(57)【要約】  細胞培養のための溶解可能な発泡足場が本明細書に提供される。溶解可能な発泡足場は、ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーとを含む。
2021503894.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞培養のための溶解可能な発泡足場であって、
ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、
表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーと
を含む、溶解可能な発泡足場。
【請求項２】
接着ポリマーコーティングをさらに含む、請求項１に記載の溶解可能な発泡足場。
【請求項３】
前記接着ポリマーコーティングがペプチドを含む、請求項２に記載の溶解可能な発泡足場。
【請求項４】
前記接着ポリマーコーティングが、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン、及びそれらの混合物からなる群より選択されるペプチドを含む、請求項２に記載の溶解可能な発泡足場。
【請求項５】
前記接着ポリマーコーティングが、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣを含む、請求項２に記載の溶解可能な発泡足場。
【請求項６】
前記少なくとも１つの第１のポリマーが、セルロース誘導体、タンパク質、又は合成両親媒性ポリマーを含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の溶解可能な発泡足場。
【請求項７】
表面活性を有しない少なくとも１つの第２のポリマーをさらに含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の溶解可能な発泡足場。
【請求項８】
前記少なくとも１つの第２のポリマーが、合成ポリマー、半合成ポリマー、又は天然ポリマーを含む、請求項７に記載の溶解可能な発泡足場。
【請求項９】
水溶性可塑剤をさらに含む、請求項１〜８のいずれか一項に記載の溶解可能な発泡足場。
【請求項１０】
約５５質量％未満の水溶性可塑剤を含む、請求項９に記載の溶解可能な発泡足場。
【請求項１１】
溶解可能な発泡足場を形成する方法であって、前記方法が、
ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるポリガラクツロン酸化合物を水溶液に加えることによって第１の水性混合物を形成すること；
表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーと二価金属塩とを水溶液に加えることによって第２の水性混合物を形成すること；
前記第１の水性混合物を前記第２の水性混合物と合わせて、合わせた水性混合物を形成すること；
前記合わせた水性混合物にゲル誘導剤を加えること；及び
前記合わせた水性混合物に気泡を導入して発泡足場を形成すること
を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、その内容が依拠され、その全体がここに参照することによって以下に完全に記載されているかのように本願に援用される、２０１７年１１月２１日出願の米国仮特許出願第６２／５８９，２３８号及び２０１８年２月１９日出願の米国仮特許出願第６２／６３２，１７８号の優先権の利益を主張する。
【技術分野】
【０００２】
本開示は、概して、溶解可能な細胞培養材料に関する。特に、本開示は、細胞培養のための溶解可能な発泡足場及びそのような溶解可能な発泡足場の製造方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
インビトロ研究は、創薬プロセス及び潜在的な新しい治療法の探索にとって重要である。しかしながら、２次元（２Ｄ）培養基板上での従来のインビトロ細胞培養では、インビボ環境をシミュレーションすることができない。インビボ環境におけるほとんどすべての細胞は、他の細胞及び細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に３次元（３Ｄ）の態様で囲まれているため、２Ｄ細胞培養は細胞の天然の３Ｄ環境を適切にはシミュレートしない。２Ｄ培養の細胞は、硬い表面に付着するように強いられ、幾何学的に制約されており、平らな形態を採用するが、これは、細胞内シグナル伝達に重要な細胞骨格調節を変化させ、結果として、細胞の成長、移動、及びアポトーシスに影響を与える可能性がある。さらには、細胞の分化、増殖、及び遺伝子発現に重要なＥＣＭの組織は、ほとんどの２Ｄ細胞には存在しない。２Ｄ培養のこれらの制限により、インビボで観察されるものとは著しく異なるインビトロでの生物学的応答がしばしば発生する。
【０００４】
現在、創薬では、化合物をスクリーニングする標準的な手順は、２Ｄ細胞培養をベースとした試験で始まり、その後に動物モデルの試験が行われ、その後、臨床試験が行われる。公的に入手可能なデータによれば、化合物のわずか約１０％のみが臨床開発を経て成功裏に進行する。多くの薬物は、主に、臨床効果の欠如及び／又は許容できない毒性を原因として、臨床試験中に（とりわけ、臨床開発の最も費用のかかるフェーズであるフェーズＩＩＩ中に）不合格となる。これらの不合格の一部は、（一又は複数の）薬物に対する細胞応答が不自然な微小環境に起因して変化する２Ｄ培養試験から収集されたデータに起因する。創薬に関連する高コストの理由から、効果のない及び／又は許容できない毒性化合物を創薬プロセスのできるだけ早い段階で排除する能力に対する需要が高まっている。インビボでの細胞の挙動をより現実的に模倣し、インビボ試験によってより予測可能な結果を提供することができる、インビトロの細胞をベースとしたシステムが現在検討されている。
【０００５】
最近の研究では、３Ｄ細胞培養は、２Ｄ培養とは対照的に、インビボで細胞が経験する環境をより正確に表していることが示唆されており、３Ｄ培養における細胞応答は、２Ｄ培養における細胞応答よりもインビボ挙動に類似していることが実証されている。３Ｄ培養の追加の次元は、周囲の細胞との相互作用に関与する細胞表面レセプターの空間組織に影響を与えるだけでなく、細胞への物理的拘束も引き起こすことから、細胞応答の違いにつながると考えられている。３Ｄ培養におけるこれらの空間的及び物理的側面は、細胞の外側から内側への信号伝達に影響を与え、最終的には遺伝子発現及び細胞の挙動に影響を与えると考えられる。
【０００６】
３Ｄ培養の利益は、細胞の天然の３Ｄ環境をシミュレートする細胞培養技術の開発に影響を与えてきた。一部のバイオリアクタは、細胞の接着及び成長を促進するための固定床又は充填床を形成する、固定充填材の形態をしたキャリアを含む。固定床の充填材の構成は、局所的な流体、熱、及び物質移動に影響を及ぼし、通常は、所与の空間での細胞培養を最大化するために、非常に高密度である。さらに別の３Ｄ細胞培養技術は、マトリクスの細孔及び他の内部空間内の培養細胞の成長及び増殖を促進する、多孔質の３Ｄマトリクス又は足場である。
【０００７】
上記の技術の各々において、細胞の回収にプロテアーゼ処理を使用することができる。しかしながら、プロテアーゼ処理などの一般的に用いられる回収手順では、細胞の構造及び機能に損傷を与える可能性のある過酷な条件に細胞をさらすこととなる。加えて、プロテアーゼ処理のみでは、しばしば、限られた量の細胞剥離しか引き起こさない。固定床材料では、問題は、一部には、固定床材料の密集した性質を原因とし、これは、プロテアーゼ剤を床全体に循環させて、回収した細胞の収量を増加させることをさらに困難にする。同様に、プロテアーゼ剤を３Ｄマトリクスの内部空間内に循環させることは困難であるかもしれず、したがって、回収プロセス中に細胞を取り外すことが困難になる。この困難さは、固定床材料の表面又はマトリクスの表面に細胞を付着させる働きをする、培養細胞が分泌する細胞外高分子の存在によって悪化する。
【０００８】
代替的に又はプロテアーゼ処理と組み合わせて、機械的な力を加えて培養細胞を固定床材料又は３Ｄマトリクスから解放する、細胞を回収するための方法及びシステムが開発されている。例えば、固定床材料又は３Ｄマトリクス、若しくは、固定床材料又は３Ｄマトリクスを含む、より大きいシステムを振盪又は振動させて、培養細胞を解放することができる。機械的な力を加えると、培養細胞に物理的な損傷を生じ、それにより、細胞培養収量を低下させる可能性がある。
【発明の概要】
【０００９】
本開示の実施形態によれば、細胞培養のための溶解可能な発泡足場が本明細書に提供される。溶解可能な発泡足場は、ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーとを含む。
【００１０】
本開示の実施形態によれば、溶解可能な発泡足場を形成する方法が提供される。該方法は、ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるポリガラクツロン酸化合物を水溶液に加えることによって第１の水性混合物を形成すること；表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーと二価金属塩とを水溶液に加えることによって第２の水性混合物を形成すること；第１の水性混合物と第２の水性混合物とを合わせて、合わせた水性混合物を形成すること；合わせた水性混合物にゲル誘導剤を加えること；並びに、合わせた水性混合物に気泡を導入して、発泡足場を形成することを含む。
【００１１】
本開示の実施形態によれば、溶解可能な発泡足場で細胞を培養する方法が提供される。該方法は、細胞が溶解可能な発泡足場の細孔内に入るように該溶解可能な発泡足場に細胞を播種すること、及び、溶解可能な発泡足場を細胞培養培地と接触させることを含む。溶解可能な足場は、ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーとを含む。
【００１２】
本開示の実施形態によれば、溶解可能な発泡足場から細胞を回収する方法が提供される。該方法は、溶解可能な発泡足場を酵素に曝露することによって溶解可能な発泡足場を消化すること、及び、溶解可能な発泡足場をキレート化剤に曝露することを含む。溶解可能な足場は、ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーとを含む。本開示の実施形態によれば、組成物から形成される発泡足場生成物が提供される。該組成物は、ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーと、約５５質量％未満の水溶性可塑剤とを含む。
【００１３】
追加の特徴及び利点は、以下の詳細な説明に記載され、一部には、その説明から当業者に容易に明らかとなり、あるいは、以下の詳細な説明、特許請求の範囲、並びに添付の図面を含めた本明細書に記載される実施形態を実施することによって認識されよう。
【００１４】
前述の概要及び後述する詳細な説明はいずれも、単なる例示であり、特許請求の範囲の性質及び特徴を理解するための概観又は枠組みを提供することが意図されていることが理解されるべきである。添付の図面は、さらなる理解を提供するために含まれ、本明細書に組み込まれて、その一部を構成する。図面は、１つ以上の実施形態を例証しており、その説明とともに、さまざまな実施形態の原理および動作を説明する役割を担う。
【００１５】
本開示は、純粋に非限定的な例として与えられた以下の説明及び添付の図面からより明確に理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００１６】
【図１】本開示による溶解可能な発泡足場の斜視図
【図２】実施例１で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図３】実施例２で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図４】実施例３で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図５】実施例４で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図６】実施例５で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図７】実施例６で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図８】実施例７で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図９】実施例８で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図１０】実施例９で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図１１】実施例１０で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図１２】実施例１１で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図１３】４つの発泡足場を形成するためにさまざまな量の可塑剤を添加した、実施例１２で調製された４つの発泡体の写真
【図１４】実施例１３で調製した発泡足場のＳＥＭ写真
【図１５】実施例４で調製した発泡足場の細孔内で形成されたスフェロイドを示す写真
【図１６】実施例１４で調製した発泡足場に付着した細胞を示す写真
【図１７】実施例１５で調製した発泡足場に付着した細胞を示す写真
【図１８】実施例１５で調製した発泡足場に付着した、６日間の増殖後の細胞を示す写真
【図１９】実施例２４の培養条件のそれぞれについてのトランスフェクトされたＨＥＫ細胞のＧＦＰ陽性率を示す棒グラフ
【図２０】実施例２５の発泡足場のセットあたりのトランスフェクトされた細胞のＧＦＰ陽性率を示す棒グラフ
【図２１】実施例２５の発泡足場のセットあたりのウイルス粒子（ｖｐ）の数を示す棒グラフ
【図２２】実施例２５の発泡足場のセットあたりの得られた細胞あたりのウイルス粒子の数を示す棒グラフ
【図２３】感染後の実施例２５の発泡足場のセットのそれぞれについてのＧＦＰ発現を示す細胞の割合を示す棒グラフ
【発明を実施するための形態】
【００１７】
これより、その一例が添付の図面に示されている、本実施形態について詳細に参照する。可能な場合はいつでも、同一又は類似した部分についての言及には、図面全体を通して同じ参照番号が用いられる。
【００１８】
単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。同じ特性を列挙するすべての範囲の端点は、独立して組み合わせ可能であり、列挙された端点を含む。参考文献はすべて、参照することにより本明細書に組み込まれる。
【００１９】
本明細書で用いられる場合、「有する」、「有している」、「含む」、「含んでいる」、「備える」、「備えている」などは、オープンエンドの意味で用いられており、一般に「含むがそれらに限定されない」ことを意味する。
【００２０】
本明細書で使用される科学的用語及び技術的用語はすべて、特に指定されない限り、当技術分野で一般的に用いられる意味を有する。本明細書で提供される定義は、本明細書で頻繁に用いられる特定の用語の理解を容易にするためのものであり、本開示の範囲を限定することを意味するものではない。
【００２１】
本開示は、最初に一般的に、次に幾つかの例示的な実施形態に基づいて、以下に詳細に説明される。個々の例示的な実施形態において互いに組み合わせて示される特徴は、すべてを実現する必要はない。特に、個々の特徴は、省略されてもよく、あるいは、幾つかの他の方法で、同じ例示的実施形態又は他の例示的実施形態の示された他の特徴と組み合わされてもよい。
【００２２】
本開示の実施形態は、細胞培養のための溶解可能な発泡足場、及びそのような溶解可能な発泡足場の製造方法に関する。本開示の実施形態はさらに、溶解可能な発泡足場における付着細胞、細胞凝集体、又はスフェロイドの細胞培養の方法に関する。さらには、本開示の実施形態は、溶解可能な発泡足場を含むバイオリアクタシステムに関する。以下の考察で明らかになるように、本明細書に開示される発泡足場は、溶解可能かつ不溶性と記載されている。本明細書で用いられる場合、「不溶性」という用語は、例えば細胞培養培地を含む従来の細胞培養条件下で、溶解せず、架橋されたままである材料又は材料の組合せを指すために用いられる。また、本明細書で用いられる場合、「溶解可能」という用語は、材料又は材料の組合せを消化又は分解する適切な濃度の酵素に曝露されたときに消化される材料又は材料の組合せを指すために用いられる。本明細書に記載される溶解可能な発泡足場は、開孔構造及び高度に相互接続された細孔を有する、多孔質足場である。足場の細孔は、細胞間の相互作用及び３Ｄ形式でのＥＣＭの形成を補助する、細胞の培養のための保護された環境を提供する。溶解可能な発泡足場は完全に消化され、プロテアーゼ処理及び／又は機械的回収技術を使用して、細胞を損傷することなく、細胞を回収することができる。
【００２３】
図１は、本開示による溶解可能な発泡足場１０の斜視図である。以下でさらに詳細に説明され、本開示の他の図からより明らかになるように、溶解可能な発泡足場１０は、開孔構造を含む多孔質発泡体である。溶解可能な発泡足場１０は、約８５％〜約９６％の多孔率、及び約５０μｍ〜約５００μｍの平均細孔径を有する。溶解可能な発泡足場１０は、細胞の培養のための発泡足場の細孔内に、保護された環境を提供する。加えて、溶解可能な発泡足場１０はまた、細胞を損傷することなく、足場で培養された細胞の回収を容易にする材料を消化又は分解する適切な酵素に曝露されたときに、溶解可能である。
【００２４】
本明細書に記載される溶解可能な発泡足場は、少なくとも１つのイオノトロピック架橋した多糖類を含む。概して、多糖類は、細胞培養用途に有益な属性を有している。多糖類は、親水性であり、細胞毒性がなく、培養培地中で安定である。例には、ポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）としても知られるペクチン酸又はそれらの塩、部分的にエステル化されたペクチン酸又はそれらの塩、若しくは部分的にアミド化されたペクチン酸又はそれらの塩が含まれる。ペクチン酸は、ある特定のペクチンエステルの加水分解によって形成することができる。ペクチンは細胞壁多糖類であり、自然界では植物において構造的な役割を有する。ペクチンの主な供給源には、柑橘類の皮（例えば、レモン及びライムの皮）並びにリンゴの皮が含まれる。ペクチンは、１，２−結合Ｌ−ラムノースによってランダムに中断された、１，４−結合アルファ−Ｄ−ガラクツロネート骨格に基づいている、主として直線状のポリマーである。平均分子量は約５０，０００〜約２００，０００ダルトンの範囲である。
【００２５】
ペクチンのポリガラクツロン酸鎖は、例えばメチル基など、部分的にエステル化されていてもよく、遊離酸基は、ナトリウム、カリウム、又はアンモニウムイオンなどの一価のイオンで部分的に又は完全に中和されていてもよい。メタノールで部分的にエステル化されたポリガラクツロン酸はペクチン酸と呼ばれ、その塩はペクチン酸塩（ペクチネート）と呼ばれる。高メトキシル（ＨＭ）ペクチンのメチル化度（ＤＭ）は例えば６０〜７５モル％であってよく、低メトキシル（ＬＭ）ペクチンのメチル化度は１〜４０モル％でありうる。本明細書に記載される部分的にエステル化されたポリガラクツロン酸のエステル化度は、約７０モル％未満、又は約６０モル％未満、又は５０モル％未満、又はさらには約４０モル％未満、及びそれらの間のすべての値でありうる。特定の理論に縛られはしないが、最小量の遊離カルボン酸基（エステル化されていない）は、ある程度のイオノトロピック架橋を促進し、不溶性である、溶解可能な足場の形成を可能にすると考えられている。
【００２６】
あるいは、ペクチンのポリガラクツロン酸鎖は部分的にアミド化されていてもよい。ポリガラクツロン酸が部分的にアミド化されたペクチンは、例えば、アンモニアで処理することによって生成することができる。アミド化されたペクチンは、カルボキシル基（〜ＣＯＯＨ）、メチルエステル基（〜ＣＯＯＣＨ３）、及びアミド化基（−ＣＯＮＨ２）を含む。アミド化度は変動してもよく、例えば、約１０％〜約４０％がアミド化されうる。
【００２７】
本開示の実施形態によれば、本明細書に記載される溶解可能な発泡足場は、ペクチン酸と部分的にエステル化されたペクチン酸との混合物を含みうる。相容性のあるポリマーとのブレンドも使用することができる。例えば、ペクチン酸及び／又は部分的にエステル化されたペクチン酸を、デキストラン、置換セルロース誘導体、アルギン酸、デンプン、グリコーゲン、アラビノキシラン、アガロースなどの他の多糖類と混合することができる。ヒアルロン酸及びコンドロイチン硫酸などのグリコサミノグリカン、又はエラスチン、フィブリン、シルクフィブロイン、コラーゲン及びそれらの誘導体などのさまざまなタンパク質も使用することができる。水溶性の合成ポリマーもまた、ペクチン酸及び／又は部分的にエステル化されたペクチン酸とブレンドすることができる。例示的な水溶性の合成ポリマーには、限定はしないが、ポリアルキレングリコール、ポリ（ヒドロキシアルキル（メタ）アクリレート）、ポリ（メタ）アクリルアミド及び誘導体、ポリ（Ｎ−ビニル−２−ピロリドン）、並びにポリビニルアルコールが含まれる。
【００２８】
本開示の実施形態によれば、本明細書に記載される溶解可能な発泡足場は、少なくとも１つの第１のポリマーをさらに含みうる。少なくとも１つの第１のポリマーは、水溶性であり、非イオノトロピック的に架橋可能であり、かつ表面活性を有する。本明細書で用いられる場合、「表面活性」という用語は、２つの液体間又は液体と固体の間又は気体と液体の間の表面張力（又は界面張力）を低下又は排除する薬剤の活性を指す。少なくとも１つの第１のポリマーは、約８を超える、又はさらには約１０を超える親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有しうる。例えば、少なくとも１つの第１のポリマーは、約８〜約４０、又は約１０〜約４０のＨＬＢを有しうる。少なくとも１つの第１のポリマーは、約８〜約１５、又はさらには約１０〜約１２のＨＬＢを有しうる。ＨＬＢは、ポリマーの親油性又は親水性の程度の基準を提供する。より大きいＨＬＢ値はより強い親水性を示し、より小さいＨＬＢ値はより強い親油性を示す。一般に、ＨＬＢ値は１〜４０の範囲で変動し、親水性−親油性の移行は、しばしば約８から約１０の間であると考えられている。ＨＬＢ値が親水性−親油性の移行よりも小さい場合、材料は親油性であり、ＨＬＢ値が親水性−親油性の移行よりも大きい場合、材料は親水性である。
【００２９】
本開示の実施形態による例示的な第１のポリマーは、セルロース誘導体、タンパク質、合成両親媒性ポリマー、及びそれらの組合せのいずれかでありうる。例示的なセルロース誘導体には、限定はしないが、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）が含まれる。例示的なタンパク質には、限定はしないが、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、カゼイン、及びハイドロフォビンが含まれる。例示的な合成両親媒性ポリマーには、限定はしないが、Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃｓ（登録商標）という商品名で入手可能なポロキサマー（英国スナイス所在のＣｒｏｄａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから市販される）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）という商品名で入手可能なポロキサマー（米国ニュージャージー州パーシッパニー所在のＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．から市販される）、及びＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）という商品名で入手可能なポロキサマー（米国ニュージャージー州パーシッパニー所在のＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐ．から市販される）が含まれる。
【００３０】
本明細書に記載される溶解可能な発泡足場は、少なくとも１つの第２のポリマーをさらに含みうる。少なくとも１つの第２のポリマーは水溶性であり、表面活性を有しない。例示的な第２のポリマーは、合成ポリマー、半合成ポリマー、天然ポリマー、及びそれらの組合せのいずれかでありうる。例示的な合成ポリマーには、限定はしないが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド；（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドのホモポリマー及びコポリマー；ポリビニルメチルエーテル−無水マレイン酸、及びポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックコポリマーが含まれる。例示的な半合成ポリマーには、限定はしないが、デキストラン誘導体、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及び誘導体、メチルセルロース及び誘導体、エチルセルロースセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロースが含まれる。例示的な天然ポリマーには、限定はしないが、デンプン及びデンプン誘導体、カードラン、プルラン及びジェランガム、キサンタンガム、デキストランなどの微生物発酵によって得られるポリマー；アルブミン、カゼイン、及びカゼイン塩などのタンパク質；ゼラチン；寒天、アルギン酸塩、及びカラギーナンなどの海藻抽出物；グアーガム及び誘導体並びにローカストビーンガムなどの種子抽出物；ヒアルロン酸、及びコンドロイチン硫酸が含まれる。
【００３１】
本明細書に記載される溶解可能な発泡足場は、それらの機械的強度を高めるため、及び、細胞培養培地と接触して配置されたときに足場の溶解を防止するために、架橋されうる。架橋は、以下に記載するように、イオントロピックゲル化によって行うことができ、ここで、イオントロピックゲル化は、多価対イオンの存在下で高分子電解質が架橋して架橋足場を形成する能力に基づく。特定の理論に縛られはしないが、溶解可能な発泡足場の多糖類のイオントロピックゲル化は、二価カチオンと多糖類との強い相互作用の結果であると考えられている。
【００３２】
本開示の実施形態によれば、本明細書に記載される足場は多孔質発泡足場である。本明細書に記載される発泡足場は、約８５％〜約９６％の多孔率を有しうる。例えば、本明細書に記載される発泡足場は、約９１％〜約９５％、又は約９４％〜約９６％の多孔率を有しうる。本明細書で用いられる場合、「多孔率」という用語は、溶解可能な足場の開放細孔容積の尺度を指し、％多孔率に関して言及されており、ここで％多孔率とは、溶解可能な発泡足場の総容積中の空隙のパーセントである。本明細書に記載される発泡足場は、約５０μｍ〜約５００μｍの平均細孔径を有しうる。例えば、平均細孔径は、約７５μｍ〜約４５０μｍ、又は約１００μｍ〜約４００μｍ、又はさらには１５０μｍ〜約３５０μｍ、及びそれらの間のすべての値でありうる。
【００３３】
本明細書に記載される足場は、約０．４０ｇ／ｃｍ３未満の湿潤密度を有しうる。例えば、本明細書に記載される足場は、約０．３５ｇ／ｃｍ３未満、又は約０．３０ｇ／ｃｍ３未満、又は約０．２５ｇ／ｃｍ３未満の湿潤密度を有しうる。本明細書に記載される足場は、約０．１６ｇ／ｃｍ３〜約０．４０ｇ／ｃｍ３、又は約０．１６ｇ／ｃｍ３〜約０．３５ｇ／ｃｍ３、又は約０．１６ｇ／ｃｍ３〜約０．３０ｇ／ｃｍ３、又はさらには約０．１６ｇ／ｃｍ３〜約０．２５ｇ／ｃｍ３、及びそれらの間のすべての値の湿潤密度を有しうる。本明細書に記載される足場は、約０．２０ｇ／ｃｍ３未満の乾燥密度を有しうる。例えば、本明細書に記載される足場は、約０．１５ｇ／ｃｍ３未満、又は約０．１０ｇ／ｃｍ３未満、又は約０．０５ｇ／ｃｍ３未満の乾燥密度を有しうる。本明細書に記載される足場は、約０．０２ｇ／ｃｍ３〜約０．２０ｇ／ｃｍ３、又は約０．０２ｇ／ｃｍ３〜約０．１５ｇ／ｃｍ３、又は約０．０２ｇ／ｃｍ３〜約０．１０ｇ／ｃｍ３、又はさらには約０．０２ｇ／ｃｍ３〜約０．０５ｇ／ｃｍ３、及びそれらの間のすべての値の乾燥密度を有しうる。
【００３４】
足場には幾つかの細孔タイプが可能である。開放細孔は、足場の両側での細胞のアクセスを可能にし、溶解可能な足場を介した液体の流れ及び栄養素の輸送を可能にする。部分的に開放された細孔は、足場の片側での細胞のアクセスを可能にするが、栄養素及び老廃物の大量輸送は拡散に限定される。閉じた細孔には開口部がなく、細胞による、又は栄養素及び老廃物の大量輸送によるアクセスはできない。本明細書に記載される溶解可能な発泡足場は、開孔構造と、高度に相互接続された細孔とを有する。概して、開孔構造及び高度に相互接続された細孔は、細胞が溶解可能な発泡足場の細孔内に移動できるようにし、栄養素、酸素、及び廃棄物の大量輸送もまた促進する。開孔構造は、細胞間の相互作用のための大きい表面積及びＥＣＭ再生のためのスペースを提供することにより、細胞接着及び細胞移動にも影響を与える。
【００３５】
本明細書に記載される溶解可能な発泡足場は、材料を消化又は分解する適切な酵素に曝露されると、消化される。発泡足場の消化、細胞の回収、又はその両方に適した非タンパク質分解酵素には、ペクチン質を加水分解する関連酵素の異種グループである、ペクチン分解酵素又はペクチナーゼが含まれる。ペクチナーゼ（ポリガラクツロナーゼ）は、複雑なペクチン分子をガラクツロン酸のより短い分子へと分解する酵素である。ペクチナーゼの商業的に入手可能な供給源は、概して、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）の選択された株から産生されるペクチン分解酵素調製物である、Ｐｅｃｔｉｎｅｘ（商標）ＵＬＴＲＡ  ＳＰ−Ｌ（米国ノースカロライナ州フランクリントン所在のＮｏｖｏｚｙｍｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｉｎｃ．から市販される）などの多酵素である。「Ｐｅｃｔｉｎｅｘ」ＵＬＴＲＡ  ＳＰ−Ｌは、主に、ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１５）、ペクチントランスエリミナーゼ（ＥＣ  ４．２．２．２）、及びペクチンエステラーゼ（ＥＣ：３．１．１．１１）を含む。ＥＣ指定は、酵素が触媒する化学反応に基づく酵素についての酵素委員会の分類スキームである。
【００３６】
本開示の実施形態によれば、溶解可能な発泡足場の消化はまた、足場を二価カチオンキレート化剤に曝露することも含む。例示的なキレート化剤には、限定はしないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、クエン酸、及び酒石酸が含まれる。
【００３７】
本明細書に記載される溶解可能な発泡足場の消化を完了する時間は、約１時間未満でありうる。例えば、発泡足場の消化を完了する時間は、約４５分未満、又は約３０分未満、又は約１５分未満、又は約１分〜約２５分、又は約３分〜約２０分、又はさらには約５分〜約１５分でありうる。
【００３８】
本開示の実施形態によれば、本明細書に記載される足場は、接着ポリマーコーティングをさらに含みうる。接着ポリマーはペプチドを含みうる。例示的なペプチドは、限定はしないが、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型及びＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン（ゼラチン）、及び同様のペプチド、並びにそれらの混合物を含みうる。加えて、ペプチドはＲＧＤ配列を有するものでありうる。コーティングは、例えば、Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ（登録商標）ＩＩ−ＳＣ（米国ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから市販される）でありうる。任意選択的に、接着ポリマーは、細胞外マトリックスを含みうる。コーティングは、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）（米国ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから市販される）でありうる。
【００３９】
本開示の実施形態によれば、本明細書に記載される溶解可能な発泡足場を形成する方法もまた開示される。本明細書に記載される方法は、水溶液に多糖類を溶解させることを含む、第１の水性混合物を形成することを含みうる。多糖類は、ペクチン酸又はそれらの塩、部分的にエステル化されたペクチン酸又はそれらの塩、又は部分的にアミド化されたペクチン酸又はそれらの塩、及びこれらの多糖類のブレンドなど、上述したものでありうる。
【００４０】
本明細書に記載される溶解可能な発泡足場を形成する方法は、水溶液中に水不溶性の二価金属塩を含む第２の水性混合物を形成することをさらに含みうる。二価金属塩の金属には、限定はしないが、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、ストロンチウム、バリウム、及び相容のカチオン、並びにそれらの組合せが含まれうる。二価金属塩のアニオンには、限定はしないが、シュウ酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、並びに同様の有機及び無機アニオン、並びにそれらの組合せが含まれうる。
【００４１】
本開示の実施形態によれば、第２の水性混合物を形成することは、上述した少なくとも１つの第１のポリマーを第２の水性混合物に加えることをさらに含みうる。任意選択的に、本明細書に記載される方法は、上述した少なくとも１つの第２のポリマーを第２の水性混合物に加えることをさらに含みうる。本開示の実施形態によれば、少なくとも１つの第１のポリマー及び少なくとも１つの第２のポリマーは、第２の水性混合物に別々に加えてもよく、あるいは、第２の水性混合物に一緒に加えてもよい。混合物として加える場合、混合物は、約５０％の少なくとも１つの第１のポリマーと、約５０％の少なくとも１つの第２のポリマーとを含みうる。例えば、混合物は、約３５％〜約６５％（及び、それらの間のすべての値）の少なくとも１つの第１のポリマーと、約３５％〜約６５％（及び、それらの間のすべての値）の少なくとも１つの第２のポリマーとを含みうる。
【００４２】
本開示の実施形態によれば、第２の水性混合物を形成することは、第２の水性混合物に水溶性可塑剤を加えることをさらに含みうる。本明細書に記載される可塑剤は非毒性であり、溶解可能な発泡足場の多糖類の溶解性に影響を与えない。可塑剤は、得られる発泡体が柔らかく、しなやかになるように、得られる発泡体に柔軟性及び柔らかさを提供する。本明細書に記載される可塑剤は、限定はしないが、グリセロール、ソルビトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの組合せなどの多価アルコールを含みうる。第２の水性混合物に水溶性可塑剤を加えることは、第２の水性混合物を形成するために加える総固形添加剤の約５５質量％未満を加えることを含みうる。例えば、第２の水性混合物に水溶性可塑剤を加えることは、第２の水性混合物を形成するために加える総固形添加剤の約５０質量％未満、又は約４０質量％未満、又は約３０質量％未満、又は約２５質量％未満、又は約１５質量％〜約５５質量％、又は約１５質量％〜約５０質量％、又は約１５質量％〜約４０質量％、又は約１５質量％〜約３０質量％、又は約１５質量％〜約２５質量％、及びそれらの間のすべての値を加えることを含みうる。本明細書で用いられる場合、用語「第２の水性混合物を形成するために加えた総固形添加剤」とは、水を除く水性混合物の成分のすべてを指す。
【００４３】
本開示の実施形態によれば、第２の水性混合物を形成することは、第２の水性混合物に乳化剤を加えることをさらに含みうる。本明細書に記載される乳化剤は、限定はしないが、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、「Ｔｗｅｅｎ」８０（それぞれ、英国スナイス所在のＣｒｏｄａ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌから市販されている）を含みうる。
【００４４】
本開示の実施形態によれば、第２の水性混合物を形成することは、第２の水性混合物に少なくとも１つの浸出性固体を加えることをさらに含みうる。本明細書に記載される浸出性固体には、発泡足場の形成中に細孔を強化又は生成する材料が含まれる。浸出性固体は、限定はしないが、塩、生体適合性の単糖類及び二糖類、並びに水溶性タンパク質などの非毒性の浸出性材料でありうる。例示的な塩には、限定はしないが、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、酒石酸ナトリウム、クエン酸ナトリウムなどが含まれる。例示的な生体適合性の単糖類及び二糖類には、限定はしないが、グルコース、フルクトース、デキストロース、マルトース、ラクトース、及びスクロースが含まれる。例示的な水溶性タンパク質には、限定はしないが、ゼラチン及びアガロースが含まれる。
【００４５】
第２の水性混合物に関連する上述の材料の各々は、すべて、第２の水性混合物に任意選択的に加えてもよく、任意の順序で第２の水性混合物に加えることができ、２つ以上の材料を第２の水性混合物に加えることができる可能性を有する。１つの例示的な方法では、第２の水性混合物を形成することは、二価金属塩を含む水溶液に浸出性固体を加えること、及び、水性混合物を混合して水性混合物に溶解する浸出性固体の溶解を促進することを含む。その後、少なくとも１つの第１のポリマー、少なくとも１つの第２のポリマー、及び／又は水溶性可塑剤を第２の水性混合物に加える。
【００４６】
本明細書に記載される溶解可能な発泡足場を形成する方法は、第１及び第２の水性混合物の形成後に、第２の水性混合物を第１の水性混合物と合わせて、合わせた水性混合物を形成することをさらに含みうる。混合、拍動、攪拌、曝気、泡立て、注入、又は他の機械的作用によって水性混合物に気泡を導入することにより、合わせた水性混合物から発泡体を形成することができる。ガスは、例えば、限定はしないが、空気、窒素、ヘリウム、水素、アルゴン、二酸化炭素、又は他の不活性ガスでありうる。合わせた水性混合物への気泡の導入は、約３０分未満、例えば、約１分〜約３０分、又は約３分〜約２５分、又はさらには約５分〜約２０分の時間で行うことができる。合わせた水性混合物に気泡を導入しつつ、溶解可能な発泡足場を形成する方法は、合わせた水性混合物にゲル誘導剤を加えることをさらに含みうる。ゲル誘導剤は、緩衝作用を提供する酸、及び／又は酸をゆっくりと生成する物質でありうる。例示的な酸には、限定はしないが、乳酸ラクトン、グリコール酸ラクトン、グルコノデルタラクトン、及び酸無水物が含まれる。
【００４７】
本明細書に記載される溶解可能な発泡足場を形成する方法は、溶解可能な発泡足場を接着ポリマーコーティングでコーティングすることをさらに含みうる。溶解可能な発泡足場をコーティングすることは、足場を、水溶液中、接着ポリマーを有する水溶液に曝露することを含みうる。前述の通り、接着ポリマーはペプチドを含みうる。例示的なペプチドは、限定はしないが、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型及びＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン（ゼラチン）、及び同様のペプチド、並びにそれらの混合物を含みうる。加えて、ペプチドはＲＧＤ配列を有するものでありうる。コーティングは、例えば、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣ（米国ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ，Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから市販される）でありうる。
【００４８】
本開示の実施形態によれば、本明細書に記載される溶解可能な発泡足場で細胞を培養する方法もまた開示される。限定はしないが、不死化細胞、初代培養細胞、癌細胞、幹細胞（例えば、胚性又は人工多能性）などを含む、あらゆる種類の細胞を溶解可能な発泡足場上で培養することができる。細胞は、哺乳動物細胞、鳥類細胞、魚類細胞などでありうる。細胞は、限定はしないが、腎臓、線維芽細胞、乳房、皮膚、脳、卵巣、肺、骨、神経、筋肉、心臓、結腸直腸、膵臓、免疫（例えば、Ｂ細胞）、血液などを含む、任意の組織タイプのものでありうる。細胞は、分散（例えば、新たに播種される）、コンフルエント、２次元、３次元、スフェロイドなどを含む、任意のバッグ内で培養された形態であってもよい。溶解可能な発泡足場で細胞を培養することは、溶解可能な発泡足場に細胞を播種することを含みうる。溶解可能な発泡足場に細胞を播種することは、足場を、細胞を含む溶液と接触させることを含みうる。溶解可能な発泡足場に細胞を播種する間に、細胞は溶解可能な発泡足場の細孔に入る。溶解可能な発泡足場が接着ポリマーコーティングを含む場合、細胞は、溶解可能な発泡足場の細孔に入り、足場材料に付着しうる。
【００４９】
溶解可能な発泡足場で細胞を培養することは、足場を細胞培養培地と接触させることをさらに含みうる。概して、足場を細胞培養培地と接触させることは、細胞が培養される培地を有する環境内の足場上に培養される細胞を配置することを含む。足場を細胞培養培地と接触させることは、細胞培養培地を足場上にピペッティングすること、又は足場を細胞培養培地に沈設すること、又は細胞培養培地を足場上に継続的に通過させることを含みうる。概して、本明細書で用いられる場合、「継続的」という用語は、細胞培養環境に出入りする細胞培養培地の一貫した流れで細胞を培養することを指す。足場上の細胞培養培地のこのような継続的な方式での通過は、所定の期間、細胞培養培地に足場を沈設し、その後、所定の期間後に細胞培養培地の少なくとも一部を除去し、溶解可能な発泡足場と接触する細胞培養培地の体積が実質的に一定に維持されるように新鮮な細胞培養培地を加えることを含みうる。細胞培養培地は、所定のスケジュールに従って除去及び交換されうる。例えば、細胞培養培地の少なくとも一部は、１時間ごと、又は１２時間ごと、又は２４時間ごと、又は２日間ごと、又は３日間ごと、又は４日間ごと、又は５日間ごとに除去及び交換されうる。
【００５０】
細胞培養培地は、例えば、限定はしないが、糖、塩、アミノ酸、血清（例えば、ウシ胎児血清）、抗生物質、成長因子、分化因子、着色剤、又は他の所望の因子でありうる。例示的な細胞培養培地には、ダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ハムのＦ１２栄養混合物、最小必須培地（ＭＥＭ）、ＲＰＭＩ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）、Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ（商標）−ＸＦ培地などが含まれる。
【００５１】
本開示の実施形態によれば、本明細書に記載される溶解可能な発泡足場から細胞を回収する方法もまた開示される。本明細書に記載される細胞を回収する方法は、溶解可能な発泡足場を酵素に曝露することによって溶解可能な発泡足場を消化することを含みうる。前述の通り、発泡足場の消化、細胞の回収、又はその両方に適した非タンパク質分解酵素には、ペクチン質を加水分解する関連酵素の異種グループである、ペクチン分解酵素又はペクチナーゼが含まれる。ペクチナーゼの商業的に入手可能な供給源は、概して、アスペルギルス・アキュレアタス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ  ａｃｕｌｅａｔｕｓ）の選択された株から産生されるペクチン分解酵素調製物である、「Ｐｅｃｔｉｎｅｘ」ＵＬＴＲＡ  ＳＰ−Ｌ（米国ノースカロライナ州フランクリントン所在のＮｏｖｏｚｙｍｅ  Ｎｏｒｔｈ  Ａｍｅｒｉｃａｎ，Ｉｎｃ．から市販される）などの多酵素である。「Ｐｅｃｔｉｎｅｘ」ＵＬＴＲＡ  ＳＰ−Ｌは、主に、ポリガラクツロナーゼ（ＥＣ  ３．２．１．１５）、ペクチントランスエリミナーゼ（ＥＣ  ４．２．２．２）、及びペクチンエステラーゼ（ＥＣ：３．１．１．１１）を含む。ＥＣ指定は、酵素が触媒する化学反応に基づく酵素についての酵素委員会の分類スキームである。
【００５２】
溶解可能な発泡足場を酵素に曝露することは、足場を約１〜約２００Ｕの酵素濃度に曝露することを含みうる。例えば、該方法は、足場を約２Ｕ〜約１５０Ｕ、又は約５Ｕ〜約１００Ｕ、又はさらには約１０Ｕ〜約７５Ｕ、及びそれらの間のすべての値の酵素濃度に曝露することを含みうる。
【００５３】
本明細書に記載される細胞を回収する方法は、材料をキレート化剤に曝露することをさらに含みうる。例示的なキレート化剤には、限定はしないが、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、シクロヘキサンジアミン四酢酸（ＣＤＴＡ）、エチレングリコール四酢酸（ＥＧＴＡ）、クエン酸、及び酒石酸が含まれる。溶解可能な発泡足場をキレート化剤に曝露することは、足場を約１ｍＭ〜約２００ｍＭキレート化剤濃度に曝露することを含みうる。例えば、該方法は、足場を、約１０ｍＭ〜約１５０ｍＭ、又は約２０ｍＭ〜約１００ｍＭ、又はさらには約２５ｍＭ〜約５０ｍＭ、及びそれらの間のすべての値のキレート化剤濃度に曝露することを含みうる。
【実施例】
【００５４】
本開示の実施形態は、単なる例示であり、限定することは意図していない、ある特定の例示的実施形態及び特定の実施形態に関して以下にさらに説明される。
【００５５】
実施例１
【００５６】
【表１】
2021503894.tif 000003
【００５７】
約１６２グラムのポリガラクツロン酸ナトリウム塩を１０４℃の温度に設定された油浴内で脱塩水に溶解することによって、２．０質量％のポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）を含む第１の水性混合物を調製した。水性混合物を室温まで冷却した。約１．０６グラムのＣａＣＯ３を、ワイヤーループの泡立て器を備えたＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄミキサーのボウル内の約２４．５２グラムの超純水に加えることによって第２の水性混合物を調製した。約０．１２５グラムの「ＴＷＥＥＮ」２０（米国ミズーリ州セントルイス所在のＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈから市販される）も、ＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄミキサーのボウルに加えた。次に、約１７．５グラムのスクロースをミキサーボウルに加え、混合して、第２の水性混合物におけるスクロースの溶解を促進した。約７．５グラムのグリセロール、約１．９４グラムのＭｅｔｈｏｃｅｌ  ＨＰＭＣ  Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ７２４、及び第１の水性混合物を加えて、ミキシングボウル内に合わせた水性混合物を形成し、ある攪拌速度（ＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄミキサーの速度１）で約５分間混合した。次に、合わせた水性混合物を速い泡立て速度（ＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄミキサーの速度１０）で約２０分間泡立て、合わせた水性混合物に空気を導入した。合わせた水性混合物を泡立て続けながら、約３０ｍＬの水中、約３．７７グラムのグルコノラクトン（ＧＤＬ）の水溶液をミキシングボウルに加え、約１分間泡立て続けた。
【００５８】
上述のプロセスに従い、約０．２５ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度を有する不透明な白い発泡体を得た。発泡体をミキシングボウル内で覆いをせずに室温で約１時間放置して、発泡体内で架橋が起こる時間を与えた。次に、発泡体を約−８０℃の温度に約１６時間曝露して発泡体を凍結させ、次に、−８６℃の温度及び０．１１ｍｂａｒ（約１１Ｐａ）の圧力に約７２時間、曝露した。得られた発泡体は、約０．０４〜約０．０４５ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察され、高度に相互接続された細孔を有する多孔質であることが観察された。図２は、この実施例１で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。得られた発泡体の組成は、約１．３質量％のＰＧＡ、約０．７８質量％のＨＰＭ、及び約２．０８質量％の全固形分を含むと決定された。
【００５９】
実施例２
【００６０】
【表２】
2021503894.tif 000004
【００６１】
約０．５３グラムを加えることによって第２の水性混合物を調製したことを除き、実施例１に記載のプロセスを繰り返した。得られた発泡体は、高度に相互接続された細孔を有する多孔質であることが観察された。図３は、この実施例２で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。
【００６２】
実施例３
【００６３】
【表３】
2021503894.tif 000005
【００６４】
約１６２グラムのポリガラクツロン酸ナトリウム塩を１０４℃の温度に設定された油浴内の脱塩水に溶解することによって、２．０質量％のポリガラクツロン酸（ＰＧＡ）を含む第１の水性混合物を調製した。水性混合物を室温まで冷却した。約７．５グラムのグリセロールを超純水に加え、マイクロ波の下、８００Ｗで約３０秒間加熱することによって、第２の水性混合物を調製した。約０．９７グラムのウシゼラチンを約５．８ｍＬの超純水中で冷膨潤させ、次に、第２の水性混合物に加え、溶解が観察されるまで攪拌した。約１．０６グラムのＣａＣＯ３及び約０．１２５グラムの「ＴＷＥＥＮ」２０を第２の水性混合物に加えた。次に、第２の水性混合物を約１分間超音波処理し、次いで、ワイヤーループの泡立て器を備えたＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄミキサーのボウルに移した。次に、約１７．５グラムのスクロース及び約０．９７グラムのＭｅｔｈｏｃｅｌ  ＨＰＭＣ  Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ７２４をＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄミキサーのボウルに加え、水性混合物を約５分間攪拌した。２．０質量％のＰＧＡを含む第１の水性混合物を加えて、ミキシングボウル内に合わせた水性混合物を形成し、ある攪拌速度（ＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄミキサーの速度１）で約３分間、混合した。次に、合わせた水性混合物を速い泡立て速度（ＫｉｔｃｈｅｎＡｉｄミキサーの速度１０）で約２０分間泡立て、合わせた水性混合物に空気を導入した。合わせた水性混合物を泡立て続けながら、約３０ｍＬの水中、約３．７７グラムのグルコノラクトン（ＧＤＬ）の溶液をミキシングボウルに加え、約１分間泡立て続けた。
【００６５】
上述のプロセスに従って不透明な白い発泡体を得た。発泡体をミキシングボウル内で覆いをせずに室温で約１時間放置して、発泡体内で架橋が起こる時間を与えた。次に、発泡体を約−８０℃の温度に約１６時間曝露して発泡体を凍結させ、次に、−８６℃の温度及び０．１１ｍｂａｒ（約１１Ｐａ）の圧力に約７２時間、曝露した。得られた発泡体は、約０．０４ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察され、高度に相互接続された細孔を有する多孔質であることが観察された。図４は、この実施例３で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。
【００６６】
実施例４
【００６７】
【表４】
2021503894.tif 000006
【００６８】
ウシゼラチンの代わりに、約０．９７グラムのブタゼラチンを約５．８ｍＬの超純水中で冷膨潤させて、次に第２の水性混合物に加え、溶解が観察されるまで攪拌したことを除き、実施例３に記載のプロセスを繰り返した。得られた発泡体は、約０．２１ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．０６ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察され、高度に相互接続された細孔を有する多孔質であることが観察された。図５は、この実施例４で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。
【００６９】
実施例５
【００７０】
【表５】
2021503894.tif 000007
【００７１】
約１７２グラムの３．０質量％ポリガラクツロン酸ナトリウム塩を１０４℃の温度に設定された油浴内の脱塩水に溶解することによって第１の水性混合物を調製したことを除き、実施例１に記載のプロセスを繰り返した。さらに、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ＨＰＭＣ  Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ７２４を第２の水性混合物から省いた。得られた発泡体は、約０．４０ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．１１ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察された。発泡体は、実施例１で形成された発泡体よりも多孔率が低いことが観察され、細孔は、実施例１で形成された発泡体の細孔よりも相互接続が少なかった。Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ＨＰＭＣ  Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ７２４、又は表面活性を有する任意のポリマーを省いたことにより、発泡体の多孔率及び細孔間の相互接続性のレベルが低下したと考えられる。図６は、この実施例５で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。約０．４０ｇ／ｃｍ３を超える湿潤密度及び約０．１１ｇ／ｃｍ３を超える乾燥密度を有する発泡体は、細胞の培養を支援することできることが実証されたが、約０．４０ｇ／ｃｍ３未満の湿潤密度及び約０．１１ｇ／ｃｍ３未満の乾燥密度を有する発泡体は、この実施例５で形成された発泡体が有するような湿潤及び乾燥密度を有する発泡体と比較して、改善された細胞培養条件を示した。
【００７２】
実施例６
【００７３】
【表６】
2021503894.tif 000008
【００７４】
約１６２グラムの１．５９質量％ポリガラクツロン酸ナトリウム塩を１０４℃の温度に設定された油浴内の脱塩水に溶解することによって第１の水性混合物を調製したことを除き、実施例１に記載のプロセスを繰り返した。加えて、０．５３グラムのＣａＣＯ３を約２４．５２グラムの超純水に加えることによって第２の水性混合物を調製し、約２．５８グラムのＭｅｔｈｏｃｅｌ  ＨＰＭＣ  Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ７２４を第２の水性混合物に加えた。得られた発泡体は、約０．３６ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．０９ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察された。図７は、この実施例６で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。
【００７５】
実施例７
【００７６】
【表７】
2021503894.tif 000009
【００７７】
第２の水性混合物にスクロースを加えなかったことを除き、実施例１に記載のプロセスを繰り返した。得られた発泡体は、約０．２３ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．０３ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察された。図８は、この実施例７で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。
【００７８】
実施例８
【００７９】
【表８】
2021503894.tif 000010
【００８０】
約１６２グラムの２．５９質量％ポリガラクツロン酸ナトリウム塩を１０４℃の温度に設定された油浴内の脱塩水に溶解することによって第１の水性混合物を調製したことを除き、実施例１に記載のプロセスを繰り返した。加えて、０．９７グラムのＭｅｔｈｏｃｅｌ  ＨＰＭＣ  Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ７２４を第２の水性混合物に加えることによって第２の水性混合物を調製した。合わせた水性混合物におけるＰＧＡのＭｅｔｈｏｃｅｌ  ＨＰＭＣ  Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ７２４に対する比を８１／１９になるように制御した。得られた発泡体は、約０．１８ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．０５７ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察された。図９は、この実施例８で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。
【００８１】
実施例９
【００８２】
【表９】
2021503894.tif 000011
【００８３】
１．９４グラムのデキストランを第２の水性混合物加えることによって第２の水性混合物を調製し、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ＨＰＭＣ  Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ７２４を水性混合物から省いたことを除き、実施例１に記載のプロセスを繰り返した。得られた発泡体は、約０．３４ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．０９５ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察された。発泡体は、実施例１で形成された発泡体よりも多孔性が低いことが観察され、細孔は、実施例１で形成された発泡体の細孔よりも相互接続が少なかった。Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ＨＰＭＣ  Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ７２４、又は表面活性を有する任意のポリマーを省いたことにより、発泡体の細孔間の相互接続性のレベルが低下したと考えられる。さらには、界面活性を有しないポリマーの添加は、発泡体における細孔の形成に寄与しなかった。図１０は、この実施例９で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。
【００８４】
実施例１０
【００８５】
【表１０】
2021503894.tif 000012
【００８６】
Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ＨＰＭＣ  Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ７２４の代わりに、１．９４グラムのＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）Ｐ１２３を第２の水性混合物に加えることによって第２の水性混合物を調製したことを除き、実施例１に記載のプロセスを繰り返した。合わせた水性混合物におけるＰＧＡのＰｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１２３に対する比を６２．５／３７．５になるように制御した。得られた発泡体は、約０．１８ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．０３ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察され、実施例１で形成された発泡体より高い多孔率を有することが観察された。図１１は、この実施例１０で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。
【００８７】
実施例１１
【００８８】
【表１１】
2021503894.tif 000013
【００８９】
Ｍｅｔｈｏｃｅｌ  ＨＰＭＣ  Ｃｕｌｍｉｎａｌ  ７２４の代わりに、Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１２３とデキストランの５０：５０の質量比ブレンドを加えることによって第２の水性混合物を調製したことを除き、実施例１に記載のプロセスを繰り返した。得られた発泡体は、約０．２０ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．０３８ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察され、実施例１で形成された発泡体より高い多孔率を有することが観察された。図１２は、この実施例１１で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。
【００９０】
実施例１２
【００９１】
【表１２】
2021503894.tif 000014
【００９２】
実施例１１に記載のプロセスを繰り返し、第２の水性混合物にさまざまな量のグリセロールを加えた複数の発泡体を形成した。この実施例の第１の発泡体の形成では、６．５グラムのグリセロールを第２の水性混合物に加えた。グリセロールは、合わせた水性混合物を形成するために添加された総固形添加剤の１９質量％を構成していた。得られた発泡体は、約０．１９ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．０５５ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察された。この実施例の第２の発泡体の形成では、７．５グラムのグリセロールを第２の水性混合物に加えた。グリセロールは、合わせた水性混合物を形成するために添加された総固形添加剤の２２質量％を構成していた。得られた発泡体は、約０．２１ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．０４８ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察された。この実施例の第３の発泡体の形成では、１９．４４グラムのグリセロールを第２の水性混合物に加えた。グリセロールは、合わせた水性混合物を形成するために添加された総固形添加剤の４２質量％を構成していた。得られた発泡体は、約０．２３ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．２３ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察された。この実施例の第４の発泡体の形成では、２９．１６グラムのグリセロールを第２の水性混合物に加えた。グリセロールは、合わせた水性混合物を形成するために添加された総固形添加剤の５２質量％を構成していた。得られた発泡体は、約０．２６ｇ／ｃｍ３の湿潤発泡密度及び約０．３５ｇ／ｃｍ３の乾燥発泡密度を有することが観察された。
【００９３】
実施例１２の４つの発泡体は、発泡体の形成中に添加された際の密度及び多孔率に対する可塑剤の量の影響を示している。可塑剤の含有量を増やすと、乾燥が遅くなり、密度が高くなり、多孔率が低くなることが観察された。また、図１３に示されるように、グリセロールの量が、第２の水性混合物を形成するために加えた総固形添加剤の約２０〜２５質量％を超えて増加すると、発泡体のほぼ円筒の形状が失われた。第２の水性混合物に加えた可塑剤の量が、第２の水性混合物を形成するために加えた総固形添加剤の約５２質量％未満のときに、発泡体の細孔の多孔率及び相互接続性が最大であることが観察された。
【００９４】
実施例１３
【００９５】
【表１３】
2021503894.tif 000015
【００９６】
Ｐｌｕｒｏｎｉｃ  Ｐ１２７とデキストランの５０：５０の質量比ブレンドを加えることによって第２の水性混合物を調製したことを除き、実施例１に記載のプロセスを繰り返した。得られた発泡体は、実施例１１で調製された発泡体に似た多孔率及び細孔の相互接続性を有することが観察された。図１４は、この実施例１３で調製された発泡体のＳＥＭ写真を示している。
【００９７】
実施例１４
実施例１〜１２の各プロセスに従って形成された発泡体を、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣでコーティングした。約５．０ｍｇのＣｏｒｎｉｎｇ（登録商標）「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣ粉末を、７０：３０のエタノール：水の比を有する約２０ｍＬのエタノール水溶液に加えることによって、２５０μｇ／ｍｌの「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣエタノール水溶液を調製した。約２〜３ｍｍの厚さ及び約２２ｍｍの直径を有する各発泡体を、ポリスチレンの６ウェル細胞培養プレートの別々のウェルに配置した。２５０μｇ／ｍｌの「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣエタノール水溶液約４．０ｍＬを各ウェルに加え、プレートを室温で約１．５時間静置した。過剰の溶液をウェルから除去し、発泡体を約５．０ｍＬの７０％エタノール水溶液で１回洗浄した。次に、７０％エタノール水溶液中、約４．０ｍＬの０．０５％ｖ／ｖグルタルアルデヒド（６．０ｍＬの水及び１４ｍＬのエタノール中、４０μｌの２５％グルタルアルデヒド溶液を混合することによって調製した）を加えることによって、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣコーティングを架橋させた。プレートを室温で約１．５時間静置して、架橋が生じるための時間を与えた。次に、発泡体を超純水で３回すすいだ。
【００９８】
実施例１５
実施例１〜１２の各プロセスに従って形成された発泡体をゼラチンでコーティングした。約５００ｍｇのゼラチン粉末（ブタの皮膚由来）を超純水で膨潤させ、続いて２０ｍＬの超純水で溶解及び均質化することによって、０．１質量％のゼラチン溶液を調製した。約２〜３ｍｍの厚さ及び約２２ｍｍの直径を有する各発泡体を、ポリスチレンの６ウェル細胞培養プレートの別々のウェルに置いた。約４．０ｍＬのゼラチン溶液を各ウェルに加え、プレートを室温で約１．５時間静置した。過剰な溶液をウェルから除去し、発泡体を約５．０ｍＬの７０％エタノール水溶液で１回洗浄した。次に、７０％エタノール水溶液中、約４．０ｍＬの０．０５％ｖ／ｖグルタルアルデヒド（２５ｍＬの超純水中、５０μｌの２５％グルタルアルデヒド溶液を混合することによって調製した）を加えることによって、ゼラチンコーティングを架橋させた。プレートを室温で約１．５時間静置して、架橋が生じるための時間を与えた。次に、発泡体を超純水で３回すすいだ。
【００９９】
実施例１６
実施例４のプロセスに従って形成した発泡体上でのベロ細胞の培養について調査した。ベロ細胞（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ−８１、米国バージニア州マナサス所在のＡＴＣＣから市販される）を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＩＭＤＭ培地における細胞培養プレート上で培養した。発泡体を、約２〜３ｍｍの厚さ及び約２２ｍｍの直径を有する部分へと切断した。発泡体部分を７０％エタノール水溶液で約５．０分間消毒して、次に６ウェル超低接着細胞培養プレートの別々のウェルに配置した。発泡体部分を超純水で２回、ＩＭＤＭ培地で１回、洗浄した。播種する前に、過剰の培地をウェルから取り除いた。
【０１００】
トリプシンを使用して細胞培養プレートからベロ細胞を回収し、ＩＭＤＭ培地に再懸濁し、約１００，０００の細胞を含む１５０μＬを、６ウェル細胞培養プレートのウェル内に配置された発泡体部分の各々に播種した。６ウェル細胞培養プレートを細胞培養インキュベータ内に置き、約２．０時間後、約３．０ｍＬのＩＭＤＭ培地を各ウェルに加えた。細胞培養インキュベータ内で約１８時間後、位相差顕微鏡を使用して発泡体部分を視覚化した。細胞はコーティングされていない発泡体部分には付着せず、代わりに、発泡体部分の細孔にスフェロイドを形成したことを示す、位相差顕微鏡から得られた画像が図１５に示されている。したがって、本開示の溶解可能な発泡足場は、スフェロイド又は非付着性細胞の培養に利用することができることが判明した。
【０１０１】
実施例１７
実施例４のプロセスに従って形成し、実施例１４のプロセスに従ってコーティングした発泡体上でのヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の培養について調査した。ｈＭＳＣ継代２（米国メリーランド州フレデリック所在のＲｏｏｓｔｅｒＢｉｏ  Ｉｎｃ．から市販される）を、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地（カナダ国ブリティッシュコロンビア州バンクーバー所在のＳＴＥＭＣＥＬＬ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓから市販される無血清培地）における細胞培養プレート上で培養した。発泡体を、約２〜３ｍｍの厚さ及び約２２ｍｍの直径を有する部分へと切断した。発泡体部分を７０％エタノール水溶液で約５．０分間消毒して、次に６ウェル超低接着細胞培養プレートの別々のウェルに配置した。発泡体部分を超純水で２回、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地で１回、洗浄した。播種する前に、過剰の培地をウェルから取り除いた。
【０１０２】
トリプシンを使用してｈＭＳＣを細胞培養プレートから回収し、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地に再懸濁し、約１００，０００の細胞を含む１５０μＬを、６ウェル細胞培養プレートのウェル内に配置された発泡体部分の各々に播種した。６ウェル細胞培養プレートを細胞培養インキュベータ内に置き、約２．０時間後、約３．０ｍＬの「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地を各ウェルに加えた。細胞培養インキュベータ内で約１８時間後、細胞を１μｇ／ｍＬのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで着色し、蛍光顕微鏡を使用して視覚化した。細胞が、発泡体部分には付着することができず、発泡体部分の細孔内に広がったことを示す、蛍光顕微鏡から得られた画像が図１６に示されている。このように、本開示の「Ｃｏｒｎｉｎｇ」「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣでコーティングされた溶解可能な発泡足場は、スフェロイド又は非接着細胞に加えて接着細胞の培養にも利用することができ、足場が無血清培地での細胞培養を支援することが判明した。
【０１０３】
実施例１８
実施例４のプロセスに従って形成し、実施例１５のプロセスに従ってコーティングした発泡体上でのヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の培養について調査した。実施例１７で使用したｈＭＳＣ継代２を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＩＭＤＭ培地の細胞培養プレート上で培養した。発泡体を、約２〜３ｍｍの厚さ及び約２２ｍｍの直径を有する部分へと切断した。発泡体部分を７０％エタノール水溶液で約５．０分間消毒して、次に６ウェル超低接着細胞培養プレートの別々のウェルに配置した。発泡体部分を超純水で２回、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地で１回、洗浄した。播種する前に、過剰の培地をウェルから取り除いた。
【０１０４】
トリプシンを使用してｈＭＳＣを細胞培養プレートから回収し、ＩＭＤＭ培地に再懸濁し、約１００，０００の細胞を含む１５０μＬを、６ウェル細胞培養プレートのウェル内に配置された発泡体部分の各々に播種した。６ウェル細胞培養プレートを細胞培養インキュベータ内に置き、約２．０時間後、約３．０ｍＬのＩＭＤＭ培地を各ウェルに加えた。細胞培養インキュベータ内で約１８時間後、細胞を１μｇ／ｍＬのＣａｌｃｅｉｎ−ＡＭで着色し、蛍光顕微鏡を使用して視覚化した。細胞が、発泡体部分には付着することができず、発泡体部分の部分の細孔内に広がったことを示す、蛍光顕微鏡から得られた画像が図１７に示されている。ｈＭＳＣ細胞の増殖を発泡体上で６日間進行させ、再び蛍光顕微鏡を使用して視覚化した。発泡体部分に付着し、さらに発泡体部分の細孔内に広がった細胞を示す、６日後の蛍光顕微鏡から得られた画像が図１８に示されている。このように、本開示のゼラチンでコーティングされた溶解可能な発泡足場は、スフェロイド又は非接着細胞に加えて接着細胞の培養にも利用することができ、足場が血清含有培地での細胞培養を支援することが判明した。
【０１０５】
実施例１９
実施例２及び４のプロセスに従って形成し、実施例１５のプロセスに従ってコーティングした発泡体上のベロ細胞の増殖について調査した。実施例１６で使用したベロ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＩＭＤＭ培地における組織培養処理した（ＴＣＴ）プレート上で培養した。発泡体を、約２〜３ｍｍの厚さ及び約２２ｍｍの直径を有する部分へと切断した。発泡体部分を７０％エタノール水溶液で約５．０分間消毒し、次に、ポリスチレンの６ウェル細胞培養プレートの別々のウェルに配置した。発泡体部分を超純水で２回、ＩＭＤＭ培地で１回、洗浄した。播種する前に、過剰の培地をウェルから取り除いた。
【０１０６】
トリプシンを使用してベロ細胞をＴＣＴプレートから回収し、ＩＭＤＭ培地に再懸濁した。一部の発泡体部分に約２５，０００の細胞を含む１５０μＬを播種し、他の発泡体部分に約５０，０００の細胞を含む１５０μＬを播種し、発泡体部分を６ウェル細胞培養プレートのウェル内に配置した。６ウェル細胞培養プレートを細胞培養インキュベータ内に約６日間、置いた。約６日後、培地を除去し、約５０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼと約５．０ｍＭのＥＤＴＡを含む約２．０ｍＬの消化溶液の各ウェルに加えることによって発泡体を溶解させた。発泡体は、５．０分以内に溶解することが観察された。発泡体の溶解後、http://bio.lonza.com/uploads/tx_mwaxmarketingmaterial/Lonza_BenchGuides_Protocol_for_Performing_a_Trypan_Blue_Viability_Test__Technical_Reference_Guide.pdfから取得した“Protocol for Performing a Trypan Blue Viability Test: Technical Reference Guide.” Lonza Cologne GmbH, September 2012に詳述されているように、トリパンブルー排除プロトコルを使用して細胞をカウントした。
【０１０７】
細胞が発泡体部分のすべての細孔表面にコロニーを形成したことが観察された。実施例４のプロセスに従って形成したコーティング発泡体では約７０〜９０倍の増殖が観察され、実施例２のプロセスに従って形成したコーティング発泡体では約４０〜７０倍の増殖が観察された。このように、本開示のゼラチンでコーティングした溶解可能な発泡足場をベロ細胞の増殖に利用することができることが判明した。
【０１０８】
実施例２０
実施例４のプロセスに従って形成し、実施例１５のプロセスに従ってコーティングした発泡体上でのヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の分化について調査した。実施例１７で使用したｈＭＳＣ継代２を、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地における細胞培養プレート上で培養した。発泡体を、約２〜３ｍｍの厚さ及び約２２ｍｍの直径を有する部分へと切断した。発泡体部分を７０％エタノール水溶液で約５．０分間消毒し、次に、ポリスチレンの６ウェル細胞培養プレートの別々のウェルに配置した。発泡体部分を超純水で２回、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地で１回、洗浄した。播種する前に、過剰の培地をウェルから取り除いた。
【０１０９】
トリプシンを使用してｈＭＳＣを細胞培養プレートから回収し、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地に再懸濁し、約１００，０００の細胞を含む１５０μＬを、６ウェル細胞培養プレートのウェル内に配置された発泡体部分の各々に播種した。６ウェル細胞培養プレートを細胞培養インキュベータ内に約３日間置いた。約３日後、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地を除去し、骨細胞分化培地、軟骨細胞分化培地、及び脂肪細胞分化培地（それぞれ、米国マサチューセッツ州ウォルサム所在のＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃからＳｔｅｍＰｒｏ（商標）骨形成分化キット、「ＳｔｅｍＰｒｏ」軟骨分化キット、及び「ＳｔｅｍＰｒｏ」脂肪生成分化キットという商品名で市販される）をウェルに加えた（各タイプの分化培地を、他のタイプの分化培地とは異なるウェルの発泡体部分に加えた）。３週間後、骨細胞分化培地に曝露された発泡体部分をアリザリンレッドで染色し、軟骨細胞分化培地に曝露された発泡体部分をアルシアンブルーで染色し、脂肪細胞分化培地に曝露された発泡体部分をオイルレッドＯで染色した。染色後、本開示のゼラチンでコーティングした溶解可能な発泡足場上で培養されたｈＳＭＣが、軟骨形成、骨形成、及び脂肪形成分化を維持することが観察された。このように、本開示の溶解可能な発泡足場上で培養された細胞が、インビボの細胞の生物学的応答と同様の生物学的応答を示すことが判明した。
【０１１０】
実施例２１
実施例２、１１及び１３のプロセスに従って形成し、実施例１４のプロセスに従ってコーティングした発泡体上でのヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の増殖について調査した。実施例１７で使用したｈＭＳＣ継代２を、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地における細胞培養プレート上で培養した。発泡体を、約２〜３ｍｍの厚さ及び約２２ｍｍの直径を有する部分へと切断した。発泡体部分を７０％エタノール水溶液で約５．０分間消毒して、次に６ウェル超低接着細胞培養プレートの別々のウェルに配置した。発泡体部分を超純水で２回、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地で１回、洗浄した。播種する前に、過剰の培地をウェルから取り除いた。
【０１１１】
トリプシンを使用してｈＭＳＣを細胞培養プレートから回収し、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地に再懸濁し、約１００，０００の細胞を含む１５０μＬを、６ウェル細胞培養プレートのウェル内に配置された発泡体部分の各々に播種した。６ウェル細胞培養プレートを細胞培養インキュベータ内に約７日間置き、４日目に培地を除去し、新鮮な培地と交換した。約７日後、培地を除去し、約５０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼと約５．０ｍＭのＥＤＴＡを含む約２．０ｍＬの消化溶液の各ウェルに加えることによって発泡体を溶解させた。発泡体は、５．０分以内に溶解することが観察された。発泡体の溶解後、前述のトリパンブルー排除プロトコルを使用して細胞をカウントした。細胞は発泡体部分のすべての細孔表面にコロニーを形成し、本開示の「Ｃｏｒｎｉｎｇ」「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣでコーティングされた溶解可能な発泡足場上でのｈＳＭＣの増殖が成功裏に達成されたことが観察された。
【０１１２】
実施例２２
実施例２及び１１のプロセスに従って形成し、実施例１４のプロセスに従ってコーティングした発泡体上での静的条件及び動的条件におけるヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の培養の比較について調査した。ｈＭＳＣ継代２を実施例１７のように培養した。トリプシンを使用してｈＭＳＣを細胞培養プレートから回収し、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地に再懸濁し、約１００，０００の細胞を含む１５０μＬを、実施例２で形成した２０個の発泡足場及び実施例１１で形成した２０個の発泡足場に播種した。足場を６ウェル細胞培養プレートのウェル内に配置し、これを細胞培養インキュベータ内に約２時間置いた。約２時間後、実施例２に従って形成された足場を含む６ウェル細胞培養プレート、及び実施例１１に従って形成された足場を含む６ウェル細胞培養プレートをインキュベータから取り出し、足場を別々のバイオリアクタに移した。他の６ウェル細胞培養プレートはインキュベータ内に残した。すべての足場をそれぞれの条件下で約６日間保持し、その後、約５０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼと約５．０ｍＭのＥＤＴＡを含む消化溶液を加えることによって溶解させた。発泡体の溶解後、前述のトリパンブルー排除プロトコルを使用して細胞をカウントした。本開示の「Ｃｏｒｎｉｎｇ」「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣでコーティングされた溶解可能な発泡足場上での細胞の増殖は、静的条件下においても動的条件下と同様であることが観察された。
【０１１３】
実施例２３
ヒト間葉系幹細胞（ｈＭＳＣ）の多継代培養について調査した。本明細書に記載されるように、細胞培養の継代数は、培養が継代培養された回数、すなわち、回収され、再播種された回数の記録である。したがって、本開示に関連する多継代培養は、細胞が１つの溶解可能な発泡足場から回収され、異なる溶解可能な発泡足場に再播種されるプロセスを説明する。トリプシンを使用してｈＭＳＣを細胞培養プレートから回収し、「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地に再懸濁し、約１００，０００の細胞を含む１５０μＬを、実施例２で形成し、実施例１４でコーティングした発泡足場の第１のセットに播種した。足場を「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地内に配置し、細胞培養インキュベータ内に約６日間置いた。約６日後、約５０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼと約５．０ｍＭのＥＤＴＡを含む消化溶液を加えることによって足場を溶解させた。発泡体の溶解後、前述のトリパンブルー排除プロトコルを使用して細胞をカウントした。次に、足場の第１のセットから回収した約１００，０００の細胞を含む溶液を使用して、実施例２で形成し、実施例１４でコーティングした発泡足場の第２のセットに播種した。足場を「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地内に配置し、細胞培養インキュベータ内に約７日間置いた。約７日後、約５０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼと約５．０ｍＭのＥＤＴＡを含む消化溶液を加えることによって足場を溶解させた。発泡体の溶解後、トリパンブルー排除プロトコルを使用して細胞をカウントした。次に、足場の第２のセットから回収した約１００，０００の細胞を含む溶液を使用して、実施例２で形成し、実施例１４でコーティングした発泡足場の第３のセットに播種した。足場を「Ｍｅｓｅｎｃｕｌｔ」−ＸＦ培地内に配置し、細胞培養インキュベータ内に約７日間置いた。約７日後、約５０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼと約５．０ｍＭのＥＤＴＡを含む消化溶液を加えることによって足場を溶解させた。発泡体の溶解後、トリパンブルー排除プロトコルを使用して細胞をカウントし、次に、細胞培養プレートに播種し、実施例２０で使用した分化培地、軟骨細胞分化培地、及び脂肪細胞分化培地に細胞を曝露した。３週間後、骨細胞分化培地に曝露した細胞をアリザリンレッドで染色し、軟骨細胞分化培地に曝露した細胞をアルシアンブルーで染色し、脂肪細胞分化培地に曝露した細胞をオイルレッドＯで染色した。染色後、本開示の「Ｃｏｒｎｉｎｇ」「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣでコーティングされた溶解可能な発泡足場上での多継代培養を経たｈＳＭＣが、軟骨形成、骨形成、及び脂肪形成分化を維持することが観察された。
【０１１４】
実施例２４
実施例１１のプロセスに従って形成し、実施例１４のプロセスに従ってコーティングした発泡足場上でのヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞のトランスフェクションを、「Ｃｏｒｎｉｎｇ」「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣの溶解可能なマイクロキャリア（米国ニューヨーク州コーニング所在のＣｏｒｎｉｎｇ  Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄから市販される）上でのＨＥＫ細胞のトランスフェクションと比較した。ＨＥＫ細胞を溶解可能なマイクロキャリア上に播種した。溶解可能なマイクロキャリアの第１のセットを、６ウェル細胞培養プレート内に配置し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＩＭＤＭ培地に曝露した。６ウェル細胞培養プレートを細胞インキュベータ内に置き、静的条件で約３日間増殖させた。溶解可能なマイクロキャリアの第２のセットを使い捨てのスピナーフラスコ内に配置し、断続的に攪拌しながら（２．０時間ごとに１５分攪拌）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＩＭＤＭ培地に約３日間懸濁した。約３日後、約１５０μＬのトランスフェクション試薬を、６ウェル細胞培養プレートのウェル内の溶解可能なマイクロキャリアに加え、約１．０ｍＬのトランスフェクション試薬を断続的に攪拌しながらスピナーフラスコに加えた。
【０１１５】
発泡体の一部にＨＥＫ細胞を播種した。一部の発泡体部分を６ウェル細胞培養プレート内に配置し、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＩＭＤＭ培地に曝露し、次に、６ウェル培養プレートを細胞インキュベータ内に約３日間置いた。他の発泡体部分を半径流灌流カートリッジデバイスのチャンバ内に約３日間置いた。灌流カートリッジデバイスは、使用済みの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＩＭＤＭ培地の継続的な除去と、チャンバからの１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充した新鮮なＩＭＤＭ培地の追加を可能にした。約３日後、約１５０μＬのトランスフェクション試薬を６ウェル細胞培養プレートのウェル内の発泡体部分に加え、約１．０ｍＬのトランスフェクション試薬を灌流カートリッジデバイス内の発泡体部分に加えた。
【０１１６】
トランスフェクション試薬の添加後、溶解可能なマイクロキャリアから及び発泡体部分から細胞を回収し、レポーター遺伝子として緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）の応答を測定することによってレポーター遺伝子発現レベルを検出した。トランスフェクション効率の指標として使用することができる、トランスフェクトしたＨＥＫ細胞のＧＦＰ陽性率を、フローサイトメトリーを使用して測定した。本明細書で用いられる場合、「トランスフェクション効率」という用語は、トランスフェクション試薬への曝露後に細胞内に存在する所与の核酸又は生物学的に活性な分子を有する細胞の割合を指す。図１９は、培養条件のそれぞれについてのトランスフェクトされたＨＥＫ細胞のＧＦＰ陽性率を示す棒グラフである。図示されるように、バー１６１０は、６ウェル細胞培養プレート内の溶解可能な発泡体部分上で培養されたトランスフェクトされたＨＥＫ細胞のＧＦＰ陽性率を表し；バー１６２０は、灌流カートリッジデバイス内の溶解可能な発泡体部分上で培養されたトランスフェクトされたＨＥＫ細胞のＧＦＰ陽性率を表し；バー１６３０は、６ウェル細胞培養プレート内の溶解可能なマイクロキャリア上で培養されたトランスフェクトされたＨＥＫ細胞のＧＦＰ陽性率を表し；バー１６４０は、スピナーフラスコ内の溶解可能なマイクロキャリア上で培養されたトランスフェクトされたＨＥＫ細胞のＧＦＰ陽性率を表している。本開示の「Ｃｏｒｎｉｎｇ」「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣでコーティングされた溶解可能な発泡足場上で培養された細胞は、マイクロキャリア上で培養された細胞より大きいトランスフェクション効率を示すことが観察された。特定の理論に縛られはしないが、発泡足場の細孔内の細胞は、マイクロキャリアの表面に付着した細胞よりも大きい、トランスフェクション試薬への曝露を経験したと考えられる。
【０１１７】
実施例２５
実施例１１のプロセスに従って形成し、実施例１４のプロセスに従ってコーティングした発泡足場上でのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターの産生を実証した。発泡足場の第１及び第２のセットに１００万の２９３ａａｖ細胞を播種し、半径流灌流カートリッジデバイスのチャンバに移し、そこでそれらを、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を補充したＩＭＤＭ培地に曝露した。
【０１１８】
約２４時間後、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用して、発泡足場の第１のセットに由来する細胞にＡＡＶ−２ヘルパーフリーパッケージングシステム（米国カリフォルニア州サンディエゴ所在のＣｅｌｌ  Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．から市販される）をトランスフェクトした。同じく約２４時間後に、ＰＥＩ法を使用して、発泡足場の第２のセットに由来する細胞にＡＡＶ−２ヘルパーフリーパッケージングシステムをトランスフェクトした。リン酸カルシウム法では、６．４μｇ／ｍＬのプラスミド濃度及びモル比１：１：１のプラスミドを用いて調製したリン酸カルシウム／ＤＮＡ複合体と共に、細胞を約１８時間インキュベートした。ＰＥＩ法では、発泡足場上の細胞に２μｇプラスミド／ｍＬをトランスフェクトした。ＰＥＩ法の各々では、２／１のＰＥＩ／ＤＮＡ比及びモル比１：１：１のプラスミドを使用した。
【０１１９】
半径流灌流カートリッジデバイスを、２０ｍＬ／分の灌流速度で約２時間、その後５ｍＬ／分で約１６時間動作させた。細胞のすべてのセットについて、約１８時間後に培地を除去し、新鮮な培地と交換した。次に細胞をさらにインキュベートし、トランスフェクションの７２時間後に回収した。発泡足場を集め、約５０Ｕ／ｍＬのペクチナーゼと約５．０ｍＭのＥＤＴＡを含む消化溶液を加えることによって溶解させた。発泡足場の溶解後、遠心分離を使用して細胞を回収し、ｄＰＢＳで洗浄した。細胞の一部をフローサイトメトリー分析用に保持し、残りの細胞を、２０ｍＭのＴｒｉｓ  ｐＨ８、１５０ｍＭのＮａＣｌ、５０Ｕ／ｍＬのベンゾナーゼを補充した０．１％のデオキシコール酸ナトリウムバッファーを使用して溶解した。
【０１２０】
３７℃で約３０分のインキュベーション後、ウイルス抽出物を約５分間１４，０００ｒｐｍで遠心分離することによって清澄化した。ＡＡＶ−２  ＥＬＩＳＡアッセイ（ドイツ国ハイデルベルク所在のＰＲＯＧＥＮ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｋ  ＧｍｂＨから市販される）を使用してウイルス力価を測定した。
【０１２１】
フローサイトメトリーを使用してトランスフェクション効率を分析し、良好なトランスフェクション効率が観察された。図２０は、発泡足場のセットのそれぞれについてのトランスフェクトした細胞のＧＦＰ陽性率を示す棒グラフである。図示されるように、バー１７１０は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用してトランスフェクトした細胞のＧＦＰ陽性率を表し、トランスフェクション効率は約８６．４％であると測定され；バー１７２０は、ＰＥＩトランスフェクション法を使用してトランスフェクトした細胞のＧＦＰ陽性率を表し、トランスフェクション効率は約７３．８％であると測定された。
【０１２２】
ＥＬＩＳＡアッセイを使用してウイルス力価も測定した。図２１は、発泡足場のセットあたりのウイルス粒子（ｖｐ）の数を示す棒グラフである。図示されるように、バー１８１０は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用してトランスフェクトした細胞のウイルス粒子を表し、８．７×１０１１個のウイルス粒子が測定され；バー１８２０は、ＰＥＩトランスフェクション法を使用してトランスフェクトした細胞のウイルス粒子を表し、５．７×１０１１個のウイルス粒子が測定された。図２２は、発泡足場のセットあたりの細胞あたりのウイルス粒子の数を示す棒グラフである。図示されるように、バー１９１０は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用してトランスフェクトした細胞のウイルス粒子／細胞を表し、１．１７×１０５個のウイルス粒子／細胞が測定され；バー１９２０は、ＰＥＩトランスフェクション法を使用してトランスフェクトした細胞のウイルス粒子／細胞を表し、６．８×１０４個のウイルス粒子／細胞が測定された。
【０１２３】
最後に、感染したＨＥＫ２９３細胞でＧＦＰ発現を誘導する抽出物の能力を試験することによって、ウイルスベクターの機能性を評価した。ウイルスベクター感染性は、感染させるために１０５個のウイルス粒子／細胞を使用して調製した抽出物をＨＥＫ２９３細胞に感染させることによって評価した。感染後約７２時間で、感染したＨＥＫ細胞のＧＦＰ陽性率をフローサイトメトリーによって測定した。発泡足場の各セットに由来する細胞の感染が観察された。ＧＦＰ発現を遺伝子導入の効率の特定に使用し、本実施例では約１０％〜約２６％の範囲であった。このように、本明細書に開示される発泡足場上で、機能的ＡＡＶベクターを産生することができると結論付けられた。図２３は、感染後の発泡足場のセットのそれぞれについてのＧＦＰ発現を示す細胞の割合を示す棒グラフである。図示されるように、バー２０１０は、リン酸カルシウムトランスフェクション法を使用してトランスフェクトした細胞についてのＧＦＰ発現を示す細胞の割合を表し、約２６％の細胞がＧＦＰ発現を示しており；バー２０２０は、ＰＥＩトランスフェクション法を使用してトランスフェクトした細胞についてのＧＦＰ発現を示す細胞の割合を表し、約１０％の細胞がＧＦＰ発現を示した。
【０１２４】
本開示の態様（１）によれば、細胞培養のための溶解可能な発泡足場が提供される。溶解可能な発泡足場は、ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーとを含む。
【０１２５】
本開示の態様（２）によれば、接着ポリマーコーティングをさらに含む、態様（１）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１２６】
本開示の態様（３）によれば、接着ポリマーコーティングがペプチドを含む、態様（２）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１２７】
本開示の態様（４）によれば、接着ポリマーコーティングが、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン、及びそれらの混合物からなる群より選択されるペプチドを含む、態様（２）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１２８】
本開示の態様（５）によれば、接着ポリマーコーティングが「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣを含む、態様（２）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１２９】
本開示の態様（６）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーが、約８を超える親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する、態様（１）〜（５）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１３０】
本開示の態様（７）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーが、約１０を超える親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する、態様（１）〜（６）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１３１】
本開示の態様（８）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーが、約１０〜約４０の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有することができる、態様（１）〜（７）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１３２】
本開示の態様（９）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーがセルロース誘導体を含む、態様（１）〜（８）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１３３】
本開示の態様（１０）によれば、セルロース誘導体が、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）からなる群より選択される、態様（９）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１３４】
本開示の態様（１１）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーがタンパク質を含む、態様（１）〜（８）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１３５】
本開示の態様（１２）によれば、タンパク質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、カゼイン、及びハイドロフォビンからなる群より選択される、態様（１１）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１３６】
本開示の態様（１３）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーが合成両親媒性ポリマーを含む、態様（１）〜（８）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１３７】
本開示の態様（１４）によれば、合成両親媒性ポリマーがポロキサマーを含む、態様（１３）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１３８】
本開示の態様（１５）によれば、表面活性を有する少なくとも２つの第１の水溶性ポリマーを含む、態様（１）〜（１４）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１３９】
本開示の態様（１６）によれば、表面活性を有しない少なくとも１つの第２のポリマーをさらに含む、態様（１）〜（１５）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１４０】
本開示の態様（１７）によれば、少なくとも１つの第２のポリマーが合成ポリマーを含む、態様（１６）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１４１】
本開示の態様（１８）によれば、合成ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド；（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドのホモポリマー及びコポリマー；ポリビニルメチルエーテル−無水マレイン酸、及びポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックコポリマーからなる群より選択される、態様（１７）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１４２】
本開示の態様（１９）によれば、少なくとも１つの第２のポリマーが半合成ポリマーを含む、態様（１６）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１４３】
本開示の態様（２０）によれば、半合成ポリマーが、デキストラン誘導体、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及び誘導体、メチルセルロース及び誘導体、エチルセルロースセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロースからなる群より選択される、態様（１９）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１４４】
本開示の態様（２１）によれば、少なくとも１つの第２のポリマーが天然ポリマーを含む、態様（１６）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１４５】
本開示の態様（２２）によれば、天然ポリマーが、デンプン、デンプン誘導体、カードラン、プルラン、ジェランガム、キサンタンガム、デキストラン、アルブミン、カゼイン、カゼイン塩、ゼラチン、寒天、アルギン酸塩、カラギーナン、グアーガム、グアーガム誘導体、ローカストビーンガム、ヒアルロン酸、及びコンドロイチン硫酸からなる群より選択される、態様（２１）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１４６】
本開示の態様（２３）によれば、水溶性可塑剤をさらに含む、態様（１）〜（２２）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１４７】
本開示の態様（２４）によれば、水溶性可塑剤が、グリセロール、多価アルコール、ソルビトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール及びそれらの組合せからなる群より選択される、態様（２３）に記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１４８】
本開示の態様（２５）によれば、約５５質量％未満の水溶性可塑剤を含む、態様（２３）〜（２４）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１４９】
本開示の態様（２６）によれば、約１５質量％〜約５５質量％の水溶性可塑剤を含む、態様（２３）〜（２５）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１５０】
本開示の態様（２７）によれば、約８５％〜約９６％の多孔率を含む、態様（１）〜（２６）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１５１】
本開示の態様（２８）によれば、約５０μｍ〜約５００μｍの平均細孔径を含む、態様（１）〜（２７）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１５２】
本開示の態様（２９）によれば、約７５μｍ〜約４５０μｍの平均細孔径を含む、態様（１）〜（２８）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１５３】
本開示の態様（３０）によれば、約１００μｍ〜約４００μｍの平均細孔径を含む、態様（１）〜（２９）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１５４】
本開示の態様（３１）によれば、約０．４０ｇ／ｃｍ３未満の湿潤密度を含む、態様（１）〜（３０）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１５５】
本開示の態様（３２）によれば、約０．３０ｇ／ｃｍ３未満の湿潤密度を含む、態様（１）〜（３１）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１５６】
本開示の態様（３３）によれば、約０．１６ｇ／ｃｍ３〜約０．４０ｇ／ｃｍ３の湿潤密度を含む、態様（１）〜（３２）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１５７】
本開示の態様（３４）によれば、約０．２０ｇ／ｃｍ３未満の乾燥密度を含む、態様（１）〜（３３）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１５８】
本開示の態様（３５）によれば、約０．１０ｇ／ｃｍ３未満の乾燥密度を含む、態様（１）〜（３４）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１５９】
本開示の態様（３６）によれば、約０．０２ｇ／ｃｍ３〜約０．２０ｇ／ｃｍ３の乾燥密度を含む、態様（１）〜（３５）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１６０】
本開示の態様（３７）によれば、開孔構造を含む、態様（１）〜（３６）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１６１】
本開示の態様（３８）によれば、溶解可能な発泡足場の消化が約１時間未満で完了する、態様（１）〜（３７）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１６２】
本開示の態様（３９）によれば、溶解可能な発泡足場の消化が約１５分未満で完了する、態様（１）〜（３８）のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場が提供される。
【０１６３】
本開示の態様（４０）によれば、溶解可能な発泡足場を形成する方法が提供される。該方法は、ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるポリガラクツロン酸化合物を水溶液に加えることによって第１の水性混合物を形成すること；表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーと二価金属塩とを水溶液に加えることによって第２の水性混合物を形成すること；第１の水性混合物と第２の水性混合物とを合わせて、合わせた水性混合物を形成すること；合わせた水性混合物にゲル誘導剤を加えること；並びに、合わせた水性混合物に気泡を導入して発泡足場を形成することを含む。
【０１６４】
本開示の態様（４１）によれば、第２の水性混合物を形成することが、表面活性を有しない少なくとも１つの第２のポリマーを加えることをさらに含む、態様（４０）に記載の方法が提供される。
【０１６５】
本開示の態様（４２）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーと少なくとも１つの第２のポリマーとを加えることが、約３５％〜約６５％の少なくとも１つの第１のポリマーと約３５％〜約６５％の少なくとも１つの第２のポリマーとを加えることを含む、態様（４１）に記載の方法が提供される。
【０１６６】
本開示の態様（４３）によれば、第２の水性混合物を形成することが、表面活性を有する少なくとも２つの第１の水溶性ポリマーを加えることを含む、態様（４０）〜（４２）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１６７】
本開示の態様（４４）によれば、二価金属塩が、マグネシウム、カルシウム、亜鉛、ストロンチウム、バリウム、及びそれらの組合せからなる群より選択されるカチオンと、シュウ酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、及びそれらの組合せからなる群より選択されるアニオンとを含む、態様（４０）〜（４３）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１６８】
本開示の態様（４５）によれば、第２の水性混合物を形成することが、第２の水性混合物に水溶性可塑剤を加えることをさらに含む、態様（４０）〜（４３）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１６９】
本開示の態様（４６）によれば、水溶性可塑剤が、グリセロール、多価アルコール、ソルビトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの組合せからなる群より選択される、態様（４５）に記載の方法が提供される。
【０１７０】
本開示の態様（４７）によれば、水溶性可塑剤が、第２の水性混合物の総固形添加剤の約５５質量％未満を構成する、態様（４５）〜（４６）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１７１】
本開示の態様（４８）によれば、水溶性可塑剤が、第２の水性混合物の総固形添加剤の約１５質量％〜約５５質量％を構成する、態様（４５）〜（４７）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１７２】
本開示の態様（４９）によれば、第２の水性混合物を形成することが、第２の水性混合物に乳化剤を加えることをさらに含む、態様（４０）〜（４８）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１７３】
本開示の態様（５０）によれば、第２の水性混合物を形成することが、第２の水性混合物に少なくとも１つの浸出性固体を加えることをさらに含む、態様（４０）〜（４９）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１７４】
本開示の態様（５１）によれば、少なくとも１つの浸出性固体が、塩、生体適合性の単糖類及び二糖類、並びに水溶性タンパク質からなる群より選択される、態様（５０）に記載の方法が提供される。
【０１７５】
本開示の態様（５２）によれば、ゲル誘導剤が、乳酸ラクトン、グリコール酸ラクトン、グルコノデルタラクトン、及び酸無水物からなる群より選択される、態様（４０）〜（５１）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１７６】
本開示の態様（５３）によれば、溶解可能な発泡足場を接着ポリマーコーティングでコーティングすることをさらに含む、態様（４０）〜（５２）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１７７】
本開示の態様（５４）によれば、接着ポリマーコーティングがペプチドを含む、態様（５３）に記載の方法が提供される。
【０１７８】
本開示の態様（５５）によれば、接着ポリマーコーティングが、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン、及びそれらの混合物からなる群より選択されるペプチドを含む、態様（５３）に記載の方法が提供される。
【０１７９】
本開示の態様（５６）によれば、接着ポリマーコーティングが「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣを含む、態様（５３）に記載の方法が提供される。
【０１８０】
本開示の態様（５７）によれば、溶解可能な発泡足場で細胞を培養する方法が提供される。該方法は、細胞が溶解可能な発泡足場の細孔内に入るように溶解可能な発泡足場に細胞を播種することであって、該溶解可能な足場が、ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーとを含む、播種すること；並びに、溶解可能な発泡足場を細胞培養培地と接触させることを含む。
【０１８１】
本開示の態様（５８）によれば、細胞が、溶解可能な発泡足場の細孔内で凝集してスフェロイドを形成する、態様（５７）に記載の方法が提供される。
【０１８２】
本開示の態様（５９）によれば、溶解可能な発泡足場が接着ポリマーコーティングを含み、溶解可能な発泡足場に細胞を播種することが、溶解可能な発泡足場の表面に細胞を接着させることを含む、態様（５７）又は（５８）に記載の方法が提供される。
【０１８３】
本開示の態様（６０）によれば、溶解可能な発泡足場を細胞培養培地と接触させることが、溶解可能な発泡足場を細胞培養培地に沈設することを含む、態様（５７）〜（５９）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１８４】
本開示の態様（６１）によれば、溶解可能な発泡足場を細胞培養培地と接触させることが、溶解可能な発泡足場上に細胞培養培地を継続的に通過させることを含む、態様（５７）〜（６０）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１８５】
本開示の態様（６２）によれば、溶解可能な発泡足場上に細胞培養培地を継続的に通過させることが、細胞培養培地の少なくとも一部を溶解可能な発泡足場との接触から取り除くこと、及び、溶解可能な発泡足場と接触する細胞培養培地の体積が実質的に一定に維持されるように、溶解可能な発泡足場を新鮮な細胞培養培地と接触させることを含む、態様（６１）に記載の方法が提供される。
【０１８６】
本開示の態様（６３）によれば、溶解可能な発泡足場から細胞を回収する方法が提供される。該方法は、溶解可能な発泡足場を酵素に曝露することによって溶解可能な発泡足場を消化することであって、溶解可能な足場が、ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーとを含む、消化すること；並びに、溶解可能な発泡足場をキレート化剤に曝露することを含む。
【０１８７】
本開示の態様（６４）によれば、酵素が非タンパク質分解酵素を含む、態様（６３）に記載の方法が提供される。
【０１８８】
本開示の態様（６５）によれば、非タンパク質分解酵素が、ペクチン分解酵素及びペクチナーゼからなる群より選択される、態様（６４）に記載の方法が提供される。
【０１８９】
本開示の態様（６６）によれば、溶解可能な発泡足場を消化することが、溶解可能な発泡足場を約１Ｕ〜約２００Ｕの酵素に曝露することを含む、態様（６３）〜（６５）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１９０】
本開示の態様（６７）によれば、溶解可能な発泡足場を約１ｍＭ〜約２００ｍＭのキレート化剤に曝露することを含む、態様（６３）〜（６６）のいずれかに記載の方法が提供される。
【０１９１】
本開示の態様（６８）によれば、組成物から形成される発泡足場生成物が提供される。該組成物は、ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーと、約５５質量％未満の水溶性可塑剤とを含む。
【０１９２】
本開示の態様（６９）によれば、接着ポリマーコーティングをさらに含む、態様（６８）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０１９３】
本開示の態様（７０）によれば、接着ポリマーコーティングがペプチドを含む、態様（６９）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０１９４】
本開示の態様（７１）によれば、接着ポリマーコーティングが、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン、及びそれらの混合物からなる群より選択されるペプチドを含む、態様（６９）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０１９５】
本開示の態様（７２）によれば、接着ポリマーコーティングが「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣを含む、態様（６９）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０１９６】
本開示の態様（７３）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーが、約８を超える親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する、態様（６８）〜（７２）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０１９７】
本開示の態様（７４）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーが、約１０を超える親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する、態様（６８）〜（７３）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０１９８】
本開示の態様（７５）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーが、約１０〜約４０の親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有することができる、態様（６８）〜（７４）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０１９９】
本開示の態様（７６）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーがセルロース誘導体を含む、態様（６８）〜（７５）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２００】
本開示の態様（７７）によれば、セルロース誘導体が、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、ヒドロキシプロピルセルロース（ＨＰＣ）、メチルセルロース（ＭＣ）、ヒドロキシエチルメチルセルロース（ＨＥＭＣ）、及びヒドロキシプロピルメチルセルロース（ＨＰＭＣ）からなる群より選択される、態様（７６）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２０１】
本開示の態様（７８）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーがタンパク質を含む、態様（６８）〜（７５）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２０２】
本開示の態様（７９）によれば、タンパク質が、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、ゼラチン、カゼイン、及びハイドロフォビンからなる群より選択される、態様（７８）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２０３】
本開示の態様（８０）によれば、少なくとも１つの第１のポリマーが合成両親媒性ポリマーを含む、態様（６８）〜（７５）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２０４】
本開示の態様（８１）によれば、合成両親媒性ポリマーがポロキサマーを含む、態様（８０）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２０５】
本開示の態様（８２）によれば、表面活性を有する少なくとも２つの第１の水溶性ポリマーを含む、態様（６８）〜（８１）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２０６】
本開示の態様（８３）によれば、発泡足場組成物が、表面活性を有しない少なくとも１つの第２のポリマーをさらに含む、態様（６８）〜（８２）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２０７】
本開示の態様（８４）によれば、少なくとも１つの第２のポリマーが合成ポリマーを含む、態様（８３）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２０８】
本開示の態様（８５）によれば、合成ポリマーが、ポリエチレングリコール、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、カルボキシビニルポリマー、ポリアクリル酸、ポリアクリルアミド；（２−ヒドロキシプロピル）メタクリルアミドのホモポリマー及びコポリマー；ポリビニルメチルエーテル−無水マレイン酸、及びポリエチレンオキシド／ポリプロピレンオキシドブロックコポリマーからなる群より選択される、態様（８４）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２０９】
本開示の態様（８６）によれば、少なくとも１つの第２のポリマーが半合成ポリマーを含む、態様（８３）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２１０】
本開示の態様（８７）によれば、半合成ポリマーが、デキストラン誘導体、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース及び誘導体、メチルセルロース及び誘導体、エチルセルロースセルロース、エチルヒドロキシエチルセルロース、及びヒドロキシプロピルセルロースからなる群より選択される、態様（８６）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２１１】
本開示の態様（８８）によれば、少なくとも１つの第２のポリマーが天然ポリマーを含む、態様（８３）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２１２】
本開示の態様（８９）によれば、天然ポリマーが、デンプン、デンプン誘導体、カードラン、プルラン、ジェランガム、キサンタンガム、デキストラン、アルブミン、カゼイン、カゼイン塩、ゼラチン、寒天、アルギン酸塩、カラギーナン、グアーガム、グアーガム誘導体、ローカストビーンガム、ヒアルロン酸、及びコンドロイチン硫酸からなる群より選択される、態様（８８）に記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２１３】
本開示の態様（９０）によれば、水溶性可塑剤が、グリセロール、多価アルコール、ソルビトール、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、及びそれらの組合せからなる群より選択される、態様（６８）〜（８９）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２１４】
本開示の態様（９１）によれば、約１５質量％〜約５５質量％の水溶性可塑剤を含む、態様（６８）〜（９０）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２１５】
本開示の態様（９２）によれば、約８５％〜約９６％の多孔率を含む、態様（６８）〜（９１）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２１６】
本開示の態様（９３）によれば、約５０μｍ〜約５００μｍの平均細孔径を含む、態様（６８）〜（９２）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２１７】
本開示の態様（９４）によれば、約７５μｍ〜約４５０μｍの平均細孔径を含む、態様（６８）〜（９３）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２１８】
本開示の態様（９５）によれば、約１００μｍ〜約４００μｍの平均細孔径を含む、態様（６８）〜（９４）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２１９】
本開示の態様（９６）によれば、約０．４０ｇ／ｃｍ３未満の湿潤密度を含む、態様（６８）〜（９５）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２２０】
本開示の態様（９７）によれば、約０．３０ｇ／ｃｍ３未満の湿潤密度を含む、態様（６８）〜（９６）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２２１】
本開示の態様（９８）によれば、約０．１６ｇ／ｃｍ３〜約０．４０ｇ／ｃｍ３の湿潤密度を含む、態様（６８）〜（９７）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２２２】
本開示の態様（９９）によれば、約０．２０ｇ／ｃｍ３未満の乾燥密度を含む、態様（６８）〜（９８）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２２３】
本開示の態様（１００）によれば、約０．１０ｇ／ｃｍ３未満の乾燥密度を含む、態様（６８）〜（９９）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２２４】
本開示の態様（１０１）によれば、約０．０２ｇ／ｃｍ３〜約０．２０ｇ／ｃｍ３の乾燥密度を含む、態様（６８）〜（１００）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２２５】
本開示の態様（１０２）によれば、開孔構造を含む、態様（６８）〜（１０１）のいずれかに記載の発泡足場生成物が提供される。
【０２２６】
本開示は限られた数の実施形態を含むが、この開示の利益を有する当業者は、本開示の範囲から逸脱しない他の実施形態が考案されうることを認識するであろう。
【０２２７】
以下、本発明の好ましい実施形態を項分け記載する。
【０２２８】
実施形態１
細胞培養のための溶解可能な発泡足場であって、
ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、
表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーと
を含む、溶解可能な発泡足場。
【０２２９】
実施形態２
水溶性可塑剤をさらに含む、実施形態１に記載の溶解可能な発泡足場。
【０２３０】
実施形態３
約５５質量％未満の水溶性可塑剤を含む、実施形態２に記載の溶解可能な発泡足場。
【０２３１】
実施形態４
接着ポリマーコーティングをさらに含む、実施形態１〜３のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場。
【０２３２】
実施形態５
前記接着ポリマーコーティングがペプチドを含む、実施形態４に記載の溶解可能な発泡足場。
【０２３３】
実施形態６
前記接着ポリマーコーティングが、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン、及びそれらの混合物からなる群より選択されるペプチドを含む、実施形態４に記載の溶解可能な発泡足場。
【０２３４】
実施形態７
前記接着ポリマーコーティングが、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣを含む、実施形態４に記載の溶解可能な発泡足場。
【０２３５】
実施形態８
前記少なくとも１つの第１のポリマーが、約８を超える親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する、実施形態１〜７のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場。
【０２３６】
実施形態９
前記少なくとも１つの第１のポリマーがセルロース誘導体を含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場。
【０２３７】
実施形態１０
前記少なくとも１つの第１のポリマーがタンパク質を含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場。
【０２３８】
実施形態１１
前記少なくとも１つの第１のポリマーが、合成両親媒性ポリマーを含む、実施形態１〜８のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場。
【０２３９】
実施形態１２
表面活性を有する少なくとも２つの第１の水溶性ポリマーを含む、実施形態１〜１１のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場。
【０２４０】
実施形態１３
表面活性を有しない少なくとも１つの第２のポリマーをさらに含む、実施形態１〜１２のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場。
【０２４１】
実施形態１４
前記少なくとも１つの第２のポリマーが合成ポリマーを含む、実施形態１３に記載の溶解可能な発泡足場。
【０２４２】
実施形態１５
前記少なくとも１つの第２のポリマーが半合成ポリマーを含む、実施形態１３に記載の溶解可能な発泡足場。
【０２４３】
実施形態１６
前記少なくとも１つの第２のポリマーが天然ポリマーを含む、実施形態１３に記載の溶解可能な発泡足場。
【０２４４】
実施形態１７
約５０μｍ〜約５００μｍの平均細孔径を含む、実施形態１〜１６のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場。
【０２４５】
実施形態１８
約０．４０ｇ／ｃｍ３未満の湿潤密度を含む、実施形態１〜１７のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場。
【０２４６】
実施形態１９
開孔構造を含む、実施形態１〜１８のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場。
【０２４７】
実施形態２０
前記溶解可能な発泡足場の消化が約１時間未満で完了する、実施形態１〜１９のいずれかに記載の溶解可能な発泡足場。
【０２４８】
実施形態２１
溶解可能な発泡足場を形成する方法であって、該方法が、
ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるポリガラクツロン酸化合物を水溶液に加えることによって第１の水性混合物を形成すること；
表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーと二価金属塩とを水溶液に加えることによって第２の水性混合物を形成すること；
前記第１の水性混合物を前記第２の水性混合物と合わせて、合わせた水性混合物を形成すること；
前記合わせた水性混合物にゲル誘導剤を加えること；及び
前記合わせた水性混合物に気泡を導入して発泡足場を形成すること
を含む、方法。
【０２４９】
実施形態２２
第２の水性混合物を形成することが、前記第２の水性混合物に水溶性可塑剤を加えることをさらに含む、実施形態２１に記載の方法。
【０２５０】
実施形態２３
前記水溶性可塑剤が、前記第２の水性混合物の総固形添加剤の約５５質量％未満を構成する、実施形態２２に記載の方法。
【０２５１】
実施形態２４
第２の水性混合物を形成することが、表面活性を有しない少なくとも１つの第２のポリマーを加えることをさらに含む、実施形態２１〜２３のいずれかに記載の方法。
【０２５２】
実施形態２５
少なくとも１つの第１のポリマーと少なくとも１つの第２のポリマーとを加えることが、約３５％〜約６５％の前記少なくとも１つの第１のポリマーと、約３５％〜約６５％の前記少なくとも１つの第２のポリマーとを加えることを含む、実施形態２４のに記載の方法。
【０２５３】
実施形態２６
第２の水性混合物を形成することが、表面活性を有する少なくとも２つの第１の水溶性ポリマーを加えることを含む、実施形態２１〜２５のいずれかに記載の方法。
【０２５４】
実施形態２７
前記二価金属塩が、
マグネシウム、カルシウム、亜鉛、ストロンチウム、バリウム、及びそれらの組合せからなる群より選択されるカチオンと、
シュウ酸塩、酒石酸塩、リン酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、及びそれらの組合せからなる群より選択されるアニオンと
を含む、実施形態２１〜２６のいずれかに記載の方法。
【０２５５】
実施形態２８
第２の水性混合物を形成することが、前記第２の水性混合物に乳化剤を加えることをさらに含む、実施形態２１〜２７のいずれかに記載の方法。
【０２５６】
実施形態２９
第２の水性混合物を形成することが、前記第２の水性混合物に少なくとも１つの浸出性固体を加えることをさらに含む、実施形態２１〜２８のいずれかに記載の方法。
【０２５７】
実施形態３０
前記少なくとも１つの浸出性固体が、塩、生体適合性の単糖類及び二糖類、並びに水溶性タンパク質からなる群より選択される、実施形態２９に記載の方法。
【０２５８】
実施形態３１
前記ゲル誘導剤が、乳酸ラクトン、グリコール酸ラクトン、グルコノデルタラクトン、及び酸無水物からなる群より選択される、実施形態２１〜３０のいずれかに記載の方法。
【０２５９】
実施形態３２
前記溶解可能な発泡足場を接着ポリマーコーティングでコーティングすることをさらに含む、実施形態２１〜３１のいずれかに記載の方法。
【０２６０】
実施形態３３
前記接着ポリマーコーティングがペプチドを含む、実施形態３２に記載の方法。
【０２６１】
実施形態３４
前記接着ポリマーコーティングが、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン、及びそれらの混合物からなる群より選択されるペプチドを含む、実施形態３２に記載の方法。
【０２６２】
実施形態３５
前記接着ポリマーコーティングが、「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣを含む、実施形態３２に記載の方法。
【０２６３】
実施形態３６
溶解可能な発泡足場で細胞を培養する方法において、該方法が、
細胞が溶解可能な発泡足場の細孔に入るように、前記溶解可能な発泡足場に細胞を播種することであって、該溶解可能な足場が、
ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、
表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーと
を含む、播種すること、及び
前記溶解可能な発泡足場を細胞培養培地と接触させること
を含む、方法。
【０２６４】
実施形態３７
細胞が、前記溶解可能な発泡足場の前記細孔内で凝集してスフェロイドを形成する、実施形態３６に記載の方法。
【０２６５】
実施形態３８
前記溶解可能な発泡足場が接着ポリマーコーティングを含み、溶解可能な発泡足場に細胞を播種することが、前記溶解可能な発泡足場の表面に細胞を接着させることを含む、実施形態３６又は３７に記載の方法。
【０２６６】
実施形態３９
前記溶解可能な発泡足場を細胞培養培地と接触させることが、前記溶解可能な発泡足場を細胞培養培地に沈設することを含む、実施形態３６〜３８のいずれかに記載の方法。
【０２６７】
実施形態４０
前記溶解可能な発泡足場を細胞培養培地と接触させることが、前記溶解可能な発泡足場上に細胞培養培地を継続的に通過させることを含む、実施形態３６〜３９のいずれかに記載の方法。
【０２６８】
実施形態４１
前記溶解可能な発泡足場上に細胞培養培地を継続的に通過させることが、前記細胞培養培地の少なくとも一部を前記溶解可能な発泡足場との接触から取り除くこと、及び、前記溶解可能な発泡足場と接触する細胞培養培地の体積が実質的に一定に維持されるように、前記溶解可能な発泡足場を新鮮な細胞培養培地と接触させることを含む、実施形態４０に記載の方法。
【０２６９】
実施形態４２
溶解可能な発泡足場から細胞を回収する方法において、該方法が、
前記溶解可能な発泡足場を酵素に曝露することによって前記溶解可能な発泡足場を消化することであって；
前記溶解可能な足場が、
ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、
表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーと
を含む、消化すること、及び
前記溶解可能な発泡足場をキレート化剤に曝露すること
を含む、方法。
【０２７０】
実施形態４３
前記酵素が非タンパク質分解酵素を含む、実施形態４２に記載の方法。
【０２７１】
実施形態４４
前記非タンパク質分解酵素が、ペクチン分解酵素及びペクチナーゼからなる群より選択される、実施形態４３に記載の方法。
【０２７２】
実施形態４５
前記溶解可能な発泡足場を消化することが、前記溶解可能な発泡足場を約１Ｕ〜約２００Ｕの前記酵素に曝露することを含む、実施形態４２〜４４のいずれかに記載の方法。
【０２７３】
実施形態４６
前記溶解可能な発泡足場を約１ｍＭ〜約２００ｍＭの前記キレート化剤に曝露することを含む、実施形態４２〜４５のいずれかに記載の方法。
【０２７４】
実施形態４７
組成物から形成される発泡足場生成物であって、
ペクチン酸；部分的にエステル化されたペクチン酸、部分的にアミド化されたペクチン酸、及びそれらの塩のうちの少なくとも１つから選択されるイオノトロピック架橋ポリガラクツロン酸化合物と、
表面活性を有する少なくとも１つの第１の水溶性ポリマーと、
約５５質量％未満の水溶性可塑剤と
を含む、発泡足場生成物。
【０２７５】
実施形態４８
約１５質量％〜約５５質量％の水溶性可塑剤を含む、実施形態４７に記載の発泡足場生成物。
【０２７６】
実施形態４９
接着ポリマーコーティングをさらに含む、実施形態４７又は４８に記載の発泡足場生成物。
【０２７７】
実施形態５０
前記接着ポリマーコーティングがペプチドを含む、実施形態４９に記載の発泡足場生成物。
【０２７８】
実施形態５１
前記接着ポリマーコーティングが、ＢＳＰ、ビトロネクチン、フィブロネクチン、ラミニン、Ｉ型コラーゲン、ＩＶ型コラーゲン、変性コラーゲン、及びそれらの混合物からなる群より選択されるペプチドを含む、実施形態４９に記載の発泡足場生成物。
【０２７９】
実施形態５２
前記接着ポリマーコーティングが「Ｓｙｎｔｈｅｍａｘ」ＩＩ−ＳＣを含む、実施形態４９に記載の発泡足場生成物。
【０２８０】
実施形態５３
前記少なくとも１つの第１のポリマーが約８を超える親水性−親油性バランス（ＨＬＢ）を有する、実施形態４７〜５２のいずれかに記載の発泡足場生成物。
【０２８１】
実施形態５４
前記少なくとも１つの第１のポリマーがセルロース誘導体を含む、実施形態４７〜５３のいずれかに記載の発泡足場生成物。
【０２８２】
実施形態５５
前記少なくとも１つの第１のポリマーがタンパク質を含む、実施形態４７〜５３のいずれかに記載の発泡足場生成物。
【０２８３】
実施形態５６
前記少なくとも１つの第１のポリマーが合成両親媒性ポリマーを含む、実施形態４７〜５３のいずれかに記載の発泡足場生成物。
【０２８４】
実施形態５７
表面活性を有する少なくとも２つの第１の水溶性ポリマーを含む、実施形態４７〜５６のいずれかに記載の発泡足場生成物。
【０２８５】
実施形態５８
前記発泡足場組成物が、表面活性を有しない少なくとも１つの第２のポリマーをさらに含む、実施形態４７〜５７のいずれかに記載の発泡足場生成物。
【０２８６】
実施形態５９
前記少なくとも１つの第２のポリマーが合成ポリマーを含む、実施形態５８に記載の発泡足場生成物。
【０２８７】
実施形態６０
前記少なくとも１つの第２のポリマーが半合成ポリマーを含む、実施形態５８に記載の発泡足場生成物。
【０２８８】
実施形態６１
前記少なくとも１つの第２のポリマーが天然ポリマーを含む、実施形態５８に記載の発泡足場生成物。
【０２８９】
実施形態６２
約８５％〜約９６％の多孔率を含む、実施形態４７〜６１のいずれかに記載の発泡足場生成物。
【０２９０】
実施形態６３
約５０μｍ〜約５００μｍの平均細孔径を含む、実施形態４７〜６２のいずれかに記載の発泡足場生成物。
【０２９１】
実施形態６４
約０．４０ｇ／ｃｍ３未満の湿潤密度を含む、実施形態４７〜６３のいずれかに記載の発泡足場生成物。
【０２９２】
実施形態６５
開孔構造を含む、実施形態４７〜６４のいずれかに記載の発泡足場生成物。
【図１】
2021503894.tif 000016
【図２】
2021503894.tif 000017
【図３】
2021503894.tif 000018
【図４】
2021503894.tif 000019
【図５】
2021503894.tif 000020
【図６】
2021503894.tif 000021
【図７】
2021503894.tif 000022
【図８】
2021503894.tif 000023
【図９】
2021503894.tif 000024
【図１０】
2021503894.tif 000025
【図１１】
2021503894.tif 000026
【図１２】
2021503894.tif 000027
【図１３】
2021503894.tif 000028
【図１４】
2021503894.tif 000029
【図１５】
2021503894.tif 000030
【図１６】
2021503894.tif 000031
【図１７】
2021503894.tif 000032
【図１８】
2021503894.tif 000033
【図１９】
2021503894.tif 000034
【図２０】
2021503894.tif 000035
【図２１】
2021503894.tif 000036
【図２２】
2021503894.tif 000037
【図２３】
2021503894.tif 000038
【国際調査報告】
2021503894.tif 000039
2021503894.tif 000040
2021503894.tif 000041