(57)【要約】個体から分離された試料と、ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせと、を接触させる段階と、ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを接触させて形成される複合体から、試料において、ＢＡＧ２の存在またはレベルを測定する段階と、試料から測定されたＢＡＧ２の存在またはレベルを、対照群から測定されたＢＡＧ２レベルと比較する段階と、を含む癌を診断する方法、及び癌を診断するためのキットである。【選択図】なし
2021508832.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
個体から分離された試料と、ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせと、を接触させる段階と、
前記ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを接触させて形成される複合体から、前記試料において、ＢＡＧ２の存在またはレベルを測定する段階と、
前 記試料から測定されたＢＡＧ２の存在またはレベルを、対照群から測定されたＢＡＧ２レベルと比較する段階と、を含む癌診断方法。
【請求項２】
前記試料は、血液、血清、血漿、またはそれらの組み合わせであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記ＢＡＧ２は、血液、血液、血清、血漿、またはそれらの組み合わせに可溶性であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記ＢＡＧ２ポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号１または２のアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記方法は、前記個体から分離された試料と、カテプシンＢのポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせと、を接触させる段階と、
前記カテプシンＢのポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを接触させて形成される複合体から、カテプシンＢの存在またはレベルを測定する段階と、
前記試料から測定されたカテプシンＢの存在またはレベルと、対照群から測定されたカテプシンＢのレベルと、を比較する段階と、をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項６】
前記カテプシンＢは、プロカテプシンＢであることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記カテプシンＢポリペプチドのアミノ酸配列は、配列番号３ないし８のうちから選択されたいずれか１つのアミノ酸配列を有することを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項８】
前記試料において、ＢＡＧ２またはカテプシンＢの存在またはレベルを測定する段階は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析（ＲＩＡ）、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、蛋白質チップ、またはそれらの組み合わせによってなることを特徴とする請求項５に記載の方法。
【請求項９】
前記癌は、乳癌、大腸癌、肺癌、肉腫、黒色腫、頭頸部癌、子宮頸部癌、子宮癌、肝臓癌、腎臓癌、膵腸癌及び神経芽細胞種から選択されたことを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項１０】
前記乳癌は、転移性乳癌であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１１】
前記乳癌は、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）であることを特徴とする請求項９に記載の方法。
【請求項１２】
血液、血清、血漿、またはそれらの組み合わせに存在するＢＡＧ２を検出するものであり、
前記ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを含む癌診断用キット。
【請求項１３】
前記キットは、カテプシンＢのポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせをさらに含むことを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１４】
前記癌は、乳癌、大腸癌、肺癌、肉腫、黒色腫、頭頸部癌、子宮頸部癌、子宮癌、肝臓癌、腎臓癌、膵腸癌及び神経芽細胞種から選択されたことを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１５】
前記乳癌は、転移性乳癌であることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【請求項１６】
前記乳癌は、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ）であることを特徴とする請求項１２に記載のキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、血液中に存在する、ＢＡＧ２、プロカテプシンＢ、またはそれらの組み合わせから癌を診断する方法に係り、具体的には、三重陰性乳癌を診断する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ＢＡＧ（co-chaperone Ｂｃｌ−２−associated athanogene）蛋白質ファミリは、細胞内蛋白質フォールディング、ストレス反応、神経分化、細胞死滅、細胞増殖などを含む多様な生理学的過程を媒介し、多様な協力蛋白質と機能的に結合する（Takayama and Reed., 2001;Doong et al., 2002）。それらにおいて、抗細胞死滅活性を有するＢＡＧドメインファミリ構成員のうち１つであるＢＡＧ２は、シャペロン関連ユビキチンリガーゼであるＣＨＩＰ（Ｃ−terminus of Ｈｓｃ７０−interacting protein）の陰性調節子として知られている（Arndtet al., 2005; Dai et al., 2005）。ＣＨＩＰ活性を抑制を介した蛋白質の調節において、ＢＡＧ２の主役割は、ＰＩＮＫ１及びＣＦＴＲのようなシャペロン関連蛋白質の安定化を介して、神経退行性疾患及び常染色体劣性障害と係わっている（Qu etal., 2015; Arndt et al., 2005）。ＢＡＧ２の発現は、プロテアソーム抑制子誘導の細胞死滅を増加させ、ＢＡＧ２ノックダウンは、甲状腺癌腫細胞を、プロテアソーム抑制子であるＭＧ１３２に露出させる場合、細胞死滅を部分的に抑制することにより、ＢＡＧ２が、抗細胞死滅（pro-apoptotic）活性を有することができることが提示されている（Wang et al., 2008）。一方、多様な突然変異Ｋ−Ｒａｓ誘導の腫瘍において、ＢＡＧ２の過発現が、強力な腫瘍遺伝子であるＳＴＫ３３蛋白質の安定化を促進させ、腫瘍発生を促進させることができるということが提示されている（Azoiteiet al., 2012）。しかし、そのような発見にもかかわらず、癌の進行及び転移におけるＢＡＧ２の役割、特に、乳癌においては、はっきりと明らかにされていない。
【０００３】
カテプシンＢ（ＣＴＳＢ：cathepsinＢ）は、内在的及び外来的なペブチダーゼ活性を有するリソゾームのシステインプロテアーゼであり、蛋白質循環の役割を行うと考えられる（Mortand Buttle, 1997）。ＣＴＳＢは、不活性／未成熟の前形態（pro-form）酵素（４１／４３ｋＤａ）として合成され、Ｎ−末端の６２個アミノ酸の前ペプチドの蛋白質加水分解過程を介して、活性一本鎖形態（３１ｋＤａ）または二本鎖形態（重鎖（２５／２６ｋＤａ）、軽鎖（５ｋＤａ））に転換される。ＣＴＳＢの異常（aberrant）発現／活性は、折々悪性腫瘍と連結されていた（Joyce et al., 2004;Withans, 2012）。しかし、成熟したＣＴＳＢは、一般的に、リソゾームに位置し、リソゾーム媒介自家捕食（autophagy）／細胞死滅間抑制子プロテアーゼとして、蛋白質循環において機能することにより、細胞質ＣＴＳＢの抗細胞死滅的役割を示すと認識される（Stokaet al., 2001; Foghsgaard et al., 2001; Bhoopathi et al., 2010）。一方、癌進行におけるそのようなＣＴＳＢの二重的機能の調節子は、明確に明らかにされていない。
さらに、細胞において、ＢＡＧ２及びカテプシンＢの存在位置、分布、細胞の機能による位置移動などについては、詳細に研究されていない。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００４】
一様相は、個体から分離された試料と、ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせと、を接触させる段階と、前記ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを接触させて形成される複合体から、前記試料において、ＢＡＧ２の存在またはレベルを測定する段階と、前記試料から測定されたＢＡＧ２の存在またはレベルを、対照群から測定されたＢＡＧ２レベルと比較する段階と、を含む癌を診断する方法を提供する。
他の様相は、血液、血清（serum）、血漿（plasma）、またはそれらの組み合わせに存在するＢＡＧ２を検出するものであり、前記ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを含む癌診断用キットを提供する。
【発明の効果】
【０００５】
一様相による血中ＢＡＧ２ポリペプチドの存在またはレベルを測定して癌を診断する方法により、癌を診断するために組織を採取した既存の方法に比べ、さらに容易であって正確に癌を診断することができる。
他の様相は、血液から血中ＢＡＧ２ポリペプチドの存在またはレベルを測定するための癌診断用キットにより、多様な診断機関において、癌診断のために、前記癌診断方法を容易に活用することができる。
【図面の簡単な説明】
【０００６】
【図１】ＲＮＡシーケシングを利用し、内腔型細胞株及びＴＮＢＣ細胞株において、ＢＡＧファミリの異なる発現量差を分析したボルカノプロット（volcano plot）を示したグラフである。
【図２】ボルカノプロットから分析された、内腔型細胞株及びＴＮＢＣ細胞株におけるＢＡＧ２のｍＲＮＡ発現量を示したグラフである。
【図３】５２個の乳癌細胞株から分析されたＢＡＧ２発現量を、スキャッタードットプロット（scatter dot-plot）で示したグラフである。
【図４】正常細胞類型及び各乳癌細胞類型において、ＢＡＧ２発現量を分析したマイクロアレイ（Ａ）及びそのＲＮＡシーケシング結果（４Ｂ）を示したグラフである。
【図５】内腔型組織及びＴＮＢＣ組織でのＢＡＧ２発現量を分析した定量的ＲＴ−ＰＣＲ結果を示したグラフである。
【図６】ＢＡＧ２が、ＣＴＳＢの形態及び活性に及ぼす影響を、免疫ブロット側面（Ａ）及びＣＴＳＢ活性度側面（Ｂ）で分析したグラフである。
【図７】ＴＮＢＣを培養した条件培地から、ＢＡＧ２及びＣＴＳＢを、免疫ブロットして検出した結果を示したグラフである。
【図８】ＴＮＢＣを培養した条件培地から検出されたプロカテプシンＢのレベルを示したグラフである。
【図９】ＢＡＧ２過発現細胞株を培養した条件培地から検出されたＢＡＧ２及びＣＴＳＢを、免疫ブロットして検出した結果を示したグラフである。
【図１０】健康人と乳癌患者との血清からＢＡＧ２の存在を検出した結果を示したグラフである。
【発明を実施するための形態】
【０００７】
以下、本発明についてさらに詳細に説明する。
本発明で使用される全ての技術用語は、異なって定義されない以上、本発明の関連分野において、通常の当業者が一般的に理解するような意味で使用される。また、本明細書には、望ましい方法や試料が記載されるが、それと類似していたり、同等であったりするものなども、本発明の範疇に含まれる。本明細書に参考文献として記載される全ての刊行物の内容は、全体が本明細書に参照として統合される。
一様相は、個体から分離された試料と、ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせと、を接触させる段階と、前記ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを接触させて形成される複合体から、前記試料において、ＢＡＧ２の存在またはレベルを測定する段階と、前記試料から測定されたＢＡＧ２の存在またはレベルを、対照群から測定されたＢＡＧ２レベルと比較する段階と、を含む癌診断方法を提供する。
【０００８】
他の具体例において、前記方法は、癌を診断するための情報を提供する方法であって、個体で癌の存在を検出し、個体内に存在する癌を診断するためのものである。
個体から分離された試料内にＢＡＧ２が存在する場合、ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせが前記試料中のＢＡＧ２と結合することができる。前記抗体またはポリペプチドは、前記試料中のＢＡＧ２の存在を視覚化させるために、例えば、蛍光物質（fluorophore）、発色団（chromophore）、または基質を発色団に転換させることができる酵素で標識されたものでもある。
前記結合反応により、前記試料中のＢＡＧ２が、前記ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせと複合体を形成することになり、前記複合体から、当業者に知られた方法を利用し、ＢＡＧ２存在、または必要により、そのレベルを測定することができる。一具体例において、前記複合体を測定する段階は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ（enzyme linked immunosorbent assay）、放射線免疫分析（ＲＩＡ：radioimmunoassay）、放射免疫拡散法（radioimmunodiffusion）、オクタロニー（Ouchterlony）免疫拡散法、ロケット（rocket）免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法（immunoprecipitation assay）、補体固定分析法（complementfixation assay）、ＦＡＣＳ、蛋白質チップ（protein chip）、またはそれらの組み合わせにもよる。
【０００９】
前記試料から測定されたＢＡＧ２の存在またはレベルを、対照群から測定されたＢＡＧ２レベルと比較し、前記個体に癌が存在するか否かということを診断することができる。前記対照群は、健康な個体から採取された試料、または必要によっては、多様な類型の乳癌患者平均、非転移性乳癌患者、またはＴＮＢＣ型ではない乳癌患者から採取された試料でもある。従って、前記対照群から測定されたＢＡＧ２レベルは、ＢＡＧ２レベルの健康な個体から採取された試料、または必要によっては、多様な類型の乳癌患者平均、非転移性乳癌患者、またはＴＮＢＣ型ではない乳癌患者から採取された試料中のＢＡＧ２濃度の平均値を意味するものでもある。前記対照群として使用される試料は、前記診断のための試料と、解剖学的に同一位置で採取したものであり、同一種類のものでもある。例えば、前記試料が、個体の肘窩中間静脈（median cubital vein）から採取された血液であるならば、前記対照群また対照群の肘窩中間静脈から採取された血液でもある。前記健康な個体は、任意の急性または慢性の疾患を病んでいない者であり、少なくとも癌を病んでおらず、望ましくは、乳癌を病んでいない者でもある。
【００１０】
前記健康な個体から採取された試料中のＢＡＧ２レベルは、ＢＡＧ２が実質的に存在しないものでもある。従って、対照群を、健康な個体から得られた値として設定する場合、診断対象になる個体において、ＢＡＧ２の存在が測定されたり、そのレベルが著しく高かったりすると測定されるならば、前記個体は癌を病んでいると疑うことができる。一方、本発明の実施例から分かるように、乳癌患者のうち転移性乳癌患者、特に、ＴＮＢＣ型患者の血液においては、ＢＡＧ２の存在が測定される確率が高く、平均値が著しく高い。従って、対照群を、多様な類型の乳癌患者平均、非転移性乳癌患者、またはＴＮＢＣ型ではない乳癌患者から分離された試料として設定する場合、診断対象になる個体において、ＢＡＧ２のレベルが、前記対照群の場合より高いか、あるいは著しく高いと測定されるならば、前記個体は、転移性乳癌またはＴＮＢＣ型乳癌を病んでいると疑うことができる。
本明細書において、前記「ポリペプチド」は、「蛋白質」と相互交換的に使用される。
前記試料は、診断の対象になる個体から分離されたものであり、細胞、器官、細胞溶解物、全血、血液、血清、血漿、リンパ、細胞外液、体液、尿、糞便、組織、骨髓、唾液、喀痰、脳脊髄液、またはそれらの組み合わせでもある。
【００１１】
一具体例において、前記試料は、血液、血清（serum）、血漿（plasma）、またはそれらの組み合わせでもある。本発明者らは、ＢＡＧ２が細胞外に分泌され、実際、乳癌患者の血液からＢＡＧ２が検出されることを証明した。従って、一具体例において、前記ＢＡＧ２は、血液、血液、血清、血漿、またはそれらの組み合わせに可溶性でもある。
一具体例において、本発明の診断方法は、前記個体から分離された試料と、カテプシンＢ（cathepsin Ｂ）のポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせと、を接触させる段階と、前記カテプシンＢのポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを接触させて形成される複合体から、カテプシンＢの存在またはレベルを測定する段階と、前記試料から測定されたカテプシンＢの存在またはレベルと、対照群から測定されたカテプシンＢのレベルと、を比較する段階と、をさらに含んでもよい。
【００１２】
本発明者らは、ＢＡＧ２は、カテプシンＢが成熟した形態に転換されることを妨害し、結果として、癌細胞の細胞死滅（apoptosis）を抑制することができるということを証明し、それと一致し、ＢＡＧ２、及び成熟されえない形態のカテプシンＢがいずれも細胞外に分泌されることを観察した。従って、本発明の診断方法は、ＢＡＧ２及びカテプシンＢを同時に検出することにより、診断の正確度をさらに上昇させることができる。
カテプシンＢは、プロカテプシンＢ、及び成熟した形態である一本鎖（single−chain）または二本鎖（double−chain）のカテプシンＢにも区分されるが、本発明者らは、ＢＡＧ２によって成熟されえない形態のカテプシンＢが、細胞外に分泌されることを証明した。従って、一具体例において、本発明の診断方法において、前記カテプシンＢは、プロカテプシンＢ（pro−cathepsin Ｂ）でもある。前記プロカテプシンＢは、「未成熟カテプシンＢ」または「未成熟ＣＴＳＢ」と同一意味にも使用されたものでもある。
一具体例において、前記試料中のカテプシンＢ、及び前記カテプシンＢのポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを接触させて形成される複合体を測定する段階は、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、蛋白質チップ、またはそれらの組み合わせにもよる。
【００１３】
用語「抗体」は、抗原性部位に対して指示される特異的な免疫グロブリンを意味する。前記抗体は、ＢＡＧ２及びプロカテプシンＢそれぞれに特異的に結合するポリペプチド、またはポリペプチドの組み合わせを意味し、ＢＡＧ２遺伝子またはプロカテプシンＢ遺伝子を発現ベクターにクローニングし、各遺伝子によってコーディングされる蛋白質を得て、得られたＢＡＧ２蛋白質またはプロカテプシンＢ蛋白質から、当業界に通常的な方法により、各蛋白質に対して特異的な抗体を製造することができる。前記抗体の形態は、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、または組み換え抗体（例えば、ＳｃＦｖ断片、diabody、一本鎖抗体など）を含み、全ての免疫グロブリン抗体が含まれる。前記抗体は、２個の全体長の軽鎖、及び２個の全体長の重鎖を有する完全な形態だけではなく、２個の軽鎖、及び２個の重鎖を有する完全形態の完全抗体の構造を有さないが、抗原性部位に指示される特異的な抗原結合部位（結合ドメイン）を有し、抗原結合機能を保有している抗体分子の機能的断片も含む。
【００１４】
前述のＢＡＧ２及びプロカテプシンＢのポリペプチドは、それぞれヒト（Homo sapiens）またはマウス（Mus musculus）に由来するものでもあり、猿、牛、馬のような他の哺乳動物に由来するものでもある。前記ＢＡＧ２のアミノ酸配列は、配列番号１または２（それぞれ、GenBank Accession Ｎｏ．ＮＰ＿００４２７３．１及びＮＰ＿６６３３６７．１）を含むものでもあり、前記プロカテプシンＢのアミノ酸配列は、配列番号３ないし８（それぞれ、GenBank Accession Ｎｏ．ＮＰ＿００１８９９，１，ＮＰ＿６８００９０．１，ＮＰ＿６８００９１．１，ＮＰ＿６８００９２．１，ＮＰ＿６８００９３．１またはＮＰ＿０３１８２４．１）を含むものでもある。前記配列番号１ないし８のアミノ酸配列が一部一致しないとしても、生物学的に同等な活性を有させるアミノ酸配列は、ＢＡＧ２ポリペプチドまたはプロカテプシンＢポリペプチドとも見なされる。前述のＢＡＧ２ポリペプチドまたはプロカテプシンＢポリペプチドは、それぞれ配列番号１または２、及び配列番号３または８のうちいずれか一つと、６０％以上、例えば、７０％以上、８０％以上、９０％以上、９５％以上、９９％以上または１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含むものでもある。また、前記ＢＡＧ２ポリペプチドまたはプロカテプシンＢポリペプチドは、それぞれ前記配列番号１または２、及び配列番号３または８のうちいずれか１つの配列において、１個以上のアミノ酸、２個以上のアミノ酸、３個以上のアミノ酸、４個以上のアミノ酸、５個以上のアミノ酸、６個以上のアミノ酸、または７個以上のアミノ酸の残基が異なる配列を有するポリペプチドでもある。
【００１５】
前記診断方法の対象になる個体は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、鼠（rat）、牛、馬、豚、犬、羊、山羊または猫でもあり、望ましくは、ヒトである。
一具体例において、本発明の診断方法で診断することができる癌は、乳癌、大腸癌、肺癌、肉腫、黒色腫、頭頸部癌、子宮頸部癌、子宮癌、肝臓癌、腎臓癌、膵腸癌及び神経芽細胞種から選択されたものでもある。
【００１６】
本発明者らは、ＢＡＧ２が乳癌患者で過発現し、特に、ＢＡＧ２レベルが高く測定された乳癌患者は、高い確率で転移性乳癌を病んでいるということを証明した。従って、一具体例において、本発明の診断方法で診断することができる乳癌は、転移性乳癌でもある。
乳癌の分子的下位類型において、三重陰性乳癌（ＴＮＢＣ：triple-negative breast cancer）は、体系的な治療にもかかわらず、好ましくない予後を示し、高い死亡率と係わった非常に攻撃的な類型である。ＴＮＢＣは、内腔型（luminal type）またはＨＥＲ２過多型（ＨＥＲ２−enriched type）と比較し、異質的な類型である（Foulkeset al., 2010; Dent et al., 2007; Masuda et al., 2013）。ほとんどの標的乳癌治療は、ホルモン受容体性及びＨＥＲ２陽性の乳癌に対して好戦的な成果を示す一方、ＴＮＢＣ患者は、３種標的受容体（ＥＲ、ＰＲ及びＨＥＲ２）、または他の好ましく定義された分子標的が不在であるので、効果的な治療のために、限定されたオプション（例えば、ポリＡＤＰ−リボースポリメラーゼ（ＰＡＲＰ）、表皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ：epidermal growth factor receptor）及びＳｒｃチロシンキナーゼなど）を有してしまう。従って、ＴＮＢＣ患者に不要な治療的接近を防止し、効果的な治療法を選択するために、多様な類型の乳癌患者において、ＴＮＢＣ患者を迅速であって正確に区別する必要がある。
【００１７】
本発明者らは、ＢＡＧ２が乳癌患者で過発現し、特に、ＢＡＧ２レベルが高く測定された乳癌患者は、高い確率でＴＮＢＣ型乳癌を病んでいるということを証明した。従って、一具体例において、本発明の診断方法で診断することができる乳癌は、三重陰性乳癌（または、ＴＮＢＣ型乳癌）でもある。
【００１８】
他の様相は、前記ＢＡＧ２ポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせを含む癌診断用キットを提供する。前記キットは、血液、血清、血漿、またはそれらの組み合わせに存在するＢＡＧ２を検出するものであり、該キットに適用される試料には、個体から分離された血液、血清、血漿、またはそれらの組み合わせを提供する。
【００１９】
一具体例において、前記キットは、カテプシンＢのポリペプチド、またはその断片に特異的に結合する抗体、ポリペプチド、またはそれらの組み合わせをさらに含んでもよい。
前記キットは、そのキットが利用する分析方法（例えば、ウェスタンブロッティング、ＥＬＩＳＡ、放射線免疫分析、放射免疫拡散法、オクタロニー免疫拡散法、ロケット免疫電気泳動、組織免疫染色、免疫沈澱分析法、補体固定分析法、ＦＡＣＳ、蛋白質チップ、またはそれらの組み合わせ）に適する１以上の他の構成成分組成物、溶液または装置をさらに含んでもよい。例えば、試料中のＢＡＧ２またはカテプシンＢと、それらそれぞれに特異的な抗体との免疫複合体の検出のために、基質、適する緩衝溶液、発色酵素または蛍光物質で標識された二次抗体、発色基質をさらに含んでもよい。前記基質は、ニトロセルロース膜、ポリビニル樹脂で合成された９６ウェルプレート、ポリスチレン樹脂で合成された９６ウェルプレート、及びガラススライドグラスなどでもあり、発色酵素として、ペルオキシダーゼ（peroxidase）、アルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase）が利用され、蛍光物質として、ＦＩＴＣ、ＲＩＴＣなど、発色基質として、２，２’−アジノ−ビス（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）またはｏ−フェニレンジアミン（ＯＰＤ）、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）などが使用されもする。
前記キットで言及された用語または要素のうち、請求された診断方法に係わる説明で言及されたようなことは、請求された診断方法に係わる説明で言及されたようなものであると理解される。
【実施例】
【００２０】
１．実施例１：多様な乳癌株におけるＢＡＧ２の発現確認
１−１．乳癌細胞株に係わる転写体（transcriptome）分析
ＴＮＢＣ進行と係わる新規分子的標的を確認するために、本発明者らは、まず、乳癌細胞株において、ＲＮＡシーケシングを利用した転写体分析を行った。まず、多様な乳癌細胞株から、該分野に周知されている方法を利用してＲＮＡを抽出し、業体（Theragen）に遺伝体分析を依頼した。その後、乳癌細胞株を、内腔型（ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ−７５Ｂ）またはＴＮＢＣ（ＭＤＡ−ＭＢ−２３１、Ｈｓ５７８Ｔ）に区分し、ＢＡＧ２の発現量を比較した。
その結果、図１及び２に示されているように、ＢＡＧ２が内腔型細胞株と比較し、特異的にＴＮＢＣ細胞株で過発現しているということが分かった。
【００２１】
１−２．５２個乳癌細胞株でのＢＡＧ２発現傾向確認
実施例１−１で拡張し、さらに多様な乳癌細胞においてＢＡＧ２発現傾向を確認した。乳癌細胞情報は、パブリックマイクロアレイデータセット（ＧＳＥ４１３１３、Riazet al., 2013）から得た。Riaz ｅｔ ａｌ．に公開された５２個の乳癌細胞株において、ＢＡＧ２発現傾向を確認した結果、図３に示されているように、ＢＡＧ２が、ＴＮＢＣにおいて、内腔型に比べ、著しく高く発現するということが分かった（Ｐ＜０．０００１）。
【００２２】
１−３．臨床的ＢＡＧ２発現傾向確認
細胞株で確認したＢＡＧ２発現傾向をさらに正確に確認するために、本発明者らは、癌ゲノムアトラス（ＴＣＧＡ：The Cancer Genome Atlas）保存所から得られた乳癌患者のＲＮＡシーケシングデータセット及びマイクロアレイを利用し、乳癌の多様な下位類型において、ＢＡＧ２発現傾向を分析した。
その結果、図４の（Ａ）及び（Ｂ）に示されているように、正常、内腔型Ａ（ＬｕｍＡ）、内腔型Ｂ（Ｌｕｍ Ｂ）及びＨＥＲ２過多（ＨＥＲ２）の患者と比較し、ＴＮＢＣ患者において、ＢＡＧ２発現が著しく高いレベルにあるということが分かった。
【００２３】
１−４．ＢＡＧ２発現傾向の実験的確認
公開されたデータベースを利用して分析された前述の傾向性を実験的にさらに確認するために、定量的ＲＴ−ＰＣＲ（quantitative ＲＴ−ＰＣＲ）を行った。
具体的には、検討委員会（ＩＲＢ：the institutional review board）承認（ＩＲＢ承認番号：３−２０１３−０２６８）後、江南セブランス病院から、乳癌のうち、内腔型１２個及びＴＮＢＣ６個を得た。その後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Invitrogen）を利用し、販売者の指針により、細胞から総ＲＮＡを単離した。その後、１８ｒＲＮＡをハウスキーピング遺伝子にし、ＢＡＧ２検出のためのプライマーを利用し、power ＳＹＢＲ Green ＰＣＲMaster Mix及びViia ７ real-time ＰＣＲ装置（Applied Biosystems）を利用し、定量的ＲＴ−ＰＣＲを行った。
その結果、図５に示されているように、ＴＮＢＣにおいて、内腔型に比べ、ＢＡＧ２が過発現しているということを確認することができた。
【００２４】
２．実施例２：ＢＡＧ２及びカテプシンＢの相互作用確認
ＢＡＧ２が、カテプシンＢの調節上位因子として作用しうるか否かということを確認するために、ＢＡＧ２及びカテプシンＢの相互作用いかん、ＢＡＧ２によるカテプシンＢの活性変化を観察した。
【００２５】
２−１．ＢＡＧ２及びカテプシンＢの相互作用の蛋白質レベルでの確認
ＢＡＧ２欠失細胞株を作製するために、まず、ＢＡＧ２特異的ｓｈＲＮＡを、Mission−ｓｈＲＮＡ（Sigma）から購入した。ＢＡＧ２特異的ｓｈＲＮＡレンチウイルス作製のために、２９３Ｔ細胞を、ｐＬＫＯ−ＢＡＧ２、またはスクランブルされた対照群ｐＬＫＯ−ｐＧＬ２に対し、Δ８．９及びＶＳＶ−Ｇをコーディングするパッケージングプラスミドと共に形質注入させた（使用されたＢＡＧ２ｓｈＲＮＡの標的配列（５’→３’）：ＧＴＡＣＴＡＧＧＡＴＣＴＡＧＣＡＴＡＴＴＴ）。形質注入後、３６ないし４８時間後、ウイルス上澄み液を収集し、０．４５μｍ濾過器を介して濾過した。ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ）を、６ウェルプレートに、１ｘ１０５細胞／ウェルに接種（seed）し、ウイルス粒子（particle）及びポリブレン（８ｕｇ／ｍｌ）で感染させた。感染後、前記ウイルスを含む培地を一般培地に替えた後、前記細胞をプロミシン（２μｇ／ｍｌ）で選択した。製造されたＢＡＧ２欠失細胞株をＢＡＧ２ｓｈＲＮＡにした。
ＢＡＧ２を過発現させるために、同様に、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１（ＡＴＣＣ）に、Lipofectamine ２０００（Invitrogen）を利用し、販売者の指針により、Ｍｙｃ−ｔａｇＢＡＧ２発現ベクターを形質注入し、ＢＡＧ２を過発現する細胞をＢＡＧ２ ＯＶにし、ＢＡＧ２ ｓｈＲＮＡにＢＡＧ２を形質注入したものを、ＢＡＧ２回復した細胞として、ＢＡＧ２救助（rescue）にした。
【００２６】
前記各細胞をＰＢＳで洗浄して溶解させた後、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を介して分離させ、ＰＶＤＦ膜（Millipore）に移動させ、図６に表示された各抗体を利用して免疫ブロットすることにより、各蛋白質を検出した。特に、ＣＴＳＢ抗体は、前形態（pro-form）及び成熟した形態のＣＴＳＢ（ＳＣ（single chain）及びＤＣ（double chain））をいずれも認知するので、分子量で区分することができる。
その結果、図６（Ａ）に示されているように、ＢＡＧ２欠失細胞においては、切断されたカスパーゼ３が発現し、カスパーゼ３の活性型が増加しているということが分かったが、それは、ＢＡＧ２の回復によって減少した。また、ＢＡＧ２欠失細胞においては、一本鎖（ＳＣ）カテプシンＢも増加したと観察されたが、それは、カスパーゼ３と同様に、ＢＡＧ２の回復によって減少した。従って、ＢＡＧ２がプロカテプシンＢにおいて成熟した形態である一本鎖カテプシンＢに転換されることを妨害するメカニズムに関与するということが分かる。
【００２７】
２−２．ＢＡＧ２のＣＴＳＢ活性に対する影響力確認
ＣＴＳＢ調節に対するＢＡＧ２の影響力をさらに確実なものにするために、ＢＡＧ２存在いかんによるＣＴＳＢの活性変化を観察した。
具体的には、前記実施例３−１でのように、ＢＡＧ２欠失ＭＣＦ１０ＣＡ１ａ細胞を作製し、ＢＡＧ２発現ベクターを形質注入し、ＢＡＧ２を過発現させるか、あるいはＢＡＧ２欠失細胞において、ＢＡＧ２発現を回復させた。成熟したＣＴＳＢは、Ａｒｇ−Ａｒｇを含む合成ペプチドを基質にするので、その後、蛍光形成カテプシンＢ基質（２００μＭＡｃ−ＲＲ−ＡＦＣ，Ａｂｃａｍ）と販売者との指針により、準備された細胞試料を、２７℃で１時間インキュベーションした。蛍光測定は、多重プレート検出器であるWallac １４４０ Victor２（PerkinElmer）上で行い、相対的な蛍光ユニットを３５５ｎｍの励起波長を利用し、４６０ｎｍで測定した。
その結果、図６（Ｂ）に示されているように、ＢＡＧ２欠失ＭＣＦ１０ＣＡ１ａ細胞に、ＢＡＧ２をさらに導入した結果、ＢＡＧ２不在のＣＴＳＢ活性が増大することが観察され、ＢＡＧ２が、ＣＴＳＢ成熟型への変換を抑制し、結果として、ＣＴＳＢ活性を低下させるということが分かる。従って、ＢＡＧ２は、ＣＴＳＢと相互作用し、ＣＴＳＢ成熟型への変換を抑制し、カスパーゼ３媒介された細胞死滅の阻害に関与するということが分かる。
【００２８】
実施例３．血中ＢＡＧ２のＣＴＳＢ存在確認
３−１．ＴＮＢＣ細胞のＢＡＧ２及びＣＴＳＢの分泌いかん確認
ＢＡＧ２及びＣＴＳＢが、ＴＮＢＣ細胞内に存在するだけではなく、細胞外に分泌されもするかということを確認した。
具体的には、ＴＮＢＣ細胞として、Ｈｓ５７８Ｔ、ＭＤＡ−ＭＢ−２３１及びＭＣＦ１０ＡＣａ１に、実施例２−１のように、ＢＡＧ２が欠失された細胞を作製した後、各細胞を条件培地ＤＭＥＭ（Ｃａｔ．ＬＭ００１−０５、ＷＥＬＧＥＮＥ）で培養し、細胞が採取されないように注意を払いながら、その上澄み液を採取した後、実施例２−１のように免疫ブロットした。蛋白質総量を示すために、一部を販売者の指針により、クマシブルー染色（ＥＬＴ００６、ＥＬＢＩＯ）した。
また、前記培地から得られた試料のうち一部は、プロカテプシンＢ quantikinｅ ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステム）を利用し、販売者の指針によって分析し、ＢＡＧ２過発現された細胞株であるＭＣＦ１０ＡＴ１を培養した培地において、ＢＡＧ２及びＣＴＳＢの存在いかんを再確認した。
その結果、図７ないし図９から分かるように、ＢＡＧ２が発現されるＴＮＢＣ細胞を培養した培地内に、ＢＡＧ２及びＣＴＳＢがいずれも観察された。特に、ＣＴＳＢは、プロ−ＣＴＳＢとしてＢＡＧ２発現と傾向性が同一に示された。
【００２９】
３−２．血中でのＢＡＧ２及びＣＴＳＢの分泌いかん確認
ＢＡＧ２が細胞外に分泌されるということを確認したので、さらに、血中に分泌され、血液でにおいても検出されるか否かということを確認した。
具体的には、健康な支援者（Ｎ＝１７）の血清、及び悪性乳癌患者（Ｎ＝７６）の血清を採取した。前述の得られた血清を、ヒトＢＡＧ２ＥＬＩＳＡキット（MyBiosource）を利用して販売者の指針によって分析した。
その結果、図１０から分かるように、乳癌患者の血清において、健康な支援者と比較し、ＢＡＧ２が血中において著しい程度に検出されるということが分かる。
前記実施例において、Ｐ値は、垂直両側スチューデントｔ−検定（unpaired two-tailed Student’s t-test）を利用し、３回の独立した実験から平均＋＿ＳＤで示した。
以上、本発明について、その望ましい実施例を中心に説明した。本発明が属する技術分野で当業者であるならば、本発明が、本発明の本質的な特性から外れない範囲で変形された形態に具現されるということを理解することができるであろう。従って、前述の開示された実施例は、限定的な観点ではなく、説明的な観点から考慮されなければならない。本発明の範囲は、前述の説明ではなく、特許請求の範囲に示されており、それと同等な範囲内にある全ての差異は、本発明に含まれたものであると解釈されなければならないのである。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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