(57)【要約】  本発明は、均質な水不溶性物質試料の厚さが均一な試片を製造する方法及びこのような試片に対してＭＡＬＤＩ質量分析を行って、水不溶性物質を定量分析下は方法に関するものである。具体的に、試片は、水不溶性物質とマトリックスとの混合物に揮発性溶媒を投入し、この溶媒が蒸発するまで水不溶性物質とマトリックスとの混合物を分散させて得た試料を水溶性物質からなるペレットカップに入れて、同じ圧力でプレスした後、ペレットカップを水で溶かすことで製造可能である。
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ステップＳ１）水不溶性物質とマトリックスとを混合した後、揮発性溶媒を投入して、前記揮発性溶媒が蒸発するまで前記水不溶性物質とマトリックスとを分散させて、水不溶性物質の試料を取得する段階と、
（ステップＳ２）前記試料を水溶性材質からなるペレットカップの溝に満たし、それをひっくり返してプレスした後、前記ペレットカップを水で溶かして水不溶性物質試片を得る段階と、
を含む、水不溶性物質の定量分析のためのＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法。
【請求項２】
前記水不溶性物質が、アントラキノン系顔料、銅フタロシアニン系顔料、ペリレン系顔料、ジケトピロロピロール系顔料、ベンズイミダゾロン系顔料、イソインドリン系顔料、ジオキサジン系顔料またはこれらの混合物を含む、請求項１に記載のＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法。
【請求項３】
前記アントラキノン系顔料が、Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｒｅｄ  １７７（ＰＲ１７７、４，４'−ｄｉａｍｉｎｏ［１，１'−ｂｉａｎｔｈｒａｃｅｎ］−９，９'，１０，１０'−ｔｅｔｒａｏｎ）である、請求項２に記載のＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法。
【請求項４】
前記水不溶性物質と混合される前記マトリックスは、ＤＣＴＢ（ｔｒａｎｓ−２−［３−（４−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｒｏｐｅｎｙｌｉｄｅｎｅ］ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＤＰＦ（α、β−ｄｉｐｈｅｎｙｌｆｕｍａｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸、ジトラノール（１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）またはこれらの混合物を含む、請求項１から３の何れか一項に記載のＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法。
【請求項５】
前記水不溶性物質及び前記マトリックスに投入される前記揮発性溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、クロロホルムまたはこれらの混合物を含む、請求項１から４の何れか一項に記載のＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法。
【請求項６】
前記ペレットカップは、単位体積当たり同量の試料を限定させる、請求項１から５の何れか一項に記載のＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法。
【請求項７】
前記ペレットカップは、ＫＢｒ、ＮａＢｒ、ＭｇＢｒ２、ＮａＣｌまたはこれらの混合物からなる、請求項１から６の何れか一項に記載のＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法。
【請求項８】
請求項１から７の何れか一項に記載のＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法で製造された水不溶性物質試片を利用した水不溶性物質の定量分析方法であって、
前記水不溶性物質試片に対してＭＡＬＤＩ質量スペクトルを得る段階と、
前記ＭＡＬＤＩ質量スペクトルのピークの結果から水不溶性物質及びマトリックスのシグナル強度比率を算出し、それを不溶性物質とマトリックスとの重量比で図示して定量検定線を作成する段階と、
を含む、水不溶性物質の定量分析方法。
【請求項９】
前記水不溶性物質試片の互いに異なる地点から測定されたＭＡＬＤＩ質量スペクトルの相対標準偏差（ＲＳＤ）が、４０％以下である、請求項８に記載の水不溶性物質の定量分析方法。
【請求項１０】
前記水不溶性物質試片を同一条件下で製造された複数個で適用して測定されたＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量スペクトルのＲＳＤが、４０％以下である、請求項８または９に記載の水不溶性物質の定量分析方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本願は、２０１８年９月１１日付の大韓民国特許出願１０−２０１８−０１０８０９７号及び２０１９年９月１０日付の大韓民国特許出願１０−２０１９−０１１２１４０号にに基づいた優先権の利益を主張し、当該大韓民国特許出願の文献に開示されたあらゆる内容は、本明細書の一部として含まれる。
【０００２】
本発明は、ＭＡＬＤＩ質量分析用の水不溶性物質試料の製造方法及び該試片を利用した定量分析方法に係り、より詳細には、ＭＡＬＤＩ質量分析用の均質であり、厚さ偏差の小さい水不溶性物質試片を製作する方法及びこのような試片を用いて商用ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ装備を通じて再現性のあるＭＡＬＤＩスペクトルを得る方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
質量スペクトルを通じて定量的情報を得るためには、同じ試料に対して再現性のあるスペクトルを得て、試料の濃度による線形検定曲線（ｃａｌｉｂｒａｔｉｏｎ  ｃｕｒｖｅ）を作成できなければならない。
【０００４】
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析法（Ｍａｔｒｉｘ−Ａｓｓｉｓｔｅｄ  Ｌａｓｅｒ  Ｄｅｓｏｒｐｔｉｏｎ  Ｉｏｎｉｚａｔｉｏｎ−Ｔｉｍｅ  ｏｆ  Ｆｌｉｇｈｔ  Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、以下、簡単に「ＭＡＬＤＩ」と称する）は、不溶性物質を分析することができる質量分析法である。しかし、ＭＡＬＤＩは、試料とマトリックス（ｍａｔｒｉｘ）との混合で作られた結晶が不均質であり、レーザショット・ツー・ショット（ｓｈｏｔ−ｔｏ−ｓｈｏｔ）変動性によって、イオンシグナルが安定せず、スペクトルの再現性が落ちて、正確な定量分析に使用しにくい技術として知られている。最近、ペプチドと生物単分子物質に対してＭＡＬＤＩスペクトルの再現性を確保した場合が報告されたが、合成高分子の定量法は標準化されておらず、商用ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ装備を活用して一定に効果的な結果を得にくい。
【０００５】
本発明者らは、ＭＡＬＤＩスペクトルの再現性を高めるために、可溶性高分子試料に対してホール（ｈｏｌｅ）があるマスク（ｍａｓｋ）を通じた電気噴霧（ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ）によって厚さが均一な高分子試片を自体製造した（大韓民国出願第１０−２０１７−０１３００１０号、出願日：２０１７．１０．１１、出願人：株式会社ＬＧ化学）。また、本発明者らは、試片の厚さがスペクトルの再現性に影響を及ぼすという事実を見つけ、製作した厚さ偏差の小さい濃度別の高分子試片を用いて再現性のあるＭＡＬＤＩスペクトルを得た後、内部標準物質を使用して線形検定曲線を作成する技術を開発した（大韓民国出願第１０−２０１７−０１５７１６１号、出願日：２０１７．１１．２３、出願人：株式会社ＬＧ化学）。前記特許文献に開示されたあらゆる内容は、本明細書で参考文献として引用する。しかし、これらの方法は、不溶性（または、難溶性）物質に対しては適用することができなかった。
【０００６】
従来技術で不溶性物質の場合、ＭＡＬＤＩスペクトルの再現性の確保のために、乳棒（ｐｅｓｔｌｅ）と乳鉢（ｍｏｒｔａｒ）、ボールミル（ｂａｌｌ  ｍｉｌｌ）などを用いて、試料の均質度を確保しようとする試みがあったと報告されたが、これは、熟練度によって均質度偏差が大きく、静電気によって試料の取り扱いが容易ではなかった。また、マトリックスと不溶性物質とを混合した後、プレス（ｐｒｅｓｓ）して、ペレット状に試片を作製する方法があるが、これは、試片の厚さ調節が困難であった。
【０００７】
また、不溶性物質の試片の製造のための方法として、ＣＳ技術（ｃｏｍｐｒｅｓｓｅｄ−ｓａｍｐｌｅ  ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ）などが知られている。ＣＳ技術は、試片を載せたプレートに穴を開け、穴の一側を塞いだ状態で試料を入れ、プレスして試片を製作する方法である。しかし、前記ＣＳ技術によれば、プレートの穴のために、試片に電場が均一に形成されず、穴の中心と縁部とで得たスペクトルでピークのｍ／ｚが異なって表われる。
【０００８】
以後、前記短所を克服するために、穴のサイズを減らし、試料に導電性物質（例えば、鉄粉など）を添加して、電場のねじれを最小化するための試みがあったが、この方法は、穴のサイズが小さいほど試料を穴に入れることが難しく、試料と導電性物質とを混ぜて試料の均質性を確保することが常に一定ではないので、試片製作の再現性を落とすことができると予想される。このように、不溶性物質に対して再現性のあるＭＡＬＤＩスペクトルを提供する試片を得る方法は、開発されていない。
【０００９】
商用ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ装備を用いて不溶性物質に対するＭＡＬＤＩスペクトルの再現性を確保するためには、不溶性物質とマトリックスとを均質に混合する課題、及び厚さ偏差の小さい試片を製作する課題が解決されなければならない。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
本発明が解決しようとする課題は、水不溶性物質の再現性のあるＭＡＬＤＩスペクトルを得るために、水不溶性物質の試料が均質に分布されている均一な厚さの試片を製造する方法を提供することである。
【００１１】
本発明が解決しようとする他の課題は、厚さが均一な水不溶性物質の試片に対して再現性のあるＭＡＬＤＩスペクトルを得て、これにより水不溶性物質を定量分析することである。
【課題を解決するための手段】
【００１２】
前記課題を解決するために、本発明は、ＭＡＬＤＩ質量分析用の水不溶性物質の試片を製造する方法であって、（ステップＳ１）水不溶性物質とマトリックスとを混合した後、揮発性溶媒を投入して、前記揮発性溶媒が蒸発するまで前記水不溶性物質とマトリックスとを分散させて、水不溶性物質試料を取得する段階；及び（ステップＳ２）前記試料を水溶性材料からなるペレットカップの溝に満たし、それをひっくり返してプレスした後、前記ペレットカップを水で溶かして水不溶性物質試片を得る段階；を含む方法を提供する。
【００１３】
さらに、本発明は、前記方法で製造された水不溶性物質試片を利用した水不溶性物質の定量分析方法であって、前記水不溶性物質試料に対してＭＡＬＤＩ質量スペクトルを得る段階；及び前記スペクトルのピークの結果から水不溶性物質及びマトリックスのシグナル強度比率を算出し、それを水不溶性物質とマトリックスとの重量比で図示して定量検定線を作成する段階；を含む不溶性物質の定量分析方法を提供する。
【発明の効果】
【００１４】
本発明は、均質であり、厚さ偏差の小さい水不溶性物質試片を製作することにより、再現性のあるＭＡＬＤＩスペクトルを獲得することができて、商用ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ装備を利用した不溶性物質の定量分析を可能にする。
【図面の簡単な説明】
【００１５】
【図１】本発明の一実施形態によるＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法で均質な水不溶性物質試料を取得する過程を例示したものである。
【図２】本発明の一実施形態によるＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法で水不溶性物質試料から試片を取得する過程を例示したものである。
【図３】本発明の一実施形態によるＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法に使われたＫＢｒペレットカップの製作過程を例示したものである。
【図４】ペレットカップの製作を含んで試片の製造過程を示した図面である。
【図５】本発明の一実施形態によるＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法で得た水不溶性物質試料の顕微鏡写真である。
【図６】本発明の実施例及び比較例によって、それぞれ製造された水不溶性物質試料のスポット・ツー・スポット（ｓｐｏｔ−ｔｏ−ｓｐｏｔ）ＭＡＬＤＩ質量スペクトルの再現性の評価結果である。
【図７】本発明の実施例によって同一条件下で製造された３つの水不溶性物質試片のそれぞれに対して得たＭＡＬＤＩ質量スペクトルである。
【図８】本発明の実施例によって製造された水不溶性物質試料に対して取得されたＭＡＬＤＩ質量スペクトルの結果から、分析物質（水不溶性物質）及びマトリックスのシグナル強度比率を分析物質とマトリックスとの重量比で図示して作成した線形の定量検定線を示した図面である。
【発明を実施するための形態】
【００１６】
本発明は、多様な変換を加え、さまざまな実施例を有することができるので、特定実施例を図面に例示し、詳細な説明で具体的に説明する。しかし、これは、本発明を特定の実施形態に限定しようとするものではなく、本発明の思想及び技術範囲に含まれる、あらゆる変換、均等物または代替物を含むものと理解しなければならない。本発明を説明するに当って、関連した公知技術についての具体的な説明が、本発明の要旨を不明にする恐れがあると判断される場合、その詳細な説明を省略する。
【００１７】
本発明に使われた用語「水不溶性」は、水に溶解が全くされないか、溶解が難しいものをいずれも含む意味である。
【００１８】
本発明に使われた用語「均質度」または「均質性」は、試料または試料内に一定比率で含まれた成分が互いに均一に分布されている状態を意味する。
以下、本発明についてより詳しく説明する。
【００１９】
本発明の一実施形態は、再現性のある水不溶性物質のＭＡＬＤＩスペクトルを得るために、水不溶性物質試料が均質に分布されている均一な厚さの試片を製造する方法に関するものであって、前記方法は、（ステップＳ１）水不溶性物質試料を取得する段階；及び（ステップＳ２）ペレットカップを用いて前記試料から試片を得る段階；を含む。
【００２０】
前記ステップＳ１では、水不溶性物質とマトリックスとを混合した後、揮発性溶媒を投入して、前記揮発性溶媒が蒸発するまで前記水不溶性物質とマトリックスとを分散させて、水不溶性物質試料を取得する。
【００２１】
図１は、本発明の一実施形態によるＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法で均質な水不溶性物質試料を取得する過程を具体的に例示したものである。
【００２２】
図１を参照する時、本発明では、乳棒と乳鉢とを用いて分析対象である水不溶性物質とマトリックスとを混合し（ａ）、混合物に揮発性溶媒を投入してマトリックスを溶かしながら、これにより生成された溶液に水不溶性物質を分散させ（ｂ）、引き続き使われた揮発性溶媒が全部蒸発するまで分散液をスパチュラでかき混ぜる（ｃ及びｃ'）ことにより、水不溶性物質試料を取得することができる。
【００２３】
すなわち、本発明は、従来技術で試料の均質性を高めるために、乳棒と乳鉢とを用いて分析物質（水不溶性物質）とマトリックスとを混合する段階（ａ）に付け加えて、揮発性溶媒を用いてマトリックスを溶かし、その溶液に水不溶性物質を分散させる段階（ｂ）及び分散状態を保持しながら溶媒蒸発を通じてマトリックスと水不溶性物質とを均質に混合する段階（ｃ及びｃ'）を行うことに特徴がある。このような本発明の試料取得過程によれば、試料の均質度が向上し、試料に静電気が発生せず、試料の取り扱い性が良くなる。
【００２４】
本発明によって取得された試料で、各成分が均一に分布された程度は、これにより製造された試片のＭＡＬＤＩスペクトルの結果の誤差範囲から評価することができ、前記誤差範囲が小さいほど試料の分布均一性、すなわち、均質度に優れていると評価することができる。
【００２５】
一実施形態において、前記水不溶性物質は、アントラキノン系顔料、例えば、Ｐｉｇｍｅｎｔ  Ｒｅｄ  １７７（ＰＲ１７７、４，４'−ｄｉａｍｉｎｏ［１，１'−ｂｉａｎｔｈｒａｃｅｎ］−９，９'，１０，１０'−ｔｅｔｒａｏｎｅ）、銅フタロシアニン系顔料、ペリレン系顔料、ジケトピロロピロール系顔料、ベンズイミダゾロン系顔料、イソインドリン系顔料、ジオキサジン系顔料などであるが、これらに限定されるものではない。
【００２６】
一実施形態において、前記水不溶性物質と混合される前記マトリックスは、水に対する溶解度が低い物質であって、ＤＣＴＢ（ｔｒａｎｓ−２−［３−（４−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｒｏｐｅｎｙｌｉｄｅｎｅ］ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）、ＤＰＦ（α、β−ｄｉｐｈｅｎｙｌｆｕｍａｒｏｎｉｔｒｉｌｅ）、α−シアノ−４−ヒドロキシケイ皮酸（α−ｃｙａｎｏ−４−ｈｙｄｒｏｘｙｃｉｎｎａｍｉｃ  ａｃｉｄ）、ジトラノール（Ｄｉｔｈｒａｎｏｌ、１，８，９−ｔｒｉｈｙｄｒｏｘｙａｎｔｈｒａｃｅｎｅ）などから選択されうるが、これらに限定されるものではない。
【００２７】
前記水不溶性物質及び前記マトリックスの含量は、特に制限されないが、１：２０〜１：１００、例えば、１：２０の重量比で混合される。
【００２８】
一実施形態において、前記水不溶性物質及び前記マトリックスに投入される前記揮発性溶媒は、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、クロロホルム（ｃｈｌｏｒｏｆｏｒｍ）などから選択される１つ以上であるが、これらに限定されるものではない。
【００２９】
一実施形態において、水不溶性物質とマトリックスとの混合時に、乳棒と乳鉢の以外にも、ボールミルを利用できる。
【００３０】
次に、前記ステップＳ２では、前記取得した試料を水溶性材質からなるペレットカップの溝に満たし、それをひっくり返してプレスした後、前記ペレットカップを水で溶かして水不溶性物質試片を得る。
【００３１】
図２は、本発明の一実施形態によるＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法で水不溶性物質試料から試片を取得する過程を具体的に例示したものである。
【００３２】
図２を参照する時、本発明では、水溶性材質のペレットカップを準備して、その溝に前記取得した水不溶性物質試料を満たし（ｄ）、試料が満たされたペレットカップをひっくり返し（ｅ）、その状態でプレスを行った後（ｆ）、使われたペレットカップを水で溶かし（ｇ）、追加乾燥させることにより（ｈ）、水不溶性試片を取得することができる。この際、前記プレスは、ホットプレス（ｈｏｔ  ｐｒｅｓｓ）を用いて１〜５ｂａｒの圧力で１０〜２０秒間行うことができる。
【００３３】
本発明では、試片製造時に、前記の過程によって取得した均質な水不溶性物質試料を一定量で一定面積に試料間の同じ圧力でプレスするために、同量の試料を一定の面積に限定させる手段としてペレットカップを利用する。前記ペレットカップは、水に溶かされる水溶性材質であれば、制限なしで使われ、例えば、ＫＢｒ、ＮａＢｒ、ＭｇＢｒ２、ＮａＣｌまたはこれらが混合物からなるペレットカップを使用することができる。
【００３４】
図３は、本発明の一実施形態によるＭＡＬＤＩ質量分析用試片の製造方法に使われたＫＢｒペレットカップの製作過程を例示したものである。
【００３５】
図３を参照する時、ＫＢｒペレットカップ製作装置として平らな四角形プレート６、プレート６上に置かれる中央に円形穴がある四角フレーム１、四角フレーム１の円形穴に順次に置かれる円形部材２、３及び４と、円形部材４上に置かれた後、プレスされる円形部材５を使用することができる。
具体的なＫＢｒペレットカップの製作過程は、次の通りである。
【００３６】
まず、プレート６上に中央に円形穴があるフレーム１を載せ、フレーム１の円形穴に円形部材２を入れる（段階ｉ）。プレート６は、ＫＢｒペレットカップ製作から試片の製作まで全工程がなされる板であって、形状、寸法及び材質は、特に限定されず、試片製作全体工程が容易になされるものであれば良い。引き続き、円形部材２上に円形部材３を入れる（段階ｉｉ）。この際、円形部材２は、中心に凸部を有し、円形部材３は、中央に小さな円形穴が開けられた形態である。引き続き、円形部材３の中心孔にＫＢｒを満たす（段階ｉｉｉ）。円形部材２の凸部及びそのサイズと円形部材３中心の孔及びそのサイズは、今後ＫＢｒペレットカップの形状及び寸法に相応する。円形部材３の中心孔にＫＢｒが全部満たされれば、その上に円形部材４を載せる（段階ｉｖ）。円形部材４は、中心に凸部を有する。次いで、円形部材４上に円形部材５を載せた後（段階ｖ）、プレスを行う（段階ｖｉ）。この際、円形部材５の全体面積にわたって同じ圧力を適用する。前記円形部材２、３及び４は、フレーム１の円形穴内に順次に置かれるので、フレーム１の円形穴に正確に合うサイズでなければならない。円形部材５を十分にプレスした後、円形部材５と４とを除去し、円形部材２とフレーム１とを除去して、プレート６上に円形部材３のみ残す。円形部材３の中心孔には、ＫＢｒがプレスによって堅く満たされている。最終的に、円形部材３を除去してＫＢｒペレットカップを完成する（段階ｖｉｉ）。完成されたペレットカップは、円形部材２の凸部によって中央に溝が掘れた形状である。
【００３７】
本発明において、フレーム１の形状及び寸法は、特に限定されず、単にフレーム１の円形穴に円形部材２、３及び４が全部入ることが望ましいので、フレーム１の厚さは、円形部材２、３及び４の合わせた厚さと同じか、それよりも厚い。円形部材５は、円形部材４のサイズよりも小さくて初めてプレスしやすい。前記円形部材１から５の材質は、特に限定されず、例えば、ステンレススチール（ｓｔａｉｎｌｅｓｓ  ｓｔｅｅｌ）、アルミニウム（ａｌｕｍｉｎｉｕｍ）などを使用することができる。
【００３８】
一実施形態において、前記プレスは、ホットプレスを用いて行うことができる。例えば、前記プレスは、１〜５ｂａｒの圧力で１０〜２０秒間実施することができる。
前記フレーム１の円形穴及び円形部材３中心の穴のサイズは、特に限定されるものではない。
一実施形態において、前記ペレットカップは、円形または多角形の形態を有してもよい。
【００３９】
図４は、ペレットカップの製作を含んだ試片の製造過程を概略的に示したものであって、ペレットカップ製作装置１０にＫＢｒのようなペレットカップ材質を充填した後、プレスしてペレットカップを製作する段階（具体的な方法は、図３を参照）、前記ペレットカップに水不溶性物質試料を満たした後、ひっくり返してＭＡＬＤＩサンプルプレート（ｓａｍｐｌｅ  ｐｌａｔｅ）に装着した後、プレスする段階、及びペレットカップを溶解させる段階を含む。
【００４０】
このように、ペレットカップを用いる場合、従来のＣＳ技術による試片製造時のように試片を載せたプレートに穴を開ける必要がなく、ＣＳ技術を使用する場合、電場の不均一性によって発生する短所を克服することができる。すなわち、本発明で適用したペレットカップは、その内に試料を限定させた状態で単位体積当たり同じ圧力でプレスを行うことができるので、厚さが均一な試片の製造が可能である。また、ペレットカップと共にプレスされた試料に対してペレットカップのみを水で溶かすことにより、試片表面がプレスによる損傷を防止することができる。
【００４１】
前記のような方式で製造された本発明の水不溶性物質試片は、２０μｍ以下、例えば、１０μｍ以下の厚さを有しうる。また、前記試片の厚さを複数地点、例えば、３つ以上の地点で測定し、その平均値の標準偏差を算出した時、厚さ偏差は、３０％以下である。
【００４２】
このように、分析が可能な厚さを確保しながら、厚さ偏差の小さい水不溶性物質試片をＭＡＬＤＩ質量分析に利用する場合、再現性のあるＭＡＬＤＩスペクトルが得られ、これにより水不溶性物質試料の定量分析が可能である。
【００４３】
したがって、本発明では、ペレットカップを用いて製造された水不溶性物質試片のＭＡＬＤＩ質量分析を利用した水不溶性物質の定量分析方法を提供する。
【００４４】
具体的に、前記分析方法は、ペレットカップを用いて製造された水不溶性物質試片に対してＭＡＬＤＩ質量スペクトルを得る段階；及び前記スペクトルのピークの結果から水不溶性物質及びマトリックスのシグナル強度比率を算出し、それを水不溶性物質とマトリックスとの重量比で図示して定量検定線を作成する段階；を含みうる。
【００４５】
前記ＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、商用ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ  ＭＳ装備を使用して得られる。この際、良好なＳ／Ｎ比（ｓｉｇｎａｌ−ｔｏ−ｎｏｉｓｅ  ｒａｔｉｏ）を有するスペクトルを得るためには、試片で地点当たり、例えば、５０〜２００ショット（ｓｈｏｔ）ずつ多様な地点、例えば、３つ以上、または５つ以上の地点（ｓｐｏｔ）で、各地点当たり１つのスペクトルを得て、平均値を取得する。
【００４６】
一実施形態において、前記水不溶性物質試片のＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、同じ試片で３ヶ所以上の地点を測定（ｓｐｏｔ−ｔｏ−ｓｐｏｔ）した時、その結果の誤差を示す相対標準偏差（ｒｅｌａｔｉｖｅ  ｓｔａｎｄａｒｄ  ｄｅｖｉａｔｉｏｎ、ＲＳＤ）が、４０％以下、詳細には、３５％以下、例えば、２５〜３５％または２５〜３０％の範囲である。また、同一条件下で製造された３つ以上の複数個試片から測定されたサンプル・ツー・サンプル（ｓａｍｐｌｅ−ｔｏ−ｓａｍｐｌｅ）ＭＡＬＤＩ質量スペクトルの結果のＲＳＤは、４０％以下、詳細には、３０％以下、例えば、２０〜３０％または２５〜３０％である。このようなＲＳＤ範囲は、本発明によって製造されて厚さ均一性を確保した試片から得たＭＡＬＤＩスペクトルの再現性を立証するものである。
【００４７】
また、再現性のあるＭＡＬＤＩスペクトルの結果を用いて作成した定量検定線、すなわち、水不溶性物質及びマトリックスのシグナル強度比率を水不溶性物質とマトリックスとの重量比で図示した定量検定線は、いずれも線形で示され（図８参照）、これにより水不溶性物質の定量分析が可能である。
【００４８】
以下、当業者が容易に実施できるように、本発明を具体的な実施例として詳しく説明する。しかし、本発明は、さまざまな異なる形態として具現可能であり、ここで説明する実施例に限定されるものではない。
【００４９】
＜実施例１＞
段階１：試料の製造
分析しようとする水不溶性物質として、下記化学式で表現されるＰｉｇｍｅｎｔ  Ｒｅｄ  １７７（ＰＲ１７７、Ｃ２８Ｈ１６Ｎ２Ｏ４、Ｅｘａｃｔ  Ｍａｓｓ  ４４４．１１）とマトリックスとしてＤＣＴＢ（ｔｒａｎｓ−２−［３−（４−ｔｅｒｔ−ｂｕｔｙｌｐｈｅｎｙｌ）−２−ｍｅｔｈｙｌ−２−ｐｒｏｐｅｎｙｌｉｄｅｎｅ］ｍａｌｏｎｏｎｉｔｒｉｌｅ）とを使用した。図２に示すように、前記水不溶性物質及びマトリックスを乳鉢に１：２０の重量比で入れ、乳棒で磨きながら混合した。これに、前記混合物を分散させるための揮発性溶媒としてＴＨＦ（２ｍＬ）を投入して混合し続けた。引き続き、ＴＨＦが蒸発するまでスパチュラでかき混ぜながら混合し続けて、水不溶性物質及びマトリックスが均一に分布された試料を取得した。
【００５０】
【化１】
2021508369.tif 000003
【００５１】
段階２：試片の製造
前記段階から製造された試料を図４に示すように製作したＫＢｒペレットカップの溝に満たした。試料が満たされたＫＢｒペレットカップをひっくり返してＭＡＬＤＩサンプルプレートに装着した後、前記ＫＢｒペレットカップに５ｂａｒの圧力を２０秒間加えた。引き続き、ＫＢｒを水で溶かして厚さが約１０μｍであるＰＲ１７７試片を製作した。
【００５２】
図５は、製造された試片の顕微鏡写真を示したものであり、これにより試料の表面損傷がないことを確認することができる。
【００５３】
＜比較例１＞
段階１：試料の製造
水不溶性物質としてＰＲ  １７７及びマトリックスとしてＤＣＴＢを乳鉢に１：２０の重量比で入れ、乳棒で磨きながら混合する過程のみを行って、試料を製造した。
【００５４】
段階２：試片の製造
実施例１の段階２と同じ過程で試片を製造した。
【００５５】
＜比較例２＞
段階１：試料の製造
実施例１の段階１と同じ過程で試料を製造した。
【００５６】
段階２：試片の製造
段階１から取得された試料をＫＢｒペレットカップの使用なしに、ＭＡＬＤＩサンプルプレート上に載せた後、単純プレスすることにより、試片を製造した。
【００５７】
実験例１：スポット・ツー・スポット再現性の評価
ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ質量分析器（ＵｌｔｒａｆｌｅＸｔｒｅｍｅ，Ｂｒｕｋｅｒ  Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して、前記実施例及び比較例によって、それぞれ製造されたＰＲ１７７試片の５箇所地点に対してＭＡＬＤＩ質量スペクトルを得た。前記スペクトルの結果から、各地点でのＰＲ１７７イオン（Ａ＋・）の基本ピークとＤＣＴＢ由来イオンのうち、最も大きな強度（ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）を有するイオン（Ｍ＋）の基本ピークとの強度比率（Ａ＋・／Ｍ＋  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）を計算した。比較例１によって製造されたＰＲ１７７試片の５箇所地点のそれぞれに対する強度比率を図６の（ａ）で、比較例２によって製造されたＰＲ１７７試片の５箇所地点のそれぞれに対する強度比率を図６の（ｂ）で、実施例１によって製造されたＰＲ１７７試片の５箇所地点のそれぞれに対する強度比率を図６の（ｃ）で示した。
【００５８】
図６の（ａ）及び図６の（ｂ）において、比較例１及び比較例２から製造された試片の各地点での強度比率（Ａ＋・／Ｍ＋  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）は、平均から大きく外れることが見られる（緑色矢印参照）。特に、同じ方式で試料を製造した後、試片製造時に、ペレットカップを使用しない比較例２の場合、特定位置にシグナルがよく出る条件下でも、試片の位置を変更すれば、シグナルが全く検出されない場合も発生したが、このような現象は、試片の厚さ偏差が激しくて、レーザと試片との位置関係が多く変わって発生したと見なされる。
【００５９】
一方、図６の（ｃ）の実施例１による方法で製造された試片に対する結果では、各地点での強度比率（Ａ＋・／Ｍ＋  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）は、平均から外れる程度が小さいことが見られる（実施例１の場合、強度比率間のＲＳＤが３０％以下である）。
【００６０】
このように、本発明でのように、水不溶性物質及びマトリックスを混合する試料製造時に、揮発性溶媒を使用して混合物の分散性を改善させて得た試料をペレットカップを使用して試片を製造した場合が、水不溶性物質とマトリックスとを乳鉢及び乳棒を用いて単純混合のみを行って、試料を得た比較例１及び試片製造時に、ペレットカップを使用していない比較例２に比べて、試片の均質度が向上して、ＭＡＬＤＩ質量スペクトルのスポット・ツー・スポット再現性が高い。
【００６１】
実験例２：サンプル・ツー・サンプル再現性の評価
前記実施例によって同じ条件下で３つの試片を製造した。各試片に対して得たＭＡＬＤＩ質量スペクトルを図７に（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）で示した。
【００６２】
図７から、３つの試片でピークの強度パターン及びピーク位置の再現性を確認することができる。また、ＰＲ１７７イオン（Ａ＋・）の基本ピークとＤＣＴＢ由来イオンのうち、最も大きな強度を有するイオン（Ｍ＋）の基本ピークとの強度比率（Ａ＋・／Ｍ＋  ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ  ｒａｔｉｏ）間のＲＳＤは、２５％を示した。したがって、本発明によって製造された試片のＭＡＬＤＩ質量スペクトルは、サンプル・ツー・サンプル再現性も高い。
【００６３】
実験例３：定量検定線の評価
図７の質量スペクトルピークを用いて分析物質（水不溶性物質）及びマトリックスのシグナル強度比率を算出し、それを分析物質とマトリックスとの重量比で図示して定量検定線を作成し、その結果を図８に示した。
【００６４】
具体的に、図８は、ｍ／ｚ  ３３２（ａ）及びｍ／ｚ  ２５０（ｂ）に該当するマトリックスピークを用いて作成した定量検定線であって、いずれも線形を示している（Ｒ２＝０．９９以上）。
【００６５】
以上、本発明の内容の特定の部分を詳しく記述したところ、当業者において、このような具体的な記述は、単に望ましい実施形態であり、これにより、本発明の範囲が制限されるものではないという点は明白である。したがって、本発明の実質的な範囲は、下記の特許請求の範囲とそれらの等価物とによって定義される。
【図１】
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【図２】
2021508369.tif 000005
【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【国際調査報告】
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