(57)【要約】  例において、フローセルは、基体、該基体上にありそして露出基体領域を定義する選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワーク、および少なくともいくつかの該露出領域の上にシークエンシング表面化学を含む。該シークエンシング表面化学は、i)活性パッド、該活性パッドに付着したポリマー層、および該ポリマー層に付着したプライマー；またはii)ナノ構造および該ナノ構造に付着した酵素からなるグループから選択される。
2021532738.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
基体；
該基体上にありそして露出基体領域を定義する選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワーク；
および少なくともいくつかの該露出領域上にあるシークエンシング表面化学、よりなり、
該表面化学が、
i)活性化パッド、該活性化パッドに付着したポリマー層、および該ポリマー層に付着したプライマー；または
ii)ナノ構造および該ナノ構造に付着した酵素
からなるグループから選択される、フローセル。
【請求項２】
上記選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワークが、アミンおよびジイミドの平面超分子ネットワークである、請求項１に記載のフローセル。
【請求項３】
前記アミンが、メラミンまたはその類似体であり、前記ジイミドが、ペリレンテトラカルボン酸ジイミドまたはその類似体である、請求項２に記載のフローセル。
【請求項４】
前記表面化学が、前記ii)ナノ構造および該ナノ構造に付着した酵素であり；そして
ii)において：該ナノ構造が、コンダクターおよびセミコンダクターからなるグループから選択される材料を包含し、チューブ、ワイヤー、およびリボンからなるグループから選択される幾何学的形状を有する、伝導性チャネルであり；そして
前記酵素がポリメラーゼである
請求項１に記載のフローセル。
【請求項５】
一つのポリメラーゼが一つのナノ構造に付着している、請求項４に記載のフローセル。
【請求項６】
前記ナノ構造が電気的に２つの電極に接続されている、請求項４に記載のフローセル。
【請求項７】
さらに前記ポリメラーゼを前記ナノ構造に付着させるテザーよりなる、請求項４に記載のフローセル。
【請求項８】
前記ナノ構造が、シリコンナノワイヤーおよびカーボンナノチューブからなるグループから選択される、請求項４に記載のフローセル。
【請求項９】
表面化学が、前記i)活性化層、ポリマー層、およびプライマーであり；
前記i)において、該ポリマー層が
【化１】
2021532738.tif 000015
（式中、Ｒ１は、Ｈまたは必要により置換されていてもよいアルキルである；
ＲＡはアジド、必要により置換されていてもよいアミノ、必要により置換されていてもよいアルケニル、必要により置換されていてもよいヒドラゾン、必要により置換されていてもよいヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要により置換されていてもよいテトラゾール、必要により置換されていてもよいテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールからなるグループから選択される；
Ｒ５、Ｒ６およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈおよび必要により置換されていてもよいアルキルからなるグループから選択される；
各−（ＣＨ２）Ｐ−は、必要により置換されていてもよい；
ｐは、１ないし５０の範囲の整数である；
ｎは１ないし５００００の範囲の整数である；および、
ｍは１ないし１０００００の範囲の整数である。）
である、請求項１に記載のフローセル。
【請求項１０】
基体；
該基体上にありそして露出基体領域を定義する選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワーク；
各該露出基体領域に付着したナノ構造；
少なくともいくつかの該ナノ構造に付着した酵素；および
インプットおよびアウトプット流体ポート：を包含する
着脱可能なフローセル：
i)前記着脱可能なフローセルを恒久的に収容するか、またはii)前記着脱可能なフローセルを収納する
レセプタクル；および
脱パターニング試薬を前記着脱可能なフローセルに選択的に送り前記基体から選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワークを取り除き、およびパターニング試薬を前記着脱可能なフローセルに選択的に送り前記基体にフレッシュで選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワークを適用する
流体システム
よりなる、シークエンシングシステム。
【請求項１１】
各前記ナノ構造が、コンダクターおよびセミコンダクターからなるグループから選択される材料を包含し、そしてチューブ、ワイヤー、およびリボンからなるグループから選択される幾何学的形状を有する、伝導性チャネルであり；
各前記ナノ構造は個々に電気的にアドレス可能である、
請求項１０に記載のシークエンシングシステム。
【請求項１２】
前記流体システムが、少なくとも前記脱パターニング試薬と前記パターニング試薬を包含する試薬カートリッジを収納するカートリッジレセプタクルを包含する、
請求項１０に記載のシークエンシングシステム。
【請求項１３】
さらに前記試薬カートリッジより、
該試薬カートリッジが：
脱パターニング試薬レセプタクル；
該脱パターニング試薬レセプタクル内に収容されている脱パターニング試薬；
２つの分離したコンパートメントを包含するパターニング試薬レセプタクル；
該２つの分離したコンパートメントの第１内に収容されるパターニング試薬第１成分；
および
該２つの分離したコンパートメントの第２に収容されるパターニング試薬第２成分；
を包含する流体貯蔵システムを包含する、
請求項１２に記載のシークエンシングシステム。
【請求項１４】
前記脱パターニング試薬が酸化試薬を包含し；
前記パターニング試薬第１成分が、ペリレンテトラカルボン酸ジイミドまたはその類似体であり、そして；
前記パターニング試薬第２成分が、メラミンまたはその類似体である、
請求項１３に記載のシークエンシングシステム。
【請求項１５】
前記酸化試薬が、過マンガン酸塩、過ホウ酸塩、ハロゲン、過塩素酸塩および過酸化物からなるグループから選択される、請求項１４に記載のシークエンシングシステム。
【請求項１６】
多孔性分子ネットワークを、ナノ構造を上に配置させた基体の表面に適用することにより、マスクされた基体を形成すること、そうすることにより、各ナノ構造の少なくとも一部分は露出状態を維持している；および、
該多孔性ネットワークに不活性である酵素溶液に該マスクされた基体をさらすこと、そうすることにより、ナノ構造の暴露部分の少なくともいくつかにそれぞれの酵素が選択的に付着する、ことよりなる、方法。
【請求項１７】
多孔性分子ネットワークの上記適用が、ペリレンテトラカルボン酸ジイミドまたはその類似体およびメラミンまたはその類似体の飽和混合物を加熱すること；
ナノワイヤーを付着させた基体上に前記飽和混合物を堆積させること；および
堆積した飽和混合物を冷却すること、を含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
多孔性分子ネットワークを基体に適用し、露出基体領域のパターンを定義すること；
前記露出基体領域を活性化し活性化パッドを形成すること；
前記多孔性分子ネットワークを取り除くこと、そうすることにより、前記活性化パッドが無傷で残り、格子間基体領域に分離される；
各前記活性化パッドにそれぞれのポリマー層を適用すること；および、
前記それぞれのポリマー層の一つ一つにプライマーをグラフトすることよりなる、方法。
【請求項１９】
前記多孔性分子ネットワークを取り除くことが、該多孔性分子ネットワークを酸化試薬にさらすこと、を含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記多孔性分子ネットワークを適用することが、
ペリレンテトラカルボン酸ジイミドまたはその類似体およびメラミンまたはその類似体の飽和混合物を加熱すること；
ナノワイヤーを付着させた基体上に前記飽和混合物を堆積させること；および、
該堆積飽和混合物を冷却すること、を含む、請求項１８に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年８月６日に出願された米国仮出願シリアルナンバー６２/７１５１７７の利益を主張し、その出願内容全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【背景技術】
【０００２】
生物学的または化学的反応における種々のプロトコルは、局所担体表面上あるいはあらかじめ定義されたチャンバー内での多くの制御反応を行うことを含む(involve)。指定された反応が次に観察あるいは検出され、それに続く分析が該反応に含まれる化学物質の特性を明らかにしうる。実施例の中には、制御反応が蛍光を生じることもあり、それ故、光学システムを検出に使用しうる。他の実施例においては、制御反応は、チャージ、伝導性、あるいは他の何らかの電気特性を変え、それ故、電子システムを検出に使用しうる。
【０００３】
概略
本明細書に開示の第1の側面は、フローセルである。該フローセルは、基体；該基体上にありそして露出基体領域（exposed substrate regions)を定義する選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワーク；および少なくともいくつかの該露出領域上にシークエンシング表面化学(surface chemistry)よりなり(comprise)、該表面化学は、i)活性化パッド(activated pad)、該活性化パッドに付着した(attached)ポリマー層、および該ポリマー層に付着したプライマー；またはii)ナノ構造および該ナノ構造に付着した酵素からなるグループから選択される。
【０００４】
フローセルの例において、選択的に脱着可能な多孔性ネットワークはアミンとジイミドの平面超分子(planar supermolecular)ネットワークである。一例において、該アミンはメラミンまたはその類似体であり、該ジイミドはペリレンテトラカルボン酸ジイミドまたはその類似体である。
【０００５】
フローセルの例において、表面化学は、ii)ナノ構造および該ナノ構造に付着した酵素；およびii)において：該ナノ構造は、コンダクター、セミコンダクターからなるグループから選択される材料を包含し(including)、チューブ、ワイヤー、およびリボンからなるグループから選択される幾何学的形状（geometry)を有する(having)伝導性チャネルであり；該酵素はポリメラーゼである。一例において、１ポリメラーゼは１ナノ構造に付着している。一例において、ナノ構造は電気的に２つの電極に接続されている。一例において、フローセルはさらに、ポリメラーゼをナノ構造に付着させる(attaching)テザー(tether)よりなる。一例において、該ナノ構造は、シリコンナノワイヤーおよびカーボンナノチューブからなるグループから選択される。
【０００６】
フローセルの例において、表面化学は、i)活性化層、ポリマー層、およびプライマーであり；i)において、該ポリマー層は、
【化１】
2021532738.tif 000003
式中、Ｒ１は、Ｈまたは必要により置換されていてもよいアルキルである；ＲＡはアジド、必要により置換されていてもよいアミノ、必要により置換されていてもよいアルケニル、必要により置換されていてもよいヒドラゾン、必要により置換されていてもよいヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要により置換されていてもよいテトラゾール、必要により置換されていてもよいテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールからなるグループから選択される；Ｒ５、Ｒ６およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈおよび必要により置換されていてもよいアルキルからなるグループから選択される；各−（ＣＨ２）Ｐ−は、必要により置換されていてもよい；ｐは、１ないし５０の範囲の整数である；ｎは１ないし５００００の範囲の整数である；そして、ｍは１ないし１０００００の範囲の整数である。
【０００７】
本明細書に開示されているフローセルのいかなる特徴も、任意の望ましい方法および/または構成で共に組み合わせてもよいことが理解されるべきである。
【０００８】
本明細書に開示されている第２の側面は、シークエンシングシステム（sequencing system)である。シークエンシングシステムは、基体；該基体上にありそして露出基体部分を定義する選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワーク；各該露出基体領域に付着したナノ構造；少なくともいくつかの該ナノ構造に付着した酵素；およびインプットおよびアウトプット流体ポートを包含する着脱可能なフローセル；i)前記着脱可能なフローセルを恒久的に収容する(house)か、またはii)着脱可能なフローセルを収納する(receive)レセプタクル(receptacle)；および脱パターニング試薬を前記着脱可能なフローセルに選択的に送り前記基体から選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワークを取り除き、そしてパターニング試薬を前記着脱可能なフローセルに選択的に送り前記基体にフレッシュで選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワークを適用する流体システムよりなる。
【０００９】
シークエンシングシステムの例においては、各ナノ構造はコンダクターおよびセミコンダクターからなるグループから選択される材料を包含し、そしてチューブ、ワイヤー、およびリボンからなるグループから選択される幾何学的形状を有する伝導性チャネルであり；各ナノ構造は個々に電気的にアドレス可能である。
【００１０】
シークエンシングシステムの例においては、流体システムは、少なくとも脱パターニング試薬とパターニング試薬を包含する試薬カートリッジを収納するカートリッジレセプタクルを包含する。いくつかの例においては、シークエンシングシステムはさらに試薬カートリッジより、該試薬カートリッジは、脱パターニング試薬レセプタクル；該脱パターニング試薬レセプタクル内に収容されている脱パターニング試薬；２つの分離したコンパートメントを包含するパターニング試薬レセプタクル；該２つの分離したコンパートメントの第１内に収容されるパターニング試薬第１成分；および該２つの分離したコンパートメントの第２に収容されるパターニング試薬第２成分；を包含する流体貯蔵システムを包含する。一例において、脱パターニング試薬は酸化試薬を包含する；パターニング試薬第１成分は、ペリレンテトラカルボン酸ジイミドまたはその類似体である；およびパターニング試薬第２成分はメラミンまたはその類似体である。一例において、酸化試薬は過マンガン酸塩、過ホウ酸塩、ハロゲン、過塩素酸塩および過酸化物からなるグループから選択される。
【００１１】
シークエンシングシステムのいかなる特徴も任意の望ましい方法において共に組み合わされてもよいということが理解されるべきである。さらに、シークエンシングシステムおよび/またはフローセルの特徴の任意の組合せは、共に使用されてもよく、および/または本明細書に開示のいかなる例と組み合わされてもよいということが理解されるべきである。
【００１２】
本明細書に開示の第３の側面は方法である。該方法は,
多孔性分子ネットワークを、ナノ構造を上に配置させた基体の表面に適用することにより、マスクされた基体を形成すること、そうすることにより、各ナノ構造の少なくとも一部分は露出状態を維持している；および、該多孔性ネットワークに不活性である酵素溶液に該マスクされた基体をさらすこと、そうすることにより、少なくともいくつかのナノ構造の暴露部分にそれぞれ酵素が選択的に付着する、ことよりなる。
【００１３】
本方法の例においては、多孔性分子ネットワークの適用は、ペリレンテトラカルボン酸ジイミドまたはその類似体およびメラミンまたはその類似体の飽和混合物を加熱すること；ナノワイヤーを付着させた基体上に該飽和混合物を堆積させること；および堆積した飽和混合物を冷却すること、を含む。
【００１４】
本方法のいかなる特徴も任意の望ましい方法において共に組み合わされてもよいということが理解されるべきである。さらに、本方法および/またはシークエンシングシステムおよび/またはフローセルの特徴の任意の組合せは、共に使用されてもよく、および/または本明細書に開示のいかなる例と組み合わされてもよいということが理解されるべきである。
【００１５】
本明細書に開示の第４の側面は、もう一つの方法である。本方法は、多孔性分子ネットワークを基体に適用し露出基体領域のパターンを定義すること；該露出基体領域を活性化し活性化パッドを形成すること；該多孔性分子ネットワークを取り除くこと、そうすることにより、該活性化パッドが無傷で残り、格子間基体領域により分離される；それぞれのポリマー層を各活性化パッドに適用すること；およびプライマーを該それぞれのポリマー層の一つ一つにグラフトすることよりなる。
【００１６】
本方法の例において、多孔性分子ネットワークを取り除くことは、該多孔性分子ネットワークを酸化試薬にさらすことを含む。
【００１７】
本方法の例において、多孔性分子ネットワークを適用することは：ペリレンテトラカルボン酸ジイミドまたはその類似体およびメラミンまたはその類似体の飽和混合物を加熱すること；ナノワイヤーを付着させた基体上に該飽和混合物を堆積させること；および堆積飽和混合物を冷却することを含む。
【００１８】
本方法のいかなる特徴も任意の望ましい方法において共に組み合わされてもよいということが理解されるべきである。さらに、本方法および/またはシークエンシングシステムおよび/またはフローセルの特徴の任意の組合せは、共に使用されてもよく、および/または本明細書に開示のいかなる例と組み合わされてもよいということが理解されるべきである。
【００１９】
さらに、いかなる方法の、および/またはいかなるシークエンシングシステムの、および/またはいかなるフローセルのいかなる特徴も、任意の望ましい方法において組み合わされてもく、および/または本明細書に開示のいかなる例と組み合わされてもよいということが理解されるべきである。
【００２０】
本開示の例示の特徴は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになるであろう。図面において、同様の参照番号は、おそらく同一ではないが、ほぼ同じ構成要素に対応する。簡潔にするために、先に記載された機能を有する参照番号または特徴は、それらが出現する他の図面との関連において記載されていることもあるし記載されていないこともある。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ】本明細書に開示されるフローセルの一例を形成する方法の一例を示す平面概略図である。
【図１Ｂ】本明細書に開示されるフローセルの一例を形成する方法の一例を示す平面概略図である
【図２】図１Ｂの２−２線に沿ったフローセルの断面図である。
【図３Ａ】本明細書に開示される方法の別の例を示すフロー図である。
【図３Ｂ】図３Ａに示される方法により形成されるフローセルの一例の断面図である。
【図４】本明細書に開示される方法の別の例を示すフロー図である。
【図５Ａ】図４の方法の一例を示す平面概略図である。
【図５Ｂ】図４の方法の一例を示す平面概略図である。
【図５Ｃ】図４の方法の一例を示す平面概略図である。
【図６】図６に示されている多孔性分子ネットワークは図５Ｃに示されているそれとは異なる例であるということを除いて、図５Ｃの６−６線に沿った断面図である。
【図７】本明細書に開示の例示シークエンシングシステム部分の斜視図である。
【００２２】
本明細書に開示の例においては、ナノメータースケールでのパターニングが、多孔性分子ネットワークの使用を通して可能となる。該多孔性ネットワークは基体表面上に自己集合し、i)下にある基体の部分またはii)基体上に予め配置されたナノ構造が露出しているところにパターンを創出する。高疎水性多孔性分子ネットワークは、基体表面の残部を少なくとも実質的にカバーし、そして基体表面上にマスクを創出する。このマスクは、続いて起こる堆積表面が付着することを最小にしうるものであり、場合によっては、完全に妨げさえするが、i)下にある基体の露出領域またはii)露出ナノ構造に対しては、該引き続く堆積表面化学を妨げない。このように多孔質分子ネットワークは、所望の領域のみを機能化する。
【００２３】
多孔性分子ネットワークは、適用された表面化学に有害な悪影響を与えない穏やかな条件を使用して基体表面から容易に除去可能である。
【００２４】
本明細書に開示のいくつかの例においては、多孔性分子ネットワークはシークエンシングオペレーションの間、基体表面上にとどまってもよい。このような例においては、高疎水性の多孔性分子ネットワークは、導入された試薬と表面化学との間の相互作用を増加する助けになりうる。
【００２５】
本明細書に使用されている用語は、別段の規定のない限り関連技術におけるそれらの通常の意味を有しているということが理解されるべきである。本明細書に使用されるいくつかの用語およびそれらの意味を下記に記載する。
【００２６】
単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈が明らかにそうでないことを示さない限り、複数の指示対象を包含する。
【００２７】
用語、よりなる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）、包含する（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有する（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）およびこれらの用語の種々の形態は、互いに同義であり、等しく広いことを意味する。
【００２８】
用語、トップ（ｔｏｐ）、底（ｂｏｔｔｏｍ）、低い（ｌｏｗｅｒ）、上の（ｕｐｐｅｒ）、上（ｏｎ）等は、本明細書において、フローセルおよび/またはフローセルの種々の構成要素を記述するのに使用される。これらの方向を示す用語は特定の方向を示すことを意味しておらず、構成要素間の相対的方向を指定するのに使用さているということが理解されるべきである。方向を示す用語の使用は、本明細書に開示される例を、いずれかの特定の方向に限定すると解釈されるべきでない。
【００２９】
本明細書に使用されている用語「付着され（ａｔｔａｃｈｅｄ）」は、お互いに、接合され（ｊｏｉｎｅｄ）、固定され（ｆａｓｔｅｎｅｄ）、癒着され（ａｄｈｅｒｅｄ）、連結され（ｃｏｎｎｅｃｔｅｄ）または結合され（ｂｏｕｎｄ）といった２つの物の状態を言っている。例えば、核酸は共有結合または非共有結合でポリマーコーティングに付着されうるといった具合である。共有結合は原子間で電子対を共有することにより特徴付けられる。非共有結合は、電子対の共有を含まない物理的結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルヴァールス力、親水性相互作用および疎水性相互作用を包含しうる。
【００３０】
本明細書に使用されている用語「フローセル」は、反応を行うことができるチャンバー（すなわち、フローチャネル）、試薬をチャンバーに運ぶインレット、およびチャンバーから試薬を除去するアウトレットを有する容器を意味することを意図している。いくつかの例においては、チャンバーは、チャンバー内で起こっている反応を検出することを可能とする。例えば、チャンバー/フローチャネルは、凹部でのアレイ、光学的に標識された分子等の光学的検出を可能とする１以上の透明な表面を包含しうる。別の例では、チャンバー/フローチャネルは、電気シグナルの検出を可能とする電子回路構成を包含しうる。
【００３１】
本明細書に使用されている用語「堆積」は、手動または自動化されうるもので、表面特性の変性が結果として生じる、任意の好適な適用技術のことを言っている。一般に、堆積は、蒸着技術、コーティング技術、グラフティング技術等を使用して行いうる。いくつかの具体的な例としては、化学蒸着（CVD)、スプレーコーティング（例えば、超音波スプレーコーティング）、スピンコーティング、ダンク(dunk)またはディップコーティング、ドクターブレードコーティング、パドルディスペンシング、フロースルーコーティング、エアゾールプリンティング、スクリーンプリンティング、マイクロコンタクトプリンティング、インクジェットプリンティング等を包含する。
【００３２】
本明細書に使用されている「ヌクレオチド」は、窒素含有複素環塩基、糖、および１以上のリン酸基を含む。ヌクレオチドは、核酸シークエンスのモノマーユニットである。ＲＮＡにおいては、糖はリボースであり、ＤＮＡにおいては、糖はデオキシリボース、すなわち、リボースにおける２’位に存在するヒドロキシル基を欠く糖である。窒素含有複素環塩基（すなわち、核塩基（ｎｕｃｌｅｏｂａｓｅ）は、プリン塩基またはピリミジン塩基でありうる。プリン塩基は、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、およびそれらの変性誘導体または類似体を包含する。ピリミジン塩基は、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、およびそれらの変性誘導体および類似体を包含する。デオキシリボースのＣ−１原子は、ピリミジンのＮ−１またはプリンのＮ−９に結合している。核酸類似体は、リン酸塩バックボーン、糖、または核塩基のどれか部分的に変えられていてもよい。核酸類似体の例としては、例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ）等、ユニバーサル塩基(universal base)またはリン酸塩‐糖バックボーン類似体を包含する。
【００３３】
本明細書に使用されている「プライマー」は、単鎖核酸シークエンス（例えば、単鎖ＤＮＡまたは単鎖ＲＮＡ）として定義される。増幅(amplification)プライマーと呼ばれるいくつかのプライマーは、テンプレート(template)増幅およびクラスター生成のスターティングポイントとして働いている。他のプライマーは、シークエンシングプライマーと呼ばれており、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成のスターティングポイントとして働いている。例えば、増幅プライマーの５’末端はポリマーコーティングの官能基とカップリング反応することを可能とするように変性されてもよい。プライマーの長さは、任意の数の塩基長とすることができ、種々の非天然ヌクレオチドを包含しうる。例において、シークエンシングプライマーは、１０〜６０塩基、または２０〜４０塩基の短鎖である。
【００３４】
用語「基体」は、その上にフローセルの種々の構成要素が加えられる支持体のことを言っている。支持体は、ウェハー、パネル、矩形シート、ダイ、または任意の他の好適な構成であってもよい。支持体は、一般に硬質であり、水性液体に不溶である。支持体は、凹部を変性するのに使用される化学物質に対して不活性でありうる。例えば、支持体は、プライマーを付着させるようなブロックコポリマーを形成するのに使用される化学物質に不活性でありうる。好適な支持体の例は、以下にさらに記載される。
【００３５】
本明細書に使用されている用語「表面化学」は、いくつかの即目において、活性化パッド、該活性化パッドに付着したポリマー層、および該ポリマー層の少なくとも一部分に付着したプライマーのことを言っている。他の側面においては、用語「表面化学」は、ナノ構造および該ナノ構造に付着した酵素のことを言っている。
【００３６】
多孔性分子ネットワーク
【００３７】
本発明に開示の例において、多孔性分子ネットワークは、アミンおよびジイミドの平面超分子ネットワークである。選択されたアミンはおよびジイミドは、ホモ分子(homomolecular)水素結合よりヘテロ分子(heteromolecular)水素結合を優先的に受ける。以下は、メラミンとペリレンテトラカルボン酸ジイミド（ＰＴＣＤＩ）間のヘテロ分子水素結合の例である。
【化２】
2021532738.tif 000004
上記のように、３つの水素結合がこれらの分子間で形成されている。
メラミンは水素結合ネットワークに関与することができる３つの官能性ユニット（Ｈ２Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−ＮＨ２）を包含し、ペリレンテトラカルボン酸ジイミドは、水素結合ネットワークに関与する２つの官能性ユニット（Ｏ＝ＣＲ−ＮＲ−ＣＲ＝Ｏ）を包含する。メラミンおよびペリレンテトラカルボン酸ジイミドの３重および２重のシメトリーは、それぞれ、例えば、図１Ａに示されているような、六辺形ネットワークという結果になる。これらの分子の生体分子集合はネットワーク（例えば、図１Ａに示されている六辺形ネットワーク）のパターンを定義し、該パターンのエッジで定義される細孔（例えば、図１Ａに示されている各六辺形の中央）の形成という結果になる。
【００３８】
複数の水素結合ドナーおよび/またはアクセプターの存在により、基体の表面にわたって二次元ネットワークが形成される。このように、メラミンとＰＴＣＤＩは、多孔性分子ネットワークを形成しうる２つの分子の例であるが、他のアミンおよびジイミドの組み合わせも他のパターンの幾何学的形状を形成するのに使用されうるということが理解されるべきである。例として、官能性メラミンユニット（Ｈ２Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−ＮＨ２）４つを有し、６重軸のシメトリーを示すアミン分子は、ＰＴＣＤＩとメラミンの使用の結果生じる六辺形細孔に代わって、矩形の、例えば四角の細孔の形成を可能とする。このことは、それから分子ネットワークが定義される構成分子の賢明な選択により細孔サイズを調整できること可能とする。
【００３９】
好適なアミンの例は下記メラミンおよびその類似体を包含する。
【化３】
2021532738.tif 000005
メラミン類似体は、ジイミドとの水素結合ネットワークに関与する官能性ユニット（Ｈ２Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−ＮＨ２）を少なくとも包含する。メラミン類似体の例として、４，４’，４’−（１，３，５−ベンゼントリイル）トリス−２，６−ピリジンジアミン： 
【化４】
2021532738.tif 000006
その変異体もが挙げられる。変異体の例において、中心のベンゼン環は、異なる数（３とは異なる）、例えば、２，６−ジアミノピリジル（または他のＨ２Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−ＮＨ２含有）部分の２または４つを取り付けることを可能とする異なる芳香族環または他の環系に置換される。いくつかの変異体において、アルキニレン、ビス（アルキニレン）またはアリーレンジラジカルのような１以上のスペーサーユニットを中心ユニットとペンダント２，６−ジアミノピリジル（または他のＨ２Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−ＮＨ２含有）部分間に介在させてもよい。メラミン類似体の別の例として：
【化５】
2021532738.tif 000007
が挙げられ、４つのＨ２Ｎ−Ｃ−Ｎ−Ｃ−ＮＨ２部分を包含している。いくつかのメラミン類似体を記載したが、選択されたアミンが選択されたジイミドとヘテロ分子水素結合を優先的にうける限り、他の芳香族アミンまたは非芳香族共役アミンも使用しうると考えられる。
【００４０】
好適なジイミドの例としては、ペリレンテトラカルボン酸ジイミド（ＰＴＣＤＩ）：
【化６】
2021532738.tif 000008
またはその類似体が挙げられる。ＰＴＣＤＩ類似体は、アミンと水素結合ネットワークに関与する少なくとも２つのジイミド官能性ユニット（Ｏ＝ＣＲ−ＮＲ−ＣＲ＝Ｏ）を包含する。ＰＴＣＤＩ類似体の例として、
【化７】
2021532738.tif 000009
が挙げられる。
ジイミドに変えられた後は、以下の芳香族部分のどれもＰＴＣＤＩ類似体として使用しうると考えられる。
【化８】
2021532738.tif 000010
【００４１】
多孔性分子ネットワークは溶液中で予め集合させてもよく、そして所望の基体表面に堆積させてよい。分子は超分子自己集合が可能なので、溶液は、溶媒および形成さるべきマトリクス/ネットワークの２つの構成成分以外の試薬（例えば、触媒）を包含しない。溶媒の例としてはジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）が挙げられる。他の溶媒が選択されてもよく、形成されるべきマトリクス/ネットワークの２つの構成成分にいくぶんか依存する。
【００４２】
多孔性分子ネットワーク集合は、熱力学平衡に達することにより溶液中に形成されうる。該熱力学平衡に達する一つの方法は、ペリレンテトラカルボン酸ジイミドまたはその類似体およびメラミンまたはその類似体との飽和混合物を加熱することである。該飽和混合物は、ペリレンテトラカルボン酸ジイミドまたはその類似体およびメラミンまたはその類似体を好適な化学量論（モル比）で包含する。例において、ジイミドとアミンは１：１のモル比で存在する。しかしながら、化学量論は、選択される分子および特定の基体表面に対する親和力に依存する。もし一つの分子が基体表面に対してより高い親和性を有すると、該分子の溶液中の量は、溶液中の他の分子の量よりも低くなりうる。
【００４３】
溶液が加熱される温度は、溶液中の２つの構成成分にいくぶんか依存する。例としては、加熱は、約５１℃（〜３２５Ｋ）ないし約１２７℃（−４００Ｋ）までの範囲の温度で行われる。
【００４４】
そして、加熱飽和混合物は、（例えば、本明細書に開示の任意の方法で）基体上に堆積され、冷却されてよく。冷却は１分当たり約１０℃までの速度でゆっくりと達成されてよい。例において、冷却速度は約０．１℃／分から約１０℃／分の範囲である。別の例においては、冷却速度は約０．５℃／分から約５℃／分の範囲である。さらなる別の例では、冷却速度は約１℃／分である。
【００４５】
基体表面上に形成する多孔性分子ネットワークは非反応性パイ（π）系である。一例においては、このタイプの系は、本質的に化学的不活性であり、それ故、基体表面を表面化学で機能化するのに使用される多くの試薬および/または活性化方法に反応しないであろう；それ故、このタイプの系はそれが適用される基体表面を容易に不動態化する。この不動態化特性のいくぶんかにより、多孔性分子ネットワークは基体表面を表面化学で選択的に機能化するパターンとして使用されうる。多孔性分子ネットワークが、異なるフローセルをパターニングすることに使用される方法の例は以下にさらに詳細に記載されている。
【００４６】
その上、多孔性分子ネットワークの非反応性パイ（π）系は、多孔性分子ネットワークが下にある基体表面に共有結合的に付着していないことを意味している。このようなので、多孔性分子ネットワークは、所望により、基体表面から容易に除去されうる。多孔性分子ネットワークの除去には、基体表面それ自体よりジイミド部分に対してより高い親和性を有する試薬を使用しうる。この試薬は、熱力学平衡をシフトさせ、多孔性分子ネットワークが基体表面から脱着される。除去試薬の例として、酸化試薬が挙げられ、それはジイミド部分の環を酸化しうる。酸化されたジイミドは平面ではなく、基体表面から容易に脱着される。好適な酸化試薬は、過マンガン酸塩、過ホウ酸塩、ハロゲン、過塩素酸塩および過酸化物からなるグループから選択される。多孔性分子ネットワーク除去が起こるときの例は以下にさらに詳細に記載される。
【００４７】
光学検出用フローセル
【００４８】
本明細書に開示されている一例において、フローセルは、基体；該基体上にありそして露出基体領域を定義する選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワーク；および少なくともいくつかの該露出領域上にシークエンシング表面化学を包含し、該表面化学は、活性化層、該活性化層に付着したポリマー、該ポリマー層に付着したプライマーを包含する。
【００４９】
このフローセルの製造方法の例が、図１Ａおよび図１Ｂに模式的に示されている。該方法は、多孔性分子ネットワーク１４を期待１２に適用し、露出基体領域１８（図１Ａ）のパターンを定義すること；および表面化学２０を少なくともいくつかの露出基体領域１８に適用することを包含する（図１Ｂ）。図２に示されているように、この方法の例においては、表面化学２０の適用は、露出基体領域18
を活性化し、活性化パッド２２を形成すること；それぞれのポリマー層２４を各該活性化パッドに適用すること；および各該それぞれのポリマー層２４にプライマー26
をグラフトすることを包含する。
【００５０】
図１Ａは、多孔性分子ネットワーク１４を上に自己集合させた基体１２の平面概略図を示している。
【００５１】
好適な基体１２の例としては、エポキシシロキサン、ガラスおよび変性または機能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料の共重合体、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（ＣｈｅｍｏｕｒｓからのＴＥＦＬＯＮ登録商標など）、環状オレフィン／シクロオレフィン重合体（ＣＯＰ）（ＺｅｏｎからのＺＥＯＮＯＲ（登録商標）など）、ポリイミドなど）、ナイロン、セラミックス／セラミック酸化物、シリカ、溶融シリカ、シリカ系材料、ケイ酸アルミニウム、シリコン及び変性シリコン（例えば、ホウ素ドープｐ＋シリコン）、窒化ケイ素（Ｓｉ３Ｎ４）、酸化ケイ素（ＳｉＯ２）、五酸化タンタル（ＴａＯ５）または他の酸化タンタル（ＴａＯｘ）、酸化ハフニウム（Ｈａ０２）、炭素、金属、無機ガラス等が挙げられる。支持体はまた、表面に酸化タンタルまたは他のセラミック酸化物のコーティング層を有するガラスまたはシリコンであってもよい。
【００５２】
例において、基板（１２）は、約２ｍｍないし約３００ｍｍの範囲の直径を有してもよく、または最大寸法が約１０フィート（〜３メートル）までの矩形シートまたはパネルであってもよい。例において、基体は、約２００ｍｍないし約３００ｍｍの範囲の直径を有するウェーハである。別の例において、支持体は、約０．１ｍｍないし約１０ｍｍの範囲の幅を有するダイである。例としての寸法を提供したが、任意の好適な寸法を有する支持体を使用することができることが理解されるべきである。別の例として、３００ｍｍの円形ウェーハより大きな表面積を有する矩形の支持体であるパネルを使用することができる。
【００５３】
多孔性分子ネットワーク１４は、自己集合アミンとジイミド分子により定義されているパターン１６、および、該パターン１６に定義される細孔を包含する。パターン１６は基体１２の一部分を被覆し、細孔は、露出基体領域１８に相当する。多孔性分子ネットワーク１４は、本明細書に記載されているように、予め自己集合させて基体１２上に堆積されてもよい。リンスと乾燥を表面化学２０を適用するに先行して行ってもよい。
【００５４】
上述したように、この例における表面化学２０の適用は、最初に露出基体領域１８を活性化することを含む。いくつかの例においては、活性化は、露出基体領域をシランまたはシラン誘導体でシラン化(silanize)することを含む。シラン化に使用されるシランまたはシラン誘導体は、多孔性分子ネットワーク１４の拡張(extended)パイ系に親和性を有しておらず、多孔性分子ネットワーク１４は、シランまたはシラン誘導体が反応する基体１２上の隔離されたアンカーポイント（例えば、露出基体領域１８）を効果的に定義する。
【００５５】
露出基体領域１８が、シラン化により活性化されると、シラン化は、任意のシランまたはシラン誘
導体を使用して達成されうる。シランまたはシラン誘導体の選択は、シランまたはシラン誘導体とポリマー層２４との間に共有結合が形成されることが望ましいので、形成されるポリマー層２４にいくぶん依存する。シランまたはシラン誘導体を露出基体領域１８に付着させるのに使用する方法は、使用されているシランまたはシラン誘導体に依存しうる。いくつかの例が本明細書に記載されている。
【００５６】
好適なシラン化方法の例として、蒸着（例えば、ＹＥＳ法）、スピンコーティングまたは他の体積方法が挙げられる。
【００５７】
ＹＥＳ ＣＶＤオーブンを利用する例においては、その上に多孔性分子ネットワーク１４を有する基体１２が、ＣＶＤオーブン内に置かれる。チャンバーがベントされ、そしてシラン化サイクルがスタートされてよい。サイクル中、シランまたはシラン誘導体容器は、好適な温度（例えば、ノルボルネンシランに対して約120℃)に維持され、シランまたはシラン誘導体の蒸気ラインは、好適な温度（例えば、ノルボルネンシランに対して約12５℃)に維持され、真空ラインは、好適な温度（例えば、約145℃)に維持されてよい。
【００５８】
別の例においては、シランまたはシラン誘導体（例えば、液体ノルボルネンシラン）は、ガラスバイアル内で堆積され、その上に多孔性分子ネットワーク１４を有する基体１２と共に、ガラス真空デシケーター内に置おかれてもよい。デシケーターを約１５ｍＴｏｒｒないし約３０ｍＴｏｒｒの範囲の圧力に排気し、約６０℃~約１２５℃範囲の温度でオーブン内に置くことができる。
【００５９】
蒸着、ＹＥＳ法および／または真空デシケーターは、ノルボルネン、ノルボルネン誘導体（例えば、炭素原子の１つに代えて酸素または窒素を包含する（ヘテロ）ノルボルネン）、トランスシクロオクテン、トランスシクロオクテン誘導体、トランスシクロペンテン、トランスシクロヘプテン、トランス−シクロノネン、ビシクロ［３．３．１］ノン−１−エン、ビシクロ［４．３．１］デク−１（（９）−エン、ビシクロ［４．２．１］ノン−１（（８）−エン、およびビシクロ［４．２．１］ノン−１−エン等のシクロアルケン不飽和部分を包含するそれらのシランまたはシラン誘導体等の種々のシランまたはシラン誘導体と共に使用しうる。これらシクロアルケンのいずれも、例えば、水素、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、シクロアルケニル、シクロアルキニル、アリール、ヘテロアリール、ヘテロアリサイクリル、アラルキル、または（ヘテロアリサイクル）アルキル等のＲ基で置換しうる。ノルボルネン誘導体の例としては、［５−ビシクロ［２．２．１］ヘプト−２−エニル）エチル］トリメトキシシランが挙げられる。他の例としては、シランまたはシラン誘導体が、シクロオクチン、シクロオクチン誘導体、またはビシクロノニン（例えば、ビシクロ［６．１．０］ノン−４−インまたはその誘導体、ビシクロ［６．１．０］ノン−２−イン、またはビシクロ［６．１．０］ノン−３−イン）等のシクロアルキン不飽和部分を包含するとき、これらの方法が使用しうる。これらのシクロアルキンは、本明細書に記載のいずれのＲ基でも置換しうる。
【００６０】
シランまたはシラン誘導体の付着は、少なくともいくつかの露出基体領域１８上に活性化パッド２２を形成する。シランまたはシラン誘導体は、基体１２と反応し、パターン１６と反応しないので、それぞれの活性化パッド２２は露出基体領域１８上に形成される。この例では、活性化パッド２２はパターン１６によりお互いから隔離する。
【００６１】
次に、ポリマー層２４が、活性化パッド２２適用されてよい。ポリマー層２４は、液体およびガスに透過性のある半硬質ポリマー材料であってよい。ポリマ層２４を構成するのに使用される分子は、多孔性分子ネットワーク１４よりむしろ活性化パッド２２と優先的に反応するように選択されうる。場合によっては、該分子は、活性化パッド２２に非常に反応性があり、多孔性分子ネットワークに対して親和性がほぼないか、全くなくてもよい。このことは、分子反応性の特異性を高め、該分子をして、多孔性分子ネットワーク１４上ではなく、活性化パッド２２上にそれぞれのポリマー層を形成することを可能ならしめる。
【００６２】
ポリマー層２４の例として、ポリ(N-(5-アジドアセトアミジルペンチル)アクリルアミド-コ-アクリルアミド、ＰＡＺＡＭ、ＰＡＺＡＭを挙げることができ、アクリルアミドコポリマーのいくつかの他の形態が、以下の構造（Ｉ）で表される：
【化９】
2021532738.tif 000011
式中、
Ｒ１は、Ｈまたは必要により置換されていてもよいアルキルである；
ＲＡはアジド、必要により置換されていてもよいアミノ、必要により置換されていてもよいアルケニル、必要により置換されていてもよいヒドラゾン、必要により置換されていてもよいヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、必要により置換されていてもよいテトラゾール、必要により置換されていてもよいテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールからなるグループから選択される；
Ｒ５、Ｒ６およびＲ８は、それぞれ独立して、Ｈおよび必要により置換されていてもよいアルキルからなるグループから選択される；
各−（ＣＨ２）Ｐ−は、必要により置換されていてもよい；
ｐは、１ないし５０の範囲の整数である；
ｎは１ないし５００００の範囲の整数である；そして、
ｍは１ないし１０００００の範囲の整数である。
当業者は、構造式（Ｉ）中の繰り返し”ｎ”および”ｍ”特色は、代表的であり、モノマーのサブユニットがポリマー構造中に任意の順序（例えば、ランダム、ブロック、パターン化(patterned)またはそれらの組み合わせ）で存在しうるということを認識する。
【００６３】
ＰＡＺＡＭの分子量は、約１０ｋＤａから約１５００ｋＤａの範囲であってもよく、または特定の例では、約３１２ｋＤａであってもよい
【００６４】
いくつかの例においては、ＰＡＺＡＭは、線状ポリマーである。他のいくつかの例においては、ＰＡＺＡＭは、軽く架橋したポリマーである。
【００６５】
他の例においては、ポリマー層２４は構造（Ｉ）のバリエーションであってもよい。一例において、アクリルアミドユニットは、Ｎ，Ｎ−ジメチルアクリルアミド
【化１０】
2021532738.tif 000012
で置き換えてもよい。この例においては、構造（Ｉ）におけるアクリルアミドユニットは、
【化１１】
2021532738.tif 000013
（式中、）
で置き換えられてもよい。Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、それぞれＨであり、Ｒ９およびＲ１０は、各メチル基（アクリルアミドの場合のように、水素の代わりに）である。この例においては、ｑは、１ないし１０００００の範囲の整数であってよい。別の例においては、Ｎ，Ｎ−ジメチルアミドを、アクリルアミドユニットに加えて使用してもよい。この例においては、構造（Ｉ）は、繰り返し”ｎ”および”ｍ”特色に加えて、
【化１２】
2021532738.tif 000014
を包含しうる。式中、Ｒ６、Ｒ７、およびＲ８は、それぞれＨであり、Ｒ９およびＲ１０は、各メチル基である。この例においては、ｑは、１ないし１０００００の範囲の整数であってよい。
【００６６】
活性化パッド２２および続いて適用されるプライマー２６と相互作用するように機能化されている限り、他のモノマーを使用してポリマー層２４を形成してもよいということが理解されるべきである。ポリマー層２４を形成するのに好適な分子の他の例としては、アガロース等のコロイダル構造；またはゼラチン等のポリマーメッシュ構造；またはポリアクリルアミドポリマーやコポリマー、シランフリーアクリルアミド（ＳＡＦ）、またはＳＦＡのアジド―ル化版（azidolyzed version)等の架橋ポリマー構造を有するものが挙げられる。好適なポリアクリルアミドの例としては、アクリルアミドとアクリル酸またはビニル基を含有するアクリル酸から、または[2+2]フォト-付加環化反応を形成するモノマーから合成されてよい。高分子層２４を形成するのに好適な分子のさらなる他の例として、アクリルアミドとアクリレートとの混合コポリマーが挙げられる。
【００６７】
本明細書に述べられているように、ポリマー層２４を形成するのに使用される分子は、多孔性分子ネットワーク１４の拡張パイ系に親和性を全く（または、ほとんど）有しておらず、そのためポリマー層２４は、多孔性分子ネットワーク１４上よりもむしろ活性化パッド２２上に形成する。分子（例えば、ＰＡＺＡＭ）は、スピンコーティング、またはディッピングあるいはディップコーティング、正または負圧下の機能化分子のフロー、または別の好適な技術を使用して堆積されてよい。機能化分子は混合物で存在してもよい。例において、該混合物としては、ＰＡＺＡＭの水溶液あるいはエタノールと水混合物溶液が挙げられる。分子は反応して多孔性分子ネットワーク１４上ではなくて、活性化パッド２２上にポリマー層２４を形成する。
【００６８】
コーティングされた後、分子は、硬化プロセスにさらされ、各活性化パッド２２を横切ってポリマー層２４を形成してもよい。例において、機能化分子の硬化は、約１ミリ秒から約数日までの範囲の時間、室温（例えば、約２５℃）から約９５℃までの温度範囲で行われうる。別の例において、時間は１０秒から少なくとも２４時間までの範囲でもよい。さらに別の例においては、時間は約５分から約２時間までの範囲でもよい。
【００６９】
ポリマー層２４の活性化パッド２２への付着は、共有結合を通していてもよい。ポリマー層２４の活性化パッド２２への共有結合は、種々使用されている間、最終的に形成されたフローセルの寿命にわたって、それぞれ隔離された領域で表面化学２０を維持するのに役立つ。以下は、活性化パッド２２とポリマー層２４間で起こりうるいくつかの反応例である。
【００７０】
シランまたはシラン誘導体が、不飽和部分としてノルボルネンまたはノルボルネン誘導体を包含するとき、ノルボルネンまたはノルボルネン誘導体は、i)ＰＡＺＡＭのアジド/アジド（azide/azido)基と１，３−双極付加環化反応を経る；ii)ＰＡＺＡＭに付着しているテトラジン基とカップリング反応を経る；ＰＡＺＡＭに付着しているヒドラゾン基と付加環化反応を経る；ＰＡＺＡＭに付着しているテトラゾール基とフォトクリック(photo-click)反応を経る；ＰＡＺＡＭに付着しているニトリルオキシド基と付加環化反応を経ることができる。
【００７１】
シランまたはシラン誘導体が、不飽和部分としてシクロオクチンまたはシクロオクチン誘導体を包含するとき、シクロオクチンまたはシクロオクチン誘導体は、i)ＰＡＺＡＭのアジド/アジドと歪み促進(strain-promoted)アジド‐アルキン１，３-付加環化（ＳＰＡＡＣ）を経る；またはii)ＰＡＺＡＭに付着しているニトリルオキシドと歪み促進アルキン―ニトリルオキシド付加環化反応を経ることができる。
【００７２】
シランまたはシラン誘導体が、不飽和部分としてビシクロノニンを包含するとき、ビシクロノニンは、二環式環系におけるひずみのため、ＰＡＺＡＭに付着しているアジドまたはニトリルオキシドと、同様のＳＰＡＡＣアルキン付加環化反応を経ることができる。
【００７３】
グラフトプロセスは、プライマー２６をポリマー層２４にグラフトするために行われる。プライマー２６は、アルキン官能基を包含する順方向増幅プライマーあるいは逆方向増幅プライマーのいずれでもよく、また別のものが末端にあってもよい。使用されうる末端プライマーの他の例としてはテトラジン末端プライマー、アジド末端プライマー、アミノ末端プライマー、エポキシまたはグリシジル末端プライマー、チオフォスフェート末端プライマー、チオール末端プライマー、アルデヒド末端プライマー、ヒドラジン末端プライマー、およびトリアゾリンジオン末端プライマーが挙げられる。プライマーの混合物もまた使用しうる。好適なプライマーの例として、ＨＩＳＥＱ（商標）、ＨＩＳＥＱＸ（商標）、ＭＩＳＥＱ（商標）、ＭＩＳＥＱＤＸ（商標）、ＭＩＮＩＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱＤＸ（商標）、ＮＯＶＡＳＥＱ（商標）、ＩＳＥＱ（商標）、ＧＥＮＯＭＥ  ＡＮＡＬＹＺＥＲ（商標）など、および他の機器プラットフォーム上でシークエンシングする用にＩｌｌｕｍｉｎａ社により販売されている市販用のフローセルの表面で使用される、Ｐ５および/またはＰ７プライマーが挙げられる。
【００７４】
例において、グラフト化は、（例えば、一時的に結合された蓋（lid）を使用し）堆積を経るフロー、ダンクコーティング、スプレーコーティング、パドルディスペンシング、またはプライマー２６をポリマー層２４に付着させる別の好適な方法により成し遂げられうる。これら例示の各技術は、プライマー溶液またはプライマー、水、緩衝液、および触媒を包含していてもよい混合物を利用しうる。
【００７５】
ダンクコーティングは、基体１２（活性化パッド２２およびポリマー層２４をその上に有する）を一連の温度制御バスに浸浸することを含んでよい。該バスは、フロー制御および/または窒素ブランケットでカバーされていてもよい。バスはプライマー溶液または混合物を包含しうる。種々のバスを通じて、プライマー２６がポリマー層２４の官能基に付着する。例において、基体１２は、反応が起こりプライマー２６が付着する、プライマー溶液または混合物を包含する第１バスの中へ導入され、次に、さらに洗浄用バスに移される。バスからバスへの移動は、ロボットアームを含んでもよいし、手動で行ってもよい。乾燥システムがダンクコーティングにおいても使用されてもよい。
【００７６】
スプレーコーティングは、基体１２（活性化パッド２２およびポリマー層２４をその上に有する）上へ、プライマー溶液または混合液を直接スプレーすることにより成し遂げられうる。スプレーコートされたウェハーは、約０℃から約７０℃までの範囲の温度で約４分から約６０分までの範囲の時間インキュベートされてよい。インキュベーション後、プライマー溶液または混合物は、例えばスピンコーターを使用して、希釈、除去することができる。
【００７７】
パドルディスペンシングは、プールアンドスピンオフ(pool and spin off)法に従い行ってもよく、それ故、スピンコーターで行いうる。プライマー溶液または混合物を基体１２（活性化パッド２２およびポリマー層２４をその上に有する）に適用（手動または自動プロセスを介して）する。適用されたプライマー溶液または混合物を、パターン１６上を含め、全表面にわたって適用または散布してもよい。プライマーコート基体１２を、約０℃から約８０℃までの温度範囲で、約２分から約６０分までの時間、インキュベートしてもよい。インキュベーション後、プライマー溶液または混合物は、例えばスピンコーターを使用して、希釈、除去することができる。
【００７８】
プライマー２６は、ポリマー層２４の官能基と反応し、多孔性分子ネットワーク１４の拡張パイ系に対して全く親和性を有していない。なので、プライマー２６は、多孔性分子ネットワーク１４上というよりもむしろポリマー層２４にグラフトする。
【００７９】
該方法の別の例においては、表面化学２０の適用は、多孔性分子ネットワークの適用前後に行ってもよい。これらの他の例においては、基体表面活性化は、多孔性分子ネットワーク１４の適用に先立って行われ、ポリマー層２４形成およびプライマー２６グレーチング（grating)は、多孔性分子ネットワークの適用後に行われる。
【００８０】
この例においては、（むきだしの）基体１２の表面は、プラズマアッシングにさらされ、基体１２の表面上に表面活性化剤（例えば、-ＯＨ基）が発生する。-ＯＨ基の追加により基体１２の多孔性分子ネットワーク（疎水性である）に対する親和性が減少しうるということに注意されたく、それ故、プラズマアッシングの条件とタイミングは、表面が親水性になりすぎないように制御されうる。
【００８１】
この例においては、多孔性分子ネットワーク１４は、活性化基体表面上に追加され、活性化基体表面の別々の領域が露出する。多孔性分子ネットワーク１４が、活性化基体上に適用されると、活性化パッド２２が形成される。
【００８２】
また、本実施例においても、本明細書に記載されているように、ポリマー層２４を、活性化パッド２２に選択的に適用してもよく、プライマー２６を本明細書に記載されているように、ポリマー層２４にグラフトしてもよい。
【００８３】
ここで、図２を参照すると、図１Ａおよび図１Ｂに示されている方法（例えば、パターニングそして表面化学２０の追加）により形成されるフローセル１０の例が示されている。プライマー２４の単一のタイプが示されているが、２以上の異なるプライマー２４が付着されていてもよい。
【００８４】
本例においては、表面化学２０の別々の各セクションのＸよびＹの寸法は、多孔性分子ネットワーク１４の各細孔のＸよびＹの寸法に実質的に対応している。多孔性分子ネットワーク１４の細孔は、ナノメーター精度で表面化学２０を配列することを可能とする。
【００８５】
図２に示されている例においては、選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワーク１４は、記述されている方法を通じて基体１２上にとどまり、そして、続いて起こるシークエンシング操作の間フローセル１０の一部としてとどまっている。これは、多孔性分子ネットワーク１４の分子構造が、シークエンシング操作中に使用される蛍光体と相互作用しないときに望ましくなる。この例においては、分子ネットワーク１４の骨格は、シークエンシング操作の間、生体分子の非特異的吸着の方向に表面を不動態化する(passivate)のを助けることができる。
【００８６】
他の例においては、選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワーク１４は、該方法の間、基体１２から取り除いてもよく、そのときは、続いて行われるシークエンシング操作の間、フローセルの一部として存在しない。この方法１００の例が、図３Ａに示されており、結果として生じるフローセル１０’の例が、図３Ｂに示されている。この方法１００は、多孔性分子ネットワーク１４を基体１２に適用し、露出基体領域１８のパターンを定義すること（参照番号１０２）；該露出基体領域１８を活性化し、活性化パッド２２を形成すること（参照番号１０４）；多孔性分子ネットワーク１４を取り除くこと、これにより、活性化パッド２２は無傷のままとどまり、格子間基体領域２８により分離される（参照番号１０４；それぞれのポリマー層２４を各活性化パッド２２に適用すること（参照番号１０６）；および、プライマー２６をそれぞれのポリマー層２４の各々にグラフトすること（参照番号１０８）を包含する。この方法１００は、多孔性分子ネットワーク１４の分子構造が、シークエンシング操作の間に使用される蛍光体と相互作用することができるときに、望ましいものになりうる。いくらかの蛍光体が、いくつかの例の多孔性分子ネットワーク１４にくっつきうる。この相互作用は、多孔性分子ネットワーク１４にくっついている蛍光体標識分析物が、シークエンシングテンプレートと相互作用をすることができないので、シークエンシングを混乱させるか、または別の悪影響を及ぼす。これらの例においては、活性化パッド２２（表面化学２０がとどまるアンカーポイント）を創出するのに多孔性分子ネットワーク１４を効果的に利用し、そして、続いて行われるシークエンシング操作を妨げないように多孔性分子ネットワーク１４を取り除くのに、該方法１００は使用しうる。これらの例においては、多孔性分子ネットワーク１４の指紋および潜在的な干渉が除去される。
【００８７】
方法１００においては、多孔性分子ネットワーク１４は本明細書に記載されているように形成してよく、活性化はシランまたはシラン誘導体を使用して本明細書に記載されているように生じてもよい。この例においては、別々の各セクションの活性化パッド２２のＸおよびＹの寸法（およびそれ故、表面化学２０の各セクション）は、シランまたはシラン誘導体が細孔で露出基体領域１８を活性化するので、多孔性分子ネットワーク１４の各細孔のＸおよびＹの寸法に相当する。
【００８８】
活性化パッド２２が形成されると、方法１００は次に多孔性分子ネットワーク１４を取り除くことを包含する。多孔性分子ネットワーク１４の化学的性質により、本明細書に記載されている酸化試薬のいずれにも影響されやすい。酸化試薬は、任意の体積技術を使用して、多孔性分子ネットワーク１４上（および基体１２の残部の上）に堆積しうる。酸化試薬にさらすことにより、多孔性分子ネットワーク１４は、ジイミドの酸化により、（例えば、脱着を経て）基体１２から持ち上げられる。酸化試薬は活性化パッド２２と反応せず、それ故、これらの基体１２の活性化部分は、引き続き行われる反応に対して無傷のままである。基体１２およびその上の活性化パッド２２は、多孔性分子ネットワーク１４が除去された後、洗浄（例えば、水で）洗浄してもよい。
【００８９】
多孔性分子ネットワーク１４の除去により、基体１２部分がさらけ出される。その部分を、本明細書においては、格子間領域２８と呼ぶ。格子間領域１８は連続であってもよく（そして多孔性分子ネットワーク１４と同じパターンを有していてもよく）、一方、シラン化領域２２は分離している。
【００９０】
方法１００においては、ポリマー層２４は本明細書に記載されているように形成されてよい。これらの例においては、ポリマー層２４を形成するのに使用される分子は、基体１２に対して親和性がなく、それ故、ポリマー層２４は、基体１２の格子間領域２８上よりむしろシラン化パッド２２上に選択的に形成する。方法１００においては、プライマーグラフティング２６も本明細書に記載されているように起こりうる。
【００９１】
本明細書に開示されているフローセル１０、１０’は、合成によるシークエンシング（sequencing-by-synthesis）(SBS)、環状アレイシークエンシング（cyclic-array sequencing）、連結によるシークエンシングン（sequencing-by-ligation）、パイロシークエンシング（pyrosequencing）としばしば称される技術を包含する種々のシークエンシングアプローチおよびテクノロジーにおいて使用しうる。これらの技術のいずれをもってしても、プライマー２６は、表面化学２０のパーツとして存在するので、パターン１６あるいは格子間領域２８上ではなくて、シークエンシングは表面化学２０に限られる。
【００９２】
一例として、合成によるシークエンシング（ＳＢＳ）反応は、Ｉｌｌｕｍｉｎａ社（サンディエゴ、ＣＡ）のＨＩＳＥＱ（商標）、ＨＩＳＥＱＸ（商標）、ＭＩＳＥＱ（商標）、ＭＩＳＥＱＤＸ（商標）、ＭＩＮＩＳＥＱ（商標）、ＮＯＶＡＳＥＱ（商標）、ＮＥＸＴＳＥＱＤＸ（商標）、またはＮＥＸＳＥＱ（商標）、または任意の他のシーケンサシステム等のシステム上で行うことができる。ＳＢＳにおいては、核酸テンプレート（すなわち、シークエンシングテンプレート）に沿ったシークエンシングプライマーの伸展(extension)がモニターされ、テンプレートにおけるヌクレオチドのシークエンスを決定する。基礎をなす化学的プロセスは重合（例えば、ポリメラーゼ酵素によって触媒作用が及ぼされている）あるいは連結（ligation）（例えば、リガーゼ酵素により触媒作用が及ぼされている）でありうる。
【００９３】
特定のポリメラーゼベースのＳＢＳプロセスにおいては、核酸ライブラリーテンプレート（library template)が、フローセル１０、１０’に導入され、それにより核酸ライブラリーテンプレートはプライマー２６にハイブリダイズする(hybridizes)。いくつもの核酸ライブラリーテンプレートが、例えば、フローセル１０、１０’上に固定されている２つのタイプのプライマー２６の１つにハイブリダイズされる。クラスターの生成が次に行われうる。クラスター生成の一例において、核酸ライブラリーテンプレートが、高適合度ＤＮＡポリメラーゼを使用して３’伸展によりハイブリダイズ化プライマー２６(hybridized primers)からコピーされる。オリジナルの核酸ライブラリーテンプレートは変性し、プライマー２６が配置されているところに該コピーを固定する。等温ブリッジ増幅（isothermal bridge amplification)が、固定されたコピーを増幅するのに使用されうる。例えば、コピーされたテンプレートは、ループオーバー(loop over)し、隣接する相補プライマー２６にハイブリダイズし、そしてポリメラーゼは、該コピーされたテンプレートをコピーし、ダブルストランド化（stranded)ブリッジを形成し、それらは変性し２つのシングルのストランド化ストランドを形成する。これらの２つのストランドはループオーバーし、隣接する相補プライマー２６にハイブリダイズし、そして、再び伸展され、２つの新しいダブルストランド化ループを形成する。該プロセスは、等温変性および増幅サイクルにより各テンプレートコピー上で繰り返され、密なクローンクラスターを生成する。ダブルストランド化ブリッジの各クラスターは変性される。例においては、リバースストランド（reverse strand)が、特定の塩基開裂により除去され、順方向テンプレートストランド(forward template strand)を残す。
【００９４】
テンプレートの３’末端および任意のプライマー２６をブロックして、望まれないプライミングを防止することができる。シークエンシングプライマーをフローセル１０、１０’に導入することができる。シークエンシングプライマーは核酸テンプレートストランドのアダプター(adapter)に相補的であるので、それは該アダプター（例えば、テンプレートのリード(read)1シークエンシングプライマー）にハイブリダイズする。
【００９５】
蛍光標識されたヌクレオチドは、プライマーに付加されたヌクレオチドの順番とタイプの検知がテンプレートのシークエンスを決定するのに使用することができるようなそんなテンプレート依存スタイルにおいて、テンプレートに付加される（それにより、シークエンシングプライマーを伸展させ）。例えば、第１のＳＢＳサイクルを開始するために、１以上の標識ヌクレオチド、ＤＮＡポリメラーゼ等を、テンプレートストランドを付着させたプライマー２６のアレイを収容するフローチャネルの中へ/を経て(into/through)送ってもよい。シークエンシングプライマー伸展により、標識ヌクレオチドが取り込まれることをひき起こし、この取り込みが、イメージング事象を通して検知される。イメージング事象の間、イルミネーションシステム（図示せず）が、励起光を表面化学２０に提供しうる。
【００９６】
いくつかの例において、ヌクレオチドが一旦付加されると、ヌクレオチドは、さらなるプライマー伸展を終結させるリバーシブルなターミネーション特性をさらに包含することができる。例えば、リバーシブルなターミネーター部分を有するヌクレオチド類似体を、脱遮断剤が送られ、該部分を除去するまで、続いて起こる伸展が起こることができないそんなふうに、テンプレートストランドに沿って、シークエンシングプライマーに付加することができる。それ故、リバーシブルなターミネーションを使用する例に対しては、（検知が生じる前後に）脱遮断試薬をフローチャネルに送ることができる。
【００９７】
種々の液体送達ステップ間で洗浄を行ってもよい。そして、ＳＢＳサイクルを、ｎ回繰り返し、ｎ個のヌクレオチドでシークエンシングプライマーを伸展し、それにより長さｎのシークエンスを検知することができる
【００９８】
ＳＢＳを詳細に記述したが、本明細書に記載されているフローセル１０、１０’は、他のシークエンシングプロトコルで、ゲノタイピング(genotyping)のために、または他の化学的および/または生物学的応用において、利用されうるということが理解されるべきである。さらなる別の例においては、本明細書に開示されているフローセル１０、１０’は、オン‐セル(on-cell)ライブラリー生成に使用されうる。
【００９９】
電気的検知用フローセル
【０１００】
本明細書に記載の別の例においては、フローセルは、基体；該基体上にありそして露出基体領域を定義する選択的に着脱可能な多孔性分子ネットワーク；および該露出領域の少なくともいくつかの上にシークエンシング表面化学を包含し、該表面化学は、ナノ構造および該ナノ構造に付着した酵素を包含する。
【０１０１】
このフローセルの製造方法の例が、図４および図５Ａないし図５Ｃに示されている。
【０１０２】
図４に示されているように、方法２００は、ナノ構造をその上に集合させた基体１２の表面に多孔性分子ネットワーク１４を適用することにより、マスクされた基体を形成すること、それにより、各ナノ構造の少なくとも一部分が露出したまま残る（参照番号２０２）；および、多孔性分子ネットワーク１４に不活性である酵素溶液に、該マスクされた基体をさらすこと、それにより、該ナノ構造の該露出部分の少なくともいくつかにそれぞれの酵素を選択的に付着させること（参照番号２０４）を包含する。
【０１０３】
図５Ａは、ナノ構造をその上に集合させた基体１２の平面概略図を示す。基体１２は本明細書に記載されている例のいずれでもよい。
【０１０４】
ナノ構造は、図５Ａにおいては参照番号３０で示されている。ナノ構造３０は、電荷センサー３２の伝導性チャネルであり、電極３４、３４’をも包含している。本明細書に使用されている、「電荷センサー」は、その表面またはその周囲の電界における摂動を電気信号に変換する検知デバイスを意味することを意図されている。例えば、電荷センサー３２は反応成分の到達または離脱を電気信号に変換することができる。いくつかの例においては、電荷センサー３２は、２つの反応成分（例えば、テンプレート核酸およびヌクレオチド）間の相互作用を電気信号に変換することができる。例示の電荷センサー３２は、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）ベースのＦＥＴ、シングルウォールナノチューブ（ＳＷＮＴ）ベースのＦＥＴ、シリコンナノワイヤー（ＳｉＮＷ）ＦＥＴ、ポリマーナノワイヤーＦＥＴ、およびグラフェンナノリボンＦＥＴ（ＭｏＳ２、シリセン等の２Ｄ材料から作製された関連ナノリボンＦＥＴ）等の電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）である。電界効果トランジスタにおいては、電流は、２つの電極３４、３４’（ソースおよびドレイン）に接続されている伝導パス(伝導チャネル/ナノ構造３０)に沿って流れる。ソースとドレイン間のチャネルコンダクタンスは、薄い誘電体を介して容量的結合可能な第３（ゲート）電極によりスイッチオンおよびオフされる。
【０１０５】
ナノ構造３０は、電荷センサー３２用伝導性チャネルとして機能することができる限り、どのようなタイプのものであってもよい。伝導性チャネルに好適な材料の例としては、コンダクター（例えば、金属、カーボンベースの材料、いくつかの金属酸化物、伝導性ポリマー等）またはセミコンダクター（例えば、シリコン、他の金属酸化物等）が挙げられる。ナノ構造３０は、チューブ、ワイヤ、リボン等の任意の好適な形状を有していてよく、該ナノ構造３０の少なくとも一つの寸法（例えば、長さ、幅、直径等）は、ナノスケールでありうる。例として、ナノ構造３０は、コンダクターおよびセミコンダクターからなるグループから選択される材料を包含する伝導性チャネルであり、そして、チューブ、ワイヤ、およびリボンからなるグループから選択される形状を有している。ナノ構造３０のいくらかの具体例として、カーボンナノチューブ（ＣＮＴ）、シングルウォールカーボンナノチューブ（ＳＷＣＮ）、シリコンナノワイヤー（ＳｉＮＷ）、ポリマーナノワイヤー、ナノリボン（例えば、グラフェンナノリボン、ＭｏＳ２、シリセン等の２Ｄ材料から作製されたナノリボン等）、または、電荷センサー３２の伝導性チャネルとして機能することができる他の任意のナノ構造を挙げることができる。例において、ナノ構造３０は、シリコンナノワイヤーである。別の例においては、ナノ構造はカーボンナノチューブである。
【０１０６】
図５Ａに示されている、ナノ構造３０の対抗端部は、それぞれの電極３４、３４’と電気的に通じている。ナノ構造３０に化学的にそして電気的に付着することができる電極材料を任意好適に使用しうる。好適な電極材料としては、金、プラチナ、カーボン、インジウムスズ酸化物等を挙げることができる。
【０１０７】
いくつかの例においては、基体１２上に電荷センサー３２を集合させることは、電極３４、３４’を作製することおよび任意の好適な技術、例えば、直接成長、溶液ディッピング、または種々のプリンティング技術などを使用して電極３４、３４’間にナノ構造３０を作製することを包含する。一つの例として、カーボンナノチューブは、アーク放電、レーザーアブレーション、高圧一酸化炭素不均衡化、または化学蒸着（ＣＶＤ）を使用して製造しうる。別の例として、シリコンナノワイヤー（ＳｉＮＷｓ）は、固体のエッチングにより、または気相あるいは固相から触媒成長を経てシリコン前駆体ら製造しうる。
【０１０８】
各電荷センサー３２は個々に配線されてよい（それ故、個々にモニターされうる）。言い換えれば、個々の電荷センサー３２の電極３４、３４’は、それらの操作を可能ならしめる電子回路構成に接続されうる（例えば、一度、検出器または電源に接続され(hooked up)うる。該電子回路構成は検出器に、そして電源に、電気的に接続可能であってよい。
【０１０９】
基体１２上の電荷センサー３２の配列は、基体１２上に形成されるべき多孔性分子ネットワーク１４の、パターン１６、特に細孔の幾何学的形状にいくぶんか準拠しうる。これは、多孔性分子ネットワーク１４が基体１２上および電荷センサー３２上で自己集合するということ、および少なくとも一部のナノ構造３０が多孔性分子ネットワーク１４の細孔中に置かれることが望ましいということの事実に、いくぶんか起因するからである。多孔性分子ネットワーク１４は、ナノ構造３０の表面トップに部分的に堆積し、ナノ構造３０上で起こる機能化の量を制限しうる、および/またはナノ構造３０に付着さされている生体分子の間隔をあけうる、および/または電荷センサー３２の部分を不動態化して試薬（例えば、溶液塩等）が該不動態化部分と相互作用することから防ぎうる。
【０１１０】
図４の参照番号２０２に示されているように、方法２００は、ナノ構造３０をその上に集合させた基体１２の表面に多孔性分子ネットワーク１４を適用することにより、マスクされた基体を形成することを包含し、それにより、各ナノ構造３０の少なくとも一部分が露出したまま残る。本明細書に記載されているように、多孔性分子ネットワーク１４は、溶液中で予め集合させ、そして基体１２上に堆積させてよい。
【０１１１】
多孔性分子ネットワーク１４は、細孔のサイズおよび電荷センサー３２の位置に少なくともいくぶんかは依存して、基体１２の表面上、場合によっては、電荷センサー３２のサイズおよび構成要素（３０、３４、３４’）上に自己集合する。堆積すると、多孔性分子ネットワークは自己集合し、基体１２の部分および/または基体１２上の電荷センサー３２部分は細孔で露出する。これにより、図５Ｂに示されているように、マスクされた基体が形成される。多孔性分子ネットワーク１４および電荷センサー３２を簡単、明確に示すために、図５Ｂにおける各電荷センサー３２は、多孔性分子ネットワーク１４のそれぞれの細孔で露出されているように示されている。しかしながら、多孔性分子ネットワーク１４の個々の細孔は、電荷センサー３２より小さく、場合によっては、ナノ構造３０より小さいということが理解されるべきである。そうなので、多孔性分子ネットワーク１４は、露出基体１２に加え、電極３４、３４’および/または電荷センサー３２のナノ構造３０のいくらかまたは全部を覆う場合もある。電極３４、３４’およびナノ構造３０の一部を覆って広がっている多孔性分子ネットワーク１４の例が図６に示されている。多孔性分子ネットワーク１４により何が覆われているか、そして多孔性分子ネットワーク１４の細孔部で何が露出しているかは電荷センサー３２および多孔性分子ネットワーク１４の自己集合の寸法や位置にいくぶん依存しているということが理解されるべきである。本明細書に開示されている例においては、いくつかのナノ構造３０は多孔性分子ネットワーク１４に完全に覆われているかもしれない、および/または基体１２の部分はいくつかの細孔で露出されているかもしれないということが理解されるべきあるとはいえ、多孔性分子ネットワーク１４の少なくともいくつかの細孔は、ナノ構造３０の少なくとも一部の部分を露出させている。
【０１１２】
方法２００は、次に、マスクされた基体を多孔性分子ネットワーク１４に不活性な酵素溶液にさらすことを包含する。「不活性な」とは、酵素溶液は多孔性分子ネットワーク１４にくっつかず、または、と反応せず、該溶液中の酵素は、ナノ構造３０の露出部分少なくともいくつかに選択的に付着するということを意味している。この酵素溶液の不活性は、溶液の親水性および多孔性分子ネットワーク１４の疎水性のためでありうる。多孔性分子ネットワーク１４は、共役しており、それ故、非常に疎水性である。酵素溶液は、（多孔性分子ネットワーク１４に比べ）親水背であり、それ故、多孔性分子ネットワーク１４にくっつかず、または、と反応しない。そのようなので、マスクされた基体が、酵素溶液にさらされたとき、溶液中の酵素は、多孔性分子ネットワーク１４よりむしろナノ構造３０の露出部分のいくつかに引き寄せられうる。多孔性分子ネットワーク１４は、ナノ構造３０の一部または全部の表面のいくらかを覆いうるので、これらのナノ構造３０の小さな部分のみが細孔で露出しうる。該小さな露出部分は、いずれか一つのナノ構造３０で起こりうる機能化を制限し、生体分子付着の特異性を向上させうる。いくつかの例においては、該小さな露出ナノ構造部分は、単一の酵素を付着させることができ、電荷センサー３２の検知機能を向上させうる。
【０１１３】
酵素溶液は酵素３６（単独で、またはそれに付着したテザ―３８と組み合わせで）および酵素の液体キャリアを包含しうる。該液体キャリアは水ベースの溶液である。一つの例においては、食塩水が該液体キャリアとして使用しうる。
【０１１４】
本発明の例においては、単一の酵素３６が、単一のナノ構造３０に付着することが望ましい（図５Ｃおよび図６に示されているように）。このプロセスにおいて助けるために、使用される酵素３６は、パターン１６の細孔で露出しうるナノ構造３０の部分のサイズと同様の（similar)溶液中における流体力学的半径を有するように選択されうる。「同様の(similar)」とは、流体力学的半径が、多孔性分子ネットワークの細孔サイズより５０％まで大きいかまたは小さくありうるということを意味している。好適な酵素３６の例は、ポリメラーゼである。好適なＤＮＡポリメラーゼの例としては、Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｘ、Ｙ、およびＲＴとして同定されるファミリーへの構造的相同性により分類されるものが挙げられる。ファミリーＡにおけるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、真核性ミトコンドリアＤＮＡポリメラーゼγ（ガンマ）、E. coli DNA Pol I、Thermus aquaticus Pol I、およびBacillus stearothermophilus Pol I.が挙げられる。ファミリーＢにおけるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、真核性ＤＮＡポリメラーゼα（アルファ）、δ（デルタ）およびε（イプシロン）；ＤＮＡポリメラーゼζ（ゼータ）；Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｐｈｉ２９ ＤＮＡポリメラーゼ、およびＲＢ６９バクテリオファージＤＮＡポリメラーゼが挙げられる。ファミリーＣにおける例としては、例えば、E. coliＤＮＡポリメラーゼＩＩＩアルファサブユニットが挙げられる。ファミリーＤにおける例としては、ArchaeaのEuryarchaeotaサブドメイン由来のポリメラーゼが挙げられる。ファミリーＸにおけるポリメラーゼとしては、例えば、真核性ポリメラーゼPol β（ベータ）、Pol σ（シグマ）、Pol λ（ラムダ）、Pol μ（ミュー）、およびS.cerevisiae Pol4が挙げられる。ファミリーＹにおけるＤＮＡポリメラーゼとしては、例えば、Polη（イータ）、Pol iota、Pol kappa、E. coli Pol IV(DINB)およびE coli Pol V(UmuD'2C)が挙げられる。ＤＮＡポリメラーゼのＲＴ（逆転写酵素）ファミリーとしては、例えば、レトロウイルス逆転写酵素および真核性テロメラーゼ（telomerase）が挙げられる。
【０１１５】
酵素３６は、ナノ構造３０の露出部分に直接付着されてもよいし、ナノ構造３０の露出部分に間接的に、例えば、テザ―３８（図６に示されている）を通して、付着されてもよい。酵素３６とナノ構造３０の露出部分との間、または、酵素３６とテザ―３８との間、およびテザ―３８とナノ構造３０の露出部分との間の付着は、共有結合または非共有結合であってよく、ナノ構造３０の材料、酵素３６、および使用されているテザ―３８に依存しうる。例において、付着はニッケルＮＴＡ/Ｈｉｓ タグ ケミストリー（tag chemistry)を使用して達成される。
【０１１６】
テザ―３８は、酵素３６（例えば、ポリメラーゼ）用アンカーと使用されうる。好適なテザ―３８としては、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＤＮＡ鎖、ペプチド核酸（ＰＮＡ）鎖、脂肪族炭化水素鎖等が挙げられる。いくつかの例においては、テザ―３８長さは、ナノ構造３０から少なくとも１０ｎｍ離れていれば酵素３６を保持するのに十分である。これは、例えば、ポリメラーゼ（または他の酵素３６）への相似変化（conformal change）、ポリメラーゼ（または他の酵素３６）の電荷、および/または、ポリメラーゼ（または他の酵素３６）に保持されるターゲット/テンプレートポリヌクレオチド鎖の電荷が、ナノ構造３０のセンシング操作を妨げないようにするために、望ましくありうる。
【０１１７】
マスクされた基体が酵素溶液にさらされたとき、酵素３６またはテザ―３８をナノ構造３０の露出部分にカップリングするために加熱を行ってもよい。しかしながら、カップリング反応（例えば、アミドカップリング）には、室温（例えば、約１８℃から約２５℃までの範囲にわたる）で起こるものもあり、それ故、さらなる加熱の使用は、酵素３６またはテザ―３８、ナノ構造３０、および構成要素３６と３０または３８と３０間で起こっているカップリング反応のタイプに依存しうるということが理解されるべきである。
【０１１８】
図６に示されているフローセル１０”の例は、方法２００の結果として形成されている。アレイにおける各ナノ構造３０は、酵素３６で機能化されているが、いくつかの例においては、カップリング反応はナノ構造３０のすべてで起こりえないということ、それ故、アレイにおけるナノ構造３０のいくつか（すべてではなく）が機能化されうるということが理解されるべきである。この例、フローセル１０”においては、多孔性分子ネットワーク１４は、続いて起こるシークエンシング操作の間、基体１２上、および電荷センサー３２の被覆部分上にとどまりうる。検知は電子的であり、蛍光体を含まないので、疎水性多孔性分子ネットワーク１４は、導入された試薬（親水性である）を酵素機能化ナノ構造３０へガイドする助けをすることができる。
【０１１９】
図６には示されていないが、各電荷センサー３２は、個々のセンサー３２の電気的反応を検知することができるディテクターを包含していてもよいということが理解されるべきである。例においては、各ディテクターは電流計である。
【０１２０】
本発明に開示されているフローセル１０”は、ポリメラーゼ組み込み事象（すなわち、ヌクレオチドが発生期のストランド中に取り込まれた）のただ一つの分子を検知するのに使用しうる。より詳しくは、電荷センサー３２は、ただ一つの分子反応の動態をモニターすることができる。
【０１２１】
ただ一つの分子検知のために、テンプレートポリヌクレオチド鎖がフローセル１０”に導入されうる。テンプレートポリヌクレオチド鎖は、シークエンスされる任意のサンプルであってよく、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはそれらの類似体(例えば、ペプチド核酸）で構成されていてもよい。テンプレート（またはターゲット）ポリヌクレオチド鎖のソースは、ゲノムＤＮＡ、またはメッセンジャーＲＮＡ、または天然ソース由来の他の核酸であってもよい。
【０１２２】
テンプレートポリヌクレオチド鎖は、ポリメラーゼ（酵素３６の一例）により、所定の位置に保持されてもよく、ナノ構造３０に直接または間接に付着されている。テンプレートポリヌクレオチド鎖は、生物学的に安定な溶液中で、テンプレートポリヌクレオチド鎖に添って形成される発生期のストランド中に取り込まれるべきはすのヌクレオチド等の試薬と共に導入されうる。生物学的に安定な溶液は、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）あるいは線状増幅(linear amplification)等のポリメラーゼ塩基導入反応に好適な任意のバッファであってよい。一つの例において、生物学的に安定な溶液は、７近傍のｐＨ、数ミリモルを超える塩濃度、およびミリモル濃度のＭｇ２＋イオンを有するバッファを包含しうる。
【０１２３】
導入される少なくともいくつかのヌクレオチドは、テンプレートポリヌクレオチド鎖のターゲット核酸に相補的な塩基を包含しうる。ヌクレオチドは、テンプレートポリヌクレオチド鎖にも結合しているポリメラーゼにより、いくぶん、所定の位置に保持される。結合されているヌクレオチドは、電荷センサー３２で信号を変え、それはディテクターで検知可能である。
【０１２４】
ただ一つの分子（ヌクレオチド）が、電荷センサー３２に検知された後、フローセル１０”は、本明細書に開示されている酸化試薬等の脱パターニング試薬にさらされてもよいということが理解されるべきである。この例においては、脱パターニング試薬はポリメラーゼから結合ヌクレオチドを取り除き、多孔性分子ネットワーク１４のジイミドをも酸化し、基体１２から多孔性分子ネットワーク１４を分離する。
【０１２５】
フローセル１０”は、パターニング試薬(溶液中で予め集合させた多孔性分子ネットワークを包含している）を導入し、それは、電荷センサー３２のまわり基体１２上に新たな多孔性分子ネットワーク１４を形成する、そして、テンプレートポリヌクレオチド鎖の次のターゲット核酸に対して導入されるべきヌクレオチドを包含しているサンプルを導入することにより再度使用してもよい。ただ一つの分子検知、脱パターニング、および再パターニングは、全テンプレートポリヌクレオチド鎖のために継続しうる。
【０１２６】
このフローセル１０”は、異なるテンプレートポリヌクレオチド鎖でのシークエンシング操作において再度使用することもできるであろう。
【０１２７】
フローセルの蓋
【０１２８】
図２、図３Ｂ、および図６に示されている例は、それに蓋が結合されていないフローセル１０、１０’、１０”の例である。示されてはいないが、フローセル１０、１０’、１０”は、基体１２の少なくとも一部に結合されている蓋を有していてもよい。蓋は、それが単一のフローチャネルまたは多数の流体的に分離されたフローチャネルを定義するように、基体１２上に位置付けられてもよい。表面化学２０、２０’（単独でまたはアレイとして）フローチャネル中に存在しているということが理解されるべきである。
【０１２９】
フローセル１０、１０’（光学的検知を利用している）にあっては、蓋は、表面化学２０の方向に指向している励起光に透明である任意の材料であってよい。例として、蓋は、ガラス（例えば、ボロシリケート、溶融シリカ等）、プラスチック等であってよい。好適なボロシリケートグラスの商業的に入手可能な例は、Schott North America社から入手可能なＤ263(登録商標)である。好適なプラスチック材料の商業的に入手可能な例、すなわち、シクロオレフィンポリマーは、Zeon Chemical L.P.社から入手可能なＺＥＯＮＯＲ（登録商標）製品である。フローセル１０”（電子的検知を利用している）にあっては、蓋は、透明な材料または他の任意の望ましい材料を含め、任意の材料であってよい。蓋は、レーザー接合、拡散接合、陽極接合、共晶接合、プラズマ活性化結合、ガラスフリット結合、または当該技術分野で公知の他の方法等、任意の適切な技術を使用して接合されてよい。
【０１３０】
検知システム
【０１３１】
本明細書に開示されている検知システム４０の一例が図７に示されている。このシステム４０はフローセル１０”を包含しており、電子検知システム４０である。この例においては、フローセル１０”は、着脱可能なフローセル１０”として参照されているが、このフローセル１０”は、システム４０に恒久的に封じ込められてもよいし、また、システム４０から着脱可能であってもよいということが理解されるべきである。着脱可能な例においては、着脱可能なフローセル１０”は取り除いて、例えば、違うシークエンシング操作のために、新しい着脱可能なフローセル１０”に置き換えることができる。検知システム４０は一例であり、該システムの他の構成を使用しうるということが理解されるべきである。
【０１３２】
例としての検知システム４０は、例えば、電気コンポーネント、コンピュターコンポーネント、電源、ファン等を包含する種々の固定コンポーネントを含有しているハウジング４２を包含する電子検知システムである。スクリーン４４が、例えば、ハウジング４２の前面に存在してもよく、オペレーションステータス、実行されている分析手順のステータス（例えば、シークエンシングラン）、デバイス４０へのまたはからのデータトランスファーのステータス、使用指示、警告等等の種々のタイプの情報を提供することができるグラフィカルユーザーインターフェースとして機能してもよい。レセプタクル４６は、ハウジング４２の前面に存在してもよい。レセプタクル４６は、２つのセクション、フローセルレセプタクル部分および試薬カートリッジレセプタクル部分を包含しうる。レセプタクル４６フローセル部分は、着脱可能なフローセル１０”を恒久的に収容してもよいし、着脱可能なフローセル１０”を収納（およびリリース）してもよい。レセプタクル４６のフローセル部分が着脱可能なフローセル１０”を恒久的に収容するとき、レセプタクル４６は、単一のスロット５０を包含し、試薬カートリッジレセプタクル部分における試薬カートリッジを収納してもよい。レセプタクル４６のフローセル部分が、交換可能なフローセル１０”を収納するとき、レセプタクル４６は、２つのスロット４８、５０を包含してよく、その一つは、着脱可能なフローセル１０”を収納するものであり、他のものは、試薬カートリッジを収納するものである。スロット４８、５０は、保護ドアを有してもよい。
【０１３３】
検知システム４０は、ステータスインジケータ５２を包含してもよく、それは、この例においては、レセプタクル４６のフレーム上にあるインジケータライトの形態である。ステータスインジケータ５２は、試薬カートリッジおよび/または交換可能なフローセル１０”の存在または不存在を表示することができる。
【０１３４】
図示されているように、フローセル１０”は、基体１２と蓋５４を包含する。恒久的であれ、交換可能であれ、着脱可能なフローセル１０”は、着脱可能なフローセル１０”の電荷センサー３２（図５Ａ）にバルク試薬（bulk reagent)の送出を可能とするインプットおよびアウトプット流体ポート５６、５８を包含していてもよい。
【０１３５】
シークエンシングシステム４０は、着脱可能なフローセル１０”のインプット流体ポート５６へ、センサー３２上に、そして着脱可能なフローセル１０”の流体アウトプット５８外に、試薬を選択的に導入する試薬デリバリーシステムを包含していてもよい。試薬デリバリーシステムは、ポート５６、５８に恒久的にまたは交換可能に付着させることができるチューブまたは他の流体工学を包含してもよい。試薬デリバリーシステムはまた、試薬カートリッジ６０に操作的に接続することができるチューブまたは他の流体工学を包含してもよい。試薬デリバリーシステムはまた、シークエンシングおよび脱パターニング/パターニングプロトコルに従い（例えば、着脱可能なフローセル１０”を使用するために本明細書に記載されている方法に従い）、試薬カートリッジ６０から試薬を回収し、そしてそれをインプット流体ポート５６に送るポンプまたは他の適切な装備を包含していてもよい。
【０１３６】
試薬カートリッジ６０は着脱可能なフローセル１０”に種々の試薬を提供することができる。試薬カートリッジ６０は、リザーバ、流体接続、ポンプ、バルブ等の種々の流体コンポーネントを保護するハウジングを包含する。例において、試薬カートリッジ６０は流体貯蔵システムを包含し、それは脱パターニング試薬レセプタクル６２および該脱パターニング試薬レセプタクル６２内に収容されている脱パターニング試薬（例えば、酸化試薬）；２つの分離したコンパートメント６４，６６を包含するパターニング試薬レセプタクルを包含しており、パターニング試薬（例えば、メラミンまたはその類似体）の第１の成分が、２つの分離したコンパートメント６４の第１番目に収容され、そしてパターニング試薬（例えば、ＰＴＣＤＩまたはその類似体）の第２の成分が、２つの分離したコンパートメント６６の第２番目に収容されている。試薬カートリッジ６０はまたサンプルコンパートメント６８を包含していてもよく、それはテンプレートポリヌクレオチド鎖（シークエンスされるべき）用およびヌクレオチド（該テンプレートポリヌクレオチド鎖に沿って形成される発生期のストランド中に導入されるべき）を包含するサンプル用のサブコンパートメントを包含していてもよい。試薬カートリッジ６０は、シークエンシングの間、テンプレートポリヌクレオチド鎖およびサンプルをリリースするように、結合されたヌクレオチドおよび多孔性分子ネットワーク１４を除去する脱パターニング試薬をリリースするように、そして、フレッシュな多孔性分子ネットワーク１４を形成するパターニング試薬をリリースするようにプログラムされていてもよい。試薬カートリッジ６０はまた、混合チャンバーを包含していてもよく、そこで、パターニング試薬は、それが着脱可能なフローセル１０”の基体１２上に導入される前に、導入され、予め集合することを可能とされる。
【０１３７】
追記
【０１３８】
前述の概念と、以下でより詳細に論じられる追加の概念とのすべての組み合わせ（そのような概念が相互に矛盾しないという条件で）が、本明細書に開示されている本発明の主題の一部であるとして考えられているということを理解いただきたい。特に、本開示の最後に見られる請求主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示されている進歩性ある主題の一部であるとして考えられている。また、本明細書に明示的に用いられ、参照により組み込まれている開示にも現れるであろう専門用語は、本明細書に開示されている特定の概念と最も整合する意味が与えられているということを理解いただきたい。
【０１３９】
本明細書全体を通して、「一例(one example)」、「別の例(another example)」、「例(an example)」などへの言及は、例に関連して記載される特定の要素（例えば、特徴(feature)、構成(structure)、および／または特性(characteristic)）が、本明細書に記載されている少なくとも１つの例に包含され、他の例に存在しても存在しなくてもよいことを意味している。さらに、任意の例のための記載された要素は、文脈が明確にそうでないことを指示しない限り、様々な例において任意の好適な方法で組み合わされてもよいということが理解されるべきである。
【０１４０】
特許請求の範囲を含め、本開示を通して使用されている用語「実質的に」および「約」は、処理におけるばらつき等の小さな変動を記述および説明するのに使用されている。例えば、それは、±％５％以下、例えば±２％以下、例えば±１％以下、例えば±０．５％以下、例えば±０．２％以下、例えば±０．１％以下、例えば±０．０５％以下を意味しうる。
【０１４１】
さらに、本明細書に提示されている範囲は、述べられている範囲、述べられている範囲内の任意の値または部分範囲を、それらが明示的に列挙されているかのように、包含しているということが理解されるべきである。例えば、1から５０までによって表される範囲は、明示的に説明されている１から５０までの許容限度だけでなく、約１５、２２．５、４５などの個々の値および約２０から約４８まで等の部分範囲をも包含していると解釈されるべきである。
【０１４２】
いくつかの例が詳細に記載されているが、開示されている例は修正されてもよいということが理解されるべきである。それ故、先行の記述は非限定的であると考えるべきである。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【国際調査報告】
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