(57)【要約】  本発明は、機能的なミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を提供し、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する。かかる細胞を産生するための方法、および原発性ミトコンドリア病の治療のためのそれらの使用がさらに開示される。【選択図】なし【特許請求の範囲】
【請求項１】
原発性ミトコンドリア病、障害、またはそれらの症状の治療を必要とするヒト患者において、かかる治療に使用するための医薬組成物であって、前記組成物が、細胞の生存能力を支援することができる薬学的に許容可能な液体培地中、前記患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５〜２×１０７個のヒト幹細胞を含み、前記ヒト幹細胞は、ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がない凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化され、前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、前記ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する、医薬組成物。
【請求項２】
前記富化が、百万個の細胞あたり少なくとも０．０８８〜最大１７６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を前記幹細胞に導入することを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
【請求項３】
前記富化が、百万個の細胞あたり０．８８〜最大１７．６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量と前記幹細胞を接触させることを含む、請求項２に記載の医薬組成物。
【請求項４】
前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアが、同系または同種異系である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項５】
前記ヒト幹細胞が、ＣＤ３４＋である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項６】
前記原発性ミトコンドリア病または障害が、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異に関連している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項７】
ミトコンドリアＤＮＡの突然変異に関連している前記原発性ミトコンドリア病または障害が、ピアソン症候群；カーンズ・セイヤー症候群；ミトコンドリア脳症乳酸アシドーシスおよび脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）症候群；レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；ニューロパチー、運動失調、および色素性網膜炎（ＮＡＲＰ）症候群；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）症候群；母性遺伝性糖尿病および難聴（ＭＩＤＤ）；アルパース様症候群；慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）；ミトコンドリアＤＮＡ関連型の先天性乳酸アシドーシス（ＣＬＡ）；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群（ＭＤＤＳ）；ならびにミトコンドリアＤＮＡ関連型のリー症候群からなる群から選択される、請求項６に記載の医薬組成物。
【請求項８】
前記原発性ミトコンドリア病または障害が、核ＤＮＡの突然変異に関連している、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項９】
核ＤＮＡの突然変異に関連している前記原発性ミトコンドリア病または障害が、ミトコンドリア神経胃腸脳症（ＭＮＧＩＥ）症候群；アルパース症候群；フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）；進行性外眼筋麻痺（ＰＥＯ）；鉄芽球性貧血；運動失調ニューロパチー症候群（ＡＮＳ）；メンデルの神経変性ミトコンドリア病（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｐａｔｈｙ）；３−メチルグルタコン酸尿症（ＭＥＧ）難聴（Ｄ）、脳症（Ｅ）およびリー様病（Ｌ）症候群（ＭＥＧＤＥＬ）；ゼンガー症候群（Ｓｅｎｇｅｒｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；微小変化群ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）；核ＤＮＡ関連型の先天性乳酸アシドーシス（ＣＬＡ）；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群（ＭＤＤＳ）および核ＤＮＡ関連型のリー症候群からなる群から選択される、請求項８に記載の医薬組成物。
【請求項１０】
前記原発性ミトコンドリア病または障害が、腎臓、肝臓、脳、筋肉、膵臓、眼、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される器官に関連している、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１１】
前記症状が、歩行能力障害、運動技能障害、言語技能障害、記憶障害、体重増加障害、発育不良、低血中アルカリホスファターゼレベル、低血中マグネシウムレベル、高血中クレアチニンレベル、低血中重炭酸塩レベル、低血中塩基過剰レベル、高尿中グルコース／クレアチニン比、高尿中塩化物／クレアチニン比、高尿中ナトリウム／クレアチニン比、高血中乳酸レベル、高尿マグネシウム／クレアチニン比、高尿中カリウム／クレアチニン比、高尿中カルシウム／クレアチニン比、糖尿、マグネシウム尿、高血中尿素レベル、低Ｃ−ペプチドレベル、高ＨｂＡ１Ｃレベル、副甲状腺機能低下症、眼瞼下垂、聴力損失、心伝導障害、てんかん発作、脳卒中様発作、ＥＥＧ障害、高血中アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＡＳＴ）レベル、高血中アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）レベル、低ＡＴＰ含有量、およびリンパ球における酸素消費量からなる群から選択される、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。     
【請求項１２】
前記医薬組成物が特定の組織または器官に投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１３】
前記医薬組成物が、全身投与によって投与される、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１４】
前記患者の体重１キログラムあたり約１０６個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む、請求項１３に記載の医薬組成物。
【請求項１５】
合計約５×１０５〜５×１０９個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１６】
前記ミトコンドリア富化ヒト幹細胞が、ミトコンドリア富化前の前記幹細胞における対応するレベルと比較して、
（ｉ）増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、
（ｉｉ）増加したＣＳ活性レベル、
（ｉｉｉ）増加したＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択された少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の含有量、
（ｉｖ）増加したＯ２消費率、
（ｖ）増加したＡＴＰ産生率、または
（ｖｉ）それらの任意の組み合わせ
のうちの少なくとも１つを有する、請求項１〜１５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１７】
前記ヒト幹細胞が、前記外因性ミトコンドリアで富化される前の前記患者から得られるかまたは由来する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１８】
前記ヒト幹細胞が、前記外因性ミトコンドリアで富化される前の前記患者とは異なるドナーから得られるかまたは由来する、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項１９】
前記ドナーが、少なくとも部分的に前記患者とＨＬＡ適合する、請求項１８に記載の医薬組成物。
【請求項２０】
前記ヒト幹細胞が、造血幹細胞である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２１】
前記ヒト幹細胞が、間葉系幹細胞である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２２】
前記ヒト幹細胞が、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２３】
前記ヒト幹細胞が、前記凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを前記ヒト幹細胞に導入する前に、少なくとも１回の凍結−解凍サイクルを受けている、請求項２〜２２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２４】
前記ヒト幹細胞が、骨髄、脂肪組織、口腔粘膜、皮膚線維芽細胞、血液、または臍帯血の細胞から単離されるか、由来するか、または得られる、請求項１〜２３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２５】
前記健康な機能的外因性ミトコンドリアが、胎盤、培養で成長させた胎盤細胞、または血液細胞から単離されるかまたは得られる、請求項１〜２４のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２６】
前記ヒト幹細胞が、前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアでの富化後に、少なくとも１回の凍結−解凍サイクルを受けている、請求項１〜２５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２７】
前記健康な機能的外因性ミトコンドリアが、全ミトコンドリアの５％〜３０％の間を構成する、請求項１〜２６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
【請求項２８】
前記健康な機能的外因性ミトコンドリアが、全ミトコンドリアの１０％〜３０％を構成する、請求項２７に記載の医薬組成物。
【請求項２９】
健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアでヒト幹細胞を富化するためのエクスビボ法であって、
（ｉ）ミトコンドリア病、障害、またはそれらの症状に罹患している患者からまたはドナーから単離されたまたは部分的に精製された複数のヒト幹細胞を含む、第１の組成物を提供するステップと、
（ｉｉ）ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がないドナーから得られた複数の単離された凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを含む、第２の組成物を提供するステップと、
（ｉｉｉ）前記第１の組成物の前記ヒト幹細胞を、前記第２の組成物の前記凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアと、１０６個の幹細胞あたり０．０８８〜１７６ｍＵのＣＳ活性の比率で接触させて、第３の組成物を提供するステップと、
（ｉｖ）前記凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアが前記ヒト幹細胞に入るのを可能にする条件下で前記第３の組成物をインキュベートし、それにより前記ヒト幹細胞を前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化し、よってミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む第４の組成物を提供するステップと、を含み、
前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアが、前記第４の組成物中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する、方法。
【請求項３０】
前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアが前記ヒト幹細胞に入るのを可能にする前記条件が、前記ヒト幹細胞を、前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアとともに、１６〜３７℃の範囲の温度で０．５〜３０時間の範囲の時間にわたってインキュベートすることを含む、請求項２９に記載の方法。
【請求項３１】
インキュベーションの前に、前記方法が、２５００×ｇを超える遠心力での前記ヒト幹細胞および前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアの単一遠心分離をさらに含む、請求項２９または請求項３０に記載の方法。
【請求項３２】
前記ヒト幹細胞が、ＣＤ３４＋である、請求項２９〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記ミトコンドリア富化ヒト幹細胞におけるミトコンドリア富化のレベルが、
（ｉ）同種異系ミトコンドリアの場合、内因性ミトコンドリアＤＮＡおよび外因性ミトコンドリアＤＮＡのレベル、
（ｉｉ）クエン酸シンターゼ活性のレベル、
（ｉｉｉ）コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラボタンパク質サブユニットＡ（ＳＤＨＡ）もしくはチトクロームＣオキシダーゼ（ＣＯＸ１）タンパク質のレベル、
（ｉｖ）酸素（Ｏ２）消費率、
（ｖ）ＡＴＰ産生率、または
（ｖｉ）それらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つによって決定される、請求項２９〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ミトコンドリア富化ヒト幹細胞を凍結することをさらに含み、任意選択で解凍することをさらに含む、請求項２９〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアでの富化の前または後に、前記幹細胞を拡大することをさらに含む、請求項２９〜３４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアが、前記ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する、請求項２９〜３５のいずれか一項に記載の方法によって得られる健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞を含む、組成物。
【請求項３７】
原発性ミトコンドリア病、障害、またはそれらの症状の治療を必要とする患者において、それらを治療する方法であって、前記患者に医薬組成物を非経口投与するステップを含み、前記医薬組成物が、少なくとも約５×１０５〜５×１０９個のヒト幹細胞を含み、前記ヒト幹細胞は、ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がない凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化され、前記健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、前記ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する、方法。
【請求項３８】
請求項１〜２８のいずれか一項に記載の医薬組成物を投与することを含む、原発性ミトコンドリア病もしくは障害、またはそれらの症状の治療を必要とする患者において、それらを治療する、方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本発明は、外因性機能的ヒトミトコンドリアで富化された哺乳類幹細胞、より具体的にはヒト幹細胞に関する。本発明はさらに、それらの製造方法、およびかかる富化された細胞を利用する治療方法に関する。
【背景技術】
【０００２】
ミトコンドリアは、ほとんどの真核細胞に見られる、直径０．５〜１．０μｍの範囲の膜結合小器官である。ミトコンドリアは、ほぼ全ての真核生物に見出され、細胞型に応じて数および位置が異なる。ミトコンドリアは、独自のＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）と、ＲＮＡおよびタンパク質を合成するための独自の機構とを含有する。ｍｔＤＮＡは３７個の遺伝子しか含有しないため、哺乳類の体内の遺伝子産物のほとんどは核ＤＮＡによってコードされている。
【０００３】
ミトコンドリアは、ピルビン酸酸化、クレブス回路、ならびにアミノ酸、脂肪酸、およびステロイドの代謝などの、真核細胞内の多数の重要な課題を実行する。しかしながら、ミトコンドリアの主な機能は、電子伝達鎖および酸化的リン酸化系（「呼吸鎖」）によるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）としてのエネルギーの生成である。ミトコンドリアが関与する追加のプロセスには、熱産生、カルシウムイオンの貯蔵、カルシウムシグナリング、プログラム細胞死（アポトーシス）、および細胞増殖が含まれる。したがって、治療を必要とするミトコンドリアの機能不全または機能障害に関連する当技術分野で既知の多くの疾患および障害が存在する。
【０００４】
細胞内のＡＴＰ濃度は、典型的には、１〜１０ｍＭである。ＡＴＰは、エネルギー源として単糖および複合糖（炭水化物）または脂質を使用した酸化還元反応によって産生され得る。複雑な燃料をＡＴＰに合成するには、まず、より小さく、より単純な分子に分解する必要がある。複雑な炭水化物は、グルコースおよびフルクトースなどの単糖に加水分解される。脂肪（トリグリセリド）は代謝されて脂肪酸およびグリセロールをもたらす。
【０００５】
グルコースを二酸化炭素に酸化する全体的なプロセスは細胞呼吸として知られており、グルコースの単一分子から約３０個のＡＴＰの分子を産生することができる。ＡＴＰは、いくつかの異なる細胞プロセスによって産生される。真核生物においてエネルギーを生成するために使用される３つの主要な経路は、解糖およびクエン酸回路／酸化的リン酸化（両方とも細胞呼吸の構成要素）およびベータ酸化である。非光合成の好気性真核生物によるこのＡＴＰ産生の大部分はミトコンドリアで起こり、典型的な細胞の総体積のほぼ２５％を占める場合がある。
【０００６】
ミトコンドリア病は、機能障害のミトコンドリアによって引き起こされる一群の障害である。原発性ミトコンドリア病は、ミトコンドリア機能に影響を与えるミトコンドリアＤＮＡの突然変異、または遺伝子産物がミトコンドリアに取り込まれる核ＤＮＡの遺伝子（ミトコンドリアタンパク質）の突然変異によって引き起こされ得る。ミトコンドリア病は、疾患がしばしば受け継がれる方法だけでなく、ミトコンドリアが細胞機能にとって非常に重要でもあるため、独特の特性を持っている。神経筋疾患の症状があるこれらの疾患のサブクラスは、しばしばミトコンドリアミオパチーと呼ばれる。原発性ミトコンドリア病とは異なり、後天性ミトコンドリア機能障害としても知られる続発性ミトコンドリア機能障害は、ミトコンドリアの酸化的リン酸化カスケードに直接関与していない核ＤＮＡの遺伝子によって引き起こされ得る。影響を受ける遺伝子は、ミトコンドリアタンパク質をコードせず、ＯＸＰＨＯＳプロセスの実行に必要な複雑な機構の産生に影響を与えることにより、酸化的リン酸化（ＯＸＰＨＯＳ）にも影響を与えない。続発性ミトコンドリア機能障害は、多くの疾患または障害、例えば、脂肪肝疾患、心筋梗塞、脳卒中を伴う可能性があり、酸化ストレスを引き起こす可能性がある環境または薬物関連の悪影響に続発して獲得される可能性もある。後者は、老化、炎症応答、ミトコンドリア毒性薬（ｍｉｔｏｔｏｘｉｃ  ｄｒｕｇ）などのミトコンドリアに悪影響を与える他の様々なプロセスで見られるように、ｍｔＤＮＡの変化および／または機能障害のミトコンドリアをもたらす可能性がある。
【０００７】
影響を受けたミトコンドリアの数がある特定のレベルに達すると、ミトコンドリア病が臨床的に明らかになる場合があり、この現象は「ヘテロプラスミー閾値」と呼ばれる。ミトコンドリアＤＮＡの突然変異は、エラーチェック能力が非効率的であるため、およびＤＮＡがネイキッドであり、核ヒストンのような保護がないため、頻繁に発生する。これは、ミトコンドリアＤＮＡ障害が自発的かつ比較的頻繁に発生する可能性があることを意味する。ミトコンドリアＤＮＡの複製を制御する酵素（すべて核ＤＮＡの遺伝子によってコードされている）の欠損も、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異を引き起こす可能性がある。ほとんどのミトコンドリア機能および生合成は核ＤＮＡによって制御されている。ヒトミトコンドリアＤＮＡは呼吸鎖の１３のタンパク質のみをコードするが、ミトコンドリアを標的とする推定１，５００のタンパク質および構成要素のほとんどは核にコードされている。核にコードされているミトコンドリア遺伝子の欠損は、貧血、認知症、てんかん、糖尿病、ミオパチー、高血圧、リンパ腫、網膜症、発作、および神経発達障害を含む、幅広い臨床疾患の表現型に関連している。
【０００８】
ピアソン症候群（ＰＳ）は、骨髄不全、貧血、および膵臓機能障害を特徴とするミトコンドリア病である。他の臨床的特徴は、発育不良、インスリン依存性糖尿病および外分泌膵臓欠損症を伴う膵臓線維症、腎不全、筋肉および神経障害である。成人期まで生存した少数の患者は、しばしばカーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）の症状を発症する。
【０００９】
腎ファンコニー症候群またはファンコニー症候群は、腎臓の近位尿細管での不適切な再吸収の症候群である。この症候群は、様々な根底にある先天性または後天性疾患、毒性、または薬物有害反応によって引き起こされる可能性がある。その結果、様々な代謝小分子が尿細管液から再吸収されるのではなく、尿に運ばれる。
【００１０】
ＫＳＳは、ミトコンドリアミオパチーであり、慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）のより重篤な症候群の変種であり、眼および瞼の動きを制御する筋肉の孤立した関与を特徴とする症候群である。ＫＳＳは、眼瞼下垂および眼筋麻痺を引き起こす。ＫＳＳは、眼のＣＰＥＯおよび色素性網膜症、ならびに心伝導異常の組み合わせを伴う。他の症状には、小脳性運動失調、近位筋力低下、難聴、真性糖尿病、成長ホルモン欠乏症、および副甲状腺機能低下症が含まれ得る。
【００１１】
レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）またはレーバー視神経萎縮症は、網膜神経節細胞（ＲＧＣ）およびその軸索のミトコンドリア遺伝性（母親から子孫に伝達される）変性であり、主に若年成人男性に影響を与える急性または亜急性の中心視力の喪失をもたらす。しかしながら、ＬＨＯＮは、主にミトコンドリア（核ではない）ゲノムの突然変異が原因であり、卵子のみがミトコンドリアを胚に寄与するため、母親を介してのみ伝達される。ＬＨＯＮは通常、３つの病原性ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）点突然変異のうちの１つが原因である。これらの突然変異は、それぞれミトコンドリアの酸化的リン酸化鎖の複合体ＩのＮＤ４、ＮＤ１、およびＮＤ６サブユニット遺伝子のヌクレオチド位置１１７７８  Ｇ〜Ａ、３４６０  Ｇ〜Ａ、および１４４８４Ｔ〜Ｃにある。これらの突然変異は、細胞のエネルギー生産の低下につながる可能性があり、その結果、細胞の損傷およびある特定の視神経細胞死を引き起こす。現時点では、専門家は、家族が症状を発症するかどうかを判断することはできないが、ＬＨＯＮ突然変異を有する男性の平均５０％および女性の１５％が生涯で視力を失う。
【００１２】
ミトコンドリア脳筋症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳと略される）は、ＭＥＲＲＦおよびレーバー遺伝性視神経症も含むミトコンドリア細胞障害のファミリーの１つである。この疾患は、男女ともに現れる可能性がある。ＭＥＬＡＳは、ミトコンドリアＤＮＡの遺伝子の突然変異によって引き起こされる。ＭＥＬＡＳで影響を受ける遺伝子の一部（ＭＴ−ＮＤ１、ＭＴ−ＮＤ５）は、酸素および単糖をエネルギーに変換するのに役立つ、ミトコンドリアのＮＡＤＨデヒドロゲナーゼ（複合体Ｉとも呼ばれる）の一部であるタンパク質をコードしている。他の遺伝子（ＭＴ−ＴＨ、ＭＴ−ＴＬ１、およびＭＴ−ＴＶ）は、ミトコンドリア特異的転移ＲＮＡ（ｔＲＮＡ）をコードしている。ＭＴ−ＴＬ１における突然変異は、ＭＥＬＡＳの全症例の８０％以上を引き起こす。それらは、ミトコンドリアがタンパク質を作り、酸素を使用し、エネルギーを産生する能力を損なう。
【００１３】
ミトコンドリア呼吸鎖障害（ＭＲＣＤ）は、ミトコンドリア酸化的リン酸化系（ＯＸＰＨＯＳ）に影響を与える分子欠損が原因である、細胞の生体エネルギー機構の関与を共有する不均一な群の障害である。臨床的には、それらは通常は複数の組織を伴うが、主に神経系および骨格筋に影響を与える傾向がある。心臓症状は、頻繁であり、肥大型または拡張型心筋症および心伝導障害を含み、成人または乳児の多臓器ミトコンドリア障害の一部であるか、または頻度は少ないが、孤立した臨床状態として現れる。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア病は、ミトコンドリア呼吸鎖疾患（ＭＲＣＤ）である。
【００１４】
幹細胞は一般に、他の種類の細胞に分化することができ、かつ／または分裂してほぼ同じ種類の幹細胞を産生することができる細胞である。哺乳動物では、幹細胞の主な種類は、胚性幹細胞および成体幹細胞である。ヒトの成体幹細胞には、骨髄幹細胞、脂肪組織幹細胞、血液幹細胞の少なくとも３つの既知の供給源がある。他の幹細胞には、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、組織特異的幹細胞、および人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）が含まれる。
【００１５】
ＷＯ２０１３／００２８８０は、受精能増強手順で使用するために、老化した卵母細胞の品質を回復させるか、卵母細胞幹細胞を増強するか、またはその誘導体（例えば、細胞質または単離ミトコンドリア）を改善するための生体エネルギー剤を含む組成物および方法を記載する。
【００１６】
本発明者らに対するＷＯ２０１３／０３５１０１は、ミトコンドリア組成物およびそれを使用する治療方法に関し、部分的に精製された機能的なミトコンドリアの組成物、および組成物を使用して、組成物を必要とする対象に組成物を投与することによってミトコンドリア機能の増加から恩恵を受ける病態を治療する方法を開示する。
【００１７】
ＷＯ２０１６／００８９３７は、ドナー細胞の集団から単離されたミトコンドリアのレシピエント細胞の集団への細胞間移動のための方法に関する。本方法は、ある量のミトコンドリアの移動の改善された有効性を示す。
【００１８】
ＵＳ２０１２／０１０７２８５は、細胞のミトコンドリア増強を対象としている。ある特定の実施形態には、幹細胞を改変する方法、または改変された幹細胞を少なくとも１つの生体組織に投与する方法が含まれるが、これらに限定されない。
【００１９】
ＷＯ２０１６／１３５７２３は、機能的ミトコンドリアで少なくとも５０％富化されたヒト骨髄細胞、それらの産生方法、およびかかる細胞を利用する治療方法に関する。
【００２０】
様々な原発性ミトコンドリア病および障害によって影響を受ける細胞および器官におけるミトコンドリア機能を増加させるための新規方法に対する当技術分野における必要性が依然として存在する。
【発明の概要】
【００２１】
ミトコンドリア増強療法は、欠損ミトコンドリアによって引き起こされる重篤な作用を患う子供の様々な生理学的パラメーターの欠損を改善するために初めて使用された。ミトコンドリア増強療法のプラスの作用は、欠損ミトコンドリアの機能を回復させることができると仮定されてきたが、それはヒト年少患者において首尾よく実行されなかった。特に、健康なミトコンドリアでの低レベルの富化でも、患者の健康の非常に有益で長期的な改善、ならびに様々な器官および組織の生理学的パラメーターの有意な改善を首尾よく提供することができることが現在開示されている。
【００２２】
動物モデルシステムを使用して、宿主細胞のミトコンドリア含有量を５０％または１００％以上をはるかに超えて増加させることが容易であることが以前に示されている。本明細書で以下に例示するように、ドナーからレシピエントへのミトコンドリアのわずかな増加でさえ、所望の臨床転帰を達成できることが現在見出された。
【００２３】
本発明は、外因性機能的ミトコンドリアで富化された哺乳類幹細胞、および様々な原発性ミトコンドリア病を治療するための方法を提供する。特に、本発明は、健康なドナーから得られた機能的ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を含む組成物を提供する。本発明はさらに、原発性ミトコンドリア病を有する対象の治療のための同種異系または自家の「ミトコンドリア富化」幹細胞の使用のための方法を提供する。
【００２４】
ミトコンドリア病に罹患しており、エクスビボで処理され、同じ対象に戻された対象の幹細胞の提供は、同種異系細胞療法を伴う他の方法に比べて大きな利益を提供する。例えば、本明細書で提供される方法は、時間および費用がかかるプロセスであり、常に成功するとは限らない、集団をスクリーニングし、患者とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合するドナーを見つける必要性を排除する。本方法は、同種異系細胞集団の拒絶を防止するための生涯にわたる免疫抑制療法の必要性をさらに有利に排除する。したがって、本発明は、細胞が患者の体から採取され、外因性（例えば、同種異系）ミトコンドリアでエクスビボで処理され、同じ患者に戻される、エクスビボ矯正療法の独自の方法論を有利に提供する。さらに、本発明は、経験的に異なる組織および器官において体全体に分布され、これらの部位でのミトコンドリア機能を増加させる幹細胞の投与に関する。
【００２５】
本発明は、部分的に、ミトコンドリア富化幹細胞による原発性ミトコンドリア病に罹患している年少者の治療が、標的組織および器官におけるミトコンドリア機能および含有量を増加させ、ミトコンドリア機能障害に関連する多種多様な有害な状態および症状を寛解させるという驚くべき発見に基づく。
【００２６】
さらに、本明細書で初めて例示されるように、これらの細胞のミトコンドリア含有量がミトコンドリア富化後に適度にしか上昇しなかった場合でも、富化されたヒト幹細胞がヒト患者の様々な疾患および症状の治療に有効であることが予想外に見出された。一部の本発明者らのＷＯ２０１６／１３５７２３は、少なくとも５０％の骨髄細胞のミトコンドリア富化に関するが、驚くべきことに、約５％〜約４５％のヒト幹細胞のミトコンドリア富化が、ヒト患者の多くの臨床パラメーターに長期的な有意な改善を提供するのに十分であることが見出された。
【００２７】
本発明によって提供される組成物および方法は、ミトコンドリア「増強療法」の一形態と見なすことができる。本発明の原理によれば、少数の機能的ミトコンドリアおよび／またはミトコンドリアの機能低下のいずれかは、野生型の健康な機能的ミトコンドリアで富化された幹細胞の添加によって軽減される。無傷の機能的ミトコンドリアで富化された幹細胞の患者の組織および器官への融合または侵入は、細胞／組織／器官あたりのミトコンドリアコピー数の増加およびミトコンドリア機能の増加の両方を提供する。さらに、本発明の原理によれば、低レベルのミトコンドリア機能を示す細胞は、機能的ミトコンドリアで富化された幹細胞の添加によって置き換えることができる。富化された幹細胞は、機能障害または機能低下を起こした同じ種類の細胞に分化し、それによって機能障害を寛解させるか、または機能を回復させる可能性があると仮定されている。
【００２８】
本発明は、一態様では、原発性ミトコンドリア病、障害、またはそれらの症状の治療を必要とする患者において、それらを治療する方法を提供し、本方法は、患者に医薬組成物を非経口投与するステップを含み、医薬組成物は、少なくとも約５×１０５〜５×１０９個のヒト幹細胞を含み、ヒト幹細胞は、ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がない凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化され、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する。
【００２９】
別の態様では、本発明は、原発性ミトコンドリア病、障害、またはそれらの症状の治療を必要とするヒト患者において、かかる治療に使用するための医薬組成物を提供し、組成物は、細胞の生存能力を支援することができる薬学的に許容可能な液体培地中、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５〜２×１０７個のヒト幹細胞を含み、ヒト幹細胞は、ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がない凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化され、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する。
【００３０】
いくつかの実施形態では、富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．０８８〜最大１７６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。
【００３１】
さらなる実施形態では、富化は、百万個の細胞あたり０．８８〜最大１７．６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量と幹細胞を接触させることを含む。いくつかの実施形態では、単離されたミトコンドリアの用量は、所望の濃度でレシピエント細胞に添加される。ミトコンドリアドナー細胞の数とミトコンドリアレシピエント細胞の数との比率は、２：１（ドナー細胞対レシピエント細胞）を超える比率である。典型的な実施形態では、比率は、少なくとも５、あるいは少なくとも１０以上である。特定の実施形態では、ミトコンドリアが収集されるドナー細胞とレシピエント細胞との比率は、少なくとも２０、５０、１００、またはおそらくさらに高い。各可能性は、別個の実施形態である。
【００３２】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ＣＤ３４＋である。
【００３３】
ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、同種異系ミトコンドリアである。他の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは同系である。
【００３４】
ある特定の実施形態では、原発性ミトコンドリア病または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異に関連している。ある特定の実施形態では、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異に関連している原発性ミトコンドリア病または障害は、ピアソン症候群（ＰＳ）；カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）；ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）症候群；レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；ニューロパチー、運動失調、および色素性網膜炎（ＮＡＲＰ）症候群；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）症候群；母性遺伝性糖尿病および難聴（ＭＩＤＤ）；アルパース様症候群；慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）；ミトコンドリアＤＮＡ関連型の先天性乳酸アシドーシス（ＣＬＡ）；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群（ＭＤＤＳ）；ならびにミトコンドリアＤＮＡ関連型のリー症候群からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３５】
ある特定の実施形態では、原発性ミトコンドリア病または障害は、ミトコンドリア機能に必要な遺伝子産物をコードしている核ＤＮＡの突然変異に関連している。ある特定の実施形態では、核ＤＮＡの突然変異に関連している原発性ミトコンドリア病または障害は、ミトコンドリア神経胃腸脳症（ＭＮＧＩＥ）症候群；アルパース症候群；フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）；進行性外眼筋麻痺（ＰＥＯ）；鉄芽球性貧血；運動失調ニューロパチー症候群（ＡＮＳ）；メンデルの神経変性ミトコンドリア病（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉｏｐａｔｈｙ）；３−メチルグルタコン酸尿症（ＭＥＧ）難聴（Ｄ）、脳症（Ｅ）およびリー様病（Ｌ）症候群（ＭＥＧＤＥＬ）；ゼンガー症候群（Ｓｅｎｇｅｒｓ  ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；微小変化群ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）；核ＤＮＡ関連型の先天性乳酸アシドーシス（ＣＬＡ）；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群（ＭＤＤＳ）および核ＤＮＡ関連型のリー症候群からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３６】
ある特定の実施形態では、原発性ミトコンドリア病または障害は、腎臓、肝臓、脳、筋肉、膵臓、眼、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される器官に関連している。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３７】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア機能障害の症状は、歩行能力障害、運動技能障害、言語技能障害、記憶障害、体重増加障害、発育不良、低血中アルカリホスファターゼレベル、低血中マグネシウムレベル、高血中クレアチニンレベル、低血中重炭酸塩レベル、低血中塩基過剰レベル、高尿中グルコース／クレアチニン比、高尿中塩化物／クレアチニン比、高尿中ナトリウム／クレアチニン比、高血中乳酸レベル、高尿マグネシウム／クレアチニン比、高尿中カリウム／クレアチニン比、高尿中カルシウム／クレアチニン比、糖尿、マグネシウム尿、高血中尿素レベル、低Ｃ−ペプチドレベル、高ＨｂＡ１Ｃスコア、副甲状腺機能低下症、眼瞼下垂、聴力損失、心伝導障害、てんかん発作、脳卒中様発作、ＥＥＧ障害、高血中ＡＳＴ／ＡＬＴレベル、低ＡＴＰ含有量、およびリンパ球における低酸素消費量からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００３８】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、特定の組織または器官に投与される。
【００３９】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、全身投与によって投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり約１０６個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約合計５×１０５〜５×１０９個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。
【００４０】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞は、ミトコンドリア富化前の幹細胞における対応するレベルと比較した（ｉ）増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、（ｉｉ）増加したＣＳ活性レベル、（ｉｉｉ）増加したＳＤＨＡおよびＣＯＸ１から選択された少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の含有量、（ｉｖ）増加したＯ２消費率、（ｖ）増加したＡＴＰ産生率、または（ｖｉ）それらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つを有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４１】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、外因性ミトコンドリアで富化される前に、患者から得られるかまたは由来する。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、外因性ミトコンドリアで富化される前の患者とは異なるドナーから得られるかまたは由来する。
【００４２】
ある特定の実施形態では、幹細胞のドナーは、少なくとも部分的に患者とＨＬＡ適合する。
【００４３】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞は、ミトコンドリア富化ヒト前駆細胞である。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞は、造血幹細胞である。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞は、間葉系幹細胞である。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。
【００４４】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを該ヒト幹細胞に導入する前に、少なくとも１回の凍結−解凍サイクルを受けている。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）ヒト幹細胞を凍結すること、（ｂ）ヒト幹細胞を解凍すること、および（ｃ）凍結−解凍した健康な機能的外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入することを含む。
【００４５】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、骨髄の細胞から単離されるか、由来するか、または得られる。他の実施形態では、ヒト幹細胞は、脂肪組織、口腔粘膜、皮膚線維芽細胞、血液、または臍帯血から単離されるか、由来するか、または得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４６】
ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、胎盤、培養で成長させた胎盤細胞、または血液細胞から単離されるかまたは得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、ヒト胎盤、培養で成長させたヒト胎盤細胞、またはヒト血液細胞から単離されるかまたは得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００４７】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアで富化された後、少なくとも１回の凍結−解凍サイクルを受けている。ある特定の実施形態では、上記の方法は、（ａ）健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を凍結し、（ｂ）健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を解凍してから、健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を患者に投与する追加ステップをさらに含む。
【００４８】
ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、全ミトコンドリアの５％〜３０％を構成する。ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、全ミトコンドリアの少なくとも１０％かつ３０％未満を構成する。ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、全ミトコンドリアの少なくとも１０％かつ２５％未満を構成する。
【００４９】
別の態様では、本発明はさらに、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアでヒト幹細胞を富化するためのエクスビボ法を提供し、本方法は、（ｉ）ミトコンドリア病、障害、またはそれらの症状に罹患している患者からまたは好適なドナーから単離されたまたは部分的に精製された複数のヒト幹細胞を含む第１の組成物を提供するステップ、（ｉｉ）ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がないドナーから得られた複数の単離された凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物を提供するステップ、（ｉｉｉ）１０６個の幹細胞あたり０．０８８〜１７６  ｍＵのＣＳ活性の比率で、第１の組成物のヒト幹細胞を第２の組成物の凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアと接触させ、したがって第３の組成物を提供するステップ、および（ｉｖ）凍結−解凍した健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアがヒト幹細胞に入るのを可能にする条件下で、第３の組成物をインキュベートし、それにより該健康な機能的外因性ミトコンドリアで該ヒト幹細胞を富化し、したがってミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む第４の組成物を提供するステップを含み、第４の組成物の全ミトコンドリアは、少なくとも３％かつ３３％未満の健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアを含む。
【００５０】
いくつかの実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアがヒト幹細胞に入るのを可能にする条件は、ヒト幹細胞を、該健康な機能的外因性ミトコンドリアとともに、１６〜３７℃の範囲の温度で０．５〜３０時間の範囲の時間にわたってインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアがヒト幹細胞に入るのを可能にする条件は、細胞の生存を支援する環境下の培養培地中で、ヒト幹細胞を、該健康な機能的外因性ミトコンドリアとともに、１６〜３７℃の範囲の温度で０．５〜３０時間の範囲の時間にわたってインキュベートすることを含む。いくつかの実施形態によると、培養培地は、ヒト血清アルブミンを含有する生理食塩水である。いくつかの実施形態では、インキュベーションの条件は、５％のＣＯ２を含有する雰囲気を含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションの条件は、空気中に見られるレベルを超える追加のＣＯ２を含まない。
【００５１】
いくつかの実施形態では、本方法は、インキュベーション前、インキュベーション中、またはインキュベーション後のヒト幹細胞および健康な機能的外因性ミトコンドリアの遠心分離をさらに含む。いくつかの実施形態では、インキュベーションの前に、本方法は、２５００×ｇを超える遠心力でのヒト幹細胞および健康な機能的外因性ミトコンドリアの単一遠心分離をさらに含む。
【００５２】
いくつかの実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、凍結−解凍サイクルを受けていない対照ミトコンドリアと比較して、解凍後に同等の酸素消費率を示す。
【００５３】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞を凍結することをさらに含み、任意選択で解凍することをさらに含む。
【００５４】
追加の実施形態では、ヒト幹細胞は、ミトコンドリア増強の前または後に拡大される。
【００５５】
いくつかの態様および実施形態では、本発明は、健康な機能的外因性ミトコンドリアが、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する、その様々な実施形態において上記の方法によって得られる健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞を含む組成物を提供する。
【００５６】
別の態様では、本発明はさらに、上記のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与するステップを含む、原発性ミトコンドリア病または障害またはそれらの症状の治療を必要とするヒト患者においてそれらを治療する方法を提供する。
【００５７】
本発明のさらなる実施形態および適用可能性の全範囲は、以下に与えられる詳細な説明から明らかになるであろう。しかしながら、本発明の精神および範囲内での様々な変更および修正は、この詳細な説明から当業者に明らかになるであろうから、詳細な説明および具体的な実施例は、本発明の好ましい実施形態を示しているが、単に例示として与えられているにすぎないことは理解されるはずである。従来および伝統的なアプローチのさらなる制限および不利な点は、かかるシステムを、図面を参照して本出願の残りの部分に記載される本発明のいくつかの態様と比較することによって、当業者に明らかになるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００５８】
【図１】ＨｅＬａ−ＴｕｒｂｏＧＦＰ−ミトコンドリア細胞から単離されたＧＦＰ標識ミトコンドリアとともにインキュベートしたＣＤ３４＋細胞の蛍光共焦点顕微鏡で得られた顕微鏡写真を示す。
【図２Ａ】未処理の細胞（ＮＴ）と比較した、様々な濃度（０．０４４、０．４４、０．８８、２．２、４．４、８．８、１７．６ｍＵｎｉｔのＣＳ活性）のＣ５７ＢＬマウスからの外因性ミトコンドリアとともに細胞をインキュベートした後のＦＶＢ／Ｎ骨髄細胞におけるＣ５７ＢＬｍｔＤＮＡのコピー数を示す棒グラフである。
【図２Ｂ】Ｊａｎｕｓレベルに正規化された、未処理の細胞（ＮＴ）と比較した、様々な濃度（０．０４４、０．４４、０．８８、２．２、４．４、８．８、１７．６ｍＵｎｉｔのＣＳ活性）のＣ５７ＢＬマウスからの外因性ミトコンドリアとともに細胞をインキュベートした後のＦＶＢ／Ｎ骨髄細胞におけるｍｔＤＮＡコードされている（ＣＯＸ１）タンパク質の含有量を示す棒グラフである。
【図２Ｃ】Ｊａｎｕｓレベルに正規化された、未処理の細胞（ＮＴ）と比較した、様々な濃度（０．０４４、０．４４、０．８８、２．２、４．４、８．８、１７．６ｍＵｎｉｔのＣＳ活性）のＣ５７ＢＬマウスからの外因性ミトコンドリアとともに細胞をインキュベートした後のＦＶＢ／Ｎ骨髄細胞における核コードされている（ＳＤＨＡ）タンパク質の含有量を示す棒グラフである。
【図３Ａ】ＧＦＰ標識ミトコンドリアの量を増加して富化した後のマウスＢＭ細胞のＣＳ活性の比較を示す棒グラフである。
【図３Ｂ】ＧＦＰ標識ミトコンドリアの活性（灰色の棒）と比較した、これらの細胞におけるチトクロームｃレダクターゼ活性（黒色の棒）の比較を示す棒グラフである。
【図４】Ｃ５７ＢＬマウスからの外因性ミトコンドリアで富化した骨髄細胞をＩＶ注射した後の様々な時点でのＦＶＢ／Ｎマウスの骨髄中のＣ５７ＢＬｍｔＤＮＡのレベルを示す棒グラフである。
【図５】２つの異なる胎盤由来ミトコンドリアバッチ（ＰＬＣ１およびＰＬＣ２）を用いたＭＡＴ後の健康なドナーのＣＤ３４＋細胞における胎盤ハプログループのパーセンテージを示すドットプロットである。
【図６Ａ】対照、遠心分離をしたまたはしない、ヒト胎盤細胞から単離されたＧＦＰ標識ミトコンドリアとともにインキュベートした未処理ヒトＢＭ細胞およびヒトＢＭ細胞におけるＣＳ活性の比較を示す棒グラフである。
【図６Ｂ】対照、未処理ヒトＢＭ細胞、および遠心分離をした、ヒト胎盤細胞から単離されたＧＦＰ標識ミトコンドリアとともにインキュベートしたヒトＢＭ細胞におけるＡＴＰレベルの比較を示す棒グラフである。
【図７Ａ】ピアソン患者の臍帯血細胞におけるｍｔＤＮＡの欠失、ならびにその欠失を示すサザンブロット分析の図解である。
【図７Ｂ】非増強臍帯血細胞（ＵＣＢ）を注射したマウスと比較した、ヒトミトコンドリアで富化されたピアソン臍帯血細胞（ＵＣＢ＋Ｍｉｔｏ）を使用したミトコンドリア増強療法の２ヶ月後のＮＳＧＳマウスの骨髄におけるヒトｍｔＤＮＡコピー数を示す棒グラフである。
【図８】Ｃ５７／ＢＬ胎盤から得られた健康な機能的ミトコンドリアで富化された幹細胞投与１ヶ月後のＦＶＢ／Ｎマウスの骨髄におけるＦＶＢ／ＮＡＴＰ８突然変異ｍｔＤＮＡレベルを示す棒グラフである。
【図９Ａ】本発明によって提供される、ピアソン症候群（ＰＳ）患者の異なる治療段階のスキームである。
【図９Ｂ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者のＭＥＴスコアを示す棒グラフである。
【図９Ｃ】療法前（Ｂ）および治療後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の血中に見られる乳酸のレベルを示す棒グラフである。
【図９Ｄ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の体重および身長の標準偏差スコアを示す折れ線グラフである。
【図９Ｅ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者のアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）レベルを示す折れ線グラフである。
【図９Ｆ】本発明により提供される療法前後のＰＳ患者の血中赤血球（ＲＢＣ）レベルの長期的な上昇を示す折れ線グラフである。
【図９Ｇ】本発明により提供される療法前後のＰＳ患者の血中ヘモグロビン（ＨＧＢ）レベルの長期的な上昇を示す折れ線グラフである。
【図９Ｈ】本発明により提供される療法前後のＰＳ患者の血中ヘマトクリット（ＨＣＴ）レベルの長期的な上昇を示す折れ線グラフである。
【図９Ｉ】療法前後、マグネシウム補給前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の血中マグネシウムのレベルを示す棒グラフである。
【図９Ｊ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者のクレアチニンレベルを示す折れ線グラフである。
【図９Ｋ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の重炭酸塩レベルを示す折れ線グラフである。
【図９Ｌ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の塩基過剰レベルを示す折れ線グラフである。
【図９Ｍ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の尿中グルコース対クレアチニン比を示す棒グラフである。
【図９Ｎ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の尿中カリウム対クレアチニン比を示す棒グラフである。
【図９Ｏ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の尿中塩化物対クレアチニン比を示す棒グラフである。
【図９Ｐ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の尿中ナトリウム対クレアチニン比を示す棒グラフである。
【図１０Ａ】細胞あたりの正常なｍｔＤＮＡの数を表す１８ＳゲノムＤＮＡと比較した、欠失領域（各患者）のデジタルＰＣＲによって測定され、ベースラインごとに正規化された、療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療された３人のＰＳ患者（Ｐｔ．１、Ｐｔ．２、およびＰｔ．３）の正常なｍｔＤＮＡ含有量を示す折れ線グラフである。
【図１０Ｂ】ＭＡＴ後のベースライン時の３人のＰＳ患者（Ｐｔ．１、Ｐｔ．２、およびＰｔ．３）のヘテロプラスミーレベル（全ｍｔＤＮＡと比較した欠失ｍｔＤＮＡ）を示す折れ線グラフである。点線は、各患者のベースラインを表す。
【図１１Ａ】本発明によってさらに提供される、ピアソン症候群（ＰＳ）患者の異なる治療段階の別のスキームである。
【図１１Ｂ】療法前（Ｂ）および治療後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の血中乳酸レベルを示す棒グラフである。
【図１１Ｃ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の立ち上がり（ｓｉｔ−ｔｏ−ｓｔａｎｄ）スコアを示す棒グラフである。
【図１１Ｄ】療法前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の６分間の歩行試験スコアを示す棒グラフである。
【図１１Ｅ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の３回の連続反復（Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３）の力量計スコアを示す棒グラフである。
【図１１Ｆ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者における尿中マグネシウム対クレアチニン比を示す棒グラフである。
【図１１Ｇ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者における尿中カリウム対クレアチニン比を示す棒グラフである。
【図１１Ｈ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者における尿中カルシウム対クレアチニン比を示す棒グラフである。
【図１１Ｉ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の尿中ＡＴＰ８対１８Ｓのコピー数比を示す棒グラフである。
【図１１Ｊ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者のリンパ球におけるＡＴＰレベルを示す棒グラフである。
【図１２Ａ】本発明によってさらに提供される、ピアソン症候群（ＰＳ）患者およびカーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）患者の異なる治療段階のさらに別のスキームである。
【図１２Ｂ】療法前（Ｂ）および治療後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者の血中乳酸レベルを示す棒グラフである。
【図１２Ｃ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者のＡＳＴおよびＡＬＴレベルを示す棒グラフである。
【図１２Ｄ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者のトリグリセリド、総コレステロール、およびＶＬＤＬコレステロールレベルを示す棒グラフである。
【図１２Ｅ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者のヘモグロビンＡ１Ｃ（ＨｂＡ１Ｃ）スコアを示す棒グラフである。
【図１２Ｆ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者（Ｐｔ．３）の立ち上がりスコアを示す折れ線グラフである。
【図１２Ｇ】治療前後の時間の関数として、本発明で提供される方法によって治療されたＰＳ患者（Ｐｔ．３）の６分間の歩行試験スコアを示す折れ線グラフである。
【図１３】治療前後の、本発明で提供される方法によって治療されたＫＳＳ患者の末梢血中のＡＴＰ含有量を示す棒グラフである。
【発明を実施するための形態】
【００５９】
本発明は、治療的に有意な量の外因性の機能的で健康なミトコンドリアの標的化および／または全身送達のための細胞プラットフォーム、より具体的には幹細胞プラットフォームを提供する。本発明はさらに、かかる細胞プラットフォームを産生するための方法、およびミトコンドリア病を治療する際にそれらを利用するための方法を提供する。
【００６０】
健康な機能的外因性ミトコンドリアで適度に富化されたヒト幹細胞でさえ、多様な病状のミトコンドリア病および障害を患う患者の器官、組織、および細胞への健康な機能的ミトコンドリアのインビボ全身送達を達成することができることが今初めて示された。
【００６１】
機能的ミトコンドリアが適度に富化された幹細胞を提供することで、これまで利用できなかったヒトにおける原発性ミトコンドリア病の療法を改善することができる。例えば、ピアソン症候群（ＰＳ）およびカーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）などのミトコンドリアＤＮＡの突然変異に関連する原発性ミトコンドリア病は、今や機能的ミトコンドリアで適度にしか富化されなかった幹細胞を、疾患の影響を受けた組織または器官に移植することによって治療され、疾患の長期的な無効化につながり得る。疾患の影響を受けた細胞が幹細胞自体である場合、投与された富化幹細胞が影響を受けた細胞に取って代わり、やはり疾患の長期的な無効化につながり得る。他の例では、原発性ミトコンドリア病が核ＤＮＡの突然変異に関連しており、影響を受けた細胞が幹細胞であるか、幹細胞に由来する場合、投与された幹細胞が影響を受けた細胞にとって代わり、やはり疾患の長期的な無効化につながり得る。本発明が、初めて、ヒトにおける原発性ミトコンドリア病の病的状態の持続的矯正、およびこれらの疾患の長期的な無効化のための幹細胞ベースの手段および方法を提供し、投与前にこれらの細胞の低から中程度のミトコンドリアの富化のみを必要とすることが強調されるべきである。
【００６２】
本発明はさらに、いくつかの驚くべき発見に基づいており、その中でも、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞の単回投与が、様々な臨床パラメーターの結果によって決定されるように、少なくとも１年間、反復介入する必要なく、腎臓、肝臓、脳、筋肉、および膵臓などの器官の機能を含む、ヒト患者の全体的な生理学的および認知状態を改善するのに十分であったことである。様々な器官および症状で長期的な作用を得るには、１回の療法で十分だったが、これらの作用の少なくとも一部を維持するには、さらなる治療回が必要である可能性が残っている。
【００６３】
本発明は、一態様では、原発性ミトコンドリア病、障害、またはそれらの症状の治療を必要とする対象において、それらを治療する方法を提供し、本方法は、複数の幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与するステップを含み、幹細胞は、ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がない健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化される。いくつかの実施形態では、対象は哺乳類対象であり、幹細胞は哺乳類幹細胞である。ある特定の実施形態では、対象はヒト対象であり、幹細胞はヒト幹細胞である。
【００６４】
別の態様では、本発明は、原発性ミトコンドリア病、障害、またはそれらの症状の治療を必要とするヒト患者において、かかる治療に使用するための医薬組成物を提供し、組成物は、ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がない凍結−解凍した健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞を含み、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する。
【００６５】
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５〜４×１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５〜２×１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも５×１０５〜１．５×１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０６〜１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも１０５個または少なくとも１０６個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、合計少なくとも５×１０５〜最大５×１０９個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、合計少なくとも１０６〜最大１０９個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。他の実施形態では、医薬組成物は、合計少なくとも２×１０６〜最大５×１０８個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。
【００６６】
別の態様では、本発明は、健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒトＣＤ３４＋幹細胞を含む組成物を提供し、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化ヒトＣＤ３４＋幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する。
【００６７】
さらに別の態様では、本発明は、原発性ミトコンドリア病もしくは障害、またはそれらの症状の治療に使用するための医薬組成物を提供し、医薬組成物は、健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒトＣＤ３４＋幹細胞を含み、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化ヒトＣＤ３４＋幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する。本明細書で使用される場合、「方法」という用語は、一般に、化学、薬理学、生物学、生化学、および医学の技術の実務医に既知であるか、またはそれらの実務医によって既知の方法、手段、技法、および手順から容易に開発されたかのいずれかのそれらの方法、手段、技法、および手順を含むがこれらに限定されない、所与の課題を達成するための方法、手段、技法、および手順を指す。
【００６８】
本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、疾患または状態に関連するかまたは誘導される少なくとも１つの症状の縮小、軽減、または寛解を含む。本明細書で使用される場合、「治療する」という用語はまた、防止的（例えば、予防的）、姑息的、および治癒的治療を含む。
【００６９】
本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、少なくとも１つの生物学的に活性な薬剤を含む任意の組成物を指す。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語はさらに、例えば、治療、予防、診断、防止、または予後の作用のために対象に送達される活性医薬成分を含む組成物を指す。本明細書で使用される場合、「医薬組成物」という用語はさらに、ヒト幹細胞を含む任意の組成物を指し、任意選択で、細胞が生存可能な状態に維持される培地または担体をさらに含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、活性医薬成分および薬学的に許容される担体を含む。本明細書で使用される場合、「薬学的に許容される担体」という用語は、生理学的に適合性のあるあらゆるすべての溶媒、分散媒、コーティング、抗菌剤および抗真菌剤、等張剤および吸収遅延剤などを含む。薬学的に許容される担体の例には、水、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどのうちの１つ以上、ならびにそれらの組み合わせが含まれる。
【００７０】
本明細書で使用される場合、「生物学的に活性な薬剤」という用語は、例えば、生細胞（複数可）、組織（複数可）、器官（複数可）、およびヒト（複数可）などの生物学的システムにおいて応答を誘発することができる任意の分子を指す。本発明による生物学的に活性な薬剤の非限定的な例には、細胞、無傷ミトコンドリア、ミトコンドリアＤＮＡ、およびミトコンドリアタンパク質が含まれる。本発明の原理によれば、ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がない健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化された複数のヒト幹細胞は、生物学的に活性な薬剤である。
【００７１】
本明細書で使用される場合、「幹細胞」という用語は、一般に、任意の種類の幹細胞を指す。幹細胞は、他の種類の細胞に分化することができ、分裂してほぼ同じ種類の幹細胞を産生することができる未分化細胞である。幹細胞は、全能性または多能性のいずれかであり得る。本明細書で使用される場合、「ヒト幹細胞」という用語は、一般に、ヒトに自然に見出されるすべての幹細胞、およびエクスビボで産生または誘導され、ヒトと適合性のあるすべての幹細胞を指す。幹細胞のような「前駆細胞」は、特定の種類の細胞に分化する傾向があるが、すでに幹細胞よりも特異的であり、その「標的」細胞に分化させられる。幹細胞と前駆細胞の最も重要な違いは、幹細胞は無制限に複製することができるのに対し、前駆細胞は限られた回数しか分裂することができないことである。本明細書で使用される場合、「ヒト幹細胞」という用語は、「前駆細胞」および「完全に分化していない幹細胞」をさらに含む。
【００７２】
本発明の原理によれば、幹細胞は、幹細胞中のミトコンドリアの数および／または機能を増加させるために、必要としている患者に投与される前に、健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化される。いかなる理論または機構に限定されることなく、投与された幹細胞におけるミトコンドリアの数および／または機能の増加は、ヒト患者において初めて本明細書に例示される様々な治療作用に関与している。
【００７３】
「機能的ミトコンドリア」、「健康なミトコンドリア」、「健康な機能的ミトコンドリア」、および「健康な機能的外因性ミトコンドリア」という用語は、本明細書では交換可能に使用され、正常な非病的レベルの活性を示す、ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異のないミトコンドリアを指す。ミトコンドリアの活性は、テトラメチルローダミンエチルエステル過塩素酸塩（ＴＭＲＥ）染色、Ｏ２消費、ＡＴＰ産生、およびＣＳ活性レベルなど、当技術分野で周知の様々な方法で測定することができる。
【００７４】
以下に例示される実施形態では、ミトコンドリアはヒトミトコンドリアである。
【００７５】
「健康なドナー」および「健康な対象」という用語は、交換可能に使用され、治療されている疾患または状態を患っていない対象を指す。
【００７６】
ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、同系または同種異系である。
【００７７】
本明細書で使用される場合、「富化」という用語は、ミトコンドリア含有量、例えば、ヒト細胞の無傷の、機能的で、健康なミトコンドリアの数を増加させる、エクスビボで実行される任意の作用を指す。本発明の原理によれば、健康な機能的外因性ミトコンドリアがヒト幹細胞に導入され、したがってこれらの細胞を健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化する。かかる富化はヒト幹細胞のミトコンドリア含有量を変化させることを理解するべきである。ナイーブヒト幹細胞は、実質的に、宿主／自家／内因性ミトコンドリアの１つの集団を有するが、外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞は、実質的に、宿主／自家／内因性ミトコンドリアの１つの集団と、導入されたミトコンドリアの別の集団（すなわち、外因性ミトコンドリア）とのミトコンドリアの２つの集団を有する。したがって、「富化された」という用語は、外因性ミトコンドリアの受容／取り込み後の細胞の状態に関する。ミトコンドリアの２つの集団間の数および／または比率を決定することは、２つの集団がいくつかの態様、例えばミトコンドリアＤＮＡにおいて異なるため、簡単である。したがって、「健康な機能性ヒトミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞」という句は、「内因性ミトコンドリアと健康な機能的外因性ミトコンドリアとを含むヒト幹細胞」という句と等しい。例えば、全ミトコンドリアの少なくとも１％かつ３３％未満の健康な機能的外因性ミトコンドリアを含むヒト幹細胞は、９９：１の比率〜６７：３３の比率の宿主／自家／内因性ミトコンドリアおよび健康な機能的外因性ミトコンドリアを含むと見なされる。例えば、「全ミトコンドリアの３％」は、富化後、元の（内因性）ミトコンドリア含有量が全ミトコンドリアの９７％であり、導入された（外因性）ミトコンドリアが全ミトコンドリアの３％であることを意味し、これは（３／９７＝）３．１％の富化と等しい。別の例として、「全ミトコンドリアの３３％」は、富化後、元の（内因性）ミトコンドリア含有量が全ミトコンドリアの６７％であり、導入された（外因性）ミトコンドリアが全ミトコンドリアの３３％であることを意味し、これは（３３／６７＝）４９．２％の富化と等しい。
【００７８】
ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも１％かつ３３％未満を構成する。ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、全ミトコンドリアの約１％、３％、５％、７％、１０％、１５％、または２０％〜約２５％、２７％、２９％、または３１％を構成する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「約」という用語は、所与の数より１０％超または未満を意味する。例えば、約１０％は、９％、９％〜１１％、または１１％を意味する。典型的には、本明細書で使用される場合、数値は、示された数値の±１０％を指す。
【００７９】
ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、幹細胞の全ミトコンドリアの少なくとも１％を構成し、幹細胞は、骨髄細胞、またはそれに由来するかもしくはそれから得られた細胞ではない。ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、幹細胞の全ミトコンドリアの約１％〜約９９％、およびその任意の部分範囲を構成し、幹細胞は、骨髄細胞、またはそれに由来するかもしくはそれから得られた細胞ではない。ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、幹細胞の全ミトコンドリアの少なくとも約１％、３％、５％、７％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、または９９％を構成し、幹細胞は、骨髄細胞、またはそれに由来するかもしくはそれから得られた細胞ではない。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８０】
機能的ミトコンドリアによる幹細胞の富化の程度は、酸素（Ｏ２）消費率、クエン酸シンターゼの含有量または活性レベル、アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率を含むがこれらに限定されない機能的および／または酵素的アッセイによって決定され得る。別の方法では、健康なドナーミトコンドリアによる幹細胞の富化は、ドナーのミトコンドリアＤＮＡの検出によって確認することができる。いくつかの実施形態によれば、機能的ミトコンドリアによる幹細胞の富化の程度は、ヘテロプラスミーの変化のレベルによって、および／または細胞あたりのｍｔＤＮＡのコピー数によって決定され得る。各可能性は、本発明の個別の実施形態を表す。
【００８１】
ＴＭＲＭ（テトラメチルローダミンメチルエステル）または関連するＴＭＲＥ（テトラメチルローダミンエチルエステル）は、ミトコンドリア膜電位の変化を特定することにより、生細胞のミトコンドリア機能を評価するために一般的に使用される細胞透過性蛍光発生色素である。いくつかの実施形態によれば、富化のレベルは、ＴＭＲＥまたはＴＭＲＭで染色することによって決定することができる。ある特定の実施形態によれば、健康な機能的ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、当技術分野で認識されている従来のアッセイによって決定することができる。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞におけるミトコンドリアの富化のレベルは、（ｉ）宿主／内因性ミトコンドリアＤＮＡおよび外因性ミトコンドリアＤＮＡのレベル、（ｉｉ）クエン酸シンターゼ（ＣＳ）、ＣＯＸ１、ＳＤＨＡおよびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択されるミトコンドリアタンパク質のレベル、（ｉｉｉ）ＣＳ活性レベル、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせよって決定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞におけるミトコンドリアの富化のレベルは、（ｉ）同種異系ミトコンドリアの場合、宿主（内因性）欠損ミトコンドリアＤＮＡおよび健康な外因性ミトコンドリアＤＮＡのレベル、（ｉｉ）クエン酸シンターゼ活性のレベル、（ｉｉｉ）コハク酸デヒドロゲナーゼ複合体フラボタンパク質サブユニットＡ（ＳＤＨＡ）もしくはチトクロームＣオキシダーゼ（ＣＯＸ１）タンパク質のレベル、（ｉｖ）酸素（Ｏ２）消費率、（ｖ）アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、または（ｖｉ）それらの任意の組み合わせのうちの少なくとも１つによって決定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８２】
本明細書で使用される場合、「健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞」という句は、健康な機能的ミトコンドリアを含むヒト幹細胞を指し、健康な機能的ミトコンドリアは、ヒト幹細胞とは異なる起源のものである、すなわち、これらのミトコンドリアは、外因性の供給源から得られる／由来する／単離されると理解されるべきである。ヒト幹細胞内の「外因性」、「外来性」、または「非元来」の健康な機能的ミトコンドリアの存在は、これらの細胞が該ミトコンドリアで富化されているという証拠として役立つ。平均的な当業者は、当技術分野に周知の方法に基づいて、ヒト幹細胞が異なる起源からの外因性ミトコンドリアを含むことを決定する方法を知っているであろう（例えば、Ｚａｎｄｅｒ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｆｏｒｅｎｓｉｃ  Ｓｃｉ．Ｉｎｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２０１７，Ｖｏｌ．２９，ｐａｇｅｓ  ２４２−２４９を参照されたい）。かかる方法は、ヒト幹細胞内または複数のヒト幹細胞内の異なるミトコンドリア集団間の、例えば遺伝的差異に基づき得る。例えば、ヒトにおいて、ミトコンドリアＤＮＡは、３７個の遺伝子をコードしており（Ｎａｔｕｒｅ．２９０  （５８０６）：４５７−６５）、したがって、ｍｔＤＮＡを配列決定することにより、ヒト幹細胞または複数のヒト幹細胞におけるｍｔＤＮＡの１つ、２つ以上の異なる集団の存在を容易に決定することができる。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞におけるミトコンドリアの富化のレベルは、細胞中の全ミトコンドリアＤＮＡの少なくとも統計的に代表的な部分を配列決定し、宿主／内因性ミトコンドリアＤＮＡおよび外因性ミトコンドリアＤＮＡの相対レベルを決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞中のミトコンドリアの富化のレベルは、一ヌクレオチド多型（ＳＮＰ）分析によって決定される。ある特定の実施形態では、最大のミトコンドリア集団および／もしくは最大のミトコンドリアＤＮＡ集団は、宿主／内因性ミトコンドリア集団および／もしくは宿主／内因性ミトコンドリアＤＮＡ集団であり、かつ／または２番目に大きいミトコンドリア集団および／もしくは２番目に大きいミトコンドリアＤＮＡ集団は、外因性ミトコンドリア集団および／もしくは外因性ミトコンドリアＤＮＡ集団である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００８３】
いくつかの実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、ヒト幹細胞を該健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアとインキュベートした後に、ミトコンドリア富化幹細胞を洗浄することを含む。このステップは、細胞片またはミトコンドリア膜の残遺物および幹細胞に入らなかったミトコンドリアを実質的に欠いているミトコンドリア富化幹細胞の組成物を提供する。いくつかの実施形態では、洗浄は、ヒト幹細胞を該健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアとインキュベートした後に、ミトコンドリア富化幹細胞を遠心分離することを含む。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む医薬組成物は、遊離ミトコンドリア、すなわち、幹細胞に入らなかったミトコンドリア、または他の細胞片から分離される。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む医薬組成物は、検出可能な量の遊離ミトコンドリアを含まない。
【００８４】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「ミトコンドリア病」という用語および「原発性ミトコンドリア病」という用語は、交換可能に使用され得る。本明細書で使用される場合、「原発性ミトコンドリア病」という用語は、ミトコンドリアＤＮＡの既知のもしくは明白な病原性突然変異によって、または遺伝子産物がミトコンドリアに取り込まれる核ＤＮＡの遺伝子の突然変異によって診断されるミトコンドリア病を指す。いくつかの実施形態によれば、原発性ミトコンドリア病は、先天性疾患である。いくつかの実施形態によれば、原発性ミトコンドリア病は、続発性ミトコンドリア機能障害ではない。「続発性ミトコンドリア機能障害」および「後天性ミトコンドリア機能障害」という用語は、本出願を通して交換可能に使用される。
【００８５】
いくつかの実施形態によれば、原発性ミトコンドリア病は、影響を受けた細胞における正常以下のミトコンドリアパラメーターを特徴とする。いくつかの実施形態によれば、影響を受けた細胞は、（ｉ）         正常以下の酸素（Ｏ２）消費率、（ｉｉ）正常以下のクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル、（ｉｉｉ）正常以下のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを有する。
【００８６】
本明細書で使用される場合、「正常以下の酸素（Ｏ２）消費率」という用語は、ミトコンドリア病に罹患していない対象または複数の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアに見られる酸素（Ｏ２）消費率に由来するまたはそれに対応する対照酸素（Ｏ２）消費率よりも実質的に低い酸素（Ｏ２）消費率を指す。
【００８７】
本明細書で使用される場合、「正常以下のクエン酸シンターゼの含有量または活性レベル」という用語は、ミトコンドリア病に罹患していない対象または複数の対象のクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルに由来するかまたはそれに対応するクエン酸シンターゼの対照含有量値または活性レベルよりも実質的に低いクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを指す。
【００８８】
本明細書で使用される場合、「正常以下のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率」という用語は、ミトコンドリア病に罹患していない対象または複数の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアに見られるアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率に由来するかまたはそれに対応する対照アデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率よりも実質的に低いアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率を指す。
【００８９】
ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「実質的に低い」という用語は、正常値を下回る統計的に有意な減少を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「実質的に低い」という用語は、病理学的減少、すなわち、実質的に低い値に関連する少なくとも１つの病理学的症状が明らかになるレベルを指す。
【００９０】
ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「正常以下」という用語は、ミトコンドリア病に罹患していない対象または複数の対象の対応する細胞または対応するミトコンドリアに見られる対応する値よりも少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍低い値を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９１】
ある特定の実施形態では、原発性ミトコンドリア病または障害は、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異に関連している。本明細書で使用される場合、「ミトコンドリアＤＮＡの突然変異に関連する」という句は、一般に、ミトコンドリア病または障害の病因が、少なくとも部分的に、ミトコンドリア分子をコードするミトコンドリアＤＮＡのコード領域の突然変異または一群の突然変異に作動可能に関連していることを意味する。
【００９２】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリアＤＮＡの突然変異に関連しているミトコンドリア病または障害は、ピアソン症候群（ＰＳ）；カーンズ・セイヤー症候群（ＫＳＳ）；ミトコンドリア脳症、乳酸アシドーシス、および脳卒中様発作（ＭＥＬＡＳ）症候群；レーバー遺伝性視神経症（ＬＨＯＮ）；ニューロパチー、運動失調、および色素性網膜炎（ＮＡＲＰ）症候群；赤色ぼろ線維を伴うミオクローヌスてんかん（ＭＥＲＲＦ）症候群；母性遺伝性糖尿病および難聴（ＭＩＤＤ）；アルパース様症候群；慢性進行性外眼筋麻痺（ＣＰＥＯ）；ミトコンドリアＤＮＡ関連型の先天性乳酸アシドーシス（ＣＬＡ）；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群（ＭＤＤＳ）；ならびにミトコンドリアＤＮＡ関連型のリー症候群からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９３】
ある特定の実施形態では、原発性ミトコンドリア病または障害は、核ＤＮＡの突然変異に関連している。本明細書で使用される場合、「核ＤＮＡの突然変異に関連する」という句は、一般に、ミトコンドリア病または障害の病因が、少なくとも部分的に、ミトコンドリア分子をコードする核ＤＮＡのコード領域の突然変異または一群の突然変異に作動可能に関連していることを意味する。「ミトコンドリア分子」という用語は、一般に、健康な機能的ミトコンドリアにおいて送達されるおよび／または活性であるおよび／または見出される任意の分子を指す。かかる分子は、核酸分子、タンパク質分子、酵素分子などであり得る。いくつかの実施形態では、原発性ミトコンドリア病または障害は、ＯＸＰＨＯＳタンパク質を直接コードするか、またはＯＸＰＨＯＳプロセスを実行するために必要な複雑な機構の産生に影響を与えることによって間接的にＯＸＰＨＯＳ機能に影響を与える核ＤＮＡの遺伝子の突然変異に関連する。
【００９４】
ある特定の実施形態では、核ＤＮＡの突然変異に関連している原発性ミトコンドリア病または障害は、ミトコンドリア神経胃腸脳症（ＭＮＧＩＥ）症候群；アルパース症候群；フリードライヒ運動失調症（ＦＡ）；進行性外眼筋麻痺（ＰＥＯ）；鉄芽球性貧血；運動失調ニューロパチー症候群（ＡＮＳ）；メンデルの神経変性ミトコンドリア病；３−メチルグルタコン酸尿症（ＭＥＧ）難聴（Ｄ）、脳症（Ｅ）およびリー様病（Ｌ）（ＭＥＧＤＥＬ）症候群；ゼンガー症候群；微小変化群ネフローゼ症候群（ＭＣＮＳ）；核ＤＮＡ関連型の先天性乳酸アシドーシス（ＣＬＡ）；ミトコンドリアＤＮＡ枯渇症候群（ＭＤＤＳ）および核ＤＮＡ関連型のリー症候群からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９５】
ある特定の実施形態では、ＡＮＳは、ミトコンドリア劣性運動失調症候群（ＭＩＲＡＳ）；てんかんを伴う脊髄小脳性運動失調（ＳＣＡＥ）；感覚性運動失調ニューロパチー構音障害および眼筋麻痺（ＳＡＮＤＯ）；ならびにミオクローヌスてんかんミオパチー感覚性運動失調症（ＭＥＭＳＡ）からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【００９６】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア病または障害は、後天性ミトコンドリア機能障害に関連している。本明細書で使用される場合、「後天性ミトコンドリア機能障害に関連する」という句は、一般に、ミトコンドリア病または障害が成人期に症候性になり、時間とともに悪化し、かつ／またはミトコンドリア分子をコードするミトコンドリアまたは核ＤＮＡのコード領域の突然変異または一群の突然変異に必ずしも作動可能に関連しているとは限らないことを意味する。
【００９７】
ある特定の実施形態では、後天性ミトコンドリア機能障害に関連しているミトコンドリア病または障害は、成人期に症候性になる。ある特定の実施形態では、後天性ミトコンドリア機能障害に関連しているミトコンドリア病または障害は、時間とともに悪化する。ある特定の実施形態では、後天性ミトコンドリア機能障害に関連しているミトコンドリア病または障害は、ミトコンドリア分子をコードするミトコンドリアまたは核ＤＮＡのコード領域の突然変異または一群の突然変異に作動可能に関連していないか、または部分的にしか関連していない。ある特定の実施形態では、患者は成人である。ある特定の実施形態では、患者は２０歳超である。ある特定の実施形態では、患者は、３０、４０、５０、６０または７０歳超である。
【００９８】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア病または障害は、腎臓、肝臓、脳、筋肉、膵臓、眼、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される器官に関連している。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア病または障害は、腎臓に関連している。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア病または障害は、肝臓に関連している。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア病または障害は、脳に関連している。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア病または障害は、筋肉に関連している。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア病または障害は、心臓に関連している。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア病または障害は、膵臓に関連している。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア病または障害は、眼に関連している。
【００９９】
ある特定の実施形態では、症状は、歩行能力障害、運動技能障害、言語技能障害、記憶障害、体重増加障害、発育不良、低血中アルカリホスファターゼレベル、低血中マグネシウムレベル、高血中クレアチニンレベル、低血中重炭酸塩レベル、低血中塩基過剰レベル、高尿中グルコース／クレアチニン比、高尿中塩化物／クレアチニン比、高尿中ナトリウム／クレアチニン比、高血中乳酸レベル、高尿マグネシウム／クレアチニン比、高尿中カリウム／クレアチニン比、高尿中カルシウム／クレアチニン比、糖尿、マグネシウム尿、高血中尿素レベル、低Ｃ−ペプチドレベル、高ＨｂＡ１Ｃレベル、副甲状腺機能低下症、眼瞼下垂、聴力損失、心伝導障害、低ＡＴＰ含有量、およびリンパ球における酸素消費量からなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。症状を「高」および「低」と定義することは、それぞれ「正常より検出可能に高い」および「正常より検出可能に低い」に対応し、正常レベルは、ミトコンドリア病に罹患していない複数の対象における対応するレベルであることを理解されたい。
【０１００】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、特定の組織または器官に投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１０４個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約１０４〜約１０８個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。
【０１０１】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、非経口投与によって投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、全身投与によって投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内注射によって投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、静脈内注入によって投与される。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、少なくとも１０５個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、約１０６〜約１０８個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１０５〜２＊１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり少なくとも約１０５個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり約１０５〜約２＊１０７個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。ある特定の実施形態では、医薬組成物は、患者の体重１キログラムあたり約１０６〜約５＊１０６個のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む。
【０１０２】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、富化前に患者から得られるかまたは由来する。さらなる実施形態では、富化前に患者から得られるかまたは由来するヒト幹細胞は、（ｉ）正常以下の酸素（Ｏ２）消費率、（ｉｉ）正常以下のクエン酸シンターゼの含有量もしくは活性レベル、（ｉｉｉ）正常以下のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、または（ｉｖ）（ｉ）、（ｉｉ）、および（ｉｉｉ）の任意の組み合わせを有する。
【０１０３】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞は、富化前に患者とは異なるドナーから得られるかまたは由来する。
【０１０４】
ある特定の実施形態では、ドナーは、少なくとも部分的に患者とヒト白血球抗原（ＨＬＡ）適合する。ある特定の実施形態では、上記の方法は、患者とミトコンドリア富化ヒト幹細胞との間の有害な免疫原性反応を防止、遅延、最小化、または無効にする薬剤を患者に投与するステップをさらに含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、有害な免疫原性反応は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。
【０１０５】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、ＣＤ３４＋である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、造血幹細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、間葉系幹細胞である。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）または人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）である。本明細書で使用される場合、「多能性幹細胞（ＰＳＣ）」という用語は、無制限に増殖することができ、また体内に複数の細胞型を生じさせることができる細胞を指す。本明細書で使用される場合、「人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）」という用語は、ヒト成体体細胞から生成することができる一種の多能性幹細胞を指す。いくつかの実施形態では、ＰＳＣは非胚性幹細胞である。特定の実施形態では、ヒト胚性幹細胞は、特許請求の範囲から明示的に除外されることが明確に理解されるべきである。本明細書で使用される場合、「胚性幹細胞（ＥＳＣ）」という用語は、胚盤胞の内部細胞塊に由来する一種の全能性幹細胞を指す。全能性幹細胞は、体内の他のすべての細胞型を生じさせることができる細胞である。
【０１０６】
本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、それらの起源に関係なく、ＣＤ３４陽性であると特徴付けられる幹細胞を指す。この用語はさらに、幹細胞から得られるか、または骨髄から動員されるか、または臍帯血から得られるＣＤ３４陽性であると特徴付けられる造血幹細胞を指す。本明細書で使用される場合、「ＣＤ３４＋細胞」という用語は、表面マーカータンパク質ＣＤ３４を発現する細胞を意味する。ＣＤ３４の発現は、ＣＤ３４に対する抗体を使用した免疫蛍光分析またはＦＡＣＳ分析によって決定することができる。
【０１０７】
ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、臍帯細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、骨髄細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、造血細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、間葉系幹細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、内皮前駆細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、血管の内皮細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、肥満細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、亜集団樹状細胞（第ＸＩＩＩａ因子陰性である）である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、長期造血幹細胞（ＬＴ−ＨＳＣ）である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、ヒトＨＳＣ細胞である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、対象に対して同種異系であり、該ＣＤ３４＋細胞は、患者に対してＨＬＡ適合である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、患者とＨＬＡ適合である。ある特定の実施形態では、ＣＤ３４＋細胞は、患者に対して自家である。
【０１０８】
ある特定の実施形態では、ミトコンドリア富化ヒト幹細胞は、凍結−解凍した健康な機能的外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入することによって得られる。ある特定の実施形態では、上記の方法は、ヒト幹細胞を単離する、由来する、または得る前ステップ、および健康な機能的外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入し、したがってミトコンドリア富化ヒト幹細胞を産生する前ステップをさらに含む。いくつかの実施形態では、上記の方法は、健康な機能的外因性ミトコンドリアを細胞に導入する前に、ヒト幹細胞からＣＤ３４陽性細胞を選択するステップをさらに含む。ＣＤ３４陽性細胞の選択は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳまたはＰｒｏｄｉｇｙシステム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ）を含むがこれらに限定されない、当技術分野で既知の方法によって行うことができる。
【０１０９】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、凍結−解凍した健康な機能的外因性ミトコンドリアを該ヒト幹細胞に導入する前に、少なくとも１回の凍結−解凍サイクルを受けている。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）ヒト幹細胞を凍結すること、（ｂ）ヒト幹細胞を解凍すること、および（ｃ）健康な機能的外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入することを含む。
【０１１０】
いくつかの実施形態では、本方法は、健康な機能的外因性ミトコンドリアでの富化の前または後に幹細胞を拡大することをさらに含む。いくつかの実施形態では、本方法は、第１の組成物の幹細胞を、幹細胞を拡大させることができる培養または増殖培地中で該細胞を培養することによって、拡大させることをさらに含む。他の実施形態では、本方法は、第４の組成物のミトコンドリア富化幹細胞を、幹細胞を拡大させることができる培養または増殖培地中で該細胞を培養することによって、拡大させることをさらに含む。本出願を通して使用される場合、「培養または増殖培地」という用語は、細胞培養培地、細胞成長培地、細胞に栄養を提供する緩衝液などの流体培地である。本出願を通して、および特許請求の範囲で使用される場合、「医薬組成物」という用語は、細胞培養培地、細胞成長培地、細胞に栄養を提供する緩衝液などの流体担体を含む。
【０１１１】
本発明の原理によれば、健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化する前にヒト幹細胞を凍結する可能性は、例えば、健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化する前に、ヒト幹細胞のある特定の属性を試験するのに十分な時間を提供する、かつ／またはヒト幹細胞の貯蔵期間を延長する、かつ／またはヒト幹細胞を容易に分布させることができるため、有益である。
【０１１２】
本発明の原理によれば、健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化した後にヒト幹細胞を凍結する可能性は、例えば、健康な機能的な外因性ミトコンドリアで富化した後に、富化ヒト幹細胞のある特定の属性を試験するのに十分な時間を提供する、かつ／または富化ヒト幹細胞の貯蔵期間を延長する、かつ／または富化ヒト幹細胞を容易に分布させることができるため、有益である。
【０１１３】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、骨髄、脂肪組織、口腔粘膜、皮膚線維芽細胞、血液、または臍帯血の細胞から単離されるか、由来するか、または得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、骨髄からまたは骨髄の細胞から単離されるか、由来するか、または得られる。
【０１１４】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、健康な機能的外因性ミトコンドリアを好適な供給源から単離または得る前ステップ、および健康な機能的外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入し、したがってミトコンドリア富化ヒト幹細胞を産生する前ステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、本方法は、（ａ）健康な機能的外因性ミトコンドリアを凍結すること、（ｂ）健康な機能的外因性ミトコンドリアを解凍すること、および（ｃ）健康な機能的外因性ミトコンドリアをヒト幹細胞に導入することを含む。
【０１１５】
本発明の原理によれば、ヒト幹細胞を富化する前に健康な機能的外因性ミトコンドリアを凍結する可能性は、例えば、ヒト幹細胞を富化する前に、健康な機能的外因性ミトコンドリアの機能性および／もしくはある特定の属性を試験するのに十分な時間を提供する、ならびに健康な機能的外因性ミトコンドリアの貯蔵期間を延長する、かつ／または健康な機能的外因性ミトコンドリアを容易に分布させることができるため、ミトコンドリア増強療法プロセスにとって重要である。
【０１１６】
いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、凍結−解凍サイクルを受けていない対照ミトコンドリアと比較して、解凍後に同等の酸素消費率を示す。
【０１１７】
いくつかの実施形態によれば、凍結−解凍サイクルは、該機能的ミトコンドリアを解凍前に少なくとも２４時間凍結することを含む。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクルは、該機能的ミトコンドリアを解凍前に少なくとも１ヶ月間、解凍前に数ヶ月以上凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクル後の機能的ミトコンドリアの酸素消費量は、凍結−解凍サイクル前の機能的ミトコンドリアの酸素消費量と等しいかまたはそれよりも高い。
【０１１８】
本明細書で使用される場合、「凍結−解凍サイクル」という用語は、機能的ミトコンドリアを０  ℃を下回る温度に凍結し、ミトコンドリアを０℃を下回る温度で所定の期間維持し、ミトコンドリアを室温または体温またはミトコンドリアによる幹細胞の処理を可能にする０℃超の任意の温度に解凍することを指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。本明細書で使用される場合、「室温」という用語は、典型的には、１８℃〜２５℃の温度を指す。本明細書で使用される場合、「体温」という用語は、３５．５℃〜３７．５℃、好ましくは３７℃の温度を指す。別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、機能的ミトコンドリアである。
【０１１９】
別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、−７０℃以下の温度で凍結された。別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、少なくとも−２０℃以下の温度で凍結された。別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、少なくとも−４℃以下の温度で凍結された。別の実施形態によれば、ミトコンドリアの凍結は、漸進的である。いくつかの実施形態によれば、ミトコンドリアの凍結は、瞬間凍結による。本明細書で使用される場合、「瞬間凍結」という用語は、ミトコンドリアを低温貯蔵温度に供することによって急速に凍結することを指す。
【０１２０】
別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも３０分間凍結された。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクルは、機能的ミトコンドリアを解凍前に少なくとも３０、６０、９０、１２０、１８０、２１０分間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、２４、４８、７２、９６、または１２０時間凍結された。各凍結時間は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも４、５、６、７、３０、６０、１２０、３６５日間凍結された。各凍結時間は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクルは、解凍前に機能的ミトコンドリアを少なくとも１、２、３週間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクルは、解凍前に機能的ミトコンドリアを少なくとも１、２、３、４、５、６ヶ月間凍結することを含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２１】
別の実施形態では、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、解凍前に少なくとも３０分間−７０℃で凍結された。いかなる理論または機構によっても拘束されることを望むものではないが、ミトコンドリアを凍結し、それらを長期間後に解凍する可能性は、長期間の貯蔵後でも再現性のある結果をもって、ミトコンドリアの容易な貯蔵および使用を可能にする。
【０１２２】
一実施形態によれば、解凍は、室温である。別の実施形態では、解凍は、体温である。別の実施形態によれば、解凍は、本発明の方法によるミトコンドリアの投与を可能にする温度である。別の実施形態によれば、解凍は、漸進的に実行される。
【０１２３】
別の実施形態によれば、凍結融解サイクルを受けたミトコンドリアは、凍結緩衝液中で凍結された。別の実施形態によれば、凍結−解凍サイクルを受けたミトコンドリアは、単離緩衝液中で凍結された。本明細書で使用される場合、「単離緩衝液」という用語は、本発明のミトコンドリアが単離されている緩衝液を指す。非限定的な例では、単離緩衝液はスクロース緩衝液である。いかなる機構または理論によっても拘束されることを望むものではないが、単離緩衝液中でミトコンドリアを凍結すると、凍結前に単離緩衝液を凍結緩衝液に交換するか、または解凍時に凍結緩衝液を交換する必要がないため、時間および単離ステップが省ける。
【０１２４】
別の実施形態によれば、凍結緩衝液は、抗凍結剤を含む。いくつかの実施形態によれば、抗凍結剤は、糖、オリゴ糖、または多糖である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。別の実施形態によれば、凍結緩衝液中の糖濃度は、ミトコンドリア機能を保存するように作用する十分な糖濃度である。別の実施形態によれば、単離緩衝液は、糖を含む。別の実施形態によれば、単離緩衝液中の糖濃度は、ミトコンドリア機能を保存するように作用する十分な糖濃度である。別の実施形態によれば、糖は、スクロースである。
【０１２５】
ある特定の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、胎盤、培養で成長させた胎盤細胞、または血液細胞から単離されるかまたは得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１２６】
いくつかの態様によれば、本発明は、原発性ミトコンドリア病、障害、またはそれらの症状の治療を必要とする患者において、それらを治療する方法を提供し、本方法は、患者に複数のヒトＣＤ３４＋幹細胞を含む医薬組成物を投与するステップを含み、ヒトＣＤ３４＋幹細胞は、ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がない凍結−解凍した健康な機能的外因性ミトコンドリアで富化され、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、ミトコンドリア富化ヒトＣＤ３４＋幹細胞中の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を構成する。
【０１２７】
別の態様では、本発明はさらに、健康な機能的外因性ミトコンドリアでヒト幹細胞を富化するためのエクスビボ法を提供し、本方法は、（ｉ）原発性ミトコンドリア病、障害、またはそれらの症状に罹患している患者からの複数のヒト幹細胞を含む第１の組成物を提供するステップ、（ｉｉ）ミトコンドリアＤＮＡに病原性突然変異がないドナーから得られた複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物を提供するステップ、（ｉｉｉ）第１の組成物のヒト幹細胞を第２の組成物の健康な機能的外因性ミトコンドリアと接触させ、したがって第３の組成物を提供するステップ、（ｉｖ）健康な機能的外因性ミトコンドリアがヒト幹細胞に入るのを可能にする条件下で、第３の組成物をインキュベートし、それにより該健康な機能的外因性ミトコンドリアで該ヒト幹細胞を富化し、したがってミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む第４の組成物を提供するステップを含み、健康な機能的外因性ミトコンドリアは、第４の組成物の全ミトコンドリアの少なくとも３％かつ３３％未満を含む。
【０１２８】
本明細書で使用される場合、「エクスビボ法」という用語は、人体外でのみ実行されるステップを含む任意の方法を指す。特に、エクスビボ法は、後に治療される対象に再導入または移植される体外の細胞の操作を含む。
【０１２９】
「接触する」という用語は、ミトコンドリアおよび細胞の組成物を十分に近接させて、ミトコンドリアが細胞に入るのを促進することを指す。ミトコンドリアを幹細胞に「導入する」という用語は、接触するという用語と交換可能に使用される。
【０１３０】
いくつかの実施形態によれば、健康な機能的外因性ミトコンドリアでヒト幹細胞を富化するための方法は、細胞の膜電位を測定することを含まない。
【０１３１】
いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．０４４〜最大１７６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．０８８〜最大１７６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。他の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．２〜最大１５０ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。他の実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．４〜最大１００ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．６〜最大８０ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．７〜最大５０ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．８〜最大２０ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．８８〜最大１７．６ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。いくつかの実施形態では、健康な機能的外因性ミトコンドリアによる幹細胞の富化は、百万個の細胞あたり少なくとも０．９〜最大１５ミリユニットのＣＳ活性のミトコンドリアの用量を幹細胞に導入することを含む。
【０１３２】
ミトコンドリアの用量は、本明細書で説明するように、健康な機能的ミトコンドリアの量の他の定量化可能な測定値のＣＳ活性ユニットまたはｍｔＤＮＡコピー数で表すことができる。「ＣＳ活性の単位」は、１ｍＬの反応体積で１分間に１マイクロモルの基質の変換を可能にする量として定義される。
【０１３３】
別の態様では、本発明はさらに、上記のミトコンドリア富化ヒト幹細胞を含む医薬組成物を患者に投与するステップを含む、原発性ミトコンドリア病または障害またはそれらの症状の治療を必要とするヒト患者においてそれらを治療する方法を提供する。
【０１３４】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア病に罹患している患者から得られた幹細胞」という句は、患者から単離された時点で患者の幹細胞であった細胞を指す。
【０１３５】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア病に罹患している患者に由来する幹細胞」という句は、患者の幹細胞ではなく、幹細胞になるように操作された細胞を指す。この句はさらに、異なる種類の幹細胞になるように操作されたある特定の種類の幹細胞を含む。本明細書で使用される場合、「操作された」という用語は、体細胞を未分化状態に再プログラミングし、人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）になり、任意選択で、骨髄細胞（Ｘｕ  Ｙ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２，ＰＬｏＳ  ＯＮＥ，Ｖｏｌ．７（４），ｐａｇｅ  ｅ３４３２１）などの所望の系統または集団の細胞になるようにｉＰＳｃをさらに再プログラミングする（Ｃｈｅｎ  Ｍ．ｅｔ  ａｌ．，ＩＯＶＳ，２０１０，Ｖｏｌ．５１（１１），ｐａｇｅｓ  ５９７０−５９７８）ための、この分野で既知の方法のいずれか１つ（Ｙｕ  Ｊ．ｅｔ  ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００７，Ｖｏｌ．３１８（５８５８），ｐａｇｅｓ  １９１７−１９２０）を使用することを指す。
【０１３６】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア病に罹患している患者」という用語は、ミトコンドリア病と診断された、ミトコンドリア病を有すると疑われる、またはミトコンドリア病を発症するリスク群にあるヒト対象を指す。ある特定のミトコンドリア病は遺伝性であるため、ミトコンドリア病の遺伝的保因者またはミトコンドリア病と診断された対象の子孫は、ミトコンドリア病を発症するリスク群と見なされる。
【０１３７】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア病に罹患していない対象／ドナー」という用語は、ミトコンドリア病と診断されない、ミトコンドリア病を有すると疑われない、かつ／またはミトコンドリア病を発症するリスク群にないヒト対象を指す。本用語はさらに、ミトコンドリアＤＮＡに突然変異がない対象および／またはミトコンドリアに移動した分子（例えば、タンパク質またはＲＮＡ分子）をコードする核ＤＮＡに突然変異がない対象を含む。
【０１３８】
本明細書で使用される場合、「単離された健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリア」という用語は、ミトコンドリア病に罹患していない対象から得られた細胞から得られたかまたは由来する無傷のミトコンドリアを指す。本用語はさらに、ミトコンドリアＤＮＡに突然変異を持たない対象から得られた機能的ミトコンドリアを含む。いくつかの実施形態では、かかるミトコンドリアは外因性ミトコンドリアである。ミトコンドリアの文脈において、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「単離された」という用語は、該供給源に見出される他の構成要素から少なくとも部分的に精製されたミトコンドリアを含む。ある特定の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の２０％〜８０％、２０〜７０％、４０〜７０％、２０〜４０％、または２０〜３０％である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、試料内の細胞タンパク質の総量の２０％〜８０％である。ある特定の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内分画の合計重量の２０％〜８０％である。他の実施形態では、複数の単離された健康な機能的外因性ミトコンドリアを含む第２の組成物中のミトコンドリアタンパク質の総量は、ミトコンドリアおよび他の細胞内分画の合計重量の８０％を超える。
【０１３９】
本明細書で使用される場合、「ヒト機能的ミトコンドリアがヒト幹細胞に入るのを可能にする条件」という句は、一般に、時間、温度、およびミトコンドリアとヒト幹細胞との間の近接性などのパラメーターを指す。かかる条件は、本発明によって提供される。
【０１４０】
ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、約１６〜約３７℃の範囲の温度で、０．５〜３０時間の範囲の時間にわたって、健康な機能的外因性ミトコンドリアとともにインキュベートされる。ある特定の実施形態では、ヒト幹細胞は、１〜３０または５〜２５時間の範囲の時間にわたって、健康な機能的外因性ミトコンドリアとともにインキュベートされる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態では、インキュベーションは、２０〜３０時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、少なくとも１、５、１０、１５、または２０時間である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。他の実施形態では、インキュベーションは、最大５、１０、１５、２０、または３０時間である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態では、インキュベーションは２４時間である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、室温（１６℃〜３０℃）である。他の実施形態では、インキュベーションは３７℃である。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、５％ＣＯ２雰囲気中である。他の実施形態では、インキュベーションは、空気中に見られるレベルを超える追加のＣＯ２を含まない。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、幹細胞中のミトコンドリア含有量が、それらの初期ミトコンドリア含有量と比較して平均して１％〜４５％増加するまでである。
【０１４１】
インキュベーションの条件を操作することにより、産物の特徴を操作することができる。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、３７℃で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも６時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、少なくとも１２時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、１２〜２４時間実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、４．４ミリユニットのＣＳを有するかまたは示す外因性ミトコンドリアの量あたり１＊１０５〜１＊１０７個のナイーブ幹細胞の比率で実行される。ある特定の実施形態では、インキュベーションは、４．４ミリユニットのＣＳを有するかまたは示す外因性ミトコンドリアの量あたり１＊１０６個のナイーブ幹細胞の比率で実行される。ある特定の実施形態では、条件は、ＣＳ活性によって決定されるように、ナイーブ幹細胞のミトコンドリア含有量を少なくとも約３％、５％、または１０％増加させるのに十分である。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１４２】
本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア含有量」という用語は、細胞内のミトコンドリアの量を指す。いくつかの実施形態では、インキュベーションは、細胞の生存を支援する培地中である。いくつかの実施形態では、培地は、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）である。他の実施形態では、培地は、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）を含有する生理食塩水である。いくつかの実施形態では、生理食塩水は、１％〜１０％のＨＳＡを含有する。さらなる実施形態では、生理食塩水は、３〜６％のＨＳＡを含有する。さらに別の実施形態では、生理食塩水は、４．５％のＨＳＡを含有する。特定の実施形態では、幹細胞と健康な機能的ミトコンドリアとのインキュベーションは、１６〜３０℃の範囲の温度で、１５〜３０時間の範囲の時間、３〜６％のＨＳＡを含有する生理食塩水中であり、空気中で見られるレベルを超える追加のＣＯ２を含まない。
【０１４３】
ある特定の実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、幹細胞と外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に遠心分離をさらに含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。いくつかの実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、幹細胞と外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に単一遠心分離ステップを含む。いくつかの実施形態では、遠心力は１０００ｇ〜８５００ｇの範囲である。いくつかの実施形態では、遠心力は２０００ｇ〜４０００ｇの範囲である。いくつかの実施形態では、遠心力は２５００ｇを超える。いくつかの実施形態では、遠心力は２５００ｇ〜８５００ｇの範囲である。いくつかの実施形態では、遠心力は２５００ｇ〜８０００ｇの範囲である。いくつかの実施形態では、遠心力は３０００ｇ〜８０００ｇの範囲である。他の実施形態では、遠心力は４０００ｇ〜８０００ｇの範囲である。特定の実施形態では、遠心力は７０００ｇである。他の実施形態では、遠心力は８０００ｇである。いくつかの実施形態では、遠心分離は２分〜３０分の範囲の時間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、遠心分離は３分〜２５分の範囲の時間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、遠心分離は５分〜２０分の範囲の時間にわたって実行される。いくつかの実施形態では、遠心分離は８分〜１５分の範囲の時間にわたって実行される。
【０１４４】
いくつかの実施形態では、遠心分離は、４〜３７℃の範囲の温度で実行される。ある特定の実施形態では、遠心分離は、４〜１０℃または１６〜３０℃の範囲の温度で実行される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。特定の実施形態では、遠心分離は２〜６℃で実行される。特定の実施形態では、遠心分離は４℃で実行される。いくつかの実施形態では、その様々な実施形態における上記の方法は、幹細胞と外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に単一遠心分離、続いて細胞を３０℃より低い温度で静止させることを含む。いくつかの実施形態では、ヒト機能的ミトコンドリアがヒト幹細胞に入るのを可能にする条件は、幹細胞と外因性ミトコンドリアとのインキュベーションの前、インキュベーション中、またはインキュベーションの後に単一遠心分離、続いて１６〜２８℃の範囲の温度で細胞を静止させることを含む。
【０１４５】
ある特定の実施形態では、第１の組成物は新鮮である。ある特定の実施形態では、第１の組成物は、凍結され、次いでインキュベーションの前に解凍された。ある特定の実施形態では、第２の組成物は新鮮である。ある特定の実施形態では、第２の組成物は、凍結され、次いでインキュベーションの前に解凍された。ある特定の実施形態では、第４の組成物は新鮮である。ある特定の実施形態では、第４の組成物は、凍結され、次いで投与の前に解凍された。
【０１４６】
いくつかの実施形態では、第４の組成物中の幹細胞は、第１の組成物中の幹細胞と比較して、（ｉ）増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量、（ｉｉ）増加したＣＳ、ＣＯＸ１、およびＳＤＨＡからなる群から選択された少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質の含有量、（ｉｉｉ）増加した酸素（Ｏ２）消費率、（ｉｖ）増加したクエン酸シンターゼの活性レベル、（ｖ）増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率、または（ｖｉ）（ｉ）、（ｉｉ）、（ｉｉｉ）、（ｉｖ）および（ｖ）の任意の組み合わせを有する。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。これらの様々なパラメーターを決定するための方法は、当技術分野で周知である。
【０１４７】
本明細書で使用される場合、「増加したミトコンドリアＤＮＡ含有量」という用語は、ミトコンドリア富化前の、第１の組成物中のミトコンドリアＤＮＡ含有量よりも検出可能に高いミトコンドリアＤＮＡの含有量を指す。ミトコンドリアＤＮＡ含有量は、核遺伝子に対して正規化された、ミトコンドリア富化の前後のミトコンドリア遺伝子の定量的ＰＣＲを実行することによって測定され得る。
【０１４８】
本明細書で使用される場合、「増加した少なくとも１つのミトコンドリアタンパク質含有量」という用語は、ミトコンドリア富化前の第１の組成物中の該ミトコンドリアタンパク質の含有量よりも検出可能に高い、核コード化またはミトコンドリアコード化のいずれかのミトコンドリアタンパク質、例えば、ＣＳ、ＣＯＸ１、およびＳＤＨＡの含有量を指す。
【０１４９】
本明細書で使用される場合、「増加した酸素（Ｏ２）消費率」という用語は、ミトコンドリア富化前の第１の組成物における酸素（Ｏ２）消費率よりも検出可能に高い酸素（Ｏ２）消費率を指す。
【０１５０】
本明細書で使用される場合、「増加したクエン酸シンターゼ含有量または活性レベル」という用語は、ミトコンドリア富化前の第１の組成物中のクエン酸シンターゼの含有量値または活性レベルよりも検出可能に高いクエン酸シンターゼの含有量または活性レベルを指す。
【０１５１】
本明細書で使用される場合、「増加したアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率」という用語は、ミトコンドリア富化前の第１の組成物中のアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率よりも検出可能に高いアデノシン三リン酸（ＡＴＰ）産生率を指す。
【０１５２】
ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出可能に高い」という用語は、正常値と増加した値との間の統計的に有意な増加を指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「検出可能に高い」という用語は、非病理学的増加、すなわち、実質的に高い値に関連する病理学的症状が明らかにならないレベルを指す。ある特定の実施形態では、本明細書で使用される場合、「増加した」という用語は、複数の健康な対象の対応する細胞もしくは対応するミトコンドリア、またはミトコンドリア富化前の第１の組成物の幹細胞に見られる対応する値よりも１．０５倍、１．１倍、１．２５倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍以上高い値を指す。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１５３】
特定の状況では、ミトコンドリア富化前の同じ細胞は、ＣＳおよびＡＴＰ活性を測定し、富化レベルを決定するための対照として機能する。
【０１５４】
クエン酸シンターゼ（ＣＳ）は、ミトコンドリアマトリックスに局在するが、核ＤＮＡによってコードされている。クエン酸シンターゼは、クレブス回路の第１のステップに関与し、無傷のミトコンドリアの存在の定量的酵素マーカーとして一般的に使用される（Ｌａｒｓｅｎ  Ｓ．ｅｔ  ａｌ．，２０１２，Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，Ｖｏｌ．５９０（１４），ｐａｇｅｓ  ３３４９−３３６０；Ｃｏｏｋ  Ｇ．Ａ．ｅｔ  ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ．，１９８３，Ｖｏｌ．７６３（４），ｐａｇｅｓ  ３５６−３６７）。ある特定の実施形態では、第１の組成物または第４の組成物中の幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの含有量を決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、第１の組成物または第４の組成物中の幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの活性レベルを決定することによって決定される。ある特定の実施形態では、第１の組成物または第４の組成物中の幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの含有量と相関する。ある特定の実施形態では、第１の組成物または第４の組成物中の幹細胞のミトコンドリア含有量は、クエン酸シンターゼの活性レベルと相関する。ＣＳ活性は、例えば、ＣＳ活性キットＣＳ０７２０（Ｓｉｇｍａ）を使用することによって測定することができる。
【０１５５】
真核生物のＮＡＤＰＨ−チトクロームＣレダクターゼ（チトクロームＣレダクターゼ）は、小胞体に局在するフラボタンパク質である。それは電子をＮＡＤＰＨからいくつかのオキシゲナーゼに移動し、その中で最も重要なのは生体異物の解毒に関与するチトクロームＰ４５０ファミリーの酵素である。チトクロームＣレダクターゼは、小胞体マーカーとして広く使用されている。ある特定の実施形態では、第２の組成物は、チトクロームＣレダクターゼまたはチトクロームＣレダクターゼ活性を実質的に含まない。ある特定の実施形態では、第４の組成物は、第１の組成物と比較して、チトクロームＣレダクターゼまたはチトクロームＣレダクターゼ活性で富化されていない。
【０１５６】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、骨髄造血細胞を含む。本明細書で使用される場合、「骨髄造血細胞」という用語は、骨髄造血、例えば、骨髄およびそれから生じるすべての細胞、すなわち、すべての血液細胞の産生に関与する細胞を指す。
【０１５７】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、赤血球生成細胞を含む。本明細書で使用される場合、「赤血球生成細胞」という用語は、赤血球生成、例えば、赤血球（ｒｅｄ  ｂｌｏｏｄ  ｃｅｌｌ）（赤血球（ｅｒｙｔｈｒｏｃｙｔｅ））の産生に関与する細胞を指す。
【０１５８】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）を含む。本明細書で使用される場合、「多能性造血幹細胞」または「造血芽細胞」という用語は、造血のプロセスを通じて他のすべての血液細胞を生じさせる幹細胞を指す。
【０１５９】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、一般的な骨髄系前駆細胞、一般的なリンパ球系前駆細胞、またはそれらの任意の組み合わせを含む。本明細書で使用される場合、「一般的な骨髄系前駆細胞」という用語は、骨髄系細胞を生成する細胞を指す。本明細書で使用される場合、「一般的なリンパ球系前駆細胞」という用語は、リンパ球を生成する細胞を指す。
【０１６０】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は、巨核球、赤血球、肥満細胞、骨髄芽球、好塩基球、好中球、好酸球、単球、マクロファージ、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、小リンパ球、Ｔリンパ球、Ｂリンパ球、形質細胞、細網細胞、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１６１】
ある特定の実施形態では、幹細胞は間葉系幹細胞を含む。本明細書で使用される場合、「間葉系幹細胞」という用語は、骨芽細胞（骨細胞）、軟骨細胞（ｃｈｏｎｄｒｏｃｙｔｅ）（軟骨細胞（ｃａｒｔｉｌａｇｅ  ｃｅｌｌ））、筋細胞（筋肉細胞）、および脂肪細胞（ａｄｉｐｏｃｙｔｅ）（脂肪細胞（ｆａｔ  ｃｅｌｌ））を含む、様々な細胞型に分化することができる、多能性間質細胞を指す。
【０１６２】
ある特定の実施形態では、幹細胞は、骨髄造血細胞からなる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、赤血球生成細胞からなる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、多能性造血幹細胞（ＨＳＣ）からなる。ある特定の実施形態では、幹細胞は、一般的な骨髄系前駆細胞、一般的なリンパ球系前駆細胞、またはそれらの任意の組み合わせからなる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。ある特定の実施形態では、幹細胞は、間葉系幹細胞からなる。
【０１６３】
ＣＤ３４抗原としても知られる造血前駆細胞抗原ＣＤ３４は、ヒトではＣＤ３４遺伝子によってコードされているタンパク質である。ＣＤ３４は、細胞表面糖タンパク質の分化クラスターであり、細胞−細胞接着因子として機能する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、骨髄前駆細胞抗原ＣＤ３４を発現する（ＣＤ３４＋である）。ある特定の実施形態では、幹細胞は、それらの外膜上に骨髄前駆細胞抗原ＣＤ３４を提示する。ある特定の実施形態では、幹細胞は、骨髄前駆細胞抗原ＣＤ３４を発現しない（ＣＤ３４−である）。ある特定の実施形態では、幹細胞は、それらの外膜上に骨髄前駆細胞抗原ＣＤ３４を提示しない。
【０１６４】
ある特定の実施形態では、第１の組成物中の幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患している患者に直接由来する。ある特定の実施形態では、第１の組成物中の幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患していない患者に直接由来する。本明細書で使用される場合、「直接由来する」という用語は、他の細胞に直接由来した幹細胞を指す。ある特定の実施形態では、幹細胞は、造血幹細胞に由来した。
【０１６５】
ある特定の実施形態では、第１の組成物中の幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患している患者に間接的に由来する。ある特定の実施形態では、第１の組成物中の幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患していない対象に間接的に由来する。本明細書で使用される場合、「間接的に由来する」という用語は、非幹細胞または他の種類の幹細胞に由来した幹細胞を指す。ある特定の実施形態では、幹細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳｃ）になるように操作された体細胞に由来した。
【０１６６】
ある特定の実施形態では、第１の組成物中の幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患している患者の骨髄から直接得られる。ある特定の実施形態では、第１の組成物中の幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患していない対象の骨髄から直接得られる。本明細書で使用される場合、「直接得られた」という用語は、例えば、外科手術または注射器による針を介した吸引などの手段によって、骨髄自体から得られた幹細胞を指す。
【０１６７】
ある特定の実施形態では、第１の組成物中の幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患している患者の骨髄から間接的に得られる。ある特定の実施形態では、第１の組成物中の幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患していない対象の骨髄から間接的に得られる。本明細書で使用される場合、「間接的に得られた」という用語は、骨髄自体以外の場所から得られた幹細胞を指す。
【０１６８】
ある特定の実施形態では、第１の組成物中の幹細胞は、脂肪組織、口腔粘膜、皮膚線維芽細胞、血液、および／または臍帯血から直接または間接的に得られる。各可能性は、別個の実施形態である。
【０１６９】
ある特定の実施形態では、第１の組成物中の幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患している患者の末梢血から得られる。ある特定の実施形態では、第１の組成物中の幹細胞は、ミトコンドリア病に罹患していない対象の末梢血から得られる。本明細書で使用される場合、「末梢血」という用語は、血液系中を循環する血液を指す。
【０１７０】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、前ステップをさらに含み、本ステップは、ミトコンドリア病に罹患している患者に、幹細胞の末梢血への動員を誘導する薬剤を投与することを含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、前ステップをさらに含み、本ステップは、ミトコンドリア病に罹患している対象に、幹細胞の末梢血への動員を誘導する薬剤を投与することを含む。
【０１７１】
ある特定の実施形態では、幹細胞の末梢血への動員を誘導する薬剤は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、１，１’−［１，４−フェニレンビス（メチレン）］ビス［１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン］（Ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ、ＣＡＳ番号１５５１４８−３１−５）、それらの塩、およびそれらの任意の組み合わせからなる群から選択される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１７２】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、ミトコンドリア病に罹患している患者の末梢血から幹細胞を単離するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、ミトコンドリア病に罹患していない対象の末梢血から幹細胞を単離するステップをさらに含む。本明細書で使用される場合、「末梢血から単離する」という用語は、血液の他の成分からの幹細胞の単離を指す。
【０１７３】
アフェレーシスの間、ドナーまたは患者の血液は、１つの特定の成分を分離し、残りを循環に戻す装置を通過する。したがって、それは体外で実行される医療手順である。ある特定の実施形態では、単離はアフェレーシスによって実行される。
【０１７４】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーションの前に、第３の組成物中の幹細胞および機能的ミトコンドリアを濃縮することをさらに含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーション中に、第３の組成物中の幹細胞および機能的ミトコンドリアを濃縮することをさらに含む。いくつかの実施形態では、インキュベーション中の第３の組成物中の幹細胞および機能的ミトコンドリアの濃縮は、連続遠心分離によって実行される。
【０１７５】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーションの前に第３の組成物を遠心分離することをさらに含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーション中に第３の組成物を遠心分離することをさらに含む。ある特定の実施形態では、上記の方法は、インキュベーションの後に第３の組成物を遠心分離することをさらに含む。
【０１７６】
複数の細胞またはミトコンドリアを対象とする任意の測定可能な特徴または特性または態様へのいずれの言及は、複数の細胞またはミトコンドリアの測定可能な平均的な特徴または特性または態様を対象とすることが強調されるべきである。
【０１７７】
ヘテロプラスミーとは、細胞または個体内に２種以上のミトコンドリアＤＮＡが存在することである。ヘテロプラスミーレベルは、変異ｍｔＤＮＡ分子対野生型／機能的ｍｔＤＮＡ分子の比率であり、ミトコンドリア病の重症度を考慮するのに重要な要素である。低レベルのヘテロプラスミー（十分な量のミトコンドリアが機能している）は、健康な表現型に関連しているが、高レベルのヘテロプラスミー（十分な量のミトコンドリアが機能していない）は病状に関連している。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも１％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも３％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも５％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも１０％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも１５％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも２０％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも２５％低い。ある特定の実施形態では、第４の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルは、第１の組成物中の幹細胞のヘテロプラスミーレベルよりも少なくとも３０％低い。
【０１７８】
ある特定の実施形態では、本方法は、第４の組成物を凍結することをさらに含む。ある特定の実施形態では、本方法は、第４の組成物を凍結し、その後解凍することをさらに含む。
【０１７９】
本明細書で使用される場合、「自家細胞」または「自家である細胞」という用語は、患者自身の細胞であることを指す。「同種異系細胞」という用語は、異なるドナー個体からの細胞を指す。「自家ミトコンドリア」という用語は、同じ母性遺伝的に関連する細胞から得られたミトコンドリアを指す。「同種異系ミトコンドリア」という用語は、異なるドナー個体からのミトコンドリアを指す一方で、異なるドナー個体は、治療される対象に母性遺伝的に関連していない。
【０１８０】
本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、「同系」という用語は、拒絶なく個体間の移植を可能にするのに十分な遺伝的同一性または遺伝的近同一性を指す。ミトコンドリアの文脈における「同系」という用語は、本明細書では、同じ母体の血統を意味する「自家ミトコンドリア」という用語と交換可能に使用される。
【０１８１】
「外因性ミトコンドリア」という用語は、細胞の外部にある供給源から標的細胞（すなわち、幹細胞）に導入されるミトコンドリアを指す。例えば、いくつかの実施形態では、外因性ミトコンドリアは、標的細胞とは異なる細胞に由来するかまたは単離され得る。例えば、外因性ミトコンドリアは、ドナー細胞で産生／作製され、ドナー細胞から精製／単離／得られ、その後、標的細胞に導入され得る。
【０１８２】
「内因性ミトコンドリア」という用語は、細胞によって作製／発現／産生されており、外部供給源から細胞に導入されないミトコンドリアを指す。いくつかの実施形態では、内因性ミトコンドリアは、細胞のゲノムによってコードされているタンパク質および／または他の分子を含有する。いくつかの実施形態では、「内因性ミトコンドリア」という用語は、「宿主ミトコンドリア」という用語と等しい。
【０１８３】
ある特定の実施形態では、健康な機能的ヒト外因性ミトコンドリアは、自家または同種異系ミトコンドリアである。
【０１８４】
いくつかの実施形態では、内因性ミトコンドリアの外因性ミトコンドリアからの特定／区別は、後者が標的細胞に導入された後、例えば、限定されないが、ミトコンドリアＤＮＡ（ｍｔＤＮＡ）配列の差異、例えば、内因性ミトコンドリアと外因性ミトコンドリアとの間の異なるハプロタイプを特定すること、外因性ミトコンドリアの組織に由来する特定のミトコンドリアタンパク質、例えば、胎盤からのチトクロームｐ４５０コレステロール側鎖切断（Ｐ４５０ＳＣＣ）、褐色脂肪組織からのＵＣＰ１などを特定すること、またはそれらの任意の組み合わせを含む、様々な手段によって実行され得る。
【０１８５】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、ミトコンドリア生合成を促進する薬剤を患者に投与するステップをさらに含む。本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア生合成」という用語は、ミトコンドリアの成長および分裂を指す。ある特定の実施形態では、ミトコンドリア生合成を促進する薬剤は、エリスロポエチン（ＥＰＯ）またはその塩である。ある特定の実施形態では、薬剤は、組換えヒトエリスロポエチンおよび単離されたヒトエリスロポエチンからなる群から選択される。
【０１８６】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、患者と幹細胞との間の有害な免疫原性反応を防止、遅延、最小化、または無効にする薬剤を患者に投与するステップをさらに含む。ある特定の実施形態では、有害な免疫原性反応は、移植片対宿主病（ＧｖＨＤ）である。ある特定の実施形態では、ＧｖＨＤは、疾患の急性形態（ａＧｖＨＤ）である。ある特定の実施形態では、ＧｖＨＤは、疾患の慢性形態（ｃＧｖＨＤ）である。
【０１８７】
ある特定の実施形態では、上記の方法は、医薬組成物の投与の前に、患者に移植前コンディショニング剤を投与する前ステップをさらに含む。本明細書で使用される場合、「移植前コンディショニング剤」という用語は、ヒト対象内の幹細胞を殺傷ことができる任意の薬剤を指す。ある特定の実施形態では、移植前コンディショニング剤はブスルファンである。
【０１８８】
本明細書で使用される場合、「突然変異」という用語は、ミトコンドリアまたは核ＤＮＡにおける少なくとも１つのヌクレオチドの挿入、欠失、または置換を指す。ある特定の実施形態では、突然変異は病理学的突然変異である。
【０１８９】
ある特定の実施形態では、医薬組成物は局所投与される。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、対象の骨髄への直接投与によるものである。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、組織または器官への投与である。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、眼に対してである。硝子体液は、水晶体と網膜との間の眼の空間を満たす、透明で無色のゼラチン状の塊である。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、眼の硝子体液に対してである。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、直接筋肉内注射によるものである。ある特定の実施形態では、医薬組成物は全身投与される。ある特定の実施形態では、対象への医薬組成物の投与は、組織または器官への静脈内、動脈内、筋肉内、皮下、および直接注射からなる群から選択される経路によるものである。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１９０】
ある特定の実施形態では、機能的ミトコンドリアは、胎盤、培養で成長させた胎盤細胞、および血液細胞からなる群から選択されるヒト細胞またはヒト組織から得られる。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。
【０１９１】
別の実施形態によれば、ミトコンドリア膜の無傷性は、当該技術分野で既知の任意の方法によって決定され得る。非限定的な例では、ミトコンドリア膜の無傷性は、テトラメチルローダミンメチルエステル（ＴＭＲＭ）またはテトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）蛍光プローブを使用して測定される。各可能性は、本発明の別個の実施形態を表す。顕微鏡下で観察され、ＴＭＲＭまたはＴＭＲＥ染色を示すミトコンドリアには、無傷ミトコンドリア外膜を有する。本明細書で使用される場合、「ミトコンドリア膜」という用語は、ミトコンドリア内膜、ミトコンドリア外膜、およびその両方からなる群から選択されるミトコンドリア膜を指す。
【０１９２】
本発明はある特定の実施形態を参照して説明されてきたが、当業者は、本発明の範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、同等物に置き換えることができることを理解するだろう。さらに、その範囲から逸脱することなく、特定の状況または材料を本発明の教示に適合させるために多くの修正を行うことができる。したがって、本発明は、開示された特定の実施形態に限定されないが、本発明は、添付の特許請求の範囲に含まれるすべての実施形態を含むことが意図される。
【０１９３】
以下の実施例は、本発明のより完全な理解を提供するために提示される。本発明の原理を例示するために記載された特定の技術、条件、材料、割合、および報告されたデータは、例示であり、本発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。
【実施例】
【０１９４】
実施例１．ミトコンドリアは、ＭＡＴ手順後に迅速にＣＤ３４＋細胞に入る。
ＨｅＬａ−ＴｕｒｂｏＧＦＰ−Ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ細胞（ＣｅｌｌＴｒｅｎｄ  ＧｍｂＨ）から単離されたミトコンドリアを使用して、健康なドナーからのＣＤ３４＋細胞をＭｉｔｏｔｒａｃｋｅｒＯｒａｎｇｅ（ＭＴＯ）で処理し、ＭＡＴの前に洗浄した。細胞を２％ＰＦＡで１０分間固定し、ＤＡＰＩで固定した。６０Ｘ／１．４２油浸対物レンズを備えた共焦点顕微鏡を使用して細胞をスキャンした。
【０１９５】
図１に見られるように、外因性ミトコンドリアは、ＭＡＴ後０．５時間でＣＤ３４＋細胞に入り（明るく、ほぼ白色の、細胞内の斑点）、試験された８時間および２４時間にわたって続いた。
【０１９６】
実施例２．マウスにおけるミトコンドリア増強療法。
ミトコンドリアの含有量および活性を増加させるために、異なるマウス細胞を、１０％ＦＣＳを含有するＤＭＥＭ中で、３７℃、５％ＣＯ２雰囲気で、２４時間、単離されたミトコンドリアとともにインキュベートした。表１は、プロセス前の細胞のＣＳ活性と比較した、プロセス後の細胞のＣＳ活性の相対的な増加によって決定される、ミトコンドリア増強プロセスの代表的な結果を示す。
【表１】
2021531284.tif 000002
【０１９７】
ＦＶＢ／Ｎ骨髄細胞（ｍｔＤＮＡ  ＡＴＰ８に突然変異を持つ）を、様々な用量（１ｍＬ中の１Ｍ細胞あたり０．０４４、０．４４、０．８８、２．２、４．４、８．８、１７．６ｍＵｎｉｔｓ  ＣＳ活性）で、胎盤から単離されたＣ５７／ＢＬ野生型（ＷＴ）ミトコンドリアとともにインキュベートした。図２Ａに見られるように、ＷＴ特異的配列を使用したｄＰＣＲは、ほとんどの投薬量で用量依存的にＷＴｍｔＤＮＡの増加を示した。富化された細胞は、ｍｔＤＮＡコード化（ＣＯＸ１）（図２Ｂ）および核コード化（ＳＤＨＡ）（図２Ｃ）タンパク質の含有量の用量依存的な増加も示した。
【０１９８】
マウス骨髄細胞（１０６）は、未処理であるか、またはマウスメラノーマ細胞から単離されたＧＦＰ標識ミトコンドリア（１７ｍｉｌｌｉＵまたは３４ｍｉｌｌｉＵ、ミトコンドリア含有量のマーカーとしてのクエン酸シンターゼ活性のレベルを示す）とともに２４時間インキュベートされた。細胞をミトコンドリアと混合し、８０００ｇで遠心分離し、再懸濁した。２４時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、クエン酸シンターゼ（ＣＳ）活性（図３Ａ）およびチトクロームｃレダクターゼ活性（図３Ｂ）のレベルを、ＷＯ２０１６／１３５７２３で以前に説明されているように、それぞれＣＳ０７２０およびＣＹ０１００キット（Ｓｉｇｍａ）を使用して測定した。
【０１９９】
図３に示される結果は、上記の実験で使用された機能的ミトコンドリアの組成物が、ＥＲではなくミトコンドリアで骨髄細胞を富化することを明確に示す。
【０２００】
ミトコンドリア増強療法の作用をインビボで調べるために、Ｃ５７／ＢＬ胎盤ミトコンドリアの４．４ｍＵｎｉｔｓＣＳ活性で富化されたＦＶＢ／Ｎ骨髄細胞（１ｘ１０６）をＦＶＢ／ＮマウスにＩＶ注射した。処置の１日後、１週間後、１ヶ月後、および３ヶ月後にマウスから骨髄を収集し、ｄＰＣＲを使用してＷＴｍｔＤＮＡのレベルを検出した。図４に見られるように、かなりの量のＷＴ  ｍｔＤＮＡが治療の１日後に骨髄で検出された。
【０２０１】
実施例３．ＭＡＴは、細胞内で外因性および内因性のｍｔＤＮＡの共存をもたらす。
健康なドナーＣＤ３４＋細胞のミトコンドリア増強は、２つの異なる胎盤由来ミトコンドリアバッチで実行され、細胞は２４時間のインキュベーション後に十分に洗浄された。ＩｌｌｕｍｉｎａベースのｍｔＤＮＡ配列決定は、同じ細胞内に移動したミトコンドリアと内因性ミトコンドリアとの両方が存在することを示す。
【０２０２】
図５に見られるように、異なる胎盤からの両方のＭＡＴ実験は、同様の増強率をもたらした。
【０２０３】
実施例４．ミトコンドリアは、ヒト骨髄細胞に入ることができる。
ヒトＣＤ３４＋細胞（１．４＊１０５、ＡＴＣＣ  ＰＣＳ−８００−０１２）は未処理であるか、ヒト胎盤細胞から単離されたＧＦＰ標識ミトコンドリアとともに２０時間インキュベートされた。細胞を蒔く前に、ミトコンドリアを細胞と混合し、８０００ｇで遠心分離し、再懸濁した。インキュベーション後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＣＳ０７２０  Ｓｉｇｍａキットを使用してＣＳ活性を測定した（図６Ａ）。ＡＴＰ含有量は、ＷＯ２０１６／１３５７２３で以前に説明されているように、ＡＴＰｌｉｔｅ（Ｐｅｒｋｉｎ  Ｅｌｍｅｒ）（図６Ｂ）を使用して測定された。
【０２０４】
図６に示される結果は、ヒト骨髄細胞のミトコンドリア含有量が、単離されたヒトミトコンドリアとの相互作用および共培養によって、ヒトもしくはマウスの線維芽細胞またはマウスの骨髄細胞のいずれかの能力を超える程度まで、何倍も増加する可能性があることを明確に示す。
【０２０５】
実施例５．ヒト臍帯血を移植したＮＳＧＳマウスからの骨髄は、ＭＡＴの２ヶ月後により多くのヒトｍｔＤＮＡを含有する
ピアソン患者の臍帯血細胞を０．８８ｍＵのヒトミトコンドリアとともに２４時間インキュベートした後、培地を除去し、細胞を洗浄し、４．５％ＨＳＡに再懸濁した。富化された細胞をＮＳＧＳマウスにＩＶ注射した（マウスあたり１００，０００個のＣＤ３４＋細胞）。
【０２０６】
図７Ａは、ピアソン患者の臍帯血細胞におけるｍｔＤＮＡ欠失の図であり、４９７８ｋｂの欠失ＵＣＢｍｔＤＮＡ領域（左）、ならびに欠失を示すサザンブロット分析（右）を示す。
【０２０７】
ＭＡＴの２ヶ月後にマウスから骨髄を収集し、ＵＣＢ非欠失ＷＴ  ｍｔＤＮＡ配列を特定するプライマーおよびプローブを使用して、非欠失ＷＴ  ｍｔＤＮＡのコピー数をｄＰＣＲで分析した。
【０２０８】
図７Ｂに見られるように、ミトコンドリア増強療法の２ヶ月後、マウスの骨髄は、増強されていない臍帯血細胞を注射されたマウスの骨髄と比較して、約１００％多くのヒトｍｔＤＮＡを含有した。
【０２０９】
実施例６．インビボでの安全性および生体分布動物研究
ミトコンドリアは、２つの異なるバックグラウンドからの対照の健康なマウスの骨髄細胞に導入される。ミトコンドリアの供給源は、異なるｍｔＤＮＡ配列を有するマウスからのものである（Ｊｅｎｕｔｈ  ＪＰ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９６，Ｖｏｌ．１４，ｐａｇｅｓ  １４６−１５１）。
【０２１０】
野生型マウス（Ｃ５７ＢＬ）胎盤からミトコンドリアを単離した。骨髄細胞はＦＶＢ／Ｎマウスから単離された。突然変異したＦＶＢ／Ｎ骨髄細胞（１０６）に健康な機能的Ｃ５７ＢＬミトコンドリア（４．４ミリユニット）をロードし、ＦＶＢ／ＮマウスにＩＶ投与した。
【０２１１】
本方法のステップは、（１）Ｃ５７ＢＬマウスの胎盤からミトコンドリアを単離し、−８０℃で凍結し、解凍するか、または新鮮なものを使用する、（２）ｍｔＤＮＡ突然変異ＦＶＢ／Ｎマウスから骨髄細胞を得る、（３）ミトコンドリアおよび骨髄細胞を接触させ、８０００ｇで５分間遠心分離し、再懸濁し、２４時間インキュベートする、（４）骨髄細胞をＰＢＳで２回洗浄し、ＦＶＢ／Ｎマウスの尾静脈に注射する。移植後、例えば、２４時間、１週間、１ヶ月、３ヶ月後の様々な時点で、組織（血液、骨髄、リンパ球、脳、心臓、腎臓、肝臓、肺、脾臓、骨格筋、眼、卵巣／精巣）を収集し、さらなる配列分析のためにＤＮＡを抽出した。
【０２１２】
移植１ヶ月後の骨髄におけるＦＶＢ／Ｎのレベルの低下を図８に示す。
【０２１３】
実施例７．ピアソン症候群（ＰＳ）および腎ファンコニー症候群（ＦＳ）を有する年少者に対するＭＮＶ−ＢＬＤ（血液由来ミトコンドリア）で富化された自家ＣＤ３４＋細胞を使用した人道的治療。
患者１は、ＰＳと診断された６．５歳の男児患者であり、ｍｔＤＮＡのヌクレオチド５８３５〜９７５３が欠失している。ミトコンドリア増強療法（ＭＡＴ）前の、彼の体重は１４．５  ＫＧであり、１００メートル以上歩くことも階段を上ることもできなかった。彼の成長は治療前の３年間大幅に遅れ、ベースラインでの体重は−４．１標準偏差スコア（ＳＤＳ）であり、身長は−３．２ＳＤＳ（母集団と比較して）であり、１年以上胃瘻管（Ｇ−チューブ）によって栄養補給されていたにもかかわらず、改善しなかった。彼は、腎不全（ＧＦＲ  ２２ｍｌ／分）および電解質補給を必要とする近位尿細管症を有した。彼は、カルシウム補給を必要とする副甲状腺機能低下症、および心電図検査での不完全な右脚ブロック（ＩＣＲＢＢ）を有した。
【０２１４】
造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の動員は、ＧＣＳＦを５日間単独で皮下投与することによって実行された。白血球アフェレーシスは、Ｓｐｅｃｔｒａ  Ｏｐｔｉａシステム（ＴｅｒｕｍｏＢＣＴ）を使用して、施設のガイドラインに従って末梢静脈アクセスを介して実行された。ＣＤ３４陽性選択は、ＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  ＣＤ３４試薬を製造元の指示に従って使用することにより、動員された末梢血由来細胞で実行された。ミトコンドリアは、２５０ｍＭスクロース緩衝液ｐＨ７．４を使用して、母体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分画遠心分離によって単離された。ＭＡＴの場合、自家ＣＤ３４＋細胞は、患者の母親からの健康なミトコンドリア（４．４ミリユニットのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）を有するミトコンドリアの量あたり１＊１０６個の細胞）とともにインキュベートされ、細胞ミトコンドリア含有量が１．５６倍増加した（ＣＳ活性によって示されるようにミトコンドリア含有量の５６％の増加）。ミトコンドリアとのインキュベーションは、４．５％ＨＳＡを含有する生理食塩水中で、室温で２４時間実行した。富化された細胞は、生理食塩水中の４．５％ヒト血清アルブミンに懸濁された。図９Ａに示されるタイムラインに従って、患者は、ＩＶ注入により、体重１キログラムあたり、健康なミトコンドリアで富化された１．１＊１０６個の自家ＣＤ３４＋細胞の１回の治療を受けた。
【０２１５】
図９Ｂは、細胞療法後の時間の関数としての患者の有酸素代謝当量（ＭＥＴ）スコアのレベルを示す。データは、患者の有酸素ＭＥＴスコアが経時的に５（ウォーキングおよびサイクリングなどの中強度の活動）から８（ランニング、ジョギング、および縄跳びなどの激しい強度の活動）に大幅に増加したことを示す。
【０２１６】
図９Ｃは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の血中に見られる乳酸のレベルを示す。血中乳酸は、ミトコンドリアが損傷した場合、または組織への酸素輸送がミトコンドリア機能障害の特徴の１つである正常な代謝要求を支援するには不十分である場合に、嫌気性代謝の結果として血中に現れる乳酸である。図４Ｃに見られるように、ＭＡＴ後、患者１の血中乳酸レベルは正常値に低下した。
【０２１７】
表２は、細胞療法後の時間の関数としての患者の小児ミトコンドリア病尺度（ＩＰＭＤＳ）−生活の質（ＱｏＬ）質問票の結果を示す。「苦情と症状」および「身体検査」の両方のカテゴリで、０は関連する属性の「正常」を表す一方で、悪化した状態は重症度に応じて１〜５のスコアが付けられる。
【表２】
2021531284.tif 000003
【０２１８】
患者は治療前の３年間は体重が増えていない、すなわち、３．５歳から体重が増えていないことに留意するべきである。図４Ｄに示されるデータは、患者の体重および身長の標準偏差スコアによって測定された成長を示し、データは、ＭＡＴ前の４年間およびフォローアップ期間中に開始されている。データは、１回の治療から約９ヶ月または１５ヶ月後に、それぞれ患者の体重および身長が増加したことを示す。
【０２１９】
患者の成長の別の証拠は、アルカリホスファターゼレベルから来ている。アルカリホスファターゼレベルテスト（ＡＬＰテスト）は、血流中のアルカリホスファターゼ酵素の量を測定する。血中のＡＬＰレベルが正常よりも低い場合は、栄養失調を示している可能性があり、これは、ある特定のビタミンおよびミネラルの不足が原因である可能性がある。図９Ｅに示されるデータは、患者のアルカリホスファターゼレベルをわずか１２ヶ月で１５９から４８６  ＩＵ／Ｌに上げるには、１回の治療で十分であることを示す。
【０２２０】
図９Ｆ〜Ｈに見られるように、治療は赤血球レベル（図９Ｆ）、ヘモグロビンレベル（図９Ｇ）、およびヘマトクリットレベル（図９Ｈ）の顕著な改善をもたらした。これらの結果は、貧血の症状を寛解させるには１回の治療で十分であることを示す。図９Ｉは、マグネシウム補給および細胞療法後の時間の関数としての患者の血中マグネシウムレベルを示す。データは、患者のマグネシウムの血中レベルが経時的に大幅に増加したため、マグネシウム補給はもはや必要ないことを示す。マグネシウムを補給せずに高レベルのマグネシウムを達成することは、マグネシウム吸収の改善ならびに腎臓近位尿細管での再吸収の証拠である。
【０２２１】
図９Ｊは、細胞療法前後の時間の関数としての患者の血中クレアチニンのレベルを示す。データは、患者のクレアチニンレベルが最初は正常（１ｍｇ／ｄＬ未満）であったが、経時的に、治療の約１２ヶ月前に、状態が悪化した。高レベルのクレアチニンに到達することは腎不全のマーカーである。細胞療法を開始した後、彼の状態は安定し、さらなる悪化（点線で示される）が防止された。
【０２２２】
図９Ｋ〜９Ｌにさらに見られるように、細胞治療はまた、重炭酸塩を補給することなく、重炭酸塩（図９Ｊ）および塩基過剰（図９Ｌ）のレベルの顕著な改善をもたらした。
【０２２３】
図９Ｍ〜９Ｐに見られるように、１回の治療で、尿中のグルコースレベル（図９Ｍ）およびある特定の塩分レベル（図９Ｎ−カリウム；図９Ｏ−塩化物；図９Ｐ−ナトリウム）などのいくつかの腎尿細管症指標のレベルが顕著に低下した。
【０２２４】
使用された療法の成功の遺伝的指標は、総ｍｔＤＮＡと比較した正常なｍｔＤＮＡの普及率である。図１０Ａ（Ｐｔ．１）に示されるように、患者の正常なｍｔＤＮＡの普及率は、ベースラインの約１からわずか４ヶ月で１．６（＋６０％）にまで、治療の２０ヶ月後に１．９（＋９０％）に増加した。特に、正常なｍｔＤＮＡレベルは、ほとんどの時点でベースラインレベルを上回った。図１０Ｂ（Ｐｔ．１）に示されるように、ベースラインで比較的高レベルのヘテロプラスミーを有した者は、ＭＡＴ後ヘテロプラスミー（欠失ｍｔＤＮＡが少ない）が減少した。これはフォローアップ期間を通して続いた。
【０２２５】
病院の神経内科医の報告によると、健康なミトコンドリア（欠失突然変異を持たない）を有する自家細胞の移植後の患者において神経学的改善が実証されている。患者は、歩行能力、階段を上る能力、およびはさみを使い、絵を描く能力を向上させた。指示を実行する能力、応答時間、ならびに運動技能および言語技能にも実質的な改善が見られた。また、患者の母親が患者の記憶の改善を報告した。
【０２２６】
上に示されたデータが示すように、本発明によって提供される１回の治療方法は、ＰＳ、ＦＳの治療、腎機能の改善、および末梢血における正常なｍｔＤＮＡの普及率の増加に成功した。有益な作用のかかる組み合わせの証拠は、彼の年齢の健康な対象にとっては正常である患者の体重増加、および彼の認知状態においてさらに見出される。
【０２２７】
実施例８．ピアソン症候群（ＰＳ）を有する年少者に対するＭＮＶ−ＢＬＤ（血液由来ミトコンドリア）で富化された自家ＣＤ３４＋細胞を使用した人道的治療。
患者２は、ＰＳと診断された７歳の女児患者であり、ｍｔＤＮＡの４９７７ヌクレオチドが欠失している。患者はまた、貧血、内分泌膵機能不全を患っており、彼女はまた、４年間インスリン依存性糖尿病を有した。患者は、乳酸値が高く（＞２５ｍｇ／ｄＬ）、体重が少なく、食事および体重増加に問題があった。患者はさらに高マグネシウム尿症（高レベルの尿中マグネシウム、低レベルの血中マグネシウム）を患っている。患者は、記憶および学習の問題、乱視があり、ＴＭＲＥ、ＡＴＰ含有量、およびＯ２消費率（健康な母親と比較して）によって決定される末梢リンパ球のミトコンドリア活性が低い。
【０２２８】
造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の動員、白血球アフェレーシス、ならびにＣＤ３４陽性選択は、白血球アフェレーシス前の−１日目にプレリキサフォル（ｎ＝２）を添加して患者１（実施例３）と同様に実行された。ミトコンドリアは、２５０ｍＭスクロース緩衝液ｐＨ７．４を使用して、母体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分画遠心分離によって単離された。ＭＡＴの場合、自家ＣＤ３４＋細胞は、患者の母親からの健康なミトコンドリア（４．４ミリユニットのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）を有するミトコンドリアの量あたり１＊１０６個の細胞）とともにインキュベートされ、細胞ミトコンドリア含有量が１．６２倍増加した（ＣＳ活性によって示されるようにミトコンドリア含有量の６２％の増加）。ミトコンドリアとのインキュベーションは、４．５％ＨＳＡを含有する生理食塩水中で、室温で２４時間実行した。ミトコンドリア富化後、患者からのＣＤ３４＋細胞はコロニー形成率を２６％増加させたことに留意するべきである。
【０２２９】
患者２（治療日１５ＫＧ）は、図１１Ａに示されるタイムラインに従って、ＩＶ注入により、体重１キログラムあたり、健康なミトコンドリアで富化された１．８＊１０６個の自家ＣＤ３４＋細胞で治療された。
【０２３０】
図１１Ｂは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の血中に見られる乳酸のレベルを示す。血中乳酸は、ミトコンドリアが損傷した場合、または組織への酸素輸送がミトコンドリア機能障害の特徴の１つである正常な代謝要求を支援するには不十分である場合に、嫌気性代謝の結果として血中に現れる乳酸である。データは、血中乳酸レベルが経時的に大幅に低下したことを示す。
【０２３１】
図１１Ｃおよび１１Ｄは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の「立ち上がり」および「６分間歩行」試験の結果を示す。
【０２３２】
図１１Ｅは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の右脚の筋肉に対して実行された力量計試験の結果を示す。各テストでは、３回の連続反復が記録された。データは、筋力の増加および倦怠感の減少の態様の両方で、患者の筋肉能力が経時的に改善されたことを示す。
【０２３３】
図１１Ｆ〜１１Ｈは、それぞれＩ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の尿中に見られるクレアチニンと比較したマグネシウム、カリウム、およびカルシウムの比率を示す。
【０２３４】
図１１Ｉは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の尿中のＡＴＰ８と１８Ｓとの間の遺伝的比率を示す。
【０２３５】
図１１Ｊは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者のリンパ球のＡＴＰ含有量を示す。対照は、ミトコンドリアのドナーである患者の母親のリンパ球のＡＴＰ含有量である。
【０２３６】
図１０Ａ（Ｐｔ．２）は、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての正常なｍｔＤＮＡの普及率を示す。図６Ｂ（Ｐｔ．２）に見られるように、正常なｍｔＤＮＡの普及率は、ベースラインの約１からわずか１ヶ月で２（＋１００％）にまで増加し、治療後１０ヶ月まで比較的高いままであった。特に、正常なｍｔＤＮＡレベルは、すべての時点でベースラインレベルを上回った
【０２３７】
図１０Ｂ（Ｐｔ．２）は、ＭＡＴ後の時間の関数としてのヘテロプラスミーレベルの変化を示す。患者２では、ＭＡＴ後のヘテロプラスミー（欠失ｍｔＤＮＡが少ない）が減少したことがわかる。これはフォローアップ期間を通して続いた。
【０２３８】
実施例９．ピアソン症候群（ＰＳ）およびファンコニー症候群（ＦＳ）を有する年少者に対するＭＮＶ−ＢＬＤ（血液由来ミトコンドリア）で富化された自家ＣＤ３４＋細胞を使用した人道的治療。
患者３は、ＰＳと診断された１０．５歳の女児患者であり、ｍｔＤＮＡのヌクレオチド１２１１３〜１４４２１が欠失している。患者は、貧血、および腎不全ステージ４に発展したファンコニー症候群も患っていた。患者は週に３回透析で治療された。過去２ヶ月で、患者は、重度の視力障害、視野の狭小化、および近見視力の喪失も患っていた。患者は身体活動をまったく行うことができなかった（歩くことはなく、ベビーカーに座っている）。患者の乳酸レベルは高く（＞５０ｍｇ／ｄＬ）、インスリンで治療された膵臓障害を有した。脳ＭＲＩは多くの病変および萎縮領域を示した。患者は、胃瘻造設術によってのみ栄養補給された。患者には記憶および学習の問題があった。患者は、テトラメチルローダミンエチルエステル（ＴＭＲＥ）、ＡＴＰ含有量、およびＯ２消費率（健康な母親と比較して）試験によって決定される末梢リンパ球のミトコンドリア活性が低い。
【０２３９】
造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の動員、ならびに白血球アフェレーシス、およびＣＤ３４陽性選択は、白血球アフェレーシス前の−１日目にプレリキサフォル（ｎ＝１）を添加して患者１（実施例３）と同様に実行された。白血球アフェレーシスは、恒久的な透析カテーテルを介して実行された。ミトコンドリアは、２５０ｍＭスクロース緩衝液ｐＨ７．４を使用して、母体の末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）から分画遠心分離によって単離された。ＭＡＴの場合、自家ＣＤ３４＋細胞は、患者の母親からの健康なミトコンドリア（４．４ミリユニットのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）を有するミトコンドリアの量あたり１＊１０６個の細胞）とともにインキュベートされ、細胞ミトコンドリア含有量が１．１４倍増加した（ＣＳ活性によって示されるようにミトコンドリア含有量の１４％の増加）。細胞を、４．５％ＨＳＡを含有する生理食塩水中で、室温でで２４時間ミトコンドリアとともにインキュベートした。ミトコンドリア富化後、患者からのＣＤ３４＋細胞はコロニー形成率を５２％増加させたことに留意するべきである。
【０２４０】
患者３（２１ＫＧ）は、図１２Ａに示されるタイムラインに従って、ＩＶ注入により、体重１キログラムあたり、母親からの健康なミトコンドリアで富化された２．８＊１０６個の自家ＣＤ３４＋細胞で治療された。
【０２４１】
図１２Ｂは、療法前後の時間の関数としての患者の血中に見られる乳酸レベルを示す。
【０２４２】
図１２Ｃは、細胞療法前後の時間の関数としての患者の血中のＡＳＴおよびＡＬＴ肝臓酵素のレベルを示す。低レベル血中肝臓酵素を達成することは、肝損傷の減少の証拠である。
【０２４３】
図１２Ｄは、細胞療法前後の時間の関数としての患者の血中のトリグリセリド、総コレステロール、および超低密度リポタンパク質（ＶＬＤＬ）コレステロールのレベルを示す。血中のトリグリセリド、総コレステロール、およびＶＬＤＬコレステロールの低レベルを達成することは、肝機能の増加および脂質代謝の改善の証拠である。
【０２４４】
糖化ヘモグロビン（ヘモグロビンＡ１ｃ、ＨｂＡ１ｃ、Ａ１Ｃ、Ｈｂ１ｃ、Ｈｂ１ｃ、またはＨＧＢＡ１Ｃとも呼ばれることがある）は、主に３ヶ月の平均血漿グルコース濃度を特定するために測定される一形態のヘモグロビンである。赤血球の寿命は４ヶ月（１２０日）であるため、検査は平均３ヶ月に制限される。図１２Ｅは、治療前後の時間の関数としての患者のＡ１Ｃ検査の結果を示す。
【０２４５】
図１２Ｆおよび１２Ｇは、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての患者の「立ち上がり」（１１２Ｆ）および「６分間歩行」（１２Ｇ）試験の結果を示し、治療５ヶ月後の両方のパラメーターにおける改善を示す。
【０２４６】
図１０Ａ（Ｐｔ．３）は、Ｉ．Ｖ．注射後の時間の関数としての正常なｍｔＤＮＡの普及率を示す。図１０Ａ（Ｐｔ．３）に見られるように、正常なｍｔＤＮＡの普及率は、治療７か月後に５０％増加した。特に、正常なｍｔＤＮＡレベルは、ほとんどの時点でベースラインレベルを上回った
【０２４７】
図１０Ｂ（Ｐｔ．３）は、ＭＡＴ後の時間の関数としてのヘテロプラスミーレベルの変化を示す。ベースラインでヘテロプラスミーのレベルが比較的低かった患者３では、ＭＡＴ後にヘテロプラスミーが減少した（欠失ｍｔＤＮＡが少ない）ことがわかる。これはフォローアップ期間を通して続いた。
【０２４８】
まとめると、上記に示す結果は、外因性の健康な機能的ミトコンドリアで富化された自家ＣＤ３４＋ＨＳＰＣの増強が、低から中程度のミトコンドリア富化（本明細書で例示されるように１４％）でも、ＰＳを有する患者の疾患進行を停止させ得、多くの症状の改善につながり得ることを示した。
【０２４９】
実施例１０．カーンズ−セイヤー症候群（ＫＳＳ）を有する年少者に対するＭＮＶ−ＢＬＤ（血液由来ミトコンドリア）で富化された自家ＣＤ３４＋細胞を使用した人道的治療。
患者４は、１４歳、１９．５ｋｇの女児患者で、カーンズ・セイヤー症候群と診断され、トンネル状視野、眼瞼下垂、眼筋麻痺、および網膜萎縮を経験していた。患者は、視力の問題、ＣＰＥＯ、てんかん発作、病的ＥＥＧ、座位または歩行障害を伴う重度のミオパチー、心不整脈を有した。患者は、ミトコンドリアＤＮＡに７．４  Ｋｂの欠失があり、これには次の遺伝子が含まれる：ＴＫ、ＮＣ８、ＡＴＰ８、ＡＴＰ６、ＣＯ３、ＴＧ、ＮＤ３、ＴＲ、ＮＤ４Ｌ、ＴＨ、ＴＳ２、ＴＬ２、ＮＤ５、ＮＤ６、ＴＥ、ＮＣ９、およびＣＹＢ。
【０２５０】
造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）の動員、ならびに白血球アフェレーシス、およびＣＤ３４陽性選択は、患者３（実施例５）と同様に実行された。ＭＡＴの場合、自家ＣＤ３４＋細胞は、４．５％ＨＳＡを含有する生理食塩水中で、患者の母親からの健康なミトコンドリア（４．４ミリユニットのクエン酸シンターゼ（ＣＳ）を有するミトコンドリアの量あたり１＊１０６個の細胞）とともに室温で２４時間インキュベートされた。富化により、細胞ミトコンドリア含有量が１．０３倍増加した（ＣＳ活性によって示されるようにミトコンドリア含有量が３％増加した）。
【０２５１】
患者４は、図１２Ａに示されるタイムラインに従って、体重１キログラムあたり、健康なミトコンドリアで富化された２．２＊１０６個の自家ＣＤ３４＋細胞で治療された。
予想外に、健康なミトコンドリアでわずか３％富化されたＣＤ３４＋による１回の治療の４ヶ月後、患者はてんかん発作を伴わずにＥＥＧの顕著な改善を示した。治療の５ヶ月後、患者は疾患に関連した房室（ＡＶ）ブロックを患い、ペーサーが取り付けられた。患者は回復し、改善が続いた。図１３に示されるように、末梢血中のＡＴＰ含有量は、治療の６ヶ月後に測定され、治療前と比較してＡＴＰ含有量が約１００％増加したことを示す。治療の７ヶ月後、患者は一人で座り、助けを借りて歩き、話すことができ、食欲が増し、３．６ＫＧ増えた。
【０２５２】
実施例１１．ヒトミトコンドリアで富化されたヒト幹細胞を使用したミトコンドリア病に罹患した患者の治療。
患者は、ミトコンドリアまたは核ＤＮＡの１つ以上の突然変異（複数可）、経験している症状、またはその両方に基づいて、ミトコンドリア病と診断される。
患者は、年齢、体重、および臨床状態に合わせたタイムラインに従って、健康なドナーから得られ、単離された健康な機能的ミトコンドリアで富化された自家または同種異系のヒト幹細胞で治療される。投与されるヒト幹細胞は、ナイーブヒト幹細胞を健康な機能的ミトコンドリアとともにインキュベートすることによって調製される。
【０２５３】
患者の臨床状態は、治療前、治療中、および／または治療後監視される。患者の臨床状態、生理学的および／または認知は、次の試験のうちの１つによって決定され得る：ウェクスラー就学前・小学生知能尺度（Ｗｅｃｈｓｌｅｒ  ｐｒｅｓｃｈｏｏｌ＆ｐｒｉｍａｒｙ  ｓｃａｌｅ  ｏｆ  ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｃｅ）（ＷＰＰＳＩ  Ｖ３）、国際小児ミトコンドリア病尺度（ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ  ｐｅｄｉａｔｒｉｃ  ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ  ｄｉｓｅａｓｅ  ｓｃａｌｅ）（ＩＰＭＤＳ）質問票、身体検査、神経心理学検査（例えば、発達神経心理学的評価によるリスト記憶テスト、ＮＥＰＳＹ  ＩＩ（ＮＥＰＳＹ  ＩＩ−第２版）、子供用ウェクスラー知能尺度（ＷＩＳ）による数唱試験−４版、および視覚−運動統合（ＶＭＩ）：投与、スコアリング、および教育マニュアル（第６版）のＢｅｅｒｙ−Ｂｕｋｔｅｎｉｃａ発達検査による視覚−運動統合全血球数、血液ガス、血液生化学、手動分画血液検査、尿生化学、体重増加、呼吸機能、および正常なミトコンドリアＤＮＡ含有量。
【０２５４】
本発明は、本明細書に記載の特定の実施形態によって範囲が限定されない。実際、本明細書に記載されたものに加えて、本発明の様々な修正が、前述の説明および添付の図面から当業者に明らかになるであろう。このような修正は、添付の特許請求の範囲内に含まれることが意図される。
【図１】
2021531284.tif 000004
【図２Ａ】
2021531284.tif 000005
【図２Ｂ】
2021531284.tif 000006
【図２Ｃ】
2021531284.tif 000007
【図３Ａ】
2021531284.tif 000008
【図３Ｂ】
2021531284.tif 000009
【図４】
2021531284.tif 000010
【図５】
2021531284.tif 000011
【図６Ａ】
2021531284.tif 000012
【図６Ｂ】
2021531284.tif 000013
【図７Ａ】
2021531284.tif 000014
【図７Ｂ】
2021531284.tif 000015
【図８】
2021531284.tif 000016
【図９Ａ】
2021531284.tif 000017
【図９Ｂ】
2021531284.tif 000018
【図９Ｃ】
2021531284.tif 000019
【図９Ｄ】
2021531284.tif 000020
【図９Ｅ】
2021531284.tif 000021
【図９Ｆ】
2021531284.tif 000022
【図９Ｇ】
2021531284.tif 000023
【図９Ｈ】
2021531284.tif 000024
【図９Ｉ】
2021531284.tif 000025
【図９Ｊ】
2021531284.tif 000026
【図９Ｋ】
2021531284.tif 000027
【図９Ｌ】
2021531284.tif 000028
【図９Ｍ】
2021531284.tif 000029
【図９Ｎ】
2021531284.tif 000030
【図９Ｏ】
2021531284.tif 000031
【図９Ｐ】
2021531284.tif 000032
【図１０Ａ】
2021531284.tif 000033
【図１０Ｂ】
2021531284.tif 000034
【図１１Ａ】
2021531284.tif 000035
【図１１Ｂ】
2021531284.tif 000036
【図１１Ｃ】
2021531284.tif 000037
【図１１Ｄ】
2021531284.tif 000038
【図１１Ｅ】
2021531284.tif 000039
【図１１Ｆ】
2021531284.tif 000040
【図１１Ｇ】
2021531284.tif 000041
【図１１Ｈ】
2021531284.tif 000042
【図１１Ｉ】
2021531284.tif 000043
【図１１Ｊ】
2021531284.tif 000044
【図１２Ａ】
2021531284.tif 000045
【図１２Ｂ】
2021531284.tif 000046
【図１２Ｃ】
2021531284.tif 000047
【図１２Ｄ】
2021531284.tif 000048
【図１２Ｅ】
2021531284.tif 000049
【図１２Ｆ】
2021531284.tif 000050
【図１２Ｇ】
2021531284.tif 000051
【図１３】
2021531284.tif 000052
【国際調査報告】
2021531284.tif 000053
2021531284.tif 000054