(57)【要約】試験を受けている試料中のエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）に使用することができる組成物、方法、およびキットが開示されている。ＥＢＶの核酸は、リアルタイムＰＣＲによって特異性で、非ＥＢＶ生物からの干渉なしに、分離、増幅、および検出することができる。いくつかの実施形態では、増幅に使用される核酸は、ヒト血液、または血液産物から単離される。核酸単離、増幅、および検出ステップは全て、自動装置を使用して実施することができる。一態様では、本開示は、試料中のエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）の存在または不在を決定するために有用な反応混合物に関する。【特許請求の範囲】
【請求項１】
試料中のエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）の存在または不在を決定するための反応混合物であって、前記反応混合物が、
ＥＢＶ核酸を検出するための検出プローブオリゴマーであって、
前記検出プローブオリゴマーが、最大３０個のヌクレオチドの長さであり、配列番号２２の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、検出プローブオリゴマーと、
増幅オリゴマー対であって、
前記対の第１の増幅オリゴマーが、配列番号３の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、
前記対の第２の増幅オリゴマーが、配列番号４の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、増幅オリゴマー対と、を含む、反応混合物。
【請求項２】
前記検出プローブオリゴマーが、検出可能な標識をさらに含む、請求項１に記載の反応混合物。
【請求項３】
前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、請求項２に記載の反応混合物。
【請求項４】
前記検出プローブオリゴマーが、少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項５】
前記検出プローブオリゴマーの前記少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、少なくとも１つの５−メチルシトシン塩基を含む、請求項４に記載の反応混合物。
【請求項６】
前記検出プローブオリゴマーが、２２個のヌクレオチドの長さであり、配列番号９の塩基配列を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項７】
前記第１および第２の増幅オリゴマーの各々が、最大２５個のヌクレオチドの長さである、請求項１〜６のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項８】
前記第１の増幅オリゴマーが、２０個のヌクレオチドの長さであり、前記第１の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号３の２０個の連続する塩基からなる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項９】
前記第１の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号５である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１０】
前記第２の増幅オリゴマーが、２０個のヌクレオチドの長さであり、前記第２の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号４の２０個の連続する塩基からなる、請求項１〜９のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１１】
前記第２の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号７である、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の反応混合物。
【請求項１２】
前記第１の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号５または配列番号６のいずれかであり、前記第２の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号７または配列番号８のいずれかである、請求項７に記載の反応混合物。
【請求項１３】
前記第１の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号５である、請求項１２に記載の反応混合物。
【請求項１４】
前記第２の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号７である、請求項１２に記載の反応混合物。
【請求項１５】
前記第２の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号７である、請求項１３に記載の反応混合物。
【請求項１６】
試料中のエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）の存在または不在を決定する方法であって、前記方法が、
（ａ）ＥＢＶの存在について試験される試料を、
配列番号３の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、第１の増幅オリゴマー、
配列番号４の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、第２の増幅オリゴマー、ならびに
配列番号２２の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、最大３０個のヌクレオチドの長さの検出プローブオリゴマーを含む、オリゴマーの組み合わせと接触させるステップと、
（ｂ）前記オリゴマーの組み合わせを使用してインビトロ核酸増幅反応を行うステップであって、任意のＥＢＶ標的核酸が、前記試料中に存在する場合、増幅産物を生成するためのテンプレートである、ステップと、
（ｃ）前記検出プローブオリゴマーで、前記増幅産物の存在または不在を検出し、それによって前記試料中のＥＢＶの存在または不在を決定するステップと、を含む、方法。
【請求項１７】
前記検出プローブオリゴマーが、検出可能な標識をさらに含む、請求項１６に記載の方法。
【請求項１８】
前記検出プローブオリゴマーの前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、請求項１７に記載の方法。
【請求項１９】
前記検出プローブオリゴマーが、少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項１６〜１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２０】
前記少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、少なくとも１つの５−メチルシトシン塩基を含む、請求項１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記検出プローブオリゴマーが、２２個のヌクレオチドの長さであり、配列番号９の塩基配列を含む、請求項１６〜２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記試料が、ヒト血液、ヒト血漿、またはヒト血清のいずれかから単離された核酸を含む、請求項１６〜２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２３】
前記インビトロ核酸増幅反応が、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む、請求項１６〜２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
ステップ（ｂ）および（ｃ）が、同時に行われ、前記インビトロ核酸増幅反応が、リアルタイム核酸増幅反応である、請求項１６〜２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
ステップ（ｂ）における前記インビトロ核酸増幅反応が、前記試料中に存在し得るＥＢＶの任意の核酸に加えて、前記試料中に存在し得るサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の任意の核酸を増幅および検出するマルチプレックスインビトロ核酸増幅反応である、請求項１６〜２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
ステップ（ｂ）における前記インビトロ核酸増幅反応が、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ増幅反応である、請求項１６〜２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
ステップ（ａ）の前に、核酸を単離する前記ステップがあり、前記ステップの全てが、単一の自動装置を使用して行われる、請求項１６〜２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
１つ以上のバイアルにおいて、
エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）核酸を検出するための検出プローブオリゴマーであって、
前記検出プローブオリゴマーが、最大３０個のヌクレオチドの長さであり、配列番号２２の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、検出プローブオリゴマーと、
増幅オリゴマー対であって、
前記対の第１の増幅オリゴマーが、配列番号３の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、
前記対の第２の増幅オリゴマーが、配列番号４の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、増幅オリゴマー対と、を含む、試薬のキット。
【請求項２９】
前記検出プローブオリゴマーが、検出可能な標識をさらに含む、請求項２８に記載のキット。
【請求項３０】
前記検出プローブオリゴマーの前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、請求項２９に記載のキット。
【請求項３１】
前記検出プローブオリゴマーが、少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項２８〜３０のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３２】
前記検出プローブオリゴマーの前記少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、少なくとも１つの５−メチルシトシン塩基を含む、請求項３１に記載のキット。
【請求項３３】
前記検出プローブオリゴマーが、２２個のヌクレオチドの長さであり、配列番号９の塩基配列を含む、請求項２８〜３２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３４】
前記第１および第２の増幅オリゴマーの各々が、最大２５個のヌクレオチドの長さである、請求項２８〜３３のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３５】
前記第１の増幅オリゴマーが、２０個のヌクレオチドの長さであり、前記第１の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号３の２０個の連続する塩基からなる、請求項２８〜３４のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３６】
前記第１の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号５である、請求項２８〜３５のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３７】
前記第２の増幅オリゴマーが、２０個のヌクレオチドの長さであり、前記第２の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号４の２０個の連続する塩基からなる、請求項２８〜３６のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３８】
前記第２の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号７である、請求項２８〜３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項３９】
前記第１の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号５または配列番号６のいずれかであり、前記第２の増幅オリゴマーの塩基配列が、配列番号７または配列番号８のいずれかである、請求項２８〜３５または請求項３７のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４０】
前記第１の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号５である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４１】
前記第２の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号７である、請求項３９に記載のキット。
【請求項４２】
前記第２の増幅オリゴマーの前記塩基配列が、配列番号７である、請求項４０に記載のキット。
【請求項４３】
前記第１および第２の増幅オリゴマーが、１つのバイアルに一緒に包装され、前記プローブオリゴヌクレオチドが、別個のバイアルに包装される、請求項２８〜４２のいずれか一項に記載のキット。
【請求項４４】
エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）核酸を検出するための検出プローブオリゴマーであって、前記検出プローブオリゴマーが、最大３０個のヌクレオチドの長さであり、配列番号２２の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、検出プローブオリゴマー。
【請求項４５】
検出可能な標識をさらに含む、請求項４４に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項４６】
前記検出可能な標識が、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含む、請求項４５に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項４７】
少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項４８】
前記少なくとも１つのヌクレオチド類似体が、少なくとも１つの５−メチルシトシン塩基を含む、請求項４７に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項４９】
前記検出プローブオリゴマーが、最大２６個のヌクレオチドの長さであり、配列番号１７の配列またはその補体内に完全に含有される塩基配列を含む、請求項４４〜４８のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項５０】
前記検出プローブオリゴマーが、最大２２個のヌクレオチドの長さである、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項５１】
前記検出プローブオリゴマーが、２２個のヌクレオチドの長さであり、配列番号９の塩基配列またはその補体を含む、請求項４４〜４９のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項５２】
前記検出プローブオリゴマーが、２２個のヌクレオチドの長さであり、配列番号９の塩基配列を含む、請求項５１に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項５３】
少なくとも９つのヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項５２に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項５４】
９つの５−メチルシトシンヌクレオチド類似体をさらに含む、請求項５２に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項５５】
前記検出プローブオリゴマーが、配列番号９からなる塩基配列を有する２２個のヌクレオチドの長さである、請求項４４〜４６のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項５６】
複数の５−メチルシトシンヌクレオチド類似体を含む、請求項５５に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項５７】
配列番号９の配列中の全てのシトシン塩基が、５−メチルシトシンヌクレオチド類似体である、請求項５５に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項５８】
前記検出プローブオリゴマーが、二重標識加水分解プローブである、請求項４６〜５７のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
【請求項５９】
前記プローブが、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼの存在下で相補的な核酸鎖にハイブリダイズされる、請求項４４〜５８のいずれか一項に記載の検出プローブオリゴマー。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
関連出願
本出願は、２０１８年８月１日に出願された、米国仮特許出願第６２／７１３，３３０号の利益を主張する。先行出願の開示全体は、参照により本明細書に組み込まれる。
【０００２】
本開示は、一般に、バイオテクノロジーの分野に関する。より具体的には、本開示は、エプスタインバールウイルス（ＥＢＶ）を検出するための分子診断アッセイに関する。
【背景技術】
【０００３】
エプスタイン−バールウイルス（「ＥＢＶ」）は、ヘルペスファミリーにおける８つの既知のヒトヘルペスウイルスタイプのうちの１つであり、ヒトにおける最も一般的なウイルスのうちの１つである。ヒトヘルペスウイルス４としても知られるこのウイルスは、世界中で見られる。ほとんどの人は、人生のある時点でＥＢＶに感染している。ウイルスは、最も一般的には体液（例えば、唾液）を通して広がり、伝染性単核症の原因である。加えて、ＥＢＶは、バーキットリンパ腫、ホジキンリンパ腫、胃癌、鼻咽頭癌、多発性硬化症、リンパ腫様肉芽腫症などを含む、いくつかの他の疾患に関与している。
【０００４】
ＥＢＶ感染症の症状は、感染個体の年齢によって異なる。小児期の感染症は、症状を引き起こさないか、または他の軽度の短い小児期の病気と区別可能ではない症状を引き起こす場合がある。ティーンエイジャーおよび成人における症状は、通常、２〜４週間で回復するが、より顕著であり、倦怠感、発熱、喉の炎症、首のリンパ節の腫大、脾腫、および発疹を含み得る。ウイルスは、Ｂ細胞において潜伏（不活性）のままであり得るが、再活性化されて感染状態をもたらし得る。ＥＢＶ感染症の症状は、他の病気と同様であり得るため、血液を抗ＥＢＶ抗体について検査することは、改善された診断試験に使用されている。
【０００５】
ＥＢＶは、Ｂ細胞および上皮細胞の両方に感染し得る。ウイルスは、８５個の遺伝子に組織化される約１７２ｋｂの二本鎖ＤＮＡゲノムを有する。ＥＢＶビリオンのＤＮＡゲノムは、タンパク質ヌクレオカプシドによって囲まれ、これは次にタンパク質でできたテグメントによって囲まれ、次に脂質および表面糖タンパク質（エンベロープタンパク質）を含有する脂質エンベロープによって囲まれている。ウイルスの溶解複製（産生性感染）は、ゲノムの線形化を必要とし、これは次いでウイルスでコードされたＤＮＡポリメラーゼによって複製される。潜伏中、ＥＢＶゲノムが環状立体構造を有する場合、宿主細胞のＤＮＡポリメラーゼは、複製に関与している。
【０００６】
症状の範囲、および症状が人生の異なる段階で異なり得るという事実を考えると、ＥＢＶ感染を特定するための単純化された正確なアプローチの必要性がある。残念ながら、ＥＢＶは、核酸配列レベルで密接に関連しているいくつかのウイルスの中の１つである。したがって、課題は、任意の他のヘルペスウイルス標的核酸を検出することなく、またヒト核酸を検出することなく、特異的な感度の高い方法でＥＢＶを検出することができることである。本開示は、この点に対処する。
【発明の概要】
【課題を解決するための手段】
【０００７】
一態様では、本開示は、試料中のエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）の存在または不在を決定するために有用な反応混合物に関する。一般的に言えば、反応混合物は、ＥＢＶ核酸を検出するための検出プローブオリゴマーを含み、検出プローブオリゴマーは、最大３０個のヌクレオチドの長さであり、配列番号２２の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする。反応混合物には、増幅オリゴマー対も含まれ、対の第１の増幅オリゴマーは、配列番号３の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にし、対の第２の増幅オリゴマーは、配列番号４の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、検出可能な標識をさらに含む。検出可能な標識は、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む。検出プローブオリゴマーの少なくとも１つのヌクレオチド類似体は、少なくとも１つの５−メチルシトシン塩基を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、２２個のヌクレオチドの長さであり、配列番号９の塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の増幅オリゴマーの各々は、最大２５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、２０個のヌクレオチドの長さであり、第１の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号３の２０個の連続する塩基からなる。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号５である。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、２０個のヌクレオチドの長さであり、第２の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号４の２０個の連続する塩基からなる。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号７である。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号５または配列番号６のいずれかであり、第２の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号７または配列番号８のいずれかである。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号５である。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号７である。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号７である。
【０００８】
別の態様では、本開示は、試料中のエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）の存在または不在を決定する方法に関する。方法は、（ａ）ＥＢＶの存在について試験される試料を、配列番号３の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、第１の増幅オリゴマーと、配列番号４の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、第２の増幅オリゴマーと、配列番号２２の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、最大３０個のヌクレオチドの長さの検出プローブオリゴマーと、を含む、オリゴマーの組み合わせと接触させるステップを含む。（ｂ）オリゴマーの組み合わせを使用してインビトロ核酸増幅反応を行うステップもあり、任意のＥＢＶ標的核酸は、試料中に存在する場合、増幅産物を生成するためのテンプレートである。（ｃ）検出プローブオリゴマーで、増幅産物の存在または不在を検出し、それによって試料中のＥＢＶの存在または不在を決定するステップもある。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、検出可能な標識をさらに含む。検出プローブオリゴマーの検出可能な標識は、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む。少なくとも１つのヌクレオチド類似体は、少なくとも１つの５−メチルシトシン塩基を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、２２個のヌクレオチドの長さであり、配列番号９の塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、試料は、ヒト血液、ヒト血漿、またはヒト血清のいずれかから単離された核酸を含む。いくつかの実施形態では、インビトロ核酸増幅反応は、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼを含む。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）および（ｃ）は、同時に行われ、インビトロ核酸増幅反応は、リアルタイム核酸増幅反応である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）におけるインビトロ核酸増幅反応は、試料中に存在し得るＥＢＶの任意の核酸に加えて、試料中に存在し得るサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の任意の核酸を増幅および検出するマルチプレックスインビトロ核酸増幅反応である。いくつかの実施形態では、ステップ（ｂ）におけるインビトロ核酸増幅反応は、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するＤＮＡポリメラーゼを含むＰＣＲ増幅反応である。いくつかの実施形態では、ステップ（ａ）の前に、核酸を単離するステップがあり、ステップの全ては、単一の自動装置を使用して行われる。
【０００９】
別の態様では、本開示は、試薬のキットに関する。キットは、１つ以上のバイアルにおいて、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）核酸を検出するための検出プローブオリゴマーであって、検出プローブオリゴマーが、最大３０個のヌクレオチドの長さであり、配列番号２２の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする、検出プローブオリゴマーと、増幅オリゴマーの対と、を含む。対の第１の増幅オリゴマーは、配列番号３の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする。対の第２の増幅オリゴマーは、配列番号４の１８〜２５個の連続する塩基を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、検出可能な標識をさらに含む。検出プローブオリゴマーの検出可能な標識は、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む。検出プローブオリゴマーの少なくとも１つのヌクレオチド類似体は、少なくとも１つの５−メチルシトシン塩基を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、２２個のヌクレオチドの長さであり、配列番号９の塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、第１および第２の増幅オリゴマーの各々は、最大２５個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーは、２０個のヌクレオチドの長さであり、第１の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号３の２０個の連続する塩基からなる。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号５である。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーは、２０個のヌクレオチドの長さであり、第２の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号４の２０個の連続する塩基からなる。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号７である。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号５または配列番号６のいずれかであり、第２の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号７または配列番号８のいずれかである。いくつかの実施形態では、第１の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号５である。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号７である。いくつかの実施形態では、第２の増幅オリゴマーの塩基配列は、配列番号７である。いくつかの実施形態では、第１および第２の増幅オリゴマーは、１つのバイアルに一緒に包装され、プローブオリゴヌクレオチドは、別個のバイアルに包装される。
【００１０】
別の態様では、本開示は、エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）核酸を検出するための検出プローブオリゴマーに関する。検出プローブオリゴマーは、最大３０個のヌクレオチドの長さであり、配列番号２２の塩基配列またはその補体を含み、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にする。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、検出可能な標識をさらに含む。検出可能な標識は、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分を含む相互作用標識対を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、少なくとも１つのヌクレオチド類似体をさらに含む。少なくとも１つのヌクレオチド類似体は、少なくとも１つの５−メチルシトシン塩基を含むことができる。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、最大２６個のヌクレオチドの長さであり、配列番号１７の配列またはその補体内に完全に含有される塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、最大２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、２２個のヌクレオチドの長さであり、配列番号９の塩基配列またはその補体を含む。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、２２個のヌクレオチドの長さであり、配列番号９の塩基配列を含む。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、少なくとも９つのヌクレオチド類似体をさらに含む。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、９つの５−メチルシトシンヌクレオチド類似体をさらに含む。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、配列番号９からなる塩基配列を有する２２個のヌクレオチドの長さである。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、複数の５−メチルシトシンヌクレオチド類似体を含む。いくつかの実施形態では、配列番号９の配列中の全てのシトシン塩基は、５−メチルシトシンヌクレオチド類似体である。いくつかの実施形態では、検出プローブオリゴマーは、二重標識加水分解プローブである。いくつかの実施形態では、プローブは、５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を含むＤＮＡポリメラーゼの存在下で相補的な核酸鎖にハイブリダイズされる。
【発明を実施するための形態】
【００１１】
定義
他に定義されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語および科学用語は、記載される方法および組成物に関連する当業者によって一般に理解されるのと同じ意味を有する。一般的な定義は、分子生物学の分野に関連する技術書において見られ得る（例えば、Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ  ａｎｄ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，２ｎｄ  ｅｄ．，Ｓｉｎｇｌｅｔｏｎ  ｅｔ  ａｌ．，１９９４，Ｊｏｈｎ  Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ、またはＴｈｅ  Ｈａｒｐｅｒ  Ｃｏｌｌｉｎｓ  Ｄｉｃｔｉｏｎａｒｙ  ｏｆ  Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈａｌｅ＆Ｍａｒｈａｍ，１９９１，Ｈａｒｐｅｒ  Ｐｅｒｅｎｎｉａｌ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，ＮＹ）。本明細書で使用される場合、以下の用語および語句は、特に明記しない限り、それらに帰する意味を有する。
【００１２】
「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」という用語は、文脈上明確に別段の指示がない限り、複数の指示対象を含む。例えば、本明細書で使用される場合、「核酸」は、１つ以上の核酸を表すと理解される。そのようなものとして、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つ以上の」、および「少なくとも１つの」という用語は、本明細書において互換的に使用することができる。
【００１３】
本開示で論じられる温度、濃度、および時間の前に暗黙の「約」があり、わずかな非実質的な逸脱が、本教示の範囲内であることが理解されるであろう。一般に、「約」という用語は、組成物の活性または安定性に任意の有意な効果を有さない組成物の成分の量における非実質的な変動を示す。全ての範囲は、「端点を含まない」などの明示的な除外がない場合に端点を包含すると解釈されるべきであり、よって、例えば、「１０〜１５以内」には、１０および１５の値が含まれる。また、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含むこと（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」、「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」、「含有すること（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、および「含むこと（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」の使用は、限定的であることを意図しない。前述の概要および詳細な説明の両方は、例示的かつ説明的なものにすぎず、教示を限定するものではないことを理解されたい。参照によって組み込まれる任意の資料が本開示の明示的内容と矛盾する限りにおいて、明示的内容が優先する。
【００１４】
特に記述のない限り、様々な成分「を含む」と列挙する本明細書の実施形態は、列挙された成分「からなる」または「から本質的になる」としても企図され、様々な成分「からなる」と列挙する本明細書の実施形態は、列挙された成分「を含む」または「から本質的になる」としても企図され、様々な成分「から本質的になる」と列挙する本明細書の実施形態は、列挙された成分「からなる」または「を含む」としても企図される（この互換性は、特許請求の範囲におけるこれらの用語の使用には当てはまらない）。「〜から本質的になる」とは、本明細書に記載される組成物および方法の基本的および新規特徴を実質的に変化させない追加の成分（複数可）、組成物（複数可）、または方法ステップ（複数可）が、それらの組成物または方法に含まれ得ることを意味する。そのような特徴は、試料中に存在するエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）核酸配列を、ＥＢＶ核酸を他の既知の病原体（例えば、ＣＭＶ）と区別する特異性で、任意に、約５０コピー／ｍｌの濃度で試料中に存在するウイルスを検出することができる感度で、任意に、サイクル増幅反応が使用される場合には増幅反応の開始から約６０分以内および／または約４０サイクル以内で検出する能力を含む。
【００１５】
「試料」は、ＥＢＶまたはその成分、例えば、核酸または核酸の断片を含有し得る任意の検体を含む。試料は、例えば、末梢血、血漿、血清、リンパ節、膣スワブ試料、頸部ブラシ試料、呼吸器組織もしくは滲出液、例えば、気管支鏡検査、気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）、もしくは肺生検、喀痰、唾液、胃腸組織、糞便、尿、精液、または他の体液もしくは材料を含む、ＥＢＶまたはそれに由来する標的核酸を含有し得る、生きたまたは死んだヒトに由来する任意の組織または材料を含む「生物学的試料」を含む。生物学的試料は、組織または細胞構造を物理的または機械的に破壊し、よって、標準的な方法を使用して分析用の生物学的試料を調製するために使用される、酵素、緩衝液、塩、洗剤などをさらに含有し得る溶液中に細胞内成分を放出するように処理され得る。また、試料は、試料を濾過デバイスの上もしくは中に通すことから、または遠心分離後に、または媒体、マトリックス、もしくは支持体への付着によって得られるものなどの処理された試料を含み得る。
【００１６】
「核酸」および「ポリヌクレオチド」とは、従来のＲＮＡ、ＤＮＡ、混合ＲＮＡ−ＤＮＡ、およびそれらの類似体であるポリマーを含む、ポリヌクレオチドを形成するために一緒に結合した窒素含有複素環式塩基または塩基類似体を有するヌクレオシドまたはヌクレオシド類似体を含む多量体化合物を指す。核酸「バックボーン」は、糖−ホスホジエステル結合、ペプチド−核酸結合（「ペプチド核酸」またはＰＮＡ、ＰＣＴ公開第ＷＯ９５／３２３０５号）、ホスホロチオエート結合、メチルホスホネート結合、またはそれらの組み合わせのうちの１つ以上を含む、様々な結合から構成され得る。核酸の糖部分は、リボース、デオキシリボース、または置換（例えば、２’メトキシもしくは２’ハロゲン化物置換）を有する類似の化合物であり得る。窒素含有塩基は、従来の塩基（Ａ、Ｇ、Ｃ、Ｔ、Ｕ）、それらの類似体（例えば、イノシンまたは他のもの、Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ  ５−３６，Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，ｅｄ．，１１ｔｈｅｄ．，１９９２を参照されたい）、プリンまたはピリミジンの誘導体（例えば、Ｎ４−メチルデオキシグアノシン、デアザ−またはアザ−プリン、デアザ−またはアザ−ピリミジン、５位または６位に置換基を有するピリミジン塩基、２位、６位、または８位に置換基を有するプリン塩基、２−アミノ−６−メチルアミノプリン、Ｏ６−メチルグアニン、４−チオ−ピリミジン、４−アミノ−ピリミジン、４−ジメチルヒドラジン−ピリミジン、およびＯ４−アルキル−ピリミジン、米国特許第５，３７８，８２５号およびＰＣＴ公開第ＷＯ９３／１３１２１号）であり得る。核酸は、バックボーンがポリマーの位置（複数可）に窒素含有塩基を含まない、１つ以上の「非塩基性」残基を含み得る（米国特許第５，５８５，４８１号）。核酸は、従来のＲＮＡもしくはＤＮＡ糖、塩基、および結合のみを含み得るか、または従来の成分および置換の両方（例えば、２’メトキシ結合を有する従来の塩基、もしくは従来の塩基および１つ以上の塩基類似体の両方を含有するポリマー）を含み得る。核酸は、「ロックド核酸」（ＬＮＡ）、糖立体構造を模倣するＲＮＡ中にロックされた二環式フラノース単位を有する１つ以上のＬＮＡヌクレオチドモノマーを含有する類似体を含み、これは相補的ＲＮＡおよびＤＮＡ配列に対するハイブリダイゼーション親和性を増強する（Ｖｅｓｔｅｒ  ａｎｄ  Ｗｅｎｇｅｌ，２００４，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ４３（４２）：１３２３３−４１）。ハイブリダイゼーション複合体の安定性に影響を及ぼし得るオリゴマーの実施形態は、ＰＮＡオリゴマー、２’−メトキシもしくは２’−フルオロ置換ＲＮＡを含むオリゴマー、または荷電結合（例えば、ホスホロチオエート）もしくは中性基（例えば、メチルホスホネート）を含有するオリゴマーを含む、ハイブリダイゼーション複合体の全電荷、電荷密度、もしくは立体会合に影響を及ぼすオリゴマーを含む。別に示さない限り、５−メチルシトシンは、ＲＮＡまたはＤＮＡバックボーン（またはそれらの混合物）を含む前述のバックボーン／糖／結合のいずれかと共に使用され得る。オリゴヌクレオチド、アンプリコン、または他の核酸の長さ��ついての範囲に言及する場合、その範囲は全ての整数を含む（例えば、１９〜２５個の連続するヌクレオチドの長さは、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、および２５個を含む）ことが理解される。
【００１７】
本明細書で使用される場合、「ヌクレオチド」は、リン酸基、５炭素糖、および窒素含有塩基（本明細書では「核酸塩基」とも呼ばれる）からなる核酸のサブユニットである。ＲＮＡに見られる５炭素糖は、リボースである。ＤＮＡでは、５炭素糖は、２’−デオキシリボースである。用語はまた、リボースの２’位にあるメトキシ基（本明細書では「２’−Ｏ−Ｍｅ」または「２’−メトキシ」とも呼ばれる）などのそのようなサブユニットの類似体も含む。
【００１８】
「ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物」とは、本質的に同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するＲＮＡおよびＤＮＡ分子を意味する。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物は、異なる糖部分（すなわち、リボース対デオキシリボース）を有し、ＲＮＡ中のウラシルおよびＤＮＡ中のチミンの存在によって異なり得る。等価物は、特定の配列に対して同程度の相補性を有するので、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物間の差は、相同性の差には寄与しない。「ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ」とは、ＤＮＡおよびＲＮＡヌクレオチドの両方を含む核酸を意味する。文脈に明確に別段の指示がない限り、ＥＢＶ核酸への言及には、ＥＢＶ  ＲＮＡおよびＤＮＡ等価物、ならびにそれらのＤＮＡ／ＲＮＡキメラが含まれる。
【００１９】
「ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基」とは、ＲＮＡおよびＤＮＡにおいて同じ相補的塩基対ハイブリダイゼーション特性を有するヌクレオチド塩基を意味する。ここでは、塩基チミンの代わりに塩基ウラシルを使用することができ、またはその逆も可能であり、したがって、ウラシルおよびチミンは、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基である。ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基の置換を可能にするポリヌクレオチド塩基配列５’−ＡＧＣＴ−３’は、配列５’−ＡＧＣＵ−３’も説明するであろう。等価物は、特定の配列に対して同程度の相補性を有するので、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基間の差は、相同性の差には寄与しない。
【００２０】
「補体」という用語は、別の核酸分子の連続する核酸配列と相補的である連続する核酸配列（標準的なヌクレオチドについてＡ：Ｔ、Ａ：Ｕ、Ｃ：Ｇ）を含む核酸分子を指す。例えば、５’−ＡＡＣＴＧＵＣ−３’は、５’−ＧＡＣＡＧＴＴ−３’の補体である。２つの核酸配列は、それらのそれぞれの連続する核酸配列が少なくとも７０％相補的である場合、「十分に相補的」である。
【００２１】
本明細書で使用される場合、「標的核酸」は、増幅される標的配列を含む核酸である。標的核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡであってもよく、一本鎖または二本鎖のいずれかであってもよい。標的核酸は、増幅されない場合がある、標的配列以外の他の配列を含んでもよい。
【００２２】
本明細書で使用される場合、「標的配列」という用語は、増幅および／または検出される標的核酸の特定のヌクレオチド配列を指す。「標的配列」は、増幅プロセス（例えば、ＰＣＲ、ＴＭＡ）中にオリゴヌクレオチド（例えば、プライミングオリゴヌクレオチドおよび／またはプロモーターオリゴヌクレオチド）が複合体化する複合体化配列を含む。標的核酸がもともと一本鎖である場合、「標的配列」という用語はまた、標的核酸中に存在するような「標的配列」に相補的な配列を指すであろう。標的核酸がもともと二本鎖である場合、「標的配列」という用語は、センス（＋）鎖およびアンチセンス（−）鎖の両方を指す。
【００２３】
「標的ハイブリダイズ配列」は、標的核酸配列とハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの部分を指すために本明細書において使用される。好ましくは、標的ハイブリダイズ配列は、標的核酸配列と特異的にハイブリダイズするように構成される。標的ハイブリダイズ配列は、それらがハイブリダイズするように構成される標的配列の部分に１００％相補的であってもよいが、必ずしもそうでなくてもよい。標的ハイブリダイズ配列はまた、標的配列に対して挿入、欠失、および／または置換されたヌクレオチド残基を含んでもよい。標的配列に対する標的ハイブリダイズ配列の１００％未満の相補性は、例えば、ＥＢＶのバリアントにハイブリダイズするように構成されたオリゴマーの場合のように、標的核酸が種内の複数の株である場合に生じ得る。標的核酸に対して１００％未満の相補性を有するように標的ハイブリダイズ配列を構成する他の理由が存在することが理解される。
【００２４】
ＥＢＶ核酸の領域に関して本明細書で使用される「配列を標的とする」という用語は、オリゴヌクレオチドが本明細書に記載される増幅および検出を可能にする様式で標的配列にハイブリダイズするプロセスを指す。１つの好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、標的ＥＢＶ核酸配列と相補的であり、ミスマッチを含有しない。別の好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、相補的であるが、標的ＥＢＶ核酸配列との１、２、３、４、または５つのミスマッチを含有する。好ましくは、オリゴマーは、標的配列に特異的にハイブリダイズする。
【００２５】
「〜するように構成される」という用語は、参照されたオリゴヌクレオチド標的ハイブリダイズ配列のポリヌクレオチド配列構成の実際の配置を示す。例えば、標的配列から指定されたアンプリコンを生成するように構成される増幅オリゴマーは、標的配列にハイブリダイズし、アンプリコンを生成するために増幅反応に使用され得るポリヌクレオチド配列を有する。また、一例として、標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成されるオリゴヌクレオチドは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で参照された配列に特異的にハイブリダイズするポリヌクレオチド配列を有する。
【００２６】
本明細書で使用される場合、「〜に特異的にハイブリダイズするように構成される」という用語は、増幅オリゴヌクレオチド、検出プローブ、または他のオリゴヌクレオチドの標的ハイブリダイズ領域が、参照されたＥＢＶ標的領域の配列を標的とし得るポリヌクレオチド配列を有するように設計されることを意味する。そのようなオリゴヌクレオチドは、その配列のみを標的とすることに限定されないが、むしろ組成物として、キットにおいて、またはＥＢＶ標的核酸を標的とするための方法において有用である。オリゴヌクレオチドは、試料からのＥＢＶの増幅および検出のためのアッセイの成分として機能するように設計され、したがって試験試料中に一般的に見られる他の核酸の存在下でＥＢＶを標的とするように設計される。「〜に特異的にハイブリダイズする」とは、当該技術分野において理解されるように、非標的核酸へのいくらかの小さいレベルのハイブリダイゼーションが起こり得るため、排他的にハイブリダイズすることを意味しない。むしろ、「〜に特異的にハイブリダイズする」とは、試料中の標的核酸の正確な検出が決定され得るように、オリゴヌクレオチドが標的を主にハイブリダイズするようにアッセイにおいて機能するように構成されることを意味する。
【００２７】
本明細書で使用される場合、「領域」という用語は、核酸の一部分を指し、当該部分は、全核酸よりも小さい。例えば、参照における核酸がオリゴヌクレオチドプロモータープライマーである場合、「領域」という用語は、より小さいプロモーター部分を指すために使用され得る。同様に、かつまた単なる例として、核酸がＥＢＶ標的核酸である場合、「領域」という用語は、核酸のより小さい領域を指すために使用され得、より小さい領域は、本開示の１つ以上のオリゴヌクレオチドによって標的化される。別の非限定的な例として、参照における核酸がアンプリコンである場合、領域という用語は、プローブの標的ハイブリダイズ配列によるハイブリダイゼーションについて特定されたより小さいヌクレオチド配列を指すために使用され得る。
「オリゴマー」、「オリゴヌクレオチド」、または「オリゴ」は、一般に、１，０００個のヌクレオチド（ｎｔ）未満の核酸を指し、約２〜５個のヌクレオチドの下限および約５００〜９００個のヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲のものを含む。いくつかの特定の実施形態は、約５〜１５、１６、１７、１８、１９、もしくは２０個のヌクレオチドの下限および約５０〜６００個のヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲のオリゴマーであり、他の特定の実施形態は、約１０〜２０個のヌクレオチドの下限および約２２〜１００個のヌクレオチドの上限を有するサイズ範囲である。オリゴマーは、天然に存在する供給源から精製されてもよいが、任意の周知の酵素的または化学的方法を使用することによって合成されてもよい。オリゴヌクレオチドという用語は、試薬の任意の特定の機能を示さず、むしろ、本明細書に記載される全てのそのような試薬を網羅するために一般的に使用される。オリゴヌクレオチドは、様々な異なる機能を果たし得る。例えば、それは、相補鎖に特異的であり、これにハイブリダイズすることができ、核酸ポリメラーゼの存在下でさらに伸長され得る場合、プライマーとして機能し得、ＲＮＡポリメラーゼによって認識される配列を含有し、転写を可能にする場合、プライマーとして機能し、プロモーターを提供し得（例えば、Ｔ７プライマー）、標的核酸、またはそのアンプリコンにハイブリダイズすることができ、検出可能な部分（例えば、アクリジニウム−エステル化合物）をさらに提供する場合、標的核酸を検出するように機能し得る。オリゴマーは、機能名（例えば、捕捉プローブ、プライマー、またはプロモータープライマー）によって呼ばれ得るが、当業者は、そのような用語がオリゴマーを指すことを理解するであろう。
【００２８】
本明細書で使用される場合、指定された参照核酸配列に「実質的に対応する」オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドが参照核酸配列と十分に類似し、オリゴヌクレオチドが、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で同じ標的核酸配列とハイブリダイズするという点で、参照核酸配列と類似のハイブリダイゼーション特性を有することを意味する。当業者は、「実質的に対応するオリゴヌクレオチド」が、参照配列とは異なり、依然として同じ標的核酸配列にハイブリダイズし得ることを理解するであろう。また、第２の核酸に対応する第１の核酸は、文脈上別段に明確な指示がない限り、そのＲＮＡまたはＤＮＡ等価物およびそのＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含み、その補体を含むことが理解される。核酸からのこの変形は、配列内の同一の塩基のパーセンテージ、またはプローブもしくはプライマーとその標的配列との間の完全に相補的な塩基のパーセンテージに関して記述され得、よって、特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、塩基同一性または相補性のこれらのパーセンテージが１００％〜約８０％、好ましくは１００％〜約８５％、またはより好ましくは１００％〜約９０％もしくは１００％〜約９５％である場合、参照核酸配列に「実質的に対応する」。核酸からのこの変形はまた、参照配列と比較した核酸配列における核酸塩基置換の数、または標的配列と比較した配列内のミスマッチの数に関して記述され得、よって、特定の実施形態では、オリゴヌクレオチドは、この核酸塩基置換またはミスマッチの数が最大４つ、好ましくは最大３つ、またはより好ましくは最大２つもしくは最大１つ（すなわち、端点を含む、０〜４つ、好ましくは０〜３つ、またはより好ましくは０〜２もしくは０〜１つ）の置換もしくはミスマッチである場合、参照核酸配列に「実質的に対応する」。同様に、核酸または増幅された核酸の領域は、参照核酸配列に対応するものとして本明細書において参照することができる。当業者は、許容されないレベルの非特異的ハイブリダイゼーションを引き起こすことなく、特異的標的配列へのハイブリダイゼーションを可能にするために、様々なパーセンテージの相補性で必要とされ得るハイブリダイゼーション条件への様々な修正を理解するであろう。
【００２９】
本明細書で使用される場合、ＤＮＡ配列に関連する「またはその補体、またはＲＮＡ等価物、またはそのＤＮＡ／ＲＮＡキメラ」という語句は、（参照されたＤＮＡ配列に加えて）ＤＮＡ配列の補体、参照されたＤＮＡ配列のＲＮＡ等価物、参照されたＤＮＡ配列の補体のＲＮＡ等価物、参照されたＤＮＡ配列のＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、および参照されたＤＮＡ配列の補体のＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む。同様に、ＲＮＡ配列に関連する「またはその補体、またはＤＮＡ等価物、またはそのＤＮＡ／ＲＮＡキメラ」という語句は、（参照されたＲＮＡ配列に加えて）ＲＮＡ配列の補体、参照されたＲＮＡ配列のＤＮＡ等価物、参照されたＲＮＡ配列の補体のＤＮＡ等価物、参照されたＲＮＡ配列のＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、および参照されたＲＮＡ配列の補体のＤＮＡ／ＲＮＡキメラを含む。
【００３０】
「増幅オリゴヌクレオチド」または「増幅オリゴマー」とは、標的核酸、またはその補体にハイブリダイズし、核酸増幅反応に関与する（例えば、プライマーまたはプロモーター−プライマーとして機能する）オリゴヌクレオチドである。特定の増幅オリゴマーは、標的核酸配列またはその相補鎖の領域に相補的である、少なくとも約１０個の連続する塩基、および任意に少なくとも１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、または２３個の連続する塩基を含有する。連続する塩基は、増幅オリゴマーが結合する標的配列に対して少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または完全に相補的であり得る。当業者は、列挙された範囲が、その範囲内の全ての整数および有理数（例えば、９２％または９８．３７７％）を含むことを理解するであろう。特定の増幅オリゴマーは、約１０〜約６０塩基長、またはより好ましくは約１８〜約２６塩基長であり、任意に修飾されたヌクレオチドを含み得る。
【００３１】
「プライマー」とは、テンプレート核酸にハイブリダイズし、ポリメラーゼ酵素によって伸長される３’末端を有するオリゴマーである。プライマーは、例えば、標的配列に対して非相補的である５’領域を含めることによって、任意に修飾され得る。そのような修飾は、タグ、プロモーター、またはプライマーもしくは標的オリゴヌクレオチドを操作もしくは増幅するために使用されるか、もしくは有用な、他の非標的特異的配列などの、機能的付加を含むことができる。
【００３２】
転写媒介増幅の文脈内では、５’プロモーター配列で修飾されたプライマーは、本明細書において「プロモーター−プライマー」と呼ばれる。分子生物学または生化学の分野における当業者は、プライマーとして機能することができるオリゴマーが、５’プロモーター配列を含むように修飾され、プロモーター−プライマーとして機能することができ、同様に、任意のプロモーター−プライマーが、その５’プロモーター配列の有無にかかわらずプライマーとして機能することができることを理解するであろう。３’遮断末端を組み込むように修飾されたプロモーター−プライマーは、本明細書において「プロモータープロバイダー」と呼ばれ、これは、標的核酸にハイブリダイズし、転写を開始するように作用する上流プロモーター配列を提供することができるが、オリゴ伸長のためのプライマーは提供しない。
【００３３】
本明細書で使用される場合、「非標的特異的配列」または「非標的ハイブリダイズ配列」は、オリゴマー配列の一領域を指し、当該領域は、標準的なハイブリダイゼーション条件下で標的配列と安定にハイブリダイズしない。非標的特異的配列を有するオリゴマーとしては、プロモータープライマーおよび分子ビーコンが挙げられるが、これらに限定されない。
【００３４】
「核酸増幅」とは、標的核酸配列、もしくはその相補配列、またはそれらの断片の複数のコピー（すなわち、完全標的核酸よりも少なく含有する増幅配列）を生成する任意のインビトロ手順を指す。核酸増幅手順の例には、転写関連方法、例えば、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、および他のもの（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号、同第５，５５４，５１６号、同第５，４３７，９９０号、同第５，１３０，２３８号、同第４，８６８，１０５号、および同第５，１２４，２４６号）、レプリカーゼ媒介増幅（例えば、米国特許第４，７８６，６００号）、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）（例えば、米国特許第４，６８３，１９５号、同第４，６８３，２０２号、および同第４，８００，１５９号）、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）（例えば、欧州特許第０３２０３０８号）、ヘリカーゼ依存性増幅（例えば、米国特許第７，２８２，３２８号）、ならびに鎖置換増幅（ＳＤＡ）（例えば、米国特許第５，４２２，２５２号）が含まれる。増幅は、線形または指数関数的であり得る。ＰＣＲ増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、プライマー、および熱サイクリングステップを使用して、ＤＮＡまたはｃＤＮＡの２つの相補鎖の複数のコピーを合成する。ＬＣＲ増幅は、少なくとも４つの別々のオリゴヌクレオチドを使用して、ハイブリダイゼーション、ライゲーション、および変性の複数サイクルを使用することによって標的およびその相補鎖を増幅する。ヘリカーゼ依存性増幅は、ヘリカーゼを使用して、ＤＮＡ二本鎖の２つの鎖を分離して一本鎖テンプレートを生成し、続いてテンプレートにハイブリダイズする配列特異的プライマーのハイブリダイゼーションおよびＤＮＡポリメラーゼによる伸長を行い、標的配列を増幅する。ＳＤＡは、標的配列を含む半修飾ＤＮＡ二本鎖の１つの鎖にニックを入れる制限エンドヌクレアーゼの認識部位を含有するプライマーを使用し、続いて、一連のプライマー伸長および鎖置換ステップにおける増幅を行う。レプリカーゼ媒介増幅は、自己複製ＲＮＡ分子、およびＱＢレプリカーゼなどのレプリカーゼを使用する。特定の実施形態はＰＣＲまたはＴＭＡを使用するが、本明細書に開示されるオリゴマーが他の増幅方法におけるプライマーとして容易に使用され得ることは当業者には明らかであろう。
【００３５】
転写関連増幅は、ＤＮＡポリメラーゼ、ＲＮＡポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、リボヌクレオシド三リン酸、プロモーター含有オリゴヌクレオチドを使用し、任意に他のオリゴヌクレオチドを含んで、最終的に核酸テンプレートから複数のＲＮＡ転写物を産生し得る（例えば、Ｋａｃｉａｎ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号、Ｂｕｒｇ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，４３７，９９０号、ＰＣＴ公開第ＷＯ８８／０１３０２号および同第ＷＯ８８／１０３１５号（Ｇｉｎｇｅｒａｓ  ｅｔ  ａｌ．）、Ｍａｌｅｋ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第５，１３０，２３８号、Ｕｒｄｅａ  ｅｔ  ａｌ．の米国特許第４，８６８，１０５号および同第５，１２４，２４６号、ＰＣＴ公開第ＷＯ９４／０３４７２号（ＭｃＤｏｎｏｕｇｈ  ｅｔ  ａｌ．）、ならびにＰＣＴ公開第ＷＯ９５／０３４３０号（Ｒｙｄｅｒ  ｅｔ  ａｌ．）において詳細に記載される）。ＴＭＡを使用する方法は、以前に詳細に記載されている（例えば、米国特許第５，３９９，４９１号および同第５，５５４，５１６号）。
【００３６】
リアルタイムでアンプリコンを検出するサイクリック増幅法において、「閾値サイクル」（Ｃｔ）という用語は、標的の増幅に関連するシグナルの出現時間の尺度であり、一般に、正規化レポーターシグナルの標準偏差の１０倍である。増幅が「閾値サイクル」に達すると、一般に、プローブが結合する配列の陽性増幅産物があると考えられる。次いで、増幅産物の同一性を、ゲル電気泳動、核酸配列決定、および他のそのような分析手順などの当業者に既知の方法によって決定することができる。
【００３７】
「アンプリコン」または「増幅産物」とは、核酸増幅反応において生成される核酸分子を意味し、これは標的核酸に由来する。アンプリコンまたは増幅産物は、標的核酸と同じまたは反対方向であり得る標的核酸配列を含有する。
【００３８】
本明細書で使用される場合、「相対蛍光単位」（「ＲＦＵ」）という用語は、蛍光強度の測定単位である。ＲＦＵは、測定に使用される検出手段の特徴で異なり、試料と対照との間の相対強度を比較するための測定として使用することができる。
【００３９】
「検出プローブオリゴマー」、「検出プローブ」、または「プローブ」とは、標的核酸の検出のために、核酸ハイブリダイゼーションを促進する条件下で、増幅配列を含む標的配列に特異的にハイブリダイズするオリゴマーを指す。検出は、直接的（すなわち、標的に直接ハイブリダイズするプローブ）または間接的（すなわち、プローブを標的に結合する中間構造体にハイブリダイズするプローブ）のいずれかであり得る。検出プローブは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、それらの類似体、またはそれらの組み合わせ（例えば、ＤＮＡ／ＲＮＡキメラ）であってもよく、それらは、標識または非標識であってもよい。検出プローブは、代替バックボーン結合（例えば、２’−Ｏ−メチル結合）をさらに含み得る。プローブの標的配列は、一般に、プローブが特異的にハイブリダイズするより大きい配列内の特異的な配列を指す。検出プローブは、標的特異的配列（複数可）および非標的特異的配列（複数可）を含み得る。そのような非標的特異的配列は、検出および／または増幅を容易にするために使用することができる、ヘアピン構造などの所望の二次または三次構造を付与するであろう配列を含むことができる（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第６，８３５，５４２号、および同第６，８４９，４１２号を参照されたい）。定義された配列のプローブは、例えば、化学合成によって、および組換え核酸分子からのインビトロまたはインビボ発現によって、当業者に既知の技法によって産生され得る。
【００４０】
「ハイブリダイゼーション」または「ハイブリダイズする」とは、２つの完全または部分的に相補的な核酸鎖が、平行または逆平行方向で、指定されたハイブリダイゼーションアッセイ条件下で一緒になって、二本鎖領域を有する安定な構造を形成する能力を意味する。ハイブリッドと呼ばれることもある、この二本鎖構造の２つの構成鎖は、水素結合によって結合される。これらの水素結合は、最も一般的には、単一核酸鎖上の塩基アデニンおよびチミンもしくはウラシル（ＡおよびＴもしくはＵ）またはシトシンおよびグアニン（ＣおよびＧ）を含有するヌクレオチド間に形成されるが、塩基対合は、これらの「カノニカル」対のメンバーではない塩基間に形成することもできる。非カノニカル塩基対合は、当該技術分野で周知である。例えば、Ｒ．Ｌ．Ｐ．Ａｄａｍｓ  ｅｔ  ａｌ．，Ｔｈｅ  Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ  ｏｆ  ｔｈｅ  Ｎｕｃｌｅｉｃ  Ａｃｉｄｓ（１１ｔｈ  ｅｄ．１９９２）を参照されたい。
【００４１】
「優先的にハイブリダイズする」とは、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、増幅または検出プローブオリゴマーが、その標的核酸にハイブリダイズして、安定なオリゴマー：標的ハイブリッドを形成することができるが、十分な数の安定なオリゴマー：非標的ハイブリッドを形成しないことを意味する。標的核酸に優先的にハイブリダイズする増幅および検出オリゴマーは、標的核酸を増幅および検出するのに有用であるが、非標的化生物、特に系統発生的に密接に関連した生物には有用ではない。よって、オリゴマーは、非標的核酸よりも十分にかなりの程度まで標的核酸にハイブリダイズして、当業者が、必要に応じて、指定された標的に由来する核酸を正確に増幅し、および／またはその存在（もしくは不在）を検出することを可能にする。一般に、オリゴヌクレオチド配列とその標的配列との間の相補性の程度を低減することは、その標的領域へのオリゴヌクレオチドのハイブリダイゼーションの程度または割合を低下させるであろう。しかしながら、１つ以上の非相補的ヌクレオシドまたは核酸塩基の包含は、非標的生物に対して区別するオリゴヌクレオチドの能力を促進し得る。
【００４２】
優先的ハイブリダイゼーションは、当該技術分野で既知であり、本明細書、例えば、以下に提供される例に記載される技法を使用して測定することができる。いくつかの実施形態では、試験試料中の標的および非標的ハイブリダイゼーションシグナル間に少なくとも１０倍の差、少なくとも１００倍の差、または少なくとも１，０００倍の差がある。いくつかの実施形態では、試験試料中の非標的ハイブリダイゼーションシグナルは、バックグラウンドシグナルレベル以下である。
【００４３】
「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」または「ストリンジェントな条件」とは、オリゴマーが、密接に関連する非標的核酸に由来する核酸ではなく、標的核酸に優先的にハイブリダイズすることを可能にする条件を意味する。ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件の定義は変わらないが、ストリンジェントなハイブリダイゼーションに使用することができる実際の反応環境は、オリゴマーのＧＣ含量および長さ、オリゴマー配列と試験試料中に存在し得る非標的核酸配列との間の類似性の程度、ならびに標的配列を含む因子に応じて変わり得る。ハイブリダイゼーション条件には、温度およびハイブリダイゼーション試薬または溶液の組成が含まれる。ＥＢＶの１つ以上のバリアントに由来する標的核酸を本開示のオリゴマーで増幅および／または検出するための例示的なハイブリダイゼーションアッセイ条件は、一価塩（例えば、ＫＣｌ）などの塩濃度が、約０．６〜０．９Ｍの範囲にある場合、約６０℃の温度に対応する。他の許容されるストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、当業者によって容易に確認される。
【００４４】
「アッセイ条件」とは、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの安定したハイブリダイゼーションを可能にする条件を意味する。アッセイ条件は、標的核酸へのオリゴヌクレオチドの優先的ハイブリダイゼーションを必要としない。
【００４５】
「標識」または「検出可能な標識」とは、検出されるか、または検出可能なシグナルをもたらす、プローブに直接的または間接的に結合した部分または化合物を指す。直接的結合は、共有結合または非共有相互作用（例えば、水素結合、疎水性もしくはイオン性相互作用、およびキレートもしくは配位錯体形成）を使用し得るが、間接的結合は、架橋部分またはリンカーを（例えば、抗体もしくは追加のオリゴヌクレオチド（複数可）を介して）使用し得る。放射性核種、リガンド、例えば、ビオチンもしくはアビジン、またはさらにポリヌクレオチド配列、酵素、酵素基質、反応性基、クロモフォア、例えば、検出可能な色を与える色素または粒子（例えば、ラテックスまたは金属ビーズ）、発光化合物（例えば、生物発光、リン光、または化学発光化合物）、および蛍光化合物または部分（すなわち、フルオロフォア）を含む、任意の検出可能な部分が使用され得る。フルオロフォアの実施形態には、約４９５〜６５０ｎｍの範囲の光を吸収し、約５２０〜６７０ｎｍの範囲の光を放出するものが含まれ、これらには、ＦＡＭ（商標）、ＴＥＴ（商標）、ＣＡＬ  ＦＬＵＯＲ（商標）（ＯｒａｎｇｅまたはＲｅｄ）、およびＱＵＡＳＡＲ（商標）化合物として知られるものが含まれる。フルオロフォアは、フルオロフォアに近接したときに光を吸収して、バックグラウンド蛍光を減少させる、クエンチャー分子と組み合わせて使用され得る。そのようなクエンチャーは、当該技術分野で周知であり、例えば、ＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ（商標）（もしくはＢＨＱ（商標））またはＴＡＭＲＡ（商標）化合物を含む。特定の実施形態は、混合物中の結合標識プローブが非結合標識プローブと比較して検出可能な変化を示す均質なシステムにおいて検出可能である「均質な検出可能な標識」を含み、これは、ハイブリダイズしていない標識プローブからハイブリダイズしたものを物理的に除去することなく、標識を検出することを可能にする（例えば、米国特許第５，２８３，１７４号、同第５，６５６，２０７号、および同第５，６５８，７３７号）。特定の均質な検出可能な標識には、アクリジニウムエステル（「ＡＥ」）化合物、例えば、周知の標準的ＡＥまたはＡＥ誘導体）を含む、化学発光化合物が含まれる（米国特許第５，６５６，２０７号、同第５，６５８，７３７号、および同第５，６３９，６０４号）。標識を合成し、標識を核酸に結合し、標識からのシグナルを検出する方法は、周知である（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．（Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ  Ｓｐｒｉｎｇ  Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ，１９８９）第１０章、ならびに米国特許第５，６５８，７３７号、同第５，６５６，２０７号、同第５，５４７，８４２号、同第５，２８３，１７４号、および同第４，５８１，３３３号、ならびに欧州特許出願第０  ７４７  ７０６号）。ＡＥ化合物を核酸に結合する特定の方法は、既知である（例えば、米国特許第５，５８５，４８１号および米国特許第５，６３９，６０４号、第１０列、第６行〜第１１列、第３行、および実施例８を��照されたい）。特定のＡＥ標識位置は、プローブの中央領域およびＡ／Ｔ塩基対の領域付近、プローブの３’もしくは５’末端、またはプローブが所望の標的配列と比較して検出すべきではない既知の配列とのミスマッチ部位もしくはその付近である。他の検出可能に標識されたプローブには、ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ、分子トーチ、および分子ビーコンが含まれる。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブは、ドナーおよびアクセプター標識を含み、クエンチャーの存在からフルオロフォアを放出するために増幅中にプローブを酵素的に分解すると蛍光が検出される。分子トーチおよびビーコンは、開放および閉鎖構成で存在し、閉鎖構成は、フルオロフォアを消光し、開放位置は、フルオロフォアをクエンチャーから分離して蛍光を可能にする。標的核酸へのハイブリダイゼーションは、そうでなければ閉鎖されているプローブを開放する。
配列は、完全に相補的である必要はないが、２つの核酸配列の安定なハイブリダイゼーション、例えば、プローブおよび標的配列の安定なハイブリッドを可能にする場合、「十分に相補的」である。すなわち、「十分に相補的」な配列は、標準的な塩基対合（例えば、Ｇ：Ｃ、Ａ：Ｔ、またはＡ：Ｕ）を使用することによって相補的なヌクレオチドの一連のサブセット間の水素結合によって別の配列にハイブリダイズするが、２つの配列は、配列全体が適切なハイブリダイゼーション条件で安定なハイブリダイゼーション複合体を形成する限り、相補的ではない１つ以上の残基（非塩基性位置を含む）を含有し得る。十分に相補的な配列は、一緒にハイブリダイズする配列において少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、または完全に相補的であり得る。適切なハイブリダイゼーション条件は、当業者に周知であり、配列組成に基づいて予測することができるか、または日常的な試験を使用することによって経験的に決定することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ  ｅｔ  ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ  Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ  Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ  ｅｄ．§§１．９０−１．９１、７．３７−７．５７、９．４７−９．５１、および１１．４７−１１．５７、特に§§９．５０−９．５１、１１．１２−１１．１３、１１．４５−１１．４７、および１１．５５−１１．５７）。
【００４６】
「伸長不可能な」オリゴマーは、伸長を防止するためにその３’末端またはその近くに遮断部分を含む。３’末端付近の遮断基は、いくつかの実施形態では、３’末端の５残基以内であり、ポリメラーゼのオリゴマーへの結合を制限するのに十分に大きく、他の実施形態は、３’末端に共有結合した遮断基を含有する。多くの異なる化学基、例えば、アルキル基、非ヌクレオチドリンカー、アルカン−ジオールジデオキシヌクレオチド残基、およびコルジセピンが、３’末端を遮断するために使用され得る。遮断部分のさらなる例には、３’−デオキシヌクレオチド（例えば、２’，３’−ジデオキシヌクレオチド）；３’−リン酸化ヌクレオチド；フルオロフォア、クエンチャー、または伸長に干渉する他の標識；反転ヌクレオチド（例えば、任意に露出した５’−ＯＨもしくはリン酸塩を有する、３’−３’ホスホジエステルを通して先行するヌクレオチドに結合した）；またはポリメラーゼによる新生核酸鎖のさらなる伸長を防止するためにオリゴヌクレオチドに結合されたタンパク質もしくはペプチドが含まれる。本開示の伸長不可能なオリゴヌクレオチドは、少なくとも１０個の塩基の長さであり得、最大１５、２０、２５、３０、３５、４０、５０個以上のヌクレオチドの長さであり得る。検出可能な標識を含む伸長不可能なオリゴヌクレオチドは、プローブとして使用することができる。
【００４７】
特に特許請求の範囲における、「配列番号Ｘの配列」への言及は、対応する配列表に記載の塩基配列を指し、文脈で明確に別段の指示がない限り、バックボーン（例えば、ＲＮＡ、２’−Ｏ−Ｍｅ  ＲＮＡ、もしくはＤＮＡ）または塩基修飾（例えば、シトシン残基のメチル化）の同一性を必要としない。
【００４８】
「試料調製」とは、試料中に存在するＥＢＶ核酸のその後の増幅および／または検出のために試料を処理する任意のステップまたは方法を指す。試料は、標的核酸が少数成分である成分の複合体混合物であり得る。試料調製は、より大きい試料体積から、微生物または核酸などの成分を濃縮する任意の既知の方法、例えば、より大きい試料体積からの空中浮遊もしくは水性粒子の濾過によるもの、または標準的な微生物学的方法を使用することによる試料からの微生物の単離によるものを含み得る。試料調製は、細胞内成分を実質的に水性または有機相に放出するための細胞成分の物理的破壊および／または化学的溶解、ならびに濾過、遠心分離、または吸着を使用することなどによる、破片の除去を含み得る。試料調製は、標的核酸を選択的または非特異的に捕捉し、それを他の試料成分から分離する核酸オリゴヌクレオチドの使用を含み得る（例えば、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第６，１１０，６７８号および国際特許出願公開第ＷＯ２００８／０１６９８８号に記載される）。
【００４９】
「分離すること」または「精製すること」とは、試料の１つ以上の成分が他の試料成分から除去または分離されることを意味する。試料成分は、通常、細胞断片、タンパク質、炭水化物、脂質、および他の核酸も含み得る、一般に水性の溶液相に標的核酸を含む。「分離すること」または「精製すること」は、精製の任意の程度を含意しない。典型的には、分離することまたは精製することは、他の試料成分から標的核酸の少なくとも７０％、または少なくとも８０％、または少なくとも９５％を除去する。
【００５０】
本明細書で使用される場合、「非線形界面活性剤」という用語は、分岐鎖構造を有する界面活性剤を意味する。非線形界面活性剤は、例えば、主鎖および／または１つ以上の分岐鎖にあり得る、１つ以上の環構造を含み得る。例示的な非線形界面活性剤には、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、ポリソルベート６０、およびジギトニンが含まれる。特定の変形では、非線形界面活性剤は、非イオン性である。
【００５１】
増幅および／または検出システムの文脈における「特異性」という用語は、配列およびアッセイ条件に依存する、標的および非標的配列間を区別するその能力を説明するシステムの特徴を指すために、本明細書において使用される。核酸増幅に関して、特異性は、一般に、副産物の数に対する産生された特異的アンプリコンの数の比（例えば、信号対雑音比）を指す。検出に関して、特異性は、一般に、非標的核酸から産生されたシグナルに対する標的核酸から産生されたシグナルの比を指す。
【００５２】
「感度」という用語は、核酸増幅反応が検出または定量化され得る精度を指すために本明細書において使用される。増幅反応の感度は、一般に、増幅システムにおいて確実に検出され得る標的核酸の最小コピー数の尺度であり、例えば、用いられている検出アッセイ、および増幅反応の特異性、例えば、副産物に対する特異的アンプリコンの比に依存するであろう。
【００５３】
エプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）の核酸を検出するための組成物、方法、およびキットが本明細書に開示されている。より具体的には、高レベルの特異性および感度でＥＢＶ核酸を増幅および検出するために使用することができるオリゴヌクレオチドプライマーおよびプローブが開示されている。これは、配列選択によって、および望ましくないハイブリダイゼーション反応を回避する目的でヌクレオチド類似体を含むオリゴヌクレオチドの修飾によって達成された。
【００５４】
本開示は、試料中のエプスタイン−バールウイルス（ＥＢＶ）の核酸を増幅および検出するための組成物、キット、および方法を提供する。好ましくは、試料は、ヒト対象から得られた生物学的試料である。組成物、キット、および方法は、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ１遺伝子内の標的配列またはその補体を含む、ＥＢＶゲノム内の標的配列を認識するオリゴヌクレオチド配列を提供する。そのようなオリゴヌクレオチドは、その機能が以前に記載されている、プライマー、プロモータープライマー、遮断オリゴヌクレオチド、およびプロモータープロバイダーオリゴヌクレオチドを含み得る、増幅オリゴヌクレオチドとして使用され得る（例えば、各々が参照によって本明細書に組み込まれる、米国特許第４，６８３，１９５号、第４，６８３，２０２号、第４，８００，１５９号、第５，３９９，４９１号、第５，５５４，５１６号、第５，８２４，５１８号、および第７，３７４，８８５号を参照されたい）。他のオリゴヌクレオチドは、ＥＢＶの増幅配列を検出するための、またはＥＢＶ標的核酸の捕捉のためのプローブとして使用され得る。
【００５５】
方法は、ＥＢＶ核酸の高感度および特異的検出を提供する。方法は、ＥＢＶ標的領域の核酸増幅を行い、例えば、増幅産物を、試料中のＥＢＶの存在を示すシグナルを提供する核酸検出プローブで特異的にハイブリダイズすることによって、増幅産物を検出することを含む。増幅ステップは、試料を、ＥＢＶ標的核酸中の標的配列に特異的な１つ以上の増幅オリゴマーと接触させることと、ＥＢＶ核酸が試料中に存在する場合に増幅産物を産生することと、を含む。増幅は、少なくとも１つの核酸ポリメラーゼおよび増幅オリゴマーを使用して、テンプレート鎖からコピーを産生することによって（例えば、テンプレート鎖を使用してプライマーから配列を伸長することによって）、標的配列またはその補体の追加のコピーを合成する。増幅産物を検出するための一実施形態は、増幅産物を、選択された増幅オリゴマーによって増幅された配列（例えば、選択された増幅オリゴマーの対によって隣接される標的配列に含有される配列）に特異的な少なくとも１つの検出プローブオリゴマーと接触させることを含む、ハイブリダイズステップを使用する。
【００５６】
本開示の好ましい組成物は、試料中に存在することが疑われる他の非ＥＢＶ核酸（例えば、他のウイルス病原体）との最小限の交差反応性で、ＥＢＶの核酸に特異的にハイブリダイズするように構成される。いくつかの態様では、本開示の組成物は、表５および６のいずれかに列挙される１つ以上の非ＥＢＶ病原体に対する最小限の交差反応性で、ＥＢＶ核酸に特異的にハイブリダイズするように構成される。一態様では、本開示の組成物は、これらの非ＥＢＶ病原体のうちの１つ以上を検出する成分および方法をさらに含む、マルチプレックスシステムの一部である。例えば、同じ反応においてＥＢＶおよびサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の核酸を独立して増幅および検出する組成物が存在し得る。増幅されたＥＢＶ核酸および増幅されたＣＭＶ核酸は、区別可能な蛍光標識で標識されたハイブリダイゼーションプローブを使用して検出することができる。この方法では、ＥＢＶは、マルチプレックス反応において同様に増幅され得る他の標的核酸とは独立したマルチプレックス増幅反応において検出することができる。
【００５７】
本開示の特定の態様では、試料中のＥＢＶの存在または不在を決定するために、少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む組成物が提供される。典型的には、組成物は、配列番号１の配列に対応するＥＢＶ標的核酸の標的領域を増幅するための少なくとも２つの増幅オリゴマーを含む。そのような実施形態では、少なくとも１つの増幅オリゴマーは、センス配向の標的ハイブリダイズ配列（「センスＴＨＳ」）を含み、少なくとも１つの増幅オリゴマーは、アンチセンス配向の標的ハイブリダイズ配列（「アンチセンスＴＨＳ」）を含み、センスＴＨＳおよびアンチセンスＴＨＳは、各々、配列番号１またはその補体内に含有される配列に対応するＥＢＶ標的配列に特異的にハイブリダイズするように構成され、標的ハイブリダイズ配列は、アンチセンスＴＨＳによって標的化されるＥＢＶ配列が、センスＴＨＳによって標的化されるＥＢＶ配列の下流に位置するように選択される（すなわち、少なくとも２つの増幅オリゴマーは、それらが増幅される標的領域に隣接するように位置している）。一般に、核酸増幅産物を合成するのに有用な反対鎖増幅オリゴマーは、本明細書において、一方を他方から区別するために「第１の」および「第２の」増幅オリゴマーと呼ばれることがある。あるいは、反対鎖増幅オリゴマーは、「順方向」および「逆方向」増幅オリゴマー、または順方向および逆方向「プライマー」（オリゴマーがポリメラーゼによって伸長される場合）とも呼ばれ得る。
【００５８】
特定の実施形態では、組成物は、ＥＢＶ核酸の増幅のための水性もしくは乾燥製剤、またはそのような製剤を含むか、もしくはこれから再構成される反応混合物として提供される。
【００５９】
特定の変形では、試料中のＥＢＶの存在または不在を決定するための組成物は、第１および第２の増幅オリゴマーを使用して増幅可能なＥＢＶ  ＥＢＮＡ１標的配列にハイブリダイズするように構成された少なくとも１つの検出プローブオリゴマーをさらに含む。好ましいＥＢＶ  ＥＢＮＡ１特異的プローブは、２０〜２５個のヌクレオチドの長さであり得、配列番号２の配列、またはその補体内に含有される塩基の配列を含み得る。プローブハイブリダイズ配列は、第１および第２の増幅オリゴマーの標的ハイブリダイズ配列によって隣接される。特に好適な検出プローブオリゴマーには、例えば、配列番号２の２２個の連続する塩基、またはその補体を有し、ＲＮＡおよびＤＮＡ等価塩基、ならびにそのＲＮＡ等価物またはＤＮＡ／ＲＮＡキメラを可能にするオリゴマーを含む。有用なプローブの一例は、配列番号９によって与えられる。本開示による好ましいプローブは、共有結合された標識をさらに含む（すなわち、検出可能に標識されたプローブ）。非常に好ましいプローブは、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分の両方を含む。検出プローブオリゴマーは、任意に、核酸バックボーンにおける１つ以上の結合で２’−メトキシバックボーンを含む。いくつかの変形では、組成物は、少なくとも２つの検出プローブオリゴマーを含む。特定の実施形態では、検出プローブオリゴマーは、ＥＢＶ核酸の検出のための水性もしくは乾燥（例えば、凍結乾燥）製剤、またはそのような製剤を含むか、もしくはそのような製剤から再構成される、反応混合物で提供される。
典型的には、本開示による検出プローブオリゴマーは、標識をさらに含む。特に好適な標識は、検出可能な光シグナルを放出する化合物を含む。例となる標識には、均質なアッセイにおいて検出され得るフルオロフォアおよび発光（例えば、化学発光）化合物が含まれる。２つ以上の標識、および２つ以上のタイプの標識が特定のプローブ上に存在してもよく、または検出は、各プローブが、検出可能なシグナルを産生する化合物で標識される、プローブの混合物を使用することに依存し得る（例えば、各々が本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第６，１８０，３４０号および同第６，３５０，５７９号を参照されたい）。標識は、共有結合、キレート化、およびイオン相互作用を含む様々な手段によってプローブに結合され得る。好ましくは、標識は、共有結合している。例えば、いくつかの実施形態では、検出プローブは、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物などの結合した化学発光標識を有する（例えば、各々が本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第５，１８５，４３９号、同第５，６３９，６０４号、同第５，５８５，４８１号、および同第５，６５６，７４４号を参照されたい）。蛍光または化学発光標識などの標識は、非ヌクレオチドリンカーによってプローブに結合させることができる（例えば、各々が本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第５，５８５，４８１号、同第５，６５６，７４４号、および同第５，６３９，６０４号、特に第１０列、第６行〜第１１列、第３行、および実施例８を参照されたい）。
【００６０】
いくつかの実施形態では、プローブ（例えば、蛍光標識を含む）は、第１の標識と相互作用する第２の標識をさらに含む。例えば、第２の標識は、クエンチャーであり得る。蛍光標識およびクエンチャー部分の両方を含む検出プローブは、蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）アッセイにおいて特に有用である。そのような検出プローブの具体的な変形は、ＴａｑＭａｎ（商標）検出プローブ（Ｒｏｃｈｅ  Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ  Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、および「分子ビーコン」ハイブリダイゼーションプローブを含む（各々が参照によって本明細書に組み込まれる、Ｔｙａｇｉ  ｅｔ  ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１６：４９−５３，１９９８、米国特許第５，１１８，８０１号および同第５，３１２，７２８号を参照されたい）。ＴａｑＭａｎ（商標）プローブ（または蛍光標識およびクエンチャーの両方を含む類似の二重標識線形プローブ）は、プローブの標的またはアンプリコンへのハイブリダイゼーション、続いて５’−３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼによる髄核融解が、蛍光標識の解放をもたらして、増加した蛍光、または第２の標識との相互作用とは独立した蛍光をもたらすアッセイにおいて使用することができる。
【００６１】
いくつかの用途では、検出前にハイブリダイズされていないプローブの除去をまず必要とせずに試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を容易にするために、少なくともある程度の自己相補性を示す検出プローブが使用される。そのような検出プローブの具体的な実施形態は、例えば、一般にヘアピンと呼ばれる立体構造などの、分子内ハイブリダイゼーションによって保持される立体構造を形成するプローブを含む。好適なヘアピンプローブには、「分子トーチ」（例えば、米国特許第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号を参照されたい）、および「分子ビーコン」（例えば、米国特許第５，１１８，８０１号および米国特許第５，３１２，７２８号を参照されたい）が含まれる。分子トーチは、結合領域（例えば、−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）３−リンカー）によって接続され、かつ所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件下で互いにハイブリダイズする、自己相補性の別個の領域（造語「標的結合ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」）を含む。適切な標的または変性条件に曝露されると、分子トーチの２つの相補的な領域（完全にまたは部分的に相補的であり得る）が融解し、標的結合ドメインを、所定のハイブリダイゼーションアッセイ条件が回復したときに標的配列へのハイブリダイゼーションに利用可能にする。分子トーチは、標的結合ドメインが標的閉鎖ドメインよりも標的配列へのハイブリダイゼーションを優先するように設計される。分子トーチの標的結合ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、分子トーチが標的核酸にハイブリダイズされるときとは対照的に、分子トーチが自己ハイブリダイズされるときに異なるシグナルが産生されるように配置される相互作用標識（例えば、フルオロフォア／クエンチャー）を含み、それによって、それと会合した存続可能な標識を有するハイブリダイズされていないプローブの存在下で試験試料中のプローブ：標的二本鎖の検出を可能にする。
【００６２】
他の実施形態では、検出プローブは、分子内結合によって維持される立体構造を実質的に形成しない線形オリゴマーである。特定の変形では、線形検出プローブオリゴマーは、標識として化学発光化合物（例えば、アクリジニウムエステル（ＡＥ）化合物）を含む。他の実施形態では、線形検出プローブオリゴマーは、標識としてフルオロフォアを含む。フルオロフォアを含む線形検出プローブオリゴマーのいくつかの実施形態では、オリゴマーは、消光部分（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）をさらに含む。
【００６３】
本開示に関連して使用され得る相互作用するドナー／アクセプター標識対の例には、ＦＲＥＴと非ＦＲＥＴ対とを区別しようとせずに、フルオレセイン／テトラメチルローダミン、ＩＡＥＤＡＮＳ／フルオロレセイン、ＥＤＡＮＳ／ＤＡＢＣＹＬ、クマリン／ＤＡＢＣＹＬ、フルオレセイン／フルオレセイン、ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ／ＢＯＤＩＰＹ  ＦＬ、フルオレセイン／ＤＡＢＣＹＬ、ルシファーイエロー／ＤＡＢＣＹＬ、ＢＯＤＩＰＹ／ＤＡＢＣＹＬ、エオシン／ＤＡＢＣＹＬ、エリスロシン／ＤＡＢＣＹＬ、テトラメチルローダミン／ＤＡＢＣＹＬ、Ｔｅｘａｓ  Ｒｅｄ／ＤＡＢＣＹＬ、ＣＹ５／ＢＨ１、ＣＹ５／ＢＨ２、ＣＹ３／ＢＨ１、ＣＹ３／ＢＨ２、およびフルオレセイン／ＱＳＹ７色素が含まれる。当業者であれば、ドナーおよびアクセプター色素が異なる場合、アクセプターの増感された蛍光の出現によって、またはドナー蛍光の消光によって、エネルギー移動が検出され得ることを理解するであろう。ＤＡＢＣＹＬおよびＱＳＹ７色素などの非蛍光アクセプターは、直接（すなわち、非増感）アクセプター励起から生じるバックグラウンド蛍光の潜在的な問題を有利に排除する。ドナー−アクセプター対の１つのメンバーとして使用され得る例示的なフルオロフォア部分には、フルオレセイン、ＲＯＸ、およびＣＹ色素（例えば、ＣＹ５）が含まれる。ドナー−アクセプター対の別のメンバーとして使用され得る例示的なクエンチャー部分には、Ｂｉｏｓｅａｒｃｈ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｎｏｖａｔｏ，Ｃａｌｉｆ．）から入手可能なＤＡＢＣＹＬおよびＢＬＡＣＫ  ＨＯＬＥ  ＱＵＥＮＣＨＥＲ部分が含まれる。
【００６４】
いくつかの実施形態では、標識されたオリゴマー（例えば、検出プローブ）は、伸長不可能である。例えば、標識されたオリゴマーは、３’末端３’−デオキシヌクレオチド（例えば、末端２’，３’−ジデオキシヌクレオチド）を有する、３’末端反転ヌクレオチド（例えば、最後のヌクレオチドが、３’−３’ホスホジエステル結合またはその類似体、例えば、ホスホロチオエートによって最後から２番目のヌクレオチドに結合されるように反転している）を有する、または結合したフルオロフォア、クエンチャー、もしくは伸長に干渉する他の標識（おそらく末端ヌクレオチドの３’位を介して結合しているが、必ずしもそうではない）を有する、３’リン酸化によって伸長不可能にすることができる。いくつかの実施形態では、３’末端ヌクレオチドは、メチル化されていない。
【００６５】
本明細書に記載されるような１つ以上の検出プローブオリゴマーを含む組成物も本開示によって提供される。
【００６６】
いくつかの態様では、本開示は、本明細書に記載されるようなオリゴマーまたはオリゴマーの組み合わせを利用する方法を提供する。本明細書に開示される任意の方法はまた、方法の目的を達成するように向けられた方法に関与する材料の対応する使用の開示として理解されるべきである。ＥＢＶ  ＥＢＮＡ１標的ハイブリダイズ配列を含むオリゴマーおよびそのようなオリゴマーを含む任意の組み合わせ（例えば、キットおよび組成物）のうちのいずれかは、ＥＢＶの検出または定量化における使用、およびＥＢＶの検出または定量化のための組成物の調製における使用について開示されるものとしても理解されるべきである。
【００６７】
大まかに述べると、方法は、以下の構成要素：ＥＢＶ核酸（例えば、臨床試料などの試料由来）が捕捉オリゴマーにアニールされる、標的捕捉、単離（例えば、捕捉オリゴマーと会合していない材料を除去するための、洗浄）、増幅、およびアンプリコン検出（例えば、増幅と共にリアルタイムで実施され得る、アンプリコン定量化）のうちの１つ以上を含み得る。特定の実施形態は、前述のステップの各々を含む。特定の実施形態は、任意に先行する線形増幅ステップでの、指数関数的増幅を含む。特定の実施形態は、指数関数的増幅およびアンプリコン検出を含む。特定の実施形態は、上に列挙される構成要素のうちのいずれか２つを含む。特定の実施形態は、すぐ上に列挙される任意の２つの構成要素（例えば、洗浄および増幅、または増幅および検出）含む。
【００６８】
いくつかの実施形態では、本開示は、本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせを使用して、試料中のＥＢＶの存在または不在を決定するための方法を提供する。そのような方法は、一般に、（１）ＥＢＶ  ＥＢＮＡ１核酸標的領域を増幅するために、試料を少なくとも２つの増幅オリゴマーと接触させることと、（２）増幅オリゴマーを使用してインビトロ核酸増幅反応を行って、増幅産物を生成することと、（３）増幅産物の存在または不在を検出し、それによって試料中のＥＢＶの存在または不在を決定することと、を含む。
【００６９】
本開示に従った検出方法は、典型的には、少なくとも２つの増幅オリゴマーと接触させる試料を得るステップをさらに含む。特定の実施形態では、ステップ（１）〜（３）で使用される試料を「得ること」は、例えば、試験施設または方法の１つ以上のステップが実施される他の場所で試料を受け取ること、および／または方法の１つ以上のステップが実施される施設内の場所から（例えば、貯蔵所もしくは他の保管所から）試料を回収することを含む。
【００７０】
ＥＢＶ標的配列を増幅することは、増幅される標的領域に隣接する少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用するインビトロ増幅反応を利用することができる。特定の実施形態では、増幅される標的領域は、配列番号１の配列またはその補体内に含有されるＥＢＶ  ＥＢＮＡ１標的領域である。標的領域を増幅するために特に適したオリゴマーの組み合わせが本明細書に記載される。例えば、いくつかの実施形態では、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ１標的領域を増幅するための増幅オリゴマーの組み合わせは、それぞれ、（Ａ）１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは、２０〜２５個のヌクレオチドの長さの第１のＥＢＶ  ＥＢＮＡ１特異的標的ハイブリダイズ配列であって、標的ハイブリダイズ配列が、配列番号３の配列内に完全に含有されるか、またはそのＲＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラである、配列と、（Ｂ）１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは、２０〜２１個のヌクレオチドの長さの第２のＥＢＶ  ＥＢＮＡ１特異的標的ハイブリダイズ配列であって、標的ハイブリダイズ配列が、配列番号４の配列内に完全に含有されるか、またはそのＲＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラである、配列と、を含む第１および第２の増幅オリゴマーを含む。いくつかの実施形態では、ＥＢＶ標的領域を増幅するための増幅オリゴマーの組み合わせは、それぞれ、（Ａ）配列番号５もしくは配列番号５に実質的に対応する配列、またはそのＲＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、または配列番号６もしくは配列番号６に実質的に対応する配列、またはそのＲＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラのいずれかである第１のＥＢＶ  ＥＢＮＡ１特異的標的ハイブリダイズ配列と、（Ｂ）配列番号７もしくは配列番号７に実質的に対応する配列、またはそのＲＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラ、または配列番号８もしくは配列番号８に実質的に対応する配列、またはそのＲＮＡ等価物もしくはＤＮＡ／ＲＮＡキメラのいずれかである第２のＥＢＶ  ＥＢＮＡ１特異的標的ハイブリダイズ配列と、を含む、第１および第２のＥＢＶ  ＥＢＮＡ１特異的増幅オリゴマーを含む。
【００７１】
本開示に従った検出方法は、方法のその後のステップに供される試料を得るステップをさらに含むことができる。特定の実施形態では、使用される試料を「得ること」は、例えば、方法の１つ以上のステップが実施される試験施設もしくは他の場所で試料を受け取ること、および／または方法の１つ以上のステップが実施される施設内の場所から（例えば、貯蔵所もしくは他の保管所から）試料を回収することを含む。
【００７２】
特定の実施形態では、方法は、（例えば、核酸増幅ステップを行う前に捕捉ステップを使用して）試料中の他の成分からＥＢＶ標的核酸を精製することをさらに含む。そのような精製は、試料中に含有される核酸を他の試料成分から分離する方法、または非核酸試料成分（例えば、タンパク質、炭水化物、塩、脂質など）を除去もしくは分解する方法を含み得る。いくつかの実施形態では、試料中のＤＮＡは、（例えば、ＤＮａｓｅで）分解され、任意にＤＮａｓｅを除去もしくは不活性化するか、または分解されたＤＮＡを除去する。いくつかの他の実施形態では、試料中のＲＮＡは、（例えば、ＲＮＡを加水分解するアルカリ性条件下での処理によって）分解される。
【００７３】
特定の実施形態では、標的核酸を精製することは、標的核酸を捕捉して、標的核酸を他の試料成分から特異的または非特異的に分離することを含む。非特異的標的捕捉法は、実質的に水性の混合物からの核酸の選択的沈殿、他の試料成分を除去するために洗浄される支持体への核酸の付着、またはＥＢＶ核酸および他の試料成分を含有する混合物から核酸を物理的に分離する他の手段を含み得る。
【００７４】
任意に、標的捕捉は、ハイブリダイズ条件下でＥＢＶ標的配列にハイブリダイズする１つ以上の捕捉プローブオリゴマーを含有する液相混合物において生じることができる。捕捉プローブが捕捉プローブテールを含む実施形態について、捕捉プローブテールが固定化プローブにハイブリダイズするようにハイブリダイズ条件を調整することによって、ＥＢＶ標的：捕捉プローブ複合体を捕捉することができる。任意に、ＥＢＶ核酸は、標的配列から実質的に独立しているハイブリダイゼーションアプローチを使用して、固体支持体上に捕捉することができる。特定の実施形態は、常磁性ビーズなどの微粒子固体支持体を使用する。
【００７５】
核酸の単離は、捕捉の後に続くことができ、例えば、固体支持体上の複合体は、他の試料成分から分離される。単離は、他の試料成分および／または非結合オリゴマーを除去する任意の適切な技法（例えば、ＥＢＶ標的配列と会合した支持体を１回以上洗浄すること）によって達成することができる。常磁性ビーズなどの微粒子固体支持体を使用する実施形態では、ＥＢＶ標的と会合した粒子は、洗浄溶液に懸濁され、いくつかの実施形態では磁気引力を使用することによって、洗浄溶液から回収され得る。取り扱いステップの数を制限するために、単離された標的核酸は、支持体上の複合体中の標的配列を増幅オリゴマーと単純に混合し、増幅ステップを進めることによって、増幅され得る。
【００７６】
ＥＢＶ標的配列を指数関数的に増幅することは、増幅される標的領域に隣接する少なくとも２つの増幅オリゴマーを使用するインビトロ増幅反応を利用することができる。いくつかの実施形態では、上記のような少なくとも第１および第２のオリゴマーが提供される。増幅反応は、温度サイクルまたは等温のいずれかであり得る。好適な増幅方法としては、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、レプリカーゼ媒介増幅、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、および転写媒介または転写関連増幅（ＴＭＡ）が挙げられる。
検出ステップは、増幅された標的配列に特異的に会合したシグナルを検出するために、様々な既知の技法のいずれかを使用して行われ得る。これは、増幅産物を標識された検出プローブとハイブリダイズさせ、いくつかの実施形態におけるハイブリダイゼーション後にプローブから放出される標識からのものを含む、標識されたプローブから生じるシグナルを検出することを含むことができる。いくつかの実施形態では、標識されたプローブは、上述されるように、クエンチャーまたは第１の標識と相互作用する他の部分などの第２の部分を含む。検出ステップはまた、増幅された配列（例えば、その核酸塩基配列の全てまたは一部分）に関する追加の情報を提供し得る。検出は、増幅反応が完了した後に実施され得るか、または標的領域を（例えば、リアルタイム形式を使用して）増幅することと同時に実施され得る。一実施形態では、検出ステップは、例えば、米国特許第５，６３９，６０４号および同第５，２８３，１７４号に開示されるように、均質な検出（例えば、混合物からのハイブリダイズされていないプローブの除去なしでのハイブリダイズされたプローブの検出）を可能にする。いくつかの実施形態では、核酸の表面との会合は、光学的変化または電気的変化として検出することができる物理的変化をもたらす。増幅された核酸は、それらをマトリックス中またはその上で濃縮し、核酸もしくはそれらと会合した色素（例えば、臭化エチジウムまたはサイバーグリーンなどの挿入剤）を検出するか、または溶液相中の核酸と会合した色素の増加を検出することによって検出され得る。他の検出方法は、増幅産物中の配列に特異的にハイブリダイズするように構成され、プローブ：産物複合体の存在を検出する核酸検出プローブを使用してもよく、または増幅産物と会合した検出可能なシグナルを増幅し得るプローブの複合体を使用することによるものであってもよい（例えば、各々が本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第５，４２４，４１３号、同第５，４５１，５０３号、および同第５，８４９，４８１号）。増幅産物と特異的に会合する直接的または間接的に標識されたプローブは、試料中の標的核酸の存在を示す検出可能なシグナルを提供する。特に、増幅産物は、ＥＢＶ  ＥＢＮＡ１遺伝子における標的配列またはそれにおける配列に相補的な標的配列を含有し、プローブは、増幅産物に含有される配列に直接的または間接的に結合して、試験された試料中のＥＢＶ核酸の存在を示すであろう。
【００７７】
増幅ステップの終わり近くまたは終わりに増幅産物を検出する実施形態では、増幅産物へのプローブのハイブリダイゼーションを示すシグナルを提供するために、線形検出プローブが使用され得る。そのような検出の一例は、標的核酸にハイブリダイズする発光標識プローブを使用する。次いで、発光性標識が、非ハイブリダイズプローブから加水分解される。検出は、ルミノメーターを使用して化学発光を測定することによって行うことができる。（例えば、本明細書に参照によって組み込まれる、国際特許出願公開第ＷＯ  ８９／００２４７６号を参照されたい）。リアルタイム検出を使用する他の実施形態では、検出プローブは、例えば、プローブが増幅産物に結合するときに検出されるレポーター部分で標識される、例えば、分子ビーコン、分子トーチ、またはハイブリダイゼーションスイッチプローブなどのヘアピンプローブ（例えば、蛍光標識および消光部分の両方を含む二重標識ヘアピンプローブ）であり得る。リアルタイム検出を使用するさらに他の実施形態では、検出プローブは、フルオロフォアおよび消光部分の両方で標識されたオリゴマーなどの線形オリゴマー（例えば、ＴａｑＭａｎプローブ）である。そのようなプローブは、標的ハイブリダイズ配列および非標的ハイブリダイズ配列を含み得る。そのようなプローブの様々な形態は、以前に記載されている（例えば、各々が本明細書に参照によって組み込まれる、米国特許第５，２１０，０１５号、同第５，４８７，９７２号、同第５，１１８，８０１号、同第５，３１２，７２８号、同第５，９２５，５１７号、同第６，１５０，０９７号、同第６，８４９，４１２号、同第６，８３５，５４２号、同第６，５３４，２７４号、および同第６，３６１，９４５号、ならびに米国特許出願公開第２００６００６８４１７Ａ１号および同第２００６０１９４２４０Ａ１号を参照されたい）。
【００７８】
ＥＢＶ核酸の検出のためのアッセイは、任意に、ＩＣ配列に特異的な増幅および検出オリゴマーを使用することによって、同じアッセイ反応混合物において増幅および検出される非ＥＢＶ内部対照（ＩＣ）核酸を含み得る。ＩＣ核酸は、例えば、ＤＮＡプラスミド、ＲＮＡテンプレート配列（例えば、インビトロ転写物）、または試料にスパイクされる合成核酸であり得る。あるいは、ＩＣ核酸配列は、細胞成分であり得、これは、検体と比較して外因性細胞源または内因性細胞源に由来し得る。これらの場合、内部対照核酸は、増幅反応混合物においてＥＢＶ核酸と共増幅され得る。内部対照増幅産物およびＥＢＶ標的配列増幅産物は、独立して検出され得る。これは、各々が区別可能なフルオロフォアで標識されている、異なる標的特異的ハイブリダイゼーションプローブ（例えば、二重標識ハイブリダイゼーションプローブ）を使用して達成することができる。
【００７９】
特定の実施形態では、増幅されたＩＣ配列からのシグナルの増幅および検出は、意図された標的ＥＢＶ核酸（例えば、ＥＢＶに陰性反応を示す試料）についてシグナルが得られない場合、アッセイ試薬、条件、およびアッセイステップの性能がアッセイにおいて適切に使用されたことを実証する。定量的な結果が望ましい場合、ＩＣは、アッセイのための内部キャリブレータとして使用することもできる。例えば、ＩＣ増幅および検出から得られたシグナルを使用して、増幅されたＥＢＶ標的配列について得られたシグナルに基づいて試料中のＥＢＶ核酸の量を定量化するためのアルゴリズムにおいて使用されるパラメータを設定することができる。ＩＣはまた、アッセイにおける１つ以上のステップの完全性を監視するために有用である。ＩＣ標的配列のためのプライマーおよびプローブは、任意の周知の方法を使用することによって構成および合成されるが、ただし、プライマーおよびプローブは、ＥＢＶ標的配列を増幅および検出するために使用される実質的に同じアッセイ条件を使用して、ＩＣ標的配列の増幅および増幅されたＩＣ配列の検出のために機能する。標的捕捉ベースの精製ステップを含む好ましい実施形態では、ＩＣ標的に特異的な標的捕捉プローブが標的捕捉ステップにおいてアッセイに含まれ、ＩＣが、アッセイステップの全てにおける意図されたＥＢＶ分析物のものと類似した方法でアッセイにおいて処理されることが好ましい。
【００８０】
試料中のＥＢＶの存在または不在を決定するための製剤も本明細書において提供される。いくつかの実施形態では、製剤は、（１）本明細書に記載されるＥＢＶ標的領域の増幅のための少なくとも２つのＥＢＶ  ＥＢＮＡ１特異的増幅オリゴマー、および（２）ｐＨ緩衝液を含む水性製剤である。ＥＢＶ核酸の増幅のための水性製剤は、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、逆転写酵素、または検出プローブオリゴマーなどの１つ以上の追加の成分を含み得る。いくつかの実施形態では、製剤は、（１）本明細書に記載されるＥＢＶ  ＥＢＮＡ１検出プローブオリゴマー、および（２）ｐＨ緩衝液を含む水性製剤である。１つ以上の検出プローブオリゴマーを含む水性製剤は、界面活性剤、ＤＮＡポリメラーゼ酵素、逆転写酵素、または少なくとも１つの増幅オリゴマーなどの１つ以上の追加の成分を含み得る。特に好適な界面活性剤には、例えば、ポリエチレングリコールモノ［４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）フェニル］エーテルおよびポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、またはポリソルベート６０）が含まれる。いくつかの実施形態では、水性検出プローブ製剤中の界面活性剤は、例えば、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル（例えば、ポリソルベート２０、ポリソルベート４０、またはポリソルベート６０）またはジギトニンなどの非線形界面活性剤である。ＥＢＶ核酸の増幅または検出のための上記のような水性製剤は、トレハロース、ラフィノース、またはそれらの組み合わせなどの増量剤をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、上記の水性製剤は、マグネシウム塩、カリウム塩、またはナトリウム塩などの無機塩を含有する。いくつかの変形では、無機塩の濃度は、４ｍＭ以下である。上記のような水性製剤に特に適したｐＨ緩衝液は、トリス（２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）である。
【００８１】
関連態様では、長期貯蔵のために、本明細書に記載されるような水性製剤は、バイアル、アンプル、または他の容器にアリコートされ、当該技術分野で既知の手順に従って乾燥（例えば、凍結乾燥）され得る。乾燥産物は、典型的には、粉末またはケーキのように見える。容器は、次いで封止される。水性製剤からそのような乾燥製剤を調製する方法、およびそのような方法によって調製された乾燥製剤は、本開示の追加の態様である。さらに別の態様では、本開示は、本明細書に記載されるような水性製剤への再構成を可能にする乾燥製剤を提供する。ＥＢＶ核酸の増幅または検出のための乾燥製剤は、典型的には、本明細書に記載される１つ以上の増幅オリゴマーおよび／または検出プローブに加えて、トレハロース、ラフィノース、またはそれらの組み合わせなどの増量剤を含有する。無機塩をさらに含むいくつかの実施形態では、乾燥製剤の質量に対する無機塩の質量パーセントは、０．３０％以下、０．２５％以下、または０．２０％以下である。本明細書に記載される凍結乾燥製剤から乾燥製剤を調製する方法もまた、本開示によって包含される。そのような方法は、一般に、乾燥製剤を好適な希釈剤（例えば、水性ｐＨ緩衝液または水）に溶解して、再構成された製剤を提供することを含む。
【００８２】
試料中のＥＢＶ標的核酸の存在または不在を決定するための反応混合物もまた、本開示によって提供される。本開示による反応混合物は、（１）ＥＢＶ  ＥＢＮＡ１標的核酸の増幅のための本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせ、および（２）ＥＢＶ  ＥＢＮＡ１増幅産物の存在または不在を決定するための本明細書に記載される１つ以上の検出プローブオリゴマーのうちの一方または両方を含む。反応混合物は、例えば、捕捉プローブ（参照によって本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１３／０２０９９９２に記載されるようなポリ−（ｋ）捕捉プローブ）などの多数の任意の成分をさらに含み得る。増幅反応混合物について、反応混合物は、典型的には、インビトロ増幅を実施するために好適な他の試薬、例えば、緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、およびｄＴＴＰ、ならびに／またはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）、ならびに／または酵素（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素および／もしくはＲＮＡポリメラーゼ）を含み、典型的には、ＥＢＶ標的核酸が存在しても存在しなくてもよい試験試料成分を含むであろう。反応混合物は、ＥＢＶゲノムの１つの標的領域のみのための増幅オリゴマーを含み得るか、またはそれは、複数のＥＢＶ標的領域のための増幅オリゴマーを含み得る。加えて、増幅オリゴマーの組み合わせと共に検出プローブを含む反応混合物について、反応混合物のための増幅オリゴマーおよび検出プローブオリゴマーの選択は、共通の標的領域によって結合される（すなわち、反応混合物は、反応混合物の増幅オリゴマーの組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含むであろう）。いくつかの実施形態では、反応混合物は、上記のような水性製剤を含む。いくつかの実施形態では、反応混合物は、水、または任意にｐＨ緩衝液を含む水性溶液を使用して、乾燥製剤から再構成される。
【００８３】
本明細書に記載される方法を実施するためのキットも提供される。本開示によるキットは、（１）ＥＢＶ標的核酸の増幅のための本明細書に記載されるオリゴマーの組み合わせ、および（２）ＥＢＶ増幅産物の存在または不在を決定するための本明細書に記載される１つ以上の検出プローブオリゴマーのうちの一方または両方の包装された組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される任意のオリゴマーの組み合わせがキット中に存在する。キットは、例えば、捕捉プローブ（例えば、ＵＳ２０１３／０２０９９９２に記載されるようなポリ−（ｋ）捕捉プローブ）などの多数の任意の成分をさらに含み得る。キット中に存在し得る他の試薬は、インビトロ増幅を実施するために好適な試薬、例えば、緩衝液、塩溶液、適切なヌクレオチド三リン酸（例えば、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、ならびに／またはＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、およびＵＴＰ）、ならびに／または酵素（例えば、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ、または逆転写酵素および／もしくはＲＮＡポリメラーゼ）を含む。本明細書に記載されるオリゴマーは、様々な異なる実施形態において包装することができ、当業者は、本開示が多くの異なるキット構成を包含することを理解するであろう。例えば、キットは、任意に、ＥＢＶゲノムの１つの標的領域のみのための増幅オリゴマーを含むことができるか、またはそれは、複数のＥＢＶ標的領域のための増幅オリゴマーを含み得る。加えて、増幅オリゴマーの組み合わせと共に検出プローブを含むキットについて、キットのための増幅オリゴマーおよび検出プローブオリゴマーの選択は、共通の標的領域によって結合される（すなわち、キットは、キットの増幅オリゴマーの組み合わせによって増幅可能な配列に結合するプローブを含むであろう）。特定の実施形態では、キットは、本開示による方法を実施するための説明書のセットをさらに含み、説明書は、添付文書および／またはキットもしくはその成分の包装に関連し得る。
【００８４】
本開示のプライマーは、インビトロ核酸増幅アッセイにおいてＥＢＶゲノムの核酸（例えば、ＤＮＡ）を増幅するために使用することができる。この目的のために、いくつかのインビトロ核酸増幅システムのいずれかを使用することができる。以下に特に記載されるものは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって増幅を実証する実験手順であり、増幅反応が起こっているときに増幅産物の検出が行われた。これは、「リアルタイムＰＣＲ」、またはより一般的には「リアルタイム増幅および検出」と呼ばれることがある。代替の実施形態では、リアルタイムＰＣＲは、加水分解プローブ（すなわち、Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼなどのＤＮＡポリメラーゼのヌクレアーゼ活性によって消化されるプローブ）、分子ビーコン、分子トーチなどを使用して実施することができる。
【００８５】
開示されたオリゴヌクレオチド試薬は、分子診断およびスクリーニングアッセイに使用することができる。好ましいプライマーおよびプローブの組み合わせは、増幅および検出反応が反応あたり５０コピーのＥＢＶ標的ＤＮＡを含有する場合、少なくとも９５％のＥＢＶ検出または反応性率を有する。これは、複数のＥＢＶ株で実証された。プライマーおよびプローブの製剤は、ヒト血液に潜在的に見られる一般的な生物（例えば、血清および血漿）と交差反応しない。任意に、本開示のプライマーおよびプローブは、ＤＮＡ内部対照核酸との干渉または交差反応性なしに、ＥＢＶ標的配列を増幅および検出するプライマーおよびプローブの存在下で機能することができる。ＥＢＶの核酸および内部対照を検出するプローブは、互いに独立して（例えば、検出装置の異なる「チャネル」で）検出され得るフルオロフォアで標識される。同様に、ＥＢＶを検出するために使用されるプライマーおよびプローブは、交差反応性または干渉なしにＣＭＶも検出するマルチプレックスアッセイにおいて使用することができる。好ましくは、マルチプレックスアッセイにおいてＥＢＶおよびＣＭＶを検出するためのプローブもまた、区別可能なフルオロフォアで標識される。有利なことに、ＥＢＶを検出するための好ましいプライマーおよびプローブの組み合わせは、血漿および血清中に一般的に見られる生物の存在下でＥＢＶの核酸を検出することができる。
【００８６】
テンプレート配列、ならびにプライマーおよびプローブドメイン
ＥＢＶ標的核酸配列のための様々な増幅および検出オリゴヌクレオチドが、開示された技法の開発中に調製および評価された。全てのオリゴヌクレオチド設計は、ＥＢＶゲノムのＥＢＮＡ１遺伝子を標的とした。オリゴヌクレオチドのセットは、配列番号１の配列内に含有される標的配列領域を増幅および検出する能力について試験された。
【００８７】
本開示による核酸増幅産物の配列は、好ましくは、配列番号１の配列、またはその補体内に完全に含有される配列を含む。配列番号１の配列は、順方向プライマーおよびプローブを誘導することができる配列ドメインを含有する。より具体的には、ＥＢＶ配列を増幅するための順方向プライマーは、配列番号３の１８〜２５個の連続する塩基、またはより好ましくは２０〜２５個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含むことができる。任意に、順方向プライマーは、１８〜２５個のヌクレオチドの長さ、より好ましくは２０〜２５個のヌクレオチドの長さである。例えば、順方向プライマーは、１８個のヌクレオチドの長さ、１９個のヌクレオチドの長さ、２０個のヌクレオチドの長さ、２１個のヌクレオチドの長さ、２２個のヌクレオチドの長さ、２３個のヌクレオチドの長さ、２４個のヌクレオチドの長さ、または２５個のヌクレオチドの長さであり得る。１つ以上の順方向プライマーと組み合わせて有用な逆方向プライマーは、配列番号１の配列内に含有され、これに相補的である、配列番号４の１８〜２５個の連続する塩基、またはより好ましくは２０〜２１個の連続する塩基の標的ハイブリダイズ配列を含むことができる。例えば、逆方向プライマーは、１８個のヌクレオチドの長さ、１９個のヌクレオチドの長さ、２０個のヌクレオチドの長さ、２１個のヌクレオチドの長さ、２２個のヌクレオチドの長さ、２３個のヌクレオチドの長さ、２４個のヌクレオチドの長さ、または２５個のヌクレオチドの長さであり得る。任意に、順方向および逆方向プライマーを使用して合成された増幅産物を検出するために有用なプローブは、最大３０個のヌクレオチドの長さであり得る。より好ましくは、プローブは、最大２６個のヌクレオチドの長さであり、さらにより好ましくは最大２３個のヌクレオチドの長さであり、またさらにより好ましくは最大２２個のヌクレオチドの長さである。プローブは、配列番号２の少なくとも１８個の連続するヌクレオチド、より好ましくは２０〜２６個の連続するヌクレオチド、より好ましくは２４個の連続するヌクレオチド、さらにより好ましくは２３個の連続するヌクレオチド、またはまたさらにより好ましくは２２個の連続するヌクレオチドを含むことができる。検出可能に標識されたプローブオリゴヌクレオチドは、（例えば、長さの選択によって、および／またはヌクレオチド類似体の組み込みによって）同じ鎖プライマー（すなわち、この実施例における順方向プライマー）のＴｍよりも高い融解温度（Ｔｍ）を有するように構成された。この配置は、ＰＣＲ温度サイクリングルーチン中にプライマー結合および伸長が起こった温度よりも高い温度でのプローブ結合を保証した。任意に、核酸増幅産物を検出するためのプローブは、フルオロフォア部分および／またはクエンチャー部分を含むことができる。
【実施例】
【００８８】
表１は、ＥＢＶ核酸増幅産物の検出における使用のために設計されたプローブの配列を列挙する。任意に、検出される増幅産物は、配列番号３および配列番号４内からの反対方向の増幅オリゴヌクレオチドを、配列番号１によって与えられる配列を有するＥＢＶテンプレートポリヌクレオチドと共に使用して合成することができる。表１に列挙された全ての配列は、配列番号２の配列内に含有される連続するヌクレオチドを表す。任意に、表にした配列のいずれかを有するオリゴヌクレオチドは、検出可能な標識部分（例えば、フルオロフォア）に結合することができる。好ましくは、示された配列を有するオリゴヌクレオチドは、相互作用標識の対のセット（例えば、フルオロフォア部分およびクエンチャー部分）に結合され得る。表１に示されるヌクレオチド塩基配列を有する全てのプローブは、その補体と共に、本開示によって包含される。以下に提示される実施例は、例示の目的で配列番号９のプローブを使用した。
【表１】
2021532787.tif 000002
【００８９】
実施例１は、ＥＢＶのＥＢＮＡ１コード領域における核酸配列の検出を示すために、指定された配列ドメイン（すなわち、プライマーおよびプローブの組み合わせ）内からの特定のオリゴヌクレオチドを試験するために使用される手順を説明する。この手順においてテンプレートとして機能したＥＮＢＡ１標的配列を有するクローン化されたプラスミド。増幅および検出は、リアルタイムＰＣＲプロトコルを使用して行った。内部対照核酸は、共増幅され、独立して検出されて、任意の陰性結果を検証した。
【００９０】
実施例１
ＥＢＮＡ１をコードする領域におけるＥＢＶ核酸の増幅および検出
プライマーの対となるセットは、ＥＢＮＡ１標的領域を含有するクローン化されたプラスミドテンプレートでプライミングされたリアルタイムＰＣＲ反応においてプローブと組み合わせた。順方向プライマーは、配列番号５および配列番号６の配列を有した。逆方向プライマーは、配列番号７および配列番号８の配列を有した。全ての反応は、各１つの順方向プライマーおよび逆方向プライマーを含んだ。配列番号２の配列内からの単一のプローブは、配列番号９の配列を有した。
【００９１】
ＰＣＲ反応混合物は、当業者によく知られるように、アンプリコン合成に必要な熱安定性Ｔａｑ  ＤＮＡポリメラーゼおよび試薬（例えば、ヌクレオチド、塩、補因子など）を含んだ。テンプレート核酸は、配列番号１の配列またはＥＢＮＡ１標的配列とは無関係の内部対照配列を含んだ。全ての試験は、プライマーおよび内部対照アンプリコンに特異的な標識された加水分解プローブを含んだ。ＥＢＶ特異的プローブは、その５’末端においてＣａｌ  Ｆｌｕｏｒ  Ｏｒａｎｇｅ  ５６０蛍光部分で、その３’末端においてＢｌａｃｋ  Ｈｏｌｅ  Ｑｕｅｎｃｈｅｒ  １部分で標識した。個々の順方向および逆方向プライマーの組み合わせは、増幅反応において試験し、増幅産物は、配列番号９の加水分解プローブを使用して検出した。ＥＢＶテンプレートは、各試験されたプライマーの組み合わせについて、１０コピー／反応、１００コピー／反応、および１，０００コピー／反応のレベルで含まれた。増幅ルーチンは、核酸を変性させる９５℃での２分のステップで開始した。これに続いて、６０℃で０．２５分間、および９５℃で０．０８分間の４５サイクルを行った。ＥＢＶ特異的アンプリコンの出現は、モニタリング蛍光光度計のＨＥＸチャネルにおける蛍光シグナルの蓄積によってモニターされ、蛍光消光の喪失は、標識された加水分解プローブのＴａｑ依存性切断を示した。蛍光は、サイクル数の関数としてモニターした。
【００９２】
表２は、リアルタイムＰＣＲ手順の結果をまとめ、結果は、各異なるオリゴヌクレオチドセットについてメトリックの収集物を使用して評価した。これらのメトリックは、ＲＦＵ範囲比、信号対雑音比、ＲＦＵ範囲、静的閾値を超える時点での蛍光ラン曲線の勾配（「Ｔｓｌｏｐｅ」）、および１，０００コピーのＥＢＶテンプレート核酸を含んだ反応についてのＣｔ値を含んだ。ＲＦＵ範囲比は、１００コピー／反応レベルでの蛍光ＲＦＵ（相対蛍光単位）を１，０００コピー／反応レベルでのＲＦＵ範囲で割ることによって計算した。Ｃｔを除く全てのメトリックは、１００コピー／反応試験データから取得した。表にした情報から明らかとなるように、標識されたプローブは、全ての試験において十分に機能した。この実証において使用された全てのプライマーの組み合わせも、良好な結果をもたらした。しかしながら、配列番号５および配列番号７によって、ならびに配列番号５および配列番号８によって特定されたプライマーの組み合わせは、表に示される全ての測定値に関して特に良好な結果を与えたことが確認された。
【表２】
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【００９３】
実施例２は、実施例１からの選択されたオリゴヌクレオチド試薬を使用して感度および線形性を実証した手順を説明する。
【００９４】
実施例２
ＥＢＶ標的核酸感度
感度は、３つの濃度（５〜５００コピー／反応）で検体輸送培地（ＳＴＭ）に配列番号１のＥＢＮＡ１標的領域を有するＥＢＶプラスミドクローンを試験することによってまず評価した。ＳＴＭは、３％（重量／体積）のラウリル硫酸リチウムを含むリン酸緩衝（ｐＨ６．６〜ｐＨ６．８）溶液である。存在し得る任意の細胞の溶解を促進することに加えて、ＳＴＭは、試料中に存在し得るヌクレアーゼ酵素の活性を阻害することによって核酸を保護する。ＰＣＲ製剤は、配列番号５および配列番号７のＥＢＶプライマー、ならびに配列番号９のプローブを含んだ。感度試験について、３０の複製を使用して行った。プラスミドクローンを、示された濃度でＳＴＭにスパイクし、３つのプローブロットで試験した。線形性試験について、増幅反応を、６の複製を使用して行い、プラスミドを、示された濃度でＳＴＭにスパイクし、１つのプローブロットで試験した。全ての検体は、自動装置を使用して処理して、標的捕捉によって核酸を単離し、次いでリアルタイムＰＣＲプロトコルを使用して単離された核酸を増幅した。
【００９５】
手順の結果を表３にまとめる。この手順では、「反応性」は、蛍光の大きさが５００ＲＦＵで設定された静的閾値を超えたときに示された。ＥＢＶプラスミドの１００％検出は、１０コピー／反応まで観察された。
【表３】
2021532787.tif 000004
【００９６】
実施例３は、異なるマトリックスにおけるＥＢＶの検出のための感度のレベルを確立した手順を説明する。
【００９７】
実施例３
ウイルス感度
プールされた血漿、プールされた血清、およびＳＴＭ中のＥＢＶ参照株Ｂ９５−８は、配列番号１のテンプレート配列、配列番号５および配列番号７のプライマー、ならびに配列番号９のプローブを含んだＰＣＲ製剤との反応性について評価した。簡潔には、ＥＢＶウイルス株Ｂ９５−８を、示された濃度で各マトリックスにスパイクした。血漿および血清中の検体を、３ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（ＰＫ）酵素および５０ｎｇ／μｌの追加の標的捕捉オリゴ（ＴＣＯ）を含有するＰＢＳで１：０．２に希釈し、標的ヌクレオチド配列から実質的に独立した方法で溶液相から固体支持体ビーズへの核酸の捕捉を可能にした。ＰＫも追加のＴＣＯもＳＴＭ試料に添加されなかった。全ての試験は、２０の複製で実施した。実施例２と同様に、全ての検体は、自動装置を使用して処理して、標的捕捉によって核酸を単離し、次いでリアルタイムＰＣＲプロトコルを使用して単離された核酸を増幅した。
【００９８】
手順からの結果を表４にまとめる。同様に、「反応性」は、蛍光測定値の大きさが５００ＲＦＵで設定された静的閾値を超えたときに示された。９５％検出は、１００コピー／ｍｌでＳＴＭにスパイクされたＥＢＶについて観察された。１００％検出は、血清において１，０００コピー／ｍｌ、血漿において３１６コピー／ｍｌで観察された。血液産物から核酸を単離および増幅することは、検出の感度をわずかにのみ低減した。よって、ＥＢＶを検出するためのリアルタイムアッセイは、血液産物から単離された核酸を使用してＥＢＶを検出するために使用することができる。これは、標的捕捉によって核酸を単離し、次いでリアルタイムＰＣＲプロトコルを使用して単離された核酸を増幅する自動装置の使用を含み得る。
【表４】
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【００９９】
実施例４は、ヒト血液中に潜在的に見られる一連の生物の検出の欠如を実証することによって、ＥＢＶリアルタイムアッセイの特異性を示す手順を説明する。手順は、３５個の異なる生物がＥＢＶアッセイによって検出されなかったことを確認した。
【０１００】
実施例４
ＥＢＶアッセイは高度に特異的である
ヒト血液中に一般的に見られる生物の収集物は、約１×１０４〜約１×１０６生物／ｍｌをＳＴＭにスパイクすることによって９つのパネルに調製した。各パネルは、配列番号１のテンプレート配列、配列番号５および配列番号７のプライマー、ならびに配列番号９のプローブを含んだＰＣＲ製剤との特異性について評価した。
【０１０１】
表５は、手順からのパネル組成および反応性結果をまとめる。試験された生物のいずれも、ＥＢＶについて陽性結果をもたらさなかったが、ＩＣは、全ての試験において検出された（すなわち、これによって全ての試験が機能的に反応性であったことを確認した）。陽性対照試験は、ＥＢＶおよびＩＣの検出について陽性であり、陰性対照は、ＩＣのみの検出について陽性であった。まとめると、結果は、増幅および検出システムがＥＢＶに特異的であり、他の生物からの核酸を検出しなかったことを確認した。
【表５】
2021532787.tif 000006
【０１０２】
実施例５は、多数の試験生物のいずれかによる干渉なしに、ＥＢＶの効率的な検出を実証した手順を説明する。
【０１０３】
実施例５
干渉試験
ＥＢＶ反応性は、特異性試験からの３５個の生物の存在下で、またヒト末梢血単核細胞の存在下で評価した。簡潔には、特異性試験からのパネル２〜８をＳＴＭ中で１：１０に希釈し、ＥＢＶ（株：Ｂ９５−８）を２７，７７８コピー／ｍｌで試料にスパイクした。パネル１は、ＳＴＭ中で新たに調製した。５×１０４細胞／ｍｌの末梢血単核細胞を含有する追加のパネルを試験した。両方のパネルは、２７，７７８コピー／ｍｌでスパイクされたＥＢＶを有した。ＢＫも各パネルにスパイクし、２７，７７８コピー／ｍｌでＢＫ干渉を評価した。各パネルは、配列番号１のテンプレート配列、配列番号５および配列番号７のプライマー、ならびに配列番号９のプローブを含んだＰＣＲ製剤で４〜５つの一般的に見られる生物の存在下でのＥＢＶ性能について評価した。
【０１０４】
表６は、様々なパネル組成を使用して得られた反応性の結果を表す。結果は、ＳＴＭ中の２７，７７８コピー／ｍｌのＥＢＶからなる陽性対照と比較した。ＥＢＶは、陽性対照と比較した場合、２．０Ｃｔ以下の差でパネルの１００％において検出された。内部対照は、パネルの１００％において検出された。陽性対照試験は、ＥＢＶおよびＩＣについて陽性であり、陰性対照試験は、ＩＣのみについて陽性であった。よって、試験された生物のいずれかが、プローブおよびプライマーの示された組み合わせを使用してＥＢＶの検出に干渉したという証拠はなかった。
【表６−１】
2021532787.tif 000007
【表６−２】
2021532787.tif 000008
【０１０５】
本明細書において開示および特許請求される組成物、キット、および方法の全ては、本開示に照らして過度の実験なしに作製および実行することができる。本開示は好ましい実施形態を説明するが、当業者には、本開示の趣旨および範囲から逸脱することなく、変形が適用され得ることが明らかであろう。当業者にとって明らかな全てのそのような変形および等価物は、現在存在するか、またはその後に開発されるかにかかわらず、本開示の趣旨および範囲内にあるとみなされる。
【０１０６】
本明細書で言及される全ての特許、特許出願、および刊行物は、本開示が関係する当業者のレベルを示している。全ての特許、特許出願、および出版物は、各個々の刊行物が、任意および全ての目的のためにその全体において参照によって組み込まれることが具体的かつ個別に示されたのと同程度まで、全ての目的のためにその全体において参照によって本明細書に組み込まれる。
【配列表】
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【国際調査報告】
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