(57)【要約】本発明は、（i）糖類原材料および少なくとも1つのリン供給源からのアルファ-D-グルコース1-リン酸中間体の生成を触媒する能力を有する、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、（ii）アルファ-D-グルコース1-リン酸中間体およびグルコース基質からのトレハロースの生産を触媒する能力を有し、少なくとも1つのアミノ酸位置において野生型トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を持つトレハロースホスホリラーゼバリアントである、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、（iii）アルファ-ホスホリラーゼの触媒作用によってアルファ-D-グルコース1-リン酸中間体と副産物とを生成する、少なくとも1つの糖類原材料、ならびに（iv）リン酸およびその無機塩からなる群より選択される少なくとも1つのリン供給源を任意の順序で混合し反応させる工程を含む、トレハロースの生産方法に関する。2021503955.tif 000047
2021503955.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
（a）スクロースおよびデンプンからなる群より選択される糖類原材料ならびにリン酸およびその無機塩からなる群より選択される少なくとも1つのリン供給源からのアルファ-D-グルコース1-リン酸中間体の生成を触媒する能力を有する、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、
（b）アルファ-D-グルコース1-リン酸中間体およびグルコース基質からのトレハロースの生産を触媒する能力を有し、少なくとも1つのアミノ酸位置において野生型トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を持つトレハロースホスホリラーゼバリアントである、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、
（c）アルファ-ホスホリラーゼの触媒作用によってアルファ-D-グルコース1-リン酸中間体とフルクトース副産物およびデンプン副産物の群から選択される副産物とを生成する、スクロースおよびデンプンからなる群より選択される少なくとも1つの糖類原材料、ならびに
（d）リン酸およびその無機塩からなる群より選択される少なくとも1つのリン供給源
を任意の順序で混合し反応させる工程を含む、トレハロースの生産方法。
【請求項２】
（i）グルコース基質、および/または
（ii）少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ
を、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、スクロースおよびデンプンからなる群より選択される少なくとも1つの糖類原材料、ならびに少なくとも1つのリン供給源と任意の順序で混合し反応させる工程をさらに含む、請求項1記載の方法。
【請求項３】
（a）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼおよび少なくとも1つのリン供給源で加リン酸分解的に切断することによる、アルファ-D-グルコース1-リン酸中間体および副産物への少なくとも1つの糖類原材料の変換、
（b）少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼによる、トレハロースへのアルファ-D-グルコース1-リン酸中間体およびグルコース基質の変換、
（c）少なくとも1つのグルコースイソメラーゼによる、グルコース基質へのフルクトース副産物の変換
からなる群より選択される変換のうちの2つ以上を特徴とする、請求項1または2記載の方法。
【請求項４】
（a）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、少なくとも1つの糖類原材料、グルコース基質、および少なくとも1つのリン供給源の反応および混合を伴う、二酵素プロセス、ならびに/または
（b）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、少なくとも1つの糖類原材料、および少なくとも1つのリン供給源の反応および混合を伴う、三酵素プロセス、ならびに/または
（c）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、グルコース基質、少なくとも1つの糖類原材料、および少なくとも1つのリン供給源の反応および混合を伴う、三酵素プロセス
としてさらに特徴づけられる、請求項3記載の方法。
【請求項５】
少なくとも30℃から80℃まで、好ましくは少なくとも40℃から80℃まで、より好ましくは少なくとも45℃から80℃までの温度で実行される、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
少なくとも1つの糖類原材料をスクロースの形態で混合し反応させ、好ましくはスクロースを100mMから2000mMまでの濃度範囲、好ましくは500mM〜2000mMの濃度範囲、より好ましくは1000mM〜2000mMの濃度範囲で反応に加える、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、以下の特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法:
（A）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の30％〜100％の残存酵素活性を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（B）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の少なくとも52℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（C）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の52℃〜90℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（D）3時間〜9日またはそれ以上の半減期、好ましくは24時間〜9日またはそれ以上の半減期、より好ましくは4日〜9日またはそれ以上の半減期を特徴とするプロセス安定性という形での熱安定性。
【請求項８】
（i）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスであって、スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）である、三酵素プロセス、ならびに/または
（ii）グルコースイソメラーゼを加えることなく、グルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスであって、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）であり、好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、好ましくは、糖類原材料は好ましくはスクロースである、二酵素プロセス
を可能にする少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼの使用を特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも20％相同および/または同一であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなるトレハロースホスホリラーゼバリアントであり、該バリアントは、
（a）712A、712G、712I、712M、712P、または712V、好ましくは712M、および/あるいは
（b）383A、383G、383I、383L、383M、383V、383N、383C、383Q、383S、または383T、好ましくは383A、383G、383M、383V、383N、383C、383Q、383S、または383T、より好ましくは383G、383V、383C、383S、または383T、さらに好ましくは383Vまたは383T、最も好ましくは383V、および/あるいは
（c）114A、114G、114I、114M、114P、または114V、好ましくは114I、および/あるいは
（d）118は、118A、118G、118I、118L、118M、118P、または118V、好ましくは118Vである、および/あるいは
（e）225A、225G、225I、225L、225M、225P、または225V、好ましくは225I、225L、225M、または225V、より好ましくは225V、および/あるいは
（f）304G、304I、304L、304M、304P、または304V、好ましくは304Iまたは304L、より好ましくは304I、および/あるいは
（g）323A、323G、323I、323L、323M、323P、または323V、好ましくは323Iまたは323V、より好ましくは323I、および/あるいは
（h）349Wまたは349Y、好ましくは349Y、および/あるいは
（i）357A、357I、357L、357M、357P、または357V、好ましくは357A、および/あるいは
（j）487A、487G、487I、487L、487M、487P、または487V、好ましくは487A、487M、487G、487L、または487V、より好ましくは487A、および/あるいは
（k）550A、550G、550I、550L、550M、または550P、好ましくは550Iまたは550P、より好ましくは550I、および/あるいは
（l）556N、556C、556Q、またはS556T、好ましくは556T、および/あるいは
（m）564Dまたは564E、好ましくは564E、および/あるいは
（n）590N、590C、590Q、590S、590T、590A、590G、590I、590L、590M、590P、または590V、好ましくは590N、590G、または590A、より好ましくは590N、および/あるいは
（o）649Dまたは649E、好ましくは649E
の群より選択されるアミノ酸位置のうちの2個から15個まで、3個から15個まで、4個から15個まで、5個から15個まで、6個から15個まで、7個から15個まで、8個から15個まで、9個から15個まで、10個から15個まで、11個から15個まで、12個から15個まで、13個から15個まで、14個から15個まで、または15個を含み、
ここで、アミノ酸のナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す、
請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、SEQ NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも77％相同および/または同一であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなるトレハロースホスホリラーゼバリアントであり、該バリアントは、アミノ酸位置383、114、225、304、323、349、357、550、556、564、および649からなる群より選択されるアミノ酸位置のうちの2つ以上にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１１】
トレハロースホスホリラーゼバリアントが、アミノ酸位置712、118、487、および590からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す、請求項10記載の方法。
【請求項１２】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、SEQ NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも68％相同および/または同一であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなるトレハロースホスホリラーゼバリアントであり、該バリアントは、アミノ酸位置383、114、225、304、323、349、357、550、556、および564からなる群より選択されるアミノ酸位置のうちの2つ以上にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１３】
トレハロースホスホリラーゼバリアントが、アミノ酸位置712、118、487、590、および649からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す、請求項12記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、SEQ NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも63％相同および/または同一であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなるトレハロースホスホリラーゼバリアントであり、該バリアントは、アミノ酸位置383、114、225、304、323、349、357、556、および564からなる群より選択されるアミノ酸位置のうちの2つ以上にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法。
【請求項１５】
トレハロースホスホリラーゼバリアントが、アミノ酸位置712、118、487、550、590、および649からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す、請求項14記載の方法。
【請求項１６】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントが、以下の特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とする、請求項9〜15のいずれか一項記載の方法:
（A）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の30％〜100％の残存酵素活性を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（B）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の少なくとも52℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（C）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の52℃〜90℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（D）3時間〜9日またはそれ以上の半減期、好ましくは24時間〜9日またはそれ以上の半減期、より好ましくは4日〜9日またはそれ以上の半減期を特徴とするプロセス安定性という形での熱安定性。
【請求項１７】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、それが、
（i）糖類原材料スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性を、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）にすることができ、かつ/または
（ii）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスであって、スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）である、三酵素プロセス
を可能にし、かつ/または
（iii）グルコースイソメラーゼを加えることなく、グルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスであって、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）であり、好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、糖類原材料は好ましくはスクロースである、二酵素プロセス
を可能にする
ことを特徴とする、請求項9〜16のいずれか一項記載の方法。
【請求項１８】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一かつ/または少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、該トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列が、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置712、383、114、118、192、197、220、225、304、306、318、323、339、349、357、459、476、481、484、487、488、506、511、526、530、532、533、537、550、556、564、590、667、703、および705からなる群、好ましくはSEQ ID NO:1のアミノ酸位置383、225、304、323、487、550、556、564、590、および705からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１９】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、以下の特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とする、請求項18記載の方法:
（A）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の30％〜100％の残存酵素活性を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（B）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の少なくとも52℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（C）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の52℃〜90℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（D）3時間〜9日またはそれ以上の半減期、好ましくは24時間〜9日またはそれ以上の半減期、より好ましくは4日〜9日またはそれ以上の半減期を特徴とするプロセス安定性という形での熱安定性。
【請求項２０】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、それが、
（i）糖類原材料スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性を、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）にすることができ、かつ/または
（ii）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスであって、スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）である、三酵素プロセス
を可能にし、かつ/または
（iii）グルコースイソメラーゼを加えることなく、グルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスであって、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）であり、好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、糖類原材料は好ましくはスクロースである、二酵素プロセス
を可能にする
ことを特徴とする、請求項18〜19のいずれか一項記載の方法。
【請求項２１】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、SEQ ID NO:81および/またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、アミノ酸配列に対して少なくとも85％同一かつ/または少なくとも85％相同であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、該トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、アミノ酸位置108、112、221、300、319、345、379、483、544、550、558、584、643、および707からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含む、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項２２】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、以下の特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とする、請求項21記載の方法:
（A）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の30％〜100％の残存酵素活性を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（B）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の少なくとも52℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（C）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の52℃〜90℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（D）3時間〜9日またはそれ以上の半減期、好ましくは24時間〜9日またはそれ以上の半減期、より好ましくは4日〜9日またはそれ以上の半減期を特徴とするプロセス安定性という形での熱安定性。
【請求項２３】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、それが、
（i）糖類原材料スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性を、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）にすることができ、かつ/または
（ii）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスであって、スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）である、三酵素プロセス
を可能にし、かつ/または
（iii）グルコースイソメラーゼを加えることなく、グルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスであって、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）であり、好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、糖類原材料は好ましくはスクロースである、二酵素プロセス
を可能にする
ことを特徴とする、請求項21〜22のいずれか一項記載の方法。
【請求項２４】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、以下のいずれか1つからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなる、請求項1〜23のいずれか一項記載の方法:
（a）
2021503955.tif 000041
、好ましくは
2021503955.tif 000042
からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなる、ならびに/または
（b）
2021503955.tif 000043
、好ましくは
2021503955.tif 000044
からなる配列の群より選択される、ならびに/または
（c）SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、およびSEQ ID NO:189、好ましくはSEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:185、およびSEQ ID NO:188からなる配列の群より選択される、ならびに/または
（d）SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:180、およびSEQ ID NO:188。
【請求項２５】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、およびSEQ ID NO:170のうちのいずれか1つからなる群より選択されるアミノ酸配列、好ましくはSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、およびSEQ ID NO:104からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなる、請求項1〜8および請求項18〜23のいずれか一項記載の方法。
【請求項２６】
少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼが、SEQ ID NO:202およびSEQ ID NO:205からなる群より選択されるアミノ酸配列、好ましくはSEQ ID NO:202のアミノ酸配列に対して少なくとも75％の配列同一性および/または配列相同性を有するスクロースホスホリラーゼである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項２７】
少なくとも1つのグルコースイソメラーゼが、SEQ ID NO:220のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性および/または配列相同性を持つグルコースイソメラーゼである、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項２８】
（i）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼが、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、およびSEQ ID NO:219からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列、好ましくはSEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、およびSEQ ID NO:219からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなるスクロースホスホリラーゼの形態にあり、かつ/または
（ii）少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、
2021503955.tif 000045
2021503955.tif 000046
からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなるトレハロースホスホリラーゼの形態にあり、かつ/または
（iii）少なくとも1つのグルコースイソメラーゼが、SEQ ID NO:220〜SEQ ID NO:240からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなるグルコースイソメラーゼの形態にある、
請求項1〜27のいずれか一項記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
発明の分野
本発明はトレハロースの生産方法に関する。より具体的には、本発明は、安価な糖類原材料と種々の安定な酵素とを利用して、一連の酵素反応によって高い生産性でトレハロースを生産する方法であって、グルコシル単糖とアルファ-D-グルコース1-リン酸とを反応させて、グルコースとアルファ-D-グルコース1-リン酸をトレハロースと無機リン酸とに変換する工程を含む方法に関する。本発明の方法は、トレハロースを生産する方法の有効性の改良をもたらす機能的特徴を持つ酵素および酵素バリアント、例えばトレハロースを生産するためのトレハロースホスホリラーゼ、アルファ-ホスホリラーゼおよび/またはグルコースイソメラーゼの使用を含む。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
マルトース、デンプンおよびスクロースのような異なる原材料を使ってトレハロース（（2R,3S,4S,5R,6R）-2-（ヒドロキシメチル）-6-［（2R,3R,4S,5S,6R）-3,4,5-トリヒドロキシ-6-（ヒドロキシメチル）オキサン-2-イル］オキシオキサン-3,4,5-トリオール）を生物工学的に生産するための異なる合成経路は、異なる酵素および異なる酵素活性を含めて、当技術分野ではいくつか記載されている。
【０００３】
例えばUS5,565,341（特許文献1）、US5,643,775（特許文献2）、およびWO1998/044116（特許文献3）は、糖類原材料とリン酸および/またはその無機塩とをホスホリラーゼの存在下でインキュベートすることでα-グルコース1-リン酸を生成させ、生成したα-グルコース1-リン酸をトレハロースホスホリラーゼの存在下でグルコースと接触させることによる、トレハロースの生産プロセスを開示している。
【０００４】
ホスホリラーゼは、無機リン酸からアクセプター分子へのリン酸基の付加を触媒する酵素である。
【０００５】
トレハロースの可逆的な加リン酸分解的切断を触媒するホスホリラーゼは当技術分野において公知であり、トレハロースホスホリラーゼと呼ばれる。トレハロースホスホリラーゼは、それらが触媒する反応の基礎を成す機序に基づいて区別することができる。
【０００６】
トレハロースホスホリラーゼの第1のグループは、無機リン酸をグルコシルアクセプターとして使用し、アノマー配置を正味で保持しつつ、トレハロースをグルコースとアルファ-D-グルコース1-リン酸（aG1P）とに加リン酸分解的に切断する反応を触媒し、それゆえに、保持型ホスホリラーゼに分類される。そのような第1グループのトレハロースホスホリラーゼには国際生化学・分子生物学連合によってEC番号EC2.4.1.231が割り当てられており、さまざまな真核菌類から機能的に特徴づけられている。
【０００７】
トレハロースホスホリラーゼの第2のグループは、EC番号EC2.4.1.64が割り当てられている反転型トレハロースホスホリラーゼであり、これは、配置の反転を伴って、トレハロースをグルコースとベータ-D-グルコース1-リン酸とに加リン酸分解的に切断する反応を触媒している。このように、これらのホスホリラーゼは、EC2.4.1.231トレハロースホスホリラーゼとは異なる反応機序を有する。
【０００８】
具体的に述べると、本発明では、数ある反応のなかでもとりわけ、グルコースとアルファ-D-グルコース-1リン酸（「aG1P」）とをトレハロースに変換する能力、または無機リン酸の存在下でトレハロースをグルコースとaG1Pとに加リン酸分解的に切断する能力を有する、EC番号EC2.4.1.231の一定のホスホリラーゼを考慮する。
【０００９】
トレハロースホスホリラーゼの工業的利用は、それらの生化学的特徴づけの基礎を成す反応、すなわちトレハロースの加リン酸分解的切断を触媒する反応が、可逆的であるという事実に起因する。このため、トレハロースホスホリラーゼは、グルコースおよびaG1Pからトレハロースおよび無機リン酸への変換を触媒するのに、特に有用である。
【００１０】
トレハロースホスホリラーゼによって触媒される反応は可逆的（平衡反応）であり、反応の具体的方向に応じて、基質阻害または生成物阻害を受けうる。工業上妥当な量の所望の生成物を得るには、基質の変換を高い比活性で触媒するトレハロースホスホリラーゼが要求される。加えて、トレハロースホスホリラーゼの他の速度論的因子、例えば基質選択性およびKMも、生成物収量にとって重要な役割を果たしうる。他の関連局面として、位置選択性、他の因子（例えば粗抽出物成分、基質夾雑物または副生成物）による阻害、および適切な宿主における組換え可溶性発現を挙げることができるが、それらに限定されるわけではない。
【００１１】
野生型トレハロースホスホリラーゼの大きな短所は、25℃から40℃までの穏当な温度でさえ溶解状態では酵素活性が急速に失われることであり、これがそれらの応用を著しく制限している。工業的応用には、30℃を上回る温度（40℃を上回る温度であればなお良い）で数日にわたる高い安定性が望ましい。熱的に不安定な酵素の場合、長い反応時間は、より多量の酵素をプロセス時間中に必要とし、それは多くの場合、プロセス全体にわたって酵素を繰り返し添加することによって実現される。例えばヒラタケ（Pleurotus ostreatus）由来のトレハロースホスホリラーゼは、25℃でおよそ1.3時間、およそ41℃では3分の半減期を示す（Schwarz et al.,J Biotechnol 129,140-150（2007）（非特許文献1）、Han et al.,Protein Expression and Purification 30,194-202（2003）（非特許文献2））。スエヒロタケ（Schizophyllum commune）およびマイタケ（Grifola frondosa）由来のトレハロースホスホリラーゼは、それよりはわずかに安定であり、それぞれ30℃で4.8時間および37℃で1時間の半減期を持つ（Schwarz et al.,J Biotechnol 129,140-150（2007）（非特許文献1））。
【００１２】
そのような短所に対処するために当技術分野ではさまざまな戦略が適用された。例えばトレハロース、グリセロールおよびポリエチレングリコール（PEG）の添加は、トレハロースホスホリラーゼの安定性を増加させることが示された（Klimacek et al.,Biotechnology Techniques 13:243-248,1999（非特許文献3）、Eis et al.,Biochem J 341,385-393（1999）（非特許文献4）、Schwarz et al.J Biotechnol 129,140-150（2007）（非特許文献1））。最も良い安定化は20％PEG 4000を添加することによって達成され、これは、スエヒロタケ由来のトレハロースホスホリラーゼの半減期を、30℃、40℃および50℃で、それぞれ4.5日、2.2時間および6分にした（Klimacek et al.,Biotechnology Techniques 13:243-248,1999（非特許文献3）、Eis et al.,Biochem J 341,385-393（1999）（非特許文献4））。PEG4000の添加は酵素の安定性を改良したものの、そのような改良は、40℃以上および数時間〜数日間のプロセス時間での応用にとっては、依然として不十分である。さらにまた、PEG4000の存在は、酵素反応によって得られる生成物にとって、工業規模でのコスト構造および下流処理要件に支障をきたしうる。
【００１３】
スエヒロタケ由来のトレハロースホスホリラーゼの半減期は、固定化により、30℃、40℃および50℃でそれぞれ22日、3.3日および2時間まで改良することもできた（Klimacek et al.,Biotechnology Techniques 13:243-248,1999（非特許文献3））。しかし固定化は、担体および製造コストが高いので、酵素生産コストの上昇をもたらし、工業的利用可能性という点からは、酵素を回収して複数サイクルにわたって再使用することができる場合にのみ有効である。加えて、固定化は、酵素反応の生成物に関して、プロセスおよび下流処理の選択肢を制限する。
【００１４】
それゆえに、トレハロースホスホリラーゼを使用する合成反応が25℃から35℃までの範囲の温度で行われることは驚くにはあたらない（Schwarz et al.,J of Biotechnology 129 140-150（2007）（非特許文献1）、Saito et al.,Appl Microbiol Biotechnol 50:193-198（1998）（非特許文献5）、Saito et al.Appl Microbiol Biotechnol 64:4340-4345（1998）（非特許文献6））。
【００１５】
一般に、酵素触媒反応の分野では、反応温度が高いほど生成物形成速度は加速され、その結果、生成物の空時収量が増加する。生成物形成の空時収量は、反応時間中に製造される生成物の反応体積（通常はリットルで示される）あたりの量を記述する値である。生成物形成速度は、酵素が安定である温度範囲内では、温度の関数である。そのため、空時収量の改良を可能にするには、十分な熱安定性を持つ酵素が必要である。酵素の熱安定性は、通常、長期間にわたるプロセス安定性と相関する。プロセス安定酵素は、穏当な温度での、ただし反応開始時に添加される初期酵素活性の単位あたり、より長いプロセス時間にわたる、反応を可能にする。一方、不安定酵素を使って高温での空時収量の増加またはプロセス時間の延長を実現することも、酵素活性の投入量を増加させれば、確かに可能である。しかしこれは、酵素単位あたりの空時収量を著しく減少させ、プロセスに占める酵素のコスト配分を増加させる。酵素の熱安定性は逆にコスト配分を低下させる。
【００１６】
工業的プロセスにおける使用に向けて酵素の性能とそれらの適性とを改良するためのさらなるアプローチは、酵素工学である。この技法では、改良された特性を持つ、出発酵素のバリアントが開発される（概観するには、例えばS.Lutz,U.T.Bornscheuer,Protein Engineering Handbook,Wiley VCH,Weinheim,2009（非特許文献7）を参照されたい）。なかんずくホスホリラーゼが酵素工学によって改良された。例えばUS 2013-0029384（特許文献4）は、熱安定性が改良された、グリコシルヒドロラーゼファミリー13に属するスクロースホスホリラーゼのバリアントを開示している。EC番号EC2.4.1.231のトレハロースホスホリラーゼのバリアントは、今までのところ、該トレハロースホスホリラーゼの反応機序を解明するためのバリアントに限られている。そのようなバリアントに基づいて、Goedlら（Biochem J 397;491-500;2006）（非特許文献8）は、スエヒロタケ由来のトレハロースホスホリラーゼのアミノ酸位置D379、H403、R507およびK512における置換が活性の低減につながることを発見した。次に挙げる単一変異D379N、H403A、R507AおよびK512Aのうちの1つを有するバリアントは、トレハロース加リン酸分解について低減した活性を示した。Goedlら（FEBS J 275;903-913,2008）（非特許文献9）は、さらに具体的に、スエヒロタケ由来のトレハロースホスホリラーゼの変異R507AおよびK512Aが、野生型のトレハロースホスホリラーゼの触媒効率（kcat/KM）に強い影響を持つことを見いだした。
【００１７】
当技術分野において利用することができる野生型トレハロースホスホリラーゼはトレハロースを生産するための酵素プロセスにとってあらゆる点で満足できるものではなく、当技術分野において記載されたトレハロースホスホリラーゼの工業的利用可能性を効率よく改良しようとする試みも成功していないので、野生型トレハロースホスホリラーゼと比べて有利な、特に高温でのプロセス安定性に関して有利な、新しいトレハロースホスホリラーゼを使用することによる、トレハロースの改良された工業的生産方法が必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】
【００１８】
【特許文献１】US5,565,341
【特許文献２】US5,643,775
【特許文献３】WO1998/044116
【特許文献４】US 2013-0029384
【非特許文献】
【００１９】
【非特許文献１】Schwarz et al.,J Biotechnol 129,140-150（2007）
【非特許文献２】Han et al.,Protein Expression and Purification 30,194-202（2003）
【非特許文献３】Klimacek et al.,Biotechnology Techniques 13:243-248,1999
【非特許文献４】Eis et al.,Biochem J 341,385-393（1999）
【非特許文献５】Saito et al.,Appl Microbiol Biotechnol 50:193-198（1998）
【非特許文献６】Saito et al.Appl Microbiol Biotechnol 64:4340-4345（1998）
【非特許文献７】S.Lutz,U.T.Bornscheuer,Protein Engineering Handbook,Wiley VCH,Weinheim,2009
【非特許文献８】Goedl et al.,Biochem J 397;491-500;2006
【非特許文献９】Goedl et al.,FEBS J 275;903-913,2008
【発明の概要】
【００２０】
したがって、本発明の基礎にある課題は、トレハロースを工業的に生産するための改良された製造プロセスの提供である。
【００２１】
この課題は、当技術分野において公知の酵素候補配列に由来する、特に2つの異なる生物の配列に由来する、プロセス効率に対する影響が最も大きい改良型トレハロースホスホリラーゼ配列バリアントを使用する、二酵素プロセスの形態にある、好ましくは三酵素プロセスの形態にある、本発明の方法によって解決される。本発明では、スクロースホスホリラーゼ候補およびグルコースイソメラーゼ候補ならびにそれらの配列バリアントも使用され、それによって、有効性の向上したトレハロース生産プロセスが可能になる。
【図面の簡単な説明】
【００２２】
【図１】安定剤として加えた1Mスクロースの存在下および非存在下で、SEQ ID NO:1の野生型トレハロースホスホリラーゼについて、残存活性（％）を温度の関数として示す図である。
【図２】SEQ ID NO:1の野生型トレハロースホスホリラーゼおよび本発明のさまざまなトレハロースホスホリラーゼについて、残存活性（％）を時間の関数として示す図である。
【発明を実施するための形態】
【００２３】
発明の詳細な説明
第1の局面において、本発明は、
a）スクロースおよびデンプンからなる群より選択される糖類原材料ならびにリン酸およびその無機塩からなる群より選択される少なくとも1つのリン供給源からのアルファ-D-グルコース1-リン酸中間体の生成を触媒する能力を有する、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、
b）アルファ-D-グルコース1-リン酸中間体およびグルコース基質からのトレハロースの生成を触媒する能力を有し、少なくとも1つのアミノ酸位置において野生型トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を持つトレハロースホスホリラーゼバリアントである、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、
c）アルファ-ホスホリラーゼの触媒作用によってアルファ-D-グルコース1-リン酸中間体とフルクトース副産物およびデンプン副産物の群から選択される副産物とを生成する、スクロースおよびデンプンからなる群より選択される少なくとも1つの糖類原材料、ならびに
d）リン酸およびその無機塩からなる群より選択される少なくとも1つのリン供給源
を任意の順序で混合し反応させる工程を含む、トレハロースの生産方法に関する。
【００２４】
好ましい一態様において、本方法は、グルコース基質を、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、スクロースおよびデンプンからなる群より選択される少なくとも1つの糖類原材料、ならびに少なくとも1つのリン供給源と任意の順序で混合し反応させる工程を、さらに含む。
【００２５】
別の好ましい態様において、本方法は、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼを、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、スクロースおよびデンプンからなる群より選択される少なくとも1つの糖類原材料、ならびに少なくとも1つのリン供給源と任意の順序で混合し反応させる工程を、さらに含む。
【００２６】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係するすべての態様の好ましい一態様でもある）において、本方法は、グルコース基質が少なくとも1つのグルコースイソメラーゼの触媒作用によってフルクトース副産物から生成すること、および/またはグルコース基質が別個の工程において、任意の順序で、外部からの反応物として補足されることを特徴とする。
【００２７】
本発明との関連において、特に、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼは、糖類原材料としてのスクロースをアルファ-D-グルコース1-リン酸中間体およびフルクトース副産物に変換すると理解される。少なくとも1つのグルコースイソメラーゼが存在すれば、フルクトース副産物はグルコースへとさらに変換されうるので、それを、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼによる変換のためのグルコース基質として使用することができる。加えて、そして少なくとも部分的には、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼの存在下で、本発明の方法による反応に、グルコース基質を別途、補足してもよい。グルコースイソメラーゼが存在しない場合、本方法では、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼによる変換のために、グルコース基質を別途、補足する必要がある。
【００２８】
さらに別の好ましい態様において、本方法は、
a）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼおよび少なくとも1つのリン供給源で加リン酸分解的に切断することによる、アルファ-D-グルコース1-リン酸中間体および副産物への少なくとも1つの糖類原材料の変換、
b）少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼによる、トレハロースへのアルファ-D-グルコース1-リン酸中間体およびグルコース基質の変換、
c）少なくとも1つのグルコースイソメラーゼによる、グルコース基質へのフルクトース副産物の変換
からなる群より選択される変換のうちの2つ以上が存在することを特徴とする。
【００２９】
本発明との関連において、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼは、リン酸をグルコシルアクセプターとして使用することによってスクロースまたはデンプンをアルファ-D-グルコース1-リン酸（aG1P）へと加リン酸分解的に切断する反応を触媒する酵素である。少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼは、好ましくは、スクロースホスホリラーゼまたはグルカンホスホリラーゼ（例えばEC 2.4.1.1によって規定されるグルカンホスホリラーゼ）である。最も好ましくは、アルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、ここで、スクロースホスホリラーゼ（「SP」または「SP酵素」ともいう）は、好ましくは、酵素分類EC 2.4.1.7によって規定され、一方、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、好ましくは、酵素分類EC 2.4.1.231によって規定されるトレハロースホスホリラーゼ（「TP」または「TP酵素」ともいう）である。本発明の少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ（「GI」または「GI酵素」ともいう）は、好ましくは、酵素分類EC 5.3.1.5によって規定されるキシロースイソメラーゼである。
【００３０】
別の好ましい態様において、本発明の方法は、
a）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、少なくとも1つの糖類原材料、グルコース基質、および少なくとも1つのリン供給源の反応および混合を伴う、二酵素プロセス、ならびに/または
b）好ましくはスクロースホスホリラーゼである少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、好ましくはスクロースである少なくとも1つの糖類原材料、および少なくとも1つのリン供給源の反応および混合を伴う、三酵素プロセス、ならびに/または
c）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、少なくとも1つの糖類原材料、グルコース基質および少なくとも1つのリン供給源の反応および混合を伴う、三酵素プロセス
として特徴づけられる。
【００３１】
本発明との関連において、トレハロースの生産方法は、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼおよび少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼの存在下で、二酵素プロセスとして実施されうると理解すべきである。糖類原材料としてのスクロースおよび/またはデンプンの使用とは無関係に、反応にはグルコース基質を補足する必要があり、トレハロースと等モル量のデンプン副産物および/またはフルクトース副産物が生成することになる。
【００３２】
さらに別の好ましい態様において、本発明の方法は、
a）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼおよび少なくとも1つのリン供給源で加リン酸分解的に切断することによる、アルファ-D-グルコース1-リン酸中間体および副産物への少なくとも1つの糖類原材料の変換、
b）少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼによる、トレハロースへのアルファ-D-グルコース1-リン酸中間体およびグルコース基質の変換、
c）少なくとも1つのグルコースイソメラーゼによる、グルコース基質へのフルクトース副産物の変換
からなる群より選択される変換のうちの2つ以上の存在を特徴とし、ここで、工程b）のグルコース基質は、この変換に補足されるか、または工程c）において得られる。
【００３３】
本発明との関連において、トレハロースの生産方法は、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼの存在下で、三酵素プロセスとして実施することができるとも理解される。少なくとも1つの糖類原材料としてスクロースを使用する場合、グルコース基質を反応に加える必要はなく、グルコースはグルコースイソメラーゼの触媒作用によるフルクトースの変換によってインサイチューで生成し、それによってフルクトース副産物の収量を低減させることになる。それとは無関係に、任意でグルコース基質を補足してもよい。少なくとも1つの糖類原材料としてデンプンを使用する三酵素プロセスでは、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼがデンプン副産物をインサイチューでグルコースに変換することはできず、グルコース基質を補足する必要がある。
【００３４】
好ましくは、変換のうちの少なくとも1つまたは複数は、別々の容器において行われる。本発明との関連において、「別々の容器において実施される」という特徴は、1つまたは複数の個々の変換工程が、互いに独立して実行されることを意味する。具体的には、異なる容器において実施される1つまたは複数の個々の変換工程は、逐次的に実行される。
【００３５】
本発明との関連において、異なる別々の容器において実施される二酵素プロセス、好ましくは異なる別々の容器において逐次的に実施される二酵素プロセスの場合、具体的には、第1の個別変換工程では、アルファ-ホスホリラーゼによるアルファ-グルコース1-リン酸の生産を実行することができ、一方、第2工程では、アルファ-グルコース1-リン酸をトレハロースホスホリラーゼによってグルコースと反応させることが、さらに理解される。異なる容器において実施される三酵素プロセス、好ましくは異なる容器において逐次的に実施される三酵素プロセスの場合、具体的には、第1容器におけるアルファ-ホスホリラーゼの第1変換、第2容器におけるグルコースイソメラーゼの第2変換、および第3容器におけるトレハロースホスホリラーゼの第3変換は、それぞれ個別に実施するか、または第1の代替的選択肢として、アルファ-ホスホリラーゼの第1変換とグルコースイソメラーゼの第2変換とを第1容器において組み合わせた後、第2容器においてトレハロースホスホリラーゼの第3変換を行うか、または第2の代替的選択肢として、第1容器においてアルファ-ホスホリラーゼの第1変換を実施した後、第2容器においてグルコースイソメラーゼおよびトレハロースホスホリラーゼの第2および第3変換を行うことができる。
【００３６】
より好ましくは、別々の各容器からの反応生成物を、さらに別の容器において後続の変換を実施する前に、反応ブロスから精製することができる。具体的には、別の容器において後続の変換を実施する前に、個々の反応生成物を互いに分離すること、例えば所望の生成物を不要な副生成物から分離することができる。特定の反応ブロスから1つまたは複数の個別反応生成物を精製するための、および/または反応生成物を互いに分離するための、適切な手段および方法は、当業者には公知である。
【００３７】
変換のうちの少なくとも1つまたは複数を同じ容器において実施することも、同等に好ましい。本発明との関連において、「同じ容器において実施される」という特徴は、個々の反応工程が1つの反応環境において実行されることで、生産フローならびに/または個別変換および対応する反応中間体もしくは反応生成物の形成の速度論を、個々の成分または投入材料の添加および/または差引きおよび/または不活化（例えば化学的もしくは熱的不活化によるもの）によって左右し、かつ/またはそれらを一方向または反対方向にシフトさせることが可能になることを意味する。具体的には、糖類原材料、リン供給源、グルコース基質および酵素のいずれかを、ここでは、任意の順序で加えることができる。グルコース基質は、インサイチューで形成させることができ（例えばフルクトース副産物とグルコースイソメラーゼとの反応による）、かつ/または反応混合物に加えることができる。
【００３８】
第1局面の好ましい一態様（これは第1局面に関係するすべての態様の好ましい一態様でもある）において、本方法は、
a）二酵素プロセスの場合に、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、少なくとも1つの糖類原材料、グルコース基質、および少なくとも1つのリン供給源が、同時に、または任意の順序で逐次的に混合されること、ならびに/または
b）三酵素プロセスの場合に、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、少なくとも1つの糖類原材料、および少なくとも1つのリン供給源が、同時に、または任意の順序で逐次的に混合されること、ならびに/または
c）三酵素プロセスの場合に、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、少なくとも1つの糖類原材料、グルコース基質、および少なくとも1つのリン供給源が、同時に、または任意の順序で逐次的に混合されること
を特徴とする。
【００３９】
本発明との関連において、「任意の順序で」という用語は、例えば糖類原材料、リン供給源、随意のグルコース基質、および/または酵素のいずれかを混合しかつ/または反応させることなどによって、複数の工程を逐次的に実施するか、または同時に実施することを包含する。具体的には、一定の基質および/または一定の酵素を事前に混合し、次に他の基質および/または酵素の添加によって変換を開始させることは、工業的規模での生産において役立ちうる。また、一定の基質を与えることによって酵素の活性を調整することも役立ちうる。例えば、糖類原材料、リン供給源、随意のグルコース基質および少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼを除く酵素のいずれかをすべて事前に混合し、次に、第1の個別変換工程を触媒する少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼの添加によって、反応を開始させることができる。本発明において、「任意の順序で」という用語は、反応全体の時間経過中に、糖類原材料、リン供給源、随意のグルコース基質、酵素のいずれか、または前記のいずれかの任意の組合せを、混合物に逐次的に加えるか、反応中の複数の時点で補足することも包含する。
【００４０】
本発明との関連において、「混合する」という用語は、反応物を、すなわち糖類原材料、リン供給源、随意のグルコース基質、および/または酵素のいずれかを、接触させる行為をいう。「混合する」行為としては、例えば（i）反応物を反応容器に注ぎ込むこと、（ii）1つまたは複数の一定の反応物を、隔離されたコンパートメントから、他の反応物が入っている反応容器中に放出させること（例えば細胞溶解またはホモジナイゼーションによる、無傷の細胞から他の反応物が入っている培地への酵素の放出）、または（iii）酵素を含まない反応物溶液を、固定床反応器に固定化された酵素上に通すことを挙げることができ、ここで、これらの手法（i）〜（iii）のそれぞれは、撹拌または振とうのような物理的擾乱をさらに含んでもよい。
【００４１】
本発明の方法における使用に適したリン酸の無機塩としては、リン酸カリウムおよびリン酸ナトリウムが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００４２】
一態様において、リン供給源は、糖類原材料1kgにつき0.1mmol〜10molの量、例えば1mmol〜1mol、または例えば10mmol〜400mmolの量で存在する。
【００４３】
本発明の方法における使用に適したデンプンとしては、可溶性デンプン、デンプン、グリコーゲン、デキストリンおよびグルカンが挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【００４４】
好ましくは、本方法は、少なくとも20℃から80℃まで、好ましくは少なくとも30℃から80℃まで、好ましくは少なくとも39℃から80℃まで、より好ましくは少なくとも40℃から80℃まで、より好ましくは少なくとも39℃から60℃まで、さらに好ましくは少なくとも40℃から60℃まで、最も好ましくは少なくとも45℃から60℃までの温度で実行される。
【００４５】
さらに好ましくは、本方法は、少なくとも20℃から80℃まで、21℃から80℃まで、22℃から80℃まで、23℃から80℃まで、24℃から80℃まで、25℃から80℃まで、26℃から80℃まで、27℃から80℃まで、28℃から80℃まで、29℃から80℃まで、好ましくは少なくとも30℃から80℃まで、31℃から80℃まで、32℃から80℃まで、33℃から80℃まで、34℃から80℃まで、35℃から80℃まで、36℃から80℃まで、37℃から80℃まで、38℃から80℃まで、39℃から80℃まで、より好ましくは少なくとも40℃から80℃まで、41℃から80℃まで、42℃から80℃まで、43℃から80℃まで、44℃から80℃まで、45℃から80℃まで、46℃から80℃まで、47℃から80℃まで、48℃から80℃まで、49℃から80℃まで、さらに好ましくは少なくとも39℃から60℃まで、40℃から60℃まで、41℃から60℃まで、42℃から60℃まで、43℃から60℃まで、44℃から60℃まで、45℃から60℃まで、46℃から60℃まで、47℃から60℃まで、48℃から60℃まで、49℃から60℃まで、最も好ましくは少なくとも45℃から60℃までの温度で実行される。
【００４６】
本発明においては、本方法の過程で実施される各個別変換について、ある特別な温度が最適でありうると理解される。本発明のさらに好ましい一態様では、本発明の1つまたは複数の変換が、少なくとも20℃から80℃まで、21℃から80℃まで、22℃から80℃まで、23℃から80℃まで、24℃から80℃まで、25℃から80℃まで、26℃から80℃まで、27℃から80℃まで、28℃から80℃まで、29℃から80℃まで、好ましくは少なくとも30℃から80℃まで、31℃から80℃まで、32℃から80℃まで、33℃から80℃まで、34℃から80℃まで、35℃から80℃まで、36℃から80℃まで、37℃から80℃まで、38℃から80℃まで、39℃から80℃まで、より好ましくは少なくとも40℃から80℃まで、41℃から80℃まで、42℃から80℃まで、43℃から80℃まで、44℃から80℃まで、45℃から80℃まで、46℃から80℃まで、47℃から80℃まで、48℃から80℃まで、49℃から80℃まで、さらに好ましくは少なくとも39℃から60℃まで、40℃から60℃まで、41℃から60℃まで、42℃から60℃まで、43℃から60℃まで、44℃から60℃まで、45℃から60℃まで、46℃から60℃まで、47℃から60℃まで、48℃から60℃まで、49℃から60℃まで、最も好ましくは少なくとも45℃から60℃までの温度で、個別に実行される。最も好ましくは、少なくとも、トレハロースホスホリラーゼによるアルファ-D-グルコース1-リン酸中間体およびグルコース基質の変換を含んでいる本方法における任意の工程が、少なくとも20℃から80℃まで、21℃から80℃まで、22℃から80℃まで、23℃から80℃まで、24℃から80℃まで、25℃から80℃まで、26℃から80℃まで、27℃から80℃まで、28℃から80℃まで、29℃から80℃まで、好ましくは少なくとも30℃から80℃まで、31℃から80℃まで、32℃から80℃まで、33℃から80℃まで、34℃から80℃まで、35℃から80℃まで、36℃から80℃まで、37℃から80℃まで、38℃から80℃まで、39℃から80℃まで、より好ましくは少なくとも40℃から80℃まで、41℃から80℃まで、42℃から80℃まで、43℃から80℃まで、44℃から80℃まで、45℃から80℃まで、46℃から80℃まで、47℃から80℃まで、48℃から80℃まで、49℃から80℃まで、さらに好ましくは少なくとも39℃から60℃まで、40℃から60℃まで、41℃から60℃まで、42℃から60℃まで、43℃から60℃まで、44℃から60℃まで、45℃から60℃まで、46℃から60℃まで、47℃から60℃まで、48℃から60℃まで、49℃から60℃まで、最も好ましくは少なくとも45℃から60℃までの温度で実行される。
【００４７】
一態様では、少なくとも1つの糖類原材料をスクロースまたはデンプンの形態で混合し反応させ、好ましくはスクロースまたはデンプンを1mMから2000mMまで、例えば100mMから2000mMまで、または500mM〜2000mM、または1000mM〜2000mMの濃度範囲で反応に加える。
【００４８】
好ましくは、少なくとも1つの糖類原材料をスクロースの形態で混合し反応させ、好ましくはスクロースを100mMから2000mMまで、好ましくは500mM〜2000mM、より好ましくは1000mM〜2000mMの濃度範囲で反応に加える。
【００４９】
さらに好ましくは、少なくとも1つの糖類原材料をスクロースの形態で混合し反応させ、好ましくはスクロースを、100mMから2000mMまで、200mMから2000mMまで、300mMから2000mMまで、400mMから2000mMまで、500mMから2000mMまで、600mMから2000mMまで、700mMから2000mMまで、800mMから2000mMまで、900mMから2000mMまで、1000mMから2000mMまで、1100mMから2000mMまで、1200mMから2000mMまで、1300mMから2000mMまで、1400mMから2000mMまで、1500mMから2000mMまで、1600mMから2000mMまで、1700mMから2000mMまで、1800mMから2000mMまで、1900mMから2000mMまで、好ましくは500mMから2000mMまで、600mMから2000mMまで、700mMから2000mMまで、800mMから2000mMまで、900mMから2000mMまで、1000mMから2000mMまで、1100mMから2000mMまで、1200mMから2000mMまで、1300mMから2000mMまで、1400mMから2000mMまで、1500mMから2000mMまで、1600mMから2000mMまで、1700mMから2000mMまで、1800mMから2000mMまで、1900mMから2000mMまで、より好ましくは1000mMから2000mMまで、1100mMから2000mMまで、1200mMから2000mMまで、1300mMから2000mMまで、1400mMから2000mMまで、1500mMから2000mMまで、1600mMから2000mMまで、1700mMから2000mMまで、1800mMから2000mMまで、1900mMから2000mMまでの濃度範囲で反応に加える。
【００５０】
好ましい一態様において、本発明の方法は、少なくとも1つの糖類原材料、少なくとも1つのリン供給源、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスとして実行され、ここに本方法は、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）の使用を特徴とし、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、糖類原材料スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性を、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.1g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.2g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.4g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.5g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、好ましくはTP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、さらに好ましくはTP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり90g/���L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）までにすることができる。
【００５１】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも1つの糖類原材料、少なくとも1つのリン供給源、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスとして実行され、糖類原材料スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性は、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.1g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.2g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.4g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.5g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、好ましくはTP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、さらに好ましくはTP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少���くとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）までである。
【００５２】
別の好ましい態様において、本発明の方法は、グルコースイソメラーゼを加えることなく、少なくとも1つの糖類原材料、少なくとも1つのリン供給源、少なくとも1つのグルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスとして実行され、本方法は、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼの使用を特徴とし、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性を、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも3.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.25g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.5g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.75g/（L*h）〜TP1kUあたり15g/（L*h）にすることができる。好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、糖類原材料はスクロースである。
【００５３】
好ましくは、本発明の方法は、グルコースイソメラーゼを加えることなく、少なくとも1つの糖類原材料、少なくとも1つのリン供給源、少なくとも1つのグルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスとして実行され、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性は、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも3.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも4.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.25g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.5g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.75g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）までである。好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、糖類原材料はスクロースである。
【００５４】
好ましくは、前記TP酵素1kUあたりの生産性を与える少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、本明細書に記載する局面および/または態様のいずれか1つによるトレハロースホスホリラーゼバリアントである。
【００５５】
本発明との関連において、「TP酵素1kUあたりの生産性」という用語は、反応時間中に反応に供されたトレハロースホスホリラーゼ酵素活性1kU（キロ単位、1,000単位）あたりに生産される空時収量（すなわち反応体積あたり時間あたりに得られるトレハロース生成物の量）を意味すると理解すべきである。トレハロースホスホリラーゼ活性は、当技術分野において公知の標準的酵素アッセイによって、例えば本発明の実施例項に概説するTPアッセイIを使用するなどして決定される。本発明の方法によるトレハロースホスホリラーゼ1kUあたりの生産性は、トレハロース生成物が酵素的変換によってもはや形成されなくなる反応の完了時まで、酵素的変換中の任意の時点で決定されるかまたは決定されうる。
【００５６】
好ましくは、TP酵素1kUあたりの生産性は、少なくとも20℃から80℃まで、好ましくは少なくとも30℃から80℃まで、より好ましくは少なくとも39℃から80℃まで、より好ましくは少なくとも40℃から80℃まで、より好ましくは少なくとも39℃から60℃まで、さらに好ましくは少なくとも40℃から60℃まで、最も好ましくは少なくとも45℃から60℃までの反応温度で本方法を実行することによって得られる。
【００５７】
さらに好ましくは、TP酵素1kUあたりの生産性は、少なくとも20℃から80℃まで、21℃から80℃まで、22℃から80℃まで、23℃から80℃まで、24℃から80℃まで、25℃から80℃まで、26℃から80℃まで、27℃から80℃まで、28℃から80℃まで、29℃から80℃まで、好ましくは少なくとも30℃から80℃まで、31℃から80℃まで、32℃から80℃まで、33℃から80℃まで、34℃から80℃まで、35℃から80℃まで、36℃から80℃まで、37℃から80℃まで、38℃から80℃まで、39℃から80℃まで、より好ましくは少なくとも40℃から80℃まで、41℃から80℃まで、42℃から80℃まで、43℃から80℃まで、44℃から80℃まで、45℃から80℃まで、46℃から80℃まで、47℃から80℃まで、48℃から80℃まで、49℃から80℃まで、さらに好ましくは少なくとも39℃から60℃まで、40℃から60℃まで、41℃から60℃まで、42℃から60℃まで、43℃から60℃まで、44℃から60℃まで、45℃から60℃まで、46℃から60℃まで、47℃から60℃まで、48℃から60℃まで、49℃から60℃まで、最も好ましくは少なくとも45℃から60℃までの反応温度で本方法を実行することによって得られる。
【００５８】
好ましい一態様において、本発明の方法は、少なくとも1つの糖類原材料、少なくとも1つのリン供給源、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスにおいて、少なくとも30℃〜70℃、好ましくは39℃〜60℃、より好ましくは40℃〜60℃の反応温度で実行され、本方法は少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼの使用を特徴とし、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、糖類原材料スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性を、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.1g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.2g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.4g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.5g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、好ましくはTP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、さらに好ましくはTP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあた��10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）までにすることができる。
【００５９】
好ましくは、本発明の方法は、少なくとも1つの糖類原材料、少なくとも1つのリン供給源、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスにおいて、少なくとも30℃〜70℃、好ましくは39℃〜60℃、より好ましくは40℃〜60℃の温度で実行され、糖類原材料スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性は、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.1g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.2g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.4g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.5g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、好ましくはTP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、さらに好ましくはTP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h���まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも18g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）までである。
【００６０】
同等に好ましい一態様において、本発明の方法は、グルコースイソメラーゼを加えることなく、少なくとも1つの糖類原材料、少なくとも1つのリン供給源、少なくとも1つのグルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスにおいて、少なくとも30℃〜70℃、好ましくは39℃〜60℃、より好ましくは40℃〜60℃の温度で実行され、本方法は少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼの使用を特徴とし、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性を、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも3.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも4.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kU��たり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.25g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.5g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.75g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）までにすることができる。好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、好ましくは糖類原材料はスクロースである。
【００６１】
好ましくは、本発明の方法は、グルコースイソメラーゼを加えることなく、少なくとも1つの糖類原材料、少なくとも1つのリン供給源、少なくとも1つのグルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスにおいて、少なくとも30℃〜70℃、好ましくは39℃〜60℃、より好ましくは40℃〜60℃の温度で実行され、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性は、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも3.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも4.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.25g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.5g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.75g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）までである。好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、好ましくは糖類原材料はスクロースである。
【００６２】
好ましくは、一定の温度において前記TP酵素1kUあたりの生産性を与える少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、本明細書に記載する局面および/または態様のいずれか1つによるトレハロースホスホリラーゼバリアントである。
【００６３】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、担子菌門（Basidomycota）に属する生物、好ましくはハラタケ綱（Agaricomycetes）に属する生物、より好ましくはスエヒロタケ属（Schizophyllum）、ヒラタケ属（Pleurotus）、マイタケ属（Grifola）、ハラタケ属（Agaricus）、ホウロクタケ属（Trametes）、カワラタケ属（Coriolus）、ホウロクタケ属（Trametes）、シハイタケ属（Trichaptum）およびカイガラタケ属（Lenzites）からなる群の属に属する生物に由来し、さらに好ましくはスエヒロタケ属およびマイタケ属に由来し、最も好ましくは生物スエヒロタケまたはマイタケに由来する。
【００６４】
第1局面の好ましい一態様（これは第1局面に関係するすべての態様の好ましい一態様でもある）において、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、以下に定義する特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とする。
【００６５】
（A）酵素を52℃で15分間、好ましくは1Mスクロースの存在下でインキュベートした後の、30％〜100％の残存酵素活性を特徴とする、熱安定性。
【００６６】
これに関連して、特徴（A）は、好ましくは、52℃で15分間、好ましくは1Mスクロースの存在下でインキュベートした後の熱安定性であり、30％〜90％、好ましくは38％〜90％、好ましくは39％〜90％、より好ましくは42％〜90％、より好ましくは54％〜90％、より好ましくは55％〜90％、さらに好ましくは63％〜90％、さらに好ましくは64％〜90％、さらに好ましくは65％〜90％、さらに好ましくは68％〜90％、最も好ましくは64％〜86％；および/または
30％〜90％、好ましくは31％〜90％、好ましくは32％〜90％、好ましくは33％〜90％、好ましくは34％〜90％、好ましくは35％〜90％、好ましくは36％〜90％、好ましくは37％〜90％、好ましくは38％〜90％、好ましくは39％〜90％、より好ましくは40％〜90％、より好ましくは41％〜90％、より好ましくは42％〜90％、より好ましくは43％〜90％、より好ましくは44％〜90％、より好ましくは45％〜90％、より好ましくは46％〜90％、より好ましくは47％〜90％、より好ましくは48％〜90％、より好ましくは49％〜90％、さらに好ましくは50％〜90％、さらに好ましくは51％〜90％、さらに好ましくは52％〜90％、さらに好ましくは53％〜90％、さらに好ましくは54％〜90％、さらに好ましくは55％〜90％、さらに好ましくは60％〜90％、さらに好ましくは61％〜90％、さらに好ましくは65％〜90％、さらに好ましくは70％〜90％、さらに好ましくは75％〜90％、最も好ましくは72％〜81％、および/または
38％〜100％、好ましくは55％〜100％、好ましくは60％〜100％、好ましくは70％〜100％、好ましくは75％〜100％、好ましくは76％〜100％、好ましくは77％〜100％、好ましくは78％〜100％、好ましくは79％〜100％、より好ましくは80％〜100％、より好ましくは81％〜100％、より好ましくは82％〜100％、より好ましくは83％〜100％、より好ましくは84％〜100％、より好ましくは85％〜100％、より好ましくは86％〜100％、より好ましくは87％〜100％、より好ましくは88％〜100％、より好ましくは89％〜100％、さらに好ましくは90％〜100％、さらに好ましくは91％〜100％、さらに好ましくは92％〜100％、さらに好ましくは93％〜100％、さらに好ましくは94％〜100％、さらに好ましくは95％〜100％、さらに好ましくは96％〜100％、さらに好ましくは97％〜100％、さらに好ましくは98％〜100％、さらに好ましくは99％〜100％、最も好ましくは100％の残存酵素活性によって定義される。
【００６７】
（B）52℃で15分間、好ましくは1Mスクロースの存在下で、酵素をインキュベートした後の、少なくとも52℃のTm50値を特徴とする、熱安定性。
【００６８】
（C）52℃〜90℃で15分間、好ましくは1Mスクロースの存在下で酵素をインキュベートした後の、52℃〜90℃のTm50値を特徴とする、熱安定性。
【００６９】
これに関連して、特徴（C）は、好ましくは、52℃〜90℃、好ましくは52℃〜80℃、好ましくは52.5℃〜80℃、好ましくは53℃〜80℃、好ましくは53.5℃〜80℃、より好ましくは54℃〜80℃、好ましくは54.5℃〜80℃、さらに好ましくは55℃〜80℃、好ましくは55.5℃〜80℃、好ましくは56℃〜80℃、好ましくは56.5℃〜80℃、好ましくは57℃〜80℃、好ましくは57.5℃〜80℃、さらに好ましくは52℃〜70℃、さらに好ましくは52.5℃〜70℃、さらに好ましくは53℃〜70℃、さらに好ましくは53.5℃〜70℃、さらに好ましくは54℃〜70℃、さらに好ましくは54.5℃〜70℃、さらに好ましくは55℃〜70℃、さらに好ましくは55.5℃〜70℃、さらに好ましくは56℃〜70℃、さらに好ましくは56.5℃〜70℃、さらに好ましくは57℃〜70℃、さらに好ましくは57.5℃〜70℃、さらに好ましくは52℃〜65℃、さらに好ましくは52.5℃〜65℃、さらに好ましくは53℃〜65℃、さらに好ましくは53.5℃〜65℃、さらに好ましくは54℃〜65℃、さらに好ましくは54.5℃〜65℃、さらに好ましくは55℃〜65℃、さらに好ましくは55.5℃〜65℃、さらに好ましくは56℃〜65℃、さらに好ましくは56.5℃〜65℃、さらに好ましくは57℃〜65℃、さらに好ましくは57.5℃〜65℃、さらに好ましくは52℃〜60℃、さらに好ましくは52.5℃〜60℃、さらに好ましくは53℃〜60℃、さらに好ましくは53.5℃〜60℃、さらに好ましくは54℃〜60℃、さらに好ましくは54.5℃〜60℃、さらに好ましくは55℃〜60℃、さらに好ましくは55.5℃〜60℃、さらに好ましくは56℃〜60℃、さらに好ましくは56.5℃〜60℃、さらに好ましくは57℃〜60℃、さらに好ましくは57.5℃〜60℃、最も好ましくは52℃〜57.5℃のTm50値を特徴とする、52℃で15分間、好ましくは1Mスクロースの存在下でインキュベートした後の熱安定性である。
【００７０】
（D）好ましくは1Mスクロースの存在下で、3時間〜9日またはそれ以上の半減期、好ましくは24時間〜9日またはそれ以上の半減期、より好ましくは4日〜9日またはそれ以上の半減期を特徴とするプロセス安定性という形での熱安定性。
【００７１】
好ましくは、特徴（D）は、
3時間〜9日またはそれ以上、好ましくは24時間〜9日またはそれ以上、好ましくは39時間〜9日またはそれ以上、好ましくは2日〜9日またはそれ以上、より好ましくは4日〜9日またはそれ以上、より好ましくは5.5日〜9日またはそれ以上、より好ましくは少なくとも7日〜9日またはそれ以上、さらに好ましくは少なくとも9日またはそれ以上、最も好ましくは9日の、45℃における半減期を特徴とするプロセス安定性、および/あるいは
24時間〜9日またはそれ以上、より好ましくは39時間〜9日またはそれ以上、より好ましくは2日〜9日またはそれ以上、より好ましくは4日〜9日またはそれ以上、より好ましくは5.5日〜9日またはそれ以上、より好ましくは7日〜9日またはそれ以上、さらに好ましくは少なくとも9日またはそれ以上、最も好ましくは9日の45℃における半減期を特徴とするプロセス安定性、および/あるいは
4日〜9日またはそれ以上、好ましくは5.5日から9日までまたはそれ以上、より好ましくは7日から9日までまたはそれ以上、さらに好ましくは少なくとも9日またはそれ以上、最も好ましくは9日の、45℃における半減期を特徴とするプロセス安定性
を特徴とする熱安定性である。
【００７２】
好ましくは、特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とする少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、本明細書に記載する局面および/または態様のいずれか1つによるトレハロースホスホリラーゼバリアントである。
【００７３】
本明細書に記載する局面および態様のいずれか1つの好ましい一態様において、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とし、少なくとも1つの糖類原材料、少なくとも1つのリン供給源、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスであって、スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性が、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.1g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.2g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.4g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも1.5g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、好ましくはTP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、さらに好ましくはTP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.6g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも1.8g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも2.0g/（L*h）からTP1kUあたり10g/（L*h）までである三酵素プロセスの実施を可能にする。
【００７４】
本発明の好ましい一態様において、特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とし、かつ少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスを、指定されたスクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性で実施することを可能にする少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、本明細書に記載する局面および/または態様のいずれか1つによるトレハロースホスホリラーゼバリアントである。
【００７５】
本明細書に記載する局面および態様のいずれか1つの同等に好ましい一態様において、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とし、グルコースイソメラーゼを加えることなく、少なくとも1つの糖類原材料、少なくとも1つのリン供給源、少なくとも1つのグルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスであって、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性が、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも3.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）、TP1kUあたり少なくとも4.1g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.2g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.3g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.4g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.6g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.7g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.9g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも5g/（L*h）からTP1kUあたり100g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり90g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり80g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり70g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h���からTP1kUあたり60g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり50g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり40g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.8g/（L*h）からTP1kUあたり30g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.25g/（L*h）からTP1kUあたり25g/（L*h）まで、TP1kUあたり少なくとも4.5g/（L*h）からTP1kUあたり20g/（L*h）まで、またはTP1kUあたり少なくとも4.75g/（L*h）からTP1kUあたり15g/（L*h）までである二酵素プロセスの実施を可能にする。好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、好ましくは糖類原材料はスクロースである。
【００７６】
本発明の好ましい一態様において、特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とし、グルコースイソメラーゼを加えることなく、グルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスを、指定された、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性で実施することを可能にする、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、本明細書に記載する局面および/または態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントである。
【００７７】
第1局面の別の好ましい態様（これは前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも20％相同および/または同一であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなるトレハロースホスホリラーゼバリアントであり、このバリアントは、
a）712A、712G、712I、712M、712Pまたは712V、好ましくは712M、および/あるいは
b）383A、383G、383I、383L、383M、383V、383N、383C、383Q、383Sまたは383T、好ましくは383A、383G、383M、383V、383N、383C、383Q、383Sまたは383T、より好ましくは383G、383V、383C、383Sまたは383T、さらに好ましくは383Vまたは383T、最も好ましくは383V、および/あるいは
c）114A、114G、114I、114M、114Pまたは114V、好ましくは114I、および/あるいは
d）118は、118A、118G、118I、118L、118M、118Pまたは118V、好ましくは118Vである、および/あるいは
e）225A、225G、225I、225L、225M、225Pまたは225V、好ましくは225I、225L、225Mまたは225V、より好ましくは225V、および/あるいは
f）304G、304I、304L、304M、304Pまたは304V、好ましくは304Iまたは304L、より好ましくは304I、および/あるいは
g）323A、323G、323I、323L、323M、323P、または323V、好ましくは323Iまたは323V、より好ましくは323I、および/あるいは
h）349Wまたは349Y、好ましくは349Y、および/あるいは
i）357A、357I、357L、357M、357Pまたは357V、好ましくは357A、および/あるいは
j）487A、487G、487I、487L、487M、487Pまたは487V、好ましくは487A、487M、487G、487Lまたは487V、より好ましくは487A、および/あるいは
k）550A、550G、550I、550L、550Mまたは550P、好ましくは550Iまたは550P、より好ましくは550I、および/あるいは
l）556N、556C、556QまたはS556T、好ましくは556T、および/あるいは
m）564Dまたは564E、好ましくは564E、および/あるいは
n）590N、590C、590Q、590S、590T、590A、590G、590I、590L、590M、590Pまたは590V、好ましくは590N、590Gまたは590A、より好ましくは590N、および/あるいは
o）649Dまたは649E、好ましくは649E
の群より選択されるアミノ酸位置のうちの2個から15個まで、3個から15個まで、4個から15個まで、5個から15個まで、6個から15個まで、7個から15個まで、8個から15個まで、9個から15個まで、10個から15個まで、11個から15個まで、12個から15個まで、13個から15個まで、14個から15個まで、または15個を含み、
ここで、アミノ酸のナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す。
【００７８】
トレハロースホスホリラーゼ酵素の任意の野生型配列の、SEQ ID NO:1における上述の位置に対応しているアミノ酸位置を同定する方法は、当業者には理解されるであろう。本発明の開示を限定するわけではないが、明確な説明のために、SEQ ID NO:1の位置114、118、225、304、323、349、383、487、550、556、564、590、649および712に対応する、さらなる野生型トレハロースホスホリラーゼ酵素の配列位置におけるナンバリングおよびアミノ酸を、表1に示す。例えば、最後の文で挙げた位置に対応するマイタケトレハロースホスホリラーゼにおける比較可能な位置は、SEQ ID NO:160の位置108、112、221、300、319、345、379、483、544、550、558、584、643、707である。
【００７９】
本発明に関して、トレハロースホスホリラーゼの触媒活性にとって不可欠な、トレハロースホスホリラーゼ酵素のアミノ酸位置における置換、特にSEQ ID NO:1のトレハロースホスホリラーゼのアミノ酸位置D379、H403、R507およびK512における置換、あるいはSEQ ID NO:81および/もしくはSEQ ID NO:160のトレハロースホスホリラーゼのアミノ酸位置D375、H399、R503およびK508または当技術分野において記載され公知である他のトレハロースホスホリラーゼ酵素の任意の類似する位置における置換はいずれも、本発明のトレハロースホスホリラーゼ酵素バリアントを作出する際の置換対象からは除外されるべきである。
【００８０】
好ましい一態様において、本明細書において規定されるトレハロースホスホリラーゼバリアントは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも77％相同および/または同一であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、このバリアントまたはポリペプチドは、アミノ酸位置383、114、225、304、323、349、357、550、556、564、および649からなる群より選択されるアミノ酸位置のうちの2つ以上にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す。
【００８１】
好ましくは、これに関連して、トレハロースホスホリラーゼバリアントは、アミノ酸位置712、118、487、および590からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す。
【００８２】
これに関連して、トレハロースホスホリラーゼバリアントは、好ましくは、SEQ ID NO:1に対するアミノ酸配列の相同性および/または同一性が、少なくとも77.1％であり、少なくとも77.2％であり、少なくとも77.3％であり、少なくとも77.4％であり、少なくとも77.5％であり、少なくとも77.6％であり、少なくとも77.7％であり、少なくとも77.8％であり、少なくとも77.9％、78.0％であり、少なくとも78.1％であり、少なくとも78.2％であり、少なくとも78.3％であり、少なくとも78.4％であり、少なくとも78.5％であり、少なくとも78.6％であり、少なくとも78.7％であり、少なくとも78.8％であり、少なくとも78.9％、79.0％であり、少なくとも79.1％であり、少なくとも79.2％であり、少なくとも79.3％であり、少なくとも79.4％であり、少なくとも79.5％であり、少なくとも79.6％であり、少なくとも79.7％であり、少なくとも79.8％であり、少なくとも79.9％であり、少なくとも80％であり、少なくとも81％であり、少なくとも82％であり、少なくとも83％であり、少なくとも84％であり、好ましくは少なくとも85％、または少なくとも86％、または少なくとも87％、または少なくとも88％、または少なくとも89％であり、より好ましくは少なくとも90％、または少なくとも91％、または少なくとも92％、または少なくとも93％、または少なくとも94％、または少なくとも95、さらに好ましくは少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％、少なくとも99.1％、または少なくとも99.2％、または少なくとも99.3％、または少なくとも99.4％、または少なくとも99.5％、または少なくとも99.6％、または少なくとも99.7％、または少なくとも99.8％、特に少なくとも99.9％、または100％であることを特徴とする。
【００８３】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、トレハロースホスホリラーゼバリアントは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも68％相同および/または同一であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、このバリアントまたはポリペプチドは、アミノ酸位置383、114、225、304、323、349、357、550、556、および564からなる群より選択されるアミノ酸位置のうちの2つ以上にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す。
【００８４】
好ましくは、これに関連して、バリアントは、アミノ酸位置712、118、487、590、および649からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す。
【００８５】
これに関連して、トレハロースホスホリラーゼバリアントは、好ましくは、SEQ ID NO:1に対するアミノ酸配列の相同性および/または同一性が、少なくとも69％であり、少なくとも70％であり、少なくとも71％であり、少なくとも72％であり、少なくとも73％であり、少なくとも74％であり、少なくとも75％であり、または少なくとも76％、または少なくとも77％、77.1％であり、少なくとも77.2％であり、少なくとも77.3％であり、少なくとも77.4％であり、少なくとも77.5％であり、少なくとも77.6％であり、少なくとも77.7％であり、少なくとも77.8％であり、少なくとも77.9％、78.0％であり、少なくとも78.1％であり、少なくとも78.2％であり、少なくとも78.3％であり、少なくとも78.4％であり、少なくとも78.5％であり、少なくとも78.6％であり、少なくとも78.7％であり、少なくとも78.8％であり、少なくとも78.9％、79.0％であり、少なくとも79.1％であり、少なくとも79.2％であり、少なくとも79.3％であり、少なくとも79.4％であり、少なくとも79.5％であり、少なくとも79.6％であり、少なくとも79.7％であり、少なくとも79.8％であり、少なくとも79.9％であり、少なくとも80％であり、少なくとも81％であり、少なくとも82％であり、少なくとも83％であり、少なくとも84％であり、好ましくは少なくとも85％、または少なくとも86％、または少なくとも87％、または少なくとも88％、または少なくとも89％であり、より好ましくは少なくとも90％、または少なくとも91％、または少なくとも92％、または少なくとも93％、または少なくとも94％、または少なくとも95、さらに好ましくは少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％、少なくとも99.1％、または少なくとも99.2％、または少なくとも99.3％、または少なくとも99.4％、または少なくとも99.5％、または少なくとも99.6％、または少なくとも99.7％、または少なくとも99.8％、特に少なくとも99.9％、または100％であることを特徴とする。
【００８６】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、バリアントは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも63％相同および/または同一であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、このバリアントまたはポリペプチドは、アミノ酸位置383、114、225、304、323、349、357、556、および564からなる群より選択されるアミノ酸位置のうちの2つ以上にアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す。
【００８７】
好ましくは、これに関連して、バリアントは、アミノ酸位置712、118、487、550、550、590、および649からなる群より選択されるアミノ酸位置に少なくとも1つのさらなるアミノ酸置換を含み、ここでアミノ酸ナンバリングはSEQ ID NO:1におけるアライメント位置を指す。
【００８８】
これに関連して、トレハロースホスホリラーゼバリアントは、好ましくは、SEQ ID NO:1に対するアミノ酸配列の相同性および/または同一性が、少なくとも64％、または少なくとも65％、または少なくとも66％、または少なくとも67％、または少なくとも68％、または少なくとも69％であり、少なくとも70％であり、少なくとも71％であり、少なくとも72％であり、少なくとも73％であり、少なくとも74％であり、少なくとも75％、または少なくとも76％、または少なくとも77％、77.1％であり、少なくとも77.2％であり、少なくとも77.3％であり、少なくとも77.4％であり、少なくとも77.5％であり、少なくとも77.6％であり、少なくとも77.7％であり、少なくとも77.8％であり、少なくとも77.9％、78.0％であり、少なくとも78.1％であり、少なくとも78.2％であり、少なくとも78.3％であり、少なくとも78.4％であり、少なくとも78.5％であり、少なくとも78.6％であり、少なくとも78.7％であり、少なくとも78.8％であり、少なくとも78.9％、79.0％であり、少なくとも79.1％であり、少なくとも79.2％であり、少なくとも79.3％であり、少なくとも79.4％であり、少なくとも79.5％であり、少なくとも79.6％であり、少なくとも79.7％であり、少なくとも79.8％であり、少なくとも79.9％であり、少なくとも80％であり、少なくとも81％であり、少なくとも82％であり、少なくとも83％であり、少なくとも84％であり、好ましくは少なくとも85％、または少なくとも86％、または少なくとも87％、または少なくとも88％、または少なくとも89％であり、より好ましくは少なくとも90％、または少なくとも91％、または少なくとも92％、または少なくとも93％、または少なくとも94％、または少なくとも95、さらに好ましくは少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％、少なくとも99.1％、または少なくとも99.2％、または少なくとも99.3％、または少なくとも99.4％、または少なくとも99.5％、または少なくとも99.6％、または少なくとも99.7％、または少なくとも99.8％、特に少なくとも99.9％、または100％であることを特徴とする。
【００８９】
好ましくは、本発明のトレハロースホスホリラーゼは、
2021503955.tif 000003
からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなる。
【００９０】
より好ましくは、本発明のトレハロースホスホリラーゼは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:185、およびSEQ ID NO:188からなる配列の群から選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなる。
【００９１】
本発明の好ましい一態様において、本明細書に記載する態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、本明細書に記載の局面および/または態様のいずれか1つに記載される特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とするトレハロースホスホリラーゼである。
【００９２】
好ましくは、本明細書に記載する局面および/または態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、以下の特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とするトレハロースホスホリラーゼバリアントである:
（A）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の30％〜100％の残存酵素活性を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（B）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の少なくとも52℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（C）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の52℃〜90℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（D）3時間〜9日またはそれ以上の半減期、好ましくは24時間〜9日またはそれ以上の半減期、より好ましくは4日〜9日またはそれ以上の半減期を特徴とするプロセス安定性という形での熱安定性。
【００９３】
好ましくは、本明細書に記載する局面および/または態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とするトレハロースホスホリラーゼバリアントであり、このバリアントはさらに
（i）本明細書に記載の局面および/または態様のいずれか1つに記載されるTP酵素1kUあたりの生産性を与え、かつ/または
（ii）グルコースイソメラーゼを加えることなく、グルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスを、本明細書に記載の局面および/または態様のいずれか1つに記載される糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性で実施することを可能にし、かつ/または
（iii）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスを、本明細書に記載の局面および/または態様のいずれか1つに記載されるスクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性で実施することを可能にする。
【００９４】
好ましくは、本明細書に記載する局面および/または態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、それが、
（i）糖類原材料スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性を、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）にすることができ、かつ/または
（ii）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスであって、スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜1kUあたり100g/（L*h）である三酵素プロセス
を可能にし、かつ/または
（iii）グルコースイソメラーゼを加えることなく、グルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスであって、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）であり、好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、糖類原材料は好ましくはスクロースである二酵素プロセス
を可能にする
ことを特徴とする。
【００９５】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、トレハロースホスホリラーゼは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一であるかかつ/または少なくとも80％相同であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、前記1つまたは複数のアミノ酸位置は、SEQ ID NO:1のアミノ酸位置712、383、10、114、118、192、197、220、225、304、306、318、323、339、349、357、459、476、481、484、487、488、506、511、526、530、532、533、537、550、556、564、590、649、667、703、および705からなる群より選択され、好ましくは前記1つまたは複数のアミノ酸位置はSEQ ID NO:1のアミノ酸位置712、383、114、118、192、197、220、225、304、306、318、323、339、349、357、459、476、481、484、487、488、506、511、526、530、532、533、537、550、556、564、590、667、703、および705から選択され、より好ましくは前記1つまたは複数のアミノ酸位置はSEQ ID NO:1のアミノ酸位置712、383、114、118、225、304、323、349、357、487、550、556、564、590、および649からなる群より選択され、最も好ましくは前記1つまたは複数のアミノ酸位置は、アミノ酸位置383、225、304、323、487、550、556、564、590、および705からなる群より選択される。
【００９６】
好ましくは、トレハロースホスホリラーゼは、SEQ ID NO:1のアミノ酸配列に対して少なくとも80％同一および/または80％相同であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、アミノ酸位置L712、P383、V10、L114、I118、S192、S197、Y220、N225、A304、D306、P318、T323、L339、F349、G357、A459、Q476、E481、A484、Q487、K488、A506、A511、R526、E530、G532、D533、D537、V550、S556、T564、D590、A649、R667、A703およびK705からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置にアミノ酸置換を含み、好ましくは前記1つまたは複数のアミノ酸位置は、アミノ酸位置L712、P383、L114、I118、S192、S197、Y220、N225、A304、D306、P318、T323、L339、F349、G357、A459、Q476、E481、A484、Q487、K488、A506、A511、R526、E530、G532、D533、D537、V550、S556、T564、D590、R667、A703およびK705からなる群より選択され、より好ましくは前記1つまたは複数のアミノ酸位置は、アミノ酸位置L712、P383、L114、I118、N225、A304、T323、F349、G357、Q487、V550、S556、T564、D590およびA649からなる群より選択され、最も好ましくは前記1つまたは複数のアミノ酸位置はアミノ酸位置P383、N225、A304、T323、Q487、V550、S556、T564、D590およびK705からなる群より選択される。
【００９７】
その好ましい一態様（これは本明細書に記載した前述の態様のすべての好ましい一態様でもある）において、トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、以下の置換からなる群より選択される1つまたは複数の置換を含む:
−  V10R、V10HまたはV10K、好ましくはV10Rである、SEQ ID NO:1の位置V10におけるアミノ酸置換、
−  L114A、L114G、L114I、L114M、L114PまたはL114V、好ましくはL114Iである、SEQ ID NO:1の位置L114におけるアミノ酸置換、
−  I118A、I118G、I118L、I118M、I118PまたはI118V、好ましくはI118Vである、SEQ ID NO:1の位置I118におけるアミノ酸置換、
−  S192A、S192G、S192I、S192L、S192M、S192PまたはS192V、好ましくはS192Vである、SEQ ID NO:1の位置S192におけるアミノ酸置換、
−  S197A、S197G、S197I、S197L、S197M、S197PまたはS197V、好ましくはS197Gである、SEQ ID NO:1の位置S197におけるアミノ酸置換、
−  Y220FまたはY220W、好ましくはY220Fである、SEQ ID NO:1の位置Y220におけるアミノ酸置換、
−  N225A、N225G、N225I、N225L、N225M、N225PまたはN225V、好ましくはN225Vである、SEQ ID NO:1の位置N225におけるアミノ酸置換、
−  A304G、A304I、A304L、A304M、A304PまたはA304V、好ましくはA304Iである、SEQ ID NO:1の位置A304におけるアミノ酸置換、
−  D306R、D306HまたはD306K、好ましくはD306Hである、SEQ ID NO:1の位置D306におけるアミノ酸置換、
−  P318R、P318HまたはP318K、好ましくはP318Hである、SEQ ID NO:1の位置P318におけるアミノ酸置換、
T323A、T323G、T323I、T323L、T323M、T323PまたはT323V、好ましくはT323Iである、SEQ ID NO:1の位置T323におけるアミノ酸置換、
−  L339A、L339G、L339I、L339L、L339M、L339PまたはL339V、好ましくはL339Iである、SEQ ID NO:1の位置L339におけるアミノ酸置換、
−  F349WまたはF349Y、好ましくはF349Yである、SEQ ID NO:1の位置F349におけるアミノ酸置換、
−  G357A、G357I、G357L、G357M、G357PまたはG357V、好ましくはG357Aである、SEQ ID NO:1の位置G357におけるアミノ酸置換、
−  P383A、P383G、P383I、P383L、P383M、P383V、P383N、P383C、P383Q、P383SまたはP383T、好ましくはP383VまたはP383S、より好ましくはP383Vである、SEQ ID NO:1の位置P383におけるアミノ酸置換、
−  A459N、A459C、A459QまたはA459S、A459T、好ましくはA459Sである、SEQ ID NO:1の位置A459におけるアミノ酸置換、
−  Q476A、Q476G、Q476I、Q476L、Q476M、Q476PまたはQ476V、好ましくはQ476Gである、SEQ ID NO:1の位置Q476におけるアミノ酸置換、
−  E481A、E481G、E481I、E481L、E481M、E481PまたはE481V、好ましくはE481Iである、SEQ ID NO:1の位置E481におけるアミノ酸置換、
−  A484N、A484C、A484Q、A484SまたはA484T、好ましくはA484Sである、SEQ ID NO:1の位置A484におけるアミノ酸置換、
−  Q487A、Q487G、Q487I,Q487L、Q487M、Q487PまたはQ487V、好ましくはQ487A、Q487G、Q487LまたはQ487V、より好ましくはQ487Aである、SEQ ID NO:1の位置Q487におけるアミノ酸置換
−  K488A、K488G、K488I、K488L、K488M、K488PまたはK488V、好ましくはK488Aである、SEQ ID NO:1の位置K488におけるアミノ酸置換、
−  A506N、A506C、A506Q、A506SまたはA506T、好ましくはA506Sである、SEQ ID NO:1の位置A506におけるアミノ酸置換、
−  A511N、A511C、A511Q、A511SまたはA511T、好ましくはA511Sである、SEQ ID NO:1の位置A511におけるアミノ酸置換、
−  R526DまたはR526E、好ましくはR526Eである、SEQ ID NO:1の位置R526におけるアミノ酸置換、
−  E530A、E530G、E530I、E530L、E530M、E530P、E530V、好ましくはE530Vである、SEQ ID NO:1の位置E530におけるアミノ酸置換、
−  G532R、G532HまたはG532K、好ましくはG532Rである、SEQ ID NO:1の位置G532におけるアミノ酸置換、
−  D533A、D533G、D533I、D533L、D533M、D533PまたはD533V、好ましくはD533Gである、SEQ ID NO:1の位置D533におけるアミノ酸置換、
−  D537A、D537G、D537I、D537L、D537M、D537PまたはD537V、好ましくはD537Mである、SEQ ID NO:1の位置D537におけるアミノ酸置換、
−  V550A、V550G、V550I、V550L、V550MまたはV550P、好ましくはV550Iである、SEQ ID NO:1の位置V550におけるアミノ酸置換、
−  S556N、S556C、S556QまたはS556T、好ましくはS556Tである、SEQ ID NO:1の位置S556におけるアミノ酸置換、
−  T564DまたはT564E、好ましくはT564Eである、SEQ ID NO:1の位置T564におけるアミノ酸置換、
−  D590N、D590C、D590Q、D590S、D590T、D590A、D590G、D590I、D590L、D590M、D590PまたはD590V、好ましくはD590NまたはD590A、より好ましくはD590Nである、SEQ ID NO:1の位置D590におけるアミノ酸置換、
−  A649DまたはA649E、好ましくはA649Eである、SEQ ID NO:1の位置A649におけるアミノ酸置換、
−  R667D、R667E、R667R、R667HまたはR667K、好ましくはR667EまたはR667K、より好ましくはR667Eである、SEQ ID NO:1の位置R667におけるアミノ酸置換、
−  A703DまたはA703E、好ましくはA703Eである、SEQ ID NO:1の位置A703におけるアミノ酸置換、
−  K705N、K705C、K705Q、K705SまたはK705T、好ましくはK705Nである、SEQ ID NO:1の位置K705におけるアミノ酸置換、および
−  L712A、L712G、L712I、L712M、L712PまたはL712V、好ましくはL712Mである、SEQ ID NO:1の位置L712におけるアミノ酸置換。
【００９８】
好ましくは、トレハロースホスホリラーゼは、
2021503955.tif 000004
からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなる。
【００９９】
好ましくは、アミノ酸配列は、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、およびSEQ ID NO:190からなる配列の群より選択される。
【０１００】
第1局面およびその好ましい態様のいずれかのこの態様との関連において、トレハロースホスホリラーゼバリアントは、好ましくは、SEQ ID NO:1に対するアミノ酸配列の相同性および/または同一性が、少なくとも81％、または少なくとも82％、または少なくとも83％、または少なくとも84％、または少なくとも85％、より好ましくは少なくとも86％、または少なくとも87％、または少なくとも88％、または少なくとも89％、または少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも91％、または少なくとも92％、または少なくとも93％、または少なくとも94％、または少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％、または少なくとも99％、少なくとも99.1％、または少なくとも99.2％、または少なくとも99.3％、または少なくとも99.4％、または少なくとも99.5％、または少なくとも99.6％、または少なくとも99.7％、または少なくとも99.8％、特に少なくとも99.9％、または100％であることを特徴とする。
【０１０１】
本発明の好ましい一態様において、前述の態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、本明細書に記載の局面および/または態様のいずれか1つに記載される特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とするトレハロースホスホリラーゼである。
【０１０２】
好ましくは、本明細書に記載する態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、以下の特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とするトレハロースホスホリラーゼである:
（A）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の30％〜100％の残存酵素活性を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（B）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の少なくとも52℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（C）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の52℃〜90℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（D）3時間〜9日またはそれ以上の半減期、好ましくは24時間〜9日またはそれ以上の半減期、より好ましくは4日〜9日またはそれ以上の半減期を特徴とするプロセス安定性という形での熱安定性。
【０１０３】
好ましくは、前述の態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、本明細書に記載の局面および/または態様のいずれか1つに記載される特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とするトレハロースホスホリラーゼであり、さらに
（i）一定の温度において、本明細書に記載する局面および態様のいずれか1つに記載されるTP酵素1kUあたりの生産性を与え、かつ/または
（ii）グルコースイソメラーゼを加えることなく、グルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む、本明細書に記載する局面および態様のいずれか1つに記載する二酵素プロセスの実施を可能にし、かつ/または
（iii）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む、本明細書に記載する局面および態様のいずれか1つに記載する三酵素プロセスの実施を可能にする。
【０１０４】
好ましくは、本明細書に記載する態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、それが、
（i）糖類原材料スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性を、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）にすることができ、かつ/または
（ii）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスであって、スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）である三酵素プロセス
を可能にし、かつ/または
（iii）グルコースイソメラーゼを加えることなく、グルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスであって、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）であり、好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、糖類原材料は好ましくはスクロースである二酵素プロセス
を可能にする
ことを特徴とする。
【０１０５】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、トレハロースホスホリラーゼバリアントは、SEQ ID NO:81および/またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、アミノ酸配列のいずれか1つに対して少なくとも85％もしくは86％同一および/または少なくとも85％もしくは86％相同であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、アミノ酸位置108、112、221、300、319、345、379、483、544、550、558、584、643、および707からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置、好ましくは、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、アミノ酸位置108、112、221、300、319、379、483、544、550、および558からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置、より好ましくは、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、アミノ酸位置108、221、319、379、483、550、および558からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含む。
【０１０６】
好ましくは、トレハロースホスホリラーゼバリアントは、SEQ ID NO:81のアミノ酸配列に対して少なくとも85％もしくは86％同一および/または少なくとも85％もしくは86％相同であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:81のアミノ酸位置L108、V112、N221、A300、T319、F345、P379、I483、V544、S550、Q558、N584、A643およびL707からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置、好ましくはSEQ ID NO:81のアミノ酸位置L108、V112、N221、A300、T319、P379、I483、V544、S550およびQ558からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置、より好ましくはSEQ ID NO:81のアミノ酸位置L108、V221、T319、P379、I483、S550および558からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含む。
【０１０７】
同等に好ましくは、トレハロースホスホリラーゼバリアントは、SEQ ID NO:160のアミノ酸配列に対して少なくとも85％もしくは86％同一および/または少なくとも85％もしくは86％相同であるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:160のアミノ酸位置L108、V112、N221、A300、T319、F345、P379、V483、V544、S550、Q558、N584、A643およびL707からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置、好ましくはSEQ ID NO:160のアミノ酸位置L108、V112、N221、A300、T319、P379、V483、V544、S550およびQ558からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置、より好ましくはSEQ ID NO:160のアミノ酸位置L108、V221、T319、P379、V483、S550およびQ558からなる群より選択される1つまたは複数のアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含む。
【０１０８】
その好ましい一態様（これは本明細書に記載する前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸配列は、
a）L108A、L108G、L108I、L108M、L108PまたはL108V、好ましくはL108Iである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置L108におけるアミノ酸置換、
b）V112A、V112G、V112L、V112M、V112PまたはV112I、好ましくはV112Iである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置V112におけるアミノ酸置換、
c）N221A、N221G、N221I、N221L、N221M、N221PまたはN221V、好ましくはN221I、N221L、N221MまたはN221V、より好ましくはN221Vである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置N221におけるアミノ酸置換、
d）A300G、A300I、A300L、A300M、A300PまたはA300V、好ましくはA300IまたはA300L、より好ましくはA300Iである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置A300におけるアミノ酸置換、
e）T319A、T319G、T319I、T319L、T319M、T319PまたはT319V、好ましくはT319IまたはT319V、より好ましくはT319Iである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置T319におけるアミノ酸置換、
f）P379A、P379G、P379I、P379L、P379M、P379V、P379N、P379C、P379Q、P379SまたはP379T、好ましくはP379A、P379G、P379M、P379V、P379N、P379C、P379Q、P379SまたはP379T、より好ましくはP379G、P379V、P379CまたはP379S、またはP379T、さらに好ましくはP379VまたはP379T、最も好ましくはP379Vである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置P379におけるアミノ酸置換、
g）I483A、I483G、I483I、I483L、I483M、I483PまたはI483V、好ましくはI483A、I483G、1483L、I483MまたはI483V、より好ましくはI483Aである、SEQ ID NO:81の位置I483におけるアミノ酸置換、
h）Q483A、Q483G、Q483I、Q483L、Q483M、Q483PまたはQ483V、好ましくはQ483A、Q483G、Q483L、Q483MまたはQ483V、より好ましくはQ483Aである、SEQ ID NO:160の位置Q483におけるアミノ酸置換、
i）V544A、V544G、V544I、V544L、V544MまたはV544P、好ましくはV544IまたはV544P、より好ましくはV544Iである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置V544におけるアミノ酸置換、
j）S550N、S550C、S550QまたはS550T、好ましくはS550Tである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置S550におけるアミノ酸置換、
k）Q558DまたはQ558E、好ましくはQ558Eである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置Q558におけるアミノ酸置換、
l）D558N、D558C、D558Q、D558S、D558T、D558A、D558G、D558I、D558L、D558M、D558PまたはD558V、好ましくはD558N、D558GまたはD558A、より好ましくはD558Nである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置D558におけるアミノ酸置換、
m）A643DまたはA643E、好ましくはA643Eである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置A643におけるアミノ酸置換、
n）L707A、L707G、L707I、L707M、L707PまたはL707V、好ましくはL707Mである、SEQ ID NO:81またはSEQ ID NO:160の、好ましくはSEQ ID NO:160の、位置L707におけるアミノ酸置換
からなる群より選択される1つまたは複数の置換を含む。
【０１０９】
好ましくは、これに関連して、トレハロースホスホリラーゼは、SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、およびSEQ ID NO:189からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列、好ましくはSEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:185、およびSEQ ID NO:188からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなる。
【０１１０】
第1局面およびその任意の好ましい態様のこの態様との関連において、トレハロースホスホリラーゼバリアントは、好ましくは、SEQ ID NO:81および/またはSEQ ID NO:160、好ましくはSEQ ID NO:160に対するアミノ酸配列の相同性および/または同一性が、少なくとも85％、より好ましくは少なくとも86％、または少なくとも87％、または少なくとも88％、または少なくとも89％、または少なくとも90％、さらに好ましくは少なくとも91％、または少なくとも92％、または少なくとも93％、または少なくとも94％、または少なくとも95％、最も好ましくは少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％、または少なくとも99％、少なくとも99.1％、または少なくとも99.2％、または少なくとも99.3％、または少なくとも99.4％、または少なくとも99.5％、または少なくとも99.6％、または少なくとも99.7％、または少なくとも99.8％、特に少なくとも99.9％、または100％であることを特徴とする。
【０１１１】
本発明の好ましい一態様において、前述の態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、本明細書に記載の局面および/または態様のいずれか1つに記載される特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とするトレハロースホスホリラーゼバリアントである。
【０１１２】
好ましくは、本明細書に記載する態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、以下の特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とする:
（A）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の30％〜100％の残存酵素活性を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（B）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の少なくとも52℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（C）酵素を52℃で15分間インキュベートした後の52℃〜90℃のTm50値を特徴とする熱安定性、および/あるいは
（D）3時間〜9日またはそれ以上の半減期、好ましくは24時間〜9日またはそれ以上の半減期、より好ましくは4日〜9日またはそれ以上の半減期を特徴とするプロセス安定性という形での熱安定性。
【０１１３】
好ましくは、前述の態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、本明細書に記載の局面および/または態様のいずれか1つに記載される特徴（A）、（B）、（C）、および（D）からなる群より選択される特徴のうちの1つまたは複数を特徴とし、さらに
（i）一定の温度において、本明細書に記載する局面および態様のいずれか1つに記載されるTP酵素1kUあたりの生産性を与え、かつ/または
（ii）グルコースイソメラーゼを加えることなく、グルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む、本明細書に記載する局面および態様のいずれか1つに記載する二酵素プロセスの実施を可能にし、かつ/または
（iii）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼを任意の順序で混合し反応させる工程を含む、本明細書に記載する局面および態様のいずれか1つに記載する三酵素プロセスの実施を可能にする。
【０１１４】
好ましくは、本明細書に記載する態様のいずれか1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントは、それが、
（i）糖類原材料スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性を、TP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）にすることができ、かつ/または
（ii）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、好ましくはスクロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む三酵素プロセスであって、スクロースからのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも1.0g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）である三酵素プロセス
を可能にし、かつ/または
（iii）グルコースイソメラーゼを加えることなく、グルコース基質、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼ、および少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ（TP）を任意の順序で混合し反応させる工程を含む二酵素プロセスであって、糖類原材料からのトレハロースのTP酵素1kUあたりの生産性がTP1kUあたり少なくとも3g/（L*h）〜TP1kUあたり100g/（L*h）であり、好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼはスクロースホスホリラーゼであり、糖類原材料は好ましくはスクロースである二酵素プロセス
を可能にする
ことを特徴とする。
【０１１５】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様および好ましい態様の好ましい一態様でもある）において、本発明の方法は、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、上述の態様のいずれかに規定されるトレハロースホスホリラーゼ、好ましくはトレハロースバリアントであることを特徴とする。
【０１１６】
より好ましくは、本発明の方法は、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、以下のいずれか1つからなる群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなることを特徴とする:
a）
2021503955.tif 000005
、より好ましくは、少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼは、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、SEQ ID NO:190、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:185、およびSEQ ID NO:188からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなる、ならびに/または
b）
2021503955.tif 000006
、好ましくは、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:70、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:76、SEQ ID NO:77、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:113、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:132、SEQ ID NO:133、SEQ ID NO:134、SEQ ID NO:135、SEQ ID NO:136、SEQ ID NO:137、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:139、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:141、SEQ ID NO:152、SEQ ID NO:154、SEQ ID NO:155、SEQ ID NO:156、SEQ ID NO:157、SEQ ID NO:158、SEQ ID NO:159、およびSEQ ID NO:190からなる配列の群より選択される、ならびに/または
c）SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172、SEQ ID NO:173、SEQ ID NO:174、SEQ ID NO:175、SEQ ID NO:176、SEQ ID NO:177、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:179、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:181、SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183、SEQ ID NO:184、SEQ ID NO:185、SEQ ID NO:186、SEQ ID NO:187、SEQ ID NO:188、およびSEQ ID NO:189、好ましくはSEQ ID NO:176、SEQ ID NO:178、SEQ ID NO:180、SEQ ID NO:185、およびSEQ ID NO:188からなる群より選択される、ならびに/または
d）SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:115、SEQ ID NO:121、SEQ ID NO:138、SEQ ID NO:140、SEQ ID NO:147、SEQ ID NO:180、およびSEQ ID NO:188。
【０１１７】
少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼバリアントが、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:84、SEQ ID NO:85、SEQ ID NO:86、SEQ ID NO:87、SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:91、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:93、SEQ ID NO:94、SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:98、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:102、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:104、SEQ ID NO:105、SEQ ID NO:106、SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:109、SEQ ID NO:161、SEQ ID NO:162、SEQ ID NO:163、SEQ ID NO:164、SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166、SEQ ID NO:167、SEQ ID NO:168、SEQ ID NO:169、およびSEQ ID NO:170のうちのいずれか1つからなる群より選択されるアミノ酸配列、好ましくはSEQ ID NO:87、SEQ ID NO:89、およびSEQ ID NO:104からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなることも、同等に好ましい。
【０１１８】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼは、スクロースホスホリラーゼ、好ましくはアクチノバクテリア綱（Actinobacteria）、バチルス綱（Bacilli）、ベータプロテオバクテリア綱（Betaproteobacteria）、クロストリジウム綱（Clostridia）、ガンマプロテオバクテリア綱（Gammaproteobacteria）またはバチルス綱、さらに好ましくはビフィドバクテリウム目（Bifidobacteriales）またはラクトバチルス目（Lactobacillales）に属するもの、さらに好ましくはビフィドバクテリウム科（Bifidobacteriaceae）、ラクトバチルス科（Lactobacillaceae）、ロイコノストック科（Leuconostocaceae）またはレンサ球菌科（Streptococcaceae）に属するもの、さらに好ましくはビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）に属するもの、最も好ましくは種ビフィドバクテリウム・サーモフィラム（Bifidobacterium thermophilum）およびビフィドバクテリウム・マグナム（Bifidobacterium magnum）に属するもの、最も好ましくは種ビフィドバクテリウム・マグナムに由来するスクロースホスホリラーゼである。
【０１１９】
好ましくは、これに関連して、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼは、SEQ ID NO:202および/またはSEQ ID NO:205からなる群より選択されるアミノ酸配列、好ましくはSEQ ID NO:202のアミノ酸配列に対して少なくとも75％の配列同一性および/または配列相同性を有するスクロースホスホリラーゼである。
【０１２０】
好ましくは、これに関連して、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼは、SEQ ID NO:202のアミノ酸配列に対して少なくとも75％の配列同一性および/または配列相同性を持つ野生型スクロースホスホリラーゼのバリアントである。
【０１２１】
さらに好ましくは、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼは、SEQ ID NO:202のアミノ酸配列に対して少なくとも75％の配列同一性および/または配列相同性を持つビフィドバクテリウム・マグナム由来の野生型スクロースホスホリラーゼのバリアントである。
【０１２２】
別の好ましい態様において、スクロースホスホリラーゼは、SEQ ID NO:202に対して少なくとも84％の相同性および/または同一性を持つアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:202と比較して、それぞれがアミノ酸位置92、124、148、188、231、371、461からなる群より独立して選択される1つまたは複数のアミノ酸位置に1つまたは複数の置換を含むように改変されており、好ましくは、前記1つまたは複数のアミノ酸位置は、それぞれがアミノ酸位置92、124、148、188、231からなる群より独立して選択され、より好ましくは前記1つまたは複数のアミノ酸位置は、それぞれがアミノ酸位置124、148、188からなる群より独立して選択され、最も好ましくは前記1つまたは複数のアミノ酸位置はそれぞれがアミノ酸位置148、188からなる群より独立して選択される。
【０１２３】
好ましくは、上記に加えて、アミノ酸配列は、SEQ ID NO:202と比較して、2つ以上の置換を含むように改変され、追加の置換アミノ酸位置は、それぞれがアミノ酸位置92、124、148、157、188、231、371および461からなる群より独立して選択される。
【０１２４】
さらに好ましくは、スクロースホスホリラーゼは、SEQ ID NO:202に対して少なくとも84％の相同性および/または同一性を持つアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなり、そのアミノ酸配列は、SEQ ID NO:202と比較して、1つまたは複数のアミノ酸位置に1つまたは複数の置換を含むように改変され、前記1つまたは複数のアミノ酸位置はそれぞれがアミノ酸位置E92、S124、A148、Q188、I231、L371、T461からなる群より独立して選択され、好ましくは前記1つまたは複数のアミノ酸位置は、それぞれがアミノ酸位置E92、S124、A148、Q188、I231からなる群より独立して選択され、より好ましくは前記1つまたは複数のアミノ酸位置はそれぞれがアミノ酸位置S124、A148、Q188からなる群より独立して選択され、最も好ましくは前記1つまたは複数のアミノ酸位置はそれぞれがアミノ酸位置L148、Q188からなる群より独立して選択される。
【０１２５】
同じくより好ましくは、上記に加えて、アミノ酸配列は、SEQ ID NO:202と比較して、2つ以上の置換を含むように改変され、追加の置換アミノ酸位置は、それぞれがアミノ酸位置E92、S124、A148、T157、Q188、I231、L371およびT461からなる群より独立して選択される。
【０１２６】
第1局面の別の好ましい態様（これは前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、アミノ酸配列は、SEQ ID NO:202と比較して、1つまたは複数のアミノ酸位置に1つまたは複数の置換を含むように改変され、前記1つまたは複数のアミノ酸位置における置換は、それぞれが以下の置換からなる群より独立して選択される:
（i）位置E92はA、R、N、D、C、Q、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、YまたはVで置換され、好ましくはA、I、LまたはVで置換され、最も好ましくはLで置換される;
（ii）位置S124はA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、T、W、YまたはVで置換され、好ましくはR、H、K、N、M、C、S、TまたはQで置換され、さらに好ましくはQ、KまたはTで置換され、さらに好ましくはK、Tで置換され、最も好ましくはKで置換される;
（iii）位置A148はR、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、YまたはVで置換され、好ましくはR、HまたはKで置換され、より好ましくはKまたはRで置換され、最も好ましくはKで置換される;
（iv）位置T157はA、R、M、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、YまたはVで置換され、好ましくはDで置換される;
（v）位置Q188はA、R、N、D、C、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、T、W、YまたはVで置換され、好ましくはF、WまたはYで置換され、最も好ましくはYで置換される;
（vi）位置I231はA、R、N、D、C、Q、E、G、H、L、K、M、F、P、S、T、W、YまたはVで置換され、好ましくはA、I、LまたはVで置換され、最も好ましくはVで置換される;
（vii）位置L371はA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、K、M、F、P、S、T、W、YまたはVで置換され、好ましくはA、I、LまたはVで置換され、最も好ましくはAで置換される;
（viii）位置T461はA、R、N、D、C、Q、E、G、H、I、L、K、M、F、P、S、W、YまたはVで置換され、好ましくはGまたはPで置換され、最も好ましくはGで置換される。
【０１２７】
本発明に関して、代替的野生型アルファ-ホスホリラーゼ、好ましくは代替的スクロースホスホリラーゼ、またはそのバリアントが選択され、その代替的スクロースホスホリラーゼ酵素および/またはバリアントは、当技術分野における野生型スクロースホスホリラーゼとの比較で、増加した熱安定性、低い加水分解活性および高いスクロース濃度における効率のよいアルファ-グルコース1-リン酸の生成によって区別されると理解される。
【０１２８】
別の好ましい態様において、スクロースホスホリラーゼは、特徴（E）、（F）、（G）、（H）のうちの少なくとも1つまたはそれらの任意の組合せを有する:
（E）少なくとも66.5℃から90℃まで、最も好ましくは少なくとも68.0℃から72℃まで、少なくとも68.5℃から72℃まで、または少なくとも68.0℃から70℃までのTm50値、
（F）70℃で15分間のインキュベーション後に、少なくとも25％〜最大100％、最も好ましくは少なくとも50％から64％までの残存活性、
（G）少なくとも200％から600％まで、最も好ましくは少なくとも275％から373％までのP/H比、
（H）20Uの熱精製スクロースホスホリラーゼを使用し30℃において1Mスクロースおよび1Mリン酸から24時間で、少なくとも300mMから1000mMまで、最も好ましくは少なくとも300mMから501mMまで、少なくとも350mMから501mMまで、少なくとも354mMから501mMまで、少なくとも367mMから501mMまで、少なくとも400mMから501mMまで、少なくとも422mMから501mMまで、少なくとも450mMから501mMまで、少なくとも484mMから501mMまでのaG1P形成活性。
【０１２９】
好ましくは、本発明との関連において、好ましくはこの好ましい態様との関連において、スクロースホスホリラーゼは、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、およびSEQ ID NO:219からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列、好ましくはSEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、およびSEQ ID NO:219からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなる。
【０１３０】
第1局面の別の好ましい態様（これは前述の態様の好ましい一態様でもある）において、SEQ ID NO:202に対するアミノ酸配列の相同性および/または同一性は、少なくとも75.0％であり、少なくとも75.1％であり、少なくとも75.2％であり、少なくとも75.3％であり、少なくとも75.4％であり、少なくとも75.5％であり、少なくとも75.6％であり、少なくとも75.7％であり、少なくとも75.8％であり、少なくとも75.9％、76.0％であり、少なくとも76.1％であり、少なくとも76.2％であり、少なくとも76.3％であり、少なくとも76.4％であり、少なくとも76.5％であり、少なくとも76.6％であり、少なくとも76.7％であり、少なくとも76.8％であり、少なくとも76.9％、77.0％であり、少なくとも77.1％であり、少なくとも77.2％であり、少なくとも77.3％であり、少なくとも77.4％であり、少なくとも77.5％であり、少なくとも77.6％であり、少なくとも77.7％であり、少なくとも77.8％であり、少なくとも77.9％、78.0％であり、少なくとも78.1％であり、少なくとも78.2％であり、少なくとも78.3％であり、少なくとも78.4％であり、少なくとも78.5％であり、少なくとも78.6％であり、少なくとも78.7％であり、少なくとも78.8％であり、少なくとも78.9％、79.0％であり、少なくとも79.1％であり、少なくとも79.2％であり、少なくとも79.3％であり、少なくとも79.4％であり、少なくとも79.5％であり、少なくとも79.6％であり、少なくとも79.7％であり、少なくとも79.8％であり、少なくとも79.9％であり、少なくとも80％であり、少なくとも81％であり、少なくとも82％であり、少なくとも83％であり、少なくとも84％であり、好ましくは少なくとも85％、または少なくとも86％、または少なくとも87％、または少なくとも88％、または少なくとも89％であり、より好ましくは少なくとも90％、または少なくとも91％、または少なくとも92％、または少なくとも93％、または少なくとも94％、または少なくとも95、さらに好ましくは少なくとも96％、または少なくとも97％、または少なくとも98％、最も好ましくは少なくとも99％、少なくとも99.1％、または少なくとも99.2％、または少なくとも99.3％、または少なくとも99.4％、または少なくとも99.5％、または少なくとも99.6％、または少なくとも99.7％、または少なくとも99.8％、特に少なくとも99.9％、または100％である。
【０１３１】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様および好ましい態様の好ましい一態様でもある）において、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼは、上述の態様のいずれかにおいて規定されるスクロースホスホリラーゼである。
【０１３２】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼは、ストレプトミセス属（Streptomyces）、アクチノミセス属（Actinomyces）、アクチノプラネス属（Actinoplanes）、アエロモナス属（Aeromonas）、アルスロバクター属（Arthrobacter）、バチルス属（Bacillus）、バクテロイデス属（Bacteroides）、ビフィドバクテリウム属（Bifidobacterium）、ブレビバクテリウム属（Brevibacterium）、バークホルデリア属（Burkholderia）、ユウレイボヤ属（Ciona）、シトロバクター属（Citrobacter）、コリネバクテリウム属（Corynebacterium）、デセムジア属（Desemzia）、エンテロバクター属（Enterobacter）、エシェリシア属（Escherichia）、ゲオバチルス属（Geobacillus）、グルタミシバクター属（Glutamicibacter）、ゴードニア属（Gordonia）、ホルデウム属（Hordeum）、ラクノクロストリジウム属（Lachnoclostridium）、ラクトバチルス属（Lactobacillus）、ロイコノストック属（Leuconostoc）、ミクロバクテリウム属（Microbacterium）、ミクロビスポラ属（Microbispora）、ミクロモノスポラ属（Micromonospora）、マイコバクテリウム属（Mycobacterium）、ノカルジア属（Nocardia）、ノカルジオプシス属（Nocardiopsis）、オプンティア属（Opuntia）、オルピノミセス属（Orpinomyces）、ペナルスロバクター属（Paenarthrobacter）、パラバークホルデリア属（Paraburkholderia）、パラコロバクテリウム属（Paracolobacterium）、ペクトバクテリウム属（Pectobacterium）、ピロミセス属（Piromyces）、シュードノカルジア属（Pseudonocardia）、サッカロミセス属（Saccharomyces）、サルシナ属（Sarcina）、シェファーソミセス属（Scheffersomyces）、セレニケレウス属（Selenicereus）、スフィンゴモナス属（Sphingomonas）、ストレプトコッカス属（Streptococcus）、ストレプトスポランギウム属（Streptosporangium）、サーモアナエロバクター属（Thermoanaerobacter）、サーモアナエロバクテリウム属（Thermoanaerobacterium）、サーモポリスポラ属（Thermopolyspora）、サーモトガ属（Thermotoga）、サーマス属（Thermus）、ビブリオ属（Vibrio）、キサントモナス属（Xanthomonas）またはザイモモナス属（Zymomonas）のいずれかに属する生物、より好ましくはストレプトミセス属、アクチノプラネス属、アルスロバクター属、ゲオバチルス属またはサーモアナエロバクター属のいずれかに属する生物、最も好ましくはストレプトミセス属に属する生物に由来するキシロースイソメラーゼである。
【０１３３】
本発明との関連において、好ましくは第1局面（第1局面に関係するすべての好ましい態様を含む）との関連において、グルコースイソメラーゼは、SEQ ID NO:220のアミノ酸配列に対して少なくとも95％の配列同一性および/または配列相同性を持つグルコースイソメラーゼバリアントであり、グルコースイソメラーゼのアミノ酸配列は、それぞれがSEQ ID NO:220のアミノ酸位置10、33、34、35、53、59、89、90および95からなる群より独立して選択される1つまたは複数のアミノ酸位置、好ましくはSEQ ID NO:220のアミノ酸位置R10、A33、L34、D35、F53、I59、A89、T90およびT95からなる群より独立して選択される1つまたは複数のアミノ酸位置に、アミノ酸置換を含む。
【０１３４】
これの好ましい一態様（これは前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、グルコースイソメラーゼは、好ましくは、以下の置換からなる群より選択される1つまたは複数の置換を含む:
R10HまたはR10K、好ましくはR10Kである、SEQ ID NO:220の位置R10におけるアミノ酸置換、
A33I、A33L、A33V、A33G、A33N、A33M、A33C、A33S、A33QまたはA33T、好ましくはA33IまたはA33N、最も好ましくはA33Iである、SEQ ID NO:220の位置A33におけるアミノ酸置換、
L34F、L34W、L34YまたはL34P、好ましくはL34Fである、SEQ ID NO:220の位置L34におけるアミノ酸置換、
D35G、D35N、D35M、D35C、D35S、D35QまたはD35T、好ましくはD35CまたはD35S、より好ましくはD35Sである、SEQ ID NO:220の位置D35におけるアミノ酸置換、
F53A、F53I、F53LまたはF53V、好ましくはF53Lである、SEQ ID NO:220の位置F53におけるアミノ酸置換、
I59F、I59W、I59YまたはI59P、好ましくはI59Fである、SEQ ID NO:220の位置I59におけるアミノ酸置換、
A89I、A89LまたはA89V、好ましくはA89Vである、SEQ ID NO:220の位置A89におけるアミノ酸置換、
T90G、T90N、T90M、T90C、T90SまたはT90Q、好ましくはT90Sである、SEQ ID NO:220の位置T90におけるアミノ酸置換、
T95F、T95W、T95Y、T95P、T95R、T95HまたはT95K、好ましくはT95YまたはT95R、より好ましくはT95Yである、SEQ ID NO:220の位置T95におけるアミノ酸置換。
【０１３５】
第1局面の好ましい一態様（これは第1局面に関係するすべての態様の好ましい一態様でもある）において、グルコースイソメラーゼは、以下の特徴（I）、（K）、（L）および（M）のうちの少なくとも1つまたはそれらの任意の組合せを有する:
（I）50mMのフルクトース濃度におけるフルクトースからグルコースへの変換に関して、SEQ ID NO:220のグルコースイソメラーゼと比較して、少なくとも1.1倍から3.0倍までの、増加したグルコースイソメラーゼ活性、
（K）200mMのフルクトース濃度におけるフルクトースからグルコースへの変換に関して、SEQ ID NO:220のグルコースイソメラーゼと比較して、少なくとも1.2倍から3.0倍までの、増加したグルコースイソメラーゼ活性、
（L）グルコースイソメラーゼを温度74℃で15分間インキュベートした後の残存活性として表されるグルコースイソメラーゼの熱安定性であって、そのような残存活性が少なくとも30％から100％までである熱安定性、
（M）50mM〜190mM、最も好ましくは140mM〜152mM、かつ/または190mM未満、最も好ましくは155mM未満、最も好ましくは152mM未満である、グルコースイソメラーゼのkM値。
【０１３６】
好ましくは、本発明との関連において、好ましくは第1局面（第1局面に関係するすべての好ましい態様を含む）との関連において、グルコースイソメラーゼは、SEQ ID NO:220〜SEQ ID NO:240からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列、好ましくはSEQ ID NO:221〜SEQ ID NO:240からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列、より好ましくはSEQ ID NO:232〜SEQ ID NO:240からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなる。
【０１３７】
第1局面の別の好ましい態様（これは前述の態様の好ましい一態様でもある）において、SEQ ID NO:220に対するアミノ酸配列の相同性および/または同一性は、少なくとも95％、または好ましくは少なくとも95.5％、または少なくとも96％、または少なくとも96.5％、または少なくとも97％、または少なくとも97.5％、または少なくとも98％、または少なくとも98.5％、または少なくとも99％、最も好ましくは少なくとも99.1％、または少なくとも99.2％、または少なくとも99.3％、または少なくとも99.4％、または少なくとも99.5％、または少なくとも99.6％、または少なくとも99.7％、または少なくとも99.8％、特に少なくとも99.9％、または100％である。
【０１３８】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様および好ましい態様の好ましい一態様でもある）において、少なくとも1つのグルコースイソメラーゼは、上述の態様のいずれかに規定されるグルコースイソメラーゼである。
【０１３９】
第1局面の別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様および好ましい態様の好ましい一態様でもある）において、本発明の方法は、
i）少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼが、SEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、およびSEQ ID NO:219からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列、好ましくはSEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、およびSEQ ID NO:219からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなるスクロースホスホリラーゼの形態にあること、ならびに/あるいは
（ii）少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼが、
2021503955.tif 000007
からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列、好ましくは
2021503955.tif 000008
からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなるトレハロースホスホリラーゼの形態にあること、ならびに/あるいは
iii）少なくとも1つのグルコースイソメラーゼが、SEQ ID NO:220〜SEQ ID NO:240からなる配列の群より選択されるアミノ酸配列を含むかまたは同アミノ酸配列からなるグルコースイソメラーゼの形態にあること
を特徴とする。
【０１４０】
別の好ましい態様において、本発明の方法は、本方法において使用される酵素のうちの1つまたは複数が、精製製剤、部分精製製剤または非精製製剤として存在することを特徴とする。
【０１４１】
本発明との関連において、「精製（された）」という用語は、一般に、1つまたは複数の酵素が、任意の起源から、好ましくは任意の生物源から、好ましくはその発現後に、より好ましくはその生物内での組換え発現後に、その酵素が機能的かつ触媒的に活性であって指定されたその触媒反応を実施するように、生化学的に精製されていることを意味する。生化学的精製には、タンパク質化学、分子生物学および/またはタンパク質生化学の当業者に公知のあらゆる方法が含まれ、例えば、沈殿剤、高温でのインキュベーション、液相から細胞デブリおよび核酸を除去するための液/固分離、精密濾過、遠心分離、高速液体イオン交換カラムクロマトグラフィーを使用するすべての手段、アフィニティークロマトグラフィー、バッチ精製、サイズ排除クロマトグラフィーなどのすべての手段が挙げられるが、それらに限定されるわけではない。
【０１４２】
本発明との関連において、「部分精製（された）」という用語は、一般に、1つまたは複数の酵素が、任意の起源から、好ましくは任意の生物源から、好ましくはその発現後に、より好ましくはその生物内での組換え発現後に、当業者に公知の、そして上述したような、あらゆる種類の手段または方法によって、生化学的に精製されていることを意味するが、その酵素調製物は、関心対象の酵素に加えて、さらなる成分および/または夾雑物を依然として含有しうる。「部分精製（された）」という用語は、関心対象の1つもしくは複数の酵素を含有するまたは関心対象の1つもしくは複数の酵素からなるあらゆる種類のタンパク質調製物であって、本発明の方法が、その部分的なおよび/または後続の反応または変換をすべて含めて、可能となるように、各酵素のそれぞれの触媒活性を可能にするものを指しうると理解すべきである。
【０１４３】
本発明との関連において、「非精製」という用語は、一般に、本発明の1つまたは複数の関心対象の酵素を含むあらゆる種類のタンパク質調製物であって、前記1つまたは複数の酵素が、任意の起源から、好ましくは任意の生物源から、好ましくはその発現後に、より好ましくはその生物内での組換え発現後に得られ、特別な精製ルーチンには供されていないものを指す。本発明との関連において、非精製酵素は、酵素が生産宿主によって発現され、その宿主によって発酵ブロス中に分泌されるか、または宿主の破壊もしくは溶解によって生産宿主から粗溶解物に放出された酵素調製物を特に意味し、この場合、そのような発酵ブロスまたは粗溶解物はそのまま酵素調製物として役立ちうる。得られた酵素調製物は、関心対象の酵素に加えて、さらなる成分および/または夾雑物を含有しうる。「非精製」という用語は、1つもしくは複数の関心対象の酵素を含むまたは1つもしくは複数の関心対象の酵素からなるあらゆる種類のタンパク質調製物であって、本発明の方法が、その部分的なおよび/または後続の反応または変換をすべて含めて、可能となるように、各酵素のそれぞれの触媒活性を可能にするタンパク質調製物を指しうると理解すべきである。
【０１４４】
好ましくは、酵素のうちの1つまたは複数は、固定化されていない形態で存在するか、または固定化された形態で存在し、好ましくは1つまたは複数の酵素は担体上に固定化される。
【０１４５】
好ましくは、本発明の1つまたは複数の酵素を固定化するための適切な担体は、1つまたは複数の関心対象の酵素を、好ましくは吸着結合または共有結合によって、官能化されたポリマー樹脂上に、より好ましくは静電相互作用、疎水性相互作用、化学的リンカー、架橋、ポリマーマトリックスへの封入によって、またはアフィニティー結合を利用して、カップリングおよび/または結合させるのに適したあらゆる種類の化学的または生物学的マトリックスからなる群より選択される。
【０１４６】
別の好ましい態様（これは第1局面に関係する前述したすべての態様の好ましい一態様でもある）において、酵素のうちの1つまたは複数は、1つ、2つ、3つ、さらにはそれ以上の個々の組換えタンパク質をコードする1つまたは複数の核酸配列を含有する、そのような核酸配列によってコードされるタンパク質の発現に適した発現要素から発現される。
【０１４７】
本明細書に開示するアミノ酸配列に基づいてそのような核酸分子を得ることは、広く公知である。好ましくは、核酸配列は、トレハロースホスホリラーゼの発現および/または本明細書に記載する酵素のいずれかの発現に使用される発現系に依存する。酵素のための発現要素は、本発明の酵素をコードする核酸分子を含むかまたは同核酸分子からなる組換えプラスミド、組換えエピソーム発現ベクター、酵母人工染色体および組換えゲノム組込み型核酸要素などの発現要素から選択されうる。トレハロースホスホリラーゼの発現および/または本明細書に記載する酵素のいずれかの発現に使用される好ましい発現要素は、本発明の酵素をコードする核酸分子を含むかまたは同核酸分子からなる組換えプラスミドおよび組換えゲノム組込み型核酸要素であり、トレハロースホスホリラーゼの発現および/または本明細書に記載の酵素のいずれかの発現に使用される好ましい発現系に、トランスフェクションまたはゲノム組込みによって導入される。好ましい発現系は大腸菌（E.coli）、バチルス属の種、P.パストリス（P.pastoris）およびコウジカビ属（Aspergillus）の種のような真菌発現系である。
【０１４８】
さらなる一態様において、本発明は、トレハロースホスホリラーゼおよび/または本明細書に記載する酵素のいずれかをコードする核酸分子を含有するベクターが使用される方法に関する。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。酵素の発現に適したベクターは、最新技術に記載がある。
【０１４９】
好ましい一態様において、本発明は、トレハロースホスホリラーゼの発現方法および/または本明細書に記載する酵素のいずれかの発現方法に関する。そのような方法は、トレハロースホスホリラーゼおよび/または本発明の酵素のいずれかをコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む本明細書に開示する宿主生物を、該核酸分子の発現が可能な条件下で培養する工程、ならびにトレハロースホスホリラーゼおよび/または本明細書に記載する酵素のいずれかを収穫する工程を含む。
【０１５０】
さらなる一態様において、本発明は、本発明のベクターを含有する宿主生物に関する。酵素を発現させるためのベクターを含有する宿主に適した宿主は記載されており、好ましくは宿主生物は大腸菌、バチルス属の種、P.パストリスおよびコウジカビ属の種のような真菌発現系、好ましくは大腸菌およびP.パストリスである。そのようなベクターを宿主生物に組み入れるための方法も公知である。
【０１５１】
これに関連して、酵素のうちの1つまたは複数は、酵母細胞、植物細胞、哺乳動物細胞、昆虫細胞、真菌細胞および細菌細胞からなる群より選択される宿主生物において発現される。
【０１５２】
本発明との関連において、酵母細胞は、例えば限定するわけではないが、サッカロマイセス・セレビシエ（Saccharomyces cerevisiae）、シゾサッカロミセス・ポンベ（Schizosaccharomyces pombe）、ヤロウィア・リポリティカ（Yarrowia lipolytica）、カンジダ・グラブラタ（Candida glabrata）、アシュビア・ゴシピイ（Ashbya gossypii）、トルラ酵母（Cyberlindnera jadinii）、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、クリベロマイセス・ラクティス（Kluyveromyces lactis）、ハンセヌラ・ポリモルファ（Hansenula polymorpha）、カンジダ・ボイディニイ（Candida boidinii）、アルクスラ・アデニニボランス（Arxula adeninivorans）、キサントフィロミセス・デンドロロウス（Xanthophyllomyces dendrorhous）またはカンジダ・アルビカンス（Candida albicans）種など、さまざまな種に由来することができ、最も好ましくは、サッカロマイセス・セレビシエ種由来の細胞でありうる。
【０１５３】
さらに、真菌細胞は、例えば限定するわけではないが糸状菌、サーモミセス属（Thermomyces）、アクレモニウム属（Acremonium）、コウジカビ属、ペニシリウム属（Penicillium）、ムコール属（Mucor）、ニューロスポラ属（Neurospora）、トリコデルマ属（Trichoderma）などに属する任意のメンバーなど、さまざまな種に由来することができ、一方、細菌細胞は、大腸菌および枯草菌（Bacillus subtilis）などの種からの細胞であることができる。
【０１５４】
本発明の好ましい一態様において、本方法の1つまたは複数の変換は、本明細書に記載する宿主細胞のうちの1つまたは複数において実施および/または履行される。
【０１５５】
トレハロースホスホリラーゼおよび/または本明細書に記載され使用される追加の酵素のうちの1つもしくは複数が完全長酵素として存在することは、本発明内である。トレハロースホスホリラーゼおよび/または本明細書に記載され使用される追加の酵素のうちの1つもしくは複数がフラグメントとして存在することも、本発明内である。好ましくはフラグメントは、トレハロースホスホリラーゼ活性および/または本明細書に記載の他の任意の酵素活性、好ましくは本明細書に規定されそれぞれ開示されるトレハロースホスホリラーゼ活性を保持している。
【０１５６】
本発明の任意の各局面（その任意の態様を含む）の一態様において、本開示の任意のトレハロースホスホリラーゼのTm50値および/もしくは所与の温度における所与の時間後の残存活性、ならびに/またはプロセス安定性は、本明細書に開示するTPアッセイIおよび/またはTPアッセイIIを使って決定される。
【０１５７】
本発明の任意の各局面（その任意の態様を含む）の一態様において、本開示の任意のスクロースホスホリラーゼのTm50値および/または所与の温度における所与の時間後の残存活性は、明細書に開示するSPアッセイIおよび/またはSPアッセイIIを使って決定される。
【０１５８】
本発明の任意の各局面（その任意の態様を含む）の一態様において、本開示の任意のグルコースイソメラーゼのTm50値および/または所与の温度における所与の時間後の残存活性は、明細書に開示するGIアッセイIおよび/またはGIアッセイIIを使って決定される。
【０１５９】
本発明の任意の各局面（その任意の態様を含む）の酵素のいずれか、好ましくは少なくとも1つのトレハロースホスホリラーゼ、少なくとも1つのアルファ-ホスホリラーゼおよび/または少なくとも1つのグルコースイソメラーゼは、以下の形態のうちの1つで存在することを理解すべきである:溶液、乾燥粉末、凍結乾燥粉末または固定化された形態。
【０１６０】
本発明の任意の各局面（その任意の態様を含む）の態様では、以下の定義が適用される。
【０１６１】
相同性の定義：  本発明に関して、相同性は、好ましくはBLASSP（Stephen F,Altschul,Thomas L.Madden,Alejandro A.Schaffer,Jinghui Zhang,Zheng Zhang,Webb Miller,and David J.Lipman（1997）「Gapped BLAST and PSI-BLAST:a new generation of protein database search programs」Nucleic Acids Res.25:3389-3402、Stephen F.Altschul,John C.Wootton,E,Michael Gertz,Richa Agarwala,Aleksandr Morgulis,Alejandro A.Schaffer,and Yi-Kuo Yu（2005）「Protein database searches using compositionally adjusted substitution matrices」FEBS J.272:5101-5109）を使用して、好ましくはバージョンBLASTP 2.2.29＋（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）を使用して、好ましくは以下の設定を使って、同一性として算出される:
・  フィールド「Enter Query Sequence」:Query subrange:none
・  フィールド「Choose Search Set」:Database:non-redundant protein sequences（nr）;optional parameters:none
・  フィールド「Program Selection」:Algorithm:blastp（protein-protein BLAST）
・  Algorithm parameters:フィールド「General parameters」:Max target sequences:100;Short queries:Automatically adjust parameters for short input sequences;Expect threshold:10;Word size:3;Max matches in a query range:0
・  Algorithm parameters:フィールド「Scoring parameters」:Matrix:BLOSUM62;Gap Costs:Existence:11 Extension:1;Compositional adjustments:Conditional compositional score matrix adjustment
・  Algorithm parameters:フィールド「Filters and Masking」:Filter:none;Mask:none。
【０１６２】
結果を35％超のクエリカバレージを持つ配列についてフィルタリングする。
【０１６３】
熱安定性の定義：  本明細書に関して、酵素の熱安定性とは、高温で所与の時間インキュベートした時に酵素活性を保つそのような酵素の特性をいう。これにより酵素活性は任意のアッセイ条件で決定することができる。本発明では、以下の特徴のうちの1つまたは複数を測定することによって、一定の酵素の熱安定性の改良を決定した。
【０１６４】
−  Tm50値：  本発明において、Tm50値とは、適切な緩衝液中、その温度で15分間のインキュベーション後に、酵素がその初期活性の50％を持つ温度である。初期活性とは、熱処理なしの、すなわち室温で15分間インキュベートした、各酵素の活性である。酵素活性は、原則として、任意の活性アッセイを使って決定することができる。本発明では、それぞれTP、SPまたはGI酵素のために、TPアッセイIもしくはII、SPアッセイIもしくはIIまたはGIアッセイIもしくはIIを、後述のように、そして実施例に明記するように、使用した。適切な緩衝液、なかんずくTm50値の測定に適した緩衝液は、実施例に明記するように、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7である。TP酵素のTm50値の測定には、実施例に明記するとおり、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7が1Mスクロースをさらに含有する場合もあった。
【０１６５】
−  プロセス安定性/半減期：  本発明では、適切な緩衝液および適切な温度で、長期安定性を決定した。半減期は、酵素がt＝0分における活性の50％を持つことになるまでの時間と定義される。酵素活性は、原則として、任意の活性アッセイを使って決定することができる。本発明では、それぞれTP、SPまたはGI酵素のために、TPアッセイIもしくはII、SPアッセイIもしくはIIまたはGIアッセイIもしくはIIを、後述のように、そして実施例に明記するように、使用した。適切な緩衝液、なかんずくプロセス安定性の測定に適した緩衝液は、実施例に明記するように、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7である。TP酵素のプロセス安定性の測定には、実施例に明記するとおり、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7が1Mスクロースをさらに含有した。
【０１６６】
−  15分/52℃後の残存活性：  本発明において、15分/52℃後の残存活性は、52℃で15分間インキュベートした後の酵素の活性を、52℃でインキュベートしなかった時のその活性と比較したものと定義される。残存活性は、52℃で15分間インキュベートした後の活性を、52℃でインキュベートしなかった場合の活性で割り、その値に100を掛けて、パーセントの単位で残存活性値を得ることによって算出される。酵素活性は、原則として、任意の活性アッセイを使って決定することができる。本発明では、後述のように、そして実施例に明記するように、それぞれTP、SPまたはGI酵素のために、TPアッセイIもしくはII、SPアッセイIもしくはIIまたはGIアッセイIもしくはIIを使用した。
【０１６７】
−  15分/52.5℃後の残存活性：  本発明において、15分/52.5℃後の残存活性は、52.5℃で15分間インキュベートした後の酵素の活性を、52.5℃でインキュベートしなかった時のその活性と比較したものと定義される。残存活性は、52.5℃で15分間インキュベートした後の活性を、52.5℃でインキュベートしなかった場合の活性で割り、その値に100を掛けて、パーセントの単位で残存活性値を得ることによって算出される。酵素活性は、原則として、任意の活性アッセイを使って決定することができる。本発明では、後述のように、そして実施例に明記するように、それぞれTP、SPまたはGI酵素のために、TPアッセイIもしくはII、SPアッセイIもしくはIIまたはGIアッセイIもしくはIIを使用した。
【０１６８】
−  15分/70℃後の残存活性：  本発明において、15分/70℃後の残存活性は、70℃で15分間インキュベートした後の酵素の活性を、70℃でインキュベートしなかった時のその活性と比較したものと定義される。残存活性は、70℃で15分間インキュベートした後の活性を、70℃でインキュベートしなかった場合の活性で割り、その値に100を掛けて、パーセントの単位で残存活性値を得ることによって算出される。酵素活性は、原則として、任意の活性アッセイを使って決定することができる。本発明では、後述のように、そして実施例に明記するように、それぞれTP、SPまたはGI酵素のために、TPアッセイIもしくはII、SPアッセイIもしくはIIまたはGIアッセイIもしくはIIを使用した。
【０１６９】
TP酵素1kUあたりの生産性の定義：  TP酵素1kUあたりのトレハロースホスホリラーゼ（TP）の生産性は、糖類原材料から二酵素プロセスまたは三酵素プロセスにおいて生産された反応体積1リットルあたりのトレハロースの量を、反応時間および反応に加えたTP酵素触媒活性の量（単位kU）でそれぞれ割ることによって算出される。TP単位は、当技術分野において公知の標準的酵素アッセイによって決定される。TP単位は、本発明との関連において概説するTPアッセイIを使って決定することができる。このアッセイは、トレハロースの量が1リットルあたりのトレハロース無水物のグラム数として与えられ、反応時間が時間で表されることを特徴とする。本発明の方法によるトレハロースホスホリラーゼ1kUあたりの生産性は、トレハロース生成物が酵素的変換によってもはや形成されなくなる反応の完了時まで、酵素的変換中の任意の時点で決定されるかまたは決定されうる。
【０１７０】
糖類原材料はスクロースまたはデンプンであることができ、好ましくはスクロースである。本方法を別々の逐次的工程において実施する場合、TP1kUあたりの生産性は、反応の一部としてトレハロースホスホリラーゼ酵素を含む工程について決定されるか、または決定することができ、その場合、そのような個別工程の酵素的変換のための基質は、任意の先の工程において糖類原材料から得られたaG1P中間体である。
【０１７１】
TP酵素の加リン酸分解活性および合成活性の定義：  TPはトレハロースの可逆的加リン酸分解的切断を触媒するので、活性は、トレハロース加リン酸分解方向にも、合成方向にも決定することができる。本発明において、加リン酸分解活性は、TPアッセイIとして後述する条件において、aG1Pおよびグルコースを与える、無機リン酸の存在下でのトレハロース切断に関する活性と定義される。合成活性は、TPアッセイIIとして後述する条件におけるaG1Pおよびグルコースからのトレハロース合成に関する活性と定義される。任意の活性およびトレハロースホスホリラーゼの任意の活性が、一態様において、触媒活性であることは、本発明内である。
【０１７２】
TPアッセイIの定義：  加リン酸分解活性は、通常、トレハロースから生成したaG1Pがホスホグルコムターゼによってグルコース-6-リン酸に変換される連続共役アッセイを使って、30℃でアッセイした。グルコース-6-リン酸とNADPは、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼによって、6-ホスホ-グルコネートとNADPHとに変換される。検出は、NADPHの吸光度を340nmで測定することに基づく。アッセイ溶液は、75mMリン酸カリウム緩衝液pH7、2.5mM NADP、10μMグルコース1,6-二リン酸、10mM MgCl2、225mMトレハロース、3U/mLホスホグルコムターゼおよび3.4U/mLグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼを含有した。
【０１７３】
TPアッセイIIの定義：  合成活性は、通常、以下の条件を使って40℃でアッセイした:50mM MESナトリウム緩衝液pH7、100mM aG1Pおよび記載のとおり100mMまたは500mMのグルコース濃度。遊離したリン酸を、酸性条件下でのモリブデン酸との複合体形成に基づくアッセイで測定することによって、反応の進行を断続的に決定した。モリブデン酸複合体は硫酸第一鉄によって還元されて青色を呈し、それを750nmでの光度測定によって分析する。分析のために、250μLの試料を250μLの0.5M HClおよび500μLのモリブデン酸試薬（3.5％硫酸中の73.2g/L Fe（II）SO4・7H2Oおよび10g/Lモリブデン酸アンモニウム・4H2O）と混合する。室温（RT）で15〜30分間のインキュベーション後に、750nmで吸光度を測定する。外部標準を使って試料中の無機リン酸の量を定量する。
【０１７４】
SP酵素の加リン酸分解活性の定義：  本発明において、スクロースホスホリラーゼの加リン酸分解活性は、スクロースをaG1Pとフルクトースに加リン酸分解的に切断する活性と定義される。スクロースホスホリラーゼの加リン酸分解活性は、通常は、後述のように、そして実施例に明記するように、SPアッセイIまたはSPアッセイIIを使ってアッセイした。
【０１７５】
SP酵素の加水分解活性の定義：  本発明において、スクロースホスホリラーゼの加水分解活性は、後述のSPアッセイIIIを使って、aG1Pをグルコースと無機リン酸に加水分解的に切断する活性と定義される。
【０１７６】
SPアッセイIの定義：  SPアッセイIでは、スクロース基質から生成したaG1Pがホスホグルコムターゼによってグルコース-6-リン酸に変換される、30℃における連続共役アッセイを使用する。グルコース-6-リン酸とNADPは、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼによって、6-ホスホ-グルコネートとNADPHとに変換される。検出は、NADPHの吸光度を340nmで測定することに基づく。アッセイ溶液は、75mMリン酸カリウム緩衝液pH7、2.5mM NADP、10μMグルコース1,6-二リン酸、10mM MgCl2、250mMスクロース、3U/mLホスホグルコムターゼおよび3.4U/mLグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼを含有した。1Uは、指定された条件において1μmolのaG1Pの生成を触媒する酵素の量と定義される。
【０１７７】
SPアッセイIIの定義：  代替的選択肢として、加リン酸分解活性を、記載の非共役アッセイで決定することもできる。簡単に述べると、スクロースホスホリラーゼを、500mMスクロースおよび200mMリン酸カリウム緩衝液pH7の存在下、30℃でインキュベートする。離散した時点において、20μlの試料を採取し、80μLの0.25M HClの添加によって失活させる。試料を中和し、aG1P濃度を決定した。aG1P濃度を決定するために、10μLの試料を、48mMリン酸カリウム緩衝液、2mM MgCl2、0.7mM NADP、3.8mMグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼおよび3.3U/mLホスホグルコムターゼを含有する90μLの検出試薬に加えた。室温で20分間のインキュベーション後に、340nmにおける吸光度を決定した。既知量のaG1Pを含む試料から導き出したaG1P検量線で、aG1Pの量を定量した。1Uは、指定された条件において1μmolのaG1Pの生成を触媒する酵素の量と定義される。
【０１７８】
SPアッセイIIIの定義：  スクロースホスホリラーゼの加水分解活性は、100mM aG1Pおよび50mM 2-（N-モルホリノ）エタンスルホン酸緩衝液pH7を含有する溶液に加えて30℃でインキュベートすることによって決定した。離散した時点で100μlの試料を採取し、200μLの1M HClの添加によって失活させた。試料を中和し、実施例1で述べるようにaG1P濃度を決定した。簡単に述べると、10μLの試料を、48mMリン酸カリウム緩衝液、2mM MgCl2、0.7mM NADP、3.8mMグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼおよび3.3U/mLホスホグルコムターゼを含有する90μLの検出試薬に加えた。室温で20分間のインキュベーション後に、340nmにおける吸光度を決定した。既知量のaG1Pを含む試料から導き出したaG1P検量線で、aG1Pの量を定量した。加水分解活性は、経時的なaG1P濃度の線形回帰により、初期傾斜から算出した。1Uは、指定された条件において毎分1μmolのaG1Pの加水分解的切断を触媒する酵素の量と定義される。スクロースホスホリラーゼが非精製無細胞抽出物に由来する場合は、宿主バックグラウンドのaG1P分解活性を除去するために、熱精製工程を実施した。そのために細胞抽出物を55℃で15分間インキュベートした。可溶性酵素を含有する熱精製無細胞抽出物を遠心分離によってデブリから分離した。別の野生型酵素と比較した、野生型酵素またはそのバリアントであるスクロースホスホリラーゼの加水分解活性の減少は、固有の酵素特徴に起因して、反応におけるaG1Pの安定性が高いことを示す。
【０１７９】
GIアッセイIの定義：  以下の条件を使用し、40℃においてフルクトースからのグルコースの形成をモニタリングすることによって、グルコースイソメラーゼ活性をアッセイした:50mMリン酸カリウム緩衝液pH7、10 Mg2＋（MgCl2またはMgSO4として）、0.2mL/mL反応液のグルコースイソメラーゼ酵素調製物（最大収率が18％に達するように50mMリン酸カリウム緩衝液pH7に希釈）および記載のとおり50mMまたは200mMのフルクトース濃度。グルコースイソメラーゼの作用によってフルクトースから生成したグルコースは、グルコースがヘキソキナーゼによってグルコース-6-リン酸に変換される不連続共役アッセイを使って決定した。グルコース-6-リン酸とNADPは、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼによって、6-ホスホ-グルコネートとNADPHとに変換される。検出は、NADPHの吸光度を340nmで測定することに基づく。D-グルコース-HKキット（HK/G6P-DHフォーマット）をマイクロプレートフォーマットで使用した（Megazyme International Ireland（アイルランド・ウィックロウ）から入手可能な製品番号K-GLUHK-110AまたはK-GLUHK-220A）。このアッセイは、製造者の推奨に従って実施され、試料中のグルコースの量は外部標準を使って定量される。
【０１８０】
GIアッセイIIの定義：  グルコースイソメラーゼ活性を測定するための反応を、以下の条件においてフルクトースからのグルコースの形成をモニタリングすることによって行った:50mMリン酸カリウム緩衝液pH7、10mM MgSO4、0.05mL/mL反応液のグルコースイソメラーゼ酵素調製物（最大収率が18％に達するように50mMリン酸カリウム緩衝液pH7に希釈）、50〜1000mMのフルクトース濃度および40℃。反応1mLにつき0.1mLの0.25M HClを加えることにより、反応を停止した。グルコースイソメラーゼの作用によってフルクトースから生成したグルコースを、グルコースがグルコースオキシダーゼによってグルコノラクトンに変換される不連続共役アッセイを使って決定した。この反応の副成物である過酸化水素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼによって、2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸（ABTS）を酸化するために使用されて、405nmに吸光度を示す着色生成物を与える。酸で停止させた反応の10μLアリコートを、50mMリン酸カリウム緩衝液pH6、1mM ABTS、5U/mLグルコースオキシダーゼおよび1U/mLセイヨウワサビペルオキシダーゼを含有するアッセイミックス90μLと混合した。30℃で60〜70分のインキュベーション後に、405nmにおける吸光度を測定した（終点測定）。外部標準を使って試料中のグルコースの量を定量する。
【０１８１】
P/H比の定義：  スクロースホスホリラーゼのP/H比は、それぞれのスクロースホスホリラーゼの加リン酸分解活性と加水分解活性の比である。これは、SPアッセイIを使って決定されたそのようなスクロースホスホリラーゼの加リン酸分解活性を、SPアッセイIIIを使って決定された同じスクロースホスホリラーゼの加水分解活性で割り、その値に100を掛けて、そのスクロースホスホリラーゼについてのP/H比をパーセントの単位で得ることによって算出される。
【０１８２】
aG1P形成：  本発明では、高い基質スクロース濃度におけるアルファ-D-グルコース1-リン酸（aG1P）形成におけるスクロースホスホリラーゼの効率を、1Mスクロースおよび1Mリン酸緩衝液pH7を含有する溶液中で、20Uの各熱精製スクロースホスホリラーゼを、30℃で24時間インキュベートし、次に、反応混合物のaG1P濃度を定量することによって試験した。aG1P濃度は、10μLの試料を、48mMリン酸カリウム緩衝液、2mM MgCl2、0.7mM NADP、3.8mMグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼおよび3.3U/mLホスホグルコムターゼを含有する90μLの検出試薬に加えることによって決定した。室温で20分間のインキュベーション後に、340nmにおける吸光度を決定した。既知量のaG1Pを含む試料から導き出したaG1P検量線で、aG1Pの量を定量した。
【０１８３】
一態様において、別段の表示がない場合には、本発明のポリペプチド、またはトレハロースホスホリラーゼバリアント、好ましくは任意のトレハロースホスホリラーゼが呈するあらゆる活性、酵素活性、加リン酸分解活性および合成活性は、それぞれ本明細書に開示する方法およびアッセイによって規定され、それぞれ決定される。
【０１８４】
本発明は、図面、実施例、表、および配列表によってさらに例示され、それらから、さらなる特徴、態様、および利点を理解することができる。
【０１８５】
（表１）配列IDの概要
2021503955.tif 000009
2021503955.tif 000010
2021503955.tif 000011
2021503955.tif 000012
2021503955.tif 000013
2021503955.tif 000014
2021503955.tif 000015
2021503955.tif 000016
2021503955.tif 000017
2021503955.tif 000018
2021503955.tif 000019
2021503955.tif 000020
【０１８６】
（表２）SEQ ID NO:1の位置114、118、225、304、323、349、383、487、550、556、564、590、649、712における、SEQ ID NO:1とのアライメント後のさまざまな野生型トレハロースホスホリラーゼのアミノ酸および対応する位置（アライメントはClustal omega（Goujon M,McWilliam H,Li W,Valentin F,Squizzato S,Paern J,Lopez R Nucleic Acids research 2010 Jul,38 Suppl:W695-9）を使って行った）
2021503955.tif 000021
2021503955.tif 000022
【実施例】
【０１８７】
実施例1：  野生型酵素のクローニングと変異体の作出
組換え発現株の調製：  野生型酵素の遺伝子、すなわちスエヒロタケ（S.commune）のトレハロースホスホリラーゼ遺伝子、マイタケ（G.frondosa）のトレハロースホスホリラーゼ遺伝子、ビフィドバクテリウム・マグナム（B.magnum）のスクロースホスホリラーゼ遺伝子およびストレプトミセス属の種SKのグルコースイソメラーゼ遺伝子はすべて、大腸菌における発現用にコドン最適化され、Eurofins MWG OperonまたはGeneart Thermo Fisher Scientificで合成された。これらの遺伝子を発現ベクターpLE1A17（pRSF-1b（Novagen）の誘導体）にクローニングした。その結果得られたプラスミドを、大腸菌BL21（DE3）、大腸菌W3110または内在性酵素遺伝子がいくつか欠失している大腸菌W3110派生株（これらを合わせて「発現宿主」という）の形質転換に使用した。
【０１８８】
分子生物学的方法：  最新技術において公知の標準的な部位特異的変異導入技術によって、変異型の酵素を作出した。
【０１８９】
実施例2：  酵素調製物の調製
TP酵素調製物の調製：  組換えTPを含有する発現宿主を、培地I（4.6g/L酵母エキス、9.3g/Lペプトン、25mM Na2HPO4・12H2O、25mM KH2PO4、50mM NH4Cl2、Na2SO4、5g/Lグリセロール、0.5g/Lグルコース・1H2O、2mM MgSO4、50μg/mLカナマイシン）に、新鮮な終夜培養物を接種することにより、振とうフラスコ中で発現させた。培養物を600nmにおける光学密度が0.6〜0.8になるまで37℃で成長させた。培養物を最終濃度0.1mMのIPTGで誘導した。発現は24〜25℃で終夜行った。スクロースを含まない細胞抽出物を調製するために、細胞を遠心分離によって収穫し、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7、2mM MgCl2、0.5mg/mLリゾチームおよび20U/mLヌクレアーゼを含有する緩衝液に懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊した。可溶性酵素を含有する無細胞抽出物を遠心分離によってデブリから分離した。安定剤としてスクロースを含む細胞抽出物を調製するために、細胞を遠心分離によって収穫し、100mMリン酸カリウム緩衝液pH7、2mM MgCl2、0.5mg/mLリゾチームおよび20U/mLヌクレアーゼを含有する緩衝液に懸濁した。細胞を超音波処理によって破壊した。可溶性酵素を含有する無細胞抽出物を遠心分離によってデブリから分離し、2Mスクロース溶液で1:2希釈した。
【０１９０】
SP酵素調製物の調製：  組換えSPを含有する発現宿主を、培地I（4.6g/L酵母エキス、9.3g/Lペプトン、25mM Na2HPO4・12H2O、25mM KH2PO4、50mM NH4Cl2,、Na2SO4、5g/Lグリセロール、0.5g/Lグルコース・1H2O、2mM MgSO4、50μg/mLカナマイシン）に、新鮮な終夜培養物を接種することによって発現させた。培養物を600nmにおける光学密度が0.6〜0.8になるまで37℃で成長させた。培養物を最終濃度0.1mMのIPTGで誘導した。発現は30℃で終夜行った。無細胞抽出物の調製は、他の記述に従い、周知の手順を使って行った。細胞を遠心分離によって収穫し、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7、2mM MgCl2、0.5mg/mLリゾチームおよび20U/mLヌクレアーゼを含有する緩衝液に懸濁した。細胞破壊は、超音波処理によって、または凍結/融解サイクルの反復によって達成した。可溶性酵素を含有する無細胞抽出物を遠心分離によってデブリから分離した。
【０１９１】
GI酵素調製物の調製：  組換えSPを含有する発現宿主を、培地I（4.6g/L酵母エキス、9.3g/Lペプトン、25mM Na2HPO4・12H2O、25mM KH2PO4、50mM NH4Cl2、Na2SO4、5g/Lグリセロール、0.5g/Lグルコース・1H2O、2mM MgSO4、50μg/mLカナマイシン）に、新鮮な終夜培養物を接種することによって発現させた。培養物を600nmにおける光学密度が0.8〜1.0になるまで37℃で成長させた。培養物を最終濃度0.1mMのIPTGで誘導した。発現は30℃で終夜行った。無細胞抽出物の調製は、遠心分離によって細胞を収穫した後の化学酵素溶解（chemoenzymatic lysis）によって行った。そのために、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7、1×CelLytic（商標）B細胞溶解試薬（Sigma）、2mM Mg2＋（MgCl2またはMgSO4として）、0.5mg/mLリゾチームおよび20U/mLヌクレアーゼを含有する緩衝液に細胞を懸濁し、30℃で45分間インキュベートした。可溶性酵素を含有する無細胞抽出物を、3,270×gおよび4℃で30分間の遠心分離によってデブリから分離した。
【０１９２】
実施例3：  熱安定性に対するスクロースの効果
実施例2で得たSEQ ID NO:1のTPの酵素調製物の50μLアリコートを、1Mスクロースと共に、および1Mスクロースなしで、36〜53.7℃の範囲の温度で15分間インキュベートした。変性したタンパク質を遠心分離によって分離した。その結果得られた上清および熱不活化工程なしの細胞抽出物の活性を、以下のアッセイを使って決定した。加リン酸分解活性は、トレハロースから生成したaG1Pがホスホグルコムターゼによってグルコース-6-リン酸に変換される連続共役アッセイを使って、30℃でアッセイした。グルコース-6-リン酸とNADPは、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼによって、6-ホスホ-グルコネートとNADPHとに変換される。検出は、NADPHの吸光度を340nmで測定することに基づく。アッセイ溶液は、75mMリン酸カリウム緩衝液pH7、2.5mM NADP、10μMグルコース1,6-二リン酸、10mM MgCl2、225mMトレハロース、3U/mLホスホグルコムターゼおよび3.4U/mLグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼを含有した。1Uは、指定された条件において1μmolのaG1Pの生成を触媒する酵素の量と定義される。図1は、安定剤としての1Mスクロースありおよび1MスクロースなしでのSEQ ID NO:1の変性プロファイルであり、熱不活化を受けていない酵素調製物との比較で、得られた残存活性を示している。1Mスクロースの添加はおよそ40℃から47.5℃へのTm50の増加をもたらす。そこで、TP用の安定剤として1Mスクロースを選んだ。
【０１９３】
実施例4：  TPバリアントの残存活性
実施例2で得たSEQ ID NO:1〜79、SEQ ID NO:84〜159およびSEQ ID NO:190のTP酵素の酵素調製物の50μLアリコートを1Mスクロースと共に、52℃で15分間インキュベートした。変性したタンパク質を遠心分離によって分離した。その結果得られた上清および熱不活化工程なしの細胞抽出物の活性を、以下のアッセイを使って決定した。合成活性は以下の条件を使って40℃でアッセイした:50mM MESナトリウム緩衝液pH7、100mM aG1Pおよび500mMグルコース。遊離したリン酸を、酸性条件下でのモリブデン酸との複合体形成に基づくアッセイで測定することによって、反応の進行を断続的に決定した。モリブデン酸複合体は硫酸第一鉄によって還元されて青色を呈し、それを750nmでの光度測定によって分析する。分析のために、250μLの試料を250μLの0.5M HClおよび500μLのモリブデン酸試薬（3.5％硫酸中の73.2g/L Fe（II）SO4・7H2Oおよび10g/Lモリブデン酸アンモニウム・4H2O）と混合する。室温で15〜30分間のインキュベーション後に、750nmで吸光度を測定する。外部標準を使って試料中の無機リン酸の量を定量する。1Uは、指定された条件において1μmolの無機リン酸の生成を触媒する酵素の量と定義される。残存活性は、熱処理後の活性を熱処理なしの活性で割って100を掛けることによって算出した。その結果得られた残存活性を表3に列挙する。
【０１９４】
（表３）52℃で15分間のインキュベーション後の残存活性（％）
2021503955.tif 000023
2021503955.tif 000024
2021503955.tif 000025
2021503955.tif 000026
2021503955.tif 000027
【０１９５】
実施例2で得たSEQ ID NO:160〜189のTP酵素の酵素調製物の50μLアリコートを1Mスクロースと共に、52.5℃で15分間インキュベートした。変性したタンパク質を遠心分離によって分離した。その結果得られた上清および熱不活化工程なしの細胞抽出物の活性を、以下のアッセイを使って決定した。合成活性は以下の条件を使って40℃でアッセイした:50mM MESナトリウム緩衝液pH7、100mM aG1Pおよび500mMグルコース。遊離したリン酸を、酸性条件下でのモリブデン酸との複合体形成に基づくアッセイで測定することによって、反応の進行を断続的に決定した。モリブデン酸複合体は硫酸第一鉄によって還元されて青色を呈し、それを750nmでの光度測定によって分析する。分析のために、250μLの試料を250μLの0.5M HClおよび500μLのモリブデン酸試薬（3.5％硫酸中の73.2g/L Fe（II）SO4・7H2Oおよび10g/Lモリブデン酸アンモニウム・4H2O）と混合する。室温で15〜30分間のインキュベーション後に、750nmで吸光度を測定する。外部標準を使って試料中の無機リン酸の量を定量する。1Uは、指定された条件において1μmolの無機リン酸の生成を触媒する酵素の量と定義される。残存活性は、熱処理後の活性を熱処理なしの活性で割って100を掛けることによって算出した。その結果得られた残存活性を表4に列挙する。表からわかるように、SEQ ID NO:176、178、180、185およびSEQ ID NO:188の残存活性は、50％を上回っている。これは、これらの配列のTm50値が52.5℃を上回ることを意味する。
【０１９６】
（表４）52℃で15分間のインキュベーション後の残存活性（％）
2021503955.tif 000028
【０１９７】
実施例5：  スクロースを伴うTPのTm50値の決定
実施例2で得たSEQ ID NO:1、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:58、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72、SEQ ID NO:73、SEQ ID NO:74、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:79、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:180およびSEQ ID NO:188のTP酵素の酵素調製物の50μLアリコートを1Mスクロースと共に36〜53.7℃の範囲の温度で15分間インキュベートした。変性したタンパク質は遠心分離によって分離した。その結果得られた上清および熱不活化工程なしの細胞抽出物の活性を、以下のアッセイを使って決定した。加リン酸分解活性は、トレハロースから生成したaG1Pがホスホグルコムターゼによってグルコース-6-リン酸に変換される連続共役アッセイを使って、30℃でアッセイした。グルコース-6-リン酸とNADPは、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼによって、6-ホスホ-グルコネートとNADPHとに変換される。検出は、NADPHの吸光度を340nmで測定することに基づく。アッセイ溶液は、75mMリン酸カリウム緩衝液pH7、2.5mM NADP、10μMグルコース1,6-二リン酸、10mM MgCl2、225mMトレハロース、3U/mLホスホグルコムターゼおよび3.4U/mLグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼを含有した。1Uは、指定された条件において1μmolのaG1Pの生成を触媒する酵素の量と定義される。残存活性は、熱処理後の活性を熱処理なしの活性で割って100を掛けることによって算出した。酵素が50％の残存活性を持つ温度としてTm50値を決定した（表５）。
【０１９８】
（表５）1Mスクロースを含有する50mMリン酸カリウム緩衝液pH7におけるTP酵素のTm50値
2021503955.tif 000029
【０１９９】
実施例6：  SPのTm50値の決定
実施例2で得たSEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:218およびSEQ ID NO:219のSP酵素の酵素調製物の50μLアリコートを、50℃〜80℃の範囲の温度で15分間インキュベートした。氷上で30分間の再生工程と沈殿したタンパク質を除去するための遠心分離の後に、上清中のスクロースホスホリラーゼ活性を、以下のアッセイを使って決定した。スクロースホスホリラーゼの加リン酸分解活性は、スクロース基質から生成したaG1Pがホスホグルコムターゼによってグルコース-6-リン酸に変換される連続共役アッセイを使って30℃でアッセイした。グルコース-6-リン酸とNADPは、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼによって、6-ホスホ-グルコネートとNADPHとに変換される。検出は、NADPHの吸光度を340nmで測定することに基づく。アッセイ溶液は、75mMリン酸カリウム緩衝液pH7、2.5mM NADP、10μMグルコース1,6-二リン酸、10mM MgCl2、250mMスクロース、3U/mLホスホグルコムターゼおよび3.4U/mLグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼを含有した。1Uは、指定された条件において1μmolのaG1Pの生成を触媒する酵素の量と定義される。さらに、熱処理を加えていない細胞抽出物の活性も同じアッセイを使って決定した。残存活性は、熱処理後の活性を熱処理なしの活性で割って100を掛けることによって算出した。酵素が50％の残存活性を持つ温度としてTm50値を決定した（表６）。
【０２００】
（表６）SP酵素のTm50値
2021503955.tif 000030
【０２０１】
実施例7：  GIの熱安定性
さまざまな温度で熱不活化を実施してから活性測定を行うことにより、グルコースイソメラーゼバリアントの変性プロファイルを決定した。実施例2で得たグルコースイソメラーゼ調製物をいくつかのアリコートに分割した。各グルコースイソメラーゼバリアントの60μLアリコートを65〜85℃の範囲の温度で15分間インキュベートした。変性したタンパク質は4℃および3,270×gで10分間の遠心分離によって分離した。上清の活性を以下のアッセイを使って決定した。以下の条件を使用し、40℃においてフルクトースからのグルコースの形成をモニタリングすることによって、グルコースイソメラーゼ活性をアッセイした:50mMリン酸カリウム緩衝液pH7、10 Mg2＋（MgCl2またはMgSO4として）、0.2mL/mL反応液のグルコースイソメラーゼ酵素調製物（最大収率が18％に達するように50mMリン酸カリウム緩衝液pH7に希釈）および200mMフルクトース。グルコースイソメラーゼの作用によってフルクトースから生成したグルコースは、グルコースがヘキソキナーゼによってグルコース-6-リン酸に変換される不連続共役アッセイを使って決定した。グルコース-6-リン酸とNADPは、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼによって、6-ホスホ-グルコネートとNADPHとに変換される。検出は、NADPHの吸光度を340nmで測定することに基づく。D-グルコース-HKキット（HK/G6P-DHフォーマット）をマイクロプレートフォーマットで使用した（Megazyme International Ireland（アイルランド、ウィックロウ）から入手可能な製品番号K-GLUHK-110AまたはK-GLUHK-220A）。このアッセイは、製造者の推奨に従って実施され、試料中のグルコースの量は外部標準を使って定量される。各グルコースイソメラーゼバリアントの別のアリコートは、熱不活化を行わずに、同じアッセイで活性についてそのままアッセイした。残存活性は、熱処理後の活性を熱処理なしの活性で割って100を掛けることによって算出した。酵素が50％の残存活性を持つ温度としてTm50値を決定した（表７）。
【０２０２】
（表７）50mMリン酸カリウム緩衝液pH7におけるグルコースイソメラーゼバリアントのTm50値
2021503955.tif 000031
【０２０３】
実施例8：  プロセス安定性の決定
SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:78、SEQ ID NO:160、SEQ ID NO:180およびSEQ ID NO:188のTPのプロセス安定性を、1Mスクロースを含有する50mMリン酸カリウム緩衝液pH7中、45℃で決定した。実施例2で得た1Mスクロースを含む酵素調製物を1Mスクロースを含有する50mMリン酸カリウム緩衝液pH7に希釈し、45℃で16日にわたってインキュベートした。試料を経時的に採取し、以下のアッセイを使って活性を測定した。加リン酸分解活性は、トレハロースから生成したaG1Pがホスホグルコムターゼによってグルコース-6-リン酸に変換される連続共役アッセイを使って、30℃でアッセイした。グルコース-6-リン酸とNADPは、グルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼによって、6-ホスホ-グルコネートとNADPHとに変換される。検出は、NADPHの吸光度を340nmで測定することに基づく。アッセイ溶液は、75mMリン酸カリウム緩衝液pH7、2.5mM NADP、10μMグルコース1,6-二リン酸、10mM MgCl2、225mMトレハロース、3U/mLホスホグルコムターゼおよび3.4U/mLグルコース6-リン酸デヒドロゲナーゼを含有した。1Uは、指定された条件において1μmolのaG1Pの生成を触媒する酵素の量と定義される。残存活性は、熱処理後の活性を熱処理なしの活性で割って100を掛けることによって算出した。結果を図2に示す。SEQ ID NO:1は、最初の3時間以内に迅速な活性喪失を示し、およそ1時間の半減期を示した。Tm50値から予期されるとおり、新しいバリアントは大きく改良されたプロセス安定性を示した。SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:65およびSEQ ID NO:78は、最も大きな改良を示し、半減期はおよそ8.8日であった。これは、野生型酵素と比較して200倍以上の改良にあたる。
【０２０４】
実施例9：  トレハロース合成：  さまざまな温度での三酵素（3E）プロセス
それぞれ30℃、45℃、50℃または55℃に予熱した110mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5、1.25Mスクロース、GI酵素およびTP酵素を含有する反応アリコートに、SP酵素を加える。aG1P分解副反応を避けるために、すべての酵素を、熱精製するか（例えば55℃、60℃または他の適切な温度で15分間）、欠失株から得るか、または当技術分野において公知の任意の生化学的方法、例えば沈殿またはクロマトグラフィーなどを使って精製する。反応を500rpm、30℃、45℃、50℃または55℃でインキュベートする。SP酵素はSEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219から選択することができる。TP酵素は
2021503955.tif 000032
から選択することができる。GI酵素は、SEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240から選択することができる。試料を経時的に採取し、フルクトース、グルコース、スクロースおよびトレハロースの量を、HPLCで決定する（カラム:Luna 5μm NH2 100Å、250×4.6mm（Phenomenex）、カラム温度:40℃、移動相:80/20（v/v）アセトニトリル/水、無勾配分析、流速:2mL/分、注入量:10μL。試料中のフルクトース、グルコース、スクロースおよびトレハロースの量は外部標準を使って定量する）。あるいは、SEQ ID NO:10もしくは11のSPおよび/またはSEQ ID NO:11のGIを使用することもできる。
【０２０５】
実施例10：  トレハロース合成：  さまざまなスクロース濃度での三酵素（3E）プロセス
実施例5と同様に、110mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5、GI酵素、TP酵素および300mMまたは1Mのスクロースを含有する反応アリコートに、SP酵素を加えた。aG1P分解副反応を避けるために、すべての酵素を、熱精製するか（例えば55℃、60℃または他の適切な温度で15分間）、欠失株から得るか、または当技術分野において公知の任意の生化学的方法、例えば沈殿またはクロマトグラフィーなどを使って精製する。SP酵素はSEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219から選択することができる。TP酵素は
2021503955.tif 000033
から選択することができる。GI酵素はSEQ ID NO:220、SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222、SEQ ID NO:223、SEQ ID NO:224、SEQ ID NO:225、SEQ ID NO:226、SEQ ID NO:227、SEQ ID NO:228、SEQ ID NO:229、SEQ ID NO:230、SEQ ID NO:231、SEQ ID NO:232、SEQ ID NO:233、SEQ ID NO:234、SEQ ID NO:235、SEQ ID NO:236、SEQ ID NO:237、SEQ ID NO:238、SEQ ID NO:239、SEQ ID NO:240から選択することができる。反応を500rpm、45℃でインキュベートする。試料を経時的に採取し、フルクトース、グルコース、スクロースおよびトレハロースの量を、HPLCで決定する（カラム:Luna 5μm NH2 100Å、250×4.6mm（Phenomenex）、カラム温度:40℃、移動相:80/20（v/v）アセトニトリル/水、無勾配分析、流速:2mL/分、注入量:10μL。試料中のフルクトース、グルコース、スクロースおよびトレハロースの量は外部標準を使って定量する）。
【０２０６】
実施例11：  トレハロース合成：  二酵素（2E）プロセス
それぞれ30℃、50℃または55℃に予熱した110mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5、300mMスクロース、300mMグルコースおよびTP酵素を含有する反応アリコートに、SP酵素を加える。aG1P分解副反応を避けるために、すべての酵素を、熱精製するか（例えば55℃、60℃または他の適切な温度で15分間）、欠失株から得るか、または当技術分野において公知の任意の生化学的方法、例えば沈殿またはクロマトグラフィーなどを使って精製する。反応を500rpm、30℃、50℃または55℃でインキュベートする。SP酵素はSEQ ID NO:202、SEQ ID NO:203、SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205、SEQ ID NO:206、SEQ ID NO:207、SEQ ID NO:208、SEQ ID NO:209、SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211、SEQ ID NO:212、SEQ ID NO:213、SEQ ID NO:214、SEQ ID NO:215、SEQ ID NO:216、SEQ ID NO:217、SEQ ID NO:218、SEQ ID NO:219から選択することができる。TP酵素は
2021503955.tif 000034
から選択することができる。試料を経時的に採取し、フルクトース、グルコース、スクロースおよびトレハロースの量を、HPLCで決定する（カラム:Luna 5μm NH2 100Å、250×4.6mm（Phenomenex）、カラム温度:40℃、移動相:80/20（v/v）アセトニトリル/水、無勾配分析、流速:2mL/分、注入量:10μL。試料中のフルクトース、グルコース、スクロースおよびトレハロースの量は外部標準を使って定量する）。
【０２０７】
実施例12：  KM値の決定
以下のアッセイを使用し、以下の条件下で、50〜1000mMフルクトースの範囲内のさまざまなフルクトース濃度において、グルコースイソメラーゼバリアントの活性を決定した:10mM MgSO4、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.0、40℃。グルコースイソメラーゼ活性を測定するための反応は、以下の条件において、フルクトースからのグルコースの形成をモニタリングすることによって行った:50mMリン酸カリウム緩衝液pH7、10mM MgSO4、0.05mL/mL反応液のグルコースイソメラーゼ酵素調製物（最大収率が18％に達するように50mMリン酸カリウム緩衝液pH7に希釈）、50〜1000mMのフルクトース濃度および40℃。反応1mLにつき0.1mLの0.25M HClを加えることによって反応を停止させた。グルコースイソメラーゼの作用によってフルクトースから生成したグルコースを、グルコースがグルコースオキシダーゼによってグルコノラクトンに変換される不連続共役アッセイを使って決定した。この反応の副成物である過酸化水素は、セイヨウワサビペルオキシダーゼによって、2,2'-アジノ-ビス（3-エチルベンゾチアゾリン-6-スルホン酸（ABTS）を酸化するために使用されて、405nmに吸光度を示す着色生成物を与える。酸で停止させた反応の10μLアリコートを、50mMリン酸カリウム緩衝液pH6、1mM ABTS、5U/mLグルコースオキシダーゼおよび1U/mLセイヨウワサビペルオキシダーゼを含有するアッセイミックス90μLと混合した。30℃で60〜70分のインキュベーション後に、405nmにおける吸光度を測定した（終点測定）。外部標準を使って試料中のグルコースの量を定量する。その結果得られた活性をミカエリス-メンテンの式に当てはめて、そこから所与のグルコースイソメラーゼバリアントについてフルクトースに関するミカエリス定数KMを導き出した。表7からわかるように、試験したバリアントはどちらも野生型グルコースイソメラーゼよりも低いKMを示す。
【０２０８】
（表７）グルコースイソメラーゼのKM値
2021503955.tif 000035
【０２０９】
実施例13：  トレハロース合成：  30℃、39℃および40℃での三酵素プロセス
リン酸カリウム緩衝液pH7.5、スクロースおよびMgSO4を含有する反応アリコートをそれぞれ30℃、39℃または40℃に予熱し、SP、GIおよびTP酵素調製物を、そこに加えた（最終濃度:200mMスクロース、10mM MgSO4、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5、0.75U/mL SP、2.25U/mL GI、0.5U/mL TP）。SEQ ID NO:160のTP酵素調製物を含有する反応は以下の最終組成を持った:200mMスクロース、10mM MgSO4、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5、0.405U/mL SP、1.215U/mL GI、0.27U/mL TP。aG1P分解副反応を避けるために、すべての酵素を、熱精製するか（例えば60℃で15分間）、欠失株から得るか、または当技術分野において公知の任意の生化学的方法、例えば沈殿またはクロマトグラフィーなどを使って精製した。GE Helathcare製のPD-10カラムを製造者の説明書に従って使用することにより、市販のGI Sternenzym GI 3000（Sternenzym GmbH＆Co.KG、アーレンスブルク）を脱塩し、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7に溶出させた。市販の固定化GI Sweetzyme（登録商標）IT Extra（Novozymes、Sigma＃G4166）を微粉末に粉砕した。反応を500rpmで振とうしながら、それぞれ30℃、39℃または40℃の温度でインキュベートした。
【０２１０】
23時間後に試料を採取し、トレハロースの量をHPLCで決定した（カラム:Luna 5μm NH2 100Å、250×4.6mm（Phenomenex）、カラム温度:40℃、移動相:80/20（v/v）アセトニトリル/水、無勾配分析、流速:2mL/分、注入量:10μL）。外部標準を使って試料中のトレハロースの量を定量した。
【０２１１】
さまざまなTP酵素により、ただし同じSP酵素およびGI酵素を使って、30℃、39℃および40℃で23時間後に形成されたトレハロースの量およびTP1kUあたりの生産性を、表8に示す。
【０２１２】
（表８）30℃、39℃または40℃で23時間後のトレハロース形成
2021503955.tif 000036
【０２１３】
このデータは、TPバリアントの使用が、野生型配列SEQ ID NO:1およびSEQ ID NO:160と比較して、39℃および40℃の温度でのトレハロース合成プロセス（三酵素プロセス）におけるトレハロース合成にとって有利であることを示している。
【０２１４】
表9は、さまざまなSP酵素調製物をそれぞれSEQ ID 1のTP酵素調製物またはSEQ ID 65のTP酵素調製物と共に使用した場合の23時間後のトレハロース形成およびTP1kUあたりの生産性を示している。すべてのアッセイにおいて、同じGI酵素調製物を反応に加えた。
【０２１５】
（表９）30℃、39℃または40℃で23時間後のトレハロース形成
2021503955.tif 000037
【０２１６】
このデータは、野生型酵素の代わりにTPバリアントによってトレハロースを生産することの利点が、プロセス中に存在するSP酵素候補とは無関係であることを示している。さらに、さまざまなSP酵素がトレハロース合成に適していることも明白である。
【０２１７】
表10は、さまざまなGI酵素調製物をSEQ ID 1のTP酵素調製物またはSEQ ID 65のTP酵素調製物と共に使用した場合の23時間後のトレハロース形成およびTP1kUあたりの生産性を示している。すべてのアッセイにおいて、同じSP酵素調製物を反応に加えた。
【０２１８】
（表１０）30℃、39℃または40℃で23時間後のトレハロース形成
2021503955.tif 000038
【０２１９】
このデータは、野生型酵素の代わりにTPバリアントによってトレハロースを生産することの利点が、プロセス中に存在するGI酵素候補とは無関係であることを示している。さらに、さまざまなGI酵素がトレハロース合成に適していることも明白である。
【０２２０】
実施例14：  トレハロース合成：  200mM、600mMおよび900mMスクロースにおける三酵素（3E）プロセス
リン酸カリウム緩衝液pH7.5、スクロースおよびMgSO4を含有する反応アリコートを30℃に予熱し、SP、GIおよびTP酵素調製物を、そこに加えた（最終濃度:それぞれ200mM、600mMまたは900mMスクロース、10mM MgSO4、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5、0.525U/mL SP、1.575U/mL GI、0.35U/mL TP）。aG1P分解副反応を避けるために、すべての酵素を、熱精製するか（例えば60℃で15分間）、欠失株から得るか、または当技術分野において公知の任意の生化学的方法、例えば沈殿またはクロマトグラフィーなどを使って精製した。GE Helathcare製のPD-10カラムを製造者の説明書に従って使用することにより、市販のGI Sternenzym GI 3000（Sternenzym GmbH＆Co.KG、アーレンスブルク）を脱塩し、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7に溶出させた。市販の固定化GI Sweetzyme（登録商標）IT Extra（Novozymes、Sigma＃G4166）を微粉末に粉砕した。反応を500rpmおよび30℃でインキュベートした。
【０２２１】
試料を経時的に採取し、トレハロースの量をHPLCで決定した（カラム:Luna 5μm NH2 100Å、250×4.6mm（Phenomenex）、カラム温度:40℃、移動相:80/20（v/v）アセトニトリル/水、無勾配分析、流速:2mL/分、注入量:10μL。試料中のトレハロースの量は外部標準を使って定量した）。結果を表11に示す。
【０２２２】
（表１１）200、600または900mMスクロースを使った23時間後のトレハロース形成
2021503955.tif 000039
【０２２３】
このデータは、本3Eトレハロース合成プロセスにおいて、TPおよび酵素調製物が900mMスクロースまでは基質阻害を示さないことを示している。
【０２２４】
実施例15：  トレハロース合成：  30℃、42℃および43℃での二酵素（2E）プロセス
リン酸カリウム緩衝液pH7.5、スクロース、グルコースおよびMgSO4を含有する反応アリコートをそれぞれ30℃、42℃または43℃に予熱し、そこにSPおよびTP酵素を加えた（最終濃度:200mMスクロース、200mMグルコース、10mM MgSO4、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7.5、0.525U/mL SP、0.35U/mL TP）。aG1P分解副反応を避けるために、すべての酵素を、熱精製するか（例えば60℃で15分間）、欠失株から得るか、または当技術分野において公知の任意の生化学的方法、例えば沈殿またはクロマトグラフィーなどを使って精製した。GE Helathcare製のPD-10カラムを製造者の説明書に従って使用することにより、市販のGI Sternenzym GI 3000（Sternenzym GmbH＆Co.KG、アーレンスブルク）を脱塩し、50mMリン酸カリウム緩衝液pH7に溶出させた。反応を500rpmおよびそれぞれ30℃、42℃または43℃でインキュベートした。試料を経時的に採取し、トレハロースの量をHPLCで決定した（カラム:Luna 5μm NH2 100Å、250×4.6mm（Phenomenex）、カラム温度:40℃、移動相:80/20（v/v）アセトニトリル/水、無勾配分析、流速:2mL/分、注入量:10μL。試料中のトレハロースの量は外部標準を使って定量した）。
【０２２５】
結果を表12に示す。
【０２２６】
（表１２）30℃、42℃および43℃で23時間後のトレハロース形成
2021503955.tif 000040
【０２２７】
このデータは、TPバリアントの使用が、42℃および43℃の温度でのトレハロース合成プロセス（2E）におけるトレハロース合成にとって、野生型配列SEQ ID NO:1と比較して有利であることを示している。
【図１】
2021503955.tif 000048
【図２】
2021503955.tif 000049
【配列表】
2021503955000001.app
【国際調査報告】
2021503955.tif 000050
2021503955.tif 000051
2021503955.tif 000052
2021503955.tif 000053