(57)【要約】本発明は、第１の目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ１）；フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフ（ＦＳＭ／ＴＲＭ）；および第２の目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ２）を含む核酸構築物を提供する。本発明はまた、このような構築物を発現するベクターおよび細胞を提供する。本発明はまた、核酸構築物中の２つの導入遺伝子の相対発現をモジュレートするための方法であって、下流導入遺伝子の発現を減少させるために、前記２つの導入遺伝子の間にフレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフを含める工程を含む方法を提供する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
第１の目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ１）；フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）；および第２の目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ２）を含む、核酸構築物。
【請求項２】
ＮＯＩ１およびＮＯＩ２が別個のタンパク質として発現されるように、切断部位（ＣＬ）をコードするヌクレオチド配列も含む、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項３】
構造：
ＮＯＩ１−ＣＬ−ＦＳＭ−ＮＯＩ２；または
ＮＯＩ１−ＴＲＭ−ＣＬ−ＮＯＩ２
を有する、請求項２に記載の核酸構築物。
【請求項４】
ウラシル、チミンまたはグアニン塩基のリピートを含むフレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項５】
前記ＦＳＭが配列ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含む、請求項４に記載の核酸構築物。
【請求項６】
前記ＦＳＭが終止コドンも含む、請求項４または５に記載の核酸構築物。
【請求項７】
前記ＦＳＭが、以下の配列：
ＵＵＵＵＵＵＵＧＡ（配列番号２）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＧ（配列番号３）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＡ（配列番号４）
の１つを含む、請求項６に記載の核酸構築物。
【請求項８】
配列ＳＴＯＰ−ＣＵＡＧまたはＳＴＯＰ−ＣＡＡＵＵＡ（ここで、「ＳＴＯＰ」は終止コドンである）を含む翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）を含む、請求項１〜３のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項９】
前記翻訳リードスルーモチーフが、以下の配列：
ＵＧＡ−ＣＵＡＧ（配列番号５）
ＵＡＧ−ＣＵＡＧ（配列番号６）
ＵＡＡ−ＣＵＡＧ（配列番号７）
ＵＧＡ−ＣＡＡＵＵＡ（配列番号８）
ＵＡＧ−ＣＡＡＵＵＡ（配列番号９）
ＵＡＡ−ＣＡＡＵＵＡ（配列番号１０）
の１つを含む、請求項８に記載の核酸構築物。
【請求項１０】
構造：
ＮＯＩ１−ＴＲＭ−ＣＬ−ＮＯＩ２
ＮＯＩ１−ＴＲＭ１−ＴＲＭ２−ＣＬ−ＮＯＩ２
ＮＯＩ１−ＣＬ１−ＴＲＭ−ＣＬ２−ＮＯＩ２
ＮＯＩ１−ＴＲＭ−ＣＬ−ＳＰ−ＮＯＩ２
ＮＯＩ１−ＴＲＭ１−ＣＬ１−ＮＯＩ２−ＴＲＭ２−ＣＬ２−ＮＯＩ３
ＮＯＩ１−ＴＲＭ１−ＣＬ１−ＴＲＭ２−ＣＬ２−ＮＯＩ２
（ここで、
ＴＲＭ１およびＴＲＭ２は同じものまたは異なるものでもよく、第１および第２の翻訳リードスルーモチーフであり；
ＣＬ１およびＣＬ２は同じものまたは異なるものでもよく、それぞれが切断部位をコードする第１および第２の核酸配列であり、
ＳＰは減衰シグナルペプチドであり；ならびに
ＮＯＩ３は第３の目的のヌクレオチド配列である）
を有する、請求項８または９に記載の核酸構築物。
【請求項１１】
前記切断部位が、自己切断ペプチド、フューリン切断部位またはタバコエッチウイルス切断部位を含む、請求項２〜１０のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１２】
前記切断部位が、アフトウイルスもしくはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａ様ペプチドを含む、請求項１１に記載の核酸構築物。
【請求項１３】
ＮＯＩ２が、サイトカイン、ケモカインまたは毒素をコードする、請求項１〜１２のいずれかに記載の核酸構築物。
【請求項１４】
細胞において発現されると、２つの産物：
ａ）ＮＯＩ１のみによりコードされる第１の産物；ならびに
ｂ）ＮＯＩ１およびＮＯＩ２によりコードされる第２の産物であって、フレームスリップまたは翻訳リードスルーが起こる場合に産生される第２の産物
を産生することができる、請求項１に記載の核酸構築物。
【請求項１５】
前記第２の産物がキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、前記第１の産物が、ＣＡＲ媒介性細胞シグナル伝達を誘導することができない前記ＣＡＲの短縮バージョンである、請求項１４に記載の核酸構築物。
【請求項１６】
前記第１の産物が、細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり、前記第２の産物が、細胞内シグナル伝達ドメインおよび１つまたはそれを超える共刺激ドメインを含むＣＡＲである、請求項１４に記載の核酸構築物。
【請求項１７】
請求項１〜１６のいずれかに記載の核酸構築物を含む、ベクター。
【請求項１８】
請求項１７に記載のレトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクター。
【請求項１９】
請求項１〜１６のいずれか一項に記載の核酸構築物または請求項１７もしくは１９に記載のベクターを含む、細胞。
【請求項２０】
請求項１９に記載の細胞を作製するための方法であって、請求項１〜１６のいずれかに記載の核酸構築物または請求項１７もしくは１８に記載のベクターを細胞に導入する工程を含む、方法。
【請求項２１】
核酸構築物中の２つの導入遺伝子の相対発現をモジュレートするための方法であって、下流導入遺伝子の発現を減少させるために、前記２つの導入遺伝子の間にフレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフを含める工程を含む、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、導入遺伝子の相対発現をモジュレートするための構築物および方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
複数の導入遺伝子の発現
遺伝子治療は、病的症状を処置または矯正するための生体分子を発現するように細胞を修飾することを伴う。生理学的または治療的に関連するレベルの生体分子のいずれかの取得は、遺伝子治療を成功させるために重要である。
【０００３】
遺伝子発現をモジュレートするための現在の方法は、一般に、転写速度を増加もしくは減少させるか、またはそれらに調節エレメントを挿入して、操作された転写因子および小分子の作用を通じてそれらの発現を誘導性にするようにプロモーター領域を修飾することに依拠する。
【０００４】
遺伝子治療のアプローチは、多くの場合、１つを超える導入遺伝子の発現を伴う。複数の産物を産生するために複数のベクターを細胞に形質導入することは困難であり、費用がかかり、予測不可能である。この理由により、単一のベクターからの２つのタンパク質の共発現を可能にするために様々な方法が開発されている（図１を参照のこと）。
【０００５】
最初の試みは、同じカセット内で２つの異なるプロモーターを使用したが、これは、それぞれが別個のタンパク質をコードする２つの別個の転写産物をもたらす。多くの理由により、これは困難なアプローチである。重要な問題は、第１のプロモーターが優位であり、第２のプロモーターのサイレンシングを引き起こす「プロモーター干渉」である。加えて、異なるプロモーターは、異なる細胞状況では異なって機能し、これは、各導入遺伝子の相対発現の一貫した「調整（tuning）」を達成困難にする。
【０００６】
代替的なアプローチは、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）を使用することである。ここでは、単一の転写産物が生成される。転写産物中のＩＲＥＳ配列は、２つの導入遺伝子のオープンリーディングフレームの間に配置され、ｍＲＮＡキャップ構造を模倣する。したがって、リボソームは、５’キャップまたはＩＲＥＳのいずれかで翻訳を開始し、２つの別個のタンパク質の発現をもたらす。この方法の重要な制限は、相対発現を制御することができないことである。３’転写産物は、典型的には、５’のものよりも低く発現されるが、発現の比は予測および調整困難である。
【０００７】
口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）（および関連ウイルス）が単一のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）から複数のタンパク質を発現できるようにするＦＭＤＶ  ２Ａペプチドの役割を明らかにした後に、さらなるアプローチが開発された（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．；８２，１０２７−１０４１（２００１））。２Ａペプチド（およびホモログ）は、ＯＲＦの翻訳の直後に非常に高い効率で切断され、単一のＯＲＦからの複数のペプチドの発現を可能にする。２Ａペプチドなどの自己切断ペプチドの使用は、１：１の比で導入遺伝子の発現をもたらす。
【０００８】
国際公開第２０１６／１７４４０９号は、核酸構築物内の導入遺伝子発現の比を変動させるための改変シグナルペプチドの使用について記載している。この系では、変異を、例えばタイプＩ膜貫通タンパク質のシグナルペプチドモチーフに導入して、細胞表面への輸送の有効性を減少させる。このアプローチは、細胞表面の発現レベルを、野生型シグナルペプチドモチーフと比較して約１０倍減少させることを可能にする。
【０００９】
しかしながら、この戦略は、細胞表面へのタンパク質の輸送を減少させることにより機能するので、細胞表面タンパク質の発現を低下させるためにのみ適切である。また、発現の１０倍の減少は、過剰発現が宿主細胞の死をもたらし得る毒性化合物の発現などのいくつかの用途については十分ではない可能性がある。
【００１０】
したがって、細胞における２つまたはそれを超える導入遺伝子の相対発現を改変するための代替的なアプローチであって、これらの制限を伴わない代替的なアプローチが必要である。
【００１１】
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
キメラ抗原受容体Ｔ細胞（ＣＡＲ−Ｔ細胞）療法は、細胞表面上の腫瘍特異的抗原を認識するキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）の発現を通じて、細胞溶解性Ｔ細胞を標的腫瘍細胞に向け直す。キメラ抗原受容体は、抗体またはリガンド結合モチーフ、スペーサードメインおよび膜貫通ドメインがＴ細胞受容体（ＴＣＲ）のＣＤ３ζ鎖由来の細胞内シグナル伝達ドメインに融合されたものからなる。ＣＤ２８、ＯＸ４０または４−１ＢＢなどの共受容体由来のシグナル伝達ドメインもまた、ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインと共にＣＡＲ１に含められ得る。
【００１２】
ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は、それ自体が、印象的な奏効率を達成したＢ細胞白血病などの血液悪性腫瘍のための有効な処置であることを実証している。しかしながら、多くの要因が複合的にＣＡＲ−Ｔ細胞活性を制限する固形腫瘍の処置では、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法は同じ成功を達成することができなかった。これらとしては、ＰＤ−Ｌ１などの免疫抑制リガンドの発現、好ましい炎症反応を緩和するサイトカインの分泌、腫瘍細胞によるアポトーシスを誘導するリガンドの発現、および栄養素の枯渇が挙げられる。免疫抑制性腫瘍微小環境を克服するために、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、免疫抑制性シグナル伝達を遮断するか、またはＴ細胞が好ましくない腫瘍微小環境で生存することを可能にする分子を発現するように操作されている。
【００１３】
炎症反応を増強するサイトカインは、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の有効性を増加させ得る。これらとしては、ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ１５、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１が挙げられ、これらは、外部から提供されるか、またはＣＡＲＴ細胞療法中に放出されると、ＣＡＲ−Ｔ細胞の反応を増強することが示されている。
【００１４】
ＩＬ−１２は強力な免疫調節性サイトカインであり、通常、Ｔおよびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞シグナル；ならびに細胞外マトリックス成分に反応して食細胞および樹状細胞から分泌される。ＣＡＲ−Ｔ細胞は、構成的または誘導性プロモーターからＩＬ−１２を発現するように操作されており、これは、固形腫瘍をターゲティングする場合にＣＡＲ−Ｔ細胞療法の有効性を改善することが示されている。ＩＬ−１２は全身的に毒性であるので、ＣＡＲＴ細胞または他の免疫細胞は、ＩＬ−１２を腫瘍微小環境１に放出するように操作されている。しかしながら、トランスジェニックＴ細胞のＩＬ−１２分泌は、非常に毒性の全身レベルをもたらし得る。
【００１５】
サイトカイン、ケモカインまたは毒素の発現は、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の有効性を改善し得るが、これらの生体分子の分泌は、治療的利益および最小副作用を提供する安全レベル内に毒性を制限するように厳密に調節されなければならない。これは、シス作用性配列を挿入もしくは欠失させて所望のレベルの転写を得るか、または誘導性エレメントをプロモーター領域に導入することにより、プロモーター領域からの遺伝子転写の速度を調節することにより達成され得る。注目すべき誘導性プロモーター系としては、テトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）２の１９ｂｐヌクレオチド配列に結合する操作された形態のテトラサイクリンリプレッサータンパク質（ＴｅｔＲ）と併せてＴＲＥを利用するテトラサイクリンオフおよびテトラサイクリンオフ系が挙げられる。テトラサイクリンオフ系では、ＴｅｔＲを単純ヘルペスウイルス由来のビリオンタンパク質（viron  protein）１６（ＶＰ１６）のトランス活性化ドメインに融合して、テトラサイクリントランスアクチベーター（ｔＴＡ）を生成する。テトラサイクリンの非存在下では、ｔＴＡはプロモーター領域中のＴＲＥに結合し、遺伝子転写を増強する；逆に、テトラサイクリンの存在下では、ｔＴＡはＴＲＥに結合することができず、転写は起こらない。ｔＴＡ中のＴｅｔＲドメインを変異させて、ＴＲＥへの結合についてそれをテトラサイクリン依存的にすることにより、系上に逆ｔＴＡ（ｒｔＴＡ）およびテトラサイクリンが作られた。テトラサイクリンの存在下では、ｒｔＴＡは、ＴＲＥに結合して転写を刺激することができるが、その非存在下ではできない。テトラサイクリン誘導系は導入遺伝子発現の制御を可能にするが、それは、小分子の使用、プロモーター配列へのＴＲＥの挿入、およびそれを行うためのｔＴＡまたはｒｔＴＡのいずれかの発現に依拠し、細胞に大きな負担をかける。
【００１６】
遺伝子発現を制御するための代替的なアプローチは、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を使用することである。上記で説明されているように、ＩＲＥＳは一次導入遺伝子の下流に配置され、通常は一次導入遺伝子よりも低いレベルで、さらなる導入遺伝子の構成的発現を促進する。免疫反応を増強し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の注入前の宿主のプレコンディショニングの必要性を回避するために、このようなアプローチは、ＣＡＲ−Ｔ細胞においてＩＬ−１２を構成的に発現させるために使用されている。しかしながら、ＩＬ−１２の発現レベルは予測不可能であり、依然としてインビボで毒性である可能性がある。
【００１７】
したがって、上記不利な点に関連しない分子、例えばサイトカイン、ケモカインまたは毒素とキメラ抗原受容体を共発現させるための代替的な方法が必要である。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【００１８】
本発明者らは、導入遺伝子の発現をモジュレートする手段としてフレームスリップまたは翻訳リードスルーを使用する系を開発した。特に、前記系は、単一のｍＲＮＡ転写産物から発現される２つまたはそれを超える導入遺伝子の相対発現を制御するために使用され得る。
【００１９】
したがって、第１の態様では、本発明は、第１の目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ１）；フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフ（ＦＳＭ／ＴＲＭ）；および第２の目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ２）を含む核酸構築物を提供する。
【００２０】
核酸構築物はまた、ＮＯＩ１およびＮＯＩ２が別個のタンパク質として発現されるように、切断部位（ＣＬ）をコードするヌクレオチド配列を含み得る。
【００２１】
核酸構築物は、構造：
ＮＯＩ１−ＦＳＭ／ＴＲＭ−ＣＬ−ＮＯＩ２またはＮＯＩ１−ＣＬ−ＦＳＭ／ＴＲＭ−ＮＯＩ２
を含み得る。
【００２２】
特に、核酸構築物は、構造：
ＮＯＩ１−ＣＬ−ＦＳＭ−ＮＯＩ２；または
ＮＯＩ１−ＴＲＭ−ＣＬ−ＮＯＩ２
を含む。
【００２３】
核酸構築物は、２つを超える目的のヌクレオチド配列を含み得る。例えば、核酸構築物は、構造：
ＮＯＩ１−ＦＳＭ１／ＴＲＭ１−ＣＬ１−ＮＯＩ２−ＦＳＭ２／ＴＲＭ２−ＣＬ２−ＮＯＩ３、または
ＮＯＩ１−ＣＬ１−ＦＳＭ１／ＴＲＭ１−ＮＯＩ２−ＣＬ２−ＦＳＭ２／ＴＲＭ２−ＮＯＩ３
（ここで、
ＮＯＩ１、ＮＯＩ２およびＮＯＩ３は目的のヌクレオチド配列であり；
ＦＳＭ１／ＴＲＭ１およびＦＳＭ２／ＴＲＭ２は同じものまたは異なるものでもよく、フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフであり；ならびに
ＣＬ１およびＣＬ２は同じものまたは異なるものでもよく、それぞれが切断部位をコードする核酸配列である）
を有し得る。
【００２４】
フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）は、ウラシル、チミンまたはグアニン塩基のリピート、例えば配列ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）を含み得る。
【００２５】
フレームスリップモチーフはまた、終止コドンを含み得る。例えば、ＦＳＭは、以下の配列：
ＵＵＵＵＵＵＵＧＡ（配列番号２）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＧ（配列番号３）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＡ（配列番号４）
の１つを含み得る。
【００２６】
翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）は、配列ＳＴＯＰ−ＣＵＡＧまたはＳＴＯＰ−ＣＡＡＵＵＡ（ここで、「ＳＴＯＰ」は終止コドンである）を含み得る。例えば、翻訳リードスルーモチーフは、以下の配列：
ＵＧＡ−ＣＵＡＧ（配列番号５）
ＵＡＧ−ＣＵＡＧ（配列番号６）
ＵＡＡ−ＣＵＡＧ（配列番号７）
ＵＧＡ−ＣＡＡＵＵＡ（配列番号８）
ＵＡＧ−ＣＡＡＵＵＡ（配列番号９）
ＵＡＡ−ＣＡＡＵＵＡ（配列番号１０）
の１つを含み得る。
【００２７】
翻訳リードスルーモチーフを含む核酸構築物は２つの隣接ＴＲＭを含み得、これらは、同じものまたは異なるものでもよい。
【００２８】
翻訳リードスルーモチーフを含む核酸構築物は、それぞれが切断部位をコードする２つの核酸配列を含み得る。ＴＲＭは、２つの切断部位コード配列の間に位置し得るか、またはそれぞれが切断部位の上流に配置された２つのＴＲＭが存在し得る。
【００２９】
翻訳リードスルーモチーフを含む核酸構築物は、第２の（または後続の）目的のヌクレオチドの上流に位置する減衰または非効率シグナルペプチドを含み得る。
【００３０】
翻訳リードスルーモチーフを含む核酸構築物は、以下の構造：
ＮＯＩ１−ＴＲＭ−ＣＬ−ＮＯＩ２
ＮＯＩ１−ＴＲＭ１−ＴＲＭ２−ＣＬ−ＮＯＩ２
ＮＯＩ１−ＣＬ１−ＴＲＭ−ＣＬ２−ＮＯＩ２
ＮＯＩ１−ＴＲＭ−ＣＬ−ＳＰ−ＮＯＩ２
ＮＯＩ１−ＴＲＭ１−ＣＬ１−ＮＯＩ２−ＴＲＭ２−ＣＬ２−ＮＯＩ３
ＮＯＩ１−ＴＲＭ１−ＣＬ１−ＴＲＭ２−ＣＬ２−ＮＯＩ２
（ここで、
ＴＲＭ１およびＴＲＭ２は同じものまたは異なるものでもよく、第１および第２の翻訳リードスルーモチーフであり；
ＣＬ１およびＣＬ２は同じものまたは異なるものでもよく、切断部位をコードする第１および第２の核酸配列であり、
ＳＰは減衰シグナルペプチドであり；ならびに
ＮＯＩ３は第３の目的のヌクレオチド配列である）
の１つを有し得る。
【００３１】
切断部位は、例えば、自己切断ペプチド、フューリン切断部位またはタバコエッチウイルス切断部位を含み得る。
【００３２】
切断部位は、例えば、アフトウイルスもしくはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドまたは２Ａ様ペプチドを含み得る。
【００３３】
第２（または後続）の目的のヌクレオチドは、サイトカイン、ケモカインまたは毒素をコードし得る。
【００３４】
核酸構築物は、細胞において発現されると、２つの産物：
ａ）ＮＯＩ１のみによりコードされる第１の産物；ならびに
ｂ）ＮＯＩ１およびＮＯＩ２によりコードされる第２の産物であって、フレームスリップまたは翻訳リードスルーが起こる場合に産生される第２の産物
を産生することができるものであり得る。
【００３５】
この実施形態では、第２の産物は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）であり得、第１の産物は、ＣＡＲ媒介性細胞伝達を誘導することができないＣＡＲの短縮バージョンであり得る。
【００３６】
あるいは、第１の産物は、細胞内シグナル伝達ドメインを含むキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）（すなわち、第１世代ＣＡＲ）であり得、第２の産物は、細胞内シグナル伝達ドメインおよび１つまたはそれを超える共刺激ドメインを含むＣＡＲ（すなわち、第２世代または第３世代ＣＡＲである。
【００３７】
第２の態様では、本発明は、本発明の第１の態様による核酸構築物を含むベクターを提供する。
【００３８】
ベクターは、例えば、レトロウイルスベクターまたはレンチウイルスベクターであり得る。
【００３９】
第３の態様では、本発明は、本発明の第１の態様による核酸構築物または本発明の第２の態様によるベクターを含む細胞を提供する。
【００４０】
第４の態様では、本発明は、本発明の第３の態様による細胞を作製するための方法であって、本発明の第１の態様による核酸構築物または本発明の第２の態様によるベクターを細胞に導入する工程を含む方法を提供する。
【００４１】
第５の態様では、核酸構築物中の２つの導入遺伝子の相対発現をモジュレートするための方法であって、下流導入遺伝子の発現を減少させるために、前記２つの導入遺伝子の間にフレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフを含める工程を含む方法を提供する。
【００４２】
導入遺伝子発現を制御する手段としてフレームスリップまたは翻訳リードスルーを使用することの重要な利点は、広範囲の発現が達成可能であり、２つの導入遺伝子が発現される場合に、第２の導入遺伝子の発現レベルを第１の導入遺伝子の１％未満に減少させ得ることである。これは、改変シグナルペプチドを使用して達成され得るレベルよりもかなり低いものであり、非常に低いレベルの発現が必須である毒性化合物などのタンパク質の発現に前記技術を使用することを可能にする。
【００４３】
フレームスリップまたは翻訳リードスルーの使用は、予測可能な規定の比で導入遺伝子の発現を可能にする。異なるフレームスリッピングまたはリードスルーモチーフを使用することにより、導入遺伝子発現のレベルを調整することも可能である。
【００４４】
この系は、任意の導入遺伝子の発現を制御するために使用され得、細胞表面タンパク質の発現に限定されない。
【図面の簡単な説明】
【００４５】
【図１】同じベクターから異なるタンパク質を発現させるために利用される方法。（ａ）同じカセット内の２つの異なるプロモーターは、それぞれが別個のタンパク質を生じさせる２つの異なる転写産物をもたらす。（ｂ）内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）の使用は、２つの別個のタンパク質に翻訳される単一の転写産物をもたらす。（ｃ）ＦＭＤＶ２Ａペプチドの使用は、２つの別個のタンパク質に迅速に切断される単一の転写産物および単一のポリタンパク質をもたらす。
【図２】フレームスリップモチーフおよび構築物設計。（Ａ）一連の７つのウリジンを導入遺伝子配列に挿入したフレームスリップモチーフであって、フレームスリップを促進するフレームスリップモチーフを示す図。フレームスリッピングは、通常は−１方向の代替的なリーディングフレームの継続的な転写／翻訳、および機能的タンパク質の生成をもたらす。（Ｂ）導入遺伝子、フレームスリップモチーフ（ＳＬＩＰ）および２Ａ自己切断ペプチド配列の位置を示す構築物の構造。（Ｃ）ＲＱＲ８選別選択マーカーと、それに続く、制御配列（６×Ｕ）またはフレームスリップモチーフ（７×Ｕ）のいずれかと、ＣＤ１９の膜貫通および短縮エンドドメインに融合されたＣＤ２２の外部ドメインからなるＣＤ２２−ＣＤ１９キメラタンパク質とを含有する構築物を形質導入したＳｕｐＴ１細胞のフローサイトメトリー分析。フレームスリップモチーフの導入は、ＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの発現の劇的な減少をもたらし、同様のレベルのＲＱＲ８選別選択マーカーが観察された。
【図３】翻訳リードスルーモチーフおよび構築物設計。（Ａ）公知の翻訳リードスルーモチーフの例。（Ｂ〜Ｇ）翻訳リードスルーモチーフ構築物の構造。（Ｂ）翻訳リードスルーモチーフを第１の導入遺伝子の３’側ならびに２Ａ自己切断ペプチド配列および導入遺伝子２の５’側に配置した２つの導入遺伝子からなる翻訳リードスルー構築物。導入遺伝子１の発現は、導入遺伝子２よりも有意に高い。（Ｂ’）単一の終止コドンで達成されるものよりも発現レベルをさらに減少させるために２つの終止コドンを翻訳リードスルーモチーフに組み込んだ二重終止翻訳リードスルー構築物。（Ｃ）２つの２Ａ自己切断ペプチド配列に挟まれた翻訳リードスルーモチーフからなるユニバーサル翻訳リードスルー構築物。この構築物は、予測不可能なレベルの翻訳リードスルーをもたらし得る配列依存的効果を軽減する。（Ｄ）導入遺伝子２の発現レベルをさらに減少させるために翻訳リードスルーモチーフを減衰シグナルペプチド（attenuated  signal  peptide）配列と組み合わせたコンビナトリアルアプローチ。（ＥおよびＥ’）減少した導入遺伝子発現のカスケードを生じさせるために複数のモチーフを直列に配置した複合翻訳リードスルーモチーフ。（Ｅ）翻訳リードスルーモチーフおよび２Ａ自己切断ペプチド配列を使用して、単一のカセットから複数の導入遺伝子を発現させる。（Ｅ’）自己切断ペプチド配列を使用して、導入遺伝子２の５’側の翻訳リードスルーモチーフを分離する。（ＦおよびＦ’）機能的翻訳リードスルー構築物。（Ｆ）翻訳リードスルーモチーフをＣＡＲのスペーサードメインの３’側に配置することにより、抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ／ＶＨＨ）および機能的ＣＡＲの分泌を達成し得る。機能的リードスルーは機能的ＣＡＲの発現をもたらし、終止コドンにおける翻訳の終結は分泌抗体を生じさせる。（Ｆ’）翻訳リードスルーモチーフを第１のエンドドメイン（ＣＤ３ζエンドドメインまたは共受容体エンドドメインのいずれか）の３’側に配置することにより、第１世代、第２世代および第３世代ＣＡＲの組み合わせを産生し得る。機能的翻訳リードスルーは、第１世代ＣＡＲから第２または第３世代ＣＡＲに発現を切り替える。
【図４Ａ】ＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの発現を制御するための減衰シグナルペプチドおよび翻訳リードスルーモチーフアプローチの比較。（Ａ）ＲＱＱ８選別選択マーカーおよびＣＤ２２−ＣＤ１９キメラをコードする構築物をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。シグナルペプチド変異体（１行目）、翻訳リードスルーモチーフ構築物（２行目および３行目）および二重終止翻訳リードスルーモチーフ（４行目）。野生型シグナルペプチドと比較して、リジン１１シグナルペプチド変異体（Ｌ１１Ｋ変異）では、ＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの発現は減少する。ｓｔｏｐ−ＣＵＡＧおよびｓｔｏｐ−ＣＡＡＵＵＡ翻訳リードスルーモチーフは、それらをＣＤ２２−ＣＤ１９導入遺伝子の５’側に配置した場合に同様の結果をもたらし、両モチーフは、キメラの発現レベルをＲＱＲ８選別選択マーカーの約２％またはそれ未満に減少させる。二重終止翻訳リードスルーモチーフ（４行目）を使用して、より低い発現レベルのＣＤ２２−ＣＤ１９キメラを得た。（Ｂ）減衰シグナルペプチド変異体を翻訳リードスルー構築物と比較する、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上のＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの平均蛍光強度の定量。翻訳リードスルー構築物を使用して、減衰シグナルペプチド変異体と比較して実質的により低いレベルのＣＤ２２−ＣＤ１９キメラを得た。
【図４Ｂ】ＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの発現を制御するための減衰シグナルペプチドおよび翻訳リードスルーモチーフアプローチの比較。（Ａ）ＲＱＱ８選別選択マーカーおよびＣＤ２２−ＣＤ１９キメラをコードする構築物をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞のフローサイトメトリー分析。シグナルペプチド変異体（１行目）、翻訳リードスルーモチーフ構築物（２行目および３行目）および二重終止翻訳リードスルーモチーフ（４行目）。野生型シグナルペプチドと比較して、リジン１１シグナルペプチド変異体（Ｌ１１Ｋ変異）では、ＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの発現は減少する。ｓｔｏｐ−ＣＵＡＧおよびｓｔｏｐ−ＣＡＡＵＵＡ翻訳リードスルーモチーフは、それらをＣＤ２２−ＣＤ１９導入遺伝子の５’側に配置した場合に同様の結果をもたらし、両モチーフは、キメラの発現レベルをＲＱＲ８選別選択マーカーの約２％またはそれ未満に減少させる。二重終止翻訳リードスルーモチーフ（４行目）を使用して、より低い発現レベルのＣＤ２２−ＣＤ１９キメラを得た。（Ｂ）減衰シグナルペプチド変異体を翻訳リードスルー構築物と比較する、トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上のＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの平均蛍光強度の定量。翻訳リードスルー構築物を使用して、減衰シグナルペプチド変異体と比較して実質的により低いレベルのＣＤ２２−ＣＤ１９キメラを得た。
【図５−１】直列の翻訳リードスルーモチーフ。Ａ）直列に配置した終止コドンおよび翻訳リードスルーモチーフを用いて生成した構築物の図。簡単にするために、直列の翻訳リードスルーモチーフを有する構築物の構造を示す４つの例のみが示されている。ＣＤ８ａストーク上に提示されるＨＡエピトープである細胞表面マーカーは常にカセット中の第１の位置にあり、それに続いて、異なるコード配列を有するタンデムＣｌｏｖｅｒ３またはＥＢＦＰのいずれかが自己切断ペプチド配列（２Ａ）により分離されている。終止コドンを（トリプトファンをコードする）ＵＧＧで置き換え、タンデムｍＣｌｏｖｅｒまたはＥＢＦＰが第２または第３の位置にある２つの対照構築物をクローニングした。直列の翻訳リードスルーモチーフを有する構築物について、３つすべての終止コドン（ＵＧＡ、ＵＡＧおよびＵＡＡ）を試験し、利用した翻訳リードスルーモチーフはＣＵＡＧであった。同じ終止コドンを両位置で使用した。Ｂ）構築物を形質導入したＰＢＭＣのフローサイトメトリーは、０、１または２個の終止コドン／翻訳リードスルーモチーフを有する構築物からのタンデムＣｌｏｖｅｒ３蛍光強度を示す（対照は終止コドンなしであり、タンデムＣｌｏｖｅｒ３が位置２にある）。ヒストグラムは、直列の翻訳リードスルーモチーフを有する構築物からのタンデムＣｌｏｖｅｒ３発現の減少を示しており、レベルは、存在する終止コドンに応じて変動する。Ｃ）細胞表面マーカーと比べたタンデムＣｌｏｖｅｒ３蛍光強度レベルの正規化。ＵＧＡ、ＵＡＧまたはＵＡＡ終止コドンおよびＣＵＡＧ翻訳リードスルーモチーフのすぐ下流に配置した場合、レベルはそれぞれ６倍、２４倍または３３倍減少した。タンデムＣｌｏｖｅｒ３配列を２つの終止コドンおよび翻訳リードスルーモチーフの下流に配置した場合、タンデムＣｌｏｖｅｒ３レベルの１００倍の減少が観察された。
【図５−２】直列の翻訳リードスルーモチーフ。Ａ）直列に配置した終止コドンおよび翻訳リードスルーモチーフを用いて生成した構築物の図。簡単にするために、直列の翻訳リードスルーモチーフを有する構築物の構造を示す４つの例のみが示されている。ＣＤ８ａストーク上に提示されるＨＡエピトープである細胞表面マーカーは常にカセット中の第１の位置にあり、それに続いて、異なるコード配列を有するタンデムＣｌｏｖｅｒ３またはＥＢＦＰのいずれかが自己切断ペプチド配列（２Ａ）により分離されている。終止コドンを（トリプトファンをコードする）ＵＧＧで置き換え、タンデムｍＣｌｏｖｅｒまたはＥＢＦＰが第２または第３の位置にある２つの対照構築物をクローニングした。直列の翻訳リードスルーモチーフを有する構築物について、３つすべての終止コドン（ＵＧＡ、ＵＡＧおよびＵＡＡ）を試験し、利用した翻訳リードスルーモチーフはＣＵＡＧであった。同じ終止コドンを両位置で使用した。Ｂ）構築物を形質導入したＰＢＭＣのフローサイトメトリーは、０、１または２個の終止コドン／翻訳リードスルーモチーフを有する構築物からのタンデムＣｌｏｖｅｒ３蛍光強度を示す（対照は終止コドンなしであり、タンデムＣｌｏｖｅｒ３が位置２にある）。ヒストグラムは、直列の翻訳リードスルーモチーフを有する構築物からのタンデムＣｌｏｖｅｒ３発現の減少を示しており、レベルは、存在する終止コドンに応じて変動する。Ｃ）細胞表面マーカーと比べたタンデムＣｌｏｖｅｒ３蛍光強度レベルの正規化。ＵＧＡ、ＵＡＧまたはＵＡＡ終止コドンおよびＣＵＡＧ翻訳リードスルーモチーフのすぐ下流に配置した場合、レベルはそれぞれ６倍、２４倍または３３倍減少した。タンデムＣｌｏｖｅｒ３配列を２つの終止コドンおよび翻訳リードスルーモチーフの下流に配置した場合、タンデムＣｌｏｖｅｒ３レベルの１００倍の減少が観察された。
【図６−１】翻訳リードスルーモチーフの下流のヒトｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２の制御発現。Ａ）ＩＬ−１２α（ｐ３５）およびＩＬ−１２β（ｐ４０）サブユニットの間の融合物からなるヒトｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２を、両タンパク質の発現を容易にする自己切断ペプチドと共に選別選択マーカーＲＱＲ８の下流に配置した構築物の構造を示すダイアグラム。翻訳リードスルーモチーフＣＡＡＵＵＡを用いて、３つすべての終止コドンを試験した。Ｂ）構築物を形質導入し、ＣＤ３εおよびＲＱＲ８に対する抗体で染色したＰＢＭＣの代表的なフローサイトメトリープロット。Ｃ）形質導入効率の決定の２４、４８および７２時間後における形質導入ＰＢＭＣ由来の分泌ＩＬ−１２の定量。結果は、翻訳リードスルー構築物によりＩＬ−１２分泌が有意に減少することを実証している。
【図６−２】翻訳リードスルーモチーフの下流のヒトｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２の制御発現。Ａ）ＩＬ−１２α（ｐ３５）およびＩＬ−１２β（ｐ４０）サブユニットの間の融合物からなるヒトｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２を、両タンパク質の発現を容易にする自己切断ペプチドと共に選別選択マーカーＲＱＲ８の下流に配置した構築物の構造を示すダイアグラム。翻訳リードスルーモチーフＣＡＡＵＵＡを用いて、３つすべての終止コドンを試験した。Ｂ）構築物を形質導入し、ＣＤ３εおよびＲＱＲ８に対する抗体で染色したＰＢＭＣの代表的なフローサイトメトリープロット。Ｃ）形質導入効率の決定の２４、４８および７２時間後における形質導入ＰＢＭＣ由来の分泌ＩＬ−１２の定量。結果は、翻訳リードスルー構築物によりＩＬ−１２分泌が有意に減少することを実証している。
【図７−１】翻訳リードスルーモチーフの下流のマウスＩＬ−１２の制御発現。Ａ）自殺遺伝子（ＲａｐａＣａｓｐ９）、細胞表面マーカーＴｈｙ１．１およびマウスｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２を有するトリシストロン性構築物のダイアグラム。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、減衰シグナルペプチドモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフにより、マウスｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２レベルをモジュレートした。Ｂ）構築物を形質導入し、ＣＤ３およびＴｈｙ１．１に対する抗体で染色したＢａｌｂＣ脾細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。Ｃ）形質導入した脾細胞由来の分泌ＩＬ−１２レベルのＥＬＩＳＡによる定量。Ｄ）形質導入した脾細胞由来の上清を使用して、活性化脾細胞を再刺激した。ＥＬＩＳＡにより、ＩＦＮｇの存在について、再刺激由来の上清を分析した。重要なことに、これらの結果は、翻訳リードスルーモチーフを形質導入した脾細胞由来の上清が、再刺激脾細胞からのＩＦＮγ分泌を誘発することができたことを実証した。
【図７−２】翻訳リードスルーモチーフの下流のマウスＩＬ−１２の制御発現。Ａ）自殺遺伝子（ＲａｐａＣａｓｐ９）、細胞表面マーカーＴｈｙ１．１およびマウスｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２を有するトリシストロン性構築物のダイアグラム。内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、減衰シグナルペプチドモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフにより、マウスｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２レベルをモジュレートした。Ｂ）構築物を形質導入し、ＣＤ３およびＴｈｙ１．１に対する抗体で染色したＢａｌｂＣ脾細胞の代表的なフローサイトメトリープロット。Ｃ）形質導入した脾細胞由来の分泌ＩＬ−１２レベルのＥＬＩＳＡによる定量。Ｄ）形質導入した脾細胞由来の上清を使用して、活性化脾細胞を再刺激した。ＥＬＩＳＡにより、ＩＦＮｇの存在について、再刺激由来の上清を分析した。重要なことに、これらの結果は、翻訳リードスルーモチーフを形質導入した脾細胞由来の上清が、再刺激脾細胞からのＩＦＮγ分泌を誘発することができたことを実証した。
【図８Ａ】翻訳リードスルーＩＬ−１２構築物の毒性試験。Ａ）前記ＲａｐａＣａｓｐ６、Ｔｈｙ１．１およびＩＬ−１２コード構築物と、短縮マウスＣＤ３４（ｍｕｄＣＤ３４）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）および抗ＧＤ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含有する第２の構築物とを脾細胞に共形質導入した。ＣＤ３４およびＴｈｙ１．１に対する抗体で形質導入した脾細胞を染色し、フローサイトメトリーを行って形質導入効率を決定した。Ｂ）形質導入した脾細胞をマウスに注射し、１５日後、それらを屠殺し、それらの脾臓を摘出した。構成的発現ＩＬ−１２を形質導入した脾細胞を注射したマウスにおいてのみ、脾臓肥大が観察された（２Ａと示されている群）。
【図８Ｂ】翻訳リードスルーＩＬ−１２構築物の毒性試験。Ａ）前記ＲａｐａＣａｓｐ６、Ｔｈｙ１．１およびＩＬ−１２コード構築物と、短縮マウスＣＤ３４（ｍｕｄＣＤ３４）、ホタルルシフェラーゼ（ＦＬｕｃ）および抗ＧＤ２キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）を含有する第２の構築物とを脾細胞に共形質導入した。ＣＤ３４およびＴｈｙ１．１に対する抗体で形質導入した脾細胞を染色し、フローサイトメトリーを行って形質導入効率を決定した。Ｂ）形質導入した脾細胞をマウスに注射し、１５日後、それらを屠殺し、それらの脾臓を摘出した。構成的発現ＩＬ−１２を形質導入した脾細胞を注射したマウスにおいてのみ、脾臓肥大が観察された（２Ａと示されている群）。
【図９−１】脾細胞のフローサイトメトリー分析。Ａ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９に対する抗体で屠殺マウス由来の脾細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。使用したゲーティング戦略が示されている。Ｂ〜Ｆ）存在するＣＤ１１ｂ＋（マクロファージ）、ＣＤ３＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４＋（ヘルパーＴ細胞）、ＣＤ８＋（細胞傷害性Ｔ細胞）およびＣ１９＋（Ｂ細胞）のパーセンテージ。ＩＬ−１２またはＩＲＥＳを構成的に発現する構築物を形質導入した脾細胞を注射したマウスの脾臓では、増加した数のマクロファージおよびＴ細胞が存在していた。ＩＬ−１２を構成的に発現する脾細胞を有するマウスでは、Ｂ細胞数の減少が観察された。
【図９−２】脾細胞のフローサイトメトリー分析。Ａ）ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９に対する抗体で屠殺マウス由来の脾細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した。使用したゲーティング戦略が示されている。Ｂ〜Ｆ）存在するＣＤ１１ｂ＋（マクロファージ）、ＣＤ３＋（Ｔ細胞）、ＣＤ４＋（ヘルパーＴ細胞）、ＣＤ８＋（細胞傷害性Ｔ細胞）およびＣ１９＋（Ｂ細胞）のパーセンテージ。ＩＬ−１２またはＩＲＥＳを構成的に発現する構築物を形質導入した脾細胞を注射したマウスの脾臓では、増加した数のマクロファージおよびＴ細胞が存在していた。ＩＬ−１２を構成的に発現する脾細胞を有するマウスでは、Ｂ細胞数の減少が観察された。
【発明を実施するための形態】
【００４６】
本発明は、導入遺伝子の発現を減少させるモチーフ、例えばフレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフを含む核酸構築物に関する。
【００４７】
フレームスリップ
転写中に、ＲＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡテンプレートへの相補性に基づいて、成長中のＲＮＡ鎖へのヌクレオチドの取り込みを触媒する。しかしながら、ＲＮＡポリメラーゼが一続きのリピート塩基に遭遇すると、スリッページまたは「スタッタリング」が発生し得る。転写スリッページは、天然では例えば、大腸菌ｐｙｒＢＩおよびｃｏｄＢＡオペロンの調節、パラミクソウイルスにおけるＰ遺伝子の発現、ならびにＴｈｅｒｍｕｓ  ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓの細胞ｄｎａＸ遺伝子の解読に利用される。
【００４８】
ＲＮＡポリメラーゼがスリップすると、リピート塩基の１つ（またはおそらく２つ）が欠如するので、これは、代替的なリーディングフレームをコードするｍＲＮＡの合成をもたらし得る。
【００４９】
本発明の核酸構築物は、代替的なリーディングフレームをコードするｍＲＮＡをもたらすＲＮＡポリメラーゼのスリッページが存在する場合にのみ下流導入遺伝子の転写が起こるような転写フレームスリップ部位を含み得る。
【００５０】
タンパク質へのｍＲＮＡ配列の翻訳は、リボソーム、開始および伸長因子、アミノアシル転移ＲＮＡ（ａａ−ｔＲＮＡ）、アミノアシルｔＲＮＡシンテターゼならびに終結因子のオーケストレーションを伴う複雑なプロセスである。翻訳の開始は、因子の複合体がｍＲＮＡの５’末端に結合すると始まり、次いで、これが４０ＳリボソームのリクルートおよびｍＲＮＡのスキャンをもたらす。開始因子と４０Ｓリボソームとの複合体が、アミノ酸メチオニン（ＡＵＧコドン）をコードするコドン（ヌクレオチドのトリプレット）に遭遇すると、６０Ｓリボソームがリクルートされ、適切なアミノ酸がロードされた同族ｔＲＮＡの対形成からポリペプチド合成が始まる。翻訳の開始は、ＡＵＧ以外の代替的な開始コドンで起こり得るが、ＡＵＧは、最も頻繁に使用される開始コドンである。ポリペプチドの伸長は、ｔＲＮＡがその同族コドンに結合し、新たに付加されたアミノ酸と伸長中のポリペプチドとの間にペプチド結合が形成し、ポリペプチドが移動して次のコドンを露出させる周期的な方法で起こる。
【００５１】
翻訳中に、リボソームが特定のコドンで停止する場所では、リボソーム中断が起こり得る。リボソーム中断は、核細胞経路（nucleocytic  pathway）によるｍＲＮＡの分解を促進し得るか、またはそれは、−１もしくは−２方向のスリップを誘導し得る。ＵＵＵＵＵＵＡなどのｍＲＮＡ内の反復配列は、翻訳フレームスリッピングを誘導することが公知であり、この配列は、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の群特異抗原遺伝子（ｇａｇ）およびポリメラーゼ（ｐｏｌ）遺伝子の３’末端に存在する。ＨＩＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ遺伝子の翻訳フレームスリッピング−１は、Ｇａｇ−Ｐｏｌポリタンパク質の発現をもたらす。
【００５２】
本発明の核酸構築物は、リボソームによるフレームスリップが存在する場合にのみ下流転写産物の翻訳が起こるように、翻訳フレームスリッピング部位を含み得る。
【００５３】
フレームスリップ部位は、同じタイプの一続きの塩基を含み得る。
【００５４】
フレームスリップモチーフは、核酸構築物中の切断部位の上流および／または下流に配置され得る。フレームスリップモチーフは、核酸構築物中の第１および第２の導入遺伝子の間に位置する。
【００５５】
フレームスリップモチーフは単独で使用され得る。この実施形態では、第２の導入遺伝子は、フレームスリップが第２の導入遺伝子の転写または翻訳に必要であるように、フレームスリッピング部位の下流のフレームの外に配置され得る。
【００５６】
モチーフは、例えば、５、７、８、１０または１１個の一続きの塩基を含み得る。部位は、例えば、ウラシル、アデノシンまたはグアニン塩基のリピートを含み得る。部位は、例えば、配列番号１として示されている配列を含み得る。
ＵＵＵＵＵＵＵ（配列番号１）。
【００５７】
あるいは、フレームスリップ部位は、終止コドンと組み合わせて使用され得る。この実施形態では、終止コドンは、終止コドンが無視されるためにフレームスリッピングが必要であるように、フレームスリップ部位の下流のフレーム内に位置する。
【００５８】
終止コドンは、ＵＧＡ、ＵＡＧまたはＵＡＡであり得る。フレームスリップ部位は、３の倍数のウラシル、アデノシンまたはグアニン塩基のリピート、例えばウラシル、アデノシンまたはグアニン塩基の３、６または９個のリピートを含み得る。
【００５９】
フレームスリップ部位／終止コドン組み合わせの例は、配列番号２、３および４として示されている。
ＵＵＵＵＵＵＵＧＡ（配列番号２）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＧ（配列番号３）
ＵＵＵＵＵＵＵＡＡ（配列番号４）。
【００６０】
翻訳リードスルー
リボソームがＵＧＡ、ＵＡＧまたはＵＡＡ終止コドンに遭遇すると、翻訳は終結する。この時点で、終結因子は終止コドンを認識し、リボソームの解離および再利用を容易にする。終結因子と近同族ｔＲＮＡとの間の競合およびポリペプチドの継続的な伸長は０．１％の割合でしか起こらないので、翻訳の終了は、通常、終止コドンの再コーディングにより高い忠実度で起こる。しかしながら、特定の遺伝子では、翻訳リードスルーをもたらす終止コドンの再コーディングのレベルの上昇が報告されている。いくつかの場合では、これは、機能的リードスルーと称されるプロセスで、さらなる機能的モチーフを有するより長いポリペプチドの生成をもたらした。
【００６１】
終結因子１（ＲＦ１）が終止コドンを認識することができず、近同族ａａ−ｔＲＮＡがアミノ酸を伸長中のポリペプチドに挿入し、それにより、終止コドンを抑制すると、翻訳リードスルーが起こる。終結因子およびａａ−ｔＲＮＡの局所濃度は、終止コドン抑制および翻訳リードスルーのレベルに影響を及ぼし、低濃度の終結因子は翻訳リードスルーを促進する。哺乳動物では、ＵＡＧ終止コドンの抑制は、トリプトファン、アルギニンまたはシステイン残基の挿入をもたらす。
【００６２】
終止コドン抑制の最初期に発見された例の１つは、翻訳リードスルーがタンパク質３のＣ末端への２２個のアミノ酸の付加をもたらすウサギベータグロビン遺伝子である。
【００６３】
翻訳リードスルーの頻度は、１）使用される終止コドン（ＵＧＡ、ＵＡＧまたはＵＡＡ）；２）終止コドンに直接隣接する配列（終止コドンの上流および下流の６ヌクレオチドが特に重要である）および；３）ｍＲＮＡの３’末端におけるシス作用性配列の存在を含む多くの要因に依存する。
【００６４】
３つの終止コドンの終結効率は変動し、ＵＡＡは最も強い終止コドンであり、ＵＧＡは最も弱く、終結効率の階層はＵＡＡ＞ＵＡＧ＞ＵＧＡとして定義される。その結果、最高レベルの翻訳リードスルーはＵＧＡ終止コドンで示され、最低はＵＡＡ終止コドンで示される。
【００６５】
翻訳リードスルーを示す遺伝子の配列分析は、終止コドン抑制および持続的な翻訳を促進する少なくとも２つの異なるモチーフ：ＳＴＯＰ−ＣＵＡＧおよびＳＴＯＰ−ＣＡＡＵＵＡ（ここで、ｓｔｏｐはＵＧＡ、ＵＡＧまたはＵＡＡであり得る）を同定した。翻訳リードスルーのレベルは、使用される終止コドンに依存する：ＵＧＡは最高レベルの翻訳リードスルーを立証し、ＵＡＧおよびＵＡＡ終止コドンから漸減レベルのリードスルーが得られるので、リードスルーの全体的な階層はＵＧＡ＞ＵＡＧ＞ＵＡＡである。
【００６６】
本発明の核酸構築物は、配列番号５〜１０として示されている配列の１つを含み得る。
ＵＧＡＣＵＡＧ（配列番号５）
ＵＡＧＣＵＡＧ（配列番号６）
ＵＡＡＣＵＡＧ（配列番号７）
ＵＧＡＣＡＡＵＵＡ（配列番号８）
ＵＡＧＣＡＡＵＵＡ（配列番号９）
ＵＡＡＣＡＡＵＵＡ（配列番号１０）
【００６７】
翻訳リードスルー部位は、核酸構築物中の第１および第２の導入遺伝子の間に位置し得る。翻訳リードスルー部位は、核酸構築物中の切断部位の上流および／または下流に配置され得る。翻訳リードスルー部位は、切断部位に隣接し得る（図３Ｃ）。２つまたはそれを超える翻訳リードスルー部位が使用され得、例えば、互いの隣に（図３Ｂ’）または切断部位に隣接して配置され得る（図Ｅ’）。
【００６８】
下流導入遺伝子の発現レベルをさらに減少させるために、複数の終止コドンが翻訳リードスルーモチーフの５’側に挿入され得る（図２Ｂ）。多重終止翻訳リードスルーモチーフの例は、２つのＵＧＡ終止コドンがＣＵＡＧリードスルーモチーフの５’側に配置された配列番号１１として示されている。
ＵＧＡＵＧＡＣＵＡＧ（配列番号１１）
【００６９】
核酸構築物が２つを超える導入遺伝子を含む場合、複合翻訳リードスルーモチーフは、切断部位をコードする配列の５’側に直列に配置され得る。これは、複数の導入遺伝子が異なる比で発現されることを可能にする。さらなる各リードスルーモチーフを用いて、発現レベルは、上流導入遺伝子と比べて１０〜５０倍減少するはずである。
【００７０】
複合翻訳リードスルーモチーフを有する核酸構築物は、構造：
ＮＯＩ１−ＴＲＭ１−ＣＬ１−ＮＯＩ２−ＴＲＭ２−ＣＬ２−ＮＯＩ３
を有し得る。
【００７１】
リードスルー部位は、２つのバージョンのタンパク質（リードスルー部位までの（すなわち、リードスルーが起こらない場所の）転写産物の翻訳により作られる短いバージョン、ならびにリードスルー部位以外および下流の（すなわち、リードスルーが起こる場所の）転写産物の翻訳により作られる長いバージョン）が作られるようにコード配列内に配置され得る。このような配置の例は、図３のＦおよびＦ’に示されている。
【００７２】
改変シグナルペプチド
翻訳リードスルーモチーフは導入遺伝子発現を有意に減少させるが、特定の状況では、発現レベルをさらに減少させる必要があり得る。タイプＩ膜貫通タンパク質および分泌タンパク質の場合、発現のさらなる減少は、改変シグナルペプチド配列と翻訳リードスルーモチーフを組み合わせることにより達成され得る。このようなアプローチは、シグナルペプチド配列を有するタイプＩ膜貫通タンパク質および分泌タンパク質に適する。この場合、改変シグナルペプチドおよび第２の導入遺伝子は、翻訳リードスルーモチーフおよび自己切断ペプチド配列の３’側に配置される（図３Ｄ）。
【００７３】
シグナルペプチドは、分泌経路に向かう新たに合成されたタンパク質の大部分のＮ末端に存在する一般には５〜３０アミノ酸長の短いペプチドである。これらのタンパク質としては、特定の細胞小器官（例えば、小胞体、ゴルジまたはエンドソーム）のいずれかの内部に存在し、細胞から分泌されるタンパク質および膜貫通タンパク質が挙げられる。
【００７４】
シグナルペプチドは、一般に、単一のアルファヘリックスを形成する傾向を有する一続きの長い疎水性アミノ酸であるコア配列を含有する。シグナルペプチドは正に荷電した短い一続きのアミノ酸で始まり得、これは、トランスロケーション中のポリペプチドの適切なトポロジーの強化に役立つ。シグナルペプチドの末端には、典型的には、シグナルペプチダーゼにより認識および切断される一続きのアミノ酸がある。シグナルペプチダーゼは、トランスロケーションの途中またはその完了後のいずれかで切断して、遊離シグナルペプチドおよび成熟タンパク質を生成し得る。次いで、遊離シグナルペプチドは、特定のプロテアーゼにより消化される。
【００７５】
一般に、シグナルペプチドは分子のアミノ末端に位置するが、いくつかのカルボキシ末端シグナルペプチドが公知である。
【００７６】
改変シグナルペプチドは、国際公開第２０１６／１７４４０９号（これは、参照により本明細書に組み込まれる）に詳細に記載されている。改変シグナルペプチドは、それが由来する野生型シグナルペプチドよりも少ない疎水性アミノ酸を有するように１つまたはそれを超える変異、例えば置換または欠失を含み得る。「野生型」という用語は、それが由来する天然タンパク質に存在するシグナルペプチドの配列を意味する。
【００７７】
核酸構築物が、両方が膜貫通タンパク質をコードする２つの導入遺伝子を含む場合、下流導入遺伝子によりコードされるタンパク質（これは、より低い相対発現を有する）は、上流導入遺伝子によりコードされるタンパク質（これは、より高い相対発現を有する）よりも少ない疎水性アミノ酸を含み得る。
【００７８】
シグナルペプチド効率を改変するために変異される疎水性アミノ酸は、アラニン（Ａ）；バリン（Ｖ）；イソロイシン（Ｉ）；ロイシン（Ｌ）；メチオニン（Ｍ）；フェニルアラニン（Ｐ）；チロシン（Ｙ）；またはトリプトファン（Ｗ）であり得る。
【００７９】
改変シグナルペプチドは、疎水性アミノ酸の１、２、３、４または５つのアミノ酸欠失または置換を含み得る。疎水性アミノ酸は、非疎水性アミノ酸、例えば親水性または中性アミノ酸で置き換えられ得る。
【００８０】
核酸構築物
本発明は、第１の目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ１）；フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフ（ＦＳＭ／ＴＲＭ）；および第２の目的のヌクレオチド配列（ＮＯＩ２）を含む核酸構築物に関する。
【００８１】
「目的のヌクレオチド」は、ＲＮＡまたはＤＮＡであり得る。目的のヌクレオチド（ＮＯＩ）は、タンパク質の全部または一部であり得る目的のポリペプチド（ＰＯＩ）をコードする。
【００８２】
ＮＯＩ１およびＮＯＩ２（必要に応じて後続のＮＯＩ（複数可）と一緒に）は、一緒に転写および翻訳される場合にタンパク質をコードし得る。例えば、核酸構築物は、細胞において発現されると、２つの産物：
ａ）ＮＯＩ１のみによりコードされる第１の産物；ならびに
ｂ）ＮＯＩ１およびＮＯＩ２によりコードされる第２の産物であって、フレームスリップまたは翻訳リードスルーが起こる場合に産生される第２の産物
を産生することができるものであり得る。
【００８３】
ＮＯＩ１およびＮＯＩ２によりコードされる全長産物の相対発現レベルは、ＮＯＩ１のみによりコードされる短縮産物の発現レベル未満であり得る。
【００８４】
あるいは、核酸構築物は、目的のヌクレオチド配列が別個のタンパク質として発現されるように、１つまたはそれを超える切断部位を含み得る。
【００８５】
本発明の核酸構築物は、第１および第２のポリペプチドを含むポリタンパク質をコードし得る。ポリタンパク質は切断部位で切断されて、２つの別個のポリペプチドを生じさせ得る。
【００８６】
ＮＯＩは、細胞内タンパク質、膜貫通タンパク質または分泌タンパク質をコードし得る。
【００８７】
ＮＯＩは、例えば、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）もしくはその一部、またはＣＡＲもしくはＣＡＲ発現細胞の活性に影響を与える作用物質（agent）、例えばサイトカインをコードし得る。
【００８８】
導入遺伝子は、標的抗原をコードし得る。この点で、前記技術は、様々な非常に低レベルの標的抗原を用いて標的抗原を産生するために使用され得る。これらは、例えば、ＣＡＲまたは操作されたＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を発現するＴ細胞の機能アッセイで使用され得る。
【００８９】
ＮＯＩは、細胞による別の実体の合成に関与するタンパク質をコードし得る。例えば、細胞は、２つの酵素：ＧＭ３シンターゼおよびＧＤ２シンターゼ（国際公開第２０１５／１３２６０４号）のトランスジェニック発現によりがん抗原ジシアロガングリオシド（ＧＤ２）を発現するように誘導され得る。細胞におけるこれらの酵素の発現レベルを低下させることにより、ＧＤ２ｌｏｗ標的細胞を作ることが可能である。
【００９０】
ＮＯＩは、炎症反応を増強しおよび／またはＣＡＲ−Ｔ細胞療法の有効性を増加させるサイトカインなどのサイトカインをコードし得る。サイトカインは、以下：ＩＬ−７、ＩＬ−１２、ＩＬ１５、ＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−１８およびＩＬ−２１から選択され得る。特に、サイトカインはＩＬ−１２であり得る。
【００９１】
インターロイキン１２（ＩＬ−１２）は、抗原刺激に反応して樹状細胞、マクロファージ、好中球およびヒトＢリンパ芽球細胞により天然に産生されるインターロイキンである。ＩＬ−１２は、Ｔｈ１細胞へのナイーブＴ細胞の分化に関与する。それは、Ｔ細胞の成長および機能を刺激し得るＴ細胞刺激因子として公知である。それは、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）および腫瘍壊死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）の産生を刺激し、ＩＦＮ−γのＩＬ−４媒介性抑制を減少させる。
【００９２】
ＩＬ−１２は、ナチュラルキラー細胞およびＴリンパ球の活性において重要な役割を果たす。ＩＬ−１２は、ＮＫ細胞およびＣＤ８＋細胞傷害性Ｔリンパ球の細胞傷害活性の増強を媒介する。
【００９３】
ＩＬ−１２は、腫瘍微小環境をモジュレートしてがんに対して免疫反応を向け直すための特に重要な強力な免疫調節性サイトカインである。ＩＬ−１２は全身的に毒性であるので、ＩＬ−１２を局所的に産生するための方法が関心対象である。
【００９４】
ＩＬ−１２は、２つの別個の遺伝子ＩＬ−１２Ａ（ｐ３５）およびＩＬ−１２Ｂ（ｐ４０）によりコードされるヘテロ二量体サイトカインである。活性ヘテロ二量体（「ｐ７０」と称される）は、タンパク質合成後に形成される。
【００９５】
ＮＯＩは、ＩＬ−１２Ａおよび／またはＩＬ−１２Ｂをコードし得る。ヒトＩＬ−１２Ａの配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９４５９から入手可能である。シグナルペプチドを欠くこの配列の一部は、配列番号５３として以下に示されている。ヒトＩＬ−１２Ｂの配列は、Ｕｎｉｐｒｏｔアクセッション番号Ｐ２９４６０から入手可能である。シグナルペプチドを欠くこの配列の一部は、配列番号５４として以下に示されている。
【化１】
2021532768.tif 000002
【００９６】
ＮＯＩは、リンカーにより接続されたヒトＩＬ−１２α（ｐ３５）およびＩＬ−１２β（ｐ４０）サブユニットの間の融合物である「ｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２」をコードし得る。適切なｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２配列は、配列番号５５として以下に示されている。
【化２−１】
2021532768.tif 000003
【化２−２】
2021532768.tif 000004
【００９７】
配列番号５５では、マウスカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域ＭＯＰＣ６３（Ｕｎｉｐｒｏｔ  Ｐ０１６６１）由来のシグナルペプチドは太字で示されており；セリン−グリシンリンカーは下線付きの太字である。
【００９８】
ＮＯＩは、配列番号５３、５４もしくは５５として示されている配列の１つまたはそのバリアントを含み得る。バリアント配列が、インビボで発現される場合にＩＬ−１２機能を保持するという条件で、バリアント配列は、配列番号５３、５４または５５と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有し得る。例えば、バリアント配列は、インビボで細胞傷害性Ｔ細胞の活性を増強する能力を保持し得、および／またはバリアント配列は、Ｔ細胞によるインターフェロンガンマ（ＩＦＮ−γ）の産生を刺激し得る。
【００９９】
ＩＬ−１２またはｆｌｉｅｘｉ−ＩＬ１２をコードする配列は、フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフの下流に配置され得る。これは、サイトカイン発現を制御し、ＣＡＲと比べてサイトカインの発現レベルを減少させる手段を提供する。
【０１００】
ＮＯＩは、ケモカイン、例えば、ＣＡＲ−Ｔ細胞療法の有効性を改善するケモカインをコードし得る。ケモカインはＣＣＬ１９であり得る。特に、核酸構築物は、ＣＣＬ１９およびＩＬ−７を共発現し得る。
【０１０１】
ＮＯＩは、抗体またはその一部をコードし得る。例えば、ＮＯＩは、免疫調節性抗体または抗体断片をコードし得る。抗体は、阻害性シグナル（ＰＤ１など）を遮断し得るか、または免疫系（例えば、ＯＸ４０作動薬、４１ＢＢ作動薬またはＩＣＯＳ作動薬）を活性化し得る。
【０１０２】
導入遺伝子は、毒性化合物、例えばボツリヌス菌、ジフテリアまたはシュードモナス毒素をコードし得る。
【０１０３】
キメラ抗原受容体
古典的なキメラ抗原受容体（ＣＡＲ）は、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）に接続するキメラタイプＩ膜貫通タンパク質である。バインダーは、典型的には、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）由来の一本鎖可変断片（ｓｃＦｖ）であるが、それは、抗体様抗原結合部位を含む他のフォーマットをベースとするものであり得る。スペーサードメインは、通常、膜からバインダーを分離し、それを適切な配向にすることを可能にするために必要である。使用される一般的なスペーサードメインはＩｇＧ１のＦｃである。抗原に応じて、よりコンパクトなスペーサー、例えばＣＤ８α由来のストークおよびさらにはＩｇＧ１ヒンジのみで十分であり得る。膜貫通ドメインはタンパク質を細胞膜に固定し、スペーサーをエンドドメインに接続する。
【０１０４】
初期ＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζのγ鎖のいずれかの細胞内部分由来のエンドドメインを有していた。その結果、これらの第１世代受容体は免疫学的シグナル１を伝達したが、これは、同族標的細胞のＴ細胞殺滅をトリガーするために十分であったが、Ｔ細胞を完全に活性化して増殖および生存させることができなかった。この制限を克服するために、複合エンドドメインが構築された：ＣＤ３ζのものへのＴ細胞共刺激分子の細胞内部分の融合は、抗原認識後に活性化および共刺激シグナルを同時に伝達し得る第２世代受容体をもたらす。最も一般に使用される共刺激ドメインはＣＤ２８のものである。これは、Ｔ細胞増殖をトリガーする最も強力な共刺激シグナル（すなわち、免疫学的シグナル２）を供給する。生存シグナルを伝達する密接に関連するＯＸ４０および４１ＢＢなどのＴＮＦ受容体ファミリーエンドドメインを含むいくつかの受容体も記載されている。活性化、増殖および生存シグナルを伝達することができるエンドドメインを有するさらに強力な第３世代ＣＡＲが今では記載されている。
【０１０５】
ＣＡＲが標的抗原に結合すると、これは、それが発現されるＴ細胞への活性化シグナルの伝達をもたらす。したがって、ＣＡＲは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に向けてＴ細胞の特異性および細胞傷害性を誘導する。
【０１０６】
したがって、ＣＡＲは、典型的には、（ｉ）抗原結合ドメイン；（ｉｉ）スペーサー；（ｉｉｉ）膜貫通ドメイン；および（ｉｉｉ）シグナル伝達ドメインを含むまたはそれに関連する細胞内ドメインを含む。
【０１０７】
ＣＡＲは、一般構造：
抗原結合ドメイン−スペーサードメイン−膜貫通ドメイン−細胞内シグナル伝達ドメイン（エンドドメイン）
を有し得る。
【０１０８】
本発明の核酸構築物のＮＯＩまたはＮＯＩの組み合わせは、ＣＡＲの全部または一部をコードし得る。
【０１０９】
機能的リードスルーは、ＣＡＲの機能性を増加させるために利用され得る。これは、翻訳リードスルーモチーフを抗原結合ドメインの下流またはＣＡＲのシグナル伝達ドメインの間に挿入することにより達成され得る（図３ＦおよびＦ’）。
【０１１０】
いくつかの状況では、抗原結合ドメイン（ｓｃＦｖ／ＶＨＨ）を分泌させて、ＣＡＲＴ細胞が、低レベルの標的抗原を発現する正常組織を標的とするオンターゲットオフ腫瘍効果を軽減することが望ましい場合がある。分泌された抗原結合ドメインは、正常細胞の表面上において発現される抗原に結合し、それにより、ＣＡＲＴ細胞による正常細胞の認識を防止するはずである。機能的リードスルーは、翻訳リードスルーモチーフをＣＡＲの膜貫通ドメインのすぐ上流に配置することにより、抗原結合ドメインを分泌するようにＴ細胞を操作するために使用され得る。
【０１１１】
核酸構築物は、一般構造：
ｓｃＦｖ／ＶＨＨ−ＴＲＭ−スペーサー−ＴＭドメイン−エンドドメイン、または
ｓｃＦｖ／ＶＨＨ−スペーサー−ＴＲＭ−ＴＭドメイン−エンドドメイン
（ここで、
ｓｃＦｖ／ＶＨＨは、抗原結合ドメインをコードするヌクレオチド配列であり、
スペーサーは、スペーサーをコードするヌクレオチド配列であり、
ＴＭドメインは、ＴＭドメインをコードするヌクレオチド配列であり、および
エンドドメインは、エンドドメインをコードするヌクレオチド配列であり、例えば、第１、第２または第３世代エンドドメインであり得る）
を有し得る。
【０１１２】
機能的リードスルーはまた、第１、第２または第３世代であるＣＡＲの組み合わせを生成するために使用され得る。この状況では、翻訳リードスルーモチーフは、ＣＤ３ｚおよび共受容体エンドドメインの間に配置され得、これが、第１世代ＣＡＲ（ＣＤ３ζシグナル伝達ドメインのみ）の高レベルの発現、および実質的に低いレベルの第２または第３世代ＣＡＲをもたらす。
核酸構築物は、一般構造：
ｓｃＦｖ／ＶＨＨ−スペーサー−ＴＭドメイン−ＣＤ３ζエンドドメインＴＲＭ−共刺激ドメイン、または
ｓｃＦｖ／ＶＨＨ−スペーサー−ＴＭドメイン−ＣＤ３ζエンドドメインＴＲＭ１−共刺激ドメイン１−ＴＲＭ２−共刺激ドメイン２
（ここで、
ｓｃＦｖ／ＶＨＨは、抗原結合ドメインをコードするヌクレオチド配列であり、
スペーサーは、スペーサーをコードするヌクレオチド配列であり、
ＴＭドメインは、ＴＭドメインをコードするヌクレオチド配列であり、および
ＣＤ３ζエンドドメインは、ＣＤ３ζエンドドメインをコードするヌクレオチド配列であり、
共刺激ドメインは、共受容体、例えばＣＤ２８またはＴＮＦ受容体スーパーファミリーのメンバー由来のエンドドメインなどの共刺激ドメインをコードするヌクレオチド配列である）
を有し得る。
【０１１３】
共受容体およびＣＤ３ζシグナル伝達ドメインの両方を有するＣＡＲは少ないので、ＣＡＲの会合が主に共刺激シグナル（シグナル２）を細胞に提供し、減少した抗原シグナル（シグナル１）を細胞に提供するようにＣＤ３ζおよび共受容体エンドドメインの位置を交換することにより、異なる反復が生成され得る。
【０１１４】
キメラサイトカイン受容体
国際公開第２０１７／０２９５１２号は、非サイトカイン結合分子の結合特異性をサイトカイン受容体のエンドドメインに移植するキメラサイトカイン受容体について記載している。それはまた、二量体化ドメイン；およびサイトカイン受容体エンドドメインを含むキメラ膜貫通タンパク質について記載している。
【０１１５】
二量体化は自発的に起こり得、この場合、キメラ膜貫通タンパク質は構成的に活性である。あるいは、二量体化は、化学的二量体化誘導物質（ＣＩＤ）の存在下でのみ起こり得、この場合、膜貫通タンパク質は、ＣＩＤの存在下でのみサイトカインタイプシグナル伝達を引き起こす。
【０１１６】
構成的に活性なキメラサイトカイン受容体は、外部ドメインとして抗体のＦａｂ部分を含み得る。この点で、二量体化ドメインは、重鎖定常ドメイン（ＣＨ）および軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）の二量体化部分を含み得る。
【０１１７】
キメラ膜貫通タンパク質は、２つのポリペプチド：
（ｉ）
（ａ）第１の二量体化ドメイン；および
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；ならびに
（ｉｉ）
（ａ）第１の二量体化ドメインと二量体化する第２の二量体化ドメイン；および
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含み得る。
【０１１８】
特に、キメラ膜貫通タンパク質は、
（ｉ）
（ａ）重鎖定常ドメイン（ＣＨ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第１の鎖
を含む第１のポリペプチド；および
（ｉｉ）
（ａ）軽鎖定常ドメイン（ＣＬ）
（ｂ）サイトカイン受容体エンドドメインの第２の鎖
を含む第２のポリペプチド
を含み得る。
【０１１９】
サイトカイン受容体エンドドメインの第１および第２の鎖は、タイプＩサイトカイン受容体エンドドメインα、βおよびγ鎖から選択され得る。
【０１２０】
サイトカイン受容体エンドドメインは、
（ｉ）ＩＬ−２受容体β鎖エンドドメイン
（ｉｉ）ＩＬ−７受容体α鎖エンドドメイン；または
（ｉｉｉ）ＩＬ−１５受容体α鎖エンドドメイン；および／または
（ｉｖ）共通γ鎖受容体エンドドメイン
を含み得る。
【０１２１】
ＩＬ−２
ＩＬ−２は、多くの場合にα、βおよびγ「鎖」と称される３つの異なるタンパク質の異なる組み合わせにより生成される３つの形態を有するＩＬ−２受容体に結合する；これらのサブユニットはまた、他のサイトカインに対する受容体の一部である。ＩＬ−２Ｒのβおよびγ鎖は、タイプＩサイトカイン受容体ファミリーのメンバーである。
【０１２２】
３つの受容体鎖は、様々な細胞タイプ上において別個に異なって発現され、異なる組み合わせおよび順序で集合して、低親和性、中程度親和性および高親和性のＩＬ−２受容体を生成し得る。
【０１２３】
α鎖は低親和性でＩＬ−２に結合し、βおよびγの組み合わせは一緒になって、主に記憶Ｔ細胞およびＮＫ細胞上において中程度親和性でＩＬ−２に結合する複合体を形成し；３つの受容体鎖はすべて、活性化Ｔ細胞および制御性Ｔ細胞上において高親和性（Ｋｄ約１０〜１１Ｍ）でＩＬ−２に結合する複合体を形成する。
【０１２４】
これらの３つのＩＬ−２受容体鎖は細胞膜に広がり、細胞内に伸びることにより、生化学的シグナルを細胞内部に送達する。アルファ鎖はシグナル伝達に関与しないが、ベータ鎖はチロシンホスファターゼＪＡＫ１と複合体形成する。同様に、ガンマ鎖は、ＪＡＫ３と称される別のチロシンキナーゼと複合体形成する。これらの酵素は、ＩＬ−２Ｒの外部ドメインへのＩＬ−２結合により活性化される。
【０１２５】
初期Ｔ細胞もまた抗原により刺激されると、ＩＬ−２シグナル伝達は、エフェクターＴ細胞および記憶Ｔ細胞へのＴ細胞の分化を促進する。抗原選択Ｔ細胞クローンの数および機能の拡大に依存するＴ細胞免疫記憶の発生におけるそれらの役割を通じて、それらはまた、長期細胞性免疫において重要な役割を有する。
【０１２６】
本発明のキメラサイトカイン受容体は、ＩＬ−２受容体β鎖および／またはＩＬ−２受容体（すなわち、共通）γ鎖を含み得る。
【０１２７】
ＩＬ−２β鎖および共通γ鎖のエンドドメインのアミノ酸配列は、配列番号５６および５７として示されている。
【化３】
2021532768.tif 000005
【０１２８】
「に由来する」という用語は、本発明のキメラサイトカイン受容体のエンドドメインが、内因性分子の野生型配列と同じ配列、またはＪＡＫ−１もしくはＪＡＫ−３と複合体形成して上記シグナル伝達経路の１つを活性化する能力を保持するそのバリアントを有することを意味する。
【０１２９】
バリアント配列が、野生型配列の機能、すなわちＪＡＫ−１またはＪＡＫ−３と複合体形成して例えばＪＡＫ−ＳＴＡＴシグナル伝達経路を活性化する能力を保持するという条件で、「バリアント」配列は、野生型配列（例えば、配列番号５６または５７）と少なくとも８０、８５、９０、９５、９８または９９％の配列同一性を有する。
【０１３０】
２つのポリペプチド配列間の同一性のパーセンテージは、ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖで自由に利用可能なＢＬＡＳＴなどのプログラムにより容易に決定され得る。
【０１３１】
定常領域ドメイン
ヒトでは、２つのタイプの軽鎖：カッパ（κ）鎖およびラムダ（λ）鎖がある。ラムダクラスは、４つのサブタイプ：λ１、λ２、λ３およびλ４を有する。Ｆａｂタイプキメラ受容体の軽鎖定常領域は、これらの軽鎖タイプのいずれかに由来し得る。
【０１３２】
キメラサイトカイン受容体の軽鎖定常ドメインは、カッパ鎖定常ドメインである配列番号５８として示されている配列を有し得る。
【化４】
2021532768.tif 000006
【０１３３】
５つのタイプの哺乳動物免疫グロブリン重鎖：それぞれ免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよびＩｇＥのクラスを規定するγ、δ、α、μおよびεがある。重鎖γ、δおよびαは、３つのタンデムＩｇドメインから構成される定常ドメインを有し、柔軟性を付加するためにヒンジを有する。重鎖μおよびεは、４つのドメインから構成されている。
【０１３４】
本発明のキメラサイトカイン受容体のＣＨドメインは、γ免疫グロブリン重鎖に由来する配列番号５９として示されている配列を含み得る。
【化５】
2021532768.tif 000007
【０１３５】
好ましい実施形態では、本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１のヌクレオチド配列；フレームスリップモチーフ（ＦＳＭ）または翻訳リードスルーモチーフ（ＴＲＭ）；およびキメラサイトカイン受容体（ＣＣＲ）をコードする第２のヌクレオチド配列を含む核酸構築物を提供する。
【０１３６】
切断部位
本発明の第１の態様の核酸構築物は、第１および第２のポリペプチドが別個の実体として発現され得るように、第１および第２のポリペプチドをコードする核酸配列の間に位置する切断部位をコードする配列を含み得る。
【０１３７】
切断部位は、第１および第２のポリペプチドを含むポリペプチドが分離されることを可能にする任意の配列であり得る。
【０１３８】
「切断」という用語は本明細書では便宜的に使用されるが、切断部位は、古典的切断以外の機構により、第１および第２のポリペプチドを個々の実体に分離させ得る。例えば、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２Ａ自己切断ペプチド（以下を参照のこと）については、「切断」活性：宿主細胞プロテイナーゼによるタンパク質分解、自己タンパク質分解または翻訳効果の説明のために、様々なモデルが提案されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら、（２００１）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．８２：１０２７−１０４１）。切断部位が、第１および第２のポリペプチドをコードする核酸配列の間に位置する場合に、第１および第２のポリペプチドを別個の実体として発現させる限り、このような「切断」の正確な機構は、本発明の目的のために重要ではない。
【０１３９】
切断部位はフューリン切断部位であり得る。
【０１４０】
フューリンは、サブチリシン様プロプロテインコンバターゼファミリーに属する酵素である。このファミリーのメンバーは、潜在型前駆体タンパク質をそれらの生物学的に活性な産物にプロセシングするプロプロテインコンバターゼである。フューリンは、対形成した塩基性アミノ酸プロセシング部位で前駆体タンパク質を効率的に切断し得るカルシウム依存性セリンエンドプロテアーゼである。フューリン基質の例としては、プロ副甲状腺ホルモン、トランスフォーミング成長因子ベータ１前駆体、プロアルブミン、プロベータセクレターゼ、膜タイプ１マトリックスメタロプロテイナーゼ、プロ神経成長因子のベータサブユニットおよびフォン・ビルブランド因子が挙げられる。フューリンは、塩基性アミノ酸標的配列（標準的には、Ａｒｇ−Ｘ−（Ａｒｇ／Ｌｙｓ）−Ａｒｇ’（配列番号５０））のすぐ下流でタンパク質を切断し、ゴルジ装置中に豊富である。
【０１４１】
切断部位は、タバコエッチウイルス（ＴＥＶ）切断部位であり得る。
【０１４２】
ＴＥＶプロテアーゼは、キモトリプシン様プロテアーゼである高度に配列特異的なシステインプロテアーゼである。それは、その標的切断部位に非常に特異的であるので、インビトロおよびインビボの両方で融合タンパク質の制御切断に頻繁に使用される。コンセンサスＴＥＶ切断部位は、ＥＮＬＹＦＱ＼Ｓ（配列番号５１）（ここで、「＼」は切断されるペプチド結合を示す）である。ヒト細胞などの哺乳動物細胞は、ＴＥＶプロテアーゼを発現しない。したがって、本核酸構築物がＴＥＶ切断部位を含み、哺乳動物細胞において発現される実施形態では、外因性ＴＥＶプロテアーゼもまた、哺乳動物細胞において発現されなければならない。
【０１４３】
切断部位は、自己切断ペプチドをコードし得る。
【０１４４】
「自己切断ペプチド」は、第１および第２のポリペプチドを含むポリペプチドおよび自己切断ペプチドが産生されると、いかなる外部切断活性も必要とせずにそれが異なる別個の第１および第２のポリペプチドにすぐに「切断」または分離されるように機能するペプチドを指す。
【０１４５】
自己切断ペプチドは、アフトウイルスまたはカルジオウイルス由来の２Ａ自己切断ペプチドであり得る。アフトウイルスおよびカルジオウイルスの主な２Ａ／２Ｂ切断は、それ自体のＣ末端における２Ａ「切断」により媒介される。口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）およびウマ鼻炎Ａウイルスなどのアフトウイルスでは、２Ａ領域は、タンパク質２ＢのＮ末端残基（保存的プロリン残基）と一緒に、それ自体のＣ末端における「切断」を媒介することができる自律的エレメントに相当する約１８アミノ酸の短いセクションである。
【０１４６】
より長いカルジオウイルスタンパク質のＣ末端１９アミノ酸は、２ＢのＮ末端プロリンと一緒に、アフトウイルスＦＭＤＶ２ａ配列とほぼ等しい効率で「切断」を媒介する。カルジオウイルスとしては、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）およびタイラーマウス脳炎ウイルス（ＴＭＥＶ）が挙げられる。
【０１４７】
ＥＭＣＶおよびＦＭＤＶ２Ａの変異性分析は、モチーフＤｘＥｘＮＰＧＰ（配列番号５２）が「切断」活性に本質的に関与することを明らかにした（Ｄｏｎｅｌｌｙら（２００１）上記）。
【０１４８】
本発明の切断部位は、アミノ酸配列：
Ｄｘ１Ｅｘ２ＮＰＧＰ（ここで、ｘ１およびｘ２は任意のアミノ酸である。Ｘ１は、以下の群：Ｉ、Ｖ、ＭおよびＳから選択され得る。Ｘ２は、以下の群：Ｔ、Ｍ、Ｓ、Ｌ、Ｅ、ＱおよびＦから選択され得る）を含み得る。
【０１４９】
例えば、切断部位は、表２に示されているアミノ酸配列の１つを含み得る。
【表２−１】
2021532768.tif 000008
【表２−２】
2021532768.tif 000009
【０１５０】
２Ａ配列に基づく切断部位は、例えば１５〜２２アミノ酸長であり得る。配列は、２Ａタンパク質のＣ末端、それに続いて（２ＢのＮ末端プロリンに対応する）プロリン残基を含み得る。
【０１５１】
変異性研究はまた、天然に存在する２Ａ配列に加えて、いくつかのバリアントも活性であることを示した。切断部位は、１つ、２つまたは３つのアミノ酸置換を有する天然に存在する２Ａポリペプチド由来のバリアント配列であって、２つまたはそれを超える別個のタンパク質へのポリタンパク質配列の「切断」を誘導する能力を保持するバリアント配列に対応し得る。
【０１５２】
切断配列は、すべてがある程度活性であることが示されている以下のものから選択され得る（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）上記）：
【化６】
2021532768.tif 000010
【０１５３】
ＤｘＥｘＮＰＧＰの配列に基づいて、「モチーフ、「２Ａ様」配列は、アフトウイルスまたはカルジオウイルス以外のピコルナウイルス、「ピコルナウイルス様」昆虫ウイルス、Ｃ型ロタウイルスならびにＴｒｙｐａｎｏｓｏｍａ種および細菌配列内の反復配列で見出された（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）上記）。切断部位は、これらの２Ａ様配列、例えば：
【化７−１】
2021532768.tif 000011
【化７−２】
2021532768.tif 000012
の１つを含み得る。
【０１５４】
切断部位は、配列番号３１（ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ）として示されている２Ａ様配列を含み得る。
【０１５５】
５〜３９アミノ酸のＮ末端「伸長」を含めることにより、活性を増加させ得ることが示されている（Ｄｏｎｎｅｌｌｙら（２００１）上記）。特に、切断配列は、以下の配列の１つ、または例えば最大５つのアミノ酸変化を有するそのバリアントであって、切断部位活性を保持するそのバリアントを含み得る：
【化８】
2021532768.tif 000013
【０１５６】
ベクター
本発明はまた、本発明の第１態様による核酸構築物を含むベクターを提供する。
【０１５７】
このようなベクターは、第１および第２のポリペプチドを発現するように核酸構築物を宿主細胞に導入するために使用され得る。
【０１５８】
ベクターは、例えば、プラスミドまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、またはトランスポゾンベースのベクター、または合成ｍＲＮＡであり得る。
【０１５９】
ベクターは、哺乳動物細胞、例えばＴ細胞または標的細胞をトランスフェクトまたは形質導入することができるものであり得る。
【０１６０】
細胞
本発明はさらに、本発明の核酸構築物またはベクターを含む細胞であって、核酸配列によりコードされる第１および第２のポリペプチドを発現する細胞を提供する。
【０１６１】
細胞は、任意の真核細胞、例えば免疫学的細胞であり得る。
【０１６２】
細胞は、細胞傷害性免疫細胞、例えばＴ細胞またはナチュラルキラー細胞であり得る。
【０１６３】
導入遺伝子が標的抗原を発現する場合、その細胞は、Ｔ細胞またはＣＡＲ−Ｔ細胞の標的細胞であり得る。
【０１６４】
方法
さらなる態様では、本発明は、本発明による細胞を作製するための方法であって、本発明の核酸構築物またはベクターを細胞に導入する工程を含む方法を提供する。
【０１６５】
核酸構築物は、形質導入またはトランスフェクションにより導入され得る。
【０１６６】
細胞は、被験体から単離された細胞、例えば、被験体から単離されたＴ細胞またはＮＫ細胞であり得る。
【０１６７】
本発明はまた、核酸構築物中の２つの導入遺伝子の相対発現をモジュレートするための方法であって、下流導入遺伝子の発現を減少させるために、前記２つの導入遺伝子の間にフレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフを含める工程を含む方法を提供する。
【０１６８】
核酸構築物は、２つの導入遺伝子の間に位置する切断部位をコードする配列を含み得る。２つの導入遺伝子の相対発現は、異なるフレームスリップモチーフもしくは翻訳リードスルーモチーフを選択することにより、ならびに／またはモチーフのすぐ５’および／もしくは３’側の配列を変異させることにより調整され得る。
【０１６９】
本発明はまた、核酸構築物中の２つの導入遺伝子の相対発現をモジュレートするための方法であって、下流導入遺伝子の発現を減少させるために、前記２つの導入遺伝子の間にフレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフを含める工程を含む方法を提供する。
【０１７０】
フレームスリップモチーフまたは翻訳リードスルーモチーフは、本発明の先の態様に記載されているとおりであり得る。
【０１７１】
次に、実施例により本発明をさらに説明するが、実施例は、本発明を行う上で当業者を支援するのに役立つものであり、本発明の範囲を限定することを決して意図しない。
【実施例】
【０１７２】
実施例１−フレームスリップ構築物の作製および試験
以下の構築物をＳｕｐＴ１細胞に形質導入した。
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ＳＫＩＰ＿７ｘＵ−ＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ｔｍ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ＳＫＩＰ＿６ｘＵ−ＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ｔｍ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ（対照）
【０１７３】
構築物は、国際公開第２０１３／１５３３９１号に記載されている選別自殺膜貫通タンパク質であるＲＱＲ８；およびＣＤ２２外部ドメインとＣＤ１９膜貫通およびエンドドメインとを有するキメラタンパク質をコードする。
【０１７４】
第１の構築物は、転写スリッページおよびｍＲＮＡからの塩基の喪失を促進する７つのチミン塩基（ｍＲＮＡ中のウラシル）を有する転写フレームスリップを含み、これは、ＣＤ２２コード配列をフレーム内に配置し、ＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの発現をもたらす。
【０１７５】
フローサイトメトリー分析は、フレームスリップモチーフの導入がＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの発現の劇的な減少をもたらし、同様のレベルのＲＱＲ８選別選択マーカーが観察されたことを示した（図２Ｃ）。
【０１７６】
実施例２−翻訳リードスルー構築物の作製および試験
２つの翻訳リードスルーモチーフＳＴＯＰ−ＣＵＡＧおよびＳＴＯＰ−ＣＡＡＵＵＡは、ヒトＴ細胞（ＳｕｐＴ１）およびヒトＢ細胞（Ｒａｊｉ）において機能的であり、下流自己切断２Ａペプチド配列および導入遺伝子コード配列（ＣＤ２２およびＢＣＭＡ）の翻訳リードスルーを支援することが示された。
【０１７７】
異なる終止コドンと組み合わせてこれらのリードスルーモチーフの機能を試験するために、以下の構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質導入した。
リードスルーモチーフＳＴＯＰ−ＣＵＡＧ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−ＳＴＯＰ−ＴＧＡＣＴＡＧ−２Ａ−ｈＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ＴＭ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−ＳＴＯＰ−ＴＡＧＣＴＡＧ−２Ａ−ｈＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ＴＭ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−ＳＴＯＰ−ＴＡＡＣＴＡＧ−２Ａ−ｈＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ＴＭ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−ＮＯ＿ＳＴＯＰ＿ＴＧＧＣＴＡＧ−Ｔ２Ａ−ｈＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ＴＭ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
リードスルーモチーフＳＴＯＰ−ＣＡＡＵＵＡ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−ＳＴＯＰ−ＴＧＡＣＡＡＴＴＡ−２Ａ−ｈＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ＴＭ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−ＳＴＯＰ−ＴＡＧＣＡＡＴＴＡ−２Ａ−ｈＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ＴＭ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−ＳＴＯＰ−ＴＡＡＣＡＡＴＴＡ−２Ａ−ｈＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ＴＭ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８＿ＮＯ＿ＳＴＯＰ＿ＴＧＧＣＡＡＴＴＡ−Ｔ２Ａ−ｈＣＤ２２−ＣＤ１９ＴＭ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
シグナルペプチド変異体
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−シグナルＫ９−ｈＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ＴＭ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−シグナルＫ１０−ｈＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ＴＭ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−シグナルＫ１１−ｈＣＤ２２ｅｃｔｏ−ＣＤ１９ＴＭ−ｄＣＤ１９ｅｎｄｏ
【０１７８】
野生型シグナルペプチド配列は、改変シグナルペプチドＫ１９、Ｋ１０およびＫ１１の配列と一緒に配列番号４２〜４５として以下に示されている。
配列番号４２−マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域シグナルペプチド（野生型）
ＭＥＴＤＴＬＩＬＷＶＬＬＬＬＶＰＧＳＴＧ
配列番号４３−マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域シグナルペプチド（Ｋ９変異体）
ＭＥＴＤＴＬＩＬＫＶＬＬＬＬＶＰＧＳＴＧ
配列番号４４−マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域シグナルペプチド（Ｋ１０変異体）
ＭＥＴＤＴＬＩＬＷＫＬＬＬＬＶＰＧＳＴＧ
配列番号４５−マウスＩｇカッパ鎖Ｖ−ＩＩＩ領域シグナルペプチド（Ｋ１１変異体）
ＭＥＴＤＴＬＩＬＷＶＫＬＬＬＶＰＧＳＴＧ
【０１７９】
フローサイトメトリーによりＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの発現を分析し、結果は図４Ａに示されている。野生型シグナルペプチドと比較して、リジン１１シグナルペプチド変異体（Ｌ１１Ｋ変異）では、ＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの発現は減少した。ｓｔｏｐ−ＣＵＡＧおよびｓｔｏｐ−ＣＡＡＵＵＡ翻訳リードスルーモチーフは、それらをＣＤ２２−ＣＤ１９導入遺伝子の５’側に配置した場合に同様の結果をもたらし、両モチーフは、キメラの発現レベルをＲＱＲ８選別選択マーカーの約２％またはそれ未満に減少させた。二重終止翻訳リードスルーモチーフ（４行目）を使用して、ＣＤ２２−ＣＤ１９キメラのより低い発現レベルを得た。
【０１８０】
トランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞の表面上において、ＣＤ２２−ＣＤ１９キメラの平均蛍光強度を定量し、結果は図４Ｂに示されている。翻訳リードスルー構築物を使用して、減衰シグナルペプチド変異体と比較して実質的により低いレベルのＣＤ２２−ＣＤ１９キメラを得た。
【０１８１】
実施例３−機能的翻訳リードスルー：可溶性抗ＣＤ２２Ｆａｂの分泌
以下に示されているように、ＲＱＲ８選別選択マーカーと、それに続く２Ａ自己切断ペプチド配列と、ＣＬおよびＣＨ１スペーサー領域を有する抗ＣＤ２２  ＣＡＲとをコードする核酸構築物を設計して、可溶性Ｆａｂ断片を産生した。
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ２２＿ＦａｂＣＡＲ＿９Ａ８−１−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＡＧ−４１ＢＢｚ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ２２＿ＦａｂＣＡＲ＿９Ａ８−１−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＡＡ−４１ＢＢｚ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ２２＿ＦａｂＣＡＲ＿９Ａ８−１−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＧＡ−４１ＢＢｚ
【０１８２】
これらの構築物をＰＢＭＣに形質導入し、低または高レベルのＣＤ２２を発現する標的細胞を使用して細胞傷害性アッセイを行って、ＣＡＲの有効性を決定した。これは、低レベルの標的抗原が正常組織上において発現され、細胞傷害反応の微調整が、ＣＡＲＴ細胞によるこれらの細胞のターゲティングを防止するために必要である状況を模倣する。
【０１８３】
実施例４−機能的翻訳リードスルー：第１世代から第２世代または第３世代ＣＡＲへの転換
機能的翻訳リードスルーを使用して、第１世代および第２世代ＣＡＲの間の転換を切り替え得るかを調査するために、以下の構築物を生成する：
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−Ｚｅｔａ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−Ｚｅｔａ−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＡＡ−４１ＢＢ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−Ｚｅｔａ−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＧＡ−４１ＢＢ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−Ｚｅｔａ−ＮＯ＿ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＣＡ−４１ＢＢ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−Ｚｅｔａ−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＡＧ−４１ＢＢ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−Ｚｅｔａ−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＡＡ−ＣＤ２８
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−Ｚｅｔａ−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＡＧ−ＣＤ２８
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−Ｚｅｔａ−ＮＯ＿ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＣＡ−ＣＤ２８
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−Ｚｅｔａ−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＧＡ−ＣＤ２８
【０１８４】
この第１のセットの構築物は、選別選択マーカーＲＱＲ８と、ＦｃスペーサードメインおよびＣＤ３ζエンドドメインを有する第１世代抗ＣＤ１９ＣＡＲと、それに続く、翻訳リードスルーモチーフと、４−１ＢＢまたはＣＤ２８共刺激エンドドメインとを発現する。ＣＡＲのスペーサードメインに結合して増殖をトリガーする抗Ｆｃ抗体でコーティングしたプレート中で培養する形質導入ＰＢＭＣを使用して、再刺激アッセイを設定する。ＣＤ３ζのみを有する対照第１世代ＣＡＲは限定的な増殖を示すが、他のＣＡＲは、共刺激シグナルが存在するのでより大きく増殖する。
【０１８５】
以下に示されているように、第１のセットの構築物と同様に第２のセットの構築物を生成する：
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−４１ＢＢ−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＡＡ−Ｚｅｔａ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−４１ＢＢ−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＧＡ−Ｚｅｔａ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−４１ＢＢ−ＮＯ＿ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＣＡ−Ｚｅｔａ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−４１ＢＢ−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＡＧ−Ｚｅｔａ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−ＣＤ２８−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＡＡ−Ｚｅｔａ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−ＣＤ２８−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＧＡ−Ｚｅｔａ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−ＣＤ２８−ＮＯ＿ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＣＡ−Ｚｅｔａ
・ＳＦＧｍＲ．ＲＱＲ８−２Ａ−ａＣＤ１９ｆｍｃ６３−ＨＣＨ２ＣＨ３ｐｖａａ−ＣＤ２８−ＳＴＯＰ＿ＳＫＩＰ＿ＴＡＧ−Ｚｅｔａ
【０１８６】
これらの構築物では、４−１ＢＢまたはＣＤ２８由来の共刺激ドメインは翻訳リードスルーモチーフの前にあり、ＣＤ３ζエンドドメインはその後に配置されている。これらの構築物を形質導入したＰＢＭＣを使用して、細胞傷害性アッセイおよび増殖アッセイを設定する。これらの構築物からの翻訳リードスルーは、機能的ＣＡＲ（すなわち、細胞内シグナル伝達ドメインを有するＣＡＲ）を産生するために必要である。
【０１８７】
実施例５−複合リードスルーモチーフの作製および試験
多重導入遺伝子カセットの発現を非常に低いレベルに減少させるために、以下のように、２つのＳＴＯＰ−翻訳リードスルーモチーフを有する構築物を設計した：
マーカー（ＲＱＲ８またはＨＡ８）−ＳＴＯＰ＿リードスルー−２Ａ−ＧＤ３シンターゼ−ＳＴＯＰ＿リードスルー−２Ａ−ＧＤ２シンターゼ
【０１８８】
ガングリオシドＧＤ２は、２つの酵素ＧＤ２シンターゼおよびＧＤ３シンターゼにより合成される。上記構築物は、マーカー遺伝子と比較して減少したＧＤ３シンターゼ発現をもたらし、さらに低いＧＤ２シンターゼ発現をもたらす。
【０１８９】
実施例６−ユニバーサルリードスルー構築物の作製および試験
リードスルーモチーフからの状況依存的発現に関する問題を克服するために、一群のユニバーサル構築物を生成し、これに、規定のレベルで発現される第２の導入遺伝子をクローニングし得る。ユニバーサル構築物は、自己切断２Ａペプチド配列、それに続く終止コドンおよびリードスルーモチーフおよび第２の自己切断ペプチド配列からなる。終止リードスルーモチーフを自己切断ペプチド配列と隣接させることにより、翻訳リードスルーに対する状況依存的効果を減少させ、一貫した予測可能なレベルの導入遺伝子発現を生じさせる。
【０１９０】
試験した構築物は以下のとおりである：
リードスルーモチーフＳＴＯＰ  ＣＵＡＧ
・マーカー−２Ａ−導入遺伝子１−２Ａ−ＵＧＡ−ＣＵＡＧ−２Ａ−導入遺伝子２
・マーカー−２Ａ−導入遺伝子１−２Ａ−ＵＡＧ−ＣＵＡＧ−２Ａ−導入遺伝子２
・マーカー−２Ａ−導入遺伝子１−２Ａ−ＵＡＡ−ＣＵＡＧ−２Ａ−導入遺伝子２
リードスルーモチーフＳＴＯＰ  ＣＡＡＵＵＡ
・マーカー−２Ａ−導入遺伝子１−２Ａ−ＵＧＡ−ＣＡＡＵＵＡ−２Ａ−導入遺伝子２
・マーカー−２Ａ−導入遺伝子１−２Ａ−ＵＡＧ−ＣＡＡＵＵＡ−２Ａ−導入遺伝子２
・マーカー−２Ａ−導入遺伝子１−２Ａ−ＵＡＡ−ＣＡＡＵＵＡ−２Ａ−導入遺伝子２
【０１９１】
実施例７−翻訳リードスルーモチーフを直列に配置することによる超低発現
超低レベルの導入遺伝子発現を得ることが可能であるかを決定するために、トリシストロンカセット中で２つの翻訳リードスルーモチーフを直列に配置した構築物を生成した（図５Ａ）。カセット中の第１の導入遺伝子は常に、形質導入細胞の同定のためにＣＤ８ａストーク上に提示されたＨＡエピトープからなる細胞表面マーカーであり、それに続いて、終止コドン、翻訳リードスルーモチーフおよび自己切断ペプチド配列であった。カセット中の第２の導入遺伝子は、タンデムＣｌｏｖｅｒ３（緑色蛍光タンパク質）または強化青色蛍光タンパク質（ＥＢＦＰ）のいずれかの２つの蛍光タンパク質の一方であり、それに続いて、終止コドン、翻訳リードスルーモチーフおよび自己切断ペプチド配列であった。カセット中の第３の導入遺伝子は交互の蛍光タンパク質であった。終止コドンおよび翻訳リードスルーモチーフを直列に配置することにより、第３の位置の蛍光タンパク質の発現レベルは、第２の位置のものよりも低いはずである。
【０１９２】
構築物を末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）に形質導入し、フローサイトメトリーを行って、細胞表面マーカーと比べた蛍光タンパク質の発現レベルを定量した。これらの実験の結果は、蛍光タンパク質の発現レベルが、２つの終止コドンおよび翻訳リードスルーモチーフの下流の第３の位置に配置した場合、第２の位置に配置した場合よりも有意に低いことを実証した（図５Ｂ）。以前の実験と一致して、翻訳リードスルーのレベルは終止コドンに依存的であり、階層的な終止コドンストリンジェンシーはＵＡＡ＞ＵＡＧ＞ＵＧＡであった。タンデムＣｌｏｖｅｒ３の場合、終止コドンなしの対照と比較した発現レベルの減少は、ＵＡＡについては３３倍、ＵＡＧについては２４倍およびＵＧＡについては６倍であった。第３の位置に配置した場合、タンデムＣｌｏｖｅｒ３発現のレベルは、３つすべての終止コドンについて１００倍超減少した（図５Ｃ）。
【０１９３】
実施例８−翻訳リードスルーによるＩＬ−１２分泌の制御
ＩＬ−１２は強力な炎症促進性サイトカインであり、病原体、Ｔ細胞およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞からのシグナルならびに炎症性細胞外マトリックスの成分に反応して食細胞および樹状細胞から分泌される。ＩＬ−１２の主な標的は、細胞表面上においてＩＬ−１２受容体を発現する細胞傷害性Ｔ細胞、ＴＨ１ヘルパーＴ細胞およびＮＫ細胞である。ＩＬ−１２に反応して、ＴＨ１ヘルパーＴ細胞はＩＦＮγおよびＴＮＦαを放出する。
【０１９４】
ＣＡＲ−Ｔ細胞は、構成的にまたは誘導性プロモーターからＩＬ−１２を発現するように操作されており、これは固形腫瘍をターゲティングする場合にＣＡＲ−Ｔ細胞療法の有効性を改善することが示されている。ＩＬ−１２の全身投与は毒性があり、この問題を回避するために、ＣＡＲＴ細胞または他の免疫細胞は、ＩＬ−１２を腫瘍微小環境に放出するように操作されている。しかしながら、トランスジェニックＴ細胞ＩＬ−１２分泌は、サイトカインの非常に毒性の全身レベルをもたらし得る。
【０１９５】
本発明者らは、ヒトＩＬ−１２α（ｐ３５）およびＩＬ−１２β（ｐ４０）サブユニットの間の融合物ｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２を選別選択マーカーＲＱＲ８および自己切断ペプチド配列の下流にクローニングした構築物を設計した。終止コドンまたは制御配列（トリプトファンをコードするＵＧＧ）および翻訳リードスルー配列ＣＡＡＵＵＡをＲＱＲ８コード配列のすぐ下流に配置した（図６Ａ）。前記構築物をＰＢＭＣに形質導入し、ＣＤ３εおよびＲＱＲ８に対する抗体で染色して形質導入効率を決定し、導入遺伝子の存在を検証した（図６Ｂ）。形質導入効率を決定した後、ＰＢＭＣを培養に戻し、２４、４８および７２時間の時点で上清を収集し、高感度ＥＬＩＳＡにより、ＩＬ−１２の存在について分析した（図６Ｃ）。データは、終止コドンおよび翻訳リードスルーモチーフを含めることにより、レベルが４０倍を上回って減少したことを実証した（図６Ｃ）。終止コドンストリンジェンシーの階層の傾向は、最高のストリンジェントから最低の順にＵＡＡ＞ＵＡＧ＞ＵＧＡであった。これらのデータは、形質導入細胞からのＩＬ−１２分泌のレベルを有意に減少させることが可能であったことを実証した。
【０１９６】
分泌レベルのｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２が免疫反応をトリガーすることができたことを実証するために、本発明者らは、別の一群の構築物を生成した。これらは、自殺遺伝子（ＲａｐａＣａｓｐ９）、マウス細胞表面マーカーＴｈｙ１．１およびマウスｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２を含有するトリシストロン性構築物であった（図７Ａ）。マウスｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２配列はトリシストロンカセットの末端に位置し、自己切断ペプチド配列を使用して、ポリペプチドの発現を容易にした。翻訳リードスルー構築物（ＵＡＡ−ＣＡＡＵＵＡ）を、減衰シグナルペプチド配列を有するマウスｆｌｅｘｉ−ＩＬ−１２を含有する構築物、および内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を利用してサイトカインの発現を制御する別のものと比較した。ＢａｌｂＣマウスから得られた脾細胞に前記構築物を形質導入し、ＣＤ３および細胞表面マーカーＴｈｙ１．１に対する抗体を使用してフローサイトメトリーを行って、形質導入効率を決定した（図７Ｂ）。形質導入効率を決定した後、脾細胞を培養に戻し、２４、４８および７２時間の時点で上清を収集し、ＥＬＩＳＡにより、マウスＩＬ−１２の存在について分析した（図７Ｃ）。結果は、ＩＲＥＳからのＩＬ−１２の発現が約３倍減少したことを実証した。対照的に、翻訳リードスルーモチーフＵＡＡ−ＣＡＡＵＵＡからのＩＬ−１２の発現は、ＥＬＩＳＡによりもはや検出可能ではない点まで減少した（図７Ｃ）。ＩＬ−１２が培地中に存在するかを確認するために、上清を回収し、それを使用して活性化脾細胞を再刺激した。ＩＦＮγは、ＩＬ−１２で刺激されたＴ細胞およびＮＫ細胞により分泌されるので、ＩＦＮγの存在について、これらの再刺激脾細胞由来の上清を分析した（図７Ｄ）。再刺激脾細胞から採取したすべての上清において、ＩＦＮγは検出可能であった。ＩＬ−１２  ＥＬＩＳＡの結果と一致して、対照またはＩＲＥＳ形質導入脾細胞由来の上清で再刺激した脾細胞から、最高レベルのＩＦＮγ分泌が観察された。重要なことに、翻訳リードスルー構築物を形質導入した脾細胞由来の上清で再刺激した脾細胞から、ＩＦＮγの分泌が観察された（図７Ｄ）。これらの結果は、形質導入細胞からのＩＬ−１２分泌レベルの有意な減少を得ることが可能であり、治療利益を維持しながら、潜在的にこの強力なサイトカインの毒性作用を軽減することを実証した。
【０１９７】
より治療的な状況で翻訳リードスルー構築物からのＩＬ−１２分泌の有効性および安全性プロファイルを実証するために、短縮したマウスＣＤ３４、抗ＧＤ２キメラ抗原受容体およびホタルルシフェラーゼをコードする構築物ならびに前に記載したサイトカイン発現構築物を脾細胞に共形質導入した。形質導入した脾細胞をＣＤ３４およびＴｈｙ１．１に対する抗体で染色し、フローサイトメトリーにより分析して、形質導入効率を決定した（図８Ａ）。５×１０６個の形質導入した脾細胞をマウスに注射し、１５日後、マウスを屠殺し、それらの脾臓を摘出した。脾臓サイズの比較は、ＩＬ−１２が構成的に発現される場合にのみ脾腫が観察され（２Ａ）、他の群における脾臓サイズが対照と同程度であったことを示した（図８Ｂ）。
【０１９８】
注射マウスの脾臓にリクルートされた細胞タイプをより詳細に調査するために、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８およびＣＤ１９に対する抗体で脾細胞を染色し、フローサイトメトリーにより分析した（図９Ａ）。結果は、構成的に発現されたＩＬ−１２を形質導入した脾細胞を注射したマウスの脾臓にマクロファージ（ＣＤ１１ｂ＋）がリクルートされ、約２０％の細胞がＣＤ１１ｂ＋であったことを示した。ＩＲＥＳ構築物が翻訳リードスルー構築物よりも高レベルのＩＬ−１２をもたらしたことを示す先のＥＬＩＳＡデータと一致して、これらの細胞を注射したマウスの脾臓では、より多くのＣＤ１１ｂ＋細胞が存在していた（図９Ｂ）。ＩＬ−１２またはＩＲＥＳを構成的に発現する構築物を形質導入した脾細胞を注射したマウスでは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の両方のＴ細胞のリクルートの増加が観察された（図９Ｃ、ＤおよびＥ）。対照的に、翻訳リードスルー構築物を形質導入した脾細胞を注射したマウスの脾臓におけるＣＤ１１ｂ＋およびＣＤ３＋細胞の数は、対照と同程度であった。ＩＬ−１２を構成的に発現する脾細胞を注射したマウス由来の脾臓においてのみ、Ｂ細胞数の減少が観察された。総合すると、これらの結果は、抗原の非存在下では、翻訳リードスルー構築物からのＩＬ−１２の発現が、いかなる毒性も免疫細胞のリクルートも引き起こさなかったことを示唆していた。
【０１９９】
上記本明細書で言及される刊行物はすべて、参照により本明細書に組み込まれる。記載されている本発明の方法および系の様々な変更およびバリエーションは、本発明の範囲および精神から逸脱せずに当業者に明らかである。特定の好ましい実施形態に関して本発明を説明したが、特許請求の範囲に記載されている本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されるべきでないことは理解すべきである。実際、記載されている本発明の実施様式の様々な変更は、分子生物学または関連分野の当業者に明らかであり、以下の特許請求の範囲の範囲内であることを意図する。
【図１（ａ）】
2021532768.tif 000014
【図１（ｂ）】
2021532768.tif 000015
【図１（ｃ）】
2021532768.tif 000016
【図２】
2021532768.tif 000017
【図３】
2021532768.tif 000018
【図４Ａ】
2021532768.tif 000019
【図４Ｂ】
2021532768.tif 000020
【図５−１】
2021532768.tif 000021
【図５−２】
2021532768.tif 000022
【図６−１】
2021532768.tif 000023
【図６−２】
2021532768.tif 000024
【図７−１】
2021532768.tif 000025
【図７−２】
2021532768.tif 000026
【図８Ａ】
2021532768.tif 000027
【図８Ｂ】
2021532768.tif 000028
【図９−１】
2021532768.tif 000029
【図９−２】
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【手続補正書】
【提出日】令和3年4月13日(2021.4.13)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
2021532768000001.app
【国際調査報告】
2021532768.tif 000031
2021532768.tif 000032
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2021532768.tif 000034
2021532768.tif 000035
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