(57)【要約】  １つまたは複数のエピジェネティック修飾化合物を使用して幹細胞のベータ細胞への分化を促進する組成物および方法が本明細書で開示される。本開示は分化したベータ細胞を選別し富化する組成物および方法にも関する。本開示は増殖を低減させるために細胞集団を照射する組成物および方法にも関する。【選択図】図１
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【特許請求の範囲】
【請求項１】
膵前駆細胞またはその前駆体の集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、クロモグラニンＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞の割合が増加した、またはＣ−ペプチド陽性かつＮＫＸ６．１陽性（Ｃ−ＰＥＰ＋、ＮＫＸ６．１＋）の細胞の割合が増加した内分泌細胞の集団をもたらす、方法。
【請求項２】
膵前駆細胞またはその前駆体の集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、ＶＭＡＴまたはＣｄｘ２を発現する細胞の割合が減少した内分泌細胞の集団をもたらす、方法。
【請求項３】
前記エピジェネティック修飾化合物が、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち１つまたは複数を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項４】
前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、請求項３に記載の方法。
【請求項５】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＥＺＨ２阻害剤である、請求項４に記載の方法。
【請求項６】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、およびＥＰＺ６４３８からなる群から選択される、請求項４または５に記載の方法。
【請求項７】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、請求項６に記載の方法。
【請求項８】
前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させる前記ＤＺＮｅｐの濃度が、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約０．７５μＭ〜約２．５μＭ、または約１μＭ〜約２μＭである、請求項７に記載の方法。
【請求項９】
前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が少なくとも約０．５μＭである、請求項８に記載の方法。
【請求項１０】
前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が約１μＭである、請求項８に記載の方法。
【請求項１１】
前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである、請求項１１に記載の方法。
【請求項１３】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、およびＴＭＰ１９５からなる群から選択される、請求項１２に記載の方法。
【請求項１４】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、請求項１３に記載の方法。
【請求項１５】
前記エピジェネティック修飾化合物がＨＤＡＣ阻害剤およびＥＺＨ２阻害剤を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１６】
前記エピジェネティック修飾化合物がＤＺＮｅｐおよびＫＤ５１７０を含む、請求項１または２に記載の方法。
【請求項１７】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、請求項１から１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１８】
前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団を（ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、（ｉｉ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、（ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｖ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、および（ｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、請求項１から１７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１９】
（Ａ）前記ＳＨＨ経路阻害剤がＳＡＮＴ１を含む、
（Ｂ）前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
（Ｃ）前記γ−セクレターゼ阻害剤がＸＸＩを含む、
（Ｄ）前記ＥＧＦファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
（Ｅ）前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤がＬＤＮを含む、
（Ｆ）前記ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤がＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含む、
（Ｇ）前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がＧＣ−１を含む、
（Ｈ）前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
（Ｉ）前記ＲＯＣＫ阻害剤がチアゾビニンを含む、
請求項１８に記載の方法。
【請求項２０】
前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団を、ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む、請求項１８または１９に記載の方法。
【請求項２１】
前記接触させるステップが少なくとも３日間である、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２２】
前記接触させるステップが、前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団を前記エピジェネティック修飾化合物と３日を超える期間接触させるステップ、および前記期間のうち最初の３日間に前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団と前記接触させるステップの後で、前記ＳＨＨ経路阻害剤、前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、または前記ＥＧＦファミリーからの前記成長因子を除去するステップを含む、請求項２１に記載の方法。
【請求項２３】
前記接触させるステップが少なくとも５日間である、請求項１８から２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２４】
前記接触させるステップが約７日間である、請求項１８から２３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２５】
前記膵前駆細胞の集団のうち少なくとも１個の細胞がＰＤＸ１およびＮＫＸ６−１のうち少なくとも１つを発現する、請求項１から２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２６】
前記膵前駆細胞の集団のうち少なくとも１個の細胞がＰＤＸ１およびＮＫＸ６−１の両方を発現する、請求項１から２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２７】
前記内分泌細胞の集団のうち少なくとも１個の細胞がＣＨＧＡを発現する、請求項１から２６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２８】
前記内分泌細胞の集団のうち少なくとも１個の細胞がＣ−ペプチドおよびＮＫＸ６．１を発現する、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項２９】
前記内分泌細胞の集団が、フローサイトメトリーによって測定して、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、２２０％、２５０％、２８０％、３００％、３２０％、３５０％、３８０％、４００％、４２０％、４５０％、４８０％、または５００％高い割合のＣＨＧＡ＋細胞を含む、請求項１から２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３０】
前記内分泌細胞の集団が、フローサイトメトリーによって測定して、前記エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、２２０％、２５０％、２８０％、３００％、３２０％、３５０％、３８０％、４００％、４２０％、４５０％、４８０％、または５００％高い割合のＣ−ＰＥＰ＋、ＮＫＸ６．１＋細胞を含む、請求項１から２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３１】
前記内分泌細胞の集団が、フローサイトメトリーによって測定して、前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、２２０％、２５０％、２８０％、３００％、３２０％、３５０％、３８０％、または４００％低い割合の、ＶＭＡＴまたはＣｄｘ２を発現する細胞を含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項３２】
請求項１から３１のいずれか一項に記載の方法によって生成された細胞。
【請求項３３】
細胞集団を含む組成物であって、前記細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、
（ａ）少なくとも約２０％の、Ｃ−ペプチドおよびＮＫＸ６．１を発現する細胞、
（ｂ）少なくとも約６０％の、ＣＨＧＡを発現する細胞、
（ｃ）多くとも約２０％の、Ｃｄｘ２を発現する細胞、または
（ｄ）多くとも約４５％の、ＶＭＡＴ１を発現する細胞
を含む、組成物。
【請求項３４】
フローサイトメトリーによって測定して、少なくとも約３０％のＩＳＬ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の細胞および多くとも約２０％のＩＳＬ１陰性ＮＫＸ６．１陰性の細胞を含む細胞集団を含む組成物。
【請求項３５】
前記細胞集団が、少なくとも約３５％のＩＳＬ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の細胞を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３６】
前記細胞集団が、少なくとも約４０％のＩＳＬ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の細胞を含む、請求項３４に記載の組成物。
【請求項３７】
前記細胞集団が、多くとも約１５％のＩＳＬ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の細胞を含む、請求項３４から３６のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３８】
フローサイトメトリーによって測定して、
（ａ）少なくとも約２０％の、Ｃ−ペプチドおよびＮＫＸ６．１を発現する細胞、
（ｂ）少なくとも約６０％の、ＣＨＧＡを発現する細胞、および
（ｃ）多くとも約２０％の、Ｃｄｘ２を発現する細胞
を含む、請求項３３から３７のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項３９】
フローサイトメトリーによって測定して、多くとも約４５％の、ＶＭＡＴ１を発現する細胞を含む、請求項３８に記載の組成物。
【請求項４０】
エピジェネティック修飾化合物をさらに含む、請求項３３から３９のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項４１】
前記エピジェネティック修飾化合物が、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち１つまたは複数を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４２】
前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項４３】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＥＺＨ２阻害剤である、請求項４２に記載の組成物。
【請求項４４】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、およびＥＰＺ６４３８からなる群から選択される、請求項４２または４３に記載の組成物。
【請求項４５】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、請求項４４に記載の組成物。
【請求項４６】
前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させる前記ＤＺＮｅｐの濃度が、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約０．７５μＭ〜約２．５μＭ、または約１μＭ〜約２μＭである、請求項４５に記載の組成物。
【請求項４７】
前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が少なくとも約０．５μＭである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４８】
前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が約１μＭである、請求項４６に記載の組成物。
【請求項４９】
前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む、請求項４０から４８のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５０】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである、請求項４９に記載の組成物。
【請求項５１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、およびＴＭＰ１９５からなる群から選択される、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、請求項５０に記載の組成物。
【請求項５３】
前記エピジェネティック修飾化合物がＨＤＡＣ阻害剤およびＥＺＨ２阻害剤を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項５４】
前記エピジェネティック修飾化合物がＤＺＮｅｐおよびＫＤ５１７０を含む、請求項４０に記載の組成物。
【請求項５５】
（ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、（ｉｉ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、（ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｖ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、および（ｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤をさらに含む、請求項３３から５４のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項５６】
（Ａ）前記ＳＨＨ経路阻害剤がＳＡＮＴ１を含む、
（Ｂ）前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
（Ｃ）前記γ−セクレターゼ阻害剤がＸＸＩを含む、
（Ｄ）前記ＥＧＦファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
（Ｅ）前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤がＬＤＮを含む、
（Ｆ）前記ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤がＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含むか
（Ｇ）前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がＧＣ−１を含む、
（Ｈ）前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
（Ｉ）前記ＲＯＣＫ阻害剤がチアゾビニンを含む、
請求項５５に記載の組成物。
【請求項５７】
ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤を含む、請求項５５または５６に記載の組成物。
【請求項５８】
膵前駆細胞、およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤またはヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤のうち少なくとも１つを含む組成物。
【請求項５９】
内分泌細胞をさらに含む、請求項５８に記載の組成物。
【請求項６０】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである、請求項５８または５９に記載の組成物。
【請求項６１】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、およびＴＭＰ１９５からなる群から選択される、請求項６０に記載の組成物。
【請求項６２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、請求項６１に記載の組成物。
【請求項６３】
前記組成物中の前記ＫＤ５１７０の濃度が、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約０．７５μＭ〜約２．５μＭ、または約１μＭ〜約２μＭである、請求項６２に記載の組成物。
【請求項６４】
前記ＫＤ５１７０の前記濃度が少なくとも０．５μＭである、請求項６３に記載の組成物。
【請求項６５】
前記ＫＤ５１７０の前記濃度が約１μＭである、請求項６４に記載の組成物。
【請求項６６】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＥＺＨ２阻害剤である、請求項５８から６５のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項６７】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、およびＥＰＺ６４３８からなる群から選択される、請求項６６に記載の組成物。
【請求項６８】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、請求項６７に記載の組成物。
【請求項６９】
前記組成物中の前記ＤＺＮｅｐの濃度が、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約０．７５μＭ〜約２．５μＭ、または約１μＭ〜約２μＭである、請求項６８に記載の組成物。
【請求項７０】
前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が少なくとも約０．５μＭである、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７１】
前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が約１μＭである、請求項６９に記載の組成物。
【請求項７２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０であり、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、請求項５８に記載の組成物。
【請求項７３】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組成物である、請求項５８から７２のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７４】
（ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、（ｉｉ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、（ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｖ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、および（ｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤をさらに含む、請求項５８から７３のいずれか一項に記載の組成物。
【請求項７５】
（Ａ）前記ＳＨＨ経路阻害剤がＳＡＮＴ１を含むか、
（Ｂ）前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含むか、
（Ｃ）前記γ−セクレターゼ阻害剤がＸＸＩを含むか、
（Ｄ）前記ＥＧＦファミリーからの成長因子がベータセルリンを含むか、
（Ｅ）前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤がＬＤＮを含むか、
（Ｆ）前記ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤がＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含むか、
（Ｇ）前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がＧＣ−１を含むか、
（Ｈ）前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含むか、または
（Ｉ）前記ＲＯＣＫ阻害剤がチアゾビニンを含む、
請求項７４に記載の組成物。
【請求項７６】
ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤をさらに含む、請求項７４または７５に記載の組成物。
【請求項７７】
膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させて、内分泌細胞を含む細胞集団を産生させるステップ、および
前記内分泌細胞を含む細胞集団を成熟させて、グルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する少なくとも１個の膵β細胞を得るステップ
を含む方法。
【請求項７８】
前記細胞集団を（ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、（ｉｉ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、（ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｖ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、および（ｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、請求項７７に記載の方法。
【請求項７９】
（Ａ）前記ＳＨＨ経路阻害剤がＳＡＮＴ１を含む、
（Ｂ）前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
（Ｃ）前記γ−セクレターゼ阻害剤がＸＸＩを含む、
（Ｄ）前記ＥＧＦファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
（Ｅ）前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤がＬＤＮを含む、
（Ｆ）前記ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤がＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含む、
（Ｇ）前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がＧＣ−１を含む、
（Ｈ）前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
（Ｉ）前記ＲＯＣＫ阻害剤がチアゾビニンを含む、
請求項７８に記載の方法。
【請求項８０】
前記細胞集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む、請求項７８または７９に記載の方法。
【請求項８１】
前記細胞集団をヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と接触させるステップをさらに含む、請求項７７から８０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８２】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、請求項８１に記載の方法。
【請求項８３】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、およびＥＰＺ６４３８からなる群から選択される、請求項７７から８２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８４】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、請求項８３に記載の方法。
【請求項８５】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させる前記ステップが、前記内分泌細胞を含み、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、クロモグラニンＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞の割合が増加した、またはＣ−ペプチド陽性かつＮＫＸ６．１陽性（Ｃ−ＰＥＰ＋、ＮＫＸ６．１＋）の細胞の割合が増加した集団をもたらす、請求項７７から８４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８６】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させる前記ステップが、前記内分泌細胞を含み、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、ＶＭＡＴまたはＣｄｘ２を発現する細胞の割合が減少した集団をもたらす、請求項７７から８５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８７】
前記膵前駆細胞またはその前駆体のうち前記少なくとも１個の細胞がＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１の両方を発現する、請求項７７から８６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８８】
複数の幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させて前記膵前駆細胞またはその前駆体を含む前記細胞集団を得るステップをさらに含む、請求項７７から８７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項８９】
請求項７７から８８のいずれか一項に記載の方法によって産生された膵β細胞。
【請求項９０】
（ａ）Ｐｄｘ１陰性ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤およびトランスフォーメーション成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子と接触させ、それによりＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を産生させるステップ、および
（ｂ）前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記細胞集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させて、内分泌細胞を含む細胞集団を産生させるステップ
を含む方法。
【請求項９１】
前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤がＤＭＨ−１、その誘導体、類似体、または変異体を含む、請求項９０に記載の方法。
【請求項９２】
前記Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記ＤＭＨ−１の濃度が、約０．０１μＭ〜約１０μＭ、約０．０５μＭ〜約５μＭ、約０．１μＭ〜約１μＭ、または約０．１５μＭ〜約０．５μＭである、請求項９１に記載の方法。
【請求項９３】
前記Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記ＤＭＨ−１の濃度が約０．２５μＭのＤＭＨ−１である、請求項９１に記載の方法。
【請求項９４】
前記ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子がアクチビンＡを含む、請求項９１から９３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９５】
前記Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記アクチビンＡの濃度が、約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９６】
前記Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記アクチビンＡの濃度が少なくとも約５ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９７】
前記Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団に接触させる前記アクチビンＡの濃度が約２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡである、請求項９４に記載の方法。
【請求項９８】
前記Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団を接触させる前記ステップが、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、請求項９０から９７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項９９】
前記エピジェネティック修飾化合物が、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、およびブロモドメイン阻害剤からなる群から選択される化合物を含む、請求項９０から９８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１００】
前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、請求項９９に記載の方法。
【請求項１０１】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＥＺＨ２阻害剤である、請求項１００に記載の方法。
【請求項１０２】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、およびＥＰＺ６４３８からなる群から選択される、請求項１００または１０１に記載の方法。
【請求項１０３】
前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、請求項１０２に記載の方法。
【請求項１０４】
前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させる前記ＤＺＮｅｐの濃度が、約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約０．７５μＭ〜約２．５μＭ、または約１μＭ〜約２μＭである、請求項１０３に記載の方法
【請求項１０５】
前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が少なくとも約０．５μＭである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０６】
前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が約１μＭである、請求項１０４に記載の方法。
【請求項１０７】
前記エピジェネティック修飾化合物がヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む、請求項９０から１０６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１０８】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである、請求項１０７に記載の方法。
【請求項１０９】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、およびＴＭＰ１９５からなる群から選択される、請求項１０８に記載の方法。
【請求項１１０】
前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、請求項１０９に記載の方法。
【請求項１１１】
ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、請求項９０から１１０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１２】
前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記集団を（ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、（ｉｉ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、（ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｖ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、および（ｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む、請求項９０から１１１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１３】
（Ａ）前記ＳＨＨ経路阻害剤がＳＡＮＴ１を含む、
（Ｂ）前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤がレチノイン酸を含む、
（Ｃ）前記γ−セクレターゼ阻害剤がＸＸＩを含む、
（Ｄ）前記ＥＧＦファミリーからの成長因子がベータセルリンを含む、
（Ｅ）前記ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤がＬＤＮを含む、
（Ｆ）前記ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤がＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含むか、
（Ｇ）前記甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤がＧＣ−１を含む、
（Ｈ）前記プロテインキナーゼ阻害剤がスタウロスポリンを含む、または
（Ｉ）前記ＲＯＣＫ阻害剤がチアゾビニンを含む、
請求項１１２に記載の方法。
【請求項１１４】
前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む、請求項１１２または１１３に記載の方法。
【請求項１１５】
前記接触させるステップが少なくとも３日間である、請求項１１２から１１４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１６】
前記接触させるステップが、前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む前記集団を前記エピジェネティック修飾化合物と３日を超える期間接触させるステップ、および前記期間のうち最初の３日間に前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団と前記接触させるステップの後で、前記ＳＨＨ経路阻害剤、前記ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、または前記ＥＧＦファミリーからの成長因子を除去するステップを含む、請求項１１５に記載の方法。
【請求項１１７】
前記接触させるステップが少なくとも５日間である、請求項１１２から１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１８】
前記接触させるステップが約７日間である、請求項１１２から１１６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１１９】
前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して多くとも約１０％の、Ｃｄｘ２を発現する細胞を含む、請求項９０から１１８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２０】
前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団が、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤および前記トランスフォーメーション成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子と接触していない対応する細胞集団と比較して、より少ない割合の、Ｃｄｘ２を発現する細胞を含む、請求項９０から１１９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２１】
前記内分泌細胞を含む細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、少なくとも約４０％の、ＩＳＬ１およびＮＫＸ６．１を発現する細胞を含む、請求項９０から１２０のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２２】
前記内分泌細胞を含む細胞集団が、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤および前記トランスフォーメーション成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子と前記接触をしていない対応する細胞集団と比較して、より多い割合の、ＩＳＬ１およびＮＫＸ６．１を発現する細胞を含む、請求項９０から１２１のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２３】
前記内分泌細胞を含む細胞集団が、フローサイトメトリーによって測定して、多くとも約１５％のＩＳＬ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の細胞を含む、請求項９０から１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２４】
前記内分泌細胞を含む細胞集団が、前記骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤および前記トランスフォーメーション成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子と前記接触をしていない対応する細胞集団と比較して、より少ない割合のＩＳＬ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の細胞を含む、請求項９０から１２２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２５】
前記内分泌細胞を含む細胞集団を凍結保存するステップをさらに含む、請求項９０から１２４のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２６】
前記内分泌細胞を含む細胞集団が細胞クラスターであり、前記方法が、
（ａ）前記細胞クラスターから複数の細胞を分離するステップ、および
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記複数の細胞を再凝集培地中で培養して、前記複数の細胞の少なくとも一部に第２の細胞クラスターを形成させるステップ
をさらに含む、請求項９０から１２５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１２７】
前記分離するステップが、前記複数の細胞をフローサイトメトリーに供するステップを含まない、請求項１２６に記載の方法。
【請求項１２８】
前記再凝集培地が血清を含まない、請求項１２６または１２７に記載の方法。
【請求項１２９】
前記再凝集培地が外因性分化因子を含まない、請求項１２６から１２８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３０】
前記内分泌細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させて、グルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する少なくとも１個の膵β細胞を得るステップをさらに含む、請求項９０から１２９のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３１】
前記成熟させるステップが無血清培地中で実施される、請求項１３０に記載の方法。
【請求項１３２】
前記成熟させるステップがゼノフリー培地中で実施される、請求項１３０または１３１に記載の方法。
【請求項１３３】
前記成熟させるステップが外因性分化因子を含まない培地中で実施される、請求項１３０から１３２のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３４】
前記成熟させるステップがヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下で実施される、請求項１３０から１３３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１３５】
前記ＨＳＡが約０．１％〜約５％、約０．５％〜約２％の濃度で存在する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３６】
前記ＨＳＡが約１％の濃度で存在する、請求項１３４に記載の方法。
【請求項１３７】
（ａ）集団中の多能性幹細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と接触させることによって、前記多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ、
（ｂ）前記胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの成長因子と接触させることによって、前記胚体内胚葉細胞の少なくとも一部を原腸管細胞に分化させるステップ、
（ｃ）前記原腸管細胞をＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子と接触させることによって前記原腸管細胞の少なくとも一部をＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップ、
（ｄ）前記Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させることによって前記Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくとも一部をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップ、ならびに
（ｅ）前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、γ−セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させることによって前記Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくとも一部を少なくとも１個のＮＫＸ６．１＋かつＣ−ペプチド＋の細胞を含む細胞集団に分化させるステップ
を含む方法。
【請求項１３８】
請求項９０から１２９のいずれか一項または請求項１３７に記載の方法によって産生された内分泌細胞を含む細胞集団。
【請求項１３９】
請求項１３０から１３６のいずれか一項に記載の方法によって産生されるＳＣ−β細胞を含む細胞集団。
【請求項１４０】
内分泌細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞集団を約１００ｒａｄ〜約１００，０００ｒａｄの線量で約１分〜約６０分の時間の照射に曝露するステップを含む方法。
【請求項１４１】
幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、膵前駆細胞、または内分泌細胞を含む細胞集団を照射に曝露するステップを含み、前記照射が、照射に供されていない対応する細胞集団と比較して増殖能力が低減した細胞集団をもたらす、細胞の増殖を低減させる方法。
【請求項１４２】
前記細胞集団が、約１００ｒａｄ〜約５０，０００ｒａｄ、約１００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約１００ｒａｄ〜約１０，０００ｒａｄ、約２５０ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約５００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約１，０００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約２，５００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約５，０００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、または約１０，０００ｒａｄ〜約１５，０００ｒａｄの照射に曝露される、請求項１４０または１４１に記載の方法。
【請求項１４３】
前記細胞集団が約１０，０００ｒａｄの照射に曝露される、請求項１４０または１４１に記載の方法。
【請求項１４４】
前記細胞集団が、約１分〜約５５分、約１分〜約５０分、約１分〜約４５分、約１分〜約４０分、約１分〜約３５分、約１分〜約３０分、約１分〜約２５分、約１分〜約２０分、約１分〜約１０分、約１分〜約５分、約１０分〜約５５分、約１５分〜約５５分、約２０分〜約５５分、約２５分〜約５５分、約３０分〜約５５分、約２０分〜約４０分、または約２５分〜約３５分、照射に曝露される、請求項１４０から１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４５】
前記細胞集団が約３０分、照射に曝露される、請求項１４０から１４３のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４６】
前記照射がイオン化照射を含む、請求項１４０から１４５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４７】
前記イオン化照射がガンマ線、Ｘ線、紫外線放射、アルファ線、ベータ線、または中性子線を含む、請求項１４０から１４６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４８】
前記照射が、前記照射に供されていない対応する細胞クラスターと比較して増殖が低減した細胞集団をもたらす、請求項１４０から１４７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１４９】
前記細胞集団が、約５０μｍ〜約５００μｍ、約５０μｍ〜約３００μｍ、約５０μｍ〜約２００μｍ、約５０μｍ〜約１５０μｍ、約６００μｍ〜約１５０μｍ、約７００μｍ〜約１５０μｍ、約８０μｍ〜約１５０μｍ、または約６０μｍ〜約１００μｍの直径を有する第２の細胞クラスターを含む、請求項１４０から１４８のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５０】
（ａ）第１の細胞クラスターから複数の細胞を分離するステップ、および
（ｂ）ステップ（ａ）からの前記複数の細胞を再凝集培地中で培養して、前記複数の細胞の少なくとも一部に前記第２の細胞クラスターを形成させるステップ
をさらに含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５１】
前記分離するステップが、前記複数の細胞をフローサイトメトリーに供するステップを含まない、請求項１５０に記載の方法。
【請求項１５２】
前記第１の細胞クラスターが、第３の細胞クラスターを分離し、前記第３の細胞クラスターから分離した細胞を培養して、前記第１の細胞クラスターを形成させることによって得られる、請求項１５０または１５１に記載の方法。
【請求項１５３】
前記細胞クラスターが前記照射の前に凍結保存され、前記方法が、凍結保存された前記細胞クラスターを前記照射の前に解凍するステップをさらに含む、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５４】
前記細胞クラスターが前記照射に供されている間に凍結保存される、請求項１４９に記載の方法。
【請求項１５５】
凍結保存された前記細胞クラスターを照射の後に解凍し、前記内分泌細胞の少なくとも一部を分化させるステップをさらに含む、請求項１５４に記載の方法。
【請求項１５６】
膵前駆細胞またはその前駆体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させることによって前記内分泌細胞を含む前記細胞集団を得るステップをさらに含む、請求項１４０から１５５のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５７】
幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させ、それにより前記内分泌細胞を含む前記細胞集団を産生させるステップをさらに含む、請求項１４０から１５６のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５８】
前記内分泌細胞の少なくとも一部をｉｎ  ｖｉｔｒｏで膵β細胞に成熟させ、それにより細胞集団を産生させるステップをさらに含む、請求項１４０から１５７のいずれか一項に記載の方法。
【請求項１５９】
前記膵β細胞をそれを必要とする対象に埋め込むステップをさらに含む、請求項１５８に記載の方法。
【請求項１６０】
埋め込まれた前記膵β細胞が、前記対象において少なくとも約５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、またはそれより長く、血中グルコースレベルを制御するように構成されている、請求項１５９に記載の方法。
【請求項１６１】
請求項１４０から１５７のいずれか一項に記載の方法によって産生された内分泌細胞を含む細胞集団。
【請求項１６２】
請求項１５８から１６０のいずれか一項に記載の方法によって産生された膵β細胞を含む細胞集団。
【発明の詳細な説明】
【技術分野】
【０００１】
相互参照
[0001]本出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる２０１８年３月２日出願の米国仮特許出願第６２／６３７，９２３号の利益を主張する。
【背景技術】
【０００２】
[0002]膵島細胞の再生、可塑性、および機能を指令する分子機構の解明によって、糖尿病を治療するためのβ細胞置換戦略を改善し拡大することが可能である。幹細胞から誘導されたβ−細胞の産生によって、膵島細胞および膵臓器官の産生に向けた潜在的に有用なステップを提供することができる。幹細胞から誘導された組織によって治療可能な急速に進行する疾患の１つが糖尿病である。１型糖尿病は膵島におけるβ−細胞の自己免疫的破壊に起因する。２型糖尿病は末梢組織のインスリン抵抗性およびβ−細胞の機能異常に起因する。糖尿病患者、特に１型糖尿病を患っている患者は、新たなβ−細胞の移植によって治癒する可能性がある。死体ヒト膵島の移植を受けた患者は、この戦略によって５年またはそれ以上、インスリン依存性を脱することができるが、ドナー膵島の希少性およびその品質のために、このアプローチには限界がある。幹細胞からヒトβ−細胞の無制限な供給を産生できれば、この療法を数百万人の新たな患者に広げることができ、これは幹細胞の生物学を臨床に変換する重要なテストケースになり得る。
参照による組込み
[0001]本明細書に記述する全ての刊行物、特許、および特許出願は、それぞれの個別の刊行物、特許、または特許出願が参照により組み込まれていると具体的にかつ個別に示されていると同程度に、参照により本明細書に組み込まれる。他に指示がなければ、本明細書に記述する刊行物、特許、および特許出願は、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
【発明の概要】
【０００３】
[0002]一部の態様では、膵前駆細胞またはその前駆体の集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含む方法であって、接触させるステップが、エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、クロモグラニンＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞の割合が増加しまたはＣ−ペプチド陽性かつＮＫＸ６．１陽性（Ｃ−ＰＥＰ＋、ＮＫＸ６．１＋）細胞の割合が増加した内分泌細胞の集団をもたらす、方法が本明細書で提供される。
【０００４】
[0003]一部の態様では、膵前駆細胞またはその前駆体の集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含む方法であって、接触させるステップが、エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、ＶＭＡＴまたはＣｄｘ２を発現する細胞の割合が減少した内分泌細胞の集団をもたらす、方法が本明細書で提供される。
【０００５】
[0004]一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち１つまたは複数を含む。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＥＺＨ２阻害剤である。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、およびＥＰＺ６４３８からなる群から選択される。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の例では、膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させるＤＺＮｅｐの濃度は約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約０．７５μＭ〜約２．５μＭ、または約１μＭ〜約２μＭである。一部の例では、ＤＺＮｅｐの濃度は少なくとも約０．５μＭである。一部の例では、ＤＺＮｅｐの濃度は約１μＭである。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、およびＴＭＰ１９５からなる群から選択される。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０である。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はＨＤＡＣ阻害剤およびＥＺＨ２阻害剤を含む。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はＤＺＮｅｐおよびＫＤ５１７０を含む。一部の例では、本方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【０００６】
[0005]一部の例では、本方法は、膵前駆細胞またはその前駆体の集団を（ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、（ｉｉ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、（ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｖ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、および（ｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む。一部の例では、（Ａ）ＳＨＨ経路阻害剤はＳＡＮＴ１を含む、（Ｂ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む、（Ｃ）γ−セクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含む、（Ｄ）ＥＧＦファミリーからの成長因子はベータセルリンを含む、（Ｅ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮを含む、（Ｆ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤はＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含む、（Ｇ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はＧＣ−１を含む、（Ｈ）プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンを含む、または（Ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビニンを含む。一部の例では、本方法は、膵前駆細胞またはその前駆体の集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む。一部の例では、接触させるステップは少なくとも３日間である。一部の例では、接触させるステップは、膵前駆細胞またはその前駆体の集団をエピジェネティック修飾化合物と３日を超える期間接触させるステップ、および上記期間のうち最初の３日間に膵前駆細胞またはその前駆体の集団と接触させるステップの後でＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、またはＥＧＦファミリーからの成長因子を除去するステップを含む。一部の例では、接触させるステップは少なくとも５日間である。一部の例では、接触させるステップは約７日間である。一部の例では、膵前駆細胞の集団のうち少なくとも１個の細胞はＰＤＸ１およびＮＫＸ６−１のうち少なくとも１つを発現する。一部の例では、膵前駆細胞の集団のうち少なくとも１個の細胞はＰＤＸ１およびＮＫＸ６−１の両方を発現する。一部の例では、内分泌細胞の集団のうち少なくとも１個の細胞はＣＨＧＡを発現する。一部の例では、内分泌細胞の集団のうち少なくとも１個の細胞はＣ−ペプチドおよびＮＫＸ６．１を発現する。一部の例では、内分泌細胞の集団はフローサイトメトリーによって測定して、エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、２２０％、２５０％、２８０％、３００％、３２０％、３５０％、３８０％、４００％、４２０％、４５０％、４８０％、または５００％高い割合のＣＨＧＡ＋細胞を含む。一部の例では、内分泌細胞の集団はフローサイトメトリーによって測定して、エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、２２０％、２５０％、２８０％、３００％、３２０％、３５０％、３８０％、４００％、４２０％、４５０％、４８０％、または５００％高い割合のＣ−ＰＥＰ＋、ＮＫＸ６．１＋の細胞を含む。一部の例では、内分泌細胞の集団はフローサイトメトリーによって測定して、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団よりも少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、２２０％、２５０％、２８０％、３００％、３２０％、３５０％、３８０％、または４００％低い割合の、ＶＭＡＴまたはＣｄｘ２を発現する細胞を含む。
【０００７】
[0006]一部の態様では、本明細書で提供する任意の方法によって生成された細胞が本明細書で提供される。
[0007]一部の態様では、細胞集団を含む組成物であって、細胞集団がフローサイトメトリーによって測定して、（ａ）Ｃ−ペプチドおよびＮＫＸ６．１を発現する少なくとも約２０％の細胞、（ｂ）ＣＨＧＡを発現する少なくとも約６０％の細胞、（ｃ）Ｃｄｘ２を発現する多くとも約２０％の細胞、または（ｄ）ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約４５％の細胞を含む、組成物が本明細書で提供される。
【０００８】
[0008]一部の態様では、フローサイトメトリーによって測定して、少なくとも約３０％のＩＳＬ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の細胞ならびに多くとも約２０％のＩＳＬ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の細胞を含む細胞集団を含む組成物が本明細書で提供される。
【０００９】
[0009]一部の例では、細胞集団は少なくとも約３５％のＩＳＬ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の細胞を含む。一部の例では、細胞集団は少なくとも約４０％のＩＳＬ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の細胞を含む。一部の例では、細胞集団は多くとも約１５％のＩＳＬ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の細胞を含む。一部の例では、組成物はフローサイトメトリーによって測定して、（ａ）Ｃ−ペプチドおよびＮＫＸ６．１を発現する少なくとも約２０％の細胞、（ｂ）ＣＨＧＡを発現する少なくとも約６０％の細胞、および（ｃ）Ｃｄｘ２を発現する多くとも約２０％の細胞を含む。一部の例では、組成物はフローサイトメトリーによって測定して、ＶＭＡＴ１を発現する多くとも約４５％の細胞を含む。一部の例では、組成物はエピジェネティック修飾化合物をさらに含む。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち１つまたは複数を含む。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＥＺＨ２阻害剤である。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、およびＥＰＺ６４３８からなる群から選択される。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ組成物はＤＺＮｅｐである。一部の例では、膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させるＤＺＮｅｐの濃度は約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約０．７５μＭ〜約２．５μＭ、または約１μＭ〜約２μＭである。一部の例では、ＤＺＮｅｐの濃度は少なくとも約０．５μＭである。一部の例では、ＤＺＮｅｐの濃度は約１μＭである。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、およびＴＭＰ１９５からなる群から選択される。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０である。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はＨＤＡＣ阻害剤およびＥＺＨ２阻害剤を含む。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はＤＺＮｅｐおよびＫＤ５１７０を含む。一部の例では、組成物は（ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、（ｉｉ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、（ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｖ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、および（ｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤をさらに含む。組成物の一部の例では、（Ａ）ＳＨＨ経路阻害剤はＳＡＮＴ１を含む、（Ｂ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む、（Ｃ）γ−セクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含む、��Ｄ）ＥＧＦファミリーからの成長因子はベータセルリンを含む、（Ｅ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮを含む、（Ｆ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤はＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含む、（Ｇ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はＧＣ−１を含む、（Ｈ）プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンを含む、または（Ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビニンを含む。一部の例では、組成物はベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤を含む。
【００１０】
[0010]一部の態様では、膵前駆細胞、およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤またはヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤のうち少なくとも１つを含む組成物が本明細書で提供される。
【００１１】
[0011]一部の例では、組成物は内分泌細胞をさらに含む。組成物の一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、およびＴＭＰ１９５からなる群から選択される。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０である。一部の例では、組成物中のＫＤ５１７０の濃度は約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約０．７５μＭ〜約２．５μＭ、または約１μＭ〜約２μＭである。一部の例では、ＫＤ５１７０の濃度は少なくとも０．５μＭである。一部の例では、ＫＤ５１７０の濃度は約１μＭである。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＥＺＨ２阻害剤である。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、およびＥＰＺ６４３８からなる群から選択される。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の例では、組成物中のＤＺＮｅｐの濃度は約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約０．７５μＭ〜約２．５μＭ、または約１μＭ〜約２μＭである。一部の例では、ＤＺＮｅｐの濃度は少なくとも０．５μＭである。一部の例では、ＤＺＮｅｐの濃度は約１μＭである。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０であり、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の例では、組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ組成物である。一部の例では、組成物は（ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、（ｉｉ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、（ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｖ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、および（ｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤をさらに含む。一部の例では、（Ａ）ＳＨＨ経路阻害剤はＳＡＮＴ１を含む、（Ｂ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む、（Ｃ）γ−セクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含む、（Ｄ）ＥＧＦファミリーからの成長因子はベータセルリンを含む、（Ｅ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮを含む、（Ｆ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤はＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含む、（Ｇ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はＧＣ−１を含む、（Ｈ）プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンを含む、または（Ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビニンを含む。一部の例では、組成物はベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤をさらに含む。
【００１２】
[0012]一部の態様では、膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させて内分泌細胞を含む細胞集団を産生させるステップ、および内分泌細胞を含む細胞集団を成熟させてグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する少なくとも１個の膵β細胞を得るステップを含む方法が本明細書で提供される。
【００１３】
[0013]一部の例では、本方法は、細胞集団を（ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、（ｉｉ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、（ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｖ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、および（ｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む。一部の例では、（Ａ）ＳＨＨ経路阻害剤はＳＡＮＴ１を含む、（Ｂ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む、（Ｃ）γ−セクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含む、（Ｄ）ＥＧＦファミリーからの成長因子はベータセルリンを含む、（Ｅ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮを含む、（Ｆ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤はＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含む、（Ｇ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はＧＣ−１を含む、（Ｈ）プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンを含む、または（Ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビニンを含む。一部の例では、本方法は細胞集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は細胞集団をヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と接触させるステップをさらに含む。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０である。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、およびＥＰＺ６４３８からなる群から選択される。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップは、内分泌細胞を含み、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較してクロモグラニンＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞の割合が増加しまたはＣ−ペプチド陽性かつＮＫＸ６．１陽性（Ｃ−ＰＥＰ＋、ＮＫＸ６．１＋）の細胞の割合が増加した集団をもたらす。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップは、内分泌細胞を含み、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較してＶＭＡＴまたはＣｄｘ２を発現する細胞の割合が減少した集団をもたらす。一部の例では、膵前駆細胞またはその前駆体のうち少なくとも１個の細胞はＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１の両方を発現する。一部の例では、本方法は複数の幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化して膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団を得るステップをさらに含む。
【００１４】
[0014]一部の態様では、本明細書で提供される任意の方法によって産生された膵β細胞が本明細書で提供される。
[0015]一部の態様では、（ａ）Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤およびトランスフォーメーション成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子と接触させ、それによりＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を産生させるステップ、および（ｂ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させて内分泌細胞を含む細胞集団を産生させるステップを含む方法が本明細書で提供される。
【００１５】
[0016]一部の例では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＤＭＨ−１、その誘導体、類似体、または変異体を含む。一部の例では、Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団に接触させるＤＭＨ−１の濃度は約０．０１μＭ〜約１０μＭ、約０．０５μＭ〜約５μＭ、約０．１μＭ〜約１μＭ、または約０．１５μＭ〜約０．５μＭである。一部の例では、Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団に接触させるＤＭＨ−１の濃度は約０．２５μＭのＤＭＨ−１である。一部の例では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子はアクチビンＡを含む。一部の例では、Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団に接触させるアクチビンＡの濃度は約０．５ｎｇ／ｍＬ〜約２００ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ〜約１００ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ〜約５０ｎｇ／ｍＬ、または約５ｎｇ／ｍＬ〜約３０ｎｇ／ｍＬである。一部の例では、Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団に接触させるアクチビンＡの濃度は少なくとも約５ｎｇ／ｍＬまたは少なくとも約１０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡである。一部の例では、Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団に接触させるアクチビンＡの濃度は約２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡである。一部の例では、Ｐｄｘ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団を接触させるステップは、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、およびブロモドメイン阻害剤からなる群から選択される化合物を含む。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＥＺＨ２阻害剤である。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、およびＥＰＺ６４３８からなる群から選択される。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の例では、膵前駆細胞またはその前駆体の集団に接触させるＤＺＮｅｐの濃度は約０．０５μＭ〜約５０μＭ、約０．１μＭ〜約１０μＭ、約０．５μＭ〜約５μＭ、約０．７５μＭ〜約２．５μＭ、または約１μＭ〜約２μＭである。一部の例では、ＤＺＮｅｐの濃度は少なくとも約０．５μＭである。一部の例では、ＤＺＮｅｐの濃度は約１μＭである。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、およびＴＭＰ１９５からなる群から選択される。一部の例では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０である。一部の例では、本方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。一部の例では、本方法はＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前���細胞を含む集団を（ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、（ｉｉ）レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、（ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、（ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子、（ｖ）骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、（ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、（ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、および（ｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤からなる群から選択される薬剤と接触させるステップをさらに含む。一部の例では、（Ａ）ＳＨＨ経路阻害剤はＳＡＮＴ１を含む、（Ｂ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む、（Ｃ）γ−セクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含む、（Ｄ）ＥＧＦファミリーからの成長因子はベータセルリンを含む、（Ｅ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮを含む、（Ｆ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤はＡｌｋ５ｉ  ＩＩを含む、（Ｇ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はＧＣ−１を含む、（Ｈ）プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンを含む、または（Ｉ）ＲＯＣＫ阻害剤はチアゾビニンを含む。一部の例では、本方法は、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、およびスタウロスポリンからなる群から選択される薬剤と接触させるステップを含む。一部の例では、接触させるステップは少なくとも３日間である。一部の例では、接触させるステップは、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む集団をエピジェネティック修飾化合物と３日を超える期間接触させるステップ、および上記期間のうち最初の３日間に膵前駆細胞またはその前駆体の集団と接触させるステップの後でＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、またはＥＧＦファミリーからの成長因子を除去するステップを含む。一部の例では、接触させるステップは少なくとも５日間である。一部の例では、接触させるステップは約７日間である。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定してＣｄｘ２を発現する多くとも約１０％の細胞を含む。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤およびトランスフォーメーション成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子と接触していない対応する細胞集団と比較して、Ｃｄｘ２を発現するより少ない割合の細胞を含む。一部の例では、内分泌細胞を含む細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定してＩＳＬ１およびＮＫＸ６．１を発現する少なくとも約４０％の細胞を含む。一部の例では、内分泌細胞を含む細胞集団は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤およびトランスフォーメーション成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子と接触していない対応する細胞集団と比較して、ＩＳＬ１およびＮＫＸ６．１を発現するより多い割合の細胞を含む。一部の例では、内分泌細胞を含む細胞集団は、フローサイトメトリーによって測定して、多くとも約１５％のＩＳＬ−１陰��、ＮＫＸ６．１陰性の細胞を含む。一部の例では、内分泌細胞を含む細胞集団は、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤およびトランスフォーメーション成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子と接触していない対応する細胞集団と比較して、より少ない割合のＩＳＬ−１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の細胞を含む。一部の例では、本方法は内分泌細胞を含む細胞集団を凍結保存するステップをさらに含む。一部の例では、内分泌細胞を含む細胞集団は細胞クラスターであり、本方法は（ａ）細胞クラスターから複数の細胞を分離するステップ、および（ｂ）ステップ（ａ）からの複数の細胞を再凝集培地中で培養して複数の細胞の少なくとも一部に第２の細胞クラスターを形成させるステップをさらに含む。一部の例では、分離するステップは複数の細胞をフローサイトメトリーに供するステップを含まない。一部の例では、再凝集培地は血清を含まない。一部の例では、再凝集培地は外因性分化因子を含まない。一部の例では、本方法は内分泌細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させて、グルコースチャレンジに応答してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する少なくとも１個の膵β細胞を得るステップをさらに含む。一部の例では、成熟させるステップは無血清培地中で実施される。一部の例では、成熟させるステップはゼノフリー培地中で実施される。一部の例では、成熟させるステップは外因性分化因子を含まない培地中で実施される。一部の例では、成熟させるステップはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）の存在下で実施される。一部の例では、ＨＳＡは約０．１％〜約５％、約０．５％〜約２％の濃度で存在する。一部の例では、ＨＳＡは約１％の濃度で存在する。
【００１６】
[0017]一部の例では、本明細書で提供される方法は、（ａ）集団中の多能性幹細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と接触させることによって多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ、（ｂ）胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの成長因子と接触させることによって胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかを原腸管細胞に分化させるステップ、（ｃ）原腸管細胞をＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子と接触させることによって原腸管細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップ、（ｄ）Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させることによってＰｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップ、ならびに（ｅ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、γ−セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させることによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくともいくつかを少なくとも１個のＮＫＸ６．１＋かつＣ−ペプチド＋の細胞を含む細胞集団に分化させるステップを含む方法を含む。
【００１７】
[0018]一部の態様では、本明細書で提供される任意の方法によって産生された内分泌細胞を含む細胞集団が本明細書で提供される。一部の態様では、本明細書で提供される任意の方法によって産生されたＳＣ−β細胞を含む細胞集団が本明細書で提供される。
【００１８】
[0019]一部の態様では、内分泌細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞集団を約１００ｒａｄ〜約１００，０００ｒａｄの線量で約１分〜約６０分の時間の照射に曝露するステップを含む方法が本明細書で提供される。
【００１９】
[0020]一部の態様では、幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、膵前駆細胞、または内分泌細胞を含む細胞集団を照射に曝露するステップを含み、照射が照射に供されていない対応する細胞集団と比較して増殖能力が低減した細胞集団をもたらす、細胞の増殖を低減させる方法が本明細書で提供される。
【００２０】
[0021]一部の態様では、細胞集団は約１００ｒａｄ〜約５０，０００ｒａｄ、約１００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約１００ｒａｄ〜約１０，０００ｒａｄ、約２５０ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約５００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約１，０００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約２，５００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約５，０００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、または約１０，０００ｒａｄ〜約１５，０００ｒａｄの照射に曝露される。一部の例では、細胞集団は約１０，０００ｒａｄの照射に曝露される。一部の例では、細胞集団は約１分〜約５５分、約１分〜約５０分、約１分〜約４５分、約１分〜約４０分、約１分〜約３５分、約１分〜約３０分、約１分〜約２５分、約１分〜約２０分、約１分〜約１０分、約１分〜約５分、約１０分〜約５５分、約１５分〜約５５分、約２０分〜約５５分、約２５分〜約５５分、約３０分〜約５５分、約２０分〜約４０分、または約２５分〜約３５分、照射に曝露される。一部の例では、細胞集団は約３０分、照射に曝露される。一部の例では、照射はイオン化照射を含む。一部の例では、イオン化照射はガンマ線、Ｘ線、紫外線放射、アルファ線、ベータ線、または中性子線を含む。一部の例では、照射は、照射に供されていない対応する細胞クラスターと比較して増殖が低減した細胞集団をもたらす。一部の例では、細胞集団は約５０μｍ〜約５００μｍ、約５０μｍ〜約３００μｍ、約５０μｍ〜約２００μｍ、約５０μｍ〜約１５０μｍ、約６００μｍ〜約１５０μｍ、約７００μｍ〜約１５０μｍ、約８０μｍ〜約１５０μｍ、または約６０μｍ〜約１００μｍの直径を有する第２の細胞クラスターを含む。一部の例では、本方法は（ａ）第１の細胞クラスターから複数の細胞を分離するステップ、および（ｂ）ステップ（ａ）からの複数の細胞を再凝集培地中で培養して複数の細胞の少なくとも一部に第２の細胞クラスターを形成させるステップをさらに含む。一部の例では、分離するステップは複数の細胞をフローサイトメトリーに供するステップを含まない。一部の例では、第１の細胞クラスターは、第３の細胞クラスターを分離し、第３の細胞クラスターから分離した細胞を培養して第１の細胞クラスターを形成させることによって得られる。一部の例では、細胞クラスターは照射の前に凍結保存され、本方法は凍結保存された細胞クラスターを照射の前に解凍するステップをさらに含む。一部の例では、細胞クラスターは照射に供されている間に凍結保存される。一部の例では、本方法は凍結保存された細胞クラスターを照射の後に解凍し、内分泌細胞の少なくともいくつかを分化させるステップをさらに含む。一部の例では、本方法は膵前駆細胞またはその前駆体をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させることによって内分泌細胞を含む細胞集団を得るステップをさらに含む。一部の例では、本方法は幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化し、それにより内分泌細胞を含む細胞集団を産生させるステップをさらに含む。一部の例では、本方法は内分泌細胞の少なくともいくつかをｉｎ  ｖｉｔｒｏで膵β細胞に成熟させ、それにより  を含む細胞集団を産生させるステップをさらに含む。一部の例では、本方法は膵β細胞の埋め込みを必要とする対象に膵β細胞を埋め込む��テップをさらに含む。一部の例では、埋め込まれた膵β細胞は対象において少なくとも約５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、またはそれより長く、血中グルコースレベルを制御するように構成される。
【００２１】
[0022]一部の態様では、本明細書に記載した任意の照射方法によって産生された内分泌細胞を含む細胞集団が本明細書で提供される。一部の態様では、本明細書に記載した任意の照射方法によって産生された膵β細胞を含む細胞集団が本明細書で提供される。
【００２２】
[0023]一部の態様では、膵前駆細胞またはその前駆体の集団を少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物を含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、ＶＭＡＴまたはＣｄｘ２を発現する細胞の割合が減少した内分泌細胞の集団をもたらす、方法が本明細書で提供される。
【００２３】
[0024]一部の実施形態では、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物はＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＥＺＨ２阻害剤である。
【００２４】
[0025]一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、およびＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の実施形態では、組成物中のＤＺＮｅｐの濃度は０．１μＭより大きい。一部の実施形態では、ＤＺＮｅｐの濃度は少なくとも０．５μＭである。一部の実施形態では、ＤＺＮｅｐの濃度は約１μＭである。一部の実施形態では、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、およびＴＭＰ１９５のうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０である。一部の実施形態では、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物はＨＤＡＣ阻害剤およびＥＺＨ２阻害剤を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物はＤＺＮｅｐおよびＫＤ５１７０を含む。
【００２５】
[0026]一部の実施形態では、本明細書で提供する方法においてＶＭＡＴを発現する細胞のうち少なくとも１個はＩＮＳ−である。一部の実施形態では、膵前駆細胞の集団のうち少なくともいくつかの細胞はＰＨ細胞の集団に分化する。一部の実施形態では、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、内分泌細胞の集団のうちの増加した割合の細胞がＮＫＸ６．１−またはＣｈｒｏｍＡ＋である。一部の実施形態では、増加した割合の細胞のうち少なくとも１個の細胞はＮＫＸ６．１−かつＣｈｒｏｍＡ＋である。一部の実施形態では、膵前駆細胞の集団のうち少なくともいくつかの細胞がβ細胞の集団に分化させる。一部の実施形態では、β細胞は幹細胞から誘導されたβ（ＳＣ−β）細胞である。一部の実施形態では、β細胞はＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する。一部の実施形態では、β細胞はグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する。
【００２６】
[0027]一部の実施形態では、本明細書に記載した方法の組成物は、ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、またはスタウロスポリンのうち少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、接触させるステップは少なくとも３日間である。一部の実施形態では、接触させるステップは少なくとも５日間である。一部の実施形態では、接触させるステップは約７日間である。
【００２７】
[0028]一部の実施形態では、膵前駆細胞の集団のうち少なくとも１個の膵前駆細胞はＰＤＸ１およびＮＫＸ６−１のうち少なくとも１つを発現する。一部の実施形態では、内分泌細胞の集団のうち少なくとも１個の内分泌細胞はＣＨＧＡを発現する。
【００２８】
[0029]本明細書に記載した方法のいずれかによって生成した内分泌細胞が本明細書で提供される。
[0030]膵前駆細胞、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、および任意選択で内分泌細胞を含む組成物が本明細書で提供される。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、またはＴＭＰ１９５のうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０である。一部の実施形態では、組成物中のＫＤ５１７０の濃度は少なくとも０．１μＭである。一部の実施形態では、ＫＤ５１７０の濃度は少なくとも０．５μＭである。一部の実施形態では、ＫＤ５１７０の濃度は約１μＭである。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＥＺＨ２阻害剤である。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の実施形態では、ＤＺＮｅｐの濃度は少なくとも０．１μＭである。一部の実施形態では、ＤＺＮｅｐの濃度は少なくとも０．５μＭである。一部の実施形態では、ＤＺＮｅｐの濃度は約１μＭである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０であり、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の実施形態では、組成物はｉｎ  ｖｉｔｒｏ組成物である。一部の実施形態では、組成物はベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、またはスタウロスポリンのうち少なくとも１つをさらに含む。
【００２９】
[0031]膵前駆細胞またはその前駆体をヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップを含み、接触させるステップが膵前駆細胞の分化を誘起する、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、膵前駆細胞はβ細胞に分化される。一部の実施形態では、β細胞は幹細胞から誘導されたβ（ＳＣ−β）細胞である。一部の実施形態では、β細胞はＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する。一部の実施形態では、β細胞はグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、またはＴＭＰ１９５のうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０である。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＥＺＨ２阻害剤である。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０であり、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の実施形態では、本方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【００３０】
[0032]膵前駆細胞またはその前駆体を、細胞の分化をもたらすために十分な量のＫＤ５１７０と接触させるステップを含む方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、本方法は膵前駆細胞をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の実施形態では、膵前駆細胞は内分泌細胞に分化する。一部の実施形態では、膵前駆細胞はβ細胞に分化する。一部の実施形態では、β細胞は幹細胞から誘導されたβ（ＳＣ−β）細胞である。一部の実施形態では、β細胞はＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する。一部の実施形態では、β細胞はグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する。
【００３１】
[0033]（ａ）複数の幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化して膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団を得るステップ、（ｂ）細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と接触させて少なくとも１個の内分泌細胞を産生させるステップ、および（ｃ）内分泌細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させて少なくとも１個のＳＣ−β細胞を得るステップを含む方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、幹細胞はヒト多能性幹細胞である。一部の実施形態では、本方法は細胞集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、またはスタウロスポリンのうち少なくとも１つと接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞はＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞はグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する。一部の実施形態では、本方法は細胞集団をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０である。
【００３２】
[0034]膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団を、内分泌細胞を産生するために十分な量のヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップ、および内分泌細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させて、グルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する少なくとも１つのＳＣ−β細胞を得るステップを含む方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、本方法は複数の幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させて膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団を得るステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は細胞集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、またはスタウロスポリンのうち少なくとも１つと接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は細胞集団をヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０である。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。
【００３３】
[0035]（ｉ）標的細胞を刺激性化合物と接触させるステップであって、接触させるステップが標的細胞の選択マーカーを誘起して標的細胞の細胞表面に局在化させるステップ、および（ｉｉ）細胞表面の選択マーカーの局在化に基づいて標的細胞を選択するステップを含む、細胞の集団から標的細胞を選択するための方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、選択マーカーはＰＳＡ−ＮＣＡＭを含む。一部の実施形態では、標的細胞を選択するステップは細胞ソーティングによる。一部の実施形態では、選択するステップは、選択マーカーが標的細胞の表面に局在化しているときに標的細胞の選択マーカーを抗原結合ポリペプチドと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、抗原結合ポリペプチドは抗体を含む。一部の実施形態では、抗原結合ポリペプチドはＰＳＡ−ＮＣＡＭに結合する。一部の実施形態では、本方法は、細胞の集団を、細胞の集団のうち少なくとも１個の細胞の細胞表面から選択マーカーを除去する化合物と処理するステップをさらに含む。一部の実施形態では、細胞の集団は標的細胞を刺激性化合物と接触させるステップの前に上記化合物と処理される。一部の実施形態では、化合物は選択マーカーを少なくとも１個の細胞の細胞表面から開裂させる。一部の実施形態では、化合物は酵素である。一部の実施形態では、化合物はエンドシアリダーゼである。一部の実施形態では、エンドシアリダーゼはエンドニューラミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ｎ）である。一部の実施形態では、標的細胞は内分泌細胞である。一部の実施形態では、刺激性化合物はアルギニンまたはグルコースのうち少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、内分泌細胞はβ細胞である。一部の実施形態では、β細胞はＳＣ−β細胞である。一部の実施形態では、刺激性化合物はイソプロテレノールを含む。一部の実施形態では、内分泌細胞はＥＣ細胞である。一部の実施形態では、細胞の集団のうち１個または複数の細胞は刺激性化合物と接触したときに選択マーカーを細胞表面に局在化することができない。一部の実施形態では、刺激性化合物はグルコースまたはアルギニンのうち少なくとも１つであり、１個または複数の細胞はＥＣ細胞である。一部の実施形態では、刺激性化合物はイソプロテレノールであり、１個または複数の細胞はβ細胞である。一部の実施形態では、標的細胞を選択するステップは細胞の集団のうち１個または複数の細胞から標的細胞を分離する。
【００３４】
[0036]膵前駆細胞またはその前駆体の集団を少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物を含む組成物と接触させるステップを含み、接触させるステップが少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物と接触していない膵前駆細胞の対応する集団と比較して増加した割合の膵島細胞をもたらす、方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、膵島細胞は少なくとも１個のβ細胞を含む。一部の実施形態では、β細胞はＳＣ−β細胞を含む。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞はグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する。一部の実施形態では、膵島細胞は少なくとも１個のアルファ細胞を含む。一部の実施形態では、膵島細胞はデルタ細胞を含む。一部の実施形態では、膵島細胞はポリホルモナル（ＰＨ）細胞を含む。一部の実施形態では、本方法は複数の幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化して膵前駆細胞またはその前駆体の集団を得るステップをさらに含む。一部の実施形態では、幹細胞はヒト多能性幹細胞である。一部の実施形態では、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物はＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち１つまたは複数を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＥＺＨ２阻害剤である。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一部の実施形態では、組成物中のＤＺＮｅｐの濃度は０．１μＭより大きい。一部の実施形態では、ＤＺＮｅｐの濃度は少なくとも０．５μＭである。一部の実施形態では、ＤＺＮｅｐの濃度は約１μＭである。一部の実施形態では、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物はヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、またはＴＭＰ１９５のうち少なくとも１つである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０である。一部の実施形態では、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物はＨＤＡＣ阻害剤およびＥＺＨ２阻害剤を含む。一部の実施形態では、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物はＤＺＮｅｐおよびＫＤ５１７０を含む。
【００３５】
[0037]本開示の特徴は、添付の特許請求の範囲において詳細に示されている。本開示の特徴および利点についてのより十分な理解は、本開示の原理が利用される例示的実施形態を示す以下の詳細な説明、および以下の添付の図面を参照することによって得られるであろう。
【図面の簡単な説明】
【００３６】
【図１】[0038]３−デアザネプラノシンＡ塩酸塩（ＤＺＮｅｐ）、ＧＳＫ１２６、ＥＰＺ６４３８の化学構造を示す。
【図２】[0039]ＫＤ５１７０およびＭＣ１５６８の化学構造を示す。
【図３】[0040]メチルトランスフェラーゼ阻害剤の化学構造を示す。
【図４】[0041]ＤＺＮｅｐ類似体の化学構造を示す。
【図５】[0042]本明細書に記載されている分化ステージの概要である。
【図６】[0043]本明細書に記載されているステージ５のヒストンメチル化および脱アセチル化の阻害を含む、ｈＰＳＣからＩＮＳ＋細胞への分化誘導の概略図である。ＤＥ：胚体内胚葉；ＰＧＴ；原腸管；ＰＰＴ１；早期膵前駆細胞；ＰＰＴ２；ＰＤＸ１＋／ＮＫＸ６．１＋膵前駆細胞；ＥＮ：ＮＫＸ６．１／Ｃペプチド＋細胞；ＳＣ−β：幹細胞由来ベータ細胞。
【図７】[0044]ステージ５の細胞が、ＮＧＮ３を発現して、幹細胞（ＳＣ）の膵島細胞への分化を開始することを示す。
【図８】[0045]ステージ５においてＥＺＨ２またはＨＤＡＣを阻害することによって、内分泌細胞およびＳＣ−β細胞が増加することを示す。
【図９】[0046]ステージ５においてＥＺＨ２およびＨＤＡＣを併用阻害することによって、内分泌細胞が有意に増加することを示す。
【図１０】[0047]ステージ５においてＥＺＨ２およびＨＤＡＣを併用阻害することによって、内分泌細胞が有意に増加することを示す。
【図１１】[0048]ステージ５においてＥＺＨ２およびＨＤＡＣを併用阻害することによって、ＳＣ  β細胞が有意に増加することを示す。
【図１２】[0049]ステージ５（ｎ＝２）における内分泌細胞の増加を示す。
【図１３】[0050]ＥＺＨ２およびＨＤＡＣを併用阻害することによって、ステージ５におけるニューロゲニン３＋前駆細胞が増加することを示す。
【図１４】[0051]ＤＺＮｅｐが他のＥＺＨ２阻害剤より優れていることを示す。
【図１５】[0052]ＫＤ５１７０が他のＨＤＡＣ阻害剤より優れていることを示す。
【図１６】[0053]ステージ５においてＥＺＨ２およびＨＤＡＣを併用阻害することによって、ＮＫＸ６−１＋前駆細胞が増加することを示す。
【図１７】[0054]ステージ５においてＥＺＨ２およびＨＤＡＣを試験するための実験概要である。
【図１８】[0055]候補スクリーニング設定の概略図である。
【図１９】[0056]（ＶＭＡＴ１＋  ＩＮＳ−）ＥＣ集団における特異的減少を示す。
【図２０】[0057]（ＮＫＸ６．１−  ＣｈｒｏｍＡ＋）ＰＨ細胞が同時に増加することを示す。ＰＨ：ポリホルモン細胞。
【図２１】[0058]（ＮＫＸ６．１＋  ＩＮＳ＋）ＳＣ−β集団のパーセンテージが影響を受けていないことを示す。
【図２２】[0059]細胞表面マーカー発見スクリーニングの様々なプレートを示す。
【図２３】[0060]ステージ５のＭＡＣＳマーカーのスクリーニングを示す。
【図２４】[0061]ＳＣ−ベータ細胞の標識化およびＭＡＣＳマーカーのスクリーニングの概略図を示す。
【図２５】[0062]ＰＳＡ−ＮＣＡＭのマイクロビーズに基づく選別により、オンターゲット細胞が濃縮され、ＳＯＸ９＋細胞が低減することを示す。
【図２６】[0063]ＰＳＡ−ＮＣＡＭ選別後に、ＥＣ細胞（ＶＭＡＴ１＋）が残存することを示す。
【図２７】[0064]エンド−Ｎ酵素処理の際に、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ発現が有意に減少することを示す。エンド−Ｎは、ＮＣＡＭに関連するシアル酸残基の最小長７〜９残基の特徴を有する、α−２，８−結合を含むシアル酸の線状ポリマーを迅速かつ特異的に分解するエンドシアリダーゼである。生理的条件でのＮＣＡＭにおけるＰＳＡの切断。
【図２８】[0065]ＰＳＡ−ＮＣＡＭのマイクロビーズ選別を使用してＥＣ細胞を取り除く概略図である。
【図２９】[0066]ＥＣ細胞が、分化プロセスにおいて早期に特異化した腸前駆細胞から生じ得ることを示す。
【図３０】[0067]ステージ０完了時にＯＣＴ４のパーセンテージが低いと、後のステージではＣＤＸ２のパーセンテージがより高くなることを示す。高いＯｃｔ４％は、安定した分化に必要とされる。Ｓｏｘ１７誘導におけるばらつきは、高いＯｃｔ４％と同程度のままである。
【図３１】[0068]ＥＣ細胞分化の阻害剤を特定するための化合物スクリーニングに基づく手法の概略図である。
【図３２】[0069]ステージ５の細胞上での化合物スクリーニングの概略図である。
【図３３】[0070]増殖細胞の照射線量に依存する低減を示す。
【図３４】[0071]高線量のガンマ線照射がＳＣ−膵島の組成および機能に有意な影響を及ぼさなかったことを示す。
【図３５】[0072]凍結保存したＳＣ−膵島が照射の６０日後にＢＧを制御する能力を失ったことを示す。
【図３６】[0073]対照試料と比較した、照射した試料のベータ細胞数を示す。
【図３７】[0074]照射した移植ｍＲＡ膵島細胞によって維持される血糖コントロールを示す。
【図３８】[0075]照射したＳＣ−膵島を有する全ての動物における血糖コントロールを示す。
【図３９】[0076]ヒト多能性幹細胞を本開示による幹細胞由来膵β細胞に分化させるための２つの例示的プロトコール（ｖ１１およびｖ１２）の図を示す。
【図４０】[0077]ｖ１２プロトコールによって、ｖ１１プロトコールと比較して、ステージ５で高い割合のＩＳＬ１およびＮＫＸ６．１を発現する細胞（ＩＳＬ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性）ならびに低い割合のＩＳＬ陰性、ＮＫＸ６．１陰性細胞、ならびにステージ４で低い割合のＣＤＸ２陽性細胞が産生されたことを示す。
【図４１】[0078]ｖ１２プロトコールによって産生された細胞クラスターが、ｖ１１プロトコールと比較して、凍結保存後により高い回収率を有したことを示す。
【図４２】[0079]ｖ１１プロトコールとｖ１２プロトコールが同等の割合のＳＣ−β細胞を産生したことを示す。
【図４３】[0080]ｖ１１プロトコールとｖ１２プロトコールが同等のＧＳＩＳ応答およびインスリン含量を有する細胞クラスターを産生したことを示す。
【図４４】[0081]それぞれ、低グルコース（ＬＧ）、高グルコース（ＨＧ）、および塩化カリウム（ＫＣｌ）チャレンジに応答して、バイオリアクター中で、本発明において提供される方法に従って産生した例示的細胞集団のインスリン放出性能、ならびにこの細胞集団のインスリン含量をまとめる。
【発明を実施するための形態】
【００３７】
[0082]以下の記述および実施例によって、本開示の実施形態を詳細に説明する。本開示は本明細書に記載した特定の実施形態に限定されず、したがって変動し得ることを理解されたい。当業者であれば、本開示には多数の変形および改変が存在し、これらは本開示の範囲内に包含されることが認識される。
【００３８】
[0083]全ての用語は当業者によって理解されるように理解されることを意図している。他に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語および科学用語は、本開示が関連する技術における当業者によって共通に理解されると同じ意味を有する。
【００３９】
[0084]本明細書で用いる見出しは整理の目的のみのためであって、記載した主題を限定するものと解釈すべきではない。
[0085]本開示の種々の特徴を単一の実施形態に関連して記述することができるが、特徴を個別にまたは任意の適切な組合せで提供することもできる。逆に、明確にするために本開示を個別の実施形態に関連して本明細書に記載することができるが、本開示を単一の実施形態で実行することもできる。
【００４０】
[0086]以下の定義は当技術における定義を補うものであって本出願を指向しており、関連するまたは関連しないいかなる例、例えば広く共有されているいかなる特許または特許出願にも帰属されない。本明細書に記載した方法および材料と同様のまたは等価のいかなる方法および材料も本開示を試験するための実施において用いることができるが、本明細書には好ましい材料および方法を記載している。したがって、本明細書で用いる用語は特定の実施形態を記述する目的のためのみであって、限定することを意図していない。
定義
[0087]本出願において単数形の使用は、特に他の記述がなければ、複数形を含む。本明細書で用いる場合、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈によって他が明確に記述されない限り、複数の指示物を含むことに留意しなければならない。
【００４１】
[0088]本出願において「または」の使用は、他の記述がなければ、「および／または」を意味する。本明細書で用いる用語「および／または」および「それらの任意の組合せ」ならびにそれらの文法的等価物は、相互交換可能に用いられ得る。これらの用語は、任意の組合せが具体的に意図されることを伝達することができる。説明目的のみのために、以下の語句、「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」または「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらの任意の組合せ」は、「個別にＡ、個別にＢ、個別にＣ、ＡおよびＢ、ＢおよびＣ、ＡおよびＣ、ならびにＡ、Ｂ、およびＣ」を意味し得る。用語「または」は、文脈によって特に離接的な使用が意味されない限り、接続的または離接的に用いられ得る。
【００４２】
[0089]さらに、用語「含む(including)」ならびに「含む(include、includes)」および「含まれる(included)」等の他の形態の使用は、限定的でない。
[0090]明細書中における「一部の実施形態」、「一実施形態(an embodiment、one embodiment)」、または「他の実施形態」への言及は、その実施形態に関連して記述された特定の特徴、構造、または特性が本開示の少なくとも一部の実施形態に含まれるが、必ずしも全ての実施形態には含まれないことを意味する。
【００４３】
[0091]本明細書および特許請求の範囲で用いる場合、単語「含む（comprising）」（ならびに「comprise」および「comprises」等のcomprisingの任意の形）、「有する(having)」（ならびに「have」および「has」等のhavingの任意の形）、「含む(including)」（ならびに「includes」および「include」等のincludingの任意の形）、または「含む(containing)」（ならびに「contains」および「contain」等のcontainingの任意の形）は包括的またはオープンエンドであり、言及されていない追加的な要素または方法ステップを排除しない。本明細書で論じる任意の実施形態は本開示の任意の方法または組成物に関して実行することができ、逆もそうであることが意図されている。さらに、本開示の組成物は本開示の方法を達成するために用いることができる。
【００４４】
[0092]本明細書で用いる参照の数値およびその文法的等価物に関連する用語「約」は、その数値それ自体およびその数値のプラスマイナス１０％の値の範囲を含み得る。
[0093]用語「約」または「ほぼ」は、当業者によって決定される特定の値についての許容される誤差範囲内を意味し、これは部分的にその値がどのようにして測定されまたは決定されたか、例えば測定システムの限界によることになる。例えば、「約」は当技術における慣例によって標準偏差の１倍以内または１倍を超えることを意味し得る。あるいは、「約」は所与の値の２０％まで、１０％まで、５％まで、または１％までの範囲を意味し得る。別の例では、「約１０」の量は、１０および９から１１までの任意の量を含む。さらに別の例では、参照数値に関連する用語「約」は、その値のプラスマイナス１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、または１％の範囲をも含み得る。あるいは、特に生物学的なシステムまたはプロセスに関しては、用語「約」は、ある値の１桁以内、好ましくは５倍以内、より好ましくは２倍以内を意味し得る。出願および特許請求の範囲において特定の値が記載されている場合には、他に記述がなければ、特定の値についての許容される誤差範囲内を意味する用語「約」を前提とすべきである。
【００４５】
[0094]本明細書で用いる用語「糖尿病」およびその文法的等価物は、長期間にわたる高い血糖レベルによって特徴付けられる疾患を意味し得る。例えば、本明細書で用いる用語「糖尿病」およびその文法的等価物は、それだけに限らないが、１型糖尿病、２型糖尿病、嚢胞性線維症関連糖尿病、外科的糖尿病、妊娠性糖尿病、およびミトコンドリア糖尿病を含む全てまたは任意の型の糖尿病を意味し得る。一部の例では、糖尿病は遺伝性糖尿病の１形態であり得る。
【００４６】
[0095]用語「内分泌細胞」は、特に特定しない限り、「膵島」、「膵島細胞」、「膵島同等物」、「膵島様細胞」、「膵臓島」、およびその文法的等価物等の、生体の膵臓に存在するホルモン生成細胞を意味し得る。一実施形態では、内分泌細胞は膵前駆細胞または前駆体から分化することができる。膵島細胞は、それだけに限らないが、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞、および／または膵ε細胞を含む様々な型の細胞を含み得る。膵島細胞は細胞の群、細胞クラスター、その他をも意味し得る。
【００４７】
[0096]用語「前駆細胞」および「前駆体」細胞は本明細書において相互交換可能に用いられ、分化によって生じることができる細胞と比較してより原始的な（例えば発生経路または発達において完全に分化した細胞よりも早いステップにある）細胞表現型を有する細胞を意味する。前駆細胞はまた、顕著なまたは極めて高い増殖可能性を有し得ることが多い。前駆細胞は発生経路および細胞が発生し分化する環境に応じて、多くの異なった分化細胞型または単一の分化細胞型を生じることができる。
【００４８】
[0097]インスリン陽性内分泌細胞に関連する用語としての「その前駆体」は、前駆細胞をインスリン陽性内分泌細胞に分化するために適した条件下で培養したときにインスリン陽性内分泌細胞に分化することができる、例えば多能性幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、膵前駆細胞、または内分泌前駆細胞を含む任意の細胞を意味し得る。
【００４９】
[0098]本明細書で用いる用語「外分泌細胞」は、外分泌腺、即ち管を通してその分泌物を放出する腺の細胞を意味し得る。特定の実施形態では、外分泌細胞は膵外分泌細胞を意味し得る。これは小腸に分泌される酵素を生成することができる膵細胞である。これらの酵素は、食物が胃腸管を通過する際にこれを消化することを助けることができる。膵外分泌細胞はランゲルハンス島としても公知であり、これは２つのホルモン、即ちインスリンおよびグルカゴンを分泌することができる。膵外分泌細胞はいくつかの細胞型、即ちα−２細胞（これはホルモングルカゴンを生成することができる）、またはβ細胞（これはホルモンインスリンを製造することができる）およびα−１細胞（これは制御因子ソマトスタチンを生成することができる）のうち１つであり得る。非インスリン生成外分泌細胞は、本明細書で本用語を用いる場合、α−２細胞またはα−１細胞を意味し得る。用語「膵外分泌細胞」は「膵内分泌細胞」を包含し、これは血流中に分泌されるホルモン（例えばインスリン（β細胞から生成される）、グルカゴン（α−２細胞によって生成される）、ソマトスタチン（デルタ細胞によって生成される）、および膵ポリペプチド（Ｆ細胞によって生成される）を生成する膵細胞を意味し得る。
【００５０】
[0099]用語「幹細胞から誘導されたβ細胞」、「ＳＣ−β細胞」、「機能性β細胞」、「機能性膵β細胞」、「成熟ＳＣ−β細胞」、およびそれらの文法的等価物は、膵β細胞を示す少なくとも１つのマーカー（例えばＰＤＸ−１またはＮＫＸ６．１）を呈し、インスリンを分泌し、および内分泌成熟β細胞に特徴的なグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を呈する細胞（例えば非天然膵β細胞）を意味し得る。一部の実施形態では、本明細書で用いる用語「ＳＣ−β細胞」および「非天然β細胞」は相互交換可能である。一部の実施形態では、「ＳＣ−β細胞」は成熟した膵細胞を含む。ＳＣ−β細胞は幹細胞から（例えば直接）誘導される必要はないことを理解されたい。それは、本開示の方法が、出発点として任意の細胞を用いて任意のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体からＳＣ−β細胞を誘導することができるからである（本発明はこの様式に限定することを意図していないので、例えば胚幹細胞、人工多能性幹細胞、前駆細胞、部分的に再プログラミングされた体細胞（例えば人工多能性幹細胞とそれが誘導されたもとの体細胞との間の中間状態に部分的に再プログラミングされた体細胞）、万能性細胞、全能性細胞、上記の任意の細胞の分化転換したバージョン、その他を用いることができる）。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は多重のグルコースチャレンジ（例えば少なくとも１回、少なくとも２回、もしくは少なくとも３回またはそれ以上の一連のグルコースチャレンジ）に対する応答を呈する。一部の実施形態では、応答は多重のグルコースチャレンジに対する内因性膵島（例えばヒト膵島）の応答に類似している。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞の形態は内因性β細胞の形態に類似している。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は内因性β細胞のＧＳＩＳ応答に類似したｉｎ  ｖｉｔｒｏのＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は内因性β細胞のＧＳＩＳ応答に類似したｉｎ  ｖｉｖｏのＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は内因性β細胞のＧＳＩＳ応答に類似したｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏの両方のＧＳＩＳ応答を呈する。ＳＣ−β細胞のＧＳＩＳ応答は、ＳＣ−β細胞を宿主（例えばヒトまたは動物）に移植した後、２週以内に観察することができる。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞はインスリンを分泌顆粒に詰め込む。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞はカプセル化された結晶インスリン顆粒を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は１を超える刺激インデックスを呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は１．１を超える刺激インデックスを呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は２を超える刺激インデックスを呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞はサイトカインに応答してサイトカイン誘起アポトーシスを呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞からのインスリンの分泌は公知の抗糖尿病薬（例えば分泌促進物質）に応答して増強される。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞はモノホルモナルである。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は他のホルモン、例えばグルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドを異常に共発現しない。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は低い複製速度を呈する。��部の実施形態では、ＳＣ−β細胞はグルコースに応答して細胞内Ｃａ２＋を増加させる。
【００５１】
[0100]本明細書で用いる場合、用語「インスリン生成細胞」およびその文法的等価物は、膵前駆細胞またはその前駆体から分化し、インスリンを分泌する細胞を意味する。インスリン生成細胞は、その用語が本明細書に記載されているように、膵β細胞、ならびに構造的または誘導的な様式でインスリンを合成（例えばインスリン遺伝子を転写し、プロインスリンｍＲＮＡを翻訳し、およびプロインスリンｍＲＮＡを修飾してインスリンタンパク質に）し、発現（例えばインスリン遺伝子が運搬する表現型の形質を実現）し、または分泌（インスリンを細胞外スペースに放出）する膵β様細胞（例えばインスリン陽性内分泌細胞）を含み得る。例えばインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体を本開示の方法に従ってＳＣ−β細胞に分化することによって生成されたインスリン生成細胞の集団は、膵β細胞またはβ様細胞（例えば内因性β細胞の少なくとも１つもしくは少なくとも２つの特徴を有し、内因性成熟β細胞に類似したグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を呈する細胞）であってよい。例えば本明細書に開示した方法によって生成されたインスリン生成細胞の集団は成熟した膵β細胞またはＳＣ−β細胞を含んでよく、非インスリン生成細胞（例えばインスリンを生成せずまたは分泌しないこと以外は細胞様表現型を有する細胞）を含んでもよい。
【００５２】
[0101]用語「インスリン陽性β様細胞」、「インスリン陽性内分泌細胞」、およびそれらの文法的等価物は、膵β細胞を示す少なくとも１つのマーカーを呈し、インスリンも発現するが、内因性β細胞に特徴的なグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を欠く細胞（例えば膵内分泌細胞）を意味し得る。
【００５３】
[0102]用語「β細胞マーカー」は、限定なく、特異的に膵β細胞中に発現しまたは存在するタンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多型、スプライス変異体、タンパク質または核酸の断片、要素、およびその他の分析物質を意味する。例示的なβ細胞マーカーには、それだけに限らないが、膵および十二指腸のホメオボックス１（Ｐｄｘ１）ポリペプチド、インスリン、ｃ−ペプチド、アミリン、Ｅ−カドヘリン、Ｈｎｆ３β、ＰＣＩ／３、Ｂ２、Ｎｋｘ２．２、ＧＬＵＴ２、ＰＣ２、ＺｎＴ−８、ＩＳＬ１、Ｐａｘ６、Ｐａｘ４、ＮｅｕｒｏＤ、１  Ｉｎｆ１ｂ、Ｈｎｆ−６、Ｈｎｆ−３ベータ、およびＭａｆＡ、ならびにZhangら、Diabetes. 50(10):2231-6 (2001)によって記載されたものが含まれる。一部の実施形態では、β細胞マーカーは核３−細胞マーカーである。一部の実施形態では、β細胞マーカーはＰｄｘ１またはＰＨ３である。
【００５４】
[0103]用語「膵内分泌マーカー」は、限定なく、特異的に膵内分泌細胞中に発現しまたは存在するタンパク質、ペプチド、核酸、タンパク質および核酸の多型、スプライス変異体、タンパク質または核酸の断片、要素、およびその他の分析物質を意味し得る。例示的な膵内分泌細胞マーカーには、それだけに限らないが、Ｎｇｎ−３、ＮｅｕｒｏＤ、およびＩｓｌｅｔ−１が含まれる。
【００５５】
[0104]用語「膵前駆細胞」、「膵内分泌前駆細胞」、「膵前駆体」、「膵内分泌前駆体」、およびそれらの文法的等価物は本明細書で相互交換可能に用いられ、膵内分泌細胞、膵外分泌細胞、または膵導管細胞を形成することができる膵ホルモン発現細胞になることができる幹細胞を意味し得る。これらの細胞は少なくとも１つの型の膵細胞、例えばインスリンを生成するβ細胞、グルカゴンを生成するα細胞、ソマトスタチンを生成するδ細胞（またはＤ細胞）、および／または膵ポリペプチドを生成するＦ細胞に向けた分化に関与している。そのような細胞は以下のマーカー、ＮＧＮ３、ＮＫＸ２．２、ＮｅｕｒｏＤ、ＩＳＬ−１、Ｐａｘ４、Ｐａｘ６、またはＡＲＸのうち少なくとも１つを発現することができる。
【００５６】
[0105]本明細書で用いる用語「Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞」は、膵β細胞等のＳＣ−β細胞に分化する能力を有する膵内胚葉（ＰＥ）細胞である細胞を意味し得る。Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞はマーカーＰｄｘ１を発現する。その他のマーカーには、それだけに限らないが、Ｃｄｃｐ１、またはＰｔｆ１ａ、またはＨＮＦ６もしくはＮＲｘ２．２が含まれる。Ｐｄｘ１の発現は、抗Ｐｄｘ１抗体を用いる免疫化学または定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞はＮＫＸ６．１の発現を欠く。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、それがＮＫＸ６．１の発現を欠くので、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞と称することもできる。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は「膵前腸内胚葉細胞」と名付けることもできる。
【００５７】
[0106]本明細書で用いる用語「Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６−１陽性の膵前駆細胞」は、膵β細胞等のインスリン生成細胞に分化する能力を有する膵内胚葉（ＰＥ）細胞である細胞を意味し得る。Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６−１陽性の膵前駆細胞はマーカーＰｄｘ１およびＮＫＸ６−１を発現する。その他のマーカーには、それだけに限らないが、Ｃｄｃｐ１、またはＰｔｆ１ａ、またはＨＮＦ６もしくはＮＲｘ２．２が含まれる。ＮＫＸ６−１の発現は、抗ＮＫＸ６−１抗体を用いる免疫化学または定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。本明細書で用いる場合、用語「ＮＫＸ６．１」および「ＮＫＸ６−１」は等価で相互交換可能である。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６−１陽性の膵前駆細胞は「膵前腸前駆体細胞」と名付けることもできる。
【００５８】
[0107]本明細書で用いる用語「Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞」は、転写因子ニューロゲニン−３（Ｎｇｎ３）を発現する膵内分泌細胞の前駆体を意味し得る。前駆細胞は多能性幹細胞よりも分化しており、僅かな種類の細胞にしか分化できない。特に、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞は５種類の膵内分泌細胞型（α、β、δ、ε、およびＰＰ）に分化する能力を有している。Ｎｇｎ３の発現は、抗Ｎｇｎ３抗体を用いる免疫化学または定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。
【００５９】
[0108]用語「ＮｅｕｒｏＤ」および「ＮｅｕｒｏＤ１」は相互交換可能に用いられ、膵内分泌前駆細胞において発現するタンパク質およびそれをコードする遺伝子を特定する。
[0109]用語「選択マーカー」は、発現された場合に、細胞毒性もしくは細胞増殖抑制性の薬剤に対する耐性（例えば抗生剤耐性）、原栄養性、またはそのタンパク質を発現する細胞を発現しない細胞から区別するための基礎として用いることができる特定のタンパク質の発現等の選択可能な表現型を細胞に付与する遺伝子、ＲＮＡ、またはタンパク質を意味する。本明細書で用いる用語「選択マーカー」は、遺伝子または遺伝子の発現生成物、例えばコードされたタンパク質を意味し得る。一部の実施形態では、選択マーカーは、それを発現しない細胞または顕著に低いレベルでそれを発現する細胞と比較して、それを発現する細胞に増殖および／または生存の有利性を付与する。そのような増殖および／または生存の有利性は、典型的には細胞がある条件、即ち「選択的条件」下に維持されている場合に生じる。効果的な選択を確実にするため、細胞の集団は、そのマーカーを発現しない細胞が増殖せずおよび／または生存せず、それらがその集団から排除されまたはその数が集団のごく少ない部分にまで減少するような条件下および十分な時間で維持することができる。細胞の集団を選択的条件下に維持することによって増殖および／または生存の有利性を付与するマーカーを発現する細胞を選択して、そのマーカーを発現しない細胞を主としてまたは完全に排除するプロセスは、本明細書において「陽性選択」と称され、そのマーカーは「陽性選択に有用」と呼ばれる。陰性選択および陰性選択に有用なマーカーも、本明細書に記載した方法のある場合には目的である。そのようなマーカーの発現は、そのマーカーを発現しない細胞または顕著に低いレベルでそれを発現する細胞と比較して、そのマーカーを発現する細胞に増殖および／または生存の不利益を付与する（あるいは、別の方式で考慮すると、そのマーカーを発現しない細胞は、そのマーカーを発現する細胞と比較して、増殖および／または生存の有利性を有する）。したがって、そのマーカーを発現する細胞は、選択的条件で十分な時間維持されれば、細胞の集団から主としてまたは完全に排除され得る。
【００６０】
[0110]用語「エピジェネティクス」は、ＤＮＡ配列の変化を含まない遺伝子機能の遺伝性の変化を意味する。エピジェネティクスは遺伝子の活性および発現に影響する染色体の変化を意味することが最も多いが、ゲノムの修飾に由来しない任意の遺伝可能な表現型の変化を記述するために用いることもできる。細胞および生理学的な表現型の形質に対するそのような効果は外的または環境的な要因に起因することがあるか、または正常な発生プログラムの一部であることもある。エピジェネティクスはヌクレオチド配列の変化を含まないゲノムの機能的に関連する変化を意味することもある。そのような変化を生成する機構の例としてはＤＮＡのメチル化およびヒストンの修飾があり、そのそれぞれは根底にあるＤＮＡ配列を改変せずに、遺伝子が発現される様式を改変する。遺伝子の発現はＤＮＡのサイレンサー領域に結合している抑制タンパク質の作用によって制御され得る。これらのエピジェネティクスは細胞の寿命の間の細胞分割を通して持続することができ、これらが生命体の根底にあるＤＮＡ配列の変化を含まないとしても、多世代にわたって持続することができる。真核細胞の生物学におけるエピジェネティクスの１つの例として、細胞分化のプロセスがある。形態形成の間に全能性幹細胞が種々の多能性細胞になり、次いでこれが完全に分化した細胞になることができる。
【００６１】
[0111]用語「エピジェネティック修飾化合物」は、遺伝子にエピジェネティクスを起こさせる、即ちＤＮＡ配列を変化させずに遺伝子の発現を変化させる化合物を意味する。エピジェネティクスは、遺伝子がオンまたはオフされるかを決定することを助け、ある種の細胞、例えばベータ細胞におけるタンパク質の生成に影響することができる。ＤＮＡのメチル化およびヒストンの修飾等のエピジェネティック修飾はＤＮＡの接近可能性およびクロマチンの構造を改変し、それにより遺伝子発現のパターンを規制する。これらのプロセスは成体生命体における独特の細胞系統の正常な発生および分化に重要である。これらは外因性の影響によって修飾することができ、したがって表現型または病態表現型の環境的改変に寄与し得るか、またはその結果であり得る。重要なことに、エピジェネティック修飾は多能性遺伝子の規制において重要な役割を有し、これは分化の間に不活性化される。非限定的なエピジェネティック修飾化合物の例には、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【００６２】
[0112]用語「分化した細胞」またはその文法的等価物は、その天然形においてその用語が本明細書において定義されるように多能性ではない任意の初代細胞を意味する。別の言い方では、用語「分化した細胞」は、細胞分化プロセスにおいて特殊性の低い細胞型（例えば人工多能性幹細胞等の幹細胞）の細胞から誘導された特殊性の高い細胞型の細胞を意味し得る。理論に限定されることは望まないが、正常な個体発生の過程における多能性幹細胞は、最初に膵細胞およびその他の内胚葉細胞型を形成することができる内胚葉細胞に分化することができる。内胚葉細胞のさらなる分化は膵経路に導かれ、細胞の約９８％は外分泌性、導管性、またはマトリックスの細胞になり、約２％が内分泌細胞になる。早期の内分泌細胞は膵島前駆細胞であり、次いでこれがさらに、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、または膵ポリペプチドを分泌するインスリン生成細胞（例えば機能性内分泌細胞）に分化することができる。内胚葉細胞は内胚葉起源の他の細胞、例えば肺、肝臓、腸、胸腺等に分化することもできる。
【００６３】
[0113]本明細書で用いる場合、用語「体細胞」は、生殖系列細胞とは反対に、生命体を形成する任意の細胞を意味し得る。哺乳動物では、生殖系列細胞（「配偶子」としても公知である）は、受精の間に融合して接合子と呼ばれる細胞を生成する精子および卵子であり、接合子から哺乳動物の胚の全体が発生する。体細胞がそれから作られる細胞である精子および卵子（生殖母細胞）および未分化幹細胞は別として、哺乳動物の体内の全ての他の細胞型は体細胞である。内部器官、皮膚、骨、血液、および結合組織は全て体細胞から作られている。一部の実施形態では、体細胞は「非胚性体細胞」であり、これは胚に存在せずまたは胚から得られず、そのような細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に起因しない体細胞を意味する。一部の実施形態では、体細胞は「成体体細胞」であり、これは胚または胎児以外の生命体に存在しもしくはこれから得られ、またはそのような細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ増殖に起因する細胞を意味する。他に指示しなければ、少なくとも１個のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体をインスリン生成性でグルコース応答性の細胞に変換するための方法は、ｉｎ  ｖｉｖｏおよびｉｎ  ｖｉｔｒｏの両方で実施することができる（少なくとも１個のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体が対象の中に存在する場合にはｉｎ  ｖｉｖｏが実施され、単離され培地中に維持された少なくとも１個のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体を用いてｉｎ  ｖｉｔｒｏが実施される）。
【００６４】
[0114]本明細書で用いる場合、用語「成体細胞」は胚発生の後で体内の至るところに見出される細胞を意味し得る。
[0115]本明細書で用いる場合、用語「内胚葉細胞」は極めて早期の胚の中の３つの一次胚細胞層のうちの１つからのものである細胞を意味し得る（他の２つの胚細胞層は中胚葉および外胚葉である）。内胚葉は３つの層のうち最も内側にある。内胚葉細胞は分化して最初に胚性腸を生じ、次いで呼吸管および消化管（例えば腸）のライニング、肝臓、ならびに膵を生じる。
【００６５】
[0116]本明細書で用いる用語「内胚葉起源の細胞」は、内胚葉細胞から発生しまたは分化した任意の細胞を意味し得る。例えば、内胚葉起源の細胞には肝臓、肺、膵、胸腺、腸、胃、および甲状腺の細胞が含まれる。理論に縛られることは望まないが、肝臓および膵の前駆細胞（膵前駆細胞とも称される）は胚前腸内の内胚葉細胞から発生する。これらが特定されてからすぐに、肝臓および膵の前駆細胞は全く異なった細胞機能および再生能力を急速に獲得する。これらの変化は、脊椎動物の間で高度に保存された誘起シグナルおよび遺伝子制御因子によって引き起こされる。臓器の発生および再生に対する興味は、肝不全およびＩ型糖尿病の治療処置における肝細胞および膵β細胞への強いニーズによって加速されてきた。多様なモデルの生命体およびヒトにおける研究によって、肝細胞および膵細胞の分化を引き起こし、多様な幹細胞および前駆細胞の型からの肝細胞およびβ細胞の分化をどのように促進するかについての指針を提供する進化的に保存された誘起シグナルおよび転写因子のネットワークが明らかになってきた。
【００６６】
[0117]本明細書で用いる用語「胚体内胚葉」は、内胚葉細胞から分化し、ＳＣ−β細胞（例えば膵β細胞）に分化することができる細胞を意味し得る。胚体内胚葉細胞はマーカーＳｏｘ１７を発現する。胚体内胚葉細胞に特徴的なその他のマーカーには、それだけに限らないが、ＭＩＸＬ２、ＧＡＴＡ４、ＨＮＦ３Ｂ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＶＷＦ、ＣＡＬＣＲ、ＦＯＸＱ１、ＣＸＣＲ４、Ｃｅｒｂｅｒｕｓ、ＯＴＸ２、グーセコイド、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、ＣＭＫＯＲ１、およびＣＲＩＰ１が含まれる。特に、本明細書の胚体内胚葉細胞はＳｏｘ１７ならびに一部の実施形態ではＳｏｘ１７およびＨＮＦ３Ｂを発現し、顕著なレベルのＧＡＴＡ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＰＦ、またはＤＡＢは発現しない。胚体内胚葉細胞はマーカーＰｄｘ１については陽性ではない（例えばそれらはＰｄｘ１陰性である）。胚体内胚葉細胞は肝臓、肺、膵、胸腺、腸、胃、および甲状腺の細胞を含む細胞に分化する能力を有している。Ｓｏｘ１７およびその他の胚体内胚葉のマーカーの発現は、例えば抗Ｓｏｘ１７抗体を用いる免疫化学または定量的ＲＴ−ＰＣＲ等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。
【００６７】
[0118]用語「膵内胚葉」は、膵β細胞を含む多重の膵臓系統に分化することができるが、非膵臓系統に分化する能力をもはや有しない内胚葉起源の細胞を意味し得る。
[0119]本明細書で用いる用語「原腸管細胞」または「腸管細胞」は、内胚葉細胞から分化し、ＳＣ−β細胞（例えば膵β細胞）に分化することができる細胞を意味し得る。原腸管細胞は以下のマーカー、ＨＮＰ１−β、ＨＮＦ３−β、またはＨＮＦ４−αのうち少なくとも１つを発現する。原腸管細胞は肺、肝臓、膵、胃、および腸の細胞を含む細胞に分化する能力を有している。ＨＮＦ１−βおよびその他の原腸管のマーカーの発現は、例えば抗ＨＮＦ１−β抗体を用いる免疫化学等の当業者には公知の任意の方法によって評価することができる。
【００６８】
[0120]本明細書で用いる用語「幹細胞」は、増殖することができ、次に分化したまたは分化可能な娘細胞を生じることができる多数の母細胞を産生する能力を有するより多くの前駆細胞を生じる未分化の細胞を意味し得る。娘細胞それ自体は、増殖し、続いて１つまたは複数の成熟細胞型に分化する子孫を生成するように誘起される一方、親の発生可能性を有する１個または複数の細胞を保持することができる。用語「幹細胞」は、特定の状況下ではより特殊化されまたは分化した表現型に分化する能力または可能性を有し、特定の状況下では実質的に分化せずに増殖する能力を保持している前駆細胞のサブセットを意味し得る。一実施形態では、幹細胞という用語は一般に、その子孫（descendants、progeny）が、胚の細胞および組織の漸進的多様化で起こるように、分化によって、例えば完全に個別の特徴を獲得することによって、しばしば異なる方向に、特殊化する、天然に存在する母細胞を意味する。細胞の分化は典型的には多くの細胞分割を通して起こる複雑なプロセスである。分化した細胞は万能性細胞由来であってよく、万能性細胞はそれ自体、万能性細胞由来、等々である。これらの万能性細胞のそれぞれは幹細胞であると考えられるが、それぞれが生じることができる細胞型の範囲はかなり変動し得る。いくつかの分化した細胞はより大きな発生の可能性を有する細胞を生じる能力をも有する。そのような能力は天然であってもよく、種々の因子を用いる処理によって人工的に誘起してもよい。多くの生物学的な例では、幹細胞は２つ以上の異なった細胞型を有する子孫を生成することができるので「万能性」でもあるが、これは「幹細胞性」であるために必要ではない。「自己更新」は幹細胞の定義の他の古典的な部分であり、これは本書で用いるように重要である。理論的には、自己更新は２つの主な機構のいずれかによって起こり得る。幹細胞は非対称的に分割され、１つの娘は幹細胞状態を保持し、他の娘はいくつかの異なった他の特定の機能および表現型を発現することができる。あるいは、集団中の幹細胞のいくつかは２つの幹細胞に対称的に分割することができ、それにより集団中のいくつかの幹細胞は全体として維持される一方、集団中の他の細胞は分化した子孫のみを生じる。形式的には、幹細胞として始まった細胞が分化した表現型に向かって進行するが、「逆行」し、幹細胞の表現型を逆発現することも可能である。これは当業者によって「脱分化」または「再プログラミング」または「逆分化」と称されることが多い。本明細書で用いる場合、用語「多能性幹細胞」には、胚幹細胞、人工多能性幹細胞、胎盤幹細胞等が含まれる。
【００６９】
[0121]本明細書で用いる用語「多能性」は、種々の条件下で２種以上の分化した細胞型に分化し、好ましくは３種全ての胚細胞層に特徴的な細胞型に分化する能力を有する細胞を意味し得る。多能性細胞は、一次的には例えばヌードマウスの奇形腫形成アッセイを用いて２種以上の細胞型、好ましくは３種全ての胚葉層に分化する能力によって特徴付けられる。多能性は胚幹（ＥＳ）細胞マーカーの発現によっても証明されるが、多能性のための好ましい試験は３種の胚葉層のそれぞれの細胞へ分化する能力を実証することである。そのような細胞を単に培養するだけではそれ自体、これらの細胞を多能性にするわけではないことに留意されたい。再プログラミングされた多能性細胞（例えば本明細書でその用語を定義するようにｉＰＳ細胞）は、一般には培養中に限られた回数の分割のみの能力を有する初代親細胞と比較して、成長の可能性を失わずに延長された継代の能力を有することも特徴としている。
【００７０】
[0122]本明細書で用いる場合、用語「ｉＰＳ細胞」および「人工多能性幹細胞」は相互交換可能に用いられ、例えば１つまたは複数の遺伝子の強制的な発現を誘起することによって、非多能性細胞から、典型的には成体体細胞から人工的に誘導された（例えば誘起された、または完全な逆転による）多能性幹細胞を意味し得る。
【００７１】
[0123]用語「表現型」は、実際の遺伝子型に関わらず、環境条件および因子の特定の組のもとに細胞または生命体を定義する１つまたはいくつかの生物的特徴の全てを意味し得る。
【００７２】
[0124]用語「対象」、「患者」、または「個体」は本明細書で相互交換可能に用いられ、それから細胞が得られ、および／または本明細書に記載した細胞を用いる予防的処置を含む処置がそれに提供される動物、例えばヒトを意味し得る。ヒト対象等の特定の動物に特有な感染、病態、または疾患状態の処置については、対象という用語はその特定の動物を意味し得る。本明細書で相互交換可能に用いられる「非ヒト動物」および「非ヒト哺乳動物」には、ラット、マウス、ウサギ、ヒツジ、ネコ、イヌ、ウシ、ブタ、および非ヒト霊長類等の哺乳動物が含まれる。用語「対象」には、それだけに限らないが哺乳類、爬虫類、両生類、および魚類を含む任意の脊椎動物も包含される。しかし有利には、対象はヒト等の哺乳動物、または例えばイヌ、ネコ、ウマ、その他の家畜、もしくはウシ、ヒツジ、ブタ、その他の生産用哺乳動物等のその他の哺乳動物である。「それを必要とする患者」または「それを必要とする対象」は、本明細書では糖尿病に限らず、例えば疾患または障害を有すると診断されたか、その疑いがある患者を意味する。
【００７３】
[0125]本明細書で用いる「投与する」は、本明細書に記載した１つまたは複数の組成物を患者または対象に提供することを意味し得る。例として限定せずに、組成物の投与、例えば注射は、静脈内（ｉ．ｖ．）注射、皮下（ｓ．ｃ．）注射、皮内（ｉ．ｄ．）注射、腹腔内（ｉ．ｐ．）注射、または筋肉内（ｉ．ｍ．）注射によって実施することができる。１つまたは複数のそのような経路を採用することができる。非経口投与は、例えばボーラス注射または時間をかけた段階的潅流によるものでよい。あるいは、または同時に、投与は経口経路によるものでよい。さらに、投与は細胞のボーラスまたはペレットを手術で堆積してもよく、医用デバイスを位置決めしてもよい。一実施形態では、本開示の組成物は、増殖性障害を治療しまたは予防するために有効な量の本明細書に記載した核酸配列または本明細書に記載した少なくとも１つの核酸配列を含むベクターを発現する操作された細胞または宿主細胞を含み得る。薬学的組成物は、１つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤、または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載した細胞集団を含んでよい。そのような組成物は、中性緩衝食塩液、リン酸緩衝食塩液等の緩衝液、グルコース、マンノース、スクロース、もしくはデキストラン、マンニトール等の炭水化物、タンパク質、ポリペプチド、またはグリシン等のアミノ酸、抗酸化剤、ＥＤＴＡもしくはグルタチオン等のキレート化剤、アジュバント（例えば水酸化アルミニウム）、および保存剤を含んでもよい。
【００７４】
[0126]用語「処理する（treat、treating）」、「処理」、およびそれらの文法的等価物には、単離された細胞に適用する場合、細胞を任意の種類のプロセスまたは条件に供するか、または細胞に任意の種類の操作または手順を実施することが含まれる。対象に適用する場合、この用語は医学的または外科的な注意、介護、または管理を個体に提供することを意味する。個体は通常、病気または傷害を有するか、または集団の平均的な構成員と比較して病気になる危険が増大しており、そのような注意、介護、または管理を必要としている。
【００７５】
[0127]本明細書で用いる場合、用語「処置する」および「処置」は、疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患の改善として、例えば有利なまたは所望の臨床的結果を対象が得るように、有効量の組成物を対象に投与することを意味し得る。本発明の目的のため、有利なまたは所望の臨床的結果には、それだけに限らないが、１つまたは複数の症状の緩和、疾患の程度の消失、疾患の状態の安定化（例えば悪化しないこと）、疾患の進行の遅延または遅くなること、疾患の状態の改善または軽減、および寛解（部分的であっても全面的であっても）が、検出されても検出されなくても、含まれる。処置することは、処置を受けなかった場合に予想される生存と比較して延長された生存を意味することもある。したがって、当業者であれば、処置が疾患の状態を改善することはあるが、疾患の完全な治癒ではないこともあることを認識している。本明細書で用いる場合、用語「処置」には予防が含まれる。あるいは、疾患の進行が減弱されまたは停止されれば、「処置」は効果的である。「処置」は、処置を受けなかった場合に予想される生存と比較して延長された生存を意味することもある。処置を必要とする者には、心臓の病態があると既に診断された者、ならびに遺伝的な感受性または体重、食事、健康等のその他の要因によって心臓の病態が進行する可能性がある者が含まれる。
【００７６】
[0128]用語「治療有効量」、「治療量」、またはそれらの文法的等価物は、必要な用量および期間で、所望の治療結果を達成するための有効な量を意味し得る。治療有効量は、疾患の状態、個体の年齢、性別、および体重等の要因、ならびに１または複数の対象において所望の応答を引き起こす本明細書に記載した組成物の能力によって変動し得る。本開示の組成物の投与すべき正確な量は、年齢、体重、腫瘍の大きさ、感染または転移の程度、および患者（対象）の病態における個別の相違を考慮して臨床医が決定することができる。
【００７７】
[0129]あるいは、患者または対象に対する本明細書に記載した１つまたは複数の組成物の投与の薬理学的および／または生理学的な効果は「予防」であってよく、例えばその効果は疾患またはその症状を完全にまたは部分的に防止する。「予防有効量」は、必要な用量および期間で、所望の予防結果（例えば疾患の発症の防止）を達成するための有効な量を意味し得る。
【００７８】
[0001]全体に開示したいくつかの数値は、例えば「Ｘは少なくともまたは少なくとも約１００、または２００［または任意の数］である」と称される。この数値にはその数それ自体および以下
ｉ）Ｘは少なくとも１００である、
ｉｉ）Ｘは少なくとも２００である、
ｉｉｉ）Ｘは少なくとも約１００である、および
ｉｖ）Ｘは少なくとも約２００である
の全てが含まれる。
【００７９】
[0002]全体に開示した数値によって、これら全ての異なった組合せが意図されている。他にその反対が具体的に指示されなければ、それが治療薬の投与についてであっても、日、月、年、重量、用量、その他についてであっても、開示した全ての数値はこのように解釈すべきである。
【００８０】
[0003]全体に開示した範囲は、例えば「Ｘは１〜２日目もしくは約１〜２日目に、または２〜３日目もしくは約２〜３日目に［または任意の数値範囲に］投与される」と称されることがある。この範囲にはその数それ自体（例えば範囲の終点）および以下
ｉ）Ｘは１日目と２日目の間に投与される、
ｉｉ）Ｘは２日目と３日目の間に投与される、
ｉｉｉ）Ｘは約１日目と２日目の間に投与される、
ｉｖ）Ｘは約２日目と３日目の間に投与される、
ｖ）Ｘは１日目と約２日目の間に投与される、
ｖｉ）Ｘは２日目と約３日目の間に投与される、
ｖｉｉ）Ｘは約１日目と約２日目の間に投与される、および
ｖｉｉｉ）Ｘは約２日目と約３日目の間に投与される
の全てが含まれる。
【００８１】
[0130]全体に開示した範囲によって、これら全ての異なった組合せが意図されている。他にその反対が具体的に指示されなければ、それが治療薬の投与についてであっても、日、月、年、重量、用量、その他についてであっても、開示した全ての範囲はこのように解釈すべきである。
Ｉ．要旨
[0131]態様では、本開示は膵前駆細胞を分化する組成物および方法を提供する。本明細書で提供する組成物および方法は、高純度の膵β細胞、高インスリン含量、および天然の膵β細胞または天然の膵島と類似し得る優れたグルコース依存性インスリン分泌応答を有する膵β細胞、細胞集団、または細胞クラスターを提案することができる。
【００８２】
[0132]一部の態様では、膵前駆細胞またはその前駆体の集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含み、接触させるステップが、エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、クロモグラニンＡ陽性（ＣＨＧＡ＋）細胞の割合が増加しまたはＣ−ペプチド陽性かつＮＫＸ６．１陽性（Ｃ−ＰＥＰ＋、ＮＫＸ６．１＋）の細胞の割合が増加した内分泌細胞の集団をもたらす、方法が本明細書で提供される。
【００８３】
[0133]一部の態様では、本開示は、膵前駆細胞またはその前駆体の集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させるステップを含み、接触させるステップが、エピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、ＶＭＡＴまたはＣｄｘ２を発現する細胞の割合が減少した内分泌細胞の集団をもたらす、方法を提供する。
【００８４】
[0134]一部の態様では、本開示は、細胞集団を含む組成物であって、細胞集団がフローサイトメトリーによって測定して、（ａ）少なくとも約２０％の、Ｃ−ペプチドおよびＮＫＸ６．１を発現する細胞、（ｂ）少なくとも約６０％の、ＣＨＧＡを発現する細胞、（ｃ）多くとも約２０％の、Ｃｄｘ２を発現する細胞、または（ｄ）多くとも約４５％の、ＶＭＡＴ１を発現する細胞を含む、組成物を提供する。一部の例では、組成物はフローサイトメトリーによって測定して、（ａ）少なくとも約２０％の、Ｃ−ペプチドおよびＮＫＸ６．１を発現する細胞、（ｂ）少なくとも約６０％の、ＣＨＧＡを発現する細胞、および（ｃ）多くとも約２０％の、Ｃｄｘ２を発現する細胞を含む。一部の例では、組成物はまた、フローサイトメトリーによって測定して、多くとも約４５％の、ＶＭＡＴ１を発現する細胞を含む。一部の例では、組成物はエピジェネティック修飾化合物をさらに含む。
【００８５】
[0135]一部の態様では、本開示はフローサイトメトリーによって測定して、少なくとも約３０％のＩＳＬ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の細胞ならびに多くとも約２０％のＩＳＬ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の細胞を含む細胞集団を含む組成物を提供する。請求項３４の組成、細胞集団は少なくとも約３５％のＩＳＬ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の細胞を含む。一部の例では、細胞集団は少なくとも約４０％のＩＳＬ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の細胞を含む。一部の例では、細胞集団は多くとも約１５％のＩＳＬ１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の細胞を含む。一部の例では、組成物はエピジェネティック修飾化合物をさらに含む。
【００８６】
[0136]一部の態様では、本開示は、膵前駆細胞、およびヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤またはヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤のうち少なくとも１つを含む組成物を提供する。一部の態様では、本開示は、膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させて内分泌細胞を含む細胞集団を産生させるステップ、および内分泌細胞を含む細胞集団を成熟させて、グルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する少なくとも１個の膵β細胞を得るステップを含む方法を提供する。一部の例では、成熟ステップは、内分泌細胞を含む細胞集団を対象にｉｎ  ｖｉｖｏで埋め込んだ後に行われる。一部の例では、成熟ステップはｉｎ  ｖｉｔｒｏで行われる。
【００８７】
[0137]一部の態様では、本開示は（ａ）Ｐｄｘ−１陰性、ＮＫＸ６．１陰性の原腸管細胞の集団を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤およびトランスフォーメーション成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子と接触させ、それによりＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団を産生させるステップ、および（ｂ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞集団をエピジェネティック修飾化合物と接触させて内分泌細胞を含む細胞集団を産生させるステップを含む方法を提供する。
【００８８】
[0138]一部の例では、本明細書で提供される方法は、（ａ）集団中の多能性幹細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と接触させることによって多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ、（ｂ）胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの成長因子と接触させることによって胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかを原腸管細胞に分化させるステップ、（ｃ）原腸管細胞をＲＯＣＫ阻害剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子と接触させることによって原腸管細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップ、（ｄ）Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞をＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＳＨＨ経路阻害剤と接触させることによってＰｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップ、ならびに（ｅ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ＥＧＦファミリーからの成長因子、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ＳＨＨ経路阻害剤、ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、γ−セクレターゼ阻害剤、プロテインキナーゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、およびエピジェネティック修飾化合物と接触させることによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくともいくつかを少なくとも１個のＮＫＸ６．１＋かつＣ−ペプチド＋の細胞を含む細胞集団に分化させるステップを含む。
【００８９】
[0139]一部の態様では、本開示は細胞を照射して増殖を低減させる方法を提供する。一部の例では、本方法は内分泌細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏの細胞集団を約１００ｒａｄ〜約１００，０００ｒａｄの線量で約１分〜約６０分の時間の照射に曝露するステップを含む。
【００９０】
[0140]一部の例では、細胞の増殖を低減させる方法は幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、膵前駆細胞、または内分泌細胞を含む細胞集団を照射に曝露するステップであって、照射が照射に供されていない対応する細胞集団と比較して増殖能力が低減した細胞集団をもたらすステップを含む。
ＩＩ．内分泌細胞を産生する方法
[0141]態様では、本開示は膵前駆細胞または前駆体から内分泌細胞を産生する組成物および方法に関する。幹細胞から内分泌細胞を産生して少なくとも１個のＳＣ−β細胞を提供するある例示的な詳細なプロトコールは、それぞれ参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０２４０２１２号および第２０１５／０２１８５２２号に記載されている。
【００９１】
[0142]一部の例では、内分泌細胞の第１の集団を産生するための方法は、膵前駆細胞またはその前駆体の集団を少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物を含む第１の組成物と接触させて内分泌細胞の第１の集団を産生させるステップであって、少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物を欠く第２の組成物を用いて産生された内分泌細胞の第２の集団と比較して、内分泌細胞の第１の集団の中の低減した割合の細胞がＶＭＡＴ＋またはＣｄｘ２＋を発現するステップを含む。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾化合物はステージ５で添加され（図５〜図６）、それにより内分泌細胞がその割合を以下：（１）ＶＭＡＴ１マーカー（図１９）またはＣｄｘ２によってマークされる内分泌の集団を低減させる、（２）アルファ細胞およびその他の非ベータ細胞である膵島細胞への運命に運命付けられる細胞の割合を増加させる（図２０）、および（３）組成物中のベータ細胞の割合を増加させる（図８）、のように変化させることを誘起することができる。
【００９２】
[0143]一部の実施形態では、内分泌細胞の第１の集団はＶＭＡＴ＋かつＩＮＳ−である。一部の実施形態では、膵前駆細胞の集団はＰＨ細胞の集団に分化する。一部の実施形態では、エピジェネティック修飾化合物を欠く第２の組成物を用いて産生された内分泌細胞の第２の集団と比較して、内分泌細胞の第１の集団の中の増加した割合の細胞はＮＫＸ６．１−またはＣｈｒｏｍＡ＋である。一部の実施形態では、増加した割合の細胞はＮＫＸ６．１−かつＣｈｒｏｍＡ＋である。一部の実施形態では、膵前駆細胞の第１の集団はβ細胞の集団に分化する。一部の実施形態では、β細胞は幹細胞から誘導されたβ（ＳＣ−β）細胞である。一部の実施形態では、β細胞はＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する。一部の実施形態では、β細胞はグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する。一部の実施形態では、本明細書に記載した方法はｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される。
【００９３】
[0144]一部の例では、第１の組成物および第２の組成物は、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）プロテインキナーゼ阻害剤、ｖｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アゴニスト、またはｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤のうち少なくとも１つを含む。一部の実施形態では、第１の組成物および第２の組成物は、ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、スタウロスポリン、またはそれらの任意の組合せのうち少なくとも１つを含む。一部の例では、第１の組成物および第２の組成物は、いずれもベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、およびスタウロスポリンを含む。
【００９４】
[0145]膵前駆細胞またはその前駆体をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップを含み、接触させるステップが膵前駆細胞を誘起して内分泌細胞に分化させる、内分泌細胞を産生する方法が本明細書で提供される。一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐを含む。一部の例では、本方法は膵前駆細胞またはその前駆体を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）プロテインキナーゼ阻害剤、ｖｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アゴニスト、またはｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤のうち少なくとも１つと接触させるステップをさらに含む。
【００９５】
[0146]膵前駆細胞またはその前駆体をヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップを含み、接触させるステップが膵前駆細胞を誘起して内分泌細胞に分化させる、内分泌細胞を産生する方法が本明細書で提供される。一部の例では、本方法は膵前駆細胞またはその前駆体を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）プロテインキナーゼ阻害剤、ｖｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路アゴニスト、またはｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤のうち少なくとも１つと接触させるステップをさらに含む。
【００９６】
[0147]一部の実施形態では、内分泌細胞はβ細胞に分化する。一部の実施形態では、β細胞は幹細胞から誘導されたβ（ＳＣ−β）細胞である。一部の実施形態では、β細胞はＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する。一部の実施形態では、β細胞はグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。
【００９７】
[0148]膵前駆細胞またはその前駆体をヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と接触させるステップを含み、ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、内分泌細胞を産生する方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、本方法は膵前駆細胞をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、内分泌細胞はＣＨＧＡを発現する。一部の実施形態では、内分泌細胞はβ細胞に分化する。一部の実施形態では、β細胞は幹細胞から誘導されたβ（ＳＣ−β）細胞である。一部の実施形態では、β細胞はＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する。一部の実施形態では、β細胞はグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する。
【００９８】
[0149]細胞の集団および培地を含む組成物であって、細胞が膵前駆細胞を含み、培地がヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む組成物も本明細書で提供される。一部の実施形態では、膵前駆細胞は培地と接触すると誘起されて内分泌細胞に分化する。
【００９９】
[0150]非限定的なエピジェネティック修飾化合物の例には、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【０１００】
[0151]一実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はゼステホモログ２（ＥＺＨ２）のエンハンサーの阻害剤である。ＥＺＨ２はヒストン−リシン  Ｎ−メチルトランスフェラーゼ酵素である。ＥＺＨ２阻害剤の非限定的な例には、３−デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）、ＥＰＺ６４３８、ＥＰＺ００５６８７（Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）競合的阻害剤）、ＥＩ１、ＧＳＫ１２６、およびＵＮＣ１９９９が含まれる。ＤＺＮｅｐは全てのタンパク質メチルトランスフェラーゼの生成物系阻害剤であるＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）の加水分解を阻害してＳＡＨの細胞内濃度の上昇を導き、これが次にＥＺＨ２を阻害する。ＤＺＮｅｐはＥＺＨ２に特異的ではなく、他のＤＮＡメチルトランスフェラーゼをも阻害する。ＧＳＫ１２６はＥＺＨ１の１５０倍の選択性を有するＳＡＭ競合性ＥＺＨ２阻害剤である。ＵＮＣ１９９９はＧＳＫ１２６の類似体であり、その相当物であるＧＳＫ１２６より選択性が低い。
【０１０１】
[0152]一実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０（メルカプトケトン系ＨＤＡＣ阻害剤）、ＭＣ１５６８（クラスＩＩａ  ＨＤＡＣ阻害剤）、ＴＭＰ１９５（クラスＩＩａ  ＨＤＡＣ阻害剤）、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はボリノスタット、ロミデプシン（Ｉｓｔｏｄａｘ）、チダミド、パノビノスタット（ファリダク）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、バルプロ酸、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、アベキシノスタット（ＰＣＩ−２４７８１）、エンチノスタット（ＭＳ−２７５）、ＳＢ９３９、レスミノスタット（４ＳＣ−２０１）、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、キシノスタット（ＪＮＪ−２６４８１５８５）、ＨＢＩ−８０００（ベンザミドＨＤＩ）、ケベトリン、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＲ−４２、ＣＨＲ−２８４５、ＣＨＲ−３９９６、４ＳＣ−２０２、ＣＧ２００７４５、ＡＣＹ−１２１５、ＭＥ−３４４、スルホラファン、またはそれらの任意の変異体である。
【０１０２】
[0153]一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えばＤＺＮｅｐ）の濃度は０．０１〜１０μＭまたは約０．０１〜１０μＭであってよい。例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えばＤＺＮｅｐ）の濃度は約０．０１〜１、０．１〜１、０．２５〜１、０．５〜１、１〜５、または１〜１０μＭであってよい。ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えばＤＺＮｅｐ）の濃度は約５、４、３、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５、または０．０１μＭ未満であってよい。
【０１０３】
[0154]一部の実施形態では、本方法は膵前駆細胞または前駆体を第１のまたは第２の組成物と少なくとも１日、少なくとも２日、少なくとも３日、少なくとも４日、少なくとも５日、少なくとも６日、少なくとも７日、少なくとも８日、少なくとも９日、少なくとも１０日、少なくとも１１日、少なくとも１２日、少なくとも１３日、少なくとも１４日、少なくとも１５日、少なくとも１６日、少なくとも１７日、少なくとも１８日、少なくとも１９日、または少なくとも２０日、接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は膵前駆細胞または前駆体を第１のまたは第２の組成物と約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約８日、約９日、約１０日、約１１日、約１２日、約１３日、約１４日、約１５日、約１６日、約１７日、約１８日、約１９日、または約２０日、接触させるステップを含む。
【０１０４】
[0155]一部の実施形態では、膵前駆細胞はＰＤＸ１およびＮＫＸ６．１のうち少なくとも１つを発現する。一部の実施形態では、膵前駆細胞はＰＤＸ１とＮＫＸ６．１の両方を発現する。一部の実施形態では、内分泌細胞はＣＨＧＡを発現する。
エピジェネティック修飾
[0156]エピジェネティクスはＤＮＡ配列の変化によらない遺伝性の改変を意味し得る。むしろ、ＤＮＡのメチル化およびヒストンの修飾等のエピジェネティック修飾はＤＮＡの接近容易性およびクロマチンの構造を改変し、それにより遺伝子発現のパターンを規制することができる。これらのプロセスは成体生命体における独特の細胞系統の正常な発生および分化に重要であり得る。これらは外因性の影響によって修飾することができ、したがって表現型または病態表現型の環境的改変に寄与し得るか、またはその結果であり得る。重要なことに、エピジェネティックプログラミングは多能性遺伝子の規制において重要な役割を有し得、これは分化の間に不活性化される。
【０１０５】
[0157]クロマチンは核内タンパク質と会合した染色体ＤＮＡの複合体である。クロマチン中のＤＮＡはヌクレオソームと称される単位の中でヒストンタンパク質の周囲に詰め込まれている。ヌクレオソームは、２つのＨ２Ａ−Ｈ２Ｂダイマーによって取り囲まれた２つのＨ３−Ｈ４ヒストンダイマーからなるヒストンタンパク質のオクタマーコアと会合した１４７塩基対のＤＮＡを有し得る。Ｎ−末端のヒストンテールはヌクレオソームから核管腔に突出し得る。Ｈ１ヒストンはヌクレオソームの間に位置するリンカーＤＮＡと会合することができる。ヌクレオソームの間隔はクロマチンの構造を決定し、これはヘテロクロマチンとユークロマチンに幅広く分割することができる。クロマチンの構造および転写マシナリーへの遺伝子の接近可能性は、ＤＮＡおよびヒストンテールへの修飾によって規制することができる。
【０１０６】
[0158]分化した哺乳動物細胞において、ＤＮＡ中に見出される主要なエピジェネティック修飾はＣｐＧジヌクレオチド配列中のシトシン残基のＣ５位へのメチル基の共有結合の修飾（ＤＮＡのメチル化）であり得る。未分化の幹細胞では、ＣｐＧ中以外のシトシンもメチル化されることがあり、非ＣｐＧシトシンのメチル化は特に胚幹細胞における遺伝子の規制に重要であり得る。しかしＣｐＧのメチル化はリピート要素およびトランスポゾンの転写の抑制を確実にするためには重要な機構であり、刷り込みおよびＸ染色体の不活化にも重要な役割を果たし得る。ＣｐＧのメチル化による転写遺伝子のサイレンシングも、非発現細胞中で組織特異的遺伝子を抑制することによって、発生および分化の間のいくつかの組織特異的遺伝子の発現を制限することができる。
【０１０７】
[0159]ＣｐＧのメチル化はいくつかの機構によって転写を抑制することができる。特定のＣｐＧにおけるメチル基の存在は、いくつかの転写因子によるＤＮＡの認識および結合を直接ブロックすることができる。あるいは、他の因子がメチル化されたＤＮＡに優先的に結合し、転写因子の接近をブロックすることがある。例えば、ＭｅＣＰ２およびその他のファミリーメンバーはメチルＣｐＧに結合し、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）等のヒストン修飾タンパク質を動員することによって、転写抑制に寄与することができる。続いてヒストンの脱アセチル化はクロマチンの縮合を促進し、転写をさらに抑制することができる。この一連の事象によって、ＤＮＡのメチル化およびある種のヒストンの修飾の機能がともに、エピジェネティック修飾の対象となる遺伝子の転写のオンオフ状態にいかに寄与しているかが説明される。
【０１０８】
[0160]ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ酵素（ＤＮＭＴ）のファミリーは、ｄｅ  ｎｏｖｏのＤＮＡのメチル化およびその維持に関与している。胚発生の間、ｄｅ  ｎｏｖｏメチル化はＤＮＭＴ３ＡおよびＤＮＭＴ３Ｂ  １５によって行われ得る。あまねく発現しているＤＭＮＴ１はＣｐＧのメチル化の細胞内レベルを維持するために主として関わり得る。ＤＮＭＴ１は半メチル化ＤＮＡを認識し、複製の間に形成された非メチル化娘ストランドにメチル基を付加するように複合体中で機能し得る。ＣｐＧの塩基対形成により、引き続く複製サイクルの間のメチル化の相互の維持を可能にすることができる。このようにして、非遺伝子的形質（ＤＮＡのメチル化）を細胞から細胞へと伝えることができ、それとともに遺伝子発現に対する文脈的効果を伝えることができる。このように、メチル化は長期で比較的安定なエピジェネティック形質であると考えることができ、その効果は細胞の表現型を維持するために貢献し得る。
【０１０９】
[0161]ＤＮＡのメチル化はある種のヒストンの状態、例えば脱アセチル化の持続を促進し、それにより翻訳後のヒストンの修飾を保持する機構を提供することができる。ヒストンは翻訳後に修飾され、ホスホリル化、遍在化、アセチル化、およびメチル化を含む多くの方式でクロマチンを再構成することができる。これらのヒストンの修飾の中で、Ｈ３およびＨ４のテールのリシン残基のε−アミノ基におけるヒストンのアセチル化は、高度に一貫して転写の促進に関連している。アセチル化されて開いたクロマチンの構造によっても、転写リプレッサーの接近が可能になる。例えば、ＢＲＧ１およびＢｒｄ４等のいくつかのブロモドメイン含有因子はアセチル化ヒストンを標的としており、これらの因子はここでリプレッサー（またはアクチベーター）複合体の形成に介在し得る。アセチル化は、ＣＲＥＢ結合タンパク質（ＣＢＰ）、およびｐ３００、ＭＹＳＴ、ならびにＧＮＡＴ等のヒストンアセチルトランスフェラーゼ（ＨＡＴ）コファクターの成長するファミリーの１つを動員するＤＮＡ配列特異的転写因子の認識および結合によりクロマチンの領域を標的とすることができる。
【０１１０】
[0162]ヒストンの脱アセチル化はＣｐＧのメチル化およびクロマチンの不活性状態と相関し得る。ヒストンデアセチラーゼ酵素（ＨＤＡＣ）には４つのクラスがあり、そのメンバーはヒストンおよび／またはその他のタンパク質標的を脱アセチル化することができる。これらの規制タンパク質はそれ自体、アセチル化、ホスホリル化、およびスモイル化による規制の対象となり、これはその機能、細胞内分布、およびタンパク質−タンパク質の会合に影響し得る。配列特異的ＤＮＡ結合タンパク質およびコリプレッサー複合体との相互作用は、ある種のＨＤＡＣタンパク質からヒストンを遺伝子特異的な様式で標的とし得る。
【０１１１】
[0163]大部分のヒストンリシンメチルトランスフェラーゼは、ＳＥＴホモロジードメイン、即ちそれらの構造的類似性に基づいて７つのサブファミリーにグループ分けすることができるタンパク質の広いファミリーを有し得る。ＳＥＴ１ファミリーメンバーはＨ３Ｋ４をメチル化することによって、活性クロマチンを特異的に助長することができる。その他のヒストンリシンメチルトランスフェラーゼファミリーはいくつかのヒストン標的をメチル化することができる。さらに、これらのメチルトランスフェラーゼのいくつかはメチル化ＤＮＡまたはＣＢＰ３９等の他のタンパク質に特異的に結合する追加のドメインを有し得る。ＨＤＡＣタンパク質はヒトでは１８メンバーのファミリーを含むことができ、それらの大きさ、細胞内局在、触媒活性部位の数、および酵母のＨＤＡＣタンパク質への相同性に基づいて４つのクラスに分けられる。クラスＩにはＨＤＡＣ１、ＨＤＡＣ２、ＨＤＡＣ３、およびＨＤＡＣ８が含まれる。クラスＩＩは６つのＨＤＡＣタンパク質からなり、これらはさらに２つのサブクラスに分割される。クラスＩＩａにはＨＤＡＣ４、ＨＤＡＣ５、ＨＤＡＣ７、およびＨＤＡＣ９が含まれ、これらはそれぞれ単一の触媒活性部位を含む。クラスＩＩｂにはＨＤＡＣ６およびＨＤＡＣ１０が含まれ、これらはいずれも２つの活性部位を含むが、ＨＤＡＣ６のみが触媒として有効な２つの活性部位を有する。ＨＤＡＣ１１は系統発生学的な解析に基づく唯一のクラスＩＶのメンバーである。クラスＩ、ＩＩ、およびＩＶのＨＤＡＣタンパク質は、結晶学的解析によって示されるように、金属イオン依存性機構によって作用し得る。対照的に、サーチュイン（ＳＩＲＴ１−７）と称されるクラスＩＩＩのＨＤＡＣタンパク質は、他のＨＤＡＣタンパク質とは無関係のＮＡＤ＋依存性機構によって作用し得る。一実施形態では、ＨＤＡＣタンパク質のＨＤＡＣ阻害剤は細胞の分化を誘起する。一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤は細胞の分化に関連する重要な遺伝子を上方制御する。
エピジェネティック修飾化合物
[0164]用語「エピジェネティック修飾化合物」は、遺伝子にエピジェネティクスを起こさせる、即ちＤＮＡ配列を変化させずに遺伝子の発現を変化させる化合物を意味し得る。エピジェネティクスは遺伝子がオンまたはオフされるかを決定することを助け、ある種の細胞、例えばβ−細胞におけるタンパク質の生成に影響することができる。ＤＮＡのメチル化およびヒストンの修飾等のエピジェネティック修飾はＤＮＡの接近可能性およびクロマチンの構造を改変し、それにより遺伝子発現のパターンを規制することができる。これらのプロセスは成体生命体における独特の細胞系統の正常な発生および分化に重要であり得る。これらは外因性の影響によって修飾することができ、したがって表現型または病態表現型の環境的改変に寄与し得るか、またはその結果であり得る。重要なことに、エピジェネティック修飾は多能性遺伝子の規制において重要な役割を有し得、これは分化の間に不活性化される。非限定的なエピジェネティック修飾化合物の例には、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【０１１２】
[0165]一実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はゼステホモログ２（ＥＺＨ２）のエンハンサーの阻害剤である。ＥＺＨ２はヒストン−リシン  Ｎ−メチルトランスフェラーゼ酵素である。本明細書で提供される方法において使用できるＥＺＨ２阻害剤の非限定的な例には、３−デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）、ＥＰＺ６４３８、ＥＰＺ００５６８７（Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）競合的阻害剤）、ＥＩ１、ＧＳＫ１２６、およびＵＮＣ１９９９が含まれる。ＤＺＮｅｐは全てのタンパク質メチルトランスフェラーゼの生成物系阻害剤であるＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）の加水分解を阻害してＳＡＨの細胞内濃度の上昇を導き、これが次にＥＺＨ２を阻害することができる。ＤＺＮｅｐはＥＺＨ２に特異的ではなく、他のＤＮＡメチルトランスフェラーゼをも阻害することができる。ＧＳＫ１２６はＥＺＨ１の１５０倍の選択性を有するＳＡＭ競合性ＥＺＨ２阻害剤である。ＵＮＣ１９９９はＧＳＫ１２６の類似体であり、その相当物であるＧＳＫ１２６より選択性が低い。
【０１１３】
[0166]一実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はＫＤ５１７０（メルカプトケトン系ＨＤＡＣ阻害剤）、ＭＣ１５６８（クラスＩＩａ  ＨＤＡＣ阻害剤）、ＴＭＰ１９５（クラスＩＩａ  ＨＤＡＣ阻害剤）、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はボリノスタット、ロミデプシン（Ｉｓｔｏｄａｘ）、チダミド、パノビノスタット（ファリダク）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、バルプロ酸、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、アベキシノスタット（ＰＣＩ−２４７８１）、エンチノスタット（ＭＳ−２７５）、ＳＢ９３９、レスミノスタット（４ＳＣ−２０１）、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、キシノスタット（ＪＮＪ−２６４８１５８５）、ＨＢＩ−８０００（ベンザミドＨＤＩ）、ケベトリン、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＲ−４２、ＣＨＲ−２８４５、ＣＨＲ−３９９６、４ＳＣ−２０２、ＣＧ２００７４５、ＡＣＹ−１２１５、ＭＥ−３４４、スルホラファン、またはそれらの任意の変異体である。
ＩＩＩ．膵前駆細胞を産生する方法
[0167]態様では、本開示は原腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵β細胞に分化させる組成物および方法に関する。一部の例では、本方法は原腸管細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤およびトランスフォーメーション成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子を含む組成物と接触させるステップを含む。一部の例では、組成物はそれだけに限らないが線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの成長因子、ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）経路阻害剤、レチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）活性化剤、およびＲｈｏ関連タンパク質キナーゼ（ＲＯＣＫ）阻害剤を含む１つまたは複数の追加的な分化因子をさらに含む。
【０１１４】
[0168]一部の例では、本明細書で提供する方法は、原腸管細胞を含む細胞の集団をＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子を含む第１の組成物と接触させることによって、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを産生させるステップを含み、原腸管細胞はＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化する。一部の例では、接触させるステップは約１日、２日、または３日を要する。一部の例では、接触させるステップは約１日を要する。一部の例では、原腸管細胞は、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子を含む組成物と接触することによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞に分化する。一部の例では、産生させるステップは、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を、それだけに限らないが、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの成長因子、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤を含む１つまたは複数の分化因子を含む第２の組成物と接触させることによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップをさらに含む。一部の例では、第２の組成物はＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を含まない。
【０１１５】
[0169]一部の例では、本明細書で提供する方法により、原腸管細胞を含む細胞の集団をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることによって、多くとも約３０％、多くとも約２５％、多くとも約２０％、多くとも約１５％、多くとも約１０％、多くとも約５％、多くとも約４％、多くとも約３％、多くとも約２％、または多くとも約１％のＣＨＧＡ陽性細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。一部の例では、本明細書で提供する方法により、原腸管細胞を含む細胞の集団をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることによって、フローサイトメトリーによって測定して多くとも約２５％、多くとも約２０％、多くとも約１５％、または多くとも約１０％のＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。一部の例では、本明細書で提供する方法により、原腸管細胞を含む細胞の集団をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることによって、多くとも約３０％のＣＨＧＡ陽性細胞および多くとも約３０％のＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。一部の例では、本明細書で提供する方法により、原腸管細胞を含む細胞の集団をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることによって、多くとも約２０％のＣＨＧＡ陽性細胞および多くとも約５％のＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。一部の例では、本明細書で提供する方法により、原腸管細胞を含む細胞の集団をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化させることによって、多くとも約１５％のＣＨＧＡ陽性細胞および多くとも約３％のＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。
【０１１６】
[0170]一部の例では、本明細書で提供するＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＤＭＨ−１、その誘導体、類似体、または変異体を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供するＢＭＰシグナル伝達経路はＤＭＨ−１を含む。一部の実施形態では、本方法は原腸管細胞を約０．０１μＭ〜約１０μＭ、約０．０５μＭ〜約５μＭ、約０．１μＭ〜約１μＭ、または約０．１５μＭ〜約０．５μＭのＤＭＨ−１と接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は、原腸管細胞を約０．０１、０．０２、０．０３、０．０４、０．０５、０．０６、０．０７、０．０８、０．０９、０．１０、０．１１、０．１２、０．１３、０．１４、０．１５、０．１６、０．１７、０．１８、０．１９、０．２０、０．２１、０．２２、０．２３、０．２４、０．２５、０．２６、０．２７、０．２８、０．２９、０．３０、０．３１、０．３２、０．３３、０．３４、０．３５、０．３６、０．３７、０．３８、０．３９、０．４、０．４２、０．４５、０．４８、０．５０、０．５５、０．６０、０．６５、０．７０、０．７５、０．８０、０．８５、０．９０、０．９５、１、１．２、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、２．０、４．０、６．０、８．０、または１０μＭと接触させるステップを含む。一部の実施形態では、本方法は原腸管細胞を約０．２５μＭと接触させるステップを含む。一部の例では、原腸管細胞の分化に使用するＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮ１９３１８９（本明細書では「ＬＤＮ」とも名付ける）を含まない。
【０１１７】
[0171]一部の例では、本明細書で提供する方法は、原腸管細胞を含む細胞の集団をＤＭＨ−１、またはその誘導体、類似体、もしくは変異体と接触させることによって、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを産生するステップを含む。
【０１１８】
[0172]特定の理論に縛られることは望まないが、本明細書で開示した方法の一部の実施形態では、原腸管細胞のＰｄｘ１陽性膵前駆細胞への分化の間に、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害は、標的を外した細胞、例えば腸系統の細胞またはＣＤＸ２遺伝子発現陽性の細胞の産生を低減させることに寄与することができる。一方、一部の例では、原腸管細胞のＰｄｘ１陽性膵前駆細胞またはＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞への分化の間、ＩＩ型受容体介在ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の活性化は、ニューロゲニン３（Ｎｇｎ３）またはクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）の早期の誘起を低減することに寄与することができる。これらの早期の誘起は、一部の例では、成熟したＳＣ−β細胞よりはポリホルモン性の細胞の産生に導く。成熟したＳＣ−β細胞は、一部の例ではモノホルモン性であり、例えばインスリンのみを分泌するが、ソマトスタチンまたはグルカゴンのような他の膵ホルモンを分泌しない。ＢＭＰシグナル伝達経路とＴＧＦ−βシグナル伝達経路のクロストークがあり得る。一部の例では、ＢＭＰシグナル伝達経路の阻害剤は副作用、例えばとりわけ、ＩＩ型受容体介在ＴＧＦ−βシグナル伝達経路のブロックを有することがある。例えば比較的選択性が低いＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤であるＬＤＮ１９３１８９によるＩＩ型受容体介在ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害は、図１５に示すように、ＮＧＮ３／ＣＨＧＡの早期の誘起を導き、それによりポリホルモン性細胞を産生することがある。ある理論に縛られることは望まないが、一部の例では、高度に選択的なＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、例えばＤＭＨ−１またはその誘導体、類似体、もしくは変異体を使用することによって、ＩＩ型受容体介在ＴＧＦ−βシグナル伝達経路に対する阻害効果を低減することができる。他の一部の例では、特定の理論に縛られることは望まないが、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子をＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と共インキュベーションすることによって、ＢＭＰシグナル伝達経路を選択的に阻害する一方、ＩＩ型受容体介在ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の比較的高い活性化レベルを維持することができる。一部の例では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子をＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と共インキュベーションすることによって、標的を外した細胞、例えばＣＤＸ２陽性細胞の産生を低減し、例えば原腸管細胞から分化した細胞におけるＮＧＮ３またはＣＨＧＡの早期の誘起の結果としてのポリホルモン性細胞の産生を低減することができる。
【０１１９】
[0173]一部の態様では、本開示は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞または前駆体を含む細胞の集団を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ａ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｂ）ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、および任意選択でｃ）低濃度のレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤を含む少なくとも２つのβ細胞成熟因子と少なくとも５日間接触させて集団中の少なくとも１個のＰｄｘ陽性膵前駆細胞のＮＫＸ６−１陽性膵前駆細胞への分化を誘起するステップを含み、ＮＫＸ６−１陽性膵前駆細胞がＮＫＸ６−１を発現する、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞からＮＫＸ６−１陽性膵前駆細胞を生成する方法を提供する。
【０１２０】
[0174]一部の実施形態では、集団中のＰｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくとも１０％が誘起されてＮＫＸ６−１陽性膵前駆細胞に分化する。一部の実施形態では、集団中のＰｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくとも９５％が誘起されてＮＫＸ６−１陽性膵前駆細胞に分化する。一部の実施形態では、ＮＫＸ６−１陽性膵前駆細胞はＰｄｘ１、ＮＫＸ６−１、およびＦｏｘＡ２を発現する。一部の実施形態では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、胚幹細胞および人工多能性幹細胞からなる群から選択される多能性幹細胞の集団から生成される。
ＩＶ．幹細胞および再プログラミング
[0175]ＳＣ−β細胞（例えば成熟膵β細胞またはβ−様細胞）またはその前駆体を生成するための幹細胞の使用が本明細書で提供される。一実施形態では、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０２４０２１２号および第２０１５／０２１８５２２号に記載されたものと同様のプロトコールを用い、少なくとも１個のＳＣ−β細胞を提供するために、幹細胞の代わりに、またはそれとともに胚細胞を使用してよい。好適な胚細胞は、例えば最後の生理周期の約８〜１１週後に採取したヒト胎児材料中に存在する原初胚細胞から調製することができる。説明的な胚細胞の調製法は、例えばShamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998および米国特許第６，０９０，６２２号に記載されている。
【０１２１】
[0176]ＳＣ−β細胞（例えば膵β細胞）を産生する組成物および方法が本明細書で提供される。一般には、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体、例えば本明細書に開示した方法によって生成した膵前駆細胞は、様々な細胞の混合物または組合せ、例えば原腸管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６−１陽性の膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞（例えばβ−様細胞）、および／またはその他の多能性細胞もしくは幹細胞等の細胞の混合物を含み得る。
【０１２２】
[0177]少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体は、幹細胞または多能性細胞を所望の分化段階に分化する任意の好適な培養プロトコールに従って生成することができる。一部の実施形態では、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体は、少なくとも１個の多能性細胞を少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体に分化させるために適した時間および条件下で少なくとも１個の多能性細胞を培養することによって生成される。
【０１２３】
[0178]一部の実施形態では、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体は、実質的に純粋なＳＣ−β細胞またはその前駆体の集団である。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞またはその前駆体の集団は多能性細胞または分化した細胞の混合物を含む。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞またはその前駆体の集団は胚幹細胞または多能性細胞またはｉＰＳ細胞を実質的に含まないか、それらを欠いている。
【０１２４】
[0179]一部の実施形態では、体細胞、例えば線維芽細胞は、対象から例えば組織生検、例えば皮膚生検として単離することができ、本明細書に記載した組成物および方法における使用のための少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体を生成するためのさらなる分化のための人工多能性幹細胞に再プログラミングすることができる。一部の実施形態では、体細胞、例えば線維芽細胞は当業者には公知の方法によって培地中に維持され、一部の実施形態では、本明細書に開示した方法によってＳＣ−β細胞に変換される前に増加させられる。
【０１２５】
[0180]一部の実施形態では、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体は当業者には公知の方法によって培地中に維持され、一部の実施形態では、本明細書に記載した方法によってＳＣ−β細胞に変換される前に増加させられる。
【０１２６】
[0181]さらに、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体、例えば膵前駆細胞は任意の哺乳動物種からのものであってよく、その非限定的な例にはネズミ科、ウシ科、サル科、ブタ科、ウマ科、ヒツジ科、またはヒトの細胞が含まれる。明確かつ単純にするため、本明細書における方法の説明は哺乳動物の少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体に言及しているが、本明細書に記載した方法の全ては少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体の他の細胞型に容易に適用できることを理解されたい。一部の実施形態では、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体はヒト個体から誘導される。
幹細胞
[0182]本開示の実施形態は膵β細胞またはその前駆体の産生のための幹細胞の使用に関し得る。本明細書で用いる用語「幹細胞」は、自己更新し、分化した細胞型を産生する能力を有する細胞（例えば植物幹細胞、脊椎動物幹細胞）を意味し得る（Morrisonら、(1997) Cell 88:287-298）。細胞発生学の文脈においては、形容詞「分化した」または「分化している」は相対的な用語である。「分化した細胞」は、それと比較している細胞よりも発生の経路をさらに下流に進行した細胞であり得る。したがって、多能性幹細胞は系統が制限された前駆細胞（例えば中胚葉幹細胞）に分化することができ、これは次にさらに制限された細胞（例えばニューロン前駆細胞）に分化することができ、これは最終段階の細胞（例えば最終分化細胞、例えばニューロン、心筋細胞等）に分化することができる。最終段階の細胞はある種の組織型において特徴的な役割を果たし、さらに増殖する能力を保持できることも保持できないこともある。幹細胞は特定のマーカー（例えばタンパク質、ＲＮＡ等）の存在および特定のマーカーの非存在によって特徴付けることができる。幹細胞はｉｎ  ｖｉｔｒｏとｉｎ  ｖｉｖｏの両方の機能性アッセイ、特に多種の分化した子孫を生じる幹細胞の能力に関連するアッセイによっても同定することができる。一実施形態では、宿主細胞は成体幹細胞、体幹細胞、非胚幹細胞、胚幹細胞、造血幹細胞であり、多能性幹細胞、およびトロホブラスト幹細胞を含む。
【０１２７】
[0183]目的の幹細胞、例えば本明細書で提供する方法に使用できる幹細胞は、多能性幹細胞（ＰＳＣ）を含み得る。本明細書で用いる用語「多能性幹細胞」または「ＰＳＣ」は、生命体の全ての細胞型を生成することができる幹細胞を意味する。したがって、ＰＳＣは生命体の全ての胚葉の細胞（例えば脊椎動物の内胚葉、中胚葉、および外胚葉）を生じることができる。多能性細胞は奇形腫を形成すること、および生命体の外胚葉、中胚葉、または内胚葉の組織に寄与することができる。植物の多能性幹細胞は植物の全ての細胞型（例えば根、茎、葉、その他の細胞）を生じることができる。
【０１２８】
[0184]本開示の実施形態は膵β細胞またはその前駆体の産生のためのＰＳＣの使用に関し得る。動物のＰＳＣはいくつかの異なった方式で誘導することができる。例えば、胚幹細胞（ＥＳＣ）は胚の内部細胞集塊から誘導することができる（Thomsonら、Science. 1998 Nov. 6; 282(5391):1145-7）。一方、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）は体細胞から誘導することができる（Takahashiら、Cell. 2007 Nov. 30; 131(5):861-72；Takahashiら、Nat Protoc. 2007; 2(12):3081-9；Yuら、Science. 2007 Dec. 21; 318(5858):1917-20. Epub 2007 Nov. 20）。用語ＰＳＣはその起源に関わらず多能性幹細胞を意味することができるので、用語ＰＳＣは用語ＥＳＣおよびｉＰＳＣ、ならびにＰＳＣの別の例である用語、胎児胚幹細胞（ＥＧＳＣ）をも包含することができる。ＰＳＣは確立された細胞株の形態であってよく、これらは初代胚組織から直接得ることができ、または体細胞から誘導することもできる。
【０１２９】
[0185]本開示の実施形態は膵β細胞またはその前駆体の産生のためのＥＳＣの使用に関し得る。「胚幹細胞（ＥＳＣ）」は胚から、典型的には胚盤胞の内部細胞集塊から単離されたＰＳＣを意味し得る。ＥＳＣ株、例えばｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．社）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）；Ｍｉｚ−ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ−１、ＨＳＦ−６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；およびＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  （ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）がＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙されている。目的の幹細胞にはその他の霊長類からの胚幹細胞、例えばアカゲザル幹細胞およびマーモセット幹細胞も含まれる。幹細胞は任意の哺乳動物種、例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、霊長類等から得ることができる（Thomsonら、(1998) Science 282:1145；Thomsonら、(1995) Proc. Natl. Acad. Sci USA 92:7844；Thomsonら、(1996) Biol. Reprod. 55:254；Shamblottら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998）。培養では、ＥＳＣは大きな核−細胞質比、明確な境界、および目立った核を有する平坦なコロニーとして成長することができる。さらに、ＥＳＣはＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、ＴＲＡ−１−６０、ＴＲＡ−１−８１、およびアルカリホスファターゼを発現することができるが、ＳＳＥＡ−１は発現しない。ＥＳＣを産生し特徴解析する方法の例は、例えばそれぞれが全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，０２９，９１３号、同第５，８４３，７８０号、および同第６，２００，８０６号に見出すことができる。未分化の形態のｈＥＳＣを増殖させる方法は、それぞれが全体として本明細書に組み込まれるＷＯ第９９／２０７４１号、ＷＯ第０１／５１６１６号、およびＷＯ第０３／０２０９２０号に記載されている。
【０１３０】
[0186]「胎児胚幹細胞（ＥＧＳＣ）または胎児胚細胞」または「ＥＧ細胞」は、胚細胞および／または胚細胞前駆細胞、例えば原初胚細胞、例えば精子および卵子になることができる胚細胞から誘導されたＰＳＣを意味し得る。胎児胚細胞（ＥＧ細胞）は上記の胎児幹細胞と同様の特性を有すると考えられている。ＥＧ細胞を産生し特徴解析する方法の例は、例えばそれぞれが全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，１５３，６８４号；Matsui, Y.ら、(1992) Cell 70:841；Shamblott, M.ら、(2001) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 113；Shamblott, M.ら、(1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:13726；およびKoshimizu, U.ら、(1996) Development, 122:1235に見出すことができる。
【０１３１】
[0187]本開示の実施形態は膵β細胞またはその前駆体の産生のためのｉＰＳＣの使用に関し得る。「人工多能性幹細胞」または「ｉＰＳＣ」は、ＰＳＣでない細胞から（例えばＰＳＣに対して分化した細胞から）誘導されたＰＳＣを意味し得る。ｉＰＳＣは最終的に分化した細胞を含む多種の異なった細胞型から誘導することができる。ｉＰＳＣはＥＳ細胞様の形態を有し、大きな核−細胞質比、明確な境界、および目立った核を有する平坦なコロニーとして成長することができる。さらに、ｉＰＳＣは、それだけに限らないがアルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ３、ＳＳＥＡ４、Ｓｏｘ２、Ｏｃｔ３／４、Ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ１６０、ＴＲＡ１８１、ＴＤＧＦ１、Ｄｎｍｔ３ｂ、ＦｏｘＤ３、ＧＤＦ３、Ｃｙｐ２６ａ１、ＴＥＲＴ、およびｚｆｐ４２を含む当業者には公知の１つまたは複数の重要な多能性マーカーを発現することができる。ｉＰＳＣを産生し特徴解析する方法の例は、例えばそれぞれが全体として本明細書に組み込まれる米国特許公開第２００９／００４７２６３号、同第２００９／００６８７４２号、同第２００９／０１９１１５９号、同第２００９／０２２７０３２号、同第２００９／０２４６８７５号、および同第２００９／０３０４６４６に見出すことができる。一般にｉＰＳＣを産生するためには、体細胞を再プログラミングして多能性幹細胞にする当技術で公知の再プログラミング因子（例えばＯｃｔ４、ＳＯＸ２、ＫＬＦ４、ＭＹＣ、Ｎａｎｏｇ、Ｌｉｎ２８、その他）を体細胞に提供する。
【０１３２】
[0188]本開示の実施形態は膵β細胞またはその前駆体の産生のための体細胞の使用に関し得る。「体細胞」は実験的操作の非存在下では生命体内の全ての型の細胞を通常には生じない生命体内の任意の細胞を意味し得る。換言すれば、体細胞は十分に分化しており、したがって生体の３つ全ての胚葉の細胞、例えば外胚葉、中胚葉、および内胚葉の細胞を天然には産生しない細胞であり得る。例えば、体細胞にはニューロンおよびニューロン前駆細胞が含まれ、ニューロン前駆細胞は中枢神経系の全てのまたはいくつかの細胞型を天然に生じることができるが、中胚葉または内胚葉の系統の細胞を生じることはできない。
【０１３３】
[0189]ある特定の例では、幹細胞は本明細書で開示した方法による少なくとも１つの分化因子または組成物に曝露される前には未分化（例えば特定の系統に関わっていない細胞）であってよく、一方、他の例では、本明細書に記載した少なくとも１つの分化因子または組成物に曝露する前に幹細胞を１つまたは複数の中間細胞型に分化することが望ましいことがある。例えば、幹細胞は未分化細胞の形態学的、生物学的、または物理的な特徴を呈することがあり、これらの特徴はこれらの細胞を胎児起源または成体起源の分化した細胞と区別するために用いることができる。一部の例では、未分化細胞は高い核／細胞質比および目立った核を有する細胞のコロニーにおいて微視的な二次元で現れ得る。幹細胞はそれ自体（例えば実質的に未分化細胞が何ら存在しない）であってよく、または分化細胞の存在下に使用してもよい。ある特定の例では、幹細胞は成長し、任意選択で分化し得るために、好適な栄養剤および任意選択で他の細胞の存在下で培養することができる。例えば、幹細胞の成長を補助するために、胎児線維芽細胞または線維芽細胞様細胞が培養中に存在してもよい。線維芽細胞は幹細胞の成長の１つの段階の間に存在してよいが、必ずしも全ての段階に存在する必要はない。例えば、線維芽細胞は最初の培養段階で幹細胞の培養に添加し、１つまたは複数の引き続く培養段階では幹細胞の培養に添加しなくてもよい。
【０１３４】
[0190]本発明の全ての態様において使用する幹細胞は任意の種類の組織（例えば胎児もしくは前胎児の組織等の胚組織、または成体組織）から誘導される任意の細胞であってよく、これらの幹細胞は適切な条件下で種々の細胞型、例えば３つの胚葉（内胚葉、中胚葉、および外胚葉）の全てまたは少なくとも１つの誘導体からなる子孫を生成する能力があるという特徴を有し得る。これらの細胞型は確立された細胞株の形態で提供することができ、または初代胚組織から直接得て、直ちに分化に使用することもできる。ＮＩＨ  Ｈｕｍａｎ  Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ  Ｒｅｇｉｓｔｒｙに列挙されている細胞、例えばｈＥＳＢＧＮ−０１、ｈＥＳＢＧＮ−０２、ｈＥＳＢＧＮ−０３、ｈＥＳＢＧＮ−０４（ＢｒｅｓａＧｅｎ，Ｉｎｃ．社）；ＨＥＳ−１、ＨＥＳ−２、ＨＥＳ−３、ＨＥＳ−４、ＨＥＳ−５、ＨＥＳ−６（ＥＳ  Ｃｅｌｌ  Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ社）；Ｍｉｚ−ｈＥＳ１（ＭｉｚＭｅｄｉ  Ｈｏｓｐｉｔａｌ−Ｓｅｏｕｌ  Ｎａｔｉｏｎａｌ  Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）；ＨＳＦ−１、ＦＩＳＦ−６（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ  ｏｆ  Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ  ａｔ  Ｓａｎ  Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）；およびＨ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１３、Ｈ１４（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ  Ａｌｕｍｎｉ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ  （ＷｉＣｅｌｌ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）が含まれる。一部の実施形態では、成熟したインスリン陽性細胞への化学的に誘起された分化のために使用したヒト幹細胞または多能性幹細胞の供給源には、ヒト胚を破壊するステップは含まれていなかった。一部の実施形態では、成熟したインスリン陽性細胞への化学的に誘起された分化のために使用したヒト幹細胞または多能性幹細胞の供給源には、ヒト胚を破壊するステップは含まれていない。
【０１３５】
[0191]別の例では、幹細胞は固体組織を含む組織から単離することができる。一部の実施形態では、組織は皮膚、脂肪組織（例えばアジポーズ組織）、筋肉組織、心臓または心臓組織である。他の実施形態では、組織は例えばそれだけに限らないが臍帯血、胎盤、骨髄、または軟骨である。
【０１３６】
[0192]本明細書で提供する方法において使用され得る幹細胞には、Thomsonら、(1998) Science 282:1145によって記載されたヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞、アカゲザル幹細胞等の他の霊長類からの胚幹細胞（Thomsonら、(1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844）、マーモセット幹細胞（Thomsonら、(1996) Biol. Reprod. 55:254）、およびヒト胎児胚（ｈＥＧ）細胞（Shambloftら、Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998）によって例示される種々の型の胚細胞も含まれ得る。本明細書で提供する方法には、中胚葉幹細胞およびその他の早期心臓発生細胞等の系統に関与する幹細胞も適用可能である（Reyesら、(2001) Blood 98:2615-2625、EisenbergおよびBader、(1996) Circ Res. 78(2):205-16等を参照されたい）。幹細胞は任意の哺乳動物種、例えばヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、ネコ、げっ歯類、例えばマウス、ラット、ハムスター、霊長類等から得ることができる。一部の実施形態では、ヒト胚は本明細書に開示した方法および組成物に使用する多能性細胞の供給源のために破壊されなかった。一部の実施形態では、ヒト胚は本明細書に開示した方法および組成物に使用する多能性細胞の供給源のために破壊されない。
【０１３７】
[0193]内皮、筋肉、および／またはニューロンの幹細胞の好適な供給源からの細胞の混合物を、本開示の目的のために哺乳動物のドナーから収穫することができる。好適な供給源は造血微小環境である。例えば、好ましくは固定化された（例えば動員された）循環末梢血を対象から取り出すことができる。一実施形態では、幹細胞は再プログラミングされた幹細胞、例えば体細胞または分化した細胞から誘導された幹細胞であってよい。そのような実施形態では、脱分化された幹細胞は、例えばそれだけに限らないが新生物細胞、腫瘍細胞、およびがん細胞、あるいは人工多能性幹細胞もしくはｉＰＳ細胞等の、誘導され再プログラミングされた細胞であってよい。
【０１３８】
[0194]一部の実施形態では、本明細書に記載した膵β細胞は、毛髪細胞、角化細胞、性腺刺激ホルモン産生細胞、副腎皮質刺激ホルモン産生細胞、甲状腺刺激ホルモン産生細胞、ソマトトロピン産生細胞、乳腺刺激ホルモン産生細胞、クロマフィン細胞、傍濾胞細胞、グロムス細胞、メラニン形成細胞、母斑細胞、メルケル細胞、象牙芽細胞、セメント芽細胞、角膜角化細胞、網膜ムラー細胞、網膜色素上皮細胞、ニューロン、グリア細胞（例えば乏突起樹状細胞、星状膠細胞）、上衣細胞、松果体細胞、肺細胞（例えばＩ型肺細胞およびＩＩ型肺細胞）、クララ細胞、ゴブレット細胞、Ｇ細胞、Ｄ細胞、ＥＣＬ細胞、胃主細胞、壁細胞、小窩細胞、Ｋ細胞、Ｄ細胞、Ｉ細胞、ゴブレット細胞、パネス細胞、腸細胞、マイクロフォールド細胞、肝細胞、肝星細胞、（例えば中胚葉からのクッパー細胞）、胆嚢細胞、房心細胞、膵星細胞、膵α細胞、膵β細胞、膵δ細胞、膵Ｆ細胞（例えばＰＰ細胞）、膵ε細胞、甲状腺（例えば濾胞性細胞）、副甲状腺（例えば副甲状腺主細胞）、好酸性細胞、尿路上皮細胞、骨芽細胞、骨細胞、軟骨芽細胞、軟骨細胞、線維芽細胞、線維細胞、筋芽細胞、筋細胞、筋サテライト細胞、腱細胞、心筋細胞、脂肪芽細胞、脂肪細胞、カハル介在細胞、血管芽細胞、内皮細胞、メサンギウム細胞（例えば糸球体内メサンギウム細胞および糸球体外メサンギウム細胞）、傍糸球体細胞、緻密斑細胞、間質細胞（stromal cells）、間質細胞（interstitial cells）、テロサイト単純上皮細胞、有足細胞、腎近位細管刷子縁細胞、セルトリ細胞、ライディッヒ細胞、顆粒膜細胞、ペッグ細胞、胚葉細胞、精子、卵子、リンパ球、ミエロイド細胞、内皮前駆細胞、内皮幹細胞、血管芽細胞、中血管芽細胞、周皮壁細胞、脾細胞（例えばＴリンパ球、Ｂリンパ球、樹状細胞、ミクロファージ、白血球）、トロホブラスト幹細胞、またはそれらの任意の組合せのうち１つまたは複数から誘導することができる。
再プログラミング
[0195]本明細書で用いる用語「再プログラミング」は、体細胞の分化状態を改変または逆行させるプロセスを意味し得る。細胞は再プログラミングの前に部分的にまたは最終的に分化させることができる。再プログラミングは体細胞の分化状態の多能性細胞への完全な逆行を包含し得る。そのような分化の完全な逆行は人工多能性（ｉＰＳ）細胞を生成し得る。本明細書で用いる再プログラミングは、細胞の分化状態の、例えば、多能性でも万能性でもないがそれが生じた元の分化した細胞の１つまたは複数の特定の特徴を失った細胞である万能性状態の細胞または体細胞への部分的な逆行、例えば分化した細胞の様々な体細胞型への直接的再プログラミングをも包含し得る。再プログラミングには、接合子が成体に成長する際の細胞の分化の間に起こる核酸の修飾（例えばメチル化）、クロマチンの縮合、エピジェネティクス、ゲノムの刷り込み等の遺伝可能なパターンの少なくともいくつかの改変、例えば逆行が含まれ得る。
【０１３９】
[0196]本明細書で用いる場合、用語「再プログラミング因子」は、細胞の「再プログラミング」、即ちそれによって細胞が異なった細胞型または表現型に変換される分化、および／または脱分化、および／または分化転換に関連する分子を意味し得る。再プログラミング因子は一般に、細胞の分化、脱分化、および／または分化転換に関連する遺伝子の発現に影響する。転写因子は再プログラミング因子の例である。
【０１４０】
[0197]本明細書で用いる用語「分化」およびその文法的等価物は、特殊性の低い細胞（例えばより高い細胞能力を有するより原始的な細胞）が特殊性の高い細胞型（例えばより低い細胞能力を有するより原始的でない細胞）になるプロセスを意味し、用語「脱分化」は、特殊性の高い細胞が特殊性の低い細胞型（例えばより高い細胞能力を有するより原始的な細胞）になるプロセスを意味し、用語「分化転換」は、特定の細胞型の細胞がその「細胞能力」または「原始性」のレベルを顕著に変化させずに別の細胞型に変換されるプロセスを意味し得る。理論に縛られることは望まないが、細胞がその「細胞能力」または「原始性」のレベルを顕著に変化させずに１つの系統関与細胞型または最終的に分化した細胞型から別の系統関与細胞型または最終的に分化した細胞型に変換された場合には、細胞は「分化転換」すると考えられる。
【０１４１】
[0198]本明細書で用いる場合、用語「細胞分化能」は、細胞が異なる系統の細胞に分化する能力を意味すると理解されたい。例えば、多能性細胞（例えば幹細胞）は、３つの胚葉、即ち内胚葉（胃の内部ライニング、胃腸管、肺）、中胚葉（筋肉、骨、血液、尿生殖器）、または外胚葉（上皮組織および神経系）のいずれの細胞にも分化する可能性を有し、したがって高い細胞分化能を有する。万能性細胞（例えば幹細胞またはある型の誘起された幹細胞）は多いが限られた数の系統（例えば造血幹細胞、心幹細胞、または神経幹細胞等）から細胞を生じる能力を有し、多能性細胞よりは比較的低い細胞分化能を有している。特定の系統に関与し、または最終的に分化した細胞は、さらに低い細胞分化能を有し得る。当技術で公知の分化転換の特定の例には、例えば線維芽ベータ細胞の、または膵外分泌細胞からベータ細胞への変換等が含まれる。
【０１４２】
[0199]したがって、細胞はより原始的な細胞に分化させることができ（例えば最終的に分化した細胞は万能性または多能性に分化することができ）、または細胞はより原始性の低い細胞に脱分化させることができる（例えば万能性または多能性の細胞は系統に関与する細胞または最終的に分化した細胞に分化することができる）。しかし、一実施形態では、細胞は例えば同様の細胞能力レベルで１つの細胞型（または表現型）から別の細胞型（または表現型）に変換または分化転換させることができる。したがって、本開示の一実施形態では、本開示の誘起するステップは、本開示の細胞を再プログラミングして、分化し、脱分化し、および／または分化転換することができる。本開示の一実施形態では、本開示の誘起するステップは、細胞を再プログラミングして分化転換することができる。
【０１４３】
[0200]１つまたは複数の外因性ポリヌクレオチドまたはポリペプチド再プログラミング因子を使用し、例えば分化、脱分化、および／または分化転換することによって特定の型の細胞を再プログラミングまたは誘起して別の型の細胞にする方法は、当業者には公知である。そのような方法は、細胞の再プログラミングに関連する１つまたは複数の転写因子またはその他のポリペプチドをコードする遺伝材料の導入に依拠し得る。例えば、Ｐｄｘ１、Ｎｇｎ３およびＭａｆＡ、またはそれらの機能的断片は全て、本開示の細胞の細胞分化、脱分化、および／または分化転換を誘起することができるペプチドをコードしていることが知られている公知である。当業者に公知のいくつかの方法では、再プログラミング遺伝子（上記の遺伝子等）によってコードされる外因性ポリペプチド（例えば組換えポリペプチド）が細胞と接触して、例えば本開示の細胞を誘起する。当業者であれば、他の遺伝子も細胞の再プログラミングに関連し、そのような遺伝子をコードする外因性分子（またはその機能性断片）およびコードされたポリペプチドもポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子（例えば、続いて細胞の再プログラミングに関連する別の遺伝子の発現レベルに影響するポリヌクレオチドまたはポリペプチド）であると考えられることが認識される。例えば、ｐ５３の不活性化を低減させる外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドのエピジェネティック遺伝子サイレンサーの導入によって、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を誘起する効率が上昇することが示されている。したがって、エピジェネティックサイレンサーをコードする外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチド、ならびに細胞の再プログラミングまたは細胞のプログラミング効率の上昇に直接または間接に関与すると思われるその他の遺伝子またはタンパク質は、外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子を構成すると考えられる。当業者であれば、細胞の再プログラミングの阻害に関与する遺伝子の発現をノックダウンすることができるＲＮＡｉ分子（またはＲＮＡｉ分子をコードする遺伝子材料）の導入等の、細胞の再プログラミングに影響する他の方法が存在することが認識される。したがって、細胞の再プログラミングに関連し、または細胞の再プログラミングを促進する任意の外因性のポリヌクレオチド分子またはポリペプチド分子は、本明細書に記載した外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子であると理解されたい。
【０１４４】
[0201]本開示の一部の実施形態では、本方法には小分子でない再プログラミング因子の使用は含まれない。しかし、本方法では培地、血清、血清代替物、補助剤、抗生剤、その他、例えばＲＰＭＩ、腎上皮基本培地（ＲＥＢＭ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＭＣＤＢ１３１培地、ＣＭＲＬ１０６６培地、Ｆ１２、ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、Ｄ−グルコース、Ｌ−グルタミン、ＧｌｕｔａＭＡＸ．ＴＭ−１（ジペプチド、Ｌ−アラニン−Ｌ−グルタミン）、Ｂ２７、ヘパリン、プロゲステロン、プトレシン、ラミニン、ニコチンアミド、インスリン、トランスフェリン、セレン酸ナトリウム、セレン、エタノールアミン、ヒト上皮細胞成長因子（ｈＥＧＦ）、塩基性線維芽細胞成長因子（ｂＦＧＦ）、ヒドロコルチゾン、エピネフリン、ノルマシン、ペニシリン、ストレプトマイシン、ゲンタマイシン、およびアンホテリシン等の「日常的」な組織培養成分を利用できることが認識される。これらの典型的な組織培養成分（および組織培養で日常的に使用されるその他の同様の組織培養成分）は、本開示の目的のための小分子の再プログラミング分子ではない。これらの成分は本明細書で定義する小分子でも、本明細書で定義する再プログラミング因子でもない。
【０１４５】
[0202]したがって、一実施形態では、本開示は、細胞を１つまたは複数の外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子とともに培養するステップを含まない。したがって、一実施形態では、本開示の方法は、誘起されたβ細胞を産生すること、またはそうでなければ本開示の細胞を誘起して分化させ、脱分化させ、および／または分化転換させることに関与する、例えばトランスポゾン、ウイルストランスジェニックベクター（レトロウイルスベクター等）、プラスミド、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、ペプチド、またはこれらの分子のいずれかの断片を導入することによる、１つまたは複数の外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子の導入を含まない。
【０１４６】
[0203]即ち、一実施形態では、本方法は、１つまたは複数の外因性のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの再プログラミング因子の非存在下で実施される。したがって、一実施形態では、本開示の方法では、ポリペプチド転写因子、分化、脱分化、および／または分化転換の誘起に特異的に関連するその他のポリペプチド因子、ポリペプチド転写因子をコードするポリヌクレオチド配列、分化、脱分化、および／または分化転換の誘起に特異的に関連するその他のポリペプチド因子をコードするポリヌクレオチド配列、ｍＲＮＡ、干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ならびにそれらの断片を添加せずに、小分子（例えばＨＤＡＣ阻害剤）を利用して細胞を再プログラミングすることを理解されたい。
Ｖ．ゼノフリー培地
[0204]態様では、本開示は、ゼノフリー培地中で前駆細胞（例えばｉＰＳＣ細胞等の幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、またはインスリン陽性内分泌細胞）を分化するステップを含む、膵β細胞、例えばＳＣ−β細胞を産生する方法に関する。動物起源の細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、他の動物からの製品を有しなくてよい。一部の例では、ヒトの細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地はいかなる非ヒト動物からの製品をも有しなくてよい。例えば、ヒトの細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）の代わりに、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）またはヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含んでよい。
【０１４７】
[0205]一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、血清アルブミンを欠く培地の中で前駆細胞（例えばｉＰＳＣ細胞等の幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、またはインスリン陽性内分泌細胞）を分化するステップによる、膵β細胞、例えばＳＣ−β細胞を産生するステップを含む。一部の例では、培地中に血清アルブミンまたはＨＳＡを使用しない本明細書で提供した方法によって産生された膵β細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターは、その代わりにＢＳＡを使用する他の同等の方法によって産生された膵β細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターと比較して、顕著な改善を有し得る。改善には、得られた最終の細胞集団における高いパーセンテージの膵β細胞、高いＧＳＩＳ応答（例えばグルコースチャレンジに応答するより多くのインスリン放出）、高いＧＳＩＳ刺激インデックス、産生された細胞クラスター中の膵β細胞の分布のより高い均一性、またはそれらの任意の組合せが含まれ得る。
【０１４８】
[0206]一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培地中で幹細胞、例えばｈＥＳ細胞またはｉＰＳ細胞を含む細胞の集団を分化するステップを含む。一部の例では、幹細胞は胚体内胚葉細胞に分化される。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培地中で胚体内胚葉細胞を含む細胞の集団を分化するステップを含む。一部の例では、胚体内胚葉細胞は原腸管細胞に分化される。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培地中で原腸管細胞を含む細胞の集団を分化するステップを含む。一部の例では、原腸管細胞はＰｄｘ１陽性膵前駆細胞（例えばＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞またはＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞）に分化される。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培地中でＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を含む細胞の集団を分化するステップを含む。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞はＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化される。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培地中でＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞の集団を分化するステップを含む。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞はインスリン陽性内分泌細胞に分化される。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）を含む培地中でインスリン陽性内分泌細胞を含む細胞の集団を分化するステップを含む。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞は膵β細胞、例えばＳＣ−β細胞に分化される。
【０１４９】
[0207]一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、約０．００１％（ｗ／ｖ）〜約５％（ｗ／ｖ）、約０．００５％（ｗ／ｖ）〜約４％（ｗ／ｖ）、約０．０１％（ｗ／ｖ）〜約３％（ｗ／ｖ）、約０．０２％（ｗ／ｖ）〜約２．５％（ｗ／ｖ）、約０．０３％（ｗ／ｖ）〜約２％（ｗ／ｖ）、約０．０４％（ｗ／ｖ）〜約１％（ｗ／ｖ）、約０．０４５％（ｗ／ｖ）〜約０．５％（ｗ／ｖ）、または約０．０５％（ｗ／ｖ）〜約０．１％（ｗ／ｖ）のＨＳＡを含む培地の使用を含む。一部の実施形態では、本明細書で提供する方法は、約０．００１％、０．００２％、０．００２５％、０．００５％、０．００７５％、０．０１％、０．０１２５％、０．０１５％、０．０１７５％、０．０２％、０．０２２５％、０．０２５％、０．０２７５％、０．０３％、０．０３２５％、０．０３５％、０．０３７５％、０．０４％、０．０４２５％、０．０４５％、０．０４７５％、０．０５％、０．０５２５％、０．０５５％、０．５７５％、０．０６％、０．０６２５％、０．０６５％、０．０６７５％、０．０７％、０．０７２５％、０．０７５％、０．０７７５％、０．０８％、０．０８５％、０．０９％、０．１％、０．１２％、０．１５％、０．２％、０．２５％、０．３％、０．４％、０．５％、０．６％、０．７％、０．８％、０．９％、１％、１．５％、２％、２．５％、３％、または４％、５％（ｗ／ｖ）のＨＳＡを含む培地の使用を含む。用語「ｗ／ｖ」は重量／体積または体積あたり重量のパーセンテージの短縮形である。例えば、培地１００ｍＬ中の１ｍｇのＨＳＡは１％（ｗ／ｖ）の濃度を有する。
【０１５０】
[0208]一部の例では、本明細書で提供する方法により、原腸管細胞を含む細胞の集団をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化することによって、少なくとも約６０％、少なくとも約６５％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％のＰｄｘ１陽性細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。一部の例では、本明細書で提供する方法により、原腸管細胞を含む細胞の集団をＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターに分化することによって、多くとも約６０％、多くとも約５０％、多くとも約４０％、多くとも約３５％、多くとも約３０％、多くとも約２５％、多くとも約２２％、多くとも約２０％、多くとも約１８％、多くとも約１５％、多くとも約１４％、多くとも約１３％、多くとも約１１％、多くとも約１２％、多くとも約１０％、または多くとも約５％のＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞の集団または細胞クラスターを得ることができる。
ＶＩ．幹細胞から誘導されたベータ細胞を産生する方法
[0209]ＳＣ−β細胞（例えば膵β細胞）を産生する方法が本明細書で提供される。幹細胞から内分泌細胞を産生して少なくとも１個のＳＣ−β細胞を提供する詳細なプロトコールは、それぞれが参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１５／０２４０２１２号および同第２０１５／０２１８５２２号に記載されている。
【０１５１】
[0210]内胚葉は消化管および呼吸管、甲状腺、肝臓、ならびに膵を生じることができる。内胚葉系統の代表的な疾患としてはインスリンを生成するβ細胞の破壊に起因する１型糖尿病がある。ｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるヒト多能性幹細胞（ｈＰＳＣ）からの機能性β細胞の産生は、１型糖尿病の置換細胞療法のための実際的で更新可能な細胞源になり得る。芽球段階の胚の内部細胞集塊から産生される胚幹（ＥＳ）細胞は、損傷された任意の細胞の移植または細胞に基づく療法のための有望な細胞源を表している。これらは培地中に維持され、それ自体で更新され、未分化ＥＳ細胞として無限に増殖することができる。ＥＳ細胞は外胚葉、中胚葉、および内胚葉の系統細胞または組織として、生体の全ての細胞型に分化することができる。ＥＳ細胞の主な利点は培地中での安定な自己更新および分化の可能性である。
【０１５２】
[0211]胚体内胚葉は胚発生の原腸形成のプロセスによってｉｎ  ｖｉｖｏで内部細胞集塊から産生され、このプロセスで胚盤葉上層細胞が３つの胚葉を形成するように指令される。胚体内胚葉は膵β細胞、肝臓の肝細胞、肺の肺胞細胞、甲状腺、胸腺、ならびに栄養管および呼吸管の上皮ライニング等の生命臓器に寄与する多様な細胞および組織を生じることができる。これは、臓側および壁側内胚葉を生じることができる胚体外組織の原始内胚葉とは異なる。ＥＳ細胞から誘導された胚体内胚葉は、理論的には任意の内胚葉誘導体になることができ、ＥＳ細胞を内胚葉系統に導くことは治療用の内胚葉誘導体を産生させるための必須要件である。
【０１５３】
[0212]胚体内胚葉の前後軸の正確なパターニングによって、最終的には原腸管が形成され得る。胚体内胚葉によって誘導された原腸管は、前後軸に沿って咽頭、食道、胃、十二指腸、小腸、および大腸、ならびに膵、肺、甲状腺、胸腺、副甲状腺、および肝臓等の関連する臓器を誘起する。原腸管の前腸の前部は肺、甲状腺、食道、および胃になる。膵、肝臓、および十二指腸は、前腸の後部から起源する。原腸管の中腸および後腸は小腸および大腸を生じる。前腸の前部は発生マーカー、ＮＫ２ホメオボックス（ＮＫＸ２−１）およびＳＲＹ（性決定領域Ｙ）−ボックス２（ＳＯＸ２）を発現し、前腸の後部は造血的に発現されるホメオボックス（ＨＨＥＸ）、膵および十二指腸のホメオボックス１（ＰＤＸ１）、ワンカットホメオボックス１（ＯＮＥＣＵＴ１、ＨＮＦ６として公知である）、および肝細胞核因子４アルファ（ＨＮＦ４Ａ）を発現し、中腸／後腸は尾型ホメオボックス１（ＣＤＸ１）、尾型ホメオボックス２（ＣＤＸ２）、ならびに運動ニューロンおよび膵のホメオボックス１（ＭＮＸ１）（３、１９、２０）を発現する。
【０１５４】
[0213]膵β細胞の分化の成功には、分化した細胞が生理学的に適切な量のインスリンを合成し分泌することが必要である。ｈＰＳＣ細胞の分化を指令する例示的な段階的プロトコールが開発され、これは正常な膵内分泌発生の主な段階を反復する分化プロセスを伴う（図５）。ｈＰＳＣ細胞のホルモン発現膵内分泌細胞への分化は、ｈＰＳＣ細胞を、胚の発生、中内胚葉および胚体内胚葉への分化、原腸内胚葉の確立、前腸後部のパターニング、ならびに膵内胚葉および内分泌前駆体の特定化および成熟からなる主要な段階に通過させることによって行われる。これらの段階を通じて、ｈＰＳＣ細胞は膵内分泌表現型およびｉｎ  ｖｉｔｒｏにおけるグルコース応答インスリン分泌の能力を得ることができる。
【０１５５】
[0214]一般に、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体、例えば本明細書に開示した方法によって生成した膵前駆細胞は、様々な細胞の混合物または組合せ、例えばＰｄｘ１陽性膵前駆細胞、Ｐｄｘ１およびＮＫＸ６−１を共発現する膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞（例えばβ−様細胞）、およびインスリン陽性内分泌細胞、ならびに／またはその他の多能性細胞もしくは幹細胞を含み得る。
【０１５６】
[0215]少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体は、幹細胞または多能性細胞を所望の分化段階に分化する任意の好適な培養プロトコールに従って生成することができる。一部の実施形態では、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体は、少なくとも１個の多能性細胞を少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体に分化するために適した時間および条件下で少なくとも１個の多能性細胞を培養することによって生成される。
【０１５７】
[0216]一部の実施形態では、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体は、実質的に純粋なＳＣ−β細胞またはその前駆体の集団である。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞またはその前駆体の集団は多能性細胞または分化した細胞の混合物を含む。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞またはその前駆体の集団は実質的に胚幹細胞または多能性細胞またはｉＰＳ細胞を含まないか、それらを欠いている。
【０１５８】
[0217]一部の実施形態では、体細胞、例えば線維芽細胞は、対象から例えば組織生検、例えば皮膚生検として単離することができ、本明細書に記載した組成物および方法における使用のための少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体を生成するためのさらなる分化のための人工多能性幹細胞に再プログラミングすることができる。一部の実施形態では、体細胞、例えば線維芽細胞は当業者には公知の方法によって培地中に維持され、一部の実施形態では、本明細書に開示した方法によってＳＣ−β細胞に変換される前に増加させられる。
【０１５９】
[0218]一部の実施形態では、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体は当業者には公知の方法によって培地中に維持され、一部の実施形態では、本明細書に開示した方法によってＳＣ−β細胞に変換される前に増加させられる。
【０１６０】
[0219]さらに、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体、例えば膵前駆細胞は任意の哺乳動物種からのものであってよく、その非限定的な例にはネズミ科、ウシ科、サル科、ブタ科、ウマ科、ヒツジ科、またはヒトの細胞が含まれる。明確かつ単純にするため、本明細書における方法の説明は哺乳動物の少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体に言及しているが、本明細書に記載した方法の全ては少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体の他の細胞型に容易に適用できることを理解されたい。一部の実施形態では、少なくとも１個のＳＣ−β細胞またはその前駆体はヒト個体から誘導される。
【０１６１】
[0220]膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団をヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と接触させてＳＣ−β細胞を産生するステップを含み、細胞集団が幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導される、幹細胞から誘導されたβ（ＳＣ−β）細胞を産生するための方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、幹細胞はヒト多能性幹細胞である。一部の実施形態では、本方法は、細胞集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、スタウロスポリン、またはそれらの任意の組合せのうち少なくとも１つと接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞はＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞はグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏでグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する。一部の実施形態では、本方法は細胞集団をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップをさらに含む。
【０１６２】
[0221]膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させてＳＣ−β細胞を産生するステップを含み、細胞集団が幹細胞からｉｎ  ｖｉｔｒｏで誘導され、ＳＣ−β細胞がグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏでグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する、幹細胞から誘導されたβ（ＳＣ−β）細胞を産生するための方法が本明細書で提供される。一部の実施形態では、幹細胞はヒト多能性幹細胞である。一部の実施形態では、本方法は、細胞集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、スタウロスポリン、またはそれらの任意の組合せのうち少なくとも１つと接触させるステップをさらに含む。一部の実施形態では、本方法は細胞集団をヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と接触させるステップをさらに含む。
【０１６３】
[0222]非限定的で例示的なエピジェネティック修飾化合物には、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、ブロモドメイン阻害剤、またはそれらの任意の組合せが含まれる。
【０１６４】
[0223]一実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はゼステホモログ２（ＥＺＨ２）のエンハンサーの阻害剤である。ＥＺＨ２はヒストン−リシン  Ｎ−メチルトランスフェラーゼ酵素である。ＥＺＨ２阻害剤の非限定的な例には、３−デアザネプラノシンＡ（ＤＺＮｅｐ）、ＥＰＺ６４３８、ＥＰＺ００５６８７（Ｓ−アデノシルメチオニン（ＳＡＭ）競合的阻害剤）、ＥＩ１、ＧＳＫ１２６、およびＵＮＣ１９９９が含まれる。ＤＺＮｅｐは全てのタンパク質メチルトランスフェラーゼの生成物系阻害剤であるＳ−アデノシル−Ｌ−ホモシステイン（ＳＡＨ）の加水分解を阻害してＳＡＨの細胞内濃度の上昇を導き、これが次にＥＺＨ２を阻害する。ＤＺＮｅｐはＥＺＨ２に特異的ではなく、他のＤＮＡメチルトランスフェラーゼをも阻害する。ＧＳＫ１２６はＥＺＨ１の１５０倍の選択性を有するＳＡＭ競合性ＥＺＨ２阻害剤である。ＵＮＣ１９９９はＧＳＫ１２６の類似体であり、その相当物であるＧＳＫ１２６より選択性が低い。
【０１６５】
[0224]一実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＤＺＮｅｐである。一実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである。一実施形態では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤はＫＤ５１７０（メルカプトケトン系ＨＤＡＣ阻害剤）、ＭＣ１５６８（クラスＩＩａ  ＨＤＡＣ阻害剤）、ＴＭＰ１９５（クラスＩＩａ  ＨＤＡＣ阻害剤）、またはそれらの任意の組合せである。一部の実施形態では、ＨＤＡＣ阻害剤はボリノスタット、ロミデプシン（Ｉｓｔｏｄａｘ）、チダミド、パノビノスタット（ファリダク）、ベリノスタット（ＰＸＤ１０１）、パノビノスタット（ＬＢＨ５８９）、バルプロ酸、モセチノスタット（ＭＧＣＤ０１０３）、アベキシノスタット（ＰＣＩ−２４７８１）、エンチノスタット（ＭＳ−２７５）、ＳＢ９３９、レスミノスタット（４ＳＣ−２０１）、ギビノスタット（ＩＴＦ２３５７）、キシノスタット（ＪＮＪ−２６４８１５８５）、ＨＢＩ−８０００（ベンザミドＨＤＩ）、ケベトリン、ＣＵＤＣ−１０１、ＡＲ−４２、ＣＨＲ−２８４５、ＣＨＲ−３９９６、４ＳＣ−２０２、ＣＧ２００７４５、ＡＣＹ−１２１５、ＭＥ−３４４、スルホラファン、またはそれらの任意の変異体である。
【０１６６】
[0225]一部の例では、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えばＤＺＮｅｐ）の濃度は０．０１〜１０μＭまたは約０．０１〜１０μＭであってよい。例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えばＤＺＮｅｐ）の濃度は約０．０１〜１、０．１〜１、０．２５〜１、０．５〜１、１〜５、または１〜１０μＭであってよい。ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤（例えばＤＺＮｅｐ）の濃度は約５、４、３、２、１．９、１．８、１．７、１．６、１．５、１．４、１．３、１．２、１．１、１、０．９、０．８、０．７、０．６、０．５、０．４、０．３、０．２、０．１、０．０５、または０．０１μＭ未満であってよい。
【０１６７】
[0226]本開示の態様には胚体内胚葉細胞が含まれる。本明細書において使用する胚体内胚葉細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、多能性幹細胞、例えばｉＰＳＣまたはｈＥＳＣは内胚葉細胞に分化される。一部の態様では、内胚葉細胞（ステージ１）は、例えば原腸管細胞（ステージ２）、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞（ステージ３）、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞（ステージ４）、またはＮｇｎ３陽性内分泌前駆細胞もしくはインスリン陽性内分泌細胞（ステージ５）にさらに分化され、続いてＳＣ−β細胞（ステージ６）に誘起されまたは成熟する。
【０１６８】
[0227]一部の例では、胚体内胚葉細胞は、集団中の少なくともいくつかの多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させることによって、例えば多能性細胞の集団をｉ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子およびｉｉ）ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と接触させて多能性細胞の少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞への分化を誘起することによって、得ることができ、胚体内胚葉細胞は胚体内胚葉に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。
【０１６９】
[0228]多能性幹細胞を（例えば単独で、またはＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起して胚体内胚葉細胞に分化させることができるＴＧＦ−βスーパーファミリーからの任意の成長因子を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子はアクチビンＡを含む。一部の例では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子は成長分化因子８（ＧＤＦ８）を含む。多能性幹細胞を（例えば単独で、またはＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子と組み合わせて）誘起して胚体内胚葉細胞に分化させることができる任意のＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、本明細書で提供する方法において使用することができる。一部の例では、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤はＣＨＩＲ９９Ｑ２１を含む。一部の例では、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤はＷｎｔ３ａ組換えタンパク質を含む。
【０１７０】
[0229]一部の例では、集団中の少なくともいくつかの多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化するステップは、多能性細胞の集団をｉ）アクチビンＡ、およびｉｉ）ＣＨＩＲ９９０２１と好適な期間、例えば約２日、約３日、約４日、または約５日、接触させて集団中の多能性細胞の少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞への分化を誘起するプロセスによって達成され、胚体内胚葉細胞は胚体内胚葉に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。
【０１７１】
[0230]一部の例では、本方法は、多能性細胞の集団を好適な濃度、例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬのＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子（例えばアクチビンＡ）と接触させることによって多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップを含む。一部の例では、本方法は多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約１００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの使用を含む。一部の例では、本方法は多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約２００ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡの使用を含む。
【０１７２】
[0231]一部の例では、本方法は、多能性細胞の集団を好適な濃度、例えば約０．０１μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約１．５μＭ、約２μＭ、約２．５μＭ、約３μＭ、約３．５μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約５０μＭ、約１００μＭ、または約２００μＭのＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤（例えばＣＨＩＲ９９０２１）と接触させることによって多能性細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップを含む。一部の例では、本方法は多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約２μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。一部の例では、本方法は多能性細胞の胚体内胚葉細胞への分化のための約５μＭのＣＨＩＲ９９０２１の使用を含む。
【０１７３】
[0232]一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、Ｎｏｄａｌ、Ｔｍｐｒｓｓ２、Ｔｍｅｍ３０ｂ、Ｓｔ１４、Ｓｐｉｎｋ３、Ｓｈ３ｇｌ２、Ｒｉｐｋ４、Ｒａｂ１Ｓ、Ｎｐｎｔ、Ｃｌｉｃ６、Ｃｌｄｎ５、Ｃａｃｎａ１ｂ、Ｂｎｉｐ１、Ａｎｘａ４、Ｅｍｂ、ＦｏｘＡ１、Ｓｏｘ１７、およびＲｂｍ３５ａからなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを発現し、少なくとも１つのマーカーの発現は、それが誘導されたもとの多能性幹細胞に対して、胚体内胚葉細胞において統計学的に有意な量で上方制御される。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、Ｇａｔａ４、ＳＰＡＲＣ、ＡＦＰ、およびＤａｂ２からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを、それが誘導されたもとの多能性幹細胞に対して統計的に有意な量で発現しない。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、Ｚｉｃ１、Ｐａｘ６、Ｆｌｋ１、およびＣＤ３１からなる群から選択される少なくとも１つのマーカーを、それが誘導されたもとの多能性幹細胞に対して統計的に有意な量で発現しない。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、それが誘導されたもとの多能性幹細胞に対してより高いレベルのＳｍａｄ２のホスホリル化を統計的に有意な量で有する。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで腸管を形成する能力を有する。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、腸細胞に特徴的な形態を有する細胞に分化することができ、腸細胞に特徴的な形態を有する細胞はＦｏｘＡ２および／またはＣｌａｕｄｉｎ６を発現する。一部の例では、本明細書で開示した方法によって生成した胚体内胚葉細胞は、内胚葉起源の細胞にさらに分化することができる。
【０１７４】
[0233]一部の例では、多能性幹細胞の集団は、いずれの分化の前にも、または分化の第１段階の間に、少なくとも１つのβ細胞分化因子の存在下に培養される。任意の多能性幹細胞、例えばヒト多能性幹細胞もしくはヒトｉＰＳ細胞、または本明細書で論じた任意の多能性幹細胞もしくはその他の好適な多能性幹細胞を使用することができる。一部の例では、本明細書に記載したβ細胞分化因子は多能性幹細胞の集団の培地中に存在してよく、または多能性幹細胞の集団の成長（例えば複製または増加）の間に一度にまたは定期的に添加してよい。ある特定の例では、多能性幹細胞の集団は、いずれの分化の前にも少なくとも１つのβ細胞分化因子に曝露してよい。他の例では、多能性幹細胞の集団は、分化の第１段階の間に少なくとも１つのβ細胞分化因子に曝露してよい。
【０１７５】
[0234]本開示の態様には原腸管細胞が含まれる。本明細書において使用する原腸管細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、胚体内胚葉細胞は原腸管細胞に分化される。一部の態様では、原腸管細胞は、例えばＰｄｘ１陽性膵前駆細胞、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞にさらに分化され、続いてＳＣ−β細胞に誘起されまたは成熟する。
【０１７６】
[0235]一部の例では、原腸管細胞は、集団中の少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞を原腸管細胞に分化させることによって、例えば胚体内胚葉細胞を線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させて胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかの原腸管細胞への分化を誘起することによって、得ることができ、原腸管細胞は原腸管細胞に特徴的な少なくとも１つのマーカーを発現する。
【０１７７】
[0236]胚体内胚葉細胞を（例えば単独で、または他の因子と組み合わせて）誘起して原腸管細胞に分化させることができるＦＧＦファミリーからの任意の成長因子を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は角化細胞成長因子（ＫＧＦ）を含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ２を含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ８Ｂを含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ１０を含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＦＧＦ２１を含む。
【０１７８】
[0237]一部の例では、原腸管細胞は、集団中の少なくともいくつかの胚体内胚葉細胞を原腸管細胞に分化させることによって、例えば胚体内胚葉細胞をある期間、例えば約１日、約２日、約３日、または約４日、ＫＧＦと接触させて胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかの原腸管細胞への分化を誘起することによって、得ることができる。
【０１７９】
[0238]一部の例では、本方法は、胚体内胚葉細胞を例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬの好適な濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えばＫＧＦ）と接触させることによって胚体内胚葉細胞を原腸管細胞に分化させるステップを含む。一部の例では、本方法は胚体内胚葉細胞の原腸管細胞への分化のための約５０ｎｇ／ｍＬのＫＧＦの使用を含む。一部の例では、本方法は胚体内胚葉細胞の原腸管細胞への分化のための約１００ｎｇ／ｍＬのＫＧＦの使用を含む。
【０１８０】
[0239]本開示の態様にはＰｄｘ１陽性膵前駆細胞が含まれる。本明細書において使用するＰｄｘ１陽性膵前駆細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、原腸管細胞はＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化される。一部の態様では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、例えばＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、Ｎｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞にさらに分化され、続いてＳＣ−β細胞に誘起されまたは成熟する。
【０１８１】
[0240]一部の態様では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、集団中の少なくともいくつかの原腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させることによって、例えば原腸管細胞をｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子、ｉｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｖ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、ｖｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびｖｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させて原腸管細胞の少なくともいくつかのＰｄｘ１陽性膵前駆細胞への分化を誘起することによって、得ることができ、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞はＰｄｘ１を発現する。
【０１８２】
[0241]一部の態様では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、集団中の少なくともいくつかの原腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化することによって、例えば原腸管細胞をｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子、ｉｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｖ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｖｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させて原腸管細胞の少なくともいくつかのＰｄｘ１陽性膵前駆細胞への分化を誘起することによって、得ることができ、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞はＰｄｘ１を発現する。
【０１８３】
[0242]一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、集団中の少なくともいくつかの原腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化することによって、例えば原腸管細胞をｉ）少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｖ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させて原腸管細胞の少なくともいくつかのＰｄｘ１陽性膵前駆細胞への分化を誘起することによって、得ることができ、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞はＰｄｘ１を発現する。
【０１８４】
[0243]一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、集団中の少なくともいくつかの原腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化することによって、例えば原腸管細胞をｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤、およびｉｉｉ）少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤と接触させることによって、得ることができ、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞はＰｄｘ１を発現する。
【０１８５】
[0244]一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、集団中の少なくともいくつかの原腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化することによって、例えば原腸管細胞をｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、およびｉｉ）少なくとも１つのレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤と接触させて原腸管細胞の少なくともいくつかのＰｄｘ１陽性膵前駆細胞への分化を誘起することによって、得ることができ、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞はＰｄｘ１を発現する。
【０１８６】
[0245]原腸管細胞を（例えば単独で、またはＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ−１を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１μＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１８９）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約１．２μＭ、約１．５μＭ、約１．７５μＭ、約２μＭ、約２．２μＭ、約２．５μＭ、約２．７５μＭ、約３μＭ、約３．２５μＭ、約３．５μＭ、約３．７５μＭ、約４μＭ、約４．５μＭ、約５μＭ、約８μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＤＭＨ−１）と接触させるステップを含む。
【０１８７】
[0246]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させることができるＴＧＦ−βスーパーファミリーからの任意の成長因子を使用することができる。一部の例では、ＴＧＦ−βファミリーからの成長因子はアクチビンＡを含む。一部の例では、ＴＧＦ−βファミリーからの成長因子はアクチビンＡまたはＧＤＦ８を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約５ｎｇ／ｍＬ、約７．５ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１１ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１３ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１５ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１７ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約１９ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２１ｎｇ／ｍＬ、約２２ｎｇ／ｍＬ、約２３ｎｇ／ｍＬ、約２４ｎｇ／ｍＬ、約２５ｎｇ／ｍＬ、約２６ｎｇ／ｍＬ、約２７ｎｇ／ｍＬ、約２８ｎｇ／ｍＬ、約２９ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約３５ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、または約１００ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子（例えばアクチビンＡ）と接触させるステップを含む。
【０１８８】
[0247]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させることができるＦＧＦファミリーからの任意の成長因子を使用することができる。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）を含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｍ／ｍＬの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えばＫＧＦ）と接触させるステップを含む。
【０１８９】
[0248]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＳＨＨ経路阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えばＳａｎｔ１）と接触させるステップを含む。
【０１９０】
[0249]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのプロテインキナーゼＣ活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の例では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えばレチノイン酸）と接触させるステップを含む。
【０１９１】
[0250]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、少なくとも１つのＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＰＫＣ活性化剤を使用することができる。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤はＰｄＢＵを含む。一部の例では、ＰＫＣ活性化剤はＴＰＢを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約１０μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、約７５μＭ、約８０μＭ、約１００μＭ、約１２０μＭ、約１４０μＭ、約１５０μＭ、約１７５μＭ、約１８０μＭ、約２００μＭ、約２１０μＭ、約２２０μＭ、約２４０μＭ、約２５０μＭ、約２６０μＭ、約２８０μＭ、約３００μＭ、約３２０μＭ、約３４０μＭ、約３６０μＭ、約３８０μＭ、約４００μＭ、約４２０μＭ、約４４０μＭ、約４６０μＭ、約４８０μＭ、約５００μＭ、約５２０μＭ、約５４０μＭ、約５６０μＭ、約５８０μＭ、約６００μＭ、約６２０μＭ、約６４０μＭ、約６６０μＭ、約６８０μＭ、約７００μＭ、約７５０μＭ、約８００μＭ、約８５０μＭ、約９００μＭ、約１ｍＭ、約２ｍＭ、約３ｍＭ、約４ｍＭ、または約５ｍＭの濃度のＰＫＣ活性化剤（例えばＰｄＢＵ）と接触させるステップを含む。
【０１９２】
[0251]原腸管細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＰＫＣ活性化剤、および少なくとも１つのＲＡシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、またはＨ−１１５２を含む。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ−２７６３２を含む。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎを含む。一部の例では、本方法は、原腸管細胞を例えば約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ−２７６３２またはＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）と接触させるステップを含む。
【０１９３】
[0252]一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、集団中の少なくともいくつかの原腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させることによって、例えば原腸管細胞を好適な期間、例えば約１日、約２日、約３日、または約４日、レチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＬＤＮ１９３１８９、ＰｄＢＵ、Ｙ−２７６３２、およびアクチビンＡと接触させることによって、得ることができる。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、集団中の少なくともいくつかの原腸管細胞をＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させることによって、例えば原腸管細胞を約２日、レチノイン酸、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＬＤＮ１９３１８９、ＰｄＢＵ、Ｙ−２７６３２、およびアクチビンＡと接触させることによって、得ることができる。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、少なくともいくつかの原腸管細胞をＳ３培地中で分化させることによって、得ることができる。
【０１９４】
[0253]本開示の態様にはＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞が含まれる。本明細書において使用するＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞はＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化される。一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞は、例えばＮｇｎ３陽性内分泌前駆細胞、またはインスリン陽性内分泌細胞にさらに分化され、続いてＳＣ−β細胞に誘起されまたは成熟する。
【０１９５】
[0254]一部の態様では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞からＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を生成する方法は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を含む細胞の集団を（例えば細胞のクラスター化を促進しおよび／または細胞の生存を促進する条件下で）ａ）線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｂ）ソニックヘッジホッグ経路阻害剤、および任意選択でｃ）低濃度のレチノイン酸（ＲＡ）シグナル伝達経路活性化剤を含む少なくとも２つのβ細胞分化因子と接触させて集団中の少なくとも１個のＰｄｘ陽性膵前駆細胞のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞への分化を誘起するステップを含み、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞はＮＫＸ６．１を発現する。
【０１９６】
[0255]一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞をｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤と接触させてＰｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくともいくつかのＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞への分化を誘起するステップによって得られ、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞はＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現する。
【０１９７】
[0256]一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞をｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）低濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにｖ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させてＰｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくともいくつかのＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞への分化を誘起することによって得られる。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下でＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させることによって得られる。
【０１９８】
[0257]一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は多能性細胞の集団から生成される。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞はｉＰＳ細胞の集団から生成される。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞はＥＳＣ細胞の集団から生成される。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は胚体内胚葉細胞の集団から生成される。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は原腸管細胞の集団から生成される。
【０１９９】
[0258]Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を（例えば単独で、または少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子、および少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させることができるＦＧＦファミリーからの任意の成長因子を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、角化細胞成長因子（ＫＧＦ）を含む。一部の例では、ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、およびＦＧＦ２１からなる群から選択される。一部の例では、本方法は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を例えば約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１１０ｎｇ／ｍＬ、約１２０ｎｇ／ｍＬ、約１３０ｎｇ／ｍＬ、約１４０ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約１７５ｎｇ／ｍＬ、約１８０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３０ｎｇ／ｍＬの濃度のＦＧＦファミリーからの成長因子（例えばＫＧＦ）と接触させるステップを含む。
【０２００】
[0259]Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのレチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＳＨＨ経路阻害剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例では、ＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。一部の例では、本方法は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を例えば約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えばＳａｎｔ１）と接触させるステップを含む。
【０２０１】
[0260]Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の例では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はレチノイン酸を含む。一部の例では、本方法は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を例えば約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えばレチノイン酸）と接触させるステップを含む。
【０２０２】
[0261]Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させることができる任意のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤は、Ｔｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、または１４−１１５２を含む。一部の例では、本方法は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を例えば約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ−２７６３２またはＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）と接触させるステップを含む。
【０２０３】
[0262]Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を（例えば単独で、またはＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＲＯＣＫ阻害剤と組み合わせて）誘起してＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞に分化させることができるＴＧＦ−βスーパーファミリーからの任意の活性化剤を使用することができる。一部の例では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの活性化剤はアクチビンＡまたはＧＤＦ８を含む。一部の例では、本方法は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を例えば約０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．２ｎｇ／ｍＬ、約０．３ｎｇ／ｍＬ、約０．４ｎｇ／ｍＬ、約０．５ｎｇ／ｍＬ、約０．６ｎｇ／ｍＬ、約０．７ｎｇ／ｍＬ、約０．８ｎｇ／ｍＬ、約１ｎｇ／ｍＬ、約１．２ｎｇ／ｍＬ、約１．４ｎｇ／ｍＬ、約１．６ｎｇ／ｍＬ、約１．８ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約２．２ｎｇ／ｍＬ、約２．４ｎｇ／ｍＬ、約２．６ｎｇ／ｍＬ、約２．８ｎｇ／ｍＬ、約３ｎｇ／ｍＬ、約３．２ｎｇ／ｍＬ、約３．４ｎｇ／ｍＬ、約３．６ｎｇ／ｍＬ、約３．８ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約４．２ｎｇ／ｍＬ、約４．４ｎｇ／ｍＬ、約４．６ｎｇ／ｍＬ、約４．８ｎｇ／ｍＬ、約５ｎｇ／ｍＬ、約５．２ｎｇ／ｍＬ、約５．４ｎｇ／ｍＬ、約５．６ｎｇ／ｍＬ、約５．８ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約６．２ｎｇ／ｍＬ、約６．４ｎｇ／ｍＬ、約６．６ｎｇ／ｍＬ、約６．８ｎｇ／ｍＬ、約７ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約９ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、または約５０ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子（例えばアクチビンＡ）と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を例えば約５ｎｇ／ｍＬの濃度のＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子（例えばアクチビンＡ）と接触させるステップを含む。
【０２０４】
[0263]一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、およびＲＡと５日間接触させることによって得られる。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ＫＧＦ、Ｓａｎｔ１、ＲＡ、Ｙ２７６３２、およびアクチビンＡと５日間接触させることによって得られる。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を、細胞のクラスター化を促進する条件下で、ＫＧＦと５日間接触させることによって得られる。一部の例では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞は、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞をＳ３培地中で接触させることによって得られる。
【０２０５】
[0264]本開示の態様にはインスリン陽性内分泌細胞が含まれる。本明細書において使用するインスリン陽性内分泌細胞は、任意の供給源から誘導されまたは任意の好適なプロトコールに従って産生され得る。一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞はインスリン陽性内分泌細胞に分化される。一部の態様では、インスリン陽性内分泌細胞は、例えばＳＣ−β細胞への誘起または成熟によってさらに分化される。
【０２０６】
[0265]一部の態様では、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞からインスリン陽性内分泌細胞を生成する方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を含む細胞の集団を（例えば細胞のクラスター化を促進する条件下で）ａ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、およびｂ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と接触させて、集団中の少なくとも１個のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘起するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞はインスリンを発現する。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞はＰｄｘ１、ＮＫＸ６．１、ＮＫＸ２．２、Ｍａｆｂ、ｇｌｉｓ３、Ｓｕｒ１、Ｋｉｒ６．２、Ｚｎｔ８、ＳＬＣ２Ａ１、ＳＬＣ２Ａ３、および／またはインスリンを発現する。
【０２０７】
[0266]ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、または他のβ細胞分化因子、例えば甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ−βＩ型受容体キナーゼシグナル伝達を含む。一部の例では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤はＡｌｋ５阻害剤ＩＩを含む。
【０２０８】
[0267]ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、または他のβ細胞分化因子、例えばＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意の甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の例では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はトリヨードチロニン（Ｔ３）を含む。一部の例では、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤はＧＣ−１を含む。
【０２０９】
[0268]一部の例では、本方法は細胞（例えばＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞）の集団を少なくとも１つの追加の因子と接触させるステップを含む。一部の例では、本方法はＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）プロテインキナーゼ阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、またはｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤のうち少なくとも１つと接触させるステップを含む。
【０２１０】
[0269]一部の例では、本方法は、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、またはｉｘ）ＲＯＣＫ阻害剤のうち少なくとも１つと接触させるステップを含む。
【０２１１】
[0270]一部の例では、本方法は、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を、ｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）エピジェネティック修飾化合物、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、またはｘ）ＲＯＣＫ阻害剤のうち少なくとも１つと接触させるステップを含む。
【０２１２】
[0271]一部の実施形態では、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞からインスリン陽性内分泌細胞を生成する方法において、分化因子のいくつかは分化のステップの間、最初の１日、２日、３日、４日、または５日間のみ存在する。一部の例では、ＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、およびＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子等の分化因子のいくつかは、インキュベーションの最初の３日間の後に培地から除去される。
【０２１３】
[0272]集団中のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができる任意のγ−セクレターゼ阻害剤を使用することができる。一部の例では、γ−セクレターゼ阻害剤はＸＸＩを含む。一部の例では、γ−セクレターゼ阻害剤はＤＡＰＴを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を例えば約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０５μＭ、約０．０７５μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．７μＭ、約０．８μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約２．９μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．２μＭ、約５．４μＭ、約５．６μＭ、約５．８μＭ、約６μＭ、約６．２μＭ、約６．４μＭ、約６．６μＭ、約６．８μＭ、約７μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約２０μＭ、約３０μＭ、または約５０μＭの濃度のγ−セクレターゼ阻害剤（例えばＸＸＩ）と接触させるステップを含む。
【０２１４】
[0273]集団中のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができるＥＧＦファミリーからの任意の成長因子を使用することができる。一部の例では、ＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はベータセルリンを含む。一部の例では、ＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子はＥＧＦを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を例えば約１ｎｇ／ｍＬ、約２ｎｇ／ｍＬ、約４ｎｇ／ｍＬ、約６ｎｇ／ｍＬ、約８ｎｇ／ｍＬ、約１０ｎｇ／ｍＬ、約１２ｎｇ／ｍＬ、約１４ｎｇ／ｍＬ、約１６ｎｇ／ｍＬ、約１８ｎｇ／ｍＬ、約２０ｎｇ／ｍＬ、約２２ｎｇ／ｍＬ、約２４ｎｇ／ｍＬ、約２６ｎｇ／ｍＬ、約２８ｎｇ／ｍＬ、約３０ｎｇ／ｍＬ、約４０ｎｇ／ｍＬ、約５０ｎｇ／ｍＬ、約７５ｎｇ／ｍＬ、約８０ｎｇ／ｍＬ、約９０ｎｇ／ｍＬ、約９５ｎｇ／ｍＬ、約１００ｎｇ／ｍＬ、約１５０ｎｇ／ｍＬ、約２００ｎｇ／ｍＬ、約２５０ｎｇ／ｍＬ、または約３００ｎｇ／ｍＬの濃度のＥＧＦファミリーからの成長因子（例えばベータセルリン）と接触させるステップを含む。
【０２１５】
[0274]ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＲＡシグナル伝達経路活性化剤を使用することができる。一部の例では、ＲＡシグナル伝達経路活性化剤はＲＡを含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を例えば約０．０２μＭ、約０．１μＭ、約０．２μＭ、約０．２５μＭ、約０．３μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．５５μＭ、約０．６μＭ、約０．６５μＭ、約０．７μＭ、約０．７５μＭ、約０．８μＭ、約０．８５μＭ、約０．９μＭ、約１μＭ、約１．１μＭ、約１．２μＭ、約１．３μＭ、約１．４μＭ、約１．５μＭ、約１．６μＭ、約１．７μＭ、約１．８μＭ、約１．９μＭ、約２μＭ、約２．１μＭ、約２．２μＭ、約２．３μＭ、約２．４μＭ、約２．５μＭ、約２．６μＭ、約２．７μＭ、約２．８μＭ、約３μＭ、約３．２μＭ、約３．４μＭ、約３．６μＭ、約３．８μＭ、約４μＭ、約４．２μＭ、約４．４μＭ、約４．６μＭ、約４．８μＭ、約５μＭ、約５．５μＭ、約６μＭ、約６．５μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約８．５μＭ、約９μＭ、約９．５μＭ、約１０μＭ、約１２μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１８μＭ、約２０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＡシグナル伝達経路活性化剤（例えばレチノイン酸）と接触させるステップを含む。
【０２１６】
[0275]ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＳＨＨ経路阻害剤を、本明細書で提供する方法に使用することができる。一部の例ではＳＨＨ経路阻害剤はＳａｎｔ１を含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を例えば約０．００１μＭ、約０．００２μＭ、約０．００５μＭ、約０．０１μＭ、約０．０２μＭ、約０．０３μＭ、約０．０５μＭ、約０．０８μＭ、約０．１μＭ、約０．１２μＭ、約０．１３μＭ、約０．１４μＭ、約０．１５μＭ、約０．１６μＭ、約０．１７μＭ、約０．１８μＭ、約０．１９μＭ、約０．２μＭ、約０．２１μＭ、約０．２２μＭ、約０．２３μＭ、約０．２４μＭ、約０．２５μＭ、約０．２６μＭ、約０．２７μＭ、約０．２８μＭ、約０．２９μＭ、約０．３μＭ、約０．３１μＭ、約０．３２μＭ、約０．３３μＭ、約０．３４μＭ、約０．３５μＭ、約０．４μＭ、約０．４５μＭ、約０．５μＭ、約０．６μＭ、約０．８μＭ、約１μＭ、約２μＭ、または約５μＭの濃度のＳＨＨ経路阻害剤（例えばＳａｎｔ１）と接触させるステップを含む。
【０２１７】
[0276]ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞の分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起してインスリン陽性内分泌細胞に分化させることができる任意のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤はＬＤＮ１９３１８９またはＤＭＨ−１を含む。一部の例では、本方法は、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞を例えば約３０ｎＭ、約４０ｎＭ、約５０ｎＭ、約６０ｎＭ、約７０ｎＭ、約８０ｎＭ、約９０ｎＭ、約１００ｎＭ、約１１０ｎＭ、約１２０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１４０ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１６０ｎＭ、約１７０ｎＭ、約１８０ｎＭ、約１９０ｎＭ、約２００ｎＭ、約２１０ｎＭ、約２２０ｎＭ、約２３０ｎＭ、約２４０ｎＭ、約２５０ｎＭ、約２８０ｎＭ、約３００ｎＭ、約４００ｎＭ、約５００ｎＭ、または約１μＭの濃度のＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＬＤＮ１９３１１８９）と接触させるステップを含む。
【０２１８】
[0277]集団中のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができる任意のＲＯＣＫ阻害剤を使用することができる。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ、Ｙ−２７６３２、Ｆａｓｕｄｉｌ／ＨＡ１０７７、またはＨ−１１５２を含む。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＹ−２７６３２を含む。一部の例では、ＲＯＣＫ阻害剤はＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎを含む。一部の例では、本方法は、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を例えば約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１１μＭ、約１２μＭ、約１３μＭ、約１４μＭ、約１５μＭ、約１６μＭ、約１７μＭ、約１８μＭ、約１９μＭ、約２０μＭ、約２１μＭ、約２２μＭ、約２３μＭ、約２４μＭ、約２５μＭ、約２６μＭ、約２７μＭ、約２８μＭ、約２９μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のＲＯＣＫ阻害剤（例えばＹ−２７６３２またはＴｈｉａｚｏｖｉｖｉｎ）と接触させるステップを含む。
【０２１９】
[0278]集団中のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができる任意のエピジェネティック修飾化合物を使用することができる。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤またはＨＤＡＣ阻害剤を含む。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えばＤＺＮｅｐを含む。一部の例では、エピジェネティック修飾化合物はＨＤＡＣ阻害剤、例えばＫＤ５１７０を含む。一部の例では、本方法は、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を例えば約０．０１μＭ、約０．０２５μＭ、約０．０５μＭ、約０．０７５μＭ、約０．１μＭ、約０．１５μＭ、約０．２μＭ、約０．５μＭ、約０．７５μＭ、約１μＭ、約２μＭ、約３μＭ、約４μＭ、約５μＭ、約６μＭ、約７μＭ、約７．５μＭ、約８μＭ、約９μＭ、約１０μＭ、約１５μＭ、約２０μＭ、約２５μＭ、約３０μＭ、約３５μＭ、約４０μＭ、約５０μＭ、または約１００μＭの濃度のエピジェネティック修飾化合物（例えばＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）と接触させるステップを含む。
【０２２０】
[0279]一部の例では、細胞の集団は任意選択でプロテインキナーゼ阻害剤と接触させられる。一部の例では、細胞の集団はプロテインキナーゼ阻害剤と接触させられない。一部の例では、細胞の集団はプロテインキナーゼ阻害剤と接触させられる。集団中のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を（例えば単独で、またはＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤のいずれかおよび／もしくは甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤と組み合わせて）誘起することができる任意のプロテインキナーゼ阻害剤を使用することができる。一部の例では、プロテインキナーゼ阻害剤はスタウロスポリンを含む。
【０２２１】
[0280]一部の例では、本方法は、細胞（例えばＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞）の集団をＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３またはＧＣ−１、ＲＡ、Ｓａｎｔ１、およびベータセルリンと７日間接触させて集団中の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘起するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞はインスリンを発現する。一部の例では、本方法は、細胞（例えばＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞）の集団をＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ、Ｔ３またはＧＣ−１、ＲＡ、Ｓａｎｔ１、ベータセルリン、およびＬＤＮ１９３１８９と７日間接触させて集団中の少なくとも１つのＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘起するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞はインスリンを発現する。一部の実施形態では、１つまたは複数の分化因子がステージ５の一部で、例えばステージ５の期間の最初の１日、２日、３日、４日、５日、または６日にのみ、またはステージの期間の最後の１日、２日、３日、４日、５日、または６日に、添加される。１つの例では、細胞はＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤とステージ５の間の最初の２日、３日、４日または５日にのみ接触させられ、その後、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は培地から除去される。別の例では、細胞はＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤とステージ５の間の最初の１日、２日、または３日にのみ接触させられ、その後、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は培地から除去される。
【０２２２】
[0281]一部の例では、本方法は細胞（例えばＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞）の集団をＢＥ５培地中で培養して集団中の少なくとも１個のＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘起するステップを含み、インスリン陽性内分泌細胞はインスリンを発現する。
【０２２３】
[0282]本開示の態様は膵β細胞（例えば非天然膵β細胞）を産生するステップを含む。非天然膵β細胞は、一部の例では、形態および機能において内因性成熟β細胞と類似しているが、それにも関わらず天然β細胞とは区別される。
【０２２４】
[0283]一部の例では、本明細書で提供する方法を用いて産生されたインスリン陽性膵内分泌細胞は、単独で、または他の型の細胞、例えばその前駆体、例えば幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞、もしくはＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞とともに、細胞クラスターを形成することができる。
【０２２５】
[0284]一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞集団は、いかなる外因性分化因子（例えばＴＧＦ−βシグナル伝達経路の阻害剤、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ＰＫＣ活性化剤、ＴＧＦ−βスーパーファミリー、ＦＧＦファミリー、もしくはＥＧＦファミリーからの成長因子、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤、γ−セクレターゼ阻害剤、ＲＯＣＫ阻害剤、またはＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤）の添加もなしに、ＳＣ−β細胞に成熟するように直接誘起することができる。
【０２２６】
[0285]一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞を分化因子と接触させることによって、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞集団を直接誘起してＳＣ−β細胞に成熟させることができる。分化因子は、本明細書に記載したＴＧＦ−βシグナル伝達経路の少なくとも１つの阻害剤および甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤を含み得る。一部の例では、ＳＣ−β細胞はインスリン陽性内分泌細胞を含む細胞の集団をＡｌｋ５ｉおよびＴ３もしくはＧＣ−１と接触させることによって得ることができる。
【０２２７】
[0286]一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞はＮＳ−ＧＦｓ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、ＤＭＥＭ培地、またはＣＭＲＬ培地中で成熟させることができる。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞は１０％ＦＢＳを補ったＣＭＲＬ培地中で成熟させることができる。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞は１％ＨＳＡを補ったＤＭＥＭ培地中で成熟させることができる。他の例では、ＳＣ−β細胞は、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞の集団を、２％ＢＳＡを補ってもよいＭＣＤＢ１３１培地中で培養することによって得ることができる。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞をＳＣ−β細胞に成熟させるための２％ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ１３１培地は、本明細書に記載した小分子の因子を含まなくてよい。一部の例では、インスリン陽性内分泌細胞をＳＣ−β細胞に成熟させるための２％ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ１３１培地は、血清（例えばＦＢＳ）を含まなくてよい。
【０２２８】
[0287]一部の態様では、本開示は多能性細胞からＳＣ−β細胞を産生する方法を提供し、本方法は、ａ）多能性幹細胞をＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させることによって集団中の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ、ｂ）胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかを原腸管細胞に分化させるステップ、ｃ）原腸管細胞をｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＤＭＨ−１またはＬＤＮ１９３１８９）、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって原腸管細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップ、ｄ）Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を細胞のクラスター化を促進する条件下でｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにｖ）ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間、１日おきに接触させるプロセスによってＰｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップであって、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞がＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現するステップ、ｅ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）ガンマ−セクレターゼ阻害剤、任意選択でｖｉ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、および任意選択でｖｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と５日〜７日の間、１日おきに接触させるプロセスによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させるステップ、ならびにｆ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を外因性の分化因子なしに７日〜１４日の間、１日おきに培地（例えばＮＳ−ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で培養してＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくともいくつかのＳＣ−β細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏの成熟を誘起するプロセスによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくともいくつかをＳＣ−β細胞に分化させるステップであって、ＳＣ−β細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を呈するステップを含む。一部の例では、ＧＳＩＳ応答は内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。
【０２２９】
[0288]一部の態様では、本開示は多能性細胞からＳＣ−β細胞を産生する方法を提供し、本方法は、ａ）多能性幹細胞をＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させることによって集団中の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ、ｂ）胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかを原腸管細胞に分化させるステップ、ｃ）原腸管細胞をｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、ｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤、およびｖｉｉ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの成長因子と２日間接触させるプロセスによって原腸管細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップ、ｄ）Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を細胞のクラスター化を促進する条件下でｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間、１日おきに接触させるプロセスによってＰｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップであって、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞がＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現するステップ、ｅ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）γ−セクレターゼ阻害剤、任意選択でｖｉ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、および任意選択でｖｉｉ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤と５日〜７日の間、１日おきに接触させるプロセスによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させるステップ、ならびにｆ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を外因性の分化因子なしに７日〜１４日の間、１日おきに培地（例えばＮＳ−ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で培養してＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくともいくつかのＳＣ−β細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏの成熟を誘起するプロセスによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくともいくつかをＳＣ−β細胞に分化させるステップであって、ＳＣ−β細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を呈するステップを含む。一部の例では、ＧＳＩＳ応答は内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。
【０２３０】
[0289]一部の態様では、本開示は多能性細胞からＳＣ−β細胞を産生する方法を提供し、本方法は、ａ）多能性幹細胞をＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させることによって集団中の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ、ｂ）胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかを原腸管細胞に分化させるステップ、ｃ）原腸管細胞をｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって原腸管細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップ、ｄ）Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を細胞のクラスター化を促進する条件下でｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日間、１日おきに接触させるプロセスによってＰｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップであって、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞がＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現するステップ、ｅ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｉ）ＴＨシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）γ−セクレターゼ阻害剤、および任意選択でｖｉ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子と５日〜７日の間、１日おきに接触させるプロセスによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させるステップ、ならびにｆ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を外因性の分化因子なしに７日〜１４日の間、１日おきに培地（例えばＮＳ−ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で培養してＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくともいくつかのＳＣ−β細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏの成熟を誘起するプロセスによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくともいくつかをＳＣ−β細胞に分化させるステップであって、ＳＣ−β細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を呈するステップを含む。一部の例では、ＧＳＩＳ応答は内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。
【０２３１】
[0290]一部の態様では、本開示は多能性細胞からＳＣ−β細胞を産生する方法を提供し、本方法は、ａ）多能性幹細胞をＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させることによって集団中の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ、ｂ）胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかを原腸管細胞に分化させるステップ、ｃ）原腸管細胞をｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＤＭＨ−１またはＬＤＮ１９３１８９）、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって原腸管細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップ、ｄ）Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を細胞のクラスター化を促進する条件下でｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日または６日間、１日おきに接触させるプロセスによってＰｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップであって、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞がＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現するステップ、ｅ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、ｉｉｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｉｖ）上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｖ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｖｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｖｉｉ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖｉｉｉ）エピジェネティック修飾化合物（例えばＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）、ｉｘ）プロテインキナーゼ阻害剤、およびｘ）ＲＯＣＫ阻害剤と５日〜７日の間、１日おきに接触させるプロセスによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させるステップ、ならびにｆ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を外因性の分化因子なしに７日〜１４日の間、１日おきに培地（例えばＮＳ−ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で培養してＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくともいくつかのＳＣ−β細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏの成熟を誘起するプロセスによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくともいくつかをＳＣ−β細胞に分化するステップであって、ＳＣ−β細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を呈するステップを含む。一部の例では、ＧＳＩＳ応答は内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。
【０２３２】
[0291]一部の態様では、本開示は多能性細胞からＳＣ−β細胞を産生する方法を提供し、本方法は、ａ）多能性幹細胞をＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子およびＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤と３日間接触させることによって集団中の多能性幹細胞を胚体内胚葉細胞に分化させるステップ、ｂ）胚体内胚葉細胞をＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子と３日間接触させるプロセスによって胚体内胚葉細胞の少なくともいくつかを原腸管細胞に分化させるステップ、ｃ）原腸管細胞をｉ）レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤、ｉｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの因子、ｉｉｉ）ＳＨＨ経路阻害剤、ｉｖ）ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えばＤＭＨ−１またはＬＤＮ１９３１８９）、ｖ）ＰＫＣ活性化剤、およびｖｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と接触させるプロセスによって原腸管細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性膵前駆細胞に分化させるステップ、ｄ）Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞を細胞のクラスター化を促進する条件下でｉ）ＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子、ｉｉ）少なくとも１つのＳＨＨ経路阻害剤、および任意選択でｉｉｉ）ＲＡシグナル伝達経路活性化剤、および任意選択でｉｖ）ＲＯＣＫ阻害剤、ならびにｖ）ＴＧＦβスーパーファミリーからの少なくとも１つの因子と５日または６日間、１日おきに接触させるプロセスによってＰｄｘ１陽性膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞に分化させるステップであって、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞がＰｄｘ１およびＮＫＸ６．１を発現するステップ、ｅ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をｉ）γ−セクレターゼ阻害剤、ｉｉ）少なくとも１つの骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤、ｉｉｉ）ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤、ｉｖ）甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤、ｖ）エピジェネティック修飾化合物（例えばＤＺＮｅｐまたはＫＤ５１７０）、ｖｉ）プロテインキナーゼ阻害剤、およびｖｉｉ）ＲＯＣＫ阻害剤と５日〜７日の間、１日おきに接触させ、５日〜７日の間の最初の３日の間にＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞をＳＨＨ経路阻害剤、ＲＡシグナル伝達経路、およびＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子と接触させて、その後それらをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞から除去するプロセスによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞の少なくともいくつかをＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞に分化させるステップ、ならびにｆ）Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞を外因性の分化因子なしに７日〜１４日の間、１日おきに培地（例えばＮＳ−ＧＦｓ培地、ＢＳＡを補ったＭＣＤＢ培地、ＭＣＤＢ１３１培地、またはＤＭＥＭ／Ｆ１２培地）中で培養してＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくともいくつかのＳＣ−β細胞へのｉｎ  ｖｉｔｒｏの成熟を誘起するプロセスによってＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性、インスリン陽性の内分泌細胞の少なくともいくつかをＳＣ−β細胞に分化するステップであって、ＳＣ−β細胞がｉｎ  ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ  ｖｉｖｏでＧＳＩＳ応答を呈するステップを含む。一部の例では、ＧＳＩＳ応答は内因性成熟β細胞のＧＳＩＳ応答に類似している。
【０２３３】
[0292]第１の細胞クラスターから分離された細胞を培養するために使用された培地は、ゼノフリーであり得る。動物を起源とする細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、他の動物由来の生成物を有することができない。一部の事例では、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、いずれの非ヒト動物由来の生成物も有することができない。例えば、ヒト細胞および／または細胞クラスターを培養するためのゼノフリー培地は、ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）の代わりにヒト血小板溶解物（ＰＬＴ）を含むことができる。例えば、培地は、約１％〜約２０％、約５％〜約１５％、約８％〜約１２％、約９〜約１１％の血清を含むことができる。一部の事例では、培地は、約１０％の血清を含むことができる。一部の事例では、培地は、小分子および／またはＦＢＳを含むことができない。例えば、培地は、２％のＢＳＡを補充したＭＣＤＢ１３１基礎培地を含むことができる。一部の事例では、培地は、血清を含まない。一部の例では、培地は、外因性小分子またはシグナル伝達経路アゴニストもしくはアンタゴニスト、例えば、線維芽細胞成長因子ファミリー（ＦＧＦ、例えば、ＦＧＦ２、ＦＧＦ８Ｂ、ＦＧＦ１０、またはＦＧＦ２１）からの成長因子、ソニックヘッジホッグアンタゴニスト（例えば、Ｓａｎｔ１、Ｓａｎｔ２、Ｓａｎｔ４、Ｓａｎｔ４、Ｃｕｒ６１４１４、フォルスコリン、トマチジン、ＡＹ９９４４、トリパラノール、シクロパミン、またはこれらの誘導体）、レチノイン酸シグナル伝達アゴニスト（例えば、レチノイン酸、ＣＤ１５３０、ＡＭ５８０、ＴＴＨＰＢ、ＣＤ４３７、Ｃｈ５５、ＢＭＳ９６１、ＡＣ２６１０６６、ＡＣ５５６４９、ＡＭ８０、ＢＭＳ７５３、タザロテン、アダパレン、またはＣＤ２３１４）、Ｒｈｏ関連コイルドコイル含有プロテインキナーゼ（ＲＯＣＫ）の阻害剤（例えば、チアゾビビン、Ｙ−２７６３２、ファスジル／ＨＡ１０７７、または１４−１１５２）、プロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）の活性化剤（例えば、ホルボール１２，１３−ジブチレート（ＰＤＢＵ）、ＴＰＢ、ホルボール１２−ミリステート  １３−アセテート、ブリオスタチン１、またはこれらの誘導体）、ＴＧＦβスーパーファミリーのアンタゴニスト（例えば、Ａｌｋ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ  ４４６８５９−３３−２）、Ａ８３−０１、ＳＢ４３１５４２、Ｄ４４７６、ＧＷ７８８３８８、ＬＹ３６４９４７、ＬＹ５８０２７６、ＳＢ５０５１２４、ＧＷ６６０４、ＳＢ−５２５３３４、ＳＤ−２０８、ＳＢ−５０５１２４、またはこれらの誘導体）、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）１型受容体の阻害剤（例えば、ＬＤＮ１９３１８９またはこれらの誘導体）、甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤（例えば、Ｔ３、ＧＣ−１またはこれらの誘導体）、ガンマセクレターゼ阻害剤（例えば、ＸＸＩ、ＤＡＰＴ、またはこれらの誘導体）、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路の活性化剤（例えば、ＷＮＴ３ａまたはアクチビンＡ）  上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリーからの成長因子（例えば、ベータセルリンまたはＥＧＦ）、広範囲のキナーゼ（例えば、スタウロスポリンまたはその誘導体）、非必須アミノ酸、ビタミンまたは酸化防止剤（例��ば、シクロパミン、ビタミンＤ、ビタミンＣ、ビタミンＡ、またはこれらの誘導体）、あるいはＮ−アセチルシステイン、硫酸亜鉛、またはヘパリンのような他の添加物を含むことができない。一部の事例では、再凝集培地は、外因性細胞外マトリックス分子を含むことができない。一部の事例では、再凝集培地は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）を含まない。一部の事例では、再凝集培地は、他の細胞外マトリックス分子または材料、例えば、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎならびにこれらの混合物、または、例えば、溶解された細胞膜調製物を含まない。
【０２３４】
[0293]当業者であれば、培地中に補充される血清アルブミンの濃度が変化し得ることを認識するであろう。例えば、培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１）は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、または約１５％のＢＳＡを含むことができる。他の事例では、培地は、約０．０１％、０．０５％、０．１％、１％、約２％、約３％、約４％、約５％、約１０％、または約１５％のＨＳＡを含むことができる。使用される培地（例えば、ＭＣＤＢ１３１培地）は、伝統的な基礎培地に見られない構成成分、例えば、微量元素、プトレシン、アデニン、チミジン、ならびに高レベルの一部のアミノ酸およびビタミンを含有することができる。これらの添加物によって、非常に低いレベルの血清または規定された構成成分が補充される培地を可能とすることができる。培地は、タンパク質および／または成長因子を含まなくてもよく、かつＥＧＦ、ヒドロコルチゾン、および／またはグルタミンが補充されてもよい。培地は、１つまたは複数の細胞外マトリックス分子（例えば、細胞外タンパク質）を含んでもよい。培地において使用される非限定的な例示的細胞外マトリックス分子としては、コラーゲン、胎盤マトリックス、フィブロネクチン、ラミニン、メロシン、テネイシン、ヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デルマタン硫酸、アグリカン、バイグリカン、トロンボスポンジン、ビトロネクチン、およびデコリンを挙げることができる。一部の事例では、培地は、ラミニン、例えば、ＬＮ−３３２を含む。一部の事例では、培地は、ヘパリンを含む。
【０２３５】
[0294]培地は、例えば、培地中の細胞に最適な環境を与えるために、培養中に周期的に交換することができる。再凝集のために第１の細胞クラスターから分離された細胞を培養する場合、培地は、少なくともまたは約４時間毎、１２時間毎、２４時間毎、４８時間毎、３日毎もしくは４日毎に交換することができる。例えば、培地は、約４８時間毎に交換することができる。
【０２３６】
[0295]一部の事例では、細胞は、動的条件下（例えば、細胞が、懸濁培養下にある間、一定の動きまたは撹拌に供される条件下）で培養することができる。細胞を動的培養するために、細胞は、制御ユニットに接続され、よって、制御された培養系を提供することができる容器（例えば、スピナーフラスコ（例えば、２００ｍｌ〜３０００ｍｌ、例えば、２５０ｍｌの；１００ｍｌの；または１２５ｍｌのエルレンマイヤー中の）などの非接着性容器）中で培養することができる。一部の事例では、細胞は、それらの増殖能力を維持しながら、非動的条件（例えば、静的培養）下で培養することができる。細胞を非動的培養するために、細胞は、接着性培養ベッセル中で培養することができる。接着性培養ベッセルは、ベッセル表面の細胞への接着性を改良するために、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）などの細胞接着のための基質のいずれかでコーティングされてもよい。細胞接着のための基質は、（使用される場合）幹細胞またはフィーダー細胞を付着させることを意図する任意の材料であり得る。細胞接着のための基質としては、コラーゲン、ゼラチン、ポリ−Ｌ−リシン、ポリ−Ｄ−リシン、ビトロネクチン、ラミニン、フィブロネクチン、ＰＬＯラミニン、フィブリン、トロンビン、およびＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎならびにこれらの混合物、例えば、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（商標）、ならびに溶解された細胞膜調製物が挙げられる。
【０２３７】
[0296]動的細胞培養ベッセル（例えば、スピナーフラスコ）中の培地は、撹拌され得る（例えば、スターラーによって）。スピン速度は、再凝集される第２の細胞クラスターのサイズと相関し得る。スピン速度は、第２の細胞クラスターのサイズが内因性膵島に類似することができるように制御され得る。一部の事例では、スピン速度は、第２の細胞クラスターのサイズが、約７５μｍ〜約２５０μｍとなり得るように制御される。動的細胞培養ベッセル（例えば、スピナーフラスコ）のスピン速度は、１分当たり約２０回転（ｒｐｍ）〜約１００ｒｐｍ、例えば、約３０ｒｐｍ〜約９０ｒｐｍ、約４０ｒｐｍ〜約６０ｒｐｍ、約４５ｒｐｍ〜約５０ｒｐｍであり得る。一部の事例では、スピン速度は、約５０ｒｐｍであり得る。
【０２３８】
[0297]本明細書において提供されるステージ６の細胞は、本明細書に記載されているように、分離および再凝集プロセスに供されても供されなくてもよい。一部の事例では、インスリン陽性内分泌細胞を含む細胞クラスターは再凝集され得る。細胞クラスターの再凝集により、インスリン陽性内分泌細胞を濃縮することができる。一部の事例では、細胞クラスター中のインスリン陽性内分泌細胞は、膵β細胞へとさらに成熟され得る。例えば、再凝集後に、第２の細胞クラスターは、天然の膵島に似た、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＳＩＳを呈し得る。例えば、再凝集後に、第２の細胞クラスターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのＧＳＩＳを呈する非天然膵β細胞を含み得る。一部の実施形態では、再凝集プロセスは、参照によってその全体が本明細書に組み込まれる、ＰＣＴ出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０４３１７９の開示に従って実施され得る。
【０２３９】
[0298]本明細書において提供される方法に従って得られるステージ６の細胞は、凍結保存および再凝集手順の後に、高い回収率を有することができる。一部の事例では、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ−１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置ならびにステージ５におけるエピジェネティック修飾化合物（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ＥＺＨ２阻害剤、例えば、ＤＺＮｅｐ）の処置に関与する分化プロセスで得られるステージ６の細胞は、このような処置を伴わない対応する細胞集団と比較して、ステージ５の後の凍結保存後により高い回収率を有し得る。一部の事例では、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ−１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置ならびにステージ５におけるエピジェネティック修飾化合物（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ＥＺＨ２阻害剤、例えば、ＤＺＮｅｐ）の処置に関与する分化プロセスで得られるステージ６の細胞は、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ−１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置を伴わない対応する細胞集団と比較して、ステージ５の後の凍結保存後により高い回収率を有し得る。一部の事例では、ステージ３におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤（例えば、ＤＭＨ−１またはＬＤＮ）およびＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子（例えば、アクチビンＡ）の処置ならびにステージ５におけるエピジェネティック修飾化合物（例えば、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、例えば、ＥＺＨ２阻害剤、例えば、ＤＺＮｅｐ）の処置に関与する分化プロセスで得られるステージ６の細胞は、ステージ５の後の凍結保存後に、少なくとも約３５％、３７．５％、４０％、４２．５％、４５％、４７．５％、４８％、４９％、または５０％である回収率を有し得る。回収率は、凍結保存前の細胞と比較した、凍結保存、解凍および回収、ならびに再凝集手順後に生存し、再凝集した細胞クラスターを形成する細胞のパーセンテージとして計算することができる。
【０２４０】
[0299]一部の実施形態では、本開示は、本明細書において提供される方法を使用して得られる非天然膵β細胞またはその前駆体の凍結保存に関する。一部の実施形態では、非天然膵β細胞を含む細胞集団は、凍結保存によって保存することができる。例えば、非天然β細胞、例えば、ステージ６の細胞を含む細胞集団は、一部の事例では、細胞懸濁液、例えば、単一細胞の懸濁液中に分離されてもよく、細胞懸濁液は、凍結保存、例えば、凍結保存溶液中で凍結することができる。細胞の分離は、本明細書に与えられる技法のいずれか、例えば、酵素処理によって行うことができる。細胞は、最高−２０℃、最高−３０℃、最高−４０℃、最高−５０℃、最高−６０℃、最高−７０℃、最高−８０℃、最高−９０℃、最高−１００℃、最高−１１０℃、最高−１２０℃、最高−１３０℃、最高−１４０℃、最高−１５０℃、最高−１６０℃、最高−１７０℃、最高−１８０℃、最高−１９０℃、または細胞は最高−２００℃の温度で凍結することができる。一部の事例では、細胞は、約−８０℃の温度で凍結される。一部の事例では、細胞は、約−１９５℃の温度で凍結される。凍結保存に必要とされる低温をもたらすために、以下に限定されないが、電気冷凍庫、固体二酸化炭素、および液体窒素などの任意の冷却方法を使用することができる。一部の事例では、カスタムメイドと市販の溶液の両方を含む、当業者にとって利用可能な任意の凍結保存溶液を、低温での保存用に細胞をインキュベートするために使用することができる。例えば、凍結保護物質を含有する溶液を使用してもよい。凍結保護物質は、細胞を凍結による損傷から保護するために構成される薬剤であり得る。例えば、凍結保護物質は、凍結保存溶液のガラス転移温度を低下させることができる物質であり得る。使用することができる例示的な凍結保護物質として、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）、グリコール（例えば、エチレングリコール、プロピレングリコールおよびグリセロール）、デキストラン（例えば、デキストラン−４０）、およびトレハロースが挙げられる。他の作用のために、追加の薬剤を凍結保存溶液に添加してもよい。一部の事例では、市販の凍結保存溶液、例えば、ＦｒｏｓｔａＬｉｆｅ（商標）、ｐＺｅｒｖｅ（商標）、Ｐｒｉｍｅ−ＸＶ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ  Ｓｙｎｔｈ−ａ−Ｆｒｅｅｚｅ  Ｃｒｙｏｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉｕｍ、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標）、ＣｒｙｏＳｔｏｒ（登録商標）  Ｆｒｅｅｚｉｎｇ  Ｍｅｄｉａ、ＨｙｐｏＴｈｅｒｍｏｓｏｌ（登録商標）  ＦＲＳ  Ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎ  Ｍｅｄｉａ、およびＣｒｙｏＤｅｆｅｎｄ（登録商標）  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌｓ  Ｍｅｄｉａを本明細書において提供される方法において使用することができる。
【０２４１】
[0300]分化プロセスの間に、細胞を本明細書で提供される照射処置に供することができる。一部の事例では、ステージ６における細胞集団、例えば、インスリン陽性内分泌細胞から膵β細胞へと分化される細胞を有する細胞集団または細胞クラスターは、一定期間照射される。一部の事例では、凍結保存からの回収後の再凝集後のステージ６の細胞集団は、一定期間照射される。一部の事例では、凍結保存された細胞（例えば、ステージ５の終わりに凍結保存された細胞）は、次の分化プロセスのために、解凍および回収前に、ある特定の期間照射される。
【０２４２】
[0301]Ｖ．分化因子
[0302]本開示の態様は、例えば、インスリン陽性内分泌細胞の成熟または他の前駆細胞のＳＣ−β細胞（例えば、成熟膵β細胞）への分化を誘導するために、前駆細胞（例えば、幹細胞、例えば、ｉＰＳ細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞、ＮＫＸ６．１陽性膵前駆細胞、インスリン陽性内分泌細胞）をβ細胞分化因子と接触させることに関する。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、多能性細胞（例えば、ｉＰＳＣまたはｈＥＳＣ）の胚体内胚葉細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、胚体内胚葉細胞の原腸管細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、原腸管細胞のＰｄｘ１陽性膵前駆細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞のＮＫＸ６−１陽性膵前駆細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、ＮＫＸ６−１陽性膵前駆細胞のインスリン陽性内分泌細胞への分化を誘導することができる。一部の実施形態では、分化因子は、例えば、本明細書に記載の方法に従って、インスリン陽性内分泌細胞のＳＣ−β細胞への成熟を誘導することができる。
【０２４３】
[0303]本明細書に記載の少なくとも１つの分化因子は、単独で、または他の分化作用剤と組み合わせて使用し、本明細書に開示されている方法に従って、ＳＣ−β細胞を産生することができる。一部の実施形態では、本明細書に記載の少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個、少なくとも６個、少なくとも７個、少なくとも８個、少なくとも９個、または少なくとも１０個の分化因子は、ＳＣ−β細胞を産生する方法において使用される。
【０２４４】
[0304]形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリー
[0305]本開示の態様は、分化因子としての形質転換成長因子−β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子の使用に関する。「ＴＧＦ−βスーパーファミリー」は、公知のＴＧＦβファミリーのメンバーの構造的および機能的特徴を有するタンパク質を意味する。タンパク質のＴＧＦβファミリーとしては、ＴＧＦβシリーズのタンパク質、インヒビン（インヒビンＡおよびインヒビンＢを含む）、アクチビン（アクチビンＡ、アクチビンＢ、およびアクチビンＡＢを含む）、ＭＩＳ（ミュラー管阻害物質）、ＢＭＰ（骨形成タンパク質）、ｄｐｐ（デカペンタプレジック）、Ｖｇ−１、ＭＮＳＦ（モノクローナル非特異的抑制因子）などが挙げられる。このファミリーのタンパク質の活性は、様々な細胞型の特定の受容体への特異的結合に基づき得る。このファミリーのメンバーは、特にＣ末端において、それらの機能に相関する配列同一性の領域を共有することができる。ＴＧＦβファミリーは、１００を超える別々のタンパク質を含むことができ、これらは全て、アミノ酸配列同一性の少なくとも１つの領域を共有する。本明細書に開示されている方法において使用することができるファミリーのメンバーとしては、以下のタンパク質が挙げられるが、これらに限定されず、以下のタンパク質は、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号：Ｐ０７９９５、Ｐ１８３３１、Ｐ０８４７６、Ｑ０４９９８、Ｐ０３９７０、Ｐ４３０３２、Ｐ５５１０２、Ｐ２７０９２、Ｐ４２９１７、Ｐ０９５２９、Ｐ２７０９３、Ｐ０４０８８、Ｑ０４９９９、Ｐ１７４９１、Ｐ５５１０４、Ｑ９ＷＵＫ５、Ｐ５５１０３、Ｏ８８９５９、Ｏ０８７１７、Ｐ５８１６６、Ｏ６１６４３、Ｐ３５６２１、Ｐ０９５３４、Ｐ４８９７０、Ｑ９ＮＲ２３、Ｐ２５７０３、Ｐ３０８８４、Ｐ１２６４３、Ｐ４９００１、Ｐ２１２７４、Ｏ４６５６４、Ｏ１９００６、Ｐ２２００４、Ｐ２０７２２、Ｑ０４９０６、Ｑ０７１０４、Ｐ３０８８６、Ｐ１８０７５、Ｐ２３３５９、Ｐ２２００３、Ｐ３４８２１、Ｐ４９００３、Ｑ９０７５１、Ｐ２１２７５、Ｑ０６８２６、Ｐ３０８８５、Ｐ３４８２０、Ｑ２９６０７、Ｐ１２６４４、Ｑ９０７５２、Ｏ４６５７６、Ｐ２７５３９、Ｐ４８９６９、Ｑ２６９７４、Ｐ０７７１３、Ｐ９１７０６、Ｐ９１６９９、Ｐ２７０９１、Ｏ４２２２２、Ｑ２４７３５、Ｐ２０８６３、Ｏ１８８２８、Ｐ５５１０６、Ｑ９ＰＴＱ２、Ｏ１４７９３、Ｏ０８６８９、Ｏ４２２２１、Ｏ１８８３０、Ｏ１８８３１、Ｏ１８８３６、Ｏ３５３１２、Ｏ４２２２０、Ｐ４３０２６、Ｐ４３０２７、Ｐ４３０２９、Ｏ９５３９０、Ｑ９Ｒ２２９、Ｏ９３４４９、Ｑ９Ｚ１Ｗ４、Ｑ９ＢＤＷ８、Ｐ４３０２８、Ｑ７Ｚ４Ｐ５、Ｐ５０４１４、Ｐ１７２４６、Ｐ５４８３１、Ｐ０４２０２、Ｐ０１１３７、Ｐ０９５３３、Ｐ１８３４１、Ｏ１９０１１、Ｑ９Ｚ１Ｙ６、Ｐ０７２００、Ｑ９Ｚ２１７、Ｏ９５３９３、Ｐ５５１０５、Ｐ３０３７１、Ｑ９ＭＺＥ２、Ｑ０７２５８、Ｑ９６Ｓ４２、Ｐ９７７３７、ＡＡＡ９７４１５．１、ＮＰ−７７６７８８．１、ＮＰ−０５８８２４．１、ＥＡＬ２４００１．１、１  Ｓ４Ｙ、ＮＰ−００１００９８５６．１、ＮＰ−１−０３２４０６．１、ＮＰ−９９９１９３．１、ＸＰ−５１９０６３．１、ＡＡＧ１７２��０．１、ＣＡＡ４０８０６．１、ＮＰ−１−００１００９４５８．１、ＡＡＱ５５８０８．１、ＡＡＫ４０３４１．１、ＡＡＰ３３０１９．１、ＡＡＫ２１２６５．１、ＡＡＣ５９７３８．１、ＣＡＩ４６００３．１、Ｂ４０９０５、ＡＡＱ５５８１１．１、ＡＡＫ４０３４２．１、ＸＰ−５４０３６４．１、Ｐ５５１０２、ＡＡＱ５５８１０．１、ＮＰ−９９０７２７．１、ＣＡＡ５１１６３．１、ＡＡＤ５０４４８．１、ＪＣ４８６２、ＰＮ０５０４、ＢＡＢ１７６００．１、ＡＡＨ５６７４２．１、ＢＡＢ１７５９６．１、ＣＡＧ０６１８３．１、ＣＡＧ０５３３９．１、ＢＡＢ１７６０１．１、ＣＡＢ４３０９１．１、Ａ３６１９２、ＡＡＡ４９１６２．１、ＡＡＴ４２２００．１、ＮＰ−７８９８２２．１、ＡＡＡ５９４５１．１、ＡＡＡ５９１６９．１、ＸＰ−５４１０００．１、ＮＰ−９９０５３７．１、ＮＰ−１−００２１８４．１、ＡＡＣ１４１８７．１、ＡＡＰ８３３１９．１、ＡＡＡ５９１７０．１、ＢＡＢ１６９７３．１、ＡＡＭ６６７６６．１、ＷＦＰＧＢＢ、１２０１２７８Ｃ、ＡＡＨ３００２９．１、ＣＡＡ４９３２６．１、ＸＰ−３４４１３１．１、ＡＡ−１４８８４５．１、ＸＰ−１−１４８９６６．３、１４８２３５、Ｂ４１３９８、ＡＡＨ７７８５７．１、ＡＡＢ２６８６３．１、１７０６３２７Ａ、ＢＡＡ８３８０４．１、ＮＰ−５７１１４３．１、ＣＡＧ００８５８．１、ＢＡＢ１７５９９．１、ＢＡＢ１７６０２．１、ＡＡＢ６１４６８．１、ＰＮ０５０５、ＰＮ０５０６、ＣＡＢ４３０９２．１、ＢＡＢ１７５９８．１、ＢＡＡ２２５７０．１、ＢＡＢ１６９７２．１、ＢＡＣ８１６７２．１、ＢＡＡ１２６９４．１、ＢＡＡ０８４９４．１、Ｂ３６１９２、Ｃ３６１９２、ＢＡＢ１６９７１．１、ＮＰ−０３４６９５．１、ＡＡＡ４９１６０．１、ＣＡＡ６２３４７．１、ＡＡＡ４９１６１．１、ＡＡＤ３０１３２．１、ＣＡＡ５８２９０．１、ＮＰ−００５５２９．１、ＸＰ−５２２４４３．１、ＡＡＭ２７４４８．１、ＸＰ−５３８２４７．１、ＡＡＤ３０１３３．  Ｉ、ＡＡＣ３６７４１．１、ＡＡＨ１０４０４．１、ＮＰ−０３２４０８．１、ＡＡＮ０３６８２．１、ＸＰ−５０９１６１．１、ＡＡＣ３２３１１．１、ＮＰ−６５１９４２．２、ＡＡＬ５１００５．１、ＡＡＣ３９０８３．１、ＡＡＨ８５５４７．１、ＮＰ−５７１０２３．１、ＣＡＦ９４１１３．１、ＥＡＬ２９２４７．１、ＡＡＷ３０００７．１、ＡＡＨ９０２３２．１、Ａ２９６１９、ＮＰ−００１００７９０５．１、ＡＡＨ７３５０８．１、ＡＡＤＯ２２０１．１、ＮＰ−９９９７９３．１、ＮＰ−９９０５４２．１、ＡＡＦ１９８４１．１、ＡＡＣ９７４８８．１、ＡＡＣ６００３８．１、ＮＰ  ９８９１９７．１、ＮＰ−５７１４３４．１、ＥＡＬ４１２２９．１、ＡＡＴ０７３０２．１、ＣＡＩ１９４７２．１、ＮＰ−０３１５８２．１、ＡＡＡ４０５４８．１、ＸＰ−５３５８８０．１、ＮＰ−１−０３７２３９．１、ＡＡＴ７２００７．１、ＸＰ−４１８９５６．１、ＣＡＡ４１６３４．１、ＢＡＣ３０８６４．１、ＣＡＡ３８８５０．１、ＣＡＢ８１６５７．２、ＣＡＡ４５０１８．１、ＣＡＡ４５０１９．１、ＢＡＣ２８２４７．１、ＮＰ−０３１５８１．１、ＮＰ−９９０４７９���１、ＮＰ−９９９８２０．１、ＡＡＢ２７３３５．１、Ｓ４５３５５、ＣＡＢ８２００７．１、ＸＰ−５３４３５１．１、ＮＰ−０５８８７４．１、ＮＰ−０３１５７９．１、１ＲＥＷ、ＡＡＢ９６７８５．１、ＡＡＢ４６３６７．１、ＣＡＡ０５０３３．１、ＢＡＡ８９０１２．１、ＩＥＳ７、ＡＡＰ２０８７０．１、ＢＡＣ２４０８７．１、ＡＡＧ０９７８４．１、ＢＡＣ０６３５２．１、ＡＡＱ８９２３４．１、ＡＡＭ２７０００．１、ＡＡＨ３０９５９．１、ＣＡＧＯ１４９１．１、ＮＰ−５７１４３５．１、１ＲＥＵ、ＡＡＣ６０２８６．１、ＢＡＡ２４４０６．１、Ａ３６１９３、ＡＡＨ５５９５９．１、ＡＡＨ５４６４７．１、ＡＡＨ９０６８９．１、ＣＡＧ０９４２２．１、ＢＡＤ１６７４３．１、ＮＰ−０３２１３４．１、ＸＰ−５３２１７９．１、ＡＡＢ２４８７６．１、ＡＡＨ５７７０２．１、ＡＡＡ８２６１６．１、ＣＡＡ４０２２２．１、ＣＡＢ９０２７３．２、ＸＰ−３４２５９２．１、ＸＰ−５３４８９６．１、ＸＰ−５３４４６２．１、１ＬＸＩ、ＸＰ−４１７４９６．１、ＡＡＦ３４１７９．１、ＡＡＬ７３１８８．１、ＣＡＦ９６２６６．１、ＡＡＢ３４２２６．１、ＡＡＢ３３８４６．１、ＡＡＴ１２４１５．１、ＡＡ０３３８１９．１、ＡＡＴ７２００８．１、ＡＡＤ３８４０２．１、ＢＡＢ６８３９６．１、ＣＡＡ４５０２１．１、ＡＡＢ２７３３７．１、ＡＡＰ６９９１７．１、ＡＡＴＩ２４１６．１、ＮＰ−５７１３９６．１、ＣＡＡ５３５１３．１、ＡＡ０３３８２０．１、ＡＡＡ４８５６８．１、ＢＡＣ０２６０５．１、ＢＡＣ０２６０４．１、ＢＡＣ０２６０３．１、ＢＡＣ０２６０２．１、ＢＡＣ０２６０１．１、ＢＡＣ０２５９９．１、ＢＡＣ０２５９８．１、ＢＡＣ０２５９７．１、ＢＡＣ０２５９５．１、ＢＡＣ０２５９３．１、ＢＡＣ０２５９２．１、ＢＡＣ０２５９０．１、ＡＡＤ２８０３９．１、ＡＡＰ７４５６０．１、ＡＡＢ９４７８６．１、ＮＰ−００１４８３．２、ＸＰ−５２８１９５．１、ＮＰ−５７１４１７．１、ＮＰ−００１００１５５７．  Ｉ、ＡＡＨ４３２２２．１、ＡＡＭ３３１４３．１、ＣＡＧ１０３８１．１、ＢＡＡ３１１３２．１、ＥＡＬ３９６８０．１、ＥＡＡ１２４８２．２、Ｐ３４８２０、ＡＡＰ８８９７２．１、ＡＡＰ７４５５９．１、ＣＡＩ１６４１８．１、ＡＡＤ３０５３８．１、ＸＰ−３４５５０２．１、ＮＰ−１−０３８５５４．１、ＣＡＧ０４０８９．１、ＣＡＤ６０９３６．２、ＮＰ−０３１５８４．１、Ｂ５５４５２、ＡＡＣ６０２８５．１、ＢＡＡ０６４１０．１、ＡＡＨ５２８４６．１、ＮＰ−０３１５８０．１、ＮＰ−１−０３６９５９．１、ＣＡＡ４５８３６．１、ＣＡＡ４５０２０．１、Ｑ２９６０７、ＡＡＢ２７３３６．１、ＸＰ−５４７８１７．１、ＡＡＴ１２４１４．１、ＡＡＭ５４０４９．１、ＡＡＨ７８９０１．１、ＡＡ０２５７４５．１、ＮＰ−５７０９１２．１、ＸＰ−３９２１９４．１、ＡＡＤ２０８２９．１、ＡＡＣ９７１１３．１、ＡＡＣ６１６９４．１、ＡＡＨ６０３４０．１、ＡＡＲ９７９０６．１、ＢＡＡ３２２２７．１、ＢＡＢ６８３９５．１、ＢＡＣ０２８９５．１、ＡＡＷＳ  １４５１．１、ＡＡＦ８２１８８．１、ＸＰ−５４４１８９．１、ＮＰ−９９０５６８．１、ＢＡＣ８０２１１．１、ＡＡＷ８２６２０．１、ＡＡＦ９９５９７．１、ＮＰ−５７１０６２．１、ＣＡＣ４４１７９．１、ＡＡＢ９７４６７．１、ＡＡＴ９９３０３．１、ＡＡＤ２８０３８．１、ＡＡＨ５２１６８．１、ＮＰ−００１００４１２２．１、ＣＡＡ７２７３３．１、ＮＰ−０３２１３３．２、ＸＰ−３９４２５２．１、ＸＰ−２２４７３３．２、ＪＨ０８０１、ＡＡＰ９７７２１．１、ＮＰ−９８９６６９．１、Ｓ４３２９６、Ｐ４３０２９、Ａ５５４５２、ＡＡＨ３２４９５．１、ＸＰ−５４２９７４．１、ＮＰ−０３２１３５．１、ＡＡＫ３０８４２．１、ＡＡＫ２７７９４．１、ＢＡＣ３０８４７．１、ＥＡＡ１２０６４．２、ＡＡＰ９７７２０．１、ＸＰ−５２５７０４．１、ＡＡＴ０７３０１．１、ＢＡＤ０７０１４．１、ＣＡＦ９４３５６．１、ＡＡＲ２７５８１．１、ＡＡＧ１３４００．１、ＡＡＣ６０１２７．１、ＣＡＦ９２０５５．１、ＸＰ−５４０１０３．１、ＡＡ０２０８９５．１、ＣＡＦ９７４４７．１、ＡＡＳ０１７６４．１、ＢＡＤ０８３１９．１、ＣＡＡ１０２６８．１、ＮＰ−９９８１４０．１、ＡＡＲ０３８２４．１、ＡＡＳ４８４０５．１、ＡＡＳ４８４０３．１、ＡＡＫ５３５４５．１、ＡＡＫ８４６６６．１、ＸＰ−３９５４２０．１、ＡＡＫ５６９４１．１、ＡＡＣ４７５５５．１、ＡＡＲ８８２５５．１、ＥＡＬ３３０３６．１、ＡＡＷ４７７４０．１、ＡＡＷ２９４４２．１、ＮＰ−７２２８１３．１、ＡＡＲＯ８９０１．１、ＡＡＯ  １５４２０．２、ＣＡＣ５９７００．１、ＡＡＬ２６８８６．１、ＡＡＫ７１７０８．１、ＡＡＫ７１７０７．１、ＣＡＣ５１４２７．２、ＡＡＫ６７９８４．１、ＡＡＫ６７９８３．１、ＡＡＫ２８７０６．１、Ｐ０７７１３、Ｐ９１７０６、Ｐ９１６９９、ＣＡＧ０２４５０．１、ＡＡＣ４７５５２．１、ＮＰ−００５８０２．１、ＸＰ−３４３１４９．１、ＡＷ３４０５５．１、ＸＰ−５３８２２１．１、ＡＡＲ２７５８０．１、ＸＰ−１２５９３５．３、ＡＡＦ２１６３３．１、ＡＡＦ２１６３０．１、ＡＡＤ０５２６７．１、Ｑ９Ｚ１  Ｗ４、ＮＰ−１−０３１５８５．２、ＮＰ−５７１０９４．１、ＣＡＤ４３４３９．１、ＣＡＦ９９２１７．１、ＣＡＢ６３５８４．１、ＮＰ−７２２８４０．１、ＣＡＥ４６４０７．１、ＸＰ−１−４１７６６７．１、ＢＡＣ５３９８９．１、ＢＡＢ１９６５９．１、ＡＡＭ４６９２２．１、ＡＡＡ８１１６９
．１、ＡＡＫ２８７０７．１、ＡＡＬ０５９４３．１、ＡＡＢ１７５７３．１、ＣＡＨ２５４４３．１、ＣＡＧ１０２６９．１、ＢＡＤ１６７３１．１、ＥＡＡ００２７６．２、ＡＡＴ０７３２０．１、ＡＡＴ０７３００．１、ＡＡＮ１５０３７．１、ＣＡＨ２５４４２．１、ＡＡＫ０８１５２．２、２００９３８８Ａ、ＡＡＲ１２１６１．１、ＣＡＧＯ１９６１．１、ＣＡＢ６３６５６．１、ＣＡＤ６７７１４．１、ＣＡＦ９４１６２．１、ＮＰ−４７７３４０．１、ＥＡＬ２４７９２．１、ＮＰ−１−００１００９４２８．１、ＡＡＢ８６６８６．１、ＡＡＴ４０５７２．１、ＡＡＴ４０５７１．１、ＡＡＴ４０５６９．１、ＮＰ−０３３８８６．１、ＡＡＢ４９９８５．１、ＡＡＧ３９２６６．１、Ｑ２６９７４、ＡＡＣ７７４６１．１、ＡＡＣ４７２６２．１、ＢＡＣ０５５０９．１、ＮＰ−０５５２９７．１、ＸＰ−５４６１４６．１、ＸＰ−５２５７７２．１、ＮＰ−０６０５２５．２、ＡＡＨ３３５８５．１、ＡＡＨ６９０８０．１、ＣＡＧ１２７５１．１、ＡＡＨ７４７５７．２、ＮＰ−０３４９６４．１、ＮＰ−０３８６３９．１、０４２２２１、ＡＡＦ０２７７３．１、ＮＰ−０６２０２４．１、ＡＡＲ１８２４４．１、ＡＡＲ１４３４３．１、ＸＰ−２２８２８５．２、ＡＡＴ４０５７３．１、ＡＡＴ９４４５６．１、ＡＡＬ３５２７８．１、ＡＡＬ３５２７７．１、ＡＡＬ１７６４０．１、ＡＡＣ０８０３５．１、ＡＡＢ８６６９２．１、ＣＡＢ４０８４４．１、ＢＡＣ３８６３７．１、ＢＡＢ１６０４６．１、ＡＡＮ６３５２２．１、ＮＰ−５７１０４１．１、ＡＡＢ０４９８６．２、ＡＡＣ２６７９１．１、ＡＡＢ９５２５４．１、ＢＡＡ１１８３５．１、ＡＡＲ１８２４６．１、ＸＰ−５３８５２８．１、ＢＡＡ３１８５３．１、ＡＡＫ１８０００．１、ＸＰ−１−４２０５４０．１、ＡＡＬ３５２７６．１、ＡＡＱ９８６０２．１、ＣＡＥ７１９４４．１、ＡＡＷ５０５８５．１、ＡＡＶ６３９８２．１、ＡＡＷ２９９４１．１、ＡＡＮ８７８９０．１、ＡＡＴ４０５６８．１、ＣＡＤ５７７３０．１、ＡＡＢ８１５０８．１、ＡＡＳ００５３４．１、ＡＡＣ５９７３６．１、ＢＡＢ７９４９８．１、ＡＡＡ９７３９２．１、ＡＡＰ８５５２６．１、ＮＰ−９９９６００．２、ＮＰ−８７８２９３．１、ＢＡＣ８２６２９．１、ＣＡＣ６０２６８．１、ＣＡＧ０４９１９．１、ＡＡＮ１０１２３．１、ＣＡＡ０７７０７．１  ＡＡＫ２０９１２．１、ＡＡＲ８８２５４．１、ＣＡＣ３４６２９．１、ＡＡＬ３５２７５．１、ＡＡＤ４６９９７．  Ｉ、ＡＡＮ０３８４２．１、ＮＰ−５７１９５１．２、ＣＡＣ５０８８１．１、ＡＡＬ９９３６７．１、ＡＡＬ４９５０２．１、ＡＡＢ７１８３９．１、ＡＡＢ６５４１５．１、ＮＰ−６２４３５９．１、ＮＰ−９９０１５３．１、ＡＡＦ７８０６９．１、ＡＡＫ４９７９０．１、ＮＰ−９１９３６７．２、ＮＰ−００１１９２．１、ＸＰ−５４４９４８．１、ＡＡＱ１８０１３．１、ＡＡＶ３８７３９．１、ＮＰ−８５１２９８．１、ＣＡＡ６７６８５．１、ＡＡＴ６７１７１．１、ＡＡＴ３７５０２．１、ＡＡＤ２７８０４．１、ＡＡＮ７６６６５．１、ＢＡＣ１１９０９．１、ＸＰ−１−４２１６４８．１、ＣＡＢ６３７０４．１、ＮＰ−０３７３��６．１、Ａ５５７０６、ＡＡＦ０２７８０．１、ＣＡＧ０９６２３．１、ＮＰ−０６７５８９．１、ＮＰ−０３５７０７．１、ＡＡＶ３０５４７．１、ＡＡＰ４９８１７．１、ＢＡＣ７７４０７．１、ＡＡＬ８７１９９．１、ＣＡＧ０７１７２．１、Ｂ３６１９３、ＣＡＡ３３０２４．１、ＮＰ−１−００１００９４００．１、ＡＡＰ３６５３８．１、ＸＰ−５１２６８７．１、ＸＰ−５１００８０．１、ＡＡＨ０５５１３．１、１ＫＴＺ、ＡＡＨ１４６９０．１、ＡＡＡ３１５２６．１によって特定される。
【０２４５】
[0306]本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子は、天然に得ることができるかまたは組換え体であり得る。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子は、アクチビンＡを含む。用語「アクチビンＡ」は、アクチビンＡの断片および誘導体を含み得る。例示的なアクチビンＡの配列は、米国特許出願公開第２００９／０１５５２１８号（’２１８公報）における配列番号１に開示されている。アクチビンＡの他の非限定的な例は、’２１８公報の配列番号２〜１６に提供され、アクチビンＡをコードする核酸の非限定的な例は、’２１８公報の配列番号３３〜３４に提供されている。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子は、’２１８公報の配列番号１と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含み得る。
【０２４６】
[0307]一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子は、成長分化因子８（ＧＤＦ８）を含む。用語「ＧＤＦ８」は、ＧＤＦ８の断片および誘導体を含み得る。ＧＤＦ８ポリペプチドの配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子は、ヒトＧＤＦ８ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＥＡＸ１０８８０）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２４７】
[0308]一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子は、ＧＤＦ８に密接に関連する成長因子、例えば、成長分化因子１１（ＧＤＦ１１）を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子は、ヒトＧＤＦ１１ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＦ２１６３０）と少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２４８】
[0309]一部の実施形態では、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの成長因子は、ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子を模倣する薬剤と置き換えることができる。ＴＧＦ−βスーパーファミリーからの少なくとも１つの成長因子を模倣する例示的な薬剤としては、限定されないが、ＩＤＥ１およびＩＤＥ２が挙げられる。
【０２４９】
[0310]骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤
[0311]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤の使用に関する。ＢＭＰシグナル伝達ファミリーは、ＴＧＦ−βスーパーファミリーの多様なサブセットである（Ｓｅｂａｌｄら  Ｂｉｏｌ．  Ｃｈｅｍ．  ３８５：６９７〜７１０頁、２００４年）。２０種を超える公知のＢＭＰリガンドは、３つの異なるＩＩ型（ＢＭＰＲＩＩ、ＡｃｔＲＩＩａ、およびＡｃｔＲＩＩｂ）および少なくとも３つのＩ型（ＡＬＫ２、ＡＬＫ３、およびＡＬＫ６）受容体によって認識される。二量体のリガンドは、受容体ヘテロマーのアセンブリーを促進し、構成的に活性なＩＩ型受容体セリン／トレオニンキナーゼにＩ型受容体セリン／トレオニンキナーゼをリン酸化させる。活性化Ｉ型受容体は、ＢＭＰ応答性（ＢＲ−）ＳＭＡＤエフェクター（ＳＭＡＤ１、５、および８）をリン酸化して、ＴＧＦシグナル伝達も促進するｃｏ−ＳＭＡＤであるＳＭＡＤ４との複合体における核移行を促進する。さらに、ＢＭＰシグナルは、ＳＭＡＤに依存しない手法で、ＭＡＰＫ  ｐ３８などの細胞内エフェクターを活性化し得る（Ｎｏｈｅら  Ｃｅｌｌ  Ｓｉｇｎａｌ  １６：２９１〜２９９頁、２００４年）。可溶性ＢＭＰアンタゴニスト、例えば、ノギン、コーディン、グレムリン、およびフォリスタチンは、リガンド隔離によってＢＭＰシグナル伝達を制限する。
【０２５０】
[0312]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＤＭＨ−１、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、以下の化合物または以下の化合物の誘導体、類似体、もしくはバリアントを含む：
【０２５１】
【化１】
2021516066.tif 000003
【０２５２】
[0313]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９（ＬＤＮ１９３１８９、１０６２３６８−２４−４、ＬＤＮ−１９３１８９、ＤＭ  ３１８９、ＤＭ−３１８９、ＩＵＰＡＣ名：４−［６−（４−ピペラジン−１−イルフェニル）ピラゾロ［１，５−ａ］ピリミジン−３−イル］キノロンとしても公知）を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、以下の化合物または以下の化合物の誘導体、類似体、もしくはバリアントを含む：
【０２５３】
【化２】
2021516066.tif 000004
【０２５４】
[0314]一部の事例では、ＤＭＨ−１は、ＬＤＮ１９３１８９と比較して、より選択的であり得る。本開示の一部の実施形態では、ＤＭＨ−１は、本明細書において提供される方法に対して特に有用であり得る。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、ＬＤＮ１９３１８９の使用を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、原腸管細胞からＰｄｘ１陽性膵前駆細胞を産生するために、ＬＤＮ１９３１８９、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントの使用を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物は、原腸管細胞からＰｄｘ１陽性膵前駆細胞を産生するための、ＤＭＨ−１、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントの使用に関する。
【０２５５】
[0315]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＤＮ１９３１８９の類似体または誘導体、例えば、ＬＤＮ１９３１８９の塩、水和物、溶媒、エステル、またはプロドラッグを含む。一部の実施形態では、ＬＤＮ１９３１８９の誘導体（例えば、塩）は、ＬＤＮ１９３１８９ヒドロクロリドを含む。
【０２５６】
[0316]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２０１１／００５３９３０号からの式Ｉの化合物を含む。
【０２５７】
[0317]ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤
[0318]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤の使用に関する。
【０２５８】
[0319]一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路は、ＴＧＦ−β受容体Ｉ型キナーゼ（ＴＧＦ−β  ＲＩ）シグナル伝達を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ  ４４６８５９−３３−２、ＲｅｐＳｏｘとしても公知であるＴＧＦ−Ｂ  ＲＩキナーゼのＡＴＰ競合阻害剤、ＩＵＰＡＣ名：２−［５−（６−メチルピリジン−２−イル）−１Ｈ−ピラゾール−４−イル］−１，５−ナフチリジン）を含む。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの類似体または誘導体である。
【０２５９】
[0320]一部の実施形態では、ＡＬＫ５阻害剤ＩＩの類似体または誘導体（「ＡＬＫ５ｉ」とも称される）は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許出願公開第２０１２／００２１５１９号に記載されている式Ｉの化合物である。
【０２６０】
[0321]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２０１０／０２６７７３１号に記載されているＴＧＦ−β受容体阻害剤である。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２００９／０１８６０７６号および同第２００７／０１４２３７６号に記載されているＡＬＫ５阻害剤を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａ  ８３−０１である。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、Ａ  ８３−０１ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、Ａ  ８３−０１を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ４３１５４２である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ４３１５４２ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＢ  ４３１５４２を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、Ｄ  ４４７６である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、Ｄ  ４４７６ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、Ｄ  ４４７６を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ７８８３８８である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ７８８３８８ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＧＷ  ７８８３８８を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ  ３６４９４７である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ  ３６４９４７ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＬＹ  ３６４９４７を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ  ５８０２７６である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＬＹ  ５８０２７６ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＬＹ  ５８０２７６を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ５２５３３４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ５２５３３４ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＢ  ５２５３３４を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ５０５１２４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＢ  ５０５１２４ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＢ  ５０５１２４を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＤ  ２０８である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＤ  ２０８ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＳＤ  ２０８を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ６６０４である。一部の実施形態では、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ６６０４ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＧＷ  ６６０４を除外する。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ７８８３８８である。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＴＧＦ−βシグナル伝達経路阻害剤は、ＧＷ  ７８８３８８ではない。一部の実施形態では、本明細書に記載の組成物および方法は、ＧＷ  ７８８３８８を除外する。
【０２６１】
[0322]上記化合物のコレクションから、以下のものを様々な供給源から得ることができる：Ｓｉｇｍａ，  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １４５０８，  Ｓｔ．  Ｌｏｕｉｓ，  Ｍｏ．，  ６３１７８−９９１６から入手可能なＬＹ−３６４９４７、ＳＢ−５２５３３４、ＳＤ−２０８、およびＳＢ−５０５１２４；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（ＥＭＤ  Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ，  Ｉｎｃ．），４８０  Ｓ．  Ｄｅｍｏｃｒａｔ  Ｒｏａｄ，  Ｇｉｂｂｓｔｏｗｎ，  Ｎ．Ｊ．，  ０８０２７から入手可能な６１６４５２および６１６４５３；ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ，  ９８０  Ｇｒｅａｔ  Ｗｅｓｔ  Ｒｏａｄ，  Ｂｒｅｎｔｆｏｒｄ，  Ｍｉｄｄｌｅｓｅｘ，  ＴＷ８  ９ＧＳ，  Ｕｎｉｔｅｄ  Ｋｉｎｇｄｏｍから入手可能なＧＷ７８８３８８およびＧＷ６６０４；Ｌｉｌｌｙ  Ｒｅｓｅａｒｃｈ，  Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，  Ｉｎｄ．  ４６２８５から入手可能なＬＹ５８０２７６；ならびにＢｉｏｇｅｎ  Ｉｄｅｃ，  Ｐ．Ｏ．  Ｂｏｘ  １４６２７，  ５０００  Ｄａｖｉｓ  Ｄｒｉｖｅ，  Ｒｅｓｅａｒｃｈ  Ｔｒｉａｎｇｌｅ  Ｐａｒｋ，  Ｎ．Ｃ．，  ２７７０９−４６２７から入手可能なＳＭ１６。
【０２６２】
[0323]ＷＮＴシグナル伝達経路
[0324]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＷＮＴシグナル伝達経路の活性化剤の使用に関する。
【０２６３】
[0325]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、ＣＨＩＲ９９０２１の誘導体、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１の塩、例えば、ＣＨＩＲ９９０２１のトリヒドロクロリド、ヒドロクロリド塩を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、Ｗｎｔ３ａ組換えタンパク質を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤は、グリコーゲン合成酵素キナーゼ３（ＧＳＫ３）阻害剤を含む。例示的なＧＳＫ３阻害剤としては、限定されないが、３Ｆ８、Ａ  １０７０７２２、ＡＲ−Ａ  ０１４４１８、ＢＩＯ、ＢＩＯ−アセトキシム、ＦＲＡＴｉｄｅ、１０Ｚ−ヒメニアルジシン、インディルビン−３’オキシム、ケンパウロン、Ｌ８０３、Ｌ８０３−ｍｔｓ、炭酸リチウム、ＮＳＣ  ６９３８６８、ＳＢ  ２１６７６３、ＳＢ  ４１５２８６、ＴＣ−Ｇ  ２４、ＴＣＳ  ２００２、ＴＣＳ  ２１３１１、ＴＷＳ  １１９、およびこれらのいずれかの類似体または誘導体が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、ＷＮＴシグナル伝達経路活性化剤を除外する。
【０２６４】
[0326]線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）ファミリー
[0327]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＦＧＦファミリーからの成長因子の使用に関する。
【０２６５】
[0328]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの成長因子は、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）を含む。ＫＧＦのポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＫＧＦポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ２１４３１）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２６６】
[0329]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの成長因子は、ＦＧＦ２を含む。ＦＧＦ２のポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ２ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＮＰ＿００１９９７）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２６７】
[0330]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ８Ｂを含む。ＦＧＦ８Ｂのポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ８Ｂポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＢ４０９５４）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２６８】
[0331]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ１０を含む。ＦＧＦ１０のポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ１０ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＣＡＧ４６４８９）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２６９】
[0332]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＦＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＦＧＦ２１を含む。ＦＧＦ２１のポリペプチド配列は、当業者に利用可能である。一部の実施形態では、ＦＧＦファミリーからの成長因子は、ヒトＦＧＦ２１ポリペプチド配列（ＧｅｎＢａｎｋ受託ＡＡＱ８９４４４．１）に対して少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、もしくは少なくとも９９％、またはそれより高い割合で同一であるアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。
【０２７０】
[0333]ソニックヘッジホッグ（ＳＨＨ）シグナル伝達経路
[0334]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤の使用に関する。
【０２７１】
[0335]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、Ｓａｎｔ１を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ２を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ３を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＳＡＮＴ４を含む。一部の実施形態では、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、Ｃｕｒ６１４１４を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、フォースコリンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、トマチジンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、ＡＹ９９４４を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、トリパラノールを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、化合物Ａまたは化合物Ｂを含む（米国特許出願公開第２００４／００６０５６８号に開示されている）。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤は、米国特許出願公開第２００６／０２７６３９１号に開示されているヘッジホッグシグナル伝達にアンタゴナイズするステロイダルアルカロイド（例えば、シクロパミンまたはその誘導体）を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、ＳＨＨシグナル伝達経路阻害剤を除外する。
【０２７２】
[0336]Ｒｈｏキナーゼ（ＲＯＣＫ）シグナル伝達経路
[0337]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＲＯＣＫシグナル伝達経路阻害剤（ＲＯＣＫ阻害剤）の使用に関する。
【０２７３】
[0338]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２またはチアゾビビンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、チアゾビビンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、Ｙ−２７６３２を含む。一部の事例では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、以下の化合物またはその誘導体を含む：
【０２７４】
【化３】
2021516066.tif 000005
【０２７５】
[0339]一部の事例では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＯＣＫ阻害剤は、以下の化合物またはその誘導体を含む：
【０２７６】
【化４】
2021516066.tif 000006
【０２７７】
[0340]本明細書において提供される方法および組成物において使用することができるＲＯＣＫ阻害剤の非限定的な例としては、チアゾビビン、Ｙ−２７６３２、ファスジル/ＨＡ１０７７、Ｈ−１１５２、リパスジル、Ｙ３９９８３、Ｗｆ−５３６、ＳＬｘ−２１１９、アザベンゾイミダゾール−アミノフラザン、ＤＥ−１０４、オレフィン、イソキノリン、インダゾール、およびピリジンアルケン誘導体、ＲＯＫα阻害剤、ＸＤ−４０００、ＨＭＮ−１１５２、４−（１−アミノアルキル）−Ｎ−（４−ピリジル）シクロヘキサン−カルボキサミド、Ｒｈｏｓｔａｔｉｎ、ＢＡ−２１０、ＢＡ−２０７、ＢＡ−２１５、ＢＡ−２８５、ＢＡ−１０３７、Ｋｉ−２３０９５、ＶＡＳ−０１２、ならびにキナゾリンが挙げられる。
【０２７８】
[0341]レチノイン酸シグナル伝達経路
[0342]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのレチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターの使用に関する。
【０２７９】
[0343]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターは、レチノイン酸シグナル伝達の活性化剤を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、レチノイン酸を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＲＡシグナル伝達経路活性化剤は、レチノイン酸受容体アゴニストを含む。本明細書において提供される方法および組成物における例示的なレチノイン酸受容体アゴニストとしては、限定されないが、ＣＤ  １５３０、ＡＭ  ５８０、ＴＴＮＰＢ、ＣＤ  ４３７、Ｃｈ  ５５、ＢＭＳ  ９６１、ＡＣ  ２６１０６６、ＡＣ  ５５６４９、ＡＭ  ８０、ＢＭＳ  ７５３、タザロテン、アダパレン、およびＣＤ  ２３１４が挙げられる。
【０２８０】
[0344]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターは、レチノイン酸シグナル伝達の阻害剤を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、ＤＥＡＢ（ＩＵＰＡＣ名：２−［２−（ジエチルアミノ）エトキシ］３−プロパ−２−エニルベンズアルデヒド）を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、ＤＥＡＢの類似体または誘導体を含む。
【０２８１】
[0345]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるレチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤は、レチノイン酸受容体アンタゴニストを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるレチノイン酸受容体アンタゴニストは、（Ｅ）−４−［２−（５，６−ジヒロド−５，５−ジメチル−８−フェニル−２−ナフタレニル）エテニル］安息香酸、（Ｅ）−４−［［（５，６−ジヒロド−５，５−ジメチル−８−フェニルエチニル）−２−ナフタレニル］エテニル］安息香酸、（Ｅ）−４−［２−［５，６−ジヒロド−５，５−ジメチル−８−（２−ナフタレニル）−２−ナフタレニル］エテニル］−安息香酸、および（Ｅ）−４−［２−［５，６−ジヒロド−５，５−ジメチル−８−（４−メトキシフェニル）−２−ナフタレニル］エテニル］安息香酸を含む。一部の実施形態では、レチノイン酸受容体アンタゴニストは、ＢＭＳ  １９５６１４（ＣＡＳ番号２５３３１０−４２−８）、ＥＲ  ５０８９１（ＣＡＳ番号１８７４００−８５−７）、ＢＭＳ  ４９３（ＣＡＳ番号１７０３５５−７８−９）、ＣＤ  ２６６５（ＣＡＳ番号１７０３５５−７８−９）、ＬＥ  １３５（ＣＡＳ番号１５５８７７−８３−１）、ＢＭＳ  ４５３（ＣＡＳ番号１６６９７７−４３−１）、またはＭＭ  １１２５３（ＣＡＳ番号３４５９５２−４４−５）を含む。
【０２８２】
[0346]ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達のモジュレーターを除外する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達経路活性化剤を除外する。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、レチノイン酸シグナル伝達経路阻害剤を除外する。
【０２８３】
[0347]プロテインキナーゼＣ
[0348]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのプロテインキナーゼＣ活性化剤の使用に関する。プロテインキナーゼＣは、プロテインキナーゼ酵素の最も大きなファミリーのうちの１つであり、種々のアイソフォームから構成される。従来のアイソフォームとしては、ａ、βＩ、βＩＩ、γが挙げられ；新規アイソフォームとしては、δ、ε、η、Θが挙げられ；および非典型的アイソフォームとしては、ξ、およびι／λが挙げられる。ＰＫＣ酵素は、主にサイトゾルであるが、活性化されると膜に移動する。細胞質では、ＰＫＣは、他のキナーゼによってリン酸化されるかまたは自己リン酸化する。活性化されるために、一部のＰＫＣアイソフォーム（例えば、ＰＫＣ−ε）は、ジアシルグリセロール（「ＤＡＧ」）結合部位またはホスファチジルセリン（「ＰＳ」）結合部位に結合するために分子を必要とする。他のものは、いずれの二次的結合メッセンジャーも必要とせず活性化され得る。ＤＡＧ部位に結合するＰＫＣ活性化剤としては、以下に限定されないが、ブリオスタチン、ピコローグ（ｐｉｃｏｌｏｇｕｅ）、ホルボールエステル、アプリシアトキシン、およびグニジマクリンが挙げられる。ＰＳ部位に結合するＰＫＣ活性化剤としては、以下に限定されないが、多価不飽和脂肪酸およびその誘導体が挙げられる。単独でまたは１つまたは複数の他のβ細胞分化因子と組み合わせて、少なくとも１つのインスリンを産生する内分泌細胞またはその前駆体の、ＳＣ−β細胞への分化を誘導することが可能である任意のプロテインキナーゼＣ活性化剤を本明細書に記載の方法、組成物、およびキットにおいて使用することができることが企図される。
【０２８４】
[0349]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化剤は、ＰｄｂＵを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化剤は、ＴＰＢを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ活性化剤は、ＷＩＰＯ公開第ＷＯ／２０１３／０７１２８２号に記載されているように、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸、シクロプロパン化多価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化一価不飽和脂肪アルコール、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸エステル、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸サルフェート、シクロプロパン化多価不飽和脂肪酸ホスフェート、シクロプロパン化一価不飽和脂肪酸ホスフェート、大環状ラクトン、ＤＡＧ誘導体、イソプレノイド、オクチリンドラクタムＶ、グニジマクリン、イリパリダール、インゲノール、ナフタレンスルホンアミド、ジアシルグリセロールキナーゼ阻害剤、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ−１８）、インスリン成長因子、ホルモン、および成長因子活性化剤を含む。一部の実施形態では、ブリオスタチン（ｂｒｙｏｓｔａｉｎ）は、ブリオスタチン−１、ブリオスタチン−２、ブリオスタチン−３、ブリオスタチン−４、ブリオスタチン−５、ブリオスタチン−６、ブリオスタチン−７、ブリオスタチン−８、ブリオスタチン−９、ブリオスタチン−１０、ブリオスタチン−１１、ブリオスタチン−１２、ブリオスタチン−１３、ブリオスタチン−１４、ブリオスタチン−１５、ブリオスタチン−１６、ブリオスタチン−１７、またはブリオスタチン−１８を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、プロテインキナーゼＣ活性化剤を除外する。
【０２８５】
[0350]γ−セクレターゼ阻害剤
[0351]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのγ−セクレターゼ阻害剤の使用に関する。
【０２８６】
[0352]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるγ−セクレターゼ阻害剤は、ＸＸＩを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるγ−セクレターゼ阻害剤は、ＤＡＰＴを含む。本明細書において提供される方法および組成物における追加の例示的なγ−セクレターゼ阻害剤としては、限定されないが、米国特許第７，０４９，２９６号、同第８，４８１，４９９号、同第８，５０１，８１３号、およびＷＩＰＯ公開第ＷＯ／２０１３／０５２７００号に記載のγ−セクレターゼ阻害剤が挙げられる。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、γ−セクレターゼ阻害剤を除外する。
【０２８７】
[0353]甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤
[0354]本開示の態様は、β細胞分化因子としての甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤の使用に関する。
【０２８８】
[0355]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、トリヨードチロニン（Ｔ３）を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、ＧＣ−１を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３またはＧＣ−１の類似体または誘導体を含む。本明細書において提供される方法および組成物におけるＴ３の例示的な類似体としては、以下に限定されないが、選択的および非選択的甲状腺ホルモン模倣物（ｔｈｙｒｏｍｉｍｅｔｉｃ）、ＴＲβ選択的アゴニスト−ＧＣ−１、ＧＣ−２４、４−ヒドロキシ−ＰＣＢ  １０６、ＭＢ０７８１１、ＭＢ０７３４４，３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）；選択的ＴＲ−βアゴニスト  ＧＣ−１；３−ヨードチロナミン（Ｔ（１）ＡＭ）および３，３’，５−トリヨードサイロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（ホルモンチロキシンの生物活性代謝産物（Ｔ（４））；ＫＢ−２１１５およびＫＢ−１４１；チロナミン；ＳＫＦ  Ｌ−９４９０１；ＤＩＢＩＴ；３’−ＡＣ−Ｔ２；テトラヨードサイロ酢酸（Ｔｅｔｒａｃ）およびトリヨードサイロ酢酸（Ｔｒｉａｃ）（チロキシン［Ｔ４］およびトリヨードチロニン［Ｔ３］アラニン鎖の酸化的脱アミノ化および脱炭酸化による）、３，３’，５’−トリヨードチロニン（ｒＴ３）（Ｔ４およびＴ３脱ヨウ素化による）、３，３’−ジヨードチロニン（３，３’−Ｔ２）および３，５−ジヨードチロニン（Ｔ２）（Ｔ４、Ｔ３、およびｒＴ３脱ヨウ素化による）、および３−ヨードチロナミン（Ｔ１ＡＭ）およびチロナミン（Ｔ０ＡＭ）（Ｔ４およびＴ３脱ヨウ素化およびアミノ酸脱炭酸化による）、ならびにＴＨの構造的類似体として、例えば、３，５，３’−トリヨードチロプロピオン酸（Ｔｒｉｐｒｏｐ）、３，５−ジブルモ−３−ピリダジノン−１−チロニン（Ｌ−９４０９０１）、Ｎ−［３，５−ジメチル−４−（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルフェノキシ）−フェニル］−オキサミン酸（ＣＧＳ  ２３４２５）、３，５−ジメチル−４−［（４’−ヒドロキシ−３’−イソプロピルベンジル）−フェノキシ］酢酸（ＧＣ−１）、３，５−ジクロロ−４−［（４−ヒドロキシ−３−イソプロピルフェノキシ）フェニル］酢酸（ＫＢ−１４１）、および３，５−ジヨードチロプロピオン酸（ＤＩＴＰＡ）が挙げられる。
【０２８９】
[0356]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、Ｔ３のプロドラッグまたはプロホルモン、例えば、Ｔ４甲状腺ホルモン（例えば、チロキシンまたはＬ−３，５，３’，５’−テトラヨードチロニン）を含む。
【０２９０】
[0357]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物における甲状腺ホルモンシグナル伝達経路活性化剤は、米国特許第７，１６３，９１８号に記載されているヨードチロニン組成物である。
【０２９１】
[0358]上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）ファミリー
[0359]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのＥＧＦファミリーからの成長因子の使用に関する。
【０２９２】
[0360]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ベータセルリンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＥＧＦを含む。上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）は、大きな膜内在性タンパク質前駆体からタンパク質分解によって切断された５３アミノ酸のサイトカインである。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの成長因子は、バリアントＥＧＦポリペプチド、例えば、米国特許第７，０８４，２４６号に開示されているように、ヒト野生型ＥＧＦポリペプチド配列に対して少なくとも９０％のアミノ酸同一性を有する単離された上皮細胞成長因子ポリペプチドを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの成長因子は、米国特許第８，２４７，５３１号に開示されているように、ＥＧＦ受容体に結合し、これをアゴナイズする、操作されたＥＧＦ突然変異体を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの少なくとも１つの成長因子は、ＥＧＦファミリーのシグナル伝達経路を活性化する薬剤と置き換えられる。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＥＧＦファミリーからの成長因子は、ＥＧＦを模倣する化合物を含む。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、ＥＧＦファミリーからの成長因子を除外する。
【０２９３】
[0361]プロテインキナーゼ阻害剤
[0362]本開示の態様は、β細胞分化因子としてのプロテインキナーゼ阻害剤の使用に関する。
【０２９４】
[0363]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンを含む。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、スタウロスポリンの類似体を含む。本明細書において提供される方法および組成物におけるスタウロスポリンの例示的な類似体としては、限定されないが、Ｒｏ−３１−８２２０、ビスインドリルマレイミド（Ｂｉｓ）化合物、１０’−｛５”−［（メトキシカルボニル）アミノ］−２”−メチル｝−フェニルアミノカルボニルスタウロスポリン、スタラログ（ｓｔａｒａｌｏｇ）（例えば、Ｌｏｐｅｚら、「Ｓｔａｕｒｏｓｐｏｒｉｎｅ−ｄｅｒｉｖｅｄ  ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ  ｂｒｏａｄｅｎ  ｔｈｅ  ｓｃｏｐｅ  ｏｆ  ａｎａｌｏｇ−ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ  ｋｉｎａｓｅ  ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ」、Ｊ．  Ａｍ．  Ｃｈｅｍ．  Ｓｏｃ．  ２０１３年；１３５（４８）：１８１５３〜１８１５９頁を参照されたい。）、およびｃｇｐ４１２５１が挙げられる。
【０２９５】
[0364]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、ＰＫＣβの阻害剤である。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるプロテインキナーゼ阻害剤は、以下の構造を有するＰＫＣβの阻害剤、または以下のような化合物の誘導体、類似体もしくはバリアントである：
【０２９６】
【化５】
2021516066.tif 000007
【０２９７】
[0365]一部の実施形態では、ＰＫＣβの阻害剤は、以下の構造を有するＧＳＫ−２化合物または以下のような化合物の誘導体、類似体もしくはバリアントである：
【０２９８】
【化６】
2021516066.tif 000008
【０２９９】
[0366]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣの阻害剤は、ビスインドリルマレイミドである。例示的なビスインドリルマレイミドとしては、限定されないが、ビスインドリルマレイミドＩ、ビスインドリルマレイミドＩＩ、ビスインドリルマレイミドＩＩＩ、ヒドロクロリド、またはその誘導体、類似体もしくはバリアントが挙げられる。
【０３００】
[0367]一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ阻害剤は、シュードヒペリシン、またはその誘導体、類似体、もしくはバリアントである。一部の実施形態では、本明細書において提供される方法および組成物におけるＰＫＣ阻害剤は、インドルビン−３−モノオキシム（ｉｎｄｏｒｕｂｌｉｎ−３−ｍｏｎｏｘｉｍｃ）、５−ヨードまたはその誘導体、類似体、もしくはバリアントである。ある特定の実施形態では、本明細書に開示されている方法、組成物、およびキットは、プロテインキナーゼ阻害剤を除外する。
ＶＩＩ．ＳＣ−β細胞
[0368]本開示のＳＣ−β細胞は、正常なβ細胞の機能に重要であるβ細胞の多くの特徴的な特徴を共有する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで、グルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、ｉｎ  ｖｉｖｏで、ＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏおよびｉｎ  ｖｉｖｏでのＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、内因性成熟膵β細胞のＧＳＩＳ応答に似ている。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、少なくとも１つのグルコースチャレンジに対するＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、少なくとも２つの連続的グルコースチャレンジに対するＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、少なくとも３つの連続的グルコースチャレンジに対するＧＳＩＳ応答を呈する。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、複数のグルコースチャレンジに対する内因性ヒト膵島のＧＳＩＳ応答に似ている。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、細胞をヒトまたは動物へと移植した直後に観察される。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、細胞をヒトまたは動物へと移植してからおよそ２４時間以内に観察される。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、細胞をヒトまたは動物へと移植してからおよそ１週間以内に観察される。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ応答は、細胞をヒトまたは動物へと移植してからおよそ２週間以内に観察される。一部の実施形態では、低いグルコース濃度と比較して、高いグルコース濃度に応答して分泌されるインスリンの比率によって特徴付けられる細胞の刺激指数は、内因性成熟膵β細胞の刺激指数に類似している。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１より大きい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１より大きいかまたは１に等しい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１．１より大きい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１．１より大きいかまたは１．１に等しい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、２より大きい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、１より大きいかまたは１に等しい刺激指数を呈する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、少なくとも２．１、２．２、２．３、２．４、２．５、２．６、２．７、２．８、２．９、３．０、３．１、３．２、３．３、３．４、３．５、３．６、３．７、３．８、３．９、４．０、４．１、４．２、４．３、４．４、４．５、４．６、４．７、４．８、４．９、もしくは５．０またはそれより大きい刺激指数を呈する。
【０３０１】
[0369]本開示の一部の実施形態は、ＳＣ−β細胞を含む細胞培養物または細胞集団などの細胞組成物であって、ＳＣ−β細胞が、少なくとも１種のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体に由来している細胞組成物に関する。一部の実施形態では、細胞組成物は、インスリン陽性内分泌細胞を含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＮＫＸ６．１膵前駆細胞を含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、ＰＤＸ１膵前駆細胞を含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、原腸管細胞を含む。一部の実施形態では、細胞組成物は、胚体内胚葉細胞を含む。
【０３０２】
[0370]ある特定の実施形態に従って、化学的に誘導されたＳＣ−β細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、このようなＳＣ−β細胞はヒトＳＣ−β細胞である。一部の実施形態では、インスリン陽性内分泌細胞は、胚体内胚葉細胞、例えば、ヒト胚体内胚葉幹細胞に由来している。ある特定の実施形態に従って、化学的に誘導されたＰＤＸ１陽性膵前駆細胞は哺乳動物細胞であり、好ましい実施形態では、このようなＰＤＸ１陽性膵前駆細胞はヒトＰＤＸ１陽性膵前駆細胞である。
【０３０３】
[0371]本開示の他の実施形態は、本明細書に開示されている方法によって産生されたＳＣ−β細胞を含む単離された細胞集団または細胞培養物などの組成物に関する。本開示の一部の実施形態は本明細書に開示されている方法によって産生された化学的に誘導されたＳＣ−β細胞を含む単離された細胞集団または細胞培養物などの組成物に関する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、ＳＣ−β細胞集団における全細胞の約９０％未満、約８５％未満、約８０％未満、約７５％未満、約７０％未満、約６５％未満、約６０％未満、約５５％未満、約５０％未満、約４５％未満、約４０％未満、約３５％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１２％未満、約１０％未満、約８％未満、約６％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満を含む。一部の実施形態では、組成物は、細胞集団における全細胞の約９０％超、例えば、ＳＣ−β細胞である細胞集団における全細胞の少なくとも約９５％、または少なくとも９６％、または少なくとも９７％、または少なくとも９８％または少なくとも約９９％、または少なくとも約１００％を構成するＳＣ−β細胞の集団を含む。
【０３０４】
[0372]本開示のある特定の他の実施形態は、ＳＣ−β細胞とインスリン陽性内分泌細胞またはＳＣ−β細胞が由来するその前駆体の組合せを含む、単離された細胞集団または細胞培養物などの組成物に関する。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞が由来するインスリン陽性内分泌細胞は、単離された細胞集団または培養物における全細胞の約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約４％未満、約３％未満、約２％未満または約１％未満を含む。
【０３０５】
[0373]本開示の追加の実施形態は、本明細書に記載のプロセスによって産生され、大多数の細胞型として化学的に誘導されたＳＣ−β細胞を含む、単離された細胞集団または細胞培養物などの組成物に関する。一部の実施形態では、本明細書に記載の方法およびプロセスは、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９７％、少なくとも約９６％、少なくとも約９５％、少なくとも約９４％、少なくとも約９３％、少なくとも約９２％、少なくとも約９１％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８７％、少なくとも約８６％、少なくとも約８５％、少なくとも約８４％、少なくとも約８３％、少なくとも約８２％、少なくとも約８１％、少なくとも約８０％、少なくとも約７９％、少なくとも約７８％、少なくとも約７７％、少なくとも約７６％、少なくとも約７５％、少なくとも約７４％、少なくとも約７３％、少なくとも約７２％、少なくとも約７１％、少なくとも約７０％、少なくとも約６９％、少なくとも約６８％、少なくとも約６７％、少なくとも約６６％、少なくとも約６５％、少なくとも約６４％、少なくとも約６３％、少なくとも約６２％、少なくとも約６１％、少なくとも約６０％、少なくとも約５９％、少なくとも約５８％、少なくとも約５７％、少なくとも約５６％、少なくとも約５５％、少なくとも約５４％、少なくとも約５３％、少なくとも約５２％、少なくとも約５１％または少なくとも約５０％のＳＣ−β細胞を含む、単離された細胞培養物および／または細胞集団を産生する。
【０３０６】
[0374]別の実施形態では、単離された細胞集団または細胞（または細胞培養物）の組成物は、ヒトＳＣ−β細胞を含む。他の実施形態では、本明細書に記載されている方法およびプロセスは、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％のＳＣ−β細胞を含む単離された細胞集団を産生し得る。好ましい実施形態では、単離された細胞集団は、ヒトＳＣ−β細胞を含み得る。一部の実施形態では、細胞培養物または集団におけるＳＣ−β細胞のパーセンテージは、培養物中に残っているフィーダー細胞に関係なく計算される。
【０３０７】
[0375]本開示のさらに別の態様は、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％のＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む、細胞集団または細胞（または細胞培養物）の組成物に関する。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約２０％のＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約４０％のＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約５０％のＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約１７．９％のＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約４１．５％のＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約５０．６％のＮＫＸ６．１＋／Ｃ−ペプチド＋細胞を含む。
【０３０８】
[0376]一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％のＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約４０％のＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約６０％のＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約８５％のＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約３６．９％のＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約６３．４％のＮＫＸ６．１＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約８９．５％のＮＫＸ６．１＋細胞を含む。
【０３０９】
[0377]一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％のＣ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約３０％のＣ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約５５％のＣ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約２６．８％のＣ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約５７．７％のＣ−ペプチド＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約５５．２％のＣ−ペプチド＋細胞を含む。
【０３１０】
[0378]一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約９９％、少なくとも約９８％、少なくとも約９５％、少なくとも約９０％、少なくとも約８９％、少なくとも約８８％、少なくとも約８５％、少なくとも約８０％、少なくとも約７５％、少なくとも約７０％、少なくとも約６５％、少なくとも約６０％、少なくとも約５５％、少なくとも約５０％、少なくとも約４５％、少なくとも約４０％、少なくとも約３５％、少なくとも約３０％、少なくとも約２５％、少なくとも約２４％、少なくとも約２３％、少なくとも約２２％、少なくとも約２１％、少なくとも約２０％、少なくとも約１９％、少なくとも約１８％、少なくとも約１７％、少なくとも約１６％、少なくとも約１５％、少なくとも約１４％、少なくとも約１３％、少なくとも約１２％、少なくとも約１１％、少なくとも約１０％、少なくとも約９％、少なくとも約８％、少なくとも約７％、少なくとも約６％、少なくとも約５％、少なくとも約４％、少なくとも約３％、少なくとも約２％または少なくとも約１％のクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約４０％のＣＨＧＡ＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約８５％のＣＨＧＡ＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、少なくとも約９５％のＣＨＧＡ＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約３７．７％のＣＨＧＡ＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約８７．５％のＣＨＧＡ＋細胞を含む。一部の実施形態では、本明細書において提供されるような細胞集団または細胞の組成物は、約９６．４％のＣＨＧＡ＋細胞を含む。
【０３１１】
[0379]本開示のさらなる他の実施形態は、ＳＣ−β細胞およびインスリン陽性内分泌細胞またはそれらが分化されるその前駆体の混合物を含む、単離された細胞集団または細胞培養物などの組成物に関する。例えば、約９５個毎のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体に対して少なくとも約５個のＳＣ−β細胞を含む細胞培養物または細胞集団が産生され得る。他の実施形態では、約５個毎のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体に対して少なくとも約９５個のＳＣ−β細胞を含む細胞培養物または細胞集団が産生され得る。さらに、他の比率のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体に対するＳＣ−β細胞を含む細胞培養物または細胞集団が企図される。例えば、約１，０００，０００個毎、または少なくとも１００，０００個の細胞、または少なくとも１０，０００個の細胞、または少なくとも１０００個の細胞または５００個、もしくは少なくとも２５０個もしくは少なくとも１００個もしくは少なくとも１０個のインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体に対して少なくとも約１個のＳＣ−β細胞を含む組成物を生成することができる。
【０３１２】
[0380]一部の態様では、本開示は、少なくとも約５０％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞、最大約３０％、２８％、２６％、２５％、２４％、２２％、２０％、１８％、１６％、１４％、１２％、１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、または２％のクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞、および最大約３０％、２８％、２６％、２５％、２４％、２２％、２０％、１８％、１６％、または１５％のＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞クラスターを提供する。一部の事例では、細胞クラスターは、最大約２０％のＣＤＸ２陽性、ＮＫＸ６．１陽性の細胞を含む。一部の事例では、細胞クラスターは、最大約５％のＣＨＧＡ陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、最大約２０％のＣＤＸ２陽性、ＮＫＸ６．１陽性の細胞および最大約５％のＣＨＧＡ陽性細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも約６０％、６２％、６４％、６５％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、９０％、９２％、または９５％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも約６５％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む。
【０３１３】
[0381]一部の実施形態では、少なくとも約５０％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞、最大約３０％のクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞、および最大約３０％のＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞クラスターは、約３０％を超えるクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞または約３０％を超えるＣＤＸ２陽性細胞を有する同等の細胞クラスターと比較して、特定の機能的特徴を有し得る。例えば、一部の事例では、少なくとも約５０％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞、最大約３０％のクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞、および最大約３０％のＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞クラスターのさらなる分化により、フローサイトメトリーによって測定して、少なくとも約５０％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞、および３０％を超えるクロモグラニンＡ（ＣＨＧＡ）陽性細胞または３０％を超えるＣＤＸ２陽性細胞を含む同等の細胞クラスターから分化した非天然膵β細胞を含む第２の細胞クラスターより高いグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を有する非天然膵β細胞を含む第１の細胞クラスターが得られる。
【０３１４】
[0382]一部の態様では、本開示は、少なくとも約６０％、６２％、６４％、６５％、６８％、７０％、７２％、７４％、７６％、７８％、８０％、８２％、８４％、８６％、８８％、または９０％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞および最大約４０％、３８％、３６％、３４％、３２％、３０％、２８％、２６％、２５％、２４％、２２％、２０％、１８％、１６％、１５％、１４％、１２％、または１０％のＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞クラスターを提供する。一部の実施形態では、細胞クラスターは、少なくとも約８５％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を含む。一部の実施形態では、細胞クラスターは、最大約１５％のＣＤＸ２陽性細胞を含む。一部の事例では、細胞クラスターは、少なくとも約８５％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞および最大約１５％のＣＤＸ２陽性細胞を含む。
【０３１５】
[0383]一部の実施形態では、少なくとも約６０％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞および最大約４０％のＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞クラスターは、約４０％を超えるＣＤＸ２陽性細胞を有する同等の細胞クラスターと比較して、特定の機能的特徴を有し得る。例えば、一部の事例では、少なくとも約６０％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞および最大約４０％のＣＤＸ２陽性細胞を含む細胞クラスターのさらなる分化により、フローサイトメトリーによって測定して、少なくとも約６０％のＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞および４０％を超えるＣＤＸ２陽性細胞を含む同等の細胞クラスターから分化した非天然膵β細胞を含む第２の細胞クラスターより高いグルコース刺激インスリン分泌（ＧＳＩＳ）刺激指数を有する非天然膵β細胞を含む第１の細胞クラスターが得られる。
【０３１６】
[0384]一部の態様では、本開示は、非天然膵β細胞を含む細胞クラスターを提供する。一部の実施形態では、本明細書に開示されている細胞クラスターは、原腸管細胞を骨形成タンパク質（ＢＭＰ）シグナル伝達経路阻害剤および形質転換成長因子β（ＴＧＦ−β）スーパーファミリーからの成長因子と接触させることによって原腸管細胞の分化から得られる。一部の実施形態では、細胞クラスターは、接触させることなく原腸管細胞の分化から得られた同等の第２の細胞クラスターと比較して、より数の多い、１立方マイクロメートル当たりの非天然膵β細胞を有する。一部の実施形態では、細胞クラスターは、同等の第２の細胞クラスターと比較して、少なくとも約１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、または１．６倍数の多い、１立方マイクロメートル当たりの非天然膵β細胞を有する。
【０３１７】
[0385]一部の事例では、本明細書に開示されている非天然膵β細胞を含む細胞クラスターは、ＢＭＰシグナル伝達経路阻害剤またはＴＧＦ−βファミリーからの成長因子と接触させることなく原腸管細胞の分化から得られた同等の細胞クラスターと比較して、グルコースチャレンジに応答してより高いインスリン分泌を呈する。一部の実施形態では、細胞クラスターは、同等の第２の細胞クラスターと比較して、少なくとも約１．２、１．５、２、２．５、３、３．５、４、４．５、または５倍高いインスリン分泌を呈する。一部の実施形態では、細胞クラスターは、同等の第２の細胞クラスターと比較して、より高いＧＳＩＳ刺激指数を呈する。一部の実施形態では、細胞クラスターのＧＳＩＳ刺激指数は、第２の細胞クラスターのものよりも、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２．２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、または少なくとも約３倍高い。一部の実施形態では、細胞クラスターのＧＳＩＳ刺激指数は、第２の集団のものよりも、少なくとも約３倍高い。一部の実施形態では、ＧＳＩＳ刺激指数は、２ｍＭのグルコースチャレンジに応答したインスリン分泌に対する２０ｍＭのグルコースチャレンジに応答したインスリン分泌の比率として計算される。一部の実施形態では、非天然膵β細胞は、グルコースチャレンジに曝露された場合に、ｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する。一部の事例では、非天然膵β細胞は、第１の濃度のＫ＋に応答したインスリン分泌を呈する。一部の実施形態では、細胞クラスターは、第１の濃度のＫ＋に応答した同等の第２の細胞クラスターと比較して、より高いインスリン分泌を呈する。一部の実施形態では、細胞クラスターは、第１の濃度のＫ＋に応答した同等の第２の細胞クラスターと比較して、少なくとも約１．２倍、少なくとも約１．５倍、少なくとも約１．８倍、少なくとも約２倍、少なくとも約２.２倍、少なくとも約２．４倍、少なくとも約２．８倍、少なくとも約３倍、少なくとも約３．２倍、少なくとも約３．４倍、少なくとも約３．６倍、少なくとも約３．８倍、少なくとも約４倍高いインスリン分泌を呈する。
【０３１８】
[0386]一部の事例では、本明細書に開示されている細胞集団または細胞クラスター、例えば、細胞選別プロセスを介さずに単離された細胞集団または細胞クラスターは、選別されていない。一部の実施形態では、本明細書に開示されている細胞クラスターは、所与の環境、例えば、３Ｄ懸濁液培養で培養された細胞の自己凝集によって形成された細胞クラスターを指し得る。一部の実施形態では、本明細書に開示されている細胞クラスターは、本明細書に記載されているように、分化プロセスの間に形成された中間体細胞クラスターである。一部の事例では、中間体細胞クラスター、例えば、Ｐｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陰性の膵前駆細胞を含む細胞クラスター（例えば、ステージ３の細胞クラスター）またはＰｄｘ１陽性、ＮＫＸ６．１陽性の膵前駆細胞を含む細胞クラスター（例えば、ステージ４の細胞クラスター）を含む細胞クラスターは、細胞選別に供されない。一部の事例では、細胞選別を経た細胞集団は、本明細書に開示されている中間体細胞クラスターを形成することができない。例えば、細胞選別を経た後の、Ｐｄｘ１陽性膵前駆細胞は、本明細書に開示されている細胞クラスターを形成することができない場合がある。
【０３１９】
[0387]本明細書に記載されている細胞選別は、細胞のサイズ、形状（形態）、表面タンパク質発現、内因性シグナルタンパク質の発現、またはこれらの任意の組合せにおける差に依拠することによって、複数の細胞から１群の細胞を単離するプロセスを指し得る。一部の事例では、細胞選別は、細胞をフローサイトメトリーに供することを含む。フローサイトメトリーは、レーザーまたはインピーダンスに基づく生物物理学的技術であり得る。フローサイトメトリーの間に、細胞を、流体流に懸濁させ、電子検出装置を通過させることができる。フローサイトメトリーの１種である、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）では、細胞の光学特性（例えば、レーザー励起時の発光波長）のうちの１つまたは複数のパラメーターに基づいて、物理的に分離し、それによって、フローサイトメトリーを使用して目的の細胞を精製することができる。本明細書に記載されているように、選別されていない細胞クラスターは、活性細胞選別プロセス、例えば、フローサイトメトリーに供されていない複数の細胞によって形成された細胞クラスターであり得る。一部の事例では、本明細書で議論されているフローサイトメトリーは、細胞内で発現される１つまたは複数のシグナルペプチドに基づき得る。例えば、細胞クラスターは、シグナルペプチド（例えば、蛍光タンパク質、例えば、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）またはｔｄＴｏｍａｔｏ）を発現する細胞を含むことができる。一部の事例では、シグナルペプチドは、細胞内のインスリン発現のインジケーターとして発現される。例えば、細胞クラスターは、インスリンプロモーターの制御下で、ＧＦＰをコードする外因性核酸配列を有する細胞を含むことができる。インスリンプロモーターは、内因性または外因性プロモーターであり得る。一部の事例では、これらの細胞内でのＧＦＰの発現は、細胞内でのインスリン発現を示すことができる。よって、ＧＦＰシグナルは、膵β細胞のマーカーであり得る。一部の事例では、本明細書に記載されている細胞選別は、磁気抗体または他のリガンドを使用して異なる種類の細胞を標識し、磁気特性の差を細胞選別について使用することができる、磁気活性化フローサイトメトリーを含み得る。
【０３２０】
[0388]本明細書に記載のＰｄｘ１、ＮＫＸ６．１、インスリン、ＮＧＮ３、またはＣＨＧＡのような１つまたは複数の特定のマーカーを発現する細胞のパーセンテージは、フローサイトメトリーアッセイのような技法を使用して検出したパーセンテージの値であり得る。一部の事例では、フローサイトメトリーアッセイの間に、本明細書で議論された細胞集団または細胞クラスターは、トリプシンまたはＴｒｙｐＬＥ（商標）Ｅｘｐｒｅｓｓのような消化酵素中でのインキュベーションによって、単細胞懸濁液中に分散される。分散された細胞は、ＰＢＳのような好適な緩衝液中で洗浄され、遠心分離され、次いで、４％のＰＦＡのような固定緩衝液中に再懸濁され得る。次いで、目的の細胞マーカーに対する一次抗体とのインキュベーションを行うことができ、その後、二次抗体と共にインキュベートすることができる。抗体のインキュベーション後に、細胞を洗浄し、フローサイトメトリーによる分離に供することができる。フローサイトメトリー以外の技法を使用して、本明細書に記載の細胞を特徴付ける、例えば、細胞のパーセンテージを決定することもできる。細胞の特徴付けの方法の非限定的な例としては、遺伝子のシーケンシング、顕微鏡技法（蛍光顕微鏡、原子力顕微鏡）、核型分析、イソ酵素分析、ＤＮＡ特性、ウイルス感受性が挙げられる。
【０３２１】
[0389]一部の態様では、本開示は、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団を含む組成物であって、細胞が、グルコースで誘導した際に分泌されるインスリンの量と比較して、ＫＣｌ（例えば、約２０〜約５０ｍＭ、例えば、約３０ｍＭ）で誘導した際により多量のインスリンを分泌する、組成物に関する。一部の実施形態では、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団は、グルコースで誘導した際に分泌されるインスリンの量と比較して、ＫＣｌで誘導した際に、少なくとも１．５倍、２倍、２．５倍、３倍多量のインスリンを分泌する。
【０３２２】
[0390]一部の態様では、本開示は、グルコース応答性インスリン分泌細胞の集団を含む組成物であって、細胞が、シグナル伝達因子の非存在下における同等の細胞と比較して、シグナル伝達因子の存在下ので、ＫＣｌおよび／またはグルコースで誘導した際により多量のインスリンを分泌する、組成物に関する。一部の実施形態では、細胞は、高グルコースの存在下でより多量のインスリンを分泌するが、低グルコースの存在下では分泌しない。一部の実施形態では、高グルコース濃度は、約１０〜２０ｍＭである。一部の実施形態では、低グルコース濃度は、約２〜５ｍＭである。
【０３２３】
[0391]一部の態様では、本開示は、分化した膵前駆細胞の集団を含む組成物であって、集団が、フローサイトメトリーによって決定して、少なくとも６０％の膵β細胞を含む、組成物に関する。一部の実施形態では、集団は、少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、または９０％の膵β細胞を含む。一部の実施形態では、集団は、基本培地の構成成分と接触していない同等の集団と比較して、所定の基本培地の構成成分と接触した際に、より高いパーセンテージの膵β細胞を含む。
【０３２４】
[0392]本明細書に記載の本開示の方法に従って産生された、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟した、ＳＣ−β細胞（例えば、膵β細胞）は、多くの利点を実証し、例えば、ｉｎ  ｖｉｔｒｏでのグルコース刺激インスリン分泌を実施し、遺伝子発現と超微細構造によってヒト膵島β細胞に似ており、マウスへと移植された場合にヒトインスリンを分泌し、高血糖症を改善し、細胞療法に対する新たなプラットフォーム（例えば、追加のおよび／または機能的β細胞を必要とする対象への移植）、薬物スクリーニング（例えば、インスリン産生／分泌、生存、脱分化など）、研究（例えば、正常なβ細胞と糖尿病のβ細胞の間の機能の差を決定すること）、および組織工学（例えば、膵島を再構築する際に第１の細胞型としてＳＣ−β細胞を使用すること）を提供する。
ＶＩＩＩ．増殖を低減する方法
[0393]本明細書に記載の方法に従って産生されるＳＣ−β細胞の細胞集団において増殖を低減するための方法が本明細書において提供される。方法は、内分泌細胞を含むｉｎ  ｖｉｔｒｏ細胞集団に照射するステップを含む。一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団の照射は、約１００ｒａｄ〜約１００，０００ｒａｄの線量で約１分〜約６０分の時間である。
【０３２５】
[0394]一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団の照射は、約１００ｒａｄ〜約５０，０００ｒａｄ、約１００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約１００ｒａｄ〜約１０，０００ｒａｄ、約２５０ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約５００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約１，０００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約２，５００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、約５，０００ｒａｄ〜約２５，０００ｒａｄ、または約１０，０００ｒａｄ〜約１５，０００ｒａｄの線量である。一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団の照射は、約１０，０００ｒａｄの線量である。一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団の照射は、約１分〜約５５分、約１分〜約５０分、約１分〜約４５分、約１分〜約４０分、約１分〜約３５分、約１分〜約３０分、約１分〜約２５分、約１分〜約２０分、約１分〜約１０分、約１分〜約５分、約１０分〜約５５分、約１５分〜約５５分、約２０分〜約５５分、約２５分〜約５５分、約３０分〜約５５分、約２０分〜約４０分、または約２５分〜約３５分の間行われる。一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団の照射は、約３０分間である。
【０３２６】
[0395]本明細書で使用される場合、照射は、イオン化照射を指し得る。これは、細胞集団を、ガンマ線、ｘ線、紫外線放射、アルファ線、ベータ線（電子線）、または中性子線に曝露することによって行われ得る。ある特定の理論に拘束されることを望むものではないが、イオン化照射は、細胞のＤＮＡに損傷を与えること、例えば、細胞を増殖させることによって細胞成長を、かつ結果として細胞死を制御し得る。一部の事例では、本明細書に記載されているように、照射に供された内分泌細胞を含む細胞集団は、照射に供されていない対応する細胞集団と比較して、より小さい割合の増殖の可能な細胞または増殖細胞を有する。一部の事例では、照射に曝露されていない対応する細胞集団と比較して、照射に曝露された内分泌細胞を含む細胞集団では、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、２２０％、２５０％、２８０％、３００％、３２０％、３５０％、３８０％、４００％、４２０％、４５０％、４８０％、または５００％小さい割合の増殖の可能な細胞または増殖細胞が存在する。
【０３２７】
[0396]一部の事例では、本明細書において提供される方法は、膵分化の間に、幹細胞、胚体内胚葉細胞、原腸管細胞、膵前駆細胞、または内分泌細胞を含む細胞集団を照射に曝露するステップを含む。一部の事例では、照射によって、照射に供されていない対応する細胞集団と比較して、増殖能力の低下した細胞集団が得られる。
【０３２８】
[0397]一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団は、本明細書において提供される分化方法のいずれかによって得られる細胞集団である。一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団は、本明細書において提供される段階的分化方法によって得られる細胞集団である。一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団は、分化プロトコールのステージ６の細胞集団である。一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団は、ステージ６の１日目（Ｓ６ｄ１）、Ｓ６ｄ２、Ｓ６ｄ３、Ｓ６ｄ４、Ｓ６ｄ５、Ｓ６ｄ６、またはＳ６ｄ７の細胞集団である。一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団は、凍結保存から解凍され回収された細胞集団である。一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団は、照射に曝露されている間、凍結保存されている。内分泌細胞を含む細胞集団は、本明細書に記載されているように、照射に曝露された後に膵β細胞へとさらに分化するために、解凍および回収され得る。
【０３２９】
[0398]一部の事例では、内分泌細胞を含む細胞集団は、膵β細胞を含む細胞集団へとさらに分化／成熟されてもよく、照射に対する同一の曝露を受けない対応する細胞集団と比較して、より小さい割合の増殖の可能な細胞または増殖細胞を有し得る。一部の事例では、照射に曝露されていない対応する細胞集団と比較して、内分泌を含む照射された細胞集団から得られた膵β細胞を含む細胞集団において、少なくとも約１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１２０％、１５０％、１８０％、２００％、２２０％、２５０％、２８０％、３００％、３２０％、３５０％、３８０％、４００％、４２０％、４５０％、４８０％、または５００％小さい割合の増殖の可能な細胞または増殖細胞が存在する。
【０３３０】
[0399]一部の事例では、内分泌を含む照射された細胞集団から得られた膵β細胞を含む細胞集団は、それを必要とする対象に移植される。膵β細胞を含む細胞集団は、対象における血中グルコースレベルを制御する助けとなり得る。一部の事例では、内分泌を含む照射された細胞集団から得られた膵β細胞を含む細胞集団は、対象において少なくとも約５０日、６０日、７０日、８０日、９０日、またはさらに長い間、血中グルコース制御を維持することができる。一部の事例では、内分泌を含む照射された細胞集団から得られた膵β細胞を含む細胞集団は、対象において６０日間、血中グルコース制御を維持することができる。一部の事例では、内分泌を含む照射された細胞集団から得られた膵β細胞を含む細胞集団は、対象において９０日間、血中グルコース制御を維持することができる。
ＩＸ．幹細胞由来ベータ細胞を濃縮する方法
[0400]ＳＣ−β細胞およびインスリン陽性内分泌細胞またはＳＣ−β細胞が由来するその前駆体を含む細胞の混合集団などの、細胞の異種集団由来のＳＣ−β細胞の集団を単離する方法が本明細書において提供される。上記プロセスのいずれかによって産生されたＳＣ−β細胞の集団を、いずれかの細胞表面マーカー、例えば、ＳＣ−β細胞上に存在する（インスリン陽性内分泌細胞またはそれが由来するその前駆体上に存在しない）ポリシアル化神経細胞接着分子（ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）を使用することによって、濃縮、単離および／または精製することができる。このような細胞表面マーカーは、ＳＣ−β細胞に対して特異的であるアフィニティータグとも称される。
【０３３１】
[0401]一部の実施形態では、細胞表面マーカーは、誘導性細胞表面マーカーである。例えば、ＰＳＡ−ＮＣＡＭは、ある特定のシグナルによって表面に誘導され得る。様々な種類の内分泌細胞は、様々なシグナルに応答することができる。一部の実施形態では、ＰＳＡ−ＮＣＡＭは、酵素、例えば、エンドノイラミニダーゼまたはエンドＮによって表面から選択的に切断され得る。エンドＮは、ＮＣＡＭに関連するシアル酸残基の最小長７〜９残基の特徴を有する、αー２，８−結合を含むシアル酸の線状ポリマーを迅速かつ特異的に分解するエンドシアリダーゼである。
細胞選別
[0402]本明細書において提供される方法は、内分泌細胞の第１の集団および内分泌細胞の第２の集団を含む細胞組成物であって、内分泌細胞の第１の集団の低減した割合の集団が、内分泌細胞の第２の集団と比較して、ＶＭＡＴ＋またはＣｄｘ２＋を発現する、組成物に関する。一部の実施形態では、内分泌細胞の第１および第２の集団は、グルコースおよび幹細胞（ｈＰＳＣまたはＥＣ）によって誘導され得るベータ細胞を含む。一部の実施形態では、幹細胞は、イソプロテレノールによって誘導される。一部の実施形態では、細胞集団は、誘導されたインスリン産生ベータ細胞および非インスリン産生細胞である細胞の混合物を含む。一部の実施形態では、ＰＳＡ−ＮＣＡＭは、「白紙状態」を創出するために全ての細胞から切断されることが可能であり、細胞型特異的刺激物質を用いて細胞表面に誘導して、表面に多量のＰＳＡ−ＮＣＡＭを有する唯一の細胞型を得ることができ、かつアフィニティータグ、例えば、抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体を使用して、誘導されたＳＣ−β細胞を選択的に選別することができる。このように、分化したＳＣ−β細胞が、内分泌細胞の集団において、他の内分泌細胞から選別され、濃縮され得る。ＳＣ−β細胞。一部の実施形態では、細胞集団のうちの１つまたは複数の細胞は、刺激性化合物と接触した場合に、細胞表面に選択マーカーを局在化することができない。
【０３３２】
[0403]ＳＣ−β細胞に特異的なアフィニティータグの例は、ＳＣ−β細胞の細胞表面上に存在するが、他の細胞型（例えば、インスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体）上には実質的に存在しない、ペプチドなどのマーカー分子に対して特異的である抗体（例えば、抗ＰＳＡ−ＮＣＡＭ抗体）、リガンドまたは他の結合剤である。一部のプロセスでは、ＳＣ−β細胞（例えば、ヒトＳＣ−β細胞）上の細胞表面抗原に結合する抗体は、本明細書に記載の方法によって産生される化学的に誘導された（例えば、本明細書に記載されているような少なくとも１つのβ細胞成熟因子と接触させることによって）ＳＣ−β細胞の濃縮、単離または精製のためのアフィニティータグとして使用される。このような抗体は公知であり、市販されている。
【０３３３】
[0404]当業者であれば、ＳＣ−β細胞の濃縮、単離および／または精製のために抗体を使用することに関するプロセスを容易に認識するであろう。例えば、一部の実施形態では、試薬、例えば、抗体は、細胞間および基質との接着を低減するために処理された、ＳＣ−β細胞を含む細胞集団と共にインキュベートされる。次いで、細胞集団は、洗浄、遠心分離、および再懸濁される。一部の実施形態では、抗体が標識で既に標識されていなければ、次いで、細胞懸濁液を、一次抗体に結合することが可能であるＦＡＣＳコンジュゲート抗体などの二次抗体と共にインキュベートする。次いで、ＳＣ−β細胞を緩衝液中で洗浄、遠心分離および再懸濁する。次いで、ＳＣ−β細胞懸濁液を分析し、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）を使用して選別する。抗体に結合した、再プログラムされた蛍光細胞を、非結合、非蛍光細胞（例えば、未成熟の、インスリン産生細胞）から別々に収集し、それによって、細胞懸濁液中に存在する他の細胞、例えば、インスリン陽性内分泌細胞もしくはその前駆体、または未成熟の、インスリン産生細胞（例えば、他の分化した細胞型）からのＳＣ−β細胞の単離がもたらされる。
【０３３４】
[0405]本明細書に記載のプロセスの別の実施形態では、ＳＣ−β細胞を含む単離された細胞組成物は、代替アフィニティーに基づく方法を使用することによって、またはＳＣ−β細胞に特異的である同一もしくは異なるマーカーを使用する追加回数の選別によって、さらに精製され得る。例えば、一部の実施形態では、ＦＡＣＳ選別を使用して、単独もしくはＣ−ペプチドの発現と共に、またはあるいは本明細書に開示されているβ細胞マーカーと共に、細胞集団においてこれらのマーカーのうちの１つを発現しない細胞（例えば、陰性細胞）から、ＮＫＸ６−１を発現するＳＣ−β細胞を最初に単離する。第２のＦＡＣＳ選別、例えば、第１の選別とは異なるマーカーに関して陽性である細胞を単離するためにＦＡＣＳを再度使用して陽性細胞を選別することにより、再プログラムされた細胞に関して細胞集団を濃縮する。代替の実施形態では、ＦＡＣＳ選別を使用して、ほとんどのインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体上に存在するが、ＳＣ−β細胞上に存在しないマーカーを負に選別することによって、細胞を分ける。
【０３３５】
[0406]本明細書に記載のプロセスの一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、抗体を使用せずに、蛍光標識され、次いで、蛍光活性化細胞選別機（ＦＡＣＳ）を使用することによって非標識細胞から単離される。このような実施形態では、ＧＦＰ、ＹＦＰをコードする核酸またはルシフェラーゼをコードする遺伝子などの発現可能な蛍光マーカー遺伝子をコードする別の核酸を使用して、上記の方法を使用して再プログラムされた細胞を標識する。例えば、一部の実施形態では、ＧＦＰをコードする核酸またはその生物学的に活性な断片の少なくとも１つのコピーは、ＳＣ−β細胞へと最初に化学的に誘導される少なくとも１つのインスリン陽性内分泌細胞中に導入され、その下流で、ＧＦＰ遺伝子産物またはその生物学的に活性な断片の発現がインスリンプロモーターの制御下にあるように、インスリンプロモーターなどのプロモーターがＳＣ−β細胞中で発現した。
【０３３６】
[0407]今まさに記載された手順に加えて、化学的に誘導されたＳＣ−β細胞は、細胞単離のための他の技法によって単離される場合もある。さらに、ＳＣ−β細胞はまた、ＳＣ−β細胞の選択的生存または選択的拡大を促進する成長条件での連続的継代培養の方法によって、濃縮または単離されてもよい。このような方法は当業者に公知であり、例えば、とりわけ、インスリン、アクチビンＡ、ＴＧＦ−ベータ１、２、および３を含むＴＧＦ−ベータファミリーのメンバー、骨形成タンパク質（ＢＭＰ−２、−３、−４、−５、−６、−７、−１１、−１２、および−１３）、線維芽細胞成長因子−１および−２、血小板由来成長因子−ＡＡ、および−ＢＢ、血小板リッチプラズマ、インスリン様成長因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）成長分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−７、−８、−１０、−１１、−１５）、血管内皮細胞由来成長因子（ＶＥＧＦ）、肝細胞成長因子（ＨＧＦ）、プレイオトロフィン、エンドセリン、上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）、ベータ−セルリンなどの薬剤の使用を含み得る。他の医薬化合物としては、例えば、ニコチンアミド、グルカゴン様ペプチド−１（ＧＬＰ−１）およびＩＩ、ＧＬＰ−１および２ミメティボディ、エキセンディン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモンを挙げることができる。
【０３３７】
[0408]本明細書に記載の方法を使用して、ＳＣ−β細胞の濃縮、単離および／または精製された集団は、インスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体（本明細書に記載の方法によって多能性幹細胞から分化した）から、ｉｎ  ｖｉｔｒｏで産生することができる。一部の実施形態では、好ましい濃縮、単離および／または精製方法は、ヒト多能性幹細胞から、またはヒト人工多能性幹（ｉＰＳ）細胞から分化した、ヒトインスリン陽性内分泌細胞またはその前駆体からのヒトＳＣ−β細胞のｉｎ  ｖｉｔｒｏ産生に関する。ＳＣ−β細胞が、その前は胚体内胚葉（その前はｉＰＳ細胞に由来する）に由来するインスリン陽性内分泌細胞から分化したこのような実施形態では、ＳＣ−β細胞は、ｉＰＳ細胞を産生するために細胞が得られた対象に対して自己由来であり得る。
【０３３８】
[0409]本明細書に記載の方法を使用して、ＳＣ−β細胞の単離された細胞集団は、インスリン陽性内分泌細胞または前駆体集団の化学誘導の前の細胞集団と比較して、少なくとも約２〜約１０００倍に、ＳＣ−β細胞含量が濃縮される。一部の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、インスリン陽性内分泌細胞または前駆体集団の化学誘導の前の集団と比較して、少なくとも約５〜約５００倍に濃縮され得る。他の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、インスリン陽性内分泌細胞または前駆体集団の化学誘導の前の集団と比較して、少なくとも約１０〜約２００倍に濃縮され得る。さらなる他の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、インスリン陽性内分泌細胞または前駆体集団の化学誘導の前の集団と比較して、少なくとも約２０〜約１００倍に濃縮され得る。さらに他の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、インスリン陽性内分泌細胞または前駆体集団の化学誘導の前の集団と比較して、少なくとも約４０〜約８０倍に濃縮され得る。ある特定の実施形態では、ＳＣ−β細胞は、インスリン陽性内分泌細胞または前駆体集団の化学誘導の前の集団と比較して、少なくとも約２〜約２０倍に濃縮され得る。
【０３３９】
[0410]標的細胞（例えば、ＳＣ−β細胞）を細胞集団から選択する方法であって、標的細胞を刺激性化合物と接触させるステップを含み、接触させるステップが、標的細胞の選択マーカー（例えば、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）を誘導して、標的細胞の細胞表面に局在化させ、細胞表面における選択マーカー（例えば、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ）の局在化に基づいて標的細胞（例えば、ＳＣ−β細胞）を選択する方法が本明細書において提供される。一部の実施形態では、選択マーカーは、ＰＳＡ−ＮＣＡＭを含む。一部の実施形態では、標的細胞を選択することは、細胞選別による。一部の実施形態では、選択することは、標的細胞の選択マーカーを、選択マーカーが標的細胞の表面に局在化された場合に、抗原結合ポリペプチドと接触させることを含む。一部の実施形態では、抗原結合ポリペプチドは、抗体を含む。一部の実施形態では、抗原結合ポリペプチドは、ＰＳＡ−ＮＣＡＭに結合する。一部の実施形態では、方法は、細胞の集団を、選択マーカーを標的細胞集団のうちの少なくとも１つの細胞の細胞表面から除去する化合物（例えば、酵素）で処理するステップをさらに含む。一部の実施形態では、標的細胞の刺激性化合物との接触の前に、標的細胞の集団を化合物で処理する。一部の実施形態では、化合物は、少なくとも１つの細胞の細胞表面から選択マーカーを切断する。一部の実施形態では、標的細胞は、内分泌細胞である。一部の実施形態では、刺激性化合物は、グルコースを含む。一部の実施形態では、内分泌細胞は、β細胞である。一部の実施形態では、β細胞は、ＳＣ−β細胞である。一部の実施形態では、刺激性化合物は、イソプロテレノールを含む。一部の実施形態では、内分泌細胞は、ＥＣ細胞である。刺激性化合物がグルコースであり、１つまたは複数の細胞がＥＣ細胞である、請求項１０２に記載の方法。一部の実施形態では、刺激性化合物がイソプロテレノールであり、１つまたは複数の細胞がβ細胞である。一部の実施形態では、標的細胞を選択することにより、細胞集団のうちの１つまたは複数の細胞から標的細胞を分離する。
照射
[0411]一部の実施形態では、インスリン産生内分泌細胞（例えば、幹細胞由来ベータ細胞）は、細胞のフィーダー層の存在下で培養することができる。このような細胞は、例えば、マウスまたはヒト起源であってもよい。インスリン産生内分泌細胞（例えば、幹細胞由来ベータ細胞）はまた、照射されるか、マイトマイシンｃなどの化学的不活性化剤による処理によって化学的に不活性化されるか、またはそうでなければ、所望の場合、それらの増殖を阻害するために処理され得る。他の実施形態では、インスリン産生内分泌細胞（例えば、幹細胞由来ベータ細胞）は、フィーダー細胞なしで培養される。
【０３４０】
[0412]多能性幹細胞は、フィーダー細胞を有さない場合でさえも、未分化状態で維持され得る。フィーダー細胞を含まない培養に関する環境は、適切な培養基質、特に、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）またはラミニンなどの細胞外マトリックスを含む。典型的には、細胞が完全に分散する前に、酵素消化を停止される（コラゲナーゼＩＶにより約５ｍＭ）。次いで、約１０〜２，０００個の細胞の凝集塊を、さらに分散させることなく基質上に直接プレーティングする。フィーダーフリー培養は、分化せずに細胞の増殖を支持する因子を含有する栄養培地によって支持される。このような因子は、このような因子を分泌する細胞、例えば、照射された（約４，０００ｒａｄ）初代マウス胎仔線維芽細胞、テロメル化されたマウス線維芽細胞、またはｐＰＳ細胞由来の線維芽細胞様細胞と共に、培地を培養することによって、培地中に導入することができる。培地は、２０％の血清置き換えおよび４ｎｇ／ｍＬのｂＦＧＦを補充したＫＯ  ＤＭＥＭなどの血清フリー培地中で、約５〜６×１０４ｃｍ−２の濃度でフィーダーをプレーティングすることによって条件づけることができる。１〜２日間条件付けした培地に、さらなるｂＦＧＦを補充し、１〜２日間多能性幹細胞の培養を支持するために使用する。フィーダーフリー培養方法の特徴については、国際特許出願公開第ＷＯ  ０１／５１６１６号；およびＸｕら、Ｎａｔ．  Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．  １９：９７１、２００１年においてさらに議論されている。
Ｘ．医薬組成物
[0413]本開示は、前記方法のいずれかによって産生された細胞を含有するかまたは前記細胞集団のいずれかを含有する治療用組成物に関する。治療用組成物は、例えば、人工脳脊髄液またはリン酸緩衝生理食塩水を含む生理学的に適合性の溶液をさらに含むことができる。治療用組成物を使用して、糖尿病を処置、予防、または安定化することができる。例えば、体細胞または幹細胞は、処置を必要としている個体または健康な個体から得ることができ、本開示の方法によって幹細胞由来ベータ細胞に再プログラムすることができる。本開示の一実施形態では、幹細胞由来ベータ細胞は、選別され、濃縮され、状態を処置するために個体中に導入される。別の実施形態では、幹細胞は、個体への導入前に、ベータ細胞への分化に好適な条件下で培養され、疾患組織または損傷を受けた組織の正常な機能を置き換えるかまたは補助するために使用することができる。本開示の大きな利点は、移植に好適な同じＨＬＡ型を有する健康な個体からの、患者に特異的なヒトベータ細胞または適合性幹細胞由来ベータ細胞の本質的に制限のない供給を提供することである。細胞療法において、自家細胞および／または適合性細胞の使用は、免疫拒絶を受けやすい非自家細胞の使用に対して、より大きな利益をもたらす。対照的に、自家細胞は、重大な免疫応答を誘発しにくい。
【０３４１】
[0414]一部の事例では、本開示は、疾患（例えば、糖尿病）の処置のための様々な方法において、非天然膵β細胞（ベータ細胞）集団ならびに細胞の構成成分および生成物を利用することができる医薬組成物を提供する。ある特定の事例は、生細胞（例えば、単独のまたは他の細胞型と混合した非天然膵β細胞）を含む医薬組成物を包含する。他の事例は、非天然膵β細胞の構成成分（例えば、細胞溶解液、可溶性細胞画分、条件培地、ＥＣＭ、または前述のいずれかの構成成分）または生成物（例えば、非天然膵β細胞によってまたは遺伝子修飾によって生成された栄養因子および他の生体因子、非天然膵β細胞の培養からの条件培地）を含む医薬組成物を包含する。いずれかの事例では、医薬組成物は、他の活性剤、例えば、当業者に公知の抗炎症剤、外因性小分子アゴニスト、外因性小分子アンタゴニスト、抗アポトーシス剤、酸化防止剤、および／または成長因子をさらに含んでもよい。
【０３４２】
[0415]本開示の医薬組成物は、薬学的に許容される担体（例えば、媒体または賦形剤）と共に製剤化される、非天然膵β細胞、またはその構成成分もしくは生成物を含むことができる。薬学的に許容される担体（または媒体）という用語は、生物学的に適合性の担体または媒体という用語と交換可能に使用することができ、治療上投与される細胞および他の薬剤と適合性であるだけでなく、過度の毒性、刺激、アレルギー応答、または他の合併症を有することなく、ヒトおよび動物の組織と接触して使用するのにも好適である、試薬、細胞、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指し得る。好適な薬学的に許容される担体としては、水、塩溶液（例えば、リンゲル液）、アルコール、油、ゼラチン、およびラクトース、アミロース、またはデンプンなどの炭水化物、脂肪酸エステル、ヒドロキシメチルセルロース、およびポリビニルピロリドンを挙げることができる。このような調製物は、滅菌され、所望の場合、滑沢剤、保存剤、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を与える塩、緩衝液、および着色剤などの補助剤と混合され得る。生細胞以外の細胞の構成成分または生成物を含む医薬組成物は、液体として製剤化することができる。生きた非天然膵β細胞を含む医薬組成物は、液体、半固体（例えば、ゲル、ゲルカプセル、またはリポソーム）または固体（例えば、マトリックス、スキャフォールドなど）として製剤化することができる。
【０３４３】
[0416]本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される」は、適切な医学的判断の範囲内で、過度な毒性、刺激、アレルギー応答、または他の問題もしくは合併症を伴わずにヒトおよび動物の組織と接触させて使用するのに好適な、合理的なベネフィット／リスク比に見合った、化合物、材料、組成物、および／または剤形を指し得る。
【０３４４】
[0417]本明細書で使用される場合、用語「薬学的に許容される担体」は、１つの器官、または体の部分から、別の器官、または体の部分に対象の化合物を運ぶまたは輸送することに関連する、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、液体または固体充填剤、希釈剤、賦形剤、製造助剤（例えば、滑沢剤、タルク  ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸カルシウムもしくはステアリン酸亜鉛、またはステアリン酸）、または溶媒カプセル化材料を指し得る。各担体は、製剤の他の成分に適合し、患者に有害でないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体としての役割を果たし得る材料のいくつかの例として、（１）ラクトース、グルコースおよびスクロースなどの糖類；（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン；（３）セルロースならびにカルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、エチルセルロース、微結晶性セルロースおよび酢酸セルロースなどのその誘導体；（４）粉末トラガカント；（５）麦芽；（６）ゼラチン；（７）ステアリン酸マグネシウム、ラウリル硫酸ナトリウムおよびタルクなどの滑沢剤；（８）ココアバターおよび坐剤用ワックスなどの賦形剤；（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油およびダイズ油などの油；（１０）プロピレングリコールなどのグリコール；（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリオール；（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル；（１３）寒天；（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤；（１５）アルギン酸；（１６）発熱物質無含有水；（１７）等張性生理食塩水；（１８）リンゲル液；（１９）エチルアルコール；（２０）ｐＨ緩衝溶液；（２１）ポリエステル、ポリカーボネートおよび／またはポリ無水物；（２２）ポリペプチドおよびアミノ酸などの嵩高剤；（２３）血清アルブミン、ＨＤＬおよびＬＤＬなどの血清成分；（２２）エタノールなどのＣ２〜Ｃ１２アルコール；ならびに（２３）医薬製剤中に用いられる他の非毒性適合性物質が挙げられる。湿潤剤、着色剤、放出剤、コーティング剤、甘味剤、風味剤、芳香剤、保存剤および酸化防止剤は、製剤中に存在してもよい。例えば、「賦形剤」、「担体」、「薬学的に許容される担体」などの用語は、本明細書において交換可能に使用される。
【０３４５】
[0418]細胞集団に関して本明細書で使用される「治療有効量」という表現は、任意の医学的処置に適用できる合理的なベネフィット／リスク比で、一匹の動物の少なくとも細胞小集団においていくつかの所望の治療効果を生じるのに有効である、本開示の細胞、例えば、ＳＣ−β細胞もしくは成熟膵β細胞の集団、またはＳＣ−β細胞を含む組成物における関連する細胞の量を意味する。例えば、糖化ヘモグロビンレベル、空腹時血中グルコースレベル、低インスリン血症などの１型、１．５型または２型糖尿病の少なくとも１つの症状に、統計的に有意な、測定可能な変化をもたらすのに十分である、対象に投与されたＳＣ−β細胞集団の量。治療有効量の決定は、十分に当業者の能力の範囲内である。一般的に、治療有効量は、対象の病歴、年齢、状態、性別、ならびに対象の医学的状態の重篤度および種類、ならびに他の医薬活性剤の投与に応じて変化し得る。
【０３４６】
[0419]一部の事例では、幹細胞由来ベータ細胞の医薬組成物は、薬学的に使用され得る調製物への活性化合物の処理を容易にする、賦形剤および補助剤を含む１つまたは複数の生理学的に許容される担体を使用して、従来の手法で製剤化される。適切な製剤は、選択される投与経路に依存する。本明細書に記載の医薬組成物の概要は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：  Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ、第１９版（Ｅａｓｔｏｎ、Ｐａ．：  Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年）；Ｈｏｏｖｅｒ，  Ｊｏｈｎ  Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５年；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，  Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，  Ｌ．編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．、１９８０年；ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ  ＆  Ｗｉｌｋｉｎｓ  １９９９年）に見られる。
【０３４７】
[0420]医薬組成物は、任意選択で、例えば、例のみとして、従来の混合、溶解、造粒、糖衣形成（ｄｒａｇｅｅ−ｍａｋｉｎｇ）、研和（ｌｅｖｉｇａｔｉｎｇ）、乳化、カプセル化、捕捉または圧縮プロセスによる従来の手法で製造される。
【０３４８】
[0421]ある特定の実施形態では、組成物は、酢酸、ホウ酸、クエン酸、乳酸、リン酸および塩酸などの酸；水酸化ナトリウム、リン酸ナトリウム、ホウ酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、乳酸ナトリウムおよびトリス−ヒドロキシメチルアミノメタンなどの塩基；クエン酸塩／デキストロース、炭酸水素ナトリウムおよび塩化アンモニウムなどの緩衝剤を含む、１つまたは複数のｐＨ調整剤または緩衝剤を含むこともできる。このような酸、塩基および緩衝剤は、組成物のｐＨを許容可能な範囲に維持するために必要な量で含まれる。
【０３４９】
[0422]他の実施形態では、組成物は、１つまたは複数の塩を、組成物のオスモル濃度を許容可能な範囲にするために必要な量で含むこともできる。このような塩は、ナトリウム、カリウムまたはアンモニウムカチオンおよび塩化物、クエン酸、アスコルビン酸、ホウ酸、リン酸、炭酸水素、硫酸、チオ硫酸または重亜硫酸アニオンを有する塩を含み、好適な塩として、塩化ナトリウム、塩化カリウム、チオ硫酸ナトリウム、重硫酸ナトリウムおよび硫酸アンモニウムが挙げられる。
【０３５０】
[0423]本明細書に記載の医薬組成物は、経口、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）、鼻腔内、頬側、舌下、または直腸投与経路を含むがこれらに限定されない任意の好適な投与経路によって投与される。一部の事例では、医薬組成物は、非経口（例えば、静脈内、皮下、筋肉内、脳内、脳室内、関節内、腹腔内、または頭蓋内）投与のために製剤化される。
【０３５１】
[0424]本明細書に記載の医薬組成物は、任意の好適な剤形へと製剤化され、この剤形としては、限定するものではないが、水性経口分散液、液体、ゲル、シロップ剤、エリキシル剤、スラリー、懸濁液など（治療される個体による経口摂取のための）、固体経口剤形、エアゾール剤、制御放出製剤、速溶製剤、発泡性製剤、凍結乾燥製剤、錠剤、散剤、丸剤、糖衣錠、カプセル剤、遅延放出製剤、徐放製剤、拍動性の放出製剤、多重微粒子製剤、ならびに即時混合放出および制御放出製剤が挙げられる。一部の実施形態では、医薬組成物は、カプセル剤へと製剤化される。一部の実施形態では、医薬組成物は、溶液剤（例えば、ＩＶ投与のために）へと製剤化される。一部の事例では、医薬組成物は、輸液剤として製剤化される。一部の事例では、医薬組成物は、注射剤として製剤化される。
【０３５２】
[0425]本明細書に記載の薬学的固体剤形は、任意選択で、本明細書に記載の化合物および１つまたは複数の薬学的に許容される添加剤、例えば、適合性担体、結合剤、充填剤、懸濁化剤、風味剤、甘味剤、崩壊剤、分散剤、界面活性剤、滑沢剤、着色剤、希釈剤、可溶化剤、モイスチャリング剤、可塑剤、安定化剤、浸透増強剤、湿潤剤、消泡剤、酸化防止剤、保存剤、またはこれらの１つもしくは複数の組合せを含む。
【０３５３】
[0426]さらなる他の態様では、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第２０版（２０００年）に記載されているものなど、標準的なコーティング手順を使用して、組成物の周りにフィルムコーティングが与えられる。一部の実施形態では、組成物は、粒子へと製剤化され（例えば、カプセルで投与するために）、粒子の一部または全てがコーティングされる。一部の実施形態では、組成物は、粒子へと製剤化され（例えば、カプセルで投与するために）、粒子の一部または全てはマイクロカプセル化される。一部の実施形態では、組成物は、粒子へと製剤化され（例えば、カプセルで投与するために）、粒子の一部または全ては、マイクロカプセル化されず、コーティングされない。
【０３５４】
[0427]ある特定の実施形態では、本明細書において提供される組成物は、微生物の活性を阻害するために１つまたは複数の保存剤を含んでもよい。好適な保存剤としては、水銀含有物質、例えば、メルフェン（ｍｅｒｆｅｎ）およびチオメルサール；安定化二酸化塩素；ならびに第四級アンモニウム化合物、例えば、塩化ベンザルコニウム、臭化セチルトリメチルアンモニウムおよび塩化セチルピリジニウムが挙げられる。
【０３５５】
[0428]一部の実施形態では、本開示の組成物は、例えば、糖尿病を処置または予防するのに有効な量で、幹細胞由来ベータ細胞を含むことができる。医薬組成物は、１つまたは複数の薬学的にまたは生理学的に許容される担体、希釈剤または賦形剤と組み合わせて、本明細書に記載されている幹細胞由来ベータ細胞を含むことができる。このような組成物は、緩衝剤、例えば、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水など；炭水化物、例えば、グルコース、マンノース、スクロースまたはデキストラン、マンニトール；タンパク質；ポリペプチドまたはアミノ酸、例えば、グリシン；酸化防止剤；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡまたはグルタチオン；アジュバント（例えば、水酸化アルミニウム）；および保存剤を含むことができる。
【０３５６】
[0429]医薬組成物は、当業者によく知られているように、補助化合物を含むことができる。例えば、医薬組成物は、使用される酸化防止剤の種類に応じて変わる範囲内で、酸化防止剤を含有することができる。通常使用される酸化防止剤の合理的な範囲は、約０．０１質量対容積％〜約０．１５質量対容積％のＥＤＴＡ、約０．０１質量対容積％〜約２．０質量対容積％の亜硫酸ナトリウム、および約０．０１質量対容積％〜約２．０質量対容積％のメタ重亜硫酸ナトリウムである。当業者は、上記のそれぞれについて、約０．１質量対容積％の濃度を使用することができる。他の保存剤化合物としては、腎投与に好適な他の酸化防止剤、例えば、アスコルビン酸およびその塩または亜硫酸塩またはメタ重亜硫酸ナトリウムも用いることができるが、メルカプトプロピオニルグリシン、Ｎ−アセチルシステイン、β-メルカプトエチルアミン、グルタチオンおよび類似種が挙げられる。
【０３５７】
[0430]緩衝剤は、標的組織における刺激を最小限にするために、約４．０〜８．０の範囲で製剤のｐＨを維持するために使用することができる。直接腹腔内注射のために、製剤は、ｐＨ７．２〜７．５、好ましくはｐＨ７．３５〜７．４５であるべきである。組成物は、腎臓への投与に好適な等張化剤を含んでもよい。これらの中で、血液とほぼ等張である製剤を作製するために、塩化ナトリウムが好適である。
【０３５８】
[0431]ある特定の事例では、医薬組成物は、粘度増強剤を用いて製剤化される。例示的な薬剤は、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、メチルセルロース、およびポリビニルピロリドンである。医薬組成物は、必要である場合に添加される共溶媒を有してもよい。好適な共溶媒としては、グリセリン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリソルベート、プロピレングリコール、およびポリビニルアルコールを挙げることができる。保存剤、例えば、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、クロロブタノール、酢酸フェニル水銀もしくは硝酸フェニル水銀、チメロサール、またはメチルもしくはプロピルパラベンも含まれてもよい。
【０３５９】
[0432]細胞、細胞の構成成分または細胞の生成物を含む医薬組成物は、当技術分野で公知のいくつかの送達方法のうちの１つまたは複数で、患者の腎臓に送達されてもよい。一部の事例では、組成物は、腎臓に送達される（例えば、腎被膜の上および／または腎被膜の下に）。別の実施形態では、組成物は、周期的な腹腔内または腎内注射によって、腎臓内の様々な位置に送達されてもよい。あるいは、組成物は、当業者に公知の他の剤形で、例えば、事前に形成されたかまたはｉｎ  ｓｉｔｕで形成されたゲルまたはリポソームで適用されてもよい。
【０３６０】
[0433]半固体または固体担体中に生細胞を含む医薬組成物は、腎被膜の上または下に外科移植するために製剤化されてもよい。液体組成物も外科的手段で投与されてもよいことが認識されるべきである。特定の事例では、半固体または固体の医薬組成物は、非生分解性または生分解性であってもよい半透過性ゲル、格子、細胞スキャフォールドなどを含むことができる。例えば、ある特定の事例では、外因性細胞を、その周辺から隔離し、さらに、細胞が生物学的分子（例えば、インスリン）を周辺細胞または血流に対して分泌および送達できるようにすることが、望ましいかまたは適切である場合がある。これらの事例では、細胞は、移植細胞を宿主組織から物理的に分離する、非分解性で、選択的に透過性の障壁により囲まれた生きた非天然膵β細胞または非天然膵β細胞を含む細胞集団を含む自律性インプラントとして製剤化されてもよい。そのようなインプラントは、「免疫保護性」と呼ばれることもあり、これは薬理学的に誘導された免疫抑制の非存在下で、免疫細胞および巨大分子が移植細胞を死滅させるのを防ぐ能力を有するからである。
【０３６１】
[0434]他の事例では、様々な分解性ゲルおよびネットワークを、本開示の医薬組成物に対して使用することができる。例えば、持続放出製剤に特に好適な分解性材料としては、生体適合性ポリマー、例えば、ポリ（乳酸）、ポリ（乳酸−コ−グリコール酸）、メチルセルロース、ヒアルロン酸、コラーゲンなどが挙げられる。
【０３６２】
[0435]他の事例では、生分解性、好ましくは、生体吸収性（ｂｉｏｒｅｓｏｒｂａｂｌｅまたはｂｉｏａｂｓｏｒｂａｂｌｅ）のスキャフォールドまたはマトリックス上またはその中に細胞を送達するのが望ましいかまたは適切であり得る。これらの典型的な三次元生体材料は、スキャフォールドに付着した、スキャフォールド内に分散した、またはスキャフォールドに捕捉された細胞外マトリックスに組み込まれた生細胞を含有する。一旦、身体の標的領域に移植されると、これらの移植片は宿主組織と一体となり、移植細胞が次第に確立されてくる。
【０３６３】
[0436]本開示において使用することができるスキャフォールドまたはマトリックス（「フレームワーク」と総称されることがある）材料の例としては、不織マット、多孔質発泡体、または自己集合ペプチドが挙げられる。不織マットは、例えば、グリコール酸と乳酸（ＰＧＡ／ＰＬＡ）の合成吸収性コポリマー、発泡体、および／またはポリ（イプシロン−カプロラクトン）／ポリ（グリコール酸）（ＰＣＬ／ＰＧＡ）コポリマーを含む繊維を使用して形成されてもよい。
【０３６４】
[0437]別の実施形態では、フレームワークはフェルトであり、このフェルトは、生体吸収性材料、例えば、ＰＧＡ、ＰＬＡ、ＰＣＬコポリマーもしくはブレンド、またはヒアルロン酸から製造されたマルチ糸から構成され得る。この糸は、クリンピング、カッティング、カーディングおよびニードリングからなる標準的なテキスタイル加工技術を使用してフェルトにされる。別の実施形態では、細胞を混成構造であり得る発泡体スキャフォールド上に播種する。前記実施形態の多くでは、フレームワークは、有用な形状に成型することができる。さらに、非天然膵β細胞は、プレフォーム型の、非分解性外科用または移植用デバイス上で、培養することができる。
【０３６５】
[0438]マトリックス、スキャフォールドまたはデバイスは、細胞の接着を増強するために、細胞の接種前に処理することができる。例えば、接種前に、ナイロンマトリックスは、０．１モル酢酸で処理し、ポリリジン、ＰＢＳ、および／またはコラーゲン中でインキュベートして、このナイロンをコーティングすることができる。ポリスチレンも硫酸を使用してて同様に処理することができる。また、フレームワークの外面は、細胞の接着または成長および組織の分化を向上させるために、例えば、フレームワークの血漿コーティングまたは１つもしくは複数のタンパク質（例えば、コラーゲン、弾性繊維、細網繊維）、糖タンパク質、グリコサミノグリカン（例えば、ヘパリン硫酸、コンドロイチン−４−硫酸、コンドロイチン−６−硫酸、デルマタン硫酸、ケラチン硫酸）、細胞マトリックス、および／または、以下に限定されないが、とりわけ、ゼラチン、アルギン酸塩、寒天、アガロース、および植物ゴムなどの他の材料の添加などにより修飾することができる。
【０３６６】
[0439]一態様では、本開示は、少なくとも１つの膵β細胞を含む細胞クラスターを含むデバイスを提供した。本明細書において提供されるデバイスは、対象へと移植された場合に、インスリンを産生および放出するように構成され得る。デバイスは、少なくとも１つの膵β細胞、例えば、非天然膵β細胞を含む細胞クラスターを含み得る。デバイス中の細胞クラスターは、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＳＩＳを呈し得る。デバイスは、半透膜をさらに含むことができる。半透膜は、デバイス中に細胞クラスターを保持するよう構成され、細胞クラスターによって分泌されるインスリンの通過を可能とすることができる。デバイスの一部の事例では、細胞クラスターは、半透膜によってカプセル化され得る。カプセル化は、当業者に利用可能な任意の技法によって実施され得る。半透膜は、当業者が認識し、検証するように、任意の好適な材料から作製することもできる。例えば、半透膜は、多糖またはポリカチオンから作製することができる。一部の事例では、半透膜は、ポリ（ラクチド）（ＰＬＡ）、ポリ（グリコール酸）（ＰＧＡ）、ポリ（ラクチド−コ−グリコリド）（ＰＬＧＡ）、および他のポリヒドロキシ酸、ポリ（カプロラクトン）、ポリカーボネート、ポリアミド、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリアミノ酸、ポリオルトエステル、ポリアセタール、ポリシアノアクリレート、生分解性ポリウレタン、アルブミン、コラーゲン、フィブリン、ポリアミノ酸、プロラミン、アルギネート、アガロース、ゼラチンを含むアガロース、デキストラン、ポリアクリレート、エチレン−酢酸ビニルポリマーおよび他のアシル置換酢酸セルロースならびにそれらの誘導体、ポリウレタン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル、ポリフッ化ビニル、ポリ（ビニルイミダゾール）、クロロスルホン化ポリオレフィン、ポリエチレンオキシド、またはそれらの任意の組合せから作製することができる。一部の事例では、半透膜は、アルギネートを含む。一部の事例では、細胞クラスターは、半透膜で囲まれたアルギネートコアを含むマイクロカプセル中にカプセル化される。一部の事例では、アルギネートコアは、例えば、ＲＧＤ配列（アルギニン、グリシン、アスパラギン酸）と共有結合によりコンジュゲートしたオリゴペプチドを有するアルギネートコアを含むスキャフォールドを生成するために改変される。一部の事例では、アルギネートコアは、例えば、安定性の向上した、化学酵素的に操作されたアルギネートを有する、共有結合によって強化されたマイクロカプセルを生成するために改変される。一部の事例では、アルギネートコアは、例えば、アクリレート官能化されたリン脂質のｉｎ−ｓｉｔｕ重合によってアセンブルされた膜模倣フィルムを生成するために改変される。一部の事例では、マイクロカプセルは、エピメラーゼを使用して、酵素によって改変されたアルギネートから構成される。一部の事例では、マイクロカプセルは、マイクロカプセル膜の隣接する層間に共有結合を含む。一部の実施形態では、マイクロカプセルは、フェノール部分で連結したアルギネートを含むサブシーブカプセルを含む。一部の事例では、マイクロカプセルは、アルギネート−アガロースを含むスキャフォールドを含む。一部の事例では、ＳＣ��β細胞は、アルギネート内にカプセル化される前にＰＥＧで修飾される。一部の事例では、単離された細胞、例えば、ＳＣ−β細胞の集団は、光反応性リポソームおよびアルギネート内にカプセル化される。マイクロカプセル中に用いられるアルギネートは、限定されないが、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、キトサン、ポリエステル中空繊維、コラーゲン、ヒアルロン酸、ＲＯＤを含むデキストラン、ＢＨＤおよびポリエチレングリコール−ジアクリレート（ＰＥＧＤＡ）、ポリ（ＭＰＣ−コ−ｎ−ブチルメタクリレート−コ−４−ビニルフェニルボロン酸（ＰＭＢＶ）およびポリ（ビニルアルコール）（ＰＶＡ）、アガロース、ゼラチンを含むアガロース、ならびにこれらの多層の事例を含む他の好適な生体材料で置き換えることができる。一部の事例では、本明細書において提供されるデバイスは、体外のセグメントを含み、例えば、デバイスの一部は、デバイスが対象に移植される場合に、対象の体外に存在し得る。体外セグメントは、本明細書において提供される細胞または細胞クラスターを含むか含まないかに関わらず、デバイスの任意の機能的構成成分を含み得る。
ＸＩ．処置方法
[0440]対象における疾患を処置または予防するための方法がさらに本明細書において提供される。本明細書において提供されるかまたは本明細書において提供される方法に従って産生される細胞クラスターまたは細胞を含む組成物は、対象の膵機能の度合を回復させるために、対象へと投与することができる。例えば、内因性膵島に似ている細胞クラスター、もしくは内因性膵β細胞に似ている細胞（例えば、非天然膵β細胞またはＳＣ−β細胞）またはこれらの前駆体は、糖尿病を処置するために、対象に移植することができる。
【０３６７】
[0441]方法は、本出願に開示されている細胞クラスターまたは細胞を対象、例えば、それを必要とする対象に移植するステップを含み得る。用語「移植するステップ」は、所望の部位に導入された細胞または細胞クラスターの少なくとも部分的な局在化をもたらす方法または経路によって、細胞もしくは細胞クラスター、細胞もしくはその細胞クラスターの任意の部分、または細胞、細胞クラスターもしくはこれらの任意の部分を含む任意の組成物の対象への配置を指し得る。細胞または細胞クラスターは、膵臓に直接移植されるか、またはあるいは、移植された細胞の少なくとも一部または細胞が生存可能である対象の所望の位置への送達をもたらす任意の適切な経路によって投与され得る。対象への投与後の細胞または細胞クラスターの生存期間は、数時間、例えば、２４時間程度の短さ、数日まで、数年ほどの長期であってもよい。一部の事例では、細胞もしくは細胞クラスター、または細胞もしくは細胞クラスターのいずれかの部分は、例えば、移植した細胞または細胞クラスターを移植した位置に維持し、移動を避けるために、カプセル（例えば、マイクロカプセル）で、膵臓以外の位置、例えば、肝臓内または皮下に、経投与されてもよい。
【０３６８】
[0442]本明細書で使用される場合、用語「処置すること（ｔｒｅａｔｉｎｇ）」および「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、対象が、疾患の少なくとも１つの症状の低減または疾患の改善、例えば、有益なまたは所望の臨床結果を有するように、有効量の組成物（例えば、細胞クラスターまたはその一部）を対象に投与することを指し得る。この開示の目的として、有益なまたは所望の臨床結果としては、以下に限定されないが、検出可能か検出不可能かに関わらず、１つもしくは複数の症状の緩和、疾患の程度の減弱、疾患状態の安定化（例えば、悪化しない）、疾患進行の遅延または緩慢化、疾患状態の改善または軽減、および寛解（例えば、部分的または全体的）が挙げられる。処置することは、処置を受けていない場合に期待される生存と比較して、生存が延長されることを指し得る。よって、当業者は、処置が、疾患状態を改善することができるが、疾患に対する完全な治癒でなくてもよいことを理解する。本明細書で使用される場合、用語「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」は、予防を含む。
【０３６９】
[0443]例示的な投与方式としては、以下に限定されないが、注射、注入、点眼、吸入、または摂取が挙げられる。「注射」としては、限定されないが、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、心室内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、脳脊髄内、および胸骨内への注射および注入が挙げられる。好ましい実施形態では、組成物は、静脈内注射または注入によって投与される。
【０３７０】
[0444]疾患または障害の「処置（ｔｒｅａｔｍｅｎｔ）」、「予防（ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ）」または「改善（ａｍｅｌｉｏｒａｔｉｏｎ）」は、このような疾患または障害の開始を遅延または予防すること、このような疾患または障害に関連する状態の進行、深刻化または悪化、進行または重篤度を、反転、緩和、改善、阻害、緩慢化または停止させることを意味する。一実施形態では、疾患または障害の症状は、少なくとも５％、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、または少なくとも５０％緩和される。
【０３７１】
[0445]糖尿病の処置は、標準的な医学的方法によって決定される。糖尿病処置の目標は、可能な限り安全に、糖レベルを低下させて、正常に近づけることである。共通して設定される目標は、食前に、１デシリットル当たり８０〜１２０ミリグラム（ｍｇ／ｄｌ）であり、就寝時に、１００〜１４０ｍｇ／ｄｌである。特定の内科医は、他の要因、例えば、多くの場合、患者が低血糖反応をどの程度有するかに応じて、患者に対して異なる標的を設定してもよい。有用な医療的試験としては、血糖レベルを決定するための患者の血液および尿における試験、グリコシル化ヘモグロビンレベル（ＨｂＡ１ｃ；過去２〜３カ月にわたる平均血中グルコースレベルの測定、正常範囲は４〜６％である。）についての試験、コレステロールおよび脂肪レベルについての試験、ならびに尿タンパク質レベルについての試験が挙げられる。このような試験は、当業者に公知の標準的な試験である（例えば、Ａｍｅｒｉｃａｎ  Ｄｉａｂｅｔｅｓ  Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ、１９９８年を参照されたい）。好効果の処置プログラムは、そのプログラムにおいて、糖尿病に関する合併症、例えば、目の疾患、腎臓疾患、または神経疾患を患者がほとんど患っていないことによっても決定することができる。
【０３７２】
[0446]対象における糖尿病の開始を遅延させることは、少なくとも１週間、少なくとも２週間、少なくとも１カ月、少なくとも２カ月、少なくとも６カ月、少なくとも１年、少なくとも２年、少なくとも５年、少なくとも１０年、少なくとも２０年、少なくとも３０年、少なくとも４０年またはそれより長い期間、対象の寿命全体を含み得る間、糖尿病の少なくとも１つの症状、例えば、高血糖、低インスリン血症、糖尿病性網膜症、糖尿病性腎症、失明、記憶喪失、腎不全、心血管疾患（冠動脈疾患、末梢動脈疾患、脳血管疾患、アテローム硬化症、および高血圧を含む）、神経症、自律神経機能不全、高血糖性高浸透圧昏睡、またはこれらの組合せの開始の遅延を指す。
【０３７３】
[0447]一部の態様では、本開示は、本明細書において提供される細胞または細胞クラスター（例えば、インスリン産生細胞）を含むデバイスを対象に移植するステップを含む方法であって、デバイスが、対象における血中グルコースレベルの低減に十分な量でインスリンを放出する方法に関する。一部の実施形態では、インスリン産生細胞は、グルコース応答性インスリン産生細胞である。
【０３７４】
[0448]一部の実施形態では、本明細書において提供される細胞もしくは細胞クラスター、またはデバイスの移植によって誘導されるように、対象における血中グルコースレベルの低減は、糖尿病の閾値よりも低いグルコースの量をもたらす。一部の実施形態では、対象は、哺乳動物対象である。一部の実施形態では、哺乳動物対象は、ヒトである。一部の実施形態では、グルコースの量は、移植の１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０日後に、糖尿病の閾値よりも低く低下される。
【０３７５】
[0449]上記で詳細に記載されているように、本開示の医薬組成物は、以下の：（１）経口投与、例えば、水薬（水溶液もしくは非水性溶液または懸濁液）、ロゼンジ、糖衣錠、カプセル剤、丸剤、錠剤（例えば、頬、舌下、および全身での吸収を標的とするもの）、ボーラス、散剤、顆粒剤、舌への塗布用のペースト剤；（２）非経口投与、例えば、無菌の溶液剤もしくは懸濁剤、または持続放出製剤としての、例えば、皮下、筋肉内、静脈内または硬膜外注射による；（３）局所塗布、例えば、クリーム剤、軟膏剤または制御放出パッチもしくは皮膚に塗布されるスプレー剤；（４）膣内または直腸内、例えば、ペッサリー、クリーム剤またはフォーム剤；（５）舌下；（６）眼；（７）経皮；（８）経粘膜；または（９）経鼻に採用されたものを含む固体または液体形態での投与用に専用に製剤化され得る。さらに、化合物は、患者に移植するか、または、薬剤送達システムを使用して注射され得る。例えば、Ｕｒｑｕｈａｒｔら、Ａｎｎ．  Ｒｅｖ．  Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．  Ｔｏｘｉｃｏｌ．  ２４：１９９〜２３６頁（１９８４年）；Ｌｅｗｉｓ編  「Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ  Ｒｅｌｅａｓｅ  ｏｆ  Ｐｅｓｔｉｃｉｄｅｓ  ａｎｄ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ」（Ｐｌｅｎｕｍ  Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ、１９８１年）；米国特許第３，７７３，９１９号；および米国特許第３５３，２７０，９６０号明細書を参照されたい。
【０３７６】
[0450]本明細書の方法によって処置することができる対象は、ヒトまたは非ヒト動物であり得る。一部の事例では、対象は、哺乳動物であり得る。対象の例としては、以下に限定されないが、霊長類、例えば、サル、チンパンジー、バンブー（bamboo）、またはヒトが挙げられる。一部の事例では、対象は、ヒトである。対象は、以下に限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウサギなどを含む非霊長類の動物であってもよい。一部の事例では、処置を受けている対象は、それを必要とする対象、例えば、それを必要とするヒトである。
【０３７７】
[0451]ある特定の実施形態では、対象は、哺乳動物、例えば、霊長類、例えば、ヒトである。用語「患者」および「対象」は、本明細書において交換可能に使用される。好ましくは、対象は、哺乳動物である。哺乳動物は、ヒト、非ヒト霊長類、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ウマ、またはウシであり得るが、これらの例に限定されない。ヒト以外の哺乳動物は、１型糖尿病、２型真性糖尿病、または糖尿病前症の動物モデルを表す対象として有利に使用することができる。さらに、本明細書に記載の方法を使用して、家畜および／またはペットを処置することができる。対象は、雄であっても雌であってもよい。対象は、糖尿病（例えば、１型または２型）、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または糖尿病前症を患っているか、または有すると予め診断または特定されている者、および任意選択で、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または糖尿病前症に対する処置を受ける必要がなかった者であり得る。対象は、糖尿病または糖尿病前症を患っていない者であってもよい。対象は、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または糖尿病前症を患っていると診断または特定されているが、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または糖尿病前症についての１つまたは複数の処置を受けた結果として、公知の糖尿病リスク要因における改善を示す者であってもよい。あるいは、対象は、糖尿病、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症、または糖尿病前症を有すると予め診断されていない者であってもよい。例えば、対象は、糖尿病、糖尿病に関連する合併症、もしくは糖尿病前症についての１つもしくは複数のリスク要因を呈する者、または糖尿病リスク要因を呈さない対象、または糖尿病、１つもしくは複数の糖尿病関連の合併症、もしくは糖尿病前症について無症候である対象であってもよい。対象は、糖尿病もしくは糖尿病前症を患っているかまたは糖尿病もしくは糖尿病前症になるリスクにある者であってもよい。対象は、本明細書で定義されているように、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症または糖尿病前症を有すると診断または特定された者であってもよく、あるいは、対象は、糖尿病に関連する１つもしくは複数の合併症または糖尿病前症を有すると予め診断または特定されていない者であってもよい。
【０３７８】
[0452]方法は、当技術分野の任意の手段を使用して、細胞クラスターを対象に移植するステップを含み得る。例えば、方法は、腹腔内空間、腎被膜下、腎被膜、大網、皮下空間を介して、または膵床（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ  ｂｅｄ）注入によって、細胞クラスターを移植するステップを含み得る。例えば、移植は、被膜下移植、筋肉内移植、または門脈内移植、例えば、門脈内注入であり得る。免疫防御性カプセル化は、細胞クラスターに免疫防御性を与えるために実行され得る。一部の事例では、本明細書において提供される処置の方法は、移植片（例えば、細胞またはデバイス）に対する移植拒絶応答または他の免疫応答をモジュレートするまたは低減するための免疫応答モジュレーターを投与することを含み得る。この方法において使用することができる免疫応答モジュレーターの例としては、アザチオプリンおよびミコフェノール酸のようなプリン合成阻害剤、レフルノミドおよびテリフルノミドのようなピリミジン合成阻害剤、メトトレキサートのような抗葉酸剤、タクロリムス、シクロスポリン、ピメクロリムス、アベチムス、グスペリムス、レナリドマイド、ポマリドミド、サリドマイド、ＰＤＥ４阻害剤、アプレミラスト、アナキンラ、シロリムス、エベロリムス、リダフォロリムス、テムシロリムス、ウミロリムス、ゾタロリムス、抗胸腺細胞グロブリン抗体、抗リンパ球グロブリン抗体、ＣＴＬＡ−４、その断片、ならびにアバタセプトおよびベラタセプトのようなその融合タンパク質、エタネルセプトおよびペグスネルセプトのようなＴＮＦ阻害剤、アフリベルセプト、アレファセプト、リロナセプト、エクリズマブのような補体成分５に対する抗体、アダリムマブ、アフェリモマブ、セルトリズマブペゴール、ゴリムマブ、インフリキシマブ、およびネレリモマブのような抗ＴＮＦ抗体、メポリズマブのようなインターロイキン５に対する抗体、オマリズマブのような抗ＩｇＥ抗体、ファラリモマブのような抗インターフェロン抗体、エルシリモマブのような抗ＩＬ−６抗体、レブリキズマブおよびウステキヌマブのようなＩＬ−１２およびＩＬ−２３に対する抗体、セクキヌマブのような抗ＩＬ−１７抗体、ムロモナブ−ＣＤ３、オテリキシズマブ、テプリズマブ、およびビシリズマブのような抗ＣＤ３抗体、クレノリキシマブ、ケリキシマブ、およびザノリムマブのような抗ＣＤ４抗体、エファリズマブのような抗ＣＤ１１ａ抗体、エルリズマブのような抗ＣＤ１８抗体、オビヌツズマブ、リツキシマブ、オクレリズマブおよびパスコリズマブのような抗ＣＤ２０抗体、ゴミリキシマブおよびルミリキシマブのような抗ＣＤ２３抗体、テネリキシマブおよびトラリズマブのような抗ＣＤ４０抗体、アセリズマブのようなＣＤ６２Ｌ／Ｌ−セレクチンに対する抗体、ガリキシマブのような抗ＣＤ８０抗体、ガビリモマブのような抗ＣＤ１４７／ベイシジン抗体、ルプリズマブのような抗ＣＤ１５４抗体、ベリムマブおよびブリシビモドのような抗ＢＬｙＳ抗体、イピリムマブおよびトレメリムマブのような抗ＣＴＬＡ−４抗体、ベルチリムマブ（Ｂｅｒｔｉｌｉｍｕｍａｂ）、レルデリムマブ、およびメテリムマブのような抗ＣＡＴ抗体、ナタリズマブのような抗インテグリン抗体、トシリズマブのような���ンターロイキン−６受容体に対する抗体、オデュリモマブ（ｏｄｕｌｉｍｏｍａｂ）のような抗ＬＦＡ−１抗体、バシリキシマブ、ダシリズマブ、およびイノリモマブのようなＩＬ−２受容体／ＣＤ２５に対する抗体、アトロリムマブ、セデリズマブ、フォントリズマブ、マスリモマブ、モロリムマブ、ペキセリズマブ、レスリズマブ、ロベリズマブ、シプリズマブ、タリズマブ、テリモマブアリトックス、バパリキシマブ、およびベパリモマブのようなＴリンパ球（ゾリモマブアリトック）に対する抗体を挙げることができる。
【０３７９】
[0453]「消泡剤」は、水性分散液の凝固、完成フィルム中の泡を生じさせ得るか、または一般に加工を害し得る、加工中の発泡を減少させる。例示的な消泡剤としては、シリコンエマルジョンまたはソルビタンセスキオレアートが挙げられる。
【０３８０】
[0454]「酸化防止剤」としては、例えば、ブチル化ヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）、アスコルビン酸ナトリウム、アスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウムおよびトコフェロールが挙げられる。ある特定の実施形態では、酸化防止剤は必要に応じて化学的安定性を高める。
【０３８１】
[0455]本明細書に記載の製剤は、酸化防止剤、金属キレート剤、チオール含有化合物および他の一般的な安定化剤から利益を得ることができる。このような安定化剤の例としては、以下に限定されないが、（ａ）約０．５％〜約２％ｗ／ｖのグリセロール、（ｂ）約０．１％〜約１％ｗ／ｖのメチオニン、（ｃ）約０．１〜約２％ｗ／ｖのモノチオグリセロール、（ｄ）約１ｍＭ〜約１０ｍＭのＥＤＴＡ、（ｅ）約０．０１％〜約２％ｗ／ｖのアスコルビン酸、（ｆ）約０．００３％〜約０．０２％ｗ／ｖのポリソルベート８０、（ｇ）０．００１％〜約０．５％ｗ／ｖのポリソルベート２０、（ｈ）アルギニン、（ｉ）ヘパリン、（ｊ）デキストラン硫酸、（ｋ）シクロデキストリン、（ｌ）ペントサンポリサルフェートおよび他のヘパリン類似物質、（ｍ）マグネシウムおよび亜鉛などの二価のカチオン；または（ｎ）これらの組合せが挙げられる。
【０３８２】
[0456]「結合剤」は、粘着性を与え、例えば、アルギン酸およびその塩；セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロース、メチルセルロース（例えば、Ｍｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、Ｋｌｕｃｅｌ（登録商標））、エチルセルロース（例えば、Ｅｔｈｏｃｅｌ（登録商標））、および微結晶性セルロース（例えば、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標））；微結晶性デキストロース；アミロース；ケイ酸アルミニウムマグネシウム；多糖酸；ベントナイト；ゼラチン；ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー；クロスポビドン；ポビドン；デンプン；アルファ化デンプン；トラガカント、デキストリン、糖、例えば、スクロース（例えば、Ｄｉｐａｃ（登録商標））、グルコース、デキストロース、糖蜜、マンニトール、ソルビトール、キシリトール（例えば、Ｘｙｌｉｔａｂ（登録商標））、およびラクトース；天然または合成ゴム、例えば、アカシア、トラガカント、ガティガム、イサポール殻（ｉｓａｐｏｌ  ｈｕｓｋ）の粘液、ポリビニルピロリドン（例えば、Ｐｏｌｙｖｉｄｏｎｅ（登録商標）ＣＬ、Ｋｏｌｌｉｄｏｎ（登録商標）ＣＬ、Ｐｏｌｙｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）ＸＬ−１０）、ラーチ・アラボガラクタン（ｌａｒｃｈ  ａｒａｂｏｇａｌａｃｔａｎ）、Ｖｅｅｇｕｍ（登録商標）、ポリエチレングリコール、ロウ、アルギン酸ナトリウムなどを含む。
【０３８３】
[0457]「担体」または「担体材料」としては、医薬において一般的に使用される任意の賦形剤が挙げられ、本明細書に開示されている化合物、例えば、イブルチニブの化合物および抗がん剤との適合性、ならびに所望の剤形の放出プロファイル特性に基づいて選択されるべきである。例示的な担体材料としては、例えば、結合剤、懸濁化剤、崩壊剤、充填剤、界面活性剤、可溶化剤、安定化剤、滑沢剤、湿潤剤、希釈剤などが挙げられる。「薬学的に適合性の担体材料」としては、アカシア、ゼラチン、コロイド状二酸化ケイ素、グリセロリン酸カルシウム、乳酸カルシウム、マルトデキストリン、グリセリン、ケイ酸マグネシウム、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、コレステロール、コレステロールエステル、カゼイン酸ナトリウム、大豆レシチン、タウロコール酸、ホスフォチジルコリン（ｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、塩化ナトリウム、リン酸三カルシウム、リン酸二カリウム、セルロースおよびセルロースコンジュゲート、糖類  ステアロイルラクチル酸ナトリウム、カラギーナン、モノグリセリド、ジグリセリド、アルファ化デンプンなどが挙げられ得るが、これらに限定されない。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ  Ｓｃｉｅｎｃｅ  ａｎｄ  Ｐｒａｃｔｉｃｅ  ｏｆ  Ｐｈａｒｍａｃｙ，第１９版（Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．：Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏｍｐａｎｙ、１９９５年）；Ｈｏｏｖｅｒ，Ｊｏｈｎ  Ｅ．、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ  Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｍａｃｋ  Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ  Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ  １９７５年；Ｌｉｂｅｒｍａｎ，Ｈ．Ａ．およびＬａｃｈｍａｎ，Ｌ編、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ、Ｍａｒｃｅｌ  Ｄｅｃｋｅｒ，Ｎｅｗ  Ｙｏｒｋ，Ｎ．Ｙ．、１９８０年；ならびにＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ  Ｄｏｓａｇｅ  Ｆｏｒｍｓ  ａｎｄ  Ｄｒｕｇ  Ｄｅｌｉｖｅｒｙ  Ｓｙｓｔｅｍｓ、第７版（ＬｉｐｐｉｎｃｏｔＴ  Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ１９９９）を参照されたい。
【０３８４】
[0458]「分散剤」、および／または「粘度調整剤」としては、液体媒体または造粒法もしくはブレンド法によって薬物の拡散および均質性を制御する材料が挙げられる。一部の実施形態では、これらの薬剤はまた、コーティングまたは浸食性マトリックスの有効性を促進する。例示的な拡散促進剤／分散剤としては、例えば、親水性ポリマー、電解質、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）６０もしくは８０、ＰＥＧ、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ；Ｐｌａｓｄｏｎｅ（登録商標）として商業的に公知）、および炭水化物系分散剤、例えば、ヒドロキシプロピルセルロース（例えば、ＨＰＣ、ＨＰＣ−ＳＬ、およびＨＰＣ−Ｌ）、ヒドロキシプロピルメチルセルロース（例えば、ＨＰＭＣ  Ｋ１００、ＨＰＭＣ  Ｋ４Ｍ、ＨＰＭＣ  Ｋ１５Ｍ、およびＨＰＭＣ  Ｋ１００Ｍ）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート（ＨＰＭＣＡＳ）、非結晶性セルロースなど、ケイ酸アルミニウムマグネシウム、トリエタノールアミン、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、エチレンオキシドおよびホルムアルデヒドとの４−（１，１，３，３−テトラメチルブチル）−フェノールポリマー（チロキサポールとしても公知）、ポロキサマー（例えば、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシドのブロック共重合体である、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ  Ｆ６８（登録商標）、Ｆ８８（登録商標）、およびＦ１０８（登録商標））；およびポロキサミン（例えば、エチレンジアミンへのプロピレンオキシドおよびエチレンオキシドの逐次付加から誘導された四官能性ブロック共重合体である、Ｐｏｌｏｘａｍｉｎｅ  ９０８（登録商標）としても公知の、Ｔｅｔｒｏｎｉｃ  ９０８（登録商標）（ＢＡＳＦ  Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ、Ｎ．Ｊ．））、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ポリビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ−６３０）、ポリエチレングリコール、例えば、ポリエチレングリコールは約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有し得る、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ポリソルベート−８０、アルギン酸ナトリウム、ゴム、例えば、トラガカントゴムおよびアカシアゴム、グアーゴム、キサンタン（キサンタンゴムを含む）など、糖類、セルロース誘導体、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなど、ポリソルベート−８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポリエトキシル化ソルビタンモノラウレート、ポビドン、カルボマー、ポリビニルアルコール（ＰＶＡ）、アルギネート、キトサンおよびそれらの組合せが挙げられる。セルロースまたはトリエチルセルロースなどの可塑剤も分散剤として使用することができる。リポソーム分散液および自己乳化分散液において��に有用な分散剤は、ジミリストイルホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルコリン、卵由来の天然ホスファチジルグリセロール、コレステロールおよびミリスチン酸イソプロピルである。
【０３８５】
[0459]１つまたは複数の浸食促進剤の１つまたは複数の拡散促進剤との組合せも本発明の組成物において使用することができる。
[0460]用語「希釈剤」は、送達前に目的の化合物を希釈するために使用される化学化合物を指す。希釈剤は、それらがより安定な環境を提供し得るため、化合物を安定化させるためにも使用され得る。リン酸緩衝生理食塩水溶液を含むが、これらに限定されない、緩衝溶液中に溶解した塩（これはまた、ｐＨ制御または維持も提供し得る）が当技術分野で希釈剤として利用される。ある特定の実施形態では、希釈剤は、カプセル充填のための均一な配合のために圧縮を促進するかまたは十分なかさを作り出すために、組成物のかさを増加させる。このような化合物としては、例えば、ラクトース、デンプン、マンニトール、ソルビトール、デキストロース、Ａｖｉｃｅｌ（登録商標）などの微結晶性セルロース；第二リン酸カルシウム、リン酸二カルシウム二水和物；リン酸三カルシウム、リン酸カルシウム；無水ラクトース、噴霧乾燥ラクトース；アルファ化デンプン、Ｄｉ−Ｐａｃ（登録商標）（Ａｍｓｔａｒ）などの圧縮糖；マンニトール、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、スクロース系希釈剤、精製粉末糖；第一硫酸カルシウム一水和物、硫酸カルシウム二水和物；乳酸カルシウム三水和物、デキストレート；加水分解した穀物固形物、アミロース；粉末化セルロース、炭酸カルシウム；グリシン、カオリン；マンニトール、塩化ナトリウム；イノシトール、ベントナイトなどが挙げられる。
【０３８６】
[0461]「充填剤」としては、ラクトース、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、第二リン酸カルシウム、硫酸カルシウム、微結晶性セルロース、セルロース粉末、デキストロース、デキストレート、デキストラン、デンプン類、アルファ化デンプン、スクロース、キシリトール、ラクチトール、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、ポリエチレングリコールなどの化合物が挙げられる。
【０３８７】
[0462]「滑沢剤」および「流動化剤」は、材料の付着または摩擦を防止、低減または阻害する化合物である。例示的な滑沢剤としては、例えば、ステアリン酸、水酸化カルシウム、タルク、ナトリウムステアリルフマレート、鉱物油などの炭化水素、または水素添加大豆油（Ｓｔｅｒｏｔｅｘ（登録商標））などの水素添加植物油、高級脂肪酸およびアルミニウム、カルシウム、マグネシウム、亜鉛などのそれらのアルカリ金属およびアルカリ土類金属塩、ステアリン酸、ステアリン酸ナトリウム、グリセロール、タルク、ロウ、Ｓｔｅａｒｏｗｅｔ（登録商標）、ホウ酸、安息香酸ナトリウム、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、ロイシン、ポリエチレングリコール（例えば、ＰＥＧ−４０００）またはＣａｒｂｏｗａｘ（商標）などのメトキシポリエチレングリコール、オレイン酸ナトリウム、安息香酸ナトリウム、ベへン酸グリセリル、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸マグネシウムもしくはナトリウム、Ｓｙｌｏｉｄ（商標）、Ｃａｂ−Ｏ−Ｓｉｌ（登録商標）などのコロイド状シリカ、トウモロコシデンプンなどのデンプン、シリコーン油、界面活性剤などが挙げられる。
【０３８８】
[0463]「可塑剤」は、マイクロカプセル材料またはフィルムコーティングの脆性を低下させるようにそれらを軟化させるために使用される化合物である。好適な可塑剤としては、例えば、ＰＥＧ  ３００、ＰＥＧ  ４００、ＰＥＧ  ６００、ＰＥＧ  １４５０、ＰＥＧ  ３３５０、およびＰＥＧ  ８００などのポリエチレングリコール、ステアリン酸、プロピレングリコール、オレイン酸、トリエチルセルロースおよびトリアセチンが挙げられる。一部の実施形態では、可塑剤はまた、分散剤または湿潤剤としても機能し得る。
【０３８９】
[0464]「可溶化剤」としては、例えば、トリアセチン、クエン酸トリエチル、オレイン酸エチル、カプリル酸エチル、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクサート、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、ジメチルアセトアミド、Ｎ−メチルピロリドン、Ｎ−ヒドロキシエチルピロリドン、ポリビニルピロリドン、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルシクロデキストリン、エタノール、ｎ−ブタノール、イソプロピルアルコール、コレステロール、胆汁塩、ポリエチレングリコール２００〜６００、グリコフロール、トランスクトール（ｔｒａｎｓｃｕｔｏｌ）、プロピレングリコール、およびジメチルイソソルビドなどの化合物が挙げられる。
【０３９０】
[0465]「安定化剤」としては、任意の酸化防止剤、緩衝剤、酸、保存剤などの化合物が挙げられる。
[0466]「懸濁化剤」としては、例えば、ポリビニルピロリドン、例えば、ポリビニルピロリドンＫ１２、ポリビニルピロリドンＫ１７、ポリビニルピロリドンＫ２５、またはポリビニルピロリドンＫ３０、ビニルピロリドン／酢酸ビニルコポリマー（Ｓ６３０）、ポリエチレングリコール（例えば、ポリエチレングリコールは、約３００〜約６０００、または約３３５０〜約４０００、または約７０００〜約５４００の分子量を有し得る）、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシメチルセルロースアセテートステアレート、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、例えば、トラガカントガムおよびおよびアカシアガム、グアーガム、キサンタンガムを含むキサンタンなどのガム、糖類、例えば、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウムなどのセルロース系材料、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ポリソルベート８０、アルギン酸ナトリウム、ポリエトキシ化モノラウリン酸ソルビタン、ポリエトキシ化モノラウリン酸ソルビタン、ポビドンなどの化合物が挙げられる。
【０３９１】
[0467]「界面活性剤」としては、例えば、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクサート、Ｔｗｅｅｎ６０または８０、トリアセチン、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、モノオレイン酸ソルビタン、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ポリソルベート、ポロキサマー（ｐｏｌａｘｏｍｅｒ）、胆汁塩、モノステアリン酸グリセリル、エチレンオキシドおよびプロピレンオキシド、例えばＰｌｕｒｏｎｉｃ（登録商標）（ＢＡＳＦ）などの化合物が挙げられる。いくつかの他の界面活性剤としては、ポリオキシエチレン脂肪酸グリセリドおよび植物油、例えば、ポリオキシエチレン（６０）水素添加ヒマシ油；ならびにポリオキシエチレンアルキルエーテルおよびアルキルフェニルエーテル、例えば、オクトキシノール１０、オクトキシノール４０が挙げられる。一部の実施形態では、界面活性剤は、物理安定度を増強するためまたは他の目的のために含まれてもよい。
【０３９２】
[0468]「粘度増強剤」としては、例えば、メチルセルロース、キサンタンガム、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースアセテートステアレート、ヒドロキシプロピルメチルセルロースフタレート、カルボマー、ポリビニルアルコール、アルギネート、アカシア、キトサンおよびこれらの組合せが挙げられる。
【０３９３】
[0469]「湿潤剤」としては、例えば、オレイン酸、モノステアリン酸グリセリン、モノオレイン酸ソルビタン、モノラウリン酸ソルビタン、トリエタノールアミンオレエート、モノオレイン酸ポリオキシエチレンソルビタン、モノラウリン酸ポリオキシエチレンソルビタン、ナトリウムドクサート、オレイン酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ナトリウムドクサート（ｓｏｄｉｕｍ  ｄｏｃｃｕｓａｔｅ）、トリアセチン、Ｔｗｅｅｎ  ８０、ビタミンＥ  ＴＰＧＳ、アンモニウム塩などの化合物が挙げられる。
【０３９４】
[0470]本開示は、上記に記載され、例示された実施形態に限定されないが、添付の請求項の範囲内で変更および修正が可能である。
[0471]例示的実施形態
[1]膵前駆細胞またはその前駆体の集団を少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが、前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物と接触していない内分泌細胞の対応する集団と比較して、ＶＭＡＴまたはＣｄｘ２を発現する細胞の割合が減少した内分泌細胞の集団をもたらす、方法。
[2]前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物が、ＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち１つまたは複数を含む、段落[1]に記載の方法。
[3]前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、段落[2]に記載の方法。
[4]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＥＺＨ２阻害剤である、段落[3]に記載の方法。
[5]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである、段落[3]または[4]に記載の方法。
[6]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、段落[5]に記載の方法。
[7]前記組成物中の前記ＤＺＮｅｐの濃度が０．１μＭより大きい、段落[6]に記載の方法。
[8]前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が少なくとも０．５μＭである、段落[7]に記載の方法。
[9]前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が約１μＭである、段落[7]に記載の方法。
[10]前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物がヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む、段落[1]から[9]のいずれか一項に記載の方法。
[11]前記ＨＤＡＣ阻害剤がクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである、段落[10]に記載の方法。
[12]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、またはＴＭＰ１９５のうち少なくとも１つである、段落[11]に記載の方法。
[13]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、段落[12]に記載の方法。
[14]前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物がＨＤＡＣ阻害剤およびＥＺＨ２阻害剤を含む、段落[1]に記載の方法。
[15]前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物がＤＺＮｅｐおよびＫＤ５１７０を含む、段落[1]に記載の方法。
[16]前記ＶＭＡＴを発現する細胞のうち少なくとも１個がＩＮＳ−である、段落[1]から[15]のいずれか一項に記載の方法。
[17]前記膵前駆細胞の集団のうち少なくともいくつかの細胞がＰＨ細胞の集団に分化する、段落[1]から[16]のいずれか一項に記載の方法。
[18]前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物と接触していない前記内分泌細胞の対応する集団と比較して、前記内分泌細胞の集団のうちの増加した割合の細胞がＮＫＸ６．１−またはＣｈｒｏｍＡ＋である、段落[17]に記載の方法。
[19]前記増加した割合の細胞のうち少なくとも１個の細胞がＮＫＸ６．１−かつＣｈｒｏｍＡ＋である、段落[18]に記載の方法。
[20]前記膵前駆細胞の集団のうち少なくともいくつかの細胞がβ細胞の集団に分化する、段落[1]から[19]のいずれか一項に記載の方法。
[21]前記β細胞が幹細胞から誘導されたβ（ＳＣ−β）細胞である、段落[20]に記載の方法。
[22]前記β細胞がＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する、段落[20]または[21]に記載の方法。
[23]前記β細胞がグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する、段落[20]から[22]のいずれか一項に記載の方法。
[24]ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、段落[1]から[23]のいずれか一項に記載の方法。
[25]前記組成物が、ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、またはスタウロスポリンのうち少なくとも１つを含む、段落[24]に記載の方法。
[26]前記接触させるステップが少なくとも３日間である、段落[24]または[25]に記載の方法。
[27]前記接触させるステップが少なくとも５日間である、段落[24]または[25]に記載の方法。
[28]前記接触させるステップが約７日間である、段落[24]または[25]に記載の方法。
[29]前記膵前駆細胞の集団のうち少なくとも１個の膵前駆細胞がＰＤＸ１およびＮＫＸ６−１のうち少なくとも１つを発現する、段落[1]から[28]のいずれか一項に記載の方法。
[30]前記内分泌細胞の集団のうち少なくとも１個の内分泌細胞がＣＨＧＡを発現する、段落[1]から[29]のいずれか一項に記載の方法。
[31]段落[1]から[30]のいずれか一項に記載の方法によって生成された細胞。
[32]膵前駆細胞、ヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、および任意選択で内分泌細胞を含む組成物。
[33]前記ＨＤＡＣ阻害剤がクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである、段落[32]に記載の組成物。
[34]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、またはＴＭＰ１９５のうち少なくとも１つである、段落[33]に記載の組成物。
[35]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、段落[34]に記載の組成物。
[36]前記組成物中の前記ＫＤ５１７０の濃度が少なくとも０．１μＭである、段落[35]に記載の組成物。
[37]前記ＫＤ５１７０の前記濃度が少なくとも０．５μＭである、段落[36]に記載の組成物。
[38]前記ＫＤ５１７０の前記濃度が約１μＭである、段落[37]に記載の組成物。
[39]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＥＺＨ２阻害剤である、段落[32]から[38]のいずれか一項に記載の組成物。
[40]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである、段落[39]に記載の組成物。
[41]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、段落[40]に記載の組成物。
[42]前記ＤＺＮｅｐの濃度が少なくとも０．１μＭである、段落[41]に記載の組成物。
[43]前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が少なくとも０．５μＭである、段落[42]に記載の組成物。
[44]前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が約１μＭである、段落[42]に記載の組成物。
[45]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０であり、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、段落[32]に記載の組成物。
[46]ｉｎ  ｖｉｔｒｏ組成物である、段落[32]から[45]のいずれか一項に記載の組成物。
[47]ベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、またはスタウロスポリンのうち少なくとも１つをさらに含む、段落[46]に記載の組成物。
[48]膵前駆細胞またはその前駆体をヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤およびヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが前記膵前駆細胞の分化を誘起する、方法。
[49]前記膵前駆細胞がβ細胞に分化する、段落[48]に記載の方法。
[50]前記β細胞が幹細胞から誘導されたβ（ＳＣ−β）細胞である、段落[49]に記載の方法。
[51]前記β細胞がＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する、段落[49]または[50]に記載の方法。
[52]前記β細胞がグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する、段落[49]から[51]のいずれか一項に記載の方法。
[53]前記ＨＤＡＣ阻害剤がクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである、段落[48]から[52]のいずれか一項に記載の方法。
[54]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、またはＴＭＰ１９５のうち少なくとも１つである、段落[53]に記載の方法。
[55]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、段落[54]に記載の方法。
[56]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＥＺＨ２阻害剤である、段落[48]から[55]のいずれか一項に記載の方法。
[57]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである、段落[56]に記載の方法。
[58]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、段落[57]に記載の方法。
[59]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０であり、前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、段落[48]に記載の方法。
[60]ｉｎ  ｖｉｔｒｏで実施される、段落[48]から[59]のいずれか一項に記載の方法。
[61]膵前駆細胞またはその前駆体を、前記細胞の分化をもたらすために十分な量のＫＤ５１７０と接触させるステップを含む方法。
[62]前記膵前駆細胞をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップをさらに含む、段落[61]に記載の方法。
[63]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである、段落[62]に記載の方法。
[64]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、段落[63]に記載の方法。
[65]前記膵前駆細胞が内分泌細胞に分化する、段落[61]から[64]のいずれか一項に記載の方法。
[66]前記膵前駆細胞がβ細胞に分化する、段落[61]から[65]のいずれか一項に記載の方法。
[67]前記β細胞が幹細胞から誘導されたβ（ＳＣ−β）細胞である、段落[66]に記載の方法。
[68]前記β細胞がＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する、段落[66]または[67]に記載の方法。
[69]前記β細胞がグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する、段落[66]から[68]のいずれか一項に記載の方法。
[70]ａ）複数の幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させて膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団を得るステップ、
ｂ）前記細胞集団をｉｎ  ｖｉｔｒｏでヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と接触させて少なくとも１個の内分泌細胞を産生させるステップ、および
ｃ）前記内分泌細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させて少なくとも１個のＳＣ−β細胞を得るステップ
を含む方法。
[71]前記幹細胞がヒト多能性幹細胞である、段落[70]に記載の方法。
[72]前記細胞集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、またはスタウロスポリンのうち少なくとも１つと接触させるステップをさらに含む、段落[70]または[71]に記載の方法。
[73]前記ＳＣ−β細胞がＣ−ＰＥＰおよびＮＫＸ６−１を発現する、段落[70]から[72]のいずれか一項に記載の方法。
[74]前記ＳＣ−β細胞がグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する、段落[70]から[73]のいずれか一項に記載の方法。
[75]前記細胞集団をヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤と接触させるステップをさらに含む、段落[70]から[74]のいずれか一項に記載の方法。
[76]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである、段落[75]に記載の方法。
[77]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、段落[76]に記載の方法。
[78]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、段落[70]から[77]のいずれか一項に記載の方法。
[79]膵前駆細胞またはその前駆体を含む細胞集団を、内分泌細胞を産生するために十分な量のヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤とｉｎ  ｖｉｔｒｏで接触させるステップ、および前記内分泌細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで成熟させて、グルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する少なくとも１つのＳＣ−β細胞を得るステップを含む方法。
[80]複数の幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化させて前記膵前駆細胞またはその前駆体を含む前記細胞集団を得るステップをさらに含む、段落[79]に記載の方法。
[81]前記細胞集団をベータセルリン、チアゾビニン、レチノイン酸、ＳＡＮＴ１、ＸＸＩ、Ａｌｋ５ｉ  ＩＩ、ＧＣ−１、ＬＤＮ、またはスタウロスポリンのうち少なくとも１つと接触させるステップをさらに含む、段落[79]または[80]に記載の方法。
[82]前記細胞集団をヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤と接触させるステップをさらに含む、段落[79]から[81]のいずれか一項に記載の方法。
[83]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、段落[82]に記載の方法。
[84]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである、段落[79]から[83]のいずれか一項に記載の方法。
[85]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、段落[84]に記載の方法。
[86]（ｉ）標的細胞を刺激性化合物と接触させるステップであって、前記接触させるステップが前記標的細胞の選択マーカーを誘起して前記標的細胞の細胞表面に局在化させるステップ、および
（ｉｉ）前記細胞表面の前記選択マーカーの前記局在化に基づいて前記標的細胞を選択するステップ
を含む、細胞の集団から前記標的細胞を選択するための方法。
[87]前記選択マーカーがＰＳＡ−ＮＣＡＭを含む、段落[86]に記載の方法。
[88]前記標的細胞を選択する前記ステップが細胞ソーティングによる、段落[87]に記載の方法。
[89]前記選択するステップが、前記選択マーカーが前記標的細胞の前記表面に局在化しているときに前記標的細胞の前記選択マーカーを抗原結合ポリペプチドと接触させるステップを含む、段落[88]に記載の方法。
[90]前記抗原結合ポリペプチドが抗体を含む、段落[89]に記載の方法。
[91]前記抗原結合ポリペプチドが前記ＰＳＡ−ＮＣＡＭに結合する、段落[90]に記載の方法。
[92]前記細胞の集団を、前記細胞の集団のうちの少なくとも１個の細胞の細胞表面から前記選択マーカーを除去する化合物と処理するステップをさらに含む、段落[86]から[91]のいずれか一項に記載の方法。
[93]前記細胞の集団が、前記標的細胞を前記刺激性化合物と接触させる前記ステップの前に前記化合物と処理される、段落[92]に記載の方法。
[94]前記化合物が、前記選択マーカーを前記少なくとも１個の細胞の前記細胞表面から開裂させる、段落[92]または[93]に記載の方法。
[95]前記化合物が酵素である、段落[94]に記載の方法。
[96]前記化合物がエンドシアリダーゼである、段落[95]に記載の方法。
[97]前記エンドシアリダーゼがエンドニューラミニダーゼ（Ｅｎｄｏ−Ｎ）である、段落[96]に記載の方法。
[98]前記標的細胞が内分泌細胞である、段落[86]から[97]のいずれか一項に記載の方法。
[99]前記刺激性化合物がアルギニンまたはグルコースのうち少なくとも１つを含む、段落[86]から[98]のいずれか一項に記載の方法。
[100]前記内分泌細胞がβ細胞である、段落[98]に記載の方法。
[101]前記β細胞がＳＣ−β細胞である、段落[101]に記載の方法。
[102]前記刺激性化合物がイソプロテレノールを含む、段落[98]に記載の方法。
[103]前記内分泌細胞がＥＣ細胞である、段落[98]に記載の方法。
[104]前記細胞の集団のうち１個または複数の細胞が、前記刺激性化合物と接触したときに前記選択マーカーを細胞表面に局在化することができない、段落[86]から[103]のいずれか一項に記載の方法。
[105]前記刺激性化合物がグルコースまたはアルギニンのうち少なくとも１つであり、前記１個または複数の細胞がＥＣ細胞である、段落[104]に記載の方法。
[106]前記刺激性化合物がイソプロテレノールであり、前記１個または複数の細胞がβ細胞である、段落[104]に記載の方法。
[107]前記標的細胞を選択する前記ステップが前記細胞の集団のうち前記１個または複数の細胞から前記標的細胞を分離する、段落[104]から[106]のいずれか一項に記載の方法。
[108]膵前駆細胞またはその前駆体の集団を少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物を含む組成物と接触させるステップを含み、前記接触させるステップが前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物と接触していない膵前駆細胞の対応する集団と比較して増加した割合の膵島細胞をもたらす、方法。
[109]前記膵島細胞が少なくとも１個のβ細胞を含む、段落[108]に記載の方法。
[110]前記β細胞がＳＣ−β細胞を含む、段落[109]に記載の方法。
[111]前記ＳＣ−β細胞がグルコースチャレンジに対してｉｎ  ｖｉｔｒｏグルコース刺激インスリン分泌応答を呈する、段落[110]に記載の方法。
[112]前記膵島細胞が少なくとも１個のアルファ細胞を含む、段落[108]に記載の方法。
[113]前記膵島細胞がデルタ細胞を含む、段落[108]に記載の方法。
[114]前記膵島細胞がポリホルモナル（ＰＨ）細胞を含む、段落[108]に記載の方法。
[115]複数の幹細胞をｉｎ  ｖｉｔｒｏで分化して前記膵前駆細胞またはその前駆体の集団を得るステップをさらに含む、段落[108]から[114]のいずれか一項に記載の方法。
[116]前記幹細胞がヒト多能性幹細胞である、段落[115]に記載の方法。
[117]前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物がＤＮＡメチル化阻害剤、ヒストンアセチルトランスフェラーゼ阻害剤、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤、ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤、またはブロモドメイン阻害剤のうち１つまたは複数を含む、段落[108]から[116]のいずれか一項に記載の方法。
[118]前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物がヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤を含む、段落[117]に記載の方法。
[119]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＥＺＨ２阻害剤である、段落[118]に記載の方法。
[120]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐ、ＧＳＫ１２６、またはＥＰＺ６４３８のうち少なくとも１つである、段落[118]または[119]に記載の方法。
[121]前記ヒストンメチルトランスフェラーゼ阻害剤がＤＺＮｅｐである、段落[120]に記載の方法。
[122]前記組成物中の前記ＤＺＮｅｐの濃度が０．１μＭより大きい、段落[121]に記載の方法。
[123]前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が少なくとも０．５μＭである、段落[122]に記載の方法。
[124]前記ＤＺＮｅｐの前記濃度が約１μＭである、段落[123]に記載の方法。
[125]前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物がヒストンデアセチラーゼ（ＨＤＡＣ）阻害剤を含む、段落[108]から[124]のいずれか一項に記載の方法。
[126]前記ＨＤＡＣ阻害剤がクラスＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、クラスＩＩ  ＨＤＡＣ阻害剤、またはそれらの組合せである、段落[125]に記載の方法。
[127]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０、ＭＣ１５６８、またはＴＭＰ１９５のうち少なくとも１つである、段落[126]に記載の方法。
[128]前記ＨＤＡＣ阻害剤がＫＤ５１７０である、段落[127]に記載の方法。
[129]前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物がＨＤＡＣ阻害剤およびＥＺＨ２阻害剤を含む、段落[108]に記載の方法。
[130]前記少なくとも１つのエピジェネティック修飾化合物がＤＺＮｅｐおよびＫＤ５１７０を含む、段落[108]に記載の方法。
【実施例】
【０３９５】
[0472]これらの実施例は、例示の目的のみのために提供され、本発明において与えられる請求項の範囲を限定するものではない。
実施例１．ｈＰＳＣ由来のベータ細胞におけるヒストンアセチル化
[0473]システムズアプローチ（例えば、Ａｒｄａら（Ｃｅｌｌ  Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ  ２３：  ９０９〜９２０頁、２０１６年））を使用して、（１）小児および成人からの膵組織の獲得、（２）安定した信頼性の高い細胞精製方法を開発すること、（３）包括的なトランスクリプトームおよびヒストン修飾マップの作成、ならびに（４）膵島の生理および機能の系統的アッセイを含む、ヒト膵島細胞における年齢に依存した遺伝子発現プログラムを特定する。若年および成人のヒト膵島細胞における年齢に依存した遺伝子のヒストン媒介性調節の別々の方式は、記載されたゲノムワイドヒストンマップで明らかにされる。Ｘｕら（ＥＭＢＯ  Ｊ  ２０１４）は、ヒストンメチル化が、内分泌前駆細胞におけるＮＧＮ３、ＮＫＸ６．１、およびＮＫＸ２．２遺伝子において低減されることを記載している。ＮＧＮ３細胞では、Ｈ３Ｋ２７ｍｅ３は、ＮＧＮ３、ＮｅｕｒｏＤ１、およびＮＫＸ６．１エレメントから枯渇しており、これは、各遺伝子の活性化と一致している。Ｈａｕｍａｉｔｒｅら（ＭＣＢ  ２０１３）は、膵臓の分化の間のＨＤＡＣ発現および活性の全体的低減について報告している。Ｘｉｅ（Ｃｅｌｌ  Ｓｔｅｍ  Ｃｅｌｌ，  ２０１３）は、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ分化の間に、クロマチン構造が不適切に再構築されることを報告している。ＥＺＨ２阻害およびＨＤＡＣ阻害によりＮＧＮ３発現が増加し、より多くの幹細胞由来ベータ細胞をもたらされ、このことは、ＮＧＮ３がベータ細胞の発生にとって重要であることを示唆する。
実施例２．ヒストンメチル化および脱アセチル化の阻害
[0474]ＮＧＮ３のｍＲＮＡ発現を本明細書に記載の分化誘導の各ステップにおいて調査し（図５）、細胞がＮＧＮ３を発現し、ＳＣ−β細胞の分化を開始することを確認した（図７）。ＳＣ−β細胞の分化におけるヒストンメチル化および脱アセチル化の阻害効果を調査した（図６）。ｈＥＳＣ株（Ｄ９７、Ｄ１１４、およびＤ２４１  ＨＵＥＳ８）において本明細書に記載の分化誘導のステージ５（図５〜６）をＥＺＨ２阻害剤（ＤＺＮｅｐ）、ＨＤＡＣ阻害剤（ＫＤ５１７０）、およびこれらの組合せで処理した（図６）。
【０３９６】
[0475]候補阻害剤のスクリーニングを図１８に記載したように実施した。ステージ５におけるＥＺＨ２またはＨＤＡＣの阻害（Ｄ９７  ＨＵＥＳ８）は、内分泌細胞およびＳＣ−β細胞を増加させた（図８）。ステージ５におけるＥＺＨ２およびＨＤＡＣの組合せによる阻害（Ｄ１１４  ＨＵＥＳ８）は、内分泌細胞を有意に増加させた（図９〜１１）。ＳＣ−β細胞は、ＤＺＮｅｐおよびＫＤ５１７０を含むステージ５の終わりに３５．４％含んだ。Ｃ−ペプチド陽性細胞の全パーセンテージは３９．６％であり、このことは、最大４％のＣ−ペプチド陽性ＮＫＸ６．１多ホルモン細胞が存在することを示唆した（図１１）。ステージ５におけるＥＺＨ２およびＨＤＡＣの組合せによる阻害を図１７に記載したように試験した。ステージ５におけるＥＺＨ２およびＨＤＡＣの組合せによる阻害（Ｄ２４１  ＨＵＥＳ８）は、ステージ５におけるニューロゲニン（ｎｅｏｒｏｇｅｎｉｎ）３＋前駆細胞を増加させた（図１２〜１３）。ステージ５におけるＥＺＨ２およびＨＤＡＣの組合せによる阻害は、ＮＫＸ６．１＋前駆細胞を増加させた（図１６）。
【０３９７】
[0476]ＤＺＮｅｐによる阻害は、ＶＭＡＴ１＋ＩＮＳ−  ＥＣ集団における特異的減少（図１９）、それに伴うＮＫＸ６．１−ＣｈｒｏｍＡ＋  ＰＨ細胞の増加（図２０）、および影響を受けないＮＫＸ６．１＋ＩＮＳ＋  ＳＣ−β細胞集団（図２１）を示した。ステージ５全体を通してＤＺＮｅｐ（１μＭ）による阻害は、生存能に影響を及ぼさず、（ＶＭＡＴ１＋ＩＮＳ−）ＥＣ集団の半分より多くを除去した（図１９〜２１）。
【０３９８】
[0477]まとめると、ヒストンメチルトランスフェラーゼおよびデアセチラーゼ阻害剤は、ＮＧＮ３の発現およびベータ細胞の分化を増加させ、ステージ５におけるＤＺＮｅｐによるＥＺＨ２阻害は、内分泌細胞（ＣＨＧＡ＋）、前駆細胞（ＮＫＸ６−１＋）およびプレ−ＳＣ−ｂ細胞（Ｃ−ＰＥＰ＋，ＮＫＸ６−１＋）の比率を増加させた。他のＥＺＨ２阻害剤（ＵＮＣ１９９９、ＧＳＫ１２６）は、３つの細胞型全ての比率を増加させなかった（図１４）。ステージ５におけるＫＤ５１７０によるＨＤＡＣ阻害は、プレ−ＳＣ−β細胞（Ｃ−ＰＥＰ＋、ＮＫＸ６−１＋）のパーセンテージを増加させた。他のＨＤＡＣ阻害剤（酪酸ナトリウム、ＴＳＡ、ＳＡＨＡ）は、プレ−ＳＣ−β細胞のパーセンテージを増加させなかった（図１５）。ステージ５におけるＤＺＮｅｐおよびＫＤ５１７０によるＥＺＨ２およびＨＤＡＣの組合せによる阻害（ＨＵＥＳ８）は、内分泌細胞（ＣＨＧＡ＋）、前駆細胞（ＮＫＸ６−１＋）およびプレ−ＳＣ−ｂ細胞（Ｃ−ＰＥＰ＋、ＮＫＸ６．１＋）の分化を相乗的かつ有意に促進した。
実施例３．幹細胞の膵β細胞（ＳＣ−β細胞）への分化
[0478]図３９に例示したように、２つの例示的な分化プロトコールｖ１１およびｖ１２を試験した。２つのプロトコールは、共に、同様の試薬を共有する６ステージの段階的プロトコールであり、最初の５ステージのそれらの分化ステップは、図５に示したような分化プロトコールに大部分は基づいており、それらの差異は以下の通りである：（ａ）ｖ１２プロトコールでは、ステージ３の１日目（Ｓ３ｄ１）に培地中に０．２５μＭのＤＭＨ−１が存在し、ステージ３の１日目と２日目（Ｓ３ｄ１〜Ｓ３ｄ２）に培地中に２０ｎｇ／ｍＬのアクチビンＡが存在した；（ｂ）ｖ１１プロトコールでは、ステージ３においてＤＭＨ−１もアクチビンＡも添加されなかった；（ｃ）ｖ１１プロトコールおよびｖ１２プロトコールの両方では、ステージ５の１、３、５、７日目に１００ｎＭの培地中にＤＺＮｅｐが存在した。ｖ１１プロトコールとｖ１２プロトコールの両方のステージ６を、外因性分化因子を含まない１％のＨＡＳを補充したＤＭＥＭ／Ｆ１２培地中で、ステージ５から産生細胞を培養することによって実施した。培地は、ステージ６を通して１日おきに交換した。
【０３９９】
[0479]一実験では、２つの異なるプロトコールによる幹細胞株Ｄ７０５に由来する細胞培養物を異なるステージで検査した。図４０は、それぞれ、ステージ４（Ｓ４）およびステージ５（Ｓ５）の分化細胞において、ＮＫＸ６．１、Ｐｄｘ１、Ｃｄｘ２、ＩＳＬ１、およびＣＨＧＡの表面発現レベルを調査した際のフローサイトメトリーの結果を示す。図に示されているように、ｖ１２プロトコールにより、Ｓ４でＣｄｘ２＋細胞およびＳ５でＩＳＬ１−／ＮＫＸ６．１−細胞のパーセンテージが低減し、Ｓ５で分化したＩＳＬ＋／ＮＫＸ６．１＋細胞のパーセンテージが増加した。
【０４００】
[0480]ステージ５の後の凍結保存および再凝集手順後（ＣｒｙｏＲＡ細胞）ならびにステージ６（Ｓ６）の分化のための細胞の回収前に、細胞培養物も調査した。この実験では、図４１のグラフでまとめたように、ステージ６の１１日目（Ｓ６ｄ１１）のＣｒｙｏＲＡ細胞クラスターの細胞の計数によって、ｖ１１プロトコールによって得た細胞と比較して、ｖ１２プロトコールによって得た細胞で、細胞回収率がかなり高いことが示された。２つのプロトコールによって得たＳ６ｄ１１細胞のフローサイトメトリー分析（図４２）によって、ＳＣ−β細胞組成物が同等のパーセンテージ、約４０％を構成することが示された。２つのプロトコールによって得たＳ６ｄ１４細胞におけるグルコース応答を調査するために、ｉｎ  ｖｉｔｒｏ  ＧＳＩＳアッセイも実施し、これにより、２つのプロトコール間で同等の結果が示された。インスリン含量も同等であることが示された（図４３）。
【０４０１】
[0481]一実験では、膵β細胞を含む細胞クラスターを例示的プロトコールによってバイオリアクター中で産生した。グルコースで刺激したインスリン分泌（ＧＳＩＳ）アッセイ（図４４Ａ）において、ＳＣ−膵島細胞クラスターを低い（ＬＧ、２．８ｍＭ）もしくは高い（ＨＧ、２０ｍＭ）グルコース条件または２．８ｍＭのグルコースと３０ｍＭのＫＣｌの組合せ（ＫＣｌ）に連続して曝露した。６個の独立したバッチの平均を示す。活性を分析する別の方法として、全インスリン含量に対して、ＳＣ−膵島細胞クラスターも溶解および分析した（図４４Ｂ）。データは、平均＋／−ＳＥＭである。
実施例４．ＳＣ−β細胞表面マーカーの特定スクリーニングおよび選別
[0482]選択的ＳＣ−β細胞表面マーカーの特定のための細胞表面マーカーライブラリースクリーニング（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ  ＭＡＣＳマーカースクリーニング）を、３７１種のＡＰＣコンジュゲートモノクローナル抗体を用いて実施した（図２２〜２３）。スクリーニングにより、ウェルの５２．３％（３７１のうちの１９４）が分析に十分な細胞を含有したことが示された。ニューポートグリーンまたはフルオジン３によるＳＣ−β生細胞の標識およびＭＡＣＳマーカーのスクリーニングは、図２４に記載したように実施することができる。
【０４０２】
[0483]ＰＳＡ−ＮＣＡＭマイクロビーズ選別によるＳＣ−β細胞の精製は、図２８に記載したように実施した。ＰＳＡ−ＮＣＡＭマイクロビーズに基づく選別により、オンターゲット細胞を濃縮し、ＳＯＸ９＋細胞を低減させた（図２５）。ＰＳＡ−ＮＣＡＭ選別後に、ＥＣ細胞（ＶＭＡＴ１＋）が残存した（図２６）。選別後に、細胞を１４日間培養した。エンドＮ酵素処理の際に、ＰＳＡ−ＮＣＡＭ発現が有意に低下した（図２７）。エンド−Ｎは、ＮＣＡＭに関連するシアル酸残基の最小長７〜９残基の特徴を有する、α−２，８−結合を含むシアル酸の線状ポリマーを迅速かつ特異的に分解するエンドシアリダーゼである。生理的条件でのＮＣＡＭにおけるＰＳＡの切断。
【０４０３】
[0484]ＰＳＡ−ＮＣＡＭを使用してＥＣ細胞を除去するために、既存のＰＳＡ−ＮＣＡＭはエンドＮ酵素で除去することができ、ＰＳＡ−ＮＣＡＭはアルギニンで刺激することによってＳＣ−β細胞上に選択的に発現し得る。ＰＳＡ−ＮＣＡＭを発現するＳＣ−β細胞は、図２８に記載したように、マイクロビーズを使用して選別することができる。
実施例５．ｈＥＳＣの品質およびＤＥ誘導の改良
[0485]分化の初期に腸系統を特定し、特定された腸前駆細胞からＥＣ細胞を生じされることができる（図２９）。ステージ０における低いＯｃｔ４％によって、後のステージにおいてより高いＣＤＸ２のパーセンテージがもたらされた。安定した分化には、高いＯｃｔ４％が必要であった。Ｓｏｘ１７による誘導のばらつきは、高いＯｃｔ４％でも一定のままであった（図３０）。ＣＤＸ２＋腸集団は、ステージ１の因子濃度によって決まった。Ｃｈｉｒ／ＡＡ濃度とタイミングを微調整することにより、ＣＤＸ２集団を低減させ、ＳＣ−β細胞の分化を改善することができる。
実施例６．ＥＣ細胞分化阻害剤のスクリーニング
[0486]ＥＣ細胞分化の阻害剤を特定するためのステージ５の細胞に関するさらなる化合物スクリーニング戦略を図３１〜３２に示す。Ｍａｔｒｉｇｅｌをコーティングした９６ウェルプレートを使用して、分化細胞を播種する。１ウェル当たり０．１〜０．３×１０６個の細胞で、細胞をプレーティングする。対照として、ＤＭＳＯのみを使用する。０．１％のＤＭＳＯ中０．１μＭ、１．０μＭ、および１０μＭの濃度で、Ｗｎｔ経路ライブラリー、エピジェネティックスライブラリー、ＧＰＣＲ化合物ライブラリー、および幹細胞シグナル伝達化合物ホルモンライブラリーをスクリーニングする。早期ステージマーカーとしてＣＤＸ２＋および後期ステージマーカーとしてＶＭＡＴ＋を用いて、高含量画像分析によりＥＣ細胞の定量を決定する。
実施例７．幹細胞由来膵島細胞のγ照射
[0487]幹細胞由来膵島細胞集団の増殖を様々な照射線量（８，０００ｒａｄおよび１０，０００ｒａｄ）で阻害した。照射を実施しなかった場合、細胞の増殖および移植片の拡大を観察した（図３３）。高いγ照射線量（１０，０００ｒａｄ）は、幹細胞由来膵島細胞の組成および機能に有意な影響を及ぼさなかった（図３４）。照射した凍結保存幹細胞由来膵島細胞について、血中グルコースを制御する能力を調査した。凍結保存細胞を解凍し、照射し、回収せずに照射直後に移植した。照射の６０日後に、凍結保存幹細胞由来膵島細胞は、血中グルコースを制御する能力を失った（図３５）。照射した試料において、増強されたベータ細胞数を観察した（図３５〜３６）。一実験では、凍結保存幹細胞由来膵島細胞を解凍する前に、γ照射を行い、その後、動物モデル中に移植される前に、細胞を凍結保存から回収し、再凝集させた（解凍前照射）。図３７に示したように、凍結保存からの回収後に照射された（解凍後照射）幹細胞由来膵島細胞の移植を受ける動物と比較して、解凍前照射を受ける幹細胞由来膵島細胞を移植した動物は、より長い期間血糖コントロールを呈した。照射した幹細胞由来膵島細胞を移植した全ての動物は、移植片が外植されるまで血糖コントロールを示した。（図３８）
[0488]まとめると、増殖細胞の数は、γ照射の放射線量に依存した。増殖細胞数は、幹細胞由来膵島細胞がより高い放射線量で照射された場合により低下した。γ照射は、幹細胞由来膵島細胞の組成および機能に有意な影響を与えなかった。細胞が凍結されている間にγ照射を行った場合、得られた幹細胞由来膵島細胞の移植片は、移植された動物モデルにおいてより長い血糖コントロール効果を有した。
【０４０４】
[0489]本開示の好ましい実施形態が本明細書において示され、記載されてきたが、このような実施形態は、例としてのみ提供される。多数の変化、変更、および置換が、現在、本開示から逸脱することなく当業者に対して生じるであろう。本明細書に記載の本開示の実施形態に対する様々な変更が本開示の実践において用いられ得ることが理解されるべきである。以下の特許請求の範囲が本開示の範囲を規定し、これらの請求項の範囲内の方法および構造ならびにこれらの均等物がそれらによって網羅されることが意図される。
【図１】
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【図２】
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【図３】
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【図４】
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【図５】
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【図６】
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【図７】
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【図８】
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【図９】
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【図１０】
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【図１１】
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【図１２】
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【図１３】
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【図１４】
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【図１５】
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【図１６】
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【図１７】
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【図１８】
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【図１９】
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【図２０】
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【図２１】
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【図２２】
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【図２３】
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【図２４】
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【図２５】
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【図２６】
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【図２７】
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【図２８】
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【図２９】
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【図３０】
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【図３１】
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【図３２】
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【図３３】
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【図３４】
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【図３５】
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【図３６】
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【図３７】
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【図３８】
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【図３９】
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【図４０】
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【図４１】
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【図４２】
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【図４３】
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【図４４】
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【国際調査報告】
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