(57)【要約】  本発明は４−１ＢＢ抗体およびその製造方法と使用を提供する。具体的に、本発明は４−１ＢＢ抗体を提供し、前記抗体は４−１ＢＢタンパク質に高度の親和力を有し、有効に４−１ＢＢの下流シグナルを活性化し、そしてヒト混合リンパ球またはＴ細胞において顕著にＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の発現量を増加させることができ、癌および自己免疫性疾患の治療に有用である。【特許請求の範囲】
【請求項１】
抗体の重鎖可変領域であって、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲ：
配列番号１０または配列番号２で示されるＣＤＲ１、
配列番号１１または配列番号３で示されるＣＤＲ２、および
配列番号１２または配列番号４で示されるＣＤＲ３を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換がありながら、４−１ＢＢ結合親和力を維持する誘導配列を含むことを特徴とする重鎖可変領域。
【請求項２】
請求項１に記載の重鎖可変領域を有することを特徴とする抗体の重鎖。
【請求項３】
抗体の軽鎖可変領域であって、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲ：
配列番号１４または配列番号６で示されるＣＤＲ１’、
配列番号１５または配列番号７で示されるＣＤＲ２’、および
配列番号１６または配列番号８で示されるＣＤＲ３’を含む軽鎖可変領域。
【請求項４】
請求項３に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とする抗体の軽鎖。
【請求項５】
（１）  請求項１に記載の重鎖可変領域、および／または
（２）  請求項３に記載の軽鎖可変領域
あるいは、請求項２に記載の重鎖、および／また請求項４に記載の軽鎖
を有することを特徴とする抗体。
【請求項６】
前記抗体の重鎖可変領域の配列は配列番号９で示され、および／または前記の抗体の軽鎖可変領域の配列は配列番号１３で示されることを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項７】
前記抗体の重鎖可変領域の配列は配列番号１で示され、および／または前記の抗体の軽鎖可変領域の配列は配列番号５で示されることを特徴とする請求項５に記載の抗体。
【請求項８】
（ｉ）  請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５に記載の抗体、ならびに
（ｉｉ）  任意の発現および／または精製を補助するタグ配列
を有することを特徴とする組み換えタンパク質。
【請求項９】
ＣＡＲ構築物であって、前記のＣＡＲ構築物のモノクローナル抗体抗原結合領域ｓｃＦＶ断片は４−１ＢＢと特異的に結合する結合領域で、かつ前記ｓｃＦｖは請求項１に記載の重鎖可変領域および請求項３に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とするＣＡＲ構築物。
【請求項１０】
（ａ）４−１ＢＢ関連疾患を予防および／または治療する薬物の製造、ならびに／あるいは（ｂ）検出試薬またはキットの製造に使用されることを特徴とする請求項１に記載の重鎖可変領域、請求項２に記載の重鎖、請求項３に記載の軽鎖可変領域、請求項４に記載の軽鎖、または請求項５に記載の抗体、請求項８に記載の組み換えタンパク質、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、生物医薬の分野に関し、より具体的に、４−１ＢＢ抗体およびその製造方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
４−１ＢＢは、ＣＤ１３９、またはＴＮＦＲＦ９とも呼ばれ、ＴＮＦ受容体ファミリーの一員である。４−１ＢＢは、読み枠が２５５アミノ酸（ＮＣＢＩ：ＮＰ  ＿００１５５２）を含有するＩ型膜貫通タンパク質で、１７アミノ酸を含有するＮ末端のシグナルペプチド、１６９アミノ酸の細胞外領域、２７アミノ酸の膜貫通領域および４２アミノ酸のＣ末端の細胞内領域からなる。４−１ＢＢ分子は、主に、活性化したＴ細胞、ＮＫ細胞、制御性Ｔ細胞、樹状細胞、単核球、好中球、好酸球で発現され、腫瘍の血管内皮細胞も４−１ＢＢを発現する報告がある。
【０００３】
Ｔ細胞の活性化過程において、４−１ＢＢ分子はそれに共刺激シグナルを提供することができる。Ｔ細胞の受容体が抗原に接触すると、４−１ＢＢの発現量が増加し、４−１ＢＢがリガンドと結合すると、ＮＦκＢシグナル経路の活性化につながることで、Ｔ細胞が活性化して増殖し、そして４−１ＢＢは活性化細胞のアポトーシスを抑制することもできる。動物モデルおよび体外実験では、抗４−１ＢＢアゴニスト性モノクローナル抗体が抗腫瘍活性を有することが証明された。それは選択的にＣＤ８＋  Ｔ細胞の増殖を引き起こし、炎症促進因子ＩＦＮ−γの発現を上方調節し、そして抗原特異的エフェクターＴ細胞の殺傷作用を増強させることにより、腫瘍の除去を促進することができる。抗４−１ＢＢアゴニスト性モノクローナル抗体は、ＮＫ細胞の増幅を引き起こし、そしてそれを通してＣＤ８＋Ｔ細胞の細胞毒性を増加させることもできる。また、抗４−１ＢＢアゴニスト性モノクローナル抗体は、腫瘍細胞の血管内皮細胞における接着分子の発現を上方調節し、活性化したＴ細胞の腫瘍組織への浸潤を促進することもできる。
【０００４】
そのほか、動物モデルにおいて、抗４−１ＢＢアゴニスト性モノクローナル抗体は、自己免疫性疾患、たとえば、自己免疫性脳脊髄炎、ループス様症候群やコラーゲン誘発関節炎を軽減することもできる。
【０００５】
現在、本分野で既存の４−１ＢＢ抗体は抗原結合活性、４−１ＢＢ分子の下流シグナルの活性化などの面において不十分なところがまだ多く、幅広く使用される４−１ＢＢ抗体の薬物製品がなく、癌および自己免疫性疾患の治療には、４−１ＢＢのアゴニスト性モノクローナル抗体の開発が切望されている。  
【発明の概要】
【０００６】
本発明の目的は、高親和力を持つ４−１ＢＢ抗体およびその製造方法と使用を提供することにある。  
【０００７】
本発明の第一の側面では、抗体の重鎖可変領域であって、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲ：
配列番号２または配列番号１０で示されるＣＤＲ１、
配列番号３または配列番号１１で示されるＣＤＲ２、および
配列番号４または配列番号１２で示されるＣＤＲ３を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換がありながら、４−１ＢＢ結合親和力を維持する誘導配列を含む重鎖可変領域を提供する。
【０００８】
もう一つの好適な例において、前記の重鎖可変領域は、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲ：
配列番号２で示されるＣＤＲ１、
配列番号３で示されるＣＤＲ２、および
配列番号４で示されるＣＤＲ３、
あるいは、
配列番号１０で示されるＣＤＲ１、
配列番号１１で示されるＣＤＲ２、および
配列番号１２で示されるＣＤＲ３を含み、
ここで、上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列は、さらに、任意に一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換がありながら、４−１ＢＢ結合親和力を維持する誘導配列を含む。
【０００９】
もう一つの好適な例において、前記のＣＤＲ３のアミノ酸配列は、任意に一つのアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換がありながら、４−１ＢＢ結合親和力を維持する誘導配列を含む。
【００１０】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は、さらに、ヒト由来のＦＲ領域またはネズミ由来のＦＲ領域を含む。
【００１１】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域は配列番号１または配列番号９で示されるアミノ酸配列を有する。  
【００１２】
本発明の第二の側面では、抗体の重鎖であって、本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域を有する重鎖を提供する。
【００１３】
もう一つの好適な例において、前記の抗体の重鎖は、さらに、重鎖定常領域を含む。
【００１４】
もう一つの好適な例において、前記の重鎖定常領域は、ヒト由来のもの、ネズミ由来のものまたはウサギ由来のものである。  
【００１５】
本発明の第三の側面では、抗体の軽鎖可変領域であって、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲ：
配列番号６または配列番号１４で示されるＣＤＲ１’、
配列番号７または配列番号１５で示されるＣＤＲ２’、および
配列番号８または配列番号１６で示されるＣＤＲ３’を含む軽鎖可変領域を提供する。
【００１６】
もう一つの好適な例において、前記の軽鎖可変領域は、以下の３つの相補性決定領域ＣＤＲ：
配列番号６で示されるＣＤＲ１’、
配列番号７で示されるＣＤＲ２’、および
配列番号８で示されるＣＤＲ３’、
あるいは、
配列番号１４で示されるＣＤＲ１’、
配列番号１５で示されるＣＤＲ２’、および
配列番号１６で示されるＣＤＲ３’を含む。
【００１７】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は、さらに、ヒト由来のＦＲ領域またはネズミ由来のＦＲ領域を含む。
【００１８】
もう一つの好適な例において、前記軽鎖可変領域は配列番号５または配列番号１３で示されるアミノ酸配列を有する。  
【００１９】
本発明の第四の側面では、抗体の軽鎖であって、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域を有する軽鎖を提供する。
【００２０】
もう一つの好適な例において、前記の抗体の軽鎖は、さらに、軽鎖定常領域を含む。
【００２１】
もう一つの好適な例において、前記の軽鎖定常領域は、ヒト由来のもの、ネズミ由来のものまたはウサギ由来のものである。  
【００２２】
本発明の第五の側面では、
（１）  本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、および／または
（２）  本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、
あるいは、本発明の第二の側面に記載の重鎖、および／または本発明の第四の側面に記載の軽鎖
を有する抗体を提供する。
【００２３】
もう一つの好適な例において、前記抗体のＮＦκＢ転写因子に対する親和力のＥＣ５０は０．１〜５  ｎＭである。
【００２４】
もう一つの好適な例において、前記抗体の架橋後のＮＦκＢ転写因子に対する親和力のＥＣ５０は０．４〜１  ｎＭである。
【００２５】
もう一つの好適な例において、前記架橋とは、抗体がその自身のＦｃ断片を介してほかの媒体と結合して集合することで、前記のほかの媒体は抗体と特異的に結合するＦｃ断片を含み、抗Ｆｃ抗体、細胞表面Ｆｃ受容体を含むが、これらに限定されない。
【００２６】
もう一つの好ましい例において、前記のＮＦκＢ転写因子は、ヒト４−１ＢＢタンパク質の下流に位置する。  
【００２７】
もう一つの好適な例において、前記抗体は、動物由来の抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、またはこれらの組み合わせから選ばれる。
【００２８】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は二本鎖抗体、または一本鎖抗体である。
【００２９】
もう一つの好適な例において、前記の抗体はモノクローナル抗体である。
【００３０】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は部分的にまたは全部ヒト化したモノクローナル抗体である。
【００３１】
もう一つの好適な例において、前記抗体の重鎖可変領域の配列は配列番号１で示され、かつ前記の抗体の軽鎖可変領域の配列は配列番号５で示される。
【００３２】
もう一つの好適な例において、前記抗体の重鎖可変領域の配列は配列番号９で示され、かつ前記の抗体の軽鎖可変領域の配列は配列番号１３で示される。
【００３３】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体の形態である。  
【００３４】
本発明の第六の側面では、
（ｉ）  本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、ならびに
（ｉｉ）  任意の発現および／または精製を補助するタグ配列
を有する組み換えタンパク質を提供する。
【００３５】
もう一つの好適な例において、前記のタグ配列は６Ｈｉｓタグを含む。
【００３６】
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質（またはポリペプチド）は融合タンパク質を含む。
【００３７】
もう一つの好適な例において、前記の組み換えタンパク質は、単量体、二量体、または多量体である。  
【００３８】
本発明の第七の側面では、ＣＡＲ構築物であって、前記のＣＡＲ構築物のモノクローナル抗体抗原結合領域ｓｃＦＶ断片は４−１ＢＢと特異的に結合する結合領域で、かつ前記ｓｃＦｖは本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域および本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域を有することを特徴とするＣＡＲ構築物を提供する。  
【００３９】
本発明の第八の側面では、外来の本発明の第七の側面に記載のＣＡＲ構築物を発現することを特徴とする組み換え免疫細胞を提供する。
【００４０】
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、ＮＫ細胞、Ｔ細胞からなる群から選ばれる。
【００４１】
もう一つの好適な例において、前記の免疫細胞は、ヒト由来のものまたはヒト以外の哺乳動物（たとえばネズミ）由来のものである。  
【００４２】
本発明の第九の側面では、
（ａ）  本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体からなる群から選ばれる抗体部分、ならびに
（ｂ）  検出可能なマーカー、薬物、毒素、サイトカイン、放射性核種、酵素、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる、前記抗体部分と複合する複合部分
を含むことを特徴とする抗体薬物複合体を提供する。
【００４３】
もう一つの好適な例において、前記の抗体部分と前記の複合部分は化学結合またはリンカーを介して複合している。  
【００４４】
本発明の第十の側面では、（ａ）検出試薬またはキットの製造、ならびに／あるいは（ｂ）４−１ＢＢ関連疾患を予防および／または治療する薬物の製造に使用されることを特徴とする本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第八の側面に記載の免疫細胞、本発明の第九の側面に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分の使用を提供する。
【００４５】
もう一つの好適な例において、前記４−１ＢＢ関連疾患は、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、移植片対宿主病、炎症性疾患、免疫性疾患、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００４６】
もう一つの好適な例において、前記の癌は、固形腫瘍、血液癌を含む。
【００４７】
もう一つの好適な例において、前記の固形腫瘍は、膀胱癌、胆管癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、膠細胞腫、頭部癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、膵臓腺癌、腎臓癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌および甲状腺癌、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００４８】
もう一つの好適な例において、前記の自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、乾癬、多発性硬化症、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる。
【００４９】
もう一つの好適な例において、前記の抗体は、薬物複合体（ＡＤＣ）の形態である。
【００５０】
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬またはキットは、４−１ＢＢ関連疾患の診断に使用される。
【００５１】
もう一つの好適な例において、前記検出試薬またはキットは、サンプルにおける４−１ＢＢの検出に使用される。
【００５２】
もう一つの好適な例において、前記の検出試薬は検出シートである。  
【００５３】
本発明の第十一の側面では、
（ｉ）  本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、本発明の第八の側面に記載の免疫細胞、本発明の第九の側面に記載の抗体薬物複合体、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれる活性成分、ならびに
（ｉｉ）  薬学的に許容される担体
を含む薬物組成物を提供する。
【００５４】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は液体製剤である。
【００５５】
もう一つの好適な例において、前記の薬物組成物は注射剤である。  
【００５６】
本発明の第十二の側面では、
（１）  本発明の第一の側面に記載の重鎖可変領域、本発明の第二の側面に記載の重鎖、本発明の第三の側面に記載の軽鎖可変領域、本発明の第四の側面に記載の軽鎖、または本発明の第五の側面に記載の抗体、あるいは
（２）  本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質、
（３）  本発明の第七の側面に記載のＣＡＲ構築物
からなる群から選ばれるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。
【００５７】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域をコードする核酸は配列番号１０６で示され、および／または前記軽鎖可変領域をコードする核酸は配列番号１０７で示される。
【００５８】
もう一つの好適な例において、前記重鎖可変領域をコードする核酸は配列番号１０８で示され、および／または前記軽鎖可変領域をコードする核酸は配列表の配列番号１０９で示される。  
【００５９】
本発明の第十三の側面では、本発明の第十二の側面に記載のポリヌクレオチドを含むベクターを提供する。
【００６０】
もう一つの好適な例において、前記のベクターは、細菌プラスミド、ファージ、酵母プラスミド、植物細胞ウイルス、哺乳動物細胞ウイルス、たとえばアデノウイルス、レトロウイルス、またはほかのベクターを含む。
【００６１】
本発明の第十四の側面では、遺伝子工学化された宿主細胞であって、本発明の第十三の側面に記載のベクターを含むか、あるいはゲノムに本発明の第十二の側面に記載のポリヌクレオチドが組み込まれた宿主細胞を提供する。
【００６２】
本発明の第十五の側面では、体外でサンプルにおける４−１ＢＢを検出（診断的なものまたは非診断的なものを含む）する方法であって、
（１）  体外において、前記サンプルを本発明の第五の側面に記載の抗体と接触させる工程、
（２）  抗原−抗体複合体が形成したか検出し、ここで、複合体が形成したというのはサンプルに４−１ＢＢが存在することを意味する工程、
を含む方法を提供する。
【００６３】
本発明の第十六の側面では、下地シート（支持プレート）と、本発明の第五の側面に記載の抗体または本発明の第九の側面に記載の免疫複合体を含有する測定バーとを含む検出プレートを提供する。
【００６４】
本発明の第十七の側面では、
（１）  本発明の第五の側面に記載の抗体を含有する第一の容器、および／または
（２）  本発明の第五の側面に記載の抗体に対する二次抗体を含有する第二の容器を含むか、
あるいは、本発明の第十六の側面に記載の検出プレートを含有する
ことを特徴とするキットを提供する。
【００６５】
本発明の第十八の側面では、組み換えポリペプチドの製造方法であって、
（ａ）  発現に適切な条件において、本発明の第十四の側面に記載の宿主細胞を培養する工程、
（ｂ）  培養物から、本発明の第五の側面に記載の抗体または本発明の第六の側面に記載の組み換えタンパク質である、組み換えポリペプチドを単離する工程
を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００６６】
本発明の第十九の側面では、４−１ＢＢ関連疾患を治療する方法であって、必要な対象に本発明の第五の側面に記載の抗体、前記抗体の抗体−薬物複合体、または前記抗体を発現するＣＡＲ−Ｔ細胞、またはこれらの組み合わせを施用する工程を含むことを特徴とする方法を提供する。
【００６７】
本発明のもう一つの側面において、４−１ＢＢタンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法であって、本発明の第五の側面に記載の抗体を被験サンプルと体外で接触させ、前記抗体と前記被験サンプルの結合を検出する工程を含む方法を提供する。
【００６８】
本発明のもう一つの側面において、４−１ＢＢタンパク質を過剰発現する細胞を検出する組成物であって、本発明の第五の側面に記載の抗体を活性成分として含む組成物を提供する。
【００６９】
本発明の解決しようとする技術課題は、現在４−１ＢＢ抗体、特にヒト化４−１ＢＢ抗体が欠けているという不足を克服するため、特異性が強く、生物学活性が高い、４−１ＢＢ抗体およびその製造方法を提供することである。前記の４−１ＢＢ抗体はヒト由来およびサル由来の４−１ＢＢタンパク質のいずれにも高度の親和力を有し、４−１ＢＢ分子の下流シグナルを活性化し、ヒト混合リンパ球またはＴ細胞反応において顕著にＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の発現レベルを増加させることができる。
【００７０】
本発明では、まず、ヒト由来の４−１ＢＢを免疫原として製造し、ヒト由来抗体遺伝子組み換えマウス技術によって全ヒト由来抗体の製造を行い、４−１ＢＢ抗体のリード抗体を得る。次に、リード抗体に対する初歩的な生産、精製および同定により、有効に４−１ＢＢ受容体を刺激し、その下流シグナルを活性化することで、ヒトＴ細胞反応において顕著にＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の発現レベルを増加させることができる、優れた生物レベルの抗体を得る。その後、分子生物学的方法による配列決定により、４−１ＢＢ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域のアミノ酸配列を知った。
【００７１】
もちろん、本発明の範囲内において、本発明の上記の各技術特徴および下記（たとえば実施例）の具体的に記述された各技術特徴は互いに組み合わせ、新しい、または好適な技術方案を構成できることが理解される。紙数に限りがあるため、ここで逐一説明しない。
【図面の簡単な説明】
【００７２】
【図１】４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質と融合タンパク質ｈｉｓ−ｍｕＣＤ８ａ−４−１ＢＢＬの結合活性を示す。
【図２】４−１ＢＢタンパク質で形質移入されたＨＥＫ２９３細胞のＦＡＣＳ選別の検出を示す。
【図３】ＥＬＩＳＡによる４−１ＢＢ免疫後のＨａｒｂｏｕｒ遺伝子組み換えマウスの血清抗体力価の状況の検出を示す。
【図４Ａ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とヒト４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図４Ｂ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とヒト４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図４Ｃ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とヒト４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図４Ｄ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とヒト４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図４Ｅ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とヒト４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図４Ｆ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とヒト４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図４Ｇ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とヒト４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図４Ｈ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とヒト４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図５Ａ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とサル４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図５Ｂ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とサル４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応
【図６Ａ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とサル４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図６Ｂ】ＥＬＩＳＡによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とサル４−１ＢＢ−ｈＦｃタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図７】ＥＬＩＳＡによる４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とほかの免疫チェックポイントタンパク質の結合反応の検出を示す。
【図８Ａ】ＦＡＣＳによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とＣＨＯｋ１−ｈ４−１ＢＢの結合反応の検出を示す。
【図８Ｂ】ＦＡＣＳによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とＣＨＯｋ１−ｈ４−１ＢＢの結合反応の検出を示す。
【図８Ｃ】ＦＡＣＳによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とＣＨＯｋ１−ｈ４−１ＢＢの結合反応の検出を示す。
【図８Ｄ】ＦＡＣＳによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とＣＨＯｋ１−ｈ４−１ＢＢの結合反応の検出を示す。
【図８Ｅ】ＦＡＣＳによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とＣＨＯｋ１−ｈ４−１ＢＢの結合反応の検出を示す。
【図９Ａ】ＦＡＣＳによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とＣＨＯｋ１−ｃ４−１ＢＢの結合反応の検出を示す。
【図９Ｂ】ＦＡＣＳによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とＣＨＯｋ１−ｃ４−１ＢＢの結合反応の検出を示す。
【図９Ｃ】ＦＡＣＳによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とＣＨＯｋ１−ｃ４−１ＢＢの結合反応の検出を示す。
【図９Ｄ】ＦＡＣＳによる各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体とＣＨＯｋ１−ｃ４−１ＢＢの結合反応の検出を示す。
【図１０Ａ】各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体でＮＦ−κＢ下流プロモーターを活性化するレポーター遺伝子実験を示す。
【図１０Ｂ】各４−１ＢＢ全ヒト由来抗体でＮＦ−κＢ下流プロモーターを活性化するレポーター遺伝子実験を示す。
【図１１】４−１ＢＢ全ヒト由来抗体の４−１ＢＢタンパク質とそのリガンド４−１ＢＢＬの結合反応に対する遮断を示す。
【図１２】４−１ＢＢ全ヒト由来抗体のＴ細胞刺激試験におけるＩＦＮ−γ分泌に対する影響を示す。
【図１３】４−１ＢＢ全ヒト由来抗体のＴ細胞刺激試験におけるＩＬ−２分泌に対する影響を示す。
【図１４】ファイザー社のウトミルマブ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）抗体を比較抗体として比較試験を行った結果を示す。
【図１５】４−１ＢＢ抗体のマウスＭＣ３８の腫瘍成長に対する実験結果を示す。
【図１６】異なる抗体治療群のマウス個体の腫瘍体積を示す。
【発明を実施するための形態】
【００７３】
具体的な実施形態
本発明者は幅広く深く研究したところ、初めて意外に、高い親和力および特異性を有する４−１ＢＢ抗体を見出し、そして当該抗体に基づいて全ヒト化抗体を得た。本発明の抗体は４−１ＢＢタンパク質に高度の親和力を有し、有効に４−１ＢＢの下流シグナルを活性化し、そしてヒト混合リンパ球またはＴ細胞において顕著にＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の発現量を増加させることができ、癌および自己免疫性疾患の治療に有用である。これに基づき、本発明を完成させた。
【００７４】
用語
本明細書で用いられるように、用語「結合物」とは標的と結合可能な可溶性受容体またはその断片またはその類似体、あるいは抗体またはその断片またはその類似体である。
【００７５】
本明細書で用いられるように、用語「４−１ＢＢ結合物」、「４−１ＢＢ抗体」、「抗４−１ＢＢ抗体」、「本発明の抗体」は同様の意味を持ち、特異的に４−１ＢＢを認識して４−１ＢＢと結合することができる、抗体またはその断片またはその類似体を指す。
【００７６】
本明細書で用いられるように、用語「投与」および「処理」とは外因性薬物、治療剤、診断剤または組成物を動物、ヒト、被験者、細胞、組織、器官または生物流体に応用することである。「投与」および「処理」は、治療、薬物動態学、診断、研究および実験方法でもよい。細胞の処理は、試薬と細胞の接触、および試薬と流体の接触、流体と細胞の接触を含む。また、「投与」および「処理」は、試薬、診断、結合組成物または別の細胞を通してｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｅｘ  ｖｉｖｏで処理することも意味する。「処理」は、ヒト、動物または研究の被験者に応用される場合、治療処理、予防または予防性処理、研究および診断を指し、４−１ＢＢ結合物とヒトまたは動物、被験者、細胞、組織、生理的コンパートメントまたは生理流体の接触を含む。
【００７７】
本明細書で用いられるように、用語「治療」とは患者に本発明の４−１ＢＢ結合物およびその組成物の任意の一つを含む内用または外用の治療剤を投与することで、前記患者は一つまたは複数の疾患症状を有し、既知の前記治療剤はこれらの症状に治療作用を有する。通常、有効に一つまたは複数の疾患症状を緩和する治療剤の量（治療有効量）で患者に投与する。
【００７８】
本明細書で用いられるように、用語「任意」または「任意に」はその後に記載されるイベントや状況はありうるが、必須ではない。
【００７９】
抗体
本明細書で用いられるように、用語「抗体」とは免疫グロブリンのことで、２本の同様の重鎖および２本の同様の軽鎖がジスルフィド結合を介して連結してなる４本ペプチド鎖の構造である。グロブリンの重鎖定常領域のアミノ酸の構成および配列順序により、その抗原性が異なる。よって、免疫グロブリンは５種類に分かれ、あるいは免疫グロブリンの異なるクラス、すなわち、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥと呼ばれ、異なるクラスの免疫グロブリンの重鎖定常領域に応じて、それぞれα、δ、ε、γ、およびμと呼ばれる。ＩｇＧは免疫グロブリンのうち最も重要な種類で、化学構造および生物機能によって、またＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４といった４つのサブクラスに分かれる。軽鎖は定常領域によってκ鎖またｈλ鎖に分かれる。各クラスの免疫グロブリンのサブユニット構造および三次元構造は本分野の技術者熟知である。
【００８０】
抗体の重鎖および軽鎖のＮ末端に近い約１１０のアミノ酸の配列は大きく異なり、可変領域（Ｖ領域）で、Ｃ末端に近い残りのアミノ酸配列は相対的に安定で、定常領域（Ｃ領域）である。可変領域は３つの超可変領域（ＨＶＲ）および４つの配列が相対的に保存的なＦＲ領域（ＦＲ）を含む。４つのＦＲのアミノ酸配列が相対的に保存的で、直接結合反応に関与しない。３つの超可変領域は、抗体の特異性を決定し、相補性決定領域（ＣＤＲ）とも呼ばれる。各軽鎖可変領域（ＬＣＶＲ）および重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）は３つのＣＤＲ領域および４つのＦＲ領域からなり、アミノ末端からカルボキシ末端までＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４の順で並ぶ。軽鎖の３つのＣＤＲ領域、すなわち、軽鎖超可変領域（ＬＣＤＲ）はＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３を、重鎖の３つのＣＤＲ領域、すなわち、重鎖超可変領域（ＨＣＤＲ）はＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３を指す。発明に記載の抗体または抗原結合断片のＬＣＶＲおよびＨＣＶＲ領域のＣＤＲのアミノ酸残基は数および位置において既知のＫａｂａｔ番号付け（ＬＣＤＲ１−３、ＨＣＤＲ２−３）、またはｋａｂａｔおよびｃｈｏｔｈｉａの番号付け（ＨＣＤＲ１）に準ずる。天然の重鎖および軽鎖の可変領域における４つのＦＲ領域は基本的にβシート構造となっており、連結ループを形成する３つのＣＤＲで連結され、場合によって部分βシート構造となる４つのＦＲ領域が含まれる。各鎖におけるＣＤＲは、ＦＲ領域で密接し、かつ他方の鎖のＣＤＲと一緒に抗体の抗原結合部位を形成している。同類の抗体のアミノ酸配列の比較によってどのアミノ酸がＦＲあるいはＣＤＲ領域を構成するか確認することができる。定常領域は、抗体と抗原との結合には直接関与しないが、たとえば抗体の抗体依存細胞毒性に参与するなどの異なるエフェクター機能を示す。
【００８１】
本明細書で用いられるように、用語「抗原結合断片」とは抗原結合活性を有するＦａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、または単一のＦｖ断片である。Ｆｖ抗体は抗体の重鎖可変領域、軽鎖可変領域を含有するが、定常領域がなく、かつすべての抗原結合部位を有する最小の抗体断片である。一般的に、Ｆｖ抗体はさらにＶＨとＶＬドメインの間のポリペプチドリンカーを含み、かつ抗原結合に必要な構造を形成することができる。
【００８２】
本明細書で用いられるように、用語「抗原決定基」とは抗原における不連続の本発明の抗体または抗原結合断片によって認識される立体空間部位である。
【００８３】
本発明は、完全の抗体だけではなく、免疫活性を有する抗体の断片または抗体とほかの配列からなる融合タンパク質も含む。そのため、本発明は、さらに、前記抗体の断片、誘導体および類似体を含む。
【００８４】
本発明において、抗体は当業者に熟知の技術によって製造されるネズミ抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体または全ヒト抗体を含む。組み換え抗体、たとえばキメラモノクローナル抗体およびヒト化モノクローナル抗体は、ヒトの部分および非ヒトの部分を含み、本分野で熟知されるＤＮＡ組み換え技術によって製造することができる。
【００８５】
本明細書で用いられるように、用語「モノクローナル抗体」とは単一の細胞由来のクローンから分泌される抗体である。モノクローナル抗体は、高度特異的で、単一のエピトープに対するものである。前記の細胞は、真核、原核またはファージのクローン細胞株でもよい。
【００８６】
本明細書で用いられるように、用語「キメラ抗体」はネズミ由来抗体のＶ領域の遺伝子とヒト抗体のＣ領域の遺伝子をキメラ遺伝子に連接した後、ベクターに挿入し、宿主細胞に形質移入して発現される抗体分子である。親ネズミ抗体の高い特異性および親和力を残しつつ、ヒト由来断片に有効に生物学的効果・機能を仲介させる。
【００８７】
本明細書で用いられるように、用語「ヒト化抗体」は、本発明のネズミ抗体の可変領域の改変形態で、非ヒト抗体（好ましくはマウスモノクローナル抗体）由来（または基本的にそれ由来）のＣＤＲ領域、および基本的にヒト由来抗体の配列からのＦＲ領域と定常領域を有し、すなわち、ネズミ抗体のＣＤＲ領域の配列を異種のヒト系抗体の骨格配列に接木する。ＣＤＲ配列は大半の抗体−抗原相互作用を担うため、発現ベクターを構築して特定の天然に存在する抗体の性質を模倣する組み換え抗体を発現することができる。
【００８８】
本発明において、抗体は、単特異性、二重特異性、三重特異性、またはそれ以上の多重特異性でもよい。
【００８９】
本発明において、本発明の抗体は、さらにその保存的変異体を含み、本発明の抗体のアミノ酸配列と比較すると、１０個以下、好ましくは８個以下、より好ましくは５個以下、最も好ましくは３個以下のアミノ酸が類似または近い性質を持つアミノ酸で置換されてなるポリペプチドをいう。これらの保存的突然変異のポリペプチドは、表Ａのようにアミノ酸の置換を行って生成することが好ましい。
【表Ａ】
2021502407.tif 000002
【００９０】
抗４−１ＢＢ抗体
４−１ＢＢは、ＣＤ１３９、またはＴＮＦＲＦ９とも呼ばれ、ＴＮＦ受容体ファミリーの一員である。４−１ＢＢは、読み枠が２５５アミノ酸（ＮＣＢＩ：ＮＰ  ＿００１５５２）を含有するＩ型膜貫通タンパク質で、１７アミノ酸を含有するＮ末端のシグナルペプチド、１６９アミノ酸の細胞外領域、２７アミノ酸の膜貫通領域および４２アミノ酸のＣ末端の細胞内領域からなり、具体的な配列は本特許における配列番号２２を参照する。
【００９１】
本明細書で用いられるように、用語「４−１ＢＢ」とは、一般的に、天然または組み換えのヒト４−１ＢＢ、およびヒト４−１ＢＢの非ヒトホモログである。別途に指示しない限り、４−１ＢＢのホモ二量体の分子量で４−１ＢＢのモル濃度を計算する。
【００９２】
本明細書で用いられるように、用語「ヒト４−１ＢＢ」はヒト４−１ＢＢタンパク質の成熟形態およびその天然バリアントと多型を含む。
【００９３】
本発明は、４−１ＢＢに対する高親和力の抗体であって、重鎖および軽鎖を含み、前記重鎖は重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列を、前記軽鎖は軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列を含有する抗体を提供する。
【００９４】
好ましくは、重鎖可変領域（ＶＨ）のアミノ酸配列および軽鎖可変領域（ＶＬ）のアミノ酸配列の各ＣＤＲは以下の群から選ばれる：
ａ１）配列番号２または配列番号１０；
ａ２）配列番号３または配列番号１１；
ａ３）配列番号４または配列番号１２；
ａ４）配列番号６または配列番号１４；
ａ５）配列番号７または配列番号１５；
ａ６）配列番号８または配列番号１６；
ａ７）上記アミノ酸配列のうちの任意の一つのアミノ酸配列が少なくとも１個（たとえば１〜５、１〜３個、好ましくは１〜２個、より好ましくは１個）のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を経た、４−１ＢＢ結合親和力を有する配列。
【００９５】
もう一つの好適な例において、前記少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を経た配列は、好適に、相同性が少なくとも８０％、好ましくは少なくとも９０％、より好ましくは少なくとも９５％、最も好ましくは少なくとも９９％のアミノ酸配列である。
【００９６】
好ましくは、上記アミノ酸配列の番号は表１に示される通りである。
【００９７】
【表１】
2021502407.tif 000003
【００９８】
ここで、表１における数字は配列表の「配列番号」で、たとえば５７Ｂ３Ｄ１０の重鎖タンパク質の可変領域のアミノ酸配列は配列番号１で示され、１１３Ｆ６Ｃ６の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１ドメインのアミノ酸配列は配列番号２で示されている。
【００９９】
実は、発明者は、抗体の選別過程において、さらにクローン番号：１１Ｈ１０Ｃ９、１５Ｇ１０Ｄ４、２３Ｇ３Ｂ８、５２Ｆ４Ｇ２、１１８Ｆ３Ａ２、１７０Ｄ７Ｆ２、１７２Ｅ３Ｅ３、１７８Ｄ１０Ｄ１１、１８２Ａ５Ｂ３、１００Ｆ３Ｃ４、１１９Ｂ６Ｇ５、２５８Ｆ５Ａ８、２５９Ｇ１０Ｅ１１、２６３Ａ１１Ｅ３、２８９Ｂ６Ｇ６の４−１ＢＢ抗体について、関連実験を行ったが、その各性能がクローン番号５７Ｂ３Ｄ１０および１１３Ｆ６Ｃ６の抗体よりも低く、さらなる実験は行われず、実験結果の詳細は実施例を参照する。
【０１００】
本発明の抗体は抗体の全長タンパク質、抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片、二重特異性抗体、多重特異性抗体、一本鎖抗体（ｓｉｎｇｌｅ  ｃｈａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ  ｆｒａｇｍｅｎｔ、ｓｃＦｖ）、単一ドメイン抗体（ｓｉｎｇｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ、ｓｄＡｂ）および単一領域抗体（Ｓｉｇｎｌｅ−ｄｏｍａｉｎ  ａｎｔｉｂｏｄｙ）のうちの一つまたは複数、ならびに上記抗体で製造されたモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体でもよい。前記モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ技術、ファージディスプレイ技術、単一リンパ球遺伝子クローニング技術などを含む、多くのアプローチおよび技術によって研究・製造することができるが、ハイブリドーマ技術によって野生型または遺伝子組み換えマウスからモノクローナル抗体を調製するのは主流である。
【０１０１】
前記の抗体全長タンパク質は本分野の通常の抗体全長タンパク質で、重鎖可変領域、軽鎖可変領域、重鎖定常領域および軽鎖定常領域を含む。前記のタンパク質の重鎖可変領域および軽鎖可変領域はヒト由来の重鎖定常領域およびヒト由来の軽鎖定常領域と全ヒト由来抗体の全長タンパク質を構成する。好ましくは、前記の抗体の全長タンパク質はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４である。
【０１０２】
前記の一本鎖抗体は本分野の通常の一本鎖抗体で、重鎖可変領域、軽鎖可変領域および１５〜２０アミノ酸の短鎖ペプチドを含む。
【０１０３】
前記の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片は本分野の通常の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片で、軽鎖可変領域、軽鎖定常領域および重鎖定常領域のＦｄ断片を含む。好ましくは、前記の抗原抗体結合ドメインのタンパク質断片はＦａｂおよびＦ（ａｂ’）である。
【０１０４】
前記の単一ドメイン抗体は本分野の通常の単一ドメイン抗体で、重鎖可変領域および重鎖定常領域を含む。
【０１０５】
前記の単一領域抗体は本分野の通常の単一領域抗体で、重鎖可変領域のみを含む。
【０１０６】
具体的に、本発明の抗体は二本鎖または一本鎖抗体でもよく、そして動物由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、より好ましくはヒト化抗体、ヒト−動物キメラ抗体、さらに好ましくは全ヒト化抗体から選ばれてもよい。
【０１０７】
本発明に係る抗体の誘導体は、一本鎖抗体、およびまたは抗体断片、たとえばＦａｂ、Ｆａｂ’、（Ｆａｂ’）２あるいは当該分野におけるほかの既知の抗体の誘導体など、ならびにＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧおよびＩｇＭ抗体またはほかのサブタイプの抗体のうちの任意の一つまたは複数でもよい。
【０１０８】
ここで、前記動物は、哺乳動物、たとえばネズミが好ましい。
【０１０９】
本発明の抗体は、ヒト４−１ＢＢを標的とするネズミ由来抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、ＣＤＲ接木および／または修飾の抗体でもよい。
【０１１０】
本発明の一つの好適な実施例において、上記配列番号２、３および４、または配列番号６、７および８のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を経た、４−１ＢＢ結合親和力を有する配列は、重鎖可変領域（ＶＨ）のＣＤＲ領域に位置する。
【０１１１】
本発明の一つの好適な実施例において、上記配列番号１０、１１および１２、または配列番号１４、１５および１６のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を経た、４−１ＢＢ結合親和力を有する配列は、軽鎖可変領域（ＶＬ）のＣＤＲ領域に位置する。
【０１１２】
本発明の一つのより好適な実施例において、ＶＨ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ独立に配列番号２、３および４、または配列番号６、７および８のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を経た、４−１ＢＢ結合親和力を有する配列から、ＶＬ  ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３はそれぞれ独立に配列番号１０、１１および１２、または配列番号１４、１５および１６のうちの任意の一つまたは複数の配列、あるいはこれらが少なくとも１個のアミノ酸の付加、欠失、修飾および／または置換を経た、４−１ＢＢ結合親和力を有する配列から選ばれる。
【０１１３】
本発明の上記内容において、前記付加、欠失、修飾および／または置換のアミノ酸の数は、好ましくは元のアミノ酸配列のアミノ酸の合計の３０％未満、より好ましくは２０％未満、さらに好ましくは１〜１５％、またさらに好ましくは１〜１０％である。
【０１１４】
本発明において、前記付加、欠失、修飾および／または置換のアミノ酸の数は、通常、１、２、３、４または５個、好ましくは１〜３個、より好ましくは１〜２個、最も好ましくは１個である。
【０１１５】
ポリヌクレオチド
また、本発明は、上記ポリペプチドをコードする核酸を提供する。
【０１１６】
好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸は配列表の配列番号１０６または配列表の配列番号１０８で示され、および／または、前記軽鎖可変領域をコードする核酸のヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０７または配列表の配列番号１０９で示される。
【０１１７】
より好ましくは、前記重鎖可変領域をコードする核酸は配列表の配列番号１０６で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は配列表の配列番号１０７で示され、前記重鎖可変領域をコードする核酸は配列表の配列番号１０８で示され、かつ前記軽鎖可変領域をコードする核酸は配列表の配列番号４１で示される。
【０１１８】
上記ヌクレオチド酸配列の番号は表２に示される通りである。
【０１１９】
【表２】
2021502407.tif 000004
【０１２０】
ここで、表２における数字は配列表の「配列番号」で、たとえば５７Ｂ３Ｄ１０の重鎖タンパク質の可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０６で示される。
【０１２１】
ここで、５７Ｂ３Ｄ１０の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０６における９１番目〜１０５番目で、  
５７Ｂ３Ｄ１０の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０６における１４８番目〜１９５番目で、  
５７Ｂ３Ｄ１０の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０６における２９２番目〜３４２番目で、  
５７Ｂ３Ｄ１０の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０７における６７番目〜１０２番目で、
５７Ｂ３Ｄ１０の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０７における１４８番目〜１６８番目で、
５７Ｂ３Ｄ１０の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０７における２６５番目〜２８８番目で、
１１３Ｆ６Ｃ６の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０８における９１番目〜１０５番目で、
１１３Ｆ６Ｃ６の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０８における１４８番目〜１９８番目で、
１１３Ｆ６Ｃ６の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０８における２９５番目〜３５１番目で、
１１３Ｆ６Ｃ６の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０９における７０番目〜１０２番目で、  
１１３Ｆ６Ｃ６の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ２ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０９における１４８番目〜１６８番目で、
１１３Ｆ６Ｃ６の軽鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ３ドメインをコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０９における２６５番目〜２９１番目で、
前記核酸の製造方法は本分野の通常の製造方法で、好ましくは、遺伝子クローニング技術によって上記タンパク質をコードする核酸分子を得るか、または全配列を人工的に合成する方法によって上記タンパク質をコードする核酸分子を得る工程を含む。
【０１２２】
当業者には、上記タンパク質のアミノ酸配列をコードする塩基配列に適当に置換、欠失、変更、挿入または添加を導入することによって一つのポリヌクレオチドのホモログを提供することができることがわかる。本発明において、ポリヌクレオチドのホモログは当該タンパク質をコードする遺伝子の一つまたは複数の塩基に対して抗体の活性を保つ範囲で置換、欠失または添加を行うことによって調製することができる。
【０１２３】
抗体の製造
モノクローナル抗体の生成に適する方法のいずれも本発明の抗４−１ＢＢ抗体の生成に使用することができる。たとえば、連接または天然に存在する４−１ＢＢホモ二量体またはその断片で動物を免疫させることができる。アジュバント、免疫刺激剤、重複免疫強化接種を含む、適切な免疫接種方法を使用してもよく、一つまたは複数の手段をしようしてもよい。
【０１２４】
適切な様態の４−１ＢＢのいずれも免疫原（抗原）とし、４−１ＢＢに特異的な非ヒト抗体を生成し、前記抗体の生物学活性を選別するの使用することができる。刺激免疫原は全長の成熟ヒト４−１ＢＢでもよいが、天然のホモ二量体、または一つ／複数のエピトープを含むペプチドを含む。免疫原は単独で使用してもよく、あるいは本分野で既知の一つまたは複数の免疫原性補強剤と組み合わせて使用してもよい。免疫原は天然由来の精製されたもの、あるいは遺伝的に修飾された細胞において生成したものでもよい。免疫原をコードするＤＮＡは、ゲノム由来のものまたは非ゲノム由来のもの（たとえばｃＤＮＡ）でもよい。適切な遺伝ベクターで免疫原をコードするＤＮＡを発現することができるが、前記ベクターはアデノウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、プラスミドおよび非ウイルスベクターを含むが、これらに限定されない。
【０１２５】
本発明の抗ヒト４−１ＢＢ抗体を生成する例示的な方法は実施例１に記載する。
【０１２６】
全ヒト化抗体は、任意の種類の免疫グロブリンから選ばれてもよいが、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥを含む本発明において、抗体はＩｇＧ抗体で、ＩｇＧ４サブタイプを使用する。下記実施例に記載の抗体の生物学的な測定・選別では、一定のドメイン配列が必要な配列の最適化を実現させ、必要な生物学活性を持たせることが容易である。
【０１２７】
同様に、何らの軽鎖も本明細書の化合物および方法において使用することができる。具体的に、κ鎖、λ鎖またはそのバリアントは本発明の化合物および方法において有用である。
【０１２８】
本発明の抗ヒト４−１ＢＢ抗体をヒト化する例示的な方法は実施例３に記載する。
【０１２９】
本発明の抗体またはその断片のＤＮＡ分子の配列は、通常の技術で、たとえば、ＰＣＲ増幅  あるいはゲノムライブラリースクリーニングなどの方法によって得ることができる。また、軽鎖および重鎖のコード配列を一体に融合し、一本鎖抗体を形成してもよい。
【０１３０】
関連の配列を獲得すれば、組み換え法で大量に関連配列を獲得することができる。この場合、通常、その配列をベクターにクローンした後、細胞に導入し、さらに通常の方法で増殖させた宿主細胞から関連配列を単離して得る。
【０１３１】
また、特に断片の長さが短い場合、人工合成の方法で関連配列を合成してもよい。通常、まず多数の小さい断片を合成し、そして連接させることにより、配列の長い断片を得ることができる。さらに、このＤＮＡ配列を本分野で周知の各種の既知のＤＮＡ分子（あるいはベクターなど）や細胞に導入してもよい。
【０１３２】
さらに、本発明は、上記の適当なＤＮＡ配列および適当なプロモーターあるいは制御配列を含むベクターに関する。これらのベクターは、タンパク質を発現するように、適当な宿主細胞の形質転換に用いることができる。
【０１３３】
宿主細胞は本発明の通常の様々な宿主細胞で、上記組み換え発現形質転換体が安定して自己複製し、かつ担持される前記の核酸が有効に発現されるようにさせることができればよい。具体的に、宿主細胞は、原核細胞、たとえば細菌細胞、あるいは、低等真核細胞、たとえば酵母細胞、あるいは、高等真核細胞、たとえば哺乳動物細胞でもよい。好適な動物細胞は、ＣＨＯ−Ｓ、ＣＨＯ−Ｋ１、ＨＥＫ−２９３細胞を含むが、これらに限定されない。
【０１３４】
好適な宿主細胞はＥ．ｃｏｌｉ  ＴＧ１またはＢＬ２１細胞（一本鎖抗体またはＦａｂ抗体を発現する）、またはＣＨＯ−Ｋ１細胞（全長ＩｇＧ抗体を発現する）を含む。
【０１３５】
本発明に記載のＤＮＡ組み換えによる宿主細胞の形質転換の工程は本分野で熟知の技術で行ってもよい。得られる形質転換体は通常の方法で培養し、本発明の遺伝子がコードするポリペプチドを発現することができる。用いられる宿主細胞によって、通常の培地で適切な条件において培養する。
【０１３６】
通常、本発明の抗体の発現に適切な条件で、形質転換で得られた宿主細胞を培養する。そして、通常のグロブリンの精製工程、例えばプロテインＡ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、分子篩クロマトグラフィーやアフィニティークロマトグラフィーなどの本分野の技術者に熟知の通常の分離精製手段で精製し、本発明のの抗体を得る。
【０１３７】
得られたモノクローナル抗体は、通常の手段で同定することができる。たとえば、モノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降、あるいは体外結合試験（たとえば放射免疫測定（ＲＩＡ）または酵素結合免疫吸着測定（ＥＬＩＳＡ））で測定することができる。
【０１３８】
応用
本発明は、本発明の用途、たとえば診断製剤の製造、あるいは４−１ＢＢ関連疾患を予防および／または治療する薬物の製造に使用される用途を提供する。前記４−１ＢＢ関連疾患は、癌、自己免疫疾患、ウイルス感染、移植片対宿主病、炎症性疾患、免疫性疾患、またはこれらの組み合わせを含む。中では、前記の癌は固形腫瘍、血液癌を含み、前記の固形腫瘍は、膀胱癌、胆管癌、脳癌、乳癌、結腸癌、食道癌、胃癌、膠細胞腫、頭部癌、白血病、肝臓癌、肺癌、リンパ腫、骨髄腫、頸部癌、卵巣癌、メラノーマ、膵臓腺癌、腎臓癌、唾液腺癌、胃癌、胸腺上皮癌および甲状腺癌、またはこれらの組み合わせからなる群から選ばれ、前記の自己免疫疾患は、全身性エリテマトーデス、関節リウマチ、潰瘍性大腸炎、Ｉ型糖尿病、乾癬、多発性硬化症、またはこれらの組み合わせを含む。
【０１３９】
薬物組成物
さらに、本発明は組成物を提供する。好適な例において、前記の組成物は薬物組成物で、上記の抗体またはその活性断片あるいはその融合タンパク質またはそのＡＤＣまたは相応するＣＡＲ−Ｔ細胞と、薬学的に許容される担体とを含有する。通常、これらの物質を無毒で不活性で薬学的に許容される水系担体で配合し、ｐＨ値は配合される物質の性質および治療しようとする疾患にもよるが、ｐＨ値は通常５〜８程度、好ましくは６〜８程度である。配合された薬物組成物は通常の経路で給与することができ、腫瘍内、腹膜内、静脈内、あるいは局部給与が含まれるが、これらに限定されない。
【０１４０】
本発明に係る抗体は、ヌクレオチド配列によって細胞内で発現されて細胞治療に使用してもよく、たとえば、前記抗体はキメラ抗原受容体Ｔ細胞免疫療法（ＣＡＲ−Ｔ）などに使用することができる。
【０１４１】
本発明の薬物組成物は直接４−１ＢＢタンパク質分子との結合に使用することができるため、４−１ＢＢ関連疾患の予防および治療に有用である。また、他の治療剤と併用してもよい。
【０１４２】
本発明の薬物組成物は、安全有効量（たとえば０．００１〜９９ｗｔ％、好ましくは０．０１〜９０ｗｔ％、より好ましくは０．１〜８０ｗｔ％）の本発明の上記のモノクローナル抗体（またはその抱合体）と薬学的に許容される担体または賦形剤とを含む。このような担体は、食塩水、緩衝液、ブドウ糖、水、グリセリン、エタノール、およびこれらの組み合せを含むが、これらに限定されない。薬物の製剤は投与形態に相応する。本発明の薬物組成物は、注射剤としてもよく、たとえば生理食塩水またはブドウ糖およびほかの助剤を含有する水溶液で通常の方法によって製造することができる。薬物組成物は、注射剤、溶液の場合、無菌条件で製造する。活性成分の投与量は治療有効量、たとえば毎日約１μｇ／ｋｇ体重〜約１００ｍｇ／ｋｇ体重である。また、本発明のポリペプチドはほかの治療剤と併用することが出来る。
【０１４３】
薬物組成物の使用時、安全有効量の薬物組成物を哺乳動物に施用するが、その安全有効量は、通常、少なくとも約１０μｇ／ｋｇ体重で、かつ多くの場合、約５０ｍｇ／ｋｇ体重未満で、好ましくは当該投与量が約１０μｇ／ｋｇ体重〜約２０ｍｇ／ｋｇ体重である。勿論、具体的な投与量は、さらに投与の様態、患者の健康状況などの要素を考えるべきで、すべて熟練の医者の技能範囲以内である。
【０１４４】
検出用途およびキット
本発明の抗体は検出に有用で、たとえば検体を検出することによって診断情報を提供することができる。
【０１４５】
本発明において、使用される検体（サンプル）は細胞、組織検体および生検標本を含む。本発明で用いられる用語「生検」は当業者に既知のすべての種類の生検を含む。そのため、本発明で使用される生検は、たとえば内視鏡方法あるいは器官の穿刺または針刺しによって調製された組織検体を含む。
【０１４６】
本発明で使用される検体は固定または保存された細胞または組織検体を含む。
【０１４７】
また、本発明は、本発明の抗体（またはその断片）を含有するキットを提供するが、本発明の一つの好適な例において、前記のキットはさらに容器、使用説明書、緩衝液などを含む。好適な例において、本発明の抗体は検出プレートに固定されてもよい。
【０１４８】
また、本発明は、４−１ＢＢタンパク質を過剰発現する細胞を検出する方法であって、上記のタンパク質を被験サンプルと体外で接触させ、上記のタンパク質と前記被験サンプルの結合を検出する工程を含む方法を提供する。
【０１４９】
前記の過剰発現の意味は本分野の通常のもので、４−１ＢＢタンパク質の被験サンプルにおけるＲＮＡまたはタンパク質の過剰発現（転写の増加、転写後修飾、翻訳、翻訳後修飾およびタンパク質分解による変化）、およびタンパク質の輸送形態の変化（核局在化の増加）による局部の過剰発現と機能活性の向上（たとえば基質の酵素加水分解作用が増加する場合）をいう。
【０１５０】
前記結合の検出手段は本分野の通常の検出手段、好ましくはＦＡＣＳによる検出である。
【０１５１】
本発明は、４−１ＢＢタンパク質を過剰発現する細胞を検出する組成物であって、上記のタンパク質を活性成分として含む組成物を提供する。好ましくは、さらに上記のタンパク質の機能断片からなる化合物を活性成分として含む
本分野の常識に合うことを前提に、上記各好適な条件を任意に組み合わせれば、本発明の各好適な実例が得られる。
【０１５２】
本発明で用いられる試薬および原料はいずれも市販品として得られる。
【０１５３】
本発明の主な利点は以下の通りである。
【０１５４】
本発明に係るタンパク質は全ヒト由来４−１ＢＢ抗体で、４−１ＢＢタンパク質と高親和力を有し、４−１ＢＢタンパク質受容体の細胞外領域と結合し、そして細胞レベルで４−１ＢＢ分子の下流シグナルを活性化することができる。ヒト混合リンパ球実験またはＴ細胞刺激実験では、前記の４−１ＢＢ抗体は良い生物活性を有し、ヒト混合リンパ球またはＴ細胞において顕著にＩＦＮ−γおよびＩＬ−２の発現量を増加させることができることが証明された。このように、前記の４−１ＢＢ抗体は、全ヒト由来配列以外、ヒト４−１ＢＢタンパク質と結合する高度特異的で、ヒトリンパ球の免疫反応を調節できるといった優れた特性を有する。  
【０１５５】
以下、具体的な実施例によってさらに本発明を説明する。これらの実施例は本発明を説明するために用いられるものだけで、本発明の範囲の制限にはならないと理解されるものである。以下の実施例において、具体的な条件が記載されていない実験方法は、通常、通常の条件、あるいはメーカーの薦めの条件で行われた。特に断らない限り、％と部は、重量で計算された。
【０１５６】
実施例に記載の室温は本分野の通常の室温で、一般的に１０〜３０℃である。
【０１５７】
特別に説明しない限り、実施例に記載のＰＢＳはＰＢＳリン酸緩衝液で、ｐＨ７．２である。
【０１５８】
実施例１
４−１ＢＢ抗体の製造
（一）．免疫原Ａの製造
ヒト由来４−１ＢＢタンパク質の細胞外領域のアミノ酸配列Ｌｅｕ２４−Ｇｌｎ１８６（配列表の配列番号２１で示される）をヒトＩｇＧ  Ｆｃ断片（ｈＦｃ）を持つｐＣｐＣベクター（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入、Ｖ０４４−５０）にクローニングして既に確立された標準分子生物学方法によってプラスミドを製造した。ＨＥＫ２９３細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に対して一過性形質移入（ＰＥＩ、Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行ってＦｒｅｅＳｔｙｌｅＴＭ  ２９３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）によって３７℃で増幅培養を行った。４日後細胞培養液を収集し、遠心で細胞成分を除去し、４−１ＢＢタンパク質の細胞外領域を含有する培養上清液を得た。培養上清液をプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラム（Ｍａｂｓｅｌｅｃｔ  Ｓｕｒｅ、ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）に仕込み、同時に紫外（ＵＶ）検出装置によって紫外吸収値（Ａ２８０ｎｍ）の変化をモニタリングした。仕込み後、ＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．２）で紫外吸収値がベースラインに戻るまでプロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムを洗浄し、さらに０．１  Ｍグリシン塩酸（ｐＨ２．５）で溶離させ、プロテインＡアフィニティークロマトグラフィーカラムから溶離したｈＦｃタグ付きの４−１ＢＢタンパク質４−１ＢＢ−ｈＦｃ）を収集し、ＰＢＳリン酸塩緩衝液（ｐＨ  ７．２）で４℃の冷蔵庫において一晩透析した。透析後のタンパク質を０．２２μｍで無菌ろ過した後、分注して−８０℃で保存し、すなわち、精製された免疫原Ａを得た。免疫原Ａは使用前に一連の品質管理の検出、たとえばそのタンパク質の濃度、純度、分子量および生物活性などの検出が必要で、結果は図１および表３に示す。表３では、４−１ＢＢとそのリガンドタンパク質４−１ＢＢＬのタンパク質レベルの結合は４−１ＢＢＬの濃度変化によって変わったことが示されたが、ここで、対照タンパク質は非４−１ＢＢ融合タンパク質で、表におけるデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。
【０１５９】
ここで、免疫原Ａの生物活性はＥＬＩＳＡによって検出されたが、具体的に以下の通りである。
【０１６０】
ｈＦｃタグ付きの４−１ＢＢの細胞外領域のタンパク質（４−１ＢＢ−ｈＦｃ）をＰＢＳで０．５μｇ／ｍＬに希釈し、１００μｌ／ウェルでＥＬＩＳＡマイクロプレートに入れ、４℃で一晩インキュベートした。ＥＬＩＳＡブロッキング液（１％ＢＳＡを含有するｐＨ７．４のＰＢＳリン酸緩衝液で、前記百分率は質量百分率である）で３７℃で２時間ブロッキングした後、さらに勾配希釈されたｈｉｓ−ｍｕＣＤ８ａ−４−１ＢＢＬＥＣＤ融合タンパク質を入れて３７℃で１時間インキュベートした。ｈｉｓ−ｍｕＣＤ８ａ−４−１ＢＢＬＥＣＤは４−１ＢＢリガンド４−１ＢＢＬ細胞外領域（ＮＣＢＩ配列ＮＰ＿００３８０２．１のＡｒｇ７１−Ｇｌｕ２５４）とマウスＣＤ８ａ細胞外領域（ＮＣＢＩ配列ＮＰ＿００１０７４５７９．１のＬｙｓ２８−Ａｓｐ１９４）が融合してなるもので、ｈｉｓタグはＮ末端に位置する。ｈｉｓ−ｍｕＣＤ８ａ−４−１ＢＢＬＥＣＤタンパク質の発現方法は免疫原Ａと同様で、ニッケルカラムアフィニティクロマトグラフィーによって精製した。
【０１６１】
そして、さらにビオチンで標識されたラット抗マウスＣＤ８ａ抗体を入れ、３７℃で１時間インキュベートした。ストレプトアビジンで標識された西洋ワサビペルオキシダーゼ（Ｓｉｇｍａから購入、商品番号Ｓ２４３８）を入れ、室温で３０分間インキュベートした後、１００μＬ／ウェルでＴＭＢ呈色液を入れた。室温で１５分間インキュベートした後、５０μＬの１Ｎ塩酸を入れて呈色反応を停止させ、ＥＬＩＳＡプレートリーダーによってＯＤ４５０ｎｍを読み取った。
【０１６２】
【表３】
2021502407.tif 000005
【０１６３】
（二）．免疫原Ｂの製造
ヒト由来４−１ＢＢ全長アミノ酸配列（配列表の配列番号２３で示される）がｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈから購入）にクローニングされ、そしてプラスミドを製造した。ＨＥＫ２９３細胞およびＣＨＯＫ１細胞系（いずれもＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に対してプラスミドの形質移入（形質移入はＸ−ｔｒｅｍｅ  ＧＥＮＥ  ＨＰ  ＤＮＡ  Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ  Ｒｅａｇｅｎｔを使用し、Ｒｏｃｈｅ社から購入され、カタログ番号はＣａｔ  ＃０６  ３６６  ２３６  ００１で、そして説明書に従って操作した）を行った後、０．５μｇ／ｍＬの１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地で２週間選択培養し、有限希釈法によって９６ウェルプレートでサブクローニングを行い、そして３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２で培養した。約２週間後、一部の単一のクローンウェルを選んで６ウェルプレートで増幅した。増幅されたクローンに対して既知の４−１ＢＢ抗体（ＢＤ社から購入）でフローサイトメトリー分析法によって選別した。生長が良く、蛍光強度が高く、単一クローンの細胞系を選んで続いて増幅培養して液体窒素で冷凍保存し、すなわち、免疫原Ｂを得た。具体的な選択結果は表４および図２に示すように、表４では、陽性細胞（％）とは陽性細胞の全細胞数における百分率である。表４では、一連の４−１ＢＢ陽性発現のＨＥＫ２９３細胞系を得たことが示された。
【０１６４】
【表４】
2021502407.tif 000006
【０１６５】
（三）．ハイブリドーマ細胞の製造と抗体の選別
Ｈａｒｂｏｕｒ遺伝子組み換えマウスにヒト免疫グロブリンの可変領域の遺伝子およびラット免疫グロブリンの定常領域の遺伝子を導入し、マウス自身のＩｇ発現は沈黙させられた。当該遺伝子組換えマウスは、抗原免疫後、正常マウス（たとえばＢａｌｂ／ｃ）に相当する免疫応答および抗体力価を示すことができる。
【０１６６】
Ａ．免疫原Ａで６〜８週齢のＨａｒｂｏｕｒヒト由来抗体遺伝子組換えマウス（北京維通利華社から購入）を免疫させ、マウスをＳＰＦ条件で飼育した。初回免疫の場合、免疫原（１）タンパク質をフロイント完全アジュバントで乳化した後、腹腔に０．２５ｍＬ、すなわち、各マウスに１００μｇ／匹ずつ、免疫原Ａタンパク質を注射した。強化免疫の場合、免疫原Ａタンパク質をフロイント不完全アジュバントで乳化した後、腹腔に０．２５ｍＬ、すなわち、各マウスに５０μｇ／匹ずつ、免疫原Ａタンパク質を注射した。初回免疫と１回目の強化免疫の間は２週間の間隔で、その後の毎回の強化免疫は３週間おきに行われた。毎回の強化免疫の１週間後、採血し、ＥＬＩＳＡおよびＦＡＣＳによって血清における免疫原（１）の抗体力価および特異性を検出し、結果を図３および表５に示す。表５では、４−１ＢＢ−ｈＦｃで免疫されたマウスの免疫後の血清がいずれも免疫原Ａに対して異なる程度の結合があり、抗原抗体反応を示し、中でも、最高の希釈度が１００万程度であったことが示された。ここで、ブランク対照は１％（ｗ／ｗ）ＢＳＡで、中では、バッチとは３回目の強化免疫から７日目のマウス血清を表し、表におけるデータはＯＤ４５０ｎｍ値である。
【０１６７】
【表５】
2021502407.tif 000007
【０１６８】
Ｂ．免疫原Ｂで６〜８週齢のＨａｒｂｏｕｒヒト由来抗体遺伝子組換えマウス（北京維通利華社から購入）を免疫させ、マウスをＳＰＦ条件で飼育した。実施例１の工程（二）で得られたヒト由来４−１ＢＢを含有するＨＥＫ２９３−ｈ４−１ＢＢ安定細胞系をＴ−７５細胞培養瓶で９０％コンフルエンスまで増幅培養し、培地を全部吸い捨てた。ＤＭＥＭ基礎培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２回洗浄した後、無酵素細胞分解液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）によって３７℃で細胞が培養シャーレの壁から脱落可能になるまで処理し、細胞を収集した。ＤＭＥＭ基礎培地で２回洗浄し、細胞の計数を行った後、細胞をリン酸塩緩衝液（ｐＨ  ７．２）で２×１０７細胞／ｍＬに希釈した。各マウスに毎回の免疫の時０．５ｍＬの細胞懸濁液を腹腔注射した。１回目と２回目の強化免疫の間は２週間の間隔で、その後の毎回の免疫は３週間おきに行われた。１回目の免疫以外、毎回の免疫の１週間後、採血し、ＦＡＣＳによって血清における抗体力価および特異性を検出した。２回目の強化免疫後、ＦＡＣＳによる血清抗体力価は通常１：１０００以上に達した。
【０１６９】
通常、免疫原Ａ〜Ｂで免疫させると、大半のマウスは３回の免疫後、ＦＡＣＳによる力価が１：１０００以上に達する。
【０１７０】
Ａ〜Ｂ工程が完成する前に、選ばれた各マウスに最後の免疫として１００μｇの精製された４−１ＢＢ−ｈＦｃ（免疫原Ａおよび免疫原Ｃに免疫反応が生じるマウス）またはヒト由来４−１ＢＢを含有するＨＥＫ２９３−ｈ４−１ＢＢ安定細胞系（免疫原Ｂに免疫反応が生じるマウス）を腹腔注射し、５日後マウスを殺処分し、脾臓細胞を収集した。最終濃度が１％（ｗ／ｗ）になるようにＮＨ４ＯＨを入れ、脾臓細胞に混ざった赤血球を分解させ、脾臓細胞懸濁液を得た。ＤＭＥＭ基礎培地で１０００回／分で遠心して細胞を３回洗浄した後、生細胞数５：１の比率でマウス骨髓腫細胞ＳＰ２／０（ＡＴＣＣから購入）と混合し、高効率電気融合方法またはＰＥＧ法によって細胞融合を行った。融合した細胞を２０％牛胎児血清、１×ＨＡＴを含有するＤＭＥＭ培地に希釈したが、前記百分率は質量百分率である。その後、１×１０５／２０μＬ／ウェルで９６ウェル細胞培養プレートに入れ、５％ＣＯ２、３７℃のインキュベーターに置いたが、前記百分率は体積百分率である。１４日後、ＥＬＩＳＡおよびＡｃｕｍｅｎ（マイクロプレート細胞検出法）によって細胞融合プレートの上清を選別し、ＥＬＩＳＡにおけるＯＤ４５０ｎｍ＞１．０かつＡｃｕｍｅｎにおけるＭＦＩ値＞１００の陽性クローンを２４ウェルプレートに続服し１０％（ｗ／ｗ）牛胎児血清を含有するＤＭＥＭ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）培地において、３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件で増幅培養した。３日培養した後、２４ウェルプレートにおいて増幅培養された培養液を遠心し、上清液を収集し、上清液に対して抗体のサブタイプの分析を行った。ＥＬＩＳＡ、ＦＡＣＳによって４−１ＢＢタンパク質および４−１ＢＢ陽性細胞に対する結合活性を確認し（結合活性の検出方法はそれぞれ実施例５Ａおよび実施例５Ｂを参照）、さらにＮＦ−κＢルシフェラーゼ・レポーター遺伝子実験によって抗体サンプルの４−１ＢＢ受容体を活性化する活性を確認した（検出方法は実施例５を参照する）。
【０１７１】
２４ウェルプレートの選別結果から、ＥＬＩＳＡ実験においてＯＤ４５０ｎｍ＞１．０、ＦＡＣＳ実験においてＭＦＩ値＞５０、かつＮＦ−κＢルシフェラーゼ・レポーター遺伝子実験においてハイブリドーマ細胞の培養上清が対照ＩｇＧ群に対して４−１ＢＢ受容体を１．０倍以上活性化させたハイブリドーマ細胞を条件に合致する陽性クローンとした。条件に合致するハイブリドーマ細胞を選んで有限希釈法によって９６ウェルプレートでサブクローニングを行い、１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳ含有ＤＭＥＭ培地（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件において培養した。サブクローニングから１０日後ＥＬＩＳＡおよびＡｃｕｍｅｎによって初期選別を行い、陽性クローンを選んで２４ウェルプレートで培養を続けた。３日後、ＦＡＣＳによって抗原結合陽性を確認し、そして４−１ＢＢ受容体ＮＦ−κＢルシフェラーゼ・レポーター遺伝子実験によって生物活性を評価した（評価基準は、ＥＬＩＳＡ実験においてＯＤ４５０ｎｍ＞１．０、ＦＡＣＳ実験においてＭＦＩ値＞５、かつＮＦ−κＢルシフェラーゼ・レポーター遺伝子実験においてハイブリドーマ細胞の培養上清が対照ＩｇＧ群に対して４−１ＢＢ受容体を１．０倍以上活性化させたことである）。
【０１７２】
２４ウェルプレートのサンプルの検出結果から、陽性クローンを１０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳを含有するＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）において３７℃、５％（ｖ／ｖ）ＣＯ２の条件で増幅培養し、細胞を凍結保存液［２０％（ｗ／ｗ）ＦＢＳおよび１０％（ｗ／ｗ）ＤＭＳＯを含有するＤＭＥＭ］に懸濁させ、常法によって液体窒素で凍結保存し、本発明のハイブリドーマ細胞を得、そして後の抗体の配列決定に使用される  
実施例２
軽・重鎖可変領域のアミノ酸配列の測定
全ＲＮＡ分離：実施例１のサブクローン培養で得られた上清液に対して抗原結合を検出した後（すなわち、実施例３〜６の同定および活性測定を経た後）、一部の抗体を選んで（詳しくは表６、７を参照する）配列決定を行った。遠心でハイブリドーマ細胞を５×１０７個の細胞を収集し、１ｍＬのＴｒｉｚｏｌを入れて均一に混合して１．５ｍＬ遠心管に移し、室温で５分間静置した。０．２ｍＬのクロロホルムを入れ、１５秒振とうし、２分間静置した後、４℃で１２０００ｇで５分間遠心し、上清を取って新しい１．５ｍＬ遠心管に移した。０．５ｍＬのイソプロパノールを入れ、管における液体を軽く均一に混合し、室温で１０分間静置した後、４℃で１２０００ｇで１５分間遠心し、上清を捨てた。１ｍＬの７５％エタノール（前記百分率は体積百分率である）を入れ、軽く沈殿を洗浄し、４℃で１２０００ｇで５分間遠心した後、上清を捨て、沈殿物を自然乾燥し、ＤＥＰＣで処理されたＨ２Ｏを入れて溶解させ（５５℃水浴で溶解を１０分間促進した）、全ＲＮＡを得た。
【０１７３】
逆転写とＰＣＲ：１μｇの全ＲＮＡを取り、２０μＬ系を調製し、逆転写酵素を入れた後４２℃で６０分間反応させ、７℃で１０分間反応させて反応を停止させた。１μＬのｃＤＮＡ、各プライマー２５ｐｍｏｌ、１μＬのＤＮＡポリメラーゼおよび相応する緩衝系、２５０μｍｏｌのｄＮＴＰｓを含む５０μＬのＰＣＲ系を調製した。予備変性９５℃、３分、変性９５℃、３０秒、アニーリング５５℃  、３０秒、伸長７２℃、３５秒で３５サイクル後、余分に７２℃で５分伸長するように、ＰＣＲプログラムを設定し、ＰＣＲ産物を得た。ここで、逆転写に使用されたキットはＰｒｉｍｅＳｃｒｉｐｔ  ＲＴ  Ｍａｓｔｅｒ  Ｍｉｘで、Ｔａｋａｒａから購入され、カタログ番号はＲＲ０３６で、ＰＣＲに使用されたキットはＱ５ハイフィデリティーポリメラーゼで、ＮＥＢから購入され、カタログ番号はＭ０４９２であった。
【０１７４】
クローニングと配列決定：５μＬのＰＣＲ産物を取ってアガロースゲル電気泳動によって検出し、陽性と検出されたサンプルをカラム回収キットによって精製し、ここで、回収キットはＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）  Ｇｅｌ  ＆  ＰＣＲ  Ｃｌｅａｎ−ｕｐで、ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬから購入され、カタログ番号は７４０６０９であった。連結反応：サンプル５０ｎｇ、Ｔベクター５０ｎｇ、リガーゼ０．５μＬ、緩衝液１μＬ、反応系１０μＬを１６℃で半時間反応させて連結産物を得、ここで、連結のキットはＴ４  ＤＮＡリガーゼで、ＮＥＢから購入され、カタログ番号はＭ０４０２であった。５μＬの連結産物を１００μＬの感受性細胞（Ｅｃｏｓ  １０１ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ  ｃｅｌｌｓ、Ｙｅａｓｔｅｒｎから購入、カタログ番号ＦＹＥ６０７）に入れ、氷浴で５分間置いた。その後、４２℃で水浴で１分間ヒートショックさせ、氷の上に１分間置いた後６５０μＬの抗生物質のないＳＯＣ培地を入れ、３７℃でチェーカーで２００ＲＰＭの速度で３０分間蘇生させ、２００μＬを取って抗生物質を含有するＬＢ固体培地に塗布して３７℃のインキュベーターで一晩培養した。次の日に、Ｔベクターを使用してプライマーＭ１３ＦとＭ１３Ｒで３０μＬのＰＣＲ系を調製し、集落のＰＣＲを行い、ピペットチップの先端で集落を取ってＰＣＲ反応系に吹き込み、かつ０．５μＬを取ってもう一つの１００ｎＭアンピシリンを含有するＬＢ固体培養シャーレに接種して菌株を保存した。ＰＣＲ反応終了後、５μＬを取ってアガロースゲル電気泳動によって検出し、陽性のサンプルを配列決定した。ここで、配列決定の工程はＫａｂａｔ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ  ｏｆ  Ｐｒｏｔｅｉｎｓ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ  ｏｆ  Ｈｅａｌｔｈ，  Ｂｅｔｈｅｓｄａ，  Ｍｄ．（１９９１）を参照する。
【０１７５】
配列決定の結果は表６〜７に示す。
【０１７６】
【表６】
2021502407.tif 000008
【０１７７】
ここで、表６における数字は配列表の「配列番号」で、たとえば５７Ｂ３Ｄ１０の重鎖タンパク質の可変領域のアミノ酸配列は配列表の配列番号１で示され、５７Ｂ３Ｄ１０の重鎖タンパク質の可変領域におけるＣＤＲ１ドメインのアミノ酸配列は配列表の配列番号２で示されている。
【０１７８】
【表７】
2021502407.tif 000009
【０１７９】
ここで、表７における数字は配列表の「配列番号」で、たとえば５７Ｂ３Ｄ１０の重鎖タンパク質の可変領域をコードするヌクレオチド配列は配列表の配列番号１０６で示される。  
【０１８０】
実施例３
全ヒト抗体ＩｇＧの転換と製造
（１）プラスミドの構築と準備：実施例２はすでにハイブリドーマ細胞の培養上清液から精製された４−１ＢＢ抗体を得、そして実施例１の配列決定の結果から、４−１ＢＢ抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の配列が明らかになった。４−１ＢＢ抗体の重鎖可変領域をシグナルペプチドおよびヒト由来重鎖抗体ＩｇＧ１定常領域を含む発現ベクター（ここで、発現ベクターはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入され、組み換え工程も上海睿智化学によって完成された）に組み込み、４−１ＢＢ抗体の軽鎖可変領域をシグナルペプチドおよびヒト由来軽鎖κ定常領域を含む発現ベクターに組み込み、組み換えプラスミドを得て配列決定によって検証した（配列決定方法は実施例７における配列決定方法と同様である）。アルカリ溶解法キット（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬから購入）によって高純度の組み換えプラスミドを中スケールで抽出し、質量が５００μｇ以上で、０．２２μｍろ膜（Ｍｉｌｌｏｐｏｒｅから購入）でろ過し、形質移入に備えた。
【０１８１】
（２）細胞の形質移入：  
培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２９３Ｅ細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を培養した。シェーカーは、３７℃、１３０ｒｐｍ、８％  ＣＯ２（ｖ／ｖ）濃度にセットした。
【０１８２】
Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍは形質移入時１０％（ｖ／ｖ）Ｆ６８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を最終濃度が０．１％（ｖ／ｖ）になるように入れ、０．１％（ｖ／ｖ）Ｆ６８含有Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３発現培地、すなわち、培地Ａを得た。
【０１８３】
５ｍＬの培地Ａを取って２００μｇ／ｍＬのＰＥＩ（Ｓｉｇｍａから購入）と均一に混合し、培地Ｂを得た。５ｍＬの培地Ａを１００ｕｇ／ｍＬ  工程１で得られた組換えプラスミドと均一に混合し、培地Ｃを得た。５分間後、培地Ｂと培地Ｃを合併して混合し、１５分間静置し、混合液Ｄを得た。１０ｍＬの混合液Ｄをゆっくり１００ｍＬの２９３Ｅ細胞を含有する培地Ｆｒｅｅｓｔｙｌｅ  ２９３  ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ  ｍｅｄｉｕｍに２９３Ｅの細胞密度が１．５×１０６／ｍＬになるように入れ、ＰＥＩが集中しすぎないように添加しながら振とうし、シェーカーに入れて培養した。翌日に、最終濃度が０．５％（ｗ／ｖ）になるようにペプトンを入れた。５〜７日目に、培養液の抗体価を検出した。６〜７日目に、遠心（３５００ＲＰＭ、３０分）で上清を収集し、０．２２μｍろ膜でろ過し、ろ過された細胞上清液を得て精製に提供した。
【０１８４】
（３）抗体の精製：連続して生産された内毒素のないクロマトグラフィーカラムおよびＰｒｏｔｅｉｎ  Ａフィラー（ＧＥから購入）に対し、０．１Ｍ  ＮａＯＨで３０分間処理するか、あるいは５倍カラム体積の０．５Ｍ  ＮａＯＨで洗浄した。長期間で未使用のカラムフィラーおよびクロマトグラフィーカラムは少なくとも１Ｍ  ＮａＯＨで１ｈ浸漬させ、内毒素のない水で中性になるまで洗浄し、１０倍カラム体積の１％（ｖ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ×１００でカラムフィラーを洗浄した。５倍カラム体積のＰＢＳ（ＰＢＳリン酸緩衝液、ｐＨ７．２）で平衡化した後、工程（２）で得られたろ過された細胞上清液をカラムにかけ、必要によって通過液を収集した。カラムにかけた後、５倍カラム体積のＰＢＳで洗浄した。５倍カラム体積の０．１Ｍ  ｐＨ  ３．０のグリシン−ＨＣｌで溶離させ、溶離液を収集し、そして５倍カラム体積の溶脱液のｐＨ  ８．５の１Ｍ  Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（１．５Ｍ  ＮａＣｌ）で中和し、全ヒト４−１ＢＢ抗体を得た。上記で使用された溶液はいずれも新しく調製されたものである。全ヒト４−１ＢＢ抗体を得た後、内毒素の汚染を防ぐように、１×ＰＢＳで４時間透析した。透析終了後、分光光度計またはキットによって濃度を測定し、ＨＰＬＣ−ＳＥＣによって抗体の純度を測定し、内毒素検出キット（Ｌｏｎｚａから購入）によって抗体の内毒素含有量を検出した。そして、得られた全ヒト４−１ＢＢ抗体について特性の同定を行い（実施例４〜８と同様）、検出結果はそれぞれ図４〜１３および表８〜１８に示す。図４〜１３および表８〜１７から、全ヒトＩｇＧで転換して製造された全ヒト４−１ＢＢ抗体は４−１ＢＢ分子の下流シグナル経路を活性化することができることが示された。  
【０１８５】
実施例４  
リード抗体の同定
Ａ．酵素結合免疫吸着実験（ＥＬＩＳＡ）による抗体と４−１ＢＢタンパク質の結合の検出
実施例２で得られた精製された全ヒト由来４−１ＢＢ抗体について、それぞれヒト４−１ＢＢ−ｈＦｃ蛋白、サル４−１ＢＢ−ｈｉｓおよび４−１ＢＢ蛋白が属するファミリーのほかの免疫チェックポイントタンパク質ＯＸ４０、ＧＩＴＲと交差反応を行った。
【０１８６】
実施例１で得られた精製された免疫原Ａ（４−１ＢＢ−ｈＦｃ）、サル４−１ＢＢ−ｈｉｓ、マウス４−１ＢＢ−ｈｉｓ［その製造方法は実施例１の工程（一）免疫原Ａの製造を参照するが、ここで、サル由来４−１ＢＢタンパク質の細胞外領域（ＡＣＲＯ  ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓから購入）、マウス４−１ＢＢタンパク質の細胞外領域（ｓｉｎｏ  ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌから購入）である］またはほかの免疫チェックポイントタンパク質をそれぞれＰＢＳで最終濃度が１．０μｇ／ｍＬになるように希釈した後、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＥＬＩＳＡプレートに入れた。プラスチック膜で密封して４℃で一晩インキュベートし、２日目にプレートを洗浄液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ］で２回洗浄し、ブロッキング液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０および１％（ｖ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ］を入れて室温で２時間ブロッキングした。ブロッキング液を捨て、実施例２で得られた精製された４−１ＢＢ抗体を１００μＬ／ウェルで入れた。３７℃で２時間インキュベートした後、プレートを洗浄液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ］で３回洗浄した。ＨＲＰ（西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識された二次抗体（Ｓｉｇｍａから購入）を入れ、３７℃で２時間インキュベートした後、洗浄液［０．０１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０を含有するＰＢＳ］でプレートを３回洗浄した。ＴＭＢ基質を１００μＬ／ウェル入れ、室温で３０分間インキュベートした後、停止液（１．０Ｎ  ＨＣｌ）を１００μＬ／ウェル入れた。ＥＬＩＳＡプレートリーダー（ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ  ３８４ｐｌｕｓ、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅから購入）によってＡ４５０ｎｍ値を読み取ったが、結果は図４〜７および表８〜１１に示すように、表８〜１１では、精製された抗体と４−１ＢＢ組み換えタンパク質がＥＬＩＳＡレベルで特異的に結合したことがわかった。ここで、ブランクはヒトＩｇＧで、ＣＴＬＡ４−Ｆｃを陰性対照（ｎｅｇａｔｉｖｅ  ｃｏｎｔｒｏｌ、ＮＣ）とし、表におけるデータはＯＤ  ４５０ｎｍ値である。
【０１８７】
【表８】
2021502407.tif 000010
【０１８８】
【表９】
2021502407.tif 000011
【０１８９】
【表１０】
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【０１９０】
【表１１】
2021502407.tif 000013
【０１９１】
Ｂ．フローサイトメトリー実験（ＦＡＣＳ）による抗体と４−１ＢＢ発現細胞の結合の検出
実施例１の工程（二）に記載のヒト由来４−１ＢＢ全長アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含有するｐＩＲＥＳプラスミドでＣＨＯＫ１細胞株を形質転移させてヒト４−１ＢＢ含有ＣＨＯＫ１安定形質移入細胞株（ここで、ＣＨＯｋ１−ｈ４−１ＢＢ安定細胞株と呼ぶ）を得、サル由来ＰＤＬ１全長遺伝子を持つｐＩＲＥＳプラスミド（その製造方法は実施例１の工程（一）「免疫原Ａの製造」におけるヒト由来ＩｇＧ  Ｆｃ断片（ｈＦｃ）を持つｐＣｐＣベクターの製造方法と同様で、ここで、サル由来４−１ＢＢタンパク質の細胞外領域（Ｐｈｅ１９−Ｔｈｒ２３９）のアミノ酸配列のデータベースの登録番号はＧ７ＰＳＥ７である）でＣＨＯＫ１細胞株を形質転移させてサル４−１ＢＢ含有ＣＨＯＫ１安定形質移入細胞株（ここで、ＣＨＯＫ１−ｃ４−１ＢＢ安定細胞株と呼ぶ）を得た。ＣＨＯＫ１−ｈ４−１ＢＢ安定細胞株およびＣＨＯＫ１−ｃ４−１ＢＢ安定細胞株をＴ−７５細胞培養瓶において９０％コンフルエンスまで増幅培養したら、培地を吸い捨て、ＨＢＳＳ緩衝液（Ｈａｎｋｓ  Ｂａｌａｎｃｅｄ  Ｓａｌｔ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）で２回洗浄した後、無酵素細胞分解液（Ｖｅｒｓｅｎｅ  ｓｏｌｕｔｉｏｎ：Ｌｉｆｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入）によって処理し、そして細胞を収集した。ＨＢＳＳ緩衝液で細胞を２回洗浄し、細胞の計数を行った後、細胞をＨＢＳＳ緩衝液で２×１０６細胞／ｍＬに希釈し、１％ヤギ血清ブロッキング液を入れ、前記百分率は質量百分率である。氷の上で３０分間インキュベートした後、ＨＢＳＳ緩衝液で２回遠心洗浄した。収集された細胞をＦＡＣＳ緩衝液（１％ＢＳＡ含有ＨＢＳＳで、前記百分率は質量百分率である）で２×１０６細胞／ｍＬになるように懸濁させ、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートに入れ、実施例２で得られた精製された４−１ＢＢ抗体の被験サンプルを１００μＬ／ウェル入れ、氷の上で２時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの蛍光（Ａｌｅｘａ  ４８８）で標識された二次抗体（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）を入れ、氷の上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの固定液［４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド］を入れて細胞を懸濁させ、１０分間後ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄した。１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を懸濁させ、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ社から購入）によって検出して結果を分析した。結果は図８〜９および表１２〜１３に示すように、結果から、被験抗体は細胞表面の４−１ＢＢタンパク質と結合できることがわかった。ここで、ＩｇＧ対照はヒトＩｇＧで、表におけるデータはＭＦＩで測定された細胞群の平均蛍光強度値である。
【０１９２】
【表１２】
2021502407.tif 000014
【０１９３】
【表１３】
2021502407.tif 000015
【０１９４】
実施例５  
ＮＦκＢルシフェラーゼ・レポーター遺伝子実験における４−１ＢＢ抗体活性の検出
ヒト４−１ＢＢタンパク質陽性のＨＥＫ２９３安定細胞株（製造方法は実施例１を参照する）にさらにＮＦκＢルシフェラーゼ・レポーター遺伝子プラスミドを形質転移させ、ヒト４−１ＢＢタンパク質陽性のＮＦκＢルシフェラーゼ・レポーター遺伝子を持つ安定細胞株を製造した。抗ヒトまたはラットＦｃ  Ｆ（ａｂ’）２で被験抗体と架橋させた後、架橋したか、していない抗体をこの安定細胞株に入れて細胞培養を行った。５時間後、ルシフェラーゼ検出試薬を入れ、蛍光値を読み取った。結果は図１０Ａ〜１０Ｂおよび表１４に示すように、表１４では、全ヒト４−１ＢＢ抗体は４−１ＢＢタンパク質の下流ＮＦκＢシグナル経路を強く活性化させ、かつ抗体架橋後、抗体の活性化能力がさらに増強した（ＥＣ５０値が低下した）ことがわかった。これは、４−１ＢＢ抗体を体内で応用する場合、特定の領域、たとえば腫瘍組織に到達した後、ＦｃＲを発現する細胞を介して架橋することにより、抗体の活性および安全性を向上させることを示す。表１４は全ヒト４−１ＢＢ抗体群の対照群（ヒトＩｇＧ）に対する蛍光値倍数およびＥＣ５０値を示す。            
【０１９５】
【表１４】
2021502407.tif 000016
【０１９６】
実施例６
４−１ＢＢ抗体の４−１ＢＢタンパク質とその受容体４−１ＢＢＬの結合に対する遮断の検出
４−１ＢＢタンパク質を発現するＣＨＯ細胞によって４−１ＢＢ抗体の４−１ＢＢタンパク質とその受容体４−１ＢＢＬの結合に対する遮断を検出した。
【０１９７】
実施例４のＢ部分に従ってＣＨＯＫ１−ｈ４−１ＢＢ細胞株を処理して２×１０６細胞／ｍＬの単一懸濁細胞を得、１００μＬ／ウェルで９６ウェルＦＡＣＳ反応プレートに入れ、実施例３で得られた精製された４−１ＢＢ抗体の被験サンプルを５０μＬ／ウェル入れ、さらにｈｉｓ−ｍｕＣＤ８ａ−４−１ＢＢＬＥＣＤ（製造方法は実施例１を参照する）融合タンパク質を５０μＬ入れ、氷の上で２時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの抗マウスＣＤ８ａの蛍光（Ａｌｅｘａ  ４８８）で標識された二次抗体を入れ、氷の上で１時間インキュベートした。ＦＡＣＳ緩衝液で３回遠心洗浄し、１００μＬ／ウェルの固定液［４％（ｖ／ｖ）パラホルムアルデヒド］を入れて細胞を懸濁させ、１０分間後ＦＡＣＳ緩衝液で２回遠心洗浄した。１００μＬ／ウェルのＦＡＣＳ緩衝液で細胞を懸濁させ、ＦＡＣＳ（ＦＡＣＳ  Ｃａｌｉｂｕｒ、ＢＤ社から購入）によって検出して結果を分析した。結果は図１１および表１５に示すように、表１５から、被験抗体は４−１ＢＢリガンドタンパク質と４−１ＢＢの結合を抑制できることがわかった。ここで、ＩｇＧ対照はヒトＩｇＧで、表におけるデータは対照群（ヒトＩｇＧ）に対する全ヒト４−１ＢＢ抗体のリガンド結合に対する抑制率である。
【０１９８】
【表１５】
2021502407.tif 000017
【０１９９】
実施例７
Ｔ細胞刺激実験
（一）Ｆｉｃｏｌｌによって全血を分離して末梢血の単核球ＰＢＭＣを得た。
【０２００】
新しく採取された全血をリン酸緩衝液ＰＢＳで、体積比１：１で希釈して希釈後の全血を得、無菌ピペットで軽く希釈後の全血をＦｉｃｏｌｌ液面（ＧＥ  Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅから購入）に振とうして混合しないように展開させ、Ｆｉｃｏｌｌと希釈後の全血の体積比は３：４で、回転数４００ｇで室温２０℃で３０分間勾配遠心し、遠心後の遠心管では三層に分かれ、上層は血漿で、中間の乳白色の分層は単核球であった。無菌ピペットで軽く中間層の細胞を吸い取り、新しい遠心管に収集し、ＰＢＳリン酸緩衝液で３倍体積に希釈し、回転数１００ｇで、室温で１０分間遠心し、上清を捨てた。リンパ球をＰＢＳリン酸緩衝液で１０  ｍＬに再懸濁させ、前の工程を繰返して血小板を取り出した。最後に、リンパ球を１０  ｍＬの１０％牛胎児血清を含有する多成分ＲＰＭＩ１６４０培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから購入）に再懸濁させて使用に備え、末梢血単核球ＰＢＭＣになっており、前記百分率は質量百分率である。
【０２０１】
（二）Ｔ細胞刺激実験
細胞膜に抗ＣＤ３一本鎖抗体を発現するＣＨＯＫ１細胞株の構築：抗ＣＤ３（ＯＫＴ３）（Ｋｉｐｒｉｙａｎｏｖら  １９９７，  ＰＥＤＳ  １０：４４５−４５３を参照する）がキメラされたＳｃＦｖを細胞膜にアンカーするように、当該ＳｃＦｖをマウスＣＤ８ａ（ＮＣＢＩ登録番号：  ＮＰ＿００１０７４５７９．１）のＣ末端の１１３−２２０アミノ酸配列と連結し、プラスミドｐＩＲＥＳ−ＯＳ８を構築した。プラスミドｐＩＲＥＳ−ＯＳ８の製造方法はＪｏｅ  Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：  Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌを参照する。上記プラスミドｐＩＲＥＳ−ＯＳ８をＣＨＯＫ１細胞に形質転移させ、実施例１に記載のプラスミドで細胞を形質転入する方法に従って安定継代細胞株ＣＨＯＫ１−ＯＳ８を製造し、そしてそれをＴ細胞刺激因子とした。同時に、等体積比で希釈された測定される実施例２で得られた精製された４−１ＢＢ抗体を調製し、被験サンプル溶液を得た。
【０２０２】
Ｔ細胞抽出キット（Ｓｔｅｍｃｅｌｌから購入）でメーカーが提供する方法に従って実施例７の工程（一）で得られたヒト末梢血単核球からヒトＣＤ３陽性Ｔ細胞を抽出した。このＣＤ３陽性Ｔ細胞を細胞刺激因子ＣＨＯＫ１−ＯＳ８とともに９６ウェル細胞培養プレートに入れ、同時に抗ヒトまたはラットＦｃ  Ｆ（ａｂ’）２で架橋された被験抗体を入れ、最終的に各反応ウェルの最終体積が２００μＬになるようにした。３７℃、５％ＣＯ２インキュベーターで７２時間共培養した後、上清を収集し、得られた細胞上清を−２０℃で凍結保存し、前記百分率は体積百分率である。
【０２０３】
（三）細胞上清におけるサイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）またはインターロイキンＩＬ−２の酵素結合免疫吸着の検出
細胞上清におけるサイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）またはインターロイキンＩＬ−２の酵素結合免疫吸着の検出は、Ｒ＆Ｄ  ｓｙｓｔｅｍの関連検出キットＨｕｍａｎ  ＩＦＮ−ｇａｍｍａ  Ｑｕａｎｔｉｋｉｎ（ＤＩＦ５０）およびＱｕａｎｔｉｋｉｎｅ  ＥＬＩＳＡ  ｈｕｍａｎ  ＩＬ−２（Ｓ２０５０）を使用し、そして説明書に従って操作した。被験抗体以外のすべての検出試薬は検出キットによって提供された。
【０２０４】
細胞上清におけるサイトカインであるインターフェロンγ（ＩＦＮ−γ）またはインターロイキンＩＬ−２の含有量を測定する酵素結合免疫吸着の検出は、二抗体サンドイッチＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄ  Ｓｙｓｔｅｍｓから購入，ＩＦＮ−γＣａｔ  ＃  ＤＩＦ５０和ＩＬ−２  Ｃａｔ  ＃  Ｓ２０５０）を使用した。実験の操作は厳格にキット説明書の要求に従い、すべての検出試薬は検出キットによって提供された。具体的な実験は以下のように簡単に説明する。ＩＦＮ−γまたはＩＬ−２ポリクローナル抗体をＥＬＩＳＡマイクロプレートに被覆し、実施例５の工程（二）で得られた細胞上清液を被験サンプルとし、標準品および被験サンプルを入れて室温で２時間インキュベートした。各ウェルに４００μＬの洗浄液を入れ、プレートを繰り返して４回洗浄した。さらに抗ヒトＩＦＮ−γまたはＩＬ−２の西洋ワサビペルオキシダーゼで標識された抗体を入れ、室温で２時間インキュベートし、マイクロプレートにおけるＩＦＮ−γまたはＩＬ−２と免疫複合体を形成させ、マイクロウェルを洗浄した。基質を入れて呈色させ、光を避けて室温で３０分間反応させ、最後に停止液を入れ、プレートリーダーでＡ４５０ｎｍ吸光度を測定した。
【０２０５】
抗体の実施例７の工程（二）に記載のＴ細胞刺激試験におけるＩＦＮ−γ分泌に対する影響を検出した。結果は図１２および表１６に示すように、表１６から、ＰＢＭＣリンパ球刺激試験で被験抗体がＰＢＭＣのＩＦＮ−γ分泌を増強させることができたことわかる。ここで、ＩｇＧ対照はヒトＩｇＧで、表におけるデータはＩＦＮ−ｇ値（ｐｇ／ｍＬ）である。
【０２０６】
【表１６】
2021502407.tif 000018
【０２０７】
抗体の実施例７の工程（二）に記載のＴ細胞刺激試験におけるＩＬ−２分泌に対する影響を検出した。表１７および図１３では、全ヒト化４−１ＢＢ抗体はＴ細胞刺激試験においてＩＬ−２分泌を刺激することができたことが示された。ここで、ＩｇＧ対照はヒトＩｇＧ（ｈＩｇＧ）で、表におけるデータはＩＬ−２値（ｐｇ／ｍＬ）である。
【０２０８】
【表１７】
2021502407.tif 000019
【０２０９】
実施例８
抗４−１ＢＢ抗体の親和力の分析測定
Ｂｉａｃｏｒｅ  Ｔ２００装置（から購入）によって親和定数の測定を行った。具体的な操作および方法は装置の説明書およびメーカーが提供した詳細に準じた。抗ヒトＦｃ標識センサーで抗４−１ＢＢ全ヒト由来抗体と結合させ、５つの異なる勾配のｈｉｓタグ付きのヒト４−１ＢＢタンパク質抗原との結合・解離の状況を検出した。その後、ソフトで解離定数と結合定数をフィッティングして、親和力定数は解離定数と結合定数の比である。親和力の検出結果は表１８に示す。
【０２１０】
【表１８】
2021502407.tif 000020
【０２１１】
実施例９
抗４−１ＢＢ抗体のマウス体内における抗腫瘍活性の評価
ＭＣ３８同系マウスモデルを使用し、ヒト４−１ＢＢ遺伝子ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスで抗体のマウス体内における抗腫瘍活性を評価した。実験の設計は下記の通りである。
【０２１２】
ヒト４−１ＢＢ遺伝子ノックインＣ５７ＢＬ／６マウスを選び、６匹ずつ４群に分け、ウトミルマブ（Ｕｔｏｍｉｌｕｍａｂ）、ウレルマブ（Ｕｒｅｌｕｍａｂ）および同種類抗体ｈＩｇＧ４を対照とし、投与サンプルは１１３Ｆ６Ｃ６抗体であった。投与形態は腹腔注射で、投与量は３ｍｇ／ｋｇ（ｈＩｇＧ対照）、１  ｍｇ／ｋｇ（ウトミルマブ、ウレルマブおよび１１３Ｆ６Ｃ６）で、０、４、７、１１、１４、１８日の腹腔注射を行い、週に２回、腫瘍体積、マウス体重およびマウス生存率を測定した。腫瘍体積（Ｔｕｍｏｒ  ｖｏｌｕｍｅ）の計算式は１／２×Ｌ長×Ｌ短２  である。
【０２１３】
結果は表２０および図１５、１６に示すように、本発明の抗体（１１３Ｆ６Ｃ６）は顕著に腫瘍成長を抑制し、抑制効果が顕著に対照抗体ウトミルマブおよびウレルマブよりも優れた。
【０２１４】
【表２０】
2021502407.tif 000021
【０２１５】
比較例
標的が本願の抗体と同様のファイザー社のウトミルマブ（ＰＦ−０５０８２５６６）を比較抗体とし、比較試験を行ったが、試験方法は実施例７と完全に一致する。
【０２１６】
結果は図１４および表１９に示すように、本願の４−１ＢＢ抗体はウトミルマブと比べ、より多いＩＦＮ−γサイトカインを分泌するようにＴ細胞を刺激し、Ｔ細胞に対する活性化が強い。
【０２１７】
【表１９】
2021502407.tif 000022
【０２１８】
各文献がそれぞれ単独に引用されるように、本発明に係るすべての文献は本出願で参考として引用する。また、本発明の上記の内容を読み終わった後、当業者が本発明を各種の変動や修正をすることができるが、それらの等価の形態のものは本発明の請求の範囲に含まれることが理解されるはずである。
【図１】
2021502407.tif 000023
【図２】
2021502407.tif 000024
【図３】
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【図４Ａ】
2021502407.tif 000026
【図４Ｂ】
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【図４Ｃ】
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【図４Ｄ】
2021502407.tif 000029
【図４Ｅ】
2021502407.tif 000030
【図４Ｆ】
2021502407.tif 000031
【図４Ｇ】
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【図４Ｈ】
2021502407.tif 000033
【図５Ａ】
2021502407.tif 000034
【図５Ｂ】
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【図６Ａ】
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【図６Ｂ】
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【図７】
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【図８Ａ】
2021502407.tif 000039
【図８Ｂ】
2021502407.tif 000040
【図８Ｃ】
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【図８Ｄ】
2021502407.tif 000042
【図８Ｅ】
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【図９Ａ】
2021502407.tif 000044
【図９Ｂ】
2021502407.tif 000045
【図９Ｃ】
2021502407.tif 000046
【図９Ｄ】
2021502407.tif 000047
【図１０Ａ】
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【図１０Ｂ】
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【図１１】
2021502407.tif 000050
【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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2021502407.tif 000057
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