(57)【要約】  無血清培地によりキメラ抗原レセプターＴ細胞を調製する方法を提供する。当該方法は以下の工程を含む(ａ)ＰＢＭＣ細胞を提供する工程；(ｂ)前記ＰＢＭＣ細胞に対してネガティブ選別処理を行い、選別されたＰＢＭＣ細胞を得る；(ｃ)前記選別されたＰＢＭＣ細胞を活性化して、活性化されたＴ細胞を得る工程；(ｄ)前記活性化Ｔ細胞にキメラ抗原レセプターを発現するウイルスベクターを用いて遺伝子トランスフェクションを行い、トランスフェクトされたＴ細胞を得る工程；(ｅ)前記トランスフェクトしたＴ細胞からウイルスを除去し、ウイルス除去Ｔ細胞を得る工程；および(ｆ)前記ウイルス除去Ｔ細胞を増殖培養し、キメラ抗原レセプターＴ細胞を得る工程。【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原レセプターＴ細胞を調製する無血清方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ)  無血清培地に再懸濁したＰＢＭＣ細胞を提供する工程；
(ｂ)  工程（ａ）における前記ＰＢＭＣ細胞に対してネガティブ選別処理を行い、選別されたＰＢＭＣ細胞を得る；
(ｃ)  工程（ｂ）で得られた前記選別されたＰＢＭＣ細胞を活性化して、活性化されたＴ細胞を得る工程；
(ｄ)  工程（ｃ）で得られた前記活性化Ｔ細胞にキメラ抗原レセプターを発現するウイルスベクターを用いて遺伝子トランスフェクションを行い、トランスフェクトされたＴ細胞を得る工程；
(ｅ)  前記トランスフェクトしたＴ細胞からウイルスを除去し、ウイルス除去Ｔ細胞を得る工程；および
(ｆ)前記ウイルス除去Ｔ細胞を増殖培地に再懸濁し、増殖培養を行ってキメラ抗原レセプターＴ細胞を得、前記キメラ抗原レセプターＴ細胞が所定量に達したときに前記キメラ抗原レセプターＴ細胞を採取する工程であって、前記増殖培地が細胞因子を含む無血清培地である、該工程。
【請求項２】
無血清培地が全ての工程で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）において、前記活性化処理が、塩基性媒体および添加剤を含有する活性化媒体中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記塩基性培地が、以下の群: ＬＯＮＺＡ Ｘ−ＶＩＶＯ、ＬＩＦＥ ＣＴＳ ＡＩＭ Ｖ、ＬＩＦＥ ＯｐＴｍｉｚｅｒ ＳＦＭ、ＲＰＭＩ １６４０、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ、およびＳｔｅｍｌｉｎｅａｅから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項５】
前記添加剤が、以下の群：ヒト血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、植物由来組換えアルブミンまたはそれらの組み合わせ、好ましくは組換えアルブミンから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｆ）における前記増殖培地が、細胞因子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記細胞因子が、以下の群: ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７またはそれらの組み合わせから選択される、請求項１に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｆ）において、培養フラスコ、培養バッグ、またはそれらの組み合わせの群から選択される容器中で前記増殖培養を行う、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載のキメラ抗原レセプターＴ細胞を調製する無血清方法によって調製されるものである、キメラ抗原レセプターＴ細胞。
【請求項１０】
（Ａ）請求項２に記載のキメラ抗原レセプターＴ細胞、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む、細胞調製物。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は生物学的技術の分野に関し、特に無血清培養によりキメラ抗原レセプターＴ細胞を調製する方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
キメラ抗原レセプターＴ細胞による免疫療法は、Ｔ細胞にｓｃＦｖ断片や細胞内シグナルドメインを持たせ、遺伝子編集の手段により腫瘍関連抗原を特異的に認識し、Ｔ細胞のターゲッティング、殺傷、耐久性を高める新しい治療技術である。近年、キメラ抗原レセプターＴ細胞免疫療法は臨床腫瘍免疫療法において良好な性能を有し、腫瘍の臨床的治癒に希望をもたらしている。
【０００３】
キメラ抗原レセプターＴ細胞の調製プロセスは比較的複雑であり、細胞活性化、選別、トランスフェクションおよび増殖培養などの多くの操作を含む。プロセスフロー、設備、および試薬選択のような任意の連結の不十分さは細胞調製の質に重要な影響を有し、これは結果として、キメラ抗原レセプターＴ細胞の活力、収率、安全性、およびその後の臨床効果に影響を及ぼす。
【０００４】
血清は、従来の細胞培養プロセスにおける重要な成分であるが、細胞に対する毒性および副作用を有する物質を含有する。さらに、血清の質はバッチによって大きく変化する。さらに、マイコプラズマ、ウイルスその他のリスクが血清採取の過程に持ち込まれる可能性があり、細胞治療の発展を大きく妨げている。
【０００５】
現在、市販されているキメラ抗原レセプターＴ細胞の無血清調製のための満足のいく効率的なプロセスは存在せず、キメラ抗原レセプターＴ細胞免疫療法のさらなる開発、促進および適用に深刻な影響を及ぼしている。
【０００６】
したがって、無血清細胞培養に基づいてキメラ抗原レセプターＴ細胞を調製する安全かつ効率的な方法を開発することが、当技術分野において緊急に必要とされている。
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【０００７】
本発明の目的は、無血清細胞培養に基づいてキメラ抗原レセプターＴ細胞を調製する安全かつ効率的な方法を提供することである。
【課題を解決するための手段】
【０００８】
本発明の第１の態様において、キメラ抗原レセプターＴ細胞を調製する無血清方法が提供される：
(ａ)  無血清培地に再懸濁したＰＢＭＣ細胞を提供する工程；
(ｂ)  工程（ａ）における前記ＰＢＭＣ細胞に対してネガティブ選別処理（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｓｏｒｔｉｎｇ ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）を行い、選別されたＰＢＭＣ細胞を得る；
(ｃ)  工程（ｂ）で得られた前記選別されたＰＢＭＣ細胞を活性化して、活性化されたＴ細胞を得る工程；
(ｄ)  工程（ｃ）で得られた前記活性化Ｔ細胞にキメラ抗原レセプターを発現するウイルスベクターを用いて遺伝子トランスフェクションを行い、トランスフェクトされたＴ細胞を得る工程；
(ｅ)  前記トランスフェクトしたＴ細胞からウイルスを除去し、ウイルス除去Ｔ細胞を得る工程；および
(ｆ)前記ウイルス除去Ｔ細胞を増殖培地に再懸濁し、増殖培養を行ってキメラ抗原レセプターＴ細胞を得、前記キメラ抗原レセプターＴ細胞が所定量に達したときに前記キメラ抗原レセプターＴ細胞を採取する工程であって、前記増殖培地が細胞因子を含む無血清培地である、該工程。
【０００９】
別の好ましい実施形態では、無血清培地が本方法の全ての工程で使用される。
【００１０】
別の好ましい実施形態では、工程（ａ）において、ＰＢＭＣ細胞は蘇生されたＰＢＭＣ細胞である。
【００１１】
別の好ましい実施形態において、ＰＢＭＣ細胞は、自己または同種異系である。
【００１２】
別の好ましい態様において、ＰＢＭＣ細胞はヒト由来である。
【００１３】
別の好ましい実施形態では、工程（ｂ）において、ネガティブ選別処理はＣｌｉｎｉＭＡＣＳを使用する。
【００１４】
別の好ましい実施形態では、工程（ｃ）において、活性化のための抗ＣＤ３／ＣＤ２８抗体は活性化処理を行う。
【００１５】
別の好ましい実施形態では、工程（ｃ）において、活性化処理は塩基性媒体および添加剤を含有する活性化媒体中で行われる。
【００１６】
別の好ましい実施形態では、前記塩基性培地が、以下の群から選択される: ＬＯＮＺＡ Ｘ−ＶＩＶＯ、ＬＩＦＥ ＣＴＳ ＡＩＭ Ｖ、ＬＩＦＥ ＯｐＴｍｉｚｅｒ ＳＦＭ、ＲＰＭＩ １６４０、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ、およびＳｔｅｍｌｉｎｅａｅ。
別の好ましい実施形態では、添加剤が以下の群から選択される：ヒト血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、植物由来組換えアルブミンまたはそれらの組み合わせ、好ましくは組換えアルブミン。
【００１７】
別の好ましい実施形態では、アルブミン濃度が０．０１％〜５０%(Ｗ/Ｖ)、好ましくは０．０５％〜３０%(Ｗ/Ｖ)、より好ましくは０．１％〜２０%(Ｗ/Ｖ)である。
【００１８】
別の好ましい実施形態では、活性化処理が以下の群から選択される：抗体コーティング処理、遊離抗体処理、活性化磁気ビーズ処理、またはそれらの組み合わせ。
【００１９】
別の好ましい実施形態では、活性化処理において、抗体濃度は１０ｎｇ／ｍｌ〜１００ｎｇ／ｍｌである。
【００２０】
別の好ましい実施形態では、活性化処理において、細胞に対する活性化磁性ビーズの数の比は、０．２５〜５： １、好ましくは０．５〜３： １である。
【００２１】
別の好ましい実施形態では、活性化処理の時間は３〜８日である。
【００２２】
別の好ましい実施形態では工程（ｄ）において、ウイルスベクターは以下の群から選択される：レンチウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、アデノウイルス、またはそれらの組み合わせ。
【００２３】
別の好ましい実施形態において、遺伝子トランスフェクションの感染多重度（ＭＯＩ）は、０．５〜３０、好ましくは１〜２０、より好ましくは２〜１０である。
【００２４】
別の好ましい実施形態では、工程（ｅ）において、ウイルス除去処理は、トランスフェクトされた細胞を無血清培地中に再懸濁する工程、細胞を遠心分離する工程、およびウイルス除去されたＴ細胞を得るために上清を吸引する工程を含む。
【００２５】
別の好ましい実施形態では、工程（ｆ）において、所定の量は１×１０9〜１×１０11、好ましくは２×１０9〜２×１０10である。
【００２６】
別の好ましい実施形態において、工程（ｆ）における増殖培地は、細胞因子をさらに含む。
【００２７】
別の好ましい実施形態において、細胞因子は、以下の群から選択される：ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７またはそれらの組み合わせ。
【００２８】
別の好ましい実施形態において、各細胞因子の濃度は、独立してｌ〜１００ｎｇ／ｍｌ、好ましくは２〜８０ｎｇ／ｍｌ、より好ましくは５〜５０ｎｇ／ｍｌである。
【００２９】
別の好ましい実施形態では、工程（ｆ）において、増殖培養は、以下の群から選択される容器中で行われる：培養フラスコ、培養バッグ、またはそれらの組み合わせから選択される容器中で行われる。
【００３０】
別の好ましい実施形態では、培養フラスコが以下の群から選択される：Ｇ−Ｒｅｘ培養フラスコ、Ｔ７５培養フラスコ、またはそれらの組み合わせ。
【００３１】
別の好ましい実施形態では、容器はＧ−Ｒｅｘ培養フラスコである。
【００３２】
別の好ましい実施形態において、増殖培養の時間は、８〜１４日である。
【００３３】
別の好ましい実施形態では、工程（ｆ）において、膨張培養において、容器を交換する操作は行われない。
【００３４】
別の好ましい実施形態において、キメラ抗原レセプターは、以下の群: ＣＤ１９、ＣＤ２３などから選択される標的を指向する。
【００３５】
本発明の第２の態様において、キメラ抗原レセプターＴ細胞が提供される。当該キメラ抗原レセプターＴ細胞は、請求項１に記載のキメラ抗原レセプターＴ細胞を調製する無血清方法によって調製される。
【００３６】
本発明の第３の態様において、（ａ）請求項２に記載のキメラ抗原レセプターＴ細胞および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む細胞調製物が提供される。
【００３７】
別の好ましい実施形態において、細胞調製物は液体調製物（例えば、注射）である。
【００３８】
本発明の範囲内で、本発明の前述の技術的特徴および以下に具体的に説明する技術的特徴（例えば、実施形態）を互いに組み合わせて、新しいまたは好ましい技術的解決策を形成することができることを理解されたい。
【００３９】
書面の制約のため、それらは１つずつ記述されない。
【図面の簡単な説明】
【００４０】
【図１】図１は、異なる培地におけるＣＡＲ−Ｔ細胞の成長曲線の変化を示す。
【図２】図２は、Ｇ−Ｒｅｘ培養フラスコ、培養バッグおよびＴ７５培養フラスコにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖曲線の変化を示す。
【図３】図３は、Ｇ−Ｒｅｘ培養フラスコ、培養バッグおよびＴ７５培養フラスコにおけるＣＡＲ−Ｔ細胞の陽性率曲線の変化を示す。
【図４】図４は、異なる細胞培養添加物がＣＡＲ−Ｔ細胞の増殖に及ぼす影響を示す。
【図５】図５は、異なる選別方法における細胞の増殖速度を示す。
【発明を実施するための形態】
【００４１】
広範かつ詳細な研究の後、本発明者らは、キメラ抗原レセプターＴ細胞を調製するための無血清培養の独特かつ革新的なプロセスを初めて開発した。本発明の無血清培養法に基づき、キメラ抗原レセプターＴ細胞の培養の成功率および収率を高めることができるだけでなく、ＣＡＲ−Ｔ細胞に対する血清の毒性副作用を回避することができ、血清に起因して導入されるリスクを有意に低減または排除して、キメラ抗原レセプターＴ細胞免疫療法のさらなる開発および促進を助けることができる。これにより、本発明が完成する。
【００４２】
＜定義＞
＜方法＞
本発明では、ポジティブ選別またはネガティブ選別を用いることができる。好ましい選別方法は、ＭＡＣＳに基づく選別方法である。例えば、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ技術を選別に使用することができる。
【００４３】
ＭＡＣＳは、高度に特異的な細胞選別技術である。主な成分には、ＭＡＣＳ微小球、ＭＡＣＳ選別カラムおよびＭＡＣＳ分離器が含まれる。ＭＡＣＳ微小球は、高度に特異的なモノクローナル抗体と結合した超常磁性粒子である。ＭＡＣＳ選別カラムは、永久磁場のＭＡＣＳ分離器内に配置される。ネガティブ選別は細胞混合物から非標的細胞中の磁気マーカーを除去する方法であり、すなわち、非磁気的に標識された細胞は標的細胞である。
【００４４】
好ましくは、本発明の方法では、所望の標的細胞を得るために、ネガティブ選別のためにＣｌｉｎｉＭＡＣＳまたはＣｌｉｎｉＭＡＣＳｐｌｕｓ選別技術（およびデバイス）を採用する。
【００４５】
典型的には、本発明における選別された細胞は、ＣＤ３陽性細胞から本質的に構成される。
【００４６】
＜キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ）＞
本明細書中で使用される場合、キメラ抗原レセプター（ＣＡＲ：Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）とは、細胞外ドメイン、任意のヒンジ領域、膜貫通ドメイン、および細胞内ドメインを含む。細胞外ドメインは、任意のシグナルペプチドおよび標的特異的結合要素（抗原結合ドメインとしても知られる）を含む。細胞内ドメインは、共刺激分子およびζ鎖部分を含む。ＣＡＲがＴ細胞に発現されると、細胞外セグメントは特定の抗原を認識した後、細胞内ドメインを介してシグナルを伝達することができ、細胞の活性化と増殖、細胞溶解毒性、ＩＬ−２やＩＦＮ−γなどの細胞因子の分泌を引き起こし、腫瘍細胞に影響を与え、腫瘍細胞を増殖させないようにしたり、他の方法で死滅や影響を受けるように促進したり、患者の腫瘍量を減少又は消滅させる。抗原結合ドメインは、好ましくは共刺激分子およびζ鎖由来の１つ以上の細胞内ドメインと融合される。
【００４７】
＜調製物＞
本発明は、上記第３の態様に具体的に記載されるような、細胞調製物を提供する。１の実施形態において、細胞調製物は、（ａ）本発明の第２の態様に記載されるキメラ抗原レセプターＴ細胞、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む。１の実施態様では、細胞調製物は液体調製物（例えば、注射剤）である。
【００４８】
本発明は、以下の主な利点を有する：
(ａ)  従来の細胞培養と比較して、本発明の培養方法は、無血清培地およびＧ−Ｒｅｘなどの培養系を採用し細胞に対する毒性副作用を有する物質の導入を回避し、キメラ抗原レセプターＴ細胞の培養の成功率および安全性を大幅に改善する。
【００４９】
(ｂ)  本発明の培養方法は、特別に最適化されたプロセスフローを採用し、それによって、キメラ抗原レセプターＴ細胞の培養の有効性、特に、収集されたＣＡＲ−Ｔ細胞の陽性率および収率を有意に改善する。
【００５０】
本発明は、特定の実施形態に関連してさらに説明される。これらの実施形態は本発明を例示することのみを意図しており、本発明の範囲を限定することを意図していないことを理解されたい。実験方法は、以下の実施形態において特定の条件を示すことなく、通常、従来の条件（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ： Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ,１９８９）に記載される条件）に従うか、または製造業者によって推奨される条件に従う。特に断らない限り、パーセンテージおよび部は重量パーセントおよび重量部である。
【実施例】
【００５１】
＜試薬＞
無血清培地：塩基性培地＋アルブミン
【実施例１】
【００５２】
＜培地選択＞
1.1  凍結保存又は新鮮なＰＢＭＣ
細胞数３００×１０6〜１０００×１０6の凍結保存または新鮮なＰＢＭＣを採取し、無血清培地に再懸濁する。
【００５３】
1.2  選別
ＣＤ１９およびＣＤ１４標識磁性ビーズを用いて、ＰＢＭＣを３０分間標識し、インキュベートし、必要に応じてＣｌｉｎｉＭＡＣＳ上で選別することにより必要なパイプを設置し、細胞インキュベーションの完了後、ＣＤ１９およびＣＤ１４標識不純物細胞を除去するためのネガティブ選別の操作を行い、ＣＤ３陽性細胞を主成分とする選別細胞を得る。
【００５４】
1.3  細胞活性化
ＣＤ３／ＣＤ２８を用いて選別から得た細胞を活性化し、最終濃度１．０％のアルブミンを含む無血清培地（ＩＬ−２を補充）を用いて、３×１０6〜６×１０6／ｍｌの細胞濃度で２日間接種培養を行う。
【００５５】
1.4  遺伝子形質導入
細胞を遠心分離し、上清を捨て、ＭＯＩ ２−１０に従って必要量のレンチウイルスを加え、無血清培地（最終濃度１．０％のアルブミンを含む）に再懸濁した後、培養フラスコに移し、３７℃、５% CO2で培養する（１２〜４８時間）。
【００５６】
ここで、レンチウイルスは標的ＣＡＲ遺伝子を発現するウイルスベクターである。
【００５７】
1. 5 ウイルス除去
細胞懸濁液を２００〜３００ｇで６〜８分間遠心分離する。上清を上清および廃棄し、細胞を再懸濁し、次いで細胞を無血清培地（最終濃度１．０％のアルブミンを含む）に移し、そして５０〜５００ＩＵ／ｍｌの濃度までＩＬ−２を添加し、それによってウイルス除去Ｔ細胞を得る。
【００５８】
1.6  増殖培地
ウイルスを除去したＴ細胞をＧ−Ｒｅｘ培養フラスコに移し、３７℃、５% CO2で増殖培養を行う。
【００５９】
増殖培養の３〜１０日後、Ｇ−Ｒｅｘ瓶を培養器から取り出し、細胞をよく混合し、試料を採取し、細胞を数え、ＩＬ−２を５０〜５００ＩＵ／ｍｌの濃度に補充し、細胞収量が１×１０9〜１×１０10のＣＡＲ−Ｔ細胞に達したとき、培養を継続し、回収する。
【００６０】
1.7  結果
採取した細胞において、ＣＡＲ−Ｔ陽性率は２０％を超えることが確認された。
【実施例２】
【００６１】
＜実験用消耗品の選択＞
２．１ ＰＢＭＣ蘇生、選別、細胞活性化および遺伝子形質導入
凍結保存ＰＢＭＣの蘇生、選別、細胞活性化、遺伝子導入には、実施例１と同様の方法を用いた。
【００６２】
2.2  ウイルス除去
前記細胞懸濁液を２００〜３００ｇで６〜８分間遠心分離する。上清を上清および廃棄し、フリックして細胞を再懸濁し、ウイルス除去Ｔ細胞を得る。
【００６３】
2.3  増殖培地
ウイルスを除去したＴ細胞を培地(OpTmizer SFM＋１．０％アルブミン）に移し、ＩＬ−２（最終濃度２５ＩＵ／ｍｌ）を加え、Ｇ−Ｒｅｘ培養フラスコ、培養袋、Ｔ７５培養フラスコに移し、３７℃、５% CO2で培養を継続する。
【００６４】
３日間培養を続けた後、Ｇ−Ｒｅｘ培養フラスコ、培養バッグ、Ｔ７５培養フラスコからそれぞれ試料を採取し、細胞数を計測し、細胞密度と細胞生存率を記録する。サンプルは検査用に保存する。
【００６５】
ＩＬ−２（最終濃度は２５ＩＵ／ｍｌ）を補充し、インキュベーターに戻し、培養を続ける。
【００６６】
１日間培養を続けた後、Ｇ−Ｒｅｘ培養フラスコ、培養バッグ、Ｔ７５培養フラスコからそれぞれ試料を採取し、細胞数を計測し、細胞密度と細胞生存率を記録する。サンプルは検査用に保存する。
【００６７】
２日間培養を続けた後、Ｇ−Ｒｅｘ培養フラスコ、培養バッグおよびＴ７５培養フラスコからそれぞれサンプルを採取し、細胞を計数し、細胞密度および細胞生存率を記録する。サンプルは検査用に保存する。
【００６８】
2.4  結果
図２に示すように、ＣＡＲ−Ｔ細胞は、Ｇ−Ｒｅｘ培養系において、培養バッグ及び培養フラスコよりも３日目から５日目までの細胞増殖速度が速かった。図３に示すように、ＣＡＲ−Ｔ細胞はＧ−Ｒｅｘにおいて高いＣＡＲ陽性率を維持することができ、細胞培養バッグ及び培養フラスコよりもディセント度合いが小さかった。すなわち、短時間に多数のＣＡＲ−Ｔ陽性細胞が必要とされる場合、Ｇ−Ｒｅｘは、細胞培養バッグ及び培養フラスコよりも増殖速度が速く、陽性率が高いという利点を有する。
【実施例３】
【００６９】
細胞培養添加実験
3.1  方法
この実施形態では、異なる添加剤ＩＬ−２、ＩＬ−７、ＩＬ−１５またはそれらの組み合わせを細胞培養培地に添加し、合計５つの実験群を用いた。
【表１】
2021531734.tif 000002
【００７０】
凍結保存したＰＢＭＣの蘇生、選別、磁気ビーズ標識活性化、遺伝子導入、磁気ビーズ除去、ウイルス除去および増殖培養を実施するために、実施例１と同じ方法を使用した。
【００７１】
1) 使用した培地は、ＯｐＴｍｉｚｅｒ ＳＦＭ＋アルブミンであった（最終濃度は１．０％であった）。
【００７２】
2)  ＩＬ−２を添加する全ての工程を、培養のために表１の実験群２〜５に対応する細胞因子で置き換えた。
【００７３】
3.2   結果
図４に示すように、培養系における細胞因子ＩＬ−２、ＩＬ−７およびＩＬ−１５の組み合わせは、細胞増殖の増加に最も優れた効果を有し、ＣＡＲ−Ｔ細胞の量を増加させるのに役立った。
【実施例４】
【００７４】
＜ポジティブ選別とネガティブ選別の比較実験＞
4.1  検査対象：
ポジティブ選別法およびネガティブ選別法をそれぞれ用いて、細胞培養に対する同じＰＢＭＣの効果を比較した。
【００７５】
4.2  細胞選別：
蘇生されたＰＢＭＣを選別緩衝液に再懸濁し、それを２つの等しい部分に分割し、それぞれ負の選別ＣＤ１９＋ＣＤ１４＋および正の選別ＣＤ３＋を行う。
【００７６】
4.3  細胞活性化：
選別した細胞に培地を接種し、活性化磁性ビーズを加え、よく混ぜて培養する。
【００７７】
4.4  ウイルストランスフェクション：
培養が２日目に到達したときの活性化細胞数を求め、ＭＯＩ(２〜１０）から必要なレンチウイルスベクター数を求め、対応するレンチウイルスベクターを採取し、培地に均等に再懸濁し、遠心分離して元の細胞上清を除き、レンチウイルスベクター懸濁液を加えて再懸濁し、培養を続ける。
【００７８】
4.5  ウイルスを除去し、磁気ビーズを活性化する：
培養３日目に、遠心分離によりウイルスを除去し、磁性格子により活性化磁性ビーズを除去し、培養培地を添加して培養を継続する。
【００７９】
培養８日目に試験を実施した。
【００８０】
4.6  結果
結果を表２及び図５に示す：
2021531734.tif 000003
ネガティブ選別法によるＰＢＭＣから採取した標的細胞の比率は、陽性選別法によるＰＢＭＣから採取した標的細胞の比率に近かったが、細胞増殖過程に関してはネガティブ選別法は陽性選別法と比較して明らかな増加を示した。すなわち、ネガティブ選別の方法の使用は、最終的に、より多くの陽性の細胞ＣＤ３の回収をもたらした。
【００８１】
本発明において言及される全ての文献はあたかも各文献が個々に参照として引用されるかのように、本明細書において参照として引用されている。さらに、本発明の上記教示内容を読んだ後、当業者は本発明に様々な変更または修正を加えることができ、これらの同等の形態もまた、本出願の特許請求の範囲によって限定される範囲内に入ることを理解されたい。
【図１】
2021531734.tif 000004
【図２】
2021531734.tif 000005
【図３】
2021531734.tif 000006
【図４】
2021531734.tif 000007
【図５】
2021531734.tif 000008
【手続補正書】
【提出日】令和3年5月28日(2021.5.28)
【手続補正１】
【補正対象書類名】特許請求の範囲
【補正対象項目名】全文
【補正方法】変更
【補正の内容】
【特許請求の範囲】
【請求項１】
キメラ抗原レセプターＴ細胞を調製する無血清方法であって、以下の工程を含む、方法：
(ａ)  無血清培地にＰＢＭＣ細胞を提供する工程；
(ｂ)  工程（ａ）の前記ＰＢＭＣ細胞に対してネガティブ選別を行い、選別されたＰＢＭＣ細胞を得る工程；
(ｃ)  工程（ｂ）の前記選別されたＰＢＭＣ細胞を活性化して、活性化されたＴ細胞を得る工程；
(ｄ)  工程（ｃ）の前記活性化Ｔ細胞にキメラ抗原レセプターを発現するウイルスベクターを用いて形質導入を行い、形質導入されたＴ細胞を得る工程；
(ｅ)  前記形質導入されたＴ細胞からウイルスベクターを除去する工程；および
(ｆ) 工程(ｅ)で得られた前記Ｔ細胞を増殖培地において増殖させる工程であって、前記増殖培地が無血清培地である、該工程。
【請求項２】
無血清培地が全ての工程で使用される、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
工程（ｃ）において、前記活性化が、塩基性培地および添加剤を含有する活性化媒体中で行われる、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記塩基性培地が、以下の群: ＬＯＮＺＡ Ｘ−ＶＩＶＯ、ＬＩＦＥ ＣＴＳ ＡＩＭ Ｖ、ＬＩＦＥ ＯｐＴｍｉｚｅｒ ＳＦＭ、ＲＰＭＩ １６４０、ＩｍｍｕｎｏＣｕｌｔ（商標）−ＸＦ、およびＳｔｅｍｌｉｎｅａｅから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記添加剤が、以下の群：ヒト血清アルブミン、組換えヒト血清アルブミン、植物由来組換えアルブミンまたはそれらの組み合わせ、好ましくは組換えアルブミンから選択される、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
工程（ｆ）における前記増殖培地が、サイトカインをさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項７】
前記サイトカインが、以下の群: ＩＬ−２、ＩＬ−１５、ＩＬ−７またはそれらの組み合わせから選択される、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
工程（ｆ）において、培養フラスコ、培養バッグ、またはそれらの組み合わせの群から選択される容器中で前記Ｔ細胞を増殖する、請求項１に記載の方法。
【請求項９】
請求項１に記載のキメラ抗原レセプターＴ細胞を調製する無血清方法によって調製されるものである、キメラ抗原レセプターＴ細胞。
【請求項１０】
（ａ）請求項９に記載のキメラ抗原レセプターＴ細胞、および（ｂ）薬学的に受容可能なキャリアを含む、細胞調製物。
【国際調査報告】
2021531734.tif 000009
2021531734.tif 000010
2021531734.tif 000011
2021531734.tif 000012