(57)【要約】  微生物に感染した細胞に対して免疫応答を誘発するように遺伝的に修飾されたＮＫ細胞の組成物、方法、及び使用が示される。一部の実施形態において、ＮＫ細胞は、ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する細胞外単鎖変異フラグメントをコードするセグメント、及び細胞内活性化ドメインをコードする別のセグメント、並びにそれらのセグメント間のリンカーを含む組換え核酸で遺伝的に修飾され得る。他の実施形態において、ＮＫ細胞は、α鎖Ｔ細胞受容体及びβ鎖Ｔ細胞受容体をコードするセグメント、並びにＣＤ３δの少なくとも一部及びＣＤ３γの少なくとも一部をコードする別のセグメントを含む組換え核酸で遺伝的に修飾され得る。遺伝的に修飾されたＮＫ細胞は、微生物に感染した患者に投与されて、微生物に感染した細胞に特異的な免疫応答をトリガすることができる。
2021502056.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する細胞外単鎖変異フラグメントをコードする第１の核酸セグメントと；
細胞内活性化ドメインをコードする第２の核酸セグメントと；
前記細胞外単鎖変異フラグメントと前記細胞内活性化ドメインとの間のリンカーをコードする第３の核酸セグメントと；
を含む組換え核酸であって、
前記第１、第２、及び第３のセグメントは、前記細胞外単鎖変異フラグメント、前記細胞内活性化ドメイン、及び前記リンカーが単一のキメラポリペプチドを形成するように配置されている、組換え核酸。
【請求項２】
前記細胞外単鎖変異フラグメントは、前記ＣＤ１−脂質抗原複合体に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項３】
前記細胞外単鎖変異フラグメントはさらに、前記ＶＬドメインと前記ＶＨドメインとの間にスペーサーを含む、請求項２に記載の組換え核酸。
【請求項４】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項５】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイドの少なくとも１つを含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項６】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含む、請求項５に記載の組換え核酸。
【請求項７】
結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の前記脂質抗原は、ミコール酸である、請求項６に記載の組換え核酸。
【請求項８】
前記細胞内活性化ドメインは、ナチュラルキラー細胞内で免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）媒介シグナリングをトリガするＩＴＡＭを含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項９】
前記細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζの一部を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項１０】
前記細胞内活性化ドメインはさらに、ＣＤ２８活性化ドメインの一部を含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項１１】
前記リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の組換え核酸。
【請求項１２】
第１の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されているα鎖Ｔ細胞受容体及びβ鎖Ｔ細胞受容体をコードする第１の核酸セグメントと；
第２の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されているＣＤ３δの少なくとも一部及びＣＤ３γの少なくとも一部をコードする第２の核酸セグメントと；
を含む組換え核酸組成物であって、
前記α鎖Ｔ細胞受容体及び前記β鎖Ｔ細胞受容体の少なくとも１つは、共に、ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する、組換え核酸組成物。
【請求項１３】
前記第１の核酸セグメント及び前記第２の核酸セグメントは、第３の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されている、請求項１２に記載の組換え核酸組成物。
【請求項１４】
ＣＤ３γの前記一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項１２に記載の組換え核酸組成物。
【請求項１５】
ＣＤ３δの前記一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項１２に記載の組換え核酸組成物。
【請求項１６】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の組換え核酸組成物。
【請求項１７】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイドの少なくとも１つを含む、請求項１２に記載の組換え核酸。
【請求項１８】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含む、請求項１７に記載の組換え核酸。
【請求項１９】
結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の前記脂質抗原は、ミコール酸である、請求項１８に記載の組換え核酸。
【請求項２０】
ミコール酸生成微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導する方法であって：
ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する細胞外単鎖変異フラグメントと；
細胞内活性化ドメインと；
前記細胞外単鎖変異フラグメントを前記細胞内活性化ドメインに連結する膜貫通リンカーと；
を含む組換えタンパク質を発現する遺伝的に修飾されたＮＫ細胞を用意することと：
前記遺伝的に修飾されたＮＫ細胞を、前記患者に、前記患者内の前記微生物に感染したいくつかの細胞を減らすのに有効な用量及びスケジュールで投与することと
を含む方法。
【請求項２１】
前記遺伝的に修飾されたＮＫ細胞は、ａＮＫ、ｈａＮＫ、及びｔａＮＫからなる群に由来する、請求項２０に記載の方法。
【請求項２２】
前記細胞外単鎖変異フラグメントは、前記ＣＤ１−脂質抗原複合体に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２３】
前記細胞外単鎖変異フラグメントはさらに、前記ＶＬドメインと前記ＶＨドメインとの間にスペーサーを含む、請求項２２に記載の方法。
【請求項２４】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃの少なくとも１つを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２５】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイドの少なくとも１つを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２６】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２７】
結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の前記脂質抗原は、ミコール酸である、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記細胞内活性化ドメインは、ナチュラルキラー細胞内で免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）媒介シグナリングをトリガするＩＴＡＭを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項２９】
前記細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζの一部を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３０】
前記細胞内活性化ドメインはさらに、ＣＤ２８活性化ドメインの一部を含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３１】
前記リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む、請求項２０に記載の方法。
【請求項３２】
前記遺伝的に修飾されたＮＫ細胞の投与は、静脈内注射によって実行される、請求項２０に記載の方法。
【請求項３３】
ミコール酸生成微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導する方法であって：
α鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部、及びＣＤ３γの少なくとも一部を含むタンパク質複合体を発現する遺伝的に修飾されたＮＫ細胞を用意することと；
前記遺伝的に修飾されたＮＫ細胞を、前記患者に、前記患者内の前記微生物に感染したいくつかの細胞を減らすのに有効な用量及びスケジュールで投与することと
を含む方法。
【請求項３４】
前記第１の核酸セグメント及び前記第２の核酸セグメントは、第３の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されている、請求項３３に記載の方法。
【請求項３５】
ＣＤ３γの前記一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３６】
ＣＤ３δの前記一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃの少なくとも１つを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイドの少なくとも１つを含む、請求項３３に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含む、請求項３８に記載の方法。
【請求項４０】
結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の前記脂質抗原は、ミコール酸である、請求項３９に記載の方法。
【請求項４１】
前記遺伝的に修飾されたＮＫ細胞は、ａＮＫ、ｈａＮＫ、及びｔａＮＫからなる群に由来する、請求項３３に記載の方法。
【請求項４２】
前記遺伝的に修飾されたＮＫ細胞の投与は、静脈内注射によって実行される、請求項３３に記載の方法。
【請求項４３】
遺伝的に修飾された細胞毒性細胞であって、１）ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する細胞外単鎖変異フラグメントと、２）細胞内活性化ドメインと、３）前記細胞外単鎖変異フラグメントを前記細胞内活性化ドメインに結合させる膜貫通リンカーを有するキメラタンパク質をコードする組換え核酸を含む、細胞毒性細胞。
【請求項４４】
前記細胞外単鎖変異フラグメントは、前記ＣＤ１−脂質抗原複合体に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む、請求項４３に記載の細胞毒性細胞。
【請求項４５】
前記細胞外単鎖変異フラグメントはさらに、前記ＶＬドメインと前記ＶＨドメインとの間にスペーサーを含む、請求項４４に記載の細胞毒性細胞。
【請求項４６】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃの少なくとも１つを含む、請求項４３に記載の細胞毒性細胞。
【請求項４７】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイドの少なくとも１つを含む、請求項４３に記載の細胞毒性細胞。
【請求項４８】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含む、請求項４７に記載の細胞毒性細胞。
【請求項４９】
結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の前記脂質抗原は、ミコール酸である、請求項４８に記載の細胞毒性細胞。
【請求項５０】
前記細胞内活性化ドメインは、ナチュラルキラー細胞内で免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）媒介シグナリングをトリガするＩＴＡＭを含む、請求項４３に記載の細胞毒性細胞。
【請求項５１】
前記細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζの一部を含む、請求項４３に記載の細胞毒性細胞。
【請求項５２】
前記細胞内活性化ドメインはさらに、ＣＤ２８活性化ドメインの一部を含む、請求項４３に記載の細胞毒性細胞。
【請求項５３】
前記リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む、請求項４３に記載の細胞毒性細胞。
【請求項５４】
α鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部、及びＣＤ３γの少なくとも一部を有するタンパク質複合体をコードする組換え核酸を含む、遺伝的に修飾された細胞毒性細胞。
【請求項５５】
前記第１の核酸セグメント及び前記第２の核酸セグメントは、第３の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されている、請求項５４に記載の細胞毒性細胞。
【請求項５６】
ＣＤ３γの前記一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項５４に記載の細胞毒性細胞。
【請求項５７】
ＣＤ３δの前記一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、請求項５４に記載の細胞毒性細胞。
【請求項５８】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄの少なくとも１つを含む、請求項５４に記載の細胞毒性細胞。
【請求項５９】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイドの少なくとも１つを含む、請求項５４に記載の細胞毒性細胞。
【請求項６０】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含む、請求項５４に記載の細胞毒性細胞。
【請求項６１】
結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の前記脂質抗原は、ミコール酸である、請求項６０に記載の細胞毒性細胞。
【請求項６２】
微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導するための、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の組換え核酸の使用。
【請求項６３】
微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導するための、請求項４３〜５３のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された細胞毒性細胞の使用。
【請求項６４】
微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導するための、請求項１２〜１９のいずれか一項に記載の組換え核酸の使用。
【請求項６５】
微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導するための、請求項５４〜６１のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された細胞毒性細胞の使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本出願は、２０１７年１０月５日出願の同時係属中の米国仮特許出願第６２／５６８７８５明細書の優先権を主張し、この出願は、その全体が本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本発明の分野は、免疫療法であり、とりわけ、微生物によって生成される脂質抗原の、特定のＣＤ１タンパク質との複合体を特異的に認識するキメラＴ細胞受容体を発現する修飾ＮＫ細胞に関する。
【背景技術】
【０００３】
背景の説明は、本発明を理解するのに有用であり得る情報を含む。本明細書中で提供されるあらゆる情報が先行技術であること、若しくは特許請求される本発明に関連すること、又は具体的に、若しくは暗に引用されているあらゆる刊行物が先行技術であることは、自認していない。
【０００４】
本明細書中の全ての刊行物及び特許出願は、あたかも個々の刊行物又は特許出願が、参照によって組み込まれることが具体的に、且つ個々に示されているかの如く、参照によって組み込まれる。組み込まれた参照中の用語の定義又は用法が、本明細書中で提供される用語の定義と矛盾又は相反する場合、本明細書中で提供される用語の定義が当てはまり、参照中の用語の定義は当てはまらない。
【０００５】
宿主生物中への外来病原体（例えば細菌その他）の侵入は典型的に、外来病原体由来の種々の脂質抗原、とりわけ外来病原体に対して特異的な、且つ／又は固有の脂質抗原の、宿主の抗原提示細胞表面上での提示を、ＣＤ１受容体を介してトリガする。より具体的には、脂質抗原は、細胞内で処理されて、エンドソーム内のＣＤ１アイソフォーム（ＣＤ１ａ、ｂ、ｃ、及びｄ）の１つに結合することとなり、その後、細胞表面に運搬される。次に、細胞表面上の脂質抗原−ＣＤ１受容体複合体は、Ｔ細胞のＴ細胞受容体と相互作用して、外来病原体によって感染された細胞に対するＴ細胞媒介免疫応答をトリガする。
【０００６】
Ｔ細胞受容体は、細胞表面上に提示される抗原の認識を担う２つの高度に可変的な鎖（例えば、アルファ鎖及びβ鎖）を含む。免疫グロブリンと類似して、Ｔ細胞受容体鎖の超可変性（従って特異性）は、ＤＮＡの体細胞遺伝的組換えによって決定される。より最近では、抗原特異的結合部分をシグナリング部分上にグラフトすることによって、遺伝子操作された受容体、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）が開発されており、こうしてＣＡＲを持った免疫細胞を、標的細胞（例えば、感染細胞、癌細胞その他）に向かわせている。しかしながら、特に、そのようなアプローチは伝統的に、ＭＨＣ−Ｉ及びＭＨＣ−ＩＩ提示抗原との関連で用いられてきた。
【０００７】
ゆえに、ある種の病原体からの脂質抗原提示の一部の機構、及び遺伝子操作された受容体を用いて特定の細胞を標的化する種々の方法が知られているにも拘わらず、注目する脂質抗原を提示する細胞を特異的に標的化する固有の免疫系の調節は、大部分は調査されていないままである。ゆえに、Ｔ細胞又は抗体の抗原特異性を用いて、ＮＫ細胞を、注目する病原体に冒された細胞を特異的に攻撃するように修飾する方法及び用途の向上が、必要とされている。
【発明の概要】
【０００８】
本発明の主題は、ＣＤ１−脂質抗原複合体を特異的に認識する細胞外ドメインを含み、そしてＣＤ１−脂質抗原複合体を提示する細胞に対して、ＮＫ細胞の免疫応答をトリガする活性化ドメインをさらに含むキメラタンパク質を発現する遺伝的に修飾された免疫担当細胞の種々の組成物、方法、及び使用に関する。
【０００９】
ゆえに、主題の一態様は、ＮＫ細胞内で転写され得る組換え核酸を含む。組換え核酸は、ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する細胞外単鎖変異フラグメントをコードする第１の核酸セグメント、及び細胞内活性化ドメインをコードする第２の核酸セグメントを含む。第１及び第２の核酸セグメントは、細胞外単鎖変異フラグメントと細胞内活性化ドメインとの間のリンカーをコードする第３の核酸セグメントと連結される。好ましくは、第１、第２、及び第３のセグメントは、細胞外単鎖変異フラグメント、細胞内活性化ドメイン、及びリンカーが、単一のキメラポリペプチドを形成するように配置される。更なる態様において、組換え核酸は、少なくともＴＣＲアルファ鎖及びＴＣＲベータ鎖をコードしてもよく、そして加えて、ＣＤ３デルタ及びＣＤ３ガンマをコードしてもよいｍＲＮＡである。
【００１０】
好ましくは、細胞外単鎖変異フラグメントは、ＣＤ１−脂質抗原複合体に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む。そのような実施形態において、組換え核酸はさらに、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間にスペーサーを含むことも好ましい。
【００１１】
一部の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ。他の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイド。そのような実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよいことが意図される。さらに、ＣＤ１−脂質抗原複合体が、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよい場合、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原は、ミコール酸であり得る。
【００１２】
好ましくは、細胞内活性化ドメインは、ナチュラルキラー細胞内で免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）媒介シグナリングをトリガするＩＴＡＭを含む。一部の実施形態において、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζの一部及び／又はＣＤ２８活性化ドメインの一部を含む。また、好ましくは、リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。
【００１３】
本発明の主題の別の態様において、発明者らは、ミコール酸生成微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導する方法を意図する。この方法では、組換えタンパク質を発現する遺伝的に修飾されたＮＫ細胞が提供される。最も典型的には、遺伝的に修飾されたＮＫ細胞は、以下からなる群から選択され、又はこれに由来する：ａＮＫ、ｈａＮＫ、及びｔａＮＫ。組換えタンパク質は、ＣＤ１−脂質抗原複合体及び細胞内活性化ドメインに特異的に結合する細胞外単鎖変異フラグメントを有する。加えて、細胞外単鎖変異フラグメント及び細胞内活性化ドメインは、膜貫通リンカーで連結される。当該方法は、遺伝的に修飾されたＮＫ細胞を、患者に、患者内の微生物に感染したいくつかの細胞を減らすのに、そして／又は患者内の微生物の数を減らすのに有効な用量及びスケジュールで投与することを続ける。典型的には、遺伝的に修飾されたＮＫ細胞の投与は、静脈内注射によって実行される。
【００１４】
好ましくは、細胞外単鎖変異フラグメントは、ＣＤ１−脂質抗原複合体に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む。一部の実施形態において、細胞外単鎖変異フラグメントはさらに、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間にスペーサーを含む。一部の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ。他の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイド。そのような実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよいことが意図される。さらに、ＣＤ１−脂質抗原複合体が、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよい場合、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原は、ミコール酸であり得る。
【００１５】
好ましくは、細胞内活性化ドメインは、ナチュラルキラー細胞内で免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）媒介シグナリングをトリガするＩＴＡＭを含む。一部の実施形態において、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζの一部及び／又はＣＤ２８活性化ドメインの一部を含む。また、好ましくは、リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。
【００１６】
本発明の主題のさらに別の態様は、ＮＫ細胞内で転写且つ／又は翻訳され得る組換え核酸組成物を含む。組換え核酸は、第１の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されているα鎖Ｔ細胞受容体及びβ鎖Ｔ細胞受容体をコードする第１の核酸セグメントを含む。好ましくは、α鎖Ｔ細胞受容体及びβ鎖Ｔ細胞受容体の少なくとも１つは、共に、ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する。また、組換え核酸は、第２の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されていてもよいＣＤ３δの少なくとも一部及びＣＤ３γの少なくとも一部をコードする第２の核酸セグメントを含んでもよい。一部の実施形態において、第１の核酸セグメント及び第２の核酸セグメントは、第３の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されている。
【００１７】
好ましくは、ＣＤ３γの一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、そして／又はＣＤ３δの一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ。他の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイド。そのような実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよいことが意図される。さらに、ＣＤ１−脂質抗原複合体が、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよい場合、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原は、ミコール酸であり得る。
【００１８】
本発明の主題のさらに別の態様において、好ましくは遺伝的に修飾されたＮＫ細胞である、遺伝的に修飾された細胞毒性細胞が意図される。細胞毒性細胞は、１）ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する細胞外単鎖変異フラグメント、２）細胞内活性化ドメイン、及び３）細胞外単鎖変異フラグメントを細胞内活性化ドメインに結合させる膜貫通リンカーを有するキメラタンパク質をコードする組換え核酸を含む。
【００１９】
好ましくは、細胞外単鎖変異フラグメントは、ＣＤ１−脂質抗原複合体に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含む。一部の実施形態において、組換え核酸はさらに、ＶＬドメインとＶＨドメインとの間にスペーサーを含む。
【００２０】
一部の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ。他の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイド。そのような実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよいことが意図される。さらに、ＣＤ１−脂質抗原複合体が、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよい場合、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原は、ミコール酸であり得る。
【００２１】
一部の実施形態において、細胞内活性化ドメインは、ナチュラルキラー細胞内で免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）媒介シグナリングをトリガするＩＴＡＭを含む。他の実施形態において、細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζの一部及び／又はＣＤ２８活性化ドメインの一部を含む。さらに、一部の実施形態において、リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む。
【００２２】
本発明の主題のさらに別の態様において、α鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部、及びＣＤ３γの少なくとも一部を有するタンパク質複合体をコードする組換え核酸を含む、遺伝的に修飾された細胞毒性細胞が意図される。好ましくは、第１の核酸セグメント及び第２の核酸セグメントは、第３の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されている。
【００２３】
一部の実施形態において、ＣＤ３γの一部及び／又はＣＤ３δの一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ。他の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイド。そのような実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよいことが意図される。さらに、ＣＤ１−脂質抗原複合体が、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよい場合、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原は、ミコール酸であり得る。
【００２４】
本発明の主題の更なる態様において、発明者らは、ミコール酸生成微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導する方法を意図する。この方法では、タンパク質複合体を発現する遺伝的に修飾されたＮＫ細胞が提供される。タンパク質複合体は、少なくともα鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部、及びＣＤ３γの少なくとも一部を含む。典型的には、遺伝的に修飾されたＮＫ細胞は、以下からなる群から選択され、且つ／又はこれに由来する：ａＮＫ、ｈａＮＫ、及びｔａＮＫ。当該方法はさらに、遺伝的に修飾されたＮＫ細胞を、患者に、患者内の微生物に感染したいくつかの細胞を減らすのに有効な用量及びスケジュールで投与することを続ける。典型的には、遺伝的に修飾されたＮＫ細胞の投与は、静脈内注射によって実行される。
【００２５】
好ましくは、第１の核酸セグメント及び第２の核酸セグメントは、第３の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されている。また、好ましくは、ＣＤ３γの一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含み、そして／又はＣＤ３δの一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む。一部の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ。他の実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、以下の少なくとも１つを含む：ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイド。そのような実施形態において、ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよいことが意図される。さらに、ＣＤ１−脂質抗原複合体が、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含んでもよい場合、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原は、ミコール酸であり得る。
【００２６】
加えて、発明者らはまた、微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導するための、先に記載される組換え核酸及び／又は遺伝的に修飾された細胞毒性細胞の使用を意図する。
【００２７】
本発明の主題の種々の目的、特徴、態様、及び利点は、添付の図面と共に、好ましい実施形態の以下の詳細な説明から、より明らかとなろう。
【図面の簡単な説明】
【００２８】
【図１】図１は、細胞表面上に発現される組換えキメラタンパク質の３つの例示的な実施形態を示す。
【図２】図２は、Ｔ細胞受容体タンパク質複合体をコードするｍＲＮＡ構築体の例示的な実施形態、及びＣＤ１−脂質抗原複合体とＴ細胞受容体タンパク質複合体との相互作用を示す。
【図３】図３Ａは、表面上に脂質抗原を提示する細胞に向けた、図１の組換えキメラタンパク質を発現するＮＫ細胞の細胞毒性を示すグラフを示す。図３Ｂは、図３のＴ細胞受容体タンパク質複合体を発現するＮＫ細胞の機能として細菌の生存度を示すグラフを示す。
【発明を実施するための形態】
【００２９】
発明者らは、今般、免疫担当細胞、好ましくは細胞毒性免疫担当細胞（特にＮＫ細胞）を遺伝的に修飾することによって、そしてそのように遺伝的に修飾された細胞毒性細胞を、ＣＤ１分子によって提示され得る脂質抗原を生成する微生物に感染している患者に投与することによって、細胞媒介細胞毒性が、感染細胞に対して効果的且つ特異的に誘導され得ることを発見した。そのために、発明者らはさらに、細胞毒性細胞（例えば、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞）が、脂質抗原に結合するＣＤ１リガンドをその表面上に提示する感染細胞に特異的に結合することができるように、細胞毒性細胞を修飾するための種々の組換え核酸組成物が生成され得ることを発見した。特に、そのような修飾ＮＫ細胞は、Ｔ細胞のように作用し得るが、ＮＫ細胞の細胞毒性を提供し得る。
【００３０】
例えば、細胞毒性細胞は、細胞質尾部と、脂質抗原と結合したＣＤ１受容体に対する選択的親和性があるｓｃＦｖフラグメントと融合した膜貫通ドメインとを有する組換えキメラタンパク質を発現し得る。そのような遺伝的に修飾された細胞毒性細胞は、微生物感染細胞に対する特異的認識だけでなく、脂質抗原をその表面上に提示する感染細胞への結合の直後に特異的活性化をも示すことが意図される。更なる態様において、遺伝的に修飾された細胞毒性細胞はまた、腫瘍形成の直後に、又は宿主細胞に対する自己免疫の発達の直後に、宿主細胞表面上に提示される脂質抗原を認識することが意図される。ＣＤ１−脂質抗原複合体の認識の直後に、活性化された細胞毒性細胞は、感染細胞、腫瘍細胞、又は自己免疫に冒された細胞に対して向けられる細胞毒性分子（例えば、グランザイム、パーフォリン、グラニュライシンその他）を放出して、最終的にそれらの細胞を破壊する。
【００３１】
本明細書中で用いられる用語「免疫担当細胞」は、以下に限定されないが、抗体依存細胞媒介細胞毒性、Ｔ細胞免疫応答、液性免疫その他が挙げられるあらゆるタイプの免疫応答を誘発することができる細胞を指す。本明細書中で用いられる用語「結合する」は、用語「認識する」及び／又は「検出する」を指し、そしてこれらと互換的に用いられ得、２つの分子間の相互作用は、ＫＤが１０−６Ｍ以下、又は１０−７Ｍ以下である、高い親和性を有する。本明細書中で用いられる用語「提供する」又は「提供すること」は、製造すること、生成すること、配置すること、使用可能にすること、又は直ぐに使えるようにすることのあらゆる行為を指し、そしてこれらを含む。
【００３２】
勿論、本発明の主題は、ＮＫ細胞に限られず、全ての適切なタイプの免疫担当細胞が意図される点に留意するべきである。最も好ましくは、免疫担当細胞は、自己ＮＫ細胞又は異種ＮＫ細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、ＮＫ−９２誘導体が挙げられる遺伝的に修飾されたＮＫ細胞が挙げられる細胞毒性免疫細胞であり、これらは、少なくとも１つのキラー細胞免疫グロブリン様受容体（ＫＩＲ）の発現が引き下げられ、又は無効にされるように修飾されてもよく、そのような細胞を、（阻害の欠如又は低下を介して）構成的に活性化の状態にすることとなる。したがって、適切な修飾細胞は、例えばＭＨＣクラスＩ分子との相互作用を引き下げ、又は無効にするように突然変異している１つ以上の修飾キラー細胞免疫グロブリン様受容体を有してもよい。勿論、１つ以上のＫＩＲが、欠失してもよいし、発現が（例えば、ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡその他を介して）抑制されてもよい点に留意すべきである。最も典型的には、複数のＫＩＲが、突然変異し、欠失し、又はサイレンシングされることとなり、そしてとりわけ、意図されるＫＩＲとして、細胞質尾部が短い、又は長い、２つ又は３つのドメインを有するものが挙げられる。異なる観点から見て、修飾され、サイレンシングされ、又は欠失されたＫＩＲとして、ＫＩＲ２ＤＬ１、ＫＩＲ２ＤＬ２、ＫＩＲ２ＤＬ３、ＫＩＲ２ＤＬ４、ＫＩＲ２ＤＬ５Ａ、ＫＩＲ２ＤＬ５Ｂ、ＫＩＲ２ＤＳ１、ＫＩＲ２ＤＳ２、ＫＩＲ２ＤＳ３、ＫＩＲ２ＤＳ４、ＫＩＲ２ＤＳ５、ＫＩＲ３ＤＬ１、ＫＩＲ３ＤＬ２、ＫＩＲ３ＤＬ３、及び／又はＫＩＲ３ＤＳ１が挙げられることとなる。そのような修飾細胞は、例えば、当該技術分野において周知のサイレンシングプロトコル、ＣＩＲＳＰＲ−ＣＡＳゲノム編集、又はノックアウト若しくはノックダウンプロトコルを用いて、調製されてもよい。これ以外にも、そのような細胞は、ａＮＫ細胞（活性化ナチュラルキラー細胞）として、ＮａｎｔＫｗｅｓｔ（ＵＲＬ  ｗｗｗ．ｎａｎｔｋｗｅｓｔ．ｃｏｍ参照）から商業的に得られてもよい。次に、そのような細胞はさらに、宿主生物のＮＫ細胞の１つ以上の阻害受容体用の１つ以上のリガンドを発現するように修飾されてもよい。
【００３３】
また、遺伝子操作されたＮＫ細胞は、高親和性Ｆｃγ受容体（例えば、ＣＤ１６、Ｖ１５８）を発現するように修飾されているＮＫ−９２誘導体であってもよい。Ｆｃγ受容体の高親和性変異体についての配列が、当該技術分野において周知であり、そして生成及び発現の全ての様式が、本明細書中での使用に適していると考えられる。そのような受容体の発現は、炎症に（例えば自己免疫その他に）冒された患者の細胞、患者の腫瘍細胞（例えばネオエピトープ）、特定の腫瘍型（例えば、ｈｅｒ２ｎｅｕ、ＰＳＡ、ＰＳＭＡその他）に特異的な、又は癌（例えばＣＥＡ−ＣＡＭ）と関連する抗体を用いて、腫瘍細胞の特異的な標的化を可能にすると考えられる。好都合にも、そのような抗体は、市販されており、そして（例えばＦｃγ受容体に結合した）細胞と共に用いることができる。これ以外にも、そのような細胞は、ｈａＮＫ細胞（高親和性ナチュラルキラー細胞）として、ＮａｎｔＫｗｅｓｔから商業的に得られてもよい。次に、そのような細胞はさらに、宿主生物のＮＫ細胞の１つ以上の阻害受容体用の１つ以上のリガンドを発現するように修飾されてもよい。
【００３４】
さらに、遺伝子操作されたＮＫ細胞はまた、キメラＴ細胞受容体を発現するように遺伝子操作されてもよい。とりわけ好ましい態様において、キメラＴ細胞受容体は、炎症関連ペプチド抗原、腫瘍関連ペプチド抗原、腫瘍特異的ペプチド抗原、及び癌ネオエピトープに対する結合特異性があるｓｃＦｖ部分又は他のエクトドメインを有することとなる。以前に注目されたように、そのようなキメラＴ細胞受容体を発現するようにＮＫ細胞を遺伝子操作する多数の様式があり、そして全ての様式は、本明細書中での使用に適していると考えられる。これ以外にも、そのような細胞は、ｔａＮＫ細胞（標的活性化ナチュラルキラー細胞）として、ＮａｎｔＫｗｅｓｔから商業的に得られてもよい。次に、そのような細胞はさらに、宿主生物のＮＫ細胞の１つ以上の阻害受容体用の１つ以上のリガンドを発現するように修飾されてもよい。発明者らは、ｈａＮＫ細胞又はｔａＮＫ細胞の使用が、後に記載されるように、癌−又は自己免疫−特異的エピトープを認識することによって、そして細胞表面上に提示される脂質抗原を同時に認識することによって、あらゆる癌細胞又は自己免疫に冒された細胞を標的化するための、遺伝的に修飾された細胞毒性細胞の二重特異性を提供し得ることを意図する。
【００３５】
本発明の主題の好ましい一態様において、発明者らは、組換えタンパク質をコードする組換え核酸組成物を細胞毒性細胞に導入することによって、ＣＤ１分子と結合した脂質抗原を特異的に認識するように、細胞毒性免疫担当細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞、遺伝子操作されたＮＫ細胞（ａＮＫ、ｈａＮＫ、ｔａＮＫその他）その他）が遺伝的に修飾され得ることを意図する。図１は、いくつかの例示的な組換えタンパク質を概略的に示す。通常、組換えタンパク質は、細胞外単鎖変異フラグメント、細胞内活性化ドメイン、及び細胞外単鎖変異フラグメントを細胞内活性化ドメインに結合させる膜貫通リンカーを含む。好ましくは、組換えタンパク質は、単一の組換え核酸から翻訳される単一のキメラポリペプチドから生成される。しかしながら、組換えタンパク質は、組換えタンパク質の少なくとも一部が、タンパク質−タンパク質相互作用モチーフを介して組換えタンパク質の残りと可逆的に結合され得るように、２つの互いに異なる組換え核酸から別々に翻訳される少なくとも２つのドメインを含むことも意図される。
【００３６】
ゆえに、組換えタンパク質が単一の組換え核酸によってコードされる好ましい実施形態において、組換え核酸は、少なくとも３つの核酸セグメントを含む：ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する細胞外単鎖変異フラグメントをコードする第１の核酸セグメント（配列要素）；細胞内活性化ドメインをコードする第２の核酸セグメント；及び細胞外単鎖変異フラグメントと細胞内活性化ドメインとの間のリンカーをコードする第３の核酸セグメント。
【００３７】
この実施形態において、細胞外単鎖変異フラグメントをコードする第１の核酸セグメントは、免疫グロブリンの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）をコードする核酸配列を含む。好ましい実施形態において、重鎖の可変領域（ＶＨ）をコードする核酸配列及び軽鎖の可変領域（ＶＬ）をコードする核酸配列は、短いスペーサーペプチドフラグメント（例えば、少なくとも１０個のアミノ酸、少なくとも２０個のアミノ酸、少なくとも３０個のアミノ酸その他）をコードするリンカー配列によって分離されている。最も典型的には、第１の核酸セグメントによってコードされる細胞外単鎖変異フラグメントは、ＣＤ１−脂質抗原複合体に対する結合親和性及び／又は特異性を決定する１つ以上の核酸配列を含む。ゆえに、ＶＨ及びＶＬの核酸配列は、ＣＤ１分子のタイプ、及び組換えタンパク質が標的化し得る脂質抗原に応じて変わり得る。
【００３８】
ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的なＶＨ及びＶＬの核酸配列を同定するのに適したあらゆる方法が意図される。例えば、ＣＤ１−脂質抗原複合体に対する特異性及び結合親和性が知られているモノクローナル抗体配列データベースから、ＶＨ及びＶＬの核酸配列が同定され得る。これ以外にも、ＶＨ及びＶＬの核酸配列は、候補配列のインシリコ分析を介して（例えば、ＩｇＢＬＡＳＴ配列分析ツールその他を介して）同定され得る。一部の実施形態において、ＶＨ及びＶＬの核酸配列は、適切なあらゆるインビトロアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、ＳＰＲアッセイ、結合平衡除外法その他）を介した、ＣＤ１−脂質抗原複合体に対する親和性が変化に富むペプチドのマススクリーニングを介して同定され得る。ＣＤ１及び脂質抗原のタイプに応じて変わり得る一方、ＶＨ及びＶＬの最適な核酸配列は、ＣＤ１−脂質抗原複合体に対する親和性が、少なくとも、ＫＤが少なくとも１０−６Ｍ以下、好ましくは少なくとも１０−７Ｍ以下、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ以下である細胞外単鎖変異フラグメントをコードすることが好ましい。これ以外にも、ファージパニング若しくはＲＮＡディスプレイによって、又はＣＤ１−脂質複合体（以下でより詳細にさらに記載される、ＴＣＲクローン１８）に結合することが知られているＴ細胞由来の認識ドメインをグラフティングすることによって、ＣＤ１−脂質抗原複合体への合成バインダが得られてもよい。
【００３９】
第１の核酸セグメントは、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）を１つずつコードする核酸配列を含むことが好ましい一方、他の実施形態において、第１の核酸セグメントは、複数の重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）（例えば、二価（又は多価）単鎖可変フラグメント（例えば、タンデム単鎖可変フラグメント）を生成する２つの重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ））をコードする核酸配列を含むことも意図される。この実施形態において、重鎖（ＶＨ）及び軽鎖（ＶＬ）を１つずつコードする配列は、直線的に重複され得る（例えば、ＶＨ−リンカー１−ＶＬ−リンカー２−ＶＨ−リンカー３−ＶＬ）。リンカー１、２、３の長さは、実質的に類似し得、又は同じであり得ることが意図される。しかしながら、リンカー２の長さは、リンカー１及び／又はリンカー３の長さと実質的に異なる（例えば、より長い又はより短い）ことも意図される。
【００４０】
これ以外にも、発明者らは、細胞外単鎖変異フラグメントが、Ｔ細胞受容体の細胞外ドメインで置換され得ることも意図する。例えば、一部の実施形態において、細胞外単鎖変異フラグメントは、Ｔ細胞受容体のα鎖及び／又はβ鎖の一部で置換され得る。他の実施形態において、細胞外単鎖変異フラグメントは、α鎖及びβ鎖の組合せで置換され得る。そのような実施形態において、Ｔ細胞受容体の細胞外ドメインの核酸配列、とりわけα鎖及びβ鎖の超可変領域は、ＣＤ１−脂質抗原複合体に対する測定、推定、又は予想された親和性に基づいて、選択され得る。とりわけ、ＣＤ１−脂質抗原複合体に対するＴ細胞受容体の細胞外ドメインの親和性は、少なくとも、ＫＤが少なくとも１０−６Ｍ以下、好ましくは少なくとも１０−７Ｍ以下、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ以下であることが好ましい。
【００４１】
組換え核酸はまた、組換えタンパク質の細胞内活性化ドメインをコードする第２の核酸セグメント（配列要素）を含む。最も典型的には、細胞内活性化ドメインは、１つ以上のＩＴＡＭ活性化モチーフ（免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ、ＹｘｘＬ／Ｉ−Ｘ６〜８−ＹＸＸＬ／Ｉ）を含み、これが、モチーフを発現する細胞内でシグナリングカスケードをトリガする。１つ以上のＩＴＡＭ活性化モチーフを含む適切なあらゆる核酸配列が意図される。例えば、活性化ドメインの配列は、１つ以上のＩＴＡＭ活性化モチーフ（例えば、キラー活性化受容体（ＫＡＲ）、ＮＫｐ３０、ＮＫｐ４４、及びＮＫｐ４６その他の細胞内尾部ドメイン）を含む細胞毒性細胞受容体（例えば、ＮＫ細胞受容体、ＮＫＴ細胞受容体その他）に由来し得る。別の例において、活性化ドメインの配列は、Ｔ細胞抗原受容体（例えば、ＣＤ３ζ、ＣＤ２８その他）の尾部部分に由来し得る。一部の実施形態において、細胞内活性化ドメインの核酸配列は、１つ以上のＩＴＡＭ活性化モチーフを加えて／除去して、組換えタンパク質を発現する細胞の細胞毒性を調節するように修飾され得る。
【００４２】
第１及び第２の核酸セグメントは、典型的に、組換えタンパク質のリンカー部分をコードする第３の核酸セグメントを介して連結される。好ましくは、組換えタンパク質のリンカー部分は、少なくとも１つの膜貫通ドメインを含む。加えて、発明者らは、組換えタンパク質のリンカー部分がさらに、膜貫通ドメインと細胞外単鎖変異フラグメントとの間に短いペプチドフラグメント（例えば、１〜５個のアミノ酸、３〜１０個のアミノ酸、８〜２０個のアミノ酸、又は１０〜２２個のアミノ酸のサイズを有するスペーサー）を、そして／又は膜貫通ドメインと細胞内活性化ドメインとの間に別の短いペプチドフラグメントを含むことを意図する。一部の実施形態において、膜貫通ドメイン及び／又は１つ若しくは２つの短いペプチドフラグメントの核酸配列は、細胞内活性化ドメインの配列が得られる同じ又は異なる分子に由来し得る。
【００４３】
例えば、細胞内活性化ドメインがＣＤ３ζの一部である場合、第３の核酸セグメント全体（膜貫通ドメイン及び短いペプチドフラグメントの双方をコードする）は、ＣＤ３ζ（同じ分子）又はＣＤ２８（異なる分子）に由来し得る。他の実施形態において、第３の核酸セグメントは、セグメントの少なくとも一部が、残りのセグメントと異なる分子に由来するハイブリッド配列である。更なる例において、細胞内活性化ドメインがＣＤ３ζの一部である場合、膜貫通ドメインの配列は、ＣＤ３ζ、及び膜貫通ドメインを連結する短いフラグメントに由来し得、そして細胞外単鎖変異フラグメントは、ＣＤ２８又はＣＤ８に由来してもよい。
【００４４】
さらに他の意図される実施形態において、組換え核酸は、組換えタンパク質を細胞表面に向けるシグナリングペプチドをコードする核酸セグメントを含む。あらゆる適切な、且つ／又は知られているシグナリングペプチドが意図される（例えば、ロイシンリッチモチーフその他）。好ましくは、細胞外単鎖変異フラグメントをコードする核酸セグメントは、シグナル配列が組換えタンパク質のＮ末端に位置決めされ得るように、細胞外単鎖変異フラグメントをコードする第１の核酸セグメントの上流に位置決めされる。しかしながら、シグナリングペプチドは、組換えタンパク質のＣ’末端に、又は組換えタンパク質の中央に位置決めされ得ることも意図される。
【００４５】
ゆえに、組換え細胞毒性細胞、とりわけＮＫ細胞は、細胞外認識ドメインがＣＤ１−脂質抗原複合体を認識することとなり、そしてさらに、膜貫通部分及び１つ以上の細胞内活性化ドメインを含むキメラ抗原受容体を発現するように遺伝子操作され得ることが理解されるべきである。容易に理解されるように、そのようなキメラ抗原受容体は、第１、第２、又は第３世代のＣＡＲとして構築され得、そして好ましくは、ＣＤ１−脂質複合体を特異的に認識するｓｃＦｖドメインを含むこととなる。
【００４６】
典型的には、組換え核酸はまた、組換えタンパク質の発現を制御する配列要素を含み、そして制御の様式は全て、本明細書中での使用に適していると考えられる。例えば、組換え核酸がＲＮＡである場合、発現の制御は、適切な翻訳開始部位（例えば、適切なキャップ構造、開始因子結合部位、内部リボソームエントリ部位その他）及びｐｏｌｙＡ尾部（例えば、長さが、安定性及び／又はターンオーバーを制御する場合）によって発揮されてもよい一方、組換えＤＮＡ発現は、構成的に活性のプロモータ、組織特異的プロモータ、又は誘導性プロモータを介して制御されてもよい。
【００４７】
ＣＤ１−脂質抗原複合体に関して、発明者らは、ＣＤ１が、ヒトＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃ、ＣＤ１ｄアイソタイプのいずれか１つであり得ることを意図する。また、外来生物（例えば、細菌、酵母、真菌、マイコプラズマその他）から生成されるあらゆる脂質抗原、栄養物質（例えば、植物性食品、動物性食品その他）、又は宿主生物から生成される自己脂質が、とりわけ、そして例えば、不健康な容態（例えば、腫瘍細胞、自己免疫に冒された細胞その他）において、意図される。そのような脂質抗原として、ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、スフィンゴ糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、ジアシル化硫糖脂質、マイコケチド、イソプレノイド、スフィンゴ脂質（例えば、ａＧａｌＣｅｒ、スルファチド、ｉＧｂ３その他）、グリセロ脂質（例えば、ＢｂＧＬ−２ｃ、Ｇｌｃ−ＤＡＧ−ｓ２、ＬｙｓｏＰＣ、カルジオリピンその他）、及びリポタンパク質が挙げられる。例えば、マイコバクテリウム（例えば、細胞壁内に種々の脂質成分を有する結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ））による宿主の感染の直後に、脂質抗原は、ＣＤ１（ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、又はＣＤ１ｃ）の１つ以上のアイソタイプ上にロードされ、そしてそのようなＣＤ１−脂質抗原複合体は、感染細胞の表面上に提示される。ＣＤ１のアイソタイプと結合する全ての脂質抗原が、Ｔ−細胞媒介免疫応答を誘発するのに十分な免疫原性であるわけではない一方、ＣＤ１のアイソタイプと結合する一部の脂質抗原（例えば、アルファ−ミコール酸、メトキシ−ミコール酸、又はケト−ミコール酸が挙げられるミコール酸、その他）は、ＣＤ１−脂質抗原複合体（例えば、ＣＤ１ｂ−ミコール酸複合体）が、細胞表面上に提示されて、Ｔ細胞受容体によって認識される場合、Ｔ細胞応答を効果的に誘発することができる。類似の様式で、全ての自己脂質が免疫原性であるわけではない一方、一部の腫瘍細胞は、ＣＤ１ｄ受容体上にロードされ得、且つ腫瘍細胞の表面上に提示され得る免疫原性脂質抗原（例えば、アルファ−ガラクトシルセラミドその他）を生成し得る。ＣＤ１ｄ−脂質抗原複合体は、ＮＫＴ細胞によって認識され得、これがその後、ＣＤ１ｄ−脂質抗原複合体を提示する細胞に対して、サイトカインの放出をトリガする。
【００４８】
加えて、又は代わりに、発明者らは、タンパク質複合体をコードする組換え核酸組成物を細胞毒性細胞に導入することによって、細胞毒性免疫担当細胞（例えば、ＮＫ細胞、遺伝子操作されたＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞その他）も遺伝的に修飾され得ることを意図する。図２に、そしてとりわけ好ましい実施形態に示すように、タンパク質複合体は、Ｔ細胞受容体の細胞外ドメインを有する少なくとも１つ以上の互いに異なるペプチド、及びＴ細胞共受容体の細胞内ドメインの少なくとも１つ以上の互いに異なるペプチドを含む。例えば、好ましい一タンパク質複合体は、Ｔ細胞受容体α鎖、Ｔ細胞受容体β鎖、ＣＤ３δの少なくとも一部、及びＣＤ３γの少なくとも一部を含む。別の例において、タンパク質複合体は、Ｔ細胞受容体のα鎖及びβ鎖の代わりに、γ鎖Ｔ細胞受容体及びδ鎖Ｔ細胞受容体を含んでもよい。加えて、又は代わりに、タンパク質複合体は、１つ以上のζ−鎖（細胞毒性細胞を原産としてもよいし、組換えであってもよい）を含んでもよい。そのような核酸は、遊離ミコール酸、ＧＭＭ（グルコース−６−Ｏ−モノマイコラート）の脱グリコシル化された形態を認識するＴ細胞クローンのクローン１８（クローン１８）から単離されてもよい（例えば、Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ  ｖｏｌｕｍｅ  ７，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：１３２５７（２０１６）；Ｎａｔ  Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０１３  Ｊｕｌ；１４（７）：７０６−７１３；又はＲＣＳＢ  ＰＤＢ  Ｅｎｔｒｙ  ４Ｇ８Ｅ参照）。
【００４９】
ゆえに、組換え細胞毒性細胞がＮＫ細胞である場合、Ｔ細胞受容体アルファ鎖及びベータ鎖は、組換え核酸から（好ましくは単シストロン性ｍＲＮＡ又は多シストロン性ｍＲＮＡから）発現され得て、機能的Ｔ細胞受容体を、（ａ）ＮＫ細胞内で最適化されて（ｎａｔｉｖｅｌｙ）発現されるＣＤ３ゼータ部分及びＣＤ３イプシロン部分と、そして（ｂ）組換え核酸から（ここでも、好ましくは単シストロン性ｍＲＮＡ又は多シストロン性ｍＲＮＡから）発現されることとなるＣＤ３デルタ部分及びＣＤ３ガンマ部分と共に形成することが注目されるべきである。図２は、（ａ）ＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖、並びに（ｂ）ＣＤ３デルタ及びＣＤ３ガンマを別々にコードする２つの例示的なｍＲＮＡ構築体を示す。本発明の主題のさらに別の態様において、４つの全ての組換え構成要素は、分子内にＴＣＲアルファ鎖及びベータ鎖、並びにＣＤ３デルタ及びＣＤ３ガンマをコードする単一のｍＲＮＡ構築体（Ｔｒｅｘ）から発現されてもよい。
【００５０】
タンパク質複合体をコードするのに適した、組換え核酸組成物のあらゆる形態が用いられ得る一方、発明者らは、タンパク質複合体が、互いに異なるペプチドを各々がコードする複数のセグメントを含む単一の核酸によってコードされ得ることを意図する。ゆえに、好ましい一実施形態において、核酸組成物は、２つの互いに異なるペプチド：α鎖Ｔ細胞受容体及びβ鎖Ｔ細胞受容体（又は代わりに、γ鎖Ｔ細胞受容体及びδ鎖Ｔ細胞受容体）をコードする第１の核酸セグメント、並びに２つのペプチド：Ｔ細胞共受容体の一タイプ（例えばＣＤ３δ）の少なくとも一部及びＴ細胞共受容体の別のタイプ（例えばＣＤ３γ）の少なくとも一部をコードする、又は代わりに、ＣＤ３δの一部若しくはＣＤ３γの一部の代わりとなる１つ以上のζ−鎖をコードする第２の核酸セグメントを含む。第１及び第２の核酸セグメントによってコードされる互いに異なるペプチドは、それぞれ、完全長タンパク質（例えば、完全長アルファ鎖及びβ鎖Ｔ細胞受容体及び共受容体）であることが意図される。さらに、第１及び第２の核酸セグメントによってコードされる少なくとも１つ以上の互いに異なるペプチドが、完全長タンパク質の切断型、又は一部であり得ることも意図される。
【００５１】
好ましくは、一実施形態（図２に示す１８Ａ／Ｂ）において、第１及び第２の核酸セグメントは、ｍＲＮＡであり、各々、Ｔ細胞受容体をコードするｍＲＮＡの２つのサブセグメントを含み（例えば、サブセグメントＡはα鎖Ｔ細胞受容体のｍＲＮＡであり、そしてサブセグメントＢは、β鎖Ｔ細胞受容体のｍＲＮＡである等）、ポリＡ尾部が後に続く。ｍＲＮＡの２つのサブセグメントは、２Ａ自己切断ペプチド（２Ａ）のタイプをコードする核酸配列によって分離されていることがさらに好ましい。本明細書中で用いられる２Ａ自己切断ペプチド（２Ａ）は、同じｍＲＮＡフラグメント内の２つのサブセグメントが、２つの別個の、互いに異なるペプチドに翻訳され得るような「ストップ−ゴー」又は「ストップ−キャリー」として知られている翻訳作用を実現することができるあらゆるペプチド配列を指す。２Ａペプチド配列の適切なあらゆるタイプが意図され、ブタテッショウウイルス−１  ２Ａ（Ｐ２Ａ）、ｔｈｏｓｅａ  ａｓｉｇｎａウイルス２Ａ（Ｔ２Ａ）、ウマ鼻炎Ａウイルス２Ａ（Ｅ２Ａ）、口蹄疫ウイルス２Ａ（Ｆ２Ａ）、細胞質多角体病ウイルス（ＢｍＣＰＶ  ２Ａ）、及び軟化病（ｆｌａｃｈｅｒｉｅ）ウイルス（ＢｍＩＦＶ  ２Ａ）が挙げられる。一部の実施形態において、同じタイプの２Ａ配列が、第１及び第２の核酸セグメントの双方の２つのサブセグメント間で用いられ得る（例えば、第１の核酸セグメント：α鎖受容体のｍＲＮＡ−Ｔ２Ａ−β鎖受容体のｍＲＮＡ；第２の核酸セグメント：α鎖受容体のｍＲＮＡ−Ｔ２Ａ−β鎖受容体のｍＲＮＡ）。他の実施形態において、異なるタイプの２Ａ配列が、第１及び第２の核酸セグメントの双方の２つのサブセグメント間で用いられ得る（例えば、第１の核酸セグメント：α鎖受容体のｍＲＮＡ−Ｔ２Ａ−β鎖受容体のｍＲＮＡ；第２の核酸セグメント：α鎖受容体のｍＲＮＡ−Ｐ２Ａ−β鎖受容体のｍＲＮＡ）。
【００５２】
加えて、発明者らは、第１及び第２の核酸セグメントが、単一の核酸（ｍＲＮＡ）内に、例えば２Ａ配列によって連結されて、存在し得ることも意図する。この実施形態（図２に示すＴｒｅｘ）において、第１及び第２の核酸セグメントのサブセグメントは、適切なあらゆる順序（例えば、α鎖−β鎖−ＣＤ３γ−ＣＤ３δ、β鎖−ＣＤ３γ−α鎖−ＣＤ３δ、その他）で、様々な２Ａ配列の同じものの適切なあらゆる組合せ（例えば、α鎖−Ｔ２Ａ−β鎖−Ｐ２Ａ−ＣＤ３γ−Ｆ２Ａ−ＣＤ３δ、β鎖−Ｐ２Ａ−ＣＤ３γ−Ｔ２Ａ−α鎖−Ｆ２Ａ−ＣＤ３δ、その他）で配置され得、単一のｍＲＮＡの３’にてポリＡ尾部が後に続く。
【００５３】
第１及び第２の核酸セグメントのｍＲＮＡ配列に関して、標的細胞、抗原、並びに／又は第１及び第２の核酸セグメントを発現することとなる細胞のタイプに基づいて、ｍＲＮＡ配列が選択されることが好ましい。例えば、第１の核酸セグメントによってコードされるペプチドは、ＣＤ１−脂質抗原複合体に対する実際の、又は予測される親和性が、少なくとも、ＫＤが少なくとも１０−６Ｍ以下、好ましくは少なくとも１０−７Ｍ以下、より好ましくは少なくとも１０−８Ｍ以下であることが好ましい。各ＣＤ１−脂質抗原複合体に対する高い結合親和性を有する第１の核酸セグメント配列を同定するのに適したあらゆる方法が意図される。例えば、第１の核酸セグメントの核酸配列は、適切なあらゆるインビトロアッセイ（例えば、フローサイトメトリー、ＳＰＲアッセイ、結合平衡除外法その他）を介した、ＣＤ１−脂質抗原複合体に対する親和性が変化に富むペプチドのマススクリーニングを介して同定され得る。
【００５４】
組換え核酸（記載される組換えタンパク質又はタンパク質複合体をコードする）は、適切なあらゆる手段によって、免疫担当細胞、好ましくは細胞毒性免疫細胞、より好ましくはＮＫ細胞、ＮＫ（又はＮＫ９２）細胞誘導体、又はＮＫＴ細胞中に導入される。好ましくは、組換え核酸は、細胞毒性免疫細胞に導入されるのに、そして細胞毒性免疫細胞内で発現されるのに適したベクター中に挿入され得る。適したベクターとして、以下に限定されないが、組換え核酸を細胞に導入する方法論に応じて、あらゆる哺乳類細胞発現ベクター及びウイルスベクターが挙げられる。これ以外にも、組換え核酸がＲＮＡである場合、核酸は、細胞中にトランスフェクトされてもよい。また、組換え発現の様式は、修飾細胞が、構成的な、又は誘導性の様式でキメラタンパク質を生成することでできる限り、特定の技術に限定されないことが認識されるべきである。したがって、細胞は、キメラタンパク質をコードする配列要素を有する直鎖状ＤＮＡ、環状ＤＮＡ、直鎖状ＲＮＡ、ＤＮＡ又はＲＮＡウイルスその他でトランスフェクトされてもよい。異なる観点から見て、トランスフェクションは、弾道法、ウイルス媒介法、エレクトロポレーション、レーザーポレーション、リポフェクション、ゲノム編集、リポソーム又はポリマー媒介トランスフェクション、組換え核酸を有するベシクルとの融合その他を介して実行されてもよい。
【００５５】
例えば、トランスフェクションは、ポリ（ベータ−アミノエステル）を含むナノ粒子を用いて実行されてもよい。ナノ粒子は、Ｍｏｆｆｅｔｔ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ，ｖｏｌｕｍｅ  ８，Ａｒｔｉｃｌｅ  ｎｕｍｂｅｒ：３８９（２０１７）（参照によって本明細書に組み込まれる）中で手本となって示されるように、複数のｍＲＮＡ分子（組換えＴ細胞受容体、又はその転写産物をコードする組換え核酸その他）をナノ粒子内のカーゴとして運ぶのに適していることが意図される。一部の実施形態において、ナノ粒子は、裸のナノ粒子（例えば、標的化ドメインその他がない）である。他の実施形態において、ナノ粒子は、組換え核酸の、特定のタイプの免疫細胞への標的送達のための、細胞特異的分子（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４その他）に結合する標的化ドメイン（例えば、抗体、ｓｃＦｖその他）を含んでもよい。
【００５６】
ゆえに、組換え核酸は、ゲノム中に（ゲノム編集又はレトロウイルストランスフェクションを介して）組み込まれてもよいし、安定した、又は一過性の染色体外ユニット（複製能力を有してもよい）として存在してもよいことも理解されるべきである。例えば、細胞毒性細胞をトランスフェクトするのに用いられる組換え核酸は、ウイルス核酸として構成され得、そして細胞をトランスフェクトするのに適したウイルスとして、アデノウイルス、レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス、パーボウイルス、トガウイルス、ポックスウイルス、ヘルペスウイルスその他が挙げられる。これ以外にも、組換え核酸は、染色体外ユニットとして（例えば、プラスミド、酵母人工染色体その他として）、又はゲノム編集に適した（例えば、ＣＲｉＰＲ／Ｃａｓ９、Ｔａｌｅｎ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ媒介組込に適した）構築体として構成されてもよいし、（例えば、ＲＮＡ、ＤＮＡ（合成、又はインビトロで生成されたもの）、ＰＮＡその他としての）単純なトランスフェクション用に構成されてもよい。したがって、細胞は、インビトロ又はインビボでトランスフェクトされてもよい点にも留意すべきである。
【００５７】
組換えウイルスに関して、組換えウイルスを製造する全ての知られている様式が、本明細書中での使用に適していると考えられることが意図される。しかしながら、とりわけ好ましいウイルスとして、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、アルファウイルス、ヘルペスウイルス、レンチウイルスその他が挙げられる。他の適切な選択のうち、アデノウイルスが特に好ましい。さらに、ウイルスは、複製欠損且つ非免疫原性ウイルスであることが通常好ましく、これは典型的に、選択されたウイルスタンパク質（例えば、Ｅ１、Ｅ３タンパク質）の標的欠失によって達成される。そのような所望の特性は、Ｅ２ｂ遺伝子機能を欠失させることによって、さらに増強されてもよく、そして組換えウイルスの高い力価は、最近報告されたような、遺伝的に修飾されたヒト２９３細胞を用いて達成され得る（例えば、Ｊ  Ｖｉｒｏｌ．１９９８  Ｆｅｂ；７２（２）：９２６−９３３）。最も典型的には、所望の核酸配列（ウイルス感染細胞からの発現用）は、当該技術分野において周知の適切な調節要素の制御下にある。
【００５８】
いかなる特定の理論にも拘束されることを望むものではないが、発明者らは、細胞毒性細胞（例えば、ＮＫ細胞、ＮＫＴ細胞その他）内での組換えタンパク質の発現が、微生物に感染した細胞に対する、又は免疫原性自己脂質を発現する細胞に対する細胞毒性媒介免疫応答を加えることによって、免疫応答を増大させることを意図する。より具体的には、ＮＫ細胞が組換えタンパク質を発現する場合、細胞外単鎖変異フラグメントの、ＣＤ１−脂質抗原複合体（例えば、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）感染によるＣＤ１ｂ−ミコール酸）に対する特異的認識及び／又は高親和性結合は、ＩＴＡＭ配列のＳｒｃファミリキナーゼ媒介チロシンリン酸化を含む、細胞内活性化ドメインを介したシグナリングカスケードをトリガして、チロシンキナーゼＳｙｋ及びＺＡＰ７０の、ＩＴＡＭへの結合、並びにチロシンキナーゼによるアダプター分子上の一連のリン酸化が後に続く。異なる観点から見て、Ｔ細胞型適応免疫応答が、ＮＫ細胞中に操作されて、ＮＫ細胞の細胞毒性が、ＣＤ１−脂肪親和性リガンド複合体を有する細胞に対する特異性について高くされてもよい。そのような反応は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染した細胞の処理にとりわけ有利である。というのも、ＮＫ細胞は、感染細胞を溶解させるだけでなく、ＮＫ細胞中に存在するグラニュライシンに起因する抗菌作用を示すからである。
【００５９】
発明者らはまた、そのように遺伝子操作された細胞毒性細胞が、微生物に感染した、腫瘍がある、又は自己免疫疾患に苦しむ患者に（患者のそのような細胞が、ＣＤ１に関連して脂質抗原を示す限り）投与され得ることも意図する。遺伝子操作されたＮＫ細胞は、薬学的に許容されるあらゆるキャリア内に製剤化され得（例えば、好ましくは、滅菌注射可能な組成物として製剤化される）、細胞力価が少なくとも１×１０３細胞／ｍｌ、好ましくは少なくとも１×１０５細胞／ｍｌ、より好ましくは少なくとも１×１０６細胞／ｍｌであり、そして投薬量ユニットあたり少なくとも１ｍｌ、好ましくは少なくとも５ｍｌ、より好ましくは少なくとも２０ｍｌであることが意図される。しかしながら、代わりの製剤形態もまた、本明細書中での使用に適していると考えられ、そして知られている全ての投与経路及び投与モードが、本明細書中で意図される。本明細書中で用いられる用語、遺伝子操作された細胞毒性細胞の「投与」は、遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤の直接的及び間接的な投与の双方を指し、遺伝子操作された細胞毒性細胞の直接的な投与は、典型的に、ヘルスケアの専門家（例えば、医師、看護師その他）によって実行され、間接的な投与は、遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤を、（例えば、注射その他を介した）直接投与用に、ヘルスケアの専門家に提供する、又は利用可能にする工程を含む。
【００６０】
一部の実施形態において、遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤は、皮下注射又は静脈内注射が挙げられる全身注射を介して投与される。全身注射が（例えば、脳腫瘍その他にとって）有効でない場合がある他の実施形態において、遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤は、腫瘍内注射を介して投与されることが意図される。
【００６１】
遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤の投与の用量に関して、用量は、微生物による感染の状態、微生物のタイプ（例えば、進行、重症度その他）、自己免疫疾患の状態、病徴、腫瘍のタイプ、サイズ、位置、患者の健康状態（例えば、年齢、性別その他が挙げられる）、及び他の関連するあらゆる条件に応じて変わってもよいことが意図される。変わってもよい一方、用量及びスケジュールは、遺伝子操作された細胞毒性細胞が、正常な宿主細胞に対して、重大ないかなる毒性作用ももたらさないが、それでも、感染細胞又は腫瘍に対して、感染微生物の数が減少し、感染細胞が死滅し／除去され、且つ／又は腫瘍細胞のサイズが引き下げられる等の細胞毒性作用を誘導するほど十分に有効であるように選択且つ調節されてもよい。
【００６２】
投与のスケジュールに関しても、微生物による感染の状態、微生物のタイプ、自己免疫疾患の状態、病徴、腫瘍のタイプ、サイズ、位置、患者の健康状態（例えば、年齢、性別その他が挙げられる）、及び他の関連するあらゆる条件に応じて変わってもよいことが意図される。一部の実施形態において、遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤の単回用量は、少なくとも１日、少なくとも３日、少なくとも１週、少なくとも２週、少なくとも１ヵ月、又は他の所望されるあらゆるスケジュールの間に、少なくとも１日１回又は１日２回（投与あたり半分の用量）投与され得る。他の実施形態において、遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤の用量は、スケジュールの間徐々に増やされてもよいし、スケジュールの間徐々に減らされてもよい。さらに他の実施形態において、遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤の幾通りもの投与は、間隔をあけて分離され得る（例えば、３日間連続してそれぞれ１回の投与と、７日の間隔をあけて、別に３日間連続してそれぞれ１回の投与等）。
【００６３】
一部の実施形態において、遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤の投与は、２つ以上の異なるステージ：プライミング投与及びブースト投与でなされ得る。プライミング投与の用量は、以下のブースト投与よりも（例えば、少なくとも２０％、好ましくは少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも６０％）高いことが意図される。さらに、プライミング投与の用量は、以下のブースト投与よりも低いことも意図される。加えて、複数のブースト投与がある場合、各ブースト投与は、用量が異なる（例えば、用量を増やす、用量を減らす等）。
【００６４】
一部の実施形態において、遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤投与の用量及びスケジュールは、感染細胞又は癌細胞の細胞変化によって微調整且つ通知されてもよい。例えば、癌患者に、１回以上の用量の遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤が投与された後、遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤によって誘導されるストレスに由来するあらゆる変化（例えば、ＮＫＧ２Ｄリガンドのアップレギュレーション、アポトーシス速度その他）を評価するために、癌組織の小さな生検が得られる。細胞の変化の評価は、免疫組織化学的方法（例えば、蛍光標識化、インサイチュハイブリダイゼーションその他）、生化学的方法（例えば、タンパク質の定量化、翻訳後修飾の同定その他）、又はオミクス分析が挙げられる適切なあらゆるタイプの技術によって実行され得る。評価の結果に基づいて、遺伝子操作された細胞毒性細胞製剤の用量及び／又はスケジュールは、変更され得る（例えば、ひどい細胞毒性が観察されるならば、用量を引き下げる等）。
【実施例】
【００６５】
したがって、上記の、そして更なる考慮点に基づいて、発明者らは、α鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部、及びＣＤ３γの少なくとも一部のタンパク質複合体を発現するＮＫ細胞が、特にＴ細胞受容体のアルファ鎖及びベータ鎖が脂質ＣＤ１複合体を認識する場合、ＣＤ１−脂質抗原複合体を提示する細胞に対して特異的に細胞媒介細胞毒性を増大させることを意図した。そのために、発明者らは、クローン１８  ＴＣＲ（ＰＤＢエントリ４Ｇ８Ｅ参照）のアルファ鎖及びベータ鎖、並びにＣＤ３デルタ及びＣＤ３ガンマを、本質的には図２に示される発現可能なｍＲＮＡ構築体中にクローニングした。
【００６６】
図３Ａは、先に記載したように組換えＴ細胞受容体を発現する組換えＮＫ細胞を、ＣＤ１ｄを発現する樹状細胞とインキュベートした１セットの例示的な結果を示す。より具体的には、ＮＫ細胞を遺伝子操作して、２つの互いに異なる別個の核酸セグメント（１８Ａ／Ｂ）（２つの互いに異なるペプチド（α鎖Ｔ細胞受容体及びβ鎖Ｔ細胞受容体）をコードする第１の核酸セグメント、及び２つのペプチド（ＣＤ３δの少なくとも一部及びＣＤ３γの少なくとも一部）をコードする第２の核酸セグメント）を含めた。次に、１８Ａ／Ｂで遺伝子操作したＮＫ細胞の細胞毒性を、４つの異なる条件（脂質抗原としてのミコール酸の有無、及び２つの異なるＮＫ細胞：樹状細胞（抗原提示細胞）比（１：１及び１：５））において判定した。発明者らは、感染細胞に対するＮＫ細胞の細胞毒性が特異的に、且つ著しく増大する（ミコール酸が脂質抗原として提示される場合、少なくとも３〜５倍）ことを見出して、遺伝的に修飾されたＮＫ細胞は、Ｔ細胞のようにＣＤ１−脂質抗原複合体を認識するハイブリッド細胞として効果的に機能し、且つＣＤ１−脂質抗原複合体を提示する細胞に対して細胞毒性をＮＫ細胞毒性細胞として誘発することができることを確認した。
【００６７】
発明者らはさらに、２つの互いに異なる別個の核酸セグメント（１８Ａ／Ｂ）を含むように遺伝子操作したＮＫ細胞は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）に感染した細胞に対して、タンパク質複合体の４つ全ての構成要素をコードする単一の核酸セグメント（Ｔｒｅｘ）を含むように遺伝子操作したＮＫ細胞と同程度効果的な細胞毒性作用をもたらすことができることを見出した。図３Ｂに示すように、１８Ａ／Ｂ構築体又はＴｒｅｘ構築体のいずれかを発現するＮＫ細胞は、感染細胞内で細胞内結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の約７０〜８０％を死滅させることができ、これは、言い換えると、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）生存度を２日目に少なくとも２０〜２５％に引き下げる。
【００６８】
当業者にとって、すでに記載したものの他に、より多くの修飾が、本明細書中の発明の概念を逸脱しない範囲で可能であることは明らかであるはずである。したがって、本発明の主題は、添付の特許請求の範囲を除いて、制限されるべきでない。さらに、明細書及び特許請求の範囲の双方を解釈する際に、全ての用語は、文脈と最も広く一致することが可能なように解釈されるべきである。特に、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ及びｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、要素、構成要素、又は工程を、非排他的に言及すると解釈されるべきであり、これは、参照した要素、構成要素、又は工程が、明示的に参照されていない他の要素、構成要素、又は工程と共に存在してもよいし、利用されてもよいし、組み合わされてもよいことを示す。本明細書中の記載に、そして後に続く特許請求の範囲の全体を通して用いられる、「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」の意味は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、複数の参照を含む。また、本明細書中の説明に用いられる「中に（ｉｎ）」の意味は、文脈上そうでないとする明確な指示がない限り、「中に（ｉｎ）」及び「上に（ｏｎ）」を含む。明細書及び特許請求の範囲が、Ａ、Ｂ、Ｃ…及びＮからなる群から選択される何かの少なくとも１つに言及する場合、本文は、ＡプラスＮでもＢプラスＮその他でもなく、当該群から１つのみの要素を必要とすると解釈されるべきである。
【図１】
2021502056.tif 000003
【図２】
2021502056.tif 000004
【図３】
2021502056.tif 000005
【手続補正書】
【提出日】令和2年9月10日(2020.9.10)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する細胞外単鎖変異フラグメントをコードする第１の核酸セグメントと；
細胞内活性化ドメインをコードする第２の核酸セグメントと；
前記細胞外単鎖変異フラグメントと前記細胞内活性化ドメインとの間のリンカーをコードする第３の核酸セグメントと；
を含む組換え核酸であって、
前記第１、第２、及び第３のセグメントは、前記細胞外単鎖変異フラグメント、前記細胞内活性化ドメイン、及び前記リンカーが単一のキメラポリペプチドを形成するように配置されている、組換え核酸。
【請求項２】
第１の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されているα鎖Ｔ細胞受容体及びβ鎖Ｔ細胞受容体をコードする第１の核酸セグメントと；
第２の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されているＣＤ３δの少なくとも一部及びＣＤ３γの少なくとも一部をコードする第２の核酸セグメントと；
を含む組換え核酸組成物であって、
前記α鎖Ｔ細胞受容体及び前記β鎖Ｔ細胞受容体の少なくとも１つは、共に、ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する、組換え核酸組成物。
【請求項３】
ミコール酸生成微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導する方法であって：
ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する細胞外単鎖変異フラグメントと；
細胞内活性化ドメインと；
前記細胞外単鎖変異フラグメントを前記細胞内活性化ドメインに連結する膜貫通リンカーと；
を含む組換えタンパク質を発現する遺伝的に修飾されたＮＫ細胞を用意することと：
前記遺伝的に修飾されたＮＫ細胞を、前記患者に、前記患者内の前記微生物に感染したいくつかの細胞を減らすのに有効な用量及びスケジュールで投与することと
を含む方法。
【請求項４】
ミコール酸生成微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導する方法であって：
α鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部、及びＣＤ３γの少なくとも一部を含むタンパク質複合体を発現する遺伝的に修飾されたＮＫ細胞を用意することと；
前記遺伝的に修飾されたＮＫ細胞を、前記患者に、前記患者内の前記微生物に感染したいくつかの細胞を減らすのに有効な用量及びスケジュールで投与することと
を含む方法。
【請求項５】
遺伝的に修飾された細胞毒性細胞であって、１）ＣＤ１−脂質抗原複合体に特異的に結合する細胞外単鎖変異フラグメントと、２）細胞内活性化ドメインと、３）前記細胞外単鎖変異フラグメントを前記細胞内活性化ドメインに結合させる膜貫通リンカーを有するキメラタンパク質をコードする組換え核酸を含む、細胞毒性細胞。
【請求項６】
α鎖Ｔ細胞受容体、β鎖Ｔ細胞受容体、ＣＤ３δの少なくとも一部、及びＣＤ３γの少なくとも一部を有するタンパク質複合体をコードする組換え核酸を含む、遺伝的に修飾された細胞毒性細胞。
【請求項７】
前記細胞外単鎖変異フラグメントは、前記ＣＤ１−脂質抗原複合体に対するモノクローナル抗体のＶＬドメイン及びＶＨドメインを含み、前記細胞外単鎖変異フラグメントはさらに、前記ＶＬドメインと前記ＶＨドメインとの間にスペーサーを含んでもよい、請求項１に記載の組換え核酸または請求項３に記載の方法または請求項５に記載の細胞。
【請求項８】
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｂ、ＣＤ１ｃの少なくとも１つを含むか、または
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、ミコバクテリウムのリン脂質、糖脂質、ミコール酸、リポペプチド、マイコケチド、及びイソプレノイドの少なくとも１つを含むか、または
前記ＣＤ１−脂質抗原複合体は、結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の脂質抗原を含み、
結核菌（Ｍ．Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の前記脂質抗原は、ミコール酸であってもよい、
請求項１または請求項２に記載の組換え核酸または請求項３に記載の方法または請求項５または請求項６に記載の細胞。
【請求項９】
前記細胞内活性化ドメインは、ナチュラルキラー細胞内で免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）媒介シグナリングをトリガするＩＴＡＭを含むか、または
前記細胞内活性化ドメインは、ＣＤ３ζの一部を含むか、または
前記細胞内活性化ドメインはさらに、ＣＤ２８活性化ドメインの一部を含む、
請求項１に記載の組換え核酸または請求項３に記載の方法または請求項５に記載の細胞。
【請求項１０】
前記リンカーは、ＣＤ２８膜貫通ドメイン又はＣＤ３ζ膜貫通ドメインを含む、請求項１に記載の組換え核酸または請求項３に記載の方法または請求項５に記載の細胞。
【請求項１１】
前記第１の核酸セグメント及び前記第２の核酸セグメントは、第３の自己切断２Ａペプチド配列によって分離されている、請求項２に記載の組換え核酸組成物または請求項４に記載の方法または請求項６に記載の細胞。
【請求項１２】
ＣＤ３γの前記一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含むか、または
ＣＤ３δの前記一部は、免疫受容体チロシンベース活性化モチーフ（ＩＴＡＭ）を含む、
請求項２に記載の組換え核酸組成物または請求項４に記載の方法または請求項６に記載の細胞。
【請求項１３】
前記遺伝的に修飾されたＮＫ細胞は、ａＮＫ、ｈａＮＫ、及びｔａＮＫからなる群に由来する、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項１４】
前記遺伝的に修飾されたＮＫ細胞の投与は、静脈内注射によって実行される、請求項３または請求項４に記載の方法。
【請求項１５】
微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導するための、請求項１、２、７〜１２のいずれか一項に記載の組換え核酸の使用。
【請求項１６】
微生物に感染した患者内でＮＫ細胞免疫応答を誘導するための、請求項５〜１２のいずれか一項に記載の遺伝的に修飾された細胞毒性細胞の使用。
【国際調査報告】
2021502056.tif 000006
2021502056.tif 000007
2021502056.tif 000008
2021502056.tif 000009