(57)【要約】  膜貫通ナノ細孔であって、ａ．足場成分を提供する１つ以上のポリヌクレオチド鎖と、ｂ．複数のステープル成分を提供する複数のポリヌクレオチド鎖と、を含み、複数のステープル成分の各々が、足場成分にハイブリダイズし、足場成分内に含まれる少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖の主要部分の配向が、膜の平面に実質的に平行であり、ならびに膜内に埋め込まれ、膜と実質的に同一平面上にあり、ナノ細孔が、膜を穿孔するために好適なチャネルを画定し、チャネルが、その中心に沿って延びる長手方向軸、および少なくとも３ｎｍの長手方向軸に垂直な最小内部寸法を有する、膜貫通ナノ細孔が提供される。ナノ細孔を含む膜、膜を含む生物学的センサー、および膜を使用する分子感知のための方法も開示される。【選択図】図１Ａ
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膜貫通（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）ナノ細孔であって、前記ナノ細孔が、
ａ．足場成分を提供する１つ以上のポリヌクレオチド鎖と、
ｂ．複数のステープル成分を提供する複数のポリヌクレオチド鎖と、を含み、
前記複数のステープル成分の各々が、前記足場成分にハイブリダイズし、
前記足場成分内に含まれる少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖の主要部分の配向が、膜の平面に実質的に平行であり、かつ前記膜内に埋め込まれ、前記膜と実質的に同一平面上にあり、
前記ナノ細孔が、前記膜を穿孔するために好適なチャネルを画定し、
前記チャネルが、その中心に沿って延びる長手方向軸、および少なくとも３ｎｍの前記長手方向軸に垂直な最小内部寸法を有する、膜貫通ナノ細孔。
【請求項２】
足場成分を提供する前記１つ以上のポリヌクレオチド鎖、および前記複数のステープル成分の少なくとも１つのいずれかまたは両方が、前記ナノ細孔の前記膜への挿入を促進する少なくとも１つの疎水性アンカーをさらに含む、請求項１に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項３】
前記チャネルが、環状、楕円形および多角形からなる群から選択される前記長手方向軸に垂直な形状を有する、請求項１または２に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項４】
前記ナノ細孔が１つ以上のモジュールを含む、請求項１〜３のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項５】
前記ナノ細孔が、前記１つ以上のモジュール間に接続された少なくとも１つのサブモジュールをさらに含む、請求項４に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項６】
前記または各モジュールが、前記ナノ細孔が前記チャネルの前記長手方向軸の周りで回転対称性を有するように同一である、請求項５に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項７】
前記または各モジュールが、少なくとも１つの他のモジュールに接続されている、請求項４〜６のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項８】
モジュール間の前記接続が、前記モジュールのうち１つのステープル鎖またはその一部、前記モジュールのうち１つの足場鎖またはその一部、請求項５に記載のサブモジュール、スペーサー成分を提供する１つ以上のポリヌクレオチド鎖からなる群から選択される構造によって提供される、請求項７に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項９】
前記足場成分、前記複数のステープル成分、および／または存在する場合は前記スペーサー成分内に含まれる少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖がＤＮＡを含む、請求項１〜８のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項１０】
前記ナノ細孔および／またはその成分の組み立てが、ＤＮＡオリガミ技術を介する、請求項１〜９のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項１１】
前記少なくとも１つの疎水性アンカーが、前記足場成分内に含まれるポリヌクレオチド鎖の疎水性部分から構成される、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項１２】
前記少なくとも１つの疎水性アンカーが、前記複数のステープル成分またはその疎水性部分のうちの少なくとも１つから構成される、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項１３】
前記少なくとも１つの疎水性アンカーが、複数の疎水性アンカー分子を含む、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項１４】
前記複数の疎水性アンカー分子が、
ａ．前記ナノ細孔の周囲に結合し、実質的に等距離に配置され、前記複数の疎水性アンカー分子が、前記ナノ細孔の前記チャネルの前記長手方向軸から半径方向外向きに配向され、かつ／あるいは
ｂ．前記複数の疎水性アンカー分子が、挿入されると前記膜と相互作用するか、および／または前記膜内に延びるように配向されるように、前記ナノ細孔またはその一部の膜に面する側に結合している、請求項１３に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項１５】
前記ナノ細孔が、少なくとも４つの疎水性アンカー分子を含む、請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項１６】
前記少なくとも１つの疎水性アンカー分子が、脂質およびポルフィリンからなる群から選択される、請求項１〜１０および請求項１３〜１５のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項１７】
前記脂質が、ステロール、アルキル化フェノール、フラボン、飽和および不飽和脂肪酸、ならびに合成脂質分子（ドデシル−ベータ−Ｄ−グルコシドを含む）からなる群から選択される、請求項１６に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項１８】
−前記ステロールが、コレステロール、コレステロールの誘導体、フィトステロール、エルゴステロール、および胆汁酸からなる群から選択され、
−前記アルキル化フェノールが、メチル化フェノール、ドリコールおよびトコフェロールからなる群から選択され、
−前記フラボンが、フラバノン含有化合物、および６−ヒドロキシフラボンからなる群から選択され、
−前記飽和および不飽和脂肪酸が、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびパルミチン酸の誘導体からなる群から選択され、かつ／または
−前記合成脂質分子が、ドデシル−ベータ−Ｄ−グルコシドである、請求項１７に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項１９】
前記ナノ細孔が、三角形、四角形、四辺形、五角形、六角形、七角形、および八角形からなる群から選択される多角形の形態である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項２０】
前記ナノ細孔の前記チャネルの最小内部幅が、約２０ｎｍ未満である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項２１】
前記足場成分が、配列番号１、配列番号２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項２２】
前記複数のステープル成分が、配列番号３〜１２、配列番号１５〜５６、配列番号６５〜９４、配列番号１０５〜１４０、および配列番号１５３〜２６８からなる群のうちの１つ以上から選択される配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項２３】
少なくとも１つのリンカーをさらに含み、前記リンカーの少なくとも一部が前記チャネルの表面上または前記チャネルの表面に近接して位置する、請求項１〜２２のいずれか１項に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項２４】
前記リンカーが分析物結合分子に結合し、それによって前記分析物結合分子が前記チャネル内またはチャネルに近接して位置する、請求項２３に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項２５】
前記リンカーがポリヌクレオチド鎖であり、共有結合または水素結合を介して前記分析物結合分子に結合している、請求項２４に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項２６】
前記分析物結合分子が、抗体、またはＦａｂフラグメントを含むその抗原結合フラグメント、ペプチドアプタマー、マイクロプロテイン、アフィマー、受容体またはその結合ドメイン、オリゴヌクレオチドプローブ、および核酸アプタマーからなる群から選択される分子を含む、請求項２４または２５に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項２７】
前記リンカーが、触媒活性を有する生体分子に結合している、請求項２６に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項２８】
触媒活性を有する前記生体分子が酵素である、請求項２７に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項２９】
前記生体分子が、ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、ギラーゼ、およびテロメラーゼからなる群から選択される、請求項２８に記載の膜貫通ナノ細孔。
【請求項３０】
請求項１〜２９のいずれか１項に記載の少なくとも１つの膜貫通ナノ細孔が挿入されている、膜。
【請求項３１】
前記膜が、ポリマーで形成された半流体膜を含む膜および固体膜からなる群から選択される、請求項３０に記載の膜。
【請求項３２】
前記半流体膜を形成する前記ポリマーが、両親媒性合成ブロックコポリマーで構成され、好適には親水性コポリマーブロックおよび疎水性コポリマーブロックから選択される、請求項３１に記載の膜。
【請求項３３】
前記膜が、小胞、ミセル、平面膜、または液滴の形態である、請求項３１または３２に記載の膜。
【請求項３４】
前記固体膜が、ＩＩ−ＩＶおよびＩＩＩ−Ｖ族の酸化物および窒化物、固体の有機および無機ポリマー、プラスチック、エラストマー、ならびにガラスからなる群から選択される材料から形成される、請求項３１に記載の膜。
【請求項３５】
生物学的センサーであって、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の膜および電気測定装置を含む、生物学的センサー。
【請求項３６】
生物学的センサーであって、請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の膜および蛍光測定装置を含む、生物学的センサー。
【請求項３７】
分子感知のための方法であって、
Ｉ．請求項３０〜３４のいずれか１項に記載の膜を提供することと、
ＩＩ．ナノ細孔を分析物と接触させ、前記少なくとも１つのナノ細孔を通るイオンの流れ、または前記ナノ細孔を横切る電子流を確立することと、
ＩＩＩ．前記ナノ細孔を横切る電気信号を測定することと、を含み、
前記分子感知は、分析物の検出または特徴付けを含み、電気的測定の変化は前記分析物を示す、方法。
【請求項３８】
前記電気的測定が、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定、および電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定から選択される、請求項３７に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、膜に挿入してナノ細孔として機能することができる核酸ベースのナノ構造の分野にある。このようなナノ細孔は、化学的および生物学的センサー、ナノスケールデバイス、および分子ゲーティングアプリケーションの分野で有用性を見出す可能性がある。
【背景技術】
【０００２】
ナノ細孔は、膜貫通ポリマー（ｍｅｍｂｒａｎｅ  ｓｐａｎｎｉｎｇ  ｐｏｌｙｍｅｒｓ）および複合体であり、穿孔を画定し、それによって、イオンおよび特定の分子が通過する可能性のある２つの流体、典型的には液体、好適には水溶液の間の仕切りを形成する膜にチャネルを形成する。チャネルの最小直径は、典型的にはナノメートル（１０−９メートル）の範囲であるため、所与の特定のこれらのポリペプチドは、「ナノ細孔」と名付けられている。チャネルは、典型的には、膜の平面軸に対して垂直方向に形成され、タンパク質、ペプチド、合成有機化合物、またはＤＮＡなどの核酸から形成することができる（Ｈｏｗｏｒｋａ，Ｎａｔｕｒｅ  Ｎａｎｏｔｅｃｈ．，１２，Ｊｕｌｙ；６１９−６３０（２０１７））。
【０００３】
膜に結合したナノ細孔は、多くの潜在的使用法を有する。一例は、無標識および携帯可能な様式で、生体分子を分析するためのセンサーとしてのナノ細孔の使用である。この手法の一実施形態では、電位が膜結合ナノ細孔を横切って印加され、イオンがチャネルを流れることを生じる。このイオンの流れは、電流として測定することができる。単一チャネル記録を使用する好適な電気的測定技術は、例えばＷＯ２０００／２８３１２、およびＤ．Ｓｔｏｄｄａｒｔら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，２０１０，１０６，７７０２−７に記載されている。マルチチャネル記録技術もまた、例えば、ＷＯ２００９／０７７７３４および国際公開第ＷＯ２０１１／０６７５５９号に記載されている。光学的測定は、電気的測定と組み合わせることができる（Ｓｏｎｉ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ．２０１０  Ｊａｎ；８１（１）：０１４３０１）。あるいは、膜結合ナノ細孔を通るイオンの流れは、膜を横切ってイオン勾配を提供することによって達成され得る。測定された電流は、チャネルの閉塞のサイズまたは程度を評価するために使用できる。電流のこれらの変化は、分子もしくは分子の一部が細孔でもしくはその付近で結合したことを同定するために使用することができ（分子感知）、またはある特定のシステムでは、細孔のサイズに基づいて、細孔内に存在する分子の本質を決定するために使用することができる（核酸配列決定）。核酸の鎖配列決定は、変異体ＭｓｐＡ、Ｃｌｙａ、アルファ−溶血素、およびＣｓｇＧなどのいくつかのタンパク質型ナノ細孔に関連して説明されている（ＷＯ２０１６／０３４５９１号を参照）。
【０００４】
しかしながら、タンパク質型ナノ細孔は、新規に処理および設計することが非常に困難である。それらは、典型的には、狭い管腔（５ｎｍ未満）の細孔チャネルを示し、様々なバイオセンシングアプリケーションでのそれらの有用性を制限する可能性がある。折り畳みの熱力学は複雑であり、膜に挿入されず膜を架橋しない誤って折り畳まれたタンパク質をもたらす可能性がある。折り畳みタンパク質または他の大きな生体分子用のセンサーとして有用であるためには、ナノ細孔によって形成された好適な膜チャネルは、ある特定の基準を満たすべきであり、すなわち、
１）チャネル管腔は、チャネル管腔内側の大きな生体分子の分子を収容するために少なくとも約５ｎｍ幅であるべきであり、チャネル内の大きな生体分子の結合は、分析物が細孔入口で結合する場合よりもより高い読み出し感度を生じる、
２）細孔は、電気的な読み出しにおいて一定のベースレベルを達成する（すなわち、バックグラウンドノイズを低減する）ように構造的に画定されるべきである、かつ
３）細孔寸法は、細孔を異なる生体分子サイズに適合するように容易に調整可能であるべきである。
【０００５】
現在までのところ、既存の生物学的細孔または人工細孔のいずれもこれらの基準の全てを満たすものはない。
【０００６】
タンパク質ベースのナノ細孔の限界に対処するために、研究者たちは核酸ベースのシステムを使用しようと努めてきた。核酸二重鎖、特にＤＮＡ二重鎖から構成される細孔は、調整可能な内部幅の安定したナノ細孔を形成することができることが示されている（Ｂｕｒｎｓ  Ｊ．Ｒ．，ｅｔ  ａｌ．Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．５２，１２０６９−１２０７２（２０１３）、およびＳｅｉｆｅｒｔ  Ａ．，Ｇｏｐｆｒｉｃｈ  Ｋ．，Ｂｕｒｎｓ  Ｊ．Ｒ．，Ｆｅｒｔｉｇ  Ｎ．，Ｋｅｙｓｅｒ  Ｕ．Ｆ．，Ｈｏｗｏｒｋａ  Ｓ．ＡＣＳ  Ｎａｎｏ  ９，１１１７−１１２６（２０１５））。ＤＮＡナノ細孔用のモジュール式構築原理によって、細孔直径のカスタマイズを可能にし（Ｇｏｐｆｒｉｃｈ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｎｏ．Ｌｅｔｔ．，１５（５），３１３４−３１３８（２０１５）、ＷＯ２０１３／０８３９８３）、輸送を調節するための制御可能なゲートの設置を可能にした（Ｂｕｒｎｓ  Ｊ．Ｒ．，Ｓｅｉｆｅｒｔ  Ａ．，Ｆｅｒｔｉｇ  Ｎ．，Ｈｏｗｏｒｋａ  Ｓ．Ａ．，Ｎａｔ．Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１，１５２−１５６（２０１６））。
【０００７】
膜貫通核酸ナノ細孔は、典型的には、両端が開いた中空チャネルを囲む複数の連結されたＤＮＡ二重鎖の構造コアから構成される。ＤＮＡオリガミの技術を使用して、脂質膜を貫通してまたがるステムを作成でき、一方、樽型のキャップは膜の片側に接着し、外側に伸びて漏斗を形成する（Ｌａｎｇｅｃｋｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｏｖ．１６；３３８（６１０９）：９３２−９３６（２０１２））。このようにして、核酸ナノ細孔は類似のタンパク質ナノ細孔の構成を模倣する。しかしながら、タンパク質および核酸ナノ細孔の両方のかかる構成に関連する問題は、分析物などの分子が、管腔の内面またはナノ細孔の入口もしくは出口開口部を画定する壁との非特異的結合相互作用に供される可能性があることである。かかる非特異的結合は、細孔のチャネルの閉塞につながる可能性があり、それにより、かかる細孔を含むデバイスおよびセンサーの効率、信号、および寿命を低下させる。
【０００８】
複数の束ねられた二重鎖から構成される核酸ナノ細孔に関するさらなる考慮事項は、それらが細孔を横切ってイオン漏れを起こしやすく、測定された電流の変動をもたらす可能性があるということである。この種の変動は望ましくなく、信号の精度および忠実度の低下につながり、バックグラウンドノイズが大幅に増加する。理論に拘束されることを望まないが、変動は、平面膜力に供される核酸二重鎖の束の構造的完全性の喪失によるものであり、束が短時間に分離するか、または不整列になり、電流が形成されるギャップを通って流れると考えられる。
【０００９】
本発明の目的は、先行技術に存在する問題を克服するか、または少なくとも改善することである。本発明のこれらおよび他の使用、特徴および利点は、本明細書で提供される教示から当業者には明らかであるべきである。
【発明の概要】
【００１０】
第１の態様では、本発明は、膜貫通（ｍｅｍｂｒａｎｅ−ｓｐａｎｎｉｎｇ）ナノ細孔であって、ナノ細孔が、
ａ．足場成分を提供する１つ以上のポリヌクレオチド鎖と、
ｂ．複数のステープル成分を提供する複数のポリヌクレオチド鎖と、を含み、
複数のステープル成分の各々が、足場成分にハイブリダイズし、
足場成分内に含まれる少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖の主要部分の配向が、膜の平面に実質的に平行であり、かつ膜内に埋め込まれ、膜と実質的に同一平面上にあり、
ナノ細孔が、膜を穿孔するために好適なチャネルを画定し、
チャネルが、その中心に沿って延びる長手方向軸、および少なくとも３ｎｍの長手方向軸に垂直な最小内部寸法を有する、膜貫通ナノ細孔を提供する。
【００１１】
本発明の特定の実施形態では、足場成分を提供する１つ以上のポリヌクレオチド鎖、および複数のステープル成分の少なくとも１つのいずれかまたは両方が、ナノ細孔の膜への挿入を促進する少なくとも１つの疎水性アンカーをさらに含む。
【００１２】
別の実施形態では、チャネルは、環状、楕円形および多角形からなる群から選択される長手方向軸に垂直な形状を有する。
【００１３】
本発明の第１の態様の膜貫通ナノ細孔の第１の態様の特定の実施形態では、ナノ細孔は、
ａ．足場成分を提供する１つ以上のポリヌクレオチド鎖と、
ｂ．複数のステープル成分を提供する複数のポリヌクレオチド鎖と、を含み、
複数のステープル成分の各々が、足場成分にハイブリダイズし、
足場成分内に含まれるポリヌクレオチド鎖の主要部分の配向が、膜の平面に実質的に平行であり、かつ膜内に埋め込まれ、膜と実質的に同一平面上にあり、それによって、ナノ細孔が、膜を穿孔するチャネルを画定し、中央チャネルが、少なくとも３ｎｍの最小内部幅を有する管腔を有する。
【００１４】
一実施形態では、本発明の膜貫通ナノ細孔は、１つ以上のモジュールを含む。好適には、ナノ細孔は、１つ以上のモジュール間に接続されたサブモジュールをさらに含む。実施形態では、当該または各モジュールは、ナノ細孔がチャネルの長手方向軸の周りで回転対称性を有するように同一である。さらなる実施形態では、当該または各モジュールは、少なくとも１つの他のモジュールに接続されている。好適には、モジュール間の接続は、モジュールのうちの１つのステープル鎖またはその一部、モジュールのうちの１つの足場鎖またはその一部、サブモジュール、スペーサー成分を提供する１つ以上のポリヌクレオチド鎖からなる群から選択される構造によって提供される。
【００１５】
実施形態では、膜貫通ナノ細孔の足場成分は、少なくとも第２のポリヌクレオチド鎖、任意選択的に少なくとも第２および第３またはそれ以上の足場ポリヌクレオチド鎖を含む。好適には、足場成分内に含まれる１つ以上のポリヌクレオチド鎖のポリヌクレオチド鎖、および／またはステープル成分内に含まれる複数のポリヌクレオチド鎖、および／またはスペーサー成分は、存在する場合、ＤＮＡを含む。典型的には、本発明のナノ細孔および／またはその成分の組み立ては、ＤＮＡオリガミ技術を介する。本発明の特定の実施形態では、１つ以上の足場成分は、ナノ細孔が埋め込まれ得る膜に対して同一平面上にある積層環構成を想定している。代替の実施形態では、１つ以上の足場成分は、ナノ細孔が埋め込まれ得る膜に対して同一平面上の配向にある各足場成分を並べて構成することを想定している。
【００１６】
本発明の特定の実施形態によれば、少なくとも１つの疎水性アンカーは、足場成分内に含まれるポリヌクレオチド鎖の疎水性部分から構成される。あるいは、またはさらに、少なくとも１つの疎水性アンカーは、疎水性部分を含むステープル成分内に含まれる複数のポリヌクレオチド鎖のうちの少なくとも１つから構成され得る。任意選択的に、ステープルポリヌクレオチド鎖の少なくとも１つの実質的に全てが疎水性であり、それにより疎水性アンカーを定義する。
【００１７】
特定の実施形態では、少なくとも１つの疎水性アンカーは、少なくとも１つ、好適には複数の疎水性アンカー分子を含む。好適には、複数の疎水性アンカー分子は、
ａ．ナノ細孔の周囲に結合し、実質的に等距離に配置され、複数の疎水性アンカー分子が、ナノ細孔のチャネルの縦軸から半径方向外向きに配向される、および／または
ｂ．複数の疎水性アンカー分子が、挿入されると膜と相互作用する、および／または膜内に延びるように配向されるように、ナノ細孔またはその一部の膜に面する側に結合している。
【００１８】
本発明のさらなる実施形態では、ナノ細孔は、少なくとも３つ、任意選択的に４つ、好適には少なくとも５つの疎水性アンカー分子、および任意選択的に６つ以上の疎水性アンカー分子を含む。
【００１９】
本発明の実施形態では、少なくとも１つの疎水性アンカー分子は、脂質およびポルフィリンから選択される。典型的には、アンカーが脂質を含む場合には、脂質は、ステロール、アルキル化フェノール、フラボン、飽和および不飽和脂肪酸、ならびに合成脂質分子（ドデシル−ベータ−Ｄ−グルコシドを含む）からなる群から選択される。本発明の特定の実施形態では、
−ステロールは、コレステロール、コレステロールの誘導体、フィトステロール、エルゴステロール、および胆汁酸からなる群から選択され、
−アルキル化フェノールは、メチル化フェノールおよびトコフェロールからなる群から選択され、
−フラボンは、フラバノン含有化合物および６−ヒドロキシフラボンからなる群から選択され、
−飽和および不飽和脂肪酸は、ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびパルミチン酸の誘導体からなる群から選択され、かつ／または
−合成脂質分子は、ドデシル−ベータ−Ｄ−グルコシドである。
【００２０】
本発明の特定の実施形態によれば、ナノ細孔は、三角形、四角形、四辺形、五角形、六角形、七角形、および八角形からなる群から選択される多角形の形態である。ナノ細孔のチャネルによって画定される管腔の最小内部幅が約１０ｎｍより大きく、約２０ｎｍ未満であることは、典型的であるが、必須ではない。
【００２１】
本発明の特定の実施形態では、足場成分は、少なくとも１つのポリヌクレオチド鎖を含み、配列番号１、配列番号２、配列番号１３、および配列番号１４からなる群から選択される配列を有するポリヌクレオチドから構成される。任意選択的に、ステープル成分は、配列番号３〜１２、配列番号１５〜５６、配列番号６５〜９４、配列番号１０５〜１４０、および配列番号１５３〜２６８からなる群から選択される配列を有する少なくとも１つのポリヌクレオチドを含む複数のポリヌクレオチド鎖から構成される。
【００２２】
本発明の特定の実施形態では、膜貫通ナノ細孔は、少なくとも１つのリンカーをさらに含み、ナノ細孔がその三次元構成をとった場合、リンカーの少なくとも一部は、チャネルの表面上またはチャネルの表面に近接して位置する。好適には、リンカーは、分析物結合分子に結合し、それにより、分析物結合分子は、チャネル内またはチャネルに近接して位置する。好適には、リンカーはポリヌクレオチド鎖である。好適には、リンカーは、共有結合、静電相互作用、または水素結合を介して分析物結合分子に結合している。特定の実施形態では、分析物結合分子は、抗体、またはＦａｂフラグメントを含むその抗原結合フラグメント、ペプチドアプタマー、マイクロプロテイン、アフィマー、および核酸アプタマーからなる群から選択される分子を含む。任意選択的に、リンカーは、ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、ギラーゼ、およびテロメラーゼなどの酵素の触媒活性を有する生体分子に結合される。本発明の例示的な実施形態では、生体分子は、分析物結合ポリペプチドまたは核酸から選択される。
【００２３】
本発明の第２の態様は、膜貫通ナノ細孔であって、ナノ細孔が、膜内に位置する環状または多角形の構造を形成するように構成され、ナノ細孔は、
ｉ．少なくとも１つの足場ポリヌクレオチド鎖と、
ｉｉ．複数のステープルポリヌクレオチド鎖と、を含み、
複数のステープルポリヌクレオチド鎖の各々が、少なくとも１つの足場ポリヌクレオチド鎖とハイブリダイズして、膜貫通ナノ細孔の三次元構造を形成し、
少なくとも１つの足場ポリヌクレオチド鎖および複数のステープルポリヌクレオチド鎖のいずれかまたは両方が、複数の疎水性アンカー分子をさらに含み、
膜貫通ナノ細孔は、少なくとも１つの足場ポリヌクレオチド鎖の大部分の配向が膜の平面に実質的に平行であり、それによって少なくとも約４ｎｍの最小内部幅を有する中央チャネルを画定するように配置される、膜貫通ナノ細孔を提供する。
【００２４】
本発明の第３の態様は、膜、好適には、疎水性二重層または両親媒性層を含む膜を提供し、その中に、本明細書に例示される任意の態様または実施形態に記載されるような少なくとも１つの膜貫通ナノ細孔が挿入される。典型的には、膜は、ポリマーで形成された半流体膜または固体膜を含む。好適には、半流体膜は、親水性コポリマーブロックおよび疎水性コポリマーブロックから好適に選択された両親媒性合成ブロックコポリマーから構成される。本発明の一実施形態では、親水性コポリマーブロックは、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ／ＰＥＯ）、およびポリ（２−メチルオキサゾリン）からなる群から選択され、疎水性コポリマーブロックは、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、およびポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）からなる群から選択される。代替的な実施形態では、ポリマー膜は、両親媒性ブロックコポリマーであるポリ２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン−ｂ−ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＰＭＰＣ−ｂ−ＰＤＰＡ）で構成されている。任意選択的に、膜は、生物学的脂質二重層膜であるか、またはそれを含む。
【００２５】
本発明の特定の実施形態では、膜は、小胞、ミセル、平面膜、または液滴の形態である。
【００２６】
別の実施形態では、膜は、ＩＩ−ＩＶおよびＩＩＩ−Ｖ族の酸化物および窒化物、固体の有機および無機ポリマー、プラスチック、エラストマー、ならびにガラスからなる群から選択される材料から形成される固体膜である。
【００２７】
本発明の第４および第５の態様は、生物学的センサーであって、本明細書に記載される少なくとも１つの膜、およびそれぞれ電気的または蛍光測定のための装置も含む、生物学的センサーを提供する。本発明のさらなる実施形態は、１つ以上の膜内に含まれる複数の膜貫通ナノ細孔を含む生物学的センサーを提供する。
【００２８】
本発明の第６の態様は、本明細書に記載されるような１つ以上の生物学的センサーを含む感知デバイスを提供する。感知デバイスは、診断または予知装置として機能し得る。感知デバイスは、電位差下で開口部／膜穿孔を通るイオン電流を測定するために、膜の各側面に配置された電極を含んでよい。電極は、電極に電圧を供給するために配置された制御回路、およびイオン流を測定するために配置された測定回路を含む電気回路に接続され得る。共通電極は、共通電極と膜の反対側の側面に提供された電極との間の開口部を通るイオン流を測定するために提供され得る。
【００２９】
本発明の第７の態様は、分子感知のための方法であって、
Ｉ．本明細書に記載の膜を提供することと、
ＩＩ．ナノ細孔を分析物と接触させ、少なくとも１つのナノ細孔を通るイオンの流れ、またはナノ細孔を横切る電子流を確立することと、
ＩＩＩ．ナノ細孔を横切る電気信号を測定することと、を含み、
分子感知は、分析物の検出または特徴付けを含み、電気的測定の変化は分析物を示す、方法を提供する。
【００３０】
本発明の一実施形態では、電気的測定は、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定、および電界効果トランジスタ（ＦＥＴ）測定から選択される。任意選択的に、電気的測定は、膜の第１の側から膜の第２の側へのイオンの流れを決定することを含む。任意選択的に、方法は、ステップ（ＩＩＩ）の後に、分析物が存在しない場合の１つ以上の膜貫通ナノ細孔を通るもしくは横切るイオン流または電子流と比較した、１つ以上の膜貫通ナノ細孔を通るもしくは膜を横切るイオン流または電子流の変化によって、分析物の存在を決定するさらなるステップを含む。
【００３１】
本発明の第８の態様では、分子ゲーティングのための方法であって、方法が、
ａ）本発明の第３の態様に従って膜を提供することと、
ｂ）ナノ細孔内のチャネルの最小内部幅未満の直径を有する少なくとも１つの生体分子を提供することと、
ｃ）少なくとも１つの生体分子がナノ細孔を通過するまでインキュベートすることと、を含む方法を提供する。
【００３２】
本発明の第８の態様の実施形態では、少なくとも１つの生体分子がナノ細孔を通過したとき、生体分子がナノ細孔を通って戻るのを防止する物理的変化に供される。さらなる実施形態では、少なくとも１つの生体分子は、球状タンパク質、ポリヌクレオチド−タンパク質構築物、標識ポリヌクレオチド、または標識タンパク質である。
【００３３】
本発明は、本明細書に開示されているが上に明示的に記載されていないいくつかの特徴のさらなる組み合わせによって定義され得ることが理解されるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３４】
本発明は、以下の添付の図面によって示されている。
【図１Ａ】（ａ）は、本発明の一実施形態による核酸ナノポアナノ細孔構造の表現であり、積み重ねられた環状の構成であるが、別個の脂質アンカーの存在を省略した、１０ｎｍの内部幅の管腔を画定するチャネルを示す上面（平面）図および側面図で示し、（ｂ）は、細孔によって画定されるチャネル内につながれたリンカー基および分析物結合剤（ビオチン）を有する本発明の一実施形態による核酸ナノ細孔構造の表現であり、（ｃ）は、本発明の一実施形態による核酸ナノ細孔構造の表現を示し、上部（平面）図において半径方向外向きに延びる６つの膜アンカーの存在を伴う環様構成を示し、斜視図−ｒ６ｃとして示され、そして、（ｄ）は、脂質膜に挿入され、それによってナノ細孔のチャネルを介して膜を横切る分析物の通過を可能にする、（ａ）の実施形態による環状ナノ細孔の表現である。
【図１Ｂ】（ｄ）は、脂質膜に挿入され、それによってナノ細孔のチャネルを介して膜を横切る分析物の通過を可能にする、（ａ）の実施形態による環状ナノ細孔の表現である。
【図２】本発明の一実施形態によるｒ６ｃ環状ナノ細孔の２Ｄ  ＤＮＡマップを示す（その配列は実施例１に示されている）。足場鎖は中程度の灰色で示され、より長い連続鎖であり、一方、ステープル鎖は濃い灰色で、長さがはるかに短くなっている。ＤＮＡ鎖の５’末端および３’端は、それぞれ四角形および三角形として表されている。中心軸に沿った３’末端の周りの円は、アンカー分子の配置を示す。（Ａ）とマークされた円は、リンカー／分析物相互作用分子／機能化分子が結合している３’末端を示す。
【図３】（ａ）は、Ｍ−１００ｂｐ  ＤＮＡラダー、レーン１−足場のみ、レーン２−線形構造（Ｌ、線形化環）、レーン３−環構造（ｒ０ｃ、コレステロールなし）、レーン４および５−それぞれ４つおよび６つのコレステロールタグ（ｒ４ｃおよびｒ６ｃ）が付いている環状ナノ細孔構造、レーン６−コレステロール−ＤＮＡのみ、の実験結果を示す電気泳動ゲルの写真を示し、（ｂ）は、ｒ０ｃ環（左）とＳＵＶとインキュベートした環状ナノ細孔構造の代表的なＴＥＭ画像−（スケールバー＝２０ｎｍ）である。
【図４】フルオロフォア標識ＤＮＡ環ｒ６ｃとインキュベートしたＧＵＶ小胞の共焦点蛍光画像を示す。左から右へ：緑のチャネル−フルオロフォアで標識された脂質、赤のチャネル−ＤＮＡ環、２つのチャネルのマージされた画像。スケールバー＝２０μｍ。
【図５】本発明の一実施形態のナノ細孔環構造を様々な数の膜アンカー（コレステロールタグ）の有無にかかわらず添加した後の、ＳＵＶからの６−カルボキシフルオレセイン（６−ＣＦ）、ｒ０ｃ−コレステロールタグのない環構造、ｒ２ｃ、ｒ４ｃ、およびｒ６ｃ−それぞれ２つ、４つ、および６つのコレステロールタグを有する環構造、Ｌ５ｃ−５つのコレステロールタグを有する線形構造（コントロール）、の時間依存放出を示すグラフを示す。ＳＵＶからの６−ＣＦの放出は、４および６コレステロールのナノ細孔環でのみ観察され、５コレステロール脂質アンカーの線形環では観察されない。
【図６】ナノ細孔環（ｒ６ｃ）を媒介したＧＵＶへの色素流入の時系列共焦点画像を示す。ＦＩＴＣ−デキストラン（左、流体力学的直径１５ｎｍ）およびＡｔｔｏ６３３（右、ｈ．ｄ直径１ｎｍ）を同時に測定した。
【図７】ＧＵＶ管腔内の２つの色素の蛍光強度測定に基づいた図６に示す結果のグラフを示す。
【図８】多角形のＤＮＡナノ細孔の設計およびその例示的なＴＥＭ画像の概略図を示す。全てのスケールバーの長さは２０ｎｍである。
【図９】コレステロール鎖（中灰色の円錐）と結合する幅１０ｎｍのＤＮＡの四角形の細孔構造の（Ａ）上面図および（Ｂ）底面図、（Ｃ）膜結合１０ｎｍのＤＮＡナノ細孔の概略図、（Ｄ）細孔構造の１．２％アガロースゲル分析およびコレステロール鎖およびＤＰｈＰＣ  ＳＵＶとのインキュベーション：Ｍ−１ｋｂ  ＤＮＡラダー、レーン１〜４：コレステロール結合細孔をＤＰｈＰＣ  ＳＵＶとインキュベートした後の、Ｍ１３足場、ＤＮＡ細孔、コレステロール鎖と結合したＤＮＡ細孔、（Ｅ）〜（Ｆ）ＧＵＶ上のＤＮＡ細孔の結合を示す共焦点画像［（Ｅ）−０．５％  Ｂｏｄｉｐｙ−Ｃ１２−ＨＰＣを含むＰＯＰＣ、（Ｆ）−Ａｔｔｏ６４７Ｎで標識されたＤＮＡ構造、スケールバー＝２０μｍ］、２０ｎｍ幅のナノ細孔のＴＥＭ分析（Ｇ）、および膜結合ナノ細孔のＴＥＭ分析（Ｈ）、を示す。ＧおよびＨのスケールバーは５０ｎｍである。
【図１０】平面脂質二重層に挿入された異なる多角形のＤＮＡナノ細孔の単一チャネル電流記録の比較を示す。Ａ−１０ｎｍ×１０ｎｍの三角形のＤＮＡナノ細孔、Ｂ−１０ｎｍ×１０ｎｍの四角形のＤＮＡナノ細孔、Ｃ−２０ｎｍ×２０ｎｍの四角形のＤＮＡナノ細孔のトレースおよびＩＶ曲線の例。実験は、ＤＰｈＰＣで形成された膜、および１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ８で構成された電気生理学的バッファーを使用して行われた。
【図１１】本発明の一実施形態による、三角形のナノ細孔の１０ｎｍフレームの二次元ＤＮＡマップを示す。足場鎖は薄い灰色で描かれ、ステープル鎖は中程度の灰色で描かれている。
【図１２】本発明の一実施形態による、四角形のナノ細孔の１０ｎｍフレームの二次元ＤＮＡマップを示す。足場鎖は薄い灰色で描かれ、ステープル鎖は中程度の灰色で描かれ、スペーサー鎖は濃い灰色で描かれている。
【発明を実施するための形態】
【００３５】
本発明を説明する前に、本発明の理解を補助するであろう多数の定義を提供する。本明細書に引用される全ての参考文献は、その全体が参考として援用される。他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術的および科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
【００３６】
本明細書で使用される場合、用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」とは、詳述された要素のうちのいずれかが必然的に含まれ、他の要素も同様に任意選択的に含まれ得ることを意味する。「から本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ  ｏｆ）」とは、詳述された任意の要素が必然的に含まれ、列挙された要素の基本的特徴および新規の特徴に実質的に影響を及ぼすであろう要素は除外され、他の要素が任意選択的に含まれ得ることを意味する。「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ  ｏｆ）」とは、列挙されているもの以外の全ての要素が除外されることを意味する。これらの用語の各々によって定義される実施形態は、本発明の範囲内にある。
【００３７】
本明細書で使用される用語「膜」とは、選択的に取り囲むまたは分離する透過性の境界、仕切り、バリアまたはフィルムである。膜は、それぞれシス側およびトランス側と呼ばれ得る２つの側面または表面を有する。膜は、薄い（すなわち、その幅および長さよりも実質的に薄い厚さを有する）ので、ナノ細孔によってまたがせることが可能である。本発明の文脈では、膜厚は、典型的にはナノメートル（１０−９メートル）の範囲である。膜の配置は限定されず、任意の形態、例えば、リポソーム、小胞、または平面もしくは非平面のシートとして想定してよい。本発明において有用な膜の具体例としては、脂質二重層、ポリマーフィルム、または固体基板が挙げられる。
【００３８】
本明細書で使用される用語「固体膜」または「固体基板」とは、固体物質、すなわち半流体膜ではない、から形成された膜を指し、１つ以上の開口部が提供される。例えば参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，８２８，２１１号に開示のそれぞれの１つ以上の開口部内に、１つ以上のナノ細孔を配置してもよい。固体膜は、これらに限定されないが、ＩＩ〜ＩＶおよびＩＩＩ〜Ｖ材料などの材料、窒化ケイ素、Ａｌ２Ｏ３およびＳｉＯ２、Ｓｉ、ＭｏＳ２などの酸化物および窒化物、ポリアミドなどの固体有機および無機ポリマー、Ｔｅｆｌｏｎ（登録商標）などのプラスチック、または二成分付加硬化型シリコーンゴムなどのエラストマー、ならびにガラスを含む導電体、電気半導体、または電気絶縁体を問わず、マイクロエレクトロニクス材料を含むがこれらに限定されない有機および無機材料の一方または両方を含んでよい。膜は、グラフェンなどの単原子層、または米国特許第８，６９８，４８１号および米国特許出願公開第２０１４／１７４９２７号に開示のものなどのわずかな原子数の厚さの層から形成され得、その両方が参照により本明細書に組み込まれる。参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１３／３０９７７６号に開示の、２つ以上のグラフェン層など、２つ以上の材料の層が挙げられ得る。好適な窒化ケイ素膜は、米国特許第６，６２７，０６７号に開示されており、米国特許出願公開第２０１１／０５３２８４号に開示のものなど、膜は、化学的に官能化され得、その両方が参照により本明細書に組み込まれる。かかる構造体は、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第８，８２８，２１１号に開示されている。開口部の内壁は、出願公開第ＷＯ２００９／０２０６８２号に開示されているように、官能化コーティングでコーティングしてもよい。１つ以上の開口部は、それぞれの１つ以上の開口部における１つ以上のナノ細孔の提供を補助するために、疎水性であるか、または疎水性コーティングを備えていてもよい。固体基板に開口部を提供するための好適な方法は、出願公開第ＷＯ０３００３４４６号および同第ＷＯ２０１６／１８７５１９号に開示されている。
【００３９】
本明細書で使用される「モジュラー」という用語は、より大きなシステムの全体または一部を設計または構築するための１つ以上のユニットまたはモジュールの使用を指す。本発明の文脈において、それは、ナノ細孔を構築するための個々のモジュール、サブユニット、またはビルディングブロックの使用を指す。モジュールはそれぞれ同じでもよく、またはモジュールが異なっていてもよい。ナノ細孔を形成するために、個々のモジュールは、１つ以上の他のモジュールに接続または相互リンクされ得る。モジュール間の接続手段は、共有結合または非共有化学結合などの化学的または物理的手段によるか、あるいは静電力または他の引力によるものでよい。あるいは、またはさらに、接続の手段は、追加のモジュール、ブレーシング部材、部分または結合を介することができる。ナノ細孔のモジュラー設計は、モジュールのフレームまたはフレームワーク、および支柱またはブレーシング部材として機能する、フレームを接続または支持する追加の、典型的にはより小さなサブモジュールを含んでよい。モジュールは膜にまたがって、ナノ細孔のチャネルの形成を可能にし、サブモジュールは一般に膜にまたがらず、ナノ細孔の構造的支持としてのみ意図される。モジュールおよびサブモジュールの設計、またはそれらの接続方法は、膜に挿入されたときにその形状および立体構造の完全性を維持するように、ナノ細孔の形成されたチャネルを支持および強化するように選択できる。モジュールまたはサブモジュールは、核酸、典型的にはＤＮＡから形成され得る。各個々のユニットは、好適に選択された足場およびステープル鎖を使用して、本明細書の他の箇所に記載されているＤＮＡオリガミ技術によって組み立てることができる。個々のモジュールは、さらなるＤＮＡ鎖によって、または個々のモジュールのＤＮＡ鎖間の直接結合によって接合することができる。いくつかの場合には、個々のモジュールは中心軸の周りに放射状に配置され、それによってチャネルを形成する。他の場合には、個々のモジュールは、膜の平面に垂直な方向に互いに積み重ねられて、タワーまたはパイルを形成し得る。場合によっては、タワーまたはパイルは、タワーまたはパイルが、ナノ細孔が挿入される膜にまたがるのに十分な長さのチャネルを形成するように、断面が成形され得る。モジュールが膜にまたがるチャネルを形成できるように、モジュールの任意の組み合わせまたは配置が想定される。
【００４０】
本明細書で使用される用語「核酸」とは、各ヌクレオチドの３’末端および５’末端がホスホジエステル結合によって接合している、単一鎖または二本鎖の共有結合的に連結しているヌクレオチドの配列である。ポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド塩基またはリボヌクレオチド塩基から構成され得る。核酸は、ＤＮＡおよびＲＮＡを含んでよく、典型的には合成的に製造されるが、自然の供給源から単離されてもよい。核酸としては、例えば、メチル化されているか、または例えば７−メチルグアノシンでの５’−キャッピング、切断およびポリアデニル化などの３’−プロセッシング、ならびにスプライシング、もしくはフルオロフォアもしくは他の化合物による標識付けの化学修飾を施されているＤＮＡまたはＲＮＡといった、修飾ＤＮＡまたはＲＮＡがさらに挙げられ得る。核酸としてはまた、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、グリセロール核酸（ＧＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ）、およびペプチド核酸（ＰＮＡ）などの合成核酸（ＸＮＡ）が挙げられ得る。このように、本明細書で用語「ＤＮＡ」および「ＲＮＡ」が使用される場合、これらの用語は天然のヌクレオチドのみを含むと限定されないことが理解されるべきである。本明細書において「ポリヌクレオチド」とも称される核酸のサイズは、典型的には、二本鎖ポリヌクレオチドの塩基対の数（ｂｐ）として、または単一鎖ポリヌクレオチドの場合にはヌクレオチドの数（ｎｔ）として表される。１０００ｂｐまたはｎｔは、キロベース（ｋｂ）と等しい。長さが約１００ヌクレオチド未満のポリヌクレオチドは、典型的には「オリゴヌクレオチド」と呼ばれる。
【００４１】
本明細書中で使用される場合、用語「３’」（「３プライム」）および「５’」（「５プライム」）とは、当技術分野におけるそれらの通常の意味をとって、すなわちポリヌクレオチドの末端を区別する。ポリヌクレオチドは、５’および３’末端を有し、ポリヌクレオチド配列は、慣例的に５’から３’方向に書かれる。用語「ポリヌクレオチド分子の相補体」とは、参照配列と比較して相補的な塩基配列および逆方向を有するポリヌクレオチド分子を指す。
【００４２】
本明細書で使用される用語「二重鎖」とは、二本の撚り合わせられたＤＮＡを指し、２つの相補的なＤＮＡ配列のヌクレオチドが一緒に結合し、次いでコイル状に二重らせんを形成することを意味する。
【００４３】
本発明によれば、本明細書に記載の核酸配列に対する相同性は、単に１００％の配列同一性に限定されない。明らかに低い配列同一性を有するにもかかわらず、多くの核酸配列は互いに対して生化学的同等性を示す場合がある。本発明では、相同な核酸配列は、低ストリンジェンシーの条件下で互いにハイブリダイズするであろうものと見なされる（Ｓａｍｂｒｏｏｋ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）。
【００４４】
本明細書中で使用される場合、用語「ナノ構造」とは、典型的にはバイオポリマー、好適には天然または非天然に存在する核酸からなる予め設計された二次元または三次元の分子構造を指し、その構造は、ナノスケール（すなわち、１０−９メートル）内であるその幾何学形状の少なくとも１つの寸法または面を有する。ナノスケール構造体は、好適には約１００ｎｍ未満、典型的には５０ｎｍ未満、最も好適には２０ｎｍ未満の寸法または幾何学形状を有する。ナノスケール構造体は、好適には、約０．１ｎｍより大きい、典型的には約１ｎｍより大きい、任意選択的には約２ｎｍより大きい寸法または幾何学形状を有する。核酸ナノ構造体のアセンブリは、例えば予め選択された配列のＤＮＡ鎖の混合物を加熱および冷却することによって、溶液中で自然に起こり得るか、または、核酸足場、核酸アプタマー、核酸ステープル、補酵素、および分子シャペロンを含むがこれらに限定されない追加の補因子の存在を必要とし得る。所望のナノ構造体が、ＤＮＡなどの１つ以上の予め設計された自然な自己折り畳み核酸分子から生じる場合、これは典型的には核酸「オリガミ」と称される。二次元または三次元のナノスケール構造体および形状を作成するためのＤＮＡの合理的な設計および折り畳みは、当技術分野において公知である（例えば、Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ（２００６）Ｎａｔｕｒｅ  ４４０，２９７−３０２）。古典的な足場とステープルのアプローチでは、１つ以上の長い生体足場鎖成分が、より短い合成ステープルオリゴヌクレオチドからなるステープル成分を備えた定義済みのＤＮＡナノ構造に折り畳まれる。古典的なＤＮＡナノ構造は、チャネルを囲み、膜二重層に穴を開ける多角形に配置された、平行に整列したＤＮＡ二重鎖の束で形成される。しかしながら、核酸ナノ構造の課題は、ホスホジエステルバックグラウンドの強い正味の負電荷が両親媒性および疎水性平面膜への挿入を妨げることである。結果として、これは、基板のナノスケールの開口部に結合された、またはその中に配置されたナノファンネルとして、固体状態でのそれらの使用をしばしば支持してきた。しかしながら、このような配置に関連する問題は、ＤＮＡ二重鎖とナノスケールの開口部との適合性が低いため、センサーアプリケーションで高レベルのイオン漏れを示すことが多いことである。ナノ細孔が細孔を囲む半流体膜内に埋め込まれている場合、イオン漏れは大幅に減少する。
【００４５】
ナノ構造体を形成する核酸配列は、典型的には合成して製造されるであろうが、それらはまた、従来の組換え核酸技術によっても得られ得る。必要な配列を含むＤＮＡ構築物は、微生物宿主生物（Ｅ．ｃｏｌｉなど）内で増殖させたベクター内に含まれてよい。これにより、バイオリアクター内で大量のＤＮＡを調製し、次いで従来技術を使用して採取することが可能になるであろう。所望のＤＮＡ配列を、制限エンドヌクレアーゼによる切除、およびクロマトグラフィーまたは電気泳動分離などの使用による単離によって、ベクターを単離、精製して、余分な物質を除去してもよい。
【００４６】
本発明の文脈では、用語「アミノ酸」とは、その最も広い意味で使用され、天然に存在するＬ  α−アミノ酸または残基を含むことを意味する。天然に存在するアミノ酸に対して一般的に使用される１文字および３文字の略称が本明細書で使用される：Ａ＝Ａｌａ、Ｃ＝Ｃｙｓ、Ｄ＝Ａｓｐ、Ｅ＝Ｇｌｕ、Ｆ＝Ｐｈｅ、Ｇ＝Ｇｌｙ、Ｈ＝Ｈｉｓ、Ｉ＝Ｉｌｅ、Ｋ＝Ｌｙｓ、Ｌ＝Ｌｅｕ、Ｍ＝Ｍｅｔ、Ｎ＝Ａｓｎ、Ｐ＝Ｐｒｏ、Ｑ＝Ｇｌｎ、Ｒ＝Ａｒｇ、Ｓ＝Ｓｅｒ、Ｔ＝Ｔｈｒ、Ｖ＝Ｖａｌ、Ｗ＝Ｔｒｐ、およびＹ＝Ｔｙｒ（Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ａ．Ｌ．，（１９７５）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２ｄ  ｅｄ．，ｐｐ．７１−９２，Ｗｏｒｔｈ  Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ）。総称「アミノ酸」としてはさらに、Ｄ−アミノ酸、レトロ−インベルソアミノ酸、ならびにアミノ酸類似体などの化学修飾アミノ酸、ノルロイシンなどのタンパク質に通常組み込まれていない天然に存在するアミノ酸、およびβ−アミノ酸などのアミノ酸に特徴的であることが当技術分野において公知の特性を有する化学合成された化合物が挙げられる。例えば、天然のＰｈｅまたはＰｒｏと同じペプチド化合物の立体構造の制限を可能にする、フェニルアラニンまたはプロリンの類似体または模倣物質は、アミノ酸の定義内に含まれる。かかる類似体および模倣物質は、本明細書では、それぞれのアミノ酸の「機能的等価物」と称される。アミノ酸の他の例は、参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｂｅｒｔｓ  ａｎｄ  Ｖｅｌｌａｃｃｉｏ，Ｔｈｅ  Ｐｅｐｔｉｄｅｓ：Ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ，Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｏｓｓ  ａｎｄ  Ｍｅｉｅｈｏｆｅｒ，ｅｄｓ．，Ｖｏｌ．５  ｐ．３４１，Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｎ．Ｙ．１９８３により挙げられる。
【００４７】
「ポリペプチド」は、天然に生成されるかまたは合成手段によってインビトロで生成されるかにかかわらず、ペプチド結合によって接合されているアミノ酸残基のポリマーである。長さが約１２アミノ酸残基未満のポリペプチドは、典型的には「ペプチド」と称され、長さが約１２〜約３０アミノ酸残基のものは、「オリゴペプチド」と称され得る。本明細書で使用される用語「ポリペプチド」とは、天然のポリペプチド、前駆体形態、またはプロタンパク質の生成物を指す。ポリペプチドはまた、グリコシル化、タンパク質分解切断、脂質化、シグナルペプチド切断、プロペプチド切断、リン酸化などを含んでよいがこれら限定されない、成熟または翻訳後修飾プロセスを受け得る。用語「タンパク質」とは、本明細書では、１つ以上のポリペプチド鎖を含むポリマーを指すために使用される。
【００４８】
本明細書で使用される用語「折り畳まれたタンパク質」とは、それが形成されるポリペプチド鎖（一次構造）の翻訳後にいくつかの三次元形状を獲得したタンパク質を指す。この用語は、典型的には局所的な三次元構造体が形成される折り畳みプロセスの第１段階であるタンパク質の二次構造、例えばアルファヘリックスまたはベータシートを指す場合がある。この用語は、より典型的には、タンパク質の二次構造体が折り畳まれて疎水性または共有結合的な相互作用によって構造を安定化したタンパク質の三次構造を指す場合がある。この用語はまた、１つ以上のタンパク質サブユニットが組み立てられた四次構造体を有するタンパク質も包含する。必要に応じて、折り畳みタンパク質は、「天然の」タンパク質構造とも呼ばれる場合があり、タンパク質がその生物学的機能を呈する形態でよい。
【００４９】
本明細書で使用される場合、用語「内部幅」とは、チャネルの長手方向軸に対して垂直な平面内で、１つの壁の内面から反対側の壁の内面までチャネル（例えば、管腔）の内部に広がる直線距離を指す。チャネルの内部幅は、その長手方向軸に沿って一定でもよく、または１つ以上の狭窄の存在により変化してもよい。「最小内部幅」とは、チャネルの入口と出口との間のチャネルの長手方向軸に沿った最小内部幅である。チャネルの最小内部幅は、チャネルを通過し得る物体の最大サイズを定義する。
【００５０】
本明細書中で使用される場合、用語「疎水性」とは、有機分子およびポリマーを含む無極性の特徴を有する分子を指す。例は、飽和または不飽和炭化水素である。分子は、両親媒性を有していてもよい。
【００５１】
本明細書中で使用される場合、用語「疎水性修飾」とは、１つ以上の疎水性部分を有するポリヌクレオチド鎖の修飾（接合、結合、あるいは連結）に関する。本明細書で定義される「疎水性部分」とは、疎水性有機分子である。疎水性部分は、非極性または低極性の脂肪族、脂肪族−芳香族、または芳香族鎖を含む任意の部分でよい。好適には、本発明において利用される疎水性部分は、長鎖炭素環式分子、ポリマー、ブロックコポリマー、および脂質などの分子を包含する。本明細書で定義される用語「脂質」とは、脂肪酸およびそれらの誘導体（トリ、ジ、モノグリセリド、およびリン脂質を含む）、ならびにコレステロールなどのステロール含有代謝産物に関する。本発明の実施形態内に含まれる疎水性部分は、脂質ベースの細胞膜などのリン脂質二重層と非共有結合的な引力による相互作用を形成することができ、ナノ細孔用の膜アンカーとして機能する。本発明のある特定の実施形態によれば、膜を固定する特性を有する脂質分子などの好適な疎水性部分としては、ステロール（コレステロール、コレステロールの誘導体、フィトステロール、エルゴステロール、および胆汁酸を含む）、アルキル化フェノール（メチル化フェノールおよびトコフェロールを含む）、フラボン（６−ヒドロキシフラボンなどのフラバノン含有化合物を含む）、飽和および不飽和脂肪酸（ラウリン酸、オレイン酸、リノール酸、およびパルミチン酸などの誘導体を含む）、ならびに合成脂質分子（ドデシル−ベータ−Ｄ−グルコシドを含む）が挙げられ得る。ポリマー膜用のアンカーは、脂質二重層用のアンカーと同じでもよく、または異なってもよい。特定の疎水性部分アンカーは、選択された膜の結合性能に基づいて選択され得る。
【００５２】
本発明の代替の実施形態では、疎水性修飾は、ナノ細孔構造自体に組み込まれた１つ以上の合成核酸（ＸＮＡ）内に含まれる。
【００５３】
本発明者らは、構造的に定義された広いチャネルの有機ナノ細孔を特定した。ナノ細孔の構造は、ナノ細孔が２つの溶液を分割する膜に配置される多くの用途に好適である。１つのかかる用途は、生体分子センシングアプリケーション、特に折り畳みタンパク質が細孔内を通過、結合または滞留し得るタンパク質センシング用途である。ナノ細孔の修飾型は、特定の折り畳みタンパク質または他の生体分子へのチャネルの適合性をさらに向上するのに役立ち得る。生体分子感知は、細孔管腔またはチャネル内に分子受容体を設置することによって向上され得る。
【００５４】
制御された孔径を有するナノ細孔を作成し、それらを天然または合成膜に挿入する能力は、管腔寸法を制御するカスタマイズされた選択的に透過性の膜の構築を可能にし、任意選択的に、細孔の他の特徴が、これらの膜を通過することが可能な生体分子の制御を可能にする。本発明において特に実用的であるのは、今日まで不可能であった、大きな球状タンパク質を含む大きな生体分子をかかる膜に通過させることを可能にする、本発明のナノ細孔のサイズ増加である。これは、生物学の分野における他の使用法と共に医学において潜在的な実用性を有する。例えば、いくつかの大きな、すなわち、１０〜３０ｎｍの直径の膜細孔があり、これらは、それぞれ、「補体系」（抗体および食細胞の、生物から微生物および損傷した細胞を除去し、炎症を促進し、病原体の原形質膜を攻撃する能力を向上する（補う）自然免疫系の一部）などにおいて、細菌を殺傷するために免疫細胞によって生成される。
【００５５】
一例として、本発明に従ったナノ細孔を含む天然または合成ポリマーで形成された小胞は、ナノリアクターとして使用され得る。基質タンパク質または生体分子は、ナノ細孔を通して小胞内部に入り、所望の反応が小胞内で起こることを、小胞の内部のカプセル化酵素が可能にすると考えられる。一例として、トリプシンなどのカプセル化プロテアーゼ酵素は、小胞内側で保持され得、ここで比較的大きく制御可能なサイズのナノ細孔が、いくつかの基質タンパク質以外の他のタンパク質を分解のために進入させないようにすることができ、それによって無差別な消化から特定のたんぱく質を保護する。同様に、タンパク質またはペプチド系の医薬品などの同様の小胞内に含有されるカーゴの放出に対する制御は、カーゴの通過を可能にするナノ細孔を有する膜を用いて可能であろう。本明細書に記載のナノリアクターは、マイクロ流体生合成プロセスにおいて、およびラボオンチップデバイスの一部として使用することができる。
【００５６】
本発明の実施形態によるナノ細孔は、膜内に埋め込まれ、その少なくとも一部が膜と実質的に同一平面上に配向されている膜貫通ナノ構造である。本発明の一実施形態では、ナノ細孔は、平面または湾曲したシート材料に取り付けられたグロメットまたはアイレットに類似した方法で膜内に位置する。したがって、本発明の特定の実施形態では、本発明の核酸ナノ構造は、ナノスケールのグロメットまたはアイレットとして定義され、これは、円形または多角形でよいチャネル（複数可）の形状とは無関係である。かかる配置の１つの視覚的表現は、環状ナノ細孔を示す実施形態が、平面脂質膜内に埋め込まれて示されている、図１（ｄ）に示される。本発明のこの実施形態によれば、ナノ細孔のナノ構造の大部分が、膜の外側に延びるナノ構造の割合と比較して、膜内に埋め込まれていることは明らかである。これは、以前の多くの核酸ナノ細孔とは正反対である。
【００５７】
好適には、本発明のナノ細孔は、機能的な足場成分を提供する１つ以上のポリヌクレオチド鎖を含み、足場成分内に含まれるポリヌクレオチド鎖は、ポリヌクレオチド骨格を含み、複数の機能的ステープル成分を提供する複数のポリヌクレオチド鎖を含む。足場鎖（複数）は、ナノ細孔の三次元構成を形成するために、例えば適切なワトソン−クリック塩基対ハイブリダイゼーションを介して、複数のステープルポリヌクレオチド鎖と協力してハイブリダイズする。ナノ細孔は、ステープル成分（複数可）の５’から３’配向の大部分が膜と同一平面上にあるように、膜内に埋め込むことができる環状、楕円形または多角形の構造に集合することが望ましい。
【００５８】
好適には、本発明のナノ細孔は、「足場−および−ステープル」手法を介して組み立てられる。ＤＮＡナノ構造体へのこの重要なルートにおいて、ＤＮＡは、ナノスケールの三次元形状を作製するための構築材料として利用される。この技術は他の核酸にも等しく適用可能であるが、複数のハイブリダイズしていない線状分子からのこれらの複雑なナノ構造体のアセンブリは、典型的には「ＤＮＡオリガミ」と称される。
【００５９】
ＤＮＡオリガミプロセスは、概して、複数の合理的に設計された「ステープル」ＤＮＡ鎖を使用して、１つ以上の細長い「足場」ＤＮＡ鎖を特定の形状に折り畳むことを含む。足場鎖は、任意の十分に非反復的な配列を有し得る。ステープル鎖の配列は、それらが足場鎖の特定の定義された部分にハイブリダイズし、そうすることで足場鎖に特定の立体配置をとらせるように設計される。ＤＮＡオリガミ構造体の作製に有用な方法は、例えば、Ｒｏｔｈｅｍｕｎｄ，Ｐ．Ｗ．，Ｎａｔｕｒｅ  ４４０：２９７−３０２（２００６）、Ｄｏｕｇｌａｓ  ｅｔ  ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ  ４５９：４１４−４１８（２００９）、Ｄｉｅｔｚ  ｅｔ  ａｌ，Ｓｃｉｅｎｃｅ  ３２５：７２５−７３０（２００９）、ならびに米国特許出願公開第２００７／０１１７１０９号、同第２００８／０２８７６６８号、同第２０１０／００６９６２１号、および同第２０１０／０２１６９７８号に見出すことができれ、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に援用される。ステープル配列設計は、例えば、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃａｄｎａｎｏ．ｏｒｇで入手可能なＣａＤＮＡｎｏソフトウェアを使用して容易にすることができる。
【００６０】
本発明の実施形態では、ステープルおよび／または足場成分は、それに結合している複数の疎水性膜アンカー分子をさらに含む。疎水性アンカー（または配列の一部）は、第１の足場ポリヌクレオチド鎖の主要部分の配向が膜の表面に実質的に平行であるように、湾曲または平面膜へのナノ細孔の挿入を容易にし、第１の足場ポリヌクレオチド鎖は膜内に埋め込まれており、膜と実質的に同一平面上にある。足場ポリヌクレオチド鎖の「主要部分」に言及する場合、その鎖の全長の実質的に５０％を超え、好適には６０％を超え、さらに７０％を超え、そして９０％もがそれが膜と実質的に同一平面上にあるように配向されている。特定の実施形態では、得られたナノ細孔に三次元構造を与えるために必要なクロスオーバーおよび／またはホリデイジャンクションを除いて、足場鎖の全長は、それが膜と実質的に同一平面上にあるように配向される。ＤＮＡオリガミ技術は、それにもかかわらず、本発明の列挙されたナノ構造の全体的な設計制約内に入る具体化された構造の変形を可能にすることが理解されるであろう。例として、足場鎖は、適切なステープル鎖へのハイブリダイゼーションに続いて組み立てられると、単一の単一長の足場鎖と同等の方法で役立つように協力する複数のより短い足場鎖ドから構成され得る。
【００６１】
実施形態では、本発明のナノ細孔は、１つ以上のモジュールから形成または構築される。実施形態では、ナノ細孔は、基本的なフレームまたはフレームワークを形成するモジュールの配置から形成され得る。実施形態では、フレームのモジュールは、フレームの構造を接続および支持する追加の、典型的にはより小さなサブモジュールによって支持される。モジュールの少なくとも一部は、ナノ細孔のチャネル壁の少なくとも一部を形成することを意図しており、したがって、モジュールは、それが挿入される膜にまたがるように設計および構成されている。サブモジュールは構造上の利点のみを目的としているため、膜にまたがるように意図または構成されていない。フレームの各モジュール、またはサブモジュールは、好適に異なる場合があるが、フレームのモジュールは、存在する場合、支持体を形成するサブモジュールと同様に、好適に実質的または完全に同一のユニットである。これらの実施形態では、モジュールおよびサブモジュールはそれぞれ、同じ足場およびステープルＤＮＡ構造から形成され、同じ方法で組み立てられる。個々のモジュールは、ＤＮＡ鎖によって接合され、ＤＮＡ鎖はモジュールと一体であるか、または各モジュールにハイブリダイズされる。モジュールの任意の配置が、好適には、円形または楕円形の断面のナノ細孔について企図されるが、モジュールは、互いに重なり合って、概して中空のスタックまたはタワーを形成し、それによってチャネルを形成するように配置され得る。好適には、多角形の断面を有するナノ細孔の場合、モジュールは、それらが膜の平面内に並んで位置するように配置される。上記の配置の組み合わせも企図される。モジュールは、調整可能な辺の長さ（この文脈では、膜の平面に平行なモジュールの最長寸法として定義される辺の長さ）を有し得、適切な最終的な全体的な形状で選択すると、様々なサイズおよび／または形状のナノ細孔、および調製されるそれらの細孔のチャネル内の異なるサイズおよび／または形状の管腔を許容する。それによって画定されるチャネルおよび管腔は、規則的または不規則に成形され得る。例えば、チャネルによって画定される管腔は、三角形、四辺形（例えば、四角形、長方形、または台形）、五角形、六角形、七角形、八角形などの規則的または不規則な円または多角形でよい。あるいは、チャネルは、細長い円（楕円）または細長い多角形、例えば、４つ以上の側面で形成された長方形（ｒｅｃｔａｎｇｕｌａｒ）、長方形（ｏｂｌｏｎｇ）、またはスロット形状のチャネルでよい。典型的には、モジュールの辺の長さは１０ｎｍ〜２０ｎｍのオーダーになるであろう（図８）。好適には、モジュールの側面の長さは、少なくとも２ｎｍ、３ｎｍ、４ｎｍ、５ｎｍ、６ｎｍ、７ｎｍ、８ｎｍ、９ｎｍ、または１０ｎｍでよい。好適には、モジュールの側面の長さは、最大で３０ｎｍ、２５ｎｍ、２０ｎｍでよい。サブモジュールのサイズは、モジュール間の間隔によって決定され、次に、細孔の形状、および使用されるモジュールのサイズと数によって決定される。好適には、モジュールの側面の長さは、少なくとも０．５ｎｍ、１ｎｍ、１．５ｎｍ、２ｎｍ、２．５ｎｍ、３ｎｍ、３．５ｎｍ、４ｎｍ、または５ｎｍでよい。好適には、モジュールの側面の長さは、最大で１０ｎｍ、７．５ｎｍ、または５ｎｍでよい。
【００６２】
本明細書で使用される場合、「実質的に」という用語は、行動、特性、特性、状態、構造、項目、または結果の完全またはほぼ完全な範囲または程度を指す。例えば、別のオブジェクトと「実質的に」同一平面上にあるオブジェクトは、オブジェクトが完全に同一平面上またはほぼ完全に同一平面上にあることを意味し、おそらく完全な適合から数度の変動によって変化する。当業者に理解されるように、絶対的完全性からの正確な許容可能な逸脱の程度は、いくつかの場合には、特定の状況に依存し得る。しかしながら、一般的に、絶対値への適合性の近さは、完全な適合性が達成されたかのように、同じ全体的な結果（例えば、機能的同等性）をもたらすようなものになる。
【００６３】
本発明のナノ細孔の三次元構成は、少なくとも１つのチャネル、好適には膜にまたがる単一のチャネルを画定し、チャネルは、少なくとも約３ｎｍの最小内部幅を有する管腔を有する。好適には、本発明のナノ細孔は、細孔が存在することが意図されている膜の平面に垂直に見たときに、細孔構造の少なくとも実質的に中央に位置する単一のチャネルを有する。チャネルは、膜によって画定された平面軸に垂直なナノ細孔を通過する管腔を画定する。膜の平面に平行な管腔の断面プロファイルは、円形、楕円形、または多角形でよく、内部寸法に関して変化し得る。好適には、チャネルは、その全長にわたって一定の断面プロファイルおよびサイズを有する。好適には、チャネルの断面プロファイルは、円または四辺形、典型的には四角形、長方形または台形である。この断面のチャネルの最小開口部（すなわち、最小狭窄）は、折り畳みタンパク質または他の分析物へのアクセスを可能にするのに好適である。典型的には、チャネルの最小開口部は、少なくとも３ｎｍ、６ｎｍ、６．５ｎｍ、７ｎｍ、７．５ｎｍ、８ｎｍ、８．５ｎｍ、９ｎｍ、９．５ｎｍ、１０ｎｍ、１１ｎｍ、１２ｎｍ、１３ｎｍ、１４ｎｍ、１５ｎｍ以上である。好適には、管腔は、幅が約１０ｎｍ〜約２０ｎｍの間である。チャネルの最大開口部は、細孔の構造的な妥当性を維持し、対象の分子が通過したときに電気的な読み出しを得る必要性によってのみ制限される。好適には、チャネルの最大開口部（すなわち、最小狭窄）は、２００ｎｍ、１５０ｎｍ、１００ｎｍ、７５ｎｍ、５０ｎｍ、４０ｎｍ、３０ｎｍ、２０ｎｍ、１８ｎｍ、１５ｎｍ、１２ｎｍ、または１０ｎｍである。好適には、チャネルの最小開口部（すなわち、最小狭窄）の断面積は、少なくとも５ｎｍ２、１２ｎｍ２、１５ｎｍ２、２５ｎｍ２、３５ｎｍ２、４０ｎｍ２、４５ｎｍ２、または５０ｎｍ２以上である。好適には、チャネルの最小開口部（すなわち、最小狭窄）の断面積は、最大で３５０００ｎｍ２、２５０００ｎｍ２、１５０００ｎｍ２、１００００ｎｍ２、５０００ｎｍ２、１５００ｎｍ２、１０００ｎｍ２、７５０ｎｍ２、５００ｎｍ２、２５０ｎｍ２、１００ｎｍ２、５０ｎｍ２、３０ｎｍ２、２０ｎｍ２または１５ｎｍ２、１０ｎｍ２、７ｎｍ２以下である。
【００６４】
最適な性能を達成するために、チャネルサイズの変動は、細孔ごとに最小限であるべきである。表面積のわずかな変動でさえ、開放状態（任意の標的分析物がない）または結合状態（標的分析物がチャネルの中またはその付近に存在する）の両方において、所与の細孔を通るイオン流に顕著なずれをもたらし得る。イオン流におけるかかる変動は、電気的な読み出しにおいてより低いシグナル対ノイズ比をもたらし、それによって検出感度を低減させる。本発明によるナノ細孔は、必要に応じて、細孔サイズの変動性を低くすることができる。
【００６５】
前述のように、本発明の実施形態では、ナノ構造は、その全長にわたって一貫した内部プロファイルおよびサイズ（すなわち、管腔幅）を有するチャネルを含んでよい。しかしながら、特定の感知用途では、１つ以上の内部狭窄が導入された状態で、管腔幅がチャネルの長さに沿って変化することが有利である可能性がある。かかる狭窄は、全体としてナノ構造を設計するために使用されるのと同じＤＮＡオリガミ技術を使用して設計することができる。あるいは、狭窄をもたらすために、化学修飾またはブロッキング分子の結合によって、狭窄を事後的に加えることができる。１つ以上の狭窄の導入は、漏斗の作成と同様の方法で、ナノ細孔を通るイオンおよび分析物の流れの動力学に影響を与える可能性がある。
【００６６】
本発明のナノ細孔は、ほぼ疎水性の膜（脂質二重層またはポリマー）に親水性のＤＮＡナノ細孔を結合または接続または固定するように作用する２つ以上の膜アンカーを含んでよい。脂質アンカーは、細孔に結合している。好適には、５’または３’末端に脂質アンカー、好適にはコレステロールを運ぶＤＮＡオリゴヌクレオチドを介して結合する。ポリヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドは、鎖合成反応において修飾ホスホルアミダイトを使用して官能化することができ、これは、コレステロールおよび脂質などの反応性基、またはチオールおよびビオチンを含む結合基の付加と容易に適合性がある。末端トランスフェラーゼを使用する酵素修飾を使用して、アンカーなどの修飾を組み込んだオリゴヌクレオチドを一本鎖核酸（例えば、ｓｓＤＮＡ）の３’に組み込むこともできる。これらの脂質修飾アンカー鎖は、「アダプター」オリゴヌクレオチドを介して、細孔の足場セクションを形成するＤＮＡ配列の対応するセクションにハイブリダイズする可能性がある。あるいは、脂質アンカーは、足場またはステープル鎖のいずれかとして寄与する脂質修飾オリゴヌクレオチドを使用して細孔と組み立てられる。アンカーが足場鎖、ステープル鎖およびアダプターオリゴヌクレオチドの１つまたは全てに組み込まれる、２つ以上の膜アンカーを使用するアンカーへのアプローチの組み合わせも採用され得る。
【００６７】
コレステロールは、本発明におけるアンカーとしての使用に特に好適な疎水性部分であることが見出された。アンカーとして他の脂質を使用することが企図されるが、所与の膜については、特定の疎水性部分、および所与の数の疎水性アンカーが特に好ましいことが予期され得る。
【００６８】
本発明の特定の実施形態では、膜アンカーは、それらがナノ構造から半径方向外向きに延在し、ナノ構造を取り囲みおよび囲む両親媒性膜と相互作用し得るように、ナノ細孔の周囲の周りに（すなわち、チャネルから離れて）配置される。代替の実施形態では、膜アンカーは、ナノ細孔の膜に面する表面上に配置され、ナノ構造から半径方向外向きに延在し、ナノ構造を取り囲み、取り囲む両親媒性膜と相互作用し得る。好適には、複数の膜アンカーは、ナノ構造の周囲の周りに実質的に等距離に配置される。このようにして、挿入力は、ナノ細孔の外周の周りにより均一に分散され得る。例として、２つのメンブレンアンカーが使用される場合、それらは互いに約１８０°の間隔で配置され、３つのメンブレンアンカーが使用される場合、それぞれの間隔は約１２０°であり、４つのメンブレンアンカーの場合、間隔は約９０°であり、５つのメンブレンアンカーの場合、間隔は約７２°でり、６つのメンブレンアンカーの場合、間隔は約６０°であり、７つの場合、間隔は約５２°である。膜アンカーの数が増えると、それに応じて間隔が狭くなることが理解されよう。
【００６９】
疎水性修飾がナノ細孔構造に組み込まれた１つ以上の合成核酸（ＸＮＡ）内に含まれる本発明の代替の実施形態では、１つ以上の足場および／またはステープル鎖は、完全にまたは部分的に合成核酸類似体から構成され得る。有利なことに、疎水性合成核酸の存在は、ナノ細孔が相互作用し、膜内に埋め込まれることを可能にする。かかる実施形態では、ナノ構造自体の骨格内に含まれる必要なレベルの疎水性膜アンカー能力を備えた、１つ以上の追加の疎水性膜アンカー分子は、不要かもしれない。疎水性合成核酸と脂質ベースの膜アンカーとの組み合わせを含むハイブリッド構造もまた、本発明の一部として企図される。
【００７０】
本発明のナノ細孔が挿入され得る膜は、任意の好適なタイプのものでよい。意図する使用法に応じて、膜は、脂質二重層、またはポリマーシートもしくはフィルム、または固体基板でよい。膜は好適には両親媒性層である。両親媒性層は、単分子層または二重層でよい。両親媒性層は、親水および親油特性の両方を有する、リン脂質などの両親媒性分子から形成された層である。両親媒性分子は、合成または天然でよい。膜を構成する分子の親油性は、脂質アンカーまたはナノ細孔の他の疎水性アンカー領域によるアンカーを促進する。膜の疎水性が主に負に帯電したＤＮＡ骨格の反発をもたらすことを考えると、本発明の核酸ナノ構造が膜に首尾よく挿入され得ることは驚くべきことである。本発明のナノ構造は、両親媒性の単層または二重層にうまく挿入できない複雑な核酸ナノ構造の場合によくあるように、膜の１つの表面上にクラスター化された凝集体を単に形成すると予想され得る。したがって、かかる膜内に埋め込まれるナノ構造の能力は、驚くべきものであり、最も予想外である。
【００７１】
本発明の特定の実施形態では、両親媒性層は脂質二重層でよい。脂質組成物は、リン脂質および両極性の四エーテル脂質などの天然に存在する脂質、および／または人工脂質を含んでもよい。脂質は、典型的には、ヘッド基、界面部分、および同一でも異なってもよい２つの疎水性テール基を含む。好適なヘッド基には、中性ヘッド基、双性イオンヘッド基、負に帯電したヘッド基、および正に帯電したヘッド基が含まれるが、これらに限定されない。脂質のヘッド基またはテール基は化学的に修飾されてもよい。
【００７２】
本発明に従ったナノ細孔は、標的細胞または小胞の脂質膜に挿入されて、膜を横切る特定の折り畳みタンパク質の移行を容易にし得ると考えられる。ある特定の折り畳みタンパク質への移行の特異性は、ナノ細孔内のチャネルのサイズの変動を通じて制御され得る。
【００７３】
専売品および非専売品の合成ポリマーフィルムまたはシートは、Ｏｘｆｏｒｄ  Ｎａｎｏｐｏｒｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（登録商標）によって販売されているＭｉｎＩＯＮ（登録商標）システム、Ｒｏｃｈｅ（登録商標）によって販売されているＧＳ  ＦＬＸ＋（登録商標）、およびＧＳ  Ｊｕｎｉｏｒ（登録商標）システム、Ｉｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）によって販売されているＨｉＳｅｑ（登録商標）、Ｇｅｎｏｍｅ  Ａｎａｌｙｚｅｒ  ＩＩｘ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、およびＨｉＳｃａｎＳＱ（登録商標）システム、Ｌｉｆｅ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓによって販売されているＩｏｎ  ＰＧＭ（登録商標）システム、およびＩｏｎ  Ｐｒｏｔｏｎ  Ｓｙｓｔｅｍ（登録商標）、Ｂｅｃｋｍａｎ  Ｃｏｕｌｔｅｒ（登録商標）によって販売されているＣＥＱ（登録商標）システム、ならびにＰａｃｉｆｉｃ  Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）によって販売されているＰａｃＢｉｏ  ＲＳ（登録商標）、およびＳＭＲＴ（登録商標）システムなどの、「チップ型」のナノ細孔配列決定および分析用途において広く使用されている。このタイプのポリマー膜に首尾よく挿入するナノ細孔の能力は、例えば、これらのシステムが様々な折り畳まれたタンパク質感知アプリケーションに適合することを可能にするであろう。
【００７４】
非天然型両親媒性物質および両親媒性層を形成する両親媒性物質は、当該技術分野で公知であり、例えば、ブロックコポリマー（Ｇｏｎｚａｌｅｚ−Ｐｅｒｅｚ  ｅｔ  ａｌ．，Ｌａｎｇｍｕｉｒ，２００９，２５，１０４４７−１０４５０）が含まれる。ブロックコポリマーは、ジブロック（２つのモノマーサブユニットからなる）でよいが、３つ以上のモノマーサブユニットから構築されて、両親媒性物質として挙動するより複雑な配置でもよい。コポリマーは、トリブロック、テトラブロック、またはペンタブロックコポリマーでもよい。膜は、その全体が参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＧＢ２０１３／０５２７６７に開示されている膜のうちの１つを選択することができる。両親媒性分子は、複合体への結合を促進するように化学修飾または官能化されてよい。膜は、ＰＣＴ／ＵＳ２０１６／０４０６６５に開示されているような脂質および両親媒性ポリマーの両方を含むことができる。
【００７５】
ポリマーベースの膜は、任意の好適な材料で形成され得る。典型的には、合成膜は、両親媒性合成ブロックコポリマーで構成されている。親水性ブロックコポリマーの例は、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ／ＰＥＯ）、またはポリ（２−メチルオキサゾリン）であり、一方、疎水性ブロックの例は、ポリジメチルシロキサン（ＰＤＭＳ）、ポリ（カプロラクトン）（ＰＣＬ）、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、またはポリ（メチルメタクリレート）（ＰＭＭＡ）である。実施形態では、使用されるポリマー膜は、両親媒性ブロックコポリマーであるポリ２−（メタクリロイルオキシ）エチルホスホリルコリン−ｂ−ジイソプロピルアミノ）エチルメタクリレート（ＰＭＰＣ−ｂ−ＰＤＰＡ）から形成され得る。ＤＮＡナノ細孔は、インキュベーションを通じてかかるポリマーソームの壁に挿入され得る。理論に束縛されることを望まないが、挿入の１つのプロセスは、完全な挿入を達成するために、膜テザリングの第１のステップ、続いて膜に対するＤＮＡ細孔の配向の第２のステップを広く含むと考えられる。しかしながら、これはコレステロールアンカーが細孔内に含まれることを必要とし、それなしでは挿入は起こらない。本発明の代替構成について、特に核酸類似体（例えば、ＸＮＡ）が足場および／またはステープル鎖の骨格の一部または全てを含む場合、より複雑な挿入ダイナミクスが観察され得ることが想定される。足場およびステープル鎖が、膜との疎水性相互作用を媒介することができる合成生体高分子骨格成分を組み込む場合、挿入プロセスは、膜との共面整列の初期段階とそれに続く挿入段階を含み得るか、または含まない場合があることが理解されよう。
【００７６】
膜は典型的には平面であるが、特定の実施形態では、それは湾曲または成形され得る。両親媒性膜層も支持され得る。好適には、膜は脂質二重層または単層である。脂質二重層を形成するための方法は当技術分野で公知であり、例えば、国際出願第ＰＣＴ／ＧＢ２００８／０００５６３号に開示されている。脂質二重層は通常、ＭｏｎｔａｌおよびＭｕｅｌｌｅｒ（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，１９７２；６９：３５６１−３５６６）の方法で形成される。
【００７７】
本発明の別の実施形態では、膜は、固体層を含んでよい。固体層は、マイクロエレクトロニクス材料、Ｓｉ３Ｎ４、Ａｌ２Ｏ３などの絶縁材料、ガラス、ポリアミドおよびプラスチックなどの有機および無機ポリマーを含むがこれらに限定されない、有機および／または無機材料から形成することができる。固体層は、グラフェンから形成することができ、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２００８／０１０６３７に開示されている。膜は、膜の一方の側から他方の側に延びるナノメートルスケールの寸法の１つ以上の開口部または貫通孔を備えていてもよい。固体開口部の内壁は、本発明のナノ構造の固体層への好適な固定を容易にするために、ＵＳ２０１７／００２３５４４に開示されるような脂質でコーティングされるか、またはＰＣＴ／ＵＳ２００８／０６３０６６に開示されるような化学的に機能化され得る。
【００７８】
ナノ細孔が様々な厚さの膜に挿入され得るように本発明のナノ細孔を適合させる能力は、重要な利点である。本発明の実施形態では、１つ以上の足場鎖を利用して、細孔の深さ、したがって、所与の厚さの膜にまたがるように適合させるその能力を変化させるようにコイルまたは積み重ねられた環構造を形成することができる（図１に示されるように）。いずれにせよ、本発明のナノ細孔の重要な利点は、チャネルの長さが膜の幅よりもかなり長くする必要がないことである。これにより、チャネルの内壁への分析物の非特異的結合が確実に減少する。さらに、イオンが細孔を介して膜を通過するのにかかる時間が短縮され、より高速な読み出しが可能になる。
【００７９】
本発明のナノ構造のさらなる利点は、それらが、膜の平面に垂直に配向された複数の束ねられた二重鎖から構成される核酸ナノ細孔と比較して、より構造的に安定していることである。前述のように、平面膜圧力による構造の不安定性は、細孔を横切ってイオン漏れにつながり、信号の精度および忠実度を低下させ、かかるナノ細孔を構成するセンサーのバックグラウンドノイズを大幅に増加させる可能性がある。本発明のナノ構造は、圧縮膜圧力に対してより耐性があり、構造的完全性の改善、細孔直径のより大きな一貫性（すなわち、細孔および信号の均一性）、およびイオン漏出の低減をもたらす。
【００８０】
本発明の特定の実施形態では、本発明のナノ構造は、１つ以上の標的分子結合部分の付加によって機能化されるナノ細孔にまたがる膜を含む。１つ以上の標的結合部分は、ナノ細孔の１つ以上のモジュール上に配置することができる。ナノ細孔の単一のモジュールに配置された１つ以上の結合部分があってもよく、あるいは、ナノ細孔の異なるモジュールに配置された１つ以上の結合部分があってもよい。ナノ細孔の個々のモジュールを機能化することの単純さは、特定の配置または結合部分の数がナノ細孔上に提供され得、従来技術のナノ細孔によって提供されるよりも標的モジュールの結合のより多くの制御および効率を可能にするという特定の利点を提供する。例えば、特定の結合部分をチャネルの開口部の反対側に配置して、標的が捕捉されたときにそれがチャネルを通る流れをより効果的に遮断することを確実にすることが想定される。
【００８１】
標的は、溶液中の分析物、またはフルオロフォアまたは放射性標識などの検出可能なシグナルを生成することができる分子を含んでよい。分析物の結合は、ナノ細孔のチャネルを完全にまたは部分的に閉塞するのに役立ち、その結果、検出可能な電気的読み出しを得ることができる。標的分子結合部分は、ナノ細孔の形成に寄与する１つ以上のポリヌクレオチド鎖内に含まれるか、またはそれらに結合され得るか、あるいは、１つ以上のポリヌクレオチド鎖内に組み込まれた（アビジンまたはその類似体を介して）露出チオール基またはビオチンタグに結合することによって事後的に付加され得る。結合部分は、膜に埋め込まれたナノ細孔を取り囲む溶液中に存在する分析物に結合することができるポリヌクレオチドまたはポリペプチドを含んでよい。結合分子が、チャネル内で、またはナノ細孔のシス側またはトランス側に近接して、ナノ細孔につながれているポリペプチドを含む場合、それは、以下からなる群のうちの１つから選択され得る：
Ｉ．酵素−ポリメラーゼ、ヘリカーゼ、ギラーゼ、テロメラーゼ、およびそれらの核酸結合サブドメインまたは誘導体を含む、
ＩＩ．合成または天然由来の親和性結合タンパク質およびペプチド−アフィマー、抗原結合マイクロプロテイン、操作された複数の反復タンパク質、アンキリン結合ドメイン、ラクトフェリン、カテリシジン、フィコリン、コラーゲンレクチン、Ｔ細胞受容体ドメインおよびディフェンシンを含む、
ＩＩＩ．抗体−ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化およびラクダ抗体、またはＦａｂ、ｓｃＦｖ、Ｂｉｓ−ｓｃＦｖ、ＶＨ、ＶＬ、Ｖ−ＮＡＲ、ＶｈＨまたはその他の抗原結合単一ドメイン抗体フラグメントを含む抗原結合フラグメントおよびその誘導体を含む、
ＩＶ．オリゴヌクレオチドプローブ、アプタマーおよびリボザイムを含む、合成または天然由来の親和性結合核酸および核酸類似体、
Ｖ．薬物、フルオロフォア、代謝物およびケモカインを含む天然に存在するかまたは合成の小分子、ならびに
ＶＩ．受容体の結合ドメインを含むシグナル伝達分子および／またはそのポリペプチド受容体、および受容体複合体。
【００８２】
本発明のナノ細孔構造は、試験中の溶液中に存在する可能性のある多様な範囲の潜在的な分析物の検出を可能にするセンサー用途での使用に適している。例示的な分析物は、以下を含んでよい：
ｏペプチド／ポリペプチド／タンパク質−折り畳まれ、部分的／完全に折り畳まれていない、
ｏ酵素、
ｏタンパク質／核酸コンストラクト、
ｏサイズによって定義される分子、
ｏ指定されたサイズ範囲、例えば、１〜１０ｋＤ、１〜５０ｋＤ、１〜１００ｋＤ、１０〜５０ｋＤ、１０〜１００ｋＤ、２０〜５０ｋＤ、および２０〜１００ｋＤから選択された範囲内の高分子、
ｏ多タンパク質複合体、
ｏ抗原、
ｏ糖タンパク質、
ｏ炭水化物、
ｏ生体高分子、
ｏ毒素、
ｏ代謝物およびその副産物、
ｏサイトカイン、
ｏ核酸。
【００８３】
本発明のナノ細孔構造は、複数の改良されたデバイスおよびセンサー内に組み込むことができる。かかるデバイスおよびセンサーは、様々な材料および分析物の感知および特徴付けを必要とする用途で役立つ。非限定的な例として、特に有用な用途は、ゲノム配列決定、タンパク質配列決定、他の生体分子配列決定、およびイオン、分子、化学物質、小分子、生体分子、金属原子、汚染物質、ポリマー、ナノ粒子などの検出を含む。かかる検出および特徴付けは、次に、疾患を診断するために、薬剤開発において、汚染または成人化または食品もしくは水の供給を特定するために、ならびに品質管理および標準化において使用できる。
【００８４】
説明した本発明の例示的な実施形態によれば、センサーデバイスは、典型的には、１つ以上のナノ細孔が埋め込まれている膜を含む基板を含む。基板は、分析物を含む流体（任意選択的に電解液）との接触を容易にするために配置される。少なくとも１つ、および任意選択的に複数のデバイスが基板に対して配置され、所与のデバイスは、１つまたは１つ以上の分析物のナノ細孔（複数可）を通じて結合および／または通過を検出することに応答して信号（例えば、機械的、電気的、および／または光学的）を生成する。複数のデバイスは、２より大きく１００個、または２０個、または１０個、または２〜８個のデバイスでよい。各デバイスは、電界効果センサー、プラズモンセンサー、レーザーベースのセンサー、干渉センサー、導波管センサー、カンチレバーセンサー、音響センサー、水晶振動子微量天秤（ＱＣＭ）センサー、超音波センサー、機械的センサー、熱センサー、光学染料型センサー、蛍光センサー、熱量センサー、発光センサー、グラフェンセンサー、量子ドットセンサー、量子井戸型センサー、光電センサー、２Ｄマテリアルセンサー、ナノチューブまたはナノワイヤーセンサー、酵素センサー、ＦＥＴまたはＢｉｏＦＥＴセンサーを含む電気化学センサー、電位差センサー、導電率センサー；静電容量センサー、および電子スピンセンサーからなる群の１つ以上から選択することができる。デバイスは、複数の分析物の多重化試験を可能にするアレイの形態で協力することができる。センサーデバイスは、ユーザーに意味のある読み出しを提供することができる機能するセンサーデバイスを付与するために、特定の機能または動作、または特別な目的のハードウェアとコンピューター命令との組み合わせを実行する特別な目的のハードウェアおよびシステム（例えば、回路、プロセッサー、メモリ、ＧＵＩなど）をさらに含み得る。
【００８５】
したがって、本発明の実施形態によれば、好適に構成されたナノ細孔デバイスは、様々な異なるタイプのセンサー測定を行うことを可能にし得る。これは、電気的測定および光学的測定を含むが、これらに限定されない。蛍光の測定を含む好適な光学的方法は、Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２００９，１３１  １６５２−１６５３によって開示されている。可能性のある電気的測定としては、電流測定、インピーダンス測定、トンネル測定（Ｉｖａｎｏｖ  ＡＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｎｏ  Ｌｅｔｔ．２０１１  Ｊａｎ  １２；１１（１）：２７９−８５）およびＦＥＴ測定（国際出願第ＷＯ２００５／１２４８８８号）を含む。光学的測定は電気測定と組み合わせてもよい（Ｓｏｎｉ  ＧＶ  ｅｔ  ａｌ．，Ｒｅｖ  Ｓｃｉ  Ｉｎｓｔｒｕｍ．２０１０  Ｊａｎ；８１（１）：０１４３０１）。測定は、膜貫通電流測定、例えば、細孔を通過するイオン電流の測定でよい。
【００８６】
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
【実施例】
【００８７】
実施例１：
核酸平面環状ナノ細孔の構築
このナノ構造の設計は、半流動脂質膜に埋め込むことができ、特に分析物（図１ｂ）およびイオンが膜バリアを選択的に通過することを可能にする、新しい大きなナノ細孔（図１ａ）を作成することを目的としていた。負に帯電したＤＮＡナノ細孔を脂質二重層に挿入できるようにするために、疎水性コレステロールタグも構造内の選択された位置（この場合はナノ細孔の周囲に等間隔に配置された６つの位置）に組み込まれた（図１ｃ）。
【００８８】
主要な構造体は、ｃａＤＮＡｎｏソフトウェア（上記を参照）を使用して設計され、構造的および機能的ニーズの両方を満たすように合理的に変更された、ＤＮＡ分子で構成されていた。
【００８９】
図２に示すように、構造は１つの長い足場および９つの短いステープル鎖で構成されていた。長い足場は、構造を組み立てるためのテンプレートとして機能し、そのレイパスは、ナノ細孔の全体的な形状およびサイズを画定する。短いステープルは、コレステロールタグ、フルオロフォア、およびビオチン部分で修飾され、機能化はフォールディングプロセスによって達成された。
【００９０】
図１および２に示すように、細孔構造の最小限の設計原理により、構造全体への余分な部品、変更、または無関係な追加が回避された。特に、細孔の設計は、幅１０ｎｍの膜貫通部分のみを有するように最小化され、３つのＤＮＡ二重鎖によって画定されるその７ｎｍの高さは、脂質二重層の厚さ（５ｎｍ）よりわずかに大きかっただけである。この斬新なデザインは、大きなＤＮＡでキャップされたオリガミ構造に基づく、既存の全ての従来の細孔に比べて多くの利点がある。特に、現在の設計では、構造内の静電反発力を低減することでナノ構造の安定性を高め、折り畳み時間を大幅に短縮する。場合によっては、従来の数日の予想ではなく、数時間の折り畳み時間が観察される。
【００９１】
【表１】
2021532837.tif 000003
【００９２】
【表２】
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【００９３】
実施例２
核酸平面環状ナノ細孔の組み立ておよび膜挿入
ＤＮＡ環構造は、１０本のＤＮＡ鎖、つまり１本の長い足場鎖Ｓおよび９本の短いステープル鎖から折り畳まれた。
【００９４】
最初に、長い足場鎖Ｓは、２本のより短い鎖Ｓ１およびＳ２（配列番号１および２）の酵素的ライゲーションから調製された。典型的な反応では、２００ｐｍｏｌのＳ１およびＳ２（５’−リン酸化）を２４０ｐｍｏｌの連結鎖Ｌ（配列番号３）と混合し、１×Ｔ４  ＤＮＡリガーゼバッファーで６５℃〜２５℃で２時間アニーリングした。Ｔ４  ＤＮＡリガーゼ（ＮＥＢ）を添加し、１６℃で一晩インキュベートした後、６５℃で２０分間加熱した。ライゲーションした産物を２％アガロースゲルで精製した。次に、採取した鎖Ｓを２６０ｎｍでのＵＶ吸収によって定量し、さらに使用するために−２０℃で保存した。
【００９５】
次に、コレステロール修飾（Ｃｈｌ−ＤＮＡ）および色素標識（Ａｔｔｏ６４７Ｎ）鎖の有無にかかわらず、ＤＮＡ環構造を調製するために、１０ｐｍｏｌの足場鎖Ｓおよび５×過剰の対応するステープルをフォールディングバッファー（１２ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む０．５×ＴＡＥ）中で混合し、２時間フォールディングプログラム（８５℃で５分間加熱、１℃／２．５分で６５℃〜２５℃に、１℃／０．５分で２５℃〜５℃に温度上昇）で、サーモサイクラーでアニーリングした。次に、折り畳まれた構造を特徴付けし、１．５％アガロースゲルで精製した。
【００９６】
Ｍ−１００ｂｐ  ＤＮＡラダーを参照標準として使用した。レーン１−足場のみ、レーン２−線形構造（Ｌ、線形化環）、レーン３−環構造（ｒ０ｃ、コレステロールなし）、レーン４および５−それぞれ４つおよび６つのコレステロールタグを有する環構造（ｒ４ｃおよびｒ６ｃ）、レーン６−コレステロール−ＤＮＡのみ。ゲルを、８℃で１時間の間、６５Ｖで泳動させた。臭化エチジウム溶液を用いた染色および紫外線照射によって、ＤＮＡバンドを可視化した（図３ａ参照）。
【００９７】
ナノ構造は、小さな単層小胞（ＳＵＶ）膜への挿入前後の安定性を検証するために、透過型電子顕微鏡（ＴＥＭ）によってさらに分析した（図３ｂ参照）。
【００９８】
コレステロールを含むＤＮＡ環構造と脂質膜との結合能力を確認するために、ＴＥＭおよび共焦点顕微鏡の２つの特徴付け方法を使用した。
【００９９】
ＴＥＭサンプル（図３ｂを参照）の場合、コレステロール標識ステープルを保持するＤＮＡ環構造を、１−パルミトイル−２−オレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＰＯＰＣ）ＳＵＶ  １×インキュベーションバッファー（５００ｍＭ  ＮａＣｌを含む０．５×ＴＡＥ）と共に２０分間インキュベートし、次いで、それを使用してＴＥＭグリッドを調製し、ＴＥＭ観察で確認した。ＰＯＰＣ  ＳＵＶ溶液は、２ｍＬのガラスバイアルに５０μＬの２０ｍｇ／ｍＬ  ＰＯＰＣ（クロロホルム中）を加えて調製し、アルゴン気流で乾燥させ、１ｘインキュベーションバッファーで再懸濁し、３０分間超音波処理した。
【０１００】
共焦点サンプル（図４参照）の場合、コレステロール標識ステープルおよびＡｔｔｏ６４７Ｎ−標識ステープルを保持するＤＮＡ環構造を、１×インキュベーションバッファー中のＰＯＰＣ  ＧＵＶで３０分間インキュベートし、次いでインキュベートしたサンプルを反転させた共焦点顕微鏡（（Ｌｅｉｃａ）で観察した。ＰＯＰＣ  ＧＵＶは、エレクトロフォーメーション法で調製した。簡単に説明すると、ＰＯＰＣ溶液の２つの液滴（クロロホルム中１０ｍｇ／ｍＬ、各３μＬ）をＩＴＯスライドガラスに追加した。５分後、溶媒を蒸発させ、２つの乾燥脂質フィルムパッチを形成した。次に、スライドガラスをＶｅｓｉｃｌｅ  Ｐｒｅｐ装置（Ｎａｎｉｏｎ）に適用した。２つのＯ環で囲まれた脂質フィルムパッチに６００μＬのショ糖溶液（水中１Ｍ）を加えた後、別のＩＴＯスライドガラスを上から適用し、密閉チャンバーを形成した。プログラムされたプロトコルを短時間、３Ｖ、５Ｈｚで１２０分間実行することにより、２つのスライド間に交互に交流電界を印加した。プログラム終了後、溶液を回収し、次の使用のために４℃で保存した。
【０１０１】
実施例３
ＰＯＰＣ  ＳＵＶを用いたＤＮＡ環媒介色素放出テスト（図５）
まず、ＰＯＰＣ  ＳＵＶは、従来の１ｘインキュベーションバッファーを使用せず、１ｘ色素含有バッファー（５００ｍＭ  ６−カルボキシフルオレセイン（６−ＣＦ）を含む０．５  ＴＡＥ）に変更して、前のセクションから変更した方法で調製し、脂質フィルムを再懸濁して、色素をロードしたＳＵＶを形成した。次に、過剰な色素をＧ−２５ゲル濾過によって除去した。精製されたＳＵＶ溶液は、さらに使用するために１ｘインキュベーションバッファーで１０倍の容量に希釈した。
【０１０２】
次に、色素をロードしたＳＵＶ溶液を使用して、構造の形状や構造に付いているコレステロールタグの数とは異なる様々なＤＮＡ環構造とインキュベートした。色素放出試験は、蛍光強度（λｅｘ＝４９２ｎｍ、λｅｍ＝５１７ｎｍ）を測定することにより、蛍光光度計（Ｖａｒｉａｎ）で行った。
【０１０３】
実施例４
機能性ナノ細孔は、サイズに依存した様式でＧＵＶ小胞への色素の流入を媒介する
コレステロール標識ステープルおよびＡｔｔｏ６４７Ｎ−標識ステープルを保持するＤＮＡ環構造を、１×インキュベーションバッファー中のＰＯＰＣ  ＧＵＶに添加し、共焦点観察のためにＧＵＶが落ち着くまで２分間待ってディッシュ中で穏やかに混合した。
【０１０４】
ＤＮＡ環構造が分子カーゴを輸送するための膜貫通チャネルとして脂質膜を穿孔できるかどうかを確認するために、我々は、ＦＩＴＣ−デキストラン（緑、ＭＷ＝５００ｋＤ）およびＡｔｔｏ６３３（赤）の２種類の色素を使用し、染料がＧＵＶの管腔に流れ込むかどうか蛍光強度で確認した。色素Ａｔｔｏ６３３は小分子であり、ＡＳＵｐｏｒｅを通過すると予想されるが、公称直径が約２９．４ｎｍのＦＩＴＣ−デキストラン（ＭＷ＝５００ｋＤａ）は、ＤＮＡナノ細孔（公称直径約１０ｎｍ）のチャネルを通過できない。２つの色素の蛍光強度は、ＧＵＶ管腔内の同じ微視的関心領域を調べることによって測定した。図６および７に示すように、Ａｔｔｏ６３３の強度は時間と共に増加したが、ＦＩＴＣ−デキストランの強度は５時間にわたる測定全体を通して非常に低いままであった。
【０１０５】
実施例５
核酸多角形環状ナノ細孔の構築
一般的な多角形の細孔の設計は、オリゴマータンパク質の細孔に触発され、複数のモジュラーブロックの多角形のフレームワークに依存している。図８を参照すると、多角形の細孔のブロックまたはモジュールは、挿入されると足場ポリヌクレオチド鎖の主要部分が膜に実質的に平行に走るように配置されたＤＮＡヘリックス束から好適に構成される。本発明の多角形のナノ細孔は、三角形、および四角形または長方形、五角形、六角形、または台形などの四辺形を含む任意の好適な形状を有してよい。モジュールは、図８に示すように、１０ｎｍまたは２０ｎｍなどの調整可能な辺の長さを有することがある。モジュラーブロックは、平行に整列したＤＮＡ二重鎖の束で構成されている。図８Ａ〜Ｄ（それぞれ三角形、四角形の細孔、五角形、六角形）では、ユニットは一辺の長さが約１０ｎｍの３×２の二重鎖の束で構成されている。比較すると、図８Ｅ〜８Ｆ（それぞれ、三角形および四角形）では、ユニットは一辺の長さが約２０ｎｍの３×４の二重鎖で構成されている。この例では、フレームは、約４３〜約４００ｎｍ２のチャネル領域を囲む。
【０１０６】
モジュラーブロックは、ブロックの最も内側の二重層にある一本鎖ＤＮＡリンカーを介して接続されている。細孔の不安定性および／または崩壊を回避し、全体的な構造を確保するために、剛性の二重安定剤（サブモジュール）が、四角形、五角形、および六角形の細孔の第２二重層のブロック間に配置される。
【０１０７】
１０ｎｍの三角形および１０ｎｍの四角形の細孔フレームの二次元ＤＮＡマップを図１１および１２に示す。
【０１０８】
図９Ｂおよび９Ｃに最もよく見られるように、追加の成分として、細孔は挿入時に膜に穴を開けるチャネルおよび脂質膜アンカーを形成する。
【０１０９】
【表３−１】
2021532837.tif 000005
【０１１０】
【表３−２】
2021532837.tif 000006
【０１１１】
【表３−３】
2021532837.tif 000007
【０１１２】
【表３−４】
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【０１１３】
【表３−５】
2021532837.tif 000009
【０１１４】
【表３−６】
2021532837.tif 000010
【０１１５】
【表４−１】
2021532837.tif 000011
【０１１６】
【表４−２】
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【０１１７】
【表４−３】
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【０１１８】
【表４−４】
2021532837.tif 000014
【０１１９】
【表４−５】
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【０１２０】
【表４−６】
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【０１２１】
【表４−７】
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【０１２２】
【表４−８】
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【０１２３】
【表４−９】
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【０１２４】
【表４−１０】
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【０１２５】
【表４−１１】
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【０１２６】
【表４−１２】
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【０１２７】
【表４−１３】
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【０１２８】
【表４−１４】
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【０１２９】
【表４−１５】
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【０１３０】
【表５】
2021532837.tif 000026
【０１３１】
実施例６
核酸平面環状ナノ細孔の組み立てと膜挿入
モジュールは、足場とステープルのアプローチによって個別に調製された。設計アプローチは、最初に多角形フレームの表面部分を調製することによって検証された（垂直チャネル形成テールなし）。ＤＮＡナノ構造は、アニーリングと冷却によって組み立てられた。
【０１３２】
膜の細孔を得るために、フレームは、四角形の細孔で例示されるように、膜貫通部分的なチャネル壁をその底部に備えていた（図９Ａ〜９Ｃ）。チャネル壁はフレームと同じ長さで、単一の二重鎖ＤＮＡ二重鎖の垂直スタックで構成されている（図９Ａ）。細孔の膜穿刺を容易にするために、フレームにはフレームの下部にコレステロールアンカーも装備されていた（図９Ｂ）。コレステロールアンカーの高い膜親和性は、チップを膜に通すように設計されている（図９Ｃ）。
【０１３３】
ＤＮＡオリガミ構造を折り畳むために、Ｍ１３またはＰＨＩＸ１７４（ΦＸ１７４）足場（表３）および１０倍過剰の対応するステープル（表４）を１０倍のリフォールディングバッファーと混合して最終濃度を１６ｍＭ  ＭｇＣｌ２を添加した０．５×ＴＡＥ  ｐＨ８．３にした。次に、溶液を７５℃で１０分間加熱して、望ましくないＤＮＡ二次構造を変性させ、６５℃〜２５℃（１時間／℃）までゆっくりとアニーリングし、１０℃（５分／℃）まで冷却し、回収まで４℃で保持した。折り畳みプロセスの後、ＤＮＡオリガミ構造は、１１ｍＭ  ＭｇＣｌ２を含む０．５×ＴＢＥバッファー中の１％アガロースゲルからの切除によって精製された。コレステロール−ＤＮＡ鎖（表５）は、膜結合および現在の記録実験で使用する前に、ＤＮＡコレステロール結合部位の数に対して１．５の化学量論でＤＮＡ細孔に添加された。
【０１３４】
実施例７
ＤＮＡオリガミ細孔のＴＥＭの特徴付け
本発明の一実施形態によるＤＮＡナノ細孔は、四角形の１０ｎｍ細孔について例示されるように、ゲル電気泳動における単一バンドによって示されるように均一に組み立てられた（図９Ｄ）。多角形のＤＮＡフレームの設計された寸法および形状は、透過型電子顕微鏡とネガティブ染色で確認された（図８）。
【０１３５】
細孔設計は、５ｘ二重鎖の束を特徴とする１０および２０ｎｍの四角形のブロック、および４つの二重鎖の深さの四角形の先端でテストされた（図９Ａ〜９Ｃ）。各ブロックは、１０ｎｍの四角形の細孔に対して１０個のコレステロール、２０ｎｍの四角形の細孔に対して１５個のコレステロールを特徴としていた。コレステロールを含まない１０ｎｍの四角形の細孔バリアントの形成は、ゲル電気泳動によって確認された（図９Ｄ）。単一のバンドが、均質なアセンブリを意味することがわかった。ＴＥＭによる追加の分析により、２０ｎｍの四角形の細孔の寸法および幾何学的形状が確認された（図９Ｇ）。
【０１３６】
ＴＥＭの特徴付けは、次の手順に従って実行された。
コレステロールを欠く精製されたＤＮＡ細孔６μＬをグロー放電処理されたＴＥＭグリッド（Ａｇａｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）に加え、２％ギ酸ウラニル溶液で染色した。ＴＥＭ分析は２００ｋＶで動作するＪＥＭ−２１００電子顕微鏡（ＪＥＯＬ）で実行され、画像はＯｒｉｕｓＳＣ２００カメラで取得された。コレステロールタグを付けたナノ細孔を、５００ｍＭ  ＮａＣｌを添加した０．５×ＴＡＥ中のＰＯＰＣＳＵＶと２０分間インキュベートした後、ＥＭグリッドに沈着させ、乾燥させ、ネガティブ染色し、ＴＥＭ分析を行いた。ＳＵＶの調製には、２ｍＬガラスバイアル中のＰＯＰＣ溶液（２０ｍｇ／ｍＬ  ５０μＬ、クロロホルム中）をアルゴン気流で乾燥し、乾燥したフィルムを１ｘインキュベーションバッファー（０．５×ＴＡＥ、５００ｍＭ  ＮａＣｌから１ｍＬ）で再懸濁した、３０分間、超音波処理した。
【０１３７】
実施例８
ＧＵＶへのＤＮＡ細孔結合の顕微鏡分析
膜結合は、上記で調製されたコレステロールを運ぶ細孔を使用して検証された。アッセイでは、細孔を小さな単層小胞（ＳＵＶ）とインキュベートした。ＳＵＶは大きすぎてゲルの網目構造に入ることができないため、結合はＤＮＡ細孔のゲル電気泳動バンドのアップシフトによって示された（図９Ｄ）。ＳＵＶがない場合のスメア細孔バンド（図９Ｄ）は、疎水性の脂質化面によるいくつかの細孔の非特異的相互作用を示している可能性がある。ＳＵＶへの細孔結合はＴＥＭで直接視覚化された（図９Ｈ、２０ｎｍ細孔）。膜結合の程度を調べるために、蛍光顕微鏡を使用した。Ａｔｔｏ６４７Ｎフルオロフォアを運ぶ細孔は、Ｂｏｄｉｐｙでタグ付けされた巨大な単層小胞（ＧＵＶ）とインキュベートされた。ＧＵＶの蛍光顕微鏡画像は、細孔が膜によく結合していることを示唆する、両方の信号の均一な蛍光分布をもたらした（図９Ｇ−９Ｈ）。
【０１３８】
ＰＯＰＣリン脂質で構成される巨大な単層小胞（ＧＵＶ）は、エレクトロフォーメーションによって調製された。簡単に説明すると、ＰＯＰＣ溶液の２つの液滴（クロロホルム中１０ｍｇ／ｍＬ、各３μＬ）を１つのＩＴＯスライドガラスに追加した。空気中の溶媒を５分間蒸発させると、乾燥脂質膜のパッチが形成された。スライドガラスをＶｅｓｉｃｌｅ  Ｐｒｅｐ  ｄｅｖｉｃｅ（Ｎａｎｉｏｎ）内に配置した。脂質フィルムパッチを２つのＯ環で閉じ込め、ショ糖溶液（水中１Ｍ、６００μＬ）を加え、別のＩＴＯスライドガラスを上に配置して密閉チャンバーを形成した。２枚のスライド（３Ｖ、５Ｈｚ）にわたって交互に１２０分間電界をかけ、その後小胞の溶液を回収して４℃で保存した。ＤＮＡ細孔の結合および視覚化のために、２０μＬの１０ｎｍ幅の四角形の細孔（約２０ｎＭ）を１×インキュベーションバッファー５０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ  ｐＨ７．６、３００ｍＭ  ＮａＣｌ中の５００μＬのＰＯＰＣ  ＧＵＶ溶液（０．５％  β−ＢＯＤＩＰＹ５００／５１０  Ｃ１２−ＨＰＣ、Ｄ３７９３、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒで蛍光標識）で、３０分間、インキュベートし、インキュベートしたサンプルを倒立共焦点顕微鏡（ＳＰＥｉｎｖ，Ｌｅｉｃａ）で画像化した。
【０１３９】
実施例９
ナノ細孔記録
ＤＮＡ細孔が水で満たされた穴で脂質二重層を穿刺することを示すために、単一チャネルの電流記録を使用した。１０ｎｍの三角形のＤＮＡナノ細孔、１０ｎｍ×１０ｎｍの四角形のＤＮＡナノ細孔、２０ｎｍ×２０ｎｍの四角形のＤＮＡナノ細孔のトレースおよびＩＶ曲線を図１０に示す。８０ｐＡ、２３２ｐＡおよび３９５ｐＡのコンダクタンスは４３ｎｍ２、１００ｎｍ２、および４００ｎｍ２の計算された断面細孔面積値と一致する。
【０１４０】
平面脂質二重層の電気生理学的電流測定のために、多電極キャビティアレイ（ＭＥＣＡ）チップ（ＩＯＮＥＲＡ，Ｆｒｅｉｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を備えた、集積チップ型平行二重層記録設定（Ｏｒｂｉｔ  １６  ａｎｄ  Ｏｒｂｉｔ  Ｍｉｎｉ，Ｎａｎｉｏｎ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｍｕｎｉｃｈ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用した。二重層は、オクタン（１０ｍｇ  ｍＬ−１）に溶解したＤＰｈＰＣの塗装によって形成された。電解液は、１Ｍ  ＫＣｌおよび１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０であった。細孔挿入のために、コレステロール固定ＤＮＡナノ細孔と０．５％のＯＰＯＥ（１Ｍ  ＫＣｌ、１０ｍＭ  ＨＥＰＥＳ中のｎ−オクチルオリゴオキシエチレン、ｐＨ８．０）との２：１混合物を二重層のシス側に添加した。現在のステップを検出することによって、正常な組み込みを観察した。Ｏｒｂｉｔ１６電流トレースを、２．８７３ｋＨｚでベッセルフィルター処理し、ＰＡＴＣＨＭＡＳＴＥＲソフトウェア（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ）を備えたＥＰＣ−１０パッチクランプ増幅器（ＨＥＫＡ  Ｅｌｅｋｔｒｏｎｉｋ，Ｌａｍｂｒｅｃｈｔ／Ｐｆａｌｚ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いて１０ｋＨｚで取得した。Ｏｒｂｉｔ  Ｍｉｎｉ電流トレースは、Ｅｌｅｍｅｎｔ  Ｄａｔａ  Ｒｅｃｏｒｄｅｒソフトウェア（Ｅｌｅｍｅｎｔ  ｓ．ｒ．ｌ．，Ｉｔａｌｙ）を使用して、ベッセルフィルター処理せず、１０ｋＨｚで取得された。Ｃｌａｍｐｆｉｔ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｅｖｉｃｅｓ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して単一チャネル分析を実施した。
【０１４１】
本発明のナノ細孔構造は、以下の利点を提供した：
１）大きな管腔。
これにより、タンパク質などのより大きな分析対象物の通過が可能になり、同時に既存のオリガミ細孔の幅は狭くなる。
２）材料の効率的な使用。
従来のオリガミ細孔の場合、通常は数百のステープル（約８０００ｂｐ）を消費するが、この設計では、構造を形成するために必要な鎖は１０本（３００ｂｐ）のみであった。
３）シンプルで迅速な調製条件。
従来のオリガミ細孔の場合、オリガミ構造を折り畳むのに数日かかるが、このデザインでは折り畳みが２時間に短縮された。
４）簡単で正確な機能化。
細孔構造の明確な形成はそれに原子レベルの精度を与え、このことは、さらなるエンジニアリングが幅広い機能を獲得することを可能にする。
【０１４２】
本明細書では本発明の特定の実施形態を詳細に開示してきたが、これは例としておよび説明の目的にのみ行われたものである。前述の実施形態は、次の添付の特許請求の範囲に対する限定を意図するものではない。核酸出発配列（複数可）の選択は、現在記載の実施形態の知識を有する当業者にとって日常的な事項であると思われる。本発明者らは、特許請求の範囲によって定義される本発明の趣旨および範囲から逸脱することなく、本発明に対して様々な置換、変更、および修正が行われ得ることを企図している。
【図１Ａ】
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【図１Ｂ】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【国際調査報告】
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