(57)【要約】  本発明は、とりわけ、カロリー含有量を低下させるために、食品を甘くするために、食品の繊維含有量を増大させるために、食品の食感を改善するために、及び腸内マイクロバイオーム細菌を刺激するために、食品添加物として使用することができるオリゴ糖を調製する方法に関する。さらに、これらは、動物飼料の分野、又は他の用途で応用することができる。より具体的には、本発明は、規定のキシログルカンオリゴ糖に対するキシログルカン多糖の高温加水分解に関する。本発明はさらに、本発明の方法を用いて産生されるオリゴ糖加水分解物、並びにヒト及び/又は動物の栄養摂取における、プレバイオティックとしての又は他の用途のための該オリゴ糖加水分解物の使用に関する。さらに提供されるのは、本発明の方法及び他の用途で使用するための新規のエンドグルカナーゼである。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
キシログルカン源からキシログルカンオリゴ糖(XGOS)を産生する方法であって、50℃よりも高い温度でキシログルカナーゼ活性を示す酵素による50℃よりも高い温度でのキシログルカンの酵素的加水分解を含み、該酵素が5mMと同じ又はそれよりも高い最終生成物阻害定数(Ki)を示すことを特徴とする、前記方法。
【請求項２】
前記キシログルカン源が、タマリンド、ペパーグラス、ナタネ、リンゴ、ビルベリー、ブルーベリー、オリーブ、又はこれらの画分を含む他のキシログルカン源、例えば、タマリンドカーネルパウダー、脱脂タマリンドカーネルパウダー、タマリンド種子、並びに他の源の種子及び細胞壁である、請求項1記載の方法。
【請求項３】
前記酵素が、好ましくは、GHファミリー5、9、12、16、44、又は74から選択されるエンドグルカナーゼである、請求項1又は2記載の方法。
【請求項４】
前記酵素が、配列番号1〜配列番号4から選択されるポリペプチドと少なくとも75％の配列同一性を有する、請求項1〜3のいずれか一項記載の方法。
【請求項５】
前記酵素が宿主細胞で組換え産生され、かつ該宿主細胞が前記キシログルカン源に対する内在性キシログルカナーゼ活性を示さない、請求項1〜4のいずれか一項記載の方法。
【請求項６】
・前記多糖のキシログルカナーゼ加水分解を促進する条件下で、配列番号1〜配列番号4から選択されるポリペプチドと少なくとも75％の配列同一性を有する酵素で水溶液中のキシログルカン源を加水分解して、キシログルカン源多糖加水分解物の溶液を形成させる
:工程を含む、請求項1〜5のいずれか一項記載の方法。
【請求項７】
・固形物の除去;
・例えば、イオン交換クロマトグラフィーによる、タンパク質及び塩の除去;
・例えば、限外濾過又はナノ濾過による、着色剤の除去;並びに
・前記溶液からの前記キシログルカン源多糖加水分解物の除去
:のうちの1以上の工程をさらに含む、請求項1〜6のいずれか一項記載の方法。
【請求項８】
前記酵素が前記キシログルカン源の0.05％(w/w)又はそれ未満の量で存在し、かつ/又は使用される該キシログルカン源の最終量が100g/l以上である、請求項1〜7のいずれか一項記載の方法。
【請求項９】
DP7〜DP9 XGOSの混合物を含むか、該混合物から本質的になるか、又は該混合物からなるキシログルカン加水分解物が産生される、請求項1〜8のいずれか一項記載の方法。
【請求項１０】
食品、動物飼料製品、又は他の製品を産生するための、請求項1〜9のいずれか一項記載の方法で産生されるDP7〜DP9 XGOS混合物を含む加水分解物の使用。
【請求項１１】
請求項1〜9のいずれか一項記載の方法で産生されるDP7〜DP9 XGOS混合物を含む製品。
【請求項１２】
配列番号2、3、又は4によるポリペプチドと少なくとも75％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むか、該ポリペプチドから本質的になるか、又は該ポリペプチドからなるエンドグルカナーゼ活性を有し、ただし、該エンドグルカナーゼが配列番号1のポリペプチドではない、酵素。
【請求項１３】
請求項12記載のエンドグルカナーゼをコードする核酸配列を含む核酸分子。
【請求項１４】
キシログルカン源からXGOSの混合物を産生するための、請求項12記載の酵素の使用であって、該混合物が、DP7〜DP9 XGOSを含むか、DP7〜DP9 XGOSから本質的になるか、又はDP7〜DP9 XGOSからなる、前記使用。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
(発明の分野)
本発明は、とりわけ、食品のカロリー含有量を低下させるために、食品を甘くするために、食品の繊維含有量を増大させるために、食品の食感を改善するために、及び腸内マイクロバイオーム細菌を刺激するために、食品添加物として使用することができるオリゴ糖を調製する方法に関する。さらに、これらは、動物飼料の分野、又は他の用途で応用することができる。より具体的には、本発明は、規定のキシログルカンオリゴ糖に対するキシログルカン多糖の高温加水分解に関する。本発明はさらに、本発明の方法を用いて産生されるオリゴ糖加水分解物、並びにヒト及び/又は動物の栄養摂取における、プレバイオティックとしての又は他の用途のための該オリゴ糖加水分解物の使用に関する。さらに提供されるのは、本発明の方法及び他の用途で使用するための新規のエンドグルカナーゼである。
【背景技術】
【０００２】
(発明の背景)
一般に、脂肪、油、デンプン、炭水化物、糖、及びこれらに由来する製品は、加工食品において広く利用されている。これらの成分は、食品の見た目、味、口当たり、及び他の官能特性に関して極めて重要な機能的意義を有する。しかしながら、これらは、腸を通過する間に、ヒトの体によって代謝され、したがって、そのような食品のカロリー含有量に大きく寄与することができる。最近、消費者は、ますます健康志向になってきている。したがって、多くの個人は、自身の高カロリー食品及び高レベルの脂肪を含有する食品の摂取を最小限に抑えようとしている。消費者は、従来の加工食品の低カロリー及び低脂肪バージョンを要求している。非消化性オリゴ糖を添加することにより、加工食品の官能特性を失わせることなく、糖及び脂肪の量を低下させることができる。
【０００３】
欧州食品安全局(European Agency for Food Safety)(EFSA Journal, 2010)及び米食品医薬品局(American Food and Drug Agency)(FDA)(https://www.accessdata.fda.gov/scripts/InteractiveNutritionFactsLabel/factsheets/Dietary_Fiber.pdf)のような規制当局は、食物繊維の日常摂取の重要性を認め、平均的な成人の1日当たりの推奨摂取として、1日当たり25gを提案した。しかしながら、研究により、食物繊維の現在の平均摂取が1日当たり約18gであることが示された(Hoy及びGoldmanの文献、2014)。結果として、官能特性に悪影響を及ぼすことなく、繊維含有量を増大させることにより、加工食品のカロリー/脂肪付与含有量を機能的に代替する食品添加物に対する要求の高まりが存在する。本発明は、この問題を解決して、前述の要求を満たし、かつ従来技術の困難を克服する添加物を提供する。特許出願WO1991011112A1号には、酵素が高濃度で添加される45〜50℃の温度でのオリゴ糖への酵素的キシログルカン加水分解プロセスが記載されている。さらに、このプロセスは、所望のオリゴ糖の他に、第二の下流プロセス工程で除去されなければならない15％を超える高い重合度(DP 7〜9)の小さいオリゴ糖及び単糖を生じさせる。本発明者らの発明は、酵素を慎重に選択し、高温によるプロセス効率の増大と組み合わせて、より小さいオリゴ糖及び単糖の産生を回避する。
【発明の概要】
【０００４】
(発明の概要)
本発明は、請求項1記載の方法によって、問題を解決する。驚くことに、タマリンドカーネルパウダーなどのキシログルカン源の高温加水分解が低カロリー食品添加物を提供し、この食品添加物を用いて、加工食品の現在のカロリー付与含有量を代替すると同時に、官能特性に悪影響を及ぼすことなく、繊維含有量を増大させることができることが分かった。さらに驚くことに、高温手順と及び高温プロファイルを有する酵素とを使用することにより、キシログルカン-多糖加水分解が簡素化され、全体の成績が向上し、追加の精製手順が回避されることが発見された。本発明の方法は、ただ1つの酵素で実施することができるが、それは、50℃よりも高い温度でキシログルカナーゼ活性を示す慎重に選択された特異的酵素が、700g/l以上の高い基質量でさえもキシログルカン-多糖を完全に加水分解するのに十分であるからである。
【０００５】
該酵素は、例として、例えば、グリコシドヒドロラーゼ(GH)ファミリー5、9、12、16、44、又は74に属するエンドグルカナーゼから選択される、エンドグルカナーゼであってもよい。
【０００６】
本発明は、配列番号1〜4から選択されるポリペプチドと少なくとも75％の配列同一性を有する細菌酵素をさらに提供する。該酵素は、好適には、50℃よりも高い温度でキシログルカナーゼ活性を示す。
【０００７】
本発明は、高いDP7〜DP9濃度の存在下でキシログルカナーゼ活性を示す、配列番号1〜4から選択されるポリペプチドと少なくとも75％の配列同一性を有する細菌酵素をさらに提供する。
【０００８】
本発明は、本発明の方法を用いて産生されるキシログルカン加水分解物も提供する。該キシログルカン加水分解物は、それがDP7〜DP9キシログルカンオリゴ糖(XGOS)の混合物を実質的に含むことを特徴とする。
【０００９】
本発明はさらに、食品を産生するための該キシログルカン加水分解物の使用に関する。本発明はまた、ヒトの栄養摂取において使用するためのキシログルカン加水分解物及びそれを含有する食品に関する。
【００１０】
本発明はさらに、飼料製品を産生するための該キシログルカン加水分解物の使用に関する。本発明はまた、動物の栄養摂取において使用するためのキシログルカン加水分解物及びそれを含有する飼料製品に関する。
【００１１】
本発明の方法を用いて産生されるキシログルカン加水分解物及びそれを含有する食品はまた、ヒトの健康の向上において使用するために、例えば、満腹剤として食事摂取後の血糖値を低下させるために、又は食品中のカロリーを低下させるために提供される。
【００１２】
(発明の詳細な説明)
好ましい実施態様において、本発明は、キシログルカン源からキシログルカンオリゴ糖(XGOS)を産生する方法であって、50℃よりも高い温度でキシログルカナーゼ活性を示す酵素による50℃よりも高い温度でのキシログルカンの酵素的加水分解を含む、方法を提供する。
【００１３】
好ましいキシログルカン源は、食品産生の副産物、最も好ましくは、タマリンドを含む製品ストリーム、すなわち、その画分、例えば、タマリンドカーネルパウダー、脱脂タマリンドカーネルパウダー、又はタマリンド種子を含む、タマリンドに由来する製品である。
【００１４】
本発明による別のキシログルカン源は、例えば、その画分、特に、種子及び細胞壁又はかなりのキシログルカン多糖含有量を含む任意の他の源を含む、ペパーグラス、ナタネ、リンゴ、ビルベリー、ブルーベリー、及びオリーブである。かなりの含有量とは、5％よりも高いキシログルカン含有量を意味する。本明細書に記載される方法を用いて実施されるこれらのキシログルカンの炭水化物加水分解物は、主に、6〜11の重合度(DP)を有するオリゴ糖を含む。
【００１５】
タマリンドキシログルカン加水分解物は、他の炭水化物加水分解物とは異なり、主に(典型的には、＞65％70％、好ましくは、＞75％、より好ましくは、＞80％又は＞85％、最も好ましくは、＞90％又は＞95％)、7〜9の重合度(DP)を有するオリゴ糖から構成されるという点で独特である。
【００１６】
タマリンド多糖は、熱帯及び亜熱帯のより乾燥した地域(主に、東南アジア、南米、地中海沿岸)、主に、インド、ミャンマー、バングラディッシュ、及びスリランカで広く栽培されている、おそらく熱帯アフリカ起源の一般的な森林樹木であるタマリンド木のタマリンド(Tamarindus indica)(ジャケツイバラ亜科(Caesalpinioideae)のサブファミリー、マメ科(Fabaceae)科のファミリー)の種子から得られる。タマリンドは、約55％の果肉、34％の種子(65％のキシログルカン多糖を含有する)、並びに11％の殻及び繊維からなる種子を含有する10〜15cmの長さのさやである、非裂開性豆果を形成する。タマリンド種子は、ゴムの商業的供給源であり、食品を含む多くの商業的用途を見出している。1988年に、インド一国で、年間300.000トンのタマリンドを生産し(Kumar及びBhattacharyaの文献、2008)、これは、それぞれ、約100.000トンのタマリンド種子及び66.000トン超のキシログルカンになる。
【００１７】
本発明の好ましい実施態様において、キシログルカナーゼ活性を示す酵素は、エンドグルカナーゼである。より好ましくは、該エンドグルカナーゼは、50℃を上回る活性プロファイルを有する。これは、タマリンド多糖などのキシログルカン多糖が、効率的に加水分解されて、DP7、DP8、及びDP9オリゴ糖を含むオリゴ糖混合物を生じるという利点を有する。高温の他の利点は、キシログルカン源の溶解度の上昇及び微生物汚染の回避である。
【００１８】
キシログルカンは、セロテトラオース単位(4つのβ-1,4結合D-グルコピラノース残基)から構成されるβ-グルカン骨格からなる多糖であり、ここで、サッカリド鎖の非還元末端から見て、最初の3つのグルコシド残基は、α-D-キシロピラノシド残基のC1位へのグリコシド結合で連結したC6位にあり;また一方、2番目及び/又は3番目のキシロース残基は、β-D-ガラクトピラノシド残基のC1位にC2位で結合することができる。4番目のグルコシド残基は、修飾されない。
【００１９】
タマリンドキシログルカンの加水分解により、オリゴ糖DP7: XXXG、DP8: XXLG及びXLXG、並びにDP9: XLLGが生成し、ここで、Gは、修飾されていない骨格グルコース残基を表し、Xは、キシロースで修飾された骨格グルコース残基を表し、Lは、キシロース及びガラクトースで修飾された骨格グルコース残基を表し;文字コードは、図1にまとめられているFryらの文献(1993)による命名規則を表す。場合により、タマリンドキシログルカン内では稀であるが、他の植物源由来のキシログルカンではより頻繁に、側鎖がわずかに異なり、かつ図1に記載されている産物とは異なる産物を生じることがあり:ほとんどの場合、3番目のグルコース残基上の、各々のテトラマー中のキシロシド残基のうちの1つが欠損しており、開裂酵素の加水分解選好に応じて、結果として生じるオリゴ糖の異なる組成につながり;ガラクトシド残基は、α-L-アラビノフラノシド残基に置き換えられるか又は様々な糖残基、例えば、別のガラクトシドもしくはL-フコピラノシド残基でさらに修飾されることがあり;骨格グルコシド残基も、キシロースの代わりにα-L-アラビノフラノシド残基でさらに修飾されることがあり;キシロシド残基も、β-立体配置で接続されることがある。多くの場合、糖残基は、O-アセチル化されている。さらに、タマリンドキシログルカン内では稀であるが、他の源由来のキシログルカンでは、3つのキシロース修飾グルコース骨格残基のうちの1つが、α-L-アラビノシド残基でさらに修飾されたC2位にある(Vinckenらの文献、1996)。
【００２０】
キシログルカン加水分解酵素は稀少であるが;加水分解は、異なる切断特異性を有する種々の酵素タイプによって、そのほとんど全てが、修飾されていないグルコシド残基の還元末端で行われる。環境中の側鎖切断活性が稀少であり、かつ異なる側鎖糖の各々に対して異なる活性が必要であるため、キシログルカンの側鎖は、ポリマーを急速な分解からある程度保護する。
【００２１】
キシログルカンポリマー内のグリコシド糖結合は、特定の加水分解酵素によって切断することができる。そのような酵素は、加水分解酵素と呼ばれ、A-B＋H2O→A-OH＋B-H(ここで、A及びBは、糖分子である):と記述することができる反応において水分子の付加により、グリコシド結合を切断する。これらの加水分解酵素は、関与する糖のタイプ及び結合のタイプに特異的であり、ここで、2つのグルコース分子間のβ-1,4結合は、β-1,4-グルカナーゼ活性を有する酵素によって開裂させられる。この酵素が、長いポリマー分子内の任意のβ-1,4-グリコシド結合(例えば、これは、キシログルカンの骨格中に存在する)を統計的な様式で開裂させる場合、この酵素は、エンドグルカナーゼ(例えば、セルラーゼの1種)と呼ばれる。エンドグルカナーゼは、通常、ポリマー内の2以上の隣接するグルコース残基が(例えば、セルロースに見られるように)非置換である場合にのみ活性がある。しかしながら、タマリンドキシログルカン骨格の全ての4番目の残基のみが非置換であるため、ほとんどのエンドグルカナーゼ(例えば、ほとんどの市販のセルラーゼ調製物中のもの)はタマリンドキシログルカンに対して不活性である。タマリンドキシログルカンに対する活性を有する特別なエンドグルカナーゼ(大部分は、グリコシドヒドロラーゼファミリーGH5及びGH9に属する)は、実験的に選択されなければならず;それらは、もう一方のグルコース残基が置換されているとしても、置換されていないグリコシド残基のどちらかの側のβ-1,4-グリコシド結合を分解する。さらに、いくつかの他の加水分解酵素ファミリー、例えば、GH12、GH16、GH44、又はGH74に含まれる特異的なエンドグルカナーゼは、キシログルカンを分解することができる。
【００２２】
キシログルカンに対する酵素活性に加えて、70％(wt/vol)以上の高い基質量でさえも完全な加水分解に達し、結果として高いオリゴ糖濃度を生じるための好適な酵素は、好都合な最終生成物阻害プロファイルを特徴とする。Wongら(2010)により、XXXGオリゴ糖によって線形非競合阻害される、1.46±0.13mMのKiを有するGH5エンドグルカナーゼが特徴付けられた。5mM以上のより好適な最終生成物阻害プロファイルKiを有する酵素は、GH5、GH9、GH12、GH16、GH44、及びGH74を含むGHファミリー中に見出すことができる。
【００２３】
本発明の方法の好ましい実施態様において、タマリンド多糖などのキシログルカンから、主にDP7〜DP9オリゴ糖を含む加水分解物への高温変換は、細菌又は真菌起源の加水分解エキソ酵素から選択されるエンドグルカナーゼの作用によって達成される。酵素的加水分解は、広範囲の多糖濃度にわたるタマリンド多糖を含有する水溶液中で達成することができる。したがって、反応は、タマリンド多糖を、約1重量％から多糖溶解度及び溶液粘度によってのみ制限される濃度までの濃度で水溶液に溶解させることにより実施することができる。
【００２４】
好適なエンドグルカナーゼは、多種多様な細菌及び真菌起源から選択することができる。それは、メタゲノムDNAから得ることもできる。選択されたエンドグルカナーゼの遺伝子は、大腸菌(E.coli)、バチルス属の種(Bacillus sp)、及びサーマス・サーモフィルス(Thermus thermophilus)の株を含む、好適な試験発現系でクローニングされ、その中で発現される。その後、個々の酵素は、好ましくは、DP7〜DP9オリゴ糖の生成をもたらす、所望のタマリンド多糖加水分解について試験される。好ましいエンドグルカナーゼ遺伝子は、好ましくは、好熱性微生物から得られるDNA又はメタゲノムDNAから選択及び単離される。好熱性微生物は、42℃を超える最適成長範囲を有する微生物である(Lengelerらの文献)。これらの遺伝子には、アシドサーマス属(Acidothermus)、カルディセルロシラプター属(Caldicellulosiruptor)、カルディトリクス属(Caldithrix)、クロストリジウム属(Clostridium)、デイノコッカス属(Deinococcus)、ハービニクス属(Herbinix)、ハービボラックス属(Herbivorax)、イグナウィバクテリウム属(Ignavibacterium)、ラクノクロストリジウム属(Lachnoclostridium)、メイオサーマス属(Meiothermus)、ロドサーマス属(Rhodothermus)、サーマナエロモナス属(Thermanaeromonas)、サーマナエロビブリオ属(Thermanaerovibrio)、サーモアナエロバクター属(Thermoanaerobacter)、サーモアナエロバクテリウム属(Thermoanaerobacterium)、サーモバシルス属(Thermobacillus)、サーモビフィダ属(Thermobifida)、サーモビスポラ属(Thermobispora)、サーモモノスポラ属(Thermomonospora)、サーモセジミニバクター属(Thermosediminibacter)、及びサーモトガ属(Thermotoga)という細菌属を含む細菌の群由来の耐熱性酵素が含まれる。
【００２５】
多くの場合、中温性細菌に由来する細胞外産生酵素は、高温でさえも高い安定性を有することができ、かつ本発明の方法で利用されるのに適している可能性がある。それゆえ、適切なエンドグルカナーゼを選択する別の方法は、中温性又は好冷性微生物に由来する酵素を選択することである。中温性微生物は、20〜42℃で最も良好に成長し、好冷性微生物は、20℃未満で最も良好に成長する(Lengelerらの文献)。そのようなエンドグルカナーゼは、本発明によって包含されるものとする。
【００２６】
さらに、エンドグルカナーゼ、例えば、中温性細菌に由来するエンドグルカナーゼの酵素活性は、遺伝子操作によってより高い温度に向けて改善することができる。それゆえ、適切なエンドグルカナーゼを選択する別の方法は、中温性微生物又はさらには、好冷性微生物に由来する酵素を選択すること及びその酵素活性を遺伝子操作によってより高い温度に向けて改善することである。そのようなエンドグルカナーゼは、本発明によって包含されるものとする。
【００２７】
GHファミリー5、9、12、16、44、又は74に属するエンドグルカナーゼは、中温性又は好冷性微生物、例えば、アカリオクロリス属(Acaryochloris)、アセチビブリオ属(Acetivibrio)、アセトアナエロビウム属(Acetoanaerobium)、アシディプロピオニバクテリウム属(Acidipropionibacterium)、アシドバクテリウム属(Acidobacterium)、アクチノアロテイクス属(Actinoalloteichus)、アクチノプラネス属(Actinoplanes)、アクチノポリモルファ属(Actinopolymorpha)、アクチノシンネマ属(Actinosynnema)、アエロモナス属(Aeromonas)、アグロバクテリウム属(Agrobacterium)、アグロコッカス属(Agrococcus)、アルカリゲネス属(Alcaligenes)、アルゴリファガス属(Algoriphagus)、アリシクロバチルス属(Alicyclobacillus)、アリイビブリオ属(Aliivibrio)、アリスティペス属(Alistipes)、アルカリフィルス属(Alkaliphilus)、アルカリタレア属(Alkalitalea)、アロクツネリア属(Allokutzneria)、アルテレリスロバクター属(Altererythrobacter)、アルテロモナス属(Alteromonas)、アンフィバチルス属(Amphibacillus)、アミコラトプシス属(Amycolatopsis)、アナバエナ属(Anabaena)、アナエロミクソバクター属(Anaeromyxobacter)、アクイフレクサム属(Aquiflexum)、アラキディコッカス属(Arachidicoccus)、アルカンギウム属(Archangium)、アルマチモナデテス属(Armatimonadetes)、アルセニキコッカス属(Arsenicicoccus)、アルスロバクター属(Arthrobacter)、アルスロスピラ属(Arthrospira)、アスチッカカウリス属(Asticcacaulis)、アウラチコッカス属(Auraticoccus)、アウレイモナス属(Aureimonas)、バチルス属(Bacillus)、バクテロイデス属(Bacteroides)、バルネシエラ属(Barnesiella)、ブデロビブリオ属(Bdellovibrio)、ベウテンベルギア属(Beutenbergia)、ビフィドバクテリウム属(Bifidobacterium)、ブラストクロリス属(Blastochloris)、ブラストコッカス属(Blastococcus)、ブラウチア属(Blautia)、ボセア属(Bosea)、ブラディリゾビウム属(Bradyrhizobium)、ブレブンディモナス属(Brevundimonas)、ブルセラ属(Brucella)、ブルコルデリア属(Burkholderia)、ブチリビブリオ属(Butyrivibrio)、カロトリクス属(Calothrix)、カテヌリスポラ属(Catenulispora)、カウロバクター属(Caulobacter)、セデセア属(Cedecea)、セルロモナス属(Cellulomonas)、セルロファーガ属(Cellulophaga)、セルロシリチクム属(Cellulosilyticum)、セルロシミクロビウム属(Cellulosimicrobium)、セルビブリオ属(Cellvibrio)、カマエシフォン属(Chamaesiphon)、キチノファーガ属(Chitinophaga)、クロロフレクサス属(Chloroflexus)、コンドロシスチス属(Chondrocystis)、クロモバクテリウム属(Chromobacterium)、クトノモナス属(Chthonomonas)、クラビバクター属(Clavibacter)、クロストリジウム属(Clostridium)、クヌイバクター属(Cnuibacter)、コリモナス属(Collimonas)、コルウェリア属(Colwellia)、コネクシバクター属(Conexibacter)、コプロコッカス属(Coprococcus)、コラロコッカス属(Corallococcus)、クリナリウム属(Crinalium)、クロセイコッカス属(Croceicoccus)、クルトバクテリウム属(Curtobacterium)、シアノビウム属(Cyanobium)、シアノテセ属(Cyanothece)、シクロバクテリウム属(Cyclobacterium)、シリンドロスペルマム属(Cylindrospermum)、シトファーガ属(Cytophaga)、デハロバクター属(Dehalobacter)、デハロゲニモナス属(Dehalogenimonas)、デスルフォハロビウム属(Desulfohalobium)、デスルフォトマクラム属(Desulfotomaculum)、デスルフォビブリオ属(Desulfovibrio)、ディッケヤ属(Dickeya)、ディクチオグロマス属(Dictyoglomus)、ドラコニバクテリウム属(Draconibacterium)、ディアドバクター属(Dyadobacter)、ディエラ属(Dyella)、エキ��コーラ属(Echinicola)、エムチキキア属(Emticicia)、エンシファー属(Ensifer)、エンテロバクター属(Enterobacter)、エシェリキア属(Escherichia)、ユーバクテリウム属(Eubacterium)、ファーメンティモナス属(Fermentimonas)、フィブレラ属(Fibrella)、フィブリソーマ属(Fibrisoma)、フィブロバクター属(Fibrobacter)、フィリモナス属(Filimonas)、フィムブリイモナス属(Fimbriimonas)、フランメオビルガ属(Flammeovirga)、フラビソリバクター属(Flavisolibacter)、フラボバクテリウム属(Flavobacterium)、フォルモサ属(Formosa)、フランキア属(Frankia)、フレミエラ属(Fremyella)、フロンディハビタンス属(Frondihabitans)、フエルスティア属(Fuerstia)、フソバクテリウム属(Fusobacterium)、ゲイトレリネマ属(Geitlerinema)、ゲンマティモナス属(Gemmatimonas)、ゲンマティロサ属(Gemmatirosa)、グラシエコラ属(Glaciecola)、グロエオバクター属(Gloeobacter)、グロエオカプサ属(Gloeocapsa)、グルタミシバクター属(Glutamicibacter)、ゴルドニア属(Gordonia)、ゴラメラ属(Gramella)、グラヌリセラ属(Granulicella)、グラヌロシコッカス属(Granulosicoccus)、グリモンティア属(Grimontia)、ギヌエラ属(Gynuella)、ハヘラ属(Hahella)、ハリスコメノバクター属(Haliscomenobacter)、ハロロドスピラ属(Halorhodospira)、ヘルペトシフォン属(Herpetosiphon)、ヒルシキア属(Hirschia)、ホエフレア属(Hoeflea)、ホヨセラ属(Hoyosella)、ヒメノバクター属(Hymenobacter)、ヒフォミクロビウム属(Hyphomicrobium)、イソプテリコラ属(Isoptericola)、イソスファエラ属(Isosphaera)、ヤンシノバクテリウム属(Janthinobacterium)、ヨンゲウピア属(Jeongeupia)、ヤンゲラ属(Jiangella)、ヨネシア属(Jonesia)、キブデロスポランギウム属(Kibdelosporangium)、キネオコッカス属(Kineococcus)、キリティマティエラ属(Kiritimatiella)、キタサトスポラ属(Kitasatospora)、クレブシエラ属(Klebsiella)、クリブベラ属(Kribbella)、クツネリア属(Kutzneria)、ラビリトリクス属(Labilithrix)、ラシミクロビウム属(Lacimicrobium)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、ラクニスファエラ属(Lacunisphaera)、レアドベテレラ属(Leadbetterella)、レイフソニア属(Leifsonia)、レンツェア属(Lentzea)、レプトリングビア属(Leptolyngbya)、レプトチリキア属(Leptotrichia)、リステリア属(Listeria)、ルティバクター属(Lutibacter)、リソバクター属(Lysobacter)、マヘラ属(Mahella)、マリバクター属(Maribacter)、マリカウリス属(Maricaulis)、マルモリコラ属(Marmoricola)、メガモナス属(Megamonas)、メリオリバクター属(Melioribacter)、メソリゾビウム属(Mesorhizobium)、メチロバクテリウム属(Methylobacterium)、ミクロバクテリウム属(Microbacterium)、ミクロブルビフェル属(Microbulbifer)、ミクロコレウス属(Microcoleus)、ミクロルナトゥス属(Microlunatus)、ミクロモノスポラ属(Micromonospora)、ミニシスティス属(Minicystis)、ミツアリア属(Mitsuaria)、モオレア属(Moorea)、ムシラギニバクター属(Mucilaginibacter)、ミコバクテリウム属(Mycobacterium)、ミクソバクター属(Myxobacter)、ミクソコッカス属(Myxococcus)、ナカムレラ属(Nakamurella)、ニアベラ属(Niabella)、ニアステラ属(Niastella)、ニトリスピリルム属(Nitrospirillum)、ノカルディオプシス属(Nocardiopsis)、ノノムラエア属(Nonomuraea)、ノストク属(Nostoc)、ノボスフィンゴビウム属(Novosphingobium)、オクロバクトラム属(Ochrobactrum)、オシラトリア属(Oscillatoria)、パエナルスロバクター属(Paenarthrobacter)、パエニバチルス属(Paenibacillus)、パルディバクター属(Paludibacter)、パルディスファエラ属(Paludisphaera)、パンドラエア属(Pandoraea)、パントエア属(Pantoea)、パラバクテロイデス属(Parabacteroides)、パラオエルスコウィア属(Paraoerskovia)、ペクトバクテリウム属(Pectobacterium)、ペディオコッカス属(Pediococcus)、ペドバクター属(Pedobacter)、ペロシヌス属(Pelosinus)、ペプトクロストリジウム属(Peptoclostridium)、ペプトニフィルス属(Peptoniphilus)、ファエオバクター属(Phaeobacter)、フォトバクテリウム属(Photobacterium)、フィシスファエラ属(Phycisphaera)、プランクトミセス属(Planctomyces)、プランティバクター属(Plantibacter)、プラウティア属(Plautia)、プレシオモナス属(Plesiomonas)、ポラリバクター属(Polaribacter)、ポリアンギウム属(Polyangium)、ポンティバクター属(Pontibacter)、プレボテラ属(Prevotella)、プロテイニフィルム属(Proteiniphilum)、シュードアルスロバクター属(Pseudarthrobacter)、シュードアルテロモナス属(Pseudoalteromonas)、シュードモナス属(Pseudomonas)、シュードペドバクター属(Pseudopedobacter)、シュードプロピオニバクテリウム属(Pseudopropionibacterium)、シュードキサントモナス属(Pseudoxanthomonas)、サイクロフレクサス属(Psychroflexus)、ラルストニア属(Ralstonia)、ラオウルテラ属(Raoultella)、リゾビウム属(Rhizobium)、ロドバクター属(Rhodobacter)、ロドコッカス属(Rhodococcus)、ロドブルム属(Rhodovulum)、リブラリア属(Rivularia)、ロセアテレス属(Roseateles)、ロセブリア属(Roseburia)、ルエゲリア属(Ruegeria)、ルフィバクター属(Rufibacter)、ルミニクロストリジウム属(Ruminiclostridium)、ルミノコッカス属(Ruminococcus)、ルネラ属(Runella)、サッカロファガス属(Saccharophagus)、サッカロトリクス属(Saccharothrix)、サレゲンティバクター属(Salegentibacter)、サリニスポラ属(Salinispora)、サングイバクター属(Sanguibacter)、シトネマ属(Scytonema)、セディミニスピロカエタ属(Sediminispirochaeta)、セレノモナス属(Selenomonas)、シュワネラ属(Shewanella)、シネラ属(Shinella)、シアンシウィルガ属(Siansivirga)、シミドゥイア属(Simiduia)、シノモナス属(Sinomonas)、シノリゾビウム属(Sinorhizobium)、ソリタレア属(Solitalea)、ソランギウム属(Sorangium)、スファエロカエタ属(Sphaerochaeta)、スフィンゴバクテリウム属(Sphingobacterium)、スフィンゴビウム属(Sphingobium)、スフィンゴモナス属(Sphingomonas)、スフィンゴピクシス属(Sphingopyxis)、スピロカエタ属(Spirochaeta)、スピロソマ属(Spirosoma)、シュタッケブラントティア属(Stackebrandtia)、スタニエリア属(Stanieria)、スタルケヤ属(Starkeya)、ステノトロフォモナス属(Stenotrophomonas)、スティグマテラ属(Stigmatella)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、ストレプトスポランギウム属(Streptosporangium)、シネココッカス属(Synechococcus)、シネコシスティス属(Synechocystis)、シントロフォモナス属(Syntrophomonas)、タンネレラ属(Tannerella)、テレディニバクター属(Teredinibacter)、テルリグロブス属(Terriglobus)、チオクラバ属(Thioclava)、チオラピルス属(Thiolapillus)、トレポネマ属(Treponema)、ベルコシスポラ属(Verrucosispora)、ビブリオ属(Vibrio)、キサントモナス属(Xanthomonas)、ズノングワンギア属(Zunongwangia)、並びにファミリーGH9、GH12、GH16、GH44、もしくはGH74の細菌エンドグルカナーゼの遺伝子を含む及び/又は該遺伝子を発現する任意の他の属を含む属の群に属する中温性又は好冷性細菌に由来し得る。
【００２８】
或いは、GHファミリー5、9、12、16、44、又は74に属するエンドグルカナーゼは、真核細胞又は真核生物の群、例えば、アディネタ属(Adineta)、ハラタケ属(Agaricus)、ネギ属(Allium)、アルテルナリア属(Alternaria)、アミテルメス属(Amitermes)、アンプラリア属(Ampullaria)、アノプロテルメス属(Anoplotermes)、アメフラシ属(Aplysia)、アラビドプシス属(Arabidopsis)、アレタオン属(Aretaon)、アルスロボトリス属(Arthrobotrys)、アズマザサ属(Arundinaria)、アスペルギルス属(Aspergillus)、アウロネミア属(Aulonemia)、アウストラロプラックス属(Australoplax)、アウストロテルフサ属(Austrothelphusa)、アウストルカ属(Austruca)、カラスムギ属(Avena)、ホウライチク属(Bambusa)、バンキア属(Bankia)、ベラミア属(Bellamya)、ベルグバンボス属(Bergbambos)、ベツラ属(Betula)、ビオンファラリア属(Biomphalaria)、ボトリティス属(Botrytis)、ブラキエリトルム属(Brachyelytrum)、アブラナ属(Brassica)、ブエルゲルシオクロア属(Buergersiochloa)、カメリア属(Camellia)、ナズナ属(Capsella)、トウガラシ属(Capsicum)、クリノイガ属(Cenchrus)、ヒノキ属(Chamaecyparis)、ミナミザリガニ属(Cherax)、キモノカラムス属(Chimonocalamus)、クリソスポリウム属(Chrysosporium)、クスクェア属(Chusquea)、シトラス属(Citrus)、オカヤドカリ属(Coenobita)、サトイモ属(Colocasia)、コンストリクトテルメス属(Constrictotermes)、コプトテルメス属(Coptotermes)、シジミ属(Corbicula)、キゴキブリ属(Cryptocercus)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、キュウリ属(Cucumis)、セッコク属(Dendrobium)、マチク属(Dendrocalamus)、タマホコリカビ属(Dictyostelium)、リュウガン属(Dimocarpus)、カキノキ属(Diospyros)、エイセニア属(Eisenia)、エントリア属(Entoria)、エピディニウム属(Epidinium)、ユーアスタクス属(Euastacus)、ユーカリプタス属(Eucalyptus)、トウダイグサ属(Euphorbia)、ユーリカンタ属(Eurycantha)、エクスタトソーマ属(Extatosoma)、イチジク属(Ficus)、オランダイチゴ属(Fragaria)、フザリウム属(Fusarium)、ムラサキオカガニ属(Gecarcoidea)、ゲオトリクム属(Geotrichum)、グロビテルメス属(Globitermes)、ダイズ属(Glycine)、グリプトテルメス属(Glyptotermes)、ワタ属(Gossypium)、グリギオテルメス属(Grigiotermes)、グアドゥア属(Guadua)、ハリオティス属(Haliotis)、ヘロエシウス属(Heloecius)、ヘミレイア属(Hemileia)、パラゴムノキ属(Hevea)、ヒバノバンブサ属(Hibanobambusa)、ホドテルモプシス属(Hodotermopsis)、オオムギ属(Hordeum)、ホスピタリテルメス属(Hospitalitermes)、フミコラ属(Humicola)、ボタンタケ属(Hypocrea)、イリオグラプサス属(Ilyograpsus)、アキノノゲシ属(Lactuca)、レプトグラフィウム属(Leptographium)、レプトスフェリア属(Leptosphaeria)、シロカラカサタケ属(Leucoagaricus)、リクテイミア属(Lichtheimia)、リリウム属(Lilium)、リムノリア属(Limnoria)、ミヤコグサ属(Lotus)、マクロフタルムス属(Macrophthalmus)、マクロテルメス属(Macrotermes)、マグナポルテ属(Magnaporthe)、リンゴ属(Malus)、マンゴー属(Mangifera)、サポジラ属(Manilkara)、マストテルメス属(Mastotermes)、メダウロイデア属(Medauroidea)、ウマゴヤシ属(Medicago)、メラノプシキウム属(Melanopsichium)、メロカンナ属(Melocanna)、メソセントルトゥス属(Mesocentrotus)、ミクロセロテルメス属(Microcerotermes)、ミクロテルメス属(Microtermes)、ミクティリス属(Mictyris)、ミズホペクテン属(Mizuhopecten)、ナンノクロロプシス属(Nannochloropsis)、ナスティテルメス属(Nasutitermes)、ネオカリマスティクス属(Neocallimastix)、イサザアミ属(Neomysis)、ネオサルマティウム属(Neosarmatium)、ネオテルメス属(Neotermes)、ネペンテス属(Nepenthes)、アカパンカビ属(Neurospora)、タバコ属(Nicotiana)、ニラパルバタ属(Nilaparvata)、オドントテルメス属(Odontotermes)、オイコプレウラ属(Oikopleura)、オリラ属(Olyra)、イネ属(Oryza)、オタテア属(Otatea)、オキシテナンテラ属(Oxytenanthera)、パネスティア属(Panesthia)、キビ属(Panicum)、パラセサルマ属(Parasesarma)、アオカビ属(Penicillium)、ペリカプリテルメス属(Pericapritermes)、イソゴカイ属(Perinereis)、ワニナシ属(Persea)、ペルファスマ属(Peruphasma)、ファコプソラ属(Phakopsora)、ファネロカエテ属(Phanerochaete)、インゲンマメ属(Phaseolus)、フトミミズ属(Pheretima)、マダケ属(Phyllostachys)、トウヒ属(Picea)、マツ属(Pinus)、ピロミセス属(Piromyces)、エンドウ属(Pisum)、メダケ属(Pleioblastus)、メダケ属(Pleioblastus)、メダケ属(Pleioblastus)、ポドスポラ属(Podospora)、ポプラ属(Populus)、ポプラ属(Populus)、ポルセリオ属(Porcellio)、サクラ属(Prunus)、プセウドヘリセ属(Pseudohelice)、ヤダケ属(Pseudosasa)、ナシ属(Pyrus)、ラムルス属(Ramulus)、ダイコン属(Raphanus)、レティクリテルメス属(Reticulitermes)、ロドトルラ属(Rhodotorula)、リンコテルメス属(Rhynchotermes)、キイチゴ属(Rubus)、サトウキビ属(Saccharum)、サルガネア属(Salganea)、ヤナギ属(Salix)、ニワトコ属(Sambucus)、ササ属(Sasa)、スキゾスタキウム属(Schizostachyum)、スクレロティニア属(Sclerotinia)、セミランディナリア属(Semiarundinaria)、セレンディピタ属(Serendipita)、セサルモイデス属(Sesarmoides)、セスビウム属(Sesuvium)、エノコログサ属(Setaria)、オカメザサ属(Shibataea)、マンテマ属(Silene)、シノカプリテルメス属(Sinocapritermes)、シピロイデア属(Sipyloidea)、ナス属(Solanum)、モロコシ属(Sorghum)、スフェロテルメス属(Sphaerotermes)、スポリソリウム属(Sporisorium)、ハコベ属(Stellaria)、スブリテルメス(Subulitermes)、スクレア属(Sucrea)、シンテルメス属(Syntermes)、エンマコオロギ属(Teleogryllus)、カカオ属(Theobroma)、サーモテロミセス属(Thermothelomyces)、チエラビア属(Thielavia)、ティメマ属(Timema)、トリボリウム属(Tribolium)、トリコデルマ属(Trichoderma)、コムギ属(Triticum)、ウロクロア属(Urochloa)、ウスチラゴ属(Ustilago)、ササゲ属(Vigna)、ブドウ属(Vitis)、キサントフィロミセス属(Xanthophyllomyces)、トウモロコシ属(Zea)、並びにファミリーGH5、GH9、GH12、GH16、GH44、もしくはGH74の真核生物エンドグルカナーゼの遺伝子を含む及び/又は該遺伝子を発現する任意の他の属を含む真核生物属の群に属する真核細胞又は真核生物に由来し得る。
【００２９】
エンドグルカナーゼ遺伝子を含む従来の細菌及び真核生物の属は、Carbohydrate-Active enZymes Database(CAZy)データベース(http://www.cazy.org)に掲載されている。
【００３０】
エンドグルカナーゼをコードするDNA配列を同定及び単離するために、任意のゲノム又はメタゲノム配列を、ファミリーGH5、GH9、GH12、GH16、GH44、又はGH74由来のエンドグルカナーゼのアミノ酸配列との隣接配列類似性を有するインシリコで転写されたリーディングフレームについて、バイオインフォマティクス法でスクリーニングすることができる。背景となるDNA配列は、好適な鋳型DNAを用いてPCRによりインビトロ増幅することができるか、又は合成される。合成されたDNAのコドン使用を、意図された発現宿主のコドン使用に適応させることができる。或いは、ゲノム又はメタゲノムDNAを当技術分野で公知の方法により断片化し、好適な方法で発現シグナルの後ろに連結して、ベクター-プラスミド中に入れ、意図された発現宿主に形質転換し、寒天プレート中の好適な固化培地上、又は好適な液体培地中の混合物中のいずれかにストリークした後の成長している培養物中で発現させる。本方法は、当技術分野で周知である。寒天プレート上のコロニーは、加水分解活性について、いくつかの方法によりスクリーニングすることができる。これらは、基質を、寒天培地中に、細胞をプレーティングする前の寒天培地の上の層に、又は成長したコロニーの上に広げた重層寒天中に含めることを含むが、これらに限定されない。基質は、誘導体化セルロース、例えば、カルボキシメチル-セルロース(CMC)、β-グルカン、例えば、大麦β-グルカン、キシログルカンを含む可溶性もしくは不溶性のポリマー状エンドグルカナーゼ基質、又は可溶性もしくは不溶性の発色基質、例えば、β-グルカン基質、例えば、アゾ-CM-セルロース、アゾ-大麦β-グルカン、及びアゾ-キシログルカンである。ポリマー基質由来の透明帯は、コロニー周辺の濁りの清澄化によるか、或いはコンゴレッドもしくは蛍光スチルベンなどの色素による又はウンベリフェロン誘導体による染色及び脱染色によって、インキュベーション後に目に見え;発色基質由来の透明帯、染色、又は蛍光は、不溶性材料の溶解によって、インキュベーション後に目に見える。
【００３１】
エンドグルカナーゼ活性を有する液体培養物は、下記のように、細菌細胞を破壊し、エンドグルカナーゼ活性を測定することにより同定される。活性を示す培養物中のエンドグルカナーゼ産生細胞は、当技術分野で公知の単一細胞単離のためにストリークしなければならない場合がある。単離された純粋な培養物は、記載されている活性について再検査される。エンドグルカナーゼの遺伝子は、同定されたコロニー又は培養物から、当技術分野で周知のDNA単離及びPCR増幅の方法によって単離される。
【００３２】
液体培養物、培養上清、又は酵素溶液中のエンドグルカナーゼ活性の存在は、いくつかの方法によって決定することができ、その例は、以下に列挙されている。タンパク質は、抗体ベースのアッセイ(例えば、ELISAもしくはウェスタンブロット)によるか、SDS-PAGE及びクマシーブルーもしくは銀染色によるか、又は好適な方法のいずれかによるタンパク質濃度の測定によって検出される。酵素活性は、CMC、大麦-β-グルカン、及びキシログルカンを含むエンドグルカナーゼのモデル基質、又はβ-1,4-グルコシド結合を含有する発色基質を用いて、例えば、実施例2に記載されているような、いくつかの他の方法によって決定することができる。
【００３３】
エンドグルカナーゼ活性は、セルロースのβ-グルカン分子内の内部結合におけるノンプロセッシブ型加水分解を特徴とする。加水分解点は、基質分子の長さにわたって統計的に分布している。「ノンプロセッシブ型」とは、酵素の次の加水分解作用が隣接位置で連続している様式のものではなく;該酵素が基質から離れ落ちて、次の切断のために同じ又は別の分子の異なる位置で結合し、ポリマー分子内の任意の場所で新たな切断を作り出すことを意味する。エンド型セルラーゼ活性とも呼ばれるエンドグルカン分解活性は、β-1,4-グルカン結合、例えば、混合結合型β-グルカン(例えば、大麦由来のβ-1,3-1,4-グルカン、もしくは地衣類由来のβ-1,3-1,4-グルカンであるリケニン)を含む可溶性ポリマー、又は化学修飾されたセルロース、例えば、ヒドロキシエチルセルロースもしくはカルボキシメチルセルロース(HEC、CMC)を用いる方法によって決定することができる。そのような方法の例は、以下に記載されている。
【００３４】
酵素活性は、還元末端の増加により、すなわち、新しいC1-糖末端である還元ヘミ-アセタール基を生じさせることにより、定量的に決定することができる。これらは、発色性3,5-ジニトロサリチル酸から3-アミノ-5-ニトロサリチル酸へのその還元によって定量することができ、これは、540nmでのその吸光度によって、測光法で測定することができる(Wood及びBhatの文献、1988)。別の方法は、β-1,4-グルコシダーゼを添加することによって生じるオリゴ糖を加水分解すること、並びに結果として得られた単量体グルコースを、ATP及びNADの存在下でヘキソキナーゼ及びグルコース-6-リン酸脱水素酵素を用いる組合せ酵素アッセイで定量的に決定することであることができる。還元されたNAD(NADH+)は、測光法により340nmで定量される。別のアッセイは、酵素グルコースオキシダーゼとペルオキシダーゼによる生成した過酸化水素の発色測定との併用又は電気化学的測定によるものである。オルト-フェニレンジアミンなどの色原体は、測光法による検出に使用することができる。いくつかの市販のグルコース測定アッセイ(例えば、GOD/POD)が利用可能であり、両方の方法を詳細に記載する。
【００３５】
エンドグルカナーゼ活性を決定するためのさらなる方法は、例えば、HEC、CMCなどの化学修飾されたセルロース由来の又は大麦混合結合型グルカンもしくはリケニンなどのβ-1,4-グリコシド結合を含有する可溶性β-グルカン由来の粘性ポリマー溶液の還元である。CMCと粘度計の使用は、エキソグルカナーゼ活性を有する混合物中のエンドグルカナーゼ活性を特異的に検出するための好ましい方法である。経時的な粘度の低下を決定する。粘度の減少は、セルラーゼ活性に正比例し、エンドグルカナーゼの最も感度の高い定量方法である。しかしながら、酵素活性は相対的であり、従来の酵素活性単位で表すことができない。
【００３６】
また、エンドグルカナーゼ活性測定のためのさらなる方法は、McClearyらの文献(1980)又はManganらの文献(2016)に記載されているような、発色性又は蛍光性誘導体化染色セルロース、セロデキストリン、及び/又は架橋セルロース誘導体、もしくはセロデキストリン、例えば、AZCL-HE-セルロース、アゾ-α-セルロース、アゾ-Avicel、RedCL-HE-セルロース、4,6-O-ベンジリデン-2-クロロ-4-ニトロフェニル-β-3,1-セロトリオシル-β-グルコピラノシド、4,6-O-(3-ケトブチリデン)-4-ニトロフェニル-β-D-セロペンタオシド、又は4,6-O-ベンジリデン-4-メチルウンベリフェリル-β-セロトリオシドからのオリゴ糖の遊離である。そのような基質は、可溶性であり、ポリマーを沈殿させるための特定の濃度のエタノールの添加によって区別されることもある染色オリゴ糖、又は発色体もしくは蛍光体を含有する基質のいずれかを遊離する。酵素反応の可溶性生成物は、測光法又は蛍光法によって決定することができる。一部のアッセイについては、β-グルコシダーゼを添加しなければならない。いくつかの市販のエンドグルカナーゼ測定アッセイが利用可能であり、その方法を詳細に記載する。
【００３７】
50℃よりも高い温度での酵素活性に関する活性プロファイルの増大は、例えば、エンドグルカナーゼの突然変異誘発により、好適な生成物分布を伴って達成することができる。好適には、中温性又は好冷性生物に由来するエンドグルカナーゼを突然変異誘発に供する。当業者は、酵素の特徴を最適化するために酵素に突然変異を導入する原理的技法を知っている。突然変異の例は、熱変性に対して酵素を安定化するためのジスルフィド架橋を形成するアミノ酸配列へのシステイン残基の導入である。別の態様において、熱安定性は、ランダム突然変異誘発、標的化突然変異誘発、又は指向性進化によって達成することができ、これにより、もとのアミノ酸配列の1個又は数個のアミノ酸がもとの配列と異なるアミノ酸によって置換される。別の態様において、酵素の熱安定性を増大させるために、もとのアミノ酸配列中のアミノ酸、ループ領域、又はタンパク質ドメインの欠失又は挿入を行うことができる。別の態様において、酵素の熱安定化は、カプセル化、酵素の化学的架橋、及び安定化化合物の添加によって達成することができる。そのような安定化化合物は、例えば、BSA、グリセロール、及びソルビトールである。酵素を安定化する他の方法は、50℃超で好適な酵素活性をもたらす、化学的架橋又は任意の他の方法である。
【００３８】
したがって、好ましい実施態様において、本発明の方法において使用される、50℃超で酵素活性を有するエンドグルカナーゼは、真核生物又は細菌もしくは真菌などの微生物、より好ましくは、微生物、最も好ましくは、細菌に由来する。
【００３９】
さらなる好ましい実施態様において、本発明の方法において使用される、50℃超で酵素活性を有するエンドグルカナーゼは、好熱性微生物、例えば、好熱性細菌に由来するか、又は遺伝子改変によって熱安定化される。
【００４０】
本発明による「由来する」は、対象となるエンドグルカナーゼが当業者に周知である標準的な技法に従って野生型生物から単離されることを意味する。「由来する」には、好適な宿主又は宿主細胞における対象となるエンドグルカナーゼの組換え産生も含まれる。
【００４１】
好ましい実施態様において、50℃よりも高い温度で酵素活性を有するエンドグルカナーゼは、5mM以上の好都合なオリゴ糖最終生成物阻害定数(Ki)を特徴とする。エンドグルカナーゼは、最先端の産生宿主で産生することができる。しかしながら、一部の産生宿主は、エンドグルカナーゼ標的の他に、望ましくない内在性キシログルカナーゼ酵素活性を示し得る内在性酵素を発現する。そのような望ましくない内在性酵素活性は、オリゴ糖の加水分解、望ましくない加水分解副産物、又は望ましくないトランスグリコシル化の増強をもたらし得る。加水分解又はトランスグリコシル化の増強は、例えば、より小さいオリゴ糖の量の増加、単糖の量の増加、オリゴ糖のより不均一な分布、又は好適でないオリゴ糖分布をもたらし、それにより、標的とされるDP7〜DP9 XGOSの収率を低下させ得る。それゆえ、DP7〜DP9収率の低下をもたらす望ましくないキシログルカン分解又は望ましくないXGOS分布を回避するために、産生宿主の好適性を試験するのが良い。本発明の好ましい実施態様において、エンドグルカナーゼ及び産生宿主は、副産物の形成を回避することにより、DP7〜DP9 XGOSの収率を最大化することができる。工業用XGOS産生については、エンドグルカナーゼの安定かつ総合的な産生プロセスを使用することがさらに好ましい。最も好ましくは、本発明の方法において使用されるエンドグルカナーゼは、オリゴ糖に対する、特に、DP7〜DP9 XGOSに対する活性を示す任意の内在性酵素を欠く細菌宿主で組換え産生される。それにより、他の酵素の望ましくない副活性の汚染を効果的に排除することができる。
【００４２】
好ましい方法は、配列番号1〜4を、DP7〜DP9キシログルカンオリゴ糖に対する任意のさらなる酵素活性を欠く細菌発現宿主系で発現させることである。
【００４３】
最も好ましい方法は、配列番号2〜4を、DP7〜DP9キシログルカンオリゴ糖に対する任意のさらなる酵素活性を欠く細菌宿主系で発現させることである。
【００４４】
最も好ましい宿主細胞は、酵素を分泌する原核細胞である。原核宿主細胞は、任意のグラム陽性細菌又はグラム陰性細菌であってもよい。
【００４５】
グラム陽性細菌としては、バチルス属、連鎖球菌属(Streptococcus)、ストレプトミセス属(Streptomyces)、ブドウ球菌属(Staphylococcus)、エンテロコッカス属(Enterococcus)、ラクトバチルス属(Lactobacillus)、ラクトコッカス属(Lactococcus)、クロストリジウム属(Clostridium)、ゲオバチルス属(Geobacillus)、オセアノバチルス属(Oceanobacillus)、パエニバチルス属(Paenibacillus)、及び近縁の細菌、例えば、16S rRNA遺伝子中に、前述の属の16S rRNA遺伝子と＞95％の配列同一性を有する細菌を含む属の群が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４６】
グラム陰性細菌としては、エシェリキア属(Escherichia)、シュードモナス属、サルモネラ属(Salmonella)、カンピロバクター属(Campylobacter)、ヘリコバクター属(Helicobacter)、フラボバクテリウム属、フソバクテリウム属、イリオバクター属(Ilyobacter)、ネイセリア属(Neisseria)、サーマス属(Thermus)、及びウレアプラスマ属(Ureaplasma)が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４７】
細菌宿主細胞は、任意のバチルス属、パエニバチルス属、又はゲオバチルス属細胞であってもよい。本発明の方法において使用されるエンドグルカナーゼを産生するための好適なバチルス属細胞としては、バチルス・アルカロフィルス(Bacillus alkalophilus)、バチルス・アミロリケファシエンス(Bacillus amyloliquefaciens)、バチルス・ブレビス(Bacillus brevis)、バチルス・シルクランス(Bacillus circulans)、バチルス・クラウジ(Bacillus clausii)、バチルス・コアグランス(Bacillus coagulans)、バチルス・フィルムス(Bacillus firmus)、バチルス・ラウトゥス(Bacillus lautus)、バチルス・レントゥス(Bacillus lentus)、バチルス・リケニフォルミス(Bacillus licheniformis)、バチルス・メガテリウム(Bacillus megaterium)、バチルス・プミルス(Bacillus pumilus)、ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス(Geobacillus stearothermophilus)、枯草菌(Bacillus subtilis)、及びバチルス・スリンジエンシス(Bacillus thuringiensis)細胞、並びに近縁種、例えば、16S rRNA遺伝子中に、前述のバチルス属種の16S rRNA遺伝子と＞98％の配列同一性を有するバチルス属種が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４８】
細菌宿主細胞はまた、任意の連鎖球菌属細胞であってもよい。本発明の方法において使用されるエンドグルカナーゼを産生するための好適な連鎖球菌属細胞としては、ストレプトコッカス・エキシミリス(Streptococcus equisimilis)、ストレプトコッカス・ピロゲネス(Streptococcus pyogenes)、ストレプトコッカス・ウベリス(Streptococcus uberis)、及び腺疫菌亜種ズーエピデミクス(Streptococcus equi subsp. zooepidemicus)細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００４９】
細菌宿主細胞はまた、任意のストレプトミセス属細胞であってもよい。本発明の方法において使用されるエンドグルカナーゼを産生するための好適なストレプトミセス属細胞としては、ストレプトミセス・アクロモゲネス(Streptomyces achromogenes)、ストレプトミセス・アベルミティリス(Streptomyces avermitilis)、ストレプトミセス・セリカラー(Streptomyces coelicolor)、ストレプトミセス・グリセウス(Streptomyces griseus)、及びストレプトミセス・リビダンス(Streptomyces lividans)細胞が挙げられるが、これらに限定されない。
【００５０】
細菌宿主細胞はまた、コリネバクテリウム属(Corynebacterium)細胞であってもよい。本発明の方法において使用されるエンドグルカナーゼを産生するための好適なコリネバクテリウム属細胞としては、コリネバクテリウム・グルタミクム(Corynebacterium glutamicum)細胞が挙げられるが、これに限定されない。
【００５１】
細菌宿主細胞はまた、任意のエシェリキア属細胞であってもよい。本発明の方法において使用されるエンドグルカナーゼを産生するための好適なエシェリキア属細胞としては、大腸菌(Escherichia coli)細胞が挙げられるが、これに限定されない。
【００５２】
宿主細胞はまた、真核細胞、例えば、哺乳動物、昆虫、植物、又は真菌細胞であってもよい。
【００５３】
真菌宿主細胞は、酵母細胞であってもよい。本明細書で使用される「酵母」としては、有子嚢胞子酵母(エンドミセス目(Endomycetales))、担子胞子酵母、及び不完全菌類(Fungi Imperfecti)に属する酵母(不完全酵母綱(Blastomycetes))が挙げられる。酵母宿主細胞の群としては、カンジダ属(Candida)、ハンセヌラ属(Hansenula)、クルイベロミセス属(Kluyveromyces)、ピキア属(Pichia)、サッカロミセス属(Saccharomyces)、スキゾサッカロミセス属(Schizosaccharomyces)、又はヤロウィア属(Yarrowia)細胞が挙げられるが、これに限定されない。
【００５４】
好ましい実施態様において、酵母宿主細胞は、ビール酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)、サッカロミセス・ディアスタティクス(Saccharomyces diastaticus)、サッカロミセス・ドウグラシ(Saccharomyces douglasii)、サッカロミセス・クルイベリ(Saccharomyces kluyveri)、サッカロミセス・ノルベンシス(Saccharomyces norbensis)、又はサッカロミセス・オビフォルミス(Saccharomyces oviformis)細胞を含む群から選択される。別の好ましい実施態様において、酵母宿主細胞は、クルイベロミセス・ラクティス(Kluyveromyces lactis)細胞である。別の好ましい実施態様において、酵母宿主細胞は、ヤロウィア・リポリティカ(Yarrowia lipolytica)細胞である。
【００５５】
さらなる好ましい実施態様において、真菌宿主細胞は、糸状真菌細胞である。「糸状真菌」は、下位分類の真菌類(Eumycota)及び卵菌門(Oomycota)の全ての糸状形態(Hawksworthらの文献、1995により定義されているもの)を含む。糸状真菌は、通常、キチン、セルロース、グルカン、キトサン、マンナン、及び他の複合多糖から構成される菌壁(mycelial wall)によって特徴付けられる。栄養成長は、菌糸伸長によって起こり、炭素異化は、偏性好気性である。対照的に、出芽酵母などの酵母による栄養成長は、単細胞性葉状体の出芽によって起こり、炭素異化は、発酵性であり得る。
【００５６】
好ましい実施態様において、糸状真菌宿主細胞は、アクレモニウム属(Acremonium)、アスペルギルス属(Aspergillus)、アウレオバシジウム属(Aureobasidium)、ヤケイロタケ属(Bjerkandera)、セリポリオプシス属(Ceriporiopsis)、クリソスポリウム属、コプリヌス属(Coprinus)、コリオルス属(Coriolus)、クリプトコッカス属(Cryptococcus)、フィリバシジウム属(Filibasidium)、フザリウム属(Fusarium)、フミコラ属、ボタンタケ属(Hypocrea)、マグナポルテ属(Magnaporthe)、ケカビ属(Mucor)、ミセリオフトラ属(Myceliophthora)、ネオカリマスティクス属(Neocallimastix)、アカパンカビ属(Neurospora)、パエシロミセス属(Paecilomyces)、アオカビ属、ファネロカエテ属(Phanerochaete)、フレビア属(Phlebia)、ピロミセス属、プレウロトゥス属(Pleurotus)、スキゾフィルム属(Schizophyllum)、タラロミセス属(Talaromyces)、サーモアスクス属(Thermoascus)、チエラビア属(Thielavia)、トリポクラジウム属(Tolypocladium)、トラメテス属(Trametes)、又はトリコデルマ属細胞を含む群から選択される。
【００５７】
好ましい実施態様において、糸状真菌宿主細胞は、アワモリコウジカビ(Aspergillus awamori)、アスペルギルス・フミガートゥス(Aspergillus fumigatus)、アスペルギルス・フォエティドゥス(Aspergillus foetidus)、アスペルギルス・ジャポニクス(Aspergillus japonicus)、アスペルギルス・ニデュランス(Aspergillus nidulans)、クロコウジカビ(Aspergillus niger)、又はニホンコウジカビ(Aspergillus oryzae)細胞を含む群から選択される。別の好ましい実施態様において、糸状真菌宿主細胞は、フザリウム・バクトリディオイデス(Fusarium bactridioides)、フザリウム・セレアリス(Fusarium cerealis)、フザリウム・クロックウェレンス(Fusarium crookwellense)、フザリウム・クルモルム(Fusarium culmorum)、フザリウム・グラミネアルム(Fusarium graminearum)、フザリウム・グラミヌム(Fusarium graminum)、フザリウム・ヘテロスポルム(Fusarium heterosporum)、フザリウム・ネグンディ(Fusarium negundi)、フザリウム・オキシスポルム(Fusarium oxysporum)、フザリウム・レティクラトゥム(Fusarium reticulatum)、フザリウム・ロゼウム(Fusarium roseum)、フザリウム・サンブシヌム(Fusarium sambucinum)、フザリウム・サルコクロウム(Fusarium sarcochroum)、フザリウム・スポロトリキオイデス(Fusarium sporotrichioides)、フザリウム・スルフレウム(Fusarium sulphureum)、フザリウム・トルオスム(Fusarium torulosum)、フザリウム・トリコテシオイデス(Fusarium trichothecioides)、又はフザリウム・ベネアトゥム(Fusarium venenatum)細胞を含む群から選択される。別の好ましい実施態様において、糸状真菌宿主細胞は、ヤケイロタ(Bjerkandera adusta)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・アネイリナ(Ceriporiopsis aneirina)、セリポリオプシス・カレギエア(Ceriporiopsis caregiea)、セリポリオプシス・ギルベセンス(Ceriporiopsis gilvescens)、セリポリオプシス・パンノシンタ(Ceriporiopsis pannocinta)、セリポリオプシス・リブローサ(Ceriporiopsis rivulosa)、セリポリオプシス・スブルファ(Ceriporiopsis subrufa)、セリポリオプシス・スブベルミスポラ(Ceriporiopsis subvermispora)、クリソスポリウム・ケラチノフィルム(Chrysosporium keratinophilum)、クリソスポリウム・ルクノウェンス(Chrysosporium lucknowense)、クリソスポリウム・トロピクム(Chrysosporium tropicum)、クリソスポリウム・メルダリウム(Chrysosporium merdarium)、クリソスポリウム・イノプス(Chrysosporium inops)、クリソスポリウム・パンニコーラ(Chrysosporium pannicola)、クリソスポリウム・クイーンズランディクム(Chrysosporium queenslandicum)、クリソスポリウム・ゾナトゥム(Chrysosporium zonatum)、コプリヌス・シネレウス(Coprinus cinereus)、コリオルス・ヒルストゥス(Coriolus hirsutus)、フミコラ・インソレンス(Humicola insolens)、フミコラ・ラヌギノサ(Humicola lanuginosa)、ムコル・ミエヘイ(Mucor miehei)、ミセリオフトーラ・サーモフィラ(Myceliophthora thermophila)、アカパンカビ(Neurospora crassa)、ペニシリウム・プルプロゲヌム(Penicillium purpurogenum)、ファネロカエタ・クリソスポリウム(Phanerochaete chrysosporium)、フレビア・ラディアータ(Phlebia radiata)、エリンギ(Pleurotus eryngii)、チエラビア・テルレストリス(Thielavia terrestris)、トラメテス・ウィローサ(Trametes villosa)、カワラタケ(Trametes versicolor)、トリコデルマ・ハルジアヌム(Trichoderma harzianum)、トリコデルマ・コニンギ(Trichoderma koningii)、トリコデルマ・ロンギブラキアトゥム(Trichoderma longibrachiatum)、トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)、又はトリコデルマ・ビリデ(Trichoderma viride)細胞を含む群から選択される。
【００５８】
最も好ましい実施態様において、エンドグルカナーゼは、本発明の方法において使用され、ここで、該エンドグルカナーゼは、配列番号1〜配列番号4から選択されるアミノ酸配列を有するポリペプチドと少なくとも75％の配列同一性を有する。
【００５９】
配列番号1によるエンドグルカナーゼは、クロストリジウム・サーモセラム(Clostridium thermocellum)から単離された。
【００６０】
最も活発にヘミセルロースを分解する細菌の中で、ハービボラックス・サクシノコラ(Herbivorax saccincola) SR1は、好熱性牧草サイレージ/牛糞バイオガス反応器から単離された。これは、45〜65℃の温度で成長し、60℃の最適温度を有し、キシラン、キシログルカン、及び結晶セルロースを発酵することが見出された。ハービボラックス・サクシノコラは、ルミノコッカス科(Ruminococcaceae)の新しいファミリーとして分類された(Koeckらの文献、2016)。細菌のゲノム配列の中で、GHファミリー5に属する配列が同定された(Pechtlらの文献、近刊)。そのリーディングフレームは、大腸菌でクローニングされており、発現及び精製された遺伝子産物の特徴が解析されている。配列番号2のエンドグルカナーゼが本発明の目的のための好適な酵素として選択されている。したがって、特に好ましい実施態様において、本発明の方法において使用されるエンドグルカナーゼは、新たに分離された微生物ハービボラックス・サクシノコラのDSM101079に由来し、かつ単離された新しい配列番号2のポリペプチドと少なくとも75％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドから本質的になるか又は該ポリペプチドからなる。
【００６１】
さらなる特に好ましい実施態様において、該エンドグルカナーゼは、配列番号4のポリペプチドと少なくとも75％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むか、該ポリペプチドから本質的になるか、又は該ポリペプチドからなり、ここで、該エンドグルカナーゼでは、ドックリン(dockerin)ドメインが欠失しており、それにより、7倍の酵素活性の増加がもたらされる。配列番号4のポリペプチドは、好適には、ドックリンドメインを欠失させることにより、配列番号2のポリペプチドから得られる。
【００６２】
別の特に好ましい実施態様において、該エンドグルカナーゼは、配列番号3のポリペプチドと少なくとも75％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むか、該ポリペプチドから本質的になるか、又は該ポリペプチドからなり、ここで、該エンドグルカナーゼでは、ドックリンドメインが欠失しており、それにより、4倍の酵素活性の増加がもたらされる。配列番号3のポリペプチドは、好適には、ドックリンドメインを欠失させることにより、配列番号1のポリペプチドから得られる。
【００６３】
さらなる実施態様において、本発明の方法は、加水分解物の処理工程をさらに含む。加水分解物を、例えば、最先端の方法で処理して、固形物、塩、及び不純物を除去することができる。得られるオリゴ糖溶液を、任意に、活性炭又は任意の他の最先端の脱色方法による処理によって脱色する。最後に、DP7〜DP9 XGOSを実質的に含む精製オリゴ糖混合物を凍結もしくは噴霧乾燥又は回転乾燥により乾燥させて、流通用に製剤化もしくは包装することができる流動性の良い粉末としての多機能食品添加物を提供することができるか、或いは該精製オリゴ糖混合物を濃縮液体製剤として保存する。DP7〜DP9 XGOSの残りの混合物は、得られる低カロリーの食品の官能特性を損なうことなく高いレベルで、加工食品の代謝可能な炭水化物成分を一部代用することができる。重要なことに、食品におけるDP7〜DP9 XGOS混合物の使用は、フレーバー強度に影響を及ぼすことなく、フレーバー担体として、脂肪含有量の低下も可能にする。
【００６４】
本発明に従って、タマリンド胚乳多糖の高温かつ単一の酵素加水分解を利用して、多機能食品添加物を調製する。さらに、本発明に従って、50℃よりも高い温度で酵素活性プロファイルを有するエンドグルカナーゼを用いて、タマリンド多糖を、DP7、DP8、及びDP9 XGOSを実質的に含むと考えられる食品等級の加水分解物に高い収率で変換する。典型的には、エンドグルカナーゼは、50.5〜約80℃、好ましくは、55〜75℃、より好ましくは、55〜70℃、最も好ましくは、55〜65℃の範囲の反応温度で活性プロファイルを有する。
【００６５】
より好ましくは、50℃よりも高い温度で活性プロファイルを有するエンドグルカナーゼは、タマリンド多糖を選択的に加水分解して、DP7、DP8、及びDP9 XGOSを含むオリゴ糖混合物を生じさせる。典型的には、本発明によるタマリンド多糖の酵素的加水分解は、キシログルカン多糖の大部分がDP7〜DP9 XGOSに加水分解されるまで継続される。
【００６６】
好ましい実施態様において、使用される最終的なタマリンド多糖基質量は、本発明の方法において、100g/L、200g/L、300g/L、400g/L、500g/L、600g/L、700g/L、及び750g/L以上である。
【００６７】
別の好ましい実施態様において、キシログルカン基質に対して0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、又は0.5％のエンドグルカナーゼが、本発明の方法において使用される。
【００６８】
さらなる好ましい実施態様において、タマリンド多糖基質の25％、35％、45％、55％、65％、及び75％超、又はそれより多くが加水分解されて、DP7〜DP9 XGOSを実質的に生じる。本発明との関連における「実質的に生じさせる」とは、加水分解物中の全てのオリゴ糖の画分としてのDP7〜DP9 XGOSの含有量が、少なくとも50％以上、好ましくは、60％もしくは70％、より好ましくは75％、最も好ましくは80％、又はそれを上回ることを意味する。
【００６９】
さらに好ましくは、DP7〜DP9 XGOSを実質的に生じるまでの反応時間は、72時間〜12時間又はそれ未満、より好ましくは72時間、又は60時間、48時間、もしくは36時間、最も好ましくは24時間、12時間、又はさらにはそれ未満の範囲内にある。
【００７０】
本発明の方法の最も好ましい実施態様において、使用される最終的なキシログルカン基質量は500g/L以上であり、酵素濃度は0.05％未満であり、かつ加水分解は、24時間未満で少なくとも65％のDP7〜DP9 XGOSを実質的に生じる。
【００７１】
最も好ましい実施態様において、本発明によるキシログルカン源からキシログルカンオリゴ糖(XGOS)を産生するための方法は:
・50℃よりも高い温度でキシログルカナーゼ活性を示すエンドグルカナーゼによる、50℃よりも高い温度でのキシログルカンの酵素的加水分解、
・固形物の除去、
・塩の除去、
・さらなる不純物の除去、
・任意に、加水分解物の脱色、
・例えば、凍結もしくは噴霧乾燥又は回転乾燥による加水分解物の乾燥、或いは濃縮液体製剤としての加水分解物の保存
という工程を含む。
【００７２】
タマリンド多糖の必要な加水分解を達成するために使用されるべきエンドグルカナーゼの量は、反応条件及びエンドグルカナーゼの活性レベルによって決まる。最適条件下では、エンドグルカナーゼを、タマリンド多糖出発材料と比べて、0.005％wt/wt程度の少ない量で使用することができる。典型的には、加水分解物の産生に適したエンドグルカナーゼの濃度は、タマリンド多糖出発材料と比べて、0.005％〜0.5％、好ましくは0.01％〜0.5％、より好ましくは0.05％〜0.5％wt/wtの範囲である。本発明の方法において使用されるエンドグルカナーゼの典型的な量は、タマリンド多糖出発材料と比べて、0.01％、0.05％、0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、又は0.5％wt/wtである。反応時間は、使用されるエンドグルカナーゼ及び加水分解条件によって様々に異なり得る。典型的な反応温度は、50.5〜約80℃、好ましくは55〜75℃、より好ましくは55〜70℃、最も好ましくは55〜65℃の範囲である。
【００７３】
したがって、さらなる最も好ましい実施態様において、本発明によるキシログルカン源からキシログルカンオリゴ糖(XGOS)を産生するための方法は:
・50.5〜80℃の範囲の温度でキシログルカナーゼ活性を示すエンドグルカナーゼによる、50.5〜80℃の範囲の温度でのタマリンド多糖の酵素的加水分解、
・固形物の除去、
・塩の除去、
・さらなる不純物の除去、
・任意に、加水分解物の脱色、
・例えば、凍結もしくは噴霧乾燥又は回転乾燥による加水分解物の乾燥、或いは濃縮液体製剤としての加水分解物の保存
という工程を含む。
【００７４】
本発明によるキシログルカン源からキシログルカンオリゴ糖(XGOS)を産生するための方法の一実施態様の工程は、図2で可視化されている。
【００７５】
(具体的な実施態様)
本発明のより具体的な実施態様において、タマリンドオリゴ糖の加水分解は、次のように実施することができる。
【００７６】
タマリンドカーネルパウダー(TKP)又は脱脂TKPを、50.5〜70℃、好ましくは、50.5〜65℃、より好ましくは、50.5〜60℃の範囲の温度、最も好ましくは、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、又は60℃の温度で、水又は脱塩水に溶解させる。TKPの最終濃度は、それぞれ、1、10、20、30、40、50、60、75％(wt/vol)である。所望の温度で撹拌することにより、TKPを水に添加する。TKPを溶解させる1つの例は、最終的なTKP濃度に達するまで一工程でTKPを添加することであり、別の例は、最終的なTKP濃度を達成するために、TKPを定期的に又は連続的に添加することである。
【００７７】
酵素は、加水分解の開始時に、液体又は乾燥調剤可溶性酵素として添加することができる。酵素的加水分解の別の例は、マトリックスに結合させることにより、酵素を固定化することである。1つの例では、TKPが添加される前の液体に酵素を溶解させる。別の例では、溶解したTKPに酵素を添加する。
【００７８】
別の例は、高いTKP回転率及び高い生成物濃度を達成するために、TKPを進行中のTKP加水分解反応混合物に定期的に添加することである。
【００７９】
多糖加水分解反応の進行は、この目的のために適合させた標準的な分析技法によりモニタリングすることができる。これらは、薄層クロマトグラフィー(TLC)、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)及びその変種のパルスドアンペロメトリック検出を伴う高速陰イオン交換クロマトグラフィー(HPAEC-PAD)、サイズ排除クロマトグラフィー(SEC)、核磁気共鳴(NMR)、レーザー誘起蛍光検出を伴うキャピラリーゾーン電気泳動(CZE-LIF)、飛行時間型検出を伴うマトリックス支援レーザー脱離イオン化(MALDI-TOF)、及び結合質量分析を伴う液体クロマトグラフィー(LC-MS)などの技法である。HPAEC-PADを用いて、本発明のためのオリゴ糖を調べることができる。HPAEC-PADは、特に、極めて特異的でかつ感度の高い検出、及び高分解能のオリゴ糖分離を特徴としており、ほとんどの場合、これを用いて、本発明の結果を出した。さらに、これは、事前の誘導体化を必要とせず、ほぼ自動化して実施することができる。HPAEC-PADは、高度にアルカリ性の条件で実行される。
【００８０】
加水分解産物として生じると考えられる分析物は、定量用の参照標準として使用される適切な濃度で水に溶解させることができる。これらは、L-(+)-アラビノース及びD-(+)-マンノースを除く単糖(Sigma Aldrich, St. Louis, USAから入手可能)を含み、これらは、例えば、それぞれ、Carl Roth GmbH & Co KG(Karlsruhe, Germany)及びServa Electrophoresis GmbH(Heidelberg, Germany)から購入することができる。ガラクツロン酸及びグルクロン酸は、Merck Millipore GmbH(Dusseldorf, Germany)及びSigma Aldrichから購入することができる。オリゴ糖は全て、Applichem GmbH(Gatersleben, Germany)から購入することができるセロビオース(C2)を除き、Megazyme(Bray, Ireland)から購入することができる。D-マンニトールは、内部標準(ISTD)として使用することができ、Sigma Aldrichから購入することができる。
【００８１】
HPAEC-PADによる分析のために、CarboPac(商標) PA1カラム(4×250mm)及びPA1-プレカラム(4×50mm)を備えたThermo Fisher Scientific(Waltham, USA)製のICS 3000 Dionexクロマトグラフィーシステムを使用することができる。このシステムは、PEEKチュービング(内径0.25mm)、GM-4勾配ミキサー(2mm)、0.25μLのチャネル容量のEDアンペリメトリーセル、pH-Ag/AgCl基準電極、0.002インチのガスケット、及び使い捨て金電極を用いて組み立てることができる。泳動は、30℃のカラム温度で、25μLの注入容量及び1mL/分の流速で行った。分析物分離のための好適な溶離剤勾配は、例えば、100mM NaOH及び7.5mM酢酸ナトリウム(NaOAc)を用いて、0分で開始する。後者は、100mM NaOHを維持しながら、67.5分で100mMまで直線的に増大させることができる。カラムを洗浄するために、NaOAcの濃度を650mMまで100mM NaOHで4分間増大させ、その後、各々の泳動後、100mM NaOHで16.3分間再平衡化する。PADによる炭水化物検出は、1又は2Hzに設定された「標準炭水化物四重線(quad)」波形(波形B)に基づく。多糖加水分解物の分析の前に、試料を再蒸留水で10〜200mg/lの最終XGOS濃度まで希釈する。分解産物は、上記のオリゴ糖標準(各々10〜200mg L-1)との比較により同定することができる。
【００８２】
TLCによる加水分解物の分析を多重試料の並行迅速分析に使用することができる。TLCは、例えば、Merck Millipore GmbH(Duesseldorf, Germany)製のシリカゲル60プレートを静止相として、8:2 v/vのアセトニトリル-水を移動相として用いて実施することができる。染色のために、プレートに、0.5mLの85％リン酸が新たに添加された5mL染色溶液(100mLアセトン、1gジフェニルアミン、1mLアニリン)を噴霧する。噴霧は、Sarstedt(Nurmbrecht, Germany)製のDESAGA ChromaJet DS 20を用いて行うことができる。その後、プレートを120℃で20分間顕色させる。各々の加水分解物及び陰性対照の適用容量は、各々の分析物について、例えば、4.5μL及び1μLの1μg/μLストック溶液である。
【００８３】
DP7〜DP9 XGOSを含む加水分解産物は、遠心分離、沈降、又はデカント処理によって、加水分解反応混合物から単離することができる。必要な場合、加水分解物溶液中のタンパク質成分は、反応混合物を少なくとも90℃、好ましくは、約95℃〜100℃の温度に加熱することにより変性させる(＝不活化する)ことができる。その後、変性したタンパク質成分は、沈降、デカント処理、又は濾過によって、加水分解物溶液から除去することができる。上清中の残存する可溶性タンパク質は、加水分解物溶液を従来の濾過技法に適用することよるか、又は加水分解物溶液を任意の市販のイオン交換樹脂と接触させることにより除去することができる。これは、例えば、加水分解物溶液を樹脂でスラリー化して、濾過することによるか、又は加水分解物溶液をイオン交換樹脂が充填されたカラムに通すことにより達成することができる。加水分解物溶液の処理に望ましいが、必ずしも必要ではない別の工程は、加水分解物溶液を活性炭で処理することである。これは、活性炭を、通常、溶解した加水分解物の約5〜20重量％に等しい量で、加水分解物溶液に添加し、該加水分解物溶液を加熱し、その後、該加水分解物溶液を、好ましくは、セライトなどのフィルター補助器具の使用による濾過工程に供することにより達成することができる。そのような処理は、加水分解物溶液を脱色するのに、及び有機不純物の濃度を低下させるのに効果的である。
【００８４】
粗炭水化物加水分解物は、例えば、溶液乾燥技法、好ましくは、凍結乾燥もしくは噴霧乾燥によるか、又は溶質、より好ましくは、アルコール、最も好ましくは、エタノールによる沈殿と、それに続く、濾過による、標準的な炭水化物単離技法を用いて、処理された加水分解物溶液から単離することができ、ここで、濾過は、メンブレン濾過を含むことができる。これらの手順は、脱色及び/又は滅菌などの追加の効果を有し得る。加水分解物オリゴ糖の選択的短鎖アルコール沈殿を用いて、DP7〜DP9 XGOSを含むか、DP7〜DP9 XGOSから本質的になるか、又はDP7〜DP9 XGOSからなる加水分解物産物を提供することができる。さらに、同じ結果を、限外濾過もしくはナノ濾過技法を利用することによるか、又は(連続的)擬似移動床式クロマトグラフィーを使用することにより達成することができる。
【００８５】
反応後、加水分解物オリゴ糖(XGOS)を非多糖材料から分離することができる。物理的分離の例は、沈降及び濾過である。分離は、自然沈降もしくは沈下、繊維、織布、もしくは膜フィルターを備えたタンジェントフロー濾過、粒状媒体を利用する濾過、急速フィルターもしくは緩速砂フィルター、又は多孔質セラミックフィルターにより行われることができる。分離の他の例は、凝固、凝集、及び沈殿のような化学的方法である。
【００８６】
XGOS含有加水分解物の精製は、粘土、木炭、又は活性炭などの吸着剤よる吸着処理、合成又は有機ポリマー樹脂及びキレート樹脂によるイオン交換処理、短鎖アルコールによる溶媒沈殿、電気透析、並びに乾燥によって達成することができる。さらに、合成膜を利用する精密濾過、限外濾過、ナノ濾過、逆浸透、及び透析を含む膜処理を精製工程で使用することができる。
【００８７】
生成物XGOS混合物は、典型的には、乾燥した、流動性の良い、白からクリーム色の粉末として単離される。或いは、処理された加水分解物溶液又は濃縮されたDP7〜DP9シロップは、XGOS混合物を加工食品レシピに直接導入することにより、それ自体、食品又は飼料添加物として使用することができる。
【００８８】
本発明の方法は、エンドグルカナーゼで処理されるタマリンド多糖が、DP7〜DP9 XGOSを含むか、DP7〜DP9 XGOSから本質的になるか、又はDP7〜DP9 XGOSからなる産物を生じるという利点を有する。好ましい実施態様において、DP7〜DP9 XGOSの理論的に達成可能なオリゴ糖からの収率は、少なくとも50％以上、好ましくは60％又は70％、より好ましくは75％、最も好ましくは80％以上である。さらなる実施態様において、該産物、すなわち、本発明の方法を用いて産生されるXGOS混合物中の単糖含有量は、5％未満、好ましくは4％又は3％未満、より好ましくは2％未満、最も好ましくは1％未満、例えば、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、又はそれよりさらに低い。したがって、本発明の方法は、DP7よりも小さいオリゴ糖のさらなる分離もしくは除去;又は単糖の除去が必要とされないので、経済的である。固形物、塩、及び着色剤は、クロマトグラフィー又は吸着などの確立された技術によって分離及び除去される。
【００８９】
本発明はさらに、本発明の方法によって取得可能なXGOS含有加水分解物、特に、DP7〜DP9 XGOSを含むか、DP7〜DP9 XGOSを実質的に含むか、又はDP7〜DP9 XGOSからなるXGOS含有加水分解物に関する。本発明の方法に従って調製されるXGOS混合物は、産生プロセスに応じて、無臭のシロップ又は粉末である。味は甘く、他の大きな後味はない。本発明の方法に従って調製されるXGOS混合物は、酸分解及び熱に対して安定である。さらに、本発明の方法に従って調製されるXGOS混合物は、インビトロでの代謝安定性を示す。
【００９０】
本発明に従って、タマリンドキシログルカン多糖の高温での酵素的加水分解によって産生されるDP7〜DP9 XGOSを含むか、該DP7〜DP9 XGOSを実質的に含むか、又は該DP7〜DP9 XGOSからなるXGOS混合物を調製するためのプロセスが提供される。産物のタマリンド加水分解物は、加工食品の代謝可能な炭水化物成分の少なくとも一部の代用品として使用したとき、非常に優れた食品機能特性を示すことが分かっている。したがって、本発明の別の実施態様において、その通常の代謝可能な甘味炭水化物内容物の少なくとも一部が、本発明の方法を用いて調製される、特に、タマリンドオリゴ糖の加水分解から調製される、XGOS混合物によって代用されているか又は置き換えられている加工食品が提供される。典型的には、本発明のXGOS混合物の約1〜約2部、好ましくは、1〜2部が、従来の加工食品中の代謝可能な炭水化物の各部を置き換えている。
【００９１】
(用途)
単離されたタマリンド種子多糖の種々の用途が記載されている(Rao及びSrivastavaの文献、1973を参照)。多糖は、幅広いpH範囲にわたる糖濃度のゼリーを形成する能力を有する。これは、アイスクリーム及びマヨネーズの安定剤として食品中でも使用されている。さらに、織物産業は、綿及び人造絹糸のサイジング、仕上げ、及びプリントにタマリンド多糖を利用している。美容産業において、タマリンド多糖は、エッセンシャルオイル、シェービングクリーム、及び歯磨剤のエマルジョンを調製するために使用されている。これはまた、圧縮丸剤及び錠剤の製造における結合剤として、非油性軟膏の製造における賦形剤として、並びにコロイド状ヨウ素ゼリーの調製におけるゲル化剤として使用されている。
【００９２】
タマリンド多糖加水分解物は、低カロリー加工食品を提供するための加工食品の代謝可能な炭水化物内容物の機能的代用物として、本発明に従って使用することができる。タマリンド多糖のエンドグルカナーゼ加水分解によって提供されるDP7〜DP9 XGOSを含む組成物は、改質食品の官能特性に悪影響を及ぼすことなく、加工食品中の代謝可能な炭水化物の60％もの量を代替することができることが分かっている。さらに、加工食品におけるそのようなオリゴ糖組成物の使用も、同様に、食品品質に対する目立った影響なしで、脂肪含有量の低下を可能にする。より具体的には、例えば、WO 91/11112 A1号から、タマリンド加水分解物(DP7〜DP9オリゴ糖)が加工食品組成物中の炭水化物の約10〜約40％を代替している場合、脂肪含有量を25％も低下させることができることが分かっている。したがって、加工食品中の炭水化物代用物としてのタマリンド加水分解物の使用は、カロリー含有量の顕著な低下を可能にする。また重大なことに、加水分解物は、他の当技術分野で認められている炭水化物加水分解物よりも均一な組成(DP7〜DP9 XGOSのかなりの重量パーセンテージ)を有しており−それゆえ、その機能的性能は、多種多様な加工食品において極めて予測可能である。DP7〜DP9 XGOSを含むか、DP7〜DP9 XGOSから本質的になるか、又はDP7〜DP9 XGOSからなる、本発明の方法を用いて調製されるタマリンド多糖加水分解物の別の利点は、当技術分野で認められている食品添加物のゴムとは異なり、多糖加水分解物を、その粘度の高さのために、その加工に悪影響を及ぼすことなく、加工食品中に高レベルで使用することができることである。
【００９３】
本発明の方法を用いて産生されるタマリンド由来DP7〜DP9 XGOS混合物を本発明に従って用いて、キャンディー、チューインガム、ドライケーキ及びクッキーミックス、冷凍乳製品デザート、クリーム、栄養バー、ゼラチンデザート、プリン、焼き菓子、並びにスプーンですくえるドレッシングなどの低カロリー食品を産生することができる。さらに、これは、衣用生地/製品粘度の顕著な増加を伴わないで、充填剤として利用することができる。該混合物は、水に素速く溶解して、透明な、ほぼ無色の溶液を生じることが分かっている。これは、合成甘味料用のノンカロリーキャリアとして使用することができる。合成甘味料と混合し、アイスティー又はホットコーヒーのいずれかに添加すると、製品の溶解が即座に起こる。さらに、タマリンド由来XGOS加水分解物は、甘味増強剤として作用することができる。高品質の焼いたクッキーは、加水分解物をもとのクッキーレシピで求められる糖の約10〜約40％の代わりに使用することにより調製することができる。別の用途において、タマリンド由来XGOS加水分解物は、コーヒーホワイトナーを産生するために、粉ミルク固形物と組み合わされる。
【００９４】
したがって、一実施態様において、本発明は、食品を産生するための、本発明の方法を用いて産生されるDP7〜DP9 XGOSを含むか、該DP7〜DP9 XGOSから本質的になるか、又は該DP7〜DP9 XGOSからなるXGOS混合物の使用を提供する。本発明は、本発明の方法を用いて産生されるXGOS混合物を含む食品をさらに提供する。
【００９５】
さらなる実施態様において、本発明は、栄養摂取において使用するための、例えば、食品中のカロリーを低下させるための又は食品の食感を改善するための、本発明の方法を用いて産生されるXGOS混合物を提供する。
【００９６】
さらなる実施態様において、本発明は、ヒトの健康上の利益のための、例えば、食事摂取後に血糖値を低下させるための又は満腹剤としての、本発明の方法を用いて産生されるXGOS混合物を提供する。疾患の治療方法における、例えば、糖尿病の治療方法における、本発明の方法を用いて産生されるXGOS混合物の使用も想定され、該方法は、本発明の方法を用いて産生されるXGOS混合物をそれを必要としている対象に投与することを含む。疾患、例えば、糖尿病の治療のための薬剤の調製のための、本発明の方法を用いて産生されるXGOS混合物の使用がさらに想定される。
【００９７】
本発明の方法を用いて産生されるXGOS混合物は、動物の栄養摂取においても有利である。したがって、本発明は、動物の栄養摂取で使用するための及び飼料製品を産生するための、本発明の方法を用いて産生されるXGOS混合物を提供する。
【００９８】
オリゴ糖は、ヒト及び/又は動物の栄養摂取におけるプレバイオティックとして使用することができる。したがって、本発明は、プレバイオティックとして使用するための、例えば、腸内微生物叢の刺激において使用するための、本発明の方法を用いて産生されるXGOS混合物を提供する。
【００９９】
「プレバイオティック」という用語は、宿主の健康及び幸福にとって有益な腸内微生物叢の組成及び/又は活性の特異的変化を引き起こす非消化性の選択発酵食品成分と理解されるべきである(Gibsonらの文献、2004)。プレバイオティックは、特に、腸障害を予防し、ミネラルの吸収を増強し、脂質代謝を調節し、かつ/又は免疫系を刺激することができる、ビフィズス菌及び乳酸桿菌などの、結腸の好ましい細菌の栄養物と考えることができる。
【０１００】
食品成分を摂取することにより、腸内微生物叢のバランスを調節すること可能であることが発見されて以来、「プレバイオティック」という呼称の数多くの候補が研究されている。ほとんどは、植物性炭水化物である。最も有名で、かつより特徴付けられているのは、フルクトース重合体のフルクタンであり、その中には、通常はチコリの塊茎から抽出されるが、アガベからも抽出されるイヌリン、及びイヌリンの加水分解によるか、又はサッカロース由来フルクトースからの生合成によって産生されるフルクト-オリゴ糖(FOS)がある。
【０１０１】
他のオリゴ糖:母乳中に存在する化合物に非常に近いガラクト-オリゴ糖(GOS)又は「trans-ガラクト-オリゴ糖」(TOS)、ダイズオリゴ糖(SOS)、イソマルト-オリゴ糖(IMOS)、ラクツロース、ラフィノース、キシロ-オリゴ糖(XOS)なども、多かれ少なかれ特徴付けられているプレバイオティック特性を有する
【０１０２】
既に十分特徴付けられたプレバイオティック(例えば、FOS及びGOS)に対して、並びに多数の候補分子に対して実施された数多くの研究にもかかわらず、健康機能性を有する食品及び飲料の(潜在的)産生者によって求められる以下の特性:簡単かつ経済的な産生方法、所望の結果を実際に得るための十分な濃度の使用を可能にする非常に良好な腸耐性(intestinal tolerance)、並びに加熱処理に対する及び巨大な食品産業の部門で普及している従来の酸性培地に対する高い安定性を兼ね備えるプレバイオティックが、今日に至るまで、依然として欠如している。
【０１０３】
既存のプレバイオティックは、限られた数の食品用途(特に、ヒト化ミルク)でのみ及びインビトロ/インビボ又はさらには臨床研究によって理論的に可能な効果を保証することを必ずしも可能にしない濃度で使用される。
【０１０４】
本明細書に記載されているように、本発明の方法に従って調製されるXGOS混合物は、酸分解及び熱に対して安定である。さらに、本発明の方法に従って調製されるXGOS混合物は、消化酵素に対するインビトロでの代謝安定性を示す。さらに、キシログルカン由来オリゴ糖は、腸内微生物叢の一般的な基質ではなく;対照的に、該オリゴ糖は、ラクトバチルス・アシドフィルス(Lactobacillus acidophilus)及びバクテロイデス・オバトゥス(Bacteroides ovatus)を特異的に刺激することが科学文献中で示されている(Hartemikらの文献、1996)。Larsbrinkら(2014)は、バクテロイデス属の選択されたヒト腸内細菌がキシログルカンを代謝することができることを証明した。健康なヒトに有益であることを証明するのが難しいプレバイオティック効果の他に、オリゴ糖は、食物消費後の消化及び食後血糖応答の低下に関してプラスの効果を示した。EFSAは、FOS、GOS、及び他の非代謝性オリゴ糖を含む非消化性炭水化物が小腸での加水分解及び吸収に抵抗性であると明言した。EFSAは、腸機能に関する入手可能な証拠に基づいて、EFFSAパネルが25g/日の食物繊維摂取量が成人の正常な便通に適切であると考えていると明言した(EFSA Journal 2010; 8(3):1462)。2014年、EFSAは、糖含有食品/飲料と比較した、食後血糖応答及びインスリン応答の低下に関するオリゴ糖含有食品/飲料の健康上の利益を認めた。FOS及びGOSを含む非消化性炭水化物は、食後血糖応答に寄与しない。この見解は、主張されている効果を得るために食品又は飲料中の糖に取って代わるべき非消化性炭水化物(例えば、非デンプン多糖、難消化性オリゴ糖、及び難消化性デンプン)に当てはまる(EFSA Journal 2014; 12(10):3838及びEFSA Journal 2014;12(1):3513)。
【０１０５】
他の潜在的用途は、クロマトグラフィーによる特定のオリゴ糖の単離及び精製又はそのままの状態のオリゴ糖混合物の使用を含む。単離されたオリゴ糖種は、例えば、化学的誘導体化によってさらに誘導体化し、例えば、生体界面活性剤、香気活性物質、医薬品又はプラスチック製品などのための構造化合物、表面活性物質、生体活性物質などとして使用することができる化合物の産生のための構造的起点として使用することができる。
【０１０６】
(酵素)
本発明は、配列番号1〜4の推定アミノ酸配列を有するポリペプチド、並びにそのようなポリペプチドの断片、類似体、及び誘導体をさらに提供する。配列番号1〜4のポリペプチドに言及する場合の「断片」、「誘導体」、及び「類似体」という用語は、キシログルカナーゼと本質的に同じ生物学的機能又は活性を保持するポリペプチドを意味する。類似体は、例えば、プロタンパク質部分の切断により活性化されて、活性のある成熟タンパク質を生じることができるプロタンパク質を含み得る。本発明のポリペプチドは、組換えポリペプチド、天然ポリペプチド、又は合成ポリペプチドであり得る。配列番号1〜4のポリペプチドの断片、誘導体、及び類似体は、(i)1以上のアミノ酸残基が保存又は非保存アミノ酸残基(好ましくは、保存アミノ酸残基)と置換されており、かつそのような置換されたアミノ酸残基が遺伝暗号によってコードされているものでも、コードされていないものでもよいポリペプチド、或いは(ii)1以上のアミノ酸残基が置換基を含むポリペプチド、或いは(iii)追加のアミノ酸、例えば、リーダー配列又は分泌配列或いは成熟ポリペプチドもしくはプロタンパク質配列の精製又はその基質もしくは複合体結合に利用される配列が成熟タンパク質に融合されているポリペプチドであり得る。そのような断片、誘導体、及び類似体は、本明細書中の教示に基づいて提供することが当業者の能力の範囲内であるとみなされる。
【０１０７】
本発明のポリペプチドは、配列番号1〜4のポリペプチド、並びに配列番号1〜4のポリペプチドと少なくとも75％の類似性(例えば、好ましくは、少なくとも50％;及びより好ましくは、少なくとも70％の同一性)、より好ましくは、配列番号1〜4のポリペプチドと少なくとも85％の類似性(例えば、好ましくは、少なくとも70％の同一性)、並びに最も好ましくは、配列番号1〜4のポリペプチドと少なくとも95％の類似性(例えば、好ましくは、少なくとも90％の同一性)を有するポリペプチドを含む。さらに、これらは、好ましくは、少なくとも30アミノ酸、及びより好ましくは、少なくとも50アミノ酸の配列を含有するそのようなポリペプチドの正確な部分を含むべきである。
【０１０８】
本発明のポリペプチドの断片又は部分は、ペプチド合成によって対応する全長ポリペプチドを産生するための中間体として利用することができる。本発明のポリヌクレオチドの断片又は部分は、本発明の全長ポリヌクレオチドを合成するために使用することもできる。
【０１０９】
好ましい実施態様において、該ポリペプチドは、配列番号1〜4から選択され、かつキシログルカナーゼ、特に、エンドグルカナーゼ活性を示すポリペプチドと少なくとも75％のアミノ酸配列同一性を有するポリペプチドを含むか、該ポリペプチドから本質的になるか、又は該ポリペプチドからなる。
【０１１０】
そのような酵素は、本発明の方法によるタマリンド多糖の処理において使用するのに特に好適である。本発明によって提供されるポリペプチドは、高温で、すなわち、50℃を超える温度でもまだ、タマリンド多糖を加水分解するのに十分なエンドグルカナーゼ活性を示す。
【０１１１】
本発明の方法及びポリペプチドは、これらが、かなりの量の副産物、例えば、他のXGOS又は単糖を伴わないで、DP7〜DP9 XGOSを含むか、DP7〜DP9 XGOSから本質的になるか、又はDP7〜DP9 XGOSからなる加水分解物の産生をもたらすという点で有利である。
【０１１２】
本発明はさらに、本発明によるポリペプチドをコードする、特に、配列番号1〜4から選択されるアミノ酸配列をコードする核酸配列を含む核酸分子に関する。好ましい実施態様において、本発明によるポリペプチドをコードする核酸分子は、配列番号11〜14のうちの1つの配列を含むか、該配列から本質的になるか、又は該配列からなる核酸分子である。
【０１１３】
本発明の「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、RNAの形態又はDNAの形態のものであってもよく; DNAは、cDNA、ゲノムDNA、組換えDNA、及び合成DNAを含むことが理解されるべきである。DNAは、二本鎖又は一本鎖であってもよく、一本鎖の場合、コード鎖又は非コード(アンチセンス)鎖であってもよい。該ポリペプチドをコードするコード配列は、配列番号1〜4に示されるポリペプチドのコード配列と同一であってもよく、或いはそれは、遺伝暗号の冗長性もしくは縮重又は単一ヌクレオチド多型の結果として、同じポリペプチドをコードする異なるコード配列であってもよい。例えば、それはまた、配列番号1〜4のいずれか1つのポリペプチドのコード配列の全長を含むRNA転写物であってもよい。
【０１１４】
配列番号1〜4のポリペプチドをコードする核酸は、該ポリペプチドのコード配列のみ;該ポリペプチドのコード配列とリーダーもしくは分泌配列又はプロタンパク質配列などの追加のコード配列;及び該ポリペプチドのコード配列(及び任意に、追加のコード配列)とイントロンなどの非コード配列又は該ポリペプチドのコード配列の5'及び/もしくは3'の非コード配列を含むことができるが、これらに限定されない。
【０１１５】
したがって、「ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド」という用語又は「ポリペプチドをコードする核酸」という用語は、本発明の酵素、例えば、配列番号1〜4から選択されるポリペプチドのコード配列のみを含むポリヌクレオチド又は核酸、並びに追加のコード及び/又は非コード配列を含むポリヌクレオチド又は核酸を包含することが理解されるべきである。ポリヌクレオチド及び核酸という用語は、互換的に使用される。
【０１１６】
本発明は、ポリペプチドのコード配列が宿主細胞からのポリペプチドの発現及び分泌を助けるポリヌクレオチド配列と同じリーディングフレーム内で融合され得るポリヌクレオチドも含み;例えば、細胞からのポリペプチドの輸送を制御する分泌配列として機能するリーダー配列が、そのように融合されていてもよい。そのようなリーダー配列を有するポリペプチドは、プレタンパク質又はプレプロタンパク質と呼ばれ、宿主細胞によって切断されて、タンパク質の成熟形態を形成するリーダー配列を有することができる。これらのポリヌクレオチドは、それが成熟タンパク質＋N-末端の追加のアミノ酸残基であるプロタンパク質をコードするように、5'伸長領域を有していてもよい。そのようなプロ配列を有する発現産物は、成熟タンパク質の不活性形態であるプロタンパク質と呼ばれるが;ひとたびプロ配列が切断されると、活性のある成熟タンパク質が残る。追加の配列をタンパク質に付加し、成熟タンパク質の一部とすることもできる。したがって、例えば、本発明のポリヌクレオチドは、ポリペプチド、又はプロ配列を有するタンパク質、又はプロ配列とプレ配列(リーダー配列)の両方を有するタンパク質をコードすることができる。
【０１１７】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドの精製を可能にするマーカー配列にインフレームで融合されたコード配列を有することもできる。該マーカー配列は、親和性タグ又はエピトープタグ、例えば、ポリヒスチジンタグ、ストレプトアビジンタグ、Xpressタグ、FLAGタグ、セルロースもしくはキチン結合タグ、グルタチオン-Sトランスフェラーゼタグ(GST)、ヘマグルチニン(HA)タグ、c-mycタグ、又はV5タグであることができる。
【０１１８】
HAタグは、インフルエンザヘマグルチニンタンパク質に由来するエピトープに相当し(Wilson, I.らの文献、Cell, 37: 767(1984))、c-mycタグは、ヒトMycタンパク質由来のエピトープであり得る(Evans, G. I.らの文献、Mol. Cell. Biol.5: 3610-3616(1985))。
【０１１９】
本発明は、配列間に少なくとも70％、好ましくは、少なくとも90％、及びより好ましくは、少なくとも95％の同一性又は類似性が存在し、したがって、類似の生物学的活性を有するタンパク質をコードする、上記の配列にハイブリダイズするポリヌクレオチドをさらに提供するものと考えられる。さらに、当技術分野で公知であるように、アミノ酸配列が配列中の各々の個々の残基に対する同じ又は保存されたアミノ酸置換を含有する場合、2つのポリペプチド間に「類似性」が存在する。同一性及び類似性は、配列解析ソフトウェア(例えば、PBIL(Pole Bioinformatique Lyonnais)のClustalW、http://npsa-pbil.ibcp.fr)を用いて測定することができる。本発明は、特に、ストリンジェントな条件下で上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズする、そのようなポリヌクレオチドを提供する。
【０１２０】
好適にストリンジェントな条件は、例えば、プレハイブリダイゼーション及びハイブリダイゼーション溶液中の塩もしくはホルムアミドの濃度によるか、又はハイブリダイゼーション温度によって規定されることができ、当技術分野で周知である。特に、ストリンジェンシーは、塩の濃度を低下させることにより、ホルムアミドの濃度を増大させることにより、及び/又はハイブリダイゼーション温度を上昇させることにより増大させることができる。
【０１２１】
例えば、高ストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーションが約37℃〜42℃で約50％ホルムアミドを利用することができるのに対し、低ストリンジェンシー下のハイブリダイゼーションは、約30℃〜35℃で約35％〜25％ホルムアミドを利用することができる。高ストリンジェンシー条件下のハイブリダイゼーションのための1つの特定の組の条件は、42℃、50％ホルムアミド、5×SSPE、0.3％SDS、及び200μg/mLの剪断及び変性されたサケ精子DNAを利用する。低ストリンジェンシー下のハイブリダイゼーションについては、上記の同様の条件を35℃の低温で35％ホルムアミドで使用することができる。特定のレベルのストリンジェンシーに対応する温度範囲は、対象となる核酸のプリンとピリミジンの比を計算し、それに応じて温度を調整することにより、さらに狭めることができる。上記の範囲及び条件に対するバリエーションは、当技術分野で周知である。好ましくは、ハイブリダイゼーションは、配列間に少なくとも95％、及びより好ましくは、少なくとも97％の同一性が存在する場合にのみ生じるべきである。上記のポリヌクレオチドにハイブリダイズするポリヌクレオチドは、好ましい実施態様において、配列番号1〜4のタンパク質と実質的に同じ生物学的機能又は活性を示すポリペプチドをコードする。
【０１２２】
述べたように、好適なポリヌクレオチドプローブは、少なくとも14塩基、好ましくは30塩基、及びより好ましくは、少なくとも50塩基を有することができ、かつ上記のように、それとの同一性を有し、かつ活性を保持していても、保持していなくてもよい、本発明のポリヌクレオチドにハイブリダイズする。例えば、そのようなポリヌクレオチドは、例えば、そのようなポリヌクレオチドの回収のための、それぞれ、配列番号1〜4のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドにハイブリダイズするプローブとして、又は診断プローブとして、又はPCRプライマーとして利用することができる。したがって、本発明は、配列番号1〜4のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、並びにその断片(該断片は、好ましくは、少なくとも30塩基、より好ましくは、少なくとも50塩基を有する)と少なくとも70％の同一性、好ましくは、少なくとも90％の同一性、より好ましくは、少なくとも95％の同一性を有するポリヌクレオチド、及びそのようなポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドを含む。
【０１２３】
本明細書で互換的に使用される「相同性」又は「同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列間又は2つのポリペプチド配列間の配列類似性を指し、同一性がより厳密な比較である。「パーセント同一性又は相同性」及び「同一性又は相同性」という語句は、2以上のポリヌクレオチド配列又は2以上のポリペプチド配列の比較において見出される配列類似性のパーセンテージを指す。「配列類似性」は、(任意の好適な方法によって決定される)2以上のポリヌクレオチド配列間の塩基対配列中のパーセント類似性を指す。2以上の配列は、0〜100％又はその間の任意の整数値、類似し得る。同一性又は類似性は、比較目的のために整列されることができる各々の配列中の位置を比較することにより決定することができる。比較される配列中の位置が同じヌクレオチド塩基又はアミノ酸によって占められている場合、これら分子は、その位置において同一である。ポリヌクレオチド配列間の類似性又は同一性の程度は、これらのポリヌクレオチド配列によって共有される位置における同一の又は一致するヌクレオチド数の関数である。
【０１２４】
ポリペプチド配列の同一性の程度は、これらのポリペプチド配列によって共有される位置における同一のアミノ酸の数の関数である。ポリペプチド配列の相同性又は類似性の程度は、これらのポリペプチド配列によって共有される位置におけるアミノ酸の数の関数である。本明細書で使用される「実質的に同一」という用語は、少なくとも70％、75％、少なくとも80％、少なくとも85％、少なくとも90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、又はそれを上回る同一性又は相同性を指す。
【０１２５】
配列同一性の程度は、1つの配列をクエリー配列として選び、それを、blastpアルゴリズム(NCBI)を用いてGenBankから取得した相同配列と、インターネットベースのツールであるClustalWを用いて整列させることにより決定される。
【０１２６】
当技術分野で周知であるように、遺伝暗号は、ある特定のアミノ酸が複数のヌクレオチドトリプレット(コドン)によってコードされるという点において冗長であり、本発明は、本明細書における配列中に具体的に例示されているコドンと異なるコドンを用いて同じアミノ酸をコードするポリヌクレオチド配列を含む。そのようなポリヌクレオチド配列は、本明細書において、「等価」ポリヌクレオチド配列と呼ばれる。本発明は、断片、例えば、配列番号1〜4のポリペプチドのタンパク質、類似体、及び誘導体の一部又は全てをコードする上記のポリヌクレオチドの変異体をさらに含む。ポリヌクレオチドの変異体形態は、該ポリヌクレオチドの天然のアレル変異体又は該ポリヌクレオチドの非天然の変異体であってもよい。例えば、核酸の変異体は、単に、遺伝暗号の縮重によって生じるアミノ酸のコドン配列中の相違であってもよく、又は欠失変異体、置換変異体、及び付加もしくは挿入変異体であってもよい。当技術分野で公知であるように、アレル変異体は、コードされたポリペプチドの生物学的機能を実質的に変化させない1以上のヌクレオチドの置換、欠失、又は付加を有し得る、別の形態のポリヌクレオチド配列である。
【０１２７】
本発明は、そのようなポリヌクレオチドを含むベクター、そのようなベクターで遺伝子改変されている宿主細胞、及び前述のものを用いた組換え技法による配列番号1〜4のポリペプチドの産生も含む。宿主細胞は、そのようなベクターで遺伝子改変(形質導入又は形質転換又はトランスフェクト)されており、該ベクターは、例えば、クローニングベクター又は発現ベクターであってもよい。該ベクターは、例えば、プラスミド、接合性プラスミド、ウイルス粒子、ファージなどの形態のものであってもよい。該ベクター又は該遺伝子は、特定の部位又は特定されていない部位で染色体に組み込まれてもよい。相同組換え又はトランスポザーゼ媒介性組込みなどの組換えDNAのゲノム組込みの方法は、当技術分野で周知である。改変された宿主細胞は、プロモーターを活性化し、形質転換体を選択し、又は本発明の遺伝子を増幅するために必要に応じて修飾された従来の栄養培地中で培養することができる。例えば、温度、pHなどの培養条件は、当業者によく知られている、発現のために選択される宿主細胞とともに一般に使用されるものである。
【０１２８】
本発明のポリヌクレオチドは、組換え技法によって配列番号1〜4のポリペプチドを産生するために利用することができる。したがって、例えば、該ポリヌクレオチドは、種々の発現ベクターのうちのいずれか1つに含めることができる。
【０１２９】
適当なDNA配列を、種々の手順のいずれかによってベクターに挿入することができる。一般に、DNA配列は、当技術分野で周知の手順によって、適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入され、この手順は、当業者の能力の範囲内であるとみなされる。
【０１３０】
発現ベクター中のDNA配列は、mRNA合成を指令するための適切な発現制御配列(プロモーター)に機能的に連結される。そのようなプロモーターの代表例として: LTR又はSV40プロモーター、大腸菌lac、ara、rha、又はtrp、ラムダファージPLプロモーター、及び原核もしくは真核細胞又はそのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知られている他のプロモーターを挙げることができる。
【０１３１】
より好ましくは、本発明のポリペプチドは、以下のツールを用いて発現させることができる。
【０１３２】
特に、細菌宿主細胞で、本発明の核酸コンストラクトの転写を指令するための好適なプロモーターの具体的な例は、大腸菌のlacオペロン、ストレプトミセス・セリカラーのアガラーゼ遺伝子(dagA)、枯草菌のレバンスクラーゼ遺伝子(sacB)、バチルス・リケニフォルミスのα-アミラーゼ遺伝子(amyL)、バチルス・ステアロサーモフィルス(Bacillus stearothermophilus)のマルトース生成アミラーゼ遺伝子(amyM)、バチルス・アミロリケファシエンスのα-アミラーゼ遺伝子(amyQ)、バチルス・リケニフォルミスのペニシリナーゼ遺伝子(penP)、枯草菌のxylA及びxylB遺伝子、並びに原核生物のβ-ラクタマーゼ遺伝子(Villa-Kamaroffらの文献、1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 3727-3731)から得られるプロモーター、並びにtacプロモーター(DeBoerらの文献、1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25)である。さらなるプロモーターは、Scientific American, 1980, 242: 74-94の「組換え細菌由来の有用なタンパク質(Useful proteins from recombinant bacteria)」;及びSambrookらの文献、1989、前掲に記載されている。
【０１３３】
糸状真菌宿主細胞で本発明の核酸コンストラクトの転写を指令するための好適なプロモーターの例は、ニホンコウジカビのTAKAアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイ(Rhizomucor miehei)のアスパラギン酸プロテイナーゼ、クロコウジカビの中性α-アミラーゼ、クロコウジカビの酸安定α-アミラーゼ、クロコウジカビ又はアワモリコウジカビのグルコアミラーゼ(glaA)、リゾムコール・ミエヘイのリパーゼ、ニホンコウジカビのアルカリプロテアーゼ、ニホンコウジカビのトリオースリン酸イソメラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスのアセトアミダーゼ、フザリウム・ベネアトゥムのアミログルコシダーゼ(WO 00/56900号)、フザリウム・ベネアトゥムのDaria(WO 00/56900号)、フザリウム・ベネアトゥムのQuinn(WO 00/56900号)、フザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼ(WO 96/00787号)、トリコデルマ・リーゼイのβ-グルコシダーゼ、トリコデルマ・リーゼイのセロビオ加水分解酵素I、トリコデルマ・リーゼイのセロビオ加水分解酵素II、トリコデルマ・リーゼイのエンドグルカナーゼI、トリコデルマ・リーゼイのエンドグルカナーゼII、トリコデルマ・リーゼイのエンドグルカナーゼIII、トリコデルマ・リーゼイのエンドグルカナーゼIV、トリコデルマ・リーゼイのエンドグルカナーゼV、トリコデルマ・リーゼイのキシラナーゼI、トリコデルマ・リーゼイのキシラナーゼII、トリコデルマ・リーゼイのβ-キシロシダーゼの遺伝子から得られるプロモーター、並びにNA2-tpiプロモーター(非翻訳リーダーがアスペルギルス・ニデュランスのトリオースリン酸イソメラーゼをコードする遺伝子由来の非翻訳リーダーによって置換されているクロコウジカビの中性α-アミラーゼをコードする遺伝子由来の改変プロモーター);並びにその突然変異体、切断型、及びハイブリッドプロモーターである。
【０１３４】
酵母宿主において、有用なプロモーターは、出芽酵母のエノラーゼ(ENO-1)、出芽酵母のガラクトキナーゼ(GAL1)、出芽酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH1、ADH2/GAP)、出芽酵母のトリオースリン酸イソメラーゼ(TPI)、出芽酵母のメタロチオネイン(CUP1)、及び出芽酵母の3-ホスホグリセリン酸キナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なプロモーターは、Romanosらの文献、1992, Yeast 8: 423-488に記載されている。
【０１３５】
制御配列は、転写を終結させるために宿主細胞によって認識される配列である、好適な転写ターミネーター配列であってもよい。ターミネーター配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の3'末端に機能的に連結される。選択された宿主細胞で機能する任意のターミネーターを本発明で使用することができる。
【０１３６】
糸状真菌宿主細胞のための好ましいターミネーターは、ニホンコウジカビのTAKAアミラーゼ、クロコウジカビのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスのアントラニル酸シンターゼ、クロコウジカビのα-グルコシダーゼ、及びフザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼの遺伝子から得られる。
【０１３７】
酵母宿主細胞のための好ましいターミネーターは、出芽酵母のエノラーゼ、出芽酵母のシトクロムC(CYC1)、及び出芽酵母のグリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼの遺伝子から得られる。酵母宿主細胞のための他の有用なターミネーターは、Romanosらの文献、1992、前掲に記載されている。
【０１３８】
制御配列は、宿主細胞による翻訳に重要であるmRNAの非翻訳領域である、好適なリーダー配列であってもよい。リーダー配列は、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の5'末端に機能的に連結される。選択された宿主細胞で機能する任意のリーダー配列を本発明で使用することができる。
【０１３９】
糸状真菌宿主細胞のための好ましいリーダーは、ニホンコウジカビのTAKAアミラーゼ及びアスペルギルス・ニデュランスのトリオースリン酸イソメラーゼの遺伝子から得られる。
【０１４０】
酵母宿主細胞のための好適なリーダーは、出芽酵母のエノラーゼ(ENO-1)、出芽酵母の3-ホスホグリセリン酸キナーゼ、出芽酵母のα-因子、及び出芽酵母のアルコールデヒドロゲナーゼ/グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ(ADH2/GAP)の遺伝子から得られる。
【０１４１】
制御配列は、ヌクレオチド配列の3'末端に機能的に連結され、かつ転写されたとき、ポリアデノシン残基を転写されたmRNAに付加するシグナルとして宿主細胞によって認識される配列である、ポリアデニル化配列であってもよい。選択された宿主細胞で機能する任意のポリアデニル化配列を本発明で使用することができる。
【０１４２】
糸状真菌宿主細胞のための好ましいポリアデニル化配列は、ニホンコウジカビのTAKAアミラーゼ、クロコウジカビのグルコアミラーゼ、アスペルギルス・ニデュランスのアントラニル酸シンターゼ、フザリウム・オキシスポルムのトリプシン様プロテアーゼ、及びクロコウジカビのα-グルコシダーゼの遺伝子から得られる。
【０１４３】
酵母宿主細胞のための有用なポリアデニル化配列は、Guo及びShermanの文献、1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990に記載されている。
【０１４４】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に連結されたシグナルペプチドをコードし、かつコードされたポリペプチドを細胞の分泌経路内に誘導するシグナルペプチドコード配列であってもよい。ヌクレオチド配列のコード配列の5'末端は、分泌ポリペプチドをコードするコード配列のセグメントと翻訳リーディングフレーム内で天然に連結されているシグナルペプチドコード配列を固有に含有し得る。或いは、コード配列の5'末端は、該コード配列にとって外来性であるシグナルペプチドコード配列を含有し得る。外来性シグナルペプチドコード配列は、コード配列がシグナルペプチドコード配列を天然に含有しない場合に必要とされ得る。或いは、外来性シグナルペプチドコード配列は、ポリペプチドの分泌を増強するために、天然のシグナルペプチドコード配列に単に取って代わり得る。しかしながら、発現されたポリペプチドを選択された宿主細胞の分泌経路に向かわせる、すなわち、培養培地中に分泌させる、任意のシグナルペプチドコード配列を本発明で使用することができる。
【０１４５】
細菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード配列は、バチルスNCIB 11837のマルトース生成アミラーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスのα-アミラーゼ、バチルス・リケニフォルミスのサブチリシン、バチルス・リケニフォルミスのβ-ラクタマーゼ、バチルス・ステアロサーモフィルスの中性プロテアーゼ(nprT、nprS、nprM)、及び枯草菌のprsAの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。さらなるシグナルペプチドは、Simonen及びPalvaの文献、1993、並びにBrockmeierらの文献、2006に記載されている。
【０１４６】
糸状真菌宿主細胞のための効果的なシグナルペプチドコード配列は、ニホンコウジカビのTAKAアミラーゼ、クロコウジカビの中性アミラーゼ、クロコウジカビのグルコアミラーゼ、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、フミコラ・インソレンスのセルラーゼ、フミコラ・インソレンスのエンドグルカナーゼV、及びフミコラ・ラヌギノサのリパーゼの遺伝子から得られるシグナルペプチドコード配列である。
【０１４７】
酵母宿主細胞のための有用なシグナルペプチドは、出芽酵母のα-因子及び出芽酵母のインベルターゼの遺伝子から得られる。他の有用なシグナルペプチドコード配列は、Romanosらの文献、1992、前掲に記載されている。
【０１４８】
制御配列はまた、ポリペプチドのアミノ末端に位置するプロペプチドをコードするプロペプチドコード配列であってもよい。得られるポリペプチドは、プロ酵素又はプロポリペプチド(又は場合により、酵素前駆体)として知られている。プロペプチドは、通常、不活性であり、プロポリペプチドからのプロペプチドの触媒的又は自己触媒的切断によって、成熟した活性ポリペプチドに変換されることができる。プロペプチドコード配列は、枯草菌のアルカリプロテアーゼ(aprE)、枯草菌の中性プロテアーゼ(nprT)、出芽酵母のα-因子、リゾムコール・ミエヘイのアスパラギン酸プロテイナーゼ、及びミセリオフトーラ・サーモフィラのラッカーゼ(WO 95/33836号)の遺伝子から得ることができる。
【０１４９】
シグナルペプチド配列とプロペプチド配列の両方がポリペプチドのアミノ末端に存在する場合、プロペプチド配列は、ポリペプチドのアミノ末端に隣接して位置し、シグナルペプチド配列は、プロペプチド配列のアミノ末端に隣接して位置する。
【０１５０】
宿主細胞の成長に対してポリペプチドの発現を調節することを可能にする調節配列を付加することが望ましい場合もある。調節系の例は、調節化合物の存在を含む化学的又は物理的刺激に応答して遺伝子の発現をオン又はオフにする調節系である。原核生物系の調節系としては、lac、tac、及びtrpオペレーター系が挙げられる。酵母では、ADH2系又はGAL1系を使用することができる。糸状真菌では、TAKAα-アミラーゼプロモーター、クロコウジカビのグルコアミラーゼプロモーター、及びニホンコウジカビのグルコアミラーゼプロモーターを調節配列として使用することができる。調節配列の他の例は、遺伝子増幅を可能にするものである。真核生物系では、これらの調節配列は、メトトレキサートの存在下で増幅されるジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子及び重金属で増幅されるメタロチオネイン遺伝子を含む。これらの場合、ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列は、調節配列と機能的に連結されることになる。
【０１５１】
(発現ベクター)
本発明はまた、本発明のポリヌクレオチド、プロモーター、並びに転写及び翻訳終止シグナルを含む組換え発現ベクターに関する。本明細書に記載される様々な核酸及び制御配列を接続させて、そのような部位でのポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の挿入又は置換を可能にするための1以上の(いくつかの)好都合な制限部位を含み得る組換え発現ベクターを産生することができる。或いは、本発明のポリヌクレオチド配列を、ヌクレオチド配列又は該配列を含む核酸コンストラクトを発現用の適当なベクターに挿入することにより発現させることができる。発現ベクターを作製する際に、コード配列は、該コード配列が発現のための適当な制御配列と機能的に連結されるように、ベクター中に配置される。
【０１５２】
組換え発現ベクターは、組換えDNA手順に好都合に供することができ、かつヌクレオチド配列の発現をもたらすことができる任意のベクター(例えば、プラスミド又はウイルス)であってもよい。ベクターの選択は、典型的には、ベクターと、ベクターを導入しようとする宿主細胞との適合性によって決まる。ベクターは、線状プラスミドであっても、閉環状プラスミドであってもよい。
【０１５３】
ベクターは、自律複製ベクター、すなわち、その複製が染色体複製とは無関係である染色体外実体として存在するベクター、例えば、プラスミド、染色体外エレメント、ミニ染色体、又は人工染色体であってもよい。ベクターは、自己複製を保証する任意の手段を含有し得る。或いは、ベクターは、宿主細胞に導入したとき、ゲノムに組み込まれ、それが組み込まれた染色体と一緒に複製するベクターであってもよい。さらに、宿主細胞のゲノムに導入しようとする全DNAを一緒に含有する単一のベクターもしくはプラスミド又は2以上のベクターもしくはプラスミド、或いはトランスポゾンを使用してもよい。
【０１５４】
本発明のベクターは、好ましくは、形質転換された細胞、トランスフェクトされた細胞、形質導入された細胞、又は同様の細胞の容易な選択を可能にする1以上の(いくつかの)選択マーカーを含有する。選択マーカーは、その産物が、殺生物剤又はウイルス耐性、重金属に対する耐性、栄養要求株に対する原栄養性などを提供する遺伝子である(Krollらの文献、2009−人為的に導入されたメバロン酸経路による同化作用に基づく新規の依存システムの確立:ホワイトバイオテクノロジーにおける普遍的応用としてのプラスミドの完全安定化(Establishment of a novel anabolism-based addiction system with an artificially introduced mevalonate pathway: Complete stabilization of plasmids as universal application in white biotechnology))。これらの栄養要求性は、それぞれ、アラニン、アルギニン、アスパラギン、アスパラギン酸、システイン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、プロリン、セリン、トレオニン、トリプトファン、チロシン、及びバリンのアミノ酸生合成の破壊又は欠失を含むが、これらに限定されない。栄養要求性表現型は、対象となる遺伝子の発現カセットと一緒に、エピソームによって相補される。
【０１５５】
細菌選択マーカーの例は、枯草菌もしくはバチルス・リケニフォルミス由来のdal遺伝子、又はアンピシリン、カナマイシン、クロラムフェニコール、もしくはテトラサイクリン耐性などの抗生物質耐性を付与するマーカーである。酵母宿主細胞のための好適なマーカーは、ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1、及びURA3である。糸状真菌宿主細胞で使用するための選択マーカーとしては、amdS(アセトアミダーゼ)、argB(オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ)、bar(ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ)、hph(ハイグロマイシンホスホトランスフェラーゼ)、niaD(硝酸レダクターゼ)、pyrG(オロチジン-5'-リン酸デカルボキシラーゼ)、met3(硫酸アデニルトランスフェラーゼ)、及びtrpC(アントラニル酸シンターゼ)、並びにこれらの等価物が挙げられるが、これらに限定されない。アスペルギルス属細胞で使用するのに好ましいのは、アスペルギルス・ニデュランス又はニホンコウジカビのamdS及びpyrG遺伝子、並びにストレプトミセス・ヒグロスコピクス(Streptomyces hygroscopicus)のbar遺伝子である。
【０１５６】
本発明のベクターは、好ましくは、宿主細胞のゲノムへのベクターの組込み又はゲノムとは無関係な細胞内での自律複製を可能にするエレメントを含有する。
【０１５７】
宿主細胞ゲノムへの組込みのために、ベクターは、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドの配列又は相同もしくは非相同組換えによるゲノムへの組込みのためのベクターの任意の他のエレメントに依存し得る。或いは、ベクターは、染色体中の正確な位置における相同組換えによる宿主細胞のゲノムへの組込みを指令する追加のヌクレオチド配列を含有し得る。正確な位置での組込みの可能性を高めるために、組込みエレメントは、好ましくは、相同組換えの確率を高めるために対応する標的配列と高度な配列同一性を有する、十分な数の核酸、例えば、100〜10,000塩基対、好ましくは、400〜10,000塩基対、及び最も好ましくは、800〜10,000塩基対を含有すべきである。組込みエレメントは、宿主細胞のゲノム中の標的配列と相同である任意の配列であってもよい。さらに、組込みエレメントは、非コード又はコードヌクレオチド配列であってもよい。他方、ベクターは、非相同組換えによって、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。
【０１５８】
自律複製のために、ベクターは、該ベクターが当該の宿主細胞で自律的に複製するのを可能にする複製起点をさらに含み得る。複製起点は、細胞内で機能する自律複製を媒介する任意のプラスミド複製子であってもよい。「複製起点」又は「プラスミド複製子」は、本明細書において、プラスミド又はベクターがインビボで複製するのを可能にするヌクレオチド配列と定義される。
【０１５９】
細菌の複製起点の例は、大腸菌での複製を可能にするpBR322、pUC19、pACYC177、及びpACYC184、並びにバチルス属での複製を可能にするpUB110、pE194、pTA1060、pAMβ1というプラスミドの複製起点である。
【０１６０】
酵母宿主細胞で使用するための複製起点の例は、2μ複製起点、ARS1、ARS4、ARS1とCEN3の組合せ、及びARS4とCEN6の組合せである。
【０１６１】
糸状真菌細胞で使用するための複製起点の例は、AMA1及びANS1である(Gemsらの文献、1991, Gene 98: 61-67; Cullenらの文献、1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883号)。AMA1遺伝子の単離及び該遺伝子を含むプラスミド又はベクターの構築は、WO 00/24883号に開示されている方法に従って達成することができる。
【０１６２】
本発明のポリヌクレオチドの複数のコピーを宿主細胞に挿入して、遺伝子産物の産生を増大させることができる。該ポリヌクレオチドのコピー数の増加は、配列の少なくとも1つの追加コピーを宿主細胞ゲノムに組み込むことによるか、又は増幅可能な選択マーカーを該ポリヌクレオチドとともに含めることにより得ることができ、ここで、選択マーカー遺伝子の増幅されたコピーを含有し、それにより、該ポリヌクレオチドの追加コピーを含有する細胞は、適切な選択薬剤の存在下で細胞を培養することにより選択することができる。
【０１６３】
上記のエレメントを連結させて、本発明の組換え発現ベクターを構築するために使用される手順は、当業者に周知である(例えば、Sambrookらの文献、1989、前掲を参照)。
【０１６４】
好ましい実施態様において、本発明は、配列番号1〜4のうちの1つによるポリペプチドを発現する宿主細胞を提供する。より好ましくは、該宿主細胞は、配列番号1〜4のポリペプチドをコードする、本発明のヌクレオチド分子を含む。最も好ましくは、該宿主細胞は、大腸菌又は枯草菌である。
【０１６５】
本発明は、さらなる実施態様において、配列番号1〜4のポリペプチドを産生するための方法であって、本明細書に記載される宿主細胞を酵素の産生を可能にする条件下で培養すること、及び培養物から酵素を回収することを含む、方法を提供する。
【０１６６】
(産生方法)
より好ましくは、本発明は、本発明のポリペプチド、すなわち、配列番号1〜4のポリペプチドを産生する方法であって:(a)該ポリペプチドを産生する細胞を、該ポリペプチドの産生の助けとなる条件下で培養すること;及び(b)該ポリペプチドを回収することを含む、方法を提供する。好ましい態様において、該細胞は、バチルス属のものである。より好ましい態様において、該細胞は、枯草菌又はバチルス・リケニフォルミスである。
【０１６７】
本発明はまた、本発明のポリペプチドを産生する方法であって:(a)本明細書に記載される組換え宿主細胞を、該ポリペプチドの産生の助けとなる条件下で培養すること;及び(b)該ポリペプチドを回収することを含む、方法に関する。
【０１６８】
本発明の産生方法において、細胞は、当技術分野で周知の方法を用いるポリペプチドの産生に好適な栄養培地中で培養される。例えば、細胞は、好適な培地中及びポリペプチドの発現及び/又は単離を可能にする条件下で実施される振盪フラスコ培養又は実験用もしくは工業用発酵槽での小規模もしくは大規模発酵(連続発酵、回分発酵、流加回分発酵、もしくは固体発酵を含む)により培養することができる。培養は、当技術分野で公知の手順を用いて、炭素及び窒素源並びに無機塩を含む好適な栄養培地中で行われる。好適な培地は、商業的供給業者から入手可能であるか、又は(例えば、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(American Type Culture Collection)のカタログ中の)公開されている組成に従って調製することができる。ポリペプチドが栄養培地中に分泌される場合、該ポリペプチドは、培地から直接回収することができる。ポリペプチドが培地中に分泌されない場合、それは、細胞ライセートから回収することができる。
【０１６９】
ポリペプチドは、該ポリペプチドに特異的である当技術分野で公知の方法を用いて検出することができる。これらの検出方法は、特異的抗体の使用、酵素産物の形成、又は酵素基質の消失を含み得る。例えば、酵素アッセイを用いて、本明細書に記載されるポリペプチドの活性を決定することができる。
【０１７０】
結果として得られるポリペプチドは、当技術分野で公知の方法を用いて回収することができる。例えば、該ポリペプチドは、限定されないが、遠心分離、濾過、抽出、噴霧乾燥、蒸発、又は沈殿を含む、従来の手順を用いて、栄養培地から回収することができる。
【０１７１】
本発明のポリペプチドを、限定されないが、クロマトグラフィー(例えば、イオン交換、親和性、疎水性、クロマトフォーカシング、及びサイズ排除)、電気泳動法(例えば、分取等電点フォーカシング)、示差溶解度(例えば、硫酸アンモニウム沈殿)、SDS-PAGE、又は抽出を含む、当技術分野で公知の種々の手順(例えば、タンパク質精製(Protein Purification)、J.-C. Janson及びLars Ryden編、VCH Publishers, New York, 1989を参照)により精製して、実質的に純粋なポリペプチドを得ることができる。
【０１７２】
(組成物)
本発明はまた、本発明のポリペプチド、すなわち、配列番号1〜4のポリペプチドを含む組成物に関する。好ましくは、該組成物は、そのようなポリペプチドが濃縮されている。「濃縮された」という用語は、該組成物のエンドグルカナーゼ活性が、例えば、少なくとも1.1の濃縮係数を伴って増加していることを示す。
【０１７３】
ポリペプチド組成物は、当技術分野で公知の方法に従って調製することができ、かつ液体又は乾燥組成物の形態のものであることができる。該組成物中に含まれることになるポリペプチドは、当技術分野で公知の方法に従って、かつ上記の通りに安定化することができる。
【０１７４】
(酵素調製物)
本発明はさらに、本発明のプロセスにおけるキシログルカン多糖の加水分解で使用するための、配列番号1〜4のポリペプチドを含む酵素調製物を提供する。該酵素調製物は、好ましくは、液体、粉粒体、又は凝集粉の形態のもの、より好ましくは、粉粒体又は凝集粉の形態のものである。
【０１７５】
粉粒体又は凝集粉は、好ましくは、狭い粒径分布を有し、95(重量)％を上回る粒子が25〜500μmの範囲にある。
【０１７６】
粉粒体及び凝集粉は、従来の方法によって、例えば、流動床造粒機で担体上の酵素に噴霧することにより調製することができる。担体は、好適な粒径を有する微粒子コアからなり得る。担体は、可溶性又は不溶性、例えば、塩(例えば、塩化ナトリウムもしくは硫酸ナトリウム)、糖(例えば、スクロースもしくはラクトース)、糖アルコール(例えば、ソルビトール)、デンプン、米、コーングリッツ、又は大豆であることができる。
【０１７７】
本発明は、以下の図面及び実施例によってさらに説明され、これらは、本発明の範囲を限定するものとみなされるべきではない。
【図面の簡単な説明】
【０１７８】
【図１】図1は、 タマリンドキシログルカンからオリゴ糖DP7〜DP9への加水分解を示している。エンドグルカナーゼによる加水分解の起こり得る部位は、はさみの記号によって示されている。XXXG、XXLG、XLXG、及びXLLGは、オリゴ糖の構造を説明し、Gは、修飾されていない骨格グルコース残基を表し、Xは、キシロースで修飾された骨格グルコース残基を表し、かつLは、キシロース及びガラクトースで修飾された骨格グルコース残基を表し;文字コード命名規則は、Fryらの文献、1993からのものである。
【図２】図2は、タマリンドカーネルパウダーからDP7〜DP9 XGOSを含有する加水分解物を産生するための本発明の方法の典型的な工程を示している。
【図３】図3は、本発明の方法を用いて産生された、粉末形態の 精製DP7〜DP9 XGOS混合物の写真を示している。
【図４】図4は、pH及び温度に応じた、利用されたエンドグルカナーゼ(配列番号3)の活性プロファイルを示している。相対的活性をDNSA-アッセイにより決定される大麦-β-グルカンからの還元糖の生成として決定した。
【図５】図5は、それぞれ、組換え産生された配列番号1、2、3、及び4のSDS-PAGEを示している。PageRulerプレステインドタンパク質ラダー10〜18kDa(#26616, ThermoFisher Scientific)をタンパク質標準として使用した。
【図６】図6は、それぞれ、配列番号1及び3の相対的酵素活性を示している。配列番号1の酵素活性を100％に設定した。驚くことに、配列番号3の酵素活性は、配列番号1の酵素活性と比較して、4倍超増大する。酵素活性:酵素1mg当たりのアラビノキシランからのマイクロモルの還元糖の放出をDNSAアッセイで決定した。
【図７】図7は、それぞれ、配列番号2及び4の相対的酵素活性を示している。配列番号2の酵素活性を100％に設定した。驚くことに、配列番号4の酵素活性は、配列番号1の酵素活性と比較して、7倍超増大する。酵素活性:酵素1mg当たりのアラビノキシランからのマイクロモルの還元糖の放出をDNSAアッセイで決定した。
【図８】図8は、0.006％(wt/wt)の配列番号3及び0.03％(wt/wt dTKP)の配列番号2の酵素による20％(wt/vol) dTKPからのXGOS放出を示している。酵素反応を60℃で行った。完全な加水分解は、配列番号2については24時間後に、配列番号3については24時間後に80％を超えて達成された。
【図９】図9は、0.65％(wt/wt dTKP)の配列番号3及び20％のTKP基質による dTKPからのXGOS放出を示している。酵素反応を60℃で行った。dTKPは、1時間以内に配列番号3によってXGOS DP7〜9へと完全に分解される65％(wt/wt)のキシログルカンを含有している。
【図１０】図10は、本発明の方法を用いて産生されたXGOS混合物の加水分解安定性を示している: 3％(wt/wt dTPK)の配列番号3を用いる60℃で0〜24時間のTKP 20％(wt/vol)加水分解、及びその後のHPAEC-PAD分析。HPAECの結果を、後に、経時的なオリゴ糖比(DP7〜DP9)に変換した。
【図１１】図11は、 本発明の方法を用いる高基質濃度(最大700g/L)のTKP加水分解を示している: 0.05％の配列番号3で0〜72時間。加水分解の程度をHPAEC-PAD分析により確認した。
【実施例】
【０１７９】
(実施例)
(実施例1:エンドグルカナーゼをコードする配列番号11〜14のクローニング及び配列番号1〜4の発現)
バッファー及び基質として使用される化学物質は全て、少なくとも試薬等級の市販製品であった。
【０１８０】
配列番号2のクローニング:ハービボラックス・サクシノコラDSM101079と命名された新しいセルロース分解細菌株を、牛糞を入れて操作され、55℃でコーンサイレージが供給された20lの発酵槽から分離した。ハービボラックス・サクシノコラをルミノコッカス科(Koeckらの文献、2016)の新しいファミリーとして分類した。ハービボラックス・サクシノコラDSM101079株のゲノムシークエンシングのために、合計4μgのゲノムDNAを用いて、8-kのメイトペアシークエンシングライブラリー(Nextera Mate Pair Sample Preparation Kit, Illumina社)を構築し、これを、Illumina MiSeqシステムでペアエンドプロトコルを適用してシークエンシングした。GenDB内の及び炭水化物活性酵素データベースdbCAN(Yinらの文献、2012)によるハービボラックス・サクシノコラDSM101079ゲノム配列の解析及び解釈により、主にグリコシドヒドロラーゼ(GH)及び炭水化物結合分子(CBM)の様々なファミリーに属する酵素をコードすると予測される100を超える遺伝子が明らかになった。配列番号2をグリコシドヒドロラーゼファミリー5のメンバーのコード配列と同定した。
【０１８１】
エンドグルカナーゼをコードする配列番号11及び12の遺伝子を組換え大腸菌株によって産生させた。DNAを、プライマー配列番号5〜10を用いるPCRを用いて増幅し、Gibson Assembly(NEB、カタログ番号E2611S)を用いて、誘導性T7-プロモーターの制御下のNdeI/XhoIで線状化したpET24c(+)ベクター(Novagen, MerckMillipore)にクローニングした。配列番号11については、オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号5)及び(配列番号7)を使用した。配列番号11の短縮バリアントであるバリアント配列番号13は、オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号5)及び(配列番号6)を用いて増幅した。配列番号12のDNA増幅については、オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号8)及び(配列番号9)を使用した。配列番号12の短縮バリアントであるバリアント配列番号14は、オリゴヌクレオチドプライマー(配列番号8)及び(配列番号10)を用いて増幅した。化学的にコンピテントな大腸菌DH10Β(Invitrogen, Fisher Scientific, Schwerte, Germany)を形質転換した。陽性クローンは、上記のようなプライマー組合せを用いるコロニーPCRによって選択した。配列番号1〜4のタンパク質発現については、化学的にコンピテントな大腸菌BL21 Star(DE3)(Invitrogen, Fisher Scientific, Schwerte, Germany)をそれぞれの発現ベクターで形質転換した。
【０１８２】
(細胞の成長)
配列番号1及び3のC.サーモセラムATCC27405/DSM1237由来のエンドグルカナーゼ遺伝子、並びに配列番号2及び4のハービボラックス・サクシノコラDSM101079遺伝子を有する組換え大腸菌株の流加回分発酵を、制御され、かつBiostat B Twin DCU(Sartorius AG, Gottingen, Germany)が装着された10L Uni-Vesselで実施した。発酵期間中、温度、pH、泡沫、濁度、重量、及び溶存酸素をオンラインでモニタリングした。溶存酸素(DO％)を25％(vol/vol)に設定し、撹拌を増大させ、かつ気流を一定にして維持した。泡沫の形成は、Antifoam 206(Sigma Aldrich, St. Louis, Missouri, USA)の添加により制御した。25％(vol/vol)水酸化アンモニウム溶液及び25％(vol/vol) HPO4溶液の添加により、6.9のpHを維持した。大腸菌株を、Riesenberg培地(Korzらの文献、1995)中、10Lスケールで培養した。供給溶液は、1021g/Lグリセロール、20g/L MgSO4・7H2O、13mg/L EDTA、4mg/L CoCl2・6H2O、23.5mg/L MnCl2・4H2O、2.5mg/L CuC12・2H2O、5mg/L H3BO3、4mg/L Na2MoO4×2H2O、16mg/L Zn(CH3COO)2・2H2O、40mg/Lクエン酸Fe(III)からなる(Korzらの文献、1995)。最初の炭水化物基質が消費された後、成長速度を、等式1:
【数１】
2021503953.tif 000003
(式中、mSは、基質の質量流量(g h-l)であり、μsetは、所望の比成長速度(h-l)であり、YX/Sは、バイオマス/基質産出係数(g g-1)であり、mは、比維持係数(g g-1 h-l)であり、Vは、培養容量(L)であり、かつXは、バイオマス濃度(g L-1)である)に従って制御した。
【０１８３】
植菌手順は、次の通りであった:凍結ストックに基づいて、十分な抗生物質を含有する新しい寒天プレートを調製した。1つのコロニーに関して、30mLのLysogeny Broth(Sambrookらの文献、1989)を含有するエルレンマイヤーフラスコに植菌し、30℃で12〜15時間インキュベートした。30mLのこの第一の前培養を用いて、5Lのエルレンマイヤーフラスコ中の500mLの発酵培地に植菌し、さらに14時間インキュベートした。10Lの発酵槽を6Lの発酵培地で満たし、500mLの第二の前培養を植菌した。カナマイシンを50μg/mLで添加した。グリセロール供給からラクトース供給に変更することにより、タンパク質産生を誘導した。細胞を、9000rpm及び22℃で1時間の遠心分離により、48時間後に回収した。300gの細胞の一部を3Lの溶解バッファー(50mM MOPS pH 7.3、0.1M NaCl、20mMイミダゾール)に溶解させた。チャンバーを通過する超音波フロー中での超音波処理により、細胞溶解を達成した。細胞破砕物を遠心分離(9000rpm、22℃)により分離した。0.2μmのフィルターカセットを適用する接線濾過及び溶解バッファーを用いる3容量の洗浄により、上清を残存する細胞及び破砕物から清澄化した。30kDaのフィルターカセットを用いる接線濾過、次いで、3容量の溶解バッファーを用いる透析を利用して、酵素溶液を濃縮した。GH10キシラナーゼを固定化金属イオン親和性クロマトグラフィー(IMAC)により精製した。純粋な酵素を、50mM MOPS、pH 7.3、0.25Mイミダゾール、0.1M NaCl、及び20mM CaCl2を含有する溶出バッファーで溶出させた。
【０１８４】
タンパク質発現を、12.5％ゲル(Bio-Rad Laboratories GmbH, Muenchen)を用いるSDS-PAGE及びクマシーブルー染色によりモニタリングした。タンパク質を変性バッファーに再懸濁させ、95℃で15分間加熱した。PageRulerプレステインドタンパク質ラダー10〜180kDa(#26616, ThermoFisher Scientific)を分子量標準として用いた。タンパク質をクマシーブリリアントブルーR-250(Weber及びOsbourneの文献、1969)で染色した。ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)ポリアクリルアミドゲル電気泳動をLaemmliの文献(1970)に従って実施した。Pierce(商標)BCAタンパク質アッセイキット(#23225, ThermoFisher Scientific)を使用することにより、タンパク質量を決定した。
【０１８５】
本発明の配列番号1〜4のエンドグルカナーゼを産生する別の可能性は、コンピテントな枯草菌株を、DNAを含有する適切なベクターで形質転換し、Parkらの文献(1991)に従って、組換え株を培養することである。
【０１８６】
(実施例2:配列番号1〜4の特徴解析)
大麦β-グルカン(Megazyme)などのモデル基質を使用することにより、比酵素活性を決定した。エンドグルカナーゼ活性は、モデル基質からの還元糖の生成と定義される。1単位の酵素活性は、酵素1mg当たり、60℃、1分間で生成される、マイクロモルで示した還元糖の量と定義される。酵素プロファイル並びに最適な温度及びpHを定義するために、エンドグルカナーゼ(50ng/反応)を、様々なpH(範囲4.0〜8.0)を有するクエン酸バッファー(溶液A: 0.2Mクエン酸、0.1M NaCl;溶液B: 0.4M Na2HPO4、0.1M NaCl)に溶解した1％(wt/vol)大麦β-グルカンの存在下、50〜80℃の範囲の温度で30分間インキュベートした。還元糖を3,5-ジニトロサリチル酸(DNSA)法により測定した: 50μLの試料を、マイクロタイタープレート中で、75μLのDNSA溶液(10g/L DNSA、200g/L K+-Na+-酒石酸塩、10g/L NaOH、0.5g/L Na2SO4、2g/Lフェノール)と混合し、95℃で5分間インキュベートし、氷上で冷却し、吸収を540nmで測定した。較正のために、0〜2mg/mLのグルコース溶液を使用した。
【０１８７】
配列番号1〜4の温度及びpHプロファイルは、pH 5.5〜7.5で、約60℃の最適温度を示した。1つの代表的な酵素として、配列番号3の酵素活性プロファイルが図4に示されており、これは、50℃を超える広範な温度プロファイルを示す。他の配列番号1、2、及び4は、同様の酵素プロファイルを示す。実施例2に記載されているように、配列番号11及び12は、野生型遺伝子を表す。配列番号13及び14は、それぞれ、ドックリンモジュールを欠き、それにより、全体的なタンパク質サイズが約15％低下している、配列番号11及び12の変異体である(図5)。驚くことに、野生型タンパク質の配列番号1及び2と比較して、配列番号3及び4の比酵素活性は、少なくとも4,5倍増加している(図6及び7)。活性の増加は、サイズの低下だけでは説明することができない。配列番号1〜4の酵素は全て、図8で配列番号2及び3について示されているのと同様に良好な、50℃超の温度でTKPを加水分解するのに好適な酵素活性を特徴とする。
【０１８８】
TKP加水分解に対する配列番号1〜4の好適性を評価するために、配列番号3のKi値を決定した。酵素活性を、製造業者の指示に従って、アゾ-キシログルカン(Megazyme)に対して測定した。1〜20g/lの基質濃度を選び、酵素活性を増加濃度のキシログルカンオリゴ糖の存在下で測定した。ラインウィーバー-バークプロットを用いて、阻害の様式を評価した。非競合阻害モデルを用いたGraphPad Prism6による配列番号3についての実験データの非線形回帰適合により、16.75mM(±1.35)のKi値が得られた。
【０１８９】
(実施例3: TKPの加水分解)
タマリンドカーネルパウダー(TKP)及び脱脂タマリンドカーネルパウダー(dTKP)は、Tamarind Magic, Hyderabad, Phase-IV, 3rd Gate, IDA, Cherlapally, Hyderabad - 500051, Telangana, Indiaから購入した。TKPとdTKPは両方とも、約65％(wt/wt)のキシログルカンからなる(https://www.altrafine.com/tamarind-kernel-powder/)。
【０１９０】
XGOS放出のために、20％(wt/vol)の8gのTKP又はdTKPを40mlの脱塩水に60℃で溶解させた。酵素を、基質量を基準にして、所望の濃度である3％、0.65％、0.05％、0.03％、又は0.006％(wt/wt TKP)で添加した。反応混合物のインキュベーションを、125rpm及び60℃で、ロータリーシェーカーで実施した。様々な時点で試料を採取することにより、加水分解プロセスをモニタリングした。試料を遠心分離し、上清を95℃で5分間煮沸して、残留タンパク質を変性させた。分析のために、上清の試料を回収し、再脱イオン水で10倍希釈し、HPAEC-PADにより測定した。
【０１９１】
(実施例4:最大700gのTKP/lの加水分解)
25g/LのTKPを60℃で脱塩水に溶解させた。酵素を700g/Lの最終基質量に関して0.05％の所望の濃度で添加した。加水分解プロセスを、250〜500rpmで撹拌する3枚のセグメントインペラを備えた2Lの撹拌タンク反応器(Sartorius AG, Gottingen, Germany)中、60℃で72時間実施した。基質を、700g/lの最終基質量が達成されるまで、25g/L/hの割合で供給した。プロセスモニタリングのために、試料を様々な時点で反応器から採取した。試料を遠心分離し、上清を95℃で5分間煮沸して、残留タンパク質を変性させた。XGOSを、実施例5に記載されているアルコール沈殿により、上清由来の5mL試料中で単離し、軽量した。分析のために、上清の試料を回収し、再脱イオン水で希釈し、実施例7に記載されているHPAEC-PADにより測定した。24時間後、75％を超える加水分解度に到達させ、反応時間を72時間に延長することにより、80％超にまで一層さらに向上させた。
【０１９２】
(実施例5:エタノール沈殿を伴うXGOS精製)
純粋なXGOS粉末を得るために(図3)、実施例3及び4由来の加水分解物を遠心分離により分離して、TKP/dTKPの不溶性画分を分離した(9,000rpm、20分、RT)。不溶性画分をさらに使用する1つの例は、動物飼料用のタンパク質が濃縮された高脂肪マトリックスとしてのものであり得る。上清をまず、精密濾過(接線濾過、0.2マイクロメーターフィルターカセット)により、次に、限外濾過(接線濾過、10kDaフィルターカセット)により清澄化した。残留タンパク質、ペプチド、脂肪酸、又は色素を、最大90％(vol/vol)のエタノール濃度でのエタノール沈殿及び氷上で1時間のインキュベーションにより除去した。沈殿を遠心分離により除去し、上清を濃縮し、エタノールを回転蒸発により再利用する。沈殿を、凍結乾燥、デシケーター、又は噴霧乾燥により乾燥させる。
【０１９３】
(実施例6:エタノール沈殿を伴わないXGOS精製)
純粋なXGOS粉末を得るために(図3)、実施例3由来の加水分解物を遠心分離により分離して、TKP/dTKPの不溶性画分を分離した(9,000rpm、20分、RT)。上清をまず、精密濾過(接線濾過、0.2μmフィルターカセット)により、次に、限外濾過(接線濾過、10kDaフィルターカセット)により清澄化する。より大きいスケール用の(逐次的)擬似移動床式クロマトグラフィー又はナノ濾過を使用することにより、DP7〜DP9の濃縮を達成した。濾液又は抽出物を凍結乾燥、デシケーター、又は噴霧乾燥により乾燥させた。
【０１９４】
(実施例7:オリゴ糖分析)
HPAEC-PADによる分析のために、CarboPac(商標) PA1カラム(4×250mm)及びPA1-プレカラム(4×50mm)を装備したThermo Fisher Scientific(Waltham, USA)製のICS 3000 Dionexクロマトグラフィーシステムを使用した。このシステムは、PEEKチュービング(内径0.25mm)、GM-4勾配ミキサー(2mm)、0.25μLのチャネル容量のEDアンペリメトリーセル、pH-Ag/AgCl基準電極、0.002インチのガスケット、及び使い捨て金電極を用いて組み立てた。泳動は、30℃のカラム温度で、25μLの注入容量及び1mL/分の流速で行った。分析物の分離に使用した溶離剤勾配は、100mM NaOH及び7.5mM酢酸ナトリウム(NaOAc)を用いて、0分で開始した。後者は、100mM NaOHを維持しながら、67.5分で100mMまで直線的に増大させた。カラムを洗浄するために、NaOAcの濃度を100mM NaOHで4分間、650mMまで増大させ、その後、各々の泳動後、100mM NaOHで16.3分間再平衡化した。PADによる炭水化物検出は、2Hzに設定された「標準炭水化物四重線(quad)」波形(波形B)に基づいた。
【０１９５】
多糖加水分解物の分析の前に、試料を再蒸留水で10〜200mg/lの最終XGOS濃度まで希釈した。分解産物を上記のオリゴ糖標準(各々10〜200mg L-1)との比較により同定した。
【０１９６】
TLCによる加水分解物の分析を多重試料の並行迅速分析に使用した。TLCは、Merck Millipore GmbH(Dusseldorf, Germany)製のシリカゲル60プレートを静止相として、8:2 v/vのアセトニトリル-水を移動相として用いて実施した。染色のために、プレートに、0.5mLの85％リン酸を新たに添加した5mL染色溶液(100mLアセトン、1gジフェニルアミン、1mLアニリン)を噴霧した。噴霧は、Sarstedt(Nuermbrecht, Germany)製のDESAGA ChromaJet DS 20を用いて行った。その後、プレートを120℃で20分間顕色させた。各々の加水分解物及び陰性対照の適用容量は、各々の分析物について、4.5μL及び1μLの1μg/μLストック溶液であった。
【０１９７】
定量は、Megazyme製のXGOS標準混合物を0.4g/L、0.2g/L、0.1g/L、及び0.05g/Lで用いて実施した。
【０１９８】
結果:従来技術(WO1991011112号)とは対照的に、最大DP7〜DP9量に対する酵素的TKP(20％wt/vol)加水分解は、配列番号3を用いて、0.65％(wt/wt TKP)により1時間未満で達成される(図9)。別の結果が、0.03％未満の配列番号2の酵素の濃度(wt/wt TKP)を使用することにより得られた。この濃度は、TKP(20％wt/vol)を24時間以内にDP7〜DP9オリゴ糖に完全に加水分解するのに十分である(図8)。配列番号3の酵素の濃度を0.006％(wt/wt TKP)までさらに低下させると、80％を超える十分な加水分解が24時間以内にもたらされる(図8)。
【０１９９】
(実施例8:ピーク面積決定)
20％(wt/wt)のTKPを、実施例3に従って、3％(wt/wt TKP)の配列番号3で24時間加水分解した。試料を、15分、30分、45分、1時間、2時間、3時間、4時間、8時間、及び24時間後に採取し、実施例7に記載されているHPAEC-PADを用いて分析した。産生されたオリゴ糖のピーク面積(nC*分)を、DP7、DP8、及びDP9オリゴ糖について個別に決定し、各々のオリゴ糖のパーセンテージを決定した。
【０２００】
結果:ひとたびTKPが完全に加水分解されると、DP7オリゴ糖とDP8オリゴ糖とDP9オリゴ糖の比は、安定であり、反応時間の延長によって変化しない。従来技術(WO1991011112号)とは対照的に、本発明者らは、望ましくない単糖又はXGOS収率の損失を生じるそれ以上のオリゴ糖分解を観察していない(図10)。非常に高い酵素濃度(3％)を使用しても、1時間以内に完全なTKP加水分解に達し、DP 7オリゴ糖とDP 8オリゴ糖とDP 9オリゴ糖の比は、長時間安定である(図10)。
【０２０１】
(実施例9:単糖の検出)
多糖キシログルカンは、その大部分が1,6結合キシロース側鎖で置換されている、β1→4結合グルコース残基の骨格を有する。キシロース残基は、多くの場合、ガラクトースで修飾されている。単糖へのさらなるキシログルカン加水分解の可能性を解析するために、本発明者らは、特に、酵素的加水分解後の単量体グルコース及びガラクトースの含有量を分析した。
【０２０２】
XGOS粉末中の残留ガラクトースは、製造業者(Megazyme, Ireland)により記載されているラクトース/D-ガラクトース検出キットを用いて決定した。測定は、Perkin Elmer Lambda 35 UV/Vis分光光度計を340nmで用いて実施した。XGOSが実施例3に記載されているように産生され、かつ0.05％の配列番号3を用いて実施例6に記載されているように精製される20％(wt/vol)精製XGOS溶液を用いて、ガラクトース濃度を決定した。XGOS溶液中のガラクトース濃度は、ガラクトースを用いて用意した標準曲線からガラクトース濃度を推測することにより決定した。調製物中の見掛けのガラクトース含有量は、72ppmであった。
【０２０３】
XGOS調製物中の残留グルコースは、(Kovacevicらの文献、2014)に記載されている、クロコウジカビグルコースオキシダーゼ(VII型、Sigma Aldrich)及び西洋ワサビペルオキシダーゼ(VI型、Sigma Aldrich)を用いる連動型酵素アッセイを用いて決定した。このアッセイは、20％(wt/vol)精製XGOS溶液を試料として用いて、2mM ABTS、1.3U/mLグルコースオキシダーゼ、及び0.5U/mL西洋ワサビペルオキシダーゼを含有する0.1M酢酸ナトリウムバッファー、pH 5.5中で実施した。410nmにおける吸光度の変化をTecan Sunriseマイクロプレートリーダーで追跡調査した。グルコースは、20％(wt/vol)精製XGOS溶液中で検出されなかった。対照実験:同じTKP溶液へのグルコースの添加により、20％(wt/vol)精製XGOS溶液中の検出可能な最小グルコース濃度は、54ppmであると決定された。したがって、XGOS調製物中の残留グルコース含有量は、54ppm未満である。
【０２０４】
従来技術(WO1991011112号)とは対照的に、配列番号1〜4の酵素プロセスを用いる記載されている加水分解は、単糖を産生しない。
【０２０５】
(実施例10: XGOSの代謝安定性)
オリゴ糖の代謝安定性を、統合型全食物繊維アッセイキット(Megazyme, Ireland)を用いて評価した。XGOS試料をAOAC法2011.25に記載されている酵素で消化し、HPAEC-PADを用いる実施例7に記載されている酵素処理の後に、オリゴ糖組成を分析した。キシログルカンオリゴ糖は、ブタ膵臓アミラーゼ及びアミログルコシダーゼによる加水分解に抵抗性であり、XGOSを可溶性食物繊維とみなした。
【０２０６】
(実施例11:含水率aW-値)
水分活性(aW値)は、25℃でNovasina(Lachen, Switzerland)製のSprintのAW装置を用いて決定した。エタノール沈殿を伴わないで精製されたオリゴ糖の水分含有量は、0.311であった。エタノール沈殿を含めて調製されたaW XGOS値は、0.327であった。
【０２０７】
(実施例12:酸処理に対するXGOSの安定性)
食品及び飼料製品のために、酸安定性が必要である。酸に対するDP7〜DP9 XGOSの安定性を試験するために、10％(wt/vol) XGOSを水(pH 7.0)に溶解させ、37℃で2時間インキュベートし、10mM HCl(pH 2.0)で処理され、かつ同じ条件でインキュベートされた同量のXGOSと比較した。分析は、HPAEC-PADにより行った。pH 7.0の試料とpH 2.0の試料の間のオリゴ糖組成に、違いは観察されなかった。
【０２０８】
(実施例13:熱に対するXGOSの安定性)
ペレット化、押出成形、又は低温殺菌プロセスのために、熱安定性が必要である。熱に対するDP7〜DP9 XGOSの安定性を試験するために、10％(wt/vol) XGOSを水(pH 7.0)に溶解させ、97℃で10分間インキュベートし、同量の未処理XGOSと比較した。分析は、HPAEC-PADにより行った。熱処理の後、薄い沈殿が観察され、これは、XGOS溶解性に影響を及ぼさなかった。熱処理は、DP7〜DP9 XGOSの組成を変化させず、熱処理試料と非熱処理試料で等量のXGOSが検出された。単糖又は二糖の増加は、検出することができなかった。10％(wt/vol) XGOS溶液を121℃及び2バールで20分間インキュベートし、80％を上回るXGOSが上清に残存した。XGOS組成は変化しなかった。さらに、単量体画分は、増加しなかった。
【０２０９】
(参考文献)
【化１】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【手続補正書】
【提出日】令和2年9月1日(2020.9.1)
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】配列表
【補正方法】追加
【補正の内容】
【配列表】
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【国際調査報告】
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