(57)【要約】  本発明は、１以上の異種タンパク質を高度に効率良く発現することが可能であり、病原体に対する防御的免疫応答を引き起こすワクチンとしての使用に適切な、組換えクルイベロマイセス・ラクティス(K.ラクティス)酵母に関する。本発明は特に、K.ラクティス株の酵母ゲノムへ、異種抗原をコードする核酸の標的クローニングをするためのK.ラクティス株であって、該異種抗原のために組み込まれた発現カセットを、KlLAC4遺伝子座の代わりに若しくは追加的に、KlURA3-20遺伝子座(KLLA0E22771g)及び／又はKlMET5-1遺伝子座(KLLA0B03938g)に、有するK.ラクティス株であることを特徴とする、前記K.ラクティス株を提供する。本発明は、更に又、組み込み型発現ベクター、及び本発明のK.ラクティス株の生産方法、並びにワクチンとしてのその使用、に関する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
クルイベロマイセス・ラクティス(K.ラクティス)株の酵母ゲノム内へ、異種抗原をコードする核酸の標的クローニングをするための該ラクティス株であって、KlLAC4遺伝子座の代わりに又は追加して、KlURA3-20遺伝子座(KLLA0E22771g)に、及び／若しくはKlMET5-1遺伝子座(KLLA0B03938g)に、該異種抗原のために組み込まれた発現カセットを有することを特徴とする、前記K.ラクティス株。
【請求項２】
前記発現カセットは、K.ラクティスLAC4-12プロモーター(PLAC4-12)又は該プロモーターの変種であってLAC12及びLAC4の間の遺伝子間領域も含むもの、前記抗原をコードする領域、及びAgTEF1ターミネーターを有することを特徴とする、請求項１記載のK.ラクティス株。
【請求項３】
異種抗原をコードする核酸の複数のコピーが、得られるK.ラクティス株のKlLAC4遺伝子座、若しくはKlURA3-20遺伝子座、若しくはKlMET5-1遺伝子座に、タンデム発現カセット又はマルチ発現カセットを介して挿入されていることを特徴とする、請求項１又は２記載のK.ラクティス株。
【請求項４】
前記異種抗原IBDV VP2の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4に、タンデム発現カセットの形で存在することを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項記載のK.ラクティス株。
【請求項５】
異なる異種抗原をコードする核酸の１以上のコピーが、KlLAC4遺伝子座、及び／若しくは、KlURA3-20遺伝子座、及び／若しくは、KlMET5-1遺伝子座に、シングル発現カセット、タンデム発現カセット又はマルチ発現カセットを介して挿入されていることを特徴とする、請求項１〜３いずれか１項記載のK.ラクティス株。
【請求項６】
異種抗原インフルエンザA HA(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))及びインフルエンザA M1(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))をコードする遺伝子が、前記K.ラクティス株のKlLAC4及びKlURA3-20遺伝子座に挿入されて、発現することを特徴とする、請求項１〜３及び５いずれか１項記載のK.ラクティス株。
【請求項７】
前記K.ラクティス株は、前記ゲノム本来のKIGAL4遺伝子に加えて、追加で該KIGAL4遺伝子の第二の異所性コピーを含むことを特徴とする、請求項１〜6いずれか１項記載のK.ラクティス株。
【請求項８】
前記KIGAL4遺伝子の異所性コピーは、KIGAL4プロモーター及びKIGAL4ターミネーターに隣接し、前記K.ラクティス株内の遺伝子座KLLA0E13795g(Klavt3::KlGAL4-1、配列番号:1)で組み込まれることを特徴とする、請求項7記載のK.ラクティス株。
【請求項９】
前記異種抗原IBDV VP2の遺伝子は、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4に存在することを特徴とする、請求項１〜8いずれか１項記載のK.ラクティス株。
【請求項１０】
前記K.ラクティス株は、非誘導条件下では異種タンパク質をわずかに又は全く発現しない、LAC4-12プロモーターを改変したプロモーター構造を有する、請求項１〜9いずれか１項記載のK.ラクティス株であって、-1065及び-1540の間のプロモーターPLAC4-12の基本制御領域(BCR)(LR2欠損；PLAC4-12-LR2’；配列番号:2)は削除されていることを特徴とする、前記K.ラクティス株。
【請求項１１】
前記異種抗原インフルエンザA HA(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4に存在することを特徴とする、請求項１０記載のK.ラクティス株。
【請求項１２】
異種タンパク質発現の調節を可能にする、前記LAC4-12プロモーターを改変したプロモーター構造を有する前記K.ラクティス株であって、該プロモーターのアクチベーターKlGal4(「上流活性化配列」1、2及び4、5)のための結合部位数が変動し、1、2、3又は4個のKlGal4結合部位が存在することを特徴とする、請求項１〜１１いずれか１項記載のK.ラクティス株。
【請求項１３】
前記異種抗原IBDV VP2の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4で挿入されることを特徴とする、請求項１〜１２いずれか１項記載のK.ラクティス株。
【請求項１４】
前記対立遺伝子Kllac4、Klura3-20及びKlmet5-1の遺伝子機能が回復され、前記K.ラクティス株は原栄養性であることを特徴とする、請求項１〜１３いずれか１項記載のK.ラクティス株。
【請求項１５】
前記異種抗原BVDV E2外部ドメイン(1型、CP7)、BVDV E2外部ドメイン(2型、ニューヨーク93)及びBVDV Npro-NS3(1型、CP7)の遺伝子が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4、KlURA3-20、及びKlMet5-1に挿入されることを特徴とする、請求項１〜１４いずれか１項記載のK.ラクティス株。
【請求項１６】
下記株から選択される、K.ラクティス株:
VAK952(受託番号:DSM32705)、
VAK1111(受託番号:DSM32696)、
VAK1118(受託番号:DSM32701)、
VAK1131(受託番号:DSM32700)、
VAK1171(受託番号:DSM32699)、
VAK1243(受託番号:DSM32702)、
VAK1283(受託番号:DSM32697)、
VAK1395(受託番号:DSM32706)、及び
VAK1400(受託番号:DSM32698)。
【請求項１７】
KIpURA3(配列番号:3)又はKIpMET5(配列番号:4)から選択される、組み込み型発現ベクター。
【請求項１８】
KIpMET5-PL4-12-Et、KIpMET5-PL4-12-LR2-Et、KIpMET5-PL4-Et、KIpMET5-PL4-LR2-Etから、並びにKIpURA3-PL4-12-Et、KIpURA3-PL4-12-LR2-Et、KIpURA3-PL4-Et及びKIpURA3-PL4-LR2-Et(配列番号:5、6、7又は8と組み合わされた配列番号No.3、4) から選択される、組み込み型発現ベクター。
【請求項１９】
請求項１〜１6いずれか１項記載のK.ラクティス株を作製する方法であって、下記ステップ:
(i)目的とする抗原の遺伝子配列をKIpURA3ベクター及び／又はKIpMET5ベクター内に挿入するステップ、
(ii)K.ラクティス培養体を、改変され、かつ予め酵素的に消化されたベクター構築物で形質転換するステップ、
(iii)ウラシル及び／又はメチオニンを含まない固形培地を利用して、形質転換したK.ラクティス細胞を選択するステップ、並びに
(iv)任意で原栄養性を回復するステップ、
を含む、前記方法。
【請求項２０】
前記複数の抗原の遺伝子配列が、異所的に同時に挿入され、かつ制御されて発現することを特徴とする、請求項１９記載の方法。
【請求項２１】
１の病原体の異なる複数の変種の抗原をコードする異なる遺伝子配列が、異所的に挿入され、かつ制御されて発現することを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２２】
異なる複数の病原体の抗原をコードする異なる遺伝子配列が、異所的に挿入され、かつ制御されて発現することを特徴とする、請求項２０記載の方法。
【請求項２３】
請求項１〜１６いずれか１項記載のK.ラクティス株を含む、医薬組成物。
【請求項２４】
ワクチン接種に使用するための、請求項１〜１6いずれか１項記載のK.ラクティス株。
【請求項２５】
予防ワクチン接種に使用するための、請求項１〜１6いずれか１項記載のK.ラクティス株。
【請求項２６】
請求項１〜１6いずれか１項記載のK.ラクティス株を、対象へ、該対象内で１以上の異種抗原に対する防御的免疫応答を引き起こすために充分な量で投与することを含む、ワクチン接種方法。
【請求項２７】
前記K.ラクティス株は、皮下、筋肉内、又は、口／粘膜を通して投与されることを特徴とする、請求項２４若しくは２５記載のK.ラクティス株、又は請求項２６記載の方法。
【請求項２８】
前記K.ラクティス株は、病原体に対する防御的免疫応答を、１回適用／免疫化（「単回接種」）又は２回適用／免疫化（「プライムブースト」）で引き起こすことを特徴とする、請求項２４若しくは２５記載のK.ラクティス株、又は請求項２６若しくは２７記載の方法。
【請求項２９】
前記K.ラクティス株は、１の病原体の異なる複数の変種に対する交差防御的免疫応答を、１回使用／免疫化(「単回接種」)又は２回適用／免疫化(「プライムブースト」)で引き起こすことを特徴とする、請求項２４若しくは２５記載のK.ラクティス株、又は請求項２６若しくは２７記載の方法。
【請求項３０】
前記K.ラクティス株は、異なる複数の病原体に対する防御的免疫応答を、１回使用／免疫化(「単回接種」)又は２回適用／免疫化(「プライムブースト」)で引き起こすことを特徴とする、請求項２４若しくは２５記載のK.ラクティス株、又は請求項２６若しくは２７記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
（発明の分野）
本発明は、１以上の異種タンパク質を高度に効率良く発現させるために適しており、病原体に対する防御的免疫応答の発生のためのワクチンとしての使用に適した、組換えクルイベロマイセス・ラクティス(K.ラクティス)酵母に関する。本発明は特に、K.ラクティス株の酵母ゲノム内へ、異種抗原をコードする核酸の標的クローニングをするための該ラクティス株であって、KlLAC4遺伝子座の代わりに又は追加して、KlURA3-20遺伝子座(KLLA0E22771g)に、及び／若しくはKlMET5-1遺伝子座(KLLA0B03938g)に、該異種抗原のために組み込まれた発現カセットを有することを特徴とする。本発明は更に又、組み込み型発現ベクター、及び本発明のK.ラクティス株を生成するための方法、並びにワクチンとしてのその使用、に関する。
【背景技術】
【０００２】
（発明の背景）
ワクチンは、疾患の防御(予防ワクチン)又は罹患した疾患の治療(免疫治療ワクチン)のために使用される。過去100年間位、予防ワクチン接種プログラムは感染症の減少に大きく貢献してきた。ただ、例えばウイルス、細菌又は寄生虫による持続感染又は発がん性疾患に対する免疫治療ワクチンはまだ、約20年間しか開発・使用されていない。ワクチン接種の目標は、細胞性(即ち、本質的にＴ細胞及びNK細胞が仲介する)免疫応答の誘発、及び／又は体液性(即ち、本質的にB細胞／抗体が仲介する)免疫応答の誘発、並びに病原体若しくは悪性(腫瘍形成性)細胞の抗原性成分に対する免疫学的記憶の誘発である。
【０００３】
古典的ワクチンは、それらの遺伝子的材料、即ち、DNA又はRNAの形の核酸を含む、弱毒化（不活化）又は死滅した形の病原体全体を含む。この古典的ワクチンを製造するためには、通常は、特別な安全対策並びに／又は、感染可能な生物及び／若しくは細胞培養物の使用が必要であり、更に、このようなワクチンは、しばしば、複雑かつコールドチェーンの使用を伴う、貯蔵及び輸送が必要となる。更にその上、古典的ワクチンの使用は、製造プロセスから(例えば、試験動物から、若しくは細胞培養体から)の物質が、ワクチン接種された個体に悪影響を引き起こす危険性、又は、望ましくなく再活性化された病原体の危険性を伴う。診断面でも同様に問題が存在する。たとえば、有用な動物へ完全病原体をワクチン接種する場合、ワクチン接種された動物は自然感染した動物と区別できず、これは、新たな感染検出に基づく早期警報システムが役に立たないことを意味する。そのため、病原体の特定成分のみでワクチン接種する、いわゆる「サブユニットワクチン」が開発された。その使用のための必須条件は、問題の病原体の「主要な抗原」が既知であることである。主要抗原は、通常、免疫系によって認識できる病原体の表面構成要素、たとえば、ウイルスの殻タンパク質又はウイルスのキャプシドタンパク質である。前記主要抗原はまた、完全なウイルス粒子が存在しない場合でも、宿主内でウイルスに対して、体液性及び／又は細胞性免疫応答、並びに免疫学的記憶を誘発することができる。「サブユニットワクチン接種」では、病原体の更なる構成要素は失われているため、ワクチン接種された個体は、識別診断(ワクチン接種された動物からの感染を識別する(DIVA))により、自然感染した個体から区別でき、そのため「サブユニットマーカーワクチン」とも称される。多くのサブユニットワクチンの欠点は、しばしば複雑となる製造プロセスと、しばしば見受けられる不充分な免疫原性であり、病原体自体は（前記記載の制限を伴って）効率良く培養できるが、その主要抗原は、コストがかかり通常は非効率的な手段で遺伝子工学によって作製され、複雑な手段で精製される必要がある。従って、このようにして得られたサブユニットワクチンは、貯蔵寿命が短く、しばしば冷蔵状態で保管及び輸送されなければならない生物学的材料である。これらの理由により、有用な動物用の大部分の量産ワクチンは、依然として完全な病原体を使用する古典的な原理に基づいている。
【０００４】
例えば、広く蔓延している家禽疾患、伝染性ファブリキウス嚢病(IBD)は、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)により引き起こされ、それはビルナウイルス科に属する二本鎖のセグメント化されたRNAゲノムを持つ非エンベロープ型ウイルスである。IBDに対するほとんどのワクチンは、弱毒化（弱体化）又は不活化されたウイルスをベースにしている。しかし、ここで発生する問題は、高度に弱毒化されている非不活化「生ウイルス」及び不活化ウイルスも又、平均病原性を有するIBDウイルスに対する防御を可能とするが、これは、高度に強毒性のIBDウイルス株(vvIBDV)には当てはまらないことである。最近まで、非常に強毒性の、複数の弱毒化ウイルス(intermediate hot株)が、vvIBDVに対して防御的だったが、これらのワクチン株は、ファブリキウス嚢、リンパ器官のB細胞への一時的な損傷による免疫抑制が発生する可能性という形で、副作用を伴う(Rautenschleinら(2005))。しかし、前記intermediate hot株ワクチンでさえ、最近発見されたvvIBDV株に対する完全な防御はできない（Negashら（2012)、Kasangaら（2007））。更に、高度に弱毒化された生ウイルスでのワクチン接種問題は、母性抗体(maternal antibody)がウイルス複製を妨げ、そのため免疫応答の誘発を妨げることである。従って、これらのワクチンでの効果的なワクチン接種は、孵化後3週間でのみ可能である(Kumarら(2000)、Rautenschleinら(2005)）。
【０００５】
例えば、インフルエンザAウイルスは、世界的に最も重要なウイルス病原体の一つである(Shortら(2015)、Silvaら(2012))。インフルエンザウイルスはオルソミクソウイルス科に属し、それらは、一本鎖のセグメント化されたRNAをゲノムとして持つエンベロープ型ウイルスである。ほとんどのRNAウイルスと同様に、インフルエンザウイルスも又、高い突然変異率に影響される。特にウイルスのRNAセグメントの再集合は、新しい遺伝的及び生物学的特性を持つウイルス子孫を生み出す(Shortら(2015))。急速な進化のために、特にインフルエンザウイルスに対するワクチン接種の場合に生じる問題は、既存のワクチンが、新たに出現したウイルス変種の場合に「追いつかない」ことである。従って、交差防御を示すワクチンと、従って異なるインフルエンザ変種に対する長期的防御をも開発する試みが、既に長期間行われてきている(Steelら(2010)、Krammer及びPalese(2013)、Kirchenbaum及びRoss(2014)、Berthoudら(2011))。
【０００６】
ウシウイルス性下痢ウイルス（BVDV）は、偶蹄類で広く蔓延している病原体である。BVDVは、フラビウイルス科のペスチウイルス属の一種である。このウイルスの一本鎖RNAゲノムも同様に、高い突然変異率に影響される。更に、妊娠動物の場合、胎児が感染し、免疫寛容のために持続的感染した(PI)動物が生まれることもある。該PI動物は、更にウイルスを拡散させ、100％ウイルス変異の場合、いわゆる粘膜疾患で死亡することもある。ここでも、異なるBVDウイルス変種に対して交差防御及び長期間防御を示すワクチンを開発する試みが、既に長い間行われてきている(Ridpath(2015))。
【０００７】
効果的なサブユニットワクチンは、これらの問題に対処又は解決できる。ほとんどの場合、サブユニットは病原体のタンパク質成分であり、それらは遺伝子工学により、様々な宿主細胞内で産生できる。腸内細菌大腸菌に加えて、細胞培体内で増殖できる哺乳類細胞又は昆虫細胞、植物細胞及び様々な真菌類は、異種タンパク質発現用宿主系として確立されている。細菌及び真菌類等の微生物システムは、大規模で特に良好な費用対効果で培養できる。
【０００８】
酵母属のサッカロミセス、ピキア及びクルイベロマイセスの酵母細胞は、異種タンパク質を発現させるために既に何十年も日常的に使用されてきた。細菌と対照的に、酵母細胞には、真核生物である利点、即ち多くの点で動物細胞に似ている利点があり、真核生物のタンパク質、即ち動物細胞内で形成され、かつ／又は機能的でなければならないタンパク質は、天然又は実質的に天然の形で、酵母内で良好な費用対効果で生産できる(Bathurst(1994)、Gellissen及びHollenberg(1997))。酵母は当初、異種タンパク質の産生にのみ使用され、発現後、タンパク質は酵母細胞から精製され、サブユニットワクチンとして使用されていた。酵母自体又は酵母の細胞画分をワクチンとして投与する試みは、最近やっと行われている。このような「酵母ベースのワクチン」は、病原体（抗原）の免疫学的に有効な成分を含み、（例えば、皮下、筋肉内又は経口／粘膜での）投与後、宿主生物内で、該抗原に対して、そして該抗原が由来している病原体に対しても、特異的な免疫応答を引き起こすことのできる酵母粒子である。求められるのは、ワクチン接種された生物内での、免疫学的「記憶」の誘発であり、それは、次の感染（「チャレンジ」）の際に、対応する病原体の増加及び／若しくは拡散を防止し、かつ／又は感染の病理学的影響を減らすことである。既に上記で記載したように、抗原は通常、病原体の構造タンパク質であり、それをコードする核酸配列(抗原をコードする遺伝子)は、遺伝子技術方法を使用して酵母細胞に導入され、１以上のこれら構造タンパク質の発現を可能とする。このようにして作製された、生きている形態(酵母細胞)、死んで乾燥後（酵母粒子）若しくは細胞破壊後の粉末形態、及びホモジェナイズ後の形態(酵母ライセート)の組換え型酵母が、酵母ベースのワクチンである。このワクチンの投与後、抗原は免疫系によって認識され、体液性及び／又は細胞性免疫防御を起こす。
【０００９】
酵母ベースのワクチン接種は、先行技術により当業者に公知である。ある範囲の米国特許出願並びに特許、例えば米国特許出願公開第20090304741A1号、米国特許第5830463A号、米国特許第7465454B2号及び米国特許出願公開第20070166323A1号には、免疫治療において、少なくとも一の組換え抗原を含むサッカロマイセス・セレビシエ(S.cerevisiae)株の使用が記載されている。これらの酵母は、免疫反応、特に細胞仲介型免疫反応を刺激するために有効であると示された。
【００１０】
国際公開番号第2006044923号には、C型肝炎ウイルス(HCV)の様々なタンパク質を遺伝子組換え的に発現し、該HCVタンパク質に対する免疫反応、特にＴ細胞応答を引き起こすことができる酵母(S.cerevisiae)が開示されており、それは、慢性C型肝炎に対するワクチンとして使用されることが意図されている。
【００１１】
国際公開番号第2007092792号には、インフルエンザウイルス感染に対する組換え型S.cerevisiae酵母の可能な使用が記載されており、その使用には様々な酵母株の組み合わせの使用が含まれ、その投与はT細胞の誘発、すなわち細胞性免疫応答をもたらす。
【００１２】
国際公開番号第20101054649号及び国際公開番号第2013107436号には、死滅酵母細胞全体を経口／粘膜又は皮下投与した後に、防御的体液性免疫応答を発生させるために特定された抗原を含む、種クルイベロマイセス・ラクティス株の使用が記載されている。最後に挙げた複数の特許には、出発株VAK367-D4に由来する組換えK.ラクティス株が、ワクチン接種に有効に使用された適用例が含まれている。
【００１３】
ワクチン接種のために組換えクルイベロマイセス・ラクティス酵母を使用する可能性は、先行技術により当業者に公知である(Arnoldら(2012)、国際公開番号第20101054649号及び国際公開番号第2013107436号)。適用例では、LAC4プロモーターによって制御される発現カセットを介して、細胞内で、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス(IBDV)のVP2キャプシドタンパク質を発現する、酵母K.ラクティスの皮下投与が、体液性免疫応答を引き起こし、ウイルス感染に対して効果的な防御を与えることを、示すことができた。平均的病原性のIBDウイルスに対してこれを示すことは可能だったが、高度に強毒性のIBDV（vvIBDV）に対してこれを示すことは、今まで不可能だった。以前のデータでは、ウイルス抗原の細胞内濃度を上げることにより、酵母ワクチンの有効性を高めることが示されている(Arnoldら(2012))。抗原濃度の上昇を達成するための技術的改変は、転写アクチベーター遺伝子KlGAL4-1(別名LAC9-1)の追加コピーを、IBDV-VP2発現株(寄託株DSM25406及びDSM25407)へ、pLI-1プラスミドの組み込みによって導入することにある(Krijgerら(2012)及び国際公開番号第2013107436号)。従って、今までこのようなK.ラクティスワクチン株の生成は、２つの遺伝子介入に基づいていた。第一に、抗原をコードする異種遺伝子の組み込みに基づき、第二に、KlGAL4-1遺伝子の組み込みに基づくものである。しかし、今までの実施の形では、後者は常にプラスミドのタンデムリピートの組み込みを生じ、その結果、アクチベーターの強い過剰発現による細胞毒性効果だけでなく(Breunig 1989)、この方法で生成されるワクチン株中のKlGAL4-1及びScURA3遺伝子のコピー数の変動も引き起こす。
【００１４】
非改変LAC4プロモーターを介して異種遺伝子の発現を達成する戦略は、前記適用例に記載の通り(Arnoldら(2012)、国際公開番号第20101054649号及び国際公開番号第2013107436号)、異種遺伝子の最小発現が、非誘導条件、即ち、プロモーターはある程度オープンである状態、の下ですら発生するという二次的効果を有する。KlGAL4-1遺伝子投与量が増加すると、この効果は再度、更に顕著になる。従って、異種発現において、酵母細胞に対して細胞変性効果(CPE)を有するタンパク質の場合は、培養中、例えば流加培養発酵プロセス中、での生物量形成は、厳しく制限される可能性がある。特にこれらの場合は、非誘導条件下での遺伝子発現を最小限に抑える別の方法を見つける必要がある。
【００１５】
様々なサブユニットワクチンは、病原体のサブユニットが、1個ではなく複数でワクチン接種に使用される場合にのみ、有効で効果的である。更に、ワクチン接種で複数の抗原サブユニットを使用すると、病原体の異なる変種に対する交差防御性が、非常に上昇する。同一又は異なる抗原の共発現は又、酵母細胞中の抗原濃度を再上昇させる、又は異なる病原体に対して防御するワクチンを生産する、ために使用できる。
【００１６】
前記株は、一般的に栄養要求性株であり、完全培地ではしばしば原栄養性株よりも増殖性に劣る。従って、栄養要求性酵母株を原栄養性形へ、迅速で実行可能に変換すると、増殖特性を改良することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１７】
（本発明の記載）
以上より、本発明の目的は、先行技術の欠点を克服することができる新規なK.ラクティスワクチン株を提供することである。特に、提供されるのは、ゲノム内の特定の部位に組み込まれた、限定されたコピー数のKIGAL4-1遺伝子を含む、組換えK.ラクティス株である。更に、提供されるのは、非誘導条件下では異種タンパク質をわずかに又は全く発現しないことを可能とし、酵母内で、抗原の複数のコピーの発現又は複数の抗原の発現を可能とし、より培養に適しており、病原体に対する予防ワクチン接種のために、より有効に使用できる株である。同時に、免疫調節的に活性なタンパク質(抗原)をコードする異種遺伝子は、K.ラクティスゲノムの特定の部位へ組み込まれる必要がある。異種遺伝子の組み込みを有する探索対象のクローンを選択する場合、耐性遺伝子を選択マーカーとして使用するべきではない。更に、原栄養性株は、栄養要求性株から、最も単純かつ可能な方法で作り出されるべきである。これは又、（栄養）補充されていない合成培地で作製された、酵母ワクチン株の単純化された発酵を可能にするだろう。
【課題を解決するための手段】
【００１８】
前記目的は、新規なベクター及び、新規に、遺伝子的に改変された酵母K.ラクティスの変種を含み、タンパク質抗原の特異性に最適化したワクチン株の生成を可能とする、モジュラーシステムを提供することで達成された。ベクター間でのDNA要素の構成ブロック型交換によって、効率良く、通常の、異種抗原をコードする領域の酵母ゲノムへのクローニングが、発現されるべき異種遺伝子とは別に、達成された。標的とする、関連する異種遺伝子のゲノム組み込みの結果、酵母株は非常に多くの世代にわたり安定しており、遺伝子的にそのままの状態で明確であった。これらの特性のおかげで、発酵プロセスは非選択的条件下で再現性良く進行し、規格化可能である。本発明によるK.ラクティス酵母の最適化は、タンパク質産生速度を、可能な限り高く、かつ抗原の細胞変性効果が効率良い発酵プロセスを酷く妨害するしきい値よりも下であるように、制御することにある。これは、一の遺伝子操作、又は複数の遺伝子操作の組み合わせ、即ち、
(i)ラクトース誘導可能な転写アクチベーター濃度の増加、
(ii)LAC4プロモーターの標的とする改変、及び／又は
(iii)抗原をコードする異種遺伝子の遺伝子投与量の段階的な上昇、
によって達成された。
【００１９】
更に又、本発明のK.ラクティス酵母の最適化は、
(iv)複数の抗原を同時に発現させるため、酵母ゲノム中の異種遺伝子エンコーディングカセットのための、複数の、新規な組み込み部位を確立すること、
からなる。
【００２０】
好ましい実施態様では、本発明の目的は、K.ラクティス株の酵母ゲノム内へ、異種遺伝子エンコーディング核酸の標的クローニングをするための該ラクティス株であって、KlLAC4遺伝子座の代わりに又は追加して、KlURA3-20遺伝子座(KLLA0E22771g)に、及び／若しくはKlMET5-1遺伝子座(KLLA0B03938g)に、該異種抗原のために組み込まれた発現カセットを有することを特徴とする、前記K.ラクティス株を提供することにより達成された。特別に好ましい場合は、該K.ラクティス株が、KlLAC4遺伝子座に加えて、KlURA3-20遺伝子座(KLLA0E22771g)に、及び／又はKlMET5-1遺伝子座(KLLA0B03938g)に組み込まれた、該異種抗原のための発現カセットを有する場合である。特に非常に好ましい場合は、該K.ラクティス株が、KlLAC4遺伝子座に加えて、KlURA3-20遺伝子座(KLLA0E22771g)及びKlMET5-1遺伝子座(KLLA0B03938g)に組み込まれた、該異種抗原のための発現カセットを有する場合である。このように改変されたK.ラクティス株は、異種遺伝子を発現するための遺伝子が、K.ラクティスゲノム内の、特別で、特定された遺伝子座に組み込まれ、かつ、異種遺伝子のコピー数は制御可能な利点を有する。更に又、該K.ラクティス株は、K.ラクティスゲノム内の特定された遺伝子座に、異なる複数の異種抗原の発現のための、異なる遺伝子の組み込みを可能とする。
【００２１】
本発明の文脈における「異種抗原」又は「異種タンパク質」は、ヒト又は動物内で、病原体又は発がん的変性細胞に対する免疫応答、好ましくは防御的免疫応答を発生させるのに適した全てのペプチド、ポリペプチド及びタンパク質を意味する。異種タンパク質は、あらゆる種類の病原体又は腫瘍から由来してもよく、それらのために、単独で、防御的免疫応答、好ましくは防御的免疫応答を誘発できる抗原が、特徴づけられた。
【００２２】
好ましい実施態様では、異種タンパク質は、病原体(ウイルス、細菌、寄生虫)から由来しており、それらのために、単独で、防御的免疫応答、好ましくは防御的体液性免疫応答を誘発できる抗原が、特徴づけられた。
【００２３】
例えば、それらは下記に例示される。
（寄生虫由来の異種タンパク質）
アメリカ鉤虫；十二指腸鉤虫（ズビニ鉤虫）:ASPタンパク質、ヘモグロビン分解プロテアーゼ、
リーシュマニア属：gp63、46kD前鞭毛抗原、LACK、
プラスモジウム属（マラリア原虫）：CSPタンパク質、CSA-1、CSA-3、EXP1、SSP2、STARP、SALSA、MSP1、MSP2、MSP3、AMA-1、GLURP、Pfs25、Pfs28、Pvs25、Pvs28、Pfs48/45、Pfs230、
シストソーマ属（住血吸虫）：TP1、Sm23、ShGSTs26及び28、パラミオシン、寄生虫ミオシン、Sm14。
【００２４】
（細菌由来の異種タンパク質）
結核菌：Ag85A、Hsp65、R8307、19kD、45kD、10.4、
ヘリオバクターピロリ菌（Heliobacter pylori）：VacA、LagA、NAP、hsp、ウレアーゼ、カタラーゼ、
A群レンサ球菌：M、SCPAペプチダーゼ、外毒素SPEA及びSPEC、フィブロネクチン結合タンパク質、
レンサ球菌肺炎：PspA、PsaA、BHV3、BHV4、
ネズミチフス菌：Vi抗原、
赤痢菌：LPS、
コレラ菌：CTB、
大腸菌ETEC：LT、LT-ST、CTB、
ペスト菌：F1、V。
【００２５】
（腫瘍細胞／腫瘍(腫瘍関連抗原、TAA)由来の異種タンパク質）
CEA、
5T4、
MUC1、
MART1、
HER-2。
【００２６】
（ウイルス由来の異種タンパク質は、特に好ましい。）
カリシウイルス科(Norwalk、HEV)：NV 60kD；HEV ORF2、
レオウイルス科(Rota)：VP7、VP4、
レトロウイルス科(HIV)：Gag、Pol、Nef、Env、gp160、gp120、gp140、gp41、
フラビウイルス科(フラビウイルス属：WNV、Dengue、YF、TBE、JEV)：preM-Env、NS3、NS4、NS5、
フラビウイルス科(ペスチウイルス属BVDV、CSFV、BDV；ヘパシウイルス属HCV)：E1、E2、ERNS(ペスチ)、C、NS3、NS4、NS5、
ヘパドナウイルス科(HBV)：HBS抗原、
パラミクソウイルス科(パラミクソウイルス亜科：PIV-1、PIV-2、流行性耳下腺炎、センダイ、PIV-2、PIV-4、モルビリ)：M、HN、N、F、
パラミクソウイルス科(ニューモウイルス亜科：RSV)：F、G、SH、M、
ラブドウイルス科(狂犬病)：G、
ヘルペスウイルス科(EBV、HSV2)：gp350/220(EBV)、gB2、gD2(HSV)、
コロナウイルス科(SARS)：CoV、N、M、S、
オルソミクソウイルス科(インフルエンザA、B)：HA、NA、M1、M2、NP、
パピローマウイルス科：L2、E6、E7。
【００２７】
本発明の実施態様では更に、改変されたK.ラクティス株は、前記発現カセットが、K.ラクティスLAC4-12プロモーター(PLAC4-12)又は該プロモーターの変種、発現するべき抗原のORF、及びAgTEF1ターミネーターを有する、ことで特徴付けられた。前記実施態様は、PLAC4-12プロモーター制御の下での異種遺伝子の発現は、LAC4及び／又はKlURA3及び／又はKlMET5遺伝子座へ組み込まれた後に、ラクトースによりほとんど同程度に強力に誘導されるという利点を有する。
【００２８】
前記のように、ワクチン株内の抗原濃度と、標的生物内での酵母ワクチンの免疫原性効果の間には、正の相関関係がある。例えば追加的なKlGAL4遺伝子の組み込みのため起こる、過度に強力な過剰発現の場合のCPEを防ぐために、前記ベクターシステムを代替的に改変して、迅速に効率良く、複数の遺伝子コピーを連続して連結し、この発現カセットを３個の遺伝子座中の１つへ、一段階で導入することができる(実施例5及び図7A参照)。
【００２９】
従って、本発明の更に有利な成果として、改変されたK.ラクティス株は、KlLAC4遺伝子座、若しくはKlURA3-20遺伝子座、若しくはKlMET5-1遺伝子座に、異種抗原をコードする核酸配列の複数のコピーを含み、そのコピーは、タンデム発現カセット又はマルチ発現カセットを介して、挿入されている。該発現カセットは、それぞれLAC4-12プロモーター(PLAC4-12)又は該プロモーターの変種及びAgTEF1ターミネーターに隣接している、抗原をコードする領域(遺伝子)の複数のコピーを含む。この方法で行われる抗原の遺伝子コピーの複製は、それぞれの遺伝子座の一つにより、それらの発現を著しく上昇させることが可能となる。
【００３０】
本発明の好ましい実施態様では、異種抗原IBDV-VP2の遺伝子は、タンデム発現カセットの形で、K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4に存在する。該K.ラクティス株は、異種抗原IBDV-VP2をコードする遺伝子のシングルコピーを有する株と比較して、異種抗原IBDV-VP2が増加した量で発現される利点を有する。本発明のこの実施態様によると特に好ましいのは、異種抗原IBDV-VP2の遺伝子をタンデム発現カセットの形で、遺伝子座KlLAC4に有する株VAK1118(DSM32701)である。
【００３１】
更により好ましいのは、異なる異種抗原をコードする核酸の１以上のコピーが、本発明のK.ラクティス株のKlLAC4遺伝子座、及び／若しくは、KlURA3-20遺伝子座、及び／若しくは、KlMET5-1遺伝子座に、シングル発現カセット、タンデム発現カセット又はマルチ発現カセットを介して、挿入されている場合である。その結果、その酵母細胞内では、第一に、異なる異種抗原を発現することが可能であり、第二に前記異なる異種抗原を異なる濃度で発現させることが可能である。この実施態様で特に好ましくは、異種抗原インフルエンザA HA(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))及びインフルエンザA M1(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))をコードする核酸配列が、該K.ラクティス株のKlLAC4及びKlURA3-20遺伝子座に挿入されて、発現するK.ラクティス株である。本発明のこの特に好ましい実施態様は、異種抗原インフルエンザA HA(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))及びインフルエンザA M1(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))をコードする核酸配列が、K.ラクティス株のKlLAC4及びKlURA3-20遺伝子座に挿入されている株VAK1283(DSM32697)である。
【００３２】
前記の通り、KlGAL4遺伝子投与量の増加は、抗原産生を増加できることは公知である(Krijgerら2012、及び国際公開番号第2013107436号)。KlGAL4を発現するpLI-1プラスミドを二段階プロセスで組み込むことで、これを達成することの欠点は、上記に記載した。該欠点は、本発明により、KlGAL4遺伝子の第２コピーを含む異種遺伝子を組み込むための、安定した出発株を提供することにより克服された。全ての派生株が同じ遺伝子的背景を持ち、かつ、厳密にただ1個の追加的KlGAL4遺伝子コピーが該株内に存在することは確実である。これは、複数のコピーの発現の場合に観察された細胞毒性を減少させ、ワクチン株生産のための複数の段階を１段階だけに減少させる。更に、プラスミドの可逆的な組み込み／切り出しが省略されるため、遺伝子安定性が向上する。このような株は、例えば、実施例１記載のように作製できる。
【００３３】
従って、本発明の更に有利な実施態様として提供されるのは、K.ラクティス株は、前記ゲノム本来のKIGAL4遺伝子に加えて、追加で該KIGAL4遺伝子の第二の異所性コピーを含むK.ラクティス株である。該株内では、KIGAL4転写アクチベーターの発現を最大で2倍上昇させることができ、KlLAC4遺伝子座、及び／又は、KlURA3-20遺伝子座、及び／又は、KlMET5-1遺伝子座へ挿入された異種遺伝子の発現を、LAC4-12プロモーター又は該プロモーターの下記変種によって、特定された方法で上昇させることができる。従来の実施では、KlGAL4をコードするプラスミドが、細胞内へ一過的に、かつ複数の制御されていないコピー数で導入された。その結果、異種抗原はしばしば高濃度で発現し、細胞毒性効果をもたらした。本発明のこの実施態様のK.ラクティス株の場合、細胞毒性効果は、高度の効率性で低減又は回避することができる。更に、同じ目的（LAC4制御発現カセットの挿入）のために将来開発されるであろう遺伝子座も又、この方法で制御することができる。前記KIGAL4遺伝子の異所性コピーは、KIGAL4プロモーター及びKIGAL4ターミネーターに隣接し、該K.ラクティス株内の遺伝子座KLLA0E13795g(Klavt3::KlGAL4-1、配列番号:1)で組み込まれる場合に、有利なことがわかった。本発明のこの実施態様で特に好ましくは、これらの特性を有する株VAK1111(DSM32696)である。
【００３４】
更に好ましい実施態様では、本発明は、前記異種抗原IBDV VP2をコードする核酸配列が、遺伝子座KlLAC4に存在するK.ラクティス株を提供する。本発明のこの実施態様によると特に好ましくは、株VAK1171(DSM32699)である。前記株は、追加で、該KIGAL4遺伝子の第二の異所性コピーを含み、そこにも異種抗原IBDV VP2をコードする核酸配列が同様に存在する。この株は、KIGAL4遺伝子の追加的な異所性コピーなしの株と比べて異種抗原IBDV-VP2の上昇した発現を示す。
【００３５】
微生物内での異種タンパク質産生は、それが細胞変性効果（CPE）を導く場合に問題となる。そこで本発明は、抗原産生フェースを生物量蓄積フェースから分離する方法を提供する。誘導可能なLAC4プロモーターのおかげで、これは、例えば流加培養発酵プロセスによって部分的に可能であるが、プロモーターPLAC4-12は非誘導条件下で完全に不活化(close down)されない(即ち、ある程度オープンである)ために、この方法も阻害されてしまう。非常に強力なCPEを持つ抗原の場合、その結果起きるのは、増殖率の低下と細胞ストレス応答の誘発であり、抗原産生に不利な影響を及ぼす。この問題は、KlGAL4遺伝子投与量の２倍化及び／又は抗原をコードする配列数の増加により悪化する(下記参照)。
【００３６】
従って、本発明のK.ラクティス株の更に有利な発展は、非誘導条件下では異種タンパク質をわずかに又は全く発現しない、LAC4-12プロモーターを改変したプロモーター構造を有するK.ラクティス株、にある。LAC4-12プロモーターの改変された構造は、特に、1065位及び1540位の間のプロモーターPLAC4-12の基本制御領域(BCR)(LR2欠損；PLAC4-12-LR2’；配列番号:2)は欠損していることを特徴とする(同様に、実施例2参照)。既に前記の通り、本発明のこの実施態様は、従来の実施と比べて、異種遺伝子の過剰に強い発現により、従来、引き起こされていた細胞毒性効果は、高度に効率よく減少されて回避できる利点を有する。この実施態様で好ましくは、前記異種抗原インフルエンザA HA(A/プエルトリコ/8/1934(H1N1))をコードする核酸配列が、遺伝子座KlLAC4に存在するK.ラクティス株である。本発明のこの実施態様によると特に好ましくは、株VAK1243(DSM32702)である。前記株は、LAC4-12プロモーター中にLR2欠損を含む。
【００３７】
前記K.ラクティス株は又、異種タンパク質発現の調節を可能にする、前記LAC4-12プロモーターを改変したプロモーター構造を有し、該プロモーターのアクチベーターKlGal4(「上流活性化配列」1、2及び4、5)のための結合部位数が変動し、1、2、3又は4個のKlGal4結合部位が存在してもよい。このように、１の酵母細胞内で異なる濃度で(設計による品質保証)異なる複数の異種タンパク質を発現することが可能である。短縮されたプロモーター変種は、中でもとりわけ、例えば高度に免疫原性のウイルス様粒子(VLPs)を形成するための、例えば同一株内で最適な化学量論比で複数のタンパク質を発現するための、システムのモジュール化にとって重要である。好ましい本発明のこの実施態様は、前記異種抗原IBDV VP2をコードする核酸配列が、前記K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4へ挿入されている場合である。本発明のこの実施態様によると特に好ましくは、株VAK1131(DSM32700)である。前記株は、LAC4-12プロモーター内に、LR2欠損及び上流活性化配列4及び5の欠損を含む。
【００３８】
本発明の目的の一部は、より培養に適するK.ラクティス株を提供することであった。本発明のK.ラクティス株内で対立遺伝子Kllac4、Klura3-20及びKlmet5-1の遺伝子機能が回復されることにより、この課題は解決された。得られるKラクティス株は原栄養性である。(実施例6、図8)。従って、ワクチン株の発酵が単純化され、生産プロセスの確立が促進され、より費用効率が高くなる。本発明のこの実施態様によると好ましくは、前記異種抗原のBVDV E2外部ドメイン(1型、CP7)、BVDV E2外部ドメイン(2型、ニューヨーク93)及びBVDV Npro-NS3(1型、CP7)をコードする核酸配列が、K.ラクティス株の遺伝子座KlLAC4、KlURA3-20、及びKlMet5-1に挿入されているK.ラクティス株である。本発明のこの実施態様によると特に好ましくは、株VAK1400(DSM32698)である。前記株は、原栄養性である。
【００３９】
特に好ましい実施態様では、本発明は下記株から選択されたK.ラクティス株を提供する。
VAK952(受託番号:DSM32705)、
VAK1111(受託番号:DSM32696)、
VAK1118(受託番号:DSM32701)、
VAK1131(受託番号:DSM32700)、
VAK1171(受託番号:DSM32699)、
VAK1243(受託番号:DSM32702)、
VAK1283(受託番号:DSM32697)、
VAK1395(受託番号:DSM32706)、
VAK1400(受託番号:DSM32698)。
【００４０】
前記株は、ブダペスト条約に従い2017年11月24日に、又は2017年12月1日に(DSM32705、DSM32706)、Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH（ドイツ微生物・培養細胞コレクション機関、DSMZ、Inhoffenstrasse 7B、38124 Braunschweig、ドイツ）へ、前記番号で寄託された。
【００４１】
更なる態様では、本発明は、組み込み型発現ベクターを提供し、本発明のK.ラクティス株はこのベクターのおかげで産生可能となる。
【００４２】
好ましい実施態様では、本発明は、組み込み型発現ベクターKIpURA3(配列番号:3)及びKIpMET5(配列番号:4)を提供する。これらのベクターは、(前記記載のとおりK.ラクティス株用)LAC4-12プロモーター(PLAC4-12)又は該プロモーターの変種を含み、それは、発現されるべき抗原のORF、更にAgTEF1ターミネーター配列並びに同様に、組み込み後にKlura3-20及びKlmet5-1対立遺伝子の、標的とする機能回復を可能とする標的配列を有する。抗原をコードする配列は、特定された制限部位において、発現カセットのプロモーター配列及びターミネーター配列の間でクローニングされる。前記ベクターにより、異種遺伝子発現カセットは、マーカー無しかつ抗生物質耐性を利用せずに、安定してK.ラクティスゲノム内に組み込まれる。従って、このベクターシステムの強みは、複数の異種遺伝子が異なるベクター間で容易に交換可能であることと、発現カセットのプロモーター及びターミネーターが、他のものと交換可能であることにある。発現カセットは、PLAC4-12プロモーター及びAgTEF1ターミネーター、並びにそれらの間の異種遺伝子からなる。異種遺伝子は、制限部位AscI及びNotIで交換可能である。PLAC4-12プロモーターは、前記両方のベクター内の制限部位SmaI及びAscIで交換可能であり、ターミネーターは、KIpURA3内のNotI及びBoxI(又はMluI)で、並びにKIpMET5内のNotI及びEcl136II(又はSacI)で交換可能である。別の発現カセットはKIpURA3内の制限部位SmaI及びBoxI(又はMluI)間、並びにKIpMET5内のSmaI及びEcl136II(又はSacI)間でクローニングされる。所定の制限酵素を使用して、発現カセットは又、KIpMET5及びKIpURA3ベクターの間で交換されるか、又は追加的な発現カセットが導入される。KIp3及びKIp3-MCSベクター(国際公開番号第20101054649号)に対する改良点は、選択が非誘導条件(ラクトース無し)で行われ、それによりCPEを伴うタンパク質の場合でも高い形質転換率がもたらされ、低い異種遺伝子発現でも形質転換体が多くなる可能性を抑制する。実施例3.1及び3.2も参照。
【００４３】
本発明の特に好ましい実施態様では、KIpMET5-PLAC4-12-Et、KIpMET5-PLAC4-12-LR2-Et、KIpMET5-PLAC4-Et、KIpMET5-PLAC4-LR2から、並びにKIpURA3-PLAC4-12-Et、KIpURA3-PLAC4-12-LR2-Et、KIpURA3-PLAC4-Et及びKIpURA3-PLAC4-LR2から(配列番号:5、6、7又は8と組み合わされた配列番号No.3、4)選択される組み込み型発現ベクターが提供される。
【００４４】
ベクターKIpURA3-PLAC4-12-Et、KIpURA3-PLAC4-12-LR2-Et、KIpURA3-PLAC4-Et及びKIpURA3-PLAC4-LR2は、ベクターKIpURA3-Etの変種であり、それぞれのケースで、Etx.B-HAタンパク質をコードする核酸配列が挿入される。ベクターKIpURA3-PLAC4-12-Et、KIpURA3-PLAC4-12-LR2-Et、KIpURA3-PLAC4-Et及びKIpURA3-PLAC4-LR2は、ベクターKIpURA3-Etと比べるとプロモーターが異なる。
【００４５】
ベクターKIpMET5-PLAC4-12-Et、KIpMET5-PLAC4-12-LR2-Et、KIpMET5-PLAC4-Et、KIpMET5-PLAC4-LR2は、ベクターKIpMET5の変種であり、それぞれのケースで、Etx.B-HAタンパク質をコードする核酸配列が挿入される。ベクターKIpMET5-PLAC4-12-Et、KIpMET5-PLAC4-12-LR2-Et、KIpMET5-PLAC4-Et、KIpMET5-PLAC4-LR2は、ベクターKIpMET5と比べるとプロモーターが異なる。
【００４６】
更なる態様では、本発明は、本発明のK.ラクティス株を作製する方法であって、下記ステップ:
(i)目的とする抗原をコードする核酸配列をKIpURA3ベクター又はKIpMET5ベクター内に挿入するステップ、
(ii)K.ラクティス培養体を、改変され、かつ予め酵素的に消化されたベクター構築物で形質転換するステップ、
(iii)ウラシル及び／又はメチオニンを含まない固形培地を利用して、形質転換したK.ラクティス細胞を選択するステップ、並びに
(iv)任意で原栄養性を回復するステップ、
を含む、前記方法を提供する。
【００４７】
本発明の方法の一の実施態様では、複数の抗原の遺伝子配列が、異所的に同時に挿入され、かつ制御されて発現することが可能である。１の病原体の異なる変種の抗原をコードする異なる遺伝子配列が異所的に挿入され、制御されて発現する場合が好ましい。更に又、異なる複数の病原体の抗原をコードする異なる遺伝子配列が、異所的に挿入され、かつ制御されて発現する場合が好ましい。
【００４８】
更なる態様では、本発明は、腸管外、経腸、筋肉内、粘膜または経口投与用の、本発明のK.ラクティス株を含む医薬組成物又は獣医薬組成物を提供し、その組成物は任意で、慣用のビヒクル及び／又は賦形剤と組み合わせてもよい。特に、本発明は、ワクチン接種に適した医薬組成物または獣医用医薬組成物を提供する。
【００４９】
好ましくは、医薬組成物または獣医用医薬組成物は、少なくとも１の生理学的に適合可能なビヒクル、希釈剤、アジュバント及び／又は賦形剤を含む。本発明のK.ラクティス株は、注射用の医薬組成物として、医薬適合性ビヒクル中、例えば、生理食塩水媒体又は緩衝液などの従来の媒体中に含まれてもよい。そのような媒体はまた、例えば、浸透圧を設定するための医薬適合塩、緩衝液、防腐剤などの、従来の医薬物質を含むことができる。好ましい媒体には、生理食塩水およびヒト血清が含まれる。特に好ましい媒体は、PBS緩衝食塩水である。
【００５０】
更に適切な医薬適合性のあるビヒクルは、例えば、Remington's Practice of Pharmacy、第13版及びJ. of Pharmaceutical Science & Technology, Vol.52, No.5, Sept-Oct, pages 238-311により当業者に公知である。
【００５１】
更に本発明の態様では、本発明の組換えK.ラクティス酵母を、例えば、防御的免疫化、特に病原体を対象とする防御的免疫化を発生させるため等の、ワクチン接種のための使用を提供する。
【００５２】
防御的免疫化の発生に関係する方法は、例えば、下記ステップを含む:
a)  本発明の組換え型酵母を培養及び増殖するステップ、
b)  酵母を収穫し不活化するステップ、
c)  特定の免疫化スキームに従い組換え型酵母を投与するステップ、
d)  形成された抗体の力価を決定するステップ、及び／又は
e)  免疫化を検出するステップ。
【００５３】
本発明の組換え型酵母の培養及び増殖は、任意の従来利用可能な方法を使用して達成することができる。特に好ましくは、費用対効果の高い方法で高い細胞収量をもたらす方法である。これらには、発酵法、特に高細胞密度発酵法が含まれる。流加培養発酵プロトコルを使用して発酵を実施することは、特に有利であると判明した。
【００５４】
好ましい実施態様では、防御的（予防）免疫化は、組換え型酵母が、経口で／粘膜から、筋肉内又は皮下から投与されて達成される。
【００５５】
組換え型酵母細胞は、本発明の方法では不活化された／死滅した状態で使用されるべきである。この目的のために、酵母は培養及び異種遺伝子の発現後に乾燥され、次に不活化される。不活化は、従来利用可能な任意の方法を使用して行える。本発明の方法で使用するのに特に適切なのは、熱不活化(例えば、90℃で2時間の熱不活化)又はγ線照射(例えば、25kGy又は50kGy)である。
【００５６】
本発明は、又、本発明のK.ラクティス株を、対象へ、例えば動物又はヒト、好ましくは動物へ、該対象内で１以上の異種抗原に対する免疫応答、好ましくは防御的免疫応答を引き起こすために充分な量で投与することを含むワクチン接種方法を提供する。
【００５７】
本発明のK.ラクティス株を使用する特別な利点は、１の病原体に対する防御的免疫応答を、１回適用／免疫化（「単回接種」）後、又は２回適用／免疫化（「プライムブースト」）後に、単独で、引き起こすことである。本発明のK.ラクティス株を使用する更なる利点として発見されたことは、１の病原体の異なる複数の変種に対する交差防御的免疫応答を、１回使用／免疫化（「単回接種」）後、又は２回適用／免疫化（「プライムブースト」）後に、引き起こせることである。本発明のK.ラクティス株が異なる複数の病原体の抗原に対する異なる異種遺伝子を保持して発現する場合でも、防御的免疫応答を、１回適用／免疫化（「単回接種」）又は２回適用／免疫化（「プライムブースト」）で引き起こすことすら可能である。
【発明の効果】
【００５８】
（本発明の長所の概略）
K.ラクティスプラットフォーム内の前記改良は、数多くの利点を生じた。
a)  酵母ベースでの「サブユニットワクチン」菌株の構築において、優れた単純化（即時使用可能なツールボックス／キット）と高い再現性が可能になった。それらは今や、特定の短い時間内に生産することができる。
b)  酵母ワクチンは１以上の抗原を含有できる。それらは柔軟にカスタマイズでき、異なる量で生産できる。
c)  更に、原栄養性酵母の効率的な発酵が可能になった。
d)  組換えタンパク質産生の厳密な誘導性が可能になった。後者は、CPEを引き起こすかもしれないタンパク質において特に重要である。
e)  目的とする、異種遺伝子のゲノムの安定した組み込み、及び、前記株の関連遺伝子の安定性は、生産プロセスが再現性良く進行する利点を提供する。これは、GMP生産のために特に重要である。
f)  酵母ワクチンの防御性は、異種遺伝子コピーの増加及び／又はKlGAL4濃度の上昇の結果として達成される、組換え抗原産生の上昇により改良される。
g)  更に、投与されるワクチン用量は、異種遺伝子コピーの増加及び／又はKlGAL4濃度の上昇の結果として達成される、組換え抗原産生の上昇により、低減できる。そのため、酵母生産はより費用対効果が高くなり、ワクチン接種者へのワクチン適合性が改善される。
h)  多価酵母ワクチンは、同じ病原体の異なる複数の変種に対する、又は異なる複数の病原体に対する予防のために、交差防御的又は多価防御的な方法で使用できる。不活化、並びに適切なアジュバント及び／又は適切な液体量との混合以外は、ワクチンとして使用する酵母の、更なる後処理の必要は無い。
【図面の簡単な説明】
【００５９】
本発明は、本発明は、図面及び例示的な実施形態に基づいて、下記でより特別に説明される。
【００６０】
【図１】図１は、新たに生成した、2個のKlGAL4コピーを有するK.ラクティスバックグラウンド株の特徴を示す。特定された組み込み部位にある第二の異所的なKlGAL4コピーの存在を確認し、酵母増殖に対する組み込みの効果を分析した。A:異所的なKlGAL4コピーの組み込み部位のダイヤグラム。組み込み部位を示し、遺伝子名称も表示する。B: 酵母株のKlAVT3遺伝子座に、追加的に組み込まれた異所的なKlGAL4遺伝子を有する(VAK1110)及び、追加的な組み込みのない(VAK367)を、プライマー
【化１】
2021508496.tif 000002
を使用して、PCR増幅した断片のアガロースゲル。それぞれ予測される断片サイズを、ダイヤグラムの右側に示す。
C:グルコース(YPD)又はラクトース(YPLac)での10倍段階希釈（開始-OD1）による滴下試験。インキュベーションはそれぞれ30℃及び37℃で行った。天然遺伝子座にKlGAL4コピーを有する酵母株(VAK1139)、異所的な遺伝子座にKlGAL4コピーを有し、天然遺伝子座のKlGAL4は欠損している酵母株(VAK1110)、KlGAL4コピーを有さない酵母株(ΔKlgal4；VAK964)、又は2個のKlGAL4コピーを有する酵母株(VAK1168)の増殖を比較した。示されたのは、更なるKlGAL4遺伝子の特定された組み込みのみが、生産力がほとんどない増殖欠陥をもたらすことである。前記欠陥は、37℃で誘導条件下でのみ視認できる。より明確なのは、KlGAL4を完全に欠損した場合の増殖欠陥である。
【００６１】
【図２】図２は、IBDV-VP2を産生する、追加的な異所的KlGAL4コピーを有するK.ラクティス株タンパク質の、ウェスタンブロット分析である。追加的なKlGAL4コピーの、LAC4-12プロモーター依存性組換えタンパク質産生への効果を、ウェスタンブロット法により分析した。使用した試験株は、IBDV-VP2発現カセットを有する酵母株であり、この酵母株を他のIBDV-VP2酵母株と比較した。異所的KlGAL4コピー、及びタンデムIBDV-VP2発現カセットの存在（＋）又は不存在（−）(下記参照)を上段に示した。株VAK911内に、BstEIIを使ったプラスミドpLI-1の線状化により、異所性コピーが導入され(Krijgerら2012及び国際公開番号第2013107436号)、株VAK1130内には、異所的なKlGAL4コピーがKlAVT3遺伝子座に存在する(図1参照)。酵母株VAK367は、異種遺伝子無しの野生型コントロールとして含まれている。酵母株は、YPD内で予備培養後に、YPLacで15時間培養した。SDS-PAGEを用いて、酵母株ごとに、タンパク質抽出物をそれぞれ20μg分析した。イムノブロット法を、抗IBDVウサギ血清(1:8000)及びヤギ由来のHRP結合抗ウサギ抗体(1:10000)を使用して行った。多量体的（agg.）及び単量体的（mon.）IBDV-VP2を、右側に矢印で示し、非特異性バンドはアスタリスクで示した。示されたのは、追加的なKlGAL4遺伝子の異所的な発現は、タンデム発現カセットの存在と同様に、異種抗原濃度の強い上昇をもたらすことである（下記も又、参照）。
【００６２】
【図３】図３は、LAC4-12プロモーター内のLR2欠損が、非誘導の組換えタンパク質産生、及びグルコースでの酵母増殖に及ぼす効果を示す。非改変LAC4-12プロモーターも又、非誘導条件下でGOI(対象遺伝子(Gene of Interest))の基本的発現(basal expression)を示す。これは、細胞毒性的に作用する異種抗原の場合に、特に問題である。これら実験で試験したことは、LAC4-12プロモーターのBC領域内での欠損(LR2欠損)が、非誘導条件下では、組換えタンパク質産生を減少させるか完全に抑制できるかどうかである。A:LAC4-12プロモーター(PLAC4-12)のダイヤグラム。基本制御領域(BCR)、LR2欠損及び4個のKlGal4-結合部位(上流活性化配列:U1、U2、U4、U5)及び、異種遺伝子(GOI)をコードする核酸配列も又、示されている。B:LR2欠損有り(VAK1131)及びLR2欠損無し(VAK1130)のIBDV-VP2酵母株を、非誘導条件下(YP3%EtOH)で培養した後のウェスタンブロット法。VAK1111を、異種遺伝子無しの野生型コントロールとして使用した。酵母株ごとに、タンパク質抽出物50μgを12%SDSゲル上に担持した。イムノブロット法を、抗IBDVウサギ血清(1:5000)及びヤギ由来のHRP結合抗ウサギ抗体(1:10000)を使用して実施した。担持したコントロールKlNop1は、マウス抗Nop1抗体(1:5000)及びヤギ由来のHRP結合抗マウス抗体(1:10000)を使用して検出した。C:YPD、0.5%グルコース含有YPD及びYPLacで、10倍段階希釈（開始-OD1）による滴下試験。インキュベーションは、それぞれ30℃及び37℃で行った。LAC4遺伝子座にインフルエンザA HA異種遺伝子を有する酵母株であって、LR2欠損の有るもの(VAK1243)及び無いもの(VAK952)の増殖を比較した。酵母株VAK367を、異種遺伝子無しの野生型コントロールとして使用した。示されたのは、LR2欠損が、好ましくない基本的異種タンパク質の発現を抑制したことである。更に又示されたのは、LR2欠損が、非誘導条件下と誘導条件下の両方で、細胞毒性タンパク質(インフルエンザヘマグルチニン、HA)を発現する酵母株の増殖を改善することである。これは特に37℃で明らかである。
【００６３】
【図４】図4は、タンパク質発現カセットをK.ラクティスゲノムの異なる遺伝子座へ組み込むために使用できるKIpベクターを示す。LAC4遺伝子座(KIp3ベクターシステム)の使用は、既に記載されているが(国際公開番号第20101054649号及び国際公開番号第2013107436号)、KlURA3遺伝子座及びKlMET5遺伝子座の使用は新規である。A:ゲノム中にそれぞれ組み込み部位を有する、異なるKIpベクターのダイヤグラム。B及びC:本明細書で新たに記載されたKIpURA3(B)及びKIpMET5(C)ベクター内の発現カセット及び両隣接端。異なるDNA配列セグメント及び関連する制限部位を示す。GOI:異種遺伝子(対象遺伝子)。D:KIpベクター(A、B及びC)によって構築された、酵母株内の異種タンパク質発現のウェスタンブロット分析。ここで、異種遺伝子はEtx.B-HAである。酵母「ハウスキーピング」KlNop1タンパク質(KLLA0C04389g)を、担持コントロールとして検出した。酵母株は、YPD(+U)で予備培養後に、YPLac(+U)で4時間培養した。酵母株ごとに、タンパク質抽出物30μgを12%SDS-PAGE上に担持した。イムノブロット法を、モノクローナルマウス抗HA(1:5000)及び抗KlNop1(1:5000；サンタクルス、TX、米国)抗体及び又ヤギ由来のHRP結合抗マウス抗体(1:10000；Jackson ImmunoResearch,PA、米国)を使用して実施した。示されたのは、LAC4遺伝子座(国際公開番号第20101054649号及び国際公開番号第2013107436号)と同様に、KlURA3及びKlMET5遺伝子座の両方とも、異種遺伝子発現のために使用できることである。
【００６４】
【図５】図5は、同じ酵母株内での、異なる組換えタンパク質の産生を示す。前記酵母株(VAK1234)を、KIpURA3及びKIp3-MCSベクターを使用して構築した。タンデムIBDV VP2発現型酵母株(下記参照)のタンパク質のウェスタンブロット分析であり、酵母株には、KIpURA3ベクターを利用して、異種遺伝子としてEtx.B-HAを有する追加的な発現カセットが導入されている(VAK1234)。使用されたコントロールは、ゲノム中に、Etx.B-HAを有する発現カセットを、LAC4に有する酵母株(VAK899)、若しくはKlURA3遺伝子座に有する酵母株(VAK1235)、又はタンデムIBDV-VP2発現カセットのみをLAC4遺伝子座に有する酵母株(VAK1171)である。酵母株は、YPDで予備培養後に、YPLacで6時間培養した。酵母株ごとに、タンパク質抽出物30μgを12%SDS-PAGE上に担持した。イムノブロット法でのタンパク質の検出を、Etx.B-HA用に、マウス抗HA抗体(1:5000；サンタクルス、TX、米国)及びヤギ由来のHRP結合抗マウス抗体(1:10000)を使用し、IBDV-VP2用に、ウサギ抗IBDV抗血清(1:5000；Granzowら(1997))及びヤギ由来のHRP結合抗ウサギ抗体(1:10000；Jackson ImmunoResearch,PA、米国)を使用して実施した。示されたのは、両方の異種タンパク質が同一の酵母細胞内で発現されたことである。驚くべきことに、一の抗原の発現レベルは、別の抗原の共発現によって制限されない。これは、一価及び二価株での発現レベルの比較から明らかである(同様に図12参照)。
【００６５】
【図６】図6は、異なって誘導された、KIpベクター内の発現カセット用のLAC4-12プロモーター変種を示す。KIpベクターの発現カセットが、LAC4-12プロモーターの異なる変種と共に提供された。タンパク質合成誘発の強さに対するプロモーター変種の効果を、異種遺伝子としてEtx.B-HAを有する、対応する発現カセットを含む酵母株の分析に基づいて試験した。A:プロモーター変種、異種遺伝子としてEtx.B-HAを有する関連するKIpURA3ベクター、及びそれらから構築された酵母株の概略図。BCR:転写アクチベーターKlCat8及びKlSip4、非誘導条件下での転写アクチベーター、の結合領域、U1、U2、U4、U5:転写アクチベーターKlGal4(上流活性化配列)のための結合領域。B:KIpURA3ベクターを使用して構築された、酵母株内のLAC4-12プロモーター変種(A)の特性決定のためのウェスタンブロット分析。酵母株は、YPDで予備培養後に、YPLacで4時間培養した。酵母株ごとに、タンパク質抽出物30μgを12%SDS-PAGE上に担持した。イムノブロット法を、モノクローナルマウス抗HA(1:5000)及び抗Nop1(1:5000)抗体及び又ヤギ由来のHRP結合抗マウス抗体(1:10000)を使用して実施した。示されたのは、異種遺伝子の発現率は、使用されたプロモーターの性質に依存して変化することである。
【００６６】
【図７】図7は、タンデム発現カセットによる異種遺伝子コピー数の2倍化が、組換えタンパク質産生に及ぼす効果を示す。タンデム発現カセットによる異種遺伝子コピー数の増加が、組換えタンパク質産生(IBDV-VP2)に及ぼす効果を試験した。A:タンデム発現カセットの概略図。DNAセグメント及び関連する制限部位が示される。GOI:異種遺伝子(対象遺伝子)。B:ScURA3選択マーカーを利用したランダム組み込みのための、(A)由来のタンデム構築物が示される。C:タンデム発現カセットを有する酵母株(VAK1118)(A)内、及び一個の異種遺伝子コピーのみを含む発現カセットを有する酵母株(VAK910)内での、IBDV-VP2タンパク質産生を比較するウェスタンブロット分析。酵母株はYPDで予備培養後に、YPLacで3時間又は6時間培養した。酵母株ごとに、タンパク質抽出物60μgを12%SDS-PAGE上に担持した。イムノブロット法を、抗IBDVウサギ血清(1:10000)及びヤギ由来のHRP結合抗ウサギ抗体(1:10000)を使用して実施した。多量体的（agg.）及び単量体的（mon.）IBDV-VP2を、右側に矢印で示し、非特異性バンドはアスタリスクで示した。D:ランダムに組み込まれたタンデムIBDV-VP2発現カセットを有する酵母株(B)を、１個の発現カセットを有するKIp3-MCS構築された酵母株(VAK910)及び又それに由来し、追加的なKlGAL4-1コピー(pLI-1)を有する酵母株と比較したウェスタン分析。酵母株は、YPDで予備培養後に、YPLacで8時間培養した。イムノブロット法を、下記(b)で記載したように実施した。示されたのは、タンデム発現カセットの使用は、異種タンパク質の発現率を著しく上昇させることである。
【００６７】
【図８】図8は、対立遺伝子Klura3-20及びKlmet5-1(A)の遺伝子機能を回復するための遺伝子断片を示す。KlURA3(A)及びKlMET5(B)のために、特定されたプライマーを使用して増幅された遺伝子座及び遺伝子断片を概略的に示す。これらの遺伝子断片を用いて相同組換えにより再構築された、対立遺伝子Klura3-20(A)及びKlmet5-1(B)の突然変異は、遺伝子下の星印で示す。サブクローニングされた断片を切り出す部位である制限部位が組み入れられる(drawn in)。このダイヤグラムは、URA3又はMET5遺伝子座で原栄養性異種遺伝子を発現する酵母株を作製する戦略を示す。
【００６８】
【図９】図9は、表1及び表2と組み合わせて、古典的プライムブーストワクチン接種スキームにおけるニワトリのvvIBDVに対する防御的（予防）免疫化を示す。2つの実験(A及びB)において、少なくとも16羽のSPFニワトリ群に、遺伝子的に最適化したタンデムIBDV-VP2のK.ラクティス酵母株VAK1127の、凍結乾燥及び熱不活化した酵母細胞で、プライムブースト法により、皮下にワクチン接種した。最初のワクチン接種を孵化の2週間後に行い（プライム）、その二週間後に第二の接種（ブースト）を行った。ブーストの二週間後、vvIBDV株(高度に強毒性89163/7.3)によるウイルスチャレンジを行った。感染コントロールとされた１の対象群へは、PBSのみ又はアジュバントのみを投与する模擬処置を行った。実験1(A)では、野生型酵母(VAK367)も又、コントロールとして投与した。1群当たり少なくとも7羽、実験2(B)では少なくとも5羽のニワトリを、ウイルスチャレンジ無しのコントロールとした。血清を、最初の投与直前、チャレンジの直前直後、及びそれ以外の10日間隔で採取した。セロコンバージョン（抗体陽転）強度をELISA(ProFLOK IBD Plus, Synbiotics)により決定した。キット情報に従い転換した力価を示す。A:実験2を実験1(A)と同じように行った。12羽の動物のELISA力価の平均値を、標準偏差と共に示す。両実験とも、VAK1127ワクチン接種された動物の場合に抗IBDV VP2抗体の力価が強くなる成果を示している。関連する表に、ワクチン接種された動物の、vvIBDVでのチャレンジに対する防御結果をまとめる。両方のワクチン接種実験において、ウイルス感染に対する完全防御が達成可能であった。
【００６９】
【図１０】図10は、原栄養性回復のための遺伝子改変が、タンデムIBDV-VP2酵母株の、組換えタンパク質産生量及び免疫原性に及ぼす効果を示す。栄養要求性タンデムIBDV-VP2酵母株VAK1127及び、それから由来する原栄養性酵母株VAK1171を、組換えタンパク質産生及び免疫原性の効率の点から比較した。A:新たに採取した酵母材料中のIBDV-VP2含有量を確認するためのウェスタンブロット分析。酵母株はYPDで予備培養後に、YPLacで8時間培養した。酵母株ごとに、タンパク質抽出物40μgを12%SDS-PAGE上に担持した。イムノブロット法を抗IBDVウサギ抗血清(1:10000)及びヤギ由来のHRP結合抗ウサギ抗体(1:10000)を使用して実施した。凝集的（agg.）及び単量体的（mon.）IBDV-VP2を、右側に矢印で示し、非特異性バンドはアスタリスクで示した。B: 凍結乾燥され、熱不活化した酵母材料内のIBDV-VP2含有量を確認するためのウェスタンブロット分析であり、その酵母材料は、その後、BALB/cマウスでの免疫化研究で使用された(C)。酵母株はYPDで予備的な予備培養後に、YPLacで15時間培養した。酵母株ごとに、タンパク質抽出物10μgを12%SDS-PAGE上に担持し、他方で、イムノブロット法を前記(A)のように実施し、対応するバンドを示す。C: BALB/cマウスでの免疫化実験における、二種の酵母株VAK1127及びVAK1171の免疫原性試験。5頭のマウス群それぞれを3回、前記分析した(B)酵母材料0.1mg(乾燥重量)を、皮下でワクチン接種した。使用したコントロールは、抗原無しの野生型株(VAK367)である。最初の投与を、アジュバントとしてCFA(完全フロイントアジュバント)を用いて行い、更に2回、2週間隔で、アジュバントとしてIFA(不完全フロイントアジュバント)を用いて行った。3回目の投与の1週間後に、マウスを安楽死させて採血した。血清をIBDV-VP2 ELISA(IDEXX)により分析した。抗IBDV-VP2抗体力価と相関している650nmでの吸収を、標準誤差と共に示す。モノクローナル抗IBDV-VP2抗体(正、mab64)をELISAのための正のコントロールとして使用し、サンプル緩衝液(負1)又は非特異性抗体(負2)をのコントロールとして使用した。示されたのは、両方の株の異種タンパク質発現レベルは類似であり、かつ免疫原性の可能性を示したことである。
【００７０】
【図１１】図１1は、表3と組み合わせて、遺伝子的に最適化したIBDV-VP2ワクチン酵母を、1回、皮下投与することによる、SPFニワトリのvvIBDVへの防御的（予防）免疫化を示す。少なくとも18羽のSPFニワトリ群に、遺伝子的に最適化したタンデムIBDV-VP2のK.ラクティス酵母株VAK1171の、熱不活化した細胞10mgを、孵化後2週間で皮下に1回、ワクチン接種した。使用したコントロールは、PBS又はVAK367を10mgワクチン接種した動物である。動物へ、孵化後2週間及び4週間の2回、ワクチン接種した。孵化6週間後に、全ての動物へvvIBDVチャレンジを行った。血清は、前記のようにELISA(ProFLOK IBD Plus, Synbiotics)により分析した。確認された抗体力価を示す。個々の点は、群ごとに分析した12羽のニワトリの個々の抗体力価を表し、棒は、標準偏差と共に平均値を表す。コントロールの場合、生き残ったニワトリの抗体力価のみが、チャレンジ後に確認された。示されたのは、酵母サブユニットワクチンVAK1171の「単回接種」ワクチン接種のみが、それ以降のvvIBDVへの曝露に対して完全な防御を達成することである。
【００７１】
【図１２】図12は、株VAK952及びVAK1283の特性決定を示す。(A)酵母株VAK952(一価HA)及びVAK1283(二価HA、M1)を、振とうフラスコ内のYPDで予備インキュベートし、次にYPL内で6時間誘導した。600nmでの光学密度を測定し、培養体の30 ODユニットを採取し、ガラスビーズを用いてペレットを破壊し、可溶性タンパク質画分(LF)及び不溶性タンパク質画分(P、ペレット)を、イムノブロット法で検査した。使用した主たる(primary)抗体は、α-HA1又はα-M1であり、使用した二番目の(secondary)抗体は、α-マウス-IR-Dye800CWである。シグナルは、赤外線画像システム(LI-COR Biosciences)によって作成した。(B、C)酵母株を、振とうフラスコ内のYPDで予備インキュベートし、次にYPL内で24時間、誘導した。所定の時点で、酵母培養体の光学密度を決定し、30 ODユニットを採取した。(B)VAK1283ペレットをガラスビーズを用いて破壊し、イムノブロット法で分析した。(C)VAK952及びVAK1283の光学密度の測定値を、時間の関数である成長カーブとして組み合わせ、少なくとも2個の独立した実験から平均化した。(D)ドットテストでは、酵母株をYPD含有栄養寒天プレート上で、30℃で48時間培養した。1 ODユニットから開始し、酵母を段階希釈し、次にYPD含有、又はYPL含有栄養寒天プレート上に滴下した。プレートを30℃で48時間培養し、次に写真を撮影した。Ponceau S：各画分、担持コントロールの全酵母タンパク質の染色。示されたのは、VAK952(一価HA)及びVAK1283(二価HA、M1)が、HAタンパク質を同等の量で発現することである。更に示されたのは、VAK1283及びVAK952は同等の増殖特性を示すが、VAK1283がわずかに優れていることである。
【００７２】
【図１３】図13は、VAK952（一価HA）及びVAK1283（二価HA、M1）による免疫化後、曝露感染前及び後の、BALB/cマウスの血清中の抗体力価を示す。両方の酵母株を、振とうフラスコ内のYPDで予備インキュベートし、次にYPL内で12時間(VAK952)又は6時間(VAK1283)誘導した。その後、培養体を採取し、凍結乾燥し、酵母材料を90℃で2時間かけて不活化した。免疫化のために、9週齢のメスのBALB/cマウスへ、2回(プライムブースト)若しくは1回(単回接種)、2mgの酵母(VAK952、VAK1283)若しくは1mgのVAK1283、又はPBS(アジュバント無し)を2回、3週間の間隔で、皮下へワクチン接種した。使用したアジュバントは、AddaVaxである。最終投与後3週間又は6週間で、動物を、5xMLD50のインフルエンザA/PR/8/34(H1N1)ウイルスで鼻腔内感染させた。用いた感染コントロールは、ウイルス無しPBSのみを鼻腔内投与して模擬感染させた動物(模擬)である。最終投与3週間又は6週間後、かつ曝露感染中に、動物の血清を採取し、VNTにより中和抗体(nAb)を試験した。nAb力価50:ウイルス無しコントロールと比較して、プラーク数を50％減少させる血清希釈。対応する血清希釈のlog2として特定される。対数プロットのため、力値：log2（2）=1は、検出可能な抗体が無い血清サンプルとされた。mAb:試験システムコントロール(α-H1(H37-66))。示されたのは、両方の免疫化スキームは、中和抗体(Ab)の著しい誘発をもたらすことである。更に又、プライマー-ブーストワクチン接種実験及び単回接種ワクチン接種実験の場合に得られた中和抗HA抗体力価は、VAK952及びVAK1283の場合とも、著しく異ならないことが明らかである。
【００７３】
【図１４】図14は、VAK952(一価HA)及びVAK1283(二価HA、M1)で免疫化後のインフルエンザA/PR/8/34(H1N1)での曝露感染を示す。最終投与後3週間又は6週間で(免疫化スキームのための図13参照)、BALB/cマウスを5xMLD50のインフルエンザA/PR/8/34(H1N1)ウイルスで鼻腔内感染させた。使用した感染コントロールは、ウイルス無しPBSのみを鼻腔内投与して模擬感染させた動物(模擬)である。その後、動物の、生存率(A)、重量(B)及び臨床的症状(C)を、毎日複数回、14日間にわたって検査した。臨床的な症状については、各群で平均化した0〜4のスコアを決定した(0:異常なし、1:わずかに毛並みが悪い、2:毛並みが悪く、活動減少、3:毛並みが悪く、15%体重減少、4:毛並みが悪く、20%を超える体重減少)。示されたのは、VAK952でのプライムブースト免疫化法は、ウイルス曝露に対して最適な防御を提供しない一方、VAK1283は最適な防御を提供することである。両方のワクチンでの単回接種スキームは、2mgのワクチン投与で最適な防御を生じた。1mgが投与された場合でも、VAK1283が達成する防御率は、プライムブースト方法で2mgのVAK952投与のものと類似であった。
【実施例】
【００７４】
（実験的実施態様）
（実施例1:互いに結合していない複数の遺伝子座へ安定に組み込まれた二個のKlGAL4遺伝子コピーを有する宿主株の作製）
選択マーカー無しに第二のKlGAL4遺伝子コピーを、異なる遺伝子座へ(異所的に)挿入した。シークエンシングにより、KlAVT3遺伝子(KLLA0E13795g)内への挿入位置を位置決めすることが可能である(Klavt3::KlGAL4-1、配列番号:1)(図1)。得られた株は、VAK1111と名付けた。染色体E(異所性コピー)及びD(ゲノム本来のコピー)上にある2個のKlGAL4コピーのそれぞれ独立的な減数分裂的分離を、交叉実験して確認した。更に、同じ実験で、このゲノム内のKlGAL4-1遺伝子コピー数が正確に2個であると確立された。VAK1111を、VAK367-D4と同様に、LAC4遺伝子座への発現カセットの標的組み込みに使用するために、一段階処理が可能なlac4::ScURA3破壊を導入し、ラクトース増殖に対する選択下で、マーカー無しでKIpベクター技術を使用して目的とする異種遺伝子をLAC4プロモーター及びLAC4リーディングフレームの間へ組み込むことができた(Krijgerら(2012))。得られた株VAK1123は、第2の異所的なKlGAL4遺伝子コピーを有する点でのみ、VAK367-D4とは異なる。
【００７５】
（実施例1.1:追加的に組み込まれたKlGAL4遺伝子を有する酵母ワクチン株の改善された生産性）
一の例示的な実施態様では、IBDV-oVP2T2S(Arnoldら(2012))遺伝子が、株VAK1123のLAC4遺伝子座へ挿入された(作製された株はVAK1130)。1個のKlGAL4コピーのみを有する以外は遺伝的背景が同質の株(VAK910)と比較して、IBDV-VP2の増加した生産を確立することができた。比較のために、KlGAL4遺伝子は1個のみだが2個のCDS VP2IBDVコピーを有する株VAK1118(下記参照)を追加的に示す(図2)。
【００７６】
（実施例2:細胞変性効果を有する抗原の発現を最適化するための、基本的活性が低下したPLAC4-12LR2’プロモーター）
微生物内での異種タンパク質の産生は、これが細胞変性効果（CPE）につながる場合に問題がある。従って、直面する課題は、抗原産生フェースを生物量蓄積フェースから切り離す方法を見つけることである。誘導可能なLAC4プロモーターのおかげで、これは流加培養発酵プロセスによって部分的に可能だが、非誘導条件下ではプロモーターPLAC4-12が完全に不活化されないために、全体として妨げられている。非常に強力なCPEを有する抗原の場合、増殖率の低下、及び細胞性ストレス応答の誘発が発生し、抗原産生へ悪影響を及ぼす。この問題は、KlGAL4遺伝子投与量の2倍化及び／又は抗原をコードする配列数の増加によって悪化する(下記参照)。解決策は、-1065及び-1540間のプロモーターPLAC4-12（図3A）の基本制御領域（BCR）（Mehlgartenら（2015））を削除することである(LR2欠損；PLAC4-12-LR2’；配列番号:2)。前記欠損は、出発株VAK367(1個のKlGAL4コピー)及びVAK1111(2個のKlGAL4コピー)のゲノム本来のLAC4遺伝子座へ、lac4::ScURA3破壊と共に導入された。得られた株VAK1109及びVAK1124は、CPEを有する抗原の発現に適している。プロモーターPLAC4-12LR2’も又、組み込み型ベクターKIpURA3-Et及びKIpMET5-Etへ挿入された(下記参照)。
【００７７】
（実施例2.1:改変されたプロモーターによる抗原の基本的（非誘導）発現の阻害）
1個のタンデムIBDV-VP2発現カセットがVAK1124へ組み込まれた(作製された酵母株：VAK1131；用語「タンデム発現カセット」説明のために下記及び図7参照)後、LAC4-12プロモーター内のLR2欠損は、非誘導条件下でVP2タンパク質産生の強力な低下へ導くことを示すことができた(図3B)。インフルエンザA抗原ヘマグルチニン(赤血球凝集素)を発現する株(プロモーター内にLR2欠損の無いVAK952、プロモーター内にLR2欠損を有するVAK1243)により、LR2欠損の結果、インフルエンザA HA抗原の細胞変性効果が抑制され、非誘導条件下での増殖が改善されることを示すことができた(図3C)。
【００７８】
（実施例3:K.ラクティスゲノム内への、複数の発現カセットの標的組み込みのための多用途ベクターシステム）
前記VAK367-D4(Krijgerら(2012)、国際公開番号第20101054649号)のように、酵母株VAK367は、本明細書に記載する全てのK.ラクティス菌株の遺伝子的背景を形成する。この株の背景は、ウラシル及びメチオニンを要求するものであり(ウラシル及びメチオニン栄養要求性)、それは2個の遺伝子KlURA3(KLLA0E22771g)及びKlMET5(KLLA0B03938g)内の突然変異、Klura3-20(+345位の塩基対欠失)及びKlmet5-1(G2555A及びA3682T)と称される対立遺伝子（この対立遺伝子は、機能欠損遺伝子変種である。）があるためである。
【００７９】
これらの変異性の対立遺伝子は、既にKIp3/KIp3-MCSで開発された組み込み部位LAC4(Krijgerら(2012))とは別の、標的組み込みのための更なる複数の遺伝子座を使用するため、そしてそれにより多価ワクチン株を作製するために、使用された(図4A)。選択は、これら変異した遺伝子の遺伝子機能を回復することにより、選択マーカーの追加的な挿入無しに、達成できる。この目的のために、新規な組み込み型ベクターが作製された。前記ベクター内では、発現カセット(それぞれの場合に、LAC4-12プロモーター又はそれらの変種の制御下で)は、相同組み換えによる、KlURA3遺伝子の上流組み込み及びKlMET5遺伝子の下流組み込みを可能とする遺伝子セグメントに隣接していると同時に、それら遺伝子の野生型配列を回復させる。
突然変異誘発による組み込み部位、及び代替的な成長物質のための栄養要求性選択によって、更に複数の遺伝子座を、同様に開発することができる。
【００８０】
（実施例3.1:Klura3-20及び／又はKlmet5-1対立遺伝子を有するK.ラクティス株の、KlURA3(KLLA0E22771g)及び／又はKlMET5(KLLA0B03938g)遺伝子座への発現カセット(誘導可能なLAC4-12プロモーターを有する)の標的組み込みのためのベクターKIpURA3及びKIpMET5）
組み込み型発現ベクターKIpURA3(配列番号:3)及びKIpMET5(配列番号:4)を、Klura3-20及びKlmet5-1対立遺伝子それぞれの機能の標的とする回復を可能とする適切な遺伝子断片(KlMET5/KlURA3標的配列)によって、構築した。
【００８１】
KIpMET5発現ベクターは、LAC4-12プロモーター(PLAC4-12又はその変種)、発現される抗原をコードする核酸配列、及びAgTEF1ターミネーターからなる発現カセットを含み、それは、導入されたScCYC1ターミネーターを有するゲノム本来のKlMET5断片の下流に隣接し、下流KlAIM18遺伝子を有するKlAIM18プロモーターの上流に隣接する。
KIpURA3発現ベクターは、LAC4-12プロモーター(PLAC4-12又はその変種)、発現される抗原をコードする核酸配列、及びAgTEF1ターミネーターからなる発現カセットを含み、それは、関連するプロモーターを有するKLLAOE22749gの下流に隣接し、下流KlURA3断片を有するKlURA3プロモーターの上流に隣接する(図4B、C)。
【００８２】
いずれの場合も、抗原をコードする配列は、AscI及びNotI制限部位を介してプロモーターとターミネーターの間でクローニングされる。作製されるプラスミドのEco91I又はKpnI制限により、発現カセット全体がKIpURA3ベクターバックボーンから分離され、又、作製されるプラスミドのHindIII又はBoxI制限により、発現カセット全体がKIpMET5ベクターバックボーンから分離され、制限材料がKlura3-30及び／又はKlmet5-1対立遺伝子を有するK.ラクティス宿主株へ形質転換される。このようにKlURA3-20又はKlMET5-1内へ組み込まれた異種遺伝子含有発現カセットは従って、KIp3-MCSベクターによりVAK367-D4内のLAC4へ組み込み可能なもの(国際公開番号第20101054649号)、そのものに対応する。ウラシル原栄養性及び／又はメチオニン原栄養性形質転換体の確認は、KIpMET5形質転換体にはプライマーMAB6及びVK211を使用し、KIpURA3形質転換体にはプライマーMAB6及びVK71を使用して、コロニーPCRにより標準的な方法で行われる。発現カセットを、KlURA3又はKlMET5及びそれぞれの隣接遺伝子との間の正確な標的部位へ組み込むことにより、サイズ1652bpのKIpMET5形質転換体及び、サイズ1307bpのKIpURA3形質転換体の産物を得る。この挿入によって、隣接遺伝子の機能性が損なわれた兆候は確認されなかった。
【００８３】
プライマー:
【化２】
2021508496.tif 000003
【００８４】
（実施例3.2:コーディング遺伝子カセットのKlURA3又はKlMET5遺伝子座への組み込み後の異種抗原の発現）
PLAC4-12プロモーター制御の下で、異種遺伝子は、LAC4、KlURA3及びKlMET5遺伝子座へ組み込まれた後に、ラクトースによりほとんど同程度に強力に誘導される。大腸菌(E.coli)由来の、熱に不安定で無毒のエンテロトキシンサブユニットB（Etx.B）及びC末端の(HA)3エピトープ（Etx.B-HA）を、ベクターシステム評価のための試験タンパク質として使用した。コード配列をベクターKIpMET5、KIpURA3及びKIp3-MCSにクローニングし、遺伝子座KlMET5（VAK1251）、KlURA3（VAK1235）及びLAC4（VAK899）に組み込んだ（図4D）。ウエスタンブロット法で示されるように、3個の株すべてのEtx.B-HAタンパク質の濃度は非常に似ている（図4D）。従って、ゲノム内の発現カセットの組込み部位に依存して、組換えタンパク質産生の量に対する位置的効果を確立することはできなかった。
【００８５】
（実施例3.3:同じ酵母細胞内での、2個の異種抗原の共発現）
新規なベクターシステムにより、同一酵母株内でPLAC4-12プロモーター制御の下での異なる異種タンパク質を産生する可能性を、KlURA3遺伝子座にEtx.B-HA発現カセット、及びLAC4遺伝子座にタンデムとして存在する2個のVP2IBDVコピーを有する発現カセットを有する酵母株の構築により示すことができた(VAK1234；図5、タンデムカセット説明は下記及び図7参照)。それぞれゲノム内に発現カセットが1個だけ存在する酵母菌株（VAK1235又はVAK1171）と比較して、VAK1234の場合のEtx.B-HA又はVP2IBDVのタンパク質濃度の低下は確認できなかった。
【００８６】
（実施例4:類似の誘導条件下で組換えタンパク質合成を調節するためのLAC4プロモーター変種）
抗原の免疫原性効果は、しばしば非化学量論比での複数のタンパク質の集合(assembling)に基づく。これを酵母ベースワクチンで可能にするために、ラクトース又はガラクトースにより異なって誘導できるPLAC4-12LR2’プロモーターの変種を作製した(図6A)。それらは、アクチベーターKlGal4(U1、U2、U4、U5；Godeckeら(1991))の結合部位数と、基本制御領域BCRの有無によって特徴づけられる。KIpURA3ベクターに挿入された図3Aに示される構築物に加えて、更なる結合部位の挿入によりプロモーター強度が上昇したプロモーター変種を作製することも可能であった。その結果は、このベクターシステムを拡張できるラクトース誘導可能な合成プロモーターであり、同じ誘導条件下で異なるタンパク質産生又は遺伝子発現率の実現が可能である。
【００８７】
（実施例4.1:様々なLAC4プロモーター変種の制御下での異種抗原の発現）
4個のLAC4-12プロモーター変種の制御下でのEtx.B-HAの発現。試験したのは、転写アクチベーターKlGal4の結合部位の数が異なり、非誘導条件下での基本的発現の制御領域(基本制御領域BCR；図6A；配列番号:14)の有無が異なる4個のLAC4プロモーター変種である。前記プロモーター変種を使用して、KIpURA3-Etベクター変種KIpURA3-PL412-Et、KIpURA3-PL412LR2-Et、KIpURA3-PL4-Et及びKIpURA3-PL4LR2を作製し、それぞれEtx.B-HAタンパク質を試験GOIとして挿入した。前記のとおり、代替のGOIの挿入は、制限部位AscI及びNotIで可能である。発現カセットをKlURA3遺伝子座へ組み込み、Etx.B-HAのタンパク質濃度をウェスタンブロット法で定量化した(図6B)。示されたのは、同一の誘導条件下で(ラクトース含有完全培地で4時間)、LAC4及びLAC12遺伝子間に完全な遺伝子間領域を含み、4個のKlGal4-結合部位(U1、U2、U4、U5)(Godeckeら(1991))を含む最長のプロモーター変種PLAC4-12は、最高のタンパク質濃度をもたらすことである。LAC4の近位にある2個のU1及びU2結合部位(-1064〜-10)だけが存在する場合、BCR(-1540〜-1065)の追加的な欠損は同様に、誘導条件下でのタンパク質減少効果を有する。
【００８８】
（実施例5:抗原をコードする遺伝子のコピー数上昇による抗原産生の増加）
従って、前記のベクターシステムは、迅速に効率良く複数の遺伝子コピーを連続して結合するため、及びこの発現カセットを3個の遺伝子座の一か所へ一段階で導入するために、改変された(図7A)。
LAC4遺伝子座で組み込み可能なタンデム発現カセットを作製するために、3個のPCR増幅断片を、目的とする任意のKIp3(-MCS)-GOIテンプレートにより、一段階で融合した(in-fusionクローニング):(1及び2) PLAC4-LR2及びTTEF(プライマー:VK30及びVK31、及び、VK32及びVK33)、並びに(3)LAC4標的配列(VK34及びVK35))を含む発現カセット。例えばHpaIを使用して制限(処理)後、タンデム発現カセットを、記載されたようにlac4::URA3遺伝子座に組み込むことができる(図7)。発現カセット組み込み成功後、最初の異種遺伝子コピーは、出発株に応じてPLAC4-12又はPLAC4-12-LR2のいずれかによって調節され、第二の遺伝子コピーはPLAC4-LR2によって調節される。その代わりに、2個の発現カセット間の選択マーカーを制限部位SmiI、MluI又はPmeIに挿入し、KpnIでLAC4標的配列を除去すると、KpnIを介してLAC4標的配列を除去すると、NHEJを介して無向的にゲノム内に組み込まれるタンデムカセットが作製される。MreI及びAvaIを使用して発現カセットを切り出した場合、適合性のある末端がライゲートされて、それにより長く、複数の発現カセットを作製することができる。MreIとAvaIを使用して制限を繰り返すことにより、発現カセットがタンデム（ヘッドツーテール）に配置された断片が、ライゲーションミックス内に富化する。それらは形質転換され、マーカー選択条件下で無向的に組み込まれる。
【００８９】
プライマー:
【化３】
2021508496.tif 000004
【００９０】
（実施例5.1:マルチコピー戦略が成功した使用）
この戦略は、抗原としてのIBDV-VP2及び、2個のIBDV-VP2をコードする配列(CDS-VP2IBDV)をタンデムで含有するKIp3由来の発現カセットを使用することにより確認した。KIp3ベクター(プラスミドKIp3-タンデム-oVP2T2S、配列番号:21)内のタンデムIBDV-VP2発現カセット(図7A)は、KIp3-MCS-oVP2T2S(Arnoldら、(2012))からの、VP2IBDV(CDS-VP2IBDV)のための2個のLAC4プロモーター制御されたコード配列からなる。プロモーター配列は、最初のコピー用のLAC4プロモーター領域-1123〜-10、及び第二のコピー用の-1099〜-10からなる。両方のCDS-VP2IBDVは、3’末端でAgTEF1ターミネーターと隣接している。プラスミドKIp3-タンデム-oVP2T2Sを、HpaIを使用して切断し、制限材料を株VAK367-D4内に形質転換した。このようにして作製した酵母株VAK1118は、LAC4遺伝子座に組み込まれたタンデム発現カセットを含む。ウェスタンブロット法で示されるように、遺伝的背景が同質で、1個のコピーしか持たない株と比べて、前記株内ではより高いIBDV-VP2タンパク質濃度を示す(図7B)。タンデム発現カセットは、遺伝子的に高度に安定しており、誘導性媒体(YNB+ラクトース)中で78世代を超えて増殖した後、PCR試験した100コロニーで、発現カセットの遺伝子的変化を示したものは一つも無かった(データは示さない)。
【００９１】
（実施例6:合成培地及び完全培地での単純発酵のためにK.ラクティス株の原栄養性を生み出すためのツール）
行われた研究では、ウラシル栄養要求性酵母菌株は、完全培地ではウラシル原栄養菌株よりも、より成長が貧弱であり、これは、ウラシルの添加によって部分的にだが中和される効果であることが明らかになった。ワクチン株の発酵を単純化するために、生産プロセスの確立を促進し、それらをより費用対効率の高いものにし、メチオニン及び／又はウラシルの不十分な取り込みによる増殖効果を回避するために、発見が求められるものは、目的とする株構築に必要なこれら栄養要求性の中和を、迅速に再現性良く達成する方法である。Klura3-20からKlURA3を再構成するために、プライマーVK67及びVK69、並びにテンプレートとして野生型KlURA3遺伝子を使用して、PCRによりDNA断片を作製した（図8A）。Klmet5-1対立遺伝子を修復するために、プライマーVK74及びVK75、並びにテンプレートとして野生型対立遺伝子KlMET5を用いて、PCR断片を同様に作製した（図8B）。PCR断片を対応する変異株に（個別又は一緒に）形質転換し、メチオニン無し及び／又はウラシル無しの培地で選択すると、野生型対立遺伝子が高い効率で再構成される。このプロセスは、とりわけ、株VAK1171及びVAK1400を作製するために実施された（上記参照）。
【００９２】
プライマー
【化４】
2021508496.tif 000005
【００９３】
（実施例7:最適化され、不活化されたワクチン酵母による防御的免疫化）
実施例1〜5で行われたK.ラクティスワクチンのプラットフォームの改変及び最適化は、様々なワクチン接種研究で検証された。
【００９４】
（実施例7.1:IBDV-VP2酵母株（VAK1127）の実施例を使用した、最適化したK.ラクティスプラットフォームの免疫原性）
VAK1127株は、タンデムIBDV-VP2発現カセット(配列番号:21)、2個のKlGAL4コピー及びLAC4プロモーター内のLR2欠損を含む。酵母菌株の免疫原性の特性決定のため、標的生物であるニワトリで免疫化実験を行った。チャレンジ実験では、Eterradossi及び同僚（1997）によって良く特徴づけられた高度に強毒性の(vv)IBDV株89163/7.3(AFSSA、Ploufragan、フランス)に対する、SPFニワトリの完全な防御が達成された(表1及び2)。この目的のために、独立して行われた2個の実験では、1mgの凍結乾燥され、熱不活化された(2時間、90℃)酵母(VAK1127)を、不完全フロイントアジュバント(IFA)と共に、2回(図9A及びB)皮下投与した(プライムブースト)。投与は、孵化後2週間及び4週間で行い、ウイルス曝露(チャレンジ)を孵化後6週間で行った。19日後、VAK1127ワクチン接種した動物では、抗IBDV-VP2抗体の高い力価が既に測定可能だった。コントロールでは、抗IBDV-VP2抗体の力価は、vvIBDVチャレンジ後にのみ発生した(図9)。両方の実験で、VAK1127ワクチン接種された動物の、vvIBDVでのチャレンジに対する完全な防御(0%罹患率、0%死亡率)が観察された(表1及び2)。これらの実験では、古典的プライマー-ブーストワクチン接種方法でサブユニットワクチンを使用して、vvIBDVに対する防御を観察することができた。
【００９５】
ワクチン酵母の免疫原性は、抗原を保有する原栄養酵母株への遺伝的復帰突然変異の影響を受けない。これは、IBDV-VP2酵母株の栄養要求性型又は原栄養性型により、マウスのワクチン接種実験で実証できた（図10C）。酵母株VAK1127（栄養要求性）を、前記のように（実施例6；図8）、VAK1171を作製するためのPCR断片を使用して2段階で原栄養性にした。両方の株型は、組換えタンパク質の発現レベルで著しい違いを示さない（図10A及びB）。マウスへ、0.1mgの熱不活化酵母をIFAと共に、2週間間隔で3回、皮下ワクチン接種した。栄養要求性のIBDV-VP2株（VAK1127）及び原栄養性の子孫（VAK1171）の間のセロコンバージョンの強度に差を確立することはできなかった（図10C）。
【００９６】
（実施例7.2:「単回接種」スキームでのワクチン接種による完全防御）
「単回接種」ワクチン接種、即ち、一回のワクチン投与によるワクチン接種は、通常、サブユニットワクチンでは免疫原性がないため効果的ではない。しかし、プライム／ブースト法で最適化した株VAK1127を使用して得られた抗体力価の研究データ（図9）は、単回接種アプローチでも保護が得られる可能性を示す。これは、原栄養性酵母菌株VAK1171を使って単回接種でワクチン接種を行うことにより確認された（図11；表3）。この目標を達成するために、目的とする高い投与量で（10mg）、酵母を1回だけ投与し、その後4週間間隔でチャレンジを行った。VAK1171では、vvIBDVに対する完全な防御が（罹患率0％、死亡率0％）、「単回接種」を使用して実際に達成できることが明らかになった（表3）。この結果は、ワクチン接種後約20日の高い防御的抗体力価の成果に起因させることができる（図11）。単回接種のワクチン接種スキームが、高い防御性でvvIBDVに対して防御するという事実は、使用されたワクチンの強力な免疫原性の可能性を示し、最適化したワクチンプラットフォームの素晴らしい検証を提供する。
【００９７】
（実施例7.3:インフルエンザAウイルス感染に対して使用した場合の、一価酵母ワクチンと比較した二価酵母ワクチンの防御の改善）
A型インフルエンザウイルスに対するワクチン接種を行うために、3個の異なるワクチン株を作製した。最初に、インフルエンザA株（プエルトリコ/8/1934；PR8/34）の主要抗原、HA（ヘマグルチニン）遺伝子を発現するVAK952（DSM32705）を作製した。VAK952では、Krijgerら(2012)及びArnoldら(2012)が記載したように、遺伝子はゲノムのLAC4遺伝子座に組み込まれている。二番目に、VAK1283（DSM32697）を作製した。ここでは、LAC4遺伝子座のPR8/34からのHA遺伝子に加えて、M1遺伝子が更にURA3遺伝子座に組み込まれている。M1遺伝子は、HAよりも明らかに保存されている、更に重要なインフルエンザA抗原をコードしている。既に出版されている報告では、両方の抗原を組み合わせると、インフルエンザAに対するワクチンの免疫原性を高め、かつ異なるインフルエンザウイルスに対する交差防御性を達成できることが、示されている。この態様を二価酵母ワクチンで検証するために、URA3遺伝子座にM1遺伝子を同様に含み、PR8/34からのHA遺伝子がインフルエンザウイルス(カリフォルニア/4/2009)のHA遺伝子で置き換わっている、株(VAK1395；DSM32706)を更に作製した。それぞれの株でのHAの同等の発現とM1の追加的発現が確認された。また、これら株は同等の増殖を示し、VAK1283はVAK952よりもわずかに優れていることが示された（図12）。マウスモデルで、異なる酵母濃度のプライムブーストスキーム及び単回接種スキームがそれぞれのケースで使用されたワクチン接種研究では、VAK952とVAK1283がそれぞれ同等のウイルス中和抗体の力価を誘発することが示された（図13）。しかし、チャレンジ実験では、二価VAK1283ワクチンがプライムブーストスキーマと単回接種スキーマの両方で最大の防御を可能にすることが明らかになり、これは一価VAK952ワクチンの場合とは異なる。更に、使用した酵母材料の半分での単回接種実験で、ワクチンVAK1283を使用すると、プライムブーストアプローチのVAK952と同様の防御的効果が達成された（図14及び表3）。VAK1395をワクチンとして使用した実験では、インフルエンザPR8/34に対する防御を確立することも可能だった。従って、異なるインフルエンザ変種に対する交差防御は、二価酵母ワクチンを使用して達成された。
【００９８】
【表１】
2021508496.tif 000006
【００９９】
【表２】
2021508496.tif 000007
【０１００】
【表３】
2021508496.tif 000008
【０１０１】
（表1のための注記）
(a)孵化後2週間のニワトリへ、1mg酵母(又はPBS)及びアジュバントとしてIFAを、皮下へワクチン接種した。ワクチン接種の2週間後、同様にブーストした。更に2週間後にウイルス曝露試験を、104 EID vvIBDV(高度に強毒性89163/7.3)を用いて眼鼻経路を介して行った。不活化した株VAK1127酵母全体をワクチン酵母として使用し、PBS及びIFAのみでワクチン接種した群を感染コントロールとして使用した。抗原を含まない野生型酵母（VAK367）を投与した群は、酵母効果のみのコントロールとして使った。
【０１０２】
(b)病理組織学的嚢病変評価を、0〜4のスケールを使用して行った。0：病変なし。1：濾胞の5〜25％が影響を受けた。2：濾胞の26〜50％が影響を受けた。3：濾胞の51〜75％が影響を受けた。76〜100％の嚢損傷（構造の喪失）。
【０１０３】
(c)嚢重量対体重指数（bu/bod）の平均値は、式：（嚢重量／体重）×1000を使用して計算した。非曝露コントロール群は、少なくとも7羽のニワトリからなり、曝露群は10羽からなる。標準偏差も表示する。
【０１０４】
(d)罹患率を、群全体のニワトリ数あたりの罹患ニワトリ数として表す。罹患ニワトリの百分率を括弧内に示す。
【０１０５】
(e)死亡率を、群全体のニワトリ数あたりの死亡ニワトリ数として表す。死亡ニワトリの百分率を括弧内に示す。
【０１０６】
（表2のための注記）
(a)孵化後2週間のニワトリへ、1mg酵母(又はPBS)及びアジュバントとしてIFAを、皮下へワクチン接種した。ワクチン接種の2週間後、同様にブーストした。更に2週間後にウイルス曝露試験を、104 EID vvIBDV(高度に強毒性89163/7.3)を用いて眼鼻経路を介して行った。不活化した株VAK1127酵母全体をワクチン酵母として使用し、PBS及びIFAのみでワクチン接種した群を感染コントロールとして使った。
【０１０７】
(b)病理組織学的嚢病変評価を、0〜4のスケールを使用して行った。0：病変なし。1：濾胞の5〜25％が影響を受けた。2：濾胞の26〜50％が影響を受けた。3：濾胞の51〜75％が影響を受けた。76〜100％の嚢損傷（構造の喪失）。
【０１０８】
(c)嚢重量対体重指数（bu/bod）の平均値は、式：（嚢重量／体重）×1000を使用して計算した。非曝露コントロール群は、少なくとも5羽のニワトリからなり、曝露群は9羽からなる。標準偏差も表示する。
【０１０９】
(d)罹患率を、群全体のニワトリ数あたりの罹患ニワトリ数として表す。罹患ニワトリの百分率を括弧内に示す。
【０１１０】
(e)死亡率を、群全体のニワトリ数あたりの死亡ニワトリ数として表す。死亡ニワトリの百分率を括弧内に示す。
【０１１１】
（表3のための注記）
(a)孵化後2週間のニワトリへ、10mg酵母(又はPBS)及びアジュバントとしてIFAを、皮下へワクチン接種した。4週間後にウイルス曝露試験を、104 EID vvIBDV(高度に強毒性89163/7.3)を用いて、眼鼻経路を介して行った。不活化した株VAK1171酵母全体を1回酵母ワクチンとして使用した。使用した感染コントロールは、第一はPBS及びMF59のみでワクチン接種した群で、第二は野生型酵母及びMF59を最初のワクチン接種後2週間でワクチン接種した群であり、両者とも同量の酵母又はPBSを含有するブーストを投与した。
【０１１２】
(b)病理組織学的嚢病変評価を、0〜4のスケールを使用して行った。0：病変なし。1：濾胞の5〜25％が影響を受けた。2：濾胞の26〜50％が影響を受けた。3：濾胞の51〜75％が影響を受けた。76〜100％の嚢損傷（構造の喪失）。
【０１１３】
(c)嚢重量対体重指数（bu/bod）の平均値は、式：（嚢重量／体重）×1000を使用して計算した。各群は、少なくとも9羽のニワトリからなる。標準偏差も表示する。
【０１１４】
(d)罹患率を、群全体のニワトリ数あたりの罹患ニワトリ数として表す。罹患ニワトリの百分率を括弧内に示す。
【０１１５】
(e)死亡率を、群全体のニワトリ数あたりの死亡ニワトリ数として表す。死亡ニワトリの百分率を括弧内に示す。
【０１１６】
（配列）
本特許出願は、下記配列を記載の一部として含む。
【０１１７】
【表４】
2021508496.tif 000009
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０１１８】
（参考文献）
【化５】
2021508496.tif 000010
2021508496.tif 000011
2021508496.tif 000012
【図１Ａ】
2021508496.tif 000013
【図１Ｂ】
2021508496.tif 000014
【図１Ｃ】
2021508496.tif 000015
【図２】
2021508496.tif 000016
【図３】
2021508496.tif 000017
【図４】
2021508496.tif 000018
【図５】
2021508496.tif 000019
【図６】
2021508496.tif 000020
【図７】
2021508496.tif 000021
【図８】
2021508496.tif 000022
【図９】
2021508496.tif 000023
【図１０】
2021508496.tif 000024
【図１１】
2021508496.tif 000025
【図１２】
2021508496.tif 000026
【図１３】
2021508496.tif 000027
【図１４】
2021508496.tif 000028
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月25日(2020.9.25)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021508496000001.app
【国際調査報告】
2021508496.tif 000029
2021508496.tif 000030
2021508496.tif 000031
2021508496.tif 000032
2021508496.tif 000033
2021508496.tif 000034
2021508496.tif 000035
2021508496.tif 000036
2021508496.tif 000037
2021508496.tif 000038
2021508496.tif 000039