(57)【要約】  本開示は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制するｓｉＲＮＡ、当該ｓｉＲＮＡを含む薬物組成物と複合体を提供する。前記ｓｉＲＮＡにおける各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、当該ｓｉＲＮＡは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、３つ以下のヌクレオチド差異があるヌクレオチド配列Ａを含むセンス鎖と、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、３つ以下のヌクレオチド差異があるヌクレオチド配列Ｂを含むアンチセンス鎖と、を含む。【選択図】図８
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖とアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであって、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドがそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとが、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、ヌクレオチド配列Ａを含み、前記ヌクレオチド配列Ａは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、ヌクレオチド配列Ｂを含み、前記ヌクレオチド配列Ｂは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺ−３’（配列番号１）、
５’−Ｚ’ＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡ−３’（配列番号２）
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵであり、
前記ヌクレオチド配列Ａに、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌクレオチド配列Ｂに、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂが、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであるｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
前記ヌクレオチド配列Ａと配列番号１に示されるヌクレオチド配列との間に１つ以下のヌクレオチド差異があり、及び／又は前記ヌクレオチド配列Ｂと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間に１つ以下のヌクレオチド差異がある、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列Ｂと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異が、Ｚ’Ｂの位置での差異を含み、Ｚ’Ｂが、Ａ、Ｃ又はＧから選択される、請求項１又は２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
ＺＡがＺ’Ｂと相補的なヌクレオチドである、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩが、基本的に逆相補、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記実質的に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１〜４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
ヌクレオチド配列Ａが配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列Ｂが、配列番号４に示されるヌクレオチド配列であり、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺＡ−３’（配列番号３）、
５’−Ｚ’ＢＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡ−３’（配列番号４）
ただし、前記Ｚ’Ｂはアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ＺＡはＡ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ’ＢはＺＡと相補的なヌクレオチドである、請求項１〜５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
ＺＡがＡであり、Ｚ’ＢがＵである、請求項６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
前記ヌクレオチド配列Ｉがヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記ヌクレオチド配列ＩＩがヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶの長さがそれぞれ独立して１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩがヌクレオチド配列Ａの５’末端に結合され、ヌクレオチド配列ＩＶがヌクレオチド配列Ｂの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記実質的に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１〜７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基組成がＡＧであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基組成がＡＡＧであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基組成がＣＡＡＧである、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
前記ヌクレオチド配列ＩＩがヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’オーバーハング末端を構成する、請求項１〜９に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１１】
前記ヌクレオチド配列Ｖの長さが２ヌクレオチドである、請求項１０に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１２】
前記ヌクレオチド配列Ｖが、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチドであり、或いは、前記ヌクレオチド配列Ｖが、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的である、請求項１０又は１１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１３】
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺＡ−３’（配列番号３）、
５’−Ｚ’ＢＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号５）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺＡ−３’（配列番号３）、
５’−Ｚ’ＢＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＵＵ−３’（配列番号６）
ただし、前記Ｚ’Ｂはアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ＺＡはＡ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ’ＢがＺＡと相補的なヌクレオチドである、請求項１〜１２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１４】
ｓｉＨＢＶＳ１
センス鎖：５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺ−３’（配列番号１）
アンチセンス鎖：５’−Ｚ’ＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号７）、又は
ｓｉＨＢＶＳ２
センス鎖：５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺ−３’（配列番号１）
アンチセンス鎖：５’−Ｚ’ＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＵＵ−３’（配列番号８）であって、
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵである、請求項１〜１３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１５】
前記センス鎖又は前記アンチセンス鎖の少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である、請求項１〜１４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１６】
前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１７】
前記フルオロ修飾ヌクレオチドがヌクレオチド配列Ａとヌクレオチド配列Ｂに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１６に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１８】
５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１７に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１９】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログから独立して選択される１つである、請求項１６〜１８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２０】
ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドは、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチドから選択される１つであり、ヌクレオチドアナログはイソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡから選択される１つである、請求項１９に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２１】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドがいずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドが、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項２０に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２２】
５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである、請求項２１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２３】
前記ｓｉＲＮＡがｓｉＨＢＶＳ３、ｓｉＨＢＶＳ４、ｓｉＨＢＶＳ５又はｓｉＨＢＶＳ６である、請求項２２に記載のｓｉＲＮＡ：
ｓｉＨＢＶＳ３
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号１０）
ｓｉＨＢＶＳ４
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号１１）
ｓｉＨＢＶＳ５
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号１３）、又は
ｓｉＨＢＶＳ６
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号１４）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表す。
【請求項２４】
前記修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である、請求項１〜２３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２５】
前記修飾基を有するリン酸エステル基が、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ：
【化１】
2021503941.tif 000085
【請求項２６】
前記ｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基が、
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項１〜２５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２７】
前記ｓｉＲＮＡがｓｉＨＢＶＳ７、ｓｉＨＢＶＳ８、ｓｉＨＢＶＳ９又はｓｉＨＢＶＳ１０である、請求項１〜２６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ：
ｓｉＨＢＶＳ７
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号１６）
ｓｉＨＢＶＳ８
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号１７）
ｓｉＨＢＶＳ９
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号１９）
ｓｉＨＢＶＳ１０
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号２０）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表す。
【請求項２８】
前記アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである、請求項１〜２７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項２９】
前記５’−リン酸ヌクレオチドが、式（２）に示される構造を有するヌクレオチドであり、前記５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが、構造が式（３）〜式（６）のいずれか１つに示されるヌクレオチドから選択され、
【化２】
2021503941.tif 000086
ただし、ＲはＨ、ＯＨ、メトキシ基又はフッ素から選択され、ＢａｓｅはＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される塩基を表す、請求項２８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３０】
前記ｓｉＲＮＡがｓｉＨＢＶＳ１１、ｓｉＨＢＶＳ１２、ｓｉＨＢＶＳ１３、ｓｉＨＢＶＳ１４、ｓｉＨＢＶＳ１５、ｓｉＨＢＶＳ１６、ｓｉＨＢＶＳ１７又はｓｉＨＢＶＳ１８である、請求項１〜２９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ：
ｓｉＨＢＶＳ１１
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号２１）
ｓｉＨＢＶＳ１２
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号２２）
ｓｉＨＢＶＳ１３
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号２３）
ｓｉＨＢＶＳ１４
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号２４）
ｓｉＨＢＶＳ１５
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号２５）
ｓｉＨＢＶＳ１６
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号２６）
ｓｉＨＢＶＳ１７
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号２７）
ｓｉＨＢＶＳ１８
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号２８）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、大文字Ｐ１は、当該文字の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。
【請求項３１】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含むことを特徴とする薬物組成物。
【請求項３２】
前記ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体との重量比が１：（１〜５００）である、請求項３１に記載の薬物組成物。
【請求項３３】
前記ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体との重量比が１：（１〜５０）である、請求項３１又は３２に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３４】
前記薬学的に許容可能な担体が、有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を含み、前記有機アミンが、式（２０１）に示される化合物及び／又はその薬学的に許容できる塩である、請求項３１〜３３のいずれか１項に記載の薬物組成物：
【化３】
2021503941.tif 000087
式中、
Ｘ１０１とＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ−Ａ又はＣ−Ａであり、Ａは水素又はＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖であり、
ＹとＺはそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６及びＲ１０７はそれぞれ独立して、
水素と、
環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基と、
環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基と、
置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基と、から選択され、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｎは１〜３の整数であり、ｍは０〜２０の整数であり、ｐは０又は１であり、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素は、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成し、
【化４】
2021503941.tif 000088
式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１〜６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）における窒素原子を表す。
【請求項３５】
前記有機アミンが、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンであり、
【化５】
2021503941.tif 000089
前記補助脂質はコレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、
前記ＰＥＧ化脂質は１，２−ジパルミトアミド−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］−２０００である、請求項３４に記載の薬物組成物。
【請求項３６】
前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比が（１９．７〜８０）：（１９．７〜８０）：（０．３〜５０）である、請求項３４又は３５に記載の薬物組成物。
【請求項３７】
前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比が（５０〜７０）：（２０〜４０）：（３〜２０）である、請求項３６に記載の薬物組成物。
【請求項３８】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項３９】
前記複合基が薬学的に許容できる標的基とリンカーを含み、前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基が順に共有結合又は非共有結合的に結合される、請求項３８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４０】
前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基が順に共有結合的に結合されている、請求項３９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４１】
前記リンカーが式（３０１）に示される構造を有する、請求項３９又は４０に記載のｓｉＲＮＡ複合体：
【化６】
2021503941.tif 000090
式中、ｋは１〜３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合され、
【化７】
2021503941.tif 000091
ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ−アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素原子を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合され、
【化８】
2021503941.tif 000092
ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２〜４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介して各前記ＬＡ部にエーテル結合により結合され、窒素原子を介して前記ＬＢ部にアミド結合により結合される。
【請求項４２】
前記リンカーが前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’又は３’末端に結合される、請求項３９〜４１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４３】
式（３０５）に示される構造を有し、
【化９】
2021503941.tif 000093
式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表す、請求項３８〜４２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４４】
前記リンカーが式（３０６）に示される構造を有し、
【化１０】
2021503941.tif 000094
式中、ｌは０〜３の整数であり、
＊は、前記リンカーにおける、エーテル結合により前記標的基に結合される部位を表し、
＃は、前記リンカーにおける、リン酸エステル結合により前記ｓｉＲＮＡに結合される部位を表す、請求項３９又は４０に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４５】
前記リンカーが前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項４７に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４６】
式（３０７）に示される構造を有し、
【化１１】
2021503941.tif 000095
式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、且つ、前記リンカーが前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項４４又は４５に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項４７】
式（３０８）に示される構造を有する、請求項３８に記載のｓｉＲＮＡ複合体：
【化１２】
2021503941.tif 000096
式中、
ｎ１は、１〜３から選択される整数であり、ｎ３は、０〜４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ独立して、Ｈであり、又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基であり、
【化１３】
2021503941.tif 000097
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、ＮｕがｓｉＲＮＡであり、
Ｒ２は、長さ１〜２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
2021503941.tif 000098
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、
Ｍ１は標的基を表す。
【請求項４８】
各Ｌ１が式Ａ１〜Ａ２６の基から独立して選択される１又は複数の結合の組合せである、請求項４７に記載のｓｉＲＮＡ複合体：
【化１４】
2021503941.tif 000099
式中、ｊ１は１〜２０の整数であり、ｊ２は１〜２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは、式Ａ２７〜Ａ４５の基又はその任意の組合せからなる群から選択され、
【化１５】
2021503941.tif 000100
ＲｂはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【請求項４９】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである、請求項４７又は４８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５０】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである、請求項４９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５１】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである、請求項５０に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５２】
Ｌ１の長さが３〜２５個の原子である、請求項４７〜５１のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５３】
Ｌ１の長さが４〜１５個の原子である、請求項５２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５４】
ｊ１は２〜１０の整数であり、ｊ２は２〜１０の整数であり、Ｒ’がＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、ＲｂがＣ１−Ｃ５のアルキル基である、請求項４８〜５３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５５】
ｊ１は３〜５の整数であり、ｊ２は３〜５の整数であり、Ｒ’がメチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つであり、ＲａがＡ２７又はＡ２８であり、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである、請求項５４に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５６】
ｎ１は１〜２の整数であり、ｎ３は０〜１の整数である、請求項４７〜５５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５７】
ｎ１＋ｎ３＝２〜３である、請求項４７〜５６のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５８】
ｍ１、ｍ２及びｍ３がそれぞれ独立して２〜５の整数である、請求項４７〜５７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項５９】
ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項５８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６０】
各前記標的基が独立して哺乳動物の肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体と親和性のあるリガンドである、請求項３９〜４２、４４〜４５及び４７〜５９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６１】
各前記標的基が独立してアシアロ糖タンパク質又は糖である、請求項６０に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６２】
各前記標的基が、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース、Ｌ−４−チオリボースから独立して選択される１つである、請求項６１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６３】
前記標的基の少なくとも１つ又は各々がガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンである、請求項６２に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６４】
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が独立してＨ、メチル基又はエチル基である、請求項４７〜６３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６５】
Ｒ２には、窒素含有骨格上のＮに結合される結合部位及びＲ３におけるＰに結合される結合部位がともに含まれる、請求項４７〜６４のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６６】
Ｒ２上の前記窒素含有骨格中のＮに結合される部位がＮとアミド結合を形成し、前記Ｒ３におけるＰに結合される部位がＰとリン酸エステル結合を形成する、請求項６５に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６７】
Ｒ２がＢ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’から選択され、
【化１６】
2021503941.tif 000101
ただし、
2021503941.tif 000102
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、ｑ２は１〜１０の整数である、請求項６６に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６８】
ｑ２が１〜５の整数である、請求項６７に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項６９】
式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する、請求項４７〜６８のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体：
【化１７】
2021503941.tif 000103
2021503941.tif 000104
2021503941.tif 000105
【請求項７０】
式Ａ５９におけるＰが、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合されており、前記端部とは、前記センス鎖又はアンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す、請求項４７〜６９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項７１】
式Ａ５９におけるＰが前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合される、請求項７０に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項７２】
式Ａ５９におけるＰが前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項７１に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項７３】
式Ａ５９におけるＰが、リン酸ジエステル結合を形成することにより前記ｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合される、請求項４７〜７２のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項７４】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３８〜７３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体の、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製への使用。
【請求項７５】
前記Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患は、慢性肝疾患、炎症、線維性疾患及び過形成性疾患から選択される、請求項７４に記載の使用。
【請求項７６】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３８〜７３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防方法。
【請求項７７】
請求項１〜３０のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項３１〜３７のいずれか１項に記載の薬物組成物及び／又は請求項３８〜７３のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本開示は、核酸、当該核酸を含む組成物および複合体ならびに調製方法と使用に関する。
【背景技術】
【０００２】
Ｂ型ウイルス性肝炎（Ｂ型肝炎とも呼ばれる）は、全世界、特に中国に深刻な脅威を与えている感染症である。現在全世界で公認されているＢ型肝炎予防薬としては、インターフェロンとヌクレオシドアナログの２種類があるが、この２種類の薬物は、使用後薬剤耐性が発生しやすい又は使用に制限がある等の様々な欠点があり、例えば、インターフェロンは、副作用が発生しやすく、ヌクレオシド類薬物は、薬剤耐性および投薬中止後の再発という問題がある。したがって、遺伝子レベルでウイルスの遺伝子発現をサイレンシングし、ＨＢＶ（Ｂ型肝炎ウイルス）の生成と複製を遮断することにより、根本からウイルスの代謝と肝細胞への感染を低下させることができれば、最も理想的なＢ型肝炎の治療手段となることは疑いない。また、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｍａｌｌ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ  ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉（ＲＮＡ  ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ、ＲＮＡｉ）という機構に基づき、興味あるいずれかの目的とする遺伝子（例えば、がん等の疾患を誘発する遺伝子）の発現を配列特異的に抑制又は遮断し、疾患を治療する目的を達成することができる。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００３】
低分子ＲＮＡ薬物の開発では、ｓｉＲＮＡの安定化修飾及びその送達系は、２つのキー技術である。
【課題を解決するための手段】
【０００４】
いくつかの実施形態において、本開示は、ＨＢＶ遺伝子発現を抑制できるｓｉＲＮＡを提供し、当該ｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡにおける各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、ヌクレオチド配列Ａを含み、前記ヌクレオチド配列Ａは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、ヌクレオチド配列Ｂを含み、前記ヌクレオチド配列Ｂは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺ−３’（配列番号１）、
５’−Ｚ’ＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡ−３’（配列番号２）、
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵであり、
前記ヌクレオチド配列Ａに、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌクレオチド配列Ｂに、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
【０００５】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
【０００６】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体（コンジュゲート）を提供する。
【０００７】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製への使用を提供する。
【０００８】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体の有効量を、それを必要とする被験体に投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防方法を提供する。
【０００９】
いくつかの実施形態において、本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、及び／又は薬物組成物及び／又はｓｉＲＮＡ複合体を含むキットを提供する。
【００１０】
［引用による組み込み］
本明細書で言及される全ての出版物、特許及び特許出願は、各々の出版物、特許及び特許出願が特別にかつ個別に引用により本明細書に組み込まれるのと同じ程度に、引用により本明細書に組み込まれる。
【図面の簡単な説明】
【００１１】
【図１】複合体２５及び複合体２６の体外での抑制活性結果を示す。
【図２】複合体２の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０及びオフターゲット効果の検出結果を示す。
【図３】被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外トリトソーム（Ｔｒｉｔｏｓｏｍｅ）における安定性の半定量的検出結果を示す。
【図４】被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのヒト血漿における安定性の半定量的検出結果を示す。
【図５】被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結果を示す。
【図６】マウスにおける複合体１によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制結果を示す。
【図７】マウスにおける複合体２によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制結果を示す。
【図８】マウスにおける複合体１、複合体２及び比較複合体２によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制結果を示す。
【図９】前記被験ｓｉＲＮＡ複合体のＨＢＶトランスジェニックマウスにおけるｓｉＲＮＡの血清ＨＢｓＡｇ発現量に対する時間関連性試験結果を示す。
【図１０】１．２８ｃｏｐｙマウスにおける複合体２の血清ＨＢｓＡｇ発現量に対する時間関連性試験結果を示す。
【図１１】１．２８ｃｏｐｙマウスにおける複合体２のＨＢＶ  ＤＮＡの抑制効率に対する時間関連性試験結果を示す。
【発明を実施するための形態】
【００１２】
以下に本開示の発明を実施するための形態を詳しく説明する。また、ここで説明される発明を実施するための形態は、本開示を説明又は解釈するためのものに過ぎず、本開示を制限するためのものではないと理解すべきである。
【００１３】
定義
本開示において、ＨＢＶ遺伝子とは、ＤＮＡ配列がＧｅｎｂａｎｋ登録番号ＮＣ＿００３９７７．１に示される遺伝子を指す。
【００１４】
文脈において、特に説明がない限り、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａ、Ｔは、ヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字ｄは、当該文字ｄの右側に隣接する１つのヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチドであることを表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字ｓの左右に隣接する２つのヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、Ｐ１は、当該Ｐ１の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチド、特に、ビニルリン酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＶＰで表される）、５’−リン酸ヌクレオチド（以下の実施例においてＰで表される）又は５’−チオリン酸エステル修飾ヌクレオチド（以下の実施例においてＰｓで表される）であることを表す。
【００１５】
文脈において、前記「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチドを指し、「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。「ヌクレオチドアナログ」とは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指し、例えば、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＢＮＡと略称される）又は非環式ヌクレオチドがある。前記「メトキシ修飾ヌクレオチド」とは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
【００１６】
本明細書の文脈において、「相補」又は「逆相補」という用語は、互換的に使用されてもよく、当業者に周知の意味、即ち、二本鎖核酸分子において、一方の鎖の塩基と他方の鎖上の塩基とが相補的に対合するという意味を有する。ＤＮＡにおいて、プリン塩基であるアデニン（Ａ）は、常にピリミジン塩基であるチミン（Ｔ）（又は、ＲＮＡにおいてウラシル（Ｕ）である）と対合し、プリン塩基であるグアニン（Ｃ）は、常にピリミジン塩基であるシトシン（Ｇ）と対合する。各塩基対は、いずれも１つのプリンと１つのピリミジンを含む。一方の鎖上のアデニンが常に他方の鎖上のチミン（又はウラシル）と対合するとともに、グアニンが常にシトシンと対合する場合、両方の鎖同士が相補的である、またその相補鎖の配列から当該鎖の配列を推知できると考えられる。これに応じて、「ミスマッチ」は、本分野では、二本鎖核酸において、対応する位置での塩基が相補的に対合して存在しないことを意味する。
【００１７】
文脈において、特に説明がない限り、基本的に逆相補的であるとは、関連する２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、実質的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に塩基ミスマッチが存在しないことを指す。
【００１８】
文脈において、一方のヌクレオチド配列と他方のヌクレオチド配列に「ヌクレオチド差異」が存在するとは、前者が後者に比べて、同じ位置のヌクレオチドの塩基種類が変化したことを指し、例えば、後者において１つのヌクレオチド塩基がＡであるとき、前者の同じ位置での、対応するヌクレオチド塩基がＵ、Ｃ、Ｇ又はＴである場合に、当該位置で２つのヌクレオチド配列間にヌクレオチド差異が存在すると認められている。いくつかの実施形態において、元の位置のヌクレオチドの代わりに無塩基ヌクレオチド又はその等価物を用いる場合、当該位置でヌクレオチド差異が生じたとも考えられる。
【００１９】
文脈において、特に本開示の複合分子の調製方法又はｓｉＲＮＡ複合体の調製方法を説明する際に、特に説明がない限り、前記ヌクレオシドモノマー（ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｍｏｎｏｍｅｒ）とは、調製するｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体におけるヌクレオチドの種類と順序に応じてホスホルアミダイト固相合成に用いられる修飾又は未修飾のヌクレオシドホスホルアミダイトモノマー（ｕｎｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｏｒ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ＲＮＡ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓ。ＲＮＡ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓをＮｕｃｌｅｏｓｉｄｅ  ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅｓともいうことがある）を指す。ホスホルアミダイト固相合成は、当業者に公知のＲＮＡ合成に用いられる方法である。本開示に用いられるヌクレオシドモノマーは、いずれも市販品として購入可能である。
【００２０】
本明細書で用いられる場合、２つのアルファベット文字間又は記号間のものでないダッシュ（「−」）は、置換基の結合点の位置を示すために用いられている。例えば、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基により結合する。
【００２１】
本明細書で用いられる場合、「任意の」又は「任意に」とは、続いて記載する事象又は状況が発生してもよく、発生しなくてもよいこと、並びに前記記載が事象又は状況が発生した場合と発生しない場合を含むことを指す。例えば、「任意に置換されたアルキル」は、以下の文章で定義される「アルキル」及び「置換アルキル」を含む。１又は複数の置換基を含む任意の基に関して、これらの基が、立体的に非現実的な、合成上実行不可能な及び／又は本質的に不安定な、いかなる置換又は置換パターンも導入することは意図されないと、当業者に理解される。
【００２２】
本明細書で用いられる場合、「アルキル」とは、特定の数の炭素原子を有する直鎖と分岐鎖を指し、前記特定の数は、通常１〜２０個の炭素原子、例えば、１〜１０個の炭素原子、１〜８個又は１〜６個の炭素原子である。例えば、Ｃ１−Ｃ６アルキルは、１〜６個の炭素原子の直鎖と分岐鎖アルキルを含む。特定の数の炭素を有するアルキル残基を命名する場合、当該数の炭素を有する全ての分岐鎖及び直鎖形式を含むことを意図する。したがって、例えば、「ブチル」は、ｎ−ブチル、ｓｅｃ−ブチル、イソブチル及びｔｅｒｔ−ブチルを含むことを意味し、「プロピル」は、ｎ−プロピル及びイソプロピルを含む。アルキレンは、アルキルのサブセットであり、アルキルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００２３】
本明細書で用いられる場合、「アルケニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素二重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキルを指し、前記炭素−炭素二重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から１つの水素分子を除去することにより得られる。当該基は、二重結合のシス又はトランス配置にあってもよい。典型的なアルケニルとしては、ビニルと、プロパ−１−エン−１−イル、プロパ−１−エン−２−イル、プロパ−２−エン−１−イル（アリル）、プロパ−２−エン−２−イル等のプロペニルと、ブタ−１−エン−１−イル、ブタ−１−エン−２−イル、２−メチルプロパ−１−エン−１−イル、ブタ−２−エン−１−イル、ブタ−２−エン−２−イル、ブタ−１，３−ジエン−１−イル、ブタ−１，３−ジエン−２−イル等のブテニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルケニルは、２〜２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２〜１０個、２〜８個又は２〜６個の炭素原子を有する。アルケニレンは、アルケニルのサブセットであり、アルケニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００２４】
本明細書で用いられる場合、「アルキニル」とは、少なくとも１つの炭素−炭素三重結合を有する不飽和分岐鎖又は直鎖アルキル基を指し、前記炭素−炭素三重結合は、親アルキルの隣接する炭素原子から２つの水素分子を除去することにより得られる。典型的なアルキニルとしては、エチニルと、プロパ−１−イン−１−イル、プロパ−２−イン−１−イル等のプロピニルと、ブタ−１−イン−１−イル、ブタ−１−イン−３−イル、ブタ−３−イン−１−イル等のブチニルと、を含むが、これらに限定されない。ある実施形態において、アルキニルは、２〜２０個の炭素原子を有するが、他の実施形態において、２〜１０、２〜８又は２〜６個の炭素原子を有する。アルキニレンは、アルキニルのサブセットであり、アルキニルと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００２５】
本明細書で用いられる場合、「アルコキシ」とは、酸素橋により結合した特定の数の炭素原子のアルキルを指し、例えば、メトキシ、エトキシ、プロポキシ、イソプロポキシ、ｎ−ブトキシ、ｓｅｃ−ブトキシ、ｔｅｒｔ−ブトキシ、ペンチルオキシ、２−ペンチルオキシ、イソペンチルオキシ、ネオペンチルオキシ、ヘキシルオキシ、２−ヘキシルオキシ、３−ヘキシルオキシ、３−メチルペンチルオキシ等がある。アルコキシは、通常１〜１０個、１〜８個、１〜６個又は１〜４個の、酸素橋により結合した炭素原子を有する。
【００２６】
本明細書で用いられる場合、「アリール」とは、芳香族単環式又は多環式炭化水素環系から誘導される、環炭素原子から水素原子を除去して形成されたラジカルを指す。前記芳香族単環式又は多環式炭化水素環系は、水素及び６〜１８個の炭素原子の炭素のみを含有し、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状、非局在化（４ｎ＋２）π−電子系を含む。アリールとしては、フェニル、フルオレニル及びナフチル等の基を含むが、これらに限定されない。アリーレンは、アリールのサブセットであり、アリールと同じであるが２つの結合点を有する残基を指す。
【００２７】
本明細書で用いられる場合、「シクロアルキル」とは、通常３〜７個の環状炭素原子を有する非芳香族炭素環を指す。環は、飽和であってもよいし、１又は複数の炭素−炭素二重結合を有してもよい。シクロアルキルの実例としては、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロペンテニル、シクロヘキシル及びシクロヘキセニル、並びにノルボルナン（ｎｏｒｂｏｒｎａｎｅ）等の架橋及びカゴ状環状基を含む。
【００２８】
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン化」又は「ハロ」とは、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨードを指し、用語「ハロゲン」は、フッ素、塩素、臭素及びヨウ素を含む。
【００２９】
本明細書で用いられる場合、「ハロゲン化アルキル」とは、特定の数の炭素原子が１又は複数、最大許容数までのハロゲン原子で置換された、上記のように定義されるアルキル基を指す。ハロゲン化アルキルの実例としては、トリフルオロメチル、ジフルオロメチル、２−フルオロエチル及びペンタフルオロエチルを含むが、これらに限定されない。
【００３０】
「複素環基」とは、２〜１２個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜６個のヘテロ原子とを含む、安定した３〜１８員非芳香族環状基を指す。明細書において特に説明がない限り、複素環基は、単環、二環、三環又は四環系であり、縮合環又は架橋環系を含んでもよい。複素環式ラジカルにおけるヘテロ原子は、任意に酸化されてもよい。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。複素環基は、一部飽和又は完全飽和である。複素環基は、環の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合することができる。このような複素環基の実例としては、ジオキサニル、チオフェニル［１，３］ジスルホニル、デカヒドロイソキノリニル、イミダゾリニル、イミダゾリジニル、イソチアゾリジニル、イソオキサゾリジニル、モルホリニル、オクタヒドロインドール、オクタヒドロイソインドール、２−オキサピペラジニル、２−オキサピペリジル、２−オキサピリミジニル、オキサゾリジニル、ピペリジル、ピペラジニル、４−ピペリドニル、ピロリジニル、ピラゾリジル、キヌクリジニル、チアゾリジニル、テトラヒドロフリル、トリスルホニル、テトラヒドロピラニル、チオモルホリニル、チアモルホリニル、１−オキソチオモルホリニル及び１，１−ジオキソチオモルホリニルを含むが、これらに限定されない。
【００３１】
「ヘテロアリール」とは、２個〜１７個の炭素原子と、窒素、酸素及び硫黄から選択される１〜６個のヘテロ原子とを含む、３〜１８員芳香環ラジカルから誘導される基を指す。本明細書で用いられる場合、ヘテロアリールは、単環、二環、三環又は四環系であってもよく、この環系中の環の少なくとも１つは完全不飽和であり、即ち、それは、ヒュッケル理論に従う環状非局在化（４ｎ＋２）π−電子系を含む。ヘテロアリールは、縮合環又は架橋環系を含む。ヘテロアリールにおけるヘテロ原子は任意に酸化される。１又は複数の窒素原子（存在する場合）は、任意に４級化される。ヘテロアリールは、環中の任意の原子を介して分子の残りの部分に結合する。ヘテロアリールの実例としては、アゼピニル、アクリジニル、ベンゾイミダゾリル、ベンゾインドール、１，３−ベンゾジオキサゾリル、ベンゾフリル、ベンゾオキサゾリル、ベンゾ［ｄ］チアゾリル、ベンゾチアジアゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］ジオキサゾリル、ベンゾ［ｂ］［１，４］オキサゾリル、１，４−ベンゾジオキサゾリル、ベンゾナフトフラニル、ベンゾジアゾリル、ベンゾジオキサフェニル（ｂｅｎｚｏｄｉｏｘａｐｈｅｎｙｌ）、ベンゾピラニル、ベンゾピラノニル（ｂｅｎｚｏｐｙｒａｎｏｎｙｌ）、ベンゾフリル、ベンゾフラノニル、ベンゾチオフェニル、ベンゾチエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、ベンゾトリアゾリル、ベンゾ［４，６］イミダゾ［１，２−ａ］ピリジル、カルバゾリル、シンノリル、シクロペンタ［ｄ］ピリミジニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−シクロペンタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］キナゾリニル、５，６−ジヒドロベンゾ［ｈ］シンノリニル、６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ベンゾ［６，７］シクロヘプタ［１，２−ｃ］ピリダジニル、ジベンゾフリル、ジベンゾチオフェニル、フリル、フラノニル、フロ［３，２−ｃ］ピリジル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロヘプタ［ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリダジニル、５，６，７，８，９，１０−ヘキサヒドロシクロオクタ［ｄ］ピリジル、イソチアゾリル、インダゾリル、イミダゾリル、インドール、イソインドール、インドリニル、イソインドリニル、イソキノリル、インドリジニル、イソオキサゾリル、５，８−メタノ−５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、ナフチリジノニル、１，６−ナフチリジノニル、オキサジアゾリル、２−オキソアゼピニル、オキサゾリル、オキシラニル、５，６，６ａ，７，８，９，１０，１０ａ−オクタヒドロベンゾ［Ｈ］キナゾリニル、１−フェニル−１Ｈ−ピロリル、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサジニル、フタロイル、プテリジニル、プリニル、ピロリル、ピラゾリル、ピラゾロ［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピリジル、ピリド［３，２−ｄ］ピリミジニル、ピリド［３，４−ｄ］ピリミジニル、ピラジニル、ピリミジニル、ピリダジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノキサリニル、キノリル、イソキノリル、テトラヒドロキノリル、５，６，７，８−テトラヒドロキナゾリニル、５，６，７，８−テトラヒドロベンゾ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、６，７���８，９テトラヒドロ−５Ｈ−シクロヘプタ［４，５］チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、５，６，７，８−テトラヒドロピリド［４，５−ｃ］ピリダジニル、チアゾリル、チアジアゾリル、トリアゾリル、テトラゾリル、トリアジニル、チエノ［２，３−ｄ］ピリミジニル、チエノ［３，２−ｄ］ピリミジニル、チエノ［２，３−ｃ］プリジニル及びチオフェニルを含むが、これらに限定されない。
【００３２】
本開示において各種のヒドロキシ保護基を用いることができる。一般的には、保護基は、化学官能性（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｔｉｅｓ）を特定の反応条件に不敏感にすることができ、且つ分子の残りの部分を実質的に損傷することなく分子中の当該官能性に付加する、及びそれから除去することができる。代表的なヒドロキシ保護基は、Ｂｅａｕｃａｇｅら、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ  １９９２，４８，２２２３〜２３１１、及びＧｒｅｅｎｅａｎｄ  Ｗｕｔｓ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ  Ｇｒｏｕｐｓ  ｉｎ  Ｏｒｇａｎｉｃ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｃｈａｐｔｅｒ  ２，２ｄ  ｅｄ，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ＆  Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９１に開示されており、引用により、上記文献は、全体として本明細書に組み込まれる。いくつかの実施形態において、保護基は、塩基性条件で安定しているが、酸性条件で除去されることができる。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）、モノメトキシトリチル、９−フェニルキサンテン−９−イル（Ｐｉｘｙｌ）「９−ｐｈｅｎｙｌｘａｎｔｈｅｎ−９−ｙｌ（Ｐｉｘｙｌ）」及び９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｍｏｘ）「９−（ｐ−ｍｅｔｈｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｘａｎｔｈｅｎ−９−ｙｌ（Ｍｏｘ）」を含む。いくつかの実施形態において、本明細書で使用できるヒドロキシ保護基の非排他的実例としては、Ｔｒ（トリチル）、ＭＭＴｒ（４−メトキシトリチル）、ＤＭＴｒ（４，４’−ジメトキシトリチル）及びＴＭＴｒ（４，４’，４’’−トリメトキシトリチル）を含む。
【００３３】
「被験体」という用語は、本明細書で用いられる場合、任意の動物、例えば、哺乳動物又は有袋動物を指す。本開示の主題としては、ヒト、非ヒト霊長類（例えば、アカゲザル又は他の種類のマカク属のサル）、マウス、ブタ、ウマ、ロバ、ウシ、ヒツジ、ラット及び任意の種類の家禽を含むが、これらに限定されない。
【００３４】
本明細書で用いられる場合、「治療」、「姑息的治療」又は「改善」は、ここで互換的に使用されてもよい。これらの用語は、有益な又は所望の結果を得る方法を指し、治療効果を含むが、これに限定されない。「治療効果」は、治療される潜在的障害を根絶又は改善することを意味する。また、治療効果は、被験体が依然として潜在的障害の苦痛を受ける可能性があるにもかかわらず、潜在的障害に関連する１又は複数の生理的症状を根絶又は改善することにより、被験体に改善が観察されて得られる。
【００３５】
本明細書で用いられる場合、「予防」と「予防」は互換的に使用されてもよい。これらの用語は、有益又は所望の結果を得る方法を指し、予防効果を含むが、これに限定されない。「予防効果」を得るために、当該疾患に対する診断が行っていないかもしれないが、複合体又は組成物を特定の疾患に罹患するリスクのある被験体に投与し、又は疾患の１又は複数の病理学的症状が報告された被験体に投与することができる。
【００３６】
＜ｓｉＲＮＡ＞
本開示は、Ｂ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制できるｓｉＲＮＡを提供する。
本開示のｓｉＲＮＡは、基本的な構造単位としてヌクレオチド基を含み、前記ヌクレオチド基がリン酸基、リボース基及び塩基を含むことは、当業者に公知であるので、ここでは説明を省略する。
【００３７】
ＣＮ１０２１４０４５８Ｂには、ＨＢＶ遺伝子を特異的に抑制するｓｉＲＮＡが開示されており、当該ｓｉＲＮＡの複数種の化学修飾戦略について研究している。当該研究により、修飾戦略が異なると、ｓｉＲＮＡの安定性、生物活性及び細胞毒性等の指標に与える影響が全く異なることが見出された。当該研究では、７種類の有効な修飾方法を実証し、そのうちの１つの修飾方法で得られたｓｉＲＮＡは未修飾ｓｉＲＮＡに比べて、血液安定性を向上させるとともに、未修飾ｓｉＲＮＡと基本的に同等の抑制活性を維持する。
【００３８】
本開示のｓｉＲＮＡは、センス鎖とアンチセンス鎖を含み、前記ｓｉＲＮＡにおける各ヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとは、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、ヌクレオチド配列Ａを含み、前記ヌクレオチド配列Ａは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、ヌクレオチド配列Ｂを含み、前記ヌクレオチド配列Ｂは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺ−３’（配列番号１）、
５’−Ｚ’ＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡ−３’（配列番号２）、
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵであり、
前記ヌクレオチド配列Ａに、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌクレオチド配列Ｂに、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂは、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドである。
【００３９】
文脈において、「位置が対応する」とは、ヌクレオチド配列の同一端から、ヌクレオチド配列において同じ位置にあることを指す。例えば、ヌクレオチド配列Ａの３’端の１番目のヌクレオチドは、位置が配列番号１の３’端の１番目のヌクレオチドに対応するヌクレオチドである。
【００４０】
いくつかの実施形態において、前記センス鎖は、ヌクレオチド配列Ｉのみを含み、前記アンチセンス鎖は、ヌクレオチド配列ＩＩのみを含む。
【００４１】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ａと配列番号１に示されるヌクレオチド配列との間に１つ以下のヌクレオチド差異があり、及び／又は前記ヌクレオチド配列Ｂと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間に１つ以下のヌクレオチド差異がある。
【００４２】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｂと配列番号２に示されるヌクレオチド配列との間のヌクレオチド差異は、Ｚ’Ｂの位置での差異を含み、Ｚ’Ｂが、Ａ、Ｃ又はＧから選択される。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド差異は、Ｚ’Ｂの位置での差異であり、Ｚ’ＢがＡ、Ｃ又はＧから選択され、ＺＡは、Ｚ’Ｂと相補的なヌクレオチドである。これらのヌクレオチド差異により、ｓｉＲＮＡ複合体による標的遺伝子抑制能力を顕著に低下させることがなく、これらのヌクレオチド差異を含むｓｉＲＮＡ複合体も、本開示の保護範囲内にある。
【００４３】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ａと前記ヌクレオチド配列Ｂは、基本的に逆相補、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記基本的に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に３つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、前記実質的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す。
【００４４】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列Ａは、配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列Ｂは、配列番号４に示されるヌクレオチド配列であり、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺＡ−３’（配列番号３）、
５’−Ｚ’ＢＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡ−３’（配列番号４）
ここで、前記Ｚ’Ｂは、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ＺＡは、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ’Ｂは、ＺＡと相補的なヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、ＺＡはＡであり、Ｚ’ＢはＵである。
【００４５】
且つ、前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じか又は異なり、前記センス鎖の長さが１９〜２３ヌクレオチドであり、アンチセンス鎖の長さが２０〜２６ヌクレオチドである。このように、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が、１９／２０、１９／２１、１９／２２、１９／２３、１９／２４、１９／２５、１９／２６、２０／２０、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２０／２４、２０／２５、２０／２６、２１／２０、２１／２１、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２１／２５、２１／２６、２２／２０、２２／２１、２２／２２、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２２／２６、２３／２０、２３／２１、２３／２２、２３／２３、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比は１９／２１、２１／２３又は２３／２５である。
【００４６】
本開示の１つの実施形態によれば、前記センス鎖とアンチセンス鎖とは、長さが同じであり、前記ヌクレオチド配列Ｉは、ヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、ヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがそれぞれ独立して１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩは、ヌクレオチド配列Ａの５’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＶは、ヌクレオチド配列Ｂの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しい。
【００４７】
前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、相補的であってもよく、相補的でなくてもよく、ｓｉＲＮＡの安定性を向上させるために、いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、少なくとも一部で相補的であり、いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、８０％以上又は９０％以上の塩基が相補的であり、いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、実質的に完全に逆相補的又は完全に逆相補的である。前記実質的に完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指し、いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは完全に逆相補的である。これにより、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖は、長さが等しく、その長さ比が２０／２０、２１／２１、２２／２２又は２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１又は２３／２３である。
【００４８】
いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基がＣであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２０／２０であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基組成がＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基組成がＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基組成がＡＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基組成がＣＵＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２２／２２であり、或いは、ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基組成がＣＡＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基組成がＣＵＵＧであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２３／２３である。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基組成がＡＧであり、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基組成がＣＵであり、このとき、センス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が２１／２１である。
【００４９】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶは、長さが同じであり、完全に逆相補的であるので、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基が与えられると、ヌクレオチド配列ＩＶの塩基も決定される。
【００５０】
いくつかの実施形態において、前記センス鎖とアンチセンス鎖は、長さが異なり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、ヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’オーバーハング末端を構成する。これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が、１９／２０、１９／２１、１９／２２、２０／２１、２０／２２、２０／２３、２１／２２、２１／２３、２１／２４、２２／２３、２２／２４、２２／２５、２３／２４、２３／２５又は２３／２６であってもよい。いくつかの実施形態において、前記ヌクレオチド配列Ｖは、長さが２ヌクレオチドであり、これにより、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さ比が、１９／２１、２１／２３又は２３／２５であってもよい。
【００５１】
前記ヌクレオチド配列Ｖにおける各ヌクレオチドは、任意のヌクレオチドであってもよく、合成しやすく合成コストを節約するために、前記ヌクレオチド配列Ｖは、連続した２個のチミンデオキシリボヌクレオチド（ＴＴ）又は連続した２個のウラシルリボヌクレオチド（ＵＵ）であり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖と標的ｍＲＮＡとの親和力を向上させるために、ヌクレオチド配列Ｖは、標的ｍＲＮＡの対応する位置のヌクレオチドと相補的である。したがって、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖の長さの比が１９／２１又は２１／２３であり、このとき、本開示のｓｉＲＮＡがより良好なｍＲＮＡサイレンシング活性を有する。
【００５２】
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺＡ−３’（配列番号３）、
５’−Ｚ’ＢＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号５）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖は、配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖は、配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺＡ−３’（配列番号３）、
５’−Ｚ’ＢＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＵＵ−３’（配列番号６）
ただし、前記Ｚ’Ｂは、アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ＺＡは、Ａ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ’Ｂは、ＺＡと相補的なヌクレオチドである。
【００５３】
本開示のいくつかの具体的な実施例によれば、本開示に記載されたｓｉＲＮＡはｓｉＨＢＶＳ１又はｓｉＨＢＶＳ２である。
ｓｉＨＢＶＳ１
センス鎖：５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺ−３’（配列番号１）
アンチセンス鎖：５’−Ｚ’ＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号７）
ｓｉＨＢＶＳ２
センス鎖：５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺ−３’（配列番号１）
アンチセンス鎖：５’−Ｚ’ＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＵＵ−３’（配列番号８）。
【００５４】
前述したように、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは、それぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドは未修飾ヌクレオチドであり、いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの一部又は全部は、修飾ヌクレオチドであり、ヌクレオチド基上のこれらの修飾により、本開示のｓｉＲＮＡ複合体がＢ型肝炎ウイルス遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることがない。
【００５５】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む。本開示の文脈において、用いられる用語「修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が他の基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログ、或いは、ヌクレオチド上の塩基が修飾された塩基であるヌクレオチドを指す。前記修飾ヌクレオチドにより、ｓｉＲＮＡが遺伝子発現を抑制する機能を明らかに弱める又は喪失させることがない。例えば、Ｊ．Ｋ．  Ｗａｔｔｓ，Ｇ．Ｆ．  Ｄｅｌｅａｖｅｙ，ａｎｄ  Ｍ．Ｊ．  Ｄａｍｈａ，Ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ：ｔｏｏｌｓ  ａｎｄ  ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ．  Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖ  Ｔｏｄａｙ，２００８，１３（１９−２０）：８４２−５５に開示された修飾ヌクレオチドを選択してもよい。
【００５６】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖又は前記アンチセンス鎖は、少なくとも１つのヌクレオチドが修飾ヌクレオチドであり、及び／又は少なくとも１つのリン酸エステル基が、修飾基を有するリン酸エステル基である。言い換えれば、前記センス鎖と前記アンチセンス鎖において少なくとも１本の一本鎖のリン酸−糖骨格中のリン酸エステル基及び／又はリボース基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基及び／又は修飾基を有するリボース基である。
【００５７】
いくつかの実施形態において、前記センス鎖及び／又は前記アンチセンス鎖におけるヌクレオチドは、全て修飾ヌクレオチドである。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドは、独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
【００５８】
本開示の発明者は、驚くべきことに、本開示に記載されたｓｉＲＮＡにより、動物実験において血漿中安定性と遺伝子サイレンシング効率の高度なバランスが取られていることを見出した。
【００５９】
いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ａとヌクレオチド配列Ｂに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。
【００６０】
いくつかの実施形態において、前記フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチド配列Ａとヌクレオチド配列Ｂに位置し、前記ヌクレオチド配列Ａにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが５個以下であり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列Ｂにおけるフルオロ修飾ヌクレオチドが７個以下であり、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである。
【００６１】
いくつかの実施形態において、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位又は５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドが非フルオロ修飾ヌクレオチドである。
【００６２】
本開示の文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基がフッ素で置換された、以下の式（１０１）に示される構造を有するヌクレオチドを指す。「非フルオロ修飾ヌクレオチド」とは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログを指す。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、ヌクレオチドのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチド又はヌクレオチドアナログのいずれかから独立して選択される１つである。
【００６３】
これらのリボース基の２’位のヒドロキシ基が非フッ素化基で置換されたヌクレオチドは、当業者に公知であり、これらのヌクレオチドは、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチド、２’−アルキル修飾ヌクレオチド、２’−置換アルキル修飾ヌクレオチド、２’−アミノ修飾ヌクレオチド、２’−置換アミノ修飾ヌクレオチド、２’−デオキシヌクレオチドから選択される１つであってもよい。
【００６４】
いくつかの実施形態において、２’−アルコキシ修飾ヌクレオチドは、式（１０２）に示される、メトキシ修飾ヌクレオチド（２’−ＯＭｅ）である。２’−置換アルコキシ修飾ヌクレオチドは、例えば、式（１０３）に示される２’−Ｏ−メトキシエチル修飾ヌクレオチド（２’−ＭＯＥ）であってもよい。２’−アミノ修飾ヌクレオチド（２’−ＮＨ２）は式（１０４）に示される。２’−デオキシヌクレオチド（ＤＮＡ）は式（１０５）に示される。
【００６５】
【化１】
2021503941.tif 000003
【００６６】
ヌクレオチドアナログとは、核酸においてヌクレオチドの代わりとなることができるが、アデニンリボヌクレオチド、グアニンリボヌクレオチド、シトシンリボヌクレオチド、ウラシルリボヌクレオチド又はチミンデオキシリボヌクレオチドと構造が異なる基を指す。いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、例えば、イソヌクレオチド、架橋ヌクレオチド（ｂｒｉｄｇｅｄ  ｎｕｃｌｅｉｃ  ａｃｉｄ、ＢＮＡ）又は非環式ヌクレオチドであってもよい。
【００６７】
ＢＮＡとは、拘束された又は近づけないヌクレオチドを指す。ＢＮＡは、五員環、六員環、又は七員環の、「固定された」Ｃ３’−エンド糖パッカリングを有する架橋構造を含んでもよい。通常当該橋を当該リボースの２’−、４’−位に導入して２’，４’−ＢＮＡヌクレオチド、例えば、式（１０６）に示されるＬＮＡ、式（１０７）に示されるＥＮＡ、式（１０８）に示されるｃＥＴ  ＢＮＡ等を提供する。
【００６８】
【化２】
2021503941.tif 000004
【００６９】
非環式ヌクレオチドは、ヌクレオチドの糖環が開環されたヌクレオチド、例えば、式（１０９）に示されるアンロックド核酸（ＵＮＡ）、又は式（１１０）に示されるグリセロール核酸（ＧＮＡ）であってもよい。
【００７０】
【化３】
2021503941.tif 000005
【００７１】
上記式（１０９）及び式（１１０）中、Ｒは、Ｈ、ＯＨ又はアルコキシ（Ｏ−アルキル）から選択される。
【００７２】
イソヌクレオチドとは、ヌクレオチドにおいて塩基のリボース環における位置が変化した化合物を指し、例えば、式（１１１）又は（１１２）に示される、塩基がリボース環の１’−位から２’−位又は３’−位に移行した化合物であってもよい。
【００７３】
【化４】
2021503941.tif 000006
【００７４】
上記式（１１１）〜式（１１２）の化合物において、Ｂａｓｅは、Ａ、Ｕ、Ｇ、Ｃ又はＴ等の塩基を表し、Ｒは、Ｈ、ＯＨ、Ｆ又は上述した非フッ素化基から選択される。
【００７５】
いくつかの実施形態において、ヌクレオチドアナログは、イソヌクレオチド、ＬＮＡ、ＥＮＡ、ｃＥＴ、ＵＮＡ及びＧＮＡのいずれかから選択される１つである。いくつかの実施形態において、各非フルオロ修飾ヌクレオチドは、いずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、文脈において、前記メトキシ修飾ヌクレオチドは、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す。
【００７６】
文脈において、「フルオロ修飾ヌクレオチド」、「２’−フルオロ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’−ヒドロキシ基がフッ素で置換されたヌクレオチド」及び「２’−フルオロリボース基」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドの２’−ヒドロキシ基がフッ素で置換された、式（２０７）に示される構造を有する化合物を指し、「メトキシ修飾ヌクレオチド」、「２’−メトキシ修飾ヌクレオチド」、「リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチド」及び「２’−メトキシリボース基」は、意味が同じであり、いずれもヌクレオチドのリボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換された、式（２０８）に示される構造を有する化合物を指す。
【００７７】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記センス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位又は第５、７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記センス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位又は第２、６、８、９、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖において他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
【００７８】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡは、以下の修飾を有するｓｉＲＮＡである。すなわち、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第７、８及び９位のヌクレオチドが−フルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである。
【００７９】
言い換えれば、当該ｓｉＲＮＡのリン酸−糖骨格中のリボース基は、それぞれ以下の修飾基を有する。５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第５、７、８及び９位のグリコシル基が２’−フルオロリボース基であり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が２’−メトキシリボース基であり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、８、９、１４及び１６位のグリコシル基が２’−フルオロリボース基であり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が２’−メトキシリボース基であり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第５、７、８及び９位のグリコシル基が２’−フルオロリボース基であり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が２’−メトキシリボース基であり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のグリコシル基が２’−フルオロリボース基であり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が２’−メトキシリボース基であり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第７、８及び９位のグリコシル基が２’−フルオロリボース基であり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が２’−メトキシリボース基であり、また、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のグリコシル基が２’−フルオロリボース基であり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドのグリコシル基が２’−メトキシリボース基である。
【００８０】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ｓｉＨＢＶＳ３、ｓｉＨＢＶＳ４、ｓｉＨＢＶＳ５又はｓｉＨＢＶＳ６である。
ｓｉＨＢＶＳ３
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号１０）
ｓｉＨＢＶＳ４
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号１１）
ｓｉＨＢＶＳ５
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号１３）
ｓｉＨＢＶＳ６
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号１４）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表す。
【００８１】
上記修飾を有するｓｉＲＮＡは、コストが低いだけでなく、血中のリボヌクレアーゼで核酸を切断しにくくすることができ、これにより、核酸の安定性を向上させ、核酸により強いヌクレアーゼ加水分解耐性という性能を持たせることができる。
【００８２】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖において、少なくとも１本の一本鎖のリン酸−糖骨格中のリン酸エステル基の少なくとも一部は、修飾基を有するリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、修飾基を有するリン酸エステル基は、リン酸エステル基におけるリン酸ジエステル結合の少なくとも１つの酸素原子が硫黄原子で置換されたチオリン酸エステル基である。いくつかの実施形態において、前記修飾基を有するリン酸エステル基は、式（１）に示される構造を有するチオリン酸エステル基である。
【００８３】
【化５】
2021503941.tif 000007
【００８４】
このような修飾により、ｓｉＲＮＡの二本鎖構造を安定化させ、塩基対合の高い特異性と高い親和力を維持することができる。
【００８５】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡにおいて、チオリン酸エステル基は、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、センス鎖又はアンチセンス鎖の任意の一端の２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、又はそれらの任意の組合せの少なくとも１つに結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の５’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、センス鎖の３’末端を除く全ての上記位置に結合されて存在する。いくつかの実施形態において、チオリン酸エステル基は、以下の位置のうち少なくとも一箇所に結合されて存在する。
前記センス鎖の５’末端（末端端部）から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間。
【００８６】
いくつかの実施形態において、当該ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、当該ｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、当該ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、当該ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、当該ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び当該ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間は、いずれもチオリン酸エステル基により結合されている。
【００８７】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ｓｉＨＢＶＳ７、ｓｉＨＢＶＳ８、ｓｉＨＢＶＳ９又はｓｉＨＢＶＳ１０である。
ｓｉＨＢＶＳ７
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号１６）
ｓｉＨＢＶＳ８
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号１７）
ｓｉＨＢＶＳ９
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号１９）
ｓｉＨＢＶＳ１０
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号２０）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表す。
【００８８】
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドは、５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドである。
【００８９】
慣用の前記５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、当業者に公知であり、例えば、５’−リン酸ヌクレオチドは、以下の構造を有してもよい。
【００９０】
【化６】
2021503941.tif 000008
【００９１】
また、例えば、Ａｎａｓｔａｓｉａ  Ｋｈｖｏｒｏｖａ  ａｎｄ  Ｊｏｎａｔｈａｎ  Ｋ．  Ｗａｔｔｓ，Ｔｈｅ  ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ  ｏｆ  ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  ｔｈｅｒａｐｉｅｓ  ｏｆ  ｃｌｉｎｉｃａｌ  ｕｔｉｌｉｔｙ．  Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１７，３５（３）：２３８〜４８には、以下の４種類の５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが開示されている。
【００９２】
【化７】
2021503941.tif 000009
ただし、ＲはＨ、ＯＨ、メトキシ、フッ素から選択され、ＢａｓｅはＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される塩基を表す。
【００９３】
いくつかの実施形態において、５’−リン酸ヌクレオチドは、式（２）に示される、５’−リン酸修飾を含むヌクレオチドであり、５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドは、式（３）に示される、ビニルリン酸エステル（５’−（Ｅ）−ｖｉｎｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅ、Ｅ−ＶＰ）修飾を含むヌクレオチドであり、又は、式（５）に示される、チオリン酸エステル修飾ヌクレオチドである。
【００９４】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、ｓｉＨＢＶＳ１１、ｓｉＨＢＶＳ１２、ｓｉＨＢＶＳ１３、ｓｉＨＢＶＳ１４、ｓｉＨＢＶＳ１５、ｓｉＨＢＶＳ１６、ｓｉＨＢＶＳ１７又はｓｉＨＢＶＳ１８である。
ｓｉＨＢＶＳ１１
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号２１）
ｓｉＨＢＶＳ１２
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号２２）
ｓｉＨＢＶＳ１３
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号２３）
ｓｉＨＢＶＳ１４
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号２４）
ｓｉＨＢＶＳ１５
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号２５）
ｓｉＨＢＶＳ１６
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号２６）
ｓｉＨＢＶＳ１７
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号２７）
ｓｉＨＢＶＳ１８
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号２８）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、大文字Ｐ１は、当該文字の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。
【００９５】
本開示の発明者は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡが、顕著に向上した血漿とリソソーム安定性を有するだけでなく、非常に高い遺伝子抑制活性を維持することを意外にも見出した。
【００９６】
本開示により提供されるｓｉＲＮＡは、本分野における通常のｓｉＲＮＡ調製方法（例えば、固相合成方法及び液相合成方法）により得ることができる。ここで、固相合成は、既に商用カスタマイズサービスが行われている。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができ、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。
【００９７】
＜薬物組成物＞
本開示は、活性成分として上述したｓｉＲＮＡと、薬学的に許容可能な担体を含む薬物組成物を提供する。
【００９８】
前記薬学的に許容可能な担体は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられる担体であってもよく、例えば、磁性ナノ粒子（ｍａｇｎｅｔｉｃ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ、例えば、Ｆｅ３Ｏ４又はＦｅ２Ｏ３に基づくナノ粒子）、カーボンナノチューブ（ｃａｒｂｏｎ  ｎａｎｏｔｕｂｅｓ）、メソポーラスシリコン（ｍｅｓｏｐｏｒｏｕｓ  ｓｉｌｉｃｏｎ）、リン酸カルシウムナノ粒子（ｃａｌｃｉｕｍ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ  ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ）、ポリエチレンイミン（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ、ＰＥＩ）、ポリアミドアミンデンドリマー（ｐｏｌｙａｍｉｄｏａｍｉｎｅ  （ＰＡＭＡＭ）  ｄｅｎｄｒｉｍｅｒ）、ポリリジン（ｐｏｌｙ（Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ）、ＰＬＬ）、キトサン（ｃｈｉｔｏｓａｎ）、１，２−ジオレオイル−３−トリメチルアンモニウムプロパン（１，２−ｄｉｏｌｅｏｙｌ−３−ｔｒｉｍｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ−ｐｒｏｐａｎｅ、ＤＯＴＡＰ）、ポリＤ−又はＬ−乳酸／グリコール酸共重合体（ｐｏｌｙ（Ｄ＆Ｌ−ｌａｃｔｉｃ／ｇｌｙｃｏｌｉｃ  ａｃｉｄ）ｃｏｐｏｌｙｍｅｒ、ＰＬＧＡ）、ポリ（アミノエチルエチレンリン酸エステル）（ｐｏｌｙ（２−ａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｐｈｏｓｐｈａｔｅ）、ＰＰＥＥＡ）及びポリ（Ｎ，Ｎ−ジメチルアミノエチルメタクリレート）（ｐｏｌｙ（２−ｄｉｍｅｔｈｙｌａｍｉｎｏｅｔｈｙｌ  ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）、ＰＤＭＡＥＭＡ）並びにこれらの誘導体の１又は複数があるが、これらに限定されない。
【００９９】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物におけるｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体の含有量に対して特段の要件はないが、いくつかの実施形態においては、ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体との重量比が、１：（１〜５００）であってもよい。いくつかの実施形態においては、上記重量比が１：（１〜５０）である。
【０１００】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物には、薬学的に許容できる他の添加剤が含まれてもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよい。例えば、前記薬学的に許容できる他の添加剤は、ｐＨ値緩衝液、保護剤及び浸透圧調節剤の少なくとも１種を含んでもよい。
【０１０１】
前記ｐＨ値緩衝液は、ｐＨ７．５〜８．５のトリスヒドロキシメチルアミノメタン塩酸塩緩衝液（ｔｒｉｓ（ｈｙｄｒｏｘｙｍｅｔｈｙｌ）  ａｍｉｎｏｍｅｔｈａｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ  ｂｕｆｆｅｒ）及び／又はｐＨ５．５〜８．５のリン酸塩緩衝液であってもよく、例えば、ｐＨ５．５〜８．５のリン酸塩緩衝液であってもよい。
【０１０２】
前記保護剤は、イノシトール、ソルビトール、スクロース、トレハロース、マンノース、マルトース、ラクトース及びグルコースの少なくとも１種であってもよい。前記薬物組成物の全重量を基準とし、前記保護剤の含有量は０．０１〜３０重量％であってもよい。
【０１０３】
前記浸透圧調節剤は、塩化ナトリウム及び／又は塩化カリウムであってもよい。前記浸透圧調節剤の含有量は、前記薬物組成物の浸透圧が２００〜７００ミリオスモル／キログラムとなるように決定される。所望の浸透圧により、当業者は、前記浸透圧調節剤の含有量を容易に決定することができる。
【０１０４】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、注射液等の液体製剤であってもよく、凍結乾燥粉末注射剤として、投与時に液体添加剤と混合し、液体製剤としてもよい。前記液体製剤は、皮下、筋肉又は静脈注射投与に用いることができるが、これらに限定されず、噴霧により肺に投与し、或いは、噴霧により肺を通して他の臓器組織（例えば、肝臓）に投与することもできるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、静脈注射投与に用いられる。
【０１０５】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、リポソーム製剤の形式であってもよい。いくつかの実施形態において、前記リポソーム製剤に用いられる薬学的に許容可能な担体は、アミン含有トランスフェクション化合物（以下、有機アミンともいう）、補助脂質及び／又はＰＥＧ化（ポリエチレングリコール化）脂質を含む。ここで、前記有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質は、それぞれＣＮ１０３３８０１１３Ａ（引用によりその全体を本明細書に組み込む）に記載されたアミン含有トランスフェクション化合物又はその薬学的に許容できる塩又は誘導体、補助脂質及びＰＥＧ化脂質からそれぞれ選択される１種又は複数種であってもよい。
【０１０６】
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、ＣＮ１０３３８０１１３Ａに記載された式（２０１）に示される化合物又はその薬学的に許容できる塩であってもよい。
【０１０７】
【化８】
2021503941.tif 000010
式中、
Ｘ１０１及びＸ１０２はそれぞれ独立してＯ、Ｓ、Ｎ−Ａ又はＣ−Ａであり、Ａは水素又はＣ１−Ｃ２０炭化水素鎖であり、
Ｙ及びＺはそれぞれ独立してＣ＝Ｏ、Ｃ＝Ｓ、Ｓ＝Ｏ、ＣＨ−ＯＨ又はＳＯ２であり、
Ｒ１０１、Ｒ１０２、Ｒ１０３、Ｒ１０４、Ｒ１０５、Ｒ１０６及びＲ１０７はそれぞれ独立して水素、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖脂肪族基、環式又は非環式の、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロ脂肪族基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アシル基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アリール基、置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖ヘテロアリール基であり、
ｘは１〜１０の整数であり、
ｎが１〜３の整数であり、ｍが０〜２０の整数であり、ｐが０又は１であり、ここで、ｍ＝ｐ＝０である場合、Ｒ１０２は水素であり、
ｎ又はｍの少なくとも１つが２である場合、Ｒ１０３と式（２０１）における窒素とが、式（２０２）又は式（２０３）に示される構造を形成する。
【０１０８】
【化９】
2021503941.tif 000011
式中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１〜６の整数であり、「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊Ｎは式（２０１）における窒素原子を表す。
【０１０９】
いくつかの実施形態において、Ｒ１０３はポリアミンである。他の実施形態において、Ｒ１０３はケタールである。いくつかの実施形態において、式（２０１）におけるＲ１０１及びＲ１０２のそれぞれは、独立して、任意に置換又は無置換の、分岐鎖又は直鎖アルキル又はアルケニルであり、前記アルキル又はアルケニルは、３〜約２０個の炭素原子、例えば、８〜約１８個の炭素原子、及び０〜４個の二重結合、例えば、０〜２個の二重結合を有する。
【０１１０】
いくつかの実施形態において、ｎとｍのそれぞれが独立して１又は３の値である場合、Ｒ１０３は、下記式（２０４）〜式（２１３）のいずれか１つであってもよい。
【０１１１】
【化１０】
2021503941.tif 000012
【０１１２】
式（２０４）〜式（２１３）中、ｇ、ｅ及びｆはそれぞれ独立して１〜６の整数であり、各「ＨＣＣ」は炭化水素鎖を表し、各＊はＲ１０３と式（２０１）における窒素原子との結合可能点を示し、任意の＊位置上の各Ｈは、式（２０１）における窒素原子と結合するために置換されてもよい。
【０１１３】
式（２０１）に示される化合物は、ＣＮ１０３３８０１１３Ａの記載により調製されてもよい。
【０１１４】
いくつかの実施形態において、前記有機アミンは、式（２１４）に示される有機アミン及び／又は式（２１５）に示される有機アミンである。
【０１１５】
【化１１】
2021503941.tif 000013
前記補助脂質は、コレステロール、コレステロールのアナログ及び／又はコレステロールの誘導体であり、
前記ＰＥＧ化脂質は、１，２−ジパルミトアミド−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルエタノールアミン−Ｎ−［メトキシ（ポリエチレングリコール）］−２０００（１，２−ｄｉｐａｌｍｉｔｏｙｌ−ｓｎ−ｇｌｙｃｅｒｏ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ−Ｎ−［ｍｅｔｈｏｘｙ（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ  ｇｌｙｃｏｌ）］−２０００）である。
【０１１６】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物において、前記有機アミン、前記補助脂質及び前記ＰＥＧ化脂質のモル比は（１９．７〜８０）：（１９．７〜８０）：（０．３〜５０）であり、例えば、（５０〜７０）：（２０〜４０）：（３〜２０）であってもよい。
【０１１７】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物粒子は、約３０ｎｍ〜約２００ｎｍの平均径を有し、一般に約４０ｎｍ〜約１３５ｎｍであり、より一般的には、当該リポソーム粒子の平均径は約５０ｎｍ〜約１２０ｎｍ、約５０ｎｍ〜約１００ｎｍ、約６０ｎｍ〜約９０ｎｍ又は約７０ｎｍ〜約９０ｎｍであり、例えば、当該リポソーム粒子の平均径は、約３０、４０、５０、６０、７０、７５、８０、８５、９０、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０又は１６０ｎｍである。
【０１１８】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡと上記アミン含有トランスフェクション試薬により形成された薬物組成物において、ｓｉＲＮＡと全脂質（例えば有機アミン、補助脂質及び／又はＰＥＧ化脂質）の重量比（重量／重量比）は、約１：１〜約１：５０、約１：１〜約１：３０、約１：３〜約１：２０、約１：４〜約１：１８、約１：５〜約１：１７、約１：５〜約１：１５、約１：５〜約１：１２、約１：６〜約１：１２又は約１：６〜約１：１０の範囲内にあり、例えば、本開示のｓｉＲＮＡと全脂質の重量比は約１：５、１：６、１：７、１：８、１：９、１：１０、１：１１，１：１２、１：１３、１：１４、１：１５、１：１６、１：１７又は１：１８である。
【０１１９】
いくつかの実施形態において、前記薬物組成物は、市販時に各成分が独立して存在してもよく、使用時に液体製剤として存在してもよい。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡと上記薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物は、既知の各種の方法に従い調製されてもよく、従来のｓｉＲＮＡの代わりに本開示により提供されるｓｉＲＮＡを用いればよい。いくつかの実施形態において、以下の方法に従い調製されてもよい。
【０１２０】
有機アミン、補助脂質及びＰＥＧ化脂質を上記モル比でアルコールに懸濁させ均一に混合して脂質溶液を得る。アルコールの用量は、得られた脂質溶液の総質量濃度が２〜２５ｍｇ／ｍＬ、例えば、８〜１８ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記アルコールは、薬学的に許容できるアルコール、例えば、エタノール、プロピレングリコール、ベンジルアルコール、グリセリン、ポリエチレングリコール２００、ポリエチレングリコール３００、ポリエチレングリコール４００など、室温付近で液体であるアルコールから選択される１種又は複数種であり、例えばエタノールであってよい。
【０１２１】
本開示により提供されるｓｉＲＮＡを緩衝塩溶液に溶解し、ｓｉＲＮＡ水溶液を得る。緩衝塩溶液の濃度が０．０５〜０．５Ｍであり、例えば、０．１〜０．２Ｍであってもよく、緩衝塩溶液のｐＨを４．０〜５．５に調節し、例えば、５．０〜５．２であってもよく、緩衝塩溶液の用量は、ｓｉＲＮＡの濃度が０．６ｍｇ／ｍＬ以下、例えば、０．２〜０．４ｍｇ／ｍＬとなるように決定される。前記緩衝塩は、可溶性酢酸塩、可溶性クエン酸塩から選択される１種又は複数種であり、例えば、酢酸ナトリウム及び／又は酢酸カリウムであってよい。
【０１２２】
脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液を混合した後、得られた生成物を４０〜６０℃で少なくとも２分間、例えば、５〜３０分間培養し、培養したリポソーム製剤を得る。脂質溶液とｓｉＲＮＡ水溶液の体積比は１：（２〜５）、例えば、１：４であってもよい。
【０１２３】
培養したリポソーム製剤を濃縮又は希釈し、不純物を除去し、除菌し、本開示により提供される薬物組成物を得る。その物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが６．５〜８であり、封入効率が８０％以上であり、粒子径が４０〜２００ｎｍであり、多分散指数が０．３０以下であり、浸透圧が２５０〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇであり、例えば、物理化学的パラメーターとしては、ｐＨが７．２〜７．６、封入効率が９０％以上、粒子径が６０〜１００ｎｍ、多分散指数が０．２０以下、浸透圧が３００〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇであってもよい。
【０１２４】
ここで、濃縮又は希釈は、不純物を除去する前、不純物を除去した後又は同時に行われてもよい。不純物を除去する方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、タンジェンシャルフロー系、中空糸カラムを用い、１００ＫＤａの条件で限外濾過し、限外濾過交換溶液をｐＨ７．４のリン酸塩緩衝液（ＰＢＳ）としてもよい。除菌方法としては、従来の各種の方法を採用してもよく、例えば、０．２２μｍのフィルターで濾過して除菌してもよい。
【０１２５】
＜第１種のｓｉＲＮＡ複合体＞
１つの態様において、本開示は、上記のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに結合される複合基を含む第１種のｓｉＲＮＡ複合体を提供する。
【０１２６】
本開示の文脈において、特に説明がない限り、「複合」とは、それぞれ特定の機能を有する２つ以上の化学部分間が共有結合的に互いに結合することを指し、これに応じて、「複合体」とは、当該各化学部分間が共有結合的に結合することにより形成された化合物を指す。さらには、「ｓｉＲＮＡ複合体」は、特定の機能を有する１又は複数の化学部分がｓｉＲＮＡに共有結合的に結合して形成された化合物を表す。以下に、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を単に「複合体」ともいうことがある。ｓｉＲＮＡ複合体は、文脈により、ｓｉＲＮＡ複合体の総称、第１種のｓｉＲＮＡ複合体又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体であると理解される。本開示の文脈において、「複合分子」は、反応させることによりｓｉＲＮＡに複合され、最終的に本開示のｓｉＲＮＡ複合体を形成することができる化合物であると理解すべきである。
【０１２７】
本開示は、上記のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに結合される複合基を含む第１種のｓｉＲＮＡ複合体を提供する。一般的には、第１種のｓｉＲＮＡ複合体については、前記複合基は、薬学的に許容できる少なくとも１つの標的基及び任意のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を含み、前記ｓｉＲＮＡ、前記リンカー及び前記標的基は順に結合されている。１つの実施形態において、前記標的基が１〜６個である。１つの実施形態において、前記標的基が２〜４個である。前記ｓｉＲＮＡ分子は、前記複合基に非共有結合的又は共有結合的に複合されてもよく、例えば、前記複合基に共有結合的に複合されてもよい。ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端にある。いくつかの実施形態において、前記複合基は、ヌクレオチドのリン酸基、２’−位のヒドロキシ基又は塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、前記複合基は、３’−位のヒドロキシ基に結合されてもよく、この場合、ヌクレオチド間が２’−５’リン酸ジエステル結合により結合されている。複合基は、ｓｉＲＮＡ鎖の末端に結合される場合、通常ヌクレオチドのリン酸基に結合され、ｓｉＲＮＡの内部配列に結合される場合、通常リボース糖環或いは塩基に結合される。各種の結合方法については、Ｍｕｔｈｉａｈ  Ｍａｎｏｈａｒａｎ  ｅｔ．ａｌ．  ｓｉＲＮＡ  ｃｏｎｊｕｇａｔｅｓ  ｃａｒｒｙｉｎｇ  ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌｌｙ  ａｓｓｅｍｂｌｅｄ  ｔｒｉｖａｌｅｎｔ  Ｎ−ａｃｅｔｙｌｇａｌａｃｔｏｓａｍｉｎｅ  ｌｉｎｋｅｄ  ｔｈｒｏｕｇｈ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ  ｅｌｉｃｉｔ  ｒｏｂｕｓｔ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｉｎ  ｖｉｖｏ  ｉｎ  ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ．  ＡＣＳ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  ｂｉｏｌｏｇｙ，２０１５，１０  （５）：１１８１〜７．を参照することができる。
【０１２８】
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡと複合基との間が酸不安定又は還元可能な化学結合により結合されてもよく、細胞エンドソームの酸性環境で、これらの化学結合が分解され、ｓｉＲＮＡが遊離状態になることができる。分解できない複合方法については、複合基は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖に結合され、複合によるｓｉＲＮＡ活性への影響をできるだけ低下させることができる。
【０１２９】
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、ｓｉＲＮＡ投与分野で通常用いられるリガンド、例えば、ＷＯ２００９０８２６０７Ａ２に記載された各種のリガンドであってもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０１３０】
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、コレステロール、胆汁酸、ビタミン（例えば、トコフェロール）、鎖長が異なる脂質分子等の親油性分子と、ポリエチレングリコール等のポリマーと、膜透過性ペプチド等のポリペプチドと、アプタマーと、抗体と、量子ドットと、ラクトース、ポリラクトース、マンノース、ガラクトース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）等の糖類と、葉酸（ｆｏｌａｔｅ）と、アシアロ糖タンパク質、アシアロ糖残基、リポタンパク（例えば、高比重リポタンパク、低比重リポタンパク等）、グルカゴン、神経伝達物質（例えば、アドレナリン）、成長因子、トランスフェリン等の肝実質細胞に発現する受容体リガンド等の標的分子又はその誘導体により形成されたリガンドから選択される１種又は複数種であってもよい。
【０１３１】
いくつかの実施形態において、前記各リガンドは、細胞表面の受容体と結合できるリガンドから独立して選択される。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、哺乳動物の肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、ヒト肝細胞表面の受容体と結合できるリガンドである。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合できるリガンドである。これらのリガンドの種類は、当業者に公知であり、その作用として、一般的に標的細胞表面の特異的受容体と結合し、リガンドに結合されるｓｉＲＮＡの標的細胞への送達を媒介する。
【０１３２】
いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基は、哺乳動物の肝細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と結合するいずれか１種のリガンドであってもよい。１つの実施形態において、各リガンドは、独立してアシアロ糖タンパク質、例えば、アシアロオロソムコイド（ａｓｉａｌｏｏｒｏｓｏｍｕｃｏｉｄ、ＡＳＯＲ）又はアシアロフェチュイン（ａｓｉａｌｏｆｅｔｕｉｎ、ＡＳＦ）である。１つの実施形態において、前記リガンドは、糖又は糖の誘導体である。
【０１３３】
いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドはいずれも糖である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは、単糖、多糖、修飾単糖、修飾多糖又は糖誘導体である。いくつかの実施形態において、少なくとも１つの前記リガンドは、単糖、二糖又は三糖であってもよい。いくつかの実施形態において、少なくとも１つのリガンドは修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも修飾糖である。いくつかの実施形態において、各リガンドは、いずれも独立して多糖、修飾多糖、単糖、修飾単糖、多糖誘導体又は単糖誘導体から選択される。いくつかの実施形態において、リガンドのそれぞれ又は少なくとも１つは、グルコース及びその誘導体、マンナン及びその誘導体、ガラクトース及びその誘導体、キシロース及びその誘導体、リボース及びその誘導体、フコース及びその誘導体、ラクトース及びその誘導体、マルトース及びその誘導体、アラビノース及びその誘導体、フルクトース及びその誘導体並びにシアル酸からなる群から選択される。
【０１３４】
いくつかの実施形態において、各前記リガンドは、Ｄ−マンノピラノース、Ｌ−マンノピラノース、Ｄ−アラビノース、Ｄ−キシロフラノース、Ｌ−キシロフラノース、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルコース、Ｄ−ガラクトース、Ｌ−ガラクトース、α−Ｄ−マンノフラノース、β−Ｄ−マンノフラノース、α−Ｄ−マンノピラノース、β−Ｄ−マンノピラノース、α−Ｄ−グルコピラノース、β−Ｄ−グルコピラノース、α−Ｄ−グルコフラノース、β−Ｄ−グルコフラノース、α−Ｄ−フルクトフラノース、α−Ｄ−フルクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトピラノース、β−Ｄ−ガラクトピラノース、α−Ｄ−ガラクトフラノース、β−Ｄ−ガラクトフラノース、グルコサミン、シアル酸、ガラクトサミン、Ｎ−アセチルガラクトサミン、Ｎ−トリフルオロアセチルガラクトサミン、Ｎ−プロピオニルガラクトサミン、Ｎ−ｎ−ブチリルガラクトサミン、Ｎ−イソブチリルガラクトサミン、２−アミノ−３−Ｏ−［（Ｒ）−１−カルボキシエチル］−２−デオキシ−β−Ｄ−グルコピラノース、２−デオキシ−２−メチルアミノ−Ｌ−グルコピラノース、４，６−ジデオキシ−４−ホルムアミド−２，３−ジ−Ｏ−メチル−Ｄ−マンノピラノース、２−デオキシ−２−スルホアミノ−Ｄ−グルコピラノース、Ｎ−グリコリル−α−ノイラミン酸、５−チオ−β−Ｄ−グルコピラノース、メチル２，３，４−トリス−Ｏ−アセチル−１−チオ−６−Ｏ−トリチル−α−Ｄ−グルコピラノシド（ｍｅｔｈｙｌ  ２，３，４−ｔｒｉｓ−Ｏ−ａｃｅｔｙｌ−１−ｔｈｉｏ−６−Ｏ−ｔｒｉｔｙｌ−α−Ｄ−ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）、４−チオ−β−Ｄ−ガラクトピラノース、エチル３，４，６，７−テトラ−Ｏ−アセチル−２−デオキシ−１，５−ジチオ−α−Ｄ−グルコヘプトピラノシド、２，５−アンヒドロ−Ｄ−アロニトリル、リボース、Ｄ−リボース、Ｄ−４−チオリボース、Ｌ−リボース又はＬ−４−チオリボースから独立して選択されてもよい。前記リガンドの他の選択肢は、例えば、ＣＮ１０５３７８０８２Ａの記載を参照してもよく、引用によりその開示内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０１３５】
いくつかの実施形態において、前記第１種のｓｉＲＮＡ複合体における、薬学的に許容できる標的基は、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンであってもよく、ガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子は、１価、２価、３価、４価であってもよい。ここでいう１価、２価、３価、４価は、それぞれｓｉＲＮＡ分子と、標的基としてのガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子を含む複合基から形成されたオリゴヌクレオチド複合体におけるｓｉＲＮＡ分子とガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミン分子とのモル比が１：１、１：２、１：３又は１：４であることを指すと理解すべきである。いくつかの実施形態において、前記薬学的に許容できる標的基はＮ−アセチルガラクトサミンである。いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ−アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合する場合、Ｎ−アセチルガラクトサミン分子は３価又は４価である。いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡがＮ−アセチルガラクトサミンを含む複合基と複合する場合、Ｎ−アセチルガラクトサミン分子は３価である。
【０１３６】
本開示に記載されたｓｉＲＮＡと複合分子を複合する場合、複合分子は、適切なリンカーを介してｓｉＲＮＡ分子に結合されてもよく、当業者は、標的基の具体的な種類により適切なリンカーを選択することができる。これらの複合基、リンカー、標的基の種類及びｓｉＲＮＡへの結合方法については、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２の開示内容を参照してもよく、引用によりその内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０１３７】
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ−アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０１）に示される構造であってもよい。
【０１３８】
【化１２】
2021503941.tif 000014
式中、
ｋは１〜３の整数であり、
ＬＡは、式（３０２）に示される構造を有するアミド結合を含む鎖状部であり、各前記ＬＡは、その両端でそれぞれ１つの前記標的基及び前記ＬＣ部にエーテル結合により結合される。
【０１３９】
【化１３】
2021503941.tif 000015
ＬＢは、式（３０３）に示される構造を有するＮ−アシルピロリジンを含む鎖状部であり、前記鎖状部は、その一端にカルボニル基を有し、前記ＬＣ部にアミド結合により結合され、他端に酸素基を有し、前記ｓｉＲＮＡにリン酸エステル結合により結合される。
【０１４０】
【化１４】
2021503941.tif 000016
ＬＣは、ヒドロキシメチルアミノメタン、ジヒドロキシメチルアミノメタン又はトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく２〜４価のリンカー基であり、前記ＬＣは、酸素原子を介してエーテル結合により各前記ＬＡ部に結合されるとともに、窒素原子を介してアミド結合により前記ＬＢ部に結合される。
【０１４１】
いくつかの実施形態において、ｎ＝３であり、ＬＣがトリヒドロキシメチルアミノメタンに基づく４価のリンカー基である場合、リンカーとしての−（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン−ＬＢ−によりＮ−アセチルガラクトサミン分子とｓｉＲＮＡ分子を結合して形成されたｓｉＲＮＡ複合体は、その構造が以下の式（３０４）に示される。
【０１４２】
【化１５】
2021503941.tif 000017
式中、二重螺旋構造はｓｉＲＮＡを表す。
【０１４３】
同様に、ｓｉＲＮＡと複合分子との複合部位は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’端又は５’端にあってもよく、アンチセンス鎖の５’端にあってもよく、ｓｉＲＮＡの内部配列にあってもよい。
【０１４４】
いくつかの実施形態において、本開示に記載されたｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端は、リンカー−（ＬＡ）３トリヒドロキシメチルアミノメタン−ＬＢ−により３個のＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）分子に共有結合的に複合され、ｓｉＲＮＡ分子とＧａｌＮＡｃ分子とのモル比が１：３である、構造が以下の式（３０５）に示されるｓｉＲＮＡ複合体（以下、（ＧａｌＮＡｃ）３−１−ｓｉＲＮＡともいう）を得る。
【０１４５】
【化１６】
2021503941.tif 000018
式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
【０１４６】
いくつかの実施形態において、前記標的基がＮ−アセチルガラクトサミンである場合、適切なリンカーは、式（３０６）に示される構造であってもよい。
【０１４７】
【化１７】
2021503941.tif 000019
式中、
ｌは０〜３の整数であり、
＊は、リンカーにおいてエーテル結合により標的基に結合される部位を表し、
＃は、リンカーにおいてリン酸エステル結合によりｓｉＲＮＡに結合される部位を表す。
【０１４８】
いくつかの実施形態において、ｌ＝２である場合、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０７）に示される構造を有する。
【０１４９】
【化１８】
2021503941.tif 000020
式中、二重螺旋構造は前記ｓｉＲＮＡを表し、前記リンカーは前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。
【０１５０】
上記複合体は、従来技術において既に詳しく記載された方法により合成されてもよい。例えば、ＷＯ２０１５００６７４０Ａ２には、複数種の複合体の調製方法が詳しく記載されている。当業者によく知られている方法により、本開示の第１種のｓｉＲＮＡ複合体を得る。例えば、ＷＯ２０１４０２５８０５Ａ１には、式（３０５）に示される構造の調製方法が記載されており、Ｒａｊｅｅｖらは、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１５，１６，９０３−９０８に式（３０７）に示される構造の調製方法を記載した。
【０１５１】
＜第２種のｓｉＲＮＡ複合体＞
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体は、式（３０８）に示される構造を有する第２種のｓｉＲＮＡ複合体である。
【０１５２】
【化１９】
2021503941.tif 000021
式中、
ｎ１は、１〜３から選択される整数であり、ｎ３は、０〜４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立して、Ｈであり、又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基である。
【０１５３】
【化２０】
2021503941.tif 000022
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、Ｎｕは本開示のｓｉＲＮＡである。
【０１５４】
Ｒ２は、長さ１〜２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよい。
【０１５５】
各Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、１又は複数の炭素原子は、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン化、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよい。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１〜Ａ２６の基又はその任意の組合せからなる群から選択されてもよく、Ａ１〜Ａ２６の構造と定義は以下のとおりである。
【０１５６】
【化２１】
2021503941.tif 000023
ただし、ｊ１は１〜２０の整数であり、ｊ２は１〜２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは、式Ａ２７〜Ａ４５の基からなる群から選択される１つである。
【０１５７】
【化２２】
2021503941.tif 000024
ＲｂはＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
2021503941.tif 000025
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表す。
【０１５８】
便宜上、Ｌ１は、線形アルキル基として定義されるが、例えば上述の取替及び／又は置換によって生じるアミンやアルケニル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。本開示内容の目的のために、Ｌ１の長さは、２つの結合点を結合する鎖における原子数である。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環（例えば、ヘテロシクリレン又はヘテロアリーレン）を、１個の原子とする。
【０１５９】
Ｍ１は、標的基を表し、その定義と選択可能な範囲は上記標的基と同じである。いくつかの実施形態において、各Ｍ１は、哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドから選択される１つである。
【０１６０】
Ｍ１が哺乳動物の肝臓細胞表面におけるアシアロ糖タンパク質受容体に対して親和力を有するリガンドである場合、いくつかの実施形態において、ｎ１は、１〜３の整数であってもよく、ｎ３は、０〜４の整数であってもよく、前記複合体におけるＭ１リガンドの個数が少なくとも２であることを確保する。いくつかの実施形態において、ｎ１＋ｎ３≧２であり、これにより、Ｍ１リガンドの個数が少なくとも３であり、Ｍ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体をより容易に結合させ、さらに前記複合体が細胞内取込み（エンドサイトーシス）作用により細胞に取り込まれることを促進することができる。実験から分かるように、Ｍ１リガンドの個数が３個以上である場合、Ｍ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合の容易さの向上が明らかではないので、合成の容易さ、構造／プロセスコスト及び送達効率等の多方面を総合的に考慮すると、いくつかの実施形態において、ｎ１は１〜２の整数であり、ｎ３は０〜１の整数であり、かつ、ｎ１＋ｎ３＝２〜３である。
【０１６１】
いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、独立して２〜１０の整数から選択される場合、複数のＭ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に適合させることができる。本開示により提供される複合体をより簡略化し、より合成しやすく、及び／又はコストを低下させるために、いくつかの実施形態において、ｍ１、ｍ２及びｍ３は、それぞれ独立して２〜５の整数であり、いくつかの実施形態において、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である。
【０１６２】
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５それぞれが独立してＨ、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシの１つである場合、いずれも本明細書で開示された複合体の性質を変化させることなく、本開示の目的を実現することができることは、当業者に理解され得る。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、それぞれ独立してＨ、メチル基及びエチル基から選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５は、いずれもＨである。
【０１６３】
本開示により提供される第２種のｓｉＲＮＡ複合体によれば、Ｒ３は、式Ａ５９に示される構造の基であり、そのうち、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、調製原料の入手しやすさを考慮し、いくつかの実施形態において、Ｅ１はＯＨ又はＳＨである。
【０１６４】
いくつかの実施形態において、Ｒ２は、窒素含有骨格上のＮとＡ５９との結合を実現するために選択される。本開示の文脈において、「窒素含有骨格」とは、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５が結合された炭素原子とＮが互いに結合している鎖状構造を指す。したがって、Ｒ２は、適当な方法でＡ５９基を窒素含有骨格上のＮに結合することができる任意のリンカー基であってもよい。いくつかの実施形態において、固相合成プロセスにより本開示のｓｉＲＮＡ複合体を調製する場合に、Ｒ２基には、窒素含有骨格上のＮに結合される結合部位及びＲ３におけるＰに結合される結合部位がともに含まれる必要がある。いくつかの実施形態において、Ｒ２における前記窒素含有骨格中のＮに結合される部位は、Ｎとアミド結合を形成し、前記Ｒ３上のＰに結合される部位は、Ｐとリン酸エステル結合を形成し、いくつかの実施形態において、Ｒ２は、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ５’又はＢ６’であってもよい。
【０１６５】
【化２３】
2021503941.tif 000026
ただし、
2021503941.tif 000027
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
【０１６６】
ｑ２の値の範囲は、１〜１０の整数であってもよく、いくつかの実施形態において、ｑ２は１〜５の整数である。
【０１６７】
Ｌ１は、Ｍ１リガンドと窒素含有骨格上のＮを結合し、本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体に肝標的機能を提供するという役割を果たす。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、式Ａ１〜Ａ２６の基から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１及びＡ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１、Ａ８、Ａ１０から選択される少なくとも２つの結合の組合せである。
【０１６８】
いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３〜２５個の原子、３〜２０個の原子、４〜１５個の原子又は５〜１２個の原子であってもよい。いくつかの実施形態において、Ｌ１の長さは、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個の原子である。
【０１６９】
いくつかの実施形態において、ｊ１は２〜１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ１は３〜５の整数である。ｊ２は２〜１０の整数であり、いくつかの実施形態において、ｊ２は３〜５の整数である。Ｒ’はＣ１−Ｃ４のアルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒ’は、メチル基、エチル基及びイソプロピル基の１つである。Ｒａは、Ａ２７、Ａ２８、Ａ２９、Ａ３０及びＡ３１の１つであり、いくつかの実施形態において、Ｒａは、Ａ２７又はＡ２８である。Ｒｂは、Ｃ１−Ｃ５のアルキル基であり、いくつかの実施形態において、Ｒｂは、メチル基、エチル基、イソプロピル基及びブチル基の１つである。いくつかの実施形態において、式Ａ１〜Ａ２６においてそれぞれｊ１、ｊ２、Ｒ’、Ｒａ、Ｒｂを選択することにより、Ｍ１リガンドと窒素含有骨格上のＮとの結合を実現し、Ｍ１リガンド間の空間位置をＭ１リガンドと肝表面のアシアロ糖タンパク質受容体との結合に更に適合させる。
【０１７０】
いくつかの実施形態において、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する。
【０１７１】
【化２４】
2021503941.tif 000028
2021503941.tif 000029
2021503941.tif 000030
【０１７２】
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡ配列における任意の可能な位置に結合されてもよく、例えば、式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合されてもよく、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖のいずれか１つのヌクレオチドに結合される。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の端部に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖の端部に結合される。Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡの端部とは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖又は前記アンチセンス鎖においてその一端から前の４個のヌクレオチドを指す。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖の末端に結合され、いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される。Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖の上記位置に結合される場合に、第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、細胞に入り込んだ後、巻き戻されるときに、単独のｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を放出し、ＨＢＶのｍＲＮＡがタンパク質を翻訳する過程を遮断し、Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓ  Ｂ  ｖｉｒｕｓ、ＨＢＶ）遺伝子発現を抑制することができる。
【０１７３】
式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチド上の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチドの５’位、ヌクレオチドの２’位、ヌクレオチドの３’位又はヌクレオチドの塩基に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、リン酸ジエステル結合を形成することによりＮｕに示されるｓｉＲＮＡにおけるヌクレオチドの２’位、３’位又は５’位に結合されてもよい。いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端ヌクレオチドの３’ヒドロキシ基を脱水素した酸素原子に結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖における１つのヌクレオチドの２’−ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合され、或いは、式Ａ５９におけるＰは、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡのセンス鎖の５’末端ヌクレオチドの５’ヒドロキシ基中の水素を置換することによりヌクレオチドに結合される。
【０１７４】
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ複合体において、各隣接するヌクレオチド間がリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合により結合され、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、負電荷を帯び、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基として存在してもよく、ヒドロキシ基又はスルフヒドリル基における水素イオンは、一部又は全部がカチオンで置換されてもよい。前記カチオンは、任意のカチオン、例えば、金属カチオン、アンモニウムイオンＮＨ４＋、有機アンモニウムカチオンの１つであってもよい。溶解性の向上を考慮して、１つの実施形態において、前記カチオンは、アルカリ金属イオン、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン及び４級アンモニウムカチオンから選択される１種又は複数種である。アルカリ金属イオンは、Ｋ＋及び／又はＮａ＋であってもよく、第３級アミンにより形成されたカチオンは、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン、及び／又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンであってもよい。したがって、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又は第１種や第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、少なくとも一部が塩として存在してもよい。１つの形態において、リン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、少なくとも一部がナトリウムイオンに結合され、本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又は第１種や第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、ナトリウム塩又は部分ナトリウム塩として存在する。
【０１７５】
当業者であれば明らかに知っているように、対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを用いることにより修飾ヌクレオチド基を本開示に記載されたｓｉＲＮＡに導入することができる。対応する修飾を有するヌクレオシドモノマーを調製する方法、及び修飾ヌクレオチド基をｓｉＲＮＡに導入する方法も、当業者によく知られている。全ての修飾ヌクレオシドモノマーは、市販品を購入してもよく、既知の方法により調製してもよい。
【０１７６】
＜第２種のｓｉＲＮＡ複合体の調製＞
任意の合理的な合成経路により本開示の第２種のｓｉＲＮＡ複合体を調製してもよい。
【０１７７】
いくつかの実施形態において、第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、以下の方法により調製することができる。当該方法は、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、それぞれｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖のヌクレオチド種類と順序により、３’から５’に向かって、ヌクレオシドモノマーを順に結合し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、アニールを行うことを含み、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡは、上記本開示のｓｉＲＮＡである。
【０１７８】
また、当該方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、ヌクレオシドモノマー又は固相担体に結合されたヌクレオチド配列と接触させ、式（３２１）に示される化合物をカップリング反応させてヌクレオチド配列に結合することをさらに含む。以下に、式（３２１）に示される化合物は、複合分子とも呼ばれる。
【０１７９】
【化２５】
2021503941.tif 000031
式中、
Ｒ４は、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡに結合できる部分である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、共有結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡに結合することができる部分である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、反応を経てリン酸ジエステル結合によりＮｕに示されるｓｉＲＮＡの任意の官能基に複合されることができる部分であり、
各Ｓ１は、独立してＭ１において全ての活性ヒドロキシ基がＹＣＯＯ−基で置換された基であり、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つである。
【０１８０】
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｍ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０１８１】
Ｒ４は、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現し、式（３０８）のｓｉＲＮＡ複合体の合成に適切な反応部位を提供するために選択される。いくつかの実施形態において、Ｒ４には、Ｒ２リンカー基又は保護されたＲ２リンカー基、及び反応させることによりｓｉＲＮＡとＡ５９に示される構造を形成することができる官能基が含まれる。
【０１８２】
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、Ｎｕに示されるｓｉＲＮＡ又はヌクレオシドモノマー上の基と亜リン酸エステルを形成することができる第１の官能基、及びヒドロキシ基又はアミノ基と反応させて共有結合を形成することができる第２の官能基を含み、或いは、前記共有結合により結合された固相担体を含む。いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ホスホルアミダイト、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、ホスホルアミダイト、カルボン酸又はカルボン酸塩である。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、共有結合を介して分子の他の部分に結合される固相担体であり、前記共有結合は、ヒドロキシ基又はアミノ基により形成されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は、リン酸エステル結合、カルボン酸エステル結合又はアミド結合を介して結合されている。いくつかの実施形態において、前記固相担体は樹脂である。
【０１８３】
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基、−ＯＲｋ又は式（Ｃ３）に示される基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）、（Ｃ３）、（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を含む。
【０１８４】
【化２６】
2021503941.tif 000032
式中、ｑ１は１〜４の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
2021503941.tif 000033
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。
【０１８５】
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、式（Ｃ３）に示されるように、ホスホルアミダイト官能基を含み、当該ホスホルアミダイト基は、ヌクレオチド上の任意位置のヒドロキシ基、例えば、２’位のヒドロキシ基又は３’位のヒドロキシ基とカップリング反応させて亜リン酸エステルを形成し、酸化又は硫化されて式Ａ５９に示されるリン酸ジエステル結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、複合分子をｓｉＲＮＡに複合させることができる。この場合、前記第２の官能基が存在しなくても、式（３２１）の化合物は、ヌクレオチドに複合されることができ、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体の取得に影響することはない。この場合に、ホスホルアミダイト固相合成等の方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得た後、式（３２１）の化合物と、ヌクレオチド配列において末端ヌクレオチド上のヒドロキシ基を反応させ、後の酸化又は硫化過程においてリン酸ジエステル結合結合又はチオリン酸エステル結合を形成し、式（３２１）の化合物をｓｉＲＮＡに複合させる。
【０１８６】
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、保護されたヒドロキシ基を含む。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、固相担体と反応できる基を含み、前記反応により固相担体を含む複合分子を提供する。いくつかの実施形態において、前記第２の官能基は、式（Ｃ１）、（Ｃ２）又は（Ｃ３）に示されるように、カルボキシ基、カルボン酸塩又はホスホルアミダイトを含む。前記第２の官能基がカルボキシ基又はカルボン酸塩を含む場合、式（３２１）の化合物と固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基又はアミノ基をエステル化反応又はアミド化反応させ、カルボン酸エステル結合により結合された、又はアミド結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。前記第２の官能基がホスホルアミダイト官能基を含む場合、式（３２１）の化合物と汎用の固相担体、例えば、樹脂におけるヒドロキシ基をカップリング反応させ、酸化されてリン酸ジエステル結合により結合された、固相担体を含む複合分子を形成する。その後、上記固相担体が結合された生成物を出発とし、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。ホスホルアミダイト固相合成過程において、前記第１の官能基は、脱保護され、その後、カップリング反応条件下でヌクレオシドモノマーにおけるホスホルアミダイト基とカップリングさせる。
【０１８７】
いくつかの実施形態において、前記第１の官能基は、ヒドロキシ基又は保護されたヒドロキシ基を含み、前記第２の官能基は、式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示されるように、カルボン酸エステル結合により結合された固相担体又はアミド結合により結合された固相担体、又はリン酸エステル結合により結合された固相担体を含む。この場合、出発として固相担体の代わりに式（３２１）の化合物を用い、ホスホルアミダイト固相合成方法に従いヌクレオシドモノマーを順に結合し、複合基が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る。
【０１８８】
いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、−ＣＯＯ−Ｍ＋で表されてもよく、ここで、Ｍ＋は、カチオンであり、例えば、金属カチオン、アンモニウムカチオンＮＨ４＋、有機アンモニウムカチオンから選択される１つである。１つの実施形態において、前記金属イオンは、アルカリ金属イオンから選択される１つであり、例えば、Ｋ＋又はＮａ＋である。溶解性を向上させ、反応をスムーズに行うことを考慮して、いくつかの実施形態において、有機アンモニウムイオンは、第３級アミンにより形成されたアンモニウムカチオン又は４級アンモニウムカチオン、例えば、トリエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンにより形成されたアンモニウムイオンである。いくつかの実施形態において、カルボン酸塩は、トリエチルアミンカルボン酸塩又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンカルボン酸塩である。
【０１８９】
いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）、（Ｂ１０）、（Ｂ９’）、（Ｂ１０’）、（Ｂ１１）、（Ｂ１２）、（Ｂ１１’）又は（Ｂ１２’）に示される構造を含む。
【０１９０】
【化２７】
2021503941.tif 000034
式中、ｑ１は１〜４の整数であり、ｑ２は１〜１０の整数であり、ＸはＯ又はＮＨであり、Ｍ＋はカチオンであり、Ｒｋはヒドロキシ保護基であり、ＳＰＳは固相担体を表し、
2021503941.tif 000035
は、基が共有結合的に結合する部位を表す。いくつかの実施形態において、ｑ１は１又は２である。いくつかの実施形態において、ｑ２は１〜５の整数である。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ９）又は（Ｂ１０）に示される構造を含む。いくつかの実施形態において、Ｒ４は、式（Ｂ１１）又は（Ｂ１２）に示される構造を含む。
【０１９１】
いくつかの実施形態において、Ｒｋは、Ｔｒ（トリチル基）、ＭＭＴｒ（４−メトキシトリチル基）、ＤＭＴｒ（４，４’−ビスメトキシトリチル基）、ＴＭＴｒ（４，４’，４’−トリメトキシフェニルメチル基）の１又は複数である。いくつかの実施形態において、Ｒｋは、ＤＭＴｒ、即ち、４，４’−ビスメトキシトリチル（４，４’−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉｔｙｌ）であってもよい。
【０１９２】
Ｌ１の定義は、前述したとおりである。
【０１９３】
いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ｍ１リガンドを窒素含有骨格上のＮ原子に結合し、オリゴヌクレオチド複合体に肝標的機能を提供するために用いられる。いくつかの実施形態において、Ｌ１は、Ａ１〜Ａ２６のいずれか１つ又はその組合せを含む。
【０１９４】
上記記載により、当業者であれば容易に理解できるように、本分野で公知のホスホルアミダイト固相合成方法と比較して、上記第１の官能基及び任意の第２の官能基により、複合分子がヌクレオチド配列の任意の可能な位置、例えば、ヌクレオチド配列の端部、ヌクレオチド配列の末端に結合されたｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。これに応じて、特に説明がない限り、以下に複合体の調製に関する記載において、「脱保護」、「カップリング」、「キャッピング」、「酸化」、「硫化」等の反応に言及する場合、本分野で公知のホスホルアミダイト核酸の固相合成方法に係る反応条件と試薬もまた、同様にこれらの反応に適用されると理解すべきである。例示的な反応条件と試薬は、以下に詳細に説明する。
【０１９５】
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１において少なくとも１つの活性ヒドロキシ基がヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、独立してＭ１に存在する活性ヒドロキシ基が全てヒドロキシ保護基で保護された基である。いくつかの実施形態において、当業者に既知のあらゆるヒドロキシ保護基を、Ｍ１における活性ヒドロキシ基を保護するために用いることができる。いくつかの実施形態において、保護されたヒドロキシ基は、式ＹＣＯＯ−で表されてもよく、各Ｙは、独立してＣ１−Ｃ１０アルキル基及びＣ６−Ｃ１０アリール基からなる群から選択され、前記Ｃ１−Ｃ１０アルキル基及びＣ６−Ｃ１０アリール基は、１又は複数の置換基で任意に置換され、前記置換基は、ハロゲン及びＣ１−Ｃ６アルキル基からなる群から選択される。いくつかの実施形態において、各Ｙは、独立して、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、モノフルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びＣ１−Ｃ６アルキルフェニル基からなる群から選択される。
【０１９６】
いくつかの実施形態において、各Ｓ１は、それぞれ独立して式Ａ４６〜Ａ５４からなる群から選択される。
【０１９７】
【化２８】
2021503941.tif 000036
2021503941.tif 000037
【０１９８】
いくつかの実施形態において、Ｓ１は式Ａ４９又はＡ５０である。
【０１９９】
いくつかの実施形態において、各Ｙは、メチル基、トリフルオロメチル基、ジフルオロメチル基、フルオロメチル基、トリクロロメチル基、ジクロロメチル基、クロロメチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、フェニル基、ハロフェニル基及びアルキルフェニル基から独立して選択される１つであり、本開示の複合分子を簡略化する目的で、いくつかの実施形態において、Ｙはメチル基である。
【０２００】
前述したように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、ｓｉＲＮＡの他方の鎖を合成し（例えば、上記工程で、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成した場合、固相合成方法に従いｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成することをさらに含み、その逆も同様である）、センス鎖及びアンチセンス鎖を単離し、かつ、アニールを行う工程をさらに含む。具体的には、単離工程において、ヌクレオチド配列及び／又は複合分子に結合される固相担体が切断されるとともに、必要な保護基が除去され（この場合、式（３２１）の化合物における各Ｓ１基が、対応するＭ１リガンドに変換される）、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖（又はアンチセンス鎖）及び対応するアンチセンス鎖（又はセンス鎖）が得られ、センス鎖とアンチセンス鎖をアニールして二本鎖ＲＮＡ構造を形成し、式（３０８）に示されるｓｉＲＮＡ複合体を得る。
【０２０１】
いくつかの実施形態において、前記ｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖の３’端の１番目のヌクレオシドモノマーと接触させ、式（３２１）に示される化合物を配列における１番目のヌクレオチドに結合させ、ホスホルアミダイト固相合成の条件で、所望のセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、ｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を合成する工程であって、（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基を含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる、式（３２１）に示される化合物であり、１番目のヌクレオシドモノマーと結合する前に、式（３２１）の化合物を脱保護し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、複合分子が結合された核酸のセンス鎖又はアンチセンス鎖を得る工程；ホスホルアミダイト固相合成の条件で、アンチセンス鎖又はセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、核酸のアンチセンス鎖又はセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、保護基を除去して固相担体から切断し、単離精製して核酸のセンス鎖及びアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
【０２０２】
いくつかの実施形態において、第２種のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、当該二本鎖ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖又はアンチセンス鎖のヌクレオチドの種類と順序により、３’から５’に向かってヌクレオシドモノマーを順に結合し、センス鎖及びアンチセンス鎖を合成し、各ヌクレオシドモノマーの結合が脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を含み、固相担体に結合されたセンス鎖、及び固相担体に結合されたアンチセンス鎖を得る工程と、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、式（３２１）に示される化合物を、固相担体に結合されたセンス鎖又は固相担体に結合されたアンチセンス鎖と接触させ、Ｒ４にホスホルアミダイト基である第１の官能基が含まれる式（３２１）の化合物をセンス鎖又はアンチセンス鎖に結合させる工程と、保護基を除去して固相担体から切断し、それぞれ単離精製し、複合分子が結合されたｓｉＲＮＡのセンス鎖又はアンチセンス鎖を得、アニールを行う工程を含む。
【０２０３】
いくつかの実施形態において、式Ａ５９におけるＰは、ｓｉＲＮＡにおけるセンス鎖の３’末端に結合され、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の調製方法は、
（１）式（３２１）の化合物（式（３２１）の化合物は、Ｒ４に、保護されたヒドロキシ基ＯＲｋを含む第１の官能基、及び式（Ｃ１’）又は（Ｃ３’）に示される構造を有する第２の官能基が含まれる化合物である）におけるヒドロキシ保護基Ｒｋを除去し、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下で、脱保護された生成物をヌクレオシドモノマーと接触させ、複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを得ること、
（２）当該複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’−５’に向かってホスホルアミダイト固相合成方法によりｓｉＲＮＡのセンス鎖を合成すること、
（３）ホスホルアミダイト固相合成方法により、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖を合成すること、
（４）ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離してアニールし、本開示のｓｉＲＮＡ複合体を得ることを含む。
【０２０４】
工程（１）において、式（３２１）の化合物における保護基Ｒｋを除去する方法は、脱保護条件で、式（３２１）の化合物を脱保護試薬と接触させることを含む。脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒であり、いくつかの実施形態において、５０〜１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と式（３２１）の化合物とのモル比が１０：１〜１０００：１であり、１つの実施形態において、５０：１〜５００：１である。
【０２０５】
前記カップリング反応条件とカップリング試薬としては、上記カップリング反応に適した任意の条件と試薬を用いてもよい。いくつかの実施形態において、採用される固相合成方法におけるカップリング反応と同じ条件と試薬を用いてもよい。
【０２０６】
いくつかの実施形態において、前記カップリング反応の条件としては、反応温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃である。式（３２１）の化合物とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１〜１：５０であり、いくつかの実施形態において、１：２〜１：５であり、式（３２１）の化合物とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：５０であってもよく、いくつかの実施形態において、１：３〜１：１０であり、反応時間が２００〜３０００秒であり、いくつかの実施形態において、５００〜１５００秒である。カップリング試薬は、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾール、５−ベンジルチオ１Ｈ−テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、無水アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２０７】
工程（２）において、ホスホルアミダイト核酸固相合成方法により、上記工程で調製された複合分子により固相担体に結合されるヌクレオシドモノマーを出発とし、３’−５’の方向に向かってｓｉＲＮＡ複合体のセンス鎖Ｓを合成する。この場合、複合分子は、得られたセンス鎖の３’末端に結合される。
【０２０８】
工程（２）及び（３）における前記固相合成の他の条件としては、ヌクレオシドモノマーの脱保護条件、脱保護試薬の種類と用量、カップリング反応条件、カップリング試薬の種類と用量、キャッピング反応の条件、キャッピング試薬の種類と用量、酸化反応条件、酸化試薬の種類と用量、硫化反応条件、硫化試薬及び用量を含み、本分野で通常用いられる各種の試薬、用量及び条件を採用する。
【０２０９】
例えば、いくつかの実施形態において、工程（２）及び（３）において、前記固相合成では、以下の条件を用いてもよい。
【０２１０】
ヌクレオシドモノマーの脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒であり、いくつかの実施形態において、５０〜１５０秒であり、脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固相担体における４，４’−ジメトキシトリチル保護基とのモル比が、２：１〜１００：１であり、いくつかの実施形態において、３：１〜５０：１である。
【０２１１】
カップリング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１〜１：５０であり、いくつかの実施形態において、１：５〜１：１５であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：１００であり、いくつかの実施形態において、１：５０〜１：８０であり、反応時間とカップリング試薬の選択は、前記と同じである。
【０２１２】
キャッピング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が５〜５００秒であり、いくつかの実施形態において、１０〜１００秒であり、キャッピング試薬の選択は、前記と同じである。キャッピング試薬の総量と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１：１００〜１００：１であり、いくつかの実施形態において、１：１０〜１０：１である。キャッピング試薬として等モル量の酢酸無水物とＮ−メチルイミダゾールを用いる場合に、酢酸無水物、Ｎ−メチルイミダゾール及び固相担体に結合される核酸配列のモル比が１：１：１０〜１０：１０：１であり、いくつかの実施形態において、１：１：２〜２：２：１である。
【０２１３】
酸化反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が１〜１００秒であり、いくつかの実施形態において、５〜５０秒であり、酸化試薬は、いくつかの実施形態において、ヨウ素である（いくつかの実施形態において、ヨウ素水として提供する）。酸化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、１：１〜１００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、５：１〜５０：１である。いくつかの実施形態において、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１〜１：１：３の混合溶剤で行われる。硫化反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が５０〜２０００秒であり、いくつかの実施形態において、１００〜１０００秒であり、硫化試薬は、いくつかの実施形態において、キサンタンヒドリドである。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１０：１〜１０００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１０：１〜５００：１である。いくつかの実施形態において、前記硫化反応は、アセトニトリル：ピリジン＝１：３〜３：１の混合溶剤で行われる。
【０２１４】
全てのヌクレオシドモノマーを結合した後、アニールする前、当該方法は、ｓｉＲＮＡのセンス鎖及びアンチセンス鎖を単離することをさらに含む。単離方法は、当業者に公知であり、一般的に、合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去し、精製し脱塩することを含む。
【０２１５】
合成されたヌクレオチド配列を固相担体から切断し、塩基上、リン酸基上及びリガンド上の保護基を除去するには、ｓｉＲＮＡ合成において通常の切断と脱保護方法により行われてもよい。例えば、得られた固相担体が結合されたヌクレオチド配列を濃アンモニア水と接触させ、脱保護過程において、Ａ４６〜Ａ５４基の保護基ＹＣＯＯ−をヒドロキシ基に変換させ、Ｓ１基を対応するＭ１基に変換させ、式（３０８）に示される複合体を生成する。ここで、前記濃アンモニア水は、２５〜３０重量％のアンモニア水であってもよく、濃アンモニア水の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．２ｍｌ／μｍｏｌ〜０．８ｍｌ／μｍｏｌであってもよい。
【０２１６】
合成されたヌクレオチド配列に少なくとも１つの２’−ＴＢＤＭＳ保護がある場合、前記方法は、固相担体が除去されたヌクレオチド配列をトリエチルアミン三フッ化水素酸塩と接触させることにより、当該２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去することをさらに含む。この場合、得られた目的とするｓｉＲＮＡ配列には、遊離の２’−ヒドロキシ基の対応するヌクレオシドを有する。純粋なトリエチルアミン三フッ化水素酸塩の用量は、目的とするｓｉＲＮＡ配列に対して０．４ｍｌ／μｍｏｌ〜１．０ｍｌ／μｍｏｌである。このように式（３０８）のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
【０２１７】
精製及び脱塩する方法は、当業者によく知られている。例えば、分取用イオンクロマトグラフィー精製カラムを用いて、ＮａＢｒ又はＮａＣｌの勾配溶出によって、核酸の精製を完成し、生成物を回収して合わせた後、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩することができる。
【０２１８】
このように得られたｓｉＲＮＡ複合体において、ヌクレオチド間のリン酸ジエステル結合又はチオリン酸ジエステル結合における非架橋酸素原子又は硫黄原子は、基本的にナトリウムイオンに結合されており、ｓｉＲＮＡ複合体は、基本的にナトリウム塩として存在する。熟知のイオン交換方法により、水素イオン及び／又は他のカチオンで前記ナトリウムイオンを置換し、他の形式のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。前記カチオンは、前述したとおりである。
【０２１９】
合成過程において、常に核酸配列の純度と分子量を検出し、合成品質をよりよく制御することができる。このような検出方法は、当業者に公知である。例えば、イオン交換クロマトグラフィーにより核酸純度を検出し、液体クロマトグラフィータンデム質量分析により分子量を測定することができる。
【０２２０】
アニール方法も、当業者によく知られている。例えば、簡単に合成されたセンス鎖（Ｓ鎖）とアンチセンス鎖（ＡＳ鎖）を等モル比で注射用水に混合して７０〜９５℃に加熱し、その後室温で冷却し、水素結合により二本鎖構造を形成させることができる。このように本開示のｓｉＲＮＡ複合体を得ることができる。
【０２２１】
本開示の複合体を得た後、いくつかの実施形態において、例えば、液体クロマトグラフィータンデム質量分析等の方法を用いて、分子量検出等により合成されたｓｉＲＮＡ複合体の特徴を明らかにし、合成されたｓｉＲＮＡ複合体が、目的設計のｓｉＲＮＡ複合体であるとともに、合成されたｓｉＲＮＡの配列が、合成しようとするｓｉＲＮＡの配列と一致し、例えば表１に示される配列の１つであると確認することもできる。
【０２２２】
式（３２１）に示される化合物は、有機溶剤において、エステル化反応条件下及び塩基とエステル化触媒の存在下で、式（３１３）に示される化合物を環状酸無水物と接触させ、イオン交換を行い、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む調製方法により得ることができる。
【０２２３】
【化２９】
2021503941.tif 000038
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりであり、
Ｒ６は、式（３２１）におけるＲ４を提供する基である。いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式（Ａ６１）に示される構造を有する。
【０２２４】
【化３０】
2021503941.tif 000039
式中、Ｒｉは、窒素含有骨格上のＮとの結合を実現できる、ＲｋＯと結合して１つの遊離ヒドロキシ基が結合されている任意の基であり、Ｒｋはヒドロキシ保護基である。この場合、Ｒ４にヒドロキシ保護基としての第１の官能基と第２の官能基が含まれ、前記第２の官能基が式（Ｃ１）又は（Ｃ２）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
【０２２５】
前記エステル化反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が８〜４８時間であり、いくつかの実施形態において、前記エステル化反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が２０〜３０時間である。
【０２２６】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種を含む。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。前記式（３１３）に示される化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２２７】
いくつかの実施形態において、前記環状酸無水物は、コハク酸無水物、グルタル酸無水物、アジピン酸無水物又はピメリン酸無水物の１つであり、いくつかの実施形態において、コハク酸無水物である。前記環状酸無水物と前記式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１〜５：１である。
【０２２８】
前記エステル化触媒は、当該エステル化反応を触媒する任意の触媒であってもよく、例えば、当該触媒は、４−ジメチルアミノピリジンであってもよい。前記触媒と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、２：１〜５：１である。
【０２２９】
いくつかの実施形態において、前記塩基は、任意の無機塩基、有機塩基又はこれらの組合せであってもよい。溶解性及び生成物の安定性を考慮すると、前記塩基は、例えば、第３級アミン類有機塩基であってもよい。いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミン類有機塩基と式（３１３）に示される化合物とのモル比が１：１〜２０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１〜１０：１である。
【０２３０】
前記イオン交換作用は、式（３２１）の化合物を所望のカルボン酸又はカルボン酸塩の形式に変換することであり、イオン交換方法は、当業者に公知であり、適切なイオン交換溶液と交換条件を用い、前述したカチオンがＭ＋である複合分子を得ることができ、ここで詳しい説明を省略する。いくつかの実施形態において、前記イオン交換反応は、トリエチルアミンリン酸塩溶液を用いて行われ、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の濃度が０．２〜０．８Ｍであり、いくつかの実施形態において、０．４〜０．６Ｍであり、式（３１３）の化合物に対して、前記トリエチルアミンリン酸塩溶液の用量が３〜６Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において４〜５Ｌ／ｍｏｌである。
【０２３１】
任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３２１）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出する、又は、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するというクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２３２】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、縮合反応条件下で、有機溶剤において、縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、上記イオン交換反応により得られた生成物を、さらにアミノ基又はヒドロキシ基を含む固相担体と接触させることをさらに含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ１’）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
【０２３３】
前記固相担体は、ｓｉＲＮＡの固相合成に用いられる担体の１つであり、そのうちのいくつかは、当業者に公知である。例えば、前記固相担体は、活性ヒドロキシ基又はアミノ官能基を含む固相担体から選択されてもよく、いくつかの実施形態において、前記固相担体は、アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂である。後に核酸固相合成を行いやすくするために、いくつかの実施形態において、前記アミノ樹脂又はヒドロキシ樹脂は、粒子径１００〜４００メッシュ（ｍｅｓｈ）、表面におけるアミノ基又はヒドロキシ基の担持量０．２〜０．５ｍｍｏｌ／ｇというパラメーターを有する。前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比が１０〜４００μｍｏｌ化合物／グラムの固相担体（μｍｏｌ／ｇ）である。いくつかの実施形態において、前記式（３２１）に示される化合物と固相担体との用量比が５０〜２００μｍｏｌ／ｇである。
【０２３４】
前記有機溶剤は、当業者に既知の任意の適切な溶剤又は混合溶剤であってもよい。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が２０〜２００Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５０〜１００Ｌ／ｍｏｌである。
【０２３５】
前記縮合剤は、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン及び／又はＯ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであってもよく、いくつかの実施形態において、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートである。前記縮合剤と式（３２１）に示される化合物とのモル比が１：１〜２０：１であり、いくつかの実施形態において１：１〜５：１である。
【０２３６】
いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン及び／又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３２１）に示される化合物とのモル比が１：１〜２０：１であり、いくつかの実施形態において、１：１〜５：１である。
【０２３７】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、得られた縮合生成物をキャッピング反応条件下で、有機溶剤において、キャッピング試薬及びアシル化触媒と接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることをさらに含んでもよい。前記キャッピング反応の作用は、後の反応において不必要な副生成物が生じることを避けるために、まだ完全に反応していないあらゆる活性反応官能基を除去することである。前記キャッピング反応の条件としては、反応温度が０〜５０℃であり、いくつかの実施形態において、１５〜３５℃であり、反応時間が１〜１０ｈであり、いくつかの実施形態において、３〜６ｈである。キャッピング試薬としては、当業者に公知の、ｓｉＲＮＡ固相合成に用いられるキャッピング試薬を用いてもよい。
【０２３８】
いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬１（ｃａｐ１）及びキャッピング試薬２（ｃａｐ２）からなり、キャッピング試薬１は、Ｎ−メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、Ｎ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が１：１０〜１：１であり、いくつかの実施形態において、１：３〜１：１であり、ピリジンとアセトニトリルの総体積とＮ−メチルイミダゾールとの体積が１：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１〜７：１である。前記キャッピング試薬２は、酢酸無水物であり、いくつかの実施形態において、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積が１：１〜１：１０であり、いくつかの実施形態において１：２〜１：６である。
【０２３９】
いくつかの実施形態において、前記Ｎ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比が５ｍｌ／ｇ〜５０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態において、１５ｍｌ／ｇ〜３０ｍｌ／ｇである。前記酢酸無水物のアセトニトリル溶液の体積と式（３２１）の化合物の質量との比が０．５ｍｌ／ｇ〜１０ｍｌ／ｇであり、いくつかの実施形態において、１ｍｌ／ｇ〜５ｍｌ／ｇである。
【０２４０】
いくつかの実施形態において、キャッピング試薬としては、等モル量の酢酸無水物とＮ−メチルイミダゾールを用いる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２１）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１０〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５〜３０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２４１】
前記アシル化触媒は、エステル化縮合又はアミド化縮合に使用できる任意の触媒、例えばアルカリ複素環化合物から選択されてもよい。いくつかの実施形態において、前記アシル化触媒は、４−ジメチルアミノピリジンである。前記触媒と式（３２１）に示される化合物との質量比が０．００１：１〜１：１であり、いくつかの実施形態において、０．０１：１〜０．１：１である。
【０２４２】
任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３２１）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、有機溶剤で十分に洗浄し、濾過し、未反応の反応物、過剰なキャッピング試薬及び他の不純物を除去することにより、式（３２１）の化合物を得ることができる。前記有機溶剤は、アセトニトリル、ジクロロメタン、メタノールから選択され、いくつかの実施形態において、アセトニトリルである。
【０２４３】
いくつかの実施形態において、式（３２１）に示される複合分子の調製方法は、有機溶剤において、カップリング反応条件下で、カップリング試薬の存在下で、式（３１３）に示される化合物をホスホルジアミダイトと接触させ、単離して式（３２１）に示される化合物を得ることを含む。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能が式（Ｃ３）に示される構造を含む式（３２１）の化合物が得られる。
【０２４４】
いくつかの実施形態において、カップリング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、式（３１３）の化合物とホスホルジアミダイトとのモル比が１：１〜１：５０であってもよく、例えば１：５〜１：１５であり、式（３１３）の化合物とカップリング試薬とのモル比が１：１〜１：１００であってもよく、例えば１：５０〜１：８０であり、反応時間が２００〜３０００秒であってもよく、例えば５００〜１５００秒である。前記ホスホルジアミダイトは、例えばビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィンを用いてもよく、市販品として購入してもよく、又は本分野で公知の方法により合成されてもよい。カップリング試薬は、１Ｈ−テトラゾール、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾール、５−ベンジルチオ１Ｈ−テトラゾールから選択される１種又は複数種であり、例えば、５−エチルチオ１Ｈ−テトラゾールである。前記カップリング反応は、有機溶剤で行われてもよく、前記有機溶剤は、無水アセトニトリル、無水ＤＭＦ、無水ジクロロメタンから選択される１種又は複数種であり、例えば無水アセトニトリルである。いくつかの実施形態において、式（３１３）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、例えば、５〜２０Ｌ／ｍｏｌであってもよい。当該カップリング反応を行うことにより、式（３１３）の化合物におけるヒドロキシ基とホスホルジアミダイトを反応させてホスホルアミダイト基を形成する。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３２１）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２４５】
いくつかの実施形態において、式（３２１）の化合物の調製方法は、カップリング反応条件下で、有機溶剤において、カップリング試薬の存在下で、単離して得られた生成物を、さらにヒドロキシ基含有固相担体と接触させる工程をさらに含む。その後、キャッピング反応、酸化反応を行い、単離して式（３２１）の化合物を得る。この場合、Ｒ４に第１の官能基及び第２の官能基が含まれ、第１の官能基がヒドロキシ保護基を含み、第２の官能基が式（Ｃ３’）に示される構造を有する式（３２１）の化合物が得られる。
【０２４６】
いくつかの実施形態において、前記固相担体は、本分野で公知の核酸固相合成に使用できる固相担体であり、例えば、脱保護反応された市販の汎用の固相担体（ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ３００  Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ  Ｓｕｐｐｏｒｔ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、構造が式Ｂ８０に示される）であってもよい。
【０２４７】
【化３１】
2021503941.tif 000040
【０２４８】
脱保護反応は、当業者に公知である。いくつかの実施形態において、脱保護条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、反応時間が３０〜３００秒、例えば５０〜１５０秒である。脱保護試薬は、トリフルオロ酢酸、トリクロロ酢酸、ジクロロ酢酸、クロロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸である。脱保護試薬と固定相における−ＤＭＴｒ（４，４’−ジメトキシトリチル）保護基とのモル比が２：１〜１００：１であり、例えば３：１〜５０：１である。前記脱保護を行うことにより、前記固相担体の表面に反応活性を有する遊離ヒドロキシ基が得られ、次のカップリング反応を行いやすくする。
【０２４９】
カップリング反応条件及びカップリング試薬の選択は、以上のとおりである。当該カップリング反応を行うことにより、脱保護反応で形成された遊離ヒドロキシ基とホスホルアミダイト基を反応させて亜リン酸エステル結合を形成する。
【０２５０】
いくつかの実施形態において、キャッピング反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば１５〜３５℃であり、反応時間が５〜５００秒であり、例えば１０〜１００秒であり、前記キャッピング反応をキャッピング試薬の存在下で行う。キャッピング試薬の選択と用量は、以上のとおりである。
【０２５１】
酸化反応条件としては、温度が０〜５０℃であり、例えば、１５〜３５℃であってもよく、反応時間が１〜１００秒、例えば、５〜５０秒であってもよく、酸化試薬は、例えば、ヨウ素であってもよい（いくつかの実施形態において、ヨウ素水として提供する）。いくつかの実施形態において、酸化試薬と亜リン酸エステル基とのモル比が１：１〜１００：１であり、例えば、５：１〜５０：１であってもよい。いくつかの実施形態において、前記酸化反応は、テトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１〜１：１：３の混合溶剤で行われる。
【０２５２】
いくつかの実施形態において、Ｒ６は、式Ｂ７又はＢ８の基の１つである。
【０２５３】
【化３２】
2021503941.tif 000041
式中、ｑ２の定義は、前述したとおりである。
【０２５４】
この場合、式（３１３）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応条件下及びアミド化反応縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、式（３１４）に示される化合物を式（Ａ−１）に示される化合物又は式（Ａ−２）の化合物と接触させ、その後単離する、という調製方法により得ることができる。
【０２５５】
【化３３】
2021503941.tif 000042
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１、ｑ２及びＲｋそれぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０２５６】
前記アミド化反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が１〜４８時間であってもよく、いくつかの実施形態において、前記アミド化反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が２〜１６時間である。
【０２５７】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アルコール類溶剤、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記アルコール類溶剤は、いくつかの実施形態において、メタノール、エタノール、プロパノールの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、エタノールである。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランである。前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルである。前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１４）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において３〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２５８】
いくつかの実施形態において、前記アミド化反応縮合剤は、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（４−（４，６−ｄｉｍｅｔｈｏｘｙｔｒｉａｚｉｎ−２−ｙｌ）−４−ｍｅｔｈｙｌｍｏｒｐｈｏｌｉｎｅ  ｈｙｄｒｏｃｈｌｏｒｉｄｅ）、２−エトキシ−１−エトキシカルボニル−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥＤＱ）又はＯ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェートであり、さらなる実施形態において、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オンである。前記アミド化反応縮合剤と式（３１４）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０２５９】
いくつかの実施形態において、前記第３級アミン類有機塩基は、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンである。前記第３級アミン類有機塩基と式（３１４）に示される化合物とのモル比が３：１〜２０：１であり、いくつかの実施形態において、５：１〜１０：１である。
【０２６０】
式（Ａ−１）及び式（Ａ−２）の化合物は、任意の適当な方法により調製されてもよい。例えば、ＲｋがＤＭＴｒ基である場合、グリセリン酸カルシウムとＤＭＴｒＣｌを反応させて式（Ａ−１）の化合物を調製することができる。同様に、３−アミノ−１，２−プロパンジオールと環状酸無水物を接触させた後、ＤＭＴｒＣｌと反応させて式（Ａ−２）の化合物を調製することができ、前記環状酸無水物は、炭素原子数４〜１３、いくつかの実施形態において４〜８の環状酸無水物であってもよい。当業者であれば容易に理解できるように、前記環状酸無水物の選択は、（Ａ−２）の化合物におけるｑ２の異なる値に対応しており、例えば、前記環状酸無水物がコハク酸無水物である場合、ｑ２＝１であり、前記環状酸無水物がグルタル酸無水物である場合、ｑ２＝２であり、類推してもよい。
【０２６１】
いくつかの変形において、式（３１４）に示される化合物を、前記環状酸無水物、３−アミノ−１，２−プロパンジオール及びＤＭＴｒＣｌと順に反応させることにより、式（３１３）の化合物を調製することもできる。当業者であれば容易に理解できるように、これらの変形は、式（３１３）の化合物の構造と機能に影響を与えることがなく、かつ、当業者が上記方法により容易に実現するものである。
【０２６２】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１３）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１３）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１３）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２６３】
いくつかの実施形態において、式（３１４）に示される化合物は、有機溶剤において、脱保護反応条件下で、式（３１５）に示される化合物をハロ酢酸と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０２６４】
【化３４】
2021503941.tif 000043
式中、Ｒ７は、式（３３０）、（３３１）、（３３２）又は（３３３）に示される基から選択され、いくつかの実施形態において、Ｒ７の構造が式（３３０）に示される。
【０２６５】
【化３５】
2021503941.tif 000044
【０２６６】
ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０２６７】
前記ハロ酢酸は、ジクロロ酢酸、トリクロロ酢酸、クロロ酢酸及びトリフルオロ酢酸から選択される１種又は複数種であってもよく、いくつかの実施形態において、ジクロロ酢酸である。
【０２６８】
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が０．１〜２４時間であり、いくつかの実施形態において、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が０．５〜１６時間である。
【０２６９】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１５）の化合物に対して、有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２７０】
前記ハロ酢酸と前記式（３１５）に示される化合物とのモル比が５：１〜１００：１であり、いくつかの実施形態において、１０：１〜５０：１である。
【０２７１】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１４）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１４）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１４）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２７２】
式（３１５）に示される化合物は、有機溶剤において、アミド化反応縮合剤と第３級アミン類有機塩基の存在下で、縮合反応条件下で、式（３１７）に示される化合物を式（３１６）に示される化合物と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０２７３】
【化３６】
2021503941.tif 000045
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５、Ｌ１、Ｓ１それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０２７４】
式（３１６）の化合物としては、例えば、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１４，１３６，１６９５８−１６９６１に開示された化合物を用いてもよく、或いは、式（３１６）の化合物は、当業者が各種の方法により調製することができ、例えば、米国特許ＵＳ８１０６０２２Ｂ２の実施例１に開示された方法を参照していくつかの式（３１６）の化合物を調製することができ、引用により上記文献の全ての内容が全体として本明細書に組み込まれる。
【０２７５】
いくつかの実施形態において、前記縮合反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が０．１〜２４時間であり、いくつかの実施形態において、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が０．５〜１６時間である。
【０２７６】
前記式（３１６）に示される化合物と前記式（３１７）に示される化合物とのモル比が２：１〜１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０２７７】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であり、前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３１７）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２７８】
前記アミド化反応縮合剤は、（ベンゾトリアゾール−１−イルオキシ）トリピロリジノホスホニウムヘキサフルオロホスフェート、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート又は４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩であり、いくつかの実施形態において、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩である。前記アミド化反応縮合剤と式（３１７）に示される化合物とのモル比が２：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、２．５：１〜５：１である。
【０２７９】
前記第３級アミン類有機塩基は、Ｎ−メチルモルホリン、トリエチルアミン又はＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンであり、いくつかの実施形態において、Ｎ−メチルモルホリンであり、前記第３級アミン類有機塩基と式（３１７）に示される化合物とのモル比が３：１〜２０：１であり、いくつかの実施形態において、５：１〜１０：１である。
【０２８０】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１５）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１５）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１５）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２８１】
いくつかの実施形態において、式（３１７）の化合物と十分な量の式（３１６）の化合物を一度反応させるだけで所望の式（３１５）の化合物を生成する。この場合、各Ｓ１−Ｌ１部分同士が同じである。いくつかの実施形態において、必要に応じて、式（３１７）の化合物を、異なる式（３１６）の化合物、即ち、Ｌ１及び／又はＳ１が異なる式（３１６）の化合物とバッチ反応させることにより、生成された式（３１５）の化合物に２種類以上のＳ１及び／又はＬ１を含ませることができる。例えば、１ｅｑの式（３１７）の化合物に対して、それを２ｅｑの第１の式（３１６）の化合物と接触させ、式（３１７）の化合物における２つの末端第一級アミン基に第１のＳ１−Ｌ１部分を結合した後、続いて（ｎ３＋ｎ１−１）ｅｑの第２の式（３１６）の化合物と接触させ、（ｎ３及びｎ１の定義と値の範囲は、前述したとおりである）、式（３１７）の化合物における（ｎ３＋ｎ１−１）個の第二級アミン基に第２のＳ１−Ｌ１部分を結合することができる。
【０２８２】
いくつかの実施形態において、式（３１７）に示される化合物は、有機溶剤の存在下で、脱保護反応条件下で、式（３１８）に示される化合物をメチルアミン水溶液と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０２８３】
【化３７】
2021503941.tif 000046
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ７、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０２８４】
前記脱保護反応条件としては、反応温度が０〜１５０℃であり、反応時間が５〜７２時間であり、いくつかの実施形態において、反応温度が２０〜８０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０２８５】
前記有機溶剤は、アルコールから選択され、いくつかの実施形態において、メタノール、エタノール及びイソプロパノールの１つであり、いくつかの実施形態において、メタノールであり、式（３１８）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１〜２０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、１．５〜１０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２８６】
前記メチルアミン水溶液の濃度が３０〜４０質量％であってもよく、メチルアミンと式（３１８）に示される化合物とのモル比が１０：１〜５００：１であってもよく、いくつかの実施形態において、５０：１〜２００：１である。
【０２８７】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１７）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１７）の化合物を単離することができ、例えば、順相精製シリカゲル：（１）２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１７）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２８８】
いくつかの実施形態において、式（３１８）に示される化合物は、有機溶剤の存在下で、置換反応条件下で、式（３１９）に示される化合物を、トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタン、いくつかの実施形態においてトリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）と接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０２８９】
【化３８】
2021503941.tif 000047
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０２９０】
前記置換反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が５〜７２時間であってもよく、いくつかの実施形態において、反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０２９１】
トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンは、市販品を購入することができ、トリフェニルクロロメタン（ＴｒＣｌ）、ジフェニルエチルフェニルクロロメタン、フェニルジエチルフェニルクロロメタン又はトリエチルフェニルクロロメタンと式（３１９）に示される化合物とのモル比が１：１〜１０：１であってもよく、いくつかの実施形態において、１：１〜３：１である。
【０２９２】
前記有機溶剤は、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種であってもよい。前記エポキシ類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、前記エーテル類溶剤は、いくつかの実施形態において、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、いくつかの実施形態において、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、ジクロロメタンである。式（３１９）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が３〜５０Ｌ／ｍｏｌであってもよく、いくつかの実施形態において、５〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２９３】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１８）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１８）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメタン＝０．０１：１〜０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石油エーテル＝０．１：１：１：１〜１：１：１：１で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１８）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０２９４】
いくつかの実施形態において、式（３１９）に示される化合物は、有機溶剤において、置換反応条件下で、式（３２０）に示される化合物をトリフルオロ酢酸エチルと接触させた後、単離することを含む調製方法により得ることができる。
【０２９５】
【化３９】
2021503941.tif 000048
式中、ｎ１、ｎ３、ｍ１、ｍ２、ｍ３、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５それぞれの定義と選択可能な範囲は、前述したとおりである。
【０２９６】
いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリル、エポキシ類溶剤、エーテル類溶剤、ハロゲン化アルキル類溶剤、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド及びＮ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミンの１種又は複数種である。いくつかの実施形態において、前記エポキシ類溶剤は、ジオキサン及び／又はテトラヒドロフランであり、いくつかの実施形態において、前記エーテル類溶剤は、エチルエーテル及び／又はメチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルであり、いくつかの実施形態において、前記ハロゲン化アルキル類溶剤は、ジクロロメタン、トリクロロメタン及び１，２−ジクロロエタンの１種又は複数種であり、いくつかの実施形態において、前記有機溶剤は、アセトニトリルである。式（３２０）の化合物に対して、前記有機溶剤の用量が１〜５０Ｌ／ｍｏｌであり、いくつかの実施形態において、１〜２０Ｌ／ｍｏｌである。
【０２９７】
前記置換反応条件としては、反応温度が０〜１００℃であり、反応時間が５〜７２時間であってもよく、いくつかの実施形態において、前記置換反応条件としては、反応温度が１０〜４０℃であり、反応時間が１０〜３０時間である。
【０２９８】
式（３２０）の化合物は、市販品を購入して、又は、当業者により既知の方法を用いて得ることができる。例えば、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３＝３、ｎ１＝１、ｎ３＝２であり、Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４、Ｒ１５がいずれもＨである場合、式（３２０）の化合物は、アルファ・エイサー社から市販品として購入することができる。
【０２９９】
前記トリフルオロ酢酸エチルと式（３２０）に示される化合物とのモル比が２：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１〜５：１である。
【０３００】
上記と同様に、任意の適切な単離方法により反応混合物から式（３１９）の化合物を単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を蒸発除去した後、クロマトグラフィー方法により式（３１９）の化合物を単離することができ、例えば、（１）順相精製シリカゲル：２００〜３００メッシュのシリカゲル充填剤を、メタノール：ジクロロメタン＝０．０１：１〜０．５：１で、又はメタノール：ジクロロメタン：酢酸エチル：石油エーテル＝０．１：１：１：１〜１：１：１：１で勾配溶出する、（２）逆相精製：Ｃ１８、Ｃ８逆相充填剤を、メタノール：アセトニトリル＝０．１：１〜１：０．１で勾配溶出するという２つのクロマトグラフィー条件で単離することができる。いくつかの実施形態において、溶剤を直接に除去して式（３１９）の化合物の粗製品を得ることができ、当該粗製品は、そのまま後の反応に用いることができる。
【０３０１】
本開示の第１種又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、薬学的に許容できる他の添加剤と併用してもよく、当該添加剤は、本分野で通常採用される各種の製剤又は化合物の１種又は複数種であってもよく、詳細は、上述した本開示の薬物組成物に関する記載を参照のこと。
【０３０２】
＜本開示のｓｉＲＮＡ、当該ｓｉＲＮＡを含む薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体の使用＞
いくつかの実施形態において、本開示は、ｓｉＲＮＡ、当該ｓｉＲＮＡを含む薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体の、前記Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のための薬物の調製への使用を提供する。
【０３０３】
本開示の１つの実施形態によれば、本開示は、被験体に本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体を投与することを含む、Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療方法を提供する。
【０３０４】
本開示の別の実施形態によれば、本開示は、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体を、慢性Ｂ型肝炎ウイルスに感染した肝炎細胞と接触させることを含む、前記慢性Ｂ型肝炎ウイルスに感染した肝炎細胞におけるＢ型肝炎ウイルス遺伝子の発現の抑制方法を提供する。
【０３０５】
前記Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患は、慢性肝疾患、肝炎、肝線維性疾患及び肝過形成性疾患から選択される。
【０３０６】
本開示のｓｉＲＮＡ及び／又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体を、それを必要とする被験体に投与することにより、ＲＮＡ干渉機構によりＢ型肝炎を治療する目的を達成することができる。したがって、本開示のｓｉＲＮＡ及び／又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体は、Ｂ型肝炎の予防及び／又は治療に用いられ、又はＢ型肝炎の予防及び／又は治療のための薬物の調製に用いることができる。
【０３０７】
本明細書で用いられる用語「薬剤投与／投与」とは、ｓｉＲＮＡ又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化することにより所望の効果を生じさせる方法又は経路により、ｓｉＲＮＡ又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体を被験体の体内に入れることを指す。本開示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与を含む。一般的には、局所投与により、被験体の全身よりも多くのｓｉＲＮＡ又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体が特定の部位に送達されるが、全身投与により、前記ｓｉＲＮＡ又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体が被験体のほぼ全身に送達される。本開示がＢ型肝炎の予防及び／又は治療手段を提供することを意図することを考慮すると、薬物を肝臓に送達することができる投与方法が好ましい。
【０３０８】
本分野で既知の任意の適切な経路で被験体に投与することができ、前記経路としては、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、経皮投与、気管内投与（エアロゾル）、肺部投与、鼻部投与、直腸投与及び局所投与（口腔内投与と舌下投与を含む）を含む経口投与又は胃腸外の経路を含むが、これらのみに限定されない。投与頻度は、１日、１週間、２週間、３週間、１ヶ月又は１年に１回若しくは複数回であってもよい。
【０３０９】
本開示に記載されたｓｉＲＮＡ又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体の用量は、本分野における通常の用量であってもよく、前記用量は、各種のパラメーター、特に被験体の年齢、体重及び性別により決定されてもよい。細胞培養又は実験動物で標準薬学的手順により毒性と治療効果を測定し、例えば、ＬＤ５０（５０％の群体を死亡させる用量）及びＥＤ５０（定量的反応において、５０％の最大反応強度を引き起こすことができる用量を指し、定性的反応において、５０％の実験対象に陽性反応が発生する場合の用量を指す）を測定してもよい。毒性と治療効果との間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０の比で表されてもよい。高い治療指数を示すｓｉＲＮＡ又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体が好ましい。細胞培養分析及び動物研究により得られたデータに基づいてヒト用量の範囲を得ることができる。
【０３１０】
本開示に記載された薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体を投与する場合、例えば、雄性又は雌性、６〜１２週齢、体重１８〜２５ｇのＣ５７ＢＬ／６Ｊ又はＣ３Ｈ／ＨｅＮＣｒｌＶｒマウスに対して、前記薬物組成物又はｓｉＲＮＡ複合体におけるｓｉＲＮＡの量として、（ｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体により形成された薬物組成物について、そのｓｉＲＮＡ用量が０．００１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、さらなる実施形態において、０．０１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重であり、よりさらなる実施形態において、０．０５〜５ｍｇ／ｋｇ体重であり、またさらなる実施形態において、０．１〜３ｍｇ／ｋｇ体重であり、（ｉｉ）ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容できる複合分子により形成された第１種及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体について、そのｓｉＲＮＡ用量が０．００１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重であってもよく、さらなる実施形態において、０．０１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重であり、よりさらなる実施形態において、０．０５〜２０ｍｇ／ｋｇ体重であり、またさらなる実施形態において、０．１〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。本開示に記載されたｓｉＲＮＡを投与する場合、好ましくは上記用量である。
【０３１１】
また、本開示のｓｉＲＮＡ及び／又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体を、慢性ＨＢＶに感染した肝炎細胞に導入することにより、さらにはＲＮＡ干渉機構により、慢性ＨＢＶに感染した肝炎細胞におけるＨＢＶ遺伝子の発現を抑制する目的を達成することもできる。いくつかの好ましい実施形態において、前記細胞はＨｅｐＧ２．２．１５細胞である。
【０３１２】
本開示により提供される方法により細胞におけるＨＢＶ遺伝子の発現を抑制する。提供されるｓｉＲＮＡを用いても、薬物組成物を用いても、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体を用いても、ｓｉＲＮＡ用量は、一般的に、標的遺伝子の発現を低減でき、標的細胞表面では１ｐＭ〜１μＭ、０．０１ｎＭ〜１００ｎＭ、０．０５ｎＭ〜５０ｎＭ、又は０．０５ｎＭ〜約５ｎＭの細胞外濃度となる量である。当該局所濃度を達成するのに必要な量は、送達方法、送達部位、送達部位と標的細胞又は組織との間の細胞層の数、送達するのが局所か全身か等を含む、各種の因子により変化する。送達部位における濃度は、標的細胞又は組織の表面における濃度よりも顕著に高くてもよい。
【０３１３】
＜キット＞
本開示は、本開示のｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体の少なくとも１種の有効量を含むキットを提供する。
【０３１４】
いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、容器で修飾ｓｉＲＮＡを提供することができる。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、薬学的に許容できる賦形剤を提供する容器を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットには、他の成分、例えば、安定化剤又は防腐剤等が含まれてもよい。いくつかの実施形態において、本明細書に記載されたキットは、本明細書に記載された修飾ｓｉＲＮＡを提供する容器とは別の容器で少なくとも１種の他の治療剤を含んでもよい。いくつかの実施形態において、前記キットは、修飾ｓｉＲＮＡと薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤又は他の成分（存在する場合）を混合するための説明書を含んでもよい。
【０３１５】
本開示のキットにおいて、前記修飾ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記修飾ｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は複合体、及び／又は薬学的に許容できる添加剤は、任意の形式、例えば、液体形式、乾燥形式又は凍結乾燥形式として提供されてもよい。いくつかの実施形態において、前記修飾ｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体及び／又は添加剤、並びに、前記薬物組成物、及び／又は複合体及び薬学的に許容できる任意の添加剤は、基本的にクリーン及び／又は無菌である。いくつかの実施形態において、本開示のキットで無菌水を提供することができる。
【０３１６】
以下に実施例により本開示をさらに説明するが、本開示は、これによって何ら制限されない。
【０３１７】
（発明の効果）
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内でより高い安定性、より低い毒性及び／又はより高い活性を有することができる。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の肝内ＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％の動物モデルにおける肝内ＨＢＶ遺伝子発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、体内で少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％のＨＢＶ表面抗原発現抑制率を示す。いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ、組成物又はｓｉＲＮＡ複合体は、明らかなオフターゲット効果を示していない。オフターゲット効果は、例えば、標的遺伝子でない遺伝子の正常発現の抑制であってもよい。オフターゲット遺伝子発現の結合／抑制がオンターゲット遺伝子効果に比べて５０％、４０％、３０％、２０％又は１０％を下回る場合、当該オフターゲット効果が顕著ではないと考えられている。
【０３１８】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、良好な体外抑制活性を有する。
【０３１９】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、優れた標的ｍＲＮＡ抑制効果を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を示す。
【０３２０】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、トリトソームにおいて長時間分解されずに維持し、非常に良好な安定性を示すことができる。
【０３２１】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、ヒト血漿において７２ｈ分解されず、優れたヒト血漿における安定性を示す。
【０３２２】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、カニクイザル血漿において７２ｈ分解されず、優れたサル血漿における安定性を示す。
【０３２３】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、標的ｍＲＮＡに対して良好な抑制効果を示し、１ｍｇ／ｋｇで、抑制効率が８１．７３％〜８９．２２％であり、異なるＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制効果が基本的に一致している。
【０３２４】
いくつかの実施形態において、本開示により提供されるｓｉＲＮＡ複合体は、８５日間にわたってＨＢｓＡｇ及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する効率的な抑制を示し続ける。
【０３２５】
本開示の他の特徴と利点については、後述する発明を実施するための形態部分において詳しく説明する。
【実施例】
【０３２６】
以下に実施例により本開示を詳しく説明する。特に説明がない限り、以下の実施例で用いられる試薬、培地は、いずれも市販品であり、用いられる核酸電気泳動、ｒｅａｌ−ｔｉｍｅ  ＰＣＲ等の操作は、いずれもＭｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ（１９８９））の記載を参照して行われる。
【０３２７】
別に説明がない限り、以下で提供される試薬の割合は、いずれも体積比（ｖ／ｖ）として計算される。
【０３２８】
用いられる動物モデルは以下のとおりである。
ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６−ＨＢＶ：品種名：Ｂ６−Ｔｇ  ＨＢＶ／Ｖｓｔ（１．２８ｃｏｐｙ、ｇｅｎｏｔｙｐｅ  Ａ）、北京維通達生物技術有限公司から購入する。実験前にＣＯＩ＞１０４のマウスを選択した（以下、単に１．２８ｃｏｐｙマウスということもある）。
ＡＡＶ−ＨＢＶ低濃度トランスジェニックマウス：文献の方法（董小岩ら、Ｃｈｉｎ  Ｊ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ２０１０，Ｍａｙ  ２５，２６（５）：６７９−６８６）によりＡＡＶ−ＨＢＶモデルを作製した。ｒＡＡＶ８−１．３ＨＢＶ、Ｄ型（ａｙｗ）ウイルス（北京五加和分子医学研究所有限公司から購入、１×１０１２ウイルスゲノム（ｖ．ｇ．）／ｍＬ、ロット番号２０１６１２３０１１）を無菌ＰＢＳで１×１０１１ｖ．ｇ．／ｍＬに希釈し、１匹のマウスあたり１００μＬの希釈後のｒＡＡＶ８−１．３ＨＢＶを注射した（即ち、１匹のマウスあたり１×１０１０ｖ．ｇ．を注射した）。以下、ＡＡＶ−ＨＢＶ低濃度モデルマウスということもあり、又は単にＡＡＶ−ＨＢＶという。
【０３２９】
（調製例１）複合体１〜２、１５〜１６の調製
本調製例では、複合体１（以下、Ｌ１０−ｓｉＨＢ１Ｍ１ＳＶＰ複合体ともいう）及び複合体２（以下、Ｌ１０−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体ともいう）を合成したが、複合体１５（以下、Ｌ１０−ｓｉＨＢ１Ｍ１ＳＰともいう）及び複合体１６（以下、Ｌ１０−ｓｉＨＢ１Ｍ１ＳＰｓともいう）を合成することを意図した。前記複合体は、Ｌ−９複合分子がそれぞれ番号ｓｉＨＢ１Ｍ１ＳＶＰ、ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ、ｓｉＨＢ１Ｍ１ＳＰ又はｓｉＨＢ１Ｍ１ＳＰｓのｓｉＲＮＡと複合した後に形成された複合体である。当該複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列は、表１に示される。
【０３３０】
（１−１）Ｌ−１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｌ−１０化合物を合成した。
【０３３１】
【化４０】
2021503941.tif 000049
【０３３２】
（１−１−１）複合末端セグメントＧＡＬ−５の合成
【０３３３】
【化４１】
2021503941.tif 000050
（１−１−１ａ）ＧＡＬ−２の合成
１００．０ｇのＧＡＬ−１（Ｎ−アセチル−Ｄ−ガラクトサミン塩酸塩、ＣＡＳ番号：１７７２−０３−８、寧波弘翔生化公司から購入、４６３．８ｍｍｏｌ）を１０００ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、氷水浴下で５４０ｍｌの酢酸無水物（Ｅｎｏｘ社から購入、５５６５．６ｍｍｏｌ）を加え、室温で１．５時間攪拌反応した。反応液を１０Ｌの氷水に注入し、減圧吸引濾過し、ケーキを２Ｌの氷水で洗浄した後、完全に溶解するまでアセトニトリル／トルエン混合溶剤（アセトニトリル：トルエンの体積比＝１：１）を加え、溶剤を蒸発乾固し、１３０．０ｇの白色固形製品ＧＡＬ−２を得た。
【０３３４】
（１−１−１ｂ）ＧＡＬ−３の合成
工程（１−１−１ａ）で得られたＧＡＬ−２（３５．１ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を２１３ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、氷水浴下で、窒素保護条件で、２４．０ｇのＴＭＳＯＴｆ（ＣＡＳ番号：２７６０７−７７−８、マックリン社から購入、１０８．０ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。
【０３３５】
反応液に４００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、１Ｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、均一に攪拌し、有機相を分離し、水相をジクロロエタンにより１回あたり３００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、２６．９ｇの淡黄色の粘稠な水飴状製品ＧＡＬ−３を得た。
【０３３６】
（１−１−１ｃ）ＧＡＬ−４の合成
工程（１−１−１ｂ）で得られたＧＡＬ−３（２６．９ｇ、８１．７ｍｍｏｌ）を１３６ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、乾燥した４Å分子篩粉３０ｇを加え、９．０ｇの５−ヘキセン−１−オール（ＣＡＳ番号：８２１−４１−０、Ａｄａｍａｓ−ｂｅｔａ社から購入、８９．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌し、氷浴下で窒素保護下で９．０８ｇのＴＭＳＯＴｆ（４０．９ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に３００ｍｌのジクロロメタンを加えて希釈し、珪藻土で濾過し、５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて１０分間攪拌し洗浄し、有機相を分離し、水相を３００ｍｌのジクロロエタンで１回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液及び３００ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、４１．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ−４を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
【０３３７】
（１−１−１ｄ）ＧＡＬ−５の合成
工程（１−１−１ｃ）に記載された方法により得られたＧＡＬ−４（１４．９ｇ、３４．７ｍｍｏｌ）を７７ｍｌのジクロロメタンと７７ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ１０３ｍｌの脱イオン水及び２９．７ｇの過ヨウ素酸ナトリウム（ＣＡＳ番号：７７９０−２８−５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１３８．８ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（ＣＡＳ番号：１４８９８−６７−０、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２３８ｍｇ、１．１４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で一晩反応させた。反応液に３００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを約７．５に調整し、有機相を分離して捨て、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相を捨てた。水相を固形クエン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．８５ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ−５を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  １２．０１  （ｂｒ，１Ｈ），７．８３  （ｄ，Ｊ  ＝  ９．２  Ｈｚ，１Ｈ），５．２１  （ｄ，Ｊ  ＝  ３．２  Ｈｚ，１Ｈ），４．９６  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １１．２，３．２  Ｈｚ，１Ｈ），４．４９  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，１Ｈ），４．０７  −  ３．９５  （ｍ，３Ｈ），３．９２  −  ３．８５  （ｍ，１Ｈ），３．７４  −  ３．６７  （ｍ，１Ｈ），３．４８  −  ３．３９  （ｍ，１Ｈ），２．２０  （ｔ，Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，２Ｈ），２．１１  （ｓ，３Ｈ），２．００  （ｓ，３Ｈ），１．９０  （ｓ，３Ｈ），１．７７  （ｓ，３Ｈ），１．５５  −  １．４５  （ｍ，４Ｈ）．
【０３３８】
（１−１−２）Ｍ−１１−Ｔ３の合成：
【０３３９】
【化４２】
2021503941.tif 000051
Ｊ−０（１．８８３ｇ、１０ｍｍｏｌ、アルファ・エイサー社から購入）を２５ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、トリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加えて氷水浴で０℃まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２ｈ反応させ、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで１８ｈ発泡乾燥させ、５．３４２ｇの固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３を得、さらに精製することなく、そのまま後の反応に用いた。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２２Ｆ９Ｎ４Ｏ３，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４７７．３５、実測値：４７７．６５。
【０３４０】
（１−１−３）Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒの合成：
【０３４１】
【化４３】
2021503941.tif 000052
Ｍ−１１−Ｔ３粗製品（５．３４２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５１８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させ、飽和炭酸水素ナトリウムで反応液を１回あたり２０ｍｌで２回洗浄し、２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、７．７６３ｇの固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒを得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ３４Ｈ３６Ｆ９Ｎ４Ｏ３，［Ｍ＋Ｎａ］＋、理論値：７４１．２５、実測値：７４１．５３。固形粗製品Ｍ−１１−Ｔ３−Ｔｒは、精製することなく、引き続き次のＭ−１８−Ｔｒの合成に使用した。
【０３４２】
（１−１−４）Ｍ−１８−Ｔｒの合成：
【０３４３】
【化４４】
2021503941.tif 000053
工程（１−１−３）で得られたＭ−１１−Ｔ３−Ｔｒ粗製品（７．７６３ｇ、１０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０質量％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応させ、不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００ｍｌの体積比１：１のジクロロメタン：メタノール混合溶剤を加え、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで洗浄し、水相をジクロロメタン（ＤＣＭ）で１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて２．８８７ｇの純粋なＭ−１８−Ｔｒを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．４７  −  ７．３９  （ｍ，６Ｈ），７．３２  −７．２４  （ｍ，６Ｈ），７．１９  −  ７．１２  （ｍ，３Ｈ），２．６０  −  ２．４７  （ｍ，４Ｈ），２．４６  −  ２．１９  （ｍ，１３Ｈ），１．７０  −  １．５５  （ｍ，４Ｈ），１．４０  （ｐ，Ｊ  ＝  ６．８  Ｈｚ，２Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２８Ｈ３９Ｎ４，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４３１．６５、実測値：４３２．６１。
【０３４４】
（１−１−５）Ｌ−５−Ｔｒの合成：
【０３４５】
【化４５】
2021503941.tif 000054
工程（１−１−４）で得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）と工程（１−１−１）で得られたＧＡＬ−５（６．９３ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）とを混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、Ｎ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）及び４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。２００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して７．４９ｇの純粋なＬ−５−Ｔｒを得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．８３  −  ７．１０  （ｍ，４Ｈ），７．６７  −  ７．６０  （ｍ，１Ｈ），７．４４  −  ７．３４  （ｍ，６Ｈ），７．３３  −  ７．２４  （ｍ，６Ｈ），７．２０  −  ７．１５  （ｍ，３Ｈ），５．２２  （ｓ，３Ｈ），４．９７  （ｄ，Ｊ  ＝  １１．３  Ｈｚ，３Ｈ），４．４９  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，３Ｈ），４．０６  −  ３．０７  （ｍ，９Ｈ），３．９５  −  ３．８３  （ｍ，３Ｈ），３．７７  −  ３．６４  （ｍ，３Ｈ），３．４５  −  ３．３５  （ｍ，３Ｈ），３．１２  −  ２．８７  （ｍ，８Ｈ），２．３０  −  ２．１５  （ｍ，３Ｈ），２．１１  −  １．９８  （ｍ，２２Ｈ），１．９５  −  １．８４  （ｍ，１１Ｈ），１．８１  −  １．６１  （ｍ，１４Ｈ），１．５４  −  １．３６  （ｍ，１４Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７１８．８１、実測値：１７１８．０３。
【０３４６】
（１−１−６）Ｌ−８の合成：
【０３４７】
【化４６】
2021503941.tif 000055
工程（１−１−５）で得られたＬ−５−Ｔｒ（５．９４ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させ、１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８になるように調節し、水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。精製には、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．２６ｇの純粋なＬ−８を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  ７．８４  （ｄ，Ｊ  ＝  ９．０  Ｈｚ，３Ｈ），７．２７  −  ７．２３  （ｍ，１Ｈ），７．１３  −  ７．１８  （ｍ，１Ｈ），５．２２  （ｄ，Ｊ  ＝  ３．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．９７  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １１．３，３．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．４８  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．４  Ｈｚ，３Ｈ），４．０９  −  ３．９８  （ｍ，９Ｈ），３．８８  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １９．３，９．３  Ｈｚ，３Ｈ），３．７５  −  ３．６６  （ｍ，３Ｈ），３．４４  −  ３．３８  （ｍ，３Ｈ），３．１７  −  ３．３０  （ｍ，４Ｈ），３．１０  −  ２．９７  （ｍ，４Ｈ），２．３５  −  ２．２０  （ｍ，６Ｈ），２．１５  −  ２．０８  （ｍ，９Ｈ），２．０７  −  １．９８  （ｍ，１３Ｈ），１．９４  −  １．８７  （ｍ，９Ｈ），１．８１  −  １．７４  （ｍ，９Ｈ），１．６５  −  １．４２  （ｍ，１８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ８５Ｈ１１９Ｎ７Ｏ３０，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１４７７．５９、実測値：１４７７．２３。
【０３４８】
（１−１−７ａ）Ａ−１の合成
【０３４９】
【化４７】
2021503941.tif 000056
ＤＭＴｒＣｌ（４，４’−ビスメトキシトリチルクロリド、３８．１２ｇ、１１２．５ｍｍｏｌ）を４５０ｍｌの無水ピリジンに溶解させ、ＤＬ−グリセリン酸カルシウム水和物（１２．８８ｇ、４５．０ｍｍｏｌ）を加え、４５℃で２２ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキを２００ｍｌのＤＣＭでリンスし、濾液を完全に乾燥するまで減圧濃縮し、残りを５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩（ｐＨ＝７〜８）で１回あたり２００ｍｌで２回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．３５〜１：１：１：０．５５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、５００ｍｌのジクロロメタンに改めて溶解させ、２００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で１回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩減圧し、２０．７ｇの白色固形製品Ａ−１を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．４６  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝  ６．５，２．３，１．１  Ｈｚ，１Ｈ），７．４０  −  ７．２８  （ｍ，７Ｈ），６．８９  −  ６．８１  （ｍ，４Ｈ），４．８４  （ｄ，Ｊ  ＝  ５．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．３６  −  ４．２４  （ｍ，１Ｈ），４．２９  （ｓ，６Ｈ），３．９２  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １２．４，７．０  Ｈｚ，１Ｈ），３．６７  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １２．３，７．０  Ｈｚ，１Ｈ），２．５２  （ｑ，Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ，６Ｈ），１．０３  （ｔ，Ｊ  ＝  ６．３  Ｈｚ，９Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ２３Ｏ６，［Ｍ−Ｈ］−、理論値：４０７．１５、実測値：４０６．９２。
【０３５０】
（１−１−７ｂ）Ｌ−７の合成：
【０３５１】
【化４８】
2021503941.tif 000057
工程（１−１−６）で得られたＬ−８（２．２６２ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）と工程（１−１−７ａ）で得られたＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）とを混合し、１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させ、１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後に溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、４．９００ｇの粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．３３６ｇの純粋なＬ−７を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ７．９０  −  ７．７８  （ｍ，４Ｈ），７．７５  −  ７．６４  （ｍ，１Ｈ），７．３８  −  ７．１８  （ｍ，９Ｈ），６．９１  −  ６．８３  （ｍ，４Ｈ），５．２５  −  ５．１０  （ｍ，４Ｈ），４．９７  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １１．２，３．２  Ｈｚ，３Ｈ），４．４８  −  ４．３０  （ｍ，４Ｈ），４．０２  （ｓ，９Ｈ），３．９３  −  ３．８４  （ｍ，３Ｈ），３．７６  −  ３．６６  （ｍ，９Ｈ），３．４５  −  ３．３５  （ｍ，３Ｈ），３．２４  −  ２．９８  （ｍ，１０Ｈ），２．３０  −  ２．２０  （ｍ，２Ｈ），２．１１  −  １．８８  （ｍ，３１Ｈ），１．８０  −  １．４０  （ｍ，２８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９０Ｈ１２８Ｎ７Ｏ３５，［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１５６４．６５、実測値：１５６４．８８。
【０３５２】
（１−１−８）Ｌ−９複合分子の合成：
【０３５３】
【化４９】
2021503941.tif 000058
工程（１−１−７ｂ）で得られたＬ−７（２．３００ｇ、１．２６ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．３７８ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．４６２ｇ、３．７８ｍｍｏｌ）を混合して１３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．８１４ｇ、６．３０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌し、５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して２．７７４ｇの粗製品を得た。カラム精製には、６０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．８７４ｇの純粋なＬ−９複合分子を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ）  δ  ８．５８  （ｄ，Ｊ  ＝  ４．２  Ｈｚ，１Ｈ），７．９４  −  ７．８２  （ｍ，３Ｈ），７．４１  −  ７．２９  （ｍ，５Ｈ），７．２２  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．１  Ｈｚ，５Ｈ），６．８９  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．３  Ｈｚ，４Ｈ），５．４９  −  ５．３７  （ｍ，１Ｈ），５．２１  （ｄ，Ｊ  ＝  ３．０  Ｈｚ，３Ｈ），４．９７  （ｄ，Ｊ  ＝  １１．１  Ｈｚ，３Ｈ），４．４９  （ｄ，Ｊ  ＝  ８．２  Ｈｚ，３Ｈ），４．０２  （ｓ，９Ｈ），３．８８  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １９．４、９．４  Ｈｚ，３Ｈ），３．７７  −  ３．６５  （ｍ，９Ｈ），３．５０  −  ３．３９  （ｍ，６Ｈ），３．１１  −  ２．９０  （ｍ，５Ｈ），２．６１  −  ２．５４  （ｍ，４Ｈ），２．４７  −  ２．４１  （ｍ，２Ｈ），２．２６  −  ２．１７  （ｍ，２Ｈ），２．１５  −  １．９５  （ｍ，２２Ｈ），１．９２  −  １．８４  （ｍ，９Ｈ），１．８０  −  １．７０  （ｍ，１０Ｈ），１．６５  −  １．３５  （ｍ，１７Ｈ）、１．３１  −  １．１９  （ｍ，４Ｈ），０．９６  （ｔ，Ｊ  ＝  ７．１  Ｈｚ，９Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９４Ｈ１３２Ｎ７Ｏ３８，［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１６６４．７２、実測値：１６６５．０３。
【０３５４】
（１−１−９）Ｌ−１０化合物の合成：
【０３５５】
【化５０】
2021503941.tif 000059
この工程において、Ｌ−９複合分子を固相担体に結合することにより、Ｌ−１０化合物を調製した。
【０３５６】
工程（１−１−８）で得られたＬ−９複合分子（０．２３３ｇ、０．１１２６ｍｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ、０．０６４ｇ、０．１６８９ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ、０．０２９ｇ、０．２２５２ｍｍｏｌ）を混合し、１９ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、室温で５分間攪拌し、反応液にアミノメチル樹脂（０．９０１ｇ、１００〜２００メッシュ、アミノ基担持量４００μｍｏｌ／ｇ、南開和成社から購入）を加え、２５℃でシェーカーで反応を行い、回転数２２０回転／分間、１５ｈ反応させた後に濾過し、ケーキをＤＣＭで１回あたり３０ｍｌで２回リンスし、アセトニトリルで１回あたり３０ｍｌで３回リンスし、３０ｍｌのエチルエーテルで１回リンスし、真空油ポンプで２ｈ乾燥させ、その後、表２に示す配合割合に従い原料（ＣａｐＡ、ＣａｐＢ、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）及びアセトニトリル）を加えてキャッピング反応を行った。２５℃でシェーカーに放置し、回転数２００回転／分間で５ｈ反応させ、反応液を濾過し、ケーキをアセトニトリルで１回あたり３０ｍｌで３回リンスし、完全に乾燥するまで吸引濾過し、真空油ポンプで一晩減圧乾燥させさせ、１．１００ｇ、担持量９０．８μｍｏｌ／ｇのＬ−１０化合物（即ち、固相担体に結合されたＬ−９複合分子）を得た。
【０３５７】
【表２】
2021503941.tif 000060
ここで、ＣａｐＡとＣａｐＢは、キャッピング試薬溶液であり、ＣａｐＡは、２０体積％のＮ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液であり、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が３：５であり、ＣａｐＢは、２０体積％酢酸無水物のアセトニトリル溶液であった。
【０３５８】
（１−２）複合体１〜２、１５〜１６のセンス鎖の合成
複合体１〜２、１５〜１６のセンス鎖配列が同じであるので、その調製方法も同じであった。
【０３５９】
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたＬ−１０化合物を出発として循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’−５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、保護、カップリング、キャッピング、硫化の４つの反応を行った。合成条件は、以下のように規定された。
【０３６０】
ヌクレオシドモノマーを０．１Ｍ濃度のアセトニトリル溶液で提供し、各脱保護反応の条件が同じであり、即ち、温度が２５℃であり、反応時間が７０秒であり、脱保護試薬は、ジクロロ酢酸のジクロロメタン溶液（３％ｖ／ｖ）であり、ジクロロ酢酸と固相担体における４，４’−ジメトキシトリチル保護基とのモル比が５：１であった。
【０３６１】
各カップリング反応条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、固相担体に結合される核酸配列とヌクレオシドモノマーとのモル比が１：１０であり、固相担体に結合される核酸配列とカップリング試薬とのモル比が１：６５であり、反応時間が６００秒であり、カップリング試薬は、５−エチルチオ−１Ｈ−テトラゾールの０．５Ｍアセトニトリル溶液であった。
【０３６２】
各キャッピング条件は、いずれも同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であった。キャッピング試薬溶液は、モル比が１：１であるＣａｐＡとＣａｐＢの混合溶液であり、キャッピング試薬と固相担体に結合される核酸配列とのモル比が、酢酸無水物：Ｎ−メチルイミダゾール：固相担体に結合される核酸配列＝１：１：１であった。
【０３６３】
各酸化反応条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が１５秒であり、酸化試薬が濃度０．０５Ｍのヨウ素水であった。ヨウ素と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が３０：１であった。反応をテトラヒドロフラン：水：ピリジン＝３：１：１の混合溶剤で行った。
【０３６４】
各硫化反応の条件は同じであり、温度が２５℃であり、反応時間が３００秒であり、硫化試薬がキサンタンヒドリドであった。硫化試薬と、カップリング工程において固相担体に結合される核酸配列とのモル比が１２０：１であった。反応をアセトニトリル：ピリジン＝１：１の混合溶剤で行った。
【０３６５】
切断と脱保護条件は以下のとおりである。合成された担体が結合されたヌクレオチド配列を、濃度２５ｗｔ％のアンモニア水に加え、アンモニア水の用量が０．５ｍｌ／μｍｏｌであり、５５℃で１６ｈ反応させ、液体を除去し、完全に乾燥するまで真空濃縮した。
【０３６６】
精製と脱塩：分取用イオンクロマトグラフィー精製カラム（Ｓｏｕｒｃｅ  １５Ｑ）により、ＮａＣｌによる勾配溶出で、核酸の精製を完成した。具体的には、溶出剤Ａ：２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出剤Ｂ：１．５Ｍ塩化ナトリウム、２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ  ８．１）、溶剤が水／アセトニトリル＝９：１（体積比）であり、溶出勾配：溶出剤Ａ：溶出剤Ｂ＝１００：０〜５０：５０で勾配溶出した。製品溶出液を回収してからあわせ、逆相クロマトグラフィー精製カラムにより脱塩し、具体的な条件としては、デキストランゲルカラムにより脱塩し、充填剤がデキストランゲルＧ２５であり、脱イオン水で溶出した。
【０３６７】
検出：イオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）を用いて純度を検出し、液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分子量を分析した。
【０３６８】
複合体１のセンス鎖の分子量について、理論値７４０７．２２、実測値７４０６．４であった。複合体２のセンス鎖の分子量について、理論値７４０７．２２、実測値７４０６．５であった。実測値が理論値に一致しており、３’末端にＬ−９複合分子が複合されたセンス鎖Ｓが合成されたことを示した。
【０３６９】
（１−３）複合体１〜２のアンチセンス鎖の合成
（１−３Ａ）複合体１〜２のアンチセンス鎖の調製
固相ホスホルアミダイト法により、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ｌｏａｄｅｄ  ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ、Ｋｉｎｏｖａｔｅ  Ｌｉｆｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を出発として循環させ、複合体１及び複合体２のアンチセンス鎖ＡＳを合成した。固相合成方法における脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合成と同じであった。
【０３７０】
検出：純度をイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ−ＨＰＬＣ）により検出し、分子量を液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）により分析した。複合体１について、理論値７２０８．７７、実測値７２０８．１であった。複合体２について、理論値７１７０．７２、実測値７１７０．１であった。実測値が理論値に一致しており、目的配列を有するアンチセンス鎖ＡＳが合成されたことを示した。
【０３７１】
ここで、ビニルリン酸エステルで修飾された２’−メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー（ＶＰ−Ｕｍ）は、以下の方法に従い合成された。
【０３７２】
【化５１】
2021503941.tif 000061
【０３７３】
（１−３−１）ＶＰ−Ｕ−２の合成
以下の方法に従い、ＶＰ−Ｕ−２分子を合成した。
【０３７４】
【化５２】
2021503941.tif 000062
２’−メトキシ修飾ウラシルヌクレオシド（２’−ｍｅｔｈｏｘｙ  ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｕｒａｃｉｌ  ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ）（２’−ＯＭｅ−Ｕ、５１．３０ｇ、９１．６ｍｍｏｌ）、ｔｅｒｔ−ブチルジフェニルクロロシラン（ＴＢＤＰＳＣｌ、５０．３５ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）、イミダゾール（１２．４７ｇ、１８３．２ｍｍｏｌ）を混合して４５０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪拌反応させた。ＤＭＦを留去し、６００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて洗浄し、水相をジクロロメタン（ＤＣＭ）で１回あたり３００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、５％シュウ酸で水相をｐＨ＜５になるまで洗浄し、完全に乾燥するまで溶剤を蒸発させた後ＶＰ−Ｕ−１粗製品を得、そのまま後のＶＰ−Ｕ−２の合成に用いた。
【０３７５】
ＶＰ−Ｕ−１粗製品を１００ｍｌのジクロロメタンで溶解した後、氷浴を施して１０分間攪拌し、さらに、予め４℃の冷蔵庫で冷蔵された４５０ｍｌの２％ｐ−トルエンスルホン酸溶液（溶剤が、体積比３：７のメタノール−ジクロロメタン混合溶剤である）を加え、１０分間反応させた。さらに２００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムを加えて反応をクエンチングし、有機相に飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えてｐＨ＝８になるまで洗浄した。水相をあわせ、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、さらに２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、完全に乾燥するまで溶剤を蒸発させた。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５〜１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計４０．００ｇの純粋なＶＰ−Ｕ−２を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，１Ｈ），７．６４  （ｄｔｄ，Ｊ  ＝  ５．１，４．０，２．２  Ｈｚ，４Ｈ），７．４１−７．３０  （ｍ，６Ｈ），６．７９  （ｄ，Ｊ  ＝  ４．７  Ｈｚ，１Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，１Ｈ），４．９４  （ｔ，Ｊ  ＝  ７．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．１２  （ｔｄ，Ｊ  ＝  ４．６，３．９  Ｈｚ，１Ｈ），４．０５  （ｄｄ，Ｊ  ＝  ４．８、４．０  Ｈｚ，１Ｈ），３．９６  （ｔ，Ｊ  ＝  ４．７  Ｈｚ，１Ｈ），３．６８  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝  １１．８，７．０，４．６  Ｈｚ，１Ｈ），３．５７  −  ３．４６  （ｍ，１Ｈ），３．３９  （ｓ，３Ｈ），１．０５  （ｓ，８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２６Ｈ３３Ｎ２Ｏ６Ｓｉ，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４９７．２１、実測値：４９７．４５。
【０３７６】
（１−３−２）ＶＰ−Ｕ−４の合成：
【０３７７】
【化５３】
2021503941.tif 000063
ＶＰ−Ｕ−２（１９．８４ｇ、４０．０ｍｍｏｌ）、ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ、１６．４８ｇ、８０．０ｍｍｏｌ）、ピリジン（４．２０ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）、トリフルオロ酢酸（６．６１ｇ、５３．２ｍｍｏｌ）を混合して２００ｍｌのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させ、室温で２０ｈ攪拌反応させた。別に、メチレンジホスホン酸テトラエチル（２１．４４ｇ、７４．４ｍｍｏｌ）をとり１２０ｍｌのＴＨＦに溶解させ、氷浴で降温させ、氷浴温度でｔ−ＢｕＯＫ（１１．３６ｇ、１０１．２ｍｍｏｌ）を加え、氷浴温度で１０ｍｉｎ反応させた後、室温まで昇温して０．５ｈ反応させ、その後、約１ｈかけて前述した反応液に加え、氷浴温度で１ｈ反応させた後、室温まで昇温して１８ｈ反応させた。水を加えて反応をクエンチングし、水相をジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出した。有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄した後に乾燥するまで溶剤を蒸発させた。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル＝１：１〜１：４で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計１４．００ｇの純粋なＶＰ−Ｕ−４を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，１Ｈ），７．６４  （ｄｔｄ，Ｊ  ＝  ５．１，４．０，２．２  Ｈｚ，４Ｈ），７．４１  −  ７．３０  （ｍ，６Ｈ），６．８２  −  ６．７１  （ｍ，２Ｈ），５．９０  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝  ２５．９、１５．０，１．０  Ｈｚ，１Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，１Ｈ），４．３６  −  ４．２１  （ｍ，３Ｈ），４．１８  （ｔ，Ｊ  ＝  ４．９  Ｈｚ，１Ｈ），４．０５  （ｄｄｑ，Ｊ  ＝  ９．７，８．５，６．９  Ｈｚ，２Ｈ），３．８７  （ｔ，Ｊ  ＝  ４．８  Ｈｚ，１Ｈ），３．３９  （ｓ，３Ｈ），１．３２  （ｔｄ，Ｊ  ＝  ６．９，０．７  Ｈｚ，６Ｈ），１．０５  （ｓ，８Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ３１Ｈ４２Ｎ２Ｏ８ＰＳｉ，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：６２９．２４、実測値：６２９．５１。
【０３７８】
（１−３−３）ＶＰ−Ｕ−５の合成：
【０３７９】
【化５４】
2021503941.tif 000064
ＶＰ−Ｕ−４（１４．００ｇ、２２．２９ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのテトラヒドロフランに溶解させ、トリエチルアミン三フッ化水素酸（１７．９６ｇ、１１１．４５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌して完全に反応させた。そのまま完全に乾燥するまで溶剤を蒸発させ、５０ｍｌのジクロロメタンで溶解した後で蒸発乾固する操作を２回繰り返し、粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．０５〜１：１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて計６．７０ｇの純粋なＶＰ−Ｕ−５を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９６  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．８  Ｈｚ，１Ｈ），６．７７  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １５．０，６．２  Ｈｚ，１Ｈ），５．９９  −  ５．８２  （ｍ，２Ｈ），５．７３  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．６  Ｈｚ，１Ｈ），５．２７  （ｄ，Ｊ  ＝  ５．１  Ｈｚ，１Ｈ），５．１０  （ｄｄ，Ｊ  ＝  ５．３，４．７  Ｈｚ，１Ｈ），４．２９  （ｄｄｑ，Ｊ  ＝  ９．８，８．６，７．０  Ｈｚ，２Ｈ），４．１７  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝  ６．２，５．２，１．０  Ｈｚ，１Ｈ），４．１２  −  ３．９８  （ｍ，３Ｈ），３．３９  （ｓ，２Ｈ），１．３２  （ｔｄ，Ｊ  ＝  ６．９，０．６  Ｈｚ，６Ｈ）．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１５Ｈ２４Ｎ２Ｏ８Ｐ，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：３９１．１３、実測値：３９１．３８。
【０３８０】
（１−３−４）ＶＰ−Ｕ−６の合成：
【０３８１】
【化５５】
2021503941.tif 000065
アルゴン保護条件で１０ｍｌの無水ジクロロメタンにＶＰ−Ｕ−５（３９１ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ）、ピリジントリフルオロアセテート（０．２３２ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、Ｎ−メチルイミダゾール（０．０９９ｇ、１．２ｍｍｏｌ）、ビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィン（０．４５２ｇ、１．５ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌反応させた。完全に乾燥するまで溶剤を留去し、カラムクロマトグラフィーにより精製し（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：アセトニトリル（０．５ｗｔ％トリエチルアミンを含む）＝３：１〜１：３で勾配溶出した）、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計５０８ｍｇの目的生成物ＶＰ−Ｕ−６を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６１  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  １５０．３４，１５０．２９，１７．０７，１５．５０．  ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２４Ｈ４１Ｎ４Ｏ９Ｐ２，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：５９１．２３、実測値：５９１．５５。ＶＰ−Ｕ−６が目的生成物ＶＰ−Ｕｍであり、ヌクレオシドモノマーとしてＲＮＡ鎖の合成に関与することを示した。
【０３８２】
（１−３Ｂ）複合体１５のアンチセンス鎖の調製
複合体１５のアンチセンス鎖と複合体１のアンチセンス鎖の区別は、５’−末端の１番目のヌクレオチド修飾が異なることのみにあった。固相ホスホルアミダイト法によりアンチセンス鎖を調製する場合、最後に結合されたヌクレオシドモノマーが２’−メトキシ修飾ウラシルヌクレオシドモノマー（Ｕｍ）であり、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行ってＣＰＲ−Ｉモノマー（蘇州吉瑪、番号Ｃａｔ＃１３〜２６０１−ＸＸ）をアンチセンス鎖の５’末端に結合し、５’−リン酸エステル修飾を形成した。
【０３８３】
【化５６】
2021503941.tif 000066
【０３８４】
合成において用いられた汎用の固相担体、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化反応条件、切断と脱保護、精製と脱塩条件は、センス鎖の合成と同じであった。
【０３８５】
（１−３Ｃ）複合体１６のアンチセンス鎖の調製
ＣＰＲ−Ｉモノマーを結合した場合、上記酸化反応条件の代わりに硫化反応条件を用いたこと以外、複合体１５のアンチセンス鎖と同じ合成プロセスを採用した。５’−チオリン酸エステル修飾を有する複合体１６のアンチセンス鎖を製造できると予期した。
【０３８６】
（１−４）複合体１〜２及び１５〜１６の合成
複合体１に対して、Ｓ鎖とＡＳ鎖をそれぞれ注射用水に溶解させ、４０ｍｇ／ｍＬの溶液を得、等モル比で混合し、５０℃で１５ｍｉｎ加熱し、室温で冷却した後、これらを水素結合により二本鎖構造を形成させた。超純水（Ｍｉｌｌｉ−Ｑ超純水装置で自作、抵抗率１８．２ＭΩ＊ｃｍ（２５℃））を用いて複合体を濃度が０．２ｍｇ／ｍＬになるまで希釈した後、液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。実測値が理論値と一致しており、合成された複合体１が、Ｌ−９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。
【０３８７】
複合体２に対して、同じ方法により調製し分子量を検出したところ、実測値が理論値と一致しており、合成された複合体２が、Ｌ−９複合分子を含む目的設計の二本鎖核酸配列であることが示された。
【０３８８】
複合体１５、１６に対して、同じ方法によりアニールし、目的の複合体を製造できると予期した。
【０３８９】
複合体１と複合体２、及び複合体１５、複合体１６の構造は、式（４０３）に示される。
【０３９０】
（調製例２）複合体３〜１４及び比較複合体２の調製
１）前記ｓｉＲＮＡが、それぞれ表１に示される複合体３〜１４及び比較複合体２に対応する配列であり、２）目的配列に未修飾ヌクレオチドが含まれる場合、切断と脱保護条件で、アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量に対して、０．４ｍｌ／μｍｏｌのＮ−メチルピロリドンにより製品を溶解させた後、０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン及び０．６ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去したこと以外、調製例１と同じ方法により、表題複合体を製造できると予期した。
【０３９１】
表題複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列を表１に示した。
【０３９２】
【表１】
2021503941.tif 000067
2021503941.tif 000068
2021503941.tif 000069
【０３９３】
（調製例３）Ｐ１０−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ（複合体１７）の調製
（３−１）Ｐ−１０化合物の合成
以下の方法に従い、Ｐ−１０化合物を合成した。
【０３９４】
【化５７】
2021503941.tif 000070
【０３９５】
（３−１−１）ＧＡＬ５−Ｃ４−１の合成
４０ｍｌのＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドに上記（１−１−１）に記載された方法により得られたＧＡＬ−５（１３．４３ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、４−アミノ酸ｔｅｒｔ−ブチルエステル塩酸塩（５．８７ｇ、３０．０ｍｍｏｌ）、Ｏ−ベンゾトリアゾール−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート（１３．６５ｇ、３６．０ｍｍｏｌ）及びジイソプロピルエチルアミン（１１．６３ｇ、９０．０ｍｍｏｌ）を加え、均一に溶解させた後に室温で５時間攪拌反応させた。反応液に３００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加え、酢酸エチルで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を分離し、さらに無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、完全に乾燥するまで溶剤を減圧留去して３０．３ｇの油状物粗製品ＧＡＬ５−Ｃ４−１を得、そのまま次の反応を行った。
【０３９６】
（３−１−２）ＧＡＬ５−Ｃ４−２の合成
工程（３−１−１）で得られたＧＡＬ５−Ｃ４−１粗製品（３０．３ｇ、３０ｍｍｏｌ）を１８０ｍｌギ酸に溶解させ、室温で１６時間攪拌反応させた。完全に乾燥するまで溶剤を蒸発させ、カラムクロマトグラフィーにより精製し（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出した）、反応溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、計１４．８４ｇの目的生成物ＧＡＬ５−Ｃ４−２を得た。
【０３９７】
（３−１−３）Ｐ−６の合成：
工程（１−１−４）に記載された方法により得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）と工程（３−１−２）で得られたＧＡＬ５−Ｃ４−２（８．２４ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ、２バッチの生成物をあわせたもの）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにＮ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。２０ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して計８．２７ｇの純粋なＰ−６を得た。
【０３９８】
（３−１−４）Ｐ−７の合成：
上記（３−１−３）で得られたＰ−６（６．８２ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、さらに飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８になるように調節し、水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルで精製し、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計４．８２ｇのＰ−７を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ７８Ｈ１２７Ｎ１０Ｏ３３，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７３２．９１、実測値：１７３５．７３。
【０３９９】
（３−１−５）Ｐ−８の合成：
【０４００】
【化５８】
2021503941.tif 000071
Ｐ−７（２．６５３ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計２．７９３ｇの純粋なＰ−８を得た。
【０４０１】
（３−１−６）Ｐ−９の合成：
Ｐ−８（４９０ｍｇ、０．２３１ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（６９ｍｇ、０．６９３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、６８ｍｇ、０．５５４ｍｍｏｌ）を混合して２．３ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１４９ｍｇ、１．１５５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２１ｈ攪拌反応させた。５０ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、さらに１００ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩を加えて反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、８０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して計２００ｍｇの純粋なＰ−９複合分子を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０６Ｈ１５３Ｎ１０Ｏ４１，［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１９２１．０５、実測値：１９２０．９７。
【０４０２】
（３−１−７）Ｐ−１０の合成
Ｌ−９複合分子の代わりにＰ−９複合分子を用い、固相担体に結合されたＰ−９複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１−１−９）と同じ方法により、Ｐ−１０を調製した。
【０４０３】
（３−２）Ｐ１０−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＰ−１０化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）、（１−３Ａ）、（１−４）と同じ方法により、複合体１７を調製した。構造が式（４０４）に示されるＰ１０−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると予期した。
【０４０４】
（調製例４）Ｒ５−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体１８）の調製
（４−１）Ｒ−５化合物の合成
以下の方法に従い、Ｒ−５化合物を合成した。
【０４０５】
【化５９】
2021503941.tif 000072
【０４０６】
（４−１−１）ＧＡＬ−Ｃ７−１の合成
工程（１−１−１ｂ）に記載された方法により得られたＧＡＬ−３（２６．４ｇ、８０．２ｍｍｏｌ）を１３４ｍｌの無水１，２−ジクロロエタンに溶解させ、６０ｇの４Å分子篩粉を加え、さらに７−オクテン−１−オール（１１．３ｇ、８８．２ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌反応させ、氷浴下で窒素保護下でトリフルオロメタンスルホン酸トリメチルシリル（８．９ｇ、４０．１ｍｍｏｌ）を加え、室温で２４時間攪拌反応させた。４Å分子篩粉を濾過除去し、濾液に５００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム水溶液を加えて洗浄し、有機相を分離し、水相を１００ｍｌのジクロロメタンで１回抽出し、有機相をあわせ、２５０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相を分離し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、完全に乾燥するまで溶剤を減圧留去して３３．３ｇの黄色水飴状製品ＧＡＬ−Ｃ７−１を得、精製することなく、そのまま次の酸化反応を行った。
【０４０７】
（４−１−２）ＧＡＬ−Ｃ７−２の合成
工程（４−１−１）で得られたＧＡＬ−Ｃ７−１（３３．３ｇ、７２．８ｍｍｏｌ）を１６０ｍｌのジクロロメタンと１６０ｍｌのアセトニトリルの混合溶剤に溶解させ、それぞれ２１６ｍｌの水及び固形過ヨウ素酸ナトリウム（６２．３ｇ、２９１．２ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴下で１０分間攪拌し、触媒である塩化ルテニウム（ＩＩＩ）（４９８ｍｇ、２．４ｍｍｏｌ）を加えて自然に室温まで昇温し２３時間攪拌反応させた。反応液に２００ｍｌの水を加えて希釈攪拌し、飽和炭酸水素ナトリウムを加えてｐＨを７．５に調節し、有機相を分離し、水相をジクロロメタンで３回抽出し、有機相を捨て、水相を固形クエン酸でｐＨを約３に調節し、ジクロロメタンで１回あたり２００ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でカラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを、ジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出した）により精製して２２．４ｇの白色泡状固形製品ＧＡＬ−Ｃ７−２を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ２１Ｈ３２ＮＯ１１，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：４７６．５０、実測値：４７５．９４。
【０４０８】
（４−１−３）Ｒ−１の合成：
工程（１−１−４）に記載された方法により得られたＭ−１８−Ｔｒ（２．０２ｇ、４．６９ｍｍｏｌ）とＧＡＬ−Ｃ７−２（７．３６ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにＮ−メチルモルホリン（３．１３ｇ、３０．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、４．２８ｇ、１５．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ攪拌反応させた。２００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、１００ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、１００ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して７．８２ｇの純粋なＲ−１を得た。
【０４０９】
（４−１−４）Ｒ−２の合成：
Ｒ−１（６．２３ｇ、３．４５６ｍｍｏｌ）を６９ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、ジクロロ酢酸（１３．３６７ｇ、１０３．６７ｍｍｏｌ）を加え、室温で２ｈ反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウム溶液を加えて洗浄しｐＨ＝７〜８になるように調節し、水相をジクロロメタンで１回あたり３０ｍｌで６回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．４９ｇの純粋なＲ−２を得た。
【０４１０】
（４−１−５）Ｒ−３の合成：
Ｒ−２（２．３９１ｇ、１．５３２ｍｍｏｌ）とＡ−１（２．３４２ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を混合して１６ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ）（１．３７５ｇ、４．５９６ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．１８８ｇ、９．１９１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２ｈ攪拌反応させた。１０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、１０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．５〜１：１：１：０．６で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．６４２ｇの純粋なＲ−３を得た。
【０４１１】
（４−１−６）Ｒ−４の合成：
Ｒ−３（７９５ｍｇ、０．４０７４ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８２ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１００ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、１００ｍｇ、０．８１４８ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８ｈ攪拌反応させた。５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、３０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して５０５ｍｇの純粋なＲ−４複合分子を得た。
【０４１２】
（４−１−７）Ｒ−５の合成：
Ｌ−９複合分子の代わりにＲ−４複合分子を用い、固相担体に結合されたＲ−４複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１−１−９）と同じ方法により、Ｒ−５を調製した。
【０４１３】
（４−２）Ｒ５−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＲ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）、（１−３Ａ）、（１−４）と同じ方法により、複合体１８を調製した。構造が式（４０７）に示されるＲ５−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると予期した。
【０４１４】
（調製例５）ＬＡ５−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体１９）の調製
以下のプロセス経路により、ＬＡ−５化合物を合成できると予期した。
【０４１５】
【化６０】
2021503941.tif 000073
【０４１６】
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＬＡ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）、（１−３Ａ）、（１−４）と同じ方法により、複合体１９を調製した。構造が式（４１２）に示されるＬＡ５−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると予期した。
【０４１７】
（調製例６）ＬＢ５−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体２０）の調製
（６−１）ＬＢ−５化合物の合成
以下の方法に従い、ＬＢ−５化合物を合成した。
【０４１８】
【化６１】
2021503941.tif 000074
【０４１９】
（６−１−１）ＬＢ−１の合成：
工程（１−１−６）に記載された方法により得られたＬ−８（５．０ｇ、３．３８６ｍｍｏｌ）、アジピン酸無水物（８７０ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、８２７ｍｇ、６．７７２ｍｍｏｌ）を混合して１３０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＰＥＡ、２．２ｇ、１６．９３１ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で４ｈ攪拌反応させた。７０ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで４回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：メタノール＝１：１：１：０．２〜１：１：１：１で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して４．２６７ｇの純粋なＬＢ−１を得た。
【０４２０】
（６−１−２）ＬＢ−２の合成：
工程（６−１−１）に記載された方法により得られたＬＢ−１（４．６９７ｇ、２．７５３ｍｍｏｌ、２バッチの生成物をあわせたもの）、３−アミノ−１，２−プロパンジオール（３１３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）、４−（４，６−ジメトキシトリアジン−２−イル）−４−メチルモルホリン塩酸塩（ＤＭＴＭＭ、９５３ｍｇ、３．４４２ｍｍｏｌ）及びＮ−メチルモルホリン（７００ｍｇ、６．８８４ｍｍｏｌ）を順に３０ｍｌのアセトニトリルと３ｍｌのメタノールの混合液に加え、室温で一晩攪拌反応させた。完全に乾燥するまで溶剤を蒸発させ、カラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン：メタノール＝１：０．０７〜１：０．５で勾配溶出した）により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、３．２７ｇの目的生成物ＬＢ−２を得た。
【０４２１】
（６−１−３）ＬＢ−３の合成：
ＬＢ−２（２．２７ｇ、１．３５３ｍｍｏｌ）を１４ｍｌの無水ピリジンで溶解させた。さらに４，４’−ビスメトキシトリチルクロリド（６８８ｍｇ、２．０３ｍｍｏｌ）を加えて室温で一晩攪拌反応させた。１５０ｍｌのメタノールを加えてクエンチングし、完全に乾燥するまで溶剤を蒸発させた。カラムクロマトグラフィー（２００〜３００メッシュの順相シリカゲルをジクロロメタン：メタノール＝１：０．０５〜１：０．２で勾配溶出した）により精製し、生成物溶出液を回収し、溶剤を濃縮除去し、１．６４７ｇの目的生成物ＬＢ−３を得た。
【０４２２】
（６−１−４）ＬＢ−４の合成：
ＬＢ−３（８２２ｍｇ、０．４１５ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（８３ｇ、０．８３ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、１０２ｍｇ、０．８３ｍｍｏｌ）を混合して４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＰＥＡ（２７０ｍｇ、２．０７５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で一晩攪拌反応させた。０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を３回洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり２ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、５ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、石油エーテルでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：２０で勾配溶出し、溶剤を減圧蒸発乾固して７８７ｍｇの純粋なＬＢ−４複合分子を得た。
【０４２３】
（６−１−５）ＬＢ−５の合成：
Ｌ−９複合分子の代わりにＬＢ−４複合分子を用い、固相担体に結合されたＬＢ−４複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１−１−９）と同じ方法により、ＬＢ−５を調製した。
【０４２４】
（６−２）ＬＢ５−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＬＢ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）、（１−３Ａ）、（１−４）と同じ方法により、複合体２０を調製した。構造が式（４１３）に示されるＬＢ５−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると予期した。
【０４２５】
（調製例７）Ｖ８−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体２１）の合成
以下のプロセス経路により、Ｖ−８化合物を合成できると予期した。
【０４２６】
【化６２】
2021503941.tif 000075
【０４２７】
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＶ−８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）、（１−３Ａ）、（１−４）と同じ方法により、複合体２１を調製した。構造が式（４１４）に示されるＶ８−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると予期した。
【０４２８】
（調製例８）Ｗ８−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体２２）の調製
（８−１）Ｗ−８化合物の合成
以下の方法に従い、Ｗ−８化合物を合成した。
【０４２９】
【化６３】
2021503941.tif 000076
【０４３０】
（８−１−１）Ｗ−１の合成：
Ｗ−０（２．０２４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を２５ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにトリエチルアミン（４．０４８ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、氷水浴で０℃程度まで冷却し、トリフルオロ酢酸エチル（５．６８３ｇ、４０ｍｍｏｌ）を加え、室温で２２ｈ反応させた。溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで１８ｈ発泡乾燥させ、５．８３５ｇの固形粗製品Ｗ−１を得た。
【０４３１】
（８−１−２）Ｗ−２の合成：
Ｗ−１粗製品（５．８３５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、反応液にＴｒＣｌ（３．３４５ｇ、１２ｍｍｏｌ）及びトリエチルアミン（１．５１８ｇ、１５ｍｍｏｌ）を加え、室温で２０ｈ攪拌反応させた。２０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで反応液を２回洗浄し、２０ｍｌの飽和食塩水で１回洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で有機溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、８．０１２ｇの固形粗製品Ｗ−２を得た。処理されることなく、次の脱保護反応を行った。
【０４３２】
（８−１−３）Ｗ−３の合成：
Ｗ−２粗製品（８．０１２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのメタノールに溶解させ、さらに１００ｍｌのメチルアミン水溶液（４０ｗｔ％）を加え、５０℃で２３ｈ攪拌反応させた。不溶性粒子を濾過除去し、溶剤を減圧蒸発乾固し、２００ｍｌの体積比１：１のＤＣＭ−メタノール混合溶剤を加え、５０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させ、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール：アンモニア水（２５ｗｔ％）＝１：１：０．０５〜１：１：０．２５で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで発泡乾燥させて３．０６２ｇの純粋なＷ−３を得た。
【０４３３】
（８−１−４）Ｗ−４の合成：
Ｗ−３（０．６７５ｇ、１．５１７ｍｍｏｌ）とＧＡＬ−Ｃ７−２（２．６０ｇ、５．４６ｍｍｏｌ）を混合して４７ｍｌのアセトニトリルに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．５７ｇ、１２．１４ｍｍｏｌ）を加え、最後に３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、１．８１６ｇ、６．０４ｍｍｏｌ）を加え、室温で２．５ｈ攪拌反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、８０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：５〜１００：７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して１．６１０ｇの純粋なＷ−４を得た。
【０４３４】
（８−１−５）Ｗ−５の合成：
Ｗ−４（１．６１ｇ、０．８８６ｍｍｏｌ）を１２５ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸（３．５ｍｌ、４２．４３ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ｈ反応させた。１５０ｍｌのピリジンを加えて反応液を中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用いて、１０ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ‰トリエチルアミンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１００：３０〜１００：４０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．２６ｇの純粋なＷ−５を得た。
【０４３５】
（８−１−６）Ｗ−６の合成：
Ｗ−５（１．２５ｇ、０．７９３ｍｍｏｌ）と工程（１−１−７ａ）に記載された方法により得られたＡ−１（１．２１ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を混合して１２ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、０．７１２ｇ、２．３８ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（０．６１５ｇ、４．７６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３ｈ攪拌反応させた。８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり１０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、１０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、１８５ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、石油エーテル：酢酸エチル：ジクロロメタン：Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド＝１：１：１：０．１〜１：１：１：０．７で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．５７ｇの純粋なＷ−６を得た。
【０４３６】
（８−１−７）Ｗ−７の合成：
Ｗ−６（１．２３８ｇ、０．６３ｍｍｏｌ）、コハク酸無水物（０．１８９ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）及び４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、０．２３１ｇ、１．８９ｍｍｏｌ）を混合して７ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにＤＩＥＡ（０．４０７ｇ、３．１５ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で２４ｈ攪拌反応させた。５ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で反応液を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、３０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１００：１８〜１００：２０で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．０３３ｇの純粋なＷ−７複合分子を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０１Ｈ１４６Ｎ７Ｏ３８，［Ｍ−ＤＭＴｒ］＋、理論値：１７６３．９２、実測値：１７６３．２１。
【０４３７】
（８−１−８）Ｗ−８の合成：
Ｌ−９複合分子の代わりにＷ−７複合分子を用い、固相担体に結合されたＷ−７複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１−１−９）と同じ方法により、Ｗ−８を調製した。
【０４３８】
（８−２）Ｗ８−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＷ−８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）、（１−３Ａ）、（１−４）と同じ方法により、複合体２２を調製した。構造が式（４１５）に示されるＷ８−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると予期した。
【０４３９】
（調製例９）Ｘ８−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体２３）の調製
以下のプロセス経路により、Ｘ−８化合物を合成できると予期した。
【０４４０】
【化６４】
2021503941.tif 000077
【０４４１】
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＸ−８化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）、（１−３Ａ）、（１−４）と同じ方法により、複合体２３を調製した。構造が式（４２１）に示されるＸ８−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると予期した。
【０４４２】
（調製例１０）Ｚ５−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体（複合体２４）の調製
（１０〜１）Ｚ−５化合物の合成
以下の方法に従い、Ｚ−５化合物を合成した。
【０４４３】
【化６５】
2021503941.tif 000078
【０４４４】
（１０−１−１）Ｚ−１の合成：
工程（８−１−３）に記載された方法により得られたＷ−３（１．５０ｇ、３．３７ｍｍｏｌ）と工程（３−１−２）に記載された方法により得られたＧＡＬ５−Ｃ４−２（７．１８ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を混合して３４ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジイソプロピルエチルアミン（３．４８ｇ、２６．９６ｍｍｏｌ）を加え、最後に３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、４．０４ｇ、１３．４８ｍｍｏｌ）を加え、室温で４．５ｈ攪拌反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、８０ｍｌの飽和炭酸水素ナトリウム溶液で有機相を洗浄し、８０ｍｌの飽和食塩水で有機相を洗浄し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得、２００〜３００メッシュの順相シリカゲルカラムで精製し、石油エーテルをカラムに入れ、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタン：メタノール＝３０：１〜１５：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、減圧蒸発乾固して３．９７ｇの純粋なＺ−１を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ９８Ｈ１４３Ｎ１０Ｏ３３，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９８７．９８、実測値：１９８７．９０。
【０４４５】
（１０−１−２）Ｚ−２の合成：
Ｚ−１（３．９７ｇ、２．００ｍｍｏｌ）を２５０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、さらにジクロロ酢酸（１０．９４１ｇ、８４．８５ｍｍｏｌ）を加え、室温で１ｈ反応させた。ピリジンを加えて反応液を中性に中和し、溶剤を減圧蒸発乾固して粗製品を得た。２２０ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルをカラムに入れ、１０％ピリジンでシリカゲルの酸性を中和し、１‰ピリジンでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝１０：１〜２：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して３．４９ｇの純粋なＺ−２を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ７９Ｈ１２９Ｎ１０Ｏ３３，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１７４６．９４、実測値：１７４６．９０。
【０４４６】
（１０−１−３）Ｚ−３の合成：
Ｚ−２（３．４９ｇ、２．０ｍｍｏｌ）と工程（１−１−７ａ）に記載された方法により得られたＡ−１（３．０６ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を混合して３０ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、３−ジエトキシホスホリル−１，２，３−ベンゾオキサゾール４（３Ｈ）−オン（ＤＥＰＢＴ、１．８０ｇ、６．０ｍｍｏｌ）を加え、さらにジイソプロピルエチルアミン（１．５５ｇ、１２．０ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で３ｈ攪拌反応させた。１００ｍｌのジクロロメタンで反応液を希釈し、飽和炭酸水素ナトリウムで有機相を１回あたり３０ｍｌで２回洗浄し、水相を１０ジクロロメタンで抽出し、有機相をあわせ、５０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相をあわせ無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濾過した後で溶剤を減圧蒸発乾固し、真空油ポンプで一晩発泡乾燥させて粗製品を得た。カラム精製には、２００ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、２０ｍｌのトリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、１ｗｔ％トリエチルアミンを含む石油エーテルでカラムを平衡化し、ジクロロメタン：メタノール＝２５：１〜１５：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して２．２ｇの純粋なＺ−３を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０３Ｈ１５１Ｎ１０Ｏ３８，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：２１３６．０２、実測値：２１３６．２０。
【０４４７】
（１０−１−４）Ｚ−４の合成：
Ｚ−３（２．１０ｇ、０．９８３ｍｍｏｌ）をＤＩＥＡ（０．６３５ｇ、４．９１５ｍｍｏｌ）を含む１４．８ｍｌのジクロロメタンに溶解させ、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ、２４０ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え攪拌して清澄させた後、コハク酸無水物（１９７ｍｇ、１．９６６ｍｍｏｌ）を加え、２５℃で１８ｈ攪拌反応させた。５０ｍｌのジクロロメタンを加えて反応液を希釈し、８０ｍｌの０．５Ｍトリエチルアミンリン酸塩で有機相を洗浄し、水相をジクロロメタンで１回あたり５０ｍｌで２回抽出し、有機相をあわせ減圧蒸発乾固して粗製品を得た。カラム精製には、１８８ｇの２００〜３００メッシュの順相シリカゲルを用い、１ｗｔ％トリエチルアミンでシリカゲルの酸性を中和し、ジクロロメタンでカラムを平衡化し、１ｗｔ‰トリエチルアミンを含むジクロロメタン：メタノール＝１０：１〜３：１で勾配溶出し、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固して１．９５ｇの純粋なＺ−４複合分子を得た。ＭＳ  ｍ／ｚ：Ｃ１０７Ｈ１５５Ｎ１０Ｏ４１，［Ｍ＋Ｈ］＋、理論値：１９３５．０７、実測値：１９３５．２９。
【０４４８】
（１０−１−５）Ｚ−５の合成
Ｌ−９複合分子の代わりにＺ−４複合分子を用い、固相担体に結合されたＺ−４複合分子を得たこと以外、調製例１における工程（１−１−９）と同じ方法により、Ｚ−５を調製した。
【０４４９】
（１０−２）Ｚ５−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体の合成
出発としてＬ−１０化合物の代わりにＺ−５化合物を用いてセンス鎖を合成したこと以外、調製例１における工程（１−２）、（１−３Ａ）、（１−４）と同じ方法により、複合体２４を調製した。構造が式（４２２）に示されるＺ５−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ複合体を得ることができると予期した。
【０４５０】
（調製例１１）複合体２５、２６及び比較複合体１、３の調製
本調製例では、複合体２５、２６及び比較複合体１、３（以下、それぞれＦＩＮ−ｓｉＨＢ１Ｍ１ＳＶＰ、ＦＩＮ−ｓｉＨＢ２Ｍ１ＳＶＰ及びＦＩＮ−ＮＣ、ＦＩＮ−ｓｉＨＢ３Ｍ１ＳＶＰ複合体ともいう）を合成した。当該複合体に複合されたｓｉＲＮＡの配列は、表１に示される。
【０４５１】
（１１−１）ＦＩＮ−２複合分子の合成
Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１５，１６，９０３−９０８に記載された調製方法を参照し、以下のプロセス経路により、ＦＩＮ−２複合分子を合成した。
【０４５２】
（１１−１−１）ＰＲＯ−１０の合成
【０４５３】
【化６６】
2021503941.tif 000079
（１１−１−１ａ）ＰＲＯ−７の合成
２．９３ｇのＰＲＯ−６（Ｌ−ヒドロキシプロリン、ＣＡＳ番号：５１−３５−４、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２２．４ｍｍｏｌ）を２２．５ｍｌの１，４−ｄｉｏｘａｎｅ（１，４−ジオキサン、ＣＡＳ番号：１２３−９１−１）に溶解させ、３４ｍｌの１０％（ｗ／ｗ）Ｎａ２ＣＯ３の水溶液を加え、懸濁液状態にし、６．９５ｇのＦｍｏｃ−Ｃｌ（クロロギ酸−９−フルオレニルメチル、ＣＡＳ番号：２８９２０−４３−６、Ｅｎｅｒｇｙ社から購入、２６．８ｍｍｏｌ）を３４ｍｌの１，４−ｄｉｏｘａｎｅに溶解させ、氷浴下で上記懸濁液中に加え、自然に室温まで昇温し一晩反応させた。反応液を１５０ｍｌの氷水に注入し、メチルｔｅｒｔ−ブチルエーテルで１回あたり１００ｍｌで３回抽出し、有機相を捨て、水相を濃ＨＣｌでｐＨ≦５になるように調節し、１００ｍｌの酢酸エチルで２回抽出し、有機相をあわせ、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧蒸発乾固して７．８３ｇの白色泡状固形製品ＰＲＯ−７を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９１  （ｔ，Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，２Ｈ），７．６７  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．５  Ｈｚ，２Ｈ），７．４８  −  ７．３９  （ｍ，２Ｈ），７．３８  −  ７．２７  （ｍ，２Ｈ），５．１７  （ｓ，１Ｈ），４．２７  （ｓ，２Ｈ），４．２３  −  ４．１１  （ｍ，２Ｈ），３．５５  −  ３．４１  （ｍ，３Ｈ），２．３１  −  ２．１０  （ｍ，１Ｈ），２．０８  −  １．８８  （ｍ，１Ｈ）．  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値  Ｃ２０Ｈ１９ＮＯ５  ［Ｍ−Ｈ］−３５２．１１９０、実測値３５２．１０３３．
【０４５４】
（１１−１−１ｂ）ＰＲＯ−８の合成
７．８３ｇのＰＲＯ−７（２２．２ｍｍｏｌ）を８０ｍｌのＴＨＦ（ＣＡＳ番号：１０９−９９−９）に溶解させ、油浴で６５℃に加熱し、還流状態で３６．６ｍｌの２ｍｏｌ／ＬのＢＨ３−Ｍｅ２ＳのＴＨＦ溶液（ＣＡＳ番号１３２９２−８７−０、Ｊ＆Ｋ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入、７３．２ｍｍｏｌ）を加え、３時間還流反応を続けた。反応液を流出させ、メタノールで残りの固体を溶解させ、攪拌下で反応液に気体がなくなるまでメタノールを加えてから３０分間攪拌し続け、溶剤を減圧留去した後、石油エーテルで３回精製して７．１ｇの白色固形生成物ＰＲＯ−８を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．９１  （ｔ，Ｊ  ＝  ６．７  Ｈｚ，２Ｈ），７．６７  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，２Ｈ），７．４９  −  ７．３９  （ｍ，２Ｈ），７．３８  −  ７．２６  （ｍ，２Ｈ），５．１８  （ｄｄ，Ｊ  ＝  ６．１，３．８  Ｈｚ，１Ｈ），４．２８  （ｓ，２Ｈ），４．２３  −  ４．１３  （ｍ，２Ｈ），３．５５  −  ３．３８  （ｍ，２Ｈ），２．３２  −  ２．１１  （ｍ，１Ｈ），２．０８  −  １．８９  （ｍ，１Ｈ）．  ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値  Ｃ２０Ｈ２１ＮＯ４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋３６２．１３６８、実測値３６２．１０１２．
【０４５５】
（１１−１−１ｃ）ＰＲＯ−９の合成
７．１ｇのＰＲＯ−８（２１ｍｍｏｌ）を１００ｍｌのピリジンに溶解させ、１４．２ｇのＤＭＴｒ−Ｃｌ（４，４’−ビスメトキシトリチルクロリド、４２ｍｍｏｌ）を加え、室温で５時間攪拌反応させた。溶剤を減圧留去し、粗製品を酢酸エチルで溶解した後に塩類不純物を濾過除去し、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、１％（ｖ／ｖ）ピリジンを含むＤＣＭでＤＭＴｒ−Ｃｌを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、８．２ｇの白色固形生成物ＰＲＯ−９を得た。ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値  Ｃ４１Ｈ３９ＮＯ６  ［Ｍ＋Ｎａ］＋６６４．２６７５、実測値６６４．２３４８，Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（ロット番号ＪＪＳ１６０３２４−１）純度９４．２０％。
【０４５６】
（１１−１−１ｄ）ＰＲＯ−１０の合成
８．２ｇのＰＲＯ−９（１２．８ｍｍｏｌ）を６４ｍｌのＤＭＦ（Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド）に溶解させ、４０ｍｌのピペリジン（３８４ｍｍｏｌ）を加え、室温で３０分間攪拌反応させた。反応液を３００ｍｌの氷水に注入し、酢酸エチルで１回あたり１５０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、２００ｍｌの飽和食塩水で洗浄した後、有機相を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、１％（ｖ／ｖ）ピリジンを含むＤＣＭでＦｍｏｃを溶出させた後、酢酸エチルで生成物を溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、４．６５ｇの白色固形生成物ＰＲＯ−１０を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．４０  （ｄ，Ｊ  ＝  ７．２  Ｈｚ，２Ｈ），７．３５  −  ７．１８  （ｍ，７Ｈ），６．９３  −  ６．８４  （ｍ，４Ｈ），４．５６  （ｄ，Ｊ  ＝  ３．９  Ｈｚ，１Ｈ），４．１２  （ｓ，１Ｈ），３．７４  （ｓ，６Ｈ），３．４６  −  ３．３７  （ｍ，１Ｈ），２．８８  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝  １８．５，１０．０，５．５  Ｈｚ，２Ｈ），２．７５  （ｄｄ，Ｊ  ＝  ８．７，５．８  Ｈｚ，１Ｈ），２．６２  （ｄｄ，Ｊ  ＝  １１．０，２．７  Ｈｚ，１Ｈ），１．７４  −  １．６５  （ｍ，１Ｈ），１．４０  （ｄｄｄ，Ｊ  ＝  １２．９，８．５，５．９  Ｈｚ，１Ｈ），ＨＲＭＳ  （ＥＳＩ）  ｍ／ｚ  理論値  Ｃ２６Ｈ２９ＮＯ４  ［Ｍ＋Ｎａ］＋４４２．１９９４、実測値４４２．１９９９，Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（ロット番号ＪＪＳ１６０３２９−１）純度９７．０７％。
【０４５７】
（１１−１−２）ＦＩＮ−１の合成
【０４５８】
【化６７】
2021503941.tif 000080
（１−１−１）に記載された方法により得られたＧＡＬ−５（４．５ｇ、１０ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、順に３．９ｇのＤＩＰＥＡ（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン、ＣＡＳ番号：７０８７−６８−５、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、３０ｍｍｏｌ）及び３．８ｇのＨＢＴＵ（ベンゾトリアゾール−Ｎ，Ｎ、Ｎ’，Ｎ’−テトラメチルウロニウムヘキサフルオロホスフェート、ＣＡＳ番号：９４７９０−３７−２、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、１１ｍｍｏｌ）を加え、室温で１０分間攪拌し、工程（１１−１−１ｄ）で得られたＰＲＯ−１０（４．２ｇ、１０ｍｍｏｌ）を４０ｍｌのＤＭＦに溶解させた後、上記反応液に加え、反応液に無水硫酸ナトリウムを加えて乾燥させ、室温で２時間攪拌した。反応液を１２０ｍｌの氷水に注入し、酢酸エチルで１回あたり６０ｍｌで３回抽出し、有機相をあわせ、それぞれ２０ｍｌの水、２０ｍｌの飽和食塩水で洗浄し、有機相を分離し無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、溶剤を減圧留去し、シリカゲルカラムで精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからそれに試料を負荷し、１体積％トリエチルアミン及び１体積％メタノールを含むジクロロメタン（ＤＣＭ）溶液で溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧蒸発乾固し、６．５ｇの淡黄色泡状固形製品ＦＩＮ−１を得た。１Ｈ  ＮＭＲ  （４００  ＭＨｚ，ＤＭＳＯ−ｄ６）  δ  ７．８３  （ｄ，Ｊ  ＝  ９．２  Ｈｚ，１Ｈ），７．３２  （ｔ，Ｊ  ＝  ６．６  Ｈｚ，４Ｈ），７．２０  （ｔｄ，Ｊ  ＝  ８．９，３．５  Ｈｚ，５Ｈ），６．９３  −  ６．８４  （ｍ，４Ｈ），５．２１  （ｄ，Ｊ  ＝  ３．２  Ｈｚ，１Ｈ），５．０４  −  ４．９０  （ｍ，２Ｈ），４．４９  （ｓ，１Ｈ），４．４０  （ｄ，Ｊ  ＝  ４．４  Ｈｚ，０．８Ｈ），４．３１  （ｄ，Ｊ  ＝  ５．０  Ｈｚ，０．２Ｈ），４．１５  （ｓ，１Ｈ），４．０３  （ｓ，３Ｈ），３．９３  （ｓ，１Ｈ），３．７４  （ｓ、７Ｈ）、３．５９  （ｄｔ，Ｊ  ＝  １２．０，６．０  Ｈｚ，１Ｈ），３．５０  −  ３．４０  （ｍ，１Ｈ），３．３９  −  ３．２５  （ｍ，３Ｈ），３．１３  （ｄｄ，Ｊ  ＝  ８．９，５．２  Ｈｚ，１Ｈ），３．００  （ｄｑ，Ｊ  ＝  ９．３，５．３，４．３  Ｈｚ，１Ｈ），２．２２  （ｓ，２Ｈ），２．０７  （ｓ，３Ｈ），１．９９  （ｓ，３Ｈ），１．９０  （ｓ，４Ｈ），１．７４  （ｓ，３Ｈ），１．５０  （ｓ，３Ｈ），１．３６  （ｓ，１Ｈ）。Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ（ロット番号ＬＪ１６０４２２）純度９５．４５％。
【０４５９】
（１１−１−３）ＦＩＮ−２の合成
【０４６０】
【化６８】
2021503941.tif 000081
工程（１１−１−２）で得られたＦＩＮ−１（３．０ｇ、３．５３ｍｍｏｌ）をアセトニトリルと共沸させて水を除去し、減圧吸引乾燥させ、１０ｍｌのＤＭＦに溶解させ、窒素保護下で２．１３ｇのＰＡ（ビス（ジイソプロピルアミノ）（２−シアノエトキシ）ホスフィン、Ａｄａｍａｓ社から購入、商品番号１１３５６Ｂ、７．０６ｍｍｏｌ）、３４６ｍｇのテトラゾール（ＣＡＳ番号：２８８−９４−８、Ａｌａｄｄｉｎ社から購入、４．９４ｍｍｏｌ）を加え、室温で攪拌反応させ、１０ｍｌのＤＭＦを追加し、１時間攪拌反応を続けた。溶剤を減圧留去した後でシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製し、シリカゲルカラムを予めピリジンでアルカリ化してからＤＣＭで粗製品を溶解させ負荷し、酢酸エチルで溶出させ、生成物溶出液を回収し、溶剤を減圧留去し、４．５ｇの無色シロップ状粗製品を得た。粗製品を５０体積％アセトニトリル水溶液で完全に溶解するまで溶解させ、Ｃ−１８、３３０ｇ、３００Å中圧精製カラムでサンプルを精製し、カラムをまず１体積％ピリジンのアセトニトリル溶液でアルカリ化し、勾配溶出させて製品のピークを回収し、溶剤を減圧留去して２．２ｇの白色粉末製品ＦＩＮ−２複合分子を得た。３１Ｐ  ＮＭＲ  （１６２  ＭＨｚ，ＣＤＣｌ３）  δ  １４８．０４，１４７．９４，１４７．６２，１４７．１９、リンスペクトル純度９２％、Ｃ１８  ＲＰ−ＨＰＬＣ純度９０．５４％。
【０４６１】
（１１−２）ＦＩＮ−２複合分子の固相担体への結合
核酸固相合成方法により、工程（１１−１−３）で得られたＦＩＮ−２複合分子を３回循環させることにより、汎用の固相担体（ＵｎｙＬｉｎｋｅｒＴＭ  ｌｏａｄｅｄ  ＮｉｔｔｏＰｈａｓｅ（登録商標）ＨＬ  Ｓｏｌｉｄ  Ｓｕｐｐｏｒｔｓ）に結合し、複合基（ＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮ）のＲＮＡセンス鎖の３’末端への結合を実現した。
【０４６２】
Ｒａｊｅｅｖら、ＣｈｅｍＢｉｏＣｈｅｍ  ２０１５，１６，９０３−９０８に記載された調製方法を参照して上記結合を行い、具体的には、まず、上記汎用の固相担体から始まり、固相担体におけるヒドロキシ保護基を除去し、カップリング反応条件下及びカップリング試薬の存在下でＦＩＮ−２複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング反応及び酸化反応を行った後、固相担体に結合されたＦＩＮ複合分子を得た。当該固相担体に結合されたＦＩＮ複合分子におけるヒドロキシ保護基ＤＭＴｒを除去し、ＦＩＮ−２複合分子と接触させてカップリングさせ、キャッピング反応及び酸化反応を行い、再び上記脱保護−カップリング−キャッピング−酸化工程を１回繰り返し、３番目のＦＩＮ−２複合分子を結合させ、固相担体に結合された複合基（ＦＩＮ＿ＦＩＮ＿ＦＩＮ）を得た。
【０４６３】
上記反応において、上述した脱保護、カップリング、キャッピング、酸化は、反応条件、溶剤及び試薬用量が前述した工程（１−２）に記載された核酸固相合成方法と同じであった。
【０４６４】
（１１−３）複合体２５、２６及び比較複合体１、３の合成
１）工程（１１−２）で得られた化合物を出発としてセンス鎖を合成し、２）複合ｓｉＲＮＡが表１に示される複合体２５、２６及び比較複合体１、３に対応する配列を有し、３）比較複合体１については、目的配列に未修飾ヌクレオチドが含まれるので、切断と脱保護条件で、アンモニア水により処理した後、一本鎖核酸の量に対して、０．４ｍｌ／μｍｏｌのＮ−メチルピロリドンにより製品を溶解させた後、０．３ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン及び０．６ｍｌ／μｍｏｌのトリエチルアミン三フッ化水素酸塩を加え、リボースにおける２’−ＴＢＤＭＳ保護を除去したこと以外、調製例１における工程（１−２）、（１−３Ａ）、（１−４）と同じ方法により、表題複合体を調製した。
【０４６５】
液体クロマトグラフィー質量分析計（ＬＣ−ＭＳ、Ｌｉｑｕｉｄ  Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ−Ｍａｓｓ  Ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ、Ｗａｔｅｒｓ社から購入、型番：ＬＣＴ  Ｐｒｅｍｉｅｒ）により分子量を検出した。その結果、実測値が理論値に一致しており、合成された複合体は、構造が式（３０７）に示される目的設計の化合物であることが確認された。
【０４６６】
上述した本開示の複合体の調製が完了した後、使用するまで、標準的な手段により固体粉末として凍結乾燥させて保存した。使用時、例えば注射用水を用いて改めて溶解させて所望の濃度の溶液として用いてもよい。
【０４６７】
（実験例１）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の体外（ｉｎ  ｖｉｔｒｏ）での抑制活性を証明した。
【０４６８】
（実験例１−１）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性
本実験例に用いられるＨＥＫ２９３Ａ細胞は、北京大学分子医学研究所核酸技術実験室により提供され、２０％のウシ胎児血清（ＦＢＳ、Ｈｙｃｌｏｎｅ社）及び０．２体積％のペニシリン−ストレプトマイシン（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｎ−Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｉｎ、Ｇｉｂｃｏ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）を含むＤＭＥＭ完全培地（Ｈｙｃｌｏｎｅ社）で細胞を培養し、３７℃で５％ＣＯ２／９５％空気含有インキュベーターにおいて培養した。
【０４６９】
本実験例では、複合体２５及び複合体２６の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるオンターゲット活性（ｏｎ−ｔａｒｇｅｔ  ａｃｔｉｖｉｔｙ）を調べ、即ち、複合体２５及び複合体２６が、完全マッチングした目的配列（そのヌクレオチド配列が前記複合体アンチセンス鎖の全長ヌクレオチド配列と完全に相補的である）を標的する活性を測定した。
【０４７０】
Ｋｕｍｉｃｏ  Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  ＤＮＡ  ｓｅｅｄ  ａｒｍ  ｉｓ  ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８．３６（７），２１３６−２１５１に記載された方法により、検出プラスミドを構築し、被評価ｓｉＲＮＡ複合体と共にＨＥＫ２９３Ａ細胞にコトランスフェクションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルにより、ｓｉＲＮＡ複合体のオンターゲット活性及びオフターゲット効果を反映した。具体的な工程は以下のとおりである。
【０４７１】
［１］検出プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）プラスミドにより、被験複合体におけるアンチセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含むオンターゲットプラスミドを構築した。目的配列をｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２プラスミドのＸｈｏ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ部位にクローニングした。
【０４７２】
［２］トランスフェクション
９６ウェルプレートに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の使用説明書により、それぞれｓｉＲＮＡ複合体及び上記プラスミドをコトランスフェクションした。プラスミドをウェルあたり１０ｎｇずつトランスフェクションし、０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を用いた。複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの濃度として算出される）が順に０．１ｎＭ、０．０５ｎＭ及び０．０１ｎＭであった。各群では、複合体処理しないものを対照とした。１群あたり３個の複製ウェルがあった。
【０４７３】
［３］検出
２４時間コトランスフェクションした後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット（Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｃａｔ．Ｅ２９４０）を用い、使用説明書によりＨＥＫ２９３Ａ細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベルに対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベルで標準化した。結果を図１に示した。
【０４７４】
結果から明らかなように、複合体２５及び複合体２６は、いずれも良好な体外抑制活性を有する。
【０４７５】
（実験例１−２）体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０の測定及びオフターゲットの検出
本実験例では、複合体２の体外ｐｓｉＣＨＥＣＫ系におけるＩＣ５０及びオフターゲット効果を調べた。
【０４７６】
Ｋｕｍｉｃｏ  Ｕｉ−Ｔｅｉ  ｅｔ．ａｌ．，Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｄｉｓｓｅｃｔｉｏｎ  ｏｆ  ｓｉＲＮＡ  ｓｅｑｕｅｎｃｅ  ｂｙ  ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ  ＤＮＡ  ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ：ｍｏｄｉｆｉｅｄ  ｓｉＲＮＡ  ｗｉｔｈ  ａ  ＤＮＡ  ｓｅｅｄ  ａｒｍ  ｉｓ  ａ  ｐｏｗｅｒｆｕｌ  ｔｏｏｌ  ｆｏｒ  ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｇｅｎｅ  ｓｉｌｅｎｃｉｎｇ  ｗｉｔｈ  ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ  ｒｅｄｕｃｅｄ  ｏｆｆ−ｔａｒｇｅｔ  ｅｆｆｅｃｔ．  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００８．３６（７），２１３６−２１５１に記載された方法により、検出プラスミドを構築し、被験複合体と共にＨＥＫ２９３Ａ細胞にコトランスフェクションさせ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルにより、複合体のオンターゲット活性及びオフターゲット効果を反映した。具体的な工程は以下のとおりである。
【０４７７】
［１］検出プラスミドの構築
ｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２（ＰｒｏｍｅｇａＴＭ）プラスミドにより４つの組換えプラスミドを構築した。そのうち、ＧＳＣＭは、オンターゲットプラスミドを表し、ＰＳＣＭ、ＧＳＳＭ、ＰＳＳＭは、オフターゲットプラスミドを表す。
（１）ＧＳＣＭは、複合体２におけるアンチセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の全てと完全に相補的な目的配列を含む。
（２）ＰＳＣＭは、複合体２におけるアンチセンス鎖の２１個のヌクレオチド配列の全てと完全に一致している目的配列を含む。
（３）ＧＳＳＭは、被験ｓｉＲＮＡにおいてアンチセンス鎖の５’端から１〜８位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残りの部分が被験ｓｉＲＮＡにおいてアンチセンス鎖の５’端から９〜２１位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的ではない、即ち、被験ｓｉＲＮＡにおいてアンチセンス鎖の５’端から９〜２１位のいずれかのヌクレオチドがＧ、Ｃ、Ａ又はＵである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれＴ、Ａ、Ｃ又はＧである目的配列を含む。
（４）ＰＳＳＭは、被験ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖の５’端から１〜８位のヌクレオチド配列と完全に相補的であり、残部が被験ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖の５’端から９〜１９位のヌクレオチド配列に対応し、その配列が全く相補的ではない、即ち、被験ｓｉＲＮＡにおいてセンス鎖の５’端から９〜１９位のいずれかのヌクレオチドがＧ、Ｃ、Ａ又はＵである場合、目的配列における対応する位置のヌクレオチドがそれぞれＴ、Ａ、Ｃ又はＧである目的配列を含む。ＧＳＳＭの標的配列の長さに等しくするために、目的配列の３’末端に順にヌクレオチドＣ、Ｃを加えた。
【０４７８】
目的配列をｐｓｉＣＨＥＣＫＴＭ−２プラスミドのＸｈｏ  Ｉ／Ｎｏｔ  Ｉ部位にクローニングした。
【０４７９】
［２］トランスフェクション
９６ウェルプレートに、ＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）の使用説明書により、それぞれ複合体及び上記各プラスミドをコトランスフェクションした。プラスミドをウェルあたり１０ｎｇずつトランスフェクションし、０．２μＬのＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＴＭ  ２０００を用いた。ｓｉＲＮＡ複合体の最終濃度（ｓｉＲＮＡの量として）が０．１ｎＭから、０．０００１ｎＭに倍加希釈し、プラスミドごとに１１群のｓｉＲＮＡ濃度が対応し、１群あたり３個の複製ウェルがあった。
【０４８０】
［３］検出
ＨＥＫ２９３Ａ細胞を２４時間培養した後、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子検出キット（Ｄｕａｌ  ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ  ｒｅｐｏｒｔｅｒ  ｇｅｎｅ  ａｓｓａｙ  ｋｉｔ、Ｐｒｏｍｅｇａ社、ｃａｔ．Ｅ２９４０）を用い、使用説明書により細胞を溶解させ、デュアルルシフェラーゼレポーター遺伝子の発現レベルを検出した。各特定の濃度の複合体試験群では、複合体未処理群を対照とした。ホタルルシフェラーゼタンパク質レベル（Ｆｉｒ）に対するウミシイタケルシフェラーゼタンパク質レベル（Ｒｅｎ）で標準化した。ｓｉＲＮＡの異なる濃度で測定された活性結果から、Ｇｒａｐｈｐａｄ  ５．０ソフトウェアｌｏｇ（ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ）  ｖｓ．  ｒｅｓｐｏｎｓｅ−Ｖａｒｉａｂｌｅ  ｓｌｏｐｅ機能により用量−効果曲線をフィッティングし、用量−効果曲線から以下の算出方法により被験ｓｉＲＮＡのＧＳＣＭを標的したＩＣ５０値を算出した。
【０４８１】
【数１】
2021503941.tif 000082
式中、
Ｙは、残存ｍＲＮＡの発現レベルであり、
Ｘは、トランスフェクションｓｉＲＮＡの濃度の対数値であり、
Ｂｏｔは、定常期の最低のＹ値であり、
Ｔｏｐは、定常期の最高のＹ値であり、
ＬｏｇＩＣ５０は、Ｙが最低と最高との間の半分にある場合のＸ値であり、ＨｉｌｌＳｌｏｐｅは、曲線の傾きであった。結果を図２に示した。
【０４８２】
図２から分かるように、複合体２は、優れた標的ｍＲＮＡ抑制効果を有するとともに、さらに低いオフターゲット効果を示した。
【０４８３】
（実験例２）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体の安定性を証明した。
【０４８４】
（実験例２−１）ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソーム溶解液における安定性
リソソーム溶解液で処理された試験サンプルの調製：複合体１及び複合体２（それぞれｓｉＲＮＡ濃度が２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供され、１群あたり６μｌ）をそれぞれ２７．２μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、４．０８μＬの脱イオン水及び２．７２μＬのトリトソーム（Ｘｅｎｏｔｅｃｈ社から購入、番号Ｒ０６１０ＬＴ、ロット番号１６１００６９、最終濃度０．２ｍＵ／μＬ）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０ｈ、５ｍｉｎ、１５ｍｉｎ、３０ｍｉｎ、１ｈ、２ｈ、４ｈ、８ｈに５μｌの試料を取り出し、それぞれ１５μＬの９Ｍ尿素に加えて変性させた後、４μｌの６×試料負荷緩衝液（Ｓｏｌａｒｂｉｏ社、番号２０１６０８３０）を加え、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。０時間は、被験サンプルとリソソーム溶解液を均一に混合した後、直ちに取り出した時点を表す。
【０４８５】
リソソーム溶解液で処理されていない参照サンプルの調製：等モル量の複合体４（２０μＭ）を１．５μｌとり、７．５μＬのクエン酸ナトリウム水溶液（ｐＨ５．０）、１μＬの脱イオン水と均一に混合し、３０μＬの９Ｍ尿素溶液を加えて変性させた後、８μＬの６×試料負荷緩衝液を加えて均一に混合し、直ちに−８０℃の冷蔵庫に冷凍して反応を停止させた。参照サンプルは、電気泳動図においてＣｏｎと記される。
【０４８６】
１６重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記試験サンプル及び参照サンプルをそれぞれ２０μｌとり、ゲルに負荷させ、２０ｍＡの定電流条件で１０ｍｉｎ電気泳動した後、４０ｍＡの定電流条件で３０ｍｉｎ電気泳動し続けた。電気泳動終了後、ゲルをシェーカーに放置し、Ｇｅｌｒｅｄ染料（ＢｉｏＴｉｕｍ社、番号１３Ｇ１２０３）で１０ｍｉｎ染色した。ゲルイメージングを行い観察して撮影し、結果を図３に示した。
【０４８７】
図３は、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外リソソームにおける安定性の半定量的検出結果を示す。結果から、本開示の複合体は、リソソームにおいて長時間維持して分解されず、非常に良好な安定性を示すことができることが示された。
【０４８８】
（実験例２−２）ｓｉＲＮＡ複合体のヒト血漿における安定性
複合体１、複合体２（それぞれｓｉＲＮＡ濃度が２０μＭの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供され、１群あたり１２μｌ）及び比較配列１（２０μＭ、１２μｌ）をそれぞれ１０８μＬの９０％ヒト血漿（Ｈｕｍａｎ  ｐｌａｓｍａ、ＰＢＳで希釈）と均一に混合した。３７℃で恒温培養した。それぞれ０、２、４、６、８、２４、４８、７２時間で１０μＬのサンプルを取り出し、直ちに液体窒素により急速冷凍し、−８０℃の冷蔵庫に冷凍して保存した。各時点でサンプリングした後、上記冷凍保存サンプルをそれぞれ１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）で５倍希釈した後、各サンプルを１０μＬずつとって使用に備えた。同時に、等モル量のｓｉＲＮＡ（２μＭ、２μｌ）又はｓｉＲＮＡ複合体（ｓｉＲＮＡ濃度が２μＭ、２μｌ）をとり、８μｌの１×ＰＢＳ（ｐＨ７．４）と均一に混合し、ヒト血漿処理されていない１０μＬのサンプルとして調製し、Ｃｏｎと記した。
【０４８９】
２０重量％の非変性ポリアクリルアミドゲルを配合し、上記予備サンプルにおける各群の全てのサンプルと４μＬの試料負荷緩衝液（２０ｍＭのＥＤＴＡ、３６重量％グリセリン、０．０６重量％プロムフェノールブルーの水溶液）を混合した後、前述したゲルに負荷させ、８０ｍＡの定電流条件で６０分間電気泳動した。電気泳動終了後、１×Ｓｙｂｒ  Ｇｏｌｄ染料（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｔ．１１４９４）で１５分間染色した後イメージングを行った。結果を図４に示した。
比較配列１：
センス鎖：ＣＣＵＵＧＡＧＧＣＡＵＡＣＵＵＣＡＡＡ（配列番号４６）
アンチセンス鎖：ＵＵＵＧＡＡＧＵＡＵＧＣＣＵＣＡＡＧＧＵＵ（配列番号４７）
【０４９０】
図４には、被験複合体の体外でのヒト血漿における安定性の半定量的検出結果が示された。
【０４９１】
図４の結果から分かるように、本開示の複合体は、ヒト血漿において７２ｈまでも分解されておらず、優れたヒト血漿における安定性を示した。
【０４９２】
（実験例２−３）ｓｉＲＮＡ複合体のサル血漿における安定性
他の実験において、実験例２−２と同じ方法により複合体４のサル血漿（Ｍｏｎｋｅｙ  ｐｌａｓｍａ、鴻泉生物から購入、ＨＱ７００８２、ＰＢＳで希釈）における安定性を検出した。結果を図５に示した。
【０４９３】
図５には、被験ｓｉＲＮＡ複合体の体外でのサル血漿における安定性の半定量的検出結果が示された。
【０４９４】
図５の結果から分かるように、本開示のｓｉＲＮＡ複合体は、カニクイザル血漿において７２ｈまでも分解されておらず、優れたサル血漿における安定性を示した。
【０４９５】
（実験例３）本実験例では、マウスにおいて本開示の複合体によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現に対する抑制を証明した。
【０４９６】
本実験例では、ＨＢＶトランスジェニックマウスＣ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊにおいて複合体１及び比較複合体２によるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を調べた。
【０４９７】
Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ−Ｔｇ（Ａｌｂ１ＨＢＶ）４４Ｂｒｉ／Ｊマウスは、北京大学医学部実験動物科学部から購入し、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原診断キット（酵素結合免疫吸着測定法）（上海科華生物）を用いてマウス血清におけるＨＢｓＡｇの含有量を検出し、Ｓ／ＣＯＶ＞１０のマウスを選択し、マウスを４匹／群でランダムに分け（いずれも雌性）、それぞれ番号を付け、さらに生理食塩水ＮＳ対照群を追加した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、皮下注射により単回投与し、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｌ／ｋｇの異なる用量で複合体１を投与し（０．２ｍｇ／ｍｌ及び０．０２ｍｇ／ｍｌの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供される）、投与体積が５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与後７日目に動物を死亡させ、肝臓を回収し、ＲＮＡ  ｌａｔｅｒ（Ｓｉｇｍａ  Ａｌｄｒｉｃｈ社）で保存し、組織ホモジナイザーで肝組織をホモジナイズし、さらにＴｒｉｚｏｌで全ＲＮＡ抽出の標準操作手順により抽出して全ＲＮＡを得た。
【０４９８】
蛍光定量的リアルタイムＰＣＲにより肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現量を検出した。具体的には、ＩｍＰｒｏｍ−ＩＩＴＭ逆転写キット（Ｐｒｏｍｅｇａ社）を用いてその説明書により抽出した全ＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、続いて、蛍光定量的ＰＣＲキット（北京康為世紀生物科技有限公司）を用い、ｓｉＲＮＡによる肝組織におけるＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量に対する抑制効率を検出した。当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ＧＡＰＤＨ遺伝子を内因性参照遺伝子とし、ＨＢＶ  Ｘに対するプライマー及びＧＡＰＤＨに対するプライマーを用いてそれぞれＨＢＶ及びＧＡＰＤＨを検出した。
【０４９９】
検出プライマーの配列は、表３に示される。
【０５００】
【表３】
2021503941.tif 000083
【０５０１】
当該蛍光定量的ＰＣＲ法では、ＨＢＶ  ｍＲＮＡの発現量は、ＨＢＶ  Ｘ遺伝子発現残量で表され、以下の等式により算出された。
【０５０２】
ＨＢＶ  Ｘ遺伝子発現残量＝（試験群ＨＢＶ  Ｘ遺伝子のコピー数／試験群β−アクチンのコピー数）／（対照群ＨＢＶ  Ｘ遺伝子のコピー数／対照群β−アクチンのコピー数）×１００％。図においてＨＢＶ  Ｘ／β−アクチン  ｍＲＮＡ発現量と記した。
【０５０３】
その後、下式により複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率を算出した。
【０５０４】
複合体によるｍＲＮＡに対する抑制率＝（１−ＨＢＶ  Ｘ遺伝子発現残量）×１００％。
【０５０５】
対照群は、本実験においてＮＳが施された対照群マウスであり、各試験群は、それぞれ異なるｓｉＲＮＡ複合体が施された投与群マウスであった。結果を図６に示した。
【０５０６】
図６の結果から分かるように、上記本開示の複合体１は、１ｍｇ／ｋｇの投与量で、標的ｍＲＮＡに対する抑制率が８１．７３％に達し、良好な抑制効果を示した。
【０５０７】
他の実験においては、投与されたｓｉＲＮＡ複合体を複合体２に変更して試験を行い、７日目に検出データを収集したこと以外、上記と同じ方法により、マウスＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量を検出した。結果を図７に示した。
【０５０８】
他の実験においては、投与されたｓｉＲＮＡ複合体を複合体１、複合体２及び比較複合体２に変更して試験を行い、複合体１及び比較複合体２について、それぞれ１ｍｇ／ｋｇ及び０．１ｍｇ／ｋｇの２つの用量で投与し、複合体２を１ｍｇ／ｋｇの用量で投与し、検出配列を表４に示される配列に変更したこと以外、上記と同じ方法により、マウスＨＢＶ  ｍＲＮＡ発現量を検出した。結果を図８に示した。
【０５０９】
【表４】
2021503941.tif 000084
【０５１０】
図７及び図８の結果から分かるように、上記本開示の複合体は、標的ｍＲＮＡに対して、いずれも良好な抑制効果を示し、かつ、異なるＨＢＶ  ｍＲＮＡに対する抑制効果が基本的に一致した。
【０５１１】
（実験例４）本実験では、本開示のｓｉＲＮＡ複合体のＨＢＶトランスジェニックマウスにおけるｓｉＲＮＡの血清ＨＢｓＡｇ発現量及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する抑制効率の時間関連性試験を説明した。
【０５１２】
ＡＡＶ−ＨＢＶ低濃度モデルマウスに対して、血清におけるＨＢｓＡｇの含有量に従ってランダムに分け（５匹／群）、それぞれ複合体２及びＮＳブランク対照を投与した。全ての動物について、体重に応じて投与量を算出し、単回皮下投与し、用量が３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの２群であり、薬物を０．６ｍｇ／ｍｌ及び０．２ｍｇ／ｍｌの０．９％塩化ナトリウム水溶液として提供し、投与体積が５ｍｌ／ｋｇであった。薬剤投与前（Ｄ０と記する）及び薬剤投与後７、１４、２１、２８、５６、８４、９８、１１２、１２６、１４０日目にマウスに対して眼窩静脈叢採血を行い、各時点で血清ＨＢｓＡｇレベルを検出した。
【０５１３】
１回あたり約１００μｌ眼窩採血し、遠心後の血清が２０μｌ以上であった。ＨＢｓＡｇ  ＣＬＩＡキット（安図生物、ＣＬ０３１０）により血清におけるＨＢｓＡｇの含有量を検出した。
【０５１４】
標準化された血清ＨＢｓＡｇレベル＝（薬剤投与後の試験群におけるＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前の試験群におけるＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。
【０５１５】
ＨＢｓＡｇ抑制率＝（１−薬剤投与後の試験群におけるＨＢｓＡｇの含有量／薬剤投与前の試験群におけるＨＢｓＡｇの含有量）×１００％。ここで、ＨＢｓＡｇの含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりに含まれるＨＢｓＡｇの当量（ＵＩ）で表される。
【０５１６】
結果を図９に示した。
【０５１７】
図９の結果から分かるように、薬剤投与後の異なる時点で、ＮＳ陰性対照群は、いずれの抑制作用も示さなかったのに対して、複合体２は、薬剤投与後の異なる時点でＨＢｓＡｇに対して、いずれも優れたＨＢｓＡｇ抑制効果を示し、１００日間程度の長期間、高い血清ＨＢｓＡｇ抑制率を示し続け、長期間にわたってＨＢＶ遺伝子の発現を安定的かつ効率的に抑制することができることを示した。
【０５１８】
さらなる実験では、上記方法により、１．２８ｃｏｐｙマウスにおいて、複合体２を用い、３ｍｇ／ｋｇ及び１ｍｇ／ｋｇの２つの用量群で投与し、投与時間を８５日間まで維持し、上記の方法によりＨＢｓＡｇの抑制効果を検出した。結果を図１０に示した。
【０５１９】
ＱＩＡａｍｐ  ９６  ＤＮＡ  Ｂｌｏｏｄ  Ｋｉｔ説明書を参照して血清中ＤＮＡを抽出し、定量ＰＣＲを行い、ＨＢＶ  ＤＮＡの発現レベルを検出した。結果を図１１に示した。
【０５２０】
標準化された血清ＨＢＶ  ＤＮＡレベル＝（薬剤投与後の試験群におけるＨＢＶ  ＤＮＡの含有量／薬剤投与前の試験群におけるＨＢＶ  ＤＮＡの含有量）×１００％。
【０５２１】
ＨＢＶ  ＤＮＡ抑制率＝（１−薬剤投与後の試験群におけるＨＢＶ  ＤＮＡの含有量／薬剤投与前の試験群におけるＨＢＶ  ＤＮＡの含有量）×１００％。
【０５２２】
ここで、ＨＢＶ  ＤＮＡ含有量は、血清１ミリリットル（ｍｌ）あたりに含まれるＨＢＶ  ＤＮＡのコピーで表される。
【０５２３】
図１０及び１１の結果から分かるように、１．２８ｃｏｐｙマウスにおいて、本開示の複合体２は、８５日間にわたってＨＢＶ遺伝子発現及びＨＢＶ  ＤＮＡに対する効率的な抑制を示し続けた。
【０５２４】
以上に本開示の実施形態を詳しく記載したが、本開示は、上記実施形態の具体的な細部に限定されず、本開示の技術的思想の範囲で、本開示の技術的解決手段に対して複数種の簡単な変形をすることができ、これらの簡単な変形は、いずれも本開示の保護範囲に属する。
【０５２５】
このほかに説明すべきこととして、上記発明を実施するための形態に記載された各具体的な技術的特徴は、矛盾がない場合、任意の適切な方法により組み合わせることができ、不必要な重複を避けるために、本開示では各種の可能な組合せ方法を別途説明しない。
【０５２６】
また、本開示の各種の異なる実施形態は任意に組み合わせることもでき、本開示の精神から逸脱しない限り、その組み合わせも同様に、本開示に開示された内容とみなすべきである。
【図１】
2021503941.tif 000106
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【配列表】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年7月30日(2020.7.30)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
センス鎖とアンチセンス鎖を含むｓｉＲＮＡであって、前記ｓｉＲＮＡの各ヌクレオチドがそれぞれ独立して修飾又は未修飾のヌクレオチドであり、前記センス鎖はヌクレオチド配列Ｉを含み、アンチセンス鎖はヌクレオチド配列ＩＩを含み、前記ヌクレオチド配列Ｉと前記ヌクレオチド配列ＩＩとが、少なくとも一部で逆相補的に二本鎖領域を形成し、前記ヌクレオチド配列Ｉは、ヌクレオチド配列Ａを含み、前記ヌクレオチド配列Ａは、配列番号１に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、前記ヌクレオチド配列ＩＩは、ヌクレオチド配列Ｂを含み、前記ヌクレオチド配列Ｂは、配列番号２に示されるヌクレオチド配列と長さが等しく、且つヌクレオチド差異が３つ以下であり、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺ−３’（配列番号１）、
５’−Ｚ’ＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡ−３’（配列番号２）
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵであり、
前記ヌクレオチド配列Ａに、位置がＺに対応するヌクレオチドＺＡが含まれ、前記ヌクレオチド配列Ｂに、位置がＺ’に対応するヌクレオチドＺ’Ｂが含まれ、前記Ｚ’Ｂが、前記アンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであるｓｉＲＮＡ。
【請求項２】
ヌクレオチド配列Ａが配列番号３に示されるヌクレオチド配列であり、ヌクレオチド配列Ｂが、配列番号４に示されるヌクレオチド配列であり、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺＡ−３’（配列番号３）、
５’−Ｚ’ＢＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡ−３’（配列番号４）
ただし、前記Ｚ’Ｂはアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ＺＡはＡ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ’ＢはＺＡと相補的なヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項３】
前記ヌクレオチド配列Ｉがヌクレオチド配列ＩＩＩをさらに含み、前記ヌクレオチド配列ＩＩがヌクレオチド配列ＩＶをさらに含み、ヌクレオチド配列ＩＩＩとヌクレオチド配列ＩＶの長さがそれぞれ独立して１〜４ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩがヌクレオチド配列Ａの５’末端に結合され、ヌクレオチド配列ＩＶがヌクレオチド配列Ｂの３’末端に結合され、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩと前記ヌクレオチド配列ＩＶは、長さが等しく、実質的に逆相補的又は完全に逆相補的であり、前記実質的に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間に１つ以下の塩基ミスマッチが存在することを指し、完全に逆相補的であるとは、２つのヌクレオチド配列間にミスマッチがないことを指す、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項４】
前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも１ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基がＧであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも２ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基組成がＡＧであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも３ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基組成がＡＡＧであり、
或いは、前記ヌクレオチド配列ＩＩＩとＩＶは、長さがいずれも４ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、ヌクレオチド配列ＩＩＩの塩基組成がＣＡＡＧである、請求項３に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項５】
前記ヌクレオチド配列ＩＩがヌクレオチド配列Ｖをさらに含み、ヌクレオチド配列Ｖは、長さが１〜３ヌクレオチドであり、前記アンチセンス鎖の３’末端に結合され、アンチセンス鎖の３’オーバーハング末端を構成する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項６】
前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号５に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺＡ−３’（配列番号３）、
５’−Ｚ’ＢＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号５）
或いは、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖が配列番号３に示されるヌクレオチド配列を含み、前記アンチセンス鎖が配列番号６に示されるヌクレオチド配列を含み、
５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺＡ−３’（配列番号３）、
５’−Ｚ’ＢＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＵＵ−３’（配列番号６）
ただし、前記Ｚ’Ｂはアンチセンス鎖の５’末端の１番目のヌクレオチドであり、ＺＡはＡ、Ｕ、Ｇ又はＣから選択され、Ｚ’ＢがＺＡと相補的なヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項７】
ｓｉＨＢＶＳ１
センス鎖：５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺ−３’（配列番号１）
アンチセンス鎖：５’−Ｚ’ＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＧＣ−３’（配列番号７）、又は
ｓｉＨＢＶＳ２
センス鎖：５’−ＵＧＣＵＡＵＧＣＣＵＣＡＵＣＵＵＣＵＺ−３’（配列番号１）
アンチセンス鎖：５’−Ｚ’ＡＧＡＡＧＡＵＧＡＧＧＣＡＵＡＧＣＡＵＵ−３’（配列番号８）であって、
ただし、ＺはＡであり、Ｚ’はＵである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項８】
前記センス鎖と前記アンチセンス鎖における各ヌクレオチドが独立してフルオロ修飾ヌクレオチド又は非フルオロ修飾ヌクレオチドであり、
前記フルオロ修飾ヌクレオチドがヌクレオチド配列Ａとヌクレオチド配列Ｂに位置し、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ａの第７、８、９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４、１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項９】
各非フルオロ修飾ヌクレオチドがいずれもメトキシ修飾ヌクレオチドであり、前記メトキシ修飾ヌクレオチドが、リボース基の２’−ヒドロキシ基がメトキシで置換されたヌクレオチドを指す、請求項８に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１０】
５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、８、９、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第５、７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、
或いは、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ａの第７、８及び９位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであり、５’末端から３’末端に向かって、前記ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖におけるヌクレオチド配列Ｂの第２、６、１４及び１６位のヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであり、ｓｉＲＮＡのアンチセンス鎖の他の位置のヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドである、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１１】
前記ｓｉＲＮＡがｓｉＨＢＶＳ３、ｓｉＨＢＶＳ４、ｓｉＨＢＶＳ５又はｓｉＨＢＶＳ６である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ：
ｓｉＨＢＶＳ３
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号１０）
ｓｉＨＢＶＳ４
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号１１）
ｓｉＨＢＶＳ５
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号１３）、又は
ｓｉＨＢＶＳ６
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号１４）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表す。
【請求項１２】
前記ｓｉＲＮＡにおいて、少なくとも一つのリン酸基エステル基がチオリン酸エステル基であり、該チオリン酸エステル基が、
前記センス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記センス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の５’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間、
前記アンチセンス鎖の３’末端から１番目のヌクレオチドと２番目のヌクレオチドとの間、及び
前記アンチセンス鎖の３’末端から２番目のヌクレオチドと３番目のヌクレオチドとの間からなる群より選ばれる少なくとも１つに結合されて存在する、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１３】
前記ｓｉＲＮＡがｓｉＨＢＶＳ７、ｓｉＨＢＶＳ８、ｓｉＨＢＶＳ９又はｓｉＨＢＶＳ１０である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ：
ｓｉＨＢＶＳ７
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号１６）
ｓｉＨＢＶＳ８
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号１７）
ｓｉＨＢＶＳ９
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号１９）
ｓｉＨＢＶＳ１０
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号２０）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表す。
【請求項１４】
前記アンチセンス鎖の５’末端のヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであり、前記５’−リン酸ヌクレオチドが、式（２）に示される構造を有するヌクレオチドであり、前記５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドが、構造が式（３）〜式（６）のいずれか１つに示されるヌクレオチドから選択され、
【化１】
2021503941.tif 000117
ただし、ＲはＨ、ＯＨ、メトキシ基又はフッ素から選択され、ＢａｓｅはＡ、Ｕ、Ｃ、Ｇ又はＴから選択される塩基を表す、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ。
【請求項１５】
前記ｓｉＲＮＡがｓｉＨＢＶＳ１１、ｓｉＨＢＶＳ１２、ｓｉＨＢＶＳ１３、ｓｉＨＢＶＳ１４、ｓｉＨＢＶＳ１５、ｓｉＨＢＶＳ１６、ｓｉＨＢＶＳ１７又はｓｉＨＢＶＳ１８である、請求項１に記載のｓｉＲＮＡ：
ｓｉＨＢＶＳ１１
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号２１）
ｓｉＨＢＶＳ１２
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号９）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号２２）
ｓｉＨＢＶＳ１３
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＧｍＣｍ−３’（配列番号２３）
ｓｉＨＢＶＳ１４
センス鎖：５’−ＵｍＧｍＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１２）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍＡｆＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍＵｍＵｍ−３’（配列番号２４）
ｓｉＨＢＶＳ１５
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号２５）
ｓｉＨＢＶＳ１６
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｍＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１５）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｍＧｍＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号２６）
ｓｉＨＢＶＳ１７
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＧｍｓＣｍ−３’（配列番号２７）
ｓｉＨＢＶＳ１８
センス鎖：５’−ＵｍｓＧｍｓＣｍＵｍＡｆＵｍＧｆＣｆＣｆＵｍＣｍＡｍＵｍＣｍＵｍＵｍＣｍＵｍＡｍ−３’（配列番号１８）
アンチセンス鎖：５’−Ｐ１−ＵｍｓＡｆｓＧｍＡｍＡｍＧｆＡｍＵｆＧｆＡｍＧｍＧｍＣｍＡｆＵｍＡｆＧｍＣｍＡｍｓＵｍｓＵｍ−３’（配列番号２８）
ただし、大文字Ｃ、Ｇ、Ｕ、Ａはヌクレオチドの塩基組成を表し、小文字ｍは、当該文字ｍの左側に隣接する１つのヌクレオチドがメトキシ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｆは、当該文字ｆの左側に隣接する１つのヌクレオチドがフルオロ修飾ヌクレオチドであることを表し、小文字ｓは、当該文字の左右２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステル基により結合されていることを表し、大文字Ｐ１は、当該文字の右側に隣接する１つのヌクレオチドが５’−リン酸ヌクレオチド又は５’−リン酸アナログ修飾ヌクレオチドであることを表す。
【請求項１６】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡ及び薬学的に許容可能な担体を含む、薬物組成物。
【請求項１７】
請求項１に記載のｓｉＲＮＡ及び当該ｓｉＲＮＡに複合して結合される複合基を含むｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項１８】
式（３０８）に示される構造を有する、請求項１７に記載のｓｉＲＮＡ複合体：
【化２】
2021503941.tif 000118
式中、
ｎ１は、１〜３から選択される整数であり、ｎ３は、０〜４から選択される整数であり、
ｍ１、ｍ２及びｍ３は独立して、２〜１０から選択される整数であり、
Ｒ１０、Ｒ１１、Ｒ１２、Ｒ１３、Ｒ１４及びＲ１５がそれぞれ独立して、Ｈであり、又はＣ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基及びＣ１−Ｃ１０アルコキシ基からなる群から選択され、
Ｒ３は式Ａ５９に示される構造の基であり、
【化３】
2021503941.tif 000119
式中、Ｅ１はＯＨ、ＳＨ又はＢＨ２であり、ＮｕがｓｉＲＮＡであり、
Ｒ２は、長さ１〜２０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｒ２は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
各Ｌ１は、長さ１〜７０の炭素原子の直鎖アルキレン基であり、そのうちの１又は複数の炭素原子が、Ｃ（Ｏ）、ＮＨ、Ｏ、Ｓ、ＣＨ＝Ｎ、Ｓ（Ｏ）２、Ｃ２−Ｃ１０アルケニレン基、Ｃ２−Ｃ１０アルキニレン基、Ｃ６−Ｃ１０アリーレン基、Ｃ３−Ｃ１８ヘテロシクリレン基及びＣ５−Ｃ１０ヘテロアリーレン基からなる群から選択される１又は複数で任意に置換され、Ｌ１は、Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、Ｃ６−Ｃ１０アリール基、Ｃ５−Ｃ１０ヘテロアリール基、Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＯＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＯＨ、−ＯＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＣ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＳＨ、−ＳＣ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基、ハロゲン置換基、−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ２、−Ｃ１−Ｃ１０アルキル−ＮＨ２、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、シアノ基、ニトロ基、−ＣＯ２Ｈ、−Ｃ（Ｏ）Ｏ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＣＯＮＨ２、−ＮＨＣ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＣ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−Ｎ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル）Ｃ（Ｏ）（フェニル基）、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキルフェニル基、−Ｃ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０ハロアルキル基、−ＯＣ（Ｏ）Ｃ１−Ｃ１０アルキル基、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２（フェニル基）、−ＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ２、−ＳＯ２ＮＨ（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＳＯ２ＮＨ（フェニル基）、−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０アルキル基）、−ＮＨＳＯ２（フェニル基）及び−ＮＨＳＯ２（Ｃ１−Ｃ１０ハロゲン化アルキル基）からなる群のいずれか１つ又は複数の置換基を任意に有してもよく、
2021503941.tif 000120
は、基が分子の残りの部分に結合される部位を表し、
Ｍ１は標的基を表す。
【請求項１９】
各Ｌ１が式Ａ１〜Ａ２６の基から独立して選択される１又は複数の結合の組合せである、請求項１８に記載のｓｉＲＮＡ複合体：
【化４】
2021503941.tif 000121
式中、ｊ１は１〜２０の整数であり、ｊ２は１〜２０の整数であり、
Ｒ’はＣ１−Ｃ１０のアルキル基であり、
Ｒａは、式Ａ２７〜Ａ４５の基又はその任意の組合せからなる群から選択され、
【化５】
2021503941.tif 000122
2021503941.tif 000123
ＲｂはＣ１−Ｃ１０のアルキル基である。
【請求項２０】
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ５、Ａ６、Ａ８、Ａ１０、Ａ１１、Ａ１３から選択される１又は複数の結合の組合せである、又は、
Ｌ１が、Ａ１、Ａ４、Ａ８、Ａ１０及びＡ１１から選択される少なくとも２つの結合の組合せである、請求項１８又は１９に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２１】
Ｌ１の長さが３〜２５個又は４〜１５個の原子である、請求項１９のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２２】
ｍ１、ｍ２及びｍ３がそれぞれ独立して２〜５の整数である、又は、ｍ１＝ｍ２＝ｍ３である、請求項１９記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２３】
各前記標的基が独立して哺乳動物の肝細胞表面のアシアロ糖タンパク質受容体（ＡＳＧＰＲ）と親和性のあるリガンドである、請求項１８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２４】
各前記標的基が独立してアシアロ糖タンパク質又は糖である、請求項２３に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２５】
前記標的基の少なくとも１つ又は各々がガラクトース又はＮ−アセチルガラクトサミンである、請求項２３に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２６】
式（４０３）、（４０４）、（４０５）、（４０６）、（４０７）、（４０８）、（４０９）、（４１０）、（４１１）、（４１２）、（４１３）、（４１４）、（４１５）、（４１６）、（４１７）、（４１８）、（４１９）、（４２０）、（４２１）又は（４２２）に示される構造を有する、請求項１８に記載のｓｉＲＮＡ複合体：
【化６】
2021503941.tif 000124
2021503941.tif 000125
2021503941.tif 000126
【請求項２７】
式Ａ５９におけるＰが前記ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端に結合される、請求項１８に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【請求項２８】
Ｂ型肝炎ウイルスの感染による病理学的状態又は疾患の治療及び／又は予防のために用いられる、請求項１〜１５のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ、請求項１６に記載の薬物組成物又は請求項１７〜２７のいずれか１項に記載のｓｉＲＮＡ複合体。
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０１５８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０１５８】
便宜上、Ｌ１は、線形アルキレン基として定義されるが、例えば上述の取替及び／又は置換によって生じるアミンやアルケニル基で、線形基ではない、又は名称が異なる可能性があることは、当業者に理解される。本開示内容の目的のために、Ｌ１の長さは、２つの結合点を結合する鎖における原子数である。この目的のために、前記直鎖アルキレンの炭素原子を置換して得られた環（例えば、ヘテロシクリレン又はヘテロアリーレン）を、１個の原子とする。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０２３８
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０２３８】
いくつかの実施形態において、前記キャッピング試薬は、キャッピング試薬１（ｃａｐ１）及びキャッピング試薬２（ｃａｐ２）からなり、キャッピング試薬１は、Ｎ−メチルイミダゾールであり、いくつかの実施形態において、Ｎ−メチルイミダゾールのピリジン／アセトニトリル混合溶液として提供され、ピリジンとアセトニトリルとの体積比が１：１０〜１：１であり、いくつかの実施形態において、１：３〜１：１であり、ピリジンとアセトニトリルの総体積とＮ−メチルイミダゾールの体積との比が１：１〜１０：１であり、いくつかの実施形態において、３：１〜７：１である。前記キャッピング試薬２は、酢酸無水物であり、いくつかの実施形態において、酢酸無水物のアセトニトリル溶液として提供され、酢酸無水物とアセトニトリルとの体積が１：１〜１：１０であり、いくつかの実施形態において１：２〜１：６である。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３０７
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３０７】
本明細書で用いられる用語「薬剤投与／投与」とは、ｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体を少なくとも一部、所望の部位に局在化することにより所望の効果を生じさせる方法又は経路により、ｓｉＲＮＡ、薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び／又は第２種のｓｉＲＮＡ複合体を被験体の体内に入れることを指す。本開示の方法に適した投与経路は、局所投与と全身投与を含む。一般的には、局所投与により、被験体の全身よりも多くのｓｉＲＮＡ又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体が特定の部位に送達されるが、全身投与により、前記ｓｉＲＮＡ又は薬物組成物、第１種のｓｉＲＮＡ複合体及び第２種のｓｉＲＮＡ複合体が被験体のほぼ全身に送達される。本開示がＢ型肝炎の予防及び／又は治療手段を提供することを意図することを考慮すると、薬物を肝臓に送達することができる投与方法が好ましい。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０３５９
【補正方法】変更
【補正の内容】
【０３５９】
固相ホスホルアミダイト法により、上記工程で調製されたＬ−１０化合物を出発として循環させ、センス鎖のヌクレオチドの並び順に従い３’−５’方向に一つずつヌクレオシドモノマーを結合した。ヌクレオシドモノマーを結合するごとに、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化又は硫化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、酸化の４つの反応を行った。２個のヌクレオチド間がチオリン酸エステルにより結合される場合、次のヌクレオシドモノマーを結合するとき、脱保護、カップリング、キャッピング、硫化の４つの反応を行った。合成条件は、以下のように規定された。
【国際調査報告】
2021503941.tif 000127
2021503941.tif 000128
2021503941.tif 000129
2021503941.tif 000130
2021503941.tif 000131
2021503941.tif 000132