(57)【要約】免疫細胞を改変するための方法、改変された免疫細胞を含有する細胞組成物、組換え受容体をコードする核酸配列を特定のゲノム座位にターゲティングするための、および/または該ゲノム座位での該遺伝子の発現を調節するためのキットおよび製品、ならびに改変T細胞の養子移入を含む癌免疫療法に関連したそれらの応用が提供される。これらは、TRAC遺伝子および/またはTRBC遺伝子内の少なくとも1つの部位の遺伝子破壊と、少なくとも1つの標的部位の1つまたはその近傍への組換え受容体をコードする導入遺伝子の組み込みとを含むことができる。2021520202.tif 000092
2021520202.tif 000002
【特許請求の範囲】
【請求項１】
導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖と、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含有する組成物であって、該組換え受容体が、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、および/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、ここで、
該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％、または35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％より多くは、TRAC遺伝子および/またはTRBC遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含み、かつ/または該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％、または35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％より多くは、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖を発現しかつ/または該抗原への結合を示し、かつ
該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれる、組成物。
【請求項２】
導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖と、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含有する組成物であって、該組換え受容体が、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、および/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、ここで、
該複数の細胞間の組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数は、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30、またはそれ以下より低く、かつ/または
該複数の細胞間の組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数は、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、または10％低い、
組成物。
【請求項３】
改変T細胞が、TRAC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊を含む、請求項1または2に記載の組成物。
【請求項４】
改変T細胞が、TRBC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊を含む、請求項1〜3のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５】
改変T細胞が、TRAC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊およびTRBC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊を含む、請求項1〜4のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６】
TRBC遺伝子が、T細胞受容体β定常部1（TRBC1）遺伝子またはT細胞受容体β定常部2（TRBC2）遺伝子の一方または両方である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７】
遺伝子破壊が、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによるものである、請求項1〜6のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項８】
遺伝子破壊が、CRISPR-Cas9の組み合わせによるものであり、CRISPR-Cas9の組み合わせが該少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む、請求項1〜7のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項９】
CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体である、請求項8に記載の組成物。
【請求項１０】
複数の改変T細胞のそれぞれの遺伝子破壊が、エレクトロポレーションを介して複数のT細胞に導入されたRNPによってもたらされる、請求項9に記載の組成物。
【請求項１１】
少なくとも1つの標的部位が、TRAC、TRBC1および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、請求項1〜10のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１２】
gRNAが、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
2021520202.tif 000082
からなる群より選択される配列を含む、請求項8〜11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１３】
gRNAが、配列：
2021520202.tif 000083
を含むターゲティングドメインを有する、請求項8〜12のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１４】
gRNAが、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
2021520202.tif 000084
2021520202.tif 000085
からなる群より選択される配列を含む、請求項8〜11のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５】
gRNAが、配列：
2021520202.tif 000086
を含むターゲティングドメインを有する、請求項8〜11および14のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６】
導入遺伝子の組み込みが、複数のT細胞のそれぞれに導入された鋳型ポリヌクレオチドによるものであり、該鋳型ポリヌクレオチドが構造［5'相同性アーム］-［導入遺伝子］-［3'相同性アーム］を含む、請求項1〜15のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１７】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、請求項16に記載の組成物。
【請求項１８】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50もしくは約50から100もしくは約100ヌクレオチド長、100もしくは約100から250もしくは約250ヌクレオチド長、250もしくは約250から500もしくは約500ヌクレオチド長、500もしくは約500から750もしくは約750ヌクレオチド長、750もしくは約750から1000もしくは約1000ヌクレオチド長、または1000もしくは約1000から2000もしくは約2000ヌクレオチド長である、請求項16または17に記載の組成物。
【請求項１９】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、100もしくは約100から1000もしくは約1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチドの長さである、請求項16〜18のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２０】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、200、300、400、500、600、700、もしくは800、または約200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、請求項16〜19のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２１】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300または約300ヌクレオチドを超える長さであり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、400、500、もしくは600または約400、500、もしくは600ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値であり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、500もしくは約500から600もしくは約600ヌクレオチドの長さである、請求項16〜20のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２２】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300または約300ヌクレオチドを超える長さである、請求項16〜21のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２３】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれる、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２４】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位またはその近傍に組み込まれる、請求項1〜22のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２５】
組換え受容体がキメラ抗原受容体（CAR）である、請求項1〜24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２６】
CARが、
抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン（任意で、該抗原結合ドメインはscFvである）；膜貫通ドメイン；共刺激分子（任意で、4-1BB、任意でヒト4-1BBであるか、またはそれを含む）に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン；および一次シグナル伝達ITAM含有分子（任意で、CD3ζシグナル伝達ドメイン、任意でヒトCD3ζシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む）に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、
任意で、CARが、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとの間にスペーサーをさらに含む、
請求項25に記載の組成物。
【請求項２７】
組換え受容体が、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖である、請求項1〜24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項２８】
組換え受容体が、α（TCRα）鎖およびβ（TCRβ）鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、請求項27に記載の組成物。
【請求項２９】
前記導入遺伝子が1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントをさらに含み、マルチシストロン性エレメントが、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される、請求項28に記載の組成物。
【請求項３０】
マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2A、もしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む、請求項29に記載の組成物。
【請求項３１】
前記改変細胞が1つまたは複数の第2の導入遺伝子をさらに含み、第2の導入遺伝子が、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれる、請求項1〜24のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３２】
組換え受容体が組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、組換えTCRの1つの鎖をコードする核酸配列を含み、かつ第2の導入遺伝子が、組換えTCRの異なる鎖をコードする核酸配列を含む、請求項31に記載の組成物。
【請求項３３】
前記組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列を含み、第2の導入遺伝子が、TCRβ鎖またはその一部をコードする核酸配列を含む、請求項32に記載の組成物。
【請求項３４】
第2の導入遺伝子の組み込みが、複数のT細胞のそれぞれに導入された第2の鋳型ポリヌクレオチドによるものであり、第2の鋳型ポリヌクレオチドが構造［第2の5'相同性アーム］-［1つまたは複数の第2の導入遺伝子］-［第2の3'相同性アーム］を含む、請求項31〜33のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３５】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によっては組み込まれないTRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の他の標的部位またはその近傍に組み込まれる、請求項31〜34のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３６】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれる、請求項31〜35のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３７】
1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体（CSR）、またはコレセプターから選択される分子をコードする、請求項31および34〜36のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、異種の調節または制御エレメントをさらに含む、請求項1〜37のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、異種の調節または制御エレメントをさらに含む、請求項31〜37のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４０】
異種の調節または制御エレメントが異種プロモーターを含む、請求項38または39に記載の組成物。
【請求項４１】
異種プロモーターが、ヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーターもしくはMNDプロモーターもしくはそれらの変異体であるか、またはそれを含む、請求項40に記載の組成物。
【請求項４２】
異種プロモーターが誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである、請求項40に記載の組成物。
【請求項４３】
TCRα鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含む定常（Cα）領域を含み、かつ/またはTCRβ鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含むCβ領域を含み、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基がα鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる、請求項28〜42のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４４】
1つまたは複数のシステイン残基の導入が、非システイン残基のシステイン残基への置換を含む、請求項43に記載の組成物。
【請求項４５】
Cα領域が、SEQ ID NO: 24に示されるナンバリングにより48位に対応する位置にシステインを含み、かつ/またはCβ領域が、SEQ ID NO: 20に示されるナンバリングにより57位に対応する位置にシステインを含む、請求項28〜44のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４６】
前記疾患、障害、または症状が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である、請求項1〜45のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４７】
T細胞が、CD8+ T細胞および/もしくはCD4+ T細胞またはそれらのサブタイプを含む、請求項1〜46のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４８】
T細胞が対象の自己細胞である、請求項1〜47のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４９】
T細胞が対象に対して同種異系である、請求項1〜48のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項1〜49のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５１】
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
（a）免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階；および
（b）該免疫細胞に、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体は、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含み、
ここで、該鋳型ポリヌクレオチドの導入は、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる、方法。
【請求項５２】
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体は、疾患、障害、または症状の細胞もしくは組織に関連する、該細胞もしくは組織に特異的である、かつ/または該細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができ、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
【請求項５３】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または導入後30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内、または約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に、任意で該1つまたは複数の作用物質の導入の2時間後もしくは約2時間後に、導入される、請求項51または52に記載の方法。
【請求項５４】
1つまたは複数の免疫細胞がT細胞を含む、請求項1〜53のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
T細胞がCD4+ T細胞、CD8+ T細胞、またはCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含む、請求項54に記載の方法。
【請求項５６】
T細胞がCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が1：3もしくは約1：3から3：1もしくは約3：1、任意で1：2もしくは約1：2から2：1もしくは約2：1、任意で1：1もしくは約1：1である、請求項55に記載の方法。
【請求項５７】
1つまたは複数の作用物質のそれぞれがCRISPR-Cas9の組み合わせを含み、CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む、請求項51〜56のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体である、請求項57に記載の方法。
【請求項５９】
RNPの濃度が1μMもしくは約1μMから5μMもしくは約5μMであり、任意でRNPの濃度が2μMであるかもしくは約2μMである、請求項58に記載の方法。
【請求項６０】
1つまたは複数の作用物質の導入がエレクトロポレーションによるものである、請求項51〜58のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記鋳型ポリヌクレオチドがウイルスベクターに含まれ、かつ該鋳型ポリヌクレオチドの導入が形質導入によるものである、請求項51〜60のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ベクターがAAVベクターである、請求項61に記載の方法。
【請求項６３】
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞を刺激または活性化する条件下で、該細胞を刺激剤とともにインビトロでインキュベートする段階を含む、請求項51〜62のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
刺激剤が抗CD3および/または抗CD28抗体、任意で抗CD3/抗CD28ビーズを含み、任意でビーズ対細胞の比が1：1であるかまたは約1：1である、請求項63に記載の方法。
【請求項６５】
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞から刺激剤を除去する段階を含む、請求項63または64に記載の方法。
【請求項６６】
1つまたは複数の作用物質の導入および/または鋳型ポリヌクレオチドの導入の前、間、または後に、前記細胞を1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする段階をさらに含み、
任意で、1つまたは複数の組換えサイトカインがIL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される、
請求項51〜65のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
1つまたは複数の組換えサイトカインが、10U/mLもしくは約10U/mLから200U/mLもしくは約200U/mL、任意で50IU/mLもしくは約50IU/mLから100U/mLもしくは約100U/mLの濃度のIL-2；0.5ng/mL〜50ng/mL、任意で5ng/mLもしくは約5ng/mLから10ng/mLもしくは約10ng/mLの濃度のIL-7；および/または0.1ng/mL〜20ng/mL、任意で0.5ng/mLもしくは約0.5ng/mLから5ng/mLもしくは約5ng/mLの濃度のIL-15から選択される濃度で添加される、請求項66に記載の方法。
【請求項６８】
前記インキュベーションが、1つまたは複数の作用物質の導入および鋳型ポリヌクレオチドの導入に続いて、最大またはおよそ24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日間、任意で最大または約7日間、実施される、請求項66または67に記載の方法。
【請求項６９】
組換え受容体がキメラ抗原受容体（CAR）である、請求項51〜68のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
CARが、
抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン（任意で、該抗原結合ドメインはscFvである）；膜貫通ドメイン；共刺激分子（任意で、4-1BB、任意でヒト4-1BBであるか、またはそれを含む）に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン；および一次シグナル伝達ITAM含有分子（任意で、CD3ζシグナル伝達ドメイン、任意でヒトCD3ζシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む）に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン
を含み、
任意で、CARが、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとの間にスペーサーをさらに含む、
請求項69に記載の方法。
【請求項７１】
組換え受容体が、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖である、請求項51〜68のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
組換え受容体が、α（TCRα）鎖およびβ（TCRβ）鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、請求項71に記載の方法。
【請求項７３】
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
（a）免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階；および
（b）該免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該導入遺伝子は異種プロモーターを含み、かつ該導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
【請求項７４】
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該導入遺伝子は異種プロモーターを含み、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、かつ該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
【請求項７５】
1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、請求項51〜74のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、請求項51〜74のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
1つまたは複数の作用物質が、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質、およびTRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質を含む、請求項51〜74のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
（a）免疫細胞に、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質およびT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質を導入する段階であって、それによって、該標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階；および
（b）該免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
【請求項７９】
遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊およびT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該遺伝子破壊は、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質およびTRBC遺伝子の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質により誘発されたものであり、かつ該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
【請求項８０】
TRBC遺伝子が、T細胞受容体β定常部1（TRBC1）遺伝子またはT細胞受容体β定常部2（TRBC2）遺伝子の一方または両方である、請求項51〜79のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
1つまたは複数の作用物質が、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせを含む、請求項51〜56および59〜80のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
1つまたは複数の作用物質のそれぞれがCRISPR-Cas9の組み合わせを含み、CRISPR-Cas9の組み合わせが、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む、請求項51〜56および59〜81のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
CRISPR-Cas9の組み合わせが、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体である、請求項82に記載の方法。
【請求項８４】
RNPの濃度が1μMまたは約1μMから5μMまたは約5μMであり、任意でRNPの濃度が2μMであるかまたは約2μMである、請求項83に記載の方法。
【請求項８５】
RNPがエレクトロポレーションにより導入される、請求項83または84に記載の方法。
【請求項８６】
少なくとも1つの標的部位が、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、請求項51〜76および80〜85のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
少なくとも1つの標的部位が、TRAC遺伝子のエクソン内およびTRBC1またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、請求項77〜85のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
gRNAが、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
2021520202.tif 000087
からなる群より選択される配列を含む、請求項57〜72および82〜87のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
gRNAが、配列：
2021520202.tif 000088
を含むターゲティングドメインを有する、請求項57〜72および82〜88のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
gRNAが、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、
2021520202.tif 000089
2021520202.tif 000090
からなる群より選択される配列を含む、請求項57〜72および82〜87のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
gRNAが、配列：
2021520202.tif 000091
を含むターゲティングドメインを有する、請求項57〜72および82〜87および90のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９２】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、構造［5'相同性アーム］-［導入遺伝子］-［3'相同性アーム］を含む、請求項51〜91のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９３】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、請求項92に記載の方法。
【請求項９４】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、50もしくは約50から100もしくは約100ヌクレオチド長、100もしくは約100から250もしくは約250ヌクレオチド長、250もしくは約250から500もしくは約500ヌクレオチド長、500もしくは約500から750もしくは約750ヌクレオチド長、750もしくは約750から1000もしくは約1000ヌクレオチド長、または1000もしくは約1000から2000もしくは約2000ヌクレオチド長である、請求項92または93に記載の方法。
【請求項９５】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、100もしくは約100から1000もしくは約1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチドの長さである、請求項92〜94のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９６】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、200、300、400、500、600、700、もしくは800、または約200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、請求項92〜95のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９７】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300もしくは約300ヌクレオチドを超える長さであり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、400、500、もしくは600または約400、500、もしくは600ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、請求項92〜96のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９８】
5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、300もしくは約300ヌクレオチドを超える長さである、請求項92〜97のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、請求項51〜98のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、請求項51〜99のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０１】
組換え受容体がα（TCRα）鎖およびβ（TCRβ）鎖を含む組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む、請求項73〜100のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０２】
前記導入遺伝子が1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントをさらに含み、マルチシストロン性エレメントが、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される、請求項72または101に記載の方法。
【請求項１０３】
マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む、請求項102に記載の方法。
【請求項１０４】
前記免疫細胞に、1つまたは複数の第2の導入遺伝子を含む1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階をさらに含み、
第2の導入遺伝子が、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、
請求項51〜103のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０５】
組換え受容体が組換えTCRであり、該組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、組換えTCRの1つの鎖をコードする核酸配列を含み、かつ第2の導入遺伝子が、組換えTCRの異なる鎖をコードする核酸配列を含む、請求項104に記載の方法。
【請求項１０６】
前記組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TCRα鎖をコードする核酸配列を含み、かつ第2の導入遺伝子が、TCRβ鎖またはその一部をコードする核酸配列を含む、請求項105に記載の方法。
【請求項１０７】
第2の鋳型ポリヌクレオチドが、構造［第2の5'相同性アーム］-［1つまたは複数の第2の導入遺伝子］-［第2の3'相同性アーム］を含む、請求項104〜106のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子、またはTRBC2遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によってはターゲティングされないTRAC遺伝子、TRBC1遺伝子、またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の他の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、請求項104〜107のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０９】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、請求項104〜108のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１０】
1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体（CSR）、またはコレセプターから選択される分子をコードする、請求項104〜109のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１１】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、調節または制御エレメントをさらに含む、請求項51〜110のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、異種の調節または制御エレメントをさらに含む、請求項104〜111のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
異種の調節または制御エレメントが異種プロモーターを含む、請求項111または112に記載の方法。
【請求項１１４】
異種プロモーターが、ヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーターもしくはMNDプロモーター、またはそれらの変異体であるか、またはそれを含む、請求項73、74または113に記載の方法。
【請求項１１５】
異種プロモーターが誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである、請求項73、74または113に記載の方法。
【請求項１１６】
TCRα鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含む定常（Cα）領域を含み、かつ/またはTCRβ鎖が1つまたは複数のシステイン残基の導入を含むCβ領域を含み、該1つまたは複数の導入されたシステイン残基がα鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる、請求項51〜115のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１７】
1つまたは複数のシステイン残基の導入が、非システイン残基のシステイン残基への置換を含む、請求項116に記載の方法。
【請求項１１８】
Cα領域が、SEQ ID NO: 24に示されるナンバリングにより48位に対応する位置にシステインを含み、かつ/またはCβ領域が、SEQ ID NO: 20に示されるナンバリングにより57位に対応する位置にシステインを含む、請求項116または117に記載の方法。
【請求項１１９】
前記疾患、障害、または症状が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である、請求項51〜118のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
免疫細胞がT細胞を含むか、またはT細胞に富んでいる、請求項51〜119のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
T細胞がCD8+ T細胞またはそのサブタイプを含む、請求項120に記載の方法。
【請求項１２２】
T細胞がCD4+ T細胞またはそのサブタイプを含む、請求項120に記載の方法。
【請求項１２３】
T細胞がCD4+ T細胞またはそのサブタイプとCD8+ T細胞またはそのサブタイプを含む、請求項120に記載の方法。
【請求項１２４】
T細胞がCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比が1：3もしくは約1：3から3：1もしくは約3：1、任意で1：2もしくは約1：2から2：1もしくは約2：1、任意で1：1もしくは約1：1である、請求項123に記載の方法。
【請求項１２５】
免疫細胞が、任意でiPSCである多分化能細胞または多能性細胞に由来する、請求項51〜53および57〜119のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
免疫細胞が対象由来の初代細胞である、請求項51〜125のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
対象が疾患、障害、または症状を有するか、またはその疑いがある、請求項126に記載の方法。
【請求項１２８】
対象が健康であるか、またはその疑いがある、請求項126に記載の方法。
【請求項１２９】
免疫細胞が対象の自己細胞である、請求項126または127に記載の方法。
【請求項１３０】
免疫細胞が対象に対して同種異系である、請求項126〜128のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記鋳型ポリヌクレオチドが1つまたは複数のベクターに含まれ、任意で該ベクターがウイルスベクターである、請求項73〜130のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３２】
前記ベクターがウイルスベクターであり、ウイルスベクターがAAVベクターである、請求項131に記載の方法。
【請求項１３３】
AAVベクターがAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、およびAAV8ベクターからなる群より選択される、請求項62または132に記載の方法。
【請求項１３４】
AAVベクターがAAV2またはAAV6ベクターである、請求項62、132または133に記載の方法。
【請求項１３５】
前記ベクターがウイルスベクターであり、ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、任意でレンチウイルスベクターである、請求項131に記載の方法。
【請求項１３６】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、少なくとももしくは少なくとも約2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である、請求項51〜135のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３７】
前記ポリヌクレオチドが、2500もしくは約2500から5000もしくは約5000ヌクレオチド、3500もしくは約3500から4500もしくは約4500ヌクレオチド、または3750もしくは約3750から4250もしくは約4250ヌクレオチドの長さである、請求項51〜136のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３８】
遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入、および鋳型ポリヌクレオチドの導入が、同時に、または任意の順序で連続して行われる、請求項73〜137のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３９】
前記鋳型ポリヌクレオチドの導入が、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる、請求項73〜138のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４０】
前記鋳型ポリヌクレオチドが、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または導入後30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内、または約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に、任意で1つまたは複数の作用物質の導入の2時間後もしくは約2時間後に、導入される、請求項139に記載の方法。
【請求項１４１】
遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドの導入が、1つの実験反応で行われる、請求項73〜138のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４２】
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞を刺激または活性化する条件下で、該細胞を刺激剤とともにインビトロでインキュベートする段階を含む、請求項73〜141のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４３】
刺激剤が、抗CD3および/または抗CD28抗体、任意で抗CD3/抗CD28ビーズを含み、任意でビーズ対細胞の比が1：1であるかまたは約1：1である、請求項142に記載の方法。
【請求項１４４】
1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞から刺激剤を除去する段階を含む、請求項142または143に記載の方法。
【請求項１４５】
1つまたは複数の作用物質の導入および/または鋳型ポリヌクレオチドの導入の前、間、または後に、該細胞を1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする段階をさらに含み、
任意で、1つまたは複数の組換えサイトカインがIL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される、
請求項73〜144のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
1つまたは複数の組換えサイトカインが、10U/mLもしくは約10U/mLから200U/mLもしくは約200U/mL、任意で50IU/mLもしくは約50IU/mLから100U/mLもしくは約100U/mLの濃度のIL-2；0.5ng/mL〜50ng/mL、任意で5ng/mLもしくは約5ng/mLから10ng/mLもしくは約10ng/mLの濃度のIL-7；および/または0.1ng/mL〜20ng/mL、任意で0.5ng/mLもしくは約0.5ng/mLから5ng/mLもしくは約5ng/mLの濃度のIL-15から選択される濃度で添加される、請求項145に記載の方法。
【請求項１４７】
前記インキュベーションが、1つまたは複数の作用物質の導入および鋳型ポリヌクレオチドの導入に続いて、最大またはおよそ24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、または21日間、任意で最大または約7日間、実施される、請求項145または146に記載の方法。
【請求項１４８】
複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％、または35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％より多くが、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子のドメインまたは領域をコードする遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む、請求項51〜147のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％、または35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％より多くが、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または該抗原への結合を示す、請求項51〜148のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
複数の改変細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数が、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30、またはそれ以下より低い、請求項51〜149のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５１】
複数の改変細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数が、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、または10％低い、請求項51〜150のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５２】
請求項51〜151のいずれか一項に記載の方法を用いて作製された、1つまたは複数の改変細胞。
【請求項１５３】
請求項152に記載の1つまたは複数の改変細胞を含有する、組成物。
【請求項１５４】
前記組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％、または35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％より多くが、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子のドメインまたは領域をコードする遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む、請求項153に記載の組成物。
【請求項１５５】
前記組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％、または35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％より多くが、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または該抗原への結合を示す、請求項153または154に記載の組成物。
【請求項１５６】
複数の細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖の発現および/または抗原結合の変動係数が、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30、またはそれ以下より低い、請求項153〜155のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５７】
複数の細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖の発現および/または抗原結合の変動係数が、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、または10％低い、請求項153〜156のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５８】
薬学的に許容される担体をさらに含有する、請求項153〜157のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１５９】
請求項152に記載の1つまたは複数の改変細胞、または請求項1〜50および153〜158のいずれか一項に記載の組成物を、それを必要とする対象に投与する段階を含む治療方法であって、任意で、該対象が疾患、障害、または症状を有し、任意で、該疾患、障害、または症状が癌である、方法。
【請求項１６０】
任意で癌である、癌疾患、障害、または症状を治療するための、請求項152に記載の1つまたは複数の改変細胞、または請求項1〜50および153〜158のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１６１】
任意で癌である、疾患、障害、または症状を治療するための医薬の製造における、請求項152に記載の1つまたは複数の改変細胞、または請求項1〜50および153〜158のいずれか一項に記載の組成物の使用。
【請求項１６２】
任意で癌である、癌疾患、障害、または症状の治療に使用するための、請求項152に記載の1つまたは複数の改変細胞、または請求項1〜50および153〜158のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項１６３】
1つまたは複数の作用物質であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、作用物質；
組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドであって、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、鋳型ポリヌクレオチド；および
請求項51〜151のいずれか一項に記載の方法を実施するための説明書
を含む、キット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願の相互参照
この出願は、2018年4月5日に出願された「組換え受容体を発現する細胞の作製方法および関連組成物」と題する米国仮出願第61/653,522号からの優先権を主張するものであり、その内容は全体として参照により本明細書に組み入れられる。
【０００２】
配列表の参照による組み込み
本出願は、電子フォーマットで配列表とともに提出されている。配列表は、2019年4月3日に作成された735042012740SeqList.txtと題する、サイズが179キロバイトのファイルとして提供される。配列表の電子フォーマットでの情報は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。
【０００３】
分野
本開示は、免疫細胞を遺伝子改変するための方法、改変された免疫細胞を含有する細胞組成物、組換え受容体をコードする核酸配列を特定のゲノム座位にターゲティングするための、および/または該ゲノム座位での該遺伝子の発現を調節するためのキットおよび製品、ならびに遺伝子改変T細胞の養子移入を含む癌免疫療法に関連したそれらの応用に関する。
【背景技術】
【０００４】
背景
腫瘍抗原を認識するように組換えにより発現されたT細胞受容体（TCR）または他の抗原受容体（例えば、キメラ抗原受容体（CAR））を利用する養子細胞療法は、癌および他の疾患を治療するための魅力的な治療法である。組換えTCRまたは他の抗原受容体の発現および機能は、細胞の集団内で制限されたり、かつ/または不均一なことがある。組換え受容体の高いおよび/または均一な発現レベルおよび機能を達成するために、改善された戦略が必要である。こうした戦略は、養子免疫療法で、例えば、癌、感染症および自己免疫疾患の治療で、使用するための所望の発現レベルおよび/または特性を示す細胞の作製を容易にすることができる。そのようなニーズを満たす方法で使用するための方法、細胞、組成物およびキットが提供される。
【発明の概要】
【０００５】
概要
本明細書では、T細胞受容体α定常部（T cell receptor alpha constant：TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊と、1つまたは複数の該標的部位またはその近傍に相同組換え修復（HDR）を介して組み込まれる、T細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）などの、組換え受容体をコードする導入遺伝子とを含む遺伝子改変細胞、該改変細胞を含有する組成物、該改変細胞を作製する方法、ならびに関連する方法および使用が提供される。いくつかの局面では、遺伝子破壊と導入遺伝子配列のターゲティングされた組み込みによって、1つまたは複数の内在性TCR鎖は発現が低減されるか、またはノックアウトされる。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体は、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に関連する抗原に結合することができる。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体は、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に特異的である抗原に結合することができる。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体は、疾患、障害または症状に関連する細胞もしくは組織に発現される抗原に結合することができる。
【０００６】
本明細書では、本明細書に記載される1つまたは複数の改変細胞を含む組成物も提供される。特定の態様では、該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上は、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子のドメインまたは領域をコードする遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む。特定の態様では、該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上は、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または抗原結合を示す。そのような態様のいくつかにおいて、該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上は、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または抗原への結合を示す。
【０００７】
本明細書では、複数の改変T細胞を含有する組成物が提供される。そのような態様のいくつかにおいて、組成物は、導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖と、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含み、ここで、該組換え受容体は、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に関連する、特異的である、および/または発現される抗原に結合することができる；ここで、該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上は、TRAC遺伝子および/またはTRBC遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む；および/または該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上は、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖を発現し、かつ/または抗原への結合を示す；ならびに、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれる。
【０００８】
いくつかの態様では、複数の細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖の発現および/または抗原結合の変動係数は、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、0.30またはそれ以下より低い。特定の態様では、複数の細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖の発現および/または抗原結合の変動係数は、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、または10％低い。そのような態様のいくつかにおいて、該組換え受容体は、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に関連する、特異的である、および/または発現される抗原に結合することができる。
【０００９】
特定の態様では、組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合は、組成物中の細胞をTCRα鎖またはTCRβ鎖に特異的な結合試薬と接触させ、該試薬の細胞への結合を測定することによって評価される。いくつかの態様では、結合試薬は、VβまたはVα鎖の特定のファミリーを特異的に認識する抗TCR Vβ抗体または抗TCR Vα抗体である。
【００１０】
特定の態様では、結合試薬はペプチド抗原-MHC複合体であり、これは任意で四量体であり得る。特定の態様では、本明細書に記載される組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。本明細書では、導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖と、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含む組成物が提供され、ここで、該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上は、TRAC遺伝子および/またはTRBC遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む；および組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。
【００１１】
さらに、本明細書では、導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖と、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含む組成物が提供され、ここで、該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上は、該組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または抗原結合を示す；および組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。
【００１２】
さらに、本明細書では、導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片と、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含む組成物が提供され、ここで、複数の細胞間の組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数は、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30またはそれ以下より低い。
【００１３】
さらに、本明細書では、導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片と、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含む組成物が提供され、ここで、複数の細胞間の組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数は、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、または10％低い。
【００１４】
いくつかの態様では、該組成物は、以下の段階によって作製される：（a）複数のT細胞に1つまたは複数の作用物質を導入し、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、段階；および（b）該複数のT細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階。特定の態様では、組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合は、該組成物中の細胞をTCRα鎖またはTCRβ鎖に特異的な結合試薬と接触させ、該試薬の細胞への結合を測定することによって評価される。
【００１５】
そのような態様のいくつかにおいて、改変T細胞は、TRAC遺伝子内に少なくとも1つの遺伝子破壊を含む。そのような態様のいくつかにおいて、改変T細胞は、TRBC遺伝子内に少なくとも1つの遺伝子破壊を含む。そのような態様のいくつかにおいて、改変T細胞は、TRAC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊と、TRBC遺伝子内の標的部位の少なくとも1つの遺伝子破壊を含む。
【００１６】
特定の態様では、結合試薬は、VβまたはVα鎖の特定のファミリーを特異的に認識する抗TCR Vβ抗体または抗TCR Vα抗体である。いくつかの態様では、結合試薬はペプチド抗原-MHC複合体であり、これは任意で四量体であり得る。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つは、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つは、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質と、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質とを含む。特定の態様では、TRBC遺伝子は、T細胞受容体β定常部1（TRBC1）遺伝子またはT細胞受容体β定常部2（TRBC2）遺伝子の一方または両方である。特定の態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質は、標的部位に特異的に結合するかまたはハイブリダイズするDNA結合タンパク質またはDNA結合核酸を含む。いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質は、（a）DNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼを含む融合タンパク質、または（b）RNA誘導型ヌクレアーゼ（RNA-guided nuclease）を含む。
【００１７】
特定の態様では、DNAターゲティングタンパク質またはRNA誘導型ヌクレアーゼは、ジンクフィンガータンパク質（ZFP）、TALタンパク質、または標的部位に特異的なCRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid-associated nuclease）を含む。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体として導入される。特定の態様では、RNPは、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞圧縮（cell compression）または細胞スクイージング（cell squeezing）を介して導入される。いくつかの態様では、RNPはエレクトロポレーションにより導入される。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、gRNAおよび/またはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドとして導入される。特定の態様では、少なくとも1つの標的部位は、TRAC、TRBC1および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある。
【００１８】
そのような態様のいくつかにおいて、遺伝子破壊は、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせによるものである。そのような態様のいくつかにおいて、CRISPR-Cas9の組み合わせによる遺伝子破壊は、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む。そのような態様のいくつかにおいて、CRISPR-Cas9の組み合わせは、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体である。そのような態様のいくつかにおいて、RNPはエレクトロポレーションにより導入される。そのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの標的部位は、TRAC、TRBC1および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある。
【００１９】
いくつかの態様では、gRNAは、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000003
からなる群より選択される配列を含む。特定の態様では、gRNAは、配列：GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (SEQ ID NO:31)を含むターゲティングドメインを有する。
【００２０】
特定の態様では、gRNAは、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000004
2021520202.tif 000005
からなる群より選択される配列を含む。いくつかの態様では、gRNAは、配列：
2021520202.tif 000006
を含むターゲティングドメインを有する。
【００２１】
そのような態様のいくつかにおいて、導入遺伝子は、複数のT細胞のそれぞれに導入された鋳型ポリヌクレオチドによって組み込まれる。特定の態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、構造［5'相同性アーム］-［導入遺伝子］-［3'相同性アーム］を含む。特定の態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む。いくつかの態様では、5'相同性アームは、標的部位の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。特定の態様では、3'相同性アームは、標的部位の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。特定の態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下である。いくつかの態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000ヌクレオチドである。そのような態様のいくつかにおいて、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、50もしくは約50から100もしくは約100ヌクレオチド長、100もしくは約100から250もしくは約250ヌクレオチド長、250もしくは約250から500もしくは約500ヌクレオチド長、500もしくは約500から750もしくは約750ヌクレオチド長、750もしくは約750から1000もしくは約1000ヌクレオチド長、または1000もしくは約1000から2000もしくは約2000ヌクレオチド長である。
【００２２】
特定の態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、100〜1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチド、または約100〜1000ヌクレオチド、約100〜750ヌクレオチド、約100〜600ヌクレオチド、約100〜400ヌクレオチド、約100〜300ヌクレオチド、約100〜200ヌクレオチド、約200〜1000ヌクレオチド、約200〜750ヌクレオチド、約200〜600ヌクレオチド、約200〜400ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜1000ヌクレオチド、約300〜750ヌクレオチド、約300〜600ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜1000ヌクレオチド、約400〜750ヌクレオチド、約400〜600ヌクレオチド、約600〜1000ヌクレオチド、約600〜750ヌクレオチド、または約750〜1000ヌクレオチドである。特定の態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、100もしくは約100から1000もしくは約1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチドの長さである。
【００２３】
そのような態様のいくつかにおいて、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、200、300、400、500、600、700、もしくは800、または約200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である。そのような態様のいくつかにおいて、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、300もしくは約300ヌクレオチド以上の長さである。そのような態様のいくつかにおいて、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、400、500、もしくは600、または約400、500、もしくは600ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である。そのような態様のいくつかにおいて、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、500もしくは約500から600もしくは約600ヌクレオチドの長さである。そのような態様のいくつかにおいて、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、300もしくは約300ヌクレオチド以上の長さである。
【００２４】
そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれる。いくつかの態様では、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位またはその近傍に組み込まれる。
【００２５】
そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体はキメラ抗原受容体（CAR）である。そのような態様のいくつかにおいて、CARは、抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン（そのような態様のいくつかにおいて、該抗原結合ドメインはscFvである）；膜貫通ドメイン；共刺激分子に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン；および一次シグナル伝達ITAM含有分子に由来する細胞質シグナル伝達ドメインを含む。そのような態様のいくつかにおいて、CARは、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとの間にスペーサーをさらに含む。そのような態様のいくつかにおいて、共刺激分子は4-1BB、任意でヒト4-1BBであるか、またはそれを含む。そのような態様のいくつかにおいて、ITAM含有分子はCD3ζシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。そのような態様のいくつかにおいて、ITAM含有分子はヒトCD3ζシグナル伝達ドメインである。
【００２６】
そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体は、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖である。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体は、α（TCRα）鎖およびβ（TCRβ）鎖を含む組換えTCRであり、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む。そのような態様のいくつかにおいて、導入遺伝子は1つまたは複数のマルチシストロン性エレメント（multicistronic element）をさらに含み、マルチシストロン性エレメントは、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される。そのような態様のいくつかにおいて、マルチシストロン性エレメントは、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント（ribosome skip element）、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む。
【００２７】
そのような態様のいくつかにおいて、前記改変細胞は、1つまたは複数の第2の導入遺伝子をさらに含み、第2の導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれる。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体は組換えTCRであり、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、組換えTCRの1つの鎖をコードする核酸配列を含み、第2の導入遺伝子は、該組換えTCRの異なる鎖をコードする核酸配列を含む。そのような態様のいくつかにおいて、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TCRα鎖をコードする核酸配列を含み、かつ第2の導入遺伝子は、TCRβ鎖またはその一部をコードする核酸配列を含む。そのような態様のいくつかにおいて、第2の導入遺伝子の組み込みは、複数のT細胞のそれぞれに導入された第2の鋳型ポリヌクレオチドによって行われ、第2の鋳型ポリヌクレオチドは、構造［第2の5'相同性アーム］-［1つまたは複数の第2の導入遺伝子］-［第2の3'相同性アーム］を含む。
【００２８】
特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。特定の態様では、該組成物は、免疫細胞に1つまたは複数の第2の導入遺伝子を含む1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドをさらに導入することによって作製され、ここで、第2の導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。
【００２９】
特定の態様では、第2の鋳型ポリヌクレオチドは、構造［第2の5'相同性アーム］-［1つまたは複数の第2の導入遺伝子］-［第2の3'相同性アーム］を含む。いくつかの態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む。特定の態様では、第2の5'相同性アームは、標的部位の第2の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。特定の態様では、第2の3'相同性アームは、標的部位の第2の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。
【００３０】
いくつかの態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下である。特定の態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、独立して、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000ヌクレオチドである。特定の態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、独立して、100〜1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチド、または約100〜1000ヌクレオチド、約100〜750ヌクレオチド、約100〜600ヌクレオチド、約100〜400ヌクレオチド、約100〜300ヌクレオチド、約100〜200ヌクレオチド、約200〜1000ヌクレオチド、約200〜750ヌクレオチド、約200〜600ヌクレオチド、約200〜400ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜1000ヌクレオチド、約300〜750ヌクレオチド、約300〜600ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜1000ヌクレオチド、約400〜750ヌクレオチド、約400〜600ヌクレオチド、約600〜1000ヌクレオチド、約600〜750ヌクレオチド、または約750〜1000ヌクレオチドである。
【００３１】
いくつかの態様では、1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。特定の態様では、1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍で組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によってはターゲティングされない1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。
【００３２】
いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍で組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。特定の態様では、1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体（CSR）、またはコレセプターから選択される分子をコードする。特定の態様では、コードされた分子は、4-1BBL、OX40L、CD70、LIGHTおよびCD30Lから選択される腫瘍壊死因子（TNF）リガンド、またはCD80およびCD86から選択される免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーリガンドの中から任意で選択される共刺激リガンドである。
【００３３】
そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の他の標的部位またはその近傍（組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によっては組み込まれない）に組み込まれる。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれる。そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体（CSR）、またはコレセプターから選択される分子をコードする。
【００３４】
いくつかの態様では、コードされた分子は、IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、IL-7、IL-15、IL-21、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFN-α）、インターフェロンβ（IFN-β）またはインターフェロンγ（IFN-γ）、およびエリスロポエチンの中から任意で選択されるサイトカインである。特定の態様では、コードされた分子は、CD47、PD-1、CTLA-4およびそれらのリガンドまたはCD28、OX-40、4-1BBおよびそれらのリガンドから選択される免疫抑制作用または免疫刺激作用を有するポリペプチドに任意で結合する可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）である。
【００３５】
特定の態様では、コードされた分子は、任意で以下を含む、免疫調節融合タンパク質である：（a）CD200R、SIRPα、CD279 (PD-1)、CD2、CD95 (Fas)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD272 (BTLA)、A2aR、KIR、TIM3、CD300またはLPA5に由来する抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；（b）CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD47、CD79A、CD79B、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)、CARD11、DAP10、DAP12、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRFM、Zap70、PTCH2、またはそれらの任意の組み合わせに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン；および（c）CD2、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CD80、CD86、CD95 (Fas)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD200R、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD272 (BTLA)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、CD279 (PD-1)、CD300、CD357 (GITR)、A2aR、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、GAL9、KIR、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PTCH2、ROR2、Ryk、Slp76、SIRPα、pTα、TCRα、TCRβ、TIM3、TRIM、LPA5またはZap70に由来する疎水性膜貫通ドメイン。いくつかの態様では、コードされた分子は、PD1のトランケート型細胞外ドメインと、CD28の膜貫通および細胞質シグナル伝達ドメインを任意で含む、キメラスイッチ受容体（CSR）である。特定の態様では、コードされた分子は、CD4またはCD8から任意で選択されるコレセプターである。
【００３６】
特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、組換えTCRの1つの鎖をコードし、かつ第2の導入遺伝子は、該組換えTCRの異なる鎖をコードする。いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、組換えTCRのα（TCRα）鎖をコードし、かつ第2の導入遺伝子は、該組換えTCRのβ（TCRβ）鎖をコードする。特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、独立して、調節または制御エレメントをさらに含む。
【００３７】
そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、異種の調節または制御エレメントをさらに含む。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、独立して、異種の調節または制御エレメントをさらに含む。そのような態様のいくつかにおいて、異種の調節または制御エレメントは異種プロモーターを含む。そのような態様のいくつかにおいて、異種プロモーターは、ヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーターもしくはMNDプロモーター、またはその変異体であるか、またはそれを含む。そのような態様のいくつかにおいて、異種プロモーターは、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである。
【００３８】
特定の態様では、調節または制御エレメントは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザック（Kozak）コンセンサス配列、スプライスアクセプター配列またはスプライスドナー配列を含む。いくつかの態様では、調節または制御エレメントはプロモーターを含む。特定の態様では、プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターおよび/または組織特異的プロモーターの中から選択される。特定の態様では、プロモーターは、RNA pol I、pol II、またはpol IIIプロモーターの中から選択される。いくつかの態様では、プロモーターは以下から選択される：U6もしくはH1プロモーターであるpol IIIプロモーター；またはCMV、SV40初期領域もしくはアデノウイルス主要後期プロモーターであるpol IIプロモーター。特定の態様では、プロモーターは、ヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーターもしくはMNDプロモーター、またはその変異体であるか、またはそれを含む。特定の態様では、プロモーターは誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは、Lacオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列もしくはドキシサイクリンオペレーター配列を含むか、またはその類似体であるか、またはLacリプレッサー、テトラサイクリンリプレッサーもしくはその類似体によって結合または認識されることが可能である。特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、独立して、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントを含む。
【００３９】
特定の態様では、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントは、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子の上流にある。いくつかの態様では、マルチシストロン性エレメントは、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子と、1つまたは複数の第2の導入遺伝子との間に配置される。特定の態様では、マルチシストロン性エレメントは、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される。特定の態様では、マルチシストロン性エレメントは、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボ特定の（riboparticular）スキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む。
【００４０】
そのような態様のいくつかにおいて、TCRα鎖は1つまたは複数のシステイン残基の導入を含む定常（Cα）領域を含み、かつ/またはTCRβ鎖は1つまたは複数のシステイン残基の導入を含むCβ領域を含む；ここで、1つまたは複数の導入されたシステイン残基は、α鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる。そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数のシステイン残基の導入は、非システイン残基のシステイン残基への置換を含む。そのような態様のいくつかにおいて、Cα領域は、SEQ ID NO: 24に示されるナンバリングにより48位に対応する位置にシステインを含み、かつ/またはCβ領域は、SEQ ID NO: 20に示されるナンバリングにより57位に対応する位置にシステインを含む。
【００４１】
特定の態様では、リボ特定のスキップエレメントをコードする配列は、標的部位の遺伝子とインフレームになるようにターゲティングされる。いくつかの態様では、HDRの際に、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、独立して、標的部位の遺伝子の内因性プロモーターに機能的に連結される。特定の態様では、組換えTCRは、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に関連する、特異的である、および/または発現される抗原に結合することができる。特定の態様では、疾患、障害または症状は、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である。特定の態様では、抗原は腫瘍抗原または病原性抗原である。特定の態様では、病原性抗原は細菌抗原またはウイルス抗原である。
【００４２】
いくつかの態様では、抗原はウイルス抗原であり、ウイルス抗原は、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス感染症、エプスタインバーウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス8型（HHV-8）、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）、ヒトT細胞白血病ウイルス2型（HTLV-2）、またはサイトメガロウイルス（CMV）に由来する。特定の態様では、抗原は、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33およびHPV-35の中から選択されるHPV由来の抗原である。特定の態様では、抗原はHPV-16 E6またはHPV-16 E7抗原であるHPV-16抗原である。いくつかの態様では、ウイルス抗原は、エプスタインバー核抗原（EBNA）-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNAリーダータンパク質（EBNA-LP）、潜在膜タンパク質（latent membrane protein）LMP-1、LMP-2AおよびLMP-2B、EBV-EA、EBV-MAおよびEBV-VCAの中から選択されるEBV抗原である。特定の態様では、ウイルス抗原は、TAXであるHTLV抗原である。特定の態様では、ウイルス抗原は、B型肝炎コア抗原またはB型肝炎エンベロープ抗原であるHBV抗原である。いくつかの態様では、抗原は腫瘍抗原である。
【００４３】
特定の態様では、抗原は、以下の中から選択される：神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2 (AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、メランA/MART-1、WT-1、S-100、MBP、CD63、MUC1（例：MUC1-8）、p53、Ras、サイクリンB1、HER-2/neu、癌胎児性抗原（CEA）、gp100、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A11、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-C1、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）、β-カテニン、NY-ESO-1、LAGE-1a、PP1、MDM2、MDM4、EGVFvIII、Tax、SSX2、テロメラーゼ、TARP、pp65、CDK4、ビメンチン、S100、eIF-4A1、IFN誘導性p78、メラノトランスフェリン（p97）、ウロプラキンII、前立腺特異抗原（PSA）、ヒトカリクレイン（huK2）、前立腺特異膜抗原（PSM）、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、好中球エラスターゼ、エフリンB2、BA-46、Bcr-abl、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、カスパーゼ8、FRa、CD24、CD44、CD133、CD 166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、uPA、PAI-1、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、グリコリピドF77、GD-2、インスリン成長因子（IGF）-I、IGF-II、IGF-I受容体、およびメソテリン（mesothelin）。
【００４４】
特定の態様では、T細胞はCD8+ T細胞またはそのサブタイプである。いくつかの態様では、T細胞はCD4+ T細胞またはそのサブタイプである。特定の態様では、T細胞は対象の自己細胞である。特定の態様では、T細胞は対象に対して同種異系である。いくつかの態様では、第1の鋳型ポリヌクレオチド、1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチド、ならびに/またはgRNAおよび/もしくはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドは、1つまたは複数のベクターに含まれ、該ベクターは任意でウイルスベクターである。特定の態様では、該ベクターはAAVベクターである。特定の態様では、AAVベクターはAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7またはAAV8ベクターの中から選択される。いくつかの態様では、AAVベクターはAAV2またはAAV6ベクターである。特定の態様では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。特定の態様では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【００４５】
そのような態様のいくつかにおいて、T細胞はCD8+ T細胞および/もしくはCD4+ T細胞、またはそのサブタイプを含む。そのような態様のいくつかにおいて、T細胞は対象の自己細胞である。そのような態様のいくつかにおいて、T細胞は対象に対して同種異系である。そのような態様のいくつかにおいて、本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００４６】
いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入、および鋳型ポリヌクレオチドの導入は、同時に、または任意の順序で連続して行われる。特定の態様では、鋳型ポリヌクレオチドの導入は、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる。特定の態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または導入後約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間もしくは4時間以内に導入される。
【００４７】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドの導入と、1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドの導入は、同時に、または任意の順序で連続して行われる。特定の態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドの導入は、1つの実験反応で行われる。特定の態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドおよび第2の鋳型ポリヌクレオチドの導入は、1つの実験反応で行われる。いくつかの態様では、本明細書に記載の組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。
【００４８】
いくつかの態様において、本明細書では、遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法が提供され、該方法は、以下の段階を含む：（a）免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階；および（b）該免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階。
【００４９】
そのような態様のいくつかにおいて、本明細書では、遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法が提供され、該方法は、以下の段階を含む：（a）免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階；および（b）該免疫細胞に、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該組換え受容体は、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に関連する、特異的である、および/または発現される抗原に結合することができ、該組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、その際、該鋳型ポリヌクレオチドの導入は、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる、段階。
【００５０】
いくつかの態様において、本明細書では、遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法が提供され、該方法は、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階を含み、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、かつ組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。
【００５１】
そのような態様のいくつかにおいて、本明細書では、遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法が提供され、該方法は、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階を含み、該組換え受容体は、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に関連する、特異的である、および/または発現される抗原に結合することができ、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、かつ組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。
【００５２】
そのような態様のいくつかにおいて、該鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または作用物質の導入後30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間、または約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に導入される。そのような態様のいくつかにおいて、該鋳型ポリヌクレオチドは、該1つまたは複数の作用物質の導入の2時間もしくは約2時間後に導入される。
【００５３】
そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の免疫細胞はT細胞を含む。そのような態様のいくつかにおいて、T細胞は、CD4+ T細胞、CD8+ T細胞、またはCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含む。そのような態様のいくつかにおいて、T細胞はCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比は1：3もしくは約1：3から3：1もしくは約3：1、任意で1：2もしくは約1：2から2：1もしくは約2：1である。そのような態様のいくつかにおいて、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比は約1：1である。
【００５４】
そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の作用物質はCRISPR-Cas9の組み合わせを含み、CRISPR-Cas9の組み合わせは、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む。そのような態様のいくつかにおいて、CRISPR-Cas9の組み合わせは、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体である。そのような態様のいくつかにおいて、RNPの濃度は1μMもしくは約1μMから5μMもしくは約5μMである。そのような態様のいくつかにおいて、RNPの濃度は2μMであるかまたは約2μMである。
【００５５】
そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の作用物質はエレクトロポレーションによって導入される。そのような態様のいくつかにおいて、該鋳型ポリヌクレオチドはウイルスベクターに含まれ、該鋳型ポリヌクレオチドの導入は形質導入による。そのような態様のいくつかにおいて、該ベクターはAAVベクターである。
【００５６】
そのような態様のいくつかにおいて、前記方法は、1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞を刺激または活性化する条件下で、該細胞を刺激剤とともにインビトロでインキュベートする段階を含む。そのような態様のいくつかにおいて、刺激剤は抗CD3および/または抗CD28抗体、任意で抗CD3/抗CD28ビーズを含む。そのような態様のいくつかにおいて、ビーズ対細胞の比は、1：1であるかまたは約1：1である。そのような態様のいくつかにおいて、刺激剤は、1つまたは複数の作用物質を導入する前に免疫細胞から除去される。
【００５７】
そのような態様のいくつかにおいて、前記方法は、該1つまたは複数の作用物質の導入および/または該鋳型ポリヌクレオチドの導入の前、間または後に、該細胞を1つまたは複数の組換えサイトカインとインキュベートする段階をさらに含む。そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の組換えサイトカインは、IL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される。そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の組換えサイトカインは、10U/mLもしくは約10U/mLから200U/mLもしくは約200U/mLのIL-2の濃度、そのような態様のいくつかにおいて該濃度は、50U/mLもしくは約50IU/mLから100U/mLもしくは約100U/mLである；0.5ng/mL〜50ng/mLの濃度のIL-7、そのような態様のいくつかにおいて、5ng/mLもしくは該濃度は約5ng/mLから10ng/mLもしくは約10ng/mLである；および/または0.1ng/mL〜20ng/mL、任意で0.5ng/mLもしくは約0.5ng/mLから5ng/mLもしくは約5ng/mLの濃度のIL-15；から選択される濃度で添加される。そのような態様のいくつかにおいて、インキュベーションは、該1つまたは複数の作用物質の導入および該鋳型ポリヌクレオチドの導入に続いて、最大または約24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日間、任意で最大または約7日間、実施される。
【００５８】
そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体はキメラ抗原受容体（CAR）である。そのような態様のいくつかにおいて、CARは、抗原に特異的な抗原結合ドメインを含む細胞外ドメイン；膜貫通ドメイン；共刺激分子に由来する細胞質シグナル伝達ドメイン；および一次シグナル伝達ITAM含有分子に由来する細胞質シグナル伝達ドメインを含む。そのような態様のいくつかにおいて、CARは、膜貫通ドメインと抗原結合ドメインとの間にスペーサーをさらに含む。そのような態様のいくつかにおいて、抗原結合ドメインはscFvである。そのような態様のいくつかにおいて、共刺激分子は4-1BBであるか、またはそれを含む。そのような態様のいくつかにおいて、共刺激分子はヒト4-1BBである。そのような態様のいくつかにおいて、ITAM含有分子はCD3ζシグナル伝達ドメインであるか、またはそれを含む。そのような態様のいくつかにおいて、ITAM含有分子はヒトCD3ζシグナル伝達ドメインである。
【００５９】
そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体は、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖である。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体は、α（TCRα）鎖およびβ（TCRβ）鎖を含む組換えTCRであり、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む。
【００６０】
そのような態様のいくつかにおいて、本明細書では、遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法が提供され、該方法は、以下の段階を含む：（a）免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階；および（b）該免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該導入遺伝子は異種プロモーターを含み、かつ該導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階。
【００６１】
そのような態様のいくつかにおいて、本明細書では、遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法が提供され、該方法は、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階を含み、該導入遺伝子は異種プロモーターを含み、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。
【００６２】
いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つは、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つは、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質と、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質を含む。いくつかの態様では、TRBC遺伝子は、T細胞受容体β定常部1（TRBC1）遺伝子またはT細胞受容体β定常部2（TRBC2）遺伝子の一方または両方である。
【００６３】
本明細書では、遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法が提供され、該方法は、以下の段階を含む：（a）免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子およびT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階；および（b）該免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階。
【００６４】
また、本明細書では、遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法が提供され、該方法は、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子およびT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階を含み、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、かつ組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。特定の態様では、TRBC遺伝子は、T細胞受容体β定常部1（TRBC1）遺伝子またはT細胞受容体β定常部2（TRBC2）遺伝子の一方または両方である。
【００６５】
そのような態様のいくつかにおいて、本明細書では、遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法が提供され、該方法は、以下の段階を含み：（a）免疫細胞に、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質と、T細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質を導入し、それによって、該標的部位の遺伝子破壊を誘発する段階；および（b）該免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階。
【００６６】
そのような態様のいくつかにおいて、本明細書では、遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法が提供され、該方法は、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊と、T細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）である組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階を含み、該遺伝子破壊は、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質と、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質によって誘発されたものであり、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。そのような態様のいくつかにおいて、TRBC遺伝子は、T細胞受容体β定常部1（TRBC1）遺伝子またはT細胞受容体β定常部2（TRBC2）遺伝子の一方または両方である。
【００６７】
特定の態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質は、標的部位に特異的に結合またはハイブリダイズするDNA結合タンパク質またはDNA結合核酸を含む。いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質は、（a）DNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼを含む融合タンパク質、または（b）RNA誘導型ヌクレアーゼを含む。特定の態様では、DNAターゲティングタンパク質またはRNA誘導型ヌクレアーゼは、ジンクフィンガータンパク質（ZFP）、TALタンパク質、または標的部位に特異的なCRISPR関連ヌクレアーゼ（Cas）を含む。
【００６８】
特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む。そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の作用物質のそれぞれはCRISPR-Cas9の組み合わせを含み、CRISPR-Cas9の組み合わせは少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体として導入される。そのような態様のいくつかにおいて、CRISPR-Cas9の組み合わせは、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体である。そのような態様のいくつかにおいて、RNPの濃度は1μMもしくは約1μMから5μMもしくは約5μMである。そのような態様のいくつかにおいて、RNPの濃度は2μMもしくは約2μMである。
【００６９】
特定の態様では、RNPは、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞圧縮または細胞スクイージングを介して導入される。いくつかの態様では、RNPはエレクトロポレーションにより導入される。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、gRNAおよび/またはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドとして導入される。特定の態様では、少なくとも1つの標的部位は、TRAC、TRBC1および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある。そのような態様のいくつかにおいて、少なくとも1つの標的部位は、TRAC遺伝子のエクソン内と、TRBC1またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある。
【００７０】
いくつかの態様では、gRNAは、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000007
からなる群より選択される配列を含む。特定の態様では、gRNAは、配列：
2021520202.tif 000008
を含むターゲティングドメインを有する。
【００７１】
特定の態様では、gRNAは、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000009
2021520202.tif 000010
からなる群より選択される配列を含む。いくつかの態様では、gRNAは、配列：
2021520202.tif 000011
を含むターゲティングドメインを有する。
【００７２】
特定の態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、構造［5'相同性アーム］-［導入遺伝子］-［3'相同性アーム］を含む。特定の態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む。いくつかの態様では、5'相同性アームは、標的部位の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。特定の態様では、3'相同性アームは、標的部位の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。
【００７３】
いくつかの態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下である。いくつかの態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000ヌクレオチドである。そのような態様のいくつかにおいて、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、50もしくは約50から100もしくは約100ヌクレオチド長、100もしくは約100から250もしくは約250ヌクレオチド長、250もしくは約250から500もしくは約500ヌクレオチド長、500もしくは約500から750もしくは約750ヌクレオチド長、750もしくは約750から1000もしくは約1000ヌクレオチド長、または1000もしくは約1000から2000もしくは約2000ヌクレオチド長である。
【００７４】
特定の態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、100〜1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチド、または約100〜1000ヌクレオチド、約100〜750ヌクレオチド、約100〜600ヌクレオチド、約100〜400ヌクレオチド、約100〜300ヌクレオチド、約100〜200ヌクレオチド、約200〜1000ヌクレオチド、約200〜750ヌクレオチド、約200〜600ヌクレオチド、約200〜400ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜1000ヌクレオチド、約300〜750ヌクレオチド、約300〜600ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜1000ヌクレオチド、約400〜750ヌクレオチド、約400〜600ヌクレオチド、約600〜1000ヌクレオチド、約600〜750ヌクレオチド、または約750〜1000ヌクレオチドである。そのような態様のいくつかにおいて、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、100もしくは約100から1000もしくは約1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチドの長さである。
【００７５】
そのような態様のいくつかにおいて、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、200、300、400、500、600、700、もしくは800、または約200、300、400、500、600、700、もしくは800ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である。そのような態様のいくつかにおいて、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、300もしくは約300ヌクレオチド以上の長さであり、任意で、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、400、500、もしくは600、または約400、500、もしくは600ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である。そのような態様のいくつかにおいて、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、300もしくは約300ヌクレオチド以上の長さである。
【００７６】
そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体はα（TCRα）鎖およびβ（TCRβ）鎖を含む組換えTCRであり、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TCRα鎖をコードする核酸配列およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む。そのような態様のいくつかにおいて、該導入遺伝子は1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントをさらに含み、マルチシストロン性エレメントは、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される。そのような態様のいくつかにおいて、マルチシストロン性エレメントは、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む。
【００７７】
そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体は組換えTCRであり、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、組換えTCRの1つの鎖をコードする核酸配列を含み、第2の導入遺伝子は組換えTCRの異なる鎖をコードする核酸配列を含む。そのような態様のいくつかにおいて、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TCRα鎖をコードする核酸配列を含み、第2の導入遺伝子は、TCRβ鎖またはその一部をコードする核酸配列を含む。
【００７８】
特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。特定の態様では、免疫細胞に、1つまたは複数の第2の導入遺伝子を含む1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドを導入することを含み、第2の導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。
【００７９】
特定の態様では、第2の鋳型ポリヌクレオチドは、構造［第2の5'相同性アーム］-［1つまたは複数の第2の導入遺伝子］-［第2の3'相同性アーム］を含む。いくつかの態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む。特定の態様では、第2の5'相同性アームは、標的部位の第2の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。
【００８０】
特定の態様では、第2の3'相同性アームは、標的部位の第2の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。いくつかの態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下である。特定の態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、独立して、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000ヌクレオチドである。特定の態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、独立して、100〜1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチド、または約100〜1000ヌクレオチド、約100〜750ヌクレオチド、約100〜600ヌクレオチド、約100〜400ヌクレオチド、約100〜300ヌクレオチド、約100〜200ヌクレオチド、約200〜1000ヌクレオチド、約200〜750ヌクレオチド、約200〜600ヌクレオチド、約200〜400ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜1000ヌクレオチド、約300〜750ヌクレオチド、約300〜600ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜1000ヌクレオチド、約400〜750ヌクレオチド、約400〜600ヌクレオチド、約600〜1000ヌクレオチド、約600〜750ヌクレオチド、または約750〜1000ヌクレオチドである。
【００８１】
いくつかの態様では、1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。特定の態様では、1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位に、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によってはターゲティングされない1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によってはターゲティングされない、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の他の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。
【００８２】
特定の態様では、1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体（CSR）、またはコレセプターから選択される分子をコードする。特定の態様では、コードされた分子は、4-1BBL、OX40L、CD70、LIGHTおよびCD30Lから選択される腫瘍壊死因子（TNF）リガンド、またはCD80およびCD86から選択される免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーリガンドの中から任意で選択される共刺激リガンドである。いくつかの態様では、コードされた分子は、IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、IL-7、IL-15、IL-21、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFN-α）、インターフェロンβ（IFN-β）またはインターフェロンγ（IFN-γ）、およびエリスロポエチンの中から任意で選択されるサイトカインである。特定の態様では、コードされた分子は、CD47、PD-1、CTLA-4およびそれらのリガンドまたはCD28、OX-40、4-1BBおよびそれらのリガンドから選択される免疫抑制作用または免疫刺激作用を有するポリペプチドに任意で結合する可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）である。
【００８３】
特定の態様では、コードされた分子は、任意で以下を含む、免疫調節融合タンパク質である：（a）CD200R、SIRPα、CD279 (PD-1)、CD2、CD95 (Fas)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD272 (BTLA)、A2aR、KIR、TIM3、CD300またはLPA5に由来する抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；（b）CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD47、CD79A、CD79B、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)、CARD11、DAP10、DAP12、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRFM、Zap70、PTCH2、またはそれらの任意の組み合わせに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン；および（c）CD2、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CD80、CD86、CD95 (Fas)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD200R、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD272 (BTLA)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、CD279 (PD-1)、CD300、CD357 (GITR)、A2aR、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、GAL9、KIR、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PTCH2、ROR2、Ryk、Slp76、SIRPα、pTα、TCRα、TCRβ、TIM3、TRIM、LPA5またはZap70に由来する疎水性膜貫通ドメイン。いくつかの態様では、コードされた分子は、PD1のトランケート型細胞外ドメインと、CD28の膜貫通および細胞質シグナル伝達ドメインを任意で含む、キメラスイッチ受容体（CSR）である。特定の態様では、コードされた分子は、CD4またはCD8から任意で選択されるコレセプターである。
【００８４】
特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、組換えTCRの1つの鎖をコードし、第2の導入遺伝子は組換えTCRの異なる鎖をコードする。いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、組換えTCRのα（TCRα）鎖をコードし、第2の導入遺伝子は組換えTCRのβ（TCRβ）鎖をコードする。特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、独立して、調節または制御エレメントをさらに含む。特定の態様では、調節または制御エレメントは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、スプライスアクセプター配列またはスプライスドナー配列を含む。いくつかの態様では、調節または制御エレメントはプロモーターを含む。特定の態様では、プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターおよび/または組織特異的プロモーターの中から選択される。いくつかの態様では、プロモーターは、RNA pol I、pol II、またはpol IIIプロモーターの中から選択される。
【００８５】
そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、調節または制御エレメントをさらに含む。そのような態様のいくつかにおいて、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、独立して、異種の調節または制御エレメントをさらに含む。そのような態様のいくつかにおいて、異種の調節または制御エレメントは異種プロモーターを含む。そのような態様のいくつかにおいて、異種プロモーターは、ヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーターもしくはMNDプロモーター、またはその変異体であるか、またはそれを含む。そのような態様のいくつかにおいて、異種プロモーターは、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである。
【００８６】
特定の態様では、プロモーターは、U6もしくはH1プロモーターであるpol IIIプロモーター；またはCMV、SV40初期領域もしくはアデノウイルス主要後期プロモーターであるpol IIプロモーターから選択される。特定の態様では、プロモーターは、ヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーターもしくはMNDプロモーター、またはその変異体であるか、またはそれを含む。いくつかの態様では、プロモーターは誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである。特定の態様では、プロモーターは、Lacオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列もしくはドキシサイクリンオペレーター配列を含むか、またはその類似体であるか、またはLacリプレッサー、テトラサイクリンリプレッサーもしくはその類似体によって結合または認識されることが可能である。
【００８７】
特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、独立して、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントは、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子の上流にある。特定の態様では、マルチシストロン性エレメントは、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子と、1つまたは複数の第2の導入遺伝子との間に配置される。特定の態様では、マルチシストロン性エレメントは、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される。いくつかの態様では、マルチシストロン性エレメントは、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボ特定のスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む。いくつかの態様では、リボ特定のスキップエレメントをコードする配列は、標的部位の遺伝子とインフレームになるようにターゲティングされる。
【００８８】
特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、独立して、標的部位の遺伝子の内因性プロモーターに機能的に連結される。
【００８９】
そのような態様のいくつかにおいて、TCRα鎖は1つまたは複数のシステイン残基の導入を含む定常（Cα）領域を含み、かつ/またはTCRβ鎖は1つまたは複数のシステイン残基の導入を含むCβ領域を含む；その場合、1つまたは複数の導入されたシステイン残基は、α鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる。そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数のシステイン残基の導入は、非システイン残基のシステイン残基への置換を含む。そのような態様のいくつかにおいて、Cα領域は、SEQ ID NO: 24に示されるナンバリングにより48位に対応する位置にシステインを含み、かつ/またはCβ領域は、SEQ ID NO: 20に示されるナンバリングにより57位に対応する位置にシステインを含む。
【００９０】
いくつかの態様では、組換えTCRは、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に関連する、特異的である、および/または発現される抗原に結合することができる。特定の態様では、疾患、障害または症状は、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である。特定の態様では、抗原は腫瘍抗原または病原性抗原である。いくつかの態様では、病原性抗原は細菌抗原またはウイルス抗原である。
【００９１】
特定の態様では、抗原はウイルス抗原であり、ウイルス抗原は、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス感染症、エプスタインバーウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス8型（HHV-8）、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）、ヒトT細胞白血病ウイルス2型（HTLV-2）、またはサイトメガロウイルス（CMV）に由来する。特定の態様では、抗原は、HPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33およびHPV-35の中から選択されるHPV由来の抗原である。いくつかの態様では、抗原はHPV-16 E6またはHPV-16 E7抗原であるHPV-16抗原である。
【００９２】
特定の態様では、ウイルス抗原は、エプスタインバー核抗原（EBNA）-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNAリーダータンパク質（EBNA-LP）、潜在膜タンパク質LMP-1、LMP-2AおよびLMP-2B、EBV-EA、EBV-MAおよびEBV-VCAの中から選択されるEBV抗原である。特定の態様では、ウイルス抗原は、TAXであるHTLV抗原である。いくつかの態様では、ウイルス抗原は、B型肝炎コア抗原またはB型肝炎エンベロープ抗原であるHBV抗原である。
【００９３】
特定の態様では、抗原は腫瘍抗原である。特定の態様では、抗原は、以下の中から選択される：神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2 (AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、メランA/MART-1、WT-1、S-100、MBP、CD63、MUC1（例：MUC1-8）、p53、Ras、サイクリンB1、HER-2/neu、癌胎児性抗原（CEA）、gp100、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A11、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-C1、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）、β-カテニン、NY-ESO-1、LAGE-1a、PP1、MDM2、MDM4、EGVFvIII、Tax、SSX2、テロメラーゼ、TARP、pp65、CDK4、ビメンチン、S100、eIF-4A1、IFN誘導性p78、メラノトランスフェリン（p97）、ウロプラキンII、前立腺特異抗原（PSA）、ヒトカリクレイン（huK2）、前立腺特異膜抗原（PSM）、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、好中球エラスターゼ、エフリンB2、BA-46、Bcr-abl、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、カスパーゼ8、FRa、CD24、CD44、CD133、CD 166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、uPA、PAI-1、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、グリコリピドF77、GD-2、インスリン成長因子（IGF）-I、IGF-II、IGF-I受容体、およびメソテリン。
【００９４】
そのような態様のいくつかにおいて、免疫細胞はT細胞を含むか、またはT細胞に富んでいる。そのような態様のいくつかにおいて、T細胞はCD8+ T細胞またはそのサブタイプを含む。そのような態様のいくつかにおいて、T細胞はCD4+ T細胞またはそのサブタイプを含む。そのような態様のいくつかにおいて、T細胞はCD4+ T細胞またはそのサブタイプおよびCD8+ T細胞またはそのサブタイプを含む。そのような態様のいくつかにおいて、T細胞はCD4+ T細胞とCD8+ T細胞を含み、CD4+ T細胞対CD8+ T細胞の比は、1：3もしくは約1：3から3：1もしくは約3：1である。そのような態様のいくつかにおいて、その比は、1：2もしくは約1：2から2：1もしくは約2：1である。そのような態様のいくつかにおいて、その比は、1：1または約1：1である。いくつかの態様では、免疫細胞はT細胞である。特定の態様では、T細胞はCD8+ T細胞またはそのサブタイプである。特定の態様では、T細胞はCD4+ T細胞またはそのサブタイプである。
【００９５】
いくつかの態様では、免疫細胞は多分化能細胞または多能性細胞に由来し、任意でiPSCである。そのような態様のいくつかにおいて、免疫細胞は対象由来の初代細胞である。そのような態様のいくつかにおいて、対象は疾患、障害または症状を有するか、またはその疑いがある。そのような態様のいくつかにおいて、対象は健康であるか、またはその疑いがある。そのような態様のいくつかにおいて、免疫細胞は対象の自己細胞である。そのような態様のいくつかにおいて、免疫細胞は対象に対して同種異系である。特定の態様では、免疫細胞は対象の自己細胞であるT細胞を含む。特定の態様では、免疫細胞は対象に対して同種異系であるT細胞を含む。
【００９６】
そのような態様のいくつかにおいて、鋳型ポリヌクレオチドは1つまたは複数のベクターに含まれ、それは任意でウイルスベクターである。そのような態様のいくつかにおいて、ベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターはAAVベクターである。そのような態様のいくつかにおいて、AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7およびAAV8ベクターからなる群より選択される。そのような態様のいくつかにおいて、AAVベクターはAAV2またはAAV6ベクターである。そのような態様のいくつかにおいて、ベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。そのような態様のいくつかにおいて、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【００９７】
いくつかの態様では、第1の鋳型ポリヌクレオチド、1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチド、および/またはgRNAおよび/またはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドは、1つまたは複数のベクターに含まれ、それらは任意でウイルスベクターである。特定の態様では、ベクターはAAVベクターである。特定の態様では、AAVベクターは、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7またはAAV8ベクターの中から選択される。いくつかの態様では、AAVベクターはAAV2またはAAV6ベクターである。特定の態様では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。特定の態様では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【００９８】
そのような態様のいくつかにおいて、鋳型ポリヌクレオチドは、少なくとも2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000もしくは10000、または少なくとも約2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000もしくは10000ヌクレオチドの長さ、または前述のいずれかの間の任意の値である。そのような態様のいくつかにおいて、該ポリヌクレオチドは、2500もしくは約2500から5000もしくは約5000ヌクレオチド、3500もしくは約3500から4500もしくは約4500ヌクレオチド、または3750もしくは約3750ヌクレオチドから4250もしくは約4250ヌクレオチドの長さである。
【００９９】
いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドの導入は、同時に、または任意の順序で連続して行われる。特定の態様では、鋳型ポリヌクレオチドの導入は、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる。特定の態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または導入後30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内、まはた約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に導入される。そのような態様のいくつかにおいて、鋳型ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の作用物質の導入の2時間後または約2時間後に導入される。
【０１００】
そのような態様のいくつかにおいて、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドの導入は、1つの実験反応で行われる。そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の作用物質を導入する前に、前記方法は、1つまたは複数の免疫細胞を刺激または活性化する条件下に、該細胞を刺激剤とともにインビトロでインキュベートする段階を含む。そのような態様のいくつかにおいて、刺激剤は抗CD3および/または抗CD28抗体、任意で抗CD3/抗CD28ビーズを含む。そのような態様のいくつかにおいて、ビーズ対細胞の比は、1：1であるかまたは約1：1である。そのような態様のいくつかにおいて、刺激剤は、1つまたは複数の作用物質を導入する前に、1つまたは複数の免疫細胞から除去される。
【０１０１】
そのような態様のいくつかにおいて、前記方法は、1つまたは複数の作用物質の導入および/または鋳型ポリヌクレオチドの導入の前、間または後に、該細胞を1つまたは複数の組換えサイトカインとともにインキュベートする段階をさらに含む。そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の組換えサイトカインは、IL-2、IL-7、およびIL-15からなる群より選択される。そのような態様のいくつかにおいて、1つまたは複数の組換えサイトカインは、10U/mLもしくは約10U/mLから200U/mLもしくは約200U/mL、任意で50IU/mLもしくは約50IU/mLから100U/mLもしくは約100U/mLのIL-2の濃度；0.5ng/mL〜50ng/mLの濃度のIL-7、そのような態様のいくつかにおいて、該濃度は5ng/mLもしくは約5ng/mLから10ng/mLもしくは約10ng/mLである；および/または0.1ng/mL〜20ng/mLの濃度のIL-15、そのような態様のいくつかにおいて、該濃度は0.5ng/mLもしくは約0.5ng/mLから5ng/mLもしくは約5ng/mLである；から選択される濃度で添加される。そのような態様のいくつかにおいて、インキュベーションは、1つまたは複数の作用物質の導入および鋳型ポリヌクレオチドの導入に続いて、最大または約24時間、36時間、48時間、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20または21日間実施される。そのような態様のいくつかにおいて、導入は最大または約7日である。
【０１０２】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドの導入および1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドの導入は、同時に、または任意の順序で連続して行われる。特定の態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入および鋳型ポリヌクレオチドの導入は、1つの実験反応で行われる。特定の態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドおよび第2の鋳型ポリヌクレオチドの導入は、1つの実験反応で行われる。
【０１０３】
いくつかの態様では、複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上は、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子のドメインまたは領域をコードする遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む。特定の態様では、複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上は、該組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または抗原結合もしくは抗原への結合を示す。特定の態様では、複数の改変細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数は、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30またはそれ以下より低い。いくつかの態様では、複数の改変細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数は、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、または10％低い。
【０１０４】
特定の態様では、組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合は、組成物中の細胞をTCRα鎖またはTCRβ鎖に特異的な結合試薬と接触させ、該試薬の細胞への結合を測定することによって評価される。特定の態様では、結合試薬は、Vβ鎖またはVα鎖の特定のファミリーを特異的に認識する抗TCR Vβ抗体または抗TCR Vα抗体である。いくつかの態様では、結合試薬はペプチド抗原-MHC複合体であり、これは任意で四量体である。
【０１０５】
本明細書では、本明細書に記載の方法を用いて作製された、1つの改変細胞または複数の改変細胞が提供される。
【０１０６】
そのような態様のいくつかにおいて、本明細書では、該1つの改変細胞、該複数の改変細胞または組成物を、治療を必要とする対象に投与する段階を含む、治療方法が提供される。そのような態様のいくつかにおいて、該対象は疾患、障害または症状を有する。そのような態様のいくつかにおいて、疾患、障害または症状は癌である。
【０１０７】
そのような態様のいくつかにおいて、本明細書では、癌疾患、障害または症状の治療における、該1つの改変細胞、該複数の改変細胞または組成物の使用が提供される。そのような態様のいくつかにおいて、疾患、障害または症状は癌である。
【０１０８】
そのような態様のいくつかにおいて、本明細書では、疾患、障害または症状を治療するための医薬の製造における、該1つの改変細胞、該複数の改変細胞または組成物の使用が提供される。そのような態様のいくつかにおいて、疾患、障害または症状は癌である。
【０１０９】
そのような態様のいくつかにおいて、本明細書では、癌疾患、障害または症状の治療に使用するための、該1つの改変細胞、該複数の改変細胞または組成物の使用が提供される。そのような態様のいくつかにおいて、疾患、障害または症状は癌である。
【０１１０】
本明細書では、本明細書に記載の1つの改変細胞、複数の改変細胞または組成物を対象に投与する段階を含む、治療方法が提供される。本明細書では、癌を治療するための、本明細書に記載の1つの改変細胞、複数の改変細胞または組成物の使用が提供される。本明細書では、癌を治療するための医薬の製造における、本明細書に記載の1つの改変細胞、複数の改変細胞または組成物の使用が提供される。特定の態様は、癌の治療に使用するための本明細書に記載の1つの改変細胞、複数の改変細胞または組成物を提供する。
【０１１１】
そのような態様のいくつかにおいて、本明細書では、以下を含むキットが提供される：1つまたは複数の作用物質であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、作用物質；および組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドであって、組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、鋳型ポリヌクレオチド；ならびに本明細書に記載の態様のいずれかの方法を実施するための説明書。
【０１１２】
本明細書ではまた、以下を含むキットも提供される：1つまたは複数の作用物質であった、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、作用物質；および組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドであって、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、鋳型ポリヌクレオチド。特定の態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質は、標的部位に特異的に結合またはハイブリダイズするDNA結合タンパク質またはDNA結合核酸を含む。
【０１１３】
特定の態様では、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質は、（a）DNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼを含む融合タンパク質、または（b）RNA誘導型ヌクレアーゼを含む。いくつかの態様では、DNAターゲティングタンパク質またはRNA誘導型ヌクレアーゼは、ジンクフィンガータンパク質（ZFP）、TALタンパク質、または標的部位に特異的なCRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid-associated nuclease）を含む。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質は、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせを含む。特定の態様では、1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む。
【０１１４】
いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体として導入される。特定の態様では、RNPは、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞圧縮または細胞スクイージングを介して導入される。特定の態様では、RNPはエレクトロポレーションを介して導入される。いくつかの態様では、1つまたは複数の作用物質は、gRNAおよび/またはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドとして導入される。特定の態様では、少なくとも1つの標的部位は、TRAC、TRBC1および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある。
【０１１５】
特定の態様では、gRNAは、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000012
から選択される配列を含む。いくつかの態様では、gRNAは、配列：
2021520202.tif 000013
を含むターゲティングドメインを有する。
【０１１６】
特定の態様では、gRNAは、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000014
2021520202.tif 000015
から選択される配列を含む。特定の態様では、gRNAは、配列：
2021520202.tif 000016
を含むターゲティングドメインを有する。
【０１１７】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、構造［5'相同性アーム］-［導入遺伝子］-［3'相同性アーム］を含む。特定の態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む。特定の態様では、5'相同性アームは、標的部位の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。いくつかの態様では、3'相同性アームは、標的部位の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。特定の態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下である。特定の態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000ヌクレオチドである。
【０１１８】
いくつかの態様では、5'相同性アームおよび3'相同性アームは、独立して、100〜1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチド、または約100〜1000ヌクレオチド、約100〜750ヌクレオチド、約100〜600ヌクレオチド、約100〜400ヌクレオチド、約100〜300ヌクレオチド、約100〜200ヌクレオチド、約200〜1000ヌクレオチド、約200〜750ヌクレオチド、約200〜600ヌクレオチド、約200〜400ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜1000ヌクレオチド、約300〜750ヌクレオチド、約300〜600ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜1000ヌクレオチド、約400〜750ヌクレオチド、約400〜600ヌクレオチド、約600〜1000ヌクレオチド、約600〜750ヌクレオチド、または約750〜1000ヌクレオチドである。特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。いくつかの局面では、前記キットは、1つまたは複数の第2の導入遺伝子を含む1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドをさらに含み、ここで、第2の導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。
【０１１９】
特定の態様では、第2の鋳型ポリヌクレオチドは、構造［第2の5'相同性アーム］-［1つまたは複数の第2の導入遺伝子］-［第2の3'相同性アーム］を含む。特定の態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む。いくつかの態様では、第2の5'相同性アームは、標的部位の第2の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。特定の態様では、第2の3'相同性アームは、標的部位の第2の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む。特定の態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下である。特定の態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000ヌクレオチドである。
【０１２０】
特定の態様では、第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームは、独立して、100〜1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチド、または約100〜1000ヌクレオチド、約100〜750ヌクレオチド、約100〜600ヌクレオチド、約100〜400ヌクレオチド、約100〜300ヌクレオチド、約100〜200ヌクレオチド、約200〜1000ヌクレオチド、約200〜750ヌクレオチド、約200〜600ヌクレオチド、約200〜400ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜1000ヌクレオチド、約300〜750ヌクレオチド、約300〜600ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜1000ヌクレオチド、約400〜750ヌクレオチド、約400〜600ヌクレオチド、約600〜1000ヌクレオチド、約600〜750ヌクレオチド、または約750〜1000ヌクレオチドである。
【０１２１】
特定の態様では、1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。いくつかの態様では、1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によってはターゲティングされない1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。
【０１２２】
特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる。いくつかの態様では、1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体（CSR）、またはコレセプターから選択される分子をコードする。特定の態様では、コードされた分子は、4-1BBL、OX40L、CD70、LIGHTおよびCD30Lから選択される腫瘍壊死因子（TNF）リガンド、またはCD80およびCD86から選択される免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーリガンドの中から任意で選択される共刺激リガンドである。特定の態様では、コードされた分子は、IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-30、IL-7、IL-24、IL-30、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFN-α）、インターフェロンβ（IFN-β）またはインターフェロンγ（IFN-γ）、およびエリスロポエチンの中から任意で選択されるサイトカインである。
【０１２３】
いくつかの態様では、コードされた分子は、CD47、PD-1、CTLA-4およびそれらのリガンドまたはCD28、OX-40、4-1BBおよびそれらのリガンドから選択される免疫抑制作用または免疫刺激作用を有するポリペプチドに任意で結合する可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）である。特定の態様では、コードされた分子は、任意で以下を含む、免疫調節融合タンパク質である：（a）CD290R、SIRPα、CD279 (PD-1)、CD2、CD95 (Fas)、CD242 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD272 (BTLA)、A2aR、KIR、TIM3、CD300またはLPA5に由来する抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；（b）CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD47、CD79A、CD79B、CD224 (OX40)、CD227 (4-1BB)、CD240 (SLAMF1)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)、CARD11、DAP10、DAP30、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRFM、Zap70、PTCH2、またはそれらの任意の組み合わせに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン；および（c）CD2、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CD80、CD86、CD95 (Fas)、CD224 (OX40)、CD227 (4-1BB)、CD240 (SLAMF1)、CD242 (CTLA4)、CD290R、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD272 (BTLA)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、CD279 (PD-1)、CD300、CD357 (GITR)、A2aR、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、GAL9、KIR、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PTCH2、ROR2、Ryk、Slp76、SIRPα、pTα、TCRα、TCRβ、TIM3、TRIM、LPA5またはZap70に由来する疎水性膜貫通ドメイン。特定の態様では、コードされた分子は、PD1のトランケート型細胞外ドメインと、CD28の膜貫通および細胞質シグナル伝達ドメインを任意で含む、キメラスイッチ受容体（CSR）である。
【０１２４】
いくつかの態様では、コードされた分子は、CD4またはCD8から任意で選択されるコレセプターである。特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、組換えTCRの1つの鎖をコードし、第2の導入遺伝子は、組換えTCRの異なる鎖をコードする。特定の態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、組換えTCRのα（TCRα）鎖をコードし、第2の導入遺伝子は、組換えTCRのβ（TCRβ）鎖をコードする。いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、独立して、調節または制御エレメントをさらに含む。
【０１２５】
特定の態様では、調節または制御エレメントは、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、スプライスアクセプター配列またはスプライスドナー配列を含む。特定の態様では、調節または制御エレメントはプロモーターを含む。いくつかの態様では、プロモーターは、構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターおよび/または組織特異的プロモーターの中から選択される。特定の態様では、プロモーターは、RNA pol I、pol II、またはpol IIIプロモーターの中から選択される。特定の態様では、プロモーターは以下から選択される：U6もしくはH1プロモーターであるpol IIIプロモーター；またはCMV、SV40初期領域またはアデノウイルス主要後期プロモーターであるpol IIプロモーター。いくつかの態様では、プロモーターは、ヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーターもしくはMNDプロモーターまたはその変異体であるか、またはそれを含む。特定の態様では、プロモーターは誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである。特定の態様では、プロモーターは、Lacオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列もしくはドキシサイクリンオペレーター配列を含むか、またはその類似体であるか、またはLacリプレッサー、テトラサイクリンリプレッサーもしくはその類似体によって結合または認識されることが可能である。
【０１２６】
いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、独立して、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントを含む。特定の態様では、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントは、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子の上流にある。特定の態様では、マルチシストロン性エレメントは、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子と、1つまたは複数の第2の導入遺伝子との間に配置される。いくつかの態様では、マルチシストロン性エレメントは、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される。特定の態様では、マルチシストロン性エレメントは、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボ特定の（ribocertain）スキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む。特定の態様では、リボ特定のスキップエレメントをコードする配列は、標的部位の遺伝子とインフレームになるようにターゲティングされる。
【０１２７】
いくつかの態様では、HDRの際に、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、独立して、標的部位の遺伝子の内因性プロモーターに機能的に連結される。特定の態様では、組換えTCRは、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に関連する、特異的である、および/または発現される抗原に結合することができる。特定の態様では、疾患、障害または症状は、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である。いくつかの態様では、抗原は腫瘍抗原または病原性抗原である。特定の態様では、病原性抗原は細菌抗原またはウイルス抗原である。特定の態様では、抗原はウイルス抗原であり、ウイルス抗原は、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス感染症、エプスタインバーウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス8型（HHV-8）、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）、ヒトT細胞白血病ウイルス2型（HTLV-2）、またはサイトメガロウイルス（CMV）に由来する。いくつかの態様では、抗原は、HPV-25、HPV-27、HPV-31、HPV-33およびHPV-35の中から選択されるHPV由来の抗原である。
【０１２８】
特定の態様では、抗原はHPV-25 E6またはHPV-25 E7抗原であるHPV-25抗原である。特定の態様では、ウイルス抗原は、エプスタインバー核抗原（EBNA）-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNAリーダータンパク質（EBNA-LP）、潜在膜タンパク質LMP-1、LMP-2AおよびLMP-2B、EBV-EA、EBV-MAおよびEBV-VCAの中から選択されるEBV抗原である。いくつかの態様では、ウイルス抗原は、TAXであるHTLV抗原である。特定の態様では、ウイルス抗原は、B型肝炎コア抗原またはB型肝炎エンベロープ抗原であるHBV抗原である。特定の態様では、抗原は腫瘍抗原である。
【０１２９】
いくつかの態様では、抗原は、以下の中から選択される：神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2 (AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、メランA/MART-1、WT-1、S-100、MBP、CD63、MUC1（例：MUC1-8）、p53、Ras、サイクリンB1、HER-2/neu、癌胎児性抗原（CEA）、gp100、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A11、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-C1、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）、β-カテニン、NY-ESO-1、LAGE-1a、PP1、MDM2、MDM4、EGVFvIII、Tax、SSX2、テロメラーゼ、TARP、pp65、CDK4、ビメンチン、S100、eIF-4A1、IFN誘導性p78、メラノトランスフェリン（p97）、ウロプラキンII、前立腺特異抗原（PSA）、ヒトカリクレイン（huK2）、前立腺特異膜抗原（PSM）、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、好中球エラスターゼ、エフリンB2、BA-46、Bcr-abl、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、カスパーゼ8、FRa、CD24、CD44、CD223、CD256、epCAM、CA-224、HE4、Oval、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、uPA、PAI-1、CD28、CD29、CD22、ROR1、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、グリコリピドF77、GD-2、インスリン成長因子（IGF）-I、IGF-II、IGF-I受容体、およびメソテリン。
【０１３０】
特定の態様では、第1の鋳型ポリヌクレオチド、1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチド、および/またはgRNAおよび/またはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドは、1つまたは複数のベクターに含まれ、該ベクターは任意でウイルスベクターである。特定の態様では、該ベクターはAAVベクターである。いくつかの態様では、AAVベクターはAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7またはAAV8ベクターの中から選択される。特定の態様では、AAVベクターはAAV2またはAAV6ベクターである。特定の態様では、ウイルスベクターはレトロウイルスベクターである。いくつかの態様では、ウイルスベクターはレンチウイルスベクターである。
【図面の簡単な説明】
【０１３１】
【図１Ａ】図1Aは、様々な発現方法を使用してTCR #1を発現するように改変された、内在性TCRをコードする遺伝子のノックアウトを受ける以下のT細胞について、フローサイトメトリーによって評価した場合の、CD8、および例示的組換えTCR（TCR #1）によって認識される抗原と複合体化されたペプチド-MHC四量体の表面発現を示す：組換えTCRをコードする配列のランダムな組み込みのためにレンチウイルス形質導入受ける細胞（「TCR #1レンチ」）、TRACのランダムな組み込みおよびCRISPR/Cas9媒介性ノックアウト（KO）を受ける細胞（「TCR #1レンチKO」）；またはヒトEF1αプロモーターの制御化で、組換えTCRをコードする配列の、TRAC座位おけるHDRによる標的組み込みを受ける細胞（TCR #1 HDR KO）。
【図１Ｂ】図1Bおよび1Cは、TCR #1を発現するように改変されたCD8+T細胞における、ペプチド-MHC四量体の結合の細胞表面発現の平均蛍光強度（MFI；図1B）および変動係数（それぞれの集団におけるシグナルの平均で割った、細胞の集団内のシグナルの標準偏差；図1C）を示す。
【図１Ｃ】図1Bの説明を参照のこと。
【図２Ａ】図2Aは、様々な発現方法を使用してTCR #2を発現するように改変された、内在性TCRをコードする遺伝子のノックアウトを受ける以下のT細胞について、フローサイトメトリーによって評価した場合の、CD8、および例示的組換えTCR（TCR #2）によって認識される抗原と複合体化されたペプチド-MHC四量体の表面発現を示す：組換えTCRをコードする配列のランダムな組み込みのためにレンチウイルス形質導入を受ける細胞（「TCR #2レンチ」）、TRACのランダムな組み込みおよびCRISPR/Cas9媒介性ノックアウト（KO）を受ける細胞（「TCR #2レンチKO」）；またはヒトEF1αプロモーターの制御化で、組換えTCRをコードする配列の、TRAC座位でのHDRによる標的組み込みを受ける細胞（TCR #2 HDR KO）。
【図２Ｂ】図2Bは、TCR #2を発現するように改変されたCD8+およびCD4+T細胞における、ペプチド-MHC四量体の結合の細胞表面発現の平均蛍光強度（MFI）を示す。
【図３】図3Aは、2人のドナーから生成された上記の様々な組換えTCR #1発現CD8+T細胞の平均細胞溶解活性を示す。これは、10:1、5:1、および2.5:1のエフェクター対標的（E:T）比で、HPV 16 E7を発現する標的細胞とともに上記のエフェクター細胞をインキュベートした後に、上記の各群について、モック形質導入対照と比較し、Vベータ発現（組換えTCR特異的染色）に対して正規化した、死滅％の曲線下面積（AUC）によって表される。HPV 16 E7に結合することができるが、マウスCαおよびCβ領域を含む参照TCRをコードするレンチウイルスで形質導入されたCD8+細胞を対照（「レンチ参照」）として評価した。図3Bは、上記の様々な組換えTCR #1発現CD8+T細胞による平均IFNγ分泌（pg/mL）を示す。
【図４Ａ】図4Aは、2人のドナーから生成された上記の様々な組換えTCR #2発現CD8+T細胞の平均細胞溶解活性を示す。これは、上記の各群について、10:1、5:1、および2.5:1のエフェクター対標的（E:T）比で、HPV 16 E7を発現する標的細胞とともに上記のエフェクター細胞をインキュベートした後に、モック形質導入対照と比較し、Vベータ発現（組換えTCR特異的染色）に対して正規化した、死滅％の曲線下面積（AUC）によって表される。HPV 16 E7に結合することができるが、マウスCαおよびCβ領域を含む参照TCRをコードするレンチウイルスで形質導入されたCD8+細胞を対照（「レンチ参照」）として評価した。
【図４Ｂ】図4Bおよび4Cは、上記の様々な組換えTCR #2発現CD8+T細胞による平均IFNγ（pg/mL；図4B）およびIL-2（pg/mL；図4C）分泌を示す。
【図４Ｃ】図4Bの説明を参照のこと。
【図４Ｄ】図4Dおよび4Eは、経時的な生存可能標的細胞の数によって示される、様々な組換えTCR #2発現CD8+（図4D）またはCD4+（図4E）T細胞の細胞溶解活性を示す。
【図４Ｅ】図4Dの説明を参照のこと。
【図４Ｆ】図4Fおよび4Gは、2.5:1（図4F）または10:1（図4G）のE:T比での、様々な組換えTCR #2発現細胞におけるIFNγ分泌を示す。
【図４Ｇ】図4Fの説明を参照のこと。
【図５】図5Aおよび5Bは、組換えTCR #2を発現するように改変された様々なCD4+（図5A）またはCD8+（図5B）細胞における、凍結保存（凍結状態）時または凍結保存から解凍した後（解凍状態）の、アクリジンオレンジ（AO）およびヨウ化プロピジウム（PI）で染色された細胞の％によって決定した生存率を示す。
【図６−１】図6Aおよび6Bは、様々な発現方法を使用して組換えT細胞受容体（TCR）を発現するように改変された、内在性TCRをコードする遺伝子のノックアウトを受ける以下のT細胞について、フローサイトメトリーによって評価した場合の、CD8、CD3、Vベータ（組換えTCR特異的染色）、および組換えTCRによって認識される抗原と複合体化されたペプチド-MHC四量体の表面発現を示す：TRACおよびTRBCのCRISPR/Cas9媒介性ノックアウト（KO）を受ける細胞（「TCRαβ KO」）または内在性TCRの発現を保持する細胞（「TCRαβ WT」）；EF1αまたはMNDプロモーターに連結された組換えTCRをコードする配列の、TRAC座位でのHDRによる標的組み込みを受ける細胞（「HDR EF1α」または「HDR MND」）；組換えTCRをコードする配列（「レンチヒト」）もしくはマウス定常ドメインを含む組換えTCRをコードする配列（「レンチマウス」）のランダムな組み込みのためにレンチウイルス形質導入を受ける細胞、または対照としてモック形質導入を受ける細胞（「モック形質導入」）。
【図６−２】図6-1の説明を参照のこと。
【図６−３】図6Cおよび6Dは、上記のように様々な発現方法を使用して組換えT細胞受容体（TCR）を発現するように改変されたCD8＋（図6C）またはCD4＋（図6D）T細胞における、Vベータおよびペプチド-MHC四量体の結合の細胞表面発現の幾何平均蛍光強度（gMFI）を示す。
【図６−４】図6Eおよび6Fは、Vベータ（図6F）およびペプチド-MHC四量体の結合（図6E）の発現について、上記のように様々な発現方法を使用して組換えT細胞受容体（TCR）を発現するように改変されたCD8+T細胞における変動係数（それぞれの集団におけるシグナルの平均で割った、細胞の集団内のシグナルの標準偏差）を示す。
【図７Ａ】図7A〜7Cは、様々な発現方法を使用して組換えT細胞受容体（TCR）を発現するように改変された、内在性TCRをコードする遺伝子のノックアウトを受ける以下のT細胞について、フローサイトメトリーによって評価した場合の、CD3およびCD8の表面発現を示す：TRAC、TRBC、もしくはTRACとTRBCの両方のCRISPR/Cas9媒介性ノックアウト（KO）を受ける細胞；EF1αプロモーター、MNDプロモーター、もしくはP2Aリボソームスキップ配列を使用する内在性TCRアルファプロモーター（それぞれ、「HDR EF1α」、「HDR MND」、もしくは「HDR P2A」）に連結された組換えTCRをコードする配列の、TRAC座位でのHDRによる標的組み込みを受ける細胞、または対照としてモック形質導入を受ける細胞（「モック形質導入」）（図7A）；内在性TCRの発現を保持し、EF1αプロモーター（「レンチEF1α」）もしくはMNDプロモーター（「レンチMND」）に連結された、または代用マーカーとしてトランケートされた受容体をコードする配列を有する、EF1αプロモーターに連結された（「レンチEF1α／t受容体」）組換えTCRをコードする配列のランダムな組み込みのために、レンチウイルス形質導入を受ける細胞、あるいは対照としてモック形質導入を受ける細胞（「モック」）（図7Ｂ）。図7Cは、上記の群のそれぞれにおける、CD8＋細胞の中のCD3＋CD8＋細胞のパーセンテージを示す。
【図７Ｂ】図7Aの説明を参照のこと。
【図７Ｃ】図7Aの説明を参照のこと。
【図８Ａ】図8A〜8Cは、様々な発現方法を使用して組換えT細胞受容体（TCR）を発現するように改変された、内在性TCRをコードする遺伝子のノックアウトを受ける以下のT細胞について、フローサイトメトリーによって評価した場合の、ペプチド-MHC四量体の結合およびCD8の表面発現を示す：TRAC、TRBC、もしくはTRACとTRBCの両方のCRISPR/Cas9媒介性ノックアウト（KO）を受ける細胞；EF1αプロモーター、MNDプロモーター、もしくはP2Aリボソームスキップ配列を使用する内在性TCRアルファプロモーター（それぞれ、「HDR EF1α」、「HDR MND」、もしくは「HDR P2A」）に連結された組換えTCRをコードする配列の、TRAC座位でのHDRによる標的組み込みを受ける細胞、または対照としてモック形質導入を受ける細胞（「モック形質導入」）（図8A）；内在性TCRの発現を保持し、EF1αプロモーター（「レンチEF1α」）もしくはMNDプロモーター（「レンチMND」）に連結された、または代用マーカーとしてトランケートされた受容体をコードする配列を有する、EF1αプロモーターに連結された（「レンチEF1α／t受容体」）組換えTCRをコードする配列のランダムな組み込みのために、レンチウイルス形質導入を受ける細胞、あるいは対照としてモック形質導入を受ける細胞（「モック」）（図8B）。図8Cは、7日目および13日目の上記の群のそれぞれにおける、CD8+細胞の中の四量体+CD8+細胞のパーセンテージを示す。
【図８Ｂ】図8Aの説明を参照のこと。
【図８Ｃ】図8Aの説明を参照のこと。
【図９Ａ】図9A〜9Dは、様々な発現方法を使用して組換えT細胞受容体（TCR）を発現するように改変された、内在性TCRをコードする遺伝子のノックアウトを受ける以下のT細胞について、フローサイトメトリーによって評価した場合の、Vベータ（組換えTCR特異的染色）およびCD8の表面発現を示す：TRAC、TRBC、もしくはTRACとTRBCの両方のCRISPR/Cas9媒介性ノックアウト（KO）を受ける細胞；EF1αプロモーター、MNDプロモーター、もしくはP2Aリボソームスキップ配列を使用する内在性TCRアルファプロモーター（それぞれ、「HDR EF1α」、「HDR MND」、もしくは「HDR P2A」）に連結された組換えTCRをコードする配列の、TRAC座位でのHDRによる標的組み込みを受ける細胞、または対照としてモック形質導入を受ける細胞（「モック形質導入」）（図9A）；内在性TCRの発現を保持し、EF1αプロモーター（「レンチEF1α」）もしくはMNDプロモーター（「レンチMND」）に連結された、または代用マーカーとしてトランケートされた受容体をコードする配列を有する、EF1αプロモーターに連結された（「レンチEF1α／受容体」）組換えTCRをコードする配列のランダムな組み込みのためにレンチウイルス形質導入を受ける細胞、あるいは対照としてモック形質導入を受ける細胞（「モック」）（図9B）。図9Cおよび9Dは、7日目および13日目の上記の群のそれぞれにおける、CD8+細胞の中のVベータ+CD8+細胞のパーセンテージ（図9C）およびCD4+細胞中のVベータ+CD4+のパーセンテージ細胞（図9D）を示す。
【図９Ｂ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｃ】図9Aの説明を参照のこと。
【図９Ｄ】図9Aの説明を参照のこと。
【図１０】図10は、10:1、5:1、および2.5:1のエフェクター対標的（E:T）比での、HPV 16 E7を発現する標的細胞との上記のエフェクター細胞のインキュベーションからの、モック形質導入対照と比較し、各群に対するVベータ発現に対して正規化した、死滅％の曲線下面積（AUC）によって表される、上記の様々な組換えTCR発現CD8+T細胞の細胞溶解活性を示す。対照（「レンチマウスE7参照」）として、HPV 16 E7に結合することができるが、マウスCαおよびCβ領域を含む参照TCRをコードするレンチウイルスで形質導入されたCD8+細胞を評価した。
【図１１】図11は、10:1および2.5:1のエフェクター対標的（E:T）比での、HPV 16 E7を発現する標的細胞との上記のエフェクター細胞のインキュベーションからの、上記の様々な組換えTCR発現CD8+T細胞によるIFNγ分泌（pg/mL）を示す。対照（「レンチマウスE7参照」）として、HPV 16 E7に結合することができるが、マウスCαおよびCβ領域を含む参照TCRをコードするレンチウイルスで形質導入されたCD8+細胞を評価した。
【図１２】図12は、以下の様々な機能アッセイにおける上記の様々な組換えTCR発現T細胞の相対活性を示すヒートマップを示す：10:1、5:1、および2.5:1のE:T比における死滅％のAUC（「AUC」）、7日目および13日目のCD8+細胞における四量体結合（「四量体CD8」）、抗原ペプチドでパルスしたSCC152細胞またはT2標的細胞を使用する増殖アッセイ（「CTV数」）、およびCD8+細胞からのIFNγの分泌（「CD8によって分泌されたIFNg」）。
【図１３Ａ】図13A〜13Bは、6×106（図13A）または3×106（図13B）TCR発現細胞の用量における、改変された細胞を受けていない（腫瘍単独）マウス、またはエレクトロポレーションに使用されるものと同じであるが、RNPを加えていない条件下で処理した細胞（モックKO）を投与したマウスと比較した場合の、様々な方法によって生成された以下の例示的組換えTCR #2を発現するように改変された、CD4+およびCD8+細胞を投与したUPCI:SCC152扁平上皮癌腫瘍モデルマウスにおける、経時的な腫瘍体積の変化の結果を示す：HDRによるTRAC座位での組み込みのためにターゲティングされる、ヒト伸長因子1アルファ（EF1α）プロモーターによって制御されるTCR#2（TCR #2 HDR KO EF1α）；HDRによるTRAC座位での組み込みのためにターゲティングされる、内在性TRACプロモーターによって（上流のインフレームのP2Aリボソームスキップエレメントによって）制御されるTCR#2（TCR #2 HDR KO P2A）；レンチウイルスコンストラクトを使用してランダムに組み込まれたTCR#2（TCR #2レンチ）；レンチウイルスコンストラクトを使用して、内在性TRACのノックアウトを含む細胞中にランダムに組み込まれたTCR#2（TCR #2レンチKO）；およびレンチウイルスコンストラクトを使用してランダムに組み込まれた、HPV 16 E7に結合することができるが、マウスCαおよびCβ領域を含む参照TCR（レンチ参照）。
【図１３Ｂ】図13Aの説明を参照のこと。
【図１４Ａ】図14A〜14Bは、6×106（図14A）または3×106（図14B）の用量の組換えTCR発現細胞が与えられたマウスについての、上記の各群におけるマウスの生存曲線を示す。
【図１４Ｂ】図14Aの説明を参照のこと。
【図１５Ａ】図15A〜15Bは、6×106（図15A）または3×106（図15B）の用量の組換えTCR発現細胞が与えられたマウスについての、上記の各群におけるマウスの経時的な体重の変化％を示す。
【図１５Ｂ】図15Aの説明を参照のこと。
【図１６Ａ】図16A〜16Bは、HDR鋳型ポリヌクレオチドを含むAAV調製物で形質導入してから24、48、および72時間後（図16A）、ならびに96時間または7日後（図16B）のGFPパターンの変化によって評価した場合の、試験した様々な相同性アーム長についての様々な時点での組み込みの結果を示す。
【図１６Ｂ】図16Aの説明を参照のこと。
【図１７Ａ】図17A〜17Bは、4つの異なるドナー、ドナー1および2（図17A）およびドナー3および4（図17B）に対する、24、48、72、および96時間または7日での、様々な相同性アーム長を使用するHDRについての組み込み比率の変化を示す。
【図１７Ｂ】図17Aの説明を参照のこと。
【図１８Ａ】図18A〜18Bは、内在性TRAC座位への核酸配列の組み込みによって改変された細胞における例示的抗CD19 CARの発現および活性の評価からの結果を示す。図18Aは、様々な発現方法を使用して抗CD19 CARを発現するように改変された、内在性TCRをコードする遺伝子のノックアウトを受ける以下のT細胞について、フローサイトメトリーによって評価した場合の、CD3および抗CD19 CAR（CARを特異的に認識する抗イディオタイプ（抗ID）抗体による染色で検出した）の表面発現を示す：組換えTCRをコードする配列のランダムな組み込みのために、レトロウイルス形質導入を受ける細胞（「レトロウイルスのみ」）、ヒトEF1αプロモーター（EF1α）またはP2Aリボソームスキップ配列を使用する内在性TRACプロモーター（P2A）の制御化で、組換えTCRをコードする配列の、TRAC座位でのHDRによる標的組み込みを受ける細胞。図18Bは、TRACターゲティングまたはTRBCターゲティングgRNAを含むリボ核タンパク質（RNP）複合体を用いたエレクトロポレーションを受ける上記の様々な発現方法について、フローサイトメトリーによって評価した場合の例示的抗CD19 CAR発現T細胞の発現を示す。
【図１８Ｂ】図18Aの説明を参照のこと。
【図１９Ａ】図19A〜19Cは、標的細胞を用いた抗原刺激の反復ラウンド後の、様々な発現方法を使用して改変された例示的抗CD19 CARを発現する細胞の発現および抗原特異的機能を示す。図19Aは、標的細胞による3ラウンドの刺激にわたって観察されたCAR発現細胞のパーセンテージを示す。図19Bは、平均蛍光強度（MFI）を示し、図19Cは、変動係数（それぞれの集団におけるシグナルの平均で割った、細胞の集団内のシグナルの標準偏差）を示し、これらは、3ラウンドの刺激にわたる、抗CD19 CARを発現するように改変されたT細胞についてである。
【図１９Ｂ】図19Aの説明を参照のこと。
【図１９Ｃ】図19Aの説明を参照のこと。
【図２０Ａ】図20A〜20Bは、CD19を発現するように改変されたK562標的細胞（K562-CD19）または改変されていないK562（親）とともに2:1のエフェクター対標的（E:T）比でインキュベートした、様々な改変方法を使用して例示的抗CD19 CARを発現する細胞の、IFNγ分泌（図20A；pg/mL）および細胞溶解活性（図20B）を示す。
【図２０Ｂ】図20Aの説明を参照のこと。
【図２１Ａ】図21A〜21Bは、内在性TRAC座位への核酸配列の組み込みによって改変された細胞における、例示的抗BCMA CARの発現および活性の評価からの結果を示す。図21Aは、以下の様々な発現方法を使用して抗BCMA CARを発現するように改変されたT細胞についての、フローサイトメトリーによって評価した場合の、CD3および抗BCMA CAR（BCMA-Fc融合タンパク質によって認識される）の表面発現を示す：組換えTCRをコードする配列のランダムな組み込みのために、レトロウイルス形質導入を受ける細胞（「レンチウイルスのみ」）、ヒトEF1αプロモーター（EF1α）またはP2Aリボソームスキップ配列を使用する内在性TCRアルファプロモーター（P2A）の制御化で、組換えTCRをコードする配列の、TRAC座位でのHDRによる標的組み込みを受ける細胞。図21Bは、TRACターゲティングまたはTRBCターゲティングgRNAを含むリボ核タンパク質（RNP）複合体を用いたエレクトロポレーションを受ける上記の様々な発現方法について、フローサイトメトリーによって評価した場合の例示的抗BCMA CAR発現T細胞の発現を示す。
【図２１Ｂ】図21Aの説明を参照のこと。
【図２２Ａ】図22A〜22Bは、標的細胞を用いた抗原刺激の反復ラウンド後の、様々な発現方法を使用して改変された例示的抗BCMA CARを発現する細胞の発現および抗原特異的機能を示す。図22Aは、標的細胞による3ラウンドの刺激にわたって観察されたCAR発現細胞のパーセンテージを示す。図22Bは、IFNγ分泌（上部パネルpg/mL）およびインターロイキン-2（IL-2；下部パネル）のレベルを示す。
【図２２Ｂ】図22Aの説明を参照のこと。
【発明を実施するための形態】
【０１３２】
詳細な説明
組換え受容体、例えば組換えT細胞受容体（TCR）を発現する遺伝子改変された免疫細胞を製造するための方法が、本明細書において提供される。組換え受容体、例えば組換えT細胞受容体（TCR）を発現する遺伝子改変された免疫細胞、およびそのような細胞を含む組成物も提供される。提供される態様は、特定の座位、例えば、内在性TCR遺伝子座の1つまたは複数へ、組換え受容体をコードする核酸配列を特異的にターゲティングすることを含む。いくつかの状況では、提供される態様は、内在性TCR遺伝子座における組換え受容体をコードする核酸の標的ノックインのために遺伝子編集方法および相同組換え修復（HDR）を使用して、標的遺伝子破壊、例えばDNA切断の生成を誘導し、それによって、内在性TCR遺伝子の発現を低減させるか、または排除し、細胞集団内で組換え受容体の均一または均質な発現を推進することを含む。本明細書において提供される方法で使用するための関連した細胞組成物、核酸、およびキットも提供される。
【０１３３】
T細胞ベースの療法、例えば養子T細胞療法（関心対象の疾患または障害に対して特異的な組換え受容体、例えば、TCR、CAR、および／または他の組換え抗原受容体を発現する改変された細胞の投与をともなうものを含める）は、癌ならびに他の疾患および障害の治療において有効であり得る。ある特定の状況では、養子細胞療法のために改変された細胞を生成するための利用可能なアプローチは、必ずしも完全に満足なものであるとは限らない可能性がある。いくつかの状況では、最適な効力は、投与される細胞が組換え受容体を発現する能力、ならびに、対象、腫瘍、およびそれらの環境内で、標的、例えば標的抗原を認識し、これに結合する組換え受容体、ならびに免疫細胞の集団および／または治療的細胞組成物中の細胞などの細胞の間での受容体の均一な、均質な、および／または一貫した発現に依存し得る。
【０１３４】
場合によっては、現在利用可能な方法、例えば、組換え受容体をコードする配列のランダムな組み込みは、これらの局面の1つまたは複数において、完全に満足なものではない。いくつかの局面では、組換え受容体をコードする配列の可変性の組み込みは、細胞組成物、例えば治療的細胞組成物内で、一貫していない発現、可変性の核酸コピー数、起こり得る挿入突然変異および／または受容体発現の変動性および／または遺伝子破壊をもたらし得る。いくつかの局面では、特定のランダム組み込みベクター、例えば、ある特定のレンチウイルスベクターの使用は、複製能力のあるレンチウイルス（RCL）アッセイを行うことを必要とする。
【０１３５】
場合によっては、現在利用可能な方法を使用して改変されたある特定の細胞またはある特定の細胞集団において、組換え受容体の発現の一貫性および／または効率が制限される。いくつかの態様では、組換え受容体はある特定の細胞で発現しているだけであり、発現または組換え受容体による抗原結合のレベルは、集団の細胞間で広く変動する。特定の局面では、組換え受容体の発現のレベルを予測する、制御する、および／または調節することは難しい可能性がある。場合によっては、細胞のゲノム中への受容体をコードする導入遺伝子のセミランダムまたはランダムな組み込みは、場合によっては、ゲノム中の望ましくない場所への、例えば、必須遺伝子または細胞の活性の調節に重要な遺伝子への核酸配列の組み込みが理由で、有害および／または不必要な作用をもたらし得る。場合によっては、受容体をコードする核酸配列のランダムな組み込みは、組み込み部位および／または核酸配列のコピー数に応じて、変化に富んだ、調節されていない、制御されていない、および／または最適以下の発現または抗原結合、発癌性形質転換、ならびに核酸配列の転写サイレンシングをもたらし得る。他の場合では、特に組換えTCRについて、改変された細胞中の内在性TCRの1つまたは複数の鎖の発現が、組換えTCRαまたはβ鎖と内在性TCRαまたはβ鎖の間の誤対合をもたらし得ることが理由で、改変されたまたは組換えのTCRの最適以下の発現が生じ得る。いくつかの局面では、誤対合したTCRは望ましくない細胞ターゲティングおよび潜在的な有害作用につながり得る。いくつかの局面では、誤対合したTCRは、細胞表面での組換えTCR複合体の発現を可能にすることに関与する不変CD3シグナリング分子について競合する可能性があり、それによって、組換えTCRの細胞表面発現および／または標的、例えば標的抗原を認識し、これに結合する能力を低減させる。
【０１３６】
いくつかの態様では、内在性TCR遺伝子座の1つまたは複数の標的遺伝子破壊は、改変されたまたは組換えのTCRの鎖と内在性TCRの間の誤対合の危険性または機会の低減につながり得る。いくつかの局面では、誤対合したTCRは、望ましくないかもしくは意図されない抗原認識および／もしくは副作用のより高い危険性を潜在的にもたらす可能性があり、ならびに／または望ましい改変されたもしくは組換えのTCRの発現レベルを低減させる可能性がある、新しいTCRを作出する可能性がある。いくつかの局面では、内在性TCRの発現を低減させるか、または防止することによって、TCRの発現が低減または防止されていない細胞と比較して、T細胞またはT細胞組成物において、改変されたまたは組換えのTCRの発現を増大させることができる。いくつかの態様では、組換えTCRの発現は、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、またはそれ以上増大し得る。例えば、場合によっては、改変されたまたは組換えのTCRの最適以下の発現は、細胞表面上での複合体の発現を可能にすることに関与するシグナリング分子および／またはドメイン、例えば、不変のCD3シグナリング分子（例えば、共発現したCD3 δ、ε、γおよびζ鎖の共発現の利用可能性）について、内在性TCRおよび／または誤対合した鎖を有するTCRと競合することが理由で、生じ得る。いくつかの局面では、利用可能なCD3ζ分子は、細胞中のTCRの発現および機能を制限することができる。いくつかの局面では、例えば、組換え受容体、例えば組換えTCRをコードする導入遺伝子の送達のための現在利用可能な方法は、組換え受容体の非効率的な組み込みおよび／または発現の低減を示し得る。いくつかの局面では、集団内の組み込みの効率および／または組換え受容体の発現は、低いおよび／または様々である可能性がある。
【０１３７】
いくつかの局面では、ヒト化および／または完全ヒト組換えTCRの開発は、技術的な課題をもたらす。例えば、いくつかの局面では、ヒト化および／または完全ヒト組換えTCR受容体は、内在性TCR複合体と競合し、内在性TCRαおよび／またはTCRβ鎖と誤対合を形成する可能性があり、これは、ある特定の局面では、組換えTCRのシグナリング、活性、および／または発現を低減させ、最終的に、改変された細胞の活性の低減をもたらし得る。これらの課題に対処する1つの方法は、内在性のヒトTCRαまたはTCRβ鎖との誤対合を防止するために、マウス定常ドメインを有する組換えTCRを設計することであった。しかし、マウス配列を有する組換えTCRの使用は、いくつかの局面では、免疫応答の危険性をもたらし得る。提供されるポリヌクレオチド、試薬、製造品、キット、および方法は、1つまたは複数のTCR鎖をコードする内在性遺伝子内に組換えTCRの全部または一部をコードする配列を挿入することによって、これらの課題に対処する。特定の局面では、この挿入は、内在性TCR遺伝子の発現を破壊する働きをする一方で、完全ヒト化および／またはヒト組換えTCRの発現を可能にし、内在性TCR鎖との競合もしくは内在性TCR鎖との誤対合、または潜在的に免疫原性であり得るマウス配列の使用の可能性を低減させる。
【０１３８】
いくつかの状況では、複数および／または集団の細胞を改変するために利用可能なアプローチは、核酸の導入効率の違い、組み込みのゲノムの場所および／もしくはコピー数の違い、内在性TCR鎖との誤対合および／もしくは競合、ならびに／または他の因子が理由で、不均質な、不均一な、および／または全く異なる、組換え受容体の発現をもたらす。いくつかの状況では、改変するために利用可能なアプローチは、組換え受容体発現および／または特定の座位のノックアウトの点から、不均質な細胞集団をもたらす。いくつかの局面では、細胞集団における不均質および不均一な発現は、全体的な発現レベル、発現の安定性、および／もしくは組換え受容体による抗原結合の低減、改変された細胞の機能の低減、ならびに／または不均一な薬物製品につながり、それによって、改変された細胞の効力を低減させる可能性がある。
【０１３９】
いくつかの態様では、組換えTCRまたはその断片をコードする核酸配列を含むTRACおよび／またはTRBC座位を含む遺伝子改変された細胞を生成するか、または製造する方法が、本明細書において提供される。いくつかの局面では、遺伝子改変された細胞のTRACおよび／またはTRBC座位は、通常はTCRαまたはTCRβ定常ドメインをコードする内在性TRACおよび／またはTRBC座位に組み込まれた、組換えTCRの全部または一部をコードする導入遺伝子配列（本明細書において、外来性または異種性核酸配列とも称される）を含む。いくつかの態様では、方法は、組換えTCRの全部または一部をコードする導入遺伝子を含む1種または複数種の鋳型ポリヌクレオチドを使用して、標的遺伝子破壊および相同性依存的修復（HDR）を誘導し、それによって、TRACおよび／またはTRBC座位での導入遺伝子の組み込みをターゲティングすることを含む。本方法によって生成される細胞および細胞組成物も提供される。いくつかの局面では、内在性TCRαおよび／またはTCRβ鎖の発現の排除は、内在性鎖と改変されたまたは組換えの鎖との間の誤対合を低減させることができる。
【０１４０】
いくつかの態様では、提供されるポリヌクレオチド、導入遺伝子、および／またはベクターは、免疫細胞に送達される場合、T細胞の活性をモジュレートすることができ、場合によっては、T細胞の分化または恒常性をモジュレートすることができる、組換え受容体、例えばTCRの発現をもたらす。得られた遺伝子改変された細胞または細胞組成物は、養子細胞療法の方法で使用することができる。
【０１４１】
いくつかの局面では、組換え受容体、例えば組換えT細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）を発現する遺伝子改変された免疫細胞を製造する従来の方法と比較して、提供される方法は、より高い、はるかに安定な、および／またははるかに均一もしくは均質な組換え受容体の発現を可能にする。いくつかの局面では、提供される態様は、向上した、均一な、均質な、一貫した、および／または安定な組換え受容体の発現を有する一方で、起こり得る誤対合、誤ターゲティング、セミランダムもしくはランダムな導入遺伝子の組み込み、および／または内在性TCRとの競合を最小限にする改変されたT細胞の製造において、利点を与える。いくつかの局面では、提供される態様は、関心対象の単一遺伝子座または複数の遺伝子座における予測可能な、一貫した組み込みを可能にし、核酸の一貫したコピー数（典型的には、1または2）を提供し、挿入突然変異誘発の可能性が低減している、低い、またはなく、細胞集団内において組換え受容体の発現および内在性受容体遺伝子の発現の一貫性をもたらし、RCLアッセイの要件を排除する。いくつかの局面では、提供される態様は、内在性TCR遺伝子の発現を低減させるか、または排除する、内在性TCR遺伝子座の1つまたは複数における組換え受容体をコードする核酸の標的ノックインが、より高い全体的な発現レベル、より均一な、一貫した発現、および／または抗原結合、ならびに抗腫瘍効果の向上を含めた改変された細胞の機能の向上をもたらしたという知見に基づく。
【０１４２】
提供される態様はまた、組換え受容体を発現する全ての細胞がまた、内在性TCR遺伝子座（例えば、TCRαおよび／またはTCRβ鎖をコードする内在性遺伝子）の1つまたは複数の発現の低減および／または排除のために、遺伝子編集およびHDRを介してノックアウトされる、改変されたT細胞の製造において、利点を与える。組換え受容体を発現する一部の細胞は内在性TCR遺伝子座についてノックアウトされ得るが、組換え受容体を発現する他の細胞は内在性TCR遺伝子座を保持し得る不均一な混合物を製造する可能性があるアプローチと比較して、提供される態様は、例えば、組換え受容体を発現する全ての細胞が内在性TCR遺伝子座の1つまたは複数のノックアウトを含む、実質的により均質で、均一な細胞集団を生成するために使用することができる。
【０１４３】
いくつかの局面では、提供される態様は、標的ノックインアプローチを使用した場合のTCRの組み込みおよび発現および抗原結合の効率の向上という知見に基づく。相同組換え修復（HDR）による組換え受容体（例えば、組換えTCRまたはCAR）をコードする核酸の標的ノックインと組み合わせた、遺伝子編集による内在性TCR遺伝子座（例えば、TCRαおよび／またはTCRβ鎖をコードする内在性遺伝子）の1つまたは複数の標的ノックアウトは、発現、機能、および発現の均一性、ならびに／または他の望ましい特色もしくは特性が向上し、最終的に高い効力がある、改変されたT細胞の製造を推進し得る。
【０１４４】
改変された細胞の改変、調製、および製造のための方法、ならびに改変された細胞を生成するか、または製造するためのキットおよび装置も提供される。ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体またはその一部をコードする核酸配列を含むウイルスベクター、および例えば、形質導入によって、または物理的送達、例えばエレクトロポレーションによって、そのようなポリヌクレオチドを細胞中に導入するための方法が提供される。例えば養子細胞療法のための、改変された細胞を含む組成物、細胞および組成物を対象に投与するための方法、キット、および装置も提供される。
【０１４５】
本出願で参照される、特許文献、科学論文、およびデータベースを含めた全ての刊行物は、個々の刊行物のそれぞれが個々に参照により組み入れられる場合と同じ程度に、全ての目的のために、参照によりその全体が組み入れられる。本明細書において記載される定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、公開出願、および他の刊行物に記載される定義に反するか、または該定義と矛盾する場合は、本明細書において記載される定義が、参照により本明細書に組み入れられる定義より優先する。
【０１４６】
本明細書において使用されるセクションの表題は、構成的な目的のみであり、記載される主題を制限すると解釈されるべきでない。
【０１４７】
I. 相同組換え修復（HDR）によって組換え受容体を発現する細胞を製造するための方法
遺伝子改変された免疫細胞、例えば、養子細胞療法のための遺伝子改変されたT細胞を製造する方法、本方法を行うために使用される、関連した組成物、方法、使用、ならびにキットおよび製造品が、本明細書において提供される。免疫細胞は、一般に、組換え受容体、例えば、組換えT細胞受容体（TCR）またはキメラ抗原受容体（CAR）などの組換え分子を発現するように改変される。いくつかの態様では、提供される方法のいずれかによって製造される遺伝子改変された免疫細胞を含めて、組換え受容体、例えば、TCRまたはCARを発現するように改変され、その結果、細胞集団がより向上した、均一な、均質な、および／もしくは安定な発現、ならびに／または組換え受容体による抗原結合を示す細胞の集団を含む組成物も提供される。いくつかの態様では、提供される組成物は、従来の方法を使用して生成される細胞集団および／または組成物のものと比較して、低減した発現の変動係数および／または抗原結合を示す。いくつかの態様では、組成物および／または細胞の投与をともなうものを含めた、療法のための組成物および／または細胞の方法および使用も提供される。
【０１４８】
いくつかの態様では、遺伝子改変された免疫細胞、例えば、養子細胞療法のための遺伝子改変されたT細胞を製造する方法が提供される。いくつかの態様では、提供される方法は、T細胞受容体アルファ（TCRα）鎖のドメインもしくは領域をコードする遺伝子および／またはT細胞受容体ベータ（TCRβ）鎖のドメインもしくは領域をコードする1つもしくは複数の遺伝子内の1つまたは複数の標的部位（「標的位置」、「標的DNA配列」、または「標的場所」としても公知である）の遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質（全体にわたって、提供される方法の局面に関連して、「1種または複数種の作用物質」または「作用物質」とも称される）を免疫細胞中に導入すること；ならびに組換え受容体またはその鎖をコードする導入遺伝子を含むポリヌクレオチド、例えば、鋳型ポリヌクレオチドを免疫細胞中に導入し、組換え受容体またはその鎖をコードする導入遺伝子が、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位のうちの1つ、またはその近くにターゲティングされることを含む。
【０１４９】
いくつかの態様では、組換えTCRまたはその断片をコードする核酸配列を含むTRACおよび／またはTRBC座位を含む遺伝子改変された細胞を生成するか、または製造する方法が、本明細書において提供される。いくつかの局面では、遺伝子改変された細胞のTRACおよび／またはTRBC座位は、通常はTCRαまたはTCRβ定常ドメインをコードする内在性TRACおよび／またはTRBC座位に組み込まれた、組換えTCRの全部または一部をコードする導入遺伝子配列（本明細書において、外来性または異種性核酸配列とも称される）を含む。いくつかの態様では、方法は、組換えTCRの全部または一部をコードする導入遺伝子を含む1種または複数種の鋳型ポリヌクレオチドを使用して、標的遺伝子破壊および相同性依存的修復（HDR）を誘導し、それによって、TRACおよび／またはTRBC座位での導入遺伝子の組み込みをターゲティングすることを含む。本方法によって生成される細胞および細胞組成物も提供される。
【０１５０】
特定の態様では、組換えTCRの全部または一部をコードする導入遺伝子配列は、TCRα鎖および／またはTCRβ鎖をコードするヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、1種または複数種のポリヌクレオチド、例えば、鋳型ポリヌクレオチドを使用することができる。いくつかの態様では、各ポリヌクレオチド、例えば、鋳型ポリヌクレオチドは、TCRα鎖またはTCRβ鎖のいずれかをコードするヌクレオチド配列を含むことができる。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド、例えば、鋳型ポリヌクレオチドは、組換え受容体またはその鎖、例えば、組換えTCRまたはその鎖の全部または一部をコードする核酸配列を含む。ある特定の態様では、核酸配列は、内在性受容体をコードする遺伝子座内にある標的部位に、例えば、内在性TCR鎖またはその一部をコードする1つまたは複数遺伝子にターゲティングされる。ある特定の態様では、核酸配列は、内在性遺伝子座内の組み込みのためにターゲティングされる。ある特定の態様では、組み込みは、標的部位の遺伝子にコードされる内在性受容体の発現を遺伝的に破壊する。特定の態様では、組換え受容体の一部をコードする導入遺伝子は、HDRを介して遺伝子座内にターゲティングされる。
【０１５１】
いくつかの態様では、提供される方法は、1種または複数種の作用物質を免疫細胞中に導入し、1種または複数種の作用物質のそれぞれが、独立に、T細胞受容体アルファ定常（TRAC）遺伝子および／またはT細胞受容体ベータ定常（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘導することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘導すること；および組換えT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片またはその鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを免疫細胞中に導入し、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位のうちの1つ、またはその近くにおける組み込みのためにターゲティングされることを含む。特定の態様では、標的部位、またはその近くにおける組み込みは、TRACおよび／またはTRBC遺伝子のコード配列の一部、例えば標的部位の下流または3’のコード配列の一部などの中にある。
【０１５２】
いくつかの態様では、少なくとも1つの標的部位のうちの1つは、T細胞受容体アルファ定常（TRAC）遺伝子の中にある。いくつかの態様では、少なくとも1つの標的部位のうちの1つは、T細胞受容体ベータ定常1（TRBC1）またはT細胞受容体ベータ定常2（TRBC2）遺伝子の中にある。いくつかの態様では、1つまたは複数の標的部位はTRAC遺伝子ならびにTRBC1およびTRBC2遺伝子の一方または両方の中にある。
【０１５３】
いくつかの態様では、提供される方法は、T細胞受容体アルファ（TCRα）鎖のドメインもしくは領域をコードする遺伝子および／またはT細胞受容体ベータ（TCRβ）鎖のドメインもしくは領域をコードする1つもしくは複数の遺伝子内に1つまたは複数の標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞中に、組換え受容体をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入し、組換え受容体またはその鎖をコードする導入遺伝子が、HDRを介して、少なくとも1つの標的部位のうちの1つ、またはその近くにターゲティングされることを含む。
【０１５４】
提供される態様では、用語「導入する」は、インビトロまたはインビボのいずれかで、細胞中にDNAを導入する様々な方法を包含し、そのような方法としては、形質転換、形質導入、トランスフェクション（例えば、エレクトロポレーション）、および感染が挙げられる。ベクターは、分子をコードするDNAを細胞中に導入するのに有用である。可能なベクターとしては、プラスミドベクターおよびウイルスベクターが挙げられる。ウイルスベクターとしては、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、または他のベクター、例えば、アデノウイルスベクターもしくはアデノ随伴ベクターが挙げられる。エレクトロポレーションなどの方法も、タンパク質、または例えばターゲティングgRNAとの複合体中にCas9タンパク質を含むリボ核タンパク質（RNP）を関心対象の細胞に導入または送達するために使用することができる。
【０１５５】
場合によっては、本明細書において提供される態様は、相同組換え修復（HDR）による組換え受容体（例えば、組換えTCRまたはCAR）をコードする核酸の標的ノックインと組み合わせた遺伝子編集技法によって、内在性TCR遺伝子座（例えば、TCRαおよび／またはTCRβ鎖をコードする内在性遺伝子）の1つまたは複数に、1つまたは複数の標的遺伝子破壊、例えばDNA切断を含む。いくつかの態様では、HDR工程は、ゲノムの標的場所のDNA中に切断、例えば二本鎖切断を必要とする。いくつかの態様では、DNA切断は、遺伝子編集中の工程の結果として生じ、例えばDNA切断は遺伝子編集で使用される標的ヌクレアーゼによって引き起こされる。
【０１５６】
いくつかの態様では、態様は、遺伝子編集方法および／または標的ヌクレアーゼを使用して標的DNA切断を引き起こし、続いて、鋳型ポリヌクレオチド、例えば、相同配列および1種または複数種の導入遺伝子、例えば、組換え受容体もしくはその鎖をコードする核酸および／または他の外来性もしくは組換え核酸を含む1種もしくは複数種の鋳型ポリヌクレオチドに基づくHDRを行い、DNA切断点またはその近くで、組換え受容体もしくはその鎖をコードする核酸配列および／または他の外来性もしくは組換え核酸を特異的に標的にし、組み込むことを含む。
【０１５７】
いくつかの態様では、HDRによる、組換え受容体をコードする核酸の標的遺伝子破壊および標的組み込みは、内在性T細胞受容体（TCR）の1つまたは複数のドメイン、領域、および／または鎖をコードする内在性遺伝子の1つまたは複数の標的部位（「標的位置」、「標的DNA配列」、または「標的場所」としても公知である）で生じる。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊はTCRα遺伝子で誘導される。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊はTCRβ遺伝子で誘導される。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、内在性TCRα遺伝子および内在性TCRβ遺伝子で誘導される。内在性TCR遺伝子は、TCRα定常ドメイン（ヒトではTRACにコードされる）および／またはTCRβ定常ドメイン（ヒトではTRBC1またはTRBC2にコードされる）をコードする遺伝子の1つまたは複数を含むことができる。
【０１５８】
いくつかの態様では、内在性TCR遺伝子座の1つまたは複数の標的遺伝子破壊は、改変されたまたは組換えのTCRの鎖と内在性TCRの間の誤対合の危険性または機会の低減につながり得る。誤対合したTCRは、望ましくないかもしくは意図されない抗原認識および／もしくは副作用のより高い危険性を潜在的にもたらす可能性があり、ならびに／または望ましい改変されたもしくは組換えのTCRの発現レベルを低減させる可能性がある、新しいTCRを作出する可能性がある。いくつかの局面では、内在性TCRの発現を低減させるか、または防止することによって、TCRの発現が低減または防止されていない細胞と比較して、T細胞またはT細胞組成物において、改変されたまたは組換えのTCRの発現を増大させることができる。いくつかの態様では、組換えTCRの発現は、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、またはそれ以上増大し得る。例えば、場合によっては、改変されたまたは組換えのTCRの最適以下の発現は、細胞表面上で複合体の発現を可能にすることに関与する不変のCD3シグナリング分子などのシグナリングドメインについて、内在性TCRおよび／または誤対合した鎖を有するTCRと競合することが理由で、生じ得る。
【０１５９】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、1つもしくは複数の標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質の導入より前に、該導入と同時に、または該導入に続いて、改変された細胞中に導入される。1つまたは複数の標的遺伝子破壊、例えばDNA切断の存在下で、鋳型ポリヌクレオチドは、DNA修復鋳型として使用されて、標的部位周辺の内在性遺伝子配列と鋳型ポリヌクレオチドに含まれる5’および／または3’相同性アームとの間の相同性に基づいて、HDRによって、標的遺伝子破壊の部位、またはその近くで、導入遺伝子、例えば、組換え受容体をコードする核酸配列を効果的にコピーし、組み込むことができる。
【０１６０】
いくつかの態様では、遺伝子編集およびHDR工程は、同時におよび／または1つの実験反応で行われる。いくつかの態様では、遺伝子編集およびHDR工程は、1つのまたは連続した実験反応で、連続的にまたは順次行われる。いくつかの態様では、遺伝子編集およびHDR工程は、別々の実験反応で、同時にまたは異なる時間で行われる。
【０１６１】
免疫細胞は、T細胞を含む細胞の集団を含むことができる。そのような細胞は、対象から得られた、例えば、末梢血単核球（PBMC）試料、未分画T細胞試料、リンパ球試料、白血球細胞試料、アフェレーシス生成物、または白血球アフェレーシス生成物から得られた細胞でもよい。いくつかの態様では、T細胞は、正または負の選択および濃縮方法を使用して、集団中のT細胞を濃縮するために、分離または選択することができる。いくつかの態様では、集団は、CD4+、CD8+、またはCD4+およびCD8+T細胞を含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド鋳型を導入する工程および作用物質（例えば、Cas9/gRNA RNP）を導入する工程は、同時にまたは任意の順序で順次生じ得る。特定の態様では、ポリヌクレオチド鋳型は、作用物質（例えば、Cas9/gRNA RNP）を導入する工程によって遺伝子破壊を誘導した後に、免疫細胞に導入される。いくつかの態様では、ポリヌクレオチド鋳型および1つもしくは複数の作用物質（例えば、Cas9/gRNA RNP）の導入より前に、該導入の間、ならびに／または、該導入に続いて、細胞の拡大および／または増殖を刺激する条件下で、細胞をカルチャーまたはインキュベートする。
【０１６２】
提供される方法の特定の態様では、鋳型ポリヌクレオチドの導入は、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質の導入後に行われる。遺伝子破壊を誘導するのに使用される特定の作用物質に応じて、1種または複数種の作用物質を導入するための任意の方法を記載されるように用いることができる。いくつかの局面では、破壊は、例えば、破壊されるTRACまたはTRBC座位に対して特異的な、clustered regularly interspersed short palindromic nucleic acid（CRISPR）-CasシステムなどのRNA誘導型ヌクレアーゼ、例えばCRISPR-Cas9システムを使用して、遺伝子編集によって行われる。いくつかの態様では、TRACまたはTRBC座位の領域を標的にするターゲティングドメインを含むCas9およびガイドRNA（gRNA）を含む作用物質が細胞中に導入される。いくつかの態様では、作用物質は、Cas9とTRAC/TRBCをターゲティングするターゲティングドメインとを含むgRNAのリボ核タンパク質（RNP）複合体（Cas9/gRNA RNP）であるか、またはこれを含む。いくつかの態様では、導入は、インビトロで、作用物質またはその一部を細胞と接触させることを含み、これは、24、36、もしくは48時間、または3、4、5、6、7、もしくは8日まで、細胞および作用物質を培養すること、またはインキュベートすることを含むことができる。いくつかの態様では、導入は、細胞中への作用物質の送達を行うことをさらに含むことができる。様々な態様では、本開示による方法、組成物、および細胞は、例えばエレクトロポレーションによる、Cas9とgRNAのリボ核タンパク質（RNP）複合体の細胞への直接送達を利用する。いくつかの態様では、RNP複合体は、3’ポリAテールおよび5’アンチリバースキャップアナログ（ARCA）キャップを含むように改変されたgRNAを含む。場合によっては、改変される細胞のエレクトロポレーションは、細胞のエレクトロポレーションの後かつプレーティングより前に、例えば32℃で細胞に低温ショックを与えることを含む。
【０１６３】
提供される方法のそのような局面では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、エレクトロポレーションを介して導入された1種または複数種の作用物質、例えばCas9/gRNA RNPの導入後に、細胞中に導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質の導入の直後に導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質の導入の後、30秒もしくは約30秒以内に、1分もしくは約1分以内に、2分もしくは約2分以内に、3分もしくは約3分以内に、4分もしくは約4分以内に、5分もしくは約5分以内に、6分もしくは約6分以内に、6分もしくは約6分以内に、8分もしくは約8分以内に、9分もしくは約9分以内に、10分もしくは約10分以内に、15分もしくは約15分以内に、20分もしくは約20分以内に、30分もしくは約30分以内に、40分もしくは約40分以内に、50分もしくは約50分以内に、60分もしくは約60分以内に、90分もしくは約90分以内に、2時間もしくは約2時間以内に、3時間もしくは約3時間以内に、または4時間もしくは約4時間以内に細胞中に導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、1種または複数種の作用物質を導入した、後15分または約15分から4時間または約4時間の間、例えば、15分もしくは約15分から3時間もしくは約3時間の間、15分および約15分から2時間もしくは約2時間の間、15分もしくは約15分から1時間もしくは約1時間の間、15分もしくは約15分から30分もしくは約30分の間、30分もしくは約30分から4時間もしくは約4時間の間、30分もしくは約30分から3時間もしくは約3時間の間、30分もしくは約30分から2時間もしくは約2時間の間、30分もしくは約30分から1時間もしくは約1時間の間、1時間もしくは約1時間から4時間もしくは約4時間の間、1時間もしくは約1時間から3時間もしくは約3時間の間、1時間もしくは約1時間から2時間もしくは約2時間の間、2時間もしくは約2時間から4時間もしくは約4時間の間、2時間もしくは約2時間から3時間もしくは約3時間の間、または3時間もしくは約3時間から4時間もしくは約4時間の間の時間で細胞中に導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えばエレクトロポレーションを介して導入された1種または複数種の作用物質、例えばCas9/gRNA RNPの導入の後2時間または約2時間で細胞中に導入される。
【０１６４】
細胞への鋳型ポリヌクレオチドの送達に使用される特定の方法に応じて、鋳型ポリヌクレオチドを導入するための任意の方法を記載されるように用いることができる。例示的方法としては、ウイルス、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルス、形質導入、トランスポゾン、およびエレクトロポレーションを介するものを含めた、受容体をコードする核酸の移入のためのものが挙げられる。特定の態様では、ウイルス形質導入法が用いられる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を使用して、細胞中に移入させる、または導入することができる。いくつかの態様では、組換え核酸は、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えば、ガンマ−レトロウイルスベクターを使用して、T細胞中に移入される（例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25；Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46；Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93；Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照されたい）。特定の態様では、ウイルスベクターはAAV2またはAAV6などのAAVである。
【０１６５】
いくつかの態様では、作用物質を細胞接触させるより前に、該接触の間、もしくは該接触に続いて、および／または送達（例えば、エレクトロポレーション）を行うより前に、該送達の間、もしくは該送達に続いて、提供される方法は、サイトカイン、刺激作用物質、および／または免疫細胞（例えばT細胞）の増殖、刺激、または活性化を誘導することができる作用物質の存在下で、細胞をインキュベートすることを含む。いくつかの態様では、インキュベーションの少なくとも一部は、CD3に対して特異的な抗体、CD28に対して特異的な抗体、および／またはサイトカイン、例えば抗CD3／抗CD28ビーズであるか、またはこれらを含む刺激作用物質の存在下である。いくつかの態様では、インキュベーションの少なくとも一部は、サイトカイン、例えば、組換えIL-2、組換えIL-7、および／または組換えIL-15の1つまたは複数の存在下である。いくつかの態様では、インキュベーションは、例えば、エレクトロポレーションを介した1種または複数種の作用物質、例えばCas9/gRNA RNPの、および鋳型ポリヌクレオチドの導入の前または後の8日まで、例えば、24時間、36時間、もしくは48時間、または3、4、5、6、7、もしくは8日までにわたる。
【０１６６】
いくつかの態様では、方法は、作用物質、例えばCas9/gRNA RNP、およびポリヌクレオチド鋳型を導入するより前に、細胞を刺激作用物質（例えば、抗CD3／抗CD28抗体）で活性化または刺激することを含む。いくつかの態様では、刺激作用物質（例えば、抗CD3／抗CD28）の存在下でのインキュベーションは、例えば、エレクトロポレーションを介した、1種または複数種の作用物質、例えばCas9/gRNA RNPの導入より前の6時間〜96時間、例えば、24〜48時間または24〜36時間にわたる。いくつかの態様では、刺激作用物質とのインキュベーションは、サイトカイン、例えば、組換えIL-2、組換えIL-7、および／または組換えIL-15の1つまたは複数の存在をさらに含むことができる。いくつかの態様では、インキュベーションは、組換えサイトカイン、例えばIL-2（例えば1U/mL〜500U/mL、例えば10U/mL〜200U/mL、例えば少なくとももしくは約50U/mLもしくは100U/mL）、IL-7（例えば0.5ng/mL〜50ng/mL、例えば1ng/mL〜20ng/mL、例えば少なくとももしくは約5ng/mLもしくは10ng/mL）、またはIL-15（例えば0.1ng/mL〜50ng/mL、例えば0.5ng/mL〜25ng/mL、例えば少なくとももしくは約1ng/mLもしくは5ng/mL）の存在下で行われる。いくつかの態様では、刺激作用物質（例えば、抗CD3／抗CD28抗体）は、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質Cas9/gRNA RNPおよび／またはポリヌクレオチド鋳型を細胞中に導入または送達するより前に、細胞から洗浄または除去される。いくつかの態様では、作用物質を導入するより前に、例えば、任意の刺激または活性化作用物質の除去によって、細胞を休ませる。いくつかの態様では、作用物質を導入するより前に、刺激または活性化作用物質および／またはサイトカインは除去されない。
【０１６７】
いくつかの態様では、作用物質、例えばCas9/gRNA、および／またはポリヌクレオチド鋳型の導入に続いて、組換えサイトカイン、例えば、組換えIL-2、組換えIL-7、および／または組換えIL-15の1つまたは複数の存在下で、細胞をインキュベート、培養またはカルチャーする。いくつかの態様では、インキュベーションは、組換えサイトカイン、例えばIL-2（例えば1U/mL〜500U/mL、例えば10U/mL〜200U/mL、例えば少なくとももしくは約50U/mLもしくは100U/mL）、IL-7（例えば0.5ng/mL〜50ng/mL、例えば1ng/mL〜20ng/mL、例えば少なくとももしくは約5ng/mLもしくは10ng/mL）、またはIL-15（例えば0.1ng/mL〜50ng/mL、例えば0.5ng/mL〜25ng/mL、例えば少なくとももしくは約1ng/mLもしくは5ng/mL）の存在下で行われる。細胞は、細胞の増殖または拡大を誘導するための条件下でインキュベートまたは培養することができる。いくつかの態様では、細胞は、回収のための閾値細胞数、例えば治療有効量が達成されるまで、インキュベートまたは培養することができる。
【０１６８】
いくつかの態様では、プロセスの任意の部分またはプロセスの全体の間のインキュベーションは、30℃±2℃〜39℃±2℃、例えば少なくともまたは約少なくとも30℃±2℃、32℃±2℃、34℃±2℃、または37℃±2℃の温度であり得る。いくつかの態様では、インキュベーションの少なくとも一部は30℃±2℃であり、インキュベーションの少なくとも一部は37℃±2℃である。
【０１６９】
A. 遺伝子破壊
いくつかの態様では、内在性TCRα遺伝子および／または内在性TCRβ遺伝子で、1つまたは複数の標的遺伝子破壊が誘導される。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、TCRα定常ドメイン（TCRα定常領域としても公知である；ヒトではTRACにコードされる）および／またはTCRβ定常ドメイン（TCRβ定常領域としても公知である；ヒトではTRBC1もしくはTRBC2にコードされる）をコードする遺伝子の1つまたは複数で誘導される。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、TRAC、TRBC1、およびTRBC2座位で誘導される。
【０１７０】
いくつかの態様では、標的遺伝子破壊はDNA切断またはニックをもたらす。いくつかの態様では、DNA切断の部位で、細胞のDNA修復メカニズムの作用が、ノックアウト、挿入、ミスセンス、またはフレームシフト突然変異、例えば両アレルフレームシフト突然変異、遺伝子の全部または一部の欠失をもたらし得る。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、遺伝子またはその一部の1つまたは複数のエクソンに、例えば、第1または第2エクソン内にターゲティングされ得る。いくつかの態様では、少なくとも1つの標的部位のうちの1つに近い領域の配列に特異的に結合またはハイブリダイズする、DNA結合タンパク質またはDNA結合核酸が、標的破壊に使用される。いくつかの局面では、HDRのための外来性鋳型ポリヌクレオチドの非存在下で、破壊、標的遺伝子破壊は、遺伝子のエクソン内で欠失、突然変異、およびまたは挿入をもたらす。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体をコードする核酸配列および相同配列を含む鋳型ポリヌクレオチドを、HDRによる遺伝子破壊の部位、またはその近くにおける組換え受容体をコードする配列の標的組み込みのために導入することができる（本明細書のセクションI.B.を参照されたい）。
【０１７１】
いくつかの態様では、遺伝子破壊は、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質を導入することによって引き起こされる。いくつかの態様では、そのような作用物質は、遺伝子に特異的に結合またはハイブリダイズするDNA結合タンパク質またはDNA結合核酸を含む。いくつかの態様では、作用物質は、様々な成分、例えばDNAターゲティングタンパク質およびヌクレアーゼまたはRNA誘導型ヌクレアーゼを含む、融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、作用物質は、例えば、TRAC遺伝子、およびTRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方において、1つまたは複数の標的場所を標的にすることができる。
【０１７２】
いくつかの態様では、遺伝子破壊は、標的部位（「標的位置」、「標的DNA配列」、もしくは「標的場所」とも称され、および／または「標的位置」、「標的DNA配列」、もしくは「標的場所」としても公知である）で生じる。いくつかの態様では、標的部位は、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質、例えば標的部位を特定するgRNAと複合体化されたCas9分子によって改変される標的DNA（例えば、ゲノムDNA）上の部位であるか、または該部位を含む。例えば、いくつかの態様では、標的部位は、例えば、内在性TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位のDNA中に、開裂またはDNA切断が生じる場所を含み得る。いくつかの局面では、HDRによる核酸配列の組み込みは、標的部位もしくは標的配列、またはその近くで生じ得る。いくつかの態様では、標的部位は、1つまたは複数のヌクレオチドが加えられるDNA上の2つのヌクレオチド、例えば隣接するヌクレオチドの間の部位でもよい。標的部位は、鋳型ポリヌクレオチドによって変化させられる1つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様では、標的部位は標的配列（例えば、gRNAが結合する配列）内にある。いくつかの態様では、標的部位は標的配列の上流または下流にある。
【０１７３】
1. 内在性T細胞受容体（TCR）をコードする遺伝子における標的部位
いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、内在性T細胞受容体（TCR）の1つまたは複数のドメイン、領域、および／または鎖をコードする内在性遺伝子で生じる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、TCRαおよび／またはTCRβをコードする内在性遺伝子座にターゲティングされる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、TCRα定常ドメイン（ヒトのTRAC）および／またはTCRβ定常ドメイン（ヒトのTRBC1またはTRBC2）をコードする遺伝子にターゲティングされる。
【０１７４】
いくつかの態様では、「T細胞受容体」または「TCR」は、内在性TCRを含めて、可変αおよびβ鎖（それぞれ、TCRαおよびTCRβとしても公知である）もしくは可変γおよびδ鎖（それぞれ、TCRγおよびTCRδとしても公知である）またはそれらの抗原結合部分を含み、MHC分子に結合したペプチドに特異的に結合することができる分子である。いくつかの態様では、TCRはαβ形態である。典型的には、αβおよびγδ形態で存在するTCRは、一般に構造的に類似しているが、それらを発現するT細胞は、異なる解剖学的な場所または機能を有し得る。典型的には、1つのT細胞は1タイプのTCRを発現する。TCRは、細胞表面上に、または可溶性形態で見出され得る。一般に、TCRは、主要組織適合抗原複合体（MHC）分子に結合した抗原の認識に一般に関与するT細胞（またはTリンパ球）の表面上に見出される。
【０１７５】
いくつかの態様では、TCRは、可変ドメインおよび定常ドメイン（定常領域としても公知である）、膜貫通ドメイン、ならびに／または短い細胞質尾部を含むことができる（例えば、Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease, 3rd Ed., Current Biology Publications, p. 4:33, 1997を参照されたい）。いくつかの態様では、TCR鎖は、1つまたは複数の定常ドメインを含む。例えば、所与のTCR鎖（例えば、TCRα鎖またはTCRβ鎖）の細胞外部分は、2つの免疫グロブリン様ドメイン、例えば、可変ドメイン（例えば、VαまたはVβ；典型的には、Kabatの番号付け、Kabat et al., “Sequences of Proteins of Immunological Interest, US Dept. Health and Human Services, Public Health Service National Institutes of Health, 1991, 5th ed.に基づいて、アミノ酸1〜116）、および細胞膜に隣接する定常ドメイン（例えば、α鎖定常ドメインもしくはTCR Cα、典型的には、Kabatの番号付けに基づいて鎖の位置117〜259、またはβ鎖定常ドメインもしくはTCR Cβ、典型的には、Kabatに基づいて鎖の位置117〜295）を含むことができる。例えば、場合によっては、2つの鎖によって形成されるTCRの細胞外部分は、2つの膜近位定常ドメインおよび2つの膜遠位可変ドメインを含む。
【０１７６】
いくつかの態様では、内在性TCR CαはTRAC遺伝子（IMGT命名法）にコードされる。ヒトT細胞受容体アルファ鎖定常ドメイン（TRAC）遺伝子座の例示的配列は、SEQ ID NO:1（NCBI参照配列：NG_001332.3、TRAC）に記載されている。いくつかの態様では、コードされる内在性Cαは、SEQ ID NO:19または24（UniProtKB受託番号P01848またはGenbank受託番号CAA26636.1）に記載されるアミノ酸配列を含む。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、TRAC座位に、TRAC座位の近くに、またはTRAC座位内にターゲティングされる。特定の態様では、遺伝子破壊は、TRAC座位のオープンリーディングフレームに、該オープンリーディングフレームの近くに、または該オープンリーディングフレーム内にターゲティングされる。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、TCRα定常ドメインをコードするオープンリーディングフレームに、該オープンリーディングフレームの近くに、または該オープンリーディングフレーム内にターゲティングされる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、SEQ ID NO:1に記載される核酸配列、あるいはSEQ ID NO:1に記載される核酸配列の全部または一部、例えば、500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、もしくは4,000、または少なくとも500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、もしくは4,000個の連続的ヌクレオチドに対して70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％、または少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％の配列同一性を有する配列を有する座位に、該座位の近くに、または該座位内にターゲティングされる。
【０１７７】
ヒトでは、TRACの例示的ゲノム座位は、4つのエクソンおよび3つのイントロンを含むオープンリーディングフレームを含む。TRACの例示的mRNA転写産物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）に関して、フォワード鎖の座標第14染色体：22,547,506〜22,552,154に対応する配列にわたり得る。表1は、例示的ヒトTRAC座位の転写産物のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を記載する。
【０１７８】
（表１）例示的ヒトTRAC座位のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、第14染色体、フォワード鎖）
2021520202.tif 000017
【０１７９】
いくつかの態様では、内在性TCR CβはTRBC1またはTRBC2遺伝子（IMGT命名法）にコードされる。ヒトT細胞受容体ベータ鎖定常ドメイン1（TRBC1）遺伝子座の例示的配列は、SEQ ID NO:2（NCBI参照配列：NG_001333.2、TRBC1）に記載されており；ヒトT細胞受容体ベータ鎖定常ドメイン2（TRBC2）遺伝子座の例示的配列はSEQ ID NO:3（NCBI参照配列：NG_001333.2、TRBC2）に記載されている。いくつかの態様では、コードされるCβは、SEQ ID NO:20、21、または25（Uniprot受託番号P01850、A0A5B9、またはA0A0G2JNG9）に記載されるアミノ酸配列を有するか、または含む。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、TRBC1遺伝子座に、TRBC1遺伝子座の近くに、またはTRBC1遺伝子座内にターゲティングされる。特定の態様では、遺伝子破壊は、TRBC1座位のオープンリーディングフレームに、該オープンリーディングフレームの近くに、または該オープンリーディングフレーム内にターゲティングされる。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、TCRβ定常ドメインをコードするオープンリーディングフレームに、該オープンリーディングフレームの近くに、または該オープンリーディングフレーム内にターゲティングされる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、SEQ ID NO:2に記載される核酸配列、あるいはSEQ ID NO:2に記載される核酸配列の全部または一部、例えば、500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、もしくは4,000、または少なくとも500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、もしくは4,000個の連続的ヌクレオチドに対して70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％、または少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％の配列同一性を有する配列を有する座位に、該座位近くに、または該座位内にターゲティングされる。
【０１８０】
ヒトでは、TRBC1の例示的ゲノム座位は、4つのエクソンおよび3つのイントロンを含むオープンリーディングフレームを含む。TRBC1の例示的mRNA転写産物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）に関して、フォワード鎖の座標第7染色体：142,791,694〜142,793,368に対応する配列にわたり得る。表2は、例示的ヒトTRBC1座位の転写産物のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を記載する。
【０１８１】
（表２）例示的ヒトTRBC1座位のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、第7染色体、フォワード鎖）
2021520202.tif 000018
【０１８２】
特定の態様では、遺伝子破壊は、TRBC2座位に、TRBC2座位の近くに、またはTRBC2座位内にターゲティングされる。特定の態様では、遺伝子破壊は、TRBC2座位のオープンリーディングフレームに、該座位のオープンリーディングフレームの近くに、または該座位のオープンリーディングフレーム内にターゲティングされる。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、TCRβ定常ドメインをコードするオープンリーディングフレームに、該座位のオープンリーディングフレームの近くに、または該座位のオープンリーディングフレーム内にターゲティングされる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、SEQ ID NO:3に記載される核酸配列、あるいはSEQ ID NO:3に記載される核酸配列の全部または一部、例えば、500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、もしくは4,000、または少なくとも500、1,000、1,500、2,000、2,500、3,000、3,500、もしくは4,000個の連続的ヌクレオチドに対して、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％、または少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％の配列同一性を有する配列を有する座位に、該座位の近くに、または該座位内にターゲティングされる。
【０１８３】
ヒトでは、TRBC2の例示的ゲノム座位は、4つのエクソンおよび3つのイントロンを含むオープンリーディングフレームを含む。TRBC2の例示的mRNA転写産物は、ヒトゲノムバージョンGRCh38（UCSC Genome Browser on Human Dec. 2013 (GRCh38/hg38) Assembly）に関して、フォワード鎖の座標第7染色体：142,801,041〜142,802,748に対応する配列にわたり得る。表3は、例示的ヒトTRBC2座位の転写産物のオープンリーディングフレームのエクソンおよびイントロンならびに非翻訳領域の座標を記載する。
【０１８４】
（表３）例示的ヒトTRBC2座位のエクソンおよびイントロンの座標（GRCh38、第7染色体、フォワード鎖）
2021520202.tif 000019
【０１８５】
いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチド内の導入遺伝子（例えば、外来性核酸配列）は、標的部位および／または相同性アームの場所をガイドするために使用することができる。いくつかの局面では、遺伝子破壊の標的部位は、HDRに使用される鋳型ポリヌクレオチドおよび／または相同性アームを設計するためのガイドとして使用することができる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、（例えば、組換えTCRまたはその一部をコードする）導入遺伝子配列の標的組み込みの望ましい部位の近くにターゲティングされ得る。いくつかの局面では、標的部位は、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位のオープンリーディングフレームのエクソン内にある。いくつかの局面では、標的部位は、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位のオープンリーディングフレームのイントロン内にある。
【０１８６】
いくつかの態様では、遺伝子破壊、例えばDNA切断は、コード領域の開始部分（例として、例えば開始コドンから500bp以内の初期コード領域、または、例えば開始コドンから最初の500bpの下流の残りのコード配列）に、または該部分に極めて近接して、ターゲティングされる。いくつかの態様では、遺伝子破壊、例えばDNA切断は、関心対象の遺伝子、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2の初期コード領域にターゲティングされ、この初期コード領域には、転写開始点の直後、コード配列の第1エクソン内、または転写開始点から500bp以内（例えば、500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満）、または開始コドンから500bp以内（例えば、500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満）の配列が含まれる。
【０１８７】
いくつかの態様では、標的部位は、内在性TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位のエクソン内にある。ある特定の態様では、標的部位は、内在性TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位のイントロン内にある。いくつかの局面では、標的部位は、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位の調節または制御エレメント、例えば、プロモーター、5’非翻訳領域（UTR）、または3’UTR内にある。ある特定の態様では、標的部位は、内在性TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位のオープンリーディングフレーム内にある。特定の態様では、標的部位は、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位のオープンリーディングフレーム内のエクソン内にある。
【０１８８】
特定の態様では、遺伝子破壊、例えばDNA切断は、関心対象の遺伝子または座位、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2のオープンリーディングフレームに、または該オープンリーディングフレーム内にターゲティングされる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、関心対象の遺伝子または座位のオープンリーディングフレームのイントロンに、または該イントロン内にターゲティングされる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、関心対象の遺伝子または座位のオープンリーディングフレーム内のエクソン内にターゲティングされる。
【０１８９】
特定の態様では、遺伝子破壊、例えばDNA切断は、イントロンに、またはイントロン内にターゲティングされる。ある特定の態様では、遺伝子破壊、例えばDNA切断は、エクソンに、またはエクソン内にターゲティングされる。いくつかの態様では、遺伝子破壊、例えばDNA切断は、関心対象の遺伝子、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2のエクソンに、または該エクソン内にターゲティングされる。
【０１９０】
いくつかの態様では、遺伝子破壊、例えばDNA切断は、TRAC遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位のエクソン内にターゲティングされる。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、TRAC遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソン、第2エクソン、第3エクソン、または第4エクソン内にある。特定の態様では、遺伝子破壊は、TRAC遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソン内にある。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、TRAC遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソンの5’末端から下流の500塩基対（bp）内にある。特定の態様では、遺伝子破壊は、エクソン1の最も5’のヌクレオチドからエクソン1の最も3’のヌクレオチドの上流の間にある。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、TRAC遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソンの5’末端から下流の400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、または50bp以内にある。特定の態様では、遺伝子破壊は、TRAC遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソンの5’末端から下流の1bp〜400bpの間、50〜300bpの間、100bp〜200bpの間、または100bp〜150bpの間にあり、それぞれ、範囲の両端を含む。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、TRAC遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソンの5’末端から下流の100bp〜150bpの間にあり、範囲の両端を含む。
【０１９１】
特定の態様では、遺伝子破壊、例えばDNA切断は、TRBC遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位、例えば、TRBC1および／またはTRBC2のエクソン内にターゲティングされる。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、TRBC1および／またはTRBC2遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソン、第2エクソン、第3エクソン、または第4エクソン内にある。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、TRBC1および／またはTRBC2遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソン内にある。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、TRBC1および／またはTRBC2遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソン、第2エクソン、第3エクソン、または第4エクソン内にある。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、エクソン1の最も5’のヌクレオチドからエクソン1の最も3’のヌクレオチドの上流の間にある。特定の態様では、遺伝子破壊は、TRBC遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソン内にある。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、TRBC1および／またはTRBC2遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソンの5’末端から下流の400bp、350bp、300bp、250bp、200bp、150bp、100bp、または50bp以内にある。特定の態様では、遺伝子破壊は、TRBC1および／またはTRBC2遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソンの5’末端から下流の1bp〜400bpの間、50〜300bpの間、100bp〜200bpの間、または100bp〜150bpの間にあり、それぞれ、範囲の両端を含む。ある特定の態様では、遺伝子破壊は、TRBC1および／またはTRBC2遺伝子、オープンリーディングフレーム、または座位の第1エクソンの5’末端から下流の100bp〜150bpの間にあり、範囲の両端を含む。
【０１９２】
2. 遺伝子破壊方法
本明細書において記載されるものを含めて、遺伝子破壊を引き起こすための方法は、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質、例えば、内在性DNA中の標的部位または標的場所において遺伝子破壊、開裂および／もしくは二本鎖切断（DSB）またはニックを誘導し、その結果、非相同末端結合（NHEJ）などのエラーが生じるプロセスによる切断の修復、または修復鋳型HDRを使用する修復が、遺伝子のノックアウトおよび／または関心対象の配列（例えば、外来性核酸配列もしくはキメラ受容体の一部をコードする導入遺伝子）の挿入を標的部位もしくは位置、またはその近くでもたらすことを可能にする改変されたシステムの使用を含むことができる。本明細書において提供される方法で使用するために、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質も提供される。いくつかの局面では、1種または複数種の作用物質は、導入遺伝子配列の相同組換え修復（HDR）媒介性ターゲティング組み込み（例えば、セクションI.Bにおいて本明細書で記載される）のために、本明細書において提供される鋳型ヌクレオチドと組み合わせて使用することができる。
【０１９３】
いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質は、ゲノム中の特定の部位または位置、例えば標的部位または標的場所に特異的に結合またはハイブリダイズするDNA結合タンパク質またはDNA結合核酸を含む。いくつかの局面では、TCRをコードする内在性遺伝子の標的遺伝子破壊、例えばDNA切断または開裂は、タンパク質または核酸を使用して達成され、タンパク質または核酸は、例えばキメラまたは融合タンパク質において遺伝子編集ヌクレアーゼと結合または複合体化している。いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質は、RNA誘導型ヌクレアーゼ、またはDNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼを含む融合タンパク質を含む。
【０１９４】
いくつかの態様では、作用物質は、様々な成分、例えば、RNA誘導型ヌクレアーゼ、またはDNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼを含む融合タンパク質を含む。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、ヌクレアーゼ、例えばエンドヌクレアーゼに融合したDNA結合タンパク質、例えば、1種または複数種のジンクフィンガータンパク質（ZFP）または転写活性化因子様エフェクター（TALE）を含むDNAターゲティング分子を使用して行われる。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、RNA誘導型ヌクレアーゼ、例えば、clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid（CRISPR）関連ヌクレアーゼ（Cas）システム（Casおよび／またはCfp1を含む）を使用して行われる。いくつかの態様では、標的遺伝子破壊は、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、配列特異的または標的ヌクレアーゼを使用して行われ、これには、DNA結合標的ヌクレアーゼおよび遺伝子編集ヌクレアーゼ、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）および転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、ならびにRNA誘導型ヌクレアーゼ、例えば、CRISPR関連ヌクレアーゼ（Cas）システムが含まれ、これらは、少なくとも1つの標的部位、遺伝子の配列、またはこれらの一部にターゲティングされるように特に設計されている。例示的なZFN、TALE、およびTALENは、例えば、Lloyd et al., Frontiers in Immunology, 4(221): 1-7 (2013)に記載されている。
【０１９５】
ジンクフィンガータンパク質（ZFP）、転写活性化因子様エフェクター（TALE）、およびCRISPRシステムの結合ドメインは、例えば、天然に存在するZFPまたはTALEタンパク質の認識ヘリックス領域の改変（1つまたは複数のアミノ酸の変更）を介して、所定のヌクレオチド配列に結合するように「改変する」ことができる。改変されたDNA結合タンパク質（ZFPまたはTALE）は、天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な判断基準は、置換ルール、ならびに既存のZFPおよび／またはTALEの設計および結合データの情報を格納するデータベース中の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第6,140,081号；第6,453,242号；および第6,534,261号を参照されたい。WO98/53058；WO98/53059；WO98/53060；WO02/016536、およびWO03/016496ならびに米国特許出願公開第20110301073号も参照されたい。
【０１９６】
いくつかの態様では、1種または複数種の作用物質は、例えば関心対象の遺伝子、例えば、TRAC、TRBC1、および／もしくはTRBC2またはそれらの近くで、少なくとも1つの標的部位を特異的に標的にする。いくつかの態様では、作用物質は、標的部位に特異的に結合する、標的部位を認識する、または標的部位にハイブリダイズする、ZFN、TALEN、またはCRISPR/Cas9の組み合わせを含む。いくつかの態様では、CRISPR/Cas9システムは、特異的な開裂をガイドするために、改変されたcrRNA/tracr RNA（「シングルガイドRNA」）を含む。いくつかの態様では、作用物質は、アルゴノートシステムに基づくヌクレアーゼ（例えば、T.サーモフィルス（T. thermophilus）に由来し、「TtAgo」として公知である（Swarts et al. (2014) Nature 507(7491): 258-261）を含む。本明細書において記載されるヌクレアーゼシステムのいずれかを使用する標的開裂を活用して、HDRまたはNHEJ媒介性プロセスのいずれかを使用して、導入遺伝子の配列、例えば、組換え受容体をコードする核酸配列を、例えば、内在性TCR遺伝子の特定の標的場所に挿入することができる。
【０１９７】
いくつかの態様では、「ジンクフィンガーDNA結合タンパク質」（または結合ドメイン）は、亜鉛イオンの配位を介してその構造が安定化する結合ドメイン内のアミノ酸配列の領域である1つまたは複数のジンクフィンガーを介して配列特異的にDNAに結合する、タンパク質であるか、またはより大きなタンパク質内のドメインである。ジンクフィンガーDNA結合タンパク質という用語は、ジンクフィンガータンパク質またはZFPと略されることが多い。ZFPの中には、個々のフィンガーのアセンブリーによって生成される、典型的には9〜18ヌクレオチド長の特定のDNA配列をターゲティングする人工ZFPドメインがある。ZFPは、単一フィンガードメインがおよそ30アミノ酸の長さであり、亜鉛を介して単一ベータターンの2つのシステインと配位した2つの不変のヒスチジン残基を含むアルファヘリックスを含み、2つ、3つ、4つ、5つ、または6つのフィンガーを有する含ものを含む。一般に、ZFPの配列特異性は、ジンクフィンガー認識ヘリックス上の4つのヘリックス位置（-1、2、3、および6）でアミノ酸置換を行うことによって変えることができる。したがって、例えば、ZFPまたはZFP含有分子は天然に存在せず、例えば、選択標的部位に結合するように改変されている。
【０１９８】
場合によっては、DNAターゲティング分子は、DNA開裂ドメインに融合してジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）を形成したジンクフィンガーDNA結合ドメインであるか、または該ジンクフィンガーDNA結合ドメインを含む。例えば、融合タンパク質は、少なくとも1つのIIS型制限酵素由来の開裂ドメイン（または開裂ハーフドメイン）、および改変されていてもよいし、改変されていなくてもよい、1つまたは複数のジンクフィンガー結合ドメインを含む。場合によっては、開裂ドメインはIIS型制限エンドヌクレアーゼFokIに由来し、これは、一方の鎖のその認識部位から9ヌクレオチドおよび他方の鎖のその認識部位から13ヌクレオチドにおいて、DNAの二本鎖開裂を一般に触媒する。例えば、米国特許第5,356,802号；第5,436,150号および第5,487,994号；Li et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4275-4279；Li et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2764-2768；Kim et al. (1994a) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:883-887；Kim et al. (1994b) J. Biol. Chem. 269: 978-982を参照されたい。いくつかの遺伝子特異的な改変されたジンクフィンガーが市販されている。例えば、何千もの標的に対して特異的にターゲティングされたジンクフィンガーを提供する、ジンクフィンガー構築のためのCompoZrと呼ばれるプラットフォームが利用可能である。例えば、Gaj et al., Trends in Biotechnology, 2013, 31(7), 397-405を参照されたい。場合によっては、市販のジンクフィンガーが使用されるか、または特別設計される。
【０１９９】
いくつかの態様では、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位が、改変されたZFNによる遺伝子破壊のための標的にされ得る。内在性T細胞受容体（TCR）遺伝子を標的にする例示的ZFNとしては、例えば、その開示が、参照によりその全体が組み入れられる、US2015/0164954、US2011/0158957、US2015/0056705、US8956828、およびTorikawa et al. (2012) Blood 119:5697-5705に記載されるもの、またはSEQ ID NO:213〜224（TRAC）もしくはSEQ ID NO:225および226（TRBC）のいずれかに記載されるものが挙げられる。
【０２００】
転写活性化因子様エフェクター（TALE）は、細菌種ザントモナス（Xanthomonas）由来のタンパク質であり、複数の反復配列を含み、各反復は、核酸標的配列の各ヌクレオチド塩基に特異的である2残基（RVD）を位置12および13に含む。類似したモジュラー塩基対塩基核酸結合特性（modular base-per-base nucleic acid binding properties）（MBBBD）を有する結合ドメインも、異なる細菌種に由来し得る。新しいモジュラータンパク質は、TAL反復よりも配列多様性を示すという利点を有する。いくつかの態様では、異なるヌクレオチドの認識と関係があるRVDは、Cを認識するためのHD、Tを認識するためのNG、Aを認識するためのNI、GまたはAを認識するためのNN、A、C、G、またはTを認識するためのNS、Tを認識するためのHG、Tを認識するためのIG、Gを認識するためのNK、Cを認識するためのHA、Cを認識するためのND、Cを認識するためのHI、Gを認識するためのHN、Gを認識するためのNA、GまたはAを認識するためのSN、およびTを認識するためのYG、Aを認識するためのTL、AまたはGを認識するためのVT、およびAを認識するためのSWである。いくつかの態様では、重要なアミノ酸12および13は、ヌクレオチドA、T、C、およびGに対するそれらの特異性をモジュレートするために、特に、この特異性を増強するために、他のアミノ酸残基に突然変異させることができる。
【０２０１】
いくつかの態様では、「TALE DNA結合ドメイン」または「TALE」は、1つまたは複数のTALE反復ドメイン／単位を含むポリペプチドである。反復可変2残基（RVD）をそれぞれ含む反復ドメインは、TALEとその同種標的DNA配列の結合に関与する。単一「反復単位」（「反復」とも称される）は、典型的には33〜35アミノ酸の長さであり、天然に存在するTALEタンパク質内の他のTALE反復配列と少なくともある程度の配列相同性を示す。TALEタンパク質は、反復単位内の標準または非標準のRVDを使用して、標的部位に結合するように設計することができる。例えば、米国特許第8,586,526および第9,458,205号を参照されたい。
【０２０２】
いくつかの態様では、「TALEヌクレアーゼ」（TALEN）は、典型的には転写活性化因子様エフェクター（TALE）に由来する核酸結合ドメインと核酸標的配列を開裂させるヌクレアーゼ触媒ドメインを含む融合タンパク質である。触媒ドメインは、ヌクレアーゼドメイン、またはエンドヌクレアーゼ活性を有するドメイン、例えばI-TevI、ColE7、NucA、およびFok-Iなどを含む。特定の態様では、TALEドメインは、メガヌクレアーゼ、例えばI-CreIおよびI-OnuIまたはそれらの機能変異体などに融合させることができる。いくつかの態様では、TALENは単量体のTALENである。単量体のTALENは、特異的な認識および開裂のための二量体化、例えば、改変されたTAL反復とWO2012138927に記載されているI-TevIの触媒ドメインとの融合を必要としないTALENである。TALENは遺伝子ターゲティングおよび遺伝子改変について記載されており、使用されている（例えば、Boch et al. (2009) Science 326(5959): 1509-12.；Moscou and Bogdanove (2009) Science 326(5959): 1501；Christian et al. (2010) Genetics 186(2): 757-61；Li et al. (2011) Nucleic Acids Res 39(1): 359-72を参照されたい）。
【０２０３】
いくつかの態様では、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2遺伝子は、改変されたTALENによる遺伝子破壊のための標的にされ得る。内在性T細胞受容体（TCR）遺伝子を標的にする例示的TALENとしては、例えば、その開示が、参照によりその全体が組み入れられる、WO2017/070429、WO2015/136001、US20170016025、およびUS20150203817に記載されているものが挙げられる。
【０２０４】
いくつかの態様では、「TtAgo」は遺伝子サイレンシングに関与すると考えられている原核性アルゴノートタンパク質である。TtAgoは細菌サーマス・サーモフィラス（Thermus thermophilus）に由来する。例えば、Swarts et al, (2014) Nature 507(7491): 258-261,Sheng et al., (2013) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111, 652）を参照されたい。「TtAgoシステム」は、TtAgo酵素による開裂のためのガイドDNAを含めた、必要とされる全ての成分のことである。
【０２０５】
いくつかの態様では、改変されたジンクフィンガータンパク質、TALEタンパク質、またはCRISPR/Casシステムは天然に見られず、それらの製造は、主として、ファージディスプレイ、相互作用トラップ、またはハイブリッド選抜などの実験的なプロセスから生じる。例えば、米国特許第5,789,538号；米国特許第5,925,523号；米国特許第6,007,988号；米国特許第6,013,453号；米国特許第6,200,759号；WO95/19431；WO96/06166；WO98/53057；WO98/54311；WO00/27878；WO01/60970；WO01/88197およびWO02/099084を参照されたい。
【０２０６】
ジンクフィンガーおよびTALE DNA結合ドメインは、例えば、天然に存在するジンクフィンガータンパク質の認識ヘリックス領域の改変（1つもしくは複数のアミノ酸の変更）を介して、またはDNA結合に関与するアミノ酸（反復可変2残基もしくはRVD領域）を改変することによって、所定のヌクレオチド配列に結合するように改変することができる。したがって、改変されたジンクフィンガータンパク質またはTALEタンパク質は、天然に存在しないタンパク質である。ジンクフィンガータンパク質およびTALEを改変するための方法の非限定例は、設計および選択である。設計されたタンパク質は、その設計/組成物が合理的な判断基準からもたらされる、天然に存在しないタンパク質である。設計のための合理的な判断基準は、置換ルール、ならびに既存のZFPまたはTALEの設計（標準および非標準のRVD）ならびに結合データの情報を格納するデータベース中の情報を処理するためのコンピュータ化アルゴリズムの適用を含む。例えば、米国特許第9,458,205号；第8,586,526号；第6,140,081号；第6,453,242号；および第6,534,261号を参照されたい。WO98/53058；WO98/53059；WO98/53060；WO02/016536、およびWO03/016496も参照されたい。
【０２０７】
ゲノムDNAの標的開裂のための様々な方法および組成物は記載されている。そのような標的開裂イベントを使用して、例えば、標的突然変異誘発を誘導すること、細胞のDNA配列の標的欠失を誘導すること、および所定の染色体座位での標的組換えを推進することができる。例えば、その開示が、参照によりその全体が組み入れられる、米国特許第9,255,250号；第9,200,266号；第9,045,763号；第9,005,973号；第9,150,847号；第8,956,828号；第8,945,868号；第8,703,489号；第8,586,526号；第6,534,261号；第6,599,692号；第6,503,717号；第6,689,558号；第7,067,317号；第7,262,054号；第7,888,121号；第7,972,854号；第7,914,796号；第7,951,925号；第8,110,379号；第8,409,861；米国特許公報第20030232410号；第20050208489号；第20050026157号；第20050064474号；第20060063231号；第20080159996号；第201000218264号；第20120017290号；第20110265198号；第20130137104号；第20130122591号；第20130177983号；第20130196373号；第20140120622号；第20150056705号；第20150335708号；第20160030477号、および第20160024474号を参照されたい。遺伝子破壊を導入することができる1種または複数種の作用物質も提供される。遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質の1種または複数種の成分をコードするポリヌクレオチド（例えば、核酸分子）も提供される。
【０２０８】
a. Crispr/Cas9
いくつかの態様では、TCR、例えば、ヒトのTRACおよびTRBC1またはTRBC2をコードする内在性遺伝子の標的遺伝子破壊、例えばDNA切断は、clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）およびCRISPR関連（Cas）タンパク質を使用して行われる。Sander and Joung, (2014) Nature Biotechnology, 32(4): 347-355を参照されたい。
【０２０９】
一般に、「CRISPRシステム」は、CRISPR関連（「Cas」）遺伝子の発現またはCRISPR関連（「Cas」）遺伝子の活性の指示に関与する転写産物および他の要素、例えば、Cas遺伝子をコードする配列、tracr（トランス活性化CRISPR）配列（例えば、tracrRNAまたは活性な部分的tracrRNA）、tracrメイト配列（内在性CRISPRシステムにおいて、「直列反復配列」およびtracrRNAのプロセッシングを受けた部分的直列反復配列を包含する）、ガイド配列（内在性CRISPRシステムにおいて「スペーサー」とも称される）、および／またはCRISPR座位由来の他の配列および転写産物をまとめて指す。
【０２１０】
いくつかの局面では、CRISPR/CasヌクレアーゼまたはCRISPR/Casヌクレアーゼシステムは、配列特異的にDNAに結合する非コードガイドRNA（gRNA）とヌクレアーゼの機能性を有するCasタンパク質（例えば、Cas9）とを含む。
【０２１１】
1) ガイドRNA（gRNA）
いくつかの態様では、1種または複数種の作用物質は以下の少なくとも1つを含む：TRAC遺伝子の標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）；TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方もしくは両方の標的部位と相補的であるターゲティングドメインを有するgRNA；またはgRNAをコードする少なくとも1つの核酸。
【０２１２】
いくつかの局面では、「gRNA分子」は、標的核酸、例えば、細胞のゲノムDNA上の座位へのgRNA分子／Cas9分子複合体の特異的なターゲティングまたはホーミング（homing）を促進する核酸に対するものである。gRNA分子は、本明細書において「キメラ」gRNAと称されることもある（単一RNA分子を有する）単分子でもよく、または（1つより多い、典型的には2つの別々のRNA分子を含む）モジュラーでもよい。一般に、ガイド配列、例えばガイドRNAは、標的部位で標的配列とハイブリダイズし、標的配列へのCRISPR複合体の配列特異的結合を導くのに十分な相補性を標的ポリヌクレオチド配列、例えば、ヒトのTRAC、TRBC1、および／またはTRBC2遺伝子と有する少なくとも1つの配列部分を含む、任意のポリヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、CRISPR複合体の形成において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計され、標的配列とガイドRNAのドメイン、例えばターゲティングドメインの間のハイブリダイゼーションがCRISPR複合体の形成を促進する配列を一般に指す。ハイブリダイゼーションを引き起こし、CRISPR複合体の形成を促進するのに十分な相補性があるという条件で、完全な相補性は必ずしも必要とされない。一般に、ガイド配列は、ガイド配列内の二次構造の程度を低減させるように選択される。二次構造は、任意の適切なポリヌクレオチドフォールディングアルゴリズムによって決定することができる。
【０２１３】
いくつかの態様では、関心対象の標的座位（例えば、ヒトのTRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位）に特異的なガイドRNA（gRNA）は、標的部位または標的場所でDNA切断を誘導するために、RNA誘導型ヌクレアーゼ、例えばCasに対して使用される。gRNAを設計するための方法および例示的ターゲティングドメインとしては、例えば、WO2015/161276、WO2017/193107、WO2017/093969、US2016/272999、およびUS2015/056705に記載されているものを挙げることができる。
【０２１４】
ドメインがその上に示されるいくつかの例示的gRNA構造は、WO2015/161276に、例えばその中の図1A〜1Gに記載されている。理論に拘束されることを望むものではないが、gRNAの活性型の三次元形態、または鎖内もしくは鎖間相互作用に関して、高い相補性の領域が、WO2015/161276において、例えばその中の図1A〜1Gにおいて、および本明細書において提供される他の描写において、二本鎖として示される場合もある。
【０２１５】
場合によっては、gRNAは、以下のものを5’から3’に含む単分子またはキメラのgRNAである：例えばTRAC座位の配列内の標的部位または位置を標的にするターゲティングドメイン（ヒトTRAC遺伝子座の例示的ヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1；NCBI参照配列：NG_001332.3、TRACに記載される；例示的ゲノム配列は本明細書の表1に記載される）；第1の相補性ドメイン；連結ドメイン；第2の相補性ドメイン（これは第1の相補性ドメインに相補的である）；近位ドメイン；および任意で、尾部ドメイン。場合によっては、gRNAは、以下のものを5’から3’に含む単分子またはキメラのgRNAである：例えばTRBC1またはTRBC2座位の配列内の標的部位または位置を標的にするターゲティングドメイン（ヒトTRBC1遺伝子座の例示的ヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:2；NCBI参照配列：NG_001333.2、TRBC1に記載される；例示的ゲノム配列は本明細書の表2に記載される；ヒトTRBC2遺伝子座の例示的ヌクレオチド配列はSEQ ID NO:3；NCBI参照配列：NG_001333.2、TRBC2に記載される；例示的ゲノム配列は本明細書の表3に記載される）；第1の相補性ドメイン；連結ドメイン；第2の相補性ドメイン（これは第1の相補性ドメインに相補的である）；近位ドメイン；および任意で、尾部ドメイン。
【０２１６】
他の場合では、gRNAは第1および第2の鎖を含むモジュラーgRNAである。これらの場合、第1の鎖は、好ましくは、以下のものを5’から3’に含む：ターゲティングドメイン（これは、例えばTRAC座位（ヒトTRAC遺伝子座の例示的ヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1；NCBI参照配列：NG_001332.3、TRACに記載される；例示的ゲノム配列は本明細書の表1に記載される）、またはTRBC1もしくはTRBC2座位（ヒトTRBC1遺伝子座の例示的ヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:2；NCBI参照配列：NG_001333.2、TRBC11に記載される；例示的ゲノム配列は本明細書の表2に記載される；ヒトTRBC2遺伝子座の例示的ヌクレオチド配列はSEQ ID NO:3；NCBI参照配列：NG_001333.2、TRBC2に記載される）の配列内の標的部位または位置を標的にする；および第1の相補性ドメイン。第2の鎖は、一般に、以下のものを5’から3’に含む：任意で、5’延長ドメイン；第2の相補性ドメイン；近位ドメイン；および任意で、尾部ドメイン。
【０２１７】
A)ターゲティングドメイン
ターゲティングドメインの配置の例はとしては、WO2015/161276に、例えばその中の図1A〜1Gに記載されているものが挙げられる。ターゲティングドメインは、標的核酸上の標的配列に相補的である、例えば、少なくとも80、85、90、95、98、または99％相補的である、例えば、完全に相補的である、ヌクレオチド配列を含む。標的配列を含む標的核酸の鎖は、標的核酸の「相補鎖」と本明細書において称される。ターゲティングドメインの選択のガイダンスは、例えば、Fu Y et al., Nat Biotechnol 2014 (doi: 10.1038/nbt.2808）、および Sternberg SH et al., Nature 2014 (doi: 10.1038/nature13011)に見出すことができる。
【０２１８】
ターゲティングドメインはRNA分子の一部であり、したがって、塩基ウラシル（U）を含むが、gRNA分子をコードする任意のDNAは塩基チミン（T）を含む。理論に拘束されることを望むものではないが、いくつかの態様では、ターゲティングドメインと標的配列の相補性は、gRNA分子／Cas9分子複合体と標的核酸の相互作用の特異性に寄与すると考えられる。ターゲティングドメインと標的配列の対において、ターゲティングドメイン中のウラシル塩基は、標的配列中のアデニン塩基と対形成することが理解されよう。いくつかの態様では、標的ドメインそれ自体が、5’から3’の方向で、任意の二次ドメインおよびコアドメインを含む。いくつかの態様では、コアドメインは標的配列と完全に相補的である。いくつかの態様では、ターゲティングドメインは5〜50ヌクレオチドの長さである。ターゲティングドメインが相補的である標的核酸の鎖は、本明細書において相補鎖と言及される。ドメインのヌクレオチドのいくつか、または全部は、例えば、分解を受けにくくする、生体適合性を向上させるなどのために、修飾を有し得る。非限定例として、ホスホロチオエートまたは他の修飾で標的ドメインの骨格を修飾することができる。場合によっては、ターゲティングドメインのヌクレオチドは、2’修飾、例えば、2-アセチル化、例えば、2’メチル化、または他の修飾を含むことができる。
【０２１９】
様々な態様では、ターゲティングドメインは、16〜26ヌクレオチドの長さである（すなわち、これは、16ヌクレオチドの長さ、または17ヌクレオチドの長さ、または18、19、20、21、22、23、24、25、もしくは26ヌクレオチドの長さである）。
【０２２０】
B) 例示的ターゲティングドメイン
ヒトTRAC、TRBC1、またはTRBC2の遺伝子破壊をターゲティングするために、gRNA内に含まれる例示的ターゲティングドメインとしては、例えば、WO2015/161276、WO2017/193107、WO2017/093969、US2016/272999、およびUS2015/056705に記載されているもの、または前述のターゲティング配列に結合することができるターゲティングドメインが挙げられる。化膿性連鎖球菌（S. pyogenes）または黄色ブドウ球菌（S. aureus）のCas9を使用してヒトTRAC座位の遺伝子破壊をターゲティングするために、gRNA内に含まれる例示的ターゲティングドメインとしては、記載されるもののいずれかを挙げることができる。
【０２２１】
（表４）例示的TRAC gRNAターゲティングドメイン配列
2021520202.tif 000020
2021520202.tif 000021
【０２２２】
化膿性連鎖球菌または黄色ブドウ球菌のCas9を使用してヒトTRBC1またはTRBC2座位の遺伝子破壊をターゲティングするために、gRNA内に含まれる例示的ターゲティングドメインとしては、表5に記載されるもののいずれかを挙げることができる。
【０２２３】
（表５）例示的TRBC1またはTRBC2 gRNAターゲティングドメイン配列
2021520202.tif 000022
2021520202.tif 000023
2021520202.tif 000024
【０２２４】
いくつかの態様では、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2をターゲティングするためのgRNAは、本明細書において記載される、もしくは他で、例えば、WO2015/161276、WO2017/193107、WO2017/093969、US2016/272999、およびUS2015/056705で記載される任意のもの、または前述のターゲティング配列に結合することができるターゲティングドメインであり得る。いくつかの態様では、TRAC遺伝子座においてCRISPR/Cas9 gRNAによってターゲティングされる配列は、SEQ ID NO:117、163、および165〜211に記載されており、例えば、
2021520202.tif 000025
である。いくつかの態様では、TRBC1および／またはTRBC2遺伝子座においてCRISPR/Cas9 gRNAによってターゲティングされる配列は、SEQ ID NO:118、164、および212に記載されており、例えば、
2021520202.tif 000026
である。いくつかの態様では、TRAC遺伝子座中の標的部位をターゲティングするためのgRNAターゲティングドメイン配列は、
2021520202.tif 000027
である。いくつかの態様では、TRBC1および／またはTRBC2遺伝子座中の標的部位をターゲティングするためのgRNAターゲティングドメイン配列は、
2021520202.tif 000028
である。
【０２２５】
いくつかの態様では、TRAC遺伝子座をターゲティングするためのgRNAは、配列
2021520202.tif 000029
（SEQ ID NO:26に記載される；太字および下線部分はTRAC座位の標的部位に相補的である）のインビトロ転写によって得ることができるか、または化学合成することができ、gRNAは、配列
2021520202.tif 000030
（SEQ ID NO:27に記載される；Osborn et al., Mol Ther. 24(3):570-581 (2016)を参照されたい）を有していた。TCRドメインまたは領域をコードする内在性遺伝子、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2の遺伝子破壊を引き起こすための他の例示的gRNA配列は、例えば、国際PCT特許出願公開第WO2015/161276号に記載されている。内在性TCR座位の遺伝子編集のための例示的方法としては、例えば、米国特許出願公開第US2011/0158957号、第US2014/0301990号、第US2015/0098954号、第US2016/0208243号；第US2016/272999号、および第US2015/056705号；国際PCT特許出願公開第WO2014/191128号、第WO2015/136001号、第WO2015/161276号、第WO2016/069283号、第WO2016/016341号、第WO2017/193107号、およびWO2017/093969；ならびにOsborn et al. (2016) Mol. Ther. 24(3):570-581に記載されているものが挙げられる。公知の方法のいずれかは、TCRドメインまたは領域をコードする内在性遺伝子の遺伝子破壊を引き起こすために使用することができ、本明細書において提供される態様で使用することができる。
【０２２６】
いくつかの態様では、ターゲティングドメインとしては、化膿性連鎖球菌のCas9を使用して、または髄膜炎菌（N. meningitidis）のCas9を使用して、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位で遺伝子破壊を導入するためのものが挙げられる。いくつかの態様では、ターゲティングドメインとしては、化膿性連鎖球菌のCas9を使用して、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位で遺伝子破壊を導入するためのものが挙げられる。ターゲティングドメインのいずれも、二本鎖切断（Cas9ヌクレアーゼ）または一本鎖切断（Cas9ニッカーゼ）を引き起こす化膿性連鎖球菌のCas9分子とともに使用することができる。
【０２２７】
いくつかの態様では、二重ターゲティングを使用して、逆DNA鎖に相補的である2つのターゲティングドメインを有する化膿性連鎖球菌のCas9ニッカーゼを使用することによって逆DNA鎖に2つのニックを作出し、例えば、任意のマイナス鎖ターゲティングドメインを含むgRNAは、プラス鎖ターゲティングドメインを含む任意のgRNAと対形成することができる。いくつかの態様では、2つのgRNAは、PAMが外側に向き、gRNAの5’末端間の距離が0〜50bpであるように、DNA上に配向される。いくつかの態様では、2つのgRNAは、例えば、標的ドメインの逆鎖上の2つの一本鎖切断で標的ドメインを開裂させるように、2つの異なるgRNA分子によってガイドされる1対のCas9分子／gRNA分子複合体を使用して、2つのCas9ヌクレアーゼまたは2つのCas9ニッカーゼをターゲティングするために、使用される。いくつかの態様では、2つのCas9ニッカーゼはHNH活性を有する分子、例えば、RuvC活性が失活したCas9分子、例えば、D10での突然変異、例えばD10A突然変異を有するCas9分子、RuvC活性を有する分子、例えば、HNH活性が失活したCas9分子、例えば、H840での突然変異、例えばH840Aを有するCas9分子、またはRuvC活性を有する分子、例えば、HNH活性が失活したCas9分子、例えば、N863での突然変異、例えばN863Aを有するCas9分子を含むことができる。いくつかの態様では、2つのgRNAのそれぞれは、D10A Cas9ニッカーゼと複合体化される。
【０２２８】
いくつかの態様では、標的配列（標的ドメイン）は、SEQ ID NO:1〜3に記載される、または本明細書の表1〜3に記載される、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2コード配列の任意の部分など、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位に、または該座位の近くにある。いくつかの態様では、ターゲティングドメインに相補的な標的核酸は、関心対象の遺伝子、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2の初期コード領域に位置する。初期コード領域のターゲティングは、関心対象の遺伝子の遺伝子破壊（すなわち、発現の排除）に使用することができる。いくつかの態様では、関心対象の遺伝子の初期コード領域は、開始コドン（例えば、ATG）の直後、または開始コドンから500bp以内（例えば、500、450、400、350、300、250、200、150、100、50bp、40bp、30bp、20bp、または10bp未満）の配列を含む。特定例では、標的核酸は、開始コドンから200bp、150bp、100bp、50bp、40bp、30bp、20bp、または10bp以内である。いくつかの例では、gRNAのターゲティングドメインは、標的核酸、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位中の標的核酸上の標的配列に相補的である、例えば、少なくとも80、85、90、95、98、または99％相補的である、例えば、完全に相補的である。
【０２２９】
いくつかの局面では、gRNAは、内在性TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位のオープンリーディングフレームのエクソン内の部位を標的にすることができる。いくつかの局面では、gRNAは、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位のオープンリーディングフレームのイントロン内の部位を標的にすることができる。いくつかの局面では、gRNAは、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位の調節または制御エレメント、例えば、プロモーター内の部位を標的にすることができる。いくつかの局面では、gRNAによって標的にされる、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位の標的部位は、本明細書において、例えばセクションI.A.1に記載される任意の標的部位でもよい。いくつかの態様では、gRNAは、初期コード領域に対応するエクソン、例えば、内在性TRAC、TRBC1、および／もしくはTRBC2座位のオープンリーディングフレームのエクソン1、2、もしくは3内の、または該エクソンに極めて近接した部位を、あるいは転写開始点の直後の、エクソン1、2、もしくは3内の、またはエクソン1、2、もしくは3の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満内の配列を含む部位を標的にすることができる。いくつかの態様では、gRNAは、内在性TRAC、TRBC1、および／もしくはTRBC2座位のエクソン2もしくはその近くの部位を、またはエクソン2の500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満内の部位を標的にすることができる。
【０２３０】
C) 第1の相補性ドメイン
第1の相補性ドメインの例としては、WO2015/161276に、例えばその中の図1A〜1Gに記載されているものが挙げられる。第1の相補性ドメインは、本明細書において記載される第2の相補性ドメインと相補的であり、一般に、少なくともいくつかの生理的条件下で二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を第2の相補性ドメインに対して有する。第1の相補性ドメインは、典型的には5〜30ヌクレオチドの長さであり、5〜25ヌクレオチドの長さ、7〜25ヌクレオチドの長さ、7〜22ヌクレオチドの長さ、7〜18ヌクレオチドの長さ、または7〜15ヌクレオチドの長さでもよい。様々な態様では、第1の相補的ドメインは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、または25ヌクレオチドの長さである。
【０２３１】
典型的には、第1の相補性ドメインは、第2の相補性ドメイン標的と正確な相補性を有さない。いくつかの態様では、第1の相補性ドメインは、第2の相補性ドメインの対応するヌクレオチドと相補的でない、1、2、3、4、または5ヌクレオチドを有し得る。例えば、第1の相補性ドメインの1、2、3、4、5、または6（例えば、3）ヌクレオチドのセグメントは、二本鎖において対形成しなくてもよく、非二本鎖のまたはループアウトした領域を形成することができる。ある場合には、非対形成またはループアウト領域、例えば、3ヌクレオチドのループアウトが第2の相補性ドメインに存在する。この非対形成領域は、任意で、第2の相補性ドメインの5’末端から1、2、3、4、5、または6、例えば、4ヌクレオチドで始まる。
【０２３２】
第1の相補性ドメインは、3つのサブドメインを含むことができ、これらは、5’から3’の方向で、5’サブドメイン、中央サブドメイン、および3’サブドメインである。いくつかの態様では、5’サブドメインは、4〜9、例えば、4、5、6、7、8、または9ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、中央サブドメインは、1、2、または3、例えば、1ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、3’サブドメインは、3〜25、例えば、4〜22、4〜18、もしくは4〜10、または3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチドの長さである。
【０２３３】
いくつかの態様では、第1および第2の相補性ドメインは、二本鎖の場合、例えばgRNA配列（1つの対形成鎖は下線が引かれ、1つは太字である）：
2021520202.tif 000031
中に11個の対形成ヌクレオチドを含む。
【０２３４】
いくつかの態様では、第1および第2の相補性ドメインは、二本鎖の場合、例えばgRNA配列（1つの対形成鎖は下線が引かれ、1つは太字である）：
2021520202.tif 000032
中に15個の対形成ヌクレオチドを含む。
【０２３５】
いくつかの態様では、第1および第2の相補性ドメインは、二本鎖の場合、例えばgRNA配列（1つの対形成鎖は下線が引かれ、1つは太字である）：
2021520202.tif 000033
中に16個の対形成ヌクレオチドを含む。
【０２３６】
いくつかの態様では、第1および第2の相補性ドメインは、二本鎖の場合、例えばgRNA配列（1つの対形成鎖は下線が引かれ、1つは太字である）：
2021520202.tif 000034
中に21個の対形成ヌクレオチドを含む。
【０２３７】
いくつかの態様では、例えばgRNA配列（交換されるヌクレオチドは下線が引かれる）：
2021520202.tif 000035
中のポリUトラクトを除去するために、ヌクレオチドが交換される。
【０２３８】
第1の相補性ドメインは、天然に存在する第1の相補性ドメインと相同性を有してもよく、または天然に存在する第1の相補性ドメインに由来してもよい。いくつかの態様では、これは、本明細書において開示される第1の相補性ドメイン、例えば、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌（N. meningtidis）、またはS.サーモフィラス（S. thermophilus）の第1の相補性ドメインと少なくとも50％の相同性を有する。
【０２３９】
第1の相補性ドメインのヌクレオチドの1つもしくは複数、またはさらに全てが、ターゲティングドメインについて本明細書おいて記載される線に沿って修飾を有し得ることに留意されたい。
【０２４０】
D) 連結ドメイン
連結ドメインの例としては、WO2015/161276に、例えばその中の図1A〜1Gに記載されているものが挙げられる。単分子またはキメラのgRNAでは、連結ドメインは、第1の相補性ドメインを単分子gRNAの第2の相補性ドメインと連結する働きをする。連結ドメインは、第1と第2の相補性ドメインを共有結合的または非共有結合的に連結することができる。いくつかの態様では、連結は共有結合である。いくつかの態様では、連結ドメインは、第1と第2の相補性ドメインを共有結合的に結合する。例えば、WO2015/161276、例えばその中の図1B〜1Eを参照されたい。いくつかの態様では、連結ドメインは、第1の相補性ドメインと第2の相補性ドメインの間に挿入された共有結合であるか、または該共有結合を含む。典型的には、連結ドメインは、1つまたは複数の、例えば、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドを含むが、様々な態様では、リンカーは、20、30、40、50、またはさらに100ヌクレオチドの長さでもよい。
【０２４１】
モジュラーgRNA分子では、2つの分子は相補性ドメインのハイブリダイゼーションによって結合しており、連結ドメインは存在しなくてもよい。例えば、WO2015/161276、例えばその中の図1Aを参照されたい。
【０２４２】
多種多様の連結ドメインが単分子gRNA分子での使用に適する。連結ドメインは、共有結合からなってもよく、または1つもしくは少数のヌクレオチド、例えば、1、2、3、4、もしくは5ヌクレオチドの長さほどの短さでもよい。いくつかの態様では、連結ドメインは、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、または25またはそれ以上のヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、連結ドメインは、2〜50、2〜40、2〜30、2〜20、2〜10、または2〜5ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、連結ドメインは、天然に存在する配列、例えば、第2の相補性ドメインに対して5’であるtracrRNAの配列と相同性を有するか、または該配列に由来する。いくつかの態様では、連結ドメインは、本明細書において開示される連結ドメインと少なくとも50％の相同性を有する。
【０２４３】
第1の相補性ドメインに関して本明細書において記載するように、連結ドメインのヌクレオチドのいくつか、または全部は、修飾を含むことができる。
【０２４４】
E) 5’延長ドメイン
場合によっては、モジュラーgRNAは、第2の相補性ドメインに対して5’に、5’延長ドメインと本明細書において称されるさらなる配列を含むことができる（WO2015/161276、例えばその中の図1A）。いくつかの態様では、5’延長ドメインは、2〜10、2〜9、2〜8、2〜7、2〜6、2〜5、または2〜4ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、5’延長ドメインは、2、3、4、5、6、7、8、9、または10またはそれ以上のヌクレオチドの長さである。
【０２４５】
F) 第2の相補性ドメイン
第2の相補性ドメインの例としては、WO2015/161276に、例えばその中の図1A〜1Gに記載されているものが挙げられる。第2の相補性ドメインは、第1の相補性ドメインと相補的であり、一般に、少なくともいくつかの生理的条件下で二本鎖領域を形成するのに十分な相補性を第2の相補性ドメインに対して有する。場合によっては、例えば、WO2015/161276に、例えばその中の図1A〜1Bに示すように、第2の相補性ドメインは、第1の相補性ドメインと相補性を欠く配列、例えば、二本鎖領域からループアウトする配列を含むことができる。
【０２４６】
第2の相補性ドメインは、5〜27ヌクレオチドの長さでもよく、場合によっては、第1の相補性領域よりも長くてもよい。例えば、第2の相補的ドメインは、7〜27ヌクレオチドの長さ、7〜25ヌクレオチドの長さ、7〜20ヌクレオチドの長さ、または7〜17ヌクレオチドの長さでもよい。より一般的には、相補的ドメインは、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチドの長さでもよい。
【０２４７】
いくつかの態様では、第2の相補性ドメインは3つのサブドメインを含み、これらは、5’から3’の方向で、5’サブドメイン、中央サブドメイン、および3’サブドメインである。いくつかの態様では、5’サブドメインは、3〜25、例えば、4〜22、4〜18、もしくは4〜10、または3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、もしくは25ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、中央サブドメインは、1、2、3、4、または5、例えば、3ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、3’サブドメインは、4〜9、例えば、4、5、6、7、8、または9ヌクレオチドの長さである。
【０２４８】
いくつかの態様では、第1の相補性ドメインの5’サブドメインおよび3’サブドメインは、それぞれ、第2の相補性ドメインの3’サブドメインおよび5’サブドメインと相補的であり、例えば完全に相補的である。
【０２４９】
第2の相補性ドメインは、天然に存在する第2の相補性ドメインと相同性を有してもよく、または天然に存在する第2の相補性ドメインに由来してもよい。いくつかの態様では、これは、本明細書において開示される第2の相補性ドメイン、例えば、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、またはS.サーモフィラスの第1の相補性ドメインと少なくとも50％の相同性を有する。
【０２５０】
第2の相補性ドメインのヌクレオチドのいくつか、または全部は、修飾、例えば、本明細書において記載される修飾を有し得る。
【０２５１】
G) 近位ドメイン
近位ドメインの例としては、WO2015/161276に、例えばその中の図1A〜1Gに記載されているものが挙げられる。いくつかの態様では、近位ドメインは、5〜20ヌクレオチドの長さである。いくつかの態様では、近位ドメインは、天然に存在する近位ドメインと相同性を有してもよく、または天然に存在する近位ドメインに由来してもよい。いくつかの態様では、これは、本明細書において開示される近位ドメイン、例えば、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、またはS.サーモフィラスの近位ドメインと少なくとも50％の相同性を有する。
【０２５２】
近位ドメインのヌクレオチドのいくつか、または全部は、本明細書おいて記載される線に沿って修飾を有し得る。
【０２５３】
H) 尾部ドメイン
尾部ドメインの例としては、WO2015/161276に、例えばその中の図1A〜1Gに記載されているものが挙げられる。WO2015/161276における、例えばその中の図1Aおよび図1B〜1Fにおける、尾部ドメインの検査から分かるように、幅広い尾部ドメインがgRNA分子での使用に適する。様々な態様では、尾部ドメインは、0（存在しない）、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10ヌクレオチドの長さである。ある特定の態様では、尾部ドメインのヌクレオチドは、天然に存在する尾部ドメインの5’末端の配列に由来するか、または該配列と相同性を有する。例えば、WO2015/161276、例えばその中の図1Dまたは1Eを参照されたい。尾部ドメインはまた、互いに相補的であり、少なくともいくつかの生理的条件下で二本鎖領域を形成する配列を任意で含む。
【０２５４】
尾部ドメインは、天然に存在する近位尾部ドメインと相同性を有してもよく、または天然に存在する近位尾部ドメインに由来してもよい。非限定例として、本開示の様々な態様による所与の尾部ドメインは、本明細書において開示される天然に存在する尾部ドメイン、例えば、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、またはS.サーモフィラスの尾部ドメインと少なくとも50％の相同性を有し得る。
【０２５５】
特定の場合には、尾部ドメインは、インビトロまたはインビボ転写の方法に関係するヌクレオチドを3’末端に含む。gRNAのインビトロ転写のためにT7プロモーターが使用される場合は、これらのヌクレオチドは、DNA鋳型の3’末端の前に存在するいかなるヌクレオチドでもよい。インビボ転写のためにU6プロモーターが使用される場合は、これらのヌクレオチドは配列UUUUUUでもよい。代替のpol-IIIプロモーターが使用される場合は、これらのヌクレオチドは、様々な数であっても、もしくはウラシル塩基でもよく、または代替の塩基を含んでもよい。
【０２５６】
非限定例として、様々な態様では、近位および尾部ドメインは、まとめると、以下の配列を含む：
2021520202.tif 000036
。
【０２５７】
いくつかの態様では、尾部ドメインは、例えば、転写のためにU6プロモーターが使用される場合、3’配列UUUUUUを含む。いくつかの態様では、尾部ドメインは、例えば、転写のためにH1プロモーターが使用される場合、3’配列UUUUを含む。いくつかの態様では、尾部ドメインは、例えば、使用されるpol-IIIプロモーターの終結シグナルに応じて、可変数の3’Uを含む。いくつかの態様では、尾部ドメインは、T7プロモーターが使用される場合、DNA鋳型に由来する可変性3’配列を含む。いくつかの態様では、尾部ドメインは、例えば、RNA分子を生成するためにインビトロ転写が使用される場合、DNA鋳型に由来する可変性3’配列を含む。いくつかの態様では、尾部ドメインは、例えば、転写を駆動するためにpol-IIプロモーターが使用される場合、DNA鋳型に由来する可変性3’配列を含む。
【０２５８】
いくつかの態様では、gRNAは以下の構造：5’［ターゲティングドメイン］−［第1の相補性ドメイン]−［連結ドメイン］−［第2の相補性ドメイン］−［近位ドメイン］−［尾部ドメイン]−3’を有し、ターゲティングドメインは、コアドメインおよび任意で二次ドメインを含み、10〜50ヌクレオチドの長さであり；第1の相補性ドメインは、5〜25ヌクレオチドの長さであり、いくつかの態様では、本明細書において開示される参照第1相補性ドメインと少なくとも50、60、70、80、85、90、95、98、または99％の相同性を有し；連結ドメインは、1〜5ヌクレオチドの長さであり；近位ドメインは、5〜20ヌクレオチドの長さであり、いくつかの態様では、本明細書において開示される参照近位ドメインと少なくとも50、60、70、80、85、90、95、98、または99％の相同性を有し；尾部ドメインは存在しないか、またはヌクレオチド配列が1〜50ヌクレオチドの長さであり、いくつかの態様では、本明細書において開示される参照尾部ドメインと少なくとも50、60、70、80、85、90、95、98、または99％の相同性を有する。
【０２５９】
I) 例示的キメラgRNA
いくつかの態様では、単分子またはキメラのgRNAは、好ましくは5’から3’に、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチドを含むターゲティングドメイン（これは標的核酸に相補的である）；第1の相補性ドメイン；連結ドメイン；第2の相補性ドメイン（これは第1の相補性ドメインに相補的である）；近位ドメイン；および尾部ドメイン含み、(a)近位および尾部ドメインは、まとめると、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドを含み；(b)第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して3’に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドが存在し；または(c)その対応する第1の相補性ドメインのヌクレオチドに相補的である第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して3’に、少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、もしくは54ヌクレオチドが存在する。
【０２６０】
いくつかの態様では、(a）、(b）、または(c)からの配列は、天然に存在するgRNAの対応する配列と、または本明細書において記載されるgRNAと、少なくとも60、75、80、85、90、95、または99％の相同性を有する。いくつかの態様では、近位および尾部ドメインは、まとめると、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して3’に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。いくつかの態様では、その対応する第1の相補性ドメインのヌクレオチドに相補的である第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して3’に、少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドが存在する。いくつかの態様では、ターゲティングドメインは、標的ドメインと相補性を有する16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチド（例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26個の連続したヌクレオチド）を含むか、該ヌクレオチドを有するか、または該ヌクレオチドからなり、例えば、ターゲティングドメインは、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチドの長さである。
【０２６１】
いくつかの態様では、（ターゲティングドメイン、第1の相補的ドメイン、連結ドメイン、第2の相補的ドメイン、近位ドメイン、および任意で、尾部ドメインを含む）単分子またはキメラのgRNA分子は、ターゲティングドメインが、20個のNとして示されるが、任意の配列および16〜26ヌクレオチドの長さの範囲でもよく、かつgRNA配列の後に6個のUが続き、これは、U6プロモーターの終結シグナルとして働くが、存在しないか、または数がより少なくてもよい、以下の配列：
2021520202.tif 000037
を含む。いくつかの態様では、単分子またはキメラのgRNA分子は化膿性連鎖球菌のgRNA分子である。
【０２６２】
いくつかの態様では、（ターゲティングドメイン、第1の相補的ドメイン、連結ドメイン、第2の相補的ドメイン、近位ドメイン、および任意で、尾部ドメインを含む）単分子またはキメラのgRNA分子は、ターゲティングドメインが、20個のNとして示されるが、任意の配列および16〜26ヌクレオチドの長さの範囲でもよく、かつgRNA配列の後に6個のUが続き、これは、U6プロモーターの終結シグナルとして働くが、存在しないか、または数がより少なくてもよい、以下の配列：
2021520202.tif 000038
を含む。いくつかの態様では、単分子またはキメラのgRNA分子は黄色ブドウ球菌のgRNA分子である。例示的キメラgRNAの配列および構造はまた、WO2015/161276に、例えばその中の図10A〜10Bに示される。
【０２６３】
J) 例示的モジュラーgRNA
いくつかの態様では、モジュラーgRNAは第1および第2の鎖を含む。第1の鎖は、好ましくは5’から3’に、例えば、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチドを含むターゲティングドメイン；第1の相補性ドメインを含む。第2の鎖は、好ましくは5’から3’に、任意で5’延長ドメイン；第2の相補性ドメイン；近位ドメイン；および尾部ドメイン含み、(a)近位および尾部ドメインは、まとめると、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドを含み；(b)第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して3’に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、もしくは53ヌクレオチドが存在し；または(c)その対応する第1の相補性ドメインのヌクレオチドに相補的である第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して3’に、少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、もしくは54ヌクレオチドが存在する。
【０２６４】
いくつかの態様では、(a）、(b）、または(c)からの配列は、天然に存在するgRNAの対応する配列と、または本明細書において記載されるgRNAと、少なくとも60、75、80、85、90、95、または99％の相同性を有する。いくつかの態様では、近位および尾部ドメインは、まとめると、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して3’に、少なくとも15、18、20、25、30、31、35、40、45、49、50、または53ヌクレオチドが存在する。
【０２６５】
いくつかの態様では、その対応する第1の相補性ドメインのヌクレオチドに相補的である第2の相補性ドメインの最後のヌクレオチドに対して3’に、少なくとも16、19、21、26、31、32、36、41、46、50、51、または54ヌクレオチドが存在する。
【０２６６】
いくつかの態様では、ターゲティングドメインは、標的ドメインと相補性を有する16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチド（例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26個の連続したヌクレオチド）を有するか、または該ヌクレオチドからなり、例えば、ターゲティングドメインは、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、または26ヌクレオチドの長さである。
【０２６７】
K) gRNAを設計するための方法
ターゲティングドメインを選択する、設計する、および検証するための方法を含めて、gRNAを設計するための方法が本明細書において記載される。例示的ターゲティングドメインも本明細書において提供される。本明細書において論じられるターゲティングドメインは、本明細書において記載されるgRNA中に組み込むことができる。
【０２６８】
いくつかの態様では、標的部位または標的場所でDNA切断を誘導するために、標的遺伝子（例えば、ヒトのTRAC、TRBC1、および／またはTRBC2）に特異的なガイドRNA（gRNA）が、RNA誘導型ヌクレアーゼ、例えば、Casに対して使用される。gRNAを設計するための方法および例示的ターゲティングドメインとしては、例えば、国際PCT特許出願公開WO2015/161276号に記載されているものが挙げられる。ターゲティングドメインは、Cas9ヌクレアーゼを標的部位または標的位置にターゲティングするのに使用されるgRNA中に組み込むことができる。
【０２６９】
標的配列の選択および検証ならびにオフターゲット解析のための方法は、例えば、Mali et al., 2013 Science 339(6121): 823-826；Hsu et al. Nat Biotechnol, 31(9): 827-32；Fu et al., 2014 Nat Biotechnol, doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574；Heigwer et al., 2014 Nat Methods 11(2):122-3. doi: 10.1038/nmeth.2812. PubMed PMID: 24481216；Bae et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24463181；Xiao A et al., 2014 Bioinformatics PubMed PMID: 24389662に記載されている。
【０２７０】
いくつかの態様では、使用者の標的配列内のgRNAの選択を最適化するために、例えば、ゲノム全体にわたる全オフターゲット活性を最小化するために、ソフトウェアツールを使用することができる。オフターゲット活性は開裂以外でもよい。例えば、化膿性連鎖球菌のCas9を使用する、考えられる各gRNA選択のために、ソフトウェアツールによって、ある特定の数（例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、または10）までのミスマッチ塩基対を含む全ての潜在的なオフターゲット配列（NAGまたはNGG PAMのいずれかに先行する）をゲノム全体にわたって特定することができる。各オフターゲット配列における開裂効率は、例えば実験的に得られた重み付け（weighting）スキームを使用して、予測することができる。次いで、その全予測オフターゲット開裂に従って、考えられる各gRNAをランク付けすることができ；トップにランク付けされたgRNAは、最大のオンターゲットおよび最小のオフターゲット開裂を有する可能性があるものに相当する。他の機能、例えば、gRNAベクター構築のための自動化された試薬設計、オンターゲットSurveyorアッセイのためのプライマー設計、および次世代シーケンシングを介したオフターゲット開裂のハイスループットな検出および定量化のためのプライマー設計もツールに含まれ得る。候補gRNA分子は、技術分野で公知の方法によって、または本明細書において記載されるように、評価することができる。
【０２７１】
いくつかの態様では、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、および髄膜炎菌のCas9とともに使用するためのgRNAは、DNA配列検索アルゴリズムを使用して、例えば、公的なツールcas-offinder（Bae et al. Bioinformatics. 2014；30(10): 1473-1475）に基づくカスタムgRNA設計ソフトウェアを使用して、特定される。カスタムgRNA設計ソフトウェアは、ガイドのゲノムワイドなオフターゲット傾向を計算した後に、ガイドをスコア化する。典型的には、完全なマッチから7ミスマッチに及ぶマッチが、17〜24の長さにわたるガイドについて考慮される。いくつかの局面では、一旦オフターゲット部位が計算的に決定されると、総スコアが各ガイドについて計算され、webインタフェースを使用して表形式出力にまとめられる。PAM配列に隣接する潜在的なgRNA部位の特定に加えて、ソフトウェアは、選択されたgRNA部位と1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のヌクレオチドが異なる、全てのPAM隣接配列を特定することもできる。いくつかの態様では、各遺伝子に対するgゲノム（gGenomic）DNA配列がUCSC Genome browserから得られ、公的に利用可能なRepeatMaskerプログラムを使用して、反復エレメントについて配列をスクリーニングすることができる。RepeatMaskerは、反復エレメントおよび低複雑度領域について入力DNA配列を検索する。出力は、所与のクエリ配列中に存在する反復の詳細なアノテーションである。
【０２７２】
特定した後、標的部位へのそれらの距離、それらの直交性、および5’Gの存在の1つまたは複数に基づいて、gRNAを階層にランク付けすることができる（関連するPAM、例えば、化膿性連鎖球菌の場合はNGG PAM、黄色ブドウ球菌の場合はNNGRR（例えば、NNGRRTまたはNNGRRV）PAM、および髄膜炎菌の場合はNNNNGATTまたはNNNNGCTT PAMを含むヒトゲノムにおける厳密なマッチの特定に基づく）。直交性は、標的配列に対して最小数のミスマッチを含む、ヒトゲノム中の配列の数を指す。「高レベルの直交性」または「良好な直交性」は、例えば、意図された標的を除いて、ヒトゲノム中に同一の配列を有さず、標的配列中に1つまたは2つのミスマッチを含むいかなる配列も有さない、20-merのターゲティングドメインを指すことができる。良好な直交性を有するターゲティングドメインは、オフターゲットDNA開裂を最小化するために選択される。これは非限定例であること、ならびに化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、および髄膜炎菌または他のCas9酵素とともに使用するためのgRNAを特定するために、様々なストラテジーを利用することができることを理解されたい。
【０２７３】
いくつかの態様では、化膿性連鎖球菌のCas9とともに使用するためのgRNAは、公的に利用可能なwebベースのZiFiTサーバー（Fu et al., Improving CRISPR-Cas nuclease specificity using truncated guide RNAs. Nat Biotechnol. 2014 Jan 26. doi: 10.1038/nbt.2808. PubMed PMID: 24463574。元の参考文献については、Sander et al., 2007, NAR 35:W599-605；Sander et al., 2010, NAR 38: W462-8を参照されたい）を使用して特定することができる。PAM配列に隣接する潜在的なgRNA部位の特定に加えて、該ソフトウェアは、選択されたgRNA部位と1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のヌクレオチドが異なる全てのPAM隣接配列も特定する。いくつかの局面では、各遺伝子に対するゲノムDNA配列は、UCSC Genome browserから得ることができ、公的に利用可能なRepeat-Maskerプログラムを使用して、反復エレメントについて配列をスクリーニングすることができる。RepeatMaskerは、反復エレメントおよび低複雑度の領域について入力DNA配列を検索する。出力は、所与のクエリ配列中に存在する反復の詳細なアノテーションである。
【０２７４】
特定した後、化膿性連鎖球菌のCas9とともに使用するためのgRNAを階層、例えば5階層にランク付けすることができる。いくつかの態様では、第1の階層のgRNA分子のためのターゲティングドメインは、標的部位へのそれらの距離、それらの直交性、および5’Gの存在に基づいて選択される（NGG PAMを含むヒトゲノムにおける厳密なマッチのZiFiT特定に基づく）。いくつかの態様では、標的に対して、17-merと20-merの両方のgRNAが設計される。いくつかの局面では、gRNAは、単一gRNAヌクレアーゼ切断と二重gRNAニッカーゼストラテジーの両方についても選択される。gRNAを選択するための判断基準およびどのgRNAをどのストラテジーに使用することができるかについての決定は、いくつかの考慮すべき事柄に基づき得る。いくつかの態様では、単一gRNAヌクレアーゼ開裂と二重gRNA対形成「ニッカーゼ」ストラテジーの両方のためのgRNAが特定される。二重gRNA対形成「ニッカーゼ」ストラテジーにどのgRNAを使用することができるかについての決定を含めて、gRNAを選択するためのいくつかの態様では、gRNA対は、PAMが外側を向き、D10A Cas9ニッカーゼによる切断が5’突出をもたらすと考えられるように、DNA上に配向されるべきである。いくつかの局面では、二重ニッカーゼ対による開裂は、合理的な頻度で介在配列の全体の欠失をもたらすであろうことが想定され得る。しかし、二重ニッカーゼ対による開裂はまた、gRNAの1つのみの部位にしばしばインデル突然変異をもたらし得る。単に1つのgRNAの部位でインデル突然変異を引き起こすことと比較して、どれだけ効率的に全配列を除去するかについて、候補対メンバーを試験することができる。
【０２７５】
いくつかの態様では、第1の階層のgRNA分子のためのターゲティングドメインは、(1)標的場所への合理的な距離、例えば、開始コドンの下流のコード配列の最初の500bp以内、(2)高レベルの直交性、および(3)5’Gの存在に基づいて選択することができる。いくつかの態様では、第2の階層のgRNAの選択について、5’Gの要件を除去することができるが、距離制限が必要とされ、高レベルの直交性が必要とされた。いくつかの態様では、第3の階層の選択は、同じ距離制限および5’Gの要件を使用するが、良好な直交性の要件を除去する。いくつかの態様では、第4階層の選択は、同じ距離制限を使用するが、良好な直交性と5’Gからの開始の要件を除去する。いくつかの態様では、第5の階層の選択は、良好な直交性と5’Gの要件を除去し、より長い配列（例えば、残りのコード配列、例えば、転写標的部位に対してさらに500bp上流または下流）がスキャンされる。特定の場合では、gRNAは特定の階層の判断基準に基づいて特定されない。
【０２７６】
いくつかの態様では、gRNAは、単一gRNAヌクレアーゼ開裂のために、および二重gRNA対形成「ニッカーゼ」ストラテジーのために特定される。
【０２７７】
いくつかの局面では、髄膜炎菌および黄色ブドウ球菌のCas9とともに使用するためのgRNAは、PAM配列の存在についてゲノムDNA配列をスキャンすることによって、手動で特定することができる。これらのgRNAは2つの階層に分離され得る。いくつかの態様では、第1の階層のgRNAについて、ターゲティングドメインは、開始コドンの下流のコード配列の最初の500bp以内で選択される。いくつかの態様では、第2の階層のgRNAについて、ターゲティングドメインは、残りのコード配列（最初の500bpの下流）内で選択される。特定の場合では、gRNAは特定の階層の判断基準に基づいて特定されない。
【０２７８】
いくつかの態様では、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、および髄膜炎菌のCas9とともに使用するためのガイドRNA（gRNA）を特定するための別のストラテジーは、DNA配列検索アルゴリズムを使用することができる。いくつかの局面では、ガイドRNAの設計は、公的なツールcas-offinder（Bae et al. Bioinformatics. 2014；30(10): 1473-1475）に基づくカスタムガイドRNA設計ソフトウェアを使用して行われる。該カスタムガイドRNA設計ソフトウェアは、ガイドのゲノムワイドなオフターゲット傾向を計算した後に、ガイドをスコア化する。典型的には、完全なマッチから7ミスマッチに及ぶマッチが、17〜24の長さにわたるガイドについて考慮される。一旦オフターゲット部位が計算的に決定されると、総スコアが各ガイドについて計算され、webインタフェースを使用して表形式出力にまとめられる。PAM配列に隣接する潜在的なgRNA部位の特定に加えて、ソフトウェアは、選択されたgRNA部位と1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のヌクレオチドが異なる全てのPAM隣接配列も特定する。いくつかの態様では、各遺伝子に対するゲノムDNA配列がUCSC Genome browserから得られ、公的に利用可能なRepeatMaskerプログラムを使用して、反復エレメントについて配列がスクリーニングされる。RepeatMaskerは、反復エレメントおよび低複雑度の領域について入力DNA配列を検索する。出力は、所与のクエリ配列中に存在する反復の詳細なアノテーションである。
【０２７９】
いくつかの態様では、特定した後、gRNAは、標的部位へのそれらの距離またはそれらの直交性に基づいて、階層にランク付けされる（関連するPAM、例えば、化膿性連鎖球菌の場合はNGG PAM、黄色ブドウ球菌の場合はNNGRR（例えば、NNGRRTまたはNNGRRV）PAM、および髄膜炎菌の場合はNNNNGATTまたはNNNNGCTT PAMを含むヒトゲノムにおける厳密なマッチの特定に基づく）。いくつかの局面では、良好な直交性を有するターゲティングドメインは、オフターゲットDNA開裂を最小化するために選択される。
【０２８０】
一例として、化膿性連鎖球菌および髄膜炎菌の標的について、17-merまたは20-merのgRNAを設計することができる。別の例として、黄色ブドウ球菌の標的について、18-mer、19-mer、20-mer、21-mer、22-mer、23-mer、および24-merのgRNAを設計することができる。
【０２８１】
いくつかの態様では、単一gRNAヌクレアーゼ開裂と二重gRNA対形成「ニッカーゼ」ストラテジーの両方のためのgRNAが特定される。二重gRNA対形成「ニッカーゼ」ストラテジーにどのgRNAを使用することができるかについての決定を含めて、gRNAを選択するためにいくつかの態様では、gRNA対は、PAMが外側を向き、D10A Cas9ニッカーゼによる切断が5’突出をもたらすと考えられるように、DNA上に配向されるべきである。いくつかの局面では、二重ニッカーゼ対による開裂が、合理的な頻度で介在配列の全体の欠失をもたらすであろうことが想定され得る。しかし、二重ニッカーゼ対による開裂はまた、gRNAの1つのみの部位にしばしばインデル突然変異をもたらし得る。単に1つのgRNAの部位でインデル突然変異を引き起こすことと比較して、どれだけ効率的に全配列を除去するかについて、候補対メンバーを試験することができる。
【０２８２】
遺伝子破壊のためのストラテジーを設計するために、いくつかの態様では、化膿性連鎖球菌に対する階層1のgRNA分子についてのターゲティングドメインは、標的部位へのそれらの距離およびそれらの直交性に基づいて選択される（PAMはNGGである）。場合によっては、階層1のgRNA分子についてのターゲティングドメインは、(1)標的場所への合理的な距離、例えば、開始コドンの下流のコード配列の最初の500bp以内、および(2)高レベルの直交性に基づいて選択される。いくつかの局面では、階層2のgRNAの選択について、高レベルの直交性は必要とされない。場合によっては、階層3のgRNAは、良好な直交性の要件を除去し、より長い配列（例えば、残りのコード配列）がスキャンされ得る。特定の場合では、gRNAは特定の階層の判断基準に基づいて特定されない。
【０２８３】
遺伝子破壊のためのストラテジーを設計するために、いくつかの態様では、髄膜炎菌に対する階層1のgRNA分子についてのターゲティングドメインは、コード配列の最初の500bp以内で選択され、高レベルの直交性を有していた。髄膜炎菌に対する階層2のgRNA分子についてのターゲティングドメインは、コード配列の最初の500bp以内で選択され、高い直交性を必要としなかった。髄膜炎菌に対する階層3のgRNA分子についてのターゲティングドメインは、該500bpの下流のコード配列の残りの部分内で選択された。階層が非包括的である（各gRNAは、一度だけ列挙される）ことに留意されたい。特定の場合では、gRNAは特定の階層の判断基準に基づいて特定されなかった。
【０２８４】
遺伝子破壊のためのストラテジーを設計するために、いくつかの態様では、黄色ブドウ球菌に対する階層1のgRNA分子についてのターゲティングドメインは、コード配列の最初の500bp以内で選択され、高レベルの直交性を有し、NNGRRT PAMを含む。いくつかの態様では、黄色ブドウ球菌に対する階層2のgRNA分子についてのターゲティングドメインは、コード配列の最初の500bp以内で選択され、直交性のレベルは必要とされず、NNGRRT PAMを含む。いくつかの態様では、黄色ブドウ球菌に対する階層3のgRNA分子についてのターゲティングドメインは、下流のコード配列の残りの部分内で選択され、NNGRRT PAMを含む。いくつかの態様では、黄色ブドウ球菌に対する階層4のgRNA分子についてのターゲティングドメインは、コード配列の最初の500bp以内で選択され、NNGRRV PAMを含む。いくつかの態様では、黄色ブドウ球菌に対する階層5のgRNA分子についてのターゲティングドメインは、下流のコード配列の残りの部分内で選択され、NNGRRV PAMを含む。特定の場合では、gRNAは特定の階層の判断基準に基づいて特定されない。
【０２８５】
2)Cas9
本明細書において記載される方法および組成物において、様々な種のCas9分子を使用することができる。化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、およびS.サーモフィラスのCas9分子が本明細書の開示の多くの対象であるが、本明細書において列挙される他の種のCas9タンパク質のCas9分子、該Cas9タンパク質に由来するCas9分子、該Cas9タンパク質に基づいたCas9分子も同様に使用することができる。換言すれば、本明細書における説明の多くは、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、髄膜炎菌、およびS.サーモフィラスのCas9分子を使用するが、他の種由来のCas9分子は、それらに取って代わることができる。そのような種としては、以下が挙げられる：アシドボラクス・アベナエ（Acidovorax avenae）、アクチノバチルス・プルロニューモニア（Actinobacillus pleuropneumoniae）、アクチノバチルス・サクシノゲネス（Actinobacillus succinogenes）、アクチノバチルス・スイス（Actinobacillus suis）、アクチノミセス属種（Actinomyces sp.）、シクリフィルスデニトリフィカンス（Cycliphilusdenitrificans）、アミノモナス・パウシボランス（Aminomonas paucivorans）、バチルス・セレウス（Bacillus cereus）、バチルス・スミシイ（Bacillus smithii）、バチルス・チューリンゲンシス（Bacillus thuringiensis）、バクテロイデス属種（Bacteroides sp.）、ブラストピレルラ・マリナ（Blastopirellula marina）、ブラディリゾビウム属種（Bradyrhizobium sp.）、ブレビバチルス・ラテロスポラス（Brevibacillus laterosporus）、カンピロバクター・コリ（Campylobacter coli）、カンピロバクター・ジェジュニ（Campylobacter jejuni）、カンピロバクター・ラリ（Campylobacter lari）、カンジダツス・プニセイスピリルム（Candidatus puniceispirillum）、クロストリジウム・セルロリティカム（Clostridium cellulolyticum）、クロストリジウム・パーフリンジェンス（Clostridium perfringens）、コリネバクテリウム・アクコレンス（Corynebacterium accolens）、ジフテリア菌（Corynebacterium diphtheria）、コリネバクテリウム・マツルショッティ（Corynebacterium matruchotii）、ディノロセオバクター・シバエ（Dinoroseobacter shibae）、ユーバクテリウム・ドリクム（Eubacterium dolichum）、ガンマプロテオ細菌（Gammaproteobacterium）、グルコンアセトバクター・ジアゾトロフィクス（Gluconacetobacter diazotrophicus）、ヘモフィルス・パラインフルエンザ（Haemophilus parainfluenzae）、ヘモフィルス・スプトルム（Haemophilus sputorum）、ヘリコバクター・カナデンシス（Helicobacter canadensis）、ヘリコバクター・シネディ（Helicobacter cinaedi）、ヘリコバクター・ムステラエ（Helicobacter mustelae）、イリオバクター・ポリトロパス（Ilyobacter polytropus）、キンゲラ・キンゲ（Kingella kingae）、ラクトバチルス・クリスパタス（Lactobacillus crispatus）、リステリア・イバノビイ（Listeria ivanovii）、リステリア・モノサイトゲネス（Listeria monocytogenes）、リステリア科細菌（Listeriaceae bacterium）、メチロシスティス属種（Methylocystis sp.）、メチロサイナス・トリコスポリウム（Methylosinus trichosporium）、モビルンカス・ムリエリス（Mobiluncus mulieris）、ナイセリア・バシリフォルミス（Neisseria bacilliformis）、ナイセリア・シネレア（Neisseria cinerea）、ナイセリア・フラベッセンス（Neisseria flavescens）、ナイセリア・ラクタミカ（Neisseria lactamica）、髄膜炎菌（Neisseria meningitidis）、ナイセリア属種（Neisseria sp.）、ナイセリア・ワズ��ーシイ（Neisseria wadsworthii）、ニトロソモナス属種（Nitrosomonas sp.）、パルビバクラム・ラバメンチボランス（Parvibaculum lavamentivorans）、パスツレラ・マルトシダ（Pasteurella multocida）、ファスコラルクトバクテリウム・スクシナツテンス（Phascolarctobacterium succinatutens）、ラルストニア・シジジイ（Ralstonia syzygii）、ロドシュードモナス・パルストリス（Rhodopseudomonas palustris）、ロドブラム属種（Rhodovulum sp.）、シモンシエラ・ムエレリ（Simonsiella muelleri）、スフィンゴモナス属種（Sphingomonas sp.）、スポロラクトバチルス・ビネエ（Sporolactobacillus vineae）、黄色ブドウ球菌（Staphylococcus aureus）、スタフィロコッカス・ルグドゥネンシス（Staphylococcus lugdunensis）、ストレプトコッカス属種（Streptococcus sp.）、サブドリグラヌルム属種（Subdoligranulum sp.）、ティストレラ・モビリス（Tistrella mobilis）、トレポネーマ属種（Treponema sp.）、またはベルミネフォロバクター・エイセニエ（Verminephrobacter eiseniae）。Cas9分子の例としては、例えば、WO2015/161276、WO2017/193107、WO2017/093969、US2016/272999、およびUS2015/056705に記載されているものを挙げることができる。
【０２８６】
Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、この用語が本明細書において使用される場合、gRNA分子と相互作用することができ、gRNA分子と協調して、標的ドメインおよびPAM配列を含む部位に向かうかまたは局在化する、分子またはポリペプチドを指す。Cas9分子およびCas9ポリペプチドは、これらの用語が本明細書において使用される場合、天然に存在するCas9分子、および参照配列、例えば、最も類似した天然に存在するCas9分子と少なくとも1つのアミノ酸残基が異なる、改変された、変えられた、または修飾されたCas9分子またはCas9ポリペプチドを指す。
【０２８７】
2つの異なる天然に存在する細菌性Cas9分子（Jinek et al., Science, 343(6176):1247997, 2014）について、およびガイドRNA（例えば、crRNAとtracrRNAの合成的融合体）を有する化膿性連鎖球菌Cas9（Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014；およびAnders et al., Nature, 2014, doi: 10.1038/nature13579）について、結晶構造が決定されている。
【０２８８】
天然に存在するCas9分子は、2つのローブ：認識（REC）ローブおよびヌクレアーゼ（NUC）ローブを含み；これらのそれぞれは、本明細書において記載されるドメインをさらに含む。一次構造における重要なCas9ドメインの構成の例示的概略図は、WO2015/161276に、例えばその中の図8A〜8Bに記載されている。本開示全体にわたって使用される、ドメインの命名法および各ドメインに含まれるアミノ酸残基の番号付けは、Nishimasuらに記載されている通りである。アミノ酸残基の番号付けは、化膿性連鎖球菌のCas9に関してである。
【０２８９】
RECローブはアルギニンに富むブリッジヘリックス（BH）、REC1ドメイン、およびREC2ドメインを含む。RECローブは、他の公知のタンパク質と構造的類似性を有さず、これは、RECローブがCas9特異的機能ドメインであることを示す。BHドメインは、長いα-ヘリックスであり、アルギニンに富む領域であり、化膿性連鎖球菌のCas9の配列のアミノ酸60〜93を含む。REC1ドメインは、例えばgRNAまたはtracrRNAの反復：抗反復二本鎖の認識に重要であり、したがって、標的配列を認識することによるCas9活性に重要である。REC1ドメインは、化膿性連鎖球菌のCas9の配列のアミノ酸94〜179および308〜717に2つのREC1モチーフを含む。これら2つのREC1ドメインは、直線一次構造においてREC2ドメインによって分離されているが、三次構造においてアセンブルして、REC1ドメインを形成する。REC2ドメイン、またはその一部も、反復：抗反復二本鎖の認識において役割を果たし得る。REC2ドメインは、化膿性連鎖球菌のCas9の配列のアミノ酸180〜307を含む。
【０２９０】
NUCローブは、RuvCドメイン（本明細書において、RuvC様ドメインとも称される）、HNHドメイン（本明細書において、HNH様ドメインとも称される）、およびPAM相互作用（PI）ドメインを含む。RuvCドメインは、レトロウイルスのインテグラーゼスーパーファミリーのメンバーと構造的類似性を有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の非相補鎖を開裂させる。RuvCドメインは、化膿性連鎖球菌のCas9の配列のそれぞれアミノ酸1〜59、718〜769、および909〜1098にある3つの分割されたRuvCモチーフ（RuvC I、RuvC II、およびRuvC III。これらは、一般に、RuvC Iドメイン、またはN末端RuvCドメイン、RuvC IIドメイン、およびRuvC IIIドメインと称されることが多い）からアセンブルされる。REC1ドメインと同様に、3つのRuvCモチーフは、一次構造において他のドメインによって直線的に分離されるが、三次構造では、3つのRuvCモチーフがアセンブルし、RuvCドメインを形成する。HNHドメインは、HNHエンドヌクレアーゼと構造的類似性を有し、一本鎖、例えば、標的核酸分子の相補鎖を開裂させる。HNHドメインは、RuvC IIモチーフとRuvC IIIモチーフの間にあり、化膿性連鎖球菌のCas9の配列のアミノ酸775〜908を含む。PIドメインは、標的核酸分子のPAMと相互作用し、化膿性連鎖球菌のCas9の配列のアミノ酸1099〜1368を含む。
【０２９１】
A) RuvC様ドメインおよびHNH様ドメイン
いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、HNH様ドメインおよびRuvC様ドメインを含む。いくつかの態様では、開裂活性はRuvC様ドメインおよびHNH様ドメインに依存している。Cas9分子またはCas9ポリペプチド、例えば、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、以下のドメインの1つまたは複数を含むことができる：RuvC様ドメインおよびHNH様ドメイン。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドであり、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、RuvC様ドメイン、例えば、本明細書において記載されるRuvC様ドメイン、および／またはHNH様ドメイン、例えば、本明細書において記載されるHNH様ドメインを含む。
【０２９２】
B) RuvC様ドメイン
いくつかの態様では、RuvC様ドメインは、一本鎖、例えば、標的核酸分子の非相補鎖を開裂させる。Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、1つより多いRuvC様ドメイン（例えば、1つ、2つ、3つ、またはそれ以上のRuvC様ドメイン）を含むことができる。いくつかの態様では、RuvC様ドメインは、少なくとも5、6、7、8アミノ酸の長さであるが、20、19、18、17、16、または15アミノ酸以下の長さである。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、約10〜20アミノ酸、例えば、約15アミノ酸の長さのN末端RuvC様ドメインを含む。
【０２９３】
C) N末端RuvC様ドメイン
いくつかの天然に存在するCas9分子は1つより多いRuvC様ドメインを含み、開裂はN末端RuvC様ドメインに依存している。したがって、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、N末端RuvC様ドメインを含むことができる。
【０２９４】
態様では、N末端RuvC様ドメインは開裂能力がある。
【０２９５】
態様では、N末端RuvC様ドメインは開裂能力がない。
【０２９６】
いくつかの態様では、N末端RuvC様ドメインは、本明細書に、例えば、WO2015/161276に、例えばその中の図3A〜3Bまたは図7A〜7Bに開示されるN末端RuvC様ドメインの配列と1つ程度であるが、2つ、3つ、4つ、または5つ以下の残基が異なる。いくつかの態様では、WO2015/161276、例えばその中の図3A〜3Bまたは図7A〜7Bで特定される高度に保存された残基の1つ、2つ、または3つ全てが存在する。
【０２９７】
いくつかの態様では、N末端RuvC様ドメインは、本明細書に、例えば、WO2015/161276に、例えばその中の図4A〜4Bまたは図7A〜7Bに開示されるN末端RuvC様ドメインの配列と1つ程度であるが、2つ、3つ、4つ、または5つ以下の残基が異なる。いくつかの態様ではWO2015/161276で、例えばその中の図4A〜4Bまたは図7A〜7Bで特定される高度に保存された残基の、1つ、2つ、3つ、または4つ全てが存在する。
【０２９８】
D) さらなるRuvC様ドメイン
N末端RuvC様ドメインに加えて、Cas9分子またはCas9ポリペプチド、例えば、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、1つまたは複数のさらなるRuvC様ドメインを含むことができる。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、2つのさらなるRuvC様ドメインを含むことができる。好ましくは、さらなるRuvC様ドメインは、少なくとも5アミノ酸の長さかつ例えば15アミノ酸未満の長さ、例えば5〜10アミノ酸の長さ、例えば8アミノ酸の長さである。
【０２９９】
E) HNH様ドメイン
いくつかの態様では、HNH様ドメインは、一本鎖の相補的ドメイン、例えば、二本鎖核酸分子の相補鎖を開裂させる。いくつかの態様では、HNH様ドメインは、少なくとも15、20、25アミノ酸の長さであるが、40、35、または30アミノ酸以下の長さ、例えば20〜35アミノ酸の長さ、例えば25〜30アミノ酸の長さである。例示的HNH様ドメインは本明細書において記載される。
【０３００】
いくつかの態様では、HNH様ドメインは開裂能力がある。
【０３０１】
いくつかの態様では、HNH様ドメインは開裂能力がない。
【０３０２】
いくつかの態様では、HNH様ドメインは、本明細書に、例えば、WO2015/161276に、例えばその中の図5A〜5Cまたは図7A〜7Bに開示されるHNH様ドメインの配列と、1つ程度であるが、2つ、3つ、4つ、または5つ以下の残基が異なる。いくつかの態様では、WO2015/161276で、例えばその中の図5A〜5Cまたは図7A〜7Bで特定される高度に保存された残基の1つまたは両方が存在する。
【０３０３】
いくつかの態様では、HNH様ドメインは、本明細書に、例えば、WO2015/161276に、例えばその中の図6A〜6Bまたは図7A〜7Bに開示されるHNH様ドメインの配列と1つ程度であるが、2つ、3つ、4つ、または5つ以下の残基が異なる。いくつかの態様では、WO2015/161276で、例えばその中の図6A〜6Bまたは図7A〜7Bで特定される高度に保存された残基の1つ、2つ、3つ全てが存在する。
【０３０４】
F) ヌクレアーゼおよびヘリカーゼ活性
いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、標的核酸分子を開裂させることができる。典型的には、野生型Cas9分子は、標的核酸分子の両鎖を開裂させる。ヌクレアーゼ開裂（または他の特性）を変えるように、例えば、ニッカーゼである、または標的核酸を開裂させる能力を欠く、Cas9分子またはCas9ポリペプチドをもたらすように、Cas9分子およびCas9ポリペプチドを改変することができる。標的核酸分子を開裂させることができるCas9分子またはCas9ポリペプチドは、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドと本明細書において称される。
【０３０５】
いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは以下の活性の1つまたは複数を含む：ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の一本鎖、例えば、非相補鎖または相補鎖を開裂させる能力；二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両鎖を開裂させ、二本鎖切断を作出する能力。これは、いくつかの態様では、2つのニッカーゼ活性が存在することである；エンドヌクレアーゼ活性；エキソヌクレアーゼ活性；およびヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のヘリックス構造をほどく能力。
【０３０６】
いくつかの態様では、酵素的に活性なまたはeaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、両鎖を開裂させ、二本鎖切断をもたらす。いくつかの態様では、eaCas9分子は、片方の鎖、例えば、gRNAがハイブリダイズする鎖、またはgRNAがハイブリダイズする鎖に相補的な鎖のみを開裂させる。いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、HNH様ドメインと関連する開裂活性を含む。いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、N末端RuvC様ドメインと関連する開裂活性を含む。いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、HNH様ドメインと関連する開裂活性およびN末端RuvC様ドメインと関連する開裂活性を含む。いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、活性な、または開裂能力があるHNH様ドメイン、および不活性な、または開裂能力がないN末端RuvC様ドメインを含む。いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、不活性な、または開裂能力がないHNH様ドメインおよび活性な、または開裂能力があるN末端RuvC様ドメインを含む。
【０３０７】
いくつかのCas9分子またはCas9ポリペプチドは、gRNA分子と相互作用し、gRNA分子とともにコア標的ドメインに局在化する能力を有するが、標的核酸を開裂させることができないか、または効率的な速度で開裂ことができない。開裂活性がない、または実質的な開裂活性がないCas9分子は、eiCas9分子またはeiCas9ポリペプチドと本明細書において称される。例えば、eiCas9分子またはeiCas9ポリペプチドは、本明細書において記載されるアッセイによって測定した場合に、開裂活性を欠く可能性があり、または実質的により少ない、例えば、参照Cas9分子もしくはeiCas9ポリペプチドの20、10、5、1、もしくは0.1％未満の開裂活性を有する可能性がある。
【０３０８】
G) ターゲティングおよびPAM
Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、ガイドRNA（gRNA）分子と相互作用することができ、gRNA分子と協調して、標的ドメインおよびPAM配列を含む部位に局在化するポリペプチドである。
【０３０９】
いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドが標的核酸と相互作用し、標的核酸を開裂させる能力は、PAM配列依存的である。PAM配列は標的核酸中の配列である。いくつかの態様では、標的核酸の開裂は、PAM配列から上流で生じる。異なる細菌種由来のEaCas9分子が、異なる配列モチーフ（例えば、PAM配列）を認識することができる。いくつかの態様では、化膿性連鎖球菌のeaCas9分子は、配列モチーフNGG、NAG、NGAを認識し、その配列から1〜10、例えば3〜5塩基対上流で標的核酸配列の開裂を導く。例えば、Mali et al., Science 2013；339(6121): 823-826を参照されたい。いくつかの態様では、S.サーモフィラスのeaCas9分子は、配列モチーフNGGNGおよび／またはNNAGAAW（W=AもしくはT）を認識し、これらの配列から1〜10、例えば3〜5塩基対上流で標的核酸配列の開裂を導く。例えば、Horvath et al., Science 2010；327(5962):167-170、およびDeveau et al., J Bacteriol 2008；190(4): 1390-1400を参照されたい。いくつかの態様では、S.ミュータンス（S. mutans）のeaCas9分子は、配列モチーフNGGおよび／またはNAAR（R=AまたはG））を認識すし、この配列から上流のコア標的核酸配列の1〜10、例えば3〜5塩基対の開裂を導く。例えば、Deveau et al., J Bacteriol 2008；190(4): 1390-1400を参照されたい。いくつかの態様では、黄色ブドウ球菌のeaCas9分子は、配列モチーフNNGRR（R=AまたはG）を認識し、その配列から1〜10、例えば3〜5塩基対上流で標的核酸配列の開裂を導く。いくつかの態様では、黄色ブドウ球菌のeaCas9分子は、配列モチーフNNGRRT（R=AまたはG）を認識し、その配列から1〜10、例えば3〜5塩基対上流で標的核酸配列の開裂を導く。いくつかの態様では、黄色ブドウ球菌のeaCas9分子は、配列モチーフNNGRRV（R=AまたはG）を認識し、その配列から1〜10、例えば3〜5塩基対上流で標的核酸配列の開裂を導く。いくつかの態様では、髄膜炎菌のeaCas9分子は、配列モチーフNNNNGATTまたはNNNGCTT（R=AまたはG、V=A、G、またはC）を認識し、その配列から1〜10、例えば3〜5塩基対上流で標的核酸配列の開裂を導く。例えば、Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6を参照されたい。Cas9分子がPAM配列を認識する能力は、例えば、Jinek et al., Science 2012 337:816に記載されている形質転換アッセイを使用して、決定することができる。前述の態様では、Nは任意のヌクレオチド残基、例えば、A、G、C、またはTのいずれかでもよい。
【０３１０】
本明細書において論じられるように、Cas9分子のPAM特異性を変えるために、Cas9分子を改変することができる。
【０３１１】
天然に存在する例示的Cas9分子は、Chylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737に記載されている。そのようなCas9分子としては、クラスター1〜78の細菌ファミリーのCas9分子が挙げられる。
【０３１２】
天然に存在する例示的Cas9分子としては、クラスター1細菌ファミリーのCas9分子が挙げられる。例としては、以下のもののCas9分子が挙がられる：化膿性連鎖球菌（例えば、株SF370、MGAS10270、MGAS10750、MGAS2096、MGAS315、MGAS5005、MGAS6180、MGAS9429、NZ131およびSSI-1）、S.サーモフィラス（例えば、株LMD-9）、S.シュードポルシヌス（S. pseudoporcinus）（例えば、株SPIN 20026）、S.ミュータンス（例えば、株UA159、NN2025）、S.マカカエ（S. macacae）（例えば、株NCTC11558）、S.ガロリチカス（S. gallolyticus）（例えば、株UCN34、ATCC BAA-2069）、S.エクイヌス（S. equines）（例えば、株ATCC 9812、MGCS 124）、S.ディスガラクチアエ（S. dysdalactiae）（例えば、株GGS 124）、S.ボビス（S. bovis）（例えば、株ATCC 700338）、S.アンギノーサス（S. anginosus）（例えば、株F0211）、S.アガラクチア（S. agalactiae）（例えば、株NEM316, A909）、リステリア・モノサイトゲネス（例えば、株F6854）、リステリア・イノキュア（Listeria innocua）（L.イノキュア（L. innocua）、例えば、株Clip11262）、エンテロコッカス・イタリクス（Enterococcus italicus）（例えば、株DSM 15952）、またはエンテロコッカス・フェシウム（Enterococcus faecium）（例えば、株1,231,408）。別の例示的Cas9分子は、髄膜炎菌のCas9分子である（Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6）。
【０３１３】
いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチド、例えば、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、本明細書において記載される任意のCas9分子配列、もしくは天然に存在するCas9分子配列、例えば、本明細書において列挙される（例えば、SEQ ID NO:157〜162）、もしくはChylinski et al., RNA Biology 2013 10:5, 727-737；Hou et al., PNAS Early Edition 2013, 1-6に記載されている種由来のCas9分子と、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、もしくは99％の相同性を有する；該Cas9分子配列と比較した場合に、2、5、10、15、20、30、もしくは40％以下のアミノ酸残基が異なる；少なくとも1、2、5、10、もしくは20アミノ酸であるが、100、80、70、60、50、40、もしくは30以下のアミノ酸が該Cas9分子配列と異なる；または該Cas9分子配列と同一である、アミノ酸配列を含む。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは以下の活性の1つまたは複数を含む：ニッカーゼ活性；二本鎖開裂活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／もしくはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；またはgRNA分子とともに標的核酸に向かう能力。
【０３１４】
いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、WO2015/161276の、例えばその中の図2A〜2Gにおけるコンセンサス配列のアミノ酸配列を含み、「＊」は、化膿性連鎖球菌、S.サーモフィラス、S.ミュータンス、およびL.イノキュアのCas9分子のアミノ酸配列中の対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し、「-」は、任意のアミノ酸を示す。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、SEQ ID NO:157〜162のコンセンサス配列、またはWO2015/161276に、例えばその中の図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列の配列と、少なくとも1個であるが、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個以下のアミノ酸残基が異なる。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、SEQ ID NO:162の、またはWO2015/161276に、例えばその中の図7A〜7Bに記載されているアミノ酸配列を含み、「＊」は化膿性連鎖球菌または髄膜炎菌のCas9分子のアミノ酸配列中の対応する位置に見られる任意のアミノ酸を示し、「-」は任意のアミノ酸を示し、「-」は任意のアミノ酸または存在しないことを示す。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、SEQ ID NO:161または162の、またはWO2015/161276に、例えばその中の図7A〜7Bに記載されている配列と、少なくとも1個であるが、2、3、4、5、6、7、8、9、または10個以下のアミノ酸残基が異なる。
【０３１５】
いくつかのCas9分子の配列の比較によって、ある特定の領域が保存されていることが示される。これらは、領域1（残基1〜180、または領域1’の場合は残基120〜180）；領域2（残基360〜480）；領域3（残基660〜720）；領域4（残基817〜900）；および領域5（残基900〜960）として特定される。
【０３１６】
いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、生物学的に活性な分子、例えば、本明細書において記載される少なくとも1つの活性を有するCas9分子を提供するのに十分なさらなるCas9分子配列とともに、領域1〜5を含む。いくつかの態様では、領域1〜6のそれぞれは、独立に、本明細書において記載される、例えば、SEQ ID NO:157〜162に記載されるCas9分子もしくはCas9ポリペプチドの対応する残基、またはWO2015/161276、例えば、その中の図2A〜2Gまたは図7A〜7Bに開示される配列と50％、60％、70％、または80％の相同性を有する。
【０３１７】
H) 改変されたまたは変えられたCas9分子およびCas9ポリペプチド
本明細書において記載されるCas9分子およびCas9ポリペプチド、例えば、天然に存在するCas9分子は、ニッカーゼ活性、ヌクレアーゼ活性（例えば、エンドヌクレアーゼおよび／またはエキソヌクレアーゼ活性）；ヘリカーゼ活性；gRNA分子と機能的に結合する能力；ならびに核酸上の部位を標的にする（または該部位に局在化する）能力（例えば、PAM認識および特異性）を含めたいくつかの特性のうちのいずれかを持つことができる。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、これらの特性の全てまたはサブセットを含むことができる。典型的な態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、gRNA分子と相互作用し、gRNA分子と協調して、核酸中のある部位に局在化する能力を有する。他の活性、例えば、PAM特異性、開裂活性、またはヘリカーゼ活性は、Cas9分子およびCas9ポリペプチドにおいて、より広く変動し得る。
【０３１８】
Cas9分子は、改変されたCas9分子および改変されたCas9ポリペプチドを含む（この文脈で使用される「改変された」は、Cas9分子またはCas9ポリペプチドが参照配列と異なることを単に意味し、プロセスまたは起源に制限がないことを意味する）。改変されたCas9分子またはCas9ポリペプチドは、変えられた酵素特性、例えば、変えられたヌクレアーゼ活性（天然に存在するCas9分子、もしくは他の参照Cas9分子と比較した場合）または変えられたヘリカーゼ活性を含むことができる。本明細書において記載するように、改変されたCas9分子またはCas9ポリペプチドは、（二本鎖ヌクレアーゼ活性とは対照的に）ニッカーゼ活性を有し得る。いくつかの態様では、改変されたCas9分子またはCas9ポリペプチドは、そのサイズを変える変更、例えば1つもしくは複数の、または任意のCas9活性に対して有意な影響がなく、そのサイズを低減させるアミノ酸配列の欠失などを有し得る。いくつかの態様では、改変されたCas9分子またはCas9ポリペプチドは、PAM認識に影響を及ぼす変更を含むことができる。例えば、改変されたCas9分子は、内在性野生型PIドメインによって認識されるもの以外のPAM配列を認識するように変えることができる。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、天然に存在するCas9分子と配列が異なり得るが、1つまたは複数のCas9活性に有意な変更を有さない。
【０３１９】
望ましい特性を有するCas9分子またはCas9ポリペプチドは、いくつかの方法で、例えば、望ましい特性を有する変えられたCas9分子またはCas9ポリペプチドをもたらすように、親、例えば天然に存在するCas9分子またはCas9ポリペプチドを変えることによって、作製することができる。例えば、親Cas9分子、例えば、天然に存在するか、または改変されたCas9分子に対して1つまたは複数の突然変異または差異を導入することができる。そのような突然変異および差異は、置換（例えば、保存的置換もしくは非必須アミノ酸の置換）；挿入；または欠失を含む。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、参照、例えば親Cas9分子に対して、1つまたは複数の突然変異または差異、例えば、少なくとも1、2、3、4、5、10、15、20、30、40、または50個の突然変異であるが、200、100、または80個未満の突然変異を含むことができる。
【０３２０】
いくつかの態様では、1つの突然変異または複数の突然変異は、Cas9活性、例えば、本明細書において記載されるCas9活性に対して実質的な影響を有さない。いくつかの態様では、1つの突然変異または複数の突然変異は、Cas9活性、例えば、本明細書において記載されるCas9活性に対して実質的な影響を有する。
【０３２１】
I) 非開裂型および改変型開裂Cas9分子およびCas9ポリペプチド
いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、天然に存在するCas9分子と異なる、例えば、最も近い相同性を有する天然に存在するCas9分子と異なる開裂特性を含む。例えば、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、天然に存在するCas9分子、例えば、化膿性連鎖球菌のCas9分子と以下のように異なり得る：例えば、天然に存在するCas9分子（例えば、化膿性連鎖球菌のCas9分子）と比較して、二本鎖核酸の開裂をモジュレートする、例えば、増加させるか、もしくは減少させるその能力（エンドヌクレアーゼおよび／もしくはエキソヌクレアーゼ活性）；例えば、天然に存在するCas9分子（例えば、化膿性連鎖球菌のCas9分子）と比較して、核酸の一本鎖、例えば、核酸分子の非相補鎖もしくは核酸分子の相補鎖の開裂をモジュレートする、例えば、増加させるか、もしくは減少させるその能力（ニッカーゼ活性）；または核酸分子、例えば、二本鎖もしくは一本鎖核酸分子を開裂させる能力が、排除され得る。
【０３２２】
J) 改変型開裂eaCas9分子およびeaCas9ポリペプチド
いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは以下の活性の1つまたは複数を含む：N末端RuvC様ドメインと関連する開裂活性；HNH様ドメインと関連する開裂活性；HNH様ドメインと関連する開裂活性およびN末端RuvC様ドメインと関連する開裂活性。
【０３２３】
いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、活性な、または開裂能力があるHNH様ドメイン、および不活性な、または開裂能力がないN末端RuvC様ドメインを含む。例示的な不活性な、または開裂能力がないN末端RuvC様ドメインは、N末端RuvC様ドメイン中にアスパラギン酸の突然変異を有する可能性があり、例えば、SEQ ID NO:157〜162のコンセンサス配列もしくはWO2015/161276に、例えばその中の図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列の位置9のアスパラギン酸、またはSEQ ID NO:162の位置10のアスパラギン酸は、例えば、アラニンで置換されている可能性がある。いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、N末端RuvC様ドメインが野生型と異なり、例えば、本明細書において記載されるアッセイによって測定した場合に、標的核酸を開裂させないか、または有意に低い効率、例えば、参照Cas9分子の開裂活性の20、10、5、1、もしくは.1％未満で開裂させる。参照Cas9分子は、天然に存在する非改変型Cas9分子、例えば、化膿性連鎖球菌またはS.サーモフィラスのCas9分子などの天然に存在するCas9分子でもよい。いくつかの態様では、参照Cas9分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然に存在するCas9分子である。
【０３２４】
いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、不活性な、または開裂能力がないHNHドメイン、および活性な、または開裂能力があるN末端RuvC様ドメインを含む。例示的な不活性な、または開裂能力がないHNH様ドメインは、以下の1つまたは複数の突然変異を有し得る：HNH様ドメイン中のヒスチジン、例えば、SEQ ID NO:157〜162のコンセンサス配列、またはWO2015/161276に、例えばその中の図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列の位置856に示されるヒスチジンは、例えば、アラニンで置換されている可能性があり；HNH様ドメイン中の1つまたは複数のアスパラギン、例えば、SEQ ID NO:157〜162のコンセンサス配列もしくはWO2015/161276に、例えばその中の図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列の位置870、および／またはSEQ ID NO:157〜162のコンセンサス配列もしくはWO2015/161276に、例えばその中の図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列の位置879に示されるアスパラギンは、例えば、アラニンで置換されている可能性がある。いくつかの態様では、eaCas9は、HNH様ドメインが野生型と異なり、例えば、本明細書において記載されるアッセイによって測定した場合に、標的核酸を開裂させないか、または有意に低い効率、例えば、参照Cas9分子の20、10、5、1、もしくは0.1％未満の開裂活性で開裂させる。参照Cas9分子は、天然に存在する非改変型Cas9分子、例えば、化膿性連鎖球菌またはS.サーモフィラスのCas9分子などの天然に存在するCas9分でもよい。いくつかの態様では、参照Cas9分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然に存在するCas9分子である。
【０３２５】
いくつかの態様では、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドは、不活性な、または開裂能力がないHNHドメイン、および活性な、または開裂能力があるN末端RuvC様ドメインを含む。例示的な不活性な、または開裂能力がないHNH様ドメインは、以下の1つまたは複数の突然変異を有し得る：HNH様ドメイン中のヒスチジン、例えば、SEQ ID NO:157〜162のコンセンサス配列、またはWO2015/161276に、例えばその中の図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列の位置856に示されるヒスチジンは、例えば、アラニンで置換されている可能性があり；HNH様ドメイン中の1つまたは複数のアスパラギン、例えば、SEQ ID NO:157〜162のコンセンサス配列もしくはWO2015/161276に、例えばその中の図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列の位置870、および／またはSEQ ID NO:157〜162のコンセンサス配列もしくはWO2015/161276に、例えばその中の図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列の位置879に示されるアスパラギンは、例えば、アラニンで置換されている可能性がある。いくつかの態様では、eaCas9は、HNH様ドメインが野生型と異なり、例えば、本明細書において記載されるアッセイによって測定した場合に、標的核酸を開裂させないか、または有意に低い効率、例えば、参照Cas9分子の20、10、5、1、もしくは0.1％未満の開裂活性で開裂させる。参照Cas9分子は、天然に存在する非改変型Cas9分子、例えば、化膿性連鎖球菌またはS.サーモフィラスのCas9分子などの天然に存在するCas9分子でもよい。いくつかの態様では、参照Cas9分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然に存在するCas9分子である。
【０３２６】
K) 標的核酸の片鎖または両鎖を開裂させる能力の変更
いくつかの態様では、例示的Cas9活性は、PAM特異性、開裂活性、およびヘリカーゼ活性の1つまたは複数を含む。突然変異は、例えば以下の中に存在し得る:1つまたは複数のRuvC様ドメイン、例えば、N末端RuvC様ドメイン；HNH様ドメイン；RuvC様ドメインとHNH様ドメインの外側の領域。いくつかの態様では、突然変はRuvC様ドメイン、例えば、N末端RuvC様の中に存在する。いくつかの態様では、突然変異はHNH様ドメインの中に存在する。いくつかの態様では、突然変異は、RuvC様ドメイン、例えば、N末端RuvC様ドメインとHNH様ドメインの両方の中に存在する。
【０３２７】
化膿性連鎖球菌の配列に関して、RuvCドメインまたはHNHドメインの中に作製することができる例示的突然変異としては、D10A、E762A、H840A、N854A、N863A、および／またはD986Aが挙げられる。
【０３２８】
いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、参照Cas9分子と比較して、RuvCドメインおよび／またはHNHドメインにおいて1つまたは複数の差異を含むeiCas9分子またはeiCas9ポリペプチドであり、eiCas9分子またはeiCas9ポリペプチドは、核酸を開裂させないか、または野生型が行うよりも有意に低い効率で開裂させ、例として、例えば本明細書において記載されるような開裂アッセイにおいて野生型と比較した場合に、本明細書において記載されるアッセイによって測定した際に、参照Cas9分子の50、25、10、または1％未満で切断する。
【０３２９】
特定の配列、例えば置換が、1つまたは複数の活性、例えば、ターゲティング活性、開裂活性などに影響を及ぼす可能性があるかどうかは、例えば、突然変異が保存的であるかどうかを評価することによって、評価または予測することができる。いくつかの態様では、「非必須」アミノ酸残基は、Cas9分子と関連して使用される場合、Cas9活性（例えば、開裂活性）を消失させることなく、またはより好ましくは、実質的に変えることなく、Cas9分子、例えば天然に存在するCas9分子、例えばeaCas9分子の野生型配列から変えることができる残基であるが、「必須」アミノ酸残基の変化は、活性（例えば、開裂活性）の実質的な喪失をもたらす。
【０３３０】
いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、天然に存在するCas9分子と異なる、例えば、最も近い相同性を有する天然に存在するCas9分子と異なる開裂特性を含む。例えば、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、天然に存在するCas9分子、例えば、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、またはC.ジェジュニのCas9分子と以下のように異なり得る：例えば、天然に存在するCas9分子（例えば、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、もしくはC.ジェジュニのCas9分子）と比較して、二本鎖切断の開裂をモジュレートする、例えば、増加させるか、もしくは減少させるその能力（エンドヌクレアーゼおよび／もしくはエキソヌクレアーゼ活性）；例えば、天然に存在するCas9分子（例えば、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、もしくはC.ジェジュニのCas9分子）と比較して、核酸の一本鎖、例えば、核酸分子の非相補鎖もしくは核酸分子の相補鎖の開裂をモジュレートする、例えば、増加させるか、もしくは減少させるその能力（ニッカーゼ活性）；または核酸分子、例えば、二本鎖もしくは一本鎖核酸分子を開裂させる能力が、排除され得る。
【０３３１】
いくつかの態様では、変えられたCas9分子またはCas9ポリペプチドは、以下の活性の1つまたは複数を含むeaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドである：RuvCドメインと関連する開裂活性；HNHドメインと関連する開裂活性；HNHドメインと関連する開裂活性およびRuvCドメインと関連する開裂活性。
【０３３２】
いくつかの態様では、変えられたCas9分子またはCas9ポリペプチドは、例えば、本明細書において記載されるアッセイによって測定した場合に、核酸分子（二本鎖核酸分子もしくは一本鎖核酸分子のいずれか）を開裂させないか、または有意に低い効率、例えば、参照Cas9分子の20、10、5、1、または0.1％未満の開裂活性で核酸分子を開裂させる、eiCas9分子またはeaCas9ポリペプチドである。参照Cas9分子は、天然に存在する非改変型Cas9分子、例えば、化膿性連鎖球菌、S.サーモフィラス、黄色ブドウ球菌、C.ジェジュニまたは髄膜炎菌のCas9分子などの天然に存在するCas9分子でもよい。いくつかの態様では、参照Cas9分子は、最も近い配列同一性または相同性を有する天然に存在するCas9分子である。いくつかの態様では、eiCas9分子またはeiCas9ポリペプチドは、RuvCドメインと関連する実質的な開裂活性およびHNHドメインと関連する開裂活性を欠く。
【０３３３】
いくつかの態様では、変えられたCas9分子またはCas9ポリペプチドは、WO2015/161276に、例えばその中の図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列中に示される化膿性連鎖球菌の固定されたアミノ酸残基を含む、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドであり、SEQ ID NO:162の1つまたは複数の残基（例えば、2、3、5、10、15、20、30、50、70、80、90、100、200アミノ酸残基）またはWO2015/161276に、例えばその中の図2A〜2Gに開示されるコンセンサス配列中に「-」によって表される残基において化膿性連鎖球菌のアミノ酸配列とは異なる（例えば、置換を有する）、1つまたは複数のアミノ酸を有する。
【０３３４】
いくつかの態様では、変えられたCas9分子またはCas9ポリペプチド、例えば、eaCas9分子は、例えば、2つ以上の異なるCas9分子またはCas9ポリペプチドの、例えば、異なる種の天然に存在する2つ以上のCas9分子の融合体でもよい。例えば、ある種の天然に存在するCas9分子の断片を第2の種のCas9分子の断片と融合させることができる。一例として、N末端RuvC様ドメインを含む、化膿性連鎖球菌のCas9分子の断片を、HNH様ドメインを含む、化膿性連鎖球菌以外の種（例えば、S.サーモフィラス）のCas9分子の断片と融合させることができる。
【０３３５】
L) PAM認識が変えられたまたはPAM認識がないCas9分子
天然に存在するCas9分子は、特定のPAM配列、例えば、化膿性連鎖球菌、S.サーモフィラス、S.ミュータンス、黄色ブドウ球菌、および髄膜炎菌などについて本明細書において記載されるPAM認識配列を認識することができる。
【０３３６】
いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、天然に存在するCas9分子と同じPAM特異性を有する。他の態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、天然に存在するCas9分子と関係がないPAM特異性、またはそれが最も近い配列相同性を有する天然に存在するCas9分子と関係がないPAM特異性を有する。例えば、オフターゲット部位を減少させるおよび／もしくは特異性を向上させる；またはPAM認識の要件を排除するために、例えば、PAM認識を変えるように、例えば、Cas9分子またはCas9ポリペプチドが認識するPAM配列を変えるように、天然に存在するCas9分子を変えることができる。いくつかの態様では、例えば、オフターゲット部位を減少させるおよび特異性を増大させるために、例えば、PAM認識配列の長さの延ばすように、および／またはCas9特異性を高レベルの同一性に改善するように、Cas9分子を変えることができる。いくつかの態様では、PAM認識配列の長さは、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、または15アミノ酸の長さである。
【０３３７】
異なるPAM配列を認識するおよび／またはオフターゲット活性が低減したCas9分子またはCas9ポリペプチドは、定向進化を使用して生成することができる。Cas9分子の定向進化に使用することができる例示的方法およびシステムは、例えば、Esvelt et al. Nature 2011, 472(7344): 499-503に記載されている。候補Cas9分子は、例えば本明細書において記載される方法によって、評価することができる。
【０３３８】
PAM認識を媒介するPIドメインの変更は、本明細書において論じられる。
【０３３９】
M) PIドメインが変えられた合成のCas9分子およびCas9ポリペプチド
現在のゲノム編集方法は、利用されるCas9分子によって認識されるPAM配列によってターゲティングされ得る標的配列の多様性が制限される。合成Cas9分子（もしくはSyn-Cas9分子）または合成Cas9ポリペプチド（もしくはSyn-Cas9ポリペプチド）は、この用語が本明細書において使用される場合、1つの細菌種由来のCas9コアドメイン、および機能的な変えられたPIドメイン、すなわち、例えば異なる細菌種由来の、Cas9コアドメインと天然に結合しているもの以外のPIドメインを含むCas9分子またはCas9ポリペプチドを指す。
【０３４０】
いくつかの態様では、変えられたPIドメインは、Cas9コアドメインが由来する天然に存在するCas9によって認識されるPAM配列と異なるPAM配列を認識する。いくつかの態様では、変えられたPIドメインは、Cas9コアドメインが由来する天然に存在するCas9によって認識される同じPAM配列を認識するが、異なる親和性または特異性を有する。Syn-Cas9分子またはSyn-Cas9ポリペプチドは、それぞれ、Syn-eaCas9分子もしくはSyn-eaCas9ポリペプチド、またはSyn-eiCas9分子、Syn-eiCas9ポリペプチドでもよい。
【０３４１】
例示的Syn-Cas9分子またはSyn-Cas9ポリペプチドは、a)Cas9コアドメイン、例えば、Cas9コアドメイン、例えば、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、またはC.ジェジュニのCas9コアドメイン；およびb)種XのCas9配列由来の変えられたPIドメインを含む。
【０３４２】
いくつかの態様では、変えられたPIドメインのRKRモチーフ（PAM結合モチーフ）は、Cas9コアドメインと結合しているネイティブまたは内在性PIドメインのRKRモチーフの配列と比較した場合に、1、2、または3アミノ酸残基における差異；第1、第2または第3の位置におけるアミノ酸配列の差異；第1および第2の位置、第1および第3の位置、または第2および第3の位置におけるアミノ酸配列の差異を含む。
【０３４３】
いくつかの態様では、Syn-Cas9分子またはSyn-Cas9ポリペプチドはまた、サイズ最適化されてもよく、例えば、Syn-Cas9分子またはSyn-Cas9ポリペプチドは、1つまたは複数の欠失、および任意で欠失に隣接するアミノ酸残基の間に配置される1つまたは複数のリンカーを含む。いくつかの態様では、Syn-Cas9分子またはSyn-Cas9ポリペプチドはRECの欠失を含む。
【０３４４】
N) サイズ最適化されたCas9分子およびCas9ポリペプチド
本明細書において記載される改変されたCas9分子および改変されたCas9ポリペプチドは、分子のサイズを低減させるが、望ましいCas9特性、例えば、本質的にネイティブなコンフォメーション、Cas9ヌクレアーゼ活性、および／または標的核酸分子の認識を依然として保持する欠失を含むCas9分子またはCas9ポリペプチドを含む。1つまたは複数の欠失および任意で1つまたは複数のリンカーを含むCas9分子またはCas9ポリペプチドが、本明細書において提供され、リンカーは、欠失に隣接するアミノ酸残基の間に配置される。参照Cas9分子において適切な欠失を特定するための方法、欠失およびリンカーを有するCas9分子を生成するための方法、およびそのようなCas9分子を使用するための方法は、本文書を精査する際に明らかになるであろう。
【０３４５】
欠失を有するCas9分子、例えば、黄色ブドウ球菌、化膿性連鎖球菌、またはC.ジェジュニの欠失を有するCas9分子は、対応する天然に存在するCas9分子よりも小さく、例えば、アミノ酸の数が減少している。より小さなサイズのCas9分子は、送達方法の柔軟性を高め、それによって、ゲノム編集の有用性を高める。Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、本明細書において記載される生じたCas9分子またはCas9ポリペプチドの活性に実質的に影響を及ぼさないか、または該活性を低下させない、1つまたは複数の欠失を含むことができる。本明細書において記載される欠失を含むCas9分子またはCas9ポリペプチドに保持される活性としては、以下の1つまたは複数が挙げられる:ニッカーゼ活性、すなわち、核酸分子の一本鎖、例えば、非相補鎖または相補鎖を開裂させる能力；二本鎖ヌクレアーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸の両鎖を開裂させ、二本鎖切断を作出する能力。これは、いくつかの態様では、2つのニッカーゼ活性が存在することである；エンドヌクレアーゼ活性；エキソヌクレアーゼ活性；ヘリカーゼ活性、すなわち、二本鎖核酸のヘリックス構造をほどく能力；および核酸分子、例えば、標的核酸またはgRNAの認識活性。
【０３４６】
本明細書において記載されるCas9分子またはCas9ポリペプチドの活性は、本明細書において記載される活性アッセイを使用して評価することができるか、または公知である。
【０３４７】
O) 欠失に適した領域の特定
欠失に適したCas9分子の領域は、様々な方法によって特定することができる。様々な細菌種由来の天然に存在するオルソロガスなCas9分子を化膿性連鎖球菌のCas9の結晶構造（Nishimasu et al., Cell, 156:935-949, 2014）上にモデル化して、タンパク質の三次元コンフォメーションに関して、選択されたCas9オルソログにわたって保存のレベルを調べることができる。Cas9活性に関与する領域から離れて空間的に位置する、あまり保存されていない、または保存されていない領域、例えば、標的核酸分子および／またはgRNAとの境界面は、領域またはドメインが、実質的にCas9活性に影響を及ぼさないか、またはCas9活性を低下させない欠失の候補であることを示す。
【０３４８】
P) REC最適化されたCas9分子およびCas9ポリペプチド
REC最適化Cas9分子またはREC最適化Cas9ポリペプチドは、この用語が本明細書において使用される場合、REC2ドメインとRE1CTドメインの一方または両方の欠失（まとめて、RECの欠失）を含むCas9分子またはCas9ポリペプチドを指し、欠失は、同種ドメインのアミノ酸残基の少なくとも10％を含む。REC最適化Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、eaCas9分子もしくはeaCas9ポリペプチド、またはeiCas9分子もしくはeiCas9ポリペプチドでもよい。例示的REC最適化Cas9分子またはREC最適化Cas9ポリペプチドは、(a)(i)REC2の欠失；(ii)REC1CTの欠失；または(iii)REC1SUBの欠失より選択される欠失を含む。
【０３４９】
任意で、リンカーは、欠失に隣接するアミノ酸残基の間に配置される。いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、欠失を1つのみ、または欠失を2つのみ含む。Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、REC2の欠失およびREC1CTの欠失を含むことができる。Cas9分子またはCas9ポリペプチドは、REC2の欠失およびREC1SUBの欠失を含むことができる。
【０３５０】
一般に、欠失は、同種ドメインのアミノ酸の少なくとも10％を含むと考えられ、例えば、REC2の欠失は、REC2ドメインのアミノ酸の少なくとも10％を含むと考えられる。欠失は、その同種ドメインの少なくとも10、20、30、40、50、60、70、80、または90％のアミノ酸残基；その同種ドメインの全てのアミノ酸残基；その同種ドメインの外側のアミノ酸残基；その同種ドメインの外側の複数のアミノ酸残基；その同種ドメインに対して直ぐN末端にあるアミノ酸残基；その同種ドメインに対して直ぐC末端にあるアミノ酸残基；その同種対して直ぐN末端にあるアミノ酸残基およびその同種ドメイン直ぐC末端にあるアミノ酸残基；その同種ドメインに対してN末端にある、複数の、例えば5、10、15、または20個までのアミノ酸残基；その同種ドメインに対してC末端にある、複数の、例えば5、10、15、または20個までのアミノ酸残基；その同種ドメインに対してN末端にある、複数の例えば、5、10、15、または20個までのアミノ酸残基、およびその同種ドメインに対してC末端にある、複数の例えば、5、10、15、または20個までのアミノ酸残基を含むことができる。
【０３５１】
いくつかの態様では、欠失は、その同種ドメイン；その同種ドメインのN末端アミノ酸残基；その同種ドメインのC末端アミノ酸残基を越えて延びない。
【０３５２】
REC最適化Cas9分子またはREC最適化Cas9ポリペプチドは、欠失に隣接するアミノ酸残基の間に配置されたリンカーを含むことができる。REC最適化Cas9分子中のRECの欠失に隣接するアミノ酸残基の間で使用するのに適したリンカーは、本明細書において記載される。
【０３５３】
いくつかの態様では、REC最適化Cas9分子またはREC最適化Cas9ポリペプチドは、任意のREC欠失および関連したリンカーを除いて、天然に存在するCas9、例えば、黄色ブドウ球菌のCas9分子、化膿性連鎖球菌のCas9分子、またはC.ジェジュニのCas9分子のアミノ酸配列と少なくとも50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、99、または100％の相同性を有するアミノ酸配列を含む。
【０３５４】
いくつかの態様では、REC最適化Cas9分子またはREC最適化Cas9ポリペプチドは、任意のRECの欠失および関連したリンカーを除いて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、または25個以下のアミノ酸残基が天然に存在するCas9、例えば、黄色ブドウ球菌のCas9分子、化膿性連鎖球菌のCas9分子、またはC.ジェジュニのCas9分子のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。
【０３５５】
いくつかの態様では、REC最適化Cas9分子またはREC最適化Cas9ポリペプチドは、任意のRECの欠失および関連したリンカーを除いて、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、または25％以下のアミノ酸残基が天然に存在するCas9、例えば、黄色ブドウ球菌のCas9分子、化膿性連鎖球菌のCas9分子、またはC.ジェジュニのCas9分子のアミノ酸配列と異なるアミノ酸配列を含む。
【０３５６】
配列比較については、典型的には、1つの配列が、試験配列が比較される参照配列として働く。配列比較アルゴリズムを使用する場合は、試験配列および参照配列をコンピュータに入力し、必要であればサブシーケンス座標を指定し、配列アルゴリズムのプログラムパラメーターを指定する。デフォルトのプログラムパラメーターを使用することができ、または代替のパラメーターを指定することができる。次いで、配列比較アルゴリズムによって、プログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対する試験配列の配列同一性パーセントを計算する。比較のための配列のアライメント方法は周知である。比較のための配列の最適なアライメントは、例えば、Smith and Waterman, (1970) Adv. Appl. Math. 2:482cの局地的相同性アルゴリズムによって、Needleman and Wunsch, (1970) J. Mol. Biol. 48:443の相同性アライメントアルゴリズムによって、Pearson and Lipman, (1988) Proc. Nat’l. Acad. Sci. USA 85:2444の類似性検索法によって、これらのアルゴリズムのコンピュータによる実装（Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WIのGAP、BESTFIT、FASTA、およびTFASTA）によって、または手動アライメントおよび目視検査によって行うことができる（例えば、Brent et al., (2003) Current Protocols in Molecular Biologyを参照されたい）。
【０３５７】
配列同一性パーセントおよび配列類似性パーセントを決定するのに適したアルゴリズムの2つの例は、BLASTおよびBLAST 2.0アルゴリズムであり、これらは、Altschul et al., (1977) Nuc. Acids Res. 25:3389-3402；およびAltschul et al., (1990) J. Mol. Biol. 215:403-410にそれぞれ記載されている。BLAST解析を行ためのソフトウェアは、国立バイオテクノロジー情報センターを通して公的に利用可能である。
【０３５８】
2つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、ALIGNプログラム（バージョン2.0）に組み込まれているE. Meyers and W. Miller, (1988) Comput. Appl. Biosci. 4:11-17）のアルゴリズムを使用して、PAM120重み付け残基表（PAM120 weight residue table）、12のギャップ長ペナルティ、および4のギャップペナルティを使用して、決定することもできる。さらに、2つのアミノ酸配列の間の同一性パーセントは、GCGソフトウェアパッケージ（www.gcg.comで利用可能）のGAPプログラムに組み込まれているNeedleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:444-453）のアルゴリズムを使用して、Blossom 62行列またはPAM250行列のいずれか、ならびに16、14、12、10、8、6、または4のギャップの重み（gap weight）、および1、2、3、4、5、または6の長さの重み（length weight）を使用して、決定することができる。
【０３５９】
例示的なREC欠失についての配列情報は、例えば、国際PCT特許出願公開第WO2015/161276号、第WO2017/193107号、および第WO2017/093969号に記載されている83個の天然に存在するCas9オルソログについて提供されている。
【０３６０】
Q)Cas9分子をコードする核酸
本明細書において提供される態様のいずれかに関して、Cas9分子またはCas9ポリペプチド、例えば、eaCas9分子またはeaCas9ポリペプチドをコードする核酸を使用することができる。
【０３６１】
Cas9分子またはCas9ポリペプチドをコードする例示的核酸は、Cong et al., Science 2013, 399(6121):819-823；Wang et al., Cell 2013, 153(4):910-918；Mali et al., Science 2013, 399(6121):823-826；Jinek et al., Science 2012, 337(6096):816-821、およびWO2015/161276、例えばその中の図8に記載されている。
【０３６２】
いくつかの態様では、Cas9分子またはCas9ポリペプチドをコードする核酸は、合成核酸配列でもよい。例えば、合成核酸分子は化学的に修飾されていてもよい。いくつかの態様では、Cas9 mRNAは、以下の特性の1つまたは複数（例えば、全て）を有する:Cas9 mRNAは、キャップされている、ポリアデニル化されている、5-メチルシチジンおよび／またはプソイドウリジンで置換されている。
【０３６３】
さらに、または代わりに、合成核酸配列をコドン最適化することができ、例えば、少なくとも1つの非共通コドンまたはあまり共通していないコドンが共通コドンに置き換えられている。例えば、合成核酸は、例として、例えば本明細書において記載される哺乳類発現システムにおける発現について最適化された、最適化されたメッセンジャーmRNAの合成を導くことができる。
【０３６４】
さらに、または代わりに、Cas9分子またはCas9ポリペプチドをコードする核酸は、核局在化配列（NLS）を含むことができる。核局在化配列は公知である。
【０３６５】
Cas9配列のいずれかがペプチドまたはポリペプチドとC末端で融合される場合、終止コドンが除去されるであろうことが理解されよう。
【０３６６】
R)他のCas分子およびCasポリペプチド
本明細書において開示される本発明を実施するために、様々なタイプのCas分子またはCasポリペプチドを使用することができる。いくつかの態様では、タイプII CasシステムのCas分子が使用される。他の態様では、他のCasシステムのCas分子が使用される。例えば、タイプIまたはタイプIII Cas分子が使用され得る。例示的Cas分子（およびCasシステム）は、例えば、Haft et al., PLoS Computational Biology 2005, 1(6): e60およびMakarova et al., Nature Review Microbiology 2011, 9:467-477に記載されており、両方の参考文献の内容は、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。例示的Cas分子（およびCasシステム）は、表6にも示される。
【０３６７】
（表６）Casシステム
2021520202.tif 000039
2021520202.tif 000040
2021520202.tif 000041
【０３６８】
3)Cpf1
いくつかの態様では、ガイドRNAまたはgRNAは、細胞のゲノム配列またはエピソーム配列などの標的配列への、Cas9またはCpf1などのRNA誘導型ヌクレアーゼの特異的結合ターゲティングを促進する。一般に、gRNAは、単分子（単一RNA分子を含み、あるいはキメラと称される）またはモジュラー（1つより多い、典型的には2つの別々のRNA分子、例えば、crRNAおよびtracrRNAを含み、これらは、通常、例えば二本鎖化によって互いに結合している）であり得る。gRNAおよびその構成要素は、例えば、Briner et al.（Molecular Cell 56(2), 333-339, October 23, 2014 (Briner)。これは参照により組み入れられる）およびCotta-Ramusinoにおいて、文献全体にわたって記載されている。
【０３６９】
ガイドRNAは、単分子であろうとモジュラーであろうと、一般に、完全にまたは部分的に標的に相補的であるターゲティングドメインを含み、典型的には、10〜30ヌクレオチドの長さであり、ある特定の態様では、16〜24ヌクレオチドの長さ（例えば、16、17、18、19、20、21、22、23、または24ヌクレオチドの長さ）である。いくつかの局面では、ターゲティングドメインは、Cas9 gRNAの場合はgRNAの5’末端またはその近くにあり、Cpf1 gRNAの場合は3’末端またはその近くにある。前述の説明はCas9とともに使用するためのgRNAに着目してきたが、ここまでに説明したものといくつかの点で異なるgRNAを利用する他のRNA誘導型ヌクレアーゼが発見もしくは発明されている（または将来的に発見もしくは発明され得る）ことを理解されたい。例えば、Cpf1（「CRISPR from Prevotella and Franciscella 1」）は、機能するためにtracrRNAを必要としない、最近発見されたRNA誘導型ヌクレアーゼである。（Zetsche et al., 2015, Cell 163, 759-771 October 22, 2015 (Zetsche I）。参照により本明細書に組み入れられる）。Cpf1ゲノム編集システムで使用するためのgRNAは、一般に、ターゲティングドメインおよび相補性ドメイン（あるいは、「ハンドル」と称される）を含む。Cpf1とともに使用するためのgRNAでは、ターゲティングドメインは、Cas9 gRNAに関して上で述べた5’末端ではなく、通常3’末端またはその近くに存在する（ハンドルは、Cpf1 gRNAの5’末端またはその近くにある）ことも留意されたい。
【０３７０】
異なる原核生物種由来のgRNAの間で、またはCpf1とCas9 gRNAの間で、構造的差異が存在する可能性があるが、gRNAが作動する原理は一般に一定である。作動のこの一貫性のために、gRNAをそのターゲティングドメイン配列によって大まかに定義することができ、当業者は、単分子もしくはキメラのgRNA、または1つもしくは複数の化学修飾および／もしくは配列修飾（置換、付加ヌクレオチド、トランケーションなど）を含むgRNAを含めた任意の適切なgRNAに、所与のターゲティングドメイン配列を組み込むことができることを認識するであろう。したがって、本開示のいくつかの局面では、gRNAは、単にそのターゲティングドメイン配列の点から記載され得る。
【０３７１】
より一般的には、本開示のいくつかの局面は、複数のRNA誘導型ヌクレアーゼを使用して実行することができる、システム、方法、および組成物に関する。別段の指定がない限り、gRNAという用語は、Cas9またはCpf1の特定の種に適合するgRNAだけでなく、任意のRNA誘導型ヌクレアーゼとともに使用することができる任意の適切なgRNAを包含すると理解されるべきである。例示として、gRNAという用語は、ある特定の態様では、クラス2のCRISPRシステム、例えば、タイプIIもしくはタイプV、またはCRISPRシステムに存在する任意のRNA誘導型ヌクレアーゼ、またはそれらに由来する、もしくはそれらから適合されたRNA誘導型ヌクレアーゼとともに使用するためのgRNAを含むことができる。
【０３７２】
本セクションで記載されるある特定の例示的修飾は、非限定的に5’末端もしくはその近く（例えば、5’末端の1〜10、1〜5、もしくは1〜2ヌクレオチド以内）および／または3’末端もしくはその近く（例えば、3’末端の1〜10、1〜5、もしくは1〜2ヌクレオチド以内）を含めた、gRNA配列内の任意の位置に含まれ得る。場合によっては、修飾は、機能的モチーフ、例えば、Cas9 gRNAの反復−抗反復二本鎖、Cas9またはCpf1 gRNAのステムループ構造、および／またはgRNAのターゲティングドメインの中に配置される。
【０３７３】
RNA誘導型ヌクレアーゼとしては、限定されないが、天然に存在するクラス2 CRISPRヌクレアーゼ、例えばCas9およびCpf1、ならびにそれらに由来するか、またはそれらから得られる他のヌクレアーゼが挙げられる。機能面では、RNA誘導型ヌクレアーゼは、(a)gRNAと相互作用する（例えば、複合体化する）；および(b)gRNAとともに、(i)gRNAのターゲティングドメインに相補的である配列、および任意で、(ii)以下により詳細に記載される、「プロトスペーサー隣接モチーフ」または「PAM」と称されるさらなる配列を含むDNAの標的領域と結合し、任意で該標的領域を開裂させるかまたは改変する、ヌクレアーゼと定義される。以下の例が例示するように、RNA誘導型ヌクレアーゼは、同じPAM特異性または開裂活性を有する個々のRNA誘導型ヌクレアーゼ間で変動がある可能性があるとしても、そのPAM特異性および開裂活性によって、大まかに定義することができる。当業者は、本開示のいくつかの局面は、ある特定のPAM特異性および／または開裂活性を有する任意の適切なRNA誘導型ヌクレアーゼを使用して実行することができる、システム、方法、および組成物に関することを認識するであろう。このような理由で、別段の指定がない限り、RNA誘導型ヌクレアーゼという用語は、総称的な用語として理解されるべきであり、RNA誘導型ヌクレアーゼの任意の特定のタイプ（例えば、Cas9対Cpf1）、種（例えば、化膿性連鎖球菌対黄色ブドウ球菌）またはバリエーション（例えば、完全長対トランケート型または分割型；天然に存在するPAMの特異性対改変されたPAMの特異性など）に限定されるべきではない。
【０３７４】
PAMおよびプロトスペーサーの特定の配列配向の認識に加えて、いくつかの態様におけるRNA誘導型ヌクレアーゼは、特定のPAM配列を認識することもできる。例えば、黄色ブドウ球菌のCas9は、一般にNNGRRTまたはNNGRRVのPAM配列を認識し、N残基は、gRNAターゲティングドメインによって認識される領域の直ぐ3’にある。化膿性連鎖球菌のCas9は、一般にNGG PAM配列を認識する。およびF.ノビシダ（F. novicida）のCpf1は、一般にTTN PAM配列を認識する。
【０３７５】
crRNAとTTTN PAM配列を含む二本鎖（ds）DNA標的との複合体におけるアシダミノコッカス（Acidaminococcus）種のCpf1の結晶構造が、Yamano et al. （Cell. 2016 May 5；165(4): 949-962 (Yamano)。参照により本明細書に組み入れられる）によって解明された。Cpf1は、Cas9のように、2つのローブ：REC（認識）ローブおよびNUC（ヌクレアーゼ）ローブを有する。RECローブはREC1およびREC2ドメインを含み、これらは、いかなる公知のタンパク質構造に対しても類似性がない。一方、NUCローブは3つのRuvCドメイン（RuvC-I、-IIおよび-III）ならびに1つのBHドメインを含む。しかし、Cas9と対照的に、Cpf1 RECローブはHNHドメインを欠き、公知のタンパク質構造と同様に類似性がない他のドメイン:構造的にユニークな1つのPIドメイン、3つのウェッジ（WED）ドメイン（WED-I、-II、および-III）、ならびに1つのヌクレアーゼ（Nuc）ドメインを含む。
【０３７６】
Cas9とCpf1は構造および機能に類似性を有するが、ある特定のCpf1活性は、いかなるCas9ドメインとも類似していない構造ドメインによって媒介されることを理解されたい。例えば、標的DNAの相補鎖の開裂は、Cas9のHNHドメインと配列的および空間的に異なるNucドメインによって媒介されるように思われる。さらに、Cpf1 gRNAの非ターゲティング部分（ハンドル）は、Cas9 gRNAの反復：抗反復二本鎖によって形成されるステムループ構造ではなく、シュードノット構造をとる。
【０３７７】
RNA誘導型ヌクレアーゼ、例えば、Cas9、Cpf1、またはそれらの機能的断片をコードする核酸は、本明細書において提供される。RNA誘導型ヌクレアーゼをコードする例示的核酸は以前に記載されている（例えば、Cong 2013；Wang 2013；Mali 2013；Jinek 2012を参照されたい）。
【０３７８】
3.遺伝子破壊のための作用物質の送達
いくつかの態様では、TCR、例えば、ヒトのTRACおよびTRBC1またはTRBC2をコードする内在性遺伝子の標的遺伝子破壊、例えばDNA切断は、細胞に導入するか、または移入させるためのいくつかの公知の送達方法またはビヒクルのいずれかを使用して、例えば、レンチウイルス送達ベクター、またはCas9分子およびgRNAを送達するための公知の方法もしくはビヒクルのいずれかを使用して、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質、例えば、Cas9および／またはgRNA成分を細胞に送達または導入することによって、行われる。例示的方法は、例えば、Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；Cooper et al. (2003) Blood. 101:1637-1644；Verhoeyen et al. (2009) Methods Mol Biol. 506: 97-114；およびCavalieri et al. (2003) Blood. 102(2): 497-505に記載されている。いくつかの態様では、遺伝子破壊、例えばDNA切断を誘導することができる1種または複数種の作用物質の1種または複数種の成分をコードする核酸配列が、例えば、本明細書において記載されるかまたは公知である、細胞中に核酸を導入するための任意の方法によって、細胞中に導入される。いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質の成分、例えば、CRISPRガイドRNAおよび／またはCas9酵素をコードするベクターを細胞中に送達することができる。
【０３７９】
いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質、例えば、Cas9/gRNAである1種または複数種の作用物質が、リボ核タンパク質（RNP）複合体として細胞中に導入される。RNP複合体は、リボヌクレオチドの配列、例えばRNAまたはgRNA分子、およびタンパク質、例えばCas9タンパク質またはその変異体を含む。例えば、Cas9タンパク質は、例えば、エレクトロポレーションまたは他の物理的送達方法を使用して、Cas9タンパク質および標的配列をターゲティングするgRNA分子を含むRNP複合体として送達される。いくつかの態様では、RNPは、エレクトロポレーションまたは他の物理的手段、例えば、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞圧縮または細胞スクイージングを介して、細胞中に送達される。いくつかの態様では、RNPは、さらなる送達作用物質（例えば、小分子作用物質、脂質など）の必要なく、細胞の原形質膜を通過することができる。いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質、例えばCRISPR/Cas9のRNPとしての送達は、細胞後代へ作用物質が伝わることなしに、例えばRNPが導入される細胞において、標的破壊が一過的に生じるという利点を与える。例えば、RNPによる送達は、作用物質がその後代へ受け継がれることを最小化し、それによって、後代におけるオフターゲット遺伝子破壊の機会を低減させる。そのような場合では、遺伝子破壊および導入遺伝子の組み込み（本明細書のセクションI.Bでさらに論じられる）は、後代細胞によって受け継がれ得るが、オフターゲット遺伝子破壊をさらに導入する可能性がある作用物質それ自体がなくても、後代細胞に伝えられる。
【０３８０】
遺伝子破壊を誘導することができる作用物質および成分、例えばCas9分子およびgRNA分子は、表7および8に記載されている様々な送達方法および製剤、または、例えば、WO2015/161276；US2015/0056705、US2016/0272999、US2017/0211075；もしくはUS2017/0016027に記載される方法を使用して、様々な形で標的細胞中に導入することができる。本明細書においてさらに記載するように送達方法および製剤は、本明細書において記載される方法の前または後の工程において、鋳型ポリヌクレオチドおよび／または他の作用物質を細胞に送達するために使用することができる。
【０３８１】
（表７）例示的送達方法
2021520202.tif 000042
【０３８２】
（表８）例示的送達方法の比較
2021520202.tif 000043
【０３８３】
いくつかの態様では、Cas9分子および／もしくはgRNA分子をコードするDNA、またはCas9分子および／もしくはgRNA分子を含むRNP複合体は、公知の方法によって、または本明細書において記載されるように、細胞中に送達することができる。例えば、Cas9をコードするおよび／またはgRNAをコードするDNAは、例えば、ベクター（例えば、ウイルスもしくは非ウイルスベクター）、ベクターに基づかない方法（例えば、ネイキッドDNAもしくはDNA複合体を使用する）、またはこれらの組み合わせによって、送達することができる。いくつかの態様では、作用物質および／またはそれらの成分を含むポリヌクレオチドは、ベクター（例えば、ウイルスベクター／ウイルスまたはプラスミド）によって送達される。ベクターは本明細書において記載される任意のものであってもよい。
【０３８４】
いくつかの局面では、ガイド配列と組み合わせた（および任意でガイド配列と複合体化された）CRISPR酵素（例えば、Cas9ヌクレアーゼ）が細胞に送達される。例えば、CRISPRシステムの1つまたは複数の要素は、タイプI、タイプII、またはタイプIII CRISPRシステムに由来する。例えば、CRISPRシステムの1つまたは複数の要素は、内在性CRISPRシステムを含む特定の生物、例えば、化膿性連鎖球菌、黄色ブドウ球菌、または髄膜炎菌に由来する。
【０３８５】
いくつかの態様では、Cas9ヌクレアーゼ（例えば、黄色ブドウ球菌もしくは化膿性連鎖球菌由来のmRNAにコードされるもの。例えば、pCW-Cas9、Addgene #50661、Wang et al. (2014) Science, 3:343-80-4；またはカタログ番号K002、K003、K005、もしくはK006としてApplied Biological Materials（ABM；Canada）から入手可能なヌクレアーゼもしくはニッカーゼレンチウイルスベクター）ならびに標的遺伝子（例えば、ヒトのTRAC、TRBC1、および／またはTRBC2）に特異的なガイドRNAが細胞中に導入される。いくつかの態様では、特定の遺伝子、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2遺伝子中の標的部位をターゲティングするターゲティングドメイン配列であるか、または該ターゲティングドメインを含むgRNA配列が、設計されるか、または特定される。CRISPRゲノム編集のためのゲノムワイドなgRNAデータベースが公的に利用可能であり、これは、ヒトゲノムまたはマウスゲノム中の遺伝子の構成的エクソンをターゲティングする例示的シングルガイドRNA（sgRNA）配列を含む（例えば、genescript.com/gRNA-database.htmlを参照されたい；Sanjana et al. (2014) Nat. Methods, 11:783-4も参照されたい）。いくつかの局面では、gRNA配列は、非標的部位または位置へのオフターゲット結合が最小限である配列であるか、または該配列を含む。
【０３８６】
いくつかの態様では、作用物質および／もしくはそれらの成分を含むポリヌクレオチド、またはRNP複合体は、ベクターに基づかない方法（例えば、ネイキッドDNAまたはDNA複合体を使用する）によって送達される。例えば、DNAまたはRNAまたはタンパク質またはこれらの組み合わせ、例えば、リボ核タンパク質（RNP）複合体は、例えば、有機的に修飾したシリカまたはシリケート（Ormosil）、エレクトロポレーション、（例えば、Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27, Kollmannsperger et al (2016) Nat Comm 7, 10372 doi:10.1038/ncomms10372)に記載されているような）一過的な細胞圧縮または細胞スクイージング、遺伝子銃、ソノポレーション、マグネトフェクション、脂質媒介性トランスフェクション、デンドリマー、無機ナノ粒子、リン酸カルシウム、またはこれらの組み合わせによって、送達することができる。
【０３８７】
いくつかの態様では、エレクトロポレーションを介する送達は、カートリッジ、チャンバ、またはキュベット中で、Cas9および／もしくはgRNAをコードするDNAまたはRNP複合体と細胞を混合し、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスを加えることを含む。いくつかの態様では、エレクトロポレーションを介する送達は、Cas9および／またはgRNAをコードするDNAと細胞が、装置（例えば、ポンプ）と接続している容器中で混合され、この装置が、混合物をカートリッジ、チャンバ、またはキュベットに送り込み、ここで、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスが加えられ、その後、細胞が第2の容器に送達されるシステムを使用して行われる。
【０３８８】
いくつかの態様では、送達ビヒクルは非ウイルスベクターである。いくつかの態様では、非ウイルスベクターは無機ナノ粒子である。例示的無機ナノ粒子としては、例えば、磁性ナノ粒子（例えばFe3MnO2）およびシリカが挙げられる。ナノ粒子の外表面は、正に荷電したポリマー（例えば、ポリエチレンイミン、ポリリジン、ポリセリン）とコンジュゲートすることができ、これにより、ペイロードの付着（例えば、コンジュゲーションまたは捕捉）が可能になる。いくつかの態様では、非ウイルスベクターは有機ナノ粒子である。例示的有機ナノ粒子としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）でコーティングされた中性ヘルパー脂質とともにカチオン性脂質を含むSNALPリポソーム、および脂質でコーティングされたプロタミン-核酸複合体が挙げられる。例示的な脂質および／またはポリマーは公知であり、提供される態様において使用することができる。
【０３８９】
いくつかの態様では、ビヒクルは、ナノ粒子およびリポソーム、例えば、細胞特異的抗原、モノクローナル抗体、単鎖抗体、アプタマー、ポリマー、糖、および細胞透過性ペプチドの標的細胞アップデートを増大するために、ターゲティング改変を有する（例えば、US2016/0272999に記載されている）。いくつかの態様では、ビヒクルは、融合性およびエンドソーム不安定化ペプチド／ポリマーを使用する。いくつかの態様では、ビヒクルは、（例えば、カーゴのエンドソーム脱出を加速するために）酸誘発性のコンフォメーション変化を受ける。いくつかの態様では、例えば細胞内コンパートメントにおける放出のために、刺激開裂可能なポリマーが使用される。例えば、還元細胞環境で開裂させられるジスルフィドベースの陽イオン性ポリマーが使用され得る。
【０３９０】
いくつかの態様では、送達ビヒクルは生物学的な非ウイルス性送達ビヒクルである。いくつかの態様では、ビヒクルは、弱毒化細菌（例えば、侵入性であるが、弱毒化されて発病を防止し、導入遺伝子を発現するように、天然または人工的に改変されている（例えば、リステリア・モノサイトゲネス、ある特定のサルモネラ（Salmonella）株、ビフィドバクテリウム・ロングム（Bifidobacterium longum）、および改変大腸菌）、特定の細胞を標的にするために栄養的および組織特異的指向性を有する細菌、標的細胞特異性を変えるために改変表面タンパク質を有する細菌）である。いくつかの態様では、ビヒクルは、遺伝子改変バクテリオファージ（例えば、大きなパッケージング能力、低免疫原性を有し、哺乳類のプラスミド維持配列を含み、ターゲティングリガンドが組み込まれた、改変されたファージ）である。いくつかの態様では、ビヒクルは哺乳類のウイルス様粒子である。例えば、（例えば、「空」粒子の精製、それに続く、望ましいカーゴとのウイルスのエクスビボアセンブリーによって）改変ウイルス粒子を生成することができる。ビヒクルは、ターゲティングリガンドを組み込んで、標的組織特異性を変えるように改変することもできる。いくつかの態様では、ビヒクルは生物学的リポソームである。例えば、生物学的リポソームは、ヒト細胞に由来するリン脂質ベースの粒子、例えば、対象に由来する球状構造に壊された赤血球である、赤血球ゴースト（例えば、組織ターゲティングが、様々な組織もしくは細胞特異的リガンドの付着によって達成され得る）、または分泌性エキソソーム−エンドサイトーシス起源の対象由来膜結合ナノベシクル（30〜100nm）（例えば、様々な細胞型から生成することができ、したがって、ターゲティングリガンドの必要なく細胞に取り込まれ得る）である。
【０３９１】
いくつかの態様では、Cas9分子および／またはgRNA分子をコードするRNAは、公知の方法によって、または本明細書において記載されるように、細胞、例えば、本明細書において記載される標的細胞中に送達することができる。例えば、Cas9をコードするおよび／またはgRNAをコードするRNAは、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、（例えば、Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27に記載されているような）一過的な細胞圧縮または細胞スクイージング、脂質媒介性トランスフェクション、ペプチド媒介性送達、またはこれらの組み合わせによって、送達することができる。
【０３９２】
いくつかの態様では、エレクトロポレーションを介する送達は、カートリッジ、チャンバ、またはキュベット中でCas9分子および／またはgRNA分子をコードするRNAと細胞を混合し、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスを加えることを含む。いくつかの態様では、エレクトロポレーションを介する送達は、Cas9分子および／またはgRNA分子をコードするRNAと細胞が装置（例えば、ポンプ）と接続している容器中で混合され、この装置が、混合物をカートリッジ、チャンバ、またはキュベットに送り込み、ここで、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスが加えられ、その後、細胞が第2の容器に送達されるシステムを使用して行われる。
【０３９３】
いくつかの態様では、Cas9分子は、公知の方法によって、または本明細書において記載されるように、細胞中に送達することができる。例えば、Cas9タンパク質分子は、例えば、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、（例えば、Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27に記載されているような）一過的な細胞圧縮または細胞スクイージング、脂質媒介性トランスフェクション、ペプチド媒介性送達、またはこれらの組み合わせによって、送達することができる。送達は、gRNAをコードするDNAまたはgRNAをともない得る。
【０３９４】
いくつかの態様では、エレクトロポレーションを介する送達は、カートリッジ、チャンバ、またはキュベット中で、gRNA分子とともにまたはそのままCas9分子と細胞を混合し、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスを加えることを含む。いくつかの態様では、エレクトロポレーションを介する送達は、gRNA分子とともにまたはそのままCas9分子と細胞が、装置（例えば、ポンプ）と接続している容器中で混合され、この装置が、混合物をカートリッジ、チャンバ、またはキュベットに送り込み、ここで、定められた持続時間および振幅の1回または複数回の電気的インパルスが加えられ、その後、細胞が第2の容器に送達されるシステムを使用して行われる。
【０３９５】
いくつかの態様では、作用物質および／またはそれらの成分を含むポリヌクレオチドは、ベクターとベクターに基づかない方法の組み合わせによって送達される。例えば、ビロソームは、失活したウイルス（例えば、HIVまたはインフルエンザウイルス）と組み合わされたリポソームを含み、これは、ウイルス方法単独またはリポソーム方法単独のいずれかよりも効率的な遺伝子移入をもたらし得る。
【０３９６】
いくつかの態様では、複数の作用物質またはそれらの成分が細胞に送達される。例えば、いくつかの態様では、ゲノム中の2つ以上の場所、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位の遺伝子破壊を誘導することができる作用物質が細胞に送達される。いくつかの態様では、作用物質およびそれらの成分は、1つの方法を使用して送達される。例えば、いくつかの態様では、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位の遺伝子破壊を誘導するための作用物質は、遺伝子破壊のための成分をコードするポリヌクレオチドとして送達される。いくつかの態様では、1つのポリヌクレオチドが、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位を標的にする作用物質をコードすることができる。いくつかの態様では、2つ以上の異なるポリヌクレオチドが、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位を標的にする作用物質をコードすることができる。いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質はリボ核タンパク質（RNP）複合体として送達することができ、2つ以上の異なるRNP複合体を混合物として一緒に、または別々に送達することができる。
【０３９７】
いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質および／またはそれらの成分、例えば、Cas9分子成分および／またはgRNA分子成分以外の1種または複数種の核酸分子、例えば、HDR誘導性組み込み（例えば、本明細書のセクションI.B.に記載されている）のための鋳型ポリヌクレオチドが送達される。いくつかの態様では、核酸分子、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、Casシステムの成分の1つまたは複数と同時に送達される。いくつかの態様では、核酸分子は、Casシステムの成分の1つまたは複数が送達される前または後（例えば、約1分、5分、10分、15分、30分、1時間、2時間、3時間、6時間、9時間、12時間、1日、2日、3日、1週、2週、または4週未満）に送達される。いくつかの態様では、核酸分子、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、Casシステムの成分の1つまたは複数、例えば、Cas9分子成分および／またはgRNA分子成分と異なる手段によって送達される。核酸分子、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、本明細書において記載される送達方法のいずれかによって送達することができる。例えば、核酸分子、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスまたはレンチウイルスによって送達することができ、Cas9分子成分および／またはgRNA分子成分は、エレクトロポレーションによって送達することができる。いくつかの態様では、核酸分子、例えば鋳型ポリヌクレオチドは、1種または複数種の導入遺伝子、例えば、組換えTCR、組換えCAR、および／または他の遺伝子産物をコードする導入遺伝子を含む。
【０３９８】
B. 相同組換え修復（HDR）を介する標的組み込み
本明細書において提供される態様のいくつかでは、相同組換え修復（HDR）は、ゲノム中の特定の場所、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位における、導入遺伝子、例えば、組換え受容体をコードする核酸配列を含む鋳型ポリヌクレオチドの特定の部分の標的組み込みに利用可能である。いくつかの態様では、遺伝子破壊（例えば、セクションI.Aに記載されているようなDNA切断）と1つまたは複数の相同性アーム（例えば、遺伝子破壊の周辺の核酸配列相同配列を含む）を含む鋳型ポリヌクレオチドとの存在は、DNA修復のための鋳型として働く相同配列を用いて、HDRを誘導するか、または導くことができる。遺伝子破壊の周辺の内在性遺伝子配列と鋳型ポリヌクレオチド中に含まれる5’および／または3’相同性アームの間の相同性に基づいて、細胞のDNA修復機構は、鋳型ポリヌクレオチドを使用して、遺伝子破壊の部位においてDNA切断を修復し、遺伝情報を再合成し、それによって、遺伝子破壊の部位、またはその近くで、鋳型ポリヌクレオチド中の導入遺伝子配列を効果的に挿入するか、または組み込むことができる。いくつかの態様では、遺伝子破壊、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位は、本明細書において記載される標的遺伝子破壊を引き起こすための方法のいずれかによって、引き起こすことができる。
【０３９９】
ポリヌクレオチド、例えば、本明細書において記載される鋳型ポリヌクレオチドも提供される。いくつかの態様では、提供されるポリヌクレオチドは、内在性TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位に、組換え受容体、例えば組換えTCRの一部をコードする導入遺伝子配列をターゲティングするために、例えばHDRを含む、本明細書において記載される方法で用いることができる。
【０４００】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、組換え受容体またはその一部（例えば、組換え受容体の1つもしくは複数の鎖、領域、もしくはドメイン）をコードする導入遺伝子（外来性または異種性核酸配列）、ならびに内在性ゲノム部位、またはその近く、例えば、内在性TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位にある配列に相同な相同配列（例えば、相同性アーム）を含むポリヌクレオチドであるか、または該ポリヌクレオチドを含む。いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチドは、直鎖状DNA断片として導入されるか、またはベクターに含まれる。いくつかの局面では、遺伝子破壊を誘導するための工程および（例えば、鋳型ポリヌクレオチドの導入による）標的組み込みのための工程は、同時にまたは順次行われる。
【０４０１】
1. 相同組換え修復（HDR）
いくつかの態様では、相同組換え修復（HDR）は、ゲノム中の1つまたは複数の標的部位、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位における、1種または複数種の核酸配列、例えば、導入遺伝子配列の標的組み込みまたは挿入に利用可能である。いくつかの態様では、標的配列を変える、特定の標的場所で導入遺伝子を組み込む、および／または特定の標的遺伝子中の突然変異を編集もしくは修復するために、ヌクレアーゼ誘導性HDRを使用することができる。
【０４０２】
標的部位での核酸配列の変更は、外来的に提供された鋳型ポリヌクレオチド（ドナーポリヌクレオチドまたは鋳型配列とも称される）を用いたHDRによって生じ得る。例えば、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の変更、例えば、鋳型ポリヌクレオチド内に含まれる導入遺伝子の挿入をもたらす。いくつかの態様では、相同組換えのための鋳型としてプラスミドまたはベクターを使用することができる。いくつかの態様では、直鎖状DNA断片を相同組換えのための鋳型として使用することができる。いくつかの態様では、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドを、標的配列と鋳型ポリヌクレオチドの間の相同組換え修復の代替方法（例えば、一本鎖アニーリング）による標的配列の変更のための鋳型として使用することができる。鋳型ポリヌクレオチドによってもたらされる標的配列の変更は、ヌクレアーゼ、例えば、CRISPR/Cas9などの標的ヌクレアーゼによる開裂に依存する。ヌクレアーゼによる開裂は、二本鎖切断または2つの一本鎖切断を含むことができる。
【０４０３】
いくつかの態様では、「組換え」は、2つのポリヌクレオチド間の遺伝情報の交換のプロセスを指す。いくつかの態様では、「相同組換え（HR）」は、例えば、相同組換え修復メカニズムを介した細胞中の二本鎖切断の修復の間に起こる、そのような交換の特殊化した形態を指す。このプロセスは、ヌクレオチド配列の相同性を必要とし、標的DNA（すなわち、二本鎖切断を受けたもの、例えば、内在性遺伝子中の標的部位）の鋳型修復に鋳型ポリヌクレオチドを使用し、鋳型ポリヌクレオチドから標的への遺伝情報の伝達につながるので「非乗換え遺伝子変換」または「ショートトラクト遺伝子変換」として様々に公知である。いくつかの態様では、そのような伝達は、壊れた標的と鋳型ポリヌクレオチドの間に生じるヘテロ二本鎖DNAのミスマッチ修正、および／または標的の一部となると考えられる遺伝情報を再合成するために鋳型ポリヌクレオチドが使用される「合成依存的鎖アニーリング」、および／または関連したプロセスをともない得る。そのような特殊化したHRは、鋳型ポリヌクレオチドの配列の一部または全部が標的ポリヌクレオチド中に組み込まれるような、標的分子の配列の変更をもたらすことが多い。
【０４０４】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチド、例えば、導入遺伝子を含むポリヌクレオチドは、相同性非依存的メカニズムを介して細胞のゲノム中に組み込まれる。本方法は、細胞のゲノム中に二本鎖切断（DSB）を作出し、ヌクレアーゼを使用して鋳型ポリヌクレオチド分子を開裂させ、その結果、鋳型ポリヌクレオチドがDSBの部位に組み込まれることを含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、非相同性依存的方法（例えば、NHEJ）を介して組み込まれる。インビボ開裂の際に、鋳型ポリヌクレオチドは、DSBの場所で細胞のゲノム中にターゲティングされた様式で組み込まれ得る。鋳型ポリヌクレオチドは、DSBを作出するために使用されるヌクレアーゼの1つまたは複数のために、1つまたは複数の同じ標的部位を含むことができる。したがって、鋳型ポリヌクレオチドは、組み込みが望まれる内在性遺伝子を開裂させるために使用される同じヌクレアーゼの1つまたは複数によって開裂され得る。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、DSBを誘導するために使用されるヌクレアーゼと異なるヌクレアーゼ標的部位を含む。本明細書において記載されるように、標的部位または標的場所の遺伝子破壊は、任意のメカニズム、例えば、ZFN、TALEN、CRISPR/Cas9システム、またはTtAgoヌクレアーゼによって作出され得る。
【０４０５】
いくつかの態様では、DNA修復メカニズムは、(1)単一二本鎖切断、(2)2つの一本鎖切断、(3)切断が標的部位の両側で生じる、2つの二本鎖切断、(4)二本鎖切断および2つの一本鎖切断が標的部位の両側で生じる、1つの二本鎖切断および2つの一本鎖切断、（5)1対の一本鎖切断が標的部位の両側で生じる、4つの一本鎖切断、または(6)1つの一本鎖切断の後に、ヌクレアーゼによって誘導され得る。いくつかの態様では、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドが使用され、標的部位は、代替HDRによって変えられ得る。
【０４０６】
鋳型ポリヌクレオチドによってもたらされる標的部位の変更は、ヌクレアーゼ分子による開裂に依存する。ヌクレアーゼによる開裂は、ニック、二本鎖切断、または2つの一本鎖切断、例えば標的部位のDNAの各鎖に1つを含むことができる。標的部位に切断を導入した後、切断末端で切除が生じ、一本鎖の突出DNA領域がもたらされる。
【０４０７】
標準HDRでは、標的部位に直接組み込まれるか、または導入遺伝子を挿入するかもしくは標的部位の配列を修正するための鋳型として使用されるかのいずれかであろう、標的部位に対する相同配列を含む、二本鎖の鋳型ポリヌクレオチドが導入される。切断点で切除した後、修復は、様々な経路によって、例えば、ダブルホリデイジャンクションモデル（double Holliday junction model）（もしくは二本鎖切断修復、DSBR経路）または合成依存的鎖アニーリング（SDSA）経路によって、進行し得る。
【０４０８】
ダブルホリデイジャンクションモデルでは、鋳型ポリヌクレオチド中の相同配列への標的部位の2つの一本鎖突出による鎖の侵入が生じ、その結果、2つのホリデイジャンクションを有する中間体が形成される。侵入鎖の末端から新しいDNAが合成されて、切除に起因するギャップが埋められるので、ジャンクションが移動する。新しく合成されたDNAの末端は、切除末端にライゲーションされ、ジャンクションが分解され、その結果、標的部位での挿入、例えば、鋳型ポリヌクレオチド中の導入遺伝子の挿入がもたらされる。鋳型ポリヌクレオチドとの乗換えが、ジャンクションの分解の際に生じ得る。
【０４０９】
SDSA経路では、1つの一本鎖突出のみが鋳型ポリヌクレオチドに侵入し、侵入鎖の末端から新しいDNAが合成されて、切除に起因するギャップが埋められる。新しく合成されたDNAは、次いで、残りの一本鎖突出にアニールし、ギャップを埋めるために新しいDNAが合成され、鎖がライゲーションされて、改変されたDNA二本鎖がもたらされる。
【０４１０】
代替HDRでは、一本鎖鋳型ポリヌクレオチド、例えば、鋳型ポリヌクレオチドが導入される。望ましい標的部位を変えるための、標的部位におけるニック、一本鎖切断、または二本鎖切断が、ヌクレアーゼ分子によって媒介され、切断点での切除が生じて、一本鎖突出が現れる。DNAの標的部位を修正するか、または変えるための鋳型ポリヌクレオチドの配列の組み込みは、本明細書において記載されるように、典型的にはSDSA経路によって生じる。
【０４１１】
「代替HDR」または代替相同組換え修復は、いくつかの態様では、相同な核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外来性核酸、例えば、鋳型ポリヌクレオチド）を使用してDNA損傷を修復するプロセスを指す。代替HDRは、該プロセスが標準HDRと異なる経路を利用し、標準HDRの媒介物、RAD51およびBRCA2によって阻害され得るという点において標準HDRと異なる。さらに、代替HDRは、切断の修復のために、一本鎖のまたはニックが入った相同な核酸を使用する。「標準HDR」または標準相同組換え修復は、いくつかの態様では、相同な核酸（例えば、内在性相同配列、例えば、姉妹染色分体、または外来性核酸、例えば、鋳型核酸）を使用してDNA損傷を修復するプロセスを指す。標準HDRは、典型的には、二本鎖切断において有意な切除があった場合に作用し、DNAの少なくとも1つの一本鎖部分を形成する。正常細胞では、HDRは、典型的には、切断の認識、切断の安定化、切除、一本鎖DNAの安定化、DNA乗換え中間体の形成、乗換え中間体の分解、およびライゲーションなどの一連の工程をともなう。該プロセスはRAD51およびBRCA2を必要とし、相同な核酸は典型的には二本鎖である。別段指示がない限り、いくつかの態様における用語「HDR」は、標準HDRおよび代替HDRを包含する。
【０４１２】
いくつかの態様では、二本鎖開裂は、ヌクレアーゼ、例えば、HNH様ドメインと関連する開裂活性およびRuvC様ドメイン、例えばN末端RuvC様ドメインと関連する開裂活性を有するCas9分子、例えば、野生型Cas9によってもたらされる。そのような態様は、単一gRNAしか必要としない。
【０４１３】
いくつかの態様では、1つの一本鎖切断またはニックは、ニッカーゼ活性を有するヌクレアーゼ分子、例えば、Cas9ニッカーゼによってもたらされる。標的部位にニックが入ったDNAは代替HDRの基質となり得る。
【０４１４】
いくつかの態様では、2つの一本鎖切断またはニックは、ヌクレアーゼ、例えば、ニッカーゼ活性、例えば、HNH様ドメインと関連する開裂活性またはN末端RuvC様ドメインと関連する開裂活性を有するCas9分子によってもたらされる。そのような態様は、通常2つのgRNAを必要とし、1つは各一本鎖切断の配置のためである。いくつかの態様では、ニッカーゼ活性を有するCas9分子はgRNAがハイブリダイズする鎖を開裂させるが、gRNAがハイブリダイズする鎖と相補的である鎖は開裂させない。いくつかの態様では、ニッカーゼ活性を有するCas9分子は、gRNAがハイブリダイズする鎖を開裂させるのではなく、gRNAがハイブリダイズする鎖に相補的である鎖を開裂させる。いくつかの態様では、ニッカーゼはHNH活性を有し、例えば、RuvC活性が失活しているCas9分子、例えば、D10での突然変異、例えばD10A突然変異を有するCas9分子である。D10AはRuvCを失活させ；したがって、Cas9ニッカーゼはHNH活性（のみ）を有し、gRNAがハイブリダイズする鎖（例えば、NGG PAMを有さない相補鎖）で切断すると考えられる。いくつかの態様では、H840、例えば、H840A突然変異を有するCas9分子をニッカーゼとして使用することができる。H840AはHNHを失活させ；したがって、Cas9ニッカーゼはRuvC活性（のみ）を有し、非相補鎖（例えば、NGG PAMを有し、その配列がgRNAと同一である鎖）で切断する。いくつかの態様では、Cas9分子はN末端RuvC様ドメインニッカーゼであり、例えば、Cas9分子はN863の突然変異、例えばN863Aを含む。
【０４１５】
2つの一本鎖ニックを配置するためにニッカーゼおよび2つのgRNAが使用されるいくつかの態様では、1つのニックは標的DNAの＋鎖上にあり、1つのニックは−鎖上にある。PAMは外側を向いている。gRNAは、gRNAが約0〜50、0〜100、または0〜200ヌクレオチドによって分離されるように、選択することができる。いくつかの態様では、2つのgRNAのターゲティングドメインに相補的である標的配列の間に重複はない。いくつかの態様では、gRNAは重複せず、50、100、または200ヌクレオチド程度によって分離される。いくつかの態様では、2つのgRNAの使用は、例えば、オフターゲット結合を減少させることによって、特異性を増大させることができる（Ran et al., Cell 2013）。
【０４１６】
いくつかの態様では、HDR、例えば、代替HDRを誘導するために単一ニックを使用することができる。所与の開裂部位、例えば標的部位でHR対NHEJの比を増大させるために、単一ニックを使用することができることが、本明細書において意図される。いくつかの態様では、一本鎖切断は、該gRNAのターゲティングドメインが相補的である標的部位のDNAの鎖に形成される。別の態様では、一本鎖切断は、該gRNAのターゲティングドメインが相補的である鎖以外の標的部位のDNAの鎖に形成される。
【０４１７】
いくつかの態様では、ヌクレアーゼによって作出された二本鎖または一本鎖切断を修復するために、他のDNA修復経路、例えば、一本鎖アニーリング（SSA）、一本鎖切断修復（SSBR）、ミスマッチ修復（MMR）、塩基除去修復（BER）、ヌクレオチド除去修復（NER）、鎖内架橋（ICL）、損傷乗越え合成（TLS）、誤りのない複製後修復（PRR）が細胞によって用いられ得る。
【０４１８】
2.遺伝子破壊（例えば、DNA鎖切断）の配置
標的組み込みによって、導入遺伝子がゲノム中の特定の遺伝子または座位に組み込まれる。導入遺伝子は、ゲノム中の少なくとも1つの標的部位または部位のうちの1つ、またはその近くのどこにでも組み込まれ得る。いくつかの態様では、導入遺伝子は、少なくとも1つの標的部位のうちの1つ、またはその近くに、例えば、開裂部位の上流または下流の300、250、200、150、100、50、10、5、4、3、2、1、またはそれ以下の塩基対以内、例えば、標的部位のいずれかの側の100、50、10、5、4、3、2、1塩基対以内、例えば、標的部位のいずれかの側の50、10、5、4、3、2、1塩基対以内に組み込まれる。いくつかの態様では、導入遺伝子を含む組み込まれる配列は、いかなるベクター配列（例えば、ウイルスベクター配列）も含まない。いくつかの態様では、組み込まれる配列は、ベクター配列（例えば、ウイルスベクター配列）の一部を含む。
【０４１９】
片方の鎖における二本鎖切断または一本鎖切断は、望ましい領域で変更がもたらされるように、例えば、導入遺伝子の挿入または突然変異の修正が生じるように、標的組み込みのための部位に十分に近くなければならない。いくつかの態様では、距離は、10、25、50、100、200、300、350、400、または500ヌクレオチド以下である。いくつかの態様では、切断は、末端切除の間にエキソヌクレアーゼ媒介性除去の対象になる領域内に切断があるように、標的組み込みのための部位に十分に近くなければならないと考えられる。いくつかの態様では、ターゲティングドメインは、開裂イベント、例えば、二本鎖または一本鎖切断が、変更が望まれる領域、例えば標的挿入のための部位の1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、300、350、400、または500ヌクレオチド以内に配置されるように構成される。切断、例えば、二本鎖または一本鎖切断は、変更が望まれる領域、例えば標的挿入のための部位の上流または下流に配置され得る。いくつかの態様では、切断は、変更が望まれる領域内、例えば、少なくとも2つの突然変異ヌクレオチドによって定められた領域内に配置される。いくつかの態様では、切断は、変更が望まれる領域の直ぐ近くに、例えば、標的組み込みのための部位の直ぐ上流または下流に配置される。
【０４２０】
いくつかの態様では、一本鎖切断は、第2のgRNA分子によって配置される、さらなる一本鎖切断をともなう。例えば、ターゲティングドメインは、開裂イベント、例えば、2つの一本鎖切断が、標的組み込みのための部位の1、2、3、4、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、150、200、300、350、400、または500ヌクレオチド以内に配置されるように構成される。いくつかの態様では、第1および第2のgRNA分子は、Cas9ニッカーゼをガイドする場合に、一本鎖切断が、第2のgRNAによって配置され、互いに十分接近したさらなる一本鎖切断をともなって、望ましい領域の変更をもたらすように構成される。いくつかの態様では、第1および第2のgRNA分子は、例えば、Cas9がニッカーゼである場合、第2のgRNAによって配置される一本鎖切断が、第1のgRNA分子によって配置される切断の10、20、30、40、または50ヌクレオチド以内であるように構成される。いくつかの態様では、2つのgRNA分子は、異なる鎖において、同じ位置に、または互いの数ヌクレオチド以内に切断を配置し、例えば、二本鎖切断を本質的に模倣するように構成される。
【０４２１】
HDR媒介性の導入遺伝子の挿入または修正を誘導する目的で、gRNA（単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーgRNA）およびCas9ヌクレアーゼが二本鎖切断を誘導する、いくつかの態様では、開裂部位は、標的組み込みのための部位から離れて、0〜200bp（例えば、0〜175、0〜150、0〜125、0〜100、0〜75、0〜50、0〜25、25〜200、25〜175、25〜150、25〜125、25〜100、25〜75、25〜50、50〜200、50〜175、50〜150、50〜125、50〜100、50〜75、75〜200、75〜175、75〜150、75〜125、75〜100bp）の間にある。いくつかの態様では、開裂部位は、標的組み込みのための部位から離れて、0〜100bp（例えば、0〜75、0〜50、0〜25、25〜100、25〜75、25〜50、50〜100、50〜75、または75〜100bp）の間にある。
【０４２２】
いくつかの態様では、ニッカーゼを使用して突出を有する切断を引き起こすことによって、HDRを促進することができる。いくつかの態様では、突出の一本鎖の性質は、例えばNHEJとは対照的に、HDRによって切断を修復するという細胞の可能性を増強することができる。
【０４２３】
特に、いくつかの態様では、HDRは、第1の標的部位に第1のニッカーゼをターゲティングする第1のgRNA、および第1の標的部位と逆のDNA鎖にあり、第1のニックからずれている第2の標的部位へ第2のニッカーゼをターゲティングする第2のgRNAを選択することによって促進される。いくつかの態様では、gRNA分子のターゲティングドメインは、あらかじめ選択されたヌクレオチド、例えばコード領域のヌクレオチドから十分に離れて開裂イベントを配置し、その結果、該ヌクレオチドが変わらないように構成される。いくつかの態様では、gRNA分子のターゲティングドメインは、エクソンの配列の変更または望まれないスプライシングイベントを回避するために、イントロン／エクソン境界、または天然に存在するスプライスシグナルから十分に離れてイントロンの開裂イベントを配置するように構成される。いくつかの態様では、gRNA分子のターゲティングドメインは、内在性遺伝子の欠失もしくはノックアウトを可能にする、および／または少なくとも1つの標的部位のうちの1つ、もしくはその近くにインフレームの導入遺伝子の組み込みを可能にするために、初期エクソン中に配置するように構成される。
【０４２４】
いくつかの態様では、二本鎖切断は、第2のgRNA分子によって配置される、さらなる二本鎖切断をともない得る。いくつかの態様では、二本鎖切断は、第2のgRNA分子および第3のgRNA分子によって配置される、2つのさらなる一本鎖切断をともない得る。
【０４２５】
いくつかの態様では、2つのgRNA、例えば、独立に、単分子（もしくはキメラ）またはモジュラーgRNAは、標的組み込みのための部位の両側に二本鎖切断を配置するように構成される。
【０４２６】
3.鋳型ポリヌクレオチド
内在性DNA中の1つもしくは複数の標的部位の、またはその近くの配列と相同性を有する鋳型ポリヌクレオチドは、標的DNAの構造、例えば導入遺伝子の標的挿入を変えるために使用することができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的挿入のために、導入遺伝子、例えば、組換え受容体をコードする核酸配列に隣接する相同配列（例えば、相同性アーム）を含む。いくつかの態様では、相同配列は、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位の1つまたは複数に導入遺伝子をターゲティングする。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、相同性アーム間にさらなる配列（コードまたは非コード配列）、例えば調節配列、例えばプロモーターおよび／もしくはエンハンサー、スプライス供与および／もしくは受容部位、配列内リボソーム進入部位（IRES）、リボソームスキップエレメント（例えば、2Aペプチド）をコードする配列、マーカー、および／もしくはSA部位、ならびに／または1種もしくは複数種のさらなる導入遺伝子を含む。
【０４２７】
鋳型ポリヌクレオチド中の関心対象の配列は、プロモーターとともにまたはそのまま、機能的ポリペプチドをコードする、1種または複数種の配列（例えば、cDNA）を含むことができる。
【０４２８】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチド中に含まれる導入遺伝子は、細胞表面レセプター（例えば、組換え受容体）またはその鎖、抗体、抗原、酵素、増殖因子、核内受容体、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーター、この中のいずれかの機能的断片または機能変異体、およびこの中の組み合わせをコードする配列を含む。導入遺伝子は、癌療法で有用である1種または複数種のタンパク質、例えば、1種または複数種のキメラ抗原受容体（CAR）および／または組換えT細胞受容体（TCR）をコードすることができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、本明細書のセクションIVに記載されている組換え受容体、またはその任意の鎖、領域、および／もしくはドメインのいずれかをコードすることができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、組換えT細胞受容体（TCR）またはその任意の鎖、領域、および／もしくはドメインをコードする。
【０４２９】
ある特定の態様では、ポリヌクレオチド、例えば、鋳型ポリヌクレオチドは、組換え受容体、例えば、組換えTCRまたはその鎖の全部または一部をコードする導入遺伝子を含む（contains）および／または含む（includes）。特定の態様では、導入遺伝子は、内在性受容体をコードする、遺伝子、座位、またはオープンリーディングフレーム、例えば、TCRの1つまたは複数の領域、鎖、または部分をコードする内在性遺伝子内にある標的部位にターゲティングされる。
【０４３０】
ある特定の態様では、鋳型ポリヌクレオチドは導入遺伝子、導入遺伝子の一部を含む（includes）もしくは含み（contains）、ならびに／または核酸は組換え受容体をコードし、1つもしくは複数の可変ドメインおよび1つもしくは複数の定常ドメインを含む組換えTCRもしくはその鎖である。ある特定の態様では、組換えTCRまたはその鎖は、内在性TCR定常ドメインの全部または一部および／または断片に対して、完全な、例えば、100％または約100％の同一性を有する1つまたは複数の定常ドメインを含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、定常ドメインの全部または一部、例えば、内在性TCR定常ドメインと完全にまたは部分的に同一である定常ドメインの一部または断片をコードする。いくつかの態様では、導入遺伝子は、SEQ ID NO:1、2、または3に記載される核酸配列の全部または一部に対して、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％、または少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％、99.5％、もしくは99.9％の配列同一性を有する配列のヌクレオチドを含む。
【０４３１】
態様のいくつかでは、導入遺伝子は、コドン最適化された、TCRαおよび／もしくはTCRβ鎖またはこれらの一部をコードする配列を含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、ネイティブなまたは内在性のTCRαおよび／またはTCRβ鎖の対応する部分に対して100％未満のアミノ酸配列同一性を有する、TCRαおよび／またはTCRβ鎖の一部をコードする。いくつかの態様では、コードされるTCRαおよび／またはTCRβ鎖は、対応するネイティブなまたは内在性のTCRαおよび／またはTCRβ鎖に対して70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、もしくは99％を越える同一性を有する、約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、もしくは99％を越える同一性を有する、または少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、もしくは99％を越える同一性を有するが、100％未満の同一性を有するアミノ酸配列を含む。特定の態様では、導入遺伝子は、対応するネイティブなまたは内在性のTCRαおよび／またはTCRβ定常ドメインに対して100％未満のアミノ酸配列同一性を有する、TCRαおよび／もしくはTCRβ定常ドメインまたはこれらの一部をコードする。いくつかの態様では、TCRαおよび／またはTCRβ定常ドメインは、対応するネイティブなまたは内在性のTCRαおよび／またはTCRβ鎖に対して70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、もしくは99％を越える同一性を有する、約70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、もしくは99％を越える同一性を有する、または少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％、99％、もしくは99％を越える同一性を有するが、100％未満の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０４３２】
ある特定の態様では、導入遺伝子は、TCRα鎖とTCRβ鎖の間に1つまたは複数の非天然ジスルフィド架橋を形成することができる1つまたは複数のシステイン残基を導入するために、1つまたは複数の修飾を含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、SEQ ID NO:24に記載される番号付けで位置48に対応する位置にシステインを含むTCRα定常ドメインを含むTCRα鎖またはその一部をコードする。いくつかの態様では、TCRα定常ドメインは、SEQ ID NO:19もしくは24のいずれかに記載されるアミノ酸配列か、またはそれらに対して70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％の配列同一性を有し、約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％の配列同一性を有し、もしくは少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％の配列同一性を有し、TCRβ鎖と非天然ジスルフィド結合を形成することができる1つまたは複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を有する。いくつかの態様では、導入遺伝子は、SEQ ID NO:20に記載される番号付けで位置57に対応する位置にシステインを含むTCRβ定常ドメインを含むTCRβ鎖またはその一部コードする。いくつかの態様では、TCRβ定常ドメインは、SEQ ID NO:20、21、もしくは25のいずれかに記載されるアミノ酸配列か、またはそれらに対して70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％の配列同一性を有し、約70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％の配列同一性を有し、もしくは少なくとも70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％の配列同一性を有し、TCRαと鎖非天然ジスルフィド結合を形成することができる1つまたは複数のシステイン残基を含むアミノ酸配列を有する。
【０４３３】
特定の態様では、導入遺伝子は、1つまたは複数のジスルフィド結合を導入するための1つまたは複数の修飾を含む、TCRαおよび／もしくはTCRβ鎖ならびに／またはTCRαおよび／もしくはTCRβ鎖定常ドメインをコードする。いくつかの態様では、導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子にコードされるTCRαと内在性TCRβ鎖の間、または導入遺伝子にコードされるTCRβと内在性TCRα鎖の間のネイティブなジスルフィド結合を除去または防止するための1つまたは複数の修飾を有する、TCRαおよび／もしくはTCRβ鎖ならびに／またはTCRαおよび／もしくはTCRβをコードする。いくつかの態様では、ネイティブな鎖間ジスルフィド結合を形成するおよび／または形成することができる1つまたは複数のネイティブなシステインが、別の残基、例えば、セリンまたはアラニンに置換される。いくつかの態様では、TCRαおよび／もしくはTCRβ鎖ならびに／またはTCRαおよび／もしくはTCRβ鎖定常ドメインは、1つまたは複数の非システイン残基をシステインに置き換えるように修飾される。いくつかの態様では、1つまたは複数の非天然システイン残基は、例えば、導入遺伝子にコードされる組換えのTCRαとTCRβ鎖の間で、非天然ジスルフィド結合を形成することができる。いくつかの態様では、システインは、SEQ ID NO:24に記載されるTCRα定常ドメインの番号付けを参照して、残基Thr48、Thr45、Tyr10、Thr45、およびSer15の1つまたは複数に導入される。ある特定の態様では、システインは、SEQ ID NO:20に記載されるTCRβ鎖の番号付けを参照して、TCRβ鎖の残基Ser57、Ser77、Ser17、Asp59、Glu15で導入することができる。TCRの例示的非天然ジスルフィド結合は、公開国際PCT第WO2006/000830号、第WO2006/037960号、およびKuball et al. (2007) Blood, 109:2331-2338に記載されている。いくつかの態様では、導入遺伝子は、1つまたは複数のジスルフィド結合を導入するための1つまたは複数の修飾を含むTCRα鎖および／またはTCRα定常ドメインの一部をコードする。
【０４３４】
いくつかの態様では、導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子にコードされるTCRα鎖と内在性TCRβ鎖の間のネイティブなジスルフィド結合を除去または防止するための1つまたは複数の修飾を有する、TCRα鎖および／またはTCRα定常ドメインの全部または一部をコードする。いくつかの態様では、ネイティブな鎖間ジスルフィド結合を形成するおよび／または形成することができる1つまたは複数のネイティブなシステインが、別の残基、例えば、セリンまたはアラニンに置換される。いくつかの態様では、TCRα鎖および／またはTCRα定常ドメインの一部は、1つまたは複数の非システイン残基をシステインに置き換えるように修飾される。いくつかの態様では、1つまたは複数の非天然システイン残基は、例えば、導入遺伝子にコードされるTCRβ鎖と非天然ジスルフィド結合を形成することができる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、例えば、導入遺伝子にコードされるTCRβ鎖と内在性TCRα鎖の間のネイティブなジスルフィド結合を除去または防止するための1つまたは複数の修飾を有する、TCRβ鎖および／またはTCRβ定常ドメインの全部または一部をコードする。いくつかの態様では、ネイティブな鎖間ジスルフィド結合を形成するおよび／または形成することができる1つまたは複数のネイティブなシステインが、別の残基、例えば、セリンまたはアラニンに置換される。いくつかの態様では、TCRβ鎖および／またはTCRβ定常ドメインの一部は、1つまたは複数の非システイン残基をシステインに置き換えるように修飾される。
【０４３５】
いくつかの態様では、1つまたは複数の非天然システイン残基は、例えば、導入遺伝子にコードされるTCRα鎖と非天然ジスルフィド結合を形成することができる。いくつかの態様では、1つまたは複数の異なる標的部位で導入遺伝子の組み込みをターゲティングするために、1種または複数種の異なる鋳型ポリヌクレオチドが使用される。異なる標的部位で組み込みをターゲティングするために、1つまたは複数の遺伝子破壊（例えばDNA切断）が標的部位の1つまたは複数に引き起こされ；導入遺伝子の組み込みをそれぞれの標的部位にターゲティングするために、1種または複数種の異なる相同配列が使用される。いくつかの態様では、各部位に挿入される導入遺伝子は、同じであるか、または実質的に同じである。いくつかの態様では、各部位に挿入される導入遺伝子は異なる。いくつかの態様では、タンパク質の2つ以上の異なるドメインまたは鎖をコードする2つ以上の異なる導入遺伝子が、1つまたは複数の標的部位に挿入される。いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、組換えTCRの1つの鎖をコードし、第2の導入遺伝子は、組換えTCRの異なる鎖をコードする。いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、組換えTCRのアルファ（TCRα）鎖をコードし、第2の導入遺伝子は、組換えTCRのベータ（TCRβ）鎖をコードする。いくつかの態様では、組換え受容体の異なるドメインをコードする2つ以上の導入遺伝子が、2つ以上の標的部位における組み込みのためにターゲティングされる。例えば、いくつかの態様では、組換えTCRアルファ鎖をコードする導入遺伝子がTRAC座位での組み込みのためにターゲティングされ、組換えTCRβ鎖をコードする導入遺伝子が、TRBC1および／またはTRBC2座位における組み込みのためにターゲティングされる。
【０４３６】
いくつかの態様では、2つ以上の異なる鋳型ポリヌクレオチドが、2つ以上の異なる内在性遺伝子座における組み込みのために2つ以上の導入遺伝子をターゲティングするのに使用される。いくつかの態様では、第1の鋳型ポリヌクレオチドは組換え受容体をコードする導入遺伝子を含む。いくつかの態様では、第2の鋳型ポリヌクレオチドは、1種または複数種の第2の導入遺伝子、例えば、1種または複数種異なる分子、ポリペプチド、および／または因子をコードする、1種または複数種の第2の導入遺伝子を含む。本明細書において提供される鋳型ポリヌクレオチドの説明または特徴付けのいずれも、1種または複数種の第2の鋳型ポリヌクレオチドに適用することもできる。
【０４３７】
いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子が、TRAC遺伝子中の少なくとも1つの標的部位のうちの1つ、またはその近くにおける組み込みのためにターゲティングされる。いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子が、TRBC1もしくはTRBC2遺伝子中の少なくとも1つの標的部位のうちの1つ、またはその近くにおける組み込みのためにターゲティングされる。いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子、もしくはTRBC2遺伝子中の少なくとも1つの標的部位のうちの1つ、またはその近くにおける組み込みのためにターゲティングされ、1種または複数種の第2の導入遺伝子が、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によって標的にされない標的部位の1つもしくは複数、またはその近くで組み込みのためにターゲティングされる。
【０４３８】
いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子にコードされる分子、ポリペプチド、または因子は、免疫細胞、例えばT細胞に共刺激シグナルを与えることできる、分子、ポリペプチド、因子、または作用物質である。いくつかの態様では、第2の導入遺伝子にコードされる分子、ポリペプチド、因子、または作用物質は、さらなる受容体、例えば、さらなる組換え受容体である。いくつかの態様では、さらなる受容体は、共刺激シグナルを与えることでき、および／または阻害性シグナルを無効にするか、もしくは逆転させることができる。
【０４３９】
いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子は、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性単鎖可変断片（scFv）、免疫調節性融合タンパク質、キメラスイッチ受容体（CSR）、または共受容体より選択される分子をコードする。
【０４４０】
いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子にコードされる分子、ポリペプチド、または因子は共刺激リガンドである。例示的共刺激リガンドとしては、腫瘍壊死因子（TNF）リガンドまたは免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーリガンドが挙げられる。いくつかの態様では、例示的TNFリガンドとしては、4-1BBL、OX40L、CD70、LIGHT、およびCD30Lが挙げられる。いくつかの態様では、例示的Igスーパーファミリーリガンドとしては、CD80およびCD86が挙げられる。いくつかの態様では、共刺激リガンドとしては、CD3、CD27、CD28、CD83、CD127、4-1BB、PD-1、またはPDILが挙げられる。いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子にコードされる分子、ポリペプチド、または因子は、サイトカイン、例えば、IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、IL7、IL-15、IL-21、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンアルファ（IFN-α）、インターフェロンベータ（IFN-β）、またはインターフェロンガンマ（IFN-γ）、およびエリスロポエチンである。1種または複数種の第2の導入遺伝子にコードされ得る例示的共刺激リガンドおよびサイトカインとしては、例えばWO2008121420に記載されているものが挙げられる。
【０４４１】
いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子にコードされる分子、ポリペプチド、または因子は、免疫抑制活性または免疫賦活性活性を有するポリペプチド、例えば、CD47、PD-1、CTLA-4、およびそれらのリガンド、またはCD28、OX-40、4-1BB、およびそれらのリガンドに結合する可溶性単鎖可変断片（scFv）、例えばscFvである。1種または複数種の第2の導入遺伝子にコードされ得る例示的scFvとしては、例えばWO2014134165に記載されているものが挙げられる。
【０４４２】
いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子にコードされる分子、ポリペプチド、または因子は、免疫調節性融合タンパク質またはキメラスイッチ受容体（CSR）である。いくつかの態様では、コードされる免疫調節性融合タンパク質は、(a)標的に特異的に結合する結合ドメインから構成される細胞外成分、(b)細胞内シグナリングドメインから構成される細胞内成分、ならびに(c)細胞外成分と細胞内成分を接続する疎水性成分を含む。いくつかの態様では、コードされる免疫調節性融合タンパク質は、(a)CD200R、SIRPα、CD279（PD-1）、CD2、CD95（Fas）、CD152（CTLA4）、CD223（LAG3）、CD272（BTLA）、A2aR、KIR、TIM3、CD300、またはLPA5に由来する抗原に特異的に結合する、細胞外結合ドメイン；(b)CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD47、CD79A、CD79B、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）、CD150（SLAMF1）、CD278（ICOS）、CD357（GITR）、CARD11、DAP10、DAP12、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRFM、Zap70、PTCH2、またはこれらの任意の組み合わせに由来する、細胞内シグナリングドメイン；および(c)CD2、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CD80、CD86、CD95（Fas）、CD134（OX40）、CD137（4-1BB）、CD150（SLAMF1）、CD152（CTLA4）、CD200R、CD223（LAG3）、CD270（HVEM）、CD272（BTLA）、CD273（PD-L2）、CD274（PD-L1）、CD278（ICOS）、CD279（PD-1）、CD300、CD357（GITR）、A2aR、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、GAL9、KIR、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PTCH2、ROR2、Ryk、Slp76、SIRPα、pTα、TCRα、TCRβ、TIM3、TRIM、LPA5、またはZap70に由来する、疎水性膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子にコードされる分子、ポリペプチド、または因子は、キメラスイッチ受容体（CSR）、例えば、PD1のトランケートされた細胞外ドメインおよびCD28の膜貫通シグナリングドメインを含むCSRである。1種または複数種の第2の導入遺伝子にコードされ得る例示的免疫調節性融合タンパク質またはCSRとしては、例えば、WO2014134165。US2014/0219975、WO2013/019615、およびLiu et al., Cancer Res. (2016) 76(6):1578-90に記載されているものが挙げられる。
【０４４３】
いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子にコードされる分子、ポリペプチド、または因子は共受容体である。いくつかの態様では、例示的共受容体としてはCD4またはCD8が挙げられる。
【０４４４】
いくつかの態様では、1つまたは複数の標的部位は、TRAC、TRBC1、および／もしくはTRBC2座位の1つもしくは複数、またはその近くにある。いくつかの態様では、第1の標的部位は、TRAC遺伝子座のコード配列、またはその近くにあり、第2の標的部位は、TRBC1遺伝子座のコード配列、またはその近くにある。いくつかの態様では、第1の標的部位は、TRAC遺伝子座のコード配列、またはその近くにあり、第2の標的部位は、TRBC2遺伝子座のコード配列、またはその近くにある。いくつかの態様では、第1の標的部位は、TRAC遺伝子座のコード配列、またはその近くにあり、第2の標的部位は、TRBC1座位とTRBC2座位の両方、例えば、TRBC1とTRBC2の間で保存されている配列にある。
【０４４５】
いくつかの態様では、1つまたは複数の異なるDNA部位、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2座位が標的にされ、1種または複数種の導入遺伝子が各部位に挿入される。いくつかの態様では、各部位に挿入される導入遺伝子は、同じであるか、または実質的に同じである。いくつかの態様では、各部位に挿入される導入遺伝子は異なる。いくつかの態様では、導入遺伝子は標的部位（例えばTRAC座位）のうちの1つのみに挿入され、別の標的部位は遺伝子編集（例えばノックアウト）のための標的にされる。
【０４４６】
いくつかの態様では、相同性アームの長さおよび位置ならびに標的部位に対する相対位置のいずれも、例えば、本明細書において記載されるいかなるものも、1種または複数種の第2の鋳型ポリヌクレオチドに適用することもできる。
【０４４７】
いくつかの態様では、ヌクレアーゼ誘導性HDRは、標的挿入のための導入遺伝子の発現のために、導入遺伝子（「外来性配列」または「導入遺伝子配列」とも呼ばれる）の挿入をもたらす。鋳型ポリヌクレオチド配列は、典型的には、それが配置されるゲノム配列と同一ではない。鋳型ポリヌクレオチド配列は、関心対象の場所で効率的なHDRを可能にするために、2つの相同領域が隣接する非相同配列を含むことができる。さらに、鋳型ポリヌクレオチド配列は、細胞のクロマチン中の関心対象の領域と相同でない配列を含むベクター分子を含むことができる。鋳型ポリヌクレオチド配列は、細胞のクロマチンと相同ないくつかの非連続的な領域を含むことができる。例えば、関心対象の領域中に通常は存在しない配列の標的挿入のために、該配列は、導入遺伝子中に存在していてもよく、関心対象の領域中の配列と相同の領域が隣接していてもよい。
【０４４８】
いくつかの局面では、ゲノム中の標的場所に挿入されるかまたは組み込まれる、コードおよび／または非コード配列および／または部分的コード配列を含めた関心対象の核酸配列は、「導入遺伝子」、「導入遺伝子配列」、「外来性核酸配列」、「異種配列」、または「ドナー配列」とも称され得る。いくつかの局面では、導入遺伝子は、T細胞、例えばヒトT細胞のゲノム中の特定の標的座位または標的場所の内在性ゲノム配列などの内在性ゲノム配列に対して外来性または異種性である核酸配列である。いくつかの局面では、導入遺伝子は、T細胞、例えばヒトT細胞の標的座位または標的場所の内在性ゲノム配列と比較して改変されているまたは異なる配列である。いくつかの局面では、導入遺伝子は、異なる遺伝子、種および／または起源に由来する核酸配列から生じるか、または該核酸配列と比較して改変されている核酸配列である。いくつかの局面では、導入遺伝子は、同じ種の異なる座位、例えば、異なるゲノム領域または異なる遺伝子からの配列に由来する配列である。
【０４４９】
挿入のためのポリヌクレオチドは、「導入遺伝子」または「外来性配列」、または「ドナー」ポリヌクレオチドもしくは分子とも称され得る。鋳型ポリヌクレオチドは、一本鎖および／または二本鎖のDNAでもよく、直鎖状または環状の形態で細胞中に導入することができる。鋳型ポリヌクレオチドは、一本鎖および／または二本鎖のRNAでもよく、RNA分子（例えば、RNAウイルスの一部）として導入することができる。米国特許出願公開第20100047805号および第20110207221号も参照されたい。鋳型ポリヌクレオチドはDNA形態でも導入することができ、これは、環状または直鎖状形態で細胞中に導入することができる。直鎖状形態で導入される場合は、鋳型ポリヌクレオチドの末端は、公知の方法によって、（例えば、エキソヌクレアーゼの分解から）保護され得る。例えば、1つもしくは複数のジデオキシヌクレオチド残基が直鎖状分子の3’末端に加えられ、および／または自己相補的なオリゴヌクレオチドが一端もしくは両端にライゲーションされる。例えば、Chang et al. (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:4959-4963；Nehls et al. (1996) Science 272:886-889を参照されたい。外来性ポリヌクレオチドを分解から保護するためのさらなる方法としては、限定されないが、末端アミノ基の付加、ならびに例えば、ホスホロチオエート、ホスホロアミデート、およびO-メチルリボースまたはデオキシリボース残基などの修飾ヌクレオチド間連結の使用が挙げられる。二本鎖形態で導入される場合は、鋳型ポリヌクレオチドは、1つまたは複数のヌクレアーゼ標的部位、例えば、細胞中のゲノム中に組み込まれる導入遺伝子に隣接するヌクレアーゼ標的部位を含むことができる。例えば、米国特許出願公開第20130326645号を参照されたい。
【０４５０】
いくつかの態様では、二本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、1kbを越える長さ、例えば2〜200kbの間、2〜10kbの間（または、これらの間の任意の値）の配列（導入遺伝子とも称される）を含む。二本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、少なくとも1つのヌクレアーゼ標的部位も含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば1対のZFNまたはTALENのために、少なくとも2つの標的部位を含む。典型的には、ヌクレアーゼ標的部位は、導入遺伝子の開裂ために、導入遺伝子配列の外側、例えば、導入遺伝子配列に対して5’および／または3’にある。ヌクレアーゼ開裂部位は、いかなるヌクレアーゼに対するものであってもよい。いくつかの態様では、二本鎖鋳型ポリヌクレオチド中に含まれるヌクレアーゼ標的部位は、開裂した鋳型ポリヌクレオチドが相同性非依存的方法を介して組み込まれる内在性標的を開裂させるのに使用されるのと同じヌクレアーゼに対するものである。
【０４５１】
いくつかの態様では、核酸鋳型システムは二本鎖である。いくつかの態様では、核酸鋳型システムは一本鎖である。いくつかの態様では、核酸鋳型システムは一本鎖部分および二本鎖部分を含む。
【０４５２】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、5’および3’末端の相同配列（「相同性アーム」とも呼ばれる）が隣接して、導入遺伝子、例えば、組換え受容体をコードする核酸配列を含み、その結果、DNA修復機構、例えば相同組換え機構が可能になり、修復のための鋳型として鋳型ポリヌクレオチドを使用し、ゲノムの標的組み込み部位に導入遺伝子を効果的に挿入する。相同性アームは、例えば、切除された一本鎖突出が鋳型ポリヌクレオチド内の相補性領域を見つけることを可能にするために、少なくとも末端切除が生じ得る領域まで延びるべきである。全体の長さは、プラスミドサイズまたはウイルスのパッケージング制限などのパラメーターによって制限され得る。いくつかの態様では、相同性アームは反復エレメント、例えば、ALU反復またはLINE反復中には延びない。
【０４５３】
例示的相同性アーム長としては、少なくとも50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチド、または少なくとも約50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチドが挙げられ、あるいは例示的相同性アーム長は、50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチドであるか、または約50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、または5000ヌクレオチドである。いくつかの態様では、相同性アーム長は、50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000、2000〜3000、3000〜4000、または4000〜5000ヌクレオチドである。例示的相同性アーム長としては、50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチド未満、または約50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチド未満が挙げられ、あるいは例示的相同性アーム長は、50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチドであるか、または約50、100、200、250、300、400、500、600、700、750、800、900、1000、2000、3000、4000、もしくは5000ヌクレオチドである。いくつかの態様では、相同性アーム長は、50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000、2000〜3000、3000〜4000、または4000〜5000ヌクレオチドである。
【０４５４】
標的部位（「標的位置」、「標的DNA配列」、または「標的場所」としても公知である）は、いくつかの態様では、遺伝子破壊を誘導することができる1種または複数種の作用物質、例えば、Cas9分子によって改変される標的DNA（例えば染色体）上の部位を指す。例えば、標的部位は、標的部位におけるDNAの改変されたCas9分子開裂、および標的部位における鋳型ポリヌクレオチド誘導性改変、例えば導入遺伝子の標的挿入であり得る。いくつかの態様では、標的部位は、1つまたは複数のヌクレオチドが加えられるDNA上の2つのヌクレオチド、例えば隣接するヌクレオチド間の部位でもよい。標的部位は、鋳型ポリヌクレオチドによって変化させられる1つまたは複数のヌクレオチドを含み得る。いくつかの態様では、標的部位は標的配列（例えば、gRNAが結合する配列）内にある。いくつかの態様では、標的部位は標的配列（例えば、gRNAが結合する配列）の上流または下流にある。いくつかの局面では、標的部位の両側に1対の一本鎖切断（例えば、ニック）が引き起こされ得る。
【０４５５】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、内在性遺伝子の標的部位の両側に、約500〜1000、例えば600〜900、または700〜800塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2遺伝子、座位、またはオープンリーディングフレーム（例えば、本明細書の表1〜3に記載されている）内の標的部位の5’、標的部位の3’、または標的部位の5’と3’の両方に少なくとも200、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000塩基対の相同性、または200、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000塩基対未満の相同性、または約200、300、400、500、600、700、800、900、もしくは1000塩基対の相同性を含む。
【０４５６】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位の3’に、約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、または5000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、導入遺伝子および／または標的部位の3’に、約100〜500、200〜400、または250〜350塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2遺伝子、座位、またはオープンリーディングフレーム（例えば、本明細書の表1〜3に記載されている）内の標的部位の5’に、約100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、または10塩基対未満の相同性を含む。
【０４５７】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位の5’に、約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、または5000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、導入遺伝子および／または標的部位の5’に、約100〜500、200〜400、または250〜350塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2遺伝子、座位、またはオープンリーディングフレーム（例えば、本明細書の表1〜3に記載されている）内の標的部位の3’に、約100、90、80、70、60、50、40、30、20、15、または10塩基対未満の相同性を含む。
【０４５８】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位の構造を変えるために、遺伝子破壊を導入することができる1種または複数種の作用物質とともに使用することができる、核酸配列に対するものである。いくつかの態様では、標的部位は、典型的には、開裂部位またはその近くで、鋳型ポリヌクレオチドの配列のいくつか、または全部を有するように改変される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは一本鎖である。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは二本鎖である。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、DNA、例えば二本鎖DNAである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは一本鎖DNAである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、Cas9およびgRNAと同じベクター骨格、例えば、AAVゲノム、プラスミドDNAにコードされる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、インビボでベクター骨格から切除され、例えば、これはgRNA認識配列が隣接している。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、Cas9およびgRNAと別々のポリヌクレオチド分子上にある。いくつかの態様では、Cas9およびgRNAはリボ核タンパク質（RNP）複合体の形態で導入され、鋳型ポリヌクレオチドは、例えばベクター中のポリヌクレオチド分子として導入される。
【０４５９】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、相同組換え修復イベントに関与することによって、導入遺伝子の挿入など、標的部位の構造を変える。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位の配列を変える。
【０４６０】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を導入することができる1種または複数種の作用物質によって開裂させられる標的配列上の部位に対応する配列を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を導入することができる第1の作用物質で開裂させられる標的配列上の第1の部位と遺伝子破壊を導入することができる第2の作用物質で開裂させられる標的配列上の第2の部位の両方に対応する配列を含む。
【０４６１】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは以下の成分を含む：［5’相同性アーム］−［導入遺伝子］−［3’相同性アーム]。相同性アームは、染色体中への組換え、したがって、開裂部位、例えば標的部位またはその近くのDNA中への導入遺伝子の挿入をもたらす。いくつかの態様では、相同性アームは最も遠位の標的部位に隣接する。
【０４６２】
いくつかの態様では、5’相同性アームの3’末端は導入遺伝子の5’末端の隣の位置である。いくつかの態様では、5’相同性アームは、導入遺伝子の5’末端から5’に少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、または5000ヌクレオチド延び得る。
【０４６３】
いくつかの態様では、3’相同性アームの5’末端は導入遺伝子の3’末端の隣の位置である。いくつかの態様では、3’相同性アームは、導入遺伝子の3’末端から3’に少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、または5000ヌクレオチド延び得る。
【０４６４】
いくつかの態様では、標的挿入のために、相同性アーム、例えば、5’および3’相同性アームは、最も遠位のgRNAに隣接する約1000塩基対（bp）の配列（例えば、突然変異のいずれかの側の1000bpの配列）をそれぞれ含むことができる。
【０４６５】
いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子を含む1種または複数種の第2の鋳型ポリヌクレオチドを導入することができる。いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子が、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位のうちの1つ、またはその近くにおける組み込みのためにターゲティングされる。
【０４６６】
いくつかの態様では、1種または複数種の第2の鋳型ポリヌクレオチドは、構造［第2の5’相同性アーム］−［1種または複数種の第2の導入遺伝子］−［第2の3’相同性アーム]を含む。相同性アームは、染色体中への組換え、したがって、開裂部位、例えば標的部位またはその近くのDNA中への導入遺伝子の挿入をもたらす。いくつかの態様では、相同性アームは最も遠位の開裂部位に隣接する。いくつかの態様では、第2の5’相同性アームおよび第2の3’相同性アームは、少なくとも1つの標的部位の周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む。いくつかの態様では、第2の5’相同性アームは、標的部位の第2の5’の核酸配列に相同な核酸配列を含む。いくつかの態様では、第2の3’相同性アームは、標的部位の第2の3’の核酸配列に相同な核酸配列を含む。いくつかの態様では、第2の5’相同性アームおよび第2の3’相同性アームは、独立に、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対であり、あるいは10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対未満、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対未満である。いくつかの態様では、第2の5’相同性アームおよび第2の3’相同性アームは、独立に約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000塩基の間である。いくつかの態様では、第2の5’相同性アームおよび第2の3’相同性アームは、独立に、約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対である。
【０４６７】
いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子が、TRAC遺伝子中の標的部位（例えば、本明細書の表1に記載されている）、またはその近くにおける組み込みのためにターゲティングされる。いくつかの態様では、1種または複数種の第2の導入遺伝子が、TRBC1またはTRBC2遺伝子中の標的部位（例えば、本明細書の表2〜3に記載されている）、またはその近くにおける組み込みのためにターゲティングされる。
【０４６８】
ある特定の配列反復エレメント、例えば、Alu反復またはLINEエレメントを含むことを回避するために、一方または両方の相同性アームを短縮することができることが、本明細書において意図される。例えば、配列反復エレメントを回避するために、5’相同性アームを短縮することができる。いくつかの態様では、配列反復エレメントを回避するために、3’相同性アームを短縮することができる。いくつかの態様では、ある特定の配列反復エレメントを含むことを回避するために、5’と3’の両方の相同性アームを短縮することができる。一本鎖オリゴヌクレオチド、例えば、一本鎖オリゴデオキシヌクレオチド（ssODN）として使用するために、標的挿入のための鋳型ポリヌクレオチドを設計することができることが本明細書において意図される。ssODNを使用する場合は、5’および3’相同性アームは、約200塩基対（bp）までの長さ、例えば、少なくとも25、50、75、100、125、150、175、または200bpの長さにおよび得る。オリゴヌクレオチド合成の改善が行われ続けられているので、ssODNについてより長い相同性アームも意図される。いくつかの態様では、より長い相同性アームは、化学合成以外の方法によって、例えば、長い二本鎖核酸を変性させ、例えば、固体基材に固定された鎖特異的配列に対する親和性によって片方の鎖を精製することによって作製される。
【０４６９】
いくつかの態様では、代替HDRは、鋳型ポリヌクレオチドが標的部位に対して5’（すなわち、標的部位の鎖の5’方向）に相同性が延びている場合に、より効率的に進行する。したがって、いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、より長い相同性アームおよびより短い相同性アームを有し、より長い相同性アームは標的部位の5’にアニールすることができる。いくつかの態様では、標的部位に対して5’にアニールすることができるアームは、標的部位または導入遺伝子の5’もしくは3’末端から少なくとも25、50、75、100、125、150、175、または200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、3000、4000、または5000ヌクレオチドである。いくつかの態様では、標的部位に対して5’にアニールすることができるアームは、標的部位に対して3’にアニールすることができるアームよりも少なくとも10％、20％、30％、40％、または50％長い。いくつかの態様では、標的部位に対して5’にアニールすることができるアームは、標的部位に対して3’にアニールすることができるアームよりも少なくとも2×、3×、4×、または5×長い。ssDNA鋳型がインタクト鎖または標的部位鎖にアニールすることができるかどうかに応じて、標的部位に対して5’にアニールする相同性アームは、それぞれ、ssDNA鋳型5’末端またはssDNA鋳型の3’末端にあり得る。
【０４７０】
同様に、いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、5’相同性アーム、導入遺伝子、および3’相同性アームを有し、その結果、鋳型ポリヌクレオチドは標的部位の5’へ延びた相同性を含む。例えば、5’相同性アームおよび3’相同性アームは実質的に同じ長さでもよいが、導入遺伝子は標的部位の3’よりも標的部位の5’でさらに延びてもよい。いくつかの態様では、相同性アームは、標的部位の3’末端よりも標的部位の5’末端で、少なくとも10％、20％、30％、40％、50％、2×、3×、4×、または5×さらに延びる。
【０４７１】
いくつかの態様では、代替HDRは、鋳型ポリヌクレオチドが標的部位に入る場合に、より効率的に進行する。したがって、いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、本質的に同じサイズの2つの相同性アームを有する。
【０４７２】
例えば、鋳型ポリヌクレオチドの第1の相同性アームは、鋳型ポリヌクレオチドの第2の相同性アームの10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、または1％以内の長さを有し得る。
【０４７３】
同様に、いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位の両側で実質的に同じ距離が延びるように、5’相同性アーム、導入遺伝子、および3’相同性アームを有する。例えば、相同性アームは異なる長さを有し得るが、導入遺伝子は、これを補償するように選択され得る。例えば、導入遺伝子は、標的部位の3’で延びるよりも、標的部位から5’でさらに延び得るが、標的部位の5’の相同性アームは、補償するために、標的部位の3’の相同性アームよりも短い。逆も可能であり、例えば、導入遺伝子は、標的部位の5’で延びるよりも、標的部位から3’でさらに延び得るが、標的部位の3’の相同性アームは、補償するために、標的部位の5’の相同性アームよりも短い。
【０４７４】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは一本鎖核酸である。別の態様では、鋳型ポリヌクレオチドは二本鎖核酸である。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的DNAに付加されるか、または標的DNAの変化の鋳型になる（template）であろう、例えば1つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位を改変するために使用することができるヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば標的部位の標的DNAの野生型配列に対応する、例えば1つまたは複数のヌクレオチドのヌクレオチド配列を含む。
【０４７５】
鋳型ポリヌクレオチドは導入遺伝子を含むことができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは5’相同性アームを含む。いくつかの態様では、鋳型核酸は3’相同性アームを含む。
【０４７６】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは直鎖状二本鎖DNAである。長さは、例えば、約200〜5000塩基対、例えば、約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000塩基対でもよい。長さは、例えば、少なくとも200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000塩基対でもよい。いくつかの態様では、長さは、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000塩基対以下である。いくつかの態様では、二本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、約160塩基対、例えば、約200〜4000、300〜3500、400〜3000、500〜2500、600〜2000、700〜1900、800〜1800、900〜1700、1000〜1600、1100〜1500、または1200〜1400塩基対の長さを有する。
【０４７７】
鋳型ポリヌクレオチドは直鎖状一本鎖DNAでもよい。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、(i)標的DNAのニックが入った鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖DNA、(ii)標的DNAのインタクトな鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖DNA、(iii)標的DNAの転写される鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖DNA、(iv)標的DNAの転写されない鎖にアニールすることができる直鎖状一本鎖DNA、または上記の複数である。
【０４７８】
長さは、例えば、約200〜5000塩基対、例えば、約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000ヌクレオチドでもよい。長さは、例えば、少なくとも200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000ヌクレオチドでもよい。いくつかの態様では、長さは、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、または5000ヌクレオチド以下である。いくつかの態様では、一本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、約160ヌクレオチド、例えば、約200〜4000、300〜3500、400〜3000、500〜2500、600〜2000、700〜1900、800〜1800、900〜1700、1000〜1600、1100〜1500、または1200〜1400ヌクレオチドの長さを有する。
【０４７９】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、環状二本鎖DNA、例えばプラスミドである。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、導入遺伝子および／または標的部位の両側に、約500〜1000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5’、標的部位もしくは導入遺伝子の3’、または標的部位もしくは導入遺伝子の5’と3’の両方に、約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5’、標的部位もしくは導入遺伝子の3’、または標的部位もしくは導入遺伝子の5’と3’の両方に、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5’、標的部位もしくは導入遺伝子の3’、または標的部位もしくは導入遺伝子の5’と3’の両方に、10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対以下の相同性を含む。
【０４８０】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチド、例えば、鋳型ポリヌクレオチドのいずれかの長さは、例えば、200〜10000ヌクレオチド、または約200〜10000ヌクレオチド、例えば、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチド、または約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチド、あるいは前述のいずれかの間の値でもよい。いくつかの態様では、長さは、例えば、少なくとも200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチド、または約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチド、あるいは前述のいずれかの間の値でもよい。いくつかの態様では、長さは、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチド以下、または約200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600、1800、2000、2500、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチド以下である。いくつかの態様では、長さは、200〜4000、300〜3500、400〜3000、500〜2500、600〜2000、700〜1900、800〜1800、900〜1700、1000〜1600、1100〜1500、もしくは1200〜1400ヌクレオチド、または約200〜4000、300〜3500、400〜3000、500〜2500、600〜2000、700〜1900、800〜1800、900〜1700、1000〜1600、1100〜1500、または1200〜1400ヌクレオチドである。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、少なくとも2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチドの長さ、または約2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチドの長さ、あるいは前述のいずれかの間の任意の値である。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、2500もしくは約2500から5000もしくは約5000ヌクレオチド、3500もしくは約3500から4500もしくは約4500ヌクレオチド、または3750もしくは約3750ヌクレオチドから4250ヌクレオチドもしくは約4250ヌクレオチドの間の長さである。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチドの長さ、または約2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、または10000ヌクレオチドの長さである。
【０４８１】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、内在性TRAC座位（ヒトTRAC遺伝子座の例示的ヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:1；NCBI参照配列：NG_001332.3、TRACに記載される、または本明細書の表1に記載される）をターゲティングするための相同性アームを含む。いくつかの態様では、TRAC座位の遺伝子破壊は遺伝子の初期コード領域に導入され、この初期コード領域には、転写開始点の直後、コード配列の第1エクソン内、または転写開始点から500bp以内（例えば、500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満）、または開始コドンから500bp以内（例えば、500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満）の配列が含まれる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、本明細書のセクションI.Aに記載される標的ヌクレアーゼおよび／またはgRNAのいずれかを使用して導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的ヌクレアーゼおよび／またはgRNAによって導入される遺伝子破壊の両側に、約500〜1000、例えば、600〜900、または700〜800塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、（例えば、TRAC座位における）遺伝子破壊の5’の500、600、700、800、900、または1000塩基対の配列に相同な約500、600、700、800、900、または1000塩基対の5’相同性アーム配列、導入遺伝子、および（例えば、TRAC座位における）遺伝子破壊の3’の500、600、700、800、900、または1000塩基対の配列に相同な約500、600、700、800、900、または1000塩基対の3’相同性アーム配列を含む。いくつかの態様では、TRAC座位でのターゲティング組み込みのための例示的な5’および3’相同性アームは、それぞれSEQ ID NO:124および125に記載される。いくつかの態様では、TRAC座位でのターゲティング組み込みのための例示的な5’および3’相同性アームは、それぞれSEQ ID NO:227〜233および234〜240に記載される。
【０４８２】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、内在性TRBC1またはTRBC2座位（ヒトTRBC1遺伝子座の例示的ヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:2；NCBI参照配列：NG_001333.2、TRBC1に記載され、本明細書の表2に記載される；ヒトTRBC2遺伝子座の例示的ヌクレオチド配列は、SEQ ID NO:3；NCBI参照配列：NG_001333.2、TRBC2に記載され、本明細書の表3に記載される）をターゲティングするための相同性アームを含む。いくつかの態様では、TRBC1またはTRBC2座位の遺伝子破壊は遺伝子の初期コード領域に導入され、この初期コード領域には、転写開始点の直後、コード配列の第1エクソン内、または転写開始点から500bp以内（例えば、500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満）、または開始コドンから500bp以内（例えば、500、450、400、350、300、250、200、150、100、もしくは50bp未満）の配列が含まれる。いくつかの態様では、遺伝子破壊は、本明細書のセクションI.Aに記載される標的ヌクレアーゼおよび／またはgRNAのいずれかを使用して導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的ヌクレアーゼおよび／またはgRNAによって導入される遺伝子破壊の両側に、約500〜1000、例えば、600〜900、または700〜800塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、（例えば、TRBC1またはTRBC2座位における）遺伝子破壊の5’の500、600、700、800、900、または1000塩基対の配列に相同な約500、600、700、800、900、または1000塩基対の5’相同性アーム配列、導入遺伝子、および（例えば、TRBC1またはTRBC2座位における）遺伝子破壊の3’の500、600、700、800、900、または1000塩基対の配列に相同な約500、600、700、800、900、または1000塩基対の3’相同性アーム配列を含む。
【０４８３】
いくつかの態様では、相同性アームの長さおよび位置ならびに標的部位に対する相対位置のいずれも、例えば、本明細書において記載されるいかなるものも、1種または複数種の第2の鋳型ポリヌクレオチドに適用することもできる。
【０４８４】
ある場合には、鋳型ポリヌクレオチドは、プロモーター、例えば、外来性である、および／または標的座位もしくはその近くに存在しないプロモーターを含む。いくつかの態様では、プロモーターは特定の細胞型でのみ発現を駆動する（例えば、T細胞またはB細胞またはNK細胞特異的プロモーター）。機能的ポリペプチドをコードする配列がプロモーターを有さない、いくつかの態様では、組み込まれた導入遺伝子の発現は、次いで、関心対象の領域中の内在性プロモーターまたは他の制御エレメントによって駆動される転写によって保証される。
【０４８５】
組換え受容体またはその抗原結合部分もしくはその鎖をコードする導入遺伝子、および／あるいは1種もしくは複数種の第2の導入遺伝子を含めて、導入遺伝子は、その発現が組込み部位にある内在性プロモーター、すなわち、導入遺伝子が挿入される内在性遺伝子（例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2）の発現を駆動するプロモーターによって駆動されるように、挿入することができる。例えば、導入遺伝子中のコード配列は、プロモーターなしであるが、内在性標的遺伝子のコード配列とインフレームで挿入することができ、その結果、組み込まれた導入遺伝子の発現は組込み部位にある内在性プロモーターの転写によって制御される。いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子、および／あるいは1種もしくは複数種の第2の導入遺伝子は、独立に、標的部位の遺伝子の内在性プロモーターと機能的に連結される。いくつかの態様では、リボソームスキップエレメント／自己開裂エレメント、例えば2Aエレメントが、導入遺伝子コード配列の上流に配置され、その結果、リボソームスキップエレメント／自己開裂エレメントが内在性遺伝子とインフレームで配置され、その結果、組換え体またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子、および／あるいは1種もしくは複数種の第2の導入遺伝子の発現が内在性TCRαプロモーターに機能的に連結される。
【０４８６】
いくつかの態様では、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子、および／または1種もしくは複数種の第2の導入遺伝子は、独立に、1つまたは複数のマルチシストロニックエレメントを含む。いくつかの態様では、1つまたは複数のマルチシストロニックエレメントは、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子、および／または1種もしくは複数種の第2の導入遺伝子の上流にある。いくつかの態様では、マルチシストロニックエレメントは、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子と1種または複数種の第2の導入遺伝子の間に配置される。いくつかの態様では、マルチシストロニックエレメントは、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列とTCRβまたはその一部をコードする核酸配列の間に配置される。いくつかの態様では、リボソームスキップエレメントは、T2A、P2A、E2A、もしくはF2A、または配列内リボソーム進入部位（IRES）の中より選択されるリボソームスキップエレメントをコードする配列含む。
【０４８７】
いくつかの態様では、コードされるTCRα鎖およびTCRβ鎖は、リンカーまたはスペーサー領域によって分離される。いくつかの態様では、TCRα鎖とTCRβ鎖を連結して単一ポリペプチド鎖を形成するリンカー配列が含まれる。いくつかの態様では、リンカーは、α鎖のC末端からβ鎖のN末端、またはその逆の間の距離にわたるのに十分な長さのものであり、一方で、リンカーの長さが、標的のペプチド-MHC複合体への結合を阻止するか、または低減させるほど長くないことも保証する。いくつかの態様では、リンカーは単一ポリペプチド鎖を形成することができ、同時にTCR結合特異性を保持する任意のリンカーでもよい。いくつかの態様では、リンカーは、10または約10から45アミノ酸、例えば、10〜30アミノ酸、または26〜41アミノ酸残基、例えば、29、30、31、または32アミノ酸を含むことができる。いくつかの態様では、リンカーは式-PGGG-(SGGGG)n-P-を有し、式中、nは5または6であり、Pはプロリンであり、Gはグリシンであり、Sはセリンである（SEQ ID NO:22）。いくつかの態様では、リンカーは、配列
2021520202.tif 000044
を有する。いくつかの態様では、プロテアーゼによって認識される、および／またはプロテアーゼによって開裂され得る、TCRα鎖またはその一部とTCRβ鎖またはその一部の間のリンカーまたはスペーサー。ある特定の態様では、TCRα鎖またはその一部とTCRβ鎖またはその一部の間のリンカーまたはスペーサーは、リボソームスキップエレメントまたは自己開裂エレメントを含む。
【０４８８】
いくつかの態様では、導入遺伝子は、構造［TCRβ鎖］−［リンカー］−［TCRα鎖］であるか、もしくは該構造を含むヌクレオチド配列であるか、または該ヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、導入遺伝子は、構造［TCRβ鎖］−［自己開裂エレメント］−［TCRα鎖］であるか、もしくは該構造を含むヌクレオチド配列であるか、または該ヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様では、導入遺伝子は、構造［TCRβ鎖］−［リボソームスキップ配列］−［TCRα鎖］であるか、もしくは該構造を含むヌクレオチド配列であるか、または該ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、導入遺伝子は、構造［TCRα鎖］−［リンカー］−［TCRβ鎖］であるか、もしくは該構造を含むヌクレオチド配列であるか、または該ヌクレオチド配列を含む。特定の態様では、導入遺伝子は、構造［TCRα鎖］−［自己開裂エレメント］−［TCRβ鎖］であるか、もしくは該構造を含むヌクレオチド配列であるか、または該ヌクレオチド配列を含む。ある特定の態様では、導入遺伝子は、構造［TCRα鎖］−［リボソームスキップ配列］−［TCRβ鎖］であるか、もしくは該構造を含むヌクレオチド配列であるか、または該ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様では、構造は、5’から3’の方向で、一本鎖または二本鎖ポリヌクレオチドのポリヌクレオチド鎖にコードされる。
【０４８９】
場合によっては、リボソームスキップエレメント／自己開裂エレメント、例えばT2Aは、リボソームに2AエレメントのC末端におけるペプチド結合の合成をスキップ（リボソームスキップ）させ、2A配列の末端と下流の次のペプチドの間で分離をもたらすことができる（例えば、Felipe, Genetic Vaccines and Ther. 2:13 (2004)およびde Felipe et al. Traffic 5:616-626 (2004)を参照されたい）。これにより、挿入された導入遺伝子は、組込み部位にある内在性プロモーター、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2プロモーターの転写によって制御されることが可能になる。例示的なリボソームスキップエレメント／自己開裂エレメントとしては、米国特許出願公開第20070116690号に記載されているように、口蹄疫ウイルス（F2A、例えば、SEQ ID NO:11）、ウマ鼻炎Aウイルス（E2A、例えば、SEQ ID NO:10）、ゾセア・アシグナ（Thosea asigna）ウイルス（T2A、例えば、SEQ ID NO:6または7）、およびブタテッショウウイルス-1（P2A、例えば、SEQ ID NO:8または9）由来の2A配列が挙げられる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、P2Aリボソームスキップエレメント（SEQ ID NO:8または9に記載される配列）を、導入遺伝子、例えば、組換え受容体をコードする核酸の上流に含む。
【０４９０】
いくつかの態様では、導入遺伝子は、プロモーターおよび／またはエンハンサー、例えば、構成的プロモーターまたは誘導性もしくは組織特異的プロモーターを含むことができる。いくつかの態様では、プロモーターは、構成的プロモーターであるか、または構成的プロモーターを含む。例示的構成的プロモーターとしては、例えば、シミアンウイルス40初期プロモーター（SV40）、サイトメガロウイルス最初期プロモーター（CMV）、ヒトユビキチンCプロモーター（UBC）、ヒト伸長因子1αプロモーター（EF1α）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター（PGK）、およびCMV初期エンハンサーと結合したニワトリβ-アクチンプロモーター（CAGG）が挙げられる。いくつかの態様では、構成的プロモーターは合成または改変プロモーターである。いくつかの態様では、プロモーターは、MNDプロモーター、すなわち、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーを有する改変MoMuLV LTRのU3領域を含む合成プロモーター（SEQ ID NO:18または126に記載される配列；Challita et al. (1995) J. Virol. 69(2):748-755を参照されたい）であるか、または該プロモーターを含む。いくつかの態様では、プロモーターは組織特異的プロモーターである。別の態様では、プロモーターはウイルス性プロモーターである。別の態様では、プロモーターは非ウイルス性プロモーターである。場合によっては、プロモーターは、ヒト伸長因子1アルファ（EF1α）プロモーター（SEQ ID NO:4または5に記載される配列）またはその改変形態（HTLV1エンハンサーを有するEF1αプロモーター；SEQ ID NO:127に記載される配列）またはMNDプロモーター（SEQ ID NO:18または126に記載される配列）の中より選択される。いくつかの態様では、導入遺伝子は調節エレメント、例えばプロモーターを含まない。
【０４９１】
いくつかの態様では、「タンデム」カセットは選択された部位に組み込まれる。いくつかの態様では、「タンデム」カセットの1つまたは複数は1種または複数種のポリペプチドまたは因子をコードし、これらは、それぞれが独立に調節エレメントによって制御されるか、または全てがマルチシストロニック発現システムとして制御される。いくつかの態様、例えば、ポリヌクレオチドが第1および第2の核酸配列を含む態様では、異なるポリペプチド鎖のそれぞれをコードするコード配列は、同じでもよいし、または異なっていてもよいプロモーターに、機能的に連結することができる。いくつかの態様では、核酸分子は、2つ以上の異なるポリペプチド鎖の発現を駆動するプロモーターを含むことができる。いくつかの態様では、そのような核酸分子は、マルチシストロニック（バイシストロニックまたはトリシストロニック。例えば、米国特許第6,060,273号を参照されたい）でもよい。いくつかの態様では、転写単位は、単一プロモーターからのメッセージによる遺伝子産物の共発現を可能にするIRES（配列内リボソーム進入部位）を含むバイシストロニック単位として改変することができる。あるいは、場合によっては、単一プロモーターは、単一オープンリーディングフレーム（ORF）において、本明細書において記載されるように、自己開裂ペプチド（例えば、2A配列）またはプロテアーゼ認識部位（例えば、フューリン）をコードする配列によって互いに分離された2つまたは3つのポリペプチドを含むRNAの発現を指示することができる。したがって、ORFは、単一ポリペプチドをコードし、これは、翻訳の間（2Aの場合）または翻訳の後のいずれかで、個々のタンパク質へプロセッシングされる。いくつかの態様では、「タンデムカセット」は、プロモーターを有さない配列、続いて転写終結配列を含むカセットの第1の成分、および自律発現カセットまたはマルチシストロニック発現配列をコードする第2の配列を含む。いくつかの態様では、タンデムカセットは、2つ以上の異なるポリペプチドまたは因子、例えば、組換え受容体の2つ以上の鎖またはドメインをコードする。いくつかの態様では、組換え受容体の2つ以上の鎖またはドメインをコードする核酸配列は、タンデム発現カセットまたはバイまたはマルチシストロニックカセットとして、1つの標的DNA組込み部位に導入される。
【０４９２】
導入遺伝子は、内在性遺伝子の全て、一部が発現する、または内在性遺伝子が全く発現しないように、内在性遺伝子中に挿入することができる。いくつかの態様では、（例えば、ペプチドをコードする配列を有する、または有さない）導入遺伝子は、任意の内在性座位に組み込まれる。いくつかの態様では、導入遺伝子は、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2遺伝子座に組み込まれる。
【０４９３】
いくつかの態様では、外来性配列は、転写または翻訳調節配列、例えば、プロモーター、エンハンサー、インスレーター、配列内リボソーム進入部位、2Aペプチドをコードする配列、および／またはポリアデニル化シグナルを含むこともできる。さらに、キメラ遺伝子（例えば、レポーター発現カセット）を作出するために、関心対象の遺伝子の制御エレメントをレポーター遺伝子に機能的に連結することができる。さらに、スプライス受容配列を含むこともできる。例示的な公知のスプライス受容部位配列としては、例えば、
2021520202.tif 000045
（ヒトHBB遺伝子由来）および
2021520202.tif 000046
（ヒト免疫グロブリンガンマ遺伝子由来）
が挙げられる。
【０４９４】
例示的な一態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、TRAC座位におけるターゲティングのための相同性アーム、調節配列、例えばプロモーター、および組換え受容体、例えばTCRをコードする核酸配列、を含む。例示的な一態様では、TRBC1および／またはTRBC2座位におけるターゲティングのための相同性アーム、調節配列、例えばプロモーター、ならびに別の因子をコードする核酸配列を含むさらなる鋳型ポリヌクレオチドが用いられる。
【０４９５】
いくつかの態様では、例示的鋳型ポリヌクレオチドは、HTLV1エンハンサーを有するヒト伸長因子1アルファ（EF1α）プロモーター（SEQ ID NO:127に記載される配列）もしくはMNDプロモーター（SEQ ID NO:126に記載される配列）の操作可能な制御下にある、または内在性標的遺伝子座（例えば、TRAC）から組換えTCRの発現を駆動するためにP2Aリボソームスキップエレメントをコードする核酸配列(SEQ ID NO:8に記載される配列）に連結された、組換えT細胞受容体をコードする導入遺伝子、ヒトTCRα定常領域（TRAC）遺伝子のエクソン1中の標的組込み部位周辺の配列に相同な、およそ600bpの5’相同性アーム配列（例えば、SEQ ID NO:124に記載される）、およそ600bpの3’相同性アーム配列（例えば、SEQ ID NO:125に記載される）を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、他の核酸配列、例えば、マーカー、例えば、表面マーカーまたは選択マーカーをコードする核酸配列をさらに含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、ウイルスベクター配列、例えばアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター配列をさらに含む。
【０４９６】
本明細書において記載される鋳型ポリヌクレオチドに含まれる導入遺伝子は、PCRなどの公知の標準的な技法を使用して、プラスミド、細胞、または他の供給源から単離することができる。使用のための鋳型ポリヌクレオチドは、環状スーパーコイル型、環状弛緩型、直鎖状などを含めた様々なタイプのトポロジーを含むことができる。あるいは、これは、標準的なオリゴヌクレオチド合成技法を使用して、化学合成することができる。さらに、鋳型ポリヌクレオチドは、メチル化されていてもよく、またはメチル化を欠いていてもよい。鋳型ポリヌクレオチドは、細菌または酵母の人工染色体（BACまたはYAC）の形態でもよい。
【０４９７】
ポリヌクレオチドは、例えば、複製開始点、プロモーター、および抗生物質抵抗性をコードする遺伝子などのさらなる配列を有するベクター分子の一部として、細胞中に導入することができる。さらに、鋳型ポリヌクレオチドは、ネイキッド核酸として、材料、例えば、リポソーム、ナノ粒子、もしくはポロキサマーと複合体化された核酸として導入することができ、またはウイルス（例えば、アデノウイルス、AAV、ヘルペスウイルス、レトロウイルス、レンチウイルス、およびインテグラーゼ欠陥レンチウイルス（IDLV））によって送達することができる。
【０４９８】
他の局面では、鋳型ポリヌクレオチドは、ウイルス性および／または非ウイルス性遺伝子移入方法によって送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（AAV）を介して細胞に送達される。限定されないが、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、およびこれらの組み合わせを含めて、任意のAAVベクターを使用することができる。ある場合には、AAVは、カプシド血清型と比較して異種血清型のものであるLTR（例えば、AAV5、AAV6、またはAAV8カプシドを有するAAV2 ITR）を含む。鋳型ポリヌクレオチドは、ヌクレアーゼを送達するために使用されるものと同じ遺伝子移入システム（同じベクター上を含める）を使用して送達することができ、またはヌクレアーゼに使用される異なる送達システムを使用して送達することができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはウイルスベクター（例えば、AAV）を使用して送達され、ヌクレアーゼはmRNA形態で送達される。細胞は、（例えば、ヌクレアーゼおよび／または鋳型ポリヌクレオチドを保有する）ウイルスベクターの送達より前に、該送達と同時に、および／または該送達の後に、本明細書において記載される細胞表面レセプターへのウイルスベクターの結合を阻害する1種または複数種の分子で処理することもできる。
【０４９９】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはウイルスベクター中に含まれ、少なくとも2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチドの長さ、または約2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチドの長さ、あるいは前述のいずれかの間の任意の値である。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはウイルスベクター中に含まれ、2500もしくは約2500から5000もしくは約5000ヌクレオチド、3500もしくは約3500から4500もしくは約4500ヌクレオチド、または3750もしくは約3750ヌクレオチドから4250ヌクレオチドもしくは約4250ヌクレオチドの間の長さである。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドはウイルスベクター中に含まれ、2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、もしくは10000ヌクレオチドの長さ、または約2500、2750、3000、3250、3500、3750、4000、4250、4500、4760、5000、5250、5500、5750、6000、7000、7500、8000、9000、または10000ヌクレオチドの長さである。
【０５００】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、アデノウイルスベクター、例えばAAVベクター、例えば、AAVカプシド中にパッケージングされることが可能になる長さおよび配列のssDNA分子である。ベクターは、例えば5kb未満でもよく、カプシド中へのパッケージングを促進するITR配列を含んでもよい。ベクターは組み込み欠損性であってもよい。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、導入遺伝子および／または標的部位の両側に、約150〜1000ヌクレオチドの相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5’、標的部位もしくは導入遺伝子の3’、または標的部位もしくは導入遺伝子の5’と3’の両方に、約100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5’、標的部位もしくは導入遺伝子の3’、または標的部位もしくは導入遺伝子の5’と3’の両方に、少なくとも100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000ヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5’、標的部位もしくは導入遺伝子の3’、または標的部位もしくは導入遺伝子の5’と3’の両方に、最大で100、150、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000ヌクレオチドを含む。
【０５０１】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、レンチウイルスベクター、例えばIDLV（組み込み欠損レンチウイルス）である。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、導入遺伝子および／または標的部位の両側に、約500〜1000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5’、標的部位もしくは導入遺伝子の3’、または標的部位もしくは導入遺伝子の5’と3’の両方に、約300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5’、標的部位もしくは導入遺伝子の3’、または標的部位もしくは導入遺伝子の5’と3’の両方に、少なくとも300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的部位もしくは導入遺伝子の5’、標的部位もしくは導入遺伝子の3’、または標的部位もしくは導入遺伝子の5’と3’の両方に、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対以下の相同性を含む。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の突然変異、例えば、Cas9が鋳型ポリヌクレオチドを認識し、これを開裂させることを防止するサイレント突然変異を含む。鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、変化させられる細胞のゲノム中の対応する配列に対して、少なくとも1、2、3、4、5、10、20、または30個のサイレント突然変異を含むことができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、変化させられる細胞のゲノム中の対応する配列に対して、最大で2、3、4、5、10、20、30、または50個のサイレント突然変異を含む。いくつかの態様では、cDNAは、1つまたは複数の突然変異、例えば、Cas9が鋳型ポリヌクレオチドを認識し、これを開裂させることを防止するサイレント突然変異を含む。鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、変化させられる細胞のゲノム中の対応する配列に対して、少なくとも1、2、3、4、5、10、20、または30個のサイレント突然変異を含むことができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、変化させられる細胞のゲノム中の対応する配列に対して、最大で2、3、4、5、10、20、30、または50個のサイレント突然変異を含む。
【０５０２】
本明細書において記載される二本鎖鋳型ポリヌクレオチドは、1つまたは複数の非天然塩基および／または骨格を含むことができる。特に、関心対象の領域において転写静止状態を達成するために、メチル化シトシンを有する鋳型ポリヌクレオチドの挿入を本明細書において記載される方法を使用して行うことができる。
【０５０３】
鋳型ポリヌクレオチドは、関心対象の任意の導入遺伝子（外来性配列）を含むことができる。例示的外来性配列としては、限定されないが、任意のポリペプチドコード配列（例えば、cDNAまたはその断片）、プロモーター配列、エンハンサー配列、エピトープタグ、マーカー遺伝子、開裂酵素認識部位、および様々なタイプの発現コンストラクトが挙げられる。マーカー遺伝子としては、限定されないが、抗生物質抵抗性（例えば、アンピシリン抵抗性、ネオマイシン抵抗性、G418抵抗性、ピューロマイシン抵抗性）を媒介するタンパク質をコードする配列、着色性または蛍光性または発光性タンパク質（例えば、緑色蛍光タンパク質、高感度緑色蛍光タンパク質、赤色蛍光タンパク質、ルシフェラーゼ）、ならびに増強された細胞増殖および／または遺伝子増幅を媒介するタンパク質（例えば、ジヒドロ葉酸還元酵素）をコードする配列が挙げられる。エピトープタグとしては、例えば、1または複数コピーのFLAG、His、myc、Tap、HA、または任意の検出可能なアミノ酸配列が挙げられる。
【０５０４】
いくつかの態様では、導入遺伝子は、細胞における発現が望まれる任意のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、ポリペプチドとしては、限定されないが、抗体、抗原、酵素、受容体（細胞表面または核）、ホルモン、リンホカイン、サイトカイン、レポーターポリペプチド、増殖因子、および前述のもののいずれかの機能的断片が挙げられる。いくつかの態様では、外来性配列（導入遺伝子）は、1種または複数種の組換え受容体、例えば、機能的非TCR抗原受容体、キメラ抗原受容体（CAR）、およびT細胞受容体（TCR）、例えば、トランスジェニックTCR、改変されたTCR、または組換えTCR、および前述のもののいずれかの成分をコードするポリヌクレオチドを含む。
【０５０５】
いくつかの態様では、コード配列は、例えばcDNAでもよい。外来性配列はまた、関心対象の内在性遺伝子配列と連結するための導入遺伝子の断片でもよい。例えば、関心対象の遺伝子の3’末端の配列を含む導入遺伝子の断片を利用して、挿入または置換を介して、内在性遺伝子配列の3’末端の突然変異をコードする配列を修正することができる。同様に、断片は、内在性配列の挿入/置換のために、内在性遺伝子の5’末端と類似している配列を含み、これにより、そのような内在性配列を修正または改変することができる。さらに、断片は、内在性遺伝子配列にインサイチューで連結して融合タンパク質を製造するために、関心対象の機能ドメイン（触媒性、分泌性など）をコードすることができる。
【０５０６】
いくつかの態様では、導入遺伝子は1種または複数種のマーカーをさらにコードする。いくつかの態様では、1種または複数種のマーカーは、形質導入マーカー、代用マーカー、および／または選択マーカーである。
【０５０７】
いくつかの態様では、マーカーは形質導入マーカーまたは代用マーカーである。形質導入マーカーまたは代用マーカーは、ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体をコードするポリヌクレオチドが導入された細胞を検出するために使用することができる。いくつかの態様では、形質導入マーカーは、細胞の改変を示すか、または確認することができる。いくつかの態様では、代用マーカーは、組換え受容体、例えばTCRまたはCARと細胞表面で共発現するように作製されたタンパク質である。特定の態様では、そのような代用マーカーは、活性をほとんどまたは全く有さないように改変された表面タンパク質である。ある特定の態様では、代用マーカーは、組換え受容体をコードする同じポリヌクレオチド上にコードされる。いくつかの態様では、組換え受容体をコードする核酸配列は、任意で、配列内リボソーム進入部位（IRES）、あるいは自己開裂ペプチドまたはリボソームスキップを引き起こすペプチド、例えば、2A配列、例えば、T2A、P2A、E2A、もしくはF2Aをコードする核酸によって分離されて、マーカーをコードする核酸配列に機能的に連結される。細胞の検出または選択を可能にするため、場合によっては、細胞自殺を促進するためにも、場合によっては、外因性マーカー遺伝子を、改変された細胞に関連して利用することができる。
【０５０８】
例示的代用マーカーとしては、細胞表面ポリペプチドのトランケートされた形態、例えば、非機能的であり、シグナルもしくは通常は完全長形態の細胞表面ポリペプチドによって伝達されるシグナルを伝達しないか、もしくは伝達することができない、および／または内部移行しないか、もしくは内部移行することができない、トランケートされた形態を挙げることができる。例示的なトランケートされた細胞表面ポリペプチドとしては、増殖因子または他の受容体のトランケートされた形態、例えば、トランケートされたヒト上皮増殖因子受容体2（tHER2）、トランケートされた上皮増殖因子受容体（tEGFR、例示的tEGFR配列はSEQ ID NO:12または13に記載される）、もしくは前立腺特異的膜抗原（PSMA）、またはこれらの改変形態が挙げられる。tEGFRは、抗体セツキシマブ（Erbitux（登録商標））または他の治療的抗EGFR抗体または結合分子によって認識されるエピトープを含むことができ、これは、tEGFRコンストラクトおよびコードされる外来性タンパク質で改変されている細胞を特定もしくは選択するために、ならびに／またはコードされる外来性タンパク質を発現する細胞を排除もしくは分離するために使用することができる。米国特許第8,802,374号およびLiu et al., Nature Biotech. 2016 April；34(4): 430-434）を参照されたい。いくつかの局面では、マーカー、例えば、代用マーカーとしては、CD34、NGFR、CD19、またはトランケートされたCD19、例えばトランケートされた非ヒトCD19、または上皮増殖因子受容体（例えば、tEGFR）の全部または一部（例えば、トランケートされた形態）が挙げられる。いくつかの態様では、マーカーは、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（GFP）、高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）、例えば、スーパーフォールドGFP（sfGFP）、赤色蛍光タンパク質（RFP）、例えばtdTomato、mCherry、mStrawberry、AsRed2、DsRed、もしくはDsRed2、シアン蛍光タンパク質（CFP）、青緑色蛍光タンパク質（BFP）、高感度青色蛍光タンパク質（EBFP）、および黄色蛍光タンパク質（YFP）、ならびにこれらの変異体、例えば、蛍光タンパク質の種変異体、単量体変異体、ならびにコドン最適化および／もしくは高感度変異体であるか、またはこれらを含む。いくつかの態様では、マーカーは、酵素、例えば、ルシフェラーゼ、大腸菌（E. coli）のlacZ遺伝子、アルカリホスファターゼ、分泌型胚性アルカリホスファターゼ（SEAP）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）であるか、またはこれらを含む。例示的発光レポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ（luc）、β−ガラクトシダーゼ、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、β−グルクロニダーゼ（GUS）、またはこれらの変異体が挙げられる。
【０５０９】
いくつかの態様では、マーカーは選択マーカーである。いくつかの態様では、選択マーカーは、外来性の作用物質または薬物に抵抗性を与えるポリペプチドであるか、または該ポリペプチドを含む。いくつかの態様では、選択マーカーは抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの態様では、選択マーカーは哺乳動物細胞に抗生物質抵抗性を与える抗生物質耐性遺伝子である。いくつかの態様では、選択マーカーは、ピューロマイシン抵抗性遺伝子、ハイグロマイシン抵抗性遺伝子、ブラストサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ジェネテシン抵抗性遺伝子、もしくはゼオシン抵抗性遺伝子、またはこれらの改変形態であるか、あるいはこれらを含む。
【０５１０】
いくつかの態様では、マーカーをコードする核酸は、リンカー配列、例えば開裂可能リンカー配列、例えばT2Aをコードするポリヌクレオチドに機能的に連結される。例えば、マーカーおよび任意でリンカー配列は、PCT特許出願公開第WO2014031687号に開示されるいかなるものでもよい。例えば、マーカーは、任意で、リンカー配列、例えば、T2A開裂可能リンカー配列に連結された、トランケートされたEGFR（tEGFR）でもよい。トランケートされたEGFR（例えば、tEGFR）についての例示的ポリペプチドは、SEQ ID NO:12もしくは13に記載されるアミノ酸配列、またはSEQ ID NO:12もしくは13に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列を含む。
【０５１１】
いくつかの態様では、マーカーは、T細胞で天然に見られない、またはT細胞の表面で天然に見られない分子、例えば細胞表面タンパク質、またはその一部である。
【０５１２】
いくつかの態様では、分子は非自己分子、例えば非自己タンパク質、すなわち、細胞が養子移植されるであろう受容者の免疫系によって「自己」として認識されないものである。
【０５１３】
いくつかの態様では、マーカーは治療的機能を果たさず、および／または遺伝子改変のための、例えば首尾よく改変された細胞を選択するためのマーカーとして使用される以外の効果をもたらさない。他の態様では、マーカーは、治療的分子、または別の方法である種の望ましい効果を発揮する分子、例えば、インビボで遭遇する細胞に対するリガンド、例えば、養子移植およびリガンドとの遭遇の際に細胞の応答を増強するおよび／または弱めるための共刺激または免疫チェックポイント分子でもよい。
【０５１４】
いくつかの態様では、そのような導入遺伝子は、T2Aリボソームスキップエレメントおよび／あるいは例えばTCRもしくはCARの下流の、それぞれSEQ ID NO:12もしくは13に記載されるようなtEGFR配列などのマーカーを、またはSEQ ID NO:12もしくは13に対して、少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸配列をコードする配列をさらに含む。
【０５１５】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、T細胞の機能を指示する働きをする組換え受容体をコードする。キメラ抗原受容体（CAR）は、細胞表面で発現している特定の分子標的に免疫細胞をターゲティングするように設計された分子である。その最も基本的な形態では、これは、細胞の外側で発現している特異性ドメインを細胞の内側のシグナリング経路に結び付け、その結果、特異性ドメインがその標的と相互作用すると細胞が活性化される、細胞に導入された受容体である。CARは、scFvなどの特異性ドメインまたはあるタイプの受容体がTCRのシグナリングドメインに融合している、T細胞受容体（TCR）の変異体から作製されることが多い。これらのコンストラクトは、次いで、T細胞に導入され、標的抗原を発現する細胞の存在下でT細胞を活性化させ、非MHC依存的に、活性化T細胞による標的細胞に対する攻撃をもたらす（Chicaybam et at (2011) Int Rev Immunol 30:294-311を参照されたい）。あるいは、CAR発現カセットがT細胞特異的プロモーター（例えば、FOXP3プロモーター。Mantel et. al (2006) J. Immunol 176: 3593-3602を参照されたい）の制御下にあるように、後の生着のためにCAR発現カセットを免疫細胞中に導入することができる。
【０５１６】
例示的な一態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、アデノ随伴ウイルス（AAV）ベクターコンストラクトとして含まれ、これは、内在性TRAC遺伝子のエクソン1におけるターゲティングのために、組換えTCRをコードする核酸配列の5’側および3’側にそれぞれに約600塩基対の相同性アームが隣接する、構成的プロモーターの制御化にある組換えのTCRα鎖およびTCRβ鎖をコードする核酸配列を含む。TRACにおけるターゲティングのための例示的5’相同性アームとしては、SEQ ID NO:124に記載される配列が挙げられる。TRACにおけるターゲティングのための例示的3’相同性アームとしては、SEQ ID NO:125に記載される配列が挙げられる。
【０５１７】
本明細書の教示に従ったそのような発現カセットの構築は、分子生物学で周知の方法論を利用する（例えば、AusubelまたはManiatisを参照されたい）。トランスジェニック動物を生成するために発現カセットを使用する前に、適切な細胞系統（例えば、一次細胞、形質転換細胞、または不死化細胞系統）中に発現カセットを導入することによって、選択された制御エレメントと関係があるストレス誘導因子への発現カセットの応答性を試験することができる。
【０５１８】
非コード核酸配列の標的挿入も達成することができる。アンチセンスRNA、RNAi、shRNA、およびマイクロRNA（miRNA）をコードする配列も標的挿入に使用することもできる。さらなる態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、さらなるヌクレアーゼ設計のための特異的標的部位である非コード配列を含むことができる。その後、さらなるヌクレアーゼを細胞中で発現させることができ、その結果、元の鋳型ポリヌクレオチドは開裂させられ、関心対象の別の鋳型ポリヌクレオチドの挿入によって改変される。このようにして、鋳型ポリヌクレオチドの反復的な組み込みを引き起こすことができ、関心対象の特定の座位、例えば、TRAC、TRBC1、および／またはTRBC2遺伝子座において形質の積み重ねが可能になる。
【０５１９】
いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、構造：［5’相同性アーム］−［導入遺伝子配列］−［3’相同性アーム］を含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、構造：［5’相同性アーム］−［マルチシストロニックエレメント］−［導入遺伝子配列］−［3’相同性アーム］を含む。いくつかの態様では、ポリヌクレオチドは、構造：［5’相同性アーム］−［プロモーター］−［導入遺伝子配列］−［3’相同性アーム］を含む。
【０５２０】
4.鋳型ポリヌクレオチドの送達
いくつかの態様では、ポリヌクレオチド、例えば、キメラ受容体をコードする鋳型ポリヌクレオチドなどのポリヌクレオチドは、ヌクレオチド形態で、例えば、ポリヌクレオチドまたはベクターとして細胞中に導入される。特定の態様では、ポリヌクレオチドは、キメラ受容体またはその一部をコードする導入遺伝子を含む。
【０５２１】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび／またはgRNAに加えて、改変のために細胞中に導入される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質が細胞中に導入されるより前に、導入されるのと同時に、または導入された後に、送達することができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは作用物質と同時に送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、作用物質より前、例えば、作用物質の数秒〜数時間〜数日前、例えば、限定されないが、作用物質の1〜60分（またはその間の任意の時間）、作用物質の1〜24時間（またはその間の任意の時間）前、または作用物質の24時間以上前に送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、作用物質の後、作用物質の送達の直後を含めて、作用物質から数秒〜数時間〜数日後、例えば、作用物質の送達から30秒〜4時間もしくは約30秒〜約4時間、例えば、約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間後に、および／または好ましくは作用物質の送達の4時間以内に送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、作用物質の送達から4時間以上後に送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、限定されないが、作用物質から1秒〜60分（もしくはその間の任意の時間）後以内、作用物質から1〜4時間（もしくはその間の任意の時間）後、または作用物質から4時間以上後を含めた、作用物質の後に送達される。
【０５２２】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび／またはgRNAと同じ送達システムを使用して送達することができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび／またはgRNAと異なる同じ送達システムを使用して、送達することができる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、作用物質と同時に送達される。他の態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、作用物質の送達の前または後の異なる時間に送達される。標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質における核酸、例えば、ヌクレアーゼおよび／またはgRNAの送達のための、セクションI.A.3で（例えば、表7および8で）本明細書において記載される送達方法のいずれも、鋳型ポリヌクレオチドを送達するために使用することができる。
【０５２３】
いくつかの態様では、1種または複数種の作用物質および鋳型ポリヌクレオチドは、同じ型式または方法で送達される。例えば、いくつかの態様では、1種または複数種の作用物質および鋳型ポリヌクレオチドは両方とも、ベクター、例えばウイルスベクターに含まれる。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、Cas9およびgRNAと同じベクター骨格、例えば、AAVゲノム、プラスミドDNAにコードされる。いくつかの局面では、1種または複数種の作用物質および鋳型ポリヌクレオチドは、異なる型式、例えば、Cas9-gRNA作用物質についてはリボ核酸-タンパク質複合体（RNP）、および鋳型ポリヌクレオチドについては直鎖状DNAであるが、これらは同じ方法を使用して送達される。いくつかの局面では、1種または複数種の作用物質および鋳型ポリヌクレオチドは異なる型式であり、例えば、Cas9-gRNA作用物質についてはリボ核酸-タンパク質複合体（RNP）であり、鋳型ポリヌクレオチドはAAVベクター中に含まれている状態であり、RNPは物理的送達方法（例えば、エレクトロポレーション）を使用して送達され、鋳型ポリヌクレオチドはAAVウイルス調製物の形質導入を介して送達される。いくつかの局面では、鋳型ポリヌクレオチドは、1種または複数種の作用物質の送達の直後に、例えば送達から約1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、または60分後以内に送達される。
【０５２４】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、直鎖状または環状の核酸分子、例えば、直鎖状もしくは環状のDNAまたは直鎖状RNAであり、本明細書においてセクションI.A.3（例えば、表7および8）に記載されている核酸分子を細胞中に送達するための方法のいずれかを使用して送達することができる。
【０５２５】
特定の態様では、ポリヌクレオチド、例えば、鋳型ポリヌクレオチドは、ヌクレオチド形態で、例えば、非ウイルスベクターとして、または非ウイルスベクター内で、細胞中に導入される。いくつかの態様では、非ウイルスベクターは、遺伝子送達のための任意の適切なおよび／または公知の非ウイルス性方法、例えば、限定されないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、（例えば、Lee, et al. (2012) Nano Lett 12: 6322-27に記載されているような）一過的な細胞圧縮または細胞スクイージング、脂質媒介性トランスフェクション、ペプチド媒介性送達、例えば細胞透過性ペプチド、またはこれらの組み合わせによる形質導入および／またはトランスフェクションに適したポリヌクレオチド、例えば、DNAまたはRNAポリヌクレオチドであるか、または該ポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、非ウイルス性ポリヌクレオチドは、本明細書において記載される非ウイルス性方法、例えば、本明細書の表8に列挙される非ウイルス性方法によって、細胞中に送達される。
【０５２６】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチド配列は、ゲノムDNA中の関心対象の領域と相同でない配列を含むベクター分子に含まれ得る。いくつかの態様では、ウイルスはDNAウイルス（例えば、dsDNAまたはssDNAウイルス）である。いくつかの態様では、ウイルスはRNAウイルス（例えば、ssRNAまたはdsRNAウイルス）である。例示的なウイルスベクター／ウイルスとしては、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルス、または本明細書の他の場所で記載されるウイルスのいずれかが挙げられる。
【０５２７】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、例えば、シミアンウイルス40（SV40）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）に由来するベクターなどの組換え感染性ウイルス粒子を使用して、細胞中に移入され得る。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、組換えレンチウイルスベクターまたはレトロウイルスベクター、例えば、ガンマ−レトロウイルスベクター（例えば、Koste et al. (2014) Gene Therapy 2014 Apr 3. doi: 10.1038/gt.2014.25；Carlens et al. (2000) Exp Hematol 28(10): 1137-46；Alonso-Camino et al. (2013) Mol Ther Nucl Acids 2, e93；Park et al., Trends Biotechnol. 2011 November 29(11): 550-557を参照されたい）またはHIV-1由来レンチウイルスベクターを使用して、T細胞中に移入される。
【０５２８】
いくつかの態様では、レトロウイルスベクター、例えば、モロニーマウス白血病ウイルス（MoMLV）、骨髄増殖性肉腫ウイルス（MPSV）、マウス胚性幹細胞ウイルス（MESV）、マウス幹細胞ウイルス（MSCV）、または脾フォーカス形成ウイルス（SFFV）に由来するレトロウイルスベクターは、ロングターミナルリピート配列（LTR）を有する。大抵のレトロウイルスベクターは、マウスレトロウイルスに由来する。いくつかの態様では、レトロウイルスには、任意の鳥類細胞供給源または哺乳動物細胞供給源に由来するものが含まれる。レトロウイルスは、典型的には広宿主性であり、これは、レトロウイルスがヒトを含めたいくつかの種の宿主細胞を感染させることができることを意味する。一態様では、発現させられる遺伝子は、レトロウイルスのgag、pol、および／またはenv配列に取って代わる。いくつかの実例となるレトロウイルスシステムが記載されている（例えば、米国特許第5,219,740号；第6,207,453号；第5,219,740号；Miller and Rosman (1989) BioTechniques 7:980-990；Miller, A. D. (1990) Human Gene Therapy 1:5-14；Scarpa et al. (1991) Virology 180:849-852；Burns et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:8033-8037；およびBoris-Lawrie and Temin (1993) Cur. Opin. Genet. Develop. 3:102-109）。
【０５２９】
いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドおよびヌクレアーゼは、同じベクター、例えばAAVベクター（例えばAAV6）上にあってもよい。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドはAAVベクターを使用して送達され、標的遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび／またはgRNAは異なる形態として、例えば、ヌクレアーゼおよび／またはgRNAをコードするmRNAとして送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドおよびヌクレアーゼは、同じタイプの方法、例えばウイルスベクターを使用して送達されるが、別々のベクター上にある。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質、例えば、ヌクレアーゼおよび／またはgRNAと異なる送達システムで送達される。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、インビボでベクター骨格から切除され、例えば、これはgRNA認識配列が隣接している。いくつかの態様では、鋳型ポリヌクレオチドは、Cas9およびgRNAと別々のポリヌクレオチド分子上にある。いくつかの態様では、Cas9およびgRNAはリボ核タンパク質（RNP）複合体の形態で導入され、鋳型ポリヌクレオチドは、例えばベクター中のポリヌクレオチド分子、または直鎖状核酸分子、例えば直鎖状DNAとして導入される。送達のためのタイプまたは核酸およびベクターとしては、本明細書のセクションIIIに記載されるもののいずれかが挙げられる。
【０５３０】
C. 改変されたT細胞および組成物の評価
態様のいくつかでは、方法は、特定の特性について、組換えTCRを発現するように改変されたT細胞またはT細胞組成物を評価することを含む。例えば、方法は、組換えTCRの細胞表面発現について、および／またはMHC分子との関連におけるペプチドの認識について、T細胞またはT細胞組成物を評価することを含む。例えば、本明細書において提供される態様のいずれかにおいて、本明細書において提供される方法のいずれかを使用して生成または製造された外来性組換えTCRを発現するT細胞またはT細胞組成物に対して機能アッセイを行うことができる。いくつかの態様では、TCRの機能性およびTCRシグナリングの活性を検出するためのアッセイを行うこともできる。
【０５３１】
いくつかの態様では、T細胞またはT細胞組成物は、組換えTCRの細胞表面発現について、例えば、細胞の表面上で機能的TCR、例えばTCRαβを発現する能力または性能について評価される。いくつかの態様では、T細胞またはT細胞組成物は、MHC分子との関連におけるペプチドの認識、例えば、MHC分子との関連における抗原またはエピトープとの結合に関して、発現したTCRの能力または性能について評価される。いくつかの態様では、方法は、T細胞の活性および／または機能性について、T細胞またはT細胞組成物を評価することを含む。いくつかの態様では、T細胞またはT細胞組成物は、導入遺伝子の形質導入または導入に対するマーカーの発現について評価される。
【０５３２】
いくつかの態様では、T細胞またはT細胞組成物は、組換えTCRの細胞表面発現について、例えば、細胞の表面上で機能的TCR、例えばTCRαβを発現する能力または性能について評価される。いくつかの態様では、表面TCRの発現を評価することは、各T細胞組成物の細胞をTCRα鎖またはTCRβ鎖に対して特異的な結合試薬と接触させること、および細胞への試薬の結合を評価することを含む。いくつかの態様では、結合試薬は抗体である。いくつかの態様では、結合試薬は、直接的または間接的に、検出可能な程度に標識され、任意で蛍光標識される。いくつかの態様では、結合試薬は、蛍光標識抗体、例えば、直接的または間接的に標識された抗体である。いくつかの態様では、結合試薬は抗汎TCR Vβ抗体であるか、または抗汎TCR Vα抗体である。いくつかの態様では、結合試薬は鎖の特定のファミリーを認識する。いくつかの態様では、結合試薬は、特定のファミリーを認識するか、または特定のファミリーに結合する抗TCR Vβまたは抗TCR Vα抗体、例えば、抗TCR Vβ22抗体または抗TCR Vβ2抗体である。いくつかの態様では、発現は、TCRの1つまたは複数の共通部分、例えば細胞外部分に対する抗体を使用して検出される。例えば、汎反応性抗TCR抗体、例えば、汎反応性TCR Vβ抗体、または汎反応性TCR Vα抗体を使用して、細胞の表面上のTCRの発現を検出することができる。汎反応性抗体は、その抗原またはエピトープ結合特異性にかかわらず、TCR領域を検出することができる。いくつかの態様では、細胞は、結合試薬、例えば、TCRの細胞表面発現を認識する標識抗体、例えば、蛍光標識された汎反応性TCR Vα抗体またはその抗原結合断片を使用して染色され、蛍光顕微鏡、フローサイトメトリー、または蛍光標識細胞分取（FACS）を使用して検出する。いくつかの態様では、細胞の表面上でTCRを発現するT細胞またはT細胞組成物、例えば、汎反応性抗TCR抗体、例えば汎反応性TCR Vβ抗体または汎反応性TCR Vα抗体を使用した際の染色陽性が、特定および／または選択される。
【０５３３】
いくつかの態様では、T細胞またはT細胞組成物は、MHC分子との関連におけるペプチドの認識、例えば、MHC分子との関連における抗原またはエピトープとの結合に関して、発現したTCRの能力または性能について評価される。例えば、いくつかの態様では、MHC分子との関連におけるペプチドの認識についてT細胞またはT細胞組成物を評価することは、(1)細胞またはT細胞組成物の細胞をペプチド-MHC複合体を含む標的抗原と接触させること、ならびに(2)細胞へのペプチド-MHC複合体の結合の有無を決定すること、および／またはペプチド-MHC複合体との結合時におけるTCR発現細胞のT細胞活性化の有無を決定することを含む。
【０５３４】
いくつかの態様では、組換えTCRをコードする核酸配列が導入されるT細胞またはT細胞組成物は、組換えTCRが望ましいまたは公知の抗原、例えば、TCRリガンド（MHC-ペプチド複合体）に結合することを確認することによって、試験される。いくつかの態様では、抗原またはエピトープへの細胞の結合は、いくつかの方法によって検出することができる。いくつかの方法では、受容体、例えばTCRへの結合を可視化できるように、特定の抗原、例えばMHC-ペプチド複合体を検出可能な程度に標識することができる。いくつかの態様では、抗原は可溶性でもよく、または可溶性形態で発現していてもよい。いくつかの態様では、TCRリガンドはペプチド-MHC四量体でもよく、場合によっては、ペプチド-MHC四量体を検出可能な程度に標識することができ、例えば、蛍光標識で標識することができる。ペプチド-MHC四量体は、直接的または間接的に標識することができる。いくつかの態様では、蛍光標識は、フローサイトメトリーまたは蛍光標識細胞分取（FACS）または蛍光顕微鏡を使用して検出することができる。いくつかの態様では、方法は、MHC分子と関連したペプチド、すなわち、ペプチド-MHC複合体を認識する1つまたは複数のT細胞またはT細胞組成物を特定することを含む。
【０５３５】
場合によっては、例えばMHCとの複合体中のペプチドエピトープへのTCR、例えば組換えTCRの結合は、相互作用の機能的特性をもたらすか、または生じさせる。例えば、TCR、例えば組換えTCRを発現するT細胞は、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合した場合に、細胞中でシグナル伝達経路を誘導する、エフェクター分子（例えば、サイトカイン）、レポーター、もしくは相互作用の検出可能な他のリードアウトの細胞性発現もしくは分泌を誘導する、またはT細胞活性化またはT細胞応答、例えば、T細胞増殖、サイトカイン産生、細胞障害性T細胞応答、もしくは他の応答を誘導することができる。いくつかの態様では、TCR、例えば組換えTCRは、ペプチドエピトープに特異的に結合し、ペプチドエピトープを免疫学的に認識することができ、その結果、ペプチドエピトープへの結合が免疫応答を誘発する。
【０５３６】
標的ポリペプチドのペプチドエピトープを認識する能力について、および抗原特異性についてTCRを試験する方法は、公知である。いくつかの態様では、提供される方法に従って製造されたT細胞またはT細胞組成物は、可溶性形態か、またはペプチドでパルスした抗原提示細胞（例えば、T2細胞または組換えTCRのMHCアレルとマッチする他の公知の抗原提示細胞）とのコカルチャーによるかのいずれかで、ペプチド-MHC複合体と接触させられる。例示的な抗原および組換えTCRのMHCアレルは、セクションIIIに記載されている。いくつかの態様では、方法は、外来性組換えTCRの特性、例えば機能的特性の評価を含む。いくつかの態様では、方法は、外来性組換えTCRによるT細胞活性化を評価すること、例えば、ペプチド-MHC複合体との結合時におけるTCR発現細胞のT細胞活性化の有無を決定することを含む。いくつかの態様では、そのような方法によるT細胞活性化のリードアウトは、サイトカイン（例えば、インターフェロン-γ、顆粒球／単球コロニー刺激因子（GM-CSF）、腫瘍壊死因子a（TNF-α）、またはインターロイキン2（IL-2））の放出を含む。さらに、TCR機能は、Zhao et al., J. Immunol., 174:4415-4423 (2005)に記載されているように、細胞の細胞傷害性の測定によって評価することができる。
【０５３７】
いくつかの態様では、T細胞活性化を評価することは、レポーター、例えばT細胞活性化レポーターをコードする核酸分子の活性または発現を評価すること、サイトカインの放出を評価すること、および／またはT細胞の機能活性を評価することを含む。
【０５３８】
いくつかの態様では、1種または複数種のアッセイは、1種または複数種の計測手段、結果もしくは解析のタイプ、および／またはリードアウトを含む。いくつかの態様では、1種または複数種のアッセイは、蛍光標識された試薬、例えば、直接的または間接的にフルオロフォアで標識された抗体を使用して行われ、フローサイトメトリーまたは蛍光標識細胞分取（FACS）機器を使用して検出される。例えば、フローサイトメトリーまたはFACSについては、異なるピーク励起および放射波長を有する複数の異なるフルオロフォアを検出することができる。したがって、複数のフルオロフォア標識を使用して、1つの実験反応で、複数の特性、例えば、TCRの発現、MHC分子との関連におけるペプチドの認識、および／またはT細胞活性化レポーター発現を評価することができる。いくつかの態様では、1種または複数種のアッセイは、ハイスループット、マルチプレックス、および／または大規模な様式で行われる。
【０５３９】
いくつかの態様では、方法は、T細胞活性化の局面を評価すること、例えば、サイトカインの放出を評価すること、ならびに／またはT細胞の機能活性、例えば、細胞溶解活性および／もしくはヘルパーT細胞活性を評価することをさらに含む。いくつかの態様では、評価は、本明細書において記載される態様を使用して生成されるT細胞またはT細胞組成物中で行うことができる。
【０５４０】
いくつかの態様では、機能アッセイは、本明細書において提供される態様を用いて改変された、一次T細胞、例えば、対象から直接単離したもの、および／または対象から単離し、凍結したもの、例えば、一次CD4+および／またはCD8+T細胞において行われる。
【０５４１】
いくつかの態様では、方法は、TCRもしくはT細胞の機能アッセイを行うこと、またはTCRもしくはT細胞の機能を検出することを含む。例えば、TCR活性またはT細胞活性を決定するための機能アッセイは、サイトカイン分泌、細胞溶解活性、および／またはヘルパーT細胞活性の検出を含む。例えば、T細胞活性化の評価は、サイトカインの放出を評価すること、および／またはT細胞の機能活性を評価することを含む。いくつかの態様では、抗原またはエピトープへのTCRの結合の際に、TCRの細胞質内ドメインまたは細胞内シグナリングドメインは、免疫細胞、例えば、TCRを発現するように改変されたT細胞の通常のエフェクター機能または応答の少なくとも1つを活性化する。例えば、いくつかの状況では、TCRは、T細胞の機能、例えば細胞溶解活性および／またはヘルパーT細胞活性、例えば、サイトカインもしくは他の因子の分泌を誘導する。いくつかの態様では、細胞内シグナリングドメインまたは複数の細胞内シグナリングドメインドメインは、T細胞受容体（TCR）の細胞質内配列を含み、いくつかの局面では、天然の状況で、そのような受容体と協調して働いて、抗原受容体結合に続いてシグナル伝達を開始する共受容体および／またはそのような分子の任意の誘導体もしくは変異体の細胞質内配列、ならびに／あるいは同じ機能的性能を有する任意の合成配列も含む。
【０５４２】
いくつかの態様では、外来性組換えTCRを含むT細胞またはT細胞組成物は、例えばT細胞アッセイを使用して、免疫学的リードアウトについて評価される。いくつかの態様では、TCR発現細胞はCD8+T細胞の応答を活性化することができる。いくつかの態様では、CD8+T細胞の応答は、限定されないが、51Cr放出を介する標的細胞溶解、リアルタイムイメージング試薬を使用する標的細胞溶解アッセイ、アポトーシス検出試薬（例えば、カスパーゼ3/7試薬）を使用する標的細胞溶解アッセイ、または酵素結合免疫吸着スポットアッセイ（ELISA）、細胞内サイトカイン染色、またはELISPOTなどによるインターフェロンガンマ放出の検出を含めたアッセイを使用して、CTL反応性をモニターすることによって評価することができる。いくつかの態様では、TCR発現細胞はCD4+T細胞の応答を活性化することができる。いくつかの局面では、CD4+T細胞の応答は、例えば、細胞のDNA中への［3H］-チミジンの取り込みによって、および／またはサイトカインの産生によって、例えば、ELISA、細胞内サイトカイン染色、またはELISPOTによって、増殖を測定するアッセイによって、評価することができる。場合によっては、サイトカインは、例えば、インターロイキン-2（IL-2）、インターフェロン−ガンマ（IFN-ガンマ）、インターロイキン-4（IL-4）、TNF-α、インターロイキン-6（IL-6）、インターロイキン-10（IL-10）、インターロイキン-12（IL-12）、またはTGF βを含むことができる。いくつかの態様では、TCRによる、ペプチドエピトープ、例えば、MHCクラスIまたはクラスIIエピトープの認識または結合はCD8+T細胞の応答および／またはCD4+T細胞の応答を誘発または活性化することができる。
【０５４３】
II. 遺伝子改変のための細胞
提供される態様のいくつかでは、改変するための細胞は免疫細胞、例えばT細胞である。細胞の1つまたは複数が、1つまたは複数の内在性TCR遺伝子のノックアウト、ならびに内在性TCR遺伝子の1つまたは複数に組み込まれている組換え受容体をコードする核酸および／または他の導入遺伝子を含む、遺伝子改変された細胞または細胞集団が提供される。そのような細胞の集団または組成物、そのような細胞を含むおよび／または提供される方法を使用して改変された細胞が濃縮された組成物も提供される。
【０５４４】
いくつかの態様において、改変のための細胞は、T細胞または他の細胞型の1つまたは複数のサブセット、例えば、全T細胞集団、CD4+細胞、CD8+細胞、およびその亜集団、例えば、機能；活性化状態；成熟度；分化、増大、再循環、局在化、および/もしくは持続能力についての潜在能；抗原特異性；抗原受容体のタイプ；特定の器官もしくは区画における存在；マーカーもしくはサイトカイン分泌プロファイル；ならびに/または分化の程度によって定義されるものを含む。処置される対象に関して、細胞は、同種異系および/または自己由来であり得る。方法の中には、既製品の方法が含まれる。いつくかの局面において、例えば既製品の技術のために、細胞は多能性および/または多分化能性、たとえば幹細胞、たとえば人工多能性幹細胞（iPSC）である。いくつかの態様において、方法は、本明細書に記載されているように、細胞を対象から単離する工程、それらを調製する工程、処理する工程、培養する工程、および/または改変する工程、ならびに凍結保存の前または後に、それらを同じ患者中に再導入する工程を含む。
【０５４５】
T細胞ならびに/またはCD4+ T細胞および/もしくはCD8+ T細胞のサブタイプおよび亜集団の中には、ナイーブT（TN）細胞、エフェクターT細胞（TEFF）、メモリーT細胞およびそのサブタイプ、例えば、幹細胞メモリーT（TSCM）、セントラルメモリーT（TCM）、エフェクターメモリーT（TEM）、または最終分化エフェクターメモリーT細胞、腫瘍浸潤リンパ球（TIL）、未熟T細胞、成熟T細胞、ヘルパーT細胞、細胞傷害性T細胞、粘膜関連インバリアントT（MAIT）細胞、天然に存在するかつ適応性の制御性T（Treg）細胞、ヘルパーT細胞、例えば、TH1細胞、TH2細胞、TH3細胞、TH17細胞、TH9細胞、TH22細胞、濾胞性ヘルパーT細胞、α/βT細胞、およびδ/γT細胞がある。いくつかの態様において、細胞は、制御性T細胞（Treg）である。いくつかの態様において、細胞は、組換えFOXP3またはそのバリアントをさらに含む。
【０５４６】
いくつかの態様において、細胞は、遺伝子改変を介して導入された1つまたは複数の核酸を含み、それによって、そのような核酸の組換え産物または遺伝子改変された産物を発現する。いくつかの態様において、核酸は、異種であり、すなわち、細胞または細胞から得られる試料中に正常では存在せず、例えば、改変されている細胞、および/またはそのような細胞が由来する生物において通常は見出されない、別の生物または細胞から得られるものである。いくつかの態様において、核酸は、天然には存在せず、例えば、複数の異なる細胞型由来の様々なドメインをコードする核酸のキメラ組み合わせを含むものを含む、天然において見出されない核酸である。
【０５４７】
いくつかの態様において、改変された細胞の調製は、1つまたは複数の培養工程および/または調製工程を含む。改変のための細胞は、生物学的試料などの試料、例えば、対象から得られるかまたはそれに由来するものから単離され得る。いくつかの態様において、細胞が単離される対象は、疾患もしくは状態を有するか、または細胞療法の必要があるか、または細胞療法が施与される対象である。いくつかの態様における対象は、特定の治療的介入、例えば、そのために細胞が単離され、処理され、かつ/または改変されている養子細胞療法の必要があるヒトである。
【０５４８】
したがって、いくつかの態様における細胞は、初代細胞、例えば、初代ヒト細胞である。試料には、組織、体液、および対象から直接採取された他の試料、ならびに分離、遠心分離、遺伝子改変（例えば、ウイルスベクターでの形質導入）、洗浄、および/またはインキュベーションなどの1つまたは複数の処理工程から結果として生じた試料が含まれる。生物学的試料は、生物学的供給源から直接得られた試料、または処理される試料であることができる。生物学的試料には、血液、血漿、血清、脳脊髄液、滑液、尿、および汗などの体液、組織および器官の試料が、それに由来する処理された試料を含めて含まれるが、それらに限定されない。
【０５４９】
いくつかの局面において、細胞が由来するかまたは単離される試料は、血液もしくは血液由来の試料であるか、またはアフェレーシスもしくは白血球アフェレーシスの産物であるかもしくはそれに由来する。例示的な試料には、全血、末梢血単核細胞（PBMC）、白血球、骨髄、胸腺、組織生検材料、腫瘍、白血病、リンパ腫、リンパ節、腸管関連リンパ組織、粘膜関連リンパ組織、脾臓、他のリンパ組織、肝臓、肺、胃、腸、結腸、腎臓、膵臓、乳房、骨、前立腺、子宮頸、精巣、卵巣、扁桃腺、もしくは他の器官、および/またはそれに由来する細胞が含まれる。試料には、細胞療法、例えば、養子細胞療法に関連して、自己由来および同種異系の供給源由来の試料が含まれる。
【０５５０】
いくつかの態様において、細胞は、細胞株、例えばT細胞株に由来する。いくつかの態様における細胞は、異種供給源から、例えば、マウス、ラット、非ヒト霊長類、またはブタから得られる。
【０５５１】
いくつかの態様において、細胞の単離は、1つまたは複数の調製工程および/または親和性に基づかない細胞分離工程を含む。いくつかの例において、例えば、不要な構成要素を除去する、所望の構成要素を濃縮する、特定の試薬に感受性の細胞を溶解するかまたは除去するために、細胞を、洗浄し、遠心分離し、かつ/または1つもしくは複数の試薬の存在下でインキュベートする。いくつかの例において、細胞は、密度、接着特性、サイズ、特定の構成要素に対する感受性および/または耐性などの1つまたは複数の特性に基づいて分離される。
【０５５２】
いくつかの例において、対象の循環血液由来の細胞は、例えば、アフェレーシスまたは白血球アフェレーシスによって得られる。試料は、いくつかの局面において、T細胞を含むリンパ球、単球、顆粒球、B細胞、他の有核白血球、赤血球、および/または血小板を含有し、いくつかの局面において、赤血球および血小板以外の細胞を含有する。
【０５５３】
いくつかの態様において、対象から収集された血球を、例えば、血漿画分を除去するため、および細胞をその後の処理工程に適切な緩衝液または培地に置くために洗浄する。いくつかの態様において、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で洗浄する。いくつかの態様において、洗浄溶液は、カルシウムおよび/もしくはマグネシウム、ならびに/または多くのもしくはすべての二価カチオンを含まない。いくつかの局面において、洗浄工程は、半自動「フロースルー」遠心分離機（例えば、Cobe 2991細胞プロセッサ、Baxter）において、製造業者の説明書に従って達成される。いくつかの局面において、洗浄工程は、接線流濾過（TFF）によって、製造業者の説明書に従って達成される。いくつかの態様において、細胞を、洗浄後に、例えば、Ca++/Mg++を含まないPBSなどの様々な生体適合性緩衝液に再懸濁する。ある特定の態様において、血球試料の構成要素を除去し、細胞を、培養培地に直接再懸濁する。
【０５５４】
いくつかの態様において、方法は、密度に基づく細胞分離法、例えば、赤血球を溶解することによる末梢血からの白血球の調製、およびPercollまたはFicoll勾配を通した遠心分離を含む。
【０５５５】
いくつかの態様において、単離法は、表面マーカー、例えば、表面タンパク質、細胞内マーカー、または核酸などの1つまたは複数の特異的な分子の細胞における発現または存在に基づく、異なる細胞型の分離を含む。いくつかの態様において、そのようなマーカーに基づく分離のための任意の公知の方法が、用いられてもよい。いくつかの態様において、分離は、親和性または免疫親和性に基づく分離である。例えば、いくつかの局面における単離は、1つまたは複数のマーカー、典型的には細胞表面マーカーの細胞での発現または発現レベルに基づく、例えば、そのようなマーカーに特異的に結合する抗体または結合パートナーとのインキュベーション、ならびにその後概して続く、洗浄工程、および抗体または結合パートナーに結合していない細胞からの抗体または結合パートナーに結合した細胞の分離による、細胞および細胞集団の分離を含む。
【０５５６】
そのような分離工程は、試薬に結合した細胞がさらなる使用のために保持される陽性選択、および/または抗体もしくは結合パートナーに結合していない細胞が保持される陰性選択に基づくことができる。いくつかの例において、両方の画分が、さらなる使用のために保持される。いくつかの局面において、陰性選択は、分離が、所望の集団以外の細胞によって発現されるマーカーに基づいて最も良好に実施されるように、不均一な集団において細胞型を特異的に同定する抗体が利用可能ではない場合に、特に有用であり得る。
【０５５７】
分離は、特定の細胞集団または特定のマーカーを発現する細胞の100％の濃縮または除去を結果としてもたらす必要はない。例えば、マーカーを発現する細胞などの特定の型の細胞の陽性選択または濃縮は、そのような細胞の数またはパーセンテージを増加させることを指すが、マーカーを発現しない細胞の完全な非存在を結果としてもたらす必要はない。同様に、マーカーを発現する細胞などの特定の型の細胞の陰性選択、除去、または枯渇は、そのような細胞の数またはパーセンテージを減少させることを指すが、そのような細胞すべての完全な除去を結果としてもたらす必要はない。
【０５５８】
いくつかの例において、1つの工程由来の陽性選択または陰性選択された画分が、その後の陽性選択または陰性選択などの別の分離工程に供される、複数回の分離工程が実施される。いくつかの例において、例えば、細胞を、陰性選択のために標的とされるマーカーに各々特異的な多数の抗体または結合パートナーとインキュベートすることによって、単一の分離工程が、複数のマーカーを発現する細胞を同時に枯渇させることができる。同様に、細胞を、様々な細胞型上に発現される多数の抗体または結合パートナーとインキュベートすることによって、複数の細胞型を同時に陽性選択することができる。
【０５５９】
例えば、いくつかの局面において、T細胞の特異的な亜集団、例えば、1つまたは複数の表面マーカーについて陽性であるかまたは高レベルを発現する細胞、例えば、CD28+、CD62L+、CCR7+、CD27+、CD127+、CD4+、CD8+、CD45RA+、および/またはCD45RO+ T細胞が、陽性選択または陰性選択の技法によって単離される。
【０５６０】
例えば、CD3+、CD28+ T細胞は、抗CD3/抗CD28コンジュゲート磁性ビーズ（例えば、DYNABEADS（登録商標）M-450 CD3/CD28 T Cell Expander）を用いて陽性選択することができる。
【０５６１】
いくつかの態様において、単離は、陽性選択による特定の細胞集団の濃縮、または陰性選択による特定の細胞集団の枯渇によって実施される。いくつかの態様において、陽性選択または陰性選択は、細胞を、それぞれ陽性選択または陰性選択される細胞上に発現される（マーカー＋）かまたは比較的高いレベルで発現される（マーカー高）1つまたは複数の表面マーカーに特異的に結合する1つまたは複数の抗体または他の結合物質とインキュベートすることによって達成される。
【０５６２】
いくつかの態様において、T細胞は、B細胞、単球、または他の白血球などの非T細胞上に発現されるマーカー、例えばCD14の陰性選択によって、PBMC試料から分離される。いくつかの局面において、CD4+またはCD8+選択工程が、CD4+ヘルパーT細胞およびCD8+細胞傷害性T細胞を分離するために用いられる。そのようなCD4+およびCD8+集団は、1つまたは複数のナイーブ、メモリー、および/またはエフェクターT細胞亜集団上に発現されるかまたは比較的高い程度に発現されるマーカーについての陽性選択または陰性選択によって、さらに亜集団に選別することができる。
【０５６３】
いくつかの態様において、CD8+細胞は、例えば、それぞれの亜集団に関連する表面抗原に基づく陽性選択または陰性選択によって、ナイーブ、セントラルメモリー、エフェクターメモリー、および/またはセントラルメモリー幹細胞がさらに濃縮されるかまたは枯渇する。いくつかの態様において、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、有効性を増加させるために、例えば、いくつかの局面ではそのような亜集団において特に堅牢である、投与後の長期生存、増大、および/または生着を改善するために実施される。Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82；Wang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。いくつかの態様において、TCM濃縮CD8+ T細胞とCD4+ T細胞とを組み合わせることは、有効性をさらに増強する。
【０５６４】
態様において、メモリーT細胞は、CD8+末梢血リンパ球のCD62L+およびCD62L-サブセットの両方に存在する。PBMCは、例えば抗CD8抗体および抗CD62L抗体を用いて、CD62L-CD8+および/またはCD62L＋CD8+画分を濃縮するかまたは枯渇させることができる。
【０５６５】
いくつかの態様において、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD45RO、CD62L、CCR7、CD28、CD3、および/またはCD127の陽性または高い表面発現に基づき；いくつかの局面において、それは、CD45RAおよび/またはグランザイムBを発現するかまたは高発現する細胞についての陰性選択に基づく。いくつかの局面において、TCM細胞が濃縮されたCD8+集団の単離は、CD4、CD14、CD45RAを発現する細胞の枯渇、およびCD62Lを発現する細胞の陽性選択または濃縮によって実施される。1つの局面において、セントラルメモリーT（TCM）細胞の濃縮は、CD4発現に基づいて選択された細胞の陰性画分から出発して実施され、これが、CD14およびCD45RAの発現に基づく陰性選択、ならびにCD62Lに基づく陽性選択に供される。そのような選択は、いくつかの局面において同時に実施され、他の局面においては、連続的に任意の順序で実施される。いくつかの局面において、CD8+細胞集団または亜集団の調製において用いられるのと同じCD4発現に基づく選択工程がまた、CD4に基づく分離からの陽性画分および陰性画分が両方とも保持され、任意で1つまたは複数のさらなる陽性選択または陰性選択の工程後の、方法のその後の工程において用いられるように、CD4+細胞集団または亜集団を生成するためにも用いられる。
【０５６６】
特定の例において、PBMCの試料または他の白血球試料を、CD4+細胞の選択に供し、ここで、陰性画分および陽性画分は両方とも保持される。次いで、陰性画分を、CD14およびCD45RAまたはROR1の発現に基づく陰性選択、ならびにCD62LまたはCCR7などのセントラルメモリーT細胞に特徴的なマーカーに基づく陽性選択に供し、ここで、陽性選択および陰性選択はいずれかの順序で実施される。
【０５６７】
CD4+ Tヘルパー細胞は、細胞表面抗原を有する細胞集団を同定することによって、ナイーブ、セントラルメモリー、およびエフェクター細胞に選別される。CD4+リンパ球は、標準的な方法によって得ることができる。いくつかの態様において、ナイーブCD4+ Tリンパ球は、CD45RO-、CD45RA+、CD62L-、CD4+ T細胞である。いくつかの態様において、セントラルメモリーCD4+細胞は、CD62L+およびCD45RO+である。いくつかの態様において、エフェクターCD4+細胞は、CD62L-およびCD45RO-である。
【０５６８】
1つの例において、陰性選択によってCD4+細胞を濃縮するために、モノクローナル抗体カクテルは、典型的には、CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR、およびCD8に対する抗体を含む。いくつかの態様において、抗体または結合パートナーは、陽性選択および/または陰性選択のための細胞の分離を可能にするように、磁性ビーズまたは常磁性ビーズなどの固体支持体またはマトリックスに結合している。例えば、いくつかの態様において、細胞および細胞集団は、免疫磁気（または親和性磁気）分離技法（Methods in Molecular Medicine, vol. 58: Metastasis Research Protocols, Vol. 2: Cell Behavior In vitro and In vivo, p 17-25 Edited by: S. A. Brooks and U. Schumacher（著作権） Humana Press Inc., Totowa, NJにおいて概説されている）を用いて分離されるかまたは単離される。
【０５６９】
いくつかの局面において、分離されるべき細胞の試料または組成物を、小さな磁化可能または磁気応答性材料、例えば磁気応答性粒子または微小粒子、例えば常磁性ビーズ（例えば、DynalbeadsまたはMACSビーズなど）とインキュベートする。磁気応答性材料、例えば粒子は、概して、分離することが望ましい、例えば、陰性選択または陽性選択することが望ましい細胞、複数の細胞、または細胞の集団上に存在する分子、例えば表面マーカーに特異的に結合する結合パートナー、例えば抗体に、直接または間接的に付着している。
【０５７０】
いくつかの態様において、磁性粒子またはビーズは、抗体または他の結合パートナーなどの特異的結合メンバーに結合した磁気応答性材料を含む。磁気分離法で用いられる多くの周知の磁気応答性材料がある。適している磁性粒子には、参照により本明細書に組み入れられる、Moldayの米国特許第4,452,773号、および欧州特許明細書EP 452342 Bに記載されているものが含まれる。コロイドサイズの粒子、例えば、Owenの米国特許第4,795,698号およびLibertiらの米国特許第5,200,084号に記載されているものが、他の例である。
【０５７１】
インキュベーションは、概して、磁性粒子もしくはビーズに付着している抗体もしくは結合パートナー、または、そのような抗体もしくは結合パートナーに特異的に結合する二次抗体もしくは他の試薬などの分子が、試料内の細胞上に存在する場合は細胞表面分子に特異的に結合する条件下で実施される。
【０５７２】
いくつかの局面において、試料を磁場に置き、磁気応答性または磁化可能粒子が付着している細胞を、磁石に引きつけて、非標識細胞から分離する。陽性選択のためには、磁石に引きつけられる細胞が保持され；陰性選択のためには、引きつけられない細胞（非標識細胞）が保持される。いくつかの局面において、陽性選択と陰性選択との組み合わせが同じ選択工程中に行われ、ここで、陽性画分および陰性画分が保持され、さらに処理されるかまたはさらなる分離工程に供される。
【０５７３】
ある特定の態様において、磁気応答性粒子は、一次抗体または他の結合パートナー、二次抗体、レクチン、酵素、またはストレプトアビジンでコーティングされている。ある特定の態様において、磁性粒子は、1つまたは複数のマーカーに特異的な一次抗体のコーティングを介して細胞に付着している。ある特定の態様において、ビーズではなく細胞を、一次抗体または結合パートナーで標識し、次いで、細胞型特異的二次抗体または他の結合パートナー（例えば、ストレプトアビジン）でコーティングされた磁性粒子を添加する。ある特定の態様において、ストレプトアビジンコーティング磁性粒子を、ビオチン化一次抗体または二次抗体と組み合わせて用いる。
【０５７４】
いくつかの態様において、磁気応答性粒子は、その後インキュベート、培養、および/または改変されることになる細胞に付着したままであり；いくつかの局面において、粒子は、患者への投与のための細胞に付着したままである。いくつかの態様において、磁化可能または磁気応答性粒子は、細胞から除去される。磁化可能粒子を細胞から除去するための方法は公知であり、例えば、競合する非標識抗体、切断可能リンカーにコンジュゲートした磁化可能粒子または抗体などの使用を含む。いくつかの態様において、磁化可能粒子は生分解性である。
【０５７５】
いくつかの態様において、親和性に基づく選択は、磁気活性化細胞選別（MACS）（Miltenyi Biotec, Auburn, CA）を介する。磁気活性化細胞選別（MACS）システムは、磁化粒子が付着している細胞の高純度の選択ができる。ある特定の態様において、MACSは、外部磁場の印加後に非標的種および標的種が連続的に溶出されるモードで動作する。すなわち、磁化粒子に付着した細胞は、付着していない種が溶出される間、適所に保持される。次いで、この最初の溶出工程が完了した後に、磁場に捕捉されて溶出が阻止されていた種は、それらが溶出されて回収され得るように、何らかの方法で遊離される。ある特定の局面において、非標的細胞を、標識して、不均一な細胞の集団から枯渇させる。
【０５７６】
ある特定の態様において、単離または分離は、本発明の方法の単離、細胞調製、分離、処理、インキュベーション、培養、および/または製剤化工程のうちの1つまたは複数を実施するシステム、デバイス、または装置を用いて実施される。いくつかの局面において、システムは、例えば、エラー、使用者の取り扱い、および/または汚染を最小化するように、これらの工程の各々を閉鎖環境または無菌環境で実施するために用いられる。1つの例において、システムは、国際PCT公開番号WO2009/072003、またはUS 20110003380 A1に記載されているようなシステムである。
【０５７７】
いくつかの態様において、システムまたは装置は、統合もしくは自己完結型システムで、および/または自動化もしくはプログラム可能方式で、単離、処理、操作、および製剤化工程のうちの1つまたは複数、例えばすべてを実施する。いくつかの局面において、システムまたは装置は、システムまたは装置に接続されたコンピュータおよび/またはコンピュータプログラムを含み、これにより、使用者が処理、単離、操作、および製剤化工程をプログラムする、制御する、そのアウトカムを評価する、かつ/またはその様々な局面を調整することが可能になる。
【０５７８】
いくつかの局面において、分離工程および/または他の工程は、例えば、閉鎖系および無菌系における臨床規模レベルでの細胞の自動分離のために、CliniMACSシステム（Miltenyi Biotec）を用いて実施される。構成要素には、統合マイクロコンピュータ、磁気分離ユニット、蠕動ポンプ、および様々なピンチバルブが含まれ得る。いくつかの局面における統合コンピュータは、機器のすべての構成要素を制御し、標準化された順序で反復手順を行うようにシステムに指令する。いくつかの局面における磁気分離ユニットは、可動永久磁石および選択カラム用のホルダを含む。蠕動ポンプは、チューブセット全体の流速を制御し、ピンチバルブと共に、システムを通る緩衝液の制御された流れおよび細胞の継続的な懸濁を確実にする。
【０５７９】
いくつかの局面におけるCliniMACSシステムは、無菌非発熱性溶液において供給される抗体カップリング磁化可能粒子を用いる。いくつかの態様において、細胞の磁性粒子での標識化後に、細胞を、洗浄して過剰の粒子を除去する。次いで、細胞調製バッグをチューブセットに接続し、これを次に、緩衝液を含有するバッグおよび細胞収集バッグに接続する。チューブセットは、プレカラムおよび分離カラムを含むあらかじめ組み立てられた無菌チューブからなり、使い捨て専用である。分離プログラムの開始後、システムは、自動的に細胞試料を分離カラム上にアプライする。非標識細胞が一連の洗浄工程によって除去される間、標識細胞は、カラム内に保持される。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法での使用のための細胞集団は、標識されておらず、カラムに保持されない。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法での使用のための細胞集団は、標識されており、カラムに保持される。いくつかの態様において、本明細書に記載される方法での使用のための細胞集団は、磁場の除去後にカラムから溶出され、細胞収集バッグ内に収集される。
【０５８０】
ある特定の態様において、分離工程および/または他の工程は、CliniMACS Prodigyシステム（Miltenyi Biotec）を用いて実施される。いくつかの局面におけるCliniMACS Prodigyシステムは、遠心分離による細胞の自動洗浄および分画を可能にする細胞処理ユニットを備える。CliniMACS Prodigyシステムはまた、供給源細胞産物の巨視的層を識別することによって最適な細胞分画エンドポイントを決定する、搭載カメラおよび画像認識ソフトウェアも含むことができる。例えば、末梢血は、赤血球、白血球、および血漿層に自動的に分離され得る。CliniMACS Prodigyシステムはまた、例えば、細胞分化および増大、抗原負荷、ならびに長期細胞培養などの細胞培養プロトコルを達成する、統合細胞培養チャンバも含むことができる。入力ポートは、培地の無菌除去および補充を可能にすることができ、細胞を、統合顕微鏡を用いてモニターすることができる。例えば、Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、およびWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701を参照されたい。
【０５８１】
いくつかの態様において、本明細書に記載される細胞集団を、複数の細胞表面マーカーについて染色された細胞が流体の流れにおいて運ばれるフローサイトメトリーを介して、収集し、かつ濃縮する（または枯渇させる）。いくつかの態様において、本明細書に記載される細胞集団を、調製規模（FACS）選別を介して、収集し、かつ濃縮する（または枯渇させる）。ある特定の態様において、本明細書に記載される細胞集団を、FACSに基づく検出システムと組み合わせた微小電気機械システム（MEMS）チップの使用によって、収集し、かつ濃縮する（または枯渇させる）（例えば、WO 2010/033140、Cho et al. (2010) Lab Chip 10:1567-1573；およびGodin et al. (2008) J Biophoton. 1(5):355-376を参照されたい）。どちらの場合も、細胞を、明確に定義されたT細胞サブセットの高純度での単離を可能にする、複数のマーカーで標識することができる。
【０５８２】
いくつかの態様において、抗体または結合パートナーは、陽性選択および/または陰性選択のための分離を容易にするために、1つまたは複数の検出可能なマーカーで標識される。例えば、分離は、蛍光標識抗体への結合に基づいてもよい。いくつかの例において、1つまたは複数の細胞表面マーカーに特異的な抗体または他の結合パートナーの結合に基づく細胞の分離は、例えば、調製規模（FACS）を含む蛍光活性化細胞選別（FACS）、および/または、例えばフローサイトメトリー検出システムと組み合わせた微小電気機械システム（MEMS）チップによって、流体の流れにおいて行われる。そのような方法は、同時に複数のマーカーに基づく陽性選択および陰性選択を可能にする。
【０５８３】
いくつかの態様において、調製法は、単離、インキュベーション、および/または操作の前または後のいずれかに、細胞を凍結する、例えば凍結保存するための工程を含む。いくつかの態様において、凍結およびその後の解凍工程は、細胞集団中の顆粒球を、およびある程度まで、単球を除去する。いくつかの態様において、細胞は、例えば、血漿および血小板を除去するための洗浄工程の後に、凍結溶液中に懸濁される。様々な公知の凍結溶液およびパラメーターのいずれかが、いくつかの局面において用いられてもよい。1つの例は、20％ DMSOおよび8％ヒト血清アルブミン（HSA）を含有するPBS、または他の適している細胞凍結培地を用いることを含む。次いで、これを培地で1:1希釈して、DMSOおよびHSAの最終濃度が、それぞれ10％および4％になるようにする。次いで、細胞を、1分あたり1°の速度で-80℃に凍結し、液体窒素貯蔵タンクの気相中で保管する。
【０５８４】
いくつかの態様において、提供された方法は、栽培、インキュベーション、培養、および/または遺伝子改変の工程を含む。例えば、いくつかの態様において、枯渇細胞集団および培養開始組成物をインキュベートしかつ/または改変する方法が、提供される。
【０５８５】
従って、いくつかの態様において、細胞集団は、培養開始組成物においてインキュベートされる。インキュベーションおよび/または改変は、培養器、例えば、ユニット、チャンバ、ウェル、カラム、チューブ、チュービングセット、バルブ、バイアル、培養皿、バッグ、または細胞の培養もしくは栽培のためのその他の容器において実施され得る。
【０５８６】
いくつかの態様において、細胞を、遺伝子改変の前にまたはそれに関連して、インキュベートおよび/または培養する。インキュベーション工程は、培養、育成、刺激、活性化、および/または増殖を含むことができる。いくつかの態様において、組成物または細胞を、刺激条件または刺激物質の存在下でインキュベートする。そのような条件には、集団中の細胞の増殖、増大、活性化、および/もしくは生存を誘導するように、抗原曝露を模倣するように、ならびに/または、組換え受容体、例えば組換えTCRをコードする核酸の導入のためなどの遺伝子改変のために細胞をプライミングするように、設計されたものが含まれる。
【０５８７】
条件は、特定の培地、温度、酸素含量、二酸化炭素含量、時間、作用物質、例えば、栄養素、アミノ酸、抗生物質、イオン、および/または刺激因子、例えばサイトカイン、ケモカイン、抗原、結合パートナー、融合タンパク質、組換え可溶性受容体、および細胞を活性化するように設計された任意の他の作用物質のうちの1つまたは複数を含むことができる。
【０５８８】
いくつかの態様において、刺激条件または刺激物質は、TCR複合体の細胞内シグナル伝達領域を活性化することができる1つまたは複数の作用物質、例えばリガンドを含む。いくつかの局面において、作用物質は、T細胞におけるTCR/CD3細胞内シグナル伝達カスケードを作動するかまたは開始する。そのような作用物質は、TCRに特異的な抗体などの抗体、例えば抗CD3を含むことができる。いくつかの態様において、刺激条件は、共刺激受容体を刺激することができる1つまたは複数の作用物質、例えばリガンド、例えば抗CD28を含む。いくつかの態様において、そのような作用物質および/またはリガンドは、ビーズなどの固体支持体、および/または1つもしくは複数のサイトカインに結合していてもよい。任意で、増大法は、抗CD3抗体および/または抗CD28抗体を培養培地に（例えば、少なくとも約0.5 ng/mlの濃度で）添加する工程をさらに含んでもよい。いくつかの態様において、刺激物質は、IL-2、IL-15、および/またはIL-7を含む。いくつかの局面では、IL-2濃度は少なくとも約10ユニット/mLである。
【０５８９】
いくつかの局面において、インキュベーションは、Riddellらの米国特許第6,040,177号、Klebanoff et al. (2012) J Immunother. 35(9): 651-660、Terakura et al. (2012) Blood.1:72-82、および/またはWang et al. (2012) J Immunother. 35(9):689-701に記載されている技法などの技法に従って実施される。
【０５９０】
いくつかの態様において、T細胞は、培養開始組成物への非分裂末梢血単核細胞（PBMC）などのフィーダ細胞の添加（例えば、結果として生じる細胞の集団が、増大させるべき初期集団中の各Tリンパ球に対して少なくとも約5、10、20、もしくは40個、またはそれよりも多いPBMCフィーダ細胞を含有するように）；および培養物をインキュベートすること（例えば、T細胞の数を増大させるのに十分な時間）により増大される。いくつかの局面において、非分裂フィーダ細胞は、γ線照射PBMCフィーダ細胞を含むことができる。いくつかの態様において、PBMCは、細胞分裂を阻止するために、約3000〜3600ラドの範囲のγ線を照射される。いくつかの局面において、フィーダ細胞は、T細胞の集団の添加の前に、培養培地に添加される。
【０５９１】
いくつかの態様において、刺激条件は、ヒトTリンパ球の増殖に適している温度、例えば、少なくとも約25℃、概して少なくとも約30℃、および概して37℃または約37℃を含む。任意で、インキュベーションは、非分裂EBV形質転換リンパ芽球様細胞（LCL）をフィーダ細胞として添加することをさらに含んでもよい。LCLは、約6000〜10,000ラドの範囲のγ線を照射することができる。いくつかの局面におけるLCLフィーダ細胞は、少なくとも約10:1のLCLフィーダ細胞対初期Tリンパ球の比などの、任意の適している量で提供される。
【０５９２】
いくつかの態様において、抗原特異的T細胞、例えば、抗原特異的CD4+および/またはCD8+ T細胞は、ナイーブまたは抗原特異的Tリンパ球を抗原で刺激することによって得られる。例えば、抗原特異的T細胞株またはクローンを、サイトメガロウイルス抗原に対して、感染した対象からT細胞を単離すること、および細胞をインビトロで同じ抗原で刺激することによって生成することができる。
【０５９３】
遺伝子改変された成分、例えば、遺伝子破壊を誘導するための作用物質および/または組換え受容体、例えば、CARもしくはTCRをコードする核酸の導入のための様々な方法が、公知であり、提供された方法および組成物と共に使用され得る。例示的な方法には、ポリペプチドまたは受容体をコードする核酸の移入のための方法、例えば、ウイルスベクター、例えば、レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクター、非ウイルスベクター、またはトランスポゾン、例えば、Sleeping Beautyトランスポゾン系を介した方法が含まれる。遺伝子移入の方法には、形質導入、エレクトロポレーション、もしくは細胞への遺伝子移入をもたらすその他の方法、または本明細書中のセクションI.Aに記載された任意の送達方法が含まれ得る。組換え産物をコードする核酸の移入のためのその他のアプローチおよびベクターは、例えば、WO2014055668および米国特許第7,446,190号に記載されたものである。
【０５９４】
いくつかの態様において、組換え核酸は、エレクトロポレーションを介してT細胞に移入される（例えば、Chicaybam et al, (2013)PLoS ONE 8(3): e60298およびVan Tedeloo et al. (2000)Gene Therapy 7(16): 1431-1437を参照すること）。いくつかの態様において、組換え核酸は、転位を介してT細胞に移入される（例えば、Manuri et al. (2010)Hum Gene Ther 21(4): 427-437；Sharma et al. (2013) Molec Ther Nucl Acids 2, e74；およびHuang et al. (2009) Methods Mol Biol 506: 115-126を参照すること）。免疫細胞に遺伝材料を導入し発現させるその他の方法には、（例えば、Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York. N.Y.に記載されたような）リン酸カルシウムトランスフェクション、プロトプラスト融合、カチオン性リポソーム媒介トランスフェクション；タングステン粒子によって容易にされる微粒子銃（Johnston, Nature, 346: 776-777 (1990)）；およびリン酸ストロンチウムDNA共沈殿（Brash et al., Mol. Cell Biol., 7: 2031-2034 (1987)）が含まれる。
【０５９５】
いくつかの態様において、遺伝子移入は、例えば、サイトカインまたは活性化マーカーの発現によって測定される、増殖、生存、および/または活性化のような応答を誘導する刺激と組み合わせること等によって、最初に細胞を刺激し、その後、活性化された細胞を形質導入し、臨床的な適用のために十分な数へ培養物中で増大させることによって達成される。
【０５９６】
いくつかの状況において、刺激因子（例えば、リンホカインまたはサイトカイン）の過剰発現が、対象における不要な転帰またはより低い効力、例えば、対象における毒性に関連した因子をもたらす可能性に対して、保護手段を有することが望まれ得る。従って、いくつかの状況において、改変された細胞は、細胞が、例えば、養子免疫治療において投与された時、インビボでネガティブ選択を受け易くなるようにする遺伝子セグメントを含む。例えば、いくつかの局面において、細胞は、それが投与された患者のインビボ条件の変化の結果として排除され得るよう、改変される。ネガティブ選択可能な表現型は、投与された作用物質、例えば、化合物に対する感受性を付与する遺伝子の挿入に起因し得る。ネガティブ選択可能な遺伝子には、ガンシクロビル感受性を付与する単純ヘルペスウイルスI型チミジンキナーゼ（HSV-I TK）遺伝子（Wigler et al.,Cell 11:223,1977）；細胞ヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（HPRT）遺伝子、細胞アデニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（APRT）遺伝子、細菌シトシンデアミナーゼ（Mullen et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89:33(1992)）が含まれる。
【０５９７】
いくつかの態様において、細胞、例えば、T細胞は、増大中または増大後に改変され得る。所望のポリペプチドまたは受容体の遺伝子の導入のためのこの改変は、例えば、任意の適当なレトロウイルスベクターによって実施され得る。次いで、遺伝子修飾された細胞集団を、一次刺激（例えば、CD3/CD28刺激）から解放し、その後、（例えば、新たに導入された受容体を介して）第2の型の刺激によって刺激することができる。この第2の型の刺激には、ペプチド/MHC分子の形態での抗原刺激、遺伝学的に導入された受容体の同族（架橋）リガンド（例えば、CARの天然リガンド）、または（例えば、受容体内の定常領域を認識することによって）新しい受容体のフレームワーク内に直接結合する（抗体のような）任意のリガンドが含まれ得る。例えば、Cheadle et al,"Chimeric antigen receptors for T-cell based therapy" Methods Mol Biol.2012;907:645-66またはBarrett et al.,Chimeric Antigen Receptor Therapy for Cancer Annual Review of Medicine Vol.65:333-347(2014)を参照すること。
【０５９８】
導入のための付加的な核酸、例えば、遺伝子には、例えば、移入された細胞の生存率および/または機能を促進することによって、治療の効力を改善するためのもの；細胞の選択および/または評価のため、例えば、インビボの生存または局在を評価するため、遺伝子マーカーを提供するための遺伝子；Lupton S.D.et al., Mol. and Cell Biol., 11: 6 (1991)；およびRiddell et al., Human Gene Therapy 3: 319-338 (1992)によって記載されたような、例えば、細胞がインビボでネガティブ選択を受け易くなるようにすることによって、安全性を改善するための遺伝子が含まれる。ドミナントポジティブ選択可能マーカーをネガティブ選択可能マーカーと融合させることによって得られた二機能性選択可能融合遺伝子の使用を記載している、LuptonらによるPCT/US91/08442およびPCT/US94/05601の公開も参照すること。例えば、Riddellらの米国特許第6,040,177号、カラム14〜17を参照すること。
【０５９９】
本明細書中に記載されるように、いくつかの態様において、細胞は、遺伝子改変前に、または遺伝子改変に関連して、インキュベートされかつ/または培養される。インキュベーション工程には、培養、栽培、刺激、活性化、繁殖、および/または保存、例えば、凍結保存のための凍結が含まれ得る。
【０６００】
III.核酸、ベクター、および送達
いくつかの態様において、遺伝子破壊のための1つもしくは複数の作用物質、および/または鋳型ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体もしくはその抗原結合断片もしくはその鎖をコードする導入遺伝子を含有する鋳型ポリヌクレオチド、または1つもしくは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドは、核酸の形態で、例えば、ポリヌクレオチドおよび/またはベクターとして、細胞に導入される。本明細書中のセクションIに記載されたように、改変のための成分は、様々な送達方法を使用して、様々な形態で、例えば、その成分をコードするポリヌクレオチドとして送達され得る。遺伝子破壊を誘導することができる1つもしくは複数の作用物質の1つもしくは複数の成分をコードする1つもしくは複数のポリヌクレオチド（例えば、核酸分子）、および/または導入遺伝子を含有する1つもしくは複数の鋳型ポリヌクレオチド、および導入遺伝子の標的組み込み（targeted integration）のため、細胞を遺伝子改変するためのベクターも、提供される。
【０６０１】
いくつかの態様において、鋳型ポリヌクレオチド、例えば、特定のゲノム標的位置、例えば、TRAC遺伝子座、TRBC1遺伝子座、および/またはTRBC2遺伝子座に導入遺伝子をターゲティングするための鋳型ポリヌクレオチドが、提供される。いくつかの態様において、本明細書中のセクションI.Bに記載された任意の鋳型ポリヌクレオチドが提供される。いくつかの態様において、鋳型ポリヌクレオチドは、組換え受容体またはその他のポリペプチドおよび/もしくは因子をコードする核酸配列を含む導入遺伝子と、標的組み込みのための相同性アームとを含有する。いくつかの態様において、鋳型ポリヌクレオチドは、ベクターに含有されていてよい。
【０６０２】
いくつかの態様において、遺伝子破壊を誘導することができる作用物質は、1つまたは複数のポリヌクレオチドにコードされていてよい。いくつかの態様において、作用物質の成分、例えば、Cas9分子および/またはgRNA分子は、1つまたは複数のポリヌクレオチドにコードされ、細胞に導入されてよい。いくつかの態様において、作用物質の1つまたは複数の成分をコードするポリヌクレオチドは、ベクターに含まれていてよい。
【０６０３】
いくつかの態様において、ベクターは、Cas9分子をコードする配列および/またはgRNA分子および/または鋳型ポリヌクレオチドを含み得る。ベクターは、例えば、Cas9分子配列に融合した、（例えば、核局在、核小体局在、ミトコンドリア局在のための）シグナルペプチドをコードする配列も含み得る。例えば、ベクターは、Cas9分子をコードする配列に融合した（例えば、SV40由来の）核局在配列を含み得る。
【０６０４】
1つまたは複数の制御/調節要素、例えば、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（IRES）、2A配列、およびスプライスアクセプターまたはスプライスドナーが、ベクターに含まれていてよい。いくつかの態様において、プロモーターは、RNA pol Iプロモーター、pol IIプロモーター、またはpol IIIプロモーターの中から選択される。いくつかの態様において、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIによって認識される（例えば、CMVプロモーター、SV40初期領域プロモーター、またはアデノウイルス主要後期プロモーター）。別の態様において、プロモーターは、RNAポリメラーゼIIIによって認識される（例えば、U6プロモーターまたはH1プロモーター）。
【０６０５】
別の態様において、プロモーターは、制御されたプロモーター（例えば、誘導性プロモーター）である。いくつかの態様において、プロモーターは、誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、Lacオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列、もしくはドキシサイクリンオペレーター配列を含むか、またはそれらの類似体であるか、またはLacリプレッサーもしくはテトラサイクリンリプレッサーもしくはそれらの類似体によって結合もしくは認識され得る。
【０６０６】
いくつかの態様において、プロモーターは、構成性プロモーターであるか、またはそれを含む。例示的な構成性プロモーターには、例えば、サルウイルス40初期プロモーター（SV40）、サイトメガロウイルスイミディエートアーリー（immediate-early）プロモーター（CMV）、ヒトユビキチンCプロモーター（UBC）、ヒト伸長因子1αプロモーター（EF1α）、マウスホスホグリセリン酸キナーゼ1プロモーター（PGK）、およびCMV初期エンハンサーと共役したニワトリβアクチンプロモーター（CAGG）が含まれる。いくつかの態様において、構成性プロモーターは、合成プロモーターまたは修飾型プロモーターである。いくつかの態様において、プロモーターは、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーと共に修飾型MoMuLV LTRのU3領域を含有する合成プロモーター、MNDプロモーターであるか、またはそれを含む（SEQ ID NO:18または126に記載の配列；Challita et al.(1995)J.Virol.69(2):748-755を参照すること）。いくつかの態様において、プロモーターは、組織特異的プロモーターである。別の態様において、プロモーターは、ウイルスプロモーターである。別の態様において、プロモーターは、非ウイルスプロモーターである。いくつかの態様において、例示的なプロモーターには、ヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーター（SEQ ID NO:4もしくは5に記載の配列）もしくはその修飾型（HTLV1エンハンサーを伴うEF1αプロモーター；SEQ ID NO:127に記載の配列）、またはMNDプロモーター（SEQ ID NO:18もしくは126に記載の配列）が含まれ得るが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、ポリヌクレオチドおよび/またはベクターは、制御要素、例えば、プロモーターを含まない。
【０６０７】
いくつかの態様において、ベクターまたは送達媒体は、（例えば、組換えウイルスの生成のための）ウイルスベクターである。いくつかの態様において、ウイルスは、DNAウイルス（例えば、dsDNAウイルスまたはssDNAウイルス）である。いくつかの態様において、ウイルスは、RNAウイルス（例えば、ssRNAウイルス）である。例示的なウイルスベクター/ウイルスには、例えば、レトロウイルス、レンチウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（AAV）、ワクシニアウイルス、ポックスウイルス、および単純ヘルペスウイルス、または本明細書中の他の箇所に記載されたウイルスのうちの任意のものが含まれる。
【０６０８】
いくつかの態様において、ウイルスは、分裂細胞を感染させる。別の態様において、ウイルスは、非分裂細胞を感染させる。別の態様において、ウイルスは、分裂細胞および非分裂細胞の両方を感染させる。別の態様において、ウイルスは、宿主ゲノムに組み込まれ得る。別の態様において、ウイルスは、例えば、ヒトにおいて、低下した免疫を有するよう改変されている。別の態様において、ウイルスは、複製可能である。別の態様において、ウイルスは、複製欠陥型であり、例えば、付加的なビリオン複製および/またはパッケージングのために必要な遺伝子の1つまたは複数のコード領域が、他の遺伝子に交換されているか、または欠失している。別の態様において、ウイルスは、遺伝子破壊の一過性の誘導のため、Cas9分子および/またはgRNA分子の一過性発現を引き起こす。別の態様において、ウイルスは、Cas9分子および/またはgRNA分子の長期持続的な、例えば、少なくとも1週間、2週間、1ヶ月、2ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、9ヶ月、1年、2年、または永久の発現を引き起こす。ウイルスのパッケージング能力は、例えば、少なくとも約4kbから、少なくとも約30kb、例えば、少なくとも約5kb、10kb、15kb、20kb、25kb、30kb、35kb、40kb、45kb、または50kbまで、変動し得る。
【０６０９】
いくつかの態様において、作用物質を含有するポリヌクレオチドおよび/または鋳型ポリヌクレオチドは、組換えレトロウイルスによって送達される。別の態様において、レトロウイルス（例えば、モロニーマウス白血病ウイルス）は、例えば、宿主ゲノムへの組み込みを可能にする逆転写酵素を含む。いくつかの態様において、レトロウイルスは、複製可能である。別の態様において、レトロウイルスは、複製欠陥型であり、例えば、付加的なビリオン複製およびパッケージングのために必要な遺伝子の1つまたは複数のコード領域が、他の遺伝子に交換されているか、または欠失している。
【０６１０】
いくつかの態様において、作用物質を含有するポリヌクレオチドおよび/または鋳型ポリヌクレオチドは、組換えレンチウイルスによって送達される。例えば、レンチウイルスは、複製欠陥型であり、例えば、ウイルス複製のために必要とされる1つまたは複数の遺伝子を含まない。いくつかの態様において、レンチウイルスは、HIV由来レンチウイルスである。
【０６１１】
いくつかの態様において、作用物質を含有するポリヌクレオチドおよび/または鋳型ポリヌクレオチドは、組換えアデノウイルスによって送達される。別の態様において、アデノウイルスは、ヒトにおいて低下した免疫を有するよう改変されている。
【０６１２】
いくつかの態様において、作用物質を含有するポリヌクレオチドおよび/または鋳型ポリヌクレオチドは、組換えAAVによって送達される。いくつかの態様において、AAVは、宿主細胞、例えば、本明細書中に記載される標的細胞のゲノムへそのゲノムを組み入れることができる。別の態様において、AAVは、自己相補的アデノ随伴ウイルス（scAAV）、例えば、二本鎖DNAを形成するために共にアニールする両方の鎖をパッケージングするscAAVである。開示された方法において使用され得るAAV血清型には、AAV1、AAV2、修飾型AAV2（例えば、Y444F、Y500F、Y730F、および/またはS662Vの修飾）、AAV3、修飾型AAV3（例えば、Y705F、Y731F、および/またはT492Vの修飾）、AAV4、AAV5、AAV6、修飾型AAV6（例えば、S663Vおよび/またはT492Vの修飾）、AAV7、AAV8、AAV8.2、AAV9、AAV.rh10、修飾型AAV.rh10、AAV.rh32/33、修飾型AAV.rh32/33、AAV.rh43、修飾型AAV.rh43、AAV.rh64R1、修飾型AAV.rh64R1が含まれ、AAV2/8、AAV2/5、およびAAV2/6のようなシュードタイピングされた（pseudotyped）AAVも、開示された方法において使用され得る。
【０６１３】
いくつかの態様において、作用物質を含有するポリヌクレオチドおよび/または鋳型ポリヌクレオチドは、ハイブリッドウイルス、例えば、本明細書中に記載されたウイルスのうちの1つまたは複数のハイブリッドによって送達される。
【０６１４】
パッケージング細胞は、標的細胞を感染させることができるウイルス粒子を形成させるために使用される。そのような細胞には、アデノウイルスをパッケージングすることができる293細胞、およびレトロウイルスをパッケージングすることができるψ2細胞またはPA317細胞が含まれる。遺伝子治療において使用されるウイルスベクターは、一般的には、核酸ベクターをウイルス粒子にパッケージングする産生細胞株によって生成される。ベクターは、典型的には、宿主細胞または標的細胞（適用可能な場合）へのパッケージングおよびその後の組み込みのために必要とされる最小のウイルス配列を含有し、その他のウイルス配列は、発現させたいタンパク質、例えば、Cas9をコードする発現カセットに交換されている。例えば、遺伝子治療において使用されるAAVベクターは、典型的には、宿主細胞または標的細胞におけるパッケージングおよび遺伝子発現のために必要とされるAAVゲノム由来の末端逆位配列（ITR）のみを保有する。欠けているウイルス機能は、パッケージング細胞株によってトランスに供給される。その後、ウイルスDNAは、その他のAAV遺伝子、即ち、repおよびcapをコードするが、ITR配列を欠いているヘルパープラスミドを含有する細胞株においてパッケージングされる。細胞株は、ヘルパーとしてのアデノウイルスによっても感染させられる。ヘルパーウイルスは、AAVベクターの複製およびヘルパープラスミドからのAAV遺伝子の発現を促進する。ヘルパープラスミドは、ITR配列の欠如のため、有意な量、パッケージングされない。アデノウイルスの混入は、例えば、アデノウイルスがAAVより感受性である熱処理によって低下させることができる。
【０６１５】
いくつかの態様において、ウイルスベクターは、細胞型認識の能力を有する。例えば、ウイルスベクターは、異なる/別のウイルスエンベロープ糖タンパク質によってシュードタイピングされてもよく；細胞型特異的な受容体によって改変されてもよく（例えば、ペプチドリガンド、単鎖抗体、増殖因子のようなターゲティングリガンドを組み入れるためのウイルスエンベロープ糖タンパク質の遺伝子修飾）；かつ/または一方の末端がウイルス糖タンパク質を認識し、他方の末端が標的細胞表面の一部分を認識する二重の特異性（例えば、リガンド-受容体、モノクローナル抗体、アビジン-ビオチン、および化学的コンジュゲーション）を有する分子ブリッジを有するよう改変されてもよい。
【０６１６】
いくつかの態様において、ウイルスベクターは、細胞型特異的発現を達成する。例えば、導入遺伝子（Cas9およびgRNA）の発現を特定の標的細胞のみに制限するため、組織特異的プロモーターが構築されてよい。ベクターの特異性は、導入遺伝子発現のマイクロRNA依存性の調節によっても媒介され得る。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、ウイルスベクターと標的細胞膜との融合の増加した効率を有する。例えば、融合可能な赤血球凝集素（HA）のような融合タンパク質を、細胞へのウイルス取り込みを増加させるために組み入れることができる。いくつかの態様において、ウイルスベクターは、核局在の能力を有する。例えば、（細胞分裂中の）核膜の分解を必要とし、従って、非分裂細胞を感染させないウイルスを、ウイルスのマトリックスタンパク質に核局在ペプチドを組み入れるために改変し、それによって、非増殖細胞の形質導入を可能にすることができる。
【０６１７】
IV. 組換え受容体
いくつかの態様において、標的組み込みのための導入遺伝子は、組換え受容体またはその抗原結合断片またはその鎖をコードする。いくつかの態様において、組換え受容体は、組換え抗原受容体、または抗原に結合する組換え受容体である。いくつかの態様において、組換え受容体は、T細胞によってコードされた内在性TCRとは異なる、組換えのまたは改変されたT細胞受容体（TCR）である。いくつかの態様において、組換え受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）またはTCR様CARである。いくつかの態様において、導入遺伝子は、組換え受容体のドメイン、領域、または鎖をコードしていてよく、1つまたは複数の第2の導入遺伝子は、組換え受容体の他のドメイン、領域、または鎖をコードしていてよい。いくつかの態様において、提供されたポリヌクレオチド、ベクター、組成物、方法、製品、および/またはキットは、組換えTCRまたはその抗原結合断片を発現する細胞を改変するために有用である。
【０６１８】
いくつかの態様において、提供された組換え受容体、例えば、TCRまたはCARは、癌または腫瘍のような疾患、障害、または状態の細胞または組織に関連し、それらに特異的であり、かつ/またはそれらにおいて発現された抗原に結合するかまたは認識すること、例えば、特異的に結合するかまたは認識することができる。いくつかの局面において、抗原は、ペプチドの形態であり、例えば、ペプチド抗原またはペプチドエピトープである。いくつかの態様において、提供されたTCRは、主要組織適合性（MHC）分子と会合した、ペプチドである抗原に結合し、例えば、特異的に結合する。
【０６１９】
組換え受容体が、抗原、例えば、ペプチド抗原に結合するか、または抗原、例えば、ペプチド抗原に特異的に結合することの観察は、それが全ての種の抗原に結合することを必ずしも意味しない。例えば、いくつかの態様において、抗原、例えば、MHCと会合したペプチド抗原に結合するという特色、例えば、それに特異的に結合する能力、および/またはそれとの結合について参照結合分子もしくは参照受容体と競合する能力、および/または特定の親和性で結合するかもしくは特定の程度に競合する能力は、いくつかの態様において、ヒト抗原に関する能力をさし、組換え受容体は、マウスのような別の種に由来する抗原に関して、この特色を有しなくてもよい。いくつかの局面において、例えば、ラジオイムノアッセイ（RIA）、ペプチド滴定アッセイ、またはレポーターアッセイによって測定される、組換え受容体またはその抗原結合断片の、無関係な抗原またはタンパク質、例えば、無関係なペプチド抗原との結合の程度は、組換え受容体またはその抗原結合断片の、抗原、例えば、同族抗原との結合の10％未満または約10％未満である。
【０６２０】
A. T細胞受容体（TCR）
いくつかの態様において、細胞に導入される組換え受容体は、T細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片である。
【０６２１】
いくつかの態様において、「T細胞受容体」または「TCR」とは、（それぞれ、TCRαおよびTCRβとしても公知の）α鎖およびβ鎖、もしくは（それぞれ、TCRγおよびTCRδとしても公知の）γ鎖およびδ鎖、またはそれらの抗原結合部分を含有しており、MHC分子に結合した抗原、例えば、ペプチド抗原またはペプチドエピトープに特異的に結合することができる分子である。いくつかの態様において、TCRは、αβ型である。典型的には、αβ型で存在するTCRおよびγδ型で存在するTCRは、概して構造的に類似しているが、それらを発現するT細胞は、異なる解剖学的位置または機能を有し得る。TCRは、細胞の表面上に、または可溶型で見出され得る。一般に、TCRは、T細胞（またはTリンパ球）の表面上に見出され、そこで、主要組織適合性複合体（MHC）分子に結合した抗原の認識を一般に担う。
【０６２２】
典型的には、組換え受容体、例えば、TCRの、ペプチドエピトープ、例えば、MHCとの複合体を形成したペプチドエピトープとの特異的結合は、1つまたは複数の相補性決定領域（CDR）を含有する抗原結合部位の存在によって支配される。一般に、特異的に結合する、とは、他の分子との非特異的な結合相互作用も起こり得るため、特定のペプチドエピトープ、例えば、MHCと複合体を形成したペプチドエピトープが、そのMHC-ペプチド分子が結合し得る唯一のものであることを意味しないことが理解される。いくつかの態様において、組換え受容体の、MHC分子と会合したペプチドとの結合は、そのような他の分子、例えば、MHC分子と会合した別のペプチドまたはMHC分子と会合した無関係な（対照）ペプチドとの結合より高い親和性、例えば、そのような他の分子との結合親和性より少なくとも約2倍、少なくとも約10倍、少なくとも約20倍、少なくとも約50倍、または少なくとも約100倍高い親和性による。
【０６２３】
いくつかの態様において、組換え受容体、例えば、TCRは、多数の公知のスクリーニングアッセイのうちの任意のものを使用して、安全性またはオフターゲット結合活性について評価され得る。いくつかの態様において、特定の組換え受容体、例えば、TCRに対する免疫応答の生成は、標的ペプチドエピトープを発現しないことが既知の細胞、例えば、正常組織に由来する細胞、1つもしくは複数の異なるMHC型を発現する同種細胞株、または他の組織起源もしくは細胞起源の存在下で測定され得る。いくつかの態様において、細胞または組織は、正常細胞または正常組織を含む。いくつかの態様において、細胞との結合は、二次元培養物中で試験され得る。いくつかの態様において、細胞との結合は、三次元培養物中で試験され得る。いくつかの態様において、対照として、組織または細胞は、標的エピトープを発現することが既知のものであり得る。免疫応答は、例えば、T細胞のような免疫細胞の活性化（例えば、細胞傷害活性）、サイトカイン（例えば、インターフェロンγ）の産生、またはシグナリングカスケードの活性化を評価することによって、例えば、レポーターアッセイによって、直接的または間接的に評価され得る。
【０６２４】
特記されない限り、「TCR」という用語には、完全TCRが包含され、その抗原結合部分または抗原結合断片も包含されることが理解されるべきである。いくつかの態様において、TCRは、インタクトまたは全長のTCR、例えば、α（TCRα）鎖およびβ（TCRβ）鎖を含有するTCRである。いくつかの態様において、TCRは、全長TCRより小さいが、MHC分子に結合した特異的なペプチドに結合し、例えば、MHC-ペプチド複合体に結合する抗原結合部分である。いくつかのケースにおいて、TCRの抗原結合部分または断片は、全長またはインタクトのTCRの構造ドメインの一部分のみを含有し得るが、完全TCRが結合するペプチドエピトープ、例えば、MHC-ペプチド複合体に結合することができる。いくつかのケースにおいて、抗原結合部分は、特異的なMHC-ペプチド複合体に結合するための結合部位を形成するために十分な、TCRの可変ドメイン、例えば、TCRの可変α（Vα）鎖および可変β（Vβ）鎖またはそれらの抗原結合断片を含有する。
【０６２５】
いくつかの態様において、TCRの可変ドメインは、相補性決定領域（CDR）を含有し、CDRは、一般に、抗原を認識しそれに結合する能力、ならびにペプチド、MHC、および/またはMHC-ペプチド複合体の特異性に主に寄与する。いくつかの態様において、TCRのCDRまたはそれらの組み合わせが、所定のTCR分子の抗原結合部位の全部または実質的に全部を形成する。TCR鎖の可変領域内の様々なCDRは、一般に、フレームワーク領域（FR）によって分離されており、FRは、一般に、CDRと比較してTCR分子間のより少ない可変性を示す（例えば、Jores et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 87: 9138, 1990；Chothia et al., EMBO J. 7: 3745, 1988を参照すること；Lefranc et al., Dev. Comp.I mmunol. 27: 55,2003も参照すること）。いくつかの態様において、CDR3は、抗原結合もしくは特異性を担う主要なCDRであるか、または抗原認識のため、かつ/もしくはペプチド-MHC複合体のプロセシングされたペプチド部分との相互作用のため、所定のTCR可変領域の3つのCDRの中で最も重要なものである。いくつかの状況において、α鎖のCDR1は、ある種の抗原性ペプチドのN末端部分と相互作用することができる。いくつかの状況において、β鎖のCDR1は、ペプチドのC末端部分と相互作用することができる。いくつかの状況において、CDR2は、MHC-ペプチド複合体のMHC部分との相互作用もしくはその認識に最も強く寄与するか、またはそれを担う主要なCDRである。いくつかの態様において、β鎖の可変領域は、さらなる超可変領域（CDR4またはHVR4）を含有してもよく、超可変領域は、一般に、スーパー抗原の結合に関与し、抗原認識には関与しない（Kotb(1995) Clinical Microbiology Reviews, 8:411-426）。
【０６２６】
いくつかの態様において、TCRのα鎖および/またはβ鎖は、定常ドメイン、膜貫通ドメイン、および/または短い細胞質テールを含有し得る（例えば、Janeway et al., Immunobiology: The Immune System in Health and Disease,3rd Ed., Current Biology Publications, p.4:33,1997を参照すること）。いくつかの局面において、TCRの各鎖（例えば、αまたはβ）は、1つのN末端免疫グロブリン可変ドメイン、1つの免疫グロブリン定常ドメイン、膜貫通領域、およびC末端の短い細胞質テールを保有し得る。いくつかの態様において、TCRは、例えば、細胞質テールを介して、シグナル伝達の媒介に関与するCD3複合体のインバリアントタンパク質と会合している。いくつかのケースにおいて、その構造は、TCRが、CD3およびそのサブユニットのような他の分子と会合することを可能にする。例えば、膜貫通領域を含む定常ドメインを含有するTCRは、タンパク質を細胞膜に繋留し、CD3シグナリング装置または複合体のインバリアントサブユニットと会合することができる。CD3シグナリングサブユニット（例えば、CD3γ鎖、CD3δ鎖、CD3ε鎖、およびCD3ζ鎖）の細胞内テールは、1つまたは複数の免疫受容活性化チロシンモチーフまたはITAMを含有し、一般に、TCR複合体のシグナリング能力に関与する。
【０６２７】
いくつかの態様において、TCRの様々なドメインまたは領域を決定することができる。いくつかのケースにおいて、ドメインまたは領域の正確な位置は、特定のドメインを記載するために使用される特定の構造モデリングまたは相同性モデリングまたはその他の特色に依って変動し得る。組換え受容体、例えば、TCRのドメイン構成を記載するために使用されるアミノ酸、例えば、SEQ ID NOとして記載された具体的な配列の言及は、例示目的のためであって、提供された態様の範囲を限定するものではないことが理解される。いくつかのケースにおいて、具体的なドメイン（例えば、可変または定常）は、数アミノ酸（例えば、1アミノ酸、2アミノ酸、3アミノ酸、または4アミノ酸）長いかまたは短くてもよい。いくつかの局面において、TCRの残基は、公知であるか、またはInternational Immunogenetics Information System（IMGT）ナンバリング系によって同定され得る（例えば、www.imgt.orgを参照すること；Lefranc et al.(2003)Developmental and Comparative Immunology,2&；55-77；およびThe T Cell Factsbook 2nd Edition,Lefranc and LeFranc Academic Press 2001も参照すること）。この系を使用すると、TCR Vα鎖および/またはVβ鎖のCDR1配列は、残基番号27〜38（両端を含む）に存在するアミノ酸に相当し、TCR Vα鎖および/またはVβ鎖のCDR2配列は、残基番号56〜65（両端を含む）に存在するアミノ酸に相当し、TCR Vα鎖および/またはVβ鎖のCDR3配列は、残基番号105〜117（両端を含む）に存在するアミノ酸に相当する。
【０６２８】
いくつかの態様において、TCRのα鎖およびβ鎖は、各々、定常ドメインをさらに含有する。いくつかの態様において、α鎖定常ドメイン（Cα）およびβ鎖定常ドメイン（Cβ）は、個々に、哺乳動物、例えば、ヒトまたはマウスの定常ドメインである。いくつかの態様において、定常ドメインは、細胞膜に近接している。例えば、いくつかのケースにおいて、2本の鎖によって形成されたTCRの細胞外部分は、2つの膜近位定常ドメインおよび2つの膜遠位可変ドメインを含有し、それらの可変ドメインは、各々、CDRを含有する。
【０６２９】
いくつかの態様において、CαドメインおよびCβドメインの各々はヒトである。いくつかの態様において、Cαは、TRAC遺伝子（IMGT命名法）によってコードされるか、またはそのバリアントである。いくつかの態様において、Cαは、SEQ ID NO:19に記載のアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:19との少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するかまたは含む。いくつかの態様において、Cαは、SEQ ID NO:19に記載のアミノ酸の配列を有するかまたは含む。いくつかの態様において、Cαは、SEQ ID NO:1に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸の配列、例えば、成熟ポリペプチド、またはSEQ ID NO:1に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸の配列、例えば、成熟ポリペプチドとの少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するかまたは含む。いくつかの態様において、Cβは、TRBC1遺伝子もしくはTRBC2遺伝子（IMGT命名法）によってコードされるか、またはそれらのバリアントである。いくつかの態様において、Cβは、SEQ ID NO:20もしくは21に記載のアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:20もしくは21との少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するかまたは含む。いくつかの態様において、Cβは、SEQ ID NO:20または21に記載のアミノ酸の配列を有するかまたは含む。いくつかの態様において、Cβは、SEQ ID NO:2もしくは3に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸の配列、例えば、成熟ポリペプチド、またはSEQ ID NO:2もしくは3に記載の核酸配列によってコードされるアミノ酸の配列、例えば、成熟ポリペプチドとの少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有するかまたは含む。
【０６３０】
いくつかの態様において、提供されたTCRまたはその抗原結合断片のうちの任意のものは、ヒト/マウスキメラTCRであり得る。いくつかのケースにおいて、TCRまたはその抗原結合断片は、マウス定常領域を含むα鎖および/またはβ鎖を有する。いくつかの局面において、Cα領域および/またはCβ領域は、マウス定常領域である。いくつかの態様において、Cαは、SEQ ID NO:14、15、121、もしくは122に記載のアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:14、15、121、もしく122との少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列であるかまたはそれを含むマウス定常領域である。いくつかの態様において、Cαは、SEQ ID NO:14、15、121、または122に記載のアミノ酸の配列であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、Cβは、SEQ ID NO:16、17、もしくは123に記載のアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:16、17、もしくは123との少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列であるかまたはそれを含むマウス定常領域である。いくつかの態様において、Cβは、SEQ ID NO:16、17、または123に記載のアミノ酸の配列であるかまたはそれを含む。
【０６３１】
そのような態様のうちのいくつかにおいて、TCRまたはその抗原結合断片は、TCRまたはその抗原結合断片が細胞において発現される時、TCRのα鎖およびβ鎖と内在性TCRのα鎖およびβ鎖との間の誤対合の頻度が低下し、TCRのα鎖およびβ鎖の発現が増加し、かつ/またはTCRのα鎖およびβ鎖の安定性が増加するよう、1つまたは複数の修飾をα鎖および/またはβ鎖に含有する。いくつかの態様において、1つまたは複数の修飾は、Cα領域および/またはCβ領域における1つまたは複数のアミノ酸の交換、欠失、または挿入である。いくつかの局面において、1つまたは複数の修飾は、α鎖とβ鎖との間に1つまたは複数の非ネイティブジスルフィド架橋を形成することができる1つまたは複数のシステイン残基を導入するための交換を含有する。
【０６３２】
そのような態様のうちのいくつかにおいて、TCRまたはその抗原結合断片は、SEQ ID NO:24に記載のナンバリングによる48位に相当する位置にシステインを含有するCα領域および/またはSEQ ID NO:20に記載のナンバリングによる57位に相当する位置にシステインを含有するCβ領域を含有する。いくつかの態様において、Cα領域は、SEQ ID NO:19もしくは24のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列、またはそれとの少なくとも90％の配列同一性を有し、かつβ鎖と非ネイティブジスルフィド結合を形成することができる1つもしくは複数のシステイン残基を含有するアミノ酸の配列を含有し；かつ/またはCβ領域は、SEQ ID NO:20、21、もしくは25のうちのいずれかに記載のアミノ酸配列、またはそれとの少なくとも90％の配列同一性を有し、かつα鎖と非ネイティブジスルフィド結合を形成することができる1つもしくは複数のシステイン残基を含有するアミノ酸の配列を含有する。
【０６３３】
そのような態様のうちのいくつかにおいて、TCRまたはその抗原結合断片は、コドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる。
【０６３４】
そのような態様のうちのいくつかにおいて、結合分子もしくはTCRまたはそれらの抗原結合断片は、単離されているか、もしくは精製されているか、または組換えである。そのような態様のうちのいくつかにおいて、結合分子もしくはTCRまたはそれらの抗原結合断片は、ヒトである。
【０６３５】
いくつかの態様において、TCRは、例えば、ジスルフィド結合によって、連結されている2本の鎖αおよびβのヘテロ二量体であり得る。いくつかの態様において、TCRの定常ドメインは、システイン残基がジスルフィド結合を形成し、それによって、TCRの2本の鎖を連結する、短い接続配列を含有し得る。いくつかの態様において、TCRが定常ドメインに2つのジスルフィド結合を含有するよう、TCRは、α鎖およびβ鎖の各々に付加的なシステイン残基を有していてもよい。いくつかの態様において、定常ドメインおよび可変ドメインの各々が、システイン残基によって形成されたジスルフィド結合を含有する。
【０６３６】
いくつかの態様において、TCRは、導入されたジスルフィド結合を含有していてよい。いくつかの態様において、ネイティブジスルフィド結合は、存在しない。いくつかの態様において、ネイティブ鎖間ジスルフィド結合を形成する（例えば、α鎖およびβ鎖の定常ドメイン内の）ネイティブシステインのうちの1つまたは複数は、別の残基、例えば、セリンまたはアラニンに置換される。いくつかの態様において、導入されたジスルフィド結合は、α鎖およびβ鎖、例えば、α鎖およびβ鎖の定常ドメインにおいて、非システイン残基をシステインに変異させることによって形成され得る。いくつかの態様において、組換えTCRにおける（例えば、1つまたは複数の非ネイティブジスルフィド結合をもたらす）非ネイティブシステイン残基の存在は、それが導入された細胞において、ネイティブTCR鎖を含有するミスマッチTCR対の発現より、所望の組換えTCRの産生のために有利であり得る。
【０６３７】
TCRの例示的な非ネイティブジスルフィド結合は、公開された国際PCT番号WO2006/000830、WO2006037960、およびKuball et al.(2007)Blood,109:2331-2338に記載されている。いくつかの態様において、システインは、SEQ ID NO:24に記載されたCαまたはSEQ ID NO:20に記載されたCβのナンバリングに関して、Cα鎖の残基Thr48およびCβ鎖のSer57、Cα鎖の残基Thr45およびCβ鎖のSer77、Cα鎖の残基Tyr10およびCβ鎖の残基Ser17、Cα鎖の残基Thr45およびCβ鎖のAsp59、ならびに/またはCα鎖Ser15およびCβ鎖のGlu15に導入され得る。いくつかの態様において、提供されたシステイン変異のうちの任意のものは、他の配列、例えば、本明細書中に記載されたマウスのCαおよびCβの配列の相当する位置において作成されてもよい。タンパク質の位置に関する「相当する」という用語、例えば、配列表に記載されたような開示された配列のアミノ酸位置にアミノ酸位置が「相当する」という記述は、構造的配列アライメントに基づき、またはGAPアルゴリズムのような標準的なアライメントアルゴリズムを使用して、開示された配列とのアライメントによって同定されるアミノ酸位置をさす。例えば、相当する残基は、本明細書中に記載される構造的アライメント方法によって、SEQ ID NO:24に記載されたCα配列またはSEQ ID NO:20に記載されたCβ配列との参照配列のアライメントによって決定され得る。配列を整列させることによって、例えば、保存されたアミノ酸残基および同一のアミノ酸残基をガイドとして使用して、相当する残基が同定され得る。
【０６３８】
提供されたTCRの例示的な配列（例えば、CDR、Vαおよび/またはVβ、ならびに定常領域の配列）が、本明細書中に記載される。
【０６３９】
いくつかの態様において、組換えTCRまたはその抗原結合部分（またはTCR様抗体のようなその他のMHC-ペプチド結合分子）は、MHC分子と会合して細胞によって提示された時の標的ポリペプチドのペプチドエピトープまたはT細胞エピトープ、即ち、標的ポリペプチドのMHC-ペプチド複合体を認識することが既知であるか、または認識する可能性が高いか、または認識する可能性がある。いくつかの態様において、組換えTCR（またはその他のMHC-ペプチド結合分子もしくはTCR様抗体）は、例えば、MHC-ペプチド複合体として呈示された時、標的ポリペプチドのT細胞エピトープに対して特異的結合を示すことが既知であるか、またはその可能性が高い。MHC-ペプチド結合分子（例えば、TCRまたはTCR様抗体）の結合または相互作用を評価する方法は、公知であり、本明細書中に記載された例示的な方法のうちの任意のものを含む。
【０６４０】
いくつかの態様において、MHC分子は、MHCクラスIまたはMHCクラスIIの分子である。いくつかの態様において、MHCは、多形性のペプチド結合部位または結合溝を含有し、それらは、いくつかのケースにおいて、ポリペプチドのペプチドエピトープ、例えば、細胞機構によってプロセシングされたペプチドエピトープと複合体を形成することができる。いくつかのケースにおいて、MHC分子は、T細胞上のTCRまたはその他のMHC-ペプチド結合分子によって認識可能なコンフォメーションでの抗原の提示のため、例えば、ペプチドとの複合体、即ち、MHC-ペプチド複合体として、細胞表面上に呈示または発現され得る。一般に、MHCクラスI分子は、いくつかのケースにおいて、3つのαドメインを含む膜貫通α鎖と、非共有結合的に会合したβ2ミクログロブリンとを有するヘテロ二量体である。一般に、MHCクラスII分子は、2つの膜貫通糖タンパク質αおよびβから構成され、それらの両方が、典型的には、膜を貫通している。MHC分子は、抗原結合部位またはペプチド結合のための部位を含有するMHCの有効部分と、TCRのような適切な結合分子による認識のために必要な配列とを含み得る。いくつかの態様において、MHCクラスI分子は、サイトゾルに起因するペプチドを細胞表面に送達し、そこで、ペプチド:MHC複合体は、T細胞、例えば、一般に、CD8+T細胞、いくつかのケースにおいて、CD4+T細胞によって認識される。いくつかの態様において、MHCクラスII分子は、小胞系に起因するペプチドを細胞表面に送達し、そこで、典型的には、CD4+T細胞によってそれらが認識される。一般に、MHC分子は、マウスにおいてはH-2、ヒトにおいてはヒト白血球抗原（HLA）と集合的に名付けられている、連鎖した遺伝子座の群によってコードされる。いくつかの局面において、ヒトMHCは、ヒト白血球抗原（HLA）とも呼ばれる。
【０６４１】
いくつかの態様において、ペプチドエピトープまたはT細胞エピトープは、ポリペプチドまたはタンパク質のようなより長い生物学的分子に由来するかまたはその断片に基づいていてよく、MHC分子と会合するかまたは複合体を形成することができるペプチドである。いくつかの態様において、ペプチドは、約8〜約24アミノ酸長である。いくつかの態様において、ペプチドは、MHCクラスII複合体における認識のため、9〜22または約9〜22アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様において、ペプチドは、MHCクラスI複合体における認識のため、8〜13または約8〜13アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様において、MHC分子とペプチドエピトープまたはT細胞エピトープとは、MHC分子の結合溝または間隙におけるペプチドの非共有結合性の相互作用を介して複合体を形成するかまたは会合する。
【０６４２】
いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体は、細胞の表面上に存在するかまたは呈示される。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体は、TCRもしくはその抗原結合部分またはその他のMHC-ペプチド結合分子によって特異的に認識され得る。いくつかの態様において、T細胞エピトープまたはペプチドエピトープは、MHC分子との結合特徴によって動物において免疫応答を誘導することができる。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体のようなT細胞エピトープの認識によって、TCR（またはその他のMHC-ペプチド結合分子）は、T細胞応答、例えば、T細胞増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性T細胞応答、またはその他の応答を誘導する活性化シグナルをT細胞に対して生成するかまたは誘発する。
【０６４３】
いくつかの態様において、TCRまたはその他のMHC-ペプチド結合分子は、MHCクラスI分子と会合したT細胞エピトープを認識するかまたは認識する可能性がある。MHCクラスIタンパク質は、高等脊椎動物の全ての有核細胞において発現されている。MHCクラスI分子は、12kDaの軽鎖β2ミクログロブリンと非共有結合的に会合した46kDaの重鎖から構成されるヘテロ二量体である。ヒトにおいては、例えば、HLA-A2、HLA-A1、HLA-A3、HLA-A24、HLA-A28、HLA-A31、HLA-A33、HLA-A34、HLA-B7、HLA-B45、およびHLA-Cw8のような、いくつかのMHC対立遺伝子が存在する。MHC対立遺伝子の配列は、公知であり、例えば、www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hlaにおいて利用可能なIMGT/HLAデータベースに見出され得る。いくつかの態様において、MHCクラスI対立遺伝子は、いくつかの集団において、集団のおよそ50％によって発現されているHLA-A2対立遺伝子である。いくつかの態様において、HLA-A2対立遺伝子は、HLA-A*0201、HLA-A*0202、HLA-A*0203、HLA-A*0206、またはHLA-A*0207の遺伝子産物であり得る。いくつかのケースにおいて、異なる集団の間にはサブタイプの頻度の差が存在し得る。例えば、いくつかの態様において、HLA-A2陽性コーカサス人集団の95％超が、HLA-A*0201であるが、中国人集団における頻度は、およそ23％HLA-A*0201、45％HLA-A*0207、8％HLA-A*0206、および23％HLA-A*0203であると報告されている。
【０６４４】
いくつかの態様において、MHCクラスI拘束性ペプチドは、8〜15アミノ酸長、例えば、8〜10アミノ酸長である。いくつかの態様において、MHCクラスI分子は、サイトゾル経路を介して細胞の細胞質内でプロセシングされた、疾患細胞または感染細胞において産生された内在性抗原、例えば、腫瘍タンパク質、ウイルスタンパク質、または細菌タンパク質に由来するペプチドに結合する。いくつかの態様において、細胞の表面上に呈示されたMHCクラスI-ペプチド複合体は、典型的には、CD8+T細胞、例えば、細胞傷害性T細胞において発現されたTCRによって認識される。いくつかの態様において、MHCクラスI-ペプチド複合体は、CD4+T細胞において発現されたTCR、例えば、CD8非依存性または部分的にCD8非依存性の結合を示すTCRによって認識され得る。
【０６４５】
いくつかの態様において、TCRまたはその他のMHC-ペプチド結合分子は、MHCクラスII分子と会合したT細胞エピトープを認識するかまたは認識する可能性がある。MHCクラスIIタンパク質は、一般に、抗原提示細胞（APC）と呼ばれる有核脊椎動物細胞のサブセットにおいて発現される。ヒトにおいては、例えば、DR1、DR3、DR4、DR7、DR52、DQ1、DQ2、DQ4、DQ8、およびDP1のような、いくつかのMHCクラスII対立遺伝子が存在する。いくつかの態様において、MHCクラスII対立遺伝子は、HLA-DRB1*0101、HLA-DRB*0301、HLA-DRB*0701、HLA-DRB*0401、およびHLA-DQB1*0201である。MHC対立遺伝子の配列は、公知であり、例えば、www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hlaにおいて利用可能なIMGT/HLAデータベースに見出され得る。
【０６４６】
いくつかの態様において、MHCクラスII拘束性ペプチドは、一般に、約9〜25残基長、例えば、15〜25残基長または13〜18残基長であり、いくつかのケースにおいて、約9アミノ酸または約12アミノ酸の結合コア領域を含有する。いくつかの態様において、MHCクラスII分子は、食作用またはエンドサイトーシスによって内部移行し、エンドソーム/リソソーム経路においてプロセシングされた、外来性抗原に由来するペプチドに結合する。いくつかの態様において、細胞の表面上に呈示されたMHCクラスII-ペプチド複合体は、典型的には、CD4+細胞、例えば、ヘルパーT細胞によって認識される。いくつかの態様において、呈示されたMHCクラスII-ペプチド複合体は、CD8+T細胞において発現されたTCRによって認識され得る。
【０６４７】
典型的には、ペプチドエピトープまたはT細胞エピトープは、抗原のペプチド部分である。いくつかの態様において、抗原は、既知であり、いくつかのケースにおいて、TCRまたはその抗原結合部分（またはその他のMHC-ペプチド結合分子）によって認識されるペプチドエピトープも、既知、例えば、提供された方法を実施する前に既知であり得る。
【０６４８】
いくつかの態様において、抗原は、腫瘍関連抗原、自己免疫疾患もしくは炎症性疾患に関連した特定の細胞型において発現された抗原、またはウイルス性病原体もしくは細菌性病原体に由来する抗原である。いくつかの態様において、抗原は、疾患に関与する抗原である。いくつかの態様において、疾患は、細胞の悪性または形質転換によって引き起こされるもの、例えば、癌であり得る。いくつかの態様において、抗原は、腫瘍細胞または癌細胞に由来する細胞内タンパク質抗原、例えば、腫瘍関連抗原であり得る。いくつかのケースにおいて、癌抗原の大多数が、MHC分子と会合して細胞表面でのみ標的とされ得る細胞内タンパク質に由来するため、TCRは、このクラスの抗原を認識するよう進化したため、理想的な治療薬候補である。いくつかの態様において、疾患は、感染、例えば、細菌感染またはウイルス感染によって引き起こされたものであり得る。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス関連癌抗原である。いくつかのケースにおいて、組換えTCRまたはその抗原結合部分（およびその他のMHC-ペプチド結合分子）は、感染細胞において天然にプロセシングされ、MHC分子によって細胞表面上に呈示された、ウイルスタンパク質に由来するペプチドを認識するかまたは認識する可能性がある。いくつかの態様において、疾患は、自己免疫疾患であり得る。その他の標的には、HLA Factsbook（Marsh et al.(2000)）においてリストされたもの、およびその他の公知のものが含まれる。
【０６４９】
いくつかの態様において、抗原は、腫瘍または癌に関連したものである。いくつかの態様において、腫瘍抗原または癌抗原は、悪性細胞上に見出され得るか、悪性細胞内に見出され得るか、または腫瘍細胞成長のメディエーターであるものである。いくつかの態様において、腫瘍抗原または癌抗原は、腫瘍細胞または癌細胞によって優勢に発現されるかまたは過剰発現されるものである。多数の腫瘍抗原、例えば、MHC拘束性T細胞限定（T cell-defined）腫瘍抗原が、同定されており、公知である（例えば、cancerimmunity.org/peptide/；Boon and Old(1997)Curr Opin Immunol,9:681-3；Cheever et al.(2009)Clin Cancer Res,15:5323-37を参照すること）。いくつかの態様において、腫瘍抗原には、変異型ペプチド、分化抗原、および過剰発現抗原が含まれるが、これらに限定されるわけではなく、これらは、全て、治療のための標的として役立ち得る。
【０６５０】
いくつかの態様において、腫瘍抗原または癌抗原は、リンパ腫抗原（例えば、非ホジキンリンパ腫もしくはホジキンリンパ腫）、B細胞リンパ腫癌抗原、白血病抗原、骨髄腫（即ち、多発性骨髄腫もしくは形質細胞性骨髄腫）抗原、急性リンパ芽球性白血病抗原、慢性骨髄性白血病抗原、または急性骨髄性白血病抗原である。いくつかの態様において、癌抗原は、膵臓、結腸、乳房、卵巣、肺、前立腺、頭頸部のような腺癌である癌、例えば、多発性骨髄腫およびいくつかのB細胞リンパ腫において過剰発現されるかまたはそれらに関連している抗原である。いくつかの態様において、抗原は、前立腺癌、肺癌、乳癌、卵巣癌、膵臓癌、皮膚癌、肝臓癌（例えば、肝細胞腺癌）、腸癌、または膀胱癌のような癌に関連している。
【０６５１】
いくつかの態様において、抗原は、神経膠腫関連抗原、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、アルファフェトプロテイン（AFP）、B細胞成熟抗原（BCMA、BCM）、B細胞活性化因子受容体（BAFFR、BR3）、および/または膜貫通活性化因子CAML相互作用因子（transmembrane activator and CAML interactor）（TACI）、Fc受容体様5（FCRL5、FcRH5）、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、メラニン（Melanin）-A/MART-1、WT-1、S-100、MBP、CD63、MUC1（例えば、MUC1-8）、p53、Ras、サイクリンB1、HER-2/neu、癌胎児抗原（CEA）、gp100、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A11、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-C1、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）、βカテニン、NY-ESO-1、LAGE-1a、PP1、MDM2、MDM4、EGVFvIII、Tax、SSX2、テロメラーゼ、TARP、pp65、CDK4、ビメンチン、S100、eIF-4A1、IFN誘導性p78、およびメラノトランスフェリン（melanotransferrin）（p97）、ウロプラキンII、前立腺特異抗原（PSA）、ヒトカリクレイン（huK2）、前立腺特異膜抗原（PSM）、および前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、好中球エラスターゼ、エフリンB2、BA-46、βカテニン、Bcr-abl、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、カスパーゼ8、またはB-Raf抗原であり得る腫瘍抗原である。他の腫瘍抗原には、FRa、CD24、CD44、CD133、CD166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、uPA、PAI-1、CD19、CD20、CD22、ROR1、メソテリン、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂質F77、GD-2、インスリン増殖因子（IGF）-I、IGF-II、およびIGF-I受容体に由来する任意のものが含まれ得る。特異的な腫瘍関連抗原またはT細胞エピトープは、公知である（例えば、www.cancerimmunity.org/peptide/において入手可能なvan der Bruggen et al. (2013) Cancer Immun；Cheever et al. (2009 )Clin Cancer Res, 15, 5323-37を参照すること）。
【０６５２】
いくつかの態様において、抗原は、ウイルス抗原である。多くのウイルス抗原標的、例えば、HIV、HTLV、およびその他のウイルスのウイルスゲノムに由来するペプチドが、同定されており、公知である（例えば、Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2, e321；Tsomides et al. (1994) J Exp Med, 180, 1283-93；Utz et al. (1996) J Virol, 70, 843-51を参照すること）。例示的なウイルス抗原には、A型肝炎、B型肝炎（例えば、HBVコア抗原および表面抗原（HBVc、HBVs））、C型肝炎（HCV）、エプスタインバーウイルス（例えば、EBVA）、ヒトパピローマウイルス（HPV；例えば、E6およびE7）、ヒト免疫不全1型ウイルス（HIV1）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（KSHV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、HTLN-1、HIN-1、HIN-II、CMN、EBN、またはHPNに由来する抗原が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、標的タンパク質は、細菌抗原またはその他の病原性抗原、例えば、結核菌（Mycobacterium tuberculosis）（MT）抗原、トリパノソーマ、例えば、トリパノソーマ・クルージ（Tiypansoma cruzi）（T.クルージ）の抗原、例えば、表面抗原（TSA）、またはマラリア抗原である。特異的なウイルス抗原もしくはエピトープまたはその他の病原性抗原もしくはT細胞エピトープは、公知である（例えば、Addo et al. (2007) PLoS ONE, 2: e321；Anikeeva et al. (2009) Clin Immunol, 130: 98-109を参照すること）。
【０６５３】
いくつかの態様において、抗原は、癌に関連したウイルス、例えば、癌ウイルスに由来する抗原である。例えば、癌ウイルスは、ある種のウイルスによる感染が、異なる型の癌の発症をもたらすことが公知であるもの、例えば、A型肝炎、B型肝炎（例えば、HBVコア抗原および表面抗原（HBVc、HBVs））、C型肝炎（HCV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス感染、エプスタインバーウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス8（HHV-8）、ヒトT細胞白血病ウイルス1（HTLV-1）、ヒトT細胞白血病ウイルス2（HTLV-2）、またはサイトメガロウイルス（CMV）抗原である。
【０６５４】
いくつかの態様において、ウイルス抗原は、いくつかのケースにおいて、より大きい子宮頸癌発症リスクをもたらし得るHPV抗原である。いくつかの態様において、抗原は、HPV-16抗原およびHPV-18抗原およびHPV-31抗原、HPV-33抗原またはHPV-35抗原であり得る。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、HPV-16抗原（例えば、HPV-16のE1タンパク質、E2タンパク質、E6タンパク質、および/もしくはE7タンパク質の血清反応領域、例えば、米国特許第6,531,127号を参照すること）、またはHPV-18抗原（例えば、米国特許第5,840,306号に記載されたようなHPV-18のL1タンパク質および/もしくはL2タンパク質の血清反応領域）である。いくつかの態様において、ウイルス抗原は、HPV-16のE6タンパク質および/またはE7タンパク質に由来するHPV-16抗原である。いくつかの態様において、TCRは、HPV-16 E6またはHPV-16 E7に対するTCRである。いくつかの態様において、TCRは、例えば、WO2015/184228、WO2015/009604、およびWO2015/009606に記載されたTCRである。
【０６５５】
いくつかの態様において、ウイルス抗原は、いくつかのケースにおいて、HBV陰性対象またはHCV陰性対象より大きい肝臓癌発症リスクをもたらし得るHBV抗原またはHCV抗原である。例えば、いくつかの態様において、異種抗原は、HBV抗原、例えば、B型肝炎コア抗原またはB型肝炎エンベロープ抗原である（US2012/0308580）。
【０６５６】
いくつかの態様において、ウイルス抗原は、いくつかのケースにおいて、バーキットリンパ腫、鼻咽頭癌、およびホジキン病のEBV陰性対象より大きい発症リスクをもたらし得るEBV抗原である。例えば、EBVは、いくつかのケースにおいて、多様な組織起源の多数のヒト腫瘍に関連していることが見出されているヒトヘルペスウイルスである。無症候性感染として主に見出されるが、EBV陽性腫瘍は、EBNA-1、LMP-1、およびLMP-2Aのようなウイルス遺伝子産物の活発な発現を特徴とし得る。いくつかの態様において、異種抗原は、エプスタインバー核抗原（EBNA）-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNAリーダータンパク質（EBNA-LP）、潜在膜タンパク質LMP-1、LMP-2A、およびLMP-2B、EBV-EA、EBV-MA、またはEBV-VCAを含み得るEBV抗原である。
【０６５７】
いくつかの態様において、ウイルス抗原は、いくつかのケースにおいて、HTLV-1陰性対象またはHTLV-2陰性対象より大きいT細胞白血病発症リスクをもたらし得るHTLV-1抗原またはHTLV-2抗原である。例えば、いくつかの態様において、異種抗原は、TAXのようなHTLV抗原である。
【０６５８】
いくつかの態様において、ウイルス抗原は、いくつかのケースにおいて、HHV-8陰性対象より大きいカポジ肉腫発症リスクをもたらし得るHHV-8抗原である。いくつかの態様において、異種抗原は、pp65またはpp64のようなCMV抗原である（米国特許第8,361,473号を参照すること）。
【０６５９】
いくつかの態様において、抗原は、自己抗原、例えば、自己免疫疾患または自己免疫障害に関連したポリペプチドの抗原である。いくつかの態様において、自己免疫疾患または自己免疫障害は、多発性硬化症（MS）、関節リウマチ（RA）、シェーグレン症候群、強皮症、多発性筋炎、皮膚筋炎、全身性エリテマトーデス、若年性関節リウマチ、強直性脊椎炎、重症筋無力症（MG）、水疱性類天疱瘡（真皮表皮接合部の基底膜に対する抗体）、天疱瘡（ムコ多糖タンパク質複合体または細胞内セメント物質に対する抗体）、糸球体腎炎（糸球体基底膜に対する抗体）、グッドパスチャー症候群、自己免疫性溶血性貧血（赤血球に対する抗体）、橋本病（甲状腺に対する抗体）、悪性貧血（内因子に対する抗体）、特発性血小板減少性紫斑病（血小板に対する抗体）、グレーブス病、またはアジソン病（サイログロブリンに対する抗体）であり得る。いくつかの態様において、自己抗原、例えば、前述の自己免疫疾患のうちの1つに関連した自己抗原は、コラーゲン、例えば、II型コラーゲン、ミコバクテリウム熱ショックタンパク質、サイログロブリン、アセチルコリン受容体（AcHR）、ミエリン塩基性タンパク質（MBP）、またはプロテオリピドタンパク質（PLP）であり得る。具体的な自己免疫に関連したエピトープまたは抗原は、公知である（例えば、Bulek et al. (2012) Nat Immunol, 13: 283-9；Harkiolaki et al. (2009) Immunity, 30: 348-57；Skowera et al. (2008) J Clin Invest, 1 (18): 3390-402を参照すること）。
【０６６０】
いくつかの態様において、標的抗原のペプチドエピトープの同一性は、公知であり、それは、いくつかのケースにおいて、関心対象のTCRの作製もしくは生成、または機能的活性もしくは特性の評価において、例えば、提供された方法に関連して、使用され得る。いくつかの態様において、ペプチドエピトープは、関心対象の標的抗原内のHLA拘束性モチーフの存在に基づき、決定または同定され得る。いくつかの態様において、ペプチドは、公知のコンピュータ予測モデルを使用して同定される。いくつかの態様において、MHCクラスI結合部位を予測するための、そのようなモデルには、ProPred1（Singh and Raghava(2001)Bioinformatics 17(12):1236-1237）、およびSYFPEITHI（Schuler et al.(2007)Immunoinformatics Methods in Molecular Biology,409(1):75-93 2007を参照すること）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、MHC拘束性エピトープは、全コーカサス人のおよそ39〜46％において発現されており、従って、TCRまたはその他のMHC-ペプチド結合分子の調製において使用するために適当なMHC抗原の選択を表す、HLA-A0201である。いくつかの局面において、コンピュータ予測モデルを使用した、HLA-A*0201結合モチーフ、ならびにプロテアソームおよび免疫プロテアソームのための切断部位は、公知である。MHCクラスI結合部位を予測するための、そのようなモデルには、（Singh and Raghava, ProPred: prediction of HLA-DR binding sites. BIOINFORMATICS 17(12):1236-1237 2001に、より詳細に記載された）ProPred1、およびSYFPEITHI（Schuler et al. SYFPEITHI, Database for Searching and T-Cell Epitope Prediction. in Immunoinformatics Methods in Molecular Biology,vol 409(1):75-93 2007を参照すること）が含まれるが、これらに限定されるわけではない。スクリーニングの方法、およびスクリーニングの方法において利用される細胞、例えば、主要組織適合性複合体（MHC）分子と会合した抗原またはエピトープを認識するT細胞が、提供される。
【０６６１】
いくつかの態様において、MHCは、多形性のペプチド結合部位または結合溝を含有し、それらは、いくつかのケースにおいて、ポリペプチドのペプチドエピトープ、例えば、細胞機構によってプロセシングされたペプチドエピトープと複合体を形成することができる。いくつかのケースにおいて、MHC分子は、T細胞上のTCRまたはその他のMHC-ペプチド結合分子によって認識可能なコンフォメーションでの抗原の提示のため、例えば、ペプチドとの複合体、即ち、MHC-ペプチド複合体として、細胞表面上に呈示または発現され得る。一般に、MHCクラスI分子は、いくつかのケースにおいて、3つのαドメインを含む膜貫通α鎖と、非共有結合的に会合したβ2ミクログロブリンとを有するヘテロ二量体である。一般に、MHCクラスII分子は、2つの膜貫通糖タンパク質αおよびβから構成され、それらの両方が、典型的には、膜を貫通している。MHC分子は、エピトープ結合部位またはペプチド結合のための部位を含有するMHCの有効部分と、TCRのような適切な結合分子による認識のために必要な配列とを含み得る。いくつかの態様において、MHCクラスI分子は、サイトゾルに起因するペプチドを細胞表面に送達し、そこで、ペプチド:MHC複合体は、T細胞、例えば、一般に、CD8+T細胞、いくつかのケースにおいて、CD4+T細胞によって認識される。いくつかの態様において、MHCクラスII分子は、小胞系に起因するペプチドを細胞表面に送達し、そこで、典型的には、CD4+T細胞によってそれらが認識される。一般に、MHC分子は、マウスにおいてはH-2、ヒトにおいてはヒト白血球抗原（HLA）と集合的に名付けられている、連鎖した遺伝子座の群によってコードされる。いくつかの局面において、ヒトMHCは、ヒト白血球抗原（HLA）とも呼ばれる。
【０６６２】
いくつかの態様において、ペプチドエピトープまたはT細胞エピトープは、ポリペプチドまたはタンパク質のようなより長い生物学的分子に由来するかまたはその断片に基づいていてよく、MHC分子と会合するかまたは複合体を形成することができるペプチドである。いくつかの態様において、ペプチドは、約8〜約24アミノ酸長である。いくつかの態様において、ペプチドは、MHCクラスII複合体における認識のため、9〜22または約9〜22アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様において、ペプチドは、MHCクラスI複合体における認識のため、8〜13または約8〜13アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様において、MHC分子とペプチドエピトープまたはT細胞エピトープとは、MHC分子の結合溝または間隙におけるペプチドの非共有結合性の相互作用を介して複合体を形成するかまたは会合する。
【０６６３】
いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体は、細胞の表面上に存在するかまたは呈示される。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体は、TCRもしくはその抗原結合部分またはその他のMHC-ペプチド結合分子によって特異的に認識され得る。いくつかの態様において、T細胞エピトープまたはペプチドエピトープは、MHC分子との結合特徴によって、動物において免疫応答を誘導することができる。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体のようなT細胞エピトープの認識によって、TCR（またはその他のMHC-ペプチド結合分子）は、T細胞応答、例えば、T細胞増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性T細胞応答、またはその他の応答を誘導する活性化シグナルをT細胞に対して生成するかまたは誘発する。
【０６６４】
いくつかの態様において、MHC-ペプチド結合分子は、TCRまたはそのエピトープ結合断片である。いくつかの態様において、MHC-ペプチド結合分子は、抗体またはそのエピトープ結合断片、例えば、TCR様抗体、例えば、MHC-ペプチド複合体に結合するよう改変されたものを含有するTCR様CARである。いくつかの態様において、そのような結合分子は、標的ポリペプチドのアミノ酸配列または抗原を含有する、T細胞エピトープのような結合配列に結合する。いくつかの態様において、標的ペプチドまたは標的ポリペプチドの結合配列は、公知である。いくつかの態様において、MHC-ペプチド結合分子は、天然起源に由来してもよいし、または部分的にもしくは完全に合成もしくは組換えによって作製されてもよい。
【０６６５】
いくつかの態様において、MHC-ペプチド結合分子は、例えば、細胞の表面上の、MHC分子と会合して提示または呈示されたペプチドエピトープ、即ち、MHC-ペプチド複合体に結合する能力、例えば、特異的に結合する能力を保有する分子またはその一部分である。いくつかの態様において、結合分子には、MHC-ペプチド複合体に結合すること、例えば、特異的に結合することができる、任意の天然に存在する分子、合成分子、半合成分子、または組換え作製された分子が含まれ得る。例示的なMHC-ペプチド結合分子には、MHC-ペプチド複合体に結合する特異的な能力を示す、T細胞受容体もしくは抗体またはそれらの抗原結合部分、例えば、単鎖免疫グロブリン可変領域（例えば、scTCR、scFv）が含まれる。
【０６６６】
いくつかの態様において、TCRは全長TCRである。いくつかの態様において、TCRは抗原結合部分である。いくつかの態様において、TCRは二量体TCR（dTCR）である。いくつかの態様において、TCRは単鎖TCR（sc-TCR）である。TCRは、細胞結合型であってもよいし、または可溶型であってもよい。いくつかの態様において、TCRは、細胞の表面上に発現された細胞結合型である。
【０６６７】
いくつかの態様において、dTCRは、提供されたTCRα鎖可変領域配列に相当する配列が、TCRα鎖定常領域細胞外配列に相当する配列のN末端に融合している第1のポリペプチド、および提供されたTCRβ鎖可変領域配列に相当する配列が、TCRβ鎖定常領域細胞外配列に相当する配列のN末端に融合している第2のポリペプチドを含有し、これらの第1のポリペプチドおよび第2のポリペプチドは、ジスルフィド結合によって連結されている。いくつかの態様において、結合は、ネイティブ二量体αβTCRに存在するネイティブ鎖間ジスルフィド結合に相当してよい。いくつかの態様において、鎖間ジスルフィド結合は、ネイティブTCRに存在しないものである。例えば、いくつかの態様において、1つまたは複数のシステインが、dTCRポリペプチド対の定常領域細胞外配列に組み入れられてよい。いくつかのケースにおいて、ネイティブジスルフィド結合および非ネイティブジスルフィド結合の両方が望ましい場合がある。いくつかの態様において、TCRは、膜に繋留するための膜貫通配列を含有する。
【０６６８】
いくつかの態様において、dTCRは、可変αドメイン、定常αドメイン、および定常αドメインのC末端に付着した第1の二量体形成モチーフを含有する提供されたTCRα鎖、ならびに可変βドメイン、定常βドメイン、および定常βドメインのC末端に付着した第1の二量体形成モチーフを含む提供されたTCRβ鎖を含有し、これらの第1および第2の二量体形成モチーフは、第1の二量体形成モチーフ内のアミノ酸と第2の二量体形成モチーフ内のアミノ酸との間で共有結合を形成し、TCRα鎖およびTCRβ鎖を共に連結するため、容易に相互作用する。
【０６６９】
いくつかの態様において、TCRは、MHC-ペプチド複合体に結合することができる、α鎖およびβ鎖を含有する単一のアミノ酸鎖であるscTCRである。典型的には、scTCRは、公知の方法を使用して生成され得る。例えば、国際公開PCT番号WO96/13593、WO96/18105、WO99/18129、WO04/033685、WO2006/037960、WO2011/044186；米国特許第7,569,664号；およびSchlueter, C.J. et al. J. Mol. Biol. 256, 859(1996)を参照すること。
【０６７０】
いくつかの態様において、scTCRは、提供されたTCRα鎖可変領域の配列に相当するアミノ酸配列によって構成された第1のセグメント、TCRβ鎖定常ドメイン細胞外配列に相当するアミノ酸配列のN末端に融合した、提供されたTCRβ鎖可変領域配列に相当するアミノ酸配列によって構成された第2のセグメント、および第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含有する。
【０６７１】
いくつかの態様において、scTCRは、提供されたTCRβ鎖可変領域に相当するアミノ酸配列によって構成された第1のセグメント、TCRα鎖定常ドメイン細胞外配列に相当するアミノ酸配列のN末端に融合した、提供されたTCRα鎖可変領域配列に相当するアミノ酸配列によって構成された第2のセグメント、および第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含有する。
【０６７２】
いくつかの態様において、scTCRは、α鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合した、提供されたα鎖可変領域配列によって構成された第1のセグメント、ならびに配列β鎖細胞外定常および膜貫通配列のN末端に融合した、提供されたβ鎖可変領域配列によって構成された第2のセグメントを含有し、任意で、第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含有する。
【０６７３】
いくつかの態様において、scTCRは、β鎖細胞外定常ドメイン配列のN末端に融合した、提供されたTCRβ鎖可変領域配列によって構成された第1のセグメント、ならびに配列α鎖細胞外定常および膜貫通配列のN末端に融合した、提供されたα鎖可変領域配列によって構成された第2のセグメントを含有し、任意で、第1のセグメントのC末端を第2のセグメントのN末端に連結するリンカー配列を含有する。
【０６７４】
いくつかの態様において、scTCRがMHC-ペプチド複合体に結合するためには、それらの可変領域配列がそのような結合に適応するよう、α鎖およびβ鎖が対合しなければならない。scTCRにおけるαおよびβの対合を促進する様々な方法が公知である。いくつかの態様において、単一のポリペプチド鎖を形成するため、α鎖およびβ鎖を連結するリンカー配列が含まれる。いくつかの態様において、scTCRの標的ペプチド-MHC複合体との結合を阻止するかまたは低下させるほどリンカー長が長くならないことも確実にしながら、リンカーは、α鎖のC末端とβ鎖のN末端またはその逆の距離にかかるよう十分な長さを有するべきである。
【０６７５】
いくつかの態様において、第1および第2のTCRセグメントを連結するscTCRのリンカーは、TCRの結合特異性を保持しながら、単一のポリペプチド鎖を形成することができる任意のリンカーであり得る。いくつかの態様において、リンカー配列は、例えば、式-P-AA-P-（Pはプロリンであり、AAは、アミノ酸がグリシンおよびセリンであるアミノ酸配列を表す）を有し得る。いくつかの態様において、第1および第2のセグメントは、それらの可変領域配列がそのような結合に適応するよう対合している。従って、いくつかのケースにおいて、リンカーは、第1のセグメントのC末端と第2のセグメントのN末端またはその逆の距離にかかるよう十分な長さを有するが、scTCRの標的リガンドとの結合を阻止するかまたは低下させるほどには長くない。いくつかの態様において、リンカーは、10〜45個または約10〜45個のアミノ酸、例えば、10〜30個のアミノ酸または26〜41個のアミノ酸残基、例えば、29個、30個、31個、または32個のアミノ酸を含有していてよい。いくつかの態様において、リンカーは、式-PGGG-(SGGGG)n-P-（nは5または6であり、Pはプロリンであり、Gはグリシンであり、Sはセリンである）（SEQ ID NO:22）を有する。いくつかの態様において、リンカーは、配列
2021520202.tif 000047
を有する。
【０６７６】
いくつかの態様において、scTCRは、いくつかのケースにおいて、単鎖分子のα領域とβ領域との間の対合の安定性を促進することができるジスルフィド結合を単一アミノ酸鎖の残基の間に含有する（例えば、米国特許第7,569,664号を参照すること）。いくつかの態様において、scTCRは、単鎖分子のα鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基を、β鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基と連結する共有結合性ジスルフィド結合を含有する。いくつかの態様において、ジスルフィド結合は、ネイティブdTCRに存在するネイティブジスルフィド結合に相当する。いくつかの態様において、ネイティブTCRにおけるジスルフィド結合は、存在しない。いくつかの態様において、ジスルフィド結合は、例えば、scTCRポリペプチドの第1および第2の鎖領域の定常領域細胞外配列に1つまたは複数のシステインを組み入れることによって導入された非ネイティブジスルフィド結合である。例示的なシステイン変異には、本明細書中に記載される任意のものが含まれる。いくつかのケースにおいて、ネイティブジスルフィド結合および非ネイティブジスルフィド結合の両方が存在してもよい。
【０６７７】
いくつかの態様において、scTCRは、そのC末端に融合した異種ロイシンジッパーが鎖の会合を容易にする非ジスルフィド結合短縮型TCRである（例えば、国際公開PCT番号WO99/60120を参照すること）。いくつかの態様において、scTCRは、ペプチドリンカーを介してTCRβ可変ドメインに共有結合で連結されたTCRα可変ドメインを含有する（例えば、国際公開PCT番号WO99/18129を参照すること）。
【０６７８】
いくつかの態様において、提供されたTCRのうちの任意のもの、例えば、dTCRまたはscTCRは、T細胞の表面上で活性TCRを与えるシグナリングドメインに連結されていてよい。いくつかの態様において、TCRは、細胞の表面上に発現される。いくつかの態様において、TCRは、膜貫通配列に相当する配列を含有する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、正の電荷を有する。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、CαまたはCβの膜貫通ドメインであり得る。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、非TCR起源に由来するもの、例えば、CD3z、CD28、またはB7.1に由来する膜貫通領域であってもよい。いくつかの態様において、TCRは、細胞質配列に相当する配列を含有する。いくつかの態様において、TCRは、CD3zシグナリングドメインを含有する。いくつかの態様において、TCRは、CD3とTCR複合体を形成することができる。
【０６７９】
いくつかの態様において、TCRは可溶性TCRである。いくつかの態様において、可溶性TCRは、WO99/60120またはWO03/020763に記載される構造を有する。いくつかの態様において、TCRは、例えば、それが発現されている細胞への膜繋留を可能にするための、膜貫通配列に相当する配列を含有しない。いくつかの態様において、TCRは、細胞質配列に相当する配列を含有しない。
【０６８０】
いくつかの態様において、組換え受容体、例えば、TCRまたはその抗原結合断片は、公知の組換え受容体と比較して修飾されるかまたは修飾されている。ある種の態様において、組換え受容体、例えば、TCRまたはその抗原結合断片は、本明細書中に記載されたまたは公知の組換え受容体、例えば、TCRの配列と比較して、1つまたは複数のアミノ酸変動、例えば、置換、欠失、挿入、および/または変異を含む。例示的なバリアントには、結合分子の結合親和性および/またはその他の生物学的特性を改善するために設計されたものが含まれる。結合分子のアミノ酸配列バリアントは、結合分子をコードするヌクレオチド配列に適切な修飾を導入することによって、またはペプチド合成によって調製され得る。そのような修飾には、例えば、結合分子のアミノ酸配列内の残基の欠失および/または挿入および/または置換が含まれる。最終構築物が所望の特徴、例えば、抗原結合を保有する限り、欠失、挿入、および置換の任意の組み合わせが、最終構築物に到達するために作成され得る。
【０６８１】
いくつかの態様において、MHC分子と会合した特異的なペプチドに対するより高い親和性のような、変更された特性を有するTCRを生成するため、定向進化法が使用される。いくつかの態様において、定向進化は、酵母ディスプレイ（Holler et al.(2003)Nat Immunol,4,55-62；Holler et al.(2000)Proc Natl Acad Sci U S A,97,5387-92）、ファージディスプレイ（Li et al.(2005)Nat Biotechnol,23,349-54）、またはT細胞ディスプレイ（Chervin et al.(2008)J Immunol Methods,339,175-84）を含むが、これらに限定されるわけではない、ディスプレイ法によって達成される。いくつかの態様において、ディスプレイアプローチは、公知の親TCRまたは参照TCRの改変または修飾を含む。例えば、いくつかのケースにおいて、参照TCR、例えば、本明細書中に提供される任意のものが、CDRの1つまたは複数の残基が変異した変異誘発されたTCRを作製するため、鋳型として使用され、MHC分子と会合したペプチドエピトープに対するより高い親和性のような、所望の変更された特性を有する変異体が、選択される。
【０６８２】
ある種の態様において、組換え受容体、例えば、TCRまたはその抗原結合断片は、例えば、天然レパートリー、例えば、ヒトレパートリーの配列と比較した、組換え受容体、例えばTCRの配列と比較して、1つまたは複数のアミノ酸置換を含む。置換変異誘発のための関心対象の部位には、CDR、FR、および/または定常領域が含まれる。アミノ酸置換を、関心対象の結合分子に導入し、所望の活性、例えば、保持された/改善された抗原親和性もしくはアビディティ、減少した免疫原性、改善された半減期、CD8依存性の結合もしくは活性、表面発現、TCR鎖対合の促進、および/またはその他の改善された特性もしくは機能について、生成物をスクリーニングすることができる。
【０６８３】
いくつかの態様において、組換え受容体、例えば、TCRのCDR内の1つまたは複数の残基が置換される。いくつかの態様において、置換は、例えば、ヒト対象に投与された時の免疫原性の可能性を低下させるため、例えば、生殖系列配列、例えば、生殖系列（例えば、ヒト生殖系列）に見出される結合分子配列に、配列または配列内の位置を復帰させるために作成される。
【０６８４】
ある種の態様において、置換、挿入、または欠失は、そのような変更が、組換え受容体、例えば、TCRまたはその抗原結合断片の抗原結合能力を実質的に低下させない限り、1つまたは複数のCDRにおいて起こってもよい。例えば、結合親和性を実質的に低下させない保存的変更（例えば、本明細書中に提供される保存的置換）が、CDRにおいて作成され得る。そのような変更は、例えば、CDR内の抗原接触残基の外部にあり得る。本明細書中に提供される可変配列のある種の態様において、各CDRは、変更されていないか、または1個、2個、もしくは3個を超えないアミノ酸置換を含有する。
【０６８５】
アミノ酸配列挿入には、1個の残基から100残基以上を含有するポリペプチドまでの範囲の長さのアミノ末端融合および/またはカルボキシル末端融合が含まれ、単一または複数のアミノ酸残基の配列内挿入も含まれる。
【０６８６】
いくつかの局面において、TCRまたはその抗原結合断片は、TCRまたはその抗原結合断片が細胞において発現された時、TCRのα鎖およびβ鎖と内在性TCRのα鎖およびβ鎖との間の誤対合の頻度が低下し、TCRのα鎖およびβ鎖の発現が増加し、かつ/またはTCRのα鎖およびβ鎖の安定性が増加するよう、1つまたは複数の修飾をα鎖および/またはβ鎖に含有し得る。
【０６８７】
いくつかの態様において、TCRは、α鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基を、β鎖の定常ドメインの免疫グロブリン領域の残基に連結する共有結合性のジスルフィド結合を導入するため、1つまたは複数の非ネイティブシステイン残基を含有する。いくつかの態様において、1つまたは複数のシステインは、TCRポリペプチドの第1および第2のセグメントの定常領域細胞外配列に組み入れられ得る。非ネイティブシステイン残基を導入するためのTCRにおける例示的な非限定的な修飾は、本明細書中に記載される（国際PCT番号WO2006/000830およびWO2006037960も参照すること）。いくつかのケースにおいて、ネイティブジスルフィド結合および非ネイティブジスルフィド結合の両方が望ましい場合がある。いくつかの態様において、TCRまたは抗原結合断片は、ネイティブTCRにおける鎖間ジスルフィド結合が存在しないよう修飾される。
【０６８８】
いくつかの態様において、TCRの定常領域の膜貫通ドメインは、より多数の疎水性残基を含有するよう修飾され得る（例えば、Haga-Friedman et al.(2012)Journal of Immunology,188:5538-5546を参照すること）。いくつかの態様において、TCRα鎖の膜貫通領域は、SEQ ID NO:24に記載のCαのナンバリングに関して、S116L、G119V、またはF120Lに相当する1つまたは複数の変異を含有する。
【０６８９】
いくつかの態様において、TCRまたはその抗原結合断片は、コドン最適化されるかまたはコドン最適化されているヌクレオチド配列によってコードされる。例示的なコドン最適化バリアントは、本明細書中の他の箇所に記載される。
【０６９０】
B．キメラ抗原受容体（CAR）
いくつかの態様において、細胞内に導入される組換え受容体は、キメラ抗原受容体（CAR）またはその抗原結合断片である。いくつかの態様において、特定の抗原（またはマーカーまたはリガンド）、例えば、特定の細胞型の表面上に発現される抗原に対して特異性を有するCARを発現する改変された細胞、例えばT細胞が提供される。いくつかの態様において、抗原はポリペプチドである。いくつかの態様において、抗原は、糖質または他の分子である。いくつかの態様において、抗原は、正常のまたは非標的の細胞または組織と比較して、疾患または状態の細胞、例えば、腫瘍または病原性細胞上に選択的に発現されるか、または過剰発現される。他の態様において、抗原は、正常細胞上に発現され、かつ/または改変された細胞上に発現される。
【０６９１】
特定の態様において、組換え受容体、例えばキメラ受容体は、細胞内シグナル伝達領域を含有し、これは、T細胞において一次活性化シグナルを誘導することができる細胞質（細胞内）領域などの細胞質シグナル伝達ドメイン（互換的に細胞内シグナル伝達ドメインとも呼ばれる）、例えば、T細胞受容体（TCR）構成要素の細胞質シグナル伝達ドメイン（例えば、CD3ゼータ（CD3ζ）鎖のζ鎖の細胞質シグナル伝達ドメインまたはその機能的バリアントもしくはシグナル伝達部分）を含み、かつ/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含む。
【０６９２】
いくつかの態様において、キメラ受容体は、リガンド（例えば抗原）抗原に特異的に結合する細胞外リガンド結合ドメインをさらに含有する。いくつかの態様において、キメラ受容体は、抗原に特異的に結合する細胞外抗原認識ドメインを含有するCARである。いくつかの態様において、抗原などのリガンドは、細胞の表面上に発現されるタンパク質である。いくつかの態様において、CARはTCR様CARであり、抗原は、細胞内タンパク質のペプチド抗原などのプロセシングされたペプチド抗原であり、これは、TCRのように、主要組織適合遺伝子複合体（MHC）分子に関連して細胞表面上で認識される。
【０６９３】
CARを含む例示的な抗原受容体、およびそのような受容体を改変して細胞中に導入するための方法は、例えば、国際特許出願公開番号WO2000/14257、WO2013/126726、WO2012/129514、WO2014031687、WO2013/166321、WO2013/071154、WO2013/123061、米国特許出願公開第2002131960号、同第2013287748号、同第20130149337号、米国特許第6,451,995号、同第7,446,190号、同第8,252,592号、同第8,339,645号、同第8,398,282号、同第7,446,179号、同第6,410,319号、同第7,070,995号、同第7,265,209号、同第7,354,762号、同第7,446,191号、同第8,324,353号、および同第8,479,118号、ならびに欧州特許出願番号EP2537416に記載されているもの、ならびに/または、Sadelain et al., Cancer Discov.2013 April；3（4）:388-398；Davila et al.（2013）PLoS ONE 8（4）:e61338；Turtle et al., Curr.Opin.Immunol.,2012 October；24（5）:633-39；Wu et al., Cancer,2012 March 18（2）:160-75によって記載されているものを含む。いくつかの局面において、抗原受容体は、米国特許第7,446,190号に記載されているCAR、および国際特許出願公開番号WO/2014055668 A1に記載されているものを含む。CARの例には、WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、米国特許第7,446,190号、米国特許第8,389,282号、Kochenderfer et al., 2013, Nature Reviews Clinical Oncology, 10, 267-276 (2013)；Wang et al. (2012) J. Immunother. 35(9): 689-701；およびBrentjens et al., Sci Transl Med. 2013 5(177)などの前述の刊行物のいずれかにおいて開示されているCARが含まれる。WO2014031687、US 8,339,645、US 7,446,179、US 2013/0149337、米国特許第7,446,190号、および米国特許第8,389,282号も参照されたい。
【０６９４】
いくつかの態様において、CARは、特定の抗原（またはマーカーまたはリガンド）、例えば、養子療法によって標的とされる特定の細胞型において発現される抗原、例えばがんマーカー、および/または正常細胞型もしくは非罹患細胞型上に発現される抗原などの減衰応答を誘導することが意図される抗原に対する特異性を備えて構築される。したがって、CARは、典型的には、その細胞外部分に、1つもしくは複数の抗原結合断片、ドメイン、もしくは一部分などの1つもしくは複数の抗原結合分子、または1つもしくは複数の抗体可変ドメイン、および/または抗体分子を含む。いくつかの態様において、CARは、モノクローナル抗体（mAb）の可変重鎖（VH）および可変軽鎖（VL）に由来する一本鎖抗体断片（scFv）などの、抗体分子の1つまたは複数の抗原結合部分を含む。
【０６９５】
いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合部分は、組換え受容体、例えば抗原受容体の一部として細胞上に発現される。抗原受容体の中には、機能的非TCR抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）がある。概して、ペプチド-MHC複合体に対してTCR様の特異性を示す抗体または抗原結合断片を含有するCARはまた、TCR様CARとも呼ばれ得る。いくつかの態様において、TCR様CARのMHC-ペプチド複合体に特異的な細胞外抗原結合ドメインは、いくつかの局面においてはリンカーおよび/または膜貫通ドメインを介して、1つまたは複数の細胞内シグナル伝達構成要素に連結されている。いくつかの態様において、そのような分子は、典型的には、TCRなどの天然の抗原受容体を介するシグナル、および任意で、共刺激受容体と組み合わせたそのような受容体を介するシグナルを模倣するかまたは近似することができる。
【０６９６】
いくつかの態様において、組換え受容体、例えばキメラ受容体（例えばCAR）は、抗原（またはリガンド）に結合する、例えば特異的に結合するリガンド結合ドメインを含む。キメラ受容体によって標的とされる抗原の中には、養子細胞療法を介して標的とされる疾患、状態、または細胞型に関連して発現されるものがある。疾患および状態の中には、血液がん、免疫系のがん、例えば、B、Tおよび骨髄性の白血病、リンパ腫、および多発性骨髄腫などのリンパ腫、白血病、および/または骨髄腫を含むがんおよび腫瘍を含む、増殖性、新生物性、および悪性の疾患および障害がある。
【０６９７】
いくつかの態様において、抗原（またはリガンド）はポリペプチドである。いくつかの態様において、抗原は、糖質または他の分子である。いくつかの態様において、抗原（またはリガンド）は、正常のまたは非標的の細胞または組織と比較して、疾患または状態の細胞、例えば、腫瘍または病原性細胞上に選択的に発現されるか、または過剰発現される。他の態様において、抗原は、正常細胞上に発現され、かつ/または改変された細胞上に発現される。
【０６９８】
いくつかの態様において、CARは、細胞の表面上に発現される抗原、例えば無傷の抗原を特異的に認識する、抗体または抗原結合断片（例えばscFv）を含有する。
【０６９９】
いくつかの態様において、抗原（またはリガンド）は、腫瘍抗原またはがんマーカーである。いくつかの態様において、抗原（またはリガンド）は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸アンヒドラーゼ9（CA9；CAIXまたはG250としても知られる）、がん-精巣抗原、がん/精巣抗原1B（CTAG；NY-ESO-1およびLAGE-2としても知られる）、がん胎児性抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮成長因子タンパク質（EGFR）、III型上皮成長因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体ホモログ5またはFCRH5としても知られる）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体α、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役受容体クラスCグループ5メンバーD（GPCR5D）、Her2/neu（受容体チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量黒色腫関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体α（IL-22Rα）、IL-13受容体α2（IL-13Rα2）、キナーゼインサートドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、黒色腫関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、胎児腫瘍性抗原、黒色腫の優先発現抗原（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異的膜抗原（PSMA）、受容体チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（TPBG；5T4としても知られる）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP1；TYRP1またはgp75としても知られる）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP2；ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムデルタ-イソメラーゼ、またはDCTとしても知られる）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的もしくは病原体発現抗原、またはユニバーサルタグに関連する抗原、および/またはビオチン化分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくは他の病原体によって発現される分子であるか、またはこれらを含む。いくつかの態様において受容体によって標的とされる抗原には、多数の公知のB細胞マーカーのいずれかなどの、B細胞悪性腫瘍に関連する抗原が含まれる。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b、またはCD30であるかまたはそれを含む。
【０７００】
いくつかの態様において、抗原は、病原体特異的または病原体発現抗原であるかまたはそれを含む。いくつかの態様において、抗原は、ウイルス抗原（例えばHIV、HCV、HBVなど由来のウイルス抗原）、細菌抗原、および/または寄生虫抗原である。
【０７０１】
本明細書における「抗体」という用語は、最も広い意味で用いられ、無傷の抗体、ならびに断片抗原結合（Fab）断片、F(ab')2断片、Fab'断片、Fv断片、組換えIgG（rIgG）断片、抗原に特異的に結合することができる可変重鎖（VH）領域、一本鎖可変断片（scFv）を含む一本鎖抗体断片、および単一ドメイン抗体（例えば、sdAb、sdFv、ナノボディ）断片を含む機能的（抗原結合）抗体断片を含む、ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体を含む。この用語は、免疫グロブリンの遺伝子改変されたおよび/または他の方法で改変された形態、例えばイントラボディ、ペプチボディ、キメラ抗体、完全ヒト抗体、ヒト化抗体、およびヘテロコンジュゲート抗体、多重特異性、例えば二重特異性抗体、ダイアボディ、トリアボディ、およびテトラボディ、タンデムdi-scFv、タンデムtri-scFvを包含する。特に明記されない限り、「抗体」という用語は、その機能的抗体断片を包含すると理解されるべきである。この用語はまた、IgGならびにそのサブクラス、IgM、IgE、IgA、およびIgDを含む任意のクラスまたはサブクラスの抗体を含む、無傷のまたは完全長の抗体も包含する。
【０７０２】
いくつかの態様において、抗原結合タンパク質、抗体、およびその抗原結合断片は、完全長抗体の抗原を特異的に認識する。いくつかの態様において、抗体の重鎖および軽鎖は、完全長であることができ、または抗原結合部分（Fab、F(ab')2、Fv、もしくは一本鎖Fv断片（scFv））であることができる。他の態様において、抗体重鎖定常領域は、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgD、およびIgEから選択され、特に、例えば、IgG1、IgG2、IgG3、およびIgG4、より詳細にはIgG1（例えばヒトIgG1）から選択される。別の態様において、抗体軽鎖定常領域は、例えば、κまたはλ、特にκから選択される。
【０７０３】
提供される抗体の中には、抗体断片がある。「抗体断片」とは、無傷の抗体が結合する抗原に結合する無傷の抗体の一部分を含む、無傷の抗体以外の分子を指す。抗体断片の例には、Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；ダイアボディ；直鎖抗体；可変重鎖（VH）領域、scFvおよび単一ドメインVH単一抗体などの一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成される多重特異性抗体が含まれるが、それらに限定されない。特定の態様において、抗体は、scFvなどの、可変重鎖領域および/または可変軽鎖領域を含む一本鎖抗体断片である。
【０７０４】
「可変領域」または「可変ドメイン」という用語は、抗体の抗原への結合に関与する抗体重鎖または軽鎖のドメインを指す。天然抗体の重鎖および軽鎖の可変ドメイン（それぞれ、VHおよびVL）は概して、類似した構造を有し、各ドメインは、4つの保存されたフレームワーク領域（FR）および3つのCDRを含む。（例えば、Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007)を参照されたい。）単一のVHまたはVLドメインが、抗原結合特異性を付与するのに十分であり得る。さらに、特定の抗原に結合する抗体を、抗原に結合する抗体由来のVHまたはVLドメインを用いて単離して、それぞれ相補的なVLまたはVHドメインのライブラリをスクリーニングしてもよい。例えば、Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993)；Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991)を参照されたい。
【０７０５】
単一ドメイン抗体は、抗体の重鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分、または軽鎖可変ドメインのすべてもしくは一部分を含む抗体断片である。ある特定の態様において、単一ドメイン抗体はヒト単一ドメイン抗体である。いくつかの態様において、CARは、抗原、例えばがんマーカーまたは標的とされる細胞もしくは疾患、例えば腫瘍細胞もしくはがん細胞の細胞表面抗原、例えば本明細書に記載されるかまたは当技術分野で公知の標的抗原のいずれかに特異的に結合する抗体重鎖ドメインを含む。
【０７０６】
抗体断片は、無傷の抗体のタンパク質分解消化、および組換え宿主細胞による産生を含むがそれらに限定されない、様々な技法によって作ることができる。いくつかの態様において、抗体は、組換え生産された断片、例えば、合成リンカー、例えばペプチドリンカーによって連結された2つ以上の抗体領域もしくは鎖を有するものなどの、天然には存在しない配置、および/または天然に存在する無傷の抗体の酵素消化によっては生じ得ない配置を含む断片である。いくつかの態様において、抗体断片はscFvである。
【０７０７】
「ヒト化」抗体は、すべてのまたは実質的にすべてのCDRアミノ酸残基が非ヒトCDRに由来し、すべてのまたは実質的にすべてのFRアミノ酸残基がヒトFRに由来する抗体である。ヒト化抗体は、任意で、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部分を含んでもよい。非ヒト抗体の「ヒト化型」は、典型的には、親の非ヒト抗体の特異性および親和性を保持しながら、ヒトに対する免疫原性を低減させるために、ヒト化を受けている非ヒト抗体のバリアントを指す。いくつかの態様において、ヒト化抗体中のいくつかのFR残基は、例えば、抗体の特異性または親和性を回復するかまたは改善するために、非ヒト抗体（例えば、CDR残基が由来する抗体）由来の対応する残基で置換される。
【０７０８】
したがって、いくつかの態様において、TCR様CARを含むキメラ抗原受容体は、抗体または抗体断片を含有する細胞外部分を含む。いくつかの態様において、抗体または断片は、scFvを含む。いくつかの局面において、キメラ抗原受容体は、抗体または断片を含有する細胞外部分、および細胞内シグナル伝達領域を含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達領域は、細胞内シグナル伝達ドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナル伝達ドメインは、一次シグナル伝達ドメイン、T細胞において一次活性化シグナルを誘導することができるシグナル伝達ドメイン、T細胞受容体（TCR）構成要素のシグナル伝達ドメイン、および/または免疫受容体チロシン活性化モチーフ（ITAM）を含むシグナル伝達ドメインであるかまたはそれを含む。
【０７０９】
いくつかの態様において、組換え受容体、例えばCAR、例えばその抗体部分は、スペーサーをさらに含み、これは、ヒンジ領域、例えば、IgG4ヒンジ領域、ならびに/またはCH1/CLおよび/もしくはFc領域などの、免疫グロブリン定常領域またはそのバリアントもしくは改変バージョンの少なくとも一部分であってもよく、またはそれを含んでもよい。いくつかの態様において、組換え受容体は、スペーサーおよび/またはヒンジ領域をさらに含む。いくつかの態様において、定常領域または一部分は、IgG4またはIgG1などのヒトIgGのものである。いくつかの局面において、定常領域の一部分は、抗原認識構成要素、例えばscFvと膜貫通ドメインとの間のスペーサー領域として働く。スペーサーは、スペーサーの非存在下と比較して、抗原結合後に増加した細胞の応答性を提供する長さのものであることができる。
【０７１０】
いくつかの例において、スペーサーは、12アミノ酸もしくは約12アミノ酸の長さであるか、または12アミノ酸以下の長さである。例示的なスペーサーには、少なくとも約10〜229アミノ酸、約10〜200アミノ酸、約10〜175アミノ酸、約10〜150アミノ酸、約10〜125アミノ酸、約10〜100アミノ酸、約10〜75アミノ酸、約10〜50アミノ酸、約10〜40アミノ酸、約10〜30アミノ酸、約10〜20アミノ酸、または約10〜15アミノ酸を有する、および列挙された範囲のいずれかの両端の値の間の任意の整数を含むものが含まれる。いくつかの態様において、スペーサー領域は、約12アミノ酸以下、約119アミノ酸以下、または約229アミノ酸以下を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、250アミノ酸長未満、200アミノ酸長未満、150アミノ酸長未満、100アミノ酸長未満、75アミノ酸長未満、50アミノ酸長未満、25アミノ酸長未満、20アミノ酸長未満、15アミノ酸長未満、12アミノ酸長未満、または10アミノ酸長未満である。いくつかの態様において、スペーサーは、10〜250アミノ酸長、10〜150アミノ酸長、10〜100アミノ酸長、10〜50アミノ酸長、10〜25アミノ酸長、10〜15アミノ酸長、15〜250アミノ酸長、15〜150アミノ酸長、15〜100アミノ酸長、15〜50アミノ酸長、15〜25アミノ酸長、25〜250アミノ酸長、25〜100アミノ酸長、25〜50アミノ酸長、50〜250アミノ酸長、50〜150アミノ酸長、50〜100アミノ酸長、100〜250アミノ酸長、100〜150アミノ酸長、もしくは150〜250アミノ酸長、または約10〜250アミノ酸長、約10〜150アミノ酸長、約10〜100アミノ酸長、約10〜50アミノ酸長、約10〜25アミノ酸長、約10〜15アミノ酸長、約15〜250アミノ酸長、約15〜150アミノ酸長、約15〜100アミノ酸長、約15〜50アミノ酸長、1約5〜25アミノ酸長、約25〜250アミノ酸長、約25〜100アミノ酸長、約25〜50アミノ酸長、約50〜250アミノ酸長、約50〜150アミノ酸長、約50〜100アミノ酸長、約100〜250アミノ酸長、約100〜150アミノ酸長、もしくは約150〜250アミノ酸長である。
【０７１１】
例示的なスペーサーには、単独のIgG4ヒンジ、CH2ドメインおよびCH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジ、またはCH3ドメインに連結されたIgG4ヒンジが含まれる。例示的なスペーサーには、Hudecek et al.(2013)Clin.Cancer Res.,19:3153または国際特許出願公開番号WO2014031687に記載されたものが含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:131に記載の配列を有し、SEQ ID NO:132に記載の配列によってコードされる。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:133に記載の配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:134に記載の配列を有する。
【０７１２】
いくつかの態様において、定常領域または定常部分は、IgDのものである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:135に記載の配列を有する。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:131、133、134、および135のうちの任意のものとの少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を有する。
【０７１３】
抗原認識ドメインは、一般に、1つまたは複数の細胞内シグナリング成分、例えば、抗原受容体複合体、例えば、CARのケースにおいてはTCR複合体を通した活性化を模倣し、かつ/または別の細胞表面受容体を介してシグナリングするシグナリング成分に連結されている。従って、いくつかの態様において、抗原結合成分（例えば、抗体）は、1つまたは複数の膜貫通領域および細胞内シグナリング領域に連結されている。いくつかの態様において、膜貫通ドメインは、細胞外ドメインと融合されている。一つの態様において、受容体、例えば、CARのドメインのうちの1つと天然に会合している膜貫通ドメインが使用される。いくつかの事例において、膜貫通ドメインは、受容体複合体の他のメンバーとの相互作用を最小化するため、同一のまたは異なる表面膜タンパク質の膜貫通ドメインにそのようなドメインが結合することを回避するため、選択されるか、またはアミノ酸置換によって修飾される。
【０７１４】
膜貫通ドメインは、いくつかの態様において、天然起源に由来するかまたは合成起源に由来する。起源が天然である場合、ドメインは、いくつかの局面において、膜結合型タンパク質または膜貫通タンパク質に由来する。膜貫通領域には、T細胞受容体のα鎖、β鎖、またはζ鎖、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154に由来する（即ち、それらの膜貫通領域を少なくとも含む）ものが含まれる。あるいは、膜貫通ドメインは、いくつかの態様において、合成である。いくつかの局面において、合成膜貫通ドメインは、ロイシンおよびバリンのような主に疎水性の残基を含む。いくつかの局面において、フェニルアラニン、トリプトファン、およびバリンのトリプレットが、合成膜貫通ドメインの各末端に見出されるであろう。いくつかの態様において、連結は、リンカー、スペーサー、および/または膜貫通ドメインによる。
【０７１５】
細胞内シグナリング領域には、天然抗原受容体を通したシグナル、共刺激受容体と組み合わせられたそのような受容体を通したシグナル、および/または単独の共刺激受容体を通したシグナルを模倣するかまたはそれらに近似するものが含まれる。いくつかの態様において、短いオリゴペプチドリンカーまたはポリペプチドリンカー、例えば、2〜10アミノ酸長のリンカー、例えば、グリシンおよびセリンを含有するもの、例えば、グリシン-セリンダブレットが存在し、CARの膜貫通ドメインと細胞質シグナリングドメインとの間の連結を形成する。
【０７１６】
受容体、例えば、CARは、一般に、少なくとも1つの細胞内シグナリング成分を含む。いくつかの態様において、受容体は、TCR複合体の細胞内成分、例えば、T細胞活性化および細胞傷害を媒介するTCR CD3鎖、例えば、CD3ζ鎖を含む。従って、いくつかの局面において、ROR1結合抗体は、1つまたは複数の細胞シグナリングモジュールに連結される。いくつかの態様において、細胞シグナリングモジュールは、CD3膜貫通ドメイン、CD3細胞内シグナリングドメイン、および/またはその他のCD膜貫通ドメインを含む。いくつかの態様において、受容体、例えば、CARは、Fc受容体γ、CD8、CD4、CD25、またはCD16のような1つまたは複数の付加的な分子の一部分をさらに含む。例えば、いくつかの局面において、CARは、CD3ゼータ（CD3ζ）またはFc受容体γと、CD8、CD4、CD25、またはCD16との間のキメラ分子を含む。
【０７１７】
いくつかの態様において、CARのライゲーションによって、CARの細胞質ドメインまたは細胞内シグナリング領域は、CARを発現するよう改変された免疫細胞、例えば、T細胞の正常なエフェクター機能または応答のうちの少なくとも1つを活性化する。例えば、いくつかの状況において、CARは、T細胞の機能、例えば、細胞溶解活性またはTヘルパー活性、例えば、サイトカインまたはその他の因子の分泌を誘導する。いくつかの態様において、抗原受容体成分または共刺激分子の細胞内シグナリング領域の短縮された一部分が、例えば、エフェクター機能シグナルを伝達する場合、インタクトな免疫刺激鎖の代わりに使用される。いくつかの態様において、細胞内シグナリング領域、例えば、細胞内ドメインには、T細胞受容体（TCR）の細胞質配列が含まれ、いくつかの局面において、抗原受容体エンゲージメント後にシグナル伝達を開始するために天然の状況においてそのような受容体と協調作用する共受容体のもの、および/またはそのような分子の誘導体もしくはバリアント、および/または同一の機能的能力を有する合成配列も含まれる。
【０７１８】
天然TCRの状況において、完全な活性化は、一般に、TCRを通したシグナリングのみならず、共刺激シグナルも必要とする。従って、いくつかの態様において、完全な活性化を促進するため、二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するための成分も、CARに含まれる。他の態様において、CARは、共刺激シグナルの生成のための成分を含まない。いくつかの局面において、付加的なCARが、同一の細胞において発現され、二次シグナルまたは共刺激シグナルを生成するための成分を提供する。
【０７１９】
T細胞活性化は、いくつかの局面において、2つのクラスの細胞質シグナリング配列によって媒介されるものとして記載される：TCRを通して抗原依存的な一次活性化を開始するもの（一次細胞質シグナリング配列）、および二次シグナルまたは共刺激シグナルを提供するため、抗原非依存的に作用するもの（二次細胞質シグナリング配列）。いくつかの局面において、CARは、そのようなシグナリング成分のうちの一方または両方を含む。
【０７２０】
いくつかの局面において、CARは、TCR複合体の一次活性化を制御する一次細胞質シグナリング配列を含む。刺激性に作用する一次細胞質シグナリング配列は、免疫受容活性化チロシンモチーフまたはITAMとして公知のシグナリングモチーフを含有し得る。ITAM含有一次細胞質シグナリング配列の例には、TCR、またはCD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、FcRγ、またはFcRβに由来するものが含まれる。いくつかの態様において、CAR内の細胞質シグナリング分子は、CD3ζに由来する細胞質シグナリングドメイン、その一部分、または配列を含有する。
【０７２１】
いくつかのケースにおいて、CARは、第1世代、第2世代、および/または第3世代のCARと呼ばれる。いくつかの局面において、第1世代CARは、抗原結合時にCD3鎖によって誘導されるシグナルのみを提供するものであり；いくつかの局面において、第2世代CARは、そのようなシグナルおよび共刺激シグナルを提供するもの、例えば、CD28またはCD137のような共刺激受容体に由来する細胞内シグナリングドメインを含むものであり；いくつかの局面において、第3世代CARは、異なる共刺激受容体の複数の共刺激ドメインを含むものである。
【０７２２】
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、本明細書中に記載された抗体または断片を含有する細胞外部分を含む。いくつかの局面において、キメラ抗原受容体は、本明細書中に記載された抗体または断片を含有する細胞外部分、および細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、抗体または断片は、scFvまたは単一ドメインVH抗体を含み、細胞内ドメインはITAMを含有する。いくつかの局面において、細胞内シグナリングドメインは、CD3ゼータ（CD3ζ）鎖のゼータ鎖のシグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、細胞外ドメインと細胞内シグナリング領域との間に配置された膜貫通ドメインを含む。
【０７２３】
いくつかの局面において、膜貫通ドメインは、CD28の膜貫通部分を含有する。細胞外ドメインおよび膜貫通は、直接的または間接的に連結されていてよい。いくつかの態様において、細胞外ドメインおよび膜貫通は、スペーサー、例えば、本明細書中に記載された任意のものによって連結される。いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、例えば、膜貫通ドメインと細胞内シグナリングドメインとの間に、T細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。いくつかの局面において、T細胞共刺激分子は、CD28または4-1BBである。
【０７２４】
いくつかの態様において、CARは、抗体、例えば、抗体断片、CD28の膜貫通部分もしくはその機能的バリアントであるかまたはそれらを含有する膜貫通ドメイン、ならびにCD28のシグナリング部分またはその機能的バリアントおよびCD3ζのシグナリング部分またはその機能的バリアントを含有する細胞内シグナリングドメインを含有する。いくつかの態様において、CARは、抗体、例えば、抗体断片、CD28の膜貫通部分もしくはその機能的バリアントであるかまたはそれを含有する膜貫通ドメイン、ならびに4-1BBのシグナリング部分またはその機能的バリアントおよびCD3ζのシグナリング部分またはその機能的バリアントを含有する細胞内シグナリングドメインを含有する。いくつかのそのような態様において、受容体は、Ig分子、例えば、ヒトIg分子の一部分、例えば、Igヒンジ、例えば、IgG4ヒンジを含有するスペーサー、例えば、ヒンジのみのスペーサーをさらに含む。
【０７２５】
いくつかの態様において、受容体、例えば、CARの膜貫通ドメインは、ヒトCD28の膜貫通ドメインまたはそのバリアント、例えば、ヒトCD28（アクセッション番号：P10747.1）の27アミノ酸膜貫通ドメインであるか、またはSEQ ID NO:136に記載のアミノ酸の配列、もしくはSEQ ID NO:136との少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む膜貫通ドメインであり；いくつかの態様において、組換え受容体の膜貫通ドメイン含有部分は、SEQ ID NO:137に記載のアミノ酸の配列、またはそれと少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上、または少なくとも約85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を有するアミノ酸の配列を含む。
【０７２６】
いくつかの態様において、キメラ抗原受容体は、T細胞共刺激分子の細胞内ドメインを含有する。いくつかの局面において、T細胞共刺激分子は、CD28または4-1BBである。
【０７２７】
いくつかの態様において、細胞内シグナリング領域は、ヒトCD28の細胞内共刺激シグナリングドメイン、またはその機能的バリアントもしくは一部分、例えば、その41アミノ酸ドメイン、および/またはネイティブCD28タンパク質の186〜187位にLLからGGへの置換を含むそのようなドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、SEQ ID NO:138もしくは139に記載のアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:138もしくは139との少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含み得る。いくつかの態様において、細胞内領域は、ヒト4-1BB（アクセッション番号Q07011.1）の細胞内共刺激シグナリングドメイン、またはその機能的バリアントもしくは一部分、例えば、4-1BBの42アミノ酸細胞質ドメイン、またはその機能的バリアントもしくは一部分、例えば、SEQ ID NO:140に記載のアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:140との少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
【０７２８】
いくつかの態様において、細胞内シグナリング領域は、ヒトCD3鎖、任意で、CD3ζ刺激シグナリングドメインまたはその機能的バリアント、例えば、ヒトCD3ζのアイソフォーム3（アクセッション番号：P20963.2）の112AA細胞質ドメイン、または米国特許第7,446,190号もしくは米国特許第8,911,993号に記載されるCD3ζシグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリング領域は、SEQ ID NO:129、130、もしくは141に記載のアミノ酸の配列、またはSEQ ID NO:129、130、もしくは141との少なくとも85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、もしくはそれ以上の配列同一性を示すアミノ酸の配列を含む。
【０７２９】
いくつかの局面において、スペーサーは、IgGのヒンジ領域のみ、例えば、IgG4またはIgG1のヒンジのみ、例えば、SEQ ID NO:131に記載のヒンジのみのスペーサーを含有する。他の態様において、スペーサーは、CH2ドメインおよび/またはCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えば、IgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:133に記載されるような、CH2ドメインおよびCH3ドメインに連結されたIgヒンジ、例えば、IgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサーは、SEQ ID NO:134に記載されるような、CH3ドメインのみに連結されたIgヒンジ、例えば、IgG4ヒンジである。いくつかの態様において、スペーサーは、グリシン-セリンリッチ配列、またはその他の可動性リンカー、例えば、公知の可動性リンカーであるか、またはそれらを含む。
【０７３０】
いくつかの態様において、CARは、抗HPV16 E6抗体もしくは抗HPV16 E7抗体、または断片、例えば、（例えば、VH領域のみを含有する）sdAbおよびscFvと、スペーサー、例えば、Ig-ヒンジ含有スペーサーのうちの任意のものと、CD28膜貫通ドメインと、CD28細胞内シグナリングドメインと、CD3ζシグナリングドメインとを含む。いくつかの態様において、CARは、HPV 16抗体または断片、例えば、sdAbおよびscFvと、スペーサー、例えば、Igヒンジ含有スペーサーのうちの任意のものと、CD28膜貫通ドメインと、CD28細胞内シグナリングドメインと、CD3ζシグナリングドメインとを含む。いくつかの態様において、そのようなCAR構築物は、T2Aリボソームスキップ要素および/またはtEGFR配列を、例えば、CARの下流に、さらに含む。
【０７３１】
いくつかの態様において、CARまたはその抗原結合断片は、コドン最適化されるかまたはコドン最適化されたヌクレオチド配列によってコードされる。例示的なコドン最適化バリアントは、本明細書中の他の箇所に記載される。
【０７３２】
C. TCR様CAR
いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合部分は、抗原受容体のような組換え受容体の一部として、細胞において発現される。抗原受容体には、キメラ抗原受容体（CAR）のような機能的な非TCR抗原受容体が含まれる。一般に、MHC分子と会合したペプチドに対するTCR様の特異性を示す、抗体または抗原結合断片を含有するCARは、TCR様CARとも呼ばれる。
【０７３３】
いくつかの態様において、CARは、TCR様抗体、例えば、細胞表面上にMHC-ペプチド複合体として提示される腫瘍関連抗原などの細胞内抗原を特異的に認識する抗体または抗原結合断片（例えばscFv）を含有する。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体を認識する抗体またはその抗原結合部分は、組換え受容体、例えば抗原受容体の一部として細胞上に発現されることができる。抗原受容体の中には、機能的非TCR抗原受容体、例えばキメラ抗原受容体（CAR）がある。概して、ペプチド-MHC複合体に対してTCR様の特異性を示す抗体または抗原結合断片を含有するCARはまた、TCR様CARとも呼ばれ得る。
【０７３４】
「主要組織適合遺伝子複合体」（MHC）への言及は、いくつかの場合には、細胞機構によってプロセシングされたペプチド抗原を含むポリペプチドのペプチド抗原と複合体を形成することができる、多型ペプチド結合部位または結合溝を含有するタンパク質、概して糖タンパク質を指す。いくつかの場合には、MHC分子は、TCRまたはTCR様抗体などの、T細胞上の抗原受容体が認識可能な立体配座での抗原の提示のために、ペプチドとの複合体、すなわちMHC-ペプチド複合体としてのものを含めて、細胞表面上に表示されるかまたは発現されることができる。概して、MHCクラスI分子は、いくつかの場合には3つのαドメインを備える膜貫通α鎖、および非共有結合したβ2ミクログロブリンを有するヘテロ二量体である。概して、MHCクラスII分子は、2つの膜貫通糖タンパク質、αおよびβから構成され、それらは両方とも、典型的には膜を貫通している。MHC分子は、ペプチドに結合するための1つまたは複数の抗原結合部位、および適切な抗原受容体による認識に必要な配列を含有するMHCの有効部分を含むことができる。いくつかの態様において、MHCクラスI分子は、サイトゾルが起源であるペプチドを細胞表面に送達し、ここでMHC-ペプチド複合体は、概してCD8+ T細胞であるが、いくつかの場合にはCD4+ T細胞などのT細胞によって認識される。いくつかの態様において、MHCクラスII分子は、小胞系が起源であるペプチドを細胞表面に送達し、ここでそれらは、典型的にはCD4+ T細胞によって認識される。概して、MHC分子は、マウスではH-2、ヒトではヒト白血球抗原（HLA）と総称される一群の連鎖する遺伝子座によってコードされる。したがって、典型的には、ヒトMHCはまた、ヒト白血球抗原（HLA）とも呼ばれ得る。
【０７３５】
「MHC-ペプチド複合体」もしくは「ペプチド-MHC複合体」という用語またはその変形は、例えば、概して、MHC分子の結合溝または裂におけるペプチドの非共有結合性相互作用による、ペプチド抗原とMHC分子との複合体または会合を指す。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体は、細胞の表面上に存在するかまたは表示される。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体は、抗原受容体、例えばTCR、TCR様CAR、またはその抗原結合部分によって特異的に認識されることができる。
【０７３６】
いくつかの態様において、ポリペプチドの、ペプチド抗原またはエピトープなどのペプチドは、例えば抗原受容体による認識のために、MHC分子と会合することができる。概して、ペプチドは、ポリペプチドまたはタンパク質などのより長い生物学的分子の断片に由来するか、またはそれに基づく。いくつかの態様において、ペプチドは、典型的には、長さが約8〜約24アミノ酸である。いくつかの態様において、ペプチドは、MHCクラスII複合体における認識のために、9〜22アミノ酸または約9〜22アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様において、ペプチドは、MHCクラスI複合体における認識のために、8〜13アミノ酸または約8〜13アミノ酸の長さを有する。いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体などのMHC分子に関連したペプチドの認識時に、抗原受容体、例えばTCRまたはTCR様CARは、T細胞増殖、サイトカイン産生、細胞傷害性T細胞応答、または他の応答などのT細胞応答を誘導する、T細胞への活性化シグナルを生じるかまたは誘発する。
【０７３７】
いくつかの態様において、TCR様抗体または抗原結合部分は、作製することができる（例えば、米国特許出願公開第2002/0150914号；同第2003/0223994号；同第2004/0191260号；同第2006/0034850号；同第2007/00992530号；同第20090226474号；同第20090304679号；および国際PCT公開番号WO 03/068201を参照されたい）。
【０７３８】
いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、特異的なMHC-ペプチド複合体を含有する有効量の免疫原で宿主を免疫することによって作製することができる。いくつかの場合には、MHC-ペプチド複合体のペプチドは、MHCに結合することができる抗原、例えば腫瘍抗原、例えば、ユニバーサル腫瘍抗原、骨髄腫抗原、または以下に記載される他の抗原のエピトープである。いくつかの態様において、次いで、免疫応答を惹起するために有効量の免疫原を宿主に投与し、ここで免疫原は、MHC分子の結合溝におけるペプチドの三次元提示に対する免疫応答を惹起するのに十分な期間、その三次元形態を保持する。次いで、宿主から収集した血清をアッセイして、MHC分子の結合溝におけるペプチドの三次元提示を認識する所望の抗体が生じているかどうかを判定する。いくつかの態様において、生じた抗体を評価して、抗体が、MHC分子単独、関心対象のペプチド単独、およびMHCと無関係なペプチドとの複合体からMHC-ペプチド複合体を識別できることを確認することができる。次いで、所望の抗体を単離することができる。
【０７３９】
いくつかの態様において、MHC-ペプチド複合体に特異的に結合する抗体またはその抗原結合部分は、ファージ抗体ライブラリなどの抗体ライブラリディスプレイ法を使用することによって作製できる。いくつかの態様において、例えば、ライブラリのメンバーが1つまたは複数のCDRの1個または複数個の残基で変異している、変異体Fab、scFv、または他の抗体型のファージディスプレイライブラリを生成することができる。例えば、米国特許出願公開第20020150914号、同第2014/0294841号；およびCohen CJ. et al. (2003) J Mol. Recogn. 16:324-332を参照されたい。
【０７４０】
提供された態様には、組換え受容体、例えば、抗体、例えば、TCR様抗体を含むものが含まれる。いくつかの態様において、抗原受容体およびその他のキメラ受容体、例えば、TCR様抗体は、抗原の領域またはエピトープに特異的に結合する。抗原受容体には、キメラ抗原受容体（CAR）のような機能的な非TCR抗原受容体が含まれる。CARを発現する細胞、ならびに養子細胞治療、例えば、抗原および/またはエピトープの発現に関連した疾患および障害の処置におけるその使用も提供される。
【０７４１】
従って、例えば、MHC分子と会合して呈示または提示された時のT細胞エピトープまたはペプチドエピトープに対して、T細胞受容体特異性を示す非TCR分子を含有するTCR様CARが、本明細書中に提供される。いくつかの態様において、TCR様CARは、抗体またはその抗原結合部分、例えば、本明細書中に記載されるようなTCR様抗体を含有し得る。いくつかの態様において、抗体またはその抗体結合部分は、MHC分子と会合した特異的なペプチドエピトープに対して反応性であり、抗体または抗体断片は、MHC分子と会合した特異的なペプチドを、単独のMHC分子、単独の特異的なペプチド、いくつかのケースにおいて、MHC分子と会合した無関係のペプチドから区別することができる。いくつかの態様において、抗体またはその抗原結合部分は、T細胞受容体より高い結合親和性を示し得る。
【０７４２】
いくつかの局面において、導入遺伝子は、1つまたは複数のCAR、例えば、一次シグナルを誘導するためのシグナリングドメインを含有する第1のCAR、および第2の抗原に結合し、共刺激シグナルを生成するための成分を含有する第2のCARをコードする核酸を含み得る。例えば、第1のCARは、活性化CARであり得、第2のCARは、共刺激性CARであり得る。いくつかの局面において、両方のCARは、細胞において特定のエフェクター機能を誘導するため、ライゲートされなければならず、それは、標的とされる細胞型に対する特異性および選択性を提供することができる。
【０７４３】
いくつかの態様において、活性化ドメインが、あるCARに含まれ、共刺激成分は、別の抗原を認識する別のキメラ受容体によって提供される。いくつかの態様において、CARは、活性化CARまたは刺激性CARおよび共刺激受容体を含み、それらは両方とも同一の細胞において発現される（WO2014/055668を参照すること）。いくつかの局面において、HPV16 E6抗体またはHPV16 E7抗体を含有する受容体は、刺激性CARまたは活性化CARであり；他の局面において、それは、共刺激受容体である。いくつかの態様において、導入遺伝子は、阻害性CAR（iCAR、Fedorov et al.,Sci.Transl.Medicine,5(215)December,2013を参照すること）、例えば、HPV16 E6またはHPV16 E7以外のペプチドエピトープを認識する阻害性受容体をさらにコードし、それによって、例えば、オフターゲット効果を低下させるため、阻害CARのそのリガンドとの結合によって、HPV16を標的とするCARを通して送達された活性化シグナルが、弱められるかまたは阻害される。
【０７４４】
いくつかの態様において、導入遺伝子は、組換え受容体をコードする核酸を含むことができ、付加的な受容体、例えば、共刺激シグナルもしくは生存促進シグナルを送達することができる受容体、例えば、共刺激受容体（WO2014/055668を参照すること）、および/または阻害シグナルの転帰を阻止するかもしくは変化させるため、免疫チェックポイントもしくはその他の免疫阻害分子を介して典型的に送達されるもの、例えば、そのような改変された細胞の増加した効力を促進するため、腫瘍微小環境において発現されるものをさらにコードすることができる。例えば、Tang et al.,Am J Transl Res.2015;7(3):460-473を参照すること。いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の他の外来性成分または組換え成分または改変された成分、例えば、細胞において発現されるかまたは細胞によって分泌され、例えば、微小環境において、機能を促進することができる、1つまたは複数の外来性因子および/または共刺激リガンドをさらに含むことができる。そのようなリガンドおよび成分の例示的なものには、例えば、TNFRおよび/またはIgファミリーの受容体またはリガンド、例えば、4-1BBL、CD40、CD40L、CD80、CD86、サイトカイン、ケモカイン、および/または抗体もしくはその他の分子、例えば、scFvが含まれる。例えば、特許出願公開番号WO2008121420 A1、WO2014134165 A1、US20140219975 A1を参照すること。
【０７４５】
D. キメラ自己抗体受容体（CAAR）
いくつかの態様において、キメラ受容体は、キメラ自己抗体受容体（CAAR）である。いくつかの態様において、CAARは、自己抗体に結合し、例えば、特異的に結合するか、またそれを認識する。いくつかの態様において、CAARを発現する細胞、例えば、CAARを発現するよう改変されたT細胞は、正常抗体を発現する細胞ではなく、自己抗体を発現する細胞に結合し、それを死滅させるために使用され得る。いくつかの態様において、CAAR発現細胞は、自己免疫疾患のような、自己抗原の発現に関連した自己免疫疾患を処置するために使用され得る。いくつかの態様において、CAAR発現細胞は、最終的に自己抗体を産生し、細胞表面上に自己抗体を呈示するB細胞を標的とすることができ、治療的介入のための疾患特異的標的としてこれらのB細胞をマークすることができる。いくつかの態様において、CAAR発現細胞は、抗原特異的なキメラ自己抗体受容体を使用して、疾患を引き起こすB細胞を標的とすることによって、自己免疫疾患における病原性B細胞を効率的に標的とし死滅させるために使用され得る。いくつかの態様において、キメラ受容体は、米国特許出願公開番号US 2017/0051035に記載された任意のもののようなCAARである。
【０７４６】
いくつかの態様において、CAARは、自己抗体結合ドメイン、膜貫通ドメイン、および1つまたは複数の（交換可能に、細胞質シグナリングドメインまたは細胞質シグナリング領域とも呼ばれる）細胞内シグナリング領域または細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリング領域は、細胞内シグナリングドメインを含む。いくつかの態様において、細胞内シグナリングドメインは、一次シグナリング領域、T細胞における一次活性化シグナルを刺激しかつ/もしくは誘導することができるシグナリングドメイン、T細胞受容体（TCR）成分のシグナリングドメイン（例えば、CD3ゼータ（CD3ζ）鎖の細胞内シグナリングドメインもしくは細胞内シグナリング領域またはその機能的バリアントもしくはシグナリング部分）、および/または免疫受容活性化チロシンモチーフ（ITAM）を含むシグナリングドメインであるか、またはそれらを含む。
【０７４７】
いくつかの態様において、自己抗体結合ドメインは、自己抗原またはその断片を含む。自己抗原の選択は、標的とされている自己抗体の型に依り得る。例えば、自己抗原は、特定の疾患状態、例えば、自己免疫疾患、例えば、自己抗体によって媒介される自己免疫疾患に関連したB細胞のような標的細胞上の自己抗体を認識するため、選択され得る。いくつかの態様において、自己免疫疾患には、尋常性天疱瘡（PV）が含まれる。例示的な自己抗原には、デスモグレイン1（Dsg1）およびDsg3が含まれる。
【０７４８】
V. 組成物および製剤
改変された細胞の集団、そのような細胞を含有しかつ/またはそのような細胞が濃縮された組成物も、提供される。組成物には、例えば、養子細胞治療のための投与のための薬学的組成物および製剤が含まれる。細胞および組成物を、対象、例えば、患者へ投与する治療方法も、提供される。
【０７４９】
いくつかの態様において、改変された細胞を含有する提供された細胞集団および/または組成物は、従来の方法を使用して生成された細胞集団および/または組成物の発現および/または抗原結合と比較して、より改善され、均一であり、均質であり、かつ/または安定的である発現および/または組換え受容体による抗原結合を示し、例えば、低下した変動係数を示す細胞集団を含む。いくつかの態様において、細胞集団および/または組成物は、従来の方法、例えば、導入遺伝子のランダム組み込みを使用して生成されたそれぞれの集団と比較して、導入遺伝子の発現および/または組換え受容体による抗原結合の少なくとも100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、または10％低い変動係数を示す。変動係数とは、細胞、例えば、CD4+T細胞および/またはCD8+T細胞の集団における関心対象の核酸（例えば、組換え受容体をコードする導入遺伝子）の発現の標準偏差を、それぞれの細胞の集団におけるそれぞれの関心対象の核酸の発現の平均値で割ったものとして定義される。いくつかの態様において、細胞集団および/または組成物は、本明細書中に提供された方法を使用して改変されたCD4+T細胞および/またはCD8+T細胞の集団の間で測定された時、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、または0.30、またはそれ以下より低い変動係数を示す。
【０７５０】
いくつかの態様において、組換え受容体をコードする導入遺伝子の内在性TCR遺伝子座のうちの1つまたは複数への標的ノックイン（targeted knock-in）を有し、それによって、内在性TCR遺伝子座のうちの1つまたは複数のノックアウト、例えば、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2のような組み込みのための標的遺伝子のノックアウトを有する細胞を含む細胞集団および/または組成物が、提供される。いくつかの態様において、組換え受容体をコードする導入遺伝子の組み込みを有する細胞集団の中の細胞の全部または実質的に全部が、内在性TCR遺伝子座のうちの1つまたは複数のノックアウトも有する。いくつかの態様において、組換え受容体を発現する細胞集団および/または組成物の中の細胞の少なくとも80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上が、内在性TCR遺伝子座、例えば、TRAC、TRBC1、および/またはTRBC2のうちの1つまたは複数のノックアウトを含有する。従って、提供された細胞集団および/または組成物において、組換え受容体を発現する改変された細胞の全部または実質的に全部が、内在性TCR遺伝子座への導入遺伝子の標的ノックインによって、内在性TCRのノックアウトも含有する。
【０７５１】
いくつかの態様において、導入遺伝子によってコードされた組換え受容体またはその抗原結合断片、ならびにT細胞受容体α定常（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常（TRBC）遺伝子の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む多数の改変された免疫細胞を含む細胞集団および/または組成物が提供され、ここで、組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、は90％、またはそれ以上が、T細胞受容体α定常（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常（TRBC）遺伝子の標的位置における遺伝子破壊を含み；組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくはその鎖をコードする導入遺伝子が、相同組換え修復（HDR）を介して標的位置またはその近くにターゲティングされている。
【０７５２】
いくつかの態様において、発現および/または組換え受容体による抗原結合は、本明細書中、例えば、セクションI.Cに記載された試薬および/またはアッセイを使用して評価され得る。いくつかの態様において、発現は、組換え受容体またはその一部分を認識しかつ/またはそれに特異的に結合する結合分子を使用して測定される。例えば、いくつかの態様において、導入遺伝子によってコードされた組換え受容体の発現は、抗TCR Vβ22抗体を使用して、例えば、フローサイトメトリーによって、評価される。いくつかの態様において、TCRである組換え受容体の抗原結合は、単離もしくは精製されたまたは組換えの抗原、特定の抗原を発現する細胞を使用して、かつ/またはTCRリガンド（MHC-ペプチド複合体）を使用して評価され得る。
【０７５３】
いくつかの態様において、組換え受容体を発現し、かつ/または内在性TCRコード遺伝子のうちの1つもしくは複数のノックアウトを含有する細胞が、組成物中の全細胞またはT細胞もしくはCD8+細胞もしくはCD4+細胞のようなある種の型の細胞の少なくとも30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、またはそれ以上を構成するような、細胞を含有する組成物が提供される。
【０７５４】
例えば、所与の用量またはその画分での投与のための細胞の数を含む単位用量形態組成物などの、薬学的組成物および製剤を含む、投与のための細胞を含む組成物もまた、提供される。薬学的組成物および製剤は概して、1つまたは複数の任意の薬学的に許容される担体または賦形剤を含む。いくつかの態様において、組成物は、少なくとも1つの追加の治療剤を含む。
【０７５５】
「薬学的製剤」という用語は、その中に含有される活性成分の生物学的活性を有効にするような形態であり、かつ製剤が投与される対象に対して許容できないほどの毒性を有するさらなる構成要素を含有しない調製物を指す。
【０７５６】
「薬学的に許容される担体」とは、対象に対して非毒性である、活性成分以外の薬学的製剤中の成分を指す。薬学的に許容される担体には、緩衝剤、賦形剤、安定剤、または保存剤が含まれるが、それらに限定されない。
【０７５７】
いくつかの局面において、担体の選択は、一部には、特定の細胞によっておよび/または投与の方法によって決定される。したがって、多種多様な適している製剤がある。例えば、薬学的組成物は、保存剤を含有することができる。適している保存剤には、例えば、メチルパラベン、プロピルパラベン、安息香酸ナトリウム、および塩化ベンザルコニウムが含まれ得る。いくつかの局面において、2種類以上の保存剤の混合物が用いられる。保存剤またはその混合物は、典型的には、総組成物の重量で約0.0001％〜約2％の量で存在する。担体は、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)によって記載されている。薬学的に許容される担体は、概して、使用される投薬量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、以下を含むが、それらに限定されない：リン酸塩、クエン酸塩および他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸およびメチオニンを含む抗酸化剤；保存剤（塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム；塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチル、もしくはベンジルアルコール；メチルもしくはプロピルパラベンなどのアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；3-ペンタノール；およびm-クレゾールなど）；低分子量（約10残基未満）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリジンなどのアミノ酸；グルコース、マンノース、もしくはデキストリンを含む単糖類、二糖類、および他の炭水化物；EDTAなどのキレート剤；スクロース、マンニトール、トレハロース、もしくはソルビトールなどの糖類；ナトリウムなどの塩形成対イオン；金属錯体（例えば、Zn-タンパク質錯体）；ならびに/またはポリエチレングリコール（PEG）などの非イオン性界面活性剤。
【０７５８】
いくつかの局面における緩衝剤は、組成物中に含まれる。適している緩衝剤には、例えば、クエン酸、クエン酸ナトリウム、リン酸、リン酸カリウム、ならびに様々な他の酸および塩が含まれる。いくつかの局面において、2種類以上の緩衝剤の混合物が用いられる。緩衝剤またはその混合物は、典型的には、総組成物の重量で約0.001％〜約4％の量で存在する。投与可能な薬学的組成物を調製するための方法は、公知である。例示的な方法は、例えば、Remington: The Science and Practice of Pharmacy, Lippincott Williams & Wilkins; 21st ed.(May 1, 2005)においてより詳細に記載されている。
【０７５９】
製剤には、水性溶液が含まれ得る。製剤または組成物は、細胞によって処置される特定の適応症、疾患、または状態のために有用な複数の活性成分、好ましくは、細胞に対する補完的な活性を有するものも含有し得るが、それぞれの活性は、相互に悪影響を及ぼさない。そのような活性成分は、意図された目的のために有効な量で、組み合わせられて、適当に存在する。従って、いくつかの態様において、薬学的組成物は、他の薬学的活性を有する作用物質または薬物、例えば、化学療法剤、例えば、アスパラギナーゼ、ブスルファン、カルボプラチン、シスプラチン、ダウノルビシン、ドキソルビシン、フルオロウラシル、ゲムシタビン、ヒドロキシ尿素、メトトレキサート、パクリタクセル、リツキシマブ、ビンブラスチン、および/またはビンクリスチンをさらに含む。
【０７６０】
薬学的組成物は、いくつかの態様において、疾患または状態を処置するかまたは防止するために有効な量、例えば、治療的に有効な量または予防的に有効な量で、細胞を含有する。治療効力または予防効力は、いくつかの態様において、処置された対象の定期的な評価によってモニタリングされる。所望の投薬量は、細胞の単回ボーラス投与によって送達されてもよいし、細胞の複数回ボーラス投与によって送達されてもよいし、または細胞の連続注入投与によって送達されてもよい。
【０７６１】
細胞および組成物は、標準的な投与技術、製剤、および/またはデバイスを使用して投与され得る。細胞の投与は、自己であってもよいしまたは異種であってもよい。いくつかの局面において、細胞は、対象から単離され、改変され、同一の対象へ投与される。他の局面において、それらは、ある対象から単離され、改変され、別の対象へ投与される。例えば、免疫応答性細胞または前駆体を、1名の対象から得て、同じ対象または適合性を有する異なる対象へ投与することができる。末梢血由来の免疫応答性細胞またはそれらの子孫（例えば、インビボ、エクスビボ、またはインビトロ由来）を、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、または非経口投与を含む、局所注射を介して投与することができる。治療用組成物（例えば、遺伝子改変された免疫応答性細胞を含有する薬学的組成物）を投与する場合、治療用組成物は概して、単位投薬量を注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルション）に製剤化される。
【０７６２】
製剤には、経口投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、肺投与、経皮投与、筋肉内投与、鼻腔内投与、口腔投与、舌下投与、または坐剤投与のためのものが含まれる。いくつかの態様において、細胞集団は、非経口投与される。本明細書において用いられる「非経口」という用語は、静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与、直腸投与、膣内投与、および腹腔内投与を含む。いくつかの態様において、細胞は、静脈内注射、腹腔内注射、または皮下注射による末梢全身送達を用いて、対象へ投与される。
【０７６３】
いくつかの態様における組成物は、いくつかの局面において選択されたpHに緩衝され得る、滅菌液体調製物、例えば、等張水溶液、懸濁液、エマルション、分散液、または粘性組成物として提供される。液体調製物は通常、ゲル、他の粘性組成物、および固体組成物よりも調製が容易である。加えて、液体組成物は、特に注射によって投与するのに、いくらかより便利である。他方で、粘性組成物は、特定の組織とのより長い接触期間を提供する適切な粘度範囲内で製剤化することができる。液体または粘性組成物は、担体を含むことができ、担体は、例えば、水、食塩水、リン酸緩衝食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール）およびそれらの適している混合物を含有する溶媒または分散媒であることができる。
【０７６４】
滅菌の注射可能な溶液は、細胞を溶媒中に組み込むことによって、例えば、適している担体、希釈剤、または賦形剤、例えば滅菌水、生理食塩水、グルコース、デキストロースなどとの混合物において、調製することができる。組成物は、所望される投与の経路および調製物に応じて、湿潤剤、分散剤、または乳化剤（例えば、メチルセルロース）、pH緩衝剤、ゲル化もしくは増粘添加剤、保存剤、香味剤、および/または着色剤のような補助物質を含有することができる。標準的な教科書が、いくつかの局面において、適している調製物を調製するために参考にされてもよい。
【０７６５】
抗微生物保存剤、抗酸化剤、キレート剤、および緩衝剤を含む、組成物の安定性および無菌性を増強する様々な添加剤を、添加することができる。微生物の作用の阻止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、およびソルビン酸によって確実にすることができる。注射可能な薬学的形態の持続的吸収は、吸収を遅延させる作用物質、例えば、モノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によってもたらすことができる。
【０７６６】
インビボ投与のために用いられる製剤は、概して無菌である。無菌性は、例えば、滅菌濾過膜を通した濾過によって、容易に達成され得る。
【０７６７】
VI.投与の方法および養子細胞治療における使用
細胞、集団、および組成物を投与する方法、ならびに疾患、状態、および障害、例えば、癌を処置するかまたは防止するための、そのような細胞、集団、および組成物の使用が、提供される。いくつかの態様において、細胞、集団、および組成物は、例えば、養子T細胞治療のような養子細胞治療を介して、処置される特定の疾患または状態を有する対象または患者へ投与される。いくつかの態様において、提供された方法によって調製された細胞および組成物、例えば、改変された組成物、およびインキュベーションおよび/もしくはその他の加工の工程後の最終製造（end-of-production）組成物は、対象、例えば、疾患もしくは状態を有するかまたはそのリスクを有する対象へ投与される。いくつかの局面において、方法は、それによって、例えば、改変されたT細胞によって認識される抗原を発現する癌において、腫瘍負荷を減らすことによって、疾患または状態の1つまたは複数の症状を処置し、例えば、寛解させる。
【０７６８】
本明細書中で使用されるように、「対象」とは、ヒトまたはその他の動物のような哺乳動物であり、典型的には、ヒトである。いくつかの態様において、細胞、細胞集団、または組成物が投与される対象、例えば、患者は、哺乳動物、典型的には、ヒトのような霊長類である。いくつかの態様において、霊長類は、サルまたは類人猿である。対象は、雄であってもよいしまたは雌であってもよく、任意の適当な年齢、例えば、乳児期、若年期、青年期、成人期、および老齢期の対象であり得る。いくつかの態様において、対象は、齧歯類のような非霊長類哺乳動物である。
【０７６９】
本明細書中で使用されるように、「処置」（および「処置する」または「処置すること」のようなその文法上の変動）は、疾患もしくは状態もしくは障害、またはそれらに関連する症状、有害な効果もしくは転帰、もしくは表現型の完全なまたは部分的な寛解または低下をさす。処置の所望の効果には、疾患の発生もしくは再発の防止、症状の緩和、疾患の直接的もしくは間接的な病理学的結果の縮小、転移の防止、疾患進行の速度の減少、疾患状態の寛解もしくは緩和、および緩解、または予後の改善が含まれるが、これらに限定されるわけではない。その用語は、疾患の完全な治癒、または症状の完全な排除、または全ての症状もしくは転帰に対する効果を暗示するものではない。
【０７７０】
本明細書中で使用されるように、「疾患の発症の遅延」とは、（癌のような）疾患の発症の延期、妨害、減速、遅滞、安定化、抑制、および/または遅発を意味する。この遅延は、処置されている疾患および/または個体の履歴に依って変動する時間長であり得る。十分なまたは有意な遅延には、事実上、個体が疾患を発症しない防止が包含され得る。例えば、転移の発症のような後期癌を、遅延させることができる。
【０７７１】
「防止」とは、本明細書中で使用されるように、疾患の素因を有し得るが、未だ疾患を有すると診断されていない対象において、疾患の発生または再発に関する予防を提供することを含む。いくつかの態様において、提供された細胞および組成物は、疾患の発生を遅延させるかまたは疾患の進行を減速させるために使用される。
【０７７２】
本明細書中で使用されるように、機能または活性を「抑制する」こととは、関心対象の条件またはパラメーターを除く他の点において同一である条件と比較した時、あるいは別の条件と比較して、機能または活性を低下させることである。例えば、腫瘍成長を抑制する細胞は、その細胞の非存在下での腫瘍の成長の速度と比較して、腫瘍の成長の速度を低下させる。
【０７７３】
投与に関して、薬学的製剤、細胞、または組成物の「有効量」とは、治療的または予防的な結果のような所望の結果を達成するために必要な投薬量/量および期間で有効な量をさす。
【０７７４】
薬学的製剤または細胞の「治療的に有効な量」とは、例えば、疾患、状態、もしくは障害の処置のための所望の治療結果、および/または処置の薬物動態学的もしくは薬力学的な効果を達成するために必要な投薬量および期間で有効な量をさす。治療的に有効な量は、対象の疾患状態、年齢、性別、および体重、ならびに投与される細胞の集団のような因子に依って変動し得る。いくつかの態様において、提供された方法は、有効量、例えば、治療的に有効な量で、細胞および/または組成物を投与する工程を含む。
【０７７５】
「予防的に有効な量」とは、所望の予防的結果を達成するために必要な投薬量および期間で有効な量をさす。典型的には、必ずではないが、予防的用量は、疾患に先行してまたは疾患の初期に対象において使用されるため、予防的に有効な量は、治療的に有効な量より少ないであろう。より低い腫瘍負荷の状況において、予防的に有効な量は、いくつかの局面において、治療的に有効な量より高いであろう。
【０７７６】
養子細胞治療のための細胞の投与の方法は、公知であり、提供された方法および組成物に関して使用され得る。例えば、養子T細胞治療方法は、例えば、Gruenbergらの米国特許出願公開番号2003/0170238；Rosenbergの米国特許第4,690,915号；Rosenberg(2011)Nat Rev Clin Oncol.8(10):577-85に記載されている。例えば、Themeli et al.(2013)Nat Biotechnol.31(10):928-933；Tsukahara et al.(2013)Biochem Biophys Res Commun 438(1):84-9；Davila et al.(2013)PLoS ONE 8(4):e61338を参照すること。
【０７７７】
いくつかの態様において、細胞治療、例えば、養子T細胞治療は、細胞治療を受容する予定の対象またはそのような対象に由来する試料から、細胞が単離されかつ/または他の方法で調製される、自己移入によって実施される。従って、いくつかの局面において、細胞は、処置を必要とする対象、例えば、患者に由来し、細胞は、単離および加工の後、同一の対象へ投与される。
【０７７８】
いくつかの態様において、細胞治療、例えば、養子T細胞治療は、細胞治療を受容する予定であるかまたは最終的に受容する対象ではない対象、例えば、第1の対象から、細胞が単離されかつ/または他の方法で調製される、同種移入によって実施される。そのような態様において、細胞は、次いで、同種の異なる対象、例えば、第2の対象へ投与される。いくつかの態様において、第1および第2の対象は、遺伝学的に同一である。いくつかの態様において、第1および第2の対象は、遺伝学的に類似している。いくつかの態様において、第2の対象は、第1の対象と同一のHLAクラスまたはスーパータイプを発現する。
【０７７９】
細胞は、任意の適当な手段によって投与され得る。投薬および投与は、投与が短期的であるか慢性であるかに依り得る。様々な投薬スケジュールには、単回投与、または様々な時点における複数回投与、ボーラス投与、およびパルス注入が含まれるが、これらに限定されるわけではない。
【０７８０】
いくつかの態様において、対象は、細胞または細胞を含有する組成物の投与の前に、疾患または状態、例えば、腫瘍を標的とする治療剤によって処置されたことがある。いくつかの局面において、対象は、他の治療剤に対して不応性または非応答性である。いくつかの態様において、対象は、例えば、別の治療的介入、例えば、化学療法、放射線、および/または造血幹細胞移植（HSCT）、例えば、同種HSCTによる処置の後に、持続性のまたは再発した疾患を有する。いくつかの態様において、投与は、対象が別の治療に対して抵抗性になっているにも関わらず、対象を有効に処置する。
【０７８１】
いくつかの態様において、対象は、他の治療剤に対して応答性であり、治療剤による処置は疾患負荷を低下させる。いくつかの局面において、対象は、初期には治療剤に対して応答性であるが、次第に疾患または状態の再発を示す。いくつかの態様において、対象は、再発していない。いくつかのそのような態様において、対象は、再発のリスク、例えば、再発の高いリスクを有すると決定され、従って、細胞は、例えば、再発の可能性を低下させるためまたは再発を防止するため、予防的に投与される。
【０７８２】
いくつかの局面において、対象は、別の治療剤による処置を過去に受けたことがない。
【０７８３】
いくつかの局面において処置される疾患または状態は、抗原の発現が、疾患、障害または状態の細胞または組織に関連している、それに特異的である、および/もしくはその上に発現している、ならびに/または疾患、状態または障害の病因に関与している、例えば、そのような疾患、状態、または障害を引き起こす、憎悪させる、または他の方法で関与している、いずれかのものであり得る。例示的な疾患および状態としては、悪性腫瘍もしくは細胞の形質転換（例えば、がん）、自己免疫もしくは炎症性疾患、または、例えば細菌、ウイルスもしくは他の病原体によって引き起こされる感染性疾患に関連する疾患または状態を挙げることができる。例示的な抗原は、処置することができる種々の疾患および状態に関連する抗原を含み、本明細書に記載されている。特定の態様において、免疫調節ポリペプチドおよび/または組換え受容体、例えばキメラ抗原受容体またはTCRは、疾患または状態に関連する抗原に特異的に結合する。いくつかの態様において、対象は、疾患、障害または状態、任意でがん、腫瘍、自己免疫性の疾患、障害もしくは状態、または感染性疾患を有する。
【０７８４】
いくつかの態様において、疾患、障害または状態は、種々のがんに関連する腫瘍を含む。がんは、いくつかの態様において、対象の身体内に位置している任意のがん、例えば、これらに限定されないが、頭頸部、乳房、肝臓、結腸、卵巣、前立腺、膵臓、脳、子宮頸部、骨、皮膚、眼、膀胱、胃、食道、腹膜、または肺に位置しているがんなどであり得る。例えば、抗がん剤が、結腸がん、子宮頸がん、中枢神経系のがん、乳がん、膀胱がん、肛門がん、頭頸部がん、卵巣がん、子宮内膜がん、小細胞肺がん、非小細胞肺がん、神経内分泌がん、軟部組織がん、陰茎がん、前立腺がん、膵臓がん、胃がん、胆嚢がん、または食道がんの処置のために用いられ得る。いくつかの場合において、がんは血液のがんであり得る。いくつかの態様において、疾患、障害または状態は、腫瘍、例えば固形腫瘍、リンパ腫、白血病、血液腫瘍、転移性腫瘍、または他のがんもしくは腫瘍タイプなどである。いくつかの態様において、疾患、障害または状態は、結腸、肺、肝臓、乳房、前立腺、卵巣、皮膚、黒色腫、骨のがん、脳がん、卵巣がん、上皮がん、腎細胞がん、膵臓腺がん、子宮頸がん、結腸直腸がん、神経膠芽腫、神経芽腫、ユーイング肉腫、髄芽腫、骨肉腫、滑膜肉腫、および/または中皮腫の中から選択される。
【０７８５】
疾患、状態、および障害の中には、固形腫瘍、血液悪性腫瘍、および黒色腫を含む、ならびに局限性および転移性腫瘍を含む腫瘍、感染性疾患、例えばウイルスまたは他の病原体、例えばHIV、HCV、HBV、CMV、HPVによる感染および寄生虫病など、ならびに自己免疫および炎症性疾患がある。いくつかの態様において、疾患、障害または状態は、腫瘍、がん、悪性腫瘍、新生物、または他の増殖性疾患もしくは障害である。そのような疾患には、これらに限定されないが、白血病、リンパ腫、例えば急性骨髄性（myeloid）（または骨髄性（myelogenous））白血病（AML）、慢性骨髄性（myeloid）（または骨髄性（myelogenous））白血病（CML）、急性リンパ性（またはリンパ芽球性）白血病（ALL）、慢性リンパ性白血病（CLL）、ヘアリー細胞白血病（HCL）、小リンパ球性リンパ腫（SLL）、マントル細胞リンパ腫（MCL）、辺縁帯リンパ腫、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫（HL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、未分化大細胞リンパ腫（ALCL）、濾胞性リンパ腫、治療抵抗性濾胞性リンパ腫、びまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）および多発性骨髄腫（MM）が含まれ、B細胞悪性腫瘍は、急性リンパ芽球性白血病（ALL）、成人ALL、慢性リンパ芽球性白血病（CLL）、非ホジキンリンパ腫（NHL）、およびびまん性大細胞型B細胞リンパ腫（DLBCL）内から選択される。
【０７８６】
いくつかの態様において、疾患または状態は、これらに限定されないが、ウイルス、レトロウイルス、細菌、および原虫感染、免疫不全、サイトメガロウイルス（CMV）、エプスタインバーウイルス（EBV）、アデノウイルス、BKポリオーマウイルスなどの、感染性疾患または状態である。いくつかの態様において、疾患または状態は、関節炎、例えば関節リウマチ（RA）、I型糖尿病、全身性エリテマトーデス（SLE）、炎症性腸疾患、乾癬、強皮症、自己免疫性甲状腺疾患、グレーブス病、クローン病、多発性硬化症、喘息、および/または移植に関連する疾患もしくは状態などの、自己免疫または炎症性の疾患または状態である。
【０７８７】
いくつかの態様において、疾患または障害に関連した抗原は、神経膠腫関連抗原であり得る腫瘍抗原、βヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、B細胞成熟抗原（BCMA、BCM）、B細胞活性化因子受容体（BAFFR、BR3）、および/または膜貫通活性化因子CAML相互作用因子（TACI）、Fc受容体様5（FCRL5、FcRH5）、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2（AS）、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、メラニン-A/MART-1、WT-1、S-100、MBP、CD63、MUC1（例えば、MUC1-8）、p53、Ras、サイクリンB1、HER-2/neu、癌胎児抗原（CEA）、gp100、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A11、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-C1、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、チロシナーゼ（例えば、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）もしくはチロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2））、βカテニン、NY-ESO-1、LAGE-1a、PP1、MDM2、MDM4、EGVFvIII、Tax、SSX2、テロメラーゼ、TARP、pp65、CDK4、ビメンチン、S100、eIF-4A1、IFN誘導性p78、およびメラノトランスフェリン（p97）、ウロプラキンII、前立腺特異抗原（PSA）、ヒトカリクレイン（huK2）、前立腺特異膜抗原（PSM）、および前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、好中球エラスターゼ、エフリンB2、BA-46、βカテニン、Bcr-abl、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、カスパーゼ8、またはB-Raf抗原である。他の腫瘍抗原には、FRa、CD24、CD44、CD133、CD166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、uPA、PAI-1、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、糖脂質F77、GD-2、インスリン増殖因子（IGF）-I、IGF-II、IGF-I受容体、およびメソテリンに由来する任意のものが含まれ得る。特異的な腫瘍関連抗原またはT細胞エピトープは、公知である（例えば、www.cancerimmunity.org/peptide/において入手可能なvan der Bruggen et al.(2013)Cancer Immun；Cheever et al.(2009)Clin Cancer Res,15,5323-37を参照すること）。
【０７８８】
いくつかの態様において、疾患または障害に関連した抗原は、ウイルス抗原である。HIV、HTLV、およびその他のウイルスのウイルスゲノムに由来するペプチドを含む、多くのウイルス抗原標的が同定されており、公知である（例えば、Addo et al.(2007)PLoS ONE,2,e321；Tsomides et al.(1994)J Exp Med,180,1283-93；Utz et al.(1996)JVirol,70,843-51を参照すること）。例示的なウイルス抗原には、A型肝炎、B型肝炎（例えば、HBVコア抗原および表面抗原（HBVc、HBVs））、C型肝炎（HCV）、エプスタインバーウイルス（例えば、EBVA）、ヒトパピローマウイルス（HPV；例えば、E6およびE7）、ヒト免疫不全1型ウイルス（HIV1）、カポジ肉腫ヘルペスウイルス（KSHV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、インフルエンザウイルス、ラッサウイルス、HTLN-1、HIN-1、HIN-II、CMN、EBN、またはHPNに由来する抗原が含まれるが、これらに限定されるわけではない。いくつかの態様において、標的タンパク質は、細菌性抗原またはその他の病原性抗原、例えば、結核菌（MT）抗原、トリパノソーマ、例えば、トリパノソーマ・クルージ（T.クルージ）の抗原、例えば、表面抗原（TSA）、またはマラリア抗原である。特異的なウイルス抗原またはエピトープまたはその他の病原性抗原またはT細胞エピトープは、公知である（例えば、Addo et al.,(2007)PLoS ONE,2:e321；Anikeeva et al.,(2009)Clin Immunol,130:98-109を参照すること）。
【０７８９】
いくつかの態様において、疾患または障害に関連した抗原は、癌に関連したウイルス、例えば、癌ウイルスに由来する抗原である。例えば、癌ウイルスは、ある種のウイルスによる感染が、異なる型の癌の発症をもたらすことが公知であるもの、例えば、A型肝炎、B型肝炎（例えば、HBVコア抗原および表面抗原（HBVc、HBVs））、C型肝炎（HCV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス感染、エプスタインバーウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス8（HHV-8）、ヒトT細胞白血球ウイルス1（HTLV-1）、ヒトT細胞白血球ウイルス2（HTLV-2）、もしくはサイトメガロウイルス（CMV）の抗原、または本明細書中、例えば、セクションIVに記載された組換え受容体によって標的とされた任意の抗原である。
【０７９０】
いくつかの態様において、疾患、障害、または状態に関連した抗原は、αvβ6インテグリン（avb6インテグリン）、B細胞成熟抗原（BCMA）、B7-H3、B7-H6、炭酸脱水酵素9（CAIXもしくはG250としても公知のCA9）、癌精巣抗原、癌/精巣抗原1B（NY-ESO-1およびLAGE-2としても公知のCTAG）、癌胎児抗原（CEA）、サイクリン、サイクリンA2、C-Cモチーフケモカインリガンド1（CCL-1）、CD19、CD20、CD22、CD23、CD24、CD30、CD33、CD38、CD44、CD44v6、CD44v7/8、CD123、CD133、CD138、CD171、コンドロイチン硫酸プロテオグリカン4（CSPG4）、上皮増殖因子タンパク質（EGFR）、III型上皮増殖因子受容体変異（EGFR vIII）、上皮糖タンパク質2（EPG-2）、上皮糖タンパク質40（EPG-40）、エフリンB2、エフリン受容体A2（EPHa2）、エストロゲン受容体、Fc受容体様5（FCRL5；Fc受容体相同体5もしくはFCRH5としても公知）、胎児アセチルコリン受容体（胎児AchR）、葉酸結合タンパク質（FBP）、葉酸受容体α、ガングリオシドGD2、O-アセチル化GD2（OGD2）、ガングリオシドGD3、糖タンパク質100（gp100）、グリピカン-3（GPC3）、Gタンパク質共役型受容体クラスCグループ5メンバーD（GPRC5D）、Her2/neu（受容体型チロシンキナーゼerb-B2）、Her3（erb-B3）、Her4（erb-B4）、erbB二量体、ヒト高分子量メラノーマ関連抗原（HMW-MAA）、B型肝炎表面抗原、ヒト白血球抗原A1（HLA-A1）、ヒト白血球抗原A2（HLA-A2）、IL-22受容体α（IL22Rα）、IL-13受容体α2（IL13Rα2）、キナーゼ挿入ドメイン受容体（kdr）、κ軽鎖、L1細胞接着分子（L1-CAM）、L1-CAMのCE7エピトープ、ロイシンリッチリピート含有8ファミリーメンバーA（LRRC8A）、ルイスY、メラノーマ関連抗原（MAGE）-A1、MAGE-A3、MAGE-A6、MAGE-A10、メソテリン（MSLN）、c-Met、マウスサイトメガロウイルス（CMV）、ムチン1（MUC1）、MUC16、ナチュラルキラーグループ2メンバーD（NKG2D）リガンド、メランA（MART-1）、神経細胞接着分子（NCAM）、癌胎児抗原、メラノーマ優先発現抗原（Preferentially expressed antigen of melanoma）（PRAME）、プロゲステロン受容体、前立腺特異抗原、前立腺幹細胞抗原（PSCA）、前立腺特異膜抗原（PSMA）、受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体1（ROR1）、サバイビン、栄養膜糖タンパク質（5T4としても公知のTPBG）、腫瘍関連糖タンパク質72（TAG72）、チロシナーゼ関連タンパク質1（TYRP1もしくはgp75としても公知のTRP1）、チロシナーゼ関連タンパク質2（ドパクロムトートメラーゼ、ドパクロムδイソメラーゼ、もしくはDCTとしても公知のTRP2）、血管内皮増殖因子受容体（VEGFR）、血管内皮増殖因子受容体2（VEGFR2）、ウィルムス腫瘍1（WT-1）、病原体特異的なもしくは病原体によって発現された抗原、またはユニバーサルタグに関連した抗原、および/またはビオチン化された分子、および/またはHIV、HCV、HBV、もしくはその他の病原体によって発現された分子から選択される。受容体によって標的とされる抗原には、いくつかの態様において、B細胞悪性疾患に関連した抗原、例えば、多数の公知のB細胞マーカーのうちの任意のものが含まれる。いくつかの態様において、抗原は、CD20、CD19、CD22、ROR1、CD45、CD21、CD5、CD33、Igκ、Igλ、CD79a、CD79b、もしくはCD30であるか、またはそれらを含む。いくつかの態様において、抗原は、病原体特異的なもしくは病原体によって発現された抗原であるか、またはそれらを含む。いくつかの態様において、抗原は、（HIV、HCV、HBV等に由来す���ウイルス抗原のような）ウイルス抗原、細菌抗原、および/または寄生虫抗原である。
【０７９１】
いくつかの態様において、細胞は、所望の投薬量で投与され、それは、いくつかの局面において、細胞もしくは細胞型の所望の用量もしくは数、および/または細胞型の所望の比を含む。従って、細胞の投薬量は、いくつかの態様において、細胞の総数（または体重1kg当たりの数）、および個々の集団またはサブタイプの所望の比、例えば、CD4+とCD8+との比に基づく。いくつかの態様において、細胞の投薬量は、個々の集団内の細胞または個々の細胞型の所望の総数（または体重1kg当たりの数）に基づく。いくつかの態様において、投薬量は、そのような特色の組み合わせ、例えば、全細胞の所望の数、所望の比、および個々の集団内の細胞の所望の総数に基づく。
【０７９２】
いくつかの態様において、細胞の集団またはサブタイプ、例えば、CD8+T細胞およびCD4+T細胞は、全細胞の所望の用量、例えば、T細胞の所望の用量で、またはその許容される差異の範囲内で投与される。いくつかの局面において、所望の用量は、所望の細胞数、または細胞が投与される対象の体重の単位当たりの所望の細胞数、例えば、細胞/kgである。いくつかの局面において、所望の用量は、最小の細胞数、もしくは体重の単位当たりの最小の細胞数、またはそれ以上である。いくつかの局面において、所望の用量で投与される全細胞のうち、個々の集団またはサブタイプは、所望のアウトプット比（例えば、CD4+とCD8+との比）またはその近くで、例えば、そのような比のある許容される差異または誤差の範囲内で存在する。
【０７９３】
いくつかの態様において、細胞は、細胞の個々の集団もしくはサブタイプのうちの1つもしくは複数の所望の用量、例えば、CD4+細胞の所望の用量および/もしくはCD8+細胞の所望の用量で、またはその許容される差異の範囲内で投与される。いくつかの局面において、所望の用量は、サブタイプもしくは集団の細胞の所望の数、または細胞が投与される対象の体重の単位当たりのそのような細胞の所望の数、例えば、細胞/kgである。いくつかの局面において、所望の用量は、集団もしくはサブタイプの細胞の最小の数、もしくは体重の単位当たりの集団もしくはサブタイプの細胞の最小の数、またはそれ以上である。
【０７９４】
従って、いくつかの態様において、投薬量は、全細胞の所望の固定された用量および所望の比に基づき、かつ/または個々のサブタイプもしくは亜集団のうちの1つもしくは複数、例えば、各々の所望の固定された用量に基づく。従って、いくつかの態様において、投薬量は、T細胞の所望の固定されたもしくは最小の用量、およびCD4+細胞とCD8+細胞との所望の比に基づき、かつ/またはCD4+細胞および/もしくはCD8+細胞の所望の固定されたもしくは最小の用量に基づく。
【０７９５】
ある態様において、細胞、または細胞のサブタイプの個々の集団は、対象の体重1キログラム当たり約100万〜約1000億の細胞の範囲および/またはその量の細胞で、例えば、約100万〜約500億の細胞（例えば、約500万の細胞、約2500万の細胞、約5億の細胞、約10億の細胞、約50億の細胞、約200億の細胞、約300億の細胞、約400億の細胞、もしくは前述の値のうちの任意の2つによって規定される範囲）、例えば、約1000万〜約1000億の細胞（例えば、約2000万の細胞、約3000万の細胞、約4000万の細胞、約6000万の細胞、約7000万の細胞、約8000万の細胞、約9000万の細胞、約100億の細胞、約250億の細胞、約500億の細胞、約750億の細胞、約900億の細胞、もしくは前述の値のうちの任意の2つによって規定される範囲）、いくつかの場合において、約1億の細胞〜約500億の細胞（例えば、約1億2000万の細胞、約2億5000万の細胞、約3億5000万の細胞、約4億5000万の細胞、約6億5000万の細胞、約8億の細胞、約9億の細胞、約30億の細胞、約300億の細胞、約450億の細胞）、または、これらの範囲の中にある任意の値でかつ/または対象の体重1キログラム当たり、対象へ投与される。投薬量は、疾患もしくは障害および/または患者および/または他の処置に特定の特質に依存して、変動し得る。
【０７９６】
いくつかの態様において、例えば、対象がヒトである場合、用量は、約5×108個より少ない総組換え受容体(例えば、CAR)発現細胞、T細胞、もしくは末梢血単核細胞(PBMC)を含み、例えば、約1×106〜5×108個の範囲のこのような細胞、例えば、総計2×106、5×106、1×107、5×107、1×108個、または5×108個のこのような細胞、または前述の値のいずれか2つの間の範囲である。
【０７９７】
いくつかの態様において、遺伝子改変された細胞の用量は、1×105〜5×108個の総CAR発現T細胞、1×105〜2.5×108個の総CAR発現T細胞、1×105〜1×108個の総CAR発現T細胞、1×105〜5×107個の総CAR発現T細胞、1×105〜2.5×107個の総CAR発現T細胞、1×105〜1×107個の総CAR発現T細胞、1×105〜5×106個の総CAR発現T細胞、1×105〜2.5×106個の総CAR発現T細胞、1×105〜1×106個の総CAR発現T細胞、1×106〜5×108個の総CAR発現T細胞、1×106〜2.5×108個の総CAR発現T細胞、1×106〜1×108個の総CAR発現T細胞、1×106〜5×107個の総CAR発現T細胞、1×106〜2.5×107個の総CAR発現T細胞、1×106〜1×107個の総CAR発現T細胞、1×106〜5×106個の総CAR発現T細胞、1×106〜2.5×106個の総CAR発現T細胞、2.5×106〜5×108個の総CAR発現T細胞、2.5×106〜2.5×108個の総CAR発現T細胞、2.5×106〜1×108個の総CAR発現T細胞、2.5×106〜5×107個の総CAR発現T細胞、2.5×106〜2.5×107個の総CAR発現T細胞、2.5×106〜1×107個の総CAR発現T細胞、2.5×106〜5×106個の総CAR発現T細胞、5×106〜5×108個の総CAR発現T細胞、5×106〜2.5×108個の総CAR発現T細胞、5×106〜1×108個の総CAR発現T細胞、5×106〜5×107個の総CAR発現T細胞、5×106〜2.5×107個の総CAR発現T細胞、5×106〜1×107個の総CAR発現T細胞、1×107〜5×108個の総CAR発現T細胞、1×107〜2.5×108個の総CAR発現T細胞、1×107〜1×108個の総CAR発現T細胞、1×107〜5×107個の総CAR発現T細胞、1×107〜2.5×107個の総CAR発現T細胞、2.5×107〜5×108個の総CAR発現T細胞、2.5×107〜2.5×108個の総CAR発現T細胞、2.5×107〜1×108個の総CAR発現T細胞、2.5×107〜5×107個の総CAR発現T細胞、5×107〜5×108個の総CAR発現T細胞、5×107〜2.5×108個の総CAR発現T細胞、5×107〜1×108個の総CAR発現T細胞、1×108〜5×108個の総CAR発現T細胞、1×108〜2.5×108個の総CAR発現T細胞、もしくは2.5×108 〜5×108個の総CAR発現T細胞、または概ねそれらの値の総CAR発現T細胞を含む。
【０７９８】
いくつかの態様において、遺伝子改変された細胞の用量は、少なくとも1×105個もしくは少なくとも約1×105個もしくは1×105個もしくは約1×105個のCAR発現細胞、少なくとも2.5×105個もしくは少なくとも約2.5×105個もしくは2.5×105個もしくは約2.5×105個のCAR発現細胞、少なくとも5×105個もしくは少なくとも約5×105個もしくは5×105個もしくは約5×105個のCAR発現細胞、少なくとも1×106個もしくは少なくとも約1×106個もしくは1×106個もしくは約1×106個のCAR発現細胞、少なくとも2.5×106個もしくは少なくとも約2.5×106個もしくは2.5×106個もしくは約2.5×106個のCAR発現細胞、少なくとも5×106個もしくは少なくとも約5×106個もしくは5×106個もしくは約5×106個のCAR発現細胞、少なくとも1×107個もしくは少なくとも約1×107個もしくは1×107個もしくは約1×107個のCAR発現細胞、少なくとも2.5×107個もしくは少なくとも約2.5×107個もしくは2.5×107個もしくは約2.5×107個のCAR発現細胞、少なくとも5×107個もしくは少なくとも約5×107個もしくは5×107個もしくは約5×107個のCAR発現細胞、少なくとも1×108個もしくは少なくとも約1×108個もしくは1×108個もしくは約1×108個のCAR発現細胞、少なくとも2.5×108個もしくは少なくとも約2.5×108個もしくは2.5×108個もしくは約2.5×108個のCAR発現細胞、または少なくとも5×108個もしくは少なくとも約5×108個もしくは5×108個もしくは約5×108のCAR発現細胞を含む。
【０７９９】
いくつかの態様において、細胞療法は、それぞれの両端の値を含む、1×105〜5×108個もしくは約1×105〜5×108個の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、もしくは総末梢血単核細胞（PBMC）、5×105〜1×107個もしくは約5×105〜1×107個の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、もしくは総末梢血単核細胞（PBMC）、または1×106〜1×107個もしくは約1×106〜1×107個の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、もしくは総末梢血単核細胞（PBMC）の細胞の数を含む用量の投与を含む。いくつかの態様において、細胞療法は、少なくとも1×105個または少なくとも約1×105個の総組換え受容体発現細胞、総T細胞、または総末梢血単核細胞（PBMC）、例えば、少なくとも1×106個または少なくとも1×106個、少なくとも1×107個または少なくとも約1×107個、少なくとも1×108個または少なくとも約1×108個のそのような細胞の細胞数を含む細胞の用量の投与を含む。いくつかの態様において、該数は、CD3+またはCD8+総数を基準にし、いくつかの場合には、組換え受容体発現（例えばCAR+）細胞も基準にする。いくつかの態様において、細胞療法は、それぞれ両端の値を含む、1×105〜5×108個もしくは約1×105〜5×108個のCD3+もしくはCD8+総T細胞またはCD3+もしくはCD8+組換え受容体発現細胞、5×105〜1×107個もしくは約5×105〜1×107個のCD3+もしくはCD8+総T細胞またはCD3+もしくはCD8+組換え受容体発現細胞、または1×106〜1×107個もしくは約1×106〜1×107個のCD3+もしくはCD8+総T細胞またはCD3+もしくはCD8+組換え受容体発現細胞の細胞数を含む用量の投与を含む。いくつかの態様において、細胞療法は、それぞれ両端の値を含む、1×105〜5×108個もしくは約1×105〜5×108個の総CD3+/CAR+もしくはCD8+/CAR+細胞、5×105〜1×107個もしくは約5×105〜1×107個の総CD3+/CAR+もしくはCD8+/CAR+細胞、または1×106〜1×107個もしくは約1×106〜1×107個の総CD3+/CAR+もしくはCD8+/CAR+細胞の細胞数を含む用量の投与を含む。
【０８００】
いくつかの態様において、用量のT細胞は、CD4+T細胞、CD8+T細胞、またはCD4+およびCD8+T細胞を含む。
【０８０１】
いくつかの態様において、例えば、対象がヒトである場合、CD4+およびCD8+T細胞を含む用量で含む、用量のCD8+T細胞は、約1×106から5×108 個の間の総組換え受容体（例えば、CAR）発現CD8+細胞、例えば、約5×106〜1×108個のそのような細胞の範囲で、例えば1×107、2.5×107、5×107、7.5×107、1×108、または5×108個の総数のそのような細胞、または前述の値の任意の2つ間の範囲で含む。いくつかの態様において、患者は、複数用量を投与され、用量のそれぞれまたは総用量は前述の値のいずれかの範囲内であり得る。いくつかの態様において、細胞の用量は、それぞれ両端の値を含む、1×107〜0.75×108個または約1×107〜0.75×108個の総組換え受容体発現CD8+ T細胞、1×107〜2.5×107個の総組換え受容体発現CD8+ T細胞、1×107〜0.75×108個または約1×107〜0.75×108個の総組換え受容体発現CD8+ T細胞の投与を含む。いくつかの態様において、細胞の用量は、1×107、2.5×107、5×107 7.5×107、1×108、もしくは5×108個または約1×107、2.5×107、5×107 7.5×107、1×108、もしくは5×108個の総組換え受容体発現CD8+ T細胞の投与を含む。
【０８０２】
いくつかの態様において、細胞、例えば、組換え受容体発現T細胞の用量は、単一用量として対象へ投与されるか、または、2週間、1ヶ月、3ヶ月、6ヶ月、1年、もしくはそれよりも長い期間内に1回のみ投与される。
【０８０３】
いくつかの態様において、例えば、対象がヒトである場合、用量には、約1×108個未満の全ての組換え受容体（例えば、組換えTCR）発現細胞、T細胞、または末梢血単核細胞（PBMC）、例えば、約1×106〜1×108個の範囲のそのような細胞、例えば、2×106個、5×106個、1×107個、5×107個、もしくは1×108個の全てのそのような細胞、または前述の値のうちの任意の2つの間の範囲が含まれる。
【０８０４】
いくつかの態様において、全細胞の用量および/または細胞の個々の亜集団の用量は、104もしくは約104から109もしくは約109細胞/キログラム（kg）体重、例えば、105〜106細胞/kg体重の範囲内、例えば、1×105細胞/kg、1.5×105細胞/kg、2×105細胞/kg、もしくは1×106細胞/kg体重、または約1×105細胞/kg、約1.5×105細胞/kg、約2×105細胞/kg、もしくは約1×106細胞/kg体重である。例えば、いくつかの態様において、細胞は、104もしくは約104から109もしくは約109 T細胞/キログラム（kg）体重、例えば、105〜106 T細胞/kg体重、例えば、1×105 もしくは約1×105 T細胞/kg、1.5×105 T細胞/kg、2×105 T細胞/kg、もしくは1×106 T細胞/kg体重で、またはそれらのある誤差の範囲内で投与される。
【０８０５】
いくつかの態様において、細胞は、104もしくは約104から109もしくは約109のCD4+細胞および/もしくはCD8+細胞/キログラム（kg）体重、例えば、105〜106のCD4+細胞および/もしくはCD8+細胞/kg体重、例えば、1×105もしくは約1×105のCD4+細胞および/もしくはCD8+細胞/kg、1.5×105のCD4+細胞および/もしくはCD8+細胞/kg、2×105のCD4+細胞および/もしくはCD8+細胞/kg、もしくは1×106のCD4+細胞および/もしくはCD8+細胞/kg体重で、またはそれらのある誤差の範囲内で投与される。
【０８０６】
いくつかの態様において、細胞は、少なくとも約1×106、約2.5×106、約5×106、約7.5×106、もしくは約9×106 CD4+細胞、および/もしくは少なくとも約1×106、約2.5×106、約5×106、約7.5×106、もしくは約9×106 CD8+細胞、および/もしくは少なくとも約1×106、約2.5×106、約5×106、約7.5×106、もしくは約9×106 T細胞、ならびに/またはそれら以上で、またはそれらのある誤差の範囲内で投与される。いくつかの態様において、細胞は、約108〜1012もしくは約1010〜1011 T細胞、約108〜1012もしくは約1010〜1011 CD4+細胞、および/もしくは約108〜1012もしくは約1010〜1011 CD8+細胞で、またはそれらのある誤差の範囲内で投与される。
【０８０７】
いくつかの態様において、細胞は、CD4+細胞およびCD8+細胞もしくはサブタイプのような複数の細胞集団もしくはサブタイプの所望のアウトプット比で、またはその許容される範囲内で投与される。いくつかの局面において、所望の比は、特定の比であってもよいし、または比の範囲であってもよく、例えば、いくつかの態様において、所望の比（例えば、CD4+細胞とCD8+細胞との比）は、1:5もしくは約1:5から5:1もしくは約5:1（もしくは約1:5より大きく、約5:1より小さい）、または1:3もしくは約1:3から3:1もしくは約3:1（もしくは約1:3より大きく、約3:1より小さい）、例えば、2:1または約2:1から1:5または約1:5（または約1:5より大きく、約2:1より小さい）、例えば、5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、もしくは1:5、または約5:1、4.5:1、4:1、3.5:1、3:1、2.5:1、2:1、1.9:1、1.8:1、1.7:1、1.6:1、1.5:1、1.4:1、1.3:1、1.2:1、1.1:1、1:1、1:1.1、1:1.2、1:1.3、1:1.4、1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.5、1:3、1:3.5、1:4、1:4.5、もしくは1:5である。いくつかの局面において、許容される差異は、所望の比の約1％以内、約2％以内、約3％以内、約4％以内、約5％以内、約10％以内、約15％以内、約20％以内、約25％以内、約30％以内、約35％以内、約40％以内、約45％以内、約50％以内、例えば、これらの範囲の間の任意の値である。
【０８０８】
疾患の防止または処置のため、適切な投薬量は、処置される疾患の型、細胞または組換え受容体の型、疾患の重症度および経過、細胞が防止目的で投与されるのか治療目的で投与されるのか、以前の治療、対象の病歴および細胞に対する応答、ならびに主治医の裁量に依り得る。組成物および細胞は、いくつかの態様において、一度に、または一連の処置で、適当に対象へ投与される。
【０８０９】
いくつかの局面において、用量のサイズは、1つまたは複数の基準、例えば、過去の処置、例えば、化学療法に対する対象の応答、対象における疾患負荷、例えば、腫瘍の量、体積、サイズ、もしくは程度、転移の範囲もしくは型、段階、ならびに/または対象が毒性転帰、例えば、CRS、マクロファージ活性化症候群、腫瘍崩壊症候群、神経毒性、および/もしくは投与された細胞および/もしくは組換え受容体に対する宿主免疫応答を発症する可能性もしくは発生率に基づき、決定される。
【０８１０】
いくつかの局面において、用量のサイズは、対象における疾患または状態の負荷によって決定される。例えば、いくつかの局面において、用量中の投与される細胞の数は、細胞の用量の開始の投与の直前に対象に存在する腫瘍負荷に基づき、決定される。いくつかの態様において、初回用量および/またはその後の用量のサイズは、疾患負荷と逆相関する。いくつかの局面において、例えば、大きい疾患負荷の状況において、対象は、少数の細胞を投与される。他の態様において、例えば、より低い疾患負荷の状況において、対象は、より多数の細胞を投与される。
【０８１１】
細胞は、任意の適当な手段、例えば、ボーラス注入、注射、例えば、静脈内注射もしくは皮下注射、眼内注射、眼周囲注射、網膜下注射、硝子体内注射、経中隔注射、強膜下注射、脈絡膜内注射、前房内注射、結膜下注射、テノン嚢下注射、眼球後注射、眼球周囲注射、または後強膜近傍（posterior juxtascleral）送達によって投与され得る。いくつかの態様において、それらは、非経口投与、肺内投与、および鼻腔内投与によって投与され、所望の場合、局所処置のため、病巣内投与によって投与される。非経口注入には、筋肉内投与、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、または皮下投与が含まれる。いくつかの態様において、与えられた用量は、細胞の単回ボーラス投与によって投与される。いくつかの態様において、それは、例えば、3日以内の期間での細胞の複数回ボーラス投与によって、または細胞の連続注入投与によって投与される。
【０８１２】
いくつかの態様において、細胞は、組み合わせ処置の一部として、例えば、別の治療的介入、例えば、抗体もしくは改変された細胞もしくは受容体もしくは作用物質、例えば、細胞傷害性薬剤もしくは治療剤と同時に、または任意の順序で連続的に投与される。細胞は、いくつかの態様において、同時に、または任意の順序で連続的に、1つもしくは複数の付加的な治療剤と共に、または別の治療的介入に関連して、同時投与される。いくつかの状況において、細胞集団が1つまたは複数の付加的な治療剤の効果を増強するか、またはその逆であるよう、細胞は、時間的に十分に近く、別の治療と同時投与される。いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の付加的な治療剤の前に投与される。いくつかの態様において、細胞は、1つまたは複数の付加的な治療剤の後に投与される。いくつかの態様において、1つまたは複数の付加的な作用物質には、例えば、持続性を増強するための、IL-2のようなサイトカインが含まれる。いくつかの態様において、方法は、化学療法剤の投与を含む。
【０８１３】
細胞の投与後、いくつかの態様において、改変された細胞集団の生物学的活性が、例えば、多数の公知の方法のうちの任意のものによって測定される。評価すべきパラメーターには、例えば、イメージングによるインビボの、または、例えば、ELISAもしくはフローサイトメトリーによるエクスビボの、改変されたT細胞または天然T細胞またはその他の免疫細胞の抗原との特異的結合が含まれる。ある種の態様において、標的細胞を破壊する改変された細胞の能力は、例えば、Kochenderfer et al., J. Immunotherapy, 32(7): 689-702 (2009)およびHerman et al. J. Immunological Methods, 285(1): 25-40 (2004)に記載された細胞傷害アッセイのような、任意の適当な公知の方法を使用して測定され得る。ある種の態様において、細胞の生物学的活性は、CD107a、IFNγ、IL-2、およびTNFのような1つまたは複数のサイトカインの発現および/または分泌をアッセイすることによって測定される。いくつかの局面において、生物学的活性は、腫瘍負荷または腫瘍量の低下のような臨床的転帰を評価することによって測定される。
【０８１４】
ある種の態様において、改変された細胞は、治療的または予防的な効力が増加するよう、多数の方式で、さらに修飾される。例えば、集団によって発現された改変されたCARまたはTCRは、直接的に、またはリンカーを通して間接的に、ターゲティング部分にコンジュゲートされ得る。化合物、例えば、CARまたはTCRのターゲティング部分とのコンジュゲーションの実際は、公知である。例えば、Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995)および米国特許第5,087,616号を参照すること。
【０８１５】
VII.キットおよび製品
提供された態様の実施において有用な製品、系、装置、およびキットも、提供される。いくつかの態様において、提供された製品またはキットは、遺伝子破壊を誘導することができる1つもしくは複数の作用物質の1つもしくは複数の成分、および/または鋳型ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体もしくはその抗原結合断片もしくはその鎖をコードする導入遺伝子を含有する鋳型ポリヌクレオチド、もしくは1つもしくは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドを含有する。いくつかの態様において、製品またはキットは、組換え受容体および/またはその他のポリペプチドを発現するようT細胞を改変し、提供された方法によって作製された細胞および/または細胞集団を評価する方法において、使用され得る。いくつかの態様において、本明細書中に提供された製品またはキットは、T細胞および/またはT細胞組成物、例えば、本明細書中に記載された任意のT細胞および/またはT細胞組成物を含有する。
【０８１６】
いくつかの態様において、製品またはキットは、提供された方法の実施において有用なポリペプチド、核酸、ベクター、および/またはポリヌクレオチドを含む。いくつかの態様において、製品またはキットは、遺伝子破壊を誘導することができる1つもしくは複数の作用物質の1つもしくは複数の成分、および/または鋳型ポリヌクレオチド、例えば、組換え受容体もしくはその抗原結合断片もしくはその鎖をコードする導入遺伝子を含有する鋳型ポリヌクレオチド、もしくは1つもしくは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドを含む、1つまたは複数の核酸分子、例えば、プラスミドまたはDNA断片を含む。いくつかの態様において、本明細書中に提供される製品またはキットは、対照ベクターを含有する。
【０８１７】
いくつかの態様において、本明細書中に提供される製品またはキットは、1つまたは複数の作用物質（1つまたは複数の作用物質は、各々独立に、T細胞受容体α定常（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常（TRBC）遺伝子の標的部位の遺伝子破壊を誘導することができる）；ならびに組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチド（組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して標的部位またはその近くへの組み込みのためターゲティングされる）を含有する。
【０８１８】
いくつかの態様において、本明細書中に提供される製品またはキットは、T細胞および/またはT細胞組成物、例えば、本明細書中に記載された任意のT細胞および/またはT細胞組成物を含有する。いくつかの態様において、T細胞および/またはT細胞組成物、修飾型T細胞のうちの任意のものは、本明細書中に記載されたスクリーニング法において使用される。いくつかの態様において、本明細書中に提供された製品またはキットは、対照T細胞および/または対照T細胞組成物を含有する。
【０８１９】
いくつかの態様において、製品またはキットは、組換え受容体を発現する改変された細胞の集団および/または組成物の特性を評価するために使用される1つまたは複数の成分を含む。例えば、製品またはキットは、導入された組換えTCRの特定の特性、例えば、組換えTCRの細胞表面発現、MHC分子と会合したペプチドの認識、および/またはレポーター、例えば、T細胞活性化レポーターによって生成された検出可能なシグナルを評価するために使用される結合試薬、例えば、抗体、MHC-ペプチド四量体、および/またはプローブを含み得る。いくつかの態様において、製品またはキットは、特定の特性の検出のために使用される成分、例えば、標識された成分、例えば、蛍光標識された成分、および/または検出可能なシグナルを生成することができる成分、例えば、蛍光もしくは発光を生成することができる基質を含み得る。
【０８２０】
いくつかの態様において、製品またはキットは、1つまたは複数の容器、典型的には、多数の容器と、パッケージング材料と、一般に、使用説明書、例えば、改変のための細胞への成分の導入ならびに/または改変された細胞の集団および/もしくは組成物の評価についての説明書を含む、容器および/またはパッケージングに付随するラベルまたはパッケージインサートとを含む。いくつかの態様において、製品またはキットは、治療のための改変された細胞および/または改変された細胞組成物の投与についての1つまたは複数の説明書を含む。
【０８２１】
本明細書中に提供された製品は、パッケージング材料を含有する。提供された材料のパッケージングにおいて使用するためのパッケージング材料は、周知である。例えば、各々その全体が本明細書中に組み入れられる、米国特許第5,323,907号、第5,052,558号、および第5,033,252号を参照すること。パッケージング材料の例には、ブリスターパック、ボトル、チューブ、吸入器、ポンプ、バッグ、バイアル、容器、注射器、使い捨ての実験備品、例えば、ピペットチップおよび/もしくはプラスチックプレート、またはボトルが含まれるが、これらに限定されるわけではない。製品またはキットは、材料の分配を容易にするための、またはハイスループットもしくは大規模な使用を容易にするための、例えば、ロボット機器における使用を容易にするためのデバイスを含み得る。典型的には、パッケージングは、その中に含有される組成物と非反応性である。
【０８２２】
いくつかの態様において、遺伝子破壊を誘導することができるp作用物質および/または鋳型ポリヌクレオチドは、別々にパッケージングされる。いくつかの態様において、各容器は、単一のコンパートメントを有し得る。いくつかの態様において、製品またはキットの他の成分は、別々にパッケージングされるか、または単一のコンパートメントに共にパッケージングされる。
【０８２３】
VIII.定義
他に定義されない限り、本明細書中で使用される専門用語、記号、ならびにその他の技術的および科学的な用語または用語法は、全て、特許請求の範囲に記載された主題が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同一の意味を有するものとする。いくつかのケースにおいて、一般的に理解される意味を有する用語が、明確および/または容易な参照のため、本明細書中で定義されるが、本明細書中のそのような定義の内含は、当技術分野において一般に理解されるものとの実質的な差異を表すものと必ずしも解釈されるべきでない。
【０８２４】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、アミノ酸残基のポリマーをさすために交換可能に使用され、最小の長さに限定されない。ポリペプチド、例えば、提供された抗体および抗体鎖およびその他のペプチド、例えば、リンカーは、アミノ酸残基、例えば、天然アミノ酸残基および/または非天然アミノ酸残基を含み得る。その用語には、ポリペプチドの発現後修飾、例えば、グリコシル化、シアリル化、アセチル化、リン酸化等も含まれる。いくつかの局面において、タンパク質が所望の活性を維持する限り、ポリペプチドは、ネイティブまたは天然の配列に対する修飾を含有し得る。これらの修飾は、計画的なもの、例えば、部位特異的変異誘発によるものであってもよいし、または偶発的なもの、例えば、タンパク質を産生する宿主の変異もしくはPCR増幅によるエラーによるものであってもよい。
【０８２５】
「単離された」核酸とは、その天然環境の成分から分離された核酸分子をさす。単離された核酸には、その核酸分子を通常含有する細胞に含有されているが、染色体外または天然の染色体位置とは異なる染色体位置に存在する核酸分子が含まれる。
【０８２６】
「TCRまたは抗体をコードする単離された核酸」とは、TCRのα鎖もしくはβ鎖（もしくはそれらの断片）または抗体の重鎖および軽鎖（もしくはそれらの断片）をコードする1つまたは複数の核酸分子、例えば、単一のベクターまたは別々のベクターに含まれるそのような核酸分子、および宿主細胞内の1つまたは複数の位置に存在するそのような核酸分子をさす。
【０８２７】
「宿主細胞」、「宿主細胞株」、および「宿主細胞培養物」という用語は、交換可能に使用され、外来性核酸が導入された細胞をさし、そのような細胞の子孫を含む。宿主細胞には、「形質転換体」および「形質転換細胞」が含まれ、それらには、初代形質転換細胞および継代数に関わらずそれに由来する子孫が含まれる。子孫は、親細胞と核酸内容が完全に同一でなく、変異を含有してもよい。最初に形質転換された細胞においてスクリーニングまたは選択されたのと同一の機能または生物学的活性を有する変異体子孫が、本明細書中に含まれる。
【０８２８】
本明細書中で使用されるように、「アミノ酸配列同一性（％）」および「同一性（％）」とは、アミノ酸配列（参照ポリペプチド配列）に対して使用された時、配列を整列させ、最大の配列同一性（％）を達成するために必要である場合、ギャップを導入した後、保存的置換を配列同一性の一部と見なさず、参照ポリペプチド配列内のアミノ酸残基と同一である候補配列（例えば、対象の抗体または断片）内のアミノ酸残基の百分率として定義される。アミノ酸配列同一性（％）を決定するためのアライメントは、様々な公知のソフトウェアにおいて、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN、またはMegalign（DNASTAR）ソフトウェアのような公に利用可能なコンピュータソフトウェアを使用して達成され得る。配列を整列させるための適切なパラメーター、例えば、比較される配列の全長において最大アライメントを達成するために必要とされるアルゴリズムは、決定され得る。
【０８２９】
いくつかの態様において、「機能的に連結された」とは、適切な分子（例えば、転写活性化タンパク質）が制御配列に結合した時に遺伝子発現を可能にするような、DNA配列、例えば、異種核酸および制御配列のような成分の会合を含み得る。従って、それは、記載された成分が、意図された様式で機能することを可能にする関係にあることを意味する。
【０８３０】
アミノ酸置換は、ポリペプチド内のあるアミノ酸の別のアミノ酸への交換を含み得る。置換は、保存的アミノ酸置換または非保存的アミノ酸置換であり得る。アミノ酸置換を、関心対象の結合分子、例えば、抗体に導入し、所望の活性、例えば、保持された/改善された抗原結合、減少した免疫原性、または改善されたADCCもしくはCDCについて産物をスクリーニングすることができる。
【０８３１】
アミノ酸は、一般に、以下の共通の側鎖特性によって分類され得る：
（1）疎水性：ノルロイシン、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
（2）中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
（3）酸性：Asp、Glu；
（4）塩基性：His、Lys、Arg；
（5）鎖方向に影響を及ぼす残基：Gly、Pro；
（6）芳香族：Trp、Tyr、Phe。
【０８３２】
いくつかの態様において、保存的置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーの、同一クラスの別のメンバーとの交換を含み得る。いくつかの態様において、非保存的アミノ酸置換は、これらのクラスのうちの1つのメンバーの、別のクラスとの交換を含み得る。
【０８３３】
「ベクター」という用語は、本明細書において用いられる場合、それに連結される別の核酸を増やすことができる核酸分子を指す。この用語には、自己複製性核酸構造物としてのベクター、ならびに導入されている宿主細胞のゲノム中に組み込まれるベクターが含まれる。ある特定のベクターは、それに機能的に連結される核酸の発現を導くことができる。そのようなベクターは、本明細書において「発現ベクター」と呼ばれる。
【０８３４】
「添付文書」という用語は、そのような治療用産物の使用に関わる適応症、用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌、および/または警告についての情報を含有する、治療用産物の商業的包装に慣例上含まれる説明書を指すように用いられる。
【０８３５】
本明細書において用いられる単数形「1つの（a）」、「1つの（an）」および「その（the）」は、文脈がそうでないことを明確に示す場合を除き、複数の指示対象を包含する。例えば、「1つの（a）」または「1つの（an）」は、「少なくとも1つ」または「1つまたは複数」を意味する。本明細書において記載される局面および変化形は、局面および変化形「からなる」ことおよび/またはそれら「から本質的になる」ことを包含することが理解される。
【０８３６】
本開示の全体を通して、特許請求の範囲に記載される対象の種々の局面が範囲形式で示される。範囲形式での記載は単に便宜および簡潔性のためであり、特許請求の範囲に記載される対象の範囲に関して柔軟性のない限定として解釈されるべきではないことが理解されるべきである。したがって、範囲の記載は、可能性のある部分範囲ならびにその範囲内にある個々の数値をすべて具体的に開示していると見なされるべきである。例えば、値の範囲が与えられる場合、その範囲の上限と下限との間にある各介在する値（intervening value）、およびその表記された範囲における任意の他の表記された値または介在する値が、特許請求の範囲に記載される対象の範囲内に包含されることが理解される。これらのより小さい範囲の上限および下限は、このより小さい範囲に独立して含まれてもよく、表記された範囲における任意の特に除外される限界に従うことを条件に、特許請求の範囲に記載される対象の範囲内にも包含される。表記された範囲が限界点の一方または両方を含む場合、そのような含まれた限界点のどちらかまたは両方を除外する範囲もまた、特許請求の範囲に記載される対象において含まれる。このことは、範囲の広さにかかわらず、当てはまる。
【０８３７】
本明細書において用いられる用語「約」は、この技術分野における当業者には容易に理解されるそれぞれの値についての通常の誤差範囲を指す。本明細書における「約」値またはパラメーターへの言及には、その値またはパラメーター自体に関する態様が含まれる（および記載される）。例えば、「約X」に言及する記載は、「X」の記載を含む。いくつかの態様において、「約」は、±25％、±20％、±15％、±10％、±5％、または±1％を指すことができる。
【０８３８】
本明細書において用いられる場合、組成物は、細胞を含む、2種類以上の産物、物質、または化合物の任意の混合物を指す。組成物は、溶液、懸濁液、液体、粉末、ペースト、水性、非水性、またはそれらの任意の組み合わせであってもよい。
【０８３９】
本明細書において用いられる場合、細胞または細胞の集団が特定のマーカーについて「陽性」であるという記述は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーの細胞上でのまたは細胞中での検出可能な存在を指す。表面マーカーを指す場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、該抗体を検出することによって検出されるような表面発現の存在を指し、ここで、染色は、アイソタイプが一致する対照を用いてそれ以外は同一条件下で同じ手法を実施して検出される染色を実質的に上回るレベルで、および/またはマーカーについて陽性であることが公知の細胞のものと実質的に同様のレベルで、および/またはマーカーについて陰性であることが公知の細胞のものよりも実質的に高いレベルで、フローサイトメトリーによって検出可能である。
【０８４０】
本明細書において用いられる場合、細胞または細胞の集団が特定のマーカーについて「陰性」であるという記述は、特定のマーカー、典型的には表面マーカーの細胞上でのまたは細胞中での実質的に検出可能な存在の非存在を指す。表面マーカーを指す場合、この用語は、フローサイトメトリーによって、例えば、マーカーに特異的に結合する抗体で染色し、該抗体を検出することによって検出されるような表面発現の非存在を指し、ここで、染色は、アイソタイプが一致する対照を用いてそれ以外は同一条件下で同じ手法を実施して検出される染色を実質的に上回るレベルでフローサイトメトリーによって検出されず、および/またはマーカーについて陽性であることが公知の細胞のものより実質的に低いレベル、および/またはマーカーについて陰性であることが公知の細胞のものと比較して実質的に同様のレベルである。
【０８４１】
本出願で言及される特許文書、科学論文、データベースなどの、全ての刊行物は、個々の刊行物が参照により個別に組み込まれるのと同じ程度に、あらゆる目的のためにその全体が参照により本明細書に組み入れられる。本明細書に記載の定義が、参照により本明細書に組み入れられる特許、出願、公開出願および他の刊行物に記載される定義に反しているか、さもなければ矛盾している場合、本明細書に記載の定義は、参照により本明細書に組み入れられる定義に優先するものである。
【０８４２】
本明細書で使用されるセクションの見出しは、組織的な目的でのみ使用され、記載された内容を限定するものとして解釈されるべきではない。
【０８４３】
IX.  例示的な態様
提供される態様の中には、以下のものがある：
1.  遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
（a）免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階；および
（b）該免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
2.  遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的位置の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
3.  1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、態様1または態様2の方法。
4.  1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、態様1〜3のいずれかの方法。
5.  1つまたは複数の作用物質が、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質と、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質とを含む、態様1〜4のいずれかの方法。
6.  TRBC遺伝子がT細胞受容体β定常部1（TRBC1）遺伝子またはT細胞受容体β定常部2（TRBC2）遺伝子の一方または両方である、態様4または態様5の方法。
7.  遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
（a）免疫細胞に1つまたは複数の作用物質を導入する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子およびT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができ、それによって、標的部位の遺伝子破壊を誘発する、段階；および
（b）該免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、該標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
8.  遺伝子改変された免疫細胞を作製する方法であって、
T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を有する免疫細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、該遺伝子破壊は1つまたは複数の作用物質により誘発されたものであり、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは独立して遺伝子破壊を誘発することができ、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
を含む、方法。
9.  TRBC遺伝子がT細胞受容体β定常部1（TRBC1）遺伝子またはT細胞受容体β定常部2（TRBC2）遺伝子の一方または両方である、態様7または態様8の方法。
10.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質が、標的部位に特異的に結合またはハイブリダイズするDNA結合タンパク質またはDNA結合核酸を含む、態様1〜9のいずれかの方法。
11.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質が、（a）DNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼを含む融合タンパク質、または（b）RNA誘導型ヌクレアーゼを含む、態様10の方法。
12.  DNAターゲティングタンパク質またはRNA誘導型ヌクレアーゼが、ジンクフィンガータンパク質（ZFP）、TALタンパク質、または標的部位に特異的なCRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid-associated nuclease）を含む、態様11の方法。
13.  1つまたは複数の作用物質が、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせを含む、態様10〜12のいずれかの方法。
14.  1つまたは複数の作用物質のそれぞれが、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む、態様1〜13のいずれかの方法。
15.  1つまたは複数の作用物質が、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体として導入される、態様14の方法。
16.  RNPが、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞圧縮または細胞スクイージングを介して導入される、態様15の方法。
17.  RNPがエレクトロポレーションを介して導入される、態様15または態様16の方法。
18.  1つまたは複数の作用物質が、gRNAおよび/またはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドとして導入される、態様1〜13のいずれかの方法。
19.  少なくとも1つの標的部位がTRAC、TRBC1および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、態様1〜18のいずれかの方法。
20.  gRNAが、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000048
から選択される配列を含む、態様14〜19のいずれかの方法。
21.  gRNAが配列：GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (SEQ ID NO:31)を含むターゲティングドメインを有する、態様20の方法。
22.  gRNAが、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000049
2021520202.tif 000050
から選択される配列を含む、態様14〜21のいずれかの方法。
23.  gRNAが配列：GGCCUCGGCGCUGACGAUCU (SEQ ID NO:63)を含むターゲティングドメインを有する、態様22の方法。
24.  鋳型ポリヌクレオチドが構造［5'相同性アーム］-［導入遺伝子］-［3'相同性アーム］を含む、態様1〜23のいずれかの方法。
25.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、態様24の方法。
26.  5'相同性アームが、標的部位の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様24または態様25の方法。
27.  3'相同性アームが、標的部位の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様24または態様25の方法。
28.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対以下である、態様24〜27のいずれかの方法。
29.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000塩基対である、態様28の方法。
30.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対である、態様29の方法。
31.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様1〜30のいずれかの方法。
32.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様1〜32のいずれかの方法。
33.  前記免疫細胞に、1つまたは複数の第2の導入遺伝子を含む1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドを導入することをさらに含み、第2の導入遺伝子が、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様1〜32のいずれかの方法。
34.  第2の鋳型ポリヌクレオチドが構造［第2の5'相同性アーム］-［1つまたは複数の第2の導入遺伝子］-［第2の3'相同性アーム］を含む、態様33の方法。
35.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、態様34の方法。
36.  第2の5'相同性アームが、標的部位の第2の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様34または態様35の方法。
37.  第2の3'相同性アームが、標的部位の第2の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様34または態様35の方法。
38.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000塩基対以下である、態様34〜37のいずれかの方法。
39.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、独立して、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000塩基対である、態様38の方法。
40.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、独立して、約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、または2000塩基対である、態様39の方法。
41.  1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様33〜40のいずれかの方法。
42.  1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様33〜41のいずれかの方法。
43.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によってはターゲティングされない1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様33〜42のいずれかの方法。
44.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様33〜43のいずれかの方法。
45.  1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体（CSR）、またはコレセプターから選択される分子をコードする、態様33〜44のいずれかの方法。
46.  コードされた分子が、4-1BBL、OX40L、CD70、LIGHTおよびCD30Lから選択される腫瘍壊死因子（TNF）リガンド、またはCD80およびCD86から選択される免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーリガンドの中から任意で選択される共刺激リガンドである、態様45の方法。
47.  コードされた分子が、IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、IL-7、IL-15、IL-21、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFN-α）、インターフェロンβ（IFN-β）またはインターフェロンγ（IFN-γ）、およびエリスロポエチンの中から任意で選択されるサイトカインである、態様45の方法。
48.  コードされた分子が、CD47、PD-1、CTLA-4およびそれらのリガンドまたはCD28、OX-40、4-1BBおよびそれらのリガンドから選択される免疫抑制作用または免疫刺激作用を有するポリペプチドに任意で結合する、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）である、態様45の方法。
49.  コードされた分子が、（a）CD200R、SIRPα、CD279 (PD-1)、CD2、CD95 (Fas)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD272 (BTLA)、A2aR、KIR、TIM3、CD300またはLPA5に由来する抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；（b）CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD47、CD79A、CD79B、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)、CARD11、DAP10、DAP12、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRFM、Zap70、PTCH2、またはそれらの任意の組み合わせに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン；および（c）CD2、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CD80、CD86、CD95 (Fas)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD200R、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD272 (BTLA)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、CD279 (PD-1)、CD300、CD357 (GITR)、A2aR、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、GAL9、KIR、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PTCH2、ROR2、Ryk、Slp76、SIRPα、pTα、TCRα、TCRβ、TIM3、TRIM、LPA5またはZap70に由来する疎水性膜貫通ドメインを任意で含む、免疫調節融合タンパク質である、態様45の方法。
50.  コードされた分子が、PD1のトランケート型細胞外ドメインと、CD28の膜貫通および細胞質シグナル伝達ドメインを任意で含む、キメラスイッチ受容体（CSR）である、態様45の方法。
51.  コードされた分子が、CD4またはCD8から任意で選択されるコレセプターである、態様45の方法。
52.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が組換えTCRの1つの鎖をコードし、かつ第2の導入遺伝子が該組換えTCRの異なる鎖をコードする、態様33〜44のいずれかの方法。
53.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が組換えTCRのα（TCRα）鎖をコードし、かつ第2の導入遺伝子が組換えTCRのβ（TCRβ）鎖をコードする、態様52の方法。
54.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、調節または制御エレメントをさらに含む、態様1〜53のいずれかの方法。
55.  調節または制御エレメントが、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザック（Kozak）コンセンサス配列、配列内リボソーム進入部位（IRES）、リボソームスキップ配列をコードする配列、スプライスアクセプター配列またはスプライスドナー配列を含む、態様54の方法。
56.  調節または制御エレメントがプロモーターを含む、態様55の方法。
57.  プロモーターが構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターおよび/または組織特異的プロモーターの中から選択される、態様56の方法。
58.  プロモーターがRNA pol I、pol II、またはpol IIIプロモーターの中から選択される、態様56または態様57の方法。
59.  プロモーターが、
U6もしくはH1プロモーターであるpol IIIプロモーター；または
CMV、SV40初期領域もしくはアデノウイルス主要後期プロモーターであるpol IIプロモーター；
から選択される、態様58の方法。
60.  プロモーターがヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーターもしくはMNDプロモーターまたはその変異体であるか、またはそれを含む、態様56〜58のいずれかの方法。
61.  プロモーターが誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである、態様56〜58のいずれかの方法。
62.  プロモーターが、Lacオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列もしくはドキシサイクリンオペレーター配列を含むか、またはその類似体であるか、またはLacリプレッサー、テトラサイクリンリプレッサーもしくはその類似体によって結合または認識されることが可能である、態様61の方法。
63.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントを含む、態様1〜62のいずれかの方法。
64.  1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子の上流にある、態様63の方法。
65.  マルチシストロン性エレメントが、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子と、1つまたは複数の第2の導入遺伝子との間に配置される、態様63または態様64の方法。
66.  マルチシストロン性エレメントが、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される、態様63〜65のいずれかの方法。
67.  マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む、態様66の方法。
68.  リボソームスキップエレメントをコードする配列が、標的部位の遺伝子とインフレームになるようにターゲティングされる、態様67の方法。
69.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、標的部位の遺伝子の内因性プロモーターに機能的に連結される、態様1〜53のいずれかの方法。
70.  組換えTCRが、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に関連する、特異的である、および/または発現される抗原に結合することができる、態様1〜69のいずれかの方法。
71.  疾患、障害または症状が、感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である、態様70の方法。
72.  抗原が腫瘍抗原または病原性抗原である、態様70または態様71の方法。
73.  病原性抗原が細菌抗原またはウイルス抗原である、態様72の方法。
74.  抗原がウイルス抗原であり、ウイルス抗原が、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス感染症、エプスタインバーウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス8型（HHV-8）、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）、ヒトT細胞白血病ウイルス2型（HTLV-2）、またはサイトメガロウイルス（CMV）に由来する、態様73の方法。
75.  抗原がHPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33およびHPV-35の中から選択されるHPV由来の抗原である、態様74の方法。
76.  抗原がHPV-16 E6またはHPV-16 E7抗原であるHPV-16抗原である、態様75の方法。
77.  ウイルス抗原が、エプスタインバー核抗原（EBNA）-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNAリーダータンパク質（EBNA-LP）、潜在膜タンパク質LMP-1、LMP-2AおよびLMP-2B、EBV-EA、EBV-MAおよびEBV-VCAの中から選択されるEBV抗原である、態様73の方法。
78.  ウイルス抗原が、TAXであるHTLV抗原である、態様73の方法。
79.  ウイルス抗原が、B型肝炎コア抗原またはB型肝炎エンベロープ抗原であるHBV抗原である、態様73の方法。
80.  抗原が腫瘍抗原である、態様70〜72のいずれかの方法。
81.  抗原が、神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2 (AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、メランA/MART-1、WT-1、S-100、MBP、CD63、MUC1（例：MUC1-8）、p53、Ras、サイクリンB1、HER-2/neu、癌胎児性抗原（CEA）、gp100、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A11、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-C1、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）、β-カテニン、NY-ESO-1、LAGE-1a、PP1、MDM2、MDM4、EGVFvIII、Tax、SSX2、テロメラーゼ、TARP、pp65、CDK4、ビメンチン、S100、eIF-4A1、IFN誘導性p78、メラノトランスフェリン（p97）、ウロプラキンII、前立腺特異抗原（PSA）、ヒトカリクレイン（huK2）、前立腺特異膜抗原（PSM）、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、好中球エラスターゼ、エフリンB2、BA-46、Bcr-abl、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、カスパーゼ8、FRa、CD24、CD44、CD133、CD 166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、uPA、PAI-1、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、グリコリピドF77、GD-2、インスリン成長因子（IGF）-I、IGF-II、IGF-I受容体、およびメソテリンの中から選択される、態様80の方法。
82.  免疫細胞がT細胞である、態様1〜81のいずれかの方法。
83.  T細胞がCD8+ T細胞またはそのサブタイプである、態様82の方法。
84.  T細胞がCD4+ T細胞またはそのサブタイプである、態様82の方法。
85.  免疫細胞が多分化能細胞または多能性細胞に由来し、任意でiPSCである、態様1〜81のいずれかの方法。
86.  免疫細胞が対象の自己細胞であるT細胞を含む、態様1〜85のいずれかの方法。
87.  免疫細胞が対象に対して同種異系であるT細胞を含む、態様1〜85のいずれかの方法。
88.  第1の鋳型ポリヌクレオチド、1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチド、ならびに/またはgRNAおよび/もしくはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドが、1つまたは複数のベクターに含まれ、該ベクターが任意でウイルスベクターである、態様1〜87のいずれかの方法。
89.  ベクターがAAVベクターである、態様88の方法。
90.  AAVベクターがAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7またはAAV8ベクターの中から選択される、態様89の方法。
91.  AAVベクターがAAV2またはAAV6ベクターである、態様90の方法。
92.  ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、態様88の方法。
93.  ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、態様92の方法。
94.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入、および鋳型ポリヌクレオチドの導入が、同時に、または任意の順序で連続して行われる、態様1〜93のいずれかの方法。
95.  鋳型ポリヌクレオチドの導入が、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる、態様1〜94のいずれかの方法。
96.  鋳型ポリヌクレオチドが、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または導入後約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間、もしくは4時間以内に導入される、態様95の方法。
97.  鋳型ポリヌクレオチドの導入と、1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドの導入が、同時に、または任意の順序で連続して行われる、態様33〜96のいずれかの方法。
98.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドの導入が、1つの実験反応で行われる、態様1〜97のいずれかの方法。
99.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドおよび第2の鋳型ポリヌクレオチドの導入が、1つの実験反応で行われる、態様33〜98のいずれかの方法。
100.  複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上が、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子のドメインまたは領域をコードする遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む、態様1〜99のいずれかの方法。
101.  複数の改変細胞中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上が、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または抗原結合を示す、態様1〜99のいずれかの方法。
102.  複数の改変細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数が、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30またはそれ以下より低い、態様1〜99のいずれかの方法。
103.  複数の改変細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数が、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、または10％低い、態様1〜99のいずれかの方法。
104.  組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合が、該組成物中の細胞をTCRα鎖またはTCRβ鎖に特異的な結合試薬と接触させ、該試薬の細胞への結合を測定することによって評価される、態様100〜103のいずれかの方法。
105.  結合試薬が、Vβ鎖またはVα鎖の特定のファミリーを特異的に認識する、抗TCR Vβ抗体または抗TCR Vα抗体である、態様104の方法。
106.  結合試薬がペプチド抗原-MHC複合体であり、任意で四量体である、態様104の方法。
107.  態様1〜106のいずれかの方法を用いて作製された、1つの改変細胞または複数の改変細胞。
108.  態様107の該1つの改変細胞または該複数の改変細胞を含有する組成物。
109.  該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上が、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子のドメインまたは領域をコードする遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含む、態様108の組成物。
110.  該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上が、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または抗原結合を示す、態様108の組成物。
111.  該複数の細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数が、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30またはそれ以下より低い、態様108の組成物。
112.  該複数の細胞間の組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合の変動係数が、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、または10％低い、態様108の組成物。
113.  組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合が、該組成物中の細胞をTCRα鎖またはTCRβ鎖に特異的な結合試薬と接触させ、該試薬の細胞への結合を測定することによって評価される、態様109〜112のいずれかの組成物。
114.  結合試薬が、Vβ鎖またはVα鎖の特定のファミリーを特異的に認識する、抗TCR Vβ抗体または抗TCR Vα抗体である、態様113の組成物。
115.  結合試薬がペプチド抗原-MHC複合体であり、任意で四量体である、態様113の組成物。
116.  薬学的に許容される担体をさらに含む、態様108〜115のいずれかの組成物。
117.  導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖と、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含有する組成物であって、該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上が、TRAC遺伝子および/またはTRBC遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を含み、かつ
組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、組成物。
118.  導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片もしくは鎖と、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含有する組成物であって、該組成物中の細胞の少なくとも35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、もしくは90％またはそれ以上が、組換え受容体またはその抗原結合断片を発現し、かつ/または抗原結合を示し、かつ
組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、組成物。
119.  導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片と、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含有する組成物であって、該複数の細胞間の組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数が、0.70、0.65、0.60、0.55、0.50、0.45、0.40、0.35、もしくは0.30またはそれ以下より低い、組成物。
120.  導入遺伝子によりコードされる組換え受容体またはその抗原結合断片と、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊とを含む、複数の改変T細胞を含有する組成物であって、該複数の細胞間の組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数が、ランダムな組み込みによってゲノムに組み込まれる同じ組換え受容体の発現および/または抗原結合の変動係数よりも少なくとも100％、95％、90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％または10％低い、組成物。
121.  前記組成物が、
（a）複数のT細胞に、1つまたは複数の作用物質を導入し、それによって少なくとも1つの標的部位の遺伝子破壊を誘発する段階であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、段階；および
（b）該複数のT細胞に、組換えT細胞受容体（TCR）またはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドを導入する段階であって、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、段階
により作製される、態様117〜120のいずれかの組成物。
122.  組換え受容体またはその抗原結合断片の発現および/または抗原結合が、該組成物中の細胞をTCRα鎖またはTCRβ鎖に特異的な結合試薬と接触させ、該試薬の細胞への結合を測定することによって評価される、態様117〜121のいずれかの組成物。
123.  結合試薬が、Vβ鎖またはVα鎖の特定のファミリーを特異的に認識する、抗TCR Vβ抗体または抗TCR Vα抗体である、態様122の組成物。
124.  結合試薬がペプチド抗原-MHC複合体であり、任意で四量体である、態様122の組成物。
125.  1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、態様121〜124のいずれかの組成物。
126.  1つまたは複数の作用物質の少なくとも1つが、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、態様121〜125のいずれかの組成物。
127.  1つまたは複数の作用物質が、TRAC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質と、TRBC遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる少なくとも1つの作用物質とを含む、態様121〜126のいずれかの組成物。
128.  TRBC遺伝子が、T細胞受容体β定常部1（TRBC1）遺伝子またはT細胞受容体β定常部2（TRBC2）遺伝子の一方または両方である、態様117〜127のいずれかの組成物。
129.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質が、標的部位に特異的に結合するかまたはハイブリダイズするDNA結合タンパク質またはDNA結合核酸を含む、態様121〜128のいずれかの組成物。
130.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質が、（a）DNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼを含む融合タンパク質、または（b）RNA誘導型ヌクレアーゼを含む、態様129の組成物。
131.  DNAターゲティングタンパク質またはRNA誘導型ヌクレアーゼが、ジンクフィンガータンパク質（ZFP）、TALタンパク質、または標的部位に特異的なCRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid-associated nuclease）を含む、態様130の組成物。
132.  1つまたは複数の作用物質が、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせを含む、態様129〜131のいずれかの組成物。
133.  1つまたは複数の作用物質のそれぞれが、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む、態様121〜132のいずれかの組成物。
134.  1つまたは複数の作用物質が、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体として導入される、態様133の組成物。
135.  RNPが、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞圧縮または細胞スクイージングを介して導入される、態様134の組成物。
136.  RNPがエレクトロポレーションを介して導入される、態様134または態様135の組成物。
137.  1つまたは複数の作用物質が、gRNAおよび/またはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドとして導入される、態様121〜132のいずれかの組成物。
138.  少なくとも1つの標的部位がTRAC、TRBC1および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、態様121〜137のいずれかの組成物。
139.  gRNAが、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000051
から選択される配列を含む、態様133〜138のいずれかの組成物。
140.  gRNAが配列：GAGAAUCAAAAUCGGUGAAU (SEQ ID NO:31)を含むターゲティングドメインを有する、態様139の組成物。
141.  gRNAが、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000052
2021520202.tif 000053
から選択される配列を含む、態様133〜140のいずれかの組成物。
142.  gRNAが配列：
2021520202.tif 000054
を含むターゲティングドメインを有する、態様141の組成物。
143.  鋳型ポリヌクレオチドが構造［5'相同性アーム］-［導入遺伝子］-［3'相同性アーム］を含む、態様121〜142のいずれかの組成物。
144.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、態様143の組成物。
145.  5'相同性アームが、標的部位の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様143または態様144の組成物。
146.  3'相同性アームが、標的部位の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様143または態様144の組成物。
147.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下である、態様143〜146のいずれかの組成物。
148.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000ヌクレオチドである、態様147の組成物。
149.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、100〜1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチド、または約100〜1000ヌクレオチド、約100〜750ヌクレオチド、約100〜600ヌクレオチド、約100〜400ヌクレオチド、約100〜300ヌクレオチド、約100〜200ヌクレオチド、約200〜1000ヌクレオチド、約200〜750ヌクレオチド、約200〜600ヌクレオチド、約200〜400ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜1000ヌクレオチド、約300〜750ヌクレオチド、約300〜600ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜1000ヌクレオチド、約400〜750ヌクレオチド、約400〜600ヌクレオチド、約600〜1000ヌクレオチド、約600〜750ヌクレオチド、または約750〜1000ヌクレオチドである、態様148の組成物。
150.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様117〜149のいずれかの組成物。
151.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様117〜150のいずれかの組成物。
152.  前記組成物が、該免疫細胞に、1つまたは複数の第2の導入遺伝子を含む1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドをさらに導入することによって作製され、第2の導入遺伝子が、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様117〜151のいずれかの組成物。
153.  第2の鋳型ポリヌクレオチドが構造［第2の5'相同性アーム］-［1つまたは複数の第2の導入遺伝子］-［第2の3'相同性アーム］を含む、態様152の組成物。
154.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、態様153の組成物。
155.  第2の5'相同性アームが、標的部位の第2の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様153または態様154の組成物。
156.  第2の3'相同性アームが、標的部位の第2の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様153または態様154の組成物。
157.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下である、態様153〜156のいずれかの組成物。
158.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、独立して、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000ヌクレオチドである、態様157の組成物。
159.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、独立して、100〜1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチド、または約100〜1000ヌクレオチド、約100〜750ヌクレオチド、約100〜600ヌクレオチド、約100〜400ヌクレオチド、約100〜300ヌクレオチド、約100〜200ヌクレオチド、約200〜1000ヌクレオチド、約200〜750ヌクレオチド、約200〜600ヌクレオチド、約200〜400ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜1000ヌクレオチド、約300〜750ヌクレオチド、約300〜600ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜1000ヌクレオチド、約400〜750ヌクレオチド、約400〜600ヌクレオチド、約600〜1000ヌクレオチド、約600〜750ヌクレオチド、または約750〜1000ヌクレオチドである、態様158の組成物。
160.  1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様152〜159のいずれかの組成物。
161.  1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様152〜160のいずれかの組成物。
162.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によってはターゲティングされない1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様152〜161のいずれかの組成物。
163.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様152〜162のいずれかの組成物。
164.  1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体（CSR）、またはコレセプターから選択される分子をコードする、態様152〜163のいずれかの組成物。
165.  コードされた分子が、4-1BBL、OX40L、CD70、LIGHTおよびCD30Lから選択される腫瘍壊死因子（TNF）リガンド、またはCD80およびCD86から選択される免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーリガンドの中から任意で選択される共刺激リガンドである、態様164の組成物。
166.  コードされた分子が、IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-12、IL-7、IL-15、IL-21、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFN-α）、インターフェロンβ（IFN-β）またはインターフェロンγ（IFN-γ）、およびエリスロポエチンの中から任意で選択されるサイトカインである、態様164の組成物。
167.  コードされた分子が、CD47、PD-1、CTLA-4およびそれらのリガンドまたはCD28、OX-40、4-1BBおよびそれらのリガンドから選択される免疫抑制作用または免疫刺激作用を有するポリペプチドに任意で結合する、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）である、態様164の組成物。
168.  コードされた分子が、
（a）CD200R、SIRPα、CD279 (PD-1)、CD2、CD95 (Fas)、CD152 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD272 (BTLA)、A2aR、KIR、TIM3、CD300またはLPA5に由来する抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；
（b）CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD47、CD79A、CD79B、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)、CARD11、DAP10、DAP12、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRFM、Zap70、PTCH2、またはそれらの任意の組み合わせに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン；および
（c）CD2、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CD80、CD86、CD95 (Fas)、CD134 (OX40)、CD137 (4-1BB)、CD150 (SLAMF1)、CD152 (CTLA4)、CD200R、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD272 (BTLA)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、CD279 (PD-1)、CD300、CD357 (GITR)、A2aR、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、GAL9、KIR、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PTCH2、ROR2、Ryk、Slp76、SIRPα、pTα、TCRα、TCRβ、TIM3、TRIM、LPA5またはZap70に由来する疎水性膜貫通ドメイン；
を任意で含む、免疫調節融合タンパク質である、態様164の組成物。
169.  コードされた分子が、PD1のトランケート型細胞外ドメインと、CD28の膜貫通および細胞質シグナル伝達ドメインを任意で含む、キメラスイッチ受容体（CSR）である、態様164の組成物。
170.  コードされた分子が、CD4またはCD8から任意で選択されるコレセプターである、態様164の組成物。
171.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が組換えTCRの1つの鎖をコードし、第2の導入遺伝子が該組換えTCRの異なる鎖をコードする、態様152〜163のいずれかの組成物。
172.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が組換えTCRのα（TCRα）鎖をコードし、第2の導入遺伝子が組換えTCRのβ（TCRβ）鎖をコードする、態様171の組成物。
173.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、調節または制御エレメントをさらに含む、態様117〜172のいずれかの組成物。
174.  調節または制御エレメントが、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、スプライスアクセプター配列またはスプライスドナー配列を含む、態様173の組成物。
175.  調節または制御エレメントがプロモーターを含む、態様174の組成物。
176.  プロモーターが構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターおよび/または組織特異的プロモーターの中から選択される、態様175の組成物。
177.  プロモーターがRNA pol I、pol II、またはpol IIIプロモーターの中から選択される、態様175または態様176の組成物。
178.  プロモーターが、
U6もしくはH1プロモーターであるpol IIIプロモーター；または
CMV、SV40初期領域もしくはアデノウイルス主要後期プロモーターであるpol IIプロモーター；
から選択される、態様177の組成物。
179.  プロモーターがヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーターもしくはMNDプロモーターまたはその変異体であるか、またはそれを含む、態様175〜177のいずれかの組成物。
180.  プロモーターが誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである、態様175〜177のいずれかの組成物。
181.  プロモーターが、Lacオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列もしくはドキシサイクリンオペレーター配列を含むか、またはその類似体であるか、またはLacリプレッサー、テトラサイクリンリプレッサーもしくはその類似体によって結合または認識されることが可能である、態様180の組成物。
182.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントを含む、態様108〜181のいずれかの組成物。
183.  1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子の上流にある、態様182の組成物。
184.  マルチシストロン性エレメントが、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子と、1つまたは複数の第2の導入遺伝子との間に配置される、態様182または態様183の組成物。
185.  マルチシストロン性エレメントが、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される、態様182〜184のいずれかの組成物。
186.  マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む、態様182〜185のいずれかの組成物。
187.  リボソームスキップエレメントをコードする配列が、標的部位の遺伝子とインフレームになるようにターゲティングされる、態様186の組成物。
188.  HDRの際に、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、標的部位の遺伝子の内因性プロモーターに機能的に連結される、態様117〜172のいずれかの組成物。
189.  組換えTCRが、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に関連する、特異的である、および/または発現される抗原に結合することができる、態様117〜188のいずれかの組成物。
190.  疾患、障害または症状が感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である、態様189の組成物。
191.  抗原が腫瘍抗原または病原性抗原である、態様189または態様190の組成物。
192.  病原性抗原が細菌抗原またはウイルス抗原である、態様191の組成物。
193.  抗原がウイルス抗原であり、ウイルス抗原が、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス感染症、エプスタインバーウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス8型（HHV-8）、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）、ヒトT細胞白血病ウイルス2型（HTLV-2）、またはサイトメガロウイルス（CMV）に由来する、態様192の組成物。
194.  抗原がHPV-16、HPV-18、HPV-31、HPV-33およびHPV-35の中から選択されるHPV由来の抗原である、態様193の組成物。
195.  抗原がHPV-16 E6またはHPV-16 E7抗原であるHPV-16抗原である、態様194の組成物。
196.  ウイルス抗原が、エプスタインバー核抗原（EBNA）-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNAリーダータンパク質（EBNA-LP）、潜在膜タンパク質LMP-1、LMP-2AおよびLMP-2B、EBV-EA、EBV-MAおよびEBV-VCAの中から選択されるEBV抗原である、態様192の組成物。
197.  ウイルス抗原が、TAXであるHTLV抗原である、態様192の組成物。
198.  ウイルス抗原が、B型肝炎コア抗原またはB型肝炎エンベロープ抗原であるHBV抗原である、態様192の組成物。
199.  抗原が腫瘍抗原である、態様189〜191のいずれかの組成物。
200.  抗原が、神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2 (AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、メランA/MART-1、WT-1、S-100、MBP、CD63、MUC1（例：MUC1-8）、p53、Ras、サイクリンB1、HER-2/neu、癌胎児性抗原（CEA）、gp100、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A11、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-C1、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）、β-カテニン、NY-ESO-1、LAGE-1a、PP1、MDM2、MDM4、EGVFvIII、Tax、SSX2、テロメラーゼ、TARP、pp65、CDK4、ビメンチン、S100、eIF-4A1、IFN誘導性p78、メラノトランスフェリン（p97）、ウロプラキンII、前立腺特異抗原（PSA）、ヒトカリクレイン（huK2）、前立腺特異膜抗原（PSM）、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、好中球エラスターゼ、エフリンB2、BA-46、Bcr-abl、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、カスパーゼ8、FRa、CD24、CD44、CD133、CD 166、epCAM、CA-125、HE4、Oval、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、uPA、PAI-1、CD19、CD20、CD22、ROR1、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、グリコリピドF77、GD-2、インスリン成長因子（IGF）-I、IGF-II、IGF-I受容体、およびメソテリンの中から選択される、態様199の組成物。
201.  T細胞がCD8+ T細胞またはそのサブタイプである、態様1173〜200のいずれかの組成物。
202.  T細胞がCD4+ T細胞またはそのサブタイプである、態様117〜200のいずれかの組成物。
203.  T細胞が対象の自己細胞である、態様117〜202のいずれかの組成物。
204.  T細胞が対象に対して同種異系である、態様117〜202のいずれかの組成物。
205.  第1の鋳型ポリヌクレオチド、1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチド、ならびに/またはgRNAおよび/もしくはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドが、1つまたは複数のベクターに含まれ、該ベクターが任意でウイルスベクターである、態様117〜204のいずれかの組成物。
206.  ベクターがAAVベクターである、態様205の組成物。
207.  AAVベクターがAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7またはAAV8ベクターの中から選択される、態様206の組成物。
208.  AAVベクターがAAV2またはAAV6ベクターである、態様207の組成物。
209.  ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、態様205の組成物。
210.  ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、態様209の組成物。
211.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入、および鋳型ポリヌクレオチドの導入が、同時に、または任意の順序で連続して行われる、態様117〜210のいずれかの組成物。
212.  鋳型ポリヌクレオチドの導入が、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入後に行われる、態様117〜211のいずれかの組成物。
213.  鋳型ポリヌクレオチドが、遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入直後に、または導入後約30秒、1分、2分、3分、4分、5分、6分、6分、8分、9分、10分、15分、20分、30分、40分、50分、60分、90分、2時間、3時間もしくは4時間以内に導入される、態様212の組成物。
214.  鋳型ポリヌクレオチドの導入と、1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドの導入が、同時に、または任意の順序で連続して行われる、態様152〜213のいずれかの組成物。
215.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドの導入が、1つの実験反応で行われる、態様117〜214のいずれかの組成物。
216.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質の導入と、鋳型ポリヌクレオチドおよび第2の鋳型ポリヌクレオチドの導入が、1つの実験反応で行われる、態様152〜215のいずれかの組成物。
217.  薬学的に許容される担体をさらに含有する、態様108〜216のいずれかの組成物。
218.  態様107〜216のいずれかの改変細胞、複数の改変細胞または組成物を対象に投与する段階を含む、治療方法。
219.  癌を治療するための、態様107〜216のいずれかの改変細胞、複数の改変細胞または組成物の使用。
220.  癌治療用の医薬の製造における、態様107〜216のいずれかの改変細胞、複数の改変細胞または組成物の使用。
221.  癌の治療に使用するための、態様107〜216のいずれかの改変細胞、複数の改変細胞または組成物。
222.  以下を含むキット：
1つまたは複数の作用物質であって、該1つまたは複数の作用物質のそれぞれは、独立して、T細胞受容体α定常部（TRAC）遺伝子および/またはT細胞受容体β定常部（TRBC）遺伝子内の標的部位の遺伝子破壊を誘発することができる、作用物質；および
組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子を含む鋳型ポリヌクレオチドであって、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子は、相同組換え修復（HDR）を介して、標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、鋳型ポリヌクレオチド。
223.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質が、標的部位に特異的に結合またはハイブリダイズするDNA結合タンパク質またはDNA結合核酸を含む、態様222のキット。
224.  遺伝子破壊を誘発することができる1つまたは複数の作用物質が、（a）DNAターゲティングタンパク質とヌクレアーゼを含む融合タンパク質、または（b）RNA誘導型ヌクレアーゼを含む、態様223のキット。
225.  DNAターゲティングタンパク質またはRNA誘導型ヌクレアーゼが、ジンクフィンガータンパク質（ZFP）、TALタンパク質、または標的部位に特異的なCRISPR-Cas（clustered regularly interspaced short palindromic nucleic acid-associated nuclease）を含む、態様224のキット。
226.  1つまたは複数の作用物質が、標的部位に特異的に結合するか、認識するか、またはハイブリダイズするジンクフィンガーヌクレアーゼ（ZFN）、TALエフェクターヌクレアーゼ（TALEN）、またはCRISPR-Cas9の組み合わせを含む、態様222〜225のいずれかのキット。
227.  1つまたは複数の作用物質のそれぞれが、少なくとも1つの標的部位に相補的なターゲティングドメインを有するガイドRNA（gRNA）を含む、態様222〜226のいずれかのキット。
228.  1つまたは複数の作用物質が、gRNAとCas9タンパク質とを含むリボヌクレオタンパク質（RNP）複合体として導入される、態様227のキット。
229.  RNPが、エレクトロポレーション、パーティクルガン、リン酸カルシウムトランスフェクション、細胞圧縮または細胞スクイージングを介して導入される、態様228のキット。
230.  RNPがエレクトロポレーションを介して導入される、態様228または態様229のキット。
231.  1つまたは複数の作用物質が、gRNAおよび/またはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドとして導入される、態様222〜230のいずれかのキット。
232.  少なくとも1つの標的部位がTRAC、TRBC1および/またはTRBC2遺伝子のエクソン内にある、態様222〜231のいずれかのキット。
233.  gRNAが、TRAC遺伝子内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000055
から選択される配列を含む、態様227〜232のいずれかのキット。
234.  gRNAが配列：
2021520202.tif 000056
を含むターゲティングドメインを有する、態様233のキット。
235.  gRNAが、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位に相補的なターゲティングドメインを有し、以下：
2021520202.tif 000057
2021520202.tif 000058
から選択される配列を含む、態様227〜234のいずれかのキット。
236.  gRNAが配列：
2021520202.tif 000059
を含むターゲティングドメインを有する、態様235のキット。
237.  鋳型ポリヌクレオチドが構造［5'相同性アーム］-［導入遺伝子］-［3'相同性アーム］を含む、態様222〜236のいずれかのキット。
238.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、態様237のキット。
239.  5'相同性アームが、標的部位の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様237または態様238のキット。
240.  3'相同性アームが、標的部位の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様237または態様238のキット。
241.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下である、態様237〜240のいずれかのキット。
242.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000ヌクレオチドである、態様241のキット。
243.  5'相同性アームおよび3'相同性アームが、独立して、100〜1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチド、または約100〜1000ヌクレオチド、約100〜750ヌクレオチド、約100〜600ヌクレオチド、約100〜400ヌクレオチド、約100〜300ヌクレオチド、約100〜200ヌクレオチド、約200〜1000ヌクレオチド、約200〜750ヌクレオチド、約200〜600ヌクレオチド、約200〜400ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜1000ヌクレオチド、約300〜750ヌクレオチド、約300〜600ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜1000ヌクレオチド、約400〜750ヌクレオチド、約400〜600ヌクレオチド、約600〜1000ヌクレオチド、約600〜750ヌクレオチド、または約750〜1000ヌクレオチドである、態様242のキット。
244.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様222〜243のいずれかのキット。
245.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRBC1遺伝子とTRBC2遺伝子の一方または両方内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様222〜244のいずれかのキット。
246.  1つまたは複数の第2の導入遺伝子を含む1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチドをさらに含み、第2の導入遺伝子が、相同組換え修復（HDR）を介して、少なくとも1つの標的部位の1つに、またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様222〜245のいずれかのキット。
247.  第2の鋳型ポリヌクレオチドが構造［第2の5'相同性アーム］-［1つまたは複数の第2の導入遺伝子］-［第2の3'相同性アーム］を含む、態様246のキット。
248.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、少なくとも1つの標的部位周辺の核酸配列に相同な核酸配列を含む、態様247のキット。
249.  第2の5'相同性アームが、標的部位の第2の5'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様247または態様248のキット。
250.  第2の3'相同性アームが、標的部位の第2の3'側の核酸配列に相同である核酸配列を含む、態様247または態様248のキット。
251.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、独立して、少なくとも10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または少なくとも約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド、または10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下、または約10、20、30、40、50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、もしくは2000ヌクレオチド以下である、態様247〜250のいずれかのキット。
252.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、独立して、約50〜100、100〜250、250〜500、500〜750、750〜1000、1000〜2000ヌクレオチドである、態様251のキット。
253.  第2の5'相同性アームおよび第2の3'相同性アームが、独立して、100〜1000ヌクレオチド、100〜750ヌクレオチド、100〜600ヌクレオチド、100〜400ヌクレオチド、100〜300ヌクレオチド、100〜200ヌクレオチド、200〜1000ヌクレオチド、200〜750ヌクレオチド、200〜600ヌクレオチド、200〜400ヌクレオチド、200〜300ヌクレオチド、300〜1000ヌクレオチド、300〜750ヌクレオチド、300〜600ヌクレオチド、300〜400ヌクレオチド、400〜1000ヌクレオチド、400〜750ヌクレオチド、400〜600ヌクレオチド、600〜1000ヌクレオチド、600〜750ヌクレオチド、または750〜1000ヌクレオチド、または約100〜1000ヌクレオチド、約100〜750ヌクレオチド、約100〜600ヌクレオチド、約100〜400ヌクレオチド、約100〜300ヌクレオチド、約100〜200ヌクレオチド、約200〜1000ヌクレオチド、約200〜750ヌクレオチド、約200〜600ヌクレオチド、約200〜400ヌクレオチド、約200〜300ヌクレオチド、約300〜1000ヌクレオチド、約300〜750ヌクレオチド、約300〜600ヌクレオチド、約300〜400ヌクレオチド、約400〜1000ヌクレオチド、約400〜750ヌクレオチド、約400〜600ヌクレオチド、約600〜1000ヌクレオチド、約600〜750ヌクレオチド、または約750〜1000ヌクレオチドである、態様252のキット。
254.  1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様246〜253のいずれかのキット。
255.  1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様246〜253のいずれかのキット。
256.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子、TRBC1遺伝子またはTRBC2遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子によってはターゲティングされない1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様246〜255のいずれかのキット。
257.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が、TRAC遺伝子内の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされ、かつ1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、TRBC1遺伝子および/またはTRBC2遺伝子内の1つまたは複数の標的部位またはその近傍に組み込まれるようにターゲティングされる、態様246〜256のいずれかのキット。
258.  1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、共刺激リガンド、サイトカイン、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）、免疫調節融合タンパク質、キメラスイッチ受容体（CSR）、またはコレセプターから選択される分子をコードする、態様246〜257のいずれかのキット。
259.  コードされた分子が、4-1BBL、OX40L、CD70、LIGHTおよびCD30Lから選択される腫瘍壊死因子（TNF）リガンド、またはCD80およびCD86から選択される免疫グロブリン（Ig）スーパーファミリーリガンドの中から任意で選択される共刺激リガンドである、態様258のキット。
260.  コードされた分子が、IL-2、IL-3、IL-6、IL-11、IL-30、IL-7、IL-24、IL-30、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（GM-CSF）、インターフェロンα（IFN-α）、インターフェロンβ（IFN-β）またはインターフェロンγ（IFN-γ）、およびエリスロポエチンの中から任意で選択されるサイトカインである、態様258のキット。
261.  コードされた分子が、CD47、PD-1、CTLA-4およびそれらのリガンドまたはCD28、OX-40、4-1BBおよびそれらのリガンドから選択される免疫抑制作用または免疫刺激作用を有するポリペプチドに任意で結合する、可溶性一本鎖可変フラグメント（scFv）である、態様258のキット。
262.  コードされた分子が、
（a）CD290R、SIRPα、CD279 (PD-1)、CD2、CD95 (Fas)、CD242 (CTLA4)、CD223 (LAG3)、CD272 (BTLA)、A2aR、KIR、TIM3、CD300またはLPA5に由来する抗原に特異的に結合する細胞外結合ドメイン；
（b）CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD47、CD79A、CD79B、CD224 (OX40)、CD227(4-1BB)、CD240(SLAMF1)、CD278 (ICOS)、CD357 (GITR)、CARD11、DAP10、DAP30、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、ROR2、Ryk、Slp76、pTα、TCRα、TCRβ、TRFM、Zap70、PTCH2、またはそれらの任意の組み合わせに由来する細胞内シグナル伝達ドメイン；および
（c）CD2、CD3ε、CD3δ、CD3ζ、CD25、CD27、CD28、CD40、CD79A、CD79B、CD80、CD86、CD95 (Fas)、CD224 (OX40)、CD227 (4-1BB)、CD240 (SLAMF1)、CD242 (CTLA4)、CD290R、CD223 (LAG3)、CD270 (HVEM)、CD272 (BTLA)、CD273 (PD-L2)、CD274 (PD-L1)、CD278 (ICOS)、CD279 (PD-1)、CD300、CD357 (GITR)、A2aR、DAP10、FcRα、FcRβ、FcRγ、Fyn、GAL9、KIR、Lck、LAT、LRP、NKG2D、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、PTCH2、ROR2、Ryk、Slp76、SIRPα、pTα、TCRα、TCRβ、TIM3、TRIM、LPA5またはZap70に由来する疎水性膜貫通ドメイン；
を任意で含む、免疫調節融合タンパク質である、態様258のキット。
263.  コードされた分子が、PD1のトランケート型細胞外ドメインと、CD28の膜貫通および細胞質シグナル伝達ドメインを任意で含む、キメラスイッチ受容体（CSR）である、態様258のキット。
264.  コードされた分子が、CD4またはCD8から任意で選択されるコレセプターである、態様258のキット。
265.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が組換えTCRの1つの鎖をコードし、第2の導入遺伝子が該組換えTCRの異なる鎖をコードする、態様246〜257のいずれかのキット。
266.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子が組換えTCRのα（TCRα）鎖をコードし、第2の導入遺伝子が組換えTCRのβ（TCRβ）鎖をコードする、態様265のキット。
267.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、調節または制御エレメントをさらに含む、態様222〜266のいずれかのキット。
268.  調節または制御エレメントが、プロモーター、エンハンサー、イントロン、ポリアデニル化シグナル、コザックコンセンサス配列、スプライスアクセプター配列またはスプライスドナー配列を含む、態様267のキット。
269.  調節または制御エレメントがプロモーターを含む、態様268のキット。
270.  プロモーターが構成的プロモーター、誘導性プロモーター、抑制性プロモーターおよび/または組織特異的プロモーターの中から選択される、態様269のキット。
271.  プロモーターがRNA pol I、pol II、またはpol IIIプロモーターの中から選択される、態様269または態様270のキット。
272.  プロモーターが、
U6もしくはH1プロモーターであるpol IIIプロモーター；または
CMV、SV40初期領域もしくはアデノウイルス主要後期プロモーターであるpol IIプロモーター；
から選択される、態様271のキット。
273.  プロモーターがヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーターもしくはMNDプロモーターまたはその変異体であるか、またはそれを含む、態様269〜271のいずれかのキット。
274.  プロモーターが誘導性プロモーターまたは抑制性プロモーターである、態様269〜271のいずれかのキット。
275.  プロモーターが、Lacオペレーター配列、テトラサイクリンオペレーター配列、ガラクトースオペレーター配列もしくはドキシサイクリンオペレーター配列を含むか、またはその類似体であるか、またはLacリプレッサー、テトラサイクリンリプレッサーもしくはその類似体によって結合または認識されることが可能である、態様274のキット。
276.  組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントを含む、態様222〜275のいずれかのキット。
277.  1つまたは複数のマルチシストロン性エレメントが、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子の上流にある、態様276のキット。
278.  マルチシストロン性エレメントが、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子と、1つまたは複数の第2の導入遺伝子との間に配置される、態様276または態様277のキット。
279.  マルチシストロン性エレメントが、TCRαまたはその一部をコードする核酸配列と、TCRβまたはその一部をコードする核酸配列との間に配置される、態様276〜278のいずれかのキット。
280.  マルチシストロン性エレメントが、T2A、P2A、E2AもしくはF2Aの中から選択されるリボソームスキップエレメント、または配列内リボソーム進入部位（IRES）をコードする配列を含む、態様276〜279のいずれかのキット。
281.  リボソームスキップエレメントをコードする配列が、標的部位の遺伝子とインフレームになるようにターゲティングされる、態様280のキット。
282.  HDRの際に、組換えTCRまたはその抗原結合断片もしくは鎖をコードする導入遺伝子および/または1つまたは複数の第2の導入遺伝子が、独立して、標的部位の遺伝子の内因性プロモーターに機能的に連結される、態様222〜266のいずれかのキット。
283.  組換えTCRが、疾患、障害または症状の細胞もしくは組織に関連する、特異的である、および/または発現される抗原に結合することができる、態様222〜282のいずれかのキット。
284.  疾患、障害または症状が感染性疾患もしくは障害、自己免疫疾患、炎症性疾患、または腫瘍もしくは癌である、態様283のキット。
285.  抗原が腫瘍抗原または病原性抗原である、態様283または態様284のキット。
286.  病原性抗原が細菌抗原またはウイルス抗原である、態様285のキット。
287.  抗原がウイルス抗原であり、ウイルス抗原が、A型肝炎、B型肝炎、C型肝炎ウイルス（HCV）、ヒトパピローマウイルス（HPV）、肝炎ウイルス感染症、エプスタインバーウイルス（EBV）、ヒトヘルペスウイルス8型（HHV-8）、ヒトT細胞白血病ウイルス1型（HTLV-1）、ヒトT細胞白血病ウイルス2型（HTLV-2）、またはサイトメガロウイルス（CMV）に由来する、態様286のキット。
288.  抗原がHPV-25、HPV-27、HPV-31、HPV-33およびHPV-35の中から選択されるHPV由来の抗原である、態様287のキット。
289.  抗原がHPV-25 E6またはHPV-25 E7抗原であるHPV-25抗原である、態様288のキット。
290.  ウイルス抗原が、エプスタインバー核抗原（EBNA）-1、EBNA-2、EBNA-3A、EBNA-3B、EBNA-3C、EBNAリーダータンパク質（EBNA-LP）、潜在膜タンパク質LMP-1、LMP-2AおよびLMP-2B、EBV-EA、EBV-MAおよびEBV-VCAの中から選択されるEBV抗原である、態様286のキット。
291.  ウイルス抗原が、TAXであるHTLV抗原である、態様286のキット。
292.  ウイルス抗原が、B型肝炎コア抗原またはB型肝炎エンベロープ抗原であるHBV抗原である、態様286のキット。
293.  抗原が腫瘍抗原である、態様283〜285のいずれかのキット。
294.  抗原が、神経膠腫関連抗原、β-ヒト絨毛性ゴナドトロピン、αフェトプロテイン（AFP）、レクチン反応性AFP、サイログロブリン、RAGE-1、MN-CA IX、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素、RU1、RU2 (AS)、腸カルボキシルエステラーゼ、mut hsp70-2、M-CSF、メランA/MART-1、WT-1、S-100、MBP、CD63、MUC1（例：MUC1-8）、p53、Ras、サイクリンB1、HER-2/neu、癌胎児性抗原（CEA）、gp100、MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A11、MAGE-B1、MAGE-B2、MAGE-B3、MAGE-B4、MAGE-C1、BAGE、GAGE-1、GAGE-2、pl5、チロシナーゼ、チロシナーゼ関連タンパク質1（TRP-1）、チロシナーゼ関連タンパク質2（TRP-2）、β-カテニン、NY-ESO-1、LAGE-1a、PP1、MDM2、MDM4、EGVFvIII、Tax、SSX2、テロメラーゼ、TARP、pp65、CDK4、ビメンチン、S100、eIF-4A1、IFN誘導性p78、メラノトランスフェリン（p97）、ウロプラキンII、前立腺特異抗原（PSA）、ヒトカリクレイン（huK2）、前立腺特異膜抗原（PSM）、前立腺酸性ホスファターゼ（PAP）、好中球エラスターゼ、エフリンB2、BA-46、Bcr-abl、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、カスパーゼ8、FRa、CD24、CD44、CD223、CD256、epCAM、CA-224、HE4、Oval、エストロゲン受容体、プロゲステロン受容体、uPA、PAI-1、CD28、CD29、CD22、ROR1、CD33/IL3Ra、c-Met、PSMA、グリコリピドF77、GD-2、インスリン成長因子（IGF）-I、IGF-II、IGF-I受容体、およびメソテリンの中から選択される、態様293のキット。
295.  第1の鋳型ポリヌクレオチド、1つまたは複数の第2の鋳型ポリヌクレオチド、ならびに/またはgRNAおよび/もしくはCas9タンパク質をコードする1つまたは複数のポリヌクレオチドが、1つまたは複数のベクターに含まれ、該ベクターが任意でウイルスベクターである、態様222〜294のいずれかのキット。
296.  ベクターがAAVベクターである、態様295のキット。
297.  AAVベクターがAAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7またはAAV8ベクターの中から選択される、態様296のキット。
298.  AAVベクターがAAV2またはAAV6ベクターである、態様297のキット。
299.  ウイルスベクターがレトロウイルスベクターである、態様295のキット。
300.  ウイルスベクターがレンチウイルスベクターである、態様299のキット。
【実施例】
【０８４４】
X.実施例
以下の実施例は、例示的な目的のために含まれているに過ぎず、本発明の範囲を限定するためのものではない。
【０８４５】
実施例1：組換えT細胞受容体（TCR）をコードする配列の標的ノックインまたはランダム組み込みによる、TCRを発現する改変されたT細胞の生成および評価
CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集および相同性依存性修復（HDR）を介した遺伝子破壊の部位における標的組み込み、またはレンチウイルス形質導入を介したランダム組み込みによって、T細胞受容体α（TCRα）鎖をコードする内在性遺伝子座における遺伝子破壊と共に、例示的な組換えT細胞受容体（TCR）をコードするポリヌクレオチドを、T細胞に導入した。
【０８４６】
A. 組換えTCR導入遺伝子構築物
2つの例示的な組換えTCRのうちの1つをコードする核酸配列を含有する導入遺伝子の、HDRによる標的組み込みのため、例示的な鋳型ポリヌクレオチドを生成した。例示的な鋳型ポリヌクレオチドの一般構造は、以下の通りであった：[5'相同性アーム]-[導入遺伝子配列]-[3'相同性アーム]。相同性アームは、ヒトTCRα定常領域（TRAC）遺伝子のエクソン1内の標的組み込み部位の周囲の配列に相同な核酸配列のおよそ600bpを含んでいた（SEQ ID NO:124に記載の5'相同性アーム配列；SEQ ID NO:125に記載の3'相同性アーム配列）。
【０８４７】
導入遺伝子は、ヒトパピローマウイルス（HPV）16オンコプロテインE7のエピトープを認識する2つの例示的な組換えTCR（TCR#1およびTCR#2）のうちの1つのα鎖およびβ鎖をコードする核酸配列を含み、ここで、TCRα鎖およびTCRβ鎖をコードする配列は、2Aリボソームスキップ要素によって分離されていた。TCR#1、およびTCR#2の定常領域をコードするヌクレオチド配列は、コドン最適化、ならびに/またはTCRの対合および安定性を増加させるための、TCR定常ドメイン間の界面における非ネイティブジスルフィド結合の形成を促進するための変異によっても修飾されていた。非ネイティブジスルフィド結合は、TCRα鎖定常領域（Cα）領域の残基48においてThrからCysへ、TCRβ鎖定常領域（Cβ）領域の残基57においてSerからCysへ、TCR鎖を修飾することによって促進された（Kuball et al.(2007)Blood,109:2331-2338を参照すること）。
【０８４８】
導入遺伝子は、ヒトTCRα定常領域（TRAC）遺伝子へのインフレームのHDRによる標的組み込みによって、内在性TCRα遺伝子座からの組換えTCRの発現を駆動するため、組換えTCRコード配列の上流に、（a）組換えTCRコード配列の発現を駆動するヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーター（SEQ ID NO:127に記載の配列）；または（b）P2Aリボソームスキップ要素（SEQ ID NO:128に記載の配列）のいずれかも含んでいた。
【０８４９】
HDRによる標的組み込みのため、前記の鋳型ポリヌクレオチドを含有するアデノ随伴ウイルス（AAV）ベクター構築物を生成した。鋳型ポリヌクレオチドを含むAAVベクター、血清型ヘルパープラスミド、およびアデノウイルスヘルパープラスミドの293T細胞株への三重トランスフェクションによって、AAVストックを作製した。トランスフェクトされた細胞を収集し、溶解し、AAVストックを細胞の形質導入のため収集した。
【０８５０】
対照として、ランダム組み込みのため、前記の例示的な組換えTCR導入遺伝子構築物をコードする核酸配列、またはHPV 16 E7に結合することができるがマウスのCα領域およびCβ領域を含有する参照TCRをコードする配列を、EF1αプロモーターの調節下で、例示的なHIV-1由来レンチウイルスベクターに組み入れた。得られたベクター、（gagpolプラスミドおよびrevプラスミドを含有する）ヘルパープラスミド、ならびにシュードタイピングプラスミドによって、HEK-293T細胞を一過性トランスフェクトすることによって、標準的な手法によって、シュードタイピングされたレンチウイルスベクター粒子を作製し、細胞を形質導入するために使用した。
【０８５１】
B. 改変T細胞の生成
2人の異なるヒトドナーに由来する初代ヒトCD4+T細胞および初代ヒトCD8+T細胞を、健常ドナーから得られたヒト末梢血単核細胞（PBMC）から、イムノアフィニティに基づく選択によって単離した。（TCR#1のための）CD8+細胞または（TCR#2のための）1:1比で組み合わせられたCD4+細胞およびCD8+細胞を、ヒト血清、IL-2、IL-7、およびIL-15を含有する培地において、1:1のビーズ:細胞比で、抗CD3/抗CD28試薬と共に培養することによって、37℃で72時間刺激した。CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集によって内在性TRAC遺伝子座における遺伝子破壊を導入するため、抗CD3/抗CD28試薬を除去し、化膿性連鎖球菌（Streptococcus pyogenes）Cas9、および内在性TCRα定常領域（TRAC）遺伝子のエクソン1内に遺伝子破壊をターゲティングするターゲティングドメイン配列
2021520202.tif 000060
を含むガイドRNA（gRNA）を含有する2μMリボ核タンパク質（RNP）複合体によって、細胞にエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、形質導入のため、EF1αプロモーターの調節下で例示的な組換えTCRをコードするHDR鋳型ポリヌクレオチドを含有するAAV調製物を含有する培地と、細胞を混合した（HDR KO）。対照として、エレクトロポレーションのために使用された同一の条件の下で、但し、RNPの添加なしに、細胞を処理するか（モックKO）、組換えTCR（レンチ）、もしくはHPV 16 E7に結合することができるがマウスのCα領域およびCβ領域を含有する参照TCR（レンチ参照）をコードするレンチウイルスベクターによって形質導入するか、または組換えTCRをコードするレンチウイルスベクターによって形質導入し、TRAC遺伝子座に遺伝子破壊をターゲティングするRNP複合体によってもエレクトロポレーションを行った（レンチKO）。形質導入後、ヒト血清ならびにIL-2、IL-7、およびIL-15を含有する培地において、およそ7日間、細胞を培養した。
【０８５２】
C. TCRの発現
エレクトロポレーション後7日目に、抗CD3抗体、抗CD4抗体、抗CD8抗体、組換えTCRの各々に特異的な抗Vβ抗体、およびHPV16 E7ペプチドと複合体を形成したペプチド-MHC四量体による染色について、フローサイトメトリーによって細胞を評価した。
【０８５３】
TCR#1発現CD8+細胞についての結果は、図1A〜1Cに示される。示されるように、TRAC遺伝子座におけるHDRによる標的組み込みによってTCR#1を発現する細胞は、四量体が結合する細胞の最も高い割合（図1A）、およびCD8+細胞における四量体染色の最も高い平均蛍光強度（図1B）を示した。四量体が結合するCD8+細胞の中で、四量体による結合の程度は、より低い変動係数（細胞の集団におけるシグナルの標準偏差をそれぞれの集団におけるシグナルの平均値で割ったもの；図1Cを参照すること）によって示されるように、レンチウイルス形質導入によるランダム組み込みと比較して、HDR媒介組み込みに供された細胞において、概して、より均一であった。TCR#2発現細胞についての結果は、図2A〜2Bに示される。示されるように、TRAC遺伝子座におけるHDR媒介組み込みによってTCR#2を発現するCD4+細胞およびCD8+細胞は、四量体が結合する細胞の最も高い割合（図2A）および四量体染色の最も高い平均蛍光強度（図2B）を示した。
【０８５４】
D. 細胞溶解活性およびサイトカイン産生
前記のHDRまたはランダム組み込みによって組換えTCR#1または組換えTCR#2を発現するよう改変された細胞の細胞溶解活性およびサイトカイン産生を、HPV 16 E7を発現する標的細胞と共にインビトロでインキュベートした後に、評価した。
【０８５５】
10:1、5:1、および2.5:1のエフェクター標的（E:T）比で、組換えTCR発現エフェクター細胞を、NucLight Red（NLR）によって標識されたHPV 16 E7を発現する標的細胞と共に培養することによって、細胞溶解活性を評価した。共培養の44時間後まで、2時間毎に、標識された標的細胞の喪失を測定することによって、抗原特異的に標的細胞を溶解するT細胞の能力を評価した。死滅（％）の曲線下面積（AUC）の各群2人のドナーからの平均値から、細胞溶解活性を決定し、組換えTCRの各々について、Vβ発現に対してノーマライズし、モック形質導入対照と比較した。組換えTCR発現エフェクター細胞の標的細胞とのインキュベーションの後に、サイトカイン産生を測定した。上清中のインターフェロンγ（IFNγ）およびインターロイキン2（IL-2）の分泌を、ELISAによって決定し、Vβ発現に対してノーマライズし、各群2人のドナーについて平均化した。
【０８５６】
TCR#1についての結果は、図3A〜3Bに示される。死滅およびIFNγ分泌の程度は、TRAC遺伝子座のノックアウトを伴うランダム組み込み（TCR#1レンチ）またはノックアウトを伴わないランダム組み込み（TCR#1レンチKO）と比較して、TRAC遺伝子座におけるHDRによる標的組み込みによって、EF1αプロモーターによって駆動される組換えTCR#1が導入された細胞（EF1α-TCR#1 HDR KO）において、より高かった。
【０８５７】
TCR#2についての例示的な結果は、図4A〜4Gに示される。標的細胞AUCならびに24時間後のIFNγおよびIL-2の分泌は、TRAC遺伝子座のノックアウトを伴うランダム組み込み（TCR#2レンチ）またはノックアウトを伴わないランダム組み込み（TCR#2レンチKO）、およびランダム組み込みによって導入された参照TCR（レンチ参照）と比較して、HDRによる標的組み込みによって、EF1αプロモーターによって駆動される組換えTCR#2が導入された細胞（EF1α-TCR#2 HDR KO）において、類似しているかまたはより高かった（図4A〜4C）。TRAC遺伝子座にHDRによって導入されたTCR#2を発現するCD8+細胞およびCD4+細胞は、TRAC遺伝子座のノックアウトを伴うランダム組み込みまたはノックアウトを伴わないランダム組み込み、およびランダム組み込みによって導入された参照TCRと比較して、標的細胞のより高い死滅を示した（図4D〜4E）。2.5:1のE:T比のCD8+細胞または10:1のE:T比のCD4+細胞によるIFNγ産生は、TRAC遺伝子座におけるHDRまたはランダム組み込みによって導入されたTCR#2を発現する細胞について、類似していることが観察された（図4F〜4G）。
【０８５８】
E. 組換えTCRを発現する細胞の生存率
様々な方法によって導入されたTCR#2を発現するよう改変されたCD4+細胞およびCD8+細胞の生存率を、凍結保存時、および保存された細胞の解凍後に、アクリジンオレンジ（AO）およびヨウ化プロピジウム（PI）染色によって評価した。図5A〜5Bに示されるように、細胞の生存率は、モック処理された細胞または参照TCRを発現する細胞と比較して、HDRによるTCR#2コード配列の導入によって実質的に影響されなかった。
【０８５９】
F. 結論
一般に、結果は、例示的な組換えTCRをコードする核酸配列のHDRによる標的組み込みが、ランダム組み込みによるTCRの導入と比較して、ヒトT細胞におけるヒトTCRのより高い組換えTCR発現をもたらし、それによって、組換えTCRを発現する細胞のより高い機能的活性をもたらすという観察と一致していた。
【０８６０】
実施例2：内在性のTCRα鎖およびTCRβ鎖のノックアウトを伴う、組換えT細胞受容体（TCR）をコードする配列のT細胞における標的ノックインまたはランダム組み込みによる、組換えTCRの生成およびその発現の評価
CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集によって、T細胞受容体α（TCRα）鎖およびβ（TCRβ）鎖またはその両方をコードする内在性遺伝子座を遺伝子破壊するために改変された細胞において、例示的な組換えTCRのうちの1つをコードするポリヌクレオチドを、相同性依存性修復（HDR）を介して、遺伝子破壊の部位のうちの1つへの組み込みのためにターゲティングするか、またはレンチウイルス形質導入を介したランダム組み込みによって導入した。
【０８６１】
HDRによる標的組み込みのため、以下の差異を除き、実施例1に記載されたのと実質的に同様に、例示的な組換えTCR#1をコードする鋳型ポリヌクレオチド構築物を含有するAAV調製物を生成した：組換えTCRコード配列の発現を調節するため、骨髄増殖性肉腫ウイルスエンハンサーと共に修飾型MoMuLV LTRのU3領域を含有する合成プロモーターであるMNDプロモーター（SEQ ID NO:126に記載の配列）を含有する付加的なAAV構築物を生成した。
【０８６２】
ランダム組み込みのため、実施例1に記載されたのと概して同様に、例示的な組換えTCR#1をコードする核酸配列を含有するレンチウイルス調製物を生成した。これらの研究のため、レンチウイルス形質導入構築物は、同一の構築物からの組換えTCRおよび短縮型受容体の両方の発現のため、T2Aリボソームスキップ配列をコードする配列によって、組換えTCR導入遺伝子から分離された、短縮型受容体をコードするポリヌクレオチドをさらに含有した；短縮型受容体は、形質導入についての代理マーカーとして使用するためのものであった。対照として、組換えTCRのCαおよびCβが、マウスTCRに由来する定常領域（SEQ ID NO:122に記載のマウスCα配列；SEQ ID NO:123に記載のマウスCβ配列）に交換されたキメラTCRをコードするポリヌクレオチドを生成するか、または細胞をモック形質導入に供した。
【０８６３】
前記の実施例1Bに記載されたのと概して同様に、初代ヒトCD4+T細胞および初代ヒトCD8+T細胞を単離し、CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集によって内在性のTRAC遺伝子座およびTRBC遺伝子座に遺伝子破壊を導入するために改変し、HDRのための鋳型ポリヌクレオチドを含有するAAV調製物、またはランダム組み込みのためのレンチウイルス調製物によって形質導入した。細胞を、実施例1Bに記載されたTRACを標的とするガイドRNA（gRNA）を含有するリボ核タンパク質（RNP）複合体、ならびに（ターゲティングドメイン配列
2021520202.tif 000061
を含む）TCRβ定常領域1および2の両方のエクソン1に共通のコンセンサス標的部位配列を標的とするgRNAを含有するRNPによってエレクトロポレーションを行った（TCRαβKO）。対照として、細胞を、エレクトロポレーションのために使用された同一の条件の下で、但し、RNPの添加なしに処理した（モックKO；TCRαβWTとも呼ばれる）。
【０８６４】
細胞を、その後、4日間培養し、次いで、抗CD3抗体、組換えTCR#1を認識する抗Vβ抗体、および組換えTCRによって認識される抗原（HPV16 E7ペプチド）と複合体を形成したペプチド-MHC四量体による染色について、フローサイトメトリーによって評価した。細胞を、CD8またはCD4について同時染色した。
【０８６５】
結果は、図6A〜6Eに示される。図6Aおよび6Bに示されるように、TRACおよびTRBCのCRISPR/Cas9媒介ノックアウト（KO）（図中、「TCRαβKO」と記されたパネル）は、KOおよびモック形質導入に供された細胞におけるCD3染色の欠如によって観察されるように（TCRαβKO/モック形質導入と記されたパネル）、CD8+細胞におけるTCR発現のほぼ完全な破壊をもたらした。（CD8+細胞の中の特異的Vβ抗体によって染色された細胞または四量体染色について陽性の細胞によって示される）組換えTCRの発現は、内在性TCRの発現を保持する細胞（TCRαβWT/レンチヒト）と比較して、内在性TCRがKOされた細胞（TCRαβKO/レンチヒト）において、レンチウイルス形質導入後にわずかに改善された。内在性TCRを保持する細胞において、組換えTCR発現は、完全ヒト組換えTCRのレンチウイルス形質導入と比較して、マウス定常ドメインを含有する組換えTCRのレンチウイルス形質導入によって改善された（TCRαβWT/レンチヒトとTCRαβWT/レンチマウスとを比較すること）。
【０８６６】
組換えTCRのHDR媒介標的ノックインおよび内在性TCRのKOは、レンチウイルス形質導入後に観察されるより実質的に大きい、組換えTCRを発現する細胞の割合をもたらした（図6Aおよび6Bの、TCRαβKO/レンチヒトと比較された、「HDR」と表記された左から2枚のパネル）。組換えTCR発現の幾何平均蛍光（gMFI）も、CD8+細胞におけるVβ染色もしくは四量体染色（図6C）またはCD4+細胞におけるVβ染色（図6D）によって評価されたように、レンチウイルス形質導入と比較して、HDRに供された細胞において実質的に高かった。組換えTCRが、EF1αプロモーターの調節下にあっても、MNDプロモーターの調節下にあっても、HDRによる組換えTCR発現の程度は類似していた。
【０８６７】
組換えTCRの発現について陽性であった細胞の中で、発現の程度は、ランダム組み込みレンチウイルス形質導入と比較して、HDRによる標的組み込みに供された細胞において、概してより均一またはより厳密であった（図6Aおよび6Bを参照すること）。図6Eおよび図6Fに示されるように、それぞれ、ペプチド-MHC四量体結合およびVβ発現によって決定される、組換えTCR発現のより低い変動係数（細胞の集団におけるシグナルの標準偏差をそれぞれの集団におけるシグナルの平均値で割ったもの）が、ランダム組み込みと比較して、HDR媒介組み込みに供されたCD8+細胞において観察された。結果は、内在性TCRαβ鎖のノックアウトと組み合わせられた、内在性TCRα遺伝子座への組換えTCRの標的ノックインが、組換えTCRを発現するよう改変された細胞の集団において、他の方法と比較して、より高くより均一な発現のレベルをもたらすという所見と一致している。
【０８６８】
実施例3：内在性のTCRα鎖またはTCRβ鎖または両方のノックアウトを伴う、T細胞における組換えT細胞受容体（TCR）をコードする配列のHDR媒介ノックインの評価
HDRによる組換えTCR発現をさらに評価するため、TRAC遺伝子座およびTRBC遺伝子座の二重ノックアウト、TRAC遺伝子座のみのノックアウト、またはTRBC遺伝子座のみのノックアウトを含有する細胞において、例示的な組換えTCRをコードする核酸配列を、TRAC遺伝子座への組み込みのためターゲティングした。
【０８６９】
A. 組換えTCR導入遺伝子構築物および改変細胞の生成
これらの研究は、以下の差異を除き、実施例1および2に記載されたのと実質的に同様に、例示的なTCR#1をコードするAAV（HDRのため）およびレンチウイルス構築物（ランダム組み込みのため）を使用して実施された：EF1αプロモーターまたはMNDプロモーターの機能的調節下で、組換えTCRをコードするポリヌクレオチドを含有するレンチウイルス構築物を生成した。EF1αプロモーターの機能的調節下の組換えTCR#1、およびT2Aリボソームスキップ配列をコードする配列によって、組換えTCR導入遺伝子から分離された短縮型受容体をコードするポリヌクレオチドを含有するレンチウイルス構築物も、比較のために生成された。
【０８７０】
HDRによる標的組み込みのため、実施例1および2に記載されたのと概して同様に、初代ヒトCD4+T細胞および初代ヒトCD8+T細胞を、刺激し、培養し、TRACのみを標的とするgRNA、TRBCのみを標的とするgRNA、またはTRACおよびTRBCの両方を標的とするgRNAを含有するリボ核タンパク質（RNP）複合体によるエレクトロポレーションに供した。エレクトロポレーション後、前記と概して同様に、内在性TRAC遺伝子座へのターゲティングのため、組換えTCRをコードするポリヌクレオチドを含有するAAV調製物によって、細胞を形質導入した。
【０８７１】
ランダム組み込みのため、実施例1および2に記載されたのと実質的に同様に、初代ヒトCD4+T細胞および初代ヒトCD8+T細胞を解凍し、刺激し、培養し、その後、組換えTCRをコードするレンチウイルス調製物によって形質導入した。この研究において、レンチウイルス調製物は、内在性TCRを保持する初代T細胞に形質導入された。対照として、レンチウイルス形質導入のために使用された同一の条件の下で、但し、レンチウイルスの添加なしに、細胞を処理した（モック形質導入）。
【０８７２】
B. TCRの発現
細胞を、その後さらに4〜10日間培養し、抗CD3抗体、組換えTCR#1に特異的な抗Vβ抗体、およびTCRによって認識される抗原（HPV16 E7ペプチド）と複合体を形成したペプチド-MHC四量体によって染色した後に、フローサイトメトリーによって評価した。CD8またはCD4についても細胞を同時染色した。
【０８７３】
CD3染色についての結果は、図7A〜7Cに示され、四量体染色については、図8A〜8Cに示され、Vβ染色については、図9A〜9Dに示される。
【０８７４】
図7Aおよび7Cに示されるように、TRACおよびTRBCを標的とするgRNAと複合体を形成したRNPによるエレクトロポレーションは、CD3表面発現の欠如によって証拠付けられるように、内在性TCRの効率的なノックアウトをもたらした（図7AのKO/モック形質導入と記されたパネルを参照すること；CD8+細胞の中のCD3+CD8+細胞の百分率を示す図7CのKOモックと記された群も参照すること）。TRACおよびTRBCの両方を標的とするgRNAによるKOの程度は、TRACのみまたはTRBCのみを標的とするgRNAと複合体を形成したRNPによってエレクトロポレーションされた細胞より大きく、これは、TCRのα鎖およびβ鎖の定常ドメインの両方の二重ターゲティングが、内在性TCR発現の破壊の効率を改善するという観察と一致している。内在性TCRの破壊が実施されなかった、レンチウイルスベクターによって形質導入された細胞において、CD3発現は、全ての試験された条件において類似していた（図7Bおよび7C）。図7Aおよび7Cに示されるように、CD3発現は、HDRによって組換えTCRが導入された細胞の間でも類似しており、それは、組換えTCRを導入された細胞におけるTCR/CD3表面発現と一致している。
【０８７５】
図8Aおよび8Cに示されるように、ペプチド-MHC四量体に結合したCD8+細胞の割合によって示された組換えTCR発現は、TRACのみと比較して、TRACおよびTRBCの両方がノックアウトされた細胞においてHDRが実施された条件の下で、より高かった（図8Aの上列と中央列とを比較すること；図8CのTRAC＆TRBCとTRACのみとを比較すること）。図8Cに示されるように、7日目および13日目に類似した結果が観察された。HDRが、外来性のEF1αプロモーターまたはMNDプロモーターの調節下での組み込みのための構築物によって実施されたか、内在性TCRプロモーターの調節下で実施されたか（P2A含有構築物）に関わらず、組換えTCRの類似した発現が細胞において観察された。図8Bおよび図8Cに示されるように、レンチウイルス媒介形質導入の後には、レンチウイルス構築物における短縮型受容体の存在にも関わらず、四量体染色によって評価されたように、より少ない細胞が組換えTCRを発現した。
【０８７６】
図9A〜9Cに示されるように、前記の結果と類似して、組換えTCRのVβ鎖を特異的に認識する抗体によって組換えTCRについて直接染色した時、CD8+T細胞における組換えTCRの発現が観察された。CD4+T細胞（CD8陰性集団）上の組換えTCRも検出することができる抗Vβによる染色は、CD4+細胞においても組換えTCRの発現が観察されることを示した（図9Aおよび図9D）。
【０８７７】
前記の組換えTCR発現を評価する全ての方法（抗CD3、四量体、および抗Vβ）について、前記の結果は、TRBCにターゲティングされたRNPによってエレクトロポレーションされた細胞は、組換えTCRを発現しなかったため（例えば、図8A、8C、9A、9C、および9Dの「TRBCのみ」条件を参照すること）、HDRを介したTRACへの組換えTCRの標的組み込みが、TRAC遺伝子座におけるヌクレアーゼによって誘導されるDNA切断に特異的であることも示した。
【０８７８】
C. 細胞溶解活性およびサイトカイン産生
前記のHDRまたはランダム組み込みによって組換えTCR#1を発現するよう改変されたCD8+細胞の細胞溶解活性およびサイトカイン産生を、HPV 16 E7を発現する標的細胞と共にインビトロでインキュベートした後に評価した。前記の細胞に加えて、HPV 16 E7に結合することができるがマウスのCα領域およびCβ領域を含有する参照TCRをコードするレンチウイルスによって形質導入された初代ヒトCD8+細胞も、評価した。
【０８７９】
細胞溶解活性は、10:1、5:1、および2.5:1のエフェクター標的（E:T）比で、組換えTCR発現エフェクター細胞を、HPV 16 E7を発現する標的細胞と共にインキュベートすることによって評価された。抗原特異的に標的細胞を溶解するT細胞の能力を、共培養後4時間目に評価した。細胞溶解活性を、死滅（％）の曲線下面積（AUC）から決定し、組換えTCRの各々について、Vβ発現に対してノーマライズし、モック形質導入対照と比較した。結果は図10に示される。死滅の程度は、ランダム組み込みと比較して、HDRによる標的組み込みによって組換えTCRが導入された細胞において、より高く、これは、細胞における組換えTCRのより高い発現が、より高い機能的活性をもたらすという所見と一致していた。
【０８８０】
10:1および2.5:1のE:T比で48時間、組換えTCR発現CD8+エフェクター細胞を、HPV 16 E7を発現する標的細胞と共にインキュベートした後に、サイトカイン産生もモニタリングした。上清中のIFNγ分泌を、ELISAによって決定し、各群について、Vβ発現に対してノーマライズした。結果は図11に示される。細胞溶解活性についての前記の結果と類似して、ランダム組み込みと比較して、IFNγのより大きい産生が、HDR媒介組み込みに供された細胞によって観察された。細胞溶解活性アッセイおよびIFNγ分泌の評価において、HDR媒介組み込みによって組換えTCRを発現する細胞の機能的活性は、レンチウイルス形質導入を介してマウス定常ドメインを含有する参照TCRを発現する細胞の活性と類似していた。
【０８８１】
組換えTCR発現細胞の増殖を、抗原ペプチドによってパルス処理されたSCC152標的細胞またはT2標的細胞とのインキュベーションの後に評価した。細胞は、CellTrace（商標）バイオレット（ThermoFisher）色素によって標識された。生T細胞の分裂は、フローサイトメトリーによって評価されるCellTrace（商標）バイオレット色素希釈によって示された。
【０８８２】
様々な機能アッセイの結果は、図12に示される。様々な機能的活性（（「AUC」と表記される）10:1、5:1、および2.5:1のE:T比での死滅（％）のAUC、（「四量体CD8」と表記される）7日目および13日目のCD8+細胞における四量体結合、抗原ペプチドによってパルス処理されたSCC152細胞またはT2標的細胞を使用した（「CTV数」と表記される）増殖アッセイ、ならびに（「CD8によって分泌されたIFNg」と表記される）CD8+細胞からのIFNγの分泌）における組換えTCR発現細胞集団の相対活性を示すヒートマップに示されるように、内在性TCRα鎖定常ドメイン遺伝子座へのノックインのためにターゲティングされた組換えTCRおよび内在性のTCRαβ遺伝子またはTCRα遺伝子のノックアウトを有する細胞の機能的活性は、組換えTCRをコードするポリヌクレオチドがランダムに組み込まれた細胞と比較して、より高いことが概して観察された。
【０８８３】
概して、結果は、HDRによる標的組み込みが、ランダム組み込みによるTCRの導入と比較して、ヒトT細胞におけるヒトTCRのより高い組換えTCR発現をもたらし、それによって、組換えTCRを発現する細胞のより高い機能的活性をもたらすという観察と一致していた。
【０８８４】
実施例4：HDR媒介ノックインによって生成された、組換えT細胞受容体（TCR）を発現するよう改変されたT細胞の、マウスにおけるインビボ抗腫瘍効果の評価
組換えTCRコード配列の、HDR媒介ノックイン、またはレンチウイルス形質導入を介したランダム組み込みによって生成された、例示的なTCRを発現するCD4+細胞およびCD8+細胞の抗腫瘍活性および薬物動態を、腫瘍マウスモデルにおいて、改変された細胞の投与によって評価した。
【０８８５】
A. 腫瘍負荷および生存
雌NOD/SCID/IL2Rγnull（NSG）マウスにおいて、4×106個の扁平上皮癌細胞株UPCI:SCC152（ATCC（登録商標）CRL-3240（商標））細胞の皮下注射によって、マウス腫瘍モデルを生成した。腫瘍は、およそ25日間確立され、改変された細胞の投与前に、腫瘍体積に基づきステージ決定された（P＞0.95）。
【０８８６】
前記の実施例1に記載されたのと実質的に同様に生成された、TCRをコードする配列の標的ノックインまたはランダム組み込みによって、例示的な組換えTCR#2を発現するよう改変された初代CD4+細胞および初代CD8+細胞を、腫瘍細胞の注射の26日後に投与した。2つの異なる全用量の組換えTCR発現細胞（3×106個または6×106個のTCR発現細胞）が投与され、それらの用量は、組換えTCR#2を認識する抗Vβ抗体による染色について陽性の細胞の百分率に基づいていた。以下の群を比較した：HDRによるTRAC遺伝子座における組み込みのためにターゲティングされた、ヒト伸長因子1α（EF1α）プロモーターによって調節されたTCR#2（TCR#2 HDR KO EF1α）；HDRによるTRAC遺伝子座における組み込みのためにターゲティングされた、（上流インフレームP2Aリボソームスキップ要素によって）内在性TRACプロモーターによって調節されたTCR#2（TCR#2 HDR KO P2A）；レンチウイルス構築物を使用してランダムに組み込まれたTCR#2（TCR#2レンチ）；内在性TRACのノックアウトを含有する細胞においてレンチウイルス構築物を使用してランダムに組み込まれたTCR#2（TCR#2レンチKO）；およびレンチウイルス構築物を使用してランダムに組み込まれた、HPV 16 E7に結合することができるがマウスのCα領域およびCβ領域を含有する参照TCR（レンチ参照）。対照として、改変された細胞を受容しなかったマウス（腫瘍単独）、またはエレクトロポレーションのために使用された同一の条件の下で、但し、RNPの添加なしに処理された細胞を投与されたマウス（モックKO）を使用した。表E1も、各群におけるマウスの数および各用量について投与された全T細胞の数を記載する。
【０８８７】
（表Ｅ１）マウス腫瘍モデルにおけるインビボ抗腫瘍効果の評価のための研究設計
2021520202.tif 000062
【０８８８】
改変された細胞の投与後、58日間、週2回、平均腫瘍体積を評価した。58日目に、マウスの体重の変化、生存、および腫瘍を有しないマウスの数もモニタリングした。
【０８８９】
2つの異なる用量でTCR#2発現細胞を投与されたマウスについての抗腫瘍活性（腫瘍負荷の低下）および生存の結果は、図13A〜13Bおよび図14A〜14Bに示される。図13A〜13Bに示されるように、EF1α（TCR#2 HDR KO EF1α）または内在性TRACプロモーター（TCR#2 HDR KO P2A）のいずれかの調節下で、HDRによる標的組み込みによってTCR#2を発現する細胞を投与されたマウスにおける腫瘍体積の低下は、レンチウイルス形質導入によるランダム組み込みによってTCR#2を発現する細胞を投与されたマウス（TCR#2レンチまたはTCR#2レンチKO）と比較して、より大きかった。両方の用量で、EF1αプロモーターの調節下でTCRをコードする配列のHDR媒介組み込みによってTCR#2を発現する細胞を投与されたマウス（TCR#2 HDR KO EF1α）における腫瘍体積の低下は、参照TCRを発現する細胞を投与されたマウス（レンチ参照）と比較して、比較可能であるかまたはより大きかった。図14A〜14Bに示されるように、HDR媒介組み込みによってTCR#2を発現する細胞を投与されたマウスの生存（％）は、ランダム組み込みによって生成されたTCRを発現する細胞を投与されたマウス（TCR#2レンチまたはTCR#2レンチKO）より高かった。表E2に示されるように、細胞の投与後58日目の腫瘍を有しないマウスの数も、EF1α（TCR#2 HDR KO EF1α）または内在性TRACプロモーター（TCR#2 HDR KO P2A）のいずれかの調節下で、HDR媒介組み込みによってTCR#2を発現する細胞を投与された群において、他の群と比較して、より大きかった。研究過程での体重の変化も、図15A〜15Bに示されるようにモニタリングされた。
【０８９０】
（表Ｅ２）改変された細胞の投与後58日目の腫瘍を有しないマウスの数
2021520202.tif 000063
【０８９１】
これらの結果は、HDRを介して例示的な組換えTCRをコードする配列の標的組み込みによって生成された細胞の投与が、ランダム組み込みによるTCRコード配列の導入によって生成された細胞と比較して、より大きいインビボ抗腫瘍活性をもたらすという観察と一致していた。
【０８９２】
B. 薬物動態（PK）の評価
細胞の持続性および増大を、前記の実施例4Aに記載されたマウスモデルにおいて評価した。表E1にリストされた各群のマウスから、2週間毎に交互に採血し（7日目および21日目に4匹のマウスを含む第1のコホート；14日目および28日目に3匹のマウスを含む第2のコホート）、各処理群を、週1回（7日目、14日目、21日目、および28日目に）評価した。投与された細胞の薬物動態の評価のため、各時点で、細胞を計数し、様々なマーカー（CD3、CD4、CD8、CD45、CD45RA、CCR7、PD-1）および組換えTCRの発現（組換えTCRに特異的な抗Vβを使用）、ならびにペプチド-MHC四量体の結合を、フローサイトメトリーによって決定した。
【０８９３】
EF1αプロモーターまたはP2Aプロモーターのいずれかの調節下でHDR媒介組み込みによってTCR#2を発現する細胞は、TCR発現細胞の血中数の初期の増加を示し、その後、14日目〜21日目に急速な減少を示した。参照TCRを発現する細胞は、循環TCR発現細胞のより遅い低下という異なる増大動態および持続性動態をインビボで示した。全TCR+細胞の中のCD4細胞またはCD8細胞の百分率の経時的な分析から、内在性TCRの発現を保持する細胞は、内在性TRAC遺伝子座のノックアウトを含有する細胞と比較して、初期の時点でより高いCD4百分率を示すことが観察された。概して、大部分の群について、CD4百分率の増加が経時的に観察された。
【０８９４】
CD45RAおよびCCR7のような細胞表現型マーカーの染色は、循環組換えTCR発現細胞の大多数の表現型が、7日目〜14日目に、（よりナイーブな表現型に関連している）CCR7+CD45RA+から（より成熟した表現型に関連している）CCR7-CD45RA-に変化することを示した。PD-1発現TCR+細胞の百分率も、大部分の群において、ほぼ0％の染色から、PD-1染色を示す細胞の約60％まで経時的に増加した。
【０８９５】
概して、薬物動態分析は、低用量での高い抗腫瘍活性の観察と一致して、EF1αプロモーターの調節下でHDR媒介組み込みによって組換えTCR#2を発現する細胞の末梢増大の増加および数の増加を証明した。さらに、組換えTCR#2を発現する細胞は、一般に、より成熟した表現型を経時的に示し、全体的な増大動態および持続性動態が、参照TCRを発現する細胞と比較して異なることが観察された。
【０８９６】
実施例5：導入遺伝子配列の効率的なHDR媒介組み込みのための相同性アーム長の評価
変動する長さの相同性アームが隣接する例示的な導入遺伝子を含有するポリヌクレオチドを、相同性依存性修復（HDR）を介して、導入遺伝子の標的組み込みのため、T細胞に導入し、組み込みの効率を評価した。
【０８９７】
A. 組換え導入遺伝子構築物および改変されたT細胞の生成
ヒトTCRα定常領域（TRAC）遺伝子座への標的組み込みのための変動する長さの相同性アームが隣接する緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードする導入遺伝子配列を含有する例示的なHDR鋳型ポリヌクレオチドを、T細胞に導入した。具体的には、HDRによる組み込みのため、以下の差異を除き、実施例1〜3に記載されたのと実質的に同様に、GFPをコードする鋳型ヌクレオチド構築物を含有するAAV調製物を生成した：ヒトTCRα定常領域（TRAC）遺伝子の標的組み込み部位の周囲の配列に相同な50塩基対、100塩基対、200塩基対、300塩基対、400塩基対、500塩基対、または600塩基対の5'および3'の相同性アーム（それぞれ、SEQ ID NO:227〜233および234〜240）が隣接する、MNDプロモーターの機能的調節下でGFPをコードし、SV40ポリ(A)配列に連結されているポリヌクレオチドを含有するAAV構築物を生成した。AAV構築物の全長は、SV40ポリ(A)配列と3'相同性アームとの間にフィラーDNA配列を使用することによって一定にされた。
【０８９８】
HDRによる標的組み込みのため、実施例1〜3に記載されたのと概して同様に、4人のヒトドナー（ドナー1〜4）に由来する初代ヒトCD4+T細胞および初代ヒトCD8+T細胞を1:1比で組み合わせ、刺激し、TRACを標的とするgRNAを含有するリボ核タンパク質（RNP）複合体によるエレクトロポレーションに供した。エレクトロポレーションの後、前記の様々な相同性アーム長を含有するHDR鋳型ポリヌクレオチドを含有するAAV調製物によって、細胞を形質導入した。以下の式：
2021520202.tif 000064
に基づき、（ゲノムに組み込まれた細胞内の全AAVに対する百分率を表す）組み込み比を決定するため、AAVによる形質導入の後、24時間目、48時間目、72時間目、96時間、および7日目に、フローサイトメトリーによってGFP発現を測定した。％高MFIおよび％低MFIとは、それぞれ、組み込まれたGFP導入遺伝子または組み込まれていないAAV構築物を含有する細胞を表す、フローサイトメトリーによる閾値MFIを超えていた細胞またはそれを下回っていた細胞の百分率を示す。相同性アームの長さの増加による組み込み比の変化を、特定のアーム長の組み込み比から次に短いアーム長の組み込み比を差し引くことによって評価した。
【０８９９】
A. 組み込み比の評価
図16A〜16Bに示されるように、各相同性アーム長について、評価された様々な時点で、一定のまたは増加した組み込み比が観察され、これは、組み込まれていないAAV構築物が経時的に希釈されることと一致していた。GFP発現パターンの経時的な変化の評価は、組み込まれたGFP導入遺伝子を有する細胞（高MFI）の百分率は、概して、72時間後に一定のままであるが、組み込まれていないAAVのみを含有する細胞（低MFI）の百分率は、減少し続けることを示した。
【０９００】
図17A〜17Bに示されるように、組み込み比の最も実質的な増加は、200bpの相同性アームで起こり、300bpでは軽微な増加が起こるようであった。全てのドナーにおいて、300bpと500bpとの間では実質的な増加は観察されず、500bpと600bpとの間で組み込み比の増加が観察された。結果は、高い組み込み効率のための最低300bpの相同性アームの使用を支持しており、600bpの相同性アームは、さらに高い組み込み効率を提供する。
【０９０１】
実施例6：TCRをコードする配列の標的ノックインまたはランダム組み込みによってキメラ抗原受容体（CAR）を発現する改変されたT細胞の生成および評価
CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集および相同性依存性修復（HDR）を介した遺伝子破壊の部位における標的組み込み、またはランダム組み込みによって、T細胞受容体α（TCRα）鎖をコードする内在性遺伝子座における遺伝子破壊と共に、例示的なキメラ抗原受容体（CAR）をコードするポリヌクレオチドを、T細胞に導入した。
【０９０２】
A. 例示的な抗CD19 CAR
a. 例示的な抗CD19 CARの発現
実施例1および2に記載されたのと概して同様に、CRISPR/Cas9媒介遺伝子編集によって、T細胞受容体α（TCRα）鎖をコードする内在性遺伝子座を遺伝子破壊するために改変された細胞において、表面抗原分類19に特異的な例示的なCAR（抗CD19 CAR）をコードする核酸配列を、相同性依存性修復（HDR）を介して遺伝子破壊の部位のうちの1つにおける組み込みのためにターゲティングするか、またはレトロウイルス形質導入を介したランダム組み込みによって導入した。
【０９０３】
これらの研究は、以下の差異を除き、実施例1および2に記載されたのと実質的に同様に、AAV（HDRのため）およびレトロウイルス構築物（ランダム組み込みのため）を使用して実施された：導入遺伝子配列は、例示的な抗CD19 CARをコードする核酸配列、および例示的な抗CD19 CAR配列の発現を駆動するためのEF1αプロモーター（TRAC HDR EF1aプロモーター）、またはヒトTCRα定常領域（TRAC）遺伝子へのインフレームのHDRによる標的組み込みによって、内在性TCRα遺伝子座からの例示的な抗CD19 CARの発現を駆動するための、例示的な抗CD19 CAR配列の上流のP2Aリボソームスキップ要素をコードする配列（TRAC HDR P2A）を含んでいた。
【０９０４】
HDRによる標的組み込みのため、実施例1および2に記載されたのと概して同様に、初代ヒトCD4+T細胞および初代ヒトCD8+T細胞を刺激し、培養し、TRACを標的とするgRNAを含有するリボ核タンパク質（RNP）複合体によるエレクトロポレーションに供した。エレクトロポレーションの後に、前記と概して同様に、内在性TRAC遺伝子座へのターゲティングのため、例示的な抗CD19 CARをコードするポリヌクレオチドを含有するAAV調製物によって、細胞を形質導入した。ランダム組み込みのため、TRACを標的とするgRNAを含有するRNP複合体のエレクトロポレーションを伴って（レトロウイルスTRAC RNPまたはレトロウイルスTCR KO）、または伴わずに（レトロウイルスのみ）、例示的な抗CD19 CARをコードするレトロウイルス調製物によって、初代ヒトCD4+T細胞および初代ヒトCD8+T細胞を形質導入した。対照として、細胞を、TRBCを標的とするgRNAを含有するRNP複合体によるエレクトロポレーションの後にTRAC遺伝子座におけるHDRターゲティングに供するか、またはモック処理した（モック）。9日目に、細胞を解凍した後、抗CD3抗体、または抗CD19 CARを特異的に認識する抗イディオタイプ抗体（抗ID）による染色について、フローサイトメトリーによって改変された細胞を評価した。
【０９０５】
図18Aに示されるように、TRAC遺伝子座におけるHDRによる標的組み込みによって生成された抗CD19 CAR発現T細胞は、抗ID抗体が結合する細胞の最も高い割合を示した。図18Bに示されるように、TRAC遺伝子座におけるHDRによる標的組み込みによって生成された例示的な抗CD19 CARの組み込みの効率および発現は、内在性TRAC遺伝子座の遺伝子編集を伴って、または伴わずに、ランダム組み込みを使用して改変された細胞において観察された効率と比較可能であるかまたはそれより高かった。結果は、TRAC遺伝子座におけるHDRによる標的組み込みによって改変された細胞における、ランダム組み込みによって改変された細胞と比較して類似しているかまたは改善された例示的な抗CD19 CARの発現の観察と一致していた。
【０９０６】
b. 連続再刺激後の例示的な抗CD19 CARの発現
CARの細胞表面発現を、複数回の標的抗原曝露の後に評価した。反復抗原刺激の後にエクスビボで増大し、抗原特異的な機能を示すCAR T細胞の能力は、（例えば、投与および抗原との遭遇に応答して起こる初期活性化の後の）細胞のインビボ機能および/またはインビボ持続能力と相関し得る（Zhao et al.(2015)Cancer Cell,28:415-28）。
【０９０７】
前記のHDRによる標的組み込みまたはランダム組み込みによって生成された例示的な抗CD19 CARを発現する初代ヒトT細胞を、CD19を発現するよう改変されたK562ヒト慢性骨髄性白血病（CML）細胞（K562-CD19）と共にインキュベートした。照射されたK562-CD19標的細胞を、2.5:1のエフェクター標的比（E:T）で添加した。4日毎（新しい各回の開始時）に、計3回、CAR T細胞を計数し、採集し、新鮮な培地および新しく解凍され新しく照射された標的細胞と共に初期播種密度で再播種した。各回において、CAR発現細胞の百分率、平均蛍光強度（MFI）、CAR発現の変動係数（CV）を、フローサイトメトリーによって評価した。
【０９０８】
図19Aに示されるように、抗CD19 CARを発現する細胞の百分率は、全ての試験された群において、概して、増加したか、または安定していた。図19Bおよび19Cに示されるように、反復刺激の過程で、EF1αプロモーターまたはP2A（内在性TRACプロモーター）の調節下で、内在性TRAC遺伝子座における核酸配列のHDRによる標的組み込みによって改変された例示的な抗CD19 CAR発現細胞は、レトロウイルスベクターを使用したランダム組み込みによって改変された細胞と比較して、CARのより均一でより可変性でない発現を示した。MFIは、ランダム組み込みによって改変された細胞において、概して、より高かった（図19B）。TRAC遺伝子座におけるHDR媒介ターゲティングを使用して改変された抗CD19 CAR発現細胞は、より低い変動係数（細胞の集団におけるシグナルの標準偏差をそれぞれの集団におけるシグナルの平均値で割ったもの；図19C）を示し、これは、反復刺激中の発現のより少ない増減を示した。
【０９０９】
c. 細胞溶解活性およびサイトカイン産生
前記の実施例1.Dに記載されたのと概して同様に、2:1のE:T比で48時間、抗CD19 CAR+Tエフェクター細胞を、CD19を発現するよう改変されたK562標的細胞（K562-CD19）または改変されていない対照（親K562）と共にインキュベートした後、サイトカイン産生（インターフェロンγ；IFNγ）および細胞溶解活性をモニタリングした。
【０９１０】
図20Aに示されるように、TRAC遺伝子座におけるHDR媒介ターゲティングを使用して改変された抗CD19 CAR発現細胞は、より高い抗原特異的IFNγ産生を示し、EF1αプロモーターを含むHDRによって改変された細胞が、最も高い抗原特異的IFNγ産生（左のパネル）およびより低い非特異的なまたはオフターゲットのサイトカイン産生（右のパネル）を示した。図20Bに示されるように、標的細胞死滅の程度は、抗CD19 CAR発現細胞の全ての群について類似していた（左のパネル）。非特異的な細胞死滅は、変動し、P2A（内在性TRACプロモーター）を含むHDRによって改変された細胞が、最も低い非特異的細胞死滅活性を示す（右のパネル）。
【０９１１】
B. 例示的な抗BCMA CAR
a. 例示的な抗BCMA CARの発現
前記の実施例1、2、および6Aに記載されたのと概して同様に、EF1αプロモーターもしくは（P2A配列の組み込みによる）内在性TRACプロモーターの調節下でのTRAC遺伝子座におけるHDRによって媒介された標的組み込み、またはTRACを標的とするgRNAを含有するRNP複合体の導入を伴う（LV-TRACもしくはLV-KO）もしくは伴わない（LVのみ）レンチウイルスベクターを使用したランダム組み込みによって、B細胞成熟抗原に特異的な異なる例示的なCAR（抗BCMA CAR）をコードする核酸配列を導入した。対照として、細胞を、TRBCを標的とするgRNAを含有するRNP複合体によるエレクトロポレーションの後にTRAC遺伝子座におけるHDRターゲティングに供するか、またはモック処理した（モック）。9日目に、細胞を解凍した後、抗BCMA CARに特異的に結合するIgGのFc領域にC末端で融合された組換え可溶性ヒトBCMAを含有するBCMA-Fc融合ポリペプチドによる染色によって、抗BCMA CAR発現を検出するため、そしてCD3発現を検出するため、フローサイトメトリーによって改変された細胞を評価した。
【０９１２】
図21Aに示されるように、TRAC遺伝子座におけるHDRによる標的組み込みによって生成された抗BCMA CAR発現T細胞は、ランダム組み込みを使用して改変された細胞と比較可能な、BCMA-Fcが結合する細胞の割合を示した。図21Bに示されるように、TRAC遺伝子座におけるHDRによる標的組み込みによって生成された、例示的な抗BCMA CARを発現する細胞の百分率は、内在性TRAC遺伝子座の遺伝子編集を伴って、または伴わずに、ランダム組み込みを使用して改変された細胞において観察された百分率と比較可能であった。結果は、TRAC遺伝子座におけるHDRによる標的組み込みによって改変された細胞における、ランダム組み込みを使用して改変された細胞と比較して類似しているかまたは改善された例示的な抗BCMA CARの発現の観察と一致していた。
【０９１３】
b. 連続再刺激後の例示的な抗BCMA CARの発現および活性
CARの細胞表面発現および改変された細胞の抗原特異的活性を、複数回の標的抗原曝露の後に評価した。前記と同様に生成された抗BCMA CAR発現細胞を、1:1のエフェクター標的比（E:T）で、照射されたBCMA発現RPMI-8226（BCMA+多発性骨髄腫細胞株）標的細胞と共にインキュベートした。新しい各回の開始後、3〜7日毎に、計4回、CAR T細胞を計数し、採集し、新鮮な培地および新しく解凍され新しく照射された標的細胞と共に初期播種密度で再播種した。抗BCMA CARを発現する細胞の百分率を、フローサイトメトリーによって決定した。サイトカイン産生の評価のため、連続刺激の1回目、2回目、3回目の細胞を、刺激の24時間後に収集し、インターフェロンγ（IFNγ）およびインターロイキン2（IL-2）の産生を評価した。
【０９１４】
図22Aに示されるように、抗BCMA CAR発現細胞の百分率は、様々な方法によって改変された細胞において、複数回刺激の過程において、概して類似していることが観察された。図22Bに示されるように、IFNγ産生（上のパネル）は、様々な方法を使用して改変された細胞において類似していることが観察された。EF1αプロモーターの機能的調節下で、HDRによるTRAC遺伝子座における標的組み込みによって改変された細胞は、標的細胞による刺激の後に最も高いIL-2産生を示した。
【０９１５】
C. 結論
示されたように、内在性TRAC遺伝子座への核酸配列の標的組み込みによって例示的なCARを発現するよう改変された細胞は、複数回刺激の状況においても、類似しているかまたは改善された発現および抗原特異的活性、ならびにより均一な発現を示した。
【０９１６】
本発明は、例えば、本発明の様々な局面を例示するために提供された、具体的な開示された態様に、その範囲が限定されないものとする。記載された組成物および方法に対する様々な修飾が、本明細書中の説明および教示から明白になるであろう。そのような変動は、本開示の真の範囲および本旨を逸脱することなく実施され得、本開示の範囲に含まれるものとする。
【０９１７】
配列
2021520202.tif 000065
2021520202.tif 000066
2021520202.tif 000067
2021520202.tif 000068
2021520202.tif 000069
2021520202.tif 000070
2021520202.tif 000071
2021520202.tif 000072
2021520202.tif 000073
2021520202.tif 000074
2021520202.tif 000075
2021520202.tif 000076
2021520202.tif 000077
2021520202.tif 000078
2021520202.tif 000079
2021520202.tif 000080
2021520202.tif 000081
【図１Ａ】
2021520202.tif 000093
【図１Ｂ】
2021520202.tif 000094
【図１Ｃ】
2021520202.tif 000095
【図２Ａ】
2021520202.tif 000096
【図２Ｂ】
2021520202.tif 000097
【図３】
2021520202.tif 000098
【図４Ａ】
2021520202.tif 000099
【図４Ｂ】
2021520202.tif 000100
【図４Ｃ】
2021520202.tif 000101
【図４Ｄ】
2021520202.tif 000102
【図４Ｅ】
2021520202.tif 000103
【図４Ｆ】
2021520202.tif 000104
【図４Ｇ】
2021520202.tif 000105
【図５】
2021520202.tif 000106
【図６−１】
2021520202.tif 000107
【図６−２】
2021520202.tif 000108
【図６−３】
2021520202.tif 000109
【図６−４】
2021520202.tif 000110
【図７Ａ】
2021520202.tif 000111
【図７Ｂ】
2021520202.tif 000112
【図７Ｃ】
2021520202.tif 000113
【図８Ａ】
2021520202.tif 000114
【図８Ｂ】
2021520202.tif 000115
【図８Ｃ】
2021520202.tif 000116
【図９Ａ】
2021520202.tif 000117
【図９Ｂ】
2021520202.tif 000118
【図９Ｃ】
2021520202.tif 000119
【図９Ｄ】
2021520202.tif 000120
【図１０】
2021520202.tif 000121
【図１１】
2021520202.tif 000122
【図１２】
2021520202.tif 000123
【図１３Ａ】
2021520202.tif 000124
【図１３Ｂ】
2021520202.tif 000125
【図１４Ａ】
2021520202.tif 000126
【図１４Ｂ】
2021520202.tif 000127
【図１５Ａ】
2021520202.tif 000128
【図１５Ｂ】
2021520202.tif 000129
【図１６Ａ】
2021520202.tif 000130
【図１６Ｂ】
2021520202.tif 000131
【図１７Ａ】
2021520202.tif 000132
【図１７Ｂ】
2021520202.tif 000133
【図１８Ａ】
2021520202.tif 000134
【図１８Ｂ】
2021520202.tif 000135
【図１９Ａ】
2021520202.tif 000136
【図１９Ｂ】
2021520202.tif 000137
【図１９Ｃ】
2021520202.tif 000138
【図２０Ａ】
2021520202.tif 000139
【図２０Ｂ】
2021520202.tif 000140
【図２１Ａ】
2021520202.tif 000141
【図２１Ｂ】
2021520202.tif 000142
【図２２Ａ】
2021520202.tif 000143
【図２２Ｂ】
2021520202.tif 000144
【配列表】
2021520202000001.app
【国際調査報告】
2021520202.tif 000145
2021520202.tif 000146
2021520202.tif 000147
2021520202.tif 000148
2021520202.tif 000149
2021520202.tif 000150
2021520202.tif 000151
2021520202.tif 000152
2021520202.tif 000153