(57)【要約】本発明は、治療を必要とする対象においてパーキンソン病(PD)を治療するためにフォルスコリンを使用できるという発見に関する。特定の態様において、本発明は、PDを治療する方法を提供し、ここで、フォルスコリンの治療的有効量が、鼻腔内経路または肺内経路によって対象に投与される。他の態様において、ヌーペプトの治療的有効量が、対象にさらに投与される。さらに別の態様において、本方法は、PDに起因する対象の脳への損傷を改善し、新しい神経細胞の成長を促進する。2021532070.tif 000008
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
治療を必要とする対象において少なくとも1種の神経変性疾患または障害を治療する方法であって、
少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、異性体、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量を、対象に投与する段階を含み、
該少なくとも1種のフォルスコリン類似体が、
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、およびその任意の脱酸素誘導体からなる群より選択される、
方法。
【請求項２】
少なくとも1種の神経変性疾患または障害が、パーキンソン病(PD)、レビー小体認知症(LBD)、アルツハイマー病、および前頭側頭型認知症からなる群より選択される、請求項1記載の方法。
【請求項３】
少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、対象に鼻腔内投与される、請求項1記載の方法。
【請求項４】
少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、1日に少なくとも1回、2日ごとに少なくとも1回、3日ごとに少なくとも1回、1週間に少なくとも1回、またはその間の任意の頻度および間隔で、対象に投与される、請求項1記載の方法。
【請求項５】
少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、1日に少なくとも1回、対象の各鼻孔に鼻腔内投与される、請求項1記載の方法。
【請求項６】
少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、約0.1mg/kg〜約10mg/kg（フォルスコリン重量/対象の体重）である、請求項1記載の方法。
【請求項７】
少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、約0.1mg〜約100mgである、請求項1記載の方法。
【請求項８】
少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、少なくとも1種の薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物の一部として投与される、請求項1記載の方法。
【請求項９】
少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、エアロゾル化可能な薬学的組成物の一部として投与される、請求項8記載の方法。
【請求項１０】
薬学的組成物が、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を、該フォルスコリン類似体の合計濃度が約0.1μM〜約20μMとなるように含む、請求項8記載の方法。
【請求項１１】
薬学的組成物が、緩衝水溶液、緩衝生理食塩水、エタノール、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール(PEG)、グリコフロール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、および(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)からなる群より選択される少なくとも1種の薬学的に許容される溶媒を含む、請求項8記載の方法。
【請求項１２】
薬学的組成物が、薬学的に許容される塩、乳化剤、矯味剤、着香料、安定化剤、保存剤、およびキレート剤からなる群より選択される少なくとも1種の付加的な構成成分をさらに含む、請求項8記載の方法。
【請求項１３】
薬学的組成物が、緩衝化された薬学的組成物である、請求項8記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、対象にさらに投与される、請求項1記載の方法。
【請求項１５】
少なくとも1種のヌーペプト類似体が、ヌーペプト、ピラセタム、オキシラセタム、アニラセタム、およびプラミラセタムからなる群より選択される化合物である、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、対象に経口投与される、請求項14記載の方法。
【請求項１７】
少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、約0.01mg/kg〜約5mg/kg（ヌーペプト類似体重量/対象の体重）である、請求項14記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、約5mg〜約50mgである、請求項14記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物が対象に投与された後に、対象に投与される、請求項14記載の方法。
【請求項２０】
少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物が、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量の投与を始める前に約5日〜約14日間、鼻腔内投与される、請求項19記載の方法。
【請求項２１】
パーキンソン病を治療するための少なくとも1種の付加的な作用物質を対象に投与する段階をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項２２】
パーキンソン病を治療するための少なくとも1種の付加的な作用物質が、環状AMP、レボドパ(L-ドパ)、カビドパ、ロピニロール、プラミペキソール、ロチゴチン、アマンタジン、トリヘキシフェニジル、ベンズトロピン、セレギリン、ラサギリン、トルカポン、エンタカポン、ペルゴリド、ロピニロール、フェニルジン、トラニルシプロミン、イソカルボキサジド、エンタカポン、およびアーテンからなる群より選択される、請求項21記載の方法。
【請求項２３】
対象の脳における樹状突起形成および/または神経発生を促進する、請求項1〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
対象における協調および平衡の低減を逆転させる、請求項23記載の方法。
【請求項２５】
対象における筋力低下を逆転させる、請求項23記載の方法。
【請求項２６】
対象の中脳における酸化的リン酸化の減少を逆転させる、請求項23記載の方法。
【請求項２７】
対象の中脳におけるドーパミン神経細胞の減少を逆転させる、請求項23記載の方法。
【請求項２８】
対象が哺乳動物である、請求項1記載の方法。
【請求項２９】
対象がヒトである、請求項28記載の方法。
【請求項３０】
治療を必要とする対象において神経変性疾患または障害を治療するために含むキットであって、
少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物、
少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物、および
キットの薬学的組成物を用いて神経変性疾患または障害を治療する方法を詳述した説明資料
を含む、キット。
【請求項３１】
少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物を対象に鼻腔内投与するためのアプリケーターをさらに含む、請求項30記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、2018年6月21日に出願された米国仮特許出願第62/688,189号に対する優先権を米国特許法119条(e)項に基づいて主張する。
【０００２】
連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、国立衛生研究所/国立一般医科学研究所によって授与された助成金番号GM103554およびNS105783のもとで、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において一定の権利を有している。
【背景技術】
【０００３】
発明の背景
パーキンソン病(PD)は、世界人口の最大1％に発症する慢性神経変性疾患である。PDは、加齢(＞65歳)、遺伝子変異、および環境因子(ミトコンドリア標的型の毒素および中毒性物質)を含む一連の原因および因子が報告されている多因子性疾患である。PD症例の90％は特発性であるが、PD症例の約10％は、タンパク質品質管理、ミトコンドリアおよびリソソームの機能、細胞骨格動態、抗酸化剤応答、ならびにプロテインキナーゼシグナル伝達を調節するために不可欠な18種の異なる遺伝子の遺伝子変異に関連している。PDは、中脳の黒質ドーパミン神経細胞の進行性脱落を病理学的な特徴とし、これにより、PDの進行期における運動緩慢、動作開始ができない状態、および平衡感覚の低下を含む、不可逆的な運動機能障害が、患者に起こる。PDの臨床症状は、PD患者において約90％を超える中脳ドーパミン神経細胞が失われた場合に現れる。
【０００４】
中脳および線条体を標的とすることに加えて、樹状突起の減少に起因する皮質質量の顕著な減少が、後期PDに罹患した個体において観察されている。グルコースおよび他の必須栄養素に由来するエネルギーの脳における利用の減少が、PDの神経病理の一因となっている。重要なことには、皮質および中脳のドーパミン神経細胞が、過剰なレベルの酸化ストレスを受け、それによって皮質でシンシチウムが生じ、レビー小体と呼ばれる大型の細胞内タンパク質凝集体の蓄積が起こる。PDにおける皮質神経細胞の減少は、PD症例の少なくとも50％において認知症の発症を引き起こし、これは、臨床的大うつ病を含む精神疾患を併発している。
【０００５】
現在、PDの医療関連費用は、米国だけで1年に144億ドルと推定されている。PD症例が年々増加し続けていることに加えて、PDにおける神経変性を遅らせるか、または改善することができる治療法がないことから、神経変性を改善し、神経発生を誘導して中脳および皮質中の減少した神経細胞を再増殖させることができる新しい治療法を開発する必要が強く示されている。現在の治療法は、PDの臨床症状を緩和するだけで、中脳のドーパミン神経細胞および皮質神経細胞の神経変性を改善しない。患者にレボドパ(L-DOPA)を経口投与または静脈内投与すると、中脳におけるドーパミンの生物学的利用能が首尾良く増大し、これによって、ドーパミン神経伝達が部分的に修復される。あいにく、時間とともにL-DOPA治療がPD患者に効かなくなり、新たな臨床症状(例えば嚥下不能)が発生する。モノアミンオキシダーゼB阻害薬(例えば、セレギリンおよびラサギリン)ならびにドーパミン受容体2作動薬(例えばブロモクリプチン)は、ドーパミンの利用能を高めることにより、L-DOPAが効かないPD患者の臨床症状を緩和するのに役立つことができる。残念ながら、これらの治療は疾患修飾性ではなく、症状を少し軽減するにすぎない。
【０００６】
したがって、治療を必要とする対象においてパーキンソン病を治療するための新規な疾患修飾方法および製剤が、当技術分野において依然として必要とされている。特定の態様において、該方法は、ドーパミン神経細胞および皮質神経細胞の減少を逆転させ、かつ脳中のドーパミンレベルを復活させることができる疾患修飾療法である。
【発明の概要】
【０００７】
発明の簡単な概要
1つの局面において、本発明は、治療を必要とする対象において少なくとも1種の神経変性疾患または障害を治療する方法を提供する。別の局面において、本発明は、治療を必要とする対象において神経変性疾患または障害を治療するためのキットを提供する。
【０００８】
特定の態様において、方法は、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、異性体、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量を対象に投与する段階を含み、その際、少なくとも1種のフォルスコリン類似体は、
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、およびその任意の脱酸素誘導体からなる群より選択される。
【０００９】
特定の態様において、少なくとも1種の神経変性疾患または障害は、パーキンソン病(PD)、レビー小体認知症(LBD)、アルツハイマー病、および前頭側頭型認知症からなる群より選択される。
【００１０】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、対象に鼻腔内投与される。
【００１１】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、1日に少なくとも1回、2日ごとに少なくとも1回、3日ごとに少なくとも1回、1週間に少なくとも1回、またはその間の任意の頻度および間隔で、対象に投与される。
【００１２】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、1日に少なくとも1回、対象の各鼻孔に鼻腔内投与される。
【００１３】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約0.1mg/kg〜約10mg/kg(フォルスコリン重量/対象の体重)である。
【００１４】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約0.1mg〜約100mgである。
【００１５】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、少なくとも1種の薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物の一部として投与される。
【００１６】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、エアロゾル化可能な薬学的組成物の一部として投与される。
【００１７】
特定の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を、フォルスコリン類似体の合計濃度が約0.1μM〜約20μMとなるように、含む。
【００１８】
特定の態様において、薬学的組成物は、緩衝水溶液、緩衝生理食塩水、エタノール、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール(PEG)、グリコフロール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、および(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)からなる群より選択される少なくとも1種の薬学的に許容される溶媒を含む。特定の態様において、薬学的組成物は、薬学的に許容される塩、乳化剤、矯味剤、着香料、安定化剤、保存剤、およびキレート剤からなる群より選択される少なくとも1種の付加的な構成成分をさらに含む。特定の態様において、薬学的組成物は、緩衝化された薬学的組成物である。
【００１９】
特定の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量が、対象にさらに投与される。特定の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体は、ヌーペプト、ピラセタム、オキシラセタム、アニラセタム、およびプラミラセタムからなる群より選択される化合物である。
【００２０】
特定の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、対象に経口投与される。特定の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約0.01mg/kg〜約5mg/kg(ヌーペプト類似体重量/対象の体重)である。特定の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約5mg〜約50mgである。
【００２１】
特定の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物が対象に投与された後に、対象に投与される。
【００２２】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物は、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量の投与を始める前に約5日〜約14日間、鼻腔内投与される。
【００２３】
特定の態様において、方法は、パーキンソン病を治療するための少なくとも1種の付加的な作用物質を対象に投与する段階をさらに含む。特定の態様において、パーキンソン病を治療するための少なくとも1種の付加的な作用物質は、環状AMP、レボドパ(L-ドパ)、カビドパ、ロピニロール、プラミペキソール、ロチゴチン、アマンタジン、トリヘキシフェニジル、ベンズトロピン、セレギリン、ラサギリン、トルカポン、エンタカポン、ペルゴリド、ロピニロール、フェニルジン、トラニルシプロミン、イソカルボキサジド、エンタカポン、およびアーテンからなる群より選択される。
【００２４】
特定の態様において、方法は、対象の脳における樹状突起形成および/または神経発生を促進する。特定の態様において、方法は、対象における協調および平衡の低減を逆転させる。特定の態様において、方法は、対象における筋力の低下を逆転させる。特定の態様において、方法は、対象の中脳における酸化的リン酸化の減少を逆転させる。特定の態様において、方法は、対象の中脳における黒質ドーパミン神経細胞の減少を逆転させる。
【００２５】
特定の態様において、対象は哺乳動物である。特定の態様において、対象はヒトである。
【００２６】
特定の態様において、キットは、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物、およびキットの薬学的組成物を用いて神経変性疾患または障害を治療する方法を詳述した説明資料を含む。
【００２７】
特定の態様において、キットは、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物を対象に鼻腔内投与するためのアプリケーターをさらに含む。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
本発明を例示するために、本発明の特定の態様を図面に示す。しかし、本発明は、図面で示される態様と同一の手配および手段に限定されない。
【図１】ロテノンで処置された初代皮質神経細胞、すなわちPDのインビトロの化学モデルにおいて、フォルスコリンがベースラインのミトコンドリア呼吸を有意に復活させたことを示すグラフである。
【図２】ロテノンで処置された初代皮質神経細胞において、フォルスコリンが予備呼吸能を有意に復活させたことを示すグラフである。
【図３】ロテノンで処置された初代皮質神経細胞において、フォルスコリンが解糖作用を有意に復活させたことを示すグラフである。
【図４】ロテノンで処置された初代皮質神経細胞の樹状突起中のミトコンドリア含有量を、フォルスコリンが有意に復活させたことを示すグラフである。
【図５】ロテノンで処置された初代皮質神経細胞において、フォルスコリンが樹状突起の連結性を有意に復活させたことを示すグラフである。
【図６】図6A〜6Bは、フォルスコリンで処置したPINK1ノックアウトマウスにおいて、中脳ドーパミン神経細胞の樹状突起および樹状突起中ミトコンドリアの減少が逆転することを示すグラフである。
【図７】初代皮質神経細胞をフォルスコリンおよびヌーペプトで逐次的に処置した場合、フォルスコリン処置のみの場合と比べて神経保護作用が大きいことを示すグラフである。
【図８】中脳神経細胞をフォルスコリンおよびヌーペプトで逐次的に処置した場合、フォルスコリン処置のみの場合と比べて神経保護作用が大きいことを示すグラフである。
【図９】PINK1ノックアウトマウスをフォルスコリンおよびヌーペプトで処置した場合、無処置PINK1-KOマウスまたはフォルスコリン処置PINK1-KOマウスと比べてPINK1-KOマウスの皮質中の神経発生マーカーであるダブルコルチンのタンパク質レベルが上昇することによって示されるように、神経発生が有意に増大することを示す。
【図１０】フォルスコリンの腹腔内投与またはフォルスコリンおよびヌーペプトの腹腔内投与により、PDおよび神経変性の強い運動症状を示す、パーキンソン病のインビボモデルであるPINK1-KOラットにおける平衡および協調の低減を逆転できることを示す。
【図１１】フォルスコリンの腹腔内投与またはフォルスコリンおよびヌーペプトの腹腔内投与により、PINK1-KOラットの後肢における筋力の低下を逆転できることを示す。
【図１２】フォルスコリンの腹腔内投与またはフォルスコリンおよびヌーペプトの腹腔内投与により、PINK1-KOラットの中脳における基礎呼吸が有意に復活したことを示す。
【図１３】フォルスコリンの腹腔内投与またはフォルスコリンおよびヌーペプトの腹腔内投与により、PINK1-KOラットの中脳における黒質ドーパミン神経細胞の神経変性が有意に改善したことを示す。
【図１４】フォルスコリンの鼻腔内投与により、野生型ラットの皮質における神経保護性プロテインキナーゼA(PKA)活性が有意に上昇することを示しており、フォルスコリンの鼻腔内用製剤が血液脳関門を効率的に通過することを示唆する。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明の詳細な説明
本発明は、治療を必要とする対象においてパーキンソン病(PD)を治療するためにフォルスコリンを使用できるという発見に関する。特定の態様において、本発明は、フォルスコリンの治療的有効量が対象に鼻腔内投与される、PDを治療する方法を提供する。他の態様において、ヌーペプトの治療的有効量が、対象にさらに投与される。さらに別の態様において、方法は、PDに起因する対象の脳への損傷を改善し、新しい神経細胞の成長を促進する。
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【００３０】
方法
1つの局面において、本発明は、治療を必要とする対象において、パーキンソン病ならびに関連する神経変性疾患および障害を含む、少なくとも1種の神経変性疾患または障害を治療するための方法を提供する。特定の態様において、少なくとも1種の神経変性疾患または障害は、対象の皮質を冒すものである。他の態様において、少なくとも1種の神経変性疾患または障害は、神経細胞代謝の低下を引き起こす。さらに別の態様において、少なくとも1種の疾患または障害は、パーキンソン病(PD)、レビー小体認知症(LBD)、アルツハイマー病、および前頭側頭型認知症(ピック病)からなる群より選択される。さらに別の態様において、少なくとも1種の疾患または障害は、必ずしも限定されるわけではないが、レビー小体認知症(LBD)、パーキンソン病認知症、アルツハイマー病認知症を併発したパーキンソン病、老年認知症、および前頭側頭型認知症を含む、認知症の一形態である。
【００３１】
特定の態様において、方法は、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、異性体、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。他の態様において、方法は、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量、および少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量を対象に投与する段階を含む。
【００３２】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体は、
2021532070.tif 000005
、およびその任意の脱酸素誘導体からなる群より選択される化合物である。
【００３３】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、エアロゾル化製剤によって対象に投与される。他の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、対象に鼻腔内投与される。何らかの特定の理論に限定しようとするものではないが、少なくとも1種のフォルスコリン類似体の鼻腔内投与は、血液脳関門に対する浸透を増大させ、それによって、対象における治療的効果の速度を速め、対象の服薬遵守を向上させる。鼻腔内送達は、フォルスコリンの迅速かつ効率的な送達を可能にして、場合によっては1時間未満または30分未満で治療的効果をもたらすことができる。さらに別の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体は、他の吸入手段または肺を介した手段によって投与される。さらに別の態様において、方法は、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を対象に経口投与または腹腔内投与する段階を含む。
【００３４】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体は、1日に少なくとも1回、2日ごとに少なくとも1回、3日ごとに少なくとも1回、1週間に少なくとも1回、またはその間の任意の頻度および間隔で投与される。さらに別の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体は、1日に少なくとも1回、各鼻孔に鼻腔内投与される。さらに別の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体は、神経変性疾患または障害が発生してから、対象が死亡するまでまたは神経変性疾患もしくは障害の症状がおさまるまで、投与される。
【００３５】
特定の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体は、ヌーペプト、ピラセタム、オキシラセタム、アニラセタム、およびプラミラセタムからなる群より選択される化合物である。
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【００３６】
特定の態様において、ヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、対象に経口投与される。
【００３７】
特定の態様において、方法は、少なくとも1種のフォルスコリン類似体の治療的有効量を最初に鼻腔内投与する段階、および少なくとも1種のヌーペプト類似体の治療的有効量を次に投与する段階を含む。他の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体は、少なくとも1種のヌーペプト類似体の治療的有効量の投与を始める前に約5日〜約14日間、鼻腔内投与される。
【００３８】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約0.1mg/kg〜約20mg/kgである。他の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約1mg/kg〜約10mg/kgである。さらに他の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約0.01mg〜約100mgである。さらに他の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約0.1mg〜約1mgである。
【００３９】
特定の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約0.05mg/kg〜約5mg/kg(ヌーペプト類似体重量/対象の体重)である。他の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約5mg/kg〜約50mg/kgである。さらに別の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約1mg〜約100mgである。さらに別の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、約10mg〜約30mgである。
【００４０】
特定の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、少なくとも1種の薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物の一部として投与される。他の態様において、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、エアロゾル化可能な薬学的組成物の一部として投与される。
【００４１】
特定の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を、フォルスコリン類似体の合計濃度が約0.05mg/ml〜約5mg/mlとなるように、含む。他の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を、フォルスコリン類似体の合計濃度が約0.025mg/ml〜約2.5mg/mlとなるように、含む。さらに別の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を、フォルスコリン類似体の合計濃度が約0.1μM〜約20μMとなるように、含む。さらに別の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を、フォルスコリン類似体の合計濃度が約1μM〜約10μMとなるように、含む。
【００４２】
特定の態様において、薬学的組成物は、必ずしも限定されるわけではないが、緩衝水溶液、緩衝生理食塩水、エタノール、水、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール(PEG)、グリコフロール、ジメチルスルホキシド(DMSO)、および(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)(HEPES)からなる群より選択される少なくとも1種の薬学的に許容される溶媒を含む。さらに別の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1種の薬学的に許容される塩をさらに含む。さらに別の態様において、少なくとも1種の薬学的に許容される塩は、必ずしも限定されるわけではないが、K2HPO4、KH2PO4、NaCl、HCl、安息香酸ナトリウム、クエン酸塩、硫酸塩、および酒石酸水素塩からなる群より選択される。さらに別の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1種の乳化剤をさらに含む。さらに別の態様において、少なくとも1種の乳化剤は、必ずしも限定されるわけではないが、ポリソルベート、ポリプロピレングリコール、ポリオキシプロピレン-ポリオキシエチレン縮合物(プルロニック)、グリセロール、モノステアラート、リン酸一ナトリウム、およびタウロコール酸からなる群より選択される。さらに別の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1種の矯味剤または着香料、例えば、ラウリン酸エチル、酪酸エチル、酢酸アミ、およびラウリン酸メチル、ならびにバニラ香料(バニリン)をさらに含む。さらに別の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1種の安定化剤または保存剤をさらに含む。さらに別の態様において、少なくとも1種の保存剤は、必ずしも限定されるわけではないが、安息香酸、プロピルヒドロキ安息香酸、フェノール、ベンジルアルコール、安息香酸ナトリウム、およびエデト酸二ナトリウムカルシウムより選択される。さらに別の態様において、薬学的組成物は、少なくとも1種のキレート剤をさらに含む。特定の態様において、薬学的組成物は、緩衝化された薬学的組成物である。他の態様において、薬学的組成物は、約7.4のpHに緩衝化される。
【００４３】
特定の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、少なくとも1種の薬学的に許容される担体をさらに含む薬学的組成物の一部として投与される。他の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物の治療的有効量は、経口投与用の薬学的組成物の一部として投与される。さらに別の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体製剤は、保存剤、安定化剤、作用物質、許容される塩、および乳化剤からなる群より選択される少なくとも1種の構成成分を含む経口錠剤またはゲルカプセル剤からなる。
【００４４】
特定の態様において、方法は、酸化によって損傷した神経細胞の回復を誘導する。他の態様において、方法は、皮質中の神経発生マーカーであるダブルコルチンのレベルを高めることによって、樹状突起形成(樹状突起の伸長)および/または神経発生(失われた神経細胞の置き換え)をいくらか促進する。さらに別の態様において、方法は、パーキンソン病に罹患している対象において、損傷した中脳ドーパミン神経細胞および皮質神経細胞の回復を促進する。何らかの特定のメカニズムまたは理論に限定しようとするものではないが、特定の態様において、方法は、ミトコンドリア分裂誘導因子DRP1のPKAを介したリン酸化を増大させ、それによって、Bcl-2関連死(BAD)プロモータータンパク質のリン酸化を促進し、PKA-CREBシグナル伝達軸を上方調節する。この方法は、フォルスコリンの鼻腔内用製剤が、ラットの皮質において神経保護性PKA活性を増強することを示し、このことから、フォルスコリンの鼻腔内用製剤が血液脳関門を効率的に通過することが示唆される。
【００４５】
特定の態様において、対象は哺乳動物である。他の態様において、対象はヒトである。
【００４６】
特定の態様において、本発明の方法は、対象に有毒である。他の態様において、本発明の方法は、長期使用に適しており、対象に害をもたらさない。
【００４７】
何らかの特定の理論に限定しようとするものではないが、本発明の方法は、対象の脳中の少なくとも1種のニューロトロフィン、例えば、限定されるわけではないが、脳由来神経栄養因子(BDNF)、神経成長因子(NGF)、およびグリア細胞由来の神経栄養因子のレベルを上昇させることにより、機能し得る。フォルスコリンおよびヌーペプト(またはその類似体)を併用すると、BDNF受容体(TrkB)をよけて進むことにより、内因性BDNFのレベルが高まる。ニューロトロフィンレベルの上昇により、損傷神経細胞の回復および新しい神経細胞の成長を誘発することができる。この方法によって、PDのような疾患を治療するために外因性神経栄養因子を使用する必要がなくなる。BDNFおよびGDNFは、血液脳関門を横断する特性が乏しく、かつ皮質および中脳における拡散速度が遅く、したがって脳における全体的生物学的利用能が低いことから、外因性神経栄養因子の使用を回避することは極めて望ましい。
【００４８】
本発明の化合物は、1つまたは複数の立体中心を有してよく、各立体中心は、(R)配置または(S)配置のいずれかで独立に存在し得る。1つの態様において、本明細書において説明する化合物は、本明細書において例示される個々の立体化学的形態と共に存在する。他の態様において、本明細書において説明する化合物は、光学的に活性な形態またはラセミ体で存在する。本明細書において説明する化合物は、本明細書において説明する治療的に有用な特性を有する、ラセミ体、光学的に活性な形態、位置異性体、および立体異性体、またはその組合せを包含する。光学的に活性な形態の調製は、任意の適切な様式で実現され、この様式には、非限定的な例として、再結晶技術によるラセミ体の分割、光学的に活性な出発原料からの合成、キラル合成、またはキラル固定相を用いるクロマトグラフィー分離が含まれる。1つの態様において、1種または複数種の異性体の混合物は、本明細書において説明する治療的化合物として利用される。別の態様において、本明細書において説明する化合物は、1つまたは複数のキラル中心を含む。これらの化合物は、立体選択的合成、エナンチオ選択的合成、ならびに/またはエナンチオマーおよび/もしくはジアステレオマーの混合物の分離を含む、任意の手段によって調製される。化合物およびその異性体の分解は、化学的工程、酵素的工程、分別晶出、蒸留、およびクロマトグラフィーを非限定的な例として含む任意の手段によって実現される。
【００４９】
1つの態様において、本発明の化合物は互変異性体として存在する。互変異性体はすべて、本明細書において挙げる化合物の範囲に含まれる。
【００５０】
1つの態様において、本明細書において説明する化合物は、プロドラッグとして調製される。「プロドラッグ」とは、インビボで親薬物に変換される作用物質である。1つの態様において、インビボ投与されると、プロドラッグは化学的に変換されて、該化合物の生物学的に、薬学的に、または治療的に活性な形態になる。別の態様において、プロドラッグは、1つまたは複数の段階または工程によって酵素的に代謝されて、該化合物の生物学的に、薬学的に、または治療的に活性な形態になる。
【００５１】
本明細書において説明する化合物にはまた、1つまたは複数の原子が、同じ原子番号を有するが自然界で通常認められる原子量または質量数とは異なる原子量または質量数を有する原子によって置換されている、同位体標識された化合物も含まれる。本明細書において説明する化合物に含めるのに適した同位体の例には、2H、3H、11C、13C、14C、36Cl、18F、123I、125I、13N、15N、15O、17O、18O、32P、および35Sが含まれるが、これらに限定されない。1つの態様において、同位体標識した化合物は、薬物および/または基質の組織分布の研究に有用である。別の態様において、重い同位体、例えば重水素による置換は、より優れた代謝安定性(例えばインビボ半減期の延長または必要投与量の減少)をもたらす。さらに別の態様において、11C、18F、15O、および13Nなどの陽電子放出同位体による置換は、基質受容体占有率を検査するための陽電子放出断層撮影(PET)研究において有用である。同位体標識した化合物は、任意の適切な方法によって、または別の状況で使用される非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を用いる工程によって、調製される。
【００５２】
組合せ療法および併用療法
1つの態様において、本発明の組成物は、本明細書において意図される疾患および/または障害を予防および/または治療するのに有用な少なくとも1種の付加的な化合物と同時的に使用された場合、本発明の方法において有用である。他の態様において、これらの化合物は、逐次的にまたは同時に、組み合わせて投与される。
【００５３】
1つの態様において、本発明の組成物は、本明細書において意図される疾患および/または障害を予防および/または治療するのに有用な少なくとも1種の付加的な化合物との組合せで、本発明の方法において有用である。
【００５４】
特定の態様において、本発明の方法は、パーキンソン病を治療するための少なくとも1種の付加的な作用物質を対象に投与する段階をさらに含む。他の態様において、少なくとも1種の付加的な作用物質は、環状AMP、レボドパ(L-ドパ)、カビドパ、ロピニロール、プラミペキソール、ロチゴチン、アマンタジン、トリヘキシフェニジル、ベンズトロピン、セレギリン、ラサギリン、ブロモクリプチン、トルカポン、ペルゴリド、ロピニロール、フェニルジン、トラニルシプロミン、イソカルボキサジド、エンタカポン、およびアーテンからなる群より選択される。
【００５５】
これらの付加的な化合物は、本発明の化合物または他の化合物、例えば、本明細書において意図される疾患および/もしくは障害の症状を治療、予防、もしくは軽減することが公知の市販化合物を含んでよい。特定の態様において、本発明の少なくとも1種の化合物またはその塩と、本明細書において意図される疾患および/または障害を予防および/または治療するのに有用な少なくとも1種の付加的な化合物との組合せは、本明細書において意図される疾患および/または障害の予防および/または治療において、相加的、相補的、または相乗的な効果を有する。
【００５６】
本明細書において使用される場合、2種またはそれより多い化合物の組合せは、個々の化合物が物理的に混合されているか、または個々の化合物が物理的に分離している、組成物を指し得る。組合せ療法は、所望の相加的、相補的、または相乗的な効果をもたらすように各構成要素を別々に投与することを包含する。
【００５７】
例えば、相乗的効果は、適切な方法、例として、シグモイドEmax式(Holford & Scheiner, 19981, Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453)、Loewe相加性の式(Loewe & Muischnek, 1926, Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326)、50％有効量の式(Chou & Talalay, 1984, Adv. Enzyme Regul. 22: 27-55)を用いて、かつアイソボログラム(Tallarida & Raffa, 1996, Life Sci. 58: 23-28)を使用することによって、計算することができる。前述の各式を実験データに適用して、薬物組合せの効果を評価する際に役立つ対応するグラフを作成することができる。前述の式に関連した対応するグラフは、それぞれ、濃度-効果曲線、アイソボログラム曲線、および組合せ指数曲線である。
【００５８】
投与/投薬
投与の計画は、有効量に相当するものに影響を及ぼし得る。治療的製剤は、本明細書において意図される疾患および/または障害の発生の前または後のいずれかに患者に投与されてよい。さらに、いくつかの分割された投与量、ならびに時間をずらされた投与量が、毎日もしくは逐次的に投与されてもよく、または用量は、継続的に注入されてもよく、もしくはボーラス注入であってもよい。さらに、治療的製剤の投与量は、治療状況または予防状況の緊急性によって必要とされるのに応じて、比例的に増加または減少させてもよい。
【００５９】
患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトへの本発明の組成物の投与は、本明細書において意図される疾患および/または障害を治療するのに有効な投与量および期間で、公知の手順を用いて実施されてよい。治療的効果を実現するのに必要な治療的化合物の有効量は、使用される個々の化合物の活性;投与時間;化合物の排出速度;治療期間;該化合物と組み合わせて使用される他の薬物、化合物、または物質;治療される患者の疾患または障害の状態、年齢、性別、体重、病態、全体的健康状態、および以前の病歴;ならびに医薬分野において周知である同様の因子などの因子に応じて変動し得る。投与計画を調整して、最適な治療応答を実現することができる。例えば、いくつかに分割した用量を毎日投与してもよく、または治療状況の緊急性に応じて用量を比例的に減少させてもよい。本発明の治療的化合物の有効用量範囲の非限定的な例は、約0.01μg/kg体重/日〜約100mg/kg体重/日である。当業者であれば、関連する因子を調査し、過度に実験をすることなく治療的化合物の有効量について決定できるであろう。
【００６０】
化合物は、毎日数回の頻度で対象に投与してもよく、あるいはこれよりも少ない頻度で、例えば、1日に1回、1週間に1回、2週間ごとに1回、1ヶ月に1回、またはさらに少ない頻度で、例えば、数ヶ月ごとに1回もしくはさらに、1年に1回、もしくはもっと低い頻度で、投与してもよい。1日に投与される化合物の量は、非限定的な例において、毎日、1日ごと、2日ごと、3日ごと、4日ごと、または5日ごとに投与されてよいことが、理解される。例えば、1日おきの投与の場合、用量5mg/日を月曜日に開始し、その後の1回目の用量5mg/日を水曜日に投与し、その後の2回目の用量5mg/日を金曜日に投与してよく、以下同様である。投薬の頻度は、当業者に容易に明らかになると考えられ、限定されるわけではないが、治療される疾患のタイプおよび重症度、動物のタイプおよび年齢などの任意の数の因子に応じて変わると考えられる。
【００６１】
本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投与量レベルは、個々の患者、組成物、および投与様式に対して、患者に有毒とならずに所望の治療応答を実現するのに有効である活性成分の量を得るために、変更してよい。
【００６２】
当技術分野において通常の技能を有する医師、例えば内科医または獣医は、必要とされる薬学的組成物の有効量を容易に決定し、処方することができる。例えば、内科医または獣医は、薬学的組成物中で使用される本発明の化合物の用量を、所望の治療的効果を実現するために必要とされるよりも低いレベルで開始し、所望の効果が実現されるまで投与量を徐々に増加させることができる。
【００６３】
特定の態様において、投与を容易にし、投与量を均一にするために化合物を単位剤形で製剤化することが、特に有利である。本明細書において使用される単位剤形とは、治療される患者に対する単位投与量として適した物理的に個別の単位を意味し、各単位は、必要な薬学的ビヒクルと共同して所望の治療的効果を生じるように算出された所定量の治療的化合物を含む。本発明の単位剤形は、(a)治療的化合物の独特の特徴および実現すべき個々の治療的効果、ならびに(b)本明細書において意図される疾患および/または障害を治療するためにこのような治療的化合物を調合/製剤化する技術につきものの制約によって定まり、かつこれらに直接的に依存する。
【００６４】
特定の態様において、本発明の組成物は、1日に1〜5回またはそれより多くに及ぶ投与量で患者に投与される。他の態様において、本発明の組成物は、限定されるわけではないが、毎日、2日ごと、3日ごとに1回〜1週間に1回、および2週ごとに1回を含む投与量範囲で、患者に投与される。本発明の様々な組合せ組成物の投与頻度は、限定されるわけではないが、年齢、治療される疾患または障害、性、総合的な健康状態、および他の因子を含む多くの因子に応じて、対象ごとに異なることが、当業者には容易に明らかであろう。したがって、本発明は、任意の特定の投与計画に限定されると解釈されるべきではなく、任意の患者に投与される的確な投与量および組成物は、患者に関する他の全ての因子を考慮に入れて主治医が決定する。
【００６５】
いくつかの態様において、本発明の化合物の用量は、約0.5μg〜約5,000mgである。いくつかの態様において、本明細書において説明する組成物中で使用される本発明の化合物の用量は、約5,000mg未満、または約4,000mg未満、または約3,000mg未満、または約2,000mg未満、または約1,000mg未満、または約800mg未満、または約600mg未満、または約500mg未満、または約200mg未満、または約50mg未満である。同様に、いくつかの態様において、本明細書において説明する第2の化合物の用量は、約1,000mg未満、または約800mg未満、または約600mg未満、または約500mg未満、または約400mg未満、または約300mg未満、または約200mg未満、または約100mg未満、または約50mg未満、または約40mg未満、または約30mg未満、または約25mg未満、または約20mg未満、または約15mg未満、または約10mg未満、または約5mg未満、または約2mg未満、または約1mg未満、または約0.5mg、およびそれらから整数単位または整数未満の単位で増加した任意およびすべての値である。
【００６６】
特定の態様において、本発明は、単独または第2の薬学的物質と組み合わせた、治療的有効量の本発明の化合物を保管する容器;ならびに本明細書において意図される疾患および/または障害の1種または複数種の症状を治療、予防、または軽減するために該化合物を使用するための取扱説明書を含む、容器入りの薬学的組成物を対象としている。
【００６７】
用語「容器」は、薬学的組成物を保管するため、または安定性もしくは水分吸収を管理するための、任意の入れ物を含む。例えば、特定の態様において、容器は、薬学的組成物、例えば、2つの仕切られた空間に入れられた液剤(溶液剤および懸濁剤)、半固体、凍結乾燥された固体、溶液、および粉末、または凍結乾燥製剤を含むパッケージである。他の態様において、容器は、薬学的組成物を含むパッケージではない。すなわち、容器は、包装された薬学的組成物または未包装の薬学的組成物と薬学的組成物を使用するための取扱説明書とを含む箱またはバイアルなどの入れ物である。さらに、包装技術は、当業者に周知である。薬学的組成物を使用するための取扱説明書は、薬学的組成物を含むパッケージの上に載せて入れてもよく、したがって、この取扱説明書は、包装された製品に対して、強い機能的関係を築くことを理解すべきである。しかし、取扱説明書は、意図された機能、例えば、本明細書において意図される疾患および/または障害の治療、予防、または軽減を化合物が遂行する能力に関連する情報を含んでよいことを理解すべきである。
【００６８】
投与
本発明の組成物のいずれかの投与経路には、吸入、経口、および(鼻腔内)鼻が含まれる。
【００６９】
適切な組成物および剤形には、例えば、錠剤、カプセル剤、カプレット、丸剤、ゼラチンカプセル剤、トローチ剤、乳剤、分散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、顆粒剤、ビーズ、ゲル剤、散剤、ペレット剤、マグマ剤、ロゼンジ剤、鼻腔投与または経口投与用の液状スプレー剤、および吸入用の乾燥粉末製剤またはエアロゾル化製剤などが含まれる。本発明において有用であると思われる製剤および組成物は、本明細書において説明される特定の製剤および組成物に限定されないことを理解すべきである。
【００７０】
経肺投与/鼻腔内投与
本発明の薬学的組成物は、口腔を介した経肺投与に適した製剤の形態で調製、包装、または販売されてよい。このような製剤は、活性成分を含み、かつ約0.5〜約7ナノメートル、および特定の態様においては約1〜約6ナノメートルの範囲の直径を有する、乾燥粒子を含んでよい。このような組成物は、好都合には、噴射剤の流れをそこに向けて粉末を分散させることができる乾燥粉末貯蔵器を含む器具を用いて、または密閉容器中の低沸点噴射剤中に溶解もしくは懸濁された活性成分を含む器具のような自己噴射式の溶媒/粉末分配容器を用いて投与するための、乾燥粉末の形態で存在する。特定の態様において、このような粉末は、粒子の少なくとも98重量％が0.5ナノメートルより長い直径を有し、かつ粒子の少なくとも95数量％が7ナノメートルより短い直径を有する、粒子を含む。特定の態様において、粒子の少なくとも95重量％は、1ナノメートルより長い直径を有し、かつ粒子の少なくとも90数量％は、6ナノメートルより短い直径を有する。乾燥粉末組成物は、糖のような固体の細粉末希釈剤を含んでよく、かつ好都合には、単位用量形態で提供される。
【００７１】
一般に、低沸点噴射剤には、大気圧下で華氏65度未満の沸点を有する液体噴射剤が含まれる。通常、この噴射剤は、組成物の50〜99.9％(w/w)に相当してよく、活性成分は、組成物の0.1〜20％(w/w)に相当してよい。噴射剤は、液体の非イオン性界面活性剤もしくは固体の陰イオン性界面活性剤、または(特定の態様において、活性成分を含む粒子と同じ程度の粒径を有する)固体希釈剤などの付加的成分をさらに含んでよい。
【００７２】
経肺送達用に製剤化された本発明の薬学的組成物はまた、液剤または懸濁剤の液滴の形態で活性成分を提供してもよい。このような製剤は、活性成分を含む、任意で滅菌された、水または希アルコールに溶かした液剤または懸濁剤として調製、包装、または販売されてよく、かつ任意の噴霧化器具または微粒化器具を用いて簡便に投与され得る。このような製剤は、限定されるわけではないが、香味剤、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤、または保存剤を含む、1種または複数種の付加的成分をさらに含んでよい。特定の態様において、この投与経路によって提供される液滴は、約0.1〜約200ナノメートルの範囲の平均直径を有する。
【００７３】
本発明の薬学的組成物は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる米国特許第8,333,192 B2号に挙げられているもののような吸入器を用いて送達され得る。
【００７４】
経肺送達に有用であると本明細書において説明する製剤はまた、本発明の薬学的組成物の鼻腔内送達にも有用であり得る。
【００７５】
鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分を含み、かつ約0.2〜500マイクロメートルの平均粒子を有する粗末である。このような製剤は、鼻から吸い込む様式で、すなわち鼻孔の近くに保持された粉末容器から鼻腔を通して急速に吸入することによって投与される。経鼻投与に適した製剤は、例えば、わずか0.1％(w/w)くらいから多くは100％(w/w)もの活性成分を含んでよく、本明細書において説明する付加的成分のうちの1種または複数種をさらに含んでもよい。
【００７６】
鼻腔内送達用に製剤化された本発明の薬学的組成物はまた、液剤または懸濁剤の液滴の形態で活性成分を提供してもよい。このような製剤は、活性成分を含む、任意で滅菌された、水または希アルコールに溶かした液剤または懸濁剤として調製、包装、または販売されてよく、かつ任意の噴霧化器具もしくは微粒化器具を用いて簡便に投与され得る。このような製剤は、限定されるわけではないが、香味剤、揮発性油、緩衝剤、表面活性剤、または保存剤を含む、1種または複数種の付加的成分をさらに含んでよい。特定の態様において、この投与経路によって提供される液滴は、約0.1〜約200ナノメートルの範囲の平均直径を有する。
【００７７】
1つの態様において、液体製剤は、柔軟なスタイレットおよび余分な液体が鼻から出るのを防ぐための柔らかな円錐形の栓を場合によっては備えた、鼻腔内噴霧器を用いることによって送達される。凍結乾燥型の活性成分を含むバイアルに、滅菌済みのゲージ付きシリンジを用いて滅菌リン酸緩衝生理食塩水緩衝液(pH 7.4)または同様の極性緩衝液を加えて希釈し、患者への鼻腔内投与前に点鼻用スプレー剤の栓の中に挿入することができる。
【００７８】
経口投与
経口適用の場合、錠剤、糖衣錠、液剤、ドロップ、坐剤、またはカプセル剤、カプレット、およびゼラチンカプセル剤が特に適している。経口使用向けの組成物は、当技術分野で公知の任意の方法に従って調製してよく、このような組成物は、錠剤を製造するのに適している不活性で毒性のない薬学的な賦形剤からなる群より選択される1種または複数種の作用物質を含んでよい。このような賦形剤には、例えば、ラクトースのような不活性な希釈剤;コーンスターチのような造粒剤および崩壊剤;デンプンのような結合剤;ならびにステアリン酸マグネシウムのような滑沢剤が含まれる。錠剤はコーティングされなくてもよく、または見た目を良くするためもしくは活性成分の放出を遅らせるために公知の技術によってコーティングされてもよい。経口使用向けの製剤はまた、活性成分が不活性希釈剤と混合されている硬ゼラチンカプセル剤として提供されてもよい。特定の態様において、ヌーペプトおよびその任意の類似体は、前述の態様のいずれかに従って、経口的に投与することができる。
【００７９】
付加的な投与形態
本発明のその他の剤形には、米国特許第6,340,475号、同第6,488,962号、同第6,451,808号、同第5,972,389号、同第5,582,837号、および同第5,007,790号に記載されている剤形が含まれる。本発明のその他の剤形にはまた、米国特許出願第20030147952号、同第20030104062号、同第20030104053号、同第20030044466号、同第20030039688号、および同第20020051820号に記載されている剤形が含まれる。本発明のその他の剤形にはまた、PCT出願番号WO 03/35041、WO 03/35040、WO 03/35029、WO 03/35177、WO 03/35039、WO 02/96404、WO 02/32416、WO 01/97783、WO 01/56544、WO 01/32217、WO 98/55107、WO 98/11879、WO 97/47285、WO 93/18755、およびWO 90/11757に記載されている剤形が含まれる。
【００８０】
キット
別の局面において、本発明はさらに、本発明の少なくとも1種の薬学的組成物、アプリケーター、およびその使用のための説明資料を含むキットも提供する。キット中に含まれる説明資料は、本発明の方法を実施して、対象において神経変性疾患または障害を予防または治療するための取扱説明書を含む。
【００８１】
特定の態様において、キットは、本明細書の別の箇所で説明するような少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物についての少なくとも1回分の用量を含む。他の態様において、キットは、事前に包装された単回投与用製剤中にそれぞれ、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物についての少なくとも2回分の用量を含む。さらに別の態様において、キットは、凍結乾燥型の少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物についての少なくとも1回分の用量を含む。さらに別の態様において、キットは、凍結乾燥された薬学的組成物を再構成するための薬学的に許容される担体または溶媒をさらに含む。
【００８２】
特定の態様において、キットは、本明細書の別の箇所で説明するような少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物についての少なくとも1回分の用量をさらに含む。他の態様において、少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物についての少なくとも1回分の用量は、本明細書の別の箇所で説明するような経口錠剤またはゼラチンカプセル剤の一部として製剤化される。
【００８３】
特定の態様において、キットは、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物および少なくとも1種のヌーペプト類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物のそれぞれについて少なくとも1回分の用量を提供する。他の態様において、キットは、これらの組成物が順にまたは一緒に投与されるように対象に薬学的組成物を投与するための説明資料も、さらに提供する。
【００８４】
特定の態様において、アプリケーターは、少なくとも1種のフォルスコリン類似体、またはその塩、プロドラッグ、もしくは溶媒和物を含む薬学的組成物の鼻腔内送達用に変更された、ネブライザー、吸入器、噴霧器、または類似器具である。
【００８５】
特定の態様において、キットは、本発明において意図される疾患または障害を治療するのに有用な少なくとも1種の付加的物質をさらに含む。
【００８６】
定義
本明細書において使用される場合、下記の各用語は、このセクションでそれに関連付けられている意味を有する。
【００８７】
他に規定されない限り、通常、本明細書で使用される技術用語および科学用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。通常、本明細書において使用する学名ならびに動物薬理学、薬学、分離科学、および有機化学における実験手順は、当技術分野において周知であり一般に使用されるものである。本発明の教示が実施可能のままである限り、段階の順序または特定の行為を実施するための順序は重要ではないことを理解すべきである。さらに、2つまたはそれより多い段階または行為は、同時に行っても行わなくてもよい。
【００８８】
本明細書において使用される場合、冠詞「1つの(a)」および「1つの(an)」は、冠詞の文法的対象の1つまたは複数(すなわち、少なくとも1つ)を指す。例えば、「要素(an element)」とは、1つの要素または複数の要素を意味する。
【００８９】
本明細書において使用される場合、用語「約」は、当業者によって理解され、使用される文脈に応じてある程度変わる。量および時間的期間などの測定可能な値に言及する際に本明細書において使用される場合、「約」という用語は、指定された値から±20％または±10％、より好ましくは±5％、さらにより好ましくは±1％、およびさらに一層好ましくは±0.1％の変動を包含することを意図しており、そのような変動は、開示される方法を実施するのに適切である。
【００９０】
本明細書において使用される場合、用語「組成物」または「薬学的組成物」は、本発明の範囲内で有用な少なくとも1種の化合物と薬学的に許容される担体との混合物を意味する。薬学的組成物によって、患者または対象への化合物の投与は容易になる。限定されるわけではないが、静脈内投与、経口投与、エアロゾル投与、非経口投与、眼投与、鼻腔投与、経肺投与、および局所投与を含む、化合物を投与する多様な技術が当技術分野に存在する。
【００９１】
本明細書において使用される「疾患」とは、動物が恒常性を維持することができず、かつその疾患が軽快しない場合には動物の健康が悪化し続ける、動物の健康状態である。
【００９２】
本明細書において使用される、動物の「障害」とは、動物が恒常性を維持することはできるが、該障害がない場合に予想されるよりも該動物の健康状態が好ましくない、健康状態である。治療せずに放置した場合、障害は、必ずしも動物の健康状態をさらに悪化させるわけではない。
【００９３】
本明細書において使用される場合、「説明資料」は、キット中の本発明の組成物および/または化合物の有用性を伝えるために使用することができる、刊行物、記録物、図、または他の任意の表現媒体を含む。説明資料は、本発明の方法において本発明の組成物および/または化合物を使用する方法も説明してよい。キットの説明資料は、例えば、本発明の化合物および/もしくは組成物を含む容器に添付されてよく、または化合物および/もしくは組成物を含む容器と一緒に出荷されてもよい。あるいは、説明資料は、受領者が説明資料および化合物を協同的に使用するという意図を持って、容器とは別に出荷されてもよい。説明資料の送達は、例えば、キットの有用性を伝える刊行物もしくは他の表現媒体の物理的配達であってもよく、または別法として、電子的伝送によって、例えばコンピューターを用いて、電子メールもしくはウェブサイトからのダウンロードなどにより、実現してもよい。
【００９４】
用語「患者」、「対象」、または「個体」は、本明細書において同義的に使用され、インビトロであれインサイチューであれ、本明細書において説明する方法に適する任意の動物またはその細胞を意味する。非限定的な態様において、患者、対象、または個体は、ヒトである。他の態様において、患畜は、例えば、ヒツジ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、およびマウスといった哺乳動物などの家畜およびペットを含む、非ヒト哺乳動物である。さらに別の態様において、患畜は、鳥類の動物または鳥である。好ましくは、患者は、個体、または対象は、ヒトである。
【００９５】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、化合物の生物活性または特性を抑制せず、比較的に非毒性である、担体または希釈剤などの物質を意味する。すなわち、この物質は、望ましくない生物学的作用を引き起こすことも、それが含まれる組成物の構成成分のいずれかと有害な様式で相互作用することもなく、個体に投与され得る。
【００９６】
本明細書において使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、本発明の範囲内で有用な化合物を、意図された機能をそれが果たし得るように患者体内または患者に運搬または輸送するのに関与している、薬学的に許容される物質、組成物、または担体、例えば、液状もしくは固形の増量剤、安定化剤、分散剤、懸濁化剤、希釈剤、賦形剤、増粘剤、溶剤、またはカプセル化材を意味する。典型的には、このような構築物は、身体の1つの器官または部分から、身体の別の器官または部分へと運搬または輸送される。各担体は、本発明の範囲内で有用な化合物を含む、製剤の他の成分と共存でき、かつ対象に害を与えないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体としての機能を果たし得る物質のいくつかの例には、糖、例えば、ラクトース、グルコース、およびスクロース;デンプン、例えば、トウモロコシデンプンおよびバレイショデンプン;セルロースおよびその誘導体、例えば、カルボキシルメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロース;トラガント末;麦芽;ゼラチン;タルク;賦形剤、例えば、ココアバターおよび坐剤用ワックス;油、例えば、ピーナッツ油、綿実油、サフラワー油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油;グリコール、例えばプロピレングリコール;多価アルコール、例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコール;エステル、例えば、オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル;寒天;緩衝剤、例えば、水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム;界面活性剤;アルギン酸;パイロジェンフリー水;等張性生理食塩水;リンガー溶液;エチルアルコール;リン酸緩衝液;ならびに薬学的製剤中で使用される他の非毒性の共存可能な物質が含まれる。
【００９７】
本明細書において使用される場合、専門用語「薬学的に許容される塩」とは、無機酸、有機酸、その溶媒和物、水和物、またはクラスレートを含む薬学的に許容される非毒性酸から調製される、投与される化合物の塩を意味する。
【００９８】
本明細書において使用される場合、用語「予防する」、「予防すること」、または「予防」は、作用物質または化合物の投与が始まる時点で疾患または病態に関連した症状を示していない対象において、そのような症状の発生を回避するか、または遅らせることを意味する。
【００９９】
「治療的」処置とは、病変の徴候を示している対象に対して、それらの徴候を減少または消失させる目的で施される処置である。
【０１００】
本明細書において使用される場合、用語「治療的有効量」とは、本明細書において説明または意図される疾患または病態の症状を緩和することを含めて、そのような疾患または病態を予防または治療する(発生を遅らせるもしくは予防するか、進行を防ぐか、抑制するか、程度を低くするか、または元に戻す)のに十分または有効である量を意味する。
【０１０１】
本明細書において使用される場合、用語「治療」または「治療すること」は、治療物質、すなわち、(単独もしくは別の薬学的物質と組み合わせた)本発明の化合物を患者に適用もしくは投与すること、または本明細書において意図する病態、本明細書において意図する病態の症状、もしくは本明細書において意図する病態を発症する可能性を有している患者から(例えば、診断もしくはエクスビボ用途のために)単離された組織もしくは細胞株に対して、本明細書において意図する病態、本明細書において意図する病態の症状、もしくは本明細書において意図する病態を発症する可能性について治癒するか、癒やすか、緩和するか、軽減するか、変更するか、治すか、よくするか、改善するか、もしくは影響を及ぼすために、治療物質を適用もしくは投与すること、と定義される。このような治療は、薬理ゲノム学の分野から得られる知識に基づいて、個別に適応させるか、または修正してよい。
【０１０２】
範囲:本開示の全体を通して、本発明の様々な局面は、範囲形式で示すことができる。範囲形式での説明は、便宜および簡潔さのためにすぎず、本発明の範囲に対する融通のきかない制限と解釈されるべきではないことを理解すべきである。したがって、範囲の説明は、存在し得る部分範囲すべてならびにその範囲内の個々の数値を具体的に開示したとみなされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の説明は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数および部分的な数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したとみなされるべきである。このことは、範囲の広さに関わらず、当てはまる。
【０１０３】
以下の略語が、本明細書において使用される:
BDNF  脳由来神経栄養因子
dbt-cAMP  ジブチリル環状AMP
DMSO  ジメチルスルホキシド
ECARS  細胞外酸性化速度
LBD  レビー小体認知症
L-DOPA  レボドパ
NGF  神経成長因子
PD  パーキンソン病
OCRs  酸素消費速度
TH  チロシンヒドロキシラーゼ
【０１０４】
当業者なら、慣用の域を出ない実験法を用いて、本明細書において説明される特定の手順、態様、特許請求の範囲、および実施例の多数の等価物を認識するか、または確認することができるであろう。このような等価物は、本発明の範囲内にあるとみなされ、本明細書に添付の特許請求の範囲に包含された。例えば、限定されるわけではないが、反応時間、反応規模/体積、および実験試薬、例として、溶媒、触媒、圧力、大気条件、例えば窒素雰囲気、および還元剤/酸化剤を含む、反応条件を、当技術分野において認識されている代替物および慣用の域を出ない実験法を用いて改変することは、本出願の範囲に収まることを理解すべきである。
【０１０５】
本発明の実践は、別段の定めが無い限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学、および免疫学の従来の技術を使用し、これらは当業者の技能の範囲に十分含まれる。このような技術は、“Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, second edition (Sambrook, 1989); “Oligonucleotide Synthesis” (Gait, 1984); “Animal Cell Culture” (Freshney, 1987); “Methods in Enzymology” “Handbook of Experimental Immunology” (Weir, 1996); “Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells” (Miller and Calos, 1987); “Current Protocols in Molecular Biology” (Ausubel, 1987); “PCR: The Polymerase Chain Reaction”, (Mullis, 1994); “Current Protocols in Immunology” (Coligan, 1991)などの文献で十分に説明されている。これらの技術は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの作製に応用可能であり、したがって、本発明をなす際および実践する際に考慮に入れてよい。特定の態様のために特に有用な技術を、以下のセクションで考察する。
【０１０６】
値および範囲が本明細書において提供される場合はいつでも、範囲形式での説明は、便宜および簡潔さのためにすぎず、本発明の範囲に対する融通のきかない制限と解釈されるべきではないことを理解すべきである。したがって、これらの値および範囲に包含される値および範囲はすべて、本発明の範囲内に包含されることを意図している。さらに、これらの範囲に収まるすべての値、ならびに値の範囲の上限値または下限値もまた、本出願によって意図される。範囲の説明は、存在し得るすべての部分範囲およびその範囲内の個々の数値、ならびに適切な場合には、範囲内の数値の整数未満の数を具体的に開示したとみなされるべきである。例えば、1〜6のような範囲の説明は、1〜3、1〜4、1〜5、2〜4、2〜6、3〜6などの部分範囲、ならびにその範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.3、および6を具体的に開示したとみなされるべきである。このことは、範囲の広さに関わらず、当てはまる。
【０１０７】
以下の実施例は、本発明の局面をさらに例示する。しかし、これらは、本明細書におい説明される本発明の教示または開示を限定するものでは決してない。
【実施例】
【０１０８】
以下の実施例を参照して、本発明を以下に説明する。これらの実施例は、例証のために提供されるにすぎず、本発明は、これらの実施例に限定されず、正しくは、本明細書において提供される教示の結果として明らかであるすべての変形例を包含する。
【０１０９】
さらなる説明がなくても、当業者は、前述の説明および以下の例示的な例を用いて、本発明の化合物を作製および利用し、特許請求の範囲の方法を実践することができると考えられる。したがって、以下の実施例は、本発明の好ましい態様を具体的に示し、開示の残りの部分を何らかの方法で限定するものとして解釈されるべきではない。
【０１１０】
材料および方法
材料
ロテノン、ヌーペプト、およびフォルスコリンをSIGMA-Aldrichから購入し、さらに精製はせずに使用した。アンチマイシンA、カルボニルシアニド-4-フェニルヒドラゾン(FCCP)、ロテノン、およびオリゴマイシンを含むミトコンドリアストレスキットをAgilent Technologiesから購入した。
【０１１１】
神経細胞培養手順
University of Nevada, Reno Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC)によって承認されている苦痛を最小限にする手順を用い、以前に説明されているように(Dagda et al. Cell Death Differ. 2011 Dec; 18(12): 1914-1923.)して、皮質および中脳の初代神経細胞を野生型C57BL/6マウスまたはPink1ノックアウトマウスから調製した。皮質および中脳の初代神経細胞は、14日齢のC57BL/6マウス胎仔(Hilltop Laboratory Animals, Scottdale, PA, USA)および対照の同腹仔から調製した。おおよその数として、中脳培養物のために、計画妊娠させた雌1匹に付き6〜8匹の胎仔(雄および雌)から、85,000〜100,00細胞/ウェルのウェル16個を獲得したか、またはこの患者適用について説明される大半の実験のために、8匹の胎仔から得たおよそ10倍の合計数の皮質細胞を、100,000細胞/ウェルの濃度で播種した。3日後、培地の3分の2を、B27および0.75mM L-グルタミンを含む新鮮なNeurobasal(Gibco/Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)に交換した。
【０１１２】
ロテノン製剤/ロテノン投与
ロテノン(1.26mMのストック、Sigma、カタログ番号R8875)を、使用前にその都度、水に溶かして新しく調製した。ロテノンのストックを暗所、-20℃で最長6ヶ月、維持した。ロテノンを神経芽細胞腫細胞に対して65μMで、初代皮質神経細胞に対して65nMで4〜6時間使用して、酸化ストレスおよび自己貪食ストレスを誘発した。
【０１１３】
動物の取扱い手順
マウスおよびラットを使用する実験はすべて、ARRIVE(Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments)ガイドラインに従って実施した。野生型C57BL/6マウスおよびPINK1ノックアウトマウス(B6.129S4-Pink1tm1Shn/J)、野生型(ロングエバンスラット)ラットおよびPINK1ノックアウト(LEH-PINK1tm1sage,Park6)ラット(Horizon Discovery社のSAGE labs)を人道的に、かつARRIVEガイドラインに適切に従って、取り扱った。Laboratory of Animal Resources(University of Nevada, Reno)において、十分な敷きわら、飼料(粒状の餌)、水を含み、十分に社会的、栄養的、かつ「エンリッチ」な環境のケージ中ですべてのマウスを飼育し、HVACを圧力調節した/無菌環境において、12:12時間の明/暗サイクルで維持した。
【０１１４】
マウス胎仔に由来する初代皮質神経細胞を培養するために、特定病原体除去(SPF)計画妊娠マウス(E14)が、Charles Rivers Laboratories (Reno, Nevada)から購入され供給された。
【０１１５】
フォルスコリン製剤
フォルスコリン(コレウス・フォルスコリ(Coleus forskohlii)>98％HPLC、Sigma Aldrich)をDMSOに溶かして、5mg/mlのストックとして調製した(使用準備が済むまで暗所で保管し-20℃で貯蔵した場合には、最長6ヶ月安定)。実験当日に、一定分量のフォルスコリンを解凍し、初代皮質神経細胞を処置する場合は、完全培地にフォルスコリンを溶かした濃度1μM〜最高10μMのフォルスコリンで細胞を1回処置し、またはPINK1ノックアウトマウスもしくはPINK1ノックアウトラットに対しては腹腔内投与した。
【０１１６】
フォルスコリンを鼻腔内送達する場合、実施例6に説明するように、フォルスコリンの鼻腔内用製剤を調製した。
【０１１７】
ヌーペプト製剤
ヌーペプト(>98％HPLC、Sigma Aldrich)をDMSOに溶かして、20mg/mlのストック溶液として調製した(使用準備が済むまで暗所で保管し-20℃で貯蔵した場合には、最長6ヶ月安定)。実験当日に、一定分量のヌーペプトを解凍し、初代皮質神経細胞を処置する場合は、完全培地に溶かした指定濃度(20nM)のヌーペプトで細胞を1回処置し、またはPINK1ノックアウトマウスもしくはPINK1ノックアウトラットに対しては腹腔内投与した。
【０１１８】
脳溶解物のPKA活性の測定
ELISAに基づく比色定量PKA活性キットを以下の軽微な変更を加えて製造業者の推奨(Enzo Life Sciences; ADI-EKS-390A)に従って用いて、PKAを介した基質リン酸化のレベルを測定することにより、野生型ロングエバンス頭巾斑ラットの皮質におけるPKA活性を測定した。PKA比活性を測定するために、皮質由来の溶解物を10μMのH89、すなわちPKAの薬理学的阻害剤で5分間処理し、未処理組織溶解物のキナーゼ活性の合計からH89耐性キナーゼの活性を引いた。
【０１１９】
統計学的解析
別段の定めが無い限り、結果は、3回の独立した実験の平均値±S.E.M.(standard errors of mean)として表している。データは、対比較に対するスチューデントのt検定(両側)によって解析した。一元配置ANOVA、続いて、ボンフェローニ補正したテューキーの検定を実施することによって、多群比較を行った。0.05未満のp値を統計学的に有意とみなした。
【０１２０】
検出力解析
ウェスタンブロットを用いる免疫組織化学的解析の場合、大きな効果量(コーヘンのd=1.99、β:0.80、およびα=0.05)をもたらす予備データに基づき、総標本数8(1群当たり4匹のマウス)が必要とされた。
【０１２１】
実施例1:PDモデル神経細胞のフォルスコリン処置
ウェル当たり細胞85,000〜100,000個の細胞密度で播種した初代皮質神経細胞を、LD50濃度のロテノン(65nM)、すなわちパーキンソン病の化学モデルに24時間曝露させた。次いで、ロテノンで処理した初代神経細胞を250μMのジブチリル環状AMP(dbt-cAMP)または親型もしくは水溶性型(NKH477)のフォルスコリン(6.5μM〜8.5μM、24時間)に曝露させた。ミトコンドリア機能の指標である基礎酸素消費速度(OCR)を、XF24e Extracellular Flux Analyzer(Agilent Technologies)を用いることによって解析した。ミトコンドリア機能の最大緩衝能の指標である最大酸素消費速度(OCR)もまた、1μMのFCCP、すなわちミトコンドリア脱共役剤として作用するイオノフォアで処理した初代皮質神経細胞において、XF24e Extracellular Flux Analyzerを用いることによって解析した。ロテノンは、ベースラインOCRの低下および予備呼吸能(最大OCR-ベースラインOCR)の有意な減少を誘導したが、フォルスコリンまたは水溶性のフォルスコリン類似体NKH477によって初代皮質神経細胞を処置したところ、ベースラインのミトコンドリア呼吸が部分的または完全に復活し(図1)、予備呼吸能が完全に復活した(図2)(*:DMSO対照に対してp<0.05、**:ロテノンに対してp<0.05、一元配置ANOVA、3つの独立した実験から取得し、1群当たり20ウェルから集めたデータ)。
【０１２２】
解糖作用の指標である細胞外酸性化速度(ECAR)もまた、初代神経細胞においてXF24e Extracellular Flux Analyzerを用いることによって評価した。ロテノンは、ベースラインECARの有意な低下を誘導したが、フォルスコリンまたは水溶性のフォルスコリン類似体NKH477によって初代皮質神経細胞を処置したところ、正常な解糖機能が完全に復活した(図3)(*:DMSO対照に対してp<0.05、**:ロテノンに対してp<0.05、一元配置ANOVA、3つの独立した実験から取得し、1群当たり20ウェルから集めたデータ)。
【０１２３】
また、ロテノンで処理した神経細胞を、樹状突起(MAP2B)およびミトコンドリア(TOM20)について免疫染色して、初代皮質神経細胞に由来する樹状突起中のミトコンドリア含有量を画像に基づいて解析することによっても研究した。これらの画像から、神経細胞をフォルスコリンまたはdbt-cAMPで処置することにより、樹状突起内のミトコンドリアの減少が逆転することが示された(図4)。さらに、樹状突起(MAP2B)について免疫染色して、固定した初代皮質神経細胞において樹状突起の長さを解析したところ、フォルスコリンまたはdbt-cAMP処置により、樹状突起の減少が逆転することが示された(図5)(*:DMSO対照に対してp<0.05、**:ロテノンに対してp<0.05、一元配置ANOVA、3つの独立した実験から集めた12ウェル)。全般的にみて、樹状突起中のミトコンドリアの減少を軽減し、初代皮質神経細胞中の樹状突起分枝を復活させるには、PKAシグナル伝達を誘発すれば十分であることがデータから示された。
【０１２４】
代謝データ(図1〜3)から、初代神経細胞の解糖作用およびミトコンドリア呼吸を刺激することによってフォルスコリンが向知性薬として作用できることが、裏付けられる。フォルスコリン濃度が12.5μMを上回る場合、ロテノンによる神経変性からの有意な保護は与えられなかった。この知見から、フォルスコリンが、神経細胞代謝(酸化的リン酸化および解糖作用)が減少しないように二峰性の様式で保護し、最大効果が濃度約10μMで観察されることが示唆される。
【０１２５】
初代皮質神経細胞を親型もしくは水溶性型(NKH477)のフォルスコリンのいずれかで処置すると、樹状突起分枝(神経細胞1個当たりの樹状突起の合計長)および樹状突起中のミトコンドリアレベル(ミトコンドリアに占拠されたミトコンドリアの比率(％))のロテノンによる減少であって、ロテノンによる毒性によって誘導される、未処置の初代神経細胞と比べての減少が、完全に阻止された(図4〜5)。
【０１２６】
実施例2:PDモデルマウスのフォルスコリン処置
野生型(PINK1+/+)マウスまたはPINK1ノックアウト(PINK1-/-)マウスに、2日ごとに1回、最長1週間、DMSO対照またはフォルスコリン(1mg/kg体重)を腹腔内注射して処置した。各処置の最後に、マウスを犠死させ、生理食塩水、続いて4％ホルムアルデヒドを心臓内に灌流させた。野生型マウスおよびPINK1  KOマウスから得た中脳切片をミトコンドリア(TOM20)およびチロシンヒドロキシラーゼ(TH、紫)について免疫染色して、中脳ドーパミン神経細胞および樹状突起の長さを同定した。黒質ドーパミン神経細胞中の免疫染色された樹状突起およびミトコンドリアを画像に基づいて定量することにより、フォルスコリン投与によって、樹状突起の長さ(図6A)および樹状突起中のミトコンドリアの含有量(図6B)が、未処置のPINK1ノックアウトマウスと比べて、野生型マウスと同様のレベルまで有意に増大したことが示される(*:PINK1+/+マウスに対してp<0.05、**:PINK1-/-マウスに対して<0.05、一元配置ANOVA、1群当たり3〜4匹のマウス)。
【０１２７】
実施例3:PDモデル神経細胞に対するフォルスコリンおよびヌーペプトの併用処置
ウェル当たり細胞85,000〜100,000個の細胞密度で播種した初代皮質神経細胞の第1のバッチを、LD50濃度のロテノン(65nM)に24時間曝露させた。次いで、ロテノンで前処理した初代神経細胞をフォルスコリン(6.5μM〜8.5μM、24時間)に曝露するか、またはフォルスコリン(10μM)で24時間、続いてヌーペプト(23.5nM)でさらに5.5時間、処置した。処置後、初代皮質神経細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、活性なカスパーゼ-3について免疫染色し、DAPI対比染色によって細胞を特定した(細胞の10％未満がグリアであることが判明した)。カスパーゼ-3陽性であるDAPI陽性初代皮質神経細胞の比率を定量し、未処置神経細胞に対して標準化した(図7)(*:DMSO対照に対してp<0.05、**:ロテノンに対してp<0.05、***:ロテノンおよびフォルスコリンに対してp<0.05、一元配置ANOVA、1回の独立した実験からまとめられた、1群につき25個の落射蛍光視野)。
【０１２８】
ウェル当たり細胞85,000〜100,000個の細胞密度で播種した初代皮質神経細胞の第2のバッチを、LD50濃度のロテノン(65nM)に24時間曝露させた。次いで、ロテノンで処理した初代神経細胞をフォルスコリン(6.5μM〜8.5μM、24時間)、続いてヌーペプト(10nM)にさらに10時間、曝露した。処置後、ドーパミン作動性中脳神経細胞をパラホルムアルデヒドで固定し、神経細胞マーカーであるチロシンヒドロキシラーゼ(TH)について免疫染色して中脳のドーパミン作動性神経細胞を同定し、かつDAPIで対比染色して神経細胞を同定した。図8は、実験条件ごとの落射蛍光視野当たりの核の平均数(DAPI)を示す(*:DMSO対照に対してp<0.05、**:ロテノンに対してp<0.05、***:ロテノンおよびフォルスコリンに対してp<0.05、一元配置ANOVA、1回の独立した実験からまとめられた25個の落射蛍光視野)。
【０１２９】
実施例4:併用処置は、PINK1-KOマウスの皮質における神経発生を促進する
野生型(PINK1+/+)マウスまたはPINK1ノックアウト(PINK1-/-)マウスに、2日ごとに1回、最長10日間、DMSO対照もしくはフォルスコリン(1.6mg/kg体重)を腹腔内注射して処置するか、またはフォルスコリン(1.6mg/kg体重)を2回(2日ごとに1回)、続いてフォルスコリンおよびヌーペプト(0.05μg/kg)による併用処置をさらに3回(2日ごとに1回)行って処置した。各処置の最後に、マウスを犠死させ、生理食塩水を心臓内に灌流させた。皮質を回収し、溶解し、ホモジナイズし、動物1匹当たり最大25μgのタンパク質を10％アクリルアミドゲルで電気泳動し、ダブルコルチン、すなわち未成熟な/遊走中の皮質神経細胞で主に発現される神経発生マーカーについて免疫ブロットした。図9は、ダブルコルチンに特異的な免疫反応性バンドの濃度積分値の平均値の棒グラフを示す(*: PINK1-KO/Vehに対してp<0.05、N=3〜4匹の動物/群、一元配置ANOVA、テューキーの検定)。
【０１３０】
データは、フォルスコリン単独ではなく、フォルスコリンおよびヌーペプトでPINK1-KOマウスを処置することにより、ダブルコルチンのタンパク質レベルを有意に増大できることを示しており、ヌーペプトがPINK1-KOマウスの皮質において神経発生を促進することが示唆される。
【０１３１】
実施例5:フォルスコリンおよびヌーペプトを用いてPINK1ノックアウトラットを併用処置すると、神経変性の運動症状および神経変性が改善する
野生型(PINK1+/+)ラットまたはPINK1ノックアウト(PINK1-/-)ラットに、2日ごとに1回、DMSO対照もしくはフォルスコリン(1.6mg/kg体重)を2回腹腔内注射し、続いて、ヌーペプト(0.05μg/kg)の併用投与を最長で10日間の合計治療期間中にさらに3回(2日ごとに1回)行って処置した。各処置の最後に、一連の運動試験を、ビヒクルで処置するか、または化合物で処置した野生型ラットおよびPINK1-KOラットにおいて実施して、握力分析器を用いて後肢の筋力を解析した。さらに、先が細くなった1メートルのビームバランス(2cm幅)をラットに横断させる試験を動物1匹につき最高3回行うことにより、筋肉の協調および平衡を評価した。
【０１３２】
図10は、化合物(フォルスコリンおよび/またはヌーペプト)による処置の前および後の、ラット群当たりの平均運動スコア(横断時の落下および滑り)を示す。ラットの協調および平衡を定量するために使用される運動スコアは、以下を伴った:横断1回当たり1回の滑りを示したラットにスコア1.0を割り当て、一方、試験中にビームバランスから落ちた各ラットにはスコア2.0を割り当てた。各ラットの3回の試験から得られた両方の運動パラメーターを合計し、動物の処置群ごとの平均を求めた(*:処置前(pre)に対するp<0.05、対応のあるt検定、N=6〜11匹のラット/群)。データから、フォルスコリンまたは両方の化合物(フォルスコリンおよびヌーペプト)の腹腔内注射によってパーキンソン症候群のラット(PINK1-KO)を10日間処置することにより、協調および平衡の低減(ビーム横断時の落下および滑り)を逆転できることが示唆される。
【０１３３】
図11は、動物1匹につき3回の試験をまとめた平均から導き出された、ラット群当たりの後肢の平均の強さ(力(g)/体重(kg))を示す(*:処置前(pre)に対するp<0.05、対応のあるt検定、N=6〜11匹のラット/群)。データから、フォルスコリンまたは両方の化合物(フォルスコリンおよびヌーペプト)の腹腔内注射によってパーキンソン症候群のラット(PINK1-KO)を10日間処置することにより、後肢の強さの低下を逆転できるが、ビヒクル対照(PBS)の注射はパーキンソン症候群ラットに効果がないことが示唆される。
【０１３４】
行動試験の完了後、次いで、ラットにリン酸緩衝生理食塩水を経心的に灌流し、脳を摘出し、室温でビブラトーム(脳スライサー)を用いることによって中脳切片を作製し、人工脳脊髄液中で維持した。次いで、実施例1で説明したようにして、ただし以下の変更を加えてXF24e Metabolic Analyzerを用いることにより、酸素消費速度を測定して、脳中のエネルギー生産(酸化的リン酸化)を評価した。パーキンソン症候群ラットまたは野生型ラットに由来する中脳切片のバイオエナジェティクスプロファイルを測定するために、各脳領域から直径1.2mmの生検パンチ片を慎重に切り離し、プレートの各ウェルの底に載せた。XF基礎培地中に前もって浸したメッシュ捕捉スクリーンを組織のすぐ上に慎重に載せ、(2mM L-グルタミン、1mMピルビン酸Na、10mMグルコース、および4mg/ml BSA、pH 7.4を添加した)Agilent Seahorse製のXF基礎培地700μLを各ウェルに添加した。脳切片のベースライン呼吸を5回解析した。各回は、3分の混合、3分の待機、および2分のOCR測定からなった。図12は、ビヒクル対照(PBS)、フォルスコリン(1.6mg/kg)、またはフォルスコリン(1.6mg/kg)およびヌーペプト(0.05μg/kg)を腹腔内に処置したパーキンソン症候群ラットから得た中脳切片における平均ベースライン酸素消費速度(OCR)のグラフを示す。(*:野生型に対してp<0.05、**:PINK1-KO/未処置に対してp<0.05、一元配置ANOVA、テューキーの検定、N=両方の性の7〜11匹のラット/群)。データから、パーキンソン症候群ラットの中脳における酸化的リン酸化の減少を逆転させるには、フォルスコリンまたはフォルスコリンおよびヌーペプトの腹腔内注射をすれば十分であることが示される。
【０１３５】
野生型ラットおよびPINK1-KOラットの別の群を犠死させ、生理食塩水、続いて4％ホルムアルデヒドを心臓内に灌流させた。野生型ラットおよびPINK1-KOラットから得た中脳切片をチロシンヒドロキシラーゼ(TH、紫)について免疫染色して、中脳ドーパミン神経細胞を同定した。TH陽性神経細胞の存在量についての画像に基づく定量は、NIH Image Jを用いる画像解析によって各中脳切片におけるTH染色の濃度積分値を測定することにより、評価した。図13は、ビヒクルで処置した、フォルスコリン(1.6mg/kg)で処置した、またはフォルスコリン(1.6mg/kg)およびヌーペプト(0.05μg/kg)で処置した雌のPINK1-KOラットから得た中脳切片における、TH特異的免疫蛍光法からまとめられた平均濃度積分値の棒グラフを示す。(*:野生型/ビヒクルに対してp<0.05、**:PINK1-KO/ビヒクルに対してp<0.05、一元配置ANOVA、テューキーの検定、N=4〜7匹のラット/群)。データから、フォルスコリンまたはフォルスコリンおよびヌーペプトの腹腔内投与によって、パーキンソン症候群ラットの中脳ドーパミン神経細胞の減少が完全に逆転することが示される。これらのデータから、フォルスコリンおよびヌーペプトがPDのインビボモデルにおいて神経変性を改善することが示される。
【０１３６】
実施例6:エアロゾル化フォルスコリン製剤
本発明は、下記に挙げたような、対象にフォルスコリンを鼻腔内送達するのに適したエアロゾル化可能な製剤を提供する。
【０１３７】
リン酸緩衝生理食塩水に溶かした水溶性フォルスコリン
1.68gのK2HPO4(60nM)、5.28gのKH2PO4(40nM)、および81.8gのNaCl(1.4nM)を混合する。合計体積が1Lになるまで、蒸留H2Oを加える。溶液をオートクレーブし滅菌する。pHメーターを用いて、溶液のpHを7.4に調整する。1gの安息香酸ナトリウム(0.1％)またはプロピル安息香酸を添加する。最大2mgの凍結乾燥し滅菌した医薬品グレードの水溶性フォルスコリン類似体、例えば水溶性類似体NKH477を、1mL容シリンジを用いて1mLのPBSを加えて、再調製する。鼻腔内送達の前に、再調製したフォルスコリンを鼻腔内噴霧器(NADネイザル(nasal))の受入れ容器に移す。
【０１３８】
図14は、指定された最終濃度(脳脊髄液中2.5μMおよび10μM)のフォルスコリン(1つの鼻孔につき6μl、pH7.4のPBS中で希釈した医薬品グレードのフォルスコリン)を24時間鼻腔内投与すると、野生型ロングエバンス頭巾斑ラットの皮質におけるPKA活性が有意に上昇することを示す。このデータから、フォルスコリンの鼻腔内適用により、血液脳関門を効率的に通過して、投与から24時間以内に神経保護性PKA活性が上昇することが示される。(*:0μMに対してp<0.05、一元配置ANOVA、テューキーの検定、N=3匹のラット/群)。
【０１３９】
比率1:1の不溶型フォルスコリンおよび水溶型フォルスコリン
1.68gのK2HPO4(60nM)、5.28gのKH2PO4(40nM)、および81.8gのNaCl(1.4nM)を混合する。合計体積が1Lになるまで、蒸留H2Oを加える。溶液をオートクレーブし滅菌する。pHメーターを用いて、溶液のpHを7.4に調整する。フォルスコリン15mgを1.0mLのDMSOで希釈する(36.5mM)。フォルスコリン/DMSOストック30μlを、15mgのNKH477を含む滅菌リン酸緩衝生理食塩水(PBS)0.900mLで希釈する。鼻腔内送達の前に、この配合物を鼻腔内噴霧器(NADネイザル)の受入れ容器に移す。
【０１４０】
血液脳関門浸透が高められたフォルスコリン製剤
ラウリン酸エチル(1〜10％v/v)、ポリソルベート80(Tween80)(1％v/vまたは10％v/v)、プロピレングリコール(40％v/v)、およびエタノール(40％v/v)を混合して、マイクロエマルジョンを形成させる。最大2mgの凍結乾燥し滅菌した医薬品グレードのフォルスコリンを、1mL容シリンジを用いて1mLのマイクロエマルジョンを加えて、再調製する。鼻腔内送達の前に、この配合物を鼻腔内噴霧器(NADネイザル)の受入れ容器に移す。
【０１４１】
他の態様
本明細書において、変動要素の任意の定義における要素の一覧の記載は、列挙された要素の任意の単一の要素または組合せ(もしくは部分的組合せ)としての、その変動要素の定義を含む。本明細書における態様の記載は、任意の単一の態様としてのその態様、または他の任意の態様もしくはそれらの一部分と組み合わせられたその態様を含む。
【０１４２】
本明細書に引用される、それぞれおよびすべての特許、特許出願、および刊行物の開示内容は、これによって、そっくりそのまま参照により本明細書に組み入れられる。特定の態様に関して本発明を開示したが、本発明の他の態様および変形が、本発明の真の精神および範囲から逸脱することなく当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、このような態様および等価な変形すべてを含むと解釈されるものとする。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【国際調査報告】
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