(57)【要約】  本発明は、皮下注入のためのエキソビボモデルに関し、インビトロ方法であって、ｉ）表皮の上面が覆われないようにして皮膚外植片を固化性液体マトリクスに浸漬する工程であって、このマトリクス自体は細胞培養挿入物の中に含まれており、この細胞培養挿入物の底部は多孔質膜からなる工程と、（ｉｉ）表皮の上面が覆われていないこの皮膚外植片の浸漬された部分を捕捉するようにこのマトリクスを固化させて、この同じマトリクスを上記挿入物の側壁及び多孔質膜に接着する工程とを備え、上記皮膚外植片は、厚さが少なくとも５ｍｍの皮下組織を含む方法を提供することを目的とする。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
インビトロ方法であって、
ｉ）表皮の上面が覆われないようにして皮膚外植片を固化性液体マトリクスに浸漬する工程であって、このマトリクス自体は細胞培養挿入物の中に含まれており、この細胞培養挿入物の底部は多孔質膜からなる工程と、
ｉｉ）前記表皮の上面が覆われていないこの皮膚外植片の浸漬された部分を捕捉するようにこのマトリクスを固化させて、この同じマトリクスを前記挿入物の側壁及び前記多孔質膜に接着する工程と
を備え、
前記皮膚外植片は、厚さが少なくとも５ｍｍの皮下組織を含み、前記方法は、皮下注入のためのエキソビボモデルを得ることを目的とすることを特徴とするインビトロ方法。
【請求項２】
ｉｉｉ）前記挿入物を容器又は培養ウェルに置く工程と、
ｉｖ）前記皮膚外植片を適切な培地の中で培養する工程と
をさらに備えることを特徴とする請求項１に記載の方法。
【請求項３】
ｖ）皮下に、及び前記皮膚外植片に、組成物を注入する工程
をさらに備えることを特徴とする請求項１又は請求項２に記載の方法。
【請求項４】
ｖｉ）前記組成物の注入性を決定する工程
をさらに備えることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項５】
ｖｉ）前記組成物の注入から生じる局所毒性及び／又は前記組成物の有効性を用いて前記組成物の注入ボーラスを決定する工程
をさらに備えることを特徴とする請求項３に記載の方法。
【請求項６】
請求項１に記載の方法によって得られる細胞培養挿入物であって、前記細胞培養挿入物は容器又は培養ウェルの中に置くことができ、前記細胞培養挿入物は多孔質膜からなる底部を有し、前記細胞培養挿入物は、前記挿入物の内縁及び前記多孔質膜と接触している固化したマトリクスの中に捕捉された前記皮膚外植片を含有し、前記皮膚外植片の表皮は、雰囲気と接触しており、前記皮膚外植片の真皮、表皮付属器、及び皮下組織は、固化した前記マトリクスの中に浸漬されている細胞培養挿入物。
【請求項７】
前記皮下注入のためのエキソビボモデルとしての請求項６に記載の挿入物の使用。
【請求項８】
前記皮下注入のためのエキソビボモデルが組成物の注入性を決定することを目的とすることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項９】
前記皮下注入のためのエキソビボモデルが、組成物の注入から生じる局所毒性及び／又は前記組成物の有効性を用いて、組成物の注入ボーラスを決定することを目的とすることを特徴とする請求項７に記載の使用。
【請求項１０】
請求項６に記載の挿入物と、自動注入デバイスとを含むキット。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
本国際出願は、２０１８年３月５日出願の仏国特許出願第ＦＲ１８／７０２３２号の優先権を主張する。
【０００２】
技術分野
本発明は、皮下注入の分野に関し、より具体的には、このタイプの注射のための最初のエキソビボモデルを提供する。
【背景技術】
【０００３】
通針性（注射針通過性）及び注入性は、非経口注射を意図したあらゆる処方物の２つの非常に重要な特徴である。通針性は、処方物が皮下注入針を容易に通過する能力を指し、注入性は、注入の間の処方物の性能を指す（ＧＲＯＶＥＳ、Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ．  第９巻、９９−１００頁、１９８８）。
【０００４】
通針性は、詰まること、発泡すること、又は注入するべき用量を計量することの容易さ等の種々の要因に基づく。注入性に関しては、それは、必要とされる注入の圧力又は力、流れの均一性、及び詰まりがないことに基づく。
【０００５】
これらの２つのパラメータは、処方物自体によって、及び針の構造（ジオメトリ）によって、とりわけその内径によって、その長さによって、開口部の形状によって、又はシリンジ（注入器、注射器）の先端によって影響を受けうる。２９〜３１Ｇの範囲の針という非常に微細な針を備える自己注射デバイス、例えばペン又は自動注入デバイスを扱う場合には、これらの２つのパラメータは、いずれの場合も非常に重要である。そのような針は注入時の痛みを低減する可能性がある一方で、しかしながら、それらは、注入力の上昇を必要とし、それゆえ開発中に組成物の通針性及び注入性が必要に応じて改変されることができるように、通針性及び注入性の迅速な決定を必要とする。
【０００６】
ＩＣＨガイドラインＱ６Ａ（ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＮＦＥＲＥＮＣＥ  ＯＮ  ＨＡＲＭＯＮＩＳＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＥＣＨＮＩＣＡＬ  ＲＥＱＵＩＲＥＭＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＲＥＧＩＳＴＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ  ＦＯＲ  ＨＵＭＡＮ  ＵＳＥ）によれば、プレフィルドシリンジとして又は自動注入デバイスカートリッジとして包装された非経口処方物は、送達システムの機能性に関連する試験手順及び承認基準に供される必要がある。同様に、ヒト用の薬物及びバイオ製品の包装用の容器施栓系に関する産業に対するＦＤＡのガイドラインでは、シリンジ性能の評価が必要とされる。これらの前提条件は、容器におけるプランジャーの移動を開始し維持するために必要とされる力、及びシリンジが所定量の製剤を送達する能力を決定することにより対処される必要がある。
【０００７】
これらの規制要求事項にもかかわらず、公式の試験手順は薬局方で特定されていない。現在、低い通針性は針サイズを変えることにより容易に解決することができるが、注入性については同じことが言えるわけではない。それゆえ、注入性が患者のコンプライアンスに重大な影響を及ぼす可能性があるため、初期段階でこのパラメータを検討することは重要である。
【０００８】
それゆえ、組成物の注入性を決定する方法は、先行技術において決定されてきた。こうして、ＲＩＴＳＣＨＥＬ及びＳＵＺＵＫＩ（１９７９）は、肉試料での、所定の溶液又は懸濁液の所定の圧力での所定の針−シリンジシステムに対しての緩やかな注射に必要とされる時間の決定に基づく非経口組成物の注入性を決定する方法を提案した。針を通して液体を注入するために必要とされる力を決定することは、過去にも、動力計又は動力計に接続されたミクロキャピラリーレオメータを使用してきた。最後に、これらのデバイスを用いて行った研究は、組成物の注入性が、一方で、その注入の速度及びその粘度に関連づけられ、他方で、組成物が注入される媒体の性質に関連づけられることを示した。結果として、与えられた組成物のインビボ（皮膚における）注入性の決定及び適合は、簡単には成し遂げられず、通常は、ヒトにおける最終試験工程を必要とする。
【先行技術文献】
【非特許文献】
【０００９】
【非特許文献１】ＧＲＯＶＥＳ、Ｐａｒｅｎｔｅｒａｌ  Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ  Ｍａｎｕａｌ．  Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ  Ｐｒｅｓｓ．  第９巻、９９−１００頁、１９８８
【非特許文献２】ＩＣＨガイドラインＱ６Ａ（ＩＮＴＥＲＮＡＴＩＯＮＡＬ  ＣＯＮＦＥＲＥＮＣＥ  ＯＮ  ＨＡＲＭＯＮＩＳＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＴＥＣＨＮＩＣＡＬ  ＲＥＱＵＩＲＥＭＥＮＴＳ  ＦＯＲ  ＲＥＧＩＳＴＲＡＴＩＯＮ  ＯＦ  ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬＳ  ＦＯＲ  ＨＵＭＡＮ  ＵＳＥ）
【発明の概要】
【発明が解決しようとする課題】
【００１０】
それゆえ、ヒトにおける開発（再処方）の必要性だけでなく、動物の使用がますます制限される傾向があるということを考えると、動物の必要性もできる限り制限して、特に皮下経路による組成物のインビボ注入性を簡単にかつ素早く決定するニーズが存在する。
【課題を解決するための手段】
【００１１】
実際、本発明者らは、皮下組織の「柔らかい」構造にもかかわらず、特定の培養方法における少なくとも５ｍｍの皮下組織を含む皮膚外植片（皮膚人工培養組織）の使用が、予想されたとおり、その皮下組織を経時的に不調にならせないことを明らかにした。その三次元構造の喪失が、特に、脱分化又は不適切な分化現象をともなう機能変化及び細胞構造の改変につながることも一般的である。逆に、本発明者らは、この培養方法で使用されるそのような皮膚外植片がその未変性の三次元構造を保持し、結合組織と皮下組織を形成する脂肪細胞組織とは、とりわけ細胞レベルで経時的に何ら変化を示さないことを明らかにすることができた。こうして、皮下注入を実施するために、５〜７日後に、皮下組織の上に皮膚のひだを作製することが可能である。
【００１２】
この発見により、異なる層、とりわけ皮下組織を有する皮膚の三次元構造をエキソビボで忠実に再生する培養された皮膚外植片から恩恵を受けることが可能になる。それゆえ、このような外植片（人工培養組織）の存在により、初めて、エキソビボで皮下注入及び種々のパラメータを試験することが可能になる。本発明者らによるこの発見は、最初の皮下注入のためのエキソビボモデルの開発につながり、このモデルは、数日の培養の後でさえ皮膚の三次元構造を忠実に再生する。
【００１３】
従って、本発明の第１の態様は、インビトロ方法であって、
ｉ）表皮の上面が覆われないようにして皮膚外植片を固化性液体マトリクスに浸漬する工程であって、このマトリクス自体は細胞培養挿入物の中に含まれており、この細胞培養挿入物の底部は多孔質膜からなる工程と、
ｉｉ）上記表皮の上面が覆われていないこの皮膚外植片の浸漬された部分を捕捉するようにこのマトリクスを固化させて、この同じマトリクスを上記挿入物の側壁及び多孔質膜に接着する工程と
を備え、
上記皮膚外植片は、厚さが少なくとも５ｍｍの皮下組織を含み、上記方法は、皮下注入のためのエキソビボモデルを得ることを目的とすることを特徴とするインビトロ方法に関する。
【００１４】
有利には、本発明に係る方法は、
ｉｉｉ）上記挿入物を容器又は培養ウェルに置く工程と、
ｉｖ）上記皮膚外植片を適切な培地の中で培養する工程と
をさらに備える。
【００１５】
本発明の第２の態様は、本発明に係る方法によって得られる細胞培養挿入物であって、この細胞培養挿入物は容器又は培養ウェルの中に置くことができ、この細胞培養挿入物は多孔質膜からなる底部を有し、この細胞培養挿入物は、上記挿入物の内縁及び多孔質膜と接触している固化したマトリクスの中に捕捉された皮膚外植片を含有し、この皮膚外植片の表皮は、雰囲気と接触しており、この皮膚外植片の真皮、表皮付属器、及び皮下組織は、上記固化したマトリクスの中に捕捉されている細胞培養挿入物に関する。
【００１６】
この挿入物は、本発明に係る方法によって得られる皮下注入のためのエキソビボモデルを構成するということに留意されたい。
【００１７】
本発明の第３の態様は、皮下注入のためのエキソビボモデルとしてのこのような挿入物の使用に関する。
【００１８】
有利には、組成物の注入性の決定のために、その組成物のボーラス注入を行い、上記組成物の注入から生じる局所毒性及び／又は上記組成物の有効性を用いる。
【００１９】
本発明の第４の態様は、このような挿入物と、自動注入デバイスとを含むキットであって、好ましくは、組成物の注入特性を決定することができるように動力計に結合されているキットに関する。
【図面の簡単な説明】
【００２０】
【図１】図１は、底部が多孔質膜（２）からなり、かつ固化したマトリクス（４）の中に捕捉された皮膚外植片（３）を含有する取っ手（５）を伴う細胞培養挿入物（１）の描写である。
【図２Ａ】図２Ａは、本発明に係る方法で使用された２人の別々の提供者のうちの１人に由来する皮膚外植片の、０日間、３日間、及び７日間の培養における断面を示す。
【図２Ｂ】図２Ｂは、本発明に係る方法で使用された２人の別々の提供者のうちの１人に由来する皮膚外植片の、０日間、３日間、及び７日間の培養における断面を示す。
【図３】図３は、皮下注入のためのエキソビボモデルにおける皮膚外植片内の脂肪細胞サイズの経時的な安定性を図示する。
【図４】図４は、炎症促進性カクテルを脂肪組織に注入してから６時間、１２時間、及び２４時間後の皮膚外植片の断面を示す。
【発明を実施するための形態】
【００２１】
本発明の第１の態様に関して、「皮下注入」は、「皮下組織」注入とも呼ばれる、皮下組織において実施される注入（注射）を意味する。当業者に周知であるこのタイプの注入は、一般に、皮膚のひだが指を用いて作製される必要があり、次いで皮下注入は、その皮膚のひだにおいて実施される。
【００２２】
「皮膚外植片」は、表皮、真皮及び表皮付属器に加えて、厚さが少なくとも５ｍｍの皮下組織を含む皮膚断片を意味する。表皮付属器は、毛包（毛嚢）、皮脂腺、及び汗腺に対応する。皮下組織は、皮膚の真皮の直下の組織の層である。皮下組織は、血管新生が豊富で、脂肪組織も含有する疎性結合組織である。
【００２３】
理想的には、皮膚外植片は、５〜１５ｍｍの皮下組織、好ましくは５〜１０ｍｍの皮下組織を含む。
【００２４】
工程ｉ）に関連して、皮膚外植片の浸漬は、皮下組織が固化性液体マトリクスの中に完全に浸漬されるようにされ、真皮の上層に関しては、それは（厚さ方向において）少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、理想的には完全に浸漬される。同時に、上皮層は、皮膚外植片の表面上に、（厚さの方向に）少なくとも９０％、好ましくは少なくとも９５％、そしてここでも理想的には完全に現れる。
【００２５】
固化の段階に関しては、それは、皮下組織、真皮、及び表皮の露出が固化性液体マトリクスへの皮膚外植片の浸漬の段階に続くのと同じになるように、実施される。
【００２６】
皮膚外植片は、有利には形状が円筒形であるが、他の幾何形状が本発明に係る方法の実施に完全に好適である場合もある。かくして、正方形、矩形、楕円形、三角形、又は他の形状の皮膚外植片も考えられうる。
【００２７】
皮膚外植片の寸法は、皮膚のひだを作製できるように選択される必要があり、皮膚のひだの作製は、通常、細いクランプを用いて成し遂げられる。本発明では、皮下注入を行うために皮膚のひだを作製することが絶対的に必要というわけではない。自動化された皮下注入デバイスの場合には、例えば、そのような皮膚のひだは必要ではなく、この注入は、皮下注入デバイスがあらかじめ設定された外植片の中へ針浸透深さで注入するように、皮下注入デバイスを設定することにより実施することができる。
【００２８】
円筒形の皮膚外植片の場合、１０ｍｍ〜５０ｍｍ、好ましくは１５ｍｍ〜４０ｍｍ、又はさらには１５ｍｍ〜３０ｍｍ、典型的には１７ｍｍ〜２３ｍｍの範囲の値の直径を有する皮膚外植片を使用する必要がある。
【００２９】
この皮膚外植片が哺乳動物から採取される場合、その選択はヒトか又はブタかである。本発明では、本発明に係る方法の好ましい目的を考慮して、ヒトの皮膚の外植片を使用することが最良であろう。
【００３０】
皮膚外植片の起源に関して、皮膚外植片は、腹部、胸部、臀部、背中、さらには、当然、頭皮又は皮膚がある身体の任意の他の部分の形成術を含め、身体の任意の部分からの形成術に由来することができる。
【００３１】
インビトロでの皮膚外植片の良好な生存から恩恵を受けるために、本発明に係る方法における使用の７２時間前より以降に皮膚外植片が取り出されることが好ましい。本発明では、４８時間前より以降に採取された外植片が使用されることが好ましい。通常、皮膚外植片が採取されると、その皮膚外植片が本発明に係る方法において使用できるようになるまでに少なくとも１時間かかる。
【００３２】
国際公開第２０１３／１６４４３６号パンフレットに記載された方法と比べて、ある点で改良を構成する本発明に係る方法では、使用される皮膚外植片の際だった性質のため、疎水性材料からなりかつ十分な浮力を液体マトリクス内の外植片にもたらすことになる環（又は穿孔した円盤）と皮膚外植片との結合を省略することが可能になる。
【００３３】
実際、本発明者らは、少なくとも５ｍｍの厚さの存在により、十分な浮力を液体マトリクスにある皮膚外植片にもたらすことが可能になり、そのため、さらなる手段を使用して皮膚外植片の浮力を向上させる必要がないことを見出した。
【００３４】
結果として、そして好ましいと考えられてもよい一実施形態によれば、本発明に係る方法は、工程ｉ）の前に、皮膚外植片に、特に上皮表面に、疎水性材料を固定する何らかの工程を備えないことになる。この疎水性材料は、通常、皮膚外植片の浮力を向上させるために使用される。
【００３５】
本発明では、たとえ必要でなくても、そのような予備工程を選択肢に入れることも可能である。実際、この環の固定は、試験対象の化合物のための局所投与の領域を規定することを可能にする。この場合、本発明に係る方法は、固化性液体マトリクスへの皮膚外植片の浸漬に先だって、皮膚外植片の表皮の表面に、疎水性材料からなる環又は穿孔した円盤を固定する工程ｉ）を備えることになり、その環又は穿孔した円盤の外径は、皮膚外植片の上皮表面の外径よりも大きく、その内径は、皮膚外植片のこの上皮表面の内径と同じである。
【００３６】
この環を作製するために使用することができる疎水性材料としては、皮膚に対して有毒ではない材料が好ましく、例えば、ＰＡＲＡＦＩＬＭ（登録商標）（ＳＩＧＭＡ）等のパラフィンポリマー、又はシリコーンポリマーが挙げられる。
【００３７】
皮膚外植片の表皮の表面へのこの環の固定に関しては、その固定は、好ましくは接着剤によって実施され、この接着剤は、環の下方表面に添加されることが好ましい。この接着剤は、皮膚に害を与えず環を皮膚外植片の上皮表面に接着させる任意の種類の材料から選択することができる。通常、疎水性の接着剤、例えばシリコーンベースの接着剤等、を選択することができる。
【００３８】
「固化性液体マトリクス」は、好適な条件、とりわけ特定の温度条件を実行するときに固体又はゲルのような粘稠度を帯びるような特定の組成（化合物（１又は複数）及び濃度の両方の点で）を有する任意の液体溶液を意味する。本発明では、この固化性マトリクスの性質は、皮膚生検細胞が生き続けられるようにする、つまり細胞傷害効果を何ら有さず室温（つまり１５℃〜２５℃）の固化／重合温度を有する必要がある。その特定の組成物は、動物由来、野菜由来、合成物由来、又はさらには混合物由来であることができる。加えて、これらの成分の性質及び濃度（１又は複数）は、固化したときのマトリクスの所望の物理化学的特性に応じて、特に柔軟性及び強度の点で選択されることになる。液体マトリクスの体積に関しては、それは挿入物の全量の１／３〜２／３、好ましくは全量の２／５〜３／５であり、挿入物の全量の半分が好ましい体積である。この固化性液体マトリクスの選択に関しては、固化性液体マトリクスは、皮膚外植片を構成する細胞の生存及び培養と適合する特定の条件下で固体又はゲルの形態をとることができる液体溶液、好ましくは栄養を含む液体溶液から選択されることになる。そのような固化性液体マトリクスの例は、血漿、血漿由来の溶液（例えば生理的緩衝液中の血漿の希釈液、特に少なくとも１０％、２０％、３０％、又はさらには少なくとも４０％（重量／マトリクスの総重量）への血漿の希釈液）、フィブリノーゲン溶液、コラーゲン溶液、ゼラチン溶液、合成ポリマー溶液、天然ポリマー溶液（例えばアガロース（低融点アガロース又は寒天）、デンプン、多糖類）、及びこれらの混合物である。理想的には、この固化性液体マトリクスは、成長因子を含有せず、そして血清も含有しないことがさらによい。
【００３９】
好ましい実施形態によれば、固化性液体マトリクスは、２つの溶液で構成され、これらの溶液は、皮膚外植片を浸漬する工程ｉ）に先だって一緒に挿入物の中で混合される。その場合、このマトリクスは、血漿溶液、血漿由来の溶液、フィブリノーゲン溶液、コラーゲン溶液、及びこれらの混合物から選択される第１溶液と、低融点アガロース又は寒天の第２溶液とから構成される。
【００４０】
血漿溶液、血漿由来の溶液、フィブリノーゲン溶液、コラーゲン溶液、又はこれらの混合物から選択される第１溶液は、有利には栄養液である。本発明では、この第１溶液は、主に、温度の上昇若しくは下降の作用のもとで、及び／又は特定の化合物若しくは組成物の添加により固化することができる。好ましくは、この第１溶液を固化させることができる化合物はＣａ２＋イオンである。従って、液体マトリクスは、１ｍＭ〜５ｍＭ、好ましくは１．５ｍＭ〜４．５ｍＭのＣａ２＋濃度を有する。この濃度は、液体マトリクスを固化させる。
【００４１】
第１の特定の実施形態によれば、液体マトリクスは、１ｍＭ〜２ｍＭ、好ましくは１．２ｍＭ〜１．４ｍＭのＣａ２＋濃度を有する。
【００４２】
第２の特定の実施形態によれば、液体マトリクスは、２ｍＭ〜３ｍＭ、好ましくは２．５ｍＭ〜２．９ｍＭ、より好ましくは２．８ｍＭのＣａ２＋のＣａ２＋濃度を有する。
【００４３】
血漿溶液又は血漿由来の溶液の場合、その溶液は、可逆的特性を有する抗凝固剤で最初に処理されることに留意されたい。この目的のために、この溶液は、少なくとも１つの抗線維素溶解剤、例えばクエン酸ナトリウム、トラネキサム酸又はアプロチニンを、所望の抗線維素溶解活性を得るのに十分な濃度で含む。好ましくは、液体マトリクスは、２〜５％の最終濃度（重量／マトリクスの総重量）のこの少なくとも１つの抗線維素溶解剤を有する。
【００４４】
本発明では、上記第１溶液は、好ましくはフィブリノーゲン溶液であることになる。
【００４５】
低融点アガロース又は寒天の第２溶液は、液体であるのに十分な時間及び温度で、かつ上記挿入物の中で第１溶液と混合されるための十分な時間、及び皮膚外植片が浸漬されるまでの間、約３７℃で液体で留まるのに十分な時間及び温度であらかじめ加熱される。通常、この第２溶液は、その融解温度又はそれよりわずかに高い温度に、好ましくは６５℃〜７０℃の温度に予熱される。低融点アガロース又は寒天の選択は、１．５％（重量／組成物総重量）溶液の溶液について、２４℃〜２８℃のゲル化温度、及び６５．５℃超の融解温度の恩恵を受けるようになされる。例として、低融点ＬＭＰアガロース（ＧＩＢＣＯＢＲＬ、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ（ライフ・テクノロジーズ））と呼ばれるアガロースを挙げることができる。さらにこの第２溶液に関連して、低融点アガロース又は寒天のその濃度は、１％〜５％（好ましくは生理溶液中）、より好ましくは２％〜５％、３％〜４．５％、３．５％〜４．５％、又は３．８％〜４．２％、又は３．９％〜４．１％であり、４％が最も好ましい濃度（組成物の総重量に対する重量による）である。この濃度で、及びいったんその融点又はそれよりわずかに高い温度に加熱されると、この低融点アガロース又は寒天の第２溶液は、３７°で少なくとも１時間、理想的には少なくとも４時間、１０時間、又は１６時間、液体の形態で保存することができる。好ましくは、上記第１溶液及び第２の低融点アガロース又は寒天溶液を含むこの固化性液体マトリクスは、０．１％〜２％、好ましくは０．２％〜１．８％（重量／マトリクスの総重量）の低融点アガロース又は寒天の最終濃度を有する。このような濃度により、固化すると三次元構造を保存し上記皮膚断片又は生検を生きたまま保つことが可能になるマトリクスを得ることだけでなく、固体であるが十分に柔軟性があり非脆弱性で局所的な衝撃に対して抵抗性があるマトリクスを得ることも可能になる。上記液体マトリクスは、皮膚断片又は生検を置いた後に、このようにして得られたデバイスを３７℃〜室温、好ましくは２０℃の温度で放置することにより固化される。
【００４６】
第１の特定の実施形態によれば、液体マトリクス（上記第１溶液及び上記第２溶液を含む）の中の低融点アガロース又は寒天の最終濃度は、０．５％〜２％、好ましくは０．５％〜１．２５％、より好ましくは０．５％〜１．０％であり、０．７％の濃度（重量／マトリクスの総重量）が最も好ましい濃度である。
【００４７】
第２の特定の実施形態によれば、液体マトリクス（上記第１溶液及び上記第２溶液を含む）の中の低融点アガロース又は寒天の最終濃度は、０．１％〜２％、好ましくは０．２％〜１．７５％であり、０．２５％が最も好ましい濃度である。このような濃度により、固化すると、三次元構造を保存すること、及び皮膚外植片を生きたまま保つことの両方が可能になるマトリクスを得ること、並びに同時に、十分に柔軟性があり非脆弱性で皮膚外植片に加えられる機械的な効果に対して十分に抵抗性があるマトリクスを得ることが可能になる。この液体マトリクスは、皮膚外植片を浸漬した後に、その全体を放冷することにより固化される。
【００４８】
別の好ましい実施形態によれば、上記固化性液体マトリクスは、皮膚外植片を構成する細胞以外の細胞をさらに含み、この細胞は、線維芽細胞、内皮細胞及び神経細胞からなる群から選択される。好ましくは、これらの細胞は、線維芽細胞であり、理想的には、（包皮細胞株とは反対に）初代線維芽細胞、例えばヒトの包皮から得た皮膚線維芽細胞である。これらの初代の、とりわけ皮膚の、線維芽細胞は、当業者に周知の標準的な方法（例えば文献ＨＯＷＡＲＤ  ＢＶら、Ａ  ｎｅｗ  ｍｅｔｈｏｄ  ｆｏｒ  ｔｈｅ  ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ  ｏｆ  ｄｉｐｌｏｉｄ  ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ  ｃｅｌｌ  ｃｕｌｔｕｒｅｓ  ｆｒｏｍ  ｈｕｍａｎ  ｆｏｒｅｓｋｉｎｓ、Ｐｒｏｃ．Ｓｏｃ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．Ｍｅｄ．、第１５３（２）巻、２８０−３頁、１９７６を参照）から調製して得ることができる。好ましくは、これらの細胞、とりわけ線維芽細胞は、５．１０３〜５．１０５細胞／ｍＬ、好ましくはさらに１０４〜１０５細胞／ｍＬの濃度でマトリクスに含有され、３．１０４〜５．１０４細胞／ｍＬの範囲が最も好ましい濃度範囲である。
【００４９】
加えて、液体マトリクスは、防腐剤、ｐＨ剤等の種々の化合物を含んでもよい。例として、液体マトリクスは、５〜５００ｍｇ／ｍＬ、好ましくは２５〜７５ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸を含有し、好ましいアスコルビン酸濃度は５０ｍｇ／ｍＬである。
【００５０】
第３の、同じく好ましい実施形態によれば、固化性液体マトリクスは血漿由来の溶液であり、
ａ）２５〜７５％（体積／全量＾＊）、好ましくは３５％〜４５％（ｖ／ｖ）のフィブリノーゲン、
ｂ）５％〜１２％（体積／全量）、好ましくは８％の１％ＣａＣｌ２生理食塩水溶液、
ｃ）好ましくは５％〜２％の抗線維素溶解剤であって、好ましくはトラネキサム酸又はアプロチニンから選択される抗線維素溶解剤、
ｄ）０．５％〜４％、好ましくは１％〜２％の低融点アガロース、及び
ｅ）１００％にするための０．９％  ＮａＣｌ溶液等の生理溶液
を含む。
【００５１】
固化性マトリクス及びその中に皮膚外植片を置くための方法についてのより多くの詳細のために、欧州特許出願公開第ＥＰ２  ８８２  ２９０  Ａ１号明細書を参照されたい。本発明では、これらのマトリクス及び方法は、参照によりこの特許出願に組み込まれる。
【００５２】
挿入物に関しては、それは複数の形態をとることができ、特にそれは、懸垂式の挿入物又は高床式の挿入物に対応することができる。本発明では、懸垂式の挿入物が好ましく使用される。この挿入物の底部は多孔質膜からなり、その多孔質膜の直径は５〜４０ｍｍ、より好ましくは９．５〜３０ｍｍである。この膜の多孔性に関しては、それは、液体マトリクスが固化する前に液体マトリクスがその膜を通り抜けることを防ぐようなものである必要がある。通常、この多孔質膜は、０．４〜８μｍ、好ましくは０．４μｍ〜１．５μｍの多孔性を有し、０．８μｍ〜１．２μｍの範囲が好ましい多孔性の範囲である。材料の点では、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ニトロセルロース、及びポリカーボネートの膜から選択される多孔質膜を使用することができる。最後に、そしてこのような挿入物の例として、会社ＮＵＮＣ、ＣＯＲＮＩＮＧ（コーニング）、ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ（ベクトン・ディッキンソン）（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（ミリポア）（ＭＩＬＬＩＣＥＬＬ）から供給されるものを挙げることができ、これらはポリカーボネート、ＰＥＴ、又はニトロセルロースの膜を有する挿入物の形態をとることができ、これらの膜は６穴、８穴、１２穴又は２４穴の培養プレート用の多穴プレートの中であらかじめ包装され、その膜多孔性は、０．４〜８μｍの範囲であることができる。通常、使用される挿入物は、０．８μｍ〜１μｍの多孔性を有するＰＥＴ膜を有し、８穴培養プレートのウェルに好適である。
【００５３】
液体マトリクスを固化させる工程は、カルシウムイオンの存在下で、好ましくはトロンビンも存在する状態で実施される。液体マトリクスが血漿溶液、血漿由来の溶液、フィブリノーゲン溶液、又はコラーゲン溶液を含有する液体マトリクスである場合、工程ｉｉ）でのこのマトリクスの固化は、トロンビンの添加後、及び／又は温度の上昇の後、及び／又はマトリクスに組み込まれた初代線維芽細胞等の細胞によって分泌された因子の存在下で、この溶液について得られる。有利には、この液体マトリクスは最大８時間後、好ましくは１時間未満のうちに固化し、固化工程の好ましい継続時間は、工程ｉ）における固化性液体マトリクスへの皮膚外植片の浸漬の後１０分未満である。
【００５４】
有利には、本発明に係る方法は、
ｉｉｉ）上記挿入物を容器又は培養ウェルに置く工程と、
ｉｖ）上記皮膚外植片を適切な培地の中で培養する工程と
をさらに備える。
【００５５】
通常、この挿入物が置かれる容器又はウェルは、６穴、８穴、１２穴、２４穴又は４８穴の細胞培養プレートのウェルである。本発明に係る方法で使用できる培養プレートの中には、特に会社ＮＵＮＣ、ＣＯＲＮＩＮＧ、ＢＥＣＴＯＮ  ＤＩＣＫＩＮＳＯＮ（ＢＤ  ＦＡＬＣＯＮ）、ＭＩＬＬＩＰＯＲＥ（ＭＩＬＬＩＣＥＬＬ）によって供給されるものが含まれる。
【００５６】
別の好ましい実施形態によれば、挿入物の底部は、挿入物を含有する容器／ウェルの底から１〜２．５ｍｍの距離に位置する。
【００５７】
本発明に係る方法は、この容器又はウェルを水密にする観点から、工程ｉｉｉ）の後に、さらには、工程ｉｉｉ）で挿入物が置かれた容器又はウェルにカバー又はフィルムを取り付けることからなる工程ｉｉｉ’）を備えてもよい。このようにして、得られた容器又はウェルは、陸上であれ、海上であれ、又は空中であれ、困難なく輸送することができる。実際、この皮膚外植片は、捕捉され、従って固体マトリクスによって多孔質膜を有する挿入物の中でしっかりと保持されているだけでなく、栄養供給されているので、輸送中培養培地なしで生きたまま移送されることができる。
【００５８】
「培養」又は「培養すること」は、本明細書中では、特に、皮膚外植片、それゆえその皮膚外植片を形成する細胞の生理的な状態、及び適宜、形態学的な状態を保つことを意味する。従って、この工程の目的は、細胞死現象を制限し、細胞の分化の状態を維持すること（実際には、不適切な脱分化又は分化現象を制限すること）である。
【００５９】
「培地」又は「培養培地」は、皮膚外植片細胞の培養のために必要な要素のすべてを含む液体組成物（例えばウィリアム（Ｗｉｌｌｉａｍ’ｓ）Ｅ培地、ＫＢＭ、ＤＭＥＭなど）を意味する。この培養培地は、その性質によるだけでなく容器中のその体積によっても、皮膚外植片及びそれを構成する細胞の生存を経時的に促進することを支援する。皮膚外植片の細胞の生存に加えて、この培養培地は、特に細胞へのストレスを制限することにより、皮膚外植片の細胞を構造の点でも機能の点でもその初期状態で維持することを可能にする。
【００６０】
本発明に係る方法が上記の工程ｉｉｉ’）を備えない場合、本発明に係る方法は、この容器又はウェルを水密にする観点から、工程ｉｉｉ）の後に、工程ｉｉｉ）で挿入物が置かれた容器又はウェルにカバー又はフィルムを取り付けることからなる工程ｉｖ’）を備えることができよう。このようにして、得られた容器又はウェルは、陸上であれ、海上であれ、又は空中であれ、困難なく輸送することができる。
【００６１】
好ましい実施形態によれば、本発明に係る方法は、
ｖ）皮下に、及び皮膚外植片に、組成物を注入する工程
をさらに備える。
【００６２】
この組成物は、液体形態にある試験組成物である。有利には、この組成物の体積は、１０μＬ〜１ｍＬ、好ましくは１０μＬ〜５００μＬ、特に好ましくは１０μＬ〜２００μＬである。
【００６３】
組成物の注入のための針は、典型的には、皮下組織に到達するのに十分な長さを有する。従って、長さが１０ｍｍ以上の針が好ましく使用される。このような針の例として、長さが１２ｍｍ、１６ｍｍ、２０ｍｍ、２５ｍｍ、３０ｍｍ、３５ｍｍ、４０ｍｍ又はさらには４５ｍｍの針が使用されてもよい。有利には、こうした針は、１６〜４５ｍｍの長さ、好ましくは２０〜４０ｍｍの長さを有する。使用されるべき針の直径に関しては、当業者の一般的知識に従って当業者によって単純に特定されることができる。通常、このような皮下注入針は１８Ｇ、１９Ｇ、２０Ｇ、２１Ｇ、２２Ｇ、２３Ｇ、２５Ｇ、２６Ｇ、２７Ｇ、２８Ｇ、２９Ｇ、３０Ｇ、又はさらには３１Ｇのタイプの針である。
【００６４】
特定の実施形態では、工程ｖ）は、実験者によって実施される。そのような場合、注入工程ｖ）は、その直前に、皮膚のひだの形成を可能にし、実験者にとって皮下注入工程ｖ）を容易にするように、実験者によって皮膚外植片をつまむ工程ｖ°）に先行されてもよい。
【００６５】
別の特定の実施形態では、この工程ｖ）は、自動注入デバイスによって実施される。通常、このデバイスは、表皮の表面に対して特定の深さでの注入を可能にし、これにより皮下注入が得られる。
【００６６】
別の好ましい実施形態によれば、本発明に係る方法は、
ｖｉ）上記組成物の注入性を決定する工程
をさらに備える。
【００６７】
注入工程ｖ）が実験者により実施されるとき、その実験者は、この組成物の注入性を決定することになる。これを行うために、この注入性を、この注入の特定の特徴と関連する任意の値と関連づけることが可能である。一例として、実験者は下記の尺度を使用することができよう。
スコア１：注入は不可能又は非常に困難；流動：ゼロ又は遅い（うねり）
スコア２：困難な注入；流動：最初は遅く（うねり）、次いで連続的
スコア３：的確な注入；流動：連続的
スコア４：容易な注入；流動：連続的
実験者は、与えられた組成物を数回注入することにより、その組成物に平均の注入性の値を割り当てることができる。
【００６８】
注入工程ｖ）が自動注入デバイスにより実施されるとき、注入性はこれにより決定される。これを行うために、自動注入デバイスは動力計に結合される。従って、この自動注入デバイスは、組成物の皮下注入のために必要な力（ｍＰａ）を測定することができる。
【００６９】
より具体的には、この動力計により、
１）シリンジプランジャーを移動させるために必要とされる力に対応する、初期摺動平衡応力（「初期摺動平衡応力」又はＰＢＦ）、
２）シリンジプランジャーがシリンジの末端でそのストロークを完了する前にシリンジプランジャーを移動させるための最大の力の測定値に対応する、最大力（Ｆｍａｘ）、及び／又は
３）シリンジプランジャーがその内容物を吐出するようにシリンジプランジャーを移動し続けるために必要とされる力に対応する、動的摺動平衡応力（「動的摺動平衡応力」又はＤＧＦ）
を測定することが可能になる。
【００７０】
これらの３つの値は、組成物の注入性の特徴である。
【００７１】
本発明では、及び別の好ましい実施形態によれば、本発明に係る方法は、
ｖｉ）上記組成物の注入から生じる局所毒性及び／又は上記組成物の有効性を用いて、上記組成物の注入ボーラスを決定する工程
を備えてもよい。
【００７２】
投与されるべき治療用量の知識に関連して、本発明に係る方法は、与えられた濃度の活性成分を有する組成物の体積を選択することにより、注入ボーラスを忠実に決定することを可能にする。
【００７３】
同様に、本発明に係る方法は、注入から生じる局所毒性を利用可能にすることを可能にする。これは、注入部位で形態学的分析及び／又は分子分析を実施することにより行うことができる。このような分析は、注入後にエキソビボ皮膚モデルを包埋し、得られたブロックから断面を調製し、最後に注入部位に位置するその断面を視覚的に及び／又は免疫組織化学的に分析することにより実施することができる。
【００７４】
最後に、組成物の有効性の決定に関しては、これは、組成物から生じる治療効果がエキソビボ注入モデルのレベルで決定できる場合にのみ可能である。
【００７５】
本発明の第２の態様に関しては、それは、本発明に係る方法の工程ｉｉ）の最後に得られる細胞培養挿入物である。
【００７６】
本発明では、細胞培養挿入物は、本発明に係る方法の工程ｉｉｉ’）の最後に得られる挿入物であってもよい。
【００７７】
この挿入物のすべての具体的な特徴は、上記されており、特にこの挿入物が、懸垂式の挿入物又は高床式の挿入物等の複数の形態をとることができることであり、取っ手（６０）の存在に起因して懸垂式の挿入物が好ましい。この挿入物は、特に、直径が５〜４０ｍｍ、特に９．５〜３０ｍｍであり、多孔性が０．４〜８μｍ、又はさらには０．４μｍ〜１．５μｍであり、かつポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ニトロセルロース、及びポリカーボネートの膜から選択される多孔質膜からなってもよい。
【００７８】
本発明の第３の態様に関連して、それはより具体的には、対象とする与えられた組成物の注入性の決定である。当然、この注入性は、組成物だけでなく、シリンジ、とりわけ使用される針にも依存する。
【００７９】
最後に、上で規定された挿入物と、自動注入デバイスとを含むキットは、好ましくは、組成物の注入特性を決定することができるように動力計に結合されている。好ましくは、この自動注入デバイスは、組成物の初期摺動平衡応力（ＰＢＦ）、最大力（Ｆｍａｘ）、及び動的摺動平衡応力（「動的摺動平衡応力」又はＤＧＦ）を決定することもできる。
【００８０】
以下の実施例は、単に本発明の主題の例証のために与えられたものであり、決してその制限を構成しない。
【実施例】
【００８１】
１）経時的な外植片の安定性
２人の別々の提供者由来の２つの完全な皮膚試料から皮膚外植片を調製する。この試料は表皮、真皮、及び皮下組織（１．５〜２ｃｍ）を含む。次いで、この外植片（表皮、真皮、及び皮下組織）を金属穿孔器を使用して切断し、直径１１〜２０ｍｍの円柱を得る。この円柱において、皮下組織の厚さは所望の値（０．５〜１ｃｍ）に調整されている。次いで、これらを、固化したマトリクスへの「包埋」の段階まで、緩衝生理食塩水溶液に浮いた状態で保つ。
【００８２】
次いで、各皮膚外植片を、ＮＡＴＩＶＥＳＫＩＮ（商標）モデルについて使用される方法と同様の方法を用いて包埋する。手短に言えば、カルシウムイオン（クエン酸ナトリウム）の存在下で可逆的特性を有する抗凝固剤で処理した血漿由来の溶液を含有する、底部に多孔質膜（ＰＥＴ製、１μｍ多孔性）を有する挿入物（ＭＩＬＬＩＣＥＬＬ（商標）８穴空洞）の上に、上記皮膚外植片をそっと置く。この溶液は、４２％血漿、５０％の０．９％ＮａＣｌ溶液、８％の１％ＣａＣｌ２塩溶液、抗線維素溶解剤（トラネキサム酸又はアプロチニン）、及び０．７％低融点融解アガロース（アガロースＬＭＰ  ＧＩＢＣＯＢＲＬ、ＬＩＦＥ  ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＩＥＳ）（６５．５℃のレンジで融解させる）を含有する。
【００８３】
凝固することにより、血漿は、皮膚外植片が接着する皮膚支持体として作用する。この凝固は、主に、カルシウムイオン及びトロンビンの存在下で、血漿中に存在するフィブリノーゲンが、共有結合によって一緒に連結されているフィブリン（線維素）分子の足場へ変換されることからなる。抗線維素溶解剤の機能は、血漿マトリクスを分解することができる酵素を阻害し、従って外植片の完全性を維持することである。この酵素は、皮膚外植片によって分泌される。
【００８４】
上記血漿溶液に含まれる０．７％アガロース溶液は、３７℃で徐々にゲル化し、これにより皮膚外植片をしっかりと挿入物の中に保持する。
【００８５】
図１は、底部が多孔質膜（２）からなり、かつ固化したマトリクス（４）の中に捕捉された後の皮膚外植片（３）を含有する取っ手（５）を伴うこのような細胞培養挿入物（１）を示す。
【００８６】
この皮膚外植片の全体を、培養液中で、表皮が空気と接触した状態で３７℃のＣＯ２培養器の中で７日間保つ。細胞培養プレートのウェルに置かれた（懸垂した）挿入物の中に含まれるカルシウム及びビタミンＣを添加したＤＭＥＭ培養培地を毎日変える。
【００８７】
両方の提供者について、皮膚外植片を、組織学的分析のためにパラフィンブロックの中に固定し包埋する前に、Ｄ０日、Ｄ３日、及びＤ７日の培養で採取する。
【００８８】
詳細には、最初にアルコール浴、次いで２番目のキシレン浴によって皮膚外植片を脱水する。最後に、パラフィンの第１浴によって、それまでに皮膚外植片に含まれていた水をパラフィンで置き換えることが可能になる。このパラフィン含浸した試料をそれらの浴から取り出し、包埋場所の近くまで持って行くために、底部が吸収剤紙で内張りされた容器に移す。
【００８９】
組織学的検査カセットの中に入れられた上記試料を５６℃の流動パラフィンに浸漬し、それらに含浸しているパラフィンを再び融解させる。
【００９０】
各試料に対して、組織学的検査カセットを開け、試料を可能であれば半分に切断する。包埋用型に流動パラフィンを充填し、試料（又は２つのサンプル片）をその型の中に置き、切断のために所望の方向に配向させる。同時に、型の底部のパラフィンを固化させてその中に試料を保持するために、この型を冷蔵したラックに移す。上面に試料リファレンスが付けてある組織学的検査カセットの蓋をカセットにかぶせ、パラフィンがそれを通るようにし（パラフィンは必要に応じて追加してよい）、次いでパラフィンをブロックへと固化させるために、この全体を冷えた保管場所（冷蔵庫、冷凍庫、冷所等）に数（５〜６）分間置き、これにより、試料を組織学的検査カセットの蓋を用いて正しい配向で捕捉する。この蓋はこのブロックの支持体となる。
【００９１】
ブロックが固化すると、ブロックを型から取り外す。過剰のパラフィンは、できるだけ包埋用カセットの蓋の側面で、へらで掻き取られる。
【００９２】
次いで、厚さが４〜５μｍの範囲の連続切片を、試料を内蔵しているパラフィンブロックの全長に沿って作製する。
【００９３】
図２Ａ及び図２Ｂは、０日、３日又は７日の培養の後に、本発明に係る方法で使用する２人の別々の提供者に由来する皮膚外植片に対して実施した染色（ヘマトキシリン及びエオシン）の結果を示す。
【００９４】
この結果は、構造（皮下組織を含む皮膚の異なる層が認識できる変化を示さない）及び生存率（著しい細胞死は認められない）の両方の点で、外植片の顕著な経時的な安定性を示す。
【００９５】
この分析を精密化するために、脂肪細胞の成長を画像解析（フリーフェアＩＭＡＧＥＪのＡＤＩＰＯＳＯＦＴ  ＰＬＵＧＩＮ）により経時的に追跡した。
【００９６】
図３は、０日及び７日の培養における、異なる外植片における表面積に依存する脂肪細胞の分布を示す。
【００９７】
ここでも、結果は、皮下注入のためのエキソビボモデルの皮膚外植片内での脂肪細胞の経時的な高い安定性を明らかにする。
【００９８】
最後に、これらの結果は、上記皮膚外植片がその皮下組織（並びにその真皮及び表皮）の経時的に安定な構造を有し、これにより上記皮膚外植片は完全な皮膚のエキソビボモデルとなることを示す。
【００９９】
２）皮下注入
皮膚外植片を上記のように調製する。
【０１００】
培養した皮膚外植片に対して実施した種々の試験は、これらの皮膚外植片に対して皮下注入を困難なく実施することができるということを示す。加えて、そして外植片が（…ｍｍのオーダーの）好適な直径を有する限りは、この注入を実施するように細いクランプを用いて皮膚のひだを作製することは容易である。これらの条件下では、外植片は完全に保持され、個体の皮膚のように正確に振る舞う。
【０１０１】
皮膚外植片が実際に皮下注入のためのエキソビボモデルであることを立証するために、本発明者らは、この皮膚外植片がインビボと同様に反応するかを調べた。
【０１０２】
この目的のために、ＴＮＦ−α（５００ｎｇ／ｍＬ）及びＬＰＳ（０．２ｍｇ／ｍＬ）からなる炎症促進性溶液１００μＬを、シリンジ及び長さ１２ｍｍの２７Ｇ針を使用してモデルの脂肪組織に注入した。次いで、このモデルを、細胞培養条件（３７℃の培養器、５％ＣＯ２、及び水飽和雰囲気で６時間、１２時間、又は２４時間）下で培養した。
【０１０３】
図４は、組織生存率及び構造に対する注入した溶液の効果を評価するために、厚さ５μｍのパラフィン切片に対して実施したＨ＆Ｅ染色を示す。
【０１０４】
これらの結果は、モデルの表皮における液胞化し濃縮された細胞の出現、及び真皮のコラーゲン繊維の部分的な分解を示し、これは、炎症促進性溶液の効果に結びつけられる変性を示唆する。
【０１０５】
結果として、これらの結果は、この皮下注入モデルの関連性を確認し、この皮下注入モデルは、実際にインビボで皮膚のように振る舞う。
【図１】
2021516542.tif 000003
【図２Ａ】
2021516542.tif 000004
【図２Ｂ】
2021516542.tif 000005
【図３】
2021516542.tif 000006
【図４】
2021516542.tif 000007
【国際調査報告】
2021516542.tif 000008
2021516542.tif 000009
2021516542.tif 000010
2021516542.tif 000011
2021516542.tif 000012
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