(57)【要約】  ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、制御された誘導又は拡大による、抗原特異的Ｔ細胞の作出は、高度に特異的かつ有益なＴ細胞療法をもたらしうる。本開示は、Ｔ細胞製造法、並びにがん、及び他の病態、疾患、及び障害を有する対象を処置するための個別化抗原特異的Ｔ細胞療法として使用されうる治療用Ｔ細胞組成物を提供する。【選択図】図４３
2021502414.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（ａ）少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）−刺激Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団であって、
（ｉ）集団内のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より相対的に少ないか、又は
（ｉｉ）ＡＰＣが、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）−刺激ＡＰＣである、
免疫細胞の集団；及び
（ｂ）薬学的に許容される賦形剤、
を含む医薬組成物。
【請求項２】
生物学的試料が、がんを有するヒト対象に由来する、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
少なくとも１つの抗原ペプチド配列が、対象により発現されるＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に５００ｎＭ未満のＫＤ又はＩＣ５０で結合する、請求項１又は２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々が、対象のがん細胞の発現遺伝子によりコードされ、対象の非がん細胞内には存在しない突然変異を含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上が、８〜５０天然アミノ酸の長さを有する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
少なくとも１つの抗原ペプチド配列が、少なくとも２つの抗原ペプチド配列を含む、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
組成物中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が、組成物中の全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの少なくとも約１％である、請求項１〜６のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項８】
組成物中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が、組成物中の全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの少なくとも約５％である、請求項７に記載の医薬組成物。
【請求項９】
組成物中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が、少なくとも約１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、又は５×１０８個である、請求項１〜８のいずれか１項に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物を、疾患又は障害を有する対象へ投与することを含む、処置方法。
【請求項１１】
治療に使用する医薬の製造のための、請求項１〜９のいずれか１項に記載の医薬組成物の使用。
【請求項１２】
少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、該方法は、
（ａ）１以上の抗原提示細胞（ＡＰＣ）調製物を、ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に１以上の別個の期間インキュベートし；
（ｂ）１以上のＡＰＣ調製物を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に１以上の別個の期間インキュベートし、ここで、１つ以上のＡＰＣは、１つ以上のＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）−刺激ＡＰＣを含み；又は
（ｃ）ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートし、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートされ、そして、少なくとも１つのペプチドは、免疫細胞の集団と共に第１のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得、ここで、免疫細胞の集団は、少なくとも１つのＴ細胞及び少なくとも１つのＡＰＣを含む、
ことを含む方法であって、
少なくとも１つの抗原特異的メモリーＴ細胞が拡大されるか、又は少なくとも１つの抗原特異的ナイーブＴ細胞が誘導される、前記方法。
【請求項１３】
生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物とインキュベートしてから、２８日間未満の１以上の別個の期間、該免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物と共にインキュベートすることを含む、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、３以下のＡＰＣ調製物と共に３以下の別個の期間インキュベートすることを含む、請求項１２又は１３に記載の方法。
【請求項１５】
１以上のＡＰＣ調製物のうちの少なくとも２つが、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣを含む、請求項１２〜１４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１６】
１以上のＡＰＣ調製物のうちの少なくとも３つが、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣを含む、請求項１５に記載の方法。
【請求項１７】
インキュベートすることが、ＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に７日を超える期間インキュベートすることを含む、請求項１２〜１６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１８】
ＡＰＣ調製物のＡＰＣが、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上を含む１以上の抗原ペプチドをロードされたＡＰＣを含む、請求項１２〜１７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項１９】
ＡＰＣ調製物のＡＰＣが、自家ＡＰＣ又は同種ＡＰＣである、請求項１２〜１８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２０】
ＡＰＣ調製物のＡＰＣが、樹状細胞（ＤＣ）を含む、請求項１２〜１９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２１】
ＤＣがＣＤ１４１＋ＤＣである、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を得ることを含む、請求項１２〜２１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２３】
ＣＤ１９を発現する細胞を枯渇させることをさらに含む、請求項１２〜２２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２４】
ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させることが、ＣＤ１４又はＣＤ２５に結合する薬剤を、１以上のＡＰＣ調製物のＡＰＣへ結合させることを含む、請求項１２〜２３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２５】
少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞のうちの１つ以上を対象へ投与することをさらに含む、請求項１２〜２４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２６】
インキュベートすることが、１以上のＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日を超える期間インキュベートすることを含む、請求項１２〜２５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２７】
１以上のＡＰＣ調製物のうちの少なくとも１つを、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子を含む第１の培地と共に第１の期間インキュベートすることを含む、請求項１２〜２６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項２８】
１以上のＡＰＣ調製物のうちの少なくとも１つを、１以上のサイトカイン又は増殖因子を含む第２の培地と共に、第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣを得ることを含む、請求項２７に記載の方法。
【請求項２９】
第３の期間の後で、第２の培地の１以上のサイトカイン又は増殖因子を除去することをさらに含む、請求項２８に記載の方法。
【請求項３０】
ＡＰＣ調製物のＡＰＣが、１以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される、請求項１２〜２９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３１】
１以上のサイトカイン又は増殖因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含む、請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
抗原が、ネオ抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、マイナー組織適合性抗原、又はこれらの組合せである、請求項１２〜３１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３３】
ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施される、請求項１２〜３２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３４】
ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートすることを含む、請求項１２〜３３のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３５】
少なくとも１つのペプチドを、ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第２の期間インキュベートし、これにより、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を得ることを含む、請求項１２〜３４のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３６】
第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、請求項１２〜３５のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３７】
第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、（ｉ）成熟ＡＰＣ試料のうちのＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートするか、（ｉｉ）ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第２のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第４の期間インキュベートするか、又は（ｉｉｉ）ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちのＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、請求項１２〜３６のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３８】
第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、（ｉ）成熟ＡＰＣ試料のうちのＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第５の期間インキュベートするか、（ｉｉ）ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第３のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第５の期間インキュベートするか、又は（ｉｉｉ）ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第３のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、請求項１２〜３７のいずれか１項に記載の方法。
【請求項３９】
１以上の別個の期間、３以下の別個の期間、第１の期間、第２の期間、第３の期間、第４の期間、又は第５の期間が、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、少なくとも２８時間、少なくとも２９時間、少なくとも３０時間、少なくとも３１時間、少なくとも３２時間、少なくとも３３時間、少なくとも３４時間、少なくとも３５時間、少なくとも３６時間、少なくとも３７時間、少なくとも３８時間、少なくとも３９時間、又は少なくとも４０時間である、請求項１２〜３８のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４０】
１以上の別個の期間、３以下の別個の期間、第１の期間、第２の期間、第３の期間、第４の期間、又は第５の期間が、１〜４時間、１〜３時間、１〜２時間、４〜４０時間、７〜４０時間、４〜３５時間、４〜３２時間、７〜３５時間、又は７〜３２時間である、請求項１２〜３９のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４１】
免疫細胞の集団が、ＡＰＣ、又は１つ以上のＡＰＣ調製物のうちの少なくとも１つを含む、請求項１２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４２】
免疫細胞の集団がＡＰＣを含まず、免疫細胞の集団が１以上のＡＰＣ調製物のうちの１つを含まない、請求項１２〜４１のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４３】
ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含み、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートされ、少なくとも１つのペプチドは、免疫細胞の集団と共に第１のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得、ここで、免疫細胞の集団は、少なくとも１つのＴ細胞及び少なくとも１つのＡＰＣを含む、請求項１２〜４２のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４４】
ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、少なくとも１つのＡＰＣと共にインキュベートし、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第２の期間インキュベートされ、そして、少なくとも１つのペプチドは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第２のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を得；そして、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を、第１の刺激されたＴ細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得る、ことを含む、請求項４３に記載の方法。
【請求項４５】
ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、少なくとも１つのＡＰＣと共にインキュベートし、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第３の期間インキュベートされ、そして、少なくとも１つのペプチドは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第３のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第２のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を得；そして、第２のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を、第２の刺激されたＴ細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得る、ことを含む、請求項４４に記載の方法。
【請求項４６】
第１、第２、又は第３の刺激されたＴ細胞試料のうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む、請求項１２〜４０のいずれか１項に記載の方法。
【請求項４７】
（ａ）少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む、対象に由来する生物学的試料を得；
（ｂ）ＣＤ１４を発現する細胞を生物学的試料からエンリッチし、これにより、ＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料を得；
（ｃ）ＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子と共に第１の期間インキュベートし；
（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；
（ｅ）ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、１以上のサイトカイン又は増殖因子と共に第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣ試料を得；
（ｆ）成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣを、Ｔ細胞を含む、ＣＤ１４及びＣＤ２５を枯渇させた試料と共に第４の期間インキュベートし；
（ｇ）Ｔ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし；
（ｈ）Ｔ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第６の期間インキュベートし；そして
（ｉ）Ｔ細胞のうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へと投与する、
ことを含む方法。
【請求項４８】
（ａ）少なくとも１つのＡＰＣ及び少なくとも１つのＴ細胞を含む、対象に由来する生物学的試料を得；
（ｂ）ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を得；
（ｃ）ＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；
（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；
（ｅ）ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｆ）第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｇ）任意選択で、第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｈ）第１、第２、又は第３の刺激されたＴ細胞試料のうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、
ことを含む方法。
【請求項４９】
（ａ）少なくとも１つのＡＰＣ及び少なくとも１つのＴ細胞を含む、対象に由来する生物学的試料を得；
（ｂ）ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を得；
（ｃ）ＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；
（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；
（ｅ）ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｆ）任意選択で、第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｇ）任意選択で、第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｈ）第１、第２、又は第３の刺激されたＴ細胞試料のうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、
ことを含む方法。
【請求項５０】
（ａ）少なくとも１つのＡＰＣ及び少なくとも１つのＴ細胞を含む、対象に由来する生物学的試料を得；
（ｂ）ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を得；
（ｃ）ＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；
（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；
（ｅ）第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｆ）任意選択で、第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第２のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｇ）任意選択で、第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第３のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｈ）第１、第２、又は第３の刺激されたＴ細胞試料のうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、
ことを含む方法。
【請求項５１】
（ａ）少なくとも１つのＡＰＣ及び少なくとも１つのＴ細胞を含む、対象に由来する生物学的試料を得；
（ｂ）ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を得；
（ｃ）ＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；
（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４及びＣＤ２５細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；
（ｅ）第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｆ）任意選択で、第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｇ）任意選択で、第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｈ）第１、第２、又は第３の刺激されたＴ細胞試料のうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、
ことを含む方法。
【請求項５２】
（ａ）ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートし、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートされ、そして、少なくとも１つのペプチドは、免疫細胞の集団と共に第１のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得、ここで、免疫細胞の集団は、少なくとも１つのＴ細胞及び少なくとも１つのＡＰＣを含み；
（ｂ）任意選択で、ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、少なくとも１つのＡＰＣと共にインキュベートし、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第２の期間インキュベートされ、そして、少なくとも１つのペプチドは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第２のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を得；そして、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を、第１の刺激されたＴ細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得；
（ｃ）任意選択で、ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、少なくとも１つのＡＰＣと共にインキュベートし、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第３の期間インキュベートされ、そして、少なくとも１つのペプチドは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第３のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第２のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を得；そして、第２のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を、第２の刺激されたＴ細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得；そして
（ｄ）第１の刺激されたＴ細胞試料、第２の刺激されたＴ細胞試料、又は第３の刺激されたＴ細胞試料のうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、
ことを含む方法。
【請求項５３】
（ａ）刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の１以上の細胞マーカーの発現を決定し、そして
（ｂ）刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定する、
ことを含む方法であって、
発現の決定と結合の決定が同時に実施される、前記方法。
【請求項５４】
（ａ）生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、ペプチド−ＭＨＣ複合体を含むＡＰＣと共にインキュベートし、これにより、刺激された免疫細胞試料を得；
（ｂ）刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の１以上の細胞マーカーの発現を決定し；そして
（ｃ）刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定する、
ことを含む方法であって、
発現の決定と結合の決定が同時に実施される、前記方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
[0001]本願は、２０１７年１１月８日に出願された、米国仮出願第６２／５８３，２２９号；２０１７年１１月２０日に出願された、米国仮出願第６２／５８８，５９０号；２０１８年１月１７日に出願された、米国仮出願第６２／６１８，４４５号；及び２０１８年９月２７日に出願された、米国仮出願第６２／７３７，６２５号の利益を主張するものであり、これら出願はその全体が本明細書に援用される。
【背景技術】
【０００２】
[0002]腫瘍ワクチンは、典型的には、腫瘍細胞を認識して溶解させる抗原特異的細胞傷害性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を誘導するように一緒に作用する、腫瘍抗原と免疫刺激性分子（例えば、アジュバント、サイトカイン、又はＴＬＲリガンド）とから構成される。このようなワクチンは、共通の組織特異的腫瘍抗原、又は全腫瘍細胞調製物の形態である共通抗原と患者特異的抗原との混合物を含有する。共通の組織特異的腫瘍抗原は、理想的には、多くの個体にわたって腫瘍内に選択的に発現する免疫原性タンパク質であり、一般に、合成ペプチド又は組換えタンパク質として患者へ送達される。これに対し、全腫瘍細胞調製物は、自家照射細胞、細胞溶解物、細胞融合物、熱ショックによるタンパク質調製物、又は全ｍＲＮＡとして患者へ送達される。全腫瘍細胞は自家患者から単離されるため、細胞は、患者特異的腫瘍抗原及び共通腫瘍抗原を含みうる。最後に、ワクチン中で使用されることは稀な第３のクラスの腫瘍抗原であるネオ抗原が存在し、これらは変化したアミノ酸配列をもたらす腫瘍特異的突然変異（患者特異的又は共通でありうる）を有するタンパク質から成る。このような突然変異タンパク質は、（ａ）突然変異として腫瘍細胞特有であり、その対応するタンパク質は腫瘍内にのみ存在し；（ｂ）中枢性寛容を回避し、したがって、免疫原性となる可能性が高く；（ｃ）液性免疫によるもの及び細胞性免疫によるものを含めた免疫認識の優れた標的となる。
【０００３】
[0003]養子免疫療法又は養子細胞療法（ＡＣＴ）とは、疾患を治療するための、遺伝子修飾Ｔリンパ球の対象への移植である。養子免疫療法は、がん、感染性疾患、自己免疫疾患、炎症性疾患、及び免疫不全症を含めた多種多様な疾患を処置するためのその潜在的可能性を未だ実現していない。しかし、全てではないが大半の養子免疫療法戦略は、臨床的に有効な治療用量のＴ細胞を作出するために、Ｔ細胞の活性化ステップ及び拡大ステップを必要とする。生細胞培養の固有の複雑さ及び患者間のばらつきに起因して、遺伝子操作されたＴ細胞を含めた治療用量のＴ細胞を作出するための現行の技術は、依然としてＴ細胞製造工程の煩雑さにより制約されている。既存のＴ細胞製造工程は、容易に拡大可能、反復可能、信頼可能、又は効率的なものではなく、枯渇しやすくエフェクター免疫細胞機能の喪失を起こしやすいことがある低品質のＴ細胞生成物をもたらすことが多い。現在のところ、遺伝子操作されたＴ細胞による養子免疫療法は、限定的な成功を収めているに過ぎず、臨床活性の変動を日常的に示している。したがって、このような治療は広範な臨床使用に適さない。したがって、好適な表現型及び機能を有する抗原特異的Ｔ細胞を拡大及び誘導するための組成物及び方法の開発が、依然として必要とされている。
【発明の概要】
【０００４】
[0004]一部の態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含み、集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量と相対的に異なる医薬組成物が提示される。一部の態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含み、集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量と異なる医薬組成物が提示される。一部の態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含み、集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の百分率が、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の百分率と異なる医薬組成物が提示される。一部の態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含み、集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の濃度が、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の濃度と異なる医薬組成物が提示される。
【０００５】
[0005]一部の態様では、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含み、集団内のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より相対的に少ない組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含み、集団内のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より少ない組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含み、集団内のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の百分率が、生物学的試料中のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の百分率より小さい組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含み、集団内のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の濃度が、生物学的試料中のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の濃度より小さい組成物が提示される。
【０００６】
[0006]一部の態様では、生物学的試料に由来するＴ細胞を含む免疫細胞の集団であって、Ｔ細胞が、抗原提示細胞（ＡＰＣ）−刺激Ｔ細胞であり、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含み、ＡＰＣはＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣである、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含む医薬組成物が提示される。
【０００７】
[0007]一部の態様では、生物学的試料に由来するＴ細胞を含む免疫細胞の集団であって、Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含み；少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、全Ｔ細胞、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％であり；生物学的試料は１以上の抗原特異的Ｔ細胞を含み；生物学的試料中の１以上の抗原特異的Ｔ細胞は、生物学的試料中の全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、又は０．０５％である医薬組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料から拡大又は誘導されたＴ細胞を含む免疫細胞の集団であって、生物学的試料から拡大又は誘導されたＴ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含み；少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の、量、濃度、又は百分率は、生物学的試料中の抗原特異的Ｔ細胞又は全Ｔ細胞の、量、濃度、又は百分率の少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００倍である医薬組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来するＴ細胞を含む免疫細胞の集団であって、Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含み；少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、生物学的試料から、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００倍に拡大又は誘導された抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含み；少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、全Ｔ細胞、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％であり；生物学的試料は１以上の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含み；生物学的試料中の１以上の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、生物学的試料中の全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、又は０．０５％である医薬組成物が提示される。一部の実施形態では、医薬組成物は、生物学的試料に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含み、ここで、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの少なくとも約、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％であり；生物学的試料は１以上の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含み；生物学的試料中の１以上の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、生物学的試料中の全ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、又は０．０５％である。一部の態様では、生物学的試料から拡大又は誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、生物学的試料から拡大又は誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含み；少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の、量、濃度、又は百分率は、生物学的試料中の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、又は全Ｔ細胞の、量、濃度、又は百分率の少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００倍である医薬組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来するＣＤ４＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含み；少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、生物学的試料から、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００倍に拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む医薬組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来する、ＣＤ２５を発現する細胞又はＣＤ２５及びＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させた、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、ＣＤ４＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含み；少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、生物学的試料と比較して、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、又は５００倍に拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む医薬組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来する、ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含み；少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、全Ｔ細胞、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％であり；生物学的試料は１以上の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含み；生物学的試料中の１以上の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、生物学的試料中の全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、又は０．０５％である医薬組成物が提示される。一部の実施形態では、医薬組成物は、生物学的試料に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含み、ここで、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの少なくとも約、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％であり；生物学的試料は１以上の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含み；生物学的試料中の１以上の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、生物学的試料中の全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０
．００５％、０．０１％、又は０．０５％である。一部の態様では、生物学的試料から拡大又は誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団であって、生物学的試料から拡大又は誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含み；少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の量、濃度、又は百分率は、生物学的試料中の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、又は全Ｔ細胞の量、濃度、又は百分率の少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００倍である医薬組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含み；少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、生物学的試料から、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００倍に拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む医薬組成物が提示される。一部の態様では、生物学的試料に由来するＣＤ８＋Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、ＣＤ８＋Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含み；少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、生物学的試料から、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、又は１０００倍に拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む医薬組成物が提示される。
【０００８】
[0008]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＡＰＣ−刺激Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より相対的に少ない。一部の実施形態では、集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より相対的に多い。一部の実施形態では、集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の百分率は、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の百分率より小さい。一部の実施形態では、集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の百分率は、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の百分率より大きい。一部の実施形態では、集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の濃度は、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の濃度より小さい。一部の実施形態では、集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の濃度は、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の濃度より大きい。
【０００９】
[0009]一部の実施形態では、生物学的試料は対象に由来する。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は疾患又は障害を有する。一部の実施形態では、疾患又は障害はがんである。一部の実施形態では、がんは、卵巣がん、肺がん、及び黒色腫から成る群より選択される。
【００１０】
[0010]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ４エンリッチＴ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ８エンリッチＴ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、拡大されたメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、誘導されたナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、拡大されたメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、誘導されたナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【００１１】
[0011]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ）阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せを含む培地中で刺激される。一部の実施形態では、ＩＤＯ阻害剤は、エパカドスタット、ナボキシモド、１−メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである。
【００１２】
[0012]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列は、（Ａ）点突然変異、（Ｂ）スプライス部位突然変異、（Ｃ）フレームシフト突然変異、（Ｄ）リードスルー突然変異、（Ｅ）遺伝子融合突然変異、及びこれらの組合せから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列は、対象のＨＬＡタンパク質に、対応する野生型ペプチドより大きな親和性で結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列は、対象のＨＬＡタンパク質に、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＫＤ又はＩＣ５０で結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々は、対象により発現されるＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ペプチド−ＨＬＡ複合体に、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＫＤ又はＩＣ５０で結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々は、対象の非がん細胞内に存在しない突然変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々は、対象のがん細胞の遺伝子又は発現遺伝子によりコードされる。
【００１３】
[0013]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上は、少なくとも８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０；４０；５０；６０；７０；８０；９０；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；１，０００；１，５００；２，０００；２，５００；３，０００；４，０００；５，０００；７，５００；又は１０，０００天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上は、クラスＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、８〜１２天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上は、クラスＩＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、１６〜２５天然アミノ酸の長さを有する。
【００１４】
[0014]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列は、複数の抗原ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、複数の抗原ペプチド配列は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００の抗原ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、抗原は、ネオ抗原、腫瘍関連抗原、過剰発現抗原、ウイルス抗原、マイナー組織適合性抗原、又はこれらの組合せである。
【００１５】
[0015]一部の実施形態では、ＡＰＣは、１つ以上のＡＰＣ調製物である。一部の実施形態では、ＡＰＣは、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上を含む１以上の抗原ペプチドをロードされたＡＰＣを含む。一部の実施形態では、ＡＰＣは、自家ＡＰＣ、同種ＡＰＣ、又は人工ＡＰＣである。一部の実施形態では、ＡＰＣは樹状細胞（ＤＣ）を含む。一部の実施形態では、ＡＰＣはＣＤ１４＋単球に由来する。一部の実施形態では、ＡＰＣは、ＣＤ１４エンリッチＡＰＣである。一部の実施形態では、ＡＰＣは、ＣＤ１４１エンリッチＡＰＣである。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋単球は、ＰＢＭＣを含む、対象に由来する生物学的試料からエンリッチされる。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋単球は、１以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される。一部の実施形態では、１以上のサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含む。
【００１６】
[0016]一部の実施形態では、ＣＤ１４＋単球は、ＰＢＭＣを含む、第２の生物学的試料に由来する。一部の実施形態では、第２の生物学的試料は、同じ対象に由来する。
[0017]一部の実施形態では、生物学的試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。
【００１７】
[0018]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、複数の抗原特異的Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、組成物中の少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、全Ｔ細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、組成物中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、組成物中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である。
【００１８】
[0019]一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含み；ここで、集団内のＣＤ１９及び／又はＣＤ１６を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中のＣＤ１９及び／又はＣＤ１６を発現する免疫細胞の量と異なる。一部の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含み；ここで、集団内のＣＤ１９及び／又はＣＤ１６を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中のＣＤ１９及び／又はＣＤ１６を発現する免疫細胞の量より小さい。
【００１９】
[0020]一部の態様では、本明細書に記載の組成物を、疾患又は障害を有する対象へ投与することを含む処置方法が提示される。
[0021]一部の態様では、治療に使用する医薬の製造のために、本明細書に記載の組成物を使用する方法が提示される。
【００２０】
[0022]１つの態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法を提示するものであり、該方法は、ＣＤ２５又はＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にＡＰＣをインキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にＡＰＣをインキュベートすることを含む方法を使用して拡大又は誘導された抗原特異的Ｔ細胞の量の少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、又は５００倍に拡大又は誘導された抗原特異的Ｔ細胞の量を含む。１つの態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を調製する方法を提示するものであり、該方法は、ＣＤ２５又はＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にＡＰＣをインキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にＡＰＣをインキュベートすることを含む方法を使用して拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の量の少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、又は５００倍に拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の量を含む。１つの態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を調製する方法を提示するものであり、該方法は、ＣＤ２５又はＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にＡＰＣをインキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にＡＰＣをインキュベートすることを含む方法を使用して拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量の少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、又は５００倍に拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量を含む。
【００２１】
[0023]一部の実施形態では、生物学的試料は、ＣＤ１９を発現する細胞をさらに枯渇させられる。一部の実施形態では、生物学的試料は、ＣＤ１９を発現する細胞をさらに枯渇させられる。一部の実施形態では、ＡＰＣは、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣである。一部の実施形態では、免疫細胞の集団をインキュベートすることは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はこれらの組合せを含有する培地中で実施される。一部の実施形態では、培地は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ）阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せをさらに含む。一部の実施形態では、ＩＤＯ阻害剤は、エパカドスタット、ナボキシモド、１−メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである。
【００２２】
[0024]１つの態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物を調製する方法を提示するものであり、該方法は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートし；その後、生物学的試料の少なくとも１つのＴ細胞をＡＰＣと共にインキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートすることを含まず；その後、生物学的試料の少なくとも１つのＴ細胞をＡＰＣと共にインキュベートすることを含む方法を使用して拡大又は誘導された抗原特異的Ｔ細胞の量の少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、又は５００倍に拡大又は誘導された抗原特異的Ｔ細胞の量を含む。１つの態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞を含む医薬組成物を調製する方法を提示するものであり、該方法は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートし；その後、生物学的試料の少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞をＡＰＣと共にインキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートすることを含まず；その後、生物学的試料の少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞をＡＰＣと共にインキュベートすることを含む方法を使用して拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の量の少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、又は５００倍に拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の量を含む。１つの態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を含む医薬組成物を調製する方法を提示するものであり、該方法は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートし；その後、生物学的試料の少なくとも１つのＣＤ８＋Ｔ細胞をＡＰＣと共にインキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートすることを含まず；その後、生物学的試料の少なくとも１つのＣＤ８＋Ｔ細胞をＡＰＣと共にインキュベートすることを含む方法を使用して拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量の少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９、２、２．５、３、３．５、４、４．５、５、５．５、６、６．６、７、７．５、８、８．５、９、９．５、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１２５、１５０、１７５、２００、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、又は５００倍に拡大又は誘導された抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の量を含む。
【００２３】
[0025]１つの態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法を提示するものであり、該方法は、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にＡＰＣをインキュベートすることを含む。
【００２４】
[0026]１つの態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法を提示するものであり、該方法は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）−刺激ＡＰＣを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含む。
【００２５】
[0027]１つの態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物を調製する方法を提示するものであり、該方法は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートし；その後、生物学的試料の少なくとも１つのＴ細胞をＡＰＣと共にインキュベートすることを含む。
【００２６】
[0028]１つの態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法を提示するものであり、該方法は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、１つ以上のＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物とインキュベートしてから、２８日間未満の１以上の別個の期間、免疫細胞の集団を１つ以上のＡＰＣ調製物と共にインキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的メモリーＴ細胞が拡大されるか、又は少なくとも１つの抗原特異的ナイーブＴ細胞が誘導される。
【００２７】
[0029]１つの態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法を提示するものであり、該方法は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、３つ以下のＡＰＣ調製物と共に３以下の別個の期間インキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的メモリーＴ細胞が拡大されるか、又は少なくとも１つの抗原特異的ナイーブＴ細胞が誘導される。
【００２８】
[0030]一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する。
[0031]一部の実施形態では、ＡＰＣは、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣである。一部の実施形態では、ＡＰＣ調製物のうちの少なくとも１つは、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣを含む。一部の実施形態では、ＡＰＣ調製物のうちの少なくとも２つは、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣを含む。一部の実施形態では、ＡＰＣ調製物のうちの少なくとも３つは、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣを含む。一部の実施形態では、ＡＰＣ調製物の各々は、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣを含む。
【００２９】
[0032]一部の実施形態では、ＡＰＣは、１つ以上のＡＰＣ調製物を含む。一部の実施形態では、ＡＰＣ調製物は、３つ以下のＡＰＣ調製物を含む。一部の実施形態では、ＡＰＣ調製物は、１以上の別個の期間内に、逐次的に免疫細胞と共にインキュベートされる。一部の実施形態では、生物学的試料は対象に由来する。一部の実施形態では、対象はヒトである。一部の実施形態では、対象は疾患又は障害を有する。一部の実施形態では、疾患又は障害はがんである。一部の実施形態では、がんは、卵巣がん、肺がん、及び黒色腫から成る群より選択される。
【００３０】
[0033]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ４エンリッチＴ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ８エンリッチＴ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのメモリーＴ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのナイーブＴ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【００３１】
[0034]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列は、（Ａ）点突然変異、（Ｂ）スプライス部位突然変異、（Ｃ）フレームシフト突然変異、（Ｄ）リードスルー突然変異、（Ｅ）遺伝子融合突然変異、及びこれらの組合せから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列は、点突然変異を含み、対象のＨＬＡタンパク質に、対応する野生型ペプチドより大きな親和性で結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列は、対象のＨＬＡタンパク質に、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＫＤ又はＩＣ５０で結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々は、対象により発現されるＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ＴＣＲは、ペプチド−ＨＬＡ複合体に、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＫＤ又はＩＣ５０で結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々は、対象の非がん細胞内に存在しない突然変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々は、対象のがん細胞の遺伝子又は発現遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上は、少なくとも８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０；４０；５０；６０；７０；８０；９０；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；１，０００；１，５００；２，０００；２，５００；３，０００；４，０００；５，０００；７，５００；又は１０，０００天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上は、クラスＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、８〜１２天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上は、クラスＩＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、１６〜２５天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列は、複数の抗原ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、複数の抗原ペプチド配列は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００の抗原ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、抗原は、ネオ抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、マイナー組織適合性抗原、又はこれらの組合せである。
【００３２】
[0035]一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を、生物学的試料から枯渇させることを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させることは、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５に結合する薬剤を、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣへ結合させることを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５に結合する薬剤はビオチン化される。一部の実施形態では、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させることは、固体支持体上の抗ビオチン試薬を、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５に結合する薬剤へ結合させることをさらに含む。一部の実施形態では、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５に結合する薬剤は、固体支持体へ接合される。
【００３３】
[0036]一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上を含む１以上の抗原ペプチドをロードされたＡＰＣを含む。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、自家ＡＰＣ又は同種ＡＰＣである。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）を含む。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、ＣＤ１４＋単球に由来する。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、生物学的試料からエンリッチされる。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、１以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される。一部の実施形態では、１以上のサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含む。
【００３４】
[0037]一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、第２の生物学的試料に由来する。一部の実施形態では、第２の生物学的試料は同じ対象に由来する。一部の実施形態では、生物学的試料は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。
【００３５】
[0038]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、複数の抗原特異的Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である。
【００３６】
[0039]一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞のうちの１つ以上を対象へ投与することをさらに含む。
[0040]一部の実施形態では、別個の期間の合計期間は２８日間未満である。一部の実施形態では、インキュベートすることは、ＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に７日を超える期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のうちの１つ以上を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子を含む第１の培地と共に第１の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの１つ以上を、少なくとも１つのペプチドと共に第２の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のうちの１つ以上を、１以上のサイトカイン又は増殖因子を含む第２の培地と共に第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣを得ることを含む。一部の実施形態では、１以上のサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、第３の期間の後で、かつ、第４の期間の開始の前に、第２の培地の１以上のサイトカイン又は増殖因子を除去することをさらに含む。
【００３７】
[0041]一部の実施形態では、方法はｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施される。
[0042]一部の実施形態では、生物学的試料は、対象から新たに得られるか、又は凍結試料である。
【００３８】
[0043]一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つのＡＰＣと少なくとも１つのＰＢＭＣとを含む、対象に由来する生物学的試料を得ることを含む。
[0044]一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を得ることを含む。
【００３９】
[0045]一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートすることを含む。
[0046]一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つのペプチドを、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を得ることを含む。
【００４０】
[0047]一部の実施形態では、方法は、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＰＢＭＣと共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料を得ることを含む。
【００４１】
[0048]一部の実施形態では、方法は、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料を得ることを含む。
【００４２】
[0049]一部の実施形態では、方法は、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第２のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料を得ることを含む。
【００４３】
[0050]一部の実施形態では、方法は、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料を得ることを含む。
【００４４】
[0051]一部の実施形態では、方法は、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＰＢＭＣ試料を得ることを含む。
【００４５】
[0052]一部の実施形態では、方法は、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第３のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＰＢＭＣ試料を得ることを含む。
【００４６】
[0053]一部の実施形態では、方法は、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＰＢＭＣ試料を得ることを含む。
【００４７】
[0054]一部の実施形態では、方法は、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む。一部の実施形態では、方法は、第３の刺激されたＰＢＭＣ試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む。
【００４８】
[0055]一部の実施形態では、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣをインキュベートすることは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はこれらの組合せの存在下で実施される。一部の実施形態では、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣをインキュベートすることは、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ）阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せの存在下で実施される。一部の実施形態では、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣをインキュベートすることは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はこれらの組合せの存在下で実施される。一部の実施形態では、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣをインキュベートすることは、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ）阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せの存在下で実施される。
【００４９】
[0057]本明細書の１つの態様では、少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む、対象に由来する生物学的試料を得；ＣＤ１４を発現する細胞を生物学的試料からエンリッチし、これにより、ＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料を得；ＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子と共に第１の期間インキュベートし；少なくとも１つのペプチドを、ＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、１以上のサイトカイン又は増殖因子と共に第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣ試料を得；成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣを、ＰＢＭＣを含むＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を枯渇させた試料と共に第４の期間インキュベートし；ＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし；ＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第６の期間インキュベートし；そして、ＰＢＭＣのうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む方法が提示される。
【００５０】
[0058]本明細書の１つの態様では、少なくとも１つのＡＰＣと少なくとも１つのＰＢＭＣとを含む、対象に由来する生物学的試料を得；ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を得；ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；少なくとも１つのペプチドを、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＰＢＭＣと共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；第１の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；任意選択で、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；第１、第２、又は第３の刺激されたＰＢＭＣ試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む方法が提示される。
【００５１】
[0059]本明細書の１つの態様では、少なくとも１つのＡＰＣと少なくとも１つのＰＢＭＣとを含む、対象に由来する生物学的試料を得；ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を得；ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；少なくとも１つのペプチドを、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＰＢＭＣと共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；任意選択で、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；任意選択で、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；そして、第１、第２、又は第３の刺激されたＰＢＭＣ試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む方法が提供される。
【００５２】
[0060]本明細書の１つの態様では、少なくとも１つのＡＰＣと少なくとも１つのＰＢＭＣとを含む、対象に由来する生物学的試料を得；ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を得；ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；少なくとも１つのペプチドを、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＰＢＭＣと共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；任意選択で、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第２のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；任意選択で、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第３のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；そして、第１、第２、又は第３の刺激されたＰＢＭＣ試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む方法が提供される。
【００５３】
[0061]本明細書の１つの態様では、少なくとも１つのＡＰＣと少なくとも１つのＰＢＭＣとを含む、対象に由来する生物学的試料を得；ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を得；ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；少なくとも１つのペプチドを、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＰＢＭＣと共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；任意選択で、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；任意選択で、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；第１、第２、又は第３の刺激されたＰＢＭＣ試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む方法が提供される。
【００５４】
[0062]本明細書の１つの態様では、刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の１以上の細胞マーカーの発現を決定し；そして、刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞のペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定することを含み、発現を決定することと結合を決定することは同時に実施される方法が提示される。一部の実施形態では、刺激された免疫細胞試料は、ペプチド−ＭＨＣ複合体を含むＡＰＣにより刺激された免疫細胞の集団である。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、生物学的試料に由来する。
【００５５】
[0063]本明細書の１つの態様では、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、ペプチド−ＭＨＣ複合体を含むＡＰＣと共にインキュベートし、これにより、刺激された免疫細胞試料を得；刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の１以上の細胞マーカーの発現を決定し；そして、刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞のペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定することを含み、発現を決定することと結合を決定することは同時に実施される方法が提示される。
【００５６】
[0064]一部の実施形態では、１以上の細胞マーカーは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＡＭＰ−１、４−１ＢＢ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７Ａ、グランザイムＢ、ＰＤ−１、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＦｏｘＰ３、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、１以上の細胞マーカーはサイトカインを含む。一部の実施形態では、１以上の細胞マーカーは脱顆粒マーカーを含む。一部の実施形態では、１以上の細胞マーカーは細胞表面マーカーを含む。一部の実施形態では、１以上の細胞マーカーはタンパク質を含む。一部の実施形態では、刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞のペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定することは、刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体のペプチド及びＭＨＣを含むＭＨＣ４量体への結合を決定することを含む。一部の実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣである。一部の実施形態では、ペプチド−ＭＨＣ複合体は１以上の標識を含む。一部の実施形態では、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団は、各々が１以上の生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含む、２以上の試料を含む。一部の実施形態では、２以上の試料は、２以上の試料標識により標識される。一部の実施形態では、発現を決定すること及び結合を決定することは、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む。一部の実施形態では、発現を決定すること及び結合を決定することは、単一細胞解析を含む。一部の実施形態では、発現を決定すること及び結合を決定することは、１以上の細胞マーカーのいずれも発現し、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する免疫細胞の百分率を決定することを含む。一部の実施形態では、標識はフルオロフォアを含む。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、本明細書に記載の組成物の免疫細胞の集団を代表する免疫細胞の集団を含む。
【００５７】
[0065]本発明の態様又は実施形態が、マーカッシュ群又は他の代替法による群分けとの関係で記載される場合、本発明全体として列挙された全群だけを包含するのではなく、また、群の各メンバーも個別に包含し、主要な群の全ての可能な亜群も包含し、また、群のメンバーのうちの１以上が存在しない主要な群も包含する。本発明はまた、特許請求される発明における群のメンバーのいずれかのうちの１以上の、明示的な除外も想定する。
援用
[0066]本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、及び特許出願は、各個別の刊行物、特許、又は特許出願が援用されることが具体的かつ個別に指し示された場合と同程度に、全ての目的で、それらの全体が本明細書に援用される。例えば、本明細書で言及される全ての刊行物及び特許は、刊行物中で記載されている、キット、組成物、及び方法であって、本明細書で記載される方法、キット、及び組成物との関連で使用されうるキット、組成物、及び方法について記載及び開示することを目的として、それらの全体が本明細書に援用される。本明細書で論じられる文献は、それらの開示が本願の出願日以前であったことだけのために提示される。本明細書のいかなる内容も、本明細書で記載された発明者らが、先行発明のために、又は他の任意の理由で、このような開示に先行する資格があることの容認とはみなさないものとする。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１Ａ】[0067]図１Ａは、抗原特異的Ｔ細胞の製造プロトコールについての例示的な概略を描示する。
【図１Ｂ】[0068]図１Ｂは、抗原特異的Ｔ細胞の製造プロトコールについての例示的な概略を描示する。
【図２】[0069]図２は、長鎖ペプチド又は短鎖ペプチドにより誘導された抗原特異的ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の画分を示す、例示的な結果を描示する。「バルク」とは、誘導のために使用されるＴ細胞を含有する試料が、全末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）であることを指し示す。「Ｔｒｅｇ−」とは、誘導のために使用されるＴ細胞を含有する試料が、ＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させたＰＢＭＣであることを指し示す。
【図３】[0070]図３は、ＧＡＳ７ペプチドにより誘導された抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の画分を示す、例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。
【図４】[0071]図４は、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の、ＨＩＶ短鎖ペプチド、短鎖ＰＩＮ（previously identified neoantigen）、又は長鎖ＰＩＮのペプチドプールに対する応答を示す、例示的な結果を描示する。「全ＰＢＭＣ」とは、誘導のために使用されるＴ細胞を含有する試料が、全ＰＢＭＣであることを指し示す。「ＣＤ２５−ＰＢＭＣ」とは、誘導のために使用されるＴ細胞を含有する試料が、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させたＰＢＭＣであることを指し示す。
【図５Ａ】[0072]図５Ａは、表示の条件下における、単一のＰＩＮ（previously identified neoantigen）に対する、抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答についての例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。
【図５Ｂ】[0073]図５Ｂは、表示の条件下における、単一のＰＩＮ（previously identified neoantigen）に対する、抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答についての例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。
【図６】[0074]図６は、２例のヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用する、表示のペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す、例示的な結果を描示する。
【図７】[0075]図７は、刺激の前、及び最大で３ラウンドの刺激の後の、健常ドナーにおける表示の突然変異エピトープに対する、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答についての例示的なフローサイトメトリープロットを描示する。
【図８Ａ】[0076]図８Ａは、ウイルス抗原に対する抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答の結果を示す、例示的な棒グラフを描示する。最大で３ラウンドにわたる刺激の後、全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのおよそ５０％は、表示のウイルスエピトープ（ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＥＢＶ  ＹＶＬ、ＥＢＶ  ＢＭＬＦ１、及びＭａｒｔ−１）に特異的であった。
【図８Ｂ】[0077]図８Ｂは、ペプチドをロードされた抗原提示細胞に対する抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答と、次いで、ウイルス抗原をロードされたＡＰＣ及びウイルス抗原をロードされなかったＡＰＣと共にインキュベートされた場合の応答とについてのリコールアッセイの例示的な結果を描示する。図では、表示のサイトカインを放出する２つの時点によるＣＤ８＋Ｔ細胞の画分について描示する。
【図９】[0078]図９は、誘導されたＴ細胞培養物が、抗原を発現する腫瘍株を死滅させうるかどうかについて評価するために使用される、細胞傷害作用アッセイの例示的な結果を描示する。カスパーゼ３陽性の腫瘍生細胞及び死細胞の、総腫瘍細胞に対する画分を示す。カスパーゼ３陽性の生存腫瘍細胞は、早期の細胞死を被る細胞を指し示す。
【図１０】[0079]図１０は、ペプチドをロードされた抗原提示細胞に対する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を、ＰＩＮをロードされた及びロードされないＡＰＣと共にインキュベートした場合の例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。ＩＦＮγを放出するＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率を示す。
【図１１】[0080]図１１は、突然変異体ペプチド又は野生型ペプチドで再刺激した後にＩＦＮγを放出する抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率についての例示的な結果を描示する。
【図１２】[0081]図１２は、短鎖ＨＩＶ５ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。短期的誘導及び長期的誘導の両方を示す。
【図１３】[0082]図１３は、ヒトドナーに由来する全ＰＢＭＣ試料を使用する、短鎖ＭＥ１ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答の画分を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。短期的誘導及び長期的誘導の両方を示す。
【図１４】[0083]図１４は、ヒトドナーに由来する全ＰＢＭＣ試料を使用する、短鎖ＨＩＶ３ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。短期的誘導及び長期的誘導の両方を示す。
【図１５】[0084]図１５は、ヒトドナーに由来する全ＰＢＭＣ試料を使用する、長鎖ＣＳＮＫ１Ａ１ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。短期的誘導及び長期的誘導の両方を示す。
【図１６】[0085]図１６は、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させたヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用する、長鎖ＣＳＮＫ１Ａ１ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。短期的誘導及び長期的誘導の両方を示す。
【図１７】[0086]図１７は、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させたヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用する、短鎖ＧＡＳ７ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。短期的誘導及び長期的誘導の両方を示す。
【図１８】[0087]図１８は、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させたヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用する、短鎖ＡＣＴＮ４ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。短期的誘導及び長期的誘導の両方を示す。
【図１９Ａ】[0088]図１９Ａは、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させたヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用する、短鎖ＡＣＴＮ４ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。短期的誘導が示される。
【図１９Ｂ】[0089]図１９Ｂは、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させたヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用する、短鎖ＨＩＶ３ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。長期的誘導が示される。
【図２０】[0090]図２０は、ヒトドナーに由来する全ＰＢＭＣ試料を使用する、短鎖ＨＩＶ５ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答についての例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。短期的誘導及び長期的誘導の両方を示す。
【図２１】[0091]図２１は、ヒトドナーに由来する全ＰＢＭＣ試料を使用する、短鎖ＨＩＶ３ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。短期的誘導が示される。
【図２２】[0092]図２２は、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させたヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用する、短鎖ＰＲＤＸ５ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。極めて短期的誘導及び長期的誘導の両方を示す。
【図２３】[0093]図２３は、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させたヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用する、短鎖ＨＩＶ５ペプチドに対する抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。短期的誘導及び長期的誘導の両方を示す。
【図２４】[0094]図２４は、治療用Ｔ細胞組成物を作出するための方法であって、メモリーＴ細胞の拡大とナイーブＴ細胞の誘導とを含む方法の例についての概略を描示する。
【図２５】[0095]図２５は、Ｔ細胞の機能性、表現型、及び／若しくは機能、並びに／又はＴ細胞応答について調べる方法の例を描示する。
【図２６】[0096]図２６は、Ｔ細胞の機能性、表現型、及び／若しくは機能、並びに／又はＴ細胞応答について調べるリコールアッセイの例を描示する。
【図２７Ａ】[0097]図２７Ａは、リコールアッセイにおいて、個別に又は混合物として取得した標識試料により、多重化試料の絡まりを解く能力を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。固有に標識された試料を、他のバーコードとの交差汚染が最小〜全くなく分解した。
【図２７Ｂ】[0098]図２７Ｂは、リコールアッセイにおける、９例の固有に標識された試料の混合物の多量体染色による、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出を示す例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。
【図２８Ａ】[0099]図２８Ａは、ネオ抗原をロードされていないＤＣ及びネオ抗原をロードされたＤＣによりリコールされる６例の固有にバーコード化された試料を使用する、リコールアッセイについての例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。
【図２８Ｂ】[0100]図２８Ｂは、リコール応答アッセイにおいて、表示の濃度のペプチドをロードされたＤＣと共にインキュベートされたＣＤ４＋Ｔ細胞のパーセントについて機能数とともに示す例示的な棒グラフを描示する。デノボＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含有する２つの誘導された培養物の試料を、バーコード化を伴わずに単独で又は無関係の試料と混合して解析した。バーコード化は、検出可能な機能性を変化させなかった。細胞から誘発される応答の機能数及び大きさは、試料のバーコード化による著しい変化はなかった。
【図２９Ａ】[0101]図２９Ａは、ウイルス抗原に対する抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答の結果を示す例示的な棒グラフを描示する。ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＭＡＲＴ−１、並びにＥＢＶＢＲＬＦ１及びＢＭＬＦ１のエピトープに対するＣＤ８＋メモリー応答を、出発健常ドナー材料におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の０．２３％から＞６０％へと引き上げることができた。
【図２９Ｂ】[0102]図２９Ｂは、ウイルス抗原に対する抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答が、ウイルス抗原をロードされたＤＣ及びウイルス抗原をロードされなかったＤＣによりリコールされた場合のリコールアッセイの例示的な結果を描示する。図では、表示のサイトカインを放出する２つの時点におけるＣＤ８＋Ｔ細胞の画分について描示する。
【図３０Ａ】[0103]図３０Ａは、同じ培養物において複数の特異性で誘導したデノボＣＤ４＋応答を検出及び機能的特徴付けすることによりヒット識別した例示的な結果を描示する。示される例では、誘導は、ＨＩＶ陰性健常ドナーではナイーブ標的である１０のＨＩＶ由来エピトープを標的として、４回の反復培養において実施された。抗原特異的応答は、応答の大きさは変動するが、４回中４回の生物学的反復において検出された。
【図３０Ｂ】[0104]図３０Ｂは、同じ培養物において複数の特異性で誘導したデノボＣＤ４＋応答を検出及び機能的特徴付けすることによりプールデコンボリューションした例示的な結果を描示する。各反復試験で複数の応答が検出され、いずれの場合にも同じ２つのエピトープ（ＨＩＶ＃５及びＨＩＶ＃７）が最大の大きさの応答を生じた。
【図３０Ｃ】[0105]図３０Ｃは、同じ培養物において複数の特異性で誘導したデノボでＣＤ４＋応答を検出及び機能的特徴付けすることにより感受性決定した例示的な結果を描示する。プールデコンボリューションアッセイにおける各応答でも同様の大きさが観察された。ＨＩＶ＃５、ＨＩＶ＃６、及びＨＩＶ＃４に対する応答は、それぞれ、０．４５μＭ、０．４３μＭ、及び９．１μＭのＥＣ５０を示した。
【図３１】[0106]図３１は、抗原特異的Ｔ細胞の製造プロトコールについての例示的な概略を描示する。
【図３２】[0107]図３２は、Ｔ細胞の誘導プロトコールについての例示的な概略を描示する。
【図３３】[0108]図３３は、樹状細胞の作出プロトコールについての例示的な概略を描示する。
【図３４】[0109]図３４は、患者特異的エピトープ：ＳＲＳＦ１Ｅ＞Ｋ、ＡＲＡＰ１Ｙ＞Ｈ、及びＰＫＤＲＥＪＧ＞Ｒを標的とする黒色腫患者由来、患者特異的エピトープ：ＡＡＳＤＨｎｅｏＯＲＦ及び７つのモデルとなるネオ抗原：ＡＣＴＮ４Ｋ＞Ｎ、ＣＳＮＫ１Ａ１Ｓ＞Ｌ、ＤＨＸ４０ｎｅｏＯＲＦ、ＧＬＩ３Ｐ＞Ｌ、ＱＡＲＳＲ＞Ｗ、ＦＡＭ１７８ＢＰ＞Ｌ、及びＲＰＳ２６Ｐ＞Ｌを標的とする黒色腫患者由来の白血球除去処理材料中で誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答を示す例示的なｐＭＨＣ多量体プロットを描示する。１行目及び２行目の最初のパネルプロットはメモリー応答を指し示し、残りのプロットはデノボ応答を指し示す。
【図３５−１】[0110]図３５は、ＳＲＳＦ１Ｅ＞Ｋ及びＡＲＡＰ１Ｙ＞Ｈペプチド刺激前後のｐＭＨＣ多量体プロットについての例示的データであって、ｐＭＨＣ多量体＋ＣＤ８＋Ｔ細胞に対してゲートをかけたデータを描示する。黒色腫患者において誘導されるＣＤ８＋メモリー応答、ＣＤ８＋デノボ応答についての多機能プロファイルを、１つ、２つ、又は３つの機能の組合せ（例えば、１以上の機能は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＤ１０７ａ、及び４−１ＢＢから選択される１以上の因子の産生である）により示す。
【図３５−２】図３５は、ネオ抗原をロードされたＤＣでリチャレンジした場合のネオ抗原特異的Ｔ細胞の機能性について描示する円グラフについての例示的データであって、ｐＭＨＣ多量体＋ＣＤ４＋Ｔ細胞に対してゲートをかけたデータを描示する。黒色腫患者において誘導される、ＣＤ４＋デノボ応答についての多機能プロファイルを、１つ、２つ、又は３つの機能の組合せ（例えば、１以上の機能は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＤ１０７ａ、及び４−１ＢＢから選択される１以上の因子の産生である）により示す。
【図３６】[0111]図３６は、黒色腫患者において、突然変異ペプチド及び野生型ペプチドに対して誘導されるメモリー応答及びデノボ応答の特異性を描示する。ＳＲＳＦ１Ｅ＞Ｋ及びＡＲＡＰ１Ｙ＞Ｈに特異的なＴ細胞応答は、異なる濃度（Ｘ軸：０μＭ、０．０５μＭ、０．２μＭ、０．８μＭ、及び３．２μＭ）の突然変異体又は野生型のネオ抗原ペプチドをロードされたＤＣによりチャレンジし、試料中の全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちのＩＦＮ−γ＋及び／又はＴＮＦα＋及び／又はＣＤ１０７ａ＋（Ｙ軸）を測定することにより評価した；いずれの応答も、０μＭの濃度に照らした有意差を示し、野生型のネオ抗原ペプチドに対する応答性を示さない。統計学的解析：補正ｐ値についてのＦＤＲ、Ｐ値：＊≦０．０５、＊＊＊≦０．００１、＊＊＊＊≦０．０００１。
【図３７Ａ】[0112]図３７Ａは、ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度により定量される、黒色腫患者において誘導されるメモリー応答についての細胞傷害プロファイルを描示する。図３７Ａは、ａＣＡＳ３＋腫瘍細胞の頻度により定量されるこれらのＴ細胞応答による標的細胞の殺滅も描示する。誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答の細胞傷害性能は、突然変異体又は野生型のネオ抗原を形質導入された腫瘍細胞でリチャレンジすることにより評価した。非形質導入腫瘍細胞（親Ａ３７５株）、又は２００アミノ酸の構築物を形質導入された腫瘍細胞を使用した。構築物は突然変異体配列又は野生型配列を含有しており、突然変異は中央に含有した。共培養すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ、及び腫瘍細胞上の活性カスパーゼ３の上方制御が測定された。標的比：３．３：１（ＳＲＳＦ１Ｅ＞Ｋ）である。
【図３７Ｂ】[0113]図３７Ｂは、ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度により定量される、黒色腫患者において誘導されるメモリー応答についての細胞傷害プロファイルの別の例を描示する。図３７Ｂは、ａＣＡＳ３＋腫瘍細胞の頻度により定量されるこれらのＴ細胞応答による標的細胞の殺滅も描示する。誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答の細胞傷害性能は、突然変異体又は野生型のネオ抗原を形質導入された腫瘍細胞でリチャレンジすることにより評価した。非形質導入腫瘍細胞（親Ａ３７５株）、又は２００アミノ酸の構築物を形質導入された腫瘍細胞を使用した。構築物は突然変異体配列又は野生型配列を含有しており、突然変異は中央に含有した。共培養すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ、及び腫瘍細胞上の活性カスパーゼ３の上方制御が測定された。赤丸は、ｐＭＨＣ＋画分を強調する。エフェクター：標的比：５：１（ＳＲＳＦ１Ｅ＞Ｋ）である。統計学的解析：対応のないＴ検定：Ｐ値＊＊≦０．０１、＊＊＊＊≦０．０００１である。
【図３７Ｃ】[0114]図３７Ｃは、ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞の頻度により定量される、黒色腫患者において誘導されるデノボ応答についての細胞傷害プロファイルを描示する。図３７Ｃは、ａＣＡＳ３＋腫瘍細胞の頻度により定量されるこれらのＴ細胞応答による標的細胞の殺滅も描示する。誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞応答の細胞傷害性能は、突然変異体又は野生型のネオ抗原を形質導入された腫瘍細胞でリチャレンジすることにより評価した。非形質導入腫瘍細胞（親Ａ３７５株）、又は２００アミノ酸の構築物を形質導入された腫瘍細胞を使用した。構築物は突然変異体配列又は野生型配列を含有しており、突然変異は中央に含有した。共培養すると、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ、及び腫瘍細胞上の活性カスパーゼ３の上方制御が測定された。赤丸は、ｐＭＨＣ＋画分を強調する。エフェクター：標的比：０．６６：１（ＡＲＡＰ１Ｙ＞Ｈ）である。統計学的解析：対応のないＴ検定：Ｐ値＊＊≦０．０１、＊＊＊＊≦０．０００１である。
【図３８Ａ】[0115]図３８Ａは、黒色腫患者におけるネオ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の同定を描示する。応答は、突然変異体ネオ抗原ペプチド（０．８μＭ）をロードされたＤＣによりリチャレンジした場合の、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦαの産生（Ｙ軸）に基づき同定する。ＭＫＲＮ１Ｓ＞Ｌ、ＣＲＥＢＢＰＳ＞Ｌ、及びＴＰＣＮ１Ｋ＞Ｅを陽性応答として同定した。
【図３８Ｂ】[0116]図３８Ｂは、表示の突然変異ペプチド及び野生型ペプチドに対する、図３８Ａで描示したＣＤ４＋Ｔ細胞応答の特異性を描示する。確認研究では、図３８Ａで示したＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、異なる濃度（Ｘ軸：０μＭ、０．０５μＭ、０．２μＭ、０．８μＭ、及び３．２μＭ）の突然変異体又は野生型のネオ抗原ペプチドによりチャレンジし、試料中の全ＣＤ４＋のうちのＩＦＮ−γ＋及び／又はＴＮＦα＋（Ｙ軸）を測定することにより評価した。ＣＤ４＋Ｔ細胞応答のうちの２つ（ＭＫＲＮ１Ｓ＞Ｌ及びＣＲＥＥＢＰＳ＞Ｌ）は０μＭの濃度に照らした有意差を示し、野生型のネオ抗原ペプチドに対して応答性を示さないが、ＴＰＣＮ１Ｋ＞Ｅ応答は、突然変異体及び野生型のネオ抗原ペプチドのいずれに対しても反応性であった。統計学的解析：補正ｐ値についてのＦＤＲ、Ｐ値＜０．０５。
【図３８Ｃ】[0117]図３８Ｃは、１つ、２つ、３つ、又は４つの機能の組合せ（例えば、１以上の機能は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＤ１０７ａ、及び４−１ＢＢから選択される１以上の因子の産生である）により示されるこれらのＣＤ４＋Ｔ細胞応答の多機能プロファイルを描示する。同定されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答の多機能性は、突然変異体ネオ抗原ペプチド（０．８μＭ）をロードされたＤＣのリチャレンジにより評価した。円グラフ内の百分率は、機能的なＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率（１つ、２つ、及び／又は３つの機能）を表す。描示される代表的データは、患者において誘導された刺激後ＣＤ４＋Ｔ細胞応答から生成した。
【図３９】[0118]図３９は、１つ、２つ、又は３つの機能（例えば、１以上の機能は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＣＤ１０７ａから選択される１以上の因子の産生である）の組合せにより示される、エパカドスタットの添加を伴うか又は伴わずに２例の健常ドナー（例えば、ＨＤ６６及びＨＤ６３）において誘導されたメモリー応答の機能性を描示する。
【図４０】[0119]図４０は、エパカドスタットの添加を伴うか又は伴わずに、６回の反復誘導において誘導されたデノボＣＤ８＋Ｔ細胞応答（４例の健常ドナーで平均した「ヒット率」）のパーセントを描示する。
【図４１Ａ】[0120]図４１Ａは、ＰＤ−１遮断抗体の添加を伴うか又は伴わずに、本明細書に提示したＴ細胞製造プロトコールによる誘導後のドナーＨＤ５５からの抗原特異的細胞の絶対数を描示する。
【図４１Ｂ】[0121]図４１Ｂは、ＰＤ−１遮断抗体の添加を伴うか又は伴わずに、本明細書に提示したＴ細胞製造プロトコールによる誘導後のドナーＨＤ６７からの抗原特異的細胞の絶対数を描示する。
【図４２Ａ】[0122]図４２Ａは、ＩＬ−１２の添加を伴うか又は伴わない、デノボＣＤ８＋Ｔ細胞応答のうちのｐＭＨＣ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を描示する。
【図４２Ｂ】[0123]図４２Ｂは、ＩＬ−１２の添加を伴うか又は伴わない、デノボＣＤ８＋Ｔ細胞応答のうちのＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を描示する。
【図４３】[0124]図４３は、本明細書に記載の方法の例を描示する。バイオインフォマティクスエンジンを使用して、患者特異的ネオ抗原を予測する。予測したネオ抗原をカバーする合成長鎖ペプチドを刺激プロトコールにおける免疫原として使用して、免疫原性能について評価する。刺激プロトコールには、これらのネオ抗原をコードするペプチドを患者由来ＡＰＣへと供給し、次いで、これらを患者由来Ｔ細胞と共培養して、ネオ抗原特異的Ｔ細胞をプライミングすることが含まれる。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
[0125]本明細書では、個体の腫瘍に固有の突然変異イベントから生じるネオ抗原の発見に基づいた、新規の免疫治療剤及びその使用が記載される。したがって、本明細書に記載される本開示は、疾患の処置に使用するための抗原特異的免疫細胞、例えば、Ｔ細胞を創出する方法及びプロトコールを提示する。
定義
[0126]本明細書で使用される用語は、特定の場合について記載することだけを目的とするものであり、限定的であることが意図されるものではない。本明細書で使用される単数形の「ある（a）」、「ある（an）」、及び「その」とは、文脈によりそうでないことが明らかに指し示されない限りにおいて、複数形もまた含むことが意図される。さらに、「〜を含むこと」、「〜を含む」、「〜を有すること」、「〜を有する」、「〜を伴う」という用語、又はこれらの変化形が、詳細な説明及び／又は特許請求の範囲において使用される限りにおいて、このような用語は、「〜を含むこと」という用語と同様に包含的であることが意図される。
【００６０】
[0127]「〜を含む（comprises）」、「含まれた（comprised）」、「〜を含むこと（comprising）」などの用語は、米国特許法において、それに帰せられた意味を有することが可能であり、例えば、これらの用語は、「〜を含む（includes）」、「含まれた（included）」、「〜を含むこと（including）」などを意味することが可能であるが；「〜から本質的に成ること」及び「〜から本質的に成る」などの用語は、米国特許法において、それらに帰せられた意味を有し、例えば、それらは、明示的に列挙されていない要素を許容するが、先行技術において見出されるか、又は本発明の基礎的特徴又は新規の特徴に影響を及ぼす要素を除外する。本明細書におけるいかなる事柄も、保証としては意図されない。
【００６１】
[0128]本明細書の「Ａ及び／又はＢ」などの語句において使用される、「及び／又は」という用語は、Ａ及びＢ；Ａ又はＢの両方；Ａ（単独）；並びにＢ（単独）を含むことが意図される。同様に、「Ａ、Ｂ、及び／又はＣ」などの語句において使用される、「及び／又は」という用語は、以下の具体化：Ａ、Ｂ、及びＣ；Ａ、Ｂ、又はＣ；Ａ又はＣ；Ａ又はＢ；Ｂ又はＣ；Ａ及びＣ；Ａ及びＢ；Ｂ及びＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；並びにＣ（単独）の各々を包含することが意図される。
【００６２】
[0129]「約（about）」又は「およそ（approximately）」という用語は、当業者により決定される特定の値について、許容可能な誤差の範囲内にあることを意味する場合があり、これは、値がどのようにして測定又は決定されるのか、すなわち、測定システムの限界に部分的に依存するであろう。例えば、「約」とは、当該技術分野における慣行に従い、１以上の標準偏差内を意味しうる。あるいは、「約」とは、所与の値の最大で２０％、最大で１０％、最大で５％、又は最大で１％の範囲を意味しうる。あるいは、特に、生体系又は生物学的過程に関して述べると、用語は、値の桁数の範囲内、５倍以内を意味する場合があり、より好ましくは２倍以内を意味しうる。特定の値が、本願及び特許請求の範囲において記載される場合、そうでないことが条件づけられない限りにおいて、「約」という用語は、特定の値について、許容可能な誤差の範囲内にあることを意味すると仮定されるものとする。
【００６３】
[0130]本開示の理解を容易とするために、多数の用語及び語句を以下に規定する。
[0131]「ネオ抗原」とは、タンパク質内の腫瘍特異的変化から生じる腫瘍抗原のクラスを表す。ネオ抗原は、例えば、タンパク質配列の置換、フレームシフト突然変異、融合ポリペプチド、インフレームの欠失、挿入、及び内因性レトロウイルスポリペプチドの発現から生じる腫瘍抗原を包含するがこれらに限定されない。
【００６４】
[0132]「ネオエピトープ」とは、非罹患細胞、例えば、非がん性細胞又は生殖系列細胞などの参照物においては存在しないが、罹患細胞内、例えば、がん細胞内には見出されるエピトープを表す。これは、対応するエピトープが正常非罹患細胞内又は生殖系列細胞内に見出されるが、罹患細胞、例えば、がん細胞内の１以上の突然変異に起因して、エピトープの配列が、ネオエピトープを結果としてもたらすように変化した状況を含む。
【００６５】
[0133]「参照物」は、本開示の方法により、罹患検体から得られる結果を相関及び／又は比較するのに使用されうる。典型的には、「参照物」は、１つの個体から得られた１つ以上の正常検体、特に、非罹患検体、又は同じ種の個体などの１つ以上の異なる個体（例えば健常個体）に基づいて得られうる。「参照物」は、十分に多数の正常検体を検査することにより経験的に決定されうる。
【００６６】
[0134]「突然変異」とは、核酸配列内の参照核酸と比較した変化又は差違（例えば、ヌクレオチドの置換、付加、又は欠失）を表す。「体細胞突然変異」は、生殖細胞（精子及び卵子）を除く体細胞内で生じる可能性があり、子孫へは受け継がれない。これらの変更は、がん又は他の疾患を引き起こしうる（しかし、常に引き起こすわけではない）。一部の実施形態では、突然変異は非同義突然変異である。「非同義突然変異」とは、翻訳産物内のアミノ酸置換などのアミノ酸変化を結果としてもたらす突然変異（例えば、ヌクレオチド置換）を表す。「フレームシフト」は、突然変異が、遺伝子のコドン周期性の正常相（「リーディングフレーム」としても知られる）を破壊する結果として、非天然タンパク質配列の翻訳をもたらす場合に生じる。遺伝子内の異なる突然変異が、同じリーディングフレームの変更を達成することが可能である。
【００６７】
[0135]「親和性」という用語は、結合対（例えば、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）結合性ペプチドとクラスＩ  ＨＬＡ若しくはクラスＩＩ  ＨＬＡ、又はペプチド−ＨＬＡ複合体とＴ細胞受容体（ＴＣＲ））の２つのメンバー間の結合強度についての尺度を表す。ＫＤとは、結合対の２つのメンバー間の解離定数を表し、モル濃度の単位を有する。ＫＡとは、結合対の２つのメンバー間の親和性定数を表し、解離定数の逆数である。親和性は、実験により、例えば、市販のＢｉａｃｏｒｅ  ＳＰＲユニットを使用する表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）により決定されうる。Ｋｏｆｆとは、結合対の２つのメンバーについてのオフ速度定数（例えば、ＨＬＡ結合性ペプチドとクラスＩ  ＨＬＡ若しくはクラスＩＩ  ＨＬＡとのオフ速度定数、又はペプチド−ＨＬＡ複合体とＴＣＲとのオフ速度定数）を表す。Ｋｏｎとは、結合対の２つのメンバーについてのオン速度定数（例えば、ＨＬＡ結合性ペプチドとクラスＩ  ＨＬＡ若しくはクラスＩＩ  ＨＬＡとのオン速度定数、又はペプチド−ＨＬＡ複合体とＴＣＲとのオン速度定数）を表す。
【００６８】
[0136]本開示を通して、「結合データ」結果は、「ＩＣ５０」との関係で表されうる。親和性は、５０％阻害濃度（ＩＣ５０）又は結合対の第１のメンバー（例えばペプチド）の５０％が置換される場合の濃度としても表されうる。同様に、ｌｎ（ＩＣ５０）とは、ＩＣ５０の自然対数を表す。例えば、ＩＣ５０は、結合アッセイにおける被験ペプチドの濃度であって、標識された参照ペプチドの結合の５０％の阻害が観察される場合の濃度でありうる。アッセイが試行される場合の条件（例えば、限界ＨＬＡタンパク質濃度及び／又は標識された参照ペプチド濃度）を踏まえると、これらの値は、ＫＤ値を近似しうる。結合を決定するためのアッセイは当該技術分野において周知であり、例えば、ＰＣＴ公開公報第ＷＯ９４／２０１２７号及び同第ＷＯ９４／０３２０５号、並びにＳｉｄｎｅｙら、「Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、１８．３．１（１９９８）；Ｓｉｄｎｅｙら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：２４７（１９９５）；及びＳｅｔｔｅら、Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、３１：８１３（１９９４）などの他の刊行物において詳細に記載されている。あるいは、結合は、参照基準ペプチドによる結合と比べて表されうる。結合は、生細胞（例えば、Ｃｅｐｐｅｌｌｉｎｉら、Ｎａｔｕｒｅ、３３９：３９２（１９８９）；Ｃｈｒｉｓｔｎｉｃｋら、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６７（１９９１）；Ｂｕｓｃｈら、Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２：４４３（１９９０）；Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４７：１８９（１９９１）；ｄｅｌ  Ｇｕｅｒｃｉｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５４：６８５（１９９５））、デタージェント溶解物を使用する無細胞系（例えば、Ｃｅｒｕｎｄｏｌｏら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、２１：２０６９（１９９１））、固定化精製ＭＨＣ（例えば、Ｈｉｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２、２８９０（１９９４）；Ｍａｒｓｈａｌｌら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１５２：４９４６（１９９４））、ＥＬＩＳＡ系（例えば、Ｒｅａｙら、ＥＭＢＯＪ．、１１：２８２９（１９９２））、表面プラズモン共鳴（例えば、Ｋｈｉｌｋｏら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２６８：１５４２５（１９９３））；高フラックス可溶相アッセイ（Ｈａｍｍｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１８０：２３５３（１９９４））、及びクラスＩ  ＭＨＣの安定化又はアセンブリーの測定（例えば、Ｌｊｕｎｇｇｒｅｎら、Ｎａｔｕｒｅ、３４６：４７６（１９９０）；Ｓｃｈｕｍａｃｈｅｒら、Ｃｅｌｌ、６２：５６３（１９９０）；Ｔｏｗｎｓｅｎｄら、Ｃｅｌｌ、６２：２８５（１９９０）；Ｐａｒｋｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４９：１８９６（１９９２））を使用するアッセイ系を含めた他のアッセイ系を使用しても決定されうる。
【００６９】
[0137]エピトープについて論じるのに使用される場合の「導出された」という用語は、「調製された」の同義語である。導出されたエピトープは、天然供給源から単離される場合もあり、当該技術分野における標準的なプロトコールに従い合成される場合もある。合成エピトープは、天然に存在するＬアミノ酸残基のＤ異性体又はシクロヘキシルアラニンのような非天然アミノ酸残基などの人工アミノ酸残基である「アミノ酸模倣体」を含みうる。導出又は調製されたエピトープは、天然エピトープの類似体でありうる。「〜から導出された」という用語は、由来又は供給源を表し、天然に存在するか、組換えであるか、非精製であるか、精製されているか、又は分化させた分子又は細胞を含みうる。例えば、拡大又は誘導された抗原特異的Ｔ細胞は、Ｔ細胞から導出されうる。例えば、拡大又は誘導された抗原特異的Ｔ細胞は、生物学的試料中の抗原特異的Ｔ細胞から導出されうる。例えば、成熟ＡＰＣ（例えば、プロフェッショナルのＡＰＣ）は、非成熟ＡＰＣ（例えば未成熟ＡＰＣ）から導出されうる。例えば、ＡＰＣは単球（例えばＣＤ１４＋単球）から導出されうる。例えば、樹状細胞は単球（例えばＣＤ１４＋単球）から導出されうる。例えば、ＡＰＣは骨髄細胞から導出されうる。
【００７０】
[0138]「エピトープ」とは、別の分子（例えば、免疫グロブリン、Ｔ細胞受容体、ＨＬＡ分子、又はキメラ抗原受容体）により認識される部位を、併せて形成する、分子の総体的特徴（例えば、ペプチドの電荷、並びに１次構造、２次構造、及び３次構造）である。例えば、エピトープは、特定の免疫グロブリンによる認識に関与するアミノ酸残基のセット；主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）受容体；又はＴ細胞の文脈では、Ｔ細胞受容体のタンパク質及び／若しくはキメラ抗原受容体により認識される残基でありうる。エピトープは、天然供給源からの単離により調製される場合もあり、当該技術分野における標準的なプロトコールに従い合成される場合もある。合成エピトープは、人工アミノ酸残基、アミノ酸模倣体（天然に存在するＬアミノ酸残基のＤ異性体、又は非天然アミノ酸残基など）を含みうる。本開示を通して、エピトープは、場合によって、ペプチドと称される場合もあり、ペプチドエピトープと称される場合もある。ある特定の実施形態では、本開示のペプチドの長さに制限がある。長さが制限された実施形態は、本明細書で記載されるエピトープを含むタンパク質又はペプチドが、天然配列との、１００％同一性を有する領域（すなわち、一連のアミノ酸残基）を含む場合に生じる。エピトープの定義が、例えば、全天然分子に対する読取りを回避するために、天然ペプチド配列との１００％の同一性を有する、任意の領域の長さに制限がある。したがって、本明細書で記載されるエピトープと、天然ペプチド配列との１００％の同一性を伴う領域とを含むペプチドについて、天然配列に対する、１００％の同一性を伴う領域は、一般に、６００アミノ酸残基以下、５００アミノ酸残基以下、４００アミノ酸残基以下、２５０アミノ酸残基以下、１００アミノ酸残基以下、８５アミノ酸残基以下、７５アミノ酸残基以下、６５アミノ酸残基以下、及び５０アミノ酸残基以下の長さを有する。ある特定の実施形態では、本明細書で記載される「エピトープ」は、天然ペプチド配列に対する、１００％の同一性を有する、任意の増分で、５アミノ酸残基までの、５１アミノ酸残基未満の長さ；例えば、５０、４９、４８、４７、４６、４５、４４、４３、４２、４１、４０、３９、３８、３７、３６、３５、３４、３３、３２、３１、３０、２９、２８、２７、２６、２５、２４、２３、２２、２１、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９つ、８つ、７つ、６つ、５つ、４つ、３つ、２つ、又は１つのアミノ酸残基を伴う領域を有するペプチドにより構成される。
【００７１】
[0139]「Ｔ細胞エピトープ」とは、ペプチド−ＭＨＣ（ｐＭＨＣ）複合体の形態で、ＭＨＣ分子が結合するペプチド配列を指す。ペプチド−ＭＨＣ複合体は、Ｔ細胞（例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球又はヘルパーＴ細胞）のＴＣＲが認識及び結合しうる。
【００７２】
[0140]「Ｔ細胞」は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。Ｔ細胞という用語はまた、Ｔヘルパー１型Ｔ細胞及びＴヘルパー２型Ｔ細胞の両方も含む。
[0141]「免疫細胞」とは、免疫応答において役割を果たす細胞を指す。免疫細胞は、造血細胞由来であり、Ｂ細胞及びＴ細胞などのリンパ球；ナチュラルキラー細胞；単球、マクロファージ、好中球、マスト細胞、好塩基球、及び顆粒球などの骨髄細胞を含む。
【００７３】
[0142]「免疫原性」ペプチド又は「免疫原性」エピトープ又は「免疫原性」ペプチドエピトープとは、ＨＬＡ分子に結合し、細胞媒介性応答又は体液性応答、例えば、細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）応答、ヘルパーＴリンパ球（ＨＴＬ）応答、及び／又はＢリンパ球応答を誘導するペプチドである。本明細書で記載される免疫原性ペプチドは、ＨＬＡ分子に結合し、その後、ペプチドに対する細胞媒介性応答又は体液性応答（例えば、ＣＴＬ（細胞傷害性）応答又はＨＴＬ応答）を誘導することが可能である。
【００７４】
[0143]「防御的免疫応答」又は「治療的免疫応答」とは、疾患の症状、副作用、若しくは進行を、ある形で防止するか、又はこれらを、少なくとも部分的に停止させる、病原性抗原（例えば、腫瘍抗原）に由来する抗原に対する、ＣＴＬ及び／又はＨＴＬの応答を指す。免疫応答はまた、ヘルパーＴ細胞の刺激により容易とされた抗体応答も含みうる。
【００７５】
[0144]「Ｔ細胞受容体」（「ＴＣＲ」）とは、天然分子であれ、部分的に、又は完全に合成により作製された分子であれ、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）分子に結合した抗原を認識する、Ｔリンパ球（Ｔ細胞）の表面上に見出される分子を指す。Ｔ細胞が、多様な疾患（例えば、がん）又は感染性生物と関連する抗原を認識する能力は、α鎖及びβ鎖又はγ鎖及びδ鎖の両方から構成される、そのＴＣＲにより付与される。これらの鎖を構成するタンパク質は、ＴＣＲの多大な多様性を発生させるための、固有の機構を用いるＤＮＡによりコードされる。このマルチサブユニットの免疫認識受容体は、ＣＤ３複合体と会合し、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩのタンパク質により提示されたペプチドに結合する。ＴＣＲの、ＡＰＣ上のペプチドへの結合は、Ｔ細胞の活性化において、中心的なイベントである。
【００７６】
[0145]本明細書で使用される「キメラ抗原受容体」又は「ＣＡＲ」とは、免疫グロブリンの抗原結合性ドメイン（例えば、免疫グロブリン可変ドメイン）と、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）の定常ドメインとを含む抗原結合性タンパク質を指す。本明細書で使用されるＴＣＲポリペプチドの「定常ドメイン」とは、ＴＣＲ膜近位定常ドメイン、ＴＣＲ膜貫通ドメイン、及び／若しくはＴＣＲ細胞質ドメイン、又はこれらの断片を含む。例えば、一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲβ定常ドメインへと連結された、免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含むポリペプチドを含む単量体である。一部の実施形態では、ＣＡＲは、ＴＣＲα又はＴＣＲβの定常ドメインへと連結された、免疫グロブリンの重鎖可変ドメイン又は軽鎖可変ドメインを含む、第１のポリペプチドと、ＴＣＲβ又はＴＣＲαの定常ドメインへと連結された、免疫グロブリンの重鎖又は軽鎖の可変ドメイン（例えば、κ又はλ可変ドメイン）を含む、第２のポリペプチドとを含む２量体である。
【００７７】
[0146]「主要組織適合性複合体」又は「ＭＨＣ」とは、生理学的免疫応答の一因となる、細胞の相互作用の制御において役割を果たす、遺伝子のクラスターである。「主要組織適合性複合体」という用語及び「ＭＨＣ」という略号は、ＭＨＣクラスＩ分子及びＭＨＣクラスＩＩ分子など、任意のクラスＭＨＣ分子を含むことが可能であり、全ての脊椎動物において生じる、遺伝子の複合体に関する。ヒトでは、ＭＨＣ複合体はまた、ヒト白血球抗原（ＨＬＡ）複合体としても公知である。したがって、「ヒト白血球抗原」又は「ＨＬＡ」とは、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）タンパク質（例えば、Ｓｔｉｔｅｓら、「Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、８版、Ｌａｎｇｅ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、Ｌｏｓ  Ａｌｔｏｓ、Ｃａｌｉｆ．（１９９４）を参照されたい）を指す。ＭＨＣ複合体及びＨＬＡ複合体の詳細な記載については、Ｐａｕｌ、「Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ」、３版、Ｒａｖｅｎ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ（１９９３）を参照されたい。
【００７８】
[0147]ゲノム内の主要組織適合性複合体は、細胞表面上に発現される、それらの遺伝子産物が、内因性抗原及び／又は外来抗原に結合し、これらを提示し、これにより、免疫学的過程を調節するために重要な遺伝子領域を含む。ＭＨＣタンパク質又はＭＨＣ分子は、免疫反応において、リンパ球と、抗原提示細胞又は罹患細胞との間のシグナル伝達に重要である。ＭＨＣタンパク質又はＭＨＣ分子は、ペプチドに結合し、Ｔ細胞受容体による認識のために、それらを提示する。ＭＨＣによりコードされるタンパク質は、細胞の表面上に発現され、自己抗原（細胞自体に由来するペプチド断片）及び非自己抗原（例えば、侵入微生物の断片）の両方を、Ｔ細胞へと提示する。ＭＨＣ結合性ペプチドは、タンパク質抗原のタンパク質分解性切断から生じる場合があり、潜在的なリンパ球エピトープを表しうる（例えば、Ｔ細胞エピトープ及びＢ細胞エピトープ）。ＭＨＣは、ペプチドを、細胞表面へと輸送し、ここにおいて、それらを、細胞傷害性Ｔリンパ球、ヘルパーＴ細胞、又はＢ細胞などの特異的細胞へと提示しうる。ＭＨＣ領域は、３つの亜群である、クラスＩ、クラスＩＩ、及びクラスＩＩＩへと分けられうる。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、α鎖マイクログロブリン及びβ２−マイクログロブリン（第１５染色体によりコードされる、ＭＨＣの一部ではない）を含有しうる。ＭＨＣクラスＩタンパク質は、抗原断片を、細胞傷害性Ｔ細胞へと提示しうる。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、α鎖及びβ鎖を含有することが可能であり、抗原断片を、ヘルパーＴ細胞へと提示しうる。ＭＨＣクラスＩＩＩ領域は、補体成分及びサイトカインなど、他の免疫成分をコードしうる。ＭＨＣは、多遺伝子性（いくつかのＭＨＣクラスＩ遺伝子及びＭＨＣクラスＩＩ遺伝子が存在する）及び多形性（各遺伝子の、複数の対立遺伝子が存在する）の両方でありうる。
【００７９】
[0148]「抗原プロセシング」又は「プロセシング」とは、ポリペプチド又は抗原の、前記ポリペプチド又は抗原の断片である、プロセシング生成物への分解（例えば、ポリペプチドの、ペプチドへの分解）と、これらの断片のうちの１以上の、細胞、例えば、抗原提示細胞による、特異的Ｔ細胞への提示のための、ＭＨＣ分子との会合（例えば、結合を介する）とを指す。
【００８０】
[0149]「抗原提示細胞」（ＡＰＣ）とは、ＭＨＣ分子と会合したタンパク質抗原のペプチド断片を、その細胞表面上に提示する細胞を指す。用語は、プロフェッショナルの抗原提示細胞（例えば、Ｂリンパ球、単球、樹状細胞、ランゲルハンス細胞）のほか、他の抗原提示細胞（例えば、角化細胞、内皮細胞、星状細胞、線維芽細胞、希突起膠細胞）を含む。
【００８１】
[0150]「受容体」とは、リガンドに結合することが可能な生物学的分子又は分子の群分けを指す。受容体は、細胞、細胞形成、又は生物における情報を伝達するのに用いられる。受容体は、例えば、各受容体単位がタンパク質分子から成りうる、少なくとも１つの受容体単位を含む。受容体は、リガンドの構造を補完する構造を有し、リガンドを、結合パートナーとして、複合体化させうる。情報は、特に、細胞の表面上の、リガンドの複合体化の後における、受容体のコンフォメーション変化により伝達される。一部の実施形態では、受容体とは、特に、リガンド、特に、適切な長さのペプチド又はペプチド断片と共に、受容体／リガンド複合体を形成することが可能な、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩのタンパク質を意味すると理解されるものとする。「リガンド」とは、受容体の構造と相補的な構造を有し、この受容体と共に複合体を形成することが可能な分子を指す。一部の実施形態では、リガンドとは、ペプチド又はペプチド断片が、ＭＨＣクラスＩ及びＭＨＣクラスＩＩのタンパク質などのＭＨＣタンパク質と共に、複合体を形成することが可能であるように、そのアミノ酸配列内に、適切な長さ及び適切な結合モチーフを有する、ペプチド又はペプチド断片を意味すると理解されるものとする。一部の実施形態では、「受容体／リガンド複合体」とは、また、ＭＨＣクラスＩ分子又はＭＨＣクラスＩＩ分子など、ペプチド提示ＭＨＣ分子又はペプチド断片提示ＭＨＣ分子を含む、「受容体／ペプチド複合体」又は「受容体／ペプチド断片複合体」も意味すると理解されるものとする。
【００８２】
[0151]「天然」配列又は「野生型」配列とは、天然で見出される配列を指す。本明細書で使用される「天然存在」という用語は、対象が、天然で見出されうるという事実を指す。例えば、生物（ウイルスを含む）において存在し、天然における供給源から単離される場合があり、実験室において、人為により、意図的に修飾されていないペプチド又は核酸は、天然に存在する。
【００８３】
[0152]本明細書では、「ペプチド」及び「ペプチドエピトープ」という用語は、典型的に、隣接するアミノ酸残基の、α−アミノ基と、カルボキシル基とのペプチド結合により互いと接続された、一連の残基を指示するように、「オリゴペプチド」と互換的に使用される。「合成ペプチド」とは、非天然供給源から得られたペプチド、例えば、人工ペプチドを指す。このようなペプチドは、化学合成又は組換えＤＮＡ技術などの方法を使用して作製されうる。「合成ペプチド」は、「融合タンパク質」を含む。
【００８４】
[0153]「モチーフ」という用語は、規定された長さのアミノ酸配列、例えば、約１５アミノ酸残基未満の長さ、又は約１３アミノ酸残基未満の長さ、例えば、クラスＩ  ＨＬＡモチーフについては、約８〜約１３アミノ酸残基（例えば、８、９、１０、１１、１２、又は１３）であり、クラスＩＩ  ＨＬＡモチーフについては、約６〜約２５アミノ酸残基（例えば、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、又は２５）のペプチドであって、特定のＨＬＡ分子により認識されるペプチド内の残基のパターンを指す。モチーフは、典型的に、所与のヒトＨＬＡ対立遺伝子によりコードされる、各ＨＬＡタンパク質について異なる。これらのモチーフは、１次アンカー残基と、２次アンカー残基とで、それらのパターンが異なる。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩのモチーフは、７、８、９、１０、１１、１２、又は１３アミノ酸残基の長さのペプチドを同定する。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩのモチーフは、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、又は２６アミノ酸残基の長さのペプチドを同定する。「交差反応性の結合性」ペプチドとは、結合対メンバーのクラスの、１つを超えるメンバーに結合するペプチド（例えば、クラスＩＨＬＡ分子及びクラスＩＩＨＬＡ分子の両方が結合するペプチド）を指す。
【００８５】
[0154]「残基」という用語は、アミド結合若しくはアミド結合模倣体により、ペプチド若しくはタンパク質へと組み込まれるか、又は核酸（ＤＮＡ又はＲＮＡ）コードされるアミノ酸残基又はアミノ酸模倣体残基を指す。ペプチド又はタンパク質について記載するのに使用される命名法は、従来の慣行に従う。アミノ基は、各アミノ酸残基の左側（アミノ末端又はＮ末端）に提示され、カルボキシル基は、右側（カルボキシ末端又はＣ末端）に提示される。ペプチドエピトープ内のアミノ酸残基の位置に言及される場合、アミノ酸残基は、第１の位置を、エピトープ又はそれが一部でありうるペプチド若しくはタンパク質のアミノ末端に位置する残基として、アミノ〜カルボキシルの方向に番号付けされる。本発明の、選択された具体的実施形態を表す式では、アミノ末端基及びカルボキシル末端基は、具体的には示されないが、そうでないことが指定されない限りにおいて、生理学的ｐＨ値においてそれらが呈する形態にある。アミノ酸構造式では、各残基は、一般に、標準的な３文字表記又は１文字表記により表される。アミノ酸残基のＬ形態は、大文字の１文字、又は３文字記号の大文字の第１の文字により表され、Ｄ形態を有するアミノ酸残基のＤ形態は、小文字の１文字又は小文字の３文字記号により表される。しかし、３文字記号又は全称は、大文字を伴わずに使用され、Ｌアミノ酸残基を指すことができる。グリシンは、非対称の炭素原子を有さず、単に「Ｇｌｙ」又は「Ｇ」と称する。本明細書で明示されるペプチドのアミノ酸配列は、一般に、標準的な１文字記号を使用して表記される（Ａ、アラニン；Ｃ、システイン；Ｄ、アスパラギン酸；Ｅ、グルタミン酸；Ｆ、フェニルアラニン；Ｇ、グリシン；Ｈ、ヒスチジン；Ｉ、イソロイシン；Ｋ、リシン；Ｌ、ロイシン；Ｍ、メチオニン；Ｎ、アスパラギン；Ｐ、プロリン；Ｑ、Ｇｌｕｔアミン；Ｒ、アルギニン；Ｓ、セリン；Ｔ、トレオニン；Ｖ、バリン；Ｗ、トリプトファン；及びＹ、チロシン）。
【００８６】
[0155]「保存的アミノ酸置換」とは、１つのアミノ酸残基が、類似する側鎖を有する、別のアミノ酸残基で置きかえられるアミノ酸置換である。当該技術分野では、類似する側鎖を有するアミノ酸残基のファミリーであって、塩基性側鎖（例えば、リシン、アルギニン、ヒスチジン）、酸性側鎖（例えば、アスパラギン酸、グルタミン酸）、非帯電極性側鎖（例えば、グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、チロシン、システイン）、非極性側鎖（例えば、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン）、β−分枝状側鎖（例えば、トレオニン、バリン、イソロイシン）、及び芳香族側鎖（例えば、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、ヒスチジン）を含むファミリーが規定されている。例えば、フェニルアラニンによる、チロシンの置換は、保存的置換である。ペプチド機能を消失させない、ヌクレオチド及びアミノ酸の保存的置換を同定する方法は、当該技術分野で周知である。
【００８７】
[0156]「薬学的に許容される」とは、一般に非毒性、不活性、及び／又は生理学的に適合性である、組成物又は組成物の成分を指す。「薬学的賦形剤」又は「賦形剤」は、アジュバント、担体、ｐＨ調整／緩衝剤、等張性調整剤、保湿薬剤、保存剤などの材料を含む。「薬学的賦形剤」とは、薬学的に許容される賦形剤である。
【００８８】
[0157]本開示に従い、「ワクチン」という用語は、投与時に、免疫応答、例えば、病原体又はがん細胞などの罹患細胞を認識及び攻撃する、細胞性免疫応答又は液性免疫応答を誘導する、医薬調製物（医薬組成物）又は医薬生成物に関する。ワクチンは、疾患の防止又は処置のために使用されうる。「個体化がんワクチン」又は「個別化がんワクチン」、「個別がんワクチン」という用語は、特定のがん患者に関し、がんワクチンが、個別のがん患者の必要又は特殊な状況に適合させられることを意味する。
【００８９】
[0158]本明細書では、「ポリヌクレオチド」及び「核酸」という用語が互換的に使用され、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを指し、ＤＮＡ及びＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡを含む。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾ヌクレオチド若しくは修飾塩基、及び／又はそれらの類似体、あるいはＤＮＡポリメラーゼ又はＲＮＡポリメラーゼによりポリマーへと組み込まれうる、任意の基質でありうる。一部の実施形態では、ポリヌクレオチド及び核酸は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて転写されるｍＲＮＡでありうる。一部の実施形態では、本発明の方法を使用して投与されるポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡである。
【００９０】
[0159]「単離された」又は「生物学的に純粋な」という用語は、その天然の状態で見出される通り、通常それに随伴する成分が、実質的に、又は本質的に非含有である材料を指す。したがって、本明細書で記載される単離ペプチドは、それらのｉｎ  ｓｉｔｕの環境において、通常、ペプチドと関連する材料の一部又は全部を含有しない。例えば、「単離」エピトープは、エピトープが由来するタンパク質の全配列を含まないエピトープでありうる。例えば、生存する動物において存在する、天然に存在するポリヌクレオチド又はペプチドは、単離されていないが、天然の系内共存する材料の一部又は全部から分離された、同じポリヌクレオチド又はペプチドは、単離されている。このようなポリヌクレオチドは、ベクターの一部である場合があり、かつ／又はこのようなポリヌクレオチド若しくはペプチドは、組成物の一部である場合があるが、このようなベクター又は組成物が、その天然環境の一部ではないという点において、やはり「単離」されている。単離ＲＮＡ分子は、本明細書で記載されるＤＮＡ分子の、ｉｎ  ｖｉｖｏ又はｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるＲＮＡ転写物を含み、合成により作製されたこのような分子をさらに含む。一部の実施形態では、単離されたポリペプチド、抗体、ポリヌクレオチド、ベクター、細胞、又は組成物は、実質的に純粋である。本明細書で使用される「実質的に純粋」という用語は、少なくとも５０％純粋である（すなわち、夾雑物が非含有である）か、少なくとも９０％純粋であるか、少なくとも９５％純粋であるか、少なくとも９８％純粋であるか、又は少なくとも９９％純粋な材料を指す。
【００９１】
[0160]２つ以上の核酸又はポリペプチドの文脈における、「同一な」又は「同一性」パーセントとは、配列同一性の一部としての、任意の保存的アミノ酸置換を考慮せずに、最大の対応について比較され、アライメントされる（必要な場合は、ギャップを導入する）場合に、同じであるか、又は指定された百分率の、同じであるヌクレオチド若しくはアミノ酸残基を有する、２つ以上の配列又は部分配列を指す。同一性パーセントは、配列比較ソフトウェア若しくは配列比較アルゴリズムを使用して、又は目視により測定されうる。当該技術分野では、アミノ酸配列又はヌクレオチド配列のアライメントを得るのに使用されうる、多様なアルゴリズム及びソフトウェアが周知である。これらは、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、Ｍｅｇａｌｉｇｎ、ＢｅｓｔＦｉｔ、ＧＣＧ  Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ｐａｃｋａｇｅ、及びこれらの変化形を含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、本明細書で記載される、２つの核酸又はポリペプチドは、実質的に同一であり、配列比較アルゴリズムを使用して、又は目視により測定される通りに、最大対応について比較され、アライメントされる場合に、それらが、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％の、ヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有し、一部の実施形態では、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の、ヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有することを意味する。一部の実施形態では、同一性は、少なくとも約１０、少なくとも約２０、少なくとも約４０〜６０残基、少なくとも約６０〜８０残基の長さ、又はこれらの間の任意の整数値の長さである配列の領域にわたり存在する。一部の実施形態では、同一性は、少なくとも約８０〜１００残基など、６０〜８０残基より長い領域にわたり存在する。一部の実施形態では、配列は、ペプチドのアミノ酸配列、又はヌクレオチド配列のコード領域など、比較される配列の全長にわたり、実質的に同一である。
【００９２】
[0161]「対象」という用語は、特定の処置のレシピエントである、ヒト、非ヒト霊長動物、イヌ、ネコ、齧歯動物などを含むがこれらに限定されない、任意の動物（例えば、哺乳動物）を指す。典型的に、本明細書では、ヒト対象に言及する、「対象」及び「患者」という用語は、互換的に使用される。
【００９３】
[0162]「有効量」又は「治療有効量」又は「治療効果」という用語は、対象又は哺乳動物における疾患又は障害「を処置する」のに有効な、治療剤の量を指す。治療有効量の薬物は、治療効果を有し、このように、疾患又は障害の発生を防止することもでき；疾患又は障害の発生を遅らせることもでき；疾患又は障害の進行を遅らせることもでき；疾患又は障害と関連する症状のうちの１つ以上を、ある程度緩和することもでき；罹患率及び死亡率を低減することもでき；生活の質を改善することもでき；このような効果の組合せを及ぼすこともできる。
【００９４】
[0163]「〜を処置すること」又は「処置」又は「〜を処置する」又は「〜を緩和すること」又は「〜を緩和する」という用語は、（１）診断された病理学的状態又は障害を治癒させ、遅らせる、これらの症状を軽減し、かつ／又はこれらの進行を停止させる治療的措置、及び（２）標的とされた病理学的状態又は障害の発生を防止するか、又は緩徐化させる、予防的措置又は防止的措置の両方を指す。したがって、処置を必要とする人は、既に障害を伴う人；障害を有する傾向がある人；及び障害が防止される人を含む。
【００９５】
[0164]細胞試料（例えば、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料）について記載するのに使用される場合における、「枯渇させられた」という用語は、細胞の亜集団が、除去されるか、又は枯渇させられた細胞試料を指す。例えば、ＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた免疫細胞試料とは、ＣＤ２５を発現する細胞が、除去されるか、又は枯渇させられた免疫細胞試料を指す。例えば、１以上の結合剤は、１以上の細胞又は細胞型を、試料から除去するか、又は枯渇させるのに使用されうる。例えば、ＣＤ１４＋細胞は、ＣＤ１４に結合する抗体を使用することなどにより、ＰＢＭＣ試料から枯渇させられるか、又は除去されうる。
【００９６】
[0165]「刺激」とは、刺激性分子の、そのコグネイトリガンドとの結合により誘導され、これにより、シグナル伝達イベントを媒介する応答を指す。例えば、Ｔ細胞の刺激とは、Ｔ細胞のＴＣＲの、ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を指す場合がある。例えば、Ｔ細胞の刺激とは、ＰＢＭＣが、ペプチドをロードされたＡＰＣと併せて培養された場合における、プロトコール１内又はプロトコール２内のステップを指す場合がある。
【００９７】
[0166]「エンリッチ」という用語は、対象種の濃度が、エンリッチメントを伴わない最終生成物中の、種の天然存在レベルより実質的に高濃度となるように、対象種が、部分的に精製された組成物又は画分を指す。「誘導細胞」という用語は、細胞のタンパク質発現、遺伝子発現、分化状態、形状、形態、生存などに影響を及ぼす、誘導性化合物、細胞、又は細胞の集団で処置された細胞を指す。
Ｔ細胞療法の概観及びこの製造
[0167]ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、Ｔ細胞（例えば、自家Ｔ細胞）の、制御された誘導又は拡大による、抗原特異的Ｔ細胞の作出は、高度に特異的かつ有益なＴ細胞療法（例えば、養子Ｔ細胞療法）をもたらしうる。本開示は、Ｔ細胞製造法、並びにがん及び他の状態、疾患、及び障害を伴う対象を処置するために使用されうる治療用Ｔ細胞組成物を提示する。目的は、好適な表現型及び機能を伴う、抗原特異的Ｔ細胞を拡大及び誘導することである。本開示は、抗原特異的Ｔ細胞療法（例えば、個別Ｔ細胞療法又は個別化Ｔ細胞療法）のために使用されうるＴ細胞を製造するための組成物及び方法を提示する。本明細書で提示されるＴ細胞組成物は、個別化抗原特異的Ｔ細胞療法でありうる。
【００９８】
[0168]本明細書では、Ｔ細胞を刺激する方法が提示される。例えば、本明細書で提示される方法は、抗原特異的Ｔ細胞を刺激するのに使用されうる。本明細書で提示される方法は、抗原特異的Ｔ細胞を拡大又は誘導するのに使用されうる。例えば、本明細書で提示される方法は、抗原特異的メモリーＴ細胞を拡大するのに使用されうる。例えば、本明細書で提示される方法は、抗原特異的ナイーブＴ細胞を誘導するのに使用されうる。例えば、本明細書で提示される方法は、抗原特異的ＣＤ８＋メモリーＴ細胞を拡大するのに使用されうる。例えば、本明細書で提示される方法は、抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞を誘導するのに使用されうる。例えば、本明細書で提示される方法は、抗原特異的ＣＤ４＋メモリーＴ細胞を拡大するのに使用されうる。例えば、本明細書で提示される方法は、抗原特異的ＣＤ４＋ナイーブＴ細胞を誘導するのに使用されうる。本明細書ではまた、抗原特異的Ｔ細胞を含む治療用組成物も提示される。例えば、治療用組成物は、抗原特異的メモリーＴ細胞を含みうる。例えば、治療用組成物は、抗原特異的ナイーブＴ細胞を含みうる。本明細書ではまた、本明細書で記載される治療用組成物を使用する、使用方法又は処置方法も提示される。
Ｔ細胞組成物
[0169]本明細書では、免疫細胞の集団を含む組成物（例えば、医薬組成物）が提示される。組成物は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含みうる。組成物は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含みうる。
【００９９】
[0170]一部の実施形態では、本明細書で提示される組成物は、抗原ペプチドをあらかじめロードされたＡＰＣなどのＡＰＣにより刺激されるＴ細胞を含む。組成物は、試料（例えば、生物学的試料）に由来するＴ細胞を含む、免疫細胞の集団を含むことが可能であり、Ｔ細胞は、ＡＰＣ−刺激Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、組成物は、１以上のサイトカイン、増殖因子、又はＡＰＣ若しくはＴ細胞の細胞表面受容体に結合するリガンドなどのリガンドと共にインキュベートされた免疫細胞の集団を含む。このようなサイトカイン、増殖因子、及びリガンドの非限定的な例は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、及びｐｏｌｙＩ：Ｃを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、組成物は、１以上のＡＰＣ又はＡＰＣ調製物と共にインキュベートされた、免疫細胞の集団を含む。例えば、組成物は、１つ以上のサイトカイン、増殖因子、及び／若しくはリガンドにより刺激されたＡＰＣ、又はサイトカイン、増殖因子、及び／若しくはリガンドにより刺激されたＡＰＣ調製物と共にインキュベートされた、免疫細胞の集団を含みうる。例えば、組成物は、１以上のサイトカインにより刺激されたＡＰＣ又はサイトカインにより刺激されたＡＰＣ調製物と共にインキュベートされた、免疫細胞の集団を含みうる。例えば、組成物は、１以上の増殖因子により刺激されたＡＰＣ又は増殖因子により刺激されたＡＰＣ調製物と共にインキュベートされた、免疫細胞の集団を含みうる。例えば、組成物は、１以上のリガンドにより刺激されたＡＰＣ又はリガンドにより刺激されたＡＰＣ調製物と共にインキュベートされた、免疫細胞の集団を含みうる。
【０１００】
[0171]一部の実施形態では、ＡＰＣは、自家ＡＰＣ、同種ＡＰＣ、又は人工ＡＰＣである。一部の実施形態では、ＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）を含む。一部の実施形態では、ＡＰＣは、ＣＤ１４＋単球に由来する。一部の実施形態では、ＡＰＣは、皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、リンパ節、末梢血、又は臍帯血から得られうる。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋単球は、対象に由来する、ＰＢＭＣを含む生物学的試料に由来する。例えば、ＣＤ１４＋単球は、対象に由来する、ＰＢＭＣを含む生物学的試料から単離、エンリッチ、又は精製されうる。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋単球は、１以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される。一部の実施形態では、１以上のサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋単球は、ＰＢＭＣを含む、第２の生物学的試料に由来する。
【０１０１】
[0172]一部の実施形態では、ＣＤ１４＋ＡＰＣの単離集団は、エンリッチされるか、又は実質的にエンリッチされうる。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋ＡＰＣの単離集団は、少なくとも３０％、少なくとも５０％、少なくとも７５％、又は少なくとも９０％同種である。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋ＡＰＣの単離集団は、少なくとも６０％、少なくとも７５％、又は少なくとも９０％同種である。ＣＤ１４＋ＡＰＣなどのＡＰＣは、例えば、培養物中で、単球性樹状細胞前駆体から導出されたＡＰＣのほか、例えば、末梢血、臍帯血、皮膚、脾臓、骨髄、胸腺、及びリンパ節などの組織内に存在する、内部由来のＡＰＣを含みうる。
【０１０２】
[0173]ＣＤ１４＋ＡＰＣ、及びＣＤ１４＋ＡＰＣについて、実質的にエンリッチされた細胞集団は、本発明によってもまた提供される方法により単離されうる。方法は、一般に、ＡＰＣ前駆体を含む細胞の集団を得ること、ＡＰＣ前駆体の、未成熟ＡＰＣ又は成熟ＡＰＣへの分化を含み、また、分化させた未成熟ＡＰＣ又は成熟ＡＰＣの集団からの、ＣＤ１４＋ＡＰＣの単離も含みうる。
【０１０３】
[0174]ＡＰＣ前駆細胞は、当該技術分野で公知の方法により得られうる。ＡＰＣ前駆体は、例えば、密度勾配分離、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）、パニングなどの免疫学的細胞分離法、補体溶解、ロゼッティング、磁気細胞分離法、ナイロンウール分離、及びこのような方法の組合せにより単離されうる。免疫選択性ＡＰＣのための方法は、例えば、基質へとカップリングさせた、抗ＣＤ３４及び／又は抗ＣＤ１４抗体など、ＡＰＣ前駆体と関連する細胞表面マーカーに対する抗体を使用することを含む。
【０１０４】
[0175]ＡＰＣ前駆体のエンリッチ集団もまた得られうる。当該技術分野では、このようなエンリッチ前駆体集団を得るための方法は公知である。例えば、ＡＰＣ前駆体のエンリッチ集団は、基質に接着させられた細胞の選択的除去により、組織供給源から単離されうる。例えば、骨髄又は末梢血などの組織供給源を使用して、接着性単球は、非接着性ＡＰＣ前駆体についてエンリッチされた集団を得るのに、市販のプラスチック基質（例えば、ビーズ又は磁気ビーズ）を使用して、細胞調製物から除去されうる。
【０１０５】
[0176]単球のＡＰＣ前駆体はまた、ＡＰＣ前駆体接着性基質を使用することにより、組織供給源からも得られうる。例えば、白血球除去法（leukopheresis）により単離された、末梢血白血球が、表面積対体積比が大きい、単球性ＡＰＣ前駆体接着性基質と接触され、接着性単球性ＡＰＣ前駆体が分離される。さらなる実施形態では、カップリングされる基質は、表面積対体積比が大きい、粒子状基質又は繊維状基質、例えば、マイクロビーズ、マイクロキャリアビーズ、ペレット、顆粒、粉末、毛細管、微絨毛膜などでありうる。さらに、粒子状基質又は繊維状基質は、ガラス、ポリスチレン、プラスチック、ガラスでコーティングしたポリスチレンマイクロビーズなどでありうる。
【０１０６】
[0177]ＡＰＣ前駆体はまた、分化及び／又は拡大のために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいても培養されうる。当該技術分野では、ＡＰＣ前駆体を分化／拡大するための方法が公知である。一般に、拡大は、ＡＰＣ（例えば、樹状細胞）の分化／増殖を誘導する、少なくとも１つのサイトカインの存在下で、前駆体を培養することにより達成されうる。典型的に、これらのサイトカインは、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）又は顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）である。加えて、他の薬剤は、培養物中の非ＡＰＣ細胞型の、増殖及び／又は成熟を阻害し、これにより、ＡＰＣ前駆体の集団をさらにエンリッチするのに使用されうる。典型的に、このような薬剤は、例えば、ＩＬ−１３、ＩＬ−４、又はＩＬ−１５などのサイトカインを含む。
【０１０７】
[0178]ＡＰＣ前駆体の単離集団は、未成熟ＡＰＣ又は成熟ＡＰＣを得るように培養され、分化させられる。適切な組織培養培地は、例えば、ＡＩＭ−Ｖ（登録商標）、ＲＰＭＩ  １６４０、ＤＭＥＭ、Ｘ−ＶＩＶＯ  １５（登録商標）などを含むがこれらに限定されない。組織培養培地は、典型的に、アミノ酸、ビタミン、２価カチオン、及び前駆体の分化を、ＡＰＣ表現型に対して促進するサイトカインを補充された。典型的に、分化促進サイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ及び／又はＩＬ−４である。
【０１０８】
[0179]さらに、ＡＰＣ表現型への拡大、分化、及び成熟時における、ＡＰＣ前駆体の培養物は、ＣＤ１４＋ＡＰＣの発生を促進する血漿を含みうる。典型的な血漿濃度は、約５％である。加えて、例えば、ＡＰＣ前駆体が、基質への接着により単離される場合、血漿は、培養早期の接着ステップにおいて、ＣＤ１４＋表現型を促進するように、培養培地中に含まれうる。接着時における、典型的な血漿濃度は、約１％以上である。
【０１０９】
[0180]単球性ＡＰＣ前駆体は、任意の適切な時間培養されうる。ある特定の実施形態では、前駆体の、未成熟ＡＰＣへの分化に適する培養時間は、約１〜約１０日間、例えば、約４〜約７日間でありうる。未成熟ＡＰＣの、前駆体からの分化は、細胞表面マーカー（例えば、ＣＤ１１ｃ＋、ＣＤ８３ｌｏｗ、ＣＤ８６−／ｌｏｗ、ＨＬＡ−ＤＲ＋）の存在又は非存在によるなど、当業者に公知の方法によりモニタリングされうる。未成熟ＡＰＣはまた、未成熟ＡＰＣを、さらなる分化、又は抗原の取込み、プロセシング、及び提示のための状態に維持するのに適切な組織培養培地中でも培養されうる。例えば、未成熟ＡＰＣは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で維持されうる。
【０１１０】
[0181]ＡＰＣ前駆体からの分化の後、ＣＤ１４＋細胞は、ＣＤ１４＋ＡＰＣの単離集団を得るように単離されうる。典型的に、ＣＤ１４＋ＡＰＣが、成熟の前に、エンリッチされるか、又は実質的にエンリッチされたＡＰＣから単離される場合、単離集団は、未成熟ＣＤ１４＋ＡＰＣについて、エンリッチされるか、又は実質的にエンリッチされる。一般に、ＣＤ１４＋ＡＰＣの単離は、ＣＤ１４＋細胞が単離される細胞集団を、ＣＤ１４特異的プローブと接触させることを含む。例示的な１つの実施形態では、ＣＤ１４を発現する細胞は、蛍光分子（例えば、ＦＩＴＣ又はＰＥ）へと直接コンジュゲートさせるか、又はＣＤ１４に特異的な非標識抗体と、第１の抗体に特異的な、標識された第２の抗体とを伴う、ＣＤ１４特異的プローブを使用するＦＡＣＳにより検出される。ＣＤ１４＋細胞はまた、ＦＡＣＳ分取により、ＣＤ１４ｌｏｗ及びＣＤ１４−細胞からも分離されうる。ＣＤ１４ｈｉｇｈの陽性性についてのゲーティングは、例えば、ＰＢＭＣ由来単球上のＣＤ１４染色を参照して決定されうる。典型的に、ＣＤ１４特異的結合剤は、例えば、抗ＣＤ１４抗体（例えば、モノクローナル又はこの抗原結合性断片）である。当業者には、本発明における使用に適する多数の抗ＣＤ１４抗体が周知であり、多くの抗ＣＤ１４抗体は、市販品を購入されうる。
【０１１１】
[0182]別の実施形態では、ＣＤ１４特異的プローブは、基質へとカップリングされ、ＣＤ１４＋細胞は、親和性選択により単離されうる。ＣＤ１４＋細胞を含む細胞集団は、カップリングされた基質へと曝露され、ＣＤ１４＋細胞は、特異的に接着させられる。次いで、非接着性ＣＤ１４−細胞は、基質から洗浄され、次いで、接着性細胞は、ＣＤ１４＋ＡＰＣが実質的にエンリッチされた単離細胞集団を得るように溶出される。ＣＤ１４特異的プローブは、例えば、抗ＣＤ１４抗体でありうる。基質は、例えば、市販の組織培養プレート又はビーズ（例えば、ガラスビーズ又は磁気ビーズ）でありうる。表面マーカーに特異的な、基質カップリング抗体を使用する、細胞集団の親和性単離法は、一般に公知である。
【０１１２】
[0183]培養時に、未成熟ＡＰＣ（ＣＤ１４−未成熟ＡＰＣの単離集団、又は単離前における全未成熟ＡＰＣ）は、任意選択で、所定の抗原へと曝露されうる。適切な所定の抗原は、Ｔ細胞によるモジュレーションが所望される、任意の抗原を含みうる。１つの実施形態では、未成熟ＡＰＣは、がん免疫療法及び／又は腫瘍増殖の阻害のための、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）の存在下で培養される。他の抗原は、例えば、細菌細胞、ウイルス、部分的に精製されるか、又は精製された、細菌抗原又はウイルス抗原、腫瘍細胞、腫瘍特異的抗原又は腫瘍関連抗原（例えば、腫瘍細胞溶解物、腫瘍細胞膜調製物、腫瘍から単離された抗原、融合タンパク質、リポソームなど）、抗原をその表面に発現する組換え細胞、自己抗原、及び他の任意の抗原を含みうる。抗原のうちのいずれかはまた、ペプチド若しくは組換えにより作製されたタンパク質又はこれらの部分としても提示されうる。抗原との接触後、細胞は、抗原特異的ＡＰＣの集団などを拡大するように、抗原の取込み及びプロセシングを可能とする、任意の適切な時間培養されうる。
【０１１３】
[0184]例えば、１つの実施形態では、未成熟ＡＰＣは、ＭＨＣ分子の文脈では、抗原を提示する成熟ＡＰＣへの、未成熟ＡＰＣの成熟を促進するように、抗原取込みの後で培養されうる。ＡＰＣ成熟のための方法は公知である。このような成熟は、例えば、サイトカイン（例えば、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、又はＣＤ４０リガンド）、細菌生成物（例えば、ＬＰＳ又はＢＣＧ）など、公知の成熟因子の存在下における培養により実施されうる。未成熟ＡＰＣの、成熟ＡＰＣへの成熟は、例えば、細胞表面マーカーの存在若しくは非存在（例えば、ＣＤ８３、ＣＤ８６、及びＭＨＣ分子の上方制御）を測定すること、又は、例えば、オリゴヌクレオチドアレイを使用する、成熟ＡＰＣに特異的なｍＲＮＡ又はタンパク質の発現についての試験など、当該技術分野で公知の方法によりモニタリングされうる。
【０１１４】
[0185]任意選択で、未成熟ＡＰＣは、細胞集団を拡大し、かつ／又は未成熟ＡＰＣを、さらなる分化若しくは抗原の取込みのための状態に維持するのに適切な組織培養培地中で培養されうる。例えば、未成熟ＡＰＣは、ＧＭ−ＣＳＦ及びＩＬ−４の存在下で、維持及び／又は拡大されうる。未成熟ＡＰＣはまた、未成熟ＡＰＣの成熟を阻害するように、例えば、抗炎症性サイトカイン（例えば、ＩＬ−１０及びＴＧＦ−β）などの抗炎症性分子の存在下でも培養されうる。
【０１１５】
[0186]別の態様では、ＣＤ１４＋ＡＰＣの単離集団は、成熟ＡＰＣについてエンリッチされる。ＣＤ１４＋成熟ＡＰＣの単離集団は、ＣＤ１４＋未成熟ＡＰＣの単離集団を、上記で記載された成熟因子（例えば、細菌生成物及び／又は炎症促進性サイトカイン）の存在下で培養し、これにより、成熟を誘導することにより得られうる。任意選択で、ＣＤ１４＋及びＣＤ１４−未成熟ＡＰＣ（ＡＰＣ前駆体から分化させられた）の混合集団は、成熟段階が、上記で記載された通りにモニタリングされる、成熟を誘導するように培養される場合があり、成熟ＡＰＣエンリッチメントの適切な段階において、ＣＤ１４＋細胞は、ＣＤ１４＋成熟ＡＰＣについてエンリッチされるか、又は実質的にエンリッチされた単離集団を得るように、上記で記載された通りに分離されうる。
【０１１６】
[0187]本発明のさらに別の態様に従い、ＡＰＣは、前立腺がん抗原への曝露の前に、又は曝露の後で、例えば、低温保存により保存されうる。使用されうる低温保存剤は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、グリセロール、ポリビニルピロリドン、ポリエチレングリコール、アルブミン、デキストラン、スクロース、エチレングリコール、ｉ−エリトリトール、Ｄ−リビトール、Ｄ−マンニトール、Ｄ−ソルビトール、ｉ−イノシトール、Ｄ−ラクトース、塩化コリン、アミノ酸、メタノール、アセトアミド、グリセロール一酢酸、及び無機塩を含むがこれらに限定されない。制御された、緩徐な冷却速度が、極めて重要でありうる。異なる低温保護剤及び異なる細胞型は、典型的に、異なる最適の冷却速度を有する。水が氷へと変化する、融合相の熱は、典型的に、最小であるものとする。冷却手順は、例えば、プログラム式凍結デバイス又はメタノール浴手順の使用により実行することができる。プログラム式凍結装置は、最適の冷却速度の決定を可能とし、標準的な、再現可能冷却を容易とする。Ｃｒｙｏｍｅｄ又はＰｌａｎａｒなどのプログラム式制御速度フリーザーは、凍結レジメンを、所望の冷却速度曲線に照らした微調整を可能とする。
【０１１７】
[0188]完全な凍結の後、ＡＰＣは、速やかに、長期極低温保管容器へと移されうる。典型的な実施形態では、試料は、液体窒素（−１９６℃）中又はその蒸気（−１６５℃）中で、極低温保管されうる。特に、骨髄又は末梢血に由来する造血幹細胞の、操作、低温保存、及び長期保管のための検討事項及び手順は、大部分が、本発明のＡＰＣに適用可能である。
【０１１８】
[0189]凍結細胞は、好ましくは、速やかに融解させ（例えば、３７〜４１℃で維持された水浴中で）、融解させたら、即座に冷却する。融解させたときの、細胞の凝集を防止するように、個数２０桁の細胞を処理することが所望されうる。凝集を防止するために、ＤＮアーゼ、低分子量デキストラン、及びクエン酸、ヒドロキシエチルデンプンなどの、凍結の前及び／又は後における添加を含むがこれらに限定されない、多様な手順が使用されうる。低温保護剤は、ヒトにおいて毒性である場合、融解させたＡＰＣの治療的使用の前に、除去されるべきである。低温保護剤を除去するための１つの方式は、低濃度への希釈による。凍結させたＡＰＣを融解し、回収したら、非凍結のＡＰＣに関して、本明細書で記載される通り、Ｔ細胞を活性化させるのに使用されうる。
【０１１９】
[0190]一部の実施形態では、組成物は、１種類又は複数種類の免疫細胞を枯渇させた、免疫細胞の集団を含む。例えば、組成物は、１種類又は複数種類の免疫細胞を枯渇させた、免疫細胞の集団であって、１以上の細胞表面受容体など、１以上のタンパク質を発現する免疫細胞の集団を含みうる。一部の実施形態では、組成物は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含み、この場合、集団内の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量と相対的に異なる。例えば、組成物は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含むことが可能であり、この場合、集団内の、ＣＤ１４を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中の、ＣＤ１４を発現する免疫細胞の量と相対的に異なる。例えば、組成物は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含むことが可能であり、この場合、集団内の、ＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中の、ＣＤ２５を発現する免疫細胞の量と相対的に異なる。例えば、組成物は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含むことが可能であり、この場合、集団内の、ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中の、ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量と相対的に異なる。例えば、組成物は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含むことが可能であり、この場合、集団内の、ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中の、ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より相対的に少ない。
【０１２０】
[0191]一部の実施形態では、組成物は、試料（例えば、生物学的試料）に由来するＴ細胞を含む、免疫細胞の集団を含み、この場合、Ｔ細胞は、ＡＰＣ−刺激Ｔ細胞を含み、ＡＰＣが、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣである。例えば、組成物は、試料（例えば、生物学的試料）に由来するＴ細胞を含む、免疫細胞の集団を含むことが可能であり、この場合、Ｔ細胞は、ＡＰＣ−刺激Ｔ細胞と、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、抗原特異的Ｔ細胞とを含み、ＡＰＣが、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣである。一部の実施形態では、組成物は、生物学的試料に由来する、Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団を含み、この場合、Ｔ細胞は、ＡＰＣ−刺激Ｔ細胞であり、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含み、ＡＰＣは、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣであり、集団内の、抗原特異的Ｔ細胞の量は、生物学的試料中の、抗原特異的Ｔ細胞の量より相対的に多い。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、複数の抗原特異的Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的な、複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、複数の抗原特異的Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、複数の抗原ペプチド配列に特異的な、複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、複数の抗原特異的Ｔ細胞を含む。例えば、組成物中の、複数の抗原特異的Ｔ細胞は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、１０００、１５００、２０００、３０００、４０００、５０００、６０００、７０００、８０００、９０００、１０，０００、１１，０００、１２，０００、１３，０００、１４，０００、１５，０００、１６，０００、１７，０００、１８，０００、１９，０００、２０，０００、２５，０００、３０，０００、３５，０００、４０，０００、４５，０００、５０，０００、６０，０００、７０，０００、８０，０００、９０，０００、１００，０００、２００，０００、３００，０００、４００，０００、５００，０００、６００，０００、７００，０００、８００，０００、９００，０００、１×１０６、２×１０６、３×１０６、４×１０６、５×１０６、６×１０６、７×１０６、８×１０６、９×１０６、１×１０７、２×１０７、３×１０７、４×１０７、５×１０７、６×１０７、７×１０７、８×１０７、９×１０７、１×１０８、２×１０８、３×１０８、４×１０８、５×１０８、６×１０８、７×１０８、８×１０８、９×１０８、１×１０９、２×１０９、３×１０９、４×１０９、５×１０９、６×１０９、７×１０９、８×１０９、９×１０９、１×１０１０、２×１０１０、３×１０１０、４×１０１０、５×１０１０、６×１０１０、７×１０１０、８×１０１０、９×１０１０、１×１０１１、２×１０１１、３×１０１１、４×１０１１、５×１０１１、６×１０１１、７×１０１１、８×１０１１、９×１０１１、１×１０１２、２×１０１２、３×１０１２、４×１０���２、５×１０１２、６×１０１２、７×１０１２、８×１０１２、又は９×１０１２個の抗原特異的Ｔ細胞を含みうる。例えば、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的な、複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的な、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、又は１０００の、異なるＴＣＲを含みうる。例えば、複数の抗原ペプチド配列に特異的な、複数のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）は、複数の抗原ペプチド配列に特異的な、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、又は１０００の、異なるＴＣＲを含みうる。例えば、複数の抗原ペプチド配列は、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、又は１０００の、異なる抗原ペプチド配列を含みうる。
【０１２１】
[0192]一部の実施形態では、組成物又は医薬組成物は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含む。一部の実施形態では、免疫細胞は、複数の抗原特異的Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞の各々は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。一部の実施形態では、組成物又は医薬組成物は、免疫細胞の集団を含み、この場合、集団内の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量よりも少ない。一部の実施形態では、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。
【０１２２】
[0193]一部の実施形態では、本明細書で提示される組成物は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と、薬学的に許容される賦形剤とを含み、この場合、集団内の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量と相対的に異なる。
【０１２３】
[0194]一部の実施形態では、本明細書で提示される組成物は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含み、この場合、集団内の、ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中の、ＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より相対的に少ない。
【０１２４】
[0195]一部の実施形態では、本明細書で提示される組成物は、生物学的試料に由来する、Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、Ｔ細胞が、ＡＰＣ−刺激Ｔ細胞であり、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含み、ＡＰＣが、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣである、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＡＰＣ−刺激Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、集団内の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より相対的に少ない。一部の実施形態では、集団内の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量は、生物学的試料中の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より相対的に多い。
【０１２５】
[0196]一部の実施形態では、医薬組成物は、ＣＤ４＋Ｔ細胞を含み、この場合、ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの、抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、少なくとも約２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。一部の実施形態では、医薬組成物は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、この場合、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの、抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、少なくとも約０．２％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。一部の実施形態では、医薬組成物は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含み、この場合、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの、抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、少なくとも約０．２％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、又は９０％である。
【０１２６】
[0197]一部の実施形態では、医薬組成物は、生物学的試料に由来する、Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、Ｔ細胞が、ＡＰＣ−刺激Ｔ細胞と、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、抗原特異的Ｔ細胞とを含み、ＡＰＣが、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣである、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含む。
【０１２７】
[0198]一部の実施形態では、医薬組成物は、生物学的試料に由来する、Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団であって、Ｔ細胞が、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、複数のネオ抗原Ｔ細胞を含む、免疫細胞の集団と；薬学的に許容される賦形剤とを含み；この場合、Ｔ細胞のうちの、抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、少なくとも約０．５％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、３．５％、４％、４．５％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、又は８０％である。
【０１２８】
[0199]一部の実施形態では、ネオ抗原特異的Ｔ細胞は、ＡＰＣ−刺激Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、集団内の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の百分率は、生物学的試料中の、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の百分率より小さい。一部の実施形態では、生物学的試料は、対象に由来する。一部の実施形態では、対象は、ヒトである。一部の実施形態では、対象は、疾患又は障害を有する。一部の実施形態では、疾患又は障害は、がんである。一部の実施形態では、ネオ抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、ネオ抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４エンリッチＴ細胞及び／又はＣＤ８エンリッチＴ細胞を含む。例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞又はＣＤ８＋Ｔ細胞は、対象に由来する、ＰＢＭＣを含む生物学的試料から単離、エンリッチ、又は精製されうる。一部の実施形態では、ネオ抗原特異的Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋及び／又はナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、ナイーブＴ細胞は、Ｌ−セレクチン（ＣＤ６２Ｌ）の表面発現により特徴づけられる。一部の実施形態では、ナイーブＴ細胞は、活性化マーカーである、ＣＤ２５、ＣＤ４４、又はＣＤ６９のうちの１又は複数の非存在により特徴づけられる。一部の実施形態では、ナイーブＴ細胞は、メモリーＣＤ４５ＲＯアイソフォームの非存在により特徴づけられる。一部の実施形態では、ナイーブＴ細胞は、ＣＤ１２７であるＩＬ−７受容体α、及びＣＤ１３２である共通γ鎖のサブユニットから成る、機能的ＩＬ−７受容体の発現により特徴づけられる。一部の実施形態では、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド配列は、（Ａ）点突然変異、（Ｂ）スプライス部位突然変異、（Ｃ）フレームシフト突然変異、（Ｄ）リードスルー突然変異、（Ｅ）遺伝子融合突然変異、及びこれらの組合せから選択される突然変異を含み、がんネオ抗原ペプチドは、対象のＨＬＡタンパク質に、５００ｎＭ未満のＩＣ５０、及び対応する野生型ペプチドより大きな親和性で結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド配列の各々は、対象により発現されるＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド配列の各々は、対象の非がん細胞内に存在しない突然変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド配列の各々は、対象のがん細胞の発現遺伝子によりコードされる。
【０１２９】
[0200]一部の実施形態では、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド配列のうちの１つ以上は、８〜５０天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド配列は、複数のネオ抗原ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、複数のネオ抗原ペプチド配列は、２〜５０、３〜５０、４〜５０、５〜５、６〜５０、７〜５０、８〜５０、９〜５０、又は１０〜５０のネオ抗原ペプチド配列を含む。
【０１３０】
[0201]一部の実施形態では、ＡＰＣは、１以上のＡＰＣ調製物である。一部の実施形態では、ＡＰＣは、少なくとも１つのネオ抗原ペプチド配列のうちの１つ以上を含む１以上のネオ抗原ペプチドをロードされたＡＰＣを含む。一部の実施形態では、ＡＰＣは、自家ＡＰＣ又は同種ＡＰＣである。
【０１３１】
[0202]一部の実施形態では、ＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）を含む。一部の実施形態では、ＡＰＣは、ＣＤ１４＋単球に由来する。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋単球は、対象に由来する、ＰＢＭＣを含む生物学的試料からエンリッチされる。例えば、ＣＤ１４＋は、対象に由来する、ＰＢＭＣを含む生物学的試料から単離、エンリッチ、又は精製されうる。
【０１３２】
[0203]一部の実施形態では、ＣＤ１４＋単球は、１以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される。一部の実施形態では、１以上のサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋単球は、ＰＢＭＣを含む、第２の生物学的試料に由来する。一部の実施形態では、第２の生物学的試料は、同じ対象に由来する。
【０１３３】
[0204]一部の実施形態では、生物学的試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。一部の実施形態では、組成物中の、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、全Ｔ細胞又は全免疫細胞のうちの、少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、組成物中の、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの、少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、組成物中の、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの、少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの、最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの、最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの、最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の、抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、最大で約０．５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の、ネオ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、最大で約０．５％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、最大で約０．５％である。
【０１３４】
[0205]一部の実施形態では、医薬組成物中の、抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの、少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、医薬組成物中の、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの、少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。一部の実施形態では、医薬組成物中の、抗原特異的ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの、少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、医薬組成物中の、抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの、少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、医薬組成物中の、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの、少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
製造法
[0206]本明細書では、抗原特異的Ｔ細胞を製造するための方法が提示される。本明細書では、治療用Ｔ細胞組成物など、Ｔ細胞組成物を調製する方法が提示される。例えば、方法は、抗原特異的Ｔ細胞を拡大又は誘導することを含みうる。Ｔ細胞を調製すること（例えば、誘導又は拡大すること）は、Ｔ細胞を製造することを表す場合もあり、任意の種類のＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞）を単離、刺激、培養、誘導、及び／又は拡大する手順を広く包含する。本明細書の第１の態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、ＡＰＣを、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含む方法が提示される。
【０１３５】
[0207]本明細書の第２の態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）−刺激ＡＰＣを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含む方法が提示される。
【０１３６】
[0208]本明細書の第３の態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物を調製する方法であって、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートし；そして、その後、生物学的試料の少なくとも１つのＴ細胞を、ＡＰＣと共にインキュベートすることを含む方法が提示される。
【０１３７】
[0209]本明細書の第４の態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物のうちの、第１のＡＰＣ調製物インキュベートしてから、２８日間未満の１以上の別個の期間、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物と共にインキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的メモリーＴ細胞が、拡大されるか、又は少なくとも１つの抗原特異的ナイーブＴ細胞が誘導される方法が提示される。
【０１３８】
[0210]本明細書の第５の態様では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、３つ以下のＡＰＣ調製物と共に３以下の別個の期間インキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的メモリーＴ細胞が拡大されるか、又は少なくとも１つの抗原特異的ナイーブＴ細胞が誘導される方法が提示される。
【０１３９】
[0211]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物と共に１以上の別個の期間インキュベートし、これにより、抗原特異的Ｔ細胞となるように、Ｔ細胞を刺激することを含み、この場合、抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの、少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、３つ以下のＡＰＣ調製物と共に３以下の別個の期間インキュベートし、これにより、抗原特異的Ｔ細胞となるように、Ｔ細胞を刺激することを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、２つ以下のＡＰＣ調製物と共に２以下の別個の期間インキュベートし、これにより、抗原特異的Ｔ細胞となるように、Ｔ細胞を刺激することを含む。
【０１４０】
[0212]一部の実施形態では、方法は、（ａ）少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む対象に由来する生物学的試料を得；（ｂ）ＣＤ１４を発現する細胞を生物学的試料からエンリッチし、これにより、ＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料を得；（ｃ）ＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子と共に第１の期間インキュベートし；（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４＋エンリッチ試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；（ｅ）ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、１以上のサイトカイン又は増殖因子と共に第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣ試料を得；（ｆ）成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣを、ＰＢＭＣを含む、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を枯渇させた試料と共に第４の期間インキュベートし；（ｇ）ＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし；（ｈ）ＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第６の期間インキュベートし；そして（ｉ）ＰＢＭＣのうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む。
【０１４１】
[0213]一部の実施形態では、方法は、（ａ）少なくとも１つのＡＰＣと、少なくとも１つのＰＢＭＣとを含む対象に由来する生物学的試料を得；（ｂ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を得；（ｃ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；（ｅ）ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＰＢＭＣと共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；（ｆ）第１の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；（ｇ）第２の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；（ｈ）第３の刺激されたＰＢＭＣ試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む。
【０１４２】
[0214]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、ＡＰＣを、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含む。
【０１４３】
[0215]本明細書の、一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物とインキュベートしてから、２８日間未満の１以上の別個の期間、免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物と共にインキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的メモリーＴ細胞が拡大されるか、又は少なくとも１つの抗原特異的ナイーブＴ細胞が誘導される方法が提示される。本明細書の一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、３つ以下のＡＰＣ調製物と共に３以下の別個の期間インキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的メモリーＴ細胞が拡大されるか、又は少なくとも１つの抗原特異的ナイーブＴ細胞が誘導される方法が提示される。
【０１４４】
[0216]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、免疫細胞の集団（例えば、ＰＢＭＣ）を、ＡＰＣと接触させることを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、免疫細胞の集団（例えば、ＰＢＭＣ）を、ＡＰＣと共にある期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、生物学的試料に由来する。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、ＣＤ１４を発現する細胞を枯渇させた試料（例えば、生物学的試料）に由来する。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、ＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた試料（例えば、生物学的試料）に由来する。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、ＣＤ１４を発現する細胞と、ＣＤ２５を発現する細胞とを枯渇させた試料（例えば、生物学的試料）に由来する。
【０１４５】
[0217]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）−刺激ＡＰＣを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含む。本明細書の、一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物を調製する方法であって、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートし；そして、その後、生物学的試料の、少なくとも１つのＴ細胞を、ＡＰＣと共にインキュベートする、ことを含む方法が提示される。
【０１４６】
[0218]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、試料（例えば、生物学的試料）に由来する免疫細胞の集団を、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）と接触させることを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、試料（例えば、生物学的試料）に由来する免疫細胞の集団を、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）−刺激ＡＰＣと接触させることを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、試料（例えば生物学的試料）に由来する免疫細胞の集団を、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）−刺激ＡＰＣと共にインキュベートすることを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物を調製する方法は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートし（例えばある期間）；次いで、生物学的試料のＴ細胞を、ＡＰＣと接触させる、ことを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、試料（例えば生物学的試料）に由来する免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物と接触させることを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、試料（例えば生物学的試料）に由来する免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物と共に１以上の別個の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、試料（例えば生物学的試料）に由来する免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物と共に、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、又は１０の別個の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、１以上の別個の期間は、免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物と共にインキュベートすることから計算して、２８日間未満である。
【０１４７】
[0219]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、免疫細胞の集団を、ＡＰＣと共にある期間インキュベートすることを含み、ここで、免疫細胞の集団は、ＰＢＭＣを含む生物学的試料に由来する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、免疫細胞の集団を、ＡＰＣと共にある期間インキュベートすることを含み、ここで、免疫細胞の集団は、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する。
【０１４８】
[0220]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）−刺激ＡＰＣと共にある期間インキュベートすることを含む。
【０１４９】
[0221]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物を調製する方法は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートし；次いで、生物学的試料のＴ細胞を、ＡＰＣと接触させる、ことを含む。
【０１５０】
[0222]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物と共に１以上の別個の期間インキュベートし、これにより、抗原特異的Ｔ細胞を誘導又は拡大することを含み、ここで、１以上の別個の期間は、免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物と共にインキュベートすることから計算して、２８日間未満である。一部の実施形態では、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物と共に１以上の別個の期間インキュベートすることは、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はこれらの組合せを含有する培地中で実施される。一部の実施形態では、培地は、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ）阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せをさらに含む。ＩＤＯ阻害剤は、エパカドスタット、ナボキシモド、１−メチルトリプトファン、又はこれらの組合せでありうる。一部の実施形態では、ＩＤＯ阻害剤は、抗原特異的ＣＤ８＋細胞の数を増大させうる。一部の実施形態では、ＩＤＯ阻害剤は、メモリーＣＤ８細胞応答の機能的プロファイルを維持しうる。ＰＤ−１抗体は、抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞応答の絶対数を増大させうる。ＰＤ−１抗体は、このような抗体により処置された細胞の増殖速度を増大させうる。ＩＬ−１２のさらなる存在は、抗原特異的細胞の増大、及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞の頻度の増大を結果としてもたらしうる。
【０１５１】
[0223]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物と共に１以上の別個の期間インキュベートし、これにより、抗原特異的Ｔ細胞を誘導又は拡大することを含み、ここで、抗原特異的Ｔ細胞、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞、又は抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全Ｔ細胞、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、総免疫細胞、又は全細胞のうちの少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【０１５２】
[0224]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、３つ以下のＡＰＣ調製物と共に３以下の別個の期間インキュベートし、これにより、抗原特異的Ｔ細胞となるようにＴ細胞を刺激することを含む。
【０１５３】
[0225]一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する。一部の実施形態では、ＡＰＣは、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）−刺激ＡＰＣである。一部の実施形態では、ＡＰＣは１以上のＡＰＣ調製物を含む。一部の実施形態では、ＡＰＣ調製物は、３つ以下のＡＰＣ調製物を含む。一部の実施形態では、ＡＰＣ調製物は、１以上の別個の期間内に、逐次的に、免疫細胞と共にインキュベートされる。
【０１５４】
[0226]一部の実施形態では、生物学的試料は対象に由来する。一部の実施形態では、対象はヒトである。例えば、対象は患者又はドナーでありうる。一部の実施形態では、対象は疾患又は障害を有する。一部の実施形態では、疾患又は障害はがんである。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ＣＤ４エンリッチ及び／又はＣＤ８エンリッチＴ細胞を含む。例えば、ＣＤ４＋及び／又はＣＤ８＋Ｔ細胞は、ＰＢＭＣを含む対象に由来する生物学的試料から単離、エンリッチ、又は精製されうる。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋及び／又はナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、メモリーＣＤ４＋及び／又はメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞である。
【０１５５】
[0227]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列は、（Ａ）点突然変異、（Ｂ）スプライス部位突然変異、（Ｃ）フレームシフト突然変異、（Ｄ）リードスルー突然変異、（Ｅ）遺伝子融合突然変異、及びこれらの組合せから選択される突然変異を含み、がん抗原ペプチドは、対象のＨＬＡタンパク質に、５００ｎＭ未満のＩＣ５０で、及び対応する野生型ペプチドより大きな親和性で結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々は、対象により発現されるＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々は、対象の非がん細胞内に存在しない突然変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々は、対象のがん細胞の発現遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上は、８〜５０天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列は、複数の抗原ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、複数の抗原ペプチド配列は、２〜５０、３〜５０、４〜５０、５〜５０、６〜５０、７〜５０、８〜５０、９〜５０、又は１０〜５０の抗原ペプチド配列を含む。
【０１５６】
[0228]一部の実施形態では、ＡＰＣは、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上を含む、１以上の抗原ペプチドをロードされたＡＰＣを含む。一部の実施形態では、ＡＰＣは、自家ＡＰＣ又は同種ＡＰＣである。一部の実施形態では、ＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）を含む。
【０１５７】
[0229]一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を、生物学的試料から枯渇させることを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１４＋細胞を枯渇させることは、ＣＤ１４に結合する薬剤をＡＰＣと接触させることを含む。一部の実施形態では、ＡＰＣはＣＤ１４＋単球に由来する。一部の実施形態では、ＡＰＣは生物学的試料からエンリッチされる。例えば、ＡＰＣは、ＰＢＭＣを含む対象に由来する生物学的試料から単離、エンリッチ、又は精製されうる。
【０１５８】
[0230]一部の実施形態では、ＡＰＣは、１以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される。一部の実施形態では、１以上のサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、１以上のサイトカイン又は増殖因子は、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、又はこれらの組合せを含む。
【０１５９】
[0231]一部の実施形態では、ＡＰＣは、第２の生物学的試料に由来する。一部の実施形態では、第２の生物学的試料は、同じ対象に由来する。
[0232]一部の実施形態では、生物学的試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。一部の実施形態では、方法における抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、全Ｔ細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、Ｔ細胞又は全免疫細胞のうちの約０．１％〜約５％、約５％〜１０％、約１０％〜１５％、約１５％〜２０％、約２０％〜２５％、約２５％〜３０％、約３０％〜３５％、約３５％〜約４０％、約４０％〜約４５％、約４５％〜約５０％、約５０％〜約５５％、約５５％〜約６０％、約６０％〜６５％、又は約６５％〜約７０％である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全Ｔ細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全Ｔ細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全Ｔ細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、全Ｔ細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。一部の実施形態では、方法における抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、全Ｔ細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、最大で約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、最大で約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の抗原特異的ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、最大で約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の抗原特異的メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、最大で約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、最大で約０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、又は２０％である。
【０１６０】
[0233]一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞を、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はこれらの組合せにより刺激することを含む。一部の実施形態では、方法は、ＩＤＯ阻害剤、ＰＤ−１抗体、又はＩＬ−１２の存在下で、Ｔ細胞を、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はこれらの組合せにより刺激することを含む。一部の実施形態では、方法は、抗原特異的Ｔ細胞を、対象へ投与することをさらに含む。
【０１６１】
[0234]一部の実施形態では、１以上の期間のうちの第１の期間は、約１、２、３、４、５、６、７、８、又は９日間である。
[0235]一部の実施形態では、別個の期間の合計期間は、２８日間未満である。一部の実施形態では、別個の期間の合計期間は、２０〜２７日間である。一部の実施形態では、別個の期間の合計期間は、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、又は３９日間である。
【０１６２】
[0236]一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に７日を超える期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日を超える期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に７〜２０、８〜２０、９〜２０、１０〜２０、１１〜２０、又は１２〜２０日間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に約１０〜１５日間インキュベートすることを含む。
【０１６３】
[0237]一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの第２のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に５〜９日間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの第２のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に５、６、７、８、又は９日間インキュベートすることを含む。
【０１６４】
[0238]一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの第３のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に５〜９日間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの第３のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に５、６、７、８、又は９日間インキュベートすることを含む。
【０１６５】
[0239]一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２日間インキュベートし、ＡＰＣ調製物のうちの第２のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２日間インキュベートし、そしてＡＰＣ調製物のうちの第３のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、又は２２日間インキュベートすることを含む。
【０１６６】
[0240]一部の実施形態では、生物学的試料は、対象から新たに得られるか、又は凍結させた試料から得られる。
[0241]一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの１つ以上を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子を含む第１の培地と共に第１の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、第１の期間は、少なくとも、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７、又は１８日間である。一部の実施形態では、第１の期間は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８日間以下である。一部の実施形態では、第１の期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、又は９日間である。一部の実施形態では、第１の期間は、３、４、５、６、７、８、９、又は１０日間以下である。一部の実施形態では、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの任意の組合せを含む。
【０１６７】
[0242]一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの１つ以上を、少なくとも１つのペプチドと共に第２の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、第２の期間は１時間以下である。
【０１６８】
[0243]一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ調製物のうちの１つ以上を、１以上のサイトカイン又は増殖因子を含む第２の培地と共に第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣを得ることを含む。一部の実施形態では、１以上のサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ（顆粒球マクロファージコロニー刺激因子）、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８（レシキモド）、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、ＣｐＧ、又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、第３の期間は、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、又は１８日間以下である。一部の実施形態では、第３の期間は、少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、又は１７日間である。一部の実施形態では、第３の期間は、２、３、４、又は５日間以下である。一部の実施形態では、第３の期間は、少なくとも１、２、３、又は４日間である。
【０１６９】
[0244]一部の実施形態では、方法は、第３の期間の後で、かつ、第４の期間の開始の前に、第２の培地の１以上のサイトカイン又は増殖因子を除去することをさらに含む。
[0245]一部の実施形態では、方法はｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施される。
【０１７０】
[0246]一部の実施形態では、Ｔ細胞を調製する方法は、ＡＰＣを含む生物学的試料を対象から得ることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１４＋細胞を生物学的試料からエンリッチし、これにより、ＣＤ１４＋エンリッチ試料を得ることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１４＋エンリッチ試料を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子を含む第１の培地と共に第１の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つのペプチドを、ＣＤ１４＋エンリッチ試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得ることを含む。一部の実施形態では、方法は、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、１以上のサイトカイン又は増殖因子を含む第２の培地と共に第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣ試料を得ることを含む。一部の実施形態では、方法は、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣを、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、及び少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子を含む第３の培地と第４の期間接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第５の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第６の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＰＢＭＣのうちのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む。
【０１７１】
[0247]他の一部の実施形態では、Ｔ細胞を調製する方法は、ＡＰＣを含む生物学的試料を対象から得ることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１４＋細胞を生物学的試料からエンリッチし、これにより、ＣＤ１４＋エンリッチ試料を得ることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１４＋エンリッチ試料を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子を含む第１の培地と共に、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間インキュベートすることを含む。
【０１７２】
[0248]一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つのペプチドを、ＣＤ１４＋エンリッチ試料と共に、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得ることを含む。一部の実施形態では、方法は、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、１以上のサイトカイン又は増殖因子を含む培地と共に、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣ試料を得ることを含む。一部の実施形態では、方法は、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣを、ＰＢＭＣ、及び少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子を含む培地と、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間接触させることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＰＢＭＣのうちのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む。
【０１７３】
[0249]一部の実施形態では、方法は、（ａ）少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む対象に由来する生物学的試料を得；（ｂ）ＣＤ１４を発現する細胞を生物学的試料からエンリッチし、これにより、ＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料を得；（ｃ）ＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子と共に第１の期間インキュベートし；（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；（ｅ）ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、１以上のサイトカイン又は増殖因子と共に第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣ試料を得；（ｆ）成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣを、ＰＢＭＣを含む、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を枯渇させた試料と共に第４の期間インキュベートし；（ｇ）ＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし；（ｈ）ＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第６の期間インキュベートし；そして（ｉ）ＰＢＭＣのうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む。一部の実施形態では、第１の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第２の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第３の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第４の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第５の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。
【０１７４】
[0250]一部の実施形態では、方法は、（ａ）少なくとも１つのＡＰＣ及び少なくとも１つのＰＢＭＣを含む対象に由来する生物学的試料を得；（ｂ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を得；（ｃ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；（ｅ）ペプチドロードされたＡＰ試料を、少なくとも１つのＰＢＭＣと共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；（ｆ）第１の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；（ｇ）任意選択で、第２の刺激されたＰＢＭＣ試料のＰＢＭＣを、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＰＢＭＣ試料を得；（ｈ）第１、第２、又は第３の刺激されたＰＢＭＣ試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む。一部の実施形態では、第１の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第２の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第３の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第４の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第５の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。
【０１７５】
[0251]他の一部の実施形態では、Ｔ細胞を調製する方法は、（ａ）対象から、ＡＰＣ及びＴ細胞を含む生物学的試料を得；（ｂ）生物学的試料を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子を含む第１の培地と共に第１の期間インキュベートし；（ｃ）少なくとも１つのペプチドを、（ｂ）の生物学的試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；（ｄ）ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、１以上のサイトカイン又は増殖因子を含む第２の培地と共に第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣ試料を得；（ｅ）第３の期間の後で、成熟ＡＰＣ試料を、ヒト血清と共に第４の期間インキュベートし；（ｆ）生物学的試料を、１以上のサイトカインと共に第５の期間インキュベートし；そして（ｇ）生物学的試料のＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子は、ＦＬＴ３Ｌを含む。一部の実施形態では、第１の期間は、少なくとも５時間、少なくとも８時間、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２２時間、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、又は少なくとも５日間である。一部の実施形態では、第２の期間は、少なくとも３０分間、４０分間、５０分間、１時間、２時間、又は３時間である。一部の実施形態では、第３の期間は、少なくとも１０時間、少なくとも１２時間、少なくとも１５時間、少なくとも２０時間、少なくとも２２時間、少なくとも１日間、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、又は少なくとも５日間である。一部の実施形態では、第４の期間は、約２、３、又は４日間である。一部の実施形態では、第５の期間は、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、又は１２日間である。一部の実施形態では、第１の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第２の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第３の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第４の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、第５の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。
【０１７６】
[0252]誘導又は拡大されたＴ細胞は、多様な種類のＴ細胞を含みうる。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ４エンリッチＴ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ８エンリッチＴ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのメモリーＴ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのナイーブＴ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。
【０１７７】
[0253]多様な抗原ペプチドは、Ｔ細胞を誘導又は拡大するのに使用されうる。一部の実施形態では、ペプチドは、（Ａ）点突然変異、（Ｂ）スプライス部位突然変異、（Ｃ）フレームシフト突然変異、（Ｄ）リードスルー突然変異、（Ｅ）遺伝子融合突然変異、及びこれらの組合せから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、点突然変異を含み、対応する野生型ペプチドより大きな親和性で対象のＨＬＡタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ペプチドは、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＩＣ５０で対象のＨＬＡタンパク質に結合する。一部の実施形態では、ペプチドは、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＩＣ５０又はＫＤで対象のＨＬＡタンパク質に結合する。一部の実施形態では、各ペプチドは、対象により発現されるＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合する。一部の実施形態では、誘導又は拡大された抗原特異的Ｔ細胞のＴＣＲは、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＩＣ５０又はＫＤでペプチド−ＨＬＡ複合体に結合する。一部の実施形態では、ＴＣＲは、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＩＣ５０又はＫＤでペプチド−ＨＬＡ複合体に結合する。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々は、対象の非がん細胞内に存在しない突然変異を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々は、対象のがん細胞の遺伝子又は発現遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、ペプチドは、少なくとも８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０；４０；５０；６０；７０；８０；９０；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；１，０００；１，５００；２，０００；２，５００；３，０００；４，０００；５，０００；７，５００；若しくは１０，０００、又はこれを超える天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドは、クラスＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、８〜１２天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドは、クラスＩＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、１６〜２５天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチドは、複数のペプチドを含む。一部の実施形態では、複数のペプチドは、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、若しくは５００、又はこれを超える抗原ペプチドを含む。
【０１７８】
[0254]多様な実施形態では、ＡＰＣは、Ｔ細胞を刺激／誘導するのに使用される。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、１以上の抗原ペプチドをロードされる。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、自家ＡＰＣ又は同種ＡＰＣである。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）を含む。一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を、生物学的試料から枯渇させることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＣＤ１９を発現する細胞を、生物学的試料から枯渇させることを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させることは、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５に結合する薬剤を、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣへと結合させることを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５に結合する薬剤は、ビオチン化される。一部の実施形態では、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させることは、固体支持体上の抗ビオチン試薬を、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５に結合する薬剤へと結合させることを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５に結合する薬剤は、固体支持体へと接合される。一部の実施形態では、ＣＤ１９を発現する細胞を枯渇させることは、ＣＤ１９に結合する薬剤を、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣへ結合させることを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９に結合する薬剤は、ビオチン化される。一部の実施形態では、ＣＤ１９を発現する細胞を枯渇させることは、固体支持体上の抗ビオチン試薬を、ＣＤ１９に結合する薬剤へと結合させることを含む。一部の実施形態では、ＣＤ１９に結合する薬剤は、固体支持体へと接合される。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、ＣＤ１４＋単球に由来する。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、ＣＤ１４１エンリッチＡＰＣ又はＣＤ１４１エンリッチ樹状細胞である。
【０１７９】
[0255]一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、生物学的試料からエンリッチされる。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、１以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される。一部の実施形態では、１以上のサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣは、第２の生物学的試料に由来する。一部の実施形態では、第２の生物学的試料は、同じ対象に由来する。一部の実施形態では、生物学的試料は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む。一部の実施形態では、生物学的試料は、対象から新たに得られるか、又は凍結させた試料から得られる。
【０１８０】
[0256]一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．００００１％、０．００００２％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である。
【０１８１】
[0257]一部の実施形態では、生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、又は１％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、又は１％である。一部の実施形態では、生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率は、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、０．２％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、又は１％である。
【０１８２】
[0258]一部の実施形態では、方法は、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞のうちの１つ以上を対象へ投与することをさらに含む。一部の実施形態では、別個の期間の合計期間は、２８日間未満である。一部の実施形態では、インキュベートすることは、複数のＡＰＣ調製物のうちの１つのＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に７日を超える期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、インキュベートすることは、複数のＡＰＣ調製物のうちの第１、第２、第３、又は第４のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に７日を超える期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のうちの１つ以上を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子を含む第１の培地と共に第１の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、第１の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、１以上のＡＰＣ調製物を、少なくとも１つのペプチドと共に第２の期間インキュベートすることを含む。一部の実施形態では、第２の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、方法は、ＡＰＣ又は１以上のＡＰＣを、１以上のサイトカイン又は増殖因子を含む第２の培地と共に第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣを得ることを含む。一部の実施形態では、第３の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０、若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、１以上のサイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含む。一部の実施形態では、方法は、第３の期間の後で、かつ、第４の期間の開始の前に、第２の培地の１以上のサイトカイン又は増殖因子を除去することをさらに含む。一部の実施形態では、第４の期間は、少なくとも又は最大で又は約３０、４０��若しくは５０分間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、若しくは２３時間；又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０日間である。一部の実施形態では、抗原は、ネオ抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、マイナー組織適合性抗原、又はこれらの組合せである。一部の実施形態では、方法はｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施される。一部の実施形態では、少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞は、複数の抗原特異的Ｔ細胞を含む。
抗原提示細胞（ＡＰＣ）及び調製法
[0259]一部の実施形態では、方法は、Ｔ細胞を、抗原提示細胞（ＡＰＣ）により誘導又は刺激又は拡大することを含む。ＡＰＣは、Ｔ細胞に接触させる前に、抗原ペプチドを、あらかじめロードされうる。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞を拡大又は誘導する方法は、Ｔ細胞を含む免疫細胞の集団を、ＡＰＣにより刺激することを含む。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する。一部の実施形態では、ＡＰＣは、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣである。一部の実施形態では、ＡＰＣは、１以上のＡＰＣ調製物を含む。一部の実施形態では、１以上のＡＰＣ調製物のうちの少なくとも１つは、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣを含む。一部の実施形態では、１以上のＡＰＣ調製物は、３つ以下のＡＰＣ調製物を含む。一部の実施形態では、１以上のＡＰＣ調製物は、１以上の別個の期間内に、逐次的に、免疫細胞と共にインキュベートされる。
【０１８３】
[0260]抗原提示細胞（ＡＰＣ）は、それらの細胞表面上で、ＭＨＣ分子と会合されたタンパク質抗原のペプチド断片を提示する。提示されたペプチドは、ＡＰＣの細胞表面上の、ペプチド−ＭＨＣ複合体（ｐＭＨＣ）として、ＭＨＣ分子と会合される。ペプチド−ＭＨＣ複合体のプロセシング及び提示は、タンパク質プロテアーゼ媒介性消化；抗原プロセシングと関連するトランスポーター（ＴＡＰ）に媒介される、ペプチドの、小胞体（ＥＲ）への輸送；新たに合成されたＭＨＣ分子を使用する、ペプチド−ＭＨＣ  Ｉ分子の形成；及びペプチド−ＭＨＣ分子の、細胞表面への輸送を含む、一連の逐次的段階を伴いうる。
【０１８４】
[0261]一部のＡＰＣは、抗原特異的Ｔ細胞を活性化させうる。例えば、ｐＭＨＣと相互作用するＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含むＴ細胞は、ＴＣＲ−ｐＭＨＣの形成時に、活性化されるか、刺激されるか、誘導されるか、又は拡大されうる。一部の実施形態では、抗原提示細胞のＭＨＣ（例えば、クラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣ）は、ペプチドをロードされ、提示されるペプチド配列を含む、抗原ペプチド又は抗原ポリペプチドをコードするＡＰＣ核酸（例えば、ＲＮＡ）へと導入することにより、ＡＰＣにより提示される。
【０１８５】
[0262]生物学的観点から、体細胞突然変異が、免疫応答を発生させるには、いくつかの基準が満たされる必要がある：突然変異を含有する対立遺伝子が、細胞により発現されるべきであり、突然変異が、タンパク質のコード領域内にあり、非同義であるべきであり、翻訳されるタンパク質が、プロテアソーム又は他の細胞内のタンパク質分解経路により切断されるべきであり、突然変異を含有するエピトープが、ＭＨＣ複合体により提示されるべきであり、提示されたエピトープが、ＴＣＲにより認識されるべきであり、最後に、ＴＣＲ−ｐＭＨＣ複合体が、Ｔ細胞を活性化させるシグナル伝達カスケードを立ち上げるべきである。
【０１８６】
[0263]単球は、血流内を循環し、次いで、組織へと移動し、そこで、マクロファージ及び樹状細胞へと分化しうる。古典的単球は、典型的に、ＣＤ１４細胞表面受容体の、高レベルの発現により特徴付けられる。単球及びＢ細胞は、コンピテントＡＰＣでありうるが、それらの抗原提示能は、既に感作されたＴ細胞の再活性化に限定されると考えられる。これらの細胞型は、機能的にナイーブであるか、又はプライミングされていないＴ細胞集団を、直接活性化させることが可能でない場合もある。プロフェッショナルの抗原提示細胞は、食作用又は受容体媒介性エンドサイトーシスにより、抗原を内部化し、次いで、それらの膜上において、ＭＨＣ分子に結合した抗原の断片を提示することにおいて、極めて効率的である。Ｔ細胞は、抗原提示細胞の膜上において、抗原−ＭＨＣ分子複合体を認識し、これと相互作用する。次いで、さらなる共刺激性シグナルが、抗原提示細胞によりもたらされ、Ｔ細胞の活性化をもたらす。共刺激性分子の発現は、プロフェッショナルの抗原提示細胞の、典型的な特徴である。
【０１８７】
[0264]プロフェッショナルの抗原提示細胞は、食作用又は受容体媒介性エンドサイトーシスにより、抗原を内部化し、次いで、それらの膜上において、ＭＨＣ分子に結合した抗原の断片を提示することにおいて、極めて効率的でありうる。Ｔ細胞は、ＡＰＣの膜上において、抗原−ＭＨＣ分子複合体を認識し、これと相互作用しうる。次いで、さらなる共刺激性シグナルが、ＡＰＣによりもたらされ、Ｔ細胞の活性化をもたらしうる。共刺激性分子の発現は、プロフェッショナルの抗原提示細胞の特徴を規定しうる。プロフェッショナルのＡＰＣの例は、樹状細胞（ＤＣ）、マクロファージ、及びＢ細胞を含みうるがこれらに限定されない。プロフェッショナルのＡＰＣは、高レベルのＭＨＣクラスＩＩ、ＩＣＡＭ−１、及びＢ７−２を発現しうる。
【０１８８】
[0265]プロフェッショナルの抗原提示細胞の、主要な種類のうちの１つは、抗原提示の範囲が最も広範にわたる樹状細胞である。プロフェッショナルの抗原提示細胞の、他の主要な種類は、マクロファージ、Ｂ細胞、及びある特定の活性化上皮細胞を含む。樹状細胞とは、ＭＨＣクラスＩＩ及びＩの抗原提示経路を介して、抗原（例えば、末梢組織内で捕捉される抗原）を、Ｔ細胞へと提示する白血球集団である。樹状細胞は、ナイーブＴ細胞及び既にプライミングされたＴ細胞（例えば、メモリーＴ細胞）の両方を活性化させることが可能である。樹状細胞（ＤＣ）は、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩの抗原提示経路を介して、末梢組織内で捕捉された抗原を、Ｔ細胞へと提示する白血球集団でありうる。樹状細胞は、免疫応答の、強力な誘導因子であることがあり、これらの細胞の活性化は、抗腫瘍免疫を誘導するために、極めて重要なステップでありうる。樹状細胞は、免疫応答の、強力な誘導因子であり、これらの細胞の活性化は、抗腫瘍免疫を誘導するために、極めて重要なステップである。
【０１８９】
[0266]樹状細胞は、「未成熟」細胞及び「成熟」細胞として類別されうるが、これは、２つの十分に特徴づけられた表現型を区別するための簡便な方式として使用されうる。しかし、この命名法は、分化の、全ての可能な中間段階を除外するようにみなされるべきではない。未成熟樹状細胞は、Ｆｃγ受容体及びマンノース受容体の高発現と相関する、抗原の取込み及びプロセシングの能力が高度な抗原提示細胞として特徴づけられうる。成熟表現型は、典型的に、これらのマーカーの低発現により特徴づけられるが、クラスＩ  ＭＨＣ及びクラスＩＩ  ＭＨＣ、接着分子（例えば、ＣＤ５４及びＣＤ１１）、並びに共刺激分子（例えば、ＣＤ４０、ＣＤ８０、ＣＤ８６、及び４−１ＢＢ）など、Ｔ細胞の活性化の一因となる細胞表面分子の高発現によっても特徴付けられる。成熟樹状細胞は、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ１１ｃ＋、ＨＬＡ−ＤＲ＋、ＣＤ８０＋、ＣＤ８６＋、ＣＤ５４＋、ＣＤ３−、ＣＤ１９−、ＣＤ１４−、ＣＤ１４１＋（ＢＤＣＡ−３）、及び／又はＣＤ１ａ＋でありうる。樹状細胞の成熟は、このような抗原提示樹状細胞が、Ｔ細胞のプライミングをもたらすときの、樹状細胞の活性化状態と称されうるのに対し、未成熟樹状細胞による提示は、寛容を結果としてもたらす。樹状細胞の成熟は、生得的受容体（例えば、細菌ＤＮＡ、ウイルスＲＮＡ、内毒素など）により検出される、微生物的特徴を伴う、生体分子、炎症促進性サイトカイン（例えば、ＴＮＦ、インターロイキン、及びインターフェロン）、樹状細胞表面上のＣＤ４０への、ＣＤ４０Ｌのリガンド結合、及び細胞死を被る細胞から放出される物質により引き起こされうる。樹状細胞の成熟を誘導しうる、さらなる非限定例サイトカインは、ＩＬ−４、ＧＭ−ＣＳＦ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、及びＩＬ−６を含む。例えば、樹状細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、骨髄細胞を、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、及び腫瘍壊死因子α（ＴＮＦ−α）などのサイトカインと共に培養することにより導出されうる。例えば、樹状細胞は、ＰＢＭＣから単離されたＣＤ１４＋単球から導出されうる。単球を、樹状細胞へと導出するために使用されうる、サイトカイン又は増殖因子は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、及びｐｏｌｙＩ：Ｃを含むがこれらに限定されない。
【０１９０】
[0267]典型的に、非プロフェッショナルの抗原提示細胞は、ＭＨＣクラスＩＩタンパク質を、構成的には発現しない。ＭＨＣクラスＩＩタンパク質は、典型的に、ＩＦＮ−γなど、ある特定のサイトカインによる、非プロフェッショナルの抗原提示細胞の刺激時に限り発現される。
【０１９１】
[0268]抗原提示細胞（ＡＰＣ）の供給源は、典型的に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、抗原ペプチドを発現し、提示することが可能な、ＡＰＣ又はＡＰＣ前駆体を含む組織供給源でありうる。一部の実施形態では、ＡＰＣは、標的ＲＮＡをロードされ、かつ／又は必要なサイトカイン若しくは因子で処置される場合に、プロフェッショナルのＡＰＣを増殖させ、プロフェッショナルのＡＰＣとなることが可能である。
【０１９２】
[0269]１つの態様では、ＡＰＣ前駆細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて、樹状細胞（ＤＣ）へと増殖及び成熟することが可能である。多くの組織供給源が使用されうるが、典型的な組織供給源は、脾臓、胸腺、組織生検、腫瘍、輸入リンパ管（afferent lyph）、リンパ節、骨髄、アフェレーシス若しくは白血球除去法による生成物、及び／又は末梢血を含みうる。ある特定の実施形態では、アフェレーシス生成物、骨髄、及び末梢血が、供給源でありうる。増殖因子にもまた富む、胎児組織、胎児血、又は臍帯血もまた、ＡＰＣ及び／又は前駆体ＡＰＣを得るための血液の供給源として使用されうる。前駆体細胞の例は、胚性幹細胞、ＣＤ３４＋細胞、単球始原細胞、単球、及びプレＢ細胞を含むがこれらに限定されない。例えば、ＡＰＣは、単球又はＣＤ３４＋細胞を含む前駆体細胞から導出されうる。
【０１９３】
[0270]１つの態様では、ＡＰＣ及び／又は前駆体ＡＰＣの供給源は、アフェレーシス又は白血球除去法の生成物でありうる。細胞は、当該技術分野で公知のアフェレーシス手順（例えば、Ｂｉｓｈｏｐら、Ｂｌｏｏｄ、８３巻、２号、６１０〜６１６頁（１９９４））を使用して回収されうる。アフェレーシス生成物は、典型的に、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球、及び血小板を含有しうる。１つの実施形態では、アフェレーシスにより回収された細胞は、その後の加工ステップのために、血漿画分を除去し、細胞を、適切な緩衝液中又は培地中に入れるように洗浄されうる。本発明の別の実施形態では、細胞は、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）で洗浄されうる。代替的実施形態では、洗浄液は、カルシウムを欠き、マグネシウムを欠く場合もあり、全てではないにせよ、多くの２価カチオンを欠く場合もある。洗浄ステップは、半自動式「フロースルー型」遠心分離機を使用することによるなど、当業者に公知の方法により達せられうる。洗浄の後、細胞は、例えば、Ｃａ非含有ＰＢＳ、Ｍｇ非含有ＰＢＳなど、様々な生体適合性緩衝液中に再懸濁されうる。代替的に、アフェレーシス試料のうちの、所望されない成分は、除去される場合があり、細胞は、培養培地中に、直接再懸濁されうる。
【０１９４】
[0271]ＡＰＣは、ヒト及び非ヒト霊長動物、他の哺乳動物、並びに脊椎動物を含む、様々な供給源から調製されうる。ある特定の実施形態では、ＡＰＣは、ヒト又は非ヒト脊椎動物の血液から調製されうる。ＡＰＣはまた、白血球のエンリッチ集団からも単離されうる。白血球の集団は、当業者に公知の方法により調製されうる。このような方法は、典型的に、ヘパリン処理血液の回収、アフェレーシス又は白血球除去法、バフィーコートの調製、ロゼッティング、遠心分離、密度勾配遠心分離（例えば、フィコール、コロイド状シリカ粒子、及びスクロースを使用する）、非白血球細胞の示差的溶解、及び濾過を含む。白血球集団はまた、対象から血液を回収し、血小板を除去するように脱フィブリン化させ、赤血球を溶解させることによっても調製されうる。白血球集団は、任意選択で、単球性樹状細胞前駆体についてエンリッチされうる。
【０１９５】
[0272]血液細胞集団は、エンリッチされた白血球の集団の、所望される使用に従い、様々な対象から得られうる。対象は、健常対象でありうる。代替的に、血液細胞は、例えば、がん患者又は免疫刺激が有益となる、他の患者など、免疫刺激を必要とする対象からも得られうる。同様に、血液細胞は、例えば、自己免疫障害（例えば、関節リウマチ、糖尿病、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症など）を有する患者など、免疫抑制を必要とする対象からも得られうる。白血球の集団はまた、ＨＬＡをマッチさせた健常個体からも得られうる。
【０１９６】
[0273]血液が、ＡＰＣの供給源として使用される場合、血中白血球は、それらの生存を維持する、従来の方法を使用して得られうる。本発明の１つの態様に従い、血液は、ヘパリン又は他の適切な抗凝固剤を含有する場合もあり、含有しない場合もある培地へと希釈されうる。培地の体積に対する血液の体積は、約１対１でありうる。細胞は、約１，０００ｒｐｍ（１５０ｇ）、４℃における、培地中の血液の遠心分離により濃縮されうる。血小板及び赤血球は、細胞を、赤血球を溶解させる、当該技術分野で公知の、任意の数の溶液、例えば、塩化アンモニウム中に再懸濁させることにより枯渇させられうる。例えば、混合物は、体積で約１：１の、培地及び塩化アンモニウムでありうる。細胞は、遠心分離により濃縮され、血小板及び赤血球を実質的に含有しない、白血球の集団が得られるまで、所望の溶液中で洗浄されうる。組織培養物中で一般に使用される、任意の等張性溶液は、血中白血球を、血小板及び赤血球から分離するための培地として使用されうる。このような等張性溶液の例は、リン酸緩衝生理食塩液、ハンクス平衡塩溶液、及び完全増殖培地でありうる。ＡＰＣ及び／又はＡＰＣ前駆細胞はまた、エルトリエーションによっても精製されうる。
【０１９７】
[0274]１つの実施形態では、ＡＰＣ及び／又は前駆体ＡＰＣの単離は、フィコール処理された全血液又はアフェレーシス処理された末梢血を、細胞１バッチ（典型的に、細胞約５×１０８〜約２×１０１０個）に対する、１以上の種類の無関係の抗体又は非抗体とカップリングさせた常磁性粒子（ビーズ約１バイアル又はビーズ４×１０９個）と共に、２２〜３７℃で、約３０分間〜２時間プレインキュベートした後で、常磁性粒子へと接合されるか、又はこれを貪食した細胞の磁気除去を行うことにより実施されうる。このような分離は、当該技術分野で利用可能な標準的方法を使用して実施されうる。例えば、市販される、様々な磁気分離法（例えば、ＤＹＮＡＬ（登録商標）磁気粒子濃縮器（ＤＹＮＡＬ  ＭＰＣ（登録商標）））を含む、任意の磁気分離法が使用されうる。単離の確認は、当業者に公知の、様々な方法であって、前記単離の前後における、細胞のフローサイトメトリー解析を含む方法によりモニタリングされうる。
【０１９８】
[0275]ＡＰＣは、適切な培養物容器（container又はvessel）内の、適切な培養培地中で、初代培養物を形成するように培養されうる。ある特定の実施形態では、培養培地は、１以上のサイトカインを補充されうる。適切な培養容器（container又はvessel）は、組織培養物適合性表面を伴う、任意の容器でありうる。例は、組織培養における使用のために作られた、多様なバッグ、フラスコ、ローラーボトル、ペトリディッシュ、及びマルチウェル含有プレートを含む。それらが、下記で記載される細胞の示差的接合を可能とする条件で、細胞接着を促進するように、物質、例えば、コラーゲン若しくはポリＬ−リシン、又は特定の細胞型に特異的な抗体で処理された表面もまた使用されうる。表面は、例えば、イオン化によってもまた、化学的に処理されうる。細胞は、１ｃｍ２当たりの細胞約１０５〜１０７個の初期細胞密度で播種されうる。１つの態様では、細胞は、１ｃｍ２当たりの細胞１０６個で播種されうる。
【０１９９】
[0276]１つの実施形態では、選択された組織供給源に由来する初代培養物は、細胞の集団が、非接着性細胞の分離を可能とするのに十分に、基質へと接着させられるまで、湿度、ＣＯ２、及びｐＨについての標準的な組織培養条件下、約３７℃でインキュベートされる。一晩にわたる培養の後で、前駆体が、分離されうるように、血液中の、一部の未成熟ＡＰＣ、特に、未成熟ＤＣは、単球と対照的に、当初、プラスチックに対して非接着性である。単球及び線維芽細胞は、接着性細胞の大部分を含む場合があり、通例、約３０分間〜約２４時間以内に、基質に接着させられうる。ある特定の態様では、非接着性細胞は、接着性細胞から、約１〜１６時間の間に分離されうる。非接着性細胞は、約１〜２時間後に分離されうる。著明な数量の接着性細胞を取り除くことのない、任意の方法は、接着性細胞を、非接着性細胞から分離するのに使用されうる。ある特定の態様では、細胞は、単純な振盪又はピペッティングにより取り除かれうる。ある特定の態様では、ピペッティングが、最も好ましい場合がある。
【０２００】
[0277]本発明の方法に従い単離された前駆体ＡＰＣ（例えば、単球）を含む接着性細胞は、細胞の集団が、未成熟ＡＰＣの段階に達するまで、湿度、ＣＯ２、及びｐＨについての標準的な組織培養条件下、約３７℃でインキュベートされうる。ある特定の態様では、本開示に従い、接着性細胞は、４時間〜７日間の間インキュベートされうる。しかし、当業者は、インキュベーション時間及びインキュベーション条件が変動しうることを、たやすく理解するであろう。未成熟ＡＰＣは、前駆体細胞の由来に応じて、ＣＤ１４−の場合もあり、ＣＤ１４＋の場合もある。未成熟ＡＰＣはまた、ＣＤ１ａ、ＣＤ４０、ＣＤ８６、ＣＤ５４、及び中間レベルのＭＨＣクラスＩＩも発現しうる（試料細胞上の、マーカー発現のレベルは、フローサイトメトリー解析により、ＭＨＣクラスＩＩ陰性細胞上、及び高レベルのＭＨＣクラスＩＩを発現することが公知の細胞上の発現レベルと比較されうる）。未成熟ＡＰＣは、典型的に、ＣＣＲ７を発現しない。
【０２０１】
[0278]本開示のある特定の態様では、Ｔ細胞をＡＰＣから分離することは必要でない。例えば、１つの実施形態では、ＡＰＣ及びＴ細胞を含むＰＢＭＣは、本明細書で記載される抗原へと曝露される場合があり、結果として得られる抗原特異的Ｔ細胞は、本明細書で記載される通りに、さらに拡大されうる。
【０２０２】
[0279]本発明のある特定の態様では、本明細書で記載されるＡＰＣ又はＴ細胞が、自家供給源から導出されることは要求されない。したがって、ＡＰＣ及びＴ細胞は、マッチさせたドナー若しくはマッチさせていないドナー、又は細胞系、Ｔ細胞系、若しくはｉｎ  ｖｉｔｒｏにおいて増殖させた他の細胞から得られうる。当該技術分野では、ハプロタイプをマッチさせるための方法が公知である。さらに、ＡＰＣ及びＴ細胞、又はこれらに由来する上清は、異種供給源、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長動物から得られる場合があり、ブタ細胞も使用されうる。
【０２０３】
[0280]適切なＡＰＣ調製物は、例えば、樹状細胞及び単球を含む。他の実施形態では、ＡＰＣは、例えば、Ｂ細胞、細胞、又は上皮細胞若しくは内皮細胞などの活性化非公称ＡＰＣでありうる。ＡＰＣは、未成熟ＡＰＣの場合もあり、成熟ＡＰＣの場合もある。ＡＰＣ及びＴ細胞は、典型的に、約６〜約４８時間共培養されるが、これを超える時間及びこれ未満の時間も、本発明の範囲内にある。共培養は、典型的に、Ｔ細胞の活性化を可能とするのに十分な時間実施されうるが、著明な数の未成熟ＡＰＣ又はＡＰＣ前駆体の分化及び／又は成熟に要求される時間未満実施される場合もある。
【０２０４】
[0281]ある特定の実施形態では、単球性樹状細胞前駆体は、例えば、エンリッチされた白血球又は単球を、単球性樹状細胞前駆体接着性基質と接触させることにより単離されうる。略述すると、エンリッチされた白血球又は単球の集団が、基質と接触される場合、細胞集団内の単球性樹状細胞前駆体又は単球は、基質に接着しうる。他の白血球は、基質に対する結合親和性の低減を呈し、これにより、単球性樹状細胞前駆体を、基質の表面上で、優先的にエンリッチすることが可能となる。適切な基質は、例えば、ガラス粒子、プラスチック粒子、ガラスでコーティングしたプラスチック粒子、ガラスでコーティングしたポリスチレン粒子などの粒子状基質、微小毛細管、及び微絨毛膜を含む。基質の表面は、任意選択で、単球性樹状細胞前駆体の、基質への接着を増強するように処置されうる。基質の表面は、例えば、タンパク質、サイトカイン、血漿、及び／又は単球結合性タンパク質でコーティングされうる。白血球エンリッチ細胞集団又は単球エンリッチ細胞集団を、単球性樹状細胞前駆体接着性基質と接触させた後、単球性樹状細胞前駆体は、基質に接着して、基質上で、単球性樹状細胞前駆体を含む複合体を形成する。単球性樹状細胞前駆体の結合は、例えば、ＦＡＣＳ前方側方散乱解析などにより、例えば、抗ＣＤ１４抗体など、抗細胞表面マーカー抗体を使用する抗体検出によりモニタリングされうる。一部の実施形態では、白血球集団は、基質と、約５〜約３００分間、より典型的に、約３０〜約１２０分間接触されうる。単球性樹状細胞前駆体複合体は、任意選択で、非特異的に結合した白血球を除去するのに適する洗浄緩衝液で洗浄されうる。適切な洗浄緩衝液は、組織培養培地、リン酸緩衝生理食塩液、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩液などを含む。培地は、単球性樹状細胞前駆体の生存及び／又は増殖を促進するように、アミノ酸、ビタミン、及び／又はホルモンを補充されうる。洗浄の有効性は、洗浄緩衝液のＦＡＣＳ前方側方散乱解析によりモニタリングされる場合もあり、溶出された細胞を、細胞表面マーカーについて染色することなどによりモニタリングされる場合もある。典型的に、複合体は、非特異的に結合した白血球を除去するように、何回か洗浄されうる。接着させられた単球性樹状細胞前駆体は、基質から溶出されうる。例えば、前駆体は、０．４％のＥＤＴＡ又は他の非毒性キレート剤を含有するリン酸緩衝生理食塩液を伴う処理により、基質から溶出されうる。単球性樹状細胞前駆体は、典型的に、トリプシン又は他のプロテアーゼを使用せずに、基質から溶出されうる。
【０２０５】
[0282]他の実施形態では、樹状細胞は、当業者に公知の他の方法（例えば、Ｏ’Ｄｏｈｅｒｔｙら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７８：１０６７〜７６（１９９３）；Ｙｏｕｎｇ及びＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．；、１７１：１３１５〜３２（１９９０）；Ｆｒｅｕｄｅｎｔｈａｌ及びＳｔｅｉｎｍａｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、８７：７６９８〜７０２（１９９０）；Ｍａｃａｔｏｎｉａら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．、６７：２８５〜８９（１９８９）；Ｍａｒｋｏｗｉｃｚ及びＥｎｇｌｅｍａｎ、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．、８５：９５５〜６１（１９９０）；米国特許第５，９９４，１２６号及び同第５，８５１，７５６号）に従い単離されうる。免疫分泌性樹状細胞のための方法は、例えば、基質へとカップリングされた抗ＣＤ３４及び／若しくは抗ＣＤ１４抗体（例えば、Ｂｅｒｎｈａｒｄら、Ｃａｎｃｅｒ  Ｒｅｓ．、５５：１０９９〜１０４（１９９５）；Ｃａｕｘら、Ｎａｔｕｒｅ３６０：２５８〜６１（１９９２））など、樹状細胞前駆体と関連する細胞表面マーカーに対する抗体、又はＣＤ１１ｃ、ＣＤ５４、ＣＤ８３、ＣＤ８０、及びＣＤ８６などの完全分化樹状細胞と関連する細胞表面マーカーに対する抗体を使用することを含む。
【０２０６】
[0283]他の実施形態では、ＡＰＣは、炎症状態又は他の形の活性化状態下における、非公称ＡＰＣでありうる。例えば、非公称ＡＰＣは、インターフェロン−γにより刺激された上皮細胞、ＡＰＣ活性を誘導する因子又は条件により活性化された、Ｔ細胞、Ｂ細胞、及び／又は単球を含みうる。このような非公称ＡＰＣは、当該技術分野で公知の方法に従い調製されうる。
【０２０７】
[0284]ＡＰＣは、ＡＰＣの種類に従い、所望の通りに、培養され、拡大され、分化させられ、かつ／又は成熟させられうる。ＡＰＣは、例えば、培養プレート、フラスコ、培養バッグ、及びバイオリアクターなど、任意の適切な培養器内で培養されうる。
【０２０８】
[0285]ある特定の実施形態では、ＡＰＣは、調製物中のＡＰＣの数を維持及び／又は拡大するのに適する、培養物中又は増殖培地中で培養されうる。培養培地は、単離されるＡＰＣの種類に従い選択されうる。例えば、成熟樹状細胞などの成熟ＡＰＣは、それらの維持及び拡大に適する増殖培地中で培養されうる。培養培地は、アミノ酸、ビタミン、抗生剤、２価カチオンなどを補充されうる。加えて、サイトカイン、増殖因子、及び／又はホルモンも、増殖培地中に含まれうる。例えば、成熟樹状細胞を維持及び／又は拡大するために、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）及び／又はインターロイキン４（ＩＬ−４）などのサイトカインを添加することができる。他の実施形態では、未成熟ＡＰＣは、培養及び／又は拡大されうる。未成熟樹状細胞は、標的ｍＲＮＡを取込み、新たな抗原をプロセシングする能力を保持しうる。一部の実施形態では、未成熟樹状細胞は、それらの維持及び培養に適する培地中で培養されうる。培養培地は、アミノ酸、ビタミン、抗生剤、２価カチオンなどを補充されうる。加えて、サイトカイン、増殖因子、及び／又はホルモンも、増殖培地中に含まれうる。
【０２０９】
[0286]他の未成熟ＡＰＣも同様に、培養又は拡大されうる。未成熟ＡＰＣの調製物は、成熟ＡＰＣを形成するように成熟させられうる。ＡＰＣの成熟は、抗原ペプチドへの曝露時に生じる場合もあり、抗原ペプチドへの曝露後に生じる場合もある。ある特定の実施形態では、未成熟樹状細胞の調製物は、成熟させられうる。適切な成熟因子は、例えば、サイトカインＴＮＦ−α、細菌生成物（例えば、ＢＣＧ）などを含む。別の態様では、単離ＡＰＣ前駆体は、未成熟ＡＰＣの調製物を調製するのに使用されうる。ＡＰＣ前駆体は、培養され、分化させられ、かつ／又は成熟させられうる。ある特定の実施形態では、単球性樹状細胞前駆体は、単球性樹状細胞前駆体の、未成熟樹状細胞への分化を促進するように、アミノ酸、ビタミン、サイトカイン、及び／又は２価カチオンを補充した、適切な培養培地の存在下で培養されうる。一部の実施形態では、ＡＰＣ前駆体は、ＰＢＭＣから単離される。ＰＢＭＣは、ドナー、例えば、ヒトドナーから得られる場合があり、新たに使用される場合もあり、将来の使用のために凍結される場合もある。一部の実施形態では、ＡＰＣは、１以上のＡＰＣ調製物から調製される。一部の実施形態では、ＡＰＣは、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上を含む１以上の抗原ペプチドをロードされたＡＰＣを含む。一部の実施形態では、ＡＰＣは、自家ＡＰＣ、同種ＡＰＣ、又は人工ＡＰＣである。
【０２１０】
[0287]一部の実施形態では、ＡＰＣ前駆体は、単球である。一部の実施形態では、単球は、ＣＤ１４＋単球である。一部の実施形態では、単球は、抗ＣＤ１４抗体により単離される。一部の実施形態では、単離された単球は、ウェル１つ当たり、２ｍＬの培地中の細胞１０５〜１０７個で播種される。一部の実施形態では、単離された単球は、ウェル１つ当たり、２ｍＬの培地中の細胞約３×１０６個で播種される。一部の実施形態では、単離された単球は、サイトカイン又は増殖因子を含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、単離された単球は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、単離された単球は、成熟にかける前に、少なくとも２日間、少なくとも３日間、少なくとも４日間、少なくとも５日間、又は少なくとも６日間培養される。一部の実施形態では、単球は、ｅｘ  ｖｉｖｏの培養培地中で、樹状細胞へと誘導される。一部の実施形態では、導出された樹状細胞は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、さらに成熟させられ、抗原ペプチドをロードされる。一部の実施形態では、導出された樹状細胞は、１以上の抗原ペプチドを含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、抗原ペプチドは、ネオ抗原ペプチドである。ネオ抗原ペプチドの例は、ＨＩＶ短鎖ペプチド、ＨＩＶ長鎖ペプチド、ＰＩＮ（previously identified neoantigen）短鎖ペプチド、及びＰＩＮ長鎖ペプチドを含むがこれらに限定されない。一部の実施形態では、導出された樹状細胞は、１以上のネオ抗原ペプチドを含有する培地中で、少なくとも３０分間、少なくとも５０分間、少なくとも１時間、又は少なくとも２時間培養される。一部の実施形態では、導出された樹状細胞は、抗原ペプチドと共にインキュベートした後で、１以上のサイトカインと共に、さらにインキュベートされる。一部の実施形態では、１以上のサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含む。
【０２１１】
[0288]一部の実施形態では、全ＰＢＭＣは、ＡＰＣを調製するのに使用され、これは、Ｔ細胞を刺激するのに、さらに使用されうる。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、調節性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）を枯渇させられ、次いで、ＦＬＴ３Ｌを含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＣＤ１４＋細胞を枯渇させられ、次いで、ＦＬＴ３Ｌを含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させられ、次いで、ＦＬＴ３Ｌを含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＣＤ２５＋及びＣＤ１４＋細胞を枯渇させられ、次いで、ＦＬＴ３Ｌを含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ１４＋細胞、及びＣＤ１９＋細胞を枯渇させられ、次いで、ＦＬＴ３Ｌを含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＦＬＴ３Ｌを含有する培地中で培養され、次いで、ＣＤ１４＋細胞を枯渇させられる。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＦＬＴ３Ｌを含有する培地中で培養され、次いで、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させられる。一部の実施形態では、ＰＢＭＣは、ＦＬＴ３Ｌを含有する培地中で培養され、次いで、ＣＤ１４＋細胞及びＣＤ２５＋細胞を枯渇させられる。一部の実施形態では、単離ＣＤ１４＋単球は、ＦＬＴ３Ｌを含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、ＦＬＴ３Ｌを含有する培地中で培養した後で、ＰＢＭＣ（全ＰＢＭＣ、ＣＤ１４＋枯渇ＰＢＭＣ、ＣＤ２５＋枯渇ＰＢＭＣ、ＣＤ２５＋／ＣＤ１４＋枯渇ＰＢＭＣ、又はＣＤ２５＋／ＣＤ１４＋／ＣＤ１９＋枯渇ＰＢＭＣ）又は単離ＣＤ１４＋単球は、１以上の抗原を含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、ＰＢＭＣ又は単離ＣＤ１４＋単球は、１以上の成熟サイトカインを含有する培地中で培養される。成熟サイトカインの例は、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含むがこれらに限定されない。成熟サイトカインは、細胞培養物中又は培地中に、多様な濃度で添加されうる。一部の実施形態では、成熟サイトカインは、細胞培養物中又は培地中に、少なくとも０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、又は２０ｎｇ／ｍＬの最終濃度で添加される。一部の実施形態では、成熟サイトカインは、細胞培養物中又は培地中に、少なくとも０．０５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．２μｇ／ｍＬ、０．３μｇ／ｍＬ、０．４μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．８μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、２μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、６μｇ／ｍＬ、７μｇ／ｍＬ、８μｇ／ｍＬ、９μｇ／ｍＬ、又��１０μｇ／ｍＬの最終濃度で添加される。一部の実施形態では、成熟サイトカインは、細胞培養物中又は培地中に、少なくとも１０Ｕ／ｍＬ、２０Ｕ／ｍＬ、３０Ｕ／ｍＬ、４０Ｕ／ｍＬ、５０Ｕ／ｍＬ、８０Ｕ／ｍＬ、１００Ｕ／ｍＬ、２００Ｕ／ｍＬ、５００Ｕ／ｍＬ、８００Ｕ／ｍＬ、１０００Ｕ／ｍＬ、１５００Ｕ／ｍＬ、２０００Ｕ／ｍＬ、又は２５００Ｕ／ｍＬ（本明細書で使用される酵素単位は、製造元のプロトコールに従い計算される）の最終濃度で添加される。一部の実施形態では、ＡＰＣ調製物のために使用されるＰＢＭＣ培養物（ある特定の細胞を枯渇させた、全ＰＢＭＣ又はＰＢＭＣ）は、Ｔ細胞の誘導又は刺激のために、さらなるインキュベーション又はサイトカイン処理にかけられる。この場合、ＡＰＣの調製（例えば、成熟及びペプチドローディング）及びＴ細胞の誘導又は刺激は、同じ細胞培養物を使用して実施される。他の一部の場合に、ＡＰＣ調製物は、Ｔ細胞刺激のために使用された、ＰＢＭＣ集団に由来する、個別の細胞集団である。
【０２１２】
[0289]一部の実施形態では、方法は、１つ以上のＡＰＣ又は１つ以上のＡＰＣ調製物を、ペプチドと共にインキュベートし、これにより、ペプチドをロードされたＡＰＣ試料を作出することを含む。例えば、方法は、１つ以上のＡＰＣ又は１つ以上のＡＰＣ調製物を、１つ以上のペプチドと共に０．００１〜１００μＭの濃度でインキュベートし、これにより、ペプチドをロードされたＡＰＣ試料を作出することを含みうる。例えば、方法は、１つ以上のＡＰＣ又は１つ以上のＡＰＣ調製物を、１つ以上のペプチドと共に少なくとも約０．００１μＭ、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、又は１００μＭの濃度でインキュベートすることを含みうる。例えば、方法は、１つ以上のＡＰＣ又は１つ以上のＡＰＣ調製物を、１つ以上のペプチドと共に最大で約０．００１μＭ、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、又は１００μＭの濃度でインキュベートすることを含みうる。例えば、方法は、１つ以上のＡＰＣ又は１つ以上のＡＰＣ調製物を、１つ以上のペプチドと共に約０．００１μＭ、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、又は１００μＭの濃度でインキュベートすることを含みうる。例えば、方法は、１つ以上のＡＰＣ又は１つ以上のＡＰＣ調製物を、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０、又はこれを超えるペプチドと共に少なくとも約０．００１μＭ、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、又は１００μＭの濃度でインキュベートすることを含みうる。例えば、方法は、１つ以上のＡＰＣ又は１つ以上のＡＰＣ調製物を、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９��、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０、又はこれを超えるペプチドと共に最大で約０．００１μＭ、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、又は１００μＭの濃度でインキュベートすることを含みうる。例えば、方法は、１つ以上のＡＰＣ又は１つ以上のＡＰＣ調製物を、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、若しくは２０、又はこれを超えるペプチドと共に、約０．００１μＭ、０．００５μＭ、０．０１μＭ、０．０２μＭ、０．０３μＭ、０．０４μＭ、０．０５μＭ、０．０８μＭ、０．０９μＭ、０．１μＭ、０．２μＭ、０．３μＭ、０．４μＭ、０．５μＭ、０．６μＭ、０．７μＭ、０．８μＭ、０．９μＭ、１μＭ、２μＭ、３μＭ、４μＭ、５μＭ、６μＭ、７μＭ、８μＭ、９μＭ、１０μＭ、２０μＭ、３０μＭ、４０μＭ、５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、又は１００μＭの濃度でインキュベートすることを含みうる。
Ｔ細胞
[0290]Ｔ細胞は、リンパ球として公知の白血球の群に属し、細胞媒介性免疫において、中心的な役割を果たす。Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞（ヘルパーＴ細胞）と、ＣＤ８＋Ｔ細胞（細胞傷害性Ｔ細胞）とを含む。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、Ｂ細胞の成熟、並びに細胞傷害性Ｔ細胞及びマクロファージの活性化を含む免疫過程において、他の白血球の一助となりうる。ＣＤ４＋Ｔ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で発現されるＭＨＣクラスＩＩ分子により、ペプチド抗原と共に提示されると活性化される。活性化されると、Ｔ細胞は、急速に分裂し、活性免疫応答を調節するサイトカインを分泌しうる。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ウイルス感染細胞及び腫瘍細胞を破壊することが可能であり、また、移植片拒絶にも関与している。ＣＤ８＋Ｔ細胞は、ほぼあらゆる体細胞の表面上に存在するＭＨＣクラスＩと会合する抗原への結合により、それらの標的を認識しうる。大半のＴ細胞は、Ｔ細胞受容体（ＴＣＲ）を有する。Ｔ細胞が、多様な疾患（例えば、がん）又は感染性生物と関連する抗原を認識する能力は、α鎖及びβ鎖又はγ鎖及びδ鎖の両方から構成される、そのＴＣＲにより付与される。これらの鎖を構成するタンパク質は、ＴＣＲの多様性を発生させるための、固有の機構を用いるＤＮＡによりコードされる。このマルチサブユニットの免疫認識受容体は、ＣＤ３複合体と会合することが可能であり、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上で、ＭＨＣクラスＩ及びＩＩのタンパク質により提示されたペプチドに結合する。Ｔ細胞の活性化における第１のシグナルは、Ｔ細胞受容体の、別の細胞上のＭＨＣにより提示される短鎖ペプチドへの結合によりもたらされうる。これは、このペプチドに特異的なＴＣＲを伴うＴ細胞だけが活性化されることを確実にする。Ｂ細胞及びマクロファージも、重要なＡＰＣでありうるが、パートナー細胞は、通例、ナイーブ応答の場合、プロフェッショナルの抗原提示細胞、通例、樹状細胞などの抗原提示細胞である。ＡＰＣ上の抗原性ペプチドへの、ＴＣＲの結合は、Ｔ細胞の活性化において、中心的なイベントであって、Ｔ細胞と、ＡＰＣとの間の接点である、免疫学的シナプスにおいて生じるイベントでありうる。
【０２１３】
[0291]各ＴＣＲは、可変的な相補性決定領域（ＣＤＲ）、並びにフレームワーク領域（ＦＲ）及び定常領域を含有する。α鎖可変ドメイン及びβ鎖可変ドメインの、第３の相補性決定領域（ＣＤＲ３）のループのアミノ酸配列は、それぞれ、β鎖遺伝子座内の、Ｖβ（variable）遺伝子セグメント、Ｄβ（diversity）遺伝子セグメント、及びＪβ（joining）遺伝子セグメントの間の組換え、並びにα鎖遺伝子座内の、類似するＶα遺伝子セグメント及びＪα遺伝子セグメントの間の組換えから生じる、αβＴ細胞の配列多様性の大部分を決定する。ＴＣＲのα鎖遺伝子座内及びβ鎖遺伝子座内の、複数のこのような遺伝子セグメントの存在は、多数の顕著に異なるＣＤＲ３配列がコードされることを可能とする。ＴＣＲ遺伝子再配列過程中の、Ｖβ−Ｄβ接合部、Ｄβ−Ｊβ接合部、及びＶα−Ｊα接合部における、ヌクレオチドの、独立の付加及び欠失は、ＣＤＲ３配列の多様性をさらに増大させる。この点で、免疫コンピテンスは、ＴＣＲの多様性において反映される。γδＴＣＲは、それが、生得免疫系と、緊密に相互作用する受容体をコードする点において、αβＴＣＲと、顕著に異なる。ＴＣＲγδは、発生の早期において発現され、特化した解剖学的分布を有し、固有の病原体特異性及び低分子特異性を有し、生得性細胞と、獲得性細胞との、広範なスペクトルにわたる相互作用を有する。ＴＣＲγδ細胞の、限局的なサブセットが、出生前の多様な組織に定着する、個体発生の早期に、ＴＣＲγのＶセグメント及びＪセグメントの発現の、バイアスのかかったパターンが確立される。
【０２１４】
[0292]Ｔ細胞は、当該技術分野で公知の方法に従い調製されうる。Ｔ細胞は、エンリッチＴ細胞調製物、ＡＰＣ枯渇細胞調製物、又は実質的に精製されたＴ細胞調製物でありうる。Ｔ細胞は、混合Ｔ細胞集団又は精製Ｔ細胞サブセットでありうる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞の単離集団に照らして、増大させたＴ細胞の数又は百分率を含有する、エンリッチＴ細胞調製物でありうる。
【０２１５】
[0293]Ｔ細胞又はＴ細胞のサブセットは、多様なリンパ系組織から得られうる。Ｔ細胞は、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）、骨髄、胸腺、組織生検、腫瘍、リンパ節組織、消化管に随伴するリンパ系組織、粘膜に随伴するリンパ系組織、脾臓組織、リンパ系組織、及び腫瘍を含む、多数の供給源から得られうる。本明細書で使用される「末梢血リンパ球」という用語（ＰＢＬ）及びその文法的同等物は、血液（例えば、末梢血）中を循環するリンパ球を指す場合がある。末梢血リンパ球とは、臓器に局在化していないリンパ球を指す場合がある。末梢血リンパ球は、Ｔ細胞、ＮＫ細胞、Ｂ細胞、又はこれらの任意の組合せを含みうる。
【０２１６】
[0294]方法は、Ｔ細胞を、対象から単離することを含みうる。方法は、対象から単離されたＴ細胞を得ることを含みうる。Ｔ細胞は、Ｔ細胞系から得られうる。Ｔ細胞は、自家供給源から得られうる。Ｔ細胞は、同種供給源から得られうる。Ｔ細胞はまた、異種供給源から、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長動物、及びブタからも得られうる。
【０２１７】
[0295]Ｔ細胞は、ＡＰＣ枯渇細胞調製物でありうる。Ｔ細胞は、ＡＰＣを実質的に含有しない場合がある。例えば、Ｔ細胞は、７５％を超えるＡＰＣから分離されたＴ細胞を含みうる。一部の実施形態では、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、例えば、ヘパリン処理バイアル内の血液から得られうる。ＰＢＭＣは、遠心分離により、赤血球から分離される場合があり、ＰＢＭＣは、界面から回収されうる。回収されたＰＢＭＣは、任意選択で、洗浄されうる（例えば、ＰＢＳにより）。
【０２１８】
[0296]Ｔ細胞の精製は、例えば、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ８、ＣＤ１４、ＣＤ１６、ＣＤ１９、及び／又はＣＤ２５へと方向付けられた抗体の使用を含むがこれらに限定されない、陽性選択又は陰性選択により達成されうる。ＣＤ２８＋、ＣＤ４＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＡ＋、及び／又はＣＤ４５ＲＯ＋Ｔ細胞などの特異的Ｔ細胞サブセットは、陽性選択法又は陰性選択法により単離されうる。例えば、ＣＤ４５ＲＯ＋、ＣＤ１４−、及び／又はＣＤ２５−Ｔ細胞は、陽性選択法又は陰性選択法により単離されうる。例えば、ＣＤ４５ＲＡ＋、ＣＤ１４−、及び／又はＣＤ２５−Ｔ細胞は、陽性選択法又は陰性選択法により単離されうる。例えば、ＣＤ３＋、ＣＤ１４−、及び／又はＣＤ２５−Ｔ細胞は、陽性選択法又は陰性選択法により単離されうる。例えば、ＣＤ２８＋、ＣＤ１４−、及び／又はＣＤ２５−Ｔ細胞は、陽性選択法又は陰性選択法により単離されうる。例えば、ＣＤ４＋、ＣＤ１４−、及び／又はＣＤ２５−Ｔ細胞は、陽性選択法又は陰性選択法により単離されうる。例えば、ＣＤ８＋、ＣＤ１４−、及び／又はＣＤ２５−Ｔ細胞は、陽性選択法又は陰性選択法により単離されうる。例えば、ＣＤ１４−及び／又はＣＤ２５−Ｔ細胞は、陰性選択法により単離されうる。例えば、ＣＤ１９−Ｔ細胞は、陰性選択法により単離されうる。例えば、ＣＤ１６−Ｔ細胞は、陰性選択法により単離されうる。例えば、ＣＤ３＋及びＣＤ２８＋Ｔ細胞は、ＣＤ３／ＣＤ２８コンジュゲート磁気ビーズを使用して陽性選択されうる。本発明の１つの態様では、陰性選択によるＴ細胞集団のエンリッチメントは、陰性選択される細胞に固有の表面マーカーへと方向付けられた抗体の組合せにより達せられうる。例えば、Ｔ細胞集団のエンリッチメントは、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ１４、ＣＤ２５、又はこれらの任意の組合せへと方向付けられた抗体を使用する陰性選択により達せられうる。例えば、Ｔ細胞集団のエンリッチメントは、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ２５、及び／又はＣＤ１４へと方向付けられた抗体の組合せを使用する陰性選択により達せられうる。
【０２１９】
[0297]例えば、Ｔ細胞試料は、対象の循環血液に由来する細胞を含むことが可能であり、アフェレーシス又は白血球除去法により得られうる。Ｔ細胞試料は、Ｔ細胞、単球、顆粒球、Ｂ細胞、他の有核白血球を含むリンパ球、赤血球、及び／又は血小板を含有しうる。Ｔ細胞試料のうちの、所望されない成分は、除去される場合があり、残りのＴ細胞は、培養培地中に再懸濁されうる。例えば、細胞は、血漿画分を除去するように洗浄されうる。例えば、Ｔ細胞は、赤血球の溶解、及びＰＥＲＣＯＬＬ（商標）勾配を介する遠心分離により、末梢血リンパ球から単離されうる。
【０２２０】
[0298]本明細書の多様な実施形態では、Ｔ細胞を含む、組成物及び方法が提示される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＣＲα鎖及びＴＣＲβ鎖を有するＴＣＲを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＴＣＲγ鎖及びＴＣＲδ鎖を有するＴＣＲを含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ４エンリッチＴ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、少なくとも１つのＣＤ８エンリッチＴ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、メモリーＴ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ナイーブＴ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原特異的Ｔ細胞は、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含む。一部の実施形態では、抗原ペプチド配列は、（Ａ）点突然変異、（Ｂ）スプライス部位突然変異、（Ｃ）フレームシフト突然変異、（Ｄ）リードスルー突然変異、（Ｅ）遺伝子融合突然変異、及びこれらの組合せから選択される突然変異を含む。一部の実施形態では、抗原ペプチド配列は、対象のＨＬＡタンパク質に、対応する野生型ペプチドより大きな親和性で結合する。一部の実施形態では、抗原ペプチド配列は、対象のＨＬＡタンパク質に、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＫＤ又はＩＣ５０で結合する。一部の実施形態では、各ペプチド配列は、対象により発現されるＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合する。一部の実施形態では、本明細書で記載される組成物の、Ｔ細胞のＴＣＲは、ペプチド−ＨＬＡ複合体に、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＫＤ又はＩＣ５０で結合する。
【０２２１】
[0299]一部の実施形態では、Ｔ細胞は、サイトカインを含有する培地中で培養される。サイトカインの例は、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を含む。一部の実施形態では、Ｔ細胞培養物中又は培地中のサイトカインは、少なくとも０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、又は２０ｎｇ／ｍＬ最終濃度を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞培養物中又は培地中のＩＬ−７は、少なくとも０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、又は２０ｎｇ／ｍＬ最終濃度を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞培養物中又は培地中のＩＬ−１５は、少なくとも０．０５ｎｇ／ｍＬ、０．１ｎｇ／ｍＬ、０．２ｎｇ／ｍＬ、０．３ｎｇ／ｍＬ、０．４ｎｇ／ｍＬ、０．５ｎｇ／ｍＬ、０．８ｎｇ／ｍＬ、１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、又は２０ｎｇ／ｍＬ最終濃度を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＬＴ３Ｌをさらに含有する培地中で培養される。一部の実施形態では、Ｔ細胞培養物中又は培地中のＦＬＴ３Ｌは、少なくとも１ｎｇ／ｍＬ、２ｎｇ／ｍＬ、３ｎｇ／ｍＬ、４ｎｇ／ｍＬ、５ｎｇ／ｍＬ、６ｎｇ／ｍＬ、７ｎｇ／ｍＬ、８ｎｇ／ｍＬ、９ｎｇ／ｍＬ、１０ｎｇ／ｍＬ、１２ｎｇ／ｍＬ、１５ｎｇ／ｍＬ、１８ｎｇ／ｍＬ、２０ｎｇ／ｍＬ、３０ｎｇ／ｍＬ、４０ｎｇ／ｍＬ、５０ｎｇ／ｍＬ、６０ｎｇ／ｍＬ、７０ｎｇ／ｍＬ、８０ｎｇ／ｍＬ、９０ｎｇ／ｍＬ、１００ｎｇ／ｍＬ、又は２００ｎｇ／ｍＬの最終濃度を有する。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＦＬＴ３Ｌを含有する培地中、第１の期間、インキュベート、誘導、又は刺激される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、加えて添加されたＦＬＴ３Ｌを含有する培地中、第２の期間、インキュベート、誘導、又は刺激される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、さらに添加されたＦＬＴ３Ｌを含有する培地中、第３の期間、インキュベート、誘導、又は刺激される。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、さらに添加されたＦＬＴ３Ｌを含有する培地中、各期間内に、ＦＬＴ３Ｌを、新たに添加される、第４、第５、又は第６の期間、インキュベート、誘導、又は刺激される。
抗原
[0300]本開示は、免疫原性抗原に特異的なＴ細胞を製造するための方法に関する。本開示はまた、ＡＰＣにより刺激された抗原特異的Ｔ細胞を含む組成物にも関する。一部の実施形態では、１以上の抗原ペプチドはＡＰＣへロードされ、次いで、ペプチドをロードされたＡＰＣは、Ｔ細胞を刺激して、抗原特異的Ｔ細胞を作製するのに使用される。一部の実施形態では、抗原は、ネオ抗原である。一部の実施形態では、ペプチドローディングのために使用されるＡＰＣは、樹状細胞である。
【０２２２】
[0301]一部の実施形態では、ペプチド配列は、対象の非がん細胞内に存在しない突然変異を含む。一部の実施形態では、ペプチドは、対象のがん細胞の遺伝子又は発現遺伝子によりコードされる。一部の実施形態では、ペプチド配列は、少なくとも８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０；４０；５０；６０；７０；８０；９０；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；１，０００；１，５００；２，０００；２，５００；３，０００；４，０００；５，０００；７，５００；若しくは１０，０００、又はこれを超える天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチド配列は、クラスＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、８〜１２天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチド配列は、クラスＩＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、１６〜２５天然アミノ酸の長さを有する。一部の実施形態では、ペプチド配列は、複数の抗原ペプチド配列を含む。一部の実施形態では、複数の抗原ペプチド配列は、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００の抗原ペプチド配列を含む。
【０２２３】
[0302]一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原は、ネオ抗原である。候補の免疫原性ネオ抗原配列は、当該技術分野で公知の、任意の適切な方法により同定されうる。本開示の方法は、例えば、対象の疾患に特異的な治療をもたらすか、又は疾患に対するワクチンを作製するのに有用でありうる。候補の免疫原性ネオ抗原は、既に同定されたネオ抗原でありうる。一部の実施形態では、候補の免疫原性ネオ抗原は、未だ同定されていない場合がある。本明細書で記載される方法及び組成物における使用のための、候補の免疫原性ネオ抗原は、対象に特異的でありうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法及び組成物における使用のための、候補のネオ抗原は、複数の対象に特異的でありうる。
【０２２４】
[0303]動物及びヒトのいずれにおいても、突然変異エピトープは、潜在的に、免疫応答の誘導又はＴ細胞の活性化において有効でありうる。１つの実施形態では、ウイルスなど、対象における感染作用物質の、潜在的に免疫原性のエピトープが決定されうる。１つの実施形態では、がんなどの疾患を伴う対象の、潜在的に免疫原性の突然変異エピトープが決定されうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法における使用のための、潜在的に免疫原性の抗原又はネオ抗原は、腫瘍内、及びそれらの発生元である組織型の細胞内で発現される分化抗原でありうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法における使用のための、潜在的に免疫原性の抗原又はネオ抗原は、別の分化組織内では発現されない、がん抗原／生殖細胞系列抗原でありうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法における使用のための、潜在的に免疫原性の抗原又はネオ抗原は、突然変異抗原でありうる。例えば、本明細書で記載される方法における使用のための、候補の、免疫原性の抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、ミスセンスの点突然変異、又は遺伝子セグメントの、腫瘍特異的転座を介して作出される、融合タンパク質の抗原若しくはネオ抗原を含みうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される方法における使用のための、潜在的に免疫原性の抗原又はネオ抗原は、過剰発現抗原でありうる。一部の実施形態では、潜在的に免疫原性の抗原又はネオ抗原は、腫瘍内で見出されうる。例えば、本明細書で記載される方法における使用のための、潜在的に免疫原性の抗原又はネオ抗原は、分化した正常組織の細胞内では、その発現が、厳密に調節されるタンパク質を含みうる。
【０２２５】
[0304]潜在的に免疫原性の突然変異エピトープは、次世代シーケンシング技術を使用する、がん患者に由来する、腫瘍組織及び健常組織に対する、ゲノムシーケンシング又はエクソームシーケンシングにより決定されうる。例えば、それらの突然変異の頻度、及び抗原又はネオ抗原として作用する能力に基づき選択される遺伝子は、次世代シーケンシング技術を使用してシーケンシングされうる。１つの実施形態では、シーケンシングデータは、対象のＨＬＡ分子に結合しうる、潜在的に免疫原性の突然変異ペプチドを同定するように解析されうる。１つの実施形態では、データは、コンピュータを使用して解析されうる。別の実施形態では、配列データは、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドの存在について解析されうる。１つの実施形態では、潜在的に免疫原性の抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、ＭＨＣ分子に対する、それらの親和性により決定されうる。
【０２２６】
[0305]潜在的に免疫原性の抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、直接的なタンパク質シーケンシングにより決定されうる。例えば、多次元質量分析法（例えば、タンデム質量分析（ＭＳ／ＭＳ））を使用する、酵素タンパク質消化物に対する、タンパク質シーケンシングは、本明細書で記載される方法における使用のための、潜在的に免疫原性の、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドを同定するのに使用されうる。
【０２２７】
[0306]未知のタンパク質に対する、デノボシーケンシングのためのハイスループット法は、潜在的に免疫原性の抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドを同定するのに使用されうる。例えば、メタショットガンタンパク質シーケンシングなど、未知のタンパク質に対する、デノボシーケンシングのためのハイスループット法は、対象の腫瘍を解析して、潜在的に免疫原性の、発現されたネオ抗原を同定するのに使用されうる。
【０２２８】
[0307]潜在的に免疫原性の抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドはまた、抗原特異的Ｔ細胞応答を同定するのに、ＭＨＣ多量体を使用しても同定されうる。例えば、患者試料中の、抗原特異的Ｔ細胞応答についてのハイスループット解析は、ＭＨＣ４量体ベースのスクリーニング法を使用して実施されうる。４量体ベースのスクリーニング法は、潜在的に免疫原性の腫瘍特異的抗原の初期同定のために使用される場合もあり、代替的に、患者が、潜在的に免疫原性の、どの抗原へと、既に曝露されたのかについて評価し、これにより、本明細書で記載される方法における使用のための、潜在的に免疫原性の抗原の選択を容易にするための、２次的スクリーニングプロトコールとして使用される場合もある。
【０２２９】
[0308]一部の実施形態では、免疫細胞が、解析されるか、又は特徴づけられうる。例えば、本明細書で記載される組成物の免疫細胞が、解析されるか、又は特徴づけられうる。一部の実施形態では、方法は、刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の１以上の細胞マーカーの発現を決定し；そして刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定する、ことを含むことが可能であり；ここで、発現の決定及び結合の決定は同時に実施される。一部の実施形態では、刺激された免疫細胞試料は、ペプチド−ＭＨＣ複合体を含むＡＰＣにより刺激された免疫細胞の集団である。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、生物学的試料に由来する。一部の実施形態では、方法は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、ペプチド−ＭＨＣ複合体を含むＡＰＣと共にインキュベートし、これにより、刺激された免疫細胞試料を得；刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の１以上の細胞マーカーの発現を決定し；そして刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定する、ことを含むことが可能であり；ここで、発現の決定及び結合の決定は同時に実施される。一部の実施形態では、１以上の細胞マーカーは、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＡＭＰ−１、４−１ＢＢ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７Ａ、グランザイムＢ、ＰＤ−１、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＦｏｘＰ３、又はこれらの任意の組合せを含む。一部の実施形態では、１以上の細胞マーカーは、サイトカインを含む。一部の実施形態では、１以上の細胞マーカーは、脱顆粒マーカーを含む。一部の実施形態では、１以上の細胞マーカーは、細胞表面マーカーを含む。一部の実施形態では、１以上の細胞マーカーは、タンパク質を含む。一部の実施形態では、刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定することは、刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体のペプチド及びＭＨＣを含むＭＨＣ４量体への結合の決定を含む。一部の実施形態では、ＭＨＣは、クラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣである。一部の実施形態では、ペプチド−ＭＨＣ複合体は、１以上の標識を含む。一部の実施形態では、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団は、各々が、１以上の生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含む、２つ以上の試料を含む。一部の実施形態では、２つ以上の試料は、２つ以上の試料標識により標識される。一部の実施形態では、発現の決定、及び結合の決定は、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む。一部の実施形態では、発現の決定、及び結合の決定は、単一細胞解析を含む。一部の実施形態では、発現の決定及び結合の決定は、１以上の細胞マーカーを発現し、かつ、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する免疫細胞の百分率を決定することを含む。一部の実施形態では、標識は、フルオロフォアを含む。一部の実施形態では、免疫細胞の集団は、本明細書に記載の組成物の免疫細胞の集団を代表する免疫細胞の集団を含む。一部の実施形態では、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＡＭＰ−１、４−１ＢＢ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７Ａ、グランザイムＢ、ＰＤ−１、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、若しくは任意の組合せを発現し、かつ／又はＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ２５、若しくはこれらの任意の組合せを発現しない免疫細胞集団が、解析されるか、又は特徴づけられうる。例えば、方法は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＡＭＰ−１、４−１ＢＢ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７Ａ、グランザイムＢ、ＰＤ−１、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ３、ＣＤ２８、ＣＤ４、ＣＤ８、若しくは任意の組合せを発現し、かつ／又はＣＤ１４、ＣＤ１９、ＣＤ１６、ＣＤ２５、若しくはこれらの任意の組合せを発現しないＴ細胞亜集団などの、特異的なＴ細胞亜集団を解析するか、又は特徴付けることを含みうる。例えば、方法は、ＣＤ１４、ＣＤ２５、ＣＤ１９、ＣＤ１６、又はこれらの任意の組合せを発現しない免疫細胞集団を解析するか、又は特徴付けることを含みうる。
【０２３０】
[0309]一部の実施形態では、免疫細胞集団内の、１以上の細胞マーカーの発現が決定されうる。例えば、方法は、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＡＭＰ−１、４−１ＢＢ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７Ａ、グランザイムＢ、ＰＤ−１、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１４、ＣＤ２５、ＣＤ１９、ＣＤ１６、又はこれらの任意の組合せの発現を決定することを含みうる。例えば、方法は、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、ペプチド−ＭＨＣ複合体を含むＡＰＣと共にインキュベートし、これにより、刺激された免疫細胞試料を得；刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＡＭＰ−１、４−１ＢＢ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７Ａ、グランザイムＢ、ＰＤ−１、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＦｏｘＰ３、ＣＤ１４、ＣＤ２５、ＣＤ１９、ＣＤ１６、又はこれらの任意の組合せの発現を決定し；そして刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定する、ことを含むことが可能であり、発現の決定及び結合の決定は同時に実施される。
【０２３１】
[0310]本明細書で記載される方法における使用のための、潜在的に免疫原性の、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、公知の抗原配列又はネオ抗原配列でありうる。例えば、本明細書で記載される方法における使用のための、潜在的に免疫原性の、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、抗原配列又はネオ抗原配列のデータベースに由来しうる。
【０２３２】
[0311]一部の態様では、本開示は、本明細書で記載される方法を使用して同定されるペプチド、又はペプチドをコードするポリヌクレオチド（例えば、腫瘍特異的突然変異を伴うペプチド、ウイルスペプチド、又は非がん性疾患と関連するペプチド）を提示する。
【０２３３】
[0312]一部の実施形態では、光学法は、免疫原性抗原を選択又は同定するのに使用される。一部の実施形態では、バーコード化プローブは、免疫原性抗原を選択又は同定するのに使用される。一部の実施形態では、標的特異的領域を含むバーコード化プローブ、及びバーコード化領域は、免疫原性抗原を選択又は同定するのに使用される。一部の実施形態では、標的特異的領域は、標的ポリヌクレオチドの核酸配列とハイブリダイズするか、又はこれに対する、少なくとも約９０％、９５％、若しくは１００％配列相補性を有する核酸配列を含む。
【０２３４】
[0313]一部の実施形態では、シーケンシング法は、免疫原性抗原を同定するのに使用される。任意の適切なシーケンシング法、例えば、次世代シーケンシング（ＮＧＳ）技術が、本発明に従い使用されうる。将来的には、第３世代シーケンシング法が、ＮＧＳ技術に取って代わって、方法のシーケンシングステップを加速しうるであろう。明確さを目的として、本発明の文脈における、「次世代シーケンシング」又は「ＮＧＳ」という用語は、サンガー化学反応として公知の、「従来型」シーケンシング法と異なり、全ゲノムを、小片へと分割することにより、核酸鋳型を、全ゲノムに沿って、ランダムに、並列的に読み取る、全てのハイスループットシーケンシング技術を意味する。このようなＮＧＳ技術（超並列シーケンシング技術としてもまた公知である）は、全ゲノム、エクソーム、トランスクリプトーム（ゲノムの、全ての転写された配列）、又はメチローム（ゲノムの、全てのメチル化配列）についての核酸配列情報を、極めて短期間、例えば、１〜２週間以内、例えば、１〜７日間以内、又は２４時間未満以内に配信することが可能であり、原則として、単一細胞シーケンシング法を可能とする。本発明の文脈では、市販されているか、又は文献において言及されている、複数のＮＧＳプラットフォーム、例えば、ＷＯ２０１２／１５９６４３において、詳細に記載されているＮＧＳプラットフォームが使用されうる。
【０２３５】
[0314]ある特定の実施形態では、抗原ペプチド若しくはネオ抗原ペプチド、又はこれらのエピトープは、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３１、約３２、約３３、約３４、約３５、約３６、約３７、約３８、約３９、約４０、約４１、約４２、約４３、約４４、約４５、約４６、約４７、約４８、約４９、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約１００、約１１０、約１２０、又はこれを超えるアミノ酸残基、及びこの中で導出可能な任意の範囲を含みうるがこれらに限定されない。具体的な実施形態では、免疫原性抗原又はこのエピトープは、１００アミノ酸以下である。
【０２３６】
[0315]一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩについて、抗原ペプチド若しくはネオ抗原ペプチド又はこれらのエピトープは、１３残基以下の長さであり、通常、約８〜約１１残基、特に、９又は１０残基から成る。一部の実施形態では、ＭＨＣクラスＩＩについて、免疫原性抗原ペプチド若しくはネオ抗原ペプチド、又はこれらのエピトープは、９〜２４残基の長さである。
【０２３７】
[0316]長鎖の免疫原性ペプチドは、いくつかの形でデザインされうる。一部の実施形態では、ＨＬＡ結合性ペプチドが予測されるか、又は既知である場合、長鎖の免疫原性ペプチドは、（１）各対応する遺伝子産物のＮ末端及びＣ末端に対して、２〜５アミノ酸の伸長部を伴う、個別の結合性ペプチド；又は（２）各々について、伸長配列を伴う結合性ペプチドの一部若しくは全部のコンカテネーションから成りうるであろう。他の実施形態では、シーケンシングが、長鎖（＞１０残基）のエピトープ配列、例えば、腫瘍内に存在するネオエピトープ（例えば、新規のペプチド配列をもたらす、フレームシフト、リードスルー、又はイントロンインクルージョンに起因する）を明らかにする場合、長鎖ネオ抗原ペプチドは、単一の長鎖ペプチド、又はいくつかの重複する長鎖ペプチドとしての、新規の腫瘍特異的アミノ酸の連なりの全体から成りうるであろう。一部の実施形態では、長鎖ペプチドの使用は、患者細胞による内因性プロセシングを可能とし、より有効な抗原提示及びＴ細胞応答の誘導をもたらすことが仮定される。一部の実施形態では、重複し、長鎖ネオ抗原ペプチドにわたり並べられる２つ以上のペプチドが使用されうる。
【０２３８】
[0317]一部の実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、ＨＬＡタンパク質（例えば、ＨＬＡクラスＩ又はＨＬＡクラスＩＩ）に結合する。具体的な実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、ＨＬＡタンパク質に、対応する野生型ペプチドより大きな親和性で結合する。具体的な実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、少なくとも５０００ｎＭ未満、少なくとも５００ｎＭ未満、少なくとも１００ｎＭ未満、少なくとも５０ｎＭ未満のＩＣ５０又はＫＤを有する。
【０２３９】
[0318]一部の実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、約８〜約５０アミノ酸残基の長さ、又は約８〜約３０、約８〜約２０、約８〜約１８、約８〜約１５、若しくは約８〜約１２アミノ酸残基の長さでありうる。一部の実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、約８〜約５００アミノ酸残基の長さ、又は約８〜約４５０、約８〜約４００、約８〜約３５０、約８〜約３００、約８〜約２５０、約８〜約２００、約８〜約１５０、約８〜約１００、約８〜約５０、若しくは約８〜約３０アミノ酸残基の長さでありうる。
【０２４０】
[0319]一部の実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、又はこれを超えるアミノ酸残基の長さでありうる。一部の実施形態では、ネオ抗原ペプチドは、少なくとも８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又はこれを超えるアミノ酸残基の長さでありうる。一部の実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、最大で８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、又はこれ未満のアミノ酸残基の長さでありうる。一部の実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、最大で８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５５、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、又はこれ未満のアミノ酸残基の長さでありうる。
【０２４１】
[0320]一部の実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、少なくとも８、少なくとも９、少なくとも１０、少なくとも１１、少なくとも１２、少なくとも１３、少なくとも１４、少なくとも１５、少なくとも１６、少なくとも１７、少なくとも１８、少なくとも１９、少なくとも２０、少なくとも２１、少なくとも２２、少なくとも２３、少なくとも２４、少なくとも２５、少なくとも２６、少なくとも２７、少なくとも２８、少なくとも２９、少なくとも３０、少なくとも４０、少なくとも５０、少なくとも６０、少なくとも７０、少なくとも８０、少なくとも９０、少なくとも１００、少なくとも１５０、少なくとも２００、少なくとも２５０、少なくとも３００、少なくとも３５０、少なくとも４００、少なくとも４５０、又は少なくとも５００アミノ酸の全長を有する。
【０２４２】
[0321]一部の実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、最大で８、最大で９、最大で１０、最大で１１、最大で１２、最大で１３、最大で１４、最大で１５、最大で１６、最大で１７、最大で１８、最大で１９、最大で２０、最大で２１、最大で２２、最大で２３、最大で２４、最大で２５、最大で２６、最大で２７、最大で２８、最大で２９、最大で３０、最大で４０、最大で５０、最大で６０、最大で７０、最大で８０、最大で９０、最大で１００、最大で１５０、最大で２００、最大で２５０、最大で３００、最大で３５０、最大で４００、最大で４５０、又は最大で５００アミノ酸の全長を有する。
【０２４３】
[0322]一部の実施形態では、ネオ抗原ペプチドは、約０．５〜約１２、約２〜約１０、又は約４〜約８のｐＩ値を有しうる。一部の実施形態では、ネオ抗原ペプチドは、少なくとも４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、又はこれを超えるｐＩ値を有しうる。一部の実施形態では、ネオ抗原ペプチドは、最大で４．５、５、５．５、６、６．５、７、７．５、又はこれ未満のｐＩ値を有しうる。
【０２４４】
[0323]一部の実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、約１ｐＭ〜約１ｍＭ、約１００ｐＭ〜約５００μＭ、約５００ｐＭ〜約１０μＭ、約１ｎＭ〜約１μＭ、又は約１０ｎＭ〜約１μＭの、ＨＬＡへの結合親和性を有しうる。一部の実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、少なくとも２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００μＭ、又はこれを超える、ＨＬＡへの結合親和性を有しうる。一部の実施形態では、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、最大で２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、５００、５５０、６００、７００、８００、９００μＭの、ＨＬＡへの結合親和性を有しうる。
【０２４５】
[0324]一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、例えば、サイログロブリン、アルブミンなど、ヒト血清アルブミン、破傷風毒素、ポリＬ−リシン、ポリＬ−グルタミン酸などのポリアミノ酸残基、インフルエンザウイルスタンパク質、Ｂ型肝炎ウイルスコアタンパク質など、当該技術分野で周知のキャリアなどのキャリアを含みうる。
【０２４６】
[0325]一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、末端ＮＨ２のアシル化、例えば、アルカノイル（Ｃ１〜Ｃ２０）又はチオグリコリルのアセチル化、末端カルボキシルのアミド化、例えば、アンモニア、メチルアミンなどにより修飾されうる。一部の実施形態では、これらの修飾は、支持体又は他の分子への連結のための部位をもたらしうる。
【０２４７】
[0326]一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、グリコシル化、側鎖の酸化、ビオチン化、リン酸化、表面活性材料、例えば、脂質の付加などであるがこれらに限定されない修飾を含有する場合もあり、化学修飾される、例えば、アセチル化などがなされる場合もある。さらに、ペプチド内の結合は、ペプチド結合以外、例えば、共有結合、エステル結合又はエーテル結合、ジスルフィド結合、水素結合、イオン結合などでありうる。
【０２４８】
[0327]一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、結果として得られるペプチドの物理的特性（例えば、安定性又は可溶性）を修飾する置換を含有しうる。例えば、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、システイン（Ｃ）の、α−アミノ酪酸（「Ｂ」）による置換を介して修飾されうる。その化学的性質のために、システインは、ジスルフィド架橋を形成し、ペプチドを、結合能を低減するように、十分に構造的に変更する傾向を有する。α−アミノ酪酸によるＣの置換は、この問題を緩和するだけでなく、ある特定の場合には、結合能及び交差結合能を、実際に改善する。α−アミノ酪酸によるシステインの置換は、抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドの、任意の残基において、例えば、ペプチド内のエピトープ若しくは類似体のアンカー位置若しくは非アンカー位置において、又はペプチドの他の位置において生じうる。
【０２４９】
[0328]一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、アミノ酸模倣体又は非天然アミノ酸残基、例えば、Ｄ−ナフチルアラニン又はＬ−ナフチルアラニン；Ｄ−フェニルグリシン又はＬ−フェニルグリシン；Ｄ−２−チエネイルアラニン又はＬ−２−チエネイルアラニン；Ｄ−１、２、３、若しくは４−ピレネイルアラニン又はＬ−１、２、３、若しくは４−ピレネイルアラニン；Ｄ−３−チエネイルアラニン又はＬ−３−チエネイルアラニン；Ｄ−（２−ピリジニル）−アラニン又はＬ−（２−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−（３−ピリジニル）−アラニン又はＬ−（３−ピリジニル）−アラニン；Ｄ−（２−ピラジニル）−アラニン又はＬ−（２−ピラジニル）−アラニン；Ｄ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン又はＬ−（４−イソプロピル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロメチル）−フェニルグリシン；Ｄ−（トリフルオロ−メチル）−フェニルアラニン；Ｄ−ρ−フルオロフェニルアラニン；Ｄ−ρ−ビフェニル−フェニルアラニン又はＬ−ρ−ビフェニル−フェニルアラニン；Ｄ−ρ−メトキシビフェニルフェニルアラニン又はＬ−ρ−メトキシビフェニルフェニルアラニン；Ｄ−２−インドール（アリル）アラニン又はＬ−２−インドール（アリル）アラニン；及びＤ−アルキルアラニン又はＬ−アルキルアラニンを含むことが可能であり、この場合、アルキル基は、置換又は非置換の、メチル、エチル、プロピル、ヘキシル、ブチル、ペンチル、イソプロピル、イソブチル、ｓｅｃ−イソチル、イソペンチル、又は非酸性アミノ酸残基でありうる。非天然アミノ酸の芳香環は、例えば、チアゾイル、チオフェニル、ピラゾイル、ベンズイミダゾイル、ナフチル、フラニル、ピロリル、及びピリジルの芳香環を含む。多様なアミノ酸模倣体又は非天然アミノ酸残基を有する修飾ペプチドは、ｉｎ  ｖｉｖｏにおいて、安定性の増大を顕示する傾向があるので、特に有用である。このようなペプチドはまた、保管寿命又は製造特性の改善も有しうる。
【０２５０】
[0329]ペプチドの安定性は、多数の方式でアッセイされうる。例えば、ペプチダーゼ、並びにヒト血漿及びヒト血清など、多様な生物学的培地が、安定性を調べるのに使用されている。例えば、Ｖｅｒｈｏｅｆら、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｄｒｕｇ  Ｍｅｔａｂ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ、１１：２９１（１９８６）を参照されたい。本明細書で記載されるペプチドの半減期は、２５％ヒト血清（ｖ／ｖ）アッセイを使用して、簡便に決定される。プロトコールは、以下の通りである：プールされたヒト血清（ＡＢ型、非加熱不活化させた）を、使用の前に、遠心分離により脱脂する。次いで、血清を、ＲＰＭＩ−１６４０又は別の適切な組織培養培地で、２５％へと希釈する。所定の時間間隔で、小量の反応溶液を除去し、６％の水性トリクロロ酢酸（ＴＣＡ）又はエタノールへと添加する。混濁した反応試料を、１５分間冷却（４℃）し、次いで、スピニングして、沈殿した血清タンパク質をペレット化させる。次いで、安定性特異的クロマトグラフィー条件を使用して、逆相ＨＰＬＣにより、ペプチドの存在を決定する。
【０２５１】
[0330]一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、溶液形態の場合もあり、凍結乾燥形態の場合もあり、結晶形態の場合もある。
[0331]一部の実施形態では、本明細書で記載される抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、合成により、組換えＤＮＡ技術により、又は化学合成により調製される場合もあり、天然腫瘍又は病原性生物など、天然供給源から単離される場合もある。エピトープは、個別に合成される場合もあり、ペプチド内で、直接的に、又は間接的に接続される場合もある。本明細書で記載される抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、他の天然に存在する宿主細胞タンパク質、及びこれらの断片を実質的に含有しないが、一部の実施形態では、ペプチドは、天然の断片又は粒子へと接続されるように、合成によりコンジュゲートされうる。
【０２５２】
[0332]一部の実施形態では、ペプチドは、従来の技法に従い、溶液中又は固体支持体上で合成されうる。多様な自動式合成器が市販されており、公知のプロトコールに従い使用されうる（例えば、Ｓｔｅｗａｒｔ及びＹｏｕｎｇ、「Ｓｏｌｉｄ  Ｐｈａｓｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅ  Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ」、２版、Ｐｉｅｒｃｅ  Ｃｈｅｍｉｃａｌ  Ｃｏ．、１９８４を参照されたい）。さらに、個別のペプチドは、やはり本発明の範囲内にある、大型のペプチドをもたらすように、化学的ライゲーションを使用して接続されうる。
【０２５３】
[0333]代替的に、ペプチドをコードするヌクレオチド配列が、発現ベクターへと挿入され、適切な宿主細胞へと、形質転換又はトランスフェクトされ、発現に適する条件下で培養される、組換えＤＮＡ技術も用いられうる。当該技術分野では、これらの手順は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、「Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ」、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．（１９８９）において一般に記載されている通り、一般に公知である。したがって、本明細書で記載される、１以上のエピトープを含むか、又はこれらから成る組換えペプチドは、適切なＴ細胞エピトープを提示するのに使用されうる。
【０２５４】
[0334]１つの態様では、本明細書で記載される本開示はまた、１つであるか、少なくとも２つであるか、又は２つを超える抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドを含む組成物も提示する。一部の実施形態では、本明細書で記載される組成物は、少なくとも２つの、顕著に異なるペプチドを含有する。一部の実施形態では、少なくとも２つの、顕著に異なるペプチドは、同じポリペプチドに由来する。顕著に異なるポリペプチドとは、ペプチドが、長さ、アミノ酸配列、又はこれらの両方により変動することを意味する。ペプチドは、腫瘍特異的突然変異を含有することが公知であるか、又は見出されている、任意のポリペプチドに由来する。一部の実施形態では、単離された抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドは、天然ペプチドのアミノ酸置換を結果としてもたらす、点突然変異を伴う遺伝子によりコードされる。
医薬組成物
[0335]医薬組成物は、活性薬剤の、薬学的に使用されうる調製物への加工を容易とする、賦形剤及び補助剤を含む、１以上の生理学的に許容される担体を使用して製剤化されうる。適正な製剤は、選び出された投与経路に依存しうる。周知の技法、キャリア、及び賦形剤のうちのいずれかは、適宜、かつ、当該技術分野で理解される通りに使用されうる。
【０２５５】
[0336]場合によって、医薬組成物は、細胞ベースの治療剤、例えば、Ｔ細胞療法剤として製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、ペプチドベースの治療、核酸ベースの治療、抗体ベースの治療、及び／又は細胞ベースの治療を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、ペプチドベースの治療剤、又は核酸がポリペプチドをコードする、核酸ベースの治療剤を含む。一部の実施形態では、医薬組成物は、抗体ベースの治療剤を含む。組成物は、２つ以上の免疫原性の抗原ペプチド又はネオ抗原ペプチドに特異的なＴ細胞を含みうる。
【０２５６】
[0337]医薬組成物は、有効成分に加えて、薬学的に許容される賦形剤、担体、緩衝液、安定化剤、又は当業者に周知の他の材料を含みうる。このような材料は、非毒性であるべきであり、有効成分の有効性に干渉するべきではない。担体又は他の材料の正確な性質は、投与経路に依存するであろう。
【０２５７】
[0338]許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、用いられる投与量及び濃度で、レシピエントに非毒性の担体、賦形剤、又は安定化剤であり、リン酸、クエン酸、及び他の有機酸などの緩衝液；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；メチルパラベン又はプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルチノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；及びｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシンなどのアミノ酸；単糖、二糖、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む、他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、又はソルビトールなどの糖；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；及び／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）、若しくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの、非イオン性界面活性剤を含む。
【０２５８】
[0339]許容可能な担体は、投与される患者に、生理学的に許容され、許容可能な担体が投与される化合物の治療的特性を保持する。許容可能な担体及びそれらの製剤については、一般に、例えば、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」（１８版、Ａ．Ｇｅｎｎａｒｏ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ  １９９０）において記載されている。担体の１つの例は、生理食塩液である。薬学的に許容される担体とは、対象化合物を、投与部位体内の１つの臓器若しくは部分から、体内の別の臓器若しくは部分へと運ぶか、若しくは輸送することに関与するか、又はｉｎ  ｖｉｔｒｏのアッセイ系における、液体又は固体の充填剤、希釈剤、賦形剤、溶媒、又は封入材料など、薬学的に許容される材料、組成物、又は媒体である。許容可能な担体は、製剤の他の成分と適合性であり、投与される対象に対して傷害性ではない。また、許容可能な担体は、ネオ抗原の特異的活性を変更すべきでもない。
【０２５９】
[0340]本明細書の１つの態様では、医薬の投与と適合性の、溶媒（水性又は非水性）、溶液、エマルジョン、分散培、コーティング、等張剤、吸収促進剤、又は吸収遅延剤を含む、薬学的に許容されるか、又は生理学的に許容される組成物が提示される。したがって、医薬組成物又は医薬製剤とは、対象における医薬の使用に適する組成物を指す。組成物は、特定の投与経路（すなわち、全身経路又は局所経路）と適合性であるように製剤化されうる。したがって、組成物は、多様な経路による投与に適する、担体、希釈剤、又は賦形剤を含む。
【０２６０】
[0341]一部の実施形態では、組成物は、組成物中の免疫細胞の安定性を改善するための、許容可能な添加剤をさらに含みうる。許容可能な添加剤は、免疫細胞の特異的活性を変更しえない。許容可能な添加剤の例は、マンニトール、ソルビトール、グルコース、キシリトール、トレハロース、ソルボース、スクロース、ガラクトース、デキストラン、デキストロース、果糖、ラクトース、及びこれらの混合物などの糖を含むがこれらに限定されない。許容可能な添加剤は、デキストロースなど、許容可能な担体及び／又は賦形剤と組み合わされうる。代替的に、許容可能な添加剤の例は、ペプチドの安定性を増大させ、溶液のゲル化を減少させる、ポリソルベート２０又はポリソルベート８０などの界面活性剤を含むがこれらに限定されない。界面活性剤は、溶液のうちの０．０１％〜５％の量で、組成物へと添加されうる。このような許容可能な添加剤の添加は、保管における、組成物の安定性及び半減期を増大させる。
【０２６１】
[0342]医薬組成物は、例えば、注射により投与されうる。注射用の組成物は、水溶液（水溶性の場合）又は分散液、及び滅菌注射用溶液又は滅菌注射用分散液を即席で調製するための滅菌粉末を含む。静脈内投与のために、適切な担体は、生理食塩液、静菌水、又はリン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）を含む。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコールなど）、及びこれらの適切な混合物を含有する、溶媒又は分散培でありうる。流体性は、例えば、レシチンなどのコーティングを使用することにより、分散液の場合には、要求される粒子サイズを維持することにより、かつ、界面活性剤を使用することにより維持されうる。抗菌剤及び抗真菌剤は、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、及びチメロサールを含む。等張剤、例えば、糖、マンニトール、ソルビトールなどのポリアルコール、及び塩化ナトリウムは、組成物中に含まれうる。結果として得られる溶液は、そのままの使用のためにパッケージングされる場合もあり、凍結乾燥される場合もあり；凍結乾燥された調製物は、その後、投与の前に、滅菌溶液と組み合わされうる。静脈内注射、又は罹患部位における注射のために、有効成分は、発熱物質非含有であり、適切なｐＨ、等張性、及び安定性を有する、非経口的に許容可能な水性溶液の形態となろう。当業者は、例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性媒体を使用して、適切な溶液を調製することが十分に可能である。保存剤、安定化剤、緩衝液、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤は、必要に応じて含まれうる。滅菌注射用溶液は、有効成分を、適切な溶媒中に、要求に応じて、上記で列挙された成分の１つ又は組合せと共に、要求された量で組み込むことに続き、濾過滅菌を行うことにより調製されうる。一般に、分散液は、有効成分を、基礎分散培、及び上記で列挙された成分に由来する、要求される他の成分を含有する滅菌媒体へと組み込むことにより調製される。滅菌注射用溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製法は、既に滅菌濾過されたこの溶液に由来する、有効成分に、任意のさらなる所望の成分を加えた粉末をもたらす、真空乾燥及び凍結乾燥でありうる。
【０２６２】
[0343]組成物は、例えば、単位用量の注射によるなど、従来式に静脈内投与されうる。注射のために、有効成分は、実質的に発熱物質非含有であり、適切なｐＨ、等張性、及び安定性を有する、非経口的に許容可能な水性溶液の形態でありうる。例えば、塩化ナトリウム注射液、リンゲル注射液、乳酸加リンゲル注射液などの等張性媒体を使用して、適切な溶液を調製することができる。保存剤、安定化剤、緩衝液、抗酸化剤、及び／又は他の添加剤は、要求に応じて含まれうる。加えて、組成物は、エアゾール化を介して投与されうる。
【０２６３】
[0344]組成物が、医薬又は本明細書で提示される方法のうちのいずれかにおける使用のために検討される場合、組成物は、組成物が、ヒト患者へと投与される場合に、炎症性反応又は安全でないアレルギー反応を引き起こさないように、発熱物質を、実質的に含有しない場合があることが想定される。当業者には、組成物を、発熱物質について検査し、発熱物質を実質的に含有しない組成物を調製することが十分に理解されており、市販のキットを使用して達せられうる。
【０２６４】
[0345]許容可能な担体は、吸収を安定化、増大、若しくは遅延させるか、又はクリアランスを増大若しくは遅延させる化合物を含有しうる。このような化合物は、例えば、グルコース、スクロース、若しくはデキストランなどの炭水化物；低分子的重量タンパク質；ペプチドのクリアランス若しくは加水分解を低減する組成物；又は賦形剤若しくは他の安定化剤及び／若しくは緩衝液を含む。吸収を遅延させる薬剤は、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを含む。デタージェントもまた、リポソーム性担体を含む医薬組成物の吸収を、安定化又は増大又は減少させるのに使用されうる。消化から保護するために、化合物を、酸及び酵素による加水分解に対してそれを耐性とする組成物と複合体化させる場合もあり、リポソームなど、適切に耐性の担体内に複合体化させる場合もある。当該技術分野では、化合物を、消化から保護する手段が公知である（例えば、Ｆｉｘ（１９９６）、Ｐｈａｒｍ  Ｒｅｓ．、１３：１７６０１７６４；Ｓａｍａｎｅｎ（１９９６）、Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、４８：１１９１３５；及び米国特許第５，３９１，３７７号）。
【０２６５】
[0346]組成物は、剤形（dosage formulation）と適合性の方式の、治療有効量で投与されうる。投与される数量は、処置される対象、対象の免疫系が有効成分を利用する能力、及び所望される結合能の程度に依存する。投与されることが要求される有効成分の正確な量は、医療従事者の判断に依存し、各個体に特有である。初期投与及び追加投与に適するレジメもまた、可変的であるが、初期投与に続く、その後の注射又は他の投与による、１時間又は複数時間間隔の反復投与を典型とする。代替的に、血中濃度を維持するのに十分な、連続的静脈内注入も想定される。
【０２６６】
[0347]一部の実施形態では、本発明は、免疫原性組成物、例えば、ネオ抗原特異的応答（例えば、体液性又は細胞媒介性免疫応答）を惹起することが可能な医薬組成物を対象とする。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、腫瘍特異的抗原又は腫瘍特異的ネオ抗原に対応する、本明細書で記載されるネオ抗原治療剤（例えば、ペプチド、ポリヌクレオチド、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲを含有する細胞、ポリペプチドを含有する樹状細胞、ポリヌクレオチドを含有する樹状細胞、抗体など）を含む。
【０２６７】
[0348]一部の実施形態では、本明細書で記載される医薬組成物は、特異的細胞傷害性Ｔ細胞応答、特異的ヘルパーＴ細胞応答、又はＢ細胞応答を惹起することが可能である。
[0349]一部の実施形態では、抗原のポリペプチド又はポリヌクレオチドは、このようなポリペプチド又はポリヌクレオチドを含有する抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）として提示されうる。他の実施形態では、このような抗原提示細胞は、患者における使用のためのＴ細胞を刺激するのに使用される。一部の実施形態では、抗原提示細胞は、樹状細胞である。関連する実施形態では、樹状細胞は、ネオ抗原のペプチド又は核酸によりパルスされた、自家樹状細胞である。ネオ抗原ペプチドは、適切なＴ細胞応答をもたらす、任意の適切なペプチドでありうる。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＴＬである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＨＴＬである。したがって、本開示の１つの実施形態は、本明細書で記載される、１以上のネオ抗原のポリペプチド又はポリヌクレオチドでパルスされるか、又はこれらをロードされた、少なくとも１つの抗原提示細胞（例えば、樹状細胞）を含有する免疫原性組成物である。一部の実施形態では、このようなＡＰＣは、自家（例えば、自家樹状細胞）である。代替的に、患者から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、ネオ抗原のペプチド又はポリヌクレオチドをロードされうる。関連する実施形態では、このようなＡＰＣ又はＰＢＭＣは、患者へと、注入し戻される。ポリヌクレオチドは、樹状細胞への形質導入を生じることが可能であり、これにより、ネオ抗原ペプチドの提示、及び免疫の誘導を結果としてもたらす、任意の適切なポリヌクレオチドでありうる。一部の実施形態では、このような抗原提示細胞（ＡＰＣ）（例えば、樹状細胞）又は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）は、Ｔ細胞（例えば、自家Ｔ細胞）を刺激するのに使用される。関連する実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＴＬである。他の関連する実施形態では、Ｔ細胞は、ＨＴＬである。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ８＋Ｔ細胞である。一部の実施形態では、Ｔ細胞は、ＣＤ４＋Ｔ細胞である。次いで、このようなＴ細胞は、患者へと注入される。一部の実施形態では、ＣＴＬは、患者へと注入される。一部の実施形態では、ＨＴＬは、患者へと注入される。一部の実施形態では、ＣＴＬ及びＨＴＬのいずれも、患者へと注入される。いずれかの治療剤の投与は、同時に実施される場合もあり、任意の順序で、逐次的に実施される場合もある。
【０２６８】
[0350]一部の実施形態では、治療的処置のための、本明細書で記載される医薬組成物（例えば、免疫原性組成物）は、非経口投与、外用投与、経鼻投与、経口投与、又は局所投与のために製剤化されうる。一部の実施形態では、本明細書で記載される医薬組成物は、非経口投与、例えば、静脈内投与、皮下投与、皮内投与、又は筋内投与される。一部の実施形態では、組成物は、腫瘍内投与されうる。組成物は、腫瘍に対する局所免疫応答を誘導するように、手術による切開部位に投与されうる。本明細書の一部の実施形態では、ネオ抗原ペプチドの溶液を含む、非経口投与の組成物について記載されるが、免疫原性組成物は、許容可能な担体中、例えば、水性担体中に、溶解又は懸濁される。例えば、水、緩衝水、０．９％の生理食塩液、０．３％のグリシン、ヒアルロン酸など、様々な水性担体が使用されうる。これらの組成物は、従来型の、周知の滅菌法により滅菌される場合もあり、滅菌濾過される場合もある。結果として得られる水溶液は、そのままの使用のためにパッケージングされる場合もあり、凍結乾燥される場合もあり；凍結乾燥された調製物は、その後、投与の前に、滅菌溶液と組み合わされうる。組成物は、要求に応じて、ｐＨを調整／緩衝剤、等張性調整剤、例えば、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、モノラウリン酸ソルビタン、オレイン酸トリエタノールアミンなどの保湿剤などなど、生理学的状態を近似する、薬学的に許容される補助物質を含有しうる。
【０２６９】
[0351]アジュバントが、抗原に対する免疫応答を増大させる能力は、免疫媒介性反応の著明な増大、又は疾患症状の軽減により、典型的に顕示される。例えば、液性免疫の増大は、抗原に対して惹起される抗体の力価の著明な増大により顕示される場合があり、Ｔ細胞活性の増大は、細胞増殖、又は細胞性細胞傷害作用、又はサイトカイン分泌の増大により顕示されうる。アジュバントはまた、例えば、主に、体液性応答又はＴヘルパー２応答を、主に、細胞性応答又はＴヘルパー１応答へと変化させることによっても免疫応答を変更しうる。
【０２７０】
[0352]当該技術分野では、適切なアジュバントが公知であり（ＷＯ２０１５／０９５８１１を参照されたい）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）、ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣ、ＳＴＩＮＧアゴニスト、１０１８  ＩＳＳ、アルミニウム塩、Ａｍｐｌｉｖａｘ、ＡＳ１５、ＢＣＧ、ＣＰ−８７０，８９３、ＣｐＧ７９０９、ＣｙａＡ、ｄＳＬＩＭ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＣ３０、ＩＣ３１、イミキモド、ＩｍｕＦａｃｔＩＭＰ３２１、ＩＳＰａｔｃｈ、ＩＳＳ、ＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ、ＪｕｖＩｍｍｕｎｅ、ＬｉｐｏＶａｃ、ＭＦ５９、モノホスホリルリピドＡ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＭＳ１３１２、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ２０６、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ５０Ｖ、Ｍｏｎｔａｎｉｄｅ  ＩＳＡ−５１、ＯＫ−４３２、ＯＭ−１７４、ＯＭ−１９７−ＭＰ−ＥＣ、ＯＮＴＡＫ、ＰｅｐＴｅｌ（登録商標）ベクターシステム、ＰＬＧマイクロ粒子、レシキモド、ＳＲＬ１７２、ウィロソーム及び他のウイルス様粒子、ＹＦ−１７Ｄ、ＶＥＧＦ  ｔｒａｐ、Ｒ８４８、β−グルカン、Ｐａｍ３Ｃｙｓ、Ｐａｍ３ＣＳＫ４、サポニン、マイコバクテリア抽出物、及び合成の細菌細胞壁模倣体に由来する、Ａｑｕｉｌａ製のＱＳ２１スチムロン（Ａｑｕｉｌａ  Ｂｉｏｔｅｃｈ、米国マサチューセッツ州ウースター）、並びにＲｉｂｉ製のＤｅｔｏｘ．Ｑｕｉｌ又はＳｕｐｅｒｆｏｓなど、他の特許権のあるアジュバントを含むがこれらに限定されない。樹状細胞に特異的な、いくつかの免疫学的アジュバント（例えば、ＭＦ５９）、及びそれらの調製について記載されている（Ｄｕｐｕｉｓ  Ｍら、Ｃｅｌｌ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９８；１８６（１）：１８〜２７；Ａｌｌｉｓｏｎ  Ａ  Ｃ、Ｄｅｖ  Ｂｉｏｌ  Ｓｔａｎｄ．、１９９８；９２：３〜１１）（Ｍｏｓｃａら、Ｆｒｏｎｔｉｅｒｓ  ｉｎ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、２００７；１２：４０５０〜４０６０）（Ｇａｍｖｒｅｌｌｉｓら、Ｉｍｍｕｎｏｌ  ＆  Ｃｅｌｌ  Ｂｉｏｌ．、２００４；８２：５０６〜５１６）。サイトカインもまた、使用することができる。いくつかのサイトカインは、樹状細胞の、リンパ系組織への遊走に影響を及ぼすこと（例えば、ＴＮＦ−α）、樹状細胞の、Ｔリンパ球に対する効率的な抗原提示細胞への成熟を加速化させること（例えば、ＧＭ−ＣＳＦ、ＰＧＥ１、ＰＧＥ２、ＩＬ−１、ＩＬ−１β、ＩＬ−４、ＩＬ−６、及びＣＤ４０Ｌ）（参照によりその全体において本明細書に組み込まれる、米国特許第５，８４９，５８９号）、及び免疫アジュバントとして作用すること（例えば、ＩＬ−１２）（Ｇａｂｒｉｌｏｖｉｃｈ  ＤＩら、Ｊ  Ｉｍｍｕｎｏｔｈｅｒ  Ｅｍｐｈａｓｉｓ  Ｔｕｍｏｒ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１９９６（６）：４１４〜４１８）と直接連関している。
【０２７１】
[0353]ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドもまた、治療状況において、アジュバントの効果を増強することが報告されている。理論により束縛されることを望まずに述べると、ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、主に、ＴＬＲ９を介して、生得（非獲得）免疫系を活性化させることにより作用する。ＣｐＧにより誘発されたＴＬＲ９の活性化は、ペプチド又はタンパク質抗原、生存ウイルス又は死滅ウイルス、樹状細胞性免疫原性医薬組成物、自家細胞性免疫原性医薬組成物、並びに予防的免疫原性医薬組成物及び治療的免疫原性医薬組成物の両方における多糖コンジュゲートを含む、多種多様な抗原に対する、抗原特異的な体液性応答及び細胞性応答を増強する。ＣｐＧ免疫刺激性オリゴヌクレオチドは、樹状細胞の成熟及び分化を増強する結果として、ＣＤ４＋Ｔ細胞による支援の非存在下であってもなお、ＴＨ１細胞の活性化、及び強力な細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）の発生の増強をもたらすことが重要である。ＴＬＲ９刺激により誘導されるＴＨ１バイアスは、通常、ＴＨ２バイアスを促進する、アラム又は不完全フロイントアジュバント（ＩＦＡ）などのアジュバントの存在下であってもなお維持される。ＣｐＧオリゴヌクレオチドは、他のアジュバントと共に、又はマイクロ粒子、ナノ粒子、脂質エマルジョンなどの製剤中、若しくはとりわけ、抗原が、比較的弱い場合に、強力な応答を誘導するために有用な、同様の製剤中で、製剤化又は共投与される場合に、なおより大きなアジュバント活性を示す。ＣｐＧオリゴヌクレオチドはまた、免疫応答を加速化させることも可能であり、一部の実験では、ＣｐＧを伴わない、全用量の免疫原性医薬組成物と同等な抗体応答をもたらしながら、抗原用量が低減されることを可能とした（Ａｒｔｈｕｒ  Ｍ．Ｋｒｉｅｇ、Ｎａｔｕｒｅ  Ｒｅｖｉｅｗｓ、Ｄｒｕｇ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ、２００６年６月５日、４７１〜４８４）。米国特許第６，４０６，７０５号は、抗原特異的免疫応答を誘導する、ＣｐＧオリゴヌクレオチド、非核酸アジュバント、及び抗原の組合せ使用について記載する。市販のＣｐＧ  ＴＬＲ９アンタゴニストは、本明細書で記載される医薬組成物の成分である、Ｍｏｌｏｇｅｎ（ドイツ、ベルリン）製のｄＳＬＩＭ（double Stem Loop Immunomodulator）である。ＲＮＡ結合性のＴＬＲ７、ＴＬＲ８、及び／又はＴＬＲ９など、他のＴＬＲ結合分子もまた、使用されうる。
【０２７２】
[0354]有用なアジュバントの他の例は、治療的に作用する場合もあり、かつ／又はアジュバントとして作用する場合もある、シクロホスファミド、スニチニブ、ベバシズマブ、セレブレクス、ＮＣＸ−４０１６、シルデナフィル、タダラフィル、バルデナフィル、ソラフェニブ、ＸＬ−９９９、ＣＰ−５４７６３２、パゾパニブ、ＺＤ２１７１、ＡＺＤ２１７１、イピリムマブ、トレメリムマブ、及びＳＣ５８１７５など、化学修飾されたＣｐＧ（例えば、ＣｐＲ、Ｉｄｅｒａ）、ｐｏｌｙ（Ｉ：Ｃ）（例えば、ｐｏｌｙＩ：ＣＩ２Ｕ）、非ＣｐＧ細菌性ＤＮＡ又は非ＣｐＧ細菌性ＲＮＡ、ＴＬＲ８に対するｓｓＲＮＡ４０のほか、免疫作用性小分子、及び抗体を含むがこれらに限定されない。本発明の文脈で有用な、アジュバント及び添加剤の、量及び濃度は、不要な実験を伴わずに、当業者により、たやすく決定されうる。さらなるアジュバントは、顆粒球マクロファージコロニー因子（ＧＭ−ＣＳＦ、サルグラモスチム）などのコロニー刺激因子を含む。
【０２７３】
[0355]一部の実施形態では、本開示に従う免疫原性組成物は、１つを超える、異なるアジュバントを含みうる。さらに、本発明は、上記のうちのいずれか又はこれらの組合せを含む、任意のアジュバント物質を含む医薬組成物を包含する。一部の実施形態では、免疫原性組成物は、ネオ抗原治療剤（例えば、ペプチド、ポリヌクレオチド、ＴＣＲ、ＣＡＲ、ＴＣＲ又はＣＡＲを含有する細胞、ポリペプチドを含有する樹状細胞、ポリヌクレオチドを含有する樹状細胞、抗体など）を含み、アジュバントは、個別に、任意の適切な順序で投与されうる。
【０２７４】
[0356]脂質化は、Ｎ−ミリストイル化、パルミトイル化、ＧＰＩアンカー付加、プレニル化、及びいくつかのさらなる種類の改変など、いくつかの異なる種類へと分類されうる。Ｎ−ミリストイル化とは、Ｃ１４飽和酸であるミリスチン酸の、グリシン残基への共有結合的接合である。パルミトイル化とは、長鎖脂肪酸（Ｃ１６）の、システイン残基へのチオエステル連結である。ＧＰＩアンカー付加とは、アミド結合を介する、グリコシルホスファチジルイノシトール（ＧＰＩ）連結である。プレニル化とは、イソプレノイド脂質（例えば、ファルネシル（Ｃ１５）、ゲラニルゲラニル（Ｃ２０））の、システイン残基へのチオエーテル連結である。さらなる種類の改変は、システインの硫黄原子による、Ｓ−ジアシルグリセロールの接合、セリン残基又はトレオニン残基を介するＯ−オクタノイルコンジュゲーション、システイン残基へのＳ−アルケオールコンジュゲーション、及びコレステロール接合を含みうる。
【０２７５】
[0357]脂質化ペプチドを作出するための脂肪酸は、Ｃ２〜Ｃ３０飽和脂肪酸アシル基、モノ不飽和脂肪酸アシル基、又はポリ不飽和脂肪酸アシル基を含みうる。例示的な脂肪酸は、パルミトイル基、ミリストイル基、ステアロイル基、及びデカノイル基を含みうる。一部の場合に、アジュバント特性を有する脂質部分は、外因性アジュバントの非存在下で、免疫原性を誘発又は増強するように、目的のポリペプチドへと接合される。脂質化ペプチド又はリポペプチドは、自己アジュバントリポペプチドと称されうる。上記及び本明細書の別の箇所に記載された脂肪酸のうちのいずれかは、目的のポリペプチドの免疫原性を誘発又は増強しうる。免疫原性を誘発又は増強しうる脂肪酸は、パルミトイル基、ミリストイル基、ステアロイル基、ラウロイル基、オクタノイル基、及びデカノイル基を含みうる。
【０２７６】
[0358]ネイキッドペプチド又は脂質化ペプチドなどのポリペプチドは、リポソームへと組み込まれうる。場合によって、脂質化ペプチドは、リポソームへと組み込まれうる。例えば、脂質化ペプチドの脂質部分は、リポソームの脂質２重層へと自発的に組み込まれうる。したがって、リポペプチドは、リポソームの「表面」上に提示されうる。製剤中の組込みに適する、例示的なリポソームは、マルチラメラベシクル（ＭＬＶ）、オリゴラメラベシクル（ＯＬＶ）、ユニラメラベシクル（ＵＶ）、小型ユニラメラベシクル（ＳＵＶ）、中型サイズユニラメラベシクル（ＭＵＶ）、大型ユニラメラベシクル（ＬＵＶ）、超大型ユニラメラベシクル（ＧＵＶ）、多胞ベシクル（ＭＶＶ）、逆相蒸発法（ＲＥＶ）により作られる、単一ベシクル又はオリゴラメラベシクル、逆相蒸発法により作られる、マルチラメラベシクル（ＭＬＶ−ＲＥＶ）、安定型プルリラメラベシクル（ＳＰＬＶ）、凍結融解ＭＬＶ（ＦＡＴＭＬＶ）、押出し法により調製されるベシクル（ＶＥＴ）、フレンチプレスにより調製されるベシクル（ＦＰＶ）、融合により調製されるベシクル（ＦＵＶ）、脱水−再水和ベシクル（ＤＲＶ）、及び気泡性ベシクル（ＢＳＶ）を含むがこれらに限定されない。
【０２７７】
[0359]調製法に応じて、リポソームは、ユニラメラの場合もあり、マルチラメラの場合もあり、約０．０２μｍ〜約１０μｍを超える範囲の直径で、サイズが変動しうる。リポソームは、多くの種類の細胞に吸着し、次いで、組み込まれた薬剤（例えば、本明細書で記載されるペプチド）を放出しうる。場合によって、リポソームは、標的細胞と融合し、次いで、これにより、リポソームの内容物を、標的細胞へと空ける。リポソームは、食作用性である細胞によりエンドサイトーシスされうる。エンドサイトーシスに続き、リポソーム性脂質の、リポソーム内分解、及び封入された薬剤の放出がなされうる。
【０２７８】
[0360]本明細書で提示されるリポソームはまた、担体脂質も含みうる。一部の実施形態では、担体脂質は、リン脂質である。リポソームを形成することが可能な担体脂質は、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ）、ホスファチジルコリン（ＰＣ；レシチン）、ホスファチジン酸（ＰＡ）、ホスファチジルグリセロール（ＰＧ）、ホスファチジルエタノールアミン（ＰＥ）、ホスファチジルセリン（ＰＳ）を含むがこれらに限定されない。他の適切なリン脂質は、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、ジミリストイルホスファチジルコリン（ＤＭＰＣ）、ジパルミトイルホスファチジルグリセロール（ＤＰＰＧ）、ジステアロイルホスファチジルグリセロール（ＤＳＰＧ）、ジミリストイルホスファチジルグリセロール（ＤＭＰＧ）、ジパルミトイルホスファチジン酸（ＤＰＰＡ）；ジミリストイルホスファチジン酸（ＤＭＰＡ）、ジステアロイルホスファチジン酸（ＤＳＰＡ）、ジパルミトイルホスファチジルセリン（ＤＰＰＳ）、ジミリストイルホスファチジルセリン（ＤＭＰＳ）、ジステアロイルホスファチジルセリン（ＤＳＰＳ）、ジパルミトイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＰＰＥ）、ジミリストイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＭＰＥ）、ジステアロイルホスファチジルエタノールアミン（ＤＳＰＥ）など、又はこれらの組合せをさらに含む。一部の実施形態では、リポソームは、リポソームの形成をモジュレートするステロール（例えば、コレステロール）をさらに含む。担体脂質は、任意の公知の非リン酸極性脂質でありうる。
【０２７９】
[0361]医薬組成物は、周知の技術を使用して、リポソーム内に封入されうる。生体分解性マイクロスフェアもまた、本発明の医薬組成物のための担体として用いられうる。
[0362]医薬組成物は、リポソーム又はマイクロスフェア（又はマイクロ粒子）により投与されうる。患者への投与のためのリポソーム及びマイクロスフェアを調製するための方法は、当業者に周知である。本質的に、材料は、水溶液中に溶解させ、要求される場合、界面活性剤と共に、適切なリン脂質及び脂質を添加され、必要に応じて、材料は、透析又は超音波処理する。
【０２８０】
[0363]当業者には、ポリマー又はタンパク質から形成されたマイクロスフェアが周知であり、消化管を介する、血流への、直接の通過のために調整されうる。代替的に、数日間〜数カ月間の範囲の期間にわたる徐放のために、化合物が組み込まれ、マイクロスフェア、又はマイクロスフェアの複合材料が植え込まれる場合がある。
【０２８１】
[0364]細胞ベースの免疫原性医薬組成物もまた、対象へと投与されうる。例えば、抗原提示細胞（ＡＰＣ）ベースの免疫原性医薬組成物は、当該技術分野で適する、周知の技法、担体、及び賦形剤のうちのいずれかを使用して、当該技術分野で理解される通りに製剤化されうる。ＡＰＣは、単球、単球由来細胞、マクロファージ、及び樹状細胞を含む。場合によって、ＡＰＣベースの免疫原性医薬組成物は、樹状細胞ベースの免疫原性医薬組成物でありうる。
【０２８２】
[0365]樹状細胞ベースの免疫原性医薬組成物は、当該技術分野で周知の任意の方法により調製されうる。場合によって、樹状細胞ベースの免疫原性医薬組成物は、ｅｘ  ｖｉｖｏ法又はｉｎ  ｖｉｖｏ法を介して調製されうる。ｅｘ  ｖｉｖｏ法は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて、本明細書で記載されるポリペプチドによりパルスされた、自家ＤＣの使用であって、患者への投与の前に、ＤＣを活性化させるか、又はＤＣにロードするための使用を含みうる。ｉｎ  ｖｉｖｏ法は、本明細書で記載されるポリペプチドとカップリングさせた抗体を使用して、特異的ＤＣ受容体を標的とすることを含みうる。ＤＣベースの免疫原性医薬組成物は、ＴＬＲ３アゴニスト、ＴＬＲ−７〜８アゴニスト、及びＣＤ４０アゴニストなどのＤＣ活性化因子をさらに含みうる。ＤＣベースの免疫原性医薬組成物は、アジュバントと、薬学的に許容される担体とをさらに含みうる。
【０２８３】
[0366]アジュバントは、免疫原性医薬組成物を施される患者において誘発される、免疫応答（液性免疫応答及び／又は細胞性免疫応答）を増強するのに使用されうる。ある場合に、アジュバントは、Ｔｈ１型応答を誘発しうる。他の場合に、アジュバントは、Ｔｈ２型応答を誘発しうる。Ｔｈ１型応答は、ＩＬ−４、ＩＬ−５、及びＩＬ−１０など、サイトカインの産生により特徴づけられうる、Ｔｈ２型応答と対照的に、ＩＦＮ−γなど、サイトカインの産生により特徴づけられうる。
【０２８４】
[0367]一部の態様では、ＭＰＬＡ及びＭＤＰなど、脂質ベースのアジュバントは、本明細書で開示される免疫原性医薬組成物と共に使用されうる。モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）は、例えば、リポソーム性抗原の、特異的Ｔリンパ球への提示の増大を引き起こすアジュバントである。加えて、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）もまた、本明細書で記載される免疫原性医薬製剤と共に、適切なアジュバントとして使用されうる。
【０２８５】
[0368]アジュバントはまた、サイトカインなどの刺激性分子も含みうる。サイトカインの非限定例は、ＣＣＬ２０、α−インターフェロン（ＩＦＮα）、β−インターフェロン（ＩＦＮβ）、γ−インターフェロン（ＩＦＮγ）、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）、ＴＮＦα、ＧＭ−ＣＳＦ、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ＣＴＡＣＫ（cutaneous T cell-attracting chemokine）、ＴＥＣＫ（epithelial thymus-expressed chemokine）、ＭＥＣ（mucosae-associated epithelial chemokine）、ＩＬ−１２、ＩＬ−１５、ＩＬ−２８、ＭＨＣ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−１０、ＩＬ−１８、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲＳ、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰＫ、ＳＡＰ−Ｉ、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦκＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰＩ、及びＴＡＰ２を含む。
【０２８６】
[0369]さらなるアジュバントは、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｐ、ＩＬ−８、ＲＡＮＴＥＳ、Ｌ−セレクチン、Ｐ−セレクチン、Ｅ−セレクチン、ＣＤ３４、ＧｌｙＣＡＭ−１、ＭａｄＣＡＭ−１、ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−１、Ｍａｃ−１、ｐｌ５０．９５、ＰＥＣＡＭ、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＣＤ２、ＬＦＡ−３、Ｍ−ＣＳＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＩＬ−１８の突然変異体形態、ＣＤ４０、ＣＤ４０Ｌ、血管増殖因子、線維芽細胞増殖因子、ＩＬ−７、ＩＬ−２２、神経増殖因子、血管内皮増殖因子、Ｆａｓ、ＴＮＦ受容体、Ｆｉｔ、Ａｐｏ−１、ｐ５５、ＷＳＬ−１、ＤＲ３、ＴＲＡＭＰ、Ａｐｏ−３、ＡＩＲ、ＬＡＲＤ、ＮＧＲＦ、ＤＲ４、ＤＲ５、ＫＩＬＬＥＲ、ＴＲＡＩＬ−Ｒ２、ＴＲＩＣＫ２、ＤＲ６、カスパーゼＩＣＥ、Ｆｏｓ、ｃ−ｊｕｎ、Ｓｐ−１、Ａｐ−１、Ａｐ−２、ｐ３８、ｐ６５Ｒｅｌ、ＭｙＤ８８、ＩＲＡＫ、ＴＲＡＦ６、ＩκＢ、不活性ＮＩＫ、ＳＡＰ  Ｋ、ＳＡＰ−１、ＪＮＫ、インターフェロン応答遺伝子、ＮＦκＢ、Ｂａｘ、ＴＲＡＩＬ、ＴＲＡＩＬｒｅｃ、ＴＲＡＩＬｒｅｃＤＲＣ５、ＴＲＡＩＬ−Ｒ３、ＴＲＡＩＬ−Ｒ４、ＲＡＮＫ、ＲＡＮＫリガンド、Ｏｘ４０、Ｏｘ４０リガンド、ＮＫＧ２Ｄ、ＭＩＣＡ、ＭＩＣＢ、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｂ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｅ、ＮＫＧ２Ｆ、ＴＡＰ１、ＴＡＰ２、及びこれらの機能的断片を含む。
【０２８７】
[0370]一部の態様では、アジュバントは、ｔｏｌｌ様受容体のモジュレーターでありうる。ｔｏｌｌ様受容体のモジュレーターの例は、ＴＬＲ９アゴニストを含み、イミキモドなど、ｔｏｌｌ様受容体の小分子モジュレーターに限定されない。場合によって、アジュバントは、細菌毒素、ポリオキシプロピレン−ポリオキシエチレンブロックポリマー、アルミニウム塩、リポソーム、ＣｐＧポリマー、水中油エマルジョン、又はこれらの組合せから選択される。場合によって、アジュバントは、水中油エマルジョンである。水中油エマルジョンは、少なくとも１つの油と、少なくとも１つの界面活性剤とを含むことが可能であり、油及び界面活性剤は、生体分解性（代謝可能）かつ生体適合性である。エマルジョン中の油滴は、直径５μｍ未満であることがあり、さらに、ミクロン未満の直径を有することもあり、これらの小サイズは、安定的なエマルジョンをもたらす、マイクロフルイダイザーにより達成される。サイズが２２０ｎｍ未満の液滴は、濾過滅菌にかけられうる。
【０２８８】
[0371]一部の場合に、免疫原性医薬組成物は、担体及び賦形剤（緩衝液、炭水化物、マンニトール、タンパク質、ポリペプチド、又はグリシンなどのアミノ酸、抗酸化剤、静菌剤、キレート化剤、懸濁剤、増粘剤、及び／又は保存剤を含むがこれらに限定されない）、水、石油、動物油、植物油、又はラッカセイ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油など、合成由来の油を含む油、生理食塩液、水性デキストロース溶液及び水性グリセロール溶液、芳香剤、着色剤、粘着防止剤、及び他の許容可能な添加剤、アジュバント、又は結合剤、ｐＨ緩衝剤、等張性調整剤、乳化剤、保湿剤など、要求に応じて、生理学的状態を近似する、薬学的に許容される、他の補助物質を含みうる。賦形剤の例は、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、コムギ、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、滑石、塩化ナトリウム、脱脂粉乳、グリセロール、プロピレン、グリコール、水、エタノールなどを含む。別の場合に、医薬調製物は、保存剤を実質的に含有しない。他の場合に、医薬調製物は、少なくとも１つの保存剤を含有しうる。当業者に公知の、任意の適切な担体が、本明細書で記載される医薬組成物を投与するのに用いられうるが、担体の種類は、投与方式に応じて、変動することが認識されるであろう。
【０２８９】
[0372]免疫原性医薬組成物は、チオメルサール又は２−フェノキシエタノールなどの保存剤を含みうる。一部の場合に、免疫原性医薬組成物は、水銀性材料が実質的に非含有（例えば、＜１０μｇ／ｍＬ）である、例えば、チオメルサール非含有である。α−コハク酸トコフェロールは、水銀性化合物に対する代替物として使用されうる。
【０２９０】
[0373]等張性を制御するために、免疫原性医薬組成物中には、ナトリウム塩などの生理学的塩が含まれうる。他の塩は、塩化カリウム、リン酸二水素カリウム、リン酸二ナトリウム、及び／又は塩化マグネシウムなどを含みうる。
【０２９１】
[0374]免疫原性医薬組成物は、２００ｍＯｓｍ／ｋｇ〜４００ｍＯｓｍ／ｋｇの間、２４０〜３６０ｍＯｓｍ／ｋｇの間、又は２９０〜３１０ｍＯｓｍ／ｋｇの範囲内の浸透圧を有しうる。
【０２９２】
[0375]免疫原性医薬組成物は、トリス緩衝液；ホウ酸緩衝液；コハク酸緩衝液；ヒスチジン緩衝液（特に、水酸化アルミニウムアジュバント）；又はクエン酸緩衝液など、１以上の緩衝液を含みうる。場合によって、緩衝液は、５〜２０又は１０〜５０ｍＭの範囲で含まれる。
【０２９３】
[0376]免疫原性医薬組成物のｐＨは、約５．０〜約８．５の間、約６．０〜約８．０の間、約６．５〜約７．５の間、又は約７．０〜約７．８の間でありうる。
[0377]免疫原性医薬組成物は、滅菌でありうる。免疫原性医薬組成物は、例えば、投与１回当たり＜１ＥＵ（標準的な尺度である、内毒素単位）を含有する、非発熱物質性であってもよく、投与１回当たり＜０．１ＥＵでありうる。組成物は、グルテン非含有でありうる。
【０２９４】
[0378]免疫原性医薬組成物は、デタージェント、例えば、ポリオキシエチレンソルビタンエステル界面活性剤（「Ｔｗｅｅｎ」として公知である）、又はオクトキシノール（オクトキシノール９（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００）又はｔ−オクチルフェノキシポリエトキシエタノールなど）を含みうる。デタージェントは、微量でだけ存在しうる。免疫原性医薬組成物は、オクトキシノール１０及びポリソルベート８０の各々１ｍｇ／ｍＬ未満ずつを含みうる。他の微量残存成分は、抗生剤（例えば、ネオマイシン、カナマイシン、ポリミクシンＢ）でありうる。
【０２９５】
[0379]免疫原性医薬組成物は、当該技術分野で周知の、適切な媒体中の、滅菌溶液又は滅菌懸濁液として製剤化されうる。医薬組成物は、従来型の、周知の滅菌法により滅菌される場合もあり、滅菌濾過される場合もある。結果として得られる水溶液は、そのままの使用のためにパッケージングされる場合もあり、凍結乾燥される場合もあり；凍結乾燥された調製物は、その後、投与の前に、滅菌溶液と組み合わされうる。
【０２９６】
[0380]例えば、１以上のアジュバントと組み合わせた、本明細書で開示される免疫細胞などの活性薬剤を含む医薬組成物は、ある特定のモル比を含むように製剤化されうる。例えば、１以上のアジュバントと組み合わせた、本明細書で記載される免疫細胞などの活性薬剤の、約９９：１〜約１：９９のモル比が使用されうる。一部の場合に、１以上のアジュバントと組み合わせた、本明細書で記載される免疫細胞などの活性薬剤のモル比の範囲は、約８０：２０〜約２０：８０；約７５：２５〜約２５：７５、約７０：３０〜約３０：７０、約６６：３３〜約３３：６６、約６０：４０〜約４０：６０；約５０：５０；及び約９０：１０〜約１０：９０から選択されうる。１以上のアジュバントと組み合わせた、本明細書で記載される免疫細胞などの活性薬剤のモル比は、約１：９でありえ、場合によって、約１：１でありうる。１以上のアジュバントと組み合わせた、本明細書で記載される免疫細胞などの活性薬剤は、同じ投与量単位、例えば、１つのバイアル、坐剤、錠剤、カプセル、エアゾールスプレーに併せて製剤化される場合もあり、各薬剤、形態、及び／又は化合物は、個別の単位、例えば、２つのバイアル、坐剤、錠剤、２つのカプセル、錠剤、バイアル、エアゾールスプレーなどに製剤化されうる。
【０２９７】
[0381]一部の場合に、免疫原性医薬組成物は、さらなる薬剤と共に投与されうる。さらなる薬剤の選択は、少なくとも部分的に、処置される状態に依存しうる。さらなる薬剤は、例えば、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＤ４０、又は抗ＴＩＭ３薬剤（例えば、抗ＰＤ１、抗ＣＴＬＡ４、抗ＰＤ−Ｌ１、抗ＣＤ４０、又は抗ＴＩＭ３抗体）などのチェックポイント阻害剤；又は病原体感染（例えば、ウイルス感染）に対する治療効果を有する、任意の薬剤であって、例えば、ＮＳＡＩＤ、例えば、イブプロフェン、ナプロキセン、アセトアミノフェン、ケトプロフェン、又はアスピリンなど、炎症性状態を処置するのに使用される薬物を含む薬剤を含みうる。例えば、チェックポイント阻害剤は、ニボルマブ（ＯＮＯ−４５３８／ＢＭＳ−９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ）、ペンブロリズマブ（ＭＫ−３４７５、ＫＥＹＴＲＵＤＡ）、ピジリズマブ（ＣＴ−０１１）、及びＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）から成る群より選択されるＰＤ−１／ＰＤ−Ｌ１アンタゴニストでありうる。別の例として、製剤は、加えて、ビタミンＣ、Ｅ、又は他の抗酸化剤など、１以上のサプリメントを含有しうる。
【０２９８】
[0382]１以上のアジュバントと組み合わせた、本明細書で記載される免疫細胞などの活性薬剤を含む医薬組成物は、例えば、活性薬剤の、投与されうる調製物への加工を容易とする、賦形剤、希釈剤、及び／又は補助剤を含む、１以上の生理学的に許容される担体を使用して、従来の方式で製剤化されうる。適正な製剤は、少なくとも部分的に、選び出された投与経路に依存しうる。本明細書で記載される薬剤は、経口適用、口腔内適用、外用適用、直腸内適用、経皮適用、経粘膜適用、皮下適用、静脈内適用、及び筋内適用を含む、多数の投与経路又は投与方式を使用するほか、吸入により、患者へと送達されうる。
【０２９９】
[0383]活性薬剤は、非経口投与（例えば、注射、例えば、ボーラス注射又は連続的注入により）のために製剤化され、アンプル内の単位剤形、あらかじめ充填されたシリンジ、小体積注入、又は保存剤を添加した、複数回投与用容器により提供されうる。組成物は、懸濁液、溶液、又は油性媒体中若しくは水性媒体中のエマルジョン、例えば、水性ポリエチレングリコール中の溶液などの形態を取りうる。
【０３００】
[0384]注射用製剤のために、媒体は、当該技術分野で、適切であることが公知の媒体であって、水性溶液若しくは油懸濁液、又はゴマ油、トウモロコシ油、綿実油、若しくはラッカセイ油を伴うエマルジョンのほか、エリキシル、マンニトール、デキストロース、又は滅菌水性溶液、及び同様の医薬媒体を含む媒体から選択されうる。製剤はまた、ポリ（乳酸−ｃｏ−グリコール酸）など、生体適合性、生体分解性である、ポリマー組成物も含みうる。これらの材料は、薬物をロードされ、さらに優れた持続放出性能をもたらすように、コーティング又は誘導体化された、マイクロスフェア又はナノスフェアへと作られうる。眼周囲注射又は眼内注射に適する媒体は、例えば、治療剤の、注射グレード水中、リポソーム内、及び親油性物質に適する媒体中の懸濁液を含む。当該技術分野では、眼周囲注射又は眼内注射のための、他の媒体も周知である。
【０３０１】
[0385]一部の場合に、医薬組成物は、ヒトへの静脈内投与に適合させた医薬組成物として、規定の手順に従い製剤化される。典型的に、静脈内投与のための組成物は、滅菌等張性の水性緩衝液中の溶液である。必要な場合、組成物はまた、可溶化剤及び注射部位における疼痛を和らげる、リドカインなどの局所麻酔剤も含みうる。一般に、成分は、例えば、活性薬剤の数量を表示するアンプル又は小袋など、密封容器内の、凍結乾燥粉末又は無水濃縮物として、個別に、又は単位剤形内に併せて混合されて供給される。組成物が、注入により投与される場合、滅菌医薬グレード水又は生理食塩液を含有する注入ボトルにより分注されうる。組成物が、注射により投与される場合、成分が、投与の前に混合されうるように、注射用の滅菌水又は生理食塩液のアンプルが提供されうる。
【０３０２】
[0386]投与が、注射による場合、活性薬剤は、水溶液中、具体的には、ハンクス液、リンゲル液、又は生理食塩液緩衝液など、生理学的に適合性の緩衝液中で製剤化されうる。溶液は、懸濁剤、安定化剤、及び／又は分散剤などの製剤化剤を含有しうる。別の実施形態では、医薬組成物は、ペプチドにより刺激される免疫応答を増強するように添加される、アジュバント又は他の任意の物質を含まない。
【０３０３】
[0387]既に記載された製剤に加えて、活性薬剤はまた、デポ調製物としても製剤化されうる。このような長時間作用型製剤は、植込み若しくは経皮送達（例えば、皮下送達又は筋内送達）、筋内注射、又は経皮パッチの使用により投与されうる。したがって、例えば、薬剤は、適切なポリマー性材料若しくは疎水性材料（例えば、許容可能な油中のエマルジョンとして）若しくはイオン交換樹脂、又は難溶性の誘導体、例えば、難溶性の塩により製剤化されうる。
【０３０４】
[0388]場合によって、１以上の薬剤を含む医薬組成物は、特定の感染部位に、又はこの近傍に、外用投与又は注入されると、局所的効果及び領域的効果を及ぼす。例えば、粘性液体、溶液、懸濁液、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）ベースの溶液、リポソーム性製剤、ゲル、ゼリー、クリーム、ローション、軟膏、坐剤、フォーム、又はエアゾールスプレーの、直接的な外用適用は、例えば、局所的効果及び／又は領域的効果をもたらすように、局所投与のために使用されうる。このような製剤のための、薬学的に適切な媒体は、例えば、低級脂肪族アルコール、ポリグリコール（例えば、グリセロール又はポリエチレングリコール）、脂肪酸のエステル、油、脂肪、シリコーンなどを含む。このような調製物はまた、保存剤（例えば、ｐ−ヒドロキシ安息香酸エステル）及び／又は抗酸化剤（例えば、アスコルビン酸及びトコフェロール）も含みうる。また、「Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｉｃａｌ  Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎｓ：Ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ  Ａｂｓｏｒｐｔｉｏｎ」、Ｂａｒｒｙ（編）、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｋｋｅｒ  Ｉｎｃｌ、１９８３も参照されたい。別の実施形態では、トランスポーター、担体、又はイオンチャネル阻害剤を含む局所製剤／外用製剤は、表皮又は粘膜のウイルス感染を処置するのに使用される。
【０３０５】
[0389]医薬組成物は、親水性ゲル化剤又は親油性ゲル化剤、親水性活性薬剤又は親油性活性薬剤、保存剤、抗酸化剤、溶媒、芳香剤、充填剤、日焼け止め、消臭剤、及び色素などのアジュバントを含有しうる。これらの多様なアジュバントの量は、検討される分野において、従来使用された量であり、例えば、組成物の総重量のうちの、約０．０１％〜約２０％である。それらの性質に応じて、これらのアジュバントは、脂質相、水性相、及び／又は脂質ベシクルへと導入されうる。
処置方法
[0390]本明細書ではまた、疾患、障害、又は状態を伴う対象を処置する方法も提示される。処置方法は、本明細書で開示される組成物又は医薬組成物を、疾患、障害、又は状態を伴う対象へと投与することを含みうる。
【０３０６】
[0391]本開示は、免疫原性療法を含む処置方法を提示する。疾患（がん又はウイルス感染など）のための処置方法が提示される。方法は、本明細書で提示される方法に従い、対象へと、有効量の、抗原特異的免疫原性Ｔ細胞を含む組成物を投与することを含みうる。一部の実施形態では、抗原は、ウイルス抗原を含む。一部の実施形態では、抗原は、腫瘍抗原を含む。
【０３０７】
[0392]調製されうる治療剤の非限定例は、ペプチドベースの治療、核酸ベースの治療、抗体ベースの治療、Ｔ細胞ベースの治療、及び抗原提示細胞ベースの治療を含む。
[0393]本明細書の他の一部の態様では、治療に使用する医薬の製造のための、組成物又は医薬組成物の使用が提示される。一部の実施形態では、処置方法は、対象へ、免疫原性ネオ抗原ペプチドを特異的に認識する有効量のＴ細胞を投与することを含む。一部の実施形態では、処置方法は、対象へ、Ｔ細胞内で発現されるＴＣＲなど、免疫原性ネオ抗原ペプチドを特異的に認識する有効量のＴＣＲを投与することを含む。
【０３０８】
[0394]一部の実施形態では、がんは、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、白血病、扁平上皮細胞がん、肺がん（小細胞肺がん、非小細胞肺がん、肺腺癌、及び肺扁平上皮癌を含む）、腹腔がん、肝細胞がん、胃（gastric又はstomach）がん（消化器がんを含む）、膵臓がん、神経膠芽腫、子宮頸がん、卵巣がん、肝臓がん（hepatoma）、膀胱がん、肝臓がん、乳がん、結腸がん、黒色腫、子宮内膜癌又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓（kidney又はrenal）がん、肝臓がん（liver cancer）、前立腺がん、外陰がん、甲状腺がん、肝臓癌、頭頸部がん、結腸直腸がん、直腸がん、軟部組織肉腫、カポジ肉腫、Ｂ細胞リンパ腫（低グレード／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬを含む）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中等グレード／濾胞性ＮＨＬ、中等グレードびまん性ＮＨＬ、高グレード免疫芽球性ＮＨＬ、高グレードリンパ芽球性ＮＨＬ、高グレード小非開裂細胞ＮＨＬ、巨大病変ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、ＡＩＤＳ関連リンパ腫、及びワルデンシュトロームマクログロブリン血症）、慢性リンパ球性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ芽球性白血病（ＡＬＬ）、骨髄腫、有毛細胞白血病、慢性骨髄芽球性白血病、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、母斑症と関連する血管増殖異常、浮腫、メイグス症候群、及びこれらの組合せから成る群より選択される。
【０３０９】
[0395]本明細書で記載される方法は、本明細書で記載される方法に従い同定される免疫原性ネオ抗原ペプチドが、同じ個体のための治療剤（ワクチン又は治療用抗体など）を開発するのに使用される、個別化薬の文脈で、特に有用である。したがって、対象における疾患を処置する方法は、本明細書で記載される方法に従い、対象において免疫原性ネオ抗原ペプチドを同定し；ペプチド（又はこの前駆体）を合成し；同定されたネオ抗原に特異的なＴ細胞を製造し；そして、ネオ抗原特異的Ｔ細胞を対象へ投与する、ことを含みうる。
【０３１０】
[0396]本明細書で提示される薬剤及び組成物は、単独で使用される場合もあり、手術、照射、化学療法、及び／又は骨髄移植（自家、同系、同種、又は非類縁）など、従来の治療的レジメンと組み合わせて使用される場合もある。腫瘍抗原のセットは、本明細書で記載される方法を使用して同定される場合があり、例えば、がん患者の大部分において、有用である。
【０３１１】
[0397]一部の実施形態では、少なくとも１つ以上の化学療法剤は、免疫原性療法を含む組成物に加えて投与されうる。一部の実施形態では、１以上の化学療法剤は、化学療法剤の異なるクラスに属しうる。
【０３１２】
[0398]本明細書で提示される処置方法又は使用の実施において、治療有効量の治療剤は、疾患又は状態を有する対象へと投与されうる。治療有効量は、疾患の重症度、対象の年齢及び相対的健康、使用される化合物の効力、及び他の因子に応じて、広範に変動しうる。
【０３１３】
[0399]対象は、例えば、哺乳動物、ヒト、妊婦、老齢者、成人、若齢者、思春期前若齢者、小児、幼児、乳児、新生児（newborn又はneonate）でありうる。対象は、患者でありうる。場合によって、対象は、ヒトでありうる。場合によって、対象は、小児（すなわち、思春期年齢未満である、若齢のヒト）でありうる。場合によって、対象は、乳児でありうる。場合によって、対象は、ミルク哺育乳児でありうる。場合によって、対象は、臨床研究に登録された個体でありうる。場合によって、対象は、実験室動物、例えば、哺乳動物、又は齧歯動物でありうる。場合によって、対象は、マウスでありうる。場合によって、対象は、肥満対象又は超過体重対象でありうる。
【０３１４】
[0400]一部の実施形態では、対象は、１以上の、異なるがん処置モダリティーで、既に処置されている。一部の実施形態では、対象は、放射線治療、化学療法、又は免疫療法のうちの１つ以上で、既に処置されている。一部の実施形態では、対象は、１つ、２つ、３つ、４つ、又は５つの、以前の選択治療で処置されている。一部の実施形態では、以前の治療は、細胞傷害療法である。
【０３１５】
[0401]一部の実施形態では、本明細書で開示される方法により処置されうる疾患又は状態は、がんである。がんとは、制御不能な形で増殖し、場合によって、転移する（拡大する）傾向がある、細胞の異常な増殖である。腫瘍は、がん性の場合もあり、良性の場合もある。良性腫瘍とは、腫瘍が、増殖しうるが、拡大しないことを意味する。がん性腫瘍が悪性であるとは、それが、体内の他の部分へと、増殖及び拡大しうることを意味する。がんが、拡大する（転移する）場合、新たな腫瘍は、元の（初代）腫瘍と同じ名称を保有する。
【０３１６】
[0402]本開示の方法は、当該技術分野で公知の、任意の種類のがんを処置する。本開示の方法により処置されるがんの非限定例は、黒色腫（例えば、転移性悪性黒色腫）、腎臓がん（例えば、明細胞癌）、前立腺がん（例えば、ホルモン不応性前立腺腺癌）、膵臓腺癌、乳がん、結腸がん、肺がん（例えば、非小細胞肺がん）、食道がん、頭頸部扁平上皮細胞癌、肝臓がん、卵巣がん、子宮頸がん、甲状腺がん、神経膠芽腫、神経膠腫、白血病、リンパ腫、及び他の新生物性悪性腫瘍を含みうる。
【０３１７】
[0403]加えて、本明細書で提示される疾患又は状態は、不応性又は再発性の悪性腫瘍であって、その増殖が、本開示の処置方法を使用して阻害されうる悪性腫瘍を含む。一部の実施形態では、本開示の処置方法により処置されるがんは、癌腫、扁平上皮癌、腺癌、肉腫、子宮内膜がん、乳がん、卵巣がん、子宮頸がん、卵管がん、原発性腹腔がん、結腸がん、結腸直腸がん、肛門性器領域の扁平上皮細胞癌、黒色腫、腎細胞癌、肺がん、非小細胞肺がん、肺扁平上皮細胞癌、胃がん、膀胱がん、胆嚢がん、肝臓がん、甲状腺がん、喉頭がん、唾液腺がん、食道がん、頭頸部がん、神経膠芽腫、神経膠腫、頭頸部扁平上皮細胞癌、前立腺がん、膵臓がん、中皮腫、肉腫、血液がん、白血病、リンパ腫、神経腫、及びこれらの組合せから成る群より選択される。一部の実施形態では、本開示の方法により処置されるがんは、例えば、癌腫、扁平上皮癌（例えば、子宮頸管、眼瞼、結膜、膣、肺、口腔、皮膚、膀胱、舌、喉頭、及び食道）、及び腺癌（例えば、前立腺、小腸、子宮内膜、子宮頸管、大腸、肺、膵臓、食道、直腸、子宮、胃、乳腺、及び卵巣）を含む。一部の実施形態では、本開示の方法により処置されるがんは、肉腫（例えば、筋原性肉腫）、白血病、神経腫、黒色腫、及びリンパ腫をさらに含む。一部の実施形態では、本開示の方法により処置されるがんは、乳がんである。一部の実施形態では、本開示の処置方法により処置されるがんは、トリプルネガティブ乳がん（ＴＮＢＣ）である。一部の実施形態では、本開示の処置方法により処置されるがんは、卵巣がんである。一部の実施形態では、本開示の処置方法により処置されるがんは、結腸直腸がんである。
【０３１８】
[0404]一部の実施形態では、本開示の医薬組成物で処置される患者又は患者集団は、充実性腫瘍を有する。一部の実施形態では、充実性腫瘍は、黒色腫、腎細胞癌腫、肺がん、膀胱がん、乳がん、子宮頸がん、結腸がん、胆嚢がん、喉頭がん、肝臓がん、甲状腺がん、胃がん、唾液腺がん、前立腺がん、膵臓がん、又はメルケル細胞癌である。一部の実施形態では、本開示の医薬組成物で処置される患者又は患者集団は、血液がんを有する。一部の実施形態では、患者は、びまん性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（「ＤＬＢＣＬ」）、ホジキンリンパ腫（「ＨＬ」）、非ホジキンリンパ腫（「ＮＨＬ」）、濾胞性リンパ腫（「ＦＬ」）、急性骨髄白血病（「ＡＭＬ」）、又は多発性骨髄腫（「ＭＭ」）などの血液がんを有する。一部の実施形態では、処置される患者又は患者集団は、卵巣がん、肺がん、及び黒色腫から成る群より選択されるがんを有する。
【０３１９】
[0405]本開示に従い防止及び／又は処置されうるがんの具体例は、以下：腎臓がん、腎臓がん、多形性神経膠芽腫、転移性乳がん；乳癌；乳腺肉腫；神経線維腫；神経線維腫症；小児腫瘍；神経芽細胞腫；悪性黒色腫；表皮癌；急性白血病、急性リンパ球性白血病、骨髄芽球性白血病、前骨髄球性白血病、骨髄単球性白血病、単球性白血病、赤白血病、並びに骨髄異形成症候群などの急性骨髄性白血病；慢性骨髄性（顆粒球性）白血病、慢性リンパ球性白血病、毛様細胞白血病などであるがこれらに限定されない慢性白血病などであるがこれらに限定されない白血病；真性赤血球増加症；ホジキン病、非ホジキン病などであるがこれらに限定されないリンパ腫；くすぶり型多発性骨髄腫、非分泌性骨髄腫、骨硬化性骨髄腫、形質細胞白血病、孤立性形質細胞腫、及び骨髄外形質細胞腫などであるがこれらに限定されない多発性骨髄腫；ワルデンシュトレームマクログロブリン血症；意義不明の単クローン性免疫グロブリン血症；良性単クローン性免疫グロブリン血症；重鎖病；骨肉腫（bone sarcoma）、骨髄腫性骨疾患、多発性骨髄腫、コレステリン腫誘導性骨肉腫、骨パジェット病、骨肉腫（osteosarcoma）、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性巨細胞腫、骨線維肉腫、脊索腫、骨膜肉腫、軟部組織肉腫、血管肉腫（angiosarcoma（hemangiosarcoma））、線維肉腫、カポジ肉腫、平滑筋肉腫、脂肪肉腫、リンパ管肉腫、神経鞘腫、横紋筋肉腫、及び滑膜肉腫などであるがこれらに限定されない、骨がん及び結合組織肉腫；神経膠腫、星状細胞腫、脳幹神経膠腫、上衣腫、希突起神経膠腫、非神経膠性腫瘍、聴神経鞘腫、頭蓋咽頭腫、髄芽腫、髄膜腫、松果体細胞腫、松果体芽細胞腫、原発性脳リンパ腫などであるがこれらに限定されない脳腫瘍；腺癌、小葉（小細胞）癌、乳管内癌、乳腺髄様がん、粘液性乳がん、乳腺管状がん、乳腺乳頭がん、パジェット病（若年性パジェット病を含む）、及び炎症性乳がんを含むがこれらに限定されない乳がん；褐色細胞腫及び副腎皮質癌などであるがこれらに限定されない副腎がん；甲状腺乳頭がん又は甲状腺濾胞がん、甲状腺髄様がん、及び甲状腺未分化がんなどであるがこれらに限定されない甲状腺がん；インスリノーマ、ガストリノーマ、グルカゴノーマ、ＶＩＰオーマ、ソマトスタチン分泌腫瘍、及び膵カルチノイド腫瘍又は膵島細胞腫瘍などであるがこれらに限定されない膵臓がん；クッシング病、プロラクチン分泌腫瘍、末端肥大症、及び尿崩症などであるがこれらに限定されない下垂体がん；虹彩黒色腫、脈絡叢黒色腫、及び毛様体黒色腫などの眼内黒色腫、並びに網膜芽細胞腫などであるがこれらに限定されない眼がん；扁平上皮細胞癌、腺癌、及び黒色腫などの膣がん；扁平上皮細胞癌、黒色腫、腺癌、基底細胞癌、肉腫、及びパジェット病などの外陰がん；扁平上皮細胞癌及び腺癌などであるがこれらに限定されない子宮頚がん；子宮内膜癌及び子宮肉腫などであるがこれらに限定されない子宮がん；卵巣上皮癌、境界型腫瘍、胚細胞腫瘍、及び間質性腫瘍などであるがこれらに限定されない卵巣がん；子宮頚癌；扁平上皮がん、腺癌、腺様嚢胞癌、粘表皮癌、腺扁平上皮癌、肉腫、黒色腫、疣状癌、及び燕麦細胞（小細胞）癌などであるがこれらに限定されない食道がん；腺癌、決潰型（ポリープ状）胃がん、潰瘍型胃がん、表在拡大型胃がん、びまん拡大型胃がん、胃悪性リンパ腫、脂肪肉腫、線維肉腫、及び癌肉腫などであるがこれらに限定されない胃がん；結腸がん；結腸直腸がん、ＫＲＡＳ突然変異型結腸直腸がん；結腸癌；直腸がん；肝細胞癌及び肝芽腫などであるがこれらに限定されない肝がん；腺癌などの胆嚢がん；乳頭型胆管がん、結節型胆管がん、及びびまん型胆管がんなどの胆管癌；ＫＲＡＳ変異型非小細胞肺がん、非小細胞肺がん、扁平上皮細胞癌（類表皮癌）、腺癌、大細胞癌、及び小細胞肺がんなどの肺がん；肺癌；胚細胞腫瘍、セミノーマ、退形成性セミノーマ、古典的（定型）セミノーマ、精母細胞性セミノーマ、非セミノーマ、胎児性癌、奇形腫癌、絨毛癌（卵黄嚢腫瘍）などであるがこれらに限定されない精巣がん；アンドロゲン非依存性前立腺がん、アンドロゲン依存性前立腺がん、腺癌、平滑筋肉腫、及び横紋筋肉腫などであるがこれらに限定されない前立腺がん；陰茎がん；扁平上皮細胞癌などであるがこれらに限定されない口腔がん；基底細胞がん（basal cancer）；腺癌、粘膜表皮癌、及び腺様嚢胞癌などであるがこれらに限定されない唾液腺がん；扁平上皮細胞がん及び疣状がんなどであるがこれらに限定されない咽頭がん；基底細胞癌、扁平上皮細胞癌、及び黒色腫、表在拡大型黒色腫、結節型黒色腫、悪性黒子型黒色腫、末端黒子型黒色腫などであるがこれらに限定されない皮膚がん；腎細胞がん、腺癌、副腎腫、腎線維肉腫、移行上皮がん（腎芋及び／又は尿管）などであるがこれらに限定されない腎がん；腎癌；ウィルムス腫瘍；移行上皮癌、扁平上皮細胞がん、腺癌、癌肉腫などであるがこれらに限定されない膀胱がんを含むがこれらに限定されない。加えて、がんは、粘液肉腫、骨肉腫、内皮肉腫、リンパ管内皮肉腫、中皮腫、滑膜腫、血管芽腫、上皮癌、嚢胞腺癌、気管支癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭癌、乳頭腺癌を含む。
キット
[0406]本明細書で記載される方法及び組成物は、投与のための指示書と併せて、キット形態で提供されうる。典型的に、キットは、容器内の、単位剤形の、所望されるネオ抗原による治療用組成物と、投与のための指示書とを含みうる。さらなる治療剤、例えば、サイトカイン、リンホカイン、チェックポイント阻害剤、抗体もまた、キット内に組み入れられうる。これらもまた所望でありうる、他のキット構成要素は、例えば、滅菌シリンジ、追加投与量、及び他の所望の賦形剤を含む。
【０３２０】
[0407]本明細書ではまた、本明細書で記載される、１以上の方法を伴う使用のための、キット及び製品も提示される。キットは、１種類又は複数種類の免疫細胞を含有しうる。キットはまた、本明細書で記載される、抗原特異的免疫細胞（例えば、ネオ抗原特異的Ｔ細胞）の作製に有用な、試薬、ペプチド、及び／又は細胞も含有しうる。キットは、抗原特異的免疫細胞の作製及び送達に必要な、アジュバント、試薬、及び緩衝液もさらに含有しうる。
【０３２１】
[0408]キットはまた、容器の各々が、本明細書で記載される方法において使用される、ポリペプチド及びアジュバントなど、個別の要素のうちの１つを含む、バイアル、試験管など、１以上の容器を受容するように区画化された、搬送手段、パッケージ、又は容器も含みうる。適切な容器は、例えば、ボトル、バイアル、シリンジ、及びチューブを含む。容器は、ガラス又はプラスチックなど、様々な材料から形成されうる。
【０３２２】
[0409]本明細書で提示される製品は、パッケージング材料を含有する。医薬パッケージング材料の例は、ブリスターパック、ボトル、チューブ、バッグ、容器、ボトル、及び選択された製剤及び意図される投与方式及び処置に適する、任意のパッケージング材料を含むがこれらに限定されない。キットは、典型的に、内容物を列挙するラベル及び／又は使用のための指示書、並びに使用のための指示書を伴う、パッケージ添付文書を含む。指示書のセットもまた、組み入れられうる。
実施形態の項目
［１］  （ａ）少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む生物学的試料に由来する免疫細胞の集団、及び（ｂ）薬学的に許容される賦形剤を含む医薬組成物であって、集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量と相対的に異なる、前記医薬組成物。
［２］  生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を含む組成物であって、集団内のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のＣＤ１４及びＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より相対的に少ない、前記組成物。
［３］  （ａ）生物学的試料に由来するＴ細胞を含む免疫細胞の集団、ここで、Ｔ細胞は、ＡＰＣ−刺激Ｔ細胞である少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含み、かつ、少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含み、ＡＰＣは、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣである；及び（ｂ）薬学的に許容される賦形剤、を含む医薬組成物。
［４］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのＡＰＣ−刺激Ｔ細胞を含む、項目［１］に記載の組成物。
［５］  集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より相対的に少ない、項目［１］、［３］、及び［４］のいずれか１項に記載の組成物。
［６］  集団内のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する免疫細胞の量より相対的に多い、項目［１］、［３］、及び［４］のいずれか１項に記載の組成物。
［７］  生物学的試料が対象に由来する、項目［１］〜［６］のいずれか１項に記載の組成物。
［８］  対象がヒトである、項目［７］に記載の組成物。
［９］  対象が疾患又は障害を有する、項目［７］又は［８］に記載の組成物。
［１０］  疾患又は障害ががんである、項目［９］に記載の組成物。
［１１］  がんが、卵巣がん、肺がん、及び黒色腫から成る群より選択される、項目［１０］に記載の組成物。
［１２］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、項目［１］〜［１１］のいずれか１項に記載の組成物。
［１３］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、項目［１］〜［１２］のいずれか１項に記載の組成物。
［１４］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのＣＤ４エンリッチＴ細胞を含む、項目［１］〜［１３］のいずれか１項に記載の組成物。
［１５］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのＣＤ８エンリッチＴ細胞を含む、項目［１］〜［１４］のいずれか１項に記載の組成物。
［１６］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、メモリーＴ細胞を含む、項目［１］〜［１５］のいずれか１項に記載の組成物。
［１７］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、ナイーブＴ細胞を含む、項目［１］〜［１６］のいずれか１項に記載の組成物。
［１８］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、メモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、項目［１］〜［１７］のいずれか１項に記載の組成物。
［１９］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、ナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、項目［１］〜［１８］のいずれか１項に記載の組成物。
［２０］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、項目［１］〜［１９］のいずれか１項に記載の組成物。
［２１］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、項目［１］〜［２０］のいずれか１項に記載の組成物。
［２２］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列が、（Ａ）点突然変異、（Ｂ）スプライス部位突然変異、（Ｃ）フレームシフト突然変異、（Ｄ）リードスルー突然変異、（Ｅ）遺伝子融合突然変異、及びこれらの組合せから選択される突然変異を含む、項目［１］〜［２１］のいずれか１項に記載の組成物。
［２３］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列が、対応する野生型ペプチドより大きな親和性で対象のＨＬＡタンパク質に結合する、項目［１］〜［２２］のいずれか１項に記載の組成物。
［２４］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列が、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＫＤ又はＩＣ５０で対象のＨＬＡタンパク質に結合する、項目［１］〜［２３］のいずれか１項に記載の組成物。
［２５］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々が、対象により発現されるＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合する、項目［１］〜［２４］のいずれか１項に記載の組成物。
［２６］  ＴＣＲが、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＫＤ又はＩＣ５０でペプチド−ＨＬＡ複合体に結合する、項目［１］〜［２５］のいずれか１項に記載の組成物。
［２７］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々が、対象の非がん細胞内に存在しない突然変異を含む、項目［１］〜［２６］のいずれか１項に記載の組成物。
［２８］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々が、対象のがん細胞の遺伝子又は発現遺伝子によりコードされる、項目［１］〜［２７］のいずれか１項に記載の組成物。
［２９］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上が、少なくとも８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０；４０；５０；６０；７０；８０；９０；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；１，０００；１，５００；２，０００；２，５００；３，０００；４，０００；５，０００；７，５００；又は１０，０００天然アミノ酸の長さを有する、項目［１］〜［２８］のいずれか１項に記載の組成物。
［３０］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上が、クラスＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、８〜１２天然アミノ酸の長さを有する、項目［１］〜［２９］のいずれか１項に記載の組成物。
［３１］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上が、クラスＩＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、１６〜２５天然アミノ酸の長さを有する、項目［１］〜［３０］のいずれか１項に記載の組成物。
［３２］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列が、複数の抗原ペプチド配列を含む、項目［１］〜［３１］のいずれか１項に記載の組成物。
［３３］  複数の抗原ペプチド配列が、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００の抗原ペプチド配列を含む、項目［３２］に記載の組成物。
［３４］  ＡＰＣが、１以上のＡＰＣ調製物である、項目［１］〜［３３］に記載の組成物。
［３５］  ＡＰＣが成熟ＡＰＣである、項目［３］〜［３４］のいずれか１項に記載の組成物。
［３６］  ＡＰＣが、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上を含む１以上の抗原ペプチドをロードされたＡＰＣを含む、項目［３］〜［３５］のいずれか１項に記載の組成物。
［３７］  ＡＰＣが、自家ＡＰＣ、同種ＡＰＣ、又は人工ＡＰＣである、項目［３］〜［３６］のいずれか１項に記載の組成物。
［３８］  ＡＰＣが樹状細胞（ＤＣ）を含む、項目［３］〜［３７］のいずれか１項に記載の組成物。
［３９］  ＡＰＣが、ＣＤ１４＋単球に由来するか、又はＣＤ１４エンリッチＡＰＣであるか、又はＣＤ１４１エンリッチＡＰＣである、項目［４］〜［３８］のいずれか１項に記載の組成物。
［４０］  ＣＤ１４＋単球が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む対象に由来する生物学的試料からエンリッチされる、項目［３９］に記載の組成物。
［４１］  ＣＤ１４＋単球が、１以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される、項目［３９］又は［４０］に記載の組成物。
［４２］  １以上のサイトカイン又は増殖因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含む、項目［４１］に記載の組成物。
［４３］  ＣＤ１４＋単球が、ＰＢＭＣを含む第２の生物学的試料に由来する、項目［３９］〜［４２］のいずれか１項に記載の組成物。
［４４］  第２の生物学的試料が同じ対象に由来する、項目［４３］に記載の組成物。
［４５］  生物学的試料が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、項目［１］〜［４４］のいずれか１項に記載の組成物。
［４６］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ）阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せを含む培地中で刺激される、項目［１］及び［３］〜［４５］のいずれか１項に記載の組成物。
［４７］  ＩＤＯ阻害剤が、エパカドスタット、ナボキシモド、１−メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである、項目［４６］に記載の組成物。
［４８］  組成物中の少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率が、全Ｔ細胞又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である、項目［１］〜［４７］のいずれか１項に記載の組成物。
［４９］  組成物中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である、項目［１］〜［４８］のいずれか１項に記載の組成物。
［５０］  組成物中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である、項目［１］〜［４９］のいずれか１項に記載の組成物。
［５１］  生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である、項目［１］〜［５０］のいずれか１項に記載の組成物。
［５２］  生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である、項目［１］〜［５１］のいずれか１項に記載の組成物。
［５３］  生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である、項目［１］〜［５２］のいずれか１項に記載の組成物。
［５４］  抗原が、ネオ抗原、腫瘍関連抗原、過剰発現抗原、ウイルス抗原、マイナー組織適合性抗原、又はこれらの組合せである、項目［１］〜［５３］のいずれか１項に記載の組成物。
［５５］  組成物中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の数が、少なくとも約１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、又は５×１０８個である、項目［１］〜［５４］のいずれか１項に記載の組成物。
［５６］  組成物中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の数が、少なくとも約１×１０６、２×１０６、５×１０６、１×１０７、２×１０７、５×１０７、１×１０８、２×１０８、又は５×１０８個である、項目［１］〜［５４］のいずれか１項に記載の組成物。
［５７］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、複数の抗原特異的Ｔ細胞を含む、項目［１］〜［５６］のいずれか１項に記載の組成物。
［５８］  集団内のＣＤ１９及び／又はＣＤ１６を発現する免疫細胞の量が、生物学的試料中のＣＤ１９及び／又はＣＤ１６を発現する免疫細胞の量より少ない、項目［１］〜［５７］のいずれか１項に記載の組成物。
［５９］  項目［１］又は［３］〜［５８］のいずれか１項に記載の組成物を、疾患又は障害を有する対象へ投与することを含む、処置方法。
［６０］  治療に使用する医薬の製造のための、項目［１］又は［３］〜［５８］のいずれか１項に記載の組成物の使用。
［６１］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、ＡＰＣを、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含む、前記方法。
［６２］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）−刺激ＡＰＣを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含む、前記方法。
［６３］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を含む医薬組成物を調製する方法であって、（ａ）ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３受容体リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）を、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートし；そして（ｂ）その後、生物学的試料の少なくとも１つのＴ細胞を、ＡＰＣと共にインキュベートすることを含む、前記方法。
［６４］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物とインキュベートしてから、２８日間未満の１以上の別個の期間、該免疫細胞の集団を、１以上のＡＰＣ調製物と共にインキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的メモリーＴ細胞が拡大されるか、又は少なくとも１つの抗原特異的ナイーブＴ細胞が誘導される、前記方法。
［６５］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列に特異的なＴ細胞受容体（ＴＣＲ）を含む少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞を調製する方法であって、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、３つ以下のＡＰＣ調製物と共に３以下の別個の期間インキュベートすることを含み、少なくとも１つの抗原特異的メモリーＴ細胞が拡大されるか、又は少なくとも１つの抗原特異的ナイーブＴ細胞が誘導される、前記方法。
［６６］  免疫細胞の集団が、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させた生物学的試料に由来する、項目［６２］〜［６５］のいずれか１項に記載の方法。
［６７］  生物学的試料が、ＣＤ１９を発現する細胞をさらに枯渇させられる、項目［６１］又は［６６］に記載の方法。
［６８］  ＡＰＣが、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣである、項目［６１］又は［６３］に記載の方法。
［６９］  免疫細胞の集団をインキュベートすることが、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はこれらの組合せを含有する培地中で実施される、項目［６４］〜［６７］のいずれか１項に記載の方法。
［７０］  培地が、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ）阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せをさらに含む、項目［６９］に記載の方法。
［７１］  ＩＤＯ阻害剤が、エパカドスタット、ナボキシモド、１−メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである、項目［７０］に記載の方法。
［７２］  ＡＰＣ調製物のうちの少なくとも１つが、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣを含む、項目［６４］〜［７１］のいずれか１項に記載の方法。
［７３］  ＡＰＣ調製物のうちの少なくとも２つが、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣを含む、項目［６４］〜［７１］のいずれか１項に記載の方法。
［７４］  ＡＰＣ調製物のうちの少なくとも３つが、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣを含む、項目［６４］〜［７１］のいずれか１項に記載の方法。
［７５］  ＡＰＣ調製物の各々が、ＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣを含む、項目［６４］〜［７１］のいずれか１項に記載の方法。
［７６］  ＡＰＣが、１以上のＡＰＣ調製物を含む、項目［６１］〜［６３］のいずれか１項に記載の方法。
［７７］  １以上のＡＰＣ調製物が、３つ以下のＡＰＣ調製物を含む、項目［６１］〜［７６］のいずれか１項に記載の方法。
［７８］  １以上のＡＰＣ調製物が、１以上の別個の期間内に、逐次的に、免疫細胞と共にインキュベートされる、項目［６４］〜［７７］のいずれか１項に記載の方法。
［７９］  １以上のＡＰＣ調製物のうちの少なくとも１つが、生物学的試料に由来するＡＰＣである、項目［６１］〜［７８］のいずれか１項に記載の方法。
［８０］  免疫細胞の集団が、ＡＰＣ、又は１つ以上のＡＰＣ調製物のうちの少なくとも１つを含む、項目［６１］〜［７９］のいずれか１項に記載の方法。
［８１］  免疫細胞の集団がＡＰＣを含まず、免疫細胞の集団が１以上のＡＰＣ調製物のうちの１つを含まない、項目［６１］〜［７９］のいずれか１項に記載の方法。
［８２］  ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートすることを含み、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートされ、少なくとも１つのペプチドは、免疫細胞の集団と共に第１のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得、ここで、免疫細胞の集団は、少なくとも１つのＴ細胞及び少なくとも１つのＡＰＣを含む、項目［６１］〜［８１］のいずれか１項に記載の方法。
［８３］  ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、少なくとも１つのＡＰＣと共にインキュベートし、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第２の期間インキュベートされ、少なくとも１つのペプチドは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第２のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を得；そして、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を、第１の刺激されたＴ細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、項目［８２］に記載の方法。
［８４］  ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、少なくとも１つのＡＰＣと共にインキュベートし、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第３の期間インキュベートされ、少なくとも１つのペプチドは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第３のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第２のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を得；そして、第２のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を、第２の刺激されたＴ細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、項目［８３］に記載の方法。
［８５］  生物学的試料が対象に由来する、項目［６１］〜［８４］のいずれか１項に記載の方法。
［８６］  対象がヒトである、項目［８５］に記載の方法。
［８７］  対象が疾患又は障害を有する、項目［８５］又は［８６］に記載の方法。
［８８］  疾患又は障害ががんである、項目［８７］に記載の方法。
［８９］  がんが、卵巣がん、肺がん、及び黒色腫から成る群より選択される、項目［８８］に記載の方法。
［９０］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、項目［６１］〜［８９］のいずれか１項に記載の方法。
［９１］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、項目［６１］〜［９０］のいずれか１項に記載の方法。
［９２］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのＣＤ４エンリッチＴ細胞を含む、項目［６１］〜［９１］のいずれか１項に記載の方法。
［９３］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのＣＤ８エンリッチＴ細胞を含む、項目［６１］〜［９２］のいずれか１項に記載の方法。
［９４］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのメモリーＴ細胞を含む、項目［６１］〜［９３］のいずれか１項に記載の方法。
［９５］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのナイーブＴ細胞を含む、項目［６１］〜［９４］のいずれか１項に記載の方法。
［９６］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのメモリーＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、項目［６１］〜［９５］のいずれか１項に記載の方法。
［９７］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのナイーブＣＤ４＋Ｔ細胞を含む、項目［６１］〜［９６］のいずれか１項に記載の方法。
［９８］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのメモリーＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、項目［６１］〜［９７］のいずれか１項に記載の方法。
［９９］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、少なくとも１つのナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞を含む、項目［６１］〜［９８］のいずれか１項に記載の方法。
［１００］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列が、（Ａ）点突然変異、（Ｂ）スプライス部位突然変異、（Ｃ）フレームシフト突然変異、（Ｄ）リードスルー突然変異、（Ｅ）遺伝子融合突然変異、及びこれらの組合せから選択される突然変異を含む、項目［６１］〜［９９］のいずれか１項に記載の方法。
［１０１］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列が、点突然変異を含み、対応する野生型ペプチドより大きな親和性で対象のＨＬＡタンパク質に結合する、項目［６１］〜［１００］のいずれか１項に記載の方法。
［１０２］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列が、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＩＣ５０で対象のＨＬＡタンパク質に結合する、項目［６１］〜［１０１］のいずれか１項に記載の方法。
［１０３］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々が、対象により発現されるＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合する、項目［６１］〜［１０２］のいずれか１項に記載の方法。
［１０４］  ＴＣＲが、５００ｎＭ、２５０ｎＭ、１５０ｎＭ、１００ｎＭ、５０ｎＭ、２５ｎＭ、又は１０ｎＭ未満のＫＤでペプチド−ＨＬＡ複合体に結合する、項目［６１］〜［１０３］のいずれか１項に記載の方法。
［１０５］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々が、対象の非がん細胞内に存在しない突然変異を含む、項目［６１］〜［１０４］のいずれか１項に記載の方法。
［１０６］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列の各々が、対象のがん細胞の遺伝子又は発現遺伝子によりコードされる、項目［６１］〜［１０５］のいずれか１項に記載の方法。
［１０７］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上が、少なくとも８；９；１０；１１；１２；１３；１４；１５；１６；１７；１８；１９；２０；２１；２２；２３；２４；２５；２６；２７；２８；２９；３０；４０；５０；６０；７０；８０；９０；１００；１５０；２００；２５０；３００；３５０；４００；４５０；５００；６００；７００；８００；９００；１，０００；１，５００；２，０００；２，５００；３，０００；４，０００；５，０００；７，５００；又は１０，０００天然アミノ酸の長さを有する、項目［６１］〜［１０６］のいずれか１項に記載の方法。
［１０８］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上が、クラスＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、８〜１２天然アミノ酸の長さを有する、項目［６１］〜［１０７］のいずれか１項に記載の方法。
［１０９］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上が、クラスＩＩのＨＬＡ対立遺伝子によりコードされるタンパク質に結合し、１６〜２５天然アミノ酸の長さを有する、項目［６１］〜［１０８］のいずれか１項に記載の方法。
［１１０］  少なくとも１つの抗原ペプチド配列が、複数の抗原ペプチド配列を含む、項目［６１］〜［１０９］のいずれか１項に記載の方法。
［１１１］  複数の抗原ペプチド配列が、少なくとも２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、１５０、２００、２５０、３００、３５０、４００、４５０、又は５００の抗原ペプチド配列を含む、項目［１１０］に記載の方法。
［１１２］  ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣが、少なくとも１つの抗原ペプチド配列のうちの１つ以上を含む１以上の抗原ペプチドをロードされたＡＰＣを含む、項目［６１］〜［１１１］のいずれか１項に記載の方法。
［１１３］  ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣが、自家ＡＰＣ又は同種ＡＰＣである、項目［６１］〜［１１２］のいずれか１項に記載の方法。
［１１４］  ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣが、樹状細胞（ＤＣ）を含む、項目［６１］〜［１１３］のいずれか１項に記載の方法。
［１１５］  ＤＣがＣＤ１４１＋ＤＣである、項目［１１４］に記載の方法。
［１１６］  ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を、生物学的試料から枯渇させることを含む、項目［６１］〜［１１４］のいずれか１項に記載の方法。
［１１７］  ＣＤ１９を発現する細胞を、生物学的試料から枯渇させることをさらに含む、項目［１１６］に記載の方法。
［１１８］  ＣＤ１４又はＣＤ２５又はＣＤ１９を発現する細胞を枯渇させることが、ＣＤ１４又はＣＤ２５又はＣＤ１９に結合する薬剤を、ＡＰＣ又はＡＰＣ調製物のＡＰＣへと結合させることを含む、項目［１１６］又は［１１６］に記載の方法。
［１１９］  ＣＤ１４又はＣＤ２５又はＣＤ１９に結合する薬剤が、ビオチン化される、項目［１１８］に記載の方法。
［１２０］  ＣＤ１４又はＣＤ２５又はＣＤ１９を発現する細胞を枯渇させることが、固体支持体上の抗ビオチン試薬を、ＣＤ１４又はＣＤ２５又はＣＤ１９に結合する薬剤へ結合させることをさらに含む、項目［１１８］又は［１１９］に記載の方法。
［１２１］  ＣＤ１４又はＣＤ２５又はＣＤ１９に結合する薬剤が、固体支持体へ接合される、項目［１１８］〜［１２０］のいずれか１項に記載の方法。
［１２２］  項目［６１］〜［６３］若しくは［６６］〜［１２１］のいずれか１項に記載のＡＰＣ、又は項目［６４］〜［１２１］のいずれか１項に記載のＡＰＣ調製物のＡＰＣが、ＣＤ１４＋単球に由来するか、又はＣＤ１４エンリッチＡＰＣであるか、又はＣＤ１４１エンリッチＡＰＣである、項目［６１］〜［１２１］のいずれか１項に記載の方法。
［１２３］  項目［６１］〜［６３］若しくは［６６］〜［１２２］のいずれか１項に記載のＡＰＣ、又は項目［６４］〜［１２２］のいずれか１項に記載のＡＰＣ調製物のＡＰＣが、生物学的試料からエンリッチされる、項目［６１］〜［１２２］のいずれか１項に記載の方法。
［１２４］  項目［６１］〜［６３］若しくは［６６］〜［１２３］のいずれか１項に記載のＡＰＣ、又は項目［６４］〜［１２３］のいずれか１項に記載のＡＰＣ調製物のＡＰＣが、１以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される、項目［６１］〜［１２３］のいずれか１項に記載の方法。
［１２５］  １以上のサイトカイン又は増殖因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含む、項目［１２４］に記載の方法。
［１２６］  項目［６１］〜［６３］若しくは［６６］〜［１２５］のいずれか１項に記載のＡＰＣ、又は項目［６４］〜［１２５］のいずれか１項に記載のＡＰＣ調製物のＡＰＣが、第２の生物学的試料に由来する、項目［６１］〜［１２５］のいずれか１項に記載の方法。
［１２７］  第２の生物学的試料が同じ対象に由来する、項目［１２６］に記載の方法。
［１２８］  生物学的試料が末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を含む、項目［６１］〜［１２７］のいずれか１項に記載の方法。
［１２９］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である、項目［６１］〜［１２８］のいずれか１項に記載の方法。
［１３０］  少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である、項目［６１］〜［１２９］のいずれか１項に記載の方法。
［１３１］  少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの少なくとも約０．１％、０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、又は９５％である、項目［６１］〜［１３０］のいずれか１項に記載の方法。
［１３２］  生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞の百分率が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である、項目［６１］〜［１３１］のいずれか１項に記載の方法。
［１３３］  生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である、項目［６１］〜［１３２］のいずれか１項に記載の方法。
［１３４］  生物学的試料中の少なくとも１つの抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞の百分率が、全ＣＤ４＋Ｔ細胞、全ＣＤ８＋Ｔ細胞、全Ｔ細胞、又は全免疫細胞のうちの最大で約０．００００１％、０．００００５％、０．０００１％、０．０００５％、０．００１％、０．００５％、０．０１％、０．０５％、０．１％、又は０．５％である、項目［６１］〜［１３３］のいずれか１項に記載の方法。
［１３５］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞のうちの１つ以上を、対象へ投与することをさらに含む、項目［６１］〜［１３４］のいずれか１項に記載の方法。
［１３６］  別個の期間の合計期間が２８日間未満である、項目［６１］〜［１３５］のいずれか１項に記載の方法。
［１３７］  インキュベートすることが、ＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に７日を超える期間インキュベートすることを含む、項目［６１］〜［１３６］のいずれか１項に記載の方法。
［１３８］  インキュベートすることが、ＡＰＣ調製物のうちの第１のＡＰＣ調製物を、Ｔ細胞と共に７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、又は２０日を超える期間インキュベートすることを含む、項目［６１］〜［１３７］のいずれか１項に記載の方法。
［１３９］  生物学的試料が、対象から新たに得られるか又は凍結試料である、項目［６１］〜［１３８］のいずれか１項に記載の方法。
［１４０］  ＡＰＣ又は１つ以上のＡＰＣ調製物を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子を含む第１の培地と共に第１の期間インキュベートすることを含む、項目［６１］〜［１３９］のいずれか１項に記載の方法。
［１４１］  少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの任意の組合せを含む、項目［１４０］に記載の方法。
［１４２］  １つ以上のＡＰＣ調製物を、少なくとも１つのペプチドと共に第２の期間インキュベートすることを含む、項目［１４０］又は［１４１］に記載の方法。
［１４３］  項目［６１］〜［６３］若しくは［６６］〜［１４２］のいずれか１項に記載のＡＰＣ、又は項目［６４］〜［１４２］のいずれか１項に記載のＡＰＣ調製物のうちの１つ以上を、１以上のサイトカイン又は増殖因子を含む第２の培地と共に第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣを得ることを含む、項目［１４０］〜［１４２］のいずれか１項に記載の方法。
［１４４］  １以上のサイトカイン又は増殖因子が、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、ｐｏｌｙ  Ｉ：Ｃ、又はこれらの組合せを含む、項目［１４３］に記載の方法。
［１４５］  第３の期間の後で、かつ、第４の期間の開始の前に、第２の培地の１以上のサイトカイン又は増殖因子を除去することをさらに含む、項目［１４３］又は［１４４］に記載の方法。
［１４６］  ＡＰＣ調製物のＡＰＣが、１以上のサイトカイン又は増殖因子により刺激される、項目［６１］〜［１４５］のいずれか１項に記載の方法。
［１４７］  抗原が、ネオ抗原、腫瘍関連抗原、ウイルス抗原、マイナー組織適合性抗原、又はこれらの組合せである、項目［６１］〜［１４６］のいずれか１項に記載の方法。
［１４８］  方法が、ｅｘ  ｖｉｖｏにおいて実施される、項目［６１］〜［１４７］のいずれか１項に記載の方法。
［１４９］  少なくとも１つの抗原特異的Ｔ細胞が、複数の抗原特異的Ｔ細胞を含む、項目［６１］〜［１４８］のいずれか１項に記載の方法。
［１５０］  少なくとも１つのＡＰＣと、少なくとも１つのＰＢＭＣ又は少なくとも１つのＴ細胞とを含む対象に由来する生物学的試料を得ることを含む、項目［６１］〜［１４９］のいずれか１項に記載の方法。
［１５１］  ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を得ることを含む、項目［６１］〜［１５０］のいずれか１項に記載の方法。
［１５２］  ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートすることを含む、項目［６１］〜［１５１］のいずれか１項に記載の方法。
［１５３］  少なくとも１つのペプチドを、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を得ることを含む、項目［６１］〜［１５２］のいずれか１項に記載の方法。
［１５４］  第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、項目［６１］〜［１５３］のいずれか１項に記載の方法。
［１５５］  第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共にインキュベートすることが、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目［１５４］に記載の方法。
［１５６］  第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共にインキュベートすることが、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ）阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目［１５５］に記載の方法。
［１５７］  ＩＤＯ阻害剤が、エパカドスタット、ナボキシモド、１−メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである、項目［１５６］に記載の方法。
［１５８］  第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、項目［６１］〜［１５７］のいずれか１項に記載の方法。
［１５９］  第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第２のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、項目［６１］〜［１５７］のいずれか１項に記載の方法。
［１６０］  第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、項目［６１］〜［１５７］のいずれか１項に記載の方法。
［１６１］  第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞をインキュベートすることが、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目［１５８］〜［１６０］のいずれか１項に記載の方法。
［１６２］  第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞をインキュベートすることが、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ）阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目［１６１］に記載の方法。
［１６３］  ＩＤＯ阻害剤が、エパカドスタット、ナボキシモド、１−メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである、項目［１６２］に記載の方法。
［１６４］  第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、項目［６１］〜［１６３］のいずれか１項に記載の方法。
［１６５］  第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第３のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、項目［６１］〜［１６３］のいずれか１項に記載の方法。
［１６６］  第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得ることを含む、項目［６１］〜［１６３］のいずれか１項に記載の方法。
［１６７］  第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞をインキュベートすることが、ＩＬ−７、ＩＬ−１５、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目［１６４］〜［１６６］のいずれか１項に記載の方法。
［１６８］  第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞をインキュベートすることが、インドールアミン２，３−ジオキシゲナーゼ１（ＩＤＯ）阻害剤、抗ＰＤ−１抗体、ＩＬ−１２、又はこれらの組合せの存在下で実施される、項目［１６７］に記載の方法。
［１６９］  ＩＤＯ阻害剤が、エパカドスタット、ナボキシモド、１−メチルトリプトファン、又はこれらの組合せである、項目［１６８］に記載の方法。
［１７０］  １以上の別個の期間、３以下の別個の期間、第１の期間、第２の期間、第３の期間、第４の期間、又は第５の期間が、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも３時間、少なくとも４時間、少なくとも５時間、少なくとも６時間、少なくとも７時間、少なくとも８時間、少なくとも９時間、少なくとも１０時間、少なくとも１１時間、少なくとも１２時間、少なくとも１３時間、少なくとも１４時間、少なくとも１５時間、少なくとも１６時間、少なくとも１７時間、少なくとも１８時間、少なくとも１９時間、少なくとも２０時間、少なくとも２１時間、少なくとも２２時間、少なくとも２３時間、少なくとも２４時間、少なくとも２５時間、少なくとも２６時間、少なくとも２７時間、少なくとも２８時間、少なくとも２９時間、少なくとも３０時間、少なくとも３１時間、少なくとも３２時間、少なくとも３３時間、少なくとも３４時間、少なくとも３５時間、少なくとも３６時間、少なくとも３７時間、少なくとも３８時間、少なくとも３９時間、又は少なくとも４０時間である、項目［６１］〜［１６９］のいずれか１項に記載の方法。
［１７１］  １以上の別個の期間、３以下の別個の期間、第１の期間、第２の期間、第３の期間、第４の期間、又は第５の期間が、１〜４時間、１〜３時間、１〜２時間、４〜４０時間、７〜４０時間、４〜３５時間、４〜３２時間、７〜３５時間、又は７〜３２時間である、項目［６１］〜［１７０］のいずれか１項に記載の方法。
［１７２］  第１、第２、又は第３の刺激されたＴ細胞試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与することを含む、項目［６１］〜［１７１］のいずれか１項に記載の方法。
［１７３］  （ａ）少なくとも１つの抗原提示細胞（ＡＰＣ）を含む対象に由来する生物学的試料を得；（ｂ）ＣＤ１４を発現する細胞を生物学的試料からエンリッチし、これにより、ＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料を得；（ｃ）ＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料を、少なくとも１つのサイトカイン又は増殖因子と共に第１の期間インキュベートし；（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４＋細胞エンリッチ試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；（ｅ）ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、１以上のサイトカイン又は増殖因子と共に第３の期間インキュベートし、これにより、成熟ＡＰＣ試料を得；（ｆ）成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣを、Ｔ細胞を含む、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５、及び／又はＣＤ１９を枯渇させた試料と共に第４の期間インキュベートし；（ｇ）Ｔ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし；（ｈ）Ｔ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第６の期間インキュベートし；そして（ｉ）Ｔ細胞のうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
［１７４］  （ａ）少なくとも１つのＡＰＣ及び少なくとも１つのＴ細胞を含む対象に由来する生物学的試料を得；（ｂ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を得；（ｃ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；（ｅ）ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｆ）第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｇ）任意選択で、第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｈ）第１、第２、又は第３の刺激されたＴ細胞試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
［１７５］  （ａ）少なくとも１つのＡＰＣ及び少なくとも１つのＴ細胞を含む対象に由来する生物学的試料を得；（ｂ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を得；（ｃ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、ペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；（ｅ）ペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｆ）任意選択で、第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｇ）任意選択で、第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｈ）第１、第２、又は第３の刺激されたＴ細胞試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
［１７６］  （ａ）少なくとも１つのＡＰＣ及び少なくとも１つのＴ細胞を含む対象に由来する生物学的試料を得；（ｂ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を得；（ｃ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；（ｅ）第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｆ）任意選択で、第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第２のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｇ）任意選択で、第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のうちの第３のペプチドロードされたＡＰＣ試料と共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｈ）第１、第２、又は第３の刺激されたＴ細胞試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
［１７７］  （ａ）少なくとも１つのＡＰＣ及び少なくとも１つのＴ細胞を含む対象に由来する生物学的試料を得；（ｂ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９を発現する細胞を生物学的試料から枯渇させ、これにより、ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を得；（ｃ）ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料を、ＦＬＴ３Ｌと共に第１の期間インキュベートし；（ｄ）少なくとも１つのペプチドを、（ｃ）のＣＤ１４及び／又はＣＤ２５及び／又はＣＤ１９細胞を枯渇させた試料と共に第２の期間インキュベートし、これにより、第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を得；（ｅ）第１のペプチドロードされたＡＰＣ試料を、少なくとも１つのＴ細胞と共に第３の期間インキュベートし、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｆ）任意選択で、第１の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第４の期間インキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｇ）任意選択で、第２の刺激されたＴ細胞試料のＴ細胞を、ＦＬＴ３Ｌ、及び成熟ＡＰＣ試料のＦＬＴ３Ｌ−刺激ＡＰＣと共に第５の期間インキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｈ）第１、第２、又は第３の刺激されたＴ細胞試料の少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
［１７８］  （ａ）ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、生物学的試料に由来する免疫細胞の集団と共にインキュベートし、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、免疫細胞の集団と共に第１の期間インキュベートされ、少なくとも１つのペプチドは、免疫細胞の集団と共に第１のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第１の刺激されたＴ細胞試料を得、ここで、免疫細胞の集団は、少なくとも１つのＴ細胞及び少なくとも１つのＡＰＣとを含み；（ｂ）任意選択で、ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、少なくとも１つのＡＰＣと共にインキュベートし、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第２の期間インキュベートされ、少なくとも１つのペプチドは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第２のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を得；そして、第１のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を、第１の刺激されたＴ細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第２の刺激されたＴ細胞試料を得；（ｃ）任意選択で、ＦＬＴ３Ｌ及び少なくとも１つのペプチドを、少なくとも１つのＡＰＣと共にインキュベートし、ここで、ＦＬＴ３Ｌは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第３の期間インキュベートされ、少なくとも１つのペプチドは、少なくとも１つのＡＰＣと共に第３のペプチド刺激時間インキュベートされ、これにより、第２のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を得；そして、第２のペプチドロードされた成熟ＡＰＣ試料を、第２の刺激されたＴ細胞試料と共にインキュベートし、これにより、第３の刺激されたＴ細胞試料を得；そして（ｄ）第１の刺激されたＴ細胞試料、第２の刺激されたＴ細胞試料、又は第３の刺激されたＴ細胞試料のうちの少なくとも１つのＴ細胞を、それを必要とする対象へ投与する、ことを含む方法。
［１７９］  （ａ）刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の１以上の細胞マーカーの発現を決定し、そして（ｂ）刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定する、ことを含み；発現の決定及び結合の決定が同時に実施される、前記方法。
［１８０］  刺激された免疫細胞試料が、ペプチド−ＭＨＣ複合体を含むＡＰＣにより刺激された免疫細胞の集団を含む、項目［１７９］に記載の方法。
［１８１］  免疫細胞の集団が、生物学的試料に由来する、項目［１７９］又は［１８０］に記載の方法。
［１８２］  （ａ）生物学的試料に由来する免疫細胞の集団を、ペプチド−ＭＨＣ複合体を含むＡＰＣと共にインキュベートし、これにより、刺激された免疫細胞試料を得；（ｂ）刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の１以上の細胞マーカーの発現を決定し；及び（ｃ）刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定する、ことを含み；発現の決定及び結合の決定が同時に実施される、前記方法。
［１８３］  １以上の細胞マーカーが、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ、ＬＡＭＰ−１、４−１ＢＢ、ＩＬ−２、ＩＬ−１７Ａ、グランザイムＢ、ＰＤ−１、ＣＤ２５、ＣＤ６９、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、ＣＴＬＡ−４、ＣＤ６２Ｌ、ＣＤ４５ＲＡ、ＣＤ４５ＲＯ、ＦｏｘＰ３、又はこれらの任意の組合せを含む、項目［１７９］〜［１８２］のいずれか１項に記載の方法。
［１８４］  刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体への結合を決定することが、刺激された免疫細胞試料の少なくとも１つの免疫細胞の、ペプチド−ＭＨＣ複合体のペプチド及びＭＨＣを含むＭＨＣ４量体への結合の決定を含む、項目［１７９］〜［１８３］のいずれか１項に記載の方法。
［１８５］  ＭＨＣが、クラスＩ  ＭＨＣ又はクラスＩＩ  ＭＨＣである、項目［１７９］〜［１８４］のいずれか１項に記載の方法。
［１８６］  ペプチド−ＭＨＣ複合体が、１以上の標識を含む、項目［１７９］〜［１８５］のいずれか１項に記載の方法。
［１８７］  生物学的試料に由来する免疫細胞の集団が、１以上の生物学的試料に由来する免疫細胞の集団をそれぞれ含む２つ以上の試料を含む、項目［１７９］〜［１８６］のいずれか１項に記載の方法。
［１８８］  ２つ以上の試料が、２つ以上の試料標識により標識される、項目［１８７］に記載の方法。
［１８９］  発現の決定及び結合の決定が、蛍光活性化細胞分取（ＦＡＣＳ）を含む、項目［１７９］〜［１８８］のいずれか１項に記載の方法。
［１９０］  発現の決定及び結合の決定が、単一細胞解析を含む、項目［１７９］〜［１８９］のいずれか１項に記載の方法。
［１９１］  発現の決定及び結合の決定が、１以上の細胞マーカーを発現し、かつ、ペプチド−ＭＨＣ複合体に結合する、免疫細胞の百分率を決定することを含む、項目［１７９］〜［１９０］のいずれか１項に記載の方法。
［１９２］  標識がフルオロフォアを含む、項目［１８６］又は［１８７］に記載の方法。
［１９３］  免疫細胞の集団が、項目［１］〜［５８］のいずれか１項に記載の組成物の免疫細胞の集団を代表する免疫細胞の集団を含む、項目［１７９］〜［１９２］のいずれか１項に記載の方法。
【実施例】
【０３２３】
[0410]本開示は、以下の具体例によってより詳細に記載される。以下の例は、例示を目的として提示されるものであり、いかなる形であれ、本発明を限定することは意図されない。当業者は、本発明に従う代替的な実施形態をもたらすように、変化させうるか、又は改変しうる、様々な、それほど重要ではないパラメータをたやすく認識するであろう。本明細書に列挙される全ての特許、特許出願、及び出版刊行物は、その全体が本明細書に援用される。
実施例の概要：
[0411]下記の実施例１及び２は、Ｔ細胞製造プロトコールの例（プロトコール１及びプロトコール２）である。例示的プロトコールの概略を図１Ａ及び図１Ｂに示す。実施例２１〜２３は、ＡＰＣを調製するためのステップと、これらの２つのプロトコールとを描示する。実施例１２及び１４〜１６、並びに表２〜５は、プロトコール１及び２から得られた結果をまとめる。実施例１３は、プロトコールの被験パラメータについて記載する。
【０３２４】
[0412]実施例３〜７及び２０は、プロトコール１及びプロトコール２を使用する、ＣＤ４＋メモリーＴ細胞の拡大、及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の誘導についての結果の例である。フローサイトメトリー解析の結果は、図２Ｂ、図５Ａ及び５Ｂ、図７、図１０、並びに図１２〜２３に示される。
【０３２５】
[0413]実施例８〜１１及び１６〜１９は、本明細書で記載される方法を使用して拡大又は誘導されたＴ細胞の、特異性、表現型、及び／又は機能について評価するのに使用されるアッセイの結果の例である。図２５は、Ｔ細胞の製造工程、並びにＴ細胞の特異性、表現型、及び／又は機能について評価する、これらのアッセイの使用についての一般的な概観を描示する。
【０３２６】
実施例１  Ｔ細胞製造プロトコール１
[0414]本実施例は、図１に例示されるＴ細胞製造プロトコール１についての例を提示する。
【０３２７】
[0415]材料：
ＤＣ培地（Ｃｅｌｌｇｅｎｉｘ）
ＣＤ１４マイクロビーズ、ヒト、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ：＃１３０−０５０−２０１
サイトカイン及び／又は増殖因子
Ｔ細胞培地（ＡＩＭ  Ｖ＋ＲＰＭＩ  １６４０  ｇｌｕｔａｍａｘ＋血清＋ＰｅｎＳｔｒｅｐ）
ペプチド原液：ペプチド１つ当たり１ｍＭずつ（ＨＩＶ  Ａ０２：５つ〜１０のペプチド、ＨＩＶ  Ｂ０７：５つ〜１０のペプチド、ＤＯＭ：４つ〜８つのペプチド、ＰＩＮ：６つ〜１２のペプチド）
[0416]ステップ１：ＤＣ調製のための単球の単離
１．  ＰＢＭＣの概数を計算して、各ドナーについて予測されるＤＣ収量に基づき、融解させる。
２．  ＰＢＭＣを融解させ、ＤＣ培地中に、１ｍＬ当たり約１×１０６〜１×１０８個の細胞を再懸濁させる。
３．  ベンゾナーゼ（１：１０００希釈率）を添加し、キャップを緩めたインキュベータ内に入れる。
４．  製造元のプロトコールに従い、ＣＤ１４＋単球エンリッチメントを実施する。
５．  エンリッチした細胞を、６ウェルプレート内の、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、及びｐｏｌｙＩ：Ｃから選択される１以上のサイトカイン及び／又は増殖因子を伴うＤＣ培地中、ウェル１つ当たり１×１０５〜１×１０７個で播種する。
【０３２８】
[0417]ステップ２：ペプチドのローディング及び成熟
１．  ＤＣを計数し、実験条件に従い、１５ｍＬの試験管に細胞を分割し；条件１つ当たりの細胞１〜１００万個とする。
２．  １２００ｒｐｍで５分間スピンし、５０〜４００μＬのＤＣ培地中に再懸濁させる。ペプチドを添加し、キャップを緩めたインキュベータ内に０．５〜３時間入れる。ペプチド１つ当たり１ｍＭの濃度のペプチドプールについて、体積を計算した。Ａ０２（５つのペプチド）及びＢ０７（５つのペプチド）の、ある体積の、各個別のプールを、ウェルごとに、ペプチド１つ当たり０．００１〜１００μＭの最終濃度で添加した。
３．  ０．５〜３時間後、成熟ミックスを含有する２００μＬ〜１．５ｍＬのＤＣ培地を添加し、細胞を２４ウェルプレートへ移す。
【０３２９】
成熟ミックスは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、及びｐｏｌｙＩ：Ｃから選択される１以上のサイトカインを含有する。
【０３３０】
[0418]ステップ３：長期刺激（ＬＴＳ）実験の準備
１．  全ての培地をＤＣプレートのウェルから注意深く除去し、各ウェルを、２４ウェル深型ウェルブロックの個別のウェルへ移す。
２．  各ウェルを０．５〜３ｍＬのＴ細胞培地で洗浄し、深型ウェルブロック内でＤＣ培地と組み合わせる。
３．  １００μＬ〜２ｍＬのＴ細胞培地を、各ウェルへ添加する。
４．  ＤＣを、１２００ｒｐｍで５分間スピンダウンする。
５．  全ての上清を除去し、ＤＣを１００μＬ〜２ｍＬのＴ細胞培地中に再懸濁させ、適正なウェルへと移し戻す。
６．  ＰＢＭＣをＴ細胞培地中で融解させ、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を伴うＴ細胞培地中、１ｍＬ当たりの細胞０．５×１０６〜４×１０６個で再懸濁させる。
７．  ０．５〜３ｍＬの調製されたＰＢＭＣを、各ウェルへと添加する。
【０３３１】
[0419]ステップ４：ＬＴＳの供給
培地が黄色である場合、グルコースメーターで点検する。グルコースが高濃度を維持する場合、ウェルの培養物にＩＬ−７及びＩＬ−１５を供給する。グルコースが低濃度である場合、細胞を６ウェルプレート（ウェル１つ当たり４ｍＬずつ）へと拡大し、ＩＬ−１５及びＩＬ−７を補充する。グルコースが極めて低濃度である場合、６ウェルプレート内のウェル１つ当たり６ｍＬへと拡大する。
【０３３２】
[0420]ステップ５：ＬＴＳの供給
１〜４日ごとに培養物に供給し、グルコース濃度が低下する場合は新鮮なＩＬ−１５／ＩＬ−７を追加し、培養物の体積を必要に応じて拡大する。
【０３３３】
[0421]ステップ６：再刺激
Ｔ細胞を計数し、ペプチドをロードしたＤＣの新たなバッチ上でステップ３から繰り返す。残りの細胞を解析のために凍結させる。
【０３３４】
[0422]ステップ７：ＬＴＳの供給
１〜５日ごとに培養物に供給する。
[0423]ステップ８：再刺激
Ｔ細胞を計数し、ペプチドをロードしたＤＣの新たなバッチ上でステップ３から繰り返す。残りの細胞を解析のために凍結させる。
【０３３５】
[0424]ステップ９：ＬＴＳの供給
１〜５日ごとに培養物に供給する。
[0425]ステップ１０
Ｔ細胞を計数し、解析のために凍結させる。
【０３３６】
実施例２  Ｔ細胞製造プロトコール２
[0426]このプロトコールは、実施例１で記載したプロトコールに対する代替物でありうる。
【０３３７】
[0427]実施例２は、図１に例示されるＴ細胞製造プロトコール（プロトコール２）についての例を提示する。
[0428]材料：
ＡＩＭ  Ｖ培地（インビトロジェン）
培地１（ＲＰＭＩ  １６４０  ｇｌｕｔａｍａｘ＋血清＋ＰｅｎＳｔｒｅｐ）
培地２（ＡＩＭ  Ｖ＋ＲＰＭＩ  １６４０  ｇｌｕｔａｍａｘ＋血清＋ＰｅｎＳｔｒｅｐ）
[0429]手順：
[0430]ステップ１：培地２に、１以上のサイトカインを伴う２４ウェルプレートの各ウェル内に、ＰＢＭＣ４００万個を播種する。１以上のサイトカインは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、及びｐｏｌｙＩ：Ｃから選択される。
【０３３８】
[0431]ステップ２：培地２におけるペプチドのローディング及び成熟
１．  それぞれのウェル内で、短鎖については０．００１〜１００μＭの最終濃度、長鎖については０．００１〜１００μＭの最終濃度で、目的の原液ペプチドプール（ペプチドなしの条件を除く）を作り、混合する。
２．  ０．５〜３時間インキュベートする。
３．  原液成熟カクテルを作り、インキュベーションの後で各ウェルへと添加し、混合する。成熟カクテルは、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４、ＦＬＴ３Ｌ、ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＦＮ−α、Ｒ８４８、ＬＰＳ、ｓｓ−ｒｎａ４０、及びｐｏｌｙＩ：Ｃから選択される１以上のサイトカインを含有する。
【０３３９】
[0432]ステップ３：ヒト血清を、各ウェルへ２．５〜２０体積％の最終濃度で添加し、混合する。
[0433]ステップ４：培地のうちの５０〜９０％を、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を補充した、新鮮な培地１で、各々、０．００５〜５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度へと、注意深く置きかえる。
【０３４０】
[0434]ステップ５：培地のうちの５０〜９０％を、ＩＬ−７及びＩＬ−１５を補充した、新鮮な培地１で、各々、０．００５〜５００ｎｇ／ｍＬの最終濃度へと、１〜５日ごとに、注意深く置きかえる。
【０３４１】
[0435]万一、供給しない日に、ウェルが、橙色〜黄色（清明な培地の場合における、グルコースのリードアウト）に変わる場合、既存培地のうちの、２５〜７５％を、新鮮な培地１及びＩＬ−７／ＩＬ−１５と交換する。
【０３４２】
[0436]ステップ６：計数し、凍結させる（又は以下のステップへと進んで、Ｔ細胞刺激を、プロトコール１の、ステップ８及び／又はステップ１０へ導く）。
[0437]ステップ１〜ステップ６の培養ステップにおいて、ペプチドをロードされたＤＣを、プロトコール１の「ステップ１」及び「ステップ２」における手順に従い、並列的に調製することができる。
【０３４３】
[0438]Ｔ細胞を計数し、Ｔ細胞を、ペプチドをロードしたＤＣの新たなバッチで刺激する。残りの細胞を、解析のために凍結させる。Ｔ細胞刺激手順は、プロトコール１の「ステップ３」における手順に従い実行することができる。
【０３４４】
[0439]ステップ７：Ｔ細胞を計数し、プロトコール１の「ステップ３」における、Ｔ細胞刺激手順を、ペプチドをロードしたＤＣの新たなバッチ上で繰り返す。残りの細胞を、解析のために凍結させる。
【０３４５】
[0440]ステップ８：Ｔ細胞を計数し、解析のために凍結させる。
実施例３  ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導
[0441]ヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用して、プロトコール１又はプロトコール２に従い、抗原特異的Ｔ細胞の誘導を実施した。ＣＤ８＋メモリーＴ細胞及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の誘導を、異なるプロトコールを使用して、Ｔ細胞を製造した後で解析した。細胞試料は、解析のための異なる時点において、採取することができる。ｐＭＨＣ多量体を使用して、誘導培養物中の、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の画分をモニタリングし、コンビナトリアルコーディングを使用することにより、複数のＴ細胞応答を、並列的に検出するのに使用した。図２は、プロトコール１（ｐｒｏｔ．１）及びプロトコール２（ｐｒｏｔ．２）を使用して、長鎖ペプチド又は短鎖ペプチドにより誘導された、抗原特異的ＣＤ８＋メモリーＴ細胞の画分を示す、例示的な結果を描示する。「バルク」とは、誘導のために使用される、Ｔ細胞を含有する試料が、全ＰＢＭＣであることを指し示す。「Ｔｒｅｇ−」とは、誘導のために使用される、Ｔ細胞を含有する試料が、ＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させたＰＢＭＣであることを指し示す。図３は、短期の刺激又は誘導（本実施例における培養の長さは、刺激の開始から計算する）の後で、フローサイトメトリーにより解析される、ＧＡＳ７ペプチドに対して応答した、抗原特異的ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の画分を示す、Ｔ細胞応答アッセイの例示的な結果を描示する。抗原特異的メモリーＴ細胞、及びナイーブＰＩＮ特異的Ｔ細胞の画分の増大は、短期の刺激の後で観察することができる。
【０３４６】
実施例４  ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導
[0442]ＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導を、異なるプロトコールを使用して、Ｔ細胞を製造した後で解析した。誘導されたＴ細胞を、試験ウェル内の、異なる抗原ペプチドと共にインキュベートし、ペプチドに対して応答したＴ細胞の画分を、フローサイトメトリーにより解析した。ｐＭＨＣ多量体を使用して、誘導培養物中の、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の画分をモニタリングし、コンビナトリアルコーディングを使用することにより、複数のＴ細胞応答を、並列的に検出するのに使用した。ヒット率を使用して、Ｔ細胞が、抗原ペプチドに対して、どのくらい応答性であるのかについて描示することができる。ヒット率は、試験ウェルの総数で除した、陽性応答試験ウェルの数として規定される。実験は、２連で行い、ヒット率は、２連ウェル内で確認した。図４は、プロトコール１（ｐｒｏｔ．１）及びプロトコール２（ｐｒｏｔ．２）を使用する誘導の後で、ＨＩＶ短鎖ペプチド、ＰＩＮ（previously identified neoantigen）短鎖ペプチド、又はＰＩＮ長鎖ペプチドにより誘導された、ＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を示す結果の例を描示する。「全ＰＢＭＣ」とは、誘導のために使用される、Ｔ細胞を含有する試料が、全ＰＢＭＣであることを指し示す。「ＣＤ２５−ＰＢＭＣ」とは、誘導のために使用される、Ｔ細胞を含有する試料が、ＣＤ２５＋細胞を枯渇させたＰＢＭＣであることを指し示す。短期的誘導及び長期的誘導の両方が示される。図６は、２例のヒトドナーに由来するＰＢＭＣ試料を使用して、長期誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を示す、例示的な結果を描示する。
【０３４７】
実施例５  ＣＤ４＋Ｔ細胞の応答
[0443]ＰＩＮ（previously identified neoantigen）に対するＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける誘導プロトコールを使用して誘導することができる。本実施例では、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、ＩＦＮγ産生を、抗原特異的にモニタリングすることにより同定した。図１０は、このようなフローサイトメトリー解析の代表例を示す。最後に、突然変異体ペプチド及び非野生型ペプチドに対する、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の特異性を、突然変異体ペプチド又は野生型ペプチドを伴う刺激で誘導されたＴ細胞集団により示した（図１１）。
【０３４８】
実施例６  ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導
[0444]ナイーブＣＤ８＋Ｔ細胞の誘導は、プロトコール１又はプロトコール２を使用する、Ｔ細胞の製造の後で、フローサイトメトリーにより解析した。ＰＢＭＣ試料は、ヒトドナー１又はヒトドナー２に由来し、全ＰＢＭＣ又はＣＤ２５枯渇ＰＢＭＣであった。細胞試料を、図１におけるプロトコールに従い、短期又は長期にわたる誘導の後で解析した。誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞のナイーブＣＤ８＋応答を、異なるペプチドに対して解析し、図１２〜２３にプロットした。
【０３４９】
実施例７  ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の応答
[0445]実施例１におけるＴ細胞製造プロトコールを使用して、ナイーブコンパートメントからのＣＤ８＋Ｔ細胞応答を成功裏に誘導することができる。図７は、２ラウンドの刺激の後に、健常ドナーにおける突然変異エピトープに対して発生させた、２つのＣＤ８＋Ｔ細胞応答についての、代表的なフロープロットを示す。さらに、メモリーコンパートメントからのＣＤ８＋Ｔ細胞応答も、高数まで拡大することができる。図８Ａに示される代表例では、最大で３ラウンドにわたる刺激の後、全ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの、およそ５０％は、免疫優性エピトープである、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＥＢＶ  ＹＶＬ、ＥＢＶ  ＢＭＬＦ１、及びＭａｒｔ−１に特異的であった。誘導されたＣＤ８＋メモリー応答は、ペプチドリコールアッセイにおいて、多機能性を裏付ける（脱顆粒及びサイトカインの放出、図８Ｂ）。
【０３５０】
実施例８  Ｔ細胞についてのフローサイトメトリー解析
[0446]図５Ａは、プロトコール２を使用して、図に表示される条件下において誘導された、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞のＭＥ−１応答についての、例示的なフローサイトメトリー解析を描示する。図５Ｂは、図に表示される条件下において誘導された、ＣＤ８＋ナイーブＴ細胞のＭＥ−１応答についての、フローサイトメトリー解析の例を描示する。ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの１２．６％が、長期にわたる誘導の後で、ＭＥ−１に特異的であることを観察した。
【０３５１】
実施例９  誘導されたＴ細胞についての細胞傷害作用アッセイ
[0447]細胞傷害作用アッセイを使用して、誘導されたＴ細胞培養物が、発現する腫瘍株を死滅させうるのかどうかについて評価した。本実施例では、生存腫瘍細胞上及び死滅腫瘍細胞上の、活性カスパーゼ３の発現を測定して、早期の細胞死及び死滅腫瘍細胞を定量した。図９では、誘導されたＣＤ８＋メモリー応答は、発現する腫瘍標的を死滅させることが可能であった。
【０３５２】
実施例１０  作出されたＣＤ８＋Ｔ細胞についての表現型解析
実施例１で作製したＣＤ８＋Ｔ細胞系は、表現型の発現、サイトカインプロファイル、及び自家標的細胞に対する、特異的細胞傷害活性について特徴づけられうる。表現型の発現を解析するために、各培養物のＴ細胞１×１０４〜１×１０６個を、０．１〜１０％ＦＢＳ及び０．１％のアジドナトリウムを含有するＰＢＳ（ＦＢＳ−ＰＢＳ）中で洗浄し、希釈率を１：１００とする、蛍光色素で標識した抗体（ＣＤ４５ＲＡ及びＣＤ６２Ｌ）を含有するＦＢＳ−ＰＢＳ中に再懸濁させることができる。氷上におけるインキュベーションの後、細胞を洗浄し、フローサイトメトリー解析のために固定する。選択されたＣＤ８＋Ｔ細胞培養物が、ＣＤ６２Ｌを発現するが、ＣＤ４５ＲＡを発現しない場合、多様なペプチドに対するそれらの反応性に関わらず、これは、選択されたＴ細胞培養物が、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞サブセットに属することを指し示しうる。
【０３５３】
実施例１１  ＣＤ８＋Ｔ細胞によるサイトカイン産生
[0448]ＣＤ８＋Ｔ細胞培養物のサイトカインプロファイルを解析することができる。Ｔ細胞培養物には、まず、抗原ペプチドでパルスされた自家ＡＰＣによりチャレンジする。サイトカインプロファイルは、ＥＬＩＳＡキット（ファーミンジェン、カリフォルニア州サンディエゴ）を使用して、定量的に決定する。マイクロ滴定プレート（９６ウェル、ＮＵＮＣ  Ｍａｘｉｓｏｒｐ）を、４℃で、ウェル１つ当たり０．２〜４μｇのヒトサイトカイン（ＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＴＮＦ−α、ＩＦＮ−γ）に対する、精製されたマウス捕捉モノクローナル抗体（ファーミンジェン）により、一晩コーティングする。プレートを洗浄し、非特異的結合部位を、１０％（ｗ／ｖ）ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）で０．５〜３時間飽和させ、その後洗浄した。上清及びサイトカイン標準物質を、ＰＢＳで希釈し、２連のウェルに添加する。プレートを、３７℃で、１〜３時間インキュベートし、その後、ＰＢＳ−Ｔにより洗浄する。マッチさせたビオチン化検出抗体を、各ウェルへと添加し、室温で、１〜３時間インキュベートする。洗浄の後、アビジンコンジュゲート西洋ワサビペルオキシダーゼを添加し、０．５〜３時間インキュベートする。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ、シグマ）を、発色のための基質として使用する。光学濃度は、ＥＬＩＳＡリーダー（バイオ・ラッド  ラボラトリーズ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）を使用して、４５０ｎｍで測定し、サイトカイン濃度は、２重の８点検量線を使用して、マイクロプレート用コンピュータソフトウェア（バイオ・ラッド）により定量する。
【０３５４】
実施例１２  プロトコール１及びプロトコール２：概要
【０３５５】
【表１】
2021502414.tif 000003
【０３５６】
実施例１３  プロトコール１及び２のパラメータ検査
[0449]プロトコールのパラメータを検査するための例示的実験は、プロトコール１を、患者試料中、小スケールで検査することでありうる。プロトコールのパラメータを検査するための、別の例示的実験は、ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ８＋Ｔ細胞の機能性を検査すること、抗原特異的細胞を分取すること、及び単一細胞ＲＮＡｓｅｑにより特徴付けることを含む、以前のバッチ内で作出されたＴ細胞生成物を特徴付けることでありうる。プロトコールのパラメータを検査するための、別の例示的実験は、ＤＣ調製時に、ｐｏｌｙ−ＩＣＬＣ／抗ＣＤ４０Ｌの添加について検査し、Ｔ細胞のエンリッチメントを定量することでありうる。プロトコールのパラメータを検査するための、別の例示的実験は、誘導されたＣＤ８＋ナイーブＴ細胞応答の機能性について検査することであって、殺滅アッセイにおいて、抗原特異的細胞傷害作用について評価すること、より広範なフローパネルにより、ペプチドリコールアッセイを実施して、分化及び枯渇を測定すること、ヒットのサブセットについて、感度（ペプチド滴定）及び特異度（ＷＴ対突然変異体；プールデコンボリューション）を決定すること、及びＣＤ８＋についてエンリッチして、抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞に由来する、バイスタンダー効果の可能性を除去することを含む、検査することでありうる。プロトコールのパラメータを検査するための、別の例示的実験は、機能性を精査すること、ヒットのサブセットについて、感度（ペプチド滴定）及び特異度（ＷＴ対突然変異体；プールデコンボリューション）を決定すること、分化及び枯渇についてのフローパネルによるリコールアッセイを実施して、表現型を、よりよく理解することでありうる。プロトコールのパラメータを検査するための、別の例示的実験は、抗原特異的Ｔ細胞（ＣＤ８＋メモリー、ＣＤ８＋ナイーブ、ＣＤ４＋ナイーブ）を分取し、単一細胞ＲＮＡｓｅｑによりプロファイリングすることであって、異なる誘導の表現型を比較すること、異なるコンパートメントからの誘導の表現型を比較すること、反応速度を検討することを含む、プロファイリングすることでありうる。
【０３５７】
実施例１４  ＣＤ１４及び／又はＣＤ２５を発現する細胞を枯渇させたＴ細胞インプットは、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ナイーブＴ細胞の誘導を改善する
[0450]下記の表２は、ＣＤ１４−／ＣＤ２５−枯渇が、ＣＤ８＋ナイーブのヒット率を増大させ、一貫したＣＤ４＋のヒット率を有しうることを裏付ける、プロトコール１によるＴ細胞調製法からの結果を示す。
【０３５８】
【表２】
2021502414.tif 000004
【０３５９】
実施例１５  プロトコール１及びプロトコール２の使用により著明に改善される、ＣＤ８＋ナイーブの誘導
[0451]下記の表３Ａ及び３Ｂは、本明細書で記載される、プロトコール１及びプロトコール２によるＴ細胞調製法の両方からの結果を示す。２例の被験ヒトドナーにおいて、ＣＤ８＋ナイーブの誘導は、ＣＤ２５を発現する細胞の枯渇、又はＣＤ２５及びＣＤ１４を発現する細胞の枯渇を使用した場合に、ＣＤ１４を発現する細胞の枯渇を使用する場合と比較して、著明に改善された。ＣＤ８＋ナイーブの誘導はまた、ＦＬＴ３Ｌ刺激を使用した場合にも、著明に改善された。
【０３６０】
【表３】
2021502414.tif 000005
【０３６１】
【表４】
2021502414.tif 000006
【０３６２】
実施例１６  ＵＶ媒介性ペプチド交換アッセイ
[0452]条件つきリガンドの、ＵＶ媒介性切断は、時間依存性でありうる。下記に記載した設定で、ペプチド切断は、１分後に検出することができ、およそ１５分後に、本質的に完了しうる。条件つきリガンドの、目的のペプチドとの、最適の交換を確実にするには、通常、３０〜６０分間のインキュベーション時間を使用することができる。ニトロフェニル部分及び反応生成物のいずれも、長波長のＵＶ光を吸収しうるので、タンパク質濃度は、ＵＶ媒介性切断の速度に影響を及ぼしうる。加えて、経路長も、反応速度に影響しうる。ＵＶ曝露時に形成される、空の、ペプチド受容性ＭＨＣ分子は、目的のＭＨＣリガンドの存在下で、ＵＶ媒介性切断を実施することにより、レスキューすることができる。大半の実験では、ＭＨＣに対して、１００倍モル過剰量のペプチドを使用する。ＵＶ誘導性ペプチド交換は、２５μｇ／ｍＬの、ＵＶ感受性ＭＨＣクラスＩ複合体を使用して、規定通りに実施する。しかし、ペプチド交換反応は、最大で１００〜２００μｇ／ｍＬのＭＨＣクラスＩ濃度により実施することもできる。
【０３６３】
[0453]材料：
９６ウェルプレート（カタログ番号：６５１２０１；Ｖ  ｓｈａｒｐ  ９６ウェルポリプロピレンマイクロプレート、Ｇｒｅｉｎｅｒ  Ｂｉｏ−ｏｎｅ）
２×８Ｗ、３６６ｎｍ、長波ＵＶ型ＵＶランプ（カタログ番号：０２２．９１１５、ＣＡＭＡＧ）又は２×１５Ｗ、３６５ｎｍ、ｂｌａｃｋｌｉｇｈｔ  ｂｌｕｅ  ｔｕｂｅｓを伴うＵｖｉｔｅｃ  ｔｕｂｅ  ｌｉｇｈｔ（カタログ番号：ＬＩ２１５ＢＬＢ；寸法：Ｌ×Ｗ×Ｈ＝５０５×１４０×１１７ｍｍ）を装着された、３６６ｎｍ  ＵＶランプ用ＣＡＭＡＧ  ＵＶ  Ｃａｂｉｎｅｔ  ３（モデル：０２２．９０７０、ＣＡＭＡＧ）
マイクロ滴定プレート用の回転子を伴う遠心分離機
[0454]手順：
[0455]１．  ９６ウェルプレート内の各ウェルへと、以下の試薬を添加する。
【０３６４】
【表５】
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【０３６５】
[0456]２．  ＵＶランプと、試料との間の距離をおよそ５ｃｍとして、９６ウェルプレートを、ＵＶランプ（３６６ｎｍ）下に１時間置く。
[0457]３．  プレートを、３，３００ｇで、５分間スピンする。後段の適用のために、１００μＬの上清を（プレートを、ペレットの移入を回避する角度に保つ）、新たな９６ウェルプレートへと移す。
【０３６６】
実施例１７  蛍光色素コンジュゲートｐＭＨＣ多量体をアセンブルする
[0458]ＭＨＣクラスＩ複合体を、フルオロフォアで標識したストレプトアビジンと共に複合体化させて、Ｔ細胞解析のための、ＭＨＣクラスＩ４量体を形成することができる。一般に使用されるフルオロフォアは、アロフィコシアニン及びフィコエリトリンを含み、下記では、これらのコンジュゲートを伴う、ＭＨＣ多量体の形成について記載する。しかし、Ｔ細胞を検出するための、ＭＨＣ多量体を調製するのに、ストレプトアビジンでコーティングした量子ドットもまた、使用することができる。
【０３６７】
[0459]材料：
１ｍｇ／ｍＬのＰＥ−ストレプトアビジン溶液（カタログ番号：Ｓ８６６、モレキュラープローブ）又は１ｍｇ／ｍＬのＡＰＣストレプトアビジン溶液（カタログ番号：Ｓ８６８、モレキュラープローブ）
ウェル１つ当たり１００μＬ中に、２５μｇ／ｍＬのｐＭＨＣを含有する、交換されるＭＨＣクラスＩ複合体を伴うマイクロ滴定プレート。これは、ウェル１つ当たり、２．５μｇ又は０．０５ナノモルのＭＨＣクラスＩに対応する。
【０３６８】
[0460]手順：
[0461]１．  ＰＢＳ中に２７μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＰＥ、又はＰＢＳ中に１４．６μｇ／ｍＬのストレプトアビジン−ＡＰＣの希釈液を作出し、ＭＨＣクラスＩの各ウェルに、１００μＬずつを調製する。
【０３６９】
[0462]２．  ２５μＬずつ、１０分間隔で、４回にわたる逐次的添加により、ストレプトアビジン−ＰＥ又はストレプトアビジン−ＡＰＣを、ＭＨＣクラスＩへと添加する。
実施例１８  ＭＨＣ多量体のコンビナトリアルコーディング
[0463]ＵＶ媒介性ＭＨＣペプチド交換
[0464]１．  ビオチン化ｐ×ＭＨＣ複合体の原液を、氷上で融解させる。
【０３７０】
[0465]２．  目的のビオチン化ｐ×ＭＨＣ複合体を、ＰＢＳ中に、２００μｇ／ｍＬへと希釈する。交換反応１回当たり６０μＬの体積が必要とされる。ｐＭＨＣ複合体を、Ｑｄｏｔ５８５へとコンジュゲートさせるには、交換反応１回当たり８０μＬが必要とされる。
【０３７１】
[0466]３．  ペプチド原液を、ＰＢＳ中に、４００μＭへと希釈する。ペプチド１つ当たり最低７０μＬずつを調製するが；Ｑｄｏｔ５８５へとコンジュゲートさせるｐＭＨＣ複合体を作成するのに使用されるペプチドには、ペプチド１つ当たり最低９０μＬずつを調製する。
【０３７２】
[0467]４．  Ｖ字底の９６ウェルポリプロピレンマイクロプレート内で、選び出された対立遺伝子を有する、２００μｇ／ｍＬのｐ×ＭＨＣ  ６０μＬと、ウェル１つ当たり４００μＭのペプチド溶液６０μＬとを混合する（最終濃度：１００μｇ／ｍＬのｐ×ＭＨＣ及び２００μＭのペプチド）。ｐＭＨＣ複合体を、Ｑｄｏｔ５８５へとコンジュゲートさせるには、２００μｇ／ｍＬのｐ×ＭＨＣ  ８０μＬと、４００μＭのペプチド溶液８０μＬとを混合する。
【０３７３】
[0468]５．  室温で１時間、９６ウェルマイクロプレートを、ＵＶ光（約３６６ｎｍ）へと曝露する。ＵＶランプまでの距離は、２〜５ｃｍとする。
[0469]６．  ３，３００ｇ、室温で５分間、プレートを遠心分離する。
【０３７４】
[0470]７．  休止点が含まれる場合は、ステップ６を繰り返し、２×５０μＬの上清を、２つの未使用のＶ字底の９６ウェルポリプロピレンマイクロプレートへと移し、それらを氷上に保つ。ｐＭＨＣ複合体を、Ｑｄｏｔ５８５へとコンジュゲートさせるには、２×７０μＬを移す。凝集物の移入は、潜在的に、最終的なＭＨＣ多量体染色のバックグラウンドを増大させるので、底部のペレット（目視できないことが多い）を移さないように注意する。
【０３７５】
[0471]８．  蛍光色素−ストレプトアビジンコンジュゲートへのコンジュゲーションにより、ｐＭＨＣ単量体を多量体化する。下記に、示差的コンジュゲーションについて記載する：Ｑｄｏｔ６０５−ストレプトアビジン、Ｑｄｏｔ６２５−ストレプトアビジン、Ｑｄｏｔ６５５−ストレプトアビジン、又はＱｄｏｔ７０５−ストレプトアビジンへのコンジュゲーションのための選択肢Ａ；Ｑｄｏｔ５８５−ストレプトアビジンへのコンジュゲーションのための選択肢Ｂ；及びＰＥ−ストレプトアビジン、ＡＰＣ−ストレプトアビジン、又はＰＥ−Ｃｙ７−ストレプトアビジンへのコンジュゲーションのための選択肢Ｃ。
【０３７６】
[0472]（Ａ）Ｑｄｏｔ６０５−ストレプトアビジン、６２５−ストレプトアビジン、６５５−ストレプトアビジン、又は７０５−ストレプトアビジンへのコンジュゲーション：（ｉ）ｐＭＨＣ単量体５０μＬ当たり、３．５μＬのＱｄｏｔ−ストレプトアビジンコンジュゲート（原液濃度１μＭ）を添加する（６６ｎＭの最終濃度まで）。
【０３７７】
[0473]（Ｂ）Ｑｄｏｔ５８５−ストレプトアビジンへのコンジュゲーション：（ｉ）ｐＭＨＣ単量体７０μＬ当たり、４．９μＬのＱｄｏｔ５８５−ストレプトアビジンコンジュゲート（原液濃度１μＭ）を添加する（６６ｎＭの最終濃度まで）。
【０３７８】
[0474]（Ｃ）ＰＥ−ストレプトアビジン、ＡＰＣ−ストレプトアビジン、又はＰＥ−Ｃｙ７−ストレプトアビジンへのコンジュゲーション：（ｉ）ｐＭＨＣ単量体５０μＬ当たり、４．６μＬのＰＥ−ストレプトアビジンコンジュゲート、ＡＰＣ−ストレプトアビジンコンジュゲート、又はＰＥ−Ｃｙ７−ストレプトアビジンコンジュゲート（原液濃度２００μｇ／ｍＬ）を添加する（１６．８μｇ／ｍＬの最終濃度まで）。
【０３７９】
[0475]９．  ウェルを混合し、氷上で、３０分間放置して、コンジュゲートさせる。
[0476]１０．  Ｄ−ビオチン及びＮａＮ３を、２５μＭのＤ−ビオチン及び０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮａＮ３の最終濃度まで添加する。２０倍の原液（０．４％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮａＮ３を伴う５００μＭのＤ−ビオチン）２．５μＬを、各ウェルへと添加することにより、これを行うが；ＭＨＣ多量体を、Ｑｄｏｔ５８５へとコンジュゲートさせるためには、３．５μＬを、各ウェルへと添加する。ウェルを混合し、氷上において、２０分間インキュベートする。
【０３８０】
[0477]１１．  ２５μＭのＤ−ビオチン及び０．０２％（ｗｔ／ｖｏｌ）のＮａＮ３を含有する、５０μＬのＰＢＳをＰＥ、ＡＰＣ、又はＰＥ−Ｃｙ７へとコンジュゲートさせたＭＨＣ多量体へと添加する（２倍の希釈率）。
【０３８１】
[0478]１２．  異なる複合体を混合する。混合する場合に、Ｑｄｏｔ５８５の、他のあらゆる色複合体に対する、２：１の比を使用する。他の全ての色複合体を、１：１の比で混合する。
ＭＨＣ多量体によるＴ細胞染色
[0479]１３．  ２７色全ての組合せについて、ＭＨＣ多量体を混合して、使用準備のできた１例ずつの試料を得、これを、４℃、３，３００ｇで、５分間遠心分離し、上清を移す。各Ｔ細胞染色のために、合計で、５４μＬの上清が要求される（すなわち、ミックス中に存在する、各個別のｐＭＨＣ複合体について、２μＬずつ）。
【０３８２】
[0480]１４．  ＰＢＭＣ試料（又は他の適切なＴ細胞試料）を融解させ、それらを、ＲＰＭＩで、２回洗浄する。融解時に、ＤＮアーゼで処置して、細胞の固着を低減する（例えば、細胞を、０．０２５ｍｇ／ｍＬのＰｕｌｍｏｚｙｍｅ及び２．５ｍＭのＭｇＣｌ２を含有する培地中で融解させることにより）ことが推奨される。
【０３８３】
[0481]１５．  細胞を、２％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）のＦＢＳ（ＦＡＣＳ緩衝液）を伴うＰＢＳ中に再懸濁させ、これらを、９６ウェルポリスチレンＵ字底マイクロプレートへと、ウェル１つ当たり２００μＬずつのＦＡＣＳ緩衝液中の細胞、最大で３×１０６個で分配する。
【０３８４】
[0482]１６．  プレートを、４９０ｇ、室温で、５分間スピンする。
[0483]１７．  プレートを、上下逆にして軽く叩くことにより、緩衝液を廃棄する（細胞は、ウェルの底部に、ペレットとして残される）。
【０３８５】
[0484]１８．  ステップ１３によるＭＨＣ多量体５４μＬを添加し、よく混合する。
[0485]１９．  ３７℃で、１５分間インキュベートする。
[0486]２０．  プレートを、氷上へと移動させ、５倍濃度の原液からの抗体ミックス２０μＬを添加する。
【０３８６】
[0487]２１．  希釈率を４０倍とする近赤外線死細胞染料４μＬを添加し、よく混合する。
[0488]２２．  氷上で３０分間インキュベートする。
【０３８７】
[0489]２３．  プレートを、４９０ｇ、４℃で、５分間スピンする。
[0490]２４．  プレートを、上下逆にして軽く叩くことにより、上清を廃棄する。
[0491]２５．  ＦＡＣＳ緩衝液２００μＬで、２回洗浄する（４９０ｇ、４℃で、５分間ずつ、２回遠心分離し、各スピンの後で、プレートを、上下逆にして軽く叩いて、上清を除去する）。
【０３８８】
[0492]２６．  ペレットを、５０〜１００μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させ、これを、１．４ｍＬ又は５ｍＬのＦＡＣＳ用試験管へと移す。こうして、試料は、フローサイトメーター上の取得の準備ができた。
単色補正（compensation）対照
[0493]２７．  １００μＬのＦＡＣＳ緩衝液と、１滴の陰性補正ビーズとを、１１本のＦＡＣＳ試験管へと添加する（番号：１〜１１）。
【０３８９】
[0494]２８．  １滴の抗マウスＩｇ−κ補正ビーズを、ステップ２７による試験管１〜１０へと添加し、１滴のＡｒＣアミン反応性ビーズを、新たな試験管へと添加する（番号：１２）。
【０３９０】
[0495]２９．  １ｍｇ／ｍＬの抗ＣＤ８−ビオチン５μＬを、試験管１〜８へと添加し、混合する。
[0496]３０．  試験管１〜８を、氷上で２０分間インキュベートする。
【０３９１】
[0497]３１．  試験管１〜８を、２ｍＬずつのＦＡＣＳ緩衝液で、２回洗浄する（４９０ｇ、４℃で、５分間ずつ遠心分離する）。
[0498]３２．  １μＬの近赤外線死細胞染料を、試験管１２（ステップ２８による）へと添加し；暗所内、室温で３０分間、混合及びインキュベートする。
【０３９２】
[0499]３３．  ストレプトアビジン−蛍光色素コンジュゲートを、１０倍に希釈し（Ｑｄｏｔ５８５を除く）、５μＬずつを、試験管１〜７へと添加し、１μＬの非希釈Ｑｄｏｔ５８５−ストレプトアビジンを、試験管８へと添加し、次いで、暗所内、氷上で２０分間インキュベートする。
【０３９３】
[0500]３４．  ５μＬのＦＩＴＣ抗体（ダンプチャネル抗体のうちの１つを使用する）又は５μＬのＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ  ７００抗ＣＤ８ａ抗体を、試験管９及び１０（ステップ２８による）へと添加し；暗所内、氷上で２０分間インキュベートする。
【０３９４】
[0501]３５．  試験管１〜１１を、２ｍＬずつのＦＡＣＳ緩衝液で、２回洗浄し、試験管１２を、２ｍＬずつのＰＢＳで、２回洗浄する（４９０ｇ、４℃で、５分間遠心分離する）。
【０３９５】
[0502]３６．  全ての試験管を、１５０μＬのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁させる。１滴のＡｒＣアミン反応性ビーズを、試験管１２へと添加し、混合する。補正（compensation）対照は、フローサイトメーター上の取得の準備ができた。
ゲーティング戦略
[0503]３７．  まず、リンパ球にゲートをかけ、その後、単一細胞（ＦＳＣ−α、ＦＳＣ−Ｗ）、生細胞、ダンプチャネル陰性細胞、及びＣＤ８＋細胞にゲートをかける。
【０３９６】
[0504]３８．  ８つの異なるＭＨＣ多量体チャネル内の、陽性のイベントを規定する、個別のゲートをかける。
[0505]３９．  ８つのＭＨＣ多量体陽性のゲートを反転させ、各ＭＨＣ多量体チャネルについて、ＣＤ８＋及びＭＨＣ多量体陰性細胞を選択する、８つのゲートを得る。
【０３９７】
[0506]４０．  ２つのＭＨＣ多量体陽性集団についてのゲートを、他の６つのＭＨＣ多量体集団の各々についての反転ゲートと交差させる。このゲートの組合せは、２つであり、２つだけのＭＨＣ多量体チャネル内で陽性であるＣＤ８＋細胞を選択する（すなわち、細胞が、１つ又は３つ若しくはこれを超えるＭＨＣ多量体チャネル内で、陽性である場合、これをゲートから外す）。このようなゲートの例は、ＰＥ＋及びＡＰＣ＋及びＰＥ−Ｃｙ７−及びＱｄｏｔ５８５−及びＱｄｏｔ６０５−及びＱｄｏｔ６２５−及びＱｄｏｔ６５５−及びＱｄｏｔ７０５−である。
【０３９８】
[0507]４１．  これらの交差ゲート（ステップ４０に記載する）を、ＭＨＣ多量体の、２８全ての可能な２色の組合せについて作成する。
[0508]４２．  ステップ４１による、２８のゲート全てを接続する（例えば、ゲート１又はゲート２又は・・・又はゲート２８）。
【０３９９】
[0509]４３．  ステップ３９による、８つの反転ゲートを交差させる（ＰＥ−及びＡＰＣ−及びＰＥ−Ｃｙ７−及びＱｄｏｔ５８５−及びＱｄｏｔ６０５−及びＱｄｏｔ６２５−及びＱｄｏｔ６５５−及びＱｄｏｔ７０５−）。
【０４００】
[0510]４４．  ステップ４２及び４３による２つのゲートを接続する。
[0511]４５．  全ての可能な２色コードを伴い、ステップ４４においてゲートをかけられたイベントを示す、２８のドットプロットを作成する。これらのプロットは、全てのＭＨＣ多量体について陰性であるか、又は２つのＭＨＣ多量体について陽性であるＣＤ８＋細胞だけを示し；全てのバックグラウンドイベントは、ゲートから外す。
【０４０１】
[0512]４６．  また、全ての可能な２色コードを伴い、全てのＣＤ８＋細胞を示す、２８のドットプロットも作成する。これらのプロットは、試料中のバックグラウンドレベルを良好に指し示し、また、不適切な補正を明らかにするのにも使用されうる。応答を、バックグラウンドから分離するために、これらの「非ゲーティング」プロットを、ゲーティングプロットと比較することが推奨される。これは、とりわけ、低強度集団について重要でありうる。
【０４０２】
実施例１９  蛍光細胞バーコード化ホスホフロー
[0513]細胞のバーコード化を使用して、フローサイトメトリーにより、マルチプレックスの表現型解析及び機能解析を実施することができる。ホスホフローは、ＦＣＢによる標識付けを含む、わずかな改変により実施することができる。ホルムアルデヒドによる固定の後、試料を、表示濃度のＡｌｅｘａ  Ｆｌｕｏｒ又はＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｌｕｅのスクシンイミジルエステルを含有する、１００％、２０〜２５℃のメタノール（典型的に、細胞１０６個当たり５００μＬ）中に再懸濁させると、各試料は、異なる濃度の蛍光色素を受け取る。場合によって、試料を、メタノール中に再懸濁させ、次いで、ＤＭＳＯ中に溶解させた（典型的に、１：５０の希釈率で）ＦＣＢフルオロフォアを添加する。これは、９６ウェルプレートによる実験に必要な、ＤＭＳＯ中の、ＦＣＢ染色マトリックスの、あらかじめの調製及び保管を可能とするように行うことができる。２０〜２５℃で、１５分間にわたる標識付けの後、細胞を、染色培地（０．５％のＢＳＡと、０．０２％のアジドナトリウムとを含有する、リン酸緩衝生理食塩液（ｐＨ７．０））で、２回洗浄する。４℃以下で標識付けすることは、極めて低度の標識付け強度をもたらし、ＦＣＢ染色レベルの上昇を伴わずに、試料の、メタノール染色溶液中、−８０℃における保管を可能とする。
【０４０３】
[0514]示差的に標識された試料は、１つのＦＡＣＳ試験管又はウェルへと組み合わせ、結果として得られる体積が、１００μＬを超える場合は、再度ペレット化させる。組み合わされたバーコード化試料（典型的に、１００μＬ）を、リン酸化特異的抗体及び／又は表面マーカー抗体で染色し、洗浄し、フローサイトメトリーにより解析する。フローサイトメトリーは、４０５ｎｍ、４８８ｎｍ、及び６３３ｎｍのレーザー、並びに製造元のストックフィルターを装備した、ＢＤ  ＬＳＲ２フローサイトメーター上で、Ｃａｓｃａｄｅ  Ｙｅｌｌｏｗのための、４０５ｎｍの８角形バンドパスフィルターを、Ｑｕａｎｔｕｍ  Ｄｏｔ  ６０５を検出するための６１０／２０バンドパスフィルターで置きかえて実施することができる。
【０４０４】
実施例２０  ＣＤ４＋ナイーブの誘導
[0515]ＰＩＮペプチドを使用して、プロトコール１及び２を実行した。抗原特異的ＣＤ４＋ナイーブの誘導を評価した。結果は、下記の表４に見ることができる。
【０４０５】
【表６】
2021502414.tif 000008
【０４０６】
実施例２１  製造工程：ＤＣの導出
【０４０７】
【表７】
2021502414.tif 000009
【０４０８】
実施例２２  Ｔ細胞誘導プロトコール１
[0516]Ｔ細胞の誘導＃１
【０４０９】
【表８】
2021502414.tif 000010
【０４１０】
[0517]Ｔ細胞の誘導＃２
【０４１１】
【表９】
2021502414.tif 000011
【０４１２】
[0518]Ｔ細胞の誘導＃３
【０４１３】
【表１０】
2021502414.tif 000012
【０４１４】
[0519]採取及び低温保存
【０４１５】
【表１１】
2021502414.tif 000013
【０４１６】
実施例２３  Ｔ細胞誘導プロトコール２
[0520]Ｔ細胞の誘導＃１
【０４１７】
【表１２】
2021502414.tif 000014
【０４１８】
[0521]Ｔ細胞の誘導＃２
【０４１９】
【表１３】
2021502414.tif 000015
【０４２０】
[0522]Ｔ細胞の誘導＃３
【０４２１】
【表１４】
2021502414.tif 000016
【０４２２】
[0523]採取及び低温保存
【０４２３】
【表１５】
2021502414.tif 000017
【０４２４】
実施例２４  マルチプレックス、マルチパラメータのフローサイトメトリーを使用する、ＣＤ４＋及びＣＤ８＋ネオ抗原特異的Ｔ細胞応答の同時的検出及び機能的特徴付け
[0524]タンパク質をコードする遺伝子配列を変更する体細胞突然変異に由来するがん細胞内で生じるネオ抗原は、免疫療法のための魅力的標的として出現しつつある。ネオ抗原は、健常組織と対照的に、腫瘍細胞上で、固有に発現され、免疫系により、外来抗原として認識されて、免疫原性を増大させることがある。養子細胞療法における使用のための、ネオ抗原反応性Ｔ細胞生成物を作出する、ｅｘ  ｖｉｖｏにおける、複数のラウンドのＴ細胞刺激を介して、患者特異的ネオ抗原に対する、メモリーＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答並びにデノボＣＤ４＋及びＣＤ８＋Ｔ細胞応答を惹起するための、Ｔ細胞製造工程を開発した。刺激されたＴ細胞生成物の詳細な特徴付けを使用して、これらの工程が利用する、多くの潜在的な変数について調べることができる。
【０４２５】
[0525]Ｔ細胞の機能性及び／又は特異性についてプローブするために、抗原特異的Ｔ細胞応答を、同時に検出し、それらの大きさ及び機能を特徴付けるアッセイを開発した。このアッセイは、以下のステップを用いた。まず、Ｔ細胞−ＡＰＣ共培養物を使用して、抗原特異的Ｔ細胞内の反応性を誘発した。任意選択で、蛍光細胞バーコード化を使用する、試料のマルチプレックス化を用いた。抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞を同定し、Ｔ細胞の機能性について検討するために、ＦＡＣＳ解析を使用して、ペプチド−ＭＨＣ多量体の染色、並びにマルチパラメータの、細胞内及び／又は細胞表面の細胞マーカーの染色について、同時にプローブした。この最新式結アッセイの結果は、健常ドナーから誘導されたＴ細胞応答について研究するための、その適用を裏付けた。ペプチドに対して誘導されるネオ抗原特異的Ｔ細胞応答は、健常ドナーにおいて同定した。誘導されたＴ細胞応答の大きさ、特異性、及び機能性もまた比較した。図２５及び図２６は、Ｔ細胞試料についての、細胞マーカープロファイル及びＭＨＣ４量体染色の同時的解析のための例示的工程について描示する。
【０４２６】
[0526]略述すると、異なるＴ細胞試料を、異なる濃度の、異なる蛍光色素でバーコード化した（例えば、実施例１９を参照されたい）。各試料は、異なる濃度の蛍光色素、又は異なる濃度の、複数の色素の組合せを受け取った。試料を、リン酸緩衝生理食塩液（ＰＢＳ）中に再懸濁させ、次いで、ＤＭＳＯ中に溶解させた（典型的に、１：５０の希釈率で）フルオロフォアを、５μＭの最大最終濃度まで添加した。３７℃で、５分間にわたる標識付けの後、タンパク質含有培地（例えば、１０％のプールされたヒトＡＢ型血清を含有するＲＰＭＩ培地）を添加することにより、過剰な蛍光色素を消光させた。固有にバーコード化されたＴ細胞培養物に、上記で記載した、抗原ペプチドでパルスされた自家ＡＰＣによりチャレンジした。
【０４２７】
[0527]示差的に標識された試料は、１つのＦＡＣＳ試験管又はウェルへと組み合わせ、結果として得られる体積が、１００μＬを超える場合は、再度ペレット化させる。組み合わされたバーコード化試料（典型的に、１００μＬ）を、ＬＡＭＰ−１を含む表面マーカー抗体で染色し（例えば、実施例１１を参照されたい）、アセンブルされた蛍光色素コンジュゲートペプチド−ＭＨＣ多量体（例えば、上記の実施例１７及び１８を参照されたい）と共にインキュベートした。固定及び透過化の後、試料を、加えて、ＴＮＦ−α及びＩＦＮ−γを標的とする抗体で、細胞内染色した。
【０４２８】
[0528]次いで、組み合わされた、バーコード化Ｔ細胞試料についての、細胞マーカープロファイル及びＭＨＣ４量体染色を、フローサイトメーター上で、フローサイトメトリーにより、同時に解析した。Ｔ細胞試料についての、細胞マーカープロファイルと、ＭＨＣ４量体染色とを、個別に解析する、他の方法と異なり、本実施例で記載される、Ｔ細胞試料についての、細胞マーカープロファイルと、ＭＨＣ４量体染色との同時的解析は、抗原特異的であり、かつ、細胞マーカーの染色を増大させたＴ細胞の百分率についての情報を提示する。Ｔ細胞試料についての、細胞マーカープロファイルと、ＭＨＣ４量体染色とを、個別に解析する、他の方法は、抗原特異的である、試料のＴ細胞の百分率を決定し、細胞マーカーの染色を増大させたＴ細胞の百分率を、個別に決定することから、これらの頻度の相関を可能とするにとどまる。本実施例で記載される、Ｔ細胞試料についての、細胞マーカープロファイルと、ＭＨＣ４量体染色との同時的解析は、抗原特異的Ｔ細胞の頻度と、細胞マーカーの染色を増大させたＴ細胞の頻度との相関に依拠せず、抗原特異的であり、かつ、細胞マーカーの染色を増大させたＴ細胞の頻度を提示する。本実施例で記載される、Ｔ細胞試料についての、細胞マーカープロファイルと、ＭＨＣ４量体染色との同時的解析は、単一細胞レベルにおける、抗原特異的であり、かつ、細胞マーカーの染色を増大させた細胞の決定を可能とする。
【０４２９】
[0529]所与の誘導工程の成功について査定するために、リコール応答アッセイに続き、マルチプレックス、マルチパラメータのフローサイトメトリーパネル解析を使用した。誘導培養物から採取された試料を、固有の２色蛍光細胞バーコードで標識した。標識された細胞を、抗原をロードされたＤＣ上又はロードされていないＤＣ上で、一晩インキュベートして、抗原特異的細胞内の機能応答を刺激した。翌日、固有に標識された細胞を、下記の表に従い、抗体及び多量体による染色の前に組み合わせた。
【０４３０】
【表１６】
2021502414.tif 000018
【０４３１】
[0530]個別に、又は混合物として取得された標識試料により、マルチプレックス試料を、完全にデコンボリュートする能力を決定した（図２７Ａ）。固有に標識された試料を、他のバーコードとの、交差汚染を最小として〜交差汚染を伴わずに分解することができた。多量体染色による、抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞の検出は、試料のマルチプレックス化により維持した。ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＥＢＶ  ＢＲＬＦ１、ＥＢＶ  ＢＭＬＦ１、及び／又はＭＡＲＴ−１に特異的な、約２０％のＣＤ８＋Ｔ細胞を含有する誘導培養物の試料を分割し、９つの固有の２色バーコードで標識し、次いで、同じ２色の組合せ（ブリリアントバイオレット６５０［ＢＶ６５０］及びフィコエリトリン［ＰＥ］）で、４つの特異性全てを標的とする、４量体による染色のために組み合わせた（図２７Ｂ）。９つのバーコード全ては、同等な４量体染色パターンをもたらし、４量体＋細胞の頻度を検出した。
【０４３２】
[0531]デノボＣＤ４＋Ｔ細胞応答を含有する、２つの誘導培養物の試料はまた、リコール応答アッセイにおいて、バーコード化を伴わずに単独で、又は無関係の試料と混合しても解析した（図２８Ａ及び図２８Ｂ）。細胞から誘発される応答の機能及び大きさの数は、試料のバーコード化により、著明には変化しなかった。
【０４３３】
[0532]誘導されたＣＤ８＋メモリー応答の特異性及び機能性についての同時的解析は、ＣＭＶ  ｐｐ６５、ＭＡＲＴ−１、並びにＥＢＶＢＲＬＦ１及びＢＭＬＦ１のエピトープに対するＣＤ８＋メモリー応答を、出発健常ドナー素材中のＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの、０．２３％から、＞６０％へと引き上げうることを裏付けた（図２９Ａ）。
【０４３４】
[0533]ＣＤ８＋多量体＋細胞にあらかじめゲートをかけることにより、抗原特異的Ｔ細胞の機能を、選択的に精査した（図２９Ｂ）。細胞は、抗原をロードされたＤＣへの曝露時において、細胞傷害機能（表面におけるＣＤ１０７ａへの曝露）及びＩＦＮγの分泌を呈した。
【０４３５】
[0534]同じ培養物中で、複数の特異性を伴う、デノボで誘導されたＣＤ４＋応答の検出及び機能的特徴付けもまた裏付けられた。抗原特異的機能性は、誘導されたＣＤ４＋Ｔ細胞応答を同定するのに利用された（図３０Ａ）。示される例では、誘導は、ＨＩＶ陰性健常ドナーにおけるナイーブ標的である、１０のＨＩＶ由来エピトープを標的とする、４回の反復培養において実施された。抗原特異的応答は、４回の生物学的反復全てにおいて検出された。検出された応答のうちの３つは、誘導された応答の特異性を同定する、プールデコンボリューションによる、さらなる追跡のために選択された（図３０Ｂ）。各反復試験では、複数の応答が検出され、各場合に、同じ２つのエピトープ（ＨＩＶ＃５及びＨＩＶ＃７）が、大きさが最大の応答を誘導した。いかなる理論にも束縛されることを望まずに述べると、これは、ＭＨＣクラスＩＩハプロタイプに起因する、このドナーにおける、これらのエピトープの大きな免疫原性、又はナイーブレパートリー中の、これらのエピトープを標的とするＴ細胞の、大きな前駆体頻度を反映しうる。抗原に対する感受性は、ＤＣローディング時のペプチド滴定により、３つの選択された応答について決定された（図３０Ｃ）。ＨＩＶ＃５、ＨＩＶ＃６、及びＨＩＶ＃４に対する応答は、それぞれ、０．４５μＭ、０．４３μＭ、及び９．１μＭのＥＣ５０を裏付けた。
【０４３６】
実施例２５  Ｔ細胞製造プロトコール３
[0535]材料：
[0536]  ＡＩＭ  Ｖ培地（インビトロジェン）
[0537]ヒトＦＬＴ３Ｌ、前臨床グレード、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ製、＃１４１５−０５０；５０ｎｇ／μＬ原液
[0538]ＴＮＦ−α、前臨床グレード、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ製、＃１４０６−０５０；１０ｎｇ／μＬ原液
[0539]ＩＬ−１β、前臨床グレード、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ製、＃１４１１−０５０；１０ｎｇ／μＬ原液
[0540]ＰＧＥ１又はアルプロスタジル：チェコ共和国、Ｃａｙｍａｎ製；０．５μｇ／μＬ原液
[0541]Ｒ１０培地：ＲＰＭＩ  １６４０  ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ヒト血清＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ
[0542]２０／８０培地：１８％ＡＩＭ  Ｖ＋７２％ＲＰＭＩ  １６４０  ｇｌｕｔａｍａｘ＋１０％ヒト血清＋１％ＰｅｎＳｔｒｅｐ
[0543]ＩＬ７；５ｎｇ／μＬ原液
[0544]ＩＬ１５；５ｎｇ／μＬ原液
[0545]手順：
[0546]ステップ１：２ｍＬのＡＩＭ  Ｖ培地中にＦＬＴ３Ｌを伴う、２４ウェルプレートの各ウェルに、５００万個のＰＢＭＣ（又は目的の細胞）を播種する。
【０４３７】
[0547]ステップ２：ペプチドのローディング及び成熟（ＡＩＭ  Ｖ中の）
[0548]１．  それぞれのウェル内で、目的のペプチドプール（ペプチドなしの条件を除く）を、ＰＢＭＣ（又は目的の細胞）と混合する。
【０４３８】
[0549]２．  １時間インキュベートする。
[0550]３．  インキュベーションの後で、成熟カクテル（ＴＮＦ−α、ＩＬ−１β、ＰＧＥ１、及びＩＬ−７を含む）を、各ウェルへと添加（ｍｉｘ）する。
【０４３９】
[0551]ステップ３：ヒト血清を、各ウェルへと、１０体積％の最終濃度で添加し、混合する。
[0552]ステップ４：培地を、ＩＬ７＋ＩＬ１５を補充した、新鮮なＲＰＭＩ＋１０％ＨＳ培地で置きかえる。
【０４４０】
[0553]ステップ５：インキュベーション期間中、１〜６日ごとに、培地を、ＩＬ７＋ＩＬ１５を補充した、新鮮な２０／８０培地で置きかえる。
[0554]ステップ６：２ｍＬのＡＩＭ  Ｖ培地中にＦＬＴ３Ｌを伴う、未使用の６ウェルプレートの各ウェルに、５００万個のＰＢＭＣ（又は目的の細胞）を播種する。
【０４４１】
[0555]ステップ７：再刺激のためのペプチドのローディング及び成熟（未使用のプレート）
[0556]１．  それぞれのウェル内で、目的のペプチドプール（ペプチドなしの条件を除く）を、ＰＢＭＣ（又は目的の細胞）と混合する。
【０４４２】
[0557]２．  １時間インキュベートする。
[0558]３．  インキュベーションの後で、成熟カクテルを、各ウェルへと添加（ｍｉｘ）する。
【０４４３】
[0559]ステップ８：再刺激：
[0560]１．  第１の刺激ＦＬＴ３Ｌ培養物を計数し、５００万個の培養細胞を、未使用の再刺激プレートへと添加する。
【０４４４】
[0561]２．  培養物の体積を、５ｍＬ（ＡＩＭ  Ｖ）とし、５００ｕｌのヒト血清（１０体積％）を添加する。
[0562]ステップ９：３ｍｌの培地を除去し、ＩＬ７＋ＩＬ１５を補充した、６ｍｌのＲＰＭＩ＋１０％ＨＳ培地を添加する。
【０４４５】
[0563]ステップ１０：培地のうちの７５％を、ＩＬ７＋ＩＬ１５を補充した、新鮮な２０／８０培地で置きかえる。
[0564]ステップ１１：必要な場合、再刺激を繰り返す。
【０４４６】
実施例２６  Ｔ細胞製造プロトコール３を使用する実験データ
[0565]Ｔ細胞製造プロトコール３を使用して、Ｔ細胞を調製し、刺激されたＴ細胞を解析した。試料は、２例の、黒色腫を有する患者から得た。実施例２４で記載した、同様のアッセイを使用して、Ｔ細胞を解析した。図３４は、２例の、黒色腫を有する患者から誘導された、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を定量化する、ｐＭＨＣ多量体プロットを示す。本明細書で使用されるＮＥＯ−ＳＴＩＭは、Ｔ細胞製造プロトコールを指す。図３５は、１つ、２つ、３つ、又は４つの機能の組合せにより示される、黒色腫を伴う患者において誘導された、メモリー応答及びデノボ応答についての、多機能プロファイルのデータを示す。１以上の機能は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＤ１０７ａ、及び４−１ＢＢから選択される、１以上の因子の産生である。図３６は、黒色腫を伴う患者において、突然変異ペプチド及び野生型ペプチドに対して誘導される、メモリー応答及びデノボ応答の特異性を示す。図３７Ａ及び３７Ｂ及び３７Ｃは、ＣＤ８＋ＣＤ１０７ａ＋Ｔ細胞（上パネル）の頻度により定量される、黒色腫を伴う患者において誘導されるメモリー応答及びデノボ応答についての、細胞傷害プロファイルを示す。図３７Ａ及び３７Ｂ及び３７Ｃの下パネルは、ａＣＡＳ３＋腫瘍細胞の頻度により定量される、これらのＴ細胞応答による、標的細胞の殺滅を示す。図３８Ａは、黒色腫患者における、ネオ抗原特異的ＣＤ４＋Ｔ細胞応答の同定を示す。図３８Ｂは、図３８Ａで同定された、これらのＣＤ４＋Ｔ細胞応答の、突然変異ペプチド及び野生型ペプチドに対する特異性を示す。図３８Ｃは、１つ、２つ、３つ、又は４つの機能の組合せにより示される、これらのＣＤ４＋Ｔ細胞応答についての、多機能プロファイルを示す。１以上の機能は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＣＤ１０７ａ、及び４−１ＢＢから選択される、１以上の因子の産生である。
【０４４７】
実施例２７  Ｔ細胞製造プロトコール１又は２を使用する実験データ
[0566]Ｔ細胞は、Ｔ細胞製造プロトコール１を使用して、又は、代替物として、プロトコール２を使用して調製した。実施例２４で記載した、同様のアッセイを使用して、刺激されたＴ細胞を解析した。図３９は、１つ、２つ、又は３つの機能（例えば、１以上の機能は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、及びＣＤ１０７ａから選択される、１以上の因子の産生である）の組合せにより示される、エパカドスタットの添加を伴うか、又は伴わずに、２例の健常ドナー（例えば、ＨＤ６６及びＨＤ６３）において誘導された、メモリー応答の機能性を示す。図４０は、エパカドスタットの添加を伴うか、又は伴わずに、６回の反復誘導において誘導されたデノボＣＤ８＋Ｔ細胞応答（４例の健常ドナーで平均した「ヒット率」）のパーセントを示す。図４１Ａは、ＰＤ−１遮断抗体の添加を伴うか、又は伴わずに、本明細書で提示されるＴ細胞製造プロトコールによる誘導の後における、ドナーＨＤ５５からの抗原特異的細胞の絶対数を示す。図４１Ｂは、ＰＤ−１遮断抗体の添加を伴うか、又は伴わずに、本明細書で提示されるＴ細胞製造プロトコールによる誘導の後における、ドナーＨＤ６７からの抗原特異的細胞の絶対数を示す。図４２Ａは、ＩＬ−１２の添加を伴うか、又は伴わない、デノボＣＤ８＋Ｔ細胞応答のうちの、ｐＭＨＣ＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の画分を示す。図４２Ｂは、ＩＬ−１２の添加を伴うか、又は伴わない、デノボＣＤ８＋Ｔ細胞応答のうちの、ＣＤ８＋Ｔ細胞の百分率を示す。
【０４４８】
実施例２８  患者特異的なネオ抗原の使用に対して誘導された免疫応答についての精密な特徴付け
[0567]バイオインフォマティクスエンジンを使用して、患者特異的ネオ抗原を予測した。予測されるネオ抗原をカバーする合成長鎖ペプチドを、刺激プロトコールにおける免疫原として使用して、免疫原性能について評価した。刺激プロトコールは、これらのネオ抗原をコードするペプチドを、患者由来ＡＰＣへと供給し、次いで、これを、患者由来Ｔ細胞と共に共培養して、ネオ抗原特異的Ｔ細胞をプライミングすることを伴う。
【０４４９】
[0568]複数ラウンドの刺激を、刺激プロトコールに組み込んで、メモリーＴ細胞応答及びデノボＴ細胞応答をプライミングし、活性化させ、拡大する。これらのネオ抗原特異的Ｔ細胞の特異性、表現型及び機能性は、以下のアッセイで、これらの応答を特徴付けることにより解析した：ｐＭＨＣ多量体を使用するコンビナトリアルコーディング解析を使用して、複数のネオ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞応答を検出した。マルチプレックス、マルチパラメータのフローサイトメトリーを使用するリコール応答アッセイを使用して、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答を同定及び検証した。ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答の機能性は、ＩＦＮ−γ及びＴＮＦαを含む炎症促進性サイトカインの産生、並びに脱顆粒のマーカーとしての、ＣＤ１０７ａの上方制御を測定することにより評価した。天然でプロセシングされ、提示された抗原に応答して、標的細胞を認識し、死滅させる、ＣＤ８＋Ｔ細胞応答の能力を理解するためにネオ発現する腫瘍株を使用する細胞傷害作用アッセイを使用した。細胞傷害作用は、Ｔ細胞上の細胞表面における、ＣＤ１０７ａの上方制御と、ネオ発現する腫瘍細胞上における、活性カスパーゼ３の上方制御とにより測定した。本研究では、黒色腫患者試料（ＮＶ６及びＮＶ１０）は、ＩＲＢによる承認下で得た。
【０４５０】
[0569]刺激プロトコールは、既存のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の拡大のほか、デノボＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導においても成功した（表１）。
【０４５１】
【表１７】
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【０４５２】
[0570]黒色腫患者であるＮＶ１０に由来するＰＢＭＣを使用して、既存のＣＤ８＋Ｔ細胞応答の、ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの４．５％から、ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの７２．１％への拡大を観察した（ＳＲＳＦ１Ｅ＞Ｋ）。さらに、刺激プロトコールは、患者特異的ネオ抗原に対する、２つの仮定されるデノボＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導において有効であった（ＡＲＡＰ１Ｙ＞Ｈ：ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの６．５％、及びＰＫＤＲＥＪＧ＞Ｒ：ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの１３．４％；刺激過程の前に、細胞は検出可能でなかった）（図３４）。刺激プロトコールは、別の黒色腫患者であるＮＶ６に由来するＰＢＭＣを使用して、既に記載されたネオ抗原及び新規のモデルとなるネオ抗原の両方に対する、最大で変動する大きさの、７つのデノボＣＤ８＋Ｔ細胞応答の誘導に成功した（ＡＣＴＮ４Ｋ＞Ｎ、ＣＳＮＫ１Ａ１Ｓ＞Ｌ、ＤＨＸ４０ｎｅｏＯＲＦ  ７、ＧＬＩ３Ｐ＞Ｌ、ＱＡＲＳＲ＞Ｗ、ＦＡＭ１７８ＢＰ＞Ｌ、及びＲＰＳ２６Ｐ＞Ｌの範囲：ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの０．２％〜ＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの５２％）。加えて、患者特異的ネオ抗原に対する、ＣＤ８＋メモリーＴ細胞応答も拡大された（ＡＡＳＤＨｎｅｏＯＲＦ、刺激後における、最大でＣＤ８＋Ｔ細胞のうちの１３％）。
【０４５３】
[0571]患者ＮＶ１０から誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞を、より詳細に特徴づけた。突然変異体ペプチドをロードされたＤＣによりリチャレンジしたところ、ネオ抗原特異的ＣＤ８＋Ｔ細胞は、１つ、２つ、及び／又は３つ全ての機能を呈した（ＳＲＳＦ１Ｅ＞Ｋ及びＡＲＡＰ１Ｙ＞Ｈのそれぞれについて、１６．９％及び６５．５％の、機能的なＣＤ８＋ｐＭＨＣ＋Ｔ細胞）（図３５）。
【０４５４】
[0572]異なる濃度のネオ抗原ペプチドによりリチャレンジしたところ、誘導されたＣＤ８＋Ｔ細胞は、突然変異体ネオ抗原ペプチドへと、著明に応答したが、野生型ペプチドには応答しなかった（図３６）。
【０４５５】
[0573]患者ＮＶ１０では、ＣＤ４＋Ｔ細胞応答は、突然変異体ネオ抗原をロードされたＤＣによる、リコール応答アッセイを使用して同定した（図３８Ａ〜３８Ｃ）。３つのＣＤ４＋Ｔ細胞応答（ＭＫＲＮ１Ｓ＞Ｌ、ＣＲＥＢＢＰＳ＞Ｌ、及びＴＰＣＮ１Ｋ＞Ｅ）は、突然変異体ネオ抗原ペプチドをロードされたＤＣへの反応性に基づき同定した。これらのＣＤ４＋Ｔ細胞応答はまた、突然変異体ネオ抗原ペプチドによりリチャレンジしたところ、多機能プロファイルも示した。ＣＤ４＋Ｔ細胞のうちの、３１．３％、３４．５％、及び４１．９％が、１つ、２つ、及び／又は３つの機能；それぞれ、ＭＫＲＮ１Ｓ＞Ｌ応答、ＣＲＥＢＢＰＳ＞Ｌ応答、及びＴＰＣＮ１Ｋ＞Ｅ応答を呈した。
【０４５６】
[0574]患者ＮＶ１０から誘導されたＣＤ８＋応答の細胞傷害能もまた評価した（図３７Ａ〜３７Ｃ）。ＳＲＳＦ１Ｅ＞Ｋ応答及びＡＲＡＰ１Ｙ＞Ｈ応答のいずれも、ＣＤ８＋Ｔ細胞上のＣＤ１０７ａ、及び共培養の後に、突然変異体構築物を形質導入された腫瘍細胞上の活性カスパーゼ３の、有意な上方制御を示した。
【０４５７】
[0575]刺激プロトコールを使用して、患者素材における、複数のネオ抗原特異的ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答の誘導により、予測される患者特異的ネオ抗原のほか、モデルとなるネオ抗原も、免疫原性であることを確認した。多機能的かつ突然変異体特異的な、ＣＤ８＋及びＣＤ４＋Ｔ細胞応答を誘導する能力は、高品質のネオ抗原を予測し、強力なＴ細胞応答を発生させる能力を実証する。刺激工程の終了時における、複数の、エンリッチされたネオ抗原特異的Ｔ細胞集団（メモリー及びデノボ）の存在は、新たなＴ細胞応答を惹起し、がん患者を処置し、有効ながん免疫療法を作出する能力を裏付ける。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図６】
2021502414.tif 000027
【図７】
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【図８Ａ】
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【図８Ｂ】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
2021502414.tif 000033
【図１２】
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【図１３】
2021502414.tif 000035
【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
2021502414.tif 000039
【図１８】
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【図１９Ａ】
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【図１９Ｂ】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
2021502414.tif 000049
【図２７Ａ】
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【図２７Ｂ】
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【図２８Ａ】
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【図２８Ｂ】
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【図２９Ａ】
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【図２９Ｂ】
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【図３０Ａ】
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【図３０Ｂ】
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【図３０Ｃ】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５−１】
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【図３５−２】
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【図３６】
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【図３７Ａ】
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【図３７Ｂ】
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【図３７Ｃ】
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【図３８Ａ】
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【図３８Ｂ】
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【図３８Ｃ】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１Ａ】
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【図４１Ｂ】
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【図４２Ａ】
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【図４２Ｂ】
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【図４３】
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【国際調査報告】
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