(57)【要約】短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域、及び所望により、細胞膜透過性領域を有するＡＴＦ５ペプチド、ＡＴＦ５ペプチドを含む組成物、ならびに、ＡＴＦ５ペプチドを使用した、新生細胞における増殖の阻害方法及び細胞毒性の促進方法を提供する。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域を含むＡＴＦ５ペプチドであって、前記短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域が、アミノ酸配列ＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号５３）の多様体を含み、前記多様体が、以下のとおりの、配列番号５３の１つ以上の位置において改変されている、前記ＡＴＦ５ペプチド：
ｉ．Ｅ４が正電荷を帯びる残基で置換されている；
ｉｉ．Ｃ５が無極性残基で置換されている；
ｉｉｉ．Ｑ６がアラニンで置換されている；
ｉｖ．Ｅ９が正電荷を帯びる残基で置換されている；
ｖ．Ｒ１１が負電荷を帯びる残基で置換されている；
ｖｉ．Ｎ１２が無極性残基で置換されている；
ｖｉｉ．Ｋ１６が負電荷を帯びる残基で置換されている；
ｖｉｉｉ．Ｓ２１がアラニンで置換されている。
【請求項２】
短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域を含むＡＴＦ５ペプチドであって、前記短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域が、ＬＥＧＥＧＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号５４）、ＬＥＧＥＡＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号５５）、ＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＡＶ（配列番号５６）、ＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＬＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号５７）、ＬＥＧＥＣＡＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号５８）、ＬＥＧＲＣＱＧＬＲＡＥＮＲＥＬＥＥＲＡＥＳＶ（配列番号５９）、ＬＥＧＲＣＱＧＬＲＡＥＬＲＥＬＥＥＲＡＥＡＶ（配列番号６０）、及びＬＥＧＲＡＱＧＬＲＡＥＬＲＥＬＥＥＲＡＥＡＶ（配列番号６１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、前記ＡＴＦ５ペプチド。
【請求項３】
細胞膜透過性領域を更に含み、前記ＡＴＦ５ペプチドが細胞膜透過性ＡＴＦ５ペプチドである、請求項１または請求項２に記載のＡＴＦ５ペプチド。
【請求項４】
前記細胞膜透過性領域が、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２５）、ＲＱＬＫＬＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２６）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４０）、及びＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号４１）からなる群から選択される、請求項３に記載の細胞膜透過性ＡＴＦ５ペプチド。
【請求項５】
アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号３）の多様体を含む細胞膜透過性ＡＴＦ５ペプチドであって、前記多様体が、以下からなる群から選択される配列番号３の位置において改変されている、前記細胞膜透過性ＡＴＦ５ペプチド：
ｉ．Ｃ２１Ｇ（配列番号４）；
ｉｉ．Ｃ２１Ａ（配列番号５）；
ｉｉｉ．Ｑ２２Ａ（配列番号８）；
ｉｖ．Ｅ２０Ｒ、Ｅ２５Ｒ、Ｒ２７Ｅ、及びＫ３２Ｅ（配列番号９）；
ｖ．Ｎ２８Ｌ（配列番号７）；
ｖｉ．Ｓ３７Ａ（配列番号６）；
ｖｉｉ．Ｅ２０Ｒ、Ｅ２５Ｒ、Ｒ２７Ｅ、Ｎ２８Ｌ、Ｋ３２Ｅ、及びＳ３７Ａ（配列番号１０）；ならびに
ｖｉｉｉ．Ｅ２０Ｒ、Ｃ２１Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｒ２７Ｅ、Ｎ２８Ｌ、Ｋ３２Ｅ、及びＳ３７Ａ（配列番号１１）。
【請求項６】
短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域を含むＡＴＦ５ペプチドであって、前記ペプチドが、先行請求項のいずれかに記載のアミノ酸配列と比較して、逆アミノ酸配列中にＤ−アミノ酸を含む、前記ＡＴＦ５ペプチド。
【請求項７】
前記短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域が、Ｄ−アミノ酸配列ＶＡＥＡＲＥＥＬＥＲＬＥＡＲＬＧＱＡＲＧＥＬ（配列番号６５）を有する、請求項６に記載のＡＴＦ５ペプチド。
【請求項８】
Ｄ−アミノ酸配列ＶＡＥＡＲＥＥＬＥＲＬＥＡＲＬＧＱＡＲＧＥＬＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＬＫＬＱＲ（配列番号１４）を含み、前記ＡＴＦ５ペプチドが細胞膜透過性ペプチドである、請求項７に記載のＡＴＦ５ペプチド。
【請求項９】
前記ペプチドが延長ロイシンジッパー領域を含まない、先行請求項のいずれかに記載のＡＴＦ５ペプチド。
【請求項１０】
前記ペプチドが、Ｎ末端アセチル基、及び／またはＣ末端アミド基を含む、先行請求項のいずれかに記載のＡＴＦ５ペプチド。
【請求項１１】
先行請求項のいずれかに記載のＡＴＦ５ペプチドを含む組成物。
【請求項１２】
医薬組成物である、請求項１１に記載の組成物。
【請求項１３】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＡＴＦ５ペプチドを含むキット。
【請求項１４】
請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＡＴＦ５ペプチドをコードする核酸分子。
【請求項１５】
新生細胞における細胞毒性の促進方法であって、前記新生細胞を、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＡＴＦ５ペプチドと接触させることを含む、前記方法。
【請求項１６】
新生細胞の増殖の阻害方法であって、前記新生細胞を、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＡＴＦ５ペプチドと接触させることを含む、前記方法。
【請求項１７】
新生細胞における細胞毒性の促進に使用するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＡＴＦ５ペプチド。
【請求項１８】
新生細胞の増殖の阻害に使用するための、請求項１〜１０のいずれか１項に記載のＡＴＦ５ペプチド。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、２０１８年１月３日に出願された、米国特許仮出願番号第６２／６１３，０８３号の優先権の利益を主張する。
配列表
本願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出されている配列表を含有し、その全体が参照により本明細書に組み込まれている。２０１８年１２月２１日に作成された上記ＡＳＣＩＩのコピーは、Ｓａｐｉｅｎｃｅ＿００３＿ＷＯ１＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、サイズは２９，３８５バイトである。
【背景技術】
【０００２】
活性化転写因子５（ＡＴＦ５）は、塩基性ロイシンジッパータンパク質のＡＴＦ／ＣＲＥＢ（ｃＡＭＰ応答エレメント結合タンパク質）のメンバーである。正常に発達している脳において、ＡＴＦ５は神経前駆体／神経幹細胞に非常に発現し、これらの場所において、細胞周期離脱を遮断して細胞増殖を促進することにより、神経発生及びグリア発生を阻害する。神経前駆体に、細胞周期離脱、及び、ニューロン、星状細胞、または希突起神経膠のいずれかへの分化をさせるようにするには、ＡＴＦ５の下方制御が必要である（Ｇｒｅｅｎｅ  ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ａ；Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ｂ；Ａｒｉａｓ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【０００３】
神経系の正常な発達における役割に加えて、ＡＴＦ５は、膠腫及びその他の腫瘍の生残を促進する、発がん性因子としてもまた現れている。ＡＴＦ５は、グリア芽腫、乳癌、膵臓癌、肺癌、及び大腸癌を含む様々ながんで非常に発現し、膠腫細胞の生残に不可欠であることが、多数の研究により示されている（Ｍｏｎａｃｏ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２０１０ａ）。膠腫との関係において、ＡＴＦ５の過剰発現は、疾患の予後及び生残と逆相関する。即ち、ＡＴＦ５発現が高い膠腫患者は、ＡＴＦ５発現が低い患者よりも、著しくひどいアウトカムを有する。
【０００４】
がん細胞中では、アポトーシスを誘発する遺伝子は多くの場合、不活性化される、または下方制御される一方で、抗アポトーシス遺伝子は頻繁に活性されるまたは過剰発現する。このパラダイムに一致して、ＡＴＦ５は、Ｂ細胞白血病２（Ｂｃｌ−２）及び骨髄細胞白血病１（Ｍｃｌ−１）を含む抗アポトーシスタンパク質の転写を上方制御し、腫瘍細胞の生残を促進する（Ｓｈｅｎｇ  ｅｔ  ａｌ．，２０１０ｂ；Ｃｈｅｎ  ｅｔ  ａｌ．，２０１２）。
【発明の概要】
【０００５】
本発明の主たる態様のいくつかを以下にまとめる。追加の態様は、本開示の［発明の詳細な説明］、［実施例］、［図面］、及び［特許請求の範囲］の項に記載している。本開示の各項の記載は、他の項とともに読解されるべきであることを意図する。更に、本開示の各項に記載される様々な実施形態は、様々な異なる方法で組み合わせることが可能であり、そのような組み合わせは全て、本発明の範囲内に収まることと意図される。
【０００６】
したがって、本開示は、所望により、改変強化ロイシンジッパー配列が存在しない、ＡＴＦ５ロイシンジッパードメインを含むＡＴＦ５のペプチド誘導体、ＡＴＦ５ペプチドを含む組成物及びキット、ならびに、ＡＴＦ５ペプチドを用いる、新生細胞における細胞毒性の誘発方法、及び／または新生細胞の増殖の阻害方法を提供する。特に、本開示は、ＳＴ−３ロイシンジッパー配列（配列番号５３）を含むＡＴＦ５ペプチドの多様体を提供し、これらの多様体は、非保存的アミノ酸置換を含むことができる。本発明に先立って、そのような置換が、ＳＴ−３ロイシンジッパー配列（配列番号５３）を含むＡＴＦ５ペプチドと比較して、同様または優れた細胞毒性活性を有する分子をもたらすことを予想することはできなかった。いくつかの実施形態では、本開示は、細胞膜透過性ＡＴＦ５ペプチドＳＴ−３の多様体を提供し、これらの多様体は、ＳＴ−３と比較して、同様または優れた細胞毒性活性を有する。
【０００７】
一態様では、本発明は、短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域を含むＡＴＦ５ペプチドであって、短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域が、アミノ酸配列ＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号５３）の多様体を含み、多様体が、配列番号５３の１つ以上の位置にて、以下のとおり：（ｉ）Ｅ４が正電荷を帯びる残基で置換されている；（ｉｉ）Ｃ５が無極性残基で置換されている；（ｉｉｉ）Ｑ６がアラニンで置換されている；（ｉｖ）Ｅ９が正電荷を帯びる残基で置換されている；（ｖ）Ｒ１１が負電荷を帯びる残基で置換されている；（ｖｉ）Ｎ１２が無極性残基で置換されている；（ｖｉｉ）Ｋ１６が負電荷を帯びる残基で置換されている；（ｖｉｉｉ）Ｓ２１がアラニンで置換されているように改変されている、ＡＴＦ５ペプチドを提供する。
【０００８】
別の態様においては、本発明は、短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域を含むＡＴＦ５ペプチドであって、短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域が、ＬＥＧＥＧＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号５４）、ＬＥＧＥＡＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号５５）、ＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＡＶ（配列番号５６）、ＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＬＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号５７）、ＬＥＧＥＣＡＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号５８）、ＬＥＧＲＣＱＧＬＲＡＥＮＲＥＬＥＥＲＡＥＳＶ（配列番号５９）、ＬＥＧＲＣＱＧＬＲＡＥＬＲＥＬＥＥＲＡＥＡＶ（配列番号６０）、及びＬＥＧＲＡＱＧＬＲＡＥＬＲＥＬＥＥＲＡＥＡＶ（配列番号６１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を含む、ＡＴＦ５ペプチドを提供する。
【０００９】
一実施形態では、ＡＴＦ５ペプチドは、細胞膜透過性領域を更に含み、ＡＴＦ５ペプチドが細胞膜透過性ペプチドとなる。いくつかの実施形態では、細胞膜透過性領域は、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２５）、ＲＱＬＫＬＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号２６）、ＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲ（配列番号４０）、及びＹＧＲＫＫＲＲＱＲＲ（配列番号４１）からなる群から選択されるアミノ酸配列を有する。
【００１０】
本発明の更なる態様は、アミノ酸配列ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫＬＥＧＥＣＱＧＬＥＡＲＮＲＥＬＫＥＲＡＥＳＶ（配列番号３）を含む多様体を含む細胞膜透過性ＡＴＦ５ペプチドであって、多様体が、（ｉ）Ｃ２１Ｇ（配列番号４）；（ｉｉ）Ｃ２１Ａ（配列番号５）；（ｉｉｉ）Ｑ２２Ａ（配列番号８）；（ｉｖ）Ｅ２０Ｒ、Ｅ２５Ｒ、Ｒ２７Ｅ、及びＫ３２Ｅ（配列番号９）；（ｖ）Ｎ２８Ｌ（配列番号７）；（ｖｉ）Ｓ３７Ａ（配列番号６）；（ｖｉｉ）Ｅ２０Ｒ、Ｅ２５Ｒ、Ｒ２７Ｅ、Ｎ２８Ｌ、Ｋ３２Ｅ、及びＳ３７Ａ（配列番号１０）；ならびに、（ｖｉｉｉ）Ｅ２０Ｒ、Ｃ２１Ａ、Ｅ２５Ｒ、Ｒ２７Ｅ、Ｎ２８Ｌ、Ｋ３２Ｅ、及びＳ３７Ａ（配列番号１１）からなる群から選択される、配列番号３の位置にて改変されている、細胞膜透過性ＡＴＦ５ペプチドを含む。
【００１１】
特定の実施形態において、ＡＴＦ５ペプチドは、アミノ酸逆配列に、本発明のＡＴＦ５ペプチドのＬ−アミノ酸配列に対応するＤ−アミノ酸を含む。一実施形態では、レトロ逆転ペプチドの短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域は、Ｄ−アミノ酸配列ＶＡＥＡＲＥＥＬＥＲＬＥＡＲＬＧＱＡＲＧＥＬ（配列番号６５）を有する。特定の実施形態では、レトロ逆転ペプチドは、Ｄ−アミノ酸配列ＶＡＥＡＲＥＥＬＥＲＬＥＡＲＬＧＱＡＲＧＥＬＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＬＫＬＱＲ（配列番号１４）を含む細胞膜透過性ＡＴＦ５ペプチドである。
【００１２】
いくつかの実施形態では、本発明のＡＴＦ５ペプチドは、延長ロイシンジッパー領域を含まない。
いくつかの実施形態では、本発明のＡＴＦ５ペプチドは、Ｎ末端アセチル基、及び／またはＣ末端アミド基を含む。
【００１３】
本発明のＡＴＦ５ペプチドを含む組成物もまた提供する。いくつかの実施形態では、組成物は医薬組成物である。本発明のＡＴＦ５ペプチドを含むキット、及び、本発明のＡＴＦ５ペプチドをコードする核酸分子を更に提供する。
【００１４】
本発明は、新生細胞における細胞毒性の促進に用いるための、本発明のＡＴＦ５ペプチドを提供する。本発明は更に、新生細胞の増殖の阻害に用いるための、本発明のＡＴＦ５ペプチドを提供する。本発明は更に、新生細胞における細胞毒性の促進方法であって、新生細胞を本発明のＡＴＦ５ペプチドと接触させることを含む方法を提供する。本発明は更に、新生細胞における増殖の阻害方法であって、新生細胞を本発明のＡＴＦ５ペプチドと接触させることを含む方法を提供する。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】Ａは、ＡＴＦ−５ペプチドＮＴＡｚｉｐ−ＡＴＦ５のアミノ酸配列（配列番号１）を示す。Ｂは、ＡＴＦ−５ペプチドＳＴ−２のアミノ酸配列（配列番号２）を示す。Ｃは、ＡＴＦ−５ペプチドＳＴ−３のアミノ酸配列（配列番号３）を示す。延長ロイシンジッパードメインには下線を引き、ペネトラチン細胞膜透過性ドメインは斜体字にし、ＡＴＦ−５ロイシンジッパードメインは太字にしている。
【図２】１つのシステインが置換されているＳＴ−３多様体のインビトロ活性を示す。
【図３】１つのアミノ酸置換がなされているＳＴ−３多様体のインビトロ活性を示す。
【図４】複数のアミノ酸置換がなされているＳＴ−３多様体のインビトロ活性を示す。
【図５】ＳＴ−１３、ＳＴ−１１のレトロ逆転版、ＳＴ−３多様体のインビトロ活性を示す。
【図６Ａ】ＨＬ６０ヒト前骨髄球性白血病細胞（ＰＭＬ）における、ＳＴ−１３対ＳＴ−３のインビトロ活性を示す。ＳＴ−３及びＳＴ−１３に対する、各細胞型におけるＥＣ５０値はそれぞれ、１９．０μＭ及び４．８μＭであった。
【図６Ｂ】急性骨髄性白血病細胞（ＡＭＬ１４）における、ＳＴ−１３対ＳＴ−３のインビトロ活性を示す。ＳＴ−３及びＳＴ−１３に対する、各細胞型におけるＥＣ５０値はそれぞれ、２９．６μＭ及び＜１μＭであった。
【図６Ｃ】急性骨髄性白血病細胞（ＳＥＴ２）における、ＳＴ−１３対ＳＴ−３のインビトロ活性を示す。ＳＴ−３及びＳＴ−１３に対する、各細胞型におけるＥＣ５０値はそれぞれ、９８．２μＭ及び１７．７μＭであった。
【図６Ｄ】黒色腫細胞（Ａ３７５）における、ＳＴ−１３対ＳＴ−３のインビトロ活性を示す。ＳＴ−３及びＳＴ−１３に対する、各細胞型におけるＥＣ５０値はそれぞれ、２１．８μＭ及び１．４μＭであった。
【図６Ｅ】乳癌細胞（ＭＣＦ７）における、ＳＴ−１３対ＳＴ−３のインビトロ活性を示す。ＳＴ−３及びＳＴ−１３に対する、各細胞型におけるＥＣ５０値はそれぞれ、５２．９μＭ及び＜１μＭであった。
【図７Ａ】ＨＬ６０ヒト前骨髄球性白血病細胞（ＰＭＬ）における、ＳＴ−１４のインビトロ活性を示す。ＳＴ−２及びＳＴ−１４に対するＥＣ５０値はそれぞれ、＞３００μＭ及び＜５μＭであった。
【図７Ｂ】急性骨髄性白血病細胞（ＡＭＬ１４）における、ＳＴ−１４のインビトロ活性を示す。
【図７Ｃ】グリア芽腫細胞（Ｕ２５１）における、ＳＴ−１４のインビトロ活性を示す。
【図７Ｄ】黒色腫細胞（Ａ３７５）における、ＳＴ−１４のインビトロ活性を示す。
【図７Ｅ】乳癌細胞（ＭＣＦ７）における、ＳＴ−１４のインビトロ活性を示す。
【図８Ａ】ＳＴ−１４での治療により、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２、ＢＩＲＣ５（スルビビン）、及びＡＴＦ５の発現が下方制御されることを示す。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ＲＮＡの発現を測定した。５μＭのＳＴ−１４で治療したＨＬ６０細胞における発現レベルを、治療後４時間におけるβ−アクチン発現に対して示す。
【図８Ｂ】ＳＴ−１４での治療により、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２、ＢＩＲＣ５（スルビビン）、及びＡＴＦ５の発現が下方制御されることを示す。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ＲＮＡの発現を測定した。５μＭのＳＴ−１４で治療したＨＬ６０細胞における発現レベルを、治療後２４時間におけるβ−アクチン発現に対して示す。
【図８Ｃ】ＳＴ−１４での治療により、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２、ＢＩＲＣ５（スルビビン）、及びＡＴＦ５の発現が下方制御されることを示す。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ＲＮＡの発現を測定した。０、２０、または４０μＭのＳＴ−１４で治療したＵ２５１細胞における発現レベルを、治療後４時間におけるβ−アクチン発現に対して示す。
【図８Ｄ】ＳＴ−１４での治療により、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ−２、ＢＩＲＣ５（スルビビン）、及びＡＴＦ５の発現が下方制御されることを示す。逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）により、ＲＮＡの発現を測定した。０、２０、または４０μＭのＳＴ−１４で治療したＨＬ６０細胞における発現レベルを、治療後２４時間におけるβ−アクチン発現に対して示す。
【図９】ＨＬ６０の皮下腫瘍モデルにおける、ＳＴ−３多様体の抗腫瘍活性を示す。Ｎｕ／Ｊマウスを、２５ｍｇ／ｋｇのＢＩＤ−ＩＰで治療した（ｎ＝１群あたり６〜７匹）。
【図１０Ａ】Ｕ２５１の皮下腫瘍モデルにおける、ＳＴ−１４の抗腫瘍活性を示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、１週間あたり５０ｍｇ／ｋｇのＳＣで、３週間治療した。平均の開始腫瘍体積は、約２４０ｍｍ３であった。平均腫瘍体積を示す。データ点は、平均±ＳＥＭを表す；ｐ＜０．０００１、ｎ＝各時点における、群あたりの生残動物数。
【図１０Ｂ】Ｕ２５１の皮下腫瘍モデルにおける、ＳＴ−１４の抗腫瘍活性を示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、１週間あたり５０ｍｇ／ｋｇのＳＣで、３週間治療した。平均の開始腫瘍体積は、約２４０ｍｍ３であった。生残率を示す。データ点は、平均±ＳＥＭを表す；ｐ＜０．０００１、ｎ＝各時点における、群あたりの生残動物数。
【図１０Ｃ】Ｕ２５１の皮下腫瘍モデルにおける、ＳＴ−１４の抗腫瘍活性を示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、１週間あたり５０ｍｇ／ｋｇのＳＣで、３週間治療した。平均の開始腫瘍体積は、約２４０ｍｍ３であった。個別の腫瘍体積を示す。データ点は、平均±ＳＥＭを表す；ｐ＜０．０００１、ｎ＝各時点における、群あたりの生残動物数。
【図１１Ａ】ＳＴ−１４の早期または遅延投与は、ＭＣＦ７乳癌細胞における有意な抗腫瘍活性を有することを示す。腫瘍播種の２日後に開始する３週間の間、１週間あたり２５ｍｇ／ｋｇのＳＣで３回、Ｎｕ／Ｊマウスを治療した。平均の開始腫瘍体積は、約２８０〜３３０ｍｍ３であった。播種：ビヒクル群においては、２×１０６細胞；ＳＴ−１４群においては、２×１０６細胞。データ点は平均±ＳＥＭを表す；ｐ＜０．０００１。
【図１１Ｂ】ＳＴ−１４の早期または遅延投与は、ＭＣＦ７乳癌細胞における有意な抗腫瘍活性を有することを示す。腫瘍播種の５９日後に開始する３週間の間、１週間あたり２５ｍｇ／ｋｇのＳＣで３回、Ｎｕ／Ｊマウスを治療した。平均の開始腫瘍体積は、約２８０〜３３０ｍｍ３であった。播種：ビヒクル群においては、２×１０６細胞；ＳＴ−１４群においては、５×１０６細胞。データ点は平均±ＳＥＭを表す；ｐ＜０．０００１。
【図１２】ＨＬ６０皮下腫瘍モデルにおける、ＳＴ−１４の抗腫瘍活性を示す。Ｎｕ／Ｊマウスを、１週間あたり２０ｍｇ／ｋｇのＳＣで、３週間治療した。平均の開始腫瘍体積は、約２２０ｍｍ３であった。データ点は平均±ＳＥＭを表す；ｐ＜０．０５。
【図１３】Ａ３７５皮下腫瘍モデルにおける、ＳＴ−１４の抗腫瘍活性を示す。ＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを、１日２回、２５ｍｇ／ｋｇのＳＣで、３週間治療した。平均の開始腫瘍体積は、約２５０〜３４４ｍｍ３であった。データ点は平均±ＳＥＭを表す；ｐ＝０．００２。
【発明の詳細な説明】
【００１６】
本発明の実践では、特に断りのない限り、当業者の範囲内である、薬学、製剤科学、タンパク質化学、細胞生物学、細胞培養、分子生物学、微生物学、組み換えＤＮＡ、及び免疫学の従来の技術を用いる。
【００１７】
本発明をより速やかに理解可能にするために、特定の用語をまず定義する。更なる定義は、本開示を通して説明する。別段定めがない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、本発明が関係する当業者により一般に理解されるのと同じ意味を有する。
【００１８】
本明細書において提供するあらゆる表題は、本発明の種々の態様または実施形態の限定ではなく、これらは、明細書全体を参照することにより有することができる。したがって、以下で速やかに定義される用語は、明細書全体を参照することにより、一層完全に定義される。
【００１９】
本開示に引用される参照文献は全て、その全体を本明細書に援用するものである。更に、本明細書で引用または言及されるあらゆる製品に関する、あらゆるメーカーの指示またはカタログは、参照により組み込まれる。本テキストに参照により組み込まれている文書、またはそれらの中にあらゆる教示を、本発明の実践において使用することができる。本テキストに参照により組み込まれている文書は、先行技術であるとは認められない。
Ｉ．定義
本開示における専門語または用語は、説明のためのものであり、限定を行うものではなく、本明細書の用語または専門語は、教示及び案内の見地から、当業者により解釈可能なものである。
【００２０】
本明細書及び添付の特許請求の範囲において使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈で明確に別様が規定されない限り、複数への言及を含む。用語「ａ」（または「ａｎ」）、ならびに用語「１つ以上の」及び「少なくとも１つの」は、同じ意味で用いることができる。
【００２１】
更に、「及び／または」は、別の構成成分または特徴を含む、または含まない、２つの具体的な特徴または構成成分のそれぞれの、具体的な開示として解釈される。したがって、「Ａ及び／またはＢ」などの、フレーズで用いられる場合の用語「及び／または」は、Ａ及びＢ、ＡまたはＢ、Ａ（のみ）、及びＢ（のみ）を含むことを目的としている。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／またはＣ」などのフレーズで用いられる場合の用語「及び／または」は、Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、またはＣ；ＡまたはＢ；ＡまたはＣ；ＢまたはＣ；Ａ及びＢ；Ａ及びＣ；Ｂ及びＣ；Ａ（のみ）；Ｂ（のみ）；及びＣ（のみ）を含むことが意図される。
【００２２】
言語「〜を含む」と共に実施形態が説明されている場合はいつでも、「〜からなる」及び／または「〜から本質的になる」の点で説明される別様の類似の実施形態が含まれる。
単位、接頭辞、及び記号は、国際単位系（ＳＩ）が認可する形態で表される。数値範囲は、その範囲を画定する数を含み、本明細書において提供されるあらゆる個別の値は、本明細書において提供される他の個別の値を含む範囲の終点として機能することができる。例えば、１、２、３、８、９、及び１０などの値の集合は、１〜１０、１〜８、３〜９などの数字範囲の開示でもある。同様に、開示された範囲は、その範囲により包含される各個別の値の開示である。例えば、５〜１０の定められた範囲は、５、６、７、８、９、及び１０の開示でもある。
【００２３】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、本明細書では同じ意味で用いられ、任意の長さのアミノ酸のポリマー、及びそれらの塩を意味する。ポリマーは直鎖または分枝鎖であることができ、改変アミノ酸を含むことができ、非アミノ酸により中断されることができる。例えば、本明細書で説明する、一般的でない、または非天然のアミノ酸の略称に関して、別様に示される場合を除き、当該技術分野で使用される３文字及び１文字の略称を本明細書で使用して、アミノ酸残基を表す。「Ｄ」が前に付いている、または小文字である場合を除いて、アミノ酸はＬ−アミノ酸である。ひとまとまり、またはひと続きのアミノ酸の略称を使用して、ペプチドを表す。具体的に示される場合を除いて、ペプチドは左のＮ末端と共に表され、配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって記述される。
【００２４】
用語「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」は、自然に改変された、または介入；例えば、ジスルフィド結合形成、ラクタムブリッジ形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、アシル化、アミド化、リン酸化、または、他の操作もしくは改変、例えば、標識構成成分とのコンジュゲーション、または保護基の付加により改変されたアミノ酸ポリマーもまた包含する。この定義には例えば、アミノ酸の１つ以上の類似体（例えば、アミノ−イソ酪酸（Ａｉｂ）、非天然アミノ酸など）を含有するポリペプチド、及び、Ｄ−アミノ酸、加えて当該技術分野において公知の他の改変を含む、またはそれらからなるポリペプチドもまた含まれる。特定の実施形態において、ポリペプチドは一本鎖、共有二量体、または、非共有会合鎖として生じることができる。ポリペプチドは環形態であることもまた可能である。環式ポリペプチドは例えば、遊離アミノ及び遊離カルボキシル基をブリッジングすることにより調製することができる。環式化合物の形成は、必要な場合は好適な保護を行い、脱水剤により処理することで達成することができる。開鎖（直鎖形態）から環形態への反応には、分子内環化を伴うことができる。環式ポリペプチドは、他の当該技術分野において既知の方法、例えば、１つ以上のラクタムブリッジ、水素結合サロゲート（Ｐａｔｇｉｒｉ  ｅｔ  ａｌ．２００８）、炭化水素ステープル（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００）、トリアゾールステープル（Ｌｅ  Ｃｈｅｖａｌｉｅｒ  Ｉｓａａｄ  ｅｔ  ａｌ．２００９）、またはジスルフィドブリッジ（Ｗａｎｇ  ｅｔ  ａｌ．２００６）を使用することによってもまた、調製することができる。ブリッジまたはステープルは例えば、３、４、７、または８アミノ酸離れて離間することができる。
【００２５】
用語「多様体」とは、参照配列と比較して、１つ以上のアミノ酸置換基、欠失、及び／または挿入を有するペプチドを意味する。欠失及び挿入は、内部における、及び／または１つ以上の末端におけるものであることができる。置換は、１つ以上のアミノ酸を、同様もしくは相同のアミノ酸（複数可）、または異なるアミノ酸（複数可）で置き換えることを含むことができる。例えば、いくつかの多様体は、１つ以上のアミノ酸の位置におけるアラニン置換を含む。他の置換としては、タンパク質の全体の実効電荷、極性、または疎水性にほとんど、または全く影響を有しない保存的置換が挙げられる。いくつかの多様体は、アミノ酸の電荷または極性を変える、非保存的置換を含む。置換は、アミノ酸のＬ形態またはＤ形態のいずれかを伴うものであることができる。
【００２６】
「レトロ逆転」ペプチドは、参照Ｌ−アミノ酸に対して、逆転したアミノ酸配列を有し、（アミノ酸サブユニットのα中心キラリティを反転させる）Ｄ−アミノ酸で作製され、元のＬ−アミノ酸ペプチドの側鎖トポロジーに類似の、側鎖トポロジーを維持するのに役立つ。
【００２７】
本明細書で使用する場合、用語「保存的置換」とは、１つ以上のアミノ酸が別の、生物学的に類似の残基で置き換えられていることを意味する。例としては、類似の特徴を有するアミノ酸残基、例えば小型アミノ酸、酸性アミノ酸、極性アミノ酸、塩基性アミノ酸、疎水性アミノ酸、及び芳香族アミノ酸で置き換えることが挙げられる。ペプチド及びタンパク質における、表現型的にサイレントな置換に関する更なる情報については、例えば、Ｂｏｗｉｅ  ｅｔ．ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ２４７：１３０６−１３１０（１９９０）を参照のこと。以下のスキームにおいて、アミノ酸の保存的置換を、物理化学的性質により区分する；Ｉ：中性及び／または親水性、ＩＩ：酸性及びアミド、ＩＩＩ：塩基性、ＩＶ：疎水性、Ｖ：芳香族、嵩高いアミノ酸。
【００２８】
【表１】
2021508503.tif 000002
【００２９】
以下のスキームにおいて、アミノ酸の保存的置換を、物理化学的性質により区分する；ＶＩ：中性または疎水性、ＶＩＩ：酸性、ＶＩＩＩ：塩基性、ＩＸ：極性、Ｘ：芳香族。
【００３０】
【表２】
2021508503.tif 000003
【００３１】
タンパク質の機能に影響を与えない保存的ヌクレオチド及びアミノ酸置換を識別する方法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｂｒｕｍｍｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍ．３２：１１８０−１１８７（１９９３）；Ｋｏｂａｙａｓｈｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ  Ｅｎｇ．１２（１０）：８７９−８８４（１９９９）；及びＢｕｒｋｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：４１２−４１７（１９９７）を参照のこと）。
【００３２】
２つ以上の核酸またはペプチドの関係における、用語「同一の」またはパーセント「同一性」とは、配列同一性の一部としてのあらゆる保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大に対応するように比較及びアライン（必要であればギャップを導入する）したときに、同じである２つ以上の配列もしくはサブ配列、または、特定の割合で、同じであるヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有することを意味する。パーセント同一性は、配列比較ソフトウェアもしくはアルゴリズムを使用して、または目視検査により、測定することができる。アミノ酸またはヌクレオチド配列のアラインメントを得るために使用可能な様々なアルゴリズム及びソフトウェアは、当技術分野において既知である。
【００３３】
配列アラインメントアルゴリズムの１つの非限定例は、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，９０：５８７３−５８７７（１９９３）において改変されているように、Ｋａｒｌｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，８７：２２６４−２２６８（１９９０）に記載されており、ＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．，２５：３３８９−３４０２（１９９１））。特定の実施形態において、Ｇａｐｐｅｄ  ＢＬＡＳＴを、Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓ．２５：３３８９−３４０２（１９９７）に記載されているとおりに使用することができる。ＢＬＡＳＴ−２、ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２（Ａｌｔｓｃｈｕｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｉｎ  Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，２６６：４６０−４８０（１９９６））、ＡＬＩＧＮ、ＡＬＩＧＮ−２（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｓｏｕｔｈ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）、またはＭｅｇａｌｉｇｎ（ＤＮＡＳＴＡＲ）は、配列を揃えるのに使用可能な、一般に入手可能な更なるソフトウェアプログラムである。特定の実施形態において、２つのヌクレオチド配列間のパーセント同一性は、（例えば、ＮＷＳｇａｐｄｎａ．ＣＭＰマトリックス、ならびに４０、５０、６０、７０、または９０のギャップ重み、及び１、２、３、４、５、または６の長さ重みを使用して）ＧＣＧソフトウェアパッケージのＧＡＰプログラムを使用して、決定される。特定の代替実施形態において、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ及びＷｕｎｓｃｈのアルゴリズム（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（４８）：４４４−４５３（１９７０））を組み込む、ＧＣＧソフトウェアパッケージでのＧＡＰプログラムを使用して、（例えば、ＢＬＯＳＵＭ  ６２マトリックスまたはＰＡＭ２５０マトリックスのいずれか、ならびに、１６、１４、１２、１０、８、６、または４のギャップ重み、及び１、２、３、４、５の長さ重みを使用して）２つのアミノ酸配列間でのパーセント同一性を測定することができる。あるいは、特定の実施形態において、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列間のパーセント同一性は、Ｍｙｅｒｓ及びＭｉｌｌｅｒのアルゴリズム（ＣＡＢＩＯＳ  ４：１１−１７（１９８９））を使用して測定する。例えば、ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）を使用して、かつ、残基表を含むＰＡＭ１２０、１２のギャップ長ペナルティ、及び４のギャップペナルティを使用して、パーセント同一性を測定することができる。当業者は、特定のアラインメントソフトウェアにより、最大アラインメントに対する適切なパラメーターを測定することができる。特定の実施形態において、アラインメントソフトウェアのデフォルトパラメーターを使用する。同一性を計算するための他の方策としては、Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｌｅｓｋ  ｅｄ．，１９８８）；Ｂｉｏｃｏｍｐｕｔｉｎｇ：Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ  ａｎｄ  Ｇｅｎｏｍｅ  Ｐｒｏｊｅｃｔｓ（Ｓｍｉｔｈ  ｅｄ．，１９９３）；Ｃｏｍｐｕｔｅｒ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ｄａｔａ��Ｐａｒｔ  １（Ｇｒｉｆｆｉｎ  ａｎｄ  Ｇｒｉｆｆｉｎ  ｅｄｓ．，１９９４）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｇ．ｖｏｎ  Ｈｅｉｎｊｅ，１９８７）；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  Ｐｒｉｍｅｒ（Ｇｒｉｂｓｋｏｖ  ｅｔ  ａｌ．ｅｄｓ．，１９９１）；及びＣａｒｉｌｌｏ  ｅｔ  ａｌ．，ＳＩＡＭ  Ｊ．Ａｐｐｌｉｅｄ  Ｍａｔｈ．，４８：１０７３（１９８８）に記載される方法が挙げられる。
【００３４】
本明細書で使用する場合、「ポリヌクレオチド」は、１つ以上の「核酸」、「核酸分子」、または「核酸配列」を含むことができ、あらゆる長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡを含む。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチドもしくは塩基、及び／またはそれらの類似体、あるいは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼにより、ポリマーに組み込むことができる任意の基質であることができる。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体などの修飾ヌクレオチドを含むことができる。前述の説明は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含む、本明細書で言及する全てのポリヌクレオチドに適用される。
【００３５】
「単離された」分子とは、精製されているものを含む、自然では見られない形態の分子である。
「標識」は、「標識された」分子を生成するために、分子に直接的または間接的にコンジュゲートできる検出可能な化合物である。標識は、それ自体が検出可能であることができる（例えば、放射性同位体標識もしくは蛍光標識）、または、例えば、検出可能な基質化合物もしくは組成物（例えば酵素標識）の、触媒による化学変異により、もしくは、間接検出の他の方法（例えばビオチン化）により、間接的に検出することができる。
【００３６】
「結合親和性」とは一般に、分子の１つの結合部位とその結合パートナー（例えば、受容体とそのリガンド、抗体とその抗原、二量体を形成する２つの単量体など）の、非共有相互作用の合計の強さを意味する。別段の定めがない限り、本発明で使用する場合、「結合親和性」とは、結合ペアの要素間の１：１の相互作用を反映する固有の結合親和性を意味する。分子ＸのそのパートナーＹに対する親和性は一般に、解離定数（ＫＤ）で表される。親和性は、本明細書に開示されるものを含む、当該技術分野において既知の一般的な方法により測定可能である。低親和性結合パートナーは、一般的にゆっくりと結合し、速やかに解離する傾向にあるが、高親和性結合パートナーは、一般的により素早く結合し、長時間、結合を持続している傾向にある。
【００３７】
分子の、その結合パートナーに対する親和性または結合活性は、当該技術分野において公知の任意の好適な方法、例えば、フローサイトメトリー、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、またはラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、またはキネティクス（例えばＫＩＮＥＸＡ（登録商標）、もしくはＢＩＡＣＯＲＥ（商標）、もしくはＯＣＴＥＴ（登録商標）分析）を使用して、実験により測定することができる。直接結合アッセイ、及び競合結合アッセイフォーマットを速やかに用いることができる（例えば、Ｂｅｒｚｏｆｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａｎｔｉｂｏｄｙ−Ａｎｔｉｇｅｎ  Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ，”ｉｎ  Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｐａｕｌ，Ｗ．Ｅ．，ｅｄ．，Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９８４）；Ｋｕｂｙ，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，Ｗ．Ｈ．Ｆｒｅｅｍａｎ  ａｎｄ  Ｃｏｍｐａｎｙ：Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．（１９９２）を参照のこと）。異なる条件（例えば、塩濃度、ｐＨ、温度）下にて測定した場合、特定の結合ペアの相互作用について測定した親和性は、変化する可能性がある。したがって、親和性、及び他の結合パラメーター（例えば、ＫＤまたはＫｄ、Ｋｏｎ、Ｋｏｆｆ）の測定は、当技術分野において既知のとおり、結合パートナーの標準化した溶液、及び標準化した緩衝液を用いて作製される。
【００３８】
「活性剤」とは、生物活性を得ることを意図する成分である。活性剤は、１つ以上の他の成分と会合することができる。ペプチドである活性剤はまた、「活性ペプチド」と呼ぶことができる。
【００３９】
「有効量」の活性剤とは、述べた特定の目的を実行するのに十分な量である。
用語「医薬組成物」とは、活性成分の生物学的活性を効果的にすることができる形態であり、その組成物が投与されるであろう対象に、許容できない程の毒性である更なる成分を含まない調製物を意味する。このような組成物は滅菌されていることが可能であり、生理食塩水などの、製薬上許容できる担体を含むことができる。好適な医薬組成物は、緩衝液（例えばアセテート、ホスフェート、もしくはシトレート緩衝液）、界面活性剤（例えばポリソルベート）、安定化剤（例えばポリオールもしくはアミノ酸）、防腐剤（例えば安息香酸ナトリウム）、及び／または、その他の従来の可溶化剤もしくは分散剤の１つ以上を含むことができる。
【００４０】
「対象」または「個体」または「動物」または「患者」または「哺乳類」とは、診断、予後、または治療が所望される任意の対象、特に哺乳類対象である。哺乳類対象としては、例えば、ヒト、非ヒト霊長類、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマ、ラット及びマウスを含む齧歯類、ウサギなどを含む、ヒト、家庭用動物、家畜、スポーツ用動物、及び実験動物が挙げられる。
【００４１】
用語「阻害する」、「遮断する」、及び「抑制する」は同じ意味で用いられ、発生または活性の完全な遮断を含む、発生または活性における、統計的に有意なあらゆる低下を意味する。例えば、「阻害」とは、活性または発生における、約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または１００％の低下を意味することができる。「阻害剤」とは、プロセス、経路、または分子の発生または活性において、統計的に有意な低下を生み出す分子、因子、または物質である。
【００４２】
「新生細胞」または「新生物」は通常、なんらかの形態の変異／形質転換を受けており、同じタイプの通常の細胞または組織と比較して、異常な増殖がもたらされる。新生物は、形態的な不規則性、同様に、病理学的な増殖を含む。新生細胞は良性または悪性であることができる。悪性新生物、すなわち、がんは、細胞の分化及び配置の喪失を示し、浸潤及び転移の性質を有するという点で、良性と区別される。
【００４３】
「充実性腫瘍」とは、新生細胞の塊である。「液性腫瘍」または「血液学的悪性」とは、骨髄またはリンパ系系統の血液癌である。
ＩＩ．ＡＴＦ５ペプチド及び組成物
ＡＴＦ５ペプチド
ＡＴＦ５は、Ｎ末端酸性活性化ドメイン、及びＣ末端塩基性ロイシンジッパー（ｂＺＩＰ）ドメインを有する、２８２アミノ酸の真核細胞転写因子である。ｂＺＩＰドメインは、ＤＮＡ結合領域及びロイシンジッパー領域を含有する。ロイシンジッパーは、二量体化ドメインにおいて、通常、７つのアミノ酸毎にロイシンを有する、一般構造モチーフである。ｂＺＩＰ転写因子は、ロイシンジッパーを介してホモ及び／またはヘテロ二量体化し、ＤＮＡに特異的に結合する。野生型ヒト、ラット、及びマウスＡＴＦ５は、それぞれ、ＮＣＢＩ寄託番号ＮＰ＿００１１８０５７５、ＮＰ＿７５８８３９、及びＮＰ＿１０９６１８に説明されているアミノ酸配列を有する。
【００４４】
ＮＴＡｚｉｐ−ＡＴＦ５（図１Ａ）は、ＡＴＦ５のＮ末端活性化ドメインが欠失し、ＤＮＡ結合ドメインが、改変強化ロイシンジッパー、即ち、７つの残基毎に、ロイシンを有する７塩基の繰り返しを含有する、両親媒性の酸性α−ヘリックス配列で置き換えられている、ＡＴＦ５ペプチドであり、野生型のＡＴＦ５ロイシンジッパー領域に延びる（Ａｎｇｅｌａｓｔｒｏ  ｅｔ  ａｌ．２００３）。細胞膜透過性のドミナントネガティブＡＴＦ５（ＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５）分子は、ＮＴＡｚｉｐ−ＡＴＦ５の改善版であり、（野生型と比較して）延びたロイシンジッパー配列と共に、細胞膜透過性ドメイン、及び短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー配列を含有する（ＵＳ２０１６／００４６６８６；Ｋａｒｐｅｌ−Ｍａｓｓｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）。ＣＰ−ｄ／ｎ  ＡＴＦ５分子の例を、図１Ｂに示す。本明細書で使用する場合、用語「延びたロイシンジッパー」、「ロイシンジッパー延長」、及び「強化ロイシンジッパー」とは、１〜４つのロイシン７塩基、即ちＬｅｕ−（Ｘ）６（配列番号５２）（この配列は野生型のＡＴＦ５ロイシンジッパー配列ではない）を有するペプチドを意味する。
【００４５】
ＳＴ−３（図１Ｃ）は、ロイシンジッパー延長を欠くＣＰ−ｄ／ｎ−ＡＴＦ５分子の多様体であり、新生細胞にて細胞死を誘発する。ドミナントネガティブｂＺＩＰ阻害剤の安定性及び阻害活性のために、強化ロイシンジッパー領域が必要とされることが、以前の研究で示された（Ｋｒｙｌｏｖ  ｅｔ  ａｌ．１９９５；Ｏｌｉｖｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｍｏｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ａｃｈａｒｙａ  ｅｔ  ａｌ．２００６）。それ故、延長ロイシンジッパー領域の不存在下において、ＳＴ−３が、新生細胞を特異的に標的にして殺傷する能力を保持しているという発見は、予想されなかった。
【００４６】
ＳＴ−３ロイシンジッパー配列（配列番号５３）を含むＡＴＦ５ペプチドの、非保存的多様体は、新生細胞において細胞死を誘発することを、本発明者らは発見した。本発明のＡＴＦ５由来のペプチドが、ＳＴ−３ロイシンジッパー領域に対する複数の非保存的アミノ酸置換を有する新生細胞を特異的に標的にして殺傷する能力を保持しているという発見を、本発明に先立って予想することは不可能であった。ＳＴ−３のレトロ逆転多様体は、活性であるだけでなく、ＳＴ−３に対して増加した活性を有しており、これは予想されなかった。
【００４７】
本発明は、短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域、及び所望により、細胞膜透過性領域を有するＡＴＦ５ペプチドを提供する。本発明のＡＴＦ５ペプチドは、そのペプチドが導入される細胞において、ＡＴＦ５活性を妨げることができる。いくつかの実施形態では、ＡＴＦ５ペプチドは、アポトーシスに関与する経路に影響を及ぼすことができる。ＡＴＦ５活性は、本明細書で記載される細胞殺傷アッセイを含む、当該技術分野において公知のいくつかのアッセイのいずれかにより、評価することができる。ＡＴＦ５活性は、ｃＡＭＰ応答エレメント（ＣＲＥ）への結合能によってもまた、評価することができる。
【００４８】
「ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域」は、野生型ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域に由来する短縮配列である。この用語は配列のみを指すために使用され、必ずしも二次構造を指すものではない。短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域は例えば、表１に示すアミノ酸配列を有することができる。ＳＴ−３ロイシンジッパー配列（配列番号５３）を、参照点として示す。配列番号５３における置換を、下線付き太字で示す。
【００４９】
【表３】
2021508503.tif 000004
【００５０】
ロイシンジッパー領域は、レトロ逆転形態であることができる。一実施形態では、レトロ逆転ロイシンジッパー領域は、配列ＶＡＥＡＲＥＥＬＥＲＬＥＡＲＬＧＱＡＲＧＥＬ（配列番号６５）を有する。
【００５１】
これらの配列の多様体もまた、本発明の範囲に含まれる。本発明のＡＴＦ５ペプチドは、本明細書にて開示したこれらの配列と、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性の、ロイシンジッパー領域を有することができる。
【００５２】
ＡＴＦ５ペプチドが細胞膜透過性領域を含む実施形態において、細胞膜透過性領域は、短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域に作用可能に結合している。いくつかの実施形態では、細胞膜透過性領域は短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域に、例えば、ペプチド結合、ジスルフィド結合、チオエーテル結合、または当該技術分野において公知のリンカーを介して、共有結合している（例えば、Ｋｌｅｉｎ  ｅｔ  ａｌ．２０１４を参照のこと）。例示的なリンカーとしては、置換アルキルまたは置換シクロアルキルが挙げられるが、これらに限定されない。リンカーは、ペプチドが送達された後で開裂可能であることができる。アミド結合により直接結合された細胞膜透過性領域とＡＴＦ５ロイシンジッパー領域は、「融合」と呼ばれる場合がある。融合は、活性ペプチドに関して上で論じたとおりに、細胞膜透過性領域とＡＴＦ５ロイシンジッパー領域との間に、アミノ酸リンカー配列を含有することができる。細胞膜透過性領域は、短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域のＮ末端もしくはＣ末端に、または、残基側鎖を介して、結合することができる。細胞膜透過性領域及び短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域は、同じ、または逆のキラリティを有することができる。
【００５３】
本発明の細胞膜透過性ＡＴＦ５ペプチドは、本明細書にて開示した、細胞膜透過性ドメイン及びＡＴＦ５ロイシンジッパードメインの任意の組み合わせを含むことができる。そのようなペプチドの非限定例を、表２に示す。細胞膜透過性領域は斜体字である。ＳＴ−３配列に対する置換を、下線付き太字で示す。
【００５４】
【表４】
2021508503.tif 000005
【００５５】
本発明のＡＴＦ５ペプチドのレトロ逆転形態もまた含まれる。一実施形態では、ＡＴＦ５ペプチドは、細胞膜透過性領域を含み、Ｄ−アミノ酸配列
【００５６】
【化１】
2021508503.tif 000006
【００５７】
（配列番号１３）を有するレトロ逆転ペプチドである、ＳＴ−１３である。別の実施形態では、ＡＴＦ５ペプチドは、細胞膜透過性領域を含み、
Ｄ−アミノ酸配列
【００５８】
【化２】
2021508503.tif 000007
【００５９】
（配列番号１４）を有するレトロ逆転ペプチドである、ＳＴ−１４である。細胞膜透過性領域は斜体字である。ＳＴ−３配列（配列番号３）に対する置換を、下線付き太字で示す。
【００６０】
本発明のＡＴＦ５ペプチドは、終点として、以下の長さのいずれかを有する範囲を含む、長さが、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、または６０アミノ酸、例えば、２２〜３８アミノ酸であるのが好ましい。
【００６１】
本発明のＡＴＦ５ペプチドは、本明細書にて開示した配列に対して、少なくとも約８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有するペプチドを含む。
【００６２】
ＡＴＦ５ペプチドは、改変Ｎ末端及び／または改変Ｃ末端を有することができる。例えば、ＡＴＦ５ペプチドは所望により、Ｎ末端アセチル基、及び／またはＣ末端アミド基を含むことができる。
【００６３】
本発明のＡＴＦ５ペプチドは所望により、環式であることができる。例えば、ＡＴＦ５ペプチドは１つ以上のラクタムブリッジを含むことができる。ラクタムブリッジは、必ずしもではないが、４つのアミノ酸残基を離して離間されている側鎖の間に作製されるのが好ましい（ＢｘｘｘＢ）。ラクタムブリッジは例えば、ＡｓｐまたはＧｌｕと、Ｌｙｓとの側鎖の間に形成されることができる。アミノ酸置換をラクタムブリッジの部位にて作製し、結合を容易にすることができる。
【００６４】
本発明のＡＴＦ５ペプチドは所望により、精製または検出のためなどの、１つ以上のエピトープ及び／または親和性タグを含むことができる。このようなタグの非限定例としては、ＦＬＡＧ、ＨＡ、Ｈｉｓ、Ｍｙｃ、ＧＳＴなどが挙げられる。本発明のＡＴＦ５ペプチドは所望により、１つ以上の標識を含むことができる。
【００６５】
特定の態様において、本発明は組成物、例えば、本発明のＡＴＦ５ペプチドを含み、所望により、１種以上の担体、希釈剤、賦形剤、またはその他の添加剤を更に含む医薬組成物を提供する。
【００６６】
本明細書において提供するＡＴＦ５ペプチド及び組成物、ならびに所望により、使用のための指示を含むキットもまた、本発明の範囲内である。キットは、少なくとも１つの追加の試薬、及び／または１つ以上の追加の活性剤を更に含有することができる。キットは通常、キットの内容物の意図される使用を示す標識を含む。用語「キット」は、キット上に、もしくはキットとともに提供される、または別様においては、キットに付属する、あらゆる、記述または記録された材料を含む。
【００６７】
本発明のＡＴＦ５ペプチドは、ＡＴＦ５標的遺伝子Ｂｃｌ−２、Ｍｃｌ−１、及びスルビビンを含むがこれらに限定されない、一連の遺伝子の分化遺伝子発現を容易にする。具体的には、ＡＴＦ５ペプチドは、細胞生残、増殖、及び柔軟性と関連する、ＡＴＦ５標的遺伝子の発現をノックダウンする。したがって、ＡＴＦ５ペプチドを使用して、細胞死の誘発、細胞増殖の減少、または細胞分化の活性化を、行うことができる。特定の実施形態において、本発明のＡＴＦ５ペプチドを使用して、新生細胞の増殖を阻害する、及び／または新生細胞における細胞毒性を促進する。本明細書で記載する細胞殺傷アッセイを含む、既知のアッセイにより、増殖及び細胞毒性を測定することができる。
細胞の標的化
当該技術分野において既知の方法により、本発明のＡＴＦ５ペプチドを標的細胞に導入することができる。選択される導入方法は例えば、目的の用途に応じて左右される。
【００６８】
場合によっては、ＡＴＦ５ペプチドをコードするＤＮＡまたはＲＮＡを標的細胞に送達し、この中で発現させることができる。用途に応じて、任意の好適なベクターを介して、送達を達成することができる。ベクターの例としては、例えば、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、及びエンベロープ偽型ウイルスを含むレトロウイルスから調製した、プラスミド、コスミド、ファージ、細菌、酵母菌、及びウイルスベクターが挙げられる。ベクターは、例えばナノ粒子、流体力学的送達、電気穿孔法、超音波穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、または、ＤＥＡＥ−デキストランなどのカチオン性ポリマーを使用して、細胞に導入することができる。ベクターを、例えばリポソーム中に封入した、または、カチオン性縮合剤と会合させた脂質と複合体化することができる。
【００６９】
細胞受容体を利用するメカニズムを介して、本発明のＡＴＦ５ペプチドを細胞に送達することができる。このようなメカニズムの例としては、抗体薬物複合体、キメラ抗原受容体、及びインテグリン標的化、ＲＧＤ様配列が挙げられる。ＲＧＤ様配列の例としては、ＧＲＧＤＳ（配列番号７２）及びＧＲＧＤＮＰ（配列番号７３）が挙げられる。本発明のＡＴＦ５ペプチドは、本明細書に記載したとおりに、または、当該技術分野において公知の任意の方法により結合した、１つ以上のＲＧＤ様配列、例えば、２、３、４、または５個のＲＧＤ様配列を含むことができる。１つ以上のＲＧＤ様配列（複数可）を、ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域のＮ末端またはＣ末端側に組み込むことができる。そのようなＲＧＤ様配列は、互いに独立して、かつ、ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域と独立して、レトロ逆転形態に存在することもまた可能である。あるいは、ＡＴＦ５ペプチドを、エクソソームもしくはリポソームなどのベシクル、またはミセルに封入し、細胞に送達することができる。ＡＴＦ５ペプチドを細胞に導入するための別の方法としては、例えば、炭化水素ステープル（Ｂｅｒｎａｌ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｂｉｒｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１６）、または、当該技術分野において既知のその他の環化方法を使用しての、環化によるものがある。
【００７０】
本発明の特定のＡＴＦ５ペプチドは、細胞膜透過性ドメインまたは細胞膜透過性ペプチド（ＣＰＰ）を含む。用語「細胞膜透過性ドメイン」、「細胞膜透過性領域」、及び「細胞膜透過性ペプチド」は、本明細書では同じ意味で用いられる。
【００７１】
ＣＰＰは、細胞膜を超えることができる、短い（典型的には、約６〜４０アミノ酸の）ペプチドである。多くのＣＰＰが、血液脳関門（ＢＢＢ）を超えることができる。いくつかの実施形態では、ＣＰＰは、終点として、以下の長さのいずれかを有する範囲を含む、長さが７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、または３９アミノ酸、例えば、１０〜３０アミノ酸である。ＣＰＰは、ポリペプチド、ポリヌクレオチド、及びナノ粒子などの、共有結合した、または非共有結合した分子カーゴを、細胞膜及びＢＢＢを超えて輸送する能力を有する。転座は、転座によるエンドサイトーシス性、またはエネルギー依存性（即ち非エンドサイトーシス性）であることができる。多数のＣＰＰが、文献に記載され、識別されている（例えば、Ｈａｎｄｂｏｏｋ  ｏｆ  Ｃｅｌｌ−Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（２ｄ  ｅｄ．Ｕｌｏ  Ｌａｎｇｅｌ  ｅｄ．，２００７）；Ｈｅｒｖｅ  ｅｔ  ａｌ．２００８；Ｈｅｉｔｚ  ｅｔ  ａｌ．２００９；Ｍｕｎｙｅｎｄｏ  ｅｔ  ａｌ．２０１２；Ｚｏｕ  ｅｔ  ａｌ．２０１３；Ｋｒａｕｔｗａｌｄ  ｅｔ  ａｌ．２０１６を参照のこと）。ＣＰＰのキュレーションされたデータベースは、ｃｒｄｄ．ｏｓｄｄ．ｎｅｔ／ｒａｇｈａｖａ／ｃｐｐｓｉｔｅにて維持されている（Ｇａｕｔａｍ  ｅｔ  ａｌ．２０１２）。
【００７２】
核局在化配列（ＮＬＳ）と呼ばれるペプチドは、ＣＰＰのサブセットである。従来のＮＬＳは、塩基性アミノ酸の１つ（単節型）または２つ（双節型）の領域を含有する。従来の単節型及び双節型ＮＬＳのコンセンサス配列はそれぞれ、Ｋ（Ｋ／Ｒ）Ｘ（Ｋ／Ｒ）（配列番号６６）、及び（Ｋ／Ｒ）（Ｋ／Ｒ）Ｘ１０−１２（Ｋ／Ｒ）３／５（配列番号６７）であり、ここで、３／５とは、５つの連続したアミノ酸のうちの少なくとも３つが、リジンまたはアルギニンであることを示す（Ｋｏｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。ＳＶ４０大型Ｔ抗原由来のＮＬＳ配列である、ＰＫＫＫＲＫＶ（配列番号３６）は、従来の単節型ＮＬＳの例である一方で、ヌクレオプラスミン由来のＮＬＳ配列であるＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫ（配列番号６８）は、従来の双節型ＮＬＳの例である（Ｌａｎｇｅ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ｋｏｓｕｇｉ  ｅｔ  ａｌ．２００９）。リボ核タンパク質（ＲＮＰ）ｈｎＲＮＰ  Ａ１、ｈｎＲＮＰ  Ｋ、及びＵ  ｓｎＲＮＰ由来のものなどの、従来のものでないＮＬＳも多数存在する（Ｍａｔｔａｊ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）。
【００７３】
本発明での使用に好適なＣＰＰの非限定例としては、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ  ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ転写因子（ペネトラチン、ならびにその誘導体であるＲＬ−１６及びＥＢ１）（Ｄｅｒｏｓｓｉ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｔｈｏｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｌｕｎｄｂｅｒｇ  ｅｔ  ａｌ．２００７；Ａｌｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．２００８）；ＨＩＶ−１転写トランス活性化因子（Ｔａｔ）（Ｖｉｖｅｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１）；狂犬病ウイルス糖タンパク質（ＲＶＧ）（Ｋｕｍａｒ  ｅｔ  ａｌ．２００７）；単純ヘルペスウイルスＶＰ２２（Ｅｌｌｉｏｔｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）；抗菌性プロテグリン１（ＳｙｎＢ）（Ｒｏｕｓｓｅｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、ラットインスリン１遺伝子エンハンサータンパク質（ｐＩＳ１）（Ｋｉｌｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｍａｇｚｏｕｂ  ｅｔ  ａｌ．２００１）；マウス血管内皮カドヘリン（ｐＶＥＣ）（Ｅｌｍｑｕｉｓｔ  ｅｔ  ａｌ．２００１）；ヒトカルシトニン（ｈＣＴ）（Ｓｃｈｍｉｄｔ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）；及び線維芽細胞増殖因子４（ＦＧＦ４）（Ｊｏ  ｅｔ  ａｌ．２００５）などのタンパク質由来のペプチドが挙げられる。本発明中で使用するのに好適なＣＰＰとしては、更にトランスポータン（ＴＰ）及びその誘導体（Ｐｏｏｇａ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｓｏｏｍｅｔｓ  ｅｔ  ａｌ．２０００）；ＭＰＳペプチド（融合配列ベースペプチドまたはＦＢＰとしても知られている（Ｃｈａｌｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９８）などの、転膜配列（ＭＴＳ）（Ｂｒｏｄｓｋｙ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｌｉｎｄｇｒｅｎ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｚｈａｏ  ｅｔ  ａｌ．２００１）；配列シグナルベースペプチド（ＳＢＰ）（Ｃｈａｌｏｉｎ  ｅｔ  ａｌ．１９９７）；モデル両親媒性ペプチド（ＭＡＰ）（Ｏｅｈｌｋｅ  ｅｔ  ａｌ．１９９８；Ｓｃｈｅｌｌｅｒ  ｅｔ  ａｌ．１９９９；Ｈａｌｌｂｒｉｎｋ  ｅｔ  ａｌ．２００１）、転座ペプチド２（ＴＰ２）（Ｃｒｕｚ  ｅｔ  ａｌ．２０１３）、ＭＰＧ（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．１９９７；Ｋｗｏｎ  ｅｔ  ａｌ．２００９）、Ｐｅｐ−１（Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｍｕｎｏｚ−Ｍｏｒｒｉｓ  ｅｔ  ａｌ．２００７）、及び、ポリアルギニン（例えば、Ｒ７〜Ｒ１２）（配列番号８７）（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｗｅｎｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．２０００；Ｆｕｔａｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００１；Ｓｕｚｕｋｉ  ｅｔ  ａｌ．２００２）などの合成及びキメラペプチドも挙げられる。例示的かつ非限定的な配列を、表３に示す。
【００７４】
【表５−１】
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【００７５】
【表５−２】
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【００７６】
ＣＰＰの機能は、配列特異的な相互作用よりも、ＣＰＰの物理的特性に左右されるため、ＣＰＰは、表３に示すとおりに、及び／または、当該技術分野において公知の、逆配列及び／または逆キラリティを有することができる。例えば、ＣＰＰのレトロ逆転形態（逆配列及び逆キラリティ）は、本発明中で使用するのに好適である。レトロ逆転ＣＰＰの一例は、Ｄ−アミノ酸配列ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＩＫＩＱＲ（配列番号５０）を有する。レトロ逆転ＣＰＰの別の例は、Ｄ−アミノ酸配列ＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＬＫＬＱＲ（配列番号５１）を有する。細胞膜及び／またはＢＢＢを超える能力を保持する、１つ以上のアミノ酸付加、欠失、及び／または置換を有する、これらの配列の多様体もまた、本発明中で使用するのに好適である。本発明のＡＴＦ５ペプチドは、表３に示す例示的な配列に、少なくとも約６０％、６１％、６２％、６３％、６４％、６５％、６６％、６７％、６８％、６９％、７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、または９９％の同一性を有する細胞膜透過性ドメインを含むことができる。ＣＰＰが細胞透過を媒介する能力における、アミノ酸の付加（複数可）、欠失（複数可）、及び／または置換（複数可）の効果は、当該技術分野において既知の方法を使用して試験することができる。
ＩＩＩ．調製方法
本発明のＡＴＦ５ペプチドは例えば、固相ペプチド合成もしくは液相ペプチド合成、または両方の組み合わせを使用して、化学的に合成することができる。合成は、ペプチドの断片として行われ得、その後に化学的、または酵素的のいずれかにより組み合わせられる。本発明のＡＴＦ５ポリペプチドは、組み換え法を用いて発現することができる。
【００７７】
したがって、本発明のＡＴＦ５ペプチドをコードする核酸分子もまた提供される。このような核酸は、オリゴヌクレオチド合成装置を使用する化学合成により構築することができる。本発明の核酸分子は、組み換えＡＴＦ５ペプチドが産生される宿主細胞にて便利である、所望のＡＴＦ５ペプチドのアミノ酸配列、及びこれらのコドンの選択に基づき設計することができる。標準的な方法を適用して、対象のＡＴＦ５ペプチドをコードする核酸分子を合成することができる。
【００７８】
調製を行ったら、特定のＡＴＦ５ペプチドをコードする核酸を発現ベクターに組み込み、所望の宿主におけるペプチドの発現に好適な、発現調節配列に作用可能に結合させることができる。ＡＴＦ５ペプチドの高い発現レベルを得るために、核酸を、選択した発現宿主において機能的な、転写及び翻訳発現調節配列に作用可能に結合することができる、またはこれらと合わせることができる。
【００７９】
様々な発現宿主／ベクターの組み合わせを、当業者に用いることができる。真核細胞宿主に対して有用な発現ベクターとしては、例えば、ＳＶ４０、ウシ乳頭腫ウイルス、アデノウイルス、及びサイトメガロウイルス由来の発現調節配列を含むベクターが挙げられる。細菌宿主に対して有用な発現ベクターとしては、ｐＣＲ１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９、及びこれらの誘導体を含む、Ｅ．ｃｏｌｉ由来のプラスミドなどの、既知の細菌プラスミド、Ｍ１３などの、広い宿主範囲のプラスミド、ならびに、フィラメント状一本鎖ＤＮＡファージが挙げられる。
【００８０】
好適な宿主細胞としては、適切なプロモーターにて制御されている、原核生物、酵母菌、昆虫、または、高次の真核細胞が挙げられる。原核生物としては、グラム陰性またはグラム陽性生命体、例えばＥ．ｃｏｌｉまたは桿菌が挙げられる。高次の真核細胞を確立することができる、またはこれらは、哺乳類由来の細胞株であることができ、例としては、Ｐｉｃｈｉａ  ｐａｓｔｏｒｉｓ、２９３細胞、ＣＯＳ−７細胞、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒーラー細胞、及びＢＨＫ細胞が挙げられる。無細胞翻訳系もまた、使用することができる。
【実施例】
【００８１】
本開示の実施形態は、以下の非限定的実施例を参照して、更に定義することができる。材料及び方法の両方に対する多くの変更が、本開示の範囲を逸脱することなく実施可能であることが、当業者には明らかとなろう。後述のように、参照ペプチドＳＴ−３に対する多数の多様体を作製し、試験を行った。
実施例１。保存的システイン置換を有するＳＴ−３多様体は、インビトロ活性を有する
細胞毒性活性に対する、アミノ酸位置２１におけるＳＴ−３の１つのシステインの必要性を、ＨＬ６０細胞における細胞毒性アッセイを使用して試験した。システイン残基はネイティブＡＴＦ５ドメインの中で非常に保存され、ＤＮＡ結合の前に、ＡＴＦ５のホモ二量体化のために必要であると考えられている。
【００８２】
９６ウェルディッシュ中で、１５０μＬのＲＰＭＩ＋１．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）内で、３．５×１０３細胞／ウェルの密度にて、ＨＬ６０  ＰＭＬ懸濁細胞を設定した。２０ｍｍ  Ｈｉｓ（ｐＨ７．５）にて、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で再構成したＳＴ−３を、５０μＬの体積で各ウェルに添加し、０〜８０μＬの終濃度にした。３７℃にて４８時間、ＳＴ−３により細胞をインキュベートした。Ａｂｃａｍ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ＦＩＴＣアポトーシス検出キットを使用するフローサイトメトリーにより、細胞生存能を定量化した。簡潔に述べると、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する１ｘアッセイ緩衝液に再懸濁した。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖはアポトーシス細胞を検出し、ＰＩは死細胞を染色する。染色後、アポトーシス細胞は緑色蛍光を示し、死細胞は赤色及び緑色蛍光を示し、生細胞はほとんど、または全く蛍光を示さない。前方散乱（ＦＳＣ）と側方散乱（ＳＳＣ）に基づき、分析のために細胞を選択し、ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６  Ｐｌｕｓフローサイトメーターにより分析して、ＦＩＴＣシグナル検出装置を使用して、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ結合（Ｅｘ＝４８８ｎｍ；Ｅｍ＝５３０ｎｍ）、及び、フィコエリトリン発光シグナル検出装置により、ＰＩ染色を検出した。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖｌｏｗ及びＰＩｌｏｗの割合を定量化し、生存能率として表した。
【００８３】
凍結乾燥した、ＳＴ−３、または、アミノ酸位置２１にて、システインを置換してグリシン（ＳＴ−４）もしくはアラニン（ＳＴ−５）を有するＳＴ−３を、ヒスチジン緩衝液中で新鮮に再構成して５ｍｇ／ｍＬの原液にし、細胞に添加して、０〜４０μｍの終濃度範囲にした。細胞生存能を定量化する前に、細胞をＡＴＦ５ペプチドで４８時間インキュベートした。結果を図２に示す。
【００８４】
位置２１においてシステインをアラニンまたはグリシンで置換することによって、ＳＴ−３活性は弱まっているが、切除はされていない。観察されたＥＣ５０値は、ＳＴ−３、ＳＴ−４、及びＳＴ−５に対してそれぞれ、約１６μＭ、３５μＭ、及び３８μＭであった。機能アッセイでは、ＥＣ５０は、生体応答を、その最大値から５０％低下させる濃度である。ＡＴＦ５ペプチドの場合、ＥＣ５０は、細胞生存能を、その最大値から５０％低下させる濃度として測定される。ＥＣ５０は、当該技術分野において公知の任意の数の手段により計算することができる。システインをアラニンで置換することは、細胞透過に影響を及ぼさなかった。グリシン置換多様体の透過は試験しなかった。しかし、アラニン置換のデータに基づくと、細胞透過が影響を受けることは予想されない。
実施例２。非保存的置換を有するＳＴ−３多様体は、インビトロ活性を有する
本実施例で議論されるＳＴ−３多様体を、表４にまとめている。ＳＴ−３は、約１２〜２０μＭのＥＣ５０を有する。
【００８５】
【表６】
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【００８６】
１つの置換
実施例１に記載のＨＬ６０細胞生存能アッセイを使用して、１つの非保存的アミノ酸置換を含有するＳＴ−３多様体の細胞毒性活性を試験した（図３）。多様体ＳＴ−７は、位置２８において、極性のアスパラギンを無極性のロイシンで置換しており、約３μＭのＥＣ５０を有する。ＳＴ−８は、位置２２において、極性のグルタミンを無極性のアラニンで置換しており、約５μＭのＥＣ５０を有する。ＳＴ−７及びＳＴ−８の活性におけるこの増加は、ＳＴ−３よりも３〜６倍高い。ＳＴ−６は、位置３７において、セリンをアラニンで保存的置換しており、ＳＴ−３に相当する活性を有する。
複数の置換
実施例１に記載のＨＬ６０細胞生存能アッセイを使用して、複数の非保存的アミノ酸置換を含有するＳＴ−３多様体の細胞毒性活性を試験した。多様体ＳＴ−９は、それぞれ、正電荷を帯びるアルギニンで置換された、負電荷を帯びる２つのグルタミン酸残基、ならびに、それぞれ、負電荷を帯びるグルタミン酸で置換された、正電荷を帯びる１つのアルギニン、及び正電荷を帯びる１つのリジンを有する。（表４を参照のこと。）これらの変化には、約１８％の、ＳＴ−３のＡＴＦ５ロイシンジッパー領域を伴った。ＳＴ−９の活性は、ＳＴ−３の活性よりも著しく増加した（図４）。ＳＴ−９は、ＳＴ−３の約１２〜２０μＭと比較して、約２μＭのＥＣ５０を有する。
【００８７】
ＳＴ−１０は、ＳＴ−７におけるように、位置２８において、アスパラギン（極性）の、ロイシン（無極性）での非保存的置換に加えて、ＳＴ−９のように、４つの同じ「電荷」置換を有し、ＳＴ−６におけるように、セリンのアラニンでの、保存的置換を有する。（表４を参照のこと。）ＳＴ−１０の活性は、ＳＴ−９の活性に相当する（図４）。
【００８８】
ＳＴ−１１は、ＳＴ−１０と同じ置換、加えて、ＳＴ−５におけるような、位置２１における、保存システインの、アラニンでの置換を有する。（表４を参照のこと。）ＳＴ−１１は、ＳＴ−３よりも改善された細胞毒性活性を有する（図４）。
実施例３。レトロ逆転ＳＴ−３多様体はインビトロ活性を有する
実施例１に記載したＨＬ６０細胞生存能アッセイにおいて、ＳＴ−１１のレトロ逆転形態の細胞毒性を試験した。レトロ逆転多様体のＳＴ−１３は、ＳＴ−１１に相当する活性を有し、ＳＴ−３よりも優れた活性を有した（図５）。
【００８９】
ＳＴ−１３を、第２のレトロ逆転多様体のＳＴ−１４と同様に、様々なヒトがん細胞株にて更に試験した。組織培養処理した９６ウェルディッシュ中で、１５０μＬのＲＰＭＩ＋１．５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）内で、３．５×１０３細胞／ウェルの密度にて、懸濁細胞（ＨＬ６０、ＡＭＬ１４、またはＳＥＴ２）として設定した。２０ｍＭ  Ｈｉｓ（ｐＨ７．５）にて、１０ｍｇ／ｍＬの濃度で再構成したＡＴＦ５ペプチドを、５０μＬの体積で各ウェルに添加し、０〜８０μＬの終濃度にした。３７℃にて４８時間、ペプチドにより細胞をインキュベートした。Ａｂｃａｍ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ＦＩＴＣアポトーシス検出キットを使用するフローサイトメトリーにより、細胞生存能を定量化した。簡潔に述べると、細胞をＰＢＳで洗浄し、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ＦＩＴＣ及びヨウ化プロピジウム（ＰＩ）を含有する１ｘアッセイ緩衝液に再懸濁した。ＢＤ  Ａｃｃｕｒｉ  Ｃ６  Ｐｌｕｓフローサイトメーターにより細胞を分析し、ＦＩＴＣシグナル検出装置を使用して、Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ−ＦＩＴＣ結合（Ｅｘ＝４８８ｎｍ；Ｅｍ＝５３０ｎｍ）を検出し、フィコエリトリン発光シグナル検出装置を使用して、ＰＩ染色を検出した。Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖｌｏｗ及びＰＩｌｏｗの割合を定量化し、生存能率として表した。ＧｒａｐｈＰａｄ  Ｐｒｉｓｍ  ｖ．７  ＸＭＬを使用して、ＥＣ５０値を計算した。
【００９０】
更に、−１日目に、２００μＬの培地中で、３．５×１０３細胞／ウェルの密度にて、接着Ａ３７５、ＭＣＦ７、Ｕ２５１、ＤＵ１４５、Ｕ８７、及びＡ５４９細胞を設定した。０日目に、培地を取り除き、１５０μＬの新鮮な培地を補充し、細胞を、記載のとおりにＡＴＦ５ペプチドで処理した。３７℃での４８時間のインキュベーションの後、浮遊細胞を収集し、接着細胞を、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）で洗浄し、室温にて、５０μＬの２．５％トリプシンを用いてディッシュから解離させ、浮遊細胞と合わせた。懸濁細胞に関して上述したとおりに、またはＭＴＴアッセイアッセイにより、細胞生存能を測定した（ＭＣＦ７細胞）。あるいは、細胞を穏やかに、細胞培養プレートから取り除いた後、２．５％トリプシンでトリプシン処理し、上述したＡｂｃａｍ  Ａｎｎｅｘｉｎ  Ｖ  ＦＩＴＣアポトーシス検出キットを使用するフローサイトメトリーにより、細胞生存能を定量化した。
【００９１】
懸濁細胞について上述した条件下にて、ＰＢＭＣ及びＢＭＭＣを培養した。
ＳＴ−１３（図６Ａ〜６Ｅ）、及びＳＴ−１４（図７Ａ〜７Ｅ；表５）は共に、広範囲にわたる腫瘍細胞型において、著しい細胞毒性活性を示した。ＳＴ−１４は、末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）及び骨髄単核球（ＢＭＭＣ）においてもまた、細胞毒性であった（表５）。
【００９２】
【表７】
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【００９３】
ＳＴ−１４での処理の後、ＨＬ６０細胞におけるβ−アクチン発現に対する、ＡＴＦ５、ならびに調節タンパク質のＭｃｌ−１、Ｂｃｌ−２、及びスルビビンのＲＮＡ発現を測定した。簡潔に述べると、８×１０５のＨＬ６０懸濁細胞を６ウェルプレートに配置し、０μＭ、５μＭ、２０μＭ、または４０μＭのＳＴ１０１で、４または２４時間処理した。細胞を、１，２００ｒｐｍにて７．５分間遠心分離し、７５０μｌのＤＮａｓｅ−ＲＮａｓｅ−非含有Ｈ２Ｏでペレットを洗浄して、残留培地を取り除いた。メーカーの指示に従い、Ｑｕｉｃｋ−ＲＮＡ（商標）ＭｉｎｉＰｒｅｐ  Ｐｌｕｓキット（Ｚｙｍｏ  Ｒｅｓｅａｒｃｈカタログ番号Ｒ１０５４）を使用してＲＮＡを抽出し、５５μｌのＨ２Ｏで溶出した。ＲＮＡ（２００ｎｇ）を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎのプレキャスト２％ＳＹＢＲ（商標）Ｇｏｌｄ  Ｅ−Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号Ｇ４０１００２）にかけ、ＲＮＡの質を評価した。以下の修正を加えて、メーカーのプロトコルに従い、ｅｚＤＮＡｓｅ（商標）Ｅｎｚｙｍｅ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃカタログ番号１１７６６０５０）を備える、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ  ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔ（商標）ＩＶ  ＶＩＬＯ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘを使用して、ｃＤＮＡを合成した：ｃＤＮＡを、５０℃ではなく５６℃にて伸張した。マイナスＲＴ対照を設定し、ｇＤＮＡのコンタミネーションを除外した。遺伝子特異的プライマー（表６）、及びＫＯＤ  Ｘｔｒｅｍｅ（商標）Ｈｏｔ  Ｓｔａｒｔ  ＤＮＡ  Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ  Ｓｉｇｍａカタログ番号７１９７５−３）を使用して、ｃＤＮＡを増幅した。当量のＲＮＡを各反応物に添加した。全てのＰＣＲ産物を、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎプレキャスト２％エチジウムブロマイドＥ−Ｇｅｌ（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）にかけた。ＢｉｏＲａｄ  ＩｍａｇｅＬａｂソフトウェアを使用して、遺伝子発現をβ−アクチンと比較した。
【００９４】
【表８】
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【００９５】
ＳＴ−１４の曝露は、β−アクチン発現と比較して、Ｍｃｌ−１、Ｂｃｌ２、及びＢＩＲＣ５（スルビビン）の発現を低下させた（図８Ａ〜８Ｄ）。
実施例４。ＳＴ−３多様体はインビボ活性を有する
ＨＬ６０皮下腫瘍モデルにおいて、腫瘍体積におけるＳＴ−３、及び３つの多様体の効果を試験した。簡潔に述べると、Ｍａｔｒｉｇｅｌに１：１で懸濁した、５×１０６のＨＬ６０細胞を、皮下注射により、ＮＵ／Ｊマウスの腋窩に移した。腫瘍播種の２日後に投与を開始した。平均の腫瘍体積は、１４４〜１７６ｍｍ３であった。２５ｍｇ／ｋｇの用量で、腹腔内（ＩＰ）注射によりＡＴＦ５ペプチドを１日２回投与した。試験した多様体は全て、レトロ逆転多様体であるＳＴ−１３を含むビヒクルと比較して腫瘍体積を減少させた。このことは、最大の抗腫瘍活性を示している（図９）。
【００９６】
Ｕ２５１グリア芽腫細胞、ＭＣＦ７乳癌細胞、ＨＬ６０前骨髄球性白血病細胞、及びＡ３７５黒色腫細胞を使用して、腫瘍モデルの腫瘍体積における、ＳＴ−１４の効果を試験した。簡潔に述べると、Ｍａｔｒｉｇｅｌに１：１で懸濁した、５×１０６の細胞を、皮下注射により、ＮＵ／Ｊマウス（ＭＣＦ７及びＨＬ６０細胞に関して）、またはＮＯＤ／ＳＣＩＤマウス（Ｕ２５１及びＡ３７５細胞に関して）の腋窩に移した。
【００９７】
Ｕ２５１細胞腫瘍に関して、腫瘍播種の２日後に投与を開始した。平均の腫瘍体積は、約２４０ｍｍ３であった。５０ｍｇ／ｋｇの用量で、皮下（ＳＣ）注射によりＳＴ−１４を、１週間に３回、３週間投与した。ビヒクルと比較して、ＳＴ−１４は、腫瘍体積を著しく減少させ（図１０Ａ、１０Ｃ）、生残を増加させた（図１０Ｂ〜１０Ｃ）。同様の結果は、２５ｍｇ／ｋｇのＳＴ−１４を投与しても達成された。
【００９８】
ＭＣＦ７細胞腫瘍に関して、早期投与、及び遅延投与の効果を調査した。早期投与実験において、腫瘍播種の２日後に投与を開始した（２×１０６細胞）。平均の腫瘍体積は、約２８０〜３３０ｍｍ３であった。２５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＳＣ注射によりＳＴ−１４を、１週間に３回、３週間投与した。遅延投与実験において、腫瘍播種の５９日後に投与を開始した（ビヒクル：２×１０６細胞；治療群：５×１０６細胞）。播種後９２日間、腫瘍体積を監視した。速やかな治療群及び遅延治療群の両方において、監視期間の間、ビヒクルと比較して、ＳＴ−１４は腫瘍体積を著しく低下させた（図１１Ａ〜１１Ｂ）。
【００９９】
ＨＬ６０細胞腫瘍に関して、腫瘍播種の２日後に投与を開始した。平均の腫瘍体積は、約２２０ｍｍ３であった。２０ｍｇ／ｋｇの用量で、ＳＣ注射によりＳＴ−１４を、１週間に３回、３週間投与した。ビヒクルと比較して、ＳＴ−１４は腫瘍体積を著しく低下させた（図１２）。
【０１００】
Ａ３７５細胞腫瘍に関して、腫瘍播種の２日後に投与を開始した。平均の腫瘍体積は、約２５０〜３４４ｍｍ３であった。２５ｍｇ／ｋｇの用量で、ＳＣ注射によりＳＴ−１４を、１日２回、３週間投与した。ビヒクルと比較して、ＳＴ−１４は腫瘍体積を著しく低下させた（図１３）。
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Ｓｕｚｕｋｉ  Ｔ，ｅｔ  ａｌ．Ｐｏｓｓｉｂｌｅ  ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ  ｏｆ  ｃｏｍｍｏｎ  ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ  ｍｅｃｈａｎｉｓｍｓ  ａｍｏｎｇ  ａｒｇｉｎｉｎｅ−ｒｉｃｈ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：２４３７−２４４３（２００２）．
Ｔｈｏｒｅｎ  ＰＥＧ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  Ａｎｔｅｎｎａｐｅｄｉａ  ｐｅｐｔｉｄｅ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ａｃｒｏｓｓ  ｌｉｐｉｄ  ｂｉｌａｙｅｒｓ  −  ｔｈｅ  ｆｉｒｓｔ  ｄｉｒｅｃｔ  ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ．ＦＥＢＳ  Ｌｅｔｔ．４８２：２６５−６８（２０００）．
Ｖｉｖｅｓ  Ｅ，ｅｔ  ａｌ．Ａ  ｔｒｕｎｃａｔｅｄ  ＨＩＶ−１  Ｔａｔ  ｐｒｏｔｅｉｎ  ｂａｓｉｃ  ｄｏｍａｉｎ  ｒａｐｉｄｌｙ  ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｅｓ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｔｈｅ  ｐｌａｓｍａ  ｍｅｍｂｒａｎｅ  ａｎｄ  ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｓ  ｉｎ  ｔｈｅ  ｃｅｌｌ  ｎｕｃｌｅｕｓ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１６０１０−１６０１７（１９９７）．
Ｗａｎｇ  Ｘ−Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  ｏｆ  ｓｍａｌｌ  ｃｙｃｌｉｃ  ｐｅｐｔｉｄｅｓ  ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ  ｔｈｅ  ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ  ｂｏｎｄ．ＡＲＫＩＶＯＣ  ｘｉ：１４８−１５４（２００６）．
Ｗｅｎｄｅｒ  ＰＡ，ｅｔ  ａｌ．Ｔｈｅ  ｄｅｓｉｇｎ，ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，ａｎｄ  ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ  ｏｆ  ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ  ｔｈａｔ  ｅｎａｂｌｅ  ｏｒ  ｅｎｈａｎｃｅ  ｃｅｌｌｕｌａｒ  ｕｐｔａｋｅ：ｐｅｐｔｏｉｄ  ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９７：１３００３−１３００８（２０００）．
Ｚｈａｏ  Ｙ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ  ｏｆ  ｃｅｌｌ  ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ２５４：１３７−４５（２００１）．
Ｚｏｕ  ＬＬ，ｅｔ  ａｌ．Ｃｅｌｌ−ｐｅｎｅｔｒａｔｉｎｇ  ｐｅｐｔｉｄｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ  ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ  ｍｏｌｅｃｕｌｅ  ｄｅｌｉｖｅｒｙ  ｉｎｔｏ  ｔｈｅ  ｃｅｎｔｒａｌ  ｎｅｒｖｏｕｓ  ｓｙｓｔｅｍ．Ｃｕｒｒ．Ｎｅｕｒｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．１１：１９７−２０８（２０１３）．
＊＊＊
本発明は、以下の特許請求の範囲により更に説明される。
【図１】
2021508503.tif 000013
【図２】
2021508503.tif 000014
【図３】
2021508503.tif 000015
【図４】
2021508503.tif 000016
【図５】
2021508503.tif 000017
【図６Ａ】
2021508503.tif 000018
【図６Ｂ】
2021508503.tif 000019
【図６Ｃ】
2021508503.tif 000020
【図６Ｄ】
2021508503.tif 000021
【図６Ｅ】
2021508503.tif 000022
【図７Ａ】
2021508503.tif 000023
【図７Ｂ】
2021508503.tif 000024
【図７Ｃ】
2021508503.tif 000025
【図７Ｄ】
2021508503.tif 000026
【図７Ｅ】
2021508503.tif 000027
【図８Ａ】
2021508503.tif 000028
【図８Ｂ】
2021508503.tif 000029
【図８Ｃ】
2021508503.tif 000030
【図８Ｄ】
2021508503.tif 000031
【図９】
2021508503.tif 000032
【図１０Ａ】
2021508503.tif 000033
【図１０Ｂ】
2021508503.tif 000034
【図１０Ｃ】
2021508503.tif 000035
【図１１Ａ】
2021508503.tif 000036
【図１１Ｂ】
2021508503.tif 000037
【図１２】
2021508503.tif 000038
【図１３】
2021508503.tif 000039
【配列表】
2021508503000001.app
【手続補正書】
【提出日】令和2年12月11日(2020.12.11)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
活性化転写因子５（ＡＴＦ５）ペプチドであって、短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域を含み、前記短縮ＡＴＦ５ロイシンジッパー領域が、Ｄ−アミノ酸配列ＶＡＥＡＲＥＥＬＥＲＬＥＡＲＬＧＱＡＲＧＥＬ（配列番号６５）を有する、前記ＡＴＦ５ペプチド。
【請求項２】
Ｄ−アミノ酸配列ＶＡＥＡＲＥＥＬＥＲＬＥＡＲＬＧＱＡＲＧＥＬＫＫＷＫＭＲＲＮＱＦＷＬＫＬＱＲ（配列番号１４）を含み、前記ＡＴＦ５ペプチドが細胞膜透過性ペプチドである、請求項１に記載のＡＴＦ５ペプチド。
【請求項３】
前記ペプチドが延長ロイシンジッパー領域を含まない、請求項１または２に記載のＡＴＦ５ペプチド。
【請求項４】
前記ペプチドが、Ｎ末端アセチル基、及び／またはＣ末端アミド基を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載のＡＴＦ５ペプチド。
【請求項５】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＴＦ５ペプチドを含む組成物。
【請求項６】
医薬組成物である、請求項５に記載の組成物。
【請求項７】
請求項１〜４のいずれか１項に記載のＡＴＦ５ペプチドを含むキット。
【請求項８】
新生細胞における細胞毒性の促進に用いるための請求項５または６に記載の組成物であって、前記新生細胞を前記ＡＴＦ５ペプチドと接触させる、前記組成物。
【請求項９】
新生細胞の増殖の阻害に用いるための請求項５または６に記載の組成物であって、前記新生細胞を前記ＡＴＦ５ペプチドと接触させる、前記組成物。
【国際調査報告】
2021508503.tif 000040
2021508503.tif 000041
2021508503.tif 000042
2021508503.tif 000043