(57)【要約】本発明は、概して、造血細胞の遺伝子改変のための方法に関する。特に本発明は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ポロクサマー、及び硫酸プロタミンを使用して、組換えレトロウイルスベクターによる形質導入を増強することに関する。本開示の組成物及び方法は、特に、一遺伝子による遺伝子疾患及び遺伝子障害の治療を含めた、遺伝子療法の用途に好適である。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
造血細胞の遺伝子改変方法であって、
（ａ）造血細胞を提供することと；
（ｂ）前記造血細胞をポロクサマーと接触させることと；
（ｃ）前記造血細胞をプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）又はその誘導体と接触させることと；
（ｄ）前記造血細胞を組換えレトロウイルスベクターと接触させることと
を含む、方法。
【請求項２】
前記組換えレトロウイルスベクターが、組換えレンチウイルスベクターである、請求項１記載の方法。
【請求項３】
前記造血細胞が改変操作されている、請求項１記載の方法。
【請求項４】
前記造血細胞が、ＣＤ３４を富化させた細胞である、請求項３記載の方法。
【請求項５】
前記ポロクサマーが、ポロクサマー２８８、ポロクサマー３３５、ポロクサマー３３８、及びポロクサマー４０７からなる群から選択される、請求項１記載の方法。
【請求項６】
前記ポロクサマーが、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である、請求項５記載の方法。
【請求項７】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が改変されている、請求項１記載の方法。
【請求項８】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）である、請求項７記載の方法。
【請求項９】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が改変されていない、請求項１記載の方法。
【請求項１０】
前記造血細胞を、硫酸プロタミン、及び／又は組換えフィブロネクチン断片、任意でＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）、と接触させることをさらに含む、前記請求項のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１】
接触させるステップが、同一の期間にわたって又は重複する期間にわたって、実施される、請求項１又は１０に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、５〜３０μｇ／ｍＬである、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、約１０μｇ／ｍＬである、請求項１２記載の方法。
【請求項１４】
前記ポロクサマーの濃度が、２００〜１２００μｇ／ｍＬである、請求項１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５】
前記ポロクサマーの濃度が、約１０００μｇ／ｍＬである、請求項１４記載の方法。
【請求項１６】
前記硫酸プロタミンの濃度が、４〜１０μｇ／ｍＬである、請求項１０〜１５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１７】
前記硫酸プロタミンの濃度が、約４μｇ／ｍＬである、請求項１６記載の方法。
【請求項１８】
組換えレトロウイルスベクター介在性の、造血細胞の遺伝子改変を増強する方法であって、
（ａ）造血細胞を、有効量のＰＧＥ２又はその誘導体、任意でヒトＰＧＥ２又は１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）と、及び有効量のポロクサマー、任意でポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））と、エキソビボで接触させることと；
（ｂ）前記造血細胞を、関心対象の遺伝子を含む又は関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクターと接触させることと
を含み、
ＰＧＥ２又はその誘導体及びポロクサマーの不在下での前記組換えレトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入と比較して、前記組換えレトロウイルスベクターのウイルス形質導入の有効性が増強される、方法。
【請求項１９】
前記造血細胞を、有効量の硫酸プロタミン及び／又は組換えフィブロネクチンポリペプチドもしくはそのバリアントとエキソビボで接触させることをさらに含む、請求項１８記載の方法。
【請求項２０】
前記関心対象の遺伝子が、一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害に関連する遺伝子において欠陥を補完する、請求項１８記載の方法。
【請求項２１】
前記関心対象の遺伝子又は関心対象のポリペプチドが、ＲＰＫ、ＩＴＧＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ及びＯＳＴＭ１からなる群から選択される、請求項１９記載の方法。
【請求項２２】
一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害を、予防又は寛解する、請求項１８記載の方法。
【請求項２３】
前記一遺伝子による疾患又は障害が、ファンコニ貧血、白血球接着不全症１型、ピルビン酸キナーゼ欠損症、及び乳児性悪性大理石骨病からなる群から選択される、請求項２２記載の方法。
【請求項２４】
前記造血細胞が、ＣＤ３４を富化させた細胞、任意で造血細胞、骨髄（ＢＭ）由来細胞、臍帯血（ＣＢ）由来細胞、又は動員された末梢血（ｍＰＢ（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ））細胞である、請求項１８記載の方法。
【請求項２５】
組換えレトロウイルスベクター介在性の、造血細胞の遺伝子改変のための方法であって、
（ａ）Ｇ−ＣＳＦもしくはその類似体（任意で、フィルグラスチム、サルグラモスチム、又はペグフィルグラスチム）及び／又はプレリキサホルで処置した対象から取得した生体試料（任意で、末梢血）からＣＤ３４を富化させた細胞を調製することと；
（ｂ）前記ＣＤ３４富化細胞を、ファンコニ貧血相補群（ＦＡＮＣ）遺伝子、ＩＴＧＢ２、Ｒ型ピルビン酸キナーゼ、ＯＳＴＭ１、ＴＣＩＲＧ１か、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、をコードするポリヌクレオチド、及びそれと機能的に連結した真核生物性の活性プロモーター配列を含む、組換えレトロウイルスベクターにより遺伝子改変することと
を含み、
前記遺伝子改変するステップが、前記ＣＤ３４富化細胞を、前記組換えレトロウイルスベクター、ＰＧＥ２ならびにポロクサマーと、ならびに任意で、硫酸プロタミン及び／又は組換えフィブロネクチンポリペプチドもしくはそのバリアントと、接触させることを含む、方法。
【請求項２６】
前記ＣＤ３４富化細胞が、造血細胞、骨髄（ＢＭ）由来細胞、臍帯血（ＣＢ）由来細胞、又は動員された末梢血（ｍＰＢ（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ））細胞からなる群から選択される、請求項２５記載の方法。
【請求項２７】
レンチウイルスベクターにより造血細胞に形質導入する方法であって、
前記細胞を、レンチウイルスベクターを含む液体培地中で培養すること
を含み、
前記液体培地が、ポロクサマー及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）又はその誘導体を含む、方法。
【請求項２８】
前記液体培地が、硫酸プロタミンを含む、請求項２７記載の方法。
【請求項２９】
レンチウイルスベクターにより造血細胞に形質導入する方法であって、
（ａ）ポロクサマー及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）又はその誘導体を含む溶液中のレンチウイルスベクターを提供することと；
（ｂ）液体培養培地中の造血細胞を提供することと；
（ｃ）前記溶液を液体培養培地に添加することと
を含む、方法。
【請求項３０】
前記液体培地が、硫酸プロタミンを含む、請求項２９記載の方法。
【請求項３１】
前記レンチウイルスベクターが、組換えレンチウイルスベクターである、請求項２５〜３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
前記造血細胞が改変操作されている、請求項２５〜３１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３３】
前記造血細胞が、ＣＤ３４を富化させた細胞である、請求項２５〜３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３４】
前記ポロクサマーが、ポロクサマー２８８、ポロクサマー３３５、ポロクサマー３３８、及びポロクサマー４０７からなる群から選択される、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３５】
前記ポロクサマーが、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である、請求項２５〜３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３６】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が改変されている、請求項２５〜３５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３７】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）である、請求項２５〜３６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３８】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が改変されていない、請求項２５〜３７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３９】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、５〜３０μｇ／ｍＬである、請求項２５〜３８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４０】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、約１０μｇ／ｍＬである、請求項２５〜３９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４１】
前記ポロクサマーの濃度が、２００〜１２００μｇ／ｍＬである、請求項２５〜４０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４２】
前記ポロクサマーの濃度が、約１０００μｇ／ｍＬである、請求項２５〜４１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４３】
前記硫酸プロタミンの濃度が、４〜１０μｇ／ｍＬである、請求項２５〜４２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４４】
前記硫酸プロタミンの濃度が、約４μｇ／ｍＬである、請求項２５〜４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４５】
前記レンチウイルスベクターが、ＲＰＫ、ＩＴＧＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ及びＯＳＴＭ１からなる群から選択される関心対象のポリペプチドをコードする配列を含む、請求項２５〜４４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４６】
一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害を、予防又は寛解する、請求項２５〜４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４７】
前記一遺伝子による疾患又は障害が、ファンコニ貧血、白血球接着不全症１型、ピルビン酸キナーゼ欠損症、及び乳児性悪性大理石骨病からなる群から選択される、請求項４６記載の方法。
【請求項４８】
前記造血細胞が、ＣＤ３４を富化させた細胞、任意で造血細胞、骨髄（ＢＭ）由来細胞、臍帯血（ＣＢ）由来細胞、又は動員された末梢血（ｍＰＢ（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ））細胞である、請求項２５〜４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項４９】
それを必要とする対象における疾患もしくは障害を治療、寛解及び／又は予防する方法であって、
前記対象に、プロモーター配列と操作可能に結合した治療用タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターにより形質導入した造血細胞を提供すること
を含み、
前記細胞を、組換えレトロウイルスベクターと、及びプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）もしくはその誘導体、ポロクサマー、組換えフィブロネクチン断片及び硫酸プロタミンからなる群から選択される２つ以上、３つ以上又は４つ以上の形質導入エンハンサーと、接触させることによって、前記細胞が形質導入された、方法。
【請求項５０】
前記細胞を、ＰＧＥ２及び前記ポロクサマーと接触させる、請求項４９記載の方法。
【請求項５１】
前記組換えレトロウイルスベクターが、組換えレンチウイルスベクターである、請求項４９又は請求項５０に記載の方法。
【請求項５２】
前記造血細胞が、ＣＤ３４を富化させた細胞である、請求項４９〜５１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５３】
前記ポロクサマーが、ポロクサマー２８８、ポロクサマー３３５、ポロクサマー３３８、及びポロクサマー４０７からなる群から選択される、請求項４９〜５２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５４】
前記ポロクサマーが、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である、請求項４９〜５３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５５】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が改変されている、請求項４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５６】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）である、請求項５５記載の方法。
【請求項５７】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が改変されていない、請求項４９〜５４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５８】
前記造血細胞を硫酸プロタミンと接触させることを含む、請求項４９〜５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項５９】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、５〜３０μｇ／ｍＬである、請求項４９〜５８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６０】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、約１０μｇ／ｍＬである、請求項４９〜５９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６１】
前記ポロクサマーの濃度が、２００〜１２００μｇ／ｍＬである、請求項４９〜６０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６２】
前記ポロクサマーの濃度が、約１０００μｇ／ｍＬである、請求項４９〜６１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６３】
前記硫酸プロタミンの濃度が、４〜１０μｇ／ｍＬである、請求項４９〜６２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６４】
前記硫酸プロタミンの濃度が、約４μｇ／ｍＬである、請求項４９〜６３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６５】
前記ポリヌクレオチドが、一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害に関連する遺伝子において欠陥を補完する、請求項４９〜６４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６６】
前記治療用タンパク質が、ＲＰＫ、ＩＴＧＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ及びＯＳＴＭ１からなる群から選択される、請求項４９〜６５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６７】
前記疾患又は障害が、一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害である、請求項４９〜６６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項６８】
前記一遺伝子による疾患又は障害が、ファンコニ貧血、白血球接着不全症１型、ピルビン酸キナーゼ欠損症、及び乳児性悪性大理石骨病からなる群から選択される、請求項６７記載の方法。
【請求項６９】
前記造血細胞が、ＣＤ３４を富化させた細胞、任意で造血細胞、骨髄（ＢＭ）由来細胞、臍帯血（ＣＢ）由来細胞、又は動員された末梢血（ｍＰＢ（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ））細胞である、請求項４９〜６８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７０】
前記造血細胞は、ＶＣＮ／細胞が、少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０又は少なくとも２．５である、請求項４９〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７１】
前記造血細胞は、形質導入効率が、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％又は少なくとも１００％である、請求項４９〜７０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７２】
少なくとも８０％又は少なくとも９０％が遺伝子改変された造血細胞を含む造血細胞集団を産生する方法であって、
造血細胞を、関心対象の遺伝子を含む又は関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクター（任意で、レンチウイルスベクター）とエキソビボで接触させること
を含み、
前記接触させることは、ＰＧＥ２又はその誘導体、任意でヒトＰＧＥ２又は１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、及びポロクサマー、任意でポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））、の存在下で生じる、方法。
【請求項７３】
前記ポロクサマーが、ポロクサマー２８８、ポロクサマー３３５、ポロクサマー３３８、及びポロクサマー４０７からなる群から選択される、請求項７２記載の方法。
【請求項７４】
前記ポロクサマーが、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である、請求項７２〜７３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７５】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が改変されている、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７６】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）である、請求項７５記載の方法。
【請求項７７】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体が改変されていない、請求項７２〜７４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７８】
前記造血細胞を硫酸プロタミンと接触させることをさらに含む、請求項７２〜７７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項７９】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、５〜３０μｇ／ｍＬである、請求項７２〜７８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８０】
前記ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、約１０μｇ／ｍＬである、請求項７９記載の方法。
【請求項８１】
前記ポロクサマーの濃度が、２００〜１２００μｇ／ｍＬである、請求項７２〜８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ポロクサマーの濃度が、約１０００μｇ／ｍＬである、請求項４９〜８１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８３】
前記硫酸プロタミンの濃度が、４〜１０μｇ／ｍＬである、請求項７２〜８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記硫酸プロタミンの濃度が、約４μｇ／ｍＬである、請求項８３記載の方法。
【請求項８５】
前記ポリヌクレオチドが、一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害に関連する遺伝子において欠陥を補完する、請求項７２〜８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記関心対象のポリペプチドが、ＲＰＫ、ＩＴＧＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ及びＯＳＴＭ１からなる群から選択される、請求項７２〜８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
疾患又は障害が、一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害である、請求項８５記載の方法。
【請求項８８】
前記一遺伝子による疾患又は障害が、ファンコニ貧血、白血球接着不全症１型、ピルビン酸キナーゼ欠損症、及び乳児性悪性大理石骨病からなる群から選択される、請求項８７記載の方法。
【請求項８９】
前記造血細胞が、ＣＤ３４を富化させた細胞であり、任意で骨髄（ＢＭ）由来細胞、臍帯血（ＣＢ）由来細胞、又は動員された末梢血（ｍＰＢ（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ））細胞である、請求項７２〜８８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９０】
前記造血細胞集団は、ＶＣＮ／細胞が、少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０又は少なくとも２．５である、請求項４９〜６９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９１】
少なくとも８０％又は少なくとも９０％が遺伝子改変された造血細胞を含む造血細胞集団であって、請求項７２〜９０のいずれか一項に記載の方法によって産生された、造血細胞集団。
【請求項９２】
それを必要とする対象において遺伝子疾患又は遺伝子障害を治療する方法であって、
請求項９１に記載の前記造血細胞集団を前記対象に提供すること
を含み、
前記造血細胞が、レトロウイルスベクターとエキソビボで接触させる前に前記対象から取得され、
関心対象の前記遺伝子が、前記遺伝子疾患又は遺伝子障害に起因して前記対象において変異した又は欠失している機能的ポリペプチドをコードする、方法。
【請求項９３】
前記ポリペプチドが、ＲＰＫ、ＩＴＧＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ及びＯＳＴＭ１からなる群から選択される、請求項９２記載の方法。
【請求項９４】
前記疾患又は障害が、一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害である、請求項９２記載の方法。
【請求項９５】
前記一遺伝子による疾患又は障害が、ファンコニ貧血、白血球接着不全症１型、ピルビン酸キナーゼ欠損症、及び乳児性悪性大理石骨病からなる群から選択される、請求項９４記載の方法。
【請求項９５】
前記造血細胞が、ＣＤ３４を富化させた細胞であり、任意で骨髄（ＢＭ）由来細胞、臍帯血（ＣＢ）由来細胞、又は動員された末梢血（ｍＰＢ（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ））細胞である、請求項９２〜９４のいずれか一項に記載の方法。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本願は、２０１８年７月３０日出願の米国仮特許出願第６２／７１２，１４６号に対する優先権を主張し、その内容は、全体として本明細書で援用する。
【０００２】
配列表
本願は、ＥＦＳ−Ｗｅｂ経由で電子的に出願し、また．ｔｘｔ形式で電子的に提出する配列表を含む。当該．ｔｘｔファイルは、２０１９年７月３０日に作成し、サイズが５７キロバイトである「ＲＯＰＡ＿０１００１ＷＯ＿ＳｅｑＬｉｓｔ＿ＳＴ２５．ｔｘｔ」と題した配列表を含有する。この．ｔｘｔファイルに含有する配列表は、明細書の一部であり、全体として参照により本明細書で援用する。
【０００３】
発明の分野
本発明は、概して、造血細胞の遺伝子改変方法に関する。特に本発明は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、組換えフィブロネクチン断片、ポロクサマー、及び硫酸プロタミンより選択された２以上の形質導入エンハンサーの組み合わせを使用して、組換えレトロウイルスベクターによる形質導入を増強することに関する。
【背景技術】
【０００４】
発明の背景
エキソビボでの標的細胞への遺伝子導入は、細胞及び遺伝子療法に関して臨床的に用いられる方法である。組換えレトロウイルスベクター（例えば、組換えレンチウイルスベクター）を用いて、ポリヌクレオチドを細胞（例えば、造血細胞）に送達することが可能である。標的造血細胞を組換えレトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターと接触させることにより、結果的に造血細胞に遺伝子が送達されるが、これは形質導入として知られる方法である。次いで、造血細胞が当該造血細胞自体を対象の骨髄内に移植する意図で造血細胞を対象に投与してもよい。
【０００５】
レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターの形質導入は、その効率が制限されることが多いため、形質導入効率が、遺伝子療法の成功にとって主要な障害となることが多い。したがって、臨床的な文脈において造血細胞に適用するのに好適な組成物及び方法に対する要望は満たされないままである。本開示は、こうした組成物及び方法ならびにその他のものを提供する。
【発明の概要】
【０００６】
本発明は、概して、造血細胞の遺伝子改変方法に関する。特に本発明は、２以上の形質導入エンハンサーの組み合わせであって、当該組み合わせの形質導入エンハンサーのうちの少なくとも２つが、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ポロクサマー、組換えフィブロネクチン断片、及び／又は硫酸プロタミンより選択されるものである、２以上の形質導入エンハンサーの組み合わせを使用して、組換えレトロウイルスベクターによる形質導入を増強することに関する。ある実施形態においては、この組み合わせは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ポロクサマー、及び硫酸プロタミンを含む、３以上の形質導入を含む。ある実施形態においては、この組み合わせは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ポロクサマー、組換えフィブロネクチン断片、及び硫酸プロタミンを含む、４以上の形質導入を含む。本開示の組成物及び方法は、特に、一遺伝子による遺伝子疾患及び遺伝子障害の治療を含めた、遺伝子療法の用途に好適である。有利なことには、本開示の方法は、結果として、形質導入エンハンサーなしでの形質導入と比較して、形質導入した細胞集団の低い毒性（より長い生存）をもたらす。
【０００７】
一態様においては、本開示は、造血細胞の遺伝子改変方法であって、造血細胞をポロクサマーと接触させることと、造血細胞をプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）又はその誘導体と接触させることと、造血細胞を組換えレトロウイルスベクターと接触させることとを含む、造血細胞の遺伝子改変方法を提供する。
【０００８】
一態様においては、本開示は、造血細胞の遺伝子改変方法であって、造血細胞を提供することと、造血細胞をポロクサマーと接触させることと、造血細胞をプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）又はその誘導体と接触させることと、造血細胞を組換えレトロウイルスベクターと接触させることとを含む、造血細胞の遺伝子改変方法を提供する。
【０００９】
ある実施形態においては、組換えレトロウイルスベクターが、組換えレンチウイルスベクターである。
【００１０】
ある実施形態においては、造血細胞が、改変操作されている。
【００１１】
ある実施形態においては、提供するステップは、ＣＤ３４＋細胞の富化を含む。
【００１２】
ある実施形態においては、造血細胞が、組換えフィブロネクチン断片で被覆した容器において培養されている。
【００１３】
ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー２８８、ポロクサマー３３５、ポロクサマー３３８、及びポロクサマー４０７からなる群から選択される。
【００１４】
ある実施形態においては、ポロクサマーが、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ）である。
【００１５】
ある実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体が、改変される。
【００１６】
ある実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体が、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）である。
【００１７】
ある実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体が、改変されていない。
【００１８】
ある実施形態においては、方法は、造血細胞を、硫酸プロタミン及び／又は組換えフィブロネクチン断片と接触させることをさらに含む。ある実施形態においては、組換えフィブロネクチン断片は、液体培養液中に存在し得るか、又は培養皿に被覆され得る。ある実施形態においては、細胞は、組換えフィブロネクチンを含むディッシュでの培養により予め処理されていてもよく、及び／又は組換えフィブロネクチン断片が、形質導入中に液体培地中に存在していてもよい。
【００１９】
ある実施形態においては、接触させるステップは、同時に、又は重複する期間にわたって、実行する。
【００２０】
ある実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、５〜３０μｇ／ｍＬである。
【００２１】
ある実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、約１０μｇ／ｍＬである。
【００２２】
ある実施形態においては、ポロクサマーの濃度が、２００〜１２００μｇ／ｍＬである。
【００２３】
ある実施形態においては、ポロクサマーの濃度が、約１０００μｇ／ｍＬである。
【００２４】
ある実施形態においては、硫酸プロタミンの濃度が、４〜１０μｇ／ｍＬである。
【００２５】
ある実施形態においては、硫酸プロタミンの濃度が、約４μｇ／ｍＬである。
【００２６】
ある実施形態においては、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎである、組換えフィブロネクチン断片の濃度は、液体培養液中で用いる場合、約５〜約５０ｕｇ／ｍＬである。
【００２７】
ある実施形態においては、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎである、組換えフィブロネクチン断片の濃度は、液体培養液中で用いる場合、約２０μｇ／ｍＬである。
【００２８】
第２の態様においては、本開示は、組換えレトロウイルスベクター介在性の、造血細胞の遺伝子改変を増強する方法であって、造血細胞を有効量のＰＧＥ２もしくはその誘導体により及び有効量のポロクサマーによりエキソビボで処理すること又は接触させることと；造血細胞を関心対象の遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクターに曝露する又は接触させることとを含む当該方法であって、当該組換えレトロウイルスベクターのウイルス形質導入の有効性が、ＰＧＥ２及びポロクサマーの不在下での組換えレトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入と比較して増強される、当該方法を提供する。
【００２９】
ある実施形態においては、方法は、造血細胞を、有効量の硫酸プロタミン及び／もしくは組換えフィブロネクチン断片とエキソビボで処理すること又は接触させることをさらに含む。
【００３０】
ある実施形態においては、関心対象の遺伝子が、一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害に関連する遺伝子において欠陥を補完する。
【００３１】
ある実施形態においては、関心対象の遺伝子が、ＲＰＫ、ＩＴＧＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ及びＯＳＴＭ１からなる群から選択される。特定の実施形態においては、関心対象の遺伝子が、これら遺伝子のいずれかによりコードされたタンパク質をコードするか、又はこれら遺伝子のうちのいずれかの機能的断片もしくは機能的バリアントをコードする。特定の実施形態においては、遺伝子又はタンパク質は、ヒトの遺伝子又はタンパク質である。
【００３２】
ある実施形態においては、方法は、臨床的続発症に対抗するか、又は一遺伝子による遺伝子疾患もしくは遺伝子障害を寛解する。
【００３３】
ある実施形態においては、当該一遺伝子による疾患又は障害は、ファンコニ貧血（相補群のいずれかを含める）、白血球接着不全症１型、ピルビン酸キナーゼ欠損症、及び乳児性悪性オステオポローシス（Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）からなる群から選択される。
【００３４】
ある実施形態においては、造血細胞は、ＣＤ３４を富化させた細胞、任意で造血細胞、骨髄（ＢＭ）由来細胞、臍帯血（ＣＢ）由来細胞、又は動員された末梢血（ｍＰＢ（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ））細胞である。ある実施形態においては、造血細胞は、組み換えにより改変された造血細胞により処置されようとする対象から得た。
【００３５】
第３の態様においては、本開示は、組換えレトロウイルスベクター介在性の、造血細胞の遺伝子改変方法であって、Ｇ−ＣＳＦもしくはその類似体（任意で、フィルグラスチム、サルグラモスチム、又はペグフィルグラスチム）及び／又はプレリキサホルで処置した対象から取得した生体試料（任意で、末梢血）からＣＤ３４富化細胞を調製することと；ファンコニ貧血相補群（ＦＡＮＣ）遺伝子、ＩＴＧＢ２、Ｒ型ピルビン酸キナーゼ、ＯＳＴＭ１、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＯＳＴＭ１か、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、をコードするポリヌクレオチド、及びそれと機能的に連結した真核生物性の（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃａｌｌｙ）活性プロモーター配列を含む組換えレトロウイルスベクターにより、ＣＤ３４富化細胞を遺伝子改変することと；を含み、遺伝子改変するステップは、ＣＤ３４富化細胞を、組換えレトロウイルスベクター、ＰＧＥ２及びポロクサマーと、ならびに任意で、硫酸プロタミン及び／又は組換えフィブロネクチン断片と接触させることを含む、当該方法を提供する。
【００３６】
本開示は、インビトロでの、組換えレトロウイルスベクター介在性の、造血細胞の遺伝子改変方法であって、Ｇ−ＣＳＦもしくはその類似体（任意で、フィルグラスチム、サルグラモスチム、又はペグフィルグラスチム）及び／又はプレリキサホルで処置した対象から取得した生体試料（任意で、末梢血）からＣＤ３４富化細胞を調製することと；ファンコニ貧血、白血球粘着不全症Ｉ型、ピルビン酸キナーゼ欠損症もしくは乳児性悪性オステオポローシスから選択される疾患又は障害に関する組換えレトロウイルスベクターにより、ＣＤ３４富化細胞を遺伝子改変することと；を含み、当該組換えレトロウイルスベクターは、ファンコニ貧血相補群（ＦＡＮＣ）遺伝子、ＩＴＧＢ２、Ｒ型ピルビン酸キナーゼ、ＣＬＣＮ７、ＯＳＴＭ１、ＴＣＩＲＧ１、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａか、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、をコードするポリヌクレオチド、及びそれと機能的に連結した真核生物性の（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃａｌｌｙ）活性プロモーター配列を含み；遺伝子改変するステップは、ＣＤ３４富化細胞を、ＰＧＥ２及びポロクサマーと、ならびに任意で、硫酸プロタミンと接触させることを含む、当該方法を提供する。
【００３７】
本開示は、それを必要とする対象において一遺伝子による遺伝性疾患又は遺伝性障害を治療する方法であって、当該対象に、当該一遺伝子による遺伝性疾患又は遺伝性障害に起因して欠失している又は変異したポリペプチドを発現する遺伝子改変した造血細胞を提供することを含む、当該方法を提供する。特定の実施形態においては、対象をＧ−ＣＳＦもしくはその類似体（任意で、フィルグラスチム、サルグラモスチム、又はペグフィルグラスチム）及び／又はプレリキサホルで処置した後で対象より得られた生体試料（任意で、末梢血）から取得されたＣＤ３４富化細胞を、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ポロクサマー、組換えフィブロネクチン断片及び／又は硫酸プロタミンから選択される少なくとも２つの形質導入エンハンサーの存在下でポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列を含む発現カセットを含む組換えレトロウイルスベクターと接触させることで、当該ＣＤ３４富化細胞を遺伝子改変して、その結果得られた遺伝子改変した細胞を、当該対象に提供する。ある実施形態においては、疾患又は障害が、ファンコニ貧血、白血球粘着不全症Ｉ型、ピルビン酸キナーゼ欠損症もしくは乳児性悪性オステオポローシスから選択され；また組換えレトロウイルスベクターが、ファンコニ貧血相補群（ＦＡＮＣ）遺伝子、ＩＴＧＢ２、Ｒ型ピルビン酸キナーゼ、ＣＬＣＮ７、ＯＳＴＭ１、ＴＣＩＲＧ１、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａか、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、を含むポリヌクレオチド、及びそれと機能的に連結した真核生物性の（ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃａｌｌｙ）活性プロモーター配列を含む。
【００３８】
ある実施形態においては、本開示は、それを必要とする対象においてファンコニ貧血を治療する方法であって、本明細書に開示の方法に従って、ファンコニ貧血相補群（ＦＡＮＣ）遺伝子か、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、をコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクターにより、造血細胞を遺伝子改変することによって産生した造血細胞を投与することを含む、当該方法を提供する。
【００３９】
ある実施形態においては、本開示は、それを必要とする対象において白血球粘着不全症Ｉ型を治療する方法であって、本明細書に開示の方法に従って、ＩＴＧＢ２遺伝子か、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、をコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクターにより、造血細胞を遺伝子改変することによって産生した造血細胞を投与することを含む、当該方法を提供する。
【００４０】
ある実施形態においては、本開示は、それを必要とする対象においてピルビン酸キナーゼ欠損症を治療する方法であって、本明細書に開示の方法に従って、Ｒ型ピルビン酸キナーゼ遺伝子か、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、をコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクターにより、造血細胞を遺伝子改変することによって産生した造血細胞を投与することを含む、当該方法を提供する。
【００４１】
ある実施形態においては、本開示は、それを必要とする対象において乳児性悪性オステオポローシスを治療する方法であって、本明細書に開示の方法に従って、ＣＬＣＮ７、ＯＳＴＭ１、ＴＣＩＲＧ１、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１もしくはＴＮＦＲＳＦ１１Ａ遺伝子か、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、をコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクターにより、造血細胞を遺伝子改変することによって産生した造血細胞を投与することを含む、当該方法を提供する。
【００４２】
さらなる関連の態様においては、本開示は、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が遺伝子改変された造血細胞を含む造血細胞集団を産生する方法であって、造血細胞を、関心対象の遺伝子を含む又は関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクター（任意で、レンチウイルスベクター）とエキソビボで接触させることを含み、当該接触させることは、ＰＧＥ２又はその誘導体、任意でヒトＰＧＥ２又は１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、及びポロクサマー、任意でポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））、の存在下で生じるものである、当該方法を提供する。この細胞は、レトロウイルスベクターによって当該細胞の形質導入を許容するのに十分な条件下及び時間の間、レトロウイルスベクターと接触させ得、例えば、好適な培地中で、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１６時間、又は少なくとも２４時間である。一部の実施形態においては、当該細胞は、各形質導入サイクルを１２〜２４時間、又は１６〜１８時間として、例えば予備刺激の後に、１回又は２つの連続する回数のいずれかで形質導入される。一部の実施形態においては、細胞を、同一の期間又は重複する期間にわたって、レトロウイルスベクター及び形質導入エンハンサーと接触させる。形質導入の後、細胞は、凍結ミックス（ｆｒｅｅｚｉｎｇ  ｍｉｘ）（例えば、ＣｒｙｏＳｔｏｒ  ＣＳ５、バイオライフ・ソリューションズ社（ＢｉｏＬｉｆｅ  Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ）、米国ワシントン州ボセル）中で調製されて、後の使用のために凍結保存されてもよい。この態様及び他の態様のある実施形態においては、ポロクサマーが、ポロクサマー２８８、ポロクサマー３３５、ポロクサマー３３８、及びポロクサマー４０７からなる群から選択される。特定の実施形態においては、ポロクサマーが、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ある実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体は、改変されていないか、又は改変されており、例えば１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）である。特定の実施形態においては、方法は、造血細胞を、硫酸プロタミン及び／又は組換えフィブロネクチン断片と接触させることをさらに含む。一部の実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、５〜３０μｇ／ｍＬ、又は約１０μｇ／ｍＬである。一部の実施形態においては、ポロクサマーの濃度が、２００〜１２００μｇ／ｍＬ又は約１０００μｇ／ｍＬである。一部の実施形態においては、硫酸プロタミンの濃度が、４〜１０μｇ／ｍＬ又は約４μｇ／ｍＬである。ある実施形態においては、ポリヌクレオチドが、一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害に関連する遺伝子において欠陥を補完する。ある実施形態においては、関心対象のポリペプチドが、ＲＰＫ、ＩＴＧＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ及びＯＳＴＭ１からなる群から選択される。一部の実施形態においては、疾患又は障害が、一遺伝子による疾患又は障害であり、例えば、ファンコニ貧血、白血球接着不全症１型、ピルビン酸キナーゼ欠損症、及び乳児性悪性大理石骨病（Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ）からなる群から選択される。特定の実施形態においては、造血細胞が、ＣＤ３４富化細胞又はＣＤ３４＋造血細胞であり、任意で骨髄（ＢＭ）由来細胞、臍帯血（ＣＢ）由来細胞、又は動員された末梢血（ｍＰＢ（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ））細胞である。一部の実施形態においては、造血細胞集団は、ＶＣＮ／細胞が、少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０、又は少なくとも２．５である。
【００４３】
関連の態様においては、本開示は、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が遺伝子改変された造血細胞を含む造血細胞集団であって、開示の方法によって産生された、当該造血細胞集団を提供する。
【００４４】
別の関連の態様においては、本開示は、それを必要とする対象において遺伝子疾患又は遺伝子障害を治療する方法であって、少なくとも８０％又は少なくとも９０％が遺伝子改変された造血細胞を含む造血細胞集団を対象に提供することを含み、当該細胞集団は、開示の方法によって産生されて、当該造血細胞は、レトロウイルスベクターとエキソビボで接触させる前に対象から取得したものであり、また関心対象の遺伝子が、当該遺伝子疾患又は遺伝子障害に起因して当該対象において変異した又は欠失している機能的ポリペプチドをコードするものである、当該方法を提供する。一部の実施形態においては、ポリペプチドが、ＲＰＫ、ＩＴＧＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ及びＯＳＴＭ１からなる群から選択される。一部の実施形態においては、疾患又は障害が、一遺伝子による疾患又は障害であり、例えば、ファンコニ貧血、白血球接着不全症１型、ピルビン酸キナーゼ欠損症、及び乳児性悪性大理石骨病（Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｏｓｔｅｏｐｅｔｒｏｓｉｓ）からなる群から選択される。特定の実施形態においては、造血細胞が、ＣＤ３４富化細胞であり、任意で骨髄（ＢＭ）由来細胞、臍帯血（ＣＢ）由来細胞、又は動員された末梢血（ｍＰＢ（ｍｏｂｉｌｉｚｅｄ  ｐｅｒｉｐｈｅｒａｌ  ｂｌｏｏｄ））細胞である。
【００４５】
本明細書に開示の態様及び実施形態のいずれかである種々の実施形態においては、細胞は、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で形質導入する。本明細書に開示の態様及び実施形態のいずれかである種々の実施形態においては、細胞は、形質導入前及び／又は形質導入中に、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で培養することによって前処理する。一部の実施形態においては、細胞は、Ｒｅｔｒｏ−Ｎｅｃｔｉｎを含む液体培地中で形質導入する。一部の実施形態においては、細胞は、組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で培養することによって前処理して、そしてまた組換えフィブロネクチン断片及び他のＴＥの存在下で、液体培養液中で形質導入する。すなわち、一部の実施形態は、細胞を、形質導入中に他のＴＥに曝露する前に組換えフィブロネクチンに曝露し、一方で、一部の実施形態においては、細胞を、他のＴＥと同一の期間又は重複する期間にわたって、組換えフィブロネクチンに曝露する。
【００４６】
本明細書に開示の態様及び実施形態のいずれかである種々の実施形態においては、細胞は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ポロクサマー（例えば、ＬｅｎｔｉＢｏｏｓｔ（商標））、組換えフィブロネクチン断片（例えば、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標））、及び硫酸プロタミンの存在下で形質導入する。
【００４７】
本発明の他の特徴及び利点は、以下の発明の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになり、また以下の発明の詳細な説明及び特許請求の範囲に包含されることとなる。
【図面の簡単な説明】
【００４８】
【図１】図１は、説明的な形質導入プロトコールを示す。ＴＥの量又は組み合わせは、変動し得る。凍結保存は任意である。細胞は、新鮮で又は凍結保存後に用いることができる。
【図２】図２Ａ及び２Ｂは、ＰＧＥ２の存在下で形質導入した、液体培地中の細胞に関するＶＣＮ測定の結果を示す。図２Ａに関しては、示している各濃度において、左側の棒グラフは、２．５×１０７ＴＵ／ｍＬのレンチウイルスベクターにより形質導入した細胞の結果を示しており、また右側の棒グラフは、５×１０７ＴＵ／ｍＬのレンチウイルスベクターにより形質導入した細胞の結果を示している。
【図３Ａ】図３Ａ〜３Ｃは、ＰＧＥ２の存在下で形質導入した細胞に関する、ＣＦＣアッセイの結果（図３Ａ）、ＶＣＮ測定の結果（図３Ｂ）、及びＣＦＣアッセイにおける形質導入率（％）の結果（図３Ｃ）を示す。
【図３Ｂ】図３Ａの説明を参照のこと。
【図３Ｃ】図３Ａの説明を参照のこと。
【図４】図４は、ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴの存在下で形質導入した、液体培養液中の細胞に関するＶＣＮ測定の結果を示す。
【図５Ａ】図５Ａ〜５Ｃは、ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴを用いて形質導入した細胞に関する、ＶＣＮ測定の結果、及びＣＦＣアッセイにおける形質導入率（％）の結果を示す。
【図５Ｂ】図５Ａの説明を参照のこと。
【図５Ｃ】図５Ａの説明を参照のこと。
【図６】図６は、ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（ＬＢ）、ＰＧＥ２、及び硫酸プロタミン（ＰＳ）のうちの１又は複数を用いて形質導入した、液体培養液中の細胞に関するＶＣＮ測定の結果を示す。
【図７Ａ】図７Ａ〜７Ｅは、ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（ＬＢ）、ＰＧＥ２、及び硫酸プロタミン（ＰＳ）のうちの１又は複数を用いて形質導入した細胞に関するＣＦＣアッセイの結果（図７Ａ）、ＶＣＮ測定の結果（図７Ｂ）、ならびにＰＳ単独、又はＬＢ、ＰＧＥ２及びＰＳの存在下で形質導入した細胞に関するＣＦＣアッセイにおける形質導入率（％）の結果（図７Ｃ）を示す。図７Ｄ及び７Ｅは、ＬＢ、ＰＧＥ２及びＰＳの形質導入率に対する影響（図７Ｄ）、ならびに臍帯血（ＣＢ−ＣＤ３４＋）及び動員された末梢血（ｍＰＢ−ＣＤ３４＋）を含めた、異なる源のＣＤ３４＋に由来するＣＦＣのＶＣＮ（図７Ｅ）を示す。
【図７Ｂ】図７Ａの説明を参照のこと。
【図７Ｃ】図７Ａの説明を参照のこと。
【図７Ｄ】図７Ａの説明を参照のこと。
【図７Ｅ】図７Ａの説明を参照のこと。
【図８】図８は、ＰＳ単独で（「ＴＥなし」）又はＰＳと形質導入エンハンサーＬＢ及びＰＧＥ２とで（「ＴＥあり」）、形質導入した結果の拡大を示す。液体培養中１４日後の細胞に関して、ＶＣＮアッセイを示している。
【図９Ａ】図９Ａ〜９Ｃは、ＰＳ単独で又はＰＳと形質導入エンハンサーＬＢ及びＰＧＥ２とで、形質導入した結果の拡大を示す。図９Ａは、ＣＦＣアッセイの結果を示す。図９Ｂは、ＣＦＵでのＶＣＮの結果を示す。前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ（ｂｕｒｓｔ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ））の細胞、顆粒球−マクロファージ前駆細胞ＣＦＵ−ＧＭ）、及び骨髄系前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）に関して、結果を示している。図９Ｃは、ＣＦＣにおける形質導入効率を示す。
【図９Ｂ】図９Ａの説明を参照のこと。
【図９Ｃ】図９Ａの説明を参照のこと。
【図１０】図１０Ａ及び１０Ｂは、免疫不全ＮＳＧマウスに移植した、ＰＳ単独で又はＰＳと形質導入エンハンサーＬＢ及びＰＧＥ２とで形質導入したＣＤ３４＋細胞のインビボでの結果を示す。ヒトＣＤ４５−陽性（ｈＣＤ４５＋）細胞の百分率（％）（図１０Ａ）及びＶＣＮ／細胞（図１０Ｂ）を示している。移植後月数１ヶ月（１）、２ヶ月（２）、又は３ヶ月（３）（ｍｐｔ（ｍｏｎｔｈｓ  ｐｏｓｔ−ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ））の結果を示している。
【図１１】図１１は、ＭＯＩ２０又はＭＯＩ５０での、形質導入エンハンサーＬＢ及びＰＧＥ２を含む（＋ＴＥ）又は含まない（−ＴＥ）、ＧＭＰのＬＶバッチ用の液体培養液中でのＶＣＮを示す。
【図１２】図１２Ａ〜１２Ｄは、形質導入エンハンサーＬＢ及びＰＧＥ２を含む（＋ＴＥ）又は含まない（−ＴＥ）、ＧＭＰのＬＶバッチ用の、全細胞（図１２Ａ）、ＢＦＵ（図１２Ｂ）、ＧＭ（図１２Ｃ）、及び混合の骨髄系前駆細胞（図１２Ｄ）に関するコロニー形成単位（ＣＦＵ）を示す。
【図１３】図１３Ａ及び１３Ｂは、ＭＯＩ２０（図１３Ａ）及びＭＯＩ５０（図１３Ｂ）での、前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）の細胞、顆粒球−マクロファージ前駆細胞ＣＦＵ−ＧＭ）、及び骨髄系前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）に関して、形質導入エンハンサーＬＢ及びＰＧＥ２を含む（＋ＴＥ）又は含まない（−ＴＥ）、ＧＭＰのＬＶバッチ用のＣＦＵでのＶＣＮを示す。
【図１４】図１４Ａ及び１４Ｂは、ＭＯＩ２０（図１４Ａ）及びＭＯＩ５０（図１４Ｂ）での、形質導入エンハンサーＬＢ及びＰＧＥ２を含む（＋ＴＥ）又は含まない（−ＴＥ）、ＣＦＵでのＶＣＮ及び形質導入効率を示す。
【図１５】図１５は、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＰＲＯ導入ベクターの概略的なマップである。
【図１６】図１６は、ｐＣＣＬ−ＣｈｉｍｈＣＤ１８Ｗ−８２−ＲＯ導入ベクターの概略的なマップである。
【図１７】図１７は、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ｃｏＲＰＫＷ−８２−ＲＯ導入ベクターの概略的なマップである。
【図１８】図１８は、ｐＲＲＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅ導入ベクターの概略的なマップである。
【発明を実施するための形態】
【００４９】
詳細な説明
本開示は、造血細胞の遺伝子改変に関する組成物及び方法を提供する。特に本発明は、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）、ポロクサマー、組換えフィブロネクチン断片、及び／又は硫酸プロタミンのうちの２以上についての組み合わせを使用して、組換えレトロウイルスベクターによる形質導入を増強することに関する。本開示の組成物及び方法は、特に、一遺伝子による疾患及び障害の治療を含めた、遺伝子療法の用途に好適である。形質導入効率が低いことを含めた遺伝子療法の成功を制限してきた要因は、本明細書で提供する組成物及び方法により解決される。
【００５０】
Ａ．定義
別段に規定していない限り、本明細書で使用する全ての技術的及び科学的な語は、この発明が関係する技術分野の当業者により通常理解されるのと同じ意味を有する。本発明の実施においては、本明細書に記載するものと同様又は均等である方法及び材料を用いることが可能であるが、好適な方法及び材料については以下に記載する。本明細書に記載した全ての刊行物、特許出願、特許及び他の参照文献は、それらの全体を参照により明示的に援用する。矛盾する場合には、定義を含めて本明細書を優先することとなる。さらに、本明細書に記載の材料、方法及び実施例は、説明的であるのみであり、限定を意図していない。
【００５１】
本明細書で意図される種々の実施形態は、特に反対のことが示されていない限り、当技術分野の技術の範囲にある化学、生化学、有機化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ技術、遺伝学、免疫学及び細胞生物学の従来の方法を採用することとなり、その多くは、説明の目的で以下に記載される。こうした技術は、文献において完全に説明される。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（３ｒｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，２００１）；Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ  Ｅｄｉｔｉｏｎ，  １９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；Ａｕｓｕｂｅｌ  ｅｔ  ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ  ａｎｄ  Ｓｏｎｓ，ｕｐｄａｔｅｄ  Ｊｕｌｙ  ２００８）；Ｓｈｏｒｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ  Ｃｏｍｐｅｎｄｉｕｍ  ｏｆ  Ｍｅｔｈｏｄｓ  ｆｒｏｍ  Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ  Ｐｕｂ．Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ  ａｎｄ  Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ；Ｇｌｏｖｅｒ，ＤＮＡ  Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（ＩＲＬ  Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９８５）；Ａｎａｎｄ，Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  Ａｎａｌｙｓｉｓ  ｏｆ  Ｃｏｍｐｌｅｘ  Ｇｅｎｏｍｅｓ，（Ａｃａｄｅｍｉｃ  Ｐｒｅｓｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，１９９２）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ  ａｎｄ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｅｄｓ．，１９８４）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ  Ｐｒａｃｔｉｃａｌ  Ｇｕｉｄｅ  ｔｏ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｈａｒｌｏｗ  ａｎｄ  Ｌａｎｅ，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，  Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ  Ｑ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ，Ａ．Ｍ．Ｋｒｕｉｓｂｅｅｋ，Ｄ．Ｈ．Ｍａｒｇｕｌｉｅｓ，Ｅ．Ｍ．Ｓｈｅｖａｃｈ  ａｎｄ  Ｗ．Ｓｔｒｏｂｅｒ，ｅｄｓ．，１９９１）；Ａｎｎｕａｌ  Ｒｅｖｉｅｗ  ｏｆ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ；のみならず、例えばＡｄｖａｎｃｅｓ  ｉｎ  Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ等の刊行物における研究書も参照されたく、このそれぞれは、本明細書において参照により明示的に援用する。
【００５２】
本明細書において用いる場合、「約」又は「およそ」の語は、基準である分量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、又は長さに対して３０、２５、２０、２５、１０、９、８、７、６、５、４、３、２又は１％程度で変動する分量、レベル、値、数、頻度、百分率、寸法、サイズ、量、重量、又は長さに対して参照される。特定の実施形態においては、「約」又は「およそ」の語は、ある数値に先行している場合、１５％、１０％、５％又は１％の範囲でプラスした又はマイナスした値を示す。
【００５３】
「トランスフェクション（ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）」は、非ウイルス性の方法により、裸のＤＮＡを細胞に導入する方法を指す。
【００５４】
「感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）」は、ウイルスベクターを用いて、外来ＤＮＡを細胞に導入する方法を指す。
【００５５】
「形質導入（ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ）」は、ウイルスベクターを用いた、外来ＤＮＡの細胞のゲノムへの導入を指す。
【００５６】
「ベクターコピー数（ｖｅｃｔｏｒ  ｃｏｐｙ  ｎｕｍｂｅｒ）」又は「ＶＣＮ」は、細胞数で除算した、試料中のベクターのコピー数を指す。概して、ベクターのコピー数は、組み込んだプロウイルスのＰｓｉ配列に対するプローブを用いた定量的ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＰＣＲ）により求め、またこの細胞の数は、１細胞当たり２つのコピー（１染色体当たり１）となることとなるヒトハウスキーピング遺伝子に対するプローブを用いたｑＰＣＲにより求める。
【００５７】
「形質導入効率」は、少なくとも１つのプロウイルスのコピーにより形質導入した細胞の百分率を指す。例えば、１×１０６細胞をウイルスに曝露して、０．５×１０６細胞が、それらのゲノム内にウイルスの少なくとも１つのコピーを有すると求められるのであれば、形質導入効率は５０％である。形質導入効率を求めるための説明的な方法は、フローサイトメトリーである。
【００５８】
本明細書において用いる場合、「レトロウイルス」又は「レトロウイルスの」の語は、そのゲノムＲＮＡを線状の二本鎖ＤＮＡのコピー内に逆転写して、次いでそのゲノムＤＮＡを宿主ゲノム内に共有結合的に組み込む、ＲＮＡウイルスを指す。レトロウイルスベクターは、遺伝子送達のためのよくある手段である（Ｍｉｌｌｅｒ，２０００，Ｎａｔｕｒｅ．３５７：４５５−４６０）。いったんウイルスが宿主ゲノム内に組み込まれると、それは「プロウイルス」と呼ばれる。プロウイルスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩの鋳型として機能し、またウイルスによりコードされたＲＮＡ分子の発現を司る。
【００５９】
説明的なレトロウイルス（レトロウイルス科）には、（１）モロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ネズミ乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、及びネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）等のガンマレトロウイルス属、（２）サル泡沫状ウイルス等のスプーマウイルス属、（３）ヒト免疫不全ウイルス−１及びサル免疫不全ウイルス等のレンチウイルス属が含まれるが、これに限定されない。
【００６０】
本明細書において用いる場合、「レンチウイルスの」又は「レンチウイルス」の語は、複雑レトロウイルスのグループ（又は属）を指す。説明的なレンチウイルスには、ＨＩＶ（ヒト免疫不全ウイルス；ＨＩＶ１型及びＨＩＶ２型を含む）；ビスナ・マエディウイルス（ＶＭＶ）のウイルス；ヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）；ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）；ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）；ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）；及びサル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）が含まれるがこれに限定されない。一実施形態においては、ＨＩＶ系ベクターの骨格（すなわち、ＨＩＶシス作動性配列の要素）が好ましい。
【００６１】
レトロウイルスベクター、及びより詳細にはレンチウイルスベクターを、本発明の実施で用いることができる。したがって、本明細書で用いる場合「レトロウイルスベクター」の語は、「レンチウイルスベクター」を含めて意味し、また本明細書で用いる場合「レトロウイルス」の語は、「レンチウイルス」を含めて意味する。
【００６２】
「ベクター」の語は、本明細書において、核酸分子であって、別の核酸分子を導入又は輸送することができる核酸分子を指すために用いる。導入された核酸は、概して、ベクターの核酸分子と結合、例えばベクターの核酸分子内に挿入される。あるベクターは、ある細胞において自家複製又は逆転写を司る配列を含み得るか、又は宿主細胞ＤＮＡ内への組み込みを可能にするのに十分である配列を含み得る。有用なベクターには、ウイルスベクターが含まれる。有用なウイルスベクターには、例えば、複製欠陥のレトロウイルス及びレンチウイルスが含まれる。
【００６３】
「ウイルスベクター」の語は、細胞内に核酸を導入することが可能であるベクターもしくはベクター粒子か、又は導入された核酸そのもののいずれかを指し得る。ウイルスベクターは、主にウイルスに由来する、構造的及び／又は機能的な遺伝子的な要素を含有する。「レトロウイルスベクター」の語は、主にレトロウイルスに由来する、構造的及び機能的な遺伝子的な要素又はその部分を含有するウイルスベクターを指す。「レンチウイルスベクター」の語は、主にレンチウイルスに由来する、ＬＴＲを含める、構造的及び機能的な遺伝子的な要素又はその部分を含有するウイルスベクターを指す。「雑種」の語は、例えばレンチウイルスであるレトロウイルスの配列と、非レンチウイルスのウイルス配列との両方を含有する、ベクター、ＬＴＲ又は他の核酸を指す。一実施形態においては、雑種ベクターは、逆転写、複製、組み込み及び／又はパッケージングのために、例えばレンチウイルスであるレトロウイルスの配列を含むベクター又は導入プラスミドを指す。
【００６４】
特定の実施形態においては、「レンチウイルスベクター」及び「レンチウイルス発現ベクター」の語は、レンチウイルス導入プラスミド及び／又は感染性レンチウイルス粒子を指すために用い得る。本明細書において、例えばクローニング部位、プロモーター、調節因子、非相同性の核酸等の要素に対して言及される場合、これら要素の配列は、本発明のレンチウイルス粒子内にＲＮＡ形態で存在して、かつ、本発明のＤＮＡプラスミド内にＤＮＡ形態で存在するということを理解されたい。
【００６５】
ある特定の実施形態によれば、ウイルスベクター骨格配列の大部分又は全てが、例えばＨＩＶ−１であるレンチウイルスに由来する。しかしながら、多数の異なる源のレンチウイルス配列を用いることが可能であり、また導入ベクターの本明細書に記載の機能を実施する能力を害することなく、あるレンチウイルス配列において多数の置換及び代替を適応させてもよい、ということを理解されたい。さらに、当技術分野において種々のレンチウイルスベクターが公知であり、Ｎａｌｄｉｎｉ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９６ａ、１９９６ｂ、及び１９９８）；Ｚｕｆｆｅｒｅｙ  ｅｔ  ａｌ．，（１９９７）；Ｄｕｌｌ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８、米国特許第６，０１３，５１６号；及び第５，９９４，１３６号が参照され、その多くを、本発明のウイルスベクター又は導入プラスミドを産生するために適応させてもよい。
【００６６】
本明細書で用いる場合、「ポリヌクレオチド」又は「核酸」の語は、概して、例えばＤＮＡ及びＲＮＡ等のある鎖内で共有結合したヌクレオチドモノマーを含む生体高分子を指す。一部の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、ゲノムＤＮＡ（ｇＤＮＡ）、相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）、又はＤＮＡを指す。ポリヌクレオチドは、組換え、合成又は単離されるかのいずれかの一本鎖及び二本鎖のポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））を指す。本明細書で用いる場合、「ポリリボヌクレオチド」又は「リボ核酸」の語はまた、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、ＲＮＡ、ゲノムＲＮＡ（ｇＲＮＡ）、プラス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（＋））、マイナス鎖ＲＮＡ（ＲＮＡ（−））を指す。好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは、本明細書に記載の参照配列（例えば、配列表を参照）のうちのいずれかに対して少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％の配列同一性を有するポリヌクレオチド又はバリアントを含み、典型的には、当該バリアントは、参照配列の少なくとも１つの生物活性を維持する。種々の説明的な実施形態においては、ウイルスベクター及び導入プラスミドポリヌクレオチドの配列、及びそれを含む組成物を意図している。特定の実施形態においては、１又は複数のポリペプチド製剤及び／又は関心対象の他の遺伝子をコードするポリヌクレオチドを意図している。特定の実施形態においては、これに限定されるものではないがＲＰＫ、ＩＴＧＢ２、ＦＡＮＣＡ、ＦＡＮＣＣ、ＦＡＮＣＧ、ＴＣＩＲＧ１、ＣＬＣＮ７、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１１Ａ及びＯＳＴＭ１の遺伝子を含む、ポリペプチド製剤をコードするポリヌクレオチドである。一部の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、これら遺伝子のうちのいずれかのコドン最適化されたバリアントである。一部の実施形態においては、ポリヌクレオチドは、例えば開示の遺伝子のうちのいずれかによってコードされるポリペプチド等である、ヒトポリペプチド又はその機能的断片もしくは機能的バリアントをコードする。
【００６７】
本明細書で用いる場合、「偽型」ベクターは、天然のベクターのキャプシドタンパク質もしくはエンベロープタンパク質とは異なる組換えのキャプシドタンパク質又はエンベロープタンパク質を有するベクターを指す。例えば、ＶＳＶＧ偽型レンチウイルスベクターは、ＲＮＡゲノムを含有するウイルス粒子内へのＶＳＶＧエンベロープタンパク質の組み込みを可能にする手法での、ＶＳＶＧウイルスのエンベロープタンパク質のパッケージング細胞株におけるウイルスのＲＮＡゲノムとの共発現によって生成したベクターである。偽型ベクターは、親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）を変えて、及び／又は免疫原性を低下させて、それらを遺伝子療法用途での使用に望ましくさせるようにしてもよい。異なるパッケージング細胞株においてウイルス粒子を生成することによって、又は異なるエンベロープタンパク質（又はキャプシドタンパク質）をコードするプラスミドもしくは他のＤＮＡからのエンベロープタンパク質（又はキャプシドタンパク質）を共発現することによって、偽型ベクターを生成することのみならずベクターの偽型を変更することは、当業者の技術の範囲内である。例示的な方法は、Ｃｒｏｎｉｎ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｕｒｒ．  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ．５：３８７−３９８（２００５）で提供される。一部の実施形態においては、本開示の方法は、偽型組換えレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）の使用を伴う。一部の実施形態においては、偽型組換えレトロウイルスベクターは、ＶＳＶＧ偽型である。
【００６８】
「増強する」又は「促進する」又は「増加する」又は「拡大する」によっては、概して、ビヒクル又は制御分子／組成物のいずれかによって形質導入した細胞の数と比較して、より多くの数の形質導入した細胞を引き出す、生じさせる、もしくは産生する、又は形質導入した細胞の集団においてより高いＶＣＮを引き出す、生じさせる、もしくは産生する、本明細書で意図する組成物及び／又は方法の能力を指す。一実施形態においては、本明細書で意図する組成物及び方法により形質導入した造血幹細胞又は造血前駆細胞が、既存の形質導入組成物及び方法と比較して、形質導入した細胞の数が増加することを含み、又は、形質導入した細胞の集団におけるＶＣＮが増加することを含む。細胞形質導入の増加は、例えばとりわけレポーターアッセイ、ＲＴ−ＰＣＲ、及び細胞表面タンパク質発現等である、当技術分野で公知の方法を用いて確認することが可能である。形質導入の「増加した」又は「増強した」量は、典型的には、「統計学的に有意」な量であり、またビヒクル、制御組成物又は他の形質導入方法によって形質導入した細胞の数の、１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍又はそれ以上（例えば、５００倍、１０００倍）（例えば１．５、１．６、１．７、１．８等である、１との間かつ１を超える全ての整数及び小数点を含める）である増加を含み得る。
【００６９】
「減少する」又は「低下する」又は「少なくなる」又は「低減する」又は「軽減する」によっては、概して、本発明による組成物及び／又は方法により形質導入した細胞と比較して、比較的少ない形質導入細胞を結果としてもたらすような組成物又は方法を指す。形質導入細胞の「減少した」又は「低減した」量は、典型的には、「統計学的に有意」な量であり、本発明による組成物及び／又は方法により産生した形質導入細胞（参照応答）の数の、１．１倍、１．２倍、１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍又はそれ以上（例えば、５００倍、１０００倍）（例えば１．５、１．６、１．７、１．８等である、１との間かつ１を超える全ての整数及び小数点を含める）である減少を含み得る。
【００７０】
「維持する」又は「保存する」又は「維持」又は「変化なし」又は「実質的な変化なし」又は「実質的な減少なし」によっては、概して、ビヒクル、制御分子／組成物又は特定の細胞における応答のいずれかによって引き起こされる応答と匹敵する生理学的反応に言及する。匹敵する応答は、参照応答とは有意に異なるものではない、又は参照応答から測定可能な差異がない応答である。
【００７１】
以下の記載においては、本明細書で意図する発明の種々の説明的な実施形態の全体的な理解を提供するために、ある特定の詳細を記載する。しかしながら、当業者は、特定の説明的な実施形態は、これら詳細なしに実施することができるということを理解するであろう。さらに、本明細書に記載の構造及び置換の種々の組み合わせに由来する個々のベクター又はベクターの群は、あたかも各ベクター又はベクターの各群について別個に記載したかのように同程度に本願によって開示しているものと理解されたい。すなわち、特定のベクターの構造又は特定の置換の選択は、本開示の範囲の範囲内である。
【００７２】
本明細書で用いる場合、「Ｘ−ＶＩＶＯ  ２０」又は「Ｘ−ＶＩＶＯ」は、Ｌｏｎｚａ（登録商標）社より利用可能である、Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）２０既知組成、無血清造血細胞培地を指す。Ｘ−ＶＩＶＯ  ２０以外の他の培地を用いてもよく、当業者は、細胞増殖及び形質導入に好適な培地を選択することができる。
【００７３】
本明細書で用いる場合、「ｒｈＳＣＦ」は、組換えヒト幹細胞因子を指す。
【００７４】
本明細書で用いる場合、「ｒｈＴＰＯ」は、組換えヒトトロンボポエチン（ｔｈｒｏｍｂｏｐｏｅｉｔｉｎ）を指す。
【００７５】
本明細書で用いる場合、「ｒｈ−ＦＬＴ３−Ｌ」は、組換えヒトｆｍｓ関連チロシンキナーゼ３−リガンドを指す。
【００７６】
本明細書で用いる場合、「ＩＬ−３」又は「ｒｈＩＬ−３」は、組換えヒトインターロイキン３を指す。
【００７７】
本明細書で用いる場合、「ＰＧＥ２」は、ジノプロストンとしても知られる、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）を指す。
【００７８】
本明細書で用いる場合、「ポロクサマー」は、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接されるポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央の疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロック共重合体を指す。
【００７９】
本明細書で用いる場合、「組換えフィブロネクチン断片」は、形質導入効率を促進して増強するものであるタンパク質フィブロネクチンの任意の断片を指す。理論に拘束されることなく、組換えフィブロネクチン断片は、標的細胞とのレンチウイルス又はレトロウイルスの共局在化を促進すると考えられている。組換えフィブロネクチン断片の例としては、ヒトフィブロネクチンのＣＨ２９６断片、商品名ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）、である。
【００８０】
本開示及び特許請求の範囲で提供されるＰＧＥ２もしくはその誘導体、ポロクサマー、又は硫酸プロタミンの濃度は、そこで細胞を培養する培地における各薬剤の濃度を指す。
【００８１】
本明細書で用いる場合、「ＬＢ」又は「ＬｅｎｔｉＢｏｏｓｔ」は、Ｓｉｒｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ（登録商標）社より利用可能なＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）形質導入エンハンサーを指す。同義として、ポロクサマー３３８、Ｆ１０８、及びＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）  Ｐ３３８が含まれる。
【００８２】
本明細書で用いる場合、「ＨＳＡ」は、ヒト血清アルブミンを指す。
【００８３】
本明細書で用いる場合、「ＤＭＳＯ」はジメチルスルホキシドを指す。
【００８４】
本明細書で用いる場合、「ＣＦＣ」は、コロニー形成細胞を指す。コロニー形成細胞（ＣＦＣ）アッセイは、造血前駆細胞の半流動培地においてコロニーを形成する能力によって造血前駆細胞の増殖及び分化パターンを試験するために用いる。決まった数のインプット細胞によって形成されるコロニーの数及び形態学が、前駆細胞の分化及び増殖能力についての予備的な情報を与える。例示的なアッセイは、Ｓａｒｍａ  ｅｔ  ａｌ．Ｃｏｌｏｎｙ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｃｅｌｌ（ＣＦＣ）ａｓｓａｙ  ｆｏｒ  ｈｕｍａｎ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｃｅｌｌｓ．Ｊ  Ｖｉｓ  Ｅｘｐ．２０１０  Ｄｅｃ  １８；（４６）で与えられる。
【００８５】
本明細書で用いる場合、「ＬＣ」は、「液体培養（液）」を指す。
【００８６】
本明細書で用いる場合、「ＣＦＵ」は、コロニー形成単位を指す。ＣＦＵは、ＣＦＣと同義であると理解されるが、半流動培地において増殖するＣＦＵの種類に言及して用いることもある。
【００８７】
本明細書で用いる場合、「ＴＵ」は、形質導入単位を指す。ＴＵ／ｍＬは、レトロウイルス（レンチウイルス）製剤の機能的な力価（ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ  ｔｉｔｅｒ）の共通の測定値である。
【００８８】
本明細書で用いる場合、「ＰＳ」は、硫酸プロタミンを指す。
【００８９】
本明細書で用いる場合、「ＴＥ」は、１又は複数の形質導入エンハンサーを指す。
【００９０】
本明細書で用いる場合、「ＣＢ新鮮細胞」は、新鮮臍帯血細胞を指す。
【００９１】
本明細書で用いる場合、「ＭＯＩ」は、感染効率を指す。
【００９２】
本明細書で用いる場合、「ＢＦＵ−Ｅ」は、前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）の細胞、最も早期の赤血球前駆細胞、を指す。
【００９３】
本明細書で用いる場合、「ＣＦＵ−ＧＭ」は、顆粒球−マクロファージ前駆細胞のコロニー形成単位を指す。
【００９４】
本明細書で用いる場合、「ＣＦＵ−ＧＥＭＭ」は、骨髄幹細胞（顆粒球、赤血球、単球、巨核球）のコロニー形成単位を指す。
【００９５】
本明細書で用いる場合、「ｍＰＢ」は、動員された末梢血細胞を指す。
【００９６】
本明細書で用いる場合、「ＳＣＧＭ」は、ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ（登録商標）社ＳＣＧＭ無血清培地を指す。
【００９７】
本明細書で用いる場合、「投与すること」又は「導入すること」又は「〜に提供すること」の語は、対象に造血細胞集団を、例えば対象に当該細胞集団を動脈内又は静脈内に注入することによって、送達することを指す。造血細胞集団は、例えば生理食塩水等である種々の溶液中で投与され得る。一部の実施形態においては、用いる溶液は、対象の血液に対して等張であり、またｐＨ緩衝化されることとなる。
【００９８】
典型的には、細胞は、ウイルスベクター又はウイルスベクター粒子が、非相同ＤＮＡ（例えば、ベクター又はその発現カセット）を細胞のゲノムに導入されたときに、「形質導入した」と呼ぶ。
【００９９】
本明細書で用いる場合、「宿主細胞」の語は、ウイルスベクター又はウイルスベクター粒子により形質導入した細胞を指す。「宿主細胞」の語は、元の形質導入した細胞と、その子孫とを指すということが理解されるであろう。
【０１００】
「治療、処置」、「治療すること、処置すること」等の語は、概して、所望の薬理的な及び／又は生理学的な効果を得ることを意味するために本明細書で用いる。当該効果は、例えば対象において疾患もしくはその症状が発生する可能性を低減させる、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点で予防的であってもよく、ならびに／又は、疾患に対する及び／もしくは疾患に起因する有害作用の部分的もしくは完全な治癒という点で治療的であってもよい。本明細書で用いる場合「治療」は、哺乳動物における疾患のあらゆる治療をカバーし、また（ａ）疾患に罹患しやすくなる可能性があるが、まだ罹患していると診断されていない対象において、疾患の発生を予防すること、（ｂ）疾患を阻害すること、すなわちその発生を阻止すること、又は（ｃ）疾患を緩和すること、すなわち疾患の退行を引き起こすこと、を含む。治療薬は、疾患もしくは傷害の発症前、発症中又は発症後に投与され得る。治療により患者の望ましくない臨床症状が安定化又は軽減されるような、進行中の疾患の治療が、特に関心である。こうした治療は、影響を受けた組織における機能の完全な喪失に先立って実施されることが望ましい。対象の治療は、疾患の徴候段階中で、また一部の場合においては、疾患の徴候段階の後で、施与されることとなることが望ましい。
【０１０１】
「個体」、「宿主」、「対象」及び「患者」の語は、本明細書において区別無く用いられて、またサル及びヒトを含めた、ヒト及び非ヒト霊長類；哺乳類スポーツ用動物（ｍａｍｍａｌｉａｎ  ｓｐｏｒｔ  ａｎｉｍａｌ）（例えば、ウマ）；哺乳類家畜動物（例えば、ヒツジ、ヤギ等）；哺乳類愛玩動物（イヌ、ネコ等）；ならびに、げっ歯類（例えば、ネズミ、ラット等）を含むが、これに限定されない、哺乳動物を指す。
【０１０２】
Ｂ．実施形態及び変形例
種々の組成物及び方法を、以下に記載する。本明細書において特定の組成物及び方法を例示するが、いくつかの代替的な組成物及び方法のうちのいずれもが、本明細書に開示する組成物及び方法の実施に用いるのに利用可能であり好適であるということを理解されたい。本明細書に開示する発現コンストラクト及び方法の評価は、当技術分野で標準の方法を用いて実行してもよいということもまた理解されることとなる。
【０１０３】
１．形質導入エンハンサーの組み合わせを用いた形質導入
本開示は、造血細胞をレンチウイルスベクターにより形質導入して、レンチウイルスベクターにより形質導入した細胞を高い百分率で有する造血細胞の集団を産生する有利な方法を提供する。これら方法は、特に、造血細胞をレンチウイルス遺伝子療法ベクターにより形質導入して、遺伝的欠陥を修正するのに有利であるが、これは、レンチウイルス遺伝子療法ベクターによって導入される修正された遺伝子の機能的産物を発現する細胞を多数得るからである。
【０１０４】
当技術分野で、ポリブレン、硫酸プロタミン、レトロネクチン（組換えフィブロネクチン断片）及びＤＥＡＥデキストランを含めて、種々の形質導入エンハンサーが公知である。一部の場合においては、ポリブレン等のポリカチオン性薬剤が、形質導入エンハンサーとして採用されてきた。Ｄｅｎｎｉｎｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１３  Ｍａｒ；５３（３）：３０８−３１４。さらに、ラパマイシン及びシクロスポリンＡが、形質導入エンハンサーとして用いられる。しかしながら、本開示においては、形質導入エンハンサーのそれぞれを単独で用いた場合と比較して、有意に高いレベルで造血細胞のレンチウイルスによる形質導入を達成するような形質導入エンハンサーの特定の組み合わせを特定する。
【０１０５】
一態様においては、本開示は、造血細胞を、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）又はその誘導体、ポロクサマー、硫酸プロタミン及び組換えフィブロネクチン断片より選択される少なくとも２つの形質導入エンハンサーと接触させることと、造血細胞を、組換えレトロウイルスベクターと接触させることとを含む、造血細胞の遺伝子改変方法を提供する。この細胞は、レトロウイルスベクターによって当該細胞の形質導入を許容するのに十分な条件下及び時間の間、レトロウイルスベクターと接触させ得、例えば、好適な培地中で、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、又は少なくとも１６時間である。一部の実施形態においては、当該細胞は、例えば予備刺激の後に、１回又は２つの連続する回数のいずれかで形質導入され、各形質導入サイクルを１２〜２４時間、又は１６〜１８時間とする。一部の実施形態においては、細胞を、同一の期間又は重複する期間にわたって、レトロウイルスベクター及び形質導入エンハンサーと接触させる。特定の実施形態においては、細胞を、同時に又は重複する期間にわたって、形質導入エンハンサー及び組換えレトロウイルスベクターと接触させる。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、ポロクサマーを含む。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、ポロクサマー及びＰＧＥ２もしくはその誘導体を含むか、又はポロクサマー及びＰＧＥ２もしくはその誘導体からなる。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、ポロクサマー及び硫酸プロタミンを含むか、又はポロクサマー及び硫酸プロタミンからなる。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、ポロクサマー、ＰＧＥ２及び硫酸プロタミンを含むか、又はポロクサマー、ＰＧＥ２及び硫酸プロタミンからなる。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）もしくはその誘導体、ポロクサマー、硫酸プロタミン及び組換えフィブロネクチン断片を含むか、又はプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）もしくはその誘導体、ポロクサマー、硫酸プロタミン及び組換えフィブロネクチン断片からなる。本明細書に開示の態様及び実施形態のいずれかである種々の実施形態においては、細胞は、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で形質導入する。種々の実施形態においては、細胞は、形質導入前及び／又は形質導入中に、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で培養することによって前処理する。ある実施形態においては、方法は、約２ｕｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（ＲＮ）で被覆したプレート上で細胞を培養することによる予備刺激を含む。一部の実施形態においては、細胞は、ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）を含む液体培地中で形質導入する。一部の実施形態においては、細胞は、組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で培養することによって前処理して、そしてまた組換えフィブロネクチン断片及び他のＴＥの存在下で、液体培養液中で形質導入する。
【０１０６】
一態様においては、本開示は、造血細胞の遺伝子改変方法であって、造血細胞を提供することと、造血細胞を、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）又はその誘導体、ポロクサマー（例えば、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））、硫酸プロタミン、及び組換えフィブロネクチン断片から選択される少なくとも２つの形質導入エンハンサーと接触させることと、造血細胞を組換えレトロウイルスベクターと接触させることとを含む、造血細胞の遺伝子改変方法を提供する。特定の実施形態においては、細胞を、同時に又は重複する期間にわたって、形質導入エンハンサー及び組換えレトロウイルスベクターと接触させる。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、ポロクサマーを含む。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、ポロクサマー及びＰＧＥ２又はその誘導体を含む。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、ポロクサマー及び硫酸プロタミンを含むか、又はポロクサマー及び硫酸プロタミンからなる。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、ポロクサマー、ＰＧＥ２及び硫酸プロタミンを含むか、又はポロクサマー、ＰＧＥ２及び硫酸プロタミンからなる。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）もしくはその誘導体、ポロクサマー、硫酸プロタミン及び組換えフィブロネクチン断片を含むか、又はプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）もしくはその誘導体、ポロクサマー、硫酸プロタミン及び組換えフィブロネクチン断片からなる。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）もしくはその誘導体、ポロクサマー、硫酸プロタミン及び組換えフィブロネクチン断片を含むか、又はプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）もしくはその誘導体、ポロクサマー、硫酸プロタミン及び組換えフィブロネクチン断片からなる。本明細書で開示する態様及び実施形態のいずれかである種々の実施形態においては、細胞は、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で形質導入する。種々の実施形態においては、細胞は、形質導入前及び／又は形質導入中に、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で培養することによって前処理する。ある実施形態においては、方法は、約２ｕｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（ＲＮ）で被覆したプレート上で細胞を培養することによる予備刺激を含む。一部の実施形態においては、細胞は、Ｒｅｔｒｏ−Ｎｅｃｔｉｎ（商標）を含む液体培地中で形質導入する。一部の実施形態においては、細胞は、組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で培養することによって前処理して、そしてまた組換えフィブロネクチン断片及び他のＴＥの存在下で、液体培養液中で形質導入する。
【０１０７】
本明細書で開示する方法の種々の実施形態においては、細胞集団は、レトロウイルスベクターと、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１又は複数の薬剤と、平均分子量が約１０，０００ダルトンであるポロクサマーとの存在下で培養する。特定の実施形態においては、細胞を、同時に又は重複する期間にわたって、形質導入エンハンサー及び組換えレトロウイルスベクターと接触させる。
【０１０８】
本明細書で開示する方法の種々の実施形態においては、細胞集団は、レトロウイルスベクターと、プロスタグランジンＥＰ受容体シグナル伝達経路を刺激する１又は複数の薬剤と、ポリプロピレンサブユニットの平均分子量が約２２５０ダルトンを超えて且つ約４０％を超えるポリエチレンオキシドを含むポロクサマーとの存在下で培養する。特定の実施形態においては、細胞を、同時に又は重複する期間にわたって、形質導入エンハンサー及び組換えレトロウイルスベクターと接触させる。
【０１０９】
本明細書で開示の方法の特定の実施形態においては、細胞は、例えば液体培地中の、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ）、ＰＧＥ２、及び硫酸プロタミンである３つの形質導入エンハンサーの組み合わせを含む培地中で形質導入する。細胞は、培養ディッシュに付着させてもよいし、又は細胞は、培養ディッシュに付着させなくてもよい。特定の実施形態においては、細胞を、同時に又は重複する期間にわたって、形質導入エンハンサー及び組換えレトロウイルスベクターと接触させる。ある実施形態においては、方法は、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（ＲＮ）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したプレート上で細胞を培養することによる予備刺激を含む。ある実施形態においては、細胞は、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で形質導入する。種々の実施形態においては、細胞は、形質導入前及び／又は形質導入中に、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で培養することによって前処理する。ある実施形態においては、方法は、約２ｕｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（ＲＮ）で被覆したプレート上で細胞を培養することによる予備刺激を含む。一部の実施形態においては、細胞は、Ｒｅｔｒｏ−Ｎｅｃｔｉｎ（商標）を含む液体培地中で形質導入する。一部の実施形態においては、細胞は、組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で培養することによって前処理して、そしてまた組換えフィブロネクチン断片及び他のＴＥの存在下で、液体培養液中で形質導入する。
【０１１０】
関連する態様においては、本開示は、組換えレトロウイルスベクター介在性の、造血細胞の遺伝子改変を増強する方法であって、造血細胞を、エキソビボで、２以上の形質導入エンハンサーの組み合わせの有効量により処理すること又は接触させることを含み、形質導入エンハンサーのうちの少なくとも２つは、ＰＧＥ２又はその誘導体、ポロクサマー、硫酸プロタミン及び組換えフィブロネクチン断片から選択される、当該方法を提供する。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。一部の実施形態においては、細胞を、ＰＧＥ２又はその誘導体及び有効量のポロクサマーと接触させることと；当該細胞を、関心対象の遺伝子を含むポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクターと接触させることとを含み、当該レトロウイルスベクターのウイルス形質導入の有効性が、例えばＰＧＥ２及びポロクサマーである形質導入エンハンサーの組み合わせの不在下での組換えレトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入と比較して増強される。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、ポロクサマー及びＰＧＥ２又はその誘導体を含む。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、ポロクサマー及び硫酸プロタミンを含むか、又はポロクサマー及び硫酸プロタミンからなる。ある実施形態においては、方法は、造血細胞を、有効量の硫酸プロタミンによりエキソビボで処理すること又は接触させることをさらに含む。ある実施形態においては、２以上の形質導入エンハンサーは、プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）もしくはその誘導体、ポロクサマー、硫酸プロタミン及び組換えフィブロネクチン断片を含むか、又はプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）もしくはその誘導体、ポロクサマー、硫酸プロタミン及び組換えフィブロネクチン断片からなる。本明細書で開示する態様及び実施形態のいずれかである種々の実施形態においては、細胞は、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で形質導入する。種々の実施形態においては、細胞は、形質導入前及び／又は形質導入中に、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で培養することによって前処理する。ある実施形態においては、方法は、約２ｕｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（ＲＮ）で被覆したプレート上で細胞を培養することによる予備刺激を含む。一部の実施形態においては、細胞は、Ｒｅｔｒｏ−Ｎｅｃｔｉｎ（商標）を含む液体培地中で形質導入する。一部の実施形態においては、細胞は、組換えフィブロネクチン断片で被覆したディッシュ上で培養することによって前処理して、そしてまた組換えフィブロネクチン断片及び他のＴＥの存在下で、液体培養液中で形質導入する。
【０１１１】
本明細書で開示する方法のうちのいずれかのある実施形態においては、細胞は、２以上の形質導入エンハンサーを含む溶液又は培養培地と接触させる。当該溶液もしくは培養培地は、組換えレトロウイルスベクターをさらに含んでもよく、又は細胞を形質導入エンハンサーを含む溶液もしくは培養培地と接触させた後で、組換えレトロウイルスベクターを添加してもよい。特定の実施形態においては、細胞は、当該溶液又は培養培地を含む培養ディッシュ中に存在する。特定の実施形態においては、培養ディッシュは、組換えフィブロネクチン断片で被覆される。この細胞は、レトロウイルスベクターによって当該細胞の形質導入を許容するのに十分な条件下及び時間の間、レトロウイルスベクターと接触させ得、例えば、好適な培地中で、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、又は少なくとも１６時間である。一部の実施形態においては、当該細胞は、例えば予備刺激の後に、１回又は２つの連続する回数のいずれかで形質導入され、各形質導入サイクルを１２〜２４時間、又は１６〜１８時間とする。一部の実施形態においては、細胞を、同一の期間又は重複する期間にわたって、レトロウイルスベクター及び形質導入エンハンサーと接触させる。
【０１１２】
本明細書で開示する方法のうちのいずれかの一部の実施形態においては、細胞を、ポロクサマーと接触させる。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー２８８、ポロクサマー３３５、ポロクサマー３３８、及びポロクサマー４０７からなる群から選択される。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）は、約５０μｇ／ｍＬから約１，５００μｇ／ｍＬ、約５００μｇ／ｍＬから約１，５００μｇ／ｍＬ、約７５０μｇ／ｍＬ〜約１，２５０μｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ、約９００μｇ／ｍＬ、約９５０μｇ／ｍＬ、約１０００μｇ／ｍＬ、約１０５０μｇ／ｍＬ、約１１００μｇ／ｍＬ、又は約１１５０μｇ／ｍＬの最終濃度で用いることが可能である。
【０１１３】
本明細書で開示する方法のうちのいずれかの一部の実施形態においては、細胞を、ＰＧＥ２又はその誘導体と接触させる。ある実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体が、改変される。ある実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体が、ジメチル化ＰＧＥ２である。ある実施形態においては、ジメチル化ＰＧＥ２が、１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２である。１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ２は、以下の構造（「骨格構造」として表し、「線角構造式」又は「短縮構造式」とも呼ばれる）を有する：
2021532776.tif 000003
分子式：Ｃ２２Ｈ３６Ｏ５。
【０１１４】
一部の実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体が、改変されていない。
【０１１５】
一部の実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体は、約１μＭ〜約２００μＭ、約１０μＭ〜約２０μＭ、約２０μＭ〜約４０μＭ、約４０μＭ〜約６０μＭ、約６０μＭ〜約８０μＭ、約５μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、又は約４０μＭの最終濃度で用いることが可能である。ＰＧＥ２又はその誘導体は、約０．３μＭ〜約７０μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ〜約７μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ〜約１３μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ〜約２０μｇ／ｍｌ、約２０μｇ／ｍｌ〜約２６μｇ／ｍｌ、約２μｇ／ｍｌ、約３μｇ／ｍｌ、約４μｇ／ｍｌ、約５μｇ／ｍｌ、約６μｇ／ｍｌ、約７μｇ／ｍｌ、約８μｇ／ｍｌ、約９μｇ／ｍｌ、約１０μｇ／ｍｌ、約１１μｇ／ｍｌ、約１２μｇ／ｍｌ、約１３μｇ／ｍｌ、約１４μｇ／ｍｌ、又は約１５μｇ／ｍｌの最終濃度で用いることが可能である。
【０１１６】
本明細書に開示の方法のうちのいずれかの一部の実施形態においては、方法は、造血細胞を硫酸プロタミンと接触させることを含む。硫酸プロタミンは、約４μｇ／ｍＬ〜約１５μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬ、又は約５μｇ／ｍＬ、約６μｇ／ｍＬ、約７μｇ／ｍＬ、約８μｇ／ｍＬ、約９μｇ／ｍＬ、約１０μｇ／ｍＬ、約１１μｇ／ｍＬ、約１２μｇ／ｍＬ、約１３μｇ／ｍＬ、約１４μｇ／ｍＬ、又は約１５μｇ／ｍＬ、又はそれ以上の最終濃度で用いることが可能である。ある実施形態においては、硫酸プロタミンは、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、又は約５μｇ／ｍＬの最終濃度で用いることが可能である。
【０１１７】
本明細書に開示の方法のうちのいずれかの一部の実施形態においては、細胞を、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体と接触させる。ある実施形態においては、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体は、それぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約２μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約４μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約５μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約６μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約８μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約９μｇ／ｍＬの最終濃度で用いる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいては、硫酸プロタミンは、任意に、約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、又は約６μｇ／ｍＬの最終濃度で用いてもよい。
【０１１８】
一部の実施形態においては、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体は、それぞれ約９５０μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約２μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９５０μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９５０μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９５０μｇ／ｍＬ及び約４μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９５０μｇ／ｍＬ及び約５μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９５０μｇ／ｍＬ及び約６μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９５０μｇ／ｍＬ及び約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９５０μｇ／ｍＬ及び約８μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９５０μｇ／ｍＬ及び約９μｇ／ｍＬの最終濃度で用いる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいては、硫酸プロタミンは、任意に、約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、又は約６μｇ／ｍＬの最終濃度で用いてもよい。
【０１１９】
一部の実施形態においては、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体は、それぞれ約１０００μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０００μｇ／ｍＬ及び約２μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０００μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０００μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０００μｇ／ｍＬ及び約４μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０００μｇ／ｍＬ及び約５μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０００μｇ／ｍＬ及び約６μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０００μｇ／ｍＬ及び約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０００μｇ／ｍＬ及び約８μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０００μｇ／ｍＬ及び約９μｇ／ｍＬの最終濃度で用いる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいては、硫酸プロタミンは、任意に、約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、又は約６μｇ／ｍＬの最終濃度で用いてもよい。
【０１２０】
一部の実施形態においては、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体は、それぞれ約１０５０μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０５０μｇ／ｍＬ及び約２μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０５０μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０５０μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０５０μｇ／ｍＬ及び約４μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０５０μｇ／ｍＬ及び約５μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０５０μｇ／ｍＬ及び約６μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０５０μｇ／ｍＬ及び約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０５０μｇ／ｍＬ及び約８μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１０５０μｇ／ｍＬ及び約９μｇ／ｍＬの最終濃度で用いる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいては、硫酸プロタミンは、任意に、約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、又は約６μｇ／ｍＬの最終濃度で用いてもよい。
【０１２１】
本明細書で開示する方法のうちのいずれかの一部の実施形態においては、細胞を、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体と接触させる。ある実施形態においては、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体は、それぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ及び約２μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ及び約４μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ及び約５μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ及び約６μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ及び約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ及び約８μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ及び約９μｇ／ｍＬの最終濃度で用いる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいては、硫酸プロタミンは、任意に、約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、又は約６μｇ／ｍＬの最終濃度で用いてもよい。
【０１２２】
本明細書で開示する方法のうちのいずれかの一部の実施形態においては、細胞を、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体と接触させる。ある実施形態においては、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体は、それぞれ約１ｍｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１ｍｇ／ｍＬ及び約２μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１ｍｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１ｍｇ／ｍＬ及び約４μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１ｍｇ／ｍＬ及び約５μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１ｍｇ／ｍＬ及び約６μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１ｍｇ／ｍＬ及び約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１ｍｇ／ｍＬ及び約８μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約１ｍｇ／ｍＬ及び約９μｇ／ｍＬの最終濃度で用いる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいては、硫酸プロタミンは、任意に、約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、又は約６μｇ／ｍＬの最終濃度で用いてもよい。
【０１２３】
本明細書で開示する方法のうちのいずれかの一部の実施形態においては、細胞を、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体と接触させる。ある実施形態においては、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体は、それぞれ約２ｍｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約２ｍｇ／ｍＬ及び約２μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約２ｍｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約２ｍｇ／ｍＬ及び約４μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約２ｍｇ／ｍＬ及び約５μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約２ｍｇ／ｍＬ及び約６μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約２ｍｇ／ｍＬ及び約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約２ｍｇ／ｍＬ及び約８μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約２ｍｇ／ｍＬ及び約９μｇ／ｍＬの最終濃度で用いる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいては、硫酸プロタミンは、任意に、約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、又は約６μｇ／ｍＬの最終濃度で用いてもよい。
【０１２４】
本明細書で開示する方法のうちのいずれかの一部の実施形態においては、細胞を、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体と接触させる。ある実施形態においては、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体は、それぞれ約４ｍｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約４ｍｇ／ｍＬ及び約２μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約４ｍｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約４ｍｇ／ｍＬ及び約４μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約４ｍｇ／ｍＬ及び約５μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約４ｍｇ／ｍＬ及び約６μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約４ｍｇ／ｍＬ及び約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約４ｍｇ／ｍＬ及び約８μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約４ｍｇ／ｍＬ及び約９μｇ／ｍＬの最終濃度で用いる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいては、硫酸プロタミンは、任意に、約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、又は約６μｇ／ｍＬの最終濃度で用いてもよい。
【０１２５】
本明細書で開示する方法のうちのいずれかの一部の実施形態においては、細胞を、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体と接触させる。ある実施形態においては、ポロクサマー３３８及びＰＧＥ２又はその誘導体は、それぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬ及び約２μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍｌ、又はそれぞれ約９００μｇ／ｍＬ及び約３μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬ及び約４μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬ及び約５μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬ及び約６μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬ及び約７μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬ及び約８μｇ／ｍＬ、又はそれぞれ約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬ及び約９μｇ／ｍＬの最終濃度で用いる。前述の実施形態のうちのいずれかにおいては、硫酸プロタミンは、任意に、約３μｇ／ｍＬ〜約７μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ〜約５μｇ／ｍＬ、又は約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ、約５μｇ／ｍＬ、又は約６μｇ／ｍＬの最終濃度で用いてもよい。
【０１２６】
好ましい実施形態においては、細胞は、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬでポロクサマー３３８を；約１０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬでＰＧＥ２を；及び約１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬで硫酸プロタミンを含有する培地中で、レンチウイルスベクターにより形質導入する。付着形態では、基材は、一部の場合において、商品名ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）であるヒトフィブロネクチンのＣＨ２９６断片で、濃度約２０μｇ／ｍＬ〜約１００μｇ／ｍＬでのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）溶液を用いて、被覆する。
【０１２７】
好ましい実施形態においては、細胞を、約０．５ｍｇ／ｍＬ〜約４ｍｇ／ｍＬのポロクサマー３３８と；約１０μｇ／ｍＬ〜約５０μｇ／ｍＬのＰＧＥ２と；及び約１μｇ／ｍＬ〜約１０μｇ／ｍＬの硫酸プロタミンと接触させる。
【０１２８】
好ましい実施形態においては、細胞は、約１ｍｇ／ｍＬでポロクサマー３３８を；約１０μＭでＰＧＥ２を；及び約４μｇ／ｍＬで硫酸プロタミンを含有する培地中で、レンチウイルスベクターにより形質導入する。付着形態では、基材は、一部の場合において、商品名ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）であるヒトフィブロネクチンのＣＨ２９６断片で、濃度約２０μｇ／ｍＬでのＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）溶液を用いて、被覆する。ある実施形態においては、培養ディッシュは、２ｕｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）で被覆する。ある実施形態においては、方法は、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（ＲＮ）である組換えフィブロネクチン断片で被覆したプレート上で細胞を培養することによる予備刺激を含む。
【０１２９】
好ましい実施形態においては、細胞を、約１ｍｇ／ｍＬのポロクサマー３３８と；約１０μＭのＰＧＥ２と；及び約４の硫酸プロタミンと接触させる。
【０１３０】
表１及び表２に、さらなる説明的な実施形態を提供している。形質導入エンハンサーの示した組み合わせ及び濃度のうちのいずれも、開示の方法に従って、また他の種類の細胞と共に、用いることができる。さらに、示した組み合わせのうちのいずれも、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチンと、例えば形質導入で用いる培養ディッシュをＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）で被覆する等で、さらに組み合わせて用いることができる。
【０１３１】
（表１）ＣＢ細胞及び形質導入エンハンサーの組み合わせ
2021532776.tif 000004
【０１３２】
（表２）ｍＰＢ細胞及び形質導入エンハンサーの組み合わせ
2021532776.tif 000005
2021532776.tif 000006
【０１３３】
一部の実施形態においては、接触させるステップは、同時に、又は重複する期間にわたって、実行する。
【０１３４】
一部の実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、５〜３０μｇ／ｍＬである。
【０１３５】
一部の実施形態においては、ＰＧＥ２又はその誘導体の濃度が、約１０μｇ／ｍＬである。
【０１３６】
一部の実施形態においては、ポロクサマーの濃度が、２００〜１２００μｇ／ｍＬである。
【０１３７】
一部の実施形態においては、ポロクサマーの濃度が、約１０００μｇ／ｍＬである。
【０１３８】
一部の実施形態においては、硫酸プロタミンの濃度が、４〜１０μｇ／ｍＬである。
【０１３９】
一部の実施形態においては、硫酸プロタミンの濃度が、約４μｇ／ｍＬである。
【０１４０】
一部の実施形態においては、造血細胞は、形質導入効率を増強するものである組換えフィブロネクチンもしくはその断片で被覆した容器において培養された又は培養される。組換えフィブロネクチン断片（例えば、ヒトフィブロネクチンのＣＨ２９６断片、商品名ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標））が、レンチウイルス又はレトロウイルスの標的細胞との共局在化を促進し、そして形質導入効率を増強する。
【０１４１】
一部の実施形態においては、方法は、造血細胞を、組換えフィブロネクチン断片、ポロクサマー、及びＰＧＥ２と接触させることを含む。
【０１４２】
一部の実施形態においては、方法は、造血細胞を、組換えフィブロネクチン断片、ポロクサマー、及び硫酸プロタミンと接触させることを含む。一部の実施形態においては、方法は、造血細胞を、組換えフィブロネクチン断片、ポロクサマー、ＰＧＥ２、及び硫酸プロタミンと接触させることを含む。
【０１４３】
一部の実施形態においては、方法は、造血細胞を、組換えフィブロネクチン断片、ＰＧＥ２、及び硫酸プロタミンと接触させることを含む。
【０１４４】
本明細書で開示する方法のうちのいずれかのある実施形態においては、細胞を、同一の期間又は重複する期間にわたって、形質導入エンハンサーと接触させる。ある実施形態においては、細胞はまた、例えば細胞を形質導入エンハンサーと接触させているときと同一の期間又は重複する期間にわたって、組換えレトロウイルスベクターと接触させる。ある実施形態においては、細胞は、溶液又は培養培地を含む容器内に存在するものであって、形質導入エンハンサーが、当該容器及び／又は培養培地中に存在する。
【０１４５】
プロスタグランジン
プロスタグランジンは概して、本明細書に記載されて当技術分野で公知である５員炭素環を含める、２０個の炭素原子を含有する脂肪酸に由来するホルモン様分子に関する。ジノプロストンとしても知られるプロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、医薬として用いられる天然のプロスタグランジンである。ＰＧＥ２は、以下の構造（「骨格構造」として表し、「線角構造式」又は「短縮構造式」とも呼ばれる）を有する：
2021532776.tif 000007
ＰＧＥ２分子式：Ｃ２２Ｈ３６Ｏ５。
【０１４６】
プロスタグランジンＥ２（ＰＧＥ２）は、ＣＤ３４＋細胞のエキソビボ培養におけるレンチウイルス導入遺伝子送達のレベルを増加させることが示されている。Ｈｅｆｆｎｅｒ  ｅｔ  ａｌ．Ｍｏｌ  Ｔｈｅｒ．２０１８  Ｊａｎ  ３；２６（１）：３２０−３２８。
【０１４７】
ＰＧＥ２の「類似体（ａｎａｌｏｇ）」又は「誘導体」の説明的な例としては、１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、１６−１６ジメチルＰＧＥ２  ｐ−（ｐ−アセトアミドベンズアミド）フェニルエステル、１１−デオキシ−１６，１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレン−１６、１６−ジメチルＰＧＥ２、９−デオキシ−９−メチレンＰＧＥ２、９−ケトフルプロステノール、５−トランスＰＧＥ２、１７−フェニル−オメガ−トリノルＰＧＥ２、ＰＧＥ２セリノールアミド、ＰＧＥ２メチルエステル、１６−フェニルテトラノールＰＧＥ２、１５（Ｓ）−１５−メチルＰＧＥ２、１５（Ｒ）−１５−メチルＰＧＥ２、８−イソ−１５−ケトＰＧＥ２、８−イソＰＧＥ２イソプロピルエステル、２０−ヒドロキシＰＧＥ２、ノクロプロスト（ｎｏｃｌｏｐｒｏｓｔ）、スルプロストン（ｓｕｌｐｒｏｓｔｏｎｅ）、ブタプロスト（ｂｕｔａｐｒｏｓｔ）、１５−ケトＰＧＥ２、及び１９（Ｒ）ヒドロキシＰＧＥ２が挙げられるが、これに限定されない。
【０１４８】
また本明細書で意図されるのは、９位がハロゲンで置換されたＰＧＥ２（例えば、国際公開第２００１／１２５９６号が参照され、その全体を参照により本明細書で援用する）のみならず例えばその全体を参照により本明細書で援用する米国特許出願公開第２００６／０２４７２１４号に記載されるものであるような２−デカルボキシ−２−ホスフィニコプロスタグランジン誘導体に類似の構造を有する、プロスタグランジンの類似体又は誘導体である。
【０１４９】
ポロクサマー
ポロクサマーは、ポリオキシエチレン（ポリ（エチレンオキシド））の２つの親水性鎖に隣接されるポリオキシプロピレン（ポリ（プロピレンオキシド））の中央の疎水性鎖から構成される非イオン性トリブロック共重合体である。ポロクサマーはまた、商品名Ｓｙｎｐｅｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（登録商標）、及びＫｏｌｌｉｐｈｏｒ（登録商標）としても知られる。ポリマーブロックの長さは誂えて変えることが可能であるため、多くの様々なポロクサマーが存在する。ポロクサマーは通常、文字Ｐ（ポロクサマーのＰ）の後に３つのアラビア数字を続けさせて命名され、当該アラビア数字の最初の２つのアラビア数字は、１００を乗じて、ポリオキシプロピレンコアの概ねの分子量を与えるものであり、最後のアラビア数字は、１０を乗じて、ポリオキシエチレン含量の百分率を与える（例えば、Ｐ４０７＝ポリオキシプロピレン分子量が４０００ｇ／ｍｏｌであり、ポリオキシエチレン含量が７０％であるポロクサマー）。
【０１５０】
特定の実施形態においては、ポロクサマーは、平均分子量が少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットを有する。特定の実施形態においては、ポロクサマーは、平均分子量が少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットを有する。特定の実施形態においては、ポロクサマーは、平均分子量が少なくとも約４０００ダルトン又は少なくとも約１０，０００ダルトンのポリプロピレンサブユニットを有する。
【０１５１】
特定の実施形態においては、ポロクサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。特定の実施形態においては、ポロクサマーは、少なくとも約６０％のポリエチレンオキシドを含む。特定の実施形態においては、ポロクサマーは、少なくとも約７０％のポリエチレンオキシドを含む。特定の実施形態においては、ポロクサマーは、少なくとも約８０％のポリエチレンオキシドを含む。
【０１５２】
特定の実施形態においては、ポロクサマーは、平均分子量が少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットを有し、またポロクサマーは、少なくとも約４０％のポリエチレンオキシドを含む。特定の実施形態においては、ポロクサマーは、平均分子量が少なくとも約２７５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットを有し、またポロクサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。特定の実施形態においては、ポロクサマーは、平均分子量が少なくとも約３２５０ダルトンのポリプロピレンサブユニットを有し、またポロクサマーは、少なくとも約５０％のポリエチレンオキシドを含む。
【０１５３】
ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー２８８、ポロクサマー３３５、ポロクサマー３３８、及びポロクサマー４０７からなる群から選択される。一実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー２８８である。一実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３５である。一実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８である。一実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー４０７である。ある実施形態においては、組換えレトロウイルスベクターは、組換えレンチウイルスベクターである。
【０１５４】
近年、ポロクサマーＦ１０８が、造血細胞の形質導入を改善することが示された。Ｈｏｅｆｉｇ  ｅｔ  ａｌ．Ｊ  Ｇｅｎｅ  Ｍｅｄ．  ２０１２  Ａｕｇ；１４（８）：５４９−６０；米国特許第９，７７１，５９９号。標準の造血幹細胞（ＨＳＣ）形質導入プロトコールにポロクサマーを含めることで、形質導入したＨＳＣの種々の造血系への分化能力を保持しつつ、高い形質導入効率が得られる。Ｈａｕｂｅｒ  ａｔ  ａｌ．Ｈｕｍ  Ｇｅｎｅ  Ｔｈｅｒ  Ｍｅｔｈｏｄｓ．２０１８  Ａｐｒ；２９（２）：１０４−１１３。
【０１５５】
組換えフィブロネクチン断片
組換えフィブロネクチン断片は、形質導入効率を促進して増強する、例えばヒトフィブロネクチンであるタンパク質フィブロネクチンの任意の断片であり得る。理論に拘束されることなく、組換えフィブロネクチン断片は、標的細胞とのレンチウイルス又はレトロウイルスの共局在化を促進すると考えられている。組換えフィブロネクチン断片の例としては、ヒトフィブロネクチンのＣＨ２９６断片、商品名ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）、である。
【０１５６】
造血細胞
本明細書で開示する方法に従って形質導入され得る造血細胞は、任意の造血細胞又はその集団を含む。ある実施形態においては、造血細胞は、哺乳動物から得られた、例えばヒトである哺乳動物の造血細胞である。ある実施形態においては、細胞は、本明細書で開示する方法に従って形質導入した後の造血細胞で処置しようとするヒトから取得する。ある実施形態においては、造血細胞は、ＣＤ３４＋細胞が富化されている。ある実施形態においては、造血細胞は、対象から得た生体試料から取得したＣＤ３４富化細胞の集団である。一実施形態においては、生体試料は、骨髄試料である。別の実施形態においては、生体試料は、末梢血である。別の実施形態においては、生体試料は、臍帯血である。
【０１５７】
特定の実施形態においては、例えば末梢血である生体試料は、造血幹細胞（ＨＳＣ）の動員（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）後の対象から取得する。一実施形態においては、ＨＳＣ及び／又は前駆細胞は、Ｇ−ＣＳＦ又はその類似体で対象を処置することによって動員される。末梢血中のＨＳＣ及び前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、生体試料の採取より前に動員され得る。末梢血のＨＳＣ及びＨＳＰＣは、当技術分野で公知の任意の方法によって動員可能である。末梢血のＨＳＣ及びＨＳＰＣは、対象の末梢血中で循環するＨＳＰＣの数を増加させる、本明細書に記載の又は当技術分野で公知の任意の薬剤で対象を処置することによって動員可能である。例えば、特定の実施形態においては、末梢血は、１又は複数のサイトカイン又は増殖因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ、ＫＩＴリガンド（ＫＬ）、ＩＬ−Ｉ、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−１１、Ｆｌｔ３リガンド、ＳＣＦ、トロンボポエチン又はＧＭ−ＣＳＦ（例えばサルグラモスチム等））で対象を処置することによって動員される。末梢血の動員方法において用いることが可能な異なる種類のＧ−ＣＳＦには、フィルグラスチム及び長時間作用型Ｇ−ＣＳＦ：ペグフィルグラスチムが含まれる。特定の実施形態においては、末梢血は、１又は複数のケモカイン（例えば、マクロファージ炎症性タンパク質−１ａ（ＭＩＰ１ａ／ＣＣＬ３））、ケモカイン受容体リガンド（例えば、ケモカイン受容体２リガンドＧＲＯｌ３及びＧＲ０１３Ｍ）、ケモカイン受容体類似体（例えば、ＣＴＣＥ−００２１、ＣＴＣＥ−０２１４等である間質細胞由来の因子１ａ（ＳＤＦ−１ａ）タンパク質類似体、又は例えばＭｅｔ−ＳＤＦ−１１３等であるＳＤＦ−１ａ）、又はケモカイン受容体アンタゴニスト（例えば、ＡＭＤ３１００等のケモカイン（Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ）受容体４（ＣＸＣＲ４）アンタゴニスト）で対象を処置することによって動員される。特定の実施形態においては、末梢血は、１又は複数の抗インテグリンシグナル伝達剤（例えば、機能阻害抗最晩期抗原４（ＶＬＡ−４）抗体又は抗血管細胞接着分子１（ＶＣＡＭ−１））で対象を処置することによって動員される。特定の実施形態においては、末梢血は、例えばシクロホスファミド、エトポシドもしくはパクリタキセル等である１又は複数の細胞障害性薬物で対象を処置することによって動員される。特定の実施形態においては、末梢血は、ある期間にわたって、上記に列記した１又は複数の薬剤を対象に投与することによって動員可能である。例えば、対象は、ＨＳＰＣの採取前の１日間、２日間、３日間、４日間、５日間、６日間、７日間、８日間、９日間、１０日間、１１日間、１２日間、１３日間、又は１４日間に、１日１回又は１日２回、注射により（例えば、皮下、静脈内又は腹腔内）、１又は複数の薬剤（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）で処置することが可能である。特定の実施形態においては、ＨＳＰＣは、ＨＳＰＣの末梢血への動員に用いる薬剤の最終投与後の１、２、３、４、５、６、７、８、１２、１４、１６、１８、２０又は２４時間以内に採取する。特定の実施形態においては、ＨＳＣ及びＨＳＰＣは、例えば増殖因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ）及びケモカイン受容体アンタゴニスト（例えば、ＡＭＤ３１００等であるＣＸＣＲ４受容体アンタゴニスト）又は増殖因子（例えば、Ｇ−ＣＳＦ又はＫＬ）及び抗インテグリン剤（例えば、機能阻害ＶＬＡ−４抗体）等である、上記に記載した又は当技術分野で公知の２以上の異なる種類の薬剤で対象を処置することによって動員される。一実施形態においては、ＨＳＣ及び／又は前駆細胞は、Ｇ−ＣＳＦ又はその類似体で対象を処置することによって動員される。一実施形態においては、Ｇ−ＣＳＦはフィルグラスチムである。一実施形態においては、ＨＳＣ及び／又は前駆細胞は、プレリキサホル（ｐｌｅｒｉｘａｆｏｒ）で対象を処置することによって動員される。ある実施形態においては、ＨＳＣ及び／又は前駆細胞は、フィルグラスチム及びプレリキサホルの組み合わせか、フィルグラスチム単独か、又はプレリキサホル単独かを用いて動員される。特定の実施形態においては、異なる種類の動員用薬剤を、同時に又は順次投与する。末梢血の動員方法に関するさらなる情報については、例えば、Ｃｒａｄｄｏｃｋ  ｅｔ  ａｌ．，１９９７，Ｂｌｏｏｄ  ９０（１２）：４７７９−４７８８；Ｊｉｎ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｊｏｕｒｎａｌ  ｏｆ  Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌ  Ｍｅｄｉｃｉｎｅ  ６：３９；Ｐｅｌｕｓ，２００８，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｈｅｍａｔｏｌ．１５（４）：２８５−２９２；Ｐａｐａｙａｎｎｏｐｏｕｌｏｕ  ｅｔ  ａｌ．，１９９８，Ｂｌｏｏｄ  ９１（７）：２２３１−２２３９；Ｔｒｉｃｏｔ  ｅｔ  ａｌ．，２００８，Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ  ９３（１１）：１７３９−１７４２；及びＷｅａｖｅｒ  ｅｔ  ａｌ．，２００１，Ｂｏｎｅ  Ｍａｒｒｏｗ  Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ  ２７（２）：Ｓ２３−Ｓ２９）を参照されたい。
【０１５８】
ある実施形態においては、末梢血は、対象の静脈に挿入したシリンジまたはカテーテルを介して取得する。例えば、末梢血は、血液成分分離機を用いて採取可能である。血液は、静脈からカテーテルを経て血液成分分離機に流れ込むが、これがＨＳＰＣを含めて白血球を血液の残りの部分から分離し、次いで対象の体内に当該血液の残余が戻される。血液成分分離は、十分なＨＳＰＣが採取されるまで、数時間の間、連続する日数にわたって（例えば、１〜５日）、実行可能である。
【０１５９】
ある実施形態においては、骨髄は、穿刺吸引により対象の後腸骨稜より取得される（例えば、Ｋｏｄａ  ｅｔ  ａｌ．，１９８４，Ｊ．  Ｃｌｉｎ  Ｉｎｖｅｓｔ．７３：１３７７−１３８４を参照）。
【０１６０】
ある実施形態においては、生体試料のヘマトクリット値を求めてもよい。ヘマトクリット値は、充填赤血球量が求められ得るように、処理チャンバー内で試料を遠心分離し、試料のＲＢＣを、ある層に分離することによって求められ得る。試料は、ヘマトクリット値を求めること補助するために抗凝血薬とあわせてもよく、またこうした抗凝血薬は、遠心分離前又は遠心分離中に処理チャンバーに加えてもよいということを認識されたい。あるいは、ヘマトクリット値は、試料の光学的性質を測定することによって求めてもよい。例えば、分光計を用いて試料を解析することができる。ヘマトクリット値を求める任意の種類の公知の分光法であって、例えばラマン分光法及び／又は光散乱法等を用いることができるということを認識されたい。
【０１６１】
ある実施形態においては、生体試料は、例えば生体試料からＣＤ３４＋細胞が富化された１又は複数の細胞集団を調製する前に、赤血球を枯渇させる。一部の実施形態においては、枯渇処理後に残っている細胞を洗浄する。別の実施形態においては、洗浄した細胞に、非特異的なＩｇＧを加える。一部の実施形態においては、非特異的なＩｇＧはフレボガンマ（ｆｌｅｂｏｇａｍｍａ）である。
【０１６２】
一部の場合においては、例えば１日、２日、３日、４日もしくはそれ以上空ける、又は１、２もしくは３週空ける、又は１、２もしくは３ヶ月空ける、又は数年空ける等、他の時間増分を含めた、様々な回で取得した例えば骨髄試料を含めて、２以上の生体試料を、ＣＤ３４＋選別の前に一緒に混合する。
【０１６３】
造血細胞のＣＤ３４＋細胞の富化
一部の実施形態においては、造血細胞は、ＣＤ３４陽性造血細胞である。典型的には、ＣＤ３４＋細胞は、ＣＤ３４の高ストリンジェンシーの富化によって調製する。あるいは、又は高ストリンジェンシーの富化に加えて、ＣＤ３４の低ストリンジェンシーの富化を行ってもよい。
【０１６４】
本明細書で用いる場合、「高ストリンジェンシー」又は「高ストリンジェンシー条件」は、例えばＣＤ３４である、特定の生物学的マーカーを発現する細胞に関する細胞の実質的な富化を結果としてもたらすことを意図した、細胞集団を富化する方法を指す。例えば、臨床的に用いる「高ストリンジェンシー」のＣＤ３４の富化は、ＣＤ３４＋細胞の収量の平均値：６１．６％及び中央値：６５．７％を結果としてもたらし、また平均値：８８．５％及び中央値：９５．９％の相対的純度（Ｎ＝１６６）を結果としてもたらす（Ｃｌｉｎ  Ｌａｂ．２０１６  Ｊｕｌ  １；６２（７）：１２４３−１２４８（ＰＭＩＤ：２８１６４６３８））。「高ストリンジェンシー」は、比較的稀な細胞型ＣＤ３４＋の実質的な富化を目標としたプロセスを指し、これは通常、動員された白血球除去又は骨髄の採取において０．２〜２％の細胞産物を含む。動員された白血球除去又は骨髄の採取からのＣＤ３４＋細胞の高ストリンジェンシーの富化は、０．２〜２％から８０％を超えるまで増加したＣＤ３４＋最終濃度を目標とする。これを達成するために、生体試料を捕捉基材に最初に適用させた後、捕捉基材に対して弱い結合であった細胞又は非特異的に結合した細胞を除去するために、本明細書で「洗浄」と呼ぶ繰り返しの緩衝液交換を行う。概して、細胞は、捕捉基材から除去されて、また洗浄サイクルごとに再び適用させる。当該除去及び再適用は、チューブからピペッティングにより人手で、又はポンプ及びチューブの系を用いて自動で、達成可能である。例えば、Ｄｙｎａｂｅａｄｓ（登録商標）磁性細胞分離システムと接続したＱｕａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＭａｇＣｌｏｕｄｚ（登録商標）を用いて、細胞−磁性粒子複合体を磁気スタンド上のチューブ内で分離して、そして人手で洗浄を行う。Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システムを用いて、予め設定した自動プログラムにより、細胞−磁性粒子複合体をチューブセット内の磁性カラムに適用させて、そしてバルブポンプシステムを用いて洗浄／再適用を行う。ある実施形態においては、高ストリンジェンシー条件下での選別は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ｔｙｔｏ（登録商標）、Ｑｕａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＭａｇＣｌｏｕｄｚ（登録商標）、ＧＥ社のＳｅｐａｘ（登録商標）細胞分離システム、テルモ社のＥｌｕｔｒａ（登録商標）細胞分離システム、ＣＯＢＥ社のＳｐｅｃｔｒａ（登録商標）細胞分離機、ＳｙｎＧｅｎ社のＬＡＢ（登録商標）システム又はＷＡＳＨ（登録商標）システム、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ社のＬｏｖｏ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）システムを含むがこれに限定されない種々の装置で実施され得る。選別は、ラボラトリー又はポイントオブケアで実施してもよい。細胞及び細胞集団の調製及び富化の詳細な方法は、例示的な、高ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４＋細胞の選別方法を含めて、例えば国際特許出願の公開公報である国際公開第２０１６／１１８７８０号に記載されている。高ストリンジェンシーの選別に���用である説明的な選別方法は、米国特許第８，７２７，１３２号で提供される。さらなる説明的な選別方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２７０８３号の、特に実施例１で提供される。
【０１６５】
高ストリンジェンシーの富化プロトコールにおいては、ＣＤ３４＋細胞を含む生体試料を、例えば直接結合した免疫磁気ビーズである、ＣＤ３４標識用薬剤で標識する。生体試料は、例えば細胞生存能と両立する緩衝液のｐＨ及び等張性でのエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）を任意で含んだリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）であるがこれに限定されない、任意の好適な液体中で懸濁し得る。一部の場合においては、用いる液体はまた、例えば約２．５％である好適な濃度で、ヒト血清アルブミンを含有する。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術を用いて、生体試料を、標識した後で、カラムに適用させるが、当該カラムは、磁気的に感受性がある又は強磁性の材料を含有している。ＭＡＣＳシステムを用いて、カラムの磁気的に感受性がある又は強磁性の材料が、非標的細胞のカラムを通って流れてカラムから出て行く能力に影響を及ぼすことなく、標的細胞を保持する。こうした磁気的に感受性がある又は強磁性の材料には、鉄、鋼、コバルトニッケル、及びその合金の他の強磁性の希土類金属が含まれる。当業者であれば、こうした材料は、容易に磁化及び脱磁することができるということを認識するであろう。一部の実施形態においては、生体試料は、磁気的に感受性がある又は強磁性の材料の上を、１又は複数回再循環させる。カラム充填後、結合した細胞を洗浄して、溶出し、及び／又は低速でカラム上に再充填し、富化したフラクションの純度を向上させる。好適な洗浄緩衝液には、（任意で）ＥＤＴＡ及び（任意で）ヒト血清アルブミンを含んだＰＢＳが含まれる。洗浄ステップ中に除去される、標識された生体試料の任意の成分は、廃棄バッグ又は「非標的」バッグの中に回収する。好適な洗浄ステップの後、高ストリンジェンシーで富化した細胞を、標的細胞バッグ内に溶出させる。
【０１６６】
低ストリンジェンシーの富化プロトコールにおいては、ＣＤ３４＋細胞を含む生体試料を、例えば直接結合した免疫磁気ビーズである、ＣＤ３４標識用薬剤で標識する。磁気活性化細胞選別（ＭＡＣＳ）技術を用いて、生体試料を、標識した後で、磁気的に感受性がある又は強磁性の材料を含有しているカラムに、高ストリンジェンシーの富化の場合よりも低い流量で適用させる。高ストリンジェンシーの富化の際のように、磁気的に感受性がある又は強磁性の材料が、非標的細胞のカラムを通って流れてカラムから出て行く能力に影響を及ぼすことなく、標的細胞を保持する。一部の実施形態においては、生体試料は、磁気的に感受性がある又は強磁性の材料の上を、１又は複数回再循環させる。カラムに充填後、低ストリンジェンシーの富化では、結合した細胞を、より低ストリンジェンシーで洗浄する。次いで結合細胞を、回収バッグ内に溶出させる。
【０１６７】
例示的な実施形態においては、低ストリンジェンシーの富化は、ＭＡＣＳシステムの標準の操作方法を、高ストリンジェンシーでの除去（すなわち、標的細胞の除去）を達成することを意図した「除去モード」のソフトウェアプログラムが、代わりに低ストリンジェンシーの富化を結果的にもたらすように改変させることによって実行する。除去モードでのＭＡＣＳシステムの作動により、生体試料中の標的細胞を、低速のカラム充填と富化モードでの作動よりも低いストリンジェンシーの洗浄ステップとを用いてカラム中の磁気的に感受性があるまたは強磁性の材料に結合させる。非標識細胞を、ＭＡＣＳシステムによって、洗浄バッグ又は所謂「標的」バッグ内に流す。除去モードプログラムは、次いで所謂「非標的」バッグ内に液体を向かわせるように出力弁を切り替えて、その後カラムを脱磁する。脱磁したカラムの上に液体を連続して適用させると、結果的に、低ストリンジェンシー条件下で富化したものであるＣＤ３４＋富化細胞集団が、所謂「非標的」バッグ内に溶出するが、この方法を用いて、標的細胞を回収する。
【０１６８】
この低ストリンジェンシーの富化方法は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ｔｙｔｏ（登録商標）、Ｑｕａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＭａｇＣｌｏｕｄｚ（登録商標）、ＧＥ社のＳｅｐａｘ（登録商標）細胞分離システム、テルモ社のＥｌｕｔｒａ（登録商標）細胞分離システム、ＣＯＢＥ社のＳｐｅｃｔｒａ（登録商標）細胞分離機、ＳｙｎＧｅｎ社のＬＡＢシステム（登録商標）又はＷＡＳＨ（登録商標）システム、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ社のＬｏｖｏ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）システムを含むがこれに限定されない種々の装置で実施され得るということが、当業者により認識されるであろう。当業者は、過度な実験なしに、こうしたＭＡＣＳシステムのソフトウェアを、出力弁が最初の結合ステップの通過する流れを廃棄バッグ又は「非標的」バッグ（標的バッグではなく）に向かわせて、溶出した低ストリンジェンシーのＣＤ３４富化集団を「標的」バッグに向かわせるように再プログラムすることが可能であるであろう。要するに、その後低ストリンジェンシーの富化は、従来のＭＡＣＳプログラムの通常の洗浄ステップなしに、分離モードで実行される。
【０１６９】
本明細書で用いる場合、「低ストリンジェンシー」又は「低ストリンジェンシー条件」は、生体試料中の他の細胞と比較して生物学的標識を発現する細胞の富化を犠牲にする、すなわち富化が減少する、高ストリンジェンシー選別によって達成されるよりも富化細胞集団の収量を高く維持するような手法で、例えばＣＤ３４である特定の生物学的標識を発現する細胞に関する細胞の富化を結果としてもたらすことを意図した細胞集団を富化する方法を指す。定義により、高ストリンジェンシー条件下でのフォールドエンリッチメント（ｆｏｌｄ  ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）は、低ストリンジェンシー条件下のフォールドエンリッチメントよりも大きい。高ストリンジェンシーでの（ＣＤ３４又は他の標識）富化細胞集団における、例えばＣＤ３４＋細胞である細胞のフォールドエンリッチメントは、一部の場合において、低ストリンジェンシーでの（ＣＤ３４又は他の標識）富化細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞のフォールドエンリッチメントの、２、２．２５、２．５、２．７５、３、３．２５、３．５、３．７５又は４倍である。一実施形態においては、高ストリンジェンシーでの（ＣＤ３４又は他の標識）富化細胞集団における、例えばＣＤ３４＋細胞である細胞のフォールドエンリッチメントは、低ストリンジェンシーでの（ＣＤ３４又は他の標識）富化細胞集団におけるＣＤ３４＋細胞のフォールドエンリッチメントの、２〜４倍である。ある実施形態においては、低ストリンジェンシー条件下での選別は、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＭＡＣＳＱｕａｎｔ  Ｔｙｔｏ（登録商標）、Ｑｕａｄ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社のＭａｇＣｌｏｕｄｚ（登録商標）、ＧＥ社のＳｅｐａｘ（登録商標）細胞分離システム、テルモ社のＥｌｕｔｒａ（登録商標）細胞分離システム、ＣＯＢＥ社のＳｐｅｃｔｒａ（登録商標）細胞分離機、ＳｙｎＧｅｎ社のＬＡＢ（登録商標）システム又はＷＡＳＨ（登録商標）システム、Ｆｒｅｓｅｎｉｕｓ−Ｋａｂｉ社のＬｏｖｏ（登録商標）、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳ（登録商標）システム又はＣｌｉｎｉＭＡＣＳ  Ｐｒｏｄｉｇｙ（登録商標）システムを含むがこれに限定されない種々の装置で実施され得る。選別は、ラボラトリー又はポイントオブケアで実施してもよい。低ストリンジェンシー条件下での例示的な細胞富化方法は、国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０２７０８３号において提供され、その全体を参照により本明細書で援用する。
【０１７０】
ＣＤ３４＋細胞を富化した細胞の集団は、高ストリンジェンシー条件下及び／又は低ストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４＋細胞の選別によって産生され得、それによって、高ストリンジェンシーでのＣＤ３４富化細胞集団及び／又は低ストリンジェンシーでのＣＤ３４富化細胞集団を産生する。ＣＤ３４＋細胞の選別方法は、ポジティブセレクション、ネガティブセレクション又はその組み合わせがあり得る。ある実施形態においては、対象から取得した生体試料を２つの試料に分割し、一方の試料を用いて高ストリンジェンシーでのＣＤ３４富化細胞集団を調製して、もう一方の試料を用いて低ストリンジェンシーでのＣＤ３４富化細胞集団を調製する。他の実施形態においては、対象から取得した生体試料を、はじめに低ストリンジェンシーのＣＤ３４＋選別に供して低ストリンジェンシーでのＣＤ３４富化細胞集団を調製して、次いで低ストリンジェンシーでのＣＤ３４富化集団の一部を高ストリンジェンシーのＣＤ３４＋選別に供して高ストリンジェンシーでのＣＤ３４富化細胞集団を調製する。例えば低ストリンジェンシー条件下のＣＤ３４富下細胞の選別をはじめに適用して、その後に高ストリンジェンシー条件下のさらなるＣＤ３４富下細胞の得られた集団からの選別が続いてもよいように、選別は連続して適用されてもよい。他の場合においては、高ストリンジェンシー条件下のＣＤ３４富下細胞の選別をはじめに適用して、その後に低ストリンジェンシー条件下のＣＤ３４富下細胞の残った集団からの選別が続いてもよい。一部の場合においては、低ストリンジェンシー又は高ストリンジェンシーの選別が、先に高ストリンジェンシー又は低ストリンジェンシーの選別に供された細胞のフラクションに適用されるように、細胞集団を分けてもよい。一部の場合においては、１つの生体試料を、低い又は高いストリンジェンシー条件下でのＣＤ３４富下細胞の選別の前に、２以上の試料に分ける。
【０１７１】
全ての場合において、全ての可能性のある順序の並べ替えにおいて、生体試料もしくは富化した細胞集団を混合もしくは分ける前、又は生体試料もしくは富化した細胞集団を混合もしくは分けた後の、高ストリンジェンシー又は低ストリンジェンシーでの選別を意図している。ある実施形態においては、この方法は、高ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選別することによって、対象から取得した第１の生体試料から高ストリンジェンシーでのＣＤ３４富化細胞集団を調製することと；低ストリンジェンシー条件下でＣＤ３４＋細胞を選別することによって、対象から取得した第２の生体試料から低ストリンジェンシーでのＣＤ３４富化細胞集団を調製することとを含む。
【０１７２】
形質導入した造血細胞
実施例においてさらに詳細に記載するように、例えば硫酸プロタミン、ＰＧＥ２又はその誘導体、及びポロクサマー（例えば、ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ）である本明細書で開示する形質導入エンハンサーの組み合わせの存在下で形質導入した造血細胞の集団は、形質導入エンハンサーの組み合わせなしで形質導入した造血細胞と比較して、優れた特徴を呈する。ある実施形態においては、細胞はまた、例えばＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）である組換えフィブロネクチン断片の存在下で形質導入した。特定の実施形態においては、形質導入した造血細胞又はその集団は、ＶＣＮの増加、ＶＣＮ／細胞の増加、遺伝子改変されたＣＦＵの百分率の増加、及び遺伝子改変されたＣＦＣの百分率の増加、のうちの１又は複数を有する。一部の実施形態においては、関心対象の遺伝子の救済が増強される。ＬＡＤ−１を伴う患者に関する特定の実施形態においては、ＰＧＥ２もしくはポロクサマーなしでの形質導入と比較して、又は形質導入エンハンサーなしでもしくは１つのみの形質導入エンハンサーでの形質導入と比較して、ＣＤ１８遺伝子を含むレンチウイルスベクターにより形質導入した後で、ＣＤ１８＋細胞の百分率（％）が増加する。
【０１７３】
開示の方法の一部の実施形態においては、当該方法により遺伝子改変した造血細胞の百分率は、ＰＧＥ２もしくはポロクサマーで細胞を処理せずに同一のウイルスベクターで遺伝子改変した造血細胞の百分率と比較して、又は１つのみの形質導入エンハンサーで細胞を処理した同一のウイルスベクターで遺伝子改変した造血細胞の百分率と比較して、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも２．５倍、少なくとも３倍、少なくとも３．５倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、又は少なくとも８倍増加する。
【０１７４】
一部の実施形態においては、レトロウイルス（例えば、レンチウイルス）ベクターにより造血細胞を形質導入する方法により、結果として、ＶＣＮ／細胞が少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０、又は少なくとも２．５である造血細胞の集団をもたらす。一部の実施形態においては、対象を処置する方法は、ＶＣＮ／細胞が少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０、又は少なくとも２．５である形質導入した造血細胞の集団を、対象に提供することを含む。
【０１７５】
一部の実施形態においては、レトロウイルスベクターにより造血細胞を形質導入する方法により、結果として、形質導入効率が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％である造血細胞の集団をもたらす。一部の実施形態においては、対象を処置する方法は、形質導入効率が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％である形質導入した造血細胞の集団を、対象に提供することを含む。
【０１７６】
一部の実施形態においては、レトロウイルスベクターにより造血細胞を形質導入する方法により、結果として、形質導入したコロニー形成細胞の百分率が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％である造血細胞の集団をもたらす。一部の実施形態においては、対象を処置する方法は、形質導入したコロニー形成細胞の百分率が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％である形質導入した造血細胞の集団を、対象に提供することを含む。
【０１７７】
一部の実施形態においては、本開示は、ＶＣＮ／細胞が少なくとも１．０、少なくとも１．５、少なくとも２．０、又は少なくとも２．５である、組換えレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）により形質導入した造血細胞の集団を提供する。一部の実施形態においては、本開示は、形質導入効率が少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、又は少なくとも１００％である、組換えレトロウイルスベクター（例えば、レンチウイルスベクター）により形質導入した造血細胞の集団を提供する。
【０１７８】
一部の実施形態においては、本開示は、少なくとも７０％、少なくとも７１％、少なくとも７２％、少なくとも７３％、少なくとも７４％、少なくとも７５％、少なくとも７６％、少なくとも７７％、少なくとも７８％、少なくとも７９％、少なくとも８０％、少なくとも８１％、少なくとも８２％、少なくとも８３％、少なくとも８４％、少なくとも８５％、少なくとも８６％、少なくとも８７％、少なくとも８８％、少なくとも８９％、少なくとも９０％、少なくとも９１％、少なくとも９２％、少なくとも９３％、少なくとも９４％、又は少なくとも９５％が遺伝子改変された造血細胞を含む造血細胞の集団を産生する方法であって、造血細胞を、関心対象の遺伝子を含む又は関心対象のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクター（任意で、レンチウイルスベクター）と、エキソビボで接触させることを含み、当該接触させることは、ＰＧＥ２又はその誘導体、任意でヒトＰＧＥ２又は１６，１６−ジメチルＰＧＥ２（ｄｍＰＧＥ２）、及びポロクサマー、任意でポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））の存在下で生じるものである、当該方法を提供する。この細胞は、レトロウイルスベクターによって当該細胞の形質導入を許容するのに十分な条件下及び時間の間、レトロウイルスベクターと接触させ得、例えば、好適な培地中で、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも８時間、又は少なくとも１２時間である。一部の実施形態においては、細胞を、同一の期間又は重複する期間にわたって、レトロウイルスベクター及び形質導入エンハンサーと接触させる。
【０１７９】
有利なことには、本開示の方法は、結果として、形質導入エンハンサーなしでの形質導入と比較して、形質導入した細胞集団の毒性の低下（より長い生存）をもたらす。一部の実施形態においては、本開示は、造血細胞の集団の産生方法であって、形質導入エンハンサーなしでの形質導入と比較して、毒性が、少なくとも１０％、少なくとも１１％、少なくとも１２％、少なくとも１３％、少なくとも１４％、少なくとも１５％、少なくとも１６％、少なくとも１７％、少なくとも１８％、少なくとも１９％、少なくとも２０％、少なくとも２１％、少なくとも２２％、少なくとも２３％、少なくとも２４％、少なくとも２５％、少なくとも２６％、少なくとも２７％、少なくとも２８％、少なくとも２９％、少なくとも３０％、少なくとも３１％、少なくとも３２％、少なくとも３３％、少なくとも３４％、又は少なくとも３５％低下するものである、当該方法を提供する。
【０１８０】
ベクター及び発現カセット
ポリヌクレオチド配列を哺乳動物細胞に送達する際の使用が見出される任意の都合のよい組換えレトロウイルスベクターは、本開示の組換えレトロウイルスベクターで包含される。例えば、このベクターは、例えば一本鎖の又は二本鎖のＤＮＡである、一本鎖又は二本鎖の核酸を含み得る。例えば、組換えレトロウイルスベクターはＤＮＡであり得る。このベクターは、ＲＮＡの改変された形態を含めた、一本鎖又は二本鎖のＲＮＡを含み得る。別の実施例においては、組換えレトロウイルスベクターは、例えばｍＲＮＡ又は改変ｍＲＮＡであるＲＮＡであり得る。
【０１８１】
特定の実施形態においては、組換えレトロウイルスベクターは、例えばモロニーマウス白血病ウイルス（Ｍ−ＭｕＬＶ）、モロニーマウス肉腫ウイルス（ＭｏＭＳＶ）、ハーベイマウス肉腫ウイルス（ＨａＭｕＳＶ）、ネズミ乳房腫瘍ウイルス（ＭｕＭＴＶ）、テナガザル白血病ウイルス（ＧａＬＶ）、ネコ白血病ウイルス（ＦＬＶ）、スプーマウイルス、フレンドマウス白血病ウイルス、ネズミ幹細胞ウイルス（ＭＳＣＶ）もしくはラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）である、例えばアデノウイルス、アデノ関連ウイルス、レンチウイルス（ＬＶ）、ヘルペスウイルス、アルファウイルス、又はレトロウイルスであるウイルスに由来するウイルスベクターであり得る。ＬＶの使用を包含する実施形態を、以下により詳細に記載しているが、当業者は、当技術分野における同様の知識及び技術が、非ＬＶの組換えレトロウイルスベクターも保持するために用いることができるということを認識するであろうことが予測される。一部の実施形態においては、組換えレトロウイルスベクターは、自然治癒性ＬＶ（ｓｅｌｆ−ｌｉｍｉｔｉｎｇ  ＬＶ）である。
【０１８２】
特定の実施形態においては、ウイルスベクターは、レンチウイルスベクターである。一部の実施形態においては、例えばＶＳＶＧ偽型レンチウイルスベクターである、偽型レンチウイルスベクターである。
【０１８３】
特に、本明細書で開示するある方法は、例えば造血幹細胞（ＨＳＣ）又は造血前駆細胞（本明細書においては「造血前駆体」とも呼ぶ）である幹細胞又は前駆細胞の２つの集団を、例えばＦＡＮＣＡであるポリペプチド製剤をコード及び／又は発現する組換えレトロウイルスベクターにより形質導入することに関するものであり、一方の集団は高ストリンジェンシー条件下での選別により調製され、もう一方の集団は低ストリンジェンシー条件下での選別により調製される。一実施形態においては、細胞集団は、ＣＤ３４＋細胞が富化される。一実施形態においては、ＨＳＣ又は造血前駆体は、１又は複数のＦＡＮＣＡコードタンパク質からのタンパク質活性が減じられた又は当該タンパク質活性がない対象からのものである。一実施形態においては、対象は、ＦＡ−Ａを有する。一実施形態においては、ＨＳＣの内在性ＦＡＮＣＡ遺伝子は、欠失及び／又は変異している。
【０１８４】
一実施形態においては、組換えレトロウイルスベクターにより細胞を形質導入することで、結果として、組換えレトロウイルスベクター内において治療薬をコードするポリヌクレオチド配列と操作可能に結合したプロモーターを含む発現カセットの細胞ゲノム内への組み込みをもたらす。一部の実施形態においては、組換えレトロウイルスベクターにより細胞を形質導入することで、結果として、例えば生物学的に活性なＦＡＮＣＡタンパク質である治療薬の発現をもたらす。
【０１８５】
例えば、生物学的に活性なＦＡＮＣＡタンパク質は、ＦＡコア複合体の一部を形成する。ある実施形態においては、ＦＡＮＣＡ遺伝子は、ウイルスベクターを介して送達される。一実施形態においては、ＦＡＮＣＡ遺伝子は、レンチウイルスベクターを介して送達される。ある実施形態においては、レンチウイルスベクターは、ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡ．ＷＰＲＥ＊ＬＶである。ＦＡＮＣＡレンチウイルスベクター（ＬＶ）により、ＦＡ−Ａ患者からの骨髄（ＢＭ）の細胞又は幹細胞又は前駆細胞を形質導入した後で、治療用ベクターを細胞のゲノム内に組み込むことを意図している。組み込むと、治療用タンパク質（例えば、ヒトＦＡＮＣＡタンパク質）が、細胞により発現される。形質導入したＦＡ細胞は、遺伝子的に修正されて、そしてそれによりＦＡＮＣＤ２及びＦＡＮＣＩのモノユビキチン化によってＦＡ経路を活性化することが可能である。これらタンパク質は、その後ＤＮＡ損傷領域に遊走できることとなり、他のＤＮＡ修復タンパク質と協働して、これら細胞において、健常細胞で生じるようにＤＮＡの修復を促進することとなる。
【０１８６】
本明細書で論じるように、主題の方法及び組成物は、動物の細胞において、例えばＦＡＮＣＡである導入遺伝子を発現する際の使用が見出される。例えば、主題の組成物は、調査であって、例えば細胞の生存能及び／又は機能に対する遺伝子が有する影響を判断することである調査に用いてもよい。別の例としては、主題の組成物は、医薬であって、例えばＦＡ等の疾患を治療するためである医薬に用いてもよい。
【０１８７】
一部の実施形態においては、主題の方法は、結果として、例えば疾患の発症を予防すること、疾患の進行を停止すること、疾患の進行を逆行させること等の治療効果をもたらす。例えば、一実施形態においては、疾患は、ファンコニ貧血（ＦＡ）である。別の実施形態においては、疾患又は障害は、骨髄機能不全（ＢＭＦ）である。一実施形態においては、疾患は、血小板減少症である。別の実施形態においては、疾患は、白血球減少症である。一実施形態においては、疾患は、汎血球減少症である。一実施形態においては、疾患は、好中球減少症である。別の実施形態においては、疾患は、貧血である。一部の実施形態においては、主題の方法は、治療効果が達成されたことを検出するステップを含む。当業者は、こうした治療効能を測ることは、改変された特定の疾患に適用できるであろうことを認識するであろうし、また治療効能を測るために用いる適切な検出方法を認識するであろう。
【０１８８】
したがって、本発明は、ＦＡ又はＦＡの血液学的兆候の１もしくは複数を処置する方法を提供する。一実施形態においては、ＦＡの血液学的兆候は、骨髄機能不全（ＢＭＦ）、血小板減少症、白血球減少症、汎血球減少症、好中球減少症、及び貧血のうちの１又は複数から選択される。特定の実施形態においては、血液学的兆候はＢＭＦであり、これは大部分のＦＡ患者の小児期に現れる。一実施形態においては、血液学的兆候は、血小板減少症である。別の実施形態においては、血液学的兆候は、白血球減少症である。一実施形態においては、血液学的兆候は、汎血球減少症である。一実施形態においては、血液学的兆候は、好中球減少症である。別の実施形態においては、血液学的兆候は、貧血である。一実施形態においては、血液学的兆候は、ＢＭＦ、血小板減少症、白血球減少症、汎血球減少症、好中球減少症、及び貧血のうちの２以上についての組み合わせである。
【０１８９】
本明細書で開示する方法に従って用いられ得るさらなるＬＶベクターには、以下に開示する導入ベクターを用いて調製されるものが含まれるが、これに限定されない。
【０１９０】
２．形質導入した造血細胞の使用
一部の実施形態においては、本明細書に開示の方法に従って形質導入した造血細胞を、遺伝子療法に用いる。特定の実施形態においては、造血細胞は、関心対象の遺伝子を含むベクターにより形質導入する。形質導入した細胞は、例えば対象における遺伝子疾患又は遺伝子障害を治療するために、それを必要とする対象に提供され得る。特定の実施形態においては、関心対象の遺伝子が、一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害に関連する遺伝子において欠陥を補完する。一部の実施形態においては、対象は、関心対象の内在性遺伝子において変異を含む。一部の実施形態においては、対象に提供される関心対象の遺伝子は、例えば哺乳動物細胞における発現を増強するために、コドン最適化される。
【０１９１】
ある実施形態においては、関心対象の遺伝子は、ファンコニ貧血相補群Ａ（ＦＡＮＣＡ）、相補群Ｃ（ＦＡＮＣＣ）、及び相補群Ｇ（ＦＡＮＣＧ）からなる群から選択される。ある実施形態においては、関心対象の遺伝子は、赤血球型ピルビン酸キナーゼ（ＲＰＫ（Ｒｅｄ−ｃｅｌｌ  ｔｙｐｅ  Ｐｙｒｕｖａｔｅ  Ｋｉｎａｓｅ））である。ある実施形態においては、関心対象の遺伝子は、インテグリンベータ２（ＩＴＧＢ２）であり、及び／又は関心対象の遺伝子は、本明細書で開示する遺伝子又はその機能的断片もしくは機能的バリアントのうちのいずれかによりコードされたタンパク質をコードする。
【０１９２】
ある実施形態においては、方法は、一遺伝子による遺伝子疾患又は遺伝子障害を、予防又は寛解する。
【０１９３】
ある実施形態においては、当該一遺伝子による疾患又は障害は、ファンコニ貧血、白血球接着不全症１型、ピルビン酸キナーゼ欠損症、及び乳児性悪性オステオポローシス（Ｉｎｆａｎｔｉｌｅ  Ｍａｌｉｇｎａｎｔ  Ｏｓｔｅｏｐｏｒｏｓｉｓ）からなる群から選択される。
【０１９４】
すなわち、ファンコニ貧血、白血球接着不全症１型、ピルビン酸キナーゼ欠損症、及び乳児性悪性大理石骨病を含むがこれに限定されない一遺伝子による疾患又は障害を、治療する方法を提供する。特定の実施形態においては、この方法は、それを必要とする対象に、プロモーター配列と操作可能に結合した治療用タンパク質をコードする配列を含むポリヌクレオチドを含むレトロウイルスベクターにより形質導入した造血細胞を提供することを含み、当該細胞は、例えば本明細書で開示する２以上の形質導入エンハンサーの存在下で、本明細書で開示する方法に従って形質導入した。
【０１９５】
ある実施形態においては、本発明は、例えば本明細書で開示されるいずれかである、遺伝子発現カセット、遺伝子導入カセット、又は組換えレトロウイルスベクター、を含む細胞を含む。関連の実施形態においては、細胞は、発現カセットを含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入したか又は細胞のゲノムに組み込まれた発現カセットを有するものであり、形質導入は、本明細書で開示する方法に従って実行された。ある実施形態においては、細胞は、例えばパッケージング細胞である、組換えレトロウイルスベクターを産生するために用いる細胞である。
【０１９６】
ある実施形態においては、細胞は、発現カセットによりコードした遺伝子産物を対象に提供するために、対象に送達される細胞である。すなわち、ある実施形態においては、細胞は、処置しようとする対象の自己由来であるか、又は処置しようとする対象より取得した。他の実施形態においては、細胞は、処置しようとする対象の同種異系であるか、又は処置しようとする対象とは別のドナーより取得した。特定の実施形態においては、細胞は、例えばヒト細胞である、哺乳動物の細胞である。ある実施形態においては、細胞は、血球、赤血球、造血前駆細胞、例えばある系統が枯渇した骨髄細胞である骨髄細胞、造血幹細胞（例えば、ＣＤ３４＋）、又は造血性の拘束赤血球前駆細胞（ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ  ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ  ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ  ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ  ｃｅｌｌ）である。特定の実施形態においては、細胞は、細胞を本明細書で開示した組換えレトロウイルスベクターによって形質導入した後で、当該細胞で処置しようとする対象から取得したＣＤ３４＋細胞である。特定の実施形態においては、細胞は、ＦＡと診断された対象から取得したＣＤ３４＋  ＦＡ細胞である。本開示は、本明細書で開示する方法に従って形質導入した造血細胞（任意で、ＣＤ３４富化細胞）の集団をさらに含む。
【０１９７】
一部の実施形態においては、本明細書で開示する方法は、結果として、例えば疾患の発症を予防すること、疾患の進行を停止すること、疾患の進行を逆行させること等の治療効果をもたらす。例えば、一実施形態においては、疾患は、ＢＭＦである。一実施形態においては、疾患は、血小板減少症である。別の実施形態においては、疾患は、白血球減少症である。一実施形態においては、疾患は、汎血球減少症である。一実施形態においては、疾患は、好中球減少症である。別の実施形態においては、疾患は、貧血である。一部の実施形態においては、主題の方法は、治療効果が達成されたことを検出するステップを含む。当業者は、こうした治療効能を測ることは、改変された特定の疾患に適用できるであろうことを認識するであろうし、また治療効能を測るために用いる適切な検出方法を認識するであろう。
【０１９８】
対象の導入遺伝子を用いた導入遺伝子の発現は、頑健であることが期待される。したがって、一部の例においては、治療効能を測ること等によって、例えば遺伝子産物のレベルを測定することにより検出されるような導入遺伝子の発現は、主題の組成物の投与後２ヶ月以内に、例えば投与後４週以内、３週以内又は２週以内であり、例えば投与後１週間で、観察され得る。導入遺伝子の発現はまた、経時的に持続することが期待される。したがって、一部の例においては、治療効能を測ること等によって、例えば遺伝子産物のレベルを測定することにより検出されるような導入遺伝子の発現は、主題の組成物の投与後２ヶ月以上であって、例えば４ヶ月以上、６ヶ月以上、８ヶ月以上、又は１０ヶ月以上、一部の例においては１年以上であって、例えば２年、３年、４年、又は５年、ある特定の例においては５年以上で、観察され得る。
【０１９９】
ある実施形態においては、方法は、細胞において又は対象において導入遺伝子の発現を検出するステップを含むものであって、ここでは、発現が、本開示の１又は複数の改善された要素を含まないポリヌクレオチドカセットよりの発現と比較して増強される。典型的には、発現は、例えば当技術分野で公知であるような、参照の、すなわち対照ポリヌクレオチドカセットよりの発現と比較して、２倍以上、例えば３倍、４倍、又は５倍又はそれ以上、一部の例においては１０倍、２０倍、又は５０倍又はそれ以上、例えば１００倍、増強されることとなり、これは例えばより早期に検出されること、遺伝子産物のレベルがより高いこと、細胞に対する機能的影響がより強いこと等により裏付けられる。
【０２００】
一部の実施形態においては、注入により患者が受ける細胞の用量は、形質導入過程より取得されるものであり得る。種々の好ましい実施形態においては、患者の体重１キログラム当たり、少なくとも約１×１０１個、１×１０２個、１×１０３個、１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個又はそれ以上の高ストリンジェンシーのＣＤ３４富化細胞が、患者に注入される。種々の好ましい実施形態においては、患者の体重１キログラム当たり、少なくとも少なくとも約１×１０１個、１×１０２個、１×１０３個、１×１０４個、１×１０５個、１×１０６個、１×１０７個、１×１０８個又はそれ以上の低ストリンジェンシーのＣＤ３４富化細胞が、患者に注入される。一部の実施形態においては、患者の体重１キログラム当たり、１×１０６個〜４×１０６個の高ストリンジェンシーのＣＤ３４富化細胞が、患者に注入される。他の実施形態においては、患者の体重１キログラム当たり、３×１０５個及び４×１０６個の高ストリンジェンシーのＣＤ３４富化細胞が、患者に注入される。一部の実施形態においては、患者の体重１キログラム当たり、１×１０６個〜４×１０６個の高ストリンジェンシーのＣＤ３４富化細胞が、患者に注入される。他の実施形態においては、患者の体重１キログラム当たり、３×１０５個及び４×１０６個の高ストリンジェンシーのＣＤ３４富化細胞が、患者に注入される。一部の実施形態においては、細胞は、単回投与で患者に注入されることとなる。他の実施形態においては、細胞は、多回投与で患者に注入されることとなる（例えば、高ストリンジェンシー及び低ストリンジェンシーのＣＤ３４富化細胞の集団が、１回又は複数回経時的に投与される）。形質導入した細胞は、形質導入過程の完了後直ちに注入されてもよい。特定の実施形態においては、形質導入した細胞は、使用まで保存又は凍結される一方で、ある実施形態においては、細胞の形質導入後直ちに又は間もなく対象に提供されるものであり、これは例えば１時間、２時間、４時間又は８時間以内である。
【０２０１】
組み込むと、治療用タンパク質（例えば、ヒトＦＡＮＣＡタンパク質）が、細胞により発現される。形質導入したＦＡ細胞は、遺伝子的に修正されて、そしてそれによりＦＡＮＣＤ２及びＦＡＮＣＩのモノユビキチン化によってＦＡ経路を活性化することが可能である。これらタンパク質は、ＤＮＡ損傷領域に遊走し、他のＤＮＡ修復タンパク質と協働して、これら細胞において、健常細胞で生じるようにＤＮＡの修復を促進する。
【０２０２】
実施例においてさらに詳細に記載するように、ヒトＦＡ患者からのＢＭ試料によるインビトロでの前臨床データにより、これら細胞の表現型を修正するＦＡＮＣＡ  ＬＶの有効性が既に示された。
【０２０３】
一実施形態においては、患者の体重１キログラム当たり少なくとも１×１０５〜４×１０５個の修正されたＣＤ３４＋細胞（例えば、ＦＡＮＣＡ形質導入ＨＳＣ）が投与され、処置されていないＦＡ患者において造血細胞を修復する。一部の実施形態においては、形質導入した細胞は、形質導入後直ちに患者に注入又は投与される。他の実施形態においては、形質導入した細胞は、処置された患者又は処置されていない患者に注入又は投与する前は凍結している。
【０２０４】
ＦＡ患者からのＨＳＣの遺伝子的な修正であって、これら細胞の自家移植（造血性の遺伝子療法）がその後に続く当該遺伝子的な修正は、ＦＡ患者にとって、特に同種移植のためのＨＬＡ同型同胞を欠いている患者にとって、良好な代替物である。一実施形態においては、造血性の遺伝子療法は、ＨＬＡ同型同胞を欠いている患者にとって好ましい治療レジメンである。別の実施形態においては、造血性の遺伝子療法は、ＨＬＡ同型同胞を有する患者にとって好ましい治療レジメンである。
【０２０５】
ファンコニ貧血（ＦＡ）は、常染色体劣性遺伝病であり（Ｘ連鎖性である相補群ＦＡ−Ｂは除く）、また患者の生存期間中央値は、２４年前後である（Ｂｕｔｔｕｒｉｎｉ  Ａ，ｅｔ  ａｌ．（１９９４）Ｂｌｏｏｄ  ８４：１６５０−１６５５；Ｋｕｔｌｅｒ  ＤＩ，ｅｔ  ａｌ．（２００３）Ｂｌｏｏｄ  １０１：１２４９−１２５６）。出生時におけるこれら患者の血球数は、概して正常である。これら患者において検出されるはじめの血液学的異常は、大赤血球症であることが多い。これは通常、血小板減少症、貧血及び汎血球減少症を伴って進化する。骨髄機能不全（ＢＭＦ）は通常、５〜１０年後にこれら患者で観察されるとともに、血液疾患発症の平均年齢が７歳である。ＦＡ患者の約８０％で、人生のはじめの１０年のうちにＢＭＦのエビデンスが生じることとなる。現在までの疫学的研究に基づき、発育不全より前に悪性のエピソードが現れなければ、概ね全てのＦＡ患者は４０歳までにＢＭＦを発症することとなり、このことはこれら患者の主要な死亡原因である。ＦＡの複雑な臨床症状が原因で、これら患者の管理は、主に以下の臨床症状の改善に焦点が当てられる：骨髄不全（ＢＭＦ）、骨髄性白血病、及び固形腫瘍。
【０２０６】
ある実施形態においては、本開示は、それを必要とする対象においてファンコニ貧血（ＦＡ）を治療する方法であって、本明細書に開示の方法に従って、ファンコニ貧血相補群（ＦＡＮＣ）遺伝子か、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、をコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入した造血細胞を投与することを含む、当該方法を提供する。一部の実施形態においては、遺伝子はＦＡＮＣＡをコードする。
【０２０７】
一部の実施形態においては、本明細書で開示する方法は、例えばＦＡの治療のための細胞集団を生成するために、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＰＲＯ導入ベクターを用いて産生したレンチウイルスベクターにより造血細胞を形質導入するために用いる。ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＰＲＯは、第３世代のレンチウイルスベクター系で用いられるｐＣＣＬ導入プラスミドに基づくレンチウイルスベクターである。ｐＣＣＬ導入プラスミドは、キメラＣＭＶ−ＨＩＶ  ５’ＬＴＲならびにサルウイルス４０ポリアデニル化配列及び（エンハンサーなし）複製起点の配列をＨＩＶ  ３’ＬＴＲの下流に含むベクター骨格を含有するレンチウイルスベクターであり、これはＨＩＶ組み込み部位から残っているヒト配列の大部分を置き換える。ｐＣＣＬにおいて、ＣＭＶのエンハンサー及びプロモーター（転写開始点に対して、ヌクレオチド−６７３からヌクレオチド−１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０３１０４）は、ＨＩＶ−１のＲ領域に結合した。当該ベクターが、上流のＲＲＥ及びｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素ならびに下流のｗＰＲＥ要素を含むコドン最適化ＦＡＮＣＡ遺伝子と結合したＰＧＫプロモーターを使用する（図１５）。
【０２０８】
得られるレンチウイルスベクターを用いて、自家ＣＤ３４＋造血幹細胞（「ＨＳＣ」）を形質導入して、これによって遺伝的欠陥を補完する。簡潔には、ＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ、ｐｌｅｒｉｆａｘｏｒ、又はＧ−ＣＳＦ及びｐｌｅｒｉｆａｘｏｒの組み合わせにより、患者を処置することによって動員される。ＨＳＣはその後、患者の末梢血から血液成分分離により採取される。ＣＤ３４＋細胞は、磁気捕捉（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムで）により富化されて、またＣＤ３４＋富化細胞は、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＲＯ導入プラスミドを含む第３世代のレンチウイルスベクター系の一過性トランスフェクションによって予め生成されたレンチウイルス粒子により、本明細書で開示する方法に従ってエキソビボで形質導入する。ある実施形態においては、細胞は、ＰＧＥ２及びポロクサマーの存在下で形質導入する。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。形質導入したＨＳＣは、次いで注入により患者に植え込まれ、ＦＡＮＣＡ発現細胞を伴うＨＳＣニッチを再構成する。
【０２０９】
ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＰＲＯ（５’−３’）におけるＦＡＮＣＡ発現カセット配列の配列は、以下のとおりである。ＦＡＮＣＡのコード配列は、太字の大文字で示している。ＷＰＲＥ配列は下線を施している。
2021532776.tif 000008
2021532776.tif 000009
2021532776.tif 000010
【０２１０】
このポリペプチドによりコードされたＦＡＮＣＡタンパク質配列は、配列番号２として提供する。本発明において有用であるＦＡＮＣＡの発現のためのベクターには、その開示がその全体を本明細書で援用される国際特許出願の国際公開第２０１８／０４９２７３号に開示されるベクターが含まれるが、これに限定されない。
【０２１１】
白血球接着不全症１型（ＬＡＤ−１）は、リンパ球機能関連抗原１型（ＬＦＡ−１）、補体受容体３型（ＣＲ−３）及び補体受容体４型（ＣＲ−４）を含めた、白血球に存在するいくつかの細胞表面受容体複合体に存在するタンパク質、ＣＤ１８、をコードするＩＴＧＢ２遺伝子における変異が引き起こす稀な常染色体劣性疾患である。ＬＦＡ−１の欠乏は、好中球に対して、血管への付着及び血管の外に遊走することができないようにさせるので、好中球数が増加する可能性がある。それはまた、免疫細胞相互作用、免疫認識、及び細胞死滅性のリンパ球機能を弱める。
【０２１２】
ある実施形態においては、本開示は、それを必要とする対象において白血球粘着不全症Ｉ型（ＬＡＤ−１）を治療する方法であって、本明細書に開示の方法に従って、ＩＴＧＢ２遺伝子か、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、をコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入した造血細胞を投与することを含む、当該方法を提供する。
【０２１３】
一部の実施形態においては、本明細書で開示する方法は、例えばＬＡＤ−１の治療のための細胞集団を生成するために、ｐＣＣＬ−ＣｈｉｍｈＣＤ１８Ｗ−８２−ＲＯ導入ベクターを用いて産生したレンチウイルスベクターにより造血細胞を形質導入するために用いられる。ｐＣＣＬ−ＣｈｉｍｈＣＤ１８Ｗ−８２−ＲＯは、第３世代のレンチウイルスベクター系で用いられるｐＣＣＬ導入プラスミドに基づくレンチウイルス導入ベクターである。ｐＣＣＬ導入プラスミドは、キメラＣＭＶ−ＨＩＶ  ５’ＬＴＲならびにサルウイルス４０ポリアデニル化配列及び（エンハンサーなし）複製起点の配列をＨＩＶ  ３’ＬＴＲの下流に含むベクター骨格を含有するレンチウイルスベクターであり、これはＨＩＶ組み込み部位から残っているヒト配列の大部分を置き換える。ｐＣＣＬにおいて、ＣＭＶのエンハンサー及びプロモーター（転写開始点に対して、ヌクレオチド−６７３からヌクレオチド−１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０３１０４）は、ＨＩＶ−１のＲ領域に結合した。当該ベクターが、上流のＲＲＥ及びｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素ならびに下流のｗＰＲＥ要素を含むコドン最適化ＩＴＧＢ２遺伝子と結合したＣｈｉｍプロモーターを使用する（図１６）。Ｃｈｉｍプロモーターは、ｃ−Ｆｅｓプロモーター及びＣＴＳＧ最小５’隣接領域の融合である（ＣＴＳＧプロモーターのＴＡＴＡボックスが、転写開始をｃ−Ｆｅｓ最小プロモーターのみに限定するために変異されている）。
【０２１４】
レンチウイルス粒子は、ＬＡＤ−１導入プラスミドを含む第３世代のレンチウイルスベクター系の一過性トランスフェクションにより生成する。レンチウイルス粒子を用いて、自家ＣＤ３４＋造血幹細胞（ＨＳＣ）を形質導入して、これによって遺伝的欠陥を補完する。簡潔には、ＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ、ｐｌｅｒｉｆａｘｏｒ、又はＧ−ＣＳＦ及びｐｌｅｒｉｆａｘｏｒの組み合わせにより、患者を処置することによって動員される。ＨＳＣはその後、患者の末梢血から血液成分分離により採取される。ＣＤ３４＋細胞は、磁気捕捉（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムで）により富化させ、またＣＤ３４＋富化細胞は、レンチウイルス粒子によりエキソビボで形質導入する。形質導入過程は、形質導入エンハンサー、特にポリアキサマー（ｐｏｌｙａｘａｍｅｒ）（Ｒｏｃｋｅｔ社は、臨床用途及び商業用途の両方でＳｉｒｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ社（Ｓｉｒｉｏｎ  Ｂｉｏｔｅｃｈ  ＧｍｂＨ）からＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴのライセンスを受けている）及びＰＧＥ２（ＬＧＭ  Ｐｈａｒｍａ社より市販されている）の使用を取り入れる。形質導入したＨＳＣは、次いで、注入により患者に植え込まれ、ここで当該ＨＳＣが、ＬＡＤ−１発現細胞を伴うＨＳＣニッチを再構成する。
【０２１５】
得られるレンチウイルスベクターを用いて、自家ＣＤ３４＋造血幹細胞（「ＨＳＣ」）を形質導入して、遺伝的欠陥を補完する。簡潔には、ＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ、ｐｌｅｒｉｆａｘｏｒ、又はＧ−ＣＳＦ及びｐｌｅｒｉｆａｘｏｒの組み合わせにより、患者を処置することによって動員される。ＨＳＣはその後、患者の末梢血から血液成分分離により採取される。ＣＤ３４＋細胞は、磁気捕捉（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムで）により富化され得、またＣＤ３４＋富化細胞は、ｐＣＣＬ−ＣｈｉｍｈＣＤ１８Ｗ−８２−ＲＯ導入プラスミドを含む第３世代のレンチウイルスベクター系の一過性トランスフェクションによって予め生成されたレンチウイルス粒子により、本明細書で開示する方法に従ってエキソビボで形質導入する。ある実施形態においては、細胞は、ＰＧＥ２及びポロクサマーの存在下で形質導入する。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。形質導入したＨＳＣは、次いで、注入により患者に植え込まれ、ＩＴＧＢ２発現細胞を伴うＨＳＣニッチを再構成する。
【０２１６】
ｐＣＣＬ−ＣｈｉｍｈＣＤ１８Ｗ−８２−ＲＯ（５’−３’）におけるＩＴＧＢ２発現カセット配列の配列は、以下のとおりである。ＣＤ１８としても知られるＩＴＧＢのコード配列は、太字の大文字で示している。ＷＰＲＥ配列は下線を施している。
2021532776.tif 000011
【０２１７】
ヒトＩＴＧＢ２タンパク質配列は、配列番号４として提供する。
【０２１８】
ピルビン酸キナーゼ欠損症（ＰＫＤ）は、赤血球においてエネルギー的なバランスを損なう、ＰＫＬＲ遺伝子における変異が引き起こす一遺伝子による代謝疾患であり、それによって、非常に一定しない範囲での、また新生児期の間には致命的であり得る、溶血性貧血を引き起こす。
【０２１９】
ある実施形態においては、本開示は、それを必要とする対象においてピルビン酸キナーゼ欠損症を治療する方法であって、本明細書で開示する方法に従って、Ｒ型ピルビン酸キナーゼ遺伝子か、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、をコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入した造血細胞を投与することを含む、当該方法を提供する。
【０２２０】
一部の実施形態においては、本明細書で開示する方法は、例えばＩＭＯの治療のための細胞集団を生成するために、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ｃｏＲＰＫＷ−８２−ＲＯ導入ベクターを用いて産生したレンチウイルスベクターにより造血細胞を形質導入するために用いられる。ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ｃｏＲＰＫＷ−８２−ＲＯ（ＰＫＤプラスミド）は、第３世代のレンチウイルスベクター系で用いられるｐＣＣＬ導入プラスミドに基づく。ｐＣＣＬ導入プラスミドは、キメラＣＭＶ−ＨＩＶ  ５’ＬＴＲならびにサルウイルス４０ポリアデニル化配列及び（エンハンサーなし）複製起点の配列をＨＩＶ  ３’ＬＴＲの下流に含むベクター骨格を含有するレンチウイルスベクターであり、これはＨＩＶ組み込み部位から残っているヒト配列の大部分を置き換える。ｐＣＣＬにおいて、ＣＭＶのエンハンサー及びプロモーター（転写開始点に対して、ヌクレオチド−６７３からヌクレオチド−１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０３１０４）は、ＨＩＶ−１のＲ領域に結合した。ＰＫＤプラスミドは、上流のＲＲＥ及びｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素ならびに下流のｗＰＲＥ要素を含むコドン最適化ＰＫＬＲ遺伝子と結合したＰＧＫプロモーターを含む（図１）。レンチウイルスベクター粒子は、ＰＫＤプラスミドを含む第３世代のレンチウイルスベクター系の一過性トランスフェクションにより生成する（図１７）。
【０２２１】
次いでレンチウイルスベクター粒子を用いて、自家ＣＤ３４＋造血幹細胞（「ＨＳＣ」）を形質導入し得、これによって遺伝的欠陥を補完する。簡潔には、ＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ、ｐｌｅｒｉｆａｘｏｒ、又はＧ−ＣＳＦ及びｐｌｅｒｉｆａｘｏｒの組み合わせにより、患者を処置することによって動員される。ＨＳＣはその後、患者の末梢血から血液成分分離により採取される。ＣＤ３４＋細胞は、磁気捕捉（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムで）により富化され得、またＣＤ３４＋富化細胞は、本明細書で開示する方法に従ってレンチウイルスベクター粒子によりエキソビボで形質導入する。ある実施形態においては、細胞は、ＰＧＥ２及びポロクサマーの存在下で形質導入する。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。形質導入したＨＳＣは、次いで、注入により患者に植え込まれ、ＰＫＬＲ発現細胞を伴うＨＳＣニッチを再構成する。
【０２２２】
ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ｃｏＲＰＫＷ−８２−ＲＯ（５’−３’）におけるＰＫＬＲ発現カセット配列の配列は、以下のとおりである。ＰＫＬＲのコード配列は、太字の大文字で示している。ＰＧＫプロモーターは、斜体にしており、またＷＰＲＥ配列は、下線を施している。
2021532776.tif 000012
2021532776.tif 000013
【０２２３】
このポリペプチドによりコードされたＰＫＬＲタンパク質配列は、配列番号６として提供される。さらに本発明で有用であるＰＫＬＲポリヌクレオチド配列は、配列番号７〜９を含む。本発明において有用であるＰＫＬＲの発現のためのベクターには、その開示がその全体を本明細書で援用される国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ２０１９／０４１４６５号に開示されるベクターが含まれるが、これに限定されない。
【０２２４】
乳児性悪性大理石骨病（ＩＭＯ）は、機能障害性の破骨細胞によって引き起こされる骨質量の増加を特徴とする稀な劣性遺伝疾患である。この疾患は、ほとんどの場合、破骨細胞の骨を再吸収する能力に関係するＶ型ＡＴＰアーゼのサブユニットをコードするＴＣＩＲＧ１遺伝子における変異が引き起こす。Ｒｉｃｈｔｅｒらは、破骨細胞の機能が、レンチウイルスベクター介在性の、ＴＣＩＲＧ１の発現によって修復可能であることを示しているが、再吸収の修復のみならずベクター介在性のＴＣＩＲＧ１発現に対する細胞応答についての正確な閾値はわかっていない。
【０２２５】
ある実施形態においては、本開示は、それを必要とする対象において乳児性悪性オステオポローシスを治療する方法であって、本明細書に開示の方法に従って、ＣＬＣＮ７、ＯＳＴＭ１、Ｔ細胞免疫調節因子１、Ｈ＋輸送ＡＴＰアーゼＶ０サブユニットａ３（ＴＣＩＲＧ１）、ＴＮＦＳＦ１１、ＰＬＥＫＨＭ１もしくはＴＮＦＲＳＦ１１Ａ遺伝子か、又はその機能的バリアントもしくは機能的断片をコードする遺伝子か、をコードするポリヌクレオチドを含む組換えレトロウイルスベクターにより形質導入した造血細胞を投与することを含む、当該方法を提供する。
【０２２６】
一部の実施形態においては、本明細書で開示する方法は、例えばＩＭＯの治療のために細胞集団を生成するために、ｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅ導入ベクターを用いて産生したレンチウイルスベクターにより造血細胞を形質導入するために用いられる。ｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅは、第３世代のレンチウイルスベクター系で用いられるｐＣＣＬ導入プラスミドに基づくレンチウイルス導入ベクターである。ｐＣＣＬ導入プラスミドは、キメラＣＭＶ−ＨＩＶ  ５’ＬＴＲならびにサルウイルス４０ポリアデニル化配列及び（エンハンサーなし）複製起点の配列をＨＩＶ  ３’ＬＴＲの下流に含むベクター骨格を含有するレンチウイルスベクターであり、これはＨＩＶ組み込み部位から残っているヒト配列の大部分を置き換える。ｐＣＣＬにおいて、ＣＭＶのエンハンサー及びプロモーター（転写開始点に対して、ヌクレオチド−６７３からヌクレオチド−１；ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｋ０３１０４）は、ＨＩＶ−１のＲ領域に結合した。当該ベクターが、上流のＲＲＥ及びｃＰＰＴ／ＣＴＳ要素ならびに下流のｗＰＲＥ要素を含むコドン最適化ＴＣＩＲＧ１遺伝子と結合したＥＦＳプロモーター（ＥＦ１アルファプロモーターの短く、イントロン無しの形態）を使用する（図１８）。
【０２２７】
得られるレンチウイルスベクターを用いて、自家ＣＤ３４＋造血幹細胞（「ＨＳＣ」）を形質導入して、これによって遺伝的欠陥を補完する。一部の実施形態においては、ＨＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ、ｐｌｅｒｉｆａｘｏｒ、又はＧ−ＣＳＦ及びｐｌｅｒｉｆａｘｏｒの組み合わせにより、患者を処置することによって動員される。ＨＳＣはその後、患者の末梢血から血液成分分離により採取される。ＣＤ３４＋細胞は、磁気捕捉（例えば、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  Ｂｉｏｔｅｃ社のＣｌｉｎｉＭＡＣＳシステムで）により富化され得、またＣＤ３４＋富化細胞は、ｐＣＣＬＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅ導入プラスミドを含むレンチウイルスベクター系の一過性トランスフェクションによって予め生成されたレンチウイルス粒子により、本明細書で開示する方法に従ってエキソビボで形質導入し得る。ある実施形態においては、細胞は、ＰＧＥ２及びポロクサマーの存在下で形質導入する。ある実施形態においては、ポロクサマーは、ポロクサマー３３８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））である。形質導入したＨＳＣは、次いで、注入により患者に植え込み、ＴＣＩＲＧ１発現破骨細胞を生成する。
【０２２８】
ｐＣＣＬ．ＰＰＴ．ＥＦＳ．ｔｃｉｒｇ１ｈ．ｗｐｒｅ（５’−３’）におけるＴＣＩＲＧ１発現カセット配列の配列は以下のとおりである。ＣＤ１８としても知られるＴＣＩＲＧ１のコード配列は、太字の大文字で示している。ＷＰＲＥ配列は下線を施している。
2021532776.tif 000014
2021532776.tif 000015
【０２２９】
このポリペプチドによりコードされたＴＣＩＲＧ１タンパク質配列は、配列番号１１として提供される。
【０２３０】
一部の場合において、組換えレトロウイルスベクターは、疾患又は障害に関連する遺伝子以外の遺伝子に対して導入遺伝子を提供するか、又は、疾患又は障害に関連する遺伝子以外の遺伝子を修復する。例えば、限定するものではないが、組換えレトロウイルスベクターは、免疫エフェクター遺伝子を上方制御又は下方制御し得るか、細胞表面標識を変化させ得るか、代わりのＭＨＣ分子を提供し得るか、又は、免疫グロブリン遺伝子をコードし得る。特に、一部の場合においては、組換えレトロウイルスベクターは、例えば免疫マーカー（例えば、ＨＬＡ又はＭＨＣの遺伝子）を変えることによって又は免疫エフェクター遺伝子の発現を引き起こすこと等によって、同種間の移植又は適合しないドナーによる移植の使用を提供することを意図している。
【０２３１】
細胞内で発現しようとするコード配列は、例えばポリペプチドもしくはＲＮＡベースの治療薬（ｓｉＲＮＡ、アンチセンス、リボザイム、ｓｈＲＮＡ等）である遺伝子産物をコードする、例えば遺伝子又はｃＤＮＡである任意のポリヌクレオチド配列とすることが可能である。コード配列は、それが操作可能に結合しているプロモーター配列に対して非相同であり得、すなわち、それと天然に操作可能に関連していない。あるいは、コード配列は、それが操作可能に結合しているプロモーター配列に対して内在的であり得、すなわち、そのプロモーターと事実上関連している。遺伝子産物は、哺乳動物細胞において内因的に作用し得るか、又は遺伝子産物は、外因的に作用し得、例えば分泌され得る。例えば、導入遺伝子が治療用遺伝子である場合、コード配列は、疾患もしくは障害を治療するための治療として用いることが可能である所望の遺伝子産物又はその機能的断片もしくは機能的バリアントをコードする任意の遺伝子であり得る。種々の実施形態においては、導入遺伝子は、ヒトＦＡＮＣＡをコードする。
【０２３２】
一部の実施形態においては、導入遺伝子コード配列は、出現頻度が低いコドンを、より出現頻度が高いコドンで置換することにより発現を増強するように改変されるか又は「コドン最適化」される。コード配列は、翻訳のためのアミノ酸をコードするｍＲＮＡ配列の一部である。翻訳中、６１個のトリヌクレオチドコドンのそれぞれは、２０個のアミノ酸のうちの１つに翻訳され、遺伝コードにおいて、縮重又は重複性をもたらす。しかしながら、異なる細胞型及び異なる動物種は、異なる頻度で同じアミノ酸をコードするｔＲＮＡ（それぞれがアンチコドンを保持している）を利用する。遺伝子配列が、対応するｔＲＮＡによって現れる頻度が低いコドンを含有する場合、リボソーム翻訳機構は遅くなり得、効率的な翻訳を妨害する。発現は、特定の種に対して「コドン最適化」を経て改善可能であって、ここでコード配列が変更されて同じタンパク質配列をコードするが、高度に現れるコドン及び／又は高度に発現されたヒトタンパク質により利用されるコドンを利用する（Ｃｉｄ−Ａｒｒｅｇｕｉ  ｅｔ  ａｌ．，２００３；Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７７：４９２８）。本発明の一態様においては、導入遺伝子のコード配列は、哺乳動物又は霊長類において低い頻度で発現されるコドンを、霊長類において高い頻度で発現するコドンで置換するように改変される。例えば、一部の実施形態においては、導入遺伝子によりコードされたコード配列は、上記又は本明細書で開示した配列でコードしたポリペプチドに対して少なくとも８５％の配列同一性を有するポリペプチドをコードするものであって、例えば少なくとも９０％の配列同一性であり、例えば少なくとも９５％の配列同一性、少なくとも９８％の同一性、少なくとも９９％の同一性であって、当該コード配列のうちの少なくとも１つのコドンは、上記又は本明細書で開示した配列における対応するコドンよりも、ヒトにおいて高いｔＲＮＡ頻度を有する。
【０２３３】
さらなる実施形態においては、導入遺伝子コード配列は、所望の導入遺伝子をコードしないオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）の停止又は除去によって発現を増強するように改変される。オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は、開始コドンに続き、かつ、終止コドンを含有しないものである核酸配列である。ＯＲＦは、順配向であってもよく又は逆配向であってもよく、また関心対象の遺伝子と比較して「インフレーム」であってもよく又は「フレーム外」であってもよい。こうしたオープンリーディングフレームは、関心対象の遺伝子に並ぶ発現カセットにおいて発現される可能性を有し、また望まない有害作用を導く可能性がある。本発明の一態様においては、導入遺伝子のコード配列は、コドン頻度をさらに変更することによってオープンリーディングフレームを除去するように改変されている。このことは、アミノ酸配列を保存し、かつ、関心対象の遺伝子において高度に利用されるコドンを維持しつつ（すなわち、２０％未満の頻度のコドンを回避する）、開始コドン（ＡＴＧ）を除去して、停止コドン（ＴＡＧ、ＴＡＡ又はＴＧＡ）を逆配向のＯＲＦ又はフレーム外のＯＲＦに導入することによってなされ得る。本開示においては、導入遺伝子コード配列は、コドン最適化及び非導入遺伝子のＯＲＦの除去のいずれかによって、又は両技術を用いて、最適化され得る。当業者には明らかになることとなるように、コドン最適化中に導入されたＯＲＦを除去するために、コドン最適化後に非導入遺伝子のＯＲＦを除去又は最小化することが好ましい。
【０２３４】
さらに、当業者に認識されることとなるように、発現カセット及び組換えレトロウイルスベクターは、クローニングを促進する制限部位、及び特定の組換えレトロウイルスベクターに関する調節因子を含むがこれに限定されない他の要素を任意で含有していてもよい。
【０２３５】
本発明の一部の態様においては、主題のポリヌクレオチドカセットは、遺伝子を細胞に送達して、例えば遺伝子が有する、細胞生存能及び／又は細胞機能に及ぼす影響を判断するため、細胞疾患を治療するため等に、用いられる。種々の実施形態においては、形質導入によるウイルスベクターの細胞への送達は、インビボ、エキソビボ又はインビトロで生じ得る。したがって、本発明の一部の態様においては、哺乳動物細胞における導入遺伝子の発現をもたらす組成物は、組換えレトロウイルスベクターであって、当該組換えレトロウイルスベクターは、本開示の、例えば遺伝子導入カセットであるポリヌクレオチドカセットを含む。
【０２３６】
本開示のポリヌクレオチドカセットを包含する組換えレトロウイルスベクターは、標準の方法論を用いて産生してよい。
【０２３７】
例えば、ＬＶウイルス粒子の場合、本発明によるＬＶ発現ベクターは産生細胞内に導入されて、その後にＬＶヘルパーコンストラクトの導入が続き得るものであって、当該ヘルパーコンストラクトは、産生細胞において発現させることが可能であり、またＬＶベクターにおいてＬＶヘルパー機能の不在を補完するものであるＬＶコード領域を含む。これには、ヘルパーウイルス及び／又はさらなるベクターの、産生細胞内への導入が後に続くものであって、当該ヘルパーウイルス及び／又はさらなるベクターは、効率的なＬＶ産生を支持することが可能である補助機能をもたらす。産生細胞はその後、培養されてＬＶを産生する。これらステップは、標準の方法論を用いて実行する。特定の実施形態においては、図３８〜４１に示すプラスミドを用いて、組換えレトロウイルスベクターを産生する。
【０２３８】
ウイルスベクターの産生方法
本開示のポリヌクレオチドカセットを包含する組換えレトロウイルスベクターは、標準の方法論を用いて産生してよい。
【０２３９】
例えば、ＬＶウイルス粒子の場合、本発明によるＬＶ発現ベクターは産生細胞内に導入されて、その後にＬＶヘルパーコンストラクトの導入が続き得るものであって、当該ヘルパーコンストラクトは、産生細胞において発現させることが可能であり、またＬＶベクターにおいてＬＶヘルパー機能の不在を保管するものであるＬＶコード領域を含む。これには、ヘルパーウイルス及び／又はさらなるベクターの、産生細胞内への導入が後に続くものであって、当該ヘルパーウイルス及び／又はさらなるベクターは、効率的なＬＶ産生を支持することが可能である補助機能をもたらす。産生細胞はその後、培養されてＬＶを産生する。これらステップは、標準の方法論を用いて実行する。特定の実施形態においては、図３８〜４１に示すプラスミドを用いて、組換えレトロウイルスベクターを産生する。
【０２４０】
主題のポリヌクレオチドカセット送達のためのウイルスベクターを産生する任意の好適な方法を用いることが可能であり、以下の実施例に記載したものを含むがこれに限定されない。インビトロ又はインビボで哺乳動物細胞を接触させるために、哺乳動物細胞を効果的に形質導入するのに好適である任意の濃度の感染性ウイルスベクターが調製され得る。例えば、ウイルス粒子は、１ｍｌ当たり１０８の感染単位又はそれ以上の濃度で調製され得、例えば、１ｍＬ当たり１×１０８の感染単位；１ｍＬ当たり５×１０８の感染単位；１ｍＬ当たり１０９の感染単位；１ｍＬ当たり５×１０９の感染単位；１ｍＬ当たり１０１０の感染単位；１ｍＬ当たり５×１０１０の感染単位；１ｍＬ当たり１０１１の感染単位；１ｍＬ当たり５×１０１１の感染単位；１ｍＬ当たり１０１２の感染単位；１ｍＬ当たり５×１０１２の感染単位；１ｍＬ当たり１０１３の感染単位；１ｍＬ当たり１．５×１０１３の感染単位；１ｍＬ当たり３×１０１３の感染単位；１ｍＬ当たり５×１０１３の感染単位；１ｍＬ当たり７．５×１０１３の感染単位；１ｍＬ当たり９×１０１３の感染単位；１ｍＬ当たり１×１０１４の感染単位、１ｍＬ当たり５×１０１４感染単位であるが、典型的には、１ｍＬ当たり１×１０１５以下の感染単位である。
【０２４１】
主題のＬＶ組換えレトロウイルスベクターを調製する際に、ＬＶウイルス粒子を産生する任意の宿主細胞を用いてもよく、例えば哺乳動物細胞（例えば、ＨＥＫ  ２９３Ｔ細胞）が含まれる。宿主細胞はまた、ＬＶベクターゲノムが安定的に維持されてパッケージングされるものである宿主細胞又は産生細胞において、ＬＶ  ｇａｇ／ｐｏｌ及びＲｅｖの遺伝子が安定的に維持されるものであるパッケージング細胞とすることが可能である。ＬＶベクターは、当技術分野において公知の標準技術を用いて精製及び調製される。
【０２４２】
医薬組成物及び製剤
本発明は、本明細書に記載の細胞集団及び薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含む医薬組成物ならびに製剤を含む。概して安全で、無毒性で、かつ所望であり、また霊長類での使用に許容される賦形剤を含む製剤を調製するのに有用である、薬学的に許容される担体、希釈剤及び薬剤と、主題の細胞集団を組み合わせることが可能である。こうした賦形剤、担体又は希釈剤の例としては、水、生理食塩水、リンゲル液、ブドウ糖液、及び５％ヒト血清アルブミンが挙げられるがこれに限定されない。補助的に活性な化合物もまた、当該製剤に包含可能である。製剤に用いる溶液又は懸濁液としては、注射用水、生理食塩水溶液、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、固定油、ポリエチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール、又は他の合成溶媒等である無菌希釈剤；ベンジルアルコール又はメチルパラベン等の抗菌化合物；アスコルビン酸又は亜硫酸水素ナトリウム等の抗酸化剤；エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）等のキレート化化合物；酢酸塩、クエン酸塩又はリン酸塩等の緩衝剤；凝集を防止する、例えばＴｗｅｅｎ２０等である界面活性剤；及び塩化ナトリウム又はブドウ糖等である張性を調節する化合物を挙げることができる。例えば塩酸又は水酸化ナトリウム等の酸又は塩基を用いて、ｐＨを調節することが可能である。特定の実施形態においては、製剤は無菌である。
【０２４３】
一部の実施形態においては、細胞集団は、医薬品適正製造基準（Ｃｕｒｒｅｎｔ  Ｇｏｏｄ  Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ  Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）に従って製造する。医薬品適正製造基準に従って製造されるとは、投与のために調製された製剤は、統括のための規制及び政府の承認の下で、ヒト対象に対する投与が許可されるのに十分安全であるということを意味する。概して、統括のための規制及び承認により、製剤が、正体（ｉｄｅｎｔｉｔｙ）、強度、品質、及び純度に関する事前に承認された判定基準に適合するということが命じられることとなる。判定基準には、ある製剤が医薬品適正製造基準に適合するか否かを判断するために用いる、試験結果の数値的な制限、範囲又は他の好適な測定値が含まれる。規格には、判定基準との合致を試験するために用いる解析手順について記載される。製剤は、各ロットで評価することが可能である。あるロットは、判定基準の遵守を保証することを試験される特定の量の製剤である。
【０２４４】
製剤は、投与説明書と一緒に、容器、パック、又は、例えば事前充填したシリンジであるような例えばシリンジであるディスペンサーの中に含むことが可能である。
【０２４５】
必要な又は有益な場合、製剤は、注射部位の痛みを和らげる、リドカイン等の局所麻酔を含むことが可能である。
【０２４６】
製剤中の治療有効量の細胞は、１０２細胞を超える、１０３細胞を超える、１０４細胞を超える、１０５細胞を超える、１０６細胞を超える、１０７細胞を超える、１０８細胞を超える、１０９細胞を超える、１０１０細胞を超える、又は１０１１細胞を超える、とすることが可能である。製剤中の治療有効量の細胞は、１０３細胞未満、１０４細胞未満、１０５細胞未満、１０６細胞未満、１０７細胞未満、１０８細胞未満、１０９細胞未満、１０１０細胞未満、１０１１細胞未満、又は１０１２細胞未満、とすることが可能である。製剤中の治療有効量の細胞は、１０３細胞〜１０１２細胞、１０４細胞〜１０１１細胞、１０５細胞〜１０１０細胞、１０８細胞〜１０１２細胞、１０９細胞〜１０１２細胞、１０８細胞〜１０１０細胞、又は１０９細胞〜１０１１細胞とすることが可能である。
【０２４７】
本明細書で開示する製剤において、細胞は概して、１リットル以下、５００ｍＬ以下、２５０ｍＬ以下、又は１００ｍＬ以下の体積である。したがって、投与する細胞の密度は、典型的に、１０４細胞／ｍＬを超える、１０７細胞／ｍＬを超える、又は１０８細胞／ｍＬを超える。
【０２４８】
本明細書で開示する製剤は、例えば注射、点滴、灌流又は洗浄による投与のために調製可能である。投与する治療有効量は、１０２細胞を超える、１０３細胞を超える、１０４細胞を超える、１０５細胞を超える、１０６細胞を超える、１０７細胞を超える、１０８細胞を超える、１０９細胞を超える、１０１０細胞を超える、又は１０１１個を超える、細胞を含むことが可能である。特定の実施形態においては、最小用量は、対象の体重１ｋｇ当たり２×１０６細胞である。投与する治療有効量は、１０３細胞未満、１０４細胞未満、１０５細胞未満、１０６細胞未満、１０７細胞未満、１０８細胞未満、１０９細胞未満、１０１０細胞未満、１０１１細胞未満、又は１０１２個未満、の細胞を含むことが可能である。特定の実施形態においては、最大用量は、対象の体重１ｋｇ当たり２×１０１２細胞である。投与する治療有効量の細胞は、１０３細胞〜１０１２細胞、１０４細胞〜１０１１細胞、１０５細胞〜１０１０細胞、１０８細胞〜１０１２細胞、１０９細胞〜１０１２細胞、１０８細胞〜１０１０細胞、又は１０９細胞〜１０１１細胞とすることが可能である。
【０２４９】
一部の実施形態においては、本明細書で提供する医薬組成物は、例えば生理食塩水、リン酸緩衝食塩水、リン酸塩及びアミノ酸、ポリマー、ポリオール、糖、緩衝剤、防腐剤及び他のタンパク質である薬学的に許容される担体及び／又は賦形剤との混合物中で、本明細書で開示する治療有効量の細胞集団を含む。アミノ酸、ポリマー、及び糖等の例には、オクチルフェノキシポリエトキシエタノール化合物、ポリエチレングリコールモノステアレート化合物、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル、ショ糖、フルクトース、ブドウ糖、マルトース、グルコース、マンニトール、デキストラン、ソルビトール、イノシトール、ガラクチトール、キシリトール、ラクトース、トレハロース、ウシ又はヒトの血清アルブミン、クエン酸塩、酢酸塩、リンガー液及びハンクス液、システイン、アルギニン、カルニチン、アラニン、グリシン、リシン、バリン、ロイシン、ポリビニルピロリドン、ポリエチレン及びグリコールがある。好ましくは、この製剤は、４℃で少なくとも６ヶ月間安定である。ある実施形態においては、細胞集団は、インビボの源より新しく調製される。ある実施形態においては、細胞集団は、医薬組成物への製剤化前又は製剤化後に保存のために凍結させる。
【０２５０】
一部の実施形態においては、本明細書で提供される医薬組成物は、リン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）又はリン酸ナトリウム／硫酸ナトリウム、トリス緩衝液、グリシン緩衝液、滅菌水、及び例えばＧｏｏｄ  ｅｔ  ａｌ．（１９６６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ５：４６７に記載の緩衝液等である当業者に公知の他の緩衝液である、緩衝液を含む。アデノウイルスベクター送達系に含有される腫瘍抑制遺伝子を医薬組成物が含む、緩衝液のｐＨは、６．５〜７．７５の範囲内であり得、好ましくは７〜７．５であり、また最も好ましくは７．２〜７．４であり得る。
【０２５１】
本明細書で言及する全ての刊行物は、刊行物を引用したことに関する方法及び／材料を開示及び記載するように、参照により本明細書で援用する。援用した刊行物の矛盾が存在する程度に及ぶあらゆる開示は、本開示が取って代わることを理解されたい。
【０２５２】
特許請求の範囲は、任意選択的な構成要素を除外するように立案されている可能性があるということをさらに留意されたい。このように、本明細書は、特許請求の範囲の構成要素の記載に関連して、「単に」、「のみ」等のような排他的な用語の使用に関する、又は「ネガティブ」な限定の使用に関する先行詞として機能することを意図している。
【０２５３】
本明細書で論じた刊行物は、本願の出願日の前におけるそれらの開示を単に提供するだけである。さらに、提供された公開日は、実際の公開日とは異なる可能性があり、それは別個に確認することが必要であり得る。
【０２５４】
本開示について、以下の実施例にさらに記載するが、これは特許請求の範囲に記載する開示の範囲を限定するものではない。
【実施例】
【０２５５】
実施例１
硫酸プロタミン及びＰＧＥ２による、造血細胞の形質導入
臨床用途でのレトロウイルスベクターによる造血細胞の形質導入は、困難なままである。特に、形質導入エンハンサー又はその組み合わせが、最も有効でありそうか又は達成可能である効果の大きさが最大でありそうかということは、文献からは不明である。この実施例により、硫酸プロタミン及びＰＧＥ２の組合せが、導入効率を増加させるということが確立される。
【０２５６】
以下の実施例において実施されるレンチウイルスベクターによる造血細胞の形質導入のための例示的なプロトコールは、図１で提供されるが、実施例に記載した種々の実験においては、形質導入培地は、ＴＥを含まなかったか、１つのＴＥを含んだか、又は種々の組み合わせのＴＥを含んだ。予備刺激には、２ｕｇ／ｃｍ２のＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ（商標）（ＲＮ）で被覆したプレート上で細胞を培養することを含んだ。形質導入培地は、予備刺激培地の内容物（Ｘ−ＶＩＶＯ（商標）２０培地に、１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＳＣＦ、１００ｎｇ／ｍＬのｒｈＴＰＯ、１００ｎｇ／ｍＬのｒｈ−ＦＬＴ３−Ｌ、及び２０ｎｇ／ｍＬのＩＬ−３を合わせた）と、４μｇ／ｍＬの硫酸プロタミンとを含んだ。
【０２５７】
一実施形態においては、造血細胞を、ＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）導入遺伝子レポーターを発現するＶＳＶＧ偽型ＬＶにより形質導入した。細胞を、様々な濃度でのＰＧＥ２の存在下で、液体培養液中、２．５×１０７ＴＵ／ｍＬ又は５×１０７ＴＵ／ｍＬのいずれかのレンチウイルスベクターにより形質導入し、そして液体培養中１４日後にＶＣＮを求めるためのアッセイを行った（図２Ａ）。この結果が、ＰＧＥ２の濃度を増加させることにより（１０μｇ／ｍＬ、３０μｇ／ｍＬ又は５０μｇ／ｍＬ）、ベクターのコピー数／細胞で測定した形質導入効率が増加することを示す。
【０２５８】
別の実験においては、細胞を、ＰＧＥ２の存在下で、液体培養液中、１×１０７ＴＵ／ｍＬ又は１×１０８ＴＵ／ｍＬのいずれかのレンチウイルスベクターにより形質導入し、そして液体培養中１４日後にＶＣＮを求めるためのアッセイを行った（図２Ｂ）。いずれのベクター濃度においても、ＰＧＥ２が、ＶＣＮ／細胞で求められる形質導入効率を増加させた。コロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイは、形質導入した細胞（図３Ａ、ＣＦＣ＝コロニー形成細胞）を用いて実行し、そしてＶＣＮ及び形質導入率（％）を、シングルコロニーで解析した（図３Ｂ及び３Ｃ）。試験された最高濃度のＰＧＥ２により、最大約７５％の細胞が形質導入された（図３Ｃ）。
【０２５９】
実施例２
硫酸プロタミン及びポロクサマーＦ１０８による、造血細胞の形質導入
この実施例により、硫酸プロタミン及びポロクサマーＦ１０８（ポロクサマー３３８としても知られる）が形質導入効率を増加させるということが確立される。図１に示した全般的なプロトコールに従った試験を、ポロクサマーＦ１０８（ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標））を用いて液体培養液中で実行した。液体培養液中のＶＣＮに関する結果は図４に、またＣＦＵアッセイの解析（図５Ａ）及び単離したシングルＣＦＵでのＶＣＮ（図５Ｂ及び５Ｃ）に関する結果は図５Ａ〜５Ｃに、示している。０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ及び４ｍｇ／ｍＬの濃度のＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）が、ＧＦＰ導入遺伝子レポーターを発現するＶＳＶＧ偽型ＬＶの導入効率を増加させた。ＰＧＥ２を伴う場合に、試験された最大濃度のＰＧＥ２により、最大約７５％の細胞を形質導入できた（図５Ｃ）。
【０２６０】
実施例３
硫酸プロタミン、ＰＧＥ２、及びポロクサマーＦ１０８による、造血細胞の形質導入
この実施例により、驚くべきことに、硫酸プロタミン、ＰＧＥ２及びＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）の組合せが、ＰＧＥ２又はＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）のいずれか単独で観察したもの以上に形質導入効率を増加させたということが確立される。図１に示すプロトコールに従った試験を実行し、硫酸プロタミン（ＰＳ）、ＬｅｎｔｉＢＯＯＳＴ（商標）（ＬＢ）、ＬＢとＰＧＥ２の組み合わせ、ＰＳとＬＢの組み合わせ、又はＰＳとＬＢとＰＧＥ２の組み合わせを比較するために用いた。ＬＢを１ｍｇ／ｍＬの濃度で用い、ＰＧＥ２を１０ｕｇ／ｍＬの濃度で用い、またＰＳを４ｕｇ／ｍＬで用いた。液体培養１４日後の形質導入した細胞におけるＶＣＮに関して得た結果を、図６に示している。図７Ａは、ＣＢ及びｍＰＢに由来する形質導入した細胞でのＣＦＵアッセイを示している。また、ＬＢとＰＧＥ２とＰＳの組み合わせの存在下の単離したコロニーにおけるＶＣＮも示しており（図７Ｂ、図７Ｅ）、また形質導入効率を示している（図７Ｃ、図７Ｄ）。図７Ｃに示すように、８０％を超える細胞が、これら条件下でベクターにより形質導入される。
【０２６１】
実施例４
形質導入エンハンサーのスケールアップ方法及びインビボでの試験方法
この実施例により、実施例１〜３で確立したプロトコールは、治療用ベクターに導入することが可能であり、またインプットとして臍帯血を用いた、臨床試験に十分なベクターを産生するように拡大することが可能であるということが実証される。形質導入手順のスケールアップは、ＣＤ３４富化臍帯血（ＣＢ）細胞と、形質導入エンハンサー（全ての実験で用いたＰＳ以外）を含まず、又は形質導入エンハンサー（＋ＴＥ）を含めて、特にＬＢ、ＰＧＥ２及びＰＳを含めて、ｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＰＲＯから産生したＬＶとを用いて実行した。ＬＢを１ｍｇ／ｍＬの濃度で用い、ＰＧＥ２を１０ｕｇ／ｍＬの濃度で用い、またＰＳを４ｕｇ／ｍＬで用いた。液体培養１４日後のＶＣＮを、図８に示している。移植前のインビトロで形質導入した細胞における、ＣＦＵアッセイの結果（図９Ａ）、単離したシングルＣＦＵでのＶＣＮの結果（図９Ｂ）及びＣＦＵでの形質導入効率の結果（図９Ｃ）を、図９Ａ〜９Ｃに示している。前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ（ｂｕｒｓｔ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ））の細胞、顆粒球−マクロファージ前駆細胞ＣＦＵ−ＧＭ）、及び骨髄系前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）に関して、図９Ｂに結果を示している。図１０Ａ及び１０Ｂは、インビボでの結果を示している。臍帯血ＣＤ３４＋細胞を、形質導入エンハンサー（ＴＥはＬＢとＰＧＥ２とＰＳとの組み合わせ）の存在下又は不在下で形質導入し、治療用ＬＶの一晩の感染効率（ＭＯＩ）は５０であった。ＬＢを１ｍｇ／ｍＬの濃度で用い、ＰＧＥ２を１０ｕｇ／ｍＬの濃度で用い、またＰＳを４ｕｇ／ｍＬで用いた。次いで採取した形質導入した細胞を洗浄し、１〜２．５×１０６細胞／ｍＬの密度で懸濁させた。１．３〜１．６×１０５個の範囲の形質導入した細胞を、ヒト造血の異種モデルとしての、１．５Ｇｙで照射した免疫不全ＮＳＧマウスに静脈内に移植した。ヒトＣＤ４５陽性（ｈＣＤ４５＋）細胞の百分率（％）（図１０Ａ）と、ＶＣＮ／細胞（図１０Ｂ）とを、移植動物からの骨髄細胞において、移植１ヵ月後（１ｍｐｔ）、移植２ヶ月後（２ｍｐｔ）、又は移植３ヶ月後（３ｍｐｔ）で評価した。
【０２６２】
実施例５
医薬品適正製造基準（ＧＭＰ）条件下でのＬＶ産生及びＭＰＢの形質導入
この実施例により、実施例１〜４で確立したプロトコールは、治療ベクターに導入することが可能であり、またインプットとして動員された末梢血を用いた、臨床試験に十分なベクターを産生するように拡大することが可能であるということが実証される。ＧＭＰ  ＬＶ産生を実行し、健常なドナーよりの動員された末梢血（ｍＰＢ）から精製したＣＤ３４＋造血幹細胞を用いて行った実験の次のセットにおいて用いた。ＬＶベクターは、ＦＡＮＣＡ導入遺伝子を発現するＶＳＶＧ偽型ＬＶとしたが、これはｐＣＣＬ−ＰＧＫ−ＦＡＮＣＡＷ−８２−ＰＲＯ導入ベクターを用いて産生した。図１１には、形質導入エンハンサーＰＳ、ＬＢ及びＰＧＥ２を含む（＋ＴＥ）又は含まない（−ＴＥ）液体培養液中で、２つの異なるＭＯＩでの、１４日後の形質導入した細胞におけるＶＣＮ／細胞を示している。ＬＢを１ｍｇ／ｍＬの濃度で用い、ＰＧＥ２を１０ｕｇ／ｍＬの濃度で用い、またＰＳを４ｕｇ／ｍＬで用いた。図１２Ａ〜１２Ｄは、２つの異なるＭＯＩで、形質導入エンハンサーＰＳ、ＬＢ及びＰＧＥ２を含む（＋ＴＥ）又は含まない（−ＴＥ）、ＧＭＰ００３に関する、全細胞、ＢＦＵ、ＧＭ、及び混合の骨髄系前駆細胞に対するコロニー形成単位（ＣＦＵ）アッセイの結果を示している。図１３Ａ及び１３Ｂは、ＭＯＩ２０又はＭＯＩ５０で、形質導入エンハンサーＰＳ、ＬＢ及びＰＧＥ２を含む（＋ＴＥ）又は含まない（−ＴＥ）、ＧＭＰ００３に関する、単離したシングルＣＦＵでのＶＣＮを示している。前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ（ｂｕｒｓｔ  ｆｏｒｍｉｎｇ  ｕｎｉｔ−ｅｒｙｔｈｒｏｉｄ））の細胞、顆粒球−マクロファージ前駆細胞ＣＦＵ−ＧＭ）、及び骨髄系前駆細胞（ＣＦＵ−ＧＭ）に関する結果を示している。図１４Ａ及び１４Ｂは、前期赤芽球系前駆細胞（ＢＦＵ−Ｅ）の細胞、顆粒球−マクロファージ前駆細胞（ＧＭ）、及び骨髄系前駆細胞（Ｍｉｘｅｄ）に関して、形質導入エンハンサーＰＳ、ＬＢ及びＰＧＥ２を含む（＋ＴＥ）又は含まない（−ＴＥ）、形質導入効率及びＣＦＵでのＶＣＮを示している。
【図１】
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【図２】
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【図３Ａ】
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【図３Ｂ】
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【図３Ｃ】
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【図４】
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【図５Ａ】
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【図５Ｂ】
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【図５Ｃ】
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【図６】
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【図７Ａ】
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【図７Ｂ】
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【図７Ｃ】
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【図７Ｄ】
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【図７Ｅ】
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【図８】
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【図９Ａ】
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【図９Ｂ】
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【図９Ｃ】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【配列表】
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【国際調査報告】
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