(57)【要約】本開示は、コラーゲンに基づく生体材料を操作および製造するための方法およびシステムについて記載する。本方法およびシステムは、合成生物学、発酵、材料科学および機械学習を組み合わせる。本方法の使用により得られるコラーゲン分子またはコラーゲンに基づく材料は、融解温度、堅さまたは弾性等の所望の物理的または化学的特性を有する。得られたコラーゲン分子および配列も開示される。一部の実装では、アミノ酸残基の頻度は、複数のコラーゲン配列におけるアミノ酸トリマーの配列内バリエーションを示す。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
１種または複数のコラーゲン分子を操作する方法であって、
（ａ）機械学習モデルを使用して、また、１個または複数のプロセッサおよびシステムメモリを含むコンピュータシステムによって、１種または複数の標的コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度を含む、標的データのセットを得るステップであって、前記標的データのセットが、前記機械学習モデルによって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測され、前記機械学習モデルが、
（ｉ）複数の訓練コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度、および前記複数の訓練コラーゲン配列に関連する前記少なくとも１種の物理的または化学的特性の物理的または化学的特性データを含む訓練データのセットを受け取るステップと、
（ｉｉ）前記機械学習モデルを前記訓練データのセットにフィットさせることにより、前記機械学習モデルを訓練するステップであって、訓練された機械学習モデルが、入力として、検査コラーゲン配列のアミノ酸データを受け取り、前記検査コラーゲン配列に関連する前記少なくとも１種の物理的または化学的特性の、少なくとも１つの値を予測するように構成されている、ステップと
によって得られた、ステップと、
（ｂ）前記コンピュータシステムによって、前記標的データのセットに対応する１種または複数のコラーゲン配列を決定するステップと、
（ｃ）前記１種または複数のコラーゲン配列をコードする１種または複数のポリヌクレオチドを産生するステップと、
（ｄ）前記１種または複数のコラーゲン配列を含む１種または複数のコラーゲン分子を産生するために、タンパク質産生プラットフォームにおいて、前記１種または複数のポリヌクレオチドを発現させるステップと
を含む方法。
【請求項２】
前記アミノ酸残基の頻度が、前記複数のコラーゲン配列におけるアミノ酸トリマーの配列内バリエーションを示す、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記アミノ酸残基の頻度が、（ａ）各訓練コラーゲン配列におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置における残基としての複数の異なるアミノ酸のそれぞれの頻度、および（ｂ）前記訓練コラーゲン配列における前記Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置における残基としての前記異なる複数のアミノ酸のそれぞれの頻度を含む、請求項２に記載の方法。
【請求項４】
前記複数の異なるアミノ酸が、生物において天然に存在する２０種の標準アミノ酸を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記複数のアミノ酸が、前記２０種の標準アミノ酸の翻訳後修飾物をさらに含む、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記複数のアミノ酸が、２０種の標準アミノ酸のサブセット、および前記サブセットの翻訳後に修飾されたアミノ酸からなる、請求項３に記載の方法。
【請求項７】
前記訓練データのセットが、中断されていない（Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ反復配列を有する主要コラーゲンドメインを使用して生成される、請求項１〜６のいずれかに記載の方法。
【請求項８】
前記訓練データのセットが、前記複数の訓練コラーゲン配列またはその断片の長さを含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
【請求項９】
前記アミノ酸残基の頻度が、各訓練コラーゲン配列の２個またはそれよりも多い領域におけるアミノ酸残基の頻度を含む、請求項１〜８のいずれかに記載の方法。
【請求項１０】
前記アミノ酸残基の頻度が、（ａ）各訓練コラーゲン配列の第１の領域におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置における複数の異なるアミノ酸のそれぞれの頻度、（ｂ）各訓練コラーゲン配列の前記第１の領域におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置における複数の異なるアミノ酸のそれぞれの頻度、（ｃ）各訓練コラーゲン配列の第２の領域における前記Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーの前記Ｘ位置における前記複数の異なるアミノ酸のぞれぞれの頻度、および（ｄ）各訓練コラーゲン配列の前記第２の領域における前記Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーの前記Ｙ位置における前記複数の異なるアミノ酸のぞれぞれの頻度を含む、請求項９のいずれかに記載の方法。
【請求項１１】
前記機械学習モデルが、サポートベクターマシンを含む、請求項１〜１０のいずれかに記載の方法。
【請求項１２】
前記サポートベクターマシンが、線形カーネルを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記サポートベクターマシンが、非線形カーネルを有する、請求項１１に記載の方法。
【請求項１４】
前記機械学習モデルを訓練するステップが、特徴空間の次元を低下させるために線形サポートベクターマシンおよびウェイトベクトル分析を適用することを含む、請求項１１に記載の方法。
【請求項１５】
前記機械学習モデルを訓練するステップが、特徴空間の次元を低下させるために、主成分分析を適用することを含む、請求項１〜１４のいずれかに記載の方法。
【請求項１６】
前記機械学習モデルが、ランダムフォレストモデルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１７】
前記機械学習モデルが、ニューラルネットワークモデルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１８】
前記機械学習モデルが、一般線形モデルを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項１９】
前記複数の訓練コラーゲン配列が、複数のコラーゲン配列を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２０】
前記複数の訓練コラーゲン配列が、複数のゼラチン配列を含む、請求項１〜１８のいずれかに記載の方法。
【請求項２１】
前記少なくとも１種の物理的または化学的特性が、融解またはゲル化温度、堅さ、弾性、酸素放出速度、清澄さ、濁度、紫外線遮断または吸収、粘性、溶解度、含水量または水和、プロテアーゼに対する抵抗性、および原線維へと会合する能力からなる群から選択される、請求項１〜２０のいずれかに記載の方法。
【請求項２２】
前記少なくとも１種の物理的または化学的特性が、２種またはそれよりも多い物理的または化学的特性を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２３】
前記１種または複数のポリヌクレオチドが、組換えポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２４】
前記１種または複数のポリヌクレオチドが、合成されたポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２５】
（ｄ）において産生された前記１種または複数のコラーゲン分子が、組換えコラーゲン分子を含む、請求項１〜２１のいずれかに記載の方法。
【請求項２６】
（ｅ）において産生された前記１種または複数のコラーゲン分子を使用して、ゼラチン材料またはコラーゲン誘導体を製造するステップをさらに含む、請求項１〜２５のいずれかに記載の方法。
【請求項２７】
（ａ）ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡおよびＨｙ１Ａからなる群から選択される分泌タグのアミノ酸配列；ならびに
（ｂ）複数のＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーであって、
（ｉ）前記Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置におけるアミノ酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、ピロリシン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびそれらから生じる翻訳後修飾物からなる群から選択され、
（ｉｉ）前記Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置におけるアミノ酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、ピロリシン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびそれらから生じる翻訳後修飾物からなる群から選択され、
（ｉｉｉ）天然に存在しないコラーゲンポリペプチドが、機械学習モデルによって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測された、
複数のＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマー
を含む、天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項２８】
ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位およびベータ−ラクタマーゼタンパク質からなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含む、請求項２７に記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項２９】
前記機械学習モデルが、
（ｉ）複数の訓練コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度、および前記複数の訓練コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の物理的または化学的特性データを含む訓練データのセットを受け取るステップと、
（ｉｉ）前記機械学習モデルを前記訓練データのセットにフィットさせることにより、前記機械学習モデルを訓練するステップであって、訓練された機械学習モデルが、入力として、検査コラーゲン配列のアミノ酸データを受け取り、前記検査コラーゲン配列に関連する前記少なくとも１種の物理的または化学的特性の、少なくとも１つの値を予測するように構成されている、ステップと
によって得られた、請求項２７〜２８のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項３０】
前記アミノ酸残基の頻度が、（ａ）各訓練コラーゲンまたはゼラチン反復配列におけるＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーの前記Ｘ位置における残基としての複数の異なるアミノ酸のそれぞれの頻度、および（ｂ）前記訓練コラーゲンまたはゼラチン反復配列における前記Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーの前記Ｙ位置における残基としての前記複数の異なるアミノ酸のそれぞれの頻度を含む、請求項２９に記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項３１】
前記Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーの前記ＸまたはＹ位置における前記アミノ酸のうち１個または複数が、（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシプロリンを含む、請求項２７〜３０のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項３２】
前記Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーの前記ＸまたはＹ位置における前記アミノ酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびそれらから生じる翻訳後修飾物からなる群から選択される、請求項２７〜３１のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項３３】
ホモマーまたはヘテロマー三重らせんを形成することができる、請求項２７〜３２のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項３４】
前記少なくとも１種の物理的または化学的特性が、融解またはゲル化温度を含む、請求項２７〜３３のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項３５】
前記少なくとも１種の物理的または化学的特性が、堅さを含む、請求項２７〜３３のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項３６】
前記少なくとも１種の物理的または化学的特性が、弾性を含む、請求項２７〜３３のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項３７】
前記少なくとも１種の物理的または化学的特性が、酸素放出速度を含む、請求項２７〜３３のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項３８】
前記少なくとも１種の物理的または化学的特性が、清澄さを含む、請求項２７〜３３のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項３９】
前記少なくとも１種の物理的または化学的特性が、紫外線遮断または吸収を含む、請求項２７〜３３のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項４０】
（ａ）前記機械学習モデルを使用して、１種または複数の標的コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度を含む、標的データのセットを得るステップであって、前記標的データのセットが、前記機械学習モデルによって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測される、ステップと、
（ｂ）前記標的データのセットに対応する１種または複数のコラーゲン配列を決定するステップと、
（ｃ）前記１種または複数のコラーゲン配列を含む前記天然に存在しないコラーゲンポリペプチドを産生するステップと
によって産生された、請求項２７〜３９のいずれかに記載の天然に存在しないコラーゲンポリペプチド。
【請求項４１】
（ａ）ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡおよびＨｙ１Ａからなる群から選択される分泌タグのアミノ酸配列；ならびに
（ｂ）複数のＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーであって、
（ｉ）前記Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置におけるアミノ酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、ピロリシン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびそれらから生じる翻訳後修飾物からなる群から選択され、
（ｉｉ）前記Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置におけるアミノ酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、ピロリシン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびそれらから生じる翻訳後修飾物からなる群から選択され、
（ｉｉｉ）天然に存在しないゼラチンポリペプチドが、機械学習モデルによって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測された、
複数のＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマー
を含む、天然に存在しないゼラチンポリペプチド。
【請求項４２】
コンピュータシステムの１個または複数のプロセッサによって実行されると、前記コンピュータシステムに、１種または複数のコラーゲン分子を操作するための方法を実行させるプログラムコードを記憶する、非一時的機械可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、前記プログラムコードが、
複数の訓練コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度、および前記複数の訓練コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の物理的または化学的特性データを含む訓練データのセットを受け取るためのコード、ならびに
機械学習モデルを前記訓練データのセットにフィットさせることにより、前記機械学習モデルを訓練するためのコードであって、訓練された機械学習モデルが、入力として、検査コラーゲン配列のアミノ酸データを受け取り、前記検査コラーゲン配列に関連する前記少なくとも１種の物理的または化学的特性の、少なくとも１つの値を予測するように構成されている、コード
を含む、コンピュータプログラム製品。
【請求項４３】
前記プログラムコードが、
前記機械学習モデルを使用して、１種または複数の標的コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度を含む、標的データのセットを決定するためのコードであって、前記標的データのセットが、前記機械学習モデルによって、判断基準を満たす前記少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測される、コード、および
前記標的データのセットに対応する１種または複数のコラーゲン配列を決定するためのコード
をさらに含む、請求項４２に記載のコンピュータプログラム製品。
【請求項４４】
１個または複数のプロセッサ、
システムメモリ、ならびに
前記１個または複数のプロセッサによって実行されると、コンピュータシステムに、１種または複数のコラーゲン分子を操作するための方法を実行させるコンピュータ実行可能命令を記憶した１個または複数のコンピュータ可読記憶媒体であって、前記１個または複数のプロセッサが、
複数の訓練コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度、および前記複数の訓練コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の物理的または化学的特性データを含む訓練データのセットを受け取り、
機械学習モデルを前記訓練データのセットにフィットさせることにより、前記機械学習モデルを訓練する
ように構成されており、訓練された機械学習モデルが、入力として、検査コラーゲン配列のアミノ酸データを受け取り、前記検査コラーゲン配列に関連する前記少なくとも１種の物理的または化学的特性の、少なくとも１つの値を予測するように構成されている、１個または複数のコンピュータ可読記憶媒体
を含むコンピュータシステム。
【請求項４５】
前記１個または複数のプロセッサが、
前記機械学習モデルを使用して、１種または複数の標的コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度を含む、標的データのセットであって、前記機械学習モデルによって、判断基準を満たす前記少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測される標的データのセットを決定し、
前記標的データのセットに対応する１種または複数のコラーゲン配列を決定する
ようにさらに構成されている、請求項４４に記載のコンピュータシステム。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願への相互参照
本出願は、あらゆる目的のためその全体が参照により本明細書に組み込まれる、２０１７年１１月２２日に出願された標題：METHODS  AND  SYSTEMS  FOR  ENGINEERING  COLLAGENの米国仮特許出願第６２／５９０，１８３号に対する利益および優先権を主張する。
【０００２】
背景
本開示は、コラーゲンおよびコラーゲン由来材料に関する。機械学習モデルおよび遺伝子操作技法を使用した、コラーゲンを操作するための方法およびシステムも、開示される。
【背景技術】
【０００３】
コラーゲンは、動物における最も豊富なタンパク質であり、技術および消費者市場において生体材料として配備されている。コラーゲンの物理的化学的および構造的特性は、生体材料にとって望ましく、機械的強度、プロテアーゼに対する抵抗性、および原線維(fibrils)へと会合する能力を含む。コラーゲンの変性した形態であるゼラチンは、強い透明のゲルおよび可撓性フィルムを形成することが公知であり、これにより、広範囲の商業的応用における望ましい材料となる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
現在、大部分のコラーゲン生体材料は、ブタ、ウシまたは魚類等の動物原料から得られる。しかし、動物由来の材料が一貫性を欠くこと、それらの特性を調整できないこと、および変化する消費者嗜好性によって駆り立てられる、動物質を含まないコラーゲン製品に対する需要が高まっている。さらに、ある特定の市場におけるコラーゲンに基づく製品に対する急速に増加しつつある需要から、持続可能でスケーラブルなコラーゲン生体材料製造プラットフォームの必要性が明らかになった。
【０００５】
本開示は、機械学習および遺伝子操作技法を使用して、コラーゲンおよびコラーゲン由来材料を操作するための工業用プロセスおよびシステムを提供する。コラーゲンを、ゼラチン製品の所望の物理的または化学的特性を保有するように設計し、医療、化粧品、食品等、広範囲の産業における応用を提供することができる。コラーゲンは、動物製品を使用することなく、遺伝子操作技法および微生物発現系を使用して製造することができる。
【課題を解決するための手段】
【０００６】
本開示の一態様は、１種または複数のコラーゲン分子を操作するための方法を提供する。本方法は、（ａ）機械学習モデルを使用して、また、１個または複数のプロセッサおよびシステムメモリを含むコンピュータシステムによって、１種または複数の標的コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度を含む、標的データのセットを得るステップであって、標的データのセットが、機械学習モデルによって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測され、機械学習モデルが、（ｉ）複数の訓練コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度、および複数の訓練コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の物理的または化学的特性データを含む訓練データのセットを受け取るステップと、（ｉｉ）機械学習モデルを訓練データのセットにフィットさせることにより、機械学習モデルを訓練するステップであって、訓練された機械学習モデルが、入力として、検査コラーゲン配列のアミノ酸データを受け取り、検査コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の、少なくとも１つの値を予測するように構成されている、ステップとによって得られた、ステップを含む。本方法は、また、（ｂ）コンピュータシステムによって、標的データのセットに対応する１種または複数のコラーゲン配列を決定するステップと、（ｃ）１種または複数のコラーゲン配列をコードする１種または複数のポリヌクレオチドを産生するステップと、（ｄ）タンパク質産生プラットフォームにおいて、１種または複数のコラーゲン配列を含む１種または複数のコラーゲン分子を産生するために、１種または複数のポリヌクレオチドを発現させるステップとを含む。
【０００７】
一部の実装では、アミノ酸残基の頻度は、複数のコラーゲン配列におけるアミノ酸トリマーの配列内バリエーションを示す。一部の実装では、アミノ酸残基の頻度は、（ａ）各訓練コラーゲン配列におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置における残基としての複数の異なるアミノ酸のそれぞれの頻度、および（ｂ）訓練コラーゲン配列におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置における残基としての異なる複数のアミノ酸のそれぞれの頻度を含む。一部の実装では、複数の異なるアミノ酸は、生物において天然に存在する２０種の標準アミノ酸を含む。
【０００８】
要旨
一部の実装では、複数のアミノ酸は、２０種の標準アミノ酸の翻訳後修飾物をさらに含む。一部の実装では、複数のアミノ酸は、２０種の標準アミノ酸のサブセット、およびサブセットの翻訳後に修飾されたアミノ酸からなる。
【０００９】
一部の実装では、訓練データのセットは、中断されていない（Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎ反復配列を有する主要コラーゲンドメインを使用して生成される。
【００１０】
一部の実装では、訓練データのセットは、複数の訓練コラーゲン配列またはその断片の長さを含む。
【００１１】
一部の実装では、アミノ酸残基の頻度は、各訓練コラーゲン配列の２個またはそれよりも多い領域におけるアミノ酸残基の頻度を含む。一部の実装では、アミノ酸残基の頻度は、（ａ）各訓練コラーゲン配列の第１の領域におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置における複数の異なるアミノ酸のそれぞれの頻度、（ｂ）各訓練コラーゲン配列の第１の領域におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置における複数の異なるアミノ酸のそれぞれの頻度、（ｃ）各訓練コラーゲン配列の第２の領域におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置における複数の異なるアミノ酸のぞれぞれの頻度、および（ｄ）各訓練コラーゲン配列の第２の領域におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置における複数の異なるアミノ酸のぞれぞれの頻度を含む。
【００１２】
一部の実装では、機械学習モデルは、サポートベクターマシンを含む。一部の実装では、サポートベクターマシンは、線形カーネルを有する。一部の実装では、サポートベクターマシンは、非線形カーネルを有する。一部の実装では、機械学習モデルを訓練するステップは、特徴空間の次元を低下させるために、線形サポートベクターマシンおよびウェイトベクトル分析を適用することを含む。
【００１３】
一部の実装では、機械学習モデルを訓練するステップは、特徴空間の次元を低下させるために、主成分分析を適用することを含む。
【００１４】
一部の実装では、機械学習モデルは、ランダムフォレストモデルを含む。一部の実装では、機械学習モデルは、ニューラルネットワークモデルを含む。一部の実装では、機械学習モデルは、一般線形モデルを含む。
【００１５】
一部の実装では、複数の訓練コラーゲン配列は、複数のコラーゲン配列を含む。
【００１６】
一部の実装では、複数の訓練コラーゲン配列は、複数のゼラチン配列を含む。
【００１７】
一部の実装では、少なくとも１種の物理的または化学的特性は、融解またはゲル化温度、堅さ、弾性、酸素放出速度、清澄さ、濁度、紫外線遮断または吸収、粘性、溶解度、含水量または水和、プロテアーゼに対する抵抗性、および原線維へと会合する能力からなる群から選択される。一部の実装では、少なくとも１種の物理的または化学的特性は、２種またはそれよりも多い物理的または化学的特性を含む。
【００１８】
一部の実装では、１種または複数のポリヌクレオチドは、組換えポリヌクレオチドを含む。一部の実装では、１種または複数のポリヌクレオチドは、合成されたポリヌクレオチドを含む。
【００１９】
一部の実装では、（ｄ）において産生された１種または複数のコラーゲン分子は、組換えコラーゲン分子を含む。
【００２０】
一部の実装では、本方法は、（ｅ）において産生された１種または複数のコラーゲン分子を使用して、ゼラチン材料またはコラーゲン誘導体を製造するステップをさらに含む。
【００２１】
本開示の別の態様は、（ａ）ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡおよびＨｙ１Ａからなる群から選択される分泌タグのアミノ酸配列；ならびに（ｂ）複数のＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーであって、（ｉ）Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置におけるアミノ酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、ピロリシン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびそれらから生じる翻訳後修飾物からなる群から選択され、（ｉｉ）Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置におけるアミノ酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、ピロリシン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびそれらから生じる翻訳後修飾物からなる群から選択され、（ｉｉｉ）天然に存在しないコラーゲンポリペプチドが、機械学習モデルによって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測された、複数のＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーを含む、天然に存在しないコラーゲンポリペプチドを提供する。
【００２２】
一部の実装では、天然に存在しないコラーゲンポリペプチドは、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位およびベータ−ラクタマーゼタンパク質からなる群から選択されるアミノ酸配列をさらに含む。
【００２３】
一部の実装では、機械学習モデルは、（ｉ）複数の訓練コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度、および複数の訓練コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の物理的または化学的特性データを含む訓練データのセットを受け取るステップと、（ｉｉ）機械学習モデルを訓練データのセットにフィットさせることにより、機械学習モデルを訓練するステップであって、訓練された機械学習モデルが、入力として、検査コラーゲン配列のアミノ酸データを受け取り、検査コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の、少なくとも１つの値を予測するように構成されている、ステップとによって得られた。一部の実装では、アミノ酸残基の頻度は、（ａ）各訓練コラーゲンまたはゼラチン反復配列におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置における残基としての複数の異なるアミノ酸のそれぞれの頻度、および（ｂ）訓練コラーゲンまたはゼラチン反復配列におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置における残基としての複数の異なるアミノ酸のそれぞれの頻度を含む。
【００２４】
一部の実装では、Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸまたはＹ位置におけるアミノ酸のうち１個または複数は、（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシプロリンを含む。
【００２５】
一部の実装では、Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸまたはＹ位置におけるアミノ酸は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびそれらから生じる翻訳後修飾物からなる群から選択される。
【００２６】
一部の実装では、天然に存在しないコラーゲンポリペプチドは、ホモマーまたはヘテロマー三重らせんを形成することができる。
【００２７】
一部の実装では、少なくとも１種の物理的または化学的特性は、融解またはゲル化温度を含む。一部の実装では、少なくとも１種の物理的または化学的特性は、堅さを含む。
【００２８】
一部の実装では、少なくとも１種の物理的または化学的特性は、弾性を含む。
【００２９】
一部の実装では、少なくとも１種の物理的または化学的特性は、酸素放出速度を含む。
【００３０】
一部の実装では、少なくとも１種の物理的または化学的特性は、清澄さを含む。
【００３１】
一部の実装では、少なくとも１種の物理的または化学的特性は、紫外線遮断または吸収を含む。
【００３２】
一部の実装では、天然に存在しないコラーゲンポリペプチドは、（ａ）機械学習モデルを使用して、１種または複数の標的コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度を含む標的データのセットを得るステップであって、標的データのセットが、機械学習モデルによって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測される、ステップと、（ｂ）標的データのセットに対応する１種または複数のコラーゲン配列を決定するステップと、（ｃ）１種または複数のコラーゲン配列を含む天然に存在しないコラーゲンポリペプチドを産生するステップとによって産生された。
【００３３】
本開示の追加的な態様は、（ａ）ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡおよびＨｙ１Ａからなる群から選択される分泌タグのアミノ酸配列；ならびに（ｂ）複数のＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーであって、（ｉ）Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置におけるアミノ酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、ピロリシン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびそれらから生じる翻訳後修飾物からなる群から選択され、（ｉｉ）Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置におけるアミノ酸が、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、ピロリシン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびそれらから生じる翻訳後修飾物からなる群から選択され、（ｉｉｉ）天然に存在しないゼラチンポリペプチドが、機械学習モデルによって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測された、複数のＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーを含む、天然に存在しないゼラチンポリペプチドを提供する。
【００３４】
方法を実施し、化合物を作製するための、コンピュータシステムおよびコンピュータプログラム製品も開示される。
【００３５】
本開示の一態様は、コンピュータシステムの１個または複数のプロセッサによって実行されると、コンピュータシステムに、１種または複数のコラーゲン分子を操作するための方法を実行させるプログラムコードを記憶する、非一時的機械可読媒体を含むコンピュータプログラム製品であって、前記プログラムコードが、複数の訓練コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度、および複数の訓練コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の物理的または化学的特性データを含む訓練データのセットを受け取るためのコード；ならびに機械学習モデルを訓練データのセットにフィットさせることにより、機械学習モデルを訓練するためのコードであって、訓練された機械学習モデルが、入力として、検査コラーゲン配列のアミノ酸データを受け取り、検査コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の、少なくとも１つの値を予測するように構成されている、コードを含む、コンピュータプログラム製品を提供する。
【００３６】
一部の実装では、プログラムコードは、機械学習モデルを使用して、１種または複数の標的コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度を含む標的データのセットを決定するためのコードであって、標的データのセットが、機械学習モデルによって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測される、コード；および標的データのセットに対応する１種または複数のコラーゲン配列を決定するためのコードをさらに含む。
【００３７】
本開示の別の態様は、１個または複数のプロセッサ；システムメモリ；および１個または複数のプロセッサによって実行されると、コンピュータシステムに、１種または複数のコラーゲン分子を操作するための方法を実行させるコンピュータ実行可能命令を記憶した１個または複数のコンピュータ可読記憶媒体を含むコンピュータシステムを提供する。１個または複数のプロセッサは、複数の訓練コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度、および複数の訓練コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の物理的または化学的特性データを含む訓練データのセットを受け取り；機械学習モデルを訓練データのセットにフィットさせることにより、機械学習モデルを訓練するように構成されており、訓練された機械学習モデルは、入力として、検査コラーゲン配列のアミノ酸データを受け取り、検査コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の、少なくとも１つの値を予測するように構成されている。
【００３８】
一部の実装では、１個または複数のプロセッサは、機械学習モデルを使用して、１種または複数の標的コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度を含む標的データのセットであって、機械学習モデルによって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測される標的データのセットを決定し；標的データのセットに対応する１種または複数のコラーゲン配列を決定するようにさらに構成されている。
【００３９】
本開示の上述および他の特色は、次の記載および添付の特許請求の範囲から、さらに十分に明らかとなるであろう、または以降に表記されている本開示の実施によって学習することができる。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、一部の実装に従ってコラーゲン分子を操作するためのワークフローを説明する。
【００４１】
【図２】図２は、一部の実装に従って、特徴ベクトルが生成され、コラーゲンの物理的特性によって標識される仕方を説明する。
【００４２】
【図３】図３は、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）を使用して、コラーゲン配列および特性をモデル化することができる仕方を図表により説明する。
【００４３】
【図４】図４は、コラーゲン配列および特性のモデル化に使用することができる単純化された回帰ツリーを示す。
【００４４】
【図５】図５は、ランダムフォレストモデルの訓練相においてランダムフォレストを形成するための回帰ツリーのアンサンブルを説明する。
【００４５】
【図６】図６は、検査相においてコラーゲンの特性を決定するためにランダムフォレストモデルの適用を説明する。
【００４６】
【図７】図７は、一部の実施形態に従って実装することができる例示的なデジタルデバイスを示す。
【００４７】
【図８】図８は、スイッチおよび未スイッチ細胞の間の生理学的状態の差を描写する。Ａ）未スイッチＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞。Ｂ）図８Ａと同じＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ集団だが、生理学的スイッチを起こした。Ｃ）細胞質ＲＦＰおよび周辺質ＧＦＰを含有するスイッチＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞の位相差。Ｄ）図８Ｃにおける細胞の蛍光イメージングは、標的化されたタンパク質局在化を説明する。
【００４８】
【図９】図９は、スイッチ細胞における増強されたタンパク質産生を描写する。Ａ〜Ｂ）Ｔ７誘導性タンパク質産生のための標的タンパク質は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ  ＢＬ２１において産生される、周辺質に発現されるＧＦＰである。同じ細胞集団を使用し、ＯＤ  １．１において誘導した。Ａ）タンパク質ラダー（レーン１）、ＩＰＴＧ誘導されたタンパク質の産生（レーン２）、生理学的スイッチによるＩＰＴＧ誘導されたタンパク質の産生（レーン３）。Ｂ）ＩＰＴＧのみ（左）およびＩＰＴＧ＋スイッチ（右）による、細胞ＧＦＰ誘導された培養物の２本のバイアル。Ｃ）タンパク質ラダー（レーン１）、タンパク質産生後の上清（レーン２）、細胞ペレット（レーン３）を示す、スイッチ細胞を使用した２２ＫＤコラーゲンの発現。
【００４９】
【図１０】図１０は、経時的にスイッチするＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ細胞のタイムラプスを描写する。
【００５０】
【図１１】図１１は、生理学的スイッチを起こしている他の生物を説明する。Ａ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ正常生理学。Ｂ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓスイッチ生理学。Ｃ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１正常生理学。Ｄ）Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１スイッチ生理学。Ｅ）Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ正常生理学。Ｆ）Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａスイッチ生理学。Ｇ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ正常生理学。Ｈ）Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓスイッチ生理学。
【発明を実施するための形態】
【００５１】
詳細な説明
本開示は、コラーゲンに基づく生体材料を操作および製造するための方法およびシステムについて記載する。本方法は、分子生物学、発酵、材料科学および機械学習を組み合わせる。本方法の使用により得られるコラーゲンに基づく材料は、融解温度、堅さまたは弾性等の所望の物理的または化学的特性を有する。得られたコラーゲン分子および配列も開示される。
【００５２】
数値範囲は、範囲を定義する数を包括する。本明細書を通して定められた最大数的限界の全てが、より低い数的限界が本明細書に明確に書かれているかの如く、斯かるより低い数的限界の全てを含むことが意図される。本明細書を通して定められた最小数的限界の全ては、より高い数的限界が本明細書に明確に書かれているかの如く、斯かるより高い数的限界の全てを含むであろう。本明細書を通して定められた数的範囲の全ては、より狭い数的範囲が全て本明細書に明確に書かれているかの如く、より広い数的範囲内に収まるより狭い数的範囲の全てを含むであろう。
【００５３】
本明細書に提供される見出しは、本開示の限定を意図するものではない。
【００５４】
本明細書において他に規定がなければ、本明細書で使用されているあらゆる技術および科学用語は、当業者によって一般的に理解されているものと同じ意義を有する。本明細書に含まれている用語を含む様々な科学辞典が、当業者にとって周知であり、利用できる。本明細書に記載されているものと同様または均等ないかなる方法および材料も、本明細書に開示されている実施形態の実施または検査における用途を見出すが、一部の方法および材料について記載する。
【００５５】
直ぐ下に定義されている用語は、本明細書を全体として参照することによりさらに十分に説明される。記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬は、当業者によって使用される文脈に応じて変動し得るため、本開示が、記載されている特定の方法論、プロトコールおよび試薬に限定されないことを理解されたい。
【００５６】
本明細書および添付の特許請求の範囲において使用されている場合、内容および文脈がそれ以外を明らかに指示しない限り、単数形「１つの（a）」、「１つの（an）」および「その（the）」は、複数形の指示対象を含む。よって、例えば、「１つのデバイス（a  device）」の参照は、２つまたはそれよりも多い斯かるデバイスの組合せ等を含む。他に断りがなければ、「または（or）」という接続詞は、ブール論理演算子としてその正確な意味で使用されることを意図し、二者択一での特徴の選択（Ａの選択がＢとは相互排他的である、ＡまたはＢ）、および併せた特徴の選択（ＡおよびＢの両方が選択される、ＡまたはＢ）の両方を包含する。
Ｉ．定義
【００５７】
本明細書で使用される場合、用語「約」は、±１０％を指す。
【００５８】
用語「からなる」は、「を含み、これに限定される」を意味する。
【００５９】
用語「から本質的になる」は、組成物、方法または構造物が、追加的な成分、ステップおよび／または部分を含むことができるが、ただしこれは、追加的な成分、ステップおよび／または部分が、請求されている組成物、方法または構造物の基本的および新規の特徴を実際的に変更しない場合に限ることを意味する。
【００６０】
コラーゲンは、動物の身体の様々な結合組織における細胞外空間にある構造タンパク質である。コラーゲンは、一体に巻き付いて三重らせんを形成した、３本のポリペプチド鎖からなる。
【００６１】
天然コラーゲンの四次構造は、典型的に３本のポリペプチドで構成された、三重らせんである。用語「プロコラーゲン」は、本明細書で使用される場合、天然に存在するコラーゲンへとプロセシングすることができる、細胞によって産生されるポリペプチドを指す。
【００６２】
ゼラチンは、加水分解によってタンパク質原線維からより小型のペプチドへの低下がもたらされた、不可逆的に変性した形態のコラーゲンであり、これは、加水分解のプロセスに基づく物理的および化学的な変性方法に伴い幅広い分子量範囲を有する。コラーゲンを酸、塩基または熱で処置して、ゼラチンを調製することができる。理論または機構に制約されることは望まないが、酸、塩基または熱によるコラーゲンの処置は、コラーゲンポリペプチドを変性すると考えられる。水性変性コラーゲン溶液は、食品、化粧品、医薬品、工業用製品、医療用製品、研究用培養成長培地および多くの他の応用において使用される可逆的ゲルを形成する。
【００６３】
用語「コラーゲン配列」は、２本の他のポリペプチドと結合してコラーゲン分子の三重らせんを形成することができる、コラーゲンポリペプチドのアミノ酸配列を指すように本明細書で使用されている。この用語は、ゼラチンタンパク質に見出されるアミノ酸配列を指すようにも使用されている。この後者の使用において、この用語は、「ゼラチン配列」と互換的である。
【００６４】
ランダムフォレストモデル  −  ランダムフォレストは、決定木のアンサンブルを使用した、多重回帰または分類のための方法である。アンサンブルの各決定木は、利用できる訓練データセット由来のデータのサブセットにより訓練される。決定木の各ノードにおいて、決定規則を訓練するために、いくつかの変数が、利用できる変数全てからランダムに選択される。訓練ランダムフォレストを適用する場合、検査データが、ランダムフォレストアンサンブルの決定木に提供され、最終成果は、個々の決定木の成果の組合せに基づく。分類決定木に関して、最終クラスは、全決定木の成果の過半数（majority）または最頻値（mode）であり得る。回帰決定木（または単純に回帰ツリー）に関して、最終値は、平均値、最頻値または中央値であり得る。ランダムフォレスト方法の例および詳細については、以降にさらに記載する。
【００６５】
サポートベクターマシン（ＳＶＭ）は、分類および回帰分析のための関連する学習アルゴリズムによる機械学習ツールである。分類ＳＶＭは、他の機械学習分類子と同様に、入力データのセットを取り、与えられた入力毎に、２つの可能なクラスのいずれが出力を形成するか予測する。２つのカテゴリーの一方に属するとそれぞれマークされた、訓練例のセットを与えられると、分類ＳＶＭ訓練アルゴリズムは、新たな例を一方のカテゴリーまたは他方のカテゴリーに割り当てるモデルを組み立てる。ＳＶＭは、別々のカテゴリーの例が可能な限り広い明らかなギャップによって分けられるようにマッピングされた、多次元特徴空間におけるポイントとしての例の表現であり、これは、データポイントと、２つのカテゴリーを分離する超平面との間の距離を最大化することにより実装される。線形分類を行うことに加えて、ＳＶＭは、入力を高次元特徴空間に暗にマッピングするためのカーネルトリックを使用して、非線形分類を効率的に行うことができる。
【００６６】
回帰ＳＶＭは、入力として、個体の１種または複数の独立変数（ＩＶ）を取り、訓練データにおけるＩＶおよびＤＶの間の関係に基づき個体の従属変数（ＤＶ）の値を予測する。訓練個体のセットを与えられると、回帰ＳＶＭ訓練アルゴリズムは、ＩＶおよびＤＶに関する関数を見出すモデルを組み立てる。モデルは、定義された範囲において予測誤差を限定し、誤差が範囲を上回った場合にのみ予測誤差にペナルティーを科す。
【００６７】
用語「タンパク質」、「ポリペプチド」および「ペプチド」は、長さまたは翻訳後修飾物（例えば、グリコシル化、リン酸化、脂質付加、ミリスチル化（myristilation）、ユビキチン化等）に関係なく、アミド結合によって共有結合により連結された少なくとも２個のアミノ酸のポリマーを示すように互換的に使用されている。一部の場合では、ポリマーは、少なくとも約３０個のアミノ酸残基、通常、少なくとも約５０個のアミノ酸残基を有する。より典型的には、これは、少なくとも約１００個のアミノ酸残基を含有する。本発明は、いずれか特異的な長さのアミノ酸配列に限定されることを意図するものではない。これらの用語は、全長タンパク質またはペプチドの断片であると従来考慮されてきた組成物を含む。Ｄ−およびＬ−アミノ酸、ならびにＤ−およびＬ−アミノ酸の混合物が、この定義内に含まれる。本明細書に記載されているポリペプチドは、遺伝学的にコードされたアミノ酸に制限されない。実際に、遺伝学的にコードされたアミノ酸に加えて、本明細書に記載されているポリペプチドは、全体的にまたは部分的にのいずれかで、天然に存在するおよび／または合成非コードアミノ酸で構成され得る。一部の実施形態では、ポリペプチドは、機能的活性（例えば、触媒活性）を依然として保持しつつ、全長親ポリペプチドのアミノ酸配列と比較して、アミノ酸付加または欠失（例えば、ギャップ）および／または置換を含有する、全長祖先または親ポリペプチドの部分である。
【００６８】
本明細書で使用される場合、用語「野生型（wild-type）」または「野生型（wildtype）」（ＷＴ）は、天然に存在するタンパク質（例えば、非組換えタンパク質）を指す。野生型生体分子と反応する基質またはリガンドは、「ネイティブ」基質またはリガンドと考慮されることもある。
【００６９】
用語「配列」は、全ゲノム、染色体全体、染色体セグメント、遺伝子相互作用のための遺伝子配列の収集物、遺伝子、核酸配列、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド、多糖等が挙げられるがこれらに限定されない、いずれかの生物学的配列の順序および同一性を指すように本明細書で使用されている。一部の文脈では、「配列」は、タンパク質におけるアミノ酸残基の順序および同一性（すなわち、タンパク質配列またはタンパク質文字列）、または核酸におけるヌクレオチドの順序および同一性（すなわち、核酸配列または核酸文字列）を指す。配列は、文字列によって表すことができる。「核酸配列」は、核酸を含むヌクレオチドの順序および同一性を指す。「タンパク質配列」は、タンパク質またはペプチドを含むアミノ酸の順序および同一性を指す。
【００７０】
２種の核酸のそれぞれに由来する配列が組み合わされて後代核酸（単数または複数）を産生する場合、２種の核酸は、「組み換えられる」。核酸の両方が組換えのための基質である場合、２種の配列は、「直接的に」組み換えられる。
【００７１】
「従属変数」（「ＤＶ」）は、出力もしくは効果を表す、または効果であるか確かめるために検査される。「独立変数」（「ＩＶ」）は、入力もしくは原因を表す、または原因であるか確かめるために検査される。従属変数は、独立変数が変動するにつれて変動するか、また、どの程度変動するか確かめるために試験することができる。
【００７２】
単純確率論的線形モデルにおいて、
【００７３】
ｙｉ＝ａ＋ｂｘｉ＋ｅｉ
【００７４】
（式中、項ｙｉは、従属変数のｉ番目の値であり、ｘｉは、独立変数（ＩＶ）のｉ番目の値である）である。項ｅｉは、「誤差」として公知であり、独立変数によって説明されない従属変数の可変性を含有する。
【００７５】
独立変数（ＩＶ）は、「予測変数」、「リグレッサー」、「制御された変数」、「操作された変数」、「説明変数」または「入力変数」としても公知である。
【００７６】
用語「係数」は、従属変数を乗じたスカラー値または従属変数を含有する式を指す。
【００７７】
語句「訓練セット」は、コラーゲン配列および特性データのセット、または１種もしくは複数のモデルがフィットされ組み立てられた観察を指す。例えば、タンパク質機械学習モデルに関して、訓練セットは、初期コラーゲンタンパク質ライブラリーのアミノ酸頻度、および１種または複数の物理的または化学的特性を含む。
【００７８】
用語「観察」は、機械学習モデル等のモデルを生成するための訓練セットにおいて使用することができる、タンパク質または他の生物学的実体に関する情報である。用語「観察」は、タンパク質バリアントを含む、配列決定され、アッセイされたいずれかの生物学的分子を指すことができる。一般に、より多くの観察が機械学習モデルの生産に用いられるほど、当該機械学習モデルの予測力は優れたものとなる。
【００７９】
語句「相互検証」は、従属変数の値を予測するモデルの能力の一般化可能性を検査するための方法を指す。公知の標識を有するデータセット全体は、訓練および検証セットへとランダムに分割される。この方法は、訓練セット使用してモデルを調製し、検証セットを使用してモデル誤差を検査する。このプロセスは、いかなる可能な分割バイアスも低下させるために複数回反復される。
【００８０】
用語「回帰」および「回帰分析」は、独立変数のうちいずれが、従属変数に関係するかについて理解し、これらの関係性の形態を探索するために使用される技法を指す。制限された状況において、回帰分析を使用して、独立および従属変数の間の因果関係を推測することができる。これは、変数の間の関係性を推定するための統計学的技法である。焦点が、従属変数および１種または複数の独立変数の間の関係性に置かれている場合、これは、いくつかの変数をモデル化および分析するための多くの技法を含む。より具体的には、回帰分析は、独立変数のうちいずれか１種が変動される一方で、他の独立変数が固定されたままである場合に、従属変数の典型値が変化する仕方についての理解を助ける。回帰技法を使用して、アミノ酸頻度および物理的または化学的特性情報を含有することができる、複数の観察を含む訓練セットから機械学習モデルを生成することができる。
【００８１】
「部分最小二乗」（「ＰＬＳ」）は、新たな空間へと、予測される変数（例えば、活性）および観察可能な変数（例えば、配列）を投射することにより、線形回帰モデルを見出す方法のファミリーである。ＰＬＳは、「潜在的構造への投射」としても公知である。Ｘ（独立変数）およびＹ（従属変数）データの両方が、新たな空間に投射される。ＰＬＳは、２つの行列（ＸおよびＹ）の間の基礎的関係を見出すために使用される。潜在的変数モデルは、ＸおよびＹ空間における共分散構造をモデル化するために使用される。ＰＬＳモデルは、Ｙ空間における最大多次元的分散方向を説明する、Ｘ空間における多次元的方向を見出すことを試みるであろう。ＰＬＳ回帰は、予測因子の行列が観察よりも多くの変数を有する場合に、また、Ｘ値の間に多重共線性が存在する場合に、特に有用である。
【００８２】
回帰モデルにおいて、従属変数は、項の和によって独立変数に関係する。各項は、独立変数および関連する回帰係数の積を含む。純粋に線形回帰モデルの場合、回帰係数は、次の表現形式においてβによって得られる：
【００８３】
ｙｉ＝β１ｘｉ１＋  …  ＋βｐｘｉｐ＋εｉ＝ｘｉＴβ＋εｉ
【００８４】
（式中、ｙｉは、従属変数であり、ｘｉは、独立変数であり、εｉは、誤差変数であり、Ｔは、ベクトルｘｉおよびβの内積である転置を示す）。
【００８５】
語句「主成分分析」（「ＰＣＡ」）は、直交変換を使用して、おそらく相関する変数の観察のセットを、「主成分」と呼ばれる線形に相関しない変数の値のセットへと転換する数学的手順を指す。主成分の数は、本来の変数の数未満であるまたはそれに等しい。この変換は、第１の主成分が、最大の可能な分散を有し（すなわち、データにおける可変性のうち可能な限り多くを説明する）、次いで、各後継成分が、先行成分に対して直交性である（すなわち、それと相関しない）という制約下で可能な、最高の分散を有するような方式で定義される。
【００８６】
「ニューラルネットワーク」は、計算に対するコネクショニストアプローチを使用して情報を処理する、処理エレメントまたは「ニューロン」の相互接続された群を含有するモデルである。ニューラルネットワークは、入力および出力の間の複雑な関係性をモデル化するために、および／またはデータにおけるパターンを見出すために使用される。大部分のニューラルネットワークは、非線形の、分散された、並列の様式でデータを処理する。大部分の場合では、ニューラルネットワークは、学習相においてその構造を変化させる適応システムである。関数は、様々なユニットが割り当てられるサブタスク（subtask）の明確な規定を使用するのではなく、処理エレメントによってまとめて、かつ、並列して実行される。
【００８７】
一般に、ニューラルネットワークは、処理エレメントおよびエレメントパラメータの間の接続によって決定される複雑な網羅的挙動を示す単純処理エレメントのネットワークが関与する。ニューラルネットワークは、所望のシグナルフローを産生するために、ネットワークにおける接続の強度を変更するように設計されたアルゴリズムにより使用される。強度は、訓練または学習において変更される。
【００８８】
用語「発現ベクター」または「ベクター」は、本明細書で使用される場合、外因性遺伝子の発現を方向付けることができる核酸アセンブリを指す。発現ベクターは、外因性遺伝子に作動可能に連結したプロモーター、制限エンドヌクレアーゼ部位、１種または複数の選択マーカーをコードする核酸、および組換え技術の実施において有用な他の核酸を含むことができる。
【００８９】
用語「線維芽細胞」は、本明細書で使用される場合、プロコラーゲンおよび他の構造タンパク質を合成する細胞を指す。線維芽細胞は、身体中に広く分布し、皮膚、結合組織および他の組織に見出される。
【００９０】
用語「蛍光タンパク質」は、外因性ポリヌクレオチドの発現のレポーターとして使用される、遺伝子操作技術において一般的に使用されるタンパク質である。タンパク質は、紫外線または青色光に曝露されると、蛍光を発し、明るい可視光を発する。緑色光を発するタンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）であり、赤色光を発するタンパク質は、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）である。
【００９１】
用語「遺伝子」は、本明細書で使用される場合、特異的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを指し、また、コード領域単独を指すことができる、またはコード配列に先行する（５’非コード配列）およびそれに続く（３’非コード配列）調節配列を含むことができる。
【００９２】
用語「ヒスチジンタグ」は、組換えポリペプチドにおける２〜３０個の連続する一連のヒスチジン残基である。
【００９３】
用語「宿主細胞」は、導入された外因性ポリヌクレオチドを発現するように操作された細胞である。
【００９４】
用語「ラクタマーゼ」は、本明細書で使用される場合、ラクタム（環状アミド）部分を含有する抗生物質を加水分解する酵素を指す。「ベータ−ラクタマーゼ」または「β−ラクタマーゼ」は、β−ラクタム部分を含有する抗生物質を加水分解する酵素のクラスである。
【００９５】
用語「天然に存在しない」は、本明細書で使用される場合、自然界に正常では見出されないコラーゲンまたはゼラチンを指す。天然に存在しないコラーゲンは、一実施形態では、トランケートされたコラーゲンである。他の天然に存在しないコラーゲンポリペプチドは、キメラコラーゲンを含む。キメラコラーゲンは、コラーゲンポリペプチドのある一部分が、第２のコラーゲンポリペプチドの部分と連続するポリペプチドである。例えば、ティラピアコラーゲンの部分と連続するクラゲコラーゲンの部分を含むコラーゲン分子は、キメラコラーゲンである。別の実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、分泌タグ、ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位、ＧＥＫ反復、ＧＤＫ反復および／またはベータ−ラクタマーゼ等、追加的なアミノ酸を含む融合ポリペプチドを含む。
【００９６】
用語「プロテアーゼ切断部位」は、特異的プロテアーゼによって切断されるアミノ酸配列である。
【００９７】
用語「分泌タグ」または「シグナルペプチド」は、発現されたタンパク質を宿主細胞の特定の場所または細胞のオルガネラに輸送するために、宿主細胞の細胞の仕組みをリクルートするアミノ酸配列を指す。
【００９８】
用語「トランケートされたコラーゲン」は、全長コラーゲンの１個または複数の部分が存在しない、全長コラーゲンよりも小さい単量体ポリペプチドを指す。コラーゲンポリペプチドは、Ｃ末端側の端、Ｎ末端側の端においてトランケートされる、または全長コラーゲンポリペプチドの内部部分（単数または複数）の除去によってトランケートされる。
ＩＩ．序論
【００９９】
ネイティブコラーゲンは、互いの周りに巻き付いて、緊密に詰められた右巻きの高次らせんを形成した、３本の左巻きのポリプロリンＩＩ様らせん状鎖を含む三重らせんである。Ｇｌｙ残基のみが、この高次コイルのらせんの中心付近に３残基毎の残基として歪みなしに許容され得る。これは、形態（Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙ）ｎの反復配列を生成する。ＸおよびＹ位置は、いかなるアミノ酸を許容することもできるが、天然の原線維性コラーゲンにおけるこれらの位置の約２０％は、イミノ酸によって占有されている。プロリン（Ｐｒｏ）残基が、生合成においてＸおよびＹ位置の両方に取り込まれ、これに続いて、Ｙ位置におけるプロリンの酵素による翻訳後のヒドロキシル化が為されて、ヒドロキシプロリン（Ｈｙｐ）が形成される。（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）ｎが、コラーゲンに存在する最も安定化するトリペプチド単位（またはトリマー（trimmer）反復）であり、最も一般的な配列も表す。Persikov  AV,  Ramshaw  JA,  Kirkpatrick  A,  Brodsky  B.  (2000)  Amino  acid  propensities  for  the  collagen  triple-helix.  Biochemistry.  39(48):  14960-7。
【０１００】
天然コラーゲンは、中心的三重らせんの各末端に球状プロペプチドを有するプロコラーゲン形態で合成される。３個のＣ−プロペプチドの自己会合およびジスルフィド架橋は、鎖選択およびトリマー形成の初期事象の原因となる一方、その後の事象は、三重らせんドメインの核形成およびジッパー様フォールディングを含む。プロペプチドの切断後に、マトリックスにおける棒状三重らせん状分子は、ねじれ形アレイにおいて自己会合し、原線維を形成し、他のマトリックス分子と相互作用して、各組織に要求される強度、可撓性または圧縮を提供する。Persikov  AV,  Ramshaw  JA,  Kirkpatrick  A,  Brodsky  B.  (2002)  Peptide  investigations  of  pairwise  interactions  in  the  collagen  triple-helix.  J  Mol  Biol.  316(2):  385-94。
【０１０１】
ひとたびフォールドされると、コラーゲンは、以後、架橋されない。したがって、コラーゲンの熱的アンフォールディングは不可逆的であり、ランダムにコイルしたコラーゲン分子は、いずれの冷却手順においても、適切に整列された鎖を有するネイティブ三重らせんに戻るようにフォールドされない。しかし、アンフォールドされたコラーゲン鎖は、三重らせん状断片において部分的に回復するであろうが、鎖誤整列は、様々な長さのとび出た単鎖末端をもたらすであろう。このような末端は、続いて、短い三重らせん状断片へと会合し、より長い凝集物を生じ、ネットワーク様の巨視的構造をもたらすであろう。このようなリフォールドされたコラーゲン構造は、次の２種の状態で存在することができる：希釈溶液、および濃縮形態からなるコアセルベート。濃度が十分に高く、温度が十分な低さである場合、溶液は、その流動性を失ってゼラチンとなる。相分離温度（ゼラチン融解温度）は、本来のコラーゲン配列と共に、冷却手順およびゼラチン含水量に依存する。コラーゲン配列のモジュレーションは、可変的な堅さおよび融解温度（Ｔｍ）を含む、広範囲の物理的化学的特性を有するゼラチンを産生することができる。
【０１０２】
現在、大部分のコラーゲン生体材料は、ブタ、ウシまたは魚類等の動物原料から得られる。しかし、動物由来の材料が一貫性を欠くこと、それらの特性を調整できないこと、および変化する消費者嗜好性によって駆り立てられる、動物質を含まないコラーゲン製品に対する需要が高まっている。さらに、ある特定の市場におけるコラーゲンに基づく製品に対する急速に増加しつつある需要から、持続可能でスケーラブルなコラーゲン生体材料製造プラットフォームの必要性が明らかになった。
【０１０３】
ゼラチンの構造的および物理的特性は、コラーゲン三重らせんの安定性に依存するため、三重らせん安定性の基本原則を使用して、ゼラチンの物理的化学的特性におけるその効果を理解することが有用である。
【０１０４】
モデルコラーゲンミメティックペプチドの以前の試験は、いずれの荷電および疎水性残基組合せが、コラーゲン分子断片の熱安定性、およびその高次の構造を形成する能力を制御するかについての理解をもたらした。しかし、コラーゲンに基づく生体材料の熱安定性および機械的特性を決定するアミノ酸の組合せは、依然として不明である。本開示は、合成生物学、機械学習、材料科学および発酵を組み合わせる、コラーゲンに基づく生体材料設計および製造に対するアプローチについて記載する。
ＩＩＩ  コラーゲンまたはゼラチンタンパク質を操作するためのワークフロー
【０１０５】
本開示の一態様は、コラーゲンまたはゼラチン分子を操作するための方法を提供する。本方法は、機械学習モデルを使用して、コラーゲンタンパク質配列を設計して、所望の特性を有するゼラチン製品を形成する。図１は、一部の実装に従った、ワークフロー、プロセス１００を説明する。プロセス１００は、複数の訓練コラーゲン配列のそれぞれにおけるアミノ酸含量に関する情報を含む訓練データのセットを受け取るステップが関与する。ブロック１０２を参照されたい。一部の実装では、情報は、コラーゲン配列のＸおよびＹ位置に見出される様々なアミノ酸の頻度を提供する。アミノ酸含量に関する情報に加えて、訓練データセットは、複数の訓練コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の物理的または化学的特性データを含む。例えば、各訓練セットメンバーは、ヤング率の値等の弾性の値、および単一のゼラチン分子に対するアミノ酸頻度を含む。プロセス１００は、また、機械学習モデルを訓練データのセットにフィットさせることにより、機械学習モデルを訓練するステップが関与する。ブロック１０４を参照されたい。
【０１０６】
訓練セットを生産するために、一部の実装は、可変的な配列を有する組換えコラーゲンのセットを産生するステップが関与する。一部の実装では、訓練セットは、様々な荷電残基（Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｇｌｕ、Ａｓｐ）、疎水性残基（Ｌｅｕ、Ｉｌｅ、Ｐｈｅ）、および他の天然に存在するアミノ酸を取り込む、天然に存在するコラーゲン配列および／または合成配列を含む。一部の実装では、天然に存在するアミノ酸は、２０種の標準アミノ酸（アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、バリン、トリプトファン、チロシン）を含む。一部の実装では、天然に存在するアミノ酸は、２種の非標準アミノ酸（ピロリシンおよびセレノシステイン）も含む。一部の実装では、アミノ酸は、翻訳後に修飾されたアミノ酸、例えば、プロリンに由来するヒドロキシプロリン、およびリシンに由来するヒドロキシリシンを含む。一部の実装では、アミノ酸のうち１個または複数は、（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシプロリンを含む。一部の実装では、アミノ酸のうち１個または複数は、（２Ｓ，４Ｒ）−４−ヒドロキシプロリン以外の、合成形態のヒドロキシプロリンを含む。
【０１０７】
コラーゲン配列データは、アミノ酸の頻度へと組織化することができる。図２は、特徴ベクトルを生成し、コラーゲンもしくはゼラチン分子または分子に由来する材料の物理的特性によって標識することができる仕方を説明する。一般に、機械学習に関して、特徴ベクトルは、一部のオブジェクトを表す数的特徴のｎ次元ベクトルである。よって、特徴ベクトルは、ｎ次元特徴空間におけるオブジェクトの観察を表す。一部の実装では、本明細書に適用される場合、特徴は、後述するコラーゲン配列のアミノ酸情報を含む。教師付き機械学習モデルへの入力特徴ベクトルは、ＤＶで標識することができる。
【０１０８】
一部の実装では、配列は、本明細書に示す通り、２０種の標準アミノ酸を含む。コラーゲンアミノ酸配列は、コラーゲン配列のＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマー反復のＸ位置およびＹ位置に関する、例えば、２０種のアミノ酸残基の頻度を提供するように処理され、これは、４０種の頻度（アミノ酸の数、掛ける、考慮される位置の数）を提供する。４０種の頻度は、機械学習モデルに提供される訓練データの４０次元になる。この例では、頻度は、特定の位置におけるあらゆる可能なアミノ酸と比べたアミノ酸のパーセンテージとして示されている。アミノ酸の計数および正規化された計数等、他の形態の頻度を実装することができる。図に示すアミノ酸の頻度の値は、説明を目的とする。これは、本明細書に記載されている方法の実装に影響を与えない。
【０１０９】
図２は、特徴ベクトルが、コラーゲン配列を有するコラーゲンまたはゼラチン分子を含むコラーゲンに基づく材料の物理的または化学的特性を示す特性標識に関連することを示す。一部の実装では、物理的または化学的特性は、アミノ酸配列を有する分子に由来する生体材料から測定される。例えば、物理的または化学的特性は、コラーゲン分子に由来する生体材料の堅さまたは融解温度であり得る。
【０１１０】
一部の実装では、アミノ酸の頻度は、コラーゲン配列におけるアミノ酸トリマーの配列内バリエーションを示す。図２中等、一部の実装では、頻度は、Ｘ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーが、アミノ酸配列内でどのように変動するかを示す。一部の実装では、アミノ酸の頻度は、（ａ）各訓練配列におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置における複数の異なるアミノ酸のそれぞれの頻度、および（ｂ）訓練コラーゲン配列におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置における複数の異なるアミノ酸のぞれぞれの頻度を含む。
【０１１１】
一部の実装では、モデルの訓練は、モデルがアミノ酸に関連付ける加重または係数に基づく等、機械学習モデルに基づき物理的または化学的特性に対して低い寄与を有するアミノ酸の除去を含む。したがって、訓練後に、モデルに提供されたアミノ酸は、２０種の標準アミノ酸のサブセット、およびサブセットの翻訳後に修飾されたアミノ酸のみを含むことができる。
【０１１２】
一部の実装では、訓練データのセットは、中断されていないＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマー反復配列を有する主要コラーゲンドメインを使用して生成される。例えば、コラーゲン配列が、（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）１００＋（Ｐｒｏ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ）５＋（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）８の配列を有する場合、訓練配列として（Ｐｒｏ−Ｈｙｐ−Ｇｌｙ）１００  配列が使用される。
【０１１３】
一部の実装では、訓練データのセットは、複数の訓練コラーゲン配列の長さ、またはコラーゲン配列の断片の長さを含む。
【０１１４】
一部の実装では、アミノ酸配列に関する位置的または領域的情報は、訓練セットデータにおいて提供される。例えば、一部の実装では、アミノ酸配列は、２個またはそれよりも多い領域に分けることができる。一部の実装では、アミノ酸配列は、Ｃ末端領域、中央領域およびＮ末端領域を含む、３個またはそれよりも多い領域に分けることができる。例えば、配列が、２個の領域に分けられる場合、アミノ酸の頻度は、第１の領域に関する頻度、および第２の領域に関する頻度を含む。より具体的には、アミノ酸の頻度は、（ａ）各訓練コラーゲン配列の第１の領域におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置における複数の異なるアミノ酸のぞれぞれの頻度、（ｂ）各訓練コラーゲン配列の第１の領域におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置における複数の異なるアミノ酸のぞれぞれの頻度、（ｃ）各訓練コラーゲンまたは巨大配列の第２の領域におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸ位置における複数の異なるアミノ酸のぞれぞれの頻度、および（ｄ）各訓練コラーゲン配列の第２の領域におけるＸ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＹ位置における複数の異なるアミノ酸のぞれぞれの頻度を含む。同様に、アミノ酸の頻度は、アミノ酸配列の３個またはそれよりも多い領域に関する頻度を含むことができる。
【０１１５】
一部の実装では、少なくとも１種の物理的または化学的特性は、次のうち１種または複数を含む：融解またはゲル化温度、堅さ、弾性、酸素放出速度、清澄さ、濁度、紫外線遮断または吸収、粘性、溶解度、含水量または水和、プロテアーゼに対する抵抗性、等。
【０１１６】
物理的または化学的特性は、ヤング率、剛性率、体積弾性率（bulk  modulus）等、様々な測定基準を反映する様々な方法を使用して測定することができる。一部の実装では、濁度は、３１３ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって測定される。溶液中のゼラチンは、タンパク質の高い分子量のため、光を散乱させるコロイド溶液として存在し、したがって、単純な透過率は、一部の条件に対して「清澄さ」の優れた尺度とならない場合がある。一部の実装では、ゼラチン溶液の清澄さは、国立濁度単位（National  Turbidity  Unit）（ＮＴＵ）における「比濁分析」を使用して測定することができる。一例では、これは、４０℃における４％ゼラチン溶液を使用して、９０°と共に２５°において光路から散乱された光の量（a  mount）を測定し、これを透過した光線と比較する。他の条件では、清澄さの尺度として６４０ｎｍにおける％透過率を使用することができる。
【０１１７】
一部の実装では、コラーゲンまたはゼラチン材料の他の光学的特性を測定およびモデル化することができる。例えば、融解温度の直接的測定、および示差走査熱量測定（ＤＳＣ）からのゼラチン転移の熱効果をモデル化することができる。
【０１１８】
一部の実装では、蛍光方法から測定された光学的特性をモデル化することもできる。例えば、方法は、蛍光色素、ウラニン（またはその他）が、測定に先立ちゼラチンによって吸収されることを要求する、蛍光偏光解消をモデル化することができる。例えば、Hayashi  and  Oh,  1983,  Agric.  Biol.  Chem.を参照されたい。
【０１１９】
一部の実装では、物理的特性は、一定温度で標準ピペットを通る所与の体積の溶液の流動時間として測定される、粘性を含むことができる。
【０１２０】
ワークフローにおいて、コラーゲンまたはゼラチン頻度データは、少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連する。関連は、次の通りに作製することができる。様々な実装では、コラーゲン配列は、頻度データ等、アミノ酸含量情報を提供するように処理される。コラーゲン配列は、コラーゲンまたはゼラチンタンパク質に含まれる。コラーゲンタンパク質は、物理的または化学的処置によってゼラチンに変換することができる。生体材料は、コラーゲンまたはゼラチンに由来し得る。コラーゲンタンパク質、ゼラチンタンパク質、およびコラーゲンまたはゼラチンに由来する生体材料はそれぞれ、物理的または化学的特性を有することができる。次に、物理的または化学的特性は、コラーゲン配列または対応するアミノ酸頻度データに関連することができる。ある意味では、コラーゲンまたはゼラチン分子の各型が、訓練セットにおける単一のベクトルを提供し、当該ベクトルは、（ｉ）アミノ酸含量情報、および（ｉｉ）少なくとも１種の化学的または物理的特性値を含む。
【０１２１】
一部の実装では、２種またはそれよりも多い物理的または化学的特性を、訓練セットデータにおいて提供して、モデルを訓練し、望ましいコラーゲン配列を同定する。
【０１２２】
上述の通り、プロセス１００は、機械学習モデルを訓練データのセットにフィットさせることにより、機械学習モデルを訓練するステップが関与する。機械学習モデルの型は、以降に記載する機械学習モデル型のいずれかから選択することができる。一部の実装では、機械学習モデルは、ＳＶＭモデルである、またはこれを含む。一部の実装では、ＳＶＭは、線形カーネルを有する。一部の実装では、ＳＶＭは、非線形カーネルを有する。線形カーネルを有するＳＶＭのため、一部の実装は、ＳＶＭのウェイトベクトルを分析して、いずれの位置におけるいずれのアミノ酸が、分析されるコラーゲン試料の観察される物理的特性または化学的特性の主要な決定基であるか決定するステップがさらに関与する。次に、効果において特徴空間の次元を低下させる、物理的または化学的特性に対するその寄与において重要でない特徴（特異的位置におけるアミノ酸）を除去することにより、特徴空間を低下させることができる。
【０１２３】
一部の実装では、機械学習モデルを訓練するステップは、機械学習モデルを訓練するために頻度データを提供する前に、訓練データに主成分分析を適用して、特徴空間の次元を低下させるステップが関与する。
【０１２４】
一部の実装では、モデルの訓練は、うまく機能するモデルを選択するための相互検証の使用を含む。相互検証において、初期に訓練されたモデルが評価および比較される。一部の実装では、ある量（例えば、１０％）の訓練データが、訓練セットから除去され、機械学習モデルは、他の９０％のベクトルを使用して再訓練され、得られたモデルは、残っている１０％検証セットにおいて検査される。反復して訓練および検証データを分割して、訓練セット分割に起因する潜在的バイアスを回避することにより、この手順を複数回（例えば、１００回またはそれよりも多く）反復することができる。モデルの結果は、受信者動作特性（ＲＯＣ）および／または精度再現率（ＰＲ）曲線の形態で表して、モデルの妥当性を評価することができる。
【０１２５】
一部の実装では、線形ＳＶＭ、非線形ＳＶＭおよびランダムフォレストモデルは、上に記載されている相互検証手順を使用して比較することができる。一部の実装では、多くのモデル（１つの型または複数の型の）が生成される。モデルは、その予測能力に基づき比較され、次いで、１つのモデルまたはモデルのアンサンブルを選択することができる。一部の実装では、遺伝的アルゴリズムを使用して、モデルを繰り返し生成、選択およびさらに精密にして、高い予測力を有するモデルを開発することができる。
【０１２６】
ＲＯＣ曲線下面積として測定される場合に、最もうまく機能する方法が、さらなるタンパク質設計に選択される。最もうまく機能する機械学習予測因子を得ることは、所望の物理的化学的特性（例えば、標準温度での堅さまたはＴｍ）を有する組換えコラーゲンの合理的設計を可能にする。
【０１２７】
一部の実装では、機械学習モデルは、ランダムフォレストモデルを含む。一部の実装では、機械学習モデルは、ニューラルネットワークモデルを含む。一部の実装では、機械学習モデルは、部分最小二乗モデル等、一般線形モデルを含む。ゼラチンまたはコラーゲンモデルへのこれらのモデル型の適用を下に提示する。
【０１２８】
図１を参照すると、プロセス１００は、機械学習モデルを使用して、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると機械学習モデルによって予測される標的データのセットを得るステップがさらに関与する。ブロック１０６を参照されたい。例えば、標的データのセットは、判断基準値を上回る融解温度を有するまたは群における最高の清澄さを有するゼラチンに対応すると機械学習モデルによって予測される。
【０１２９】
プロセス１００は、標的データのセットに対応する１種または複数のコラーゲン配列を決定するステップがさらに関与する。ブロック１０８を参照されたい。標的データは、訓練データと同じ方式で、アミノ酸の頻度を含む。そのため、１セットのアミノ酸頻度データは、異なるコラーゲン配列に対応することができる。標的データのセットに対応するコラーゲン配列の同定において、他の因子を考慮することができる。例えば、一部の実装では、コラーゲン配列の長さも、機械学習モデルによって処理される。そのため、長さ情報を頻度情報と組み合わせて、コラーゲン配列を決定することができる。また、一部の実装では、アミノ酸の相対的位置情報は、機械学習モデルによって処理される。斯かる位置的または領域的情報を使用して、産生されるべきコラーゲン配列を決定することもできる。一部の実装では、複数のコラーゲン配列が、１セットの頻度データに対して決定され、複数のコラーゲン分子を産生することができる。
【０１３０】
プロセス１００は、１種または複数のコラーゲン配列をコードする１種または複数のポリヌクレオチドを産生するステップがさらに関与する。ブロック１１０を参照されたい。一部の実装では、１種または複数のポリヌクレオチドは、生物において天然に存在する野生型コラーゲン配列または突然変異体コラーゲン配列に対応する配列断片を有する、組換えポリヌクレオチドを含む。一部の実装では、組換えポリヌクレオチドは、生物において天然に存在しないが、天然に存在しない遺伝子操作された生物によって組み換えられた、設計された断片を含む。一部の実装では、組換えポリヌクレオチドは、化学合成を使用して生成することができる。
【０１３１】
一部の実装では、１種または複数のポリヌクレオチドは、オリゴヌクレオチド合成機を使用してｄｅ  ｎｏｖｏ生成されたポリヌクレオチドを含む。一部の実装では、ポリヌクレオチドは、天然の生物において見出されない、設計された配列を含む。
【０１３２】
プロセス１００は、１種または複数のポリヌクレオチドを発現させて、１種または複数のコラーゲン配列を含む１種または複数のコラーゲン分子を産生するステップがさらに関与する。ブロック１１０を参照されたい。様々な発現系を使用することができる。一部の実装では、プロセスは、以降に記載する、スイッチＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  Ｃｏｌｉ細菌を含む発現系を使用する。一部の実装では、コラーゲン分子は、分泌タグのアミノ酸配列も含む。一部の実装では、分泌タグは、次のタンパク質配列のうち１種または複数を含む：ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡおよびＨｙ１Ａ。分泌タグは、細菌に、コラーゲンを周辺質空間へと分泌させる。
【０１３３】
一部の実装では、１種または複数のコラーゲン分子は、次のうち１種または複数のアミノ酸配列を含む：ヒスチジンタグ、緑色蛍光タンパク質、プロテアーゼ切断部位、ベータ−ラクタマーゼタンパク質、等。
【０１３４】
一部の実装では、プロセス１００は、ブロック１１２において産生されたコラーゲン配列を使用することによりコラーゲン分子を進化させて、新たなゼラチン製品を産生して、訓練データの新たなセットを生成し、次いでこれを使用して、新たな機械学習モデルをさらに訓練し、さらに改善されたコラーゲン配列を同定するステップが必要に応じて関与する。訓練データの新たなセットを生成するステップは、コラーゲン分子をスクリーニングして、分子または分子から作製されたゼラチン材料の物理的または化学的特性を決定するステップが関与する。破線を有する矢印１１４を参照されたい（破線は、必要に応じたステップを示す）。
【０１３５】
一部の実装では、ＳＶＭまたは一般線形モデル（例えば、ＰＬＭ）加重を使用して、修飾することができるアミノ酸を同定して、繰り返し定向進化プロセスにおいてさらに改善されたコラーゲンタンパク質を生成することができる。例えば、モデル加重によって反映される通り、物理的または化学的特性に大きい影響を有するアミノ酸は、突然変異または組換えのために標的化され得る。突然変異されたまたは組み換えられたタンパク質が産生され、所望の特性に関してスクリーニングされる。一部の実装は、突然変異されたまたは組み換えられたタンパク質を使用して、訓練データを提供して、機械学習モデルをさらに開発する。
【０１３６】
一部の実装では、プロセス１００は、ブロック１１２において産生された１種または複数のコラーゲン分子から、ゼラチンまたは他の材料を製造するステップがさらに関与する。
ＩＶ  機械学習モデル
【０１３７】
機械学習は、解答が明示的に提供されない状態で、学習して、問題を解決する能力をコンピュータに与える、コンピュータ科学の分野である。人工知能におけるパターン認識および計算的学習理論の試験から進化して、機械学習は、データから学習し、それに基づいて予測を為すことができるアルゴリズムを探索する。斯かるアルゴリズムは、訓練データを使用したモデルの訓練によりデータ駆動予測または決定を下すことにより、厳密に静的なプログラム命令に従うことを克服する。機械学習モデルは、機械学習技法を使用して、物理的現象、または現象における変数間の関係性をモデル化する。機械学習モデルは、訓練相において訓練データにフィットされ、これにより、モデルは、訓練データにおける関係性を説明するまたはこれを「学習」することができる。
【０１３８】
その妥当性に関するフィードバックが、訓練においてモデルに与えられる場合、機械学習は、教師付き学習と考慮される。例えば、モデルが、ＩＶに基づくＤＶを予測する場合、教師付き学習は、観察のＩＶおよびＤＶの両方を含む訓練データを提供する。その妥当性に関するフィードバックが、訓練においてモデルに提供されない場合、機械学習は、教師なし学習と考慮される。例えば、モデルが、ＩＶに基づくＤＶ、例えば、分類を予測する場合、教師なし学習は、観察のＩＶを含むがＤＶを含まない訓練データを提供する。
【０１３９】
本明細書に開示されている一部の実装は、コラーゲンまたはゼラチンタンパク質を操作するための機械学習モデルを提供する。機械学習モデルは、入力として、コラーゲンまたはゼラチンアミノ酸配列の頻度データを受け取る。機械学習モデルは、コラーゲンまたはゼラチンアミノ酸配列に関連する１種または複数の物理的または化学的特性の値を予測する、またはこれを出力として提供する。したがって、機械学習モデルは、コラーゲン頻度−特性モデルと称することもできる。
【０１４０】
一部の実施形態では、機械学習モデルは、非線形モデルである。他の実施形態では、これは線形モデルである。開示されているプロセスにおいて使用することができる機械学習モデルは、最小二乗モデル、部分最小二乗モデル、多重線形回帰、主成分回帰、部分最小二乗回帰、ロジスティック回帰、ＳＶＭ、ニューラルネットワーク、ベイジアン線形回帰またはブートストラップ、およびこれらのアンサンブルバージョンを含む。
線形回帰
【０１４１】
一部の実装は、線形回帰を使用して、コラーゲンアミノ酸（amino）頻度および特性の間の関係性をモデル化することができる。線形回帰は、定量的予測を為す方式を提供する。単純線形回帰において、実数値従属変数（ＤＶ）Ｙは、実数値独立変数（ＩＶ）Ｘプラスノイズの線形関数としてモデル化される：
【０１４２】
Ｙ＝β０＋β１Ｘ＋ε
【０１４３】
（式中、β０は切片であり、β１は係数であり、εはモデル由来のデータの誤差または偏差である）。
【０１４４】
多重回帰において、複数の独立変数Ｘ１、Ｘ２、…Ｘｐ≡Ｘが存在する。
【０１４５】
Ｙ＝β０＋βＴＸ＋ε
【０１４６】
ＩＶの効果が、他の変数がどのように挙動するかに関係なく、Ｙに厳密に相加な効果を有する場合、これは功を奏する。さもなければ、モデルは、次の通りにＩＶ間の相互作用を説明するように修飾することができる。
【０１４７】
Ｙ＝β０＋βＴＸ＋γＸＸＴ＋ε
サポートベクターマシン回帰
【０１４８】
一部の実装は、ＳＶＭ回帰を用いて、コラーゲンアミノ酸頻度および物理的または化学的特性の間の関係をモデル化する。説明するために、下の単純な例は、１個のみのＩＶ（すなわち、１個のみのアミノ酸の頻度）および１個のみのＤＶ（例えば、融解温度）を有する訓練データのセットを記載し、各データポイントは（ｘｉ，ｙｉ）である。ＳＶＭ回帰の目標は、全訓練データに関してデータｙｉから最大でもε偏差を有し、同時に、可能な限り平坦である、関数ｆ（ｘ）を見出すことである。換言すれば、モデルは、ε未満である限り誤差を気に掛けないが、εよりも大きいいかなる偏差も受容しない。
【０１４９】
一形態では、次の通りに線形関数が使用される。
【０１５０】
ｆ（ｘ）＝＜ｗ，ｘ＞＋ｂ
【０１５１】
（式中、＜  ，  ＞は、ドット積を示す。上の関数における平坦度は、小さいｗを求めることを意味する。関数の「平坦度」の異なる測定を使用することができる。これを確実にする方式の１つは、関数のユークリッド・ノルム、
【化１】
2021503899.tif 000003
を最小化することである。解答は次の通りに形式化される。
【０１５２】
次式を最小化し、
【０１５３】
【化２】
2021503899.tif 000004
【０１５４】
次式を満たす。
【０１５５】
【化３】
2021503899.tif 000005
【０１５６】
ベクトルのユークリッド・ノルムは、ベクトルの大きさである。ｎ次元ユークリッド空間Ｒｎにおいて、ベクトルｘ＝（ｘ１、ｘ２、…、ｘｎ）の長さの直感的概念は、次式によって捉えられる。
【０１５７】
【化４】
2021503899.tif 000006
【０１５８】
実際のところ、データポイントは、εの誤差の外側となる場合があるため、実際のデータによって解答を得ることは不可能な場合がある。モデルは、さらなる誤差を可能にする柔軟なマージンを使用して、これを説明する。モデルは、スラック変数を使用して、上の最適化問題の実行不可能な制約を緩和する。問題は、次の通りに改訂される。
【０１５９】
次式を最小化し、
【０１６０】
【化５】
2021503899.tif 000007
【０１６１】
次式を満たす。
【０１６２】
【化６】
2021503899.tif 000008
【０１６３】
定数Ｃ＞０は、ｆ（ｘ）の平坦度およびεよりも大きい偏差が耐容される限界量の間のトレードオフを決定する。
【０１６４】
図３は、ＳＶＭ回帰モデルおよびデータが、解答関数を見出す仕方を図表により説明する。左側のサブプロット（subplot）は、データポイント、解答関数、ならびに誤差εおよびζｉを示す。右側のサブプロットは、コスト関数を示す。誤差が、εに対応する影付きの区域内にある場合、これは、コストを増加させない。しかし、εを越えた誤差に関して、コストは、右側に示す通りに線形に増加する。
ランダムフォレスト
【０１６５】
図４〜図６は、ランダムフォレストモデルを組み立て適用して、コラーゲン分子およびそれに由来する材料の物理的または化学的特性を予測することができる仕方を概略的に説明する。
【０１６６】
図４は、二次元（パーセンテージ単位のプロリン頻度およびグルタミン酸頻度）のみを有する仮定上のデータのための単純化された決定木である概略図を示す。このような決定木は、回帰プロセスにおける連続値を決定するのに使用され、したがって、回帰ツリーとも称する。この単純化された説明のための例において、各特徴ベクトルは、２種の成分のみを含む：パーセンテージ単位のプロリン頻度およびグルタミン酸頻度。各データポイントは、融解温度（Ｔｍ）で標識される。コラーゲン分子またはコラーゲン材料の訓練セットを使用して、決定木を訓練する。決定木を訓練したら、検査データを決定木に適用して、検査コラーゲンの融解温度を予測することができる。次に、いくつかの決定木を、図５および図６に示す通りに確率論的機構と組み合わせて、ランダムフォレストを形成する。
【０１６７】
図４において説明されている決定木は、単なる説明を目的としており、実際のコラーゲン配列およびその融解温度を反映していない、仮定上のデータを含む。
【０１６８】
訓練相において、訓練コラーゲン配列は、二次元空間においてクラスター化され、クラスターは、異なるレベルの融解温度を有する。図４に示す決定木等、決定木は、訓練コラーゲン配列のクラスターを説明するように生成および訓練することができる。図４における決定木は、括弧内の数によって示される各葉における訓練配列の数を有する。決定木構造は、その葉がクラスターにおけるデータポイントに対応するように、形成される。検査相において、決定木は、次の通りにコラーゲン配列を予測する。上部（または逆さまの木の根）における第１の決定ノードにおいて、これが一方または他方の決定枝の特徴値を有するか否かが点検される。データポイントが、一方の決定枝に属する場合、次いで、データポイントが決定木の末端ノードまたは葉に属すると同定されるまで、次のレベルにおける２本の枝のうちどちらの１本にこれが属するかがさらに決定される。例えば、訓練コラーゲン配列は、１０％のプロリン頻度および１０％のグルタミン酸頻度を有する。その１０％のプロリン頻度は、１９．５％よりも小さいため、訓練配列は、上部から第１のレベルにおいて左枝に属する。第２のレベルにおいて、その１０％のグルタミン酸頻度は、１１．２％よりも小さいため、これは、左枝に属する。第３のレベルにおいて、その１０％のプロリン頻度は、９．５％よりも大きいため、これは、右枝に属する。第４のレベルにおいて、その１０％のグルタミン酸頻度は、８．１％よりも大きいため、これは、右枝に属する。第５のレベルにおいて、その１０％のグルタミン酸頻度は、９．５％よりも大きいため、これは、右枝に属する。このようにして、決定木は、５４℃の融解温度に関連するとコラーゲン配列を予測する。
【０１６９】
図５および図６は、決定木のアンサンブルを使用して、ブートストラップ集約（バギング（bagging））の確率論的機構およびランダムフォレストを含む回帰の実行を説明する。バギングにおいて、決定木を訓練するために、ランダムデータサブセットが、利用できる全訓練データから選択される。例えば、データサブセット２８４２は、全訓練データ２８４０からの置換えによりランダムに選択される。ランダムデータサブセットは、ブートストラップデータサブセットとも呼ばれる。次に、ランダムデータサブセット２８４２が、決定木２８５２の訓練に使用される。さらに多くのランダムデータサブセット（２８４４〜２８４８）が、ブートストラップデータサブセットとしてランダムに選択され、決定木２８５４〜２８５８の訓練に使用される。
【０１７０】
一部の実装では、決定木の予測力が、ブートストラップデータセットの外側の訓練データを使用して評価される。例えば、訓練データポイントが、データサブセット２８４２において選択されない場合、決定木２８５２の予測力の検査に使用することができる。斯かる検査は、「バッグから取り出す（out  of  the  bag）」または「ｏｏｂ」検証と命名される。一部の実装では、不十分なｏｏｂ予測力を有する決定木は、アンサンブルから除去することができる。相互検証等、他の方法を使用して、成績の悪い木を除去することもできる。
【０１７１】
決定木が訓練され刈り取られた後に、検査データを、決定木のアンサンブルに提供して、検査データを分類することができる。図２８Ｃは、検査データを決定木のアンサンブルに適用して、検査データ２８６０を分類することができる仕方を説明する。例えば、検査データポイントは、決定木２８６２において１つの決定パスを有し、Ｔｍ１を有すると予測される。同じデータポイントを、決定木２８６４によってＴｍ２として、決定木２８６６によってＴｍ３として、また、決定木２８６８によってＴｍ４として、といった具合に分類することができる。バギング方法は、個々の決定木の全ての結果を組み合わせることにより、最終ＤＶ値を決定する。ブロック２８８０を参照されたい。分類適用において、バギングは、過半数による投票によって最終分類を決定することができる。これは、分類分布の最頻値として決定することもできる。回帰において、バギングは、平均値、最頻値または中央値、加重平均、および複数の木の成果を組み合わせる他の方法によって最終分類を決定することができる。
【０１７２】
ランダムフォレストは、バギングにおいて、決定木のアンサンブルへと追加的な確率論的機構を統合することによりさらに改善される。ランダムフォレスト方法において、決定木の各ノードにおいて、ｍ個の変数を、利用できる全ての変数からランダムに選択して、決定ノードを訓練する。ブロック２８８２を参照されたい。追加的な確率論的機構が、モデルの正確さおよび安定性を改善することが示された。
Ｖ．コラーゲン発現系およびコラーゲン分子
【０１７３】
いくつかのタンパク質発現系を使用して、上に開示されているプロセスから得られた核酸配列を発現させることができる。参照により本明細書に組み込まれる共同所有の出願ＰＣＴ／ＵＳ１７／２４８５７において、細胞分裂が阻害され、周辺質空間の成長が大幅に増強された、修飾された細菌細胞（スイッチ細胞）を使用する発現系が開示された。この発現系において、発現されるタンパク質は、周辺質空間へと標的化される。このようなスイッチ細胞における組換えタンパク質産生は、非スイッチ細胞における産生と比較して、劇的に増加する。構造的には、細胞は、内膜および外膜の両方を含むが、機能的なペプチドグリカン細胞壁を欠く一方で、細胞形状は球状であり、経時的に体積を増加させる。注目すべきことに、周辺質空間は、正常であれば、総細胞体積の１０〜２０％のみを構成するが、本明細書に記載されているスイッチ状態の周辺質区画は、総細胞体積の２０％、３０％、４０％または５０％超、最大で６０％、７０％、８０％または９０％を構成することができる。
【０１７４】
ＰＣＴ／ＵＳ１７／２４８５７の修飾された細菌細胞は、例えば、ガンマプロテオバクテリアおよびアルファプロテオバクテリアから選択されるグラム陰性細菌に由来する。一部の実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓおよびＢｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａから選択される。特異的な実施形態では、細菌は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ  ｃｏｌｉ、例えば、系統ＢＬ２１（ＤＥ３）である。
【０１７５】
別の態様では、宿主細菌細胞は、マグネシウム塩を含む培養培地において拡大された周辺質空間を有し、培地中のマグネシウムイオンの濃度は、少なくとも約３、４、５または６ｍＭである。さらなる実施形態では、培地中のマグネシウムイオンの濃度は、少なくとも約７、８、９または１０ｍＭである。一部の実施形態では、培地中のマグネシウムイオンの濃度は、約５ｍＭ〜２５ｍＭの間であり、約６ｍＭおよび／または約２０、１５もしくは１０ｍＭの間である。一部の実施形態では、マグネシウム塩は、硫酸マグネシウムおよび塩化マグネシウムから選択される。
【０１７６】
他の実施形態では、培養培地は、例えば、糖（例えば、アラビノース、グルコース、スクロース、グリセロール、ソルビトール、マンニトール、フルクトース、ガラクトース、サッカロース、マルトトリオースエリスリトール（maltotrioseerythritol）、リビトール、ペンタエリスリトール、アラビトール、ガラクチトール、キシリトール、イジトール（iditol）、マルトトリオース等）、ベタイン（例えば、トリメチルグリシン）、プロリン、塩化ナトリウムを含む、浸透圧安定剤をさらに含み、培地中の浸透圧安定剤の濃度は、少なくとも約４％、５％、６％または７％（ｗ／ｖ）である。さらなる実施形態では、浸透圧安定剤の濃度は、少なくとも約８％、９％または１０％（ｗ／ｖ）である。一部の実施形態では、培地中の浸透圧安定剤の濃度は、約５％〜約２０％（ｗ／ｖ）の間である。
【０１７７】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、アミノ酸、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マグネシウム、ペプトン、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび酵母抽出物をさらに含む。
【０１７８】
宿主細菌細胞は、連続的にまたは不連続的に；バッチプロセス、フェドバッチプロセスまたは反復フェドバッチプロセスにおいて培養することができる。
【０１７９】
一部の実施形態では、細胞培養培地は、１種または複数の抗生物質をさらに含む。一部の実装では、抗生物質は、β−ラクタム抗生物質（例えば、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネムおよびモノバクタム）、ホスホン酸抗生物質、ポリペプチド抗生物質およびグリコペプチド抗生物質から選択される。特定の実施形態では、抗生物質は、アラホスファリン（alafosfalin）、アモキシシリン、アンピシリン、アズトレオナム、バシトラシン、カルベニシリン、セファマンドール、セフォタキシム、セフスロジン、セファロチン、ホスミドマイシン、メチシリン、ナフシリン、オキサシリン、ペニシリンｇ、ペニシリンｖ、ホスホマイシン、プリマキシンおよびバンコマイシンから選択される。
【０１８０】
理論に制約されることなく、組換えタンパク質産生を促進し、細胞分裂を阻害する細胞形態は、上に記す培地条件下における細胞壁の除去によって駆動されると思われる。一部の実施形態では、細胞壁合成の除去／阻害のための方法は、ペプチドグリカン合成を阻害する抗生物質（アンピシリン、カルベニシリン、ペニシリンまたはホスホマイシン等）の使用または本技術分野で公知の他の方法によって行うことができる。
【０１８１】
適切な周辺質標的化シグナル配列を有する場合、組換えにより産生されたポリペプチドは、細菌細胞の周辺質空間へと分泌され得る。Joly,  J.C.  and  Laird,  M.W.,  in  The  Periplasm  ed.  Ehrmann,  M.,  ASM  Press,  Washington  D.C.,  (2007)  345-360。周辺質の化学的に酸化性の環境は、ジスルフィド結合の形成を支持し、これにより、ポリペプチドの機能的に正確なフォールディングを支持する。
【０１８２】
一般に、シグナル配列は、発現ベクターの成分であり得る、またはベクターへと挿入される外因性遺伝子の一部であり得る。選択されるシグナル配列は、宿主細胞によって認識およびプロセシングされる（すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される）シグナル配列となるべきである。外因性遺伝子のネイティブシグナル配列を認識およびプロセシングしない細菌宿主細胞のため、シグナル配列は、いずれかの一般的に公知の細菌シグナル配列によって置換される。一部の実施形態では、組換えにより産生されたポリペプチドは、ＤｓｂＡシグナル配列を使用して、周辺質空間へと標的化することができる。Dinh  and  Bernhardt,  J  Bacteriol,  Sept.  2011,  4984-4987。ＤｓｂＡは、細菌チオールジスルフィドオキシドレダクターゼ（ＴＤＯＲ）である。ＤｓｂＡは、酵素のＤｓｂ（ジスルフィド結合）ファミリーの鍵となる成分である。ペプチドが、細胞の周辺質に出現すると、ＤｓｂＡは、鎖内ジスルフィド結合形成を触媒する。
【０１８３】
一部の実装では、天然に存在しないコラーゲンポリペプチドは、分泌タグを含むアミノ酸配列をさらに含む。分泌タグは、宿主細胞の周辺質空間へとコラーゲンを方向付ける。特定の実施形態では、シグナルペプチドは、ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡまたはＨｙ１Ａに由来する。一態様では、分泌タグは、天然に存在しないコラーゲンに取り付けられる。別の態様では、分泌タグは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンから切断される。
【０１８４】
一部の実装では、天然に存在しないコラーゲンは、ヒスチジンタグをさらに含む。ヒスチジンタグまたはポリヒスチジンタグは、コラーゲンに取り付けられる、２〜２０個のヒスチジン残基の配列である。ヒスチジンタグは、２〜２０個のヒスチジン残基、５〜１５個のヒスチジン残基、５〜１８個のヒスチジン残基、５〜１６個のヒスチジン残基、５〜１５個のヒスチジン残基、５〜１４個のヒスチジン残基、５〜１３個のヒスチジン残基、５〜１２個のヒスチジン残基、５〜１１、５〜１０個のヒスチジン残基、６〜１２個のヒスチジン残基、６〜１１個のヒスチジン残基または７〜１０個のヒスチジン残基を含む。ヒスチジンタグは、ニッケルに基づくクロマトグラフィー培地を利用したクロマトグラフィー方法によるタンパク質の精製において有用である。例示的な蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）または赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）を含む。蛍光タンパク質は、本技術分野で周知である。一実施形態では、天然に存在しないコラーゲンは、ＧＦＰおよび／またはＲＦＰを含む。一実施形態では、スーパーフォルダー（superfolder）ＧＦＰが、天然に存在しないコラーゲンに融合される。スーパーフォルダーＧＦＰは、不十分にフォールドされたポリペプチドに融合された場合であっても、適切にフォールドするＧＦＰである。一態様では、ヒスチジンタグは、天然に存在しないコラーゲンに取り付けられる。別の態様では、ヒスチジンタグは、天然に存在しないコラーゲンから切断される。
【０１８５】
一部の実装では、天然に存在しないコラーゲンは、プロテアーゼ切断部位をさらに含む。プロテアーゼ切断部位は、組換えにより産生されたコラーゲンを切断して、ポリペプチドの部分を除去するのに有用である。除去することができるポリペプチドの部分は、分泌タグ、ヒスチジンタグ、蛍光タンパク質タグおよび／またはベータ−ラクタマーゼを含む。プロテアーゼは、エンドプロテアーゼ、エキソプロテアーゼ、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、スレオニンプロテアーゼ、アスパラギン酸プロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼおよびメタロプロテアーゼを含む。例示的なプロテアーゼ切断部位は、トロンビン、ＴＥＶプロテアーゼ、第Ｘａ因子、エンテロペプチダーゼおよびライノウイルス３Ｃプロテアーゼによって切断されるアミノ酸を含む。一態様では、切断タグは、天然に存在しないコラーゲンに取り付けられる。別の態様では、切断タグは、天然に存在しないコラーゲンから、適切なプロテアーゼによって除去される。
【０１８６】
一部の実装では、天然に存在しないコラーゲンは、ベータ−ラクタマーゼである酵素をさらに含む。ベータ−ラクタマーゼは、選択マーカーとして有用である。一態様では、ベータ−ラクタマーゼは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンに取り付けられる。別の態様では、ベータ−ラクタマーゼは、天然に存在しないコラーゲンまたはエラスチンから切断される。
【０１８７】
ポリヌクレオチドは、一態様では、宿主細胞の形質転換およびポリヌクレオチドの発現に使用されるベクターである。ポリヌクレオチドは、宿主生物が、選択用薬剤の存在下で成長することを可能にする酵素をコードする核酸をさらに含む。選択用薬剤は、ガラクトース含有糖を含むある特定の糖、またはアンピシリン、ハイグロマイシン、Ｇ４１８、その他を含む抗生物質を含む。選択用薬剤に対する抵抗性の付与に使用される酵素は、β−ガラクトシダーゼまたはβ−ラクタマーゼを含む。
【０１８８】
一態様では、本開示は、ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞を提供する。宿主細胞は、グラム陰性細菌細胞、グラム陽性細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、または外因性ポリヌクレオチドの発現に使用される他のいずれかの細胞を含む、いずれかの宿主細胞であり得る。例示的なグラム陰性宿主細胞は、Ｅ．ｃｏｌｉである。
【０１８９】
本開示は、細胞分裂を阻害するように細胞が修飾されており、周辺質空間が増加した、細菌宿主細胞を提供する。本明細書に記述され、実施例１に教示されている通り、ベータ−ラクタム抗生物質は、野生型細菌細胞を、細胞複製が阻害され周辺質空間が増加した修飾された細菌細胞へと転換するためのスイッチとして有用である。例示的なベータ−ラクタム抗生物質は、ペニシリン、セファロスポリン、カルバペネムおよびモノバクタムを含む。
【０１９０】
スイッチ形態の細菌（Ｌ型）は、ある特定の塩および他の栄養素を含む培養培地において培養される。検査された、生理学的スイッチの生理学を支持する塩および培地組成は、Ｍ６３塩培地、Ｍ９塩培地、ＰＹＥ培地およびルリア・ベルターニ（Luria-Bertani）（ＬＢ）培地である。炭素、窒素および無機リン酸塩源の他の、いずれか必要なサプリメントが、単独で、または複合窒素源等、別のサプリメントもしくは培地との混合物として導入されて、適切な濃度で含まれていてもよい。ある特定の実施形態では、培地は、塩化アンモニウム、硫酸アンモニウム、塩化カルシウム、カザミノ酸、硫酸鉄（ＩＩ）、硫酸マグネシウム、ペプトン、リン酸カリウム、塩化ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび酵母抽出物から選択される１種または複数の成分をさらに含む。
【０１９１】
ベータ−ラクタマーゼは、原核細胞におけるラクタム抗生物質に対する抵抗性を付与する酵素である。典型的には、ベータ−ラクタマーゼが、細菌宿主細胞において発現される場合、発現されたベータ−ラクタマーゼタンパク質は、ベータ−ラクタマーゼタンパク質を周辺質空間に方向付ける標的化配列（分泌タグ）も含む。ベータ−ラクタマーゼは、周辺質空間へと輸送されない限り、機能的でない。本開示は、酵素を周辺質空間に標的化する独立した分泌タグを使用しない、周辺質へのベータ−ラクタマーゼの標的化を提供する。周辺質分泌タグが、ＧＦＰ、コラーゲンまたはＧＦＰ／コラーゲンキメラ等のタンパク質のＮ末端に付加された、融合タンパク質を生産することにより、ネイティブ分泌タグを欠くベータ−ラクタマーゼの機能性を使用して、Ｎ末端融合タンパク質の完全翻訳および分泌に関して選択することができる。このアプローチを使用して、本出願人らは、ＤｓｂＡ−ＧＦＰ−コラーゲン−ベータ−ラクタマーゼ融合体を使用して、翻訳および分泌を支持する標的コラーゲンにおけるトランケーション産物に関して選択した。
【０１９２】
別の態様は、天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンを産生する方法を提供する。本方法は、コラーゲンをコードするポリヌクレオチドを含む組換え宿主細胞を培養培地に接種するステップと、宿主細胞を培養するステップと、宿主細胞から天然に存在しないコラーゲンまたは天然に存在しないエラスチンを単離するステップとを含む。
【０１９３】
本開示は、
【０１９４】
ａ）マグネシウム塩を含む培地において組換えグラム陰性細菌細胞を培養するステップであって、培地中のマグネシウムイオンの濃度が、少なくとも約６ｍＭであり、細菌細胞が、タンパク質をコードする外因性遺伝子を含む、ステップと、
【０１９５】
ｂ）培地に抗生物質を添加するステップであって、抗生物質が、細菌細胞におけるペプチドグリカン新生を阻害する、ステップと、
【０１９６】
ｃ）培地からタンパク質を収集するステップと
を含む、タンパク質の発酵による調製のためのプロセスをさらに提供する。
【０１９７】
細菌は、標的タンパク質を産生する目的で、バッチプロセス（バッチ培養）においてまたはフェドバッチもしくは反復フェドバッチプロセスにおいて、例えば、ＷＯ０５／０２１７７２に記載されている通りに連続的に、または不連続的に培養することができる。一部の実施形態では、タンパク質産生は、大規模で行われる。組換えタンパク質の産生のため、様々な大規模発酵手順を利用できる。大規模発酵は、少なくとも１，０００リットルの容量、好ましくは約１，０００〜１００，０００リットルの容量を有する。このような発酵槽は、撹拌用羽根車を使用して、酸素および栄養素、特に、グルコース（好まれる炭素／エネルギー源）を分布させる。小規模発酵は、一般に、およそ２０リットル以下の容積の発酵槽における発酵を指す。
【０１９８】
標的タンパク質の蓄積のため、宿主細胞は、標的タンパク質の蓄積に十分な条件下で培養される。斯かる条件は、例えば、細胞によるタンパク質発現および蓄積を可能にする温度、栄養素および細胞密度条件を含む。さらに、斯かる条件は、当業者にとって公知の通り、細胞が、転写、翻訳、および分泌タンパク質についてはある細胞区画から別の細胞区画へのタンパク質の移行の基本的細胞機能を果たすことができる条件である。
【０１９９】
細菌細胞は、適した温度で培養される。Ｅ．ｃｏｌｉ成長のため、例えば、典型的な温度は、約２０℃〜約３９℃に及ぶ。一実施形態では、温度は、約２５℃〜約３７℃である。別の実施形態では、温度は、約３０℃である。
【０２００】
培養培地のｐＨは、主に宿主生物に応じて、約５〜９のいずれかのｐＨであり得る。Ｅ．ｃｏｌｉのため、ｐＨは、約６．８〜約７．４または約７．０である。
【０２０１】
遺伝子発現の誘導のため、典型的に、細胞は、ある特定の光学密度が達成されるまで、例えば、ＯＤ６００が約１．１になるまで培養され、このポイントで、誘導が開始されて（例えば、誘導因子の添加により、抑圧因子、抑制因子または培地成分の枯渇により、等）、標的タンパク質をコードする外因性遺伝子の発現を誘導する。一部の実施形態では、外因性遺伝子の発現は、例えば、イソプロピル−β−ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）、ラクトース、アラビノース、マルトース、テトラサイクリン、アンヒドロテトラサイクリン、バブリシン（vavlycin）、キシロース、銅、亜鉛等から選択される誘導因子により誘導性である。
【０２０２】
産物蓄積後に、組換えタンパク質の溶解および放出を誘導するために、細胞は、ボルテックスおよび遠心分離される。タンパク質の大部分は、上清に見出されるが、いずれか残っている膜結合タンパク質は、界面活性剤（トリトンＸ−１００等）を使用して放出させることができる。
【０２０３】
その後のステップにおいて、標的タンパク質は、可溶性または不溶性産物として、細胞マトリックスから放出され、産物と細胞デブリの同時回収を最小化する様式で回収される。回収は、いずれかの手段によって行うことができるが、一実施形態では、ニッケルカラムを通したヒスチジンタグ精製を含むことができる。例えば、Purification  of  Proteins  Using  Polyhistidine  Affinity  Tags,  Methods  Enzymology.  2000  ;  326:  245-254を参照されたい。
【０２０４】
一部の実装では、発現系によって産生されるコラーゲンポリペプチドは、分泌タグのアミノ酸配列を含む。一部の実装では、分泌タグは、次のうち１種または複数を含む：ＤｓｂＡ、ｐｅｌＢ、ＯｍｐＡ、ＴｏｌＢ、ＭａｌＥ、ｌｐｐ、ＴｏｒＡおよびＨｙ１Ａ。一部の実装では、コラーゲンポリペプチドは、複数のＸ−Ｙ−Ｇｌｙトリマーを含む。Ｘ−Ｙ−ＧｌｙトリマーのＸまたはＹ位置におけるアミノ酸は、アラニン、システイン、アスパラギン酸、グルタミン酸、フェニルアラニン、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、リシン、ロイシン、メチオニン、アスパラギン、プロリン、ピロリシン、グルタミン、アルギニン、セリン、スレオニン、セレノシステイン、バリン、トリプトファン、チロシン、およびそれらから生じる翻訳後修飾物からなる群から選択される。一部の実装では、コラーゲンポリペプチドは、天然に存在しない。天然に存在しないコラーゲンポリペプチドは、機械学習モデル（上に記載されているモデル等）によって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測された。
ＶＩ．デジタル装置およびシステム
【０２０５】
明らかであろうが、本明細書に記載されている実施形態は、１個または複数のコンピュータシステムにおいて記憶されたまたはそれを通して転送された命令および／またはデータの制御下で作用するプロセスを用いる。本明細書に開示されている実施形態は、これらの演算を行うための装置にも関する。一部の実施形態では、装置は、要求される目的のために特別に設計および／または構築されている、またはコンピュータに記憶されたコンピュータプログラムおよび／またはデータ構造によって選択的に活性化または再構成される汎用コンピュータであり得る。本開示によって提供されるプロセスは、いずれか特定のコンピュータまたは他の特異的装置に本来的に関係しない。特に、様々な汎用機械が、本明細書の教示に従って書き込まれたプログラムによる用途を見出す。しかし、一部の実施形態では、特化した装置が、要求される方法の演算を行うように構築される。種々のこれらの機械のための特定の構造の一実施形態について後述する。
【０２０６】
加えて、本開示のある特定の実施形態は、様々なコンピュータ実行演算を行うためのプログラム命令および／またはデータ（データ構造を含む）を含むコンピュータ可読媒体またはコンピュータプログラム製品に関する。コンピュータ可読媒体の例として、ハードディスク等の磁気媒体；ＣＤ−ＲＯＭデバイスおよびホログラフィックデバイス等の光媒体；光磁気媒体；ならびにフラッシュメモリおよびソリッドステートドライブ（ＳＳＤ）等の半導体メモリデバイスが挙げられるがこれらに限定されない。リードオンリーメモリデバイス（ＲＯＭ）およびランダムアクセスメモリデバイス（ＲＡＭ）等のハードウェアデバイスは、プログラム命令を記憶するように構成され得る。特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）およびプログラム可能な論理デバイス（ＰＬＤ）等のハードウェアデバイスは、プログラム命令を記憶し、実行するように構成され得る。本開示が、コンピュータ実行演算を行うための命令および／またはデータを含む、いずれか特定のコンピュータ可読媒体または他のいずれかのコンピュータプログラム製品に限定されることは意図されない。
【０２０７】
プログラム命令の例として、コンパイラによって産生されるコード等の低レベルコード、およびインタプリタを使用したコンピュータによって実行され得るより高レベルコードを含有するファイルが挙げられるがこれらに限定されない。さらに、プログラム命令として、本開示に従ってコンピューティング機械の演算を直接的にまたは間接的に制御する、機械コード、ソースコードおよび他のいずれかのコードが挙げられるがこれらに限定されない。コードは、入力、出力、算出、条件付き、枝、繰り返しループ等を指定することができる。
【０２０８】
説明のための一例では、本明細書に開示されている方法を具現化するコードは、適切に構成されたコンピューティングデバイスにロードされると、デバイスに、１種または複数の文字列（単数または複数）においてシミュレートされた遺伝的操作（ＧＯ）を行わせる論理命令および／またはデータを含有する、固定媒体または送信可能な（transmissible）プログラムコンポーネントにおいて具現化される。図４は、媒体８１７、ネットワークポート８１９、ユーザー入力キーボード８０９、ユーザー入力８１１または他の入力手段からの命令を読み取ることができる論理的装置である、例としてのデジタルデバイス８００を示す。装置８００は、その後、これらの命令を使用して、データ空間において統計学的演算を方向付ける、例えば、１種または複数のデータセット（単数または複数）を構築する（例えば、データ空間の複数の代表的なメンバーを決定する）ことができる。開示されている実施形態を具現化することができる論理的装置の一型は、ＣＰＵ８０７、必要に応じたユーザー入力デバイスキーボード８０９およびＧＵＩポインティングデバイス８１１、ならびにディスクドライブ８１５およびモニタ８０５（これは、ＧＯ修飾文字列を表示し、ユーザーによる斯かる文字列のサブセットの単純化された選択を提供する）等の周辺機器コンポーネントを含むコンピュータシステム８００におけるものと同様のコンピュータシステムである。固定媒体８１７は、必要に応じて使用されて全体的システムをプログラムし、例えば、ディスク型光もしくは磁気媒体または他の電子メモリ記憶エレメントを含むことができる。通信ポート８１９を使用して、システムをプログラムすることができ、いずれかの型の通信接続を表すことができる。
【０２０９】
ある特定の実施形態は、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）またはプログラム可能な論理デバイス（ＰＬＤ）の回路内に具現化することもできる。斯かる場合では、実施形態は、ＡＳＩＣまたはＰＬＤの生産に使用され得るコンピュータ可読記述子言語において実装される。本開示の一部の実施形態は、ＰＤＡ、ラップトップコンピュータシステム、ディスプレイ、画像編集機器等の種々の他のデジタル装置の回路または論理プロセッサ内で実装される。
【０２１０】
一部の実施形態では、本開示は、コンピュータシステムの１個または複数のプロセッサによって実行されると、コンピュータシステムに、コラーゲンを操作するための方法を実行させるコンピュータ実行可能命令を記憶した１個または複数のコンピュータ可読記憶媒体を含むコンピュータプログラム製品に関する。斯かる方法は、図および疑似コードによって包含される方法等、本明細書に記載されているいずれかの方法であり得る。一部の実施形態では、例えば、本方法は、（ａ）複数の訓練コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度、および複数の訓練コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性の物理的または化学的特性データを含む訓練データのセットを受け取るステップ；（ｂ）機械学習モデルを訓練データのセットにフィットさせることにより、機械学習モデルを訓練するステップであって、訓練された機械学習モデルが、入力として、検査コラーゲン配列のアミノ酸データを受け取り、検査コラーゲン配列に関連する少なくとも１種の物理的または化学的特性に関する少なくとも１つの値を予測するように構成されている、ステップを含む。一部の実装では、本方法は、また、（ｃ）機械学習モデルを使用して、１種または複数の標的コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度を含む標的データのセットを得るステップであって、標的データのセットが、機械学習モデルによって、判断基準を満たす少なくとも１種の物理的または化学的特性に関連すると予測される、ステップと、（ｄ）標的データのセットに対応する１種または複数のコラーゲン配列を決定するステップとを含む。
【０２１１】
様々な実施形態では、コンピュータシステムは、ＳＶＭモデルまたは他の機械学習モデルを訓練することにより、機械学習モデルを構築する。様々な実施形態では、コンピュータシステムは、機械学習モデルを使用して、コラーゲン配列を同定して、所望の物理的または化学的特性を有するゼラチン製品を形成する。
【実施例】
【０２１２】
ＶＩＩ．実施例
（実施例１）
発現系
材料と方法：
【０２１３】
系統：
【０２１４】
検査される生理学的スイッチおよびタンパク質産生：
【０２１５】
Ｅ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）  −  ＮＥＢから入手、製品＃ｃ２５２７
【０２１６】
Ｅ．ｃｏｌｉ  Ｋ１２  ＮＣＭ３７２２  −  Ｔｈｅ  Ｃｏｌｉ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｓｔｏｃｋ  Ｃｅｎｔｅｒから入手、ＣＧＳＣ＃１２３５５
【０２１７】
検査される生理学的スイッチ：
【０２１８】
ガンマプロテオバクテリア：
【０２１９】
Ｖｉｂｒｉｏ  ｎａｔｒｉｅｇｅｎｓ  −  ＡＴＣＣから入手、製品＃１４０４８
【０２２０】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ  −  ＡＴＣＣから入手、製品＃３１９４８
【０２２１】
Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ  ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ  ＰＡＯ１  −  ＡＴＣＣから入手、製品＃ＢＡＡ−４７
【０２２２】
アルファプロテオバクテリア：
【０２２３】
Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ  ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ  −  ＡＴＣＣから入手、製品＃１９０８９
【０２２４】
Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ  ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ／Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ  ｒａｄｉｏｂａｃｔｅｒ  −  ＡＴＣＣから入手、製品＃３３９７０
【０２２５】
Ｂｒｅｖｕｎｄｉｍｏｎａｓ  ｄｉｍｉｎｕｔａ  −  ＡＴＣＣから入手、製品＃１３１８４
【０２２６】
培地組成：
【０２２７】
１リットル  ５×ｍ６３塩：
【０２２８】
１０ｇ（ＮＨ４）２ＳＯ４  −  Ｐ２１２１２１から入手、製品＃７７８３−２０−２
【０２２９】
６８ｇ  ＫＨ２ＰＯ４  −  Ｐ２１２１２１から入手、製品＃７７７８−７７−０
【０２３０】
２．５ｍｇ  ＦｅＳＯ４．７Ｈ２Ｏ  −  Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈから入手、製品＃Ｆ７００２
【０２３１】
ｍｉｌｌｉＱ水で体積を１リットルにする。
【０２３２】
ＫＯＨ（Ｐ２１２１２１から入手、製品＃１３１０−５８−３）でｐＨ７に調整する。
【０２３３】
混合物をオートクレーブする。
【０２３４】
１リットルの１Ｍ  ＭｇＳＯ４：
２４６．５ｇ  ＭｇＳＯ４  ７Ｈ２Ｏ  −  Ｐ２１２１２１から入手、（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃１００３４−９９−８）
ｍｉｌｌｉＱ水で体積を１リットルにする。
混合物をオートクレーブする。
【０２３５】
１リットルのスイッチ培地１：
１３３．４ｍＬ  ５×ｍ６３塩
１０ｍＬ  １Ｍ  ＭｇＳＯ４
３８．６ｇグルコース  −  Ｐ２１２１２１から入手、製品＃５０−９９−７
６６．６ｇスクロース  −  Ｐ２１２１２１から入手、製品＃５７−５０−１
８．３３ｇ  ＬＢミックス  −  Ｐ２１２１２１から入手、製品＃ｌｂ−ｍｉｌｌｅｒ
ｍｉｌｌｉＱ水で体積を１リットルにする。
０．２２μＭポア真空フィルター（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃ＣＬＳ４３０５１７）を通して混合物を濾過滅菌する。
【０２３６】
１リットルのスイッチ培地２：
１３３．４ｍＬ  ５×ｍ６３塩
１０ｍＬ  １Ｍ  ＭｇＳＯ４
３８．６ｇグルコース  −  Ｐ２１２１２１から入手、製品＃５０−９９−７
６６．６ｇスクロース  −  Ｐ２１２１２１から入手、製品＃５７−５０−１
１０ｇ酵母抽出物  −  ＦｉｓｈｅｒＳｃｉ．ｃｏｍから入手、製品＃Ｊ６０２８７Ａ１
ｍｉｌｌｉＱ水で体積を１リットルにする。
０．２２μＭポア真空フィルター（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ、製品＃ＣＬＳ４３０５１７）を通して混合物を濾過滅菌する。
【０２３７】
バイオリアクタ培養のため：
５リットルのバイオリアクタ培地ＭＧＺ１２：
１）ＤＩ水における５００ｇ／Ｌ濃度の１Ｌのグルコースをオートクレーブする（ＶＷＲ、製品＃９７０６１−１７０）。
２）ＤＩ水における５００ｇ／Ｌ濃度の１Ｌのスクロースをオートクレーブする（Ｇｅｎｅｓｅｅｓｃｉ．ｃｏｍ、製品＃６２−１１２）。
３）３９４６ｍＬのＤＩ水において、次のものをオートクレーブする：
２０ｇ  （ＮＨ４）２ＨＰＯ４（ＶＷＲ、製品＃９７０６１−９３２）。
６６．５ｇ  ＫＨ２ＰＯ４（ＶＷＲ、製品＃９７０６２−３４８）。
２２．５ｇ  Ｈ３Ｃ６Ｈ５Ｏ７（ＶＷＲ、製品＃ＢＤＨ９２２８−２．５ＫＧ）。
２．９５ｇ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏ（ＶＷＲ、製品＃９７０６２−１３４）。
１０ｍＬ微量金属（Ｔｅｋｎｏｖａ）、１０００×（Ｔｅｋｎｏｖａ、製品＃Ｔ１００１）。
オートクレーブ後に、４００ｍＬの（１）を（３）に、６５ｍＬの１０Ｍ  ＮａＯＨ（ＶＷＲ、製品＃９７０６４−４８０）を（３）に、６６６ｍＬの（２）を（３）に添加する。
発酵ラン中に必要に応じて、５００ｇ／Ｌのグルコースのフィードを使用することができる。
【０２３８】
誘導において、次のものを添加する：
５０ｍＬの１Ｍ  ＭｇＳＯ４．７Ｈ２Ｏを５Ｌバイオリアクタに。
１〜１０ｍＭ濃度のＩＰＴＧ（ｃａｒｂｏｓｙｎｔｈ．ｃｏｍ、製品＃ＥＩ０５９３１）。
ホスホマイシン（５０μｇ／ｍＬまたはそれよりも高濃度）およびカルベニシリン（１００μｇ／ｍＬまたはそれよりも高濃度）を添加する。
【０２３９】
生理学的スイッチ：
【０２４０】
生理学的スイッチは、最大１Ｌ体積の振とうフラスコ内で培養される場合のＥ．ｃｏｌｉに関してはＯＤ６００が１〜１．１のときに最適にオンにされる。検査される他の種に関しては、培養物をスイッチ培地において培養し、培養物が最大ＯＤ６００に達したら、継代培養した。全ての場合において、生理学的スイッチは、１００〜２００ｕｇ／ｍＬカルベニシリン（Ｐ２１２１２１から入手、製品＃４８００−９４−６）および５０〜１００ｕｇ／ｍＬホスホマイシン（Ｐ２１２１２１から入手、製品＃２６０１６−９９−９）の添加によりオンにされる。集団の大部分は、数時間以内にスイッチ状態となる。細胞が生理学的スイッチを起こしたことを確認するために、パーフェクトフォーカスシステム、Ｎｉｋｏｎ  ＣＦＩ６０  Ｐｌａｎ  Ａｐｏ  １００×ＮＡ１．４５対物レンズ、Ｐｒｉｏｒ自動フィルターホイールおよびステージ、ＬＥＤ−ＣＦＰ／ＹＦＰ／ｍＣｈｅｒｒｙおよびＬＥＤ−ＤＡ／ＦＩ／ＴＸフィルターセット（Ｓｅｍｒｏｃｋ）、Ｌｕｍｅｎｃｏｒ  Ｓｏｌａ  ＩＩ  ＳＥ  ＬＥＤ照明システム、ならびにＨａｍａｍａｔｓｕ  Ｆｌａｓｈ  ４．０  Ｖ２  ＣＭＯＳカメラを備えるＮｉｋｏｎ  Ｔｉ−Ｅで細胞を撮像した。
【０２４１】
生理学的スイッチの画像分析：
【０２４２】
ＩｍａｇｅＪを使用して画像を分析して、寸法を測定した。スイッチ状態において、外膜の球状輪郭は、球体として扱って、総体積を算出する（Ｖ＝（４／３）πｒ３）。細胞質体積は、球体内に存在する楕円体として算出される（Ｖ＝（４／３）π＊（最長半径）＊（短い半径）２）。周辺質体積を算出するために、細胞の総体積から細胞質体積を引き算する。
【０２４３】
タンパク質発現および定量化：
【０２４４】
ＧＦＰまたはコラーゲン誘導体を保有するｐＥＴ２８ａ（ｅｍｄ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ製品＃６９８６４）およびその誘導体を含有するＥ．ｃｏｌｉ  ＢＬ２１（ＤＥ３）（ＮＥＢ製品＃ｃ２５２７）を、一晩３７℃の振とうインキュベーター内で、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシン（ｐ２１２１２１製品＃２２５１１８０）を含有するスイッチ培地において培養した。翌日、５０ｍｇ／ｍＬカナマイシンを含有する新鮮スイッチ培地において一晩培養物の１：１０希釈で継代培養を開始する。次に、ＯＤ６００が１〜１．１（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２マイクロプレートリーダーで読み取る）のときに、培養物を生理学的にスイッチし、同時にタンパク質産生を誘導する。１００ｕｇ／ｍＬカルベニシリン、５０ｕｇ／ｍＬホスホマイシンおよび１００ｕｇ／ｍＬ  ＩＰＴＧ（ｐ２１２１２１製品＃３６７−９３−１）の添加により、生理学的スイッチおよびタンパク質産生をオンにする。８時間から一晩の間、室温（およそ２２℃）で、軌道回転（orbital）振とう機において、スイッチ状態においてタンパク質発現が続けられる。総タンパク質レベルを定量化するために、培養物の混合部分において、Ｑｕｉｃｋ  Ｓｔａｒｔ（商標）Ｂｒａｄｆｏｒｄタンパク質アッセイを使用し、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ  Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ  Ｍ２マイクロプレートリーダーにおいて検量線を定量化する。タンパク質集団の残りと比べて標的タンパク質産生の相対強度を定量化するために、Ｍｉｎｉ−ＰＲＯＴＥＡＮ（登録商標）ＴＧＸ（商標）ゲルにおいて培養物の混合部分を泳動し、Ｂｉｏ−Ｓａｆｅ（商標）クーマシー染色で染色した。
【０２４５】
タンパク質産生の誘導：
【０２４６】
標準手順に従って、生理学的状態においてタンパク質産生を誘導した。本出願人らは、組換えタンパク質のＩＰＴＧ／ラクトース誘導性産生を駆動し、ＤｓｂＡシグナル配列を使用してこれを周辺質空間に標的化する、プラスミドｐＥＴ２８ａを含有する系統ＢＬ２１（ＤＥ３）を使用していた。上に記載されている通り周辺質空間に標的化されたＧＦＰタンパク質を使用して、本出願人らは、同じ光学密度で同じ時間量誘導された未スイッチ細胞集団と比較して、タンパク質産生を５倍獲得および増加させる能力を実証した（図８〜図１１を参照）。誘導は、ＯＤ６００が１．１のときに最適であり、誘導を１０時間続け、このポイントで、約２００ｍｇ／ｍＬにおける産生されたタンパク質を測定した。
（実施例２）
コラーゲンの産生
【０２４７】
本明細書に記載されている方法およびシステムを使用して、全長コラーゲンを産生することができる。タンパク質発現プロセスを説明するために、本明細書の実施例１に記述されている発現系を使用して、全長クラゲコラーゲンを産生した。同様に、上に記載されている機械学習モデルを使用して得られたコラーゲン配列を製造し発現させる。同じ方法論を使用して、クラゲコラーゲン以外のコラーゲンを産生することもできる。
【０２４８】
一部の実装では、同じシステムにおいて同じ方法を使用して、トランケートされたコラーゲン配列が発現される。
【０２４９】
一部の実装では、上に記載されている通りに機械学習モデルを使用して、１種または複数の標的コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度を含む、標的データのセットが得られる。標的データのセットは、１種または複数の標的コラーゲン配列におけるアミノ酸残基の頻度を含む。標的データのセットは、機械学習モデルによって、判断基準を満たす物理的または化学的特性に関連すると予測された。次に、所望の特性を有するゼラチン製品に対応する１種または複数のコラーゲンポリペプチド配列が得られる。一部の実装では、配列は、分子の配列のセグメントであり得る。コラーゲンポリペプチド配列は、全長またはトランケートされた配列であり得る。コラーゲンポリペプチド配列をコードする核酸が合成され、宿主細胞において発現される。ポリヌクレオチドの発現は、実施例１または他の公知の発現方法論に従って行われる。別の実施形態では、コラーゲンポリペプチドは、商業的に利用できるペプチド合成機を使用して直接的に合成される。ポリヌクレオチドを使用した全長クラゲコラーゲンの産生は、本実施例に教示されている。
【０２５０】
Ｐｏｄｏｃｏｒｙｎａ  ｃａｒｎｅａ（クラゲ）コラーゲンの野生型、全長アミノ酸配列は、配列番号１に提供されている。
GPQGVVGADGKDGTPGEKGEQGRTGAAGKQGSPGADGARGPLGSIGQQGARGEPGDPGSPGLRGDTGLAGVKGVAGPSGRPGQPGANGLPGVNGRGGLRGKPGAKGIAGSDGEAGESGAPGQSGPTGPRGQRGPSGEDGNPGLQGLPGSDGEPGEEGQPGRSGQPGQQGPRGSPGEVGPRGSKGPSGDRGDRGERGVPGQTGSAGNVGEDGEQGGKGVDGASGPSGALGARGPPGSRGDTGAVGPPGPTGRSGLPGNAGQKGPSGEPGSPGKAGSAGEQGPPGKDGSNGEPGSPGKEGERGLAGPPGPDGRRGETGSPGIAGALGKPGLEGPKGYPGLRGRDGTNGKRGEQGETGPDGVRGIPGNDGQSGKPGIDGIDGTNGQPGEAGYQGGRGTRGQLGETGDVGQNGDRGAPGPDGSKGSAGRPGLR（配列番号１）
https://www.ncbi.nlm.nih|.|gov/protein/4379341?report=genbank&log$=protalign&blast_rank=1&RID=T1N9ZEUW014
【０２５１】
全長クラゲコラーゲンをコードするコドン最適化されていないポリヌクレオチド配列は、配列番号２に開示されている。
GGACCACAAGGTGTTGTAGGAGCTGATGGCAAAGATGGAACACCGGGAGAGAAAGGTGAGCAAGGACGAACCGGAGCTGCAGGAAAACAGGGAAGCCCTGGAGCAGATGGAGCAAGAGGCCCTCTTGGATCAATTGGACAACAAGGTGCTCGTGGAGAACCTGGTGATCCAGGATCTCCCGGCTTAAGAGGAGATACTGGATTGGCTGGAGTCAAAGGAGTAGCAGGACCATCTGGTCGACCTGGACAACCCGGTGCAAATGGATTACCTGGTGTGAATGGCAGAGGCGGTTTGAGAGGCAAACCTGGTGCTAAAGGAATTGCTGGCAGTGATGGAGAAGCGGGAGAATCTGGCGCACCTGGACAGTCCGGACCTACCGGTCCACGTGGTCAACGAGGACCAAGTGGTGAGGATGGTAATCCTGGATTACAGGGATTGCCTGGTTCTGATGGAGAGCCCGGAGAGGAAGGACAACCTGGAAGATCTGGTCAACCAGGACAGCAAGGACCACGTGGTTCCCCTGGAGAGGTAGGACCAAGAGGATCTAAAGGTCCATCAGGAGATCGTGGTGACAGGGGAGAGAGAGGTGTTCCTGGACAAACAGGTTCGGCTGGAAATGTAGGAGAAGATGGAGAGCAAGGAGGCAAAGGTGTCGATGGAGCGAGTGGACCAAGTGGAGCTCTTGGTGCTCGTGGTCCCCCAGGAAGTAGAGGTGACACCGGGGCAGTGGGACCTCCCGGACCTACTGGGCGATCTGGTTTACCTGGAAACGCAGGACAAAAGGGACCAAGTGGTGAACCAGGTAGTCCAGGAAAAGCAGGATCAGCTGGTGAACAGGGTCCTCCTGGTAAAGACGGATCAAATGGTGAACCTGGATCTCCTGGCAAAGAGGGTGAACGTGGTCTTGCTGGTCCACCAGGTCCAGATGGCAGACGTGGTGAAACGGGATCTCCAGGTATCGCTGGTGCTCTTGGTAAACCAGGTTTGGAAGGACCTAAAGGTTATCCAGGATTAAGAGGAAGAGATGGAACCAATGGCAAACGAGGAGAACAAGGAGAAACTGGTCCTGATGGAGTCAGAGGTATTCCTGGAAATGATGGACAATCTGGCAAACCAGGTATTGATGGTATTGACGGAACAAATGGTCAACCAGGTGAGGCTGGATACCAAGGTGGTAGAGGTACACGTGGTCAGTTAGGTGAAACTGGTGATGTCGGACAGAATGGAGATCGAGGAGCTCCTGGTCCTGATGGATCTAAAGGTTCTGCTGGTAGACCAGGACTTCGTGG（配列番号２）
https://www.ncbi.nlm.nih|.|gov/nucleotide/3355656?report=genbank&log$=nuclalign&blast_rank=1&RID=TSYP7CMV014
【０２５２】
野生型、全長クラゲコラーゲンをコードする２種の異なるコドン最適化されたポリヌクレオチド配列を合成した。２種のポリヌクレオチド配列は、僅かに異なるコドン最適化方法が原因で僅かに異なった。上に記載されている機械学習モデルを使用して決定された配列等、他のコラーゲン配列をコードするポリヌクレオチド配列は、同じ方法を使用して合成することができる。本実施例では、トランケートされていない、全長クラゲコラーゲンに加えて、ポリヌクレオチドは、分泌タグ、９アミノ酸ｈｉｓタグ、短いリンカーおよびトロンビン切断部位もコードした。ＤｓｂＡ分泌タグは、ヌクレオチド１〜７１によってコードされる。９個のヒスチジン残基を含むヒスチジンタグは、ヌクレオチド７３〜９９によってコードされ、アミノ酸２５〜３３をコードする。リンカーは、ヌクレオチド１００〜１１１によってコードされる。トロンビン切断タグは、ヌクレオチド１１２〜１３５によってコードされ、アミノ酸３８〜４５をコードする。トランケートされたコラーゲンは、ヌクレオチド１３６〜１４２２によってコードされる。２種のポリヌクレオチドは、下に、配列番号３および４に開示されている。
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCGCAGTATGAAGATCACCATCACCACCACCACCATCACCACTCTGGCTCGAGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGTCCGCAGGGTGTTGTTGGTGCAGATGGTAAAGACGGTACCCCGGGTGAAAAAGGAGAACAGGGACGTACAGGTGCAGCAGGTAAACAGGGCAGCCCGGGTGCCGATGGTGCCCGTGGCCCGCTGGGTAGCATTGGTCAGCAGGGTGCAAGAGGCGAACCGGGCGATCCGGGTAGTCCGGGCCTGCGTGGTGATACGGGTCTGGCCGGTGTTAAAGGCGTTGCAGGTCCTTCAGGTCGTCCAGGTCAACCGGGTGCAAATGGTCTGCCGGGTGTTAATGGTCGTGGCGGTCTGCGTGGCAAACCGGGAGCAAAAGGTATTGCAGGTAGCGATGGAGAAGCCGGTGAAAGCGGTGCCCCGGGTCAGAGTGGTCCGACCGGTCCGCGCGGTCAGCGTGGTCCGTCTGGTGAAGATGGCAATCCGGGTCTGCAGGGTCTGCCTGGTAGTGATGGCGAACCAGGTGAAGAAGGTCAGCCGGGTCGTTCAGGCCAGCCGGGCCAGCAGGGCCCGCGTGGTAGCCCGGGCGAAGTTGGCCCGCGGGGTAGTAAAGGTCCTAGTGGCGATCGCGGTGATCGTGGTGAACGCGGTGTTCCTGGTCAGACCGGTAGCGCAGGTAATGTTGGCGAAGATGGTGAACAGGGTGGCAAAGGTGTTGATGGTGCAAGCGGTCCGAGCGGTGCACTGGGTGCACGTGGTCCTCCGGGCAGCCGTGGTGACACCGGTGCAGTTGGTCCGCCTGGCCCGACCGGCCGTAGTGGCTTACCGGGTAATGCAGGTCAGAAAGGTCCGTCAGGTGAACCTGGCAGCCCTGGTAAAGCAGGTAGTGCCGGTGAGCAGGGTCCGCCGGGCAAAGATGGTAGTAATGGTGAGCCGGGTAGCCCTGGCAAAGAAGGTGAACGTGGTCTGGCAGGACCGCCGGGTCCTGATGGTCGCCGCGGTGAAACGGGTTCACCGGGTATTGCCGGTGCCCTGGGTAAACCAGGTCTGGAAGGTCCGAAAGGTTATCCTGGTCTGCGCGGTCGTGATGGTACCAATGGCAAACGTGGCGAACAGGGCGAAACCGGTCCAGATGGTGTTCGTGGTATTCCGGGTAACGATGGTCAGAGCGGTAAACCGGGCATTGATGGTATTGATGGCACCAATGGTCAGCCTGGCGAAGCAGGTTATCAGGGTGGTCGCGGTACCCGTGGTCAGCTGGGTGAAACAGGTGATGTTGGTCAGAATGGTGATCGCGGCGCACCGGGTCCGGATGGTAGCAAAGGTAGCGCCGGTCGTCCGGGTTTACGTTAA（配列番号３）
ATGAAAAAGATTTGGCTGGCGCTGGCTGGTTTAGTTTTAGCGTTTAGCGCATCGGCGGCGCAGTATGAAGATCACCATCACCACCACCACCATCACCACTCTGGCTCGAGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCCATATGGGTCCGCAGGGTGTTGTTGGTGCAGATGGTAAAGACGGTACCCCGGGTGAAAAAGGTGAACAGGGTCGTACCGGTGCAGCAGGTAAACAGGGCAGCCCGGGTGCCGATGGTGCCCGTGGCCCGCTGGGTAGCATTGGTCAGCAGGGTGCACGTGGCGAACCGGGCGATCCGGGTAGCCCGGGCCTGCGTGGTGATACGGGTCTGGCCGGTGTTAAAGGCGTTGCAGGTCCTTCTGGTCGTCCAGGTCAACCGGGTGCAAATGGTCTGCCGGGTGTTAATGGTCGTGGCGGTCTGCGTGGCAAACCGGGTGCAAAAGGTATTGCAGGTAGCGATGGCGAAGCCGGTGAAAGCGGTGCCCCGGGTCAGAGCGGTCCGACCGGTCCGCGCGGTCAGCGTGGTCCGTCTGGTGAAGATGGCAATCCGGGTCTGCAGGGTCTGCCTGGTAGCGATGGCGAACCAGGTGAAGAAGGTCAGCCGGGTCGTTCTGGCCAGCCGGGCCAGCAGGGCCCGCGTGGTAGCCCGGGCGAAGTTGGCCCGCGCGGTTCTAAAGGTCCTAGCGGCGATCGCGGTGATCGTGGTGAACGCGGTGTTCCTGGTCAGACCGGTAGCGCAGGTAATGTTGGCGAAGATGGTGAACAGGGTGGCAAAGGTGTTGATGGTGCAAGCGGTCCGAGCGGTGCACTGGGTGCACGTGGTCCTCCGGGCAGCCGTGGTGACACCGGTGCAGTTGGTCCGCCTGGCCCGACCGGCCGTAGCGGCCTGCCGGGTAATGCAGGTCAGAAAGGTCCGTCTGGTGAACCTGGCAGCCCTGGTAAAGCAGGTAGCGCCGGTGAGCAGGGTCCGCCGGGCAAAGATGGTAGCAATGGTGAGCCGGGTAGCCCTGGCAAAGAAGGTGAACGTGGTCTGGCAGGTCCGCCGGGTCCTGATGGTCGCCGCGGTGAAACGGGTTCTCCGGGTATTGCCGGTGCCCTGGGTAAACCAGGTCTGGAAGGTCCGAAAGGTTATCCTGGTCTGCGCGGTCGTGATGGTACCAATGGCAAACGTGGCGAACAGGGCGAAACCGGTCCAGATGGTGTTCGTGGTATTCCGGGTAACGATGGTCAGAGCGGTAAACCGGGCATTGATGGTATTGATGGCACCAATGGTCAGCCTGGCGAAGCAGGTTATCAGGGTGGTCGCGGTACCCGTGGTCAGCTGGGTGAAACCGGTGATGTTGGTCAGAATGGTGATCGCGGCGCACCGGGTCCGGATGGTAGCAAAGGTAGCGCCGGTCGTCCGGGTCTGCGTTAA（配列番号４）
【０２５３】
配列番号３および配列番号４のポリヌクレオチドによってコードされるアミノ酸配列は、下の配列番号５に開示されている。ＤｓｂＡ分泌タグは、配列番号３または配列番号４のヌクレオチド１〜７２によってコードされ、これは、配列番号５のアミノ酸１〜２４をコードする；９個のヒスチジン残基を含むヒスチジンタグは、ヌクレオチド７３〜９９によってコードされ、アミノ酸２５〜３３をコードする；リンカーは、ヌクレオチド１００〜１１１によってコードされ、アミノ酸３４〜３７をコードする；トロンビン切断タグは、ヌクレオチド１１２〜１３５によってコードされ、アミノ酸３８〜４５をコードする；全長コラーゲンは、ヌクレオチド１３６〜１４２２によってコードされ、アミノ酸４６〜４７４をコードする。
MKKIWLALAGLVLAFSASAAQYEDHHHHHHHHHSGSSLVPRGSHMGPQGVVGADGKDGTPGEKGEQGRTGAAGKQGSPGADGARGPLGSIGQQGARGEPGDPGSPGLRGDTGLAGVKGVAGPSGRPGQPGANGLPGVNGRGGLRGKPGAKGIAGSDGEAGESGAPGQSGPTGPRGQRGPSGEDGNPGLQGLPGSDGEPGEEGQPGRSGQPGQQGPRGSPGEVGPRGSKGPSGDRGDRGERGVPGQTGSAGNVGEDGEQGGKGVDGASGPSGALGARGPPGSRGDTGAVGPPGPTGRSGLPGNAGQKGPSGEPGSPGKAGSAGEQGPPGKDGSNGEPGSPGKEGERGLAGPPGPDGRRGETGSPGIAGALGKPGLEGPKGYPGLRGRDGTNGKRGEQGETGPDGVRGIPGNDGQSGKPGIDGIDGTNGQPGEAGYQGGRGTRGQLGETGDVGQNGDRGAPGPDGSKGSAGRPGLR（配列番号５）
【０２５４】
配列番号３および配列番号４のポリヌクレオチドは、Ｇｅｎ９  ＤＮＡ、現在はＧｉｎｇｋｏ  Ｂｉｏｗｏｒｋｓの内部合成によって合成された。ｐＥＴ２８ベクターならびに配列番号３および配列番号４の間の重複は、３０〜４０ｂｐ長の間となるように設計し、酵素ＰｒｉｍｅＳｔａｒ  ＧＸＬポリメラーゼ（http://www.clontech|.|com/US/Products/PCR/GC_Rich/PrimeSTAR_GXL_DNA_Polymerase?sitex=10020:22372:US）によるＰＣＲを使用して付加した。次に、開環したｐＥＴ２８ａベクターおよびインサートＤＮＡ（配列番号３または配列番号４）を、ＳＧＩ  Ｇｉｂｓｏｎアセンブリ（https://us.vwr|.|com/store/product/17613857/gibson-assembly-hifi-1-step-kit-synthetic-genomics-inc）を使用して最終プラスミドへと一体にアセンブルした。次に、Ｅｕｒｏｆｉｎｓ  Ｇｅｎｏｍｉｃｓ（www.eurofinsgenomics|.|com）によるサンガー配列決定により、プラスミドの配列を検証した。
【０２５５】
形質転換された細胞を最小培地において培養し、細胞のグリセロールに対する５０：５０の比でグリセロールを含有する１．５アリコートにおいて凍結した。この凍結培養物の１本のバイアルを、一晩、３７℃にて２００ｒｐｍで、５０ｍｌの最小培地において復活させた。細胞を３００ｍｌの最小培地に移し、５〜１０のＯＤ６００に達するまで６〜９時間培養した。
【０２５６】
本実施例において、また、本出願を通して使用される最小培地は、次の通りに調製される。いくつかの別々の画分、塩ミックス（リン酸アンモニウム二塩基、リン酸カリウム一塩基、無水クエン酸、硫酸マグネシウム七水和物）、スクロース５００ｇ／Ｌ、グルコース５５％、微量金属ＴＭ５（表２）および水酸化ナトリウム１０Ｍにおいて、最小培地（表１）をオートクレーブした。次に、オートクレーブ後に、フード内で、上述の濃度で最小培地を一体に混合した。
【表１】
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【表２】
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【０２５７】
１４，０００ｐｓｉ圧力のホモジナイザーにおいて２回パスで、収集された細胞を破壊した。その結果得られるスラリーは、他のタンパク質と共にコラーゲンタンパク質を含有した。
【０２５８】
ホモジナイズした細胞ブロスの酸処置によって、コラーゲンを精製した。６Ｍ塩酸を使用して、ホモジナイズしたスラリーのｐＨを３に減少させた。酸性化した細胞スラリーを、一晩４℃で混合しつつインキュベートし、続いて、遠心分離を行った。酸性化したスラリーの上清をポリアクリルアミドゲルにおいて検査し、出発ペレットと比較して、相対的に高い存在量でコラーゲンを含有することが判明した。このようにして得られたコラーゲンスラリーは、塩の量が多かった。体積および塩低下を得るために、各０．１ｍ２の限外濾過カセットによるＥＭＤ  Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ接線流濾過システムを使用して、濃縮および透析濾過ステップを行った。２個のカセットを並列して使用した濾過の総面積は、０．２ｍ２であった。ＴＦＦステージにおいて５×の体積低下および１９×の塩低下を達成した。最終コラーゲンスラリーをＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて泳動して、コラーゲンの存在を確認した。このスラリーを、３日間にわたりマルチトレイ凍結乾燥器を使用して乾燥させて、白色のふんわりとしたコラーゲン粉末を得た。
【０２５９】
精製されたコラーゲンを、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて分析したところ、４２キロダルトンの予想されるサイズに、太く明らかなバンドが観察された。精製されたコラーゲンを、また、質量分析によって分析したところ、この４２キロダルトンタンパク質がクラゲコラーゲンであることが確認された。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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