(57)【要約】  Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸塩の鉄塩、モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物、任意選択で脂肪酸または脂肪酸の混合物を含む組成物、ならびにそのような組成物を調製する方法。組成物は、鉄欠乏症の治療および予防のための医薬として、栄養補助食品として、ならびに食品添加物として有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ｉ）Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸塩の鉄塩、および
（ｉｉ）モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物
を含む、組成物。
【請求項２】
組成物が、組成物の総重量の少なくとも０．５％の鉄をＣ８〜Ｃ２４脂肪酸の鉄塩の形態で含む、請求項１に記載の組成物。
【請求項３】
鉄塩がＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸の鉄塩である、請求項１または２に記載の組成物。
【請求項４】
脂肪酸が飽和脂肪酸である、請求項１から３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物が、１つまたは複数のＣ８〜Ｃ２４脂肪酸のモノおよび／またはジグリセリドを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物が、モノおよび／もしくはジグリセリドのモノエステル化クエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのモノエステル化クエン酸エステルの混合物を含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
構成成分（ｉｉ）と構成成分（ｉ）の重量比が、２０：１〜１：１である、請求項１から６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
（ｉｉｉ）脂肪酸もしくはその塩、または脂肪酸もしくは脂肪酸塩の混合物
を更に含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
構成成分（ｉｉｉ）が、１つまたは複数のＣ８〜Ｃ２４脂肪酸またはその塩を含む、請求項８に記載の組成物。
【請求項１０】
療法における使用のための、請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１１】
鉄欠乏症または鉄欠乏に関連する障害の治療または予防における使用のための、請求項１から１０のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
経口投与のための、請求項１から１１のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
治療有効量の請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物と、任意選択で薬学的に許容される賦形剤とを含む、医薬製剤。
【請求項１４】
請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物が、製剤の１〜９９重量％を構成する、請求項１３に記載の医薬製剤。
【請求項１５】
経口投与のための、請求項１３または１４に記載の医薬製剤。
【請求項１６】
硬カプセル、軟カプセル、または液体の形態の、請求項１３から１５のいずれか一項に記載の医薬製剤。
【請求項１７】
請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物を含む、栄養補助食品。
【請求項１８】
請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物を含む、食品添加物。
【請求項１９】
請求項１から９のいずれか一項に記載の組成物を含む、食料品。
【請求項２０】
鉄含有組成物の調製方法であって、
−  Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸塩の鉄塩、モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物、および任意選択で脂肪酸または脂肪酸の塩を混合する工程；
−  水および任意選択で塩基性化剤を添加する工程；ならびに
−  混合物を処理して、分散体を得る工程；
による、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、鉄含有組成物、ならびに例えば、療法における、特に鉄欠乏症および鉄欠乏性貧血の治療または予防におけるその使用に関する。より詳細には、本発明は、鉄欠乏症の治療または予防における経口使用に適した鉄含有組成物に関する。
【背景技術】
【０００２】
鉄（Ｆｅ）は、動物の身体の全ての細胞に存在する元素であり、酸素の輸送、電子伝達およびＤＮＡの合成など、いくつかの重要な機能を有する。
生理学的に、鉄は、主に糞便および尿を介した排出により、同様に例えば月経期の妊娠可能な女性などにおける血液の損失により身体から失われる。身体からの鉄の損失を補うのに不十分な鉄の摂取は、結果的に鉄欠乏症の発生をもたらし、修正されないと、最初にいわゆる潜在性鉄欠乏症（ｌａｔｅｎｔ  ｉｒｏｎ  ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）（ＬＩＤ）、続いて鉄欠乏性赤血球生成（ｉｒｏｎ−ｄｅｆｉｃｉｅｎｔ  ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓ）（ＩＤＥ）、最後に鉄欠乏性貧血をもたらす。
【０００３】
鉄の生理的損失に加えて、様々な病態が、過剰な血液損失および／または鉄の吸収困難のいずれかに起因して鉄欠乏症および鉄欠乏性貧血と関連する。胃腸からの損失の原因は、炎症性腸疾患、悪性腫瘍、または胃潰瘍などの疾患による胃腸出血でありうる。鉄の吸収不良は、鉄の吸収困難に起因して起こることがあり、セリアック病、クローン病、または胃の外科手術後において起こりうる。
【０００４】
鉄欠乏性貧血の一部の症状は、全身の脱力感（ｇｅｎｅｒａｌ  ｗｅａｋｎｅｓｓ）、めまい、重度の疲労感（ｅｘｔｒｅｍｅ  ｆａｔｉｇｕｅ）、急速な心拍（ｆａｓｔ  ｈｅａｒｔｂｅａｔ）、正常より蒼白な皮膚、胸痛、頭痛などである。貧血が未治療のまま放置されると、心不全、その後の酸素の欠如を補うための心臓の肥大などの心臓に関連する追加の合併症が起こりうる。小児および乳幼児において、鉄欠乏症は、発育遅延および不可逆的認知障害を引き起こすことがある。
【０００５】
妊娠期間中の鉄欠乏症は、早産および胎盤機能不全のリスクの増加を含む、妊娠合併症のリスクを増加する。鉄欠乏症の妊婦の胎児は、子宮内胎児死亡のリスクの増加、ならびに人生後半での統合失調症のリスクの増加を有する。
【０００６】
他より鉄欠乏症にかかる頻度の多い人口群には、妊娠可能または妊娠中の女性、食欲不振症の人、高齢者、菜食主義者、および供血者が含まれる。更に、鉄欠乏症は、炎症性腸疾患、がん、例えば、胃腸系のがん、慢性腎疾患、激しい子宮出血、および分娩後などの、様々な障害および状態に一般的に関連する。多くの発展途上国では、鉄欠乏症は、様々な寄生虫感染、例えばマラリアまたは蠕虫感染の後に続くこともある。
【０００７】
鉄欠乏性貧血を含む鉄欠乏症の治療は、通常、多くの場合に鉄含有薬剤を非経口または経腸、例えば経口投与のいずれかにより使用して、鉄の摂取を増加することを伴う。鉄調合剤の最も一般的な形態は、液体または固体のいずれかの形態（例えば、錠剤およびカプセル剤）の経口調合剤である。最も一般的な鉄薬剤は、例えば、硫酸鉄などの鉄塩を含有する経口投与用の錠剤である。しかし、多くの経口鉄薬剤は、嘔気、便秘または下痢などの副作用によって制限されており、低い患者服薬遵守を生じうる。加えて、鉄の取り込みは多くの場合に非常に低く、多くの場合に１０％未満であり、時には投与された鉄のわずか１％が吸収され、特に重篤な貧血の場合になどの急速な増加が望ましい状況下では、鉄の血中レベルの許容されないほどゆっくりとした増加速度を生じうる。低い吸収速度は、鉄調節タンパク質のヘプシジンが腸の鉄取り込みを阻害する炎症の存在下で、特に一般的である。
【０００８】
ゆっくりとした応答および／または不十分な耐性の場合、鉄は、例えば、静脈内注射または注入により非経口的に投与される必要がありうる。そのような投与は、鉄欠乏症と戦うには多くの場合に効率的であるが、より高価であること、鉄の投与に医療関係者を要すること、および投与様式に典型的に関連して経験する不快感が妨げになっている。患者が治療を受けるのに通院する必要もあり、このことは時間がかかり、仕事を休むことになりうる。
【０００９】
したがって、好ましくは、副作用が低減され、炎症の存在に無関係に身体への取り込みが高く、好ましくは経口投与されうる、更なる鉄含有調合剤の医学的必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様は、（ｉ）Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸塩のＦｅ塩と、（ｉｉ）モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物とを含む組成物である。
【００１１】
一部の実施例では、（ｉ）Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸塩のＦｅ塩、（ｉｉ）モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物、ならびに（ｉｉｉ）Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸塩またはその塩を含む組成物が提供される。
【００１２】
更なる態様は、療法において、例えば、鉄欠乏症または鉄欠乏に関連する障害の治療において使用される、本明細書に開示されている組成物である。
更なる態様は、鉄欠乏症または鉄欠乏に関連する障害の予防に使用される、本明細書に開示されている組成物である。
【００１３】
更なる態様は、治療有効量の本明細書に開示されている組成物、および任意選択で薬学的に許容される賦形剤を含む医薬製剤である。
更なる態様は、食品添加物としての、または食品添加物の調製における、または食料品の調製における、本明細書に開示されている組成物の使用である。
【００１４】
更なる態様は、本明細書に開示されている組成物を含む食品添加物または食料品である。
更なる態様は、鉄含有組成物の調製方法であって、鉄塩、例えば、Ｆｅ（ＩＩＩ）塩、モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物、および任意選択で１つまたは複数の脂肪酸を混合すること、水および塩基性化剤を添加すること、ならびに混合物を処理して、安定した分散体を得ることによる方法である。
【００１５】
また、本明細書に提供されるものは、鉄欠乏症、または鉄欠乏に関連する、もしくは鉄欠乏により引き起こされる疾患もしくは障害の治療方法であって、治療有効量の本明細書に開示されている組成物または製剤を、そのような治療の必要な温血動物、例えば哺乳動物、特にヒトに投与することによる方法である。
【００１６】
本明細書に更に提供されるものは、鉄欠乏症、または鉄欠乏に関連する、もしくは鉄欠乏により引き起こされる疾患もしくは障害の治療のための医薬の製造における、本明細書に開示されている組成物の使用である。
【図面の簡単な説明】
【００１７】
【図１】明視野顕微鏡法を使用して得た、実施例１の分散体における粒子のサイズ分布曲線である。
【図２】Ｃａｃｏ−２細胞の鉄取り込みを示す棒グラフであり、５０μＭのＦｅを含有するアスコルビン酸第一鉄（Ｆｅ−ＡＡ）からの、ならびに５０μＭのＦｅ（Ｃｉｔｒｅｍ  Ｓｔ  ５０ｕＭ）および１００μＭのＦｅ（Ｃｉｔｒｅｍ  Ｓｔ  １００ｕＭ）をそれぞれ含有する、実施例１に記載されているように調製された２つの本発明の分散体からのタンパク質の総濃度（ｎｇ  Ｆｅ／ｍｇタンパク質）に正規化されている。
【図３】アスコルビン酸第一鉄（ＦｅＳＯ４：ＡＡの１：１）（［２１ｍＭの５９Ｆｅ］、１００μｌ）または実施例４（［２１ｍＭの５９Ｆｅ］、１００μｌ）の胃管栄養法を受けたマウス（ｎ＝６）の４時間後の正常または鉄欠乏症マウスの十二指腸および屠殺体において測定した、吸収５９Ｆｅ由来の放射能により決定した線量％（ＣＰＭ）を示す棒グラフである。＊（ｐ≦０．０５）が一元配置ＡＮＯＶＡ、テューキーの検定は統計的に有意である。
【図４】アスコルビン酸第一鉄（ＦｅＳＯ４：ＡＡの１：１）（［２１ｍＭの５９Ｆｅ］、１００μｌ）の胃管栄養法を受けたマウスの４時間後の正常食餌マウス（鉄欠乏症なし）の肝臓、脾臓、腎臓および屠殺体において測定した、吸収５９Ｆｅ由来の放射能により決定した線量％（ＣＰＭ）を示す棒グラフである。
【図５】実施例４の製剤（［２１ｍＭの５９Ｆｅ］、１００μｌ）の胃管栄養法を受けたマウスの４時間後の正常食餌マウス（鉄欠乏症なし）の肝臓、脾臓、腎臓および屠殺体において測定した、吸収５９Ｆｅ由来の放射能により決定した線量％（ＣＰＭ）を示す棒グラフである。
【図６】アスコルビン酸第一鉄（ＦｅＳＯ４：ＡＡの１：１）（［２１ｍＭの５９Ｆｅ］、１００μｌ）の胃管栄養法を受けたマウスの４時間後の鉄欠乏症マウスの肝臓、脾臓、腎臓および屠殺体において測定した、吸収５９Ｆｅ由来の放射能により決定した線量％（ＣＰＭ）を示す棒グラフである。
【図７】実施例４の製剤（［２１ｍＭの５９Ｆｅ］、１００μｌ）の胃管栄養法を受けたマウスの４時間後の鉄欠乏マウスの肝臓、脾臓、腎臓および屠殺体において測定した、吸収５９Ｆｅ由来の放射能により決定した線量％（ＣＰＭ）を示す棒グラフである。
【図８】ヘモグロビン充足実験の設計を示すスキームである。
【図９】図８に概説された実験後に測定されたＣＤ１マウスのＨｂ（ｇ／ｄＬ）を示す棒グラフである。ｎ＝６匹のマウスであり、＊ＡＮＯＶＡ一元配置検定を使用した対照群との比較においてｐ＜０．０５である。
【図１０】（１）正常マウス、（２）貧血マウス、（３）ＦｅＳＯ４（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウス、および（４）実施例１の製剤（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウスの肝臓における、ｎｍｏｌ／ｍｇのタンパク質で表したマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の濃度を示す棒グラフであり、ｎ＝１群当り６匹である。ＡＮＯＶＡ一元配置検定を使用して、群間に統計的な差はなかった。
【図１１】（１）正常マウス、（２）貧血マウス、（３）ＦｅＳＯ４（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウス、および（４）実施例１の製剤（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウスの十二指腸粘膜における、ｎｍｏｌ／ｍｇのタンパク質で表したマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の濃度を示す棒グラフであり、ｎ＝１群当り６匹である。ＡＮＯＶＡ一元配置検定を使用して、群間に統計的な差はなかった。
【図１２】（１）正常マウス、（２）貧血マウス、（３）ＦｅＳＯ４（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウス、および（４）実施例１の製剤（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウスの肝臓において、５０ｍｇの肝臓湿組織（ｗｅｔ  ｔｉｓｓｕｅ）をＥＬＩＳＡにより測定して低減されたＧＳＨ（ｍｇ／Ｌ）濃度を示す棒グラフである。ｎ＝１群当り６匹である。肝臓組織にＡＮＯＶＡ一元配置検定を使用して、群間に統計的な差はなかった。
【図１３】（１）正常マウス、（２）貧血マウス、（３）ＦｅＳＯ４（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウス、および（４）実施例１の製剤（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウスの十二指腸粘膜において、２０ｍｇの十二指腸粘膜をＥＬＩＳＡにより測定して低減されたＧＳＨ（ｍｇ／Ｌ）濃度を示す棒グラフである。ｎ＝１群当り６匹である。未治療群と比較してＦｅＳＯ４治療マウス群のみが十二指腸において高いレベルのＧＳＨを表した（Ｐ≦０．０５、ＡＮＯＶＡ一元配置検定）。
【図１４】（１）正常マウス、（２）貧血マウス、（３）ＦｅＳＯ４（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウス、および（４）実施例１の製剤（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウスの肝臓における、カタラーゼ活性をＵ／ｍＬで示す棒グラフである。ｎ＝１群当り６匹である。肝臓組織にＡＮＯＶＡ一元配置検定を使用して、群間に統計的な差はなかった。
【図１５】（１）正常マウス、（２）貧血マウス、（３）ＦｅＳＯ４（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウス、および（４）実施例１の製剤（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウスの十二指腸粘膜における、カタラーゼ活性をＵ／ｍＬで示す棒グラフである。ｎ＝１群当り６匹である。肝臓組織にＡＮＯＶＡ一元配置検定を使用して、群間に統計的な差はなかった。
【図１６】（１）正常マウス、（２）貧血マウス、（３）ＦｅＳＯ４（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウス、および（４）実施例１の製剤（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウスの肝臓における非ヘミ鉄レベルのボックスプロットである。肝臓における非ヘミ鉄のレベルは、鉄欠乏症群と比較して、実施例１で治療した群において有意に（ｐ≦０．０５、ＡＮＯＶＡ一元配置検定）高く、対照群と類似していた。ｎ＝６匹／群である。
【図１７】（１）正常マウス、（２）貧血マウス、（３）ＦｅＳＯ４（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウス、および（４）実施例１の製剤（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ、１０日間）で治療した貧血マウスの血漿における血漿中のフェリチン濃度をｎｇ／ｍＬで表す棒グラフである。フェリチンのレベルは、ＦｅＳＯ４で治療した群より実施例１の製剤で処理した群において高かった（ｐ≦０．０５、ＡＮＯＶＡ一元配置検定）。ｎ＝５匹／群である。
【図１８】Ｃａｃｏ−２細胞の鉄取り込みを示す棒グラフであり、実施例１、実施例２、および実施例５のそれぞれに記載されているように調製された、３つの異なる本発明の分散体からのタンパク質の総濃度（ｎｇ  Ｆｅ／ｍｇタンパク質）に正規化されている。
【発明を実施するための形態】
【００１８】
定義
本明細書で使用されるとき、不定冠詞「ａ」および「ａｎ」、ならびに定冠詞「ｔｈｅ」は、特に文脈から明白に示されない限り、単数の指示対象と同様に複数の指示対象も含む。
【００１９】
本明細書で使用されるとき、「投与」、「投与すること」などは、対象（例えば、哺乳動物、好ましくは、ヒト）への薬、薬物、または治療薬の投与、分配、または適用を意味する。
【００２０】
本明細書で使用されるとき、「有効」は、療法に使用されるときに妥当な利益／危険比に相当して、過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激、またはアレルギー応答）を有することなく望ましい治療応答を生じるのに十分な（本発明の組成物の）量を指す。
【００２１】
本明細書で使用されるとき、「薬学的に許容される」は、通常の使用において一般に安全および非毒性である、すなわち、妥当な利益／危険比に相当して、過度の有害な副作用（例えば、毒性、刺激、またはアレルギー応答）を有することなく、ヒトおよび／または動物における使用に適しているものを指す。
【００２２】
本明細書で使用されるとき、「賦形剤」は、薬剤の活性成分と共に処方され、長期安定化のため、固体製剤を増量するため、担体および／または希釈剤として作用するため、最終剤形の活性成分に、例えば、吸収を促進する、粘度を減少する、または溶解度を増強することにより、治療の増強を付与するため、などの目的で含まれる物質である。賦形剤は、また、例えば、粉末流動性を促進すること、または非粘性を提供することにより、製造方法に有用でありうる。賦形剤の例は、接着防止剤（ａｎｔｉａｄｈｅｒｅｎｔ）、結合剤、コーティング、色素、崩壊剤、香味料、流動促進剤、滑沢剤、防腐剤、吸着剤、甘味料およびビヒクル（担体）である。
【００２３】
本明細書で使用されるとき、「症状」には、疾患または症状に関連する任意の臨床的または検査室的出現が含まれ、対象が知覚または観察できるものに限定されない。
本明細書で使用されるとき、「治療すること」、「治療」などには、治療対象において、例えば、哺乳動物、好ましくはヒトにおいて、状態、障害もしくは疾患が起こるのを予防すること、および／または状態、障害もしくは疾患を改善する、逆転する、もしくは治癒することが含まれる。
【００２４】
本明細書で使用されるとき、「対象」または「患者」は、哺乳動物および鳥類から選択される温血動物（ヒトを含む）を指す。
「哺乳動物」は、好ましくはヒトを指すが、非ヒト動物、例えば、愛玩動物（例えば、イヌおよびネコ）、家畜（例えば、ウシ、ブタおよびヒツジ）、ウマなども含まれる。
【００２５】
「トリ」は、任意の種類のトリ、例えば、メンドリ、ニワトリ、シチメンチョウ、アヒルなどの家禽、または籠で飼われるトリ、例えば、インコ、オウムなどを指す。
本明細書で使用されるとき、用語「持続放出」は、血中（例えば、血漿中）濃度（レベル）が長期間にわたって、例えば２４時間まで、またはそれよりも長くにわたって治療範囲内であるが、毒性レベルを下回るように維持される速度での経口剤形からの活性成分の放出を指す。
【００２６】
本明細書で使用されるとき、用語「遅延放出」は、対象による摂取時に直ぐに起こらないが、投与量が対象の身体中の標的部位、例えば腸に到達するまで遅延される、経口剤形からの活性成分の放出を指す。
【００２７】
本明細書で使用されるとき、「モノグリセリド」（または、「モノアシルグリセロール」）は、下記式の化合物を指し、
【００２８】
【化１】
2021536493.tif 000002
【００２９】
式中、Ｒはアシル基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−であり、Ｒ’は、飽和または不飽和脂肪族基である。
本明細書で使用されるとき、「飽和モノまたはジグリセリド」は、本明細書上記に定義されたモノまたはジグリセリドを指し、各Ｒ’は、飽和脂肪族部分である。
【００３０】
本明細書で使用されるとき、「不飽和モノまたはジグリセリド」は、本明細書上記に定義されたモノまたはジグリセリドを指し、少なくとも１つのＲ’は、不飽和脂肪族部分である。
【００３１】
本明細書で使用されるとき、「ジグリセリド」（または、「ジアシルグリセロール」）は、下記式の化合物を指し、
【００３２】
【化２】
2021536493.tif 000003
【００３３】
式中、各Ｒは、独立して選択されたアシル基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）であり、各Ｒ’は、飽和および不飽和脂肪族部分から独立して選択された脂肪族基である。
本明細書で使用されるとき、「飽和脂肪族部分」は、式ＣｎＨ２ｎ＋１の分岐鎖または非分岐鎖ヒドロカルビル基を指し、式中、ｎは、例えば５〜２５の整数であってもよい。
【００３４】
本明細書で使用されるとき、「Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−」は下記式の部分である。
【００３５】
【化３】
2021536493.tif 000004
【００３６】
本明細書で使用されるとき、「飽和脂肪族部分」は、式ＣｎＨ２ｎ＋１の分岐鎖または非分岐鎖ヒドロカルビル基を指し、式中、ｎは、例えば５〜２５の整数であってもよい。
本明細書で使用されるとき、「不飽和脂肪族部分」は、ｎ個の炭素原子およびｐ個の二重結合を含有する式ＣｎＨ２（ｎ−ｐ）＋１の分岐鎖または非分岐鎖ヒドロカルビル基を指し、式中、ｎは、例えば５〜２５の整数であってもよく、ｐは、例えば１〜３の整数であってもよく、任意の２個の二重結合は、少なくとも１個のメチレン基（−ＣＨ２−）で分離されている。
【００３７】
本明細書で使用されるとき、「クエン酸エステル」は、モノエステル化、ジエステル化、またはトリエステル化クエン酸を指し、例えば下記式である。
【００３８】
【化４】
2021536493.tif 000005
【００３９】
クエン酸に関して本明細書で使用されるとき、「モノエステル化」は、１個のカルボン酸官能基のみがエステル化されているクエン酸分子、すなわち、式（ａ）または（ｂ）のクエン酸分子を意味する。
【００４０】
【化５】
2021536493.tif 000006
【００４１】
本明細書で使用されるとき、「モノおよび／またはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物」には、１つまたは複数のモノおよび／またはジグリセリドのモノ、ジおよびトリエステル化クエン酸エステルの混合物、例えば、市販のＣｉｔｒｅｍが含まれる。
【００４２】
用語「塩基性化剤」は、本明細書で使用されるとき、水溶液のｐＨを上昇させることができる薬剤を指し、例えば、金属水酸化物および炭酸塩から、例えば、炭酸ナトリウムおよび炭酸カリウムから選択される薬剤である。
【００４３】
本明細書で使用されるとき、特に示されない限りまたは文脈から明白ではない限り、用語「Ｆｅイオン」は、酸化状態（ＩＩ）（すなわち、Ｆｅ２＋）または（ＩＩＩ）（すなわち、Ｆｅ３＋）、好ましくは酸化状態（ＩＩＩ）の元素鉄（Ｆｅ）のイオンを指す。
【００４４】
様々な出版物への参照が本明細書において行われており、これらの出版物の内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
第１の態様は、（ｉ）Ｆｅイオンと、（ｉｉ）モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物とを含む組成物に関する。
【００４５】
構成成分（ｉ）
構成成分（ｉ）は、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸のＦｅ塩を含む。好ましくは、Ｆｅ（鉄）はＦｅ（ＩＩＩ）であるが、一部の鉄は、Ｆｅ（ＩＩ）としても存在しうる。一部の実施形態において、鉄はＦｅ（ＩＩＩ）として存在する。一部の実施形態において、鉄はＦｅ（ＩＩＩ）およびＦｅ（ＩＩ）として存在する。
【００４６】
Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸のＦｅ塩は、脂肪酸の鉄塩であり、例えば、Ｃ８〜Ｃ２２脂肪酸、もしくはＣ８〜Ｃ２０脂肪酸、もしくはＣ８〜Ｃ１８脂肪酸、もしくはＣ１０〜Ｃ１８脂肪酸、もしくはＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸、もしくはＣ１４〜Ｃ８脂肪酸の鉄塩、またはこれらの塩のいずれかの水和物である。Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸は、通常、食用脂肪酸である。
【００４７】
一部の実施形態において、構成成分（ｉ）は、Ｃ１０〜Ｃ２４脂肪酸、またはＣ１０〜Ｃ２２脂肪酸、またはＣ１０〜Ｃ２０脂肪酸、またはＣ１０〜Ｃ１８脂肪酸の鉄塩である。一部の実施形態において、構成成分（ｉ）は、Ｃ１２〜Ｃ２４脂肪酸、またはＣ１２〜Ｃ２２脂肪酸、またはＣ１２〜Ｃ２０脂肪酸、またはＣ１２〜Ｃ１８脂肪酸の鉄塩である。一部の実施形態において、構成成分（ｉ）は、Ｃ１４〜Ｃ２４脂肪酸、またはＣ１４〜Ｃ２２脂肪酸、またはＣ１４〜Ｃ２０脂肪酸、またはＣ１４〜Ｃ１８脂肪酸の鉄塩である。一部の実施形態において、構成成分（ｉ）は、Ｃ１６〜Ｃ２４脂肪酸、またはＣ１６〜Ｃ２２脂肪酸、またはＣ１６〜Ｃ２０脂肪酸、または例えば１８脂肪酸の鉄塩である。これらの実施形態の一部において、脂肪酸は飽和されている。
【００４８】
一部の実施形態において、構成成分（ｉ）は、脂肪酸の鉄塩を含み、脂肪酸の塩は表１および表２に記述されている。脂肪酸の鉄塩は、市販されている、または例えば、米国特許第５，４３４，２７７号または米国特許第７，７０５，１６９号に開示されている方法のいずれかに従って調製されうる。一部の実施形態において、構成成分（ｉ）は、ステアリン酸鉄、例えばＦｅ３Ｏ（ステアリン酸塩）６を含む。
【００４９】
一部の特定の実施形態において、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸鉄塩は、式（Ａ）の炭素を含む。
【００５０】
【化６】
2021536493.tif 000007
【００５１】
式中、各Ｒは、独立して選択された脂肪族部分であり、少なくとも１つのＲ、好ましくは各Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸の脂肪族鎖に対応する。例えば、一部の特定の実施形態において、式（Ａ）の鉄塩は、各Ｒが、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、またはステアリン酸の脂肪族鎖から選択される塩である。これらの実施形態の一部において、各Ｒは、ラウリン酸の脂肪族（Ｃ１１）鎖から選択される。これらの一部の他の実施形態において、各Ｒは、ミリスチン酸の脂肪族（Ｃ１３）鎖から選択される。これらの一部の他の実施形態において、各Ｒは、パルミチン酸の脂肪族（Ｃ１５）鎖から選択される。これらの一部の他の実施形態において、各Ｒは、ステアリン酸の脂肪族（Ｃ１７）鎖から選択される。
【００５２】
式（Ａ）の錯陽イオンは、一般分子式Ｆｅ３Ｏ（ＲＣ（Ｏ）Ｏ）６（Ｈ２Ｏ）３＋により表されうることが留意される。したがって、式（Ａ）の陽イオンを含有する塩は、式［Ｆｅ３Ｏ（ＲＣ（Ｏ）Ｏ）６（Ｈ２Ｏ）３＋］ｎＬｎ−の塩と書くこともでき、式中、ｎは、少なくとも１の整数であり、例えば、ｎは１または２であり、Ｌｎ−は、ｎ個の陰電荷を担持する部分である。
【００５３】
一部の実施形態において、Ｌｎ−は、脱保護Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、ＲＡＣＯＯ−であり、すなわち、塩は、分子式［Ｆｅ３Ｏ（ＲＣ（Ｏ）Ｏ）６（Ｈ２Ｏ）３］＋ＲＡＣ（Ｏ）Ｏ−（代替的書式：ＲＡＣ（Ｏ）Ｏ［Ｆｅ３Ｏ（ＲＣ（Ｏ）Ｏ）６（Ｈ２Ｏ）３］）により表すことができる錯塩である。
【００５４】
これらの一部の実施形態において、ＲＡおよび各Ｒは、本明細書上記に記述されたＣ８〜Ｃ２４脂肪酸に対応する脂肪族部分であり、例えば、ＲＡおよび各Ｒは、Ｃ８〜Ｃ２０脂肪酸、またはＣ１０〜Ｃ２０脂肪酸、またはＣ１２〜Ｃ２０脂肪酸、例えばＣ８〜Ｃ１８脂肪酸に対応する脂肪族部分である。一部の実施形態において、脂肪酸は飽和されている。一部の実施形態において、全てのＲは同じであり、ＲＡは、Ｒと同じである、または異なっている。一部の実施形態において、ＲＡおよび全てのＲは、同じである。
【００５５】
一部の実施形態において、ＲＡおよび各Ｒは、表１または２に示されている任意の酸から独立して選択される脂肪酸の脂肪族部分に対応し、例えば、全てラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、またはステアリン酸に対応する。一部の実施形態において、ＲＡおよび全てのＲは、ステアリン酸に対応する（すなわち、ＲＡおよび各Ｒは、ｎ−ヘプタデシルである）。一部の実施形態において、ＲＡおよび全てのＲは、ステアリン酸に対応する（すなわち、ＲＡおよび各Ｒは、ｎ−ヘプタデシルである）。一部の実施形態において、ＲＡおよび全てのＲは、ラウリン酸に対応する（すなわち、ＲＡおよび各Ｒは、ｎ−ウンデシルである）。
【００５６】
一部の他の実施形態において、Ｌｎ−はＳＯ４２−であり、すなわち、塩は、分子式［Ｆｅ３Ｏ（ＲＣ（Ｏ）Ｏ）６（Ｈ２Ｏ）３＋］２ＳＯ４２−（または［Ｆｅ３Ｏ（ＲＣ（Ｏ）Ｏ）６（Ｈ２Ｏ）３］２ＳＯ４）により表すことができる。
【００５７】
式［Ｆｅ３Ｏ（ＲＣ（Ｏ）Ｏ）６（Ｈ２Ｏ）３＋］ｎＬｎ−の塩において、各Ｒは、本明細書上記に記述されたＣ８〜Ｃ２４脂肪酸の脂肪族鎖に対応する独立して選択された部分である。一部の実施形態において、全てのＲは、同じである。
【００５８】
一部の更なる実施形態において、構成成分（ｉ）は、式［Ｆｅ３Ｏ（ＲＣ（Ｏ）Ｏ）６（Ｈ２Ｏ）３＋］ｎＬｎ−の塩の水和物、例えば、１または２個の水分子を含む水和物として提供される。したがって、Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸の鉄塩への任意の参照は、本明細において特に指定のない限り、または文脈から明白ではない限り、その水和物への参照でもあることが理解されるべきである。
【００５９】
構成成分（ｉｉ）
構成成分（ｉｉ）は、モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物を含む。一部の実施形態において、構成成分（ｉｉ）は、モノおよび／またはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物であり、例えば、Ｃｉｔｒｅｍと参照される種類の市販の混合物である。
【００６０】
本明細下記では、「モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物」を、「クエン酸エステル構成成分」または「構成成分（ｉｉ）」と集合的に呼ぶことができる。本明細書に使用されるとき、モノおよび／またはジグリセリドのクエン酸エステルは、式（Ｉ）により表すことができる。
【００６１】
【化７】
2021536493.tif 000008
【００６２】
式中、Ｒ１、Ｒ２、およびＲ３のうちの１つは、クエン酸部分を表し、他の２つは、水素（Ｈ）または式Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−の脂肪酸部分を表す。Ｒ１が（モノエステル化）クエン酸部分である式（Ｉ）の化合物を例示する（非限定）例が、式（Ｉ’）により表されている。
【００６３】
【化８】
2021536493.tif 000009
【００６４】
式中、Ｒ２およびＲ３は、Ｈおよび脂肪酸残基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−から独立して選択される。
誤解を避けるため、Ｒ２およびＲ３（または、Ｒ１およびＲ３）は、両方とも、脂肪酸Ｒ’−Ｃ（Ｏ）ＯＨの残基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−であり、これらの残基は、異なっていても、同じであってもよいことが、ジグリセリドにおいて指摘される。
【００６５】
脂肪酸Ｒ’−Ｃ（Ｏ）ＯＨ（脂肪酸残基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−に対応する）は、任意の起源のもの、例えば、植物油由来のものであってもよく、例えば、飽和、一不飽和、二不飽和、または三不飽和ものであってもよく、通常は食用脂肪酸である。一部の実施形態において、脂肪酸は、不飽和、例えば、一不飽和、二不飽和または三不飽和のものである。一部の実施形態において、脂肪酸は二不飽和のものである。一部の他の実施形態において、脂肪酸は一不飽和のものである。脂肪酸は、好ましくは、非分岐鎖（直鎖）を有し、例えば、８〜２４個の炭素原子を含有する。一部の実施形態において、脂肪酸における炭素原子の数は、少なくとも１０個、少なくとも１２個、少なくとも１４個、または少なくとも１６個である。一部の実施形態において、脂肪酸における炭素原子の数は、最大で２４個、最大で２２個、最大で２０個、または最大で１８個である。一部の実施形態において、飽和酸は、表１に示されている脂肪酸のいずれか１つから選択され、Ｃ：Ｄは、脂肪酸の炭素原子の総量と、炭素−炭素二重結合の数との比である。
【００６６】
【表１】
2021536493.tif 000010
【００６７】
一部の実施形態において、飽和脂肪酸Ｒ’−Ｃ（Ｏ）ＯＨは、８〜２４個の炭素原子、または８〜２２個の炭素原子、または８〜２０個の炭素原子、または８〜１８個の炭素原子、または８〜１６個の炭素原子、または８〜１４個の炭素原子を有する脂肪酸から選択される。一部の実施形態において、飽和酸は、１０〜２４個の炭素原子、または１０〜２２個の炭素原子、または１０〜２０個の炭素原子、または１０〜１８個の炭素原子、または１０〜１６個の炭素原子、または１０〜１４個の炭素原子を有する脂肪酸から選択される。一部の実施形態において、飽和酸Ｒ’−Ｃ（Ｏ）ＯＨは、１２〜２４個の炭素原子、または１２〜２２個の炭素原子、または１２〜２０個の炭素原子、または１２〜１８個の炭素原子、または１２〜１６個の炭素原子を有する脂肪酸から選択される。一部の実施形態において、飽和酸Ｒ’−Ｃ（Ｏ）ＯＨは、１４〜２４個の炭素原子、または１４〜２２個の炭素原子、または１４〜２０個の炭素原子、または１４〜１８個の炭素原子を有する脂肪酸から選択される。
【００６８】
脂肪酸残基Ｒ’−Ｃ（Ｏ）−を形成しうる不飽和脂肪酸の一部の例は、表２に示されており、Ｃ：Ｄは、脂肪酸の炭素原子の総量と、炭素−炭素二重結合の数との比である。
【００６９】
【表２】
2021536493.tif 000011
【００７０】
一部の実施形態において、不飽和脂肪酸Ｒ’−Ｃ（Ｏ）ＯＨは、１０〜２４個、例えば、１０〜２２個、または１０〜２０個、または１０〜１８個の範囲の炭素原子の数を有する。一部の実施形態において、不飽和脂肪酸は、１２〜２４個、例えば、１２〜２２個、または１２〜２０個、または１２〜１８個の範囲の炭素原子の数を有する。一部の実施形態において、不飽和脂肪酸は、１４〜２４個、例えば、１４〜２２個、または１４〜２０個、または１４〜１８個の範囲の炭素原子の数を有する。一部実施形態において、不飽和脂肪酸は、１６〜２４個の炭素原子、または１６〜２２個の炭素原子、例えば１６〜２０個の炭素原子、例えば１６または１８個の炭素原子を有する。
【００７１】
一部の実施形態において、不飽和脂肪酸は、本明細書上記に示された炭素原子の数、および１〜５個の炭素−炭素二重結合、例えば、１〜４個の炭素−炭素二重結合、または１〜３個の炭素−炭素二重結合、例えば、１または２個の炭素−炭素二重結合を有する。一部の実施形態において、不飽和脂肪酸は、一不飽和のものである（すなわち、１個の炭素−炭素二重結合を有する）。一部の実施形態において、不飽和脂肪酸は、二不飽和のものである（すなわち、２個の炭素−炭素二重結合を有する）。一部の実施形態において、脂肪酸は、Ｃ１８脂肪酸、例えば、Ｃ１８一または二不飽和脂肪酸、特にＣ１８一不飽和脂肪酸である。一部の特定の実施形態において、脂肪酸は、Ｃ１４〜Ｃ２４一または二不飽和脂肪酸、例えば、Ｃ１４〜Ｃ２２一もしくは二不飽和脂肪酸、またはＣ１６〜Ｃ２２一もしくは二不飽和脂肪酸、例えば、Ｃ１６〜Ｃ２０一または二不飽和脂肪酸である。
【００７２】
モノおよび／またはジグリセリドのクエン酸エステル（Ｃｉｔｒｅｍ、Ｅ番号：Ｅ４７２ｃ；ＦＤＡ−ＣＦＲ番号：１７２．８３２）は、食品産業において添加物および乳化剤として使用され、毒性が非常に低い食品物質（ｆｏｏｄ  ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）と考慮されている。故に、Ｃｉｔｒｅｍは、食品への直接的な添加に「一般に安全であると考慮される」（ＧＲＡＳ）（Ｆｏｏｄ  Ｆｕｎｃｔ．２０１５，５，１４０９および本明細書における引用参考文献）に記載されていた。Ｃｉｔｒｅｍは、特に食品加工産業への様々な供給会社から購入することができ、例えば、Ａｃａｔｒｉｓ（ｗｗｗ．ａｃａｔｒｉｓ．ｃｏｍ）またはＤａｎｉｓｃｏ（ｗｗｗ．ｄａｎｉｓｃｏ．ｃｏｍ）である。
【００７３】
モノおよび／またはジグリセリドのクエン酸エステルを調製および特徴決定する一般的な方法は、よく知られており、早くも１９６０年５月２４日発行の米国特許第２，９３８，０２７号に記載されていた。
【００７４】
一実施形態によると、本明細書に開示されている組成物は、Ｃｉｔｒｅｍと一般に呼ばれている種類の、モノおよび／またはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物を含む。本発明の組成物は、特に、モノおよび／またはジグリセリドのモノエステル化クエン酸を含む。しかし、クエン酸のジおよびトリエステルも本発明の組成物に存在しうることが留意されるべきである。好ましくは、構成成分（ｉｉ）は、大きな部分のモノエステル化クエン酸を含み、すなわち、モノエステル化クエン酸分子の割合（部分）は、ジエステル化クエン酸分子の部分より多く、トリエステル化クエン酸分子の部分より多い。一部の実施形態において、少なくとも３５重量％の構成成分（ｉｉ）がモノエステル化クエン酸（モノエステル化酸の混合物を含む）である。一部の実施形態において、少なくとも５０重量％の構成成分（ｉｉ）がモノエステル化クエン酸である。一部の実施形態において、少なくとも６０重量％の構成成分（ｉｉ）がモノエステル化クエン酸である。一部の実施形態において、少なくとも７０重量％の構成成分（ｉｉ）がモノエステル化クエン酸である。一部の実施形態において、少なくとも８０重量％の構成成分（ｉｉ）がモノエステル化クエン酸である。一部の実施形態において、少なくとも９０重量％の構成成分（ｉｉ）がモノエステル化クエン酸である。一部の実施形態において、少なくとも９５重量％の構成成分（ｉｉ）がモノエステル化クエン酸である。
【００７５】
通常、構成成分（ｉｉ）は、モノおよびジグリセリドの様々なクエン酸エステルのブレンド（混合物）を含む。一部の好ましい実施形態において、ブレンドは、主に、モノおよび／またはジグリセリドのモノエステル化クエン酸エステルを含む。一部の実施形態において、モノおよび／またはジグリセリドの脂肪酸部分は、本明細書上記に記述された不飽和脂肪酸に由来する。例えば、一部の実施形態において、構成成分（ｉｉ）は、食用一不飽和Ｃ８〜Ｃ２４脂肪酸、例えば、食用一不飽和Ｃ１６〜Ｃ２０脂肪酸のモノおよび／またはジグリセリドのクエン酸エステルの大きな部分を含む。本発明の組成物に適切に存在しうるモノおよび／またはジグリセリドのクエン酸エステルの例は、ジオレオイルグリセロールシトレートである。
【００７６】
構成成分（ｉｉｉ）
一部の実施形態では、上記に記載された構成成分（ｉ）および（ｉｉ）に加えて、脂肪酸または脂肪酸の混合物である構成成分（ｉｉｉ）を含む組成物が提供される。脂肪酸構成成分（ｉｉｉ）は、１つまたは複数の脂肪酸、例えば、本明細書上記（表１および２を参照すること）に記述された１つまたは複数の脂肪酸を含んでもよい。好ましくは、構成成分（ｉｉｉ）は、本明細書上記に定義された飽和脂肪酸、例えば、１０〜２４個の炭素原子、または１２〜２４個の炭素原子、または１４〜２４個の炭素原子、例えば、１６〜２２個の炭素原子、または１６〜２０個の炭素原子を含有するものを含む。一部の実施形態において、脂肪酸構成成分（ｉｉｉ）は、ステアリン酸である。一部の実施形態において、脂肪酸構成成分（ｉｉｉ）は、ステアリン酸を含む。一部の実施形態において、脂肪酸構成成分（ｉｉｉ）は、脂肪酸の混合物、例えば、本明細書上記に定義された脂肪酸の混合物、例えば、飽和脂肪酸の混合物、または飽和および不飽和脂肪酸の混合物を含む。一部の実施形態において、脂肪酸の構成成分は、少なくとも２つの異なる脂肪酸、例えば、本明細書上記（表１および２を参照すること）に記述されたものから選択される少なくとも２つの異なる脂肪酸を含む。
【００７７】
一部の実施形態において、脂肪酸構成成分（ｉｉｉ）は、１０〜２４個の炭素原子、または１２〜２４個の炭素原子、または１４〜２４個の炭素原子、例えば、１４〜２２個の炭素原子、または１４〜２０個の炭素原子をそれぞれ含有する、少なくとも２つの異なる脂肪酸を含む。一部の実施形態において、脂肪酸構成成分（ｉｉｉ）は、ステアリン酸、および少なくとも１つの更なる脂肪酸、例えば、８〜２４個の炭素原子、または８〜２２個の炭素原子、また８〜２０個の炭素原子、例えば、８〜１８個の炭素原子、または８〜１６個の炭素原子、または８〜１４個の炭素原子を含有する脂肪酸を含む。これらの一部の実施形態において、更なる脂肪酸は、飽和脂肪酸、例えば、ミリスチン酸である。
【００７８】
例えば、一部の実施形態において、構成成分（ｉｉｉ）は、ステアリン酸などの第１の脂肪酸、および第２の脂肪酸、例えば本明細書上記に定義された第２の脂肪酸などの第２の飽和脂肪酸、例えば、ミリスチン酸を、２０：１〜１：２０、１０：１〜１：１０、または５：１〜１：５、４：１〜１：４、３：１〜１：３、２：１〜１：２、１．５：１〜１：１．５、例えば、約１：１の第１の脂肪酸と第２の脂肪酸とのモル比で含む。
【００７９】
本発明の組成物における構成成分（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の特定の重量比は、例えば、５０：１〜１：１の範囲内で変わりうる。一部の実施形態において、本発明の組成物は、構成成分（ｉｉ）および構成成分（ｉｉｉ）を、２０：１〜１：１、例えば、１０：１〜１：１、８：１〜１：１、６：１〜１：１、または５：１〜１：１の構成成分（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の重量比で含む。一部の実施形態において、本発明の組成物は、構成成分（ｉｉ）および構成成分（ｉｉｉ）を、２０：１〜２：１、１０：１〜２：１、８：１〜２：１、６：１〜２：１、または５：１〜２：１の構成成分（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の重量比で含む。一部の実施形態において、本発明の組成物は、構成成分（ｉｉ）および構成成分（ｉｉｉ）を、２０：１〜３：１、１０：１〜３：１、８：１〜３：１、６：１〜３：１、または５：１〜３：１の構成成分（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の重量比で含む。一部の実施形態において、本発明の組成物は、構成成分（ｉｉ）および構成成分（ｉｉｉ）を、２０：１〜４：１、１０：１〜４：１、８：１〜４：１、６：１〜４：１、または５：１〜４：１の構成成分（ｉｉ）と（ｉｉｉ）の重量比で含む。
【００８０】
一部の実施形態において、例えば、構成成分（ｉ）が脂肪酸の鉄塩、または脂肪酸の鉄塩の混合物を含む実施形態において、本発明の組成物は、構成成分（ｉｉ）および構成成分（ｉ）を、例えば、２０：１〜１：１、１０：１〜１：１、８：１〜１：１、６：１〜１：１、または５：１〜１：１の構成成分（ｉｉ）と（ｉ）の重量比で含むことができる。一部の実施形態において、本発明の組成物は、構成成分（ｉｉ）および構成成分（ｉ）を、２０：１〜２：１、１０：１〜２：１、８：１〜２：１、６：１〜２：１、または５：１〜２：１の構成成分（ｉｉ）と（ｉ）の重量比で含む。一部の実施形態において、本発明の組成物は、構成成分（ｉｉ）および構成成分（ｉ）を、２０：１〜３：１、１０：１〜３：１、８：１〜３：１、６：１〜３：１、または５：１〜３：１の構成成分（ｉｉ）と（ｉ）の重量比で含む。一部の実施形態において、本発明の組成物は、構成成分（ｉｉ）および構成成分（ｉ）を、２０：１〜４：１、１０：１〜４：１、８：１〜４：１、６：１〜４：１、または５：１〜４：１の構成成分（ｉｉ）と（ｉ）の重量比で含む。
【００８１】
一部の実施形態において、例えば、構成成分（ｉ）が脂肪酸の鉄塩、または脂肪酸の鉄塩の混合物を含む実施形態において、構成成分（ｉ）と構成成分（ｉｉｉ）の重量比は、２０：１〜１：２０、１０：１〜１：１０、５：１〜１：５、４：１〜１：４、３：１〜１：３、または２：１〜１：２、または１．５：１〜１：１．５の範囲でありうる。
【００８２】
一部の実施形態において、本発明の組成物は、約５〜５０重量％の構成成分（ｉ）、約５０〜９５重量％の構成成分（ｉｉ）、および約２０重量％までの構成成分（ｉｉｉ）から構成される。一部の実施形態において、組成物は、５〜２０重量の構成成分（ｉ）、６０〜９５重量％の構成成分（ｉｉ）および２０重量％までの構成成分（ｉｉｉ）から、例えば、約５〜２０重量の構成成分（ｉ）、約６０〜９０重量％の構成成分（ｉｉ）および約５〜２０重量％の構成成分（ｉｉｉ）から、または約１０〜２０重量の構成成分（ｉ）、約６０〜８０重量％の構成成分（ｉｉ）および約１０〜２０重量の構成成分（ｉｉｉ）から構成される。一部の実施形態において、本発明の組成物は、約１５〜２０重量％の構成成分（ｉ）、約６０〜７０重量％の構成成分（ｉｉ）、および約１５〜２０重量％の構成成分（ｉｉｉ）から構成される。
【００８３】
本発明の組成物の成分は、例えば本発明の組成物の１日摂取に対応する意図された量で摂取用（食用）に許容される化合物から選択されることが指摘される。組成物には療法における使用が意図される実施形態において、組成物の成分は、薬学的に許容される化合物から選択される。
【００８４】
調製方法
また、本明細書に提供されるものは、鉄含有組成物の調製方法であって、
−  本明細書に定義されている鉄塩、モノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステル、またはモノおよび／もしくはジグリセリドのクエン酸エステルの混合物、および任意選択で１つまたは複数の脂肪酸または脂肪酸塩を混合すること、
−  任意選択で、好ましくは少量の水を添加すること、および任意選択で塩基性化剤を添加すること、ならびに
−  混合物を処理して、分散体を得ること、
による方法である。
【００８５】
塩基性化剤は、例えば、炭酸塩、例えば炭酸カリウム（Ｋ２ＣＯ３）などの金属炭酸塩、または水相にヒドロキシルイオンを提供することができる任意の他の構成成分である。
混合物を処理して、安定した分散体を得ることは、例えば、１回または複数回の超音波処理、例えば、水を添加する前の１回または複数回の超音波処理、ならびに水および塩基性化剤を添加した後の１回または複数回の超音波処理を含んでもよい。
【００８６】
安定した分散体を形成するのを助けるために、１つまたは複数の乳化剤を使用することも考慮される。適切な乳化剤、例えば、８〜２０、例えば８〜１５のＨＬＢ値を有する乳化剤を選択することは、十分に当業者の知識の範囲内であると考慮される。
【００８７】
一部の実施形態において、本方法は、本明細書に定義されている鉄塩、ならびにモノおよび／またはジグリセリドのクエン酸エステル、例えばモノまたはジグリセリドのモノエステル化クエン酸エステルを混合すること、任意選択で混合物を超音波による処理（超音波処理）に付すこと、任意選択で混合物を、例えば４０℃〜８０℃、または５０℃〜７０℃の温度で加熱に付すこと、続いて少量の水および塩基性化剤、例えば、Ｋ２ＣＯ３などの炭酸塩を添加すること、任意選択で続いて更なる超音波処理にかけることを含む。一部の好ましい実施形態において、飽和脂肪酸などの脂肪酸、例えば、ステアリン酸は、例えば１回目の超音波処理の前に混合物に添加される。
【００８８】
鉄塩は、本明細書に記述されているＣ８〜Ｃ２４脂肪酸の塩である。一部の実施形態において、鉄塩は、Ｃ８〜Ｃ１８脂肪酸、またはＣ８〜Ｃ１６脂肪酸、またはＣ８〜Ｃ１４脂肪酸、例えば、本明細書上記（例えば、表１および２を参照すること）に記述された任意の脂肪酸から選択される脂肪酸の鉄塩である。
【００８９】
鉄塩は、好ましくはＦｅ（ＩＩＩ）塩である。一部の実施形態において、鉄塩は脂肪酸のＦｅ（ＩＩ）塩、例えば、Ｃ８〜Ｃ１８脂肪酸、またはＣ８〜Ｃ１６脂肪酸、またはＣ８〜Ｃ１４脂肪酸、例えば、本明細書上記（例えば、表１および２を参照すること）に記述された任意の脂肪酸から選択される脂肪酸のＦｅ（ＩＩ）塩である。
【００９０】
一部の実施形態において、構成成分（ｉ）は、１つまたは複数の脂肪酸のＦｅ（ＩＩ）および／またはＦｅ（ＩＩＩ）塩、例えば、１つまたは複数のＣ８〜Ｃ１８脂肪酸、またはＣ８〜Ｃ１６脂肪酸、またはＣ８〜Ｃ１４脂肪酸、例えば、本明細書上記（例えば、表１および２を参照すること）に記述された１つまたは複数の脂肪酸のＦｅ（ＩＩ）および／またはＦｅ（ＩＩＩ）塩である。
【００９１】
モノおよび／またはジグリセリドのクエン酸エステルの構成成分は、市販のＣｉｔｒｅｍのいずれかであってもよく、あるいはグリセロールを、クエン酸および１つもしくは複数の脂肪酸でエステル化することにより、またはモノおよびジグリセリドの混合物をクエン酸と反応させることにより調製してもよい。したがって、本明細書において参照されるモノおよび／またはジグリセリドのクエン酸エステルは、通常、様々な反応生成物の混合物であり、そのような反応物には、例えば、様々な位置異性体が含まれることが認識されているはずである。
【００９２】
本発明の組成物は、経口投与されてもよく、医薬製剤、栄養補助食品、液体または固体食品組成物、飲料製剤などに含まれてもよく、例えば、適切なビヒクル、例えば水または粘稠性液相、例えばゲル中の本発明の組成物の分散体であってもよい。一部の実施形態において、製剤は乾燥形態により、例えば、カプセルに充填されていても、食品に組み込まれていてもよい散剤として提供される。一部の実施形態において、製剤は、適切なビヒクル、例えば水または粘稠性液相、例えばゲル中の本発明の組成物の分散体として提供される。一部の実施形態において、製剤は、顆粒の散剤として提供される。
【００９３】
医薬製剤
本明細書に提供されるものは、本発明の組成物を含む医薬製剤、好ましくは、本発明の分散体、および任意選択で１種または複数の薬学的に許容される賦形剤、例えば、防腐剤、粘性剤、乳化剤、増粘剤なども、および任意選択で１つまたは複数の更なる活性成分も含有する、経口投与用の製剤、例えば、液体製剤、または経口投与用のゲルカプセル剤、例えば、硬カプセル剤または軟弾性（ゼラチン）カプセル剤である。
【００９４】
一部の実施形態において、製剤は、適切なビヒクル、例えば水または粘稠性液相、例えばゲル中の本発明の組成物の分散体として提供される。一部の実施形態において、製剤は乾燥形態により、例えば、カプセルに充填されていてもよい散剤として提供される。
【００９５】
製剤に使用されうる乳化剤は、例えば、アカシア、トラガカント、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチンおよびレシチンなどの天然源由来のものでありうる。粘性剤は、例えば、アカシア、トラガカント、アルギン酸塩、キサンタン、ペクチンなどの親水性コロイド、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース、または例えばカーボマーポリマーであってもよい。防腐剤は、例えば、アスコルビン酸、安息香酸、またはｐ−ヒドロキシ安息香酸のエステルであってもよい。
【００９６】
例えば、製剤は、本発明の組成物を、製剤の１〜９９重量％、例えば、５〜９５重量％、または１０〜９０重量％、または２０〜８０重量％の量で含み、残りは、１種または複数の賦形剤を含むことができる。
【００９７】
一部の実施形態において、本明細書に提供される製剤は、鉄を、本明細書に定義されている鉄塩の形態によって、製剤の総重量に基づいて、約０．０５重量％、約０．１重量％、例えば、約０．２重量％、約０．５重量％、約１重量％、約１．２重量％、約１．３重量％、約１．４重量％、約１．５重量％、約２重量％、約３重量％、または約５重量％の量で含むことができる。一部の実施形態において、製剤は、鉄を、製剤の総重量に基づいて、約０．０５〜５重量％、０．１〜５重量％、０．２〜５重量％、０．５〜５重量％、１．０〜５重量％、１．２〜５重量％、１．３〜５重量％、１．４〜５重量％、１．５〜５重量％、２〜５重量％、または３〜５重量％の範囲の量で含む。一部の実施形態において、製剤は、鉄を、製剤の総重量に基づいて、約０．０５〜３重量％、０．１〜３重量％、０．２〜３重量％、０．５〜３重量％、１．０〜３重量％、１．２〜３重量％、１．３〜３重量％、１．４〜３重量％、１．５〜３重量％、または２〜３重量％の範囲の量で含む。一部の実施形態において、製剤は、鉄を、製剤の総重量に基づいて、約０．０５〜２重量％、０．１〜２重量％、０．２〜２重量％、０．５〜２重量％、１．０〜２重量％、１．２〜２重量％、１．３〜２重量％、１．４〜２重量％、または１．５〜２重量％の範囲の量で含む。一部の実施形態において、製剤は、鉄を、製剤の総重量に基づいて、約０．０５〜１．５重量％、０．１〜１．５重量％、０．２〜１．５重量％、０．５〜１．５重量％、１．０〜１．５重量％、１．２〜１．５重量％、１．３〜１．５重量％、または１．４〜１．５重量％の範囲の量で含む。一部の実施形態において、製剤は、鉄を、製剤の総重量に基づいて、約０．０５〜１．３重量％、０．１〜１．３重量％、０．２〜１．３重量％、０．５〜１．３重量％、１．０〜１．３重量％、または１．２〜１．３重量％の範囲の量で含む。一部の実施形態において、製剤は、鉄を、製剤の総重量に基づいて、約０．０５〜１．２重量％、０．１〜１．２重量％、０．２〜１．２重量％、０．５〜１．２重量％、または１．０〜１．２重量％の範囲の量で含む。一部の実施形態において、製剤は、鉄を、製剤の総重量に基づいて、約０．０５〜１重量％、０．１〜１重量％、０．２〜１重量％、または０．５〜１重量％の範囲の量で含む。一部の実施形態において、製剤は、鉄を、製剤の総重量に基づいて、約０．０５〜０．５重量％、０．１〜０．５重量％、または０．２〜０．５重量％の範囲の量で含む。
【００９８】
好ましくは、本発明の医薬製剤は、例えば、腸溶性表面コーティングを有する遅延放出製剤である。一部の実施形態において、製剤は、腸内への活性成分の放出を可能にする腸溶性コーティングを有するカプセル剤である。一部の実施形態において、本発明の製剤は、例えば、ＷＯ２０１４／１４０９９１、または米国第９，７７５，８１４号もしくは米国特許第５，３３０，７５９号に記載されている腸溶性軟カプセル剤を含む。
【００９９】
一部の実施形態において、本発明の医薬製剤は、持続放出製剤である。例えば、持続放出フィルムコーティングカプセル剤は、ＷＯ２０１７／０７５２１５に記載されている。一部の実施形態において、本発明の医薬製剤は、腸内での持続放出を可能にする遅延放出製剤である。
【０１００】
医薬製剤の使用および製造についての更なる情報は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  ＳｃｉｅｎｃｅおよびＰｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ（第２２版），Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｐｒｅｓｓ，２０１３に記載されている。
【０１０１】
本発明の製剤は、例えば、妊娠可能な女性、妊娠中の女性、小児、成人、青少年、高齢者などにおいて、鉄欠乏症、または貧血などの鉄欠乏に関連する障害もしくは疾患の治療に有利に使用される。治療は、本明細書に開示されている医薬製剤を、例えば、１日に１回もしくは２回、連続的に、または例えば１か月から１２か月、もしくは１か月から６か月の期間にわたって、または所望の血中鉄レベルが治療対象において達成されるまで投与することを含むことができる。適切な１日用量は、１０〜７０ｍｇの鉄、１０〜５０ｍｇの鉄、１０〜４０ｍｇの鉄、１０〜３０ｍｇの鉄、または１０〜２０ｍｇの鉄を含むことができる。治療は、例えば、鉄欠乏症にかかりやすい人、例えば、妊娠可能な女性もしくは妊娠中の女性、菜食主義者、がん、特に胃腸系のがん、炎症性腸疾患、食欲不振、または慢性炎症などの疾患を患っている人において、ならびに高齢者、または例えば抑うつによる食欲喪失を患っている人において、予防的なものでもありうる。
【０１０２】
一部の実施形態において、本発明の組成物を含む栄養補助食品が提供される。栄養補助食品の製剤および投与形態は、一般に、医薬製剤について本明細書上記に記載されたものと同じであってもよい。例えば、栄養補助食品は、硬もしくは軟ゲルカプセル剤の形態、または液体ビヒクル中の分散体の形態で、フラスコにより、投薬用スプーンまたは類似のもの、および適切な投薬指示書を伴って提供されうる。本明細書に提供される栄養補助食品または医薬製剤は、１つまたは複数の更なる生物活性剤および／または治療活性剤、例えば、ビタミンＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、またはＫなどのビタミン、Ｃａ、Ｍｇ、Ｋ、またはＳｅなどのミネラル、レスベラトロール、リコペン、スピルリナ属抽出物、フィトールなどの植物抽出物などを追加的に含むことができる。
【０１０３】
食品における使用
更なる態様は、食品添加物としての、または食品添加物の調製における、または食料品の調製における、本明細書に開示されている組成物の使用である。例えば、本明細書に開示されている組成物を、食品、例えば、液体もしくはゼリー状の組成物、または飲料用もしくは食用調合物などの粘稠性液体に、任意の他の適切な添加物、例えば、増粘剤、乳化剤、甘味料、着色料、香味剤などと一緒に組み込むことができる。したがって、更なる態様は、本明細書に開示されている組成物を含む食品添加物または食料品、例えば、高齢者、乳幼児、妊娠中の女性、疾患状態を患っている人など、鉄の補給を特に必要とする対象に栄養を与えることが意図される食品である。
【０１０４】
本発明は、以下の非限定実施例によって例示される。
【実施例】
【０１０５】
Ｆｅステアリン酸塩の調製
塩を、ＡｂｒａｈａｍｓｏｎおよびＬｕｋａｓｋｉ（Ｊ．Ｉｎｏｒｇ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４（１９９４）１１５−１３０）に報告された合成方法に従って調製し、以下の通りである。ステアリン酸（０．６ｇ）を３０ｍｌのエタノールに溶解し、フラスコ中に一晩保存した。翌日、１ｍｌの水に溶解したＮａＯＨのペレット（２．１３ｍＭ）を加えた。フラスコを軽く加熱した後、１０ｍｌの水をステアリン酸溶液に加えた。別のフラスコにおいて、ＦｅＳＯ４（３１６．９ｍｇ）を１０ｍｌの水および５０ｍｌのエタノールに溶解し、窒素パージ下で混合し、穏やかに加熱した。ステアリン酸の溶液を、１０ｍｌのアリコートにより５分間隔で硫酸第一鉄溶液に加えた。１０ミリリットルの水を使用して、微量の残存ステアリン酸を反応混合物の中にすすぎ入れた。反応混合物は、ステアリン酸の添加後に、より暗色に変わった。加熱を４０分後に止め、１時間後に窒素パージを停止した。混合物を室温で一晩放置した。翌日、溶液を濾過し、微量を２０ｍｌの水で洗浄した。最後に、濾過溶液を６時間にわたって真空下に置いて乾燥した。ステアリン酸鉄の最終重量は０．６３２ｇ（調製１）であった。調製を同一の様式で繰り返して調製２を得て、追加の最終精製も繰り返し、得られた調製物を酢酸エチルに７０℃で溶解し、溶液を冷まして、沈殿物を形成させ、沈殿物を遠心分離により分離し、得られた生成物を真空下で一晩乾燥して、式［Ｆｅ３ＯＳｔ６（Ｈ２Ｏ）３］２ＳＯ４（Ｈ２Ｏ）２を有する調製物３を得た。
【０１０６】
【表３】
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【０１０７】
５９Ｆｅステアリン酸塩の調製
ステアリン酸（０．３ｇ）を、５００μｌの２．１３ｍＭ  ＮａＯＨと混合した１５ｍｌのエタノールに溶解した。硫酸第一鉄の標識化は、１５８．５ｍｇのＦｅＯＳ４を５ｍｌの水に溶解し、２μｌの鉄−５９（０．５ＭＢｑ）および２５ｍｌのエタノールを添加することによって達成した。続くステップは、鉄ステアリン酸塩の調製と同じであった。ステアリン酸混合物を加熱し、窒素パージに付した。熱を反応の４０分後に取り外し、窒素パージを更に２０分間続けた。フラスコを室温で一晩放置した。濾過溶液を真空下で６時間乾燥して、最終重量０．３２６ｇの鉄−５９ステアリン酸塩を生じた。
【０１０８】
Ｆｅラウリン酸塩の調製
ラウリン酸（０．４２ｇ）を３０ｍｌのエタノールに溶解し、フラスコ中に一晩保存した。翌日、１ｍｌの水に溶解したＮａＯＨのペレット（２．１３ｍＬ）を加えた。フラスコを軽く加熱した後、１０ｍｌの水をラウリン酸溶液に加えた。別のフラスコにおいて、ＦｅＳＯ４（３１６．９ｍｇ）を１０ｍｌの水および５０ｍｌのエタノールに溶解し、窒素パージ下で混合し、穏やかに加熱した。ラウリン酸の溶液を、１０ｍｌのアリコートにより５分間隔で硫酸第一鉄溶液に加えた。１０ミリリットルの水を使用して、微量の残存ラウリン酸を反応混合物の中にすすぎ入れた。反応混合物は、ラウリン酸の添加後に、より暗色に変わった。加熱を４０分後に止め、１時間後に窒素パージを停止した。混合物を室温で一晩放置した。翌日、溶液を濾過し、微量を２０ｍｌの水で洗浄し、濾過溶液を６時間にわたって真空下において乾燥した。ラウリン酸鉄の最終重量は０．３９ｇであった
実施例１
分散体は、２０ｍｇＦｅステアリン酸塩、８０ｍｇのＣｉｔｒｅｍ（実質的に不飽和モノおよびジグリセリドのクエン酸エステルの混合物）、および２０ｍｇのステアリン酸を使用して調製した。全ての化合物を混合し、６５℃で３０分間超音波処理した。超音波処理した後、１ｍｌの水および５ｍｇのＫ２ＣＯ３を加えた。更に超音波処理を３０分間実行し、混合物を渦巻混合し、６５℃で合計３０分間最終超音波処理に曝露した。得られた分散体の安定性を、調製したまま、および４℃または室温で（暗黒中に）保存した後、目視観察により観察した。保存中に沈降があったが、比較的安定した分散体が、単に３０秒間渦巻混合することによって再び形成された。顕微鏡下では、ほぼ全てのミセル粒子が１μＭより小さいことが見出され、分散体は、４℃または室温のいずれかによる４週間の保存後に比較的無変化のままであった。
【０１０９】
実施例２
ステアリン酸鉄（１．８重量％）、ステアリン酸（１．８重量％）およびＣｉｔｒｅｍ（７．１重量％）を混合し、混合物を、３０分毎にボルテックスしながら、オーブンにより１４０℃で２時間加熱して溶解させた。加熱時間の終了時に、７５℃の水（８８．９重量％）中のＫ２ＣＯ３（０．４重量％）の水溶液を加え、混合物を浴中において７５℃で超音波処理した。混合物を室温に冷まし、その間、１５分毎にボルテックス混合した。
【０１１０】
実施例３
分散体は、２０ｍｇのステアリン酸鉄、８０ｍｇのＣｉｔｒｅｍ（実質的に不飽和モノおよびジグリセリドのクエン酸エステルの混合物）、および２２．７ｍｇのステアリン酸カリウムを使用して調製した。全ての化合物を混合し、６５℃で３０分間超音波処理した。超音波処理した後、１ｍｌの水を加えた。更に超音波処理を３０分間実行し、混合物を渦巻混合し、６５℃で合計３０分間最終超音波処理に曝露した。
【０１１１】
この分散体のサイズ分布を、Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ  ４（Ｍａｌｖｅｒｎ  Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ）により調査した。明視野照明を、７０．０±０．２％に校正した光強度で分散体粒子の顕微鏡可視化に使用した。試料を、２０×対物レンズを使用してスキャンした。スキャン面積は、４．５ｍｍ×４．５ｍｍであった。試料をＨ２Ｏで８．５％に希釈し、５μＬをスライド上に置いた。機器は、約９０，０００の粒子画像を解析し、９０％のサイズが２．４２μＭ未満の直径であった（図１および表５）。
【０１１２】
【表４】
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【０１１３】
実施例４
実施例１の手順を、Ｆｅステアリン酸塩の代わりに５９Ｆｅステアリン酸塩を使用して繰り返した。安定した分散体を得た。
【０１１４】
実施例５
実施例１の手順を、Ｆｅステアリン酸塩の代わりにＦｅラウリン酸塩（２０ｍｇ）、８０ｍｇのＣｉｔｒｅｍおよび２０ｍｇのステアリン酸を使用して繰り返した。安定した分散体を得た。
【０１１５】
生物学的アッセイ
ヒト腸Ｃａｃｏ−２細胞による鉄の取り込み
ヒト腸Ｃａｃｏ−２細胞（４０〜５０継代）を、４５００ｍｇ／Ｌのグルコース、Ｌ−グルタミンおよび重炭酸ナトリウムを有し、ピルビン酸ナトリウムを有さないダルベッコー修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）において培養した。ウシ胎児血清（１０％）、Ｌ−グルタミン（１％）、ペニシリン−ストレプトマイシン（１％）、および最小非必須アミノ酸（１％）も添加した。細胞を、７５ｃｍ２のフラスコ中において、５％ＣＯ２および９５％空気の加湿雰囲気下、３７℃で増殖させた。フラスコ中で培養密度になった後、Ｃａｃｏ−２細胞を６個のウエルプレートに接種した。プレート中の培地を２日毎に交換し、約１４日後、Ｃａｃｏ−２細胞は完全に分化し、鉄輸送タンパク質を発現するはずであった。培養の１４日後、Ｃａｃｏ−２細胞を、無血清最少必須イーグル培地で一晩飢餓させた。翌日、細胞をハンクス平衡塩類溶液（ＨＢＳＳ）で洗浄し、実施例１に記載されたように調製した分散体を、鉄濃度の５０μＭもしくは１００μＭのいずれかで、または陽性対照として５０μＭのアスコルビン酸第一鉄（１：２０、ＦｅＳＯ４およびＮａアスコルビン酸塩）をＨＢＳＳ緩衝液中に２時間補充した。インキュベーションの時間の後、培地をＥｐｐｅｎｄｏｒｆ管で収集し、ガンマカウンターでモニターした。Ｃａｃｏ−２細胞を冷リン酸緩衝食塩水、ｐＨ７．４で洗浄し、０．５ｍｌのＮａＯＨ（０．１Ｎ）を加えた。細胞を１５分間放置して溶解を達成させ、Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ管で採取し、ガンマカウンターでモニターした。その後、総タンパク質の濃度をＢｒａｄｆｏｒｄ方法により測定した。
【０１１６】
アスコルビン酸第一鉄から、および本発明の製剤からのＣａｃｏ−２細胞の鉄取り込みを、タンパク質の総濃度に正規化して、図２に表す。
マウスにおける鉄のｉｎ  ｖｉｖｏ吸収−５９Ｆｅ吸収研究
貧血マウスを、Ｌａｔｕｎｄｅ−Ｄａｄａ  ｅｔ  ａｌ，Ｊ．Ｎｕｔｒ．１４４（２０１４）１８９６−９０２の方法を使用して発生させた。マウス（３週齢）を４群に分け（ｎ＝６匹）、２群には正常鉄食餌（４８ｍｇ鉄／Ｋｇ）を、他の２群には鉄欠乏食餌（３ｍｇ鉄／ｋｇ）を６週間にわたって摂取させた。実験の前に、ヘモグロビンレベルを測定して、正常群と鉄欠乏群の差を確認した。５９Ｆｅ標識鉄による治療の前日に、全てのマウスには一晩食餌を与えず、水を自由に入手させた。正常（非貧血）および鉄欠乏（貧血）マウスに、１００μｌの実施例４の製剤または５９ＦｅＳＯ４アスコルビン酸（１：１）（［Ｆｅ］＝２１ｍＭ）のいずれかを胃管栄養補給した。経口胃管栄養法の４時間後、マウスを殺処分し、組織を収集した。結果を図３に表す。
【０１１７】
硫酸第一鉄／アスコルビン酸を用いると、貧血マウスにおいて鉄の吸収に著しい増強があり（図３）、低鉄食餌が実際に動物を貧血にすることが確認された（正常動物１２．６±４％対貧血動物４７．２±１３．４％）。有意なことに、顕著に高い鉄吸収（約２倍）が、硫酸第一鉄で治療された正常動物（１２．６％）と比較して、本発明の組成物で治療された正常動物（２８．０５±４％）に観察された。加えて、実施例４の製剤で治療された貧血マウスの鉄吸収は、実施例４の製剤で治療された正常マウスより高かった（３９±６．４％）。
【０１１８】
組織分布
５９Ｆｅ取り込み研究における組織を、鉄分布の調査に使用した（図４〜７）。正常な動物において、大部分の鉄は、「屠殺体」の中（恐らく、血液およびリンパ液の中）にある。しかし、実施例４の製剤が鉄源として使用される場合は、より多くのＦｅが、肝臓、脾臓、および腎臓に中にある。鉄欠乏マウスでは、ＦｅＳＯ４が鉄源として使用される場合、より多くのＦｅ分布が肝臓にあったが、２つの供給源の全体的な分布は類似していた。
【０１１９】
経口鉄による治療後の貧血マウスにおけるヘモグロビンレベル
この研究の手順には、十分に確立された技術（Ｋａｊａｒａｂｉｌｌｅ  ｅｔ  ａｌ，Ｂｒｉｔ．Ｊ．Ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，１１７（２０１７）７６７−７７４）を採用した（図８）。貧血動物（１２．８±２．４ｇ／ｄＬ）と正常動物（１９．５５±２．４ｇ／ｄＬ）のヘモグロビンレベルに変化があった（図９）。ＦｅＳＯ４および実施例１の製剤は、両方とも正常マウスに対して貧血マウスにおいてヘモグロビンレベルを増加させた。図９に示されているように、実験の開始時（０日目）では、全ての群は対照群と比較して低いヘモグロビンレベルを有した。ＦｅＳＯ４または実施例１の製剤（Ｆｅ、２１ｍＭ、１００μｌ）のいずれかによる１０日間の胃管栄養法の後、両方の群は、Ｈｂレベルを回復し、貧血群のみが正常（対照）群と異なる値を有した。
【０１２０】
ヘモグロビン充足研究
雄ＣＤ１マウス（３週齢）に、改変ＡＩＮ−７６Ａ精製齧歯類食餌（ＴＤ．８０３９６、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ）に基づいた低鉄食餌の３ｍｇ  Ｆｅ／Ｋｇ食餌を３週間（すなわち、６週齢になるまで）摂取させることにより、Ｆｅ欠乏症にした。別の群のマウスには、正常な鉄豊富食餌（４８ｍｇ  Ｆｅ／Ｋｇ食餌）（ＴＤ．８０３９４、Ｈａｒｌａｎ  Ｔｅｋｌａｄ）を与え、対照として機能させた。食餌は同一組成のものであったが、鉄豊富食餌はクエン酸第二鉄として添加された鉄を含有した。この後、血液を尾から抜き取って、マウスの初期Ｈｂ濃度を決定した。次いで、Ｆｅ欠乏マウスを類似したＨｂ濃度に基づいて治療群に分けた。１つの群のマウスでは、鉄補給なしの低Ｆｅ食餌（低鉄食餌）を維持し、他の２つの群では、ＦｅＳＯ４または実施例１の分散体による１５０ｍｇのＦｅを１０日間にわたって毎日胃管栄養補給した。１０日後、マウスを計量し、マウスに麻酔をかけ、血液試料を、Ｈｂ、血清中鉄および血清中フェリチンの決定のために採取した。次いで、マウスを麻酔により殺処分し、続いて首を脱臼させ、脾臓、十二指腸、腎臓および肝臓試料を切り取り、液体窒素で瞬時に冷凍し、更に分析するまで−７０℃で保存した。
【０１２１】
毒性研究
貧血ＣＤ１マウスを、実施例１の製剤（２０ｍＭのＦｅ、１００μＬ）の経口胃管栄養法に１０日間付した。最終用量の後、マウスには、殺処分および組織を収集する前に、１８時間にわたって水を自由に入手させた。組織を、様々な毒物学的調査に付すまで−７０℃で保存した。４群の動物、すなわち、非貧血マウス、貧血マウス、ＦｅＳＯ４で治療した貧血マウス、および実施例１で治療した貧血マウスであった。試験を以下のパラメーターに関して行った。
【０１２２】
１．脂質過酸化（ＭＤＡ測定）
２．ＧＳＨレベル
３．カタラーゼレベル
４．非ヘミ鉄レベル
５．血漿中フェリチンレベル
方法論
十二指腸の収集は、幽門の後ろの最初の５ｃｍを取り出すことによって達成した。切片を横断開放し、粘膜をガラススライドの使用により取り出した。
【０１２３】
脂質過酸化
脂質過酸化は、Ｃｏｈｅｓｉｏｎ  ＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓからのＭＤＡマイクロプレートアッセイキット（カタログ番号ＣＡＫ１０１１）を使用して、エンドポイント生成物であるマロンジアルデヒド（ＭＤＡ）の検出によって測定した。肝臓組織（７０ｍｇ）または十二指腸粘膜（２０ｍｇ）を計量し、キットの製造会社の使用説明書に従って、アッセイ緩衝液で均質化した。全ての試料をアッセイの間中ずっと氷で保持した。色素試薬（チオバルビツール酸）を、アッセイを実施する３０分前に室温にした。吸光度を、プレートリーダーを使用して５３２および６００ｎｍで測定した。抽出物のタンパク質濃度をＢｒａｄｆｏｒｄアッセイプロトコールで分析し、ＭＤＡ値を、タンパク質含有量に対して正規化した。
【０１２４】
ＧＳＨレベル
還元型ＧＳＨを、ＭｙＢｉｏｓｏｕｒｃｅ社からのＥＬＩＳＡキット（カタログ番号ＭＢＳ０２６６３５）により測定した。アッセイは、製造会社の使用説明書に従って実施した。マウスの組織をＰＢＳですすぎ洗いして、過剰な血液を取り除き、計量し（肝臓５０ｍｇまたは十二指腸粘膜２０ｍｇ）、氷上でガラスホモジナイザーによりＰＢＳ（ｐＨ７．４）で均質化し３０００ｒｍｐにより４℃で２０分間遠心分離した。遠心分離した後、試料を室温にして、上清を注意深く収集した。全ての試薬を、使用する２０分間前に室温にした。標準曲線を、ＧＳＨ抗体−ＧＳＨ抗原相互作用およびホースラディッシュペルオキシダーゼ比色検出システムに基づいて作成した。光学密度（ＯＤ）を、停止液を添加した後の１０分以内にマイクロプレートリーダーを４５０ｎｍで使用して決定した。
【０１２５】
カタラーゼレベル
カタラーゼ酵素の活性を、Ｃａｔａｌａｓｅ  Ｋｉｔ（Ａｒｂｏｒアッセイ社、カタログ番号Ｋ０３３−Ｈ１）を使用して検出した。マウスの組織をＰＢＳですすぎ洗い、過剰な血液を取り除き、計量した（肝臓１００ｍｇまたは十二指腸粘膜２０ｍｇ）。試料調製およびアッセイの手順を、製造会社の使用説明書に従って実施した。組織試料をガラスホモジナイザーにより氷冷アッセイ培地で均質化し、１０，０００×ｇにより４℃で１５分間遠心分離した。上清を収集して、アッセイを続けた。カタラーゼ過酸化水素酵素による標準を、再構成した３０分以内に測定した。生成された色反応を、プレートリーダーを使用して４５０ｎｍで読み取った。
【０１２６】
非ヘミ鉄レベル
非ヘミ鉄を、Ｓｉｍｐｓｏｎ＆Ｐｅｔｅｒｓ（Ｂｒ  Ｊ  Ｎｕｔｒ．１９９０；６３：７９−８９）により改変したＦｏｙ  ｅｔ  ａｌ．（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ  Ｂｉｏｃｈｅｍ．１９６７；１８：５５９−５６３）の方法に従ってアッセイした。肝臓組織を氷冷ＰＢＳで洗浄し、計量し（７０ｍｇ）、ガラスＤｏｕｎｃｅホモジナイザーにより０．１５ＭのＮａＣｌ−ＨＥＰＥＳ緩衝液（ｐＨ７．４）で均質化（１：５のｗ：ｖ）した。１００μｌの得られた抽出物を２００μｌのＴＣＡ−ピロリン酸ナトリウムと共に沸騰させ、１０分間沸騰させて、１０，０００ＲＰＭで遠心分離し、上清を収集し、沸騰抽出および遠心分離を２回繰り返した。全上清収集物から、２００μＬを、１００μＬの０．２３Ｍアスコルビン酸、８０μＬの１０ｍＭフェロジン、および４２０μＬの２．０Ｍナトリウム緩衝酢酸塩（ｐＨ４．８）と混合した。全ての試料をブランクに対して５６２ｎｍで測定し、基準値と比較した。
【０１２７】
フェリチンレベル
このアッセイでは、血漿試料に存在するフェリチンが、ポリスチレンマイクロタイターウエルの表面に吸着している抗フェリチン抗体と反応する。アッセイは、Ａｂｃａｍ社により提供されたキット（カタログ番号ａｂ１５７７１３フェリチン、マウスＥＬＩＳＡキット）により実施した。血漿試料を、キットから提供されたアッセイ希釈剤で１：４０に希釈した。複合体に結合した酵素の量を、発色基質３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）の添加により測定した。比色反応を、プレートリーダーにより４５０ｎｍで測定した。試験試料中のフェリチンの量は、フェリチンの既知濃度による標準曲線から補間した。
【０１２８】
結果
肝臓および十二指腸におけるＭＤＡレベルを、図１０および１１にそれぞれ報告する。正常マウス比較すると、鉄欠乏マウスにおいて両方の組織に存在するＭＤＡレベルにわずかな減少がある（Ｎ．Ｓ．）。このことは、恐らく、低レベルの非ヘミ鉄（不安定な鉄プール）に関連している。しかし、この差は、ＦｅＳＯ４または実施例１のいずれかにより治療されたマウスにおいて更に増加している（Ｎ．Ｓ．）。図１０および１１に見られるように、実施例１は、最低レベルのＭＤＡに関連する。明らかに、実施例１の存在下ではＭＤＡに増加はない。
【０１２９】
動物の異なる群における還元型グルタチオン（ＧＳＨ）のレベルを、図１２および１３に示す。治療を受けた貧血マウスにおいてレベルが増加する傾向があり、事実、差は十二指腸ではＦｅＳＯ４で有意である。このことは、治療動物において増強された不安定鉄プールに関連する可能性がある。ＧＳＨは、実施例１の存在下で低減されず、レベルは、ＦｅＳＯ４により治療された動物と実施例１により治療された動物で類似している。
【０１３０】
カタラーゼ（図１４および１５）では、この研究から明白な結論導き出すことができない。結果にはばらつきがあり、そのため、平均値は互いに有意に異なっていなかった。
本発明の組成物を受けた動物の肝臓における非ヘミ鉄レベルは、正常な肝臓、貧血肝臓、およびＦｅＳＯ４により治療された貧血肝臓において見出されたレベルより実質的に高かった。測定値を表６に示し、図１６に例示する。
【０１３１】
【表５】
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【０１３２】
これは素晴らしい結果であり、本発明の組成物が、事実、内因性肝臓プロセスに鉄を供与するのに有効であることを示している。この知見は、実施例１が最高レベルを生成した血漿中フェリチンレベル（図１７）により確認され、未治療マウスと類似しており、一方、鉄欠乏マウスおよびＦｅＳＯ４により治療されたマウスの血漿中フェリチンレベルは、両方とも正常マウスより低かった。血漿中フェリチンレベルは、肝臓の鉄の状態を反映している。
【０１３３】
本発明の異なる組成物からのヒト腸Ｃａｃｏ−２細胞による鉄の取り込み
本明細書上記に記載されたＣａｃｏ−２アッセイを、それぞれが鉄を１００μＭの濃度で含有する実施例１、実施例２および実施例５の分散体をそれぞれ鉄の供給源として使用して繰り返した。結果を図１８に表す。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【国際調査報告】
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