(57)【要約】  本発明は、尿中バイオマーカーにより前立腺癌及び／又はその悪性度をｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏで診断する方法に関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体における前立腺癌及び／又はその悪性度をｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏで診断する方法であって、
ａ）前記個体の尿試料を準備する工程と、
ｂ）前記尿試料中の亜鉛を定量化する工程と、
ｃ）亜鉛の定量化された値を参照値と比較する工程と、
を含む、方法。
【請求項２】
工程ｂ）において、総ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｔＰＳＡ）及び／又は遊離ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｆＰＳＡ）を定量化し、工程ｃ）において、総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）の定量化された値を参照値と比較する、及び／又は遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）の定量化された値を参照値と比較する、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程ｂ）において、スペルミンも定量化し、工程ｃ）において、スペルミンの定量化された値を参照値と比較する、請求項１又は２に記載の方法。
【請求項４】
工程ｂ）において、スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）も定量化し、工程ｃ）において、スペルミンオキシダーゼの定量化された値を参照値と比較する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５】
工程ｂ）において、総ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｔＰＳＡ）、亜鉛、及びスペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）を定量化し、工程ｃ）において、総ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｔＰＳＡ）、亜鉛、及びスペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）の定量化された値を参照値と比較する、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
個体における前立腺癌及び／又はその悪性度をｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏで診断する方法であって、
ａ’）前記個体の尿試料を準備する工程と、
ｂ’）前記尿試料中の亜鉛を定量化する工程と、
ｃ’）前記尿試料中で分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）を定量化する工程と、
ｄ’）亜鉛の定量化された値を、分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）の定量化された値で正規化する工程と、
ｅ’）亜鉛の正規化された値を参照値と比較する工程と、
を含む、方法。
【請求項７】
工程ｂ’）において、総ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｔＰＳＡ）及び／又は遊離ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｆＰＳＡ）を定量化し、工程ｄ’）において、総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）の定量化された値を、分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）の定量化された値で正規化し、及び／又は遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）の定量化された値を、分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）の定量化された値で正規化し、工程ｅ’）において、総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）の正規化された値を参照値と比較する、及び／又は遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）の正規化された値を参照値と比較する、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程ｂ’）において、スペルミンを定量化し、工程ｄ’）において、スペルミンの定量化された値を、分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）の定量化された値で正規化し、工程ｅ’）において、スペルミンの正規化された値を参照値と比較する、請求項６又は７に記載の方法。
【請求項９】
工程ｂ’）において、スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）を定量化し、工程ｄ’）において、スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）の定量化された値を、分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）の定量化された値で正規化し、工程ｅ’）において、スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）の正規化された値を参照値と比較する、請求項６〜８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０】
工程ｂ’）において、総ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｔＰＳＡ）、亜鉛、及びスペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）を定量化し、工程ｄ’）において、総ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｔＰＳＡ）、亜鉛、及びスペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）の定量化された値を、分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）の定量化された値で正規化し、工程ｅ’）において、総ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｔＰＳＡ）、亜鉛、及びスペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）の正規化された値を参照値と比較する、請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記亜鉛の定量化は、比色試験によって行われる、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）及び／又は前記遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）の定量化は、イムノアッセイ、分光分析法、分光光度法、比色法、電気泳動法、錯滴定法、電流測定法によって行われる、請求項２〜５又は請求項７〜１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
個体から尿試料を収集して調製する手段と、
亜鉛を定量化する手段と、
を含む、請求項１に記載の方法用のキット。
【請求項１４】
総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）を定量化する手段と、
スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）を定量化する手段と、
分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）を定量化する手段と、
を更に含む、請求項１０に記載の方法用のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
［関連出願の相互参照］
本特許出願は、２０１８年７月１７日に出願されたイタリア国特許出願第１０２０１８０００００７２６４号の優先権を主張するものであり、このイタリア国特許出願の開示全体は、引用することによって本明細書の一部をなす。
【０００２】
本発明は、尿中バイオマーカーにより前立腺癌及び／又はその悪性度をｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏで診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
前立腺癌（ＰＣａ）は、世界中の男性にとって最も一般的な病理であり、癌関連死の２番目の原因である。
【０００４】
現在、前立腺癌の診断は、生検により採取された様々な前立腺組織試料に対する腫瘍の組織学的評価の後にのみ行われる。直腸指診（ＤＲＥ）と共に前立腺特異抗原（ＰＳＡ）の循環レベルを評価した後に、前立腺生検が指示される。
【０００５】
ＰＳＡ及びＤＲＥは、前立腺腫瘍を十中八九発症している患者を特定することを目的とした予備検査である。異常がある場合に、前立腺生検を行うことで臨床証拠が確認又は反証される。しかしながら、これらの試験の精度は限られているため、多数の過剰診断、結果として過剰治療が引き起こされる。
【０００６】
実際には、疑わしいＰＳＡレベルのため前立腺生検を受ける男性４人につき、平均してたった１人の個体しか生体検査後に前立腺癌に冒されていない。さらに、診断された前立腺癌の多くは経過が非常に遅く、患者の生涯を通じて症状を示さない場合がある。過剰診断された腫瘍を他の腫瘍と区別することは不可能であるため、スクリーニングに陽性であることが判明した患者の大多数は、しばしば生活の質に多大な影響を及ぼす有害作用（勃起不全、尿失禁、感染症等）を伴う外科手術が提案される。
【０００７】
患者の不都合に加えて、そのような高い割合の不必要な試験が医療制度のリソースに対して及ぼす経済的影響を考慮すべきである。リソースが良好に活用されているかどうか（値段に見合う価値）を評価する方法の１つは、経済的側面に対する臨床的便益を表現することである。ＰＳＡを用いたスクリーニングに対して存在する２つの経済研究において、この手術は費用効果が低いと定めていることが一致している。
【０００８】
つまり、集団全体で、ＰＳＡ試験が実施された後に行われるプロセスに関連するコスト（生検、治療、損傷の可能性による）が、経済的観点で定量化された恩恵を上回ることを意味している。
【０００９】
上記に鑑みて、前立腺癌を発症するリスクのある男性を正確に特定して腫瘍の自然進行を予測するために、前立腺癌の診断用の特異的なバイオマーカーを緊急に特定する必要があることは明らかである。
【００１０】
最近の幾つかの研究は、男性不妊症が悪性形の前立腺癌を発症するリスクのシグナルであり得ることを示唆している。特に、不妊症と診断された患者は、生殖能力のある男性集団よりも悪性の前立腺腫瘍を発症する可能性が３倍高いことが分かっている（非特許文献１）。
【００１１】
前立腺は、精子の生存、運動性、及び質の根底をなす要素を含む精液を産生するという主な機能を有する腺である。慢性炎症状態は、生殖能力に影響を与える射精液の液体部分の物理化学的特性の変化（粘度及び流動化の変動、ｐＨの変動、白い小球の存在、ＰＳＡ、ＰＡＰ、亜鉛、フルクトース、及びクエン酸のレベルの変化）を引き起こすことが分かっている。
【００１２】
腫瘍性形質転換の間に、細胞は重大な表現型変化及び機能的変化を受ける可能性がある。大部分の前立腺腫瘍は、腺癌、すなわち腺部分を巻き込む腫瘍として分類されるため、前立腺内の腫瘍性形質転換により腺の分泌機能が脅かされて、前立腺分泌物の組成が損なわれ得ることもうなずける。
【００１３】
幾つかの研究から、進行前立腺腫瘍ではＰＳＡの発現が失われ得ることが明らかになった（非特許文献２、非特許文献３、非特許文献４）。組織マイクロアレイ技術を使用したより詳細な研究により、組織内のＰＳＡの発現は、前立腺癌の診断パラメーター及び予後パラメーターの両方として使用され得ることが確認されている（非特許文献５）。
【００１４】
尿路は前立腺と密に接触しているため、前立腺組織によって産生された因子は運ばれて、結果として、尿中に検出される場合があることから、前立腺癌の診断及び予後診断のための生物学的マーカーとなる。
【００１５】
これに基づいて、ＰＳＡは前立腺房及び前立腺管を取り囲む上皮細胞の正常な産物であるため、尿中ＰＳＡの測定は、前立腺の生理学及び病理学的状況に関する有用な情報を提供するはずである（非特許文献６）。
【００１６】
特許文献１は、前立腺腫瘍マーカーとしての尿中ＰＳＡの使用を記載している。しかしながら、特許文献１では、採尿前に前立腺マッサージを行わないと、一貫した前立腺分泌物を得ることができない。特定された平均値は、健康な被験体では約５０ｎｇ／ｍｌであり、腫瘍に冒された被験体では５ｎｇ／ｍｌである。
【００１７】
２００７年に発表された研究では、前立腺腫瘍を伴う患者、その器官の良性肥大症を伴う患者、及び健康な被験体の間で、尿中ＰＳＡと血漿ＰＳＡとの間の比率が異なることが観察されている（非特許文献７）。
【００１８】
近年、循環ＰＳＡが遊離形及びプロテアーゼ阻害剤ファミリーの種々の分子に複合体化された形で存在することが分かった。より頻繁に、ＰＳＡはα１−アンチキモトリプシン（ＡＣＴ）に複合体化され、前立腺腫瘍を伴う患者が、健康なドナーよりも高いパーセンテージのＡＣＴと結合されたＰＳＡを有する一方で、健康なドナーは、より高いパーセンテージの遊離ＰＳＡを示すことが観察された（非特許文献８）。
【００１９】
様々な研究により、前立腺腫瘍において、ｍＲＮＡ及びンパク質としてのＡＣＴの発現が組織レベルで良性肥大症と比較して高いことが示されたことから、複合体化されたＰＳＡの量がより多いことは納得がいく（非特許文献９）。
【００２０】
特許文献２は、健康な被験体と前立腺癌を伴う被験体とを区別するために血漿／血清中のバイオマーカーとして、複合体化された及び遊離の、切断された及び切断されていないＰＳＡを使用することを記載している。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００２１】
【特許文献１】欧州特許出願公開第２５１５１１５号
【特許文献２】国際公開第０００２０５２号
【非特許文献】
【００２２】
【非特許文献１】Walsh TJ et al., Cancer. 2010 May 1; 116(9):2140-7
【非特許文献２】Aihara M et al., J Urol. 1994; 151:1558-1564
【非特許文献３】Weir EG et al., J Urol. 2000; 163:1739-1742
【非特許文献４】Augustin H et al., J Cancer Res Clin Oncol. 2003; 129:662-668
【非特許文献５】Erbersdobler A et al., Urology. 2009 Nov; 74(5):1169-73
【非特許文献６】Irani J et al., Eur Urol 1996; 29:407-12
【非特許文献７】Bolduc S et al., Can Urol Assoc J. 2007 Nov; 1(4):377-81
【非特許文献８】Christensson A et al., J Urol. 1993; 150:100-5
【非特許文献９】Zhu L et al., Prostate. 2013 Jan; 73(2):219-26
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００２３】
本発明の目的は、迅速かつ安価に信頼性が高く正確な結果をもたらす、尿中に存在する新しいバイオマーカーにより前立腺癌をｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏで診断する方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【００２４】
本発明によれば、上記目的は、請求項１及び請求項４に記載の方法によって達成される。
【００２５】
本発明によれば、上述の方法で使用されるキットも提供される。
【００２６】
本発明のより良い理解のために、ここで、本発明をまた添付の図面を参照して説明する。
【図面の簡単な説明】
【００２７】
【図１】前立腺癌に冒された個体及び健康な個体における、尿中バイオマーカーである亜鉛（Ｚｎ）、総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）、遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）、スペルミン、スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）の絶対値のグラフを示す図である。
【図２】前立腺癌に冒された個体及び健康な個体における、クレアチニンに対して正規化された尿中バイオマーカーであるＺｎ、ｕｔＰＳＡ、ｕｆＰＳＡ、スペルミン（Ｓｐｍ）、スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）の値のグラフを示す図である。
【図３】Ｚｎ、スペルミン（Ｓｐｍ）、ｕｔＰＳＡ、ｕｆＰＳＡ、スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）についてのＲＯＣ（受信者動作特性）曲線を示す図である。
【図４ａ】Ｚｎ−Ｓｐｍ、Ｚｎ−ｕｔＰＳＡ、Ｚｎ−ｕｆＰＳＡ、ｕｆＰＳＡ−Ｓｐｍ、ｕｔＰＳＡ−ｕｆＰＳＡ、ｕｔＰＳＡ−Ｓｐｍの組み合わせについてのＲＯＣ曲線を示す図である。
【図４ｂ】Ｚｎ−Ｓｐｍ−ｕｔＰＳＡ、Ｚｎ−Ｓｐｍ−ｕｆＰＳＡ、Ｚｎ−ｕｔＰＳＡ−ｕｆＰＳＡ、Ｓｐｍ−ｕｔＰＳＡ−ｕｆＰＳＡ、Ｓｐｍ−ｕｔＰＳＡ−ｕｆＰＳＡ−Ｚｎの組み合わせについてのＲＯＣ曲線を示す図である。
【図４ｃ】Ｚｎ−Ｓｐｍ−ＳＭＯＸ、Ｚｎ−ｕｔＰＳＡ−ＳＭＯＸ、Ｚｎ−ｕｆＰＳＡ−ＳＭＯＸ、ｕｆＰＳＡ−Ｓｐｍ−ＳＭＯＸ、ｕｔＰＳＡ−Ｓｐｍ−ＳＭＯＸ、Ｚｎ−ｕｔＰＳＡ−ＳＭＯＸ−Ｓｐｍの組み合わせについてのＲＯＣ曲線を示す図である。
【図５】腫瘍の悪性度に基づいて低リスク、中リスク及び高リスクに分けられた前立腺癌に冒された個体並びに健康な個体における、尿中バイオマーカーである亜鉛（Ｚｎ）、総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）、遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）、スペルミン、スペルミンオキシダーゼ（ＳＭＯＸ）の絶対値のグラフを示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２８】
本発明によれば、個体における前立腺癌をｉｎ  ｖｉｔｒｏ／ｅｘ  ｖｉｖｏで診断する方法は、以下の工程を含む。
【００２９】
第１の工程では、個体の尿試料が準備される。尿試料は、好ましくは、患者に前立腺マッサージを行った後に取得される。
【００３０】
第２の工程では、尿試料中の亜鉛が定量化される。好ましくは、定量化は比色試験によって実施される。
【００３１】
第３の工程では、亜鉛値が参照値と比較される。参照値は、前立腺癌に冒されていない個体に典型的な値に対応する。
【００３２】
本発明による方法は、前立腺癌の診断を可能にするだけでなく、その悪性度の評価も可能にする。本発明によるマーカーは、疾患の進行のリスクが低い、中程度、及び高い患者の尿中で発現が異なっている。「腫瘍の悪性度」とは、疾患の進行のリスクのレベルを意味する。
【００３３】
好ましくは、上述の方法の第２の工程では、総ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｔＰＳＡ）も定量化され、第３の工程では、総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）の定量化された値が参照値と比較される。
【００３４】
更により好ましくは、第２の工程では、遊離ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｆＰＳＡ）が定量化され、第３の工程では、遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）の定量化された値が参照値と比較される。
【００３５】
好ましくは、総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）及び／又は遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）の定量化は、イムノアッセイ、分光分析法、分光光度法、比色法、電気泳動法、錯滴定法、電流測定法、更により好ましくはイムノアッセイによって行われる。ＰＳＡ配列は、配列番号１として提供される。
【００３６】
更により好ましくは、第２の工程では、更なる前立腺癌バイオマーカーが定量化され、第３の工程では、上記バイオマーカーの定量化された値が参照値と比較される。上記バイオマーカーは、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、フィブリノリジン、プロフィブリノリジン、クエン酸塩、フルクトース、プトレシン、スペルミジン、スペルミン、スペルミンオキシダーゼ、プロスタグランジン類、カルシウム、銅からなる群より選択される。上記バイオマーカーは、好ましくは、スペルミン（Ｃ１０Ｈ２６Ｎ４）又はスペルミンオキシダーゼ（配列番号２）である。更により好ましくは、上記バイオマーカーは、スペルミンオキシダーゼである。好ましくは、スペルミン又はスペルミンオキシダーゼの定量化は、イムノアッセイ、分光分析法、分光光度法、比色法、電気泳動法、錯滴定法、電流測定法、更により好ましくはイムノアッセイによって行われる。
【００３７】
好ましくは、本発明による方法では、バイオマーカー（亜鉛、総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）、遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）、スペルミン、スペルミンオキシダーゼ等）の値を、クレアチニンの値に対して正規化することで、試験の精度が高められる（実施例における更なる詳細で説明されるように）。
【００３８】
したがって、この好ましい実施形態では、本発明による方法は、以下の工程を含む。
【００３９】
第１の工程では、個体の尿試料が準備される。
【００４０】
第２の工程では、尿試料中の亜鉛が定量化される。
【００４１】
第３の工程では、尿試料中の分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）が定量化される。好ましくは、定量化は、イムノアッセイ、酵素法、又はJaffe法によって行われる。
【００４２】
第４の工程では、亜鉛の定量化された値が、分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）の定量化された値で正規化される。
【００４３】
第５の工程では、亜鉛の正規化された値が参照値と比較される。参照値は、前立腺癌に冒されていない個体の典型的な値に対応する。
【００４４】
また、この実施形態では、総ＰＳＡ（前立腺特異抗原）値（ｕｔＰＳＡ）が、好ましくは定量化されて正規化され、更により好ましくは、遊離ＰＳＡ（前立腺特異抗原）値（ｕｆＰＳＡ）が定量化されて正規化される。
【００４５】
したがって、好ましくは、第２の工程では、総ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｔＰＳＡ）も定量化され、第４の工程では、総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）の定量化された値が、分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）の定量化された値で正規化され、第５の工程では、総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）の正規化された値が参照値と比較される。
【００４６】
更により好ましくは、第２の工程では、遊離ＰＳＡ（前立腺特異抗原）（ｕｆＰＳＡ）も定量化され、第４の工程では、遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）の定量化された値が、分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）の定量化された値で正規化され、第５の工程では、遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）の正規化された値が参照値と比較される。
【００４７】
更により好ましくは、第２の工程では、更なる前立腺癌バイオマーカーが定量化され、第４の工程では、上記バイオマーカーの定量化された値が、分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）の定量化された値で正規化され、第５の工程では、上記バイオマーカーの正規化された値が参照値と比較される。上記バイオマーカーは、前立腺酸性ホスファターゼ（ＰＡＰ）、フィブリノリジン、プロフィブリノリジン、クエン酸塩、フルクトース、プトレシン、スペルミジン、スペルミン、プロスタグランジン類、カルシウム、銅からなる群より選択される。上記バイオマーカーは、好ましくは、スペルミン又はスペルミンオキシダーゼである。
【００４８】
本発明による方法で使用されるキットは、
個体から尿試料を収集して調製する手段と、
亜鉛を定量化する手段と、
を含む。
【００４９】
好ましくは、キットはまた、
総ＰＳＡ（ｕｔＰＳＡ）を定量化する手段、及び／又は、
遊離ＰＳＡ（ｕｆＰＳＡ）を定量化する手段、及び／又は、
他の前立腺癌バイオマーカー、好ましくは、スペルミン又はスペルミンオキシダーゼを定量化する手段、及び／又は、
分子式Ｃ４Ｈ７Ｎ３Ｏを有する分子（クレアチニン）を定量化する手段、
を含む。
【実施例】
【００５０】
前立腺生検の適応を有する５１歳から８６歳の間の１１０人の患者から尿試料を収集した。
【００５１】
直腸指診と各小葉における底部から出発して中間部及び尖部に向かう１８０秒の期間にわたる３回の指圧からなる前立腺マッサージとの後に尿試料を収集した。収集から３０分以内に試料をＦａｌｃｏｎチューブ内で撹拌して−８０℃で凍結させた。
【００５２】
また、各患者から１２個の生検試料を採取し、解剖病理学部門によって通常の診断手順に使用した。組織学的評価により、５３人の患者において腫瘍細胞の存在が確認された（ＰＣａ）。残りの患者のうち、２９人は無病であり、１６人には良性の病理学的状況が見られ、１２人には潜在的前癌状況が見られた。これは、ＰＳＡ／ＤＲＥ／ＥＣＯの疑いのある患者のおよそ５５％が不必要な生検を受けたことを示している。
【００５３】
尿試料を解凍して、ｕｔＰＳＡ及びｕｆＰＳＡのバイオマーカーの存在をＥＬＩＳＡアッセイ（Sigma Aldrich社）によって評価し、亜鉛を比色試験（亜鉛アッセイ試験、Sigma Aldrich社）によって定量化し、スペルミンをＥＬＩＳＡアッセイ（MyBiosource社）によって定量化し、そしてスペルミンオキシダーゼをＥＬＩＳＡアッセイ（MyBiosource社）によって定量化した。
【００５４】
尿中のバイオマーカーの量は収集された尿の容量及びその濃度に依存するため、「クレアチニンに対する正規化」と呼ばれる計算を行うことで試験の精度を高めた。クレアチニンは体内で産生される物質であり、尿を介して排泄され、そのレベルは尿濃縮の指標である。クレアチニン値が高いほど、尿濃縮は大きくなる。クレアチニン値が低いほど、尿希釈は大きくなる。
【００５５】
考えられる混乱要因を排除するために、前癌状況及び良性の病理を伴う症例を除外した。
【００５６】
バイオマーカーの絶対値から、健康な患者と病気の患者との間に統計的有意差を確認することができた（図１を参照）。
【００５７】
クレアチニンに対する正規化の後に、研究対象の５つの全てのマーカーについて、病気の患者と健康な患者との間に更により大きな有意差が観察された（図２を参照）。
【００５８】
Ｚｎ、スペルミン、ｕｔＰＳＡ、ｕｆＰＳＡ、スペルミンオキシダーゼの値は腫瘍の存在と相関しており、ＡＵＣは、それぞれ０．６５６、０．６２８、０．６４４、０．６１７、０．６８４である（図３を参照）。
【００５９】
多変量解析の実施により、幾つかの要因を組み合わせると、バイオマーカーのレベルと前立腺腫瘍との相関における検定力が高まることが観察される（図４ａ、図４ｂ、及び図４ｃを参照）。
【００６０】
腫瘍の悪性度（低リスク、中リスク、高リスク）に基づいて患者を分けた後に同値を分析すると、分析された５つのマーカーのそれぞれは、より進行した段階の腫瘍を伴う患者においてより大きく減少することが強調される（図５を参照）。
【００６１】
実施例の結果から、本発明の利点は明白である。
【００６２】
尿試料における亜鉛、総ＰＳＡ、遊離ＰＳＡ、スペルミン、スペルミンオキシダーゼの単独のバイオマーカーの絶対値の分析は、既に前立腺癌の指標である。クレアチニンに対して正規化された値の分析により、更により正確な情報を得ることができる。幾つかのバイオマーカーの同時の分析により、前立腺癌を伴う患者の更により信頼性の高い特定が可能となる。特に、Ｚｎ、ｕｔＰＳＡ、及びスペルミンオキシダーゼの組み合わせにより、健康な患者と前立腺癌を伴う患者との間の識別の改善が可能となる（ＡＵＣ＝０．７１１）。
【００６３】
これらの分析物のそれぞれについて、８０％の感度での値が最適な閾値として特定された。
【００６４】
バイオマーカーが閾値よりも高い量で存在する試料を陽性とみなした。
【００６５】
このようにして、各試料についての陽性バイオマーカーの数に基づいて、０から３までのスケール（スコア）を確立し、前立腺癌を有する確率（リスク）を定義した。
【００６６】
【表１】
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【００６７】
表１から分かるように、陽性バイオマーカーを有しない個体では、前立腺癌を有する確率はゼロ（０％）である。
【００６８】
１つ、２つ、３つの陽性バイオマーカーを有する個体ではそれぞれ、確率は１４％、４３％、６６％に増加する。これらの結果は、本発明によるバイオマーカーの使用に基づいて、前立腺癌の確率が非常に低い個体を特定することが可能であり、したがって、それらの個体が侵襲的な臨床検査を受けるのを回避することが可能であることを示している。
【００６９】
本発明による方法は、侵襲的な処置を回避する、信頼性の高い診断が得られる迅速で安価な方法を表す。
【図１】
2021531464.tif 000004
【図２】
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【図３】
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【図４ａ】
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【図４ｂ】
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【図４ｃ】
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【図５】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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