(57)【要約】アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産物を産生する方法及びアデノ随伴ウイルスを精製する方法が、本明細書に提供される。ＡＡＶがアフィニティ樹脂に負荷され、洗浄ステップが行われ、ＡＡＶがアフィニティ樹脂から溶出される。様々な緩衝液が、洗浄ステップ及び溶出における使用について開示される。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法であって、
（ａ）ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶを標的としたアフィニティ樹脂上に、前記溶液中の前記ＡＡＶと前記アフィニティ樹脂との間の結合を可能にする伝導下で負荷することと、
（ｂ）少なくとも２つの洗浄ステップを行うことと、
（ｃ）前記ＡＡＶを前記アフィニティ樹脂から溶出させることと、
を含む、方法。
【請求項２】
前記ＡＡＶ含有溶液を陰イオン交換体と接触させることと、前記ＡＡＶ含有溶液を前記アフィニティ樹脂に負荷する前に前記陰イオン交換体から前記ＡＡＶ含有溶液を溶出させることと、をさらに含む、請求項１に記載の方法。
【請求項３】
前記洗浄ステップのうちの少なくとも１つが、有機溶媒または界面活性剤を含む緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含む、請求項１に記載の方法。
【請求項４】
前記緩衝液がＴｒｉｓＨＣｌ及び塩を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記緩衝液が、ヒスチジン、ヒスチジン−ＨＣｌ、アルギニン−ＨＣｌ、リジン−ＨＣｌ、グリシン、タウリン、ＭＥＳ−Ｎａ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、及びＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンのうちの１つ以上を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項６】
前記塩がＮａＣｌである、請求項４または請求項５に記載の方法。
【請求項７】
前記緩衝液が酢酸ナトリウムを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項８】
前記緩衝液が塩化マグネシウムを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項９】
前記緩衝液がＴｒｉｓＨＣｌ及びエチレングリコールを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１０】
前記緩衝液が、アルギニン−ＨＣｌならびにスクロース及びグリセロールのうちの１つを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１１】
前記緩衝液がタウリン及びエチレングリコールを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１２】
前記緩衝液が、アルギニン−ＨＣｌ、リジン−ＨＣｌ、及びヒスチジン−ＨＣｌを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１３】
前記緩衝液がＴｒｉｓＨＣｌ及びＤＭＳＯを含む、請求項３に記載の方法。
【請求項１４】
少なくとも３つの洗浄ステップが実行される、請求項１に記載の方法。
【請求項１５】
３つの洗浄ステップが実行される、請求項８に記載の方法。
【請求項１６】
前記３つの洗浄ステップが連続して実行される、請求項９に記載の方法。
【請求項１７】
前記有機溶媒または界面活性剤が、ポリソルベート８０、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ＤＭＳＯ、スクロース、またはトレハロースである、請求項３に記載の方法。
【請求項１８】
前記界面活性剤がＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ポリソルベート８０、及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）のうちの１つ以上を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記緩衝液がＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含む、請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
第１の洗浄ステップが、約５０〜約２０００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが、約３０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約５００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５〜約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約３０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約３０〜約７５体積％のエチレングリコールを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．３〜約８．８のｐＨを有する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項２１】
第１の洗浄ステップが、約５０〜約５００ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ−Ｎａ）のナトリウム塩と、約３〜約３０ｍＭのＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／界面活性剤混合物と、を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが、約３０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌまたはアルギニン−ＨＣｌ及び約７５〜約５００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５〜約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約２０〜約８０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約５０〜約２００ｍＭの塩を含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．３〜約８．８のｐＨを有する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項２２】
第１の洗浄ステップが、約５０〜約２００ｍＭのタウリン及び０．２〜１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ  ６０００）を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが約３０〜約３００ｍＭのグリシンを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５〜約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約２０〜約１５０ｍＭのタウリン、約３０〜約７５体積％のエチレングリコール、及び０．０５〜０．２％のオクチルグリコピラノシドを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．３〜約８．８のｐＨを有する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項２３】
第１の洗浄ステップが、約８０〜約４００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓと、約１１：３：３の比率（重量による）でＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ポリソルベート８０、及びＴＮＢＰを含む約１０〜約２０グラムの溶媒／界面活性剤混合物と、を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが約５〜約２０ｍｍｏｌのクエン酸ナトリウムを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５〜約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約５０〜約２００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約５０〜約２００ｍＭのリジンＨＣｌ、約５０〜約２００ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、及び約１ｍＭ〜約４ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン、及び約１０％〜約４０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．３〜約８．８のｐＨを有する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項２４】
第１の洗浄ステップが、約５０ｎＭ〜約２００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが、約２０ｎＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０ｎＭ〜約２００ｎＭの塩を含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５〜約８．８のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４０％〜約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．５〜約８．８のｐＨを有する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項２５】
第１の洗浄ステップが、約５０ｎＭ〜約２００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが、約２０ｎＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０ｎＭ〜約２００ｎＭの塩を含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５〜約８．８のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４０％〜約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．５〜約８．８のｐＨを有する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項２６】
前記塩が、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムうちの１つ以上の組み合わせから選択される、請求項２０〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記塩がＮａＣｌである、請求項２６に記載の方法。
【請求項２８】
前記塩の濃度が５００ｍＭを超えない、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記塩の濃度が２００ｍＭを超えない、請求項２０〜２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記第３の緩衝液中の塩の濃度が５００ｍＭを超えない、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記第３の緩衝液中の塩の濃度が２００ｍＭを超えない、請求項２０〜２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記第１の洗浄ステップの前に起こり、約１０〜約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、前記第４の緩衝液が約６．５〜約８．０のｐＨを有する、請求項２０〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記第１の緩衝液が約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％のポリソルベート８０を含み、前記第１の緩衝液が約６．０のｐＨを有する、請求項２０〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記第２の緩衝液が約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、前記第２の緩衝液が約８．５のｐＨを有する、請求項２０〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記第３の緩衝液が約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０体積％のエチレングリコールを含み、前記第３の緩衝液が約８．５のｐＨを有する、請求項２０〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
第１の洗浄ステップが、約５０〜約２００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．５〜約６．５のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが、約１０〜約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約８．０〜約９．０のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約１０〜約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約３０〜約７５体積％のエチレングリコールを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約８．０〜約９．０のｐＨを有する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項３７】
前記第１の洗浄ステップの前に起こり、約１０〜約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、前記第４の緩衝液が約６．５〜約８．０のｐＨを有する、請求項３６に記載の方法。
【請求項３８】
前記第１の緩衝液が約１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．１％のポリソルベート８０を含み、前記第１の緩衝液が約６．０のｐＨを有する、請求項３６または請求項３７に記載の方法。
【請求項３９】
前記第２の緩衝液が約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、前記第２の緩衝液が約８．５のｐＨを有する、請求項３６〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記第３の緩衝液が約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０体積％のエチレングリコールを含み、前記第３の緩衝液が約８．０のｐＨを有する、請求項３６〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
酸性成分が除去される、請求項４０に記載の方法。
【請求項４２】
前記酸性成分がＨＥＫ２９３  ＤＮＡのような宿主細胞ＤＮＡであり、前記酸性成分がｑＰＣＲによって測定されるように、ＡＡＶ抗原のマイクログラムあたり２５０ｐｇ未満の値に低下する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４３】
前記酸性成分がＨＥＫ２９３  ＤＮＡのような宿主細胞ＤＮＡであり、前記酸性成分がＥＬＩＳＡによって測定されるように、ＡＡＶ抗原のマイクログラムあたり２５０ｐｇ未満の値に低下する、請求項４１に記載の方法。
【請求項４４】
溶出させることが勾配溶出による溶出緩衝液の伝導性の連続的な線形増加を適用することを含む、請求項１〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
溶出させることが勾配溶出による有機溶媒の濃度の連続的な線形増加を適用することを含む、請求項１〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
溶出させることが、エチレングリコール、ＮａＣｌのような塩、及びＴｒｉｓＨＣｌのような緩衝液を含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることを含み、前記ｐＨが少なくとも７．０である、請求項１〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記塩濃度が約７５０ｍＭであり、前記緩衝液濃度が約５０ｍＭであり、前記エチレングリコールが５０〜６０％（ｗ／ｗ）である、請求項４６に記載の方法。
【請求項４８】
前記ｐＨが約８．０である、請求項４６または請求項４７に記載の方法。
【請求項４９】
前記塩がＮａＣｌであり、前記緩衝液がＴｒｉｓＨＣｌである、請求項４６〜４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５０】
溶出させることが、約７５０ｍＭのＮａＣｌ及び５０〜６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも７．０のｐＨで接触させることを含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５１】
前記溶出緩衝液が少なくとも約５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む、請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
溶出させることが、約５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、約７５０ｍＭ〜約１２５０ｍＭのＮａＣｌ及び約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも７．８のｐＨで接触させることを含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
溶出させることが、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約７５０ｍＭ〜約１０００ｍＭのＮａＣｌ及び少なくとも約５５％（ｗ／ｗ）のスクロースを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約８．０のｐＨで接触させることを含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
溶出させることが、
（ａ）約２０〜約１００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることであって、前記第５の緩衝液が約７．５〜約８．５のｐＨを有する、前記接触させることと、
（ｂ）約２０〜約１００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約４０〜約６０％（ｗ／ｗ）のグリセロール、及び約５００〜１０００ｍＭの塩を含む第２の溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることであって、前記第２の緩衝液が約７．５〜約８．５のｐＨを有する、前記接触させることと、をさらに含む、請求項５３に記載の方法。
【請求項５５】
前記ステップが連続して実行される、請求項５４に記載の方法。
【請求項５６】
溶出させることが、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約７５０ｍＭ〜約１０００ｍＭのＮａＣｌ及び少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約８．０のｐＨで接触させることを含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５７】
溶出させることが、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのタウリン、約６００ｍＭ〜約１０００ｍＭのＮａＣｌ、約０．０５〜約０．２％のオクチルグリコピラノシド、及び少なくとも約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約７．８のｐＨで接触させることを含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
溶出させることが、
（ａ）約２０〜約１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることであって、前記第５の緩衝液が約８．０〜約８．８のｐＨを有する、前記接触させることと、
（ｂ）少なくとも約６．８のｐＨで約１Ｍの硫酸アンモニウム、約５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、及び約５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含む第２の溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることと、をさらに含む、請求項５７に記載の方法。
【請求項５９】
前記ステップが連続して実行される、請求項５８に記載の方法。
【請求項６０】
溶出させることが、少なくとも約６．８のｐＨで約１Ｍの硫酸アンモニウム、約５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、及び約５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることを含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
溶出させることが、約２０％（ｗ／ｗ）のスクロース、約１０％（ｗ／ｗ）のソルビトール、約５％（ｗ／ｗ）のマンニトールまたは約５％（ｗ／ｗ）のスクロース、約１５％（ｗ／ｗ）のグリセロール、約５０ｍＭのヒスチジン、及び約７５０〜約１０００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を少なくとも約７．８のｐＨで接触させることを含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
溶出させることが、
（ａ）約２０〜約１００ｍＭのヒスチジン、約８０〜約１２０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることであって、前記第５の緩衝液が約８．０〜約８．８のｐＨを有する、前記接触させることと、
（ｂ）約２０〜約１００ｍＭのヒスチジン及び約６００〜約９００ｍＭのＮａＣｌ、及び約５〜６０％（ｗ／ｗ）のＤＭＳＯを含む第２の緩衝液と前記アフィニティ樹脂を接触させることであって、前記第５の緩衝液が約６．５〜約８．５のｐＨを有する、前記接触させることと、をさらに含む、請求項６１に記載の方法。
【請求項６３】
前記ステップが連続して実行される、請求項６２に記載の方法。
【請求項６４】
溶出させることが、約１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、約２００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液と前記アフィニティ樹脂を約２．５のｐＨで接触させることを含む、請求項１〜４９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記溶出緩衝液が約８．０のｐＨにある、請求項５０〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記溶出緩衝液が８．０のｐＨにある、請求項５０〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
溶出させることが対イオン濃度の段階的な増加を含む、請求項１〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
溶出させることが有機溶媒濃度の段階的な増加を含む、請求項１〜６７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６９】
前記溶出緩衝液中の前記塩が、塩化物、酢酸塩、硫酸塩、クエン酸塩のような、一価、二価または多価の陰イオンから選択される、請求項１〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
第１の洗浄ステップが、約５０〜約２００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第１の緩衝液が約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップが約２５〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む第２の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第２の緩衝液が約７．５〜約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップが、約２０〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第３の緩衝液を前記アフィニティ樹脂に適用することを含み、前記第３の緩衝液が約７．５〜約８．８のｐＨを有する、請求項１５または請求項１６に記載の方法。
【請求項７１】
約２０〜約５０ｍＭのＨＣｌを前記アフィニティ樹脂に約１．７〜約２．５のｐＨで適用することが後に続く、前記アフィニティ樹脂に精製水を適用することによる溶出をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
０〜１００％の勾配の２０〜５０ｍＭの塩酸／０．５〜２．０ｍＭの塩酸中の８００〜１２００ｍＭのＮａＣｌを適用することによる溶出をさらに含む、請求項７０に記載の方法。
【請求項７３】
前記溶出させるステップから得られた前記ＡＡＶが９９．９％以下のＨＣ不純物レベルを有する、請求項１〜７２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７４】
前記溶出させるステップから得られた前記ＡＡＶが９９．０％以下のＨＣ不純物レベルを有する、請求項１〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＡＡＶがＡＡＶ８であり、前記アフィニティ樹脂がＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８であり、前記溶出緩衝液が酸性でありエチレングリコールを含まない、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＡＡＶがＡＡＶ９であり、前記アフィニティ樹脂がＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９であり、前記溶出緩衝液が酸性でありエチレングリコールを含まない、請求項１〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７７】
前記ＡＡＶがＡＡＶ８であり、前記アフィニティ樹脂が、クロマトグラフィーマトリックス上に固定化されたタイプＡＤＫ８またはＡＤＫ８／９からのＡＡＶ８に対して固定化されたモノクローナル抗体からなる免疫アフィニティ樹脂である、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記ＡＡＶがＡＡＶ９であり、前記アフィニティ樹脂が、クロマトグラフィーマトリックス上に固定化されたタイプＡＤＫ９またはＡＤＫ８／９からのＡＡＶ９に対して固定化されたモノクローナル抗体からなる免疫アフィニティ樹脂である、請求項１〜７６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
酸性の荷電した汚染物質を前記ＡＡＶ含有溶液から枯渇させるために有効な正に荷電した基を含むフィルタに前記ＡＡＶ含有溶液を接触させることをさらに含む、請求項１〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
３５ｎｍを超えるウイルスを除去するためのＡＡＶ画分のナノ濾過をさらに含む、請求項１〜７９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８１】
テンタクルゲルを含むカラムを用いてＡＥＸクロマトグラフィーを実行することを含む磨きステップをさらに含む、請求項１〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してＡＡＶ画分を試験することをさらに含む、請求項１〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡがＡＡＶに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡである、請求項８２に記載の方法。
【請求項８４】
請求項１〜８３のいずれか一項に記載の方法により産生されるＡＡＶ産物。
【発明の詳細な説明】
【関連出願の相互参照】
【０００１】
本出願は、２０１７年１２月２９日に出願された米国仮出願第６２／６１１，７０９号に対する優先権を主張するものであり、その開示の全ては参照により本明細書に組み込まれる。
【技術分野】
【０００２】
本発明は、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する材料及び方法に関する。
【背景技術】
【０００３】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、線状の１本鎖ＤＮＡゲノムをパッケージ化する小さな非エンベロープウイルスである。ＡＡＶによる増殖性感染が、例えば、アデノウイルスまたはヘルペスウイルスのようなヘルパーウイルスの存在下でのみ発生するため、ＡＡＶは、Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ科及びＤｅｐｅｎｄｏｖｉｒｕｓ属に属する。ヘルパーウイルスが存在しない場合でさえも、ＡＡＶ（血清型２）は、宿主ヒトゲノムの染色体１９ｑ１３．４に組み込むことで、潜伏を達成できる。ＡＡＶは、部位特異的組込みが可能であることが知られている唯一の哺乳動物ＤＮＡウイルスである（非特許文献１）。
【０００４】
臨床において安全に使用されるＡＡＶのために、ＡＡＶは、そのゲノム内のいくつかの位置で遺伝学的に修飾されている。例えば、ウイルス複製に必要なＲｅｐ遺伝子、及び部位特異的組込みに必要な要素は、多くのウイルスベクターにおいてＡＡＶゲノムから削除されている。かかる組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）は、染色体外状態で存在し、非常に低いゲノムＤＮＡへの組込み効率を有する。したがって、完全に排除されないとしても、宿主細胞においてｒＡＡＶがランダム変異誘発を誘導する可能性は低下する。これらの特性及び病原性の欠如のため、ｒＡＡＶは、前臨床及び臨床適用の複数の側面における遺伝子治療ベクターとして大きな見通しを示している。新しい血清型及び自己相補的ベクターは、臨床において試験されている。これらの進行中のベクター開発に加えて、継続的な努力は、高い純度及び効力を有する高力価のｒＡＡＶベクターを効率的に生成できるスケーラブルな製造プロセスに集中している。
【０００５】
ヒト投与に適したＡＡＶ産物を精製するための効率的で大規模な方法を設計する努力は大きいが、より良いＡＡＶ精製方法に対する必要性が残っている。ＡＡＶの精製中により効率的に除去され得る、宿主細胞培養マトリックスからの他の様々なタンパク質及び材料がある。したがって、最終的なＡＡＶ産物から宿主細胞材料を除去するためのステップを含むＡＡＶ精製方法が望まれる。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００６】
【非特許文献１】Ｄａｙａ  ａｎｄ  Ｂｅｒｎｓ，Ｃｌｉｎｉｃａｌ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  Ｒｅｖｉｅｗｓ，ｐａｇｅｓ  ５８３−５９３（２００８）
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
細胞培養におけるＡＡＶベクター生成の特徴は、破壊された細胞からの材料を含む複雑なマトリックスの形成である。特に、宿主細胞タンパク質、プロテアソーム、細胞片、及び潜在的なウイルス特異的受容体は、破壊された細胞からの材料中にしばしば存在する。生理学的に適用可能なｐＨでより高い純度を生じる条件において最終ＡＡＶ産物から宿主細胞材料を除去するためのステップを含む開示された方法。
【０００８】
一態様では、
（ａ）ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶを標的としたアフィニティ樹脂上に、溶液中のＡＡＶとアフィニティ樹脂との間の結合を可能にする伝導下で負荷することと、
（ｂ）少なくとも２つの洗浄ステップを行うことと、
（ｃ）ＡＡＶをアフィニティ樹脂から溶出させることと、を含む、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法が提供される。
【０００９】
いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＶ含有溶液を陰イオン交換体と接触させることと、ＡＡＶ含有溶液をアフィニティ樹脂に負荷する前に陰イオン交換体からＡＡＶ含有溶液を溶出させることと、をさらに含む。
【００１０】
いくつかの実施形態では、洗浄ステップのうちの少なくとも１つは、有機溶媒または界面活性剤を含む緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴｒｉｓＨＣｌ及び塩を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ヒスチジン、ヒスチジン−ＨＣｌ、アルギニン−ＨＣｌ、リジン−ＨＣｌ、グリシン、タウリン、ＭＥＳ−Ｎａ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、及びＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸ナトリウム緩衝液を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、塩化マグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴｒｉｓＨＣｌ及びエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アルギニン−ＨＣｌならびにスクロース及びグリセロールのうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、タウリン及びエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アルギニン−ＨＣｌ、リジン−ＨＣｌ、及びヒスチジン−ＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴｒｉｓＨＣｌ及びＤＭＳＯを含む。
【００１１】
いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが実行される。いくつかの実施形態では、３つの洗浄ステップが実行される。いくつかの実施形態では、３つの洗浄ステップが連続して実行される。
【００１２】
いくつかの実施形態では、有機溶媒または界面活性剤は、ポリソルベート８０、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ＤＭＳＯ、スクロース、またはトレハロースである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ポリソルベート８０、及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを含む。
【００１３】
いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０〜約２０００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップは、約３０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約５００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップは、約３０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約３０〜約７５体積％のエチレングリコールを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は、約７．３〜約８．８のｐＨを有する。
【００１４】
いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０〜約５００ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ−Ｎａ）のナトリウム塩と、約３〜約３０ｍＭのＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／界面活性剤混合物と、を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップは、約３０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌまたはアルギニン−ＨＣｌ及び約７５〜約５００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップは、約２０〜約８０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約５０〜約２００ｍＭの塩を含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は、約７．３〜約８．８のｐＨを有する。
【００１５】
いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０〜約２００ｍＭのタウリン及び０．２〜１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ  ６０００）を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液が約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップは、約３０〜約３００ｍＭのグリシンを含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップは、約２０〜約１５０ｍＭのタウリン、約３０〜約７５体積％のエチレングリコール、及び０．０５〜０．２％のオクチルグリコピラノシド（ｏｃｔｙｌｇｌｙｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は、約７．３〜約８．８のｐＨを有する。
【００１６】
いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約８０〜約４００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓと、約１１：３：３の比率（重量による）でＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ポリソルベート８０、及びＴＮＢＰを含む約１０〜約２０グラムの溶媒／界面活性剤混合物と、を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップは、約５〜約２０ｍｍｏｌのクエン酸ナトリウムを含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップは、約５０〜約２００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約５０〜約２００ｍＭのリジンＨＣｌ、約５０〜約２００ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、及び約１ｍＭ〜約４ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン、及び約１０％〜約４０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は、約７．３〜約８．８のｐＨを有する。
【００１７】
いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０ｎＭ〜約２００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップは、約２０ｎＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０ｎＭ〜約２００ｎＭの塩を含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップは、約２０ｍＭ〜１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４０％〜約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有する。
【００１８】
いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０ｎＭ〜約２００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップは、約２０ｎＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０ｎＭ〜約２００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップは、約２０ｍＭ〜１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４０％〜約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有する。
【００１９】
いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。
【００２０】
いくつかの実施形態では、塩の濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、第３の緩衝液中の塩の濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、第３の緩衝液中の塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。
【００２１】
いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄ステップの前に起こり、約１０〜約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の緩衝液は、約６．５〜約８．０のｐＨを有する。
【００２２】
いくつかの実施形態では、第１の緩衝液は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％のポリソルベート８０を含み、第１の緩衝液は、約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第３の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０体積％のエチレングリコールを含み、第３の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。
【００２３】
いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０〜約２００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．５〜約６．５のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップは、約１０〜約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約８．０〜約９．０のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップは、約１０〜約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約３０〜約７５体積％のエチレングリコールを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は、約８．０〜約９．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄ステップの前に起こり、約１０〜約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の緩衝液は、約６．５〜約８．０のｐＨを有する。
【００２４】
いくつかの実施形態では、第１の緩衝液は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．１％のポリソルベート８０を含み、第１の緩衝液は、約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第３の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０体積％のエチレングリコールを含み、第３の緩衝液は、約８．０のｐＨを有する。
【００２５】
いくつかの実施形態では、酸性成分が除去される。いくつかの実施形態では、酸性成分は、ＨＥＫ２９３  ＤＮＡのような宿主細胞ＤＮＡであり、酸性成分は、ｑＰＣＲによって測定されるように、ＡＡＶ抗原のマイクログラムあたり２５０ｐｇ未満の値に低下する。いくつかの実施形態では、酸性成分は、ＨＥＫ２９３  ＤＮＡのような宿主細胞ＤＮＡであり、酸性成分は、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、ＡＡＶ抗原のマイクログラムあたり２５０ｐｇ未満の値に低下する。
【００２６】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、勾配溶出による溶出緩衝液の伝導性の連続的な線形増加を適用することを含む。いくつかの実施形態では、溶出させることは、勾配溶出による有機溶媒の濃度の連続的な線形増加を適用することを含む。いくつかの実施形態では、溶出させることは、エチレングリコール、ＮａＣｌのような塩、及びＴｒｉｓＨＣｌのような緩衝液を含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を接触させることを含み、ｐＨは、少なくとも７．０である。いくつかの実施形態では、塩濃度は約７５０ｍＭであり、緩衝液濃度は約５０ｍＭであり、エチレングリコールは５０〜６０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、約８．０である。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌであり、緩衝液はＴｒｉｓＨＣｌである。
【００２７】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、約７５０ｍＭのＮａＣｌ及び５０〜６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を少なくとも７．０のｐＨで接触させることを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、少なくとも約５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、溶出させることは、約５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、約７５０ｍＭ〜約１２５０ｍＭのＮａＣｌ及び約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を少なくとも７．８のｐＨで接触させることを含む。
【００２８】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約７５０ｍＭ〜約１０００ｍＭのＮａＣｌ及び少なくとも約５５％（ｗ／ｗ）のスクロースを含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を少なくとも約８．０のｐＨで接触させることを含む。
【００２９】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、
（ａ）約２０〜約１００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液とアフィニティ樹脂を接触させることをさらに含み、第５の緩衝液は約７．５〜約８．５のｐＨを有し、
（ｂ）約２０〜約１００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約４０〜約６０％（ｗ／ｗ）のグリセロール、及び約５００〜１０００ｍＭの塩を含む第２の溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を接触させることをさらに含み、第２の緩衝液は約７．５〜約８．５のｐＨを有する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、これらのステップが連続して実行される。
【００３１】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約７５０ｍＭ〜約１０００ｍＭのＮａＣｌ及び少なくとも約５０％（ｗ／ｗ）のグリセロールを含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を少なくとも約８．０のｐＨで接触させることを含む。
【００３２】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、約２ｍＭの塩化マグネシウム、約５０ｍＭのタウリン、約６００ｍＭ〜約１０００ｍＭのＮａＣｌ、約０．０５〜約０．２％のオクチルグリコピラノシド、及び少なくとも約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を少なくとも約７．８のｐＨで接触させることを含む。いくつかの実施形態では、溶出させることは、
（ａ）約２０〜約１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液とアフィニティ樹脂を接触させることをさらに含み、第５の緩衝液は約８．０〜約８．８のｐＨを有し、
（ｂ）少なくとも約６．８のｐＨで約１Ｍの硫酸アンモニウム、約５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、及び約５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含む第２の溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を接触させることをさらに含む。
【００３３】
いくつかの実施形態では、これらのステップが連続して実行される。
【００３４】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、少なくとも約６．８のｐＨで約１Ｍの硫酸アンモニウム、約５０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌ、及び約５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、溶出させることは、約２０％（ｗ／ｗ）のスクロース、約１０％（ｗ／ｗ）のソルビトール、約５％（ｗ／ｗ）のマンニトールまたは約５％（ｗ／ｗ）のスクロース、約１５％（ｗ／ｗ）のグリセロール、約５０ｍＭのヒスチジン、及び約７５０〜約１０００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を少なくとも約７．８のｐＨで接触させることを含む。
【００３５】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、
（ａ）約２０〜約１００ｍＭのヒスチジン、約８０〜約１２０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液とアフィニティ樹脂を接触させることをさらに含み、第５の緩衝液は約８．０〜約８．８のｐＨを有し、
（ｂ）約２０〜約１００ｍＭのヒスチジン及び約６００〜約９００ｍＭのＮａＣｌ、及び約５〜６０％（ｗ／ｗ）のＤＭＳＯを含む第２の緩衝液とアフィニティ樹脂を接触させることをさらに含み、第５の緩衝液は約６．５〜約８．５のｐＨを有する。
【００３６】
いくつかの実施形態では、これらのステップが連続して実行される。いくつかの実施形態では、溶出させることは、約１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、約２００ｍＭのＮａＣｌを含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を約２．５のｐＨで接触させることを含む。
【００３７】
いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約８．０のｐＨにある。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、８．０のｐＨにある。
【００３８】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、対イオン濃度の段階的な増加を含む。いくつかの実施形態では、溶出させることは、有機溶媒濃度の段階的な増加を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液中の塩は、塩化物、酢酸塩、硫酸塩、クエン酸塩のような、一価、二価または多価の陰イオンから選択される。
【００３９】
いくつかの実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０〜約２００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、
第２の洗浄ステップは、約２５〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０〜約２００ｍＭのＮａＣｌを含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有し、
第３の洗浄ステップは約２０〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は約７．５〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、約２０〜約５０ｍＭのＨＣｌをアフィニティ樹脂に約１．７〜約２．５のｐＨで適用することが後に続く、アフィニティ樹脂に精製水を適用することによる溶出をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、０〜１００％の勾配の２０〜５０ｍＭの塩酸／０．５〜２．０ｍＭの塩酸中の８００〜１２００ｍＭのＮａＣｌを適用することによる溶出をさらに含む。
【００４０】
いくつかの実施形態では、溶出させるステップから得られたＡＡＶは、９９．９％以下のＨＣ不純物レベルを有する。いくつかの実施形態では、溶出させるステップから得られたＡＡＶは、９９．０％以下のＨＣ不純物レベルを有する。
【００４１】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ８であり、アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８であり、溶出緩衝液は酸性でありエチレングリコールを含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９であり、アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９であり、溶出緩衝液は酸性でありエチレングリコールを含まない。
【００４２】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ８であり、アフィニティ樹脂はクロマトグラフィーマトリックス上に固定化されたタイプＡＤＫ８またはＡＤＫ８／９からのＡＡＶ８に対して固定化されたモノクローナル抗体からなる免疫アフィニティ樹脂である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９であり、アフィニティ樹脂はクロマトグラフィーマトリックス上に固定化されたタイプＡＤＫ９またはＡＤＫ８／９からのＡＡＶ９に対して固定化されたモノクローナル抗体からなる免疫アフィニティ樹脂である。
【００４３】
いくつかの実施形態では、方法は、酸性の荷電した汚染物質をＡＡＶ含有溶液から枯渇させるために有効な正に荷電した基を含むフィルタにＡＡＶ含有溶液を接触させることをさらに含む。
【００４４】
いくつかの実施形態では、方法は、３５ｎｍを超えるウイルスを除去するためのＡＡＶ画分のナノ濾過をさらに含む。
【００４５】
いくつかの実施形態では、方法は、テンタクルゲル（ｔｅｎｔａｃｌｅ  ｇｅｌ）を含むカラムを用いてＡＥＸクロマトグラフィーを実行することを含む磨きステップをさらに含む。
【００４６】
いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してＡＡＶ画分を試験することをさらに含む。
【００４７】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶに特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡである。
【００４８】
別の態様では、請求項１〜８３のいずれか一項に記載の方法により産生されるＡＡＶ産物が提供される。
【図面の簡単な説明】
【００４９】
【図１】洗浄ステップを伴わない比較精製プロトコル（レーン６）と対照的な本明細書に記載される複数の洗浄ステップを伴う精製プロトコル（レーン４）に従う実質的により少ない熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）を示すウエスタンブロットを示す。
【図２】レーン２におけるＡＡＶ８タンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色ゲル、本明細書に記載される複数の洗浄ステップを伴う精製プロトコル（レーン４）及び洗浄ステップを伴わない比較精製プロトコル（レーン６）からのＡＡＶ８含有溶出物を示す。
【図３】洗浄ステップを伴わない比較精製プロトコル（レーン６）より本明細書に記載される複数の洗浄ステップを伴う精製プロトコル（レーン４）に従って調製された溶出物中により多く存在するＡＡＶ８を示すウエスタンブロットを示す。ＡＡＶ８参照試料はレーン２にある。
【図４】ＡＡＶ８を発現するＨＥＫ  ２９３細胞からの細胞培養培地の（Ｌ）初期負荷からＡＡＶ８に富んだ溶出物（Ｅ）までの様々な分画中に存在するタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色ゲルを示す。洗浄ステップ（Ｗ１、Ｗ２、及びＷ３）からのフロースルーにおけるＡＡＶ８の損失はほとんどなく、ストリッピング（Ｓ）中にカラムから溶出されたＡＡＶ８はほとんどなかった。
【図５】ＡＡＶ８抗原に対するウエスタンブロットを示す。ＡＡＶ８は、ＡＡＶ８を発現するＨＥＫ  ２９３細胞からの細胞培養培地の初期負荷（Ｌ）において発現された。実質的により少ないＡＡＶ８が、その初期負荷からのフロースルー（ＦＴ）ならびにその後の洗浄ステップ（Ｗ１、Ｗ２、及びＷ３）において存在した。ＡＡＶ８は、溶出物中に存在した（Ｅ、Ｅ２）。そのうえ、実質的により少ないＡＡＶ８が、ストリッピング（Ｓ）中にカラムから溶出された。
【図６】実施例３に従う分離手順のクロマトグラムを示す。
【図７】実施例１１に従う分離手順のクロマトグラムを示す。
【図８】実施例１１に従う様々な洗浄ステップ及び溶出液からの様々な画分に存在するタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色ゲルを示す。
【図９】実施例１２に従う分離手順のクロマトグラムを示す。
【図１０】実施例１２に従う様々な洗浄ステップ及び溶出液からの様々な画分に存在するタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色ゲルを示す。
【図１１】実施例１３に従う分離手順のクロマトグラムを示す。
【図１２】実施例１３に従う様々な洗浄ステップ及び溶出液からの様々な画分に存在するタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色ゲルを示す。
【図１３】実施例１４に従う分離手順のクロマトグラムを示す。
【図１４】実施例１４に記載されるような洗浄ステップ及び溶出液から採取した様々な画分に存在するタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色ゲルを示す。
【図１５】実施例１４に記載されるような洗浄ステップ及び溶出液から採取した様々な画分からのＡＡＶ抗原に対するウエスタンブロットを示す。
【図１６】実施例１５に従う分離手順のクロマトグラムを示す。
【図１７】実施例１６に従う分離手順のクロマトグラムを示す。
【図１８】実施例１６に記載されるような洗浄ステップ及び溶出液から採取した様々な画分からのＡＡＶ抗原に対するウエスタンブロットを示す。
【図１９】実施例１７に従う分離手順のクロマトグラムを示す。
【図２０】実施例１７に記載されるような洗浄ステップ及び溶出液から採取した様々な画分に存在するタンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色ゲルを示す。
【図２１】実施例１８に記載される溶出スクリーンからの結果を示すクロマトグラムを示す。
【発明を実施するための形態】
【００５０】
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）産物を産生する方法、ＡＡＶを精製する方法、ならびに空のＡＡＶキャプシド及び完全なＡＡＶキャプシドを含む濃縮されたＡＡＶ画分から完全なＡＡＶキャプシドを精製する方法が、本明細書で提供される。
【００５１】
本開示を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」ならびに同様の指示語の使用は、本明細書において別段示されない限り、または文脈に明らかに矛盾しない限り、単数及び複数の両方を網羅すると解釈されるべきである。「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「有する」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」、及び「含有する」という用語は、別段述べられない限り、開放型用語（すなわち、「含むがそれに限定されない」ことを意味する）であると解釈されるべきである。
【００５２】
本明細書の値の範囲の列挙は、本明細書で別段示されない限り、単に、範囲及び各エンドポイント内に収まる各別個の値を個々に指す速記方法としての役割を果たすことが意図され、各別個の値及びエンドポイントは、本明細書に個々に列挙されるかのように、本明細書に組み込まれる。
【００５３】
本明細書に記載される全ての方法は、本明細書に別段示されない限り、または文脈によって別段明らかに矛盾しない限り、任意の好適な順序で実行され得る。本明細書に提供される任意の及び全ての例または例示的な言語（例えば、「〜のような」）の使用は、単に本開示をより良く例示することを意図しており、別段の主張がない限り、本開示の範囲を限定するものではない。本明細書における言語は、任意の請求されていない要素を本開示の実施にとって必須であるものとして示すものと解釈されるべきではない。
【００５４】
本開示を行うために発明者に知られている最良の形態を含む、本開示の好ましい実施形態が、本明細書に記載される。これらの好ましい実施形態の変形例は、前述の記載を読む際に、当業者に明らかになり得る。発明者は当業者がかかる変形例を必要に応じて採用することを期待し、発明者は本開示が特に本明細書で説明される以外の方法で実施されることを意図している。したがって、本開示は、適用法によって許容されるように、本明細書に添付された特許請求の範囲に列挙された主題の全ての修正形態及び均等物を含む。さらに、本明細書に別段示されない限り、または文脈に別段明らかに矛盾しない限り、上記要素の全ての可能な変形例における任意の組み合わせが、本開示に包含される。
【００５５】
細胞培養におけるＡＡＶベクター生成の特徴は、破壊された細胞からの材料を含む複雑なマトリックスの形成である。特に、宿主細胞タンパク質、プロテアソーム、細胞片、及び潜在的なウイルス特異的受容体は、破壊された細胞からの材料中にしばしば存在する。生理学的に適用可能なｐＨでより高い純度を生じる条件において最終ＡＡＶ産物から宿主細胞材料を除去するためのステップを含む開示された方法。
【００５６】
一態様では、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を精製する方法が、提供される。方法は、（ａ）ＡＡＶ含有溶液を、ＡＡＶを標的としたアフィニティ樹脂上に、溶液中のＡＡＶとアフィニティ樹脂との間の結合を可能にする伝導下で負荷することと、（ｂ）少なくとも２つの洗浄ステップを行うことと、（ｃ）ＡＡＶをアフィニティ樹脂から溶出させることと、を含む。
【００５７】
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法により精製されたＡＡＶは、ＡＡＶ１血清型、ＡＡＶ２血清型、ＡＡＶ３血清型、ＡＡＶ４血清型、ＡＡＶ５血清型、ＡＡＶ６血清型、ＡＡＶ７血清型、ＡＡＶ８血清型、ＡＡＶ９血清型、ＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ１１血清型、ＡＡＶ１２血清型、ＡＡＶ１３血清型、ＡＡＡＶ血清型、ＢＡＡＶ血清型、ＡＡＶ（ＶＲ−１９５）血清型、及びＡＡＶ（ＶＲ−３５５）血清型のものである。いくつかの実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子工学によって修飾され、及び／または化学的に修飾される。
【００５８】
いくつかの実施形態では、方法は、ＡＡＶ含有溶液を陰イオン交換体と接触させることと、ＡＡＶ含有溶液をアフィニティ樹脂に負荷する前に陰イオン交換体からＡＡＶ含有溶液を溶出させることと、をさらに含む。陰イオン交換体は、フロースルーモードで操作され得る。いくつかの実施形態では、洗浄ステップのうちの少なくとも１つは、有機溶媒または界面活性剤を含む緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴｒｉｓＨＣｌ及び塩、例えば、ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、酢酸ナトリウムを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、塩化マグネシウムを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴｒｉｓＨＣｌ及びエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アルギニン−ＨＣｌならびにスクロース及びグリセロールのうちの１つを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、タウリン及びエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、アルギニン−ＨＣｌ、リジン−ＨＣｌ、及びヒスチジン−ＨＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴｒｉｓＨＣｌ及びＤＭＳＯを含む。
【００５９】
いくつかの実施形態では、緩衝液は、アルギニン−ＨＣｌ及び塩、例えば、ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ヒスチジン及び塩、例えば、ＮａＣｌを含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴｒｉｓＨＣｌ及びエチレングリコールを含む。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、エチレングリコールである。いくつかの実施形態では、有機溶媒は、ＤＭＳＯである。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。
【００６０】
いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが実行される。いくつかの実施形態では、３つの洗浄ステップが実行される。いくつかの実施形態では、３つの洗浄ステップが連続して実行される。
【００６１】
いくつかの実施形態では、有機溶媒または界面活性剤は、ポリソルベート８０、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、ＤＭＳＯ、スクロース、またはトレハロースである。いくつかの実施形態では、界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ポリソルベート８０、及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、緩衝液は、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを含む。
【００６２】
いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが実行され、第１の洗浄ステップは、約５０〜約２０００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、第２の洗浄ステップは、約３０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約５００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有し、第３の洗浄ステップは、約３０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約３０〜約７５体積％のエチレングリコールを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は約７．３〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、第３の緩衝液中の塩の濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、第３の緩衝液中の塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄ステップの前に起こり、約１０〜約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の緩衝液は、約６．５〜約８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の緩衝液は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約０．１％のポリソルベート８０を含み、第１の緩衝液は、約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第３の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０体積％のエチレングリコールを含み、第３の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。
【００６３】
いくつかの実施形態では、有機溶媒または界面活性剤は、ポリソルベート８０、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、またはトレハロースである。
【００６４】
いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが実行され、第１の洗浄ステップは、約５０〜約２００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．５〜約６．５のｐＨを有し、第２の洗浄ステップは、約１０〜約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約８．０〜約９．０のｐＨを有し、第３の洗浄ステップは、約１０〜約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約３０〜約７５体積％のエチレングリコールを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は約８．０〜約９．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄ステップの前に起こり、約１０〜約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の緩衝液は、約６．５〜約８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の緩衝液は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．１％のポリソルベート８０を含み、第１の緩衝液は、約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第３の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０体積％のエチレングリコールを含み、第３の緩衝液は、約８．０のｐＨを有する。
【００６５】
さらなる実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが実行される。第１の洗浄ステップは、約５０〜約５００ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ−Ｎａ）のナトリウム塩と、約３〜約３０ｍＭのＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／界面活性剤混合物と、を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、第２の洗浄ステップは、約３０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌまたはアルギニン−ＨＣｌ及び約７５〜約５００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有し、第３の洗浄ステップは、約２０〜約８０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約５０〜約６０％（ｗ／ｗ）のスクロースを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は、約７．３〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、第３の緩衝液中の塩の濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、第３の緩衝液中の塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄ステップの前に起こり、約２０〜約１００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の溶出ステップは、約２０〜約１００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約４０〜約６０％（ｗ／ｗ）のスクロースを含む第１の溶出緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の溶出緩衝液は約７．５〜約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の溶出ステップの後及び第２の溶出ステップの前に起こる第５の洗浄ステップをさらに含み、洗浄ステップは、約２０〜約１００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第５の緩衝液は約７．５〜約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の溶出ステップは、約２０〜約１００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約４０〜約６０％（ｗ／ｗ）のグリセロール、及び約５００〜１０００ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む第２の溶出緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は約７．５〜約８．５のｐＨを有する。第５の洗浄ステップは、第１及び第２の溶出ステップの間でフロンティング（ｆｒｏｎｔｉｎｇ）効果を最小化するために有効であり得、例えば、第１及び第２の溶出緩衝液自体のみによって誘発される溶出を生じ、これは第１及び第２の溶出緩衝液の混合物により生じ得るフロンティングからのものでない。いくつかの実施形態では、方法は、第５の洗浄ステップ及び第２の溶出ステップの後に起こる第６の洗浄ステップをさらに含み、洗浄ステップは、約２０〜約１００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第６の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第５の緩衝液は約７．５〜約８．５のｐＨを有する。
【００６６】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約１００ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ−Ｎａ）のナトリウム塩と、約１０ｍＭのＥＤＴＡと、約１８グラムのポリソルベート８０、３．５グラムのＤＭＳＯ、及び３．５グラムのトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む約１１ｇ／ｋｇの溶媒／界面活性剤混合物と、を含み、第１の緩衝液は約６．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は、約５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約１００ｍＭのＮａＣｌを含み、第２の緩衝液は、約８．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第３の緩衝液は、約５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約５０％（ｗ／ｗ）のスクロースを含み、第３の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約１００ｍＭのＮａＣｌを含み、第４の緩衝液は、約８．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第５の緩衝液は、約５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約１００ｍＭのＮａＣｌを含み、第５の緩衝液は、約８．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第６の緩衝液は、約５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約１００ｍＭのＮａＣｌを含み、第６の緩衝液は、約８．０のｐＨを有する。
【００６７】
いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが実行され、第１の洗浄ステップは、約５０〜約２００ｍＭのタウリン、及び０．２〜１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ  ６０００）を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、第２の洗浄ステップは、約３０〜約３００ｍＭのグリシンを含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有し、第３の洗浄ステップは、約２０〜約１５０ｍＭのタウリン、約３０〜約７５体積％のエチレングリコール、及び０．０５〜０．２％のオクチルグリコピラノシドを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は約７．３〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄ステップの前に起こり、約２０〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有する。
【００６８】
いくつかの実施形態では、第１の溶出ステップは、約３０〜約７０ｍＭのタウリン、約５０〜約７０体積％のエチレングリコール、０．０５〜０．２％のオクチルグリコピラノシド、及び約６００〜約９００ｍＭのＮａＣｌを含む第１の溶出緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は約７．５〜約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の溶出ステップの後及び第２の溶出ステップの前に起こる第５の洗浄ステップをさらに含み、洗浄ステップは、約２０〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第５の緩衝液は約７．５〜約８．８のｐＨを有する。第５の洗浄ステップは、フロンティング効果を最小化するために有効であり得る。いくつかの実施形態では、第２の溶出ステップは、約３０〜約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、０．０５〜０．２Ｍの硫酸アンモニウム、及び約４０〜約６０体積％のエチレングリコールを含む第２の溶出緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は約６．５〜約７．５のｐＨを有する。第５の洗浄ステップは、第１及び第２の溶出ステップの間でフロンティング効果を最小化するために有効であり得、例えば、第１及び第２の溶出緩衝液自体のみによって誘発される溶出を生じ、これは第１及び第２の溶出緩衝液の混合物により生じ得るフロンティングからのものでない。
【００６９】
いくつかの実施形態では、方法は、第５の洗浄ステップ及び第２の溶出ステップの後に起こる第６の洗浄ステップをさらに含み、洗浄ステップは、約２０〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第６の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第５の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有する。
【００７０】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約１００ｍＭのタウリン及び約０．５％のＰＥＧ  ６０００を含み、第１の緩衝液は、約６．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は約１００ｍＭのグリシンを含み、第２の緩衝液は約７．５〜約９．２のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第３の緩衝液は、約５０ｍＭのタウリン、約５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、及び０．１％のオクチルグリコピラノシドを含み、第３の緩衝液は約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第４の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第５の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第５の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第６の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第６の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。
【００７１】
いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが実行され、第１の洗浄ステップは、約８０〜約４００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓと、約１１：３：３の比率（重量による）でＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ポリソルベート８０、及びＴＮＢＰを含む約１０〜約２０グラムの溶媒／界面活性剤混合物と、を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、第２の洗浄ステップは、約５〜約２０ｍｍｏｌのクエン酸ナトリウムを含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有し、第３の洗浄ステップは、約５０〜約２００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約５０〜約２００ｍＭのリジン−ＨＣｌ、約５０〜約２００ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、約１ｍＭ〜約４ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン、及び約１０％〜約４０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は、約７．３〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄ステップの前に起こり、約２０〜約１００ｍＭのヒスチジン及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有する。
【００７２】
いくつかの実施形態では、第１の溶出ステップは、約１５〜２５％のスクロース、５％〜１５％（ｗ／ｗ）のソルビトール、３％〜７％（ｗ／ｗ）のマンニトール、１０％〜２０％（ｗ／ｗ）のグリセロール、４０〜６０ｍＭのヒスチジン及び７００〜９００ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ）を含む第１の溶出緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の溶出緩衝液は約７．５〜約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、第１の溶出ステップの後及び第２の溶出ステップの前に起こる第５の洗浄ステップをさらに含み、洗浄ステップは、約２０〜約１００ｍＭのヒスチジン及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第５の緩衝液は約７．５〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の溶出ステップは、約３０〜約７０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７００〜約９００ｍＭの塩（例えば、ＮａＣｌ）、及び４０％〜６０％（ｗ／ｗ）のＤＭＳＯを含む第２の溶出緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は約７．５〜約８．５のｐＨを有する。第５の洗浄ステップは、第１及び第２の溶出ステップの間でフロンティング効果を最小化するために有効であり得、例えば、第１及び第２の溶出緩衝液自体のみによって誘発される溶出を生じ、これは第１及び第２の溶出緩衝液の混合物により生じ得るフロンティングからのものでない。いくつかの実施形態では、方法は、第５の洗浄ステップ及び第２の溶出ステップの後に起こる第６の洗浄ステップをさらに含み、洗浄ステップは、約２０〜約１００ｍＭのヒスチジン及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第６の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第５の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有する。
【００７３】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約２００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓと、約１１：３：３の比率（重量による）でＴｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ポリソルベート８０、及びＴＮＢＰを含む約１６〜約１７グラムの溶媒／界面活性剤混合物と、を含み、第１の緩衝液は、約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の緩衝液は約１０ｍｍｏｌのクエン酸ナトリウムを含み、第２の緩衝液は約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第３の緩衝液は、約１００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約１００ｍＭのリジン−ＨＣｌ、約１００ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、約２ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン、及び約２０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含み、第３の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約５０ｍＭのヒスチジン及び約１００ｍＭのＮａＣｌを含み、第４の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第５の緩衝液は、約５０ｍＭのヒスチジン及び約１００ｍＭのＮａＣｌを含み、第５の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第６の緩衝液は、約５０ｍＭのヒスチジン及び約１００ｍＭのＮａＣｌを含み、第６の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。
【００７４】
いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが実行され、第１の洗浄ステップは、約５０ｎＭ〜約２００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、第２の洗浄ステップは、約２０ｎＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０ｎＭ〜約２００ｎＭの塩を含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有し、第３の洗浄ステップは、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４０％〜約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は約７．５〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄ステップの前に起こり、約１０〜約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の緩衝液は、約６．５〜約８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、第３の洗浄ステップの後に起こる第５の洗浄ステップをさらに含み、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約５０％〜約７０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、及び約５００〜約９００ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第５の緩衝液は、約７．５〜約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、第５の洗浄ステップの後に起こり、約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第６の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第６の洗浄ステップをさらに含み、第６の緩衝液は、約７．０〜約８．０のｐＨを有する。
【００７５】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約１００ｍＭのタウリン及び約０．５％のＰＥＧ  ６０００を含み、第１の緩衝液は、約６．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は約１００ｍＭのグリシンを含み、第２の緩衝液は約７．５〜約９．２のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第３の緩衝液は、約５０ｍＭのタウリン、約５０体積％のエチレングリコール、及び０．１％からのオクチルグリコピラノシドを含み、第３の緩衝液は約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、第４の緩衝液は、約７．４のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第５の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、及び７５０ｍＭのＮａＣｌを含み、第５の緩衝液は、約８．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第６の緩衝液は、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、第６の緩衝液は、約７．４のｐＨを有する。
【００７６】
いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが実行され、第１の洗浄ステップは、約５０ｎＭ〜約２００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ及び約０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、第２の洗浄ステップは、約２０ｎＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０ｎＭ〜約２００ｎＭの塩を含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有し、第３の洗浄ステップは、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４０％〜約６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第３の緩衝液は約７．５〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩の濃度は、２００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄ステップの前に起こり、約１０〜約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第４の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第４の洗浄ステップをさらに含み、第４の緩衝液は、約６．５〜約８．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、第３の洗浄ステップの後に起こる第５の洗浄ステップをさらに含み、約２０ｍＭ〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約５０％〜約７０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、及び約５００〜約９００ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第５の緩衝液は、約７．５〜約８．５のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、方法は、第５の洗浄ステップの後に起こり約１０ｍＭ〜約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第６の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第６の洗浄ステップをさらに含み、第６の緩衝液は、約７．０〜約８．０のｐＨを有する。
【００７７】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約１００ｍＭのタウリン及び約０．５％のＰＥＧ  ６０００を含み、第１の緩衝液は、約６．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は約１００ｍＭのグリシンを含み、第２の緩衝液は約７．５〜約９．２のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第３の緩衝液は、約５０ｍＭのタウリン、約５０体積％のエチレングリコール、及び０．１％からのオクチルグリコピラノシドを含み、第３の緩衝液は約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ及び約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、第４の緩衝液は、約７．４のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第５の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、及び７５０ｍＭのＮａＣｌを含み、第５の緩衝液は、約８．０のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第６の緩衝液は、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、第６の緩衝液は、約７．４のｐＨを有する。
【００７８】
いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが実行され、第１の洗浄ステップは、約５０〜約２００ｍＭの酢酸ナトリウム、及び０．０５〜０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、第２の洗浄ステップは、約２５〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０〜２００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄ステップの前に起こり、約２０〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第３の洗浄ステップをさらに含み、第３の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の溶出ステップは、約２５〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約５００〜約１０００ｍＭのＮａＣｌ、及び約２５％〜７５％のＤＭＳＯ（ｗ／ｗ）を含む緩衝液を適用することが後に続く、３．０〜３．５のｐＨで０．５〜２ｍＭのＨＣｌを適用することが後に続く、アフィニティ樹脂に精製水を適用することを含み、緩衝液は、約７．５〜約８．５のｐＨを含む。いくつかの実施形態では、方法は、第１の溶出ステップの後及び第２の溶出ステップの前に起こる第４の洗浄ステップをさらに含み、洗浄ステップは、精製水をアフィニティ樹脂に適用することを含む。いくつかの実施形態では、第２の溶出ステップは、約２０〜約５０ｍＭのＨＣｌをアフィニティ樹脂に約１．７〜約２．５のｐＨで適用することを含む。
【００７９】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、及び約０．１％のポリソルベート８０を含み、第１の緩衝液は、約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第３の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第３の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第１の溶出ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７５０ｍＭのＮａＣｌ、及び約５０％のＤＭＳＯ（ｗ／ｗ）を含む緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することが後に続く、１ｍＭのＨＣｌを約３．２のｐＨで適用することが後に続く、アフィニティ樹脂に精製水を適用することを含み、緩衝液は、約８．０のｐＨを含む。ある特定の実施形態では、第２の溶出ステップは、約３３ｍＭのＨＣｌをアフィニティ樹脂に約２．０のｐＨで適用することを含む。
【００８０】
いくつかの実施形態では、少なくとも３つの洗浄ステップが実行され、第１の洗浄ステップは、約５０〜約２００ｍＭの酢酸ナトリウム、及び０．０５〜０．２％のポリソルベート８０を含む第１の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第１の緩衝液は、約５．２〜約６．８のｐＨを有し、第２の洗浄ステップは、約２５〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０〜約２００ｍＭの塩を含む第２の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、ならびにＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせから選択される。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、方法は、第１の洗浄ステップの前に起こり、約２０〜約１００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含む第３の緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含む第３の洗浄ステップをさらに含み、第３の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第１の溶出ステップは、０〜１００％の勾配の２０〜５０ｍＭの塩酸／０．５〜２．０ｍＭの塩酸中の８００〜１２００ｍＭのＮａＣｌをアフィニティ樹脂に適用することを含む。ある特定の実施形態では、勾配は、０〜１００％の３３ｍＭの塩酸／１ｍＭの塩酸中の１０００ｍＭのＮａＣｌのものである。ある特定の実施形態では、第１の溶出ステップの前に、精製水を用いた洗浄が先行する。
【００８１】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、及び約０．１％のポリソルベート８０を含み、第１の緩衝液は、約６．０のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、第２の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約１２５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第３の緩衝液は、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１２５ｍＭからのＮａＣｌを含み、第３の緩衝液は、約８．５のｐＨを有する。ある特定の実施形態では、第１の溶出ステップは、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約７５０ｍＭのＮａＣｌ、及び約５０％のＤＭＳＯ（ｗ／ｗ）を含む緩衝液をアフィニティ樹脂に適用することを含み、緩衝液は、約８．０のｐＨを含む。
【００８２】
いくつかの実施形態では、有機溶媒または界面活性剤は、ポリソルベート８０、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、またはトレハロースである。
【００８３】
いくつかの実施形態では、酸性成分が除去される。いくつかの実施形態では、酸性成分は、ＨＥＫ２９３  ＤＮＡのような宿主細胞ＤＮＡであり、酸性成分は、ｑＰＣＲによって測定されるように、ＡＡＶ抗原のマイクログラムあたり２５０ｐｇ未満の値に低下する。いくつかの実施形態では、酸性成分は、ＨＥＫ２９３  ＤＮＡのような宿主細胞ＤＮＡであり、酸性成分は、ＥＬＩＳＡによって測定されるように、ＡＡＶ抗原のマイクログラムあたり２５０ｐｇ未満の値に低下する。
【００８４】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、エチレングリコール、ＮａＣｌのような塩、及びＴｒｉｓＨＣｌのような緩衝液を含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を接触させることを含み、ｐＨは、少なくとも７．０である。いくつかの実施形態では、塩濃度は約７５０ｍＭであり、緩衝液濃度は約５０ｍＭであり、エチレングリコールは５０〜６０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５５％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌであり、緩衝液はＴｒｉｓＨＣｌである。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約８．０である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、８．０である。
【００８５】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、スクロースのような糖、塩、及びアルギニン−ＨＣｌのような緩衝液を含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を接触させることを含み、ｐＨは、少なくとも８．０である。いくつかの実施形態では、塩濃度は、約８００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液濃度は、約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、糖はスクロースであり、溶出緩衝液は５０〜６０％（ｗ／ｗ）スクロースを含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、１〜３ｍＭのＭｇＣｌ２、または約２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌであり、緩衝液はアルギニン−ＨＣｌである。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約８．０である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、８．０である。
【００８６】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、エチレングリコール、ＮａＣｌのような塩、及びタウリンを含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を接触させることを含み、ｐＨは、少なくとも７．０である。いくつかの実施形態では、ｐＨは、８．０である。いくつかの実施形態では、塩濃度は、約７５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液濃度は、約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、エチレングリコール濃度は、５０〜７０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５５％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、０．０５〜０．２％のオクチルグリコピラノシドをさらに含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約８．０である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、８．０である。
【００８７】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、（ｉ）スクロース、ソルビトール、マンニトール、及びグリセロールの混合物と、（ｉｉ）ＮａＣｌのような塩と、（ｉｉｉ）ヒスチジンのような緩衝液と、を含む溶出緩衝液にアフィニティ樹脂を接触させることを含み、ｐＨは、少なくとも７．８である。いくつかの実施形態では、塩濃度は、約８００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液濃度は、約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、スクロースの濃度は、約２０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、ソルビトールの濃度は、約１０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、マンニトールの濃度は、約５％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、グリセロールの濃度は、約１５％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌであり、緩衝液はヒスチジンである。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約８．０である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、８．０である。
【００８８】
いくつかの実施形態では、（ｉ）緩衝液、（ｉｉ）ＮａＣｌのような塩、及び（ｉｉｉ）５０〜６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液にアフィニティ樹脂を接触させることを含み、ｐＨは、少なくとも８．０である、第２の溶出させるステップが行われる。いくつかの実施形態では、塩濃度は、約１０００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液濃度は、約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、エチレングリコールの濃度は、６０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、Ｔｒｉｓ  ＨＣｌである。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌであり、緩衝液はヒスチジンである。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約８．０である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、８．０である。
【００８９】
いくつかの実施形態では、（ｉ）緩衝液、（ｉｉ）ＮａＣｌのような塩、及び（ｉｉｉ）５０〜６０％（ｖ／ｖ）のグリセロールを含む溶出緩衝液にアフィニティ樹脂を接触させることを含み、ｐＨは、少なくとも８．０である、第２の溶出させるステップが行われる。いくつかの実施形態では、塩濃度は約８００ｍＭであり、緩衝液濃度は約５０ｍＭであり、グリセロールの濃度は５０％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌであり、緩衝液はアルギニン−ＨＣｌである。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約８．０である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、８．０である。様々な実施形態では、第５の洗浄ステップは、第１の溶出ステップの後及び第２の溶出ステップの前に行われる。第５の洗浄ステップは、４０〜６０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び８０〜１２０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液にアフィニティ樹脂を７．５〜８．５のｐＨで接触させることを含む。第５の洗浄ステップは、第１及び第２の溶出ステップの間でフロンティング効果を最小化するために有効であり得、例えば、第１及び第２の溶出緩衝液自体のみによって誘発される溶出を生じ、これは第１及び第２の溶出緩衝液の混合物により生じ得るフロンティングからのものでない。
【００９０】
いくつかの実施形態では、（ｉ）緩衝液、（ｉｉ）（ＮＨ４）２ＳＯ４のような塩、及び（ｉｉｉ）４０〜６０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液にアフィニティ樹脂を接触させることを含み、ｐＨは、少なくとも８．０である、第２の溶出させるステップが行われる。いくつかの実施形態では、塩濃度は約１Ｍであり、緩衝液濃度は約５０ｍＭであり、エチレングリコールの濃度は５０％（ｖ／ｖ）である。いくつかの実施形態では、塩は（ＮＨ４）２ＳＯ４であり、緩衝液はＴｒｉｓＨＣｌである。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約７．０である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、７．０である。様々な実施形態では、第５の洗浄ステップは、第１の溶出ステップの後及び第２の溶出ステップの前に行われる。第５の洗浄ステップは、４０〜６０ｍＭのタウリン、５０〜７０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、６００〜９００ｍＭのＮａＣｌ、及び０．０５〜０．２％のオクチルグリコピラノシドを含む第５の緩衝液にアフィニティ樹脂を７．５〜８．５のｐＨで接触させることを含む。第５の洗浄ステップは、第１及び第２の溶出ステップの間でフロンティング効果を最小化するために有効であり得、例えば、第１及び第２の溶出緩衝液自体のみによって誘発される溶出を生じ、これは第１及び第２の溶出緩衝液の混合物により生じ得るフロンティングからのものでない。
【００９１】
いくつかの実施形態では、（ｉ）緩衝液、（ｉｉ）ＮａＣｌのような塩、及び（ｉｉｉ）５０〜６０％（ｗ／ｗ）のＤＭＳＯを含む溶出緩衝液にアフィニティ樹脂を接触させることを含み、ｐＨは、少なくとも８．０である、第２の溶出させるステップが行われる。いくつかの実施形態では、塩濃度は、約１０００ｍＭである。いくつかの実施形態では、緩衝液濃度は、約５０ｍＭである。いくつかの実施形態では、ＤＭＳＯの濃度は、５０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、塩はＮａＣｌであり、緩衝液はＴｒｉｓＨＣｌである。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、約８．０である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液のｐＨは、８．０である。様々な実施形態では、ＤＭＳＯ含有溶出緩衝液は、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＡＡＶ８樹脂からＡＡＶ８ではなくＡＡＶ９を溶出するために有効である。様々な実施形態では、ＤＭＳＯ含有溶出緩衝液は、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＡＡＶｘ樹脂からＡＡＶ８及びＡＡＶ９を溶出するために有効である。様々な実施形態では、ＤＭＳＯ含有溶出緩衝液は、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＡＡＶ８樹脂から、ＡＡＶ８でなく、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ＡＡＶ（ＶＲ−１９５）及びＡＡＶ（ＶＲ−３５５）のうちの１つ以上を溶出するために有効である。様々な実施形態では、ＤＭＳＯ含有溶出緩衝液は、Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＡＡＶｘ樹脂から、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ＡＡＶ（ＶＲ−１９５）及びＡＡＶ（ＶＲ−３５５）のいずれかを溶出するために有効である。
【００９２】
様々な実施形態では、第５の洗浄ステップは、第１の溶出ステップの後及び第２の溶出ステップの前に行われる。第５の洗浄ステップは、４０〜６０ｍＭのヒスチジン及び７０〜１３０ｍＭのＮａＣｌを含む第５の緩衝液にアフィニティ樹脂を８．０〜８．８のｐＨで接触させることを含む。第５の洗浄ステップは、第１及び第２の溶出ステップの間でフロンティング効果を最小化するために有効であり得、例えば、第１及び第２の溶出緩衝液自体のみによって誘発される溶出を生じ、これは第１及び第２の溶出緩衝液の混合物により生じ得るフロンティングからのものでない。
【００９３】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、勾配溶出による溶出緩衝液の伝導性の連続的な線形増加を含む。いくつかの実施形態では、溶出させることは、勾配溶出による有機溶媒の濃度の連続的な線形増加を含む。いくつかの実施形態では、溶出させることは、約７５０ｍＭのＮａＣｌ及び５０〜６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを含む溶出緩衝液とアフィニティ樹脂を少なくとも７．０のｐＨで接触させることを含む。いくつかの実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５５％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、約８．０のｐＨにある。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液は、８．０のｐＨにある。
【００９４】
いくつかの実施形態では、溶出させることは、対イオン濃度の段階的な増加を含む。いくつかの実施形態では、溶出させることは、有機溶媒濃度の段階的な増加を含む。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液中の塩は、塩化物、酢酸塩、硫酸塩、クエン酸塩のような、一価、二価または多価の陰イオンから選択される。いくつかの実施形態では、溶出させるステップから得られたＡＡＶは、９９．９％以下のＨＣ不純物レベルを有する。いくつかの実施形態では、溶出させるステップから得られたＡＡＶは、９９．０％以下のＨＣ不純物レベルを有する。
【００９５】
いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ８であり、アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８であり、溶出緩衝液は酸性でありエチレングリコールを含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９であり、アフィニティ樹脂はＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９であり、溶出緩衝液は酸性でありエチレングリコールを含まない。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ８であり、アフィニティ樹脂はクロマトグラフィーマトリックス上に固定化されたタイプＡＤＫ８またはＡＤＫ８／９からのＡＡＶ８に対して固定化されたモノクローナル抗体からなる免疫アフィニティ樹脂である。いくつかの実施形態では、ＡＡＶはＡＡＶ９であり、アフィニティ樹脂はクロマトグラフィーマトリックス上に固定化されたタイプＡＤＫ９またはＡＤＫ８／９からのＡＡＶ９に対して固定化されたモノクローナル抗体からなる免疫アフィニティ樹脂である。
【００９６】
いくつかの実施形態では、方法は、酸性の荷電した汚染物質をＡＡＶ含有溶液から枯渇させるために有効な正に荷電した基を含むフィルタにＡＡＶ含有溶液を接触させることをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、３５ｎｍを超えるウイルスを除去するためのＡＡＶ画分のナノ濾過をさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、テンタクルゲルを含むカラムを用いてＡＥＸクロマトグラフィーを実行することを含む磨きステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、方法は、例えば、ＡＡＶ８に特異的であるか、またはＡＡＶ９に特異的である、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してＡＡＶ画分を試験することをさらに含む。ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９に特異的なサンドイッチＥＬＩＳＡであり得る。
【００９７】
別の態様では、本明細書に記載される任意の方法によって産生されたＡＡＶ産物が提供される。
【００９８】
ＡＡＶ粒子、例えば、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９粒子は、複数の定義された洗浄ステップを行うことによる、例えば、ＡＡＶ結合アフィニティマトリックスに洗浄緩衝液を適用し、溶出を中性ｐＨ近傍の条件で適用して該ウイルスの感染力を維持することによる、アフィニティステップで精製される。ある特定の実施形態では、陰イオン交換ステップは、アフィニティステップの前に含まれる。陰イオン交換体ステップは、フロースルーモードにおいて行われ得る。ある特定の実施形態では、アフィニティステップにおいて使用されるアフィニティ樹脂のサイクル時間に影響を与える汚染物質が、枯渇し得る。
【００９９】
本発明の方法は、より高い純度のＡＡＶ、宿主細胞タンパク質の除去、宿主細胞ＤＮＡの枯渇、潜在的なウイルス受容体の除去、ＡＡＶがリガンドに結合する脂質エンベロープウイルス部分的から完全な不活性化（例えば、洗浄ステップ中）、及び液相中の脂質エンベロープウイルスの部分的から完全な不活性化（例えば、溶出ステップ中）を生じ得る。理論に拘束されることを望まないが、エチレングリコールはそれ自体で、または別の添加剤と組み合わされて、かかる脂質エンベロープウイルスを不活性化できる。例示的な添加剤は、非イオン性界面活性剤、脂肪族薬剤（例えば、ＴｎＢＰ）、及び界面活性剤（例えば、ポリソルベート（例えば、Ｔｗｅｅｎ（登録商標））、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、ＴｎＢＰ）を含む。例えば、溶媒−界面活性剤混合物は、１％のＴｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、０．３％のトリ−Ｎ−ブチルホスフェート、及び０．３％のＴＷＥＥＮ（登録商標）  ８０を含むことができる。
【０１００】
エンベロープウイルスの不活性化は、Ｂａｃｕｌｏトランスフェクションシステムが使用される際に、特に重要になり得る。本明細書に記載される様々な実施形態に従う溶出は、低ｐＨ曝露を防止し、ＡＡＶの高い効力を維持できる。さらなる改善は、本明細書に記載される様々な実施形態及び実施例に従って、洗浄ステップ及び溶出ステップを連続して行う場合、見られ得る。
【０１０１】
「カラム上」の脂質エンベロープウイルスの不活性化を、以下の表１に要約されるように、上の実施例１１、１２、及び１３において実行される様々なアフィニティクロマトグラフィーにおいて試験した。
【表１】
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【０１０２】
ＤＭＳＯ含有緩衝液洗浄Ｘ緩衝液は、中性ｐＨ近傍（例えば、ｐＨ８．０）でＣａｐｓｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＡＡＶ８樹脂上で、ＡＡＶ８でなくＡＡＶ９の溶出を誘発するために有効であり得、このことは驚くべき結果であった。ＤＭＳＯ含有緩衝液洗浄Ｘ緩衝液は、中性ｐＨ近傍（例えば、ｐＨ８．０）でＣａｐｓｕｒｅＳｅｌｅｃｔ  ＡＡＶｘ樹脂上で、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ３、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ６、ＡＡＶ７、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９、ＡＡＶ１０、ＡＡＶ１１、ＡＡＶ１２、ＡＡＶ１３、ＡＡＡＶ、ＢＡＡＶ、ＡＡＶ（ＶＲ−１９５）、及びＡＡＶ（ＶＲ−３５５）を含むがこれらに限定されない、様々なＡＡＶの溶出を誘発するために有効であり得、このことは驚くべき結果であった。理論に拘束されることを望まないが、洗浄Ｘ緩衝液は、カラムを洗浄する及び／または脂質エンベロープウイルスを不活性化もしくは分解する活性を有することが期待される。洗浄Ｘ緩衝液がＡＡＶ８よりＡＡＶ９を示差的に溶出させるであろうという期待は、なかった。
【０１０３】
アフィニティ精製ステップは、１つ以上の洗浄ステップを含む。１つ以上の洗浄ステップには１つ以上の溶出ステップが後に続くことができる。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、アフィニティ精製ステップの前に発生する濾過ステップを含む。
【０１０４】
ＡＡＶ粒子（例えば、ＡＡＶ８、ＡＡＶ９など）を産生する宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞を培養し、清澄化された無細胞培養上清が濃縮及び／または濾過された後に、ウイルス粒子はアフィニティマトリックスに負荷される。ある特定の実施形態では、ウイルス粒子は、約７．４〜約７．８の範囲のｐＨを有する溶液中に負荷される。ある特定の実施形態では、ウイルス粒子は、約８．３〜約８．７の範囲のｐＨを有する溶液中に負荷される。ある特定の実施形態では、ウイルス粒子は、約８．５のｐＨを有する溶液中に負荷される。ある特定の実施形態では、ｐＨは８．３〜８．７であり、溶液はＮａＣｌ及びＴｒｉｓＨＣｌを含む。ある特定の実施形態では、ウイルス粒子は、約２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１５０ｍＭのＮａＣｌを含み、約８．５のｐＨを有する溶液中に負荷される。
【０１０５】
少なくとも３つの異なる洗浄ステップが行われ得、各々は同じまたは異なる緩衝液に関与する。ある特定の実施形態では、洗浄緩衝液は異なる。
【０１０６】
ある特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、酢酸ナトリウム（ＮａＡｃｅｔａｔｅ）ベースの緩衝液であり得る第１の緩衝液を使用する。ある特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ−Ｎａ）のナトリウム塩と、ＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ、及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／界面活性剤混合物と、を含む第１の緩衝液を使用する。ある特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、約５０〜約２００ｍＭのタウリン及び０．２〜１．５％のＰＥＧ（例えば、ＰＥＧ  ６０００）を含む第１の緩衝液を使用する。ある特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓを含む第１の緩衝液と、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ポリソルベート８０、及びＴＮＢＰを含む溶媒／界面活性剤混合物と、を使用する。ある特定の実施形態では、第１の洗浄ステップは、酢酸ナトリウム及びポリソルベート８０を含む第１の緩衝液を使用する。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、第２の洗浄ステップは、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を含むＴｒｉｓベースの緩衝液、グリシンベースの緩衝液、クエン酸ナトリウムベースの緩衝液、またはＮａＣｌを含むアルギニン−ＨＣｌベースの緩衝液であり得る第２の緩衝液を使用する。ある特定の実施形態では、第３の洗浄ステップは、エチレングリコール及び／またはＮａＣｌを含むＴｒｉｓベースの緩衝液、タウリンベースの緩衝液、またはＮａＣｌを含むアルギニン−ＨＣｌベースの緩衝液であり得る第３の緩衝液を使用する。代替的には、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、またはトレハロースのうちの１つ以上は、エチレングリコールと組み合わされるか、またはエチレングリコールの代わりに使用され得る。ある特定の実施形態では、任意選択の第４の洗浄ステップ、または再平衡化ステップは、上に列挙された３つの洗浄ステップの前に実行される。任意選択の第４の洗浄ステップでは、ＮａＣｌを含むＴｒｉｓベースの緩衝液であり得る第４の緩衝液が使用される。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、事前精製は、宿主細胞産生からのＡＡＶ含有溶液のアフィニティ精製の前に、１つ以上の複雑な酸性タンパク質構造及び宿主細胞ＤＮＡを除去するために行われ得る。事前精製は、フロースルーモードにおいて陰イオン交換によって行われ得る。事前精製ステップは、本明細書に記載されるアフィニティ精製方法のいずれかの前に着手され得る。以下のうちの１つ以上は、かかるＡＡＶ含有溶液の事前精製により除去され得る：ヒストン（例えば、ヒストンＨ２Ａ型１、ヒストンＨ２Ｂ型１ーＢ、ヒストンＨ４、ヒストンＨ１．４）、６０Ｓリボソームタンパク質（例えば、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２７、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ６及び６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０）、細胞質アクチン（例えば、細胞質アクチン１）、チューブリン（例えば、チューブリンベータ−２Ａ鎖）、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｃ、Ｒｅｐ６８タンパク質、ＨＥＫ２９３ラミニン受容体３７ｋＤａ形態（ＬａｍＲ  ３７ｋＤａ）及びＡＴＰ依存性分子シャペロンＨＳＣ８２。
【０１０９】
洗浄ステップは、ＡＡＶ及び／またはアフィニティマトリックスの底部樹脂から強く結合した汚染物質を除去するために有効であり得る。例えば、緩衝液は、ＴｒｉｓＨＣｌ、酢酸塩、ホスフェート、ヒスチジン、イミダゾール、リジン、アルギニン、グリシン、タウリン、クエン酸塩、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、ＭＥＳ−Ｎａ、ホウ酸塩、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ビシン、トリシン、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ（２−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］エタンスルホン酸）、ナトリウムバルビタール（Ｖｅｒｏｎａｌ）、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸）、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３−（Ｎ，Ｎ−Ｂｉｓ［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、Ｔｒｉｚｍａ、ＨＥＰＰＳＯ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物）、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＢＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）、ＡＭＰＳＯ（Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、単一アミノ酸、またはＨＥＫ−ＨＣＰのｐＨ範囲及び枯渇率を確実にする２個以上のアミノ酸、例えば、グリシン、アルギニン、トリプトファン、アミノ酸の誘導体、例えば、タウリン（酸化されたシステイン）、Ｎ−アセチル−トリプトファン、及びグリシルグリシン、の任意の組み合わせ、のうちの１つ以上を含むことができる。同時に、洗浄ステップで使用される緩衝液は、ＡＡＶを実質的に溶出させない。
【０１１０】
ある特定の実施形態では、洗浄緩衝液は、有機溶媒または界面活性剤をさらに含むことができる。例えば、有機溶媒または界面活性剤は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０、ポリソルベート８０、Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ１００、トリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、またはトレハロースであり得るが、これらに限定されない。例えば、界面活性剤は、非イオン性ポリオキシエチレン界面活性剤（例えば、Ｂｒｉｊ  ３５）、４−ノニルフェニル−ポリエチレングリコール（Ａｒｋｏｐａｌ  Ｎ１００）、オクチルグルコシド、ｎ−ドデシルβ−Ｄ−マルトシド、ジギトニン、６−シクロヘキシルヘキシルβ−Ｄ−マルトシド、またはオクチルグリコピラノシドであり得るが、これらに限定されない。例えば、エチレングリコールは、ＰＥＧ  ２０００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ６０００（Ｍａｃｒｏｇｏｌ）のようなＰＥＧであり得るが、これらに限定されない。例えば、有機溶媒は、グリセロール（１，２，３−プロパントリオール）、及びエリトリトール（メソ−１，２，３，４−ブタンテトロール（ｂｕｔａｎｔｅｔｒｏｌ））であり得るが、これらに限定されない。
【０１１１】
有機溶媒または界面活性剤は、使用される全ての洗浄緩衝液中に存在する必要はない。しかし、有機溶媒または界面活性剤は、使用される洗浄緩衝液のうちの少なくとも１つにおいて存在する。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液、例えば、第１の洗浄緩衝液は、酢酸ナトリウム及びＴｗｅｅｎ（登録商標）  ８０の両方を含む。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０、ＤＭＳＯ及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）のうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液は、Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘ１００、ポリソルベート８０及びＴＮＢＰのうちの１つ以上を含む。いくつかの実施形態では、洗浄緩衝液、例えば、第３の洗浄緩衝液は、Ｔｒｉｓ及びエチレングリコールを含む。理論に拘束されることを望まないが、洗浄緩衝液中の有機溶媒及び界面活性剤は、強く結合した宿主タンパク質及びウイルス受容体を除去するために有効であるが、また他方では脂質エンベロープウイルスを不活性化及び／または分解する。
【０１１２】
第１の緩衝液は、５．２〜６．８のｐＨで、約５０〜約２０００ｍＭの酢酸ナトリウム、または５０〜約２５０ｍＭの酢酸ナトリウム、及び約０．０５〜約５％のポリソルベート８０もしくはＴｗｅｅｎ（登録商標）  ８０または０．０５〜約０．２％のポリソルベート８０もしくはＴｗｅｅｎ（登録商標）  ８０を含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約５０〜約７５ｍＭ、約７５〜約１００ｍＭ、約９０〜約１１０ｍＭ、約１００〜約１２５ｍＭ、約１２５〜約１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１５０〜約１７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１７５〜約２００ｍＭの酢酸ナトリウム、約２００〜約２５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２５０〜約３００ｍＭの酢酸ナトリウム、約３００〜約３５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約３５０〜約４００ｍＭの酢酸ナトリウム、約４００〜約４５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約４５０〜約５００ｍＭの酢酸ナトリウム、約５００〜約５５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約５５０〜約６００ｍＭの酢酸ナトリウム、約６００〜約６５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約６５０〜約７００ｍＭの酢酸ナトリウム、約７００〜約７５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約７５０〜約８００ｍＭの酢酸ナトリウム、約８００〜約８５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約８５０〜約９００ｍＭの酢酸ナトリウム、約９００〜約９５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約９５０〜約１０００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０００〜約１０５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０５０〜約１１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１１００〜約１１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１１５０〜約１２００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１２００〜約１２５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１２５０〜約１３００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１３００〜約１３５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１３５０〜約１４００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１４００〜約１４５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１４５０〜約１５００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１５００〜約１５５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１５５０〜約１６００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１６００〜約１６５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１６５０〜約１７００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１７００〜約１７５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１７５０〜約１８００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１８００〜約１８５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１８５０〜約１９００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１９００〜約１９５０ｍＭの酢酸ナトリウム、または約１９５０〜約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約５０〜約５００ｍＭの２−（Ｎ−モルフォリノ）エタンスルホン酸（ＭＥＳ−Ｎａ）のナトリウム塩と、約３〜約３０ｍＭのＥＤＴＡと、ポリソルベート８０、ＤＭＳＯ及びトリ（ｎ−ブチル）ホスフェート（ＴＮＢＰ）を含む溶媒／界面活性剤混合物と、を含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約５０〜約７５ｍＭ、約７５〜約１００ｍＭ、約９０〜約１１０ｍＭ、約１００〜約１２５ｍＭ、約１２５〜約１５０ｍＭ、約１５０〜約１７５ｍＭ、約１７５〜約２００ｍＭ、約２００〜約２５０ｍＭ、約２５０〜約３００ｍＭ、約３００〜約３５０ｍＭ、約３５０〜約４００ｍＭ、約４００〜約４５０ｍＭ、または約４５０〜約５００ｍＭのＭＥＳ−Ｎａのナトリウム塩を含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約５０、約７５、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭ、約４５０ｍＭ、または約５００ｍＭのＭＥＳ−Ｎａのナトリウム塩を含むことができる。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約５０〜約２００ｍＭのタウリンを含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約５０〜約７５ｍＭ、約７５〜約１００ｍＭ、約９０〜約１１０ｍＭ、約１００〜約１２５ｍＭ、約１２５〜約１５０ｍＭ、約１５０〜約１７５ｍＭ、約１７５〜約２００ｍＭのタウリンを含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約５０、約７５、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭのタウリンを含むことができる。
【０１１５】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約８０〜約４００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約８０〜約１００ｍＭ、約９０〜約１１０ｍＭ、約１００〜約１２５ｍＭ、約１２５〜約１５０ｍＭ、約１５０〜約１７５ｍＭ、約１７５〜約２００ｍＭ、約２００〜約２５０ｍＭ、約２５０〜約３００ｍＭ、約３００〜約３５０ｍＭ、約３５０〜約４００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約５０、約７５、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１２５ｍＭ、約１５０ｍＭ、約１７５ｍＭ、約２００ｍＭ、約２５０ｍＭ、約３００ｍＭ、約３５０ｍＭ、約４００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓを含むことができる。
【０１１６】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約５０〜約２００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約５０〜約８０ｍＭ、約７０〜約１００ｍＭ、約８０〜約１１０ｍＭ、約９０〜約１２０ｍＭ、約１００〜約１３０ｍＭ、約１２０〜約１５０ｍＭ、約１４０〜約１７０ｍＭ、約１７０〜約２００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約６０、約７０ｍＭ、約８０ｍＭ、約９０ｍＭ、約１００ｍＭ、約１１０ｍＭ、約１２０ｍＭ、約１３０ｍＭ、約１４０ｍＭ、約１５０ｍＭ、または約１６０ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。
【０１１７】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約２００ｍＭの酢酸ナトリウム、約２２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約２５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約２７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約３００ｍＭの酢酸ナトリウム、約３２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約３５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約３７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約４００ｍＭの酢酸ナトリウム、約４２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約４５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約４７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約５００ｍＭの酢酸ナトリウム、約５２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約５５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約５７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約６００ｍＭの酢酸ナトリウム、約６２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約６５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約６７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約７００ｍＭの酢酸ナトリウム、約７２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約７５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約７７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約８００ｍＭの酢酸ナトリウム、約８２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約８５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約８７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約９００ｍＭの酢酸ナトリウム、約９２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約９５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約９７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１０７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１１００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１１２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１１５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１１７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１２００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１２２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１２５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１２７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１３００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１３２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１３５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１３７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１４００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１４２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１４５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１４７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１５００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１５２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１５５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１５７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１６００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１６２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１６５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１６７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１７００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１７２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１７５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１７７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１８００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１８２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１８５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１８７５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１９００ｍＭの酢酸ナトリウム、約１９２５ｍＭの酢酸ナトリウム、約１９５０ｍＭの酢酸ナトリウム、約１９７５ｍＭの酢酸ナトリウム、または約２０００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約１００ｍＭ、または１００ｍＭの酢酸ナトリウムを含むことができる。
【０１１８】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約０．０５〜約０．０８％、約０．０８〜約０．１１％、約０．１１〜約０．１４％、約０．１４〜約０．１７％、または約０．１７〜約０．２０％のポリソルベート８０を含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約０．１％または０．１％のポリソルベート８０を含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約０．０５〜約０．０８％、約０．０８〜約０．１１％、約０．１１〜約０．１４％、約０．１４〜約０．１７％、または約０．１７〜約０．２０％のＴｗｅｅｎ（登録商標）  ８０を含むことができる。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）  ８０を含むことができる。ある特定の実施形態では、ｐＨは、約５．２〜約５．５、約５．５〜約５．８、約５．８〜約６．１、約６．１〜約６．４、または約６．４〜約６．８であり得る。ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、約６．０または６．０のｐＨを有する。
【０１１９】
ある特定の実施形態では、第１の緩衝液は、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡを含む。
【０１２０】
第２の緩衝液は、約３０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、または３０〜約８０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、及び塩を含むことができ、第２の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、またはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせである。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。塩、例えば、ＮａＣｌの濃度は、約７５〜約５００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態では、塩濃度、例えば、ＮａＣｌ濃度は、約７５〜約２００ｍＭである。いくつかの実施形態では、塩濃度、例えば、ＮａＣｌ濃度は、５００ｍＭを超えない。いくつかの実施形態では、塩濃度、例えば、ＮａＣｌ濃度は、２００ｍＭを超えない。理論に拘束されることを望まないが、５００ｍＭを超えないか、または２００ｍＭを超えない塩濃度は、塩溶液の伝導性が低すぎて溶出を引き起こすことができないため、洗浄ステップ中にＡＡＶの溶出を防止できる。
【０１２１】
第２の緩衝液は、約３０〜約３５ｍＭ、約３５〜約４０ｍＭ、約４０〜約４５ｍＭ、約４５〜約５０ｍＭ、約５０〜約５５ｍＭ、約５５〜約６０ｍＭ、約６０〜約６５ｍＭ、約６５〜約７０ｍＭ、約７０〜約７５ｍＭ、または約７５〜約８０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は、約５０ｍＭ、または５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は、約７５〜約１００ｍＭ、約１００〜約１２５ｍＭ、約１２５〜約１５０ｍＭ、約１５０〜約１７５ｍＭ、約１７５〜約２００ｍＭ、約２００〜約２２５ｍＭ、または約２２５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は、約１５０ｍＭ、または１５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液のｐＨは、約７．５〜約７．７、約７．７〜約７．９、約７．９〜約８．１、約８．１〜約８．３、約８．３〜約８．５、約８．５〜約８．７、約８．７〜約８．９、または約８．９〜約９．２であり得る。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液のｐＨは、約８．５、または８．５であり得る。
【０１２２】
第２の緩衝液は、約３０〜約３５ｍＭ、約３５〜約４０ｍＭ、約４０〜約４５ｍＭ、約４５〜約５０ｍＭ、約５０〜約５５ｍＭ、約５５〜約６０ｍＭ、約６０〜約６５ｍＭ、約６５〜約７０ｍＭ、約７０〜約７５ｍＭ、または約７５〜約８０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は、約５０ｍＭ、または５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は、約７５〜約１００ｍＭ、約１００〜約１２５ｍＭ、約１２５〜約１５０ｍＭ、約１５０〜約１７５ｍＭ、約１７５〜約２００ｍＭ、約２００〜約２２５ｍＭ、または約２２５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は、約１５０ｍＭ、または１５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液のｐＨは、約７．５〜約７．７、約７．７〜約７．９、約７．９〜約８．１、約８．１〜約８．３、約８．３〜約８．５、約８．５〜約８．７、約８．７〜約８．９、または約８．９〜約９．２であり得る。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液のｐＨは、約８．５、または８．５であり得る。
【０１２３】
第２の緩衝液は、約５０〜約２００ｍＭのグリシンを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は、約５０〜約１００ｍＭ、約７０〜約１２０ｍＭ、約１００〜約１５０ｍＭ、約１２０〜約１７０ｍＭ、約１５０〜約２００ｍＭのグリシンを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液のｐＨは、約７．５〜約７．７、約７．７〜約７．９、約７．９〜約８．１、約８．１〜約８．３、約８．３〜約８．５、約８．５〜約８．７、約８．７〜約８．９、または約８．９〜約９．２であり得る。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液のｐＨは、約８．５、または８．５であり得る。
【０１２４】
第２の緩衝液は、約５〜約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は、約５〜約１０ｍＭ、約７〜約１２ｍＭ、約１０〜約１５ｍＭ、約１２〜約１７ｍＭ、約１５〜約２０ｍＭのクエン酸ナトリウムを含むことができる。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液のｐＨは、約７．５〜約７．７、約７．７〜約７．９、約７．９〜約８．１、約８．１〜約８．３、約８．３〜約８．５、約８．５〜約８．７、約８．７〜約８．９、または約８．９〜約９．２であり得る。ある特定の実施形態では、第２の緩衝液のｐＨは、約８．５、または８．５であり得る。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、第２の緩衝液は、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡを含む。
【０１２６】
第３の緩衝液は、約７．５〜約９．２のｐＨで、約３０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約３０〜約７５体積％のエチレングリコールを含むことができる。第３の緩衝液は、約７．３〜約８．８のｐＨで、約２０〜約８０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び約５０〜約２００ｍＭの塩を、含むことができる。第３の緩衝液は、約８．５のｐＨで、約５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約５０体積％のエチレングリコールを含むことができる。第３の緩衝液は、約７．３〜約８．８のｐＨで、約２０〜約１５０ｍＭのタウリン、約３０〜約７５体積％のエチレングリコール、及び０．０５〜０．２％のオクチルグリコピラノシドを含むことができる。第３の緩衝液は、約７．３〜約８．８のｐＨで、約５０〜約２００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、約５０〜約２００ｍＭのリジンＨＣｌ、約５０〜約２００ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、及び約１ｍＭ〜約４ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファン、及び約１０％〜約４０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０を含むことができる。塩、例えばＮａＣｌが第３の緩衝液中に存在する場合、ある特定の実施形態では、塩の濃度は５００ｍＭを超えず、ある特定の実施形態では、塩の濃度は２００ｍＭを超えない。ある特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、酢酸ナトリウム、またはＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＭｇＣｌ２、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、及び酢酸ナトリウムのうちの１つ以上の組み合わせである。ある特定の実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。ある特定の実施形態では、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、またはトレハロースのうちの１つ以上は、エチレングリコールと組み合わされるか、またはエチレングリコールの代わりに使用され得る。
【０１２７】
理論に拘束されることを望まないが、ＡＡＶの溶出の程度は、エチレングリコールの量及び第３の緩衝液中の塩の伝導性の両方に影響される。緩衝液中の少なくとも５５％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールの量は、５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールと比較すると、溶出量を顕著に増加させることができる。したがって、所与のエチレングリコール濃度で、ＮａＣｌ濃度の増加は、溶出の程度及び速度を増加させることができる。所与のエチレングリコール濃度で、ＮａＣｌの多価の塩での置換も、溶出の程度及び速度を増加させることができる。
【０１２８】
理論に拘束されることを望まないが、塩が一定、例えば、７５０ｍＭのＮａＣｌである場合、エチレングリコールの量を増やすことは、緩衝液の溶出強度を増加させることができる。エチレングリコール含有量が一定、例えば、５５％である場合、塩の量を増加させることは、緩衝液の溶出強度を増加させることができる。したがって、溶出強度は、７５０ｍＭのＮａＣｌ中で４０％から４５％、５０％、５５％、６０％（ｗ／ｗ）へのエチレングリコールで増加する。
【０１２９】
一定の塩含有量を有する溶液のエチレングリコール含有量を増加させることは、伝導性を低下させることができる。増加したエチレングリコールの量は、緩衝液中の塩の溶解度の量を低下させることができる。
【０１３０】
ある特定の実施形態では、第３の緩衝液は、約３０〜約３５ｍＭ、約３５〜約４０ｍＭ、約４０〜約４５ｍＭ、約４５〜約５０ｍＭ、約５０〜約５５ｍＭ、約５５〜約６０ｍＭ、約６０〜約６５ｍＭ、約６５〜約７０ｍＭ、約７０〜約７５ｍＭ、約７５〜約８０ｍＭ、約８０〜約９０ｍＭ、約９０〜約１００ｍＭ、約１００〜約１１０ｍＭ、約１１０〜約１２０ｍＭ、約１２０〜約１３０ｍＭ、約１３０〜約１４０ｍＭ、約１４０〜約１５０ｍＭ、約１５０〜約１６０ｍＭ、約１６０〜約１７０ｍＭ、約１７０〜約１８０ｍＭ、約１８０〜約１９０ｍＭ、または約１９０〜約２００ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第３の緩衝液は、約５０ｍＭ、または５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第３の緩衝液は、約３０〜約３５体積％、３５〜約４０体積％、約４０〜約４５体積％、約４５〜約５０体積％、約４８〜約５２体積％、約５０〜約５５体積％、約５５〜約６０体積％、約６０〜約６５体積％、約６５〜約７０体積％、または約７０〜約７５体積％のエチレングリコールを含むことができる。ある特定の実施形態では、第３の緩衝液は、約５０％、または５０％のエチレングリコールを含むことができる。ある特定の実施形態では、第３の緩衝液のｐＨは、約７．５〜約７．７、約７．７〜約７．９、約７．９〜約８．１、約８．１〜約８．３、約８．３〜約８．５、約８．５〜約８．７、約８．７〜約８．９、または約８．９〜約９．２であり得る。ある特定の実施形態では、第３の緩衝液のｐＨは、約８．５、または８．５であり得る。
【０１３１】
ある特定の実施形態では、第３の緩衝液は、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡを含む。
【０１３２】
第４の緩衝液は、約６．５〜約８．０のｐＨで、約１０〜約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約１０〜約１５ｍＭ、約１５〜約２０ｍＭ、約２０〜約２５ｍＭ、または約２５〜約３０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約２０ｍＭ、または２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約７５〜約１００ｍＭ、約１００〜約１２５ｍＭ、約１２５〜約１５０ｍＭ、約１５０〜約１７５ｍＭ、約１７５〜約２００ｍＭ、約２００〜約２２５ｍＭのＮａＣｌ、または約２２５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約１５０ｍＭ、または１５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、ｐＨを有し、約６．５〜約６．９、約６．８〜約７．２、約７．１〜約７．５、約７．４〜約７．９、または約７．６〜約８．０であり得る。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約７．４、または７．４のｐＨを有することができる。
【０１３３】
第４の緩衝液は、約７．５〜約８．８のｐＨで、約２０〜約１００ｍＭのヒスチジン及び約７５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約２０〜約４０ｍＭ、約４０〜約６０ｍＭ、約６０〜約７５ｍＭ、または約７５〜約１００ｍＭのヒスチジンを含むことができる。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約２０ｍＭ、または２０ｍＭのヒスチジンを含むことができる。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約７５〜約１００ｍＭ、約１００〜約１２５ｍＭ、約１２５〜約１５０ｍＭ、約１５０〜約１７５ｍＭ、約１７５〜約２００ｍＭ、約２００〜約２２５ｍＭのＮａＣｌ、または約２２５〜約２５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約１５０ｍＭ、または１５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、ｐＨを有し、約７．５〜約７．９、約７．８〜約８．２、約８．１〜約８．５、約８．４〜約８．９、または約８．６〜約９．０であり得る。ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、約８．０、または８．０のｐＨを有することができる。
【０１３４】
ある特定の実施形態では、第４の緩衝液は、キレート剤、例えば、ＥＤＴＡを含む。ある特定の実施形態では、追加的な洗浄は、キレート剤、例えばＥＤＴＡを含む緩衝液を用いて行われ得る。
【０１３５】
洗浄ステップに続いて、ＡＡＶ粒子は溶出緩衝液を使用して溶出される。溶出緩衝液は、約３０〜約２００ｍＭの緩衝液、約３０〜約７５体積％のエチレングリコール、及び約５００ｍＭ〜約２０００ｍＭの塩を含むことができ、溶出緩衝液は約７．３〜約８．８のｐＨを有する。いくつかの実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５５％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも６０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴｒｉｓＨＣｌ、グリシン、クエン酸塩、アルギニン、ホスフェートグリシン−ＨＣｌ、硫酸アンモニウム、塩化マグネシウム、ホウ酸塩、ビス−Ｔｒｉｓ、ＭＯＰＳ、ビシン、トリシン、ＴＡＰＳ、ＴＡＰＳＯ、ＭＥＳ、ＰＩＰＥＳ、ＴＥＳ（２−［［１，３−ジヒドロキシ−２−（ヒドロキシメチル）プロパン−２−イル］アミノ］エタンスルホン酸）、ナトリウムバルビタール（Ｖｅｒｏｎａｌ）、ＡＤＡ（Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸）、ＡＣＥＳ（Ｎ−（２−アセトアミド）−２−アミノエタンスルホン酸）、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパン、ＢＥＳ（Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）−２−アミノエタンスルホン酸）、ＤＩＰＳＯ（３−（Ｎ，Ｎ−ビス［２−ヒドロキシエチル］アミノ）−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、Ｔｒｉｚｍａ、ＨＥＰＰＳＯ（４−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−１−（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸））、ＰＯＰＳＯ（ピペラジン−１，４−ビス（２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）二水和物）、ＴＥＡ、ＥＰＰＳ（４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸）、ＨＥＰＢＳ（Ｎ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−（４−ブタンスルホン酸）、ＡＭＰＤ（２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオール）、ＡＭＰＳＯ（Ｎ−（１，１−ジメチル−２−ヒドロキシエチル）−３−アミノ−２−ヒドロキシプロパンスルホン酸）、単一アミノ酸、またはＡＡＶのｐＨ及び溶出を確実にするための２個以上のアミノ酸、例えば、グリシン、アルギニン、トリプトファン、アミノ酸の誘導体、例えば、タウリン（酸化されたシステイン）、Ｎ−アセチル−トリプトファン、及びグリシルグリシン、の任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、緩衝液は、ＴｒｉｓＨＣｌである。
【０１３６】
いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌ、ＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＣｓＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、ＣｓＣｌ、またはＫＣｌ、ＣａＣｌ２、ＣｓＣｌ、ＬｉＣｌ、ＣａＣｌ２、クエン酸ナトリウム、ＬｉＣｌ、及びＣｓＣｌのうちの１つ以上の組み合わせである。いくつかの実施形態では、塩は、ＮａＣｌである。塩、例えば、ＮａＣｌの濃度は、約５００〜約２０００ｍＭであり得る。いくつかの実施形態では、塩濃度は、約５００〜約９００ｍＭ、約７５０ｍＭのＮａＣｌ、または７５０ｍＭのＮａＣｌである。いくつかの実施形態では、ＮａＣｌの濃度勾配が使用される場合、標的濃度は２０００ｍＭである。
【０１３７】
ある特定の実施形態では、ソルビトール、マンニトール、キシリトール、スクロース、トレハロース、グリセロール（１，２，３−プロパントリオール）、またはエリトリトール（メソ−１，２，３，４−ブタンテトロール）のうちの１つ以上は、エチレングリコールと組み合わされるか、またはエチレングリコールの代わりに使用され得る。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約３０〜約３５ｍＭ、約３５〜約４０ｍＭ、約４０〜約４５ｍＭ、約４５〜約５０ｍＭ、約５０〜約５５ｍＭ、約５５〜約６０ｍＭ、約６０〜約６５ｍＭ、約６５〜約７０ｍＭ、約７０〜約７５ｍＭ、または約７５〜約８０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約５０ｍＭ、または５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約３０〜約３５体積％、約３５〜約４０体積％、約４０〜約４５体積％、約４５〜約５０体積％、約４８〜約５２体積％、約５０〜約５５体積％、約５５〜約６０体積％、約６０〜約６５体積％、約６５〜約７０体積％、または約７０〜約７５体積％のエチレングリコールを含むことができる。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約５０％、または５０％のエチレングリコールを含むことができる。ある特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５５％（ｗ／ｗ）である。ある特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５６％（ｗ／ｗ）である。ある特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５７％（ｗ／ｗ）である。ある特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、少なくとも５８％（ｗ／ｗ）である。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約５００〜約７００ｍＭ、約５５０〜約７５０ｍＭ、約６００〜約８００ｍＭ、約６５０〜約８５０ｍＭ、約７００〜約９００ｍＭ、約７５０〜約９５０ｍＭ、約８００〜約１０００ｍＭのＮａＣｌ、約９００〜約１１００ｍＭのＮａＣｌ、約１０００〜約１２００ｍＭのＮａＣｌ、約１１００〜約１３００ｍＭのＮａＣｌ、約１２００〜約１４００ｍＭのＮａＣｌ、約１３００〜約１５００ｍＭのＮａＣｌ、約１４００〜約１６００ｍＭのＮａＣｌ、約１５００〜約１７００ｍＭのＮａＣｌ、約１６００〜約１８００ｍＭのＮａＣｌ、約１７００〜約１９００ｍＭのＮａＣｌ、約１８００〜約２０００ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約７５０ｍＭ、または７５０ｍＭのＮａＣｌを含むことができる。ｐＨは、７．３〜７．６であり得る。ｐＨは、７．５〜７．８であり得る。ｐＨは、７．７〜８．０であり得る。ｐＨは、７．９〜８．２であり得る。ｐＨは、８．１〜８．４であり得る。ｐＨは、８．３〜８．６であり得る。ｐＨは、８．５〜８．８であり得る。
【０１３８】
ある特定の実施形態では、溶出は、有機溶媒を含む溶出緩衝液を用いて行われる。例えば、有機溶媒は、１つ以上のポリオール（例えば、エチレングリコール、ソルビトール、マンニトール、キシリトール）、グリセロール、スクロース、トレハロース、またはポリオールの組み合わせを含むことができる。緩衝液は、７．５〜８．５のｐＨ範囲を有することができる。理論に拘束されることを望まないが、有機溶媒は、例えば、ＡＡＶの産生がＳｆ９昆虫細胞のＢａｃｕｌｏｖｉｒｕｓトランスフェクションを伴う場合に産生され得る脂質エンベロープウイルスを不活性化できる。アフィニティ溶出物は、後の超遠心分離ステップにおいて調整可能な密度勾配において使用され得る有機溶媒（例えば、エチレングリコールのようなポリオール）を含有できる。
【０１３９】
洗浄緩衝液中または溶出緩衝液中の任意の有機溶媒は、脂質エンベロープウイルスを分解または不活性化でき得る。かかる不活性化は、オンカラム不活性化と液体状態中不活性化との組み合わせによって発生し得る。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液及びまたは洗浄緩衝液中の有機溶媒は、脂質エンベロープウイルスの分解または不活性化を確実にするために、約５０％（ｗ／ｗ）〜約８０％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。いくつかの実施形態では、濃度は、約５０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、濃度は、約５５％（ｗ／ｗ）である。ある特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、約５６％（ｗ／ｗ）である。ある特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、約５７％（ｗ／ｗ）である。ある特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、約５８％（ｗ／ｗ）である。ある特定の実施形態では、エチレングリコールの濃度は、約５９％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、濃度は、約６０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、濃度は、約６５％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、濃度は、約７０％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、濃度は、約７５％（ｗ／ｗ）である。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液及びまたは洗浄緩衝液中の有機溶媒は、脂質エンベロープウイルスの分解または不活性化を確実にするために、約４０％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液及びまたは洗浄緩衝液中の有機溶媒は、脂質エンベロープウイルスの分解または不活性化を確実にするために、約３０％（ｗ／ｗ）の濃度を有する。いくつかの実施形態では、溶出緩衝液または洗浄緩衝液中の有機溶媒は、Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓを不活性化または分解できる。
【０１４０】
いくつかの実施形態では、第１の緩衝液は、約５．８〜約６．２のｐＨにあり、約９０〜約１１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０９〜約０．１１％のポリソルベート８０／Ｔｗｅｅｎ（登録商標）  ８０を含み、第２の緩衝液は、約８．２〜約８．８のｐＨにあり、約４５〜約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１１０〜約１３５ｍＭのＮａＣｌを含み、第３の緩衝液は、約８．２〜約８．８のｐＨにあり、約４５〜約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約４５〜約５５％のエチレングリコールを含み、任意選択の第４の緩衝液は、約７．２〜約７．６のｐＨにあり、約１５〜約２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１３５〜約１６５ｍＭのＮａＣｌを含む。ある特定の実施形態では、溶出緩衝液は、約７．８〜約８．２のｐＨにあり、約４５〜約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４５〜約５５％のエチレングリコール及び約６５０〜約８５０ｍＭのＮａＣｌを含む。約２カラム体積〜約１５カラム体積、約３カラム体積〜約７カラム体積、約４カラム体積〜約８カラム体積、約５カラム体積〜約１０カラム体積、または約７カラム体積〜約１２カラム体積のような、様々な体積が使用され得る。第１、第２、第３、第４、及び溶出緩衝液の各々の約５カラム体積、または５カラム体積が、使用され得る。代替的には、第１、第２、第３、第４、及び溶出緩衝液の各々の約１０カラム体積、または１０カラム体積が、使用され得る。例えば、カラム体積が約２ｍｌ〜約３ｍｌの際に、１０カラム体積が使用され得る。洗浄ステップの時間を延長することは、ＡＡＶ純度を改善するためにさらに行われ得る。
【０１４１】
いくつかの実施形態では、第１の緩衝液は、約７．２〜約７．６のｐＨにあり、約１５〜約２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１３５〜約１６５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２の緩衝液は、約５．８〜約６．２のｐＨにあり、約９０〜約１１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０９〜約０．１１％のポリソルベート８０を含み、第３の緩衝液は、約８．２〜約８．８のｐＨにあり、約４５〜約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１１０〜約１３５ｍＭのＮａＣｌを含み、第４の緩衝液は、約７．５〜約８．５のｐＨにあり、約４５〜約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約４５〜約５５％のエチレングリコールを含み、溶出緩衝液は、約７．８〜約８．２のｐＨにあり、約４５〜約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４５〜約５５％のエチレングリコール及び約６５０〜約８５０ｍＭのＮａＣｌを含む。各洗浄緩衝液の約１０カラム体積、または１０カラム体積が、使用され得る。
【０１４２】
いくつかの実施形態では、第１の緩衝液は、約７．２〜約７．６のｐＨにあり、約１５〜約２５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１３５〜約１６５ｍＭのＮａＣｌを含み、第２の緩衝液は、約５．８〜約６．２のｐＨにあり、約９０〜約１１０ｍＭの酢酸ナトリウム及び約０．０９〜約０．１１％のポリソルベート８０を含み、第３の緩衝液は、約８．２〜約８．８のｐＨにあり、約４５〜約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約１１０〜約１３５ｍＭのＮａＣｌを含み、第４の緩衝液は、約７．５〜約８．５のｐＨにあり、約４５〜約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び約４５〜約５５％のエチレングリコールを含む。溶出は、約７．８〜約８．２のｐＨでの第１の溶出緩衝液で開始する勾配を用いて行われ、約４５〜約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４５〜約５５％のエチレングリコール及び約６５０〜約８５０ｍＭのＮａＣｌを含み、約７．８〜約８．２のｐＨでの第２の溶出緩衝液で終了し、約４５〜約５５ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、約４５〜約５５％のエチレングリコール及び約１９００〜約２１００ｍＭのＮａＣｌを含む。各洗浄緩衝液の約１０カラム体積、または１０カラム体積が、使用され得る。溶出は、勾配の１０カラム体積を用いて行われ得る。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶ粒子を含有する溶液は、イオン交換クロマトグラフィーを受ける。ある特定の実施形態では、イオン交換は、陰イオン交換である。ある特定の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィー支持体は、細胞培養物からの残留粒子汚染物質だけでなく、酸性不純物及びウイルス粒子も除去できる。ある特定の実施形態では、陰イオン交換クロマトグラフィーは、プロテアーゼ及び／または宿主細胞ＤＮＡを除去できる。ある特定の実施形態では、イオン交換クロマトグラフィーは、膜ベースの分離、例えば、ハイブリッド膜−陰イオン交換クロマトグラフィーを用いて行われ得る。ある特定の実施形態では、純粋なＡＥＸクロマトグラフィーが、例えば、フロースルーモードまたは結合／溶出モードにおいて使用される。ある特定の実施形態では、陰イオン交換支持体は、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑ、ＳＴＲＥＡＭＬＩＮＥ  Ｑ  ＸＬ（商標）、ＰＯＲＯＳ  ５０  ＰＩ（商標）、Ｑ  ＳＥＰＨＡＲＯＳＥ（商標）、Ｅｍｐｈａｓｅ（商標）ＡＥＸ  Ｈｙｂｒｉｄ  Ｐｕｒｉｆｉｅｒ、Ｎｕｖｉａ  Ｑ、ＰＯＲＯＳ  ５０  ＨＱ、Ｃａｐｔｏ  Ｑ、Ｃａｐｔｏ  Ｑインプレス（ｉｍｐｒｅｓｓ）、Ｕｎｏｓｐｈｅｒｅ  Ｑ、Ｑ  Ｃｅｒａｍｉｃ  ＨＹＰＥＲＤ（登録商標）Ｆ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）Ｑ、ＴＯＹＯＰＥＡＲＬ（登録商標）Ｓｕｐｅｒ  Ｑ、混合モードＡＥＸ樹脂（例えば、Ｃａｐｔｏ  Ａｄｈｅｒｅ、Ｃａｐｔｏ付着インプレス、ＭＥＰ  Ｈｙｐｅｒｃｅｌｌ）、及び任意のＤＥＡＥ、ＴＭＡＥ、三級または四級アミン、またはＰＥＩベースの樹脂であり得るが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、イオン交換支持体は、Ｍｕｓｔａｎｇ（登録商標）Ｑである。
【０１４４】
ある特定の実施形態では、ＨＥＫ２９３細胞、または使用される任意の宿主細胞からのＤＮＡは、Ｂｅｎｚｏｎａｓｅ及び／またはＤＮａｓｅで処理されない。本明細書に記載される陰イオン交換体及び洗浄ステップは、かかるＤＮＡを除去するために有効であり得、ＢｅｎｚｏｎａｓｅまたはＤＮａｓｅを用いて処理する必要がない。
【０１４５】
ＡＡＶは、一般に、（ｐＨに依存して）フロースルー画分における陰イオン交換ステップから回収される。代替的には、ＡＡＶは、結合／溶出方法において使用され得る。フロースルー方法または結合／溶出方法のいずれかは、ＡＡＶよりも高い伝導性（一定のｐＨで）または低いｐＨ（一定の伝導性で）で溶出する宿主細胞不純物を除外するために行われるべきである。結合／溶出モードにおいて操作する際に、緩衝液のｐＨ及び組成物は、酸性の宿主細胞不純物のものでなく、産物の溶出を誘発するために有効である。理論に拘束されることを望まないが、各結合及び溶出ステップは、非結合条件におけるフロースルー方法が結合／溶出方法よりも少ないＡＡＶの損傷または分解を引き起こすことができるように、微小環境において力を引き起こすことができる。
【０１４６】
様々な実施形態では、本明細書に記載される精製ステップ後の、かつＩＴＲ−ｑＰＣＲアッセイにより重量／体積として測定される、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９の収率は、洗浄手順が実行されない比較手順によって得られるものより少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または、６５％大きい。
【０１４７】
様々な実施形態では、本明細書に記載される精製ステップ後の、かつＩＴＲ−ｑＰＣＲアッセイにより重量／重量として測定される、ＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９の収率は、洗浄手順が実行されない比較手順によって得られるものより少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、または、６５％大きい。
【０１４８】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶを産生及び精製する方法は、同じ洗浄プロトコルを伴わない比較手順によって得られるものよりも、タンパク質不純物の数を約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９９％低下させる。驚くべきことに、本明細書に記載されるＡＡＶを産生及び精製する方法は、タンパク質不純物の数を少なくとも２５％減少させることが見出された。驚くべきことに、本明細書に記載されるＡＡＶを産生及び精製する方法は、ＡＡＶ粒子の溶液がアフィニティマトリックス上に負荷される前に陰イオン交換クロマトグラフィーに曝露される際に、タンパク質不純物の数を少なくとも７５％減少させることが見出された。例えば、実施例２の表７のデータは、タンパク質不純物の数が２０から１４（事前の陰イオン交換なし）かつ２０から４（事前の陰イオン交換あり）に低下することを示す。
【０１４９】
ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶを産生及び精製する方法は、陰イオン交換及び洗浄ステップを伴うアフィニティ精製の両方が本明細書に提供されるように行われる際に少なくとも９８．０％、９８．１％、９８．２％、９８．３％、９８．４％、９８．５％、９８．６％、９８．７％、９８．８％、９８．９％、９９．０％、９９．１％、または９９．２％であるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９の純度を提供する。ある特定の実施形態では、本明細書に記載されるＡＡＶを産生及び精製する方法は、洗浄ステップを伴うアフィニティ精製が本明細書に提供されるように行われる際に少なくとも９６．０％、９６．１％、９６．２％、９６．３％、９６．４％、９６．５％、９６．６％、９６．７％、９６．８％、９６．９％、９７．０％、９７．１％、９７．２％、９７．３％、９７．４％、９７．５％、９７．６％、９７．７％、９７．８％、９７．９％、または９８．０％であるＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ８及びＡＡＶ９の純度を提供する。
【０１５０】
有利には、方法は、例えば、細胞培養物などの大量の出発材料に拡張可能である。ある特定の実施形態では、本明細書で提供される方法は、少なくとももしくは約５００Ｌ、少なくとももしくは約６００Ｌ、少なくとももしくは約７００Ｌ、少なくとももしくは約８００Ｌ、少なくとももしくは約９００Ｌ、または少なくとももしくは約１０００Ｌの体積からのＡＡＶを精製することができる大規模な方法である。ある特定の実施形態では、方法は、少なくとももしくは約１２５０Ｌ、少なくとももしくは約１５００Ｌ、少なくとももしくは約２０００Ｌ、少なくとももしくは約２５００Ｌ、少なくとももしくは約３０００Ｌ、少なくとももしくは約４０００Ｌ、少なくとももしくは約５０００Ｌ、少なくとももしくは約６０００Ｌ、少なくとももしくは約７０００Ｌ、少なくとももしくは約８０００Ｌ、少なくとももしくは約９０００Ｌ、少なくともまたは約１０，０００Ｌ、またはそれ以上の出発材料（例えば、細胞培養物）の最小体積に拡張可能である。例えば、方法は、ＡＡＶを産生する約１０００Ｌまたは約１０，０００Ｌまたは２５，０００Ｌまたはそれ以上の細胞培養物の最小体積で行われる。
【０１５１】
本明細書に記載されるＡＡＶを産生及び精製する方法はまた、方法が高力価のＡＡＶ産生を生じるため、有利である。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０１０のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ産物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０１１のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ産物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０１２のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ産物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０１３のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ産物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０１４のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ産物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０１５のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ産物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０１６のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ産物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される。ある特定の実施形態では、少なくとも約１０１７のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ産物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される。ある特定の実施形態では、少なくとも約２×１０１６のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ産物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される。ある特定の実施形態では、少なくとも約５×１０１７のウイルス粒子（ｖｐ）を含むＡＡＶ産物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される。
【０１５２】
本明細書に記載される方法の別の利点は、方法が非常に純粋なＡＡＶ産物をもたらすことである。ある特定の実施形態では、本開示の方法を通じて産生されるＡＡＶ産物は、１つ以上の以下の汚染物質を実質的に含まない：宿主細胞タンパク質、宿主細胞核酸（例えば、遊離宿主細胞ＤＮＡ及び遊離プラスミドＤＮＡ）、プラスミドＤＮＡ、空のウイルスキャプシド、熱ショックタンパク質７０（ＨＳＰ７０）、乳酸デヒドロゲナーゼ（ＬＤＨ）、プロテアソーム、汚染物質非ＡＡＶウイルス（例えば、脂質エンベロープウイルス）、宿主細胞培養成分（例えば、抗生物質）、マイコプラズマ、パイロジェン、細菌性エンドトキシン、細胞破片（例えば、膜脂質、タンパク質及び他の生物学的高分子から構成される破片）、ならびに外来性薬剤。ＡＡＶが本明細書に記載されるＡＡＶを産生及び精製する方法に従って精製される際に、１つ以上の、または全ての以下の不純物は、検出不可能であり得る：ヒストンＨ２Ａ型１、ヒストンＨ２Ｂ型１−Ｂ、ヒストンＨ４、熱ショック７０ｋＤａタンパク質１Ａ、ピルビン酸キナーゼＰＫＭ、伸長因子２、ＡＴＰ−クエン酸シンターゼ、ヒストンＨ１．４、免疫グロブリン重定常ガンマ１（酸性溶出方法からの固定化されたリガンド）、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２７、フルクトース−ビスホスフェートアルドラーゼＡ、熱ショック同族７１ｋＤａタンパク質、細胞質アクチン１、Ｓ−ホルミルグルタチオンヒドロラーゼ、アスパラギンシンテターゼ（グルタミン加水分解）、Ｌ−乳酸デヒドロゲナーゼＢ鎖、チューブリンベータ−２Ａ鎖、Ｘ染色体ＲＮＡ結合モチーフタンパク質、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ６、細胞質スレオニンｔＲＮＡリガーゼ、免疫グロブリンカッパ定数、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０、ＷＤリピート含有タンパク質１、アデノシルホモシステイナーゼ、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｃ、タンパク質Ｒｅｐ６８、チメット（ｔｈｉｍｅｔ）オリゴペプチダーゼ、Ｄ−３−ホスホグリセリン酸デヒドロゲナーゼ、ＡＴＰ依存性分子シャペロンＨＳＣ８２。本明細書に記載されるＡＡＶを産生及び精製する方法に従って、洗浄ステップの前に陰イオン交換ステップを追加することは、以下のものを検出不可能にすることもできる：ヒストンＨ１．４、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ２７、細胞質アクチン１、チューブリンベータ−２Ａ鎖、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ６、６０Ｓリボソームタンパク質Ｌ３０、ヘテロ核リボヌクレオタンパク質Ｃ、タンパク質Ｒｅｐ６８、及びＡＴＰ依存性分子シャペロンＨＳＣ８２。
【０１５３】
例示的な実施形態では、本開示の方法は、出発材料（例えば、細胞培養物）中に見出される汚染物質の少なくともまたは約５０％が除去される精製されたＡＡＶ産物を提供する。例示的な実施形態では、本開示の方法は、出発材料（例えば、細胞培養物）中に見出される汚染物質の少なくともまたは約６０％が除去される精製されたＡＡＶ産物を提供する。例示的な実施形態では、本開示の方法は、出発材料（例えば、細胞培養物）中に見出される汚染物質の少なくともまたは約７０％が除去される精製されたＡＡＶ産物を提供する。例示的な実施形態では、本開示の方法は、出発材料（例えば、細胞培養物）中に見出される汚染物質の少なくともまたは約８０％が除去される精製されたＡＡＶ産物を提供する。例示的な実施形態では、本開示の方法は、出発材料（例えば、細胞培養物）中に見出される汚染物質の少なくともまたは約９０％が除去される精製されたＡＡＶ産物を提供する。
【０１５４】
ある特定の実施形態では、本開示の方法を通じて産生されるＡＡＶ産物は、ヒトへの投与に好適である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）である。ある特定の実施形態では、本開示の方法を通じて産生されるＡＡＶ産物は、無菌であり、及び／または適正製造基準（ＧＭＰ）グレードのものである。ある特定の実施形態では、本開示の方法を通じて産生されるＡＡＶ産物は、遺伝子治療医薬品に関してＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０４６またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａに示されるか、または米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって命じられるような要件に準拠する。
【０１５５】
追加的に、本明細書に記載される方法から産生されたＡＡＶ産物は、非常に効力がある。ＡＡＶ産物、例えば、ＡＡＶ８またはＡＡＶ９産物の効力は、（１）マウス血漿のｍＬあたりの単位（ＦＩＸまたはＦＶＩＩＩ）として与えられるインビボ生物効力（ｂｉｏｐｏｔｅｎｃｙ）（例えば、マウスにおける活性タンパク質の産生）、または（２）インビトロ生物効力の観点で記載され得る。インビトロ生物効力試験は、細胞、例えば、培地中に目的のタンパク質を発現及び分泌し、ＥＬＩＳＡ技法及び／または酵素活性によって量を決定するＨｅｐＧ２細胞に感染するＡＡＶベクターの可能性を測定する。インビボ及びインビトロ生物効力を測定する好適な方法は、当技術分野で既知であり、本明細書にも記載される。
【０１５６】
さらなる実施形態では、本明細書に記載される方法から産生されるＡＡＶ産物は、優れた比活性を実証する。ＡＡＶの「比活性」は、ＡＡＶ８μｇに対するｑＰＣＲの比率で表される。例示的な実施形態では、本明細書に記載される方法から産生されるＡＡＶ産物は、ＡＡＶのμｇあたりのベクターゲノムの優れた比率を実証し、ＡＡＶ産物が大量の「完全な」ウイルス粒子を有することを実証する。ある特定の実施形態では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してＡＡＶ画分を試験することを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ画分中のキャプシドの大部分は完全なキャプシドであるため、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ画分の効力についての代表的な読みを提供するのに十分である。
【０１５７】
ｒＡＡＶ粒子の供給源
本開示の方法に関して、ＡＡＶは、任意のＡＡＶ血清型のものであり得る。ある特定の実施形態では、本明細書に記載の方法により精製されたＡＡＶは、ＡＡＶ１血清型、ＡＡＶ２血清型、ＡＡＶ３血清型、ＡＡＶ４血清型、ＡＡＶ５血清型、ＡＡＶ６血清型、ＡＡＶ７血清型、ＡＡＶ８血清型、ＡＡＶ９血清型、ＡＡＶ１０血清型、ＡＡＶ１１血清型、ＡＡＶ１２血清型、ＡＡＶ１３血清型、ＡＡＡＶ血清型、ＢＡＡＶ血清型、ＡＡＶ（ＶＲ−１９５）血清型、及びＡＡＶ（ＶＲ−３５５）血清型、またはキメラＡＡＶベクターのものである。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは野生型である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、遺伝子工学によって修飾され、及び／または化学的に修飾される。ある特定の実施形態では、ＡＡＶは、修飾されたキャプシド、例えば、遺伝子操作されたまたは化学的に修飾されたＡＡＶキャプシドを含む。ある特定の実施形態では、本明細書に記載される方法によって精製されたＡＡＶ粒子は、ＡＡＶ８血清型のものである。
【０１５８】
本発明の方法に関して、ＡＡＶ画分は、例示的な態様では、濃縮されたＡＡＶ画分である。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ画分は、ｍＬあたり少なくとも１×１０１０、１×１０１１または１×１０１２のＡＡＶキャプシドを含む。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ画分は、ｍＬあたり少なくとも１×１０１２のＡＡＶキャプシドを含む。ＡＡＶキャプシドは、空のＡＡＶキャプシド及び完全なＡＡＶキャプシドを含むことができる。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、ＡＡＶ画分は、トランスフェクトされた宿主細胞によって産生されるＡＡＶ画分を表す。ある特定の実施形態では、ＡＡＶ画分は、トリプルプラスミドシステムを用いてトランスフェクトされた宿主細胞を含む細胞培養物から採取された上清を表し、システムの１個のプラスミドは目的の遺伝子またはｃＤＮＡを含み、１個のプラスミドはキャプシドタンパク質ＶＰ１、キャプシドタンパク質ＶＰ２及び／またはキャプシドタンパク質ＶＰ３をコードする。ある特定の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３は、ＡＡＶ８  ＶＰ１、ＡＡＶ８  ＶＰ２、及び／またはＡＡＶ８  ＶＰ３である。ある特定の実施形態では、ＶＰ１、ＶＰ２、及び／またはＶＰ３は、ＡＡＶ９  ＶＰ１、ＡＡＶ９  ＶＰ２、及び／またはＡＡＶ９  ＶＰ３である。ｒＡＡＶ産生の目的のためのトリプルプラスミドトランスフェクションは、当該分野で既知である。例えば、Ｑｕ  ｅｔ  ａｌ．，２０１５，上記、及びＭｉｚｕｋａｍｉ  ｅｔ  ａｌ．，“Ａ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌ  ｆｏｒ  ＡＡＶ  ｖｅｃｔｏｒ  ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ  ａｎｄ  ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”ＰｈＤ  ｄｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎ，Ｄｉｖｉｓｉｏｎ  ｏｆ  Ｇｅｎｅｔｉｃ  Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ，Ｃｅｎｔｅｒ  ｆｏｒ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１９９８、及びＫｏｔｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，Ｈｕｍ  Ｍｏｌ  Ｇｅｎｅｔ  ２０（Ｒ１）：Ｒ２−Ｒ６（２０１１）を参照されたい。ある特定の実施形態では、トランスフェクションは、無機化合物、例えば、リン酸カルシウム、または有機化合物、ポリエチレンイミン（ＰＥＩ）、または非化学的手段、例えば、エレクトロポレーションを使用して行われ得る。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、付着細胞である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、懸濁細胞（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ  ｃｅｌｌ）である。ある特定の実施形態では、宿主細胞は、ＨＥＫ２９３細胞またはＳｆ９細胞である。ある特定の実施形態では、細胞培養物は、血清及びタンパク質を含まない培養培地を含む。ある特定の実施形態では、培地は、化学的に定義され、動物由来の成分、例えば加水分解物を含まない。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む画分は、トリプルプラスミドシステムを用いてトランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞を含む画分を表す。ある特定の実施形態では、ｒＡＡＶ粒子を含む画分は、米国仮出願第６２／４１７，７７５及び国際出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９９６７に記載される。
【０１６０】
追加的なステップ
本開示の方法は、本明細書に開示されるステップの任意の組み合わせを含み、任意選択で、１つ以上の追加的なステップと組み合わされ得る。したがって、例示的な態様では、本開示の方法は、本明細書に記載されるようなトリプルプラスミドシステムを用いて宿主細胞をトランスフェクトするステップをさらに含む。例示的な態様では、本開示の方法は、トリプルプラスミドシステムを用いてトランスフェクトされた宿主細胞、例えばＨＥＫ２９３細胞を含む細胞培養物から上清を採取することを含む。例示的な態様では、トランスフェクション及び採取するステップは、本明細書に記載される超遠心分離ステップの前に発生する。
【０１６１】
本開示の方法は、ＡＡＶの純度をさらに増加させ、他の不要な成分をさらに除去し、及び／または画分を濃縮し、及び／またはその後のステップのための画分を条件づけることができるさらに他の追加的なステップを含むことができる。追加的なステップは、上に記載される超遠心分離ステップの前または後に発生し得る。
【０１６２】
例示的な態様では、方法は、深層濾過（ｄｅｐｔｈ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）ステップを含む。例示的な態様では、方法は、トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞培養上清の画分を、セルロース及びパーライトを含み約５００Ｌ／ｍ２の最小透過性を有するフィルタを使用して深層濾過に供することを含む。例示的な態様では、この方法は、約０．２μｍの最小孔径を有するフィルタの使用をさらに含む。例示的な態様では、深層濾過の後に、約０．２μｍの最小孔径を有するフィルタを通じた濾過が続く。例示的な態様では、深層フィルタ及び約０．２μｍの最小孔径を有するフィルタの一方または両方は洗浄され、洗浄液は収集される。例示的な態様では、洗浄液は一緒にプールされ、深層濾過及び約０．２μｍの最小孔径を有するフィルタでの濾過により得られた濾液と組み合わされる。
【０１６３】
例示的な態様では、本開示の方法は、１つ以上のクロマトグラフィーステップを含む。例示的な態様では、方法は、望ましくない成分がクロマトグラフィー樹脂に結合し、所望のＡＡＶがクロマトグラフィー樹脂に結合しない負のクロマトグラフィーステップを含む。例示的な態様では、方法は、負の陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーステップ、または「非結合モード」でのＡＥＸクロマトグラフィーステップを含む。実施例２は、かかるステップについて説明する。「非結合モード」の利点は、手順を行うこと及びその後のアッセイを行う際の相対的容易さを含む。
【０１６４】
したがって、例示的な実施形態では、ＡＡＶ粒子を精製する方法は、ＡＡＶがＡＥＸクロマトグラフィーカラムまたは膜を通って流れることを可能にする条件下で画分をＡＥＸクロマトグラフィーカラムまたは膜に適用することと、ＡＡＶ粒子を収集することと、によってＡＡＶ粒子を含む画分に対して負の陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィーを実施することを含む。例示的な態様では、画分は、約１００ｍＭ〜約１５０ｍＭの塩、例えば、ＮａＣｌを任意選択で含む負荷緩衝液と共にＡＥＸクロマトグラフィーカラムまたは膜に適用され、ここで、負荷緩衝液のｐＨは約８〜約９である。例示的な態様では、負荷緩衝液は、約１１５ｍＭ〜約１３０ｍＭの塩、例えば、ＮａＣｌを任意選択で含み、負荷緩衝液は、約１２０ｍＭ〜約１２５ｍＭの塩、例えば、ＮａＣｌを含む。例示的な態様では、負のＡＥＸステップは、本明細書に記載される超遠心分離ステップの前に発生する。
【０１６５】
例示的な態様では、本開示の方法は、超／透析濾過システムを使用してＡＡＶ画分を濃縮することを含む。例示的な態様では、本開示の方法は、１つ以上のタンジェンシャルフロー（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ  ｆｌｏｗ  ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）濾過（ＴＦＦ）ステップを含む。例示的な態様では、ＡＡＶ画分は超／透析濾過を受ける。例示的な態様では、ＡＡＶ画分は、負のＡＥＸクロマトグラフィーを実行することを含むステップの前、負のＡＥＸクロマトグラフィーを実行することを含むステップの後、または負のＡＥＸクロマトグラフィーを実行することを含むことの前及び後に超／透析濾過システムを用いて濃縮される。例示的な態様では、ＴＦＦステップは、本明細書に記載される超遠心分離ステップの前に発生する。
【０１６６】
例示的な態様では、本開示の方法は、画分中のｒＡＡＶ粒子よりも大きいサイズのウイルスを除去するために、ｒＡＡＶ粒子を含む画分の濾過を含む。
【０１６７】
例示的な態様では、本開示の方法は、１つ以上の品質制御ステップ、例えば、プロセスの１つ以上のステップ後に（例えば、各ステップ後に）得られたＡＡＶ画分の効力または比活性を測定するステップを含む。例示的な態様では、本開示の方法は、ＡＡＶに特異的なＥＬＩＳＡを含む。例示的な態様では、ＥＬＩＳＡはサンドイッチＥＬＩＳＡである。例示的な態様では、サンドイッチＥＬＩＳＡは、ＡＡＶエピトープに特異的な抗体を含む。例示的な態様では、ＡＡＶエピトープは、組み立てられたＡＡＶキャプシド上に存在する立体構造エピトープである。本明細書で論じられるように、ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ画分の効力を決定する方法としてｑＰＣＲに取って代わることができる。例示的な態様では、本開示の方法はＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してＡＡＶ画分を試験することを含み、方法は定量的ＰＣＲを介して効力を測定する方法を含まない。例示的な態様では、ＡＡＶ画分中のキャプシドの大部分は完全なキャプシドであるため、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ画分の効力についての代表的な読みを提供するのに十分である。
【０１６８】
例示的な態様では、本開示の方法は、本開示のステップのうちの１つ以上の後にＡＡＶに特異的なＥＬＩＳＡを含む。例示的な態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介して深層濾過後に得られたＡＡＶ画分を試験して、その画分中のＡＡＶの比活性を決定することを含む。例示的な態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介して超／透析濾過後を使用してＡＡＶ画分を濃縮することの後に得られたＡＡＶ画分を試験して、その画分中のＡＡＶの比活性を決定することを含む。例示的な態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介してタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）ステップ後に得られたＡＡＶ画分を試験して、その画分中のＡＡＶの比活性を決定することを含む。例示的な態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介して負の陰イオン交換（ＡＥＸ）クロマトグラフィー後に得られたＡＡＶ画分を試験して、その画分中のＡＡＶの比活性を決定することを含む。例示的な態様では、本開示の方法は、ＡＡＶ特異的ＥＬＩＳＡを介して磨きステップ後に得られたＡＡＶ画分を試験して、その画分中のＡＡＶの比活性を決定することを含む。
【０１６９】
本開示の方法によって産生されたＡＡＶ産物は、本明細書にさらに提供される。例示的な態様では、ＡＡＶ産物は、約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される少なくとも約１０１２のウイルス粒子（ｖｐ）、または約１０００Ｌの出発材料（例えば、細胞培養物）から産生される少なくとも約１０１３のウイルス粒子（ｖｐ）を含む。例示的な態様では、ＡＡＶ産物は、導入遺伝子プラスミドを伴わずにｒｅｐ−ｃａｐ及びＡｄヘルパープラスミドをトランスフェクトすることによって生成される空のキャプシドである。精製された空のプラスミドは、患者の血液からＡＡＶ抗原に特異的な抗体を枯渇または除去するために使用され得る。
【０１７０】
例示的な態様では、本開示のＡＡＶ産物は、非常に純粋であり、非常に効力があり、ヒトにおける臨床的使用に好適である。例示的な態様では、ＡＡＶ産物は、均質な集団及び高純度のＡＡＶ粒子を含む。例示的な態様では、ＡＡＶ産物は、完全長ベクターＤＮＡを含む。例示的な実施形態では、ＡＡＶ産物は、切断されたもしくは不完全なベクターＤＮＡを含有するＡＡＶ粒子、不完全なタンパク質組成及びオリゴマー化構造を有するＡＡＶ粒子、または汚染ウイルス、例えば、非ＡＡＶ、脂質エンベロープウイルスを含むがこれらに限定されない、望ましくない汚染物質を実質的に含まない。例示的な実施形態では、ＡＡＶ産物は、目的のタンパク質の大量のコード化ｃＤＮＡを含有する。例示的な実施形態では、本開示のＡＡＶ産物は、ヒトへの投与に好適である。例示的な態様では、ＡＡＶ産物は、無菌であり、及び／または適正製造基準（ＧＭＰ）グレードのものである。例示的な実施形態では、ＡＡＶ産物は、遺伝子治療医薬品に関してＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ  Ｃｈａｐｔｅｒ  １０４６またはＥｕｒｏｐｅａｎ  Ｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａに示されるか、または米国食品医薬品局（ＵＳＦＤＡ）または欧州医薬品庁（ＥＭＡ）によって命じられるような要件に準拠する。例示的な態様では、ＡＡＶ産物は、取扱または加工をほとんどまたは全く用いずにヒトへの直接投与のためのすぐに使用できる産物である。
【実施例】
【０１７１】
以下の実施例は、単に本発明を例示するために与えられ、決してその範囲を限定するものではない。
【０１７２】
実施例１
以下の例は、ＨＥＫ２９３細胞株をトリプルプラスミドシステムを用いてトランスフェクトして、目的のタンパク質をコードする核酸を含むｒＡＡＶ粒子を産生する例示的な方法を記載する。
【０１７３】
付着性のＨＥＫ２９３細胞を、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９９６７のパラグラフ［００１４６］〜［００１５０］に記載されるように、化学的に定義され、動物由来の成分、タンパク質及び血清が含まない市販の培養培地中で懸濁状態で成長させた。細胞は３つのプラスミドでトランスフェクトした：（１）増殖性ＡＡＶ感染に不可欠なヘルパーウイルス機能を提供するヘルパープラスミド、（２）ウイルスのキャプシド生成、複製及びパッケージ化に関する全ての情報を担持するｒｅｐｃａｐ−プラスミド、（３）生じるｒＡＡＶ粒子中にパッケージ化される目的の遺伝子（ＧＯＩ）を含有するプラスミド。目的の遺伝子を担持するｒＡＡＶ粒子は、トランスフェクション後３〜５日の期間にわたってＨＥＫ２９３細胞株中にある。
【０１７４】
トランスフェクトされたＨＥＫ２９３細胞培養の上清を、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９９６７の［００１５１］〜［００１５５］、表１及び表２に記載されるように採取した。採取された上清を、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９９６７のパラグラフ［００１５６］〜［００１６０］、表３及び表４に記載されるように濃縮及び条件付け（透析濾過（ｄｉａｆｉｌｔｅｒｅｄ））した。負のクロマトグラフィーを、例えば、ＰＣＴ／ＵＳ２０１７／０５９９６７のパラグラフ［００１６１］〜［００１６５］及び表５に記載されるように透析濾過された濃縮物に対して実行した。
【０１７５】
実施例２
ＡＡＶ８産生を、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ８−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞株において展開した。清澄化した無細胞培養上清を、濃縮し、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  １００ｋＤａを用いて透析濾過した。ウイルス粒子を、非結合条件で、すなわち、ｐＨ８．５で１２５ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む溶液中で、膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ、Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷した。ｐＨ条件づけられた負荷を、２５％ＨＣｌで７．４〜７．８のｐＨ範囲にＡＡＶ８含有フロースルーを調整することによって得た。
【０１７６】
以下の試験手順を行った。まず、５９ｍｍのベッド高さ及び体積４７．４５ｍｌを有するＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティマトリックス（カタログ番号１９５３３８０１０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム（内径３２ｍｍ）を、ｐＨ７．４で少なくとも５カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化させた。ｐＨ条件づけられた負荷を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティマトリックス（カタログ番号１９５３３８０１０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム上に適用した。次いで、カラムを、ｐＨ７．４で５カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化させた（任意選択の第４の緩衝液）。
【０１７７】
次いで、カラムを、ｐＨ６．０で５カラム体積の洗浄１（Ｗ１）：１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で５カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で５カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び５０％のエチレングリコールを用いて洗浄した。
【０１７８】
５カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％のエチレングリコール、及び７５０ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８．０でカラムに適用することによって、溶出を行った。次いで、５カラム体積の以下の第２の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％のエチレングリコール、及び２０００ｍＭのＮａＣｌをカラムに適用した。
【０１７９】
上のステップについて線形流量（ｌｉｎｅａｒ  ｆｌｏｗ  ｒａｔｅ）は、６０ｃｍ／時であった。
【０１８０】
以下の比較手順を行った。２．５ｍｍのベッド高さ及び体積１．９６ｍｌを有するＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティマトリックス（カタログ番号１９５３３８０１０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム（内径１０ｍｍ）を、ｐＨ７．４で少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化させた。ｐＨ条件づけられた負荷を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティマトリックス（カタログ番号１９５３３８０１０、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム上に適用した。次いで、カラムを、ｐＨ７．４で１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化させた。
【０１８１】
洗浄ステップを、以下のＴＢＳ緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／ｐＨ７．４を使用することによって実行した。代わりに、溶出を、ｐＨ３．０で１０カラム体積の１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いて行った。
【０１８２】
上記の試験及び比較手順は、表２により詳細に説明され、「ＣＶ」は、ステップにおいて添加された溶液のカラム体積の数を示す。
【表２】
2021508484.tif 000004
【０１８３】
以下のアッセイを、表３に重量／体積で示されるデータを用いて行った。溶出緩衝液の密度を、振動Ｕチューブ密度計ＤＭＡ  ４５００Ｍ（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ）で測定した。
【０１８４】
ＥＬＩＳＡを、ＡＡＶ８抗原の量を測定するために使用した。ＥＬＩＳＡを、ＡＡＶ−８滴定ＥＬＩＳＡキット（Ａｒｔ．番号ＰＲＡＡＶ８、Ｐｒｏｇｅｎ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＴＥＣＡＮ  Ｒｏｂｏｔｅｒシステムで行った。簡単に言えば、組み立てられたＡＡＶ８キャプシド（ＡＤＫ８）上の立体構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体を、マイクロタイターストリップ上に被覆し、ＡＡＶ画分からＡＡＶ８粒子を捕捉するために使用した。捕捉ＡＡＶ８粒子は、２つのステップにより検出された。第１のステップでは、ＡＤＫ８抗体に特異的なビオチン結合モノクローナル抗体を、（ＡＤＫ８及びＡＤＫ８抗体の）免疫複合体に結合した。ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートをビオチン結合モノクローナル抗体に結合した免疫複合体に添加し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートはビオチンと反応した。ペルオキシダーゼ基質溶液を添加し、結合したＡＡＶ粒子の量に比例する呈色反応が発生する。呈色反応は、４５０ｎｍで測光的に測定される。
【０１８５】
ＩＴＲ−ｑＰＣＲアッセイを、目的の遺伝子（例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子またはヒト第ＩＸ因子）をコードするベクターにおいて見出される逆タンデムリピートを定量化することにより、ゲノムコピー力価を決定するために使用した。ＨＥＫ−ＨＣＰは、ＥＬＩＳＡによる残存宿主細胞タンパク質の測定値である。ＬＤＨを、比色活性アッセイによって決定した。
【０１８６】
ＡＡＶ８リガンド漏出ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）は、ＡＡＶ８アフィニティリガンドを捕捉薬剤として含有するＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティ培地を用いて精製された産物中に存在し得る１ｎｇ／ｍＬのＡＡＶ８アフィニティリガンドの検出のために設計される。ＡＡＶ８リガンド漏出ＥＬＩＳＡは、最適な精製プロセス開発において、及び最終産物と同様にインプロセスストリームの日常的な品質管理において役立つツールとして使用され得る。
【０１８７】
量「リガンド漏出ＥＬＩＳＡ／ＡＡＶ８−抗原」は、ＡＡＶ８のマイクログラムあたりのリガンドのナノグラムとして計算された、「ＡＡＶ８抗原」に対する「リガンド漏出ＥＬＩＳＡ」の比率を反映する。
【０１８８】
インビトロ生物効力アッセイでは、ウイルスベクターＡＡＶ８は、その後、機能的で測定可能なコードされたタンパク質を培地中に分泌する肝標的細胞株に感染する。最初のステップでは、ＨｅｐＧ２標的細胞は、ＡＡＶ８に感染して形質導入される。インキュベーション時間中に、コードされたタンパク質は細胞上清に放出される。第２のステップでは、細胞培養上清へのコードされたタンパク質の活性は、活性アッセイにより直接測定される。ＡＡＶ８試料の測定値は、参照材料に対するパーセンテージとして示される。方法は、ＡＡＶ８遺伝子治療ベクターの生物学的機能の定量的な評価を可能にする。
【表３】
2021508484.tif 000005
【０１８９】
試験手順についてＩＴＲ−ｑＰＣＲについてのステップ収率は１０５．３％であったが、比較手順のものは７１．２％であった。試験手順のインビトロ生物効力は０．４５であったが、比較手順のものは０．３３であった。
【０１９０】
アッセイも、表４における重量／重量で示されるデータを用いて行った。
【表４】
2021508484.tif 000006
【０１９１】
試験手順についてＩＴＲ−ｑＰＣＲについてのステップ収率は１２７．４％であったが、比較手順のものは７２．４％であった。ＡＡＶ８の感染力及び生物効力を低下させるであろう極端な条件を使用しなくてもよいことと組み合わされた、収率及び純度の向上は、驚くべきことであった。また、特に精製前に存在する不純物との非特異的結合や産物の複合体が実質的に多い条件下では、試験手順がアフィニティリガンドから産物を溶出させることもなくほとんどの不純物を除去することは驚くべきことであった。
【０１９２】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を、比較手順の代わりに洗浄ステップを伴う試験手順を使用する際に、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）の減少があったかどうかを決定するために、実行した。ウエスタンブロットを、１：２０００希釈で一次抗体として抗Ｈｓｐ７０抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ７９８５２）を２時間、及び１：１０００希釈で二次抗体としてヤギ抗ウサギｉｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＰ複合体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ８０２５）を１時間使用して実行した。結果は図１に示される。レーン４（テスト手順）をレーン６（比較手順）と比較すると、テスト手順でＨＳＰ７０の大幅な減少が観察された。レーン２は２０ｎｇのＨＳＰ７０を示し、レーン４は４ｎｇのＨＳＰ７０を示す。
【０１９３】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色アッセイを、存在する不純物の全体的なレベルを決定するために実行した。結果は図２に示される。レーン２は、ＡＡＶ８参照を表し、３つの特徴的なバンドを示す。溶出物（１９０μｇ／ｍｌ）を、試験手順及び比較手順の両方に従って精製した。試験手順の結果は、レーン４に示される。比較手順の結果は、レーン６に示される。比較手順では、試験手順よりも実質的により多くの不純物が見られる。
【０１９４】
１２％の抗ＡＡＶ抗体を用いたウエスタンブロットを、試験及び比較手順に従って精製後に回収されたＡＡＶ８のレベル及び純度を決定するために実行した。ウエスタンブロットを、一次抗体としてＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３に対するモノクローナル抗体を用い、二次抗体としてヤギ抗マウスＡＬＰ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ４６５６）を用いて実行した。結果は、図３に示される。レーン２は、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３の各々に３つのバンドを有するＡＡＶ参照（１３０ｎｇ、６０μｇ／ｍｌに対応する）を示す。レーン４は試験手順（１９０μｇ／ｍｌのＡＡＶ８抗原）に従う溶出物を示し、比較手順に従う溶出物を示す。ウエスタンブロットに従うと、収率は、比較手順に対し試験手順でより高い。
【０１９５】
ＬＣ−ＭＳを、様々な宿主細胞不純物の同一性及び量を決定するために実行した（ｒｐ−ＨＰＬＣ−ＵＶ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）。試料を、酵素トリプシンを使用して消化した。得られたペプチド混合物を、ＲＰカラム（ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ１８カラム、０．５×１５０ｍｍ、３．５μｍ）を使用するＨＰＬＣシステムで分離し、その後、ペプチドをＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計で分析した。データを、ソフトウェアＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒを使用して試料中のタンパク質を特定するために分析した。
【０１９６】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ１２０９（１２００  ｃａｐＨＰＬＣ）を、ＬＣ  ３Ｄシステム用のＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを用いて使用した（Ｒｅｖ．Ｂ．０４．０３−ＳＰ２（１０５））。ＨＰＬＣ方法は、ＰＥＰＭＡＰ＿ＣＡＰ＿１７０．Ｍであった。溶出物Ａは、脱イオン水中０．１％（ｖ／ｖ）のＨＣＯＯＨであり、溶出物Ｂは、アセトニトリル中０．０８％（ｖ／ｖ）のＨＣＯＯＨであった。ＨＰＬＣの詳細は以下の表５に提供される：
【表５】
2021508484.tif 000007
【０１９７】
ＭＳの詳細は以下の表６に提供される：
【表６−１】
2021508484.tif 000008
【表６−２】
2021508484.tif 000009
【０１９８】
３つの異なる精製のモードを行った。１つはこの例の比較手順を含み、もう１つはこの例の試験手順（アフィニティ精製の前にＭｕｓｔａｎｇＱによる陰イオン交換精製を含んだ）を含み、第３のものは試験手順に従って行われたがＭｕｓｔａｎｇＱによる陰イオン交換精製を伴わなかった。表７は全体的な結果を要約する。
【表７】
2021508484.tif 000010
【０１９９】
上の表では、純度は、全てのタンパク質の総曲線下面積（ＡＵＣ）に対する、ＡＡＶ８キャプシドに関連するＡＵＣパーセントを反映する。
【０２００】
以下の表８〜１０は、各タンパク質について、比較手順（表８）についてＬＣ／ＭＳにより特定されたＡＵＣ値及びペプチドの数、事前の陰イオン交換を伴う試験手順（表９）、ならびに事前の陰イオン交換を伴わない試験手順（表１０）を列挙する。
【表８−１】
2021508484.tif 000011
【表８−２】
2021508484.tif 000012
【表９−１】
2021508484.tif 000013
【表９−２】
2021508484.tif 000014
【表１０−１】
2021508484.tif 000015
【表１０−２】
2021508484.tif 000016
【０２０１】
最も少ないタンパク質は、事前の陰イオン交換と組み合わされた試験手順で検出された。陰イオン交換がないと、純度は低下し、検出されるタンパク質の数は増加する。最も低い純度及び検出されたタンパク質の最大数は、比較手順で見られる。
【０２０２】
実験例３
ＡＡＶ８産生を、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ８−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞株において展開した。清澄化した無細胞培養上清を、濃縮し、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  １００ｋＤａを用いて透析濾過した。ウイルス粒子を、非結合条件で膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ．Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷した。得られたＡＡＶ８含有フロースルーを、２５％ＨＣｌで７．４〜７．８のｐＨ範囲にｐＨ調整しなかった。代わりに、負荷を、ｐＨ８．５で１２５ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む負荷緩衝液でＡＡＶ−８含有フロースルーを再構成することにより形成した。
【０２０３】
ｐＨ８．５を有することは、ｐＨ調整ステップを含まなくてよいことに固有の利点に加えて、親和性性能における改善した頑健性と、産物または樹脂のいずれかへの不純物の非特異的結合の防止を可能にする。
【０２０４】
様々な洗浄及び溶出ステップからの試料を、どれほどのＡＡＶ８が試料中に存在するかをアッセイするために様々な点で採取した。アッセイは、どれほどのＡＡＶ８が様々な洗浄ステップにおいて失われたかを示す。以下の試験手順を行った。まず、２５ｍｍのベッド高さ及び体積１．９６ｍｌを有するＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティマトリックス（カタログ番号１９５３３８０１０．Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム（内径１０ｍｍ）を、ｐＨ７．４で少なくとも５カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化させた。負荷を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティマトリックス（カタログ番号１９５３３８０１０．Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム上に適用した。カラム上に負荷した試料の一部を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。次いで、カラムを、ｐＨ７．４で１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化させた。フロースルーの試料を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。
【０２０５】
次いで、カラムを、ｐＨ６．０で１０カラム体積の洗浄１（Ｗ１）：１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び５０％のエチレングリコールを用いて洗浄した。Ｗ１、Ｗ２、及びＷ３の各々の溶出液からの試料を、採取し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡに従ってアッセイした。
【０２０６】
１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％のエチレングリコール、及び７５０ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８．０でカラムに適用することによって、溶出を行った。
【０２０７】
上の試験手順は、表１１により詳細に記載される。
【表１１】
2021508484.tif 000017
【０２０８】
採取された試料を、収率と、損失がステップにおいて発生したかどうかと、を評価するために、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡの各々によってアッセイした。表１２は、表１１に列挙される洗浄、溶出、及び溶出後のステップの画分の全てにおいてＩＴＲ  ｑＰＣＲによってアッセイされたＡＡＶ８の分布を示す。
【表１２】
2021508484.tif 000018
【０２０９】
以下の表１３は、表１１に列挙される洗浄、溶出、及び溶出後のステップの画分の全てにおいてＥＬＩＳＡによってアッセイされたＡＡＶ８の分布を示す。
【表１３】
2021508484.tif 000019
【０２１０】
以下の表１４は、負荷及び溶出ステップのみでＥＬＩＳＡによって存在するＨＥＫ  ２９３  ＨＣＰの量を決定するためのアッセイの結果を示す。
【表１４】
2021508484.tif 000020
【０２１１】
表１２〜１４におけるデータに関連するクロマトグラムが、図６に示される。
【０２１２】
上の試料を、総タンパク質を検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び１２％銀染色によってもアッセイした。結果は、図４に示され、各レーンに対するラベルは図の中に示される。ＡＡＶ８バンドは、溶出物（Ｅ）及び５０％溶出物希釈（Ｅ２）レーン中に明らかに見える。非常に少ないＡＡＶ８が、洗浄バンドフロースルー試料（Ｗ１、Ｗ２、及びＷ３）中ならびにストリッピング（Ｓ）フロースルー試料中において見られる。したがって、方法は、洗浄中の実質的な損失または溶出後にＡＡＶ８をカラム上に残すことなく、ＡＡＶ８を効率的に除去する。
【０２１３】
次いで、試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＡＶ抗原に対するウエスタンブロットによってアッセイした。一次抗体はＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３に対するモノクローナル抗体であるが、二次抗体はアルカリホスファターゼと結合したヤギ抗マウスである。結果は、図５に示され、図４におけるものと同じ各レーンに対するラベルが使用される。洗浄及びストリッピングステップにおけるＡＡＶ８の損失は最小限である。
【０２１４】
実施例４
ＡＡＶ９産生は、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ９−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後にＨＥＫ２９３細胞株において展開される。清澄化した無細胞培養上清は、濃縮され、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  １００ｋＤａを用いて透析濾過される。ウイルス粒子は、非結合条件で、すなわち、ｐＨ８．５で１２５ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む溶液中で、膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ、Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷される。ｐＨ条件づけられた負荷は、２５％ＨＣｌを用いて７．４〜７．８の間のｐＨ範囲にＡＡＶ９含有フロースルーを調整することによって得られる。
【０２１５】
以下の試験手順が、行われる。まず、５９ｍｍのベッド高さ及び体積４７．４５ｍｌを有するＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティ樹脂（カタログ番号Ａ２７３５４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム（内径３２ｍｍ）は、ｐＨ７．４で少なくとも５カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化される。ｐＨ条件づけられた負荷は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティ樹脂（カタログ番号Ａ２７３５４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム上に適用される。次いで、カラムは、ｐＨ７．４で５カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化される（任意選択の第４の緩衝液）。
【０２１６】
次いで、カラムは、ｐＨ６．０で５カラム体積の洗浄１（Ｗ１）：１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いて洗浄される。次いで、カラムは、ｐＨ８．５で５カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄される。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で５カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び５０％のエチレングリコールを用いて洗浄される。
【０２１７】
溶出は、５カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％のエチレングリコール、及び７５０ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８．０でカラムに適用することによって行われる。次いで、５カラム体積の以下の第２の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％のエチレングリコール、及び２０００ｍＭのＮａＣｌが、カラムに適用される。
【０２１８】
上のステップについての線形流量は、６０ｃｍ／時である。
【０２１９】
以下の比較手順が、行われる。２．５ｍｍのベッド高さ及び体積１．９６ｍｌを有するＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティ樹脂（カタログ番号Ａ２７３５４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム（内径１０ｍｍ）は、ｐＨ７．４で少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化される。ｐＨ条件づけられた負荷は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティ樹脂（カタログ番号Ａ２７３５４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム上に適用される。次いで、カラムは、ｐＨ７．４で１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化される。
【０２２０】
洗浄ステップは、以下のＴＢＳ緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／ｐＨ７．４を使用することによって実行される。代わりに、溶出は、ｐＨ３．０で１０カラム体積の１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いて行われる。
【０２２１】
上記の試験及び比較手順は、表１５により詳細に説明され、「ＣＶ」は、ステップにおいて添加された溶液のカラム体積の数を示す。
【表１５】
2021508484.tif 000021
【０２２２】
溶出緩衝液の密度は、振動Ｕチューブ密度計ＤＭＡ  ４５００Ｍ（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ）で測定される。
【０２２３】
ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ９抗原の量を測定するために使用される。ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ−９滴定ＥＬＩＳＡキット（Ａｒｔ．番号ＰＲＡＡＶ９、Ｐｒｏｇｅｎ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＴＥＣＡＮ  Ｒｏｂｏｔｅｒシステムで行われる。簡単に言えば、組み立てられたＡＡＶ９キャプシド（ＡＤＫ９）上の立体構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体は、マイクロタイターストリップ上に被覆され、ＡＡＶ画分からＡＡＶ９粒子を捕捉するために使用される。捕捉ＡＡＶ９粒子は、２つのステップにより検出される。第１のステップでは、ＡＤＫ９抗体に特異的なビオチン結合モノクローナル抗体は、（ＡＤＫ９及びＡＤＫ９抗体の）免疫複合体に結合する。ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートはビオチン結合モノクローナル抗体に結合した免疫複合体に添加され、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートはビオチンと反応する。ペルオキシダーゼ基質溶液が添加され、結合したＡＡＶ粒子の量に比例する呈色反応が発生する。呈色反応は、４５０ｎｍで測光的に測定される。
【０２２４】
ＩＴＲ−ｑＰＣＲアッセイは、目的の遺伝子（例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子またはヒト第ＩＸ因子）をコードするベクターにおいて見出される逆タンデムリピートを定量化することにより、ゲノムコピー力価を決定するために使用される。ＨＥＫ−ＨＣＰは、ＥＬＩＳＡによる残存宿主細胞タンパク質の測定値である。ＬＤＨは、比色活性アッセイによって決定される。
【０２２５】
ＡＡＶ９リガンド漏出ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）は、ＡＡＶ９アフィニティリガンドを捕捉薬剤として含有するＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティ培地を用いて精製された産物中に存在し得る１ｎｇ／ｍＬのＡＡＶ９アフィニティリガンドを検出できる。ＡＡＶ９リガンド漏出ＥＬＩＳＡは、最適な精製プロセス開発において、及び最終産物と同様にインプロセスストリームの日常的な品質管理において役立つツールとして使用され得る。量「リガンド漏出ＥＬＩＳＡ／ＡＡＶ９−抗原」は、ＡＡＶ９のマイクログラムあたりのリガンドのナノグラムとして計算された、「ＡＡＶ９抗原」に対する「リガンド漏出ＥＬＩＳＡ」の比率を反映する。
【０２２６】
インビトロ生物効力アッセイでは、ウイルスベクターＡＡＶ９は、その後、機能的で測定可能なコードされたタンパク質を培地中に分泌する肝標的細胞株に感染する。第１のステップでは、ＨｅｐＧ２標的細胞は、ＡＡＶ９に感染され形質導入される。インキュベーション時間中に、コードされたタンパク質は、細胞上清に放出される。第２のステップでは、細胞培養上清へのコードされたタンパク質の活性は、活性アッセイにより直接測定される。ＡＡＶ９試料の測定値は、参照材料に対するパーセンテージとして示される。方法は、ＡＡＶ９遺伝子治療ベクターの生物学的機能の定量的な評価を可能にする。
【０２２７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、比較手順の代わりに洗浄ステップを伴う試験手順を使用する際に、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）の減少があったかどうかを決定するために、実行される。ウエスタンブロットは、１：２０００希釈で一次抗体として抗Ｈｓｐ７０抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ７９８５２）を２時間、及び１：１０００希釈で二次抗体としてヤギ抗ウサギｉｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＰ複合体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ８０２５）を１時間使用して実行される。
【０２２８】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色アッセイは、存在する不純物の全体的なレベルを決定するために実行される。
【０２２９】
１２％の抗ＡＡＶ抗体を用いたウエスタンブロットは、試験及び比較手順に従って精製後に回収されたＡＡＶ９のレベル及び純度を決定するために実行される。ウエスタンブロットは、一次抗体としてＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３に対するモノクローナル抗体を用い、二次抗体としてヤギ抗マウスＡＬＰ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ４６５６）を用いて実行される。
【０２３０】
ＬＣ−ＭＳは、様々な宿主細胞不純物の同一性と量を決定するために実行される（ｒｐ−ＨＰＬＣ−ＵＶ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）。試料は、酵素トリプシンを使用して消化される。得られたペプチド混合物は、ＲＰカラム（ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ１８カラム、０．５×１５０ｍｍ、３．５μｍ）を使用するＨＰＬＣシステムで分離され、その後、ペプチドはＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計で分析される。データは、ソフトウェアＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒを使用して試料中のタンパク質を特定するために分析される。
【０２３１】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ１２０９（１２００  ｃａｐＨＰＬＣ）は、ＬＣ  ３Ｄシステム用のＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを用いて使用される（Ｒｅｖ．Ｂ．０４．０３−ＳＰ２（１０５））。ＨＰＬＣ方法は、ＰＥＰＭＡＰ＿ＣＡＰ＿１７０．Ｍである。溶出物Ａは、脱イオン水中０．１％（ｖ／ｖ）のＨＣＯＯＨであり、溶出物Ｂは、アセトニトリル中０．０８％（ｖ／ｖ）のＨＣＯＯＨである。ＨＰＬＣの詳細は以下の表１６に提供される：
【表１６】
2021508484.tif 000022
【０２３２】
ＭＳの詳細は以下の表１７に提供される：
【表１７−１】
2021508484.tif 000023
【表１７−２】
2021508484.tif 000024
【０２３３】
３つの異なる精製のモードが、実行される。１つはこの例の比較手順を含み、もう１つはこの例の試験手順（アフィニティ精製の前にＭｕｓｔａｎｇＱによる陰イオン交換精製を含む）を含み、第３のものは試験手順に従って行われるがＭｕｓｔａｎｇＱによる陰イオン交換精製を伴わない。
【０２３４】
実施例５
ＡＡＶ９産生は、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ９−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後にＨＥＫ２９３細胞株において展開される。清澄化した無細胞培養上清は、濃縮され、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  １００ｋＤａを用いて透析濾過される。ウイルス粒子は、非結合条件で、膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ．Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷される。得られたＡＡＶ９含有フロースルーは、２５％ＨＣｌで７．４〜７．８のｐＨ範囲にｐＨ調整されない。代わりに、負荷は、ｐＨ８．５で１２５ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む負荷緩衝液でＡＡＶ−８含有フロースルーを再構成することにより形成される。
【０２３５】
ｐＨ８．５を有することは、ｐＨ調整ステップを含まなくてよいことに固有の利点に加えて、親和性性能における改善した頑健性と、産物または樹脂のいずれかへの不純物の非特異的結合の防止を可能にできる。
【０２３６】
様々な洗浄及び溶出ステップからの試料は、どれほどのＡＡＶ９が試料中に存在するかをアッセイするために様々な点で採取される。アッセイは、どれほどのＡＡＶ９が様々な洗浄ステップにおいて失われるかを示す。以下の試験手順が、行われる。まず、２５ｍｍのベッド高さ及び体積１．９６ｍｌを有するＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティ樹脂（カタログ番号Ａ２７３５４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム（内径１０ｍｍ）は、ｐＨ７．４で少なくとも５カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化される。負荷は、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ９アフィニティ樹脂（カタログ番号Ａ２７３５４、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム上に適用される。カラム上に負荷した試料の一部は、保存され、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイされる。次いで、カラムは、ｐＨ７．４で１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化される。フロースルーの試料は、保存され、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイされる。
【０２３７】
次いで、カラムは、ｐＨ６．０で１０カラム体積の洗浄１（Ｗ１）：１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いて洗浄される。次いで、カラムは、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄される。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び５０％のエチレングリコールを用いて洗浄される。Ｗ１、Ｗ２及びＷ３の各々の溶出液からの試料は、採取され、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡに従ってアッセイされる。
【０２３８】
溶出は、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％のエチレングリコール、及び７５０ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８．０でカラムに適用することによって行われる。
【０２３９】
上の試験手順は、表１８により詳細に記載される。
【表１８】
2021508484.tif 000025
【０２４０】
採取された試料は、収率と、損失がステップにおいて発生したかどうかと、を評価するために、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡの各々によってアッセイされる。
【０２４１】
上の試料は、総タンパク質を検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び１２％銀染色によってもアッセイされる。
【０２４２】
次いで、試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＡＶ９抗原に対するウエスタンブロットによってアッセイされる。一次抗体はＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３に対するモノクローナル抗体であるが、二次抗体はホスファターゼと結合したヤギ抗マウスである。
【０２４３】
実施例６
ＡＡＶ９産生は、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ９−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後にＨＥＫ２９３細胞株において展開される。清澄化した無細胞培養上清は、濃縮され、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  １００ｋＤａを用いて透析濾過される。ウイルス粒子は、非結合条件で、すなわち、ｐＨ８．５で１２５ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む溶液中で、膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ、Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷される。ｐＨ条件づけられた負荷は、２５％ＨＣｌを用いて７．４〜７．８の間のｐＨ範囲にＡＡＶ９含有フロースルーを調整することによって得られる。
【０２４４】
以下の試験手順が、行われる。まず、樹脂（「ＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂」）上に固定化された５９ｍｍのベッド高さ及び体積４７．４５ｍｌを有する抗インタクトＡＡＶ８／９抗体（カタログ番号０３−６５１１６１、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ）を含有するカラム（内径３２ｍｍ）は、ｐＨ７．４で少なくとも５カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化される。ｐＨ条件づけられた負荷は、ＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム上に適用される。次いで、カラムは、ｐＨ７．４で５カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化される（任意選択の第４の緩衝液）。
【０２４５】
次いで、カラムは、ｐＨ６．０で５カラム体積の洗浄１（Ｗ１）：１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いて洗浄される。次いで、カラムは、ｐＨ８．５で５カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄される。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で５カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び５０％のエチレングリコールを用いて洗浄される。
【０２４６】
溶出は、５カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％のエチレングリコール、及び７５０ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８．０でカラムに適用することによって行われる。次いで、５カラム体積の以下の第２の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％のエチレングリコール、及び２０００ｍＭのＮａＣｌが、カラムに適用される。
【０２４７】
上のステップについての線形流量は、６０ｃｍ／時である。
【０２４８】
以下の比較手順が、行われる。２．５ｍｍのベッド高さ及び体積１．９６ｍｌを有するＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム（内径１０ｍｍ）は、ｐＨ７．４で少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化される。ｐＨ条件づけられた負荷は、ＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム上に適用される。次いで、カラムは、ｐＨ７．４で１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化される。
【０２４９】
洗浄ステップは、以下のＴＢＳ緩衝液：２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ／１５０ｍＭのＮａＣｌ／ｐＨ７．４を使用することによって実行される。代わりに、溶出は、ｐＨ３．０で１０カラム体積の１００ｍＭのクエン酸ナトリウムを用いて行われる。
【０２５０】
上記の試験及び比較手順は、表１により詳細に説明され、「ＣＶ」は、ステップにおいて添加された溶液のカラム体積の数を示す。
【０２５１】
溶出緩衝液の密度は、振動Ｕチューブ密度計ＤＭＡ  ４５００Ｍ（Ａｎｔｏｎ  Ｐａａｒ）で測定される。
【０２５２】
ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ９抗原の量を測定するために使用される。ＥＬＩＳＡは、ＡＡＶ−９滴定ＥＬＩＳＡキット（Ａｒｔ．番号ＰＲＡＡＶ９、Ｐｒｏｇｅｎ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＴＥＣＡＮ  Ｒｏｂｏｔｅｒシステムで行われる。簡単に言えば、ＡＡＶ９キャプシド（ＡＡＶ８／９抗体（「ＡＤＫ８／９抗体」、カタログ番号０３−６５１１６１、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｉｎｃ．，Ｗａｌｔｈａｍ，ＭＡ））に特異的なモノクローナル抗体は、マイクロタイターストリップ上に被覆され、ＡＡＶ画分からＡＡＶ９粒子を捕捉するために使用される。捕捉ＡＡＶ９粒子は、２つのステップにより検出される。第１のステップでは、ＡＤＫ８／９抗体に特異的なビオチン結合モノクローナル抗体は、（ＡＤＫ８／９及びＡＤＫ８／９抗体の）免疫複合体に結合する。ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートはビオチン結合モノクローナル抗体に結合した免疫複合体に添加され、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートはビオチンと反応する。ペルオキシダーゼ基質溶液が添加され、結合したＡＡＶ粒子の量に比例する呈色反応が発生する。呈色反応は、４５０ｎｍで測光的に測定される。
【０２５３】
ＩＴＲ−ｑＰＣＲアッセイは、目的の遺伝子（例えば、ヒト第ＶＩＩＩ因子またはヒト第ＩＸ因子）をコードするベクターにおいて見出される逆タンデムリピートを定量化することにより、ゲノムコピー力価を決定するために使用される。ＨＥＫ−ＨＣＰは、ＥＬＩＳＡによる残存宿主細胞タンパク質の測定値である。ＬＤＨは、比色活性アッセイによって決定される。
【０２５４】
ＡＡＶ８／９リガンド漏出ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）は、ＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を用いて精製された製品に存在し得るアフィニティリガンドを検出できる。
【０２５５】
インビトロ生物効力アッセイでは、ウイルスベクターＡＡＶ９は、その後、機能的で測定可能なコードされたタンパク質を培地中に分泌する肝標的細胞株に感染する。第１のステップでは、ＨｅｐＧ２標的細胞は、ＡＡＶ９に感染され形質導入される。インキュベーション時間中に、コードされたタンパク質は、細胞上清に放出される。第２のステップでは、細胞培養上清へのコードされたタンパク質の活性は、活性アッセイにより直接測定される。ＡＡＶ９試料の測定値は、参照材料に対するパーセンテージとして示される。方法は、ＡＡＶ９遺伝子治療ベクターの生物学的機能の定量的な評価を可能にする。
【０２５６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析は、比較手順の代わりに洗浄ステップを伴う試験手順を使用する際に、熱ショックタンパク質７０ｋＤａ（ＨＳＰ７０）の減少があったかどうかを決定するために、実行される。ウエスタンブロットは、１：２０００希釈で一次抗体として抗Ｈｓｐ７０抗体（Ａｂｃａｍ、カタログ番号ａｂ７９８５２）を２時間、及び１：１０００希釈で二次抗体としてヤギ抗ウサギｉｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ＡＰ複合体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ８０２５）を１時間使用して実行される。
【０２５７】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ銀染色アッセイは、存在する不純物の全体的なレベルを決定するために実行される。
【０２５８】
１２％の抗ＡＡＶ抗体を用いたウエスタンブロットは、試験及び比較手順に従って精製後に回収されたＡＡＶ９のレベル及び純度を決定するために実行される。ウエスタンブロットは、一次抗体としてＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３に対するモノクローナル抗体を用い、二次抗体としてヤギ抗マウスＡＬＰ抗体（Ｓｉｇｍａ、カタログ番号Ａ４６５６）を用いて実行される。
【０２５９】
ＬＣ−ＭＳは、様々な宿主細胞不純物の同一性と量を決定するために実行される（ｒｐ−ＨＰＬＣ−ＵＶ−ＥＳＩ−ＭＳ／ＭＳ）。試料は、酵素トリプシンを使用して消化される。得られたペプチド混合物は、ＲＰカラム（ＺＯＲＢＡＸ  ３００ＳＢ−Ｃ１８カラム、０．５×１５０ｍｍ、３．５μｍ）を使用するＨＰＬＣシステムで分離され、その後、ペプチドはＱ−Ｅｘａｃｔｉｖｅ  ＨＦ質量分析計で分析される。データは、ソフトウェアＰｒｏｔｅｏｍｅ  Ｄｉｓｃｏｖｅｒｅｒを使用して試料中のタンパク質を特定するために分析される。
【０２６０】
Ａｇｉｌｅｎｔ  ＨＰＬＣ１２０９（１２００  ｃａｐＨＰＬＣ）は、ＬＣ  ３Ｄシステム用のＣｈｅｍＳｔａｔｉｏｎを用いて使用される（Ｒｅｖ．Ｂ．０４．０３−ＳＰ２（１０５））。ＨＰＬＣ方法は、ＰＥＰＭＡＰ＿ＣＡＰ＿１７０．Ｍである。溶出物Ａは、脱イオン水中０．１％（ｖ／ｖ）のＨＣＯＯＨであり、溶出物Ｂは、アセトニトリル中０．０８％（ｖ／ｖ）のＨＣＯＯＨである。ＨＰＬＣの詳細は以下の表１９に提供される：
【表１９】
2021508484.tif 000026
【０２６１】
ＭＳの詳細は以下の表２０に提供される：
【表２０−１】
2021508484.tif 000027
【表２０−２】
2021508484.tif 000028
【０２６２】
３つの異なる精製のモードが、実行される。１つはこの例の比較手順を含み、もう１つはこの例の試験手順（アフィニティ精製の前にＭｕｓｔａｎｇＱによる陰イオン交換精製を含む）を含み、第３のものは試験手順に従って行われるがＭｕｓｔａｎｇＱによる陰イオン交換精製を伴わない。
【０２６３】
実施例７
ＡＡＶ９産生は、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ９−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後にＨＥＫ２９３細胞株において展開される。清澄化した無細胞培養上清は、濃縮され、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  １００ｋＤａを用いて透析濾過される。ウイルス粒子は、非結合条件で、膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ．Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷される。得られたＡＡＶ９含有フロースルーは、２５％ＨＣｌで７．４〜７．８のｐＨ範囲にｐＨ調整されない。代わりに、負荷は、ｐＨ８．５で１２５ｍＭのＮａＣｌ及び５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含む負荷緩衝液でＡＡＶ９−含有フロースルーを再構成することにより形成される。
【０２６４】
ｐＨ８．５を有することは、ｐＨ調整ステップを含まなくてよいことに固有の利点に加えて、親和性性能における改善した頑健性と、産物または樹脂のいずれかへの不純物の非特異的結合の防止を可能にできる。
【０２６５】
様々な洗浄及び溶出ステップからの試料は、どれほどのＡＡＶ９が試料中に存在するかをアッセイするために様々な点で採取される。アッセイは、どれほどのＡＡＶ９が様々な洗浄ステップにおいて失われるかを示す。以下の試験手順が、行われる。まず、２５ｍｍのベッド高さ及び体積１．９６ｍｌを有するＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム（内径１０ｍｍ）は、ｐＨ７．４で少なくとも５カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化される。負荷は、ＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム上に適用される。カラム上に負荷した試料の一部は、保存され、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイされる。次いで、カラムは、ｐＨ７．４で１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化される。フロースルーの試料は、保存され、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイされる。
【０２６６】
次いで、カラムは、ｐＨ６．０で１０カラム体積の洗浄１（Ｗ１）：１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いて洗浄される。次いで、カラムは、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄される。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び５０％のエチレングリコールを用いて洗浄される。Ｗ１、Ｗ２及びＷ３の各々の溶出液からの試料は、採取され、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡに従ってアッセイされる。
【０２６７】
溶出は、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％のエチレングリコール、及び７５０ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８．０でカラムに適用することによって行われる。
【０２６８】
上の試験手順は、表２１により詳細に記載される。
【表２１】
2021508484.tif 000029
【０２６９】
採取された試料は、収率と、損失がステップにおいて発生したかどうかと、を評価するために、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡの各々によってアッセイされる。
【０２７０】
上の試料は、総タンパク質を検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び１２％銀染色によってもアッセイされる。
【０２７１】
次いで、試料は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＡＶ９抗原に対するウエスタンブロットによってアッセイされる。一次抗体はＡＡＶ９のＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３に対するモノクローナル抗体であるが、二次抗体はホスファターゼと結合したヤギ抗マウスである。
【０２７２】
実施例８
ＡＡＶ８  ＥＬＩＳＡを、ＡＡＶ−８滴定ＥＬＩＳＡキット（Ａｒｔ．番号ＰＲＡＡＶ８、Ｐｒｏｇｅｎ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を用いてＴＥＣＡＮ  Ｒｏｂｏｔｅｒシステムで行った。組み立てられたＡＡＶ８キャプシド（ＡＤＫ８）上の立体構造エピトープに特異的なモノクローナル抗体を、マイクロタイターストリップ上に被覆し、ＡＡＶ画分からＡＡＶ８粒子を捕捉するために使用した。捕捉ＡＡＶ８粒子は、２つのステップにより検出された。第１のステップでは、ＡＤＫ８抗体に特異的なビオチン結合モノクローナル抗体を、免疫複合体に結合した。ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートをビオチン結合モノクローナル抗体に結合した免疫複合体に添加し、ストレプトアビジンペルオキシダーゼコンジュゲートはビオチンと反応した。ペルオキシダーゼ基質溶液を添加し、結合したＡＡＶ粒子の量に比例する呈色反応が発生する。呈色反応を、４５０ｎｍで測光的に測定した。
【０２７３】
実施例９
実施例において行われたＩＴＲ−ｑＰＣＲアッセイについて、以下の手順を行った。ミリリットル（ｍｌ）あたりのベクターゲノム力価（ｖｇ）を、プライマーと、ベクターゲノムのＩＴＲ配列内の配列を検出する蛍光標識プローブと、を用いるＴａｑＭａｎベースのｑＰＣＲを使用して決定した。ＡＡＶ粒子中のＩＴＲ特異的配列を検出するために、試料は異なる処理を受けた。試料を、ｓｃＡＡＶゲノムがキャプシドから放出されるように、ＤＮＡｓｅ  Ｉ、その後にプロテイナーゼＫで処理した。次いで、ＡＡＶ  ＩＴＲ  Ｔ形状構造を分解するために、制限酵素消化を実行した。
【０２７４】
参照材料として使用されるプラスミドを、単一のカッター制限酵素で線形化し、アガロースゲルからさらに精製した。ゲル抽出されたＤＮＡのＵＶ  Ａ２６０吸光度を、ＵＶ分光光度計で３回測定し、ＤＮＡ濃度の平均値をμｇ／ｍｌで計算した。
【０２７５】
線形化された標準プラスミドについてのｍｌあたりのコピー数を決定するために、ｄｓ  ＤＮＡの分子量を、基礎となる配列の各個々のヌクレオチドの正確な質量を考慮して、ｍｏｌあたりのグラムで計算した。
【０２７６】
試験物品中のベクターゲノム力価（ｍＬあたりのベクターゲノム）を、線形回帰に適合するプラスミド標準曲線を介して計算した。
【０２７７】
実施例１０
ＡＡＶ８産生を、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ８−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞株において展開した。清澄化した無細胞培養上清を、濃縮し、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ３００ｋＤａを用いて透析濾過した。ウイルス粒子を、ＡＡＶ８についての非結合条件で膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ．Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷した。得られたＡＡＶ８含有フロースルーを、ＡＡＶ８アフィニティマトリックス用の負荷を調製するために、ｐＨ８．０で１００ｍＭのアルギニン、２００ｍＭのＮａＣｌを含む希釈緩衝液で希釈した。アルギニン含有負荷を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ３０７９３）を含有するカラム上に適用した。
【０２７８】
様々な洗浄及び溶出ステップからの試料は、どれほどのＡＡＶ８が試料中に存在するかをアッセイするために様々な点で採取した。アッセイは、どれほどのＡＡＶ８が様々な洗浄ステップにおいて失われたかを示す。以下の試験手順を行った。まず、２５ｍｍのベッド高さ及び体積２．０４ｍｌを有するＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム（内径１０ｍｍ）を、ｐＨ８．５で少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化させた。負荷を、ＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム上に適用した。カラム上に負荷した試料の一部を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化させた（洗浄１、Ｗ１）。フロースルーの試料を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。
【０２７９】
次いで、カラムを、ｐＨ６．０で１０カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：１００ｍＭの酢酸ナトリウム及び０．１％のＴｗｅｅｎ（登録商標）８０を用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄４（Ｗ４）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び５０％のエチレングリコールを用いて洗浄した。Ｗ２、Ｗ３及びＷ４の各々の溶出液からの試料を、採取し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡに従ってアッセイした。
【０２８０】
まず、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、及び７５０ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８．０でカラムに適用することによって、溶出を行った。洗浄ステップは、その後に実行しなかった。次に、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、及び１０００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８．０でカラムに適用することによって、溶出を継続した。次いで、カラムを、ｐＨ７．４で２０ｍＭのＴｒｉｓ  ＨＣｌで洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ２．５で１００ｍＭのグリシン及び２００ｍＭのＮａＣｌを含む１０カラム体積の溶液をカラムに適用することによって再生した。
【０２８１】
上の試験手順は、表２２により詳細に記載される。
【表２２】
2021508484.tif 000030
【０２８２】
実施例１１
ＡＡＶ８産生を、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ８−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞株において展開した。３０ＬのＨａｒｖｅｓｔアリコートから、細胞を、Ｍｅｇａｔｒｏｎ  ＭＴ３０００（Ｐａｌｌ）を使用して破壊し、その後、ａ）深層フィルタＰＤＰ８面積０．５ｍ２ｂ）深層フィルタＶ１００面積：０．５ｍ２及びｃ）Ｋｌｅｅｎｐａｋ  Ｃａｐｓｕｌｅ  ０．２μｍ面積０．１５ｍ２上でのＡＡＶ８含有溶液の濾過が続いた。清澄化した無細胞培養上清を、濃縮し、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ３００ｋＤａを用いて透析濾過した。ウイルス粒子を、ＡＡＶ８についての非結合条件で膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ．Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷した。得られたＡＡＶ８含有フロースルーを、ＡＡＶ８アフィニティマトリックス用の負荷を調製するために、ｐＨ８．０で１００ｍＭのアルギニン、２００ｍＭのＮａＣｌを含む希釈緩衝液で１：２希釈した。アルギニン含有負荷を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ３０７９３）を含有するカラム（内径１０ｍｍ、ベッド高さ２６ｍｍ、体積２．０４ｍｌ）上に適用した。
【０２８３】
様々な洗浄及び溶出ステップからの試料は、どれほどのＡＡＶ８が試料中に存在するかをアッセイするために様々な点で採取した。アッセイは、どれほどのＡＡＶ８が様々な洗浄ステップにおいて失われたかを示す。以下の試験手順を行った。まず、２５ｍｍのベッド高さ及び体積２．０４ｍｌを有するＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム（内径１０ｍｍ）を、ｐＨ８．０で少なくとも１０カラム体積の５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び１００ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化させた。負荷を、ＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム上に適用した。カラム上に負荷した試料の一部を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。次いで、カラムを、ｐＨ８．０で１０カラム体積の５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び１００ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化させた（洗浄１、Ｗ１）。フロースルーの試料を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。
【０２８４】
次いで、カラムを、ｐＨ６．０で１０カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：１００ｍＭのＭＥＳ−ナトリウム、１０ｍＭのＥＤＴＡ、ならびに１１．２ｇ／ｋｇのＳ／Ｄ  ＩＩ溶液（１８．０ｇのＴｗｅｅｎ（登録商標）  ８０、３．４ｇのＤＭＳＯ、及び３．６ｇのＴｎＢＰ）を用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．０で１０カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び１００ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄４（Ｗ４）：５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び５０％のスクロースを用いて洗浄した。Ｗ２、Ｗ３及びＷ４の各々の溶出液からの試料を、採取し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡに従ってアッセイした。
【０２８５】
まず、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、５５％（ｗ／ｗ）のスクロース、２ｍＭのＭｇＣｌ２、及び８００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８．０でカラムに適用することによって、溶出を行った。次いで、カラムを、ｐＨ８．０で１０カラム体積の洗浄５（Ｗ５）：５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び１００ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次に、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、５０％（ｖ／ｖ）のグリセロール、及び８００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８．０でカラムに適用することによって、溶出を継続した。次いで、カラムを、ｐＨ８．０で５０ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ及び１００ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ２．７で１００ｍＭのグリシン及び２００ｍＭのＮａＣｌを含む１０カラム体積の溶液をカラムに適用することによって再生した。
【０２８６】
上の試験手順は、表２３により詳細に記載される。３９ｃｍ／時の線形流量を、全てのステップにおいて適用した。
【表２３】
2021508484.tif 000031
【０２８７】
上の負荷ステップでは、Ｍｕｓｔａｎｇ  Ｑカラムにおける１：２希釈を、平衡化緩衝液のマトリックスに近い条件に負荷を調整するために行った。このステップを、リガンドへのＡＡＶ８の結合に関して緩衝物質の影響を調査するために行った。任意の新しく導入された化合物は潜在的な競争力のある特性を有することができ、及び／またはそれは溶出を潜在的に誘発できる。
【０２８８】
採取された試料を、収率と、損失がステップにおいて発生したかどうかと、を評価するために、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡの各々によってアッセイした。上の例に関連するクロマトグラムが、図７に示される。以下の表２４は、上の各ステップで採取された試料を示し、各成分の収率は表２５に示される。
【表２４】
2021508484.tif 000032
【０２８９】
「洗浄５」ステップは、溶出におけるフロンティング効果を低下させた。
【表２５】
2021508484.tif 000033
【０２９０】
上の試料を、総タンパク質を検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び１２％銀染色によってもアッセイした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイの結果は図８に示される。
【０２９１】
実施例１２
ＡＡＶ８産生を、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ８−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞株において展開した。３０ＬのＨａｒｖｅｓｔアリコートから、細胞を、Ｍｅｇａｔｒｏｎ  ＭＴ３０００（Ｐａｌｌ）を使用して破壊し、その後、ａ）深層フィルタＰＤＰ８面積０．５ｍ２ｂ）深層フィルタＶ１００面積：０．５ｍ２及びｃ）Ｋｌｅｅｎｐａｋ  Ｃａｐｓｕｌｅ  ０．２μｍ面積０．１５ｍ２上でのＡＡＶ８含有溶液の濾過が続いた。清澄化した無細胞培養上清を、濃縮し、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ３００ｋＤａを用いて透析濾過した。ウイルス粒子を、ＡＡＶ８についての非結合条件で膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ．Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷した。負荷を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ３０７９３）を含有するカラム（内径１０ｍｍ、ベッド高さ２６ｍｍ、体積２．０４ｍｌ）上に適用した。
【０２９２】
様々な洗浄及び溶出ステップからの試料は、どれほどのＡＡＶ８が試料中に存在するかをアッセイするために様々な点で採取した。アッセイは、どれほどのＡＡＶ８が様々な洗浄ステップにおいて失われたかを示す。以下の試験手順を行った。まず、２５ｍｍのベッド高さ及び体積２．０４ｍｌを有するＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム（内径１０ｍｍ）を、ｐＨ８．５で少なくとも１０カラム体積の５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化させた。負荷を、ＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム上に適用した。カラム上に負荷した試料の一部を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化させた（洗浄１、Ｗ１）。フロースルーの試料を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。
【０２９３】
次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：１００ｍＭのタウリン、１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：１００ｍＭのグリシンを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄４（Ｗ４）：５０ｍＭのタウリン、５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、０．１％のオクチルグリコピラノシドを用いて洗浄した。Ｗ２、Ｗ３及びＷ４の各々の溶出液からの試料を、採取し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡに従ってアッセイした。
【０２９４】
まず、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのタウリン、６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール、７５０ｍＭのＮａＣｌ、０．１％のオクチルグリコピラノシド、をｐＨ８．０でカラムに適用することによって、溶出を行った。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄５（Ｗ５）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次に、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：１Ｍの（ＮＨ４）２ＳＯ４、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び５０％（ｖ／ｖ）のエチレングリコールをｐＨ７．０でカラムに適用することによって、溶出を継続した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ２．７で１００ｍＭのグリシン及び２００ｍＭのＮａＣｌを含む１０カラム体積の溶液をカラムに適用することによって再生した。
【０２９５】
上の試験手順は、表２６により詳細に記載される。３９ｃｍ／時の線形流量を、全てのステップにおいて適用した。
【表２６】
2021508484.tif 000034
【０２９６】
採取された試料を、収率と、損失がステップにおいて発生したかどうかと、を評価するために、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ（上の実施例８に記載されるように）、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡの各々によってアッセイした。上の例に関連するクロマトグラムが、図９に示される。以下の表２７は、上の各ステップで採取された試料を示し、各成分の収率は表２８に示される。
【表２７】
2021508484.tif 000035
【０２９７】
「洗浄５」ステップは、溶出におけるフロンティング効果を低下させた。
【表２８】
2021508484.tif 000036
【０２９８】
上の試料を、総タンパク質を検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び１２％銀染色によってもアッセイした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイの結果は、図１０に示される。
【０２９９】
実施例１３
ＡＡＶ８産生を、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ８−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞株において展開した。３０ＬのＨａｒｖｅｓｔアリコートから、細胞を、Ｍｅｇａｔｒｏｎ  ＭＴ３０００（Ｐａｌｌ）を使用して破壊し、その後、ａ）深層フィルタＰＤＰ８面積０．５ｍ２ｂ）深層フィルタＶ１００面積：０．５ｍ２及びｃ）Ｋｌｅｅｎｐａｋ  Ｃａｐｓｕｌｅ  ０．２μｍ面積０．１５ｍ２上でのＡＡＶ８含有溶液の濾過が続いた。清澄化した無細胞培養上清を、濃縮し、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ３００ｋＤａを用いて透析濾過した。ウイルス粒子を、ＡＡＶ８についての非結合条件で膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ．Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷した。得られたＡＡＶ８含有フロースルーを、希釈緩衝液［１００ｍＭヒスチジン、２００ｍＭ  ＮａＣｌ、ｐＨ８．５］で１：２希釈し、追加的な４ｇのポリソルベート８０／ｋｇを、ＡＡＶ８−アフィニティについての負荷を調製するために添加した。ヒスチジン含有負荷を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶ８アフィニティマトリックス（カタログ番号Ａ３０７９３、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム（内径１０ｍｍ、ベッド高さ２６ｍｍ、体積２．０４ｍｌ）上に適用した。
【０３００】
様々な洗浄及び溶出ステップからの試料は、どれほどのＡＡＶ８が試料中に存在するかをアッセイするために様々な点で採取した。アッセイは、どれほどのＡＡＶ８が様々な洗浄ステップにおいて失われたかを示す。以下の試験手順を行った。まず、２６ｍｍのベッド高さ及び体積２．０４ｍｌを有するＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム（内径１０ｍｍ）を、ｐＨ８．５で少なくとも１０カラム体積の５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化させた。負荷を、ＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム上に適用した。カラム上に負荷した試料の一部を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ（上の実施例９に記載されるように）、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡ（上の実施例８に記載されるように）によって後でアッセイした。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の５０ｍＭのヒスチジン及び１００ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化させた（洗浄１、Ｗ１）。フロースルーの試料を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ及びＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ（上の実施例８及び９に記載されるように）、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。
【０３０１】
次いで、カラムを、ｐＨ６．０で１０カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：２００ｍＭのＢｉｓ−Ｔｒｉｓ、１６．６ｇのＳ／Ｄ溶液（Ｔｒｉｔｏｎ  Ｘ−１００、ポリソルベート８０、ＴＮＢＰ＝１０．８７、３．３１：３．０１（重量による）を用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：１０ｍＭのＮａ−クエン酸塩を用いて洗浄した。次いで、カラムを、２０％（ｗ／ｗ）のポリソルベート８０と共に、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄４（Ｗ４）：１００ｍＭのアルギニン−ＨＣｌ、１００ｍＭリジン−ＨＣｌ、１００ｍＭのヒスチジン−ＨＣｌ、２ｍＭのＮ−アセチル−Ｄ，Ｌ−トリプトファンを用いて洗浄した。Ｗ２、Ｗ３及びＷ４の各々の溶出液からの試料を、採取し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡに従ってアッセイした（上の実施例８及び９に記載されるように）。
【０３０２】
まず、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：２０％（ｗ／ｗ）のスクロース、１０％（ｗ／ｗ）のソルビトール、５％（ｗ／ｗ）のマンニトール（スクロース）、１５％（ｗ／ｗ）のグリセロール、５０ｍＭのヒスチジン、８００ｍＭのＮａＣｌをｐＨ８．０でカラムに適用することによって、溶出を行った。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄５（Ｗ５）：５０ｍＭのヒスチジン及び１００ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次に、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、７５０ｍＭのＮａＣｌ、５０％（ｗ／ｗ）のＤＭＳＯをｐＨ８．０でカラムに適用することによって、溶出を継続した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で５０ｍＭのヒスチジン及び１００ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ２．７で１００ｍＭのグリシン及び２００ｍＭのＮａＣｌを含む１０カラム体積の溶液をカラムに適用することによって再生した。
【０３０３】
上の試験手順は、表２９により詳細に記載される。３９ｃｍ／時の線形流量を、全てのステップにおいて適用した。
【表２９】
2021508484.tif 000037
【０３０４】
「洗浄５」ステップは、溶出におけるフロンティング効果を低下させた。ＡＡＶ８の溶出は、第２の溶出ステップ（溶出２）において見られなかった。ＡＡＶ８について、ＤＭＳＯは、洗浄緩衝液として、及び／または脂質エンベロープウイルスを不活性化または分解する可能性のある緩衝液として、未だに好適であり得る。
【０３０５】
採取された試料を、収率と、損失がステップにおいて発生したかどうかと、を評価するために、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡの各々によって（上の実施例８及び９に記載されるように）アッセイした。上の例に関連するクロマトグラムが、図１１に示される。以下の表３０は、上の各ステップで採取された試料を示し、各成分の収率は表３１に示される。
【０３０６】
Ｃａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＡＡＶ８樹脂からのＡＡＶ８の溶出が、ポリオール及びある特定の量の塩の存在下で中性近傍条件で発生することは予想外である。樹脂製造業者は、溶出がｐＨ３．５未満の酸性条件を必要とするであろうことを提案した。溶出が糖、糖アルコール及び／または糖及び糖アルコールの混合物で誘発され得ることも驚くべきことであった。また、極性溶媒としてのＤＭＳＯがＣａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＡＡＶ８樹脂からＡＡＶ８を溶出できないことも予想外であった。
【表３０】
2021508484.tif 000038
【０３０７】
「洗浄５」ステップは、溶出におけるフロンティング効果を低下させた。ＡＡＶ８の溶出は、第２の溶出ステップ（溶出２）において見られなかった。
【表３１】
2021508484.tif 000039
【０３０８】
上の試料を、総タンパク質を検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び１２％銀染色によってもアッセイした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイの結果は、図１２に示される。
【０３０９】
実施例１４
ＡＡＶ２産生を、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ２−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞株において展開した。ＡＡＶ２試料を、負荷を提供するために１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４で希釈した。負荷を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティマトリックス（カタログ番号：Ａ３６７３９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム（内径１０ｍｍ、ベッド高さ２５ｍｍ、体積１．９６ｍｌ）上に適用した。
【０３１０】
様々な洗浄及び溶出ステップからの試料は、どれほどのＡＡＶ２が試料中に存在するかをアッセイするために様々な点で採取した。アッセイは、どれほどのＡＡＶ２が様々な洗浄ステップにおいて失われたかを示す。以下の試験手順を行った。まず、２５ｍｍのベッド高さ及び体積１．９６ｍｌを有するＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム（内径１０ｍｍ）を、ｐＨ７．４で少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化させた。負荷を、ＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム上に適用した。カラム上に負荷した試料の一部を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした（上の実施例８及び９に記載されるように）。次いで、カラムを、ｐＨ７．４で１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化させた（洗浄１、Ｗ１）。フロースルーの試料を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした（上の実施例８及び９に記載されるように）。
【０３１１】
次いで、カラムを、ｐＨ６．０で１０カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：１００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ、０．１％のポリソルベート８０を用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄４（Ｗ４）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．０で１０カラム体積の洗浄５（Ｗ５）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール＋７５０ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、１０カラム体積の洗浄６（Ｗ６）：２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて洗浄した。Ｗ２、Ｗ３及びＷ４の各々の溶出液からの試料を、採取し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡに従ってアッセイした（上の実施例８及び９に記載されるように）。
【０３１２】
まず、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：１００ｍＭのグリシン−ＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５をカラムに適用することによって溶出を行った。次いで、カラムを、ｐＨ７．４で１０カラム体積の洗浄７（Ｗ７）：２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。カラムを、１０カラム体積の５０ｍＭリン酸ｐＨ２．０でストリップし、ｐＨ７．４で１０カラム体積の洗浄８（Ｗ８）：２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、次いで、ｐＨ２．０で１０カラム体積の５０ｍＭのリン酸でストリップした。
【０３１３】
上の試験手順は、表３２により詳細に記載される。３９ｃｍ／時の線形流量を、全てのステップにおいて適用した。
【表３２】
2021508484.tif 000040
【０３１４】
採取された試料を、収率と、損失がステップにおいて発生したかどうかと、を評価するために、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡの各々によって（上の実施例８及び９に記載されるように）アッセイした。上の例に関連するクロマトグラムが、図１３に示される。以下の表３３は、上の各ステップで採取された試料を示し、各成分の収率は表３４に示される。
【表３３】
2021508484.tif 000041
【表３４】
2021508484.tif 000042
【０３１５】
上の試料を、総タンパク質を検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び１２％銀染色によってもアッセイした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイの結果は、図１４に示される（レーン２〜１１を参照されたい）。
【０３１６】
次いで、試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＡＶ抗原に対するウエスタンブロットによってアッセイした。一次抗体はＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３に対するモノクローナル抗体であるが、二次抗体はアルカリホスファターゼと結合したヤギ抗マウスである。ウエスタンブロットアッセイの結果は、図１５に示される（レーン２〜１１を参照されたい）。
【０３１７】
実施例１５
ＡＡＶ９産生を、目的のタンパク質ならびにＡＡＶ９−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞株において展開した。ＡＡＶ９試料を、負荷を提供するために１５０ｍＭのＮａＣｌ、２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、ｐＨ７．４で希釈した。負荷を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティマトリックス（カタログ番号：Ａ３６７３９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム（内径１０ｍｍ、ベッド高さ２５ｍｍ、体積１．９６ｍｌ）上に適用した。
【０３１８】
様々な洗浄及び溶出ステップからの試料は、どれほどのＡＡＶ９が試料中に存在するかをアッセイするために様々な点で採取した。アッセイは、どれほどのＡＡＶ９が様々な洗浄ステップにおいて失われたかを示す。以下の試験手順を行った。まず、２５ｍｍのベッド高さ及び体積１．９６ｍｌを有するＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム（内径１０ｍｍ）を、ｐＨ７．４で少なくとも１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化させた。負荷を、ＡＤＫ８／９アフィニティ樹脂を含有するカラム上に適用した。カラム上に負荷した試料の一部を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした（上の実施例８及び９に記載されるように）。次いで、カラムを、ｐＨ７．４で１０カラム体積の２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化させた（洗浄１、Ｗ１）。フロースルーの試料を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした（上の実施例８及び９に記載されるように）。
【０３１９】
次いで、カラムを、ｐＨ６．０で１０カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：１００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ、０．１％のポリソルベート８０を用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄４（Ｗ４）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコールを用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．０で１０カラム体積の洗浄５（Ｗ５）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、６０％（ｗ／ｗ）のエチレングリコール＋７５０ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、１０カラム体積の洗浄６（Ｗ６）：２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．４を用いて洗浄した。Ｗ２、Ｗ３及びＷ４の各々の溶出液からの試料を、採取し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡに従ってアッセイした（上の実施例８及び９に記載されるように）。
【０３２０】
まず、１０カラム体積の以下の溶出緩衝液：１００ｍＭのグリシンＨＣｌ、２００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ２．５をカラムに適用することによって、溶出を行った。次いで、カラムを、ｐＨ７．４で１０カラム体積の洗浄７（Ｗ７）：２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。カラムを、１０カラム体積の５０ｍＭリン酸ｐＨ２．０でストリップし、ｐＨ７．４で１０カラム体積の洗浄８（Ｗ８）：２０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１５０ｍＭのＮａＣｌで洗浄し、次いで、ｐＨ２．０で１０カラム体積の５０ｍＭのリン酸でストリップした。
【０３２１】
上の試験手順は、表３５により詳細に記載される。３９ｃｍ／時の線形流量を、全てのステップにおいて適用した。
【表３５】
2021508484.tif 000043
【０３２２】
採取された試料を、収率と、損失がステップにおいて発生したかどうかと、を評価するために、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡの各々によって（上の実施例８及び９に記載されるように）アッセイした。上の例に関連するクロマトグラムが、図１６に示される。以下の表３６は、上の各ステップで採取された試料を示し、各成分の収率は表３７に示される。
【表３６】
2021508484.tif 000044
【表３７】
2021508484.tif 000045
【０３２３】
上の試料を、総タンパク質を検出するために、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及び１２％銀染色によってもアッセイした。ＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイの結果は、図１４に示される（レーン１２〜２０を参照されたい）。
【０３２４】
次いで、試料を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びＡＡＶ抗原に対するウエスタンブロットによってアッセイした。一次抗体はＡＡＶのＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３に対するモノクローナル抗体であるが、二次抗体はアルカリホスファターゼと結合したヤギ抗マウスである。ウエスタンブロットアッセイの結果は、図１５に示される（レーン１２〜２０を参照されたい）。
【０３２５】
実施例１６
この例は、酸性グリシンまたはリン酸の使用に対して、ＡＡＶ９について増強された溶出条件を実証する。
【０３２６】
ＡＡＶ９産生を、目的のタンパク質及びＡＡＶ９−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞株において展開した。３０ＬのＨａｒｖｅｓｔアリコートから、細胞を、Ｍｅｇａｔｒｏｎ  ＭＴ３０００（Ｐａｌｌ）を使用して破壊し、その後、ａ）深層フィルタＰＤＰ８面積０．５ｍ２、ｂ）深層フィルタＶ１００面積：０．５ｍ２及びｃ）Ｋｌｅｅｎｐａｋ  Ｃａｐｓｕｌｅ  ０．２μｍ面積０．１５ｍ２上でのＡＡＶ９含有溶液の濾過が続いた。清澄化した無細胞培養上清を、濃縮し、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ３００ｋＤａを用いて透析濾過した。ウイルス粒子を、ＡＡＶ９についての非結合条件で膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ．Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷した。負荷を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ３６７３９、Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ）を含有するカラム（内径１６ｍｍ、ベッド高さ５０ｍｍ、体積１０．０ｍｌ）上に適用し、その後、示されるようなカラム体積を伴う緩衝液ステップが続いた。
【０３２７】
様々な洗浄及び溶出ステップからの試料は、どれほどのＡＡＶ９が試料中に存在するかをアッセイするために様々な点で採取した。アッセイは、どれほどのＡＡＶ９が様々な洗浄ステップにおいて失われたかを示す。以下の試験手順を行った。まず、カラムを、ｐＨ８．５で少なくとも５カラム体積の５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化させた。負荷を、アフィニティ樹脂を含有するカラム上に適用した。カラム上に負荷した試料の一部を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で５カラム体積の５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化させた（洗浄１、Ｗ１）。フロースルーの試料を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。
【０３２８】
次いで、カラムを、ｐＨ６．０で５カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：１００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ、０．１％のポリソルベート８０を用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。Ｗ２及びＷ３の各々の溶出液からの試料を、採取し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡに従ってアッセイした。
【０３２９】
まず２０カラム体積の精製水、次いで２０カラム体積のｐＨ３．２で１ｍＭのＨＣｌ、次いで２０カラム体積のｐＨ８．０で５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、７５０ｍＭのＮａＣｌ、５０％のＤＭＳＯ（ｗ／ｗ）適用することによって、溶出を行った。カラムを、ｐＨ２．０で２０カラム体積の精製水、その後、１０カラム体積の３３ｍＭのＨＣｌで洗浄した。
【０３３０】
上の試験手順は、表３８により詳細に記載される。３９ｃｍ／時の線形流量を、全てのステップにおいて適用した。
【表３８】
2021508484.tif 000046
【０３３１】
採取された試料を、収率と、損失がステップにおいて発生したかどうかと、を評価するために、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ（上の実施例８に記載されるように）、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡの各々によってアッセイした。上の例に関連するクロマトグラムが、図１７に示される。以下の表３９は、上の各ステップで採取された試料を示し、ある特定の成分の収率は表４０に示される。
【表３９】
2021508484.tif 000047
【表４０】
2021508484.tif 000048
【０３３２】
上の試料も、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウエスタンブロッティングでアッセイし、結果を図１８に示した。
【０３３３】
ＡＡＶ９は、１ｍＭ塩酸でＣａｐｔｕｒｅ  ｓｅｌｅｃｔ  ＡＡＶｘから溶出され得、このことは、水系に非常に少量の遊離酸のみを導入することの利点を有する。中性近傍のｐＨでのさらなる溶出手順は、ＤＭＳＯ含有水性緩衝溶液（７５０ｍＭのＮａＣｌ、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、５０％ｗ／ｗのジメチルスルホキシド）で行われ得る。ＤＭＳＯ含有溶出物がスクロース勾配を使用した超遠心分離に適用される場合、ＤＭＳＯは有益であり得る。両方の溶出戦略は、３未満のｐＨで１００ｍＭ及び／または大量の塩化ナトリウムまたは塩化マグネシウムのような過酷な溶出条件と比較して、全てのＡＡＶサブタイプについてＡＡＶＸ樹脂からの溶出中の生物効力を維持するための改善された特性を潜在的に有する。
【０３３４】
実施例１７
この例は、酸性グリシンまたはリン酸の使用に対して、ＡＡＶ９について増強された溶出条件を実証する。
【０３３５】
ＡＡＶ９産生を、目的のタンパク質（ＦＩＸ−ｐａｄｕａ、２本鎖）ならびにＡＡＶ９−、ＶＰ１、−ＶＰ２及び−ＶＰ３のコード化ｃＤＮＡを含有するトリプルプラスミドシステムを用いたトランスフェクション後のＨＥＫ２９３細胞株において展開した。３０ＬのＨａｒｖｅｓｔアリコートから、細胞を、Ｍｅｇａｔｒｏｎ  ＭＴ３０００（Ｐａｌｌ）を使用して破壊し、その後、ａ）深層フィルタＰＤＰ８面積０．５ｍ２ｂ）深層フィルタＶ１００面積：０．５ｍ２及びｃ）Ｋｌｅｅｎｐａｋ  Ｃａｐｓｕｌｅ  ０．２μｍ面積０．１５ｍ２上でのＡＡＶ９含有溶液の濾過が続いた。清澄化した無細胞培養上清を、濃縮し、Ｐａｌｌ  Ｏｍｅｇａ  Ｔ−Ｓｅｒｉｅｓ  Ｃａｓｓｅｔｔｅ  ３００ｋＤａを用いて透析濾過した。ウイルス粒子を、ＡＡＶ９についての非結合条件で膜吸着体（ＭｕｓｔａｎｇＱ．Ｐａｌｌ部品番号ＸＴ１４０ＭＳＴＧＱＰ０５）上に負荷した。負荷を、ＰＯＲＯＳ（商標）ＣａｐｔｕｒｅＳｅｌｅｃｔ（商標）ＡＡＶＸアフィニティマトリックス（Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ、カタログ番号Ａ３６７３９）を含有するカラム（１０ｍｍ、ベッド高さ２８ｍｍ、体積２．２ｍｌ）上に適用した。
【０３３６】
様々な洗浄及び溶出ステップからの試料は、どれほどのＡＡＶ９が試料中に存在するかをアッセイするために様々な点で採取した。アッセイは、どれほどのＡＡＶ９が様々な洗浄ステップにおいて失われたかを示す。以下の試験手順を行った。まず、２８ｍｍのベッド高さ及び体積２．２ｍｌを有するアフィニティ樹脂を含有するカラム（内径１０ｍｍ）を、ｐＨ８．５で少なくとも１０カラム体積の５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて平衡化させた。負荷を、アフィニティ樹脂を含有するカラム上に適用した。カラム上に負荷した試料の一部を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて再平衡化させた（洗浄１、Ｗ１）。フロースルーの試料を、保存し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡによって後でアッセイした。
【０３３７】
次いで、カラムを、ｐＨ６．０で１０カラム体積の洗浄２（Ｗ２）：１００ｍＭのＮａＡｃｅｔａｔｅ及び０．１％のポリソルベート８０を用いて洗浄した。次いで、カラムを、ｐＨ８．５で１０カラム体積の洗浄３（Ｗ３）：５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ及び１２５ｍＭのＮａＣｌを用いて洗浄した。次いで、カラムを、３０カラム体積の精製水（洗浄４（Ｗ４））で洗浄した。Ｗ２、Ｗ３及びＷ４の各々の溶出液からの試料を、採取し、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰ抗原に対するＥＬＩＳＡに従ってアッセイした。
【０３３８】
まず２０カラム体積の０〜１００％の勾配の３３ｍＭの塩酸／１ｍＭの塩酸中の１０００ｍＭのＮａＣｌを適用することによって、溶出を行った。
【０３３９】
上の試験手順は、表４１により詳細に記載される。３９ｃｍ／時の線形流量を、全てのステップにおいて適用した。
【表４１】
2021508484.tif 000049
【０３４０】
採取された試料を、収率と、損失がステップにおいて発生したかどうかと、を評価するために、ＩＴＲ  ｑＰＣＲ、ＡＡＶ抗原に対するＥＬＩＳＡ（上の実施例８に記載されるように）、及びＨＥＫ２９３  ＨＣＰに対するＥＬＩＳＡの各々によってアッセイした。上の例に関連するクロマトグラムが、図１９に示される。銀染色は、図２０に示される。
【０３４１】
溶出されたＡＡＶ９の生物効力は、０．５１  ＢＰＵであった。
【０３４２】
実施例１８
様々な樹脂の型の溶出特性を、異なる溶出緩衝液に関して評価した。５０％エチレングリコール（ｗ／ｗ）、５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌ、７５０〜２０００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０を含むポリオール溶出緩衝液を、調製した。１００ｍＭのグリシンｐＨ２．５、１００ｍＭのＮａ−クエン酸塩ｐＨ３．０、及び５０ｍＭのリン酸ｐＨ２．０を含む酸性溶出緩衝液を、調製した。ｐＨ７．４で２ＭのＭｇＣｌ２及び５０ｍＭのＴｒｉｓＨＣｌを含むＭｇＣｌ２含有溶出緩衝液を、調製した。
【０３４３】
いくつかの樹脂を試験した。結果は、以下の表４２に示される。表において、「あり」は、ＡＡＶ８が負荷の１０％を超える量を有する潜在的な「溶出緩衝液」を用いて樹脂から溶出され得ることを示し、「なし」は、ＡＡＶが負荷の１％未満の量で「潜在的な溶出」緩衝液を用いて樹脂から溶出され得ることを示す。
【表４２】
2021508484.tif 000050
【０３４４】
様々な緩衝液を、上のＣａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ  ＡＡＶ８樹脂からＡＡＶ８を溶出させるそれらの能力について試験した。結果は、以下の表４３に示される。
【表４３】
2021508484.tif 000051
【０３４５】
表４４に列挙される溶出緩衝液も、それらがＴｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃから入手可能なＣａｐｔｕｒｅ  Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標）ＡＡＶ９からＡＡＶを溶出するのに十分であるかどうか決定するために試験した。
【表４４】
2021508484.tif 000052
【０３４６】
表４４に記載される潜在的な溶出緩衝液の各々を、Ｃａｐｔｕｒｅ選択ＡＡＶｘで使用され得る溶出緩衝液を決定するために、溶出スクリーンの一部として連続して適用した。スクリーンは、最低の溶出強度を持つ可能性のある溶出緩衝液で始まり、潜在的に最高の溶出強度を有する緩衝液で終わる。クロマトグラムが、図２１に示される。このことは、Ｃａｐｔｕｒｅ選択ＡＡＶｘに適用され得る溶出オプションの例である。
【０３４７】
本明細書に引用される出願公開、特許出願、及び特許を含む全ての参照文献は、各参照文献が参照によって組み込まれるよう個々に及び具体的に示され、その全体が本明細書に示されているような場合と同じ程度、参照によって本明細書に組み込まれる。
【図１】
2021508484.tif 000053
【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【国際調査報告】
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