質オリゴヌクレオチドのＧａｌＮＡｃ複合体合成
【化５５】
2021502120.tif 000068
基準複合体３〜４における一本鎖三分岐ＧａｌＮＡｃ複合体の合成
三分岐ＧａｌＮＡｃクラスター複合化ＳｉＲＮＡのオリゴヌクレオチド合成は、図１４に概要が示される。オリゴヌクレオチド鎖構築は、化合物例のＡ０００６におけるように、塩基担持担体、例えば、５’ＤＭＴ−２’ＦｄＡ（ｂｚ）−スクシネート−ｌｃａａ−ＣＰＧを用いて開始される。１）ＤＭＴ除去、２）必要とされるＤＭＴマスクホスホラミダイトを用いる鎖延長、３）非延長オリゴヌクレオチド鎖のキャッピング、続けてヨウ素またはＥＤＩＴＨ（ホスホロチオエート結合が望ましい場合）によるＰ（ＩＩＩ）からｐ（Ｖ）への酸化、および再度のキャッピング（Ｃａｐ／Ｏｘ／ＣａｐまたはＣａｐ／Ｔｈｉｏ／Ｃａｐ）、からなるホスホラミダイト合成カップリングサイクルは、完全長の生成物が得られるまで反復される。三価の三分岐ＧａｌＮＡｃクラスターのオンカラム複合化に対しては、必要な三価の分岐アミダイトＣ４ＸＬＴ−ｐｈｏｓを用いる同じ合成サイクルと、続いてＧａｌＮＡｃアミダイトＳＴ２３−ｐｈｏｓを用いる別の合成サイクルラウウンドが適用された。この最後の合成装置ステップの完了時に、オリゴヌクレオチドが固体担体から切断され、追加の保護基がメチルアミン処理により除去され得る。粗生成物はその後、ＡＥＸ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣによりそれぞれ精製された。
【０２４３】
二本鎖形成の基本手順
二本鎖複合体を得るために、個別の一本鎖がＨ２Ｏ中の６０ＯＤ／ｍＬの濃度に溶解される。両方の個別のオリゴヌクレオチドを反応容器に一緒に加えることができる。反応監視のために、滴定を行うことができる。第１の鎖は、２６０ｎｍでのＵＶ−吸収により測定して、第２の鎖に比べて２５％過剰で添加される。上記反応混合物を、例えば、８０℃に５分間加熱後、ゆっくり室温に冷却する。二本鎖形成をイオン対逆相ＨＰＬＣにより監視し得る。残留一本鎖ＵＶ面積から、第２の鎖の必要量を計算し、反応混合物に添加できる。反応物を、例えば、８０℃に再度加熱後、ゆっくり室温に冷却する。この手順を残留一本鎖の検出が１０％未満になるまで反復できる。
【０２４４】
上記プロセス（スキーム１〜６および図１３と１４を含む）は、ＧａｌＮＡｃを別の標的化リガンド、例えば、サッカライドに置き換えるように容易に適応され得る。
【０２４５】
上記態様のいずれかで、固相合成後の複合化でなく、予め形成されたセリノール（ＧＮ）−ホスホラミダイトを作製し、これをオンカラム複合化に使用できる。
【０２４６】
一般的合成スキーム：２
化合物例は、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成できる。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築は、例えば、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施され得る。ＧａｌＮＡｃ複合化は、必要な数の結合されたアミノ修飾リンカー構成単位を有する、以前に構築され精製されたオリゴヌクレオチドへのＧａｌＮＡｃ−カルボン酸構成単位のペプチド結合形成により達成され得る。
【０２４７】
スキーム１：ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）リンカーシントンの合成
【化５６】
2021502120.tif 000069
ｉ）トリフルオロ酢酸エチル、ＮＥｔ３、ＭｅＯＨ、０℃、１６時間、２：８６％  ５：９０％、ｉｉ）ＤＭＴＣＬ、ピリジン、０℃、１６時間、７４％、ｉｉｉ）ＬＩＢＨ４、ＥｔＯＨ／ＴＨＦ（１／１、ｖ／ｖ）、０℃、１時間、７６％、ｉｖ）２−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルクロロホスホラミダイト、ＥｔＮｉＰｒ２、ＣＨ２Ｃｌ２、５６％、ｖ）無水コハク酸、ＤＭＡＰ、ピリジン、ＲＴ、１６時間、３８％、ｖｉ）ＨＢＴＵ、ＤＩＥＡ、アミノ−ｌｃａａ  ＣＰＧ（５００Ａ）、ＲＴ、１８時間、２９％。
ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−ホスホラミダイト７は、文献に発表された方法によりセリノール誘導体１から合成できる（Ｈｏｅｖｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１６，７，１２８−１３５）。
【０２４８】
ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート６は、ＤＭＡＰなどの触媒の存在下で、無水コハク酸による中間体５の変換により作製できる。
【０２４９】
６のＣＰＧ担体などの固体担体への担持は、ＨＢＴＵなどのカップリング剤を用いて、アミノ修飾天然ＣＰＧ担体（５００Ａ）などの固体担体へのペプチド結合形成により達成され得る。ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート６およびＨＢＴＵなどのカップリング剤をＣＨ３ＣＮなどの溶媒に溶解する。ジイソプロピルエチルアミンなどの塩基をその溶液に加え、反応混合物を２分間撹拌する。天然アミノ−ｌｃａａ−ＣＰＧ担体（５００Ａ、３ｇ、アミン含量：１３６マイクロモル／ｇ）などの固体担体を反応混合物に加え、懸濁物が形成する。懸濁物を、ｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ  ｓｈａｋｅｒ上で室温にて静かに１６時間振盪させた後、濾過し、ＤＣＭおよびＥｔＯＨなどの溶媒で洗浄する。担体を減圧下で２時間乾燥させる。担体上の未反応アミンを、無水酢酸／ルチジン／Ｎ−メチルイミダゾールと共に室温で撹拌することによりキャップすることができる。担体の洗浄を上記のように繰り返し得る。固体担体を減圧下で乾燥して、固体担体１０を得る。
【０２５０】
スキーム２：ＧａｌＮＡｃシントン９の合成
【化５７】
2021502120.tif 000070
（ｖｉｉ）ＴＭＳＯＴｆ、ＤＣＭ、ヘキセノール、ｖｉｉｉ）ＲｕＣｌ３、ＮａＩＯ４、ＤＣＭ、ＣＨ３ＣＮ、Ｈ２Ｏ、２ステップで４６％。
ＧａｌＮＡｃシントン９の合成は、商業的に入手できる過アセチル化ガラクトースアミン８から出発して、Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１４，１３６（４９），ｐｐ  １６９５８−１６９６１に記載の方法に従って調製できる。
【０２５１】
スキーム３：オリゴヌクレオチド合成の基本手順
【化５８】
2021502120.tif 000071
全てのオリゴヌクレオチドは、以下で詳細に記載の標準的ホスホラミダイト化学を用いて、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ  １０合成装置で合成できる。
【０２５２】
３’および５’ＧａｌＮＡｃ複合化オリゴヌクレオチド前駆物質（化合物Ｘ０３８５Ｂ−ｐｒｅｃなど）のオリゴヌクレオチド合成の概要を図１７に示し、スキーム３にまとめる。合成は、ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート−ｌｃａａ−ＣＰＧ１０を用いて開始される。完全長の生成物が得られるまで、ホスホラミダイト合成サイクルが適用される。鎖延長の完了時に、最後の結合アミダイト構成単位の保護ＤＭＴ基を、全ての個別合成サイクルの場合と同じように、除去できる。化合物例のＸ０３８５Ｂ−ｐｒｅｃ（これは、第２の鎖の３’および５’末端にセリノール由来リンカー部分を有する）の合成を完結するために、塩基配列が完全に構築された後に、鎖構築を追加のセリノールアミダイトカップリングで終了した。
【０２５３】
最後の合成ステップの完了時に、一本鎖を４０％メチルアミン水溶液などのアミンによる処理により固体担体から切断できる。すべての残りの保護基も、このステップで除去され、メチルアミン処理はまた、セリノールアミノ官能基も解放する。得られた粗製オリゴヌクレオチドは、塩化ナトリウム勾配などの勾配を用いて、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍのイオン交換クロマトグラフィー（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ、６ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製できる。ＩＥＸ精製由来の過剰な塩を、ＳＥＣにより除去して、アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド１１を得ることができる。画分含有生成物をプールし、サイズ排除カラム（Ｚｅｔａｄｅｘ，ＥＭＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩し、凍結乾燥する。
【０２５４】
スキーム４：ＧａｌＮＡｃ複合化のための一般的な手法
【化５９】
2021502120.tif 000072
（ｉ）９、ＨＢＴＵ、ＤＩＰＥＡ、ＤＭＳＯ；１１、Ｈ２Ｏ、ＤＭＳＯ、ＤＩＰＥＡ；その後活性化９、１１；その後４０％ＭｅＮＨ２、Ｈ２Ｏ
ＧａｌＮＡｃシントン９の複合化は、上述のように、当業者に既知の標準的ペプチドカップリング条件を用いて、９をそれぞれのオリゴヌクレオチド鎖１１のセリノールアミノ官能基にカップリングすることにより達成できる。例えば、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子１１をＨ２Ｏに溶解し、ＤＭＳＯなどの極性溶媒（例えば、ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ、２／１、ｖ／ｖ）を加え、続けて、ＤＩＰＥＡなどの塩基（例えば、総体積の２．５％）を加える。別の反応容器中でＧａｌＮＡｃシントン９の予備活性化を、ＤＭＳＯなどの極性溶媒中で、ＤＩＰＥＡなどの８当量の塩基の存在下で、２当量（アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド中でアミノ官能基当たり）のカルボン酸成分を、２当量のＨＢＴＵなどのカップリング剤と反応させることにより実施できる。２分後に、活性化化合物９がそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子１１の溶液に添加される。反応の進行をＬＣＭＳまたはＡＥＸ−ＨＰＬＣによりモニターできる。複合化反応の完結時（例えば、３０分）に、粗生成物を１０ｘ  ｉＰｒＯＨ  ０．１ｘ２Ｍ  ＮａＣｌの添加により沈殿させて、遠心分離デカンテーションにより回収できる。アセチルヒドロキシ保護基を、４０％ＭｅＮＨ２（５００ＯＤ当たり１ｍＬ）などの塩基条件下で除去する。室温で１５分後に、Ｈ２Ｏ（１：１０  ｖ／ｖ）を加え、化合物１２（例えば、図１７に示すＸ０３８５Ｂ）を単離し、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより再度精製し、その後、凍結乾燥する。
【０２５５】
二本鎖形成の基本手順
個別の一本鎖をＨ２Ｏ中の６０ＯＤ／ｍＬの濃度に溶解する。両方の個別のオリゴヌクレオチドを反応容器に一緒に加えることができる。反応監視のために、滴定を行うことができる。第１の鎖を、２６０ｎｍでのＵＶ−吸収により測定して、第２の鎖に比べて２５％過剰で添加する。上記反応混合物を、例えば、８０℃に５分間加熱後、ゆっくり室温に冷却する。二本鎖形成をイオン対逆相ＨＰＬＣにより監視し得る。残留一本鎖ＵＶ面積から、第２の鎖の必要量を計算し、反応混合物に添加できる。反応系を、例えば、８０℃に再度加熱後、ゆっくり室温に冷却する。この手順を、残留一本鎖の検出が１０％未満になるまで反復できる。
【０２５６】
上記プロセス（スキーム１〜４および図１７を含む）は、ＧａｌＮＡｃを別の標的化リガンド、例えば、サッカライドに置き換えるように容易に適応され得る。
【０２５７】
本発明は、細胞中のＬＰＡ遺伝子の発現を抑制するための複合体に関し、上記複合体は核酸部分およびリガンド部分を含み、上記核酸部分は、第１のＲＮＡ鎖の少なくとも一部および第１の鎖に少なくとも部分的に相補的な第２のＲＮＡ鎖の少なくとも一部を含み、ここで上記第１の鎖が上記ＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記リガンド部分がリンカー部分、および細胞のインビボ標的化のための標的化リガンドを含み、一方または両方のＲＮＡ鎖の３’および／または５’末端のみに結合され、ここで第１のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されず、
（ｉ）第２のＲＮＡ鎖は、標的化リガンドに５’末端で結合され、ここで（ａ）第２のＲＮＡ鎖はまた、標的化リガンドに３’末端で結合され、第１のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｂ）第１のＲＮＡ鎖は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｃ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方はまた、３’末端で標的化リガンドに結合され；もしくは
（ｉｉ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されない。
【０２５８】
リンカー部分は、例えば、セリノール由来リンカー部分または本明細書で記載の他のリンカータイプの１つであり得る。
【０２５９】
本発明は、別の態様として、細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸を提供し、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、ここで上記第１の鎖がＬＰＡ遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第１の鎖が次の配列：配列番号１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３から選択されるヌクレオチド配列を含み、ここで核酸はリガンドに結合される。第２の鎖は、配列番号２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６４、６６、６８、７０、７２または７４のヌクレオチド配列を含み得る。 第１および／または第２の鎖のヌクレオチドは、本明細書で記載のように修飾され得る。
【０２６０】
好ましくは、核酸は、式Ｉ（上述の）のリガンドに結合された配列番号５または配列番号９および配列番号６または配列番号１０を含み、ここでリガンドは、記載のように核酸に結合され、ここで第１の鎖は、奇数ヌクレオチド上で２’ＯＭｅ修飾により修飾され、および偶数ヌクレオチド上で２’Ｆにより修飾され、さらに第２の鎖は、偶数ヌクレオチド上で２’ＯＭｅにより修飾され、および奇数ヌクレオチド上で２’Ｆにより修飾される。
【０２６１】
より好ましくは、核酸は、配列番号５または配列番号９および配列番号６または配列番号１０を含み、ここで核酸は、式Ｉ（上述の）のリガンドに結合され、およびさらに、核酸は、本明細書で提供される表１の抜粋である以下に示す修飾パターンを有する。
【表３】
2021502120.tif 000073
式中、特定の修飾は、次の番号で示される：
１＝２’Ｆ−ｄＵ、
２＝２’−Ｆ−ｄＡ、
３＝２’Ｆ−ｄＣ、
４＝２’Ｆ−ｄＧ、
５＝２’−ＯＭｅ−ｒＵ；
６＝２’−ＯＭｅ−ｒＡ；
７＝２’−ＯＭｅ−ｒＣ；
８＝２’−ＯＭｅ−ｒＧ。
【０２６２】
リガンドは、ＧａｌＮＡｃを含み得、図４Ａまたは４Ｂは、本発明の例をさらに示す。
【０２６３】
本発明はまた、本発明の核酸または複合化核酸を含む組成物も提供する。医薬組成物は、薬物または診断薬として、単独で、または他の薬剤と組み合わせて使用され得る。例えば、本発明の１種または複数核酸複合体は、送達担体（例えば、リポソーム）および／または担体、希釈剤などの賦形剤と組み合わせることができる。防腐剤および安定剤などの他の薬剤も添加できる。核酸の送達方法は、当技術分野において既知であり、当業者の知識の範囲内にある。
【０２６４】
本発明の核酸または複合化核酸はまた、他の治療化合物と組み合わせて、例えば組み合わされた単位用量として、別々にまたは同時に投与されてよい。本発明はまた、安定化剤、保存剤、希釈剤、緩衝剤などの生理学的に／薬学的に許容可能な賦形剤中の本発明による１種または複数の核酸または複合化核酸を含む医薬組成物も含む。
【０２６５】
本発明の薬物および医薬組成物の投与量レベルは、定型的実験により当業者により決定できる。一実施形態では、単位用量は、約０．０１ｍｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重の核酸または複合化核酸を含み得る。あるいは、投与量は、１０ｍｇ／ｋｇ体重〜２５ｍｇ／ｋｇ体重、または１ｍｇ／ｋｇ体重〜１０ｍｇ／ｋｇ体重、または０．０５ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜５ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重、または０．１ｍｇ／ｋｇ体重〜０．５ｍｇ／ｋｇ体重、または０．５ｍｇ／ｋｇ体重〜１ｍｇ／ｋｇ体重であり得る。投与量レベルはまた、例えば、体表面積などのほかのパラメーターによっても計算し得る。
【０２６６】
医薬組成物は、無菌注射可能水性懸濁液または水溶液、または凍結乾燥形態であり得る。
【０２６７】
本発明の医薬組成物および薬物は、薬学的有効量で哺乳動物対象に投与し得る。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、サルまたは原猿類、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、マウス、ラット、ハムスター、ヘッジホッグ、およびモルモット、またはその他の適合種から選択され得る。この基準では、本明細書で使用される用語「ＬＰＡ」または「ＬＰＡ（イタリック）」は、上述した種のいずれかにおける、天然にまたは人工的に発現される場合の核酸またはタンパク質を意味するが、好ましくはこの用語は、ヒト核酸またはタンパク質を意味する。
【０２６８】
本発明のさらなる態様は、疾患、障害または症候群の治療に用いるための、本発明の核酸もしくは複合化核酸または本発明の核酸または複合化核酸を含む医薬組成物に関する。治療は、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症または冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症などの心臓血管疾患および高レベルのＬｐ（ａ）含有粒子に関連する任意の他の疾患または病態を防止するおよびこれらに罹患するリスクを低減することであり得る。本発明は、安定化剤、保存剤、希釈剤、緩衝剤などの生理学的に／薬学的に許容可能な賦形剤中の本発明による１種または複数の核酸または複合化核酸を含む医薬組成物を含む。
【０２６９】
医薬組成物は、無菌注射可能水性懸濁液または水溶液、または凍結乾燥形態であり得るか、またはペレット、錠剤、カプセル、ナノ粒子、ゲル、錠剤、ビーズまたは類似の構造物などの任意の他の好適な生薬担体物質にまたはその中に接着、吸収または包含され得る。
【０２７０】
本明細書で記載の核酸は、ＬＰＡの発現を抑制できる。本明細書で記載の核酸は、ＬＰＡの発現を部分的に抑制できる。抑制は完全、すなわち、本発明の核酸の非存在下でのＬＰＡの発現レベルに比較して、０％であり得る。ＬＰＡ発現の抑制は、部分的であり得、すなわち、発現は、本発明の核酸の非存在下でのＬＰＡ発現の１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％または中間値であり得る。抑制は、ヒト患者などの対象で使用した場合、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、７週間、８週間、１０週間、１１週間、１２週間、１３週間、１４週間、または最大３ヶ月間継続する。本発明の核酸または複合化核酸、またはこれらを含む組成物は、毎週１回もしくは２回、毎週１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、５週毎に１回、６週毎に１回、７週毎に１回、または８週毎に１回の治療を含む投与計画、または前述の間隔の組み合わせなどの変動する投与頻度の投与計画での治療を含む投与計画での使用のためであり得る。核酸は、皮下での、静脈内での使用のため、または経口、直腸または腹腔内などの任意の他の適用経路で使用するためのものであり得る。
【０２７１】
本発明の核酸または複合化核酸で治療されるまたはこれを受けている細胞および／または対象では、ＬＰＡ発現が、未治療の細胞および／または対象に比べて、１５％〜最大１００％の範囲だけ抑制され得るが、少なくとも、約３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９８％、もしくは１００％またはこれらの中間値だけ抑制され得る。抑制のレベルは、ＬＰＡ発現または過剰発現に関連する疾患の治療を可能にし得、またはＬＰＡ遺伝子産物の機能および生理学的役割をさらに調査するのに役立ち得る。
【０２７２】
本発明のさらなる態様は、上記のものまたは高レベルのＬｐ（ａ）に関連する追加の病態、もしくはＬＰＡ発現の抑制が望ましい追加の治療手法などの疾患、障害または症候群を治療するための薬物の製造における本発明の核酸もしくは複合化核酸に関する。
【０２７３】
また、本発明には、上記のものなどの疾患、障害または症候群の治療または予防方法が含まれ、方法は、治療を必要としている個体（このような病態を改善するために）への、本明細書に記載の核酸または複合化核酸の投与を含む。核酸組成物は、週２回、週１回、２週毎に１回、３週毎に１回、４週毎に１回、５週毎に１回、６週毎に１回、７週毎に１回、または８週毎に１回の治療を含む投与計画で、または前述の間隔の組み合わせなどの変動する投与頻度の投与計画で投与され得る。核酸または複合化核酸は、皮下でもしくは静脈内で、または経口、直腸または腹腔内などの任意の他の適用経路で使用するためであり得る。
【０２７４】
本発明の核酸または複合化核酸はまた、他の治療化合物と組み合わせでの使用のために投与でき、別々にまたは同時に、例えば、組み合わされた単位用量として、投与される。ペプチド、細胞性もしくは人工リガンドまたは小さいおよび大きい分子などの他の生物学的に活性な分子実体への分子複合化もまた可能である。
【０２７５】
本発明の核酸または複合化核酸は、化学合成または核酸のインビトロ（例えば、ラン・オフ転写）またはインビボでの発現を含む当該技術分野における定型的方法を用いて作成できる。例えば、固相化学合成を用いて、またはウイルス誘導体または部分的なまたは完全な合成発現系を含む核酸ベースの発現ベクターを用いて、作製できる。一実施形態では、発現ベクターを用いて、中間体宿主生物または細胞型内で、中間体または最終生物内で、または目的の標的細胞内で、本発明の核酸をインビトロで産生できる。本明細書で記載の核酸の作製（合成または酵素転写）方法は、当業者には既知である。
【０２７６】
本発明は、細胞ＲＮＡ干渉機序によりＬＰＡ遺伝子転写物に結合することによりＬＰＡ  ｍＲＮＡ分解を媒介する化学分子実体からなる。発明した分子化合物を、アシアロ糖タンパク質受容体複合体（ＡＳＧＰＲ）への特異的結合により、肝細胞特異的細胞取り込みを確実にするＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）糖部分（これに限定されない）との複合体として用い得る。本発明は、以降で述べるように、異なる特性を付与する他の種々の化学構造物に関連し得る。核酸の化学修飾パターンの使用は、血清中のヌクレアーゼ安定性を付与し、例えば、皮下適用経路を可能にする。
【０２７７】
本発明は、分子および組織脂向性送達レベルでの高い特異性を特徴とし、現在利用可能な治療より良好な安全性プロファイルを付与する可能性がある。
【０２７８】
本発明は、本明細書で記載の本発明のいずれかの態様による核酸もまた提供し、ここで第１のＲＮＡ鎖は、末端５’（Ｅ）ビニルホスホネートヌクレオチドを有し、末端５’（Ｅ）ビニルホスホネートヌクレオチドは、リン酸ジエステル結合により第１の鎖中の第２のヌクレオチドに結合される。
【０２７９】
一実施形態では、第１の鎖は、２つ以上のリン酸ジエステル結合を含み得る。
【０２８０】
一実施形態では、第１の鎖は、少なくとも末端の３つの５’ヌクレオチド間にリン酸ジエステル結合を含み得る。
【０２８１】
一実施形態では、第１の鎖は、少なくとも末端の４つの５’ヌクレオチド間にリン酸ジエステル結合を含み得る。
【０２８２】
一実施形態では、第１の鎖は、式（ＸＶＩＩ）：
（ｖｐ）−Ｎ（ｐｏ）［Ｎ（ｐｏ）］ｎ−    （ＸＶＩＩ）
を含み得、式中、「ｖｐ」は５’（Ｅ）ビニルホスホネートであり、「Ｎ」はヌクレオチドであり、「ｐｏ」はリン酸ジエステル結合であり、ｎは１〜（第１の鎖中のヌクレオチドの総数−２）であり、好ましくはｎは１〜（第１の鎖中のヌクレオチドの総数−３）であり、より好ましくはｎは１〜（第１の鎖中のヌクレオチドの総数−４）である。
【０２８３】
一実施形態では、第１の鎖は、少なくとも１つのホスホロチオエート（ｐｓ）結合を含み得る。
【０２８４】
一実施形態では、第１の鎖は、末端の２つの３’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合または末端の３つの３’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合をさらに含み得る。
【０２８５】
一実施形態では、第１の鎖中の他のヌクレオチド間の結合は、リン酸ジエステル結合である。
【０２８６】
一実施形態では、第１の鎖は、２つ以上のホスホロチオエート結合を含み得る。
【０２８７】
さらなる実施形態では、第２の鎖は、末端の２つの３’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合または末端の３つの３’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。
【０２８８】
別のさらなる実施形態では、第２の鎖は、末端の２つの５’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合または末端の３つの５’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含み得る。
【０２８９】
ある実施形態では、末端５’（Ｅ）ビニルホスホネートヌクレオチドは、ＲＮＡヌクレオチドである。
【０２９０】
末端５’（Ｅ）ビニルホスホネートヌクレオチドは、５’−末端の天然のリン酸基がＥ−ビニルホスホネートで置換されているヌクレオチドであり、この場合、５’リン酸化された鎖の末端ヌクレオチドの架橋５’−酸素原子がメチニル（−ＣＨ＝）基で置換される：
【化６０】
2021502120.tif 000074
【化６１】
2021502120.tif 000075
【０２９１】
５’（Ｅ）ビニルホスホネートは５’−リン酸模倣物である。生物学的模倣物は、模倣されている元の分子と同じ機能を実行でき、元の分子に構造的に極めて類似する分子である。本発明の場合、５’（Ｅ）ビニルホスホネートは、正規の５’−リン酸の機能を模倣し、例えば、効率的ＲＩＳＣ担持を可能にする。さらに、その僅かに変化した構造のために、５’（Ｅ）ビニルホスホネートは、ホスファターゼなどの酵素による脱リン酸化から保護することにより５’−末端ヌクレオチドを安定化できる。
【０２９２】
本発明の一態様は、細胞中の標的遺伝子の発現を抑制するための本明細書で開示の核酸であり、核酸は、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、ここで上記第１の鎖が上記標的遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第１の鎖がＲＩＳＣによる核酸のプロセッシングを容易にするために複数の位置に修飾ヌクレオチドまたは非修飾ヌクレオチドを含む。
【０２９３】
一態様では、「ＲＩＳＣによるプロセッシングを容易にする」は、核酸がＲＩＳＣによりプロセッシングされ得、例えば、存在するいずれかの修飾は、核酸がＲＩＳＣによりプロセッシングされることを可能にし、適切にはそれによりｓｉＲＮＡ活性が生じ得ることを意味する。
【０２９４】
第１の鎖の５’末端からの位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第１の鎖の位置１３に対応する第２の鎖のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０２９５】
第１の鎖上の位置に「対応する」第２の鎖上のヌクレオチドは適切には、第１の鎖上のそのヌクレオチドと塩基対を形成するヌクレオチドである。
【０２９６】
一態様では、第１の鎖の位置１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドは、第１の鎖の位置１３と塩基対を形成するヌクレオチドである。
【０２９７】
一態様では、第１の鎖の位置１１に対応する第２の鎖上のヌクレオチドは、第１の鎖の位置１１と塩基対を形成するヌクレオチドである。
【０２９８】
一態様では、第１の鎖の位置１２に対応する第２の鎖上のヌクレオチドは、第１の鎖の位置１２と塩基対を形成するヌクレオチドである。
【０２９９】
この命名法は、第２の鎖の他の位置にも適用され得る。例えば、二本鎖で平滑末端である１９マー核酸では、第１の鎖の位置１３は、第２の鎖の位置７と対を形成するであろう。第１の鎖の位置１１は、第２の鎖の位置９と対を形成するであろう。この命名法は、第２の鎖の他の位置にも適用され得る。
【０３００】
第１の鎖の位置１３に対応するヌクレオチドは適切には、二本鎖領域の第１のヌクレオチドから出発して、第２の鎖の３’から数えて第２の鎖の位置１３である。同様に、第２の鎖の位置１１は適切には、二本鎖領域の第１のヌクレオチドから出発して、第２の鎖の３’から１１番目である。この命名法は、第２の鎖の他の位置にも適用され得る。
【０３０１】
一態様では、部分的に相補的な第１と第２の鎖の場合には、第１の鎖上の位置に「対応する」第２の鎖のヌクレオチドは、その位置がミスマッチが存在する位置である場合には、塩基対を形成するとは限らないが、命名法の原理は、まだ当てはまる。
【０３０２】
好ましいのは、二重鎖領域全体で完全に相補的であり（全てのオーバーハング領域を無視して）かつ核酸の二本鎖領域内でミスマッチが存在しない第１と第２の鎖である。
【０３０３】
また好ましいのは、次の核酸である。
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第１の鎖の位置１１に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０３０４】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第１の鎖の位置１１および１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０３０５】
一態様では、第１の鎖の位置１２に対応する第２の鎖上のヌクレオチドは、２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない。核酸に対するこの制限は、本明細書で記載のいずれかの他の制限でも認められ得る。
【０３０６】
従って、本発明の別の態様は、第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第１の鎖の位置１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸である。
【０３０７】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。
【０３０８】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾され、および第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０３０９】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾され、および第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。
【０３１０】
５０％超の第１および／または第２の鎖のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾を含む、好ましくは第１と第２の両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして測定して、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、もしくは８５％のまたはそれを超える第１および／または第２の鎖が２’Ｏ−メチル修飾を含むなどの、本明細書で開示の核酸。
【０３１１】
５０％超の第１および／または第２の鎖のヌクレオチドが天然のＲＮＡ修飾を含む、好ましくは第１と第２の両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして測定して、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、もしくは８５％のまたはそれを超える第１および／または第２の鎖がこのような修飾を含むなどの、本明細書で開示の核酸。好適な天然修飾は、２’Ｏメチルに加えて、他の２’糖修飾、特にＤＮＡヌクレオチドをもたらす２’Ｈ修飾を含む。
【０３１２】
好ましくは第１と第２両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして、１５％以下など、１０％超などの、２０％以下の、第１および／または第２の鎖上の２’Ｏメチル修飾ではない２’修飾を有するヌクレオチドを含む、本明細書で開示の核酸。
【０３１３】
好ましくは両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして、２０％以下（１５％以下または１０％超など）の第１および／または第２の鎖上の２’フルオロ修飾を含む、本明細書で開示の核酸。
【０３１４】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４および位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドを除いて、すべてのヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。好ましくは、２’Ｏ−メチルにより修飾されないヌクレオチドは、２’位置でフルオロにより修飾される。
【０３１５】
好ましいのは、核酸の全てのヌクレオチドが糖上の２’位置で修飾される、本明細書で開示の核酸である。好ましくは、これらのヌクレオチドは２’−フルオロ修飾により修飾され、修飾は２’Ｏ−メチル修飾ではない。
【０３１６】
本発明の核酸は、２’位置で２’Ｈにより修飾された１個または複数のヌクレオチドを含み得、従って、核酸内にＤＮＡヌクレオチドを有する。本発明の核酸は、第１の鎖の５’末端から数えて、第１の鎖の位置２および／または１４にＤＮＡヌクレオチドを含み得る。核酸は、第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上にＤＮＡヌクレオチドを含み得る。
【０３１７】
一態様では、本発明の核酸当たり１個のＤＮＡが存在する。
【０３１８】
本発明の核酸は、１個または複数のＬＮＡヌクレオチドを含み得る。本発明の核酸は、第１の鎖の５’末端から数えて、第１の鎖の位置２および／または１４にＬＮＡヌクレオチドを含み得る。核酸は、第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上にＬＮＡを含み得る。
【０３１９】
一態様では、核酸は、第１の鎖で交互の２−Ｏメチル修飾および２フルオロ修飾により修飾され、位置２および１４（５’末端から出発して）は２’フルオロで修飾される。好ましくは、第２の鎖は、第１の鎖の位置１１、または１３、または１１および１３、または１１〜１３に対応する第２の鎖上のヌクレオチドで２’フルオロ修飾により修飾される。好ましくは第２の鎖は、相補（二本鎖）領域の最初の位置で開始して３’末端から数えて位置１１〜１３で２’フルオロ修飾により修飾され、残りの修飾は天然の修飾、好ましくは２’Ｏ−メチルである。
【０３２０】
一態様では、本発明の核酸は、５’−５’結合または３’−３’結合、好ましくは第２の鎖の３’末端で３’−３’結合を用いて、１個または複数の逆位リボヌクレオチド、好ましくは逆位アデニンを含む。
【０３２１】
一態様では、核酸は、１、２、３または４つのジチオリン酸結合などの、１つまたは複数のジチオリン酸結合を含む。好ましくは、第１と第２の鎖の５’および３’末端でそれぞれ１つずつ、最大で４つのジチオリン酸結合が存在する。
【０３２２】
全ての核酸の特徴は、本明細書で開示の全ての他の本発明の態様と組み合わせることができる。
【０３２３】
特に、好ましいのは、第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、かつ核酸が下記の１つまたは複数または全てを含む、ＳｉＲＮＡ分子である核酸である：
（ｉ）好ましくは第２の鎖の３’末端での３’−３’結合である、逆位ヌクレオチド；
（ｉｉ）１つまたは複数のジチオリン酸結合；
（ｉｉｉ）第１の鎖の位置１１または１３に対応する第２の鎖のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、好ましくはこれらの位置の一方または両方が２’フルオロ修飾を含む；
（ｉｖ）全てのヌクレオチドの少なくとも８０％が２’−Ｏ−メチル修飾を有するヌクレオチドを含む核酸；
（ｖ）核酸が２０％以下の、２’フルオロ修飾を有するヌクレオチドを含む。
【０３２４】
また、本発明で提供されるのは、第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドおよび第２の鎖の５’末端から位置７および／または９または７〜９のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾され、および残りのヌクレオチドの少なくとも９０％が２’Ｏメチル修飾されるか、または別の天然２’修飾を含む、本明細書で開示の核酸である。
【０３２５】
オーバーハングのない平滑末端化二本鎖１９塩基核酸について、特に好ましい例は：
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第２の鎖の５’末端からの位置７のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸である。
【０３２６】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第２の鎖の５’末端からの位置９のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０３２７】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第２の鎖の５’末端からの位置７および９のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０３２８】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第２の鎖の５’末端からの位置７〜９のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０３２９】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されず、および第２の鎖の５’末端からの位置７および／または９、または７〜９のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。
【０３３０】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾され、および第２の鎖の５’末端からの位置７および／または９、または７〜９のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾されない、本明細書で開示の核酸。
【０３３１】
第１の鎖の５’末端から位置２および１４のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾され、および第２の鎖の５’末端からの位置７および／または９、または７〜９のヌクレオチドが２’フルオロ修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。
【０３３２】
５０％超の第１および／または第２の鎖のヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾を含む、好ましくは第１と第２の両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして測定して、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、もしくは８５％のまたはそれを超える第１および／または第２の鎖が２’Ｏ−メチル修飾を含むなどの、本明細書で開示の核酸。
【０３３３】
５０％超の第１および／または第２の鎖のヌクレオチドが天然のＲＮＡ修飾を含む、好ましくは第１と第２の両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして測定して、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、もしくは８５％のまたはそれを超える第１および／または第２の鎖がこのような修飾を含むなどの、本明細書で開示の核酸。好適な天然の修飾は、２’Ｏメチルに加えて、他の２’糖修飾、特にＤＮＡヌクレオチドをもたらす２’Ｈ修飾を含む。
【０３３４】
好ましくは第１と第２両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして、１５％以下などまたは１０％超などの、２０％以下の、第１および／または第２の鎖上の２’Ｏメチル修飾ではない２’修飾を有するヌクレオチドを含む、本明細書で開示の核酸。
【０３３５】
好ましくは両方の鎖の総ヌクレオチドのパーセンテージとして、２０％以下（１５％以下または１０％超など）の第１および／または第２の鎖上の２’フルオロ修飾を含む、本明細書で開示の核酸。
【０３３６】
第１の鎖の５’末端からの位置２および１４および第２の鎖の５’末端からの位置７および／または９のヌクレオチドを除き、全てのヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。好ましくは、２’Ｏ−メチルにより修飾されないヌクレオチドは、２’位置でフルオロにより修飾される。
【０３３７】
第１の鎖の５’末端からの位置２および１４および第２の鎖の５’末端からの位置７〜９のヌクレオチドを除き、全てのヌクレオチドが２’Ｏ−メチル修飾により修飾される、本明細書で開示の核酸。好ましくは、２’Ｏ−メチルにより修飾されないヌクレオチドは、２’位置でフルオロにより修飾される。
【０３３８】
２０塩基対二重鎖領域を含む核酸では、第２の鎖は好ましくは、第１の鎖の位置１３，１２および１１にそれぞれ対応する二本鎖の５’末端から数えてヌクレオチド８または９または１０で２’Ｏ−メチル基を有しない。
【０３３９】
２１塩基対二重鎖領域を含む核酸では、第２の鎖は好ましくは、第１の鎖の位置１３，１２および１１にそれぞれ対応する二本鎖の５’末端から数えてヌクレオチド９または１０または１１で２’Ｏ−メチル基を有しない。
【０３４０】
本発明はまた、本明細書で開示の全ての修飾配列の非修飾配列にも関する。
【０３４１】
本発明は、ここで以下の非限定的な図および実施例を参照して記載される。
【図面の簡単な説明】
【０３４２】
【図１】図１は、ヒトＲＴ−４細胞におけるＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現の抑制についての非複合化ＳｉＲＮＡ分子スクリーニングの結果を示す。
【図２Ａ−２Ｂ】図２Ａおよび２Ｂは、ヒトＲＴ−４細胞における非複合化ＬＰＡ標的化ｓｉＲＮＡ分子のＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現に対する用量反応を示す。
【図３】図３は、受容体媒介取り込みにより送達された種々の投与量のＧａｌＮＡｃ−Ｌ１  ＬＰＡ−１０３８複合化ＳｉＲＮＡ分子によるヒトおよびカニクイザル初代培養肝細胞中のＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現の抑制を示す。
【図４Ａ−４Ｂ】図４Ａおよび４Ｂは、例示的オリゴヌクレオチドが結合された異なるＬ１およびＬ６リンカーをそれぞれ有するＧａｌＮＡｃリガンドの構造の例を示す。
【図５】図５は、受容体媒介取り込みにより送達された初代ヒト肝細胞におけるＬ６−複合化ＧａｌＮＡｃ  ｓｉＲＮＡによるＬＰＡ−ｍＲＮＡのノックダウンの代表的例を示す。
【図６】図６は、複合体１を示す。
【図７】図７は、複合体２を示す。
【図８】図８は、複合体３を示す。
【図９】図９は、基準複合体１を示す。
【図１０】図１０は、基準複合体２を示す。
【図１１】図１１は、基準複合体３を示す。
【図１２】図１２は、基準複合体４を示す。  各図６〜１２および１９〜３０で、上側の鎖はアンチセンス鎖で、下側の鎖はセンス鎖である。加えて、核酸とリガンド部分の間の結合をより明確に示すために、それぞれの複合体鎖の末端のヌクレオチドは、完全に描かれている。
【図１３】図１３は、Ａ０２６８の合成を示し、これは、３’モノＧａｌＮＡｃ複合化一本鎖オリゴヌクレオチドであり、複合体１および複合体３の合成の出発材料である。（ｐｓ）は、ホスホロチオエート結合を意味する。
【図１４】図１４は、Ａ０００６の合成を示し、これは、基準複合体４の合成に使用される、５’三分岐ＧａｌＮＡｃ複合化一本鎖オリゴヌクレオチドである。（ｐｓ）は、ホスホロチオエート結合を意味する。
【図１５】図１５は、ＴＴＲノックダウンのインビトロ測定を示す。特に、図１５Ａは、基準複合体（ＲＣ）１および３、ならびに未処理対象「ＵＴ」によるＴＴＲノックダウンのインビトロ測定を示す；図１５Ｂは、基準複合体（ＲＣ）２および３、ならびに未処理対照「ＵＴ」によるＴＴＲノックダウンのインビトロ測定を示す；図１５Ｃは、複合体１、２および３、ならびにＲＣ３および未処理対象「ＵＴ」によるＴＴＲノックダウンのインビトロ測定を示す。基準複合体１および２は、比較複合体である。基準複合体３は、非標的化ＧａｌＮＡｃ  ｓｉＲＮＡであり、「未処理」（「ＵＴ」）は、未処理細胞である。ＲＣ３およびＵＴの両方は、陰性対照である。ｍＲＮＡレベルはＰｔｅｎＩＩに対して正規化した。
【図１６】図１６は、１ｍｇ／ｋｇの複合体１〜３、基準複合体（ＲＣ）１、２および４による皮下治療後７、１４、および２７日でのｎ＝４のｃ５７ＢＬ／６マウスコホート、ならびにモック治療（ＰＢＳ）個体における血清ＴＴＲの経時変化を示す。
【図１７】図１７は、３’および５’ＧａｌＮＡｃ複合化オリゴヌクレオチド前駆物質（例えば、化合物Ｘ０３８５Ｂ−ｐｒｅｃ）のオリゴヌクレオチド合成を示す。
【図１８】図１８は、初代カニクイザル肝細胞において５’位置での三分岐ＧａｌＮＡｃユニットと比較した、第２の鎖に結合された２つの単一ＧａｌＮＡｃユニットを有するＬＰＡ標的化ｓｉＲＮＡについてのノックダウンの同等の用量応答を示す。
【図１９Ａ】図１９Ａは、複合体４を示す。アンチセンスおよびセンス鎖の５’および３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。セリノール−ＧａｌＮＡｃ−リンカーは、センス鎖の３’末端および５’末端にリン酸ジエステル結合を介して結合される。
【図１９Ｂ】図１９Ｂは、複合体５を示す。アンチセンス鎖の５’および３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。セリノール−ＧａｌＮＡｃ−リンカーは、センス鎖の３’末端および５’末端にホスホロチオエート結合を介して結合される。
【図２０】図２０は、複合体６を示す。アンチセンス鎖の５’および３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。セリノール−ＧａｌＮＡｃ−リンカーは、センス鎖の３’末端および５’末端にリン酸ジエステル結合を介して結合される。
【図２１】図２１は、複合体７を示す。アンチセンスおよびセンス鎖の５’および３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。セリノール−ＧａｌＮＡｃ−リンカーは、センス鎖の３’末端および５’末端にホスホロチオエート結合を介して結合される。セリノール−ＧａｌＮＡｃ−リンカーは、ホスホロチオエート結合を介して相互に連結される。
【図２２】図２２は、複合体８を示す。アンチセンスおよびセンス鎖の５’および３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。ＧａｌＮＡｃ−Ｃ６−アミノ修飾剤リンカーは、センス鎖の５’末端で結合され、ＧａｌＮＡｃ−Ｃ７−アミノ−修飾剤リンカーは、センス鎖の３’末端で結合される。
【図２３】図２３は、複合体９を示す。アンチセンスおよびセンス鎖の５’および３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｙＣ３−アミノ−修飾剤リンカーは、センス鎖の５’および３’末端で結合される。
【図２４】図２４は、複合体１０を示す。アンチセンスおよびセンス鎖の５’および３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。ＧａｌＮＡｃ−ピペリジル−アミノ−修飾剤リンカーは、センス鎖の５’および３’末端で結合される。
【図２５】図２５は、複合体１１を示す。アンチセンスおよびセンス鎖の５’および３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。ＧａｌＮＡｃ−Ｃ３−アミノ−修飾剤リンカーは、センス鎖の５’および３’末端で結合される。
【図２６】図２６は、複合体１２を示す。アンチセンスおよびセンス鎖の５’および３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。ＧａｌＮＡｃ−Ｃ６−アミノ修飾剤リンカーは、センス鎖の５’末端で結合され、ＧａｌＮＡｃ−ＧｌｙＣ３−アミノ−修飾剤リンカーは、センス鎖の３’末端で結合される。
【図２７】図２７は、ＲＮＡ配列のみが異なる複合体１５、１６、１８および１９を示す。アンチセンスおよびセンス鎖の５’および３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、各複合体の各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。セリノール−ＧａｌＮＡｃ−リンカーは、センス鎖の３’末端および５’末端にホスホロチオエート結合を介して結合される。
【図２８】図２８は、ＲＮＡ配列のみが異なる基準複合体５および基準複合体９を示す。アンチセンス鎖の５’および３’末端およびセンス鎖の３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、両方の複合体の各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。三量体ＧａｌＮＡｃ−リンカーは、両複合体のセンス鎖の５’末端にホスホロチオエート結合を介して結合される。
【図２９】図２９は、ＲＮＡ配列のみが異なる基準複合体６および基準複合体７を示す。アンチセンス鎖の５’および３’末端およびセンス鎖の３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、両方の複合体の各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。三量体ＧａｌＮＡｃ−リンカーは、両複合体のセンス鎖の５’末端にホスホロチオエート結合を介して結合される。
【図３０】図３０は、基準複合体８を示す。アンチセンス鎖の５’および３’末端およびセンス鎖の３’末端での最後の３個のヌクレオチドは、各ヌクレオチド間のホスホロチオエートリンカーにより連結される。三量体ＧａｌＮＡｃ−リンカーは、センス鎖の５’末端にホスホロチオエート結合を介して結合される。
【図３１】図３１は、ＴＴＲノックダウンのインビトロ測定を示す。特に、図３１Ａは、「Ｌｕｃ」（基準複合体３）ならびに未処理対照「ＵＴ」と比較した、複合体４、５、６および２によるＴＴＲノックダウンのインビトロ測定を示す；図３１Ｂは、「Ｌｕｃ」（基準複合体３）ならびに未処理対照「ＵＴ」と比較した、複合体７および２によるＴＴＲノックダウンのインビトロ測定を示す。Ｌｕｃまたは基準複合体３（ＲＣ３）は、非標的化ＧａｌＮＡｃ  ｓｉＲＮＡであり、「未処理」（「ＵＴ」）は、未処理細胞である。ＲＣ３およびＵＴの両方は、陰性対照である。ｍＲＮＡレベルはＰｔｅｎＩＩに対して正規化した。
【図３２】図３２は、ＴＴＲノックダウンのインビトロ測定を示す。特に、図３２Ａは、「Ｌｕｃ」（基準複合体３）ならびに未処理対照「ＵＴ」と比較した、複合体８、９、１０、１１および２によるＴＴＲノックダウンのインビトロ測定を示す；図３２Ｂは、「Ｌｕｃ」（基準複合体３）ならびに未処理対照「ＵＴ」と比較した、複合体１２および２によるＴＴＲノックダウンのインビトロ測定を示す。Ｌｕｃまたは基準複合体３は、非標的化ＧａｌＮＡｃ  ｓｉＲＮＡであり、「未処理」（「ＵＴ」）は、未処理細胞である。ＲＣ３およびＵＴの両方は、陰性対照である。ｍＲＮＡレベルはＰｔｅｎＩＩに対して正規化した。
【図３３】図３３は、対照と比較した複合体１９によるＬＰＡ  ｍＲＮＡノックダウンのインビトロ測定を示す。Ｃｔｒは、非標的化ＧａｌＮＡｃ  ｓｉＲＮＡであり、「未処理」（「ＵＴ」）は、未処理細胞である。ＣｔｒおよびＵＴの両方は、陰性対照である。ｍＲＮＡレベルはＡＣＴＢに対して正規化した。
【図３４】図３４は、１ｍｇ／ｋｇの複合体１５、基準複合体（ＲＣ）６による皮下治療後１４、２８および４２日でのｎ＝６のｃ５７ＢＬ／６マウスコホート、ならびにモック治療（ＰＢＳ）個体におけるＡｌｄｈ２肝臓ｍＲＮＡレベルの経時変化を示す。ｍＲＮＡレベルはＰｔｅｎに対して正規化した。
【図３５】図３５は、１ｍｇ／ｋｇの複合体１６、基準複合体（ＲＣ）７による皮下治療後１４、２８および４２日でのｎ＝６のｃ５７ＢＬ／６マウスコホート、ならびにモック治療（ＰＢＳ）個体におけるＡｌｄｈ２肝臓ｍＲＮＡレベルの経時変化を示す。ｍＲＮＡレベルはＰｔｅｎに対して正規化した。
【図３６】図３６は、１ｍｇ／ｋｇの複合体１８、基準複合体（ＲＣ）８による皮下治療後１４、２８および４２日でのｎ＝６のｃ５７ＢＬ／６マウスコホート、ならびにモック治療（ＰＢＳ）個体におけるＴｍｐｒｓｓ６肝臓ｍＲＮＡレベルの経時変化を示す。  ｍＲＮＡレベルはＰｔｅｎに対して正規化した。
【図３７】図３７は、３日間にわたる３７℃での複合体４、５、６、７および２、ならびに未処理対照（ＵＴ）の血清安定性を示す。
【図３８】図３８は、３日間にわたる３７℃での複合体８、９、１０、１１、１２および２、ならびに未処理対照（ＵＴ）の血清安定性を示す。
【図３９】図３９は、受容体媒介取り込みにより送達された種々の投与量のＧａｌＮＡｃ−Ｌ６結合ｓｉＲＮＡ分子によるヒト初代培養肝細胞中のＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現の抑制を示す。
【図４０】図４０は、リンカーを介してリガンドに結合された核酸の種々の実施形態の模式図を示す。
【０３４３】
実施例
各実施例で言及されるナンバリングは、上記実施例に特異的である。
実施例１
本明細書で機能的実施例のために使用される修飾および複合化されたＳｉＲＮＡ分子。
ＬＰＡ−１０３８誘導体：
ＧａｌＮＡｃ−ＬＰＡ−１０３８−Ｌ１
第１の鎖（配列番号１１９、配列番号５ベース）
ＯＭｅＡ−（ｐｓ）−ＦＵ−（ｐｓ）−ＯＭｅＡ−ＦＡ−ＯＭｅＣ−ＦＵ−ＯＭｅＣ−ＦＵ−ＯＭｅＧ−ＦＵ−ＯＭｅＣ−ＦＣ−ＯＭｅＡ−ＦＵ−ＯＭｅＵ−ＦＡ−ＯＭｅＣ−（ｐｓ）−ＦＣ−（ｐｓ）−ＯＭｅＡ  ３’
第２の鎖（配列番号１２０、配列番号６ベース）
５’［ＳＴ２３（ｐｓ）］３  ｌｏｎｇ  ｔｒｅｂｌｅｒ（ｐｓ）ＦＵ−ＯＭｅＧ−ＦＧ−ＯＭｅＵ−ＦＡ−ＯＭｅＡ−ＦＵ−ＯＭｅＧ−ＦＧ−ＯＭｅＡ−ＦＣ−ＯＭｅＡ−ＦＧ−ＯＭｅＡ−ＦＧ−ＯＭｅＵ−ＦＵ−（ｐｓ）−ＯＭｅＡ−（ｐｓ）−ＦＵ  ３’
ＧａｌＮＡｃ−ＬＰＡ−１０３８−Ｌ６
第１の鎖（配列番号１２１、配列番号５ベース）
ＯＭｅＡ−（ｐｓ）−ＦＵ−（ｐｓ）−ＯＭｅＡ−ＦＡ−ＯＭｅＣ−ＦＵ−ＯＭｅＣ−ＦＵ−ＯＭｅＧ−ＦＵ−ＯＭｅＣ−ＦＣ−ＯＭｅＡ−ＦＵ−ＯＭｅＵ−ＦＡ−ＯＭｅＣ−（ｐｓ）−ＦＣ−（ｐｓ）−ＯＭｅＡ  ３’
第２の鎖（配列番号１２２、配列番号６ベース）
５’［ＳＴ２３（ｐｓ）］３  ＳＴ４３（ｐｓ）ＦＵ−ＯＭｅＧ−ＦＧ−ＯＭｅＵ−ＦＡ−ＯＭｅＡ−ＦＵ−ＯＭｅＧ−ＦＧ−ＯＭｅＡ−ＦＣ−ＯＭｅＡ−ＦＧ−ＯＭｅＡ−ＦＧ−ＯＭｅＵ−ＦＵ−（ｐｓ）−ＯＭｅＡ−（ｐｓ）−ＦＵ  ３’
ＦＮ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）は、２’フルオロ、２’デオキシヌクレオシドを意味する。
ＯＭｅＮ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）は、２’Ｏメチルヌクレオシドを意味する。
（ｐｓ）は、ホスホロチオエート結合を示す。
【０３４４】
ＳＴ２３およびＳＴ４３は以下の通り。
さらなる例は、ＬＰＡ  １０４１誘導体である：
ＧａｌＮＡｃ−ＬＰＡ−１０４１−Ｌ１
第１の鎖（配列番号１２３、配列番号９ベース）
５’  ＯＭｅＡ−（ｐｓ）−ＦＵ−（ｐｓ）−ＯＭｅＡ−ＦＡ−ＯＭｅＣ−ＦＵ−ＯＭｅＣ−ＦＵ−ＯＭｅＧ−ＦＵ−ＯＭｅＣ−ＦＣ−ＯＭｅＡ−ＦＵ−ＯＭｅＵ−ＦＡ−ＯＭｅＣ−（ｐｓ）−ＦＣ−（ｐｓ）−ＯＭｅＧ  ３’
第２の鎖（配列番号１２４、配列番号１０ベース）
５’［ＳＴ２３（ｐｓ）］３  ｌｏｎｇ  ｔｒｅｂｌｅｒ（ｐｓ）ＦＣ−ＯＭｅＧ−ＦＧ−ＯＭｅＵ−ＦＡ−ＯＭｅＡ−ＦＵ−ＯＭｅＧ−ＦＧ−ＯＭｅＡ−ＦＣ−ＯＭｅＡ−ＦＧ−ＯＭｅＡ−ＦＧ−ＯＭｅＵ−ＦＵ−（ｐｓ）−ＯＭｅＡ−（ｐｓ）−ＦＵ  ３’
ＧａｌＮＡｃ−ＬＰＡ−１０４１−Ｌ６
第１の鎖（配列番号１２５、配列番号９ベース）
５’  ＯＭｅＡ−（ｐｓ）−ＦＵ−（ｐｓ）−ＯＭｅＡ−ＦＡ−ＯＭｅＣ−ＦＵ−ＯＭｅＣ−ＦＵ−ＯＭｅＧ−ＦＵ−ＯＭｅＣ−ＦＣ−ＯＭｅＡ−ＦＵ−ＯＭｅＵ−ＦＡ−ＯＭｅＣ−（ｐｓ）−ＦＣ−（ｐｓ）−ＯＭｅＧ  ３’
第２の鎖（配列番号１２６、配列番号１０ベース）
５´［ＳＴ２３（ｐｓ）］３  ＳＴ４３（ｐｓ）ＦＣ−ＯＭｅＧ−ＦＧ−ＯＭｅＵ−ＦＡ−ＯＭｅＡ−ＦＵ−ＯＭｅＧ−ＦＧ−ＯＭｅＡ−ＦＣ−ＯＭｅＡ−ＦＧ−ＯＭｅＡ−ＦＧ−ＯＭｅＵ−ＦＵ−（ｐｓ）−ＯＭｅＡ−（ｐｓ）−ＦＵ  ３’
ＦＮ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）は、２’フルオロ、２’デオキシヌクレオシドを意味する。
ＯＭｅＮ（Ｎ＝Ａ、Ｃ、Ｇ、Ｕ）は、２’Ｏメチルヌクレオシドを意味する。
（ｐｓ）は、ホスホロチオエート結合を示す。
ＳＴ２３およびＳＴ４３は以下の通りである。
ＳＴ２３は、ＧａｌＮＡｃ  Ｃ４ホスホラミダイト（構造成分は下記の通り）である。
【化６２】
2021502120.tif 000076
ＳＴ４１は次の通りである。
【化６３】
2021502120.tif 000077
ＳＴ４３は次の通りであり、国際公開第２０１７／１７４６５７号に記載されている：
【化６４】
2021502120.tif 000078
【０３４５】
全てのオリゴヌクレオチドは、市販のオリゴヌクレオチド製造業者（Ｂｉｏｓｐｒｉｎｇ，Ｆｒａｎｋｆｕｒｔ，Ｇｅｒｍａｎｙ，ｏｒ  ＲｉｂｏＢｉｏ，Ｇｕａｎｇｚｈｏｕ，Ｇｕａｎｇｄｏｎｇ，ＰＲＣ）から得たか、または標準的ホスホラミダイト化学を使ってＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置（社内）で合成した。商業的に入手できる固体担体および２’Ｏ−メチルＲＮＡホスホラミダイト、２’フルオロＤＮＡホスホラミダイト（全て標準的保護）および商業的に入手できるｌｏｎｇ  ｔｒｅｂｌｅｒホスホラミダイト（Ｇｌｅｎ  ｒｅｓｅａｒｃｈ）を使用した。合成は、乾燥アセトニトリル中のホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液を用いて実施し、ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）（アセトニトリル中の０．３Ｍ）を活性化剤として使用した。その他の全ての試薬は商業的に入手できる標準的試薬であった。
【０３４６】
それぞれのＧａｌＮＡｃシントン（例えば、ＳＴ２３、ＳＴ４１またはＳＴ４３）の複合化を、標準的ホスホラミダイトカップリング条件下で、それぞれのホスホラミダイトをオリゴ鎖の５’末端にカップリングすることにより達成した。ホスホロチオエートを、標準的な商業的に入手できるチオール化試薬（ＥＤＩＴＨ，Ｌｉｎｋ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて導入した。
【０３４７】
一本鎖を、メチルアミン（４０％水溶液）を用いることによりＣＰＧから切断し、得られた粗製オリゴヌクレオチドを、塩化ナトリウム勾配を用いてＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍのイオン交換クロマトグラフィー（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ、６ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。画分含有生成物をプールし、サイズ排除カラム（Ｚｅｔａｄｅｘ，ＥＭＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩し、凍結乾燥した。
【０３４８】
アニーリングのために、等モル量のそれぞれの一本鎖を水に溶解し、８０℃に５分間加熱した。徐々に室温に冷却後、得られた二本鎖を凍結乾燥した。
【０３４９】
得られた核酸（ｓｉＲＮＡ）の配列を下表１に記載する。
【表４】
2021502120.tif 000079
2021502120.tif 000080
【表５】
2021502120.tif 000081
【０３５０】
実施例２
ヒトＲＴ−４細胞におけるＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現の抑制についての非複合化ｓｉＲＮＡ分子（表１）のスクリーニング。
リポソームトランスフェクション複合体を、１．５μｌ  ＲＮＡｉＭａｘ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）／８０ｐｍｏｌの示したｓｉＲＮＡ分子の比で３重に調製した。複合体をそれぞれ、示した２．５ｎＭおよび２５ｎＭの濃度に希釈した（値はペアにして明および暗灰色のバーとして示した）。内在的にＬＰＡを発現するＲＴ４ヒト膀胱移行細胞乳頭腫細胞を、示された濃度で予め播種したトランスフェクション複合体の上に、２４ウェルフォーマットで１２５，０００細胞／ウェルの濃度で播種した（リバーストランスフェクション）。トランスフェクションの２４時間後に、全ＲＮＡをＳｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  ２５０（Ｓｔｒａｔｅｃ）を用いて単離した。ＬＰＡ  ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング転写物としてのそれぞれの試料中のＰＰＩＢ  ｍＲＮＡ発現と比較して、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。値を、未処理細胞中で検出されるＬＰＡ  ｍＲＮＡの量に対し正規化した（プレート内）。非サイレンシングｓｉＲＮＡ化合物を追加の対照としてトランスフェクトした。正規化した３回の繰り返し値の平均およびＳＤを示す。結果を図１に示す。
【０３５１】
実施例３
ヒトＲＴ−４細胞におけるＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現に対する非複合化ＬＰＡ標的化ｓｉＲＮＡ化合物の用量応答。
ＲＴ４ヒト膀胱移行細胞乳頭腫細胞を上述のようにリバーストランスフェクションし（実施例２）、標識した種々の非複合化ｓｉＲＮＡ化合物（表１）を用いて、示された濃度（１００ｎＭ〜０．２ｎＭの範囲）で処理した。トランスフェクションの２４時間後に、全ＲＮＡをＳｐｉｎ  Ｃｅｌｌ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ  ２５０（Ｓｔｒａｔｅｃ）を用いて単離した。ＬＰＡ  ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング転写物としてのそれぞれの試料中のＰＰＩＢ  ｍＲＮＡ発現と比較して、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。値を、未処理細胞中で検出されるＬＰＡ  ｍＲＮＡの量に対し正規化した。バーは、それぞれのデータポイントに対する残留ＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現を表す。結果を図２に示す。
【０３５２】
実施例４
受容体媒介取り込みにより送達された種々の投与量のＧａｌＮＡｃ−Ｌ１  ＬＰＡ−１０３８複合化ＳｉＲＮＡ分子によるヒトおよびカニクイザル初代培養肝細胞中のＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現の抑制。
初代培養肝細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をコラーゲンコート９６ウェルプレートに４５，０００細胞／ウェル（カニクイザル）および３０，０００細胞／ウェル（ヒト）の濃度で播種した。ＧａｌＮＡｃ−Ｌ１−複合化ＬＰＡ−１０３８を示された濃度（ｎＭ）で播種直後に加えた。ｓｉＲＮＡ処理の２４時間後に、全ＲＮＡをＩｎｖｉＴｒａｐ  ＲＮＡ細胞ＨＴＳ９６ウェルキット（Ｓｔｒａｔｅｃ）を用いて単離した。ＬＰＡ  ｍＲＮＡレベルを、ハウスキーピング転写物としてのそれぞれの試料中のアクチン（カニクイザル）またはＡｐｏＢ（ヒト）ｍＲＮＡ発現レベルと比較して、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。値を、未処理細胞中のＬＰＡ発現に対し正規化した。残留ＬＰＡ  ｍＲＮＡレベルの正規化した３回の繰り返し値の平均およびＳＤを黒色バーで示す。結果を図３に示す。
【０３５３】
実施例５
受容体媒介送達時の初代培養ヒト肝細胞中の示された種々のＬ６−ＧａｌＮＡｃ複合化ｓｉＲＮＡによるヒト初代培養肝細胞中のＬＰＡ−ｍＲＮＡのノックダウン。
初代培養ヒト肝細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）をコラーゲンコート９６ウェルプレートに３０，０００細胞／ウェルで播種した（９６ウェルフォーマット）。非サイレンシング対照を含むＧａｌＮＡｃ−Ｌ６−複合化ｓｉＲＮＡを、２種の示された濃度で細胞播種の直後に加えた。ｓｉＲＮＡ処理の２４時間後に、全ＲＮＡをＩｎｖｉＴｒａｐ  ＲＮＡ細胞ＨＴＳ９６ウェルキット（Ｓｔｒａｔｅｃ）を用いて単離した。ＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現レベルを、ハウスキーピング転写物としてのＡｐｏＢ  ｍＲＮＡと比較して、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。値を、未処理細胞中のＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現に対し正規化し、残留ＬＰＡ  ｍＲＮＡレベルをバーとしてペアにして表した（１００ｎＭ  黒色バー、２０ｎＭ  灰色バー）。正規化した３回の繰り返し値の平均およびＳＤを図５に示す。
【０３５４】
実施例６−複合体の合成
化合物例を、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成した。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築を、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施した。ＧａｌＮＡｃ複合化を、必要な数の結合されたアミノ修飾リンカー構成単位を有する、以前に構築され精製されたオリゴヌクレオチドに対するＧａｌＮＡｃ−カルボン酸構成単位のペプチド結合形成により達成した。
【０３５５】
オリゴヌクレオチド合成、脱保護および精製は、当技術分野において既知の標準的手順に従った。
【０３５６】
全てのオリゴヌクレオチドは、標準的ホスホラミダイト化学を用いて、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置で合成した。商業的に入手できる固体担体および２’Ｏ−メチルＲＮＡホスホラミダイト、２’フルオロ、２’デオキシＲＮＡホスホラミダイト（全て標準的保護、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，ＬｉｎｋＴｅｃｈ）および商業的に入手できる３’−アミノ修飾剤ＴＦＡアミノＣ−６  ｌｃａａ  ＣＰＧ  ５００Å（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）を使用した。過アセチル化ガラクトースアミン８は商業的に入手できる。
【０３５７】
付随的な試薬は、ＥＭＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。合成は、乾燥アセトニトリル中のホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液を用いて実施し、ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）（アセトニトリル中の０．３Ｍ）を活性化剤として使用した。カップリング時間は１５分であった。Ｃａｐ／ＯＸ／ＣａｐまたはＣａｐ／チオ／Ｃａｐサイクルを適用した（Ｃａｐ：Ａｃ２Ｏ／ＮＭＩ／ルチジン／アセトニトリル、酸化剤：ピリジン／Ｈ２Ｏ中の０．１ＭのＩ２）。ホスホロチオエートを、標準的な商業的に入手できるチオール化試薬（ＥＤＩＴＨ，Ｌｉｎｋ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて導入した。ＤＭＴ切断は、トルエン中の３％ジクロロ酢酸で処理することにより行った。プログラム合成繰り返しの完了時に、ジエチルアミン（ＤＥＡ）洗浄を実施した。全てのオリゴヌクレオチドをＤＭＴオフモードで合成した。
【０３５８】
セリノール由来リンカー部分の結合を、塩基担持（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート−ｌｃａａ−ＣＰＧ  １０または（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）ホスホラミダイト  ７を使用して達成した（合成は、Ｈｏｅｖｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１６，７，１２８−１３５）に記載のように行った）。三分岐ＧａｌＮＡｃクラスター（ＳＴ２３／Ｃ４ＸＬＴ）を、それぞれのｔｒｅｂｌｅｒアミダイト誘導体（Ｃ４ＸＬＴ−ｐｈｏｓ）とそれに続く、ＧａｌＮＡｃアミダイト（ＳＴ２３−ｐｈｏｓ）の連続的カップリングにより導入した。
【０３５９】
一本鎖を、４０％のメチルアミン水溶液処理によりＣＰＧから切断した。得られた粗製オリゴヌクレオチドは、塩化ナトリウム勾配を用いて、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍのイオン交換クロマトグラフィー（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ、６ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。生成物含有画分をプールし、サイズ排除カラム（Ｚｅｔａｄｅｘ，ＥＭＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩し、凍結乾燥した。
【０３６０】
個別の一本鎖をＨ２Ｏ中の６０ＯＤ／ｍＬの濃度に溶解した。両方の個別のオリゴヌクレオチドを反応容器に一緒に加えた。反応監視を容易にするために、滴定を行った。第１の鎖を、２６０ｎｍでのＵＶ−吸収により測定して、第２の鎖に比べて２５％過剰で添加した。上記反応混合物を、例えば、８０℃に５分間加熱後、ゆっくり室温に冷却した。二本鎖形成をイオン対逆相ＨＰＬＣにより監視した。残留一本鎖ＵＶ面積から、第２の鎖の必要量を計算し、反応混合物に添加した。反応物を８０℃に再度加熱後、ゆっくり室温に冷却した。この手順を、１０％未満の残留一本鎖が検出されるまで反復した。
【０３６１】
化合物２〜１０の合成
化合物２〜５および（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−ホスホラミダイト７を、文献に発表された方法により合成した（Ｈｏｅｖｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１６，７，１２８−１３５）。
【０３６２】
（Ｓ）−４−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）プロポキシ）−４−オキソブタン酸（６）。
ピリジン中の５の溶液に、無水コハク酸、続いてＤＭＡＰを加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣにより判断して、全ての出発材料が消費された。反応物を濃縮した。粗製材料を、ＤＣＭ（＋１％トリエチルアミン）中の０％〜５％メタノール勾配を用いて、シリカゲルでクロマトグラフ処理して、１．３３ｇの６を得た（収率＝３８％）。ｍ／ｚ（ＥＳＩ−）：５８８．２（１００％）、（Ｃ３０Ｈ２９Ｆ３ＮＯ８−としての計算値  ［Ｍ−Ｈ］−  ５８８．６）。１Ｈ−ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ［ｐｐｍ］＝７．９４（ｄ，１Ｈ，ＮＨ），７．３９−７．３６（ｍ，２Ｈ，ＣＨアリール），７．２９−７．２５（ｍ，７Ｈ，ＣＨアリール），６．８２−６．７９（ｍ，４Ｈ，ＣＨアリール），４．５１−４．４７（ｍ，１Ｈ），４．３１−４．２４（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ，２ｘＤＭＴｒ−ＯＭｅ），３．６６−３．６０（ｍ，１６Ｈ，ＨＮＥｔ３＋），３．２６−３．２５（ｍ，２Ｈ），２．９７−２．８１（ｍ，２０Ｈ，ＮＥｔ３），２．５０−２．４１（４Ｈ，ｍ），１．４８−１．４５（ｍ，２６Ｈ，ＨＮＥｔ３），１．２４−１．１８（ｍ，２９Ｈ，ＮＥｔ３）。
【０３６３】
（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート−ｌｃａａ−ＣＰＧ（１０）
（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート（１５９ｍｇ、２７０ｕｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１１３ｍｇ、２９９ｕｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、９４μＬ、５４０ｕｍｏｌ）をその溶液に加え、混合物を２分間かきまぜた後、天然のアミノ−ｌｃａａ−ＣＰＧ（５００Ａ、３ｇ、アミノ含量：１３６ｕｍｏｌ／ｇ）を加えた。懸濁物をｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ  ｓｈａｋｅｒ上で１６時間室温にて静かに振盪させた後、濾過し、ＤＣＭおよびＥｔＯＨで洗浄した。固体担体を減圧下で２時間乾燥させた。担体上の未反応アミンを無水酢酸／ルチジン／Ｎ−メチルイミダゾールと共に室温で撹拌することにより、キャップした。担体の洗浄を上記のように反復した。固体を減圧下で乾燥して、固体担体１０を得た（３ｇ、２６ｕｍｏｌ／ｇ担持量）。
【０３６４】
ＧａｌＮＡｃシントン（９）
ＧａｌＮＡｃシントン９の合成は、Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１４，１３６（４９），ｐｐ  １６９５８−１６９６１に記載の方法に従って実施した（２つのステップで４６％収率）。
特徴付けるデータは、発表データと一致した。
【０３６５】
オリゴヌクレオチドの合成
全ての一本鎖オリゴヌクレオチドは、上記および図１３および１４に記載の反応条件に従って合成された。
【０３６６】
全ての最終一本鎖生成物をＡＥＸ−ＨＰＬＣにより分析して、それらの純度を証明した。純度は、％ＦＬＰ（完全長生成物の％）で示し、これは、最終生成物のＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析のＵＶ出力における帰属生成物シグナル下のＵＶ面積のパーセンテージである。それぞれの一本鎖生成物（非修飾、アミノ修飾、前駆物質またはＧａｌＮＡｃ複合化オリゴヌクレオチド）の確認をＬＣ−ＭＳ分析により実施した。
【表６】
2021502120.tif 000082
【０３６７】
５’１ｘＮＨ２は、複合化に利用可能な遊離セリノール由来アミノ基の位置（５’末端）および数（１ｘＮＨ２）を指す。例えば、Ａ０２６４上の１ｘ３’ＮＨ２は、鎖Ａ０２６４の３’末端でＧａｌＮＡｃシントン９と反応させることができる遊離アミノ基があることを意味する。３’５’１ｘＮＨ２は、鎖の３’末端および５’末端でＧａｌＮＡｃリンカー９と反応させることができる一つのセリノール由来遊離アミノ基があることを意味する。
【０３６８】
複合体１〜３および基準複合体１〜２の合成
複合体１〜２および基準複合体１〜２のための複合化一本鎖
ＧａｌＮＡｃシントン（９）の複合化は、ペプチドカップリング剤を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖１１のセリノールアミノ官能基にカップリングすることにより達成された。従って、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子１１をＨ２Ｏ（５００OD/ｍｌ）に溶解し、ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ、２／１、ｖ／ｖ）を加え、続けて、ＤＩＰＥＡ（総体積の２．５％）を加えた。別の反応容器中で、ＧａｌＮ（Ａｃ４）−Ｃ４−酸（９）の予備活性化を、ＤＭＳＯ中の８当量のＤＩＰＥＡの存在下で２当量（アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド１１中のアミノ官能基当たり）のカルボン酸成分を２当量のＨＢＴＵと反応させることにより実施した。２分後に、予備活性化化合物９をそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子の溶液に添加した。３０分後に、反応の進行をＬＣＭＳまたはＡＥＸ−ＨＰＬＣでモニターした。複合化反応の完結時に、粗生成物を１０ｘ  ｉＰｒＯＨ  ０．１ｘ２Ｍ  ＮａＣｌの添加により沈殿させ、遠心分離およびデカンテーションにより回収した。ＧａｌＮＡｃ部分中のアセチル化ヒドロキシル基を解放するために、得られたペレットを４０％のＭｅＮＨ２中に溶解し（１ｍＬ／５００ＯＤ）、１５分後、室温にてＨ２Ｏで希釈し（１：１０）、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより最終的に再度精製し、凍結乾燥して、最終生成物１２を得た。
【表７】
2021502120.tif 000083
【０３６９】
二本鎖形成
二本鎖形成を上記の方法に従い実施した。
二本鎖純度は、％二本鎖で与えられ、これは、ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ分析のＵＶ出力における帰属生成物シグナル下のＵＶ面積のパーセンテージである。
【表８】
2021502120.tif 000084
【０３７０】
配列
次の配列に対する修飾の凡例：
ｆは、２’フルオロ  ２’デオキシリボヌクレオチドまたは２’−フルオロリボヌクレオチドを意味する（これらの用語は、互換性がある）。
ｍは、２’Ｏメチルリボヌクレオチドを意味する。
（ｐｓ）は、ホスホロチオエート結合を意味する。
Ｓｅｒ（ＧＮ）は、セリノール由来リンカー部分：
【化６５】
2021502120.tif 000085
に結合されるＧａｌＮＡｃ−Ｃ４構成単位であり、式中、Ｏ−−−は、酸素原子と、例えば、Ｈ、リン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合の間の結合である。
Ｃ４ＸＬＴは：
【化６６】
2021502120.tif 000086
であり；
ＳＴ２３は：
【化６７】
2021502120.tif 000087
である。
【０３７１】
Ｃ４ＸＬＴ（Ｃ４ＸＬＴ−ｐｈｏｓ）ならびにＳＴ２３（ＳＴ２３−ｐｈｏｓ）のホスホラミダイト誘導体の合成は、国際公開第２０１７／１７４６５７号に記載されるように実施できる。
Ｃ４ＸＬＴ−ｐｈｏｓは：
【化６８】
2021502120.tif 000088
であり；
ＳＴ２３−ｐｈｏｓは：
【化６９】
2021502120.tif 000089
である。
【０３７２】
複合体１
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１ＡＬ３３（配列番号１２７）
５’  ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）３’
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＬ２０（配列番号１２８）
５’Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ  ３’
【０３７３】
複合体２
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＶ１Ｌ４２（配列番号１３０）
Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）
【０３７４】
複合体3
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１ＡＬ３３（配列番号１２７）
５’  ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）３’
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＶ１Ｌ４２（配列番号１３０）
５’  Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）３´
【０３７５】
基準複合体１
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＬ２０（配列番号１２８）
Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ
【０３７６】
基準複合体２
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１ＡＬ３３（配列番号１２７）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）
センス鎖−ＳＴＳ１６００１Ｖ１Ｂ（配列番号１３１）
ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ
【０３７７】
基準複合体３
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１８００１Ａ（Ａ０１３０；配列番号１３２）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＣ（ｐｓ）ｍＧ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＵ  ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ（ｐｓ）ｍＧ
センス鎖−ＳＴＳ１８００１ＢＬ４（Ａ０１３１、配列番号１３３）
［（ＳＴ２３）（ｐｓ）］３  Ｃ４ＸＬＴ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＧ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＣ（ｐｓ）ｍＧ（ｐｓ）ｆＡ
【０３７８】
基準複合体４
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１ＡＬ３３（配列番号１２７）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＬ４（配列番号１３４）
５’［（ＳＴ２３）（ｐｓ）］３  Ｃ４ＸＬＴ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ
【０３７９】
実施例７−種々のＴＴＲ  ｓｉＲＮＡ  ＧａｌＮＡｃ複合体のＴＴＲノックダウンのインビトロ測定
マウス初代培養肝細胞を３０，０００細胞／ウェルの濃度で、コラーゲンプリコート９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ａ１１４２８０３）に播種し、１０ｎＭ〜０．０００１ｎＭの範囲の濃度にてｓｉＲＮＡ複合体で処理した。処理の２４時間後、細胞を溶解しＲＮＡを、製品プロトコルに従いＩｎｖｉＴｒａｐ（登録商標）ＲＮＡ  Ｃｅｌｌ  ＨＴＳ  ９６キット／Ｃ２４ｘ９６ｐｒｅｐｓ（Ｓｔｒａｔｅｃ  ＃７０６１３００４００）を用いて抽出した。ＴＴＲおよびハウスキーピングｍＲＮＡ（ＰｔｅｎＩＩ）の転写物レベルをＴａｑＭａｎ分析により定量化した。
【０３８０】
本発明の複合体、複合体１〜３による処理の２４時間後のマウス初代培養細胞中の標的遺伝子発現は、図１５に示すように、標的遺伝子発現が陰性対照（「ＵＴ」バーおよび基準複合体３を参照）に比較して、複合体の用量が増加するに伴い減少することを示した。これは、第１の鎖が標的遺伝子に結合しており、それにより、遺伝子発現を低減させることを示す。図１５はまた、対照薬複合体として機能する基準複合体１および２の標的遺伝子発現レベルを示す。図１５Ａと１５Ｃ、および１５Ｂと１５Ｃで示されるデータ間の比較から認められるように、本発明の複合体（複合体１〜３）は、基準複合体１および２に比べて、標的遺伝子発現を低減させる。０．０１ｎＭで最も効果的な複合体は、複合体２であるように見える。０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭおよび１０ｎＭで最も効果的な複合体は、複合体３であるように見える。
【０３８１】
実施例８−マウス中の血清ＴＴＲのインビボ経時変化
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを０日目に１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ複合体で皮下治療した。血清試料を眼窩洞出血により、７、１４、および２７日目に採取し、分析まで−２０℃で貯蔵した。血清ＴＴＲ定量化を、製造業者のプロトコル（試料希釈  １：８０００または１：８００）に従いＭｏｕｓｅ  Ｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ，４１−ＰＡＬＭＳ／ｌｏｔ  ２２，２００８００３Ｂ）を用いて実施した。
【０３８２】
１ｍｇ／ｋｇの複合体１〜３、基準複合体１、２および４による皮下治療後７、１４、および２７日でのｎ＝４のｃ５７ＢＬ／６マウスコホート、ならびにモック治療（ＰＢＳ）個体における血清ＴＴＲの経時変化の結果を、図１６に示す。図１６のデータにより示されるように、本発明の複合体は、陰性対照（ＰＢＳ）および基準複合体１、２に比べて、また、特に基準複合体４に比べて、標的遺伝子発現の低減に特に効果的である。複合体２および３はまた、基準複合体１、２および４より効果的である。最も効果的な複合体は、複合体２である。従って、複合体３の投与レベルは、同じ初期ノックダウンを達成するために約３倍低く、基準複合体４に比べて、より長い期間のノックダウンをもたらすであろうことが予測される。
【０３８３】
実施例９−複合体２の合成
化合物例を、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成した。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築は、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施した。ＧａｌＮＡｃ複合化は、必要な数の結合アミノ修飾リンカー構成単位を有する、以前に構築され精製されたオリゴヌクレオチドへのＧａｌＮＡｃ−カルボン酸構成単位のペプチド結合形成により達成された。
【０３８４】
オリゴヌクレオチド合成、脱保護および精製は、当技術分野において既知の標準的手順に従った。
【０３８５】
全てのオリゴヌクレオチドは、標準的ホスホラミダイト化学を用いて、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置で合成した。商業的に入手できる固体担体および２’Ｏ−メチルＲＮＡホスホラミダイト、２’フルオロ、２’デオキシＲＮＡホスホラミダイト（全て標準的保護、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，ＬｉｎｋＴｅｃｈ）および商業的に入手できる３’−アミノ修飾剤ＴＦＡアミノＣ−６  ｌｃａａ  ＣＰＧ  ５００Å（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）を使用した。過アセチル化ガラクトースアミン８は商業的に入手できる。
【０３８６】
付随的な試薬は、ＥＭＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。合成を、乾燥アセトニトリル中のホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液を用いて実施し、ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）（アセトニトリル中の０．３Ｍ）を活性化剤として使用した。カップリング時間は１５分であった。Ｃａｐ／ＯＸ／ＣａｐまたはＣａｐ／チオ／Ｃａｐサイクルを適用した（Ｃａｐ：Ａｃ２Ｏ／ＮＭＩ／ルチジン／アセトニトリル、酸化剤：ピリジン／Ｈ２Ｏ中の０．１ＭのＩ２）。ホスホロチオエートを、標準的な商業的に入手できるチオール化試薬（ＥＤＩＴＨ，Ｌｉｎｋ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて導入した。ＤＭＴ切断を、トルエン中の３％ジクロロ酢酸で処理することにより行った。プログラム合成繰り返しの完了時に、ジエチルアミン（ＤＥＡ）洗浄を実施した。全てのオリゴヌクレオチドをＤＭＴオフモードで合成した。
【０３８７】
セリノール由来リンカー部分の結合を、塩基担持（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート−ｌｃａａ−ＣＰＧ  10または（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）ホスホラミダイト  7を使用して達成した（合成は、文献：Ｈｏｅｖｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１６，７，１２８−１３５に記載のように行った）。三分岐ＧａｌＮＡｃクラスター（ＳＴ２３／Ｃ４ＸＬＴまたはＳＴ２３／Ｃ６ＸＬＴ）を、それぞれのｔｒｅｂｌｅｒアミダイト誘導体（Ｃ４ＸＬＴ−ｐｈｏｓまたはＣ６ＸＬＴ−ｐｈｏｓ）とそれに続く、ＧａｌＮＡｃアミダイト（ＳＴ２３−ｐｈｏｓ）の連続的カップリングにより導入した。
【０３８８】
一本鎖を、４０％のメチルアミン水溶液処理によりＣＰＧから切断した。得られた粗製オリゴヌクレオチドを、塩化ナトリウム勾配を用いて、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍのイオン交換クロマトグラフィー（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ、６ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。生成物含有画分をプールし、サイズ排除カラム（Ｚｅｔａｄｅｘ，ＥＭＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩し、凍結乾燥した。
【０３８９】
個別の一本鎖をＨ２Ｏ中の６０ＯＤ／ｍＬの濃度に溶解した。両方の個別のオリゴヌクレオチドを反応容器に一緒に加えた。反応監視を容易にするために、滴定を行った。第１の鎖を、２６０ｎｍでのＵＶ−吸収により測定して、第２の鎖に比べて２５％過剰で添加した。上記反応混合物を、８０℃に５分間加熱後、ゆっくり室温に冷却した。二本鎖形成をイオン対逆相ＨＰＬＣにより監視した。残留一本鎖ＵＶ面積から、第２の鎖の必要量を計算し、反応混合物に添加した。反応物を８０℃に再度加熱後、ゆっくり室温に冷却した。この手順を、１０％未満の残留一本鎖が検出されるまで反復した。
【０３９０】
化合物２〜１０の合成
化合物２〜５および（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−ホスホラミダイト７を、文献に発表された方法により合成した（Ｈｏｅｖｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１６，７，１２８−１３５）。
【０３９１】
（Ｓ）−４−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）プロポキシ）−４−オキソブタン酸（６）。
ピリジン中の５の溶液に、無水コハク酸、続いてＤＭＡＰを加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣにより判断して、全ての出発材料が消費された。反応物を濃縮した。粗製材料を、ＤＣＭ（＋１％トリエチルアミン）中の０％〜５％メタノール勾配を用いて、シリカゲルでクロマトグラフ処理して、１．３３ｇの６を得た（収率＝３８％）。ｍ／ｚ（ＥＳＩ−）：５８８．２（１００％）、（Ｃ３０Ｈ２９Ｆ３ＮＯ８−としての計算値  ［Ｍ−Ｈ］−  ５８８．６）。１Ｈ−ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ［ｐｐｍ］＝７．９４（ｄ，１Ｈ，ＮＨ），７．３９−７．３６（ｍ，２Ｈ，ＣＨアリール），７．２９−７．２５（ｍ，７Ｈ，ＣＨアリール），６．８２−６．７９（ｍ，４Ｈ，ＣＨアリール），４．５１−４．４７（ｍ，１Ｈ），４．３１−４．２４（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ，２ｘＤＭＴｒ−ＯＭｅ），３．６６−３．６０（ｍ，１６Ｈ，ＨＮＥｔ３＋），３．２６−３．２５（ｍ，２Ｈ），２．９７−２．８１（ｍ，２０Ｈ，ＮＥｔ３），２．５０−２．４１（４Ｈ，ｍ），１．４８−１．４５（ｍ，２６Ｈ，ＨＮＥｔ３＋），１．２４−１．１８（ｍ，２９Ｈ，ＮＥｔ３）。
【０３９２】
（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート−ｌｃａａ−ＣＰＧ（１０）
（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート（１５９ｍｇ、２７０ｕｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１１３ｍｇ、２９９ｕｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、９４μＬ、５４０ｕｍｏｌ）をその溶液に加え、混合物を２分間かきまぜた後、天然のアミノ−ｌｃａａ−ＣＰＧ（５００Ａ、３ｇ、アミノ含量：１３６ｕｍｏｌ／ｇ）を加えた。懸濁物を１６時間ｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ  ｓｈａｋｅｒ上で室温にて静かに振盪させた後、濾過し、ＤＣＭおよびＥｔＯＨで洗浄した。固体担体を減圧下で２時間乾燥させた。担体上の未反応アミンを無水酢酸／ルチジン／Ｎ−メチルイミダゾールと共に室温で撹拌することにより、キャップした。担体の洗浄を上記のように反復した。固体を減圧下で乾燥して、固体担体１０を得た（３ｇ、２６ｕｍｏｌ／ｇ担持量）。
【０３９３】
ＧａｌＮＡｃシントン（９）
ＧａｌＮＡｃシントン９の合成を、Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１４，１３６（４９），ｐｐ  １６９５８−１６９６１に記載の方法に従って実施した（２つのステップで４６％収率）。
特徴付けるデータは、発表データと一致した。
【０３９４】
オリゴヌクレオチドの合成
全ての一本鎖オリゴヌクレオチドは、上記および図１３および１４に記載の反応条件に従って合成された。
【０３９５】
全ての最終一本鎖生成物をＡＥＸ−ＨＰＬＣにより分析して、それらの純度を証明した。純度は、％ＦＬＰ（完全長生成物の％）で示され、これは、最終生成物のＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析のＵＶ出力における帰属生成物シグナル下のＵＶ面積のパーセンテージである。それぞれの一本鎖生成物（非修飾、アミノ修飾、前駆物質、Ｃ４ＸＬＴ／ＳＴ２３またはＣ６ＸＬＴ／ＳＴ２３  ＧａｌＮＡｃ複合化オリゴヌクレオチド）の確認を、ＬＣ−ＭＳ分析により実施した。
【表９】
2021502120.tif 000090
【０３９６】
複合体１〜３および基準複合体１〜２の合成
複合体１〜２および基準複合体１〜２のための複合化一本鎖
ＧａｌＮＡｃシントン（９）の複合化は、ペプチドカップリング剤を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖１１のセリノールアミノ官能基へのカップリングにより達成された。従って、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子１１をＨ２Ｏに溶解し（５００ＯＤ／ｍＬ）、ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ、２／１、ｖ／ｖ）を加え、続けて、ＤＩＰＥＡ（総体積の２．５％）を加えた。別の反応容器中で、ＧａｌＮ（Ａｃ４）−Ｃ４−酸（９）の予備活性化を、ＤＭＳＯ中の８当量のＤＩＰＥＡの存在下で２当量（アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド１１中のアミノ官能基当たり）のカルボン酸成分を２当量のＨＢＴＵと反応させることにより実施した。２分後に、予備活性化化合物９がそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子の溶液に添加された。３０分後に、反応の進行をＬＣＭＳまたはＡＥＸ−ＨＰＬＣでモニターした。複合化反応の完結時に、粗生成物を１０ｘ  ｉＰｒＯＨ  ０．１ｘ２Ｍ  ＮａＣｌの添加により沈殿させ、遠心分離およびデカンテーションにより回収した。ＧａｌＮＡｃ部分中のアセチル化ヒドロキシル基を解放するために、得られたペレットを４０％のＭｅＮＨ２中に溶解し（１ｍＬ／５００ＯＤ）、１５分後に室温にてＨ２Ｏで希釈し（１：１０）、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより最終的に再度精製し、凍結乾燥して、最終生成物１２を得た。
【表１０】
2021502120.tif 000091
【０３９７】
二本鎖形成
二本鎖形成を上記の方法に従い実施した。
二本鎖純度は、％二本鎖で与えられ、これは、ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ分析のＵＶ出力における帰属生成物シグナル下のＵＶ面積のパーセンテージである。
【表１１】
2021502120.tif 000092
【０３９８】
配列
次の配列に対する修飾の凡例：
ｆは、２’フルオロ  ２’デオキシリボヌクレオチドまたは２’−フルオロリボヌクレオチドを意味する（これらの用語は、互換性がある）。
ｍは、２’Ｏメチルリボヌクレオチドを意味する。
（ｐｓ）は、ホスホロチオエート結合を意味する。
Ｓｅｒ（ＧＮ）は、セリノール由来リンカー部分：
【化７０】
2021502120.tif 000093
に結合されたＧａｌＮＡｃ−Ｃ４構成単位であり、式中、Ｏ−−−は、酸素原子と、例えば、Ｈ、リン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合の間の結合である。
Ｃ４ＸＬＴは：
【化７１】
2021502120.tif 000094
であり；
Ｃ６ＸＬＴは：
【化７２】
2021502120.tif 000095
であり；
ＳＴ２３は：
【化７３】
2021502120.tif 000096
である。
【０３９９】
Ｃ４ＸＬＴ（Ｃ４ＸＬＴ−ｐｈｏｓ）、Ｃ６ＸＬＴ（Ｃ６ＸＬＴ−ｐｈｏｓ）ならびにＳＴ２３（ＳＴ２３−ｐｈｏｓ）のホスホラミダイト誘導体の合成は、国際公開第２０１７／１７４６５７号に記載されるように行われてよい。
Ｃ４ＸＬＴ−ｐｈｏｓは：
【化７４】
2021502120.tif 000097
であり、
Ｃ６ＸＬＴ−ｐｈｏｓは：
【化７５】
2021502120.tif 000098
であり；
ＳＴ２３−ｐｈｏｓは：
【化７６】
2021502120.tif 000099
である。
【０４００】
実施例１０
カニクイザル初代培養肝細胞において第２の鎖の５’位置での三分岐ＧａｌＮＡｃユニットの場合と比較した第２の鎖に結合された２つの単一ＧａｌＮＡｃユニットを有するＬＰＡ標的化ｓｉＲＮＡに対するノックダウンの同等の用量応答。
【０４０１】
ｓｉＲＮＡは、交互２’−ＯＭｅ／２’−Ｆにより修飾され、５‘および３’末端の２つのヌクレオチド間結合の位置に、それぞれ２つのホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含む。複合体１９では、１つのセリノール−ＧａｌＮＡｃユニットそれぞれが、第２の鎖の５’および３’にＰＳ結合を介して結合される。複合体２０では、第２の鎖の２つの末端５’ヌクレオチド間がリン酸ジエステルであり、三分岐ＧａｌＮＡｃリンカーは、この末端にＰＳ結合を介して結合される。
【０４０２】
カニクイザル初代培養肝細胞におけるＬＰＡノックダウンの用量応答を、１００、２０、４、０．８、０．１６、０．０３２、および０．００６ｎＭのｓｉＲＮＡによる治療後２４時間に評価した。参照対照は構築物２であり、非標的化対照はＣｔｒと命名される。各治療群の転写物ｃｔ値をハウスキーピング遺伝子ＡＣＴＢ（Δｃｔ）に対し、およびｕｔ（ΔΔｃｔ）と呼ばれる未治療肝細胞に対し正規化した。
データを図１８に示す。
【０４０３】
材料および方法：
ｓｉＲＮＡ
【表１２】
2021502120.tif 000100
プライマー：
【表１３】
2021502120.tif 000101
【０４０４】
一般的方法
インビトロ実験
マウス初代培養肝細胞（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ：ＧＩＢＣＯ  Ｌｏｔ：＃ＭＣ７９８）を解凍し、凍結保存培地を、５％ＦＢＳ、１μＭのデキサメタゾン、２ｍＭのＧｌｕｔａＭａｘ、１％のＰｅｎＳｔｒｅｐ、４ｍｇ／ｍｌのヒト組換えインスリン、１５ｍＭのＨＥＰＥＳを補充したＷｉｌｌｉａｍｓ  Ｅ培地と交換した。細胞密度を２５００００細胞／１ｍｌに調節した。１００μｌ／ウェルのこの細胞懸濁液をコラーゲンプリコート９６ウェルプレートに播種した。試験品を各濃度について、同じ培地中で前希釈し（５倍濃縮）、この前希釈ｓｉＲＮＡまたは培地のみの２５μｌを細胞に加えた。細胞を５％ＣＯ２下、３７℃で培養した。処理の２４時間後に、上清を廃棄し、細胞を冷ＰＢＳで洗浄し、２５０μｌのＲＮＡリシスバッファー  Ｓ（Ｓｔｒａｔｅｃ）を加えた。１５分の室温でのインキュベーション後、プレートを製造業者のプロトコルに従ってＲＮＡ単離を行うまで−８０℃で貯蔵した。
【０４０５】
ＴａｑＭａｎ分析
ｍＴＴＲおよびＰＴＥＮマルチプレックスＴａｑＭａｎ分析のために、各治療群の１０μｌの単離ＲＮＡを、６００ｎＭのｍＴＴＲ−プライマー、４００ｎＭのＡｐｏＢプライマーおよび２００ｎＭの各プローブならびに０．２ユニットのＲＮアーゼ阻害剤含有０．５ユニットのＥｕｒｏｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴポリメラーゼを含む１０μｌのＰＣＲマスターミックス（ＴＡＫＹＯＮ  ｌｏｗ  Ｒｏｘ）と混合した。ＴａｑＭａｎ分析を、４８℃で１０分のＲＴステップ、９５℃で３分の初期変性ならびに９５℃で１０秒および６０℃で１分の４０サイクルにより、３８４ウェルプレート中で実施した。プライマーは、ＢＨＱ１、ＦＡＭおよびＹＹの内の２つを、配列のそれぞれの末端で１つずつ含む。
【０４０６】
ＴＭＰＲＳＳ６およびＡｐｏＢマルチプレックスＴａｑＭａｎ分析のために、各治療群の１０μｌの単離ＲＮＡを、８００ｎＭのＴＭＰＲＳＳ６プライマー、１００ｎＭのＡｐｏＢプライマーおよび２００ｎＭのどちらかのプローブならびに０．２ユニットのＲＮアーゼ阻害剤含有０．５ユニットのＥｕｒｏｓｃｒｉｐｔ  ＩＩ  ＲＴポリメラーゼを含む１０μｌのＰＣＲマスターミックス（ＴＡＫＹＯＮ  ｌｏｗ  Ｒｏｘ）と混合した。ＴａｑＭａｎ分析を、４８℃で１０分のＲＴステップ、９５℃で３分の初期変性ならびに９５℃で１０秒および６０℃で１分の４０サイクルにより、３８４ウェルプレート中で実施した。
【０４０７】
インビボ実験
種々のｓｉＲＮＡ複合体のインビボ効力を比較するために、ＰＢＳに溶解した１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡをＣ５７ＢＬ／６マウスの肩甲部の皮下に投与した。ｎ＝６のコホートを、１日目に、Ａｌｄｈ２またはＴｍｐｒｓｓ６を標的とするｓｉＲＮＡで治療し、治療後の選択した時点で屠殺した。肝臓試料を、液体窒素中で急速凍結し、製造業者のマニュアルに従うＩｎｖｉＴｒａｐ  Ｓｐｉｎ  Ｔｉｓｓｕｅ  ＲＮＡ  Ｍｉｎｉ  Ｋｉｔ（ｓｔｒａｔｅｃ）でのＲＮＡ抽出まで、−８０℃で貯蔵した。続けて、Ａｌｄｈ２、Ｔｍｐｒｓｓ６およびＰｔｅｎの転写物レベルを上述のように定量した。
【０４０８】
トリトソーム安定性アッセイ
インビトロで肝臓細胞のエンドソーム／リソソームコンパートメント中のＲＮアーゼ安定性を調べるために、ｓｉＲＮＡをスプラーグドーリーラットラット肝臓トリトソーム（Ｔｅｂｕ−Ｂｉｏ，ＣａｔＮ．：Ｒ０６１０．ＬＴ，ｌｏｔ：１６１０４０５，ｐＨ：７．４，２．８２７Ｕｎｉｔｓ／ｍｌ）中で０時間、４時間、２４時間または７２時間にわたりインキュベートした。酸性化環境を模擬するために、トリトソームを１：１０で低ｐＨ緩衝剤（１．５Ｍ酢酸、１．５Ｍ酢酸ナトリウム  ｐＨ４．７５）と混合した。次に、１０μｌのｓｉＲＮＡ（２０μＭ）を３０μｌのこの酸性化トリトソームと混合し、３７℃で示した時間にわたりインキュベートした。インキュベーション後、ＲＮＡを、生体液用の製品プロトコルに従いＣｌａｒｉｔｙ  ＯＴＸ  Ｓｔａｒｔｅｒ  Ｋｉｔ−Ｃａｒｔｒｉｇｅｓ（Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ  ＣａｔＮｏ：ＫＳＯ−８４９４）で単離した。凍結乾燥ＲＮＡを３０μｌのＨ２Ｏ中で再構成し、４ｘローディングバッファーと混合し、５μｌを分離、定性的半定量分析のための２０％ＴＢＥ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）にロードした。ＰＡＧＥを１２０Ｖで２時間実施し、ＲＮＡを、臭化エチジウム染色とこれに続くＢｉｏｒａｄ  Ｉｍａｇｉｎｇ  ｓｙｓｔｅｍを用いるデジタル画像化により可視化した。
【０４０９】
実施例１１−複合体３の合成
化合物例を、下記の方法および当業者に既知の方法に従って合成した。オリゴヌクレオチド鎖およびリンカー構成単位の構築を、ホスホラミダイト法を適用して固相合成により実施した。ＧａｌＮＡｃ複合化は、必要な数の結合されたアミノ修飾リンカー構成単位を有する、以前に構築され精製されたオリゴヌクレオチドへのＧａｌＮＡｃ−カルボン酸構成単位のペプチド結合形成により達成された。
【０４１０】
オリゴヌクレオチド合成、脱保護および精製は、当技術分野において既知の標準的手順に従った。
【０４１１】
全てのオリゴヌクレオチドを、標準的ホスホラミダイト化学を用いて、ＡＫＴＡ  ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成装置で合成した。商業的に入手できる固体担体および２’Ｏ−メチルＲＮＡホスホラミダイト、２’フルオロ、２’デオキシＲＮＡホスホラミダイト（全て標準的保護、ＣｈｅｍＧｅｎｅｓ，ＬｉｎｋＴｅｃｈ）および商業的に入手できる３’−アミノ修飾剤ＴＦＡアミノＣ−６  ｌｃａａ  ＣＰＧ  ５００Å（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）、Ｆｍｏｃ−アミノ−ＤＭＴ  Ｃ−７  ＣＥホスホラミダイト（ＧｌｙＣ３Ａｍ）、３’−アミノ修飾剤Ｃ−３  ｌｃａａ  ＣＰＧ  ５００Å（Ｃ３Ａｍ）、Ｆｍｏｃ−アミノ−ＤＭＴ  Ｃ−３  ＣＥＤホスホラミダイト（Ｃ３Ａｍ）およびＴＦＡ−アミノＣ−６  ＣＥＤホスホラミダイト（Ｃ６Ａｍ）（Ｃｈｅｍｇｅｎｅｓ）、３’−アミノ−修飾剤Ｃ７  ＣＰＧ（Ｃ７Ａｍ）（Ｇｌｅｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ）、非ヌクレオシドＴＦＡアミノホスホラミダイト（Ｐｉｐ）、非ヌクレオシドＴＦＡアミノ固体担体（ＰｉｐＡｍ）（ＡＭ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を使用した。過アセチル化ガラクトースアミン８は商業的に入手できる。
【０４１２】
付随的な試薬を、ＥＭＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈから購入した。合成を、乾燥アセトニトリル中のホスホラミダイトの０．１Ｍ溶液を用いて実施し、ベンジルチオテトラゾール（ＢＴＴ）（アセトニトリル中の０．３Ｍ）を活性化剤として使用した。カップリング時間は１５分であった。Ｃａｐ／ＯＸ／ＣａｐまたはＣａｐ／チオ／Ｃａｐサイクルを適用した（Ｃａｐ：Ａｃ２Ｏ／ＮＭＩ／ルチジン／アセトニトリル、酸化剤：ピリジン／Ｈ２Ｏ中の０．１ＭのＩ２）。ホスホロチオエートを、標準的な商業的に入手できるチオール化試薬（ＥＤＩＴＨ，Ｌｉｎｋ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて導入した。ＤＭＴ切断を、トルエン中の３％ジクロロ酢酸での処理により行った。プログラム合成繰り返しの完了時に、ジエチルアミン（ＤＥＡ）洗浄を実施した。全てのオリゴヌクレオチドをＤＭＴオフモードで合成した。
【０４１３】
セリノール由来リンカー部分の結合を、塩基担持（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート−ｌｃａａ−ＣＰＧ  10または（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）ホスホラミダイト  7を使用して達成した（合成は、Ｈｏｅｖｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．（２０１６）に記載のように行った）。三分岐ＧａｌＮＡｃクラスター（ＳＴ２３／Ｃ４ＸＬＴ）を、それぞれのｔｒｅｂｌｅｒアミダイト誘導体（Ｃ４ＸＬＴ−ｐｈｏｓ）とそれに続く、ＧａｌＮＡｃアミダイト（ＳＴ２３−ｐｈｏｓ）の連続的カップリングにより導入した。
【０４１４】
アミノ修飾部分（非セリノール由来リンカー）の結合を、それぞれの商業的に入手できるアミノ修飾構成単位ＣＰＧまたはアミダイトの使用により達成した。
【０４１５】
一本鎖を、４０％のメチルアミン水溶液処理によりＣＰＧから切断した。得られた粗製オリゴヌクレオチドを、塩化ナトリウム勾配を用いて、ＡＫＴＡ  Ｐｕｒｅ  ＨＰＬＣ  Ｓｙｓｔｅｍのイオン交換クロマトグラフィー（Ｒｅｓｏｕｒｃｅ  Ｑ、６ｍＬ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により精製した。生成物含有画分をプールし、サイズ排除カラム（Ｚｅｔａｄｅｘ，ＥＭＰ  Ｂｉｏｔｅｃｈ）で脱塩し、凍結乾燥した。
【０４１６】
個別の一本鎖をＨ２Ｏ中の６０ＯＤ／ｍＬの濃度に溶解した。両方の個別のオリゴヌクレオチドを反応容器に一緒に加えた。反応監視を容易にするために、滴定を行った。第１の鎖を、２６０ｎｍでのＵＶ−吸収により測定して、第２の鎖に比べて２５％過剰で添加した。上記反応混合物を、８０℃に５分間加熱後、ゆっくり室温に冷却した。二本鎖形成をイオン対逆相ＨＰＬＣにより監視した。残留一本鎖ＵＶ面積から、第２の鎖の必要量を計算し、反応混合物に添加した。反応物を８０℃に再度加熱し、ゆっくり室温に冷却した。この手順を、１０％未満の残留一本鎖が検出されるまで反復した。
【０４１７】
化合物２〜１０の合成
化合物２〜５および（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−ホスホラミダイト７を、文献に発表された方法により合成した（Ｈｏｅｖｅｌｍａｎｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．，２０１６，７，１２８−１３５）。
【０４１８】
（Ｓ）−４−（３−（ビス（４−メトキシフェニル）（フェニル）メトキシ）−２−（２，２，２−トリフルオロアセトアミド）プロポキシ）−４−オキソブタン酸（６）。
ピリジン中の５の溶液に、無水コハク酸、続いてＤＭＡＰを加えた。得られた混合物を室温で一晩撹拌した。ＴＬＣにより判断して、全ての出発材料が消費された。反応物を濃縮した。粗製材料を、ＤＣＭ（＋１％トリエチルアミン）中の０％〜５％メタノール勾配を用いて、シリカゲルでクロマトグラフ処理して、１．３３ｇの６を得た（収率＝３８％）。ｍ／ｚ（ＥＳＩ−）：５８８．２（１００％）、（Ｃ３０Ｈ２９Ｆ３ＮＯ８−としての計算値  ［Ｍ−Ｈ］−  ５８８．６）。１Ｈ−ＮＭＲ：（４００ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）δ［ｐｐｍ］＝７．９４（ｄ，１Ｈ，ＮＨ），７．３９−７．３６（ｍ，２Ｈ，ＣＨアリール），７．２９−７．２５（ｍ，７Ｈ，ＣＨアリール），６．８２−６．７９（ｍ，４Ｈ，ＣＨアリール），４．５１−４．４７（ｍ，１Ｈ），４．３１−４．２４（ｍ，２Ｈ），３．７７（ｓ，６Ｈ，２ｘＤＭＴｒ−ＯＭｅ），３．６６−３．６０（ｍ，１６Ｈ，ＨＮＥｔ３＋），３．２６−３．２５（ｍ，２Ｈ），２．９７−２．８１（ｍ，２０Ｈ，ＮＥｔ３），２．５０−２．４１（４Ｈ，ｍ），１．４８−１．４５（ｍ，２６Ｈ，ＨＮＥｔ３＋），１．２４−１．１８（ｍ，２９Ｈ，ＮＥｔ３）。
【０４１９】
（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート−ｌｃａａ−ＣＰＧ（１０）
（Ｓ）−ＤＭＴ−セリノール（ＴＦＡ）−スクシネート（１５９ｍｇ、２７０ｕｍｏｌ）およびＨＢＴＵ（１１３ｍｇ、２９９ｕｍｏｌ）をＣＨ３ＣＮ（１０ｍＬ）に溶解した。ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、９４μＬ、５４０ｕｍｏｌ）をその溶液に加え、混合物を２分間かきまぜた後、天然のアミノ−ｌｃａａ−ＣＰＧ（５００Ａ、３ｇ、アミノ含量：１３６ｕｍｏｌ／ｇ）を加えた。懸濁物を１６時間ｗｒｉｓｔ−ａｃｔｉｏｎ  ｓｈａｋｅｒ上で室温にて静かに振盪させた後、濾過し、ＤＣＭおよびＥｔＯＨで洗浄した。固体担体を減圧下で２時間乾燥させた。担体上の未反応アミンを、無水酢酸／ルチジン／Ｎ−メチルイミダゾールと共に室温で撹拌することによりキャップした。担体の洗浄を上記のように反復した。固体を減圧下で乾燥して、固体担体１０を得た（３ｇ、２６ｕｍｏｌ／ｇ担持量）。
【０４２０】
ＧａｌＮＡｃシントン（９）
ＧａｌＮＡｃシントン９の合成を、Ｎａｉｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．，２０１４，１３６（４９），ｐｐ  １６９５８−１６９６１に記載の方法に従って実施した（２つのステップで４６％収率）。
特徴付けるデータは、発表データと一致した。
【０４２１】
オリゴヌクレオチドの合成
全ての一本鎖オリゴヌクレオチドは、上記および図１３および１４に記載の反応条件に従って合成され、表１０および１１に概要が示される。
【０４２２】
全ての最終一本鎖生成物をＡＥＸ−ＨＰＬＣにより分析して、それらの純度を証明した。純度は、％ＦＬＰ（完全長生成物の％）で示され、これは、最終生成物のＡＥＸ−ＨＰＬＣ分析のＵＶ出力における帰属生成物シグナル下のＵＶ面積のパーセンテージである。それぞれの一本鎖生成物（非修飾、アミノ修飾、前駆物質またはＧａｌＮＡｃ複合化オリゴヌクレオチド）の確認を、ＬＣ−ＭＳ分析により実施した。
【表１４】
2021502120.tif 000102
【０４２３】
５’１ｘＮＨ２は、複合化に利用可能な遊離セリノール由来アミノ基の位置（５’末端）および数（１ｘＮＨ２）を意味する。例えば、Ａ０２６４上の１ｘ３’ＮＨ２は、鎖Ａ０２６４の３’末端でＧａｌＮＡｃシントン９と反応させることができる遊離アミノ基があることを意味する。３’５’１ｘＮＨ２は、鎖の３’末端および５’末端でＧａｌＮＡｃリンカー９と反応させることができる一つのセリノール由来遊離アミノ基があることを意味する。
【表１５】
2021502120.tif 000103
【０４２４】
同様に、３’５’１ｘＮＨ２は、複合化に利用可能な遊離アミノ基の位置（３’および５’末端）および数（それぞれ１ｘＮＨ２）を指す。例えば、Ａ０５６１上の３’５’１ｘＮＨ２は、鎖Ａ０５６１の３’末端でＧａｌＮＡｃシントン９と反応させることができる２個の遊離アミノ基（３’末端に１個、および５’末端に１個）があることを意味する。
【０４２５】
本発明の特定の複合体および基準複合体１〜２の合成
ＧａｌＮＡｃシントン（９）の複合化は、ペプチドカップリング剤を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖１１のセリノールアミノ官能基へのカップリングにより達成された。従って、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子１１をＨ２Ｏに溶解し（５００ＯＤ／ｍＬ）、ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ、２／１、ｖ／ｖ）を加え、続けて、ＤＩＰＥＡ（総体積の２．５％）を加える。別の反応容器中で、ＧａｌＮ（Ａｃ４）−Ｃ４−酸（９）の予備活性化を、ＤＭＳＯ中の８当量のＤＩＰＥＡの存在下で２当量（アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド１１中のアミノ官能基当たり）のカルボン酸成分を２当量のＨＢＴＵと反応させることにより実施した。２分後に、予備活性化化合物９がそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子の溶液に添加された。３０分後に、反応の進行をＬＣＭＳまたはＡＥＸ−ＨＰＬＣでモニターした。複合化反応の完結時に、粗生成物を１０ｘｉＰｒＯＨおよび０．１ｘ２Ｍ  ＮａＣｌの添加により沈殿させ、遠心分離およびデカンテーションにより回収した。ＧａｌＮＡｃ部分中のアセチル化ヒドロキシル基を解放するために、得られたペレットを４０％のＭｅＮＨ２中に溶解し（１ｍＬ／５００ＯＤ）、室温で１５分後、Ｈ２Ｏで希釈し（１：１０）、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより最終的に再度精製し、凍結乾燥して、最終生成物１２（表１２）を得た。
【表１６】
2021502120.tif 000104
【０４２６】
本発明の特定の複合体の合成
ＧａｌＮＡｃシントン（９）の複合化は、ペプチドカップリング剤を用いて、それぞれのオリゴヌクレオチド鎖１４のアミノ官能基へのカップリングにより達成された。従って、それぞれのアミノ修飾前駆物質分子１４をＨ２Ｏ（５００  OD/ｍｌ）に溶解し、ＤＭＳＯ（ＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ、２／１、ｖ／ｖ）を加え、続けて、ＤＩＰＥＡ（総体積の２．５％）を加える。別の反応容器中で、ＧａｌＮ（Ａｃ４）−Ｃ４−酸（９）の予備活性化を、ＤＭＳＯ中の８当量のＤＩＰＥＡの存在下で２当量（アミノ修飾前駆物質オリゴヌクレオチド１４中のアミノ官能基当たり）のカルボン酸成分を２当量のＨＢＴＵと反応させることにより実施した。２分後に、予備活性化化合物９がそれぞれのアミノ修飾前駆物質分子の溶液に添加された。３０分後に、反応の進行をＬＣＭＳまたはＡＥＸ−ＨＰＬＣでモニターした。複合化反応の完結時に、粗生成物を、１０ｘｉＰｒＯＨおよび０．１ｘ２Ｍ  ＮａＣｌの添加により沈殿させ、遠心分離およびデカンテーションにより回収した。ＧａｌＮＡｃ部分中のアセチル化ヒドロキシル基を解放するために、得られたペレットを４０％のＭｅＮＨ２中に溶解し（１ｍＬ／５００ＯＤ）、室温で１５分後、Ｈ２Ｏで希釈し（１：１０）、アニオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィーにより最終的に再度精製し、凍結乾燥して、最終生成物１５（表１３）を得た。
【表１７】
2021502120.tif 000105
【０４２７】
二本鎖形成
二本鎖形成を上記の方法に従い実施した。
二本鎖純度は、％二本鎖で与えられ、これは、ＩＰ−ＲＰ−ＨＰＬＣ分析のＵＶ出力における帰属生成物シグナル下のＵＶ面積のパーセンテージである（表１４）。
【表１８】
2021502120.tif 000106
【０４２８】
配列
次の配列に対する修飾の凡例：
ｆは、２’フルオロ  ２’デオキシリボヌクレオチドまたは２’−フルオロリボヌクレオチドを意味する（これらの用語は、互換性がある）。
ｍは、２’Ｏメチルリボヌクレオチドを意味する。
（ｐｓ）は、ホスホロチオエート結合を意味する。
ＦＡＭ＝６−カルボキシフルオレセイン
ＢＨＱ＝Ｂｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １
ＹＹ＝Ｙａｋｉｍａ  Ｙｅｌｌｏｗ
【０４２９】
定義
Ｓｅｒ（ＧＮ）は、セリノール由来リンカー部分：
【化７７】
2021502120.tif 000107
に結合されたＧａｌＮＡｃ−Ｃ４構成単位であり、式中、Ｏ−−−は、酸素原子と、例えば、Ｈ、リン酸ジエステル結合またはホスホロチオエート結合の間の結合である。
ＧＮは：
【化７８】
2021502120.tif 000108
であり；
Ｃ４ＸＬＴ（ＳＴ４１としても知られる）は：
【化７９】
2021502120.tif 000109
であり；
ＳＴ２３は：
【化８０】
2021502120.tif 000110
である；
【０４３０】
Ｃ４ＸＬＴ（Ｃ４ＸＬＴ−ｐｈｏｓ）ならびにＳＴ２３（ＳＴ２３−ｐｈｏｓ）のホスホラミダイト誘導体の合成は、国際公開第２０１７／１７４６５７号に記載されるように行ってよい。
Ｃ４ＸＬＴ−ｐｈｏｓは：
【化８１】
2021502120.tif 000111
であり；
ＳＴ２３−ｐｈｏｓは：
【化８２】
2021502120.tif 000112
である。
【表１９】
2021502120.tif 000113
式中、Ｇ＝Ｈ（複合化前）またはＧ＝ＧＮ（複合化後）である。
複合体１
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１ＡＬ３３（配列番号１２７）
５’  ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）３’
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＬ２０（配列番号１２８）
５’Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ  ３’
複合体２
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＶ１Ｌ４２（配列番号１３０）
Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）
複合体３
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１ＡＬ３３（配列番号１２７）
５’  ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）３’
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＶ１Ｌ４２（配列番号１３０）
５’  Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）３´
複合体４
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＶ１Ｌ７５（配列番号１４２）
５’  Ｓｅｒ（ＧＮ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ  Ｓｅｒ（ＧＮ）３’
複合体５
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＶ１６Ｌ４２（配列番号１４３）
５’  Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＡ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）３’
複合体６
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＶ２０Ｌ７５（配列番号１４４）
５’  Ｓｅｒ（ＧＮ）ｆＡ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＡ  Ｓｅｒ（ＧＮ）３’
複合体７
アンチセンス鎖−（配列番号１２９）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＶ１Ｌ９４（配列番号１４５）
５’  Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）３’
複合体８
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
５’  ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ  ３’
センス鎖−ＳＴＳ１６００１Ｖ１ＢＬ９６（配列番号１４６）
５’  Ｃ６Ａｍ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）Ｃ７Ａｍ（ＧＮ）３’
複合体９
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
５’  ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ  ３’
センス鎖−ＳＴＳ１６００１Ｖ１ＢＬ９７（配列番号１４７）
５’  ＧｌｙＣ３Ａｍ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ＧｌｙＣ３Ａｍ（ＧＮ）３’
複合体１０
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
５’  ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ  ３’
アンチセンス鎖−（配列番号１４８）
５’  ＰｉｐＡｍ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ＰｉｐＡｍ（ＧＮ）３’
複合体１１
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
５’  ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ  ３’
センス鎖−ＳＴＳ１６００１Ｖ１ＢＬ８８（配列番号１４９）
５’  Ｃ３Ａｍ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）Ｃ３Ａｍ（ＧＮ）３’
複合体１２
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
５’  ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ  ３’
センス鎖−ＳＴＳ１６００１Ｖ１ＢＬ８７（配列番号１５０）
５’  Ｃ６Ａｍ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ＧｌｙＣ３Ａｍ（ＧＮ）３’
複合体１５
アンチセンス鎖（配列番号１５１）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＣ（ｐｓ）ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ  ｆＡ  ｍＧ  ｆＵ  ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＣ
アンチセンス鎖（配列番号１５２）
Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＧ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＵ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ（ｐｓ）ｍＧ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）
複合体１６
アンチセンス鎖（配列番号１５３）
ｍＡ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＧ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＡ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ（ｐｓ）ｆＣ（ｐｓ）ｍＵ
アンチセンス鎖（配列番号１５４）
Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＧ（ｐｓ）ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＣ  ｍＵ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＣ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）
複合体１８
アンチセンス鎖（配列番号１５５）
ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＣ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＧ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＵ（ｐｓ）ｆＧ（ｐｓ）ｍＡ
アンチセンス鎖（配列番号１５６）
Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＣ（ｐｓ）ｆＡ  ｍＣ  ｆＣ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＣ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ  ｆＧ（ｐｓ）ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）
複合体１９
アンチセンス鎖（配列番号１３５）
ｍＡ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＣ（ｐｓ）ｆＣ（ｐｓ）ｍＧ
センス鎖（配列番号１３６）
Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＣ  （ｐｓ）  ｍＧ（ｐｓ）ｆＧ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＵ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）
基準複合体１
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１Ａ（配列番号１２９）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＬ２０（配列番号１２８）
Ｓｅｒ（ＧＮ）（ｐｓ）ｆＡ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ
基準複合体２
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１ＡＬ３３（配列番号１２７）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ（ｐｓ）Ｓｅｒ（ＧＮ）
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＶ１（配列番号１５７）
ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ
基準複合体３−「Ｌｕｃ」
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１８００１Ａ（Ａ０１３０；配列番号１３２）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＣ（ｐｓ）ｍＧ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＵ  ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ（ｐｓ）ｍＧ
センス鎖−ＳＴＳ１８００１ＢＬ４（Ａ０１３１、配列番号１３３）
［（ＳＴ２３）（ｐｓ）］３  Ｃ４ＸＬＴ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＧ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＣ（ｐｓ）ｍＧ（ｐｓ）ｆＡ
基準複合体４
アンチセンス鎖−ＳＴＳ１６００１ＡＬ３３（配列番号１２７）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ
センス鎖−ＳＴＳ１６００１ＢＬ４（配列番号１３４）
５’［（ＳＴ２３）（ｐｓ）］３  Ｃ４ＸＬＴ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＡ
基準複合体５−「Ｃｔｒ」
アンチセンス鎖（配列番号１３８）
ｍＣ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＵ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＣ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ（ｐｓ）ｆＧ（ｐｓ）ｍＡ
センス鎖（配列番号１３９）
［（ＳＴ２３）（ｐｓ）］３（Ｃ６ＸＬＴ）（ｐｓ）ｆＵ  ｍＣ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＡ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＧ
基準複合体６
アンチセンス鎖（配列番号１５１）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＣ（ｐｓ）ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ  ｆＡ  ｍＧ  ｆＵ  ｍＵ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＣ
センス鎖（配列番号１５８）
［ＳＴ２３（ｐｓ）］３  ｌｔｒｂ（ｐｓ）ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＵ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ（ｐｓ）ｍＧ（ｐｓ）ｆＡ
基準複合体７
アンチセンス鎖（配列番号１５３）
ｍＡ（ｐｓ）ｆＵ（ｐｓ）ｍＧ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＡ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ（ｐｓ）ｆＣ（ｐｓ）ｍＵ
チセンス鎖（配列番号１５９）
［ＳＴ２３（ｐｓ）］３  ｌｔｒｂ（ｐｓ）ｆＡ  ｍＧ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＣ  ｍＵ  ｆＣ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＡ  ｆＣ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＵ
基準複合体８
アンチセンス鎖（配列番号１６０）
ｍＵ（ｐｓ）ｆＡ（ｐｓ）ｍＣ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＡ  ｍＧ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＵ（ｐｓ）ｆＧ（ｐｓ）ｍＡ
センス鎖（配列番号１６１）
［ＳＴ２３（ｐｓ）］３  ＳＴ４１（ｐｓ）ｆＵ  ｍＣ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＣ  ｍＵ  ｆＧ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＣ  ｍＵ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ  ｆＧ（ｐｓ）ｍＵ（ｐｓ）ｆＡ
基準複合体９
アンチセンス鎖（配列番号１３５）
ｍＡ（ｐｓ）ｆＵ  （ｐｓ）  ｍＡ  ｆＡ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＵ  ｍＧ  ｆＵ  ｍＣ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＵ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＣ（ｐｓ）ｆＣ（ｐｓ）ｍＧ
センス鎖（配列番号１６２）
［ＳＴ２３（ｐｓ）］３  Ｃ６ＸＬＴ（ｐｓ）ｆＣ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＡ  ｍＡ  ｆＵ  ｍＧ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＣ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＡ  ｆＧ  ｍＵ  ｆＵ（ｐｓ）ｍＡ（ｐｓ）ｆＵ
【０４３１】
実施例１２−種々のＴＴＲ  ｓｉＲＮＡ  ＧａｌＮＡｃ複合体のＴＴＲノックダウンのインビトロ測定
複合体１〜３
マウス初代培養肝細胞を３０，０００細胞／ウェルの濃度で、コラーゲンプリコート９６ウェルプレート（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、＃Ａ１１４２８０３）に播種し、１０ｎＭ〜０．０００１ｎＭの範囲の濃度のｓｉＲＮＡ複合体で処理した。処理の２４時間後、細胞を溶解しＲＮＡを製品プロトコルに従いＩｎｖｉＴｒａｐ（登録商標）ＲＮＡ  Ｃｅｌｌ  ＨＴＳ  ９６キット／Ｃ２４ｘ９６ｐｒｅｐｓ（Ｓｔｒａｔｅｃ  ＃７０６１３００４００）を用いて抽出した。ＴＴＲおよびハウスキーピングｍＲＮＡ（ＰｔｅｎＩＩ）の転写物レベルをＴａｑＭａｎ分析により定量化した。
【０４３２】
本発明の複合体、複合体１〜３による、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭおよび１０ｎＭでの処理の２４時間後のマウス初代培養細胞中の標的遺伝子発現は、図１５に示すように、標的遺伝子発現が陰性対照（「ＵＴ」バーおよび基準複合体３を参照）に比較して、複合体の用量が増加するに伴い減少することを示した。これは、第１の鎖が標的遺伝子に結合し、それにより遺伝子発現を低減させることを示す。図１５はまた、対照薬複合体として機能する基準複合体１および２の標的遺伝子発現レベルを示す。図１５Ａと１５Ｃ、および１５Ｂと１５Ｃに示されるデータ間の比較から認められるように、本発明の複合体（複合体１〜３）は、基準複合体１および２に比べて、標的遺伝子発現を低減させる。０．０１ｎＭで最も効果的な複合体は、複合体２であるように見える。０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭおよび１０ｎＭで最も効果的な複合体は、複合体３であるように見える。
【０４３３】
複合体４〜７
一般的方法セクション中の「インビトロ実験」下の上記方法に従った。
本発明の複合体、複合体４〜７による、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭおよび１０ｎＭでの処理の２４時間後のマウス初代培養細胞中の標的遺伝子発現は、図３１に示すように、標的遺伝子発現が陰性対照（「ＵＴ」バーおよびＬｕｃ［基準複合体３］を参照）に比較して、複合体の用量が増加するに伴い減少することを示した。これは、第１の鎖が標的遺伝子に結合し、それにより遺伝子発現を低減させることを示す。
【０４３４】
インビトロデータは、複合体４〜７のセンス鎖の５’および３’末端で与えられる１つまたは２つのセリノール由来リンカー部分の場合、末端ヌクレオチドとリンカーの間の、および／またはセンス鎖中の末端の３個のヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合の数は、標的遺伝子発現を低減させる効力を維持しながら、変更できることを示す。
【０４３５】
複合体８〜１２および１９
一般的方法セクション中の「インビトロ実験」下の上記方法に従った。
本発明の複合体、複合体８〜１２による、０．０１ｎＭ、０．１ｎＭ、０．５ｎＭ、１ｎＭおよび１０ｎＭでの処理の２４時間後のマウス初代培養細胞中の標的遺伝子発現は、図３２に示すように、標的遺伝子発現が陰性対照（「ＵＴ」バーおよびＬｕｃ［基準複合体３］を参照）に比較して、複合体の用量が増加するに伴い減少することを示した。これは、第１の鎖が標的遺伝子に結合し、それにより遺伝子発現を低減させることを示す。特に、複合体８、９、１０および１１は、０．０１ｎＭで最も効果的な複合体であることが以前に示された複合体２と同等であるまたは複合体２よりも良好であるように見える。
【０４３６】
複合体１９もまた、図３３に示すように、陰性対照に比較して、標的遺伝子発現を低減することが示された（「ＵＴ」バーおよび非標的化ｓｉＲＮＡであり、基準複合体５とも呼ばれるＣｔｒを参照）。これは、第１の鎖が標的遺伝子に結合し、それにより遺伝子発現を低減させることを示す。
【０４３７】
複合体８〜１２および１９についてのインビトロデータは、構造上多様であり、かつセンス鎖の両端で結合されるリンカーの数が標的遺伝子発現を低減させるのに効果的であることを示す。複合体８〜１２および１９は、基準複合体３（複合体８〜１２に対して）である「Ｌｕｃ」、基準複合体５（複合体１９に対して）である「Ｃｔｒ」および未処理対照よりも効果的に標的遺伝子発現を低減する。
【０４３８】
実施例１３−マウス中の血清Ｔｔｒ、Ａｌｄｈ２およびＴｍｐｒｓｓ６のインビボ経時変化
複合体１〜３
Ｃ５７ＢＬ／６マウスを、０日目に１ｍｇ／ｋｇのｓｉＲＮＡ複合体で皮下治療した。血清試料を眼窩洞出血により、７、１４、および２７日目に採取し、分析まで−２０℃で貯蔵した。血清ＴＴＲ定量化を、製造業者のプロトコル（試料希釈  １：８０００または１：８００）に従いＭｏｕｓｅ  Ｐｒｅａｌｂｕｍｉｎ  ＥＬＩＳＡ（ＡＬＰＣＯ，４１−ＰＡＬＭＳ／ｌｏｔ  ２２，２００８００３Ｂ）を用いて実施した。
【０４３９】
１ｍｇ／ｋｇの複合体１〜３、基準複合体１、２および４による皮下治療後７、１４、および２７日でのｎ＝４のｃ５７ＢＬ／６マウスコホート、ならびにモック治療（ＰＢＳ）個体における血清ＴＴＲの経時変化の結果を、図１６に示す。図１６のデータにより示されるように、本発明の複合体は、陰性対照（ＰＢＳ）および基準複合体１、２に比べて、また、特に基準複合体４に比べて、標的遺伝子発現の低減に特に効果的である。複合体２および３もまた、基準複合体１、２および４より効果的である。最も効果的な複合体は、複合体２である。従って、複合体２の投与レベルは、同じ初期ノックダウンを達成するために約３倍低く、基準複合体４に比べて、より長い期間のノックダウンももたらすであろうと予測される。
【０４４０】
より具体的には、複合体２は、野生型マウスでの等モル投与量で基準複合体４に比べて、７日目で血清中の３倍低い標的タンパク質レベルおよび２７日目で血清中の４倍低い標的タンパク質レベルをもたらした。さらに、複合体２は、基準複合体４の等モル量による３６％の低減に比べて、単回射出後の２７日目で標的血清タンパク質レベルの８５％の低減をもたらした。
【０４４１】
複合体１５〜１８
一般的方法セクション中の「インビボ実験」下の上記方法に従った。
１ｍｇ／ｋｇの複合体１５〜１６、基準複合体６および７による皮下治療後１４、２８および４２日でのｎ＝６のｃ５７ＢＬ／６マウスコホート、ならびにモック治療（ＰＢＳ）個体における血清Ａｌｄｈ２の経時変化の結果を、図３４および３５に示す。図３４および３５のデータにより示されように、本発明の複合体は、陰性対照（ＰＢＳ）および基準複合体６および７にそれぞれ比べて、標的遺伝子発現の低減に特に効果的である。
【０４４２】
１ｍｇ／ｋｇの複合体１８、基準複合体８による皮下治療後１４、２８および４２日でのｎ＝６のｃ５７ＢＬ／６マウスコホート、ならびにモック治療（ＰＢＳ）個体における血清Ｔｍｐｒｓｓ６の経時変化の結果を、図３６に示す。図３６のデータにより示されるように、本発明の複合体は、陰性対照（ＰＢＳ）および基準複合体８に比べて、標的遺伝子発現の低減に特に効果的である。
【０４４３】
全体として、インビボデータは、第２の鎖の両端で結合される種々のリンカー例が、標的遺伝子のインビボ発現を低減させるのに効果的であることを示す。リンカーの位置決めは、第２の鎖の５’末端での三分岐ＧａｌＮＡｃリンカー対照（基準複合体６、７および８）と比較して、複合体のインビボ効力を改善する。
【０４４４】
実施例１４−血清安定性試験
一般的方法セクション中の「トリトソーム安定性アッセイ」下の上記方法に従った。
【０４４５】
図３７は、複合体２、４、５、６および７に関する血清安定性試験から得られた結果を示す。図３８は、複合体２、８、９、１０、１１および１２の血清安定性を示す。
【０４４６】
試験した本発明の全ての複合体は、対照に比べて、血清中でより安定である。
【０４４７】
全ての試験複合体は、１つのＧａｌＮＡｃリンカーユニットを第２の鎖の５’末端でおよびもう１つのユニットを３’末端でそれぞれ含む。ｓｉＲＮＡは、別義が示されない限り、交互２’−ＯＭｅ／２’−Ｆにより修飾され、それらの５‘および３’末端の２つのヌクレオチド間結合の位置で、それぞれ２つのホスホロチオエート（ＰＳ）ヌクレオチド間結合を含む。
【０４４８】
複合体４では、セリノール−ＧａｌＮＡｃユニットは、リン酸ジエステル結合を介して結合される。複合体５では、セリノール−ＧａｌＮＡｃユニットは、ＰＳを介して結合され、一方、第２の鎖中のヌクレオチド間結合はリン酸ジエステルである。複合体６では、第２の鎖はＰＳを含まない。複合体７では、２つのセリノール−ＧａｌＮＡｃユニットはそれぞれの末端でＰＳ結合を介してそれぞれの第２の鎖末端におよび相互に結合される。複合体８では、第２の鎖の５’でのＣ６−アミノ−修飾剤および３’末端でのＣ７−アミノ−修飾剤がリガンド結合のために適用された。複合体９ではＧｌｙ−Ｃ３−アミノ−修飾剤が、複合体１０ではピペリジル−アミノ−修飾剤が、複合体１１ではＣ３−アミノ−修飾剤が、および複合体２ではセリノール−ＧａｌＮＡｃユニットが、第２の鎖の両端への結合のためにリンカーとして使用された。複合体２では、両方の末端ヌクレオチド間結合ならびにヌクレオチド−セリノール結合はＰＳである。複合体１２では、第２の鎖の５’でのＣ６−アミノ−修飾剤および３’末端でのＧｌｙＣ３−アミノ−修飾剤が、リガンド結合のために適用された。「ｕｔ」は、それに対し他の試料が正規化される未処理試料を示す。「Ｌｕｃ」は、ｓｉＲＮＡ標的化ルシフェラーゼ（基準複合体３）を示し、これは、非標的化対照として用いられ、標的ｍＲＮＡレベルを低減しない。
【０４４９】
データは、センス鎖の５’および３’末端で与えられるセリノール由来リンカー部分の場合、末端ヌクレオチドとリンカーの間の、および／またはセンス鎖中の末端の３個のヌクレオチド間のホスホロチオエート（ＰＳ）結合は、血清中の安定性を維持しながら、変更できることを示す。
【０４５０】
実施例１５
受容体媒介送達時の初代培養ヒト肝細胞中の種々の示されるＬ６−ＧａｌＮＡｃ複合化ｓｉＲＮＡによるヒト初代培養肝細胞中のＬＰＡ−ｍＲＮＡのノックダウン。
【表２０】
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【０４５１】
初代培養ヒト肝細胞（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）を３０，０００細胞／ウェルでコラーゲンコート９６ウェルプレートに播種した（９６ウェルフォーマット）。ＧａｌＮＡｃ−Ｌ６−複合化ｓｉＲＮＡを、示された濃度で細胞播種の直後に加えた。ｓｉＲＮＡによる処理の２４時間後に、全ＲＮＡをＩｎｖｉＴｒａｐ  ＲＮＡ細胞ＨＴＳ９６ウェルキット（Ｓｔｒａｔｅｃ）を用いて単離した。ＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現レベルを、ハウスキーピング転写物としてのＡｐｏＢ  ｍＲＮＡと比較して、ｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。値を、未処理細胞中のＬＰＡ  ｍＲＮＡ発現に対し正規化した。正規化した３回の繰り返し値の平均およびＳＤを図３９に示す。ＩＣ５０−値および最大抑制を、４パラメーター非線形回帰曲線フィットを用いて推定した。
【０４５２】
発明の記載
１．細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、ここで上記第１の鎖がＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第１の鎖が次の配列：配列番号９、１、３、５、７、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３または本明細書で開示のいずれかの配列から選択されるヌクレオチド配列を含む、核酸。  
２．第２の鎖が、配列番号１０、２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６４、６６、６８、７０、７２または７４または本明細書で開示のいずれかの配列のヌクレオチド配列を含む、記載１の核酸。
３．上記第１の鎖が、配列番号９または配列番号５のヌクレオチド配列を含む、記載１または記載２の核酸。
４．上記第２の鎖が、配列番号１０または配列番号６のヌクレオチド配列を含む、記載１〜３のいずれか１つの核酸。
５．上記第１の鎖および／または上記第２の鎖が、それぞれ１７〜３５ヌクレオチド長である、記載１〜４のいずれか１つの核酸。
６．少なくとも１つの二重鎖領域が、１９〜２５個の連続ヌクレオチド塩基対からなる、記載１〜５のいずれか１つの核酸。
７．記載１〜６のいずれかの核酸であって、
ａ）両端で平滑末端であり；または
ｂ）一端でオーバーハングを有し、他端で平滑末端を有し；または
ｃ）両端でオーバーハングを有する、
核酸。
８．第１および／または第２の鎖上の１個または複数のヌクレオチドが、修飾されて、修飾ヌクレオチドを形成する、記載１〜７のいずれかの核酸。
９．第１の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが、修飾される、記載８の核酸。
１０．第１の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが、少なくとも第２の修飾により修飾され、少なくとも第２の修飾が、記載９の修飾とは異なる、記載９の核酸。
１１．１個または複数の修飾された偶数ヌクレオチドの少なくとも１個が、１個または複数の修飾された奇数ヌクレオチドの少なくとも１個に隣接する、記載１０の核酸。
１２．複数の奇数ヌクレオチドが、修飾される、記載９〜１１のいずれか１つの核酸。
１３．複数の偶数ヌクレオチドが、第２の修飾により修飾される、記載１０〜１２のいずれかの核酸。
１４．第１の鎖が、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含む、記載８〜１３のいずれかの核酸。
１５．第１の鎖が、記載９の修飾とは異なる第２の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含む、記載９〜１４のいずれかの核酸。
１６．第２の鎖の１個または複数の奇数ヌクレオチドが、記載９の修飾とは異なる修飾により修飾される、記載９〜１５のいずれかの核酸。
１７．第２の鎖の１個または複数の偶数ヌクレオチドが、記載９の修飾により修飾される、記載９〜１５のいずれかの核酸。
１８．第２の鎖の１個または複数の修飾された偶数ヌクレオチドの少なくとも１個が、第２の鎖の１個または複数の修飾された奇数ヌクレオチドに隣接する、記載１６または１７の核酸。
１９．第２の鎖の複数の奇数ヌクレオチドが、共通の修飾により修飾される、記載１６〜１８のいずれかの核酸。
２０．複数の偶数ヌクレオチドが、記載９の修飾により修飾される、記載１６〜１９のいずれかの核酸。
２１．第２の鎖の複数の奇数ヌクレオチドが、第２の修飾により修飾され、第２の修飾が、記載９の修飾とは異なる、記載１６〜２０のいずれかの核酸。
２２．第２の鎖が、共通の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含む、記載１６〜２１のいずれかの核酸。
２３．第２の鎖が、記載９の修飾とは異なる第２の修飾により修飾された隣接するヌクレオチドを含む、記載１６〜２２のいずれかの核酸。
２４．第１の鎖中のそれぞれの奇数ヌクレオチドおよび第２の鎖中のそれぞれの偶数ヌクレオチドが、共通の修飾により修飾される、記載８〜２３のいずれかの核酸。
２５．それぞれの偶数ヌクレオチドが、第２の修飾により第１の鎖中で修飾され、およびそれぞれの奇数ヌクレオチドが、第２の修飾により第２の鎖中で修飾される、記載２４の核酸。
２６．第１の鎖の修飾ヌクレオチドが、第２の鎖の非修飾のまたは異なって修飾されたヌクレオチドに対し少なくとも１個のヌクレオチドだけシフトされる、記載８〜２５のいずれか１つの核酸。
２７．修飾（単数または複数）がそれぞれ個別に、３’−末端デオキシチミン、２’−Ｏ−メチル、２’−デオキシ修飾、２’−アミノ修飾、２’−アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホラミデート修飾、５’−ホスホロチオエート基修飾、５’−リン酸または５’−リン酸模倣物修飾およびコレステリル誘導体またはドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群より選択される、記載８〜２６のいずれか１つの核酸。
２８．修飾が、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチドまたは非天然塩基含有ヌクレオチドのいずれか１つである、記載８〜２７のいずれか１つの核酸。
２９．少なくとも１つの修飾が、２’−Ｏ−メチルである、記載８〜２８のいずれか１つの核酸。
３０．少なくとも１つの修飾が、２’−Ｆである、記載８〜２９のいずれか１つの核酸。
３１．細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、ここで上記第１の鎖がＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第１の鎖が次の配列：配列番号９、１、３、５、７、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３から選択されるヌクレオチド配列を含み、ここで第１の鎖のヌクレオチドが奇数ヌクレオチド上で第１の修飾により修飾され、および偶数ヌクレオチド上で第２の修飾により修飾され、および第２の鎖のヌクレオチドが偶数ヌクレオチド上で第３の修飾により修飾され、および奇数ヌクレオチド上で第４の修飾により修飾され、ここで少なくとも第１の修飾が、第２の修飾と異なり、第３の修飾が、第４の修飾と異なる、核酸。
３２．第２の配列が、配列番号１０、２、４、６、８、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、６４、６６、６８、７０、７２または７４のヌクレオチド配列を含む、記載３１の核酸。
３３．第４の修飾および第２の修飾が、同じである、記載３１または３２の核酸。
３４．第１の修飾および第３の修飾が、同じである、記載３１〜３３のいずれか１つの核酸。
３５．第１の修飾が、２’Ｏ−Ｍｅであり、第２の修飾が、２’Ｆである、記載３１〜３４のいずれか１つの核酸。
３６．第１の鎖が、配列番号９および配列番号５のヌクレオチド配列を含み、および第２の鎖が、配列番号１０および配列番号６のヌクレオチド配列を含む、記載３１〜３５のいずれか１つの核酸。
３７．以下に示す配列および修飾を含む、記載３１〜３６のいずれか１つの核酸：
【表２１】
2021502120.tif 000115
式中、特定の修飾は、下記番号で示される：
１＝２’Ｆ−ｄＵ、
２＝２−Ｆ−ｄＡ、
３＝２’Ｆ−ｄＣ、
４＝２’Ｆ−ｄＧ、
５＝２’−ＯＭｅ−ｒＵ；
６＝２’−ＯＭｅ−ｒＡ；
７＝２’−ＯＭｅ−ｒＣ；
８＝２’−ＯＭｅ−ｒＧ。
３８．リガンドに結合される、記載１〜３７のいずれか１つの核酸。
３９．第１および／または第２の鎖の末端の１、２または３個の３’ヌクレオチドおよび／または５’ヌクレオチド間のホスホロチオエート結合を含む、記載１〜３８のいずれか１つの核酸。
４０．第１の鎖上の３個の末端３’ヌクレオチドのそれぞれの間、および３個の末端５’ヌクレオチドのそれぞれの間の２つのホスホロチオエート結合、および第２の鎖の３個の３’末端のヌクレオチド間の２つのホスホロチオエート結合を含む、記載１〜３９のいずれか１つの核酸。
４１．細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、ここで上記第１の鎖がＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第１の鎖が次の配列：配列番号９、１、３、５、７、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３から選択されるヌクレオチド配列を含み、ここでリガンドに結合される、核酸。
４２．リガンドが、（ｉ）１個または複数のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）部分およびその誘導体、および（ｉｉ）リンカー、を含み、ここでリンカーが、記載４１で定義の核酸にＧａｌＮＡｃ部分を結合する、記載４１の核酸。
４３．リンカーが、二価または三価または四価の分岐構造体である、記載４１または４２のいずれかの核酸。
４４．ヌクレオチドが、記載１〜４３のいずれかで定義のように修飾される、記載４１〜４３のいずれかの核酸。
４５．記載１〜４４のいずれかの核酸であって、式Ｉ：
［Ｓ−Ｘ１−Ｐ−Ｘ２］３−Ａ−Ｘ３−    （Ｉ）
を含むリガンドに結合され、式中、
Ｓは、サッカライドであり、ここでサッカライドは、Ｎ−アセチルガラクトサミンであり；
Ｘ１は、Ｃ３−Ｃ６アルキレンまたは（−ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｍ（−ＣＨ２）２−であり、ここでｍは、１、２、または３であり；
Ｐは、ホスフェートまたは修飾ホスフェート（好ましくはチオホスフェート）であり；
Ｘ２は、式（−ＣＨ２）ｎ−Ｏ−ＣＨ２−のアルキレンまたはアルキレンエーテルであり、ここでｎ＝１〜６であり；
Ａは、分岐ユニットであり、
Ｘ３は、架橋ユニットであり；
ここで記載１〜４０のいずれかで定義される核酸が、ホスフェートまたは修飾ホスフェート（好ましくはチオホスフェート）を介してＸ３に結合される、核酸。
４６．次の構造：
【化８３】
2021502120.tif 000116
2021502120.tif 000117
2021502120.tif 000118
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の１つを有する複合化核酸であって、Ｚは、記載１〜４０のいずれかの核酸である、複合化核酸。
４７．次の構造のリガンドに結合される、記載１〜４０のいずれかの核酸：
【化８４】
2021502120.tif 000121
４８．二重鎖が、別々の鎖を含む、記載１〜４７のいずれかの核酸または複合化核酸。
４９．二重鎖が、第１の鎖および第２の鎖を含む一本鎖を含む、記載１〜４８のいずれかの核酸または複合化核酸。
５０．記載１〜４９のいずれかの核酸または複合化核酸および生理学的に許容可能な賦形剤を含む組成物。
５１．疾患または病態の予防または治療またはこれらのリスクの低減での使用のための記載１〜５０のいずれかの核酸または複合化核酸。
５２．疾患、障害または症候群を予防または治療するための薬物の製造における記載１〜５１のいずれかの核酸または複合化核酸の使用。
５３．治療を必要とする個体への記載１〜５２のいずれかの核酸または複合化核酸を含む組成物の投与を含む疾患、障害または症候群を治療または予防する方法。
５４．核酸または複合化核酸が、皮下に、静脈内にまたは経口、直腸または腹腔内などのいずれか他の適用経路を用いて対象に投与される、記載５３の方法。
５５．上記疾患または病態が、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症または冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症などの心臓血管疾患および高いレベルのＬｐ（ａ）含有粒子に関連するいずれか他の疾患または病態である、記載５２〜５４の使用または方法。
５６．心臓血管疾患が、脳卒中、アテローム性動脈硬化症、血栓症または冠状動脈性心疾患または大動脈弁狭窄症任意および高いレベルのＬｐ（ａ）含有粒子に関連するいずれか他の疾患または病態である、記載５５の使用または方法。
５７．記載１〜４９のいずれか１つの核酸または複合化核酸を作製するためのプロセス。
５８．ＬＰＡの発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、ここで上記第１の鎖がＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここでＬＰＡの発現が、同じ試験条件であるが、核酸または複合化核酸の非存在下または非サイレンシング対照の存在下で観察される発現レベルよりも少なくとも１５％低いレベルに低減される、核酸。
５９．ＬＰＡの発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、ここで上記第１の鎖がＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第１の鎖が次の配列：配列番号９、１、３、５、７、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、６３、６５、６７、６９、７１または７３から選択されるヌクレオチド配列を含み、ここでＬＰＡの発現が、同じ試験条件であるが、核酸または複合化核酸の非存在下または非サイレンシング対照の存在下で観察される発現レベルよりも少なくとも１５％低いレベルに低減される、核酸。
６０．細胞中のＬＰＡの発現を抑制するための核酸であって、第１の鎖の少なくとも一部および第１の鎖に対し少なくとも部分的に相補的である第２の鎖の少なくとも一部を含む少なくとも１つの二重鎖領域を含み、ここで上記第１の鎖がＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、ここで上記第１の鎖が次の配列：配列番号６３、６５、６７および７３から選択されるヌクレオチド配列を含み、ここで第１のＲＮＡ鎖が、末端５’（Ｅ）ビニルホスホネートヌクレオチドを有する、核酸。
【０４５３】
本発明の他の項目は、以下を含む：
１．細胞中のＬＰＡ遺伝子の発現を抑制するための複合体であって、上記複合体は核酸部分およびリガンド部分を含み、上記核酸部分は、第１のＲＮＡ鎖の少なくとも一部および第１の鎖に少なくとも部分的に相補的な第２のＲＮＡ鎖の少なくとも一部を含み、ここで上記第１の鎖が上記ＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記リガンド部分がセリノール由来リンカー部分、および細胞のインビボ標的化のための標的化リガンドを含み、一方または両方のＲＮＡ鎖の３’および／または５’末端のみに結合され、ここで第１のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されず、ここで
（ｉ）第２のＲＮＡ鎖は、標的化リガンドに５’末端で結合され、ここで（ａ）第２のＲＮＡ鎖はまた、標的化リガンドに３’末端でも結合され、第１のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｂ）第１のＲＮＡ鎖は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｃ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方はまた、３’末端で標的化リガンドに結合され；もしくは
（ｉｉ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されない、
複合体
または
細胞中のＬＰＡ遺伝子の発現を抑制するための複合体であって、上記複合体は核酸部分およびリガンド部分を含み、上記核酸部分は、第１のＲＮＡ鎖の少なくとも一部および第１の鎖に少なくとも部分的に相補的な第２のＲＮＡ鎖の少なくとも一部を含み、ここで上記第１の鎖が上記ＬＰＡ遺伝子から転写されるＲＮＡの少なくとも一部に対し少なくとも部分的に相補的であり、上記リガンド部分がリンカー部分、および細胞のインビボ標的化のための標的化リガンドを含み、一方または両方のＲＮＡ鎖の３’および／または５’末端のみに結合され、ここで第１のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されず、ここで
（ｉ）第２のＲＮＡ鎖は、標的化リガンドに５’末端で結合され、ここで（ａ）第２のＲＮＡ鎖はまた、標的化リガンドに３’末端でも結合され、第１のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｂ）第１のＲＮＡ鎖は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の３’末端は結合されず；または（ｃ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方はまた、３’末端で標的化リガンドに結合され；もしくは
（ｉｉ）第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の５’末端は結合されず、任意選択で、
ここでリンカー部分は、セリノール由来リンカー部分または本明細書で記載の他のリンカータイプの１つである、
複合体。
２．第２のＲＮＡ鎖は、５’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖は、３’末端でも標的化リガンドに結合され、第１のＲＮＡ鎖の３’末端は、結合されない、項目１に記載の複合体。
３．第２のＲＮＡ鎖は、５’末端で標的化リガンドに結合され、第１のＲＮＡ鎖は、３’末端でも標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の３’末端は、結合されない、項目１に記載の複合体。
４．第２のＲＮＡ鎖は、５’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方は、３’末端でも標的化リガンドに結合される、項目１に記載の複合体。
５．第２のＲＮＡ鎖および第１のＲＮＡ鎖の両方は、３’末端で標的化リガンドに結合され、第２のＲＮＡ鎖の５’末端は、結合されない、項目１に記載の複合体。
６．リガンドが、単量体リガンドである、項目１〜５のいずれか１つに記載の複合体。
７．リガンドが、ＧａｌＮＡｃおよびガラクトース部分、特にＧａｌＮＡｃ部分から選択される、項目１〜６のいずれか１つに記載の複合体。
８．複合化ＲＮＡ鎖が、追加のリンカーを含むセリノール由来リンカー部分を介して標的化リガンドに結合され、ここで追加のリンカーは、飽和非分岐または分岐Ｃ１−１５アルキル鎖であるか、またはこれを含み、ここで任意選択で１個または複数の炭素（例えば、１、２または３個の炭素、好適には１個または２個、特に１個）が、Ｏ、Ｎ、Ｓ（Ｏ）ｐから選択されるヘテロ原子により置換されここでｐは０、１または２であり、（例えば、ＣＨ２基が、鎖の末端にてＯで、またはＮＨで、またはＳで、またはＳＯ２で置換され、または分岐部上の−ＣＨ３基が、ＯＨでまたはＮＨ２で置換される）、ここで上記鎖は、１個または複数のオキソ基（例えば、１〜３個、１個の基など）で任意に置換される、項目１〜７のいずれか１つに記載の複合体。
９．追加のリンカーが、飽和非分岐Ｃ１−１５アルキル鎖を含み、ここで１個または複数の炭素（例えば、１、２または３個の炭素、好適には１個または２個、特に１個）が、酸素原子により置換される、項目８に記載の複合体。
１０．追加のリンカーが、ＰＥＧ鎖を含む、項目９に記載の複合体。
１１．追加のリンカーが、飽和非分岐鎖Ｃ１−１５アルキル鎖を含む、項目８に記載の複合体。
１２．追加のリンカーが、飽和非分岐鎖Ｃ１−６アルキル鎖を含む、項目１１に記載の複合体。
１３．追加のリンカーが、飽和非分岐Ｃ４またはＣ６アルキル鎖、例えばＣ４アルキル鎖を含む、項目１２に記載の複合体。
１４．第１のＲＮＡ鎖が、式（ＸＶ）：
【化８５】
2021502120.tif 000122
の化合物であり、ここでｂは、０または１であり；および
第２のＲＮＡ鎖が、式（ＸＶＩ）：
【化８６】
2021502120.tif 000123
の化合物であり、ここでｃおよびｄは独立に、０または１であり；
式中、
Ｚ１およびＺ２は、それぞれ第１と第２のＲＮＡ鎖のＲＮＡ部分であり；
Ｙは、ＯまたはＳであり；
Ｒ１は、Ｈまたはメチルであり；
ｎは、０、１、２または３であり；および
Ｌは、式（ＸＶ）および（ＸＶＩ）中で同じでありまたは異なり、かつ
−（ＣＨ２）ｑ−、ｑ＝２〜１２；
−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−、ｒ＝２〜１２；
−（ＣＨ２−ＣＨ２−Ｏ）ｓ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−、ｓ＝１〜５；
−（ＣＨ２）ｔ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｔ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｔは、独立に１〜５である；
−（ＣＨ２）ｕ−ＣＯ−ＮＨ−（ＣＨ２）ｕ−Ｃ（Ｏ）−、ｕは、独立に１〜５である；および
−（ＣＨ２）ｖ−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−、ｖは２〜１２である；
からなる群より選択され、ここで末端Ｃ（Ｏ）（存在する場合）は、ＮＨ基に結合され；
ここでｂ＋ｃ＋ｄは、２または３である、項目１または記載１の複合体。
１５．ｂは０であり、ｃは１であり、ｄは１である、項目１４に記載の複合体。
１６．ｂは１であり、ｃは０であり、ｄは１である、項目１４に記載の複合体。
１７．ｂは１であり、ｃは１であり、ｄは０である、項目１４に記載の複合体。
１８．ｂは１であり、ｃは１であり、ｄは１である、項目１４に記載の複合体。
１９．ＹはＯである、項目１４〜１８のいずれか１つに記載の複合体。
２０．ＹはＳである、項目１４〜１８のいずれか１つに記載の複合体。
２１．Ｒ１はＨである、項目１４〜２０のいずれか１つに記載の複合体。
２２．Ｒ１はメチルである、項目１４〜２０のいずれか１つに記載の複合体。
２３．ｎは０である、項目１４〜２２のいずれか１つに記載の複合体。
２４．Ｌは−（ＣＨ２）ｒ−Ｃ（Ｏ）−であり、ｒは２〜１２である、項目１４〜２３のいずれか１つに記載の複合体。
２５．ｒは２〜６である、項目２４に記載の複合体。
２６．ｒは４または６、例えば、４である、項目２５に記載の複合体。
２７．本明細書で開示のいずれかの特徴または特徴の組み合わせを有する、項目１〜２６のいずれかに記載の複合体。
【表２２】
2021502120.tif 000124
2021502120.tif 000125
2021502120.tif 000126
2021502120.tif 000127
2021502120.tif 000128
2021502120.tif 000129
2021502120.tif 000130
2021502120.tif 000131
2021502120.tif 000132
【０４５４】
単一配列は２つ以上の名称を有し得る。これらの場合、これらの名前の１つが、要約配列表に示される。
特定のリンカーおよび／または修飾結合が、ＰＳおよび［ＳＴ２３（ｐｓ）］３ＳＴ４１（ｐｓ）などのＲＮＡ配列内で与えられる場合、これらは、配列の任意選択部分であるが、その配列の好ましい実施形態である。
以下の略語が使用され得る。
【表２３】
2021502120.tif 000133
2021502120.tif 000134
【図１】
2021502120.tif 000141
【図２Ａ】
2021502120.tif 000142
【図２Ｂ】
2021502120.tif 000143
【図３】
2021502120.tif 000144
【図４Ａ】
2021502120.tif 000145
【図４Ｂ】
2021502120.tif 000146
【図５】
2021502120.tif 000147
【図６】
2021502120.tif 000148
【図７】
2021502120.tif 000149
【図８】
2021502120.tif 000150
【図９】
2021502120.tif 000151
【図１０】
2021502120.tif 000152
【図１１】
2021502120.tif 000153
【図１２】
2021502120.tif 000154
【図１３】
2021502120.tif 000155
【図１４】
2021502120.tif 000156
【図１５ａ】
2021502120.tif 000157
【図１５ｂ】
2021502120.tif 000158
【図１５ｃ】
2021502120.tif 000159
【図１６】
2021502120.tif 000160
【図１７】
2021502120.tif 000161
【図１８】
2021502120.tif 000162
【図１９Ａ】
2021502120.tif 000163
【図１９Ｂ】
2021502120.tif 000164
【図２０】
2021502120.tif 000165
【図２１】
2021502120.tif 000166
【図２２】
2021502120.tif 000167
【図２３】
2021502120.tif 000168
【図２４】
2021502120.tif 000169
【図２５】
2021502120.tif 000170
【図２６】
2021502120.tif 000171
【図２７】
2021502120.tif 000172
【図２８】
2021502120.tif 000173
【図２９】
2021502120.tif 000174
【図３０】
2021502120.tif 000175
【図３１】
2021502120.tif 000176
【図３２】
2021502120.tif 000177
【図３３】
2021502120.tif 000178
【図３４】
2021502120.tif 000179
【図３５】
2021502120.tif 000180
【図３６】
2021502120.tif 000181
【図３７】
2021502120.tif 000182
【図３８】
2021502120.tif 000183
【図３９】
2021502120.tif 000184
【図４０】
2021502120.tif 000185
【国際調査報告】
2021502120.tif 000186
2021502120.tif 000187
2021502120.tif 000188
2021502120.tif 000189
2021502120.tif 000190