(57)【要約】  本発明は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株、ならびに対象における固形腫瘍の治療に組み合わせて使用するための少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
対象における固形腫瘍の治療に使用するための、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株であって、対象は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞で処理されているか又は処理される、前記チフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項２】
５つ以上のネオアンチゲンが、前記対象の固形腫瘍において同定された腫瘍特異的抗原である、請求項１に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項３】
５つ以上のネオアンチゲン
（ａ）ＣＤ８  Ｔ細胞抗原；又は
（ｂ）ＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞抗原
を含む、請求項１又は２に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項４】
治療が、少なくとも１つのチェックポイント阻害剤の投与をさらに含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項５】
少なくとも１つのチェックポイント阻害剤が、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＫＩＲ、ＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ１３７に対する抗体からなる群から選択される、請求項４に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項６】
少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞が、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ細胞である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項７】
チフス菌Ｔｙ２１ａ株が、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の養子細胞移植後に投与される、請求項１〜６のいずれか１項に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項８】
チフス菌Ｔｙ２１ａ株が、
（ａ）少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の最初の養子細胞移植から約２週間〜４ヶ月後；又は
（ｂ）少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の最初の養子細胞移植から約２〜３ヵ月後
に投与される、請求項７に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項９】
対象が、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の養子細胞移植の前にリンパ球除去化学療法を受けている、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項１０】
リンパ球及び／又は白血球数が、チフス菌Ｔｙ２１ａ株が投与される前に標準化されている、請求項９に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項１１】
チフス菌Ｔｙ２１ａ株が経口投与される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項１２】
治療が、ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）、ヒトＣＥＡ、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ヒトＰＤ−Ｌ１、ＶＥＧＦＲ−２及びヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群から選択される少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つの真核性発現カセットを含むＤＮＡ分子を含む少なくとも１つのチフス菌Ｔｙ２１ａ株の投与をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ。
【請求項１３】
固形腫瘍が、大腸癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、中皮腫、神経膠芽腫、胃癌、肝細胞癌、腎細胞癌、前立腺癌、子宮頸癌、乳癌及び黒色腫から選択される、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項１４】
（ａ）チフス菌Ｔｙ２１ａ株の単回用量が、約１０６〜約１０１０、より具体的には約１０６〜約１０９、より具体的には約１０６〜約１０８、最も具体的には約１０７〜約１０８コロニー形成単位（ＣＦＵ）を含み；及び／又は
（ｂ）チフス菌Ｔｙ２１ａ株を最初の週に２〜４回投与され、続いて２〜４週間ごとに単回用量で追加投与する、請求項１〜１３のいずれか１項に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【請求項１５】
チフス菌Ｔｙ２１ａ株が医薬組成物の形態であり、さらに少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含む、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の使用のためのチフス菌Ｔｙ２１ａ株。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ  ｔｙｐｈｉ）Ｔｙ２１ａ株、ならびに対象における固形腫瘍の治療に組み合わせて使用するための少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞に関する。
【背景技術】
【０００２】
腫瘍が免疫原性であり得るという知見は、正常組織を温存しながら悪性細胞を選択的に排除するために免疫系を利用するよう設計された多くの癌免疫療法の開発をもたらした。しかしながら、腫瘍抗原に対するワクチン接種のみから得られる生存利益は依然としてわずかである。抗癌ワクチンは多くの課題に直面しており、その一つが免疫抑制微小環境である。腫瘍の異常な脈管構造は、免疫抑制に向けて炎症細胞を分極させる低酸素微小環境を作り出す。さらに、腫瘍は、増殖因子及びサイトカインの分泌を介して、免疫細胞の増殖、分化、及び機能を全身的に変化させる。
【０００３】
癌の治癒のためには、癌幹細胞の完全な根絶が極めて重要である。ヒト腫瘍の多くの免疫逃避メカニズムは、癌免疫療法において依然として主要な課題である。このように、これまで満たされていない癌治療の併用アプローチを含めて、癌治療アプローチの改善が非常に必要である。
【０００４】
最近、ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＣＡＲ−ＮＫＴ細胞のような再プログラミングされたＴ細胞、ならびに再プログラミングされたＮＫ細胞（ＣＡＲ−ＮＫ細胞）を用いた癌の養子細胞治療が有望であることが示された。初期の試みでは、様々な固形腫瘍及び液体腫瘍に罹患した患者を治療したが、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法によるブレークスルーはＢ細胞性血液腫瘍を標的として達成された。抗ＣＤ１９修飾Ｔ細胞、ＫＹＭＲＩＡＨ（チサゲンレクロイセル）及びＹＥＳＣＡＲＴＡ（アキシカブタゲンシロルユーセル）を用いた２種類の免疫療法が、最近、ＦＤＡにより承認された。しかし、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は一部の血液癌に有効であるが、一般的な固形癌に対する有効性はわずかであり、特に持続的な完全奏効はまれである。
【０００５】
これまでＣＡＲ−Ｔ細胞の改良が主な焦点となってきたが、γδＴ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞及びナチュラルキラー（ＮＫ）細胞などの従来のαβＴ細胞以外の細胞型へのＣＡＲの導入は重要性を増してきた。
【０００６】
癌治療に関心を集めている別の免疫療法アプローチは、癌に対するワクチン接種である。癌に対する免疫にはいくつかの方法があるが、非常に有望な方法は、腫瘍抗原又は間質抗原に対するＤＮＡワクチンの担体としてのサルモネラ菌のような細菌の使用である。例えば、ＷＯ２０１４／００５６８３は、癌免疫療法、特に膵臓癌の治療に使用するためのＶＥＧＦ受容体タンパク質をコードする組換えＤＮＡ分子を含むサルモネラ菌の弱毒化株を開示している。
【０００７】
さらに、ＷＯ２０１４／１７３５４２及びＷＯ２０１５／０９０５８４は、癌免疫療法に使用するためのウィルムス腫瘍タンパク質又はメソテリンをコードする組換えＤＮＡ分子を含むサルモネラ菌の弱毒化株を開示している。
【０００８】
ＷＯ２０１３／０９１８９は、ガラクトースエピメラーゼ活性を欠損し、組換えＤＮＡ分子を保持する弱毒化突然変異体チフス菌株を増殖させる方法を開示し、ＷＯ２０１８／０１１２８９は、弱毒化サルモネラ菌株を含む個別化癌ワクチンを生成する迅速かつ効果的な方法を開示している。
【発明の概要】
【０００９】
発明の目的
先行技術に照らして、新規な癌治療を提供することが本発明の目的である。このような新規な治療法は、固形腫瘍を有する癌患者の治療選択肢を改善するための主要な利点を提供する。
【００１０】
発明の概要
１つの態様において、本発明は、対象における固形腫瘍の治療に使用するための、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株に関する。ここで、対象は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞で処理されているか又は処理される。
【００１１】
別の態様において、本発明は、対象における固形腫瘍の治療に使用するための、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞と組み合わせて、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株に関する。
【００１２】
本発明によれば、少なくとも５つ以上のネオアンチゲンは、前記対象の固形腫瘍において同定される腫瘍特異的抗原である。好ましくは、５つ以上のネオアンチゲンは、ＣＤ８  Ｔ細胞抗原又はＣＤ８及びＣＤ４  Ｔ細胞抗原を含む。１つの実施形態において、少なくとも１つのポリペプチドは、１０個以上、好ましくは２０個以上のネオアンチゲン、好ましくは３０個以上のネオアンチゲン、好ましくは５０個以上のネオアンチゲンを含む。別の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、５〜３００個のネオアンチゲン、１０〜３００個のネオアンチゲン、２０〜３００個のネオアンチゲン、好ましくは３０〜３００個のネオアンチゲン、好ましくは５０〜３００個のネオアンチゲンを含む。さらに別の実施形態では、少なくとも１つのポリペプチドは、１０〜２００個のネオアンチゲン、１０〜２００個のネオアンチゲン、２０〜２００個のネオアンチゲン、好ましくは３０〜２００個のネオアンチゲン、好ましくは５０〜２００個のネオアンチゲンを含む。
【００１３】
チフス菌Ｔｙ２１ａ株は、ネオアンチゲンではない腫瘍特異的抗原及び／又は腫瘍関連抗原を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするＤＮＡ分子をさらに含むことができ、ネオアンチゲンではない前記腫瘍特異的抗原及び／又は腫瘍関連抗原は、前記固形腫瘍において発現され、ネオアンチゲンではない腫瘍特異的抗原及び／又は腫瘍関連抗原を含む少なくとも１つのポリペプチドは、（ａ）５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含む同ＤＮＡ分子によってコードされるか、又はさらなる別個のＤＮＡ分子によってコードされ、（ｂ）５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットによってコードされるか、又はさらなる別個の発現カセットによってコードされ、又は（ｃ）５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチド又はさらなる別個のポリペプチドである。
【００１４】
本発明によれば、チフス菌Ｔｙ２１ａ株は、少なくとも１つのチェックポイント阻害剤と同時に投与することができる。好ましくは、少なくとも１つのチェックポイント阻害剤は、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＫＩＲ、ＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ１３７に対する抗体からなる群から選択される。
【００１５】
少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞は、それぞれキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ細胞とも呼ばれる、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含むＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞であり得る。１つの実施形態において、チフス菌Ｔｙ２１ａ株は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の養子細胞移植後に投与される。好ましくは、チフス菌Ｔｙ２１ａ株は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の最初の養子細胞移植後の約２週間〜４ヵ月、好ましくは２〜３ヵ月で投与される。
【００１６】
１つの実施形態において、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞、又はＮＫ細胞の養子細胞移植の前に、対象はリンパ球除去化学療法を受けている。この場合、治療を必要とする対象は免疫不全であり、チフス菌Ｔｙ２１ａ株を投与する前にリンパ球及び／又は白血球数を標準化する必要がある。
【００１７】
本発明によれば、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、腫瘍抗原、腫瘍間質抗原及び／又はチェックポイント阻害剤抗原、好ましくはヒトウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、ヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）、ヒトＣＥＡ、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ヒトＰＤ−Ｌ１、ＶＥＧＦＲ−２及びヒト線維芽細胞活性化タンパク質（ＦＡＰ）からなる群から選択される抗原をコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含む、少なくとも１つのチフス菌Ｔｙ２１ａ株とともに同時投与される。より具体的には、ＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得て；ＷＴ１は、配列番号３のアミノ酸配列、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得て；ＭＳＬＮは、配列番号４のアミノ酸配列、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得て；ヒトＣＥＡは、配列番号５のアミノ酸配列、又は配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得て；ＣＭＶ  ｐｐ６５は、配列番号６、７若しくは８のアミノ酸配列、又は配列番号６、７若しくは８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得て；及び／又はヒトＰＤ−Ｌ１は、配列番号９のアミノ酸配列、又は配列番号９のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含み得る。
【００１８】
１つの実施形態において、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、医薬組成物の形態であり、さらに、少なくとも１つの薬学的に許容される賦形剤を含み得る。医薬組成物は、腫瘍抗原及び／又は腫瘍間質抗原、好ましくはＷＴ１、ＭＳＬＮ、ＣＥＡ、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＰＤ−Ｌ１、ＶＥＧＦＲ−２及びＦＡＰからなる群から選択される抗原をコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含む、少なくとも１つのチフス菌Ｔｙ２１ａ株をさらに含むことができる。
【００１９】
治療される固形腫瘍は、大腸癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、中皮腫、神経膠芽腫、胃癌、肝細胞癌、腎細胞癌、前立腺癌、子宮頸癌、乳癌又は黒色腫のような任意の固形腫瘍であり得る。
【００２０】
本発明によるチフス菌Ｔｙ２１ａ菌株の単回用量は、約１０６〜約１０１０、より具体的には約１０６〜約１０９、より具体的には約１０６〜約１０８、最も具体的には約１０７〜約１０８コロニー形成単位を含む。一実施形態では、本発明のチフス菌Ｔｙ２１ａ株を、最初の週に２〜４回、好ましくは最初の週に４回投与し、続いて、２〜４週間ごと、特に１日目及び７日目に、好ましくは１日目、３日目、５日目及び７日目に単回用量で追加投与し、続いて、２〜４週間ごとに単回用量で追加投与する。
【図面の簡単な説明】
【００２１】
【図１Ａ−Ｂ】（Ａ）空ベクター、及び（Ｂ）ＶＸＭＮｅｏ１ｍを用いて経口で免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞における示されたエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の頻度。示されているエピトープの全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち、エピトープ特異的な五量体陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合％を示す。
【図１Ｃ】（Ｃ）ＶＸＭ０６ｍを用いて経口で免疫されたＣ５７ＢＬ／６マウスの脾細胞における示されたエピトープ特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞集団の頻度。示されているエピトープの全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうち、エピトープ特異的な五量体陽性のＣＤ８＋Ｔ細胞の割合％を示す。
【図２】医薬品の安定性試験。１０４（Ｐ４）、１０５（Ｐ５）、１０６（Ｐ６）又は１０７（Ｐ７）ＣＦＵ／ｍｌのチフス菌Ｔｙ２１ａ送達プラットフォームに基づく３種類の標的抗原をコードする３種類の構築物から製造された最終の医薬品（製造品１、製造品２及び製造品３）を指示された時間、７０℃以下でインキュベートした。生菌数（ＣＦＵ／ｍｌ）を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２２】
本発明は、本発明の以下の詳細な説明を参照することによって、より容易に理解することができる。
【００２３】
１つの態様において、本発明は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株に関する。５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株を対象における固形腫瘍の治療に用いることができる。特に、少なくとも５つ以上のネオアンチゲンは、前記対象の固形腫瘍において同定された腫瘍特異的抗原である。
【００２４】
本発明は、さらに、対象における固形腫瘍の治療に使用するための、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株に関し、ここで、対象は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞で処理されているか又は処理される。特に、少なくとも５つ以上のネオアンチゲンは、前記対象の固形腫瘍において同定された腫瘍特異的抗原である。さらに、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体は、対象の固形腫瘍において発現又は過剰発現されると同定された少なくとも１つの腫瘍抗原に結合する。従って、好ましくは、少なくとも１つの腫瘍抗原が、前記対象の固形腫瘍において発現又は過剰発現されることが同定され、対象は、前記対象の固形腫瘍において発現又は過剰発現されることが同定された少なくとも１つの腫瘍抗原を標的とする少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞で処理されているかまたは処理される。
【００２５】
さらに、本発明は、対象における固形腫瘍の治療に使用するための、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞と組み合わせて、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株に関する。あるいは、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞と組み合わせて、対象における固形腫瘍の治療に使用される。特に、少なくとも５つ以上のネオアンチゲンは、前記対象の固形腫瘍において同定された腫瘍特異的抗原である。さらに、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体は、対象の固形腫瘍において発現又は過剰発現されると同定された少なくとも１つの腫瘍抗原に結合する。従って、好ましくは、少なくとも１つの腫瘍抗原が、前記対象の固形腫瘍において発現又は過剰発現されるように同定され、前記対象は、前記対象の固形腫瘍において発現又は過剰発現されるように同定された少なくとも１つの腫瘍抗原を標的とする少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞で処理されているか又は処理される。
【００２６】
別の態様では、本発明は、対象における固形腫瘍を治療する方法に関し、本方法は、対象に５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株を投与することを含み、対象は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞で処理されているか又は処理される。より具体的には、本方法は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞を投与し、次いで、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株を対象に投与することを含む。少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞を養子細胞移植によって対象に投与する。本方法は、さらに、少なくとも５つ以上のネオアンチゲンが、前記対象の固形腫瘍中の腫瘍特異的抗原であることを同定し、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株を生成する工程を含むことができる。本方法は、さらに、前記対象の固形腫瘍において発現又は過剰発現されると同定された少なくとも１つの腫瘍抗原を同定する工程と、前記対象の固形腫瘍において発現又は過剰発現されると同定された少なくとも１つの腫瘍抗原を標的とする少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞を投与する工程とを含み得る。
【００２７】
本発明によれば、弱毒化サルモネラ菌株は、標的細胞への前記ＤＮＡ分子の送達のための５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子の細菌担体として機能する。好ましくは、ＤＮＡ分子は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むプラスミドの一部である。５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むそのような細菌担体又はデリバリーベクターもまたＤＮＡワクチンと称され得る。
【００２８】
本発明の文脈において、用語「ワクチン」は、投与時に対象において免疫応答を誘導することができる薬剤を指す。ワクチンは、好ましくは、疾患を予防し、改善し又は治療することができる。本発明の文脈において、ワクチンは、好ましくは経口ワクチンである。本発明による５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、「５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株」又は「ネオアンチゲン癌ワクチン」と略記することができる。
【００２９】
ネオアンチゲン癌ワクチン
本発明による生弱毒化サルモネラ菌株、より詳細にはチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含む組換えＤＮＡ分子を安定的に保有する。それは、この組換えＤＮＡ分子の経口送達のための担体として使用される。用語「チフス菌Ｔｙ２１ａの弱毒株」は、本明細書で使用される場合、サルモネラ菌の弱毒株、より具体的にはチフス菌を指し、ここで、弱毒株はＴｙ２１ａであり、本明細書中では「チフス菌Ｔｙ２１ａ」と同義に使用される。
【００３０】
遺伝的免疫化は、従来のワクチン接種よりも有利である可能性がある。標的ＤＮＡは、かなりの期間にわたって検出することができ、かくして、抗原のデポとして作用する。いくつかのプラスミドの配列モチーフは、ＣｐＧアイランドのように、免疫刺激性であり、ＬＰＳ及び他の細菌成分による免疫刺激によって促進されるアジュバントとして機能することができる。
【００３１】
生きた弱毒化サルモネラ菌ベクターは、インサイチュでリポ多糖（ＬＰＳ）のような自己免疫調節因子を産生し、これはマイクロカプセル化のような他の投与形態よりも有利である。さらに、本発明による粘膜ワクチンは、有益であることが証明されたリンパ管内作用モードを有する。本発明による弱毒化ワクチンの摂取後、腸のパイエル板中のマクロファージ及び他の細胞は、改変された細菌によって侵入される。細菌はこれらの食細胞に取り込まれる。チフス菌Ｔｙ２１株の細菌は、その弱毒化突然変異のために、これらの食細胞内に存続できず、死滅する。組換えＤＮＡ分子は放出され、その後、特異的輸送系又はエンドソーム漏出によって食細胞性免疫細胞の細胞質に移される。最後に、組換えＤＮＡ分子は核内に入り、そこで転写され、食細胞の細胞質中に５つ以上のネオアンチゲンを含むポリペプチドを大量に発現させる。感染細胞はアポトーシスを起こし、５つ以上のネオアンチゲンを含むポリペプチドで負荷され、腸の免疫系によって取り込まれ、プロセシングされる。細菌感染の危険シグナルはこの過程で強力なアジュバントとして働き、全身及び粘膜コンパートメントのレベルで強力な標的抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞及び抗体反応を引き起こす。免疫応答はワクチン接種１０日後にピークに達する。抗担体応答の欠如は、同じワクチンで数回ブーストすることを可能にする。
【００３２】
本発明の文脈において、用語「弱毒化された」とは、弱毒化突然変異を有しない親細菌株と比較して弱毒化突然変異による毒性が低下した細菌株を指す。弱毒化された細菌株は、病原性を失っているが、防御免疫を誘導する能力を保持していることが好ましい。弱毒化は、毒性遺伝子、調節遺伝子、及び代謝遺伝子を含む種々の遺伝子の欠失によって達成することができる。弱毒化細菌は、天然に見出されてもよく、又は、例えば、新しい培地又は細胞培養物への適応によって、実験室で人工的に産生されてもよく、又は、組換えＤＮＡ技術によって産生されてもよい。本発明によるサルモネラ菌の弱毒化株の約１０１１ＣＦＵの投与は、好ましくは、５％未満、より好ましくは１％未満、最も好ましくは１％未満の対象においてサルモネラ菌症を引き起こす。本発明のＴｙ２１ａ株は、チフス菌の弱毒化株である
【００３３】
本発明の文脈において、用語「含む（comprise）」又は「含んでいる（comprising）」は、「限定されないが、含んでいる（including）」を意味する。用語は、任意の記載された特徴、要素、整数、ステップ又はコンポーネントの存在を指定するために、オープンエンドであることが意図されているが、１つ以上の他の特徴、エレメント、整数、ステップ、コンポーネント又はグループの存在又は追加を排除するものではない。したがって、用語「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、より限定的な用語「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」及び「本質的にからなる」を含む。一実施形態では、出願全体、特にクレーム内で使用される「含む」という用語は、「からなる」という用語に置き換えることができる。本明細書中で使用される用語「ある（ａ）」は、複数を含むことができ、「１つ」を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書中で使用される用語「ネオアンチゲン」は、癌細胞においてのみ発現されるが、同一患者の正常組織においては発現されない体細胞突然変異遺伝子から生成されるペプチドに関する。遺伝子と染色体は、体細胞組織でも胚組織でも突然変異を起こすことができる。生殖細胞系突然変異とは反対に、体細胞突然変異は子孫に伝達されない。このように、遺伝子の体細胞突然変異は、癌細胞及び癌発生中に獲得されている。典型的には、突然変異は、突然変異エピトープ又は点突然変異ペプチドとも呼ばれるネオエピトープを生成する腫瘍特異的点突然変異である。これらは、正常組織には存在せず、したがって中枢性胸腺寛容をバイパスするため、高度に免疫原性である。ネオアンチゲンは、好ましくは、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩによってペプチドとして提示される新エピトープからなる。突然変異はまた、フレームシフトペプチド（ＦＳＰ）抗原を生じるフレームシフト突然変異であってもよい。ＦＳＰネオアンチゲンは、単一ヌクレオチドの挿入又は欠失によって引き起こされるが、複数の免疫学的に関連する新生エピトープを含むことができる、長い抗原性アミノ酸ストレッチを包含する。特定の実施形態では、用語「ネオアンチゲン」は、ペプチドプロセシング（ＴＥＩＰＰ）に関連するＴ細胞エピトープをさらに含む。ＴＥＩＰＰは、健常細胞においてＭＨＣ  Ｉに装填されていない、普遍的に発現される非突然変異「自己」タンパク質に由来する。免疫を逃れる癌では、抗原プロセシングに関連するトランスポーター（ＴＡＰ）のような抗原プロセシング成分がしばしばダウンレギュレートされる。したがって、突然変異又はエピジェネティックサイレンシングによるＴＡＰの非存在下など、抗原処理装置に欠陥を有する細胞においてのみ、ＴＥＩＰＰを癌細胞の表面に提示することができる（Ｍａｒｊｉｔら、Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２０１８，  ２１５（９）：２３２５）。
【００３５】
癌の進行中に、癌ゲノムに蓄積する突然変異がタンパク質をコードする遺伝子に影響を及ぼし、タンパク質配列の変化をもたらすことがある。突然変異タンパク質は、タンパク質分解的に短いペプチドに切断され、ヒトのＭＨＣ（ヒト白血球抗原（ＨＬＡ））によって腫瘍細胞表面に提示される。これらの体細胞突然変異遺伝子、すなわち、悪性細胞には存在するが正常細胞には存在しないネオアンチゲンは、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）によって異物として認識され得る。従って、用語「ネオアンチゲン」は、好ましくは、ＭＨＣ  Ｉ又はＩＩによって提示される体細胞突然変異を含むペプチドからなるペプチドを意味する。ＭＨＣ  Ｉによって提示される抗原は、ＣＤ８  Ｔ細胞抗原とも呼ばれる。ＭＨＣ  ＩＩによって提示される抗原は、ＣＤ４  Ｔ細胞抗原（又はＴヘルパー抗原）とも呼ばれる。ネオアンチゲンはＴＩＬによって異物として認識され得るので、それらは強力な腫瘍特異的免疫応答を誘導することができる。腫瘍細胞死後に放出されたネオアンチゲンは、特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）と特異的なネオアンチゲン−ＭＨＣ複合体との相互作用を介して、最終的に癌細胞を認識するＴ細胞に導く多くのプロセスを開始する。
【００３６】
用語「５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチド」とは、本明細書で使用される場合、５つ以上のネオアンチゲンを共に含む１つのポリペプチド又は１つ以上のポリペプチドを指す。５つ以上のネオアンチゲンが同じポリペプチドの一部であるか、あるいは異なるポリペプチドの一部であるかは、重要ではない。したがって、５つ以上のネオアンチゲンは、１つのポリペプチドとして、又は２つ以上のポリペプチドとして発現され得る。好ましくは、少なくとも１つ以上のポリペプチド内に含まれるネオアンチゲンは、１０以上、２０以上、３０以上、５０以上、又は５０を超えるネオアンチゲンである。本明細書で使用されるチフス菌Ｔｙ２１ａ株の文脈において、少なくとも１つのポリペプチドをコードする挿入物は、３００個までのネオアンチゲン、好ましくは２００個までのネオアンチゲンを含み得る。ＭＨＣクラスＩ又はＩＩ（ヒトＨＬＡ）上のペプチドとして提示される抗原は、典型的には、ＭＨＣ  ＩＩ（ＣＤ４抗原）については１１〜３０アミノ酸、ＭＨＣ  Ｉ（ＣＤ８抗原）については８〜１０アミノ酸である。従って、少なくとも１つのポリペプチド内に含まれるネオアンチゲンの好ましい範囲は、５〜３００個、１０〜３００個、２０〜３００個、３０〜３００個、５０〜３００個、又は５０〜３００個を超えるネオアンチゲンである。少なくとも１つのポリペプチド内に含まれるネオアンチゲンのより好ましい範囲は、５〜２００個、１０〜２００個、２０〜２００個、３０〜２００個、５０〜２００個、又は５０〜２００個を超えるネオアンチゲンである。融合したネオアンチゲンを含む各ポリペプチドは、抗原提示細胞内のネオアンチゲンにタンパク質分解的に切断され、ＨＬＡを介して提示され、Ｔ細胞応答を誘導する。
【００３７】
本発明によれば、５つ以上のネオアンチゲンは、ＣＤ８  Ｔ細胞抗原及び／又はＣＤ４  Ｔ細胞抗原を含み得る。好ましくは、５つ以上のネオアンチゲンは、ＣＤ８  Ｔ細胞抗原及びＣＤ４  Ｔ細胞抗原を含む。
【００３８】
ネオアンチゲンによるワクチン接種は、既存のネオアンチゲン特異的Ｔ細胞集団を拡大し、癌患者においてより広いレパートリーの新たなＴ細胞特異性を誘導することができるという仮説が立てられている。
【００３９】
ネオアンチゲンは、典型的には、８〜３０個のアミノ酸、好ましくは８〜２０個のアミノ酸、より好ましくは８〜１２個のアミノ酸を有するペプチドである。
【００４０】
ネオアンチゲン癌ワクチンでは、ワクチンが複数のネオアンチゲンを標的とする場合に有益であり、その結果、ネオアンチゲンのサブセットの発現の喪失による免疫回避のリスクが低下する。また、腫瘍進行中に選択されたネオアンチゲン又はネオアンチゲンの新規サブセットを標的とすることを含む、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含む別のチフス菌Ｔｙ２１ａ株で患者を連続的に治療することも本発明に包含される。
【００４１】
チフス菌Ｔｙ２１ａの弱毒化株（「チフス菌Ｔｙ２１ａ」とも呼ばれる）が、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドの担体として有利であることは、確立された品質管理アッセイであり、１つ以上のネオアンチゲンをコードする挿入物中にのみプラスミドの個体差、増殖の必要性及び経口投与による無菌試験に関する必要性がないことである。さらに、形質転換に適した発現プラスミド、ならびに担体としてのチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、多数（最大３００個）のエピトープ（ネオアンチゲン）を可能にする。ネオアンチゲンは、所望によりリンカーによって分離されたビーズのストリング（１つ以上のポリペプチドとして発現される）としてプラスミドに挿入され得る。リンカーは、限定されるものではないが、ＧＳリンカー、２Ａ切断部位、又はＩＲＥＳ配列であり得る。迅速な生成及び限定された品質管理の必要性のために、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株を生成する時間は短く、例えば、１５日以内、好ましくはネオアンチゲンの同定後１４日以内に達成することができる。１Ｌ培養では１０１１の集落形成単位（ＣＦＵ）の純収量を有するバクテリアが高収率であるため、一晩発酵で十分であり、アップスケーリングは不要である。これは、製造時間が短く、製造コストが低いことを可能にする。さらに、各ロットは何年にもわたる治療に十分であり、製剤は少なくとも３年間安定であることが示された。従って、１つのバッチは固形腫瘍を有する対象の全治療の間持続するので、バッチ変動は起こらない。
【００４２】
固形腫瘍を有する個体対象のための５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株を生成する方法は、（ａ）腫瘍細胞試料及び前記対象からの対照試料を提供する工程；（ｂ）対照試料に存在しない腫瘍細胞試料中に存在する５つ以上のネオアンチゲンを同定する工程；（ｃ）５つ以上のネオアンチゲンをコードするｃＤＮＡを選択する工程；（ｄ）５つ以上のネオアンチゲンを含むｃＤＮＡを合成する工程；（ｅ）ｃＤＮＡを少なくとも１つの真核生物発現カセットにクローニングする工程；（ｆ）５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含む少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子でチフス菌Ｔｙ２１ａ受容菌株を形質転換する工程；（ｆ）工程（ｆ）で得られた株を発酵させ、ＣＦＵに基づいて標的濃度まで希釈する工程；及び（ｇ）５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするｃＤＮＡを配列決定することを含む、前記形質転換されたチフス菌Ｔｙ２１ａを分析する工程を含む。対照試料は、治療対象の対象からの正常組織又は血液の任意の試料であり得る。好ましくは、対照試料は血液試料である。血液試料は、さらに、患者のＨＬＡタイピングのために使用され得る。腫瘍細胞の試料は、腫瘍の生検である場合がある。
【００４３】
腫瘍内の突然変異を検出（全て）し、自己ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）分子の高親和性結合を有する突然変異ペプチドを確実に予測又は決定する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、個々の患者からの適合腫瘍及び正常細胞ＤＮＡの全エキソーム配列決定（ＷＥＳ）を実施することができる。同定された体細胞突然変異は、次いで、直交的に検証され、腫瘍のＲＮＡ配列決定によって突然変異対立遺伝子の発現について評価される。次いで、患者の自己ＨＬＡ−Ａ又はＨＬＡ−Ｂタンパク質に結合すると予測されるペプチドが選択される。これは、例えば、エクスビボでのインターフェロンγ酵素結合免疫スポット（ＥＬＩＳＰＯＴ）によって確認することができる。あるいは、ＨＬＡ−ペプチドリガンドを細胞培地から単離することができ、同定はＬＣ−ＭＳ／ＭＳ分析によって行うことができる。
【００４４】
ポリペプチドは、互いに融合した複数のネオアンチゲン、好ましくは５個以上、１０個以上、２０個以上、３０個以上、又は５０個以上のネオアンチゲンを含み得る。ｐＶＡＸ１（商標）発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）又はその誘導されたｐＶＡＸ１０のようなチフス菌Ｔｙ２１ａ株をトランスフェクトするために使用される典型的なプラスミドにおいて、約３００個までのネオアンチゲンが発現され得る。したがって、ポリペプチドは、約５〜３００、１０〜３００、２０〜３００、３００〜３００又は５０〜３００個のネオアンチゲン、好ましくは１０〜２００、２０〜２００、３０〜３００又は５０〜２００個のネオアンチゲンを含み得る。ポリペプチドは、細胞内でペプチドに切断され、ネオアンチゲンのタイプに応じて、ＭＨＣ  Ｉ又はＭＨＣ  ＩＩ分子上に提示される。個々のネオアンチゲンは、リンカー、例えばＧＳリンカー、特異的に設計されたリンカー又は２Ａ切断部位によって分離することができる。ネオアンチゲンをコードするＤＮＡ分子はまた、ＩＲＥＳ配列によって分離され得、その結果、別々のポリペプチドが得られる。
【００４５】
５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、ネオアンチゲンではない少なくとも１つの腫瘍抗原及び／又は腫瘍間質抗原を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子をさらに含み、ここで、ネオアンチゲンではない前記少なくとも１つの腫瘍抗原は、治療される患者の固形腫瘍において発現される。ネオアンチゲン及び／又は腫瘍間質抗原ではない少なくとも１つの腫瘍抗原を含む少なくとも１つのポリペプチドは、（ａ）５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドを含む少なくとも１つの真核生物発現カセットを含む同一ＤＮＡ分子によって、又はさらなる別個のＤＮＡ分子によってコードされてもよく、（ｂ）５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットによって、又はさらなる別個の発現カセットによってコードされてもよく、又は（ｃ）５つ以上のネオアンチゲン又はさらなる別個のポリペプチドを含む少なくとも１つのポリペプチドであってもよい。したがって、チフス菌Ｔｙ２１ａ株を２つのＤＮＡ分子で形質転換することができ、第１のものは５つ以上のネオアンチゲンをコードし、第２のものはネオアンチゲン及び／又は腫瘍間質抗原ではない少なくとも１つの腫瘍抗原をコードする。あるいは、チフス菌Ｔｙ２１ａ株は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセット、及びネオアンチゲン及び／又は腫瘍間質抗原ではない少なくとも１つの腫瘍抗原をコードする少なくとも１つのさらなる真核生物発現カセットを含む１つのＤＮＡ分子で形質転換され得る。あるいは、チフス菌Ｔｙ２１ａ株を、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含み、さらに、ネオアンチゲン及び／又は腫瘍間質抗原ではない少なくとも１つの腫瘍抗原を含む１つのＤＮＡ分子で形質転換することもできる。この文脈における腫瘍抗原の例は、限定されるものではないが、ＷＴ１、ＭＳＬＮ、ＣＥＡ、ＨＥＲ２、ＥＧＦＲ、ＦＢＰ、ＧＤ２、ＧＤ３、ＭＡＧＥ−Ａ１、ＰＳＣＡ、ＰＳＭＡ、ＭＵＣ１、ＧＰＣ３及びＣＭＶｐｐ６５である。腫瘍抗原は、腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原であり得る。本明細書中で使用される「腫瘍特異的抗原」という用語は、腫瘍内で発現されるが、正常組織内では発現されない抗原に関する。本明細書中で使用される「腫瘍関連抗原」という用語は、正常組織と比較して腫瘍内で過剰発現された抗原に関する。本明細書中で使用される「腫瘍間質抗原」という用語は、限定されるものではないが、ＶＥＧＦＲ−２及びＦＡＰを含む、腫瘍間質において発現される抗原を指す。５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、チェックポイント阻害抗原を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含んでもよく、ここで、該少なくとも１つのチェックポイント阻害抗原又はそのリガンドは、治療される患者の固形腫瘍において過剰発現される。５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株におけるチェックポイント阻害剤抗原の発現に関して、ネオアンチゲン及び／又は腫瘍間質抗原ではない少なくとも１つの腫瘍抗原についても同様である。チェックポイント阻害剤抗原の例は、ＰＤ−１又はＰＤ−Ｌ１である。この文脈で使用されるＤＮＡ分子は、好ましくは発現プラスミドである。
【００４６】
５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子はまた、組換えＤＮＡ分子、すなわち、好ましくは異なる起源のＤＮＡ断片から構成される操作されたＤＮＡ構築物と称され得る。ＤＮＡ分子は、線状核酸、又は好ましくは、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームをプラスミドの真核生物発現カセットに導入することによって生成される環状ＤＮＡプラスミドであり得る。真核生物発現カセットを含むプラスミドは、真核生物発現プラスミドとも呼ばれ得る。
【００４７】
本発明の文脈において、用語「発現カセット」は、その発現を制御する調節配列の制御下にある少なくとも１つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）を含む核酸ユニットを指す。発現カセットは、好ましくは、真核生物標的細胞において、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする包含されたオープンリーディングフレームの転写を媒介することができる。真核生物発現カセットは、典型的には、プロモーター、少なくとも１つのオープンリーディングフレーム、及び真核生物標的細胞での発現を可能にする転写終結シグナルを含む。
【００４８】
特定の実施形態では、チフス菌Ｔｙ２１ａ株の単回用量は、約１０６〜約１０１０、より具体的には約１０６〜約１０９、より具体的には約１０７〜約１０９、より具体的には約１０６〜約１０８、最も具体的には約１０６〜約１０７のコロニー形成単位を含む。
【００４９】
より詳細には、チフス菌Ｔｙ２１ａ株の単回用量は、約１×１０６〜約１×１０１０、より詳細には約１×１０６〜約１×１０９、より詳細には約１×１０７〜約１×１０９、より詳細には約１×１０６〜約１×１０８、特に詳細には約１×１０６〜約１×１０７のコロニー形成単位（ＣＦＵ）を含む。
【００５０】
さらに、本発明のチフス菌株チフス菌Ｔｙ２１ａは、好ましくは第１週に２〜４回、好ましくは第１週に４回投与し、続いて、２〜４週間ごと、特に第１日及び第７日に、好ましくは第１日、第３日、第５日及び第７日に単回用量で追加投与し、続いて２〜４週間ごとに単回用量で追加投与する。
【００５１】
この文脈において、用語「約」又は「ほぼ」は、３の係数内、又は所与の値又は範囲の１．５の係数内を含む２の係数内を意味する。
【００５２】
特別な実施形態において、処置は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチド又は本発明による医薬組成物をコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株の単一又は複数の投与を含む。投与の単回用量は、本明細書に開示されているものと同じ又は異なるものであってもよく、好ましくは同じものであり、好ましくは、本明細書に開示されている範囲内であってもよい。特に、治療は、治療の最初の週に２〜４回の初回ワクチン接種を含み、続いて、本発明による５以上のネオアンチゲン又は医薬組成物を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株を２〜４週間ごとに単回追加投与することを含む。
【００５３】
５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、対象における固形腫瘍の治療に使用するためであり、対象は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞で処理されているか又は処理される。
【００５４】
本発明に従って治療される固形腫瘍は、任意の固形腫瘍、特に大腸癌、膵臓癌、肺癌、卵巣癌、中皮腫、神経膠芽腫、胃癌、肝細胞癌、腎細胞癌、前立腺癌、子宮頸癌、乳癌及び黒色腫から選択される固形腫瘍であり得る。
【００５５】
操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞
５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株を固形腫瘍の治療に使用するために固形腫瘍を有する対象に投与する。１つの実施形態において、対象は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞で処理されているか又はさらに処理される。好ましくは、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞は、養子細胞移植（ＡＣＴ）、すなわち、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の静脈内注射によって、固形腫瘍を有する対象に提供される。本明細書中で使用される用語「養子細胞移入」は、患者又は対象への細胞の移入を指す。少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の文脈において、それは「投与」又は「投与すべき」と同義で使用される。用語「少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞」とは、本明細書で使用される場合、「少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＮＫＴ細胞、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＮＫ細胞」を意味し、「少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞、又は「少なくとも１つの操作されたＴ細胞、少なくとも１つの操作されたＮＫＴ細胞、又は少なくとも１つの操作されたＮＫ細胞」に略することができる。より詳細には、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞は、操作された従来のαβＴ細胞又は操作されたγδＴ細胞であり得、好ましくは、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞は、操作された従来のαβＴ細胞である。
【００５６】
少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞は、通常、カスタム製造される。これには、治療対象の固形腫瘍中に発現された腫瘍抗原を同定することが必要である。治療される対象の固形腫瘍中に発現される腫瘍抗原を同定する工程は、（ａ）前記対象からの腫瘍細胞試料及び対照試料を提供する工程と、（ｂ）対照試料中に存在しない腫瘍細胞試料中に発現される腫瘍抗原を同定する工程とを含む。腫瘍細胞の試料は、腫瘍の生検である場合がある。さらに、腫瘍細胞試料は、固形腫瘍組織ならびに腫瘍間質組織を含むと理解されるべきである。少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞を生成するために治療される対象の固形腫瘍に発現される腫瘍抗原を同定し、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株を生成するために治療される対象の固形腫瘍に発現される５つ以上のネオアンチゲンを同定することは、同時に又は別々の時点で実施することができ、及び／又は同一の腫瘍細胞試料又は異なる腫瘍細胞試料において実施することができる。好ましくは、治療される対象の固形腫瘍又は固形腫瘍の間質に発現される５つ以上のネオアンチゲン、及び腫瘍抗原及び／又は腫瘍間質抗原の同定には、（ａ）前記対象からの腫瘍細胞試料及び対照試料を提供する工程；ならびに（ｂ）対照試料中に存在しない、腫瘍細胞試料中に存在する５つ以上のネオアンチゲン及び／又は腫瘍間質抗原及び／又は腫瘍間質抗原を同定する工程を含む。少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体によって標的化される腫瘍抗原は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株によって標的化されるネオアンチゲンの少なくとも１つと同一であってもよく、又は異なるものであってもよい。
【００５７】
少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞は、自己又は同種Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞であり得る。用語「自己」は、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞が、患者から得られ、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体をコードする核酸分子を導入することによって遺伝的に操作され、インビトロで拡大され、治療される対象に戻されることを意味する。好ましくは、操作されたＴ細胞は、自己Ｔ細胞であり、すなわち、治療される対象に由来する。Ｔ細胞、特に、操作された従来のαβＴ細胞は、治療される対象に対して同種異系であり、すなわち、別の健康なドナー由来であってもよい。操作されたＮＫＴ細胞ならびに操作されたＮＫ細胞は、それぞれ、自家又は同種ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞であり得る。Ｔ細胞（特に通常のαβＴ細胞）の養子細胞移植は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）のリスクがあるが、これはＮＫＴ細胞、ＮＫ細胞又はγδＴ細胞の養子細胞移植の場合よりも少ない。少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む、同種の操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞、又はＮＫ細胞は、予め作製され得るか、又は市販製造品であり得る。さらに、ＮＫ細胞については、同種異系細胞の使用は、ＮＫ細胞が自己ＭＨＣ分子によって誘発されるＫＩＲシグナル伝達によって抑制されにくいという利点を有する。
【００５８】
本明細書で使用される用語「操作された」は、細胞表面上に少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を発現するための「修飾された」を意味する。細胞表面上の少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体をコードする遺伝子又はｍＲＮＡを、好ましくはトランスフェクション又はトランスダクションにより、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞に導入する。Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体をコードするＲＮＡ又はＤＮＡでトランスフェクト又は形質導入され得る。次いで、操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞を、エクスビボで増殖又は拡大させ、その後、対象に再注入する。遺伝子送達のための適切なベクターは、当該技術分野で公知であり、例えば、レトロウイルスベクター及びレンチウイルスベクターのようなウイルスベクター、又はＰｉｇｇｙ−Ｂａｃ（ＰＢ）及びＳｌｅｅｐｉｎｇ  Ｂｅａｕｔｙ（ＳＢ）のようなトランスポゾンを含む。ＲＮＡ一時的に操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞、好ましくはＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ細胞もまた、本発明によって想定される。
【００５９】
ある態様において、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞は、その細胞表面上に少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含み、ここで、腫瘍抗原は、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、上皮増殖因子受容体（ＥＧＦＲ）、葉酸結合タンパク質（ＦＢＰ）、ＧＤ２、ＧＤ３、ヒト上皮増殖因子受容体２（ＨＥＲ２、ｅｒｂ−Ｂ２）、メラノーマ抗原Ａ１（ＭＡＧＥ−Ａ１）、メソテリン（ＭＳＬＮ）、前立腺幹細胞抗原（ＰＳＣＡ）、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）、ムチン−１（ＭＵＣ１）、グリピカン−３（ＧＰＣ３）、ウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）、上皮細胞接着分子（ＥｐＣＡＭ）、Ｂ細胞成熟抗原（ＢＣＭＡ）及びチロシンタンパク質キナーゼ膜貫通受容体（ＲＯＲ１）から選択される。腫瘍抗原は、それに限定されるものではないが、例えば、表１に列挙される固形腫瘍によって発現され得る。
【００６０】
【表１】
2021536247.tif 000002
【００６１】
用語「少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む操作されたＴ細胞」とは、腫瘍抗原に結合する組換えＴ細胞受容体を有するＴ細胞を指す。特に、これは、少なくとも１つの腫瘍抗原結合ドメイン、活性化ドメイン、及び共刺激ドメインを含む組換え表面受容体を有するＴ細胞を意味する。好ましくは、これは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、いわゆる「ＣＡＲ−Ｔ細胞」を担持するＴ細胞を意味する。本明細書において使用される場合、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体又はＣＡＲ−Ｔ細胞を含む操作されたＴ細胞は、それぞれ、操作された従来のαβＴ細胞又はＣＡＲ−αβＴ細胞を指すと理解することができる。さらに、又は代替的に、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む操作されたＴ細胞又はＣＡＲ−Ｔ細胞は、操作された従来のαβＴ細胞又はＣＡＲ−αβＴ細胞、又は操作されたγδＴ細胞又はＣＡＲ−γδＴ細胞であり得る。本発明の文脈において、操作されたＴ細胞又はＣＡＲ−Ｔ細胞は、少量の他のＴ細胞のサブセット、例えばＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫＴ細胞を含み得る。典型的には、本発明による操作されたＴ細胞又はＣＡＲ−Ｔ細胞は、それぞれ５％未満、２％未満、１％未満又は０．５％未満のＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫＴ細胞を含む。用語「少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞」は、操作されたＴ細胞の集団、好ましくは操作されたＴ細胞の実質的に純粋な集団、より好ましくは５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は９５％超のＴ細胞を含む細胞の混合物を含む。操作されたＴ細胞は、好ましくは、異なるドナー又は治療される対象からの末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）、胎盤又は誘導多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成される。
【００６２】
用語「少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む操作されたＮＫＴ細胞」とは、腫瘍抗原に結合する組換え表面受容体を有するＮＫＴ細胞、特に、少なくとも１つの腫瘍抗原結合ドメイン、活性化ドメイン及び共刺激ドメインを含む組換え表面受容体を有するＮＫＴ細胞をいう。好ましくは、これは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、いわゆる「ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞」を担持するＮＫＴ細胞を意味する。ＮＫＴ細胞は、非古典的ＭＨＣタンパク質ＣＤ１ｄを介して提示される糖脂質及び脂質を認識するＴ細胞受容体を有する。本明細書で使用される用語「ＮＫＴ細胞」は、ＣＤ１ｄ制限Ｔ細胞を指す。ＮＫＴ細胞は、αβＴ細胞受容体を共発現するＴ細胞のサブセットであるが、ＮＫ１．１のようなＮＫ細胞に典型的に関連する種々の分子マーカーも発現する。ＮＫＴ細胞は、不変Ｔ細胞受容体（不変又は１型ＮＫＴ細胞）と多様なＮＫＴ細胞（２型ＮＫＴ細胞）をもつＮＫＴ細胞に細分される。ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞は、ＣＡＲ活性がＮＫＴ細胞の固有の抗腫瘍活性と相乗的に作用し得るという利点を有する。用語「少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＮＫＴ細胞」は、操作されたＮＫＴ細胞の集団、好ましくは操作されたＮＫＴ細胞の実質的に純粋な集団、より好ましくは５０％、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は９５％超のＮＫＴ細胞を含む細胞の混合物を含む。操作されたＮＫＴ細胞は、好ましくは、異なるドナー又は治療される対象からの末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）、胎盤又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成される。
【００６３】
用語「少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む操作されたＮＫ細胞」とは、腫瘍抗原に結合する組換え表面受容体を有するＮＫ細胞、特に、少なくとも１つの腫瘍抗原結合ドメイン、活性化ドメイン及び共刺激ドメインを含む組換え表面受容体を有するＮＫ細胞をいう。好ましくは、これは、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）、いわゆる「ＣＡＲ−ＮＫ細胞」を担持するＮＫ細胞を意味する。ＮＫ細胞は、多数の活性化及び抑制性生殖細胞系にコードされた受容体を含むリンパ球である。これらの受容体には、腫瘍細胞上のストレスリガンドＭＩＣ−Ａ及びＭＩＣ−Ｂを認識するＮＫＧ２Ｄ受容体、ならびに天然の細胞毒性受容体ＮＫｐ３０、４６及びｐ４４が含まれる。一方、キラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）ファミリーはクラスＩ  ＭＨＣ分子に結合し、ＮＫ細胞活性化を阻害する。ＮＫエフェクター機能を誘発する２つの主要なメカニズムが存在する：（ｉ）自己欠損：ダウンレギュレートされたＭＨＣ提示の結果のような抑制性リガンドの欠如、及び（ｉｉ）自己誘導：プロ活性化刺激は、ストレスリガンドのアップレギュレーション又は抗体によりコーティングされた細胞のような、それらの抑制性の対応物を上回る。用語「少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＮＫ細胞」は、操作されたＮＫ細胞の集団、好ましくは、操作されたＮＫ細胞の実質的に純粋な集団、より好ましくは、５０％超、６０％超、７０％超、８０％超、９０％超又は９５％超のＮＫ細胞の混合物を含む。操作されたＮＫ細胞は、好ましくは、異なるドナー又は治療される対象から、又はＮＫ細胞株（例えば、ＮＫ−９２細胞）から、末梢血（ＰＢ）、骨髄（ＢＭ）、臍帯血（ＣＢ）、胎盤又は誘導された多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から生成される。ＣＡＲ−ＮＫ細胞は、ＣＡＲ活性がＮＫ細胞の固有の抗腫瘍活性と相乗的に作用し得るという利点を有する。
【００６４】
好ましい実施形態において、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞は、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ細胞である。
【００６５】
用語「腫瘍抗原結合細胞表面受容体」は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合ドメイン、好ましくはキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含む組換え表面受容体を指す。ＣＡＲ構築物は、典型的には、３つの成分、すなわち、細胞外抗原認識ドメイン、膜貫通ドメイン、及び細胞内シグナル伝達ドメインからなる。細胞外ドメインは抗原認識部位を含み、通常は一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）で構成される。ある態様において、細胞外ドメインはまた、同一又は好ましくは異なる抗原特異性を有する２つ以上のｓｃＦｖを含み得る。これは、典型的には、ヒンジ領域を介して膜貫通ドメインに連結され、これは、適切な配向及び抗原への結合のための柔軟性を付与する。細胞内シグナル伝達ドメインは、活性化受容体（例えば、ＣＤ３ζ又はＦｃＲγ）の細胞内ドメインなどの刺激ドメイン、好ましくは補助刺激受容体（例えば、ＣＤ３８又は４−１ＢＢ）の細胞内ドメインなどの少なくとも１つの共刺激ドメインを含む。ＣＡＲは、細胞外リガンド認識ドメイン、各細胞を活性化する細胞内シグナル伝達ドメイン（例えば、ＣＤ３ζ又はＦｃＲγ）、好ましくは補助刺激受容体（例えば、ＣＤ２８又は４−１ＢＢ）の少なくとも１つの細胞内ドメインを含む、人工細胞表面受容体、すなわち膜貫通タンパク質である。それらはキメラと呼ばれ、これは、異なる供給源からの部分が融合しているからである。細胞外リガンド認識ドメインは、好ましくは、モノクローナル抗体の特異性に基づいており、典型的には、一本鎖可変断片である。
【００６６】
ＣＡＲは、二重の機能を有する膜貫通キメラ分子をコードする：（ａ）腫瘍細胞の表面に発現される腫瘍抗原の免疫認識、及び（ｂ）活性化及び／又は溶解機構の活性化を制御するシグナル伝達事象の積極的な促進及び伝播。このシステムは、いくつかの利点を有する：（１）エクスビボでの活性化メカニズムの「再プログラミングされたＴ細胞」、「再プログラミングされたＮＫＴ細胞」又は「再プログラミングされたＮＫ細胞」を提供すること、（２）腫瘍細胞によって獲得された耐性を破壊すること、及び（３）ＨＬＡ媒介抗原認識の制限を回避し、細胞性免疫療法のより広範な適用への障壁の１つを超えること。
【００６７】
Ｔ細胞については、ＣＡＲは、例えば、細胞外リガンド認識ドメインとしてｓｃＦｖを含むキメラ融合タンパク質、及びＣＤ３ζ鎖シグナリングドメイン又はＦｃＲγ鎖シグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメインであり得る。これは、Ｔリンパ球に抗体型特異性を与え、ＩＬ−２のようなサイトカインの産生や標的細胞の溶解を含むエフェクター細胞のすべての機能を活性化する。ＣＡＲは、さらに、ＣＤ２７、４−１ＢＢ、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１又はＯＸ４０からのような細胞内ＣＤ２８共刺激ドメイン及び／又は追加のトランスデューサードメインを含み得る。典型的には、ＣＡＲは、予め設計され、及び／又はＣＡＲをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子として提供される。このように、ＣＡＲ−Ｔ細胞によって標的化される腫瘍抗原は、理論的にはネオアンチゲンでもあり得るが、典型的には、ある固形腫瘍において発現又は過剰発現され、治療される対象の固形腫瘍において発現されることが同定される腫瘍抗原である。
【００６８】
本発明によれば、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む操作されたＴ細胞は「外装ＣＡＲ−Ｔ細胞」も含む。外装ＣＡＲ−Ｔ細胞は、有効性及び持続性を改善するために、インターロイキンのような活性サイトカインを誘導するか又は恒常的に分泌するか、又はＣＡＲ−Ｔ細胞をさらに外装するリガンドを発現するようにさらに最適化されている。「外装」剤の選択は、腫瘍微小環境の知識、及び自然免疫系及び適応免疫系の他の要素の役割に基づいている。例は、インターロイキン−２（ＩＬ−２）、インターロイキン−１２（ＩＬ−１２）、インターロイキン−１５（ＩＬ−１５）、ＣＤ４０Ｌ及び４−１ＢＢＬである。これらの薬剤は、異なるメカニズムを介して、ＣＡＲ  Ｔ細胞の有効性及び腫瘍微小環境における持続性をさらに増強することが示されている。これらは、典型的には、同一のＣＡＲベクター中で独立した遺伝子として発現される。
【００６９】
最近承認された２つのＣＡＲ−Ｔ細胞ＫＹＭＲＩＡＨ（チサゲンレクロイセル）及びＹＥＳＣＡＲＴＡ（アキシカブタゲンシロルユーセル）はいずれも抗ＣＤ１９マウスｓｃＦｖを含むが、それらはＣＤ３ζ鎖と融合した異なる共刺激ドメイン：ＫＹＭＲＩＡＨについては４−１ＢＢ、ＹＥＳＣＡＲＴＡについてはＣＤ２８を介してシグナルを伝える。
【００７０】
ＮＫＴ細胞については、ＣＡＲは、例えば、細胞外リガンド認識ドメインとしてｓｃＦｖを含むキメラ融合タンパク質、及びＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメイン又はＦｃＲγ鎖シグナル伝達ドメインを含む細胞内シグナル伝達ドメインであり得る。これはＮＫＴ細胞に抗体型特異性を与え、エフェクター細胞のすべての機能を活性化する。ＮＫＴ細胞では、ＩＦＮγ及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生、パーフォリン及びＦａｓリガンドによる殺傷に基づく標的細胞の溶解がこれに含まれる。ＣＡＲは、さらに、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１、４−１ＢＢ又はＯＸ４０からのような、細胞内ＣＤ２８共刺激ドメイン及び／又は追加のトランスデューサードメインを含み得る。典型的には、ＣＡＲは、予め設計され、及び／又はＣＡＲをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子として提供される。このように、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞によって標的化される腫瘍抗原は、理論的にはネオアンチゲンでもあり得るが、典型的には、ある固形腫瘍において発現又は過剰発現され、治療される対象の固形腫瘍において発現されることが同定される腫瘍抗原である。
【００７１】
ＮＫ細胞については、ＣＡＲは、例えば、細胞外リガンド認識ドメインとしてｓｃＦｖを含むキメラ融合タンパク質、及びＣＤ３ζ鎖シグナリングドメイン又はＦｃＲγ鎖シグナリングドメインを含む細胞内シグナリングドメインであり得る。これはＮＫ細胞に抗体型特異性を与え、エフェクター細胞のすべての機能を活性化する。ＮＫ細胞では、ＩＦＮγ及び顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）の産生及び標的細胞の溶解がこれに含まれる。ＣＡＲは、さらに、ＣＤ２７、ＣＤ４０Ｌ、ＰＤ−１、４−１ＢＢ、４−１ＢＢ、ＯＸ４０又は２Ｂ４（ＣＤ２４４）又はＤＮＡＸ活性化タンパク質１２（ＤＡＰ１２）ドメインからのような、細胞内ＣＤ２８共刺激ドメイン及び／又はさらなるトランスデューサードメインを含み得る。保護的腫瘍微小環境における重要なサイトカインは、ＮＫ細胞を阻害する形質転換増殖因子β（ＴＧＦ−β）である。このように、ＴＧＦ−β受容体の細胞外ドメインをＮＫＧ２Ｄ受容体の細胞内ドメインに融合させることは、ＣＡＲ−ＮＫ細胞の効果をさらに改善する可能性がある。典型的には、ＣＡＲは、予め設計され、及び／又はＣＡＲをコードするＤＮＡ又はＲＮＡ分子として提供される。このように、ＣＡＲ−ＮＫ細胞によって標的化される腫瘍抗原は、理論的にはネオアンチゲンでもあり得るが、典型的には、ある固形腫瘍において発現又は過剰発現され、治療される対象の固形腫瘍において発現されることが同定される腫瘍抗原である。
【００７２】
少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含むＮＫ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ細胞は、さらに、ＣＤ３ζのシグナル伝達ドメインに融合され、さらにＤＡＰ１０を発現するＮＫＧ２Ｄを含むＣＡＲを含んでもよい。ＮＫＧ２ＤはＣ型レクチン様受容体である。ヒトＮＫＧ２Ｄ受容体単量体は、膜貫通ドメインとＤＡＰ１０二量体との会合を介して六量体構造に集合する。ＤＡＰ１０はアダプタータンパク質として機能し、リガンドがＮＫＧ２Ｄに結合した後にシグナルを伝達する。ＮＫＧ２Ｄリガンドは、誘導された自己タンパク質であり、正常細胞の表面には完全に存在しないか、又は低いレベルでのみ存在するが、例えば形質転換細胞（腫瘍抗原）によって過剰発現される。このように、ＣＡＲは、細胞外ドメイン及び天然受容体からの膜貫通ドメインを、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインに融合され、さらにＤＡＰ１０に結合することができる。ＮＫＧ２Ｄ受容体がいくつかの異なるリガンドを認識し、それらは細胞ストレス中にしばしばアップレギュレートされるので、ＮＫＧ２Ｄ−ＣＡＲ−ＮＫ細胞もまた多特異的であり、腫瘍細胞の抗原喪失に対してより少ない傾向がある。この受容体は、ＣＡＲ−ＮＫ細胞のために開発されたが、ＣＡＲ−Ｔ細胞及びＣＡＲ−ＮＫＴ細胞にも適している。
【００７３】
本発明によれば、その細胞表面上に少なくとも１つの腫瘍抗原結合タンパク質を含む操作されたＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞は、「外装ＣＡＲ−ＮＫ細胞」又は「外装ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞」も含む。外装されたＣＡＲ−ＮＫ細胞は、さらに、活性サイトカインを誘導又は恒常的に分泌するために、又はリガンドを発現するために最適化されており、そのリガンドは、有効性及び持続性を改善するために、ＣＡＲ細胞をさらに外装する。「外装」剤の選択は、腫瘍微小環境の知識、及び自然免疫系及び適応免疫系の他の要素の役割に基づいている。例は、ＮＫ細胞についてはＩＬ−２及びＩＬ−１５のようなインターロイキン、及びＮＫＴ細胞についてはＩＬ−１５である。これらの薬剤は、異なるメカニズムを介して、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞及びＣＡＲ−ＮＫ細胞の有効性及び腫瘍微小環境における持続性をさらに増強することが示されている。これらは、典型的には、同一のＣＡＲベクター中で独立した遺伝子として発現される。
【００７４】
ＮＫ細胞は、サイトカインの支持なしに養子移入後も存続しない。ＮＫ細胞のより短い寿命は有利であり、抗腫瘍活性を可能にする一方で、正常組織に対するオンターゲット／オフ腫瘍毒性によって引き起こされる長期の血球減少症のような長期の有害事象の確率を低下させるが、ＮＫ細胞はまた、それらの効力を制限し得る。インビボでの生存と増殖のためには、ＮＫ細胞は持続的なサイトカイン支持を必要とし、それがなければ循環血中でわずか１〜２週間しか検出できない。養子移入されたＮＫ細胞の存続を支持するために最も一般的に使用される２つのサイトカインは、ＩＬ−２及びＩＬ−１５である。したがって、ＩＬ−２及び／又はＩＬ−１５の遺伝子は、ＣＡＲ−ＮＫ細胞のＣＡＲ構築物内に組み込まれ得る。これにより、ＣＡＲで形質導入された細胞に常にサイトカインを支持することができる。
【００７５】
インターロイキンを外因的に投与してもよいが、ＩＬ−２又はＩＬ−１５の注入にはかなりの副作用がある。サイトカインの外因性投与に対する別の又は追加のアプローチは、シクロホスファミド及びフルダラビンのようなＮＫ細胞の養子細胞移植の前のリンパ球除去化学療法である。これは、成熟リンパ球（ＩＬ−１５を消費する）を枯渇させ、結果として内因性ＩＬ−１５レベルの顕著な増加をもたらすことによって、ＮＫ細胞増殖の好ましい環境を提供する。標的エピトープの選択、ＣＡＲデザイン、及び適用される投与量及び投与レジメン以外にも、固形腫瘍のＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ細胞療法の成功のために、腫瘍環境における効率的な腫瘍ホーミング及び長期生存が重要である。ほとんどの場合、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ細胞の投与前に対象はリンパ球減少しており、その後のサイトカイン支持の可能性がさらに重要である。
【００７６】
液体腫瘍におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の一般的な副作用は、重度のサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ）を引き起こすサイトカインの豊富な産生である。このリスクは固形腫瘍ではそれほど顕著ではない。理論に拘束されることなく、これは、固形腫瘍と比較して典型的に液体腫瘍においてより高い、異なるエフェクター−標的細胞化学量論によって説明され得る。さらに、このリスクは、一般に、Ｔ細胞、特に慣用的なαβＴ細胞と比較して、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の養子細胞移植では低いと考えられている。
【００７７】
さらに、ほとんどの腫瘍抗原は、特に固形腫瘍において、腫瘍選択性（腫瘍特異的抗原）ではなく、しばしば単に過剰発現（腫瘍関連抗原）である。したがって、腫瘍外毒性のリスクがある。しかしながら、腫瘍外毒性を低減する方法は、当該技術分野で公知である。例えば、腫瘍外毒性は、必要な数の細胞を２、３又はそれ以上の用量で投与することによって制御することができる。また、一過性に操作されたＲＮＡＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ細胞を用いて、腫瘍外毒性を最小限にすることができる。また、腫瘍発生の初期段階で治療を開始する場合、癌細胞数が過剰になる前に治療を開始することは、治療成績に有益であり、腫瘍外毒性を減少させる。
【００７８】
さらに、同一細胞上に発現された２つの腫瘍抗原の認識によって、標的選択性を確保することができる。これは、別々のＣＡＲにおいて、刺激シグナル及び共刺激シグナルを送達するように設計された２つのキメラ受容体、例えば、ＣＤ３ζ鎖シグナル伝達ドメイン及びＣＤ２８共刺激ドメインの結合を介して、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の二重特異的活性化を媒介するタンデムＣＡＲを使用して達成され得、効率的なシグナル伝達のために２つの異なる腫瘍抗原の独立した結合を必要とする。また、阻害性キメラ抗原受容体（ｉＣＡＲ）を使用して、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞、又はＣＡＲ−ＮＫ細胞活性を正常組織から転用することもできる。ｉＣＡＲは、天然抗原（すなわち、正常組織のみに提示される）と結合し、ＰＤ−１又はＣＴＬＡ−４からのような抑制性シグナル伝達ドメインを含み、活性ＣＡＲの活性化を停止する。このように、両アプローチ、タンデムＣＡＲ及びｉＣＡＲは、２つのキメラ抗原受容体の活性を結合する。
【００７９】
ＣＡＲ−Ｔ細胞免疫療法に特に関連するが、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ細胞免疫療法にも関連する１つの問題は、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ細胞を癌細胞に対して非効率にすることができる抗原逃避である。さらに、ＣＡＲ−Ｔ細胞、ＣＡＲ−ＮＫＴ細胞又はＣＡＲ−ＮＫ細胞は、典型的には、繰り返し投与されない。従って、他の腫瘍抗原、好ましくは複数の腫瘍抗原、例えばネオアンチゲンを標的とすることを可能にするフォローアップ療法の必要性がある。
【００８０】
安全上の理由から、ＣＡＲ修飾Ｔ細胞、及びおそらくＮＫＴ及びＮＫ細胞は、誘導性カスパーゼ−９（ｉＣａｓｐ９）又は切断型上皮増殖因子受容体（シグナル伝達ドメインを欠き、トランスジェニック細胞の迅速な除去のために抗ＥＧＦＲ抗体を標的とすることができるＥＧＦＲ）のような自殺系をさらに含むことができる。これは、ＣＡＲ−Ｔ及びＣＡＲ−ＮＫＴ細胞に特に関連している可能性がある。成熟ＣＡＲ−ＮＫ細胞は限定された残存性を有するが、臍帯血又は造血幹細胞由来のＮＫ細胞は、長期毒性に対するより高いリスクを有し、従って、自殺システムも、これらの細胞において利用され得る。
【００８１】
本発明者らは、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株が、固形腫瘍内で発現される複数のネオアンチゲンを標的とすることができるため、フォローアップ療法として特に適していることを見出した。したがって、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又は少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含むＮＫ細胞の養子細胞移植後に投与される。対象が、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞、又は少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含むＮＫ細胞の養子細胞移植の前にリンパ球除去化学療法を受けていない場合、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株を、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞、又は少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含むＮＫ細胞の養子細胞移植後（例えば、数時間又は数日以内）一緒に、又は直後に投与してもよい。
【００８２】
少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞は、典型的には、１つの養子細胞移植において投与され、繰り返し投与されない。しかしながら、必要な数の操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞を、２回又は３回のその後の養子細胞移植において分割投与として投与することができる。従って、治療は、第１の、及び所望により第２の、第３の、可能であれば、２日又はそれ以上の期間内にさらに投与することを含むことができる。養子移入された細胞の残存期間は、最大３ヶ月、最大４ヶ月、又は最大６ヶ月とすることができる。生涯存在する生きた細胞であると主張する研究者もいる。
【００８３】
少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の養子細胞移植の前に、対象は、ＶＥＧＦＲ−２をコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａで処理することができる（例えば、ＷＯ２０１４／００５６８３に開示されている）。一実施形態では、ＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１のアミノ酸配列を含む。このワクチン（ＶＸＭ０１）は、腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の数を増強することが知られている。従って、このワクチンは、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の効力を増強することができる。さらに、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞は、典型的にはオンデマンドで製造されるので、このワクチンは、癌免疫療法を提供し、一方、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞は、調製される。従って、特定の実施形態では、対象は、まず、ＶＥＧＦＲ−２をコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａで処理され、次いで、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体（リンパ球除去化学療法を伴う又は伴わない）を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞、及び５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａの養子細胞移入が行われる。
【００８４】
ある種の実施形態において、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の最初の養子細胞移入後、同時又は約２週間〜４ヵ月、好ましくは２〜３ヵ月で投与される。一方、同時刻とは、数時間又は数日以内、好ましくは同じ日又は１週間以内を意味する。
【００８５】
ある種の実施形態において、対象は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の養子細胞移植の前に、リンパ球除去、特にリンパ球除去化学療法を受けている。本明細書で使用される「リンパ球除去化学療法」という用語は、養子細胞移植の前に対象においてリンパ球減少をもたらす化学療法を指す。また、骨髄非破壊的リンパ球除去化学療法も含まれ、養子細胞移植療法の有効性も改善する可能性がある。リンパ球除去化学療法は、「コンディショニング」とも呼ばれる。リンパ球除去化学療法は当該技術分野で知られており、例えば７日間のシクロホスファミド（ＣＴＸ）又はＣＸＴ及びフルダラビンの使用を含み得る。ＣＴＸは初期の造血骨髄前駆細胞に影響を及ぼさない。
【００８６】
養子細胞移植の前にリンパ球除去化学療法を受けた対象においてネオアンチゲンに対する免疫応答を誘導するためには、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株を投与する前に、リンパ球を補充するか、言い換えれば、対象が免疫能力を回復する必要がある。リンパ球除去化学療法の種類に応じて、リンパ球除去化学療法後約１ヵ月〜２ヵ月でリンパ球が補充される。典型的には、リンパ球はリンパ球除去化学療法後、約２週間から１６週間、４週間から１６週間、２週間から１６週間、又は８週間から１２週間で補充される。好ましくは、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、リンパ球除去化学療法後、より好ましくはリンパ球数がリンパ球除去化学療法後、より好ましくは対象が免疫能を回復した後に、リンパ球数が正常化した後に、対象に投与される。正常なリンパ球数は１０００／ｍｍ３以上である。正常な白血球数は４０００／ｍｍ３以上である。免疫能は、白血球数２０００／ｍｍ３以上に基づいて決定される。
【００８７】
養子細胞移植の前にリンパ球除去を受けた場合、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞の最初の養子細胞移植の後、約２週間から４ヵ月、好ましくは１ヵ月から４ヵ月、好ましくは２ヵ月から４ヵ月、より好ましくは２ヵ月から３ヵ月に投与される。
【００８８】
ネオアンチゲン癌ワクチンとの併用療法
本発明によれば、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株を、さらに、少なくとも１つのチェックポイント阻害剤と同時投与することができる。用語「チェックポイント阻害剤」は、本明細書中で「免疫チェックポイント阻害剤」と同義で使用される。典型的には、チェックポイント療法は抑制性チェックポイントを遮断し、免疫系機能を回復させる。具体的には、少なくとも１つのチェックポイント阻害剤は、抗体、特にＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４、ＩＤＯ、ＧＩＴＲ、ＯＸ４０、ＴＩＭ−３、ＬＡＧ−３、ＫＩＲ、ＣＳＦ１Ｒ及びＣＤ１３７に対する抗体からなる群から選択され得る。チェックポイント阻害剤は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含む少なくとも１つのチフス菌Ｔｙ２１ａ株と同時に、又は別々に投与することができる。
【００８９】
少なくとも１つのチェックポイント阻害剤は、市販製造品の承認されたガレン製剤中で投与されることが好ましい。
【００９０】
本発明の文脈において、用語「同時」は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチド及びチェックポイント阻害剤をコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含む、チフス菌Ｔｙ２１ａの弱毒化株の同日、より具体的には１２時間以内、より具体的には２時間以内の投与を意味する。この文脈で使用される用語「別々に」は、異なる日、より具体的には異なる投与レジメン、及び異なる投与形態での投与を意味する。
【００９１】
少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む、少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞で処理されているかまたは処理される対象における、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株と、少なくとも１つのチェックポイント阻害剤とは、驚くべきことに、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする、比較的低用量のチフス菌Ｔｙ２１ａ株で、Ｔ細胞、ＮＫＴ細胞またはＮＫ細胞応答、及び／又は全生存に相乗効果を示す。低用量の生菌ワクチンの投与は、排出のリスクを最小限に抑え、したがって第三者への伝播のリスクを最小限に抑える。
【００９２】
本発明によれば、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株を受け取る対象は、さらに、少なくとも１つの腫瘍抗原、腫瘍間質抗原及び／又はチェックポイント阻害抗原をコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含む少なくとも１つのチフス菌Ｔｙ２１ａで処理することができる。１つの実施形態において、特に、処置が、対象に投与されるＷＴ１、ＭＳＬＮ、ＣＥＡ、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＰＤ−Ｌ１、ＶＥＧＦＲ−２及びＦＡＰからなる群から選択される抗原をコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含む少なくとも１つのチフス菌Ｔｙ２１ａをさらに含む。ＷＴ１、ＭＳＬＮ、ＣＥＡ、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＰＤ−Ｌ１、ＶＥＧＦＲ−２及びＦＡＰからなる群から選択される抗原をコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含む少なくとも１つのチフス菌Ｔｙ２１ａを、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含む少なくとも１つのチフス菌Ｔｙ２１ａと同時に又は別々に投与することができる。
【００９３】
本発明の文脈において、用語「同時」は、同日、より具体的には１２時間以内、より具体的には２時間以内に、チフス菌Ｔｙ２１ａの異なる弱毒化株を投与することを意味する。チフス菌Ｔｙ２１ａの異なる弱毒化株は、同じ剤型である可能性があるが、必ずしもそうである必要はない。この文脈で使用される用語「別々に」は、異なる日、より具体的には異なる投与レジメン、及び異なる投与形態での投与を意味する。
【００９４】
特定の実施形態では、ヒトＶＥＧＦＲ−２は、配列番号１のアミノ酸配列、又は配列番号１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ヒトウィルムス腫瘍タンパク質（ＷＴ１）は、配列番号３のアミノ酸配列、又は配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ヒトメソテリン（ＭＳＬＮ）は、配列番号４のアミノ酸配列、又は配列番号４のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ヒトＣＥＡは、配列番号５のアミノ酸配列、又は配列番号５のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施態様において、ＣＭＶ  ｐｐ６５は、配列番号６、７若しくは８のアミノ酸配列、又は配列番号６、７若しくは８のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の実施形態では、ヒトＰＤ−Ｌ１は、配列番号９もしくは１０のアミノ酸配列、又は配列番号９、１０もしくは１１のアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【００９５】
好ましくは、ＶＥＧＦＲ−２は配列番号１のアミノ酸配列を有し、ＷＴ１は配列番号３のアミノ酸配列を有し、ＭＳＬＮは配列番号４のアミノ酸配列を有し、ＣＥＡは配列番号５のアミノ酸配列を有し、ＣＭＶ  ｐｐ６５は配列番号６、７又は８のアミノ酸配列を有し、及び／又はＰＤ−Ｌ１は配列番号９、１０又は１１のアミノ酸配列を有する。
【００９６】
ＶＥＧＦＲ−２はキナーゼ挿入ドメイン含有受容体（ＫＤＲ）としても知られており、ＶＥＧＦに対する既知の細胞応答のほとんどすべてを媒介しているようである。例えば、血管新生におけるＶＥＧＦの役割は、このタンパク質とＶＥＧＦＲ−２との相互作用を介しているようである。ＶＥＧＦＲ−２は、ＶＥＧＦに対する１３５６アミノ酸の長さ２００〜２３０ｋＤａの分子量の高親和性受容体であり、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄに対する受容体であり、チロシンキナーゼ受容体に対する内皮ｃＤＮＡのスクリーニングによってヒトで同定されたものであり、以前に発見されたマウス胎児肝キナーゼ１（Ｆｌｋ−１）と８５％の配列同一性を有する。ＶＥＧＦＲ−２は通常、内皮細胞、造血前駆細胞、ならびに内皮細胞、新生造血幹細胞及び臍帯間質において発現される。しかし、静止期の成人血管系では、ＶＥＧＦＲ−２  ｍＲＮＡはダウンレギュレートされているようである。
【００９７】
ＶＥＧＦＲ−２の細胞外ドメインには、１８の潜在的なＮ結合型グリコシル化部位がある。ＶＥＧＦＲ−２は、最初は１５０ｋＤａのタンパク質として合成され、２００ｋＤａの中間体に急速にグリコシル化され、次いでより遅い速度でさらにグリコシル化されて、細胞表面に発現される成熟２３０ｋＤａのタンパク質となる。
【００９８】
メソテリンは、正常な中皮細胞上に存在する４０ｋＤａの細胞表面糖タンパク質であり、中皮腫、卵巣及び膵腺癌を含むいくつかのヒト腫瘍において過剰発現される。メソテリン遺伝子は、７１ｋＤａの前駆体タンパク質をコードし、プロセシングを受けて、巨核球増強因子（ＭＰＦ）と名付けられた３１ｋＤａの小型タンパク質と、４０ｋＤａの細胞結合断片メソテリンとを生じる。メソテリンは、インターロイキン−３の存在下で巨核球コロニー形成活性を示すことが示された。メソセリンは、中皮などの制限された正常成人組織上に低レベルで存在するが、中皮腫、卵巣及び膵臓癌、子宮頸部、頭頸部、外陰部、肺及び食道の扁平上皮癌、肺腺癌、子宮内膜癌、二相性滑膜肉腫、線維形成性小円形細胞腫瘍及び胃腺癌などの広範なヒト腫瘍において異常に過剰発現される腫瘍分化抗原である。メソテリンの正常な生物学的機能は不明である。メソテリンノックアウトマウスを用いた試験では、検出可能な表現型は認められず、雌雄ともに健康な子孫が産生された。膵癌の研究から、メソテリンは、細胞増殖、遊走、及びＳ期細胞集団を増加させることにより、腫瘍形成に役割を果たすことが示唆されている。さらに、メソテリンが免疫原性タンパク質であるという証拠がある。その発現プロファイル、発癌機能及び免疫原性のため、腫瘍抗原メソテリンは癌ワクチン開発の有望な候補である。
【００９９】
ウィルムス腫瘍遺伝子１（ＷＴ１）は、細胞増殖及び分化に関与するジンクフィンガー転写因子をコードする。ＷＴ１タンパク質は、Ｃ末端に４つのジンクフィンガーモチーフ、Ｎ末端にプロリン／グルタミンに富むＤＮＡ結合ドメインを含む。２つのコードエキソンにおける選択的スプライシングの結果として生じる複数の転写変異体は、十分に特徴づけられている。ＷＴ１は、泌尿生殖器系の発達において不可欠な役割を果たし、細胞増殖及び分化に関与する。ＷＴ１遺伝子は、小児腎新生物であるウィルムス腫瘍の原因となる遺伝子として単離された。これは、いくつかのタイプの血液悪性腫瘍及び種々の固形腫瘍を含む、広範囲の悪性腫瘍において高度に発現される。対照的に、成人におけるＷＴ１の正常組織発現は、様々なタイプの組織における生殖腺、子宮、腎臓、中皮及び前駆細胞に限定される。ＷＴ−１は分化に負の影響を与え、前駆細胞の増殖を促進する。さらに、過剰発現されたＷＴ１は免疫原性であり、癌患者において、ＷＴ１特異的Ｔ細胞及びＩｇＧ抗ＷＴ１抗体が観察されている。その発現プロファイル、その発癌機能及びその免疫原性のために、腫瘍抗原ＷＴ１は癌ワクチン開発の有望な候補である。特定の実施形態では、ＷＴ１は切断される。特定の態様において、ＷＴ１のジンクフィンガードメインは、欠失される。特定の実施形態では、切断されたＷＴ１は、配列番号３に見られるアミノ酸配列を有する。
【０１００】
ＷＴ１のＣ末端におけるジンクフィンガードメインは、４つのジンクフィンガーモチーフを含む。配列番号３に見られるアミノ酸配列の切断されたＷＴ１は、ＵｎｉＰｒｏｔｒｅｆ  Ｐ１９５４４−７のアミノ酸１〜３７１を表す。ジンクフィンガードメインの欠失は、転写因子を含む他のジンクフィンガーとの免疫学的交差反応性のリスクを最小限にする。さらに、ジンクフィンガードメインを欠損する切断型ＷＴ１は、完全長ＷＴ１よりも免疫原性が高い。さらに、ＤＮＡ結合に不可欠なジンクフィンガーモチーフを欠失させると、ＷＴ１の発癌能が失われ、発癌リスクが最小限に抑えられる。
【０１０１】
外皮タンパク質ＣＭＶ  ｐｐ６５は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の主要な免疫優性タンパク質である。ＣＭＶ  ｐｐ６５の生物学的機能は不明であるが、細胞周期の調節に関与していると考えられている。ＣＭＶ  ｐｐ６５は、ｐｏｌｏ様キナーゼ１（ＰＬＫ−１）に結合することができるプロテインキナーゼ活性を示す核親和性タンパク質である。ＨＣＭＶ  ｐｐ６５は、神経膠芽腫標本の９０％以上で発現するが、周囲の正常脳では発現しない。このように、このウイルスタンパク質は、癌免疫療法の新規開発のための腫瘍特異的標的として有望な候補である。
【０１０２】
ＣＭＶ  ｐｐ６５タンパク質は、アミノ酸４１５〜４３８に２つの二分核局在化シグナル（ＮＬＳ）と、カルボキシ末端近傍のアミノ酸５３７〜５６１と、リジン４３６におけるそのキナーゼ活性に関連するリン酸結合部位を含む。４３６位のリジンをアスパラギンに突然変異させ、５３７〜５６１位のアミノ酸を欠失させると、キナーゼ活性のないタンパク質が生じ、核局在が著しく低下する。この突然変異タンパク質は、変化しない免疫原性を示す。
【０１０３】
特定の実施形態では、ＣＭＶ  ｐｐ６５は、配列番号６に見られるアミノ酸配列を有する。配列番号６は、野生型ＣＭＶｐｐ６５のアミノ酸配列を表す。特定の他の実施態様において、ＣＭＶ  ｐｐ６５は、配列番号７に見られるアミノ酸配列を有する。配列番号７は、配列番号６の野生型ヒトＣＭＶ  ｐｐ６５に対して突然変異Ｋ４３６Ｎを有するＣＭＶ  ｐｐ６５のアミノ酸配列を表す。特定の他の実施態様において、ＣＭＶ  ｐｐ６５は、配列番号８に見られるアミノ酸配列を有する。配列番号８は、第２のよりＣ末端のＮＬＳ（核局在配列）（すなわち、配列番号７のＣＭＶｐ６５のアミノ酸５３７〜５６１）を欠く、配列番号７のＣＭＶｐｐ６５の切断されたバージョンのアミノ酸配列を表す。
【０１０４】
癌胎児性抗原（ＣＥＡＣＡＭ５及びＣＤ６６ｅとしても知られる）は、細胞接着に関与する高度に関連したグリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）細胞表面アンカー糖タンパク質のファミリーのメンバーである。ＣＥＡは通常、胎児の発達中に消化管組織で産生され、タンパク質の発現は出生前に終了する。したがって、ＣＥＡは通常、健康な成人の血中濃度が非常に低い場合にのみ存在する。しかし、一部の癌、特に大腸癌では血清濃度が上昇するため、腫瘍マーカーとなる。ＣＥＡ値は、胃癌、膵癌、肺癌、乳癌、甲状腺髄様癌、及び潰瘍性大腸炎、膵炎、肝硬変、ＣＯＰＤ、クローン病、甲状腺機能低下症などの非腫瘍性疾患でも上昇する。
【０１０５】
プログラムされた細胞死１（ＰＤ−１）は、Ｔ細胞の表面に発現され、同族抗原に対するＴ細胞の機能的サイレンスを維持する阻害シグナルを伝達する。そのリガンドＰＤ−Ｌ１は、正常では、炎症微小環境において、抗原提示細胞、胎盤細胞、及び非造血細胞上に発現される。ＰＤ−Ｌ１は免疫抑制性骨髄由来抑制細胞（ＭＤＳＣ）に発現することが報告されている。さらに、ＰＤ−Ｌ１は、宿主免疫系を逃れるためにＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１シグナル伝達軸を使用する種々のタイプの癌細胞の表面に広く発現される。癌細胞によるＰＤ−Ｌ１の発現は、疾患の病期及び患者の予後不良と相関することが示された。
【０１０６】
特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、完全長ＰＤＬ１及びＰＤ−Ｌ１の細胞外ドメインを含む切断ＰＤ−Ｌ１からなる群から選択される。切断型ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１１のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列、配列番号１１のアミノ酸配列、配列番号１０のアミノ酸配列、又は配列番号１１のアミノ酸１９〜２３８と少なくとも８０％の配列同一性を共有する、配列番号１１のアミノ酸配列、又は配列番号１０と少なくとも８０％の配列同一性を共有するアミノ酸配列を含み得る。特定の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号９に見られるアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、及びそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するタンパク質からなる群から選択される。特定の他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１０に見られるアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、及びそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するタンパク質からなる群から選択される。特定の他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１１に見出されるアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、及びそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するタンパク質からなる群から選択される。特定の他の実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号１１のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を有するＰＤ−Ｌ１、及びそれと少なくとも８０％の配列同一性を共有するタンパク質からなる群から選択される。特に、ＰＤ−Ｌ１は、配列番号９、配列番号１０又は配列番号１１に見られるアミノ酸配列を有し、好ましくはＰＤ−Ｌ１は、配列番号１１のアミノ酸１９〜２３８のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、ＰＤ−Ｌ１は、シグナル伝達ペプチドを伴う又は伴わない少なくとも細胞外ドメインを含む。
【０１０７】
本明細書中で使用される場合、用語「約」又は「約」は、所与の値又は範囲の９５％〜１０５％を含む、８０％〜１２０％、代替的に９０％〜１１０％を意味する。
【０１０８】
本発明の文脈において、「配列番号Ｘのアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を共有するタンパク質」という用語は、提供されるアミノ酸配列と整列させた場合に、８０％を超えるアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質を指す。タンパク質は、例えば、野生型タンパク質の突然変異体、例えば、野生型ＶＥＧＦＲ−２タンパク質の突然変異体、又は異なる種のホモログ、又は操作されたタンパク質、例えば、操作されたＶＥＧＦＲ−２タンパク質であり得る。所与のタンパク質の誘導体を設計及び構築する方法は、当業者に周知である。
【０１０９】
所定のアミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を共有するタンパク質は、参照アミノ酸配列と比較して、１つ以上のアミノ酸の付加、欠失及び／又は置換を含む１つ以上の突然変異を含み得る。本発明の教示によれば、前記欠失、付加及び／又は置換されたアミノ酸は、連続したアミノ酸であってもよく、又は所与の参照タンパク質と少なくとも約８０％の配列同一性を共有するタンパク質のアミノ酸配列の長さにわたって散在されてもよい。本発明の教示によれば、参照アミノ酸配列とのアミノ酸配列同一性が少なくとも約８０％であり、突然変異タンパク質が免疫原性である限り、任意の数のアミノ酸を付加、欠失、及び／又は置換することができる。好ましくは、参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を共有するタンパク質の免疫原性は、ＥＬＩＳＡにより測定すると、参照アミノ酸配列と比較して、５０％未満、４０％未満、３０％未満、２０％未満、１０％未満、５％未満、又は１％未満減少する。タンパク質相同体を設計及び構築し、その免疫原性についてそのような相同体を試験する方法は、当業者に周知である。特定の実施形態において、参照アミノ酸との配列同一性は、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、最も特に少なくとも約９９％である。親タンパク質及び親配列に対する欠失、付加及び／又は置換を有する親タンパク質及びその誘導体の比較を含む配列同一性を決定するための方法及びアルゴリズムは、当業者に周知である。ＤＮＡレベルでは、参照アミノ酸配列と少なくとも約８０％の配列同一性を共有するタンパク質をコードする核酸配列は、遺伝暗号の縮重のために、より大きく異なる場合がある。
【０１１０】
特定の実施形態では、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株の投与は、ＷＴ１、ＭＳＬＮ、ＣＥＡ、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＰＤ−Ｌ１、ＶＥＧＦＲ−２及びＦＡＰから選択される腫瘍抗原又は腫瘍間質抗原をコードするサルモネラ菌の弱毒化株、ならびに１つのチェックポイント阻害剤の投与と組み合わされる。
【０１１１】
特別な態様において、治療は、化学療法又は放射線療法を伴ってもよい。癌の治癒には、癌幹細胞を完全に根絶することが不可欠です。したがって、最大の効果を得るためには、異なる治療アプローチを組み合わせることが有益である。
【０１１２】
本発明のチフス菌Ｔｙ２１ａ株と組み合わせて使用することができる化学療法剤は、例えば、アミホスチン（ｅｔｈｙｏｌ）、カバジタキセル、シスプラチン、ダカルバジン（ＤＴＩＣ）、ダクチノマイシン、ドセタキセル、メクロールエサミン、ストレプトゾシン、シクロホスファミド、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、ドキソルビシン（ａｄｒｉａｍｙｃｉｎ）、ドキソルビシン脂肪（ｄｏｘｉｌ）、フォリン酸、ゲムシタビン（ｇｅｍｚａｒ）、ダウノルビシン、ダウノルビシン脂肪（ｄａｕｎｏｘｏｍｅ）、プロカルバジン、ケトコナゾール、マイトマイシン、シタラビン、エトポシド、メトトレキサート、５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ブレオマイシン、パクリタキセル（ｔａｘｏｌ）、ドセタキセル（ｔａｘｏｔｅｒｅ）、アルデスロイキン、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、クラドリビン、カンプトテシン、ＣＰＴ−１１、１０−ヒドロキシ−７−エチルカンプトテシン（ＳＮ３８）、ダカルバジン、フロクシウリジン、フルダラビン、ヒドロキシウレア、イホスファミド、イダルビシン、メスナ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、ミトキサントロン、トポテカン、ロイプロリド、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、オキサリプラチン、プリカマイシン、ミトタン、ペガスパルガーゼ、ペントスタチン、ピポブロマン、プリカマイシン、ストレプトゾシン、タモキシフェン、テニポシド、テストラクトン、チオグアニン、チオテパ、ウラシルマスタード、ビノレルビン、クロラムブシル及びその組み合わせが挙げられる。
【０１１３】
本発明による最も好ましい化学療法剤は、カバジタキセル、カルボプラチン、オキサリプラチン、シスプラチン、シクロホスファミド、ドセタキセル、ゲムシタビン、ドキソルビシン、パクリタキセル（taxol）、イリノテカン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、フォリン酸、５−フルオロウラシル及びブレオマイシンであり、特にゲムシタビンである。
【０１１４】
特に、チフス菌Ｔｙ２１ａ株は、化学療法又は放射線療法の前又は間に投与される。他の特定の実施形態では、チフス菌Ｔｙ２１ａ株は、化学療法又は放射線療法治療の前及びその間に投与される。
【０１１５】
チフス菌Ｔｙ２１ａ
サルモネラ菌株、特にサルモネラ・エンテリカ（Salmonella enterica）菌種の弱毒化株は、非経口投与と比較して簡便性と安全性の利点を提供する粘膜の免疫経路、すなわち経口又は鼻腔を介してＳ．エンテリカ菌株を送達できる可能性があるため、哺乳類免疫系への異種抗原の送達のための魅力的な媒体である。さらに、サルモネラ菌株は、全身及び粘膜コンパートメントの両方のレベルで強い体液性及び細胞性免疫応答を誘発する。バッチ調製コストは低く、生菌ワクチンの製剤は非常に安定している。弱毒化は、毒性遺伝子、調節遺伝子、及び代謝遺伝子を含む種々の遺伝子の欠失によって達成することができる。
【０１１６】
ａｒｏ突然変異により弱毒化されたいくつかのネズミチフス菌株は、動物モデルにおいて異種抗原に対する安全で効果的な送達媒体であることが示されている。
【０１１７】
本発明によれば、サルモネラ菌の弱毒化株は、チフス菌Ｔｙ２１ａとも呼ばれるサルモネラ・エンテリカ血清型チフス株Ｔｙ２１ａである。生きた弱毒化チフス菌Ｔｙ２１ａは、Ｖｉｖｏｔｉｆ（登録商標）（Ｂｅｒｎａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  Ｌｔｄ．，ａ  Ｃｒｕｃｅｌｌ  Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄにより製造される）としても知られるＴｙｐｈｏｒａｌ  Ｌ（登録商標）の活性成分である。これは現在、腸チフスに対する唯一の認可された経口生ワクチンである。このワクチンは広範に試験されており、患者の毒性及び第三者への伝播に関して安全であることが証明されている（Ｗａｈｄａｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｊ．Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ  Ｄｉｓｅａｓｅｓ  １９８２，１４５：２９２−２９５）。このワクチンは４０カ国以上で認可されており、数千人の小児を含む何百万人もの個人に腸チフスの予防接種に使用されている。それは、他に類を見ない安全実績を有しています。チフス菌Ｔｙ２１ａが全身的に血流に入ることを示すデータは入手できない。このように、弱毒化チフス菌Ｔｙ２１ａ生ワクチン株は、安全で忍容性が良好である一方で、腸内の免疫系を特異的に標的化することを可能にする。Ｔｙｐｈｏｒａｌ  Ｌ（登録商標）の販売承認番号は、１９９６年１２月１６日付ＰＬ１５７４７／０００１である。ワクチンの１回量は、少なくとも２×１０９の生存チフス菌Ｔｙ２１ａコロニー形成単位及び少なくとも５×１０９の生存できないチフス菌Ｔｙ２１ａ細胞を含む。
【０１１８】
この耐容性の高い腸チフスに対する経口生ワクチンは、野生型の病原性細菌分離株チフス菌Ｔｙ２の化学的突然変異誘発によって得られ、ｇａｌＥ遺伝子に機能欠損突然変異を有し、その結果ガラクトースを代謝することができない。弱毒化細菌株はまた、硫酸塩を硫化物に還元することができず、この硫化物は野生型チフス菌Ｔｙ２株と区別される。血清学的特徴に関して、チフス菌Ｔｙ２１ａ株は細菌の外膜の多糖であり、ネズミチフス菌の特徴的な成分であるＯ５抗原を欠いているＯ９抗原を含む。この血清学的特性は、バッチ出荷時の確認試験のパネルにそれぞれの試験を含める根拠を裏付けるものである。
【０１１９】
本発明によるチフス菌Ｔｙ２１ａ株で使用される発現カセットは、真核生物発現カセットであり、特にＣＭＶプロモーターを含む。本発明の文脈において、用語「真核生物発現カセット」は、真核生物細胞におけるオープンリーディングフレームの発現を可能にする発現カセットを指す。適切な免疫応答を誘導するのに必要な異種抗原の量は、細菌に対して毒性であり得、異種抗原の細胞死、過剰減衰又は発現の喪失をもたらすことが示されている。細菌ベクターでは発現しないが、標的細胞でのみ発現する真核生物発現カセットを使用することにより、この毒性問題を克服することができ、発現されるタンパク質は、典型的には、真核生物のグリコシル化パターンを示す。
【０１２０】
真核性発現カセットは、真核細胞でオープンリーディングフレームの発現を制御できる調節配列、好ましくはプロモーター及びポリアデニル化シグナルを含む。本発明のチフス菌Ｔｙ２１ａ株によって構成される真核生物発現カセットに含まれるプロモーター及びポリアデニル化シグナルは、好ましくは、免疫化される対象の細胞内で機能的であるように選択される。好適なプロモーターの例としては、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からのプロモーター、例えば、強力なＣＭＶ前初期プロモーター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、例えばＨＩＶロングターミナルリピート（ＬＴＲ）プロモーター、モロニーウイルス、エプスタインバーウイルス（ＥＢＶ）、及びロウスサルコマウイルス（ＲＳＶ）、ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、プロモーター、ニワトリβ−アクチン遺伝子の第一エキソン及び第一イントロン、ならびにウサギβ−アクチン遺伝子のスプライス受容体からなる合成ＣＡＧプロモーター、ならびにヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチン、及びヒトメタロチオネインからのプロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態において、真核生物発現カセットは、ＣＭＶプロモーターを含む。本発明の文脈において、「ＣＭＶプロモーター」という用語は、強力な即初期サイトメガロウイルスプロモーターを指す。
【０１２１】
具体的にはヒトのためのＤＮＡワクチンの製造のための、好適なポリアデニル化シグナルに関する例としては、これだけに限定されるものではないが、ウシ増殖ホルモン（ＢＧＨ）ポリアデニル化部位、ＳＶ４０ポリアデニル化シグナル、及びＬＴＲポリアデニル化シグナルが挙げられる。具体的な態様によれば、本発明のサルモネラ弱毒化変異株によって含まれる組換ＤＮＡ分子に含まれている真核性発現カセットには、ＢＧＨポリアデニル化部位が含まれる。
【０１２２】
プロモーターやポリアデニル化シグナルのようなＶＥＧＦ受容体タンパク質の発現に必要な調節エレメントに加えて、他の要素もまた組換ＤＮＡ分子に含まれている。そういった追加要素としては、エンハンサーが挙げられる。例えば、エンハンサーは、ヒトアクチン、ヒトミオシン、ヒトヘモグロビン、ヒト筋クレアチンのエンハンサー、及びウイルス性エンハンサー、例えばＣＭＶ、ＲＳＶ及びＥＢＶ等である
【０１２３】
調節配列及びコドンは、一般に種に依存するので、タンパク質産生を最大にするために、調節配列及びコドンは、好ましくは、免疫される種において有効であるように選択される。当業者は、所定の対象種、例えばヒト対象において機能性である組換えＤＮＡ分子を製造することができる。
【０１２４】
特定の実施形態では、少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子又はＤＮＡ分子は、カナマイシン抗生物質耐性遺伝子などの抗生物質耐性遺伝子、ｐＭＢ１  ｏｒｉ又はｐＵＣなどのｏｒｉ、及びＣＭＶプロモーターなどの強力なプロモーターを含む。特定の実施形態では、組換えＤＮＡ分子又は少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子は、市販のｐＶＡＸ１（商標）発現プラスミド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ  Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）に基づく又はそれに由来するプラスミドなどのプラスミドである。
【０１２５】
この発現ベクターは、高コピーｐＵＣ複製起点をｐＢＲ３２２の低コピーｐＭＢ１複製起点に置き換えることによって改変することができる。低コピー修飾は、代謝負荷を低減し、構築物をより安定にするために行われた。生成した発現ベクター骨格をｐＶＡＸ１０と命名した。
【０１２６】
特定の実施形態では、発現プラスミドは、配列番号２（ベクター骨格ｐＶＡＸ１０）のＤＮＡ分子を含み、これは、制限部位ＮｈｅＩ及びＸｈｏＩの間に位置する多重クローニング部位の一部を伴わない発現ベクターｐＶＡＸ１０の配列と相関する。
【０１２７】
特定の実施形態では、チフス菌Ｔｙ２１ａ株を経口投与する。経口投与は、非経口投与よりも簡単で、安全で、快適である。しかしながら、本発明のチフス菌Ｔｙ２１株は、任意の他の適切な経路によって投与することもできることに留意しなければならない。好ましくは、治療的に有効な用量が対象に投与され、この用量は、特定の適用、悪性腫瘍のタイプ、対象の体重、年齢、性別及び健康状態、投与方法及び製剤などに依存する。必要に応じて、投与は単回又は複数回であってもよい。
【０１２８】
５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、溶液、懸濁液、凍結乾燥物、腸溶被覆カプセル、又は任意の他の適当な形態で提供することができる。典型的には、チフス菌Ｔｙ２１ａ株は飲料溶液として処方される。この実施形態は、改善された患者コンプライアンスの利点を提供する。好ましくは、飲料溶液は、胃酸を少なくともある程度中和する手段、すなわち、胃液のｐＨを７のｐＨに近づける手段を含む。好ましくは、飲料溶液は、本発明によるチフス菌Ｔｙ２１ａ株を含む緩衝懸濁液である。特定の実施形態において、緩衝懸濁液は、チフス菌Ｔｙ２１ａ株を、好ましくは２．６ｇの炭酸水素ナトリウム、１．７ｇのＬ−アスコルビン酸、０．２ｇの乳糖一水和物、及び１００ｍｌの飲料水を含有する、適切な緩衝液中に懸濁することによって得られる。
【０１２９】
特定の実施形態では、チフス菌Ｔｙ２１ａ株の単回用量は、約１０６〜約１０１０、より具体的には約１０６〜約１０９、より具体的には約１０７〜約１０９、より具体的には約１０６〜約１０８、最も具体的には約１０６〜約１０６のコロニー形成単位を含む。
【０１３０】
より詳細には、チフス菌Ｔｙ２１ａ株の単回用量は、約１×１０６〜約１×１０１０、より詳細には約１×１０６〜約１×１０９、より詳細には約１×１０７〜約１×１０９、より詳細には約１×１０６〜約１×１０８、特に約１×１０６〜約１×１０６のコロニー形成単位を含む。
【０１３１】
さらに、本発明のチフス菌Ｔｙ２１ａ株は、好ましくは第１週に２〜４回、好ましくは第１週に４回投与し、続いて、２〜４週間ごと、特に第１日及び第７日に、好ましくは第１日、第３日、第５日及び第７日に単回用量を追加投与し、続いて２〜４週間ごとに単回用量を追加投与する。
【０１３２】
この文脈において、用語「約」又は「ほぼ」は、３の係数内、又は所与の値又は範囲の１．５の係数内を含む２の係数内を意味する。
【０１３３】
特別な態様において、処置は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチド又は本発明による医薬組成物をコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株の単一又は複数の投与を含む。投与の単回用量は、本明細書に開示されている範囲内で、同じであっても、異なっていてもよく、好ましくは本明細書に開示される範囲内である。特に、治療は、治療の最初の週に２〜４回の初回ワクチン接種を含み、続いて、５つ以上のネオアンチゲン又は本発明の医薬組成物を含む少なくとも１つのポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株を２〜４週間ごとに単回追加投与することを含み、好ましくは、複数回投与は３〜６ヵ月間連続して行われる。
【０１３４】
可能性のある副作用の発生によっては、抗生物質又は抗炎症薬での処置を含めることも好ましい。
【０１３５】
ヒスタミン、ロイコトリエン又はサイトカインによって媒介される過敏反応に類似する有害事象が生じる場合には、発熱、過敏症、血圧不安定、気管支痙攣、及び呼吸困難のための処置の選択肢が利用可能である。望ましくないＴ細胞由来自動攻撃性における処置の選択肢は、幹細胞移植後に適用される急性及び慢性の移植片対宿主疾患に対する標準的療法スキームに由来する。シクロスポリン及びグルココルチコイドが、処置の選択肢として提案される。
【０１３６】
全身性チフス菌Ｔｙ２１ａ型感染の可能性が低い症例では、シプロフロキサシン又はオフロキサシンを含むフルオロキノロン系薬剤による適切な抗生物質療法が推奨される。消化管の細菌感染症は、リファキシミンなどの各薬剤で治療する。
【０１３７】
医薬組成物
さらなる態様において、本発明は、５つ以上のネオアンチゲンを含む少なくとも１つのポリペプチドをコードする少なくとも１つの真核生物発現カセットを含むＤＮＡ分子を含むチフス菌Ｔｙ２１ａ株を含む医薬組成物に関する。
【０１３８】
本発明の医薬組成物は、溶液、懸濁液、腸溶被覆カプセル、凍結乾燥粉末、又は意図された用途に適した任意の他の形態であってもよい。本発明の医薬組成物は、１つ以上の薬学的に許容される賦形剤をさらに含むことができる。
【０１３９】
本発明の文脈において、用語「賦形剤」は、薬剤の活性成分と共に製剤化された天然又は合成物質を指す。適切な賦形剤には、抗付着剤、結合剤、コーティング、崩壊剤、フレーバー、着色剤、潤滑剤、グリダント、吸着剤、保存剤及び甘味料が含まれる。
【０１４０】
本発明の文脈において、用語「薬学的に許容される」は、生理学的に許容可能であり、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に典型的に好ましくない反応を生じない医薬組成物の分子実体及び他の成分を指す。用語「薬学的に許容される」はまた、哺乳動物、より詳細にはヒトにおける使用のために、連邦又は州政府の規制機関により承認されるか、又は米国薬局方又はその他一般に認知されている薬局方に記載されていることを意味し得る。
【０１４１】
特に、適当な飲料溶液は、胃酸を少なくともある程度中和する手段、すなわち、胃液のｐＨを７のｐＨに近づける手段を含む。特定の実施形態では、飲料溶液は、本発明のチフス菌Ｔｙ２１ａ株を、好ましくは胃酸を少なくともある程度、好ましくは炭酸水素ナトリウム２．６ｇ、Ｌ−アスコルビン酸１．７ｇ、ラクトース一水和物０．２ｇ、及び１００ｍｌの飲料水を含有する緩衝液中で、適当な緩衝液中に、好ましくは緩衝液中に懸濁することによって得られる緩衝懸濁液である。
【０１４２】
特定の態様において、医薬組成物は、医薬として、特に本発明による対象における固形腫瘍の治療に使用するために使用される。特定の実施形態では、医薬組成物は、薬剤としての使用、特に対象における固形腫瘍の治療に使用するためであり、対象は、少なくとも１つの腫瘍抗原結合細胞表面受容体を含む少なくとも１つの操作されたＴ細胞、ＮＫＴ細胞又はＮＫ細胞、又は本明細書中に開示されたいずれかの他の使用又は方法で処理されているか、又は処理される。
【実施例】
【０１４３】
実施例１：複数の抗原を含むポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株を用いて免疫応答を誘導するための概念の証明
複数の抗原を含むポリペプチドをコードするチフス菌Ｔｙ２１ａ株の作製
９つの優性ＣＤ８エピトープ（ＶＥＧＦＲ−２の２つのエピトープ（ＫＤＲ２、ＫＤＲ３と呼ばれる）、ＭＳＬＮの２つのエピトープ（ＭＳＬＮ ＧＳＬ、ＭＳＬＮ ＩＱＬと呼ばれる）、ＷＴ−１の１つのエピトープ、ＣＥＡの３つのエピトープ（ＣＥＡ−ＣＳＡ、ＣＥＡ ＣＳＶ、ＣＥＡ ＬＴＬと呼ばれる）及びＯＶＡの１つのエピトープを含む構築物をクローニングした。エピトープは、文献に基づいて、又は予測される結合特性に基づいて、モデル抗原として選択された。概念の証明のために選択されたモデルエピトープは、突然変異又はネオアンチゲンではなく、メソテリン（ＭＳＬＮ）、ウィルムス腫瘍１（ＷＴ−１）、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、腫瘍間質抗原（ＶＥＧＦＲ−２）又は卵白アルブミン（ＯＶＡ）のような既知の腫瘍関連抗原からの優性ＣＤ８エピトープであることに注意することが重要である。
【０１４４】
ワクチン接種後の複数の抗原に対するＴ細胞応答の評価
この初回動物実験では、Ｃ５７ＢＬ／６マウスにＶＸＭＮｅｏ１ｍ又はＶＸＭ空ベクターワクチンを１０１０ＣＦＵ／投与で１週間以内に２回（ｑ７ｄｘ２）経口投与した（経口）。陽性対照として、一群のマウスに、ウィルムス腫瘍（ＷＴ１）全タンパク質をコードするＶＸＭ０６ｍをプライムワクチン接種（ｑ７ｄｘ２）した。陰性対照群にはＶＸＭＮｅｏ１ｍベクターワクチン（１０１０ＣＦＵ／投与、ｑ７ｄｘ２）と同じスケジュール及び投与量の空ベクター。をｐ．ｏ投与した。試験第１７日、すなわち最後のワクチン接種の１０日後に、マウスを安楽死させ、脾臓をフローサイトメトリー（ＦＣ）による五量体分析のために除去した。
【０１４５】
【表２】
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【０１４６】
被験物質を強制経口投与管を介して強制経口投与した。動物群に関係なく、胃酸を中和するために、各動物に事前投与用緩衝液を強制経口投与した（１００μＬ／動物／投与）。この緩衝液は、炭酸水素ナトリウム２．６ｇ、Ｌ−アスコルビン酸１．７ｇ、乳糖一水和物０．２ｇを１００ｍＬの飲料水に溶解し、被験物質を塗布する３０分以内に塗布したものである。申請日に新たに申請書類を作成した。
【０１４７】
エピトープ特異的ＣＤ８  Ｔ細胞を、一組の特異的五量体を用いて、最後のワクチン接種から１０日後に採取した脾細胞上のフローサイトメトリーにより分析した。関連性のない五量体、すなわち、ＨＰＶ１６  Ｅ７  ４９−５７を用いてバックグラウンド閾値を設定した。
【０１４８】
９つの同一ペプチド五量体フローサイトメトリー試薬及び追加のＨＰＶ試薬を陰性対照として用いて測定したＣＤ８  Ｔ細胞応答の結果を図１に示す。
【０１４９】
実施例２：医薬品の安定性試験
最終医薬品は、同一の製剤及び容器／施栓系における同一のチフス菌Ｔｙ２１ａ送達プラットフォームに基づいて、３種類の異なる標的抗原をコードする３種類の構築物から製造された。充填容量１．３ｍＬ／バイアルの１０４、１０５、１０６、１０７ＣＦＵ／ｍＬの強度を製造した。バイアルを７０℃以下で安定化させた。異なる安定性評価時点において、同一性、含量、力価、ｐＨ、微生物学的純度について、あらかじめ定めた安定性試験プロトコールに従って試験を行った。あらかじめ定義された規格をすべての時点で満たし、クローン化した挿入物に関係なく７０℃以下で保存した場合、３年間にわたりＶａｘｉｍｍのプラットフォーム構築物の安定性を確認する３つの構築物すべてからの試料を得た。生菌数試験の結果を図２に示す。
【０１５０】
配列表
配列番号１      ヒトＶＥＧＦＲ−２のアミノ酸配列
配列番号２      制限部位ＮｈｅＩとＸｈｏＩの間に位置する多重クローニング部位を伴わない発現ベクターｐＶＡＸ１０のヌクレオチド配列
配列番号３      切断型（ジンクフィンガードメイン欠失）ヒトＷＴ１のアミノ酸配列
配列番号４      ヒトＭＳＬＮのアミノ酸配列
配列番号５      ヒトＣＥＡのアミノ酸配列
配列番号６      野生型ＣＭＶｐｐ６５のアミノ酸配列
配列番号７      突然変異Ｋ４３６Ｎを有するＣＭＶ  ｐｐ６５のアミノ酸配列
配列番号８      突然変異Ｋ４３６Ｎを有し、Ｃ末端ＮＬＳ（配列番号７のａａ５３７−５６１）を欠く切断型ＣＭＶ  ｐｐ６５のアミノ酸配列
配列番号９      ヒト全長ヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号１０    シグナルペプチドを欠損するヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列
配列番号１１    細胞外ドメイン及びシグナル伝達ペプチドを含む切断されたヒトＰＤ−Ｌ１のアミノ酸配列
【図１Ａ−Ｂ】
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【図１Ｃ】
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【図２】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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