(57)【要約】  本発明は、化学的に合成され、動物細胞内の遺伝子発現を調節して、実験室で様々な遺伝子機能を研究するために、又は農学、獣医学、化粧品及び／又は治療用途の有効成分として用いうる新規のＲＮＡｉトリガーに関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
細胞内の標的遺伝子の発現を調節するための、好ましくは阻害するためのコンジュゲートであって、前記コンジュゲートが、１又はそれ以上のリガンドに結合した核酸を含み、前記核酸が、好ましくはダイサーの基質ではなく、
第１、第２及び第３の核酸部分を含み、
前記第１の部分（ｉ）は、前記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部分に少なくとも部分的に相補的であり、かつ（ｉｉ）５’から３’の方向性を有し、それによって前記第１の部分の５’及び３’領域を画定し、
前記第２の部分は、（ｉ）前記第１の部分に少なくとも部分的に相補的であり、かつ（ｉｉ）５’から３’の方向性を有し、それによって前記第２の部分の５’及び３’領域を画定し、
前記第１及び第２の部分が二量体化して、少なくとも部分的に相補的な二本鎖を形成し、
前記第３の核酸部分が、前記第１の部分の前記３’領域を前記第２の部分の前記５’領域に連結する、コンジュゲート。
【請求項２】
前記第３の核酸部分が、前記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部分に対して少なくとも部分的に相補的である、請求項１に記載のコンジュゲート。
【請求項３】
前記第２の核酸部分が、前記標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部分に対して少なくとも部分的に相補的である、請求項１又は２に記載のコンジュゲート。
【請求項４】
前記１又はそれ以上のリガンドが、前記第２の核酸部分にコンジュゲートされる、請求項１〜３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５】
前記１又はそれ以上のリガンドが、前記第２の核酸部分の前記３’領域にコンジュゲートされる、請求項４に記載のコンジュゲート。
【請求項６】
前記１又はそれ以上のリガンドが、前記第１の核酸部分の前記５’及び３’領域の中間にある１又はそれ以上の領域にコンジュゲートされる、請求項１〜５のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項７】
前記１又はそれ以上のリガンドが、前記第２の核酸部分の前記５’及び３’領域の中間にある１又はそれ以上の領域にコンジュゲートされる、請求項１〜６のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項８】
前記１又はそれ以上のリガンドが、前記第３の核酸部分の１又はそれ以上の領域にコンジュゲートされる、請求項１〜７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項９】
前記１又はそれ以上のリガンドが、細胞膜又は細胞表面上の特定の標的に結合する脂質、炭水化物、アプタマー、ビタミン、及び／又はペプチドなどのいかなる細胞指向部分（ｃｅｌｌ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）である、請求項１〜８のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１０】
前記１又はそれ以上のリガンドが、１又はそれ以上の炭水化物を含む、請求項９に記載のコンジュゲート。
【請求項１１】
前記１又はそれ以上の炭水化物が、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖又は多糖であり得る、請求項１０に記載のコンジュゲート。
【請求項１２】
前記１又はそれ以上の炭水化物が、１又はそれ以上のガラクトース部分、１又はそれ以上のラクトース部分、１又はそれ以上のＮ−アセチル−ガラクトサミン部分、及び／又は１又はそれ以上のマンノース部分を含む、請求項１１に記載のコンジュゲート。
【請求項１３】
前記１又はそれ以上の炭水化物が、１又はそれ以上のＮ−アセチル−ガラクトサミン部分を含む、請求項１２に記載のコンジュゲート。
【請求項１４】
２つ又は３つのＮ−アセチル−ガラクトサミン部分を含む、請求項１３に記載のコンジュゲート。
【請求項１５】
前記１又はそれ以上のリガンドが、直線構成で、又は分岐構成で前記核酸に結合される、請求項１〜１４のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１６】
前記１又はそれ以上のリガンドが、二分岐若しくは三分岐構成として、又は異なる位置での単一リガンドに基づく構成として前記核酸に結合される、請求項１５に記載のコンジュゲート。
【請求項１７】
前記核酸が、二量体化してそれにより、前記第１及び第２の部分が前記少なくとも部分的に相補的な二本鎖を形成する、一本鎖である、請求項１〜１６のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１８】
前記核酸が、１７〜４０ヌクレオチド長である、請求項１〜１７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項１９】
前記核酸が、少なくとも２０ヌクレオチド長、又はより好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長である、請求項１８に記載のコンジュゲート。
【請求項２０】
前記第１の核酸部分が、７〜２０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜１８ヌクレオチド長、より好ましくは１８ヌクレオチド長未満である、請求項１〜１９のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項２１】
前記第２の核酸部分が、７〜２０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜１８ヌクレオチド長、より好ましくは１８ヌクレオチド長未満である、請求項１〜２０のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項２２】
前記第３の核酸部分が、１〜１０ヌクレオチド長、例えば４〜９ヌクレオチド長、例えば４、５、７、又は９ヌクレオチド長である、請求項１〜２１のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項２３】
１又はそれ以上のホスホロチオエート又はホスホロジチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項１〜２２のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項２４】
１〜１５個のホスホロチオエート又はホスホロジチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項２５】
前記第１及び／又は第２の核酸部分の前記５’及び／又は３’領域のうちの１又はそれ以上において１又はそれ以上のホスホロチオエート又はホスホロジチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２３又は２４のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項２６】
前記第３の核酸部分に存在するヌクレオチドの数に応じて、前記第３の核酸部分の、少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、好ましくは少なくとも６個、好ましくは少なくとも７個、好ましくは少なくとも８個、好ましくは少なくとも９個、好ましくは１０個の隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート又はホスホロジチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２３〜２５のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項２７】
前記第３の核酸部分に存在する各隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート又はホスホロジチオエートヌクレオチド間結合を含む、請求項２３〜２６のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項２８】
前記第１の核酸部分を前記第３の核酸部分に、及び／又は前記第２の核酸部分を前記第３の核酸部分に連結させるホスホロチオエート又はホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合を含む、請求項１〜２７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項２９】
前記第１及び／又は第２及び／又は第３の核酸部分のうちの少なくとも１つのヌクレオチドが修飾される、請求項１〜２８のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項３０】
前記第１の核酸部分の前記５’領域から始まる奇数のヌクレオチドのうちの１又はそれ以上が修飾され、及び／又は前記第１の核酸部分の前記５’領域から始まる偶数のヌクレオチドのうちの１又はそれ以上が修飾され、典型的には、前記偶数のヌクレオチドの前記修飾が、前記奇数のヌクレオチドの前記修飾とは異なる第２の修飾である、請求項２９に記載のコンジュゲート。
【請求項３１】
前記第２の核酸部分の前記３’領域から始まる前記奇数のヌクレオチドのうちの１又はそれ以上が、請求項３０に記載の前記第１の核酸部分の奇数のヌクレオチドの前記修飾とは異なる修飾によって修飾される、請求項２９又は３０に記載のコンジュゲート。
【請求項３２】
前記第２の核酸部分の前記３’領域から始まる前記偶数のヌクレオチドのうちの１又はそれ以上が、請求項３１に記載の前記第２の核酸部分の奇数のヌクレオチドの前記修飾とは異なる修飾によって修飾される、請求項２９〜３１のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項３３】
前記第１の核酸部分の前記修飾された偶数ヌクレオチドのうちの少なくとも１又はそれ以上が、前記第１の核酸部分の前記異なって修飾された奇数ヌクレオチドのうちの少なくとも１又はそれ以上に隣接している、請求項２９〜３２のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項３４】
前記第２の核酸部分の前記修飾された偶数ヌクレオチドのうちの少なくとも１又はそれ以上が、前記第２の核酸部分の前記異なって修飾された奇数のヌクレオチドのうちの少なくとも１又はそれ以上に隣接している、請求項２９〜３３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項３５】
前記第１の核酸部分の複数の隣接ヌクレオチドが、共通の修飾によって修飾される、請求項２９〜３４のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項３６】
前記第２の核酸部分の複数の隣接ヌクレオチドが、共通の修飾によって修飾される、請求項２９〜３５のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項３７】
前記複数の隣接一般的に修飾されたヌクレオチドが、２〜４個の隣接するヌクレオチド、好ましくは３又は４個の隣接するヌクレオチドである、請求項３５又は３６に記載のコンジュゲート。
【請求項３８】
前記複数の隣接一般的に修飾されたヌクレオチドが、前記第２の核酸部分の前記５’領域に位置する、請求項３７に記載のコンジュゲート。
【請求項３９】
前記複数の隣接一般的に修飾されたヌクレオチドが、第３の核酸領域に位置する、請求項３７又は３８に記載のコンジュゲート。
【請求項４０】
前記第１及び／又は第２の核酸部分の複数の奇数のヌクレオチドが、修飾される、請求項２９〜３９のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項４１】
前記第１及び／又は第２の核酸部分の複数の偶数のヌクレオチドが、第２の修飾によって修飾される、請求項２９〜４０のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項４２】
前記複数の奇数のヌクレオチドが、共通の修飾によって修飾される、請求項４０又は４１に記載のコンジュゲート。
【請求項４３】
前記複数の偶数のヌクレオチドが、共通の第２の修飾によって修飾される、請求項４１又は４２に記載のコンジュゲート。
【請求項４４】
前記第１の核酸部分の前記１又はそれ以上の前記修飾されたヌクレオチドが、前記二本鎖の前記第２の核酸部分の対応するヌクレオチドに存在する共通の修飾を有さない、請求項２９〜４３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項４５】
前記第１の核酸部分の前記１又はそれ以上の前記修飾されたヌクレオチドが、前記二本鎖の前記第２の核酸部分の対応するヌクレオチドに存在する共通の修飾を有する、請求項２９〜４３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項４６】
前記第１の核酸部分の前記１又はそれ以上の前記修飾されたヌクレオチドが、前記第２の核酸部分の一般的に修飾されたヌクレオチドに対して少なくとも１つのヌクレオチドによってシフトされる、請求項２９〜４５のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項４７】
前記修飾及び／若しくは複数の修飾が、各々かつ個々に糖、骨格又は塩基修飾であり、３’末端デオキシチミン、２’−０−メチル、２’−デオキシ修飾、２’−アミノ修飾、２’−アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホロアミデート修飾、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート基修飾、５’リン酸若しくは５’リン酸模倣修飾（ｍｉｍｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、並びにコレステリル誘導体若しくはドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群から好適に選択される、請求項２９〜４６のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項４８】
前記修飾が、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、又はヌクレオチドを含む非天然塩基のうちのいずれか１つである、請求項２９〜４７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項４９】
少なくとも１つの修飾が、リボース部分中の２’−Ｏ−メチル修飾である、請求項２９〜４８のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５０】
少なくとも１つの修飾が、リボース部分中の２’−Ｆ修飾である、請求項２９〜４９のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５１】
前記第１の核酸部分の前記５’領域の前記第１のヌクレオチドから２位及び１４位下流のうちのいずれかで、前記ヌクレオチドが、リボース部分に２’−Ｏ−メチル修飾を含有しない、請求項２９〜５０のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５２】
前記第１の核酸部分の前記５’領域の前記第１のヌクレオチドから９〜１１位下流のうちのいずれかで前記第１の核酸部分の前記ヌクレオチドのいずれかに位置が対応する、前記第２の核酸部分の前記ヌクレオチドが、リボース部分に２’−Ｏ−メチル修飾を含有しない、請求項２９〜５１のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５３】
前記第１の核酸部分の前記５’領域の前記第１のヌクレオチドから２位及び１４位下流のうちのいずれかで、前記ヌクレオチドが、リボース部分中に２’−Ｆ修飾を含有する、請求項５１又は５２に記載のコンジュゲート。
【請求項５４】
前記第１の核酸部分の前記５’領域の前記第１のヌクレオチドから９〜１１位下流のうちのいずれかで、前記第１の核酸部分の前記ヌクレオチドのいずれかに位置が対応する、前記第２の核酸部分の前記ヌクレオチドが、リボース部分中に２’−Ｆ修飾を含有する、請求項５１〜５３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５５】
１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチドを含む、請求項１〜５４のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５６】
前記１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチドが、請求項２９〜５５のいずれかに定義されるいかなる修飾ヌクレオチドを置き換えることができる、請求項５５に記載のコンジュゲート。
【請求項５７】
前記１又はそれ以上、好ましくは１つの非修飾ヌクレオチドが、前記第１の核酸部分の前記５’領域の前記第１のヌクレオチドから、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４及び／又は２５位下流のうちのいずれか、好ましくは１８、１９、２０位、及び／又は２１位下流のうちのいずれかでの前記ヌクレオチドのいずれかを表す、請求項５６に記載のコンジュゲート。
【請求項５８】
前記非修飾ヌクレオチド以外のすべてのヌクレオチド、並びに／又は前記第１の核酸部分の前記５’領域の前記第１のヌクレオチドから２位及び１４位下流のうちのいずれかでの前記ヌクレオチド、並びに／又は前記第１の核酸部分の前記５’領域の前記第１のヌクレオチドから９〜１１位下流のうちのいずれかで前記第１の核酸部分の前記ヌクレオチドのいずれかに位置が対応する、前記第２の核酸部分の前記ヌクレオチドが、リボース部分に２’−Ｏ−メチル修飾を含有する、請求項５１〜５７のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項５９】
前記核酸が、少なくとも１つのビニルホスホネート修飾、例えば、前記第１の核酸部分の前記５’領域における少なくとも１つのビニルホスホネート修飾を含む、請求項１〜５８のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項６０】
前記第１の核酸部分及び前記第２の核酸部分のうちの少なくとも１つの１又はそれ以上のヌクレオチドが、逆位ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であり、前記ヌクレオチドの前記３’炭素及び前記隣接ヌクレオチドの前記３’炭素を介して前記隣接ヌクレオチドに結合される、並びに／又は前記第１の核酸部分及び前記第２の核酸部分のうちの少なくとも１つの１又はそれ以上のヌクレオチドが、逆位ヌクレオチドであり、前記ヌクレオチドの前記５’炭素及び前記隣接ヌクレオチドの前記５’炭素を介して前記隣接ヌクレオチドに結合される、請求項１〜５９のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項６１】
前記第１の核酸部分及び前記第２の核酸部分のうちの少なくとも１つの前記３’領域にある１又はそれ以上のヌクレオチドが逆位ヌクレオチドであり、前記末端ヌクレオチドの前記３’炭素及び前記隣接ヌクレオチドの前記３’炭素を介して前記隣接ヌクレオチドに結合される、並びに／又は前記第１の核酸部分及び前記第２の核酸部分のうちの少なくとも１つの前記５’領域にある１又はそれ以上のヌクレオチドが逆位ヌクレオチドであり、前記末端ヌクレオチドの前記５’炭素及び前記隣接ヌクレオチドの前記５’炭素を介して前記隣接ヌクレオチドに結合される、並びに／又は前記第１の核酸部分及び前記第２の核酸部分のうちの少なくとも１つの前記３’及び５’領域の中間にある１又はそれ以上のヌクレオチドが逆位ヌクレオチドであり、前記末端ヌクレオチドの前記３’炭素及び前記隣接ヌクレオチドの前記３’炭素を介して前記隣接ヌクレオチドに結合される、並びに／又は第１の核酸部分及び第２の核酸部分のうちの少なくとも１つの前記３’及び５’領域の中間にある１又はそれ以上のヌクレオチドが逆位ヌクレオチドであり、前記末端ヌクレオチドの前記５’炭素及び前記隣接ヌクレオチドの前記５’炭素を介して前記隣接ヌクレオチドに結合される、並びに／又は前記第３の核酸部分の少なくとも１つの１又はそれ以上のヌクレオチドが逆位ヌクレオチドであり、前記末端ヌクレオチドの前記３’炭素及び前記隣接ヌクレオチドの前記３’炭素を介して前記隣接ヌクレオチドに結合される、並びに／又は前記第３の核酸部分の少なくとも１つの１又はそれ以上のヌクレオチドが逆位ヌクレオチドであり、前記末端ヌクレオチドの前記５’炭素及び前記隣接ヌクレオチドの前記５’炭素を介して前記隣接ヌクレオチドに結合される、請求項６０に記載のコンジュゲート。
【請求項６２】
前記逆位ヌクレオチドが、ホスホジエステル結合によってリン酸基を介して前記隣接ヌクレオチドに結合されるか、又は前記第１及び／若しくは第２の鎖の前記３’及び／若しくは５’逆位ヌクレオチドが、ホスホロチオエート基を介して前記隣接ヌクレオチドに結合されるか、又は前記第１及び／若しくは第２の鎖の前記３’及び／若しくは５’逆位ヌクレオチドが、ホスホロジチオエート基を介して前記隣接ヌクレオチドに結合される、請求項６０又は６１に記載のコンジュゲート。
【請求項６３】
平滑末端である、請求項１〜６２のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項６４】
前記第１又は第２の核酸部分のいずれかが、オーバーハングを有する、請求項１〜６３のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項６５】
請求項１で定義される２つの核酸分子を含むホモ二量体ＲＮＡ分子であり、前記核酸分子が相補的相互作用を介して一緒に結合され、前記第１の分子の前記第１の部分が、前記第２の分子の前記第２の部分と相互作用し、前記それぞれの核酸分子の前記第１及び第２の部分のバルジ構造中間体を生成する各分子内に、第３の部分が存在する、請求項１〜６４のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項６６】
前記標的ＲＮＡが、ｍＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、及び／又は他のＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つから選択される、請求項１〜６５のいずれかに記載のコンジュゲート。
【請求項６７】
請求項１〜６６のいずれかに記載のコンジュゲート、及び生理学的に許容される賦形剤を含む組成物。
【請求項６８】
疾患又は障害の治療に使用するための、請求項１〜６６のいずれかに記載のコンジュゲート又は分子。
【請求項６９】
疾患又は障害を治療するための薬剤の製造における、請求項１〜６６のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。
【請求項７０】
請求項１〜６６のいずれかに記載のコンジュゲートの、治療を必要とする個体への投与を含む、疾患又は障害の治療方法。
【請求項７１】
前記コンジュゲートが、前記個体に皮下又は静脈内に投与される、請求項７０に記載の方法。
【請求項７２】
化粧品としての使用のための、請求項１〜６６のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。
【請求項７３】
遺伝子機能分析ツールとしての研究での使用のための、請求項１〜６６のいずれかに記載のコンジュゲートの使用。
【請求項７４】
請求項１〜６６のいずれかに記載のコンジュゲートを作製するプロセス。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、化学的に合成され、動物細胞内の遺伝子発現を調節して、実験室で様々な遺伝子機能を研究するため、又は農学、獣医学、化粧品及び／又は治療用途の有効成分として用いうる新規のＲＮＡｉトリガーに関する。
【背景技術】
【０００２】
ＲＮＡ干渉又はＲＮＡｉは、動物における個々の遺伝子を特異的に下方制御する二本鎖ＲＮＡ分子の能力を特徴とする生物学的現象である。１９９８年にＣｒａｉｇ  ＭｅｌｌｏとＡｎｄｒｅｗ  Ｆｉｒｅによって発見され、新しいタイプの治療薬を提供することが期待されたため、２００６年のノーベル生理学又は医学賞を受賞した。化学的に合成されたＲＮＡｉトリガー（低分子干渉ＲＮＡ又はｓｉＲＮＡ）が哺乳動物細胞培養において機能することが示された２００１年以降、ｓｉＲＮＡは、世界中の研究所で様々な遺伝子機能を研究するために広く使用されてきた。最初のＲＮＡｉ薬物Ｏｎｐａｔｔｒｏ（商標）は、遺伝性ＡＴＴＲアミロイドーシスの患者を支援するために２０１８年８月にＦＤＡによって承認された。現在、多くの他のＲＮＡｉ薬物が開発され、臨床前及び臨床試験において試験されている。
【０００３】
ＲＮＡｉは、主要な新薬モダリティの１つになることを約束されているが、それに関連する特定の課題がある。その１つは、活性成分の生産コストが高いことである。従来のＲＮＡｉトリガー−低分子干渉ＲＮＡ（又はｓｉＲＮＡ）は、互いにアニールされた２つの１９〜２５ｎｔ長のオリゴヌクレオチド（合計約４０〜５０ヌクレオチド）から構成される。かかる分子の産生には、洗練された多段階合成が必要であり、場合によっては、広範な精製手順が続き、比較的高い産生コストをもたらす。最初のＲＮＡｉ薬品Ｏｎｐａｔｔｒｏ（商標）は、１回の治療につき年間４５０，０００ドルで提供され、そのような高い価格の要因の１つは、薬品の生産コストである可能性が高い。
【発明の概要】
【０００４】
本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を説明する目的のみであり、本発明を限定することを意図するものではない。本明細書で用いられる用語「及び／又は」は、関連するアイテムのうちの１又はそれ以上のいかなる及びすべての組み合わせを含む。本明細書で用いられる単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」（原文）は、文脈が別途明確に示さない限り、複数形並びに単数形を含むことが意図される。本明細書で用いられる用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」及び／又は「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、記載された特徴、工程、操作、要素、及び／又は構成要素の存在を特定するが、１又はそれ以上の他の特徴、工程、操作、要素、構成要素、及び／又はそれらの群の存在又は追加を排除しないことがさらに理解されるであろう。
【０００５】
別途定義されない限り、本明細書で用いられるすべての用語（技術用語及び科学用語を含む）の意味は、本発明が属する当業者に一般的に理解される意味と同じである。一般的に用いられる辞書で定義されるような用語は、関連技術及び本開示の文脈においてそれらの意味と一致する意味を有すると解釈されるべきであり、本明細書で明示的に定義されない限り、理想化された意味又は過度に形式的な意味で解釈されないことがさらに理解されるであろう。
【０００６】
本発明を説明する際、いくつかの特徴、工程、操作、要素、及び／又は構成要素が開示されることが理解されるであろう。これらの各々は、個々の利益を有し、各々はまた、他の開示された特徴、工程、操作、要素、及び／又は構成要素の１又はそれ以上、又は一部の場合にはすべてと併せて用いうる。したがって、明確化のために、本明細書は、個々の特徴、工程、操作、要素、及び／又は構成要素のすべての可能な組み合わせを不必要な方法で繰り返すことを避ける。それにもかかわらず、そのような組み合わせが完全に本発明の範囲内であることを理解して、本明細書を読むべきである。
【０００７】
新たな小型化ヘアピンＲＮＡｉトリガー（ｍｘＲＮＡ）及びその使用方法を、本明細書で考察する。以下の説明では、説明の目的のため、本発明の完全な理解を提供するために多数の具体的な詳細が記載される。しかしながら、特定の詳細なしに本発明を実施することができることは当業者に明らかであろう。
【０００８】
本開示は、本発明の例示と見なされるべきであり、本発明を図によって例示されるか、又は以下に記載される特定の実施形態に限定することを意図するものではない。
【０００９】
ここで、特定の実施形態を表す添付の図面を参照することによって、本発明を説明する。以下の構成要素を含む小型化ヘアピンＲＮＡｉトリガー分子（ｍｘＲＮＡ）を紹介する：
１）ヘアピンステムの５’セグメント（セグメントＡ）、
２）ヘアピンループ（セグメントＢ）、
３）ヘアピンステムの３’セグメント（セグメントＣ）、
ここで、
１）（Ａ）＋（Ｂ）＋（Ｃ）の全長は１７〜４０ヌクレオチドであり、
２）（Ｂ）は０〜１０ヌクレオチドであり、
３）（Ａ）は、（Ｂ）よりも０〜４ヌクレオチド長い、又は０〜４ヌクレオチド短い
４）分子の５’末端からの１７個以上のヌクレオチドは、標的ＲＮＡ、例えば、ｍＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、及び／又は他のＲＮＡ分子に相補的であり、
また（場合によっては）、
一本鎖領域若しくは二本鎖領域のいずれかの、又はその両方の内部ヌクレオチドを、例えば２’ＯＭｅ、２’Ｆ、ＬＮＡ、ＰＭＯ、ホスホロチオエート（ＰＳ、ＰＳ２）、又は他の化学修飾によって、分子の糖及び／又は塩基及び／又はホスホジエステル部分において化学修飾して、分子の所望の特性を改善し（例えば細胞内ヌクレアーゼ及び／又は細胞外ヌクレアーゼに対する安定性を高めるために）、
分子の末端を、例えばビニルホスホネート、逆位ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、又は他の修飾でキャップするか、又は化学修飾して、分子の所望の特性を改善し（例えば、細胞内ヌクレアーゼ及び／又は細胞外ヌクレアーゼに対する安定性を高めるために）、
ｍｘＲＮＡ分子を、様々な送達部分、例えば、コレステロール、炭水化物（ＧａｌＮＡｃ、その他）、アプタマー、ペプチド、低分子、及び／又はその他にコンジュゲートして、分子の細胞外送達及び細胞内送達に向けさせ及び促進する。
【００１０】
本発明によれば、細胞内の標的遺伝子の発現を調節するための、好ましくは阻害するためのコンジュゲートも提供され、該コンジュゲートは、１又はそれ以上のリガンドに結合した核酸を含み、該核酸が、好ましくはダイサーの基質ではなく、
【００１１】
第１、第２及び第３の核酸部分を含み、
【００１２】
該第１の部分（ｉ）は、該標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部分に少なくとも部分的に相補的であり、かつ（ｉｉ）５’から３’の方向性を有し、それによって該第１の部分の５’及び３’領域を画定し、
【００１３】
該第２の部分（ｉ）は、該第１の部分に少なくとも部分的に相補的であり、かつ（ｉｉ）５’から３’の方向性を有し、それによって該第２の部分の５’及び３’領域を画定し、
【００１４】
該第１及び第２の部分が二量体化して、少なくとも部分的に相補的な二本鎖を形成し、
【００１５】
第３の核酸部分が、該第１の部分の３’領域を該第２の部分の５’領域に連結する。
【００１６】
本発明によるコンジュゲートは、該標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部分に対して少なくとも部分的に相補的な第３の核酸部分を含む。さらに、本発明によるコンジュゲートは、該標的遺伝子から転写されたＲＮＡの少なくとも一部分に対して少なくとも部分的に相補的な第２の核酸部分を含むことができる。
【００１７】
好ましくは、本発明によるコンジュゲートは、第２の核酸部分にコンジュゲートされる１又はそれ以上のリガンドを含む。好適には、１又はそれ以上のリガンドは、第２の核酸部分の３’領域にコンジュゲートされる。あるいは、１又はそれ以上のリガンドは、第１の核酸部分の３’領域及び／又は第２の核酸部分の５’領域にコンジュゲートされる。なおさらなる代替案は、１又はそれ以上のリガンドが、第１の核酸部分の５’及び３’領域の中間にある１又はそれ以上の領域にコンジュゲートされ、及び／又は第２の核酸部分の５’及び３’領域の中間にある１又はそれ以上の領域にコンジュゲートされることである。なおさらなる代替として、１又はそれ以上のリガンドは、第３の核酸部分の１又はそれ以上の領域にコンジュゲートされる。
【００１８】
典型的には、１又はそれ以上のリガンドは、細胞膜又は細胞表面上の特定の標的に結合する脂質、炭水化物、アプタマー、ビタミン及び／又はペプチドなどのいかなる細胞指向部分（ｃｅｌｌ  ｄｉｒｅｃｔｉｎｇ  ｍｏｉｅｔｙ）である。好ましい実施形態では、１又はそれ以上のリガンドは、１又はそれ以上の炭水化物、例えば、単糖、二糖、三糖、四糖、オリゴ糖、又は多糖を含む。さらにより好ましくは、１又はそれ以上の炭水化物は、１又はそれ以上のガラクトース部分、１又はそれ以上のラクトース部分、１又はそれ以上のＮ−アセチル−ガラクトサミン部分、及び／又は１又はそれ以上のマンノース部分、例えば、１又はそれ以上のＮ−アセチル−ガラクトサミン部分、好ましくは２つ又は３つのＮ−アセチル−ガラクトサミン部分を含む。
【００１９】
１又はそれ以上のリガンドが、例えば、二分岐若しくは三分岐構成として、又は異なる位置での単一リガンドに基づく構成として核酸に結合するように、直線構成で、又は分岐構成で核酸に結合することができる。
【００２０】
本発明によるコンジュゲートは、二量体化してそれにより、第１及び第２の部分が少なくとも部分的に相補的な二本鎖を形成する一本鎖である核酸を含む。典型的には、核酸は、１７〜４０ヌクレオチド長、好ましくは少なくとも２０ヌクレオチド長、又はより好ましくは少なくとも２５ヌクレオチド長である。
【００２１】
本発明によるコンジュゲートにおいて、第１の核酸部分は、７〜２０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜１８ヌクレオチド長、より好ましくは１８ヌクレオチド長未満である。同様に、本発明によるコンジュゲートにおいて、第２の核酸部分は、７〜２０ヌクレオチド長、好ましくは１０〜１８ヌクレオチド長、より好ましくは１８ヌクレオチド長未満である。さらに、本発明によるコンジュゲートにおいて、第３の核酸部分は、１〜１０ヌクレオチド長、例えば、４〜９ヌクレオチド長、例えば、４、５、７、又は９ヌクレオチド長であることが好ましい。
【００２２】
本発明によるコンジュゲートは、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエートヌクレオチド間結合、例えば、１〜１５個のホスホロチオエート又はホスホロジチオエートヌクレオチド間結合をさらに含む。典型的には、第１及び／又は第２の核酸部分の５’及び／又は３’領域のうちの１又はそれ以上でのホスホロチオエート又はホスホロジチオエートヌクレオチド間結合。好ましい実施形態では、本発明によるコンジュゲートは、
【００２３】
第３の核酸部分に存在するヌクレオチドの数に応じて、第３の核酸部分の少なくとも２個、好ましくは少なくとも３個、好ましくは少なくとも４個、好ましくは少なくとも５個、好ましくは少なくとも６個、好ましくは少なくとも７個、好ましくは少なくとも８個、好ましくは少なくとも９個、好ましくは１０個の隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート又はホスホロジチオエートヌクレオチド間結合を含む。さらに、本発明によるコンジュゲートは、第３の核酸部分に存在する各隣接ヌクレオチド間のホスホロチオエート又はホスホロジチオエートヌクレオチド間結合を含むことができる。さらに、本発明によるコンジュゲートは、第１の核酸部分を第３の核酸部分に、及び／又は第２の核酸部分を第３の核酸部分に連結させるホスホロチオエート又はホスホロジチオエートのヌクレオチド間結合を含むことができる。
【００２４】
本発明による本発明によるコンジュゲートは、修飾された、第１及び／又は第２及び／又は第３の核酸部分の少なくとも１つのヌクレオチドをさらに含む。例えば、本発明によるコンジュゲートにおいて、第１の核酸部分の５’領域から始まる奇数のヌクレオチドのうちの１又はそれ以上が修飾され、及び／又は第１の核酸部分の５’領域から始まる偶数のヌクレオチドのうちの１又はそれ以上が修飾され、典型的には偶数のヌクレオチドの修飾は、奇数のヌクレオチドの修飾とは異なる第２の修飾である。典型的には、第２の核酸部分の３’領域から始まる奇数のヌクレオチドのうちの１又はそれ以上が、第１の核酸部分の奇数のヌクレオチドの修飾とは異なる修飾によって修飾される。
【００２５】
修飾パターンのさらなる特徴は以下の通りであり得るが、疑義を避けるために、以下の記述は本明細書に記載される本発明の範囲を限定するものではない：
第２の核酸部分の３’領域から始まる偶数のヌクレオチドのうちの１又はそれ以上が、第２の核酸部分の奇数のヌクレオチドの修飾とは異なる修飾によって修飾される、並びに／又は
第１の核酸部分の修飾された偶数ヌクレオチドのうちの少なくとも１又はそれ以上が、第１の核酸部分の異なって修飾された奇数ヌクレオチドのうちの少なくとも１又はそれ以上に隣接している、並びに／又は
第２の核酸部分の修飾された偶数ヌクレオチドのうちの少なくとも１又はそれ以上が、第２の核酸部分の異なって修飾された奇数ヌクレオチドのうちの少なくとも１又はそれ以上に隣接している、並びに／又は
第１の核酸部分の複数の隣接ヌクレオチドが、共通の修飾によって修飾される、並びに／又は
第２の核酸部分の複数の隣接ヌクレオチドが、共通の修飾によって修飾される、並びに／又は
複数の隣接一般的に修飾されたヌクレオチドは、第３の核酸部分が該第１の部分の３’領域を該第２の部分の５’領域に連結するときに、典型的には複数の隣接一般的に修飾されたヌクレオチドが第２の核酸部分の５’領域に位置するように、２〜４個の隣接ヌクレオチド、好ましくは３又は４個の隣接ヌクレオチドである、並びに／又は
複数の隣接一般的に修飾されたヌクレオチドが、第３の核酸領域に位置する、並びに又は
第１及び／又は第２の核酸部分の複数の奇数のヌクレオチドが、典型的には、複数の奇数のヌクレオチドが共通の修飾によって修飾されるように、修飾される、並びに／又は
第１及び／又は第２の核酸部分の複数の偶数ヌクレオチドが、典型的には、複数の偶数ヌクレオチドが共通の第２の修飾によって修飾されるように、第２の修飾によって修飾される、並びに／又は
第１の核酸部分の１又はそれ以上の修飾されたヌクレオチドが、二本鎖の第２の核酸部分の対応するヌクレオチドに存在する共通の修飾を有さない、並びに／又は
第１の核酸部分の１又はそれ以上の修飾されたヌクレオチドが、第２の核酸部分の一般的に修飾されたヌクレオチドに対して少なくとも１つのヌクレオチドによってシフトされる。
【００２６】
典型的には、本発明によるコンジュゲートにおいて、修飾及び／若しくは複数の修飾は、各々、個々に糖、骨格又は塩基修飾であり、３’−末端デオキシチミン、２’−０−メチル、２’−デオキシ修飾、２’−アミノ修飾、２’−アルキル修飾、モルホリノ修飾、ホスホロアミデート修飾、ホスホロチオエート又はホスホロジチオエート基修飾、５’リン酸又は５’リン酸模倣修飾（ｍｉｍｉｃ  ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）、並びにコレステリル誘導体又はドデカン酸ビスデシルアミド基修飾からなる群から好適に選択される。
【００２７】
修飾は、ロックドヌクレオチド、脱塩基ヌクレオチド、又はヌクレオチドを含む非天然塩基のうちのいずれか１つであり得る。
【００２８】
好ましい実施形態では、少なくとも１つの修飾は、２’−０−メチルである。さらなる好ましい実施形態では、少なくとも１つの修飾は、２’−Ｆである。
【００２９】
さらなる好ましい実施形態では、第１の核酸部分の５’領域の第１のヌクレオチドから２位及び１４位下流のいずれかのヌクレオチドは、リボース部分に２’−Ｏ−メチル修飾を含有せず、及び／又は第１の核酸部分の５’領域の第１のヌクレオチドから９〜１１位下流のうちのいずれかで、第１の核酸部分のヌクレオチドのいずれかに位置が対応する、第２の核酸部分のヌクレオチドは、リボース部分に２’−Ｏ−メチル修飾を含有しない。
【００３０】
本発明によるコンジュゲートは、好ましくは、典型的には、前述のいかなる修飾されたヌクレオチドに置き換えることができる１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチドをさらに含む。かかる１又はそれ以上の非修飾ヌクレオチドは、第２の核酸部分の５’領域に位置することができ、及び／又は第２の核酸部分の近位の位置で第３の核酸部分に位置することができる。
【００３１】
好ましくは、１又はそれ以上、好ましくは１つの非修飾ヌクレオチドは、第２の核酸部分の５’領域のヌクレオチド（若しくは複数のヌクレオチド）、典型的には、第３の核酸部分に直接結合した第２の核酸部分のヌクレオチド、及び／又は第２の核酸部分の５’領域に近接する第３の核酸部分のヌクレオチド（若しくは複数のヌクレオチド）、典型的には、第２の核酸部分に直接結合した第３の核酸部分のヌクレオチドを表し、好ましくは、第１の核酸部分の５’領域の第１のヌクレオチドから１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、及び／若しくは２５位下流のうちのいずれか、好ましくは１８、１９、２０及び／若しくは２１位下流のうちのいずれかで、ヌクレオチドのいずれかを表す。
【００３２】
本発明によるコンジュゲートにおいて、典型的には、非修飾ヌクレオチド以外のすべてのヌクレオチド、並びに／又は第１の核酸部分の５’領域の第１のヌクレオチドから２位及び１４位下流のいずれかでのヌクレオチド、並びに／又は第１の核酸部分の５’領域の第１のヌクレオチドから９〜１１位下流のうちいずれかで第１の核酸部分のヌクレオチドのいずれかに位置が対応する、第２のヌクレオチド部分のヌクレオチドは、リボース部分に２’−Ｏ−メチル修飾を含有する。
【００３３】
好ましい実施形態では、第１の核酸部分の５’領域から始まる、第１の核酸領域のすべての奇数のヌクレオチドは、２’−０−メチル修飾され、第１の核酸部分の５’領域から始まる、第１の核酸領域のすべての偶数のヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾されている。
【００３４】
特定の実施形態では、第２の核酸部分の非修飾ヌクレオチド（若しくは複数ヌクレオチド）以外の、第２の核酸部分の３’領域から始まる、第２の核酸領域のすべての奇数のヌクレオチドは、２’−Ｆ修飾され、第２の核酸部分の３’領域から始まる、第２の核酸領域のすべての偶数のヌクレオチドは２’−０−メチル修飾されている。例えば、２〜４個の隣接ヌクレオチド、好ましくは３又は４個の隣接ヌクレオチドの、複数の隣接一般的に修飾されたヌクレオチドは、第２の核酸部分の非修飾ヌクレオチド（若しくは複数ヌクレオチド）の下流に位置し、第２の核酸部分の残りのヌクレオチドについては、第２の核酸部分の３’領域から始まる、第２の核酸領域のすべての奇数のヌクレオチドは、
【００３５】
２’−Ｆ修飾されており、第２の核酸部分の３’領域から始まる、第２の核酸領域のすべての偶数のヌクレオチドは、２’−０−メチル修飾されている。
【００３６】
本発明のさらなる実施形態では、本明細書に記載のコンジュゲートにおいて、第３の核酸部分のヌクレオチドは、第１の核酸部分の３’領域に隣接する２’−０−メチル修飾から始まる、交互に２’−０−メチル、２’−Ｆのパターンで修飾される。
【００３７】
本発明によるコンジュゲートは、少なくとも１つのビニルホスホネート修飾、例えば第１の核酸部分の５’領域に少なくとも１つのビニルホスホネート修飾、をさらに含むことができる。
【００３８】
本発明によるコンジュゲートでは、第１の核酸部分及び第２の核酸部分のうちの少なくとも１つの１又はそれ以上のヌクレオチドが、逆位ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ  ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）であり、ヌクレオチドの３’炭素及び隣接ヌクレオチドの３’炭素を介して隣接ヌクレオチドに結合され、並びに／又は第１の核酸部分及び第２の核酸部分のうちの少なくとも１つの１又はそれ以上のヌクレオチドが、逆位ヌクレオチドであり、ヌクレオチドの５’炭素及び隣接ヌクレオチドの５’炭素を介して隣接ヌクレオチドに結合される。
【００３９】
本発明によるコンジュゲートは、第１の核酸部分及び第２の核酸部分のうちの少なくとも１つの３’領域にある１又はそれ以上のヌクレオチドであって逆位ヌクレオチドであり、末端ヌクレオチドの３’炭素及び隣接ヌクレオチドの３’炭素を介して隣接ヌクレオチドに結合されるもの、並びに／又は第１の核酸部分及び第２の核酸部分の少なくとも１つの５’領域にある１又はそれ以上のヌクレオチドであって、逆位ヌクレオチドであり、末端ヌクレオチドの５’炭素及び隣接ヌクレオチドの５’炭素を介して隣接ヌクレオチドに結合されるもの、並びに／又は第１の核酸部分及び第２の核酸部分のうちの少なくとも１つの３’及び５’領域の中間にある１又はそれ以上のヌクレオチドであって、１又はそれ以上のヌクレオチドが逆位ヌクレオチドであり、末端ヌクレオチドの３’炭素及び隣接ヌクレオチドの３’炭素を介して隣接ヌクレオチドに結合されるもの、並びに／又は第１の核酸部分及び第２の核酸部分のうちの少なくとも１つの３’及び５’領域の中間にある１又はそれ以上のヌクレオチドであって、逆位ヌクレオチドであり、末端ヌクレオチドの５’炭素及び隣接ヌクレオチドの５’炭素を介して隣接ヌクレオチドに結合されるもの、並びに／又は第３の核酸部分の少なくとも１つの、１又はそれ以上のヌクレオチドであって、逆位ヌクレオチドであり、末端ヌクレオチドの３’炭素及び隣接ヌクレオチドの前記３’炭素を介して隣接ヌクレオチドに結合されるもの、並びに／又は第３の核酸部分の少なくとも１つの、１又はそれ以上のヌクレオチドであって、逆位ヌクレオチドであり、末端ヌクレオチドの５’炭素及び隣接ヌクレオチドの５’炭素を介して隣接ヌクレオチドに結合されるもの、をさらに含むことができる。典型的には、第１及び／若しくは第２の鎖の３’及び／若しくは５’逆位ヌクレオチドは、ホスホジエステル結合によってリン酸基を介して隣接ヌクレオチドに結合されるか、又は第１及び／若しくは第２の鎖の３’及び／若しくは５’逆位ヌクレオチドは、ホスホロチオエート基を介して隣接ヌクレオチドに結合されるか、又は第１及び／若しくは第２の鎖の３’及び／若しくは５’逆位ヌクレオチドは、ホスホロジチオエート基を介して隣接ヌクレオチドに結合される。
【００４０】
本発明に従うコンジュゲートは、一端で平滑末端にすることができる。あるいは、本発明によるコンジュゲートは、オーバーハングを有する第１又は第２の核酸部分を含むことができる。
【００４１】
本発明によれば、前述の２つの核酸分子を含むホモ二量体ＲＮＡ分子がさらに提供され、核酸分子は相補的相互作用を介して一緒に結合され、第１の分子の第１の部分が第２の分子の第２の部分と相互作用し、それぞれの核酸分子の第１及び第２の部分のバルジ構造中間体を生成する各分子内に第３の部分が存在する。
【００４２】
本明細書に記載のコンジュゲート又はホモ二量体ＲＮＡ分子及び／又はコンジュゲートは、ｍＲＮＡ、ＩｎｃＲＮＡ、及び／又は他のＲＮＡ分子のうちの少なくとも１つから選択される標的ＲＮＡを対象とする。
【００４３】
本発明はさらに、以下を含む：
本明細書に記載のコンジュゲート又は分子、及び生理学的に許容される賦形剤を含む組成物、
疾患又は障害の治療に使用するための、本明細書に記載のコンジュゲート又は分子、
疾患又は障害を治療するための薬剤の製造における本明細書に記載のコンジュゲート又は分子の使用、
治療を必要とする個体への、例えば、個体への皮下又は静脈内投与による、本明細書に記載のコンジュゲート又は分子の投与を含む、疾患又は障害の治療方法、
遺伝子機能分析ツールとしての研究での使用のための、本明細書に記載のコンジュゲート又は分子の使用、
本明細書に記載のコンジュゲートを作製するプロセス。
【００４４】
前述のコンジュゲートであって、そのコンジュゲートが、配列番号１４、１５、１６、１７、及び１８からなる群から選択される配列を含み、リンカー及び三価ＧａｌＮＡｃ部分が核酸部分の３’末端にある、コンジュゲートも、本発明によって提供される。配列番号１４、１５、１６、１７、及び１８の配列の各々について、これらは以下のように第１、第２、及び第３の核酸部分を含み、
該第１の部分は、各配列番号の先頭から始まり、（ｉ）該標的遺伝子から転写されたＲＮＡ（本事例では、ＭＡＰ４Ｋ４）の少なくとも一部分に少なくとも部分的に相補的であり、かつ（ｉｉ）５’から３’の方向性を有し、それによって該第１の部分の５’領域及び３’領域を画定し、
該第２の部分（ｉ）は、該第１の部分に少なくとも部分的に相補的であり、かつ（ｉｉ）５’から３’の方向性を有し、それによって該第２の部分の５’及び３’領域を画定し、
第３の核酸部分が、該第１の部分の３’領域を該第２の部分の５’領域に連結し、
及び配列中、
配列番号１４では：第１の部分は１４ヌクレオチドを含み、第２の部分は１４ヌクレオチドを含み、第３の部分は５ヌクレオチドを含み、
配列番号１５では：第１の部分は１４ヌクレオチドを含み、第２の部分は１４ヌクレオチドを含み、第３の部分は４ヌクレオチドを含み、
配列番号１６では：第１の部分は１２ヌクレオチドを含み、第２の部分は１２ヌクレオチドを含み、第３の部分は７ヌクレオチドを含み、
配列番号１７では：第１の部分は１３ヌクレオチドを含み、第２の部分は１３ヌクレオチドを含み、第３の部分は４ヌクレオチドを含み、
配列番号１８では：第１の部分は１０ヌクレオチドを含み、第２の部分は１０ヌクレオチドを含み、第３の部分は９ヌクレオチドを含む。
【００４５】
上記に記載される配列について、第１及び第２の部分は、二量体化されて前述の少なくとも部分的に相補的な二重鎖を形成する。
【００４６】
典型的には、このような配列は、その第３の核酸部分の各ヌクレオチド及び／又は第１の部分の５’領域から１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３位、２４位、及び／又は２５位の非修飾ヌクレオチドとの間のホスホロチオエート又はホスホロジチオエートヌクレオチド間結合を含む。
【図面の簡単な説明】
【００４７】
【図１】小型化ヘアピンＲＮＡｉトリガー（ｍｘＲＮＡ（商標））の概略図を示す。各例において、セグメントＡはヘアピンの二本鎖の５’部分を表し、セグメントＢはヘアピンの一本鎖ループを表し、セグメントＣはヘアピンの二本鎖の３’部分を表す。太線は、標的ＲＮＡ転写産物の対応する配列に相補的な配列を表す。
【００４８】
図１の例１は、可能な限り最小のｍｘＲＮＡのうちの１つの概略図を示し、ここで、セグメントＡは７ヌクレオチドであり、セグメントＢは４ヌクレオチドであり、セグメントＣは７ヌクレオチドであり、１８ヌクレオチドすべてが標的ＲＮＡに相補的である。
【００４９】
図１の例２は、ｍｘＲＮＡの概略図を示し、セグメントＡは１４ヌクレオチドであり、セグメントＢは４ヌクレオチドであり、セグメントＣは１４ヌクレオチドであり（合計３２ヌクレオチド）、分子の５’末端から１８ｎｔは標的ＲＮＡに相補的であり（太線）、分子の５’末端の三角形は、ヌクレアーゼに対する耐性を増加させるためのキャップ、例えばビニルホスホネートなどの化学部分を表し、例えば、ＧａｌＮＡｃなどの三価化学部分（線と円）は、リンカー（波形線）を介して分子の３’末端にコンジュゲートされ、細胞、例えば、インビトロ及び／又はインビボでの肝細胞への分子の送達を容易にする。
【００５０】
図１の例３は、ｍｘＲＮＡの概略図を示し、セグメントＡは１８ヌクレオチドであり、セグメントＢは４ヌクレオチドであり、セグメントＣは１８ヌクレオチドであり（合計４０ヌクレオチド）、分子の５’末端からの最初の１８ヌクレオチドは標的ＲＮＡに相補的であり（太線）、分子全体がヌクレアーゼ安定性を増加させるために糖修飾、例えば、２’ＯＭｅ及び／又は２’Ｆで化学修飾され（図示せず）、分子の各末端の２ヌクレオチド及びループ内のヌクレオチドはヌクレアーゼ安定性を増加させるため、ホスホジエステル位置、例えば、ホスホロチオエート（星）で修飾され、送達コンジュゲート部分（例えば、ＧａｌＮＡｃ、コレステロール、他）が分子の一本鎖ループ領域に結合される。
【００５１】
図１は、上記のようなｍｘＲＮＡ分子の３つの例を図示する。例１のステムアンドループ（ｓｔｅｍ−ａｎｄ−ｌｏｏｐ）構成は、ｍｘＲＮＡ−１８ヌクレオチド長の最小バージョンのうちの１つを例示する。基本的に、分子の配列全体が標的ＲＮＡに相補的である。そのようなほぼ極端な場合、標的配列は、４ヌクレオチドによって分離された比較的長い（７ヌクレオチド）回文配列を有する必要があることが理解される。対照的に、例３は、最大（合計で４０ヌクレオチド）のｍｘＲＮＡステムアンドループ構成のうちの１つを有する分子を示す。このような構成は、従来のｓｈＲＮＡの構造に似ているが、ダイサー酵素によって細胞内で処理されて従来のｓｉＲＮＡ分子を生成しない可能性が高いという重要な違いがある（ダイサーが切断すると予想される場所の一本鎖領域のため、及び／又はエンドヌクレアーゼに対して分子を安定化するために用いられる可能性が高い化学修飾のため）。例２は、ｍｘＲＮＡステムアンドループ構成の中間（例１と例３に示された構成の間）バージョンを示す。かかる構成は標的配列に制約をもたらさないが、従来のｓｉＲＮＡ及びｓｈＲＮＡよりもはるかにコンパクトである。ステムアンドループ構成設計における多数の他の並べ替えが可能であることが理解される。
【００５２】
図１は、特に例２及び３で、特定の化学修飾及びコンジュゲーションを適用することができる場所も示す。特に、分子の内部骨格のいかなる（糖、塩基、及び／又はホスホジエステル結合の）ヌクレオチドは、分子の特性を改善するために（例えば、細胞内及び細胞外ヌクレアーゼに対する安定性を増加させるために）、様々な化学修飾で修飾され得る。さらに、分子の末端は、キャップ構造及び化学修飾によってさらに強化することができる。
様々な核酸及び非核酸部分を、ｍｘＲＮＡの様々な部分にコンジュゲートさせて、追加の特性（例えば、強化された及び／又は標的化された送達能力）を追加することもできる。
【図２】本出願の実施例セクション（以下）に記載の実験結果のグラフを提示する。
【図３】本出願の実施例セクション（以下）に記載の実験結果のグラフを提示する。
【図４】本出願の実施例セクション（以下）に記載の実験で用いられるｍｘＲＮＡ分子の二次（２Ｄ）構造を図示する。
【００５３】
ｍｘＲＮＡ分子は、従来のアプローチ及び／又は高度なアプローチを使用して化学的に合成することができ、研究室における様々な遺伝子機能を研究するための研究用ツールとして、並びに／又は農学、獣医学、化粧品、及び／又は治療用途の有効成分として用いうる。
本発明の態様は、以下の非限定的な実施例によって実証される。
【実施例】
【００５４】
実施例１：ＡＭＬ−１２細胞における単回投与トランスフェクション
ＭＡＰ４Ｋ４に対して向けられた従来の二本鎖ｓｉＲＮＡ構築物に対するｍｘＲＮＡの活性試験を実施した。Ｈｅｐ３Ｂ細胞を９６ウェルプレート中で、各ウェル当たり１５，０００個の細胞の密度でインキュベートした。この研究で試験した化合物は、５０ｎＭの最終濃度であった。ウェル当たり０．３ｐＬでＲＮＡｉＭａｘを使用してリバーストランスフェクションを行った。試験化合物に加えて、２つの対照（（ＴＴＲＰＣ）ＴＴＲ指向性ｓｉＲＮＡ及び（ＩＮＴＰＣ）ａｈａ−１指向性ｓｉＲＮＡ）も使用した（表３及び４）。インキュベーション時間は２４時間であった。その後、ｍＲＮＡを単離し、ｂＤＮＡアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ１．０／２．０）を使用して定量化した。読み出しをＧＡＰＤＨ転写物に正規化し、４連（ｑｕａｄｒｕｐｌｉｃａｔｅ）の複製の平均値を決定した。モック処理細胞からの値を１に設定した。
【００５５】
この実験から得られた結果の概要を表１及び図２に提示する。
【表１】
2021536236.tif 000003
【００５６】
実施例２：初代培養肝細胞におけるＧａｌＮＡｃコンジュゲート化合物の単回投与直接インキュベーション
初代培養マウス肝細胞（ロット番号ＭＣ８３０；Ｔｈｅｒｍｏ  Ｆｉｓｈｅｒ  Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を、ウェル当たり６０，０００細胞の密度で９６ウェルプレート内でインキュベートした。この研究で試験した化合物を、５００ｎＭの最終濃度で添加した。試験化合物に加えて、２つの対照（（ＸＤ−１２１７１）ＴＴＲ指向性ｓｉＲＮＡ及び（ＸＤ−０００３３）ａｈａ−１指向性ｓｉＲＮＡを陰性対照として）も使用した（表３及び４）。直接インキュベーショントランスフェクション（トランスフェクション脂質を含まない）法を使用した。インキュベーションの持続時間は７２時間であった。その後、ｍＲＮＡを単離し、ｂＤＮＡアッセイ（Ｑｕａｎｔｉｇｅｎｅ１．０／２．０）を使用して定量化した。読み出しをＧＡＰＤＨに正規化し、４連の複製の平均値を決定した。モック処理細胞からの値を１に設定した。
【００５７】
この実験から得られた結果の概要を表２及び図３に提示する。
【表２】
2021536236.tif 000004
【００５８】
実施例１及び２からの結果の概要
結果は、Ｌａｐｉｅｒｒｅ  ｅｔ  ａｌ，２０１１で以前に実証されたように、トランスフェクション試薬と共に使用され、コンジュゲート部分で遮断されない場合、単一オリゴ小型化ヘアピン構造（ｍｘＲＮＡ）が標的遺伝子ノックダウンを引き起こすことができることを確認する。
【００５９】
トランスフェクション試薬と共に使用する場合、かさ高い化学部分（この場合はＧａｌＮＡｃ）とコンジュゲートされたｍｘＲＮＡ分子が依然として標的遺伝子ノックダウンを引き起こすことができることを実証した。活性鎖の３’末端にコンジュゲートを添加すると、ｍｘＲＮＡの、ＲＮＡｉ機構によって認識される能力、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）に入る能力、及び／又はＲＩＳＣ内で活性を維持する能力に影響を与える可能性があるため、これは、新たなかつ非自明な所見である。
【００６０】
次に、ｍｘＲＮＡコンジュゲート（この場合ＧａｌＮＡｃとのコンジュゲート）は、受容体媒介性取り込みを介して細胞に入り、ｍＲＮＡの全く同じ部分を標的とする従来のｓｉＲＮＡ（例えば、従来のＣ１６、Ｃ１７構築物と比較するｍｘＲＮＡ  Ｃ２４、Ｃ２５、Ｃ２６構築物）よりも高い活性をもたらすことが実証された。これは新たな発見であり、特定の理論に束縛されることを望まないが、そのような改善は、従来のｓｉＲＮＡ（合計約４２ヌクレオチド）と比較した場合、ｍｘＲＮＡコンジュゲート分子のサイズが小さいためである可能性がある（合計約３２ヌクレオチド）。
【００６１】
最後に、結果は、ホスホジエステル結合修飾（例えば、ホスホロチオエート修飾）及び／又は糖修飾（例えば、２’ＯＨ位置）を含む多様な化学修飾パターンの使用が、ｍｘＲＮＡの性能をさらに改善することができることを示した。
【表３−１】
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【表３−２】
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【表４−１】
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【表４−２】
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【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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